(57)【要約】本発明は、安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体を提供する。本発明は、関連ポリペプチド、および薬学的に許容される粒子と該粒子に作用可能に付着された三量体複合体を有する組成物も提供する。本発明は、さらに、関連する核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製造法、予防法および治療法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体であって、（１）該複合体の各単量体単位がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、三量体複合体。
【請求項２】
各単量体単位の前記ｇｐ４１とｇｐ１２０がポリペプチドのタンパク分解による切断によって生じたものであり、前記切断が変異したフューリン（ｆｕｒｉｎ）認識配列で起こる、請求項１の三量体複合体。
【請求項３】
前記ジスルフィド結合が、ｇｐ１２０中のＡ４９２Ｃ変異によって導入されたシステイン残基とｇｐ４１中のＴ５９６Ｃ変異によって導入されたシステイン残基との間に形成されている、請求項１の三量体複合体。
【請求項４】
前記ｇｐ１２０が、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在せず、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする、請求項１の三量体複合体。
【請求項５】
ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１のアミノ酸配列を備えたポリペプチドであって、（１）前記ｇｐ４１配列がＮ末端へリックス中に１以上の変異を有しており、（２）前記ｇｐ１２０および前記ｇｐ４１の各配列の中に、少なくとも１つのシステイン残基が導入され、前記ｇｐ１２０と前記ｇｐ４１の間に少なくとも１つのジスルフィド結合が形成可能である、ポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが変異したフューリン認識配列を備え、タンパク分解による切断時に、ｇｐ１２０とｇｐ４１を生成することができる、請求項５のポリペプチド。
【請求項７】
請求項５のポリペプチドであって、Ａ４９２Ｃ変異によってシステイン残基がｇｐ１２０配列中に導入され、且つＴ５９６Ｃ変異によってシステイン残基がｇｐ４１配列中に導入される、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項５のポリペプチドであって、前記ｇｐ１２０が、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在しないこと、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１の三量体複合体または請求項５のポリペプチドであって、前記ｇｐ４１のＮ末端へリックス中の位置Ａに変異が位置する、複合体またはポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１の三量体複合体または請求項５のポリペプチドであって、前記ｇｐ４１のＮ末端へリックス中の位置Ｄに変異が位置する、複合体またはポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１の三量体複合体または請求項５のポリペプチドであって、非へリックス破壊アミノ酸のヘリックス破壊アミノ酸による置換が前記変異に含まれる、複合体またはポリペプチド。
【請求項１２】
前記ヘリックス破壊アミノ酸がプロリンである、請求項１１の三量体複合体またはポリペプチド。
【請求項１３】
前記ヘリックス破壊アミノ酸がグリシンである、請求項１１の三量体複合体またはポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１の三量体複合体または請求項５のポリペプチドであって、変異を受けるアミノ酸が、Ｖ５８３，Ｖ５８０、Ｌ５７６、Ｉ５７３、Ｔ５６９、Ｌ５６６、Ｑ５６２、Ｑ５９０、Ｌ５５５、Ｑ５５２、Ｉ５４８、Ｌ５４５、およびＩ５５９からなる群より選択される、三量体複合体またはポリペプチド。
【請求項１５】
前記アミノ酸変異がＩ５５９Ｐである、請求項１４の三量体複合体またはポリペプチド。
【請求項１６】
薬学的に許容される粒子と該粒子に作用可能に付着された請求項１の三量体複合体とを備えた、組成物。
【請求項１７】
請求項１６の組成物であって、前記粒子に作用可能に付着された物質を介して、前記三量体複合体が前記粒子に作用可能に付着されている、組成物。
【請求項１８】
前記三量体の各単量体中に存在する前記ジスルフィド結合が、ｇｐ１２０中のＡ４９２Ｃ変異によって導入されたシステイン残基とｇｐ４１中のＴ５９６Ｃ変異によって導入されたシステイン残基との間に形成されている、請求項１６の組成物。
【請求項１９】
請求項１６の組成物であって、前記三量体の各単量体中に存在するｇｐ１２０が、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在しないこと、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２０】
前記粒子が、常磁性ビーズ、非常磁性ビーズ、リポソーム、およびこれらを任意に組み合わせたものからなる群より選択される、請求項１６の組成物。
【請求項２１】
前記粒子が、ＰＬＧ、ラテックス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、またはこれらを任意に組み合わせたものを備える、請求項１６の組成物。
【請求項２２】
前記粒子の平均直径が約１０ｎｍ〜１００μｍである、請求項１６の組成物。
【請求項２３】
前記粒子の平均直径が約１００ｎｍ〜１０μｍである、請求項２２の組成物。
【請求項２４】
前記粒子の平均直径が約１００ｎｍ〜１μｍである、請求項２２の組成物。
【請求項２５】
前記粒子の平均直径が約１μｍ〜１０μｍである、請求項２２の組成物。
【請求項２６】
前記粒子の平均直径が約１０μｍ〜１００μｍである、請求項２２の組成物。
【請求項２７】
前記粒子の平均直径が約１０ｎｍ〜１００ｎｍである、請求項２２の組成物。
【請求項２８】
前記粒子の平均直径が約５０ｎｍである、請求項２２の組成物。
【請求項２９】
前記物質が、抗体、融合タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、レクチン、および受容体からなる群より選択される、請求項１７の組成物。
【請求項３０】
前記物質が抗体である、請求項２９の組成物。
【請求項３１】
前記物質がＣＤ４である、請求項１７の組成物。
【請求項３２】
請求項５のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３３】
請求項３２の核酸配列を備えたベクター。
【請求項３４】
前記ベクターがフュリーンをコードする配列をさらに備えた、請求項３３のベクター。
【請求項３５】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、λファージ、ＹＡＣ、またはαウイルスである、請求項３３のベクター。
【請求項３６】
請求項３３のベクター具備する宿主細胞。
【請求項３７】
ポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドが産生され得る条件下で請求項３６の宿主細胞を増殖させることと、このようにして産生されたポリペプチドを回収することとを備えた方法。
【請求項３８】
請求項１の三量体複合体または請求項１６の組成物と、薬学的に許容される担体とを備えた組成物。
【請求項３９】
サイトカインおよび／またはケモカインをさらに備えた、請求項３８の組成物。
【請求項４０】
前記サイトカインが、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−１２、インターロイキンー１５、インターロイキン−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、およびこれらを任意に組み合わせたものからなる群より選択される、請求項３９の組成物。
【請求項４１】
前記ケモカインが、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｍｉｐ３α、Ｍｉｐ３β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、およびこれらを任意に組み合わせたものからなる群より選択される、請求項３９の組成物。
【請求項４２】
請求項１の三量体複合体または請求項１６の組成物と、アジュバントとを備えた組成物。
【請求項４３】
前記アジュバントが、ａｌｕｍ、フロイントの不完全アジュバント、サポニン、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、モノホスホリル  リピドＡ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＣＲＬ−１００５、Ｌ１２１、およびこれらを任意に組み合わせたものからなる群より選択される、請求項４２の組成物。
【請求項４４】
ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−１感染細胞に対する免疫反応を被験者に誘発させる方法であって、予防または治療に有効な量の請求項１の三量体複合体または請求項１６の組成物を前記被験者に投与することを備えた方法。
【請求項４５】
前記三量体複合体または前記組成物が１回用量で投与される、請求項４４の方法。
【請求項４６】
前記三量体複合体または前記組成物が複数回用量で投与される、請求項４４の方法。
【請求項４７】
前記三量体複合体または前記組成物が異種プライムブースト療法の一環として投与される、請求項４４の方法。
【請求項４８】
治療に有効な量の請求項１の三量体複合体または請求項１６の組成物を含んだワクチン。
【請求項４９】
予防に有効な量の請求項１の三量体複合体または請求項１６の組成物を含んだワクチン。
【請求項５０】
被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法であって、予防に有効な量の請求項１の三量体複合体または請求項１６の組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法。
【請求項５１】
被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法であって、予防に有効な量の請求項１の三量体複合体または請求項１６の組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法。
【請求項５２】
前記被験者がＨＩＶ−１に曝露されている、請求項５０の方法。
【請求項５３】
前記被験者がＨＩＶ−１に曝露されている、請求項５１の方法。
【請求項５４】
ＨＩＶ−１に感染した患者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くする方法であって、治療に有効な量の請求項１の三量体複合体または請求項１６の組成物を前記患者に投与することを備え、これによって前記患者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くすることを備えた方法。
【請求項５５】
請求項１６の組成物を製造する方法であって、薬学的に許容される粒子を、安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に、該複合体が前記粒子に作用可能に付着される条件下で接触させることを備え、（１）前記複合体の各単量体単位がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法。
【請求項５６】
請求項１７の組成物を製造する方法であって、（ａ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に結合する物質が作用可能に付着された薬学的に許容される粒子と（ｂ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体とを、前記複合体が前記物質に結合可能な条件下で接触させることを備え、これによって前記複合体は前記粒子に作用可能に付着された状態になり、（１）前記複合体の各単量体単位がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法。
【請求項５７】
安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体であって、（１）該複合体の各単量体単位がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）各単量体単位のｇｐ１２０とｇｐ４１が、変異されたフューリン認識配列をその中に有するポリペプチドをタンパク分解により切断することによって生成され、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されており、（４）野生型ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０中に存在する少なくとも１つのＶ−ループが前記ｇｐ１２０から欠失している、三量体複合体。
【請求項５８】
可変ループＶ１、Ｖ２、およびＶ３のうち少なくとも１つが前記ｇｐ１２０から欠失している、請求項５７の三量体複合体。
【請求項５９】
前記ジスルフィド結合が、ｇｐ１２０中のＡ４９２Ｃ変異によって導入されたシステイン残基とｇｐ４１中のＴ５９６Ｃ変異によって導入されたシステイン残基との間に形成されている、請求項５７の三量体複合体。
【請求項６０】
請求項５７のポリペプチドであって、前記ｇｐ１２０が、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在しないこと、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする、ポリペプチド。
【請求項６１】
ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１のアミノ酸配列を備えたポリペプチドであって、（１）タンパク分解性の切断によってｇｐ１２０とｇｐ４１を生成することができる状態に置かれた変異したフューリン認識部位を、前記ポリペプチドが有しており、（２）ｇｐ１２０とｇｐ４１の各配列に、少なくとも１つのシステイン残基が導入され、ｇｐ１２０とｇｐ４１配列の間に少なくとも１つのジスルフィド結合の形成が可能であり、（４）野生型ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０中に存在する少なくとも１つのＶ−ループが前記ｇｐ１２０から欠失している、ポリペプチド。
【請求項６２】
請求項６１のポリペプチドであって、Ａ４９２Ｃ変異によってシステイン残基がｇｐ１２０配列中に導入され、且つＴ５９６Ｃ変異によってシステイン残基がｇｐ４１中に導入される、ポリペプチド。
【請求項６３】
請求項６１のポリペプチドであって、前記ｇｐ１２０配列が、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在しないこと、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする、ポリペプチド。
【請求項６４】
前記ｇｐ４１が、三量体複合体の融合後６−ヘリックスバンドル中で三量体の界面を形成する部分に１以上の変異を有する、請求項５７の三量体複合体。
【請求項６５】
前記ｇｐ４１配列が、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の三量体複合体の融合後６−ヘリックスバンドル中で三量体界面を形成する部分に１以上の変異を有する、請求項６１の三量体複合体。
【請求項６６】
前記アミノ酸変異がＩ５５９Ｐである、請求項６４の三量体複合体または請求項６５のポリペプチド。
【請求項６７】
前記変異したフューリン認識配列が配列Ｒ−Ｘ−（Ｒ／Ｋ）−Ｒを有する、請求項５７の三量体複合体または請求項６１のポリペプチド。
【請求項６８】
前記変異したフューリン認識配列が配列ＲＲＲＫＫＲを有する、請求項５７の三量体複合体または請求項６１のポリペプチド。
【請求項６９】
前記変異したフューリン認識配列が配列ＲＲＲＲＫＲを有する、請求項５７の三量体複合体または請求項６１のポリペプチド。
【請求項７０】
前記変異したフューリン認識配列が配列ＲＲＲＲＲＲを有する、請求項５７の三量体複合体または請求項６１のポリペプチド。
【請求項７１】
薬学的に許容される粒子と該粒子に作用可能に付着された請求項５７の三量体複合体とを備えた、組成物。
【請求項７２】
請求項７１の組成物であって、前記粒子に作用可能に付着された物質を介して、前記三量体複合体が前記粒子に作用可能に付着されている、組成物。
【請求項７３】
前記三量体の各単量体中の前記ジスルフィド結合が、Ａ４９２Ｃ変異によってｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基とＴ５９６Ｃ変異によってｇｐ４１中に導入されたシステイン残基との間に形成されている、請求項７１の組成物。
【請求項７４】
請求項７１の組成物であって、前記三量体の各単量体中に存在するｇｐ１２０が、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在しないこと、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする、ポリペプチド。
【請求項７５】
前記粒子が、常磁性ビーズ、非常磁性ビーズ、リポソーム、およびこれらを任意に組み合わせたものからなる群より選択される、請求項７１の組成物。
【請求項７６】
前記粒子が、ＰＬＧ、ラテックス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、またはこれらを任意に組み合わせたものを備える、請求項７１の組成物。
【請求項７７】
前記粒子の平均直径が約１０ｎｍ〜１００μｍである、請求項７１の組成物。
【請求項７８】
前記粒子の平均直径が約１００ｎｍ〜１０μｍである、請求項７７の組成物。
【請求項７９】
前記粒子の平均直径が約１００ｎｍ〜１μｍである、請求項７７の組成物。
【請求項８０】
前記粒子の平均直径が約１μｍ〜１０μｍである、請求項７７の組成物。
【請求項８１】
前記粒子の平均直径が約１０μｍ〜１００μｍである、請求項７７の組成物。
【請求項８２】
前記粒子の平均直径が約１０ｎｍ〜１００ｎｍである、請求項７７の組成物。
【請求項８３】
前記粒子の平均直径が約５０ｎｍである、請求項７７の組成物。
【請求項８４】
前記物質が、抗体、融合タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、レクチン、および受容体からなる群より選択される、請求項７２の組成物。
【請求項８５】
前記物質が抗体である、請求項８４の組成物。
【請求項８６】
前記物質がＣＤ４である、請求項８４の組成物。
【請求項８７】
請求項６１のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８８】
請求項８７の核酸配列を備えたベクター。
【請求項８９】
前記ベクターがフュリーンをコードする配列をさらに備えた、請求項８８のベクター。
【請求項９０】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、λファージ、ＹＡＣ、またはαウイルスである、請求項８８のベクター。
【請求項９１】
請求項８８のベクター具備する宿主細胞。
【請求項９２】
ポリペプチドを作製するする方法であって、前記ポリペプチドが産生され得る条件下で請求項９１の宿主細胞を増殖させることと、このようにして産生されたポリペプチドを回収することとを備えた方法。
【請求項９３】
請求項５６の三量体複合体または請求項７１の組成物と、薬学的に許容される担体とを備えた組成物。
【請求項９４】
サイトカインおよび／またはケモカインをさらに備えた、請求項９３の組成物。
【請求項９５】
前記サイトカインが、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−１２、インターロイキンー１５、インターロイキン−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、およびこれらを任意に組み合わせたものからなる群より選択される、請求項９４の組成物。
【請求項９６】
前記ケモカインが、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｍｉｐ３α、Ｍｉｐ３β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、およびこれらを任意に組み合わせたものからなる群より選択される、請求項９４の組成物。
【請求項９７】
請求項５６の三量体複合体または請求項７１の組成物と、アジュバントとを備えた組成物。
【請求項９８】
前記アジュバントが、ａｌｕｍ、フロイントの不完全アジュバント、サポニン、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、モノホスホリル  リピドＡ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＣＲＬ−１００５、Ｌ１２１、およびこれらを任意に組み合わせたものからなる群より選択される、請求項９７の組成物。
【請求項９９】
ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−１感染細胞に対する免疫反応を被験者に誘発させる方法であって、予防または治療に有効な量の請求項５７の三量体複合体または請求項７１の組成物を前記被験者に投与することを備えた方法。
【請求項１００】
前記三量体複合体または前記組成物が１回用量で投与される、請求項９９の方法。
【請求項１０１】
前記三量体複合体または前記組成物が複数回用量で投与される、請求項９９の方法。
【請求項１０２】
前記三量体複合体または前記組成物が異種プライムブースト療法の一環として投与される、請求項９９の方法。
【請求項１０３】
治療に有効な量の請求項５７の三量体複合体または請求項７１の組成物を含んだワクチン。
【請求項１０４】
予防に有効な量の請求項５７の三量体複合体または請求項７１の組成物を含んだワクチン。
【請求項１０５】
被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法であって、予防に有効な量の請求項５７の三量体複合体または請求項７１の組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法。
【請求項１０６】
被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法であって、予防に有効な量の請求項５７の三量体複合体または請求項７１の組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法。
【請求項１０７】
前記被験者がＨＩＶ−１に曝露されている、請求項１０５の方法。
【請求項１０８】
前記被験者がＨＩＶ−１に曝露されている、請求項１０６の方法。
【請求項１０９】
ＨＩＶ−１に感染した患者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くする方法であって、治療に有効な量の請求項５７の三量体複合体または請求項７１の組成物を前記患者に投与することを備え、これによって前記患者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くすることを備えた方法。
【請求項１１０】
請求項７１の組成物を作製する方法であって、薬学的に許容される粒子を、安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に、該複合体が前記粒子に作用可能に付着される条件下で接触させることを備え、（１）該複合体の各単量体単位がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）各単量体単位のｇｐ１２０とｇｐ４１が、変異されたフューリン認識配列をその中に有するポリペプチドをタンパク分解により切断することによって生成され、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されており、（４）野生型ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０中に存在する少なくとも１つのＶ−ループが前記ｇｐ１２０から欠失している、方法。
【請求項１１１】
請求項７２の組成物を作製する方法であって、（ａ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質と三量体複合体に結合する物質が作用可能に付着された薬学的に許容される粒子と（ｂ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体とを、前記複合体が前記物質に結合可能な条件下で接触させることを備え、これによって前記複合体は前記粒子に作用可能に付着された状態になり、（１）該複合体の各単量体単位がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）各単量体単位のｇｐ１２０とｇｐ４１が、変異されたフューリン認識配列をその中に有するポリペプチドをタンパク分解により切断することによって生成され、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されており、（４）野生型ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０中に存在する少なくとも１つのＶ−ループが前記ｇｐ１２０から欠失している、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本明細書に開示されている発明は、保健社会福祉省のＮＩＨ助成金Ｒ０１  ＡＩ３９４２０、Ｒ０１  ＡＩ４２３８２号、Ｒ０１  ＡＩ４５４６３号、Ｒ２１  ＡＩ４４２９１号、Ｒ２１  ＡＩ４９５６６号、およびＵ０１  ＡＩ４９７６４号による政府の援助を受けてなされたものである。従って、合衆国政府は、本発明に対して一定の権利を有している。
【０００２】
本出願を通じて、様々な文献が引用されている。本発明が属する技術分野をさらに完全に説明するために、これらの文献の開示内容を参考文献として援用する。
【０００３】
発明の背景
Ｉ．  ウイルスエンベロープ糖タンパク質
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、免疫系の破壊を特徴とする致死的疾患である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こす病原体である。ＨＩＶの複製サイクルは、ウイルス感染に対して感受性を有する宿主細胞にウイルスが付着した後に、ウイルスの膜と細胞の膜が融合することによって開始される。
【０００４】
これらの現象は、外面のウイルスエンベロープ糖タンパク質によって媒介され、この糖タンパク質は、最初、ｇｐ１６０として知られる複製能を持たない前駆体エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）として合成される。ｇｐ１６０糖タンパク質は、エンドプロテアーゼによるプロセッシングを受けて、成熟したエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０とｇｐ４１になり、ウイルスの表面上の複合体中で、互いに非共有結合的に会合している。ｇｐ１２０表面タンパク質は、ヒトＣＤ４（ＨＩＶの一次受容体）への高親和性結合部位の他、ケモカイン受容体であるＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４などの融合補助受容体と相互作用するドメインを有している。ｇｐ４１タンパク質は、ウイルスの膜を貫通し、ウイルスの膜と細胞膜の融合にとって重要なアミノ酸の配列をアミノ末端に有している。
【０００５】
融合能を有する天然型のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質複合体は、３つのｇｐ１２０と３つのｇｐ４１サブユニットから構成される三量体構造である。受容体結合（ＣＤ４と補助受容体）部位は、ｇｐ１２０部分の中に位置しており、融合ペプチドはｇｐ４１成分中に位置している（Ｃｈａｎ，１９９７；  Ｋｗｏｎｇ，  １９９８；  Ｋｗｏｎｇ，  ２０００；  Ｐｏｉｇｎａｒｄ，  ２００１；  Ｔａｎ，  １９９７；  Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ，  １９９７；  ａｎｄ  Ｗｙａｔｔ，  １９９８ａ）。
【０００６】
ＨＩＶ−１の融合に関して一般に受け入れられているモデルでは、ｇｐ１２０がＣＤ４および補助受容体に順次結合することによって、ｇｐ４１サブユニットに一連のコンホメーションの変化が引き起こされ、極めて動的なプロセスを経ながら、融合ペプチドが宿主細胞膜の中に挿入される（Ｄｏｍｓ，  ２０００；Ｊｏｎｅｓ，  １９９８  ；Ｍｅｌｉｋｙａｎ，  ２０００  ；Ｓａｔｔｅｎｔａｕ，  １９９１；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  １９９８；Ｔｒｋｏｌａ，  １９９６；Ｗｕ，  １９９６；  Ｗｙａｔｔ，  １９９８ｂ；  および  Ｚｈａｎｇ，  １９９９）。融合能を有する複合体の６つの成分間の会合は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１間並びにｇｐ４１サブユニット間の非共有的な相互作用を介して維持されている（Ｐｏｉｇｎａｒｄ，  ２０００１；  およびＷｙａｔｔ，１９９８ｂ）。これらの相互作用は比較的弱く、融合能を有する複合体は不安定である。おそらく、この不安定性によって、融合反応の効率的な進行に必要とされる様々な成分のコンホメーションの変化が促進されるが、このために、精製された形態で天然の複合体を単離する作業は著しく困難となる。簡単に言えば、精製する前に、天然の複合体がバラバラになってしまい、解離したサブユニットしか得られない。
【０００７】
ビリオン表面上に存在し、ウイルスの侵入を媒介する上で中心的な役割を担っているので、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質は、ＨＩＶワクチンの開発において重要な標的となっている。多くのＨＩＶ感染個体は、エンベロープ糖タンパク質に対して強い抗体（Ａｂ）反応を開始するが、自然感染の際に産生された抗ｇｐ１２０抗体と抗ｇｐ４１抗体の多くは、ビリオンへの結合力が弱いか、あるいは全く結合力がないので、有効に機能しない。これらの抗体は、おそらく、ｇｐ１２０単量体か、ビリオンまたは感染細胞から放出されたプロセッシングが不適切なオリゴマーを含む「ウイルスの破片」に対して誘発され、親和性成熟が行われたものであろう（Ｂｕｒｔｏｎ，１９９７）。
【０００８】
数個の予防的なＨＩＶ−１サブユニットワクチンが臨床試験の第Ｉ相および第ＩＩ相で試験されており、多価製剤は第ＩＩＩ相に入っている。これらのワクチンは、単量体のｇｐ１２０か、プロセッシングを受けていないｇｐ１６０タンパク質の何れかを含有している。さらに、これらのワクチンの多くは、不死化されたＴ細胞株中で高レベルに増殖できるように改変されたウイルス（ＴＣＬＡウイルス）に由来するものであった。これらのワクチンによって、同一のウイルス株に加え、他の幾つかのＴＣＬＡウイルスを中和する抗体が常に生じた。しかし、これらの抗体は、初代ＨＩＶ−１単離株を中和する能力は高くない（Ｍａｓｃｏｌ，１９９６）。ＴＣＬＡ株と比較すると、臨床的に問題となることが多い初代単離株は、異なる細胞指向性を有するのが通例であり、補助受容体の使用パターンが異なるので、可溶性ＣＤ４と抗体による中和を受けにくい。これらの差は、主として、ウイルスエンベロープ糖タンパク質に存在する（Ｍｏｏｒｅ、１９９５）。
【０００９】
エンベロープ糖タンパク質構造におけるオリゴマー化の重要性
現世代のＨＩＶサブユニットワクチンは、ビリオン上で提示されているのと同様には、重要な中和エピトープを上手く提示できないことが明らかにされつつある（ｐａｒｒｅｎ，１９９７）。ビリオンの天然の構造が抗体エピトープの提示に影響を与える態様には、複数の態様が存在する。第一に、ｇｐ１２０とｇｐ４１の表面領域の多くは、三量体内でのサブユニット間相互作用によって塞がっている。このため、単量体型のｇｐ１２０上では十分に露出されている（従って、免疫原性が高い）ｇｐ１２０の領域（特に、Ｎ末端およびＣ末端付近）の中には、天然な三量体上では完全に接近不能となっている領域がある（Ｍｏｏｒｅ，１９９４ａ）。このことは、（ビリオンまたは感染細胞からのｇｐ１２０単量体の流出によって）自然感染中に生じたものであれ、ｇｐ１２０サブユニットのワクチン接種後に生じたものであれ、ｇｐ１２０単量体に対して作製された抗体群は無関係であることを意味している。これにより、ウイルスにはさらに別種の保護をがもたらされ；免疫系は、ビリオンとの反応性が乏しく無効な抗体を、流出したｇｐ１２０に対して誤って生じるように仕向けられるのである。
【００１０】
第二に、これよりは些細な問題であるが、中心的なｇｐ１２０エピトープの構造がオリゴマー化によって影響を受けることがあるという問題が存在する。古典的な例としては、ヒトＭＡｂ  ＩｇＧｂ１２を広く中和するエピトープがある（Ｂｕｒｔｏｎ，１９９４）。このエピトープは、ｇｐ１２０上に存在するＣＤ４結合部位と重なり合い、単量体のｇｐ１２０上に存在する。しかし、ＩｇＧ１ｂ１２は、その単量体の反応性から予測されるよりも、天然のオリゴマーｇｐ１２０との反応性が高く、このことは、ＩｇＧ１ｂ１２の極めて高い中和活性を説明する。このように、ＩｇＧ１ｂ１２エピトープはオリゴマー依存性であるが、オリゴマー特異的ではない。
【００１１】
残念なことに、これとは逆の状況の方が一般的である。単量体のｇｐ１２０上に存在するＣＤ４結合部位関連エピトープと強く反応する多くの抗体は、天然の三量体と反応することができず、このため、ウイルスを中和しない。機序は不明であるが、ｇｐ１２０のオリゴマー化は、これらのモノクローナル抗体（Ｍａｂ）によって認識される抗体に悪影響を及ぼす（Ｆｏｕｔｓ，１９９７）。
【００１２】
天然の構造のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質によって引き起こされる問題の３つ目の例は、ｇｐ４１ＭＡｂである。初代ウイルスに対する強力な中和活性を有することが知られているｇｐ４１  ＭＡｂ（２Ｆ５）は１つしかなく（Ｔｒｋｏｌａ，１９９５）、試験が行われたものの中では、２Ｆ５のみが、本来の状態のｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体を認識すると考えられている（Ｓａｔｔｅｎｔａｕ，１９９５）。おそらく、ビリオンまたはウイルス感染細胞に結合するその他のｇｐ４１  ＭＡｂは全て、ｇｐ１２０が外れた融合能のないｇｐ４１構造と反応するものと思われる。最も安定な形態のｇｐ４１は、かかる融合後の構造なので（Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ，１９９７）、多くの抗ｇｐ４１抗体は、融合前の形態上に存在しない不適切なｇｐ４１構造に対して（自然感染の際に、またはｇｐ１６０ワクチン接種後に）生じると推測できる。
【００１３】
これらの防御機構にかかわらず、多くのＨＩＶ−１単離株は、反応性の広いヒトＭＡｂの限られた群によって著しく中和されるので、適切な液性免疫反応を誘導するのは不可能である。Ｍａｂ  ＩｇＧ１ｂ１２は、ｇｐ１２０とＣＤ４との結合を遮断する。主としてウイルス−細胞接着を立体的に妨害することによって作用を及ぼす抗体もあるが（２Ｇ１２；Ｔｒｋｏｌａ，１９９６）、２Ｆ５は、融合反応自体を直接損なわせることによって作用する。これらのＭＡｂの中和能を理解する上で不可欠なのは、これらのＭＡｂが、ビリオンやウイルス感染細胞の表面上に見られる、融合能を有するオリゴマー型のエンベロープ糖タンパク質と優先的に反応するということである（Ｐａｒｒｅｎ，１９９８）。この点が、これらのＭＡｂが活性の低い他のＭＡｂとは異なる点である。オリゴマーに対して反応性を示すＭＡｂの数が極めて少ないことによって、一次ウイルスを中和することができるＭＡｂが少ない理由が説明される。このように、稀な例外はあるが、抗ＨＩＶ中和抗体は感染性ウイルスを結合することができるのに対して、非中和抗体は結合できない（Ｆｏｕｔｓ，１９９８）。中和抗体は、補体によって媒介させるウイルス溶解などのエフェクター機能を通じて感染性ウイルスを排除する能力も有している。
【００１４】
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の抗原構造の改変
ＨＩＶ−１は、液性免疫反応から重要な中和部位を遮蔽する巧みな機序を進化させており、原則として、これらの機序は、ワクチンでは「無効化」され得る。一例としては、とりわけＴＣＬＡウイルスの場合、さらに広く保存された中和エピトープから抗体反応を逸らせる免疫優性エピトープであるＶ３ループがある。ＨＩＶ−１は、ｇｐ１２０の著しいグリコシル化によっても液性免疫から保護される。ＳＩＶ  ｇｐ１２０のＶ１／Ｖ２ループからグリコシル化部位を除去すると、中和に対して感受性を有するウイルスが作出されるのみならず、変異ウイルスの免疫原性が増加して、野生型ウイルスに対する免疫反応が向上する（Ｒｅｉｔｔｅｒ，１９９８）。同様に、免疫原性の向上をもたらすかどうかは不明であるが、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０からＶ１／Ｖ２ループを除去すると、その下に存在する保存された領域が抗体による攻撃を受け易くなる（Ｃａｏ，１９９７）。
【００１５】
注目すべきことは、ＤＮＡワクチンに関していえば、ＴＣＬＡウイルスのエンベロープ糖タンパク質のＶ１、Ｖ２、およびＶ３ループを欠失させても、中和抗体の誘導は向上しなかったということである（Ｌｕ，１９９８）。しかし、可変ループの欠失によって悪化すると思われるｇｐ１２０とｇｐ４１の相互作用の不安定性が、本実験の結果に影響を与えた可能性がある。ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体が免疫系に提示される時間を長くすることによって、原理的には、自然感染中に生じる免疫反応を著しく向上させるための手段が、インビボで発現される安定化されたエンベロープタンパク質により与えられる。
【００１６】
天然型と非天然型のＨＩＶエンベロープ糖タンパク質
現在のデータからは、ＨＩＶビリオン上において、３つのｇｐ１２０部分は、その融合能が細胞表面受容体との相互作用によって誘発される準安定的立体配置にあり、ｇｐ１２０の下に位置する３つのｇｐ４１成分と非共有結合的に会合していることが示唆されている。この前融合型は、最適な中和エピトープを提示する可能性がある。本発明者らは、この形態のエンベロープ糖タンパク質を天然ｇｐ１２０−ｇｐ４１と称する。しかし、これ以外のオリゴマー形態も可能であり、これらは図１に示されている。
【００１７】
ｇｐ１６０：完全長のｇｐ１６０分子は、組換えタンパク質として発現されたときに凝集することが多いが、疎水性膜貫通ドメインを含有していることが理由の１つである。このような分子の１つは、ｇｐ１６０前駆体がｇｐ１２０／ｇｐ４１へプロセッシングされるのを妨げる天然の変異によって生じる（ＶａｎＣｏｔｔ，１９９７）。ｇｐ１６０前駆体は、ウイルスと細胞の融合を媒介しないので、融合能を有するｇｐ１２０／ｇｐ４１の模倣体としては優れていない。ヒトで試験を行うと、組換えｇｐ１６０分子には、ｇｐ１２０に比べて何ら有利な点が存在しなかった（Ｇｏｒｓｅ，１９９８）。
【００１８】
未切断ｇｐ１４０（ｇｐ１４０ＵＮＣ）：  ｇｐ１６０前駆体タンパク質をｇｐ１２０とｇｐ４１に変換するのに必要とされる天然のタンパク分解部位を除去することによって、安定な「オリゴマー」が作製された（Ｂｅｒｍａｎ，１９８９；  ａｎｄ  Ｅａｒｌ，１９９０）。これらの構築物を可溶性タンパク質として発現されるためには、ｅｎｖ遺伝子内に停止コドンを挿入して、ｇｐ４１の膜貫通セグメントの直前で本タンパク質を切断する。このタンパク質は、ｇｐ４１の膜貫通ドメインと長い細胞質内尾部を欠いているが、ウイルスの侵入と中和抗体の誘導に重要な領域は保持されている。分泌されたタンパク質は、ペプチド結合によってｇｐ４１の外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）に共有結合された完全長のｇｐ１２０を含有している。本タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、単一種として移動し、還元条件下と非還元条件下の両方で、約１４０キロダルトン（ｋＤａ）の見かけの分子量を示す。本タンパク質は、おそらくｇｐ４１部分によって媒介される相互作用を通じて、さらに高分子量の非共有結合性オリゴマーを形成する。
【００１９】
複数の証拠から、未切断ｇｐ１４０分子は、天然のｇｐ１２０−ｇｐ４１と同じコンホメーションを採らないことが示唆されている。これらには、未切断ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体が、融合補助受容体をさほど結合しないという観察が含まれる。さらに、ビリオンは効果的であったのに、ファージディスプレーライブラリーでのパニングに用いたときに、ｇｐ１４０タンパク質は、中和ＭＡｂを効率的に選別することができなかった（Ｐａｒｒｅｎ，１９９６）。本発明者らは、未切断のｇｐ１２０−ｇｐ４１外部ドメイン物質をｇｐ１４０ＵＮＣと称している。
【００２０】
切断可能であるが、切断を受けていないｇｐ１４０（ｇｐ１４０ＮＯＮ）：生合成中に、ｇｐ１６０は、フューリンファミリーに属する細胞のエンドプロテアーゼによって切断を受けて、ｇｐ１２０とｇｐ４１になる。哺乳類細胞が、ｇｐ４１からｇｐ１２０を切断する能力は限られている。このため、エンベロープ糖タンパク質が過剰発現されると、内在性フューリン酵素は飽和され、前駆体の形態で分泌される場合がある。これらの分子は切断可能なので、本発明者らは、これをｇｐ１４０ＮＯＮと称する。ｇｐ１４０ＵＮＣと同様に、還元条件下と非還元条件下の両方で、ｇｐ１４０ＮＯＮは、約１４０ｋＤａの見かけの分子量を示して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中を移動する。ｇｐ１４０ＮＯＮは、ｇｐ１４０ＵＮＣと同じく、天然とは異なるトポロジーを有しているようである。
【００２１】
切断されたｇｐ１４０（ｇｐ１４０ＣＵＴ）：ｇｐ１４０ＣＵＴとは、完全なプロセッシングを受け、且つビリオン上で見られるオリゴマーを形成することができる完全長のｇｐ１２０と外部ドメインｇｐ４１を表す。ｇｐ１２０とｇｐ４１間の非共有結合性相互作用は寿命が十分長いので、ウイルスは新しい標的細胞に結合して、融合を開始することができる（天然感染時には、数分以内で完了すると考えられるプロセスである）。しかし、現在のところ、ほぼ均一な形態で大量の切断されたｇｐ１４０を生成するには、この会合は弱すぎることが明らかとなっている。
【００２２】
ウイルスのエンベロープ糖タンパク質の安定化
ｇｐ１２０／ｇｐ４１などのウイルスエンベロープタンパク質の準安定的な前融合コンホメーションは、感染を継続的に伝播させるには十分安定であるが、ウイルス−細胞融合に必要とされるコンホメーション変化を即座に引き起こすために十分に変化しやすいように進化している。これまでに調べられたＨＩＶ単離株の場合、ｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用は、予備的スケールで、分泌タンパク質としてｇｐ１４０ＣＵＴを産生させるには、不安定すぎることが明らかとなっている。しかし、ＨＩＶの遺伝的な多様性が著しいことに鑑みれば、本明細書に記載されているようなスクリーニング法を用いて、ｅｎｖの安定性が優れたウイルスを同定できる可能性があることは考えられる。あるいは、原理的には、ｇｐ１２０−ｇｐ４１の相互作用を不安定化することが知られている条件にウイルスを連続的に曝露した後に、安定性が高められたウイルスを選別することができるかもしれない。このような条件には、３７−６０℃に温度を上昇させること、および／または、低濃度の界面活性剤もしくはカオトロピック物質を加えることが含まれ得る。このようなウイルスから得られるエンベロープタンパク質は、本発明者らの方法を用いても、ｐＰＰＩ４発現ベクター中にサブクローニングし、安定性を解析することが可能であろう。
【００２３】
ウイルスのエンベロープタンパク質を安定化するためのアプローチとして、半経験的に人為的な改変を施すアプローチを採用することもできよう。例えば、結合対の中に相補的な「ノブ」と「穴」変異を導入することによって、安定なヘテロダイマーを作出することに成功している（Ａｔｗｅｌｌ，１９９７）。これに代えてまたはこれに加えて、塩橋、水素結合、または疎水性相互作用のような他の好ましい相互作用を導入してもよいであろう。表面（ＳＵ）および膜貫通（ＴＭ）タンパク質の構造に関する理解が増せば、本アプローチの実施は容易となろう。
【００２４】
ＳＵ−ＴＭの安定化は、ジスルフィド結合を１以上導入することによっても達することができる。哺乳類のレトロウイルスの中で、ＳＵ糖タンパク質とＴＭ糖タンパク質の間で非共有結合的な会合が行われるのは、ＨＩＶなどのレンチウイルスのみである。これに対して、Ｃ型レトロウイルスとＤ型レトロウイルスは全て、サブユニット間にジスルフィド結合を有している。レトロウイルスのＴＭ糖タンパク質の外部ドメインは、広く一般的な構造を有しており、外部ドメインのほぼ中央に、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合によって連結された小ループが存在することが共通する１つの特徴である。Ｃ型レトロウイルスとＤ型レトロウイルスのＴＭ糖タンパク質では、このループのすぐＣ末端側に対形成していないシステイン残基が存在し、ＳＵ−ＴＭジスルフィド結合の形成に使用されるのがほぼ確実である（Ｇａｌｌａｈｅｒ，１９９５  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  １９９２）。
【００２５】
ｇｐ４１および他のレンチウイルスのＴＭ糖タンパク質には３つ目のシステインは存在しないが、構造的な相同性から、前記の短い中央ループ構造の近傍にこれを挿入可能であると推測される。このように、ｇｐ１２０の最初と最後の保存領域（Ｃ１およびＣ５ドメイン）がｇｐ４１に対する接触部位らしいことを示す、突然変異による有力な証拠が存在する。
【００２６】
ＩＩ．  粒子ワクチン
ワクチンの調製に際して可溶性タンパク質を粒状形態に変換すると有利であることが、研究により明らかとされている。沈殿したアルミニウム塩、すなわち「ａｌｕｍ」は、現在でも、米国ＦＤＡによってヒトに対する使用が許可された、ワクチンに用いられる唯一のアジュバントである。動物には、他の粒状アジュバントが幾つか試されている。主な例には、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧ、ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））（Ｃｌｅｌａｎｄ，１９９４；  Ｈａｎｅｓ，１９９７；  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｌｌ，１９９４）、ポリスチレン（Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，１９９５；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，１９９８；Ｒｏｃｋ，１９９６；  ａｎｄ  Ｖｉｄａｒｄ，１９９６）、リポソーム（Ａｌｖｉｎｇ，  １９９５）、リン酸カルシウム（Ｈｅ，２０００）、架橋されたタンパク質または結晶化されたタンパク質（Ｌａｎｇｈｅｉｎ，１９８７；  ａｎｄ  Ｓｔ．  Ｃｌａｉｒ，１９９９）から調製されたビーズがある。
【００２７】
ある一連の研究では、オボアルブミンをポリスチレンビーズに連結させた（Ｖｉｄａｒｄ，１９９６）。これらの研究では、抗原特異的なＢ細胞は、直接表面Ｉｇ受容体を介して粒状抗原を結合することができ、抗原を貪食し、プロセッシングして、得られたペプチドをＴ細胞に提示し得ることが明らかとなった。この点に関して、粒状抗原の提示に最適なサイズは、４μｍであることが明らかとなった。直径が１〜１０μｍの生体分解性ＰＬＧ小球を用いた別の研究では、これらの粒子が、マクロファージと樹状細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ経路中に抗原を運ぶことができ、強力な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応をインビボで刺激し得ることが示されている（Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，１９９８）。内部に取り込まれたオボアルブミンやその他の抗原を含有するＰＬＧ小球は、可溶性抗原のみを用いたときに見られたものより強い液性免疫応答も誘導した（Ｍｅｎ，１９９６；  ａｎｄ  Ｐａｒｔｉｄｏｓ，１９９６）。
【００２８】
抗原を搭載または被覆した小球を用いて単回の免疫化を行った後に誘導される強力な長期の免疫反応は、小さな（１０μｍ未満）粒子を効率的に貪食する作用（本作用により、粒子はリンパ節に輸送されて、抗原処理を受け、Ｔヘルパー細胞に提示される）；粒子表面または内部からの抗原を漸次放出し、免疫担当細胞の刺激を引き起こすこと；表面抗原の持続的な提示（Ｃｏｏｍｂｅｓ，１９９９；Ｃｏｏｍｂｅｓ，１９９６；  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｇａｎ，１９９３）という複数の機序から生じ得る。これらの条件下では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は抗原特異的なＢ細胞に局在化し、特異抗体の産生を増大させ、これらの抗原特異的Ｂ細胞クローンの増殖を刺激するサイトカインを放出する。粒状抗原は、粘膜ワクチン接種後に分泌性ＩｇＡ反応を誘導することができるため、粘膜性液性免疫を生じさせるのにも有用である（Ｏ’Ｈａｇａｎ，  １９９３；  ａｎｄ  Ｖｉｄａｒｄ，  １９９６）。
【００２９】
一般に、粒状抗原を用いると、粒状抗原をオプソニン化する抗原特異的抗体の産生が刺激されることによって、また、抗原の貪食を引き起こし、ＭＨＣクラスＩ抗原提示経路に入ることによって、液性免疫反応と細胞性免疫反応を同時に活性化することができる（Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ，１９９５；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，１９９８；Ｒｏｃｋ；ａｎｄ  Ｖｉｄａｒｄ，１９９６）。
【００３０】
典型的には、抗原は、物理的な吸着によって粒子に付着している。ＰＬＧをベースとしたワクチンに対して一般的に行われているように、封入によって抗原を粒子中に取り込ませることも行われている（Ｈａｎｅｓ，１９９７）。稀には、粒子上に存在する官能基に抗原を共有結合させることもある（Ｌａｎｇｈｅｉｎ，１９８７）。
【発明の要約】
【００３１】
本発明は、第一の安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体であって、（１）該複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ＧＰ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基との間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、三量体複合体を提供する。
【００３２】
本発明は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１のアミノ酸配列を備えた第一のポリペプチドであって、（１）前記ｇｐ４１配列がＮ末端へリックス中に１以上の変異を有しており、（２）前記ｇｐ１２０と前記ｇｐ４１の各配列の中に、少なくとも１つのシステイン残基が導入され、前記ｇｐ１２０と前記ｇｐ４１配列の間に少なくとも１つのジスルフィド結合が形成可能である、ポリペプチドも提供する。
【００３３】
本発明は、薬学的に許容される粒子と該粒子に作用可能に付着された前記第一の三量体複合体とを備えた第一の組成物を提供する。
【００３４】
本発明は、さらに、前記ポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明は、さらに、前記核酸を有するベクターを提供する。本発明は、さらに、前記ベクターを有する宿主細胞を提供する。
【００３５】
さらに、本発明は、ポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドの生産が可能な条件下で前記宿主細胞を増殖させることと、このようにして生産されたポリペプチドを回収することとを備えた方法を提供する。
【００３６】
さらに、本発明は、前記第一の三量体複合体または前記粒子組成物と薬学的に許容される担体とを備えた第二の組成物を提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物とアジュバントとを備えた第三の組成物を提供する。
【００３８】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−１感染細胞に対する免疫反応を被験者に誘発させる方法であって、予防または治療に有効な量の前記第一の三量体複合体または第一の粒子組成物を前記被験者に投与することを備えた方法を提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、治療に有効な量の前記三量体複合体または前記粒子組成物を含んだワクチンを提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、予防に有効な量の前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物を含んだ第一のワクチンを提供する。
【００４１】
さらに、本発明は、被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法であって、予防に有効な量の前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物の三量体複合体を前記被験者に投与することにより、前記被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法を提供する。
【００４２】
さらに、本発明は、被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法であって、予防に有効な量の前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物を前記被験者に投与することにより、前記被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くすることを備えた方法を提供する。
【００４３】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１に感染した被験者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くする方法であって、治療に有効な量の前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物を前記被験者に投与することにより、前記被験者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くすることを備えた方法を提供する。
【００４４】
さらに、本発明は、前記第一の粒子組成物を製造する第一の方法であって、薬学的に許容される粒子を、安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に、該複合体が前記粒子に作用可能に付着される条件下で接触させることを備え、（１）前記複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法を提供する。
【００４５】
さらに、本発明は、第一の粒子組成物を製造する第二の方法であって、（ａ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に結合する物質が作用可能に付着された薬学的に許容される粒子と（ｂ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体とを、前記複合体が前記物質に結合可能な条件下で接触させることを備え、これによって前記複合体が前記粒子に作用可能に付着された状態になることができ、（１）前記複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基との間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法を提供する。
【００４６】
本発明は、第二の安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体であって、（１）該複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ＧＰ４１とを備え、（２）各単量体単位のｇｐ１２０とｇｐ４１が、変異されたフューリンをその中に有するポリペプチドをタンパク分解により切断することによって生成され、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されており、（４）野生型ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０中に存在する少なくとも１つのＶ−ループが前記ｇｐ１２０から欠失されている、三量体複合体を提供する。
【００４７】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１のアミノ酸配列を備えた第二のポリペプチドであって、（１）タンパク分解による切断を行ったときに、ｇｐ１２０とｇｐ４１を生成することができる状態に置かれた被変異フュリーン認識部位を、前記ポリペプチドが有しており、（２）ｇｐ１２０とｇｐ４１の各配列に、少なくとも１つのシステイン残基が導入され、ｇｐ１２０とｇｐ４１配列の間に少なくとも１つのジスルフィド結合の形成が可能であり、（４）野生型ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０中に存在する少なくとも１つのＶ−ループが前記ｇｐ１２０から欠失している、ポリペプチドを提供する。
【００４８】
本発明は、薬学的に許容される粒子と該粒子に作用可能に付着された前記第二の三量体複合体とを備えた第二の粒子組成物も提供する。
【００４９】
さらに、本発明は、前記第二のポリペプチドをコードする第二の核酸を提供する。
【００５０】
さらに、本発明は、前記第二の核酸を有する第二のベクターを提供する。
【００５１】
さらに、本発明は、前記第二のベクターを有する第二の宿主細胞を提供する。
【００５２】
さらに、本発明は、ポリペプチドを生産する第二の方法であって、前記ポリペプチドの生産が可能な条件下で前記第二の宿主細胞を増殖させることと、このようにして生産されたポリペプチドを回収することとを備えた方法を提供する。
【００５３】
さらに、本発明は、前記第二の三量体複合体または前記第二の粒子組成物と薬学的に許容される担体とを備えた第四の組成物を提供する。
【００５４】
さらに、本発明は、前記第二の三量体複合体または粒子組成物とアジュバントとを備えた第五の組成物を提供する。
【００５５】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−１感染細胞に対する免疫反応を被験者に誘発させる第二の方法であって、予防または治療に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を前記被験者に投与することを備えた方法を提供する。
【００５６】
さらに、本発明は、治療に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を含んだワクチンを提供する。
【００５７】
さらに、本発明は、予防に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を含んだワクチンを提供する。
【００５８】
さらに、本発明は、被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法であって、予防に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法を提供する。
【００５９】
さらに、本発明は、被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法であって、予防に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を前記被験者に投与することにより、前記被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法を提供する。
【００６０】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１に感染した被験者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くする方法であって、治療に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記患者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くする方法を提供する。
【００６１】
さらに、本発明は、前記第二の粒子組成物を製造する第一の方法であって、薬学的に許容される粒子を、安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に、該複合体が前記粒子に作用可能に付着される条件下で接触させることを備え、（１）前記複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法を提供する。
【００６２】
最後に、本発明は、さらに、前記第二の粒子組成物を製造する第二の方法であって、（ａ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に結合する物質が作用可能に付着された薬学的に許容される粒子と（ｂ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体とを、前記複合体が前記物質に結合可能な条件下で接触させることを備え、これによって前記複合体が前記粒子に作用可能に付着できる状態となり、（１）前記複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基との間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法を提供する。
【００６３】
本発明は、第一の安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体であって、（１）該複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ＧＰ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基との間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、三量体複合体を提供する。
【００６４】
本発明のある実施形態では、ｇｐ１４０は、ｇｐ１２０または野生型ｇｐ１２０と比較して免疫原性が変更された修飾型ｇｐ１２０を備える。別の実施形態では、前記修飾されたｇｐ１２０分子は、野生型ｇｐ１２０中に存在する可変ループが１以上存在しないことを特徴とする。別の実施形態では、前記可変ループは、Ｖ１、Ｖ２、またはＶ３を備える。別の実施形態では、前記修飾されたｇｐ１２０分子は、野生型ｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在しないことまたは存在することを特徴とする。別の実施形態では、ｇｐ１２０分子のＶ１Ｖ２領域から、１以上の標準グリコシル化部位が除去されている。
【００６５】
ある実施形態では、各単量体ユニットの前記ｇｐ４１とｇｐ１２０がポリペプチドのタンパク分解による切断によって生じたものであり、変異したフューリン認識配列に前記切断が起こる。
【００６６】
別の実施形態では、前記ジスルフィド結合は、ｇｐ１２０中のＡ４９２Ｃ変異によって導入されたシステイン残基とｇｐ４１中のＴ５９６変異によって導入されたシステイン残基との間に形成されている。
【００６７】
さらなる実施形態では、前記ｇｐ１２０が、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在せず、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする。
【００６８】
本発明は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１のアミノ酸配列を備えた第一のポリペプチドであって、（１）前記ｇｐ４１配列がＮ末端へリックス中に１以上の変異を有しており、（２）前記ｇｐ１２０および前記ｇｐ４１の各配列の中に、少なくとも１つのシステイン残基が導入され、前記ｇｐ１２０と前記ｇｐ４１配列の間に少なくとも１つのジスルフィド結合が形成可能である、ポリペプチドも提供する。
【００６９】
ある実施形態では、前記ポリペプチドは変異されたフューリン認識配列を備え、タンパク分解による切断時に、ｇｐ１２０とｇｐ４１を与えることができる。
【００７０】
別の実施形態では、ｇｐ１２０配列へのＡ４９２Ｃ変異によってシステイン残基が導入され、且つｇｐ４１配列へのＴ５９６変異によってシステイン残基が導入される。
【００７１】
さらなる実施形態では、前記ｇｐ１２０配列は、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在せず、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする。
【００７２】
前記第一の三量体複合体またはポリペプチドのある実施形態では、ｇｐ４１のＮ末端ヘリックス中に存在するＡまたはＤ位に変異が存在する。
【００７３】
前記第一の三量体複合体またはポリペプチドの別の実施形態では、非へリックス破壊アミノ酸をヘリックス破壊アミノ酸で置換することによって変異を行う。ヘリックス破壊アミノ酸としては、例えば、プロリンまたはグリシンを挙げることができる。別の実施形態では、変異されるアミノ酸は、Ｖ５８３、Ｖ５８０、Ｌ５７６、Ｉ５７３、Ｔ５６９、Ｌ５６６、Ｑ５６２、Ｑ５９０、Ｌ５５５、Ｑ５５２、Ｉ５４８、Ｌ５４５、Ｉ５５９からなる群より選択される。好ましい実施形態において、アミノ酸変異はＩ５５９Ｐである。
【００７４】
さらに、本発明は、薬学的に許容される粒子と該粒子に作用可能に付着された前記第一の三量体とを備えた第一の組成物を提供する。
【００７５】
ある実施形態では、前記粒子に作用可能に付着された物質を介して、前記第一の三量体複合体は前記粒子に作用可能に付着されている。
【００７６】
別の実施形態では、前記三量体の各単量体中に存在する前記ジスルフィド結合は、ｇｐ１２０中のＡ４９２Ｃ変異によって導入されたシステイン残基とｇｐ４１中のＴ５９６変異によって導入されたシステイン残基との間に形成されている。
【００７７】
さらなる実施形態では、前記三量体の各単量体中に存在する前記ｇｐ１２０は、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在せず、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする。
【００７８】
前記第一の組成物では、前記粒子は、例えば、常磁性ビーズ、非常磁性ビーズ、リポソーム、またはこれらを任意に組み合わせたものであり得る。前記粒子は、例えば、ＰＬＧ、ラテックス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、またはこれらを任意に組み合わせたものを備えることができる。
【００７９】
ある実施形態では、前記粒子の平均直径は約１０ｎｍ〜１００μｍである。別の実施形態では、前記粒子の平均直径は約１００ｎｍ〜１０μｍである。さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約１００ｎｍ〜１μｍである。さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約１μｍ〜１０μｍである。さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約１０μｍ〜１００μｍである。さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約１０ｎｍ〜１００ｎｍである。さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約５０ｎｍである。
【００８０】
前記第一の組成物において、物質は、例えば、抗体、融合タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、レクチン、または受容体であり得る。ある実施形態では、前記物質は抗体である。別の実施形態では、前記物質はＣＤ４である。
【００８１】
本発明は、さらに、前記ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００８２】
本発明は、さらに、前記核酸を有するベクターを提供する。好ましい実施形態では、前記ベクターは、フューリンをコードする配列をさらに備える。前記ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、λファージ、ＹＡＣ、またはαウイルスであり得る。
【００８３】
本発明は、さらに、前記ベクターを有する宿主細胞を提供する。
【００８４】
さらに、本発明は、ポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドの生産が可能な条件下で前記宿主細胞を増殖させることと、このようにして生産されたポリペプチドを回収することとを備えた方法を提供する。
【００８５】
さらに、本発明は、前記第一の三量体複合体または前記粒子組成物と薬学的に許容される担体とを備えた第二の組成物を提供する。
【００８６】
ある実施形態では、前記第二の組成物は、サイトカインおよび／またはケモカインをさらに備える。前記サイトカインは、例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、またはこれらを任意に組み合わせたものであり得る。前記ケモカインは、例えば、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｍｉｐ３α、Ｍｉｐ３β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、またはこれらを任意に組み合わせたものであり得る。
【００８７】
サイトカイン類には、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、およびこれらを任意に組み合わせたものが含まれるが、これらに限定されない。ケモカイン類には、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｍｉｐ−３α、Ｍｉｐ−３β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、ＭＩＧ、およびこれらを任意に組み合わせたものが含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
さらに、本発明は、前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物とアジュバントとを備えた第三の組成物を提供する。前記アジュバントは、例えば、ａｌｕｍ、フロイントの不完全アジュバント、サポニン、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、モノホスホリル  リピドＡ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＣＲＬ−１００５、Ｌ１２１、またはこれらを任意に組み合わせたものであり得る。
【００８９】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−１感染細胞に対する免疫反応を被験者に誘発させる方法であって、予防または治療に有効な量の前記第一の三量体複合体または第一の粒子組成物を前記被験者に投与することを備えた方法を提供する。
【００９０】
本方法では、前記三量体複合体または前記組成物を単回または複数回投与することができる。
【００９１】
本方法のある実施形態では、前記三量体複合体または前記組成物は異種プライムブースト療法の一環として投与される。
【００９２】
ある実施形態では、少なくとも３つの異なるワクチン組成物を用いてワクチン接種が行われ、該ワクチン組成物は、ワクチン抗原の型が相互に異なっている。
【００９３】
さらに、本発明は、治療に有効な量の前記三量体複合体または前記組成物を含んだワクチンを提供する。
【００９４】
本発明は、上記単離された核酸を備えたワクチンを提供する。ある実施形態では、前記ワクチンは、治療に有効な量の核酸を備える。別の実施形態では、前記ワクチンは、治療に有効な量の、上記核酸によってコードされるタンパク質を備える。別の実施形態では、前記ワクチンは、組換え核酸分子と変異ウイルスエンベロープタンパク質の組合せを備える。
【００９５】
本発明は、組換えサブユニットタンパク質、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ分子、複製ウイルスベクター、非複製ウイルスベクター、またはこれらの組合せ（これらに限定されるものではない）を備えた上記ワクチンを提供する。
【００９６】
さらに、本発明は、予防に有効な量の前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物を含んだ第一のワクチンを提供する。
【００９７】
さらに、本発明は、被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法であって、予防に有効な量の前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法を提供する。
【００９８】
さらに、本発明は、被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法であって、予防に有効な量の前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法を提供する。
【００９９】
前記方法のある実施形態では、前記被験者はＨＩＶ−１に曝露されている。
【０１００】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１に感染した被験者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くする方法であって、治療に有効な量の前記第一の三量体複合体または前記第一の粒子組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記患者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くする方法を提供する。
【０１０１】
さらに、本発明は、前記第一の粒子組成物を製造する第一の方法であって、薬学的に許容される粒子を、安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に、該複合体が前記粒子に作用可能に付着される条件下で接触させることを備え、（１）前記複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ＧＰ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法を提供する。
【０１０２】
さらに、本発明は、第一の粒子組成物を製造する第二の方法であって、（ａ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に結合する物質が作用可能に付着された薬学的に許容される粒子と（ｂ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体とを、前記複合体が前記物質に結合可能な条件下で接触させることを備え、これによって前記複合体は前記粒子に作用可能に付着可能となり、（１）前記複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ＧＰ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基との間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法を提供する。
【０１０３】
本発明は、第二の安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体であって、（１）該複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ＧＰ４１とを備え、（２）各単量体単位のｇｐ１２０とｇｐ４１が、変異されたフューリンをその中に有するポリペプチドをタンパク分解により切断することによって生成され、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、（４）野生型ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０中に存在する少なくとも１つのＶ−ループが前記ｇｐ１２０から欠失されている、三量体複合体を提供する。
【０１０４】
前記第二の三量体複合体のある実施形態では、可変ループＶ１、Ｖ２、およびＶ３のうち少なくとも１つが前記ｇｐ１２０から欠失している。
【０１０５】
別の実施形態では、前記ジスルフィド結合は、ｇｐ１２０中のＡ４９２Ｃ変異によって導入されたシステイン残基とｇｐ４１中のＴ５９６Ｃ変異によって導入されたシステイン残基との間に形成されている。
【０１０６】
さらなる実施形態では、前記ｇｐ１２０は、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在せず、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする。
【０１０７】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１のアミノ酸配列を備えた第二のポリペプチドであって、（１）タンパク分解による切断を行ったときに、ｇｐ１２０とｇｐ４１を生成することができる状態に置かれた被変異フュリーン認識部位を、前記ポリペプチドが有しており、（２）ｇｐ１２０とｇｐ４１の各配列に、少なくとも１つのシステイン残基が導入され、ｇｐ１２０とｇｐ４１配列の間に少なくとも１つのジスルフィド結合の形成が可能であり、（４）野生型ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０中に存在する少なくとも１つのＶ−ループが前記ｇｐ１２０から欠失している、ポリペプチドを提供する。
【０１０８】
ある実施形態では、Ａ４９２Ｃ変異によってｇｐ１２０配列中にシステイン残基が導入され、且つＴ５９６変異によってｇｐ４１配列中にシステイン残基が導入される。別の実施形態では、前記ｇｐ１２０配列が、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在しないこと、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする。
【０１０９】
前記第二の三量体複合体およびポリペプチドにおいて、前記ｇｐ４１は、Ｎ末端ヘリックス中に、好ましくは前記三量体複合体の融合後６−ヘリックスバンドル中で三量体の界面を形成する箇所に１以上の変異を有してもよい。好ましくは、前記アミノ酸変異はＩ５５９Ｐである。
【０１１０】
前記第二の三量体複合体およびポリペプチドにおいて、変異されたフューリン認識配列は、例えば、配列Ｒ−Ｘ−（Ｒ／Ｋ）−Ｒ、ＲＲＲＫＫＲ、ＲＲＲＲＫＲ、またはＲＲＲＲＲＲを有することができる。
【０１１１】
本発明は、薬学的に許容される粒子と該粒子に作用可能に付着された前記第二の三量体複合体とを備えた第二の粒子組成物も提供する。ある実施形態では、前記粒子に作用可能に付着された物質を介して、前記第二の三量体複合体が前記粒子に作用可能に付着されている。別の実施形態では、前記三量体の各単量体中に存在する前記ジスルフィド結合は、ｇｐ１２０中のＡ４９２Ｃ変異によって導入されたシステイン残基とｇｐ４１中のＴ５９６Ｃ変異によって導入されたシステイン残基との間に形成されている。さらなる実施形態では、前記三量体の各単量体中に存在する前記ｇｐ１２０は、（１）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在する標準グリコシル化部位が１以上存在せず、および／または（２）野生型ＨＩＶ−１のｇｐ１２０中に存在しない標準グリコシル化部位が１以上存在することをさらに特徴とする。
【０１１２】
前記第二の粒子組成物では、前記粒子は、例えば、常磁性ビーズ、非常磁性ビーズ、リポソーム、またはこれらを任意に組み合わせたものであり得る。前記粒子は、例えば、ＰＬＧ、ラテックス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、またはこれらを任意に組み合わせたものを備えることができる。
【０１１３】
ある実施形態では、前記粒子の平均直径は約１０ｎｍ〜１００μｍである。別の実施形態では、前記粒子の平均直径は約１００ｎｍ〜１０μｍである。さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約１００ｎｍ〜１μｍである。さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約１μｍ〜１０μｍである。
【０１１４】
さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約１０μｍ〜１００μｍである。さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約１０ｎｍ〜１００ｎｍである。さらなる実施形態では、前記粒子の平均直径は約５０ｎｍである。
【０１１５】
前記第二の粒子組成物において、前記物質は、例えば、抗体、融合タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、レクチン、または受容体であり得る。ある実施形態では、前記物質は抗体である。別の実施形態では、前記物質はＣＤ４である。
【０１１６】
さらに、本発明は、前記第二のポリペプチドをコードする第二の核酸を提供する。
【０１１７】
さらに、本発明は、前記第二の核酸を有する第二のベクターを提供する。好ましい実施形態では、前記第二のベクターは、フューリンをコードする配列をさらに備える。前記第二のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、λファージ、ＹＡＣ、またはαウイルスであり得る。
【０１１８】
さらに、本発明は、前記第二のベクターを有する第二の宿主細胞を提供する。
【０１１９】
さらに、本発明は、ポリペプチドを生産する第二の方法であって、前記ポリペプチドの生産が可能な条件下で前記第二の宿主細胞を増殖させることと、このようにして生産されたポリペプチドを回収することとを備えた方法を提供する。
【０１２０】
さらに、本発明は、前記第二の三量体複合体または前記第二の粒子組成物と薬学的に許容される担体とを備えた第四の組成物を提供する。
【０１２１】
ある実施形態では、前記第四の組成物は、サイトカインおよび／またはケモカインをさらに備える。前記サイトカインは、例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、またはこれらを任意に組み合わせたものであり得る。前記ケモカインは、例えば、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｍｉｐ３α、Ｍｉｐ３β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、またはこれらを任意に組み合わせたものであり得る。
【０１２２】
さらに、本発明は、前記第二の三量体複合体または粒子組成物とアジュバントとを備えた第五の組成物を提供する。前記アジュバントは、例えば、ａｌｕｍ、フロイントの不完全アジュバント、サポニン、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、モノホスホリル  リピドＡ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＣＲＬ−１００５、Ｌ１２１、またはこれらを任意に組み合わせたものであり得る。
【０１２３】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−１感染細胞に対する免疫反応を被験者に誘発させる第二の方法であって、予防または治療に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を前記被験者に投与することを備えた第二の方法を提供する。本方法では、前記三量体複合体または前記組成物を単回または複数回投与することができる。  本方法のある実施形態では、前記三量体複合体または前記組成物は異種プライムブースト療法の一環として投与される。
【０１２４】
さらに、本発明は、治療に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を含んだワクチンを提供する。
【０１２５】
さらに、本発明は、予防に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を含んだワクチンを提供する。
【０１２６】
さらに、本発明は、被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法であって、予防に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記被験者がＨＩＶ−１に感染するのを予防する方法を提供する。
【０１２７】
さらに、本発明は、被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法であって、予防に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を前記被験者に投与することを備え、これによって前記被験者がＨＩＶ−１に感染する可能性を低くする方法を提供する。
【０１２８】
さらに、本発明は、ＨＩＶ−１に感染した患者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くする方法であって、治療に有効な量の前記第二の三量体複合体または粒子組成物を前記患者に投与することを備え、これによって前記患者のＨＩＶ−１関連疾患の発症を予防もしくは遅延させまたは前記ＨＩＶ−１関連疾患の進行速度を遅くすることを備えた方法を提供する。
【０１２９】
さらに、本発明は、前記第二の粒子組成物を製造する第一の方法であって、薬学的に許容される粒子を、安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に、該複合体が前記粒子に作用可能に付着される条件下で接触させることを備え、（１）前記複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ＧＰ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基の間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法を提供する。
【０１３０】
さらに、本発明は、第二の粒子組成物を製造する第二の方法であって、（ａ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体に結合する物質が作用可能に付着された薬学的に許容される粒子と（ｂ）安定なＨＩＶ−１前融合エンベロープ糖タンパク質三量体複合体とを、前記複合体が前記物質に結合可能な条件下で接触させることを備え、これによって前記複合体は前記粒子に作用可能に付着されることが可能となり、（１）前記複合体の各単量体ユニットがＨＩＶ−１  ｇｐ１２０とＨＩＶ−１  ｇｐ４１とを備え、（２）該ｇｐ４１はＮ末端のへリックス中に１以上の変異を有し、（３）前記ｇｐ１２０中に導入されたシステイン残基と前記ｇｐ４１中に導入されたシステイン残基との間に存在する少なくとも１つのジスルフィド結合によって、前記ｇｐ１２０とｇｐ４１が互いに結合されている、方法を提供する。
【０１３１】
最後に、本発明は、前記三量体複合体に対する抗体を提供する。
【０１３２】
以下に、幾つかの定義と、本発明の理解を助けるための実施例を記す。
本明細書を通じて、各アミノ酸を表すために、以下の標準的な略号が使用される。Ａ＝ａｌａ＝アラニン、Ｒ＝ａｒｇ＝アルギニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｄ＝ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｃ＝ｃｙｓ＝システイン、Ｑ＝ｇｌｎ＝グルタミン、Ｅ＝ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ｇ＝ｇｌｙ＝グリシン、Ｈ＝ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｌ＝ｌｅｕ＝ロイシン、Ｋ＝ｌｙｓ＝リジン、Ｍ＝ｍｅｔ＝メチオニン、Ｆ＝ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｐ＝ｐｒｏ＝プロリン、Ｓ＝ｓｅｒ＝セリン、Ｔ＝ｔｈｒ＝トレオニン、Ｗ＝ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝ｔｙｒ＝チロシン、Ｖ＝ｖａｌ＝バリン、Ｂ＝ａｓｘ＝アスパラギンまたはアスパラギン酸、Ｚ＝ｇｌｘ＝グルタミンまたはグルタミン酸。
本明細書において使用する、タンパク質などの物質「安定性を増加させる」とは、当該物質の寿命を延長させること、または分解しにくくすることを意味する。例えば、ジスルフィド結合、塩橋、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力の強化、リンカーペプチド、あるいはこれらの組合せを導入することによって、安定性を増加させることができる。安定性を増加させる変化は、組換え法によって導入することもできる。本明細書において、「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」とは、野生型でないことを意味する。
【０１３３】
本明細書において、「ＨＩＶ」とは、ヒト免疫不全ウイルスを意味するものとする。ＨＩＶには、ＨＩＶ−１が含まれるが、これに限定されるものではない。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、２種類の公知のＨＩＶ種（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）の何れであってもよい。ＨＩＶ−１ウイルスは、あらゆる公知の主要なサブタイプ（クラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）または特殊なサブタイプ（グループ０）を表すことがある。
【０１３４】
ヒト免疫不全ウイルスには、ＪＲ−ＦＬ株が含まれるが、これに限定されるものではない。表面タンパク質には、ｇｐ１２０が含まれるが、これに限定されるものではない。ｇｐ１２０のＣ１またはＣ５領域のアミノ酸には、変異を導入してもよい。変異させることができるｇｐ１２０のアミノ酸残基には、Ｖ３５、Ｙ３９、Ｗ４４、Ｇ４６２、Ｉ４８２、Ｐ４８４、Ｇ４８６、Ａ４８８、Ｐ４８９、Ａ４９２、Ｅ５００が含まれるが、これらに限定されるものではない。ｇｐ１２０アミノ酸残基は、図３ａにも記載されている。変異させることができるｇｐ４１のアミノ酸残基には、Ｄ５８０、Ｗ５８７、Ｔ５９６、Ｖ５９９、Ｐ６００が含まれるが、これらに限定されるものではない。ｇｐ４１のアミノ酸残基は、図３ｂにも記載されている。
本明細書において、「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそのハイブリッドを含む任意の核酸を意味するが、これらに限定されるものではない。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、およびＵ、並びにこれらの誘導体であり得る。これらの塩基の誘導体は本分野において周知であり、ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  １９９６−  １９９７，  Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ，  Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ＵＳＡ）に一例が記載されている。
【０１３５】
ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬとは、病理解剖時に採取されたＡＩＤＳ患者の脳組織から当初単離され、レクチンで活性化された正常なヒトＰＢＭＣと共培養した株である（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  １９９０）。ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬは、ＣＣＲ５を融合共受容体として使用し、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激したＰＢＭＣと血液由来のマクロファージ中で複製能を有するが、多くの不死化Ｔ細胞株中では効率的に複製することができないことが知られている。ＨＩＶ−１ＤＨ１２３とは、ＡＩＤＳ患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から当初単離されたウイルスのクローンである（Ｓｈｉｂａｔａ，１９９５）。ＨＩＶ−１ＤＨ１２３は、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両受容体を融合共受容体として使用し、ＰＨＡで刺激したＰＢＭＣ、血液由来のマクロファージ、不死化されたＴ細胞株中で複製能を有することが知られている。
【０１３６】
ＨＩＶ−１Ｇｕｎ−１は、ＡＩＤＳに罹患した血友病Ｂ患者の末梢血単核球から当初単離され、クローニングされたウイルスである（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１９８７）。ＨＩＶ−１Ｇｕｎ−１は、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両受容体を融合共受容体として使用し、ＰＨＡで刺激したＰＢＭＣ、血液由来のマクロファージ、不死化されたＴ細胞株中で複製能を有することが知られている。
【０１３７】
ＨＩＶ−１８９．６は、ＡＩＤＳ患者から当初単離され、クローニングされたウイルスである（Ｃｏｌｌｍａｎ，１９９２）。ＨＩＶ−１８９。６は、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両受容体を融合共受容体として使用し、ＰＨＡで刺激したＰＢＭＣ、血液由来のマクロファージ、不死化されたＴ細胞株中で複製能を有することが知られている。
【０１３８】
ＨＩＶ−１ＨＸＢ２は、ＣＸＣＲ４を融合共受容体として使用し、ＰＨＡで刺激したＰＢＭＣ、不死化されたＴ細胞株中で複製能を有するが、血液由来のマクロファージ中では複製能を有しないことが知られているＴＣＬＡウイルスである。
【０１３９】
本発明の変異ウイルスエンベロープタンパク質を作製するために、上記の株を用いることができるが、当業者に周知であるように、これらに代えて、他のＨＩＶ−１株を用いることができる。
【０１４０】
本明細書で使用する「ｇｐ４１」の用語は、（ａ）膜貫通ドメインと細胞質ドメインを含む完全なｇｐ４１、（ｂ）ｇｐ４１外部ドメイン（ｇｐ４１ＥＣＴＯ）、（ｃ）１以上のグリコシル化部位の欠失または挿入によって修飾されたｇｐ４１、（ｄ）周知の免疫優性エピトープを除去または遮蔽するように修飾されたｇｐ４１、（ｅ）ｇｐ４１融合タンパク質、（ｆ）アフィニティーリガンドその他の検出可能なマーカーで標識されたｇｐ４１が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用する「外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）」とは、膜貫通領域と細胞質ドメインを除いた、膜貫通タンパク質の細胞外領域を意味する。
【０１４１】
本明細書で使用する「ＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質」とは、ジスルフィドで連結された２つのポリペプチド鎖（ＨＩＶ  ｇｐ１２０糖タンパク質のアミノ酸を有する第一の鎖と、ＨＩＶ  ｇｐ４１糖タンパク質の水溶性部分のアミノ酸配列を有する第二の鎖（「ｇｐ４１部分」））を有するタンパク質を意味する。ＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質には、前記ｇｐ４１部分がＩ５５９Ｇ、Ｌ５６６Ｖ、Ｔ５６９Ｐ、Ｉ５５９Ｐなどの点変異を有するタンパク質が含まれるがこれらに限定されるものではない。このような変異を有するＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質は、「ＨＩＶ  ＳＯＳｇｐ１４０」および「ＨＩＶ  ｇｐ１４０単量体」とも称される。
【０１４２】
本明細書で使用する「Ｃ１領域」とは、成熟ｇｐ１２０糖タンパク質中に存在する第一の保存されたアミノ酸配列を意味する。Ｃ１領域は、アミノ末端のアミノ酸を含んでいる。ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬでは、Ｃ１領域は、アミノ酸ＶＥＫＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰＶＷＫＥＡＴＴＴＬＦＣＡＳＤＡＫＡＹＤＴＥＶＨＮＶＷＡＴＨＡＣＶＰＴＤＰＮＰＱＥＶＶＬＥＮＶＴＥＨＦＮＭＷＫＮＮＭＶＥＱＭＱＥＤＩＩＳＬＷＤＱＳＬＫＰＣＶＫＬＴＰＬＣＶＴＬＮからなる。図３ａに記されている配列のアミノ酸残基３０−１３０は、この配列を有する。他のＨＩＶ単離株では、Ｃ１領域は、同じような長さのアミノ酸の相同的アミノ末端配列を備えているものと思われる。Ｗ４４ＣとＰ６００Ｃ変異は、Ａ４９２とＴ５９６変異に関する上記定義のとおりである。ＨＩＶの配列は変化するので、Ｗ４４とＰ６００は、全てのＨＩＶ単離株において４４位と６００位に位置するとは限らないであろう。他のＨＩＶ単離株では、トリプトファンとプロリンの場所に、システインでない相同アミノ酸が存在することもあり得る。本発明には、他のＨＩＶ単離株中に当業者が容易に同定することができる、このようなアミノ酸のシステイン変異が包含される。
【０１４３】
本明細書で使用する「Ｃ５領域」とは、ｇｐ１２０糖タンパク質中に存在する保存された第５のアミノ酸配列を意味する。Ｃ５領域には、カルボキシ末端のアミノ酸が含まれる。ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０では、未修飾のＣ５領域は、アミノ酸ＧＧＧＤＭＲＤＮＷＲＳＥＬＹＫＹＫＶＶＫＩＥＰＬＧＶＡＰＴＫＡＫＲＲＶＶＱＲＥからなる。図３ａに記されている配列のアミノ酸残基４６２−５００は、この配列を有する。他のＨＩＶ単離株では、Ｃ５領域は、同じような長さのアミノ酸の相同的カルボキシ末端配列を備えているものと思われる。
【０１４４】
本明細書で使用する「Ａ４９２Ｃ変異」とは、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０中のアミノ酸４９２をアラニンからシステインに点変異することを意味する。ＨＩＶの配列は変化するので、このアミノ酸が、他の全てのＨＩＶ単離株において４９２位に位置するとは限らないであろう。例えば、ＨＩＶ−１ＮＬ４−３では、対応するアミノ酸はＡ４９９である（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ４４９９２）。このアミノ酸は、アラニンやシステイン以外の相同アミノ酸であることもあり得る。本発明には、他のＨＩＶ単離株中に当業者が容易に同定することができる、このようなアミノ酸のシステイン変異が包含される。
【０１４５】
本明細書で使用する「Ｔ５９６Ｃ変異」とは、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ４１中のアミノ酸５９６をトレオニンからシステインに点変異することを意味する。ＨＩＶの配列は変化するので、このアミノ酸が、他の全てのＨＩＶ単離株において５９６位に位置するとは限らないであろう。例えば、ＨＩＶ−１ＮＬ４−３では、対応するアミノ酸はＴ６０３である（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ４４９９２）。このアミノ酸は、トレオニンやシステイン以外の相同アミノ酸であることもあり得る。
【０１４６】
本発明には、他のＨＩＶ単離株中に当業者が容易に同定することができる、このようなアミノ酸のシステイン変異が包含される。
【０１４７】
本明細書で使用する「標準グリコシル化部位（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」には、炭水化物のＮ結合部位に当たるＡｓｎ−Ｘ−ｓｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒというアミノ酸の配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、このような配列中に存在せず、Ｏ結合を介して、炭水化物を連結することができるＳｅｒまたはＴｈｒ残基も、標準グリコシル化部位である。後者の標準グリコシル化部位の場合には、ＳｅｒおよびＴｈｒ残基をセリンまたはトレオニン以外のアミノ酸に変異させることによって、Ｏ結合グリコシル化部位をなくすことができるであろう。
【０１４８】
本明細書で使用する「Ｉ５５９Ｇ」とは、ポリペプチド鎖の５５９位に位置するイソロイシン残基がグリシン残基によって置換された点変異を意味する。
【０１４９】
本明細書で使用する「Ｌ５６６Ｖ」とは、ポリペプチド鎖の５６６位に位置するロイシン残基がバリン残基によって置換された点変異を意味する。
【０１５０】
本明細書で使用する「Ｔ５６９Ｐ」とは、ポリペプチド鎖の５６９位に位置するトレオニン残基がプロリン残基によって置換された点変異を意味する。
【０１５１】
本明細書で使用する「Ｉ５５９Ｐ」とは、ポリペプチド鎖の５５９位に位置するイソロイシン残基がプロリン残基によって置換された点変異を意味する。
【０１５２】
本明細書において、粒子上の三量体複合体または他の抗原について「作用可能に付着（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ａｆｆｉｘｅｄ）」という用語を使用する場合、免疫系によって前記複合体または他の抗原を認識できるように付着することを意味する。「薬学的に許容される粒子」とは、被験者への導入に適した物質から構成されたあらゆる粒子を意味する。
【０１５３】
本明細書において、非常磁性ビースには、例えば、金属酸化物、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、または水酸化カルシウムが含まれ得る。
【０１５４】
本明細書で使用する「ベクター」とは、本分野において公知である任意の核酸ベクターを意味するものとする。このようなベクターには、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、あるクラスのベクターでは、動物乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＣ、またはＭｏＭＬＶ）、セムリキ森林ウイルス、またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスから得られたＤＮＡ要素を利用する。
【０１５５】
本明細書で使用する「宿主細胞」には、細菌細胞（グラム陽性細胞を含む）、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および動物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。適切な動物細胞には、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞、様々な初代哺乳類細胞が含まれるが、これらに限定されない。マウス繊維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ−細胞、ＣＯＳ細胞を含む多くの哺乳類細胞を宿主として使用することができるが、これらに限定されるものではない。哺乳類細胞は、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔、マイクロインジェクションなどの本分野で周知の方法によってトランスフェクトすることができる。
【０１５６】
ある実施形態では、前記プラスミドはＰＰＩ４と表記される。本発明は、ＰＰＩ４プラスミドに限定されるものではなく、当業者に公知である他のプラスミドも含まれ得る。
【０１５７】
本発明によれば、組換えタンパク質を発現させるための数多くのベクター系を使用することができる。例えば、あるクラスのベクターでは、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、またはＭｏＭＬＶ）、セムリキ森林ウイルス、またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスから得られたＤＮＡ要素を利用する。さらに、染色体中にＤＮＡが安定に組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能とするマーカーを１以上導入することによって選択することができる。該マーカーは、例えば、栄養素要求性宿主に原栄養要求性を付与すること、殺生物剤に対する耐性（例えば、抗生物質）または銅などの重金属に対する耐性を与えることができる。前記選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるべきＤＮＡ配列に直接連結させてもよいし、同時形質転換によって同じ細胞中に導入させてもよい。ｍＲＮＡの最適な合成のためには、さらなる要素を追加する必要なこともあるであろう。これらの要素には、スプライシングシグナル、転写プロモーター、エンハンサー、終結シグナルが含まれ得る。このような要素を取り込むｃＤＮＡ発現ベクターには、（Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：  ２８０，１９８３）によって記載されているベクターが含まれる。
【０１５８】
変異エンベロープタンパク質は、ａ）変異エンベロープ糖タンパク質を作製するための発現ベクターを用いて哺乳類細胞をトランスフェクトし、ｂ）得られたトランスフェクト哺乳類細胞を、変異エンベロープタンパク質が作製されるような条件下で培養し、ｃ）産生された変異エンベロープタンパク質を回収することによって作製することができる。
【０１５９】
構築物を含有する発現ベクターまたはＤＮＡ配列を発現のために調製したら、適切な哺乳類細胞宿主中に、発現ベクターをトランスフェクトし、または導入することができる。例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔、レトロウイルスの形質導入、またはその他の従来技術などの様々な技術を、この目的を達成するために使用することができる。プロトプラスト融合の場合には、培地中で細胞を増殖させ、適切な活性について細胞をスクリーニングする。変異エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を発現させると、変異タンパク質が産生される。
【０１６０】
得られたトランスフェクト細胞を培養し、産生された変異エンベロープタンパク質を回収する方法と条件は、当業者に周知であり、使用する具体的な発現ベクターと哺乳類宿主細胞に応じて、改変させ、あるいは最適化することができる。
【０１６１】
本発明において、本発明の変異エンベロープタンパク質発現させるための好ましい宿主細胞は、哺乳類細胞株である。哺乳類細胞株には、例えば、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）、ヒト胚性腎臓株２９３、ハムスター仔腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ＋（ＣＨＯ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ−（ＤＸＢ１１）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカサバンナモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２）、マウス細胞株（Ｃ１２７）、骨髄腫細胞株が含まれる。
【０１６２】
非哺乳類ベクター／細胞株の組合せを用いるその他の真核細胞発現系は、変異エンベロープタンパク質を生成するために使用することができる。これらには、バキュロウイルスベクター／昆虫細胞発現系、酵母シャトルベクター／酵母細胞発現系が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６３】
薬学的に許容される担体は当業者に周知であり、０．０１−０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理的食塩水、または０．９％生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、このような薬学的に許容される担体には、水性または非水性溶液、懸濁液、エマルジョンが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液、生理的食塩水、および緩衝化溶媒が含まれる。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム容器、リンゲルのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または不揮発性油が含まれる。静脈内賦形剤には、液体および栄養素の補給剤、リンゲルのデキストロースを基礎とした電解質補給剤などの電解質補給剤が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤やその他の添加物が存在してもよい。
【０１６４】
本明細書で使用する「ＣＣＲ５」は、ケモカインのＣ−Ｃ基の要素を結合するケモカイン受容体であって、そのアミノ酸配列が、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号１７０５８９６と関連の多型バリアントに与えられているアミノ酸配列を備えた受容体である。本明細書で使用するＣＣＲ５には、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を結合することができるＣＣＲ５の細胞外部分が含まれる。
【０１６５】
本明細書で使用する「ＣＸＣＲ４」は、ケモカインのＣ−Ｘ−Ｃ基の要素を結合するケモカイン受容体であって、そのアミノ酸配列が、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号４００６５４と関連の多型バリアントに与えられているアミノ酸配列を備えた受容体である。本明細書で使用するＣＸＣＲ４には、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を結合することができるＣＸＣＲ４の細胞外部分が含まれる。
【０１６６】
サイトカイン類は、サイトカイン類を１以上発現するベクターによって被験者に与えることができる。同様に、ケモカインは、ケモカインを発現するベクターによって与えることができる。
【０１６７】
本明細書において使用する「アジュバント」とは、タンパク質や核酸などの抗原の免疫原性を増強させるのに適した任意の物質を意味する。タンパク質ベースのワクチンとともに使用するのに適したアジュバントには、ａｌｕｍ、フロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）、サポニン、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、モノホスホリル  リピドＡ（ＭＰＬ）、Ｌ−１２１（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ；Ｓｙｎｔｅｘ  ＳＡＦ）などの非イオン性ブロックコポリマーが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態において、前記アジュバントは、ａｌｕｍ、特に、チキソトロープ性の粘性のある均一水酸化アルミニウムゲル形態のａｌｕｍである。本発明のワクチンは、水中油エマルジョンとして投与することができる。アジュバントを抗原と混合する方法は、当業者に周知である。
【０１６８】
アジュバントは、粒状形態であってもよい。前記抗原は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧ）または類似のポリマー性素材から構成される生分解性粒子中に取り込ませてもよい。このような生分解性粒子は、免疫原を徐放することにより、免疫原に対する長期免疫反応を刺激することが知られている。他の粒状アジュバントには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）として知られるＱｕｉｌＡとコレステロールのミセル混合物や酸化アルミニウムまたは酸化鉄ビーズが含まれるが、これらに限定されるものではない。抗原と粒状アジュバントを混合する方法は、当業者に周知である。ＩＳＣＯＭやミクロンサイズのポリマー性または金属酸化物粒子などの適切なアジュバントとともにタンパク質ベースの免疫原を調合し投与すると、細胞障害性Ｔリンパ球と他の細胞免疫反応が生じることも、当業者に公知である。
【０１６９】
核酸ベースのワクチンに適したアジュバントには、ＱｕｉｌＡ、精製タンパク質または核酸の形態で送達されるインターロイキン−１２、ＣｐＧ含有モチーフなどの短い細菌性免疫刺激ヌクレオチド配列、精製タンパク質または核酸の形態で送達されるインターロイキン−２／Ｉｇ融合タンパク質、ＭＦ５９などの水中油マイクロエマルジョン、ポリマー性微粒子、陽イオン性リポソーム、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｕｂｅｎｉｍｅｘなどのイムノモジュレータ、大腸菌の易熱性トキシンやビブリオ由来のコレラトキシンなどの遺伝的に解毒化したトキシンが含まれるが、これらに限定されるものではない。このようなアジュバントおよびアジュバントを抗原と混合する方法は、当業者に周知である。
【０１７０】
本明細書で使用する「予防に有効な量」とは、疾患が発症する可能性を減らすのに十分な量を意味する。
【０１７１】
本明細書で使用する「治療に有効な量」とは、疾患の進行を遅らせ、停止させ、または回復に向かわせるのに有効な量を意味する。
【０１７２】
本明細書において、「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、任意の動物または人工的に改変した動物を意味する。人工的に改変した動物には、ヒトの免疫系を有するＳＣＩＤマウスが含まれるが、これに限定されるものではない。動物には、マウス、ラット、イヌ、モルモット、フェレット、ウサギ、および類人猿が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、前記被験者はヒトである。
【０１７３】
本明細書で使用する「ウイルスに感染した」とは、標的細胞膜をウイルスまたは感染細胞と融合させることなどによって、ウイルスの遺伝情報を標的細胞中に導入することを意味する。標的は、被験者の細胞であり得る。好ましい実施形態では、標的細胞は、ヒト被験者中に存在する細胞である。
【０１７４】
本明細書で使用する「免疫する」とは、抗原に対する免疫反応を被験者に生じさせることを意味する。これは、例えば、被験者にワクチンを初回投与し、適切な期間を経た後にワクチンをさらに１回以上投与して、ワクチンに対する免疫反応を被験者に生じさせることによって行うことができる。ワクチンを投与する適切な間隔は、当業者であれば容易に決定することができ、通常は、数週間から数ヶ月の単位である。
【０１７５】
ワクチンの性質と被験者の大きさに応じて、ワクチンの用量は、約１μｇから約１０ｍｇの範囲であり得る。好ましい用量は、約３００μｇである。
【０１７６】
本発明のある側面において、免疫系を好ましい方向に（例えば、好ましいＴヘルパー１型の免疫反応の方向に、あるいはＴヘルパー２型の免疫反応を優位に）偏らせるように、ワクチン接種を行う。今日では、ＴＨ１およびＴＨ２と名付けられた２つの異なるＣＤ４＋  Ｔ細胞亜集団のうち何れを優先的に活性化し、増殖させることができるかということを基本として、Ｔ細胞依存性免疫反応を分類できることが広く受け入れられている。これらの亜集団は、限られたサイトカインのみを分泌する特性によって、互いに区別することができる。  ＴＨ１亜集団は、ＩＦＮ−γを大量に産生し、ＩＬ−４の産生は少量または皆無であるのに対して、ＴＨ２表現型は、通例、ＩＬ−４とＩＬ−５の両方を高レベルで産生するが、ＩＦＮ−γは実質的に産生しない。両表現型は、天然のＣＤ４＋  Ｔ細胞から発生でき、現時点で、インビトロとインビボで、多能性ＴＨＯ前駆細胞がそれぞれＴＨ１またはＴＨ２エフェクター細胞に分化する過程で、一方ではＩＬ−１２とＩＦＮ−γが、他方ではＩＬ−４が中心的役割を担う刺激性サイトカインとなることを示す証拠が数多く存在する。ＩＦＮ−γは、ＴＨ２エフェクター細胞の増殖と機能を阻害し、ＩＬ−４は逆の効果を有するので、ＩＦＮ−γ産生細胞（ｐｃ）またはＩＬ−４  ｐｃの何れかが優先的に増殖していることは、免疫系がＴＨ１またはＴＨ２の方向に向かっていることの指標となる。しかし、サイトカイン環境が、ＴＨ系列の分化を誘導する唯一の因子だというわけではない。遺伝的な背景、抗原の用量、抗原投与の経路、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の種類、ＴＣＲを介したシグナル伝達、Ｔ細胞上のアクセサリ分子も、分化において役割を果たしている。
【０１７７】
本発明のある側面では、ある方向に免疫反応をモジュレートする特性を有するワクチン組成物を用いることによって、Ｔヘルパー１型または２型が優位な免疫反応を免疫系に誘導させる。本発明の好ましい側面では、前記アジュバント機能の少なくとも一部は、Ｔヘルパー１または２型の免疫反応が優位になるように免疫系を誘導するための手段を備える。
【０１７８】
別の実施形態では、ある方向に免疫反応をモジュレートする特性を有するベクターを用いて、何れかの免疫系が優位になるようにする。免疫反応または送達経路（筋肉内または表皮送達など）のＴヘルパー１型またはＴヘルパー２型が優位になるように刺激できるベクターの例は、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  １９９７；  Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，  １９９７；  Ｄｏｅ，  １９９６；  Ｆｅｌｔｑｕａｔｅ，  １９９７；Ｐｅｒｔｍｅｒ，  １９９６；  Ｐｒａｙａｇａ，  １９９７；  および  Ｒａｚ，  １９９６に記載されている。
【０１７９】
本発明の別の側面では、局所的な炎症反応を誘導する能力を有するアジュバントを用いて、自然免疫反応を生じるように免疫系を誘導する。これらの反応には、インターフェロン、Ｂケモカイン、抗原処理および抗原提示細胞を誘引することができるケモカイン一般、並びに、さらに別の特異的な免疫反応を生じる一定のリンパ球集団が含まれる。これらの自然型反応は、用いるベクターまたはＤＮＡ、当該反応の特異的免疫モジュレート特性（ＣｐＧモチーフによってコードされるものを含む）、免疫化の部位に応じて、異なる特性を有する。共通の特異的ワクチン抗原を少なくとも１つ含有している特異的配列ワクチン組成物中で用いることによって、種類が異なる所望の予防ワクチン反応を生じさせ、最適化することができる。異なるワクチン組成物を組合せ、特定の感染因子の侵入部位（すなわち、経口、鼻、腸、泌尿生殖器）において望ましいワクチン効果に応じて異なった特定部位または同一の特定部位にワクチン組成物を送達させることによって、種類が異なる所望の免疫反応を得ることもできる。
【０１８０】
ある側面において、前記ワクチンは、抗原提示細胞を備える。抗原提示細胞には、樹状細胞、ランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｈａｎ  ｃｅｌｌ）、単球、マクロファージ、筋肉細胞などが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、前記抗原提示細胞は樹状細胞である。好ましくは、前記抗原提示細胞は、主要組織適合複合体Ｉまたは複合体ＩＩとともに、前記抗原、または、該抗原の免疫原性を有する部分（ペプチドなど）、またはそれらの誘導体および／または類縁体を提示する。
【０１８１】
様々な形態の抗原で初回刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）を行った後、該抗原により１回以上の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）を行うことによって、または異なる免疫部位および／または抗原提示細胞集団に抗原を送達することによって、組換え抗原に対する免疫反応を実質的に強化させるだけでなく、免疫反応の性質を目的に合うようにすることもできるであろう。実際、このようなアプローチを用いて、好ましい１型もしくは２型様のＴヘルパー反応を誘導しまたは粘膜および／または全身部位に特異的反応をさらに生じさせ得ることが想定される。このようなプロトコールは、「プライム・ブースト」プロトコールとして知られ、米国特許第６，２１０，６６３  Ｂ１号、ＷＯ  ００／４４４１０号に記載されている。
【０１８２】
プライム・ブースト法の例
【表Ａ】
2005502350.tif 000002
ＮＡ＝核酸＊
ＡＧ＝抗原
ＡＧＰ＝粒子結合抗原
＊上記実施例における核酸組成物は、ウイルスベクターの構成成分の形態であり得る。ウイルスベクターは、複製型または非複製型であり得る。
【０１８３】
ある実施形態では、少なくとも３つの異なるワクチン組成物を用いてワクチン接種が行われ、該ワクチン組成物は、ワクチン抗原の型が相互に異なっている。
【０１８４】
例えば、プライミングワクチン組成物の一実施形態は、前記抗原をコードする核酸分子を含有する、複製可能もしくは複製欠損組換えウイルス、またはウイルス様粒子である。ある実施形態では、前記プライミング組成物は、αウイルス由来の非複製組換えウイルスまたはウイルス様粒子である。
【０１８５】
プライミングワクチン組成物を投与することによって哺乳類の被験者を「プライミング」することも、本発明の方法の１つである。本明細書で使用する「プライミング」とは、ある抗原を用いた最初の免疫化によって、同じ抗原を用いた二度目の免疫のときに、該抗原に対する免疫反応を生じさせることができる任意の方法を意味し、ここで、前記二度目の免疫反応は、最初の免疫化を行わなかったときに得られる免疫反応より大きい。
【０１８６】
ある実施形態では、前記プライミングワクチンは、他の組成物と同様、全身投与される。この全身投与には、例えば、被験者の組織への物理的な損傷を特徴とする任意の非経口的な投与と組織中の損傷（ｂｒｅａｃｈ）を通じた物質の投与とが含まれる。特に、非経口投与には、皮内、経皮、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内注射、静脈内、動脈内（ｉｎｔｅｒａａｒｔｅｒｉａｌ）、腎臓透析注入技術、いわゆる、組織を通じた「無針」注射が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、全身非経口投与は、筋肉内注射である。別の実施形態では、前記ワクチンは、鼻内、経口、膣、気管内、腸および直腸粘膜表面を含む投与部位に投与される。
【０１８７】
前記プライミングワクチンは、他の組成物と同様に、身体の様々な部位に、用量依存的に投与することができる。本発明は、注射の量もしくは部位、薬学的担体、かかる免疫化プロトコールに限定されるものではない。むしろ、前記プライミング工程には、単回投与または時間単位、日単位、週単位、もしくは月単位、または年単位で投与することを含む治療計画が包含される。
【０１８８】
本明細書で使用する「プライミング量」とは、用いるプライミングワクチンの量を意味する。
【０１８９】
好ましくは、哺乳類の被験者に前記プライミングワクチンを投与してから約２〜２７週後に、追加免疫ワクチン組成物を投与する。追加免疫ワクチンの投与は、プライミングワクチンによって投与されるものと同一の抗原を含有しまたは送達できる有効量の追加免疫ワクチンを用いて行われる。
【０１９０】
１つの実施形態として、本明細書で使用する「追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）ワクチン」には、プライミングワクチンと同一の抗原またはその前駆体を含有するが、形態が異なる組成物であって、追加免疫ワクチンが宿主の免疫反応を誘導する組成物が含まれる。ある実施形態において、追加免疫ワクチンは、組換え可溶性タンパク質を含んでいる。
【０１９１】
別の例において、追加免疫ワクチン組成物のある実施形態は、タンパク質抗原をコードするＤＮＡ配列を含有する複製可能または複製欠損組換えウイルスである。別の実施態様では、前記追加免疫ワクチンは、タンパク質抗原をコードするα−ウイルス由来の核酸分子または非複製ワクチンレプリコン粒子を有する非複製αウイルスである。本来気道を通じて宿主に侵入するアデノウイルスは、鼻内投与すると、即座に気道の細胞に感染し、アジュバントが必要なく、強固な免疫反応を誘導する。別の実施形態では、前記追加免疫ワクチンは、複製欠損組換えアデノウイルスを備える。
【０１９２】
追加免疫ワクチンの別の例は、前記抗原をコードし、哺乳動物の組織中で前記抗原の発現を誘導する制御配列と作用可能に結合されたＤＮＡ配列を含有する細菌の組換えベクターである。１つの例は、組換えＢＣＧベクターである。他の例には、サルモネラ、シゲラ、リステリアをベースとした組換え細菌ベクターが含まれる。追加免疫ワクチンのさらに別の例は、前記抗原をコードし、哺乳動物の組織中で前記抗原の発現を誘導する制御配列と作用可能に結合されているが、さらなるベクター配列を全く含有していない裸のＤＮＡ配列である。これらのワクチンは、さらに、薬学的に適切な担体または生理的に許容される担体を含有してもよい。
【０１９３】
さらに別の実施形態では、前記追加免疫ワクチンは、タンパク質またはペプチド（完全な状態のものと変性を受けた状態のもの）、熱で死滅させた組換えワクチン、不活化した丸ごとの微生物、前記タンパク質をパルス提示した抗原提示細胞または前記タンパク質をコードする核酸分子に感染／トランスフェクトさせた抗原提示細胞などが含まれ、全て、アジュバント、ケモカイン、および／またはサイトカインを加えてもよいし、加えなくてもよい。
【０１９４】
プライミングおよび／または追加免疫ワクチンに使用することができるサイトカインまたはプライミングおよび／または追加免疫ワクチンから別個に投与することができるサイトカインには、インターロイキン−４、インターロイキンー５、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、インターロイキンー１５、インターロイキン−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、これらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。サイトカインは、１以上のサイトカインを発現するベクターによって与えることができる。
【０１９５】
代表的な抗原の型には、「裸の」ＤＮＡプラスミド、「裸の」ＲＮＡ分子、複製もしくは非複製ウイルスベクター中にパッケージングされたＤＮＡ分子、複製もしくは非複製ウイルスベクター中にパッケージングされたＲＮＡ分子、細菌ベクター中にパッケージングされたＤＮＡ分子、単独でもしくはウイルス様粒子中に存在するタンパク質型の抗原、またはこれらの組合せが含まれる。
【０１９６】
本明細書で使用する、「ウイルス様粒子」またはＶＬＰとは、いかなる宿主にも感染せず、宿主中で複製しない粒子であり、生きたウイルス粒子のタンパク質成分の幾つかを含有していない粒子である。ある実施形態では、ＶＬＰは、膜に封入されたウイルス様粒子を形成するのに必要とされるＨＩＶ−１のｇａｇなどの三量体状の構造タンパク質を含有する。
【０１９７】
ＶＬＰの利点には、（１）粒状且つ多価であるために、免疫を刺激する、（２）天然な状態に近く膜に随伴した形態で、ジスルフィドにより安定化されたエンベロープ糖タンパク質を提示できることが含まれる。
【０１９８】
ＶＬＰは、同じ細胞中でウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０／ｇｐ４１およびｇａｇ）を共発現させることによって得られる。ウイルスタンパク質をコードする適切な発現ベクターのトランスフェクション、ＶＬＰタンパク質をコードする１以上の組換えウイルス（例えば、ワクシニア）による細胞の感染、レトロウイルスの細胞への形質導入などの当業者に周知である、異種遺伝子を発現させる複数の手段のうち何れかによって、これを行うことができる。このようなアプローチを組み合わせて用いることもできる。ＶＬＰは、インビトロまたはインビボの何れでも作製することができる。
【０１９９】
ショ糖やその他の積層物質上での遠心やクロマトグラフィーを含む当業者に周知である方法によって、ＶＬＰを精製した形で得ることができる。
【０２００】
ある実施形態では、前記核酸送達ビークルは、ワクチン接種を受けている動物またはヒトの細胞中で複製する。ある実施形態では、前記複製する核酸は、宿主の他の細胞に伝播し、複製と抗原提示の新しいサイクルを開始し、および／またはアジュバント機能を発揮する能力を少なくとも限定的に有している。
【０２０１】
別の実施形態では、前記核酸は、ワクチン接種を受けている動物またはヒトの中で複製しない。前記核酸は、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスの核酸を有することができる。好ましい実施形態では、前記核酸は、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルスなどを含むα−ウイルスの核酸を有するが、これらに限定されない。別の実施形態では、前記核酸送達ビークルは、ＶＥＥウイルス粒子、セムリキ森林ウイルス粒子、シンドビスウイルス粒子、ポックスウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、レンチウイルス粒子、またはアデノウイルス粒子である。
【０２０２】
前記ワクチンは、組換えサブユニットタンパク質、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ分子、複製ウイルスベクター、非複製ウイルスベクター、またはこれらの組合せを備えることができるが、これらに限定されるものではない。
【０２０３】
本明細書において使用する「被験者がウイルスに感染する可能性を低くする」とは、被験者がウイルスに感染される可能性を少なくとも２倍減少させることを意味する。例えば、被験者がウイルスに感染される可能性を１％有する場合には、被験者がウイルスに感染する可能性を２倍減らせば、被験者がウイルスに感染される可能性は０．５％になる。本発明の好ましい実施形態において、被験者がウイルスに感染する可能性を低くするとは、被験者がウイルスに感染する可能性を少なくとも１０倍減らすことを意味する。
【０２０４】
本明細書で使用する、ＨＩＶ−１に「曝露される」とは、感染が生じ得るようにＨＩＶ−１と接触することを意味する。
【０２０５】
本明細書において使用する「ＣＤＲ」、すなわち相補性決定領域とは、抗体の可変ドメイン中に存在する高度に可変的なアミノ酸の配列を意味する。本明細書において、「誘導化された」抗体（”ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ”  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは、修飾を施された抗体である。誘導化の方法には、蛍光部分、放射性核種、トキシン、酵素、またはビオチンなどの親和性リガンドの付加が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０２０６】
本明細書で使用する「ヒト化」とは、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分、または全部が、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を意味する。ヒト化された型の抗体のある実施形態では、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分、または全部が、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されているが、１以上のＣＤＲ領域内に存在する一部、大部分、または全部のアミノ酸は変化していない。抗体が抗原を結合する能力を喪失させない限り、僅かなアミノ酸の付加、欠失、挿入、置換、または修飾は許容される。適切なヒト免疫グロブリン分子には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ分子が含まれる。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持しているであろう。
【０２０７】
本発明のヒト化抗体を作製する方法は、当業者に公知であろう。ヒト化抗体を作製する方法について記載した様々な文献が存在するが、その一部は、本出願に参考文献として援用される。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている方法では、ある抗体の可変領域と別の抗体の定常領域とを有するキメラ抗体が作製される。米国特許第５，２２５，５３９号は、ヒト化抗体を作製するための別のアプローチを記載している。この特許は、当該ヒト化抗体が所望の標的を認識するが、ヒト患者の免疫系によって実質的に認識されないように、ある免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲが、特異性の異なる免疫グロブリンのＣＤＲで置換されたヒト化抗体を作製する組換えＤＮＡ技術の使用について記載している。具体的には、フレームワーク上にＣＤＲを移植するには、部位特異的突然変異誘発を使用する。
【０２０８】
ヒト化免疫グロブリンを作製する方法を記載した米国特許第５，５８５，０８９号、５，６９３，７６１号、ＷＯ  ９０／０７８６１号には、抗体をヒト化するためのこれ以外のアプローチが記載されている。これらの抗体は、ドナー免疫グロブリンに由来する１以上のＣＤＲとアクセプターヒト免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域とを有し、ドナー免疫グロブリン由来のアミノ酸がさらに付加されていることもある。これらの特許は、抗体の親和性を所望の抗原に対して増加させる方法を記載している。フレームワーク中のアミノ酸の一部は、アクセプターではなくドナー中の当該位置に存在したものと同じアミノ酸になるように選択される。具体的には、これらの特許は、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲをヒト免疫グロブリンフレームワークおよび定常領域と組み合わせることによって、受容体に結合するヒト化抗体を調製することを記載している。ヒトのフレームワーク領域は、マウスの配列との相同性が最大になるように選択することができる。ＣＤＲまたは特異的な抗原と相互作用する可能性があるフレームワーク領域中のアミノ酸を同定するためには、コンピュータモデルを使用することができ、次いで、ヒト化抗体を作製するために、マウスアミノ酸をこれらの位置に用いることができる。
【０２０９】
上記特許５，５８５，０８９号、５，６９３，７６１号、ＷＯ  ９０／０７８６１号は、ヒト化抗体のデザインに使用し得る４つの基準も提案している。第一に、アクセプターに関しては、ヒト化すべきドナー免疫グロブリンと相同性が極めて高いヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用するか、あるいは、多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することを提案している。第二に、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が例外的なアミノ酸であり、この位置に存在するドナーアミノ酸がヒトの配列に典型的であれば、アクセプターではなくドナーアミノ酸を選択してもよいことを提案している。第三に、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤＲに直接隣接した位置では、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択してもよいことを提案している。第四に、抗体の三次元モデルにおいて、当該アミノ酸がＣＤＲの３Å以内に側鎖原子を有すると予想され、且つＣＤＲと相互作用可能であると予想されているフレームワークの位置に、ドナーアミノ酸残基を使用することを提案している。上記の方法は、ヒト化抗体を作製するために当業者が使用できる幾つかの方法を例示したものにすぎない。
【０２１０】
ウイルスの感染性を遮断することができる抗体を被験者が産生したかどうかを決定する１つの方法は、安定化されたウイルスのエンベロープタンパク質への抗体の結合能を調べる診断テストである。本明細書に示されているように、このような結合は、抗体がウイルスを中和できることの指標である。これに対して、安定化されていない単量体型のウイルスエンベロープタンパク質に抗体が結合しても、感染性ウイルスに結合して、その感染性を遮断する能力を抗体が有することを予測するものではない（Ｆｏｕｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：  ２７７９，  １９９７）。この方法には、感染性ウイルスを使用しなくてもよいという実際的な利点がある。
【０２１１】
この診断用途には、当業者に公知である多数のイムノアッセイフォーマットが適している。例えば、変異ウイルスエンベロープ糖タンパク質がマイクロタイタープレートのウェル上に直接または生物特異的に捕捉された酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）フォーマットを用いることができる。必要に応じて、洗浄および／またはブロッキング工程を経た後、様々な濃度範囲で被検試料をプレートに加える。抗体は、血清、血漿、精製された免疫グロブリン画分などの様々な形態で加えることができるが、これらに限定されるものではない。適切なインキュベーションおよび洗浄工程を行った後、被験者の抗体に特異的な酵素結合レポーター抗体を加えることなどによって、結合した抗体を検出することができる。適切な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼが含まれ、これらについては、免疫コンジュゲートや比色基質が数多く市販されている。試験抗体の結合は、平行的に標準アッセイを行った公知のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の結合と比べることができる。この例では、抗体の結合レベルが高いと、中和活性が高いことを示している。
【０２１２】
一例として、ワクチンが患者内で予防的な抗体反応を誘導したかどうかを調べるために診断テストを用いることができ、予防的反応が存在すれば、患者の免疫に成功したことを示し、このような反応がなければ、さらに免疫を行う必要があることを示唆している。培地から変異エンベロープタンパク質を精製する方法と条件は本発明に記載されているが、当業者に周知であるように、これらの操作は変更し、あるいは最適化できることを理解しなければならない。
【０２１３】
以下の実験の詳細を通じて、本発明に対する理解をさらに深めることができるであろう。しかしながら、論述されている具体的な方法と結果は、特許請求の範囲にさらに完全に記載されている本発明を単に例示したものにすぎないことが、当業者であれば容易に理解されるであろう。
【０２１４】
実験的の詳細
【実施例１】
【０２１５】
実験セットＩ
Ａ．  材料および方法
ＰＰＩ４−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ＪＲＦＬと称するプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｅｒｙｌａｎｄ  ２０８５２に、ＡＴＣＣアクセッション番号７５４３１のもとに、特許手続の目的の微生物の寄託の国際承認によるブダペスト条約の要求に準じ、かつ満たして寄託した。プラスミドは、１９９３年３月１２日にＡＴＣＣに寄託した。この真核シャトルベクターは、シグナル配列が組織プラスミノーゲン活性化因子に由来するものと置換された全長ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子に連結したサイトメガロウィルス主要前初期（ＣＭＶ／ＭＩＥ）プロモーター／エンハンサーを含む。ベクターにおいて、ベクターに存在するｇｐ４１配列の翻訳を防止するために、ｇｐ１２０Ｃ末端に停止コドンを配置した。また、ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、ＳＶ４０複製起点、および転写がβ−グロビンプロモーターによって促進（ｄｒｉｖｅ）されるＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０２１６】
種々のドナーに由来する抗ｇｐ１２０Ｍａｂｓのエピトープおよび一部の免疫化学的性質が、以前に記載されている（Ｍｏｏｒｅ，  １９９４ａ；  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，  １９９６）。これらは、Ｖ３遺伝子座に対するＭａｂ１９ｂ（Ｍｏｏｒｅ，  １９９５）を；Ｖ３ループに対するｍＡＢｓ５０．１および８３．１（Ｗｈｉｔｅ−Ｓｃｈａｒｆ，  １９９３）；ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）に対するＭＡｂｓ  ＩｇＧ１ｂ１２およびＦ９１（Ｂｕｒｔｏｎ，  １９９４  ；およびＭｏｏｒｅ，  １９９６）；独特なＣ３−Ｖ４グリカン依存エピトープに対するＭＡｂ  ２Ｇ１２（Ｔｒｋｏｌａ，  １９９６）；Ｃ１領域に対するＭＡｂ  Ｍ９０（ｄｉＭａｒｚｏ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  １９９２）；Ｃ５領域に対するＭＡｂ  ２３ａおよびＡｂ  Ｄ７３２４（Ｍｏｏｒｅ，  １９９６）；高次構造上のＣ１−Ｃ５エピトープに対するＭＡｂ  ２１２Ａ（Ｍｏｏｒｅ，  １９９４ｂ）；ＣＤ４−誘導性のエピトープに対するＭＡｂ  １７ｂ（Ｍｏｏｒｅ，  １９９６）；ＣＤ４−誘導性のＣ１−Ｃ４エピトープに対するＭＡｂ  Ａ３２（Ｍｏｏｒｅ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  １９９８）；Ｃ４またはＣ４／Ｖ３エピトープに対するＭＡｂ  Ｇ３−５１９およびＧ３−２９９（Ｍｏｏｒｅ，  １９９６）を含む。ｇｐ４１エピトープに対するＭＡｂは、エピトープ・クラスター１（Ｊｉｍ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｔｕｌａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に対する７Ｂ２（Ｊｉｍ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｔｕｌａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって親切に提供した）；融合ペプチド領域に対する２５Ｃ２（Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ，  １９９４）；残基６６５〜６９０を包含する中和エピトープに対する２Ｆ５（Ｍｕｓｔｅｒ，  １９９４）を含んだ。四量体ＣＤ４−ＩｇＧ２は、以前に記載されている（Ａｌｌａｗａｙ，  １９９５）。
【０２１７】
抗ＨＩＶ抗体は、市販の供与源から、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから、または発明者から得た。示した場合は、抗体は、製造業者の説明書にしたがってＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）でビオチン化した。
【０２１８】
単量体ｇｐ１２０ＪＲ−ＦＬは、記載されたとおりに（米国特許第５，８６６，１６３号および５，８６９，６２４号）、ＰＰＩ４−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ＪＲＦＬプラスミドを安定してトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において産生した。可溶性ＣＤ４は、Ｂａｒｔｅｌｓ社（Ｉｓｓａｑｕａｈ，  ＷＡ）から購入した。
【０２１９】
野生型および変異体ＨＩＶエンベロープタンパク質を発現するＰＰＩ４に基づくプラスミドの構築
野生型ｇｐ１４０ｓ（ｇｐ１４０ＷＴ）。ｇｐ１４０コード配列は、ＨＩＶ−１単離体ＪＲ−ＦＬ、ＤＨ１２３、Ｇｕｎ−１、８９．６、ＮＬ４−３、およびＨｘＢ２の全長分子クローンから、ＰＣＲ法（ＰＣＲ）を使用して増幅した。使用した５'プライマーは、Ｋｐｎ１ｅｎｖ（５'−ＧＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣ−３'）と称し、一方３'プライマーは、ＢｓｔＢ１ｅｎｖ（５'−ＣＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＴＴＣＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＴＴ−３'）である。ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼで導入されるエラーの程度を制限するために、ストリンジェントな条件下で行った。ＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化して、アガロースゲル電気泳動によって精製した。また、プラスミドＰＰＩ４−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ＪＲ−ＦＬを２つの制限酵素で消化して、大きな断片（ベクター）を同様にゲル精製した。ＰＰＩ４−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ＪＲＦＬ発現ベクターは、以前に記載されている（米国特許第５８８６１６３号および５８６９６２４号）。挿入およびベクターのライゲーションは、室温で一晩おこなった。ＤＨ５αＦ'Ｑ１０細菌を、それぞれのライゲーションしたものの１／２０で形質転換した。コロニーは、これらがインサートを含むベクターで形質転換されたかどうかを決定するために、直接ＰＣＲによってスクリーニングした。それぞれの構築物の３つの陽性クローンからのＤＮＡをプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使用して精製し、全ｇｐ１６０の両方の鎖をシーケンスした。例として、ｐＰＰＩ４−ｇｐ１４０ＷＴＪＲＦＬおよびｐＰＰＩ４−ｇｐ１４０ＷＴＤＨ１２３は、それぞれＨＩＶ−１ＪＲＦＬおよびＨＩＶ−１ＤＨ１２３に由来する野生型の切断可能なｇｐ１４０を発現するベクターをいう。
【０２２０】
ｇｐ１４０ＵＮＣ。ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０のｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位変異体は、以前に記載したとおり（Ｅａｒｌ，  １９９０）、ＲＥＫＲモチーフ内を置換することによってｇｐ１２０Ｃ末端で作製した。欠失は、変異誘発プライマー５'１４０Ｍ（５'−ＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＧＴＣＴＣＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧ−３'）および３'ｇｐ１４０Ｍ（Ｋｐｎ１ｅｎｖおよびＢｓｔＢ１ｅｎｖを結合した配列の５'−ＴＣＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＡＣＧＡＡＧＴＣＧＴＡＧＣＣＧＣＡＧＴＧＣＣ−ＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡＴＧＧＴＴＣ−３'）を使用する部位特異的変異によって作製した。上記の通りに、Ｋｐｎ１ｅｎｖおよびＢｓｔＢ１と組み合わせて、ＰＣＲ産物をＫｐｎ１およびＢｓｔＢ１で消化してｐＰＰＩ４にサブクローン化した。
【０２２１】
ｇｐ１２０およびｇｐ１４０タンパク質の可変ループ欠損形態を発現するループ欠失ｇｐ１２０ｓおよびｇｐ１４０ｓのＰＰＩ４に基づくプラスミドは、上記したように（Ｂｉｎｌｅｙ，  １９９８）、オーバーラップ伸張法によるスプライシングを使用して調製した。単独にループ欠失した変異体には、Ｄ１３２−Ｋ１５２（ＡＶ１）、Ｆ１５６−Ｉ１９１（ＡＶ２）、またはＴ３００−Ｇ３２０（ΔＶ３）を置換するためにＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙのスペーサを使用する。番号付け系は、ＨＩＶ−１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ６３６３２）のＪＲ−ＦＬクローンのものに対応する。
【０２２２】
ΔＶ１鋳型に対してＤＧＫＰＮ５'ＰＰＩ４および５ＪＶ１Ｖ２−Ｂ（５'−ＧＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣ−３'）を使用するＰＣＲ増幅と、次のＫｐｎ１およびＢａｍＨ１による消化により、Ｖ１ループをコードする配列を欠失する２９２ｂｐ断片を作製した。この断片を、Ｋｐｎ１およびＢａｍＨ１制限部位を使用して、Ｖ２ループの配列を欠失するプラスミドにクローン化した。生じたプラスミドは、ΔＶ１Ｖ２'と称し、Ｄ１３２Ｋ１５２およびＦ１５６−Ｉ１９１の両者の代わりにＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ配列を含んだ。Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３ループを欠失するＥｎｖは、プライマー３ＪＶ２−Ｂ（５'−ＧＴＣＴＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＡＣＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＧ−３'）およびＨ６ＮＥＷ（５'ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＧＡＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＡ−ＴＧＴＣ−３'）でのΔＶ３鋳型に対するＰＣＲによって作製される断片を使用して、同様の方法で作製した。ＢａｍＨ１およびＢｓｔＢ１を使用して、断片をΔＶ１Ｖ２'にクローン化した。生じたｅｎｖ構築物は、ΔＶ１Ｖ２'Ｖ３と名づけた。ΔＶ１Ｖ２'およびΔＶ１Ｖ２'Ｖ３プラスミドによってコードされる糖タンパク質は、Ｃ１２５〜Ｃ１３０にわたる短いアミノ酸配列をコードする。これらの配列は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ配列とＴ１２７−Ｉ１９１を置換する変異誘発プライマーを使用して除去した。我々は、プライマー３'ＤＶ１Ｖ２ＳＴＵ１（５'−ＧＧＣＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＴＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＣ−３'）およびＤＧＫＰＮ５'ＰＰＩ４によるＰＣＲ増幅を行い、生じた断片をＳｔｕ１およびＫｐｎ１によって消化して、これをＰＰＩ４ｇｐ１４０ベクターにクローン化した。生じたｇｐ１４０を、ΔＶ１Ｖ２＊と名付けた。同様の方法でΔＶ１Ｖ２＊Ｖ３を構築した。図１０に、アミノ酸置換を模式的に示してある。
【０２２３】
グリコシル化部位変異体。ｇｐ１２０の位置３５７および３９８における標準Ｎ結合グリコシル化部位（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ）は、アスパラギンのグルタミンへの点変異によって除去した。これらの変化は、野生型およびループ欠失ＨＩＶエンベロープタンパクをコードする鋳型に対して作製した。
【０２２４】
ジスルフィド安定化ｇｐ１４０ｓ。ｇｐ１２０およびｇｐ４１における示したアミノ酸をＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を使用する部位特異的変異生成によってシステインに対で変異させた。以下に示したとおり、エンベロープ糖タンパク質の局所的形態内にシステイン変異をうまく適応させることを試みて、導入したシステインの近くの更なるアミノ酸を、同様の方法を使用してアラニンに変異させた。変化は、野生型およびループ欠失ＨＩＶエンベロープタンパクをコードする鋳型に対して同様に作製した。
【０２２５】
一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるｇｐ１４０ｓの発現。ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＳＶ４０起点を含むＰＰＩ４などのプラスミドの高レベルの複製を促進するＳＶ４０ラージＴ抗原をトランスフェクトしたヒト胚性腎細胞株（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５７３）の接着２９３Ｔ細胞において、一過性に発現した。２９３Ｔ細胞は、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補った１０％のウシ胎児血清を含むダルベッコ最小必須培地において培養した（ＤＭＥＭ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）。細胞を１０ｃｍの皿にまいて、リン酸カルシウム沈殿法を使用して、１０μｇの精製されたＰＰＩ４プラスミドをトランスフェクトした。翌日、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンと共に０．２％のウシ血清アルブミンを含む新しいＤＭＥＭを細胞を供給した。放射性免疫沈降アッセイ法のために、培地にも、３５Ｓ−ラベルしたシステインおよびメチオニン（２００μＣｉ／プレート）を含めた。一定の実験では、細胞に、１０μｇのヒトフューリン遺伝子をコードするｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を同時トランスフェクトした。
【０２２６】
ＥＬＩＳＡ解析。２９３Ｔ細胞上清中のｇｐ１２０およびｇｐ１４０タンパク質の濃度は、ＥＬＩＳＡ法によって測定した（Ｂｉｎｌｅｙ，  １９９７ｂ）。簡潔には、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  ）をｇｐ１２０のカルボキシ末端配列（ＡＰＴＫＡＫＲＲＶＶＱＲＥＫＲ）を認識するポリクローナルヒツジ抗体で、４℃において１６〜２０時間被覆した。プレートをトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で洗浄し、次いで２％の脱脂乳のＴＢＳ溶液中でブロックした。
【０２２７】
細胞上清（１００μｌ）を１０％のウシ胎児血清を含むトリス緩衝食塩水の希釈範囲に添加した。プレートを外界温度において１時間インキュベートしてＴＢＳで洗浄した。次いで、抗ｇｐ１２０または抗ｇｐ４１抗体をさらなる時間添加した。プレートをＴＢＳで洗浄し、結合した抗体の量を、アルカリホスファターゼ複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧを使用して検出する。あるいは、同じ手順にしたがってビオチン化したリポーター抗体を使用して、ストレプトアビジン−ＡＰ接合体を使用して検出する。いずれにせよ、製造業者の説明書にしたがって、ＡＭＰＡＫキット（ＤＡＫＯ）を使用してＡＰ活性を測定する。変性したＨＩＶエンベロープタンパク質の反応性を検討するために、界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウムおよびＮＰ−４０の１％の存在下において、細胞上清を５分間煮沸した後、希釈の範囲でＥＬＩＳＡプレートに充填した。精製された組換えＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０を参照標準として使用した。
【０２２８】
放射性免疫沈降アッセイ法（ＲＩＰＡ）。３５Ｓ−ラベルされた２９３Ｔ細胞の上清を、ＲＩＰＡ解析のためにトランスフェクションの２日後に回収した。培養上清を低速遠心（〜３００ｇ）することによって破片を取り除いた後、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２の終濃度にＲＩＰＡ緩衝液を添加した。ビオチン化した抗体（〜１０μｇ）を１ｍＬの上清に添加して、外界温度で１０分間インキュベートした。次いで、試料をストレプトアビジン−アガロースビーズと共に、４℃でゆっくりとかき混ぜながら１２〜１８時間インキュベートした。あるいは、ラベルのない抗体をタンパク質Ｇ−アガロース（  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と組み合わせて使用した。ノニデット−Ｐ４０（ＮＰ４０）界面活性剤を含むＲＩＰＡ緩衝液でビーズを３回洗浄した。結合したタンパク質は、０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．００１％のブロムフェノールブルー、および示した場合には、１００ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と共に１００℃で５分間加熱することによって溶出した。試料を８％のポリアクリルアミドゲルに充填し、２００Ｖで１時間泳動した。次いで、ゲルを乾燥して、次のＳＴＯＲＭ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を使用する画像分析のためのリン光体スクリーンに暴露した。１４Ｃ−ラベルしたタンパク質を、大きさ較正標準（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）として使用した。
【０２２９】
Ｂ．  結果および考察
フューリンプロテアーゼの共発現によってｇｐ１４０ＮＯＮのプロセシングが容易になる
ｇｐ１４０ＮＯＮの産生を最小にするために、ｐｃＤＮＡ３．１−フューリンおよびｐＰＰＩ４−ｇｐ１４０ＷＴＪＲＦＬを２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、抗ｇｐ１２０ＭＡｂ  ２Ｇ１２を使用してＲＩＰＡアッセイ法を行った。図２に指示したように、フューリンは、ｇｐ１４０ＮＯＮの産生を無くすが、ｇｐ１４０ＵＮＣにおいては効果を有さなかった。その他の抗ｇｐ１２０ＭＡｂ  ｓを使用して行ったＲＩＰＡｓにおいても、同様の結果が得られた（データ示さず）。
【０２３０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にＤＴＴで試料を処理しても、これらのバンドの移動または相対量に影響を及ぼさなかったことから、ｇｐ１４０ｓは、外因性のジスルフィド結合によって結合した別々のｇｐ１２０−ｇｐ４１分子ではなく、単一のポリペプチド鎖からなることを示す。
【０２３１】
２つのシステイン変異の導入によるｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用の安定化
フューリンの同時トランスフェクションにより、現在我々はｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯ成分が非共有結合のみを介して結合した可溶性ｇｐ１４０タンパク質を発現することができ、ビリオンにおいて天然の三量体エンベロープ糖タンパク質複合体で生じることを模倣することができる。しかし、ビリオン上または感染細胞の表面では、ｇｐ１２０−ｇｐ４１の結合は弱く、その結果、ｇｐ１２０は次第に脱落する（ＭｃＫｅａｔｉｎｇ（１９９１））。我々は、これが、内因性フューリンの存在下で作製されたｇｐ１４０ＷＴタンパク質においても生じることを見出した。したがって、我々は、免疫沈降後のｇｐ１４０ＷＴ発現細胞からの上清中の安定ｇｐ１２０−ｇｐ４１ＥＣＴＯ複合体を、あるとしてもほとんど検出することができない。したがって、我々は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニット間の分子間ジスルフィド結合を導入することによって非共有ｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用を安定化させる方法を探索した。
【０２３２】
したがって、我々は、ｇｐ１２０のＣ１およびＣ５領域におけるいくつかの異なる部位の１つにおいてシステイン残基を置換し、ｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用に重要であることが以前に示されているアミノ酸に焦点をあてた（図３ａ）。同時に、我々は、ｇｐ４１の分子内ジスルフィドループの近くのいくつかの残基に第２のシステイン変異を導入した（図３ｂ）。この意図は、天然のｇｐ１２０−ｇｐ４１の物理的並置が、分子間ジスルフィド結合を自然に形成すると考えられるようなシステイン残基の対を同定することである。全部で＞５０の異なる２重システイン置換の変異体を、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０ＷＴタンパク質に関して作製し、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにおいてフューリンと共発現した。
【０２３３】
抗原捕獲ＥＬＩＳＡによるトランスフェクション上清の初期解析では、ｇｐ１２０の残基４８６にシステインを含むものを除いて、変異体の全てが分泌タンパク質として効率的に発現されることを示した（データ示さず）。我々は、次に抗ｇｐ１２０ＭＡｂｓ  ２Ｇ１２およびＦ９１（図４）での免疫沈降によってトランスフェクション上清を特徴づけた。期待される１２０ｋＤａのバンド（ｇｐ１２０）に加えて、Ｆ９１および２Ｇ１２により、２重システイン変異体トランスフェクション上清の多くから約１４０ｋＤａの第２のバンドが沈殿された。ｇｐ１２０のＣｌ領域にシステインが存在する変異体に由来するｇｐ１４０バンドは、Ｃ５領域にｇｐ１２０システインがある変異体からの対応するバンドよりも、わずかにゆっくりと移動し、かつより散在性であった（図４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の移動度が減少してぼやけたバンドの存在は、以前の報告に基づくと（Ｅａｒｌ，  １９９０；  ａｎｄ  Ｅａｒｌ，  １９９４）、おそらく不完全なまたは不適当なエンベロープ糖タンパク質のプロセスを表している。１４０ｋＤａバンドの相対的な強度は、導入したシステインの部位に非常に依存したことから、安定なサブユニット間のジスルフィド結合が形成されるには、一定の立体的要求が満たされなければならないことが示唆された。
【０２３４】
二重システイン変異体のうちのいずれがさらなる解析のために最も適切なものであるか決定するために、我々は、強力に中和する抗ｇｐ１２０ＭＡｂ  ２Ｇ１２によってそれぞれの変異体を免疫沈降し、続くＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびデンシトメトリの後に、ｇｐ１４０およびｇｐ１２０バンドの相対的な強度を決定した（図５）。我々は、ｇｐ１４０／ｇｐ１２０比が最も高い変異体を捜し、我々はこれを分子間ジスルフィド結合の最も効率的な形成を示すものとして解釈した。図５から、変異体Ａ４９２Ｃ／Ｔ５９６Ｃがこの性質を有することは明らかである。これ以降、我々は、このタンパク質をＳＯＳ  ｇｐ１４０変異体と称する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＳＯＳ  ｇｐ１４０変異体の移動度は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯ部分がペプチド結合によって連結されているｇｐ１４０ＮＯＮタンパク質のものと同一であることに留意されたい。ＳＯＳ変異体に由来するｇｐ１４０バンドは、ｇｐ１４０ＮＯＮタンパク質に由来するものほど鮮明ではないが、その他の二重システイン変異体のいずれかから得られるｇｐ１４０バンドよりも散在性でない（図４）。これは、ＳＯＳ変異体が効率的にプロセスされることを示唆する。ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０変異体の完全な核酸配列およびアミノ酸配列は、図１３に提供してある。
【０２３５】
我々は、ゲル電気泳動の前にＤＴＴで免疫沈殿タンパク質を処理することによって、１４０ｋＤａのタンパク質が分子間ジスルフィド結合によって安定化されることを確かめた。対照的に、ｇｐ１４０ＷＴおよびｇｐ１４０ＵＮＣにおける１４０ｋＤａバンドは、未切断の単一鎖タンパク質であると予想されるので、ＤＴＴ処理による影響を受けなかった。１４０ｋＤａバンドは、Ａ４９２ＣまたはＴ５９６Ｃの単一変異体においては決して観察されなかったことに留意されたい（図６ｂ）。これは、二重システイン変異体における１４０ｋＤａバンドが、ｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯ間の分子間ジスルフィド結合の形成によって生じることのさらなる証拠となる。外因性のフューリンの非存在下では、１４０ｋＤａのＳＯＳタンパク質のバンドは、ＤＴＴによって還元されないことから、バンドがｇｐ１４０ＮＯＮの二重システイン変異体であることを示唆する（図６ｃ）。
【０２３６】
ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質におけるジスルフィド結合形成の効率を改善するためのアプローチ
ジスルフィド安定化ｇｐ１４０は、２９３Ｔ細胞の上清に存在する唯一のｅｎｖ種ではない。識別できる量のフリーのｇｐ１２０も存在する。これは、ｇｐ１２０とｇｐ４１外部ドメインとの間のジスルフィド結合が不完全な効率で形成されることを意味する。フリーのｇｐ１２０は、後述する精製法によって除去することができるが、さらにその産生を減少または除去するための試みを行った。この目的のために、挿入したシステインの近くにさらなるアミノ酸置換を行った。さらに、ｇｐ１２０のシステインの位置を変更した。我々は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のように、残基５９６のｇｐ４１システインは、分子間ジスルフィド結合形成に最も好ましいようであったので、この位置を保持した。
【０２３７】
我々は、最初にｇｐ１２０のシステイン置換の位置を、これをＮ末端またはＣ末端に配置してアラニン４９２にすることによって変化させた。ｇｐ１４０／ｇｐ１４０＋ｇｐ１２０比は、これらの新たな変異体のいずれにおいても増大されず；ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に由来する比に匹敵したままか、またはこれよりも少なかった（図７）。さらに、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に由来するものと比較して、ｇｐ１４０バンドの移動度および鮮明度は異常に減少していた（図７）。次に、我々は、アラニン４９２に隣接したリジン残基の大きな側鎖がジスルフィド結合形成を妨げるかもしれないかどうか考えた。したがって、我々は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に関して、位置４９１および４９３のリジンをアラニンに変化させたが、これらの変化は、ｇｐ１４０／ｇｐ１４０＋ｇｐ１２０比を増加せず、またｇｐ１４０（図７）の移動度に影響を及ぼしもしなかった。最後に、我々は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質にｇｐ１２０の残基４４およびｇｐ４１の６００におけるシステイン対が、野生型タンパク質に導入されたときに、かなり効率的にジスルフィド結合を生じたので、ここに第２のシステイン対を導入した（図５）。しかし、４重システイン変異体Ｗ４４Ｃ／Ａ４９２Ｃ／Ｐ６００Ｃ／Ｔ５９６Ｃは、十分に発現しなかったことから、プロセシングまたは折りたたみに問題があったことが暗示される（図７）。また、更に２つの４重システイン変異体Ｗ４４Ｃ／Ｋ４９１Ｃ／Ｐ６００Ｃ／Ｔ５９６ＣおよびＷ４４Ｃ／Ｋ４９３Ｃ／Ｐ６００Ｃ／Ｔ５９６Ｃ（図７）においても、不十分な発現が観察された。
【０２３８】
ジスルフィド安定化変異体の効率または全体的発現を最適化するためのさらなるアプローチも可能である。たとえば、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質を発現する全ての細胞における適切なレベルのフューリンを保証するために、フューリンと共に安定してトランスフェクトされた細胞を作製することもできるであろう。同様に、フューリンおよびｇｐ１４０タンパク質は、単一のプラスミドから共発現させることもできる。Ｋ４９１およびＫ４９３を、単独でまたは対として非アラニン残基に変異させることもできる。導入したシステインをよりうまく適応させるために、導入したシステインの近くのその他のｇｐ１２０および／またはｇｐ４１アミノ酸を同様に変異させることもできる。
【０２３９】
ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の抗原性は、ウイルスに結合したｇｐ１２０−ｇｐ４１のものに匹敵する
ｇｐ１４０ＮＯＮと比較して、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、抗原性にいくらかの相違を有し、我々は、ビリオンに結合したｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体の構造を模倣することを目的としたタンパク質には望ましいと考える。これらを以下に要約してある。
【０２４０】
１）ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、強力な中和ＭＡｂ  ＩｇＧ１ｂ１２および２Ｇ１２に対し、またＣＤ４−ＩｇＧ２分子に対して強く結合する（図８ａ）。ＲＩＰＡ法は、相対的な親和性の正確な測定を可能にするほど十分に定量的ではないが、これらのＭＡｂｓおよびＣＤ４−ＩｇＧ２分子の、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質との反応性は、ｇｐ１４０ＮＯＮとｇｐ１２０タンパク質とのものよりも実質的に大きいようである（図８ａ）。明らかに、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、完全なＣＤ４−結合部位を有する。また、Ｖ３ループエピトープは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質上でアクセスできることが、そのＭＡｂ  ｓ１９ｂおよび８３．１（図８ａ）との反応性によって示された。
【０２４１】
２）逆に、いくつかの非中和抗ｇｐ１２０ＭＡｂは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に対して十分にまたは全く結合しないが、これらは、ｇｐ１４０ＮＯＮおよびｇｐ１２０と強く反応する（図８ｂ）。これらのＭＡｂｓは、ｇｐ４１の結合に関与し、かつ適切に形成されたｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体の状況ではふさがれると考えられるｇｐ１２０の領域であるＣ１およびＣ５ドメインに対するものを含む（Ｍｏｏｒｅ，  １９９４ａ；  ａｎｄ  Ｗｙａｔｔ，  １９９７）。逆に、Ｃ１およびＣ５に対するＭＡｂｓは、全てがｇｐ１４０ＮＯＮタンパク質と強く反応した（図８ｂ）。
【０２４２】
３）可溶性ＣＤ４を事前に結合させることによるＭＡｂ  １７ｂのエピトープの暴露は、ｇｐ１４０ＮＯＮまたはｇｐ１２０タンパク質よりも、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質においてはるかに効率的に生じる（図８ｃ）。実際に、可溶性ＣＤ４の非存在下では、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質と１７ｂの反応性は非常にわずかであった。ＣＤ４で誘導されるＭＡｂ  １７ｂのエピトープは、ｇｐ１２０の補助受容体結合部位とオーバーラップし；ＣＤ４の結合後にウイルス−細胞の融合を惹起するコンホメーション変化の際に、この部位がビリオンに結合したｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体においてさらされると考えられる。１７ｂエピトープの誘導は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のｇｐ１２０部分が、ウイルス結合ｇｐ１２０−ｇｐ４１と同様の静止（ｓｔａｔｉｃ）コンホメーションおよびコンホメーション自由度を備えていることを示唆する。ｇｐ１４０ＮＯＮタンパク質は、構成的に１７ｂに結合し、また可溶性ＣＤ４の結合によりいくらかの１７ｂエピトープの誘導があったが、これは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質よりも生じなかった。
【０２４３】
４）もう一つのｇｐ１２０上のＣＤ４誘導性エピトープは、ＭＡｂ  Ａ３２によって認識されるものである（Ｍｏｏｒｅ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  １９９８）。ＳＯＳ  ｇｐ１４０変異体に対するＡ３２のごくわずかな結合が、可溶性ＣＤ４の非存在下で生じたが、エピトープは、可溶性ＣＤ４の結合によって強力に誘導された（図８ｃ）。１７ｂで観察されたとおり、Ａ３２エピトープは、ｇｐ１４０ＮＯＮタンパク質上では、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質上よりも効率的に誘導されなかった。
【０２４４】
５）ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質と非中和ｇｐ４１ＭＡｂのセットのいずれとも反応性がなかったが、これらのＭＡｂの全てが、ｇｐ１４０ＮＯＮタンパク質に強く結合した。これらの抗ｇｐ４１ＭＡｂｓは、ｇｐ４１の外部ドメインのいくつかの領域を認識し、その全てが、ビリオンに結合したｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体のｇｐ１２０によってふさがれていると思われる（Ｍｏｏｒｅ，  １９９４ａ；  ａｎｄ  Ｓａｔｔｅｎｔａｕ，  １９９５）。これらがＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に結合することができないことは、このタンパク質が天然の三量体のものと同様の立体配置を採用するというもう一つの強力な指標であり；これらがｇｐ１４０ＮＯＮタンパク質を強く認識することは、これらのタンパク質が、ｇｐ４１とｇｐ１２０を連結するペプチド結合のために異常なコンホメーションを有するという見通しと一致する（Ｅｄｉｎｇｅｒ，  １９９９）（図８ｄ）。
【０２４５】
６）非中和ＭＡｂで観察されたこととは著しく反して、中和抗ｇｐ４１ＭＡｂ  ２Ｆ５は、効率的にＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に結合したが、ｇｐ１４０ＮＯＮタンパク質には結合しなかった。２Ｆ５エピトープは、天然のｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体に関して十分に暴露されていると思われる唯一のｇｐ４１領域であることに留意されたい（Ｓａｔｔｅｎｔａｕ、１９９５）。これが２Ｆ５に結合する能力は、また、天然の三量体のものと同様の立体配置のＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質にが採用するものと一致する。
【０２４６】
ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の抗原特性をＷ４４Ｃ／Ｔ５９６Ｃ  ｇｐ１４０変異体のものと比較した。Ｃ１ドメイン内にシステイン置換を含む変異体のセットの中で、これはｇｐ１４０形成において最も効果的なものであった。Ｗ４４Ｃ／Ｔ５９６Ｃ  ｇｐ１４０は、２Ｇ１２ＭＡｂと十分に反応したが、ＣＤ４−ＩｇＧ２およびＩｇＧ１ｂ１２にはあまり十分に結合しなかった。さらに、Ｗ４４Ｃ／Ｔ５９６Ｃ  ｇｐ１４０における１７ｂエピトープは、可溶性ＣＤ４によってほとんど誘導されなかったが、非中和抗ｇｐ４１ＭＡｂｓとのさらに強い反応性があった（図８）。したがって、我々は、この変異体が最適状態に及ばない抗原特性を有すると判断する。実際に、Ｗ４４Ｃ／Ｔ５９６Ｃｇｐ１４０タンパク質とＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質との間の性質の対比では、分子間ジスルフィド結合の位置が、生じるｇｐ１４０分子の抗原構造に有意な影響を有することを示している。
【０２４７】
ｇｐ１４０ＳＯＳタンパク質の抗原性の特徴とは対照的に、ｇｐ１４０ＷＴおよびｇｐ１４０ＵＮＣの１４０ｋＤａタンパク質は、Ｇ３−５１９および７Ｂ２などの非中和抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１ＭＡｂと強く反応した。さらに、ＭＡｂ  １７Ｂによって認識されるエピトープは、ＣＤ４誘導性ではなく、構成的に暴露された（図８ｅ）。
【０２４８】
全体として、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に対するＭＡｂｓの結合と、これらがＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬを中和する能力との間には強い相関があった。この相関は、ｇｐ１４０ＮＯＮ、ｇｐ１４０ＵＮＣ、またはｇｐ１２０タンパク質では観察されなかった。
【０２４９】
サブユニット間のジスルフィド結合の形成は、単離体に依存しない
ＨＩＶ−１単離体ＪＲ−ＦＬに由来するｇｐ１４０タンパク質での我々の観測の一般性を評価するために、その他のＨＩＶ−１株に由来するｇｐ１４０の二重システイン変異体を作製した。これらは、Ｒ５Ｘ４ウイルスＤＨ１２３およびＸ４ウイルスＨｘＢ２を含む。それぞれの場合において、システインは、ＪＲ−ＦＬのアラニン４９２およびスレオニン５９６と同じ残基に導入した。生じたＳＯＳタンパク質を一過性に２９３Ｔ細胞に発現させて、ＲＩＰＡによって解析し、これらの構築、プロセシング、および抗原性を確認した。図９に示したように、ＤＨ１２３およびＨｘＢ２ＳＯＳタンパク質において、１４０ｋＤａの物質が効率的に形成され、我々の方法が効率よく多様なウイルス単離体のエンベロープタンパクを安定化できることを示す。
【０２５０】
可変ループおよびグリコシル化部位領域において、ＨＩＶエンベロープタンパクのジスルフィド安定化を修飾した
一定の可変ループおよびグリコシル化部位変異により、根底にある保存された中和エピトープを十分にさらす手段をもたらすという証拠があるので、我々は、ジスルフィド安定化形態の構築および抗原性を検討した。最初の研究において、Ａ４９２Ｃ／Ｔ５９６Ｃ  ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０変異体を、上記したとおりにそれぞれΔＶ１、ΔＶ２、ΔＶ３、ΔＶ１Ｖ１＊、およびΔＶ１Ｖ２＊Ｖ３分子について作製した。ΔＶ１Ｖ２＊Ｖ３タンパク質については、アミノ酸３５７および３９８のＮ→Ｑ点変異によってグリコシル化部位変異体も合成した。
【０２５１】
それぞれの単独および二重のループ欠失変異体について、我々は、全長ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に匹敵する量のｇｐ１４０バンドを検出することができた（図１１ｂ）。可変ループの欠失がオリゴマー状態における抗原性を変化させるかどうかを理解するために、我々は、ＭＡｂｓのパネルでΔＶ３およびΔＶ１Ｖ２＊ＳＯＳタンパク質を沈殿させた（図１２）。２Ｆ５以外のｇｐ４１に対するＭＡｂｓは、システイン安定化タンパク質のループ欠失バージョンに結合しなかったことから、これらのエピトープがなおもふさがれていることが示される。Ｃ１およびＣ５エピトープに対するＭＡｂｓは、同様に無反応であった。中和抗体２Ｆ５は、変異体に結合し、特にΔＶ３  ＳＯＳタンパク質と反応した。ＣＤ４ＢＳに対するＭＡｂｓ（ＩｇＧ１ｂ１２、Ｆ９１）並びに２Ｇ１２は、これらの変異体にも強力に結合した。ＣＤ４−ＩｇＧ２および２Ｇ１２は、非常に高い親和性でオリゴマーのΔＶ３  ＳＯＳタンパク質に結合したことに留意されたい。さらに、ＣＤ４ｉエピトープがΔＶ１Ｖ２＊タンパク質において構成的に暴露されていることを示すデータと一致して、ΔＶ１Ｖ２＊ＳＯＳ変異体に対するＭＡｂｓ  １７ｂおよびＡ３２の結合は、ｓＣＤ４によって誘導性ではなかった。しかし、ΔＶ３  ＳＯＳ変異体は、ｓＣＤ４の非存在下において１７ｂおよびＡ３２に弱く結合し、その存在下では強く結合した。これらの結果は、Ｖ１／Ｖ２およびＶ３ループ構造が、ＣＤ４ｉエピトープをふさぐことに関与するという観測と一致する（Ｗｙａｔｔ，  １９９５）。合わせると、結果は、可変ループ欠失ｇｐ１４０ｓが、コンホメーションの整合性をなくすことなく、ジスルフィド安定化され得ることを示す。図１４および１５は、それぞれΔＶ１Ｖ２＊およびΔＶ３  ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳタンパク質の完全な核酸およびアミノ酸配列を含む。
【０２５２】
ΔＶ１Ｖ２＊Ｖ３およびΔＶ１Ｖ２＊Ｖ３  Ｎ３５７Ｑ  Ｎ３９８Ｑ  ＳＯＳ変異体については、我々は、い種々の中和および非中和ＭＡｂｓのいずれによってもｇｐ１４０（１１０ｋＤａおよび１０５ｋＤａ）を沈殿させることができなかった（図１１ａ、レーン３、４、７、および８）。しかし、我々は、変異体ｇｐ１２０ドメインと一致する強い９０ｋＤａおよび８５ｋＤａのバンドを観察した。これらの予備実験は、１つまたは複数の導入したシステインの位置を調整すること、さらなるシステイン対を付加すること、導入したシステインに隣接したアミノ酸を修飾すること、およびループを欠損する方法を修飾することを含む、ジスルフィドを安定化する３つのループを欠損したｇｐ１４０ｓによる様々なアプローチを示唆する。あるいは、その他のＨＩＶ単離体に由来する３つのループを欠失したｇｐ１４０ｓは、４９６／５９２に相同的な残基にシステインを導入することによって、より容易に安定化されるであろう。
【０２５３】
組換えＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の産生および精製
ミリグラム量の高品質ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質は、ＰＰＩ４エンベロープ発現プラスミドを安定してトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において産生する（米国特許第５，８８６，１６３号および第５，８６９，６２４号）。ＰＰＩ４発現ベクターは、β−グロビンプロモーターの制御下にｄｈｆｒ遺伝子を含む。ｄｈｆｒ＋クローンのヌクレオシドフリー培地における選択には、メトトレキセート濃度の段階的増加を使用する遺伝子増幅に従う。サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターは、異種遺伝子の高発現を促進し、ＴＰＡシグナル配列は、効率的なタンパク質分泌を保証する。高レベルのｇｐ１２０の発現および分泌は、開始ＡＴＧコドンまでおよび開始ＡＴＧコドンを含むＣＭＶ  ＭＩＥ遺伝子の完全な５'非コード配列の含むもののみで得られる。ミリグラム量のタンパク質を産生するために、組換えＣＨＯ細胞をローラーボトル内の選択培地にまいてコンフルエンシーに培養する。次いで、産生段階では、減少した血清を含む培地を使用し、このとき、上清を毎週二回回収する。レクチン親和性、イオン交換、および／またはゲル濾過クロマトグラフィーを含む精製プロセスを非変性条件下で行う。
【０２５４】
安定化ＨＩＶ−１エンベロープサブユニットタンパク質の免疫原性を決定するためのプロトコル
精製された組換えＨＩＶ−１エンベロープタンパクを適切なアジュバント（たとえば、ＡｌｕｍまたはＲｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ）中に処方する。ａｌｕｍについては、変異体ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（リン酸緩衝生理食塩水、通常の塩類溶液、または同様の培地の溶液）を、予め形成した水酸化アルミニウムゲル（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）と約５００μｇ／ｍＬアルミニウムの終濃度に合わせることによって製剤が得られる。抗原をａｌｕｍゲル上に室温で２時間吸着させる。モルモットまたはその他の動物に、約１００μｇの処方した抗原を皮下、筋肉内、または腹腔内の経路によって毎月の間隔で５回免疫した。免疫した動物からの血清を隔週の間隔で回収して、ＨＩＶ−１エンベロープタンパクとの反応性について上記の通りにＥＬＩＳＡで、および中和活性について、十分に確立されたＨＩＶ−１感染性アッセイ法（Ｔｒｋｏｌａ，  １９９８）で試験した。下記のように、免疫原性およびＳＨＩＶ−マカクまたはＨＩＶ感染症のその他の非ヒト霊長動物モデルの感染を防止または治療する効率について、最も高レベルのＨＩＶ−１中和抗体を誘発するワクチン候補を試験することができる。サブユニットワクチンは、単独で、または保護的な細胞性免疫反応を誘発するためにデザインされたものなどのその他のワクチン成分と組み合わせて使用することができる。
【０２５５】
これらの研究のために、ＨＩＶ−１エンベロープタンパクは、ＣＤ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４などの１つまたは複数の細胞のＨＩＶ受容体との複合体中に投与されてもよい。上記の通りに、可溶性ＣＤ４の結合により、安定化ＨＩＶ−１エンベロープタンパク上において、以前にはわかりにくかった保存された中和エピトープが暴露される。これらまたはその他の新エピトープに対して生じた抗体は、有意な抗ウィルス活性を備えているであろう。上記の通りに、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４などの融合補助受容体とＣＤ４−ｅｎｖ複合体の相互作用は、ＨＩＶ融合に必要なｅｎｖにおけるさらなるコンホメーション変化を誘発すると考えられる。したがって、安定化ｅｎｖ、ＣＤ４、および補助受容体を含む三者の複合体は、さらなる融合中間コンホメーションを採り、その幾つかは、治療的およびおそらく免疫学的な処置のために十分なほど長命であると思われる（Ｋｉｌｂｙ，  １９９８）。ｅｎｖ−ＣＤ４およびｅｎｖ−ＣＤ４補助受容体複合体を調製および投与するための方法は、当業者に周知である（ＬａＣａｓｓｅ，  １９９９；  Ｋａｎｇ，  １９９４；  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｈｏｎｉ，  １９９３）。
【０２５６】
安定化ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする核酸に基づくワクチンの免疫原性を決定するためのプロトコル
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号Ｖ２６０−２０）から入手可能なｐＶＡＸ１などのＤＮＡワクチンプラスミドベクターに核酸をサブクローン化するために、ＰＣＲ技術を使用する。ＰＶＡＸ１は、１９９６年１２月２２日に刊行されたＦＤＡ文書「予防的感染症の適応症のためのプラスミドＤＮＡワクチンについて考慮する点」の規格にしたがって開発された。ＰＶＡＸ１は、以下の特徴を有する：真核生物のＤＮＡ配列は、染色体組込みの可能性を最小にするために、発現のために必要なものに限定し、アンピシリンは、一部の個体においてアレルギー応答を引き起こすことが報告されているので、大腸菌においてベクターを選択するためにカナマイシンを使用し、ｐＶＡＸ１からの組換えタンパク質の発現レベルは、その親ベクターのｐｃＤＮＡ３．１で達成されるものに匹敵し、かつ小さなサイズのｐＶＡＸ１および種々の独特なクローニング部位により、非常に大きなＤＮＡ断片のサブクローニングさえ増幅する。
【０２５７】
インビボにおけるジスルフィド安定化タンパク質の発現を最適化するために、いくつかの方法を使用することができる。たとえば、イントロンＡおよびＣＭＶプロモーターの接合領域を含む、最適化されたＰＰＩ４発現ベクターの一定のエレメントをｐＶＡＸ１に挿入するために、標準的なＰＣＲクローニング技術を使用することができる。さらに、ＨＩＶ−１エンベロープのゲノムＤＮＡ配列は、哺乳類細胞における発現に最適ではないコドンの方へ偏っている（Ｈａａｓ，  １９９６）。これらは、核酸に基づいたＨＩＶワクチンの免疫原性を改善するために、標準的な変異生成技術を使用してより有利なコドンに変更することができる（Ａｎｄｒｅ，  １９９８）。コドン最適化ストラテジーでは、ＤＮＡワクチンの免疫原性を増大することが知られているＣｐＧモティーフの数を増大しようと努力することもできる（Ｋｌｉｎｍａｎ，  １９９７）。最後に、上記した一過性のトランスフェクション系については、ｅｎｖのｇｐ１２０−ｇｐ４１へのプロセシングは、同じか、または別の発現ベクターに導入された異種フューリンの発現によって容易になるであろう。
【０２５８】
インサートを含むプラスミドは、直接の注射または遺伝子銃技術の使用などの手段によって、動物に投与することができる。このような方法は、当業者に既知である。
【０２５９】
１つのプロトコルにおいて、アカゲザルマカクに、約１ｍｇ用量の核酸をそれぞれ５回接種する。用量は、４週間隔で送達する。それぞれの用量は、筋肉内に投与する。用量は、４週間隔で送達される。４月後、動物には、２つの別々の部位に、３００μｇの変異体ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を含むまたは含まない２ｍｇの核酸による単一の免疫化を受けさせる。このシリーズは、１回または複数回の引き続く組換えタンパク質サブユニットの追加免疫を伴ってもよい。動物からは、２〜４週間隔で採血する。それぞれのブリードから血清試料を調製し、次の節にて説明したように、特異的な抗体の発生についてアッセイする。
【０２６０】
ＳＨＩＶチャレンジ実験
いくつかのキメラＨＩＶ−ＳＩＶウイルスが作製されており、かつアカゲザルにおける感染性について特徴づけられている。ウイルスチャレンジ実験のために、アカゲザルには、９／１０を超える動物を感染させるために十分な予め力価を測定した用量のウイルスを静脈内に注射する。ＳＨＩＶ感染は、２つのアッセイ法によって決定する。サル血清におけるＳＩＶｐ２７抗原のＥＬＩＳＡ検出は、市販のキット（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して決定する。同様に、抗ｇａｇ抗体のウエスタンブロット検出は、市販のキット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して行う。
【０２６１】
対照サルに対する免疫化における感染率または産生されるｐ２７抗原の量のいずれかの減少により、ワクチンまたはワクチンの組み合わせが予防的な価値を有することを示すと考えられる。
【実施例２】
【０２６２】
実験セットＩＩ
Ａ．  結果の概要
ヒト免疫不全ウイルス・タイプ１（ＨＩＶ−１）エンベロープ糖タンパク質のｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニットは、弱い、非共有性相互作用を介して結合し、これは、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の適切な部位に導入されたシステイン残基間のサブユニット間ジスルフィド結合によって安定化させることができる。ＳＯＳ  ｇｐ１４０と称されるこのようなタンパク質の性質は、本明細書に記載してある。蛋白質加水分解で切断されないｇｐ１４０（ｇｐ１４０ＵＮＣ）のＨＩＶ１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１２０を、安定してトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に発現させて、精製の前後の抗原性および構造上の性質について解析した。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）および放射性免疫沈降アッセイ法において、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、広範な中和モノクロナール抗体（ＭＡｂｓ）の２Ｇ１２（抗ｇｐ１２０）および２Ｆ５（抗ｇｐ４１）に強く結合したが、ｇｐ１４０ＵＮＣは、これらのＭＡｂｓに結合しなかった。さらに、ＣＣＲ５結合部位と重複するＣＤ４誘導エピトープに対するＭＡｂ１７ｂは、ｇｐ１４０ＵＮＣに対してよりも、ＳＯＳ  ｇｐ１４０に対してより強くかつ迅速に結合した。対照的に、ｇｐ１４０ＵＮＣは、非中和抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１ＭＡｂｓとより強い反応性を示した。一連の免疫電子顕微鏡法研究では、ＳＯＳ  ｇｐ１４０において、このタンパク質の抗原特性と一致して、ｇｐ４１外部ドメイン（ｇｐ４１ＥＣＴＯ）がｇｐ１２０の「非中和」面をふさぐというモデルが示唆された。また、高解像度分子分級法であるＢｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）を、精製された形態および未精製の形態のウイルスエンベロープタンパク質の研究に対して適用することが議論されている。ＢＮ−ＰＡＧＥおよびその他の生物物理学的研究により、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は単量体であるが、ｇｐ１４０ＵＮＣはＢＮ−ＰＡＧＥによって二量体、三量体、および四量体に分離され得る、非共有性に結合した、ジスルフィド結合したオリゴマーの混合物を含むことが示された。これらのタンパク質のオリゴマーおよび抗原特性は、大部分は精製による影響を受けなかった。また、ＳＯＳシステインの変異（ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣ）を含む切断されていないｇｐ１４０タンパク質がオリゴマーであったことは、オリゴマーｇｐ１４０タンパク質のｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニットへの切断がｇｐ４１−ｇｐ４１相互作用を不安定にすることを示している。これは、融合が生じるために必要であろうが、天然のビリオン結合構造を模倣する組換えエンベロープ糖タンパク質複合体の産生を妨げる。驚くべきことに、可変ループが削除されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、全長タンパク質よりも有意に安定な、切断された、非共有結合で結合したオリゴマーとして発現された。これは、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の蛋白質加水分解によって成熟した形態を精製されたオリゴマーの形態で産生するための１つの経路を示唆する。全体として、我々の所見は、合理的なワクチンのデザインに対する関連を有する。
【０２６３】
Ｂ．導入
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を標的とするＨＩＶワクチンの開発は、天然のエンベロープ糖タンパク質複合体に固有の不安定性によって妨げられていた。したがって、天然の構造をより模倣するエンベロープ糖タンパク質複合体のより安定な形態を開発する必要がある。
【０２６４】
天然の複合体の不安定性を解決するアプローチは、ｇｐ１２０とｇｐ４１サブユニットの間に天然に存在する切断部位を除去することである。このような手段により、この部位のプロテオリシスが起こらず、ｇｐ１２０サブユニットがペプチド結合によってｇｐ４１の外部ドメイン（ｇｐ４ｌＥＣＴＯ）に共有結合で連結しているｇｐ１４０糖タンパク質の発現を引き起こす（Ｂｅｒｍａｎ，  １９９０；  Ｂｅｒｍａｎ，  １９８８；  Ｅａｒｌ，  １９９７；  Ｅａｒｌ，  １９９４  ；  ａｎｄ  Ｅａｒｌ，  １９９０）。このようなタンパク質は、オリゴマー、ときに三量体であり得る（Ｃｈｅｎ，  ２０００；  Ｅａｒｌ，  １９９７；  Ｅａｒｌ，  １９９４  ；  Ｅａｒｌ，  １９９０；  Ｅａｒｌ，  ２００１；  Ｅｄｉｎｇｅｒ，  ２０００；  Ｆａｒｚａｎ，  １９９８；  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９９６；  Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ，  ２０００  ；  Ｙａｎｇ，  ２０００ａ；  Ｙａｎｇ，  ２０００ｂ；  Ｙａｎｇ，  ２００１；  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，  ２００１）。
【０２６５】
しかし、これらが本当に、ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位を十分に利用した天然の融合適格性の複合体の構造を表すかは明らかではない。それゆえに、未切断のｇｐ１４０（ｇｐ１４０ＵＮＣ）タンパク質の受容体結合特性が損なわれる傾向があり、非中和抗体のエピトープがこれら上にさらされ、おそらく天然の構造に到達できない（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ  ；  Ｂｕｒｔｏｎ，  １９９７；  Ｈｏｆｆｍａｎ，  ２０００；  Ｓａｔｔｅｎｔａｕ，  １９９５  ；  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，  ２００１）。
【０２６６】
ｇｐ１２０−ｇｐ４１不安定性の課題に対する別のアプローチは、切断部位を保持するが、ｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯサブユニット間でジスルフィド結合を導入することである（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ  ；  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。適切に配置されると、この分子間ジスルフィド結合は、エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）合成の間に効率的に形成されて、蛋白質加水分解でプロセスされたｇｐ１４０タンパク質を分泌するが、ｇｐ１２０およびｇｐ４ｌＥＣＴＯサブユニット間の結合は、ジスルフィド結合によって維持されている。
【０２６７】
本明細書において、我々は、ｇｐ４１−ｇｐ４１の相互作用がＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質において不安定であり、これが主に単量体として発現して精製されることを示す。対照的に、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、ＳＯＳシステインの置換の有無にかかわらず多量体であることから、ｇｐ１２０およびｇｐ４１間のペプチド結合の切断が天然の複合体を不安定にすることが暗示される。単量体であるにもかかわらず、精製された形態および精製されていない形態のＳＯＳ  ｇｐ１４０は、対応するｇｐ１２０またはｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質よりも、天然の、融合適格性の、Ｅｎｖ構造のより良い抗原性構造擬態である。これは、ｇｐ４１ＥＣＴＯの存在および向きが、ＳＯＳ  ｇｐ１４０の一定の非中和エピトープをふさぎ、一方で重要な中和部位を提示するためであろう。この説明は、タンパク質の免疫電子顕微鏡法研究と一致する。予想外に、蛋白質加水分解により成熟しているが、可変ループが欠損したＳＯＳ  ｇｐ１４０糖タンパク質は、オリゴマーの安定度を増強し、このように、これらの分子は、これらの構造上および免疫原性の性質についてのさらなる研究の根拠となる。
【０２６８】
Ｃ．材料および方法
プラスミド。ＳＯＳおよびＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０の切断されていない形態をコードするｐＰＰＩ４真核生物発現ベクターは、以前に記載されている（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  ａｎｄ  Ｔｒｋｏｌａ，  １９９６）。ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、ｇｐ１２０のＣ５領域の残基Ａ５０１およびｇｐ４１の残基Ｔ６０５にシステイン置換を含む（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。ｇｐ１４０ＵＮＣでは、ｇｐ１４０がｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯに切断することを防止するために、ｇｐ１２０とｇｐ４１ＥＣＴＯとの間の接合部における配列ＫＲＲＶＶＱＲＥＫＲＡＶを六量体のＬＲモチーフと置換した（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）。ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０の可変ループ欠損した形態をコードするプラスミドは、記載されている（Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。これらの構築物において、Ｖ１ループ配列（Ｄ１３３−Ｋ１５５）およびＶ２ループ配列（Ｆ１５９−１１９４）を単独でまたは組み合わせて置換するために、トリペプチドＧＡＧを使用する。ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０に存在するシステイン置換と同じものを含むが、ｇｐ１４０の切断を防止するために、ｇｐ１２０−ｇｐ４１ＥＣＴＯ切断部位の残基ＲＥＫＲが配列ＩＥＧＲによって置換されている。フューリン遺伝子（Ｔｈｏｍａｓ，  １９８８）は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．ｌ  フューリン（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）から発現させた。
【０２６９】
ＭＡｂｓおよびＣＤ４に基づくタンパク質。以下の抗ｇｐ１２０  ＭＡｂｓを使用した：ＩｇＧ１ｂ１２［ＣＤ４結合部位（Ｂｕｒｔｏｎ，  １９９４）に対する］、２Ｇ１２［独特なＣ３−Ｖ４グリカン依存性エピトープ（Ｔｒｋｏｌａ，  １９９６）に対する］、１７ｂ［ＣＤ４誘導性のエピトープ（Ｔｈａｌｉ，  １９９３）に対する］、１９ｂ［Ｖ３ループ（Ｍｏｏｒｅ，  １９９５）に対する］、および２３Ａ［Ｃ５領域（Ｍｏｏｒｅ，  １９９６）に対する］。抗ｇｐ４１  ＭＡｂｓは、２Ｆ５［配列ＥＬＤＫＷＡの中心にあるクラスタ１エピトープに対する（Ｍｕｓｔｅｒ，  １９９３；  ａｎｄ  Ｐａｒｋｅｒ，  ２００１）］および２．２Ｂ［エピトープクラスタＩＩに対する］であった。ＭＡｂｓ  ＩｇＧ１ｂ１２、２Ｇ１２、および２Ｆ５は、広く中和する（Ｔｒｋｏｌａ，  １９９５）。ＭＡｂ  １７ｂは、可溶性ＣＤ４が存在する場合には、種々のＨＩＶ−１株を弱く中和するが（Ｔｈａｌｉ，  １９９３）、初代単離株に対するＭＡｂ  １９ｂの中和活性は、限定されている（Ｔｒｋｏｌａ，  １９９８）。ＭＡｂｓ  ２３Ａおよび２．２Ｂは、非中和性である。可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）およびＣＤ４に基づいた分子ＣＤ４−ＩｇＧ２は、他で記載した（Ａｌｌａｗａｙ，  １９９５）。
【０２７０】
ＨＩＶ−１ｇｐ１４０およびｇｐ１２０糖タンパク質。全長ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０またはΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０を分泌する安定細胞株を作製するために、我々は、ｐｃＤＮＡ３．１フューリンとｐＰＰＩ４−ＳＯＳ  ｇｐ１４０（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）またはｐＰＰＩ４−ΔＶｌＶ２＊ＳＯＳ  ｇｐ１４０（Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）をそれぞれＤＸＢ−１１ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）陰性ＣＨＯ細胞に、リン酸カルシウム沈殿法を使用して同時トランスフェクトした。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ジェネティシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）およびメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含むヌクレオシドフリーのα−ＭＥＭ培地に細胞をまき、二重に形質転換された細胞を選択した。他で（Ａｌｌａｗａｙ，  １９９５）に記載したとおり、メトトレキセート濃度を段階的に増加することによって細胞のｇｐ１４０発現を増幅させた。培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に基づいて、ＳＯＳ  ｇｐ１４０の発現、構築、およびエンドプロテアーゼによるプロセシングについてクローンを選択した。ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣを発現するＣＨＯ細胞は、ｐｃＤＮＡ３．１フューリンおよびジェネティシンを使用しなかったことを除き、同様の方法を使用して作製した。全長ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、他で（Ｔｒｋｏｌａ，  １９９６）に記載したとおり、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチンアフィニティークロマトグラフィ（Ｓｉｇｍａ）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００のゲル濾過クロマトグラフィ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）によって、ＣＨＯ細胞培養上清から精製した。ｇｐ１４０ＵＮＣ糖タンパク質は、レクチンクロマトグラフィのみによって精製した。精製されたＥｎｖｓの濃度を、記載されたとおりに（Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，  １９９３）ＵＶ分光法によって測定し、ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定解析によって実証した。組換えＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ、ＨＩＶ−１ＬＡＩ、およびＨＩＶ−１ＹＵ２  ｇｐ１２０糖タンパク質は、先に述べていた方法を使用して産生した（Ｔｒｋｏｌａ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｗｕ，  １９９６）。
【０２７１】
示した場合には、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質は、以前に記載したとおり（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）、Ｅｎｖおよびフューリンを発現するプラスミドをトランスフェクションすることによって接着２９３Ｔ細胞において一過性に発現させた。放射性免疫沈降アッセイ法のためには、解析の２４時間前に、タンパク質を［３５Ｓ］システインおよび［３５Ｓ］メチオニンで代謝的にラベルした。
【０２７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、放射性免疫沈降、Ｂｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ、およびウエスタンブロット解析。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析は、他で（Ｂｉｎｌｅｙ２０００ａ）記載したとおりに行った。還元した試料および非還元の試料は、それぞれ５０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下または非存在下において、ラムリー試料緩衝液（６２．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％のＳＤＳ、２５％のグリセロール、０．０１％のブロムフェノールブルー）中で２分間煮沸することによって調製した。タンパク質純度は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）の使用に続いて、染色したゲルの濃度測定解析によって決定した。放射性免疫沈降アッセイ法（ＲＩＰＡ）は、Ｅｎｖを含有する細胞培養上清において、先に記載したとおりに（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）行った。
【０２７３】
Ｂｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ（ＢＮ）ＰＡＧＥは、公開された方法に軽微な改変をして行った（Ｓｃｈａｇｇｅｒ，  １９９４；  ａｎｄ  Ｓｃｈａｇｇｅｒ，  １９９１）。したがって、精製されたタンパク質試料または細胞培養上清は、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填する直前に、１００ｍＭの４−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．７、４０％のグリセロール、０．１％のクマシーブルーを含む同体積の緩衝液で希釈した。典型的には、ゲル電気泳動は、陰極緩衝液として５０ｍＭのＭＯＰＳ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．７、０．００２％のクマシーブルーを、および陽極緩衝液として５０ｍＭのＭＯＰＳ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．７を使用して、１５０Ｖ（〜０．０７Ａ）で２時間行った。精製されたタンパク質を解析するときは、電気泳動工程に続いて、ゲルを５０ｍＭのＭＯＰＳ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．７を数回交換して脱色した。典型的には、レーンあたりに５μｇの精製されたタンパク質を充填した。
【０２７４】
ウエスタンブロット解析のためには、ゲルおよびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を転写緩衝液（１９２ｍＭのグリシン、２５ｍＭのトリス、０．０５％ＳＤＳ、ｐＨ８．８を含む２０％のメタノール）に１０分間浸漬した。転写に続いて、ＰＶＤＦ膜を２５'％メタノールおよび１０％の酢酸を使用してクマシーブルー色素を脱色して空気乾燥した。脱色した膜は、抗Ｖ３ループＭＡｂ  ＰＡ１（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）に続いてワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ラベルした抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）をそれぞれ０．２μｇ／ｍＬの終濃度で使用して探索した。エンベロープ糖タンパク質の照度検出は、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ７ウエスタンブロット化学発光反応プラス系（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）によって得た。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アポフェリチン、およびサイログロブリンをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）から得て分子量標準として使用した。
【０２７５】
マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）マススペクトル分析。解析前に、タンパク質を水に対して一晩透析した。示した場合には、ＳＯＳ  ｇｐ１４０（１ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）によって還元し、その後、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を透析前に添加して１００ｍＭの終濃度にした。試料を同体積のシナピン酸マトリックス溶液と混合し、室温で乾燥させてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析（Ｌｅｗｉｓ，  １９９８）によって分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＶｏｙａｇｅｒＳＴＲマススペクトロメータにおいて、遅延性抽出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）で得た。３３７ｎｍで操作した窒素レーザ（Ｌａｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）で、試料を照射した。試料標的において産生されたイオンは、３００００Ｖの偏向電圧で加速した。
【０２７６】
沈降平衡解析。沈降平衡測定は、Ａｎ−６０  Ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ａオプティマ分析用超遠心機で、２０℃においておこなった。タンパク質試料を５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌに対して一晩透析し、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、および１ｍＭの初期濃度で充填し、次いで６−セクターのセル中で、６，０００および９，０００ｒｐｍのローター速度で遠心して透析した。データは、ローター速度毎に２つの波長で得て、同時にルーチンに適合する非線形最小二乗法で処理した（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  １９８１）。溶媒密度およびタンパク質部分特異的な体積は、それぞれ溶媒およびタンパク質の組成に従って算出した（Ｌａｕｅ，  １９９２）。
【０２７７】
サイズ排除クロマトグラフィー。ＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ＵＮＣ、およびｇｐ１２０タンパク質を発現した精製ＣＨＯ細胞を、緩衝液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用するＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ  ＨＰＬＣカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＰＡ）のサイズ排除クロマトグラフーィによって分析した。タンパク質保持時間は、２８０ｎｍの波長で、カラム廃液のＵＶ吸光度をモニターすることによって決定した。カラムは、モデルタンパク質として、２２０ｋＤａ、４４０ｋＤａおよび８８０ｋＤａ（Ｇｅｒｌ，  １９８８）のオリゴマー状態で存在するフェリチンを使用して較正した。
【０２７８】
表面プラスモン共振測定
免疫電子顕微鏡観察。ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１２０の単独、並びにＭＡｂ、ＭＡｂ断片、およびｓＣＤ４との複合体の免疫電子顕微鏡解析は、以前に記載したとおりに（Ｒｏｕｘ，  １９８９；  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，  １９９６）、ギ酸ウラニルでネガティブ染色することによって行った。ＪＥＯＬＪＥＭＣＸ−１００電子顕微鏡において試料を検査して、１００，０００の直径拡大で写真を撮った。
【０２７９】
免疫複合体イメージのデジタル化および平均化。免疫複合体イメージの電子顕微鏡写真は、ＡＧＦＡ  ＤＵＯＳＣＡＮ  Ｔ２５００  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ  Ｐａｒｋ，  ＮＪ）でデジタル化した。潜在的に情報価値のある複合体を選択して、２５６  Ｈ  ２５６画素のイメージとしてウィンドウ化した。次いで、これらのランダムに測定した複合体を、ＳＰＩＤＥＲプログラム（Ｆｒａｎｋ，  １９９６）のマルチ参照アランメント機能を利用して概算のアランメントを導いた。その後、アラインしたイメージを平均化して、信号対雑音比を改善した。
【０２８０】
分子モデリング。ＥＭに基づいた解読を増強するため、およびＳＯＳ  ｇｐ１４０においてｇｐ４１ドメインの可能性のある位置を調査するために、ＳｗｉｓｓＰＤＢｖｉｅｗｅｒプログラム（Ｇｕｅｘ，  １９９７）を使用した。
【０２８１】
Ｄ．結果
精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０の構築および切断
我々は、２９３Ｔ細胞（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）の一過性トランスフェクションを介して産生した未精製のＨＩＶ−１ＪＲＦＬＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の抗原特性を以前に記載した。精製された形態で評価するための大量のこのタンパク質の調製を容易にするために、我々は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびヒトフューリンの両方を発現する安定ＣＨＯ細胞株を構築した。異種フューリンは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０（Ｂｉｎｌｅｙ，  １９９７ｂ）の効率的なタンパク分解性プロセシングを容易にするために発現させた。
【０２８２】
ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、ＣＨＯ細胞上清から〜９０％均一性（図１６、レーン８）に精製した。微量のフリーのｇｐ１２０のみが、ＳＯＳ  ｇｐ１４０標品に存在していたことから、精製の間にサブユニット間のジスルフィド結合が実質的に無傷のままであったことが示される。高分子量ＳＯＳ  ｇｐ１４０オリゴマーまたは凝集物は観察されなかった（図１６、レーン８）。非還元条件下では、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、主に１４０のｋＤａバンドとして移動した。主要な混入物は、ウシのα２−マクログロブリンであり、これは還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では〜１７０ｋＤａのバンドとして移動し（図１６、レーン３）、ＣＨＯ細胞株を無血清培養に適応することによって除去することができる（データ示さず）。ＤＴＴで還元することにより、精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、主に１２０ｋＤａバンドとして移動し、１４０ｋＤａバンドの微量な（〜１０％）画分が存在した。（図１６、レーン３）。これらのデータは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の約９０％が、蛋白質加水分解でプロセスされていることを示した。
【０２８３】
ＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、フューリンと共トランスフェクションしなかったが、同様の方法を使用してＣＨＯ細胞に発現し、〜９０％の純度で得られた。これは、主要な混入物としてα２−マクログロブリンを含んでいたが、フリーのｇｐ１２０は検出されなかった（図１６、レーン４および９）。ＤＴＴの非存在下では、α２−マクログロブリンは、〜３５０ｋＤａの二量体として移動し、ｇｐ１４０ＵＮＣオリゴマー（図１６、レーン９）からはっきりとは分離されない。非還元条件下では、ｇｐ１４０ＵＮＣの単量体（１４０ｋＤａ）、二量体（２８０ｋＤａ）、および三量体（４２０ｋＤａ）と一致するバンドがほぼ同量（図１６、レーン９）で観察された。これらのタンパク質は、ウエスタンブロット解析において抗ｇｐ１２０  ＭＡｂｓと反応した（データ示さず）。ＤＴＴで処理した場合、ｇｐ１４０ＵＮＣは、〜１４０ｋＤａの単量体のバンドおよび〜１７０ｋＤａのα２−マクログロブリン単量体のバンドの増強を生じたが；ｇｐ１４０オリゴマーでは、生じなかった（図１６、レーン４および９を比較する）。したがって、ジスルフィド結合された、還元可能なオリゴマーは、ｇｐ１４０ＵＮＣ標品の半分またはより多くを含む。還元可能なオリゴマーの比較可能な量は、サブタイプＡ、Ｂ、およびＥウイルスに由来するｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質標品でわずかな系統間の差異を伴って観察された（Ｏｗｅｎｓ，  １９９９；  ａｎｄ  Ｓｔａｒｏｐｏｌｉ，  ２０００）。このタイプの還元可能なｇｐ１６０オリゴマーは、異常な分子間ジスルフィド結合を含むことが提案されている（Ｏｗｅｎｓ，  １９９９）。そうであるならば、ｇｐ１４０ＵＮＣ標品に存在する少なくともいくつかのオリゴマーは、誤って折り畳まれたタンパク質凝集体を表す。
【０２８４】
精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０の生物物理学的性質
マトリクス支援レーザー脱離イオン化マススペクトル分析。この技術は、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０およびＳＯＳ  ｇｐ１４０の絶対的分子量を決定するために使用した。表１で指示したように（以下に示してある）、測定された分子量は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０について１２１．９ｋＤａおよびｇｐ１２０について９１．３ｋＤａであった。
【０２８５】
表１
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析によって決定された組換えＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬエンベロープ糖タンパク質の分子量
【表１】
2005502350.tif 000003
【０２８６】
還元されたＳＯＳ  ｇｐ１４０は、１１８．５ｋＤａに未切断のｇｐ１４０の小ピーク、９１．８ｋＤａにｇｐ１２０のピーク、および２７ｋＤａにｇｐ４１ＥＣＴＯのピークを生じた。切断されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質と未切断のＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質との間のグリコシル化の相違は、これらの測定質量に３．４ｋＤａの相違があることの原因である。単独でおよびＳＯＳ  ｇｐ１４０の環境において発現された場合に、ｇｐ１２０の質量により小さな相違（〜５００Ｄａ）が観察された。アラニン６システインＳＯＳ変異は、３２Ｄａ（１硫黄原子）だけｇｐ１２０の質量を増大すると考えられ、また、グリコシル化パターンの軽微な相違が原因であろう。測定したＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ｇｐ１２０の質量を、以前に報告された、ＣＨＯ細胞に発現されたＨＩＶ−１ＧＢ８  ｇｐ１２０（９１．８ｋＤａ）およびショウジョウバエ細胞に発現されたＨＩＶ−１ＷＤ６１  ｇｐ１２０（９９．６ｋＤａ）の分子量に対して比較する（Ｊｏｎｅｓ，  １９９５  ；  ａｎｄ  Ｍｙｓｚｋａ，  ２０００）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってｇｐ１２０およびＳＯＳ  ｇｐ１４０において観察された異常に高い分子量は、これらのタンパク質の高炭水化物含量を反映する（それぞれ〜１２０ｋＤａおよび〜１４０ｋＤａ、図１６）。グリカンの広がった構造およびこれらの乏しいドデシル硫酸アニオンとの反応性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルマトリックスを介した糖タンパク質の電気泳動の移動度を遅らせる（Ｊｏｎｅｓ，  １９９５）。
【０２８７】
精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０のオリゴマーの状態を検討するために、超遠心分離沈降平衡測定を使用した。０．２５〜１．ＯｍＭの範囲のタンパク質濃度にわたり、ＳＯＳ  ｇｐ１４０の明らかな分子量は、１５５ｋＤａ（図１７ａ）であることが絶えず見出された。それゆえに、精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、溶液において単量体である。研究した範囲にわたって、タンパク質濃度に対する分子量の系統だった依存性はなかった。しかし、系統的傾向では、誤差（単量体についてのデータと理論曲線との間の相違）がゼロから逸脱し（図１７ａ）、オリゴマーの物質が少量存在することを示唆した。
【０２８８】
分析的ゲル濾過クロマトグラフィー。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、精製されたＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ＵＮＣ、およびｇｐ１２０タンパク質も検討した。単量体ｇｐ１２０は、６．２４分の保持時間で、〜２００ｋＤａの明らかな分子量で溶出された（図１７ｂ）。明らかに大きなサイズのこのタンパク質は、その炭化水素部分の広がった構造を反映する。ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の保持時間（５．９５分）および明らかな分子量（〜２２０ｋＤａ）は、これがｇｐ１２０よりもわずかにより大きい単量体あることと一致する。対照的に、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、平均分子量が＞５００ｋＤａの幅広いピークとして４．９１分で溶出され、これは、オリゴマー種の混合液を含むことと一致する。クロマトグラムでは、ｇｐ１４０ＵＮＣ標品に多数の種が存在することを示唆するが、このゲル濾過技術では、ｇｐ１４０の二量体、三量体、および四量体の混合物を分離することができない。
【０２８９】
精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質のオリゴマー状態を検討するために、Ｂｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動ＢＮ−ＰＡＧＥを使用した。ＢＮ−ＰＡＧＥにおいて、大部分のタンパク質は、これらのストークス半径（Ｓｔｏｋｅｓ'  ｒａｄｉｕｓ）によって分画される。我々は、最初に、ｇｐ１２０を単独でおよびｓＣＤ４（図１７ｃ）との複合体で含む可溶性タンパク質のモデルセットに、この技術を適用した。モデルタンパク質は、多様なサイズの非共有結合オリゴマーの分布を天然に含むサイログロブリンおよびフェリチンを含んだ。これらの多サブユニットタンパク質のＢＮ−ＰＡＧＥによって決定されるオリゴマーの状態は、その他の非変性技術を使用して観察されるものと同様である（Ｇｅｒｌ，  １９８８；  ａｎｄ  Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ，  １９９９）。ＢＳＡは、溶液において単量体、二量体、およびより高オーダー種として存在し（Ｌａｍｂｉｎ，  １９８２）；ＢＮ−ＰＡＧＥにおいて、同様のオリゴマーのラダーも観察された。もっともなことだが、ナノモル濃度の範囲における会合定数を有するｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体（Ａｌｌａｗａｙ，  １９９５）は、ＢＮ−ＰＡＧＥ解析の間に完全なままであった。
【０２９０】
精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、主にＢＮ−ＰＡＧＥ（図１７ｄ）により単量体であったが、微量の二量体種（＜１０％）も観察された。精製されたｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、よく分離された二量体、三量体、および四量体として移動し（図１７ｄ）、少量の単量体が存在した。ｇｐ１４０ＵＮＣ二量体は、非変性条件下で存在する主要なタンパク質のオリゴマー形態を表した。四量体ｇｐ１４０ＵＮＣは、ＢＮ−ＰＡＧＥゲル（図１７ｄ）においては特異な微量種であったが、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１６）では、存在しなかった。ＳＤＳおよび熱で処理することにより、ｇｐ１４０ＵＮＣ四量体は、おそらく単量体および／またはジスルフィド結合した二量体などの低分子量種に戻る。予想されたとおり、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０は、主要な単量体１２０ｋＤａタンパク質として移動した。精製していないｇｐ１４０タンパク質のＢＮＰＡＧＥ解析を以下に記載してある（図２３を参照されたい）。
【０２９１】
これらの精製されたＥｎｖタンパク質のオリゴマーの状態に関しては、全体的に、超遠心分離、ゲル濾過、およびＢＮ−ＰＡＧＥ解析ではよく一致した。しかし、ＢＮ−ＰＡＧＥは、ｇｐ１４０ＵＮＣ標品に含まれるオリゴマー種の混合物を明瞭に分離することでことができる唯一の方法であった。
【０２９２】
ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびＳＯＳ  ｇｐ１４０−ＭＡｂの免疫電子顕微鏡法
抗体の非存在下において、電子顕微鏡写真では、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は大部分が単量体で、ランダムに配向し、マルチローブであることを示した（図１８ａ）。定性的に同様のイメージが、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０でも得られ（データ示さず）、２つのタンパク質は、ＭＡｂｓの非存在下またはイメージを測位するその他の手段で明瞭に区別することはできないであろう。
【０２９３】
また、ＳＯＳ  ｇｐ１４０の電子顕微鏡写真は、ＭＡｂｓ  ２Ｆ５（図１８ｂ）、ＩｇＧ１ｂ１２（図１８ｃ）、および２Ｇ１２（図１８ｄ）との複合体でも得られた。解釈を助けるために、複合体をマスクして、推定されるＭＡｂのＦｃが下向きを示すように回転した。また、観察した基本的な形状および化学量論を例示するために、それぞれの複合体についての模式図も提供する。それぞれの場合において、示された複合体は、大多数種または複数種で存在することを表す。しかし、フリーのＭＡｂおよび一価性のＭＡｂ−ＳＯＳ  ｇｐ１４０複合体などのその他の種も、それぞれの試料に存在していた（データ示さず）。
【０２９４】
ＩｇＧ１ｂ１２または２Ｆ５と結合した場合、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、むしろ典型的な、単一のＭＡｂおよび２つまでのＳＯＳ  ｇｐ１４０ｓで構成される免疫複合体を形成した（図１８ｂおよび１８ｃ）。複合体は、特徴的なＹ形の抗体構造を採用し、ＭＡｂのＦａｂ腕間は角度が変わりやすかった。対照的に、２Ｇ１２／ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、著しく異なったイメージを生じた（図１８ｄ）。結合したＳＯＳ  ｇｐ１４０ｓと共に２つの異なったＦａｂ腕を含むＹ形の複合体は、珍しかった。その代わりに、２Ｇ１２−ＳＯＳ  ｇｐ１４０のイメージは、強く直鎖状であり、平行に整列配置された２つのＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に結合した１つのＭＡｂを表すようであった。ＳＯＳ  ｇｐ１４０ｓの平行のアランメントは、２つのＦａｂ腕を同様のアランメントにさせて、全体的に直線状構造を生じさせる。これらの複合体は、Ｅｎｖ−ＭＡｂ複合体の我々の免疫電子顕微鏡法研究においては前例がない（（Ｒｏｕｘ，  １９８９  ；  Ｒｏｕｘ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｚｈｕ，  ２００１）、およびＫＨＲ、未発表の観測）。ＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ｇｐ１２０−２Ｇ１２複合体は、この平行の配位を採らないが、その代わりにＳＯＳ  ｇｐ１４０−２Ｆ５およびＳＯＳ  ｇｐ１４０−ＩｇＧ１ｂ１２複合体に似ている（データ示さず）。１つの仮説は、２Ｇ１２がｇｐ４１  ＥＣＴＯ部分間に残留する弱い相互作用を促進する向きでＳＯＳ  ｇｐ１４０に結合し、次いでこれが、観察される平行な配位の複合体を安定させる。さらにこの所見を探検するために、さらなる研究が進行中である。
【０２９５】
上記の、十分に特徴づけられたＭＡｂｓの組み合わせを、ＳＯＳ  ｇｐ１４０におけるこれらのエピトープの相対的な配置を検討するために使用した。第１の組み合わせのＳＯＳ  ｇｐ１４０−２Ｆ５−ＩｇＧ１ｂ１２では、多数の環構造が観察され（データ示さず）、２つの抗体分子によって架橋された２つのＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質で構成されているようであった。２Ｆ５およびＩｇＧ１ｂ１２のＭＡｂｓ間を識別するために、我々は、ＩｇＧ１ｂ１２  Ｆ（ａｂ'）２、ＳＯＳ  ｇｐ１４０、および無処理の２Ｆ５  ＭＡｂ間で形成される複合体を検討した。特徴的な環構造が、また観察された（図１８ｅ）。次いで、環複合体を、ＳＰＩＤＥＲプログラムパッケージを使用する計算解析に供して、いくつかの平均化されたイメージのカテゴリー得た（データ示さず）。イメージにおいてＭＡｂ  ２Ｆ５およびＩｇＧ１ｂ１２  Ｆ（ａｂ'）２成分を、明らかに描写することができ、ＳＯＳ  ｇｐ１４０分子を描写することもできる。所与のＳＯＳ  ｇｐ１４０分子に結合した場合、２Ｆ５およびＩｇＧ１ｂ１２のＦａｂ腕は、模式図に示したとおり、ほぼ正しい確度に位置する（図１８ｅ）。
【０２９６】
ＩｇＧ１ｂ１２−含む三量体複合体とは著しく対照的に、ＳＯＳ、２Ｆ５、および２Ｇ１２で構成されるものは、閉環ではなく伸長鎖を形成した（図１８ｆ）。これらの観測では、２Ｆ５および２Ｇ１２エピトープがＳＯＳ  ｇｐ１４０分子の反対の末端に配置されている。２Ｆ５／２Ｇ１２／ＳＯＳ  ｇｐ１４０複合体の化学量論には、有意な不均一性が存在し、ほんの１例を模式図に示してある。
【０２９７】
ｓＣＤ４およびＭＡｂ１７ｂとの複合体におけるＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１２０の免疫電子顕微鏡法
ＳＯＳ  ｇｐ１４０の形態を特徴づけるためのさらなる試みにおいて、我々は、これをＭＡｂ１７ｂおよび／またはｓＣＤ４（図１９）と反応させた。我々は、比較のために、対応するＹＵ２ｇｐ１２０複合体を作製した。予想されるとおり、ＳＯＳ  ｇｐ１４０プラスＭＡｂ１７ｂの組み合わせ、またはｇｐ１２０単独では、１７ｂエピトープを誘導するためにｓＣＤ４が必要であることに一致して、複合体を形態しなかった。同様に、ＭＡｂ１７ｂの非存在下で、ｓＣＤ４をＳＯＳ  ｇｐ１４０またはｇｐ１２０と混合したときにも、目立った複合体は得られなかった（データ示さず）。しかし、ｓＣＤ４／Ｅｎｖ／１７ｂについては、明らかに明確な形態の複合体が得られた（図１９ａおよび１９ｂ）。
【０２９８】
これらの複合体は、わずかに触れる程度に突き出ているｓＣＤ４分子と共に、１つまたは２つの結合したＳＯＳ  ｇｐ１４０ｓまたはｇｐ１２０ｓと１７ｂで構成されていた。次いで、これらの複合体を、コンピューターを利用した平均化に供した（図１９ｃおよび１９ｆ）。ＭＡｂ  １７ｂのフリーの腕およびＦｃ領域は、ＭＡｂの柔軟性のために、これらのイメージにおいて乱れていたので、より優れた分解観測でｓＣＤ４、Ｅｎｖ、および１７ｂ  Ｆａｂ構造を強調するために、平均化したイメージをマスクした（図１９ｄおよび１９ｇ）。ｇｐ１２０およびＳＯＳ  ｇｐ１４０のイメージは、定性的に同様であったが、一方から他方を差し引いたイメージでは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質にさらなる質量が存在することを示した（図１９ｄおよび１９ｅにおいて矢印で示した）。このさらなる質量は、ｇｐ４１ＥＣＴＯを表すのであろうが、我々は、一次配列の相違および／または使用したｇｐ１２０およびＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のグリコシル化などのその他の説明を厳密に除外することができない。
【０２９９】
電子顕微鏡写真において見られる残りの構造に関して、推定されるｇｐ４１ＥＣＴＯ部分の位置を測定するために、ＰｒｏｇｒａｍＯを使用して、ｓＣＤ４およびＦａｂ１７ｂのＤ１Ｄ２ドメインとの複合体におけるｇｐ１２０コアのＸ線構造（Ｋｗｏｎｇ、１９９８）を、ｓＣＤ４／ｇｐ１２０／ＭＡｂ１７ｂ複合体について得られたプロフィール地図（図１９ｈ）にドッキングした。電子顕微鏡法および結晶化研究のために使用したｇｐ１２０（全体対コア）とＣＤ４（４つのドメイン対２つのドメイン）分子には相違があることを考えれば、生成された構造の全体的な形態が、合理的に一致している。
【０３００】
この構造（図１９ｈ）の一致により、我々は、推定されるｇｐ４１ＥＣＴＯ部分をコアｇｐ１２０構造に関して位置づけることができる（図２０）。以前に定義したｇｐ１２０の中和、非中和、および無変化の面（Ｍｏｏｒｅ，  １９９６  ；  ａｎｄ  Ｗｙａｔｔ，  １９９８ａ）を例示したが、これはＩｇＧ１ｂ１２（Ｓａｐｈｉｒｅ，  ２００１）および２Ｇ１２（Ｗｙａｔｔ，  １９９８ａ）エピトープである。このモデルによれば、ＭＡｂ  ２Ｆ５によって認識されるｇｐ４１ＥＣＴＯ部分は、ＩｇＧ１ｂ１２エピトープに関して〜９０Ｂに、２Ｇ１２エピトープ（図２０ｂ）からは〜１８０Ｂに位置する。このモデルは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０とこれらのＭＡｂｓの組み合わせとの間で形成される複合体の電子顕微鏡イメージにそれぞれ由来するものと幅広く一致した（図１８ｅおよび１８ｆ）。この推定されるｇｐ４１ＥＣＴＯの配置は、これがｇｐ１２０の非中和面を主にふさぐ原因であると考えられ、ＳＯＳ  ｇｐ１４０について、ＭＡｂの反応性パターンと一致する結果が本明細書および他で（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）の両方で観察される。
【０３０１】
未精製ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質の抗原特性
ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０が安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に発現したときの該タンパク質の抗原性が、同じタンパク質が一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に発現されたときに以前に観察されたもの（Ｂｉｎｌｅｙ２０００ａ）と比較して異なっているかどうかを決定するために、放射性免疫沈降アッセイ法（ＲＩＰＡ）を使用した。ＣＨＯ細胞から発現された未精製の上清中のＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、Ｃ３／Ｖ４領域（ＭＡｂ２Ｇ１２）、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４−ＩｇＧ２分子）、およびＶ３ループ（ＭＡｂ１９ｂ）に位置するｇｐ１２０エピトープに対する中和剤によって効率的に認識された（図２１）。さらに、ＭＡｂ１７ｂによって定義される保存されたＣＤ４で誘導される中和エピトープは、ｓＣＤ４によりＳＯＳ  ｇｐ１４０において強力に誘導された。ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、また、広範なｇｐ４１  中和ＭＡｂ  ２Ｆ５によって、効率的に免疫沈降された。対照的に、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に対する非中和ＭＡｂｓの２３Ａおよび２．２Ｂのそれぞれとほとんど反応しなかった（図２１、レーン３および９）。我々の以前の観測（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）とこれらの解析の比較では、ＣＨＯおよび２９３Ｔ細胞に由来するＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、同様の抗原特性を備えていることを示す。
【０３０２】
未精製のＳＯＳ  ｇｐ１４０ＣＨＯ細胞上清において、比較的微量のフリーのｇｐ１２０が観察された（図２１、レーン１、５、７、および８）。このフリーのｇｐ１２０は、ＭＡｂ  ２３Ａによって優先して認識されたことから、そのＣ５エピトープが、ＳＯＳ  ｇｐ１４０ではほとんど覆い隠されていることを示唆する（図２１、レーン９）。これは、上記した（図２０ｂ）電子顕微鏡法に由来する形態モデルと一致し、また、ｇｐ１２０−ｇｐ４１界面について知られるものと一致する（Ｈｅｌｓｅｔｈ，  １９９１  ；  Ｍｏｏｒｅ，  １９９６  ；  ａｎｄ  Ｗｙａｔｔ，  １９９７）。ＳＯＳ  ｇｐ１４０のｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位におけるプロセシングを還元および非還元条件下で行われるＲＩＰＡｓによって決定すると、効率的であった（図２１、レーン１および２を比較する）。未精製のＳＯＳ  ｇｐ１４０を、ＲＩＰＡではなくウェスタンブロッティングによって解析したときは、同様のレベルの構築およびタンパク分解性プロセシングが観察された（データ示さず）。これらの所見も、２９３Ｔ細胞に由来するＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０において見られるものに匹敵する（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）。したがって、このタンパク質の折りたたみ、構築、およびプロセシングは、主にその産生に使用される細胞株からは独立しているようである。
【０３０３】
未精製のＣＨＯ細胞に発現されたＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質の抗体および受容体結合特性をさらに特徴づけるために、表面プラスモン共鳴アッセイ法ＳＰＲをさらに使用した。同じＭＡｂｓによるＳＰＲおよびＲＩＰＡを使用して得られる結果を比較することにより、我々は、これらのタンパク質の抗原性が方法に依存するかどうかを決定することができる。ＳＰＲは、１分または複数分で完了される速度的に制限された手順であるのに対して、ＲＩＰＡは、Ｅｎｖ−ＭＡｂ結合が数時間にわたって起こる平衡法である。また、精製の間にタンパク質の抗原性が有意に変化するかどうかを評価するために、精製された形態および未精製の形態のＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質に対してＳＰＲ解析を行った。また、精製されたＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ｇｐ１２０でも調査した。精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は単量体であるが、これは、ｇｐ４１の外部ドメインに連結されたｇｐ１２０サブユニットを含んでいた。ｇｐ４１の存在が、ｇｐ１２０の抗原構造に影響を及ぼし得るという証拠があるので（Ｋｌａｓｓｅ，  １９９３  ；  ａｎｄ  Ｒｅｉｔｚ，  １９８８）、我々は、単量体ＳＯＳ  ｇｐ１４０が、中和および非中和ＭＡｂｓとその相互作用において、単量体ｇｐ１２０とは異なった挙動を示すかどうかを決定する価値があると考えた。
【０３０４】
ＣＨＯ細胞上清中の未精製のＳＯＳ  ｇｐ１４０のＲＩＰＡ−（図２１）およびＳＰＲ（図２２）に基づく抗原性解析の間での結果は、よく一致した。たとえば、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、広く中和する抗ｇｐ４１  ＭＡｂ  ２Ｆ５（図２１、レーン４および図２２ｂ）を結合したが、非中和抗ｇｐ４１  ＭＡｂ  ２．２Ｂ（図２１、レーン３および図２２ｄ）には結合しなかった。同様に、ＭＡｂ  １７ｂの結合は、ｓＣＤ４（図２１、レーン６〜７および図２２ｆ）によって強力に強化された。未精製のＳＯＳ  ｇｐ１４０は、中和抗ｇｐ１２０  ＭＡｂｓ  ２Ｇ１２および１９ｂを結合したが、非中和抗ｇｐ１２０  ＭＡｂ  ２３Ａは、ＳＰＲおよびＲＩＰＡ（図２１、レーン１、８、および９）の実験のいずれにおいても結合しない（データ示さず）。合わせると、ＲＩＰＡおよびＳＰＲのデータは、ＣＨＯ細胞に由来する未精製のＳＯＳ  ｇｐ１４０が、迅速、かつ強く中和抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１ＭＡｂｓを結合するが、非中和ＭＡｂｓの本セットに対する結合は、いずれの技術にもよって測定できない。
【０３０５】
ＳＰＲは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質の抗ｇｐ４１  ＭＡｂｓとの反応性に、いくらかの有意差を示した。したがって、ｇｐ１４０ＵＮＣではなくＳＯＳ  ｇｐ１４０は、ＭＡｂ  ２．２ＢではなくＭＡｂ  ２Ｆ５に結合したが、ｇｐ１４０ＵＮＣについて逆も真であった。顕著に劇的ではないが、ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣの、抗ｇｐ１２０  ＭＡｂｓとの反応性にはいくらかの相違が観察された。２つのタンパク質のうちＳＯＳ  ｇｐ１４０は、ｓＣＤ４（図２２ｅおよび２２ｆ）の存在下において、中和ＭＡｂｓ  ＩｇＧ１ｂ１２（図２２ｇ）、２Ｇ１２（図２２ｈ）、および２２ｂに対してより優れた速度および規模で結合した。１７ｂに対するｇｐ１４０ＵＮＣの結合は、他で報告されたとおりに（Ｚｈａｎｇ，  ２００１）、ｓＣＤ４によって明らかに強化された。ＳＯＳ  ｇｐ１４０もｇｐ１４０ＵＮＣも、抗ｇｐ１２０  ＭＡｂ  ２３Ａに結合しなかった（データ示さず）。切断部位を除去するＣ５アミノ酸の置換は、ＭＡｂ  ２３Ａのエピトープに直接影響を及ぼすので、これは、ｇｐ１４０ＵＮＣにおいて予想された（Ｍｏｏｒｅ，  １９９４ｂ）。
【０３０６】
定性的に、ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣの抗原性は、精製によってわずかに変化した（図２２、パネルａ、ｃ、およびｅをパネルｂ、ｄ、およびｆと比較する）。それゆえに、精製のために使用するレクチン親和性カラムおよびゲル濾過カラムは、これらのタンパク質の特定のコンホメーション状態に有意に影響を与えることはなく、または選択することはないと思われる。しかし、これらの調査では、精製および未精製の物質を使用して誘導されるＳＰＲデータの定量的な比較を直接行うことはできない。
【０３０７】
単量体ｇｐ１２０と比較して、精製されたｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、ＭＡｂ  ２Ｇ１２と強力に反応したが、ＭＡｂ  ＩｇＧ１ｂ１２と反応しなかった。従来のＳＰＲ研究では、２Ｇ１２がオリゴマー形態のＥｎｖによく結合し、ＭＡｂ  ２Ｇ１２は、オリゴマーのＥｎｖｓに二価結合をすることができる可能性があることが示されていた。将来の研究において、２Ｇ１２−ＳＯＳ  ｇｐ１４０複合体の異常な性質を考えれば、ｇｐ１４０ＵＮＣまたはその他のオリゴマーのＥｎｖとの複合体における２Ｇ１２の電子顕微鏡法解析を行うことは有益であると考えられる（図１８ｄ）。
【０３０８】
未精製のＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質のオリゴマー特性
新たに調製したＣＨＯ細胞培養液上清中に存在するＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質のオリゴマー状態を検討するために、ＢＮ−ＰＡＧＥを使用した。ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、ＢＮ−ＰＡＧＥでは、主に単量体で存在し（図２３ａ）、微量の割合の高オーダーのタンパク質のみが存在する。２９３Ｔ細胞標品の全てではないが、一部には、ＢＮ−ＰＡＧＥを使用して、非常に変わりやすい量の二量体およびより高オーダーのオリゴマーが観察された（データは示さないが、以下の図２３ｂを参照されたい）。これは、おそらく、その他の技術（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）を使用して、未精製のＳＯＳ  ｇｐ１４０標品においてオリゴマーを観察することができるという我々の以前の報告の理由を説明する。未精製のｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、典型的には、よく分離された二量体、三量体、および三量体として存在し、微量の単量体がときに存在する（図２３ａ）。定性的に同様の結合パターンが、精製（図１７ｄ）および未精製（図２３ａ）のｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質について観察された。それぞれの場合において、ｇｐ１４０ＵＮＣの二量体は、最も多いオリゴマー種であった。ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０は、ほとんどが１２０ｋＤａの単量体のバンドとして移動したが、少量のｇｐ１２０二量体が、一部の未精製の上清中で観察された。一般に、ＢＮ−ＰＡＧＥ解析は、種々のＥｎｖタンパク質のオリゴマーの特性が精製によってこれといって変化しなかったこと示す（図２３ａおよび図１７ｄを比較する）。
【０３０９】
また、同じＣＨＯ細胞上清を分析的ゲル濾過によって分析し、カラム画分を０．２ｍＬ増分で回収し、Ｅｎｖ含量をウェスタンブロッティングによって解析した。未精製のｇｐ１２０、ＳＯＳ  ｇｐ１４０、およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質の保持時間は、それぞれ〜６．１、〜５．９、および〜５．２分であることが決定された（データ示さず）。精製されたタンパク質におけるこれらの値は、本方法の精度の範囲内で観察されるものと一致する（図１７ｂ）。したがって、ゲル濾過研究では、未精製のｇｐ１２０およびＳＯＳ  ｇｐ１４０がほとんど単量体であったが、ｇｐ１４０ＵＮＣはほとんどオリゴマーであったというＢＮ−ＰＡＧＥデータを実証する（データ示さず）。しかし、ＢＮ−ＰＡＧＥとは異なり、この分析的ゲル濾過手順は、ｇｐ１４０ＵＮＣ標品に存在するオリゴマー種の分布を特徴づけるための十分な解像力を有していない。
【０３１０】
未精製のＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質を含む上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く、ウエスタンブロット解析では、精製されたタンパク質について図１６に示したものと同様の結合パターンを生じた（データ示さず）。ｇｐ１２０標品は、〜１０％二量体を含んでおり、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を非還元条件下で行ったときにのみ観察された。したがって、ｇｐ１２０二量体は、おそらくジスルフィド結合し、かつ誤って折り畳まれた物質を表す（Ｏｗｅｎｓ，  １９９９）。
【０３１１】
可変ループを削除したＳＯＳ  ｇａｐ１４０糖タンパク質は、より安定なオリゴマーを形態する
我々は、ｇｐ１２０可変ループの一つ以上を削除して、ＣＤ４結合部位および補助受容体結合部位のまわりの下にある保存された領域を暴露するものに由来するＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０糖タンパク質を先に記載した。それぞれＶｌ、Ｖ２、およびＶ３ループ構造を個々に、または対で、サブユニット間ジスルフィド結合の形成、適当なタンパク分解性切断、もしくはタンパク質の折畳みに悪影響を及すことなく除去することができる。しかし、３つのループの欠損体は、効率的に切断されなかった（Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。これらの修飾されたＳＯＳ  ｇｐ１４０糖タンパク質のオリゴマーの特性を探索するために、これらのｇｐ１４０構築物およびフューリンを一過性に同時トランスフェクションした２９３Ｔ細胞の上清をＢＮ−ＰＡＧＥによって分析した。予想外に、可変ループの欠失は、単独および組合せの両方において、ＳＯＳ  ｇｐ１４０オリゴマーの安定度を有意に増強した。ΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０標品は、ほとんど三量体および四量体種のみを含んでいたが、ΔＶ１  ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、ｇｐ１４０ＵＮＣにおいて見られるものと同様に、二量体、三量体、および四量体の混合物を形成した（データ示さず）。ΔＶ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、主にオリゴマーであったが、有意な量の単量体も含んでいた。したがって、オリゴマーの安定度に関して、ＳＯＳタンパク質は、次のようにランクを付けることができる：ΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０  ＞  ΔＶ１  ＳＯＳ  ｇｐ１４０  ＞  ΔＶ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０  ＞  全長ＳＯＳ  ｇｐ１４０。この順位序列の理由は、まだ明らかではなく、調査中である。
【０３１２】
上記の観測に基づいて、我々は、ΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質を安定して発現するＣＨＯ細胞株を作製することを選んだ。最適化したＣＨＯ細胞株に由来する上清を還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くウエスタンブロット検出によって解析した。主要なＥｎｖバンドは、非還元ゲルでは１２０ｋＤａ（ΔＶ１Ｖ２  ｇｐ１４０タンパク質）において、および還元ゲルでは１００ｋＤａ（ΔＶｌＶ２  ｇｐ１２０タンパク質）において見られた（データ示さず）。これらの結果は、Ｖ１Ｖ２ループの欠失が〜２０ｋＤａのタンパク質分子量を明らかに減少させるという我々の従来の所見と一致する。特に、ΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、主にジスルフィド結合した凝集物およびループを欠損した〜１ＯＯｋＤａものの両者がほとんどなく、ｇｐ１２０タンパク質がなかった。したがって、ΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質（データ示さず）では、タンパク分解性切断およびＳＯＳジスルフィド結合形成が効率的に生じる。
【０３１３】
また、ΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０、全長ＳＯＳ  ｇｐ１４０、およびｇｐ１４０ＵＮＣを含むＣＨＯ細胞上清をＢＮＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって解析した（図２３ａ）。一過性にトランスフェクシトした２９３Ｔ細胞で観察されたとおり、未精製のＣＨＯ細胞に由来する物質は、オリゴマーであった。ＣＨＯ細胞に由来するΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、三量体（３６０ｋＤａ）のものと一致する分子量を有する異なった単一のバンドとして移動し；ΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０のバンドは、ｇｐ１４０ＵＮＣ二量体（２８０ｋＤａ）およびｇｐ１４０ＵＮＣ三量体（４２０ｋＤａ）のものの間にある（図２３ａ）。それゆえに、ΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、ＨＩＶ−１Ｅｎｖの蛋白質加水分解で成熟した形態を表し、非共有結合相互作用を介して、推定される三量体にオリゴマー化する。このタンパク質の精製およびさらなる生物物理学的研究は、現在進行中であり、免疫原性研究も計画されている。
【０３１４】
未切断のＳＯＳｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、同様のオリゴマー特性を有する
全体にわたり、上記の解析は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質のオリゴマー特性における明らかな相違を示す。これらのタンパク質間の１つの構造上の相違は、これらのタンパク質分解による切断状態であり、もう一つは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質を定義するサブユニット間ジスルフィド結合の有無である。ＳＯＳ  ｇｐ１４０オリゴマーを不安化するものが、ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断または導入されたシステイン残基であるかどうかの問題に取り組むために、我々は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質を作製した。ここで、サブユニット間ジスルフィド結合を形成することができるシステインは存在するが、切断を防止するためにｇｐ１２０およびｇｐ４ｌＥＣＴＯ間の切断部位も修飾した。ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣ、ＳＯＳ  ｇｐ１４０、およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質を全て一過性に２９３Ｔ細胞に発現して、ＢＮ−ＰＡＧＥによって解析した（図２３ｂ）。この実験および多くの繰り返し実験において、ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣおよびｇｐ１４０ＵＮＣは、天然のゲルにおいて同様の移動パターンを有し、主に二量体バンドおよび一部の単量体、三量体、および四量体も存在した。対照的に、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、主に単量体であるが、少量の二量体および三量体種も、この特定の解析において観察された（図２３ｂ）。
【０３１５】
上記の結果は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質がＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質よりも、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質様に挙動することを示唆する。これは、ｇｐ１４０のｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯへの切断が、ｇｐ４１ＥＣＴＯ部分間の相互作用を経てｇｐ１４０がオリゴマー化される方法に実質的な効果を有するが、ｇｐ１２０およびｇｐ４１におけるシステイン置換の存在は、これらの相互作用にあまり効果を有さないことを意味する。我々は、この観測は、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質のものと比較して、ＳＯＳ  ｇｐ１４０オリゴマーの相対的な不安定性を理解するための中心となると考える。しかし、我々は、分子間ジスルフィド結合がＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣにおいて実際に形成しているか否かを決定しておらず；ｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯ部分間の未切断のペプチド結合は、なお２つのサブユニットを共に保持していたので、これらの結合を還元するためのＤＴＴ処理による簡単な方法では不十分であることに、我々は留意する。この問題に取り組むためには、ペプチドマッピングなどの方法によって精製したＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣを特徴づけることが必要であろう。さらにｇｐ１２０−ｇｐ４ｌＥＣＴＯ複合体の構造に対するｇｐ１４０切断の効果を探検するために、このような研究は現在進行中である。
【０３１６】
Ｅ．考察
我々は、以前に分子間ジスルフィド結合を導入してｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯサブユニットを共有結合で連結したＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質変異体のＳＯＳ  ｇｐ１４０の抗原特性を記載した（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。もとの報告において、我々は、一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清に含まれているＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、ビリオン結合Ｅｎｖの抗原性擬態であったことを示した（Ｂｉｎｌｅｙ２０００ａ）。その報告において使用した方法は、未精製の２９３Ｔに由来するＳＯＳ  ｇｐ１４０のオリゴマー状態を確証的に決定するためには不十分であった（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）。本明細書において、我々は、精製および未精製のＣＨＯ細胞に由来するＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質も、これらの抗体反応性のパターンの観点から、天然のＥｎｖを模倣することを示す。しかし、ウイルス結合Ｅｎｖとは異なり、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、単量体タンパク質である。
【０３１７】
抗原性および免疫電子顕微鏡法研究では、ｇｐ１２０の中和面が天然のコンホメーションで提示されているが、非中和面がｇｐ４１ＥＣＴＯによってふさがれているというＳＯＳ  ｇｐ１４０のモデルを支持する。免疫電子顕微鏡法のデータは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０のｇｐ４１ＥＣＴＯ部分がｇｐ１２０サブユニットの非中和面をふさぐモデルを示唆する（図２０）。このモデルのための証拠は、いくつかの独立した研究に由来する。これらの最初に、定義済みエピトープに対する抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１  ＭＡｂｓの組み合わせとの複合体におけるＳＯＳ  ｇｐ１４０を検討した（図１８）。抗ｇｐ４１  ＭＡｂ  ２Ｆ５の位置によって定義されるものとして、ｇｐ４１ＥＣＴＯサブユニットは、非中和面であるＭＡｂ  ＩｇＧ１ｂ１２エピトープから〜１８０Ｂ、およびＭＡｂ  ２Ｇ１２エピトープから〜９ＯＢに位置した。研究の第２セットでは、ｓＣＤ４およびＭＡｂ  １７ｂとの複合体におけるＳＯＳ  ｇｐ１４０とｇｐ１２０を比較した（図１９）。ここで、ｇｐ１４０複合体のさらなる質量の領域は、推定上のｇｐ４１ＥＣＴＯと定義し；その位置は、同様にｇｐ１２０の非中和面と隣接していた。このモデルのｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用の形態は、突然変異生成技術に基づく以前のモデルおよびＭＡｂエピトープのマッピングと一致する（Ｈｅｌｓｅｔｈ，  １９９１）；  Ｍｏｏｒｅ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｗｙａｔｔ，  １９９７）。また、上記および下記のＭＡｂ反応性のパターンを解釈するための基礎を提供する。
【０３１８】
ＣＨＯに由来するＳＯＳ  ｇｐ１４０の抗原性を以下の多くの観点から探索した：（１）ｇｐ１４０ＵＮＣおよびｇｐ１２０との比較において；（２）精製の前後において；（３）平衡に基づくアッセイ（ＲＩＰＡ）対速度に基づくアッセイ（ＳＰＲ）において。安定してトランスフェクトしたＣＨＯ細胞または一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に発現されるＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、定性的に同様の抗原特性を備えており、精製による影響をほとんど受けなかった。我々は、最も中和する抗ｇｐ１２０  ＭＡｂｓが、ｇｐ１２０またはｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質よりもＳＯＳ  ｇｐ１４０に対してより強くおよびより迅速に結合するが、非中和性ＭＡｂｓでは逆が真であったことを観察した（図２１および２２）。これらの結果は、主に使用した解析方法（ＲＩＰＡまたはＳＰＲ）または糖タンパク質の精製状態から独立しており、したがって、ＲＩＰＡによって決定された未精製のＥｎｖ糖タンパク質の抗原性における我々の以前の研究を拡張する（Ｂｉｎｌｅｙ２０００ａ）。我々は、本研究において、主に定性的な基礎に基づいてこれらの問題について取り組んだ；ＭＡｂ反応性の定量的な比較は、現在探検している。
【０３１９】
なぜ中和ＭＡｂｓが、単量体ｇｐ１２０よりも単量体ＳＯＳ  ｇｐ１４０を認識するのかは明らかでない。１つの可能性は、２つの糖タンパク質のコンホメーションの自由度の相違に関する。単量体ｇｐ１２０は、かなりのコンホメーション柔軟性を有し、その結果、ＣＤ４結合によるコンホメーションの固定（Ａｆｒｅｅｚｉｎｇ＠）は、予想外に大きいエントロピーの損失を生じる（Ｍｙｓｚｋａ，  ２０００）。実際に、ｇｐ１２０免疫原のコンホメーションの自由度を減少することにより、一般に高次構造上のエピトープを認識する広範な中和抗体を生成する手段が提供され得ることがことが示唆されている（Ｍｙｓｚｋａ，  ２０００）。ｇｐ４１ＥＣＴＯの存在は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０のｇｐ１２０サブユニットのコンホメーションの柔軟性を最小にして、中和抗体によって認識されるコンホメーションのタンパク質を安定化させるために役立つであろう。しかし、ｓＣＤ４による１７ｂ結合の誘導は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０がなお、多くの関連したコンホメーションの試料であり得ることを示す。これらの問題に取り組むための研究は、進行中である。
【０３２０】
また、コンホメーション柔軟性におけるバリエーションは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０とｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質との間で観察される抗原性の相違の根底にあるであろう。その他の可能性のある説明は、切断がＥｎｖの全体的な構造に対して有するであろう効果、および２つのタンパク質のオリゴマー形成状態における相違を含む。これらの問題を徹底的に探検するために、さらなるＥｎｖタンパク質変異体（たとえばＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣ）、より広範な抗ＥｎｖＭＡｂｓ、および同種のサブユニット組成物の精製されたタンパク質または大きさを分けたタンパク質を使用するさらなる研究が必要とされるであろう。
【０３２１】
精製されたＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０糖タンパク質は、ｇｐ４１ＥＣＴＯにジスルフィド結合した１つのｇｐ１２０サブユニットを含む単量体であることを示すために、標準的な生物物理学的技術を使用した。ｇｐ４１サブユニットは、Ｅｎｖ三量体形成の原因であることが一般に認めれているので、（Ｃａｆｆｒｅｙ，  １９９８；  Ｃｈａｎ，  １９９７；  Ｌｕ，  １９９５；  Ｔａｎ，  １９９７；  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ，  １９９７）、我々は、切断されたＳＯＳ  ｇｐ１４０糖タンパク質内のｇｐ４１−ｇｐ４１の相互作用は弱く、この不安定性が、切断された三量体の精製を妨げていると考える。
【０３２２】
また、我々は、未精製の形態並びに精製された形態のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質のオリゴマーの状態を探検するための、迅速な、簡単な、かつ高解像度の電気泳動的技術であるＢＮ−ＰＡＧＥの適用を報告する。この技術においては、タンパク質の露出された疎水性表面に結合して通常これらの溶解性を増強する色素クマシーブルーと、関心対象のタンパク質を混合する。色素の存在下では、多くのタンパク質が陰電荷の形を採り、これにより電界において陽極の方へ移動して、ポリアクリルアミド勾配ゲルにおいて、これらのストークス＝半径によって篩にかけることができる。従来の天然のＰＡＧＥ方法は、典型的には、アルカリ条件下（ｐＨ９．５）で行われるのに対し、ＢＮ−ＰＡＧＥは、タンパク質安定性により適合した生理学的なｐＨ（ｐＨ７．５）を使用する。我々は、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体および様々な精製されたオリゴマーのモデルタンパク質の全てが、ＢＮ−ＰＡＧＥ解析の間に結合したままのことを示す。ウエスタンブロット検出と組み合わせたときに、精製の全ての段階においてＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質のオリゴマーの状態を決定するために、ＢＮ−ＰＡＧＥを使用することができる。この高分解能技術により、ｇｐ１４０の単量体、二量体、三量体、および四量体の形態を分離することができる。
【０３２３】
ＢＮ−ＰＡＧＥおよびその他の方法によって決定されたとおり、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、大部分が単量体の形態で分泌された。対照的に、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、このなかのｇｐ１２０およびｇｐ４１間のペプチド結合がなお２つのサブユニットを付着しており、相当に安定なオリゴマーを形成する。したがって、我々は、ＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０ＵＮＣが、非変性条件下で存在する主要なオリゴマーの形態を表す二量体と共に、二量体、三量体、および四量体の混合物を含むことを示す。非共有結合で結合したオリゴマーは、ｇｐ１４０ＵＮＣ標品の有意な割合を構成するにもかかわらず、半分またはそれ以上の物質は、ジスルフィド結合して、おそらく誤って折り畳まれた物質からなる（Ｏｗｅｎｓ，  １９９９）。その他にも、その他のＨＩＶ−１株に由来する、およびＳＩＶに由来する未切断のｇｐ１４０タンパク質において、同様の観測がなされた（Ｃｈｅｎ，  ２０００；  Ｅａｒｌ，  １９９７  ；  Ｅａｒｌ，  １９９４；  Ｅａｒｌ，  １９９０；  Ｅａｒｌ，  ２００１；  Ｅｄｉｎｇｅｒ，  ２０００  ；  Ｆａｒｚａｎ，  １９９８  ；  Ｈｏｆｆｍａｎ，  ２０００  ；  Ｏｗｅｎｓ，  １９９９；  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９９６；  Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ，  ２０００；  Ｓｔａｒｏｐｏｌｉ，  ２０００；  Ｙａｎｇ，  ２０００ａ；  Ｙａｎｇ，  ２０００ｂ）  ；  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，  ２００１）。次いで、なぜＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は単量体であるが、未切断のタンパク質はオリゴマーであるのか、という問題が生じる。我々は、ｇｐ１２０−ｇｐ４１ペプチド結合の切断が、エンベロープ糖タンパク質複合体の全体的なコンホメーションを変化させ、これを融合適格性のにするだけでなく、ｇｐ４１サブユニット間の結合も不安定化すると考える。この意見に対する支持は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質がｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質と同じ挙動を示すが、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質とは非常に異なっており；ｇｐ１４０タンパク質のオリゴマーの安定度を決定する際に、分子間ジスルフィド結合の操作よりも、切断が明らかにより重要であるという証拠によって提供される。ｇｐ４１−ｇｐ４１相互作用の不安定化は、ｇｐ４１を介して融合してｇｐ１２０受容体相互作用によるＥｎｖ複合体の活性化を効率的にを生じるために必要であろう。さらに、合成プロセスの後期に生じる切断／活性化をさせることにより、未成熟で、すなわちエンベロープ糖タンパク質複合体の細胞内輸送の際に生じる融合イベントの危険を最小にする。Ｅｎｖ構造の切断に対する効果を探検するために、さらなる研究が進行中である。
【０３２４】
合わせると、ＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、およびｇｐ１４０ＵＮＣの抗原性並びに生物物理学的データは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０が天然のＥｎｖの改良されているが、いまだ明らかに不完全な擬態を表すことを示唆する。ＳＯＳ  ｇｐ１４０単量体が、そのＭＡｂｓの多様なパネルとの反応性においてウイルス結合Ｅｎｖを模倣することは、おそらく驚くべきことである。ＣＤ４およびＭＡｂ１７ｂとの複合体におけるｇｐ１２０コアの免疫化学的研究およびＸ線結晶構造では、共に、中和面、非中和面、および無変化面の観点からｇｐ１２０の表面を定義した（Ｋｗｏｎｇ，  １９９８；  ａｎｄ  Ｗｙａｔｔ，  １９９８ａ）。本明細書および他で（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）示されるデータは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０上の中和面には、容易にアクセスできるが、非中和面にはできないことを示す。ｇｐ１２０の無変化面の暴露を調べるための免疫学的な方法は、いまだ存在しない（Ｍｏｏｒｅ，  １９９６）。本明細書に記載されるものとして、精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０糖タンパク質の供与源により、天然のＥｎｖのものと比較において、ＳＯＳ  ｇｐ１４０の抗原構造をさらに研究することが容易になるであろう。
【０３２５】
ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、ビリオンにおける天然の、融合適格性のエンベロープ糖タンパク質複合体の構造を模倣するか？我々は、天然のエンベロープ糖タンパク質複合体の表面にアクセスできないｇｐ１２０およびｇｐ４１の非中和エピトープの暴露に基づいて、模倣できないと考える（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  ａｎｄ  Ｓａｔｔｅｎｔａｕ，  １９９５）。ＣＤ４結合部位と重複する中和エピトープは、ウイルスに結合したＥｎｖに比べて、ＨＩＶ−１ＢＨ８  ｇｐ１４０ＵＮＣ上に十分に提示されず（Ｐａｒｒｅｎ，  １９９６）、１つのＣＤ４分子のみがＳＩＶｍａｃ３２Ｈ  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質に結合することができる。Ｅｎｖをトランスフェクトした細胞表面における未切断のエンベロープ糖タンパク質複合体に対するＭＡｂｓの結合と、対応するウイルスの中和との間に相関がないことから、未切断の複合体が異常な配位を有することを再び主張する（Ｙｏｒｋ，  ２００１）。しかし、天然の未切断のＥｎｖ複合体に対する決定的かつ比較上の構造情報がない状態では、これは未解決の点である。現在、どの抗原構造が所望の免疫応答を誘発するか予測することはできず；経験的に定義することができるだけであり、これらが適切に天然のＥｎｖ複合体の構造を模倣しない場合であっても、１つまたは複数のＥｎｖの未切断の形態が、有効な免疫原となるかもしれない。この状況を考えれば、我々は、これは、種々の抗原特性を備えているＳＯＳ  ｇｐ１４０などの種々のＥｎｖｓをデザインすることおよび正確に試験することに関連すると考える。
【０３２６】
ＳＯＳ  ｇｐ１４０が単量体であることを考えると、なにが完全に切断されたエンベロープ糖タンパク質複合体の構造をさらに安定させることができるのか？２Ｇ１２／ＳＯＳ  ｇｐ１４０複合体の免疫電子顕微鏡法データは、適切な定方向抗体が弱いオリゴマーの相互作用を強化することができることを示唆する。このような複合体の免疫原性を試験する価値があるかもしれないが、二価のＭＡｂは、Ｅｎｖ三量体よりむしろ二量体の形成を促進することが予想され得る。我々は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０ジスルフィド結合安定化ストラテジーを、ｇｐ４１サブユニットが分子間ジスルフィド結合Ｂによって安定させたものと組み合わせることをすでに試みたが、同時トランスフェクトしたフューリンの存在下でさえ、変異した成熟タンパク質が十分に発現せず、ｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニットに切断することができなかったために、これは不成功であった。同様に、ｇｐ４１のＣ末端にＧＣＮ−４ドメインを付加すると、ｇｐ１４０のｇｐ１２０およびｇｐ４１  フューリンへの適切な切断を妨げた。選択したｇｐ４１残基の部位特異的突然変異に基づいたその他のアプローチにより、現在評価している。
【０３２７】
偶然にも、我々は、ＨＩＶ−ＬＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０の可変ループ除去形態が全長対応物よりもより安定なオリゴマーを形成することを見出した。したがって、Ｖ１またはＶ２可変ループのいずれかを欠いたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、全長タンパク質よりもオリゴマーの比率を多く含み、Ｖ１Ｖ２二重ループ除去体では、主に非共有結合性に結合した三量体として発現される。１つの仮説は、広範な、広くグリコシル化された可変ループが、全長ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に関する安定なｇｐ４１−ｇｐ４１相互作用の形成を立体的に妨げるということである。実際に、ｇｐ１２０／ＣＤ４／１７ｂ複合体の結晶構造を使用して、Ｋｗｏｎｇらは、三量体界面にＶ１Ｖ２配列を配置すたオリゴマーｇｐ１２０モデルを開発した（Ｋｗｏｎｇ，  ２０００）。したがって、可変ループが除去されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、蛋白質加水分解で成熟したＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を表し、おそらくこれを最終的に産生し、オリゴマーとして精製することができる。我々は、可変ループが除去されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の未精製の形態が、有利な抗原特性を備えていることを以前に示した（Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。したがって、これらのタンパク質は、構造上および免疫原性の研究においてさらに評価する価値がある。
【実施例３】
【０３２８】
実験セットＩＩＩ−粒子ワクチン
Ａ．材料および方法
抗体および組換えＨＩＶ−１エンベロープ抗原。ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶおよびＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと称する発現ベクターは、ＡＴＣＣアクセッション番号７５１９３および７５１０４のもとに、ブダペスト条約の要求にを満たしてＡＴＣＣに寄託した。ＣＤ４−ＩｇＧ２タンパク質は、ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶおよびＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶを安定して同時トランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞由来の、記載されたとおりの精製された形態で産生した（Ａｌｌａｗａｙ，  １９９５）。
【０３２９】
ＰＰＩ４−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ＪＲＦＬと称される発現ベクターは、ＡＴＣＣアクセッション番号７５４３２のもとに、ブダペスト条約の要求を満たしてＡＴＣＣに寄託した。組換えＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０タンパク質は、以前に記載されたとおり（米国特許第５，８６９，６２４号）、ＰＰＩ４−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ＪＲＦＬを安定して同時トランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞由来の、記載されたとおりに精製された形態で産生した。
【０３３０】
ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０のＶ３ループに対するマウスモノクロナール抗体は、記載されたとおりに（Ｏｌｓｏｎ，  １９９９）、マウス腹水液に細胞株を通過させて、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによってモノクロナール抗体を単離することによって、ハイブリドーマ細胞株から調製した。
【０３３１】
ヒトモノクロナール抗体ＩｇＧ１ｂ１２（国立衛生研究所ＡＩＤＳ研究および参考試薬プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）［ＡＲＲＲＰ］Ｃａｔ．番号２６４０）は、ＣＤ４結合部位（Ｂｕｒｔｏｎ，  １９９１）と重複するｇｐ１２０上のエピトープに結合する。ヒトモノクロナール抗体２Ｇ１２（ＡＲＲＲＰ  Ｃａｔ．番号１４７６）は、ｇｐ１２０上のグリカン依存性エピトープに結合する（Ｔｒｋｏｌａ１９９６ｂ）。ヒトモノクロナール抗体２Ｆ５（ＡＲＲＲＰ  Ｃａｔ．番号１４７５）は、ＨＩＶ−１エンベロープ膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１に結合する（Ｍｕｓｔｅｒ，  １９９３）。
【０３３２】
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  μ−ＭＡＣＳプロテインＧマイクロビーズの調製。２ｍｇの精製されたＰＡ１（１ｍｇ／ｍｌ）を４ｍｌのＭｉｌｔｅｎｙ  μ−ＭＡＣＳプロテインＧマイクロビーズの懸濁液と共に４℃において一晩インキュベートした（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｃａｔ．番号１３０−０７１−１０１）。翌日、ＳｏｒｖａｌｌＲＣ５Ｃ超遠心器（ＳＳ−３４のローター）において１５分間、１２，０００ｒｐｍでマイクロビーズをペレットにした（〜２０，０００×ｇ）。単離されたマイクロビーズを４００μｌのＰＢＳで一度洗浄してマイクロ遠心器において１５分間、１５，０００ｒｐｍでペレットにした（〜１６，０００×ｇ）。タンパク質がビーズに結合したｍＡｂと共に免疫沈降された場合は、ビーズをタンパク質溶液と共に再懸濁した（下記参照）。そうでなければ、ＰＡｌ−ビーズを１ｍｇ／ｍｌ  ＰＡ１の濃度でＰＢＳに穏やかに再懸濁した。この方法を使用して、マイクロビーズ懸濁液のｍｌあたりに〜１５０μｇのＰＡ１を固定することができる。
【０３３３】
ＣＤ４−ＩｇＧ２、２Ｇ１２、ＩｇＧ１ｂ１２、および２Ｆ５の固定は、本質的には、ＰＡ１について記載したとおりに行った。容量は、１ｍｌのマイクロビーズ懸濁液のあたり、ＣＤ４−ＩｇＧ２において〜４０μｇ、ＩｇＧ１ｂ１２において〜５５ｐｇ、２Ｇ１２において６０μｇ、または２Ｆ５において９５μｇであった。
【０３３４】
ＰＡ１マイクロビーズ上におけるＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０の捕獲。６００μｇのＰＡ１を含むビーズを３ｍｇのＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ｇｐ１２０と共に慎重に再懸濁し、４℃において一晩インキュベートした。３日以上インキュベーションを行った場合に、ＰＡｌ−ビーズに結合するｇｐ１２０の効率が増大した。ｇｐ１２０の捕獲に続き、マイクロビーズをＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ超遠心器（ＳＳ−３４のローター）において１５分間、１２，０００ｒｐｍでペレットにした（〜２０，０００×ｇ）。単離されたマイクロビーズを４００μｌのＰＢＳで一度洗浄してマイクロ遠心器において１５分間、１５，０００ｒｐｍでペレットにした（〜１６，０００×ｇ）。洗浄後、ｇｐ１２０を添加したビーズを１ｍｇ／ｍｌのｇｐ１２０濃度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって決定したタンパク質バンドのもの）のＰＢＳに徹底的に再懸濁した。この方法を使用して、〜８００μｇのｇｐ１２０を６００μｇのＰＡ１とルーチンで固定した（図２４）。抗原の効率的な捕獲は、ＰＢＳ緩衝液中の精製されたｇｐ１２０並びに１％のＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ，Ｃａｔ．番号２５０３０−０８１）および０．０２％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ７４０９）を含む細胞培養液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ、Ｃａｔ．番号Ｃ１７０７）中のｇｐ１２０を使用して得られた。
【０３３５】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ上への抗体の固定化。ＰＡ１抗体は、上記のとおりに産生した。０．５ｍｇの精製されたＰＡ１（１ｍｇ／ｍｌ）を、０．１ｍｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．  ，Ｃａｔ．  番号１００．０４の懸濁液と４℃において一晩インキュベートした。翌日、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを磁石（Ｄｙｎａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，  Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ）で回収して、ＰＢＳで一度洗浄した。タンパク質がビーズに結合したｍＡｂと共に免疫沈降された場合、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを直接タンパク質溶液と共に再懸濁した（下記参照）。そうでなければ、ＰＡ１−ビーズを１ｍｇ／ｍｌ  ＰＡ１濃度のＰＢＳに慎重に再懸濁した。この方法を使用して、１ｍｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ懸濁液あたり、〜１５０μｇのＰＡ１を固定することができる（図２５）。
【０３３６】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ上へのＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０の捕獲。１５μｇのＰＡ１を含むビーズを２００μｇのＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０と共に穏やかに再懸濁し、４℃において一晩インキュベートした。捕獲に続き、ｇｐ１２０を添加したＤｙｎａｂｅａｄｓを磁石で回収してＰＢＳで二度洗浄した。洗浄液工程に続き、ｇｐ１２０−ビーズを１ｍｇ／ｍｌ  ｇｐ１２０の濃度のＰＢＳに慎重に再懸濁した。この方法を使用して、〜３．３μｇのｇｐ１２０を、１５μｇのＰＡ１と固定することができる。
【０３３７】
生物特異的なビーズワクチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。ビーズに固定されるＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ｇｐ１２０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって次のように解析した：２０μｌの再懸濁したビーズを同体積の２×ＬＤＳ／ＤＴＴ試料緩衝液（１４０ｍＭのトリスＢａｓｅ、１０６ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、２５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）と混合して７０℃で５分間インキュベートした。１０μｌおよび２５μｌのＭｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズ試料または２μｌ、５μｌ、１０μｌ、および２０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ試料を４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ  ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填して、ＭＥＳ／ＳＤＳ泳動緩衝液系（５０ｍＭのＭＥＳ、５０ｍＭのトリスＢａｓｅ、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）を使用して１７５Ｖで５０分間電気泳動にかけた。定量目的のためのビーズについてに記載したとおりに処理された、ｇｐ１２０の濃度が既知のものをゲルに含めた。電気泳動に続いて、ゲルを１０％の酢酸／４０％のメタノール中で固定し、その後、ＧｅｌｃｏｄｅＢｌｕｅ染色溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して製造者のプロトコルに従って染色した。染色されたタンパク質のバンドを解析してデンシトメトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって定量した。
【０３３８】
生物特異的なビーズワクチンによるマウスの免疫化。ワクチン接種の成功は、関心対象の抗原に対する防御免疫応答の誘導に依存する。免疫系に対する有効な抗原提示は、免疫賦活性のアジュバントと共に高度に精製されたタンパク質のデリバリーによって達成することができる。我々は、（１）免疫化のための抗原の効率的な精製が可能で、かつ（２）動物において抗原に対する免疫応答を増強するマグネチックビーズを使用する新規の二重目的アプローチを記載する。
【０３３９】
免疫原。精製されたｇｐ１２０（サブタイプＢ、ＪＲ−ＦＬ；１ｍｇ／ｍｌ）を示した用量で使用した。Ｇｐ１２０を、アジュバント、ＱＳ−２１（用量あたり１０μｇ；Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ）、または抗ｇｐ１２０ｍＡｂ（上記の通りのＰＡ１）によってＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳマグネチックビーズに捕獲されたＰＡ１と混合した。動物群には、ＱＳ−２１と共に、または伴わずにビーズを受けさせた。
【０３４０】
免疫化。５匹の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群（研究の開始期の年齢６〜１０週；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）を、それぞれのワクチンについて使用した。３回の免疫化では、２週間隔で２００μｌ体積で、１／２ｃｃのインスリン注射器および２８Ｇゲージの針（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）を使用して横腹領域の皮下注射することによって投与した。
【０３４１】
血清および組織収集。マウスから、それぞれの免疫化の１日前に後眼窩叢を介して採血し、血液収集Ｃａｐｉｊｅｃｔチューブ（Ｔｅｒｕｍｏ；  Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，  ＮＪ）で遠心することによって分離した。分離した血清の一定分量を解析前に−８０℃において凍結保存した。
【０３４２】
脾臓を回収して、群あたり５匹のマウスからプールし、７０μｍのナイロンメッシュフィルターを通して組織を穏やかに細分することによって単個細胞懸濁液を調製した。細胞を解析前に−１９６℃において凍結保存した。
【０３４３】
ＥＬＩＳＡアッセイ。血清中のＨＩＶ−１  ｇｐ１２０特異的抗体を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂｉｎｌｅｙ，  １９９７）によって定量した。簡潔には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを吸着ヒツジ抗ｇｐ１２０  ｍＡｂ  Ｄ７３２４（Ａａｌｔｏ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，  Ｄｕｂｌｉｎ，  Ｉｒｅｌａｎｄ）を介してＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０で被覆して、ブロック後、三つのウェルにおいて個々のマウスからの血清試料の階段希釈液を添加した。インキュベーション後、ウェルを洗浄して抗マウスＩｇＧ−検出抗体複合体の希釈液と共にインキュベートした後、色素生産性基質を添加した。結合は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＯＤ４９０において測定した。タイター（最大５０％）は、背景（抗原のないウェル）を減算した後、最大の半分の結合を与える抗体希釈によって定義されるものとして、それぞれの群について算出した。繰り返し測定のウェルの平均値＋／−ＳＤを示してある。
【０３４４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法。本質的に（Ｍｉｙａｈｉｒａ，  １９９５）に記載されているＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法を使用して、ＨＩＶｇｐ１２０特異的なＴ細胞を定量する。簡潔には、混合セルロースエステル膜９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を３７℃において２時間、抗マウス抗ＩＦＮγ抗体（５μｇ／ｍｌ；ＭＡＢＴｅｃｈ）で被覆し、ＰＢＳで三回洗浄する。ウェルを完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ１６４０、α−ＭＥＭ、ＦＢＳ（１０％、Ｇｉｂｃｏ）、ＨＥＰＥＳ（ｌＯｍＭ  Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ−Ｇｌｎ（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ））中において、さらに３７℃で２時間ブロックする。ＰＢＳで３回ウェルを洗浄後、脾細胞の単一細胞懸濁液をｇｐ１２０タンパク質（５μＭ）またはＨ−２ｄで切断されたｇｐ１２０ペプチド（ＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ（２μｍ））の存在下において、ウェルあたり１〜５×１０５細胞で添加して１６〜２０時間おいた。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０中で広範に洗浄し（ＰＢＳ−Ｔ；０．０５％）、ビオチン化された抗ＩＦＮγ抗体（２μｇ／ｍｌ；ＭＡＢＴｅｃｈ）と１時間、室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔ中で３回洗浄して、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ）と２時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔで洗浄後、ＨＲＰ−基質、ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール；  Ｓｉｇｍａ）と共に室温で１５分間添加する。脱イオン水を添加することよって反応を停止し、ウェルを洗浄後に、空気中で２４時間乾燥する。自動ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）およびソフトウェアを使用して、スポットを数え上げる。それぞれの条件について、脾細胞の階段希釈で３回行い、１０６個の脾細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣｓ）の頻度は算出する。背景レベルを決定するためには、脾細胞を含む陰性対照試料および完全培地単独を使用し、陽性シグナルは、対照ウェルの＞２倍のＳＦＣｓのものとして定義する。
【０３４５】
Ｂ．結果および考察
抗ｇｐ１２０−特異抗体（ＰＡ１）と磁気ビーズに付着されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク（ｇｐ１２０）を使用して、磁気ビーズが関心対象の抗原に対する免疫応答を強化する能力を検討した。ビーズの調製は、２５μｇまたは５μｇ用量のｇｐ１２０を達成するように、免疫賦活性アジュバント（ＱＳ−２１）と共にまたは伴わずに、マウス群の皮下に投与した。対照群の動物には、ＱＳ−２１と共にｇｐ１２０（２５μｇまたは５μｇ）、ＱＳ２１およびＰＡ１（ビーズなし）と混合したｇｐ１２０、またはＰＡ１（ｇｐ１２０なし）と共に磁気ビーズを受けさせた。それぞれの投与後の経時的にブリードを行い、標準的なＥＬＩＳＡアッセイ法で抗ｇｐ１２０液性反応を解析するために、血清を分離した。一時的な血清の解析では、免疫応答がそれぞれの免疫化後に増加し、抗ｇｐ１２０抗体価が３回の投与後に最大であったことを示した（図２６）。抗体のタイターを血清の階段希釈によって測定し、ＱＳ−２１と共にビーズに捕獲されたｇｐ１２０が最も強力な免疫原であることが示された（図２７）。この反応は、ｇｐ１２０の用量と相関し、２５μｇのｐ１２０で免疫した動物では、血清抗体レベルを高くした。重要なことに、これらの反応は、ビーズを伴わずにｇｐ１２０およびＱＳ２１を受けさせた動物におけるものよりも約１オーダー大きかった。これらのデータは、磁気ビーズが捕獲した抗原に対する免疫応答を増大させることを示し、この技術は、ワクチン開発のための有用性を有しているかもしれない。
【実施例４】
【０３４６】
実験セットＩＶ
Ａ．  導入
ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）のエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）複合体は、ＣＤ４＋細胞へのウイルスの侵入を媒介する。ＣＤ４受容体および補助受容体（通常ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）に対する表面サブユニットｇｐ１２０の逐次の結合により、Ｅｎｖ複合体のコンホメーション変化を誘導する。タンパク質構造におけるこれらの変化は、最終的に膜貫通サブユニットｇｐ４１の疎水性融合ペプチドの細胞膜への挿入を可能にする。その後、ウイルスおよび細胞膜が融合し、細胞質にウイルス・コアの放出および新たな感染のサイクルが開始される（総説については、Ｃｈａｎ，  １９９７；  Ｄｏｍｓ，  ２０００ａ  ；  Ｄｏｍｓ，  ２０００ｂ；  Ｅｃｋｅｒｔ，  ２００１  ；  Ｍｏｏｒｅ，  ２０００  ；およびＷｙａｔｔ，  １９９８ｂ）。
【０３４７】
ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質は、ｇｐ１６０前駆体として合成され、細胞内で切断されて、天然のプレ融合形態のエンベロープ糖タンパク質複合体が得られる（Ｈｕｎｔｅｒ，  １９９７；  ＭｃＣｕｎｅ，  １９８８；およびＭｏｕｌａｒｄ，  ２０００）。これは、一般に、３つのｇｐ１２０および３つのｇｐ４１部分を含み、非共有相互作用によって一緒に保持された三量体構造であると考えられる（Ｅｃｋｅｒｔ，  ２００１；  Ｐｏｉｇｎａｒｄ，  ２００１；およびＷｙａｔｔ，  １９９８ｂ）。天然のＥｎｖ複合体は、ｇｐ４１上にｇｐ１２０を保持する非共有サブユニット間相互作用が、ｇｐ４１部分間の分子間相互作用のために弱いので、不安定である（Ｅｃｋｅｒｔ，  ２００１；  Ｐｏｉｇｎａｒｄ，  ２００１；およびＷｙａｔｔ，  １９９８ｂ）。この不安定さは、おそらく受容体でトリガーされるコンホメーション変化が生じるためには必須であるが、これは、天然の複合体を組換えタンパク質として発現する試みにおいて問題を生じる（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）。
【０３４８】
天然のＥｎｖ複合体の組換え形態は、調製されており、その結果構造上の研究が可能である。現在、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖの構造上の情報は、ＣＤ４−結合立体配位におけるｇｐ１２０のコア断片、および最も安定な立体配位の、ｇｐ４１コアがその末端を表す６−ヘリックスバンドル形態に限られている（Ｃａｆｆｒｅｙ，  １９９８；  Ｃｈａｎ，  １９９７；  Ｋｗｏｎｇ，  ２０００ｂ，  Ｋｗｏｎｇ，  １９９８  ；  Ｌｕ，  １９９９  ；  Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃ，  １９９８；  Ｔａｎ，  １９９７；およびＷｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ，  １９９７）。６−ヘリックスバンドルは、ｇｐ４１の「膜融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）」形態と称することが多いが、この用語は、膜融合を駆り立てる６−ヘリックスの束の編成であり、単に存在するのではないので、まぎらわしい可能性がある（Ｄｏｍｓ，  ２０００ｂ  ；  Ｇａｌｌｏ，  ２００１；およびＭｅｌｉｋｙａｎ，  ２０００）。それゆえに、６−ヘリックスバンドルに対する抗体は、融合を妨げることができず、非中和性である（Ｊｉａｎｇ，  １９９８；  Ｍｏｏｒｅ，  ２００１  ；  Ｎｙａｍｂｉ，  １９９８；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９９；およびＴａｎｉｇｕｃｈｉ，  ２０００）。したがって、ｇｐ４１の「融合後（ｐｏｓｔ−ｆｕｓｉｏｎ）」の用語は、６−ヘリックスバンドルをいう場合、融合プロセスが完了した後に主要な免疫原として感染細胞上にこれが残存し、ビリオン上でＥｎｖのコンホメーションが変化するときに、ｇｐ１２０分断が早まって生じるか、または失敗に終わることを示すために使用される（Ｄｏｍｓ，  ２０００ｂ）。ＨＩＶ−１感染個体におけるｇｐ４１に対する抗体の大部分は、この融合後コンホメーションを認識する（Ｇｏｒｎｙ，  ２０００  ；  Ｍｏｏｒｅ，  ２００１；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９９；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  １９９０；  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  ２０００  ；およびＸｕ，  １９９１）。
【０３４９】
天然のＥｎｖ複合体の組換え形態の第２の目的は、これらの免疫原性を研究すること、およびこれらのワクチン抗原としての適合性を決定することである。強力にＨＩＶ−１を中和するいくらかのモノクロナール抗体（ＭＡｂｓ）は、全て天然のＥｎｖ複合体に暴露されたエピトープを認識し、このような複合体によって十分に誘導されていたのであろう（Ｂｕｒｔｏｎ，  ２０００；  Ｆｏｕｔｓ，  １９９８；  Ｍｏｏｒｅ，  １９９５ｂ  ；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９７；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９８；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９９，  Ｐｏｉｇｎａｒｄ，  ２００１  ；およびＳａｔｔｅｎｔａｕ，  １９９５ａ）。対照的に、非中和ＭＡｂｓは、天然の複合体に結合せず、おそらく未切断のｇｐ１６０前駆体、分離されたｇｐ１２０サブユニットまたは６−ヘリックスの束、融合後形態のｇｐ４１などの非天然形態のＥｎｖに対して免疫応答を表さない（Ｂｕｒｔｏｎ，  ２０００；  Ｍｏｏｒｅ，  ２００１；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９７；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９８；およびＰｏｉｇｎａｒｄ，  ２００１）。
【０３５０】
いずれの形態のＥｎｖのワクチン接種によって誘発される中和抗体も、天然のＥｎｖ複合体が生じてその最も重要な部位を遮断し、かつその全体の免疫原性を制限してしまうという機構のために、問題を含む。したがって、受容体結合に関与するｇｐ１２０の保存された領域は、可変ループによって、および広範なグリコシル化によって遮断される。ＣＤ４結合部位は陥凹しており、ＣＤ４がすでに結合した後の短い期間にのみ、共受容体結合部位が形成されまたは暴露され、これにより、抗体干渉のために利用できる時間および空間が制限される（Ｍｏｏｒｅ，  １９９８；  Ｍｏｏｒｅ，  １９９５ｂ；  Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，  １９９８；およびＷｙａｔｔ，  １９９８ａ）。このような防衛機制が、ワクチン誘導抗体によって克服することができるどうかは、不明なままである（Ｍｏｏｒｅ，  ２００１；およびＰａｒｒｅｎ，  １９９９）。この課題に対する１つのアプローチは、安定化された天然のＥｎｖ複合体を形成する試みを含み、次いで、その免疫原性を改善するために、これをさらに修飾しなければならないであろう。
【０３５１】
ｇｐ１２０とｇｐ４１外部ドメイン（ｇｐ４１ＥＣＴＯ）との間の非共有相互作用の不安定性は、安定な完全にプロセスされたＨＩＶ−１  Ｅｎｖ三量体の産生に対して障害となる。ｇｐ１２０とｇｐ４１ＥＣＴＯとの間の結合は、ＳＯＳ  ｇｐ１２０タンパク質を形成するために正しく配置された分子間ジスルフィド結合を導入することによって安定化することができる（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；およびＳａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。同時トランスフェクトされたフューリンの存在下において、ｇｐ１２０をｇｐ４１ＥＣＴＯに連結するペプチド結合が切断され、これにより、適切にプロセスされたｇｐ１４０タンパク質の産生が可能になる（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ  ；およびＳａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。ＳＯＳ  ｇｐ１４０を一過性に発現する２９３Ｔ細胞からの上清中にオリゴマータンパク質が存在することが、まず最初に報告された（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）。しかし、これらのオリゴマーは多量ではなく、これらは精製に耐えなかった。精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０は、単量体タンパク質である（Ｓｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）。
【０３５２】
Ｂ．概要
本発明は、可溶性の切断されたＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質三量体の作製および特徴づけに関する。これらのｇｐ１４０タンパク質において、ｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用は、分子間ジスルフィド結合によって安定化されており、ｇｐ４１−ｇｐ４１相互作用は、ｇｐ４１ＥＣＴＯのＮ末端の七回繰り返しにおける特異的なアミノ酸、特に位置５５９での置換によって安定化される。本研究は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質が不安定であったこと、すなわちｇｐ１４０単量体に分離されて三量体形態で精製することができなかったという観測に基づく（Ｓｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）。ｇｐ１４０前駆体は、プロセスされて成熟されるので、ＳＯＳ  ｇｐ１４０三量体の脆弱性は、ｇｐ１２０とｇｐ４１ＥＣＴＯとの間のペプチド結合を除去するタンパク質分解切断イベントによって引き起こされる。したがって、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質を特徴づけるジスルフィド結合が存在しているか否かにかかわらず、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は安定なオリゴマーを形成する（Ｂａｒｎｅｔｔ，  ２００１；  Ｓｃｈｕｌｅ，  ２００２；  Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ，  ２０００；  Ｙａｎｇ，  ２０００ｂ，  Ｙａｎｇ，  ２０００ａ；およびＺｈａｎｇ，  ２００１）。構造および免疫原性の研究のために、切断された安定なＥｎｖ三量体の形成に焦点が当てられる。この結果を達成するために、ｇｐ１４０タンパク質のプレ融合（ｐｒｅ−ｆｕｓｉｏｎ）形態におけるｇｐ４１−ｇｐ４１外部ドメインの相互作用の不安定さを克服する方法を開発した。
【０３５３】
ｇｐ４１融合後状態の不安定化は、天然の三量体ＳＯＳ  ｇｐ１４０複合体の安定化を引き起こすかもしれない。天然のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ複合体は準安定的であり、受容体の結合による活性化後に、おそらくプロセスの際にｇｐ１２０を失い、６−ヘリックスバンドルの融合後への移行を起こす（Ｃｈａｎ，  １９９８；  Ｄｏｍｓ，  ２０００ａ；  Ｄｏｍｓ，  ２０００ｂ；  Ｅｃｋｅｒｔ，  ２００１；  Ｍｏｏｒｅ，  ２０００；およびＷｙａｔｔ，  １９９８ｂ）。ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のｇｐ１２０部分には、ＣＤ４を結合することができ、ｇｐ１２０内でコンホメーション変化を受けて補助受容体結合部位を暴露する。ＣＤ４および／または補助受容体の結合により、任意のさらなるコンホメーション変化がＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のｇｐ４１ＥＣＴＯ部分において惹起されるかどうかは知られていない。もしそうならば、これらの変化を完了することはできない。しかし、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質がＣＤ４に結合したかにかかわらず、その三量体形成の原因であるｇｐ４１−ｇｐ４１相互作用は、不安定であり、すなわちタンパク質は容易に単量体になる（Ｓｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）。
【０３５４】
準安定的なｇｐ１４０のプレ融合状態とその安定な融合後の６−ヘリックスバンドルとの間には、微妙なバランスが存在する。該バランスは、ｇｐ４１ＥＣＴＯ部分間の三量体相互作用だけでなく、ｇｐ１２０とｇｐ４１ＥＣＴＯとの間の結合にも関与する。
【０３５５】
ＳＩＶｍａｃ  ｇｐ１４０タンパク質は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０よりも安定な三量体タンパク質であるようである（Ｃｅｎｔｅｒ，  ２００１およびＣｈｅｎ，  ２０００）。対照的に、ＳＩＶｍａｃ  Ｅｎｖの融合後状態は、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖのものよりも安定していない（Ｌｉｕ，  ２００１）。ＳＩＶｍａｃ  Ｅｎｖ糖タンパク質が、位置５５９にイソロイシン残基ではなくバリンを含むことが関連しているかもしれないし、または関連していないかもしれない。さらに、異常に強いｇｐ１２０−ｇｐ４１の結合を有するＳＩＶｍａｃエンベロープ糖タンパク質は、これを放出した親ウイルスと比較して、不安定な融合後の６−ヘリックスバンドルコンホメーションを有する（ＬａＢｒａｎｃｈｅ，  １９９５；およびＬｉｕ，  ２００２）。ｇｐ１２０が共有結合でｇｐ４１に連結させるために、変異体ＨＩＶ−１ＬＡＩウイルスをＳＯＳ置換を含むように設計した。これらのウイルスは、最小限に感染性であるが、融合後形態の三量体界面に対応するｇｐ４１ＥＣＴＯ領域における逆突然変異を経てより感染性の形態で培養中に放出される。ｇｐ４１ＥＣＴＯにおけるこれらの変化は、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間およびｇｐ４１部分間での相互作用の両方に影響するであろう。
【０３５６】
位置５５９に置換を導入してＳＯＳＩ５５９ＰまたはＳＯＳＩ５５９Ｇ  ｇｐ１４０タンパク質を作製すると、ｇｐ４１ＥＣＴＯにおけるコンホメーション転移の１つまたは複数を遮断する（Ｈｕｎｔｅｒ，  １９９７）。
【０３５７】
置換がどのように作用し得るのかのモデルを図３４に示してある。これらの転移を防止することにより、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質を三量体として安定化する。融合の間にｇｐ４１ＥＣＴＯが受けるいくつかのコンホメーション転移の中のどれが残基５５９の変化によって損なわれるかは、まだ既知でない。可能性には、まず、捕らえにくい天然の状態からプレヘアピン中間体への移行が効果を及ぼし得るか、または第２に、次のプレヘアピン中間体から６−ヘリックスバンドルへの転移が阻止されるのかもしれない（図３４）ことを含む。Ｎ３６（Ｌ６）Ｃ３４Ｉ５５９Ｐペプチドは、〜７５％だけがヘリックスであるという観測が、第１の可能性、すなわちＮ末端ヘリックスの形成を妨げるという選択を立証する。ｇｐ４１Ｎ末端ヘリックスにおけるペプチドに基づいた研究では、残基５５９のまわりの領域を含むこのヘリックスの第１の部分が後者の部分よりも可動性であることが示されている（Ｃｈａｎｇ，  ２００１）。
【０３５８】
プロリン置換を経てそのＮ末端ヘリックスを不安定化または分裂することによって、プレ融合膜融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス糖タンパク質の三量体構造を安定させることは、先例がない。インフルエンザＨＡ２糖タンパク質では、２２個にわたるアミノ酸が、プレ融合形態においてヘリックスではない。しかし、低ｐＨに暴露して融合をトリガーすることにより、ＨＡ２のこの領域がループ−から−ヘリックスへの転移を受けてタンパク質の融合活性配置を形成する（Ｂｕｌｌｏｕｇｈ，  １９９４）。ＨＡ２の示された位置のプロリン置換により、適切にプロセスされるが、融合不適格性のタンパク質が発現される（Ｑｉａｏ，  １９９８）。同様に、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１における位置５５９のプロリン置換により、別の感染性ウイルスの膜融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を消滅させることが知られている（Ｃｈｅｎ，  １９９４  ；およびＣｈｅｎ，  １９９８）。
【０３５９】
ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ、ＳＯＳＩ５５９Ｇ、ＳＯＳＬ５６６Ｖ、およびＳＯＳＴ５６９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質は、タンパク質分解切断の欠損も受けていない。これは、野性型ｇｐ１６０タンパク質に関して同じ位置のアミノ酸置換によって引き起こされる切断欠損とは対照的である（Ｃａｏ，  １９９３；  Ｃｈｅｎ，  １９９４；  Ｃｈｅｎ，  １９９８；およびＰｏｕｍｂｏｕｒｉｏｓ，  １９９７）。ＳＯＳサブユニット間のジスルフィド結合の存在が、ｇｐ１４０タンパク質における一部の切断欠損を救出するという初期の観測（Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）により、明らかな矛盾についての説明は、提供されるであろう。さらに、種々のＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質が、同時トランスフェクトしたフューリンの存在下で発現され、この酵素の濃度の増加により、切断効率の減少のいずれかの部分を補うであろう。
【０３６０】
ＨＩＶ−１およびＳＩＶｍａｃの両者に由来するいくつかの精製されていないおよび精製されたｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質が以前に記載されている（Ｂａｒｎｅｔｔ，  ２００１；  Ｃｅｎｔｅｒ，  ２００１；  Ｃｈｅｎ，  ２０００；  Ｅａｒｌ，  １９９４ｂ；  Ｅａｒｌ，  １９９０  ；  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  ２００２；  Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ，  ２０００；およびＺｈａｎｇ，  ２００）。ＳＩＶｍａｃ  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、主に三量体であるという一般的な合意がある（Ｃｅｎｔｅｒ，  ２００１；およびＣｈｅｎ，  ２０００）。対照的に、ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質のオリゴマー状態は、研究ごとに変化する。初期のサイズ排除クロマトグラフィー工程を含む精製手順後には、ＨＩＶ−１  ＡＤＡ    ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、これらが三量体であることを示す分子量で、均一にサイズ除外カラムから溶出された（Ｚｈａｎｇ，  ２００１）。三量体であるかもしれないオリゴマーのＵＳ４  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質の産生も報告されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  ２００２）。膜結合ｇｐ１６０および可溶性ｇｐ１４０分子の切断されていないバージョンの二量体および四量体が存在することは、以前のいくつかの研究において観察されている（Ｅａｒｌ，  １９９４ｂ；  Ｅａｒｌ，  １９９０；  Ｅａｒｌ，  １９９３；  Ｅａｒｌ，  １９９１；  Ｆａｒｚａｎ，  １９９８；  Ｙａｎｇ，  ２０００ａ  ；およびＹａｎｇ，  ２０００ｂ）。ＢＮ−ＰＡＧＥアッセイ法を使用する知見では、二量体、三量体、および四量体の混合物が精製されていないおよび精製されたＨＩＶ−１  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０ＵＮＣ標品中に存在し、二量体が最も豊富な種であった（Ｓｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）。さらに、ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０ＵＮＣおよびｇｐ１６０タンパク質の二量体および四量体の形態は、おそらく異常な分子間ジスルフィド結合によってオリゴマー化されている（図２９）（Ｏｗｅｎｓ，  １９９０；およびＳｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）。このタイプのｇｐ１４０タンパク質オリゴマーは、完全にＥｎｖの天然のコンホメーションを模倣する可能性はない。実際に、精製されていないｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質が精製されていないＳＯＳ  ｇｐ１４０単量体およびＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０三量体とは異なる抗原構造を有することが分かっている。したがって、ｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯ部分の非中和性抗体エピトープは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質よりもｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質において非常に広範に暴露されている（図３２）（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ  ；  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００；およびＳｃｈｕｌｅ，  ２００２）。今後の努力は、精製され、切断された、および切断されていない三量体、並びに精製され、切断されていない二量体および四量体を、これらの抗原構造、種々の処理後のＢＮ−ＰＡＧＥゲルにおけるこれらの移動、およびこれらの受容体結合性質を評価するために比較することを含む。
【０３６１】
Ｃ．物質および方法
Ｅｎｖの発現。以前に記載したように（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；およびＳａｎｄｅｒｓ，  ２０００）、種々の形態のＪＲＦＬ  ｇｐ１４０エンベロープ糖タンパク質を、２９３Ｔ細胞においてｐＰＰＩ４ベクターから発現させ、フューリンをｐｃＤＮＡ３．１−フューリンから発現させた。また、そのタンパク分解性プロセシングを防止するためにアミノ酸置換を有する、切断されていないＪＲＦＬ  ｇｐ１４０タンパク質（ｇｐ１４０ＵＮＣ）は、他の場所（Ｂｉｎｌｅｙ２０００ａ）に記載されている。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（商標）突然変異生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を使用して特異的な変異を作製した。ランダム変異は、関連した部位に任意のヌクレオチドを含み得るプライマーで作製した。番号付けは、ＨＸＢ２Ｅｎｖ配列に基づく。組換えＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０は、他の場所（Ｔｒｋｏｌａ，  １９９６ａ）に記載されている。
【０３６２】
抗体結合アッセイ法。放射性免疫沈降アッセイ法（ＲＩＰＡ）を行うために使用した手順およびＭＡｂｓは、全て記載されている（Ａｌｌａｗａｙ，  １９９５；  Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  Ｍｏｏｒｅ，  １９９６；  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２００２；およびＴｒｋｏｌａ，  １９９６ｂ）。ＭＡｂｓは、Ｊａｍｅｓ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  （１７ｂ，  ２．２Ｂ）、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｌｅｗｉｓ  （Ｂ１２）、Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｋａｔｉｎｇｅｒ  （２Ｆ５，  ２Ｇ１２，  ４Ｄ４，  ４Ｅ１０）、およびＤｅｎｎｉｓ  Ｂｕｒｔｏｎ  （ＩｇＧｌｂｌ２）によって提供された。
【０３６３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＢＮ−ＰＡＧＥ、およびウエスタンブロット解析。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＢｌｕｅＮａｔｉｖｅ（ＢＮ）ＰＡＧＥ、およびウエスタンブロット解析は、上記したように行った（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ  ；  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００；およびＳｃｈｕｌｅ，  ２００２）。ゲル電気泳動の前に、一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの培養液上清を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を使用して１０倍に濃縮した。
【０３６４】
エンベロープ糖タンパク質のゲル濾過解析。ｐＰＰＩ４−ｇｐ１４０プラスｐｃＤＮＡ３．１−フューリンをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの上清を１００倍に濃縮し、次いで、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）で平衡化した分析的Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１０／３０２００ＨＲカラムを使用してサイズ分画した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＢＮ−ＰＡＧＥを使用して画分（３００μ１）を分析し；両方の場合において、Ｅｎｖ糖タンパク質を検出するためにウェスタンブロッティングを使用した。カラムは、既知の大きさのタンパク質標準（ＨＭＷ−標準；  Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＪ）を使用して較正した。
【０３６５】
三量体安定性実験。ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０三量体を含むゲル濾過カラムからの溶離液を種々の試薬と、または種々の条件下でインキュベートし、次いでＢＮ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット手順を使用して解析した。以下の界面活性剤は、以下の供給者から得られた；ＳＤＳ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ；ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００），  Ｓｉｇｍａ；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリアート、Ｔｗｅｅｎ−２０；エチルフェニル−ポリエチレングリコール（ＮＰ−４０）、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ；ｎ−オクチルβ−Ｄグルコピラノシド（ｏｃｔ−グルコシド），  Ｓｉｇｍａ；Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ３０％  溶液、（Ｅｍｐｉｇｅｎ）Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ。
【０３６６】
ペプチド産生。ＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  Ｎ３６（Ｌ６）Ｃ３４モデルペプチドをコードするプラスミドｐＮ３６／Ｃ３４ＪＲ−ＦＬは、ｐＮ３６／Ｃ３４ＨＸＢ２に由来した（Ｌｕ，  １９９９）。アミノ酸置換は、Ｋｕｎｋｅｌら（Ｋｕｎｋｅｌ，  １９８７）の方法を使用してｐＮ３６／３４ＪＲ−ＦＬのＮ３６セグメントに導入し、次いでＤＮＡシーケンシングによって検査した。全ての組換えペプチドは、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）において発現した。細菌をＬＢ培地中で３７℃において６００ｎｍの光学濃度が０．８まで増殖させて、でイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドで３〜４時間誘導した。細胞を０℃において氷酢酸で溶解した。細菌可溶化液を遠心分離して（３０分間３５，０００ｇ）封入体から可溶性画分を分離した。変性したペプチドを含む可溶性画分を５％の酢酸中で室温において一晩透析した。ペプチドを、Ｃ−１８調製用カラム（Ｖｙｄａｃ，  Ｈｅｓｐｅｒｉａ，  ＣＡ）および０．１％のトリフルオロ酢酸の存在下で水−アセトニトリル勾配を使用する逆相高性能液体クロマトグラフィ（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）によって可溶性画分から均一に精製し、次いで凍結乾燥した。マトリクス支援レーザ脱離電離−飛行時間型のマススペクトル分析（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，  ＭＡＡ）を使用することによって、それぞれのペプチドの分子量を確かめた。それぞれのペプチドの濃度は、６Ｍの塩化グアニジニウム（Ｅｄｅｌｈｏｃｈ，  １９６７）に可溶化後に２８０ｎｍで決定した。
【０３６７】
円偏光二色性（ＣＤ）分光法。ＨＰＬＣ精製したペプチドを６Ｍの塩化グアニジニウムおよびｌＯｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中に可溶化し、中性ｐＨにおいてＰＢＳで希釈することによってフォールディングした。単一部位が置換された変異体ペプチドは、置換の位置にしたがって命名した。ＣＤ実験は、Ａｖｉｖ  ６２Ａ  ＤＳ円偏光二色性分光計を使用して行った。モル楕円率の波長依存、［θ］を、１０μＭペプチドの１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０（ＰＢＳ）溶液を使用して、４℃でモニターした。ヘリックス含量は、Ｃｈｅｎら（Ｃｈｅｎ，  １９７４）の方法によって算出した。熱安定性は、温度の関数として２２２ｎｍ（［θ］２２２）においてＣＤシグナルの変化をモニターすることによって決定した。熱による融解は、温度を２℃ずつ上昇させ、所望の温度において２分の平衡化時間および３０秒積分時間で行った。全ての融解物は、可逆性であった。重ね合わせできるフォールディングおよびアンフォールディングの曲線を観察し、＞９０％のシグナルが、冷却によって回復した。融解温度または協同熱的変性転移（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ）の中央値（Ｔｍ）は、温度の逆数に関する、［θ］２２２値の一次微分導関数の最大から決定した（Ｃａｎｔｏｒ，  １９８０）。Ｔｍの評価の誤差は、±０．５℃である。
【０３６８】
沈降平衡解析。Ａｎ−６０のＴｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）を備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）分析用超遠心機を使用した。ペプチド溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して一晩透析し、１０、３０、および１００μＭの初濃度で充填して、２０℃において２０，０００および２３，０００ｒｐｍのローター速度で解析した。同時に、データセットを、プログラムＮＯＮＬＩＮ（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  １９８１）を使用して、Ｉｎ（吸光度）対（ラジカル距離：ｒａｄｉｃａｌ  ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）２の単一種モデルにあてはめた。タンパク質部分比容および溶媒密度をＬａｕｅら（Ｌａｕｅ，  １９９２）によって記載されたとおりに算出した。
【０３６９】
Ｄ．結果および考察
変異生成によるＳＯＳ  ｇｐ１４０三量体の安定化
精製され、切断されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は単量体であるが、このタンパク質のオリゴマー形態が、一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの新たに調製した上清中で観察された（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；およびＳｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）。これは、明らかに不安定であるが、ＳＯＳ  ｇｐ１４０のオリゴマー形態は、少しも安定ではないのではないかもしれないことを示唆する。したがって、切断されたオリゴマーのＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の安定性を増大しようとする試みのための突然変異生成ストラテジーを採用した。ｇｐ４１ＥＣＴＯサブユニット間の相互作用は、ｇｐ１４０のオリゴマー形成にかかわっているという証拠が明らかに優性であったため（Ｅａｒｌ，  １９９３；  Ｓｈｕｇａｒｓ，  １９９６；およびＷｙａｔｔ，  １９９８ｂ）、ｇｐ４１ＥＣＴＯ配列を変化することに焦点をあてた。しかし、天然のエンベロープ糖タンパク質三量体のプレ融合形態のｇｐ４１部分間の接触点の可能性についての構造上またはその他のデータは、利用できない。ｇｐ４１の融合後状態の不安定化は、プレ融合状態のを選んでコンホメーションの平衡を移行することにより、そのプレ融合配置を安定化するかもしれない（Ｊｅｌｅｓａｒｏｖ，  ２００１；  Ｊｉ，  ２０００；  Ｌｉｕ，  ２００１；  Ｌｉｕ，  ２００２  ；およびＬｕ，  １９９９）。融合後のｇｐ４１の６−ヘリックスバンドルの構造上および遺伝的なデータを利用することができる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  １９９５  ；  Ｃａｆｆｒｅｙ，  １９９８；  Ｃａｏ，  １９９３；  Ｃｈａｎ，  １９９７；  Ｃｈｅｎ，  １９９４；  Ｃｈｅｎ，  １９９８；  Ｈｕｎｔｅｒ，  １９９７  ；  Ｌｉｕ，  ２００１；  Ｌｕ，  １９９９  ；  Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ，  １９９８；  Ｐｏｕｍｂｏｕｒｉｏｓ，  １９９７；  Ｔａｎ，  １９９７；  Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ，  １９９７；  Ｗｅｎｇ，  １９９８  ；およびＷｅｎｇ，  ２０００）。
【０３７０】
タンパク質の６−ヘリックスバンドル形態におけるｇｐ４１の三量体の安定性は、Ｎ末端の七回繰り返し領域のａおよびｄ部位の残基によって決定される（Ｊｅｌｅｓａｒｏｖ，  ２００１；  Ｊｉ，  ２０００；およびＬｕ，  ２００１）（図２８）。これらのアミノ酸の大部分は、絶対的に保存されている。疎水性のＶａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ残基は、３つのＮ末端ヘリックス間の無極性界面を形成する。これらの残基は、６−ヘリックスバンドルの折りたたみおよび熱安定性の重要な決定因子である（Ｓｈｕ，  １９９９）。これらの保存された疎水性残基に非保存的な置換を行うと、６−ヘリックスバンドルを不安定化し、これを形成する確率を減少することによって、ｇｐ４１ＥＣＴＯサブユニットをこれらを望ましいプレ融合配置のままにさせるであろう。部位５５２、５６２、および５９０の親水性グルタミン残基は、これらの残基に関与する埋めこまれた極性相互作用が、その熱安定性を犠牲にしてＮ末端コイルドコイル三量体の形成のための構造特異性を与えるので、まず変更しないままにした（Ｊｉ，  ２０００）（図２８）。また、残基Ｔｈｒ−５６９の置換も評価した。
【０３７１】
どのアミノ酸がｇｐ４１ＥＣＴＯのプレ融合配置に許容されるかを予測することができないので、ランダム突然変異生成を行った。それゆえに、異なる生化学的性状を有する種々のアミノ酸が、標的としたＶａｌ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕ残基の代わりに導入された。コアイソロイシンは、三量体コイルドコイル（イソロイシンジッパーとしても知られる）（Ｈａｒｂｕｒｙ，  １９９４）に対して最も高い安定性を与えるため、突然変異生成アプローチの重点は、Ｉｌｅ−５５９およびＩｌｅ−５７３の残基を変更することであった。大部分のサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）株において、これらの部位にＶａｌおよびＴｈｒ残基がそれぞれ見出され、この場合、これらは、融合後のコイルドコイル構造を不安定するように機能するであろう（Ｊｅｌｅｓａｒｏｖ，  ２００１；  Ｌｉｕ，  ２００１；およびＬｉｕ，  ２００２）。ＳＩＶ  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、対応するＨＩＶ−１タンパク質よりも高い三量体傾向を有することに留意されたい（Ｃｅｎｔｅｒ，  ２００１；およびＣｈｅｎ，  ２０００）。
【０３７２】
ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質のオリゴマー状態をモニターするためのｂｌｕｅ  ｎａｔｉｖｅ（ＢＮ）ＰＡＧＥの使用は、他の場所（Ｓｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）に記載されている。この技術は、より安定なＳＯＳ  ｇｐ１４０変異体、すなわち、修飾されていないＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質が主に単量体として動作する条件下で三量体のままであったものを同定するためのスクリーニングアッセイ法として役立った。変異体ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質を、ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断を容易にするために同時トランスフェクトしたフューリンの存在下において、一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において発現した。これらのＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の発現および三量体の安定性に対する種々の単一残基置換の効果は、表２に要約してある（下記参照）。この情報を誘導するためにどのようにＢＮ−ＰＡＧＥが使用されたかの例を図２９ａに示してある。
【０３７３】
ランダムに作製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０突然変異体の多くは発現されないか、または特に残基５５５、５７６、および５８７で置換したもでは、発現が不十分であった。これは、おそらく、これらの部位のアミノ酸の変化がタンパク質の折畳みに有害な作用を有するためである。しかし、その他の保存された残基（たとえば５４８、５７３、５８０、および５８３）では、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質がなおも効率的に発現されたという点で置換が許容された。その他の部位における置換のＳＯＳ  ｇｐ１４０発現に対する効果は、特に残基５４５、５５９、５６６、および５６９に導入されたアミノ酸の同一性に依存した。したがって、位置５４５で、ＬｅｕからＰｈｅへの変化（Ｌ５４５Ｆ）は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０発現を減少したが、この位置におけるＡｓｎ（Ｌ５４５Ｎ）Ｐｒｏ（Ｌ５４５Ｐ）、またはＧｌｙ（Ｌ５４５Ｇ）の導入は、あまり効果を有さなかった。同様に、位置５５９（Ｉ５５９Ｆ、Ｉ５５９Ｎ）のＩｌｅからＰｈｅへ、またはＩｌｅからＡｓｎへの置換は、激しくｇｐ１４０発現を減少させた（図２ａ、レーンｓ３および６）。対照的に、位置５５９におけるＶａｌ（１５５９Ｖ）、Ｇｌｙ（Ｉ５５９Ｇ）、またはＡｒｇ（Ｉ５５９Ｒ）残基の導入は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０発現に対してあまり効果がなく、およびＰｒｏ（Ｉ５５９Ｐ）置換は、全てにおいて全く有害な作用を有さなかった（図２９ａ、レーン４、７、および８）。どのように導入された残基がＳＯＳ  ｇｐ１４０発現を変化する効果を有することができるかのその他の例は、残基５６６および５６９における変化を含む（表２）。
【０３７４】
効率的に発現された変質ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のサブセット間のオリゴマー安定性に相違があったかどうか決定するために、ＢＮ−ＰＡＧＥを使用した。天然の条件下で、野性型ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、主に単量体として移動し、いくらかの二量体および三量体種も存在する（図２９ａ、レーン２）。オリゴマーであるＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の比率は、実験間で変化するが、図２９ａに示したゲルは、最も一般的に観察されるものの典型である。対照的に、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、二量体が優性のオリゴマーの形態として移動する（図２９ａ、レーン１）。
【０３７５】
ＳＯＳ  ｇｐ１４０の効率的な発現と一致して、大部分のアミノ酸置換は、そのオリゴマー形成の程度にわずかな効果しか有さなかった（表２）。しかし、位置５５９におけるいくつかの置換は、明らかにＳＯＳ  ｇｐ１４０のオリゴマー形成状態を変えた（図２９ａ）。したがって、Ｉｌｅ−５５９が、非保存的なＧｌｙ（Ｉ５５９Ｇ）、Ａｒｇ（Ｉ５５９Ｒ）、またはＰｒｏ（Ｉ５５９Ｐ）残基によって置換された場合、最も豊富なタンパク質の形態は、絶えず三量体であった（図２９ａ、レーン４、５、および８）。対照的に、位置５５９の保存的なＩｌｅからＶａｌへの置換は、Ｉ５５９Ｖと野性型ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質を識別できなかったという点で、効果を有さなかった（図２９ａ、レーン２および７）。部位５６６および５６９における一部の置換（たとえば、Ｌ５６６Ｖ、Ｔ５６９Ｐ）、三量体であったＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の比率をわずかに増加した（表２）。トランスフェクションあたりの三量体の割合が変化したが、図２９ａ（および図３０、下記を参照されたい）に示したＳＯＳ  ｇｐ１４０  Ｉ５５９Ｐ標品における三量体の量は、典型的であった。時々、９０％の多量の三量体が観察された。
【０３７６】
一部のＳＯＳ  ｇｐ１４０変異体の発現とこれらがオリゴマーであった範囲との間には相関があるように見えた。したがって、部位５５９、５６６、および５６９の置換は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０の発現およびオリゴマー形成に影響を及ぼした（表２、図２９ａ）。これらの残基は、特に三量体（ｇｐ１４０糖タンパク質のプレ融合形態）の正しい折りたたみのために重要であろう。
【０３７７】
上記の実験は、位置５５９におけるヘリックスを不安定化する残基ＧｌｙまたはＰｒｏの導入が、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質が三量体を形成する傾向を増加することを示す。それゆえに、ｇｐ１４０のこの領域は、タンパク質のプレ融合配置においてヘリックスではないであろう。インフルエンザＨＡ２タンパク質において、低ｐＨに暴露することによるループからヘリックスへの転移の誘導は、融合中間体の伸長したコイルドコイルコンホメーションの形成に必須である（Ｂｕｌｌｏｕｇｈ，  １９９４）。ＨＡ２のこの特定の領域における種々のプロリン置換により、タンパク質加水分解で切断された三量体の産生が可能になる。しかし、これらの突然変異体は、これらが重要なループからヘリックスへの転移を受けることができないので、融合に障害がある（Ｑｉａｏ，  １９９８）。したがって、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の位置５５９の近くのその他の残基のプロリン置換が、Ｉ５５９Ｐ置換と同じ三量体安定化効果を有し得るかどうかを調査した。しかし、これらの突然変異体の大部分が効率的に発現することができたが、これらのうちで、Ｉ５５９Ｐ置換と同じ方法でＳＯＳ  ｇｐ１４０の三量体形態を安定させしたものはなかった（表３、下記を参照されたい）。
【０３７８】
種々のアミノ酸置換の組み合わせを試験した。通常、評価される二重または三重変異体の全てにおいて、Ｉ５５９ＰまたはＩ５５９Ｇの変化の一方または他方が存在することが、三量体化された表現型を得るためには必須であった。その他のいくつかの置換（たとえば、Ｌ５６６ＶおよびＴ５６９Ｐ）は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０三量体をわずかに安定させる効果を有した。
【０３７９】
表２
変異体ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の特徴の概要。
【表２−１】
2005502350.tif 000004
【表２−２】
2005502350.tif 000005
【表２−３】
2005502350.tif 000006
ａＳＯＳ  ｇｐ１４０において。
ｂ相対的な尺度：発現（−）；最小の発現（＋／−）；野生型ＳＯＳ  ｇｐ１４０（＋＋）未満の発現量；野生型ＳＯＳ  ｇｐ１４０（＋＋＋）より多い発現量。全てのタンパク質が発現された（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；
Ｂｉｎｌｅｙ，  ２００２；およびＳａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。データは、少なくとも３回の独立したトランスフェクションに由来した。
ＣＢＮ−ＰＡＧＥにおいて評価したとおり。ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の三量体の安定性は、（＋／−）で記載した（一部のトランスフェクションでは、一部の三量体が存在した）。三量体の最大量（＋＋）は、残基Ｉｉｅ−５５９における置換を含むｇｐ１４０タンパク質においてのみ見出され、独立したトランスフェクションにおいて総Ｅｎｖ発現の４０％−＞９０％に及んだ。データは、少なくとも３回の独立したトランスフェクションに由来した。
ｄデータは、図２９ｃに由来した。
ｅ決定されない（発現なし）。
【０３８０】
表３
変異形ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の特徴の概要
【表３】
2005502350.tif 000007
【０３８１】
ａＳＯＳ  ｇｐ１４０において。
ｂ相対的な尺度：発現（−）；最小の発現（＋／−）；野生型ＳＯＳ  ｇｐ１４０（＋＋）未満の発現量；野生型ＳＯＳ  ｇｐ１４０（＋＋＋）より大い発現量。全てのタンパク質が発現された（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；
Ｂｉｎｌｅｙ，  ２００２；およびＳａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。データは、少なくとも３回の独立したトランスフェクションに由来した。
ＣＢＮ−ＰＡＧＥにおいて評価したとおり。ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の三量体の安定性は、（＋／−）で記載した（一部のトランスフェクションでは、一部の三量体が存在した）。三量体の最大量（＋＋）は、残基Ｉｉｅ−５５９における置換を含むｇｐ１４０タンパク質においてのみ見出され、独立したトランスフェクションにおいて総Ｅｎｖ発現の４０％−＞９０％に及んだ。データは、少なくとも３回の独立したトランスフェクションに由来した。
ｄデータは、図２９ｃに由来した。
ｅ決定しされない（発現なし）。
ｆ表２にも存在する。
【０３８２】
非共有結合で、かつ切断された安定ＳＯＳ三量体形態
上記の結果に基づいて、さらなる解析のために、ＳＯＳ  Ｉ５５９ＰおよびＩ５５９Ｇ  ｇｐ１４０タンパク質に焦点をあてた。これらのタンパク質は、本明細書においてそれぞれＳＯＳ  Ｉ５５９ＰおよびＳＯＳＩ５５９Ｇｇｐ１４０タンパク質として命名してある。ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質は、ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｇ  ｇｐ１４０よりも高レベルで一貫して発現されたが、位置５５９のグリシン残基が存在することにより、後者のタンパク質に柔軟性を与えるかもしれない。このような柔軟性のどれもが、Ｉ５５９Ｇ置換をその他の修飾と組み合わせたとき、および場合に有用なことを証明するかもしれないと考えられた。また、残基５５９以外の部位の置換により、限られた範囲だけでさえも、安定化された三量体で同様の結果が得られるかどうかを理解するために、ＳＯＳ  Ｌ５６６ＶおよびＴ５６９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質をさらに研究した。
【０３８３】
ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ、ＳＯＳＩ５５９Ｇ、ＳＯＳＬ５６６Ｖ、およびＳＯＳＴ５６９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質標品に存在するオリゴマー種が共有結合または非共有結合で結合されたかどうかを調査するために、これらを、変性させるが非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して解析した（図２９ｂ）。ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質を比較（図２９ｂ、レーン１）のために含めた。予想されるとおり、ＳＯＳ  ｇｐ１４０は、主に１４０ｋＤａ種（図２９ｂ、レーン２）として移動した。しかし、一部のより高分子量のＳＤＳ耐性種も、ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣ標品に存在した。より高い分子量の種はＳＯＳ  ｇｐ１４０標品のわずかな成分だけであったが、これらは、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質の支配的な形態であった（図２９ｂ、レーン１）。これらのタンパク質のより高分子量のタイプは、主に共有結合で結合された二量体、および一部の場合は、二量体の二量体の可能性がある四量体であると考えられる（下記参照）。
【０３８４】
ＳＯＳ  ｇｐ１４０変異体は、ＳＤＳ処理後の支配的な種が常に１４０ｋＤａ単量体であったという点で、野性型ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質とまったく区別できなかった（図２９ｂ、レーン３から７）。したがって、ＳＯＳ  Ｉ５５９ＰおよびＳＯＳＩ５５９Ｇ  ｇｐ１４０タンパク質の三量体形態は、異常な分子間ジスルフィド結合の形成によっては作製されない。その代わりに、タンパク質は、非共有相互作用によって結合している。
【０３８５】
本発明の目標は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニット間の切断部位で、適切にプロセスされる安定なオリゴマーｇｐ１４０タンパク質を作製することである。したがって、ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ、ＳＯＳＩ５５９Ｇ、ＳＯＳＬ５６６Ｖ、およびＳＯＳＴ５６９Ｐ  ｇｐ１４０変異体が適切にプロセスされるかどうかの測定を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の前に、タンパク質をＳＤＳおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下において煮沸して、変性および還元を達成した（図２９ｃ）。これらの条件下で、種々のＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のそれぞれを、ｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯ形態に変換した（図２９ｃおよびデータ示さず）。したがって、１４０ｋＤａバンドがＤＴＴ処理で残らなかったという点で（＞９０％）（図２９ｃ、レーン２〜７）、それぞれのｇｐ１４０タンパク質は、実質的に切断されていた。対照的に、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質は、これが。ｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニット間のペプチド結合を有しているために、ＤＴＴによる影響を受けず、なおも１４０ｋＤａバンドとして移動した（図２９ｃ、レーン１）（Ｂｉｎｌｅｙ２０００ａ）。したがって、ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ、ＳＯＳＩ５５９Ｇ、ＳＯＳＬ５６６Ｖ、およびＳＯＳＴ５６９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質の三量体の安定性の増加は、どのような切断欠損によっても引き起こされず、または関連していない。
【０３８６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した大部分のＳＯＳ  ｇｐ１４０標品は、少しの割合のＳＤＳ耐性のオリゴマーを含み、これらの形態のｇｐ１４０は、ｇｐ１４０ＵＮＣ標品において比較的豊富であった（図２９ｂ）。ジスルフィド結合（図２９ｃ）を還元するためにＤＴＴも存在するときは、これらのより高分子量タイプのｇｐ１４０が観察されなかったので、これらは、おそらく異常な分子間ジスルフィド結合を介して結合されたタンパク質形態を表す（Ｓｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）。より高分子量のタンパク質が、二量体または三量体であったかどうかを決定するために、ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｇ  ｇｐ１４０タンパク質をＳＤＳの量を増大して処理し、次いで、ＢＮ−ＰＡＧＥ解析を行った（図２９ｄ）。ＳＤＳの非存在下では、三量体、二量体、および単量体は、ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｇ  ｇｐ１４０タンパク質のこの標品中に、おおざっぱに同等の比率で存在した（図２９ｄ、レーン２）。しかし、ＳＤＳ濃度を増大すると、三量体バンドは完全に消失したが、二量体バンドは、１％と同程度のＳＤＳ濃度に暴露しても残った（図２９ｄ；図２９ｂ、レーン４）。ウエスタンブロットにおける強い強度の二量体バンドは、おそらく一旦ｇｐ１４０タンパク質がＳＤＳで変性されたら、検出ＭＡｂの反応性が増大することに由来する。単量体バンドの強度の顕著な増加は、三量体が、二量体と単量体ではなく、むしろ３つの単量体に分離することを示唆する（下記参照）。ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｇ  ｇｐ１４０三量体は、非共有性のＳＤＳ感受性の結合によって形成されるが、二量体が異常なサブユニット間のジスルフィド結合を介して結合されていると結論された。同様の結果は、ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質でも得られた（図３２）。野生型ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質では、その三量体形態があまり不安定であったので、もちろんこのように試験することができなかった。
【０３８７】
ゲル濾過によるオリゴマーｇｐ１４０種の分画
ＢＮ−ＰＡＧＥ解析により、アミノ酸置換、特に５５９位におけるものが、ＳＯＳ  ｇｐ１４０三量体を安定化することができることが示された。独立した技術によってこれを実証するために、Ｅｎｖをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から分泌されるｇｐ１４０タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用する分析的ゲル濾過クロマトグラフィによって研究した。分子量が既知のタンパク質を参照標準に提供した。これらは、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、およびサイログロブリン（６６９ｋＤａ）であった。しかし、完全にグリコシル化されたｇｐ１２０およびｇｐ１４０分子は、形態が非球形であり、ゲル濾過では、これらの絶対分子量を正確に決定することができな点に留意する必要がある（Ｃｅｎｔｅｒ，  ２０００；  Ｃｅｎｔｅｒ，  ２００１；およびＳｃｈｕｌｅ，  ２００２）。
【０３８８】
溶離液画分を回収し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって解析して、種々のＥｎｖタンパク質形態の移動位置を同定した（図３０）。ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）のものと同様の明らかな分子量に対応して、主に画分１４および１５を中心に見出された（図３ａ、最上部パネル）。したがって、溶出されたＳＯＳ  ｇｐ１４０単量体の平均の明らかな分子量は、〜２４０ｋＤａであり、また、ゲル濾過を使用した以前に報告された値の〜２２０ｋＤａと一致している。（Ｓｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）。このＳＯＳ  ｇｐ１４０の標品に存在する少量のｇｐ１２０は、わずかに少ない〜２２０ｋＤａの明らかな分子量を有していた（図３０ａ）。ＳＯＳ  ｇｐ１４０標品の大部分において、少量の共有結合で結合されたオリゴマー（おそらく二量体）も見られ、画分９および１０（データ示さず）のあたりが中心であった。これらの結果は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０が、主に単量体タンパク質である（Ｓｃｈｕｌｋｅ，  ２００２）という初期の所見を確証させる。対照的に、ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質が、画分１〜１６の幅広い範囲にわたって溶出されることは、オリゴマーおよび単量体の両方の種が存在することを示している（図３０ａ、下部パネル）。また、同様のオリゴマーがＳＯＳ  ｇｐ１４０標品に通常存在しているように（図２９ｂ、レーン２）、少量の共有結合で結合されたオリゴマーが観察された（図２９ｂ、レーン３も参照されたい）。次いで、異なるオリゴマーの種を分離するために、同じＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０のゲル濾過画分をＢＮ−ＰＡＧＥによって解析した。これにより、三量体、二量体、および単量体タンパク質が、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００のカラムで明らかに分離されたことを示した。三量体は主に画分４〜９に、二量体は画分７〜１１に、および単量体は画分１１〜１５（図３０ｂ）に存在した。同様の結果は、Ｉ５５９Ｐ、Ｌ５６６Ｖ、およびＴ５６９Ｐ変異体を含むＳＯＳ  ｇｐ１４０３つの突然変異体で得られた（データ示さず）。
【０３８９】
ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０単量体の明らかな分子量は、野生型ＳＯＳ  ｇｐ１４０で観察されたものと一致する（〜２４０ｋＤａ、上記参照されたい）。二量体の保持は、明らかな分子量の〜４１０ｋＤａの平均と一致して画分９のあたりを中心としたが、三量体（ピーク画分６）は、明らかな分子量の〜５２０ｋＤａの平均を有する。三量体は、これらの期待される大きさのｇｐ１４０単量体の３倍の大きさと一致する位置に溶出されないことは重要である。したがって、これらは「予想される」〜６６０〜７２０ｋＤａ（すなわち、３×〜２２０〜２４０ｋＤａ）に対して、分子量〜５２０ｋＤａと一致した位置で溶出される。同じもことが、より小さい程度で、二量体にもあてはまり、「予想される」〜４４０〜４８０ｋＤａ（すなわち、２×〜２２０〜２４０ｋＤａ）と比較して〜４１０ｋＤａで溶出される。これに対する説明は、おそらく三量体およびおそらく二量体も、ｇｐ１４０単量体のものよりも小型のコンホメーションに折り畳まれているのであろう。電子顕微鏡法研究では、この見解を確かめることができるであろう。あるいは、三量体におけるグリコシル化部位は、単量体の同じ部位よりも修飾酵素によるアクセスができないため、ｇｐ１４０の種々のオリゴマー形態のグリコシル化の性質および程度を変化してもよい。全体的に、非球状タンパク質の分子量の評価におけるゲル濾過の限界を考えれば（Ｃｅｎｔｅｒ，  ２０００  ；  Ｃｅｎｔｅｒ，  ２００１；およびＳｃｈｕｌｅ，  ２００２）、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の種々の精製されたオリゴマー種の絶対的な分子量を決定するために、その他の技術（たとえば、マススペクトル分析）を使用する必要があるだろう。
【０３９０】
ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０三量体の安定性
ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質の三量体ピークに対応するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム画分（画分６および７）をこれらの安定性の解析のためにプールした（図３１）。三量体は、２５℃および３７℃における１時間インキュベーションでは安定していたが（図３１ａ、レーン１および２）、４５℃（図３１ａ、レーン３）で１時間後には、一部の単量体が見えるようになり、５５℃または６５℃において１時間加熱後には、ほとんど全てのタンパク質が単量体形態であった（図３１ａ、レーン４および５）。３回の−８０℃における凍結解凍サイクルでは、三量体を単量体に変換しなかった（図３１ａ、レーン７）。次に、分画した三量体を種々の界面活性剤と２５℃において１時間でインキュベートした（図３１ｂ）。三量体は、０．１％の陰イオン界面活性剤ＳＤＳとのインキュベーションにより単量体に分離されたが（図３１ｂ、レーン２）、しかし、これらは、同濃度の非イオン性または双性イオン性界面活性剤のトリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＮＰ−４０、オクチル−グルコシド、およびＥｍｐｉｇｅｎ（図３１ｂ、レーン３〜７）に対して少なくとも部分的に耐性であった。また、ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０三量体が１．ＯＭまでの濃度のＮａＣｌの存在で、または穏和な酸（ｐＨ４．０）に対する暴露後に、単量体に分離しなかったことが観察された（データ示さず）。
【０３９１】
二量体は、加熱または界面活性剤で処理したＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０三量体では、非常に低レベルのみで存在した。これは、三量体の構築ユニットが、単量体および二量体ではなく、むしろ３つの等価な単量体であることを示唆する。
【０３９２】
安定化ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の抗原構造分析
本発明の目標は、ビリオンに結合したＥｎｖの抗原構造をできるだけ近く模倣する、切断された安定ｇｐ１４０三量体を形成することであり、精製されていないＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質の反応性を、ＭＡｂｓおよびＣＤ４に基づく試薬のパネルで研究した。また、比較のために、ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質も研究した（図３２）。野生型ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質はいずれも、ＣＤ４−ＩｇＧ２分子によって免疫沈降されたことから、両タンパク質（図３２、レーン２）のｇｐ１２０サブユニットにおいてＣＤ４−結合部位（ＣＤ４ＢＳ）は無傷であったことを示した。ＣＤ４ＢＳに結合したエピトープに対する中和ＭＡｂ  ＩｇＧ１ｂ１２も、マンノース依存性のｇｐ１２０エピトープに対する中和ＭＡｂ  ２Ｇ１２のように、両方のタンパク質に効率的に結合した（Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２００２；およびＴｒｋｏｌａ，  １９９６ｂ）（図３２、レーン１および３）。さらに、ｓＣＤ４の１７ｂエピトープの誘導は、ＳＯＳおよびＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質の両者において非常に効率的であった（図３２、レーン４および５）。このエピトープは、ＣＤ４誘導性のｇｐ１２０上の補助受容体結合部位と重なる（Ｒｉｚｚｕｔｏ，  １９９８；  Ｔｈａｌｉ，  １９９３；  Ｗｙａｔｔ，  １９９８ａ  ；およびＷｙａｔｔ，  １９９５）。したがって、ｇｐ４１ＥＣＴＯにおけるＩ５５９Ｐ置換は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のｇｐ１２０サブユニットがＣＤ４受容体に結合し、次いでｇｐ１２０サブユニット内で受容体を媒介したコンホメーション変化を受ける能力には影響を及ぼさない。この点に関しては、ＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質は、野性型ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質と区別できないように見える。
【０３９３】
ｇｐ４１ＥＣＴＯには、３つの主なエピトープクラスターがある。１つのクラスターは、中和ＭＡｂｓ  ２Ｆ５、４Ｅ１０、およびｚ１３によって認識され、ｇｐ４１ＥＣＴＯのＣ末端近くに位置する（Ｐａｒｋｅｒ，  ２００１；  Ｓｔｉｅｇｌｅｒ，  ２００１；およびＺｗｉｃｋ，  ２００１）（図２８ａ）。ｇｐ４１ＥＣＴＯのこの領域は、これらが２Ｆ５（図３２、レーン６）および４Ｅ１０（データ示さず）に効率的に結合することによって示されるとおり、ＳＯＳおよびＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質によくさらされている。クラスターＩおよびクラスターＩＩのｇｐ４１ＥＣＴＯエピトープは、非常に免疫原性が高い。しかし、ｇｐ４１のこれらの領域に対する抗体は、これらのエピトープが、天然のプレ融合形態のエンベロープ糖タンパク質複合体において、ｇｐ４１ＥＣＴＯ部分間の相互作用によって、またはｇｐ１２０サブユニットが存在するためにふさがれているため、非中和性である（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ  ；  Ｊｉａｎｇ，  １９９８；  Ｍｏｏｒｅ，  ２００１；  Ｎｙａｍｂｉ，  １９９８；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９９；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  １９９０；  Ｓａｔｔｅｎｔａｕ，  １９９５ｂ；およびＴａｎｉｇｕｃｈｉ，  ２０００）。クラスターＩ（２．２Ｂ）およびクラスタＩＩ（４Ｄ４）に対するＭＡｂｓのエピトープは、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質と効率的に相互作用するが、ＳＯＳまたはＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質には結合しない（図３２、レーン７および８）。同様の結果は、その他のＭＡｂｓとこれらのエピトープクラスターについても得られた（データ示さず）。この結果のパターンは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０の抗原構造における以前の報告と一致する（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００；およびＳｃｈｕｌｅ，  ２００２）。ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の残基６０５におけるシステイン置換の導入により、クラスターＩ  ＭＡｂｓの一部または全てのエピトープのすぐ近くを直接攪乱することができる。しかし、クラスターＩＩ  ＭＡｂエピトープの場合には、これらがＣ末端のヘリックスス領域のＣｙｓ−６０５置換から約４０残基に位置するために、これはできない（図２８ａ）。
【０３９４】
また、ＳＯＳ  ｇｐ１４０変異体のＩ５５９Ｇ、Ｌ５６６Ｖ、およびＴ５６９Ｐを、上記のＭＡｂｓおよびＣＤ４に基づく試薬との反応性について試験した。これらのそれぞれは、ＳＯＳおよびＳＯＳ  Ｉ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質と同様に挙動した（データ示さず）。
【０３９５】
ｇｐ４１の６−ヘリックスバンドル形態の不安定化
得られた突然変異生成の結果は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０三量体が、ｇｐ４１ＥＣＴＯサブユニットのＮ末端七回繰り返し領域におけるＩ５５９Ｇ、Ｉ５５９Ｐ、並びにいくらかの程度で、Ｌ５６６ＶおよびＴ５６９Ｐ置換によって安定化され得ることを示す。疎水的相互作用がｇｐ４１コアの安定化における主な因子であることを考えると（Ｊｅｌｅｓａｒｏｖ，  ２００１およびＬｕ，  １９９９）、これらのアミノ酸置換が６−ヘリックスバンドル構造を不安定化するように見える。この仮定を直接試験するために、それぞれの４アミノ酸置換の効果を、ＪＲＦＬ  ｇｐ４１ＥＣＴＯコアの全体的な構造および安定性について決定した。したがって、この可溶性ｇｐ４１コアの組換えペプチドモデルを作製した。Ｎ３６（Ｌ６）Ｃ３４と命名したこのモデルペプチドは、ジスルフィド結合したｇｐ４１ＥＣＴＯのループ領域を置換する短いペプチドリンカーを介して結合されたＮ３６およびＣ３４ペプチドからなる（図３３ａ）（Ｌｕ，  １９９９）。Ｎ３６ペプチドは、ＪＲＦＬ  ｇｐ４１タンパク質配列の残基５４６〜５８１からなるが、Ｃ３４ペプチドは、残基６２８〜６６１からなる。上記４アミノ酸の変化のそれぞれをＮ３６（Ｌ６）Ｃ３４ペプチドに導入した。沈降平衡解析では、Ｎ３６（Ｌ６）Ｃ３４変異体の分子量は、Ｉ５５９Ｐ変異体を除いて全て、理想的な三量体について算出されるものの１０％以内であり、残留する系統的なずれもない（データ示さず）。
【０３９６】
円偏光二色性（ＣＤ）測定では、Ｎ３６（Ｌ６）Ｃ３４野生型、並びにＩ５５９Ｇ、Ｌ５６６Ｖ、およびＴ５６９Ｐ変異体ペプチドは、４℃において、それぞれ＞９５％ヘリックスであったが、Ｉ５５９Ｐ変異体ペプチドは、明らかに〜７５％ヘリックスのみであった（表４、下記を参照されたい）。これらの条件下において、Ｉ５５９Ｇ、Ｉ５５９Ｐ、Ｌ５６６Ｖｂ、およびＴ５６９Ｐペプチドの熱変性（Ｔｍ'ｓ）中央値は、野性型ペプチド（表４）の７８℃のＴｍと比較して、それぞれ４６、３４、７２、および４４℃である。転移前および転移後のスロープおよび主要な転移の勾配は、Ｎ３６（Ｌ６）Ｃ３４、Ｉ５５９Ｇ、およびＬ５６６Ｖペプチド（図３３ｂ）について非常に似ている。対照的に、Ｉ５５９ＰおよびＴ５６９Ｐペプチドは、幅広い熱的変性転移を示す（図３３ｂ）。沈降平衡実験では、Ｎ３６（Ｌ６）Ｃ３４ペプチド、およびそのＩ５５９Ｇ、Ｌ５６６Ｖ、およびＴ５６９Ｐ変異体、ペプチド濃度の１０倍（１０〜１００Ｍ）の範囲にわたり分離した三量体としてそれぞれ沈降することを示す（表４；図３３ｃ）。また、Ｉ５５９Ｐペプチドは、溶液中において、１５μＭ以下の濃度で三量体であるが、これは１０〜１００μＭの間で三量体分子量から系統的なずれを示すことから、Ｉ５５９Ｐが会合を起こしやすいことを示している。合わせると、これらの結果は、Ｉｌｅ−５５９からＧｌｙへ、およびＴｈｒ−５６９からＰｒｏへの置換は、それぞれ６−ヘリックスバンドルのかなりの不安定化を引き起こすが、その全体的な折り畳みには影響しない。対照的に、Ｉｌｅ−５５９からＰｒｏへの置換は、６−ヘリックスバンドル形成を本質的に分裂させる。さらに、Ｌｅｕ−５６６からＶａｌへの変化は、６−ヘリックスバンドルの、わずかな、好ましくない、残留する不安定化に関係している。
【０３９７】
表４
ＪＲＦＬ  ｇｐ４１コア変異体の生物物理学的な特徴づけ
【表４】
2005502350.tif 000008
【０３９８】
ａ全てのＣＤスキャンおよび融解物は、１０μＭのペプチドのＰＢＳ（ｐＨ７．０）溶液において行った。２２２ｎｍのＣＤシグナル（［θ］２２２ｎｍ）を報告する。熱変性（ＴＭ）の中央値は、２２２ｎｍでＣＤシグナルの温熱依存性から評価した。
ｂ沈降平衡の結果は、単量体について算出された分子量に対する実験的分子量の比として（Ｍｏｂｓ／Ｍｃａｌｃ）報告してある。
Ｃ沈降平衡によって算出される凝集物。
【０３９９】
全体的に、これらの実験では、Ｉ５５９Ｐ、Ｉ５５９Ｇ、Ｌ５６６ＶおよびＴ５６９Ｐ置換が、実際に６−ヘリックスバンドル（ｇｐ４１ＥＣＴＯの融合後コンホメーション）を不安定にすることを確認する。実際に、Ｉ５５９Ｐの変化は、Ｎ末端ヘリックスを不安定にすることによって、完全に融合後状態の形成を防止するために十分であるように見える。したがって、モデルペプチドを使用して得られた結果は、対応するアミノ酸置換が、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質に導入されたときに観察されたものと一致する。さらに、両結果のセットは、ｇｐ４１ＥＣＴＯの６−ヘリックスバンドル形態の形成を不安定にするか、またはそうでなければ阻止することにより、ｇｐ１４０タンパク質をその天然の、三量体の、プレ融合配置に維持することを助けるという基本的な仮定を支持する。
【０４００】
本明細書に記載される三量体を安定化する置換は、切断されたＥｎｖ三量体の有意な量の産生を簡単にする。これらの物質は、ワクチンのデザインにおいて、および構造上の研究のために有用である。
【実施例５】
【０４０１】
実験セットＶ
Ａ．  概要
ウイルス感染した細胞では、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）前駆体ｇｐ１６０は、細胞のプロテアーゼによって切断されて、融合能を有するｇｐ１２０／ｇｐ４１へテロダイマー（２つのサブユニットが非共有結合的に会合している）になる。しかし、完全長のｇｐ１６０または膜貫通ドメインのすぐＮ末端側が切断された可溶性ｇｐ１４０として、組換えＥｎｖが高レベルで発現されているときには、切断が不十分なことがある。本発明者らは、ワクチン抗原として使用するために、完全に切断されたＥｎｖを取得する方法を幾つか調べた。本発明者らは、精製Ｅｎｖがインビトロで精製プロテアーゼにより酵素的に消化され得るかどうかを調べた。プラスミンは、Ｅｎｖ前駆体を効率的に切断したが、ｇｐ１２０の別の部位も切断した（Ｖ３ループである可能性が最も高い）。これに対して、可溶型のフューリンはｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位に対して特異的であったが、切断の効率は低かった。Ｅｎｖを完全長または可溶型のフューリンと共発現させると、Ｅｎｖの切断が増大するのみならず、Ｅｎｖの発現も減少した。細胞のプロテアーゼによるＥｎｖ切断部位の使用が増大し得るか調べるためにＥｎｖ切断部位（ＲＥＫＲ）を変異させると、幾つかの変異体で、野生型タンパク質に比べて、プロセッシングの効率が増大した。最適な切断部位の配列は、ＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＫＲ、およびＲＲＲＫＫＲであった。これらの変異は、Ｅｎｖタンパク質が融合を媒介する能力を有意に変化させなかったので、Ｅｎｖの構造を根本的に乱すことはなかった。さらに、野生型のＥｎｖとは異なり、切断部位変異体の発現は、フューリンの共発現によって著しい減少を示さなかった。従って、Ｅｎｖ切断部位変異体とフューリンを共発現させることは、プロセッシングされたＥｎｖを高レベルで発現させる有用な方法である。
【０４０２】
Ｂ．  序論
Ｅｎｖ糖タンパク質複合体は、ヒト免疫不全症候群ウイルス１型（ＨＩＶ−１）が感受性細胞に感染するに際して、受容体結合と膜融合を媒介する（Ｐｏｉｇｎａｒｄ，２００１）。Ｅｎｖ糖タンパク質複合体は、オリゴマー化して高度にグリコシル化されたトリマーを形成するポリペプチド前駆体（ｇｐ１６０）として合成される（Ｄｏｍｓ，  １９９３；  ａｎｄ  Ｅａｒｌ，  １９９４）。合成の後期段階に、おそらくは、トランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ，ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ  ｎｅｔｗｏｒｋ）の中で、ｇｐ１６０はフューリンによって（Ｄｅｃｒｏｌｙ，１９９４；  Ｄｅｃｒｏｌｙ，  １９９６；  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  １９９３；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９８；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９９  ；  および  Ｍｏｕｌａｒｄ，  ２０００）、またはその他の関連ズブチリシン様プロテアーゼ（Ｄｅｃｒｏｌｙ，  １９９４  ；Ｄｅｃｒｏｙｌｙ，  １９９６  ；Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ  １９９５  ；Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ，  １９９７  ；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  ２０００；  およびＶｏｌｌｅｎｗｅｉｄｅｒ，  １９９６）によって切断されて、表面サブユニット（ＳＵ；ｇｐ１２０）と膜貫通サブユニット（ＴＭ；ｇｐ４１）になる（Ｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，  １９９７；  Ｋｏｚａｒｓｋｙ，  １９８９）  ；  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  １９９３  ；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９８；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９９；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  ２０００；  および  Ｓｔｅｉｎ，  １９９０）。ｇｐ１２０−ｇｐ４１接合部に位置するモチーフ（塩基性アミノ酸残基のテトラマーＲ−Ｘ−Ｒ／Ｋ−Ｒ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含有する）のところで切断は起こる。その後、ｇｐ１２０とｇｐ４１タンパク質は非共有結合的な会合を保ち、機能的ネイティブ（ｇｐ１２０−ｇｐ４１）３複合体を形成する（Ｄｏｍｓ，  １９９３；  Ｅａｒｌ，  １９９４；  ａｎｄ  Ｐｏｉｇｎａｒｄ，  ２００１）。
【０４０３】
融合の間、ｇｐ１２０タンパク質は、ウイルス受容体および標的細胞上の共受容体と相互作用する。これによって、コンフォメーションの変化が引き起こされ、この変化により、ｇｐ４１のＮ末端に位置する疎水性融合ペプチドが標的細胞膜の中に挿入される（Ｐｏｉｇｎａｒｄ，  ２００１）。未切断ｇｐ１６０には融合能がないので（Ｂｏｓｃｈ，  １９９０；  Ｇｕｏ，  １９９０  ；  Ｉｗａｎｔａｎｉ，  ２００１；  ａｎｄ  ＭｃＣｕｎｅ，  １９８８）、融合にはｇｐ１６０の切断が必須である。一般的に、切断されたＥｎｖのみがビリオン中に取り込まれるが（Ｄｕｂａｙ，１９９５）、未切断のＥｎｖもビリオンに随伴することは可能である（Ｉｗａｔａｎｉ，２００１；  ａｎｄ  ＭｃＣｕｎｅ，１９８８）。インフルエンザＡ（Ｂｅｎｄｅｒ，  １９９９；  Ｇｏｔｏ，  １９９８；  Ｈｏｒｉｍｏｔｏ，  １９９５；  Ｋａｗａｏｋａ，  １９９１；  Ｋａｗａｋｏｗａ，  １９８８；  Ｋｌｅｎｋ，  １９９４；  ａｎｄ  Ｏｈｕｃｈｉ，  １９８９）、セムリキ森林ウイルス（Ｆｅｒｌｅｎｇｈｉ，  １９９８；  ａｎｄ  Ｓａｌｍｉｎｅｎ，  １９９２）、ニューキャッスル病ウイルス（Ｓｅｒｇｅｌ，２００１）などのエンベロープに包まれた他のウイルスから類推すると、ｇｐ１６０の切断により、低エネルギー状態から融合を可能とする準安定的なＥｎｖの立体配置への以降が誘導されるのかもしれない。エンベロープに包まれたウイルスの科の多くで、Ｅｎｖ前駆体の切断が共通して必要とされるということは、ウイルス集合において、この切断現象が普遍的な重要性を有することを示唆している（Ｂｏｌｔ，  ２０００；  Ｆｅｒｌｅｎｇｈｉ，  １９９８；  Ｋｌｅｎｋ，  １９９４  ；  Ｓａｋｕｒａｉ，  １９９９；  Ｓｔａｄｌｅｒ，  １９９７  ；  Ｓｕｇｒｕｅ，  ２００１；  Ｖｏｌｃｈｋｏｖ，  １９９８；  ａｎｄ  Ｗｅｉｄｍａｎｎ，  ２０００）。
【０４０４】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖは、ウイルスを中和する抗体を生成させるためのワクチン設計計画において焦点となっている。ＨＩＶ−１を中和するためには、抗体は、ネイティブのトリマーウイルス随伴Ｅｎｖ複合体に結合することが可能でなければならない（Ｂｕｒｔｏｎ，  １９９７；  Ｂｕｒｔｏｎ，  ２０００；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９７  ；  ａｎｄ  Ｐａｒｒｅｎ，  ２００１）。現在までに調べられたＥｎｖをベースとするワクチンの候補の多くは、モノマーのｇｐ１２０サブユニットか、様々な形態の未切断１６０またはｇｐ１４０（ｇｐ１２０＋ｇｐ４１外部ドメイン）前駆体タンパク質の何れかであった（Ｂａｒｎｅｔｔ，  ２００１；  Ｅａｒｌ，  ２００１；  Ｆａｒｚａｎ，  １９９８；  Ｈｕ，  １９９１；  Ｌｙ，  ２０００；  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９９６；  Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ，  ２０００；  Ｙａｎｇ，  ２０００ａ；  Ｙａｎｇ，  ２０００ｂ；  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，  ２００１）。切断されたＥｎｖ中での緩やかな非共有結合性のｇｐ１２０−ｇｐ４１の会合では、ｇｐ１２０がｇｐ４１と解離してしまうの、未切断のｇｐ１４０またはｇｐ１６０タンパク質を使用することが必要であると考えられてきた（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ，  １９８５；  ＭｃＫｅａｔｉｎｇ  １９９１  ；  Ｍｏｏｒｅ，  １９９０；  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  １９８６）。しかし、ｇｐ１２０、未切断のｇｐ１４０およびｇｐ１６０タンパク質は、ネイティブのトリマーＥｎｖ複合体の構造を完全には模倣していない。その結果、ｇｐ１２０および未切断Ｅｎｖタンパク質に対して生じた抗体は、相同なＨＩＶ−１単離株を中和できることはあるが、一般的には異種の初代単離株を交叉中和することはない（Ｂａｒｎｅｔｔ，  ２００１；  Ｅａｒｌ，  ２００１  ；  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，  ２００１）。
【０４０５】
ウイルスタンパク質の全体構造に対する切断の影響は、様々なウイルスで研究されてきた。インフルエンザＡヘマグルチニン前駆体（ＨＡ０）を切断しても、局所的なリフォールディングが生じるだけで、全体構造に対する影響はほとんどない（Ｃｈｅｎ、１９９８）。しかし、モデルインフルエンザＡ  ＨＡＯがどの程度正確にＨＩＶ−１  ｇｐ１６０に当てはまるかは不明である。すなわち、２つのウイルスは関連性が薄く、それらの融合能は全く異なる機序によって引き起こされるので、ＨＡＯから得られた結果を外装して、ｇｐ１６０の構造と機能を全ての面にわたって予測しようとすることは適切ではないであろう。現に、未切断のＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質は、切断されたタンパク質と抗原性が異なっており、従って、構造も異なっていると推察される（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ）。さらに、エンベロープで包まれた他の幾つかのウイルスのＥｎｖタンパク質では、切断を行うと、エンベロープタンパク質の目覚しいリフォールディングが生じる（Ｄｕｔｃｈ，  ２００１；  Ｆｅｒｌｅｎｇｈｉ，  １９９８；  Ｈｅｉｎｚ，  １９９５  ；  Ｐａｒｅｄｅｓ，  １９９８；  Ｓａｌｍｉｎｅｎ，  １９９２；  Ｓｃｈａｌｉｃｈ，  １９９６；  Ｓｅｒｇｅｌ，  ２００１；  ａｎｄ  Ｓｔａｄｌｅｒ，  １９９７）。このように、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）のトリマースパイク前駆体の突出ドメインは合体して、稠密な成熟スパイクを形成する（Ｆｅｒｌｅｎｇｈｉ，１９９８；  ａｎｄ  Ｓａｌｍｉｎｅｎ，１９９２）。ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）のＥタンパク質とＳＶ５パラミクソウイルスのＦタンパク質の成熟型の構造は、抗体によって調べたところ、未成熟型とは著しく異なっているようである（Ｄｕｔｃｈ，  ２００１；  Ｈｅｉｎｚ，  １９９５；  Ｓｃｈａｌｉｃｈ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｓｔａｄｌｅｒ，  １９９７）。ＳＶ５  Ｆタンパク質の膜貫通ドメインの７回リピート領域に対する抗体は未切断型しか認識しないということに留意しなければならない（Ｄｕｔｃｈ，２００１）。総じて、先の例が、切断がＨＩＶ−１  Ｅｎｖに与える構造的な影響に対して、ＨＡＯより優れたパラダイムとなるかどうかは不明であるが、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖの切断型をさらに分析すべきことを示唆していることは明らかである。
【０４０６】
Ｅｎｖのネイティブ構造を模倣することは、ＨＩＶ−１ワクチンの設計戦略として有用であり得る。しかし、Ｅｎｖ切断の効率が低く（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ  ；  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  １９９３；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９９  ；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  ２０００  ；  Ｖｏｌｌｅｎｗｅｉｄｅｒ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ，  １９９５）、切断が起こった後に複合体が不安定となるために、ネイティブＥｎｖ複合体を組換えタンパク質として作製することは困難であった（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ，  １９８５；  ＭｃＫｅａｔｉｎｇ，  １９９１；  Ｍｏｏｒｅ，  １９９０；  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  １９８６）。切断型のＥｎｖ中でのｇｐ１２０−ｇｐ４１の会合は、ｇｐ１２０とｇｐ４１の間に分子間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を適切な位置に導入することによって安定化することができる（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ）。しかし、Ｅｎｖをトランスフェクトした細胞の中で、ｇｐ１４０前駆体を完全に切断するためには、フューリンを共発現することが必要であった（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ）。このアプローチの欠点は、フューリンを共発現するとＥｎｖの発現が著しく低下してしまうということである（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  １９９３；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９９；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  ２０００；  ａｎｄ  Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ，  １９９５）。さらに、Ｅｎｖタンパク質の中には、フューリンを共発現した場合でさえ、切断が完全でないものもあった（Ｄｅｃｒｏｌｙ，  １９９４；  Ｄｅｃｒｏｌｙ，  １９９６  ；  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  １９９  ；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  ２０００；  ａｎｄ  Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ，  １９９５）。ｇｐ１２０可変ループ（Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００；  ａｎｄ  Ｔｒａｖｉｓ，  １９９２）、Ｅｎｖの他の領域（Ｄｅｄｅｒａ，  １９９２  ；  Ｍｅｒａｔ，  １９９９  ；  Ｓｙｕ，  １９９１；  Ｔｓｃｈａｃｈｌｅｒ，  １９９０；  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ，  １９９１）、および切断部位近傍の残基（Ａｄａｍｓ，  ２０００；  Ｆｒｅｅｄ，  １９８９；  Ｇｕｏ，  １９９０；  ａｎｄ  Ｓｙｕ，  １９９１）を変化させると、何れも、一般に予想されない態様で、Ｅｎｖの切断効率に影響を与えることができる。総じて、切断効率は、ｇｐ１２０−ｇｐ４１接合部に位置する結合へのフューリンの接近に影響を与える因子であるフォールディング、オリゴマー化、およびｇｐ１６０のグリコシル化によって決定される。
【０４０７】
Ｃ．  材料と方法
プラスミドと変異導入。ｇｐ４１の膜貫通ドメインと細胞質内ドメインを欠く可溶性ｇｐ１４０を発現するｐＰＰＩ４プラスミドは、他の文献に記載されている（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ；Ｓａｎｄｅｒｓ，２０００；  ａｎｄ  Ｔｒｋｏｌａ，  １９９６ａ）。特に断っていなければ、本研究で発現されるＥｎｖ糖タンパク質は、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ分子クローン、サブタイプＢ、Ｒ５初代単離株から得たものである。しかし、本発明者らは、以前記載したように（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ）、分子クローン、ＨＸＢ２、８９．６、８９．６ＫＢ９、ＤＨ１２３、Ｇｕｎ−１ＷＴからｇｐ１４０タンパク質を発現させ、Ｌｙｎｎ  Ｍｏｒｒｉｓ、Ｃａｒｏｌｙｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ、および  Ｍａｒｉａ  Ｐａｐａｔｈａｎｏｐｏｕｌｏｕｓ博士（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ，  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）から頂いたｐＴ７ブルーをベースとしたソースプラスミドを用いて、南アフリカ単離株ＤＵ１５１からもｇｐ１４０タンパク質を発現させた。ＳＩＶｍａｃとＳＩＶｍｎｅ由来のｇｐ１４０タンパク質は、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬと同様に発現させた。上記ｇｐ１４０タンパク質のうちの幾つかに対しては、ｇｐ１２０とｇｐ４１の間に分子間ジスルフィド結合を導入するようにデザインされたシステイン置換を含有する変異体も作製した。このジスルフィド結合の位置は、ＳＯＳ  ｇｐ１４０と称するタンパク質を作製するために、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０中に導入されたジスルフィド結合に対応している（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ）。ＳＯＳ変異を欠くが、ネイティブｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位を保持している野生型ｇｐ１４０タンパク質は、ｇｐ１４０ＷＴと表記する。他のｇｐ１４０タンパク質を変異させて、野生型ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位であるＲＥＫＲを置換し、ｇｐ１４０ＲＲＲＫＫＲ、ｇｐ１４０ＲＲＲＲＫＲ、ｇｐ１４０ＲＲＲＲＲＲ、ｇｐ１４０ＫＫＲＫＫＲ、およびｇｐ１４０ＲＥＲＲＲＫＫＲと名付けた。全てのアミノ酸置換は、適切なプライマーを用い、ＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅＴＭ部位特異的突然変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）を使用して行った。プラスミドｐＳＶを用いて、感染性と融合アッセイのために完全長のＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１６０を発現させた（Ｄｒａｇｉｃ，１９９６）。本タンパク質の変異体を構築し、ｐＰＰＩ４  ｇｐ１４０変異体と同様に命名した。水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）  Ｇタンパク質は、ｐＳＶプラスミドによっても発現された（Ｄｒａｇｉｃ，１９９６）。フューリンは、以前記載したように、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｕｒｉｎから発現した（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ）。残基Ｅ−６８４に代えて、フューリン遺伝子中に停止コドンを導入して、プラスミドｐＣＤＮＡ−Ｆｕｒｉｎ  'ＴＣを作製した。この変異により、フューリンは、その外部ドメインのＣ末端近くで切断され、活性型の分泌性フューリンが発現される（Ｐｌａｉｍａｕｅｒ，２００１）。ｐＧＥＭフューリンソースプラスミドは、Ｇａｒｙ  ＴｈｏｍａｓおよびＳｅａｎ  Ｍｏｌｌｏｙ博士（Ｖｏｌｌｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｐｏｒｔｌａｎｄ，  ＯＲ）から頂いた（Ｍｏｌｌｏｙ，  １９９２；  ａｎｄ  Ｍｏｌｌｏｙ，  １９９４）。
【０４０８】
抗ＨＩＶ−１およびＳＩＶ抗体と血清。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｂ１２は、変性型のｇｐ１２０上に露出していることが多いｇｐ１２０のＣ２ドメイン中に存在するエピトープを認識する（Ａｂａｃｉｏｇｌｕ，１９９４）。本モノクローナル抗体は、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｌｅｗｉｓ博士（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ）から頂いた。ＭＡｂ  ２Ｆ５は、ｇｐ４１外部ドメインのＣ末端領域中に存在する中和エピトープを認識し（Ｍｕｓｔｅｒ，１９９３）、Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｋａｔｉｎｇｅｒ博士（Ｐｏｌｙｍｕｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ）から頂いた。精製ＳＩＶ免疫グロブリン（ＳＩＶＩＧ）は、以前に記載したように、ＳＩＶｍａｃ２５１に感染したアカゲザルの血清から精製した（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ｂ）。
【０４０９】
ＨＩＶ−１に感染したヒトから得た精製されたヒト免疫グロブリン（ＨＩＶＩＧ）は、Ｊｏｈｎ  Ｍａｓｃｏｌａ博士（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ＮＩＨ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ）から頂いた。
【０４１０】
トランスフェクション、免疫沈降、およびウェスタンブロッティング  ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションと代謝標識および免疫沈降は、それぞれ、標識ＨＩＶ−１またはＳＩＶタンパク質を沈殿させるためにＨＩＶＩＧまたはＳＩＶＩＧを用いて、以前に記載したように行った（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ；  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，２０００）。特に断っていなければ、１０ｃｍの細胞培養プレート中にトランスフェクションを行うために、１０μｇの各プラスミドを用いた。別の実験では、ＭＡｂ  ２Ｆ５またはＭＡｂ  Ｂ１２をプローブとして用いた変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによって、精製ｇｐ１４０タンパク質を分析した（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ２０００）。
【０４１１】
Ｅｎｖ発現と切断効率の測定。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ(商標)とＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて、濃度測定を行った。Ｅｎｖの切断効率は、各ケースともに、バックグラウンド密度を差し引いた後に、以下の式（ｇｐ１２０バンドの密度／ｇｐ１２０＋ｇｐ１４０バンドまたはｇｐ１２０＋ｇｐ１６０バンドの密度の合計）によって算出した。各タンパク質について得られた値は、ケースごとに得られた値から６％以内の偏差で再現性があった。Ｅｎｖタンパク質の発現レベルは、ｇｐ１２０＋ｇｐ１４０またはｇｐ１２０＋ｇｐ１６０バンドの密度を合計し、バックグラウンド密度を差し引くことによって算出した。各ゲルにおいて、発現は、当該実験で標準化のために用いた標準に対する比として記録されている。
【０４１２】
ワクシニアウイルス。ｖ−ＶＳＥ５ウイルス（７．５Ｋのプロモーターの制御下で完全長のＳＩＶｍｎｅ  Ｅｎｖを発現する）とｖ−ＶＳ４ウイルス（１１Ｋプロモーターの制御下にあるＳＩＶｍｎｅｇａｇ−ｐｏｌを発現する）については、以前に記載されている（Ｐｏｌａｃｉｎｏ，１９９９）。ワクシニア組換えＶＶ：ｈｆｕｒ（完全長のヒトフューリンを発現する）は、Ｇａｒｙ  ＴｈｏｍａｓとＳｅａｎ  Ｍｏｌｌｏｙ博士から頂いた（Ｍｏｌｌｏｙ，１９９４）。タンパク質を作製する場合には、感染効率（ＭＯＩ）５で、ＢＳＣ４０細胞を感染させた。代謝作用によって［３５Ｓ］標識システインと［３５Ｓ］メチオニンで標識された上清タンパク質を、２日後に集めた。上記被トランスフェクト細胞上清と同じような方法で、サンプルを処理した。
【０４１３】
精製されたＥｎｖタンパク質、酵素、およびインビトロでの酵素消化。精製されたヒトフューリンは、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）から購入した。これは、膜貫通ドメインと細胞質尾部が除去された可溶型のフューリンである。比活性が１ユニットのフューリンは、１分当たり、蛍光を発生する１ｐｍｏｌの基質ペプチドを発生させるのに必要な量である。精製ヒトプラスミンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入した。最適な消化条件を決定するために、高度に精製されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．が調製）．を用いた。このタンパク質の早期産生バッチは、約５０％が切断されていた。対照として、同じように産生、精製したＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０を用いた（Ｔｒｋｏｌａ，１９９６）。プラスミン消化の場合には、総用量８０μＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０中のプラスミン２００ｐｍｏｌ（およそ０．２Ｕ）とともに、８μｇ（約６０ｐｍｏｌ）のＳＯＳ  ｇｐ１４０またはｇｐ１２０を３７℃でインキュベートした。フューリンの消化の場合、総量８０μＬの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５中のフューリン２０Ｕとともに、８μｇ（およそ６０ｐｍｏｌ）のＳＯＳ  ｇｐ１４０を３７℃でインキュベートした。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによって、消化物を分析した。
【０４１４】
ウイルスの感染性と細胞−細胞融合アッセイ。偽型化したルシフェラーゼレポーターウイルスは、リン酸カルシウムトランスフェクションによって作製した。このように、５μｇのＥｎｖ欠失ＮＬ４−３  ＨＩＶ−１ウイルス構築物ｐＮＬ−ｌｕｃと完全長のＪＲ−ＦＬ  Ｅｎｖ糖タンパク質か陽性対照ＶＳＶ−Ｇタンパク質の何れかを発現する１５μｇのｐＳＶベクターとを、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした（Ｄｒａｇｉｃ，１９９６）。ｐＮＬ−ｌｕｃウイルスは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を担持している。ｐＳＶプラスミドは、野生型ｇｐ１６０（ｇｐ１６０ＷＴ）か、ＲＥＫＲをＲＲＲＲＲＲに変化させた切断部位を有する変異体（ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１６０ＲＲＲＲＲＲと表記）の何れかを発現した。偽型化されたウイルスを含有するトランスフェクト細胞から得た上清を４８時間後に採集し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。ＥＬＩＳＡによって、ウイルスストックをｐ２４タンパク質含量に対して標準化し（Ｄｒａｇｉｃ，１９９６）、ＨｅＬａ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞を用いて感染を行った。感染力は、ウイルス接種溶液中に存在するｐ２４タンパク質１ｎｇ当りの発光量として表した（Ｄｒａｇｉｃ，１９９６）。
【０４１５】
細胞−細胞融合活性は、他の文献に記載されているように、蛍光性細胞質色素転移アッセイを用いて測定した（Ｍｅｌｉｋｙａｎ，２０００）。簡潔に述べると、６ｃｍの皿の上に存在する２９３Ｔ細胞を、完全長のＪＲ−ＦＬ  Ｅｎｖを発現している１０μｇのｐＳＶ７Ｄベクターでトランスフェクトした後、製造者の指示書に従って、２ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１．５μＭ  ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）で標識した。０．５ｍＭ  ＥＤＴＡと０．５ｍＭ  ＥＧＴＡを加えたＰＢＳ中でインキュベートすることによって、細胞を皿から剥離させた後、遠心管の中に移した。１００μＭ  ７−アミノ−４−クロロメチルクマリン（ＣＭＡＣ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に、約５×１０６のＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ細胞（Ｔｒｋｏｌａ，１９９９）を懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。残存する遊離の色素を除去するために徹底的な洗浄を行った後、エフェクターと標的細胞を混合し、ポリリジンでコートした８ウェルに区切られているスライド中に移し、３７℃で２時間インキュベートした。エフェクター細胞と接触している標的細胞の数に対して、融合産物の数（両細胞質マーカーにより染色）を標準化して、蛍光ビデオ顕微鏡により融合の程度を求めた。
【０４１６】
Ｄ．結果
精製未切断ＳＯＳ  ｇｐ１４０の酵素的プロセッシング。
原理的には、Ｅｎｖを切断するための１つの方法は、ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位を認識し得るプロテアーゼを用いて精製Ｅｎｖタンパク質をインビトロで処理することである。ズブチリシンファミリーに属する高活性のプロテアーゼであるプラスミンは、組換えｇｐ１６０を切断してｇｐ１２０−ｇｐ４１を与えるが、他のトリプシン様プロテアーゼはこの能力を欠いていた（Ｏｋｕｍｕｒａ，１９９９）。プラスミンは、細胞表面に位置するインフルエンアＨＡＯもプロセッシングすることができる（Ｇｏｔｏ，１９９８）。従って、本発明者らは、５０％切断された精製可溶性ＳＯＳ  ｇｐ１４０の調製に対するプラスミンの影響を調べた。過剰のプラスミンとともに、部分切断されたＳＯＳ  ｇｐ１４０調製物を３７℃で２時間または１６時間インキュベートし、２Ｆ５抗ｇｐ４１  ＭＡｂを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによって該タンパク質を分析した（図３５）。プラスミンで２時間処理すると、未切断ｇｐ１４０のバンド強度は減少していたが、プロセッシングが完結するには、さらに長い反応時間（１６時間）が必要であった（図３５ａ）。これは、プラスミンによるｇｐ１６０切断に関する従来の報告と一致する（Ｏｋｕｍｕｒａ，１９９９）。しかし、ｇｐ１２０特異的なＭＡｂであるＢ１２を用いて、１６時間のプラスミン消化物のウェスタンブロットをプローブすると、プラスミンはｇｐ１２０も消化して断片（そのうちの１つは約７０ｋＤａである）を与えることが明らかであった（図３５ｂ）。ＭＡｂ  Ｂ１２は、Ｖ３ループのＮ末端に位置する、ｇｐ１２０の第二の保存されたドメイン中のエピトープを認識する（Ａｂａｃｉｏｇｌｕ，１９９４）。このように、プラスミンは、ｇｐ１２０の内部を切断し（他のトリプシン様プロテアーゼに対する基質であるＶ３ループ中の部位である可能性が最も高い）、通例、５０ｋＤａの断片と７０ｋＤａの断片を与える（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，１９９１；  ＭｃＫｅａｔｉｎｇ，１９９１；  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｚ，１９９３）。プラスミンはｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位をプロセッシングするのは確かだが、それ故、Ｅｎｖの切断を増大させるために本酵素を使用するのは、実践的な技法とはいえない。
【０４１７】
次に、本発明者らは、可溶性フューリンが効率的に、但し、より高度の特異性をもって、ｇｐ１４０を切断するかどうかを調べた。１６時間のインキュベーションの間、可溶性フューリンは、ｇｐ１２０のさらなる分解を引き起こさずに、ＳＯＳ  ｇｐ１４０をかなり切断し、ｇｐ１２０を与えたが、切断はなお不完全であった（図３５ｃ、レーン１と３を比較）。以下の計算によって示されるように、可溶性フューリンによるｇｐ１４０の切断効率は低かった。１ユニット（Ｕ）の可溶性フューリンは、１ｐｍｏｌの蛍光発生ペプチド基質を１分間に処理することができる（Ａｎｇｌｉｋｅｒ，１９９５）。ｇｐ１４０が同程度の効率の基質であれば、約４ｐｇ（３０ｐｍｏｌ）の未切断ｇｐ１４０を含有する８μｇのｇｐ１４０は、２０ユニットのフューリンによって、２分以内に消化されるであろう。
【０４１８】
しかし、実際には、１６時間を経た後でも、わずか５０％のｇｐ１４０が処理されたにすぎなかった。この期間を通じて処理速度が均一であるとすれば、０．７ｆｍｏｌ／分でｇｐ１４０が切断されたことになる（すなわち、ｇｐ１４０は、モデルペプチドに比べて、フューリンによる切断効率が約１０００倍も低い）。
【０４１９】
フューリン消化のｐＨが、その効率性に影響を与えた可能性がある。例えば、細胞外経路が弱酸性であると、ＴＥＢＶ  Ｅｎｖ前駆体の構造が変化し、切断効率を増加させ得る（Ｓｔａｄｌｅｒ，１９９７）。このように、フューリンは、インビトロにおいて、ｐＨ６．２でＴＥＢＶ  Ｅｎｖ前駆体を切断することができるが、ｐＨ７．５では切断できない（Ｓｔａｄｌｅｒ，１９９７）。さらに、ＮＨ４Ｃｌで細胞を処理して分泌経路のｐＨを上昇させると、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖのプロセッシングを妨害することができる（Ｗｉｌｌｅｙ，１９８８）。従って、本発明者らは、弱酸性のＰＨが、１６時間のインキュベーション中に、可溶性フューリンによるｇｐ１４０の効率的な切断を可能とすることがあり得るかどうかを調べた。報告によると、フューリンは６．５から８の範囲のｐＨで最も活性が高いとされているが（＞８０％）、Ｅｎｖ切断の至適ｐＨは５．８であることが明らかとなった（Ｄｅｃｒｏｌｙ，１９９６）。しかし、ｐＨ５．８でも、ｇｐ１４０は約６０％切断されたにすぎず（図３５ｄ）、反応のｐＨを最適化しても、完全な切断を得るには不十分であった。総括すると、ｇｐ１４０の切断効率を若干増加させるためだけに、大過剰のフューリンが必要とされるので、これも、日常的に使用するための実際的な技法とはいえないと、本発明者らは結論付けた。
【０４２０】
組換えＥｎｖタンパク質は、細胞プロテアーゼによって不完全なプロセッシングを受ける；フューリンとＥｎｖの共発現の影響。
本発明者らは、適宜ＨＩＶＩＧまたはＳＩＶＩＧを用いた免疫沈降によって、７つのＨＩＶ−１と４つのＳＩＶのｇｐ１４０タンパク質の内在性ｇｐ１２０−ｇｐ４１の切断程度について調べた。切断部位（ＲＥＫＲ）は７つのＨＩＶ−１単離株全てで保存されていたが、ＳＯＳ  ｇｐ１４０切断効率（物質と方法に明記されている）は３８−５８％にわたって変動し、切断が完全なケースはなかった（図３６ａ）。ＳＯＳシステイン置換を欠いた対応する７つのＨＩＶ−１  ｇｐ１４０ＷＴタンパク質を用いても、同様の結果が得られた（データは示さず）。フューリンの同時トランスフェクトが存在しないとタンパク質分解が不十分なので、ＲＥＫＲ切断部位が保持されているにもかかわらず、これらのタンパク質は、ｇｐ１２０と未切断ｇｐ１４０の混合物として分泌される（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）。対応するＳＯＳ  ｇｐ１４０変異体に比べて、各ｇｐ１４０ＷＴタンパク質の切断効率は、僅かに高いのが一般的であった（データは示さず）。それぞれ、ＲＮＫＲ切断部位モチーフを有するＳＩＶｍａｃ２５１とＳＩＶｍｎｅ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質およびＳＩＶｍｎｅ  ｇｐ１４０ＷＴタンパク質を用いた場合にも、切断が不完全であることが観察された。これに対して、ＳＩＶｍａｃ２５１  ｇｐ１４０ＷＴタンパク質の切断は、ほぼ完全であった（図３６ａ）。後者のタンパク質中の切断部位モチーフは同一なので、フォールディングの相違などの間接的な要因が切断効率に影響を与えているにちがいない。
【０４２１】
フューリンを共発現させるとＥｎｖタンパク質の発現が減少する。
【０４２２】
次に、本発明者らは、ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０とｇｐ１４０ＷＴタンパク質とともにフューリンを共発現させたときの効果を調べた。これによって、切断効率が増加することが以前に示されているからである（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ；  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  １９９３；  ａｎｄ  Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ；  １９９５）。様々な量の完全長フューリン発現プラスミドｐＣＤＮＡ−ｆｕｒｉｎを、一定量のＥｎｖ発現プラスミドとともに同時トランスフェクトした（図３６ｂ）。フューリンを十分に発現させることによって、両形態のｇｐ１４０タンパク質がほぼ完全に（＞９０％）切断されたが、同時に、ｇｐ１４０とｇｐ１２０バンドの総強度の減少によって測定したところ、Ｅｎｖの総発現の著しい減少も引き起こされた
異なる形態のＥｎｖタンパク質と異なる発現系を用いてＥｎｖとフューリンの共発現の効果を確認するために、本発明者らは、単独で、且つＧａｇおよびＰｏｌとともに、ＳＩＶｍｎｅ  Ｅ１１Ｓ  ｇｐ１６０を、ＢＳＣ４０細胞中において組換えワクシニアウイルスから発現させた。ＥｎｖをＧａｇ−Ｐｏｌと共発現させることによって、完全長の膜結合型ｇｐ１６０（偽ビリオンとして分泌される）がｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体に切断される効率を調べることが可能となった（図３６ｃ）。ＳＩＶｍｎｅ  ｇｐ１６０の発現は、同一のｇｐ１６０をコードするｐＰＰＩ４ベースのプラスミドをトランスフェクトした後に比べて、ワクシニアウイルスｖ−ＶＳＥ５を感染させた後の方が、およそ１０倍高かった（データは示さず）。フューリンの不存在下では、ｇｐ１６０切断は極めて低かった（図３６ｃ、レーン１と３）。切断の程度は、フューリンとの共発現によって若干増加したにすぎなかったが、Ｅｎｖの総発現はかなり減少した（図３６ｃ、レーン２と４）。実際、Ｇａｇ−ＰｏｌとＥｎｖをフューリンとともに共発現させると、Ｅｎｖタンパク質はほとんど検出不可能であった（図３６ｃ、レーン２）。フューリンを共発現させると、Ｇａｇ−Ｐｏｌも免疫沈降されるレベルが減少した（図３６ｃ、レーン２）。偽ビリオンからのＧａｇ−Ｐｏｌの沈殿は、表面Ｅｎｖとの抗体の反応性を介して間接的に起こり、Ｅｎｖ発現はフューリンによって減少するからであろう。あるいは、様々なプラスミドからのタンパク質の発現に対する非特異的な競合によって、これを説明できるかもしれない。共発現されたＧａｇ−Ｐｏｌの不存在下であっても、完全長ｇｐ１６０は、ある程度上清中に存在した（図３６ｃ、レーン３と４）。これは、細胞小胞と会合していたものであるか（Ｇｌｕｓｃｈａｎｋｏｆ，１９９７）、または死滅した細胞から放出されたものである可能性がある。
【０４２３】
総括すると、発現系とは無関係に、フューリンの発現はｇｐ１４０とｇｐ１６０の両タンパク質に対して、定性的に類似の効果を有することは明白である。さらに、ワクシニアウイルス系でのＥｎｖ発現の増加には、Ｅｎｖ切断の程度のさらなる減少を伴っている。
【０４２４】
フューリン基質の配列が、共発現されたフューリンの存在下でのＥｎｖの発現に対して与える影響。
フューリンを共発現させると、フューリンの基質の中には発現が減少するものもあるが、細胞に対するフューリンの明白な毒性効果というより、ＴＧＮ中でフューリンが新生タンパク質と複合体を形成して、新生タンパク質を保持することによるものであろう（Ｍｏｌｌｏｙ，１９９４；Ｍｏｕｌａｒｄ，２０００；  ａｎｄ  Ｓｔａｒｏｐｏｌｉ，２０００）。これを調査するために、本発明者らは、フューリンの共発現によって引き起こされたＥｎｖ発現の減少には、Ｅｎｖタンパク質がフューリン認識モチーフを有していることが必要かどうかを調べた（図３６ｄ）。本発明者らは、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質（ＫＲＲＶＶＱＲＥＫＲＡＶフューリン認識配列が、ＬＲＬＲＬＲＬＲＬＲＬＲに置き換えられている（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ）の発現に対して、フューリンの共発現がほとんど影響を与えないことを観察した（図３６ｄ、レーン３と４）。本実験では、フューリンの存在下でｇｐ１４０ＵＮＣの発現は僅かに増加したが、アッセイを繰り返すと、増加が観察されないのが通常であった（データは示さず）。ｇｐ１４０ＵＮＶ発現に対してフューリンが効果を有していないことは、切断部位の配列が修飾されていないｇｐ１４０ＷＴとＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の発現がかなり阻害されることと極めて対照的である（図３６ｄ、レーン１と２、図３６ｂ）。これらの結果は、フューリンによって引き起こされたＥｎｖ発現の減少は、細胞中に保持されるＥｎｖ−フューリン複合体の形成によるものであるという仮説と一致する。
【０４２５】
可溶型フューリンは、Ｅｎｖの発現を大幅に減少させずに効率的なＥｎｖ切断を行う。
ＴＧＮ中でフューリン−Ｅｎｖ複合体が形成されるようなので、これを克服するために、本発明者らは、Ｅｎｖを可溶型のフューリンとともに共発現させた。フューリンのタンパク分解活性は、専ら内腔ドメイン中に含まれているので、可溶型の酵素は酵素活性を保持している（Ｍｏｌｌｏｙ，  １９９４；  Ｍｏｌｌｏｙ，  １９９２；  ａｎｄ  Ｐｌａｉｍａｕｅｒ，  ２００１）。完全長のフューリンの存在下で、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０ＷＴとＳＯＳ  ｇｐ１４０を発現させると、予想どおり、Ｅｎｖの発現が減少することが観察された（図３６ｅ、レーン２と５）。しかし、完全長の膜結合型酵素に代えて、可溶型のフューリン（Ｆｕｒｉｎ  'ＴＣ）を使用しても、実質的に同じ結果が観察された（図３６ｅ、レーン３  および６）。このように、フューリン認識配列の存在は重要であるが（図３６ｄ）、Ｅｎｖがフューリンと複合体を形成してＴＧＮ中に直接保持されることによって、フューリンを共発現した際のＥｎｖ発現の減少が全て説明されるものではないと思われる（Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ，  １９９７；  Ｍｏｌｌｏｙ，  １９９４；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９９，  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ，  １９８８）。
【０４２６】
切断配列の改変により、細胞プロテアーゼによるＥｎｖのプロセッシングを増加させることができる。
ｇｐ１４０切断の効率を増加させるための本発明者らの次なるアプローチは、フューリン認識配列を様々に変化させることであった。このアプローチの妥当性は、１つには、他のＲＮＡウイルスの研究から得られている。例えば、インフルエンザＡウイルスのバリアントの中には、塩基性残基が挿入されたＨＡＯ前駆体タンパク質中にタンパク分解切断部位を進化させているものがある。これに伴って切断効率が増加し、ウイルスの病原性が増す。このように、無病原性クローンは、ＨＡｏ切断部位内に単一のアルギニン残基を含有しているにすぎないが、病原性クローンの対応する部位には、複数の塩基性残基が含有されており、ＲＲＲＫＫＲなどのモチーフを形成している（Ｂｅｎｄｅｒ，  １９９９；  Ｇｏｔｏ，  １９９８；  Ｈｏｒｉｍｏｔｏ，  １９９５；  Ｋａｗａｏｋａ，  １９９１；  Ｋａｗａｏｋａ，  １９８８；  ａｎｄ  Ｏｈｕｃｈｉ，  １９８９）。ペプチド切断アッセイを用いた生化学的な証拠によって、複数のアルギニンを含む配列は、フューリンにとって極めて効率のよい標的であることが確認された（Ｃａｍｅｒｏｎ，  ２０００）。最も効率的に認識される標的配列は、６または７つのアルギニンリピートからなり、例えば、認識配列ＲＲＲＲＲＲを有するペプチドは、ＲＲＲＲモチーフを有するペプチドより、約５０倍の効率で切断された（Ｃａｍｅｒｏｎ，２０００）。
【０４２７】
インフルエンザＡとは異なり、ＨＩＶ−１とＳＩＶの株は、単純なＲ−Ｘ−Ｒ／Ｋ−Ｒフューリン認識配列しか含有していない。このため、本発明者らは、ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０とｇｐ１４０ＷＴタンパク質の切断部位中に塩基性アミノ酸を導入した。変異を受けたｇｐ１４０タンパク質は、通常のＲＥＫＲモチーフを含有するｇｐ１４０タンパク質より効率的にプロセッシングを受けたが、内在性の細胞プロテアーゼで完全に切断された変異体は存在しなかった（図３７ａ、表５）。
【表５】
2005502350.tif 000009
【０４２８】
最も効率的に切断された２つの変異体には、ＲＲＲＲＲＲまたはＲＲＲＫＫＲモチーフが含有されていた（図３７ａ、レーン１、３、および５を比較）。フューリンを共発現させると、野生型Ｅｎｖが約９０％（あるいは、他の実験では、９０％未満、データは示さず）しか切断されなかったのに対して、これらの変異体は１００％切断された。予想外の発見としては、フューリンは、切断部位変異体ｇｐ１４０タンパク質の総発現を減少させなかったのに対して、上述のように、野生型ｇｐ１４０の発現は著しく減少したことである（図３７ａ、レーン２、４、６を比較）。様々な量のｐＣＤＮＡ−フューリン（０．１μｇ、１μｇ、または１０μｇ）とともに、ＲＲＲＲＲＲ  ｇｐ１４０変異体を共発現させたときに、このことが確認された（図３７ｂ）。この実験では、フューリンの共発現によって、実際には、分泌されるＥｎｖタンパク質の総量が増加したが、他の実験では、この変異体または関連変異体に増加が常に見られるというわけではなかった。
【０４２９】
ＲＥＫＲ切断部位に塩基性の挿入を有する一群のｇｐ１４０変異体の発現レベルと切断効率が表５にまとめられている。同時トランスフェクトしたフューリンの不存在下で切断が増加し、フューリンの存在下で完全に切断されたが、Ｅｎｖ発現の程度は顕著に増加しないという点で、近縁の変異体ＲＲＫＫＲ、ＲＲＲＲＫＲ、ＲＲＲＲＲＲは何れも同様の特性を有していた。変異体ＫＫＲＫＫＲとＲＥＲＲＲＫＫＲも、野生型タンパク質に比べて切断効率が高く、フューリンの同時トランスフェクションによって、この発現は影響を受けなかった。しかしながら、他の変異体に比べて発現レベルは低く、標準的なＲＥＫＲモチーフを含有する野生型ｇｐ１４０タンパク質よりかなり劣っていた。被検タンパク質がｇｐ１４０ＷＴまたはＳＯＳ  ｇｐ１４０であっても、塩基性残基挿入の効果は同様であったが、ｇｐ１４０ＷＴタンパク質の中には、対応するＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質より若干高いレベル発現されたものもあった（表５）。タンパク分解による切断部位に塩基性アミノ酸を挿入すると、一般的に切断効率に影響を及ぼすかどうかという点を明らかにするために（すなわち、ＪＲ−ＦＬクローンに限定されないということ）、本発明者らは、サブタイプＣ初代単離株、ＤＵ１５１のＳＯＳ  ｇｐ１４０の切断部位をＲＥＫＲからＲＲＲＲＲＲに変異させた。同時トランスフェクトされたフューリンが存在しないと、未修飾ＤＵ１５１ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質は部分的に切断されるに留まった（図３７ｃ、レーン１）。フューリンを共発現させると、Ｅｎｖ発現は有意に減少し、幾つかの実験では、Ｅｎｖタンパク質がゲル上に観察できない程度まで減少した（図３７ｃ、レーン２、データは示さず）。これに対して、ＲＲＲＲＲＲ変異体は、フューリンが存在しなくてもさらに効率的に切断され、フューリンが存在すると完全に切断された。さらに、Ｅｎｖの総発現は、野生型ｇｐ１４０と比べて高かった（図３７ｃ、レーン２と４を比較）。
【０４３０】
ＨＩＶ−１感染性に対する切断部位変異の影響。
本発明者らは、Ｅｎｖ−偽型アッセイ（Ｄｒａｇｉｃ，１９９６）を用いて、塩基性切断部位の挿入を含有するＥｎｖ変異体がウイルス感染機能を保持しているかどうかを調べた。２９３Ｔ細胞中のｐＳＶプラスミドによって発現されたＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１６０ＲＲＲＲＲＲ変異体は、ｐＮＬ−ｌｕｃを首尾よく偽型化することができ、Ｈｅｌａ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞に感染できるウイルスを与えた。ＪＲ−ＦＬｇｐ１６０ＲＲＲＲＲＲ  Ｅｎｖ偽型の感染性は、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１６０ＷＴ偽型に比べて約１／３〜１／４であったが、偽型化されたウイルス株で通例見受けられる範囲に留まっていた（図３８ａ）。変異体Ｅｎｖの機能的活性を独立にテストするために、本発明者らは、蛍光細胞質色素転移アッセイ（Ｍｅｌｉｋｙａｎ，２０００）を用いて、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１６０ＲＲＲＲＲＲ変異体が細胞−細胞融合を媒介する能力を調べた。ＲＲＲＲＲＲ変異体との融合が、統計学的には有意ではない程度に若干増加したのは（図３８ｂ）、細胞可溶化液のウェスタンブロット分析によって、野生型ｇｐ１６０より、５倍高いレベルで発現されているからかもしれない。総括すると、ＲＥＫＲをＲＲＲＲＲＲに置換しても、融合と感染に必要とされるＥｎｖのコンフォメーションが全体的に破壊されるということはない。
【０４３１】
Ｅ．考察
ＨＩＶ−１を含むエンベロープで覆われた多くのウイルスのＥｎｖタンパク質は、タンパク分解によるプロセッシングを受けて完全な機能的活性が与えられる不活性前駆体として合成される。ＨＩＶ−１の場合には、ｇｐ１６０前駆体は切断されて、融合活性を有するｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体になる。モノマーのｇｐ１２０のコア断片（Ｋｗｏｎｇ，１９９８）と後融合型のｇｐ４１の構造（Ｃｈａｎ，  １９９７；  Ｌｕ，  １９９５；  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ，  １９９７）は、決定されている。しかし、未切断のｇｐ１６０またはｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体の構造については、後者はトリマーであると考えられているものの（Ｃｈａｎ，  １９９７；  Ｄｏｍｓ，  １９９３；  Ｌｕ，  １９９５；  Ｐｏｉｇｎａｒｄ，  ２００１；  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ，  １９９７）、殆ど明らかになっていない。原理的には、ｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用が弱く、ｇｐ１２０が流出するので、融合活性のある複合体は不安定である。ｇｐ１２０とｇｐ４１の間にジスルフィド結合を導入することによって、ｇｐ１２０−ｇｐ４１の解離を防ぐことができる（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ）。しかし、おそらくは、会合したｇｐ４１サブユニットがさらに不安定となるために、精製型の本タンパク質（ＳＯＳ  ｇｐ１４０）はモノマーである。
【０４３２】
このため、本発明者らは、タンパク分解によるプロセッシングを受けるタンパク質を作製する方法について調べた。高レベルでｇｐ１４０またはｇｐ１６０タンパク質を発現させると、切断タンパク質と未切断タンパク質の混合物が得られるのが通常であり、宿主細胞のプロテアーゼにょる切断部位のプロセッシングが不完全であることを示唆している。様々な組換え系や細胞株の中で、Ｅｎｖを発現させたときに、部分切断は一般的な現象である（Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ，  １９９７；  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  １９９３  ；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９８  ；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９９；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  ２０００  ；  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  １９９５；  Ｓｐｉｅｓ，  １９９４；  ａｎｄ  Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ，  １９９５）。天然Ｅｎｖタンパク質と変異体Ｅｎｖタンパク質間のフォールディングの差が、切断部位を含有するループ構造であると思われる（Ｃｈｅｎ，１９９８）露出部分に影響を与えている可能性がある（Ｄｅｄｅｒａ，  １９９２；  Ｍｅｒａｔ，  １９９９；  Ｓｙｕ，  １９９１；  Ｔｒａｖｉｓ，  １９９２；  Ｔｓｃｈａｃｈｌｅｒ，  １９９０；  Ｗｉｌｌｅｙ，  １９９１）。Ｅｎｖ切断に対する別の影響は、グリカンによってフューリン認識部位が直接的または間接的にマスクされることである（Ｐａｒｅｄｅｓ，１９９８）。総括すると、この部位のプロテアーゼへのアクセスには、Ｅｎｖフォールディングとグリコシル化がともに複雑に関係している（Ｃｈｅｎ，  １９９８；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  ２０００；  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ  ２０００）。
【０４３３】
本発明者らは、まず、インビトロで精製プロテアーゼを加えることによって、プロセッシングを受けていない精製Ｅｎｖタンパク質を切断する可能性について調べた。以前に報告されたように（Ｏｋｕｍｕｒａ，１９９９）、プラスミンはｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位を効率的にプロセッシングできるが、ｇｐ１２０の別の部位（Ｖ３ループ内の部位である可能性が最も高い）も切断した。このため、プラスミンを用いることは非現実的である。精製フューリンは、低効率ではあるが（Ｄｅｃｒｏｌｙ，１９９４；  ａｎｄ  Ｖｏｌｌｅｎｗｅｉｄｅｒ，１９９６）、分泌されたＥｎｖも切断することができる（Ｄｅｃｒｏｌｙ，１９９４；  Ｄｅｃｒｏｌｙ，１９９６；  Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ，  １９９７；  ａｎｄ  Ｍｏｕｌａｒｄ，１９９８）。本発明者ら自身の発見も同様であった。すなわち、ＳＯＳ  ｇｐ１４０のフューリンによる消化を、酵素を大過剰で加え、至適ｐＨで行っても、Ｅｎｖ基質の約４０％は切断されず、切断に対してさらに強い耐性を有するｇｐ１４０の集団が他に存在していることをうかがわせた。これは、おそらく、高グリコシル化タンパク質か、またはフォールディングが上手く行わないタンパク質であろう。フューリンは、本来的には、非効率的な酵素ではなく、合成ペプチドを高い効率で切断するが（Ｃａｍｅｒｏｎ，２００１；  ａｎｄ  Ｐｌａｉｍａｕｅｒ，２００１）、ｇｐ１６０上に存在するフューリン認識部位のコンフォメーションによって、本基質を切断する能力が制約を受ける。本質的にｇｐ１６０がフューリンの基質になりにくいことは、例えば、ｇｐ１６０と炭疽菌毒素とを比べることによって明らかとなり、ｐＨ７．２で、炭疽菌毒素はフューリンによって、ｇｐ１６０より数桁高い効率で切断される（Ｍｏｌｌｏｙ，  １９９２）。
【０４３４】
ｇｐ１６０の切断を増大させるための１つの方法は、外来フューリンを共発現させることであるが、これを行うと、Ｅｎｖの総発現が減少してしまうことがある。フューリンを共発現させると、主なタンパク質（ＨＩＶ−１  Ｅｎｖを含むが、これに限定されない）の発現は減少する（Ｂｉｎｌｅｙ，  ２０００ａ；  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  １９９３；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９９；  Ｓｔａｒｏｐｏｌｉ，  ２０００  ；  ａｎｄ  Ｖｏｌｌｅｎｗｅｉｄｅｒ，  １９９６）。考えられる１つの説明は、フューリンによって切断されにくいＥｎｖタンパク質はフューリンと安定な複合体を形成し、分泌されずに、これらの複合体がＴＧＮ中に留まるか、あるいはリソゾームへとリサイクルされるということである（Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ，  １９９７；  Ｍｏｌｌｏｙ，  １９９４；  Ｍｏｕｌａｒｄ，  １９９９；  Ｓｔａｒｏｐｏｌｉ，  ２０００；  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ，  １９８８）。最適な切断部位を含有するＥｎｖ変異体とともにフューリンを共発現させても、Ｅｎｖ発現はほとんど減少しないという本発明者らの観察によって、この考え方は裏付けられる。完全長（膜結合）または可溶型のフューリンのうちの何れかとともにＥｎｖを共発現させるとｇｐ１４０の発現が減少したので、この減少は、フューリン−Ｅｎｖ複合体が膜と直接会合しなくても起こり得る。未切断Ｅｎｖとフューリンとの複合体の除去と分解には、別の膜会合細胞タンパク質が関与しているのであろう。末端切断されたフューリンは培地中に流出するが、完全長のフューリンと同様、なお膜画分からも単離することができる（Ｍｏｌｌｏｙ，１９９４）。
【０４３５】
フューリンの共発現によって、分泌されるｇｐ１４０タンパク質の切断が増加するが、細胞表面上に発現された完全長のｇｐ１６０分子を用いた場合には、このことは起こらないと報告されている（Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ，１９９７；  ａｎｄ  Ｙｏｒｋ，２００１）。これに対して、本発明者らおよび他の研究者らは（Ｖｏｌｌｅｎｗｅｉｄｅｒ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ，  １９９５）、少なくとも幾つかの実験条件下では、少なくとも幾分は、ｇｐ１６０の切断がフューリンによって増加し得ることを見出した。明らかに、次いで、異なる実験系に異なる影響を与える変量（おそらく、発現ベクター、用いたＥｎｖ遺伝子と細胞株）については、理解が少ない。
【０４３６】
Ｅｎｖの切断効率を上手く向上させるための方法は、フューリン認識部位を変異させることであった。天然のインフルエンザＡウイルスのバリアントに対する研究によって、ＨＡＯタンパク質の切断部位中および切断部位近傍に塩基性アミノ酸を挿入すると、タンパク分解の増大が伴い（Ｂｅｎｄｅｒ，１９９９）、宿主細胞の範囲と病原性の増加も伴うことが多いことが明らかとなった（Ｂｅｎｄｅｒ，  １９９９；  Ｇｏｔｏ，  １９９８；  Ｈｏｒｉｍｏｔｏ，  １９９５；  Ｋａｗａｏｋａ，  １９９１；  Ｋａｗａｏｋａ，  １９８８；  ａｎｄ  Ｏｈｕｃｈｉ，  １９８９）。さらに、既に、ＢｒａｓｓａｒｄとＬａｍｂによって、インフルエンザＢ糖タンパク質の切断を向上させることが行われている。彼らは、保存された単一塩基性切断部位を、病原性インフルエンザＡクローンに存在する複数塩基性切断部位と置換した（Ｂｒａｓｓａｒｄ，１９９７）。従って、本発明者らは、４つのアミノ酸からなるＨＩＶ−１  Ｅｎｖの保存された切断認識配列を改変することによって、切断効率を増加させ得るのではないかと考えた。本発明者らは、病原性インフルエンザＡ株由来のＨＡＯタンパク質中に見出される配列に基づいた、数個のバリアントフューリン認識配列が、共発現されたフューリンの不存在下においても、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖの切断を増大させることを見出した。これらのバリアント配列の中で最高のものは、ＲＲＲＫＫＲ、ＲＲＲＲＫＲ、およびＲＲＲＲＲＲであり、標準的なＲＥＫＲ配列が存在するときに得られる程度に比べて、Ｅｎｖの切断程度は概ね倍増した。さらに、フューリンを共発現させても、これらの変異配列を含有するＥｎｖタンパク質の発現は減少しなかったが、切断効率は１００％に近づけることができた。これらの改善されたフューリン基質がさらに効率的に切断される結果、Ｅｎｖが分泌経路から排出される速度がさらに速まり、完全にプロセッシングされたＥｎｖの総発現が高まるものと思われる。さらに、ＲＥＫＲをＲＲＲＲＲＲに変異させても、Ｅｎｖを相補したレポーターウイルス、またはＥｎｖを介した膜融合の感染性にはほとんど影響がなかった。従って、切断部位の変異は、Ｅｎｖの全体的なフォールディングに対していかなる悪影響も与えず、このようなＥｎｖ変異体をワクチン抗原として用いるという考え方が妥当であることを示している。
【０４３７】
フューリンによるｇｐ１６０の認識はかなり非効率であるが、ＨＩＶ−１中にＲＥＫＲ配列（ＳＩＶではＲＮＫＲ）が厳格に保存されているということは、この配列がウイルスに選択的な優位性を与えていることを示唆している。コンセンサス切断部位モチーフに隣接した塩基性残基が挿入されたＥｎｖ配列はないので（Ｋｕｉｋｅｎ，２０００）、Ｅｎｖ切断の速度が高くなると、不利なのかもしれない。例えば、高レベルのプロセッシングされた細胞表面Ｅｎｖによって引き起こされる融合によって、感染細胞が急速に破壊されすぎると、その細胞から子孫ビリオンを得る率が減少してしまうであろう。免疫学的な機序としては、主に非中和抗体の誘導を引き起こす囮として作用することによって、未切断Ｅｎｖは実際にウイルスにとって有利に働いている可能性がある（Ｂｕｒｔｏｎ，  ２０００；  Ｐａｒｒｅｎ，  １９９７；  ａｎｄ  Ｓａｋｕｒａｉ，  １９９９）。
【０４３８】
本明細書において、本発明者らは、コンセンサスＲＥＫＲ配列より、フューリンにとって効率性の高い基質であるポリ塩基性切断部位を含有するＨＩＶ−１  Ｅｎｖ変異体を作製できることを実証した。Ｅｎｖ切断部位変異体をフューリンと共発現させることは、プロセッシングされたＥｎｖを多量に得るための有用な方法である。これらのＥｎｖ変異体を用いれば、切断されたＥｎｖの大量生産が簡易化され、この切断されたＥｎｖは、ＨＩＶ−１ワクチンを設計する上で有用なはずである。
【参考文献】
【０４３９】
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【図面の簡単な説明】
【０４４０】
【図１】様々な形態のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質。模式図は、１）単量体ｇｐ１２０、２）完全長の組換えｇｐ１６０、３）ｇｐ１２０とｇｐ４１（ｇｐ１４０ＵＮＣまたはｇｐ１４０ＮＯＮ）の間に保持されたペプチド結合を有する、タンパク質分解によるプロセッシングを受けていないｇｐ１４０三量体、４）ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質（分子間ジスルフィドによって安定化されている、タンパク分解によるプロセッシングを受けたｇｐ１４０）、５）ビリオンが随伴した天然のｇｐ１２０−ｇｐ４１三量体を表している。ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質（３）の影が付してある部分はＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質上または天然のｇｐ１２０−ｇｐ４１三量体上では、ほとんどまたは全く露出されていない主要な抗体接近可能領域を示している。
【図２】フューリンの同時トランスフェクションによって、ｇｐ１２０とｇｐ４１間のペプチド結合の切断効率が増大する。同時トランスフェクトしたフューリン発現プラスミドの存在下または不存在下で、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０野生型（ＷＴ）またはｇｐ１４０ＵＮＣ（ｇｐ１２０−ｇｐ４１切断部位に変異を導入したもの）タンパク質を発現するＤＮＡを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。抗ｇｐ１２０  ＭＡｂ  ２Ｇ１２を用いて、前記細胞から分泌された３５Ｓ標識エンベロープ糖タンパク質を免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。レーン１、ｇｐ１４０ＷＴ（ｇｐ１４０／ｇｐ１２０の二本バンド）；レーン２、ｇｐ１４０ＷＴ＋フューリン（ｇｐ１２０のみ）；レーン３、ｇｐ１４０ＵＮＣ（ｇｐ１４０のみ）；レーン４、ｇｐ１４０ＵＮＣ＋フューリン（ｇｐ１４０のみ）。主な分子種のおよその分子量（ｋＤａ）が、左側に示されている。
【図３Ａ】ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０のシステイン置換の位置。１以上の変異体中でシステインに変異したＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０ＷＴタンパク質の様々な残基が、ｇｐ１２０とｇｐ４１  ＥＣＴＯサブユニットの模型図上に黒塗りの矢印で示されている。アラニン−４９２とトレオニンー５９６残基（ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質中では、ともにシステインに変異されている）の位置は、さらに大きな黒塗りの矢印で示されている。（ａ）  ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０。
【図３Ｂ】（ｂ）  ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ４１。ｇｐ１２０のＣ末端とｇｐ４１のＮ末端に存在する白抜きの枠は、ｇｐ１２０とｇｐ４１の間に存在する切断部位を除去するために変異させた、ｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質中の領域を表している。
【図４】選抜したＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０の二重システイン変異体の免疫沈降分析。抗ｇｐ１２０ＭＡｂと抗ｇｐ４１ＭＡｂを用いて、被トランスフェクト２９３Ｔ細胞から分泌された３５Ｓ標識エンベロープ糖タンパク質を免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＭＡｂは、２Ｇ１２（抗ｇｐ１２０  Ｃ３−Ｖ４領域）またはＦ９１（抗ｇｐ１２０  ＣＤ４結合部位領域）の何れかを用いた。
【０４４１】
各タンパク質（一方はｇｐ１２０中、他方はｇｐ４１ＥＣＴＯ中）中の２つのシステイン置換の位置は、レーンの上に表記されている。レーン１５には、ｇｐ１４０ＷＴタンパク質が示されている。ｇｐ１４０ＷＴタンパク質を除く全てのタンパク質は、同時トランスフェクトしたフューリンの存在下で発現された。
【図５】分子間ジスルフィド結合形成の効率は、システイン置換の位置に依存する。フューリンと様々なｇｐ１４０変異体が同時トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から分泌された３５Ｓ標識エンベロープ糖タンパク質を、抗ｇｐ１２０  ＭＡｂ  ２Ｇ１２を用いて免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。各変異体について、デンシトメトリーにより、１４０ｋＤａのバンドと１２０ｋＤａのバンドの強度を測定し、ｇｐ１４０／ｇｐ１４０＋ｇｐ１２０比を算出し、記録した。影の濃さは、ｇｐ１４０／ｇｐ１４０＋ｇｐ１２０比の大きさに比例している。ｇｐ４１およびｇｐ１２０のＣ１とＣ５ドメイン中のアミノ酸置換の位置は、それぞれ、上下の横側に記載されている。Ｎ．Ｄ．＝実施せず。
【図６】ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質中で、分子間ｇｐ１２０−ｇｐ４１結合が形成されていることの確認。２９３Ｔ細胞に、ｇｐ１４０タンパク質を発現しているプラスミドをトランスフェクトし、表記がある場合には、フューリン発現プラスミドもトランスフェクトした。表記のＭＡｂを用いて、分泌された３５Ｓ標識糖タンパク質を免疫沈降させ、還元条件下（＋ＤＴＴ）または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。（ａ）ＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ＷＴ、およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質の２Ｇ１２による放射性免疫沈降。還元条件（レーン４−６）または非還元条件（レーン１−３）下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、免疫沈降されたタンパク質を分離した。（ｂ）ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質および対応する単一のシステイン変異を含有したｇｐ１４０タンパク質の２Ｇ１２による放射性免疫沈降。Ａ４９２ＣまたはＴ５９６Ｃ単一システイン変異体ｇｐ１４０タンパク質ともに、１４０ｋＤａのタンパク質のバンドは観察されない。（ｃ）同時トランスフェクトされたフューリンの存在下または不存在下で、産生されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質の２Ｇ１２による放射性免疫沈降。還元条件（レーン３−４）または非還元条件（レーン１−２）下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、免疫沈降されたタンパク質を分離した。外来性フューリンの非存在下では産生されず、外来性フューリンの存在下で産生される１４０ｋＤａのＳＯＳ  タンパク質バンドをＤＴＴが還元することが示されている。
【図７】ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０のシステイン変異体の分析。抗ｇｐ１２０  ＭＡｂ２Ｇ１２を用いて、被トランスフェクト２９３Ｔ細胞から分泌された３５Ｓ標識エンベロープ糖タンパク質を免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。全てのｇｐ１４０は、同時トランスフェクトされたフューリンの存在下で発現させた。レーン１−８、表記の二重システイン変異を含有するｇｐ１４０。レーン９−１１、残基４１９（レーン９）、残基４９３（レーン１０）、または残基４９１と４９３の両方（レーン１１）のリジンがアラニンに置換されているとともに、Ａ４９２Ｃ／Ｔ５９６Ｃ二重システイン置換を含有するｇｐ１４０タンパク質。レーン１２−１４、四重システイン置換を含有するｇｐ１４０タンパク質。
【図８−１】ＳＯＳ  ｇｐ１４０、Ｗ４４Ｃ／Ｔ５９６Ｃ  ｇｐ１４０変異体、ｇｐ１４０ＵＮＣおよびｇｐ１４０ＷＴタンパク質の抗原構造の比較。表記の抗ｇｐ１２０ＭＡｂと抗ｇｐ４１ＭＡｂを用いて、被トランスフェクト２９３Ｔ細胞から分泌された３５Ｓ標識エンベロープ糖タンパク質を免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。同時トランスフェクトされたフューリンの存在下で、変異体は発現されたが、野生型ｇｐ１４０は発現されなかった。（ａ）ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬを中和する抗ｇｐ１２０免疫グロブリン。（ｂ）ｇｐ１２０のＣ１、Ｃ４、およびＣ５領域に対する非中和抗体。
【図８−２】（ｃ）ＣＤ４によって誘導されるエピトープに対する抗体を、単独で、およびｓＣＤ４と組み合わせて調べた。（ｄ）中和（２Ｆ５）抗体および非中和（７Ｂ２、２．２Ｂ  および２５Ｃ２）抗ｇｐ４１抗体およびＭＡｂ  ２Ｇ１２。（ｅ）ｇｐ１４０ＷＴ（奇数番号レーン）とｇｐ１４０ＵＮＣ（偶数番号レーン）の放射性免疫沈降。
【図９】様々なＨＩＶ−１単離株からのジスルフィド結合で安定化されたｇｐ１４０タンパク質の調製。表記の外来性フューリンの存在下または非存在下で、野生型または変異体ｇｐ１４０を発現するプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。３５Ｓ標識上清を調製し、上述のように、ＭＡｂ  ２Ｇ１２を用いた放射性免疫沈降によって分析した。レーン１：ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質。レーン２：ｇｐ１４０ＷＴ＋フューリン。レーン３：ｇｐ１４０ＷＴ、フューリンなし。（ａ）ＨＩＶ−１ＤＨ１２３。（ｂ）ＨＩＶ−１ＨｘＢ２。
【図１０】可変領域中に様々な欠失を有する糖タンパク質のアミノ酸配列。欠失された野生型配列は白い影で示されており、以下のものが含まれる。  ΔＶ１：Ｄ１３２−Ｋ１５２；  ΔＶ２：Ｆ１５６−Ｉ１９１；  ΔＶ１Ｖ２’：Ｄ１３２−Ｋ１５２、およびＦ１５６−Ｉｌ９１；  ΔＶ１Ｖ２＊：Ｖ１２６−Ｓ１９２；  ΔＶ３：  Ｎ２９６−Ｑ３２４。
【図１１】可変ループ領域中に欠失を有するエンベロープタンパク質におけるサブユニット間システイン架橋の形成。（ａ）２Ｇ１２とＦ９１を用いて、４９２位と５９６位に２つのシステインを有する（ＣＣと表記されている）ΔＶ１Ｖ２＊Ｖ３タンパク質およびΔＶ１Ｖ２＊Ｖ３  Ｎ３５７Ｑ  Ｎ３９８Ｑタンパク質（それぞれ、レーン３と７、および４と８）を沈降させた。システイン変異を含まない適切な対照が、レーン１、２、５、および６に示されている。システインが付加されていない野生型タンパク質は、レーン９と１０に示されている。レーン１０の野生型タンパク質を除き、全てのタンパク質はフューリンによって切断された。およそのサイズが、右側にｋＤａで示されている。（ｂ）２Ｇ１２を用いて、４９２位と５９６位に２つのシステイン（ＣＣ）を有する様々なループ欠失タンパク質を沈殿させた（レーン３、５、７、９、１１、および１３）。同一の欠失を有し、余分なシステインが加えられていないタンパク質が、隣接したレーンに与えられている。これらの対照タンパク質は、フューリンによって切断されなかった。レーン１には、完全長のＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質が対照として加えられている。
【図１２】可変ループ中に欠失を有するＡ４９２Ｃ／Ｔ５９６Ｃ変異体の抗原性の解明。全ての変異体は、外来性フューリンの存在下で発現させた。一番上には、ＲＩＰＡで用いた抗体が示されている。（ａ）Ａ４９２Ｃ／Ｔ５９６Ｃ  ΔＶ１Ｖ２＊変異体と（ｂ）Ａ４９２Ｃ／Ｔ５９６Ｃ  ΔＶ３変異体。
【図１３】ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０のヌクレオチド（ａ）およびアミノ酸（ｂ）配列。アミノ酸に付された番号は、野生型ＪＲ−ＦＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ６３６３２）のものと対応している。システインの変異は、下線付きの太字で示されている。
【図１４】ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ΔＶ１Ｖ２＊ＳＯＳ  ｇｐ１４０のヌクレオチド（ａ）およびアミノ酸（ｂ）配列。アミノ酸に付された番号は、野生型ＪＲ−ＦＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ６３６３２）のものと対応している。システインの変異は、下線付きの太字で示されている。
【図１５】ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ΔＶ３  ＳＯＳ  ｇｐ１４０のヌクレオチド（ａ）およびアミノ酸（ｂ）配列。アミノ酸に付された番号は、野生型ＪＲ−ＦＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ６３６３２）のものと対応している。システインの変異は、下線付きの太字で示されている。
【図１６】精製されたＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ＵＮＣ、およびｇｐ１２０タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。５０ｍＭ  ＤＴＴを加えた（還元）または加えない（非還元）Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中のＣＨＯ細胞によって発現されたタンパク質（０．５μｇ）を、３−８％のポリアクリルアミドグラジエントゲル上で分離した。
【図１７−１】ＣＨＯ細胞によって発現された精製ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬエンベロープ糖タンパク質の生物物理学的分析。（ａ）０．２５ｍＭから１．０ｍＭのタンパク質濃度で、ＳＯＳ  ｇｐ１４０の超遠心分析を行った。実験データ（白丸）を、理想的な単量体、ダイマー、および三量体の理論曲線（１、２、および３の表示がなされている）と比較した。（ｂ）分析用サイズ排除クロマトグラフィー。ＰＢＳ緩衝液中のＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム上で、精製ＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ＵＮＣ、およびｇｐ１２０タンパク質を分離し、これらの保持時間を、分子量既知の標準タンパク質（２２０ｋＤａ、４４０ｋＤａ、８８０ｋＤａ、矢印）と比較した。ＳＯＳ  ｇｐ１４０の主ピークの保持時間（５．９５分）は、単量体のｇｐ１２０（保持時間６．２４分）より若干大きな単量体であることと合致したが、ｇｐ１４０ＵＮＣ（保持時間４．９１分）はオリゴマー分子種として移動している。
【図１７−２】（ｃ）ＢＮ−ＰＡＧＥを用いて、ｇｐ１２０および可溶性ＣＤ４と複合体を形成したｇｐ１２０を、純粋な標準タンパク質、サイログロブリン、フェリチン、アルブミンのオリゴマー状態と比較した。タンパク質は、クマシーブルーを用いてゲル上で可視化させた。（ｄ）ＣＨＯ細胞由来の精製ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０、ＳＯＳ  ｇｐ１４０、およびｇｐ１４０ＵＮＣ糖タンパク質のＢＮ−ＰＡＧＥ分析。
【図１８】ＳＯＳ  ｇｐ１４０単独（ａ）、およびＭＡｂと複合体を形成したｇｐ１４０（ｂ−ｆ）の陰性染色電子顕微鏡。バー＝４０ｎｍ。ｂ−ｆでは、ＭＡｂの予想されるＦｃが下向きになるように、パネルをマスクし、回転させた。複数のＭＡｂを使用したときには、ＭＡｂ  ２Ｆ５の予想されるＦｃが下向きにされている。ｂ−ｆでは、免疫複合体の基本的な幾何構造と化学量論を表すために、図解的な表示も示してある。この模式図では、ＳＯＳ  ｇｐ１４０、完全なＭＡｂ、およびＦ（ａｂ’）２が、それぞれ楕円、Ｙ型構造、およびＶ型構造で示されているが、サイズどおりではない。用いたＭＡｂは、（ｂ）２Ｆ５、（ｃ）ＩｇＧ１ｂ１２、（ｄ）２Ｇ１２、（ｅ）  ＭＡｂ  ２Ｆ５＋Ｆ  （ａｂ’）２  ＩｇＧｌｂｌ２、（ｆ）ＭＡｂ  ２Ｆ５＋ＭＡｂ  ２Ｇ１２である。
【図１９】ｓＣＤ４およびＭＡｂ  １７ｂと複合体を形成したＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１２０の各平均およびサブトラクション電子顕微鏡像。バー＝４０ｎｍ。パネルａとｂは、それぞれ、ＳＯＳ  ｇｐ１４０（ａ）とＹＵ２  ｇｐ１２０（ｂ）の三次構造の各電子顕微鏡像である。ＭＡｂ  １７ｂのＦｃ領域を下向きに配列してある。パネルｃとｆは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０（パネルｃ）とｇｐ１２０（パネルｆ）の三次構造の平均電子顕微鏡像である。パネルｄとｇは、ＳＯＳ  ｇｐ１４０複合体（パネルｄ）とｇｐ１２０複合体（パネルｇ）の非透過（ｍａｓｋｅｄ）平均電子顕微鏡像である。パネルｅは、ｇｐ１４０複合体（パネルｄ）からｇｐ１２０複合体（パネルｇ）を差し引いたときの残りの密度を表している。パネルｄとｅにおいて、矢印は、残差密度が最大の領域を指しており、これは、ＳＰＳ  ｇｐ１４０中に存在するが、ｇｐ１２０中には存在しない仮定上のｇｐ４１ＥＣＴＯ部分に相当する。パネルｈは、ｓＣＤ４および１７ｂＦａｂ断片［ＰＤＢコード１ＧＣ１］（Ｋｗｏｎｇ，１９９８）と複合体を形成しｇｐ１２０中心部のＸ線結晶構造のリボン図上に重ね合わされたｇｐ１２０複合体（パネルｇ）の概観を表している。ｇｐ１２０複合体は、見易くするために拡大されている。
【図２０】ＳＯＳ  ｇｐ１４０の電子顕微鏡データから得られた、ｇｐ１２０と比較したｇｐ４１ＥＣＴＯのおよその位置を示したモデル。（ａ）ｓＣＤ４（黄）とＦａｂ１７ｂ［ＰＤＢコード１ＧＣ１］（Ｋｗｏｎｇ，１９９８）（薄い青）と複合体を形成したｇｐ１２０中心部のＸ線結晶構造と比較したｇｐ４１ＥＣＴＯ（濃い青の楕円で表されている）の予想位置。抗原特性に応じて（Ｍｏｏｒｅ，１９９６；  ａｎｄ  Ｗｙａｔｔ，１９９８ａ）、ｇｐ１２０中心表面を３つの面に分割し、非中和面を薄紫、中和面を赤、無機能面（ｓｉｌｅｎｔ  ｆａｃｅ）を緑に着色した。（ｂ）ＩｇＧ１ｂ１２エピトープ（Ｓａｐｈｉｒｅ，２００１）と２Ｇ１２エピトープ（Ｗｙａｔｔ，１９９８ａ）は、それぞれ、黄色と白で示されている。基準点を与えるために、ｇｐ１２０のＣ末端と会合している残基を青に着色した。
【図２１】ＣＨＯ細胞によって発現された未精製ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０のＲＩＰＡ分析。３５Ｓ標識されたシステインとメチオニンの存在下で、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を培養した。表記のＭＡｂとプロテインＧ−アガロースビーズを用いて、培養上清を免疫沈降させ、結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。捕捉に用いたＭＡｂおよび／またはＣＤ４関連タンパク質は、各レーンの上に記されている。レーン２では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、タンパク質をＤＴＴで還元し、残りのサンプルを非還元条件下で分析した。
【図２２−１】ＣＨＯ細胞によって発現されたＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ＵＮＣ、ｇｐ１２０タンパク質のＳＰＲ分析。抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１ＭＡｂをセンサーチップ上に固定化し、記載のとおり、精製型または未精製型の表記のｇｐ１２０またはｇｐ１４０糖タンパク質を含有する緩衝液に曝した。注記がある場合には、分析の前に、Ｅｎｖタンパク質を８倍モル過剰量のｓＣＤ４と１時間混合した。安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の培養上清から未精製ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質を得た。ウェスタンブロッティングによって、これらのタンパク質濃度を測定し、それぞれのタンパク質が概ね等しい量で加えられるように調整した。センサーグラムの結合フェーズのみが示されている。一般的に、解離速度は非常に遅いので、有意な情報を得ることができなかった。
【図２２−２】ＣＨＯ細胞によって発現されたＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ＵＮＣ、ｇｐ１２０タンパク質のＳＰＲ分析。抗ｇｐ１２０および抗ｇｐ４１ＭＡｂをセンサーチップ上に固定化し、記載のとおり、精製型または未精製型の表記のｇｐ１２０またはｇｐ１４０糖タンパク質を含有する緩衝液に曝した。注記がある場合には、分析の前に、Ｅｎｖタンパク質を８倍モル過剰量のｓＣＤ４と１時間混合した。安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来の培養上清から未精製ＳＯＳ  ｇｐ１４０およびｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質を得た。ウェスタンブロッティングによって、これらのタンパク質濃度を測定し、それぞれのタンパク質が概ね等しい量で加えられるように調整した。センサーグラムの結合フェーズのみが示されている。一般的に、解離速度は非常に遅いので、有意な情報を得ることができなかった。
【図２３】未分画細胞培養上清のＢＮ−ＰＡＧＥ分析。（ａ）安定なＣＨＯ細胞株から得た培養上清中に存在するＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬｇｐ１２０、ＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ＵＮＣ、およびΔＶ１Ｖ２  ＳＯＳ  ｇｐ１４０糖タンパク質の比較。（ｂ）タンパク分解による切断によって、ｇｐ１４０オリゴマーは不安定化される。フュリーンとＳＯＳ  ｇｐ１４０、ｇｐ１４０ＵＮＣ、ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＵＮＣをコードするプラスミドとを用いて、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。細胞培養上清に０．１％クマシーブルーを含有するＭＯＰＳ緩衝液を加え、ＢＮ−ＰＡＧＥによって分離した。次いで、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写させ、ウェスタンブロッティングによって可視化させた。分子量マーカーとして、サイログロブリンとＢＳＡダイマーを使用した（図２ｃ参照）。
【図２４】ＰＡ１−マイクロビーズ上へのＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０の固定化。記載されているように、ＰＡ１磁気マイクロビーズ上にＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０を固定化した。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クマシー染色を行うことによって、５μＬと１２．５μＬの再懸濁したビーズを分析した。比較と定量のために、２．５μｇのｇｐ１２０を加えた。
【図２５】ＰＡ１−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ上へのＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０の固定化。記載されているように、ＰＡ１磁気Ｄｙａｎｂｅａｄｓ上にＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１２０を固定化した。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クマシー染色を行うことによって、表記の容量の再懸濁したビーズを分析した。定量のために、ｇｐ１２０の量を増加させながら加えた。
【図２６】ｇｐ１２０ワクチンによって生じた抗ｇｐ１２０抗体反応の経時分析。天然ｇｐ１２０特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、各免疫化の後に血清反応を分析した。ｇｐ１２０の用量は、脚注の括弧内に記されている。
【図２７】３つの用量のｇｐ１２０ワクチンで免疫した動物から得た血清中の抗ｇｐ１２０力価（最大量の５０％）。データは、１グループ当たり５匹の動物の平均＋／−ＳＤであり、ｇｐ１２０の用量は括弧内に記されている。
【図２８Ａ】ｇｐ４１ＥＣＴＯへの変異導入法。（ａ）ｇｐ４１ＥＣＴＯのＮ末端にある７つのリピート中に存在するａおよびｄ位の残基（二次構造中に、灰色で表した）を置換した。主なＭＡｂエピトープが記されている（Ｅａｌ，１９９７；  Ｐａｒｋｅｒ，２００１；  Ｘｕ，１９９１；  ａｎｄ  Ｚｗｉｃｋ，２００１）。
【図２８Ｂ】（ｂ）６−へリックスバンドル（融合した後のｇｐ４１ＥＣＴＯの形態）の断面の模式図と、１つのＮ末端ヘリックスをらせん状の車輪式に現した図が示されている。Ｎ末端に位置する７つのリピート（黒）のａおよびｄ位にある残基が、三量体界面を形成する。
【図２９】ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のＰＡＧＥ分析。（ａ）５５９位に変異を有するＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質のＢＮ−ＰＡＧＥ。比較のためにｇｐ４１ＵＮＣタンパク質を加えた。（ｂ）非還元条件下でのＳＯＳ  ｇｐ１４０バリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（ｃ）還元条件下でのＳＯＳ  ｇｐ１４０バリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（ｄ）２５℃で、１時間、ＳＯＳＩ５５９Ｇ  ｇｐ１４０タンパク質をＳＤＳで処理した。用いたＳＤＳ濃度は、左から右へと増加し、０％，  ０．００５％、  ０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％であった。次いで、ＢＮ−ＰＡＧＥ分析を行った。単量体ｇｐ１２０（２０ｎｇ）を分子量の標準として用いた。
【図３０】ＳＯＳＩ５５９Ｐ  ｇｐ１４０のゲル濾過分析。（ａ）ＳＯＳおよびＳＯＳＩ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上で分画した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによって分析した。（ｂ）（ａ）で得た同じＳＯＳＩ５５９Ｐ  ｇｐ１４０画分を、ＢＮ−ＡＰＧＥとウェスタンブロッティングによって分析した。標準タンパク質の溶出位置（ピーク画分）が示されている。
【図３１】ＳＯＳＩ５５９Ｐ  ｇｐ１４０三量体の安定性。ＳＯＳＩ５５９Ｐ  ｇｐ１４０三量体の採取源として、図３に示されているものと同様のゲル濾過プロフィールから得られた画分６と７をプールした。三量体は、（ａ）表記の温度で１時間インキュベートするか、あるいは（ｂ）２５℃で１時間、濃度０．１％の様々な界面活性剤に曝露させた。次いで、ＢＮ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを用いて、タンパク質を分析した。
【図３２】ｇｐ１４０タンパク質の抗原構造の分析。  ｇｐ１４０ＵＮＣ、ＳＯＳ  ｇｐ１４０、およびＳＯＳＩ５５９Ｐ  ｇｐ１４０タンパク質と様々な中和ＭＡｂおよび非中和ＭＡｂ（Ｂｉｎｌｅｙ，２０００ａ）を用いて、ＲＩＰＡを行った。
【図３３】ＨＩＶ−１  ｇｐ４１ＥＣＴＯ中核構造と変異体ペプチド。（ａ）標識されたＮ３６とＣ３４ヘリックスをアミノ末端に１つずつ有するＮ３６／ＣＤ４結晶構造が示されている。３つのＣ３４ヘリックス（赤）が、Ｎ３６三量体のコイル状コイル（青）に接触して密集している。
【０４４２】
ａ（赤）およびｄ（緑）位に位置する残基のファンデルワールス表面が、Ｎ３６  コイル状コイル（ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ）のヘリックス骨格上に重ねられている。本研究で置換されたアミノ酸は、ａおよびｄ層の上に示されている。図は、プログラムＧＲＡＳＰ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，１９９１）を用いて作成した。（ｂ）２２２ｎｍのＣＤ分光法によって、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中のペプチド濃度１０μＭで、Ｎ３６（Ｌ６）Ｃ３４（白丸）、Ｉ５５９Ｇ（黒丸）、Ｉ５５９Ｐ（白四角）、Ｌ５６６Ｖ（白菱形）およびＴ５６９Ｐペプチド（白三角）の熱融解遷移曲線を測定した。フォールディングしていない分子の割合の増加が、温度の関数として示されている。全ての融解は可逆的であった。重ね合わせることができるフォールディング曲線とアンフォールディング曲線が観察された。９０％を超えるシグナルが、冷却時に回復した。（ｃ）Ｔ５６９Ｐペプチドの平衡沈降分析。本ペプチドの代表的データは、２０℃、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中での２０，０００、約３０μＭのペプチド濃度で採取した。データは、三量体モデルに最もフィットした（曲線３）。ダイマー（曲線２）とテトラマー（曲線４）の曲線が、比較のために図示されている。曲線３から得られた残差の分析には、系統誤差は現れていない。
【図３４】ｇｐ４１ＥＣＴＯと融合時における遷移のモデル。左側パネル：ｇｐ４１の仮定上の天然な前融合の立体配置（Ｈｕｎｔｅｒ，１９９７）。中央のパネル：プレヘアピン中間型。右側パネル：融合後の状態。前融合立体配置には、Ｎ末端ヘリックスは存在しておらず、５５９−５６９位周囲の領域はヘリックスではない。Ｉ５５９Ｐと関連の置換によって、前ヘアピン中間体中のＮ末端ヘリックスの形成または６−ヘリックスバンドルの形成を崩壊させることが提示されている。このようにすることにより、前融合立体配置中に、修飾されたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質が維持される。隣接する分子間ジスルフィド結合（黄色の棒）とＮ結合型グリカンの位置とともに、ＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質を作るＴ６０５Ｃ置換の位置も明記されている。明確にするために、１つのｇｐ４１分子から得られる２つのヘリックスのみが示されている。
【図３５】プラスミンまたは可溶性フューリンによるＥｎｖのインビトロ酵素切断  ８μｇの部分（およそ５０％）切断した精製ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０またはｇｐ１２０  を、様々な時間にわたって、３７℃で、プロテアーゼとともにインキュベートした。次いで、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットによって、Ｅｎｖタンパク質を分析した。（ａ）  ２時間または１６時間のプラスミン（２０μｇ）消化から得られたＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質。抗ｇｐ４１  ＭＡｂ  ２Ｆ５をプローブとして、ウェスタンブロットを行った。（ｂ）１６時間のプラスミン（２０μｇ）消化から得られるＳＯＳ  ｇｐ１４０またはｇｐ１２０サンプル。抗ｇｐ１２０  ＭＡｂ  Ｂ１２をプローブとして、ウェスタンブロットを行った。（ｃ）プラスミンまたは可溶性フューリンを加えまたは加えずに、３７℃で、１６時間にわたって、ＳＯＳ  ｇｐ１４０をｐＨ７．５でインキュベートした。ＭＡｂ  Ｂ１２をプローブとして、ウェスタンブロットを行った。（ｄ）表記のｐＨで、１６時間にわたって、フューリンを加えまたは加えずに、ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０をインキュベートした。ＭＡｂ  Ｂ１２をプローブとして、ウェスタンブロットを行った。材料と方法に記載されているように、可溶性フューリンによって得られたパーセント切断を計算し、レーン１０の対照との比較で表示した（フューリンなし、０％切断）。
【図３６−１】フューリンを加えまたは加えないＥｎｖタンパク質の切断と発現。３５Ｓ標識Ｅｎｖタンパク質を含有する培養上清は、適宜ＨＩＶＩＧまたはＳＩＶＩＧの何れかを用いて免疫沈降させた後、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。３回の反復測定のうち代表的な結果が示されている。各パネルでは、材料と方法に記載されているように、パーセント切断を計算した。さらに、ｇｐ１２０＋ｇｐ１４０またはｇｐ１２０＋ｇｐ１６０バンドの相対発現を計算し、各ゲル中の標準（その発現を１．００とした）に対する比として表した。（ａ）ｐＰＰＩ４をベースとしたプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞中で、可溶性ｇｐ１４０タンパク質を発現させた。（ｂ）様々な量の共発現された完全長フューリンの存在下であることを除いて、パネルａと同様に、ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０またはｇｐ１４０ＷＴタンパク質を発現させた。（ｃ）表記のように、感染効率５で、ワクシニアウイルスｖ−ＶＳ４（ＳＩＶｍｎｅ  Ｇａｇ−Ｐｏｌを発現）および／またはｖ−ＳＥ５（ＳＩＶｍｎｅ  Ｅｎｖを発現）により、ＢＳＣ４０細胞を感染させた。一部の細胞は、同じく感染効率５で、完全長フューリンを発現するワクシニアウイルス  ｖｖ：ｈｆｕｒ  に同時感染させた（レーン２と４）。
【図３６−２】（ｄ）完全長フューリンを同時トランスフェクトしてまたは同時トランスフェクトせずに、ｐＰＰＩ４をベースとしたプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞中で、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０ＷＴとｇｐ１４０ＵＮＣタンパク質を発現させた。（ｅ）表記のように、完全長フューリン（ＦＬ）、末端切断された可溶性フューリン（δＴＣ）を同時トランスフェクトしてまたはトランスフェクトせずに、ｐＰＰＩ４をベースとしたプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞中で、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１４０ＷＴとＳＯＳ  ｇｐ１４０タンパク質を発現させた。
【図３７】切断配列を変えると、細胞のプロテアーゼによるＥｎｖのプロセッシングを増加させることができる。同時トランスフェクトされた完全長のフューリンの不存在下（レーン１、３、および５）または存在下（レーン２、４、および６）で、（ａ）野生型のＲＥＫＲ切断部位（レーン１と２）または変異体ＲＲＲＫＫＲ（レーン３と４）またはＲＲＲＲＲＲ（レーン５と６）切断部位配列を有するＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０を発現させた。（ｂ）  ０（レーン１）、０．１μｇ（レーン２）、１μｇ（レーン３）、または１０μｇ（レーン４）の同時トランスフェクトされた完全長フューリンとともに、ＪＲ−ＦＬ  ＳＯＳ  ｇｐ１４０ＲＲＲＲＲＲを発現させた。（ｃ）同時トランスフェクトされた完全長フューリンの不存在下（レーン１と３）または存在下（レーン２と４）で、ＤＵ１５１  ＳＯＳ  ｇｐ１４０（レーン１と２）およびそのＲＲＲＲＲＲ変異体（レーン３と４）を発現させた。全てサンプルは、図３６の脚注に記載されているように標識し、免疫沈降させた。図３６のように、Ｅｎｖのパーセント切断と相対発現を求めた。
【図３８】Ｅｎｖ切断部位変異体は、感染と融合機能を有している。（ａ）ルシフェラーゼ計測値を用いた単一ラウンドの感染アッセイを用いて、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１６０ＷＴ、ＪＲ−ＦＬ  ｇｐ１６０ＲＲＲＲＲＲ変異体、またはＶＳＶ−Ｇにより偽型化されたｐＮＬ−ｌｕｃウイルスのＨｅＬａ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞に対する感染性を測定した。エンベロープを欠く陰性対照ウイルス（ｐＮＬ−ｌｕｃトランスフェクション上清から得た）の標準化したルシフェラーゼの値は、１ユニット未満であった。（ｂ）色素転写アッセイで、ｇｐ１６０ＷＴまたはｇｐ１６０ＲＲＲＲＲＲタンパク質が媒介する細胞−細胞融合を分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005502350.tif 000412