(57)【要約】真核細胞における特定の遺伝子座の特異的変化のための方法およびベクターを提供する。一つの方法は、部位特異的相同組換えによって宿主細胞ゲノムに組み入れられたベクター配列を有する細胞を作製および同定する目的のために、細胞内蛍光プローブ（FPIC）遺伝子標的DNAベクターを利用する。方法はまた、部位特異的相同組換えもしくは非相同組換え、または挿入のいずれかによって、宿主細胞のゲノムに組み入れられた外因性のベクター配列を有する細胞を同定するためにインビボで検出可能なマーカーをコードする配列を利用する。さらに、FPICベクターを用いて改変された細胞、およびそのような細胞から作製された生物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、FPIC遺伝子標的ベクターを利用して部位特異的相同組換えを受けた形質転換細胞を得る方法：
a）ベクターによる細胞の形質転換に適した条件下で、部位特異的相同組換えを受けるように設計されたFPIC遺伝子標的ベクターを細胞に接触させる段階であって、該ベクターが、
細胞の内因性ゲノム配列と実質的に相同であって、該細胞において相同組換えを受けることができる第一のDNA配列、
細胞の内因性のゲノム配列と相同でなく、該細胞において相同組換えを受けることができない第二のDNA配列であって、ヌクレオチド配列を含む細胞が同定されるようにするヌクレオチド配列をさらに含む第二のDNA配列、
細胞の内因性のゲノム配列と実質的に相同であって、該細胞において相同組換えを受けることができる第三のDNA配列、
細胞の内因性ゲノム配列と相同でなく、該細胞において相同組換えを受けることができない第四のDNA配列であって、ヌクレオチド配列を含む細胞をヌクレオチド配列を含まない細胞から同定および単離できるようにするヌクレオチド配列をさらに含む第四のDNA配列
を含む段階；
b）該第二のDNA配列を表す転写された配列が存在することに関して、および該第四のDNA配列を表す転写された配列が存在しないことに関して選択的な条件下で、細胞を増殖させることにより、該FPIC遺伝子標的ベクターによって形質転換した細胞を選択または濃縮する段階；ならびに
c）該第二のDNA配列を有する細胞を該第四のDNAを有する細胞から分離することにより、FPIC遺伝子標的ベクターを利用して部位特異的相同組換えを受けた形質転換細胞を得る段階。
【請求項２】
陽性選択マーカーをコードする第二のDNA配列を有するが、細胞標的DNAの改変を行うことができる部位特異的相同組換え事象の転写された選択特徴をコードする第四のDNA配列を有しない形質転換細胞のゲノムDNAを特徴付ける段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
FPIC遺伝子標的ベクターが、抗生物質の存在下で細胞をインキュベートすることによって、または蛍光の放射によって検出可能である陽性選択マーカーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
FPIC遺伝子標的ベクターが、抗生物質の存在下で細胞をインキュベートすることによって検出可能である陰性選択マーカーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
FPIC遺伝子標的ベクターが、抗生物質または薬剤を用いなくとも検出可能である陰性選択マーカーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
細胞が相同組換えを受けることができる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
細胞が多細胞生物の細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
細胞が植物細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
細胞が、内因性の細胞ゲノムを多数改変する目的のために多数回の部位特異的相同組換えを受けている、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
多細胞生物を作製するために形質転換細胞が利用される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
細胞が胚性幹細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
相同組換えを受けることができる細胞における部位特異的相同組換えのための単離細胞内蛍光プローブ（FPIC）遺伝子標的ベクターであって、
該ベクターが、
細胞の内因性ゲノム配列に対して実質的に相同であって、該細胞において相同組換えを受けることができる第一のDNA配列、
細胞の内因性のゲノム配列に対して相同でなく、該細胞において相同組換えを受けることができない第二のDNA配列であって、ヌクレオチド配列を含む細胞が同定できるようにするヌクレオチド配列をさらに含む第二のDNA配列、
細胞の内因性ゲノム配列に対して実質的に相同であって、該細胞において相同組換えを受けることができる第三のDNA配列、
細胞の内因性のゲノム配列に対して相同でなく、該細胞において相同組換えを受けることができない第四のDNA配列であって、該DNA配列を含む細胞を該ヌクレオチド配列を含まない細胞から同定および分離できるようにするヌクレオチド配列をさらに含む第四のDNA配列
を含み；
該FPIC遺伝子標的ベクターが、5'から3'方向に、細胞の内因性ゲノムDNA配列に対して実質的に相同である第一のDNA配列、第二のDNA配列、細胞の内因性ゲノムDNA配列に対して実質的に相同である第三のDNA配列、および第四のDNA配列を含み；ならびに
該ベクターが部位特異的相同組換えを受けることができ、それによって細胞の内因性の標的ゲノムDNA配列の改変が起こる、単離FPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項１３】
細胞の内因性のゲノム標的DNAがエキソンおよびイントロンを含む、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項１４】
ベクターが、細胞の標的ゲノムDNA配列と実質的に相同であるエキソンおよびイントロンの全てまたは一部を含む、請求項13記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項１５】
ベクターが、細胞の標的ゲノムDNA配列配列と実質的に相同である調節因子の全てまたは一部を含む、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項１６】
ベクターが、細胞の標的ゲノムDNA配列と実質的に相同である配列の変化を含み、該変化が、欠失、置換、付加、点突然変異、またはその組み合わせを含む、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項１７】
第二のDNA配列が、細胞における転写された非機能的な選択特徴をコードして、細胞の内因性ゲノム配列に対して相同でなく、したがって部位特異的相同組換えを受けることができない、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項１８】
第四のDNA配列が細胞における転写された非機能的な選択特徴をコードして、細胞の内因性のゲノム配列に対して相同でなく、したがって、部位特異的相同組換えを受けることができない、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項１９】
第四のDNA配列が、蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２０】
蛍光タンパク質が、GFP、CFP、YFP、RFP、dsRED、またはHcREDである、請求項19記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２１】
第二のDNA配列が抗生物質抵抗性マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２２】
抗生物質抵抗性マーカーが、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、ゼオシン、またはハイグロマイシンである、請求項21記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２３】
第二のDNA配列が蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２４】
蛍光タンパク質が、GFP、CFP、YFP、RFP、dsRED、またはHcREDである、請求項23記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２５】
第四のDNA配列が陰性選択物質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２６】
陰性選択物質がチミジンキナーゼまたはジフテリア毒素A鎖である、請求項25記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２７】
ベクターが、細胞の内因性ゲノムDNA配列とは相同でないが、第一および第三のDNA配列に対して外部で5'に存在する第五のDNA配列をさらに含む、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２８】
第四および第五のDNA配列のそれぞれが、選択可能な転写された配列をコードするDNAを含む細胞を、選択可能な転写された配列をコードするDNAを含まない細胞から分離できるようにする、選択可能な転写された配列をコードする、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項２９】
第一のDNA配列と第三のDNA配列の実質的に相同な配列がそれぞれ、約50塩基対〜50,000塩基対である、請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクター。
【請求項３０】
請求項12記載のFPIC遺伝子標的ベクターによって形質転換された細胞。
【請求項３１】
ベクターによって、少なくとも一つの細胞の内因性のゲノム標的DNA配列の改変が起こる、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
ベクターが、細胞の内因性のゲノム標的DNA配列に少なくとも一つの外因性の調節因子を導入する、請求項31記載の細胞。
【請求項３３】
胚性幹細胞である請求項30記載の細胞。
【請求項３４】
請求項31記載の細胞から作製されたヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３５】
細胞が部位特異的相同組換えを受けた、請求項1記載の方法によって作製された濃縮細胞集団。
【請求項３６】
請求項35記載の細胞から作製されたヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３７】
請求項35記載の細胞から作製されたトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下でその全文が参照として本明細書に組み入れられる、2001年12月4日に出願された米国特許出願第60/338,768号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に遺伝子座を改変する目的で細胞を操作すること、より詳しくは、遺伝子標的ベクター、および細胞における遺伝子改変を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
外来遺伝子材料を原核生物および真核生物の双方のゲノムに安定に導入することは、外因性遺伝子の発現または内因性遺伝子座の破壊のような様々な目的のために多様な場合において首尾よく行われている。これは主に、ランダムゲノム操作または部位特異的相同組換えのいずれかによって行われる。ランダムな組み込みは、ほとんどの場合、部位特異的でない位置で宿主細胞のゲノムに直鎖状のDNA断片を挿入することを含む。これらの挿入は、多量体またはコンカテマーとして存在する傾向があり、たいていの場合特定の遺伝子座の破壊および不活化は起こらない。内因性の遺伝子座がランダム挿入事象によって破壊されうる可能性もまた存在し、このため、細胞または形質転換細胞に由来する生物上に及ぼす外因性遺伝子の影響の分析は難しい。さらに、組み込み領域によっては有意な範囲の外因性プロモーター活性が認められうる。
【０００４】
部位特異的相同組換えによる宿主ゲノムへのDNAの挿入によって、外因性のDNA分子の一コピー組み込みのために宿主ゲノムの特定の領域の標的化を行うことができる。相同組換えは、特異的リコンビナーゼ酵素の機能によって有意に類似のヌクレオチド配列を交換することを含む。細胞の内因性ゲノムDNA配列を部位特異的に外因性DNAによって操作するように設計された初期の実験は、モデル系として酵母について行われた。酵母ゲノムとleu2.sup座での形質転換によって導入された外因性のプラスミドとの間の組換えが証明された（Hinnenら、（1978）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75、1929）。より最近、哺乳類の細胞の相同組換え能を利用することによって、細胞の内因性ゲノムDNAにおいて特異的に変異したDNA配列を作製することが可能となった。機能獲得および機能喪失対立遺伝子はいずれも、幹細胞およびそのような細胞から作製された動物において作製されている（下記参照）。さらに、陽性-陰性選択ベクターおよび方法を適用することによって、変異DNA配列を含む細胞および動物の作製およびそれらに関する研究が加速された（Capecchiら、（1997）、米国特許第5,631,153号）。
【０００５】
部位特異的相同組換えによって変異した特定の遺伝子座を有する胚性幹細胞から多くの動物が作製されている。これらには、特定の遺伝子座での相同組換えによって標的化された胚性幹細胞を胚盤胞に注入することによって作製されたキメラに由来するマウスが含まれる。いくつかの例には、p53およびparaxis座（Donehowerら、（1992）、Nature 356、215；Burgessら、（1996）、Nature 384、570）が含まれる。相同組換えによって改変された胚性幹細胞に由来するブタも含まれる（Butlerら、（2002）、Nature 415、103）。
【０００６】
今日まで、内因性のDNA配列を外因性のDNA配列に置換するためにゲノムの特定の領域を標的化することができる主に二つのタイプのベクターが設計されている。これらのベクターは、多数の異なる細胞タイプにおいて標的化された多様な対立遺伝子を作製するために十分であることが証明されている。挿入ベクターは、選択マーカーをコードする内部ヌクレオチド配列に隣接する二つの相同性領域を含む。ベクターは、相同性領域の一つにおいて直鎖状となる。単一の交叉事象および相同組換えによって、ゲノム配列の部分的複製が起こる。染色体内組換えによって、しばしば複製された内因性配列が排除される。このタイプの標的ベクターの短所は、骨格またはベクター配列を含む細胞の消失によって正確に標的化された事象を有意に濃縮することができる陰性選択マーカーが存在しないことである。さらに、相同性領域内での直鎖化によって、相同組換えのために利用できるDNA配列配列の量が減少して、このように鎖が交換する機会は減少する（Thomasら、（1986）、Cell 44、49）。最後に、染色体内組換えは既定の領域内で起こらなければならないか、または遺伝子座の野生型構築の再生が起こりうる。
【０００７】
置換ベクターは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子のような陽性選択マーカーに通常隣接する二つの相同性領域を含む。陰性選択マーカーはしばしば、陰性選択カセットを含む細胞の消失によって全集団における正確に標的化された細胞の濃縮を提供するために、相同性領域の一つに対して外部に隣接して存在する。置換ベクターを細胞に導入した後に、同時または段階的な陽性および陰性選択を行うと、陰性選択マーカーの適用によって、部位特異的相同組換えを受ける確率が約8〜12倍高い細胞が単離される。哺乳類細胞におけるおそらく最初に成功した遺伝子標的化実験において、Capecchiらは、置換ベクターを用いることによるマウスHPRTおよびint-2座の標的化を証明した（米国特許第5,631,153号）。それ以降、多数の遺伝子座の標的化が成功しているが、そのいくつかは挿入ベクターによって、大多数は置換ベクターによって行われた。これらの多くには、相同性領域のいずれかまたは双方に対して外部に存在する陰性選択マーカーが含まれ、それによって標的化した対立遺伝子の同定効率がしばしば増加する。
【０００８】
置換ベクターおよび陽性-陰性選択の方法および利用に関しては、なおも多数の短所が存在する。HSVチミジンキナーゼのような多くの陰性選択カセットを利用する場合、抗生物質またはガンシクロビルのような選択物質を加える必要があり、これは細胞に対して不適当なストレスと、望ましくないまたは未熟な分化を引き起こしうる。さらに、陰性選択マーカーによる濃縮に関して細胞を選択する場合、選択マーカーが存在しないために薬剤に対する抵抗性を有する細胞の回収のために多くの時間を要する。同様に、この方法論によって典型的に得られる濃縮率は多くとも約8〜12倍である。同様に、陽性-陰性選択ベクターの作製はしばしば戦略的に難しく、時間を要する。このように、外因性の核酸分子を細胞ゲノムに部位特異的に挿入させる標的ベクターが必要である。本発明は、この必要性を満足させ、さらなる利点を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
ベクターDNAと真核細胞における標的DNAとの相同組換えによってゲノムDNA配列を改変するための方法を提供する（図1）。方法は、細胞のゲノム内に存在する配列と実質的に類似の配列を含むベクター、本明細書においてFPIC遺伝子標的ベクターと呼ばれるベクターとの相同組換えを受けることができる細胞の形質転換を最初に含む。宿主細胞のゲノムへのベクター組み込みは本質的に無作為に、ゲノムの特定の領域に対する選択性がなく起こりうるが、特定の割合の細胞が同様に、部位特異的相同組換えによってゲノムに組み入れられた遺伝子標的ベクターを含む。形質転換された宿主細胞をその後選択することによって、部位特異的相同組換えを首尾よく受けた細胞を単離および同定することができる。選択は、遺伝子標的ベクター内に存在する配列を表す特異的に転写されたヌクレオチド配列の存在を検出できることに基づく。
【００１０】
本発明のFPICベクターには、宿主細胞ゲノム内に存在する配列と実質的に相同である第一のDNA配列、および第一の配列の下流または上流の宿主細胞ゲノム内に存在する他の配列と実質的に相同である第三のDNA配列が含まれる。ベクターはさらに、第一と第三のDNA配列との間に、宿主ゲノムに存在する配列に対してほとんどまたは全く相同性を示さず、上記のゲノムに組み入れられたベクター配列を有する細胞の同定能を付与する第二のDNA配列を含む。ベクターはまた、第一または第二の配列に対して5'または3'のいずれかに存在し得て、宿主ゲノムに存在する配列に対してほとんどまたは全く相同性を示さず、そして細胞宿主ゲノムに組み入れられた配列を含む細胞を同定するために異なる独自の手段を付与する第四のDNA配列を含む。第二と第四のDNA配列を組み合わせて利用することによって、ベクターと内因性の配列との相同組換えを受けた細胞を同定することができる。したがって、本発明は、相同組換えが特異的遺伝子変化を付与する、そのようなベクターによって形質転換された細胞、特に相同組換えがそのようなベクターによって媒介される細胞、およびそのような形質転換細胞から作製された生物も提供する。
【００１１】
一つの態様において、本発明は、FPIC遺伝子標的ベクターを利用して部位特異的相同組換えを受けた形質転換細胞を同定する方法を提供する。そのような方法は、例えば、a）ベクターが、宿主ゲノム内に存在する内因性のゲノム配列に対して実質的に相同である第一のDNA配列；上記の細胞における陽性選択特徴をコードして、細胞の内因性ゲノム配列に対して相同でなく、したがって部位特異的相同組換えを受けることができない第二のDNA配列；宿主ゲノム内に存在する内因性のゲノム配列に対して実質的に相同であって、第一のDNA配列とは異なる第三のDNA配列；および上記の細胞において特異的に転写された配列を表し、機能的なタンパク質産物をコードせず、細胞の内因性ゲノム配列に対して相同でなく、したがって部位特異的相同組換えを受けることができない第四のDNA配列を含む；ベクターが、内因性の標的配列を有する第一のDNA配列と、内因性の標的DNA配列を有する第三のDNA配列との鎖の交換を通して細胞において部位特異的相同組換えを受けることができる；ならびにFPIC遺伝子標的ベクターにおけるDNA配列の構築が、標的DNA配列に対して実質的に相同な第一のDNA配列、陽性選択マーカーをコードする第二のDNA配列、標的DNA配列に対して実質的に相同である第三のDNA配列、転写されるが機能的なタンパク質産物をコードしない第四のDNA配列の順である、部位特異的相同組換えを受けるように設計されたFPIC遺伝子標的ベクターによって細胞を形質転換することによって、b）上記の第二のDNA配列の陽性選択マーカー遺伝子産物の存在に関して、そして上記の第四のDNA配列の転写された非機能的配列が存在しないことに関して選択することによって、上記のFPIC遺伝子標的ベクターによって首尾よく形質転換された細胞を選択または濃縮するために細胞を増殖させることによって、およびc）陽性選択マーカーをコードする上記の第二のDNA配列を有する細胞を、機能的なタンパク質をコードしない転写された配列を表す上記の第四のDNA配列を有する細胞から分離することによって行うことができる。そのような方法にはさらに、細胞の標的DNAの改変を可能にする部位特異的相同組換え事象に関して、陽性選択マーカーをコードする第二のDNA配列を有するが、転写された配列をコードするものの機能的なタンパク質産物をコードしない第四のDNA配列を有しない上記の細胞のゲノムDNAの特徴を調べる段階が含まれうる。
【００１２】
もう一つの態様において、本発明は、FPIC遺伝子標的ベクターを利用して部位特異的相同組換えを受けた形質転換細胞を同定する方法を提供する。そのような方法は、例えば、a）ベクターが、宿主ゲノム内に存在する内因性のゲノム配列に対して実質的に相同である第一のDNA配列；転写されたヌクレオチド配列をコードするが機能的なタンパク質産物をコードせず、細胞の内因性のゲノム配列に対して相同でなく、したがって部位特異的相同組換えを受けることができない第二のDNA配列；宿主ゲノム内に存在する内因性のゲノム配列に対して実質的に相同であって、第一のDNA配列とは異なる第三のDNA配列；および陰性選択マーカーをコードして、細胞の内因性ゲノム配列に対して相同でなく、したがって部位特異的相同組換えを受けることができない第四のDNA配列を含む；ベクターが、内因性の標的配列を有する第一のDNA配列と、内因性の標的DNA配列を有する第三のDNA配列との鎖交換を通して細胞において部位特異的相同組換えを受けることができる；ならびにFPIC遺伝子標的ベクターにおけるDNA配列の構築が、標的DNA配列に対して実質的に相同な第一のDNA配列、転写された配列をコードするが機能的なタンパク質産物をコードしない第二のDNA配列、標的DNA配列に対して実質的に相同である第三のDNA配列、陰性選択マーカーをコードする第四のDNA配列の順である、部位特異的相同組換えを受けるように設計されたFPIC遺伝子標的ベクターによって細胞を形質転換することによって、b）上記の第二のDNA配列の存在に関して選択することによって、上記のFPIC遺伝子標的ベクターによって首尾よく形質転換された細胞を選択または濃縮するために細胞を増殖させることによって、ならびにc）転写された配列をコードする上記の第二のDNA配列を有する細胞を、陰性選択マーカーをコードする上記の第四のDNAを有する細胞から分離することによって、行うことができる。そのような方法にはさらに、細胞の標的DNAの改変を可能にする部位特異的相同組換え事象に関して、転写された配列を表すが機能的なタンパク質産物をコードしない第二のDNA配列を有するが、第四のDNA配列を有しない上記の細胞のゲノムDNAの特徴を調べる段階が含まれうる。
【００１３】
さらにもう一つの態様において、本発明は、FPIC遺伝子標的ベクターを利用して部位特異的相同組換えを受けた形質転換細胞を同定する方法を提供する。そのような方法は、例えば、a）ベクターが、宿主ゲノム内に存在する内因性のゲノム配列に対して実質的に相同である第一のDNA配列；転写された配列をコードするものの機能的なタンパク質をコードせず、細胞の内因性ゲノム配列に対して相同でなく、したがって部位特異的相同組換えを受けることができない第二のDNA配列；宿主ゲノム内に存在する内因性のゲノム配列に対して実質的に相同であって、第一のDNA配列とは異なる第三のDNA配列；および上記の細胞において特異的に転写された配列を表すが、機能的なタンパク質産物をコードせず、細胞の内因性ゲノム配列に対して相同でなく、したがって部位特異的相同組換えを受けることができない第四のDNA配列を含む；ベクターが、内因性の標的配列を有する第一のDNA配列と、内因性の標的DNA配列を有する第三のDNA配列との鎖交換を通して細胞において部位特異的相同組換えを受けることができる；ならびにFPIC遺伝子標的ベクターにおけるDNA配列の構築が、標的DNA配列に対して実質的に相同な第一のDNA配列、転写された配列を表すが機能的なタンパク質産物をコードしない第二のDNA配列、標的DNA配列に対して実質的に相同である第三のDNA配列、転写されるが機能的なタンパク質産物をコードしない第四のDNA配列の順である、部位特異的相同組換えを受けるように設計されたFPIC遺伝子標的ベクターによって細胞を形質転換することによって、部位特異的相同組換えを受けるように設計されたFPIC遺伝子標的ベクターによって細胞を形質転換することによって、b）機能的なタンパク質産物をコードしない転写された配列を表す第二のDNA配列の存在に関して、そして上記の第四のDNA配列からの機能的なタンパク質産物をコードしない転写された配列が存在しないことに関して選択することによって、上記のFPIC遺伝子標的ベクターによって首尾よく形質転換された細胞を選択または濃縮するために細胞を増殖させることによって、ならびにc）機能的なタンパク質産物をコードしない転写された配列を表す上記の第二のDNA配列を有する細胞を、機能的なタンパク質をコードしない転写された配列を表す上記の第四のDNA配列を有する細胞から分離することによって行うことができる。そのような方法にはさらに、細胞の標的DNAの改変を可能にする部位特異的相同組換え事象に関して、機能的なタンパク質産物をコードしない転写された配列を表す第二のDNA配列を有するが、転写された配列をコードするものの機能的なタンパク質産物をコードしない第四のDNA配列を有しない上記の細胞のゲノムDNAの特徴を調べる段階が含まれうる。
【００１４】
さらにもう一つの態様において、本発明は、FPIC遺伝子標的ベクターを利用して部位特異的相同組換えを受けた形質転換細胞を同定する方法を提供する。そのような方法は、例えば、a）ベクターが、宿主ゲノム内に存在する内因性のゲノム配列に対して実質的に相同である第一のDNA配列；転写された配列をコードするものの機能的なタンパク質産物をコードせず、細胞の内因性ゲノム配列に対して相同でなく、したがって部位特異的相同組換えを受けることができない第二のDNA配列；宿主ゲノム内に存在する内因性のゲノム配列に対して実質的に相同であって、第一のDNA配列とは異なる第三のDNA配列；および陽性選択マーカーをコードして、細胞の内因性ゲノム配列に対して相同でなく、したがって部位特異的相同組換えを受けることができない第四のDNA配列を含む；ベクターが、内因性の標的配列を有する第一のDNA配列と、内因性の標的DNA配列を有する第三のDNA配列との鎖交換を通して細胞において部位特異的相同組換えを受けることができる；ならびにFPIC遺伝子標的ベクターにおけるDNA配列の構築が、標的DNA配列に対して実質的に相同な第一のDNA配列、転写された配列を表すが機能的なタンパク質産物をコードしない第二のDNA配列、標的DNA配列に対して実質的に相同である第三のDNA配列、陽性選択マーカーをコードする第四のDNA配列の順である、部位特異的相同組換えを受けるように設計されたFPIC遺伝子標的ベクターによって細胞を形質転換することによって、b）機能的なタンパク質産物をコードしない転写された配列を表す第二のDNA配列の存在に関して、そして上記の第四のDNA配列から転写された陽性選択タンパク質産物が存在しないことに関して選択することによって、上記のFPIC遺伝子標的ベクターによって首尾よく形質転換された細胞を選択または濃縮するために細胞を増殖させることによって、ならびにc）機能的なタンパク質産物をコードしない転写された配列を表す上記の第二のDNA配列を有する細胞を、陽性選択マーカーをコードする上記の第四のDNA配列を有する細胞から分離することによって、行うことができる。そのような方法にはさらに、細胞の標的DNAの改変を可能にする部位特異的相同組換え事象に関して、機能的なタンパク質産物をコードしない転写された配列を表す第二のDNA配列を有するが、陽性選択マーカーをコードする第四のDNA配列を有しない上記の細胞のゲノムDNAの特徴を調べる段階が含まれうる。
【００１５】
本発明の目的は、内因性のヌクレオチド配列を改変する目的で真核生物のゲノムの特定の領域を標的化する部位特異的相同組換え法、およびそのような部位特異的相同組換えを特徴とする細胞およびそのような細胞を含むヒト以外の生物を提供することである。したがって、本発明のもう一つの目的は、部位特異的相同組換えを受けた細胞を選択および検出するための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、記述の方法を適用するためのベクターを提供することである。本発明のなおもう一つの目的は、細胞における特異的な非相同遺伝子標的配列の有無を同定するために核酸およびペプチド核酸（PNA）分子ビーコン（molecular beacon）プローブを提供することである。本発明のなおさらなる目的は、記述の部位特異的相同組換え法によって改変された細胞を提供することである。本発明のなおもう一つの目的は、記述の部位特異的相同組換えおよび検出法によって改変されているトランスジェニック動物および植物を提供することである。
【００１６】
したがって、本発明は、相同組換えを受けることができる細胞における部位特異的相同組換えのための単離FPIC遺伝子標的ベクターに関する。そのようなFPIC遺伝子標的ベクターには、標的細胞の細胞の内因性ゲノムDNAの特徴配列と実質的に相同であって、標的細胞において相同組換えを受けることができる第一のDNA配列；細胞の内因性のゲノム配列に対して相同ではなく、標的細胞のゲノムにおいて相同組換えを受けることができない第二のDNA配列（第二のDNA配列はさらに、上記のヌクレオチド配列を含む細胞を同定できるようにするヌクレオチド配列を含む）；細胞の内因性ゲノム配列に対して実質的に相同であって、標的細胞において相同組換えを受けることができる第三のDNA配列；および選択的に、標的細胞の細胞の内因性ゲノム配列と相同ではなく、細胞において相同組換えを受けることができない第四のDNA配列（第四のDNA配列は存在する場合、上記のDNA配列を含む細胞を、上記のヌクレオチド配列を含まない細胞から同定および分離できるようにするヌクレオチド配列をさらに含む）を含む。好ましくは、FPIC遺伝子標的ベクターにおける成分DNA配列は、以下のように5'から3'方向に結合している：細胞の内因性ゲノムDNA配列と実質的に相同である第一のDNA配列、第二のDNA配列、細胞の内因性ゲノムDNA配列と実質的に相同である第三のDNA配列、および第四のDNA配列。そのようなベクターは、部位特異的相同組換えを受けることができ、それによって細胞の内因性標的ゲノムDNA配列の改変が起こるという点において特徴を有する。
【００１７】
そのため、本発明はまた、そのようなFPIC遺伝子標的ベクターを利用して部位特異的相同組換えを受けた形質転換細胞を得る方法にも関する。そのような方法は、例えば、ベクターによる細胞の形質転換に適した条件下で、細胞を、本明細書に開示のFPIC遺伝子標的ベクターに接触させること；上記の第二のDNA配列を表す転写された配列の存在に関して、そして上記の第四のDNA配列を表す転写された配列が存在しないことに関して選択的な条件下で、ベクターに接触させた細胞を増殖させ、それによって上記のFPIC遺伝子標的ベクターによって形質転換した細胞を選択または濃縮すること；および上記の第二のDNA配列を有する細胞を上記の第四のDNAを有する細胞から分離して、それによってFPIC遺伝子標的ベクターを利用して部位特異的相同組換えを受けた形質転換細胞を得ることによって行うことができる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞の内因性ゲノム標的DNA配列の中に、部位特異的相同組換えによって改変部を導入するのに有用な遺伝子標的ベクターの開発に基づいている。したがって、遺伝子標的ベクターが、細胞を遺伝的に改変するためにこのベクターを用いる方法と同じように提供される。また、本発明に係る遺伝子標的ベクターを用いて遺伝子改変した細胞、および、このような細胞、例えば、本発明に係る標的ベクターを用いて、部位特異的な態様で、細胞に内在する一つ以上のゲノムDNA配列が遺伝子改変されている胚幹（ES）細胞などから作出される、ヒト以外のトランスジェニック生物、および、このような改変（ES）細胞から得られるヒト以外の生物も提供される。
【００１９】
本明細書において、「細胞の内因性ゲノムDNA配列」という用語は、ある細胞のゲノムの中に正常に存在する塩基配列と定義される。本明細書では、細胞の内因性ゲノムDNA配列は、本発明に係る遺伝子標的ベクターの配列と相同組換えを起こすことができ、したがって、開示されているFPIC遺伝子標的ベクターによる改変を行うための標的として利用することができる。本定義に包含される配列は、細胞のゲノムの中に存在する特定の遺伝子のコード領域または非コード領域を意味することもできる。構造遺伝子、分泌タンパク質、ホルモン、レセプター、酵素、転写因子などのタンパク質産物をコードする遺伝子が本定義に含まれる。また、これらの配列は、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー因子などの調節因子という実体を意味することもできる。細胞の内因性ゲノム標的DNA配列の構成は、通常、FPIC遺伝子標的ベクターの中に存在する特異的な配列と類似している。すなわち、部位特異的な相同組換えを起こさせるFPIC遺伝子標的ベクターの内部に存在する配列と実質的に相同な配列を含む。
【００２０】
「部位特異的相同組換え」という用語は、塩基組成が実質的に類似したDNA配列間における鎖交換乗換え事象を意味する。これらの乗換え事象は、FPIC遺伝子標的ベクターおよび細胞の内因性ゲノムDNA配列に含まれている配列の間で生じうる。さらに、一個以上の部位特異的相同組換え事象が、FPIC遺伝子標的ベクターと、細胞の内因性ゲノム配列に存在するDNA配列との間で起き、FPIC遺伝子標的ベクターに含まれるDNA配列が、細胞の内因性ゲノム配列中に存在する特定の配列を置換するという結果をもたらすことも可能である。また、単独の部位特異的相同組換え事象が、FPIC遺伝子標的ベクターと、細胞の内因性ゲノム配列に存在するDNA配列との間で起き、細胞の内因性ゲノム中の特定の位置に大部分または全部のFPIC遺伝子標的ベクターが挿入されるという挿入事象がもたらされうる。
【００２１】
「第一のDNA配列」という用語は、FPIC遺伝子標的ベクターの中に存在し、細胞に内因性のゲノム配列と実質的に相同であるDNA配列を意味する。これらの配列は、部位特異的相同組換えを起こすことができ、類似配列を含む細胞の中に導入されると、組換えを起こすと予想されている配列である。
【００２２】
「第二のDNA配列」という用語は、特定の特徴に基づいてその存在を検出することができる配列であって、細胞の標的配列とは無関係に、陽性選択マーカーの上流にあるプロモーターおよび調節因子の有無によって発現させることができるが、それが必要というわけではない配列を意味する。第二のDNA配列は、細胞の内因性ゲノムDNA配列と実質的に相同である第一と第三とのDNA配列の間に置かれる。第二のDNA配列は、細胞の内因性ゲノムDNA配列と非相同であるため、これらの配列との部位特異的相同組換えを起こすことはできない。
【００２３】
「第三のDNA配列」という用語は、FPIC遺伝子標的ベクターの中に存在し、細胞に内因性のゲノム配列と実質的に相同ではあるが、まだ差異があり、第一のDNA配列におそらく隣接しているか、適度な近傍に存在するDNA配列を意味する。これらの配列は、部位特異的相同組換えを起こすことができ、類似配列を含む細胞の中に導入されると、組換えを起こすと予想されている配列である。
【００２４】
「第四のDNA配列」という用語は、特定の特徴に基づいてその存在を検出することができる特異的配列であって、第一および第三のDNA配列の外側に位置する配列を意味する。第四のDNA配列は、それ自身のプロモーターおよび調節因子を含むため、その発現は、細胞の内因性ゲノム標的DNA配列の中に存在する調節因子とは無関係である。第四のDNA配列は、細胞の内因性ゲノムDNA配列と非相同であり、そのため、これらの配列との部位特異的相同組換えを起こすことはできない。
【００２５】
置換FPIC遺伝子標的ベクターにおいて、第一、第二、第三および第四のDNA配列は、第二のDNA配列が第一および第三のDNA配列の間に位置し、第四のDNA配列が第一または第三のDNA配列の5'側か3'側に置かれるように構成されている。図2は、部位特異的相同組換えに利用されるFPIC遺伝子標的ベクターの構成を描いたものである。
【００２６】
第四のDNA配列は、FPIC遺伝子標的ベクターに含まれる第一および第三のDNA配列の上流または下流に位置することができる。上流とは、通常、細胞に内因性のゲノム配列と同じ方向に第一および第三のDNA配列をもつベクター中の第一および第三のDNA配列の5'側を意味し、下流とは、通常、その3'側を意味する。5'側および3'側が、それぞれ第一および第三のDNA配列を意味することは明確にすべきである。この構成は、置換ベクターであることを示している。第二のDNA配列を第一および第三のDNA配列に対して転倒させ、その発現可能性を依然保持し、したがって、その存在を検出できるようにすることは可能である。さらに、FPIC遺伝子標的ベクター内の第一および第三のDNA配列の一部を、細胞内の標的DNA中の類似配列と比較して、互いに対して転倒させることも可能である。このタイプの構成は、挿入ベクターであることを示している。挿入ベクターは、通常、部位特異的相同組換えに際して、大部分のベクター配列を細胞内ゲノムの中に組み込ませる。
【００２７】
さらなる選択特徴を、第四のDNA配列とは反対側の位置に置かれた第五のDNA配列によって表すことができる。「反対側」という用語は、第一または第三のDNA配列いずれかの外側であって、これらの配列の反対側の位置、すなわち、第四のDNA配列によってコードされる陽性マーカーに対して5'側または3'側のいずれかを意味する。
【００２８】
挿入FPIC遺伝子標的ベクターにおいては、ベクターを直鎖化すると、第一の配列に対して第三の配列が逆の5'から3'方向になるよう、第一、第二、および第三の配列が構成されている。この逆方向によって、FPIC遺伝子標的ベクターと細胞の内因性ゲノムDNA配列との間で部位特異的相同組換えが起こる場合に、ベクターを部位特異的な位置に挿入することが可能になる。大抵の場合、ベクター全体が挿入され、実質的に相同なDNA配列部分が複製される。第四のDNA配列コードは、FPIC遺伝子標的ベクター中に含まれうるが、含まれていなくてもよい。
【００２９】
FPIC遺伝子標的ベクターの長さは、陽性選択マーカーの選択、転写されるが、機能的なタンパク質産物をコードしない塩基配列の選択、第二のDNA配列によってコードされる陽性選択マーカーを発現させることができるプロモーターの有無、適当な相同組換えに必要とされる第一および第三のDNA配列の長さ、基本ベクターのサイズ、および、アンピシリン耐性など、細菌においてプラスミドベクターを選択するために何を選ぶかによって、ならびにプラスミド骨格の複製開始点のサイズによって異なる。しかし、既知のプラスミドおよび陽性選択マーカーのサイズに基づいて、ベクター全体で、少なくとも数キロ塩基対の長さになると合理的に推定される。
【００３０】
本明細書において、「分子ビーコン」という用語は、細胞の中に存在する特異的な塩基配列を同定するためのプローブと定義される。この分子ビーコンは、DNAまたはRNAなどの塩基配列だけからなることもあり、または、ペプチドと核酸（PNA）複合体からなることもある。分子ビーコンが特異的塩基配列に結合すると、インビトロまたはインビボいずれかにおいて、これらの配列の存在を同定することが可能になる。
【００３１】
本明細書において、「機能的」という用語は、陽性選択マーカーについて、陽性選択マーカーをコードするDNAを含む細胞の検出および単離を可能にし、また、これらの細胞を、陽性選択マーカーを含まない細胞、または転写されるが機能的なタンパク質をコードしていない配列を含む細胞から区別するのを可能にする能力をマーカーに付与することと定義される。細胞内における陽性選択マーカーの存在を検出するために、複数の選択薬剤を利用することができる。これらは、G418、ヒポキサンチン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、およびブラストサイジンなどであるが、これらに限定されず、例えば、表1に列挙されている。さらに、マーカーの存在を同定するために薬剤の添加を必要としない陽性選択マーカーも、それらの選択マーカーを含む細胞を、別の選択マーカーを含む細胞、または選択マーカーを含まない細胞から単離することが可能であれば、機能的であると考えられる。いくつかの例として、蛍光タンパク質であるGFP、CFP、YFP、RFP、dsRED、およびHcREDなどがあるが、これらに限定されず、表1にも列挙されている。
【００３２】
（表１）FPIC遺伝子標的ベクターにおいて利用される陽性選択マーカー
2005511050.tif 000002
【００３３】
FPIC遺伝子標的ベクターは、宿主ゲノムの領域に実質的に相同的なDNA配列1および3という2つの相同領域を含む。典型的には、ベクターは、約50塩基対から50,000塩基対の第一および第三のDNA配列に対して相同性を示す長さを有する。また、陽性選択マーカー、陰性選択マーカー、または転写されるが機能的なタンパク質をコードしない配列をコードし、FPIC遺伝子標的ベクター組込み配列、およびその一部が宿主ゲノム中に存在するか否かを同定することを可能にするDNA配列2および4も含む。第二のDNA配列は、例えばシアン蛍光タンパク質（CFP）などの陽性選択マーカーをコードすることができ、2つの相同領域の間に置かれると、部位特異的相同組換えが起きて宿主ゲノムに組込まれる配列の中に含まれることになる。理想的には、第四のDNA配列が、転写されても機能的なタンパク質をコードしない場合には、第二のDNA配列が陽性選択マーカーをコードする。第二のDNA配列が陽性選択マーカーをコードする場合には、第四のDNA配列は、転写される配列であるが、機能的なタンパク質をコードしない配列であり、相同性領域の外側に置かれるため、相同組換えの際に宿主ゲノムの中には取り込まれない。または、第二のDNA配列が、転写される配列であるが機能的なタンパク質をコードしない配列であるときは、第四のDNA配列が陽性選択マーカーをコードする。また、第二のDNA配列が、転写されても機能的なタンパク質をコードしない配列であり、第四のDNA配列が陰性選択マーカーであることも可能である。さらに、第二および第四のDNA配列双方は、転写されても機能的なタンパク質をコードしない配列であることも可能である。選択プロセスは、顕微鏡下、または、第二のDNA配列を含む細胞を、第四のDNA配列を含む細胞から同時に分別単離することができるFACS細胞選別装置によって細胞を選別する過程を含む。これらの細胞の同定には、蛍光または別の方法によって陽性選択マーカーを検出すること、および、細胞内にある特異的な転写配列を同定する分子ビーコン技術を応用して、転写される配列であるが機能的なタンパク質をコードしない配列を検出することが含まれる。次に、組織培養で細胞を増殖させ、正確な部位特異的相同組換えによる遺伝子ターゲティング事象が起きたものを遺伝子判定することができる。相同組換えを起こした細胞を単離するために、分子ビーコン技術に適した転写配列と一緒に陽性選択マーカーを利用することは、現存の遺伝子ターゲティング法に対する実質的な改良法をもたらすことになる。
【００３４】
本発明に係る方法において利用されるFPIC遺伝子標的ベクターは、第二のDNA配列が2つの相同性領域の間に機能的に置かれ、また、第四のDNA配列が2つの相同性領域の外側または外部に機能的に置かれるよう構成されている。部位特異的相同組換えを起こしうるゲノムの内在性領域であるエキソン配列またはコード配列を破壊または置換し、それによって内因性の遺伝子座が不活性化、すなわち非機能化するように第二のDNA配列を位置させることが可能である。
【００３５】
一つの局面において、イントロン、エキソンの非翻訳領域、またはプロモーターなどの調節領域のような、エキソン配列またはコード配列とはならないゲノム領域の中に置換または挿入されるように、第二のDNA配列を位置させることができる。このシナリオでは、特定の遺伝子座を不活性化することなく、その遺伝子座で部位特異的相同組換えを起こした細胞を選択できる。
【００３６】
別の局面において、第二のDNA配列は、その配列に固有の調節因子を含み、部位特異的組換えのために選ばれたゲノム領域の中に新規の調節因子が導入されるように置かれることも可能である。本発明は、部位特異的相同組換えを行ない、次に、組換えを起こした細胞を同定する目的で記載されているFPIC遺伝子標的ベクターを含む。
【００３７】
また、本発明は、FPIC遺伝子標的ベクター、および本明細書に記載されている同定方法によって部位特異的相同組換えを起こした細胞も含む。さらに、本発明は、FPIC遺伝子標的ベクターおよび本明細書記載の方法を用いて部位特異的相同組換えを起こした細胞から得られた、ヒト以外のトランスジェニック動物を含む。
【００３８】
また、FPIC遺伝子標的ベクターおよび本明細書記載の方法を用いて部位特異的相同組換えを起こした細胞から得られた、トランスジェニック植物も含まれる。以前から、植物は、陽性-陰性選択による遺伝子ターゲティングだけでなく、部位特異的相同組換えを起こすことが実証されているため、FPIC遺伝子標的ベクターおよび本明細書記載の方法を実施することができる（Siebertら、（2002）、Plant Cell, 14, 1121; Haninら、（2001）、Plant J., 28, 671; Xiaohuiら、（2001）、Gene, 272, 249）。
【００３９】
本発明記載の方法において、宿主細胞のゲノム内への大部分のベクターの組込みは、本質的に無作為な形式で起こり、ゲノムの特定の領域に対する選択性はない。しかし、当然、第一のDNAベクターの一定割合が、部位特異的相同組換えによって宿主細胞のゲノムの中に組み込まれることが示唆されている。その後、細胞を選択することによって、うまく部位特異的相同組換えを起こした細胞を単離・同定することができる。この選択は、FPIC遺伝子標的ベクターの構成および組成に基づくものである。FPIC遺伝子標的ベクターは、宿主ゲノムの領域に実質的に相同的なDNA配列1および3という2つの相同領域を含む。また、FPIC遺伝子標的ベクター組込み配列、およびその一部が宿主ゲノム中に存在するか否かの同定を可能にするDNA配列2、および選択的にDNA配列4も含む。第二のDNA配列は2つの相同領域の間に置かれ、部位特異的相同組換えが起きて宿主ゲノムに組込まれる配列の中に含まれることになる。選択プロセスは、顕微鏡下、または、第二のDNA配列を含む細胞を第四のDNA配列を含む細胞から同時に分別単離することができるFACS細胞選別装置によって細胞を選別する過程を含む。そして、組織培養で細胞を増殖させ、正確な部位特異的相同組換えによる遺伝子ターゲティング事象が起きたものを遺伝子判定することができる。
【００４０】
本発明に係るFPIC遺伝子標的ベクター法は、第二のDNA配列が2つの相同性領域の間に機能的に置かれるよう構成されている。また、部位特異的相同組換えを起こしうるゲノムの内因性領域であるエキソン配列またはコード配列を破壊または置換し、それによって内因性の遺伝子座が不活性化、すなわち非機能化するように第二のDNA配列を位置させることも可能である。
【００４１】
第二のDNA配列は、イントロン、エキソンの非翻訳領域、またはプロモーターなどの調節領域のような、エキソン配列またはコード配列とはならないゲノム領域の中に置換または挿入されるように置くことができる。このシナリオでは、特定の遺伝子座を不活性化することなく、その遺伝子座で部位特異的相同組換えを起こした細胞を選択できる。
【００４２】
第三のシナリオでは、第二のDNA配列を、その配列に固有の調節因子を含み、部位特異的組換えのために選択されたゲノム領域の中に新規の調節因子が導入されるように置くことも可能である。
【００４３】
第二および第四のDNA配列の配列構成は、通常、細胞の内因性ゲノムDNA配列に非相同的であり、そのため、部位特異的相同組換えを起こすことができない。したがって、部位特異的相同組換えはすべて、細胞の内因性ゲノムDNA配列に実質的に相同な領域をコードし、そのため、鎖交換乗換えプロセスを起こすことができる第一および第三のDNA配列によるものである。さらに、第二および第四のDNA配列は、互いに対し、ならびに細胞の内因性ゲノムDNA配列に対しても、方向に関係なく置くことができる。しかし、第二のDNA配列をこのように置くには、細胞の内因性ゲノムDNA調節因子とは無関係に、これらの配列が転写されることが必要である。
【００４４】
FPIC遺伝子標的ベクターで使用するための好適な陽性選択マーカーが多数存在する（表1参照）。これらの配列は、陽性選択マーカーを持つ細胞を選択して、該細胞を、陽性選択マーカーを持たない細胞から区別することを可能にする。最も広く利用されている陽性選択マーカーであって、第二のDNA配列として利用されるものは、おそらく、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物をコードする。第二のDNA配列として適当な別の陽性選択マーカーには、ブラストサイジン耐性、ピューロマイシン耐性、ブレオマイシン耐性、およびハイグロマイシン、ピューロマイシン耐性をコードするものがあるが、これらに限定されるものではない。これら陽性選択マーカーのいくつかは、植物における部位特異的相同組換えのためにFPIC遺伝子標的ベクターを使用するときに利用することもできる。
【００４５】
「陰性選択マーカー」という用語には、細胞の中、または細胞の近傍に導入されると、細胞殺傷作用によって通常の集団から細胞を除去することが可能になる特定の遺伝子、DNA配列、タンパク質、ペプチド、またはアミノ酸配列が含まれる。「陰性選択」という用語は、該細胞を死滅させる方法を実施して、細胞に対する選択を行なうことを意味する。多数の陰性選択マーカーを用いて、部位特異的相同組換えを起した細胞を同定できるように増幅または濃縮することができる。これらには、チミジンキナーゼ、ジフテリア毒素A鎖、hprtおよびgptなどがある。表2を参照のこと。
【００４６】
（表２）同時形質転換法において使用される陰性選択マーカー
2005511050.tif 000003
【００４７】
本明細書において、「変異DNA配列」とは、細胞の内因性ゲノムDNA配列の塩基組成を変更する配列を意味する。このような変更は、細胞DNA配列の機能的能力の不活性化をもたらすことがある。また、このような変化は、細胞DNA配列の機能的能力を増強したり、または細胞DNA配列の機能的能力に影響しないこともある。
【００４８】
本明細書において、「変異したDNA配列」とは、FPIC遺伝子標的ベクターの使用によって変化を起こした細胞の内因性ゲノムDNA配列のことを言う。変異したDNA配列は、FPIC遺伝子標的ベクターと細胞の内因性ゲノムDNA配列との間で部位特異的相同組換えが起きるときに生じると一般的には考えられている。「変異した標的細胞」は、部位特異的相同組換えを起こすことができる細胞であって、本明細書に開示されているようなFPIC遺伝子標的ベクターに存在する変異DNA配列を利用することによって、細胞のゲノム内に作り出された変異したDNA配列を有する。
【００４９】
本明細書において、「実質的に非相同なDNA」または「実質的に相同なDNAではない」という用語は、DNA配列を標的として、部位特異的相同組換えのプロセスを引き起こすのに十分な程度に類似した塩基配列を含まないDNA配列を意味する。このような非類似配列は、2つの配列の間の塩基対構成にミスマッチがあるため、標的DNA配列との間で部位特異的相同組換えを起こすことができない。
【００５０】
細胞ゲノムの中に変異したDNA配列を確立する応用上の利点はいくつかある。FPIC遺伝子標的ベクターが標的とする特定の細胞型が雄性由来である場合、組織培養において例えばX染色体連鎖遺伝子の機能的関連性を分析することができる。さらに、FPIC遺伝子標的ベクターによって胚性幹細胞を操作すると、ヒトの疾患を研究するための動物モデルを作出することが可能になることがある。陽性選択技術により、マウスの胚性幹細胞の中で、例えばp53遺伝子座がうまく不活性化されており、この遺伝子座によってコードされるタンパク質産物に欠損をもつマウスを作出するためにこれらの細胞が利用されている（Donehowerら、（1992）、Nature, 326, 215）。これらのマウスは、発達上は正常であるが、自然発生癌に対し感受性である。FPIC遺伝子標的ベクターと技術は、該細胞から作出された胚性幹細胞および動物において同様の遺伝子改変が起こすことができる。FPIC遺伝子標的ベクターと技術のこの他の利用法には、さまざまな細胞上および生理学的な事象を研究できるようにする機能獲得型対立遺伝子を作出することなどがある。c-myc、サイクリンD1およびErbB-2など、多くの原癌遺伝子が機能獲得型対立遺伝子として解析されてきた（総説として、Hutchinsonら、(2000), Oncogene, 19, 130を参照）。FPIC遺伝子標的ベクターおよび本明細書記載の方法を用いることによって、これらの細胞に由来する胚性幹細胞およびトランスジェニック動物において機能喪失型および機能獲得型の研究を効率的に行なうことができるようになる。
【００５１】
ベクターと細胞の内因性ゲノム標的配列の間で部位特異的相同組換えを起こした細胞を作出および同定する目的で、FPIC遺伝子標的ベクターおよび方法が利用される。このプロセスを経た細胞を同定するためにベクターを実質的に濃縮する。「実質的に濃縮」するとは、ベクターと細胞のDNA配列との間で部位特異的相同組換えが起きた細胞を同定する可能性を実質的に高めることができることを意味する。可能性の有意な上昇とは、非特異的な挿入または組込事象に較べて、相同組換え事象が少なくとも2倍、好ましくは少なくとも10倍、より好ましくは少なくとも100倍、さらに好ましくは少なくとも10,000倍に増加することである。FPIC遺伝子標的ベクターを使用することによって得られた、実質的に濃縮された細胞集団は、約1％、より好ましくは10％、さらに好ましくは99％の単離細胞であって、FPIC遺伝子標的ベクターと細胞の内因性ゲノム標的配列との間で部位特異的相同組換えを起こしている細胞を含む。
【００５２】
FPIC遺伝子標的ベクターによって標的される特定遺伝子に内因性の調節因子の制御下で第二のDNA配列の転写が行われるように設計することができる。そのような場合、ベクターは、第二のDNA配列が、その配列を転写させるのに十分な上流因子を持たないように設計する。FPIC遺伝子標的ベクターと細胞に内因性の標的配列との間の相同組換えによって、標的遺伝子に特異的で、第二のDNA配列を転写させる調節因子が提供される。第二のDNA配列は、ほとんどの場合、部位特異的相同組換えが起こらなければ転写されず、それによって、これらの配列を転写させるのに十分な内因性の細胞性調節因子を提供する。このようなベクターの構成の実例は、第二のDNA配列を、細胞の内因性ゲノム標的DNAに実質的に相同で、プロモーターと5'側非翻訳領域を含む第一のDNA配列と、細胞の内因性ゲノム標的DNAに実質的に相同で、イントロンの一部と下流エキソンを含む第三のDNA配列との間に置くことである。FPIC遺伝子標的ベクターと細胞の内因性ゲノム標的配列との間の部位特異的相同組換えの結果、第二のDNA配列が、内因性調節因子の制御下に置かれるようになる。
【００５３】
改変のために標的となる遺伝子の機能について多数の表現型をもたらすことのできる、第二のDNA配列を置くためのさまざまなシナリオが考えられる。例えば、内因性の遺伝子座を破壊することなく、FPIC遺伝子標的ベクターと細胞の内因性ゲノム標的配列との間で部位特異的相同組換えを行わせることができる。これは、宿主細胞のゲノムの中に第二のDNA配列を導入しても調節配列、エキソン配列、またはコード配列を破壊しないように、イントロンまたは非コード領域の中に第二のDNA配列を置くことによって遂行される。このようなベクターの構成例は、細胞の内因性ゲノム標的DNAに実質的に相同であって、エキソンとイントロンの一部を含む第一のDNA配列と、細胞の内因性ゲノム標的DNAに実質的に相同であって、イントロンと下流のエキソンを含む第三のDNA配列との間に第二のDNA配列を置くことである。そして、FPIC遺伝子標的ベクターと細胞の内因性ゲノム標的配列との間の部位特異的相同組換えの結果、イントロンの中に陽性選択マーカーが置かれ、したがって、エキソンをコードする重要な配列を破壊しないですむ。必要なのは、第二のDNA配列が、FPIC遺伝子標的ベクターの中に存在する調節因子の制御下に置かれなければならないことである。
【００５４】
変異DNA配列を、部位特異的相同組換えを起こすことができる標的細胞のゲノムの中に導入することは、機能喪失型または機能獲得型の対立遺伝子の作出に限定されない。例えば、部位特異的相同組換えによる標的となる、具体的な細胞に内因性の遺伝子座を発現させる目的で、内因性の調節配列を、FPIC遺伝子標的ベクターによって標的とされる細胞から作出される細胞またはトランスジェニック動物もしくは植物の中にある新規の組織特異的および/または細胞型特異的な領域に導入することも可能である。この目的のために、FPIC遺伝子標的のためのベクターと方法を使用することによって、部位特異的相同組換えを起こすことができる、実質的にすべての遺伝子の空間的および時間的な発現パターンを支配または調節することができるようになる。本明細書に記載されている技術のこの目的での応用例は、原癌遺伝子のc-mycをコードする配列の上流にあるPit-1遺伝子座に由来するプロモーターおよび調節因子を導入することである。このようなシナリオによって、発達中の下垂体、および成人の下垂体の成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞（lactotrope）、および甲状腺刺激ホルモン産生細胞の異所発現を可能にし、甲状腺における腫瘍形成のモデルを提供する（Rhodesら（1996）、Mol. Cell Endocrinol., 124, 163; Baxterら、（2001）、75, 9790）。表3は、FPIC遺伝子ターゲティング法により内因性の遺伝子座を発現させるのに利用できる特徴的な調節配列のいくつかを列挙したものである。
【００５５】
（表３）調節因子の例
2005511050.tif 000004
【００５６】
部位特異的相同組換えを起こすことができる細胞型は、細胞の内因性ゲノムDNA配列を変異させるために、FPIC遺伝子標的ベクターおよびその方法によって操作することができる。部位特異的相同組換えを起こすことができる細胞は、ヒト、マウス、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、イヌおよびネコなどであるが、これらに限定されない多様な生物および生物種から得ることができる。一般的には、FPIC遺伝子標的ベクターおよびその方法によって、細胞の内因性ゲノムDNAの中に変異したDNAを作出するために、部位特異的相同組換えを起こすことができる真核細胞をうまく標的とすることができる。
【００５７】
FPIC遺伝子標的ベクターとその方法、または同時形質転換法を利用することによって作出された改変を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を作出することが望まれる場合には、好適な細胞型は胚性幹細胞である。これらの細胞は、通常、移植前胚の内部細胞塊から得られ、遺伝子操作用の組織培養で増殖させる。FPIC遺伝子標的ベクターとその方法によって細胞の内因性ゲノムDNA配列を変異させるには、マイクロインジェクション技術によって胚盤胞の中に細胞を導入し、この胚盤胞を偽妊娠した雌の宿主に移植する（Hoganら、（編）（1994）、「マウス胚の操作、実験マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo, A laboratory manual）」、コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク）。または、遺伝子改変した幹細胞を含む胚を作出するために桑実胚凝集法（morula aggregation method）を行うことができる（Kongら（2000）、Lab. Anim., 29, 25）。出生後段階を経て生存する胚は、しばしば、ある割合の細胞が胚盤胞に由来し、ある割合の細胞は、FPIC遺伝子標的ベクターとその方法によって変異した細胞に由来するというキメラ細胞含有を示す。その後、FPIC遺伝子標的ベクターとその方法によって変異した対立遺伝子についてヘテロ接合およびホモ接合になるまで、キメラ動物を飼育することができる。
【００５８】
ヒトにおける特定の遺伝子の欠陥を修正するために、本明細書記載のFPIC遺伝子ターゲティング法を利用することができる。例えば、FPIC遺伝子標的ベクターと細胞の内因性ゲノムDNA配列との間の部位特異的相同組換えによってヒト幹細胞の中に変異したDNA配列を作出し、その後、特定の遺伝子疾患を矯正するか、特定の遺伝子産物を補うために、それらの細胞を患者に移植する。遺伝子不活性化のための可能な別の使用法は、細胞表面上にあるタンパク性のレセプターを破壊することである。例えば、ウイルスのレセプターと推定されるレセプターの発現が適当なFPIC遺伝子標的ベクターを用いて破壊されている培養細胞株または生物を、ウイルスを用いて測定し、そのレセプターが実際にウイルス感染に関与していることを確認することができる。さらに、適当なFPIC遺伝子標的ベクターを用いて、特定の遺伝子欠損に関するトランスジェニック動物モデルを作成することができる。例えば、多くの遺伝子欠損は、例えば、アルファサラセミアおよびベータサラセミア、血友病、ゴーシェ病およびα1-アンチトリプシンの産生に影響を与える欠損、ADA、PNP、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症、ならびに網膜芽細胞腫のように、特定の遺伝子が機能的遺伝子産物を発現できないということで特徴づけられている。このような病状に関連する対立遺伝子の一方または両方が破壊されているか、特定の遺伝子欠損をコードするように改変されているトランスジェニック動物を、治療用のモデルとして用いることができる。出生時に生存能力のあるこれらの動物に対して、実験的な治療法を施すことができる。しかし、遺伝子欠損が生存に影響を及ぼすときには、トランスジェニック動物の適当な世代（例えばF0、F1）を用いて、遺伝子治療のためにインビボ技術を研究することができる。
【００５９】
FPIC遺伝子標的ベクターは、部位特異的相同組換えを起こすことのできる細胞の内因性ゲノムDNA中のDNA配列を変異させるという特定の目的のために設計されている。FPIC遺伝子標的ベクターの構成要素には、細胞の内因性ゲノムDNA配列に実質的に相同なDNA領域を少なくとも一つ、これらの配列を含んでいない細胞からこれらの配列を含んでいる細胞を同定する能力を与えることができる一個のDNA配列、これらの配列を含んでいない細胞からこれらの配列を含んでいる細胞を同定および分離することを可能にする別の少なくとも一つのDNA配列などがある（図3）。
【００６０】
さらに、直鎖状のベクターは、環状のものよりも有意に高い標的導入頻度を示すので、細胞の内因性ゲノムDNA配列を変異させる目的で細胞内に導入する前にFPIC遺伝子標的ベクターを直鎖化することが好ましい（Thomasら、（1986）、Cell, 44, 49）。しかし、これらの目的のために、直鎖化せずにFPIC遺伝子標的ベクターをうまく利用することも可能である。
【００６１】
さまざまな対立遺伝子を標的とする目的で、第二および第四のDNA配列、特に、置換ベクターにおける2つの実質的に相同な領域の間に置かれた第二のDNA配列を転写させるために、さまざまな調節因子を利用することができる。陽性マーカーの発現に影響を与えうるか、部位特異的相同組換えのプロセスに影響を与えうるヘテロクロマチン構成または隣接する調節因子のせいでその転写レベルに敏感な第二および第四のDNA配列の転写レベルを操作することによって、うまく標的となりうる。表4には、本発明において利用することができる、より一般的な調節領域が列挙されている。
【００６２】
（表４）選択マーカーの発現を誘導するために使用される調節領域
2005511050.tif 000005
【００６３】
部位特異的相同組換えを成功させるのに必要なFPIC遺伝子標的ベクターの長さは、変異したDNA配列を作出するために標的となる具体的な遺伝子にしばしば依存する重要なパラメータである。ベクターの長さはいくつかの要素によって決まる。転写または発現されるDNA配列、陽性または陰性の選択マーカーが異なると配列の構成も変わるため、第二および第四のDNA配列を表すDNA配列の選択が全体のベクターの長さに影響を与える。また、置換ベクターでは、細胞の内因性ゲノムDNA配列に実質的に相同な2つの配列である第一および第三のDNA配列の長さが、遺伝子ターゲティングに成功するために正しく取り組まれなければならない重大なパラメータである。一般的に、一つの相同性領域は25 bpまで短くすることができる（Ayaresら（1986）、Genetics, 83, 5199）が、これよりも著しく長い相同性領域を使用することが推奨されている。ある程度の長さまでは、FPIC遺伝子標的ベクターで提供される相同性の程度が高くなると、標的導入効率が高くなる（Zhangら（1994）、Mol. Cell Biol., 14, 2404）。ほとんどの場合、ベクターの全長は最低でも1 kbで、通常、最大で500 kbを超えることはないが、但し、ベクターの長さは、ベクターを構築するのに用いられた技術にも依存する。例えば、実質的に相同な2つの領域を提供するものとしてコスミド、BAC、またはYACを用いてFPIC遺伝子標的ベクターを構築し、それによって相当に大きなベクターを作出することが可能である（Ananvoranichら（1997）、Bio Technologies, 23, 812; Coccbiaら（2000）、Nucleic Acids Res., 28, E81）。また、ベクターの長さには、ベクターによって細胞を形質転換する前に除去されない限り、複製開始点、および、アンピシリンなど、細菌の薬剤耐性産物をコードする配列のような、プラスミドの基本的配列も含まれる。
【００６４】
変異したDNA配列を細胞標的の中で作出するため細胞の内因性ゲノムDNA配列に実質的に相同で部位特異的相同組換えを起こすというFPIC遺伝子標的ベクターのDNA配列は、細胞内の対応配列に対して有意に高い相同性をもつことが好ましい。高い相同性があると、部位特異的相同組換えの乗換えおよび鎖交換の過程において効率的な塩基対合が可能になる。FPIC遺伝子標的DNA配列と細胞のDNA配列との間にミスマッチ塩基対合があると相同組換えができにくくなる。例えば、FPIC標的遺伝子置換ベクターにおける第一および第三のDNA配列は、細胞の内因性ゲノムDNA配列に100％相同であることが好ましく、80％相同であるというのはあまり好ましくない。50％相同であるというのはさらに好ましくない。第二および第四のDNA配列は、細胞の内因性ゲノムDNA配列と非相同であるため、これらの配列と部位特異的組換えを起こすことはない。
【００６５】
一定の場合には、FPIC遺伝子標的ベクターと細胞の内因性ゲノムDNA配列との間で部位特異的相同組換えを起こすに当たって、細胞のゲノムに組み込まれているDNA配列を除去することが有利なことがある。これは、これらの配列の発現が負の効果を与える可能性があり、細胞や生物の生存力や生存率を失わせる可能性があるからである。または、宿主細胞のゲノムの中に導入された調節因子が、これらの因子と隣り合って並んでいる内因性の遺伝子座の発現に有害な作用を与える可能性がある。宿主ゲノムから配列を除去することは、いくつかの方法によって可能である。Cre-Lox技術は、FPIC遺伝子標的ベクターとその方法によって細胞の内因性ゲノムDNAに導入された特異的な配列を除去するためにうまく応用することができる（Cre-Loxについての概説は、Rydingら（2001）、J. Endocrinol., 171, 1）。例えば、細胞を形質転換する前に予め、陽性選択マーカーとそれに対応する調節因子をコードする配列を、FPIC遺伝子標的ベクターの中でlox P組換え部位の近傍に置くことができる。これらの配列を宿主細胞のゲノムの中に導入した後、Creリコンビナーゼを一過的または安定的に発現させて、lox P部位一個と、lox P部位の間に位置する配列すべてを除去することができる。配列を除去するためにCre-Lox技術を応用した例が多数ある。Kaartineらは、16細胞期の桑実胚にアデノウイルスを感染させてCreを一過的に発現させることによって、lox P部位の近傍にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼカセットを除去できることを実証した（Kaartineら（2001）、Genesis, 31, 126）。Xuらは、EIIaプロモーターの調節下でCreを発現するマウスとの交配によって、また、Cre-発現プラスミドもつカセットを含む細胞を前核注入することによって、lox Pの近傍にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼカセットを除去することに成功した（Xuら（2001）、 Genesis, 30, 1）。このように、ヒトの遺伝子治療などのために細胞の欠陥エキソン配列を置換または修正するよう、FPIC遺伝子標的ベクターを設計すれば、FPIC遺伝子標的ベクターと宿主DNAとの間で部位特異的相同組換えを完了させた後に、第二のDNA配列の転写された配列と対応する調節因子を除去することができる。
【００６６】
本明細書に開示されているFPIC遺伝子標的ベクターおよびその方法は、植物においてDNA配列を変異させる目的で利用することもできる。実際、植物系統において相同組換えを行なった例がいくつか存在している（Siebertら（2002）、 Plant Cell, 14, 1121、および概説として、Schaefer (2002), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 53, 477を参照のこと）。また、相同組換えは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座およびプロトポルフィリンオキシダーゼ（PPO）遺伝子座など、いくつかの植物遺伝子座を標的として陽性-陰性選択技術を用いて利用されてきた（Xiaohuiら、（2001）, Gene, 272, 249; Haninら、（2001）、 Plant J., 28, 671）。FPIC遺伝子ターゲティング技術を実施して部位特異的相同組換えにより変異したDNA配列を作出するために利用できる耐性マーカーは数多くあると想定されている。それらには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および植物細胞の中に導入されると陽性選択できる特性を示すことができる除草剤または殺虫剤に対する耐性などがある。FPIC遺伝子標的ベクターとその方法を利用して作出される、植物における変異は、外因性の調節因子を導入することによる機能喪失、機能獲得、または内因性の遺伝子座の発現量の変更に及ぶ。機能喪失型または機能獲得型の変異は、特異的な内因性DNA配列の除去、または、特定の植物遺伝子によってコードされているアミノ酸組成を変化させることによって作出することができる。さらに、FPIC遺伝子標的ベクターとその方法を用いて外因性遺伝子またはコード領域を内因性遺伝子座に導入することによって、「ノックイン（knock-in）」実験を植物中で行なうことができる。
【００６７】
植物細胞へのFPIC遺伝子標的ベクターの導入は、プロトプラストの中に外因性DNAを挿入するために以前に開発された方法など、さまざまな方法によって行なうことができる（Hainら（1985）、 Mol. Gen. Genet., 199, 161; Negrutiuら（1987）、 Plant Mol. Biol., 8, 363; Paszkowskiら（1984）、 EMBO J., 3, 2717）。マイクロインジェクションによっても、FPIC遺伝子標的ベクターを植物細胞の中にうまく導入することが可能である（De la Penaら（1987）, Nature, 325, 274; Crosswayら（1986）、Mol. Gen. Genet., 202, 179）。さらに、リポソームによる形質転換によって、FPIC遺伝子標的ベクターを植物細胞の中に導入することも可能である（Deshayesら（1985）、EMBO J., 4, 2731）。植物細胞へのFPIC遺伝子標的ベクターの導入に成功すると、部位特異的相同組換えによって、FPIC遺伝子標的ベクターの構造および構成に従って細胞の内因性ゲノムDNA配列の変異が可能になる。
【００６８】
本発明に記載されている細胞分離方法には、FACStar Plus（商標）の細胞選別装置を利用する細胞選別法や手作業による分離技術があるが、本発明は、この装置またはこれらの分離技術に限定されるものではない（図1）。他の固有なDNA配列の発現に対して特異的なDNA配列を発現する細胞を効果的に分離するために別の細胞選別装置を提供することもできる。それらには、FACS Vantages SE I、およびFACS Vantages SE II、または、本発明に記載されている方法に基づいて細胞を選別することができる装置があるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
一定の場合、細胞の中に特異的な塩基配列が存在するか否かを検出する方法は、分子ビーコンの使用を含む。分子ビーコンは、インビトロおよび/またはインビボで特異的な塩基配列に結合する核酸またはペプチドと核酸の複合体である。分子ビーコンが標的塩基配列に結合すると、分子ビーコンの設計に応じた特異的波長の発光がしばしば起きる（Tyagiら（1996）、Nature Biotechnol., 14, 303; Tyagiら（1998）、Nature Biotechnol., 16, 49; Vetら（1999）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 6394; Kostrikisら（1998）、Science, 279, 1228）。分子ビーコンは、典型的には、2本の相補的なアーム配列の中に埋め込まれた標的塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチド配列からなる。別のタイプの分子ビーコンは、さらに安定性を増すためにしばしばタンパク質またはアミノ酸の配列に結合したものを含む。EDANSなどのフルオロフォアが5'側リン酸基に結合しており、DABCYLなどの消光因子が3'側水酸基に結合している。さまざまなフルオロフォアとDABCYLによるその消光効率を表5に一覧した。分子ビーコン配列が標的配列に結合すると、消光因子とフルオロフォアが離れることによって、特定の波長の蛍光を発生することができる。インビトロまたはインビボで特異的な標的塩基配列の有無を効率的に同定することを可能にするのは蛍光である。SybGreen（商標）マーカーに結合しているものなど、色素に結合した分子ビーコンプローブも利用できる。
【００７０】
（表５）分子ビーコンにおける、DABCYLによるさまざまなフルオロフォアの消光
2005511050.tif 000006
【００７１】
分子ビーコン技術は、生細胞中の特異的な塩基配列の同定に応用することができる。生細胞の中に分子ビーコンを導入するために、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびリン酸カルシウム沈殿法が用いられ、成功している（Matsuo, (1998), Biochim. Biophys. Acta, 1379, 178; Sazaniら、(2001), Nucleic Acids Res., 29, 3965; Doyleら（2001）、40, 53; Dirksら（2001）、Histochem. Cell Biol., 115, 3）。FPIC遺伝子ターゲティング法では、細胞に存在する特異的な塩基配列を同定するために細胞の中に分子ビーコンをうまく導入するこれらの方法の一つまたはすべてを用いることができる。
【００７２】
FPIC遺伝子ターゲティング法では、第二のDNA配列を含む、形質転換された標的細胞を選択するためにFPIC遺伝子標的ベクターが使用される。このような選択法は、相同組換えが起き、形質転換された標的細胞を実質的に濃縮する。本明細書において、「実質的な濃縮」とは、相同的形質転換体対非相同的形質転換体の比率と較べて、形質転換された標的細胞が、すなわち、形質転換細胞に対する形質転換標的細胞の割合が、少なくとも2倍に濃縮され、好ましくは10倍に濃縮され、より好ましくは100倍に濃縮され、さらに好ましくは10,000倍に濃縮されることを意味する。場合によっては、ランダムな組込みに対する相同組換えの比率が、1000対1という桁数になることもあり、10,000個の形質転換細胞のうち1個しかないという場合もある。FPIC遺伝子標的ベクターと本発明の方法によって得られる実質的な濃縮は、得られた細胞集団の約1％、また、好ましくは約20％、また、より好ましくは約95％が、FPIC遺伝子標的ベクターが相同的に組み込まれた形質転換標的細胞を含む細胞集団をしばしば生じさせる。以後、このように実質的に濃縮された形質転換標的細胞集団をその後の遺伝子操作、細胞培養実験、またはトランスジェニック動物もしくは植物などのトランスジェニック生物の作製に用いることができる。
【００７３】
以下に理論的な例を実施例として提示するが、それらは本発明の範囲を制約するものと解すべきではない。
【００７４】
実施例1
FPIC遺伝子標的ベクターを用いた、ES細胞におけるptch2遺伝子座の不活性化
1．ptch2標的ベクターの構築
ptch2は、膜貫通ドメインをもつレセプターで、胚発生と出生後の過程におけるヘッジホッグシグナル伝達の調節に関与すると考えられている（Motoyamaら、（1998）、 Nat. Genet., 18, 104; Carpenterら、PNAS, 95, 13630、これらは各々、参照として本明細書に組み入れられる）。ptch2を標的とするベクターは、ptch2レセプターの膜貫通ドメイン2から8までを含む、エキソン5から11までのゲノム配列を含むファージクローンを利用して、ラムダファージマウスDNAライブラリーから構築することができる（図4）。簡単に説明すると、本明細書において第一のDNA配列と称する、理論的には1.7 kbの3'側相同性領域を、ptch2ファージクローンから単離したゲノムDNAからPCRによって増幅し、KpnIおよびNotI部位を隣接させることができる。この断片をpPOLYLINKERプラスミドにサブクロニーングすることができ、以後、このプラスミドをpPolylinker1.7と称するものとする。本明細書において第三のDNA配列と称する、理論的な5'側相同性領域であって、エキソン5、6およびエキソン7の5'側領域の大部分を含む領域を、制限酵素BamHIおよびNcoIを用いて取り出し、クレノウ断片DNAポリメラーゼによって平滑末端化し、さらに、平滑末端をpPolylinker1.7のHpaI部位にサブクロニーングしてpPolylinker1.7upperと名付けられたプラスミドを作製することができる。続いて、本明細書において第二のDNA配列と称する、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターの調節下で抗生物質耐性マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするDNA断片を5'側および3'側の相同性領域の間に挿入して、膜貫通ドメイン2、3および4をコードする領域を置換し、それによって、レセプターを不活性化し、P2と名付けられたプラスミドを作製することができる。本明細書において第四のDNA配列と称する、転写されるが非機能的な配列をサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの調節下にコードするDNA断片を、5'側相同性領域の上流にサブクロニーングして、P2TVと名付けられたベクターを作製することができる。
【００７５】
2．ptch2標的ベクターによるES細胞の形質転換
3'側相同性領域のすぐ下流で、標的導入ベクターの3'末端にあるNotIを、胚性幹（ES）細胞を形質転換する前に直鎖化するために利用することができる。胚性幹細胞を形質転換する前に、100μgのP2TVGベクターを直鎖化し、フェノール/クロロフォルム抽出し、エタノール沈殿してから、1μg/μlの濃度になるよう濾過滅菌水に再懸濁することができる。幹細胞は、10 cmのゼラチン化プレート上で約50％コンフルエントな状態になるまで、ダルベッコの基礎培地（DMEM）の中に15％FCS、0.1 mM非必須アミノ酸、1 mMピルビン酸ナトリウム、10-4 Mβ-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン、50μg/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、1000 U/ml LIFを含むM15培地において37℃、5％CO2で増殖させる。無血清DMEMで洗浄した細胞を、リポフェクタミン（Lipofectamine）（商標）試薬によるリポフェクション技術により、製造業者の説明書（インビトロジェン社（Invitrogen Corp.）；カリフォルニア州カールスバッド（ Carlsbad, CA））に従って、10 cmプレートのES細胞につき8μgの直鎖状ベクターで形質転換を行なうことができる。形質転換してから24〜48時間後に、細胞をFACStar Plus（商標）の細胞選別装置で分離するために回収するか、または、以下で説明するように抗生物質による選択にかけることができる。細胞を回収するには、濾過滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で2回洗浄した後、10 cmプレート当たり1 mlの0.05％トリプシン/EDTAで15分間トリプシン処理することが含まれる。過剰量のトリプシンを除去し、細胞を、PBS中に1 mM EDTA、25 mM HEPES、pH 7.0，および1％透析FCSを含む細胞選別用緩衝液に、10×106細胞/mlの密度になるよう再懸濁する。
【００７６】
3．細胞内分子ビーコンの導入
a）P2TVGで形質転換されたES細胞を200μg/mlジェネテシン（G418）による選抜下に置き、陽性選択マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼを安定して取り込んだ細胞を選抜する。細胞を12日間選抜し、第四のDNA配列に含まれる定常的活性型プロモーターからの調節を受けて転写される非機能配列に特異的にハイブリダイズする分子ビーコンプローブを導入するために、カチオン性脂質形質転換法、リン酸カルシウム法、自由取り込み（free uptake）法、またはエレクトロポレーション法を実施する。分子ビーコンプローブがこれらの非機能な転写配列にハイブリダイズすることによって、検出に使用される特定の分子ビーコンに固有の特徴である特異的な波長の蛍光発光が可能になる。
【００７７】
b）または、分子ビーコンプローブを、形質転換してから48時間後に細胞内に導入することができ、その後、FACS細胞選別法によって分離を行うためにES細胞を回収することができる。
【００７８】
4．ptch2ターゲティングされたES細胞とターゲティングされなかったES細胞の分離
上記したようにES細胞を回収して、FACS細胞選別装置でまとめて選別し、第四のDNA配列の転写産物が分子ビーコンプローブと特異的にハイブリダイズして蛍光を発する細胞を分離する。蛍光細胞以外の選別細胞集団と未選別細胞は、さらにDNAを単離して遺伝子型を判定するために再び平板培養することができる。これらの細胞の増殖を200μg/mlジェネテシン（G418）による選抜下で行ない、陽性選択マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼを安定して取り込んだ細胞を選抜することができる。
【００７９】
5．部位特異的相同組換えによるptch2変異の遺伝子判定による確認
以下のプロトコールによって、選別後のES細胞および/または未選別の陰性対照細胞からゲノムDNAを単離することができる。細胞は、10 cmのプレート内で約80％コンフルエントになるまで増殖させ、100 mM塩化ナトリウム、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、10 mM EDTA、および0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む1 mlの溶解用緩衝液を直接プレートに加える。細胞を室温で15分間インキュベートし、1.5 mlのエッペンドルフチューブに移して、穏やかに振とうしながら55℃で一晩インキュベートする。溶解液を等量の1:1フェノール/クロロフォルムで2回抽出し、クロロフォルムで1回抽出する。等量のイソプロパノールでゲノムDNAを沈殿させる。15000×gで遠心分離した後、ゲノムDNAの沈殿物を300μlの濾過滅菌水に再懸濁する。
【００８０】
各試料から得られたゲノムDNAを、PGKプロモーター内の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーと、3'側相同性領域のすぐ下流にある配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより遺伝子判定することができる（図4）。各オリゴヌクレオチド24 pmolずつを、最終濃度200μMの各dNTP、2.5 mM MgCl2、1×PCR緩衝液、および1UのTaq DNAポリメラーゼ（インビトロジェン社製）の存在下、100 ngのゲノムDNAと混合する。以下のサイクルパラメータを適用して増幅を行なう。すなわち、94.0℃で2分間、その後、96℃で30秒間、58℃で30秒間、72℃で2.5分間を35回繰り返す。反応産物を0.8％アガロースゲル上で1 kbのラダー分子量標準と並行して電気泳動し、PCR産物をUV検出するために臭化エチジウムで染色する。1.7 kbのPCR産物が検出されると、FPIC遺伝子ターゲティング技術を実施することによって正確な遺伝子ターゲティングができたことが示される。
【００８１】
実施例2
FPIC遺伝子標的ベクターを用いた、ES細胞におけるparaxis遺伝子座の不活性化
1．paraxis標的ベクターの構築
paraxisは、哺乳動物の胚発生の過程で体節形成の調節に関与する塩基性のヘリックス-ループ-ヘリックス型の転写因子である（Burgessら、（1995）、168, 296; Burgessら、（1996）、Nature, 384, 570; Barnesら、（1997）、Devel. Biol., 189, 95、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）。陽性-陰性選択用paraxis標的導入ベクターの構造については以前に記載されている（Burgessら、前掲、1996）。FPIC遺伝子ターゲティング技術を成功して、効率的に実施するために、このベクターを改変することができる。
【００８２】
paraxisのゲノム構成は、5 kbのイントロンによって隔離された2個のエキソンからなる（図5）。第一エキソンは、開始メチオニンコドン、およびDNA結合ならびに二量体化に関与するヘリックス-ループ-ヘリックス（bHLH）ドメインを含む。第一エキソンは、開始メチオニンからbHLHドメインまでを含む配列を除去する欠失体が選択され、それによってparaxisタンパク質産物を不活性化する。paraxis遺伝子座の5'末端で相同組換えを起こさせるために、本明細書において第一のDNA配列と称される3.0 kbの5'側相同性領域を利用することができる。paraxis遺伝子座の3'末端で相同組換えを起こさせるためには、本明細書において第三のDNA配列と称される2.0 kbの3'側相同性領域を利用することができる。本明細書において第二のDNA配列と称する、PGKプロモーターの調節下にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼを利用して、エキソン1の大部分とイントロン1の5'側領域を置換することができる（図5）。FPIC遺伝子標的ベクターの第四のDNA配列は、分子ビーコンプローブに特異的にハイブリダイズする非機能的配列を転写させるCMVプロモーターに代表される。記載した順序でこれらの配列を含むベクターは、PTV-1と称する。
【００８３】
2．paraxis標的ベクターによるES細胞の形質転換
増殖させる胚性幹細胞は、約50％コンフルエントな状態になるまで増殖させてから、4μgの直鎖状ベクターによって形質転換させる。形質転換は、上記のリポフェクションプロトコールにより、製造業者の説明書（インビトロジェン社）に従って実施される。
【００８４】
3．細胞内分子ビーコンの導入
a）PTV-1で形質転換されたES細胞を200μg/mlジェネテシン（G418）による選抜下に置き、陽性選択マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼを安定して取り込んだ細胞を選抜する。細胞を12日間選抜し、第四のDNA配列に含まれる定常的活性型プロモーターからの調節を受けて転写される非機能配列に特異的にハイブリダイズする分子ビーコンプローブを導入するために、カチオン性脂質形質転換法、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション法、または自由取り込み法を実施する。分子ビーコンプローブがこれらの非機能な転写配列にハイブリダイズすることによって、検出に使用される特定の分子ビーコンに固有の特徴である特異的な波長の蛍光発光が可能になる。
【００８５】
b）または、分子ビーコンプローブを、形質転換してから48時間後に細胞内に導入することができ、その後、FACS細胞選別法によって分離を行うためにES細胞を回収することができる。
【００８６】
4．paraxisターゲティングされたES細胞とターゲティングされなかったES細胞の分離
上記したような抗生物質による選抜を行なうか、それを行なわずに細胞を回収して、FACS細胞選別装置でまとめて選別し、蛍光を発しない細胞から蛍光を発する細胞を分離する。選別された蛍光を発しない細胞の集団は、DNAを単離し、遺伝子型判定を行なうために、10 cmのプレート当たり10×106細胞という密度で再平板培養し、80％コンフルエントな状態まで増殖させることができる。このような増殖は、200μg/mlジェネテシン（G418）による選抜下にある細胞を用いて行ない、陽性選択マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼを安定して取り込んだ細胞を選択することができる。
【００８７】
5．部位特異的相同組換えによるparaxis変異の遺伝子判定による確認
上記したように、選別後のES細胞集団または未選別の陰性対照細胞からゲノムDNAを単離する。各試料から得られたゲノムDNAは、neoコード配列の3'側にあるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル内の配列に特異的なオリゴヌクレオチドと、3'側相同性領域のすぐ下流にある配列に特異的なオリゴヌクレオチドとを用いるPCRによって遺伝子判定される（図5）。反応の容量および条件は、プライマーのアニーリング温度を55℃にする以外は上記したとおりである。反応産物を0.8％アガロースゲル上で1 kbのラダー分子量標準と並行して電気泳動し、PCR産物をUV検出するために臭化エチジウムで染色する。蛍光細胞を選別した試料集団からのDNAを用いて検出される1.5 kbのPCR産物は、部位特異的相同組換えが起きて、遺伝子ターゲティングに成功したことを示している。
【００８８】
本発明を上記の実施例により説明したが、これらを変更および改変したものも、本発明の精神と範囲に含まれることは当然である。従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみ制約を受ける。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】FPIC遺伝子標的ベクターを用いる定方向変異誘発に関係する工程の概略フローチャート図である。
【図２】相同組換えによるFPIC遺伝子標的化の分子事象の略図である。
【図３】いくつかのタイプのFPIC遺伝子標的ベクターの略図である。
【図４】ptch2座でのFPIC遺伝子標的化の略図である。
【図５】paraxis座でのFPIC遺伝子標的化の略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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