(57)【要約】【課題】日本脳炎ウイルス遺伝子III型（GIII）に分類されるウイルスだけではなく、同V型（GV）に分類されるウイルスにも高い効果を示す新規のワクチンが必要とされている。【解決手段】(i)日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子及び(ii)日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルス由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を含む、２種混合の日本脳炎ワクチンを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子及び(ii)日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルス由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を含む、２種混合の日本脳炎ワクチン。
【請求項２】
前記日本脳炎ウイルス様粒子(i)で動物に免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスに対する中和抗体価が、前記抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスに対する中和抗体価と等しいかそれ以上である、請求項１に記載の２種混合の日本脳炎ワクチン。
【請求項３】
(i)日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を含み、
日本脳炎ウイルス様粒子(i)で動物に免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスに対する中和抗体価が、前記抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスに対する中和抗体価以上である、
日本脳炎ワクチン。
【請求項４】
日本脳炎ウイルス様粒子(i)及び/又は(ii)が、カイコ由来細胞又はカイコ蛹によって産生される、請求項１〜３のいずれかに記載の日本脳炎ワクチン。
【請求項５】
日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスが中山株ウイルス又は北京株ウイルスであり、及び/又は、日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスがMuar株ウイルスである、請求項１〜４のいずれかに記載の日本脳炎ワクチン。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の日本脳炎ワクチンの製造方法であって、
カイコのタンパク質発現系を使用し、
日本脳炎ウイルス遺伝子III型又はV型に分類される日本脳炎ウイルスにおけるｐｒＭタンパク質をコードするｐｒＭ遺伝子とＭタンパク質をコードするＭ遺伝子とＥタンパク質をコードするＥ遺伝子とをこの順で包含するＤＮＡ断片において、コードされるアミノ酸配列が、野生型の日本脳炎ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらないように、前記ＤＮＡ断片のコドンを改変して、カイコの発現用のコドン最適化ＤＮＡ断片を得る工程、
得られたコドン最適化ＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入する工程、
得られた発現ベクターと、線状化したバキュロウイルス由来ＤＮＡとを、カイコ細胞にコトランスフェクションする工程、
得られたカイコ細胞から、コドン最適化ＤＮＡ断片を含むバキュロウイルス組換え体を得る工程、
カイコ蛹を前記バキュロウイルス組換え体に感染させて、カイコ蛹を飼育する工程、及び
前記カイコ蛹から、日本脳炎ウイルス様粒子を単離する工程、
を含む、日本脳炎ワクチンの製造方法。
【請求項７】
前記コドン最適化ＤＮＡ断片の配列が、配列番号４及び/又は７の塩基配列である、請求項６に記載の日本脳炎ワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルス属に分類される日本脳炎ウイルスに対するワクチン、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本脳炎は、フラビウイルス属に分類される日本脳炎ウイルスによって引き起こされる蚊媒介性のウイルス感染症であり、その患者は東アジアから東南アジア、南アジア地域等に広く分布している。日本においては、日本脳炎ワクチン接種の普及に従い、日本脳炎患者は減少し、1990年以降、当該患者は年間人口100,000人当たり10人以下となっている。しかし、依然として日本脳炎は健康上の重大な脅威となりうるものであり、東南アジアを中心に、近年でも症状を示す患者数は多く確認されている。さらに、効果的なワクチンを使用しても、日本脳炎ウイルスは蚊豚システムで積極的かつ静かに循環しており、アジアおよびその他の太平洋諸国の多くの地域では日本脳炎の発生率が増加している（非特許文献１及び２参照）。
日本脳炎ウイルスは、そのゲノム配列に基づいて遺伝子I型〜V型の５つの型（GI〜GV）に分類される。これまでに販売されてきた日本脳炎ワクチンの製造においては、日本脳炎ウイルス遺伝子III型(GIII)に属する、マウス脳由来の北京株ウイルス、又はマウス脳由来の中山株ウイルスが使用されている（非特許文献３及び４参照）。そして、従来、日本脳炎ワクチンは、ウイルス感染マウスの脳乳剤を原材料とするものであった。しかしながら、マウス脳由来の汚染物質によるアレルギー性中枢神経障害や病原微生物の混入の恐れがあることや、大量にマウスを必要とするためコストが高いことや動物愛護の点から動物細胞や昆虫細胞を用いたin vitro系での日本脳炎ワクチンの製造が試みられている（特許文献１及び２参照）。
このような状況下で、さらにより安価で安全で有効な新規ワクチンの開発が進められている。
ここで、近年の研究により、日本脳炎ウイルス遺伝子III型（GIII）に分類されるウイルス由来の日本脳炎ワクチンは、交叉反応等に基づいて同I〜IV型（GI〜GIV）に分類されるウイルスには効果を示すが、同V型（GV）に分類されるウイルスには効果を示さないことが明らかになっている（非特許文献３及び４参照）。具体的には、非特許文献３のTable 3（下記表１として、前記Table 3のデータを示す）に示されるように、北京株ワクチン（2倍希釈）においては、homo価が640より高い場合に、同じ遺伝子3型(GIII)に分類される中山株ウイルスに対しては320、GＩ型ウイルスに対しては160〜320、GIII型ウイルスに対しては80〜320のウイルス中和抗体価を示すが、GＶ型のMuarウイルスに対しては20という非常に低い中和抗体価を示すことが明らかになっている。
【０００３】
【表１】
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【０００４】
同様のことは中山株ワクチンにも当てはまる。したがって、現在、特に広く使用される日本脳炎ワクチンである北京株ワクチンでは、ＧＶ型ウイルスに対する効果が非常に少ないことが懸念されている。
また、GV型のウイルスは他の型のウイルスと比較して異なる挙動を示すことも明らかになっている。さらに、最初はGV型のウイルスはインドネシア−マレーシア地域でのみ確認されていたが、２００９年に中国において、２０１０年及び２０１２年に韓国においてGV型のウイルスが確認されており、流行の恐れも懸念されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−６５１１８号公報
【特許文献２】特開２０００−８３６５７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】根路銘ら、臨床検査  vol 48 no. 4 2004年4月
【非特許文献２】Neromeら、Journal of General Virology (2007), 88, 2762-2768
【非特許文献３】Tajimaら、Journal of General Virology (2015), 96, 2661-2669
【非特許文献４】Lei Caoら、PLOS Neglected Tropical Diseases May 3, 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
日本脳炎ウイルス遺伝子III型（GIII）に分類されるウイルスだけではなく、同V型（GV）に分類されるウイルスにも高い効果を示す新規のワクチンが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、カイコ蛹に発現させた日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来の日本脳炎ウイルス様粒子が、予想外にGIII型のウイルスだけでなく、GV型のウイルスに対しても、予想外に高い効果を示すとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、(i)日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子及び(ii)日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルス由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を含む、２種混合の日本脳炎ワクチンを提供する。
本発明において、前記日本脳炎ウイルス様粒子(i)で動物に免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスに対する中和抗体価が、前記抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスに対する中和抗体価と等しいかそれ以上であることが好ましい。
また、本発明は、(i)日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を含み、日本脳炎ウイルス様粒子(i)で動物に免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスに対する中和抗体価が、前記抗体の日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスに対する中和抗体価以上である、日本脳炎ワクチンを提供する。
【０００９】
本発明において、前記日本脳炎ウイルス様粒子(i)及び/又は(ii)が、カイコ由来細胞又はカイコ蛹によって産生されることが好ましく、日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルスが中山株ウイルス又は北京株ウイルスであり、及び/又は、日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類されるウイルスがMuar株ウイルスであることが好ましい。
また、本発明は、上記の日本脳炎ワクチンの製造方法であって、カイコのタンパク質発現系を使用し、日本脳炎ウイルス遺伝子III型又はV型に分類される日本脳炎ウイルスにおけるｐｒＭタンパク質をコードするｐｒＭ遺伝子とＭタンパク質をコードするＭ遺伝子とＥタンパク質をコードするＥ遺伝子とをこの順で包含するＤＮＡ断片において、コードされるアミノ酸配列が、野生型の日本脳炎ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらないように、前記ＤＮＡ断片のコドンを改変して、カイコの発現用のコドン最適化ＤＮＡ断片を得る工程、得られたコドン最適化ＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入する工程、得られた発現ベクターと、線状化したバキュロウイルス由来ＤＮＡとを、カイコ細胞にコトランスフェクションする工程、得られたカイコ細胞から、コドン最適化ＤＮＡ断片を含むバキュロウイルス組換え体を得る工程、カイコ蛹を前記バキュロウイルス組換え体に感染させて、カイコ蛹を飼育する工程、及び前記カイコ蛹から、日本脳炎ウイルス様粒子を単離する工程を含む、日本脳炎ワクチンの製造方法を提供する。
本発明において、前記コドン最適化ＤＮＡ断片の配列が、配列番号４及び/又は７の塩基配列であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
新規の日本脳炎ワクチン、特に、日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス及び同V型に分類されるウイルスの双方に対して高い効果をもたらす日本脳炎ワクチンを提供する。
また、安全で非常に高い収率を提供する日本脳炎ワクチンの製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ボンビュクス・モリ（学名：Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）におけるコドン使用頻度を示す。ボンビュクス・モリの１１８０のコーディング領域（ＣＤＳ）中の４５００４３コドン中の使用頻度を調べた表である。それぞれのコドンの１０００個当たりの出現頻度を示す。括弧内の数字は、出現総数を示す。太字で示したところが、各アミノ酸に対するもっとも使用頻度の高い遺伝子コドンであることを示す。
【図２】図１で示した最も使用頻度の高い遺伝子コドンを元にした最適化したコドン対応表を示す。セリン（Ｓ）はＵＣＡであり、その相補鎖はＴＧＡであり、終止コドンである。そのため、セリンの相補鎖は終止コドンとなり、相補鎖に大きなフレームが出現することはない。
【図３】中和抗体価の確認における、中山株ウイルス様粒子（JEV-NVLP）でウサギに免疫して作った抗体-攻撃ウイルスの関係を示す図である。
【図４】中和抗体価の確認における、Ｍｕａｒ株ウイルス様粒子（JEV-VLP）でウサギに免疫して作った抗体-攻撃ウイルスの関係を示す図である。
【図５】JEV-NVLPをマウスでの免疫化に使用した場合のマウスにおける抗体産生能を示す図である。
【図６−１】中山株ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列（配列番号４）とアミノ酸配列（配列番号３）の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。中山株ウイルスのＰｒｅＭタンパク質遺伝子、Ｍタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。ＰｒｅＭ／Ｍタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５０１位、Ｅタンパク質：５０２位〜２００１位、ＦＬＡＧタグ：２００２位〜２０２５位。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図６−３】図６−２の続きである。
【図６−４】図６−３の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜ウイルス様粒子＞
本発明のウイルス様粒子は、フラビウイルス属に分類される日本脳炎ウイルス由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含むが、当該粒子内に日本脳炎ウイルスのＣタンパク質及びその中のＲＮＡを含まない、非病原性である粒子を意味する。当該ウイルス様粒子の構造は、３０nm〜３００nmであることが好ましく、より好ましくは５０〜１５０ｎｍ、さらに好ましくは６０ｎｍ〜１２０ｎｍの直径を有する粒子の表面に明瞭なＨＡスパイクが密に配置した構造を有し、形態的にウイルス粒子に酷似している。
本発明のウイルス様粒子は、カイコ由来細胞又はカイコ蛹によって発現されるものが好ましく、カイコ由来の脂質や糖鎖修飾を有していてもよい。
上記脂質としては、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール、リン脂質等が挙げられる。
【００１３】
グリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジクリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジクリセリド等が挙げられる。
スフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブシド、ガングリオシド等が挙げられる。
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
上記の脂質から、加水分解等によって誘導される脂肪酸等を含んでもよい。上記脂肪酸としては、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸等が挙げられる。
本発明のウイルス様粒子を含有するワクチンは、免疫原性を備える組換えウイルス膜タンパク質のスパイクを密に備える構造をしていることにより、アジュバントを用いなくても、従来にはない高い免疫原性を示すことが可能となる。アジュバントを用いないため、アレルギーやアナフィラキシショック等の副作用も低減することができる
【００１４】
＜中和抗体価＞
本発明の中和力価は、プラーク中和試験法を利用して得られる。プラーク中和試験法では、まず、以下の要領で、細胞プレートを作製する。最初に細胞増殖用培地を用いて細胞数を2〜3×105 細胞/mLに調製し、6ウェルプレートに2mL/ウェルずつ分注し、均一な細胞シートになるようにプレートを前後左右によく振とうした後、35℃、湿度100%、5% CO2インキュベーター内で静置培養し、培養1日後に使用する。80〜90%程度の細胞シートが形成されていれば使用可能である。
次にプラーク中和試験法の具体的な手順について説明する。検査血清（すなわちＶＬＰワクチン免疫血清や各免疫血清）を56℃で30分非働化した後、希釈液にて4倍階段希釈(40x、160x, 640x, 2560x)する。保存ウイルス（中山株、北京株、Muar株）を200PFU/100μLになるように希釈し、これを攻撃ウイルスとする(氷浴中)。40x〜2560x希釈血清300 μLに攻撃ウイルス300 μLを加える(氷浴中)。対照ウイルスは、希釈液1.8mLに攻撃ウイルス1.8mLを等量加える(氷浴中)。各試験管はよく振とう混和してから37℃の恒温水槽内で90分間中和反応を行ない、中和反応の終わった各試験管は、すみやかに氷浴中に移し、細胞プレートの培養上清を完全に除く。対照ウイルス、及び、血清とウイルス混和液のそれぞれを、ウェルあたり100μLを壁面より接種する。対照ウイルスは6〜12ウェル、血清とウイルス混和液の場合は3〜4ウェルを用い、接種直後に接種液が細胞全面に行き渡るようにプレートを軽く動かす。ウイルス吸着時間は、35℃, 5％CO2インキュベーター内で90分静置するが、15分毎にプレートを動かして接種液が細胞全面に潤うようにする。ウイルス吸着反応終了後、接種液を除かずに、重層培地2mLを各ウェルに加え、35℃、5%ＣＯ2下で4〜6日間培養する。その後、各ウェルの重層培地上へ3.7%中性緩衝ホルマリン液(ホルマリン原液(37%)をPBS (-)で10倍に希釈する)を1.5mL加えて軽く振とうし、室温で1時間以上放置する。ホルマリン固定終了後、流水道水下で培地とホルマリン液を洗い流し、メチレンプル-染色液を各ウェルに1.5mL加え1時間室温に放置し、染色終了後、水道水で染色液を洗い落とし、プラーク数を算定する。染色したプレートは最終合否判定日より1ヶ月間は保存する。
【００１５】
ここで、発明において「中和抗体価」とは、対照ウイルス（非血清対照）と比較して50％のプラーク数減少をもたらす血清の最大の希釈倍率の逆数として定義される。
本発明の「ウイルス様粒子で動物に免疫して作った抗体」において、「動物」は、免疫系を有し、ワクチンを接種することによってウイルスに対する体液性免疫または細胞性免疫を獲得することができる動物であれば、特に限定されないが、ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、トリ、ウマ、イヌ、ネコなどの動物でありうる。また、「ウイルス様粒子で動物に免疫して作った抗体」において、「免疫して作った抗体」とは、例えばウイルス様粒子をマウスの場合は腹腔に、ウサギの場合は頸部皮下又は臀部筋中に注射し、14日〜（28日（1ヶ月）2ヶ月、3ヶ月）〜4ヶ月後等に採血し、その血清に含まれ得るものである。
【００１６】
＜ウイルス様粒子の製造方法＞
本発明においては、カイコ由来細胞又はカイコ蛹によるタンパク質発現系を使用して、ウイルス様粒子を製造するのが好ましい。
本発明においてはカイコを用いたタンパク質発現の向上を目的として、コドン最適化を行う。かずさＤＮＡ研究所が提供するＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅから得られるボンビュクス・モリのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  （ＵＲＬ：  http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=7091）（図１）をもとに、作成されたアミノ酸配列と遺伝子配列の対応表（図２）を作成した。この対応表において、相補鎖に長いコーディングフレームが出来ることで思わぬ副産物が合成されるのを防ぐため、Ｓｅｒの配列は、ＵＣＡ（最もボンビュクス・モリでの使用頻度も高い）を用い、相補鎖に多くのＵＧＡ（終止コドン）が生じるように設計した。
日本脳炎ウイルス等に関する、Ｇｅｎｂａｎｋ等に登録されているアミノ酸配列中のｐｒｅＭタンパク質−Ｍタンパク質−Ｅタンパク質のアミノ酸配列にＦＬＡＧタグ等のタグ配列を付加して、核酸設計の基となるウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を得る。このウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、ウイルスの完全なprMタンパク質をコードする完全なprM遺伝子、Mタンパク質をコードする完全なM遺伝子および完全なＥタンパク質をコードするウイルス様粒子遺伝子配列を決定し、カイコのコドン使用頻度の最適化を考慮し、当該ウイルス様粒子遺伝子配列を改変する。このような手順により、カイコの発現用のコドン最適化ＤＮＡ断片を得る。
【００１７】
ここで、本発明においては、標的ウイルスにおけるｐｒＭタンパク質をコードするｐｒＭ遺伝子とＭタンパク質をコードするＭ遺伝子とＥタンパク質をコードするＥ遺伝子とをこの順で包含するＤＮＡ断片において、コードされるアミノ酸配列が、野生型の標的ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらないように、前記ＤＮＡ断片のコドンを改変する。「コードされるアミノ酸配列が、野生型の標的ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と比べて変異が起こらない」というのは、標的ウイルスのコドン最適化ＤＮＡ断片にコードされるＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列が、野生型の標的ウイルスにおける対応するアミノ酸配列と実質的に同一であることを意味する。なお、実質的に同一とは、９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有することを意味する。
【００１８】
その後、得られたコドン最適化ＤＮＡ断片を、周知の任意の方法を利用して、バキュロウイルスにおいて適した公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターと、線状化したバキュロウイルス由来ＤＮＡとを、カイコ細胞にコトランスフェクションする工程、得られたカイコ細胞から、コドン最適化DNA断片を組換えたバキュロウイルス組換え体を得る工程、カイコ蛹を前記バキュロウイルス組換え体に感染させて、カイコ蛹を飼育する工程、及び前記カイコ蛹から、ウイルス様粒子を単離する工程を経て、ウイルス様粒子を得ることができる。
【００１９】
組換え体バキュロウイルスのボンピュクス・モリのへの導入(接種)時期は蚕蛹期であれば特に限定されないが、蚕蛹期のうちの早期であることが好ましく、具体的には、蛹になった当日 (脱皮1日目)〜4日目 (脱皮5日目)が好ましく、翌日 (脱皮2日目) 〜翌々日 (脱皮3日目)がより好ましい。
上記組換え体バキュロウイルスをカイコ蛹に接種後、これらの蛹を所定の期間飼育するが、その際の温度条件は、20℃〜30℃が好ましく、22℃〜28℃がより好ましく、24℃〜27℃がさらに好ましく, 26℃が特に好ましい。上詑飼育の期間は、上記接種後から蛹が成虫(蛾)に変態する前までの時期であれば特に限定されないが、上記接種後2日間〜6日間が好ましく, 2日間〜4日間がより好ましく、3日間がさらに好ましい。
カイコ蛹からのウイルス様粒子の回収は、本技術分野における当業者に周知の任意の方法を用いることができる。例えば、カイコ蛹を等張緩衝溶液中にてホモゲナイズ後、固定化赤血球あるいはシアル酸カラム(フェツインカラム)を用いて回収することができる。また、ショ糖密度勾配遠心法等の分画方法を用いてウイルス様粒子の形状で含む分画を得ることもできる。
【００２０】
本発明のワクチンは、上記本発明のウイルス様粒子を含有する本発明のウイルス様粒子は高い免疫原性を備えるため、アジュバントを用いなくとも、従来にはない高い免疫原性を示すことが可能であるアジュバントを用いないため、アレルギーやアナフィラキシショック等の副作用も低減することができる。また、当然のことながら、本発明のウイルス様粒子の上記球状外殻の中空の内部にはウイルス由来の核酸は存在しないため、非病原性である。本発明のワクチンはヒトを含む動物のウイルス感染を、効果的に防ぐことができる。また、本発明のワクチンは、従来の鶏卵を用いた製造方法等に比較して、製造に必要な期間を著しく短縮することができる。そのため、インフルエンザ等のウイルス感染症の流行の際に、短期間でワクチンの調達をすることができ、人々を感染症から守り健康を維持させることに多大な貢献を果たすことができる。さらに、従来の鶏卵を用いるワクチンの製造においては、ワクチンに用いる種ウイルスを扱うため、P3施設等の高度安全施設を必要とすること、ワクチンの免疫原性が低いため大量のワクチンを製造する必要があること等の理由により莫大な製造コストが必要であるのに対し、本発明の製造方法によると製造コストを著しく低減することができる。
【００２１】
＜ワクチン組成物＞
１つの実施態様において、本発明は、ウイルスの感染に対するワクチンを、動物に接種する方法であって、本発明に係るポリペプチドを含むかまたは本発明に係る生産方法に従って生産されるワクチンの有効量を、前記動物に投与することを含む方法である。
１つの実施態様において、本発明は、ウイルスに対する免疫応答を、動物に誘導する方法であって、本発明に係るポリペプチドを含むかまたは本発明に係る記載の生産方法により生産されるワクチンの有効量を、前記動物に投与することを含む方法である。別の態様において、本発明は、ウイルスワクチン組成物に関する。本ワクチン組成物は、前記ウイルス様粒子の他、追加成分、及び医薬的に許容される担体を含むことができる。追加成分としては、アジュバント、及び抗インフルエンザウイルス剤等の抗インフルエンザウイルス作用を増強させる成分を挙げることができる。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルション、水中油エマルション、水中油中エマルション、アクリルまたはメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸、アルケニル誘導体、カルボマー、ブロックコポリマーを挙げることができる。また、抗ウイルス剤としては、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビル、及びラニナミビル等のノイラミターゼ阻害剤、アマンタジン、リマンタジン、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤等を挙げることができる。本発明の組成物が含有する医薬的に許容される担体としては、医薬品として用いることが許可されている溶媒、分散剤、コーティング剤、安定剤（アルブミン、エチレンジアミン四酢酸アルカリ塩）、希釈剤（水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等）、保存剤、賦形剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤（塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等）、吸収遅延剤を含む。
【００２２】
例えば、本発明の組成物は、非経口投与または経口に適する剤形とすることができる。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤などが挙げられ、注射剤には、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形が含まれる。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗原タンパク質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。また、非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製される。
ワクチンの有効量は、ウイルスに対する十分な体液性免疫または細胞性免疫を誘発するなどの生物学的効果を達成するのに十分な量をいう。また、投与方法は、吸入、鼻腔内、経口、非経口（例えば皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下投与）の投与が含まれる。有効量および投与方法は、投与されるヒトの年齢、性別、状態、体重に依存してよい。例えばインフルエンザワクチンの場合、一般には、１ｍｌ中に一株あたり１５μg以上のＨＡタンパク質を含むワクチンを、６ヶ月以上３歳未満の者には０．２５ｍｌを皮下に、３歳以上１３歳未満の者には０．５ｍｌを皮下に、およそ２〜４週間の間隔をおいて２回注射する。１３歳以上の者については、０．５ｍｌを皮下に、１回、又は、およそ１〜４週間の間隔をおいて２回注射する。
次に、本発明を実施例により詳細に説明するが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
［使用した細胞及びウイルス］
ベロ細胞（カタログ番号JCRB 9013、ロット番号11292002）は、Japanese Collection of Research Bioresources[JCRB]細胞バンクから購入した。
日本脳炎ウイルスである、中山株ウイルス、北京株ウイルス、及びMuar株ウイルスは、国立感染症研究所（東京、日本）から入手した。
カイコＢｍ−Ｎ細胞は、株式会社 バキュロテクノロジーズ（香川県）から入手した。
バキュロウイルスBombyx mori核多角体ウイルス-BmNPVのP6E株は、株式会社 バキュロテクノロジーズ（香川県）から入手した。
【００２４】
［実施例１］日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類される日本脳炎ウイルス様粒子の製造方法
＜日本脳炎-中山株ウイルス様粒子（JEV-NVLP）を発現する遺伝子を有するバキュロウイルス組換え体の構築＞
Yamaji H等によるJ Biosci Bioeng 2012;114:657-62、Yun SI等によるHum Vaccin Immunother 2014;10:263-79及びLuca VC等によるJ Virol 2012;86:2337-46などの文献の内容に基づいて、日本脳炎ウイルス遺伝子III型由来のＭタンパク質及びＥタンパク質を含有するウイルス様粒子を発現するために使用する、バキュロウイルス組換え体を作製した。
まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＢＱ５２６９１で登録されているアミノ酸配列中のｐｒｅＭタンパク質から、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質までのアミノ酸配列（配列番号１）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号２）を付加して、核酸設計の基となる中山株ウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号３）。この中山株ウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、中山株ウイルスの完全なprMタンパク質をコードする完全なprM遺伝子、Mタンパク質をコードする完全なM遺伝子および完全なＥタンパク質をコードするJEV-NVLP遺伝子配列に関し、後の工程で使用するカイコ蛹において、該中山株ウイルス様粒子の発現を増強できるように当該JEV-NVLP遺伝子配列のコドン最適化を行ない、コドン最適化JEV-NVLP遺伝子配列を得た（配列番号４）。なお、コドン最適化JEV-NVLP遺伝子配列のＤＮＡ断片の合成には、Dragon Genomics（Shiga、Japan）を用いた。
【００２５】
合成したＤＮＡ断片をIn-Fusionキット（Clontech、Mountain View、CA、USA）を使用して発現ベクターであるｐＰｍ-８プラスミドに挿入して、ｐＢｍ-８-JEV-NVLPベクターを作製した。続いて、ｐＢｍ-８-JEV-NVLPベクターおよびバキュロウイルスBombyx mori核多角体ウイルス-BmNPVのP6E株由来の線状化ＤＮＡを、血清を含まない培地中でカイコＢｍ―Ｎ細胞にコトランスフェクションした。５時間のインキュベーションの後、前記無血清培地をTC-100培地および10％ウシ胎仔血清を含有する最小必須培地に交換し、当該細胞をさらに5〜7日間インキュベートした。その後、培地を回収し、3000rpmで5分間遠心分離して、沈降した細胞破片を分離した。同様の遠心分離を繰り返して、JEV-NVLPバキュロウイルス組換え体濃縮液を得た。
【００２６】
ここで、顕微鏡観察による細胞の外観及び形態の変性に基づいてJEV-NVLPバキュロウイルス組換え体に感染したカイコＢｍ―Ｎ細胞を確認した。さらに、日本脳炎ウイルス（中山株ウイルス）に対するマウス抗血清又はウサギ抗血清と、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗マウスIgG抗体（米国ペンシルベニア州ウエストグローブ）とを用いた蛍光抗体法で、JEV-NVLPバキュロウイルス組換え体に感染したカイコＢｍ―Ｎ細胞を再確認した。また、JEV-NVLPバキュロウイルス組換え体に感染したカイコＢｍ―Ｎ細胞が日本脳炎ウイルス遺伝子III型に分類されるウイルス由来のＥタンパク質を含有する日本脳炎ウイルス様粒子を産生していることを、中山株ウイルスに対する前記マウス抗血清またはウサギ抗血清、ヤギポリクローナル抗JEVウサギ血清（NIID、Tokyo、Japanから入手した）、FITC結合ウサギ抗ヤギIgG-AP抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）及び、ECLプラス試薬（GE Healthcare、Port Washington、NY、USA）を使用したウエスタンブロット分析で確認した。
【００２７】
＜カイコ蛹における中山株ウイルス様粒子の生成と精製＞
得られたJEV-NVLPバキュロウイルス組換え体濃縮液（１×１０10pfu/ml）を1×106/蛹にPBSで調整（希釈）した20μlを、カイコ蛹に注射してJEV-NVLPバキュロウイルス組換え体に感染させた。感染１〜５日後にそれぞれ、カイコ蛹を回収し、破砕し、破砕物に0.01％ホルマリンおよびフェニルチオウレアを添加した。そして、その混合物を３サイクルの超音波処理でホモジェナイズした。得られたホモジネートを、Beckman遠心分離機を備えたSW28ローターを用いて16,000rpmで30分間遠心分離し、続いて同じローターを用いて、さらに10〜50％（w / w）の線状スクロース勾配で遠心分離して、20個の画分を生成した。ウイルス様粒子抗原の存在を検出するために、すべての画分に対し、公知の手順でタンパク質含量定量、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびウエスタンブロット分析に供した。なお、これらのアッセイ等で使用した抗体等は、上記と同じである。その結果、感染後３日目のカイコ蛹から得られるＥタンパク質収量が一番高いことが分かった。具体的には、感染後３日目の30匹のカイコ蛹のホモジネートから9,480μgのEタンパク質を回収できることを確認した。したがって、計算上、各カイコ蛹は、300μg以上のEタンパク質を産生することができた。
別途同様に行った実験では、30匹の蛹から15,840μgのEタンパク質が回収され、396μgのEタンパク質/蛹が産生された。また、得られたウイルス様粒子（VLP）抗原を電子顕微鏡で観察したところ、直径30〜200nmのサイズの粒子が確認された。
以上から、本発明におけるカイコ蛹の発現系では、予想外に高い収率で安全にウイルス様粒子抗原を得ることができることが分かった。
【００２８】
［実施例２］日本脳炎ウイルス遺伝子V型に分類される日本脳炎ウイルス様粒子の製造方法
＜日本脳炎-Muar株ウイルス様粒子（JEV-VLP）を発現する遺伝子を有するバキュロウイルス組換え体の構築＞
ＧｅｎｂａｎｋにＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＤＸ３１６６３で登録されているアミノ酸配列中のｐｒｅＭタンパク質から、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質までのアミノ酸配列（配列番号５）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号３）を付加して、核酸設計の基となるMuar株ウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号６）。この中山株ウイルスＰｒｅＭ／Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列に相当するMuar株のPreM/M-E融合タンパク質のアミノ酸配列のうち最初のValタンパクを中山株同様にMetに改変することで開始コドンとし、また、TAGアミノ酸配列を加え、該Muar株ウイルス様粒子の発現を増強できるように当該JEV-VLP遺伝子配列のコドン最適化を行ない、コドン最適化JEV-VLP遺伝子配列を得た（配列番号７）。
それ以外の手順は、全て実施例２と同様に行った。
【００２９】
［実施例３］2種混合ワクチンの製造方法
実施例１で得られたウイルス様粒子と、実施例２で得られたウイルス様粒子をそれぞれタンパク量(20μg/ml)で規定し、それぞれのVLPを等量混合して作製した。
【００３０】
［実施例４］カイコで発現させた日本脳炎ウイルス様粒子の中和抗体価の確認（プラーク中和試験）
上述のプラーク中和試験法に基づいて、以下の実験を行った。
カイコ蛹で産生された中山株ウイルス様粒子（JEV-NVLP）をウサギに免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルスに対する中和抗体価を測定することで免疫原性を調べた。具体的には、ウサギに中山株ウイルス様粒子（JEV-NVLP）100〜200μg/mlの0.5〜1 mlを2週間間隔で7回注射（免疫）し、採血後の血液を1200rpmで10分間遠心して得られた抗血清を用いて中和抗体価を確認した。
JEV-NVLPに対する試験抗ウサギ血清を、10倍連続希釈後、さらに連続希釈し、同じ量の攻撃ウイルスと混合した。プラーク阻害アッセイのために、接種前に、攻撃ウイルスを10倍希釈した抗血清と混合した。 6ウェルプレートで6日間インキュベートした後、アガロース培地を除去し、生存プラークを計数した。
中山株に感染したVero細胞で産生されたプラークは非常に小さかったが、血清の濃度が増加するにつれてプラーク数は明らかに減少した。この傾向は、北京株ウイルスおよびMuar株ウイルスによって産生されたプラーク数でも観察された。この抗体試験抗ウサギ抗体-攻撃ウイルスの関係を、図３に示す。抗体の希釈倍数とプラーク数との間に相関関係が観察された。図３の曲線に基づいて、各ウェルの平均プラーク数を１００％とし、プラーク数を５０％に減少させるのに必要な最大の血清希釈倍率である中和抗体価を算出した（表２）。JEV-NVLPに対する抗血清は、ＩＩＩ型に分類される中山株ウイルス及び北京株ウイルスに対してそれぞれ高い阻害効果をもたらした。特に、JEV-NVLPに対する抗血清は、Ｖ型に分類されるMuar株において、中山株よりも高い力価を有していた。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
［実施例５］カイコで発現させた日本脳炎ウイルス様粒子の中和抗体価の確認
カイコ蛹で産生されたMuar株ウイルス様粒子（JEV-VLP）でウサギに免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルスに対する中和抗体価を測定することで免疫原性を調べた。手順は実施例４と同様に行った。この抗体試験抗ウサギ抗体-攻撃ウイルスの関係を、図４に示す。抗体の希釈倍数とプラーク数との間に相関関係が観察された。図４の曲線に基づいて、各ウェルの平均プラーク数を１００％とし、プラーク数を５０％に減少させるのに必要な最大の血清希釈倍率である中和抗体価を算出した（表３）。JEV-VLPに対する抗血清は、Ｖ型に分類されるＭｕａｒ株ウイルスに対して高い阻害効果をもたらした。また、当該抗血清は、中山株ウイルスに対しても高い阻害効果をもたらした。これは、従来のワクチンでは得られなかった予想外の効果であった。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
［実施例６］カイコで発現させた日本脳炎ウイルス様粒子の中和抗体価の確認（２種混合ワクチン）
実施例３で作製した2種混合ワクチンでウサギに免疫して作った抗体の日本脳炎ウイルスに対する中和抗体価を測定することで免疫原性を調べた。中和抗体価を確認する手順は実施例４と同様に行った。そして、2種混合ワクチンによって得られる中和抗体価を算出した（表４）。なお、表４には、表２及び表３の結果、及び、表１で示した従来技術が反映されている。
【００３５】
【表４】
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【００３６】
現在、広く市販されている中山株と北京株ワクチンの免疫血清に対し、JEV GＶ型のMuar株の中和抗体価は、２０と低く反応し、その予防効果は期待できない。これに対し、中山株ウイルス様粒子を含むワクチンは、中山株、Muar株に高く反応するが、北京株にはやや低く反応している。一方、Muar株ウイルス様粒子を含むワクチンは、ホモのMuar株ウイルスに非常に高く反応し、中山株にも高く反応するが、北京株には極端に低い反応を示し、中和抗体価は僅か76となっている。以上から、中山株ウイルス様粒子とMuar株ウイルス様粒子とを含む２種混合ワクチンは、9,600、8,000、8,000と、ほぼ同程度の抗体価を有していることから、本日本脳炎２種混合ワクチンは、現在世界で流行しているGＩ、GIII、GＶ型の日本脳炎ウイルスを制圧することが可能になると考えられる。本発明により、中山株とMuar株、あるいは北京株とMuar株ウイルスの2種混合ワクチンの登場が期待される。
【００３７】
［実施例７］JEV-NVLPワクチンによる予防接種
部分的に精製したJEV-NVLPをマウスでの免疫化に使用した。最初に、JEV-NVLPを完全アジュバントと混合した。得られたアジュバントワクチンを最初の免疫化（初回投与）に使用し、不完全アジュバントワクチンを2週間後の2回目の免疫化（2回目の投与）に使用した。さらにアジュバントを含まない第3の免疫化（第3の用量）を4週間後に与え、血液サンプルを2週間後に収集した。結果を図５に示す。なお、動物実験の基本的なルールは、動物実験の基本規則（沖縄生物資源研究所）と実験動物の管理と使用に関するガイドライン（日本科学会）に従った。
図５に示すように、一連の3回の用量で免疫したマウスでは、より高い中和力価がJEV-Muar株について観察された。引き続く高いプラーク中和力価が相同な中山株において確認された。対照的に、JEV-NVLPに対する上記の強力な抗血清は、北京株によるプラーク形成の阻害には他の２種ほどは影響を及ぼさなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【配列表】
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