(57)【要約】本発明は、第２のポリペプチドに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチド、および微生物感染を処置または予防するための方法を提供し、ここでこの第１のポリペプチドは、α１，３フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化され、そしてこの第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１領域を含む。本発明は、微生物付着を媒介する糖質エピトープが、高密度で、ムチン型タンパク質骨格上の異なるコア糖鎖によって特異的に発現され得るという発見に一部基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２のポリペプチドに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、該第１のポリペプチドが、α１，３フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化され、該第２のポリペプチドが、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１領域を含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記第１のポリペプチドが、ムチンポリペプチドである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ムチンポリペプチドが、Ｐセレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも１領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ムチンポリペプチドが、Ｐセレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含む、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記第１のポリペプチドが、α糖タンパク質ポリペプチドである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記第１のポリペプチドが、α−１−酸糖タンパク質の少なくとも１領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記第２のポリペプチドが、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記第２のポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが、ダイマーである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載の融合ポリペプチドを含む吸収体。
【請求項１４】
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染の症状を、その必要のある被験体において予防または軽減する方法であって、該方法は、該被験体に請求項１に記載の融合ポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
症候性消化酸疾患および胃癌を予防または軽減する必要のある被験体において、症候性消化酸疾患および胃癌を予防または軽減する方法であって、該方法が、請求項１に記載の融合ポリペプチドを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記症候性消化酸疾患が、胃酸消化性潰瘍である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞への微生物の付着を減少させる方法であって、該方法が、該細胞と請求項１に記載の融合ポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記細胞が、インビボ、インビトロまたはエキソビボで接触される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物が、細菌、ウイルスまたは真菌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌が、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、胃粘膜細胞である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２２】
細菌毒素の細胞への付着を減少させる方法であって、該方法が、該細胞と請求項１に記載の融合ポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記細胞が、胃粘膜細胞である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、微生物感染を処置または予防するための組成物および方法に関し、より詳細には、微生物付着を媒介する糖質ペプチドを含む融合ポリペプチドを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
微生物（例えば、細菌、ウイルスおよび真菌）ならびに細菌毒素は、コロニー形成および病原性に対する細胞糖質レセプターへの付着に依存する。３５より多くの細菌病原体が、標的細胞上に多く存在する細胞表面オリゴサッカリドへ結合することによって、細胞付着を開始する。糖質付着を媒介する細菌タンパク質は、付着因子、レクチンおよび赤血球凝集素である。付着因子糖質特異性は、病原体がどの種にコロニー形成し得るか（宿主範囲）に寄与し得るだけでなく、コロニー形成が生じ得る生物体における部位（組織向性）にも寄与する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、微生物付着を媒介する糖質エピトープが、高密度で、ムチン型タンパク質骨格上の異なるコア糖鎖によって特異的に発現され得るという発見に一部基づく。ポリペプチドは、本明細書中で、ＭＡ融合ポリペプチドと称される。
【０００４】
１つの局面において、本発明は、第２のポリペプチドに作動可能に連結されたα１，３フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。この第１のポリペプチドは、例えば、ムチンポリペプチド（例えば、ＰＳＧＬ−１またはその一部）である。好ましくは、ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外タンパク質である。あるいは、この第１のポリペプチドは、α糖タンパク質（例えば、α１−酸糖タンパク質（すなわち、オロソムコイドまたはＡＧＰ）またはその一部）である。α１，３フコシルトランスフェラーゼは、例えば、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６またはＦＵＴ７である。
【０００５】
第２のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンポリペプチドの領域を含む。例えば、この第２のポリペプチドは、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの領域を含む。あるいは、この第２のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のＦＣ領域を含む。
【０００６】
ＭＡ融合ポリペプチドは、マルチマーである。好ましくは、ＭＡ融合ポリペプチドは、ダイマーである。
【０００７】
ＭＡ融合ポリペプチドをコードする核酸、ならびに本明細書中に記載されるＭＡ融合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、および本明細書中に記載されるベクターまたは核酸を含む細胞もまた、本発明に含まれる。あるいは、このベクターは、α１，３フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は、微生物または微生物毒素の細胞への接着を阻害（例えば、減少）する方法を提供する。付着は、細胞とＭＡ融合ポリペプチドとを接着させることによって阻害される。この細胞は、インビボ、インビトロまたはエキソビボで接触される。この細胞は、例えば、胃細胞である。本発明はまた、微生物感染に罹患しているかまたは微生物感染を発症する危険性のある被験体を同定し、この被験体にＭＡ融合ポリペプチドを投与することによって、この被験体における微生物感染の症状または微生物感染に関連する障害を予防または軽減する方法を特徴とする。この微生物は、細菌（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ウイルスまたは真菌である。
【０００９】
被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト）、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタである。この被験体は、微生物感染または微生物感染に関連する状態に罹患しているかまたは微生物感染または微生物感染に関連する状態を発症する危険性がある。微生物感染または微生物感染に関連する障害に罹患しているかまたはこれらを発症する危険性のある被験体は、当該分野で公知の方法（例えば、組織の目視試験、または組織もしくは血液に関連する微生物のコロニー形成の検出）によって同定される。微生物感染または微生物感染に関連する障害の症状としては、異常な疼痛、吐き気または嘔吐が挙げられる。例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉのような微生物感染または微生物感染に関連する障害に罹患している被験体は、当該分野で公知の血液、息または便の試験で同定される。
【００１０】
ＭＡ融合ポリペプチドを含む薬学的組成物もまた、本発明に含まれる。
【００１１】
別段定義されなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中で記載されるものと同様かまたは同じ方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）が、支配する。さらに、この材料、方法、および例は、単なる例示に過ぎず、限定することを意図しない。
【００１２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかである。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、微生物付着を媒介する糖質エピトープが、糖タンパク質（例えば、ムチン型糖タンパク質およびα糖タンパク質）のタンパク質骨格上で高密度で特異的に発現され得るという発見に一部基づく。この高密度の糖質エピトープは、一価のオリゴサッカリドと比較して増加した原子価および親和性を生じる。
【００１４】
糖抗原、シアリルルイス（ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ）（例えば、Ｌｅａ、Ｌｅｂａ、Ｌｅｘ、Ｌｅｙ）は、細胞付着分子に対するリガンドである。ヒト胃病原体であるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉは、ルイス抗原またはそれらの表面リポポリサッカリド（ＬＰＳ）Ｏ−抗原を発現する。
【００１５】
本発明は、複数のシアリルルイスエピトープを含む糖タンパク質−免疫グロブリン融合タンパク質（本明細書中では、「ＭＡ融合タンパク質またはＭＡ融合ペプチド」と称される）を提供し、これは微生物（例えば、細菌、ウイルスまたは真菌）または細菌毒素と細胞との間の付着相互作用をブロック（すなわち、阻害）する際に有用である。このＭＡ融合タンパク質は、微生物または毒素の細胞への付着の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％を阻害する。例えば、ＭＡ融合タンパク質は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの胃粘膜への付着を阻害する際に有用である。
【００１６】
このＭＡ融合ペプチドは、野生型シアリルーＬｅの遊離サッカリドと比較した場合、微生物または毒素の付着を阻害する際に、糖質分子を基準にしてより有効である。このＭＡ融合ペプチドは、等量の野生型シアリル−Ｌｅ決定因子の遊離サッカリドと比較した場合、２、４、１０、２０、５０、８０、１００倍またはそれ以上の数の微生物または毒素を阻害する。
【００１７】
本発明のＭＡ融合タンパク質は、シアリルルイス抗原に対して特異的なエピトープを輸送する。例えば、ＭＡ融合タンパク質は、Ｌｅａエピトープ、Ｌｅｂエピトープ、ＬｅｘエピトープまたはＬｅｙエピトープのいずれかを輸送する。好ましくは、ＭＡ融合タンパク質は、Ｌｅｘエピトープを輸送する。あるいは、ＭＡ融合物は、２つのシアリルルイス抗原を輸送する。例えば、ＭＡ融合タンパク質は、ＬｅｘエピトープおよびＬｅｂエピトープの両方を輸送する。あるいは、ＭＡ融合タンパク質は、４つ全てのエピトープ（すなわち、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹ）を輸送する。これらのシアリルルイス抗原は、Ｏ結合される。あるいは、シアリルルイス抗原は、Ｎ結合される。
【００１８】
（融合ポリペプチド）
種々の局面において、本発明は、第２のポリペプチドに作動可能に連結された、糖タンパク質の少なくとも一部（例えば、ムチンポリペプチドまたはαグロブリンポリペプチド）を含む第１のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、非ムチンポリペプチドに作動可能に連結された少なくとも糖タンパク質ポリペプチドの一部を含む。
【００１９】
「ムチンポリペプチド」とは、ムチンドメインを有するポリペプチドをいう。このムチンポリペプチドは、１、２、３、５、１０、２０個またはそれ以上のムチンドメインを有する。このムチンポリペプチドは、Ｏグリカンで置換されたアミノ酸配列によって特徴付けられる任意の糖タンパク質である。例えば、ムチンポリペプチドは、２個おきまたは３個おきのアミノ酸がセリンまたはスレオニンであるアミノ酸を有する。このムチンポリペプチドは、分泌タンパク質である。あるいは、このムチンポリペプチドは、細胞表面タンパク質である。
【００２０】
ムチンドメインは、スレオニン、セリンおよびプロリンのアミノ酸が豊富であり、それらのアミノ酸において、オリゴサッカリドが、Ｎ−アセチルガラクトサミンを介してヒドロキシアミノ酸に結合する（Ｏ−グリカン）。ムチンドメインは、Ｏ−結合グリコシル化部位を含むか、あるいはＯ−結合グリコシル化部位からなる。ムチンドメインは、１、２、３、５、１０、２０、５０、１００以上のＯ−結合グリコシル化部位を有する。あるいは、ムチンドメインは、Ｎ−結合グリコシル化部位を含むか、あるいはＮ−結合グリコシル化部位からなる。ムチンポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％、９０％、９５％または１００％がグリカンに起因する。ムチンポリペプチドは、ＭＵＣ遺伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３など）によってコードされる任意のポリペプチドである。あるいは、ムチンポリペプチドは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ、または赤血球細胞グリコホリンである。好ましくは、ムチンは、ＰＳＧＬ−１である。
【００２１】
「α−グロブリンポリペプチド」とは、血清糖タンパク質をいう。αグロブリンとしては、例えば、肺および肝臓により生成される酵素、およびハプトグロビン（これはヘマグロビンに一緒に結合する）が挙げられる。αグロブリンは、α１グロブリンまたはα２グロブリンである。α１グロブリンは、大部分は、α１アンチトリプシン（肺および肝臓によって生成される酵素）である。α２グロブリン（これは血清ハプトグロビンを含む）は、ヘモグロビンに結合して、腎臓によるその排泄を防止するタンパク質である。他のαグロブリンは、炎症、組織損傷、自己免疫疾患または特定の癌の結果として生成される。好ましくは、αグロブリンは、α−１酸糖タンパク質（すなわち、オロソムコイド）である。
【００２２】
「非ムチンポリペプチド」とは、その質量の少なくとも４０％未満がグルカンに起因するポリペプチドである。
【００２３】
本発明のＭＡ融合タンパク質において、ムチンポリペプチドは、ムチンタンパク質の全てまたは一部に対応する。ＭＡ融合タンパク質は、ムチンタンパク質の少なくとも一部を含む。「少なくとも一部」とは、ムチンポリペプチドが、少なくとも１つのムチンドメイン（例えば、Ｏ結合グリコシル化部位）を含むことを意味する。ムチンタンパク質は、ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分を含む。
【００２４】
αグロブリンポリペプチドは、αグロブリンポリペプチドの全てまたは一部に対応し得る。ＭＡ融合タンパク質は、αグロブリンポリペプチドの少なくとも一部を含む。「少なくとも一部」とは、αグロブリンポリペプチドが少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位を含むことを意味する。
【００２５】
第１のポリペプチドは、１つ以上の血液型トランスフェラーゼによってグリコシル化される。第１のポリペプチドは、２、３、５個またはそれ以上の血液型トランスフェラーゼによってグリコシル化される。グリコシル化は、連続的または継続的である。あるいは、グリコシル化は、同時またはランダム（すなわち、特定の順序がない）である。例えば、第１のポリペプチドは、α１，３フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。例示的なα１，３フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６およびＦＵＴ７である。あるいは、第１のポリペプチドは、Ｎ結合シアリルルイス決定因子またはＯ結合シアリルルイス決定因子をタンパク質骨格に付加し得る任意の酵素によってグリコシル化される。α１，３フコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよびα１，３フコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ０００１４１、ならびにＮＭ０００１５０、ＮＰ０００１１４０およびＮＭ０００１４９、およびＮＰ００２０３５およびＮＭ００２０３４が挙げられ、これらはその全体が本明細書中で参考として援用される。
【００２６】
第１のポリペプチドは、ネイティブ（すなわち、野生型）のポリペプチドより多くグリコシル化される。第１のポリペプチドは、その質量の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％より多くが糖に起因する。
【００２７】
融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」とは、第１および第２のポリペプチドが、第１のポリペプチドのＯ結合グリコシル化および／またはＮ結合グリコシル化を可能にする様式で、（最も代表的には、ペプチド結合のような共有結合を介して）化学的に結合されていることを意図する。融合ポリペプチドをコードする核酸を言及するために使用される場合、用語、「作動可能に連結された」とは、ムチンまたはαグロブリンポリペプチドをコードする核酸および非ムチンポリペプチドが、互いにインフレームで融合されていることを意味する。非ムチンポリペプチドは、ムチンまたはαグロブリンポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【００２８】
ＭＡ融合タンパク質は、１つ以上のさらなる部分に結合される。例えば、ＭＡ融合タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質にさらに結合され、ここで、ＭＡ融合タンパク質の配列は、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、ＭＡ融合タンパク質の精製を容易にし得る。あるいは、ＭＡ融合タンパク質は、固体支持体にさらに結合され得る。種々の固体支持体が、当業者に公知である。このような組成物は、抗血液型抗体の除去を容易にする。例えば、ＭＡ融合タンパク質は、例えば、金属化合物、シリカ、ラテックス、ポリマー材料から作製される粒子；マイクロタイタープレート；ニトロセルソースもしくはナイロン、またはそれらの組み合わせに結合される。固体支持体に結合されたＭＡ融合タンパク質は、生物学的サンプル（例えば、胃組織、血液または血漿）から微生物または細菌毒素を除去するための吸収体として使用される。
【００２９】
融合タンパク質は、異種シグナル配列（すなわち、ムチンまたはグロブリン核酸によってコードされるポリペプチドに存在しないポリペプチド配列）をそのＮ末端に含む。例えば、ネイティブのムチンまたはα糖タンパク質のシグナル配列は、除去され、そして別のタンパク質由来のシグナル配列と置換される。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ポリペプチドの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用によって増加され得る。
【００３０】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端またはスタガー末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ  ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合、付着末端の充填、所望しない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いることによって、一緒にインフレームで連結される。融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成される。あるいは。遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅が、２つの連続した遺伝子フラグメント（これは後に、キメラ遺伝子配列を生成するように、アニーリングされそして再増幅され得る）の間の相補オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを使用して実施される（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。ムチンまたはαグロブリンをコードする核酸は、このような発現ベクターにクローニングされ得、その結果、この融合部分が免疫グロブリンタンパク質にインフレームで結合される。
【００３１】
ＭＡ融合ポリペプチドは、オリゴマー（例えば、ダイマー、トリマーまたはペンタマー）として存在し得る。好ましくは、ＭＡ融合ポリペプチドは、ダイマーである。
【００３２】
第１のポリペプチド、および／または第１のポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知のムチンコード配列またはαグロブリンコード配列を用いて構築される。ムチンポリペプチドおよびムチンポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ６６３６２５およびＮＭ１４５６５０、ＣＡＤ１０６２５およびＡＪ４１７８１５、ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４、ＸＰ００６８６７およびＸＭ００６８６７およびＮＰ００３３１７７７およびＮＭ００９１５１を含み、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。αグロブリンポリペプチドおよびαグロブリンポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、ぞれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ２６２３８およびＢＣ０２６２３８；ＮＰ０００５９７；ならびにＢＣ０１２７２５、ＡＡＨ１２７２５およびＢＣ０１２７２５、およびＮＰ４４５７０およびＮＭ０５３２８８が挙げられ、これはその全体が本明細書中で参考として援用される。
【００３３】
そのムチンポリペプチド部分は、増大した糖質含有量を生じる（非変異配列に対して）、天然に存在するムチン配列（野生型）において変異を有する改変体ムチンポリペプチドとして提供される。例えば、改変体ムチンポリペプチドは、野生型ムチンと比較して、さらなるＯ結合型グリコシル化部位を含む。あるいは、その改変体ムチンポリペプチドは、野生型ムチンポリペプチドと比較して、増大した数のセリン、スレオニン、またはプロリン残基を生じるアミノ酸配列変異体を含む。この増大した糖質含有量は、当業者に公知の方法によって、ムチンのタンパク質：糖質の比を決定することによって評価される。
【００３４】
同様に、αグロブリンポリペプチド部分は、糖質含量の増加（非変異配列と比較して）をもたらす天然に存在するαグロブリン配列（野生型）における変異を有する、改変体αグロブリンポリペプチドとして提供される。例えば、改変体αグロブリンポリペプチドは、野生型αグロブリンと比較してさらなるＮ結合グリコシル化部位を含んだ。
【００３５】
あるいは、ムチンまたはαグロブリンポリペプチド部分は、タンパク質分解に対するより耐性（非変異配列と比較して）のムチンまたはαグロブリン配列を生じる、天然に存在するムチンまたはαグロブリン配列（野生型）における変異を有する改変体ムチンまたはαグロブリンポリペプチドとして提供される。
【００３６】
第１のポリペプチドは、全長ＰＳＧＬ−１を含む。あるいは、この第１のポリペプチドは、全長ＰＳＧＬ−１ポリペプチド（例えば、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分）未満を含む。例えば、４００アミノ酸長未満（例えば、３００、２５０、１５０、１００、５０、または２５アミノ酸長以下）の第１のポリペプチド。
【００３７】
第１のポリペプチドは、全長α酸グロブリンを含む。あるいは、第１のポリペプチドは、全長未満のα酸グロブリンポリペプチドを含む。例えば、第１のポリペプチドは、２００未満のアミノ酸長（例えば、１５０，１００、５０または２５アミノ酸長以下）である。
【００３８】
第２のポリペプチドは、好ましくは可溶性である。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２のムチンまたはαグロブリンポリペプチドとのＭＡ融合ポリペプチドの会合を促進する配列を含む。第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１つの領域を含む。「少なくとも１つの領域」とは、免疫グロブリン分子の任意の一部（例えば、軽鎖、重鎖、ＦＣ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域またはそれらの任意のフラグメント）を含むことを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号に記載される。
【００３９】
第２のポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、その第２のポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチド未満（例えば、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ＦｖまたはＦｃ）を含む。好ましくは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含む。より好ましくは、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含む。
【００４０】
この第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能より少ないエフェクター機能を有する。あるいは、この第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のより少ないかより多いエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体結合およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号を参照のこと）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。一実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対して低い親和性を有するかまたは全く親和性を有さない。あるいは、第２のポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ１ｑに対して低い親和性を有するかまたは全く親和性を有さない。
【００４１】
本発明の別の局面は、ムチンポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。そのベクターは、免疫グロブリンポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸に作動可能に連結されたムチンポリペプチドをコードする核酸を含む。さらに、そのベクターは、α１，３フコシルトランスフェラーゼのような血液型トランスフェラーゼをコードする核酸を含む。この血液型トランスフェラーゼは、ＭＡ融合タンパク質のムチンまたはαグロブリン部分のペプチド骨格上のシアリルルイス決定因子の付加を促進する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、別の核酸（これに対してそのベクターが連結される）を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、プラスミドとは、さらなるＤＮＡセグメントが連結される環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに連結される。特定のベクターは、これが導入される宿主細胞において自己複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入される際に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書中において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、交換可能に使用される。しかし、本発明は、等価な機能を提供する、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【００４２】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に適切な形態で本発明の核酸を含み、これは、この組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含み、これは、発現される核酸配列に作動可能に連結されることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」とは、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞内に導入される場合には宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、その目的のヌクレオチド配列が、調節配列に連結されることを意味することが意図される。
【００４３】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＺＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節配列は、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるものおよび特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を方向付けるもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入され、それにより本明細書中に記載されるような核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチド（例えば、ＭＡ融合ポリペプチド、ＭＡ融合ポリペプチドの変異形態など）を含むタンパク質またはペプチドを産生する。
【００４４】
本発明の組換え発現ベクターが、原核生物細胞または真核生物細胞のＭＡ融合ポリペプチドの発現のために設計される。例えば、ＭＡ融合ポリペプチドを含むワクチンは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現される。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）でさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写かつ翻訳される。
【００４５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて最も頻繁に行われる。融合ベクターは、多くのアミノ酸をそのベクター中にコードされるタンパク質に（通常は組換えタンパク質のアミノ末端に）加える。このような融合ベクターは、代表的に、３つの目的に寄与する：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増大するため；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性を上昇させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質溶解性切断部位は、融合部分と組換えタンパク質との接合部で導入され、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にし、その後、融合タンパク質の精製が続く。このような酵素およびそのコグネイト認識配列（ｃｏｇｎａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ標的の組換えタンパク質に対し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）ならびにｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、が挙げられる。
【００４６】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【００４７】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大にする１つの戦略は、タンパク質溶解的に組換えタンパク質を切断する能力が損なわれた宿主細菌においてタンパク質を発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別の戦略は、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変え、それによって各アミノ酸についての個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンとなるようにすることである（例えば、Ｗａｄａら，１９９２．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。このような本発明の核酸配列の変更は、標準的ＤＮＡ合成技術によって実行される。
【００４８】
ＭＡ融合ポリペプチド発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら，１９８７．Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．），ならびにｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００４９】
あるいは、ＭＡ融合ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において発現される。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現のための利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【００５０】
本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方についての他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【００５１】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、相互交換可能に使用される。このような用語は、特定の目的細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫をも指すことが理解される。続く産生において、変異または環境的影響のいずれかに起因して特定の改変が起こり得るため、実際には、このような子孫は、親細胞と同一でない場合があるが、なお、本明細書中で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００５２】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞である。例えば、融合ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現される。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００５３】
ベクターＤＮＡは、従来的形質転換技術または従来的トランスフェクション技術を介して、原核細胞または真核細胞に導入される。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）の宿主細胞への導入のための、分野で認められた（ａｒｔ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ）種々の技術をいうことを意図する。これらの技術としては、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクトするための適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．  第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の研究室マニュアルにおいて見出される。
【００５４】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクトのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクト技術に依存して、細胞の小さい画分のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組込み得ることが公知である。これらの組込み物を同定し、選択するために、一般的に、選択マーカー（例えば、抗体に対する耐性）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーとしては、薬物に対する耐性を与える選択マーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート）が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸が、ムチン融合ポリペプチドを含有するワクチンをコードする同一ベクターにより宿主細胞に導入されるかまたは別のベクターにより導入される。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は、生存するのに対して、他の細胞は死滅する）により同定される。
【００５５】
本発明の宿主細胞（例えば、培養された原核宿主細胞または真核宿主細胞）は、ＭＡ融合ポリペプチドを産生する（すなわち、発現する）ために使用される。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用するＭＡ融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。１つの実施形態において、その方法は、ＭＡ融合ポリペプチドが産生されるような適した培地中での本発明の宿主細胞（ＭＡ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）の培養を包含する。別の実施形態において、その方法はさらに、ＭＡ融合ポリペプチドの培地もしくは宿主細胞からの単離を包含する。
【００５６】
ＭＡ融合ポリペプチドを含有するワクチンは、従来の条件（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動など）に従って単離され、かつ精製される。例えば、ワクチンは、溶液を、固定化したＡタンパク質またはＧタンパク質（これらは融合タンパク質のＦｃ部分に選択的に結合する）を含むカラムに通すことによって精製される。例えば、Ｒｅｉｓ、Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：３０９８〜３１０２（１９８４）；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８７／００３２９を参照のこと。融合ポリペプチドは、カオトロピック塩で処理することにより、または酢酸水溶液（１Ｍ）で溶出することにより溶出され得る。
【００５７】
あるいは、本発明に従うＭＡ融合ポリペプチドは、当該分野で公知の方法を使用して化学的に合成される。ペプチド合成機を使用する合成を含めて、種々のタンパク質合成方法が当該分野で一般的である。ポリペプチドの化学的合成は、例えば、以下に記載される。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、Ｂｏｄａｓｎｓｋｙ、編  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９８；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：２４１〜２４７（１９８６）；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３０：７０５〜７３９（１９８７）；Ｋｅｎｔ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７〜９８９（１９８８）およびＫａｉｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１８７〜１９８（１９８９）を参照のこと。このポリペプチドは、標準的ペプチド精製技術を使用してそれらが化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないように精製される。用語「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、そのペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質からそのペプチドが分けられるペプチドの調製を含む。１つの実施形態において、用語「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、約３０％未満（乾重量による）の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製、さらにより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製、そして最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製を含む。
【００５８】
ポリペプチドの化学合成は、改変されたアミノ酸またはＤ―アミノ酸を含む非天然のアミノ酸および他の小さな有機分子の取り込みを促進する。ペプチド中の１つ以上のＬアミノ酸の対応するＤ−アミノ酸アイソフォームとの置換は、ペプチドの酵素的加水分解に対する抵抗を増加させ、かつ生物学的に活性なペプチドの１つ以上の特性（すなわち、レセプターの結合、機能的な潜在性または作用の持続性）を増強するために使用される。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙら，１９９３．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．３６：２５８５−２５９４；Ｋｉｒｂｙら，１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８０２−３８０８；Ｍｏｒｉｔａら，１９９４．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５３：８４−８８；Ｗａｎｇら，１９９３．Ｉｎｔ．Ｊ  Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４２：３９２−３９９；ＦａｕｃｈｅｒｅおよびＴｈｉｕｎｉｅａｕ，１９９２．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２３：１２７−１５９を参照のこと。
【００５９】
ペプチド配列の中への共有結合性架橋の導入は、立体配置的にトポグラフィックにポリペプチド骨格を束縛し得る。この戦略は増加した潜在性、選択性および安定性を備えた融合ポリペプチドのペプチドアナログを開発するために使用される。環状ペプチドの立体配置的エントロピーがその線形の対応物より低いので、特異的な立体配置の受け入れが非環状アナログより環状アナログのためのエントロピーにおいてより小さな減少が生じ得、それにより、より好まれる結合のための自由エネルギーを生じる。大環状化は、ペプチドＮ末端とＣ末端との間のアミド結合、および側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間のアミド結合（例えば、ｐＨ  ８．５でＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６とともに）（Ｓａｍｓｏｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：５１８２−５１８５（１９９６））、あるいは２つのアミノ酸側鎖間のアミド結合の形成によりしばしば遂行される。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ，Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ，３９：５１−１２４（１９８８）を参照のこと。ジスルフィド架橋もまた、それらの柔軟性を減少させるために線形配列へ導入される。例えば、Ｒｏｓｅら，Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ，３７：１−１０９（１９８５）；Ｍｏｓｂｅｒｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１０６：５０５−５１２（１９８２）を参照のこと。さらに、システイン残基のペニシラミン（Ｐｅｎ、３−メルカプト−（Ｄ）バリン）との置換は、あるオピオイド−受容体相互作用の選択性を増加させるために使用された。ＬｉｐｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｇｕｔｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２８７−３２０（１９９５）。
（微生物付着を減少させる方法）
微生物または微生物毒素の細胞への付着は、組織または細胞と本発明のＭＡ融合ペプチドとを接触させることによって阻害（例えば、減少）される。あるいは、付着は、ＭＡ融合ペプチドをコードする核酸を細胞に導入することによって阻害される。微生物は、例えば、細菌、ウイルスまたは真菌である。細菌は、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉである。処置される組織としては、腸組織、心臓組織、肺組織、真皮組織、または肝臓組織が挙げられる。例えば、組織は、胃粘膜組織である。細胞としては、例えば、胃細胞、心臓細胞または肺細胞が挙げられる。
【００６０】
付着の阻害は、罹患組織の微生物のコロニー形成の減少によって特徴付けられる。組織または細胞は、ＭＡペプチドと直接接触される。あるいは、インヒビターが、被験体に全身投与される。ＭＡペプチドは、微生物付着を減少（例えば、阻害）するのに十分な量で投与される。付着は、当該分野で公知の標準的な付着アッセイを使用して測定される。
【００６１】
この方法は、種々の微生物感染または微生物感染に関連する疾患の症状を緩和するのに有用である。この微生物感染は、例えば、細菌感染、ウイルス感染または真菌感染である。細菌感染は、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染である。微生物感染（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染）に関連する疾患としては、例えば、消化酸疾患（例えば、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、胃萎縮、胃ＭＡＬＴリンパ腫および胃癌）が挙げられる。
【００６２】
本明細書中に記載される方法は、本明細書中に記載されるような微生物感染または障害の１つ以上の症状の重篤度の減少またはこの症状の緩和をもたらす。微生物感染または微生物感染に関連する障害は、代表的には、標準的な方法を使用する医師によって、診断され、そして／またはモニタリングされる。
【００６３】
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染に関連する障害の症状としては、異常な不快さ、体重減少、食欲不振、鼓脹、げっぷ、吐き気または嘔吐が挙げられる。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染は、血液、息、便および組織の試験を使用して診断される。潰瘍は、例えば、上部ＧＩシリーズまたは内視鏡で診断される。胃ＭＡＬＴリンパ腫および胃癌は、例えば、生検によって組織病理学的に診断される。
【００６４】
被験体は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタである。処置は、微生物感染または障害の診断の前に施される。あるいは、処置は、被験体が感染を有した後に施される。
【００６５】
処置の有効性は、特定の微生物感染または微生物感染に関連する障害を診断または処置するための任意の公知の方法と関連して決定される。微生物感染または障害の１つ以上の症状の緩和は、この化合物が臨床的利益を与えることを示す。
【００６６】
（ＭＡ融合ポリペプチドまたはこれをコードする核酸を含む薬学的組成物）
本発明のＭＡ融合タンパク質またはこの融合タンパク質をコードする核酸分子（本明細書中で、「治療剤」または「活性化合物」と称される）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与に適切な薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質、または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、医薬投与に適合性の、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。適切なキャリアは、当該分野で標準的な参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載され、これは本明細書中に参考として援用される。このようなキャリアおよび希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた使用され得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合性である限り、組成物におけるその使用が基とされる。補助活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
【００６７】
本明細書中に開示される活性剤はまた、リポソームとして処方され得る。リポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載される方法）によって調製される。循環時間が増大したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【００６８】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成を用いて、逆相エバポレーション法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生成するために、規定された孔サイズのフィルターを通して押し出される。
【００６９】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜および経腸投与が挙げられる。非経口、経皮または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸）；および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロール）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアル中に入れられ得る。
【００７０】
注射用用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、滅菌キャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、無菌であり、かつ容易にシリンジ中に（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）存在する程度まで、流動性でなければならない。この組成物は、製造条件下および貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌のような微生物の夾雑作用に対して保護されなければならない。キャリアは、溶媒または分散媒体であり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリプロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散剤の場合、必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖質、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。注射用組成物の延長した吸収は、この組成物に、吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによってもたらされ得る。
【００７１】
滅菌注射用溶液は、活性化合物（例えば、ＭＡ融合タンパク質）を必要な量で、必要に応じて上記の成分の１つまたは組み合わせと共に、組込み、次いで滅菌濾過することによって、調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を滅菌ビヒクル（これは基本分散媒体および必要な上記の他の成分を含む）に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは活性成分と、その予め滅菌濾過した溶液由来の任意のさらなる所望の成分を生じ得る。
【００７２】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。この組成物は、ゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、そして錠剤、トローチまたはカプセル剤の形態で使用される。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための流体キャリアを使用して調製され得、ここでこの流体キャリア中の化合物は、経口適用され、そしてうがいされ、そして吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料は、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の任意の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ）；潤滑剤（例えば、ステアリン三マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑沢剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバー）。
【００７３】
吸入による投与について、これらの化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）またはネブライザーを含む加圧容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００７４】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。例えば、経粘膜投与または経皮投与について、透過されるべきバリアに適切な透過剤が、処方物に使用される。このような透過剤は一般に、当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜投与について、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフジシン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与について、活性化合物は、当該分野で一般的に知られている軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔまたはｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームに処方される。
【００７５】
これらの化合物はまた、坐剤（例えば、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリド）を用いて）、または腸送達のための保持浣腸剤の形態で調製され得る。
【００７６】
これらの活性化合物は、化合物が身体から迅速に排出されるのを保護するキャリアを用いて調製される（例えば、制御放出処方物、移植物および微小カプセル化送達システムを含む）。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酪酸）が使用され得る。このような処方物を調製するための方法は、当業者に明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法）に従って調製され得る。
【００７７】
経口組成物または非経口組成物は、容易な投与および投薬量の一貫性のための投薬単位形態で処方される。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態とは、処置される被験体の単位投薬量として適した物理的に別個単位をいう；各々の単位は、必要な薬学的キャリアと共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態のための仕様書は、活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のための活性化合物のような化合物の当該分野で固有の制限によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
【００７８】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリクスを含み得る。あるいは、完全遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）が組換え細胞からインタクトで産生される場合、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を生じる１つ以上の細胞を含み得る。
【００７９】
徐放性放出調製物が、所望の場合調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用マイクロスフェア））およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。
【００８０】
この薬学的組成物は、容器、パックまたはディスペンサー中に、投与のための指示書と共に含まれ得る。
【００８１】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに例示される。
【実施例】
【００８２】
（実施例１：一般的方法）
本明細書中に記載のデータを、以下の試薬および方法を使用して生成した。
【００８３】
（細胞培養）
ＣＯＳ−７  ｍ６細胞（Ｓｅｅｄ，１９８７）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、およびＳＶ４０ラージＴ抗原発現２９３ヒト胚性腎臓細胞株を、１０％  ウシ胎仔血清（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２５μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および２ｍＭ  グルタミン（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で培養した。細胞を２〜４日ごとに継代した。そのＨＨ１４ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ  ＨＢ−９２９９；米国特許第４，８５７，６３９号）を、１０％  ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／μｌのストレプトマイシン、および２ｍＭ  グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。
【００８４】
（分泌ＰＳＧＬ−１またはＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂキメラのトランスフェクションおよび生成）
トランスフェクションカクテルを、３９μｌの２０％グルコース、３９μｇのプラスミドＤＮＡ、１２７μｌのｄＨ２Ｏ、および１５．２μｌの０．１Ｍ  ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を５ｍｌポリスチレン管中に混合することによって調製した。全てのトランスフェクション混合物において、１３μｇのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂプラスミドを使用した。種々のグリコシルトランスフェラーゼについて１３μｇのプラスミドを添加し、必要な場合、ＣＤＭ８プラスミドを添加して、合計３９μｇのプラスミドＤＮＡにした。混合物を、１０ｍｌの培養培地中、約７０％コンフルエントのその細胞に添加する前に、室温で１０分間放置した。７日後、細胞上清を回収し、細片を遠沈し（１４００×ｇ、１５分）、ＮａＮ３を最終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）になるように添加した。
【００８５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析のための分泌ＰＳＧＬ−１またはＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂの精製）
融合タンパク質を、４℃において一晩転倒混和することによって、５０μｌのヤギ抗ｍＩｇＧアガロースビーズ（１００：１スラリー；Ｓｉｇｍａ）で、回収した上清から精製した。融合タンパク質を有するビーズを、ＰＢＳ中で３回洗浄し、その後の分析のために使用した。代表的には、サンプルを、５０μｌの２×還元サンプル緩衝液中に溶解し、１０：１のサンプルを、各ウェルにロードした。
【００８６】
（上清中のＰＳＧＬ−１またはＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂ濃度を決定するためのＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に、５０μｌの５０ｍＭ  炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中、０．５μｇ／ウェルのアフィニティー精製ヤギ抗ｍＩｇＧ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）を室温で２時間コーティングした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）３００μｌを用いて４℃で一晩ブロッキングし、その後の洗浄の後、５０μｌのサンプル上清を添加し、培養培地で連続希釈した。洗浄した後、プレートを、５０μｌのヤギ抗ｍＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）（ブロッキング緩衝液中で１：１０，０００希釈）とともに２時間インキュベートした。発色溶液については、１錠の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）を、１１ｍｌの０．０５Ｍ  クエン酸／リン酸緩衝液（３μｌの３０％（ｗ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含有）中に溶解した。１００μｌの発色溶液を添加した。その反応を、２５μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止した。そのプレートを、４５０ｎｍおよび５４０ｎｍで自動化マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で読み取った。標準物質として、精製ｍＩｇＧ  Ｆｃフラグメント（Ｓｉｇｍａ）の培養培地中での希釈系列を、三連で使用した。
【００８７】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、５％  濃縮ゲルおよび８％の分離ゲルを用いてＬａｅｍｍｌｉの方法（１９７０）によって行い、分離したタンパク質を、以前に記載されたように（Ｌｉｕら，１９９７）、ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｃ  ｅｘｔｒａ膜に電気泳動的にブロットした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）（３％  ＢＳＡを含む）中で一晩ブロッキングした後、膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、それらを、抗体とともに、１時間室温にてインキュベートした。全ての抗体を、ＴＢＳ−Ｔ中の３％  ＢＳＡで１：２００に希釈した。膜をＴＢＳ−Ｔで３回希釈し、その後、ＴＢＳ−Ｔ中の３％  ＢＳＡで１：２０００希釈した、二次西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗体であるヤギ抗ｍＩｇＭ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）またはヤギ抗ｍＩｇＧ３（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）とともに、室温で１時間インキュベートした。結合した二次抗体を、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、製造業者の説明書に従って、化学発光によって可視化した。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ自体を検出するために、ＨＲＰ標識ヤギ抗ｍＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を、上記のように、ＴＢＳ−Ｔ中の３％  ＢＳＡで１：１０，０００希釈で使用したが、二次抗体とはインキュベートしなかった。
【００８８】
（実施例２：種々の宿主細胞において作製された組換えＰＳＧＬ−１またはＡＰＧ／ｍＩｇＧに対するシアリルルイスｘ決定因子）
ＳＬｅＸ置換ムチン／Ｉｇは、２９３ＴおよびＣＯＳにおいて産生されたが、ＣＯＨ細胞においては産生されなかった（予想通り、これらは、ＳＬｅＸの形成に必要なＯ−グリカン上にラクトサミン配列を有さないため）。２９３Ｔ細胞を、ＦＵＴ７をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトし、そしてＡＧＰ／Ｉｇも同様にトランスフェクトした。
【００８９】
図１〜３は、α１−酸糖タンパク質（ＡＧＰ）−マウスＩｇＧ２ｂＦｃ融合タンパク質が、ＣＨＯ、ＣＯＳおよび２９３Ｔ細胞において、単独で（レーン２）またはα１，３フコシルトランスフェラーゼＩＩＩ〜ＶＩＩをコードするｃＤＮＡと共に（レーン３〜７）発現され、抗マウスＩｇＧアガロースビーズでアフィニティ精製され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗シアリル−ＬｅＸ（クローンＣＳＬＥＸ）または抗マウスＩｇＧ抗体を使用するウエスタンブロットによって分析されることを示す。シアリル−ＬｅＸ置換ウシ血清アルブミンをポジティブコントロール（＋）として使用し、ベクター骨格のみでトランスフェクトした細胞（ＣＤＭ８）は、ネガティブコントロール（レーン１）としての役割を果たし、同様に、非置換ウシ血清アルブミン（−）も、ネガティブコントロールとしての役割を果たした。ＡＧＰは、Ｎ結合グリカンのみを有し、従って、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞および２９３Ｔ細胞が異なるα１，３フコシルトランスフェラーゼと一緒になってシアリル−ＬｅＸ置換Ｎ結合グリカンを生成する能力が評価され得る。図に示され得るように、シアリル−ＬｅＸ保有Ｎ結合グルカンは、ＦＵＴ３、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６およびＦＵＴ７をコードするｃＤＮＡで同時トランスフェクトされたＣＨＯ細胞において生成したＡＧＰ−ｍＩｇＧ融合物でしか検出されなかった。
【００９０】
（実施例３：ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ結合Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）
２９３Ｔ細胞においてＦＵＴ７を用いて作製されたムチン／Ｉｇは、ＳＬｅＸ結合に強く結合を示すが、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの株である非ＳＬｅＸ結合には結合しない（図４）
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、１０７  ＣＦＵ、株２３（結合、ＳＬｅＸ−ＢＳＡ被覆ＥＬＩＳＡによって分類される）または株５７（非結合）を、室温で１時間、５００μｌの以下の上清と共にインキュベートした。
【００９１】
ＰＢＳ
ＣＤＭ８でトランスフェクトした２９３Ｔ
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ（ＨＩ−５細胞中で発現）
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ（２９３Ｔ細胞中で発現）
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ（ＦＵＴ７を同時発現する２９３Ｔ細胞中で作製、少量のＳＬｅＸ決定因子）
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ（２９３Ｔ細胞中で発現）
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ（ＦＵＴ７を同時発現する２９３Ｔ細胞中で作製、多量のＬＳｅＸ決定因子）。
【００９２】
図４において、＋は、異なる上清中とほぼ同量のＰＳＧＬ−１を含むサンプルを示し、−は、モックトランスフェクトした細胞（上清番号２）由来の上清サンプルを示す。ゲルを非還元条件下で泳動させ、そして抗−ｍＩｇＧ−ＨＲＰ抗体でプローブした。これらの上清中の融合タンパク質の濃度は、約１μｇ／μｌであった。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、異なるα１，３−ＦＵＴでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清から免疫精製したＡＧＰ／ｍＩｇのウエスタンブロットの写真である。
【図２】図２は、異なるα１，３−ＦＵＴでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清から免疫精製したＡＧＰ／ｍＩｇのウエスタンブロットの写真である。
【図３】図３は、異なるα１，３−ＦＵＴでトランスフェクトした２９３細胞の上清から免疫精製したＡＧＰ／ｍＩｇのウエスタンブロットの写真である。
【図４】図４は、ＰＢＳ中でインキュベートしたＨｐの溶解物またはトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来の異なる上清のウエスタンブロットの写真である。
【００９４】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と共に記載されてきたが、前述の説明は、例示することが意図されるのであって、本発明の範囲を制限しない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。他の局面、利点、および改変は、上記の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2005532793.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
2005532793.tif 000005
【国際調査報告】
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2005532793.tif 000007
2005532793.tif 000008
2005532793.tif 000009
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