(57)【要約】ヒト胚幹細胞は、分化ヒト細胞を含有する培養物中で胚様体を形成する。胚様体類中のヒト細胞の幾つかは、心筋細胞として分化する。そこで、それら心筋細胞の生物学的及び電気的特性を、ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞の心臓毒性メカニズムについての薬物スクリーニングプロトコールにおける使用と関連して説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤のヒト心細胞に対する作用について試験する方法であって、下記の工程、
ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞を培養する工程、
少なくとも１つの心筋細胞の膜間活動電位を測定する工程、
前記心筋細胞を前記薬剤に暴露させる工程、及び
前記心筋細胞の活動電位が前記の暴露後に変化したかどうかを観察する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記心筋細胞が、心房タイプ、心室タイプ及び結節タイプの心筋細胞からなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記培養を、前記ヒト胚幹細胞が胚様体を形成するのを可能にすることによって実施し、前記測定が、胚様体に電極を刺入することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ヒト心細胞に対する薬剤の作用について試験する方法であって、下記の工程、
ヒト胚幹細胞を培養して胚様体を形成させる工程、
物理的に収縮している培養物からの胚様体を同定する工程、
前記胚様体の物理的収縮特性を測定する工程、
前記胚様体を前記薬剤に暴露させる工程、及び
前記胚様体の収縮特性のあらゆる変化を観察する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
測定する前記収縮特性が、物理的収縮強度である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
測定する前記収縮特性が、収縮速度である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
ヒト心細胞中のHERGチャネルの電気特性に対する薬剤の作用について試験する方法であって、下記の工程、
ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞を培養する工程、
電極を培養物中の少なくとも１つの心筋細胞中に挿入する工程、
前記心筋細胞の膜間活動電位の持続性を測定する工程、
前記心筋細胞を前記薬剤に暴露させる工程、及び、
前記HERGチャネルが変化する場合のような前記活動電位持続性が前記薬剤によって変化するかどうかを観察する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記心筋細胞が、心房タイプ、心室タイプ及び結節タイプの心筋細胞からなる群から選ばれる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記培養を、前記ヒト胚幹細胞が胚様体を形成するのを可能にすることによって実施し、前記測定が、胚様体に電極を刺入することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
ヒト心細胞における分極事象後に遅延を誘発する薬剤の可能性について試験する方法であって、下記の工程、
ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞を培養する工程、
前記心筋細胞の膜間活動電位のチャートを経時的に取得する工程、
前記心筋細胞を前記薬剤に暴露させる工程、及び
分極事象後の遅延が前記薬剤によって誘発されたかどうかを観察する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記心筋細胞が、心房タイプ、心室タイプ及び結節タイプの心筋細胞からなる群から選ばれる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記培養を、前記ヒト胚幹細胞が胚様体を形成するのを可能にすることによって実施し、前記測定が、胚様体に電極を刺入することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ヒト心細胞中の長期のQT症候群を誘発させる薬剤の可能性について試験する方法であって、下記の工程、
ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞を培養する工程、
複数の前記心筋細胞の膜間活動電位のチャートを経時的に取得する工程、
前記心筋細胞を前記薬剤に暴露させる工程、及び
長期のQT症候群が前記薬剤によって前記心筋細胞のいずれかにおいて誘発されたかどうかを観察する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記心筋細胞が、心房タイプ、心室タイプ及び結節タイプの心筋細胞からなる群から選ばれる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記培養を、前記ヒト胚幹細胞が胚様体を形成するのを可能にすることによって実施し、前記測定が、胚様体に電極を刺入することを含む、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、2002年7月26日に出願された米国仮特許出願S.N. 60/399,330号からの優先権を主張する。
ヒト胚幹細胞は、生体外で安定に増殖し培養し得、少なくとも多能性であり、全能性であり得るヒト細胞である。このことは、該細胞が人体の多くの種々の成熟分化細胞タイプとして分化し得、実際に、成人人体の全ての細胞タイプに分化し得ることを意味する。ヒト胚幹細胞は、胚組織から調製し、その後、生体外培養液中で連続的に培養する。
培養においては、ヒト胚幹細胞は、ある種の因子と一緒に培養することにより、未分化状態に通常は維持されている。とりわけ、線維芽細胞供給体層上或いは線維芽細胞由来の因子の存在下でのヒト胚幹細胞の培養は、この幹細胞を未分化状態に維持する。線維芽細胞又は線維芽細胞由来の因子を除去すると、ヒト胚幹細胞は、自然に種々の組織タイプに分化し始め得る。種々の組織タイプへの自然分化過程において幹細胞によって形成される中間構成体には、胚様体として知られる構成体が存在する。胚様体は、胚幹細胞の培養物中に形成された凝集体として発生する。培養条件及び細胞系の個性は胚様体の形成率に影響するものの、多くの条件において、胚様体は、自然に発生し且つ種々の異なる組織タイプに自然に分化し始める。
胚様体中に存在する組織タイプには、心筋細胞が存在することが知られている。これらの早期心筋細胞は、ヒト成人心細胞の先駆体である。成人心筋細胞は、細胞サイクルから永続的に離脱し、再生し得ない。心筋細胞が幹細胞によって形成された胚様体内に存在する細胞の中に存在するという事実は、胚様体の１部が時には規則的な心拍様収縮を示すという事実によって明らかであった。即ち、ヒト胚幹細胞が心筋細胞の幾つかの機能特性を有する細胞として分化することは、以前に実証されている。正確には、心筋細胞を形成するのが何であるか、さらに心筋細胞がその分化において如何に成熟するのかは、従来から未知であった。また、電気機械的メカニズムが胚様体中に存在する心筋細胞中で活性であるのは何か、さらに、幹細胞由来の心筋細胞の挙動に如何なる分析法を実施し得るのかも未知であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本発明において、胚様体中に形成されたヒト胚幹細胞由来の心筋細胞が、心室、心房及び結節細胞のような主要心筋細胞タイプの全てに分化することが初めて開示される。全ての胚様体が心筋細胞を含有するものではないが、心筋細胞を含有する胚様体は、自然に鼓動する。また、本発明においては、そのような心筋細胞の鼓動を制御し、モニターすることができ、そのような鼓動強度の分析により、環境及び条件において明確にした変化に対する培養物中の上記各心細胞の応答性を測定し得ることも開示する。胚様体中の個々の細胞の電位をモニターすることにより、胚様体中の個々の心筋細胞の性質を明らかにすることができ、潜在的に毒性剤又は治療剤のような外的刺激に対するそのような細胞の応答を試験するのに使用できる。とりわけ、心細胞のHERGカリウムチャネルに対する化学物の作用を評価し、それによって、ヒト心細胞に対する薬物の実際の作用を従来可能でなかった方法で生体外試験することができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
心細胞の電気活性は、その活動電位に関連して最良に特性決定される。活動電位は、心筋細胞内部からその環境への経時的に測定する膜間電位のチャートである。種々のタイプの成熟及び原始心細胞の活動電位は、他のタイプの活動電位と異なる。本発明においては、結節様、胚心房様及び胚心室様の３つの主要群すべての活動電位がヒト胚幹細胞によって形成された心筋細胞において観察され得ることを実証する。個々の収縮性増殖物に刺入することにより、細胞から記録した再現性のある活動電位形態が明らかになり、各増殖物、即ち、胚様体が主要細胞タイプからなることを示唆していた。
ヒト胚幹細胞から形成された胚様体中に心筋細胞を見出し得ることは、以前に実証されている。ヒト胚幹細胞の身体内の種々の組織タイプへの分化は、胚様体類(以下、EB類と称する)として知られている事物の形成により最も一般的になされている。EB類は、その構成体内で分化組織タイプを示し始める胚幹細胞培養物中で見出される不規則な群塊として発生する細胞凝集体である。幾つかの胚様体は、自然に鼓動し、心筋細胞タイプの挙動の存在を示唆している。固定化した細胞上での免疫染色法を使用した以前の研究において、ヒト胚幹細胞由来のEB類における心臓特異性たんぱく質の存在は明らかにされていた。細胞凝集体からの電気活性の細胞外記録により、自然な電気活性心細胞がEB類中に存在するという概念は裏付されているが、これらの記録は、測定電位が細胞外電極の領域に存在する多くの細胞の平均であるので、EB類中に存在する心筋細胞タイプに関しては情報を提供し得ていない。胚様体形成を生じさせる種々の方法が存在し、使用された方法は、心筋細胞を含有する胚様体を多め又は少なめの割合で生じ得、形成された心筋細胞のタイプは以前には特性決定されていない。即ち、心筋細胞がEB類内に形成されていることは以前に明らかにされているものの、心筋細胞のタイプ、これら細胞の能力、及びこれら細胞の細胞内電気生理学記録への接近性は、以前には特性決定されていない。本発明においては、心室、心房及び結節細胞のような、成熟心筋の主要細胞タイプが胚幹細胞から形成された胚様体類内で全て見出され得ることを説明する。
【０００４】
ヒト胚幹細胞からの心筋細胞の培養は、ヒト心細胞特性の簡単な試験を生体外で実施するのを可能にする。最も簡単なレベルにおいては、心筋細胞を含有するEBを容器又は培養容器内で培養し、その胚様体の脈動又は鼓動を観察することが可能である。胚様体の全てが心筋細胞を形成し脈動又は鼓動挙動を示すものではないが、リズミカルに脈動する胚様体は、その中に心筋細胞を含有することが見出されるであろう。以下でより詳細に説明するもっと高度なレベルにおいては、各種胚心細胞タイプが個々にその取込み活動電位を有し得、その後、活動電位の変化を、細胞の各種化学的、電気的又は物理的撹乱後に観察し得る。
以下で説明する実施例は、培養液中に40〜95日維持し、胚様体を産生したヒト胚幹細胞由来の心筋細胞を使用した。これが、本発明者等が活動電位形態の異質性を見出した段階である。心房及び心室ミオサイトの特徴を有する活動電位は観察されたものの、その相対的に正のMDP (−50〜60 mV)及び遅い活動電位上昇(5〜30 V/sec)は、−80 mV範囲の静止膜電位及び150〜350 V/s.18範囲のdV/dtmaxを有する新生児及び成人ヒト心房及び心室心筋細胞とは対照的である。上記幹細胞由来の心筋細胞は、マウス幹細胞系において説明されている“中間”段階と相関しているようである。ヒト胚及び胎児心臓における活動電位を説明する入手可能な限られたデータは、7〜8週間の発育で、心房及び心室ミオサイトの静止膜電位及びdV/dtmaxが成人細胞のそれに達することを示唆している。即ち、本発明者等は、本研究において観察された心房及び心室活動電位を胚性と称する；その理由は、これら電圧が7週間発育以前のヒト胚において予測される活動電位特性を有するからである。観察された結節タイプの活動電位は、この活動電位形態が発育中に殆ど変化を示さないことから、結節として単純に記した。マウス系に比較してのこの際立って遅い生体外活動電位特性の発生は、マウスとヒトを比較しての著しい妊娠期間の差異に関連しているようである。
【０００５】
胚様体増殖物の收集物の酵素分解は多様な心筋細胞タイプを生ずるので、各増殖物は、おそらくは１部は発育中の心臓内でミオサイトの不均質収集物を擬態する心筋細胞の均質混合物からなっているものと想定される。しかしながら、鋭敏な微小電極による活動電位の本発明の細胞内記録法は、繰返しの明白な細胞測定を個々の増殖物から実施した点で特異的であり、本発明者等は、各増殖物が主要細胞タイプによって占められていることを見出した。即ち、本発明者等は、各増殖物がその特異な微小環境に応答して１つの主要タイプの心細胞の分化と増殖をもたらすものと想定する。
インタクト心細胞又はある種の心筋細胞タイプの１つの特徴的特性は、固有の又は自然な鼓動速度である。鼓動速度を有する細胞は、ペースメーカー細胞とも称する。EB類中に存在する心筋細胞は、特定の活動パターン(連続に対して散発的な)に特徴を有する自然な鼓動又は収縮並びに鼓動頻度を示す。上記のような活動電位を直接測定するか或いは細胞収縮の時間又は振幅を測定することにより、培養物中の心筋細胞の自然な鼓動速度又はパターンに対する薬物又は他の介入物の作用を特性決定ことができる。EB類中の鼓動速度を上昇又は低下させる薬剤は、インタクトヒト心臓に対しても同様な作用を有することが予測され得る。同様に、散発的な鼓動の一時休止期間を増大させることによって鼓動パターンを変化させる薬剤も、患者における心臓遮断を発生させる性向を有することが予測され得る。
【０００６】
EB類中の心筋細胞の試験における１つの問題は、自然鼓動速度が変動性であり、種々の要因に依存し得ることである。目的はEB類中の心筋細胞挙動に対する外来性物質の作用を実証する制御されたデータを得ることであるので、活性の制御されたベースラインをを得る１つの方法は、培養物中の心筋細胞の鼓動を人工的に調節することである。この調節は、EBに電界刺激を与えることによって容易になし得る。この調節は、EBを含む培養容器の反対側に電極を適用することによって最も簡単に行い得る。周期的な刺激電圧を電極間に適用する場合(例えば、1ヘルツで10マイクロ秒間の40ボルトDCパルス)、EB類は、該電極刺激周波数において規則的な脈動又は鼓動を示すであろう。温度変化もEB鼓動の振幅に影響し得るので、この過程の１部として、EB培養物を一定温度に維持することが必要である。そのような鼓動中にEB類を光学的に走査することは、画像形成法を使用してEBをビデオ顕微鏡で観察しそのようなEB中で生ずる鼓動振幅を測定することによって可能である。その後、EBを化学又は他の刺激物で刺激して、刺激がEBにより生じた鼓動の強度に対して有する作用を観察することができる。心細胞内の電気機械的活性を拮抗させる薬剤はそのような鼓動の振幅を低下させるであろうし、そのような電気機械的活性を作動させる薬剤はそのような鼓動の強度を増大させるであろう。さらに、収縮の速度及び胚様体の緩和のような他の鼓動特性をモニターして更なるメカニズム情報を得ることもできる。
図１に、そのような試験から得られたデータを示す。図１においては、EBは、1ヘルツで電気的に刺激されている温度制御小培養容器内に含まれており、従って、脈動又は鼓動の基礎振幅を示し、EB端部の物理的置換によって光学的に検証したその振幅は、100の対照又は基礎値を有するものと任意に定義している。その後、心細胞の電気及び機械的特性に影響し得る試験化合物のような刺激物を、EBが静止している培地中に添加する。この試験における化学刺激物即ち試験化合物は、1マイクロモルのイソプロテラノールの添加であった(イソプロテラノールは、心臓収縮の速度及び強度の増大を活性化し得る心細胞中のβ-アドレナリンレセプターに対する既知の作用薬である)。イソプロテラノールは、成人心細胞における“戦闘又は逃亡”応答の擬似体であることが知られている。EBの鼓動速度は人工的に適用した電界刺激の速度によって調整するので、EBの脈動速度は変化しないが、図１に示すように、EBの鼓動又は収縮の振幅は、化学刺激物の適用時に劇的に増大している。このことは、心臓収縮に対する作用を有する化学物を、胚幹細胞由来のEB中に含まれる培養物中の心筋細胞を使用してモデル化し得ることを実証している。
【０００７】
また、EB中の個々の心筋細胞の電気活動電位特性を精査することも可能である。この精査は、極めて微細な微小電極を作成しこの微小電極をEB中に物理的に指向させることによって行う。この電極によってどの細胞を精査するかを選択することはできないが、この電極が奏した電気信号を測定し、細胞により発生した電気信号に基づき、精査が及ぶ心筋細胞がどのタイプであるのかを判定することは可能である。このことは、種々のタイプの心細胞がイオンチャネルと他のたんぱく質との特異な組合せの発現に基づく明確な電気生理学的特性を有することにより可能である。
即ち、鼓動中のEB類において生ずる細胞の活動電位を特性決定する試みを行った。これらの試験は、細胞分離又は分離した心細胞の再塗布から生じ得る電気的挙動の潜在的な変化を回避するために、インタクトEB増殖物において実施した。この試みの焦点は、１部には、複数のタイプの心筋細胞がヒト胚幹細胞から得られるかどうかを判定することであったので、試験は、40〜95日間のEB類分化時間窓、即ち、明確な細胞タイプを解明するための正確な時間を与えるように選定した期間の細胞において実施した。
図２、３及び４に、ヒト幹細胞培養物中で産生する胚様体中の種々の細胞中に挿入したそのようなプローブから得られた電気信号を示す。図２においては、胚心室細胞タイプの活動電位を検出している。その波型は、細胞によって発生した電位の強度と形状により判定したとき、心室細胞の特徴である。図３においては、胚心房細胞タイプの活動電位を例示している。図４においては、結節タイプ電気特性をチャートしている。培養物中のEB類中の実際の心筋細胞からすべて採取したこれらの信号は、心臓電気生理学の分野に精通している者にとっての細胞タイプの診断である。これらの活動電位は、成熟心臓の３つの主要細胞タイプが生体外培養物中のEB中に心筋細胞間に存在していることを実証している。ここ場合も、各種の鼓動EB類が異なる主要細胞タイプを有することが観察されており、３つの主要細胞タイプの全てが観察され得る。
【０００８】
胚幹細胞由来の心筋細胞がある方式の薬物スクリーニングにおいて有用であり得ることは以前に提案されているものの、潜在的な薬物が活動電位の再分極(基礎値への戻り)に対して有し得る作用はとりわけ興味あることである。再分極を長期化し、従って、活動電位期間を増大させる薬剤は、潜在的に致死性の心室性不整脈に関連する薬物誘発性長期QT症候群を生ずる可能性を有する。名称QT症候群は略称ではなく、任意にQとTと命名した活動電位チャートの各点間の時間間隔を称する。この症候群は、複数群の製薬剤に亘って見られる主要毒性形の１つを示す。各種のイオンチャネルの調節は活動電位を長期化するものの、ヒトにおいては、HERGチャネルとして知られるカリウムチャネルは、薬物による遮断にとりわけ感受性であり、表面心電図上での活動電位及びQT間隔の長期化をもたらす。現在のところ、ヒト心臓ミオサイトにおける活動電位長期化及びHERGチャネルブロックについてスクリーニングする生体外方法は、利用できない。各種のスクリーニング方法が動物心細胞及び非心細胞中でのHERGチャネルの発現を使用する候補薬物の評価において使用下にあるが、これらの方法は、複数の場合には機能していない。事実、最近の歴史は幾つかの重要な製剤、とりわけ、FDAにより販売について承認されたターフェナジン(SeldaneTMとして市販された)及びアステミゾール(HismanalTMとして市販された)を明らかにしているが、これらの製剤は、その後、稀ではあるがヒトにおいて致死的心臓不整脈に至るという理由により、ヒト心細胞内のHERGチャネル活性に有害作用を有することが見出されたとき市場から撤退した。ヒトES由来の心筋細胞がHERGチャネル遺伝子を発現する時期及び発現するかどうかは、本発明において説明する研究前には未知であった。
【０００９】
本出願人は、ヒト胚幹細胞から産生させた培養物中の心筋細胞のHERGチャネル応答を試験し得ること及びこれらの心筋細胞が成人の成熟心細胞と同じ応答特性を有することを測定している。図５に、培養物中の１つのEB中の心筋細胞である心房タイプ細胞について実施した試験を示す。図５で基礎と表示した該細胞によって発生した電位の電気的プロフィールは、胚心房タイプ活動電位の特徴であることに注目されたい。基礎信号が観察されている培養物に、500ナノモルのE4031を添加した。E4031は、成人心細胞における急速遅延調節カリウム電流(IKr)を遮断する公知の高特異性HERGチャネルブロッカーである。EBを培養している培地への該化学物の添加は、図５に“500 nM E4031”とマークした曲線によって示されているように、上記心房タイプ細胞により発生した活動電位の改変をもたらしていた。活動電位は、静止状態への遅れた戻りのために長期化された。これは、正確に、上記分子のE4031が成人心細胞に対して有することが知られている作用であり、且つ、正確に、HERGチャネルの遮断から予測されるであろう作用である。従って、この試験は、分子類を成人ヒト心細胞内のHERGチャネルに対するその作用について試験することが、培養物中のヒト胚幹細胞由来の心筋細胞類を試験することによって可能であることを実証している。
本出願人は、EB類中の心筋細胞類の電気活性が脱分極(DAS)後の遅延として知られる電気活性も示すことを測定している。この電気特性は、疾病ヒト心筋又はカルシウム過負荷を生ずる薬剤で治療した心筋において見出される。これらのDADは、ある態様の潜在的に致死性の心室性頻拍症を含む不整脈誘発に至る基礎メカニズムとして作用する。EB類のDAD発生に必要な複雑な細胞環境を示す能力は、EB類をDAD形成を調節する薬物のような介入物を試験するための適切なモデルとし、心臓不整脈に対する新たな薬理学的療法を潜在的に推進する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下は、ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞において実施した研究を説明する方法及び材料並びに幾つかの実施例である。とりわけ、ヒト胚幹細胞から産生させたEB類からの大量の心室タイプ、心房タイプ又は結節タイプ細胞の分離を可能にする方法を説明する。このことは、薬物スクリーニング又は他の毒性試験目的において大量のそのような細胞の収集及び培養を可能にする。
【実施例】
【００１１】
EB生成及び心臓分化
hED細胞系H1、H7、H9及びH14を以前に説明されているようにして誘導し維持した。EB生成においては、ES細胞コロニーを約500〜800個の細胞を含有する細胞凝集体中に1 mg/mlのジスパーゼを使用して分散させた。その後、細胞凝集体を塩基性線維芽増殖因子を含まないES細胞培地を含む細胞培養フラスコ(BD Bioscience社)内の懸濁液中で6日間毎日培地を変えながら培養した。心臓分化を促進するために、6日齢EB類を、15%FBS(心臓分化用に選定)、2ミリモル/LのL-グルタミン及び1%非不可欠アミノ酸を加えたDMEMからなる培地中の0.1%ゼラチンでコーティーングした6ウェルプレートに移した。分化中、培地は毎日交換した。自然収縮性細胞がEB類からの増殖物中の群塊として出現した。これらの鼓動EB類を95日までの長期培養物中に維持した。
免疫染色
鼓動中心をパスツールピペットで分離し、0.05%トリプシンで20分間断続渦流により消化した。細胞を遠心分離したのち、20%のFCSと0.5%のトリ胚抽出物(GIBCO/BRL)を含有するDMEM培地中に再懸濁させ、細胞をゼラチン(0.3%)コーティーングカバーグラス上に塗布し、10%FCS培地中で2日間インキュベートした。免疫染色は、別途説明しているようにして実施した。
【００１２】
細胞内電気生理学
単一の鼓動している顕微解剖EB増殖物をガラスカバースリップ上で1〜10日間培養した。その後、このカバースリップを倒立顕微鏡(Nikon Diaphot 200)上に設けた試験チャンバーの底部に付着させた。EB類を、140のNaCl、1のMgCl2、10のHEPES、10のグルコース、1.8のCaCl2からなり(各々ミリモル/L)、NaOHによるpH 7.4のタイロード(Tyrodes)溶液と一緒に37℃で潅流させた。収縮は、ビデオ末端検出を使用して測定した。細胞内電気生理学試験においては、3モル/LのKClを充填したとき30〜100MΩの抵抗を有する鋭敏なガラス微小電極を作成した。自然鼓動しているEB類に上記微小電極を刺入し、ピペット電気容量を0にした。膜電位の細胞内記録は、ブリッジモードのAxoclamp-2A増幅器(Axon Instruments社、カリフォルニア州フォースターシティー)を使用して実施し、少なくとも5分間安定な最高拡張期電位(MDP)を示した記録をデータ分析に含ませた。幾つかの試験においては、調製物を1〜3 Hzの速度で電界刺激に供した。データを20 kHzでデジタル化し、2 kHzでフィルター処理した。各APをpClamp8.02 (Axon Instruments社、カリフォルニア州フォースターシティー)とOrigin 6.0ソフトウェア(Microcal社、マサチューセッツ州ノーサンプトン)を使用して分析し、50%及び90%再分極でのAP期間(APD50及びAPD90)、AP増幅(APA)、最高拡張期電位(MDP)、及びAP上昇の最高上昇速度(dV/dtmax)を判定した。
【００１３】
収縮測定
収縮は、ビデオ末端検出を使用して測定した。ガラスカバースリップ上で培養した単一の鼓動胚様体(EB)増殖物を、倒立顕微鏡(Nikon Diaphot 200)上に設けた試験チャンバーの底部に付着させた。調製物を、140のNaCl、1のMgCl2、10のHEPES、10のグルコース、1.8のCaCl2を含有し(各々ミリモル/L)、NaOHによるpH 7.4の更なる薬物含むタイロード溶液と一緒に上述のようにして連続して潅流させた。Grass SD-9スティミュレーター (Quincy社、マサチューセッツ州)による電界刺激を200-μl試験チャンバー(Warner Instrument社)の各相対壁に沿う２つの白金電極により実施した。刺激プロトコールは、37℃で1〜3 Hz、10-msの時間、及び30〜50 Vであった。個々の鼓動EB類を、Video Edge Detector VED 105 (Crescent Electronics社)によりCCD BW Camera NL-2332 (National Electronic社)及びSony BW Video Monitor PVM-97 (Sony社)を介してモニターした。鼓動EB増殖物の鋭端での単収縮応答を、1 kHzで、pClamp 8.2獲得ソフトウェアによるDigiData 1200 A/Dコンバーター(共に、Axon Instruments社、カリフォルニア州フォースターシティー)によって記録した。収縮応答は、基礎値に対して標準化する。試験チャンバー温度は、Dual Automatic Temperature Controller TC-344B (Warner Instrument社)により37±0.5℃に制御した。
【００１４】
EB類中での心臓分化
本発明者等の初期の試験は、H1、H7、H9及びH14 ES細胞系が自然収縮性増殖物を含むEB類を形成し得ることを示した。鼓動EB類を先ず約10日目で分化中に観察し、30日後、約10〜25%のEB類が自然収縮を示している。日毎の穏やかな培地交換及び低EB密度により、EB類は、95日目までの分化の観察期間において培養物中で収縮し続けた。その後、残りの試験をH9及びH14細胞系由来のEB類に絞ったが、これら２つの細胞系からの結果は、区別し得なかった。
免疫染色を実施して、鼓動EB増殖物中のCM類の存在を確認し、収縮性/筋節性たんぱく質組織化を検証した。鼓動中心を消化し、α-アクチニン、筋節性ミオシン重鎖(MHC)及び心臓トロポニン I (cTnI)に対する各抗体を使用する免疫染色のための単分子層として塗布した。鼓動中心から分離した細胞は、カバーガラス上での塗布の6〜48時間後に自然鼓動を再開した。
抗α-アクチニン抗体による染色は、未組織化の筋フィラメントから良好に組織化されたZ-系を含む筋節性筋フィラメントまでの範囲の変動性のある細胞質パターンを示した。筋節性MHC染色は、この抗体による典型的な染色パターンである細胞質全体に亘って分布した豊富なシグナルを示した。
cTnIの免疫染色は、良好に組織化された平行な筋フィラメントと若干の細胞におけるIバンドの線条型パターンを示した。これらの観察は、心臓ミオサイトが分化中のEB類中に存在し、且つ幾つかのCM類は有意な筋節組織化を示すことを明らかに示唆していた。細胞は鼓動中心からではあったものの、核染色によって表示された非CM類は存在していたが心臓特異性たんぱく質免疫染色は欠如していた。鼓動中心から分離したCM類の割合は、2%〜70%の範囲で広く変動していた。
【００１５】
β-アドレナリン刺激に対する正の筋収縮性応答
β-アドレナリン刺激に対する応答における心筋収縮性の増大は、種々のイオンチャネル、膜トランスポーター及び筋フィラメントたんぱく質を刺激する信号化経路に結合させた適切な表面膜レセプターを必要とする。しかしながら、β-アドレナリン刺激に対する心収縮性応答は発育途中に亘って変化し、最早期の胚心臓ミオサイトは、β-アドレナリン作用薬に対して未応答性である。従って、鼓動EB増殖物がβ-アドレナリン作用薬イソプロテレノール(Iso)に対する応答における収縮特性の変化を示すかどうかを測定することを探索した。EB増殖物の収縮は、鼓動速度を制御するための電界刺激中のビデオ末端検出法を使用して測定した。各刺激収縮を示す増殖物末端の偏向度は、収縮の尺度を提供する。図２は、基礎条件下1 Hzで、その後、洗い流し後の1μモル/LのIsoで刺激したEBの収縮パターンを実証している。収縮強度の明らかな増大が観察され、平均1μモル/LのIsoで、収縮強度における33プラス又はマイナス27%の増大を生じている(n = 5、p = 0.05)。この測定は、EB間で、１部には各鼓動増殖物の明確且つ複雑な幾何学に基づく優位の変動性を示した。これらの結果は、β-アドレナリンレセプターがヒト胚幹細胞由来の心筋細胞中に存在し、これらレセプターの刺激により正の収縮性応答発生することを実証している。
自然電気活性のパターン
培養物中の鼓動EB類の観察は、少なくとも２つの明確な鼓動パターン、即ち、連続鼓動又は散発鼓動を明らかにした。この鼓動パターンをさらに試験するために、20の自然収縮性EB類中での鋭敏な微小電極による活動電位の細胞内記録を行った。連続電気活性は、12/20のEB類において記録された。連続電気活性を示すEB類は、記録期間全体に亘って比較的一定で、38〜106 bpm範囲である自然活動電位速度を有していた。8/20のEB類においては、散発的活性が観察され、活性の明白な周期性が明らかであった。活性の各突発は、比較的速い速度で再開し、その後漸減し引続き休止する活動電位に特徴を有する。散発活性においては、活性時間及び休止の持続性はEB間で変動し、各EBにおいて自然電気活性と休止の持続性に粗い平行性が存在する。
【００１６】
活動電位の複数タイプ
EB類中の心筋細胞のタイプを特性決定するために、20の異なるEB類の105の安定な刺入物からの活動電位の形状及び特性を試験した。試験した分化の時間窓(40〜95日間)において、活動電位の形態において明らかな異質性が存在した；しかしながら、活動電位は、３つの主要タイプ：結節様、胚心房様及び胚心室様に分類できた(図面)。この分類は、活動電位の最高上昇速度(dV/dtmax)、活動電位持続性(APD)、活動電位振幅(APA)、及び表に要約したような第４期脱分極の顕著性によって測定したときの活動電位の特性に基いていた。結節様活動電位(図面)は、顕著な第４期脱分極、遅い上昇(dV/dtmax)及び小さめのAPAにより特性決定した。胚心室様活動電位は、より三角形状の胚心房活動電位に比較して、有意に長い持続性をもたらした有意の活動電位プラトー期の存在により識別し得た。さらに、胚心室様活動電位は、自然活性速度が遅いほど、EB類が40〜95日目の培養物中で長く維持される傾向を一般に示していた。
これらの後者の２つの群の活動電位は、これらの活動電位が新生児及び成人心筋とは全く異なっている胚心臓をより暗示する特性を有するので、胚性と称する。とりわけ、胚性活動電位は、より脱分極化した最高拡張期電位(MDP)及び遅いdV/dtmax (約5〜30V/秒)に基く“遅い”タイプの活動電位に特徴を有する。
活動電位、従って、所定のEB増殖物中の心細胞タイプを比較するために、増殖物当り14までの別々の記録による複数の別々の刺入を行った。本発明者等の知見は、単一のEBからの複数の細胞内記録が主要活動電位フェノタイプに特徴を有するということであった。単一EBの各刺入物から記録した活動電位の全ての定性的比較を得るために、EB当りでグループ化した測定APD90をプロットした。一般に、APD90群は、与えられたEBにおいて一緒に緊密に群塊していたが、試験したEB間で変動性を示していた。これらの結果は、与えられた鼓動EB増殖物のいずれにおいても、自然分化は、観察された再現性のある活動電位形態に基き主要心臓ミオサイト細胞タイプを好むことを示唆している。
【００１７】
活動電位の速度適応
心筋細胞の基本的特性は、APDの低下による心臓速度の増大に適応する能力である。速度適応は、心房及び心室筋において存在し、ある種の疾病状態において損われる。速度によるAPDの短絡は、胚(7〜12週)ヒト心室筋においても観察される。従って、胚心室様活動電位が適切な速度適応性を示したかどうかを測定することを探求した。分離したEB増殖物を３つの異なる速度で電界刺激に供し、その後、定常状態の活動電位を記録し分析した。1から2 Hzへの刺激周波数の増大は、平均約20%においてAPD50及びAPD90の短絡をもたらしており(図５C)、速度を3 Hzに増大させたとき、APDの更なる小さな低下があった。しかしながら、試験した異なる刺激での明らかなAPA又は活動電位の上昇における変化はなかった。これらの結果は、鼓動EB類中に存在する胚心室様心筋細胞が速度適応性を示すのに必要なイオンチャネルと調節特性を有することを実証している。同様な結果は、胚心房様ミオサイトにおいても観察された。
ヒト幹細胞由来の心筋細胞は有意なIKrを有する
心臓活動電位の再分極は、電圧作動性K+チャネルによって奏せられる重要な役割を有する複数のイオン電流に基く；しかしながら、存在するK+チャネルの正確なタイプの有意の種の変動が存在する。ヒト心臓においては、HERGカリウムチャネル(KCNH2)を通る電流、IKrは、活動電位の再分極において主要な役割を発揮する。HERGチャネルも、これらチャネルが活動電位長期化及び潜在的に致死性の心室性不整脈トルサード ド ポアント(torsades de pointes)を生じ得る薬物遮断に対する無差別的なターゲットを代表するので、薬物開発において重要である。従って、ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞における活動電位の再分極に対するIKrの寄与を、HERG特異性チャネルブロッカーE-4031を使用して試験した。500 nMのE-4031の適用は、胚心房及び胚心室様心筋細胞の双方において活動電位長期化をもたらした。APの長期化は、HERG電流が最高である最後の再分極(第３期)において最も明白であった。胚心房様心筋細胞においては、APD50ではなくAPD90が有意に長期化し、胚心室様心筋細胞においては、APD50及びAPD90双方の有意の長期化がE-4031によって生じており、APD90に対する作用の方が大きかった。APA又はMDPに対するE-4031による統計的に有意な作用はなかった。これらの結果は、HERGチャネルが胚心房及び胚心室様心筋細胞の双方において発現されていること及びIKrがこれら細胞タイプにおける活動電位の再分極に有意に寄与していることを示唆していた。
【００１８】
脱分極後の早期及び遅延誘発
ある種のタイプの心臓不整脈の基礎をなす主要メカニズムは、脱分極後に由来する活性誘発である。これらは、活動電位の再分極中に生ずる脱分極後早期(EAD)と完全再分極後に生ずる脱分極後遅延(DAD)に分類し得る。EAD及びDADは異なる細胞メカニズムに由来するが、双方とも、心臓ミオサイト中に存在するイオンチャンネル相互作用化とCa2+循環たんぱく質との特異的で複雑な組合せを必要とする。従って、EAD及びDADを発生させる能力について胚心室様心筋細胞を試験した。EADは、長期化活動電位の環境中で典型的に生ずる。EADは、活動電位プラトー近くで生ずる脱分極として定義され、E-4031で処理した3/5の胚心室様CM類において観察された。EADは、E-4031の不存在下では全く観察されなかった。DADは、損傷又はジゴキシン毒性によって発生するようなCa2+過負荷中に典型的に生ずる。DADは、微小電極刺入直後の少数の細胞において自然に生ずることが観察され、おそらくは、刺入及びCa2+過負荷に関連する損傷によるものであろう。これらの細胞は、活動電位特性の特性決定においては使用しなかったが、ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞のDADを示す能力を実証している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】上記実施例において集積した、収縮の速度及び収縮の振幅を経時的に測定して確定させたヒト胚幹細胞から生成させた胚様体中で生じた機械的収縮の振幅を示すグラフである。
【図２】ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞中で観察した胚心室タイプ活動電位のグラフを示す。
【図３】ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞中で観察した胚心房タイプ活動電位のグラフを示す。
【図４】ヒト胚幹細胞由来の心筋細胞中で観察した結節タイプ活動電位のグラフを示す。
【図５】上記実施例において示したADP試験からのデータを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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