(57)【要約】  本発明は、汚染DNAおよび細胞内でDNAと結合してもよいウイルスのような他の分子を実質的に含まない種々のグリコサミノグリカン（GAG）-ペプチド複合体およびポリペプチドを、結合組織から単離する方法に関する。本発明はまた、哺乳動物の任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎または他の変性状態のような炎症性および変性疾患における結合組織の治療、防御および回復のための、DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体およびポリペプチドの、直接のまたはさらなるプロセシング後の使用に関する。図２は、37℃で100mM 酢酸カルシウムバッファー（pH4.5）を使用して自己溶解法に付す前および後の、３μmのウシ気管軟骨粉末の組織学的切片の顕微鏡写真（倍率×400）を示す。パネルAとCは、自己溶解処理前の軟骨切片であり、パネルBとDは後の切片である。パネルAとBは、トルイジンブルー（TB）（グリコサミノグリカン（GAG）に結合する色素）による染色の結果であり、CとDは、マッソントリクローム（マッソンTC）（未変性のコラーゲン繊維をマゼンタ色に染色することが知られている色素）で染色した切片を示す。自己溶解後に切片BでGAGの染色の喪失が見られるが、Dに示すようにGAGのほとんどを除去するとコラーゲンの染色強度がわずかに上昇することに注意されたい。これらの切片で緑の対染色で同定される細胞核は、自己溶解処理により明らかに変化しない。
2005519914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合組織由来のGAG-ペプチド複合体とポリペプチドの調製法であって：
有効なpHと温度で１価または２価の塩を含有する自己溶解培地に接触させることにより、結合組織の粒子を酵素介在自己溶解に付して、内因性酵素のタンパク質分解作用により、組織粒子内から自己溶解培地中に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体と少なくとも１つのポリペプチドを放出させ、残存組織粒子を残す工程；および自己溶解培地からGAG-ペプチド複合体とポリペプチドとを回収する工程、を含んでなる方法。
【請求項２】
１価の塩は、水素、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびこれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
２価の塩は、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
pHは、2.5〜8.5、好ましくは3.5〜8.0、さらに好ましくは４〜７、最も好ましくは4.5〜７の範囲である、請求項１の方法。
【請求項５】
温度は、20〜45℃、好ましくは25〜45℃、さらに好ましくは32〜45℃、最も好ましくは37℃である、請求項１の方法。
【請求項６】
結合組織は、皮膚、骨、腱、靭帯および軟骨よりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
結合組織は、ウシ、ヒツジ、ブタ、シカおよびウマの、気管、関節、耳、または鼻の軟骨；
ニワトリの胸骨；ニワトリの肋骨軟骨；サメの骨格軟骨；および成長しているシカ枝角軟骨
よりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項８】
結合組織は、成長しているシカ枝角軟骨、ウシの気管、関節および鼻軟骨、好ましくはウシの気管および鼻軟骨よりなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項の方法により得られる、DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体、および／またはDNAを実質的に含まないポリペプチド。
【請求項１０】
該GAG-ペプチド複合体は請求項１〜８のいずれか１項の方法により得られる、DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体から得られるコンドロイチン硫酸塩。
【請求項１１】
DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体の１価または２価の塩であって、１価の塩は、水素、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびこれらの混合物よりなる群から選択され、２価の塩は、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される上記塩。
【請求項１２】
DNAを実質的に含まないポリペプチドの１価または２価の塩であって、１価の塩は、水素、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびこれらの混合物よりなる群から選択され、２価の塩は、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される上記塩。
【請求項１３】
DNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸の１価または２価の塩であって、１価の塩は、水素、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびこれらの混合物よりなる群から選択され、２価の塩は、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される上記塩。
【請求項１４】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体、および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸の使用。
【請求項１５】
コンドロイチン硫酸塩は１価または２価の塩であり、かつ１価の塩は、水素、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびこれらの混合物よりなる群から選択され、２価の塩は、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１４の使用。
【請求項１６】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体、およびDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドの使用。
【請求項１７】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩、および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸のカルシウム塩の使用。
【請求項１８】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩、およびDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドのカルシウム塩の使用。
【請求項１９】
GAG-ペプチド複合体のカルシウム塩はDNAを実質的に含まない、請求項１８の使用。
【請求項２０】
GAG-ペプチド複合体とポリペプチドのカルシウム塩は、結合組織から、好ましくは気管軟骨から、さらに好ましくはウシ気管軟骨から、請求項１〜８のいずれか１項の方法により同時単離される、請求項１８の使用。
【請求項２１】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドの使用。
【請求項２２】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法であって、かかる治療が必要な被験体に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸塩の有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項２３】
コンドロイチン硫酸塩は１価または２価の塩であり、かつ１価の塩は、水素、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびこれらの混合物よりなる群から選択され、２価の塩は、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される、請求項２２の方法。
【請求項２４】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法であって、かかる治療が必要な被験体に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体およびDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項２５】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法であって、かかる治療が必要な被験体に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸のカルシウム塩の有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項２６】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法であって、かかる治療が必要な被験体に、少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩およびDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドを投与することを含んでなる方法。
【請求項２７】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患の治療方法であって、かかる治療が必要な被験体に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項２８】
DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸塩を、薬剤学的に許容される担体とともに含んでなる医薬組成物。
【請求項２９】
コンドロイチン硫酸塩は１価または２価の塩であり、かつ１価の塩は、水素、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびこれらの混合物よりなる群から選択され、２価の塩は、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される、請求項２８の医薬組成物。
【請求項３０】
DNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドを薬剤学的に許容される担体とともに含んでなる医薬組成物。
【請求項３１】
コラーゲンペプチドを得るために、残存組織粒子を加水分解する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３２】
請求項３１の方法により調製されるコラーゲンペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汚染DNAおよび細胞内でDNAと関連しているウイルスのような他の分子を実質的に含まない種々のグリコサミノグリカン（GAG）-ペプチド複合体およびポリペプチドを、結合組織から単離する方法に関する。本発明はまた、細胞内に局在化しており一部の細胞内成分に結合していることが知られているウイルスや他の病原体による汚染の可能性も無く、哺乳動物の任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎または他の変性症状のような炎症性および変性疾患における結合組織の治療、防御および回復のための、DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体およびポリペプチドの、直接のまたはさらなるプロセシング後の使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、好ましくはDNAを実質的に含まない、GAG-ペプチド複合体とポリペプチドのカルシウム塩の混合物の使用に関し、これは、結合組織細胞の同化と巨大分子生合成を増強し、動物モデルで免疫抑制と抗炎症活性とを示すことがわかっている。マトリックス成分の細胞生合成を抑制しその分解を促進することが知られている炎症促進性メディエーター（例えばインターロイキン-1）の存在下でも、結合組織の細胞増殖、マトリックス遺伝子発現、および上記調製物による炎症を改善することにより、これらの天然のGAG-ペプチド複合体とポリペプチドは、関節炎や関連する変性疾患の特徴的な病態である組織破壊と炎症の進行を遅らせるかまたは止めることができる。
【背景技術】
【０００３】
リウマチ様関節炎（RA）、骨関節炎（OA）、円盤変性（DD）、および骨粗鬆症（OP）のような筋骨格疾患は、世界中で発病の大きな原因である。これらの疾患は、健康とクオリティオブライフに大きな影響を有し、医療システムに莫大なコストをかけている（Scott JC, Hochberg MC. 関節炎と他の筋骨格疾患、Chronic Disease Epidemiology中、Brownson RC, Remington PLおよびDavis JL編、ワシントンDC、American Public Health Association, 1993）。筋骨格疾患は、オーストラリア社会で毎年13億ドルの直接コストと42億ドルの間接コストがかかると推定されている。これはGNPの1.3％である（オーストラリア関節炎財団（Arthritis Foundation of Australia）、Access Economics Pty Litd レポート、2001）。他の先進国で行われた人口ベースの研究は、オーストラリアと同様の発症率と医療負担を示し、例えば、2300万人のアメリカ人が関節炎の治療を求めており、その管理に関連するコストは毎年700億ドルを超えている（Ruchlin HS, Elkin FB, Paget SA, リウマチ様関節炎と骨関節炎のコスト有効性分析の評価、Arthritis C Res 1997; 10:413-21）。さらに、OA、DDおよびOPの罹患率は、先進国の人間の寿命が延びるのに伴い増加し続けている。実際先進国の人口の20％は、2000年までに筋骨格疾患の医学的治療または専門の医療サポートを積極的に要求すると予測されている（Croft P. ヨーロッパ以外での骨関節炎の発生、Ann Rheum Dis 1996; 55:661-4）。
【０００４】
OAのような筋骨格疾患の病因は多元的であり、最も関連する危険因子は老化であるが、機械的、ホルモン的および遺伝的因子のすべても、程度は異なるが寄与している。これらの病因決定因子が大きな関節傷害を与えて機能の障害と症状の出現を引き起こすと、OAは臨床症状として現れる。この臨床症状は、関節軟骨（AC）の喪失と、関節縁の増殖（骨増殖症）を伴う軟骨下骨の広範なリモデリングとによる関節窩狭窄により、放射線的に現れる。OAの後期段階では、関節は、広範なAC線維化、プロテオグリカン（PG）の染色の喪失、および大きな接触ストレスの部位の骨の象牙質化が、病態的な特徴である。軟骨が線維化しているか侵食されているOAの領域の下の軟骨下骨は一般に硬化性であり、未成熟な網状骨からなる（Felson DT. 骨関節炎. Rheum Dis Clin Nth Amer 1990; 16:499-512）。
【０００５】
ACのPGは、数百のGAG鎖が共有結合したタンパク質コアからなる。ACのPGの主要なGAG置換基はコンドロイチン硫酸であり、その異性体構造と分布はよく知られている（Poole AR、関節炎における関節軟骨のコラーゲンとプロテオグリカンの変化、Rheumatology, 1986, 10:316-371）。すなわち、成体軟骨のCh-6-Sは、非常に若い動物のAC中に多い対応する4-硫酸化異性体（Ch-4-S）より多い。ACの細胞外マトリックス中で水和PG複合体は、II型コラーゲン繊維の３次元ネットワークにより、巨大分子凝集物の形で捕捉される。軟骨下骨板に固定されているPG、水および繊維性コラーゲンネットワークのユニークな構造は、正常な生体機械的機能に必要な弾性という生体機械的性質をACに与える（Poole AR、関節炎における関節軟骨のコラーゲンとプロテオグリカンの変化、Rheumatology, 1986, 10:316-371）。
【０００６】
OAとRA関節における軟骨破壊の生成物は、抗原性があることが証明されており［Glant TT, Fulop C, Cs-Szaho G, Buzas E. Ragasa D, Mikecz K. プロテオグリカン誘導関節炎における軟骨アグレカン（aggrecans）の関節炎発症性／自己免疫性エピトープのマッピング、Scand J Rheumatol 1995; 24:43-9, Rowley M, Tait B, Mackay IR, Cunningham T, Phillips B. リウマチ様関節炎におけるコラーゲン抗体：変性コラーゲンに対する抗体とHLA-DR4とのその結合の意義、Arthritis Rheum 1986; 29:174-84, Seibel MJ, Jelsma R, Saed-Nejad F, Ratcliffe A. ヒトとウシ軟骨プロテオグリカン中のケラチン硫酸の免疫化学的定量における変動、Biochem Soc Trans 1990; 18(5):969-70］、髄液（SF）中に放出されると滑膜炎症を誘発することがある。この滑膜炎はいったん発展すると、関節の髄液ヒアルロン酸（HA）の主要な細胞供給源である存在する常在性滑膜細胞の代謝を変化させ得る。局所マクロファージと浸潤性白血球から放出される炎症性メディエーターもまた、血管透過性の亢進と血漿液体によるSFの希釈を促進し、こうして局所HA濃度を低下させる（Muller-Ladner U, Gay RE, Gay S. 滑膜細胞の構造と機能、Arthritis and Allied Conditions中, Koopman WJ編、Baltimore, Williams とWilkins, 1997, 243）。このHAの希釈が滑膜細胞による異常合成による分子サイズの低下と一緒になって、SFの流動学的性質を大きく低下させ、その結果ACを潤滑し防御する能力が低下する（Balazas EA、滑液の物理的性質とヒアルロン酸の特殊な役割、Disorders of the Knee中、Helfet AJ編、Philadelphia, JP Lippincott, 1982, 61-74）。滑膜のマクロファージはまた、局所的炎症により滑膜腔に入る白血球とともに、サイトカイン、［例えば、インターロイキン-1（IL-1）］、凝固促進因子、プロテイナーゼ、および亜酸化窒素ラジカル（NO）を含む酸素由来フリーラジカルの豊富な供給源である（Pelletier J-P, DiBattista JA, Roughley P, McCollum R, Martel-Pelletier J. 軟骨破壊におけるサイトカインと炎症、Rheum Dis Clin N Am 1993; 19:545-68、Dean DD、骨関節炎におけるプロテイナーゼ介在軟骨分解、Sem Arthritis Rheuma 1991; 20:2-11）。滑液中に放出される過剰のタンパク質分解活性のほとんどは、存在する内因性インヒビターにより排除されるが、サイトカインおよびフリーラジカルは、軟骨中に自由に拡散でき、軟骨細胞によるPGとコラーゲン合成をダウンレギュレートする。これらの炎症促進性ペプチド混合物はまた、軟骨細胞による異化性プロテイナーゼ、サイトカインおよびNO・のようなフリーラジカルの産生を開始することができ、これはオートクリンおよびパラクライン経路を介して、さらなるACマトリックス破壊に寄与する（Evans CH, Watkins SC, Stefanovic-Racic M. 亜酸化窒素と軟骨代謝、Methods Enzymol 1996; 269:75-88）。
【０００７】
上記より、OAのような関節炎疾患では、関節のすべての組織が冒され、その過度の分解と同時に起きる炎症性反応の誘発により、病状の進行のみでなく症状（最も一般的なものは疼痛と関節機能の障害である）の出現に至る。
【０００８】
リウマチ疾患と椎間板起源の背部痛の薬理的管理は、つい最近まで、症状の原因である基礎疾患よりも、これらの疾患の症状を標的としてきた。過去50年間、鎮痛剤、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症剤（NSAID）が、リウマチ疾患の薬物治療の主流であった。しかし、これらの合成薬の多くの使用に起因する有害な副作用（Lichtenstein DR, Syngal S, Wolfe MM. 非ステロイド抗炎症剤と消化管、両刃の剣. Arthritis Rheum 1995; 38:5-18, Davies MN, Wallace JL. 非ステロイド抗炎症剤誘導性消化管毒性、古い問題への新しい考察. J Gastroenterol 1997;32:127-33, Manoukian AV, Carson JL. NSAID誘導性肝疾患、頻度と予防. Drug Safety 1996;15:64-71, Huskisson EC, Berry H, Gishen P, Jubb RW, Whitehead J. 膝の骨関節炎の進行に対する抗炎症薬物の効果. J Rheumatol 1995;22:1941-6）が、代替治療法の評価と開発を促進してきており、特に食用植物と動物源による治療は、本質的に副作用が無いと予測される。
【０００９】
この点で最も一般的に使用されている製品は、グルコサミンとコンドロイチン硫酸（ChS）であり、これらは軟骨PGの成分である。市販のグルコサミンは一般に、甲殻類の外骨格中に存在するキトサンから単離されていることに注意すべきである。グルコサミンとコンドロイチン硫酸を単独または組合せて行った比較臨床試験は、これらがOAの症状を緩和することを示した（McAlindon TE, LaValley MP, Gulin JP, Felson DT, 骨関節炎の治療のためのグルコサミンとコンドロイチン：体系的品質評価とメタ解析. JAMA, 2000; 263: 1469-1475）。これらの物質は、遅効性の疾患改変抗ニュートラシューティカルズとして分類されてきた。我々は、OAや他の筋骨格疾患の治療のために、これらの物質を単独でおよび種々の他の薬剤とともに使用したことを記載する多くの特許開示を周知している（US Patent 5,364,845, Nov 15 1994; US Patent 6,136,795, Oct 24 2000; US Patent 6,162,787, December 19, 2000, US Patent 6,271,213, Aug 7, 2001, US Patent 6,432,929, August 13 2002, およびそこに引用されている文献).  
ChSは天然の供給源から得られるため、食物添加物としてまたは補助食品として一般大衆に直接販売でき、FDAのような政府機関が要求するような合成製造医薬品に使用されている厳しい品質管理基準に適合する必要は無い。市販のコンドロイチン硫酸は、通常ウシ組織（例えば、肺および気管）から、化学的または酵素的方法を使用して、軟骨PGのGAGタンパク質コア結合を加水分解することにより製造される（US Patent , 1,950,100 Mar 1932, オーストラリア特許AU-A1-66307/80 Jan 1981, AU-A-70540/87 Dec 1987, US Patent 6,162,787, December 19, 2000、およびそこに引用されている文献）。陰性荷電した水溶性ChSはまた、軟骨の加水分解により生成されるタンパク質およびペプチドから、アセトン、脂肪族アルコールによる複数回の沈殿、または塩化セチルピリジニウム（CPC）のような４級アンモニウム塩との水不溶性複合体の形成により、分離され精製される（US Patent, 1,950,100 Mar 1932, オーストラリア特許AU-A1-66307/80 Jan 1981, AU-A-70540/87 Dec 1987）。しかし、これらの巨大分子もまた陰イオン性であり、陰イオン的に荷電したChSと同時沈降するため、これらの方法はいずれも、混入核酸（DNAとRNA）や、軟骨の化学的または酵素的分解中に放出される他の細胞内成分を容易に除去できない。
【００１０】
混入核酸は、これらの混入分子（例えば、Benzonase（メルク（merck））のようなリボヌクレアーゼ）を分解する酵素で消化することにより、ChSから選択的に除去できるであろうが、これは高価な方法であり、使用された酵素はどこかの段階でChS調製物から除去しなければならない。軟骨組織から未変性のプロテオグリカンを抽出するのに、以前はグアニジン塩酸や高イオン強度溶液（例えば、塩化カリウム）のようなカオトロピック溶媒も使用されていたが、低温（４℃未満）で、かつ必要な巨大分子の内因性酵素による分解を防ぐためにプロテアーゼインヒビターを添加して行われた（Hascall VCとSajdera SW, ウシの鼻軟骨からのタンパク質−多糖複合体、凝集物の生成における糖タンパク質の機能.  J.Biological Chem. 1969,244;2384-2396; Oegema T, Hascall  V, Dziewiatkowski  D, ラットの軟骨肉腫からのプロテオグリカンの単離と性状解析. J. Biol. Chem. 1975, 250: 6151-6159; Inerot SとHeinegard D, ウシの気管軟骨プロテオグリカン、年齢による構造と組成の変化.  Collagen and Related Research, 1983, 3: 245-262）。しかし、こうして単離したこれらのプロテオグリカン複合体からGAG-ペプチドまたはChS鎖を放出するためには、パパインのような外因性酵素を添加してタンパク質分解的消化を行って、これらのタンパク質コアを分解することが必要である（US Patent 6,162,787, December 19, 2000,  Inerot SとHeinegard D, ウシの気管軟骨プロテオグリカン、年齢による構造と組成の変化、Collagen and Related Research, 1983, 3: 245-262, およびそこに引用されている文献）。さらに、これらの高イオン強度またはカオトロピック条件を使用して軟骨を抽出することはまた細胞膜を破壊し、こうして細胞内成分（例えば、核酸）をPGとともに水性培地中に放出させる。
【００１１】
キャラクタライゼーションされていないGAG-ペプチドもまた、酢酸ナトリウムまたは水（pH4.5）を使用して、ウシ鼻軟骨から調製されているが、ウシ気管軟骨ではない（Nakano T, Nakano K, Sim JS, 0.1M 酢酸ナトリウムを用いるウシ鼻軟骨からのグリコサミノグリカンペプチドの抽出, J Agriculture and Food Chemistry, 1998, 46; 772-778, Nakano T, Ikawa N, Ozimek L, ウシ鼻軟骨からのコンドロイチン硫酸−ペプチドの抽出のための経済的方法. Can Agric Engineering, 2000, 42; 205 -208）。しかし、これらのGAG-ペプチド調製物中のDNAの有無も、その各薬理活性も、記載の筋骨格条件の処理のための直接使用も、これらの文献に記録された情報からは推定できない。再度、Nakanoらは、著者らが最終的に必要とするChSを得るためには、この抽出法により単離された生成物の以後のタンパク質分解的または化学的加水分解が必要であることを開示している。
【００１２】
この点で、商業的関心のある生成物（例えばChS）を製造するために、結合組織を完全に消化するのに使用されるタンパク質分解酵素のほとんどは、その広範囲の基質特異性と広範な利用可能性から、細菌または植物源から得られることに注意することは重要である。従って、これらの酵素により認識され切断されるアミノ酸配列、ならびにそのタンパク質分解性陰イオンにより生成されるポリペプチド断片のアミノ酸配列は、哺乳動物結合組織の内因性プロテイナーゼにより産生される切断部位とポリペプチド配列とは異なる。例えば、哺乳動物クラスのシステインプロテイナーゼ（カテプシン）を用いた研究は、その好適な基質結合部位と触媒性切断部位が、植物由来のシステインプロテイナーゼ（パパイン）とは異なることを証明している（Barrett Aj, Buttle DJ, Mason Rw, リソソームシステインプロテイナーゼ, ISI Atlas of Science, 1988: 256-260）。さらに、パパインによるPGの精製調製物の消化は、まだグリコシド結合した約10アミノ酸を有する単一のChS鎖を放出したが、カテプシンDまたはBまたはGによる軟骨PGの対応する消化は、２つ以上のChS鎖と、パパイン消化PGにより生成されたものとは異なるアミノ酸配列を有するより長いアミノ酸を含有するクラスターを生成した（Roughley PJとBarrett AJ, 組織プロテイナーゼによる軟骨プロテオグリカンの分解, Biochem J, 1977, 167: 629-637）。
【００１３】
いくつかの特許開示が、筋骨格疾患と関節軟骨欠陥の治療のための軟骨の加水分解物の調製と使用法を引用しているが、これらの発明は、そのような治療のためのＩ型およびII型コラーゲンから産生されるペプチドの使用に限定されており、GAG-ペプチド複合体を単独またはこれらのコラーゲン由来ポリペプチドとともに使用した時の薬理活性については言及していない。さらにこれらの前記開示はいずれも、その調製物中の核酸のような細胞内汚染物質の有無を認識していない（US Patent 3.966,908, June 29, 1976, US Patent 4,804,745 Feb 1989, US Patent 5,399.347  Mar 1995, US Patent 5,364,845 Dec 1996, US Patent 6,025,327 Feb 2000, US Patent 6,372,794 April 2002）。
【００１４】
ニュートラシューティカルズまたは補助食品として販売されているChS調製物中のウシまたは他の動物の核酸のヒトによる長期消費の結果は現在不明であるが、これらの細胞内陰イオン巨大分子は、レトロウイルスや、伝染性の海綿状脳症（例えばヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病、クールー、Gerstmann-Straussler-Scheiner症候群、ヒツジやヤギのスクレーピー、およびウシのウシ海綿状脳症）の伝搬に関与しているといわれる熱／プロテイナーゼ耐性プリオンタンパク質と、強く結合しているかまたは複合体を形成していることに注意すべきである（Weissmann Cら, プリオンの感染, www.pnas.org/cgi/doi/1073/pnas. 172403799; Narang H, 海綿状脳症物質の本質の批判的総説：タンパク質理論対ウイルス理論, Exp Biol. Med, 2002,227: 4-19; C,ら, プリオンタンパク質はレトロウイルスヌクレオカプシドタンパク質に類似したDNA鎖転移性を有する, J. Mol. Biol., 2001, 307: 1011-1021; Nandi PKとSizaret P-Y, マウス組換えプリオンタンパク質はヌクレオカプシドの凝縮球状構造への秩序ある凝集を誘導する,  Arch Virol, 2001, 146: 327-45; Cominicini S, et al, ウシおよびヒツジプリオンDoppel遺伝子（PRND）のゲノム構成、比較分析および遺伝子多型, Mamm Genome 2001, 9: 729-33）。従ってこれらの細胞内物質は、骨関節炎や関連疾患に起因する症状の抑制のための１日１ｇ以上のChSの製造業者の推奨用量に適合する時、被験体により多量に消費されるであろう。
【００１５】
本発明に含まれる文書、記録、材料、装置、物品などの考察は、本発明の事情を説明することのみを目的とする。これは、これらの一部またはすべてが、本出願の各請求項の優先日以前にオーストラリアに存在したとして、本発明に関連する分野の先行技術の一部または一般的情報であることを認めるものと考えてはならない。
【発明の開示】
【００１６】
第１の態様において本発明は、結合組織由来のGAG-ペプチド複合体とポリペプチドの調製法であって：
有効なpHと温度で１価または２価の塩を含有する自己溶解培地に接触させることにより、結合組織の粒子を酵素介在自己溶解に付して、内因性酵素のタンパク質分解作用により、組織粒子内から自己溶解培地中に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体と少なくとも１つのポリペプチドを放出させ、残存組織粒子を残す工程；および自己溶解培地からGAG-ペプチド複合体とポリペプチドとを回収する工程、を含んでなる方法を提供する。
【００１７】
結合組織は、コラーゲン、非コラーゲン性タンパク質、およびプロテオグリカンが豊富である。結合組織プロテオグリカンは、タンパク質コア（約５％）に共有結合した硫酸化多糖（約95％）でできた鎖からなる巨大分子複合体である。
【００１８】
グリコサミノグリカン（GAG）は、プロテオグリカンの多糖鎖であり、グルクロン酸またはイズロン酸にグリコシド結合したアミノ糖（グルコサミンまたはガラクトサミン）の誘導体を含む繰り返し二糖単位からなる。最も一般的は誘導体は、N-アセチル化グルコサミンまたはガラクトサミン環の４位または６位で置換されたO-硫酸化エステルである。
【００１９】
GAGの例には、ヒアルロン酸（ヒアルロナン）（これは硫酸化されていない）、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、およびヘパラン硫酸がある。
【００２０】
プロテオグリカン構造の切断により、プロテオグリカンタンパク質コア由来のポリペプチド断片に結合した１つ以上の多糖を含む複合体が産生される。これらの複合体は本明細書において「GAG-ペプチド複合体」と呼ぶ。
【００２１】
用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸を含むが典型的には10以上のアミノ酸を含むペプチドを含む。ポリペプチドは典型的には、タンパク質（ここでタンパク質は、糖タンパク質と非グリコシル化タンパク質を含む）の化学的または酵素的切断により得ることができる。用語ポリペプチドは、非グリコシル化またはグリコシル化タンパク質の切断により得られるマトリックス由来ポリペプチドを含む。ポリペプチドの性質は、その構成アミノ酸の種類と配列により決定される。
【００２２】
好適な１価の塩は、水素、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびこれらの混合物から選択され、２価の塩は好ましくは、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物から選択される。さらに好適な塩は、カルシウムとマグネシウムである。
【００２３】
pHは、2.5〜8.5、好ましくは3.5〜8.0、さらに好ましくは４〜７、最も好ましくは4.5〜７の範囲である。
【００２４】
温度は、20〜45℃、好ましくは25〜45℃、さらに好ましくは32〜45℃、最も好ましくは37℃である。
【００２５】
本発明はまた、上記方法により調製される、DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体とポリペプチドを提供する。
【００２６】
本発明はさらに、DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体とDNAを実質的に含まないポリペプチドの１価または２価の塩を提供する。
【００２７】
本発明の方法に適した結合組織には、皮膚、骨、腱、靭帯および軟骨がある。結合組織起源は、広範囲の種（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、トリ、シカ、および魚を含む）から得られる。軟骨が好適であり、ヒアリン、弾性、または線維型軟骨でもよい。軟骨の好適な動物種および解剖学的位置は、ウシ、ヒツジ、ブタ、シカまたはウマの、気管、関節、耳、または鼻の軟骨、ニワトリの胸骨または肋骨軟骨、サメの骨格軟骨、および増殖しているシカの枝角軟骨である。成熟した動物（例えばウシの場合は３才を超える）より若い動物の組織が好ましい。
【００２８】
結合組織は、当該分野で公知の方法に要求されるように処理および洗浄して、接着している軟組織を除去し、特に限定されないが切り刻み、さいの目に切断、破砕などを含む手段により、必要な粒子サイズまで小さくされる。適切な粒子サイズは、商業的な便利さに基づいて選択される。好適な粒子サイズは５mmまでのオーダー、好ましくは１〜３mmである。
【００２９】
自己溶解の速度は、多くの要因（pH、温度、濃度、組織の種類、組織の粒子サイズ、およびインキュベーション時間を含む）により変動することを当業者は理解するであろう。好適な実施形態において１〜３mmのサイズの軟骨粒子が、水性培地中でpH４〜５で32〜42℃の温度で、最大36時間好ましくは16〜24時間自己溶解される。
【００３０】
DNA含量の測定には多くの方法があり、使用される方法とは無関係にサンプル毎に変動があることが予測されることも当業者は理解するであろう。本発明者らは、DNA蛍光色素結合アッセイ、および直接分光法を使用して、これらの調製物中のDNAレベルを推定した。分光法は通常タンパク質含量の低い水溶性調製物中のDNAレベルを定量するのに使用され、一方蛍光色素は、タンパク質を含有するサンプルや他の組織由来の分子中のDNAの量を測定するのに使用される（Davis LG, Kuehl WM, Battey JF, Basic methods in Molecular Biology, 第２版, AppletonとLange, Norfolk, Connecticut, 1994）。
【００３１】
用語「DNAを実質的に含まない」とは、本発明の文脈において、原料（自己溶解前の組織粒子）の公知のDNA含量と比較して、または本明細書に記載の方法とは別の方法により製造される市販のコンドロイチン硫酸調製物と比較して、DNAの大幅な減少を示すと理解されたい。例えば、３つの市販のコンドロイチン硫酸調製物中の硫酸化グリコサミノグリカン（S-GAG）とDNAの比は、平均約300：１（表３）であることが、本発明者らにより見いだされた。これに対して、本発明の自己溶解培地中に放出されたGAG-ペプチドとポリペプチドは、自己溶解培地中のS-GAG対DNAの比が1000対１より大きく、DNA Hoechst 33258蛍光色素結合アッセイでまたは分光光学的にDNAは検出できない。1000：１より大きい比は、用語「DNAを実質的に含まない」の範囲内であることを、当業者は理解するであろう。これに対して、ヒトの消費用の市販のChSA中のS-GAG対DNAの比が約300：１（表３）であることは、DNAを実質的に含まないとはいえないと本発明者らは考える。
【００３２】
本発明の文脈において、DNA含量は、細胞内巨大分子成分のマーカーとして使用される。例えば、DNAが実質的に存在しないことは、一般的な細胞内成分（例えば、核酸および関連する分子）が実質的に存在しないことを示す。
【００３３】
自己溶解培地からGAG-ペプチド複合体とポリペプチドを回収する方法は、当該分野で公知である。例えば、残存する組織粒子は、ろ過により自己溶解培地から除去され、GAG-ペプチド複合体とポリペプチドは培地から単離される。適切な単離法には、上清の中和後に：
凍結乾燥；または
アセトンまたは脂肪族アルコールによる沈殿；または
塩化セチルピリジニウムのような４級アンモニウム塩との水不溶性複合体の形成；または
サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー、または他の型のクロマトグラフィー、または膜ろ過技術を使用する分離
を行う方法がある。
【００３４】
GAG-ペプチド複合体とポリペプチドは、従来法を使用してさらに精製および／または分離してもよい。本明細書に記載の方法により調製されるGAG-ペプチド複合体の穏和な化学的または酵素的加水分解により、１価（例えば、H、Na、Ｋ，アンモニウム）または２価（例えば、Ca、Mg、Zn、Cu）の塩として得られるChSはまた、DNAを実質的に含まず、S-GAG対DNAの比は1000：１より大きい。コラーゲンペプチドは当該分野で公知の方法により単離される（US Patent 4,804,745 Feb 1989, US Patent 5,399.347  Mar 1995, US Patent 5,364,845 Dec 1996, US Patent 6,025,327 Feb 2000）。
【００３５】
第２の態様において本発明は、上記方法により得られるGAG-ペプチド複合体であるGAG-ペプチド複合体から得られる、DNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸塩を提供する。
【００３６】
本発明はまた、DNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸の１価または２価の塩を提供し、ここで１価の塩は、水素、ナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびこれらの混合物よりなる群から選択され、２価の塩は、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される。
【００３７】
DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体、DNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸塩、およびDNAを実質的に含まないポリペプチドとGAG-ペプチド複合体との混合物は、炎症性および変性組織疾患の結合組織の治療、防御および回復のために、および癌の治療のための抗血管形成物質として、または機能不全血管中の血流を改善するための抗脂肪血症／線溶促進物質として使用される。
【００３８】
この点で本発明者らは驚くべきことに、DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体およびDNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体／ポリペプチド混合物が示す薬理活性が、等しい重量ベースで薬理活性を比較すると、市販のChSの対応する活性より優れていることを発見した。
【００３９】
従って第３の態様において本発明は、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体；および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸塩；DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体とDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドの使用を提供する。
【００４０】
本発明はまた、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法であって、かかる治療が必要な被験体に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体；および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸；DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体とDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００４１】
コンドロイチン硫酸は、１価（好ましくはNa、Ｋ，アンモニウム）または２価（好ましくはCa、Mg、Zn、Cu、さらに好ましくはCa、Mg）の塩として存在してもよい。
【００４２】
第４の態様において本発明は、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体；および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸；DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体とDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドを、薬剤学的に許容される担体とともに含む医薬組成物を提供する。コンドロイチン硫酸は、１価（好ましくはNa、Ｋ，アンモニウム）または２価（好ましくはCa、Mg、Zn、Cu、さらに好ましくはCa、Mg）の塩として存在してもよい。医薬組成物は、グルコサミンのような、コンドロイチン硫酸と一緒に使用されることが公知の賦形剤を含有してもよい。
【００４３】
好適な態様において本発明は、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩、および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸のカルシウム塩の使用を提供する。
【００４４】
本発明はまた、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法であって、かかる治療が必要な被験体に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩、および／またはDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸のカルシウム塩の有効量を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００４５】
本発明者らは、上記方法で作成したGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩とポリペプチドのカルシウム塩の混合物の使用が、細胞を抑制性炎症促進性サイトカインに暴露した時でさえ、結合組織の細胞同化と、PGおよびHAのような巨大分子成分の細胞生合成を増強すること、および関節炎の動物モデルに投与した時、一緒に免疫抑制および抗炎症性活性を示すことを見いだした。
【００４６】
従って第５の態様において本発明は、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩とDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドのカルシウム塩の使用を提供する。
【００４７】
本発明はまた、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法であって、かかる治療が必要な被験体に、少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩およびDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドを投与することを含んでなる方法を提供する。好ましくはGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩は、DNAを実質的に含まない。GAG-ペプチド複合体とポリペプチドのカルシウム塩は、結合組織から、好ましくは気管軟骨から、さらに好ましくはウシ気管軟骨から、上記方法により同時単離される。
【００４８】
第６の態様において本発明は、少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩およびDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドのカルシウム塩を、薬剤学的に許容される担体とともに含んでなる医薬組成物を提供する。好ましくはGAG-ペプチド複合体のカルシウム塩は、DNAを実質的に含まない。
【００４９】
第７の態様において本発明は、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドの使用を提供する。
【００５０】
本発明はまた、治療が必要な被験体に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドを投与することを含んでなる、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患の治療方法を提供する。
【００５１】
第８の態様において本発明は、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドを薬剤学的に許容される担体とともに含んでなる医薬組成物を提供する。
【００５２】
本発明の第１の態様の方法は、使用される結合組織に対して基本的に非破壊的である。すなわち、培地中にGAG-ペプチド複合体とポリペプチドを放出した後に自己溶解培地から除去される残存組織粒子は、コラーゲン誘導体の供給源として使用することができる。この点で、軟骨のような結合組織からChSを調製する従来法は、徹底的なタンパク質分解的または化学的消化を使用して、マトリックスのタンパク質性成分を破壊し、水溶液中にChSを放出させ単離する。本方法により得られる残存組織粒子は、タンパク質分解的または化学的に加水分解することができ、次に精製して、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患の、結合組織の治療、防御および回復のために、または創傷治癒の増強のために、または細胞培養、細胞移植のための人工的バイオマトリックスの製造のために、または薬剤や増殖因子を含む生物活性化合物の宿主組織への送達のために使用される、種々の分子量サイズのコラーゲンペプチドが得られる。
【００５３】
第９の態様において本発明は、残存組織粒子を加水分解してコラーゲンペプチドを得る工程をさらに含む、本発明の第１の態様の方法を提供する。
【００５４】
本発明はまた、上記方法により調製されるコラーゲンペプチドを提供する。
【００５５】
本明細書を通して、特に明記しない場合は、用途「含む」またはその変形（例えば「含んでなる」）は、記載の要素、整数または工程、または要素、整数または工程の群を含むが、任意の他の要素、整数または工程、または要素、整数または工程の群を排除するものではないことを理解されたい。
【００５６】
本発明がより明瞭に理解できるように、以下の例と図面を参照して好適な型をさらに記載する。
【００５７】
DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体とポリペプチドは、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のために、直接またはさらなるプロセシング後に使用される。
【００５８】
これらの化合物はDNAを実質的に含まないため、DNAに関係しているウイルスのような他の分子も実質的に含まない。そのような関連分子を避けることは、健康リスクを避けることができるであろう。ウシおよび他の動物の核酸は、レトロウイルスや、伝染性の海綿状脳症（例えばヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病、クールー、Gerstmann-Straussler-Scheiner症候群、ヒツジやヤギのスクレーピー、およびウシのウシ海綿状脳症）の伝搬に関与しているといわれる熱／プロテイナーゼ耐性プリオンタンパク質に、強く結合するかまたは複合体を形成する。
【００５９】
GAG-ペプチド複合体のカルシウム塩は、マトリックスポリペプチドと組合せてさらに増強される特定の薬理学的有効性を有することがわかった。カルシウム塩の摂取は、食餌カルシウムの供給源であるという追加の利点を与えるであろう。
【００６０】
本発明の方法は、使用される結合組織に対して基本的に非破壊的である。すなわち自己溶解が完了し、GAG-ペプチド複合体とポリペプチドを含む培地が除去された後に残存する組織粒子は、コラーゲン誘導体の供給源として使用することができる。この点で、結合組織（例えば、軟骨）からChSを調製するための伝統的な方法は、徹底的なタンパク質分解的または化学的消化を使用して、マトリックスのタンパク質性成分を破壊し、水溶液中にChSを放出させ単離する。本発明の方法により得られる残存軟骨粒子は、タンパク質分解的または化学的に加水分解して、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性疾患の、結合組織の治療、防御および回復のために、または創傷治癒の増強のために、または細胞培養、細胞移植のための人工的バイオマトリックスの製造のために、または薬剤や増殖因子を含む生物活性化合物の宿主組織への送達のために使用される、種々の分子量サイズのコラーゲンペプチドが得られる。
【００６１】
前記で広く記載した本発明の精神または範囲を逸脱することなく、具体例で示されるように、本発明に多くの変更および／または修飾をすることができることは当業者により理解されるであろう。従って本例は、すべての点で例示的であり決して限定的ではないと見なされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
略語と定義：
繰り返しを避けるために、および本発明の方法により軟骨から単離される生成物のこの定義を明瞭にするために、これらは省略され、まとめてペプタカン（P）と呼ぶ。本明細書に記載の方法により単離される異なるペプタカンは、添え字の付加により同定される。すなわち：
カルシウムペプタカン（CaP）−は、ウシ気管軟骨粉末を、37℃で0.1Ｍの酢酸カルシウム（pH4.5）での自己溶解に付すことにより得られる水溶性生成物である。
【００６３】
ナトリウムペプタカン（NaP）−は、ウシ気管軟骨粉末を、37℃で0.1Ｍの酢酸ナトリウム（pH4.5）での自己溶解に付すことにより得られる水溶性生成物である。
【００６４】
水ペプタカン（H2OP）−は、ウシ気管軟骨粉末を、37℃で0.1Ｍの希酢酸（pH4.5）での自己溶解に付すことにより得られる水溶性生成物である。
【００６５】
dCaP−は、H2Oに対して透析したCaPである。
【００６６】
dNaP−は、H2Oに対して透析したNaPである。
【００６７】
dH2OP−は、H2Oに対して透析したH2OPである。
【００６８】
pCaP−は、ゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィーにより精製したCaPである。
【００６９】
pNaP−は、ゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィーにより精製したNaPである。
【００７０】
pH2OP−は、ゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィーにより精製したH2OPである。
【００７１】
実験プロトコール
ウシ、ヒツジ、シカまたはブタ気管軟骨もしくは鼻軟骨、ニワトリの胸骨、または骨格サメ軟骨またはシカ枝角軟骨から、接着する軟組織を機械的にまたはすでに記載のように（US Patent 5,399.347  Mar 1995, US Patent 5,364,845 Dec 1996, US Patent 6,025,327 Feb 2000）除去した。これらのきれいにしたヒアリン軟骨を水で洗浄し、１mm〜３mmのサイズに切り刻み、凍結乾燥し、−20℃に保存した。ウシ気管のコンドロイチン硫酸A（ChSA）は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（アメリカ合衆国）から購入したか、またはビオイベリカ（Bioiberica））（バルセロナ、スペイン）からの供与である（バッチ1/0015、バッチ05/2001、バッチ18/11/99）。他のすべての化学品は、分析グレードであり、地方の業者から購入した。
【００７２】
軟骨粉末からのグリコサミノグリカンペプチド（GAG-ペプチド）複合体とポリペプチドの放出
略語で上記で列記した種々のペプタカン生成物を得るために異なるバッファー（例えば、酢酸ナトリウムもしくはカルシウム、または希酢酸）を使用して、軟骨粉末からのGAG-ペプチドおよびポリペプチドの放出の動態についての試験を、種々の条件下で行った。これらの実験の目的は、自己溶解速度と水相への生成物放出の速度に対する、(i) 粒子サイズ−３mm、５mm、(ii) 異なるpH、例えばpH範囲3.5〜7.0、(iii) 異なる温度、４℃、25℃、および37℃、および(iv) 動物種と組織の位置の影響を調べることであった。すべての実験は攪拌しながら行い、硫酸化GAGとポリペプチドの放出を24時間にわたって追跡した。試験は、軟骨からのGAG-ペプチド複合体の放出の動態についての試験は、24時間後にGAG含量の80％以上が、水性培地中に移動できることを示した。試験はまた、放出速度が軟骨粒子サイズに依存し、より小さい調製物がより迅速な放出を受けることを示した。しかし24時間までに、得られた収率は同じであった。pHと温度は、放出速度の重要な決定因子であることがわかり、これは、放出プロセスが固体組織内に存在する内因性酵素により仲介されることを示した。この提唱された機構は、特異的酵素インヒビターの非存在下および存在下で自己溶解実験を行うことにより確認された。N-エチルマレイミドの添加が、水性培地中へのGAG-ペプチドとポリペプチドの放出の最も有意な阻害を与えたため、我々は、システインクラスのプロテイナーゼ（例えば、カテプシン）が自己溶解プロセスへの主要な（唯一ではない）寄与物質であると考えている。
【００７３】
すべての実験で、ろ過により水相を軟骨粉末から分離し、ろ液を遠心分離して微粒子を除去し、次に所望の陽イオンを含有するアルカリ性溶液を添加してpH7.0に中和した。化学分析後のこれらのペプタカン溶液は、凍結乾燥して薬理学的試験に直接使用したか、または精製および／またはコンドロイチン硫酸に変換した。凍結乾燥したペプタカンはまた、後述のように透析し分画した調製物のストック物質として使用した。あるいは、ペプタカンは、軟骨消化物から得られる水溶液から、過剰のアセトン、エタノールまたはメタノールを用いて、通常３〜５×容量の水性抽出物を加えて沈殿させて、単離することができるであろう。こうして得られた調製物は、無水エタノールで洗浄され、真空下で乾燥され、次に真空デシケーター中で保存される。
【００７４】
酢酸カルシウム自己溶解前後のウシ気管軟骨サンプルの組織学的検査
0.1Ｍ酢酸カルシウム（pH4.5）で37℃で24時間処理前および後の切り刻んだ３mmの軟骨サンプルを、10％(v/v)の中性バッファー化ホルマリンで48時間固定した。次に試料を洗浄し、増加する濃度のアルコール（70〜100％v/v）で脱水し、安息香酸メチル／セロイジンで次にパラフィンロウで２重包埋した。ロータリーミクロトームで切片（４μm）を切り、スーパーフロストプラス（Superfrost Plus）（Menzel Glaser, アメリカ合衆国）ガラススライドに接着させた。トルイジンブルー（TB）（硫酸化GAGに結合する色素）とマッソントリクローム（TC）（未変性のコラーゲンに結合する色素）による組織学的染色を、既に記載されている（Hwa S-Y, Burkhardt D, Little C, Ghosh P, 骨関節炎のヒツジモデルにおける軟骨と軟骨下骨に対するジアセレイン（Diacerein）の作用, J Rheumatology, 2001, 28: 825-834）ように制御条件下でバッチで行った。簡単に説明すると、切片を脱パラフィン化し、70％(v/v)アルコールで15分間平衡化させ、次に0.04％(w/v)色素／0.1Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）で10分間染色した。次にこれらを0.1％(w/v)ファストグリーン中で２分間対染色し、イソプロパノール次にキシレンで脱水し、カバーグラスをのせた。
【００７５】
ゲルろ過によるグリコサミノグリカンペプチドサンプルの精製
凍結乾燥したペプタカンを水に溶解して、4.0mg/ml濃度の清澄な溶液を得た。上記ペプタカン溶液の1.0mlを、あらかじめ平衡化したHiLoad 16/60 スーパーデックス200カラムに注入し、0.5Ｍ NaClで流速1.0ml／分で溶出した。画分（2.0ml）を５mlのプラスチックチューブに集めた。各画分のGAG-ペプチドとタンパク質含量を、それぞれ硫酸化グリコサミノグリカン（S-GAG）（Farndale RW, Buttle DJ とBarrett AJ. ジメチルメチレンブルーの使用による硫酸化グリコサミノグリカンの改良された定量と鑑別. Biochim. Biophys. Acta: 883, 173-177）とBCAアッセイ（Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJとKlenk DC. Anal. Biochem. 150, 76-85, 1985）を使用して測定した。S-GAG陽性画分をプールし、凍結乾燥した。これらをpCaPまたはpNaPまたはpH2OPと命名した。
【００７６】
硫酸化グリコサミノグリカン（S-GAG）DMMBアッセイ
ペプタカンの総S-GAG含量を、異染色素1,9-ジメチルメチレン（DMMB）（Farndale RW, Buttle DJとBarrett AJ. ジメチルメチレンブルーの使用による硫酸化グリコサミノグリカンの改良された定量と鑑別. Biochim. Biophys. Acta: 883, 173-177）を使用する反応により測定した。ウシ気管軟骨（ICN、アメリカ合衆国）から得られた市販のコンドロイチン硫酸A（ChSA）を使用して、96ウェルマイクロタイタープレートで標準曲線を作成した。ChSA標準物質とペプタカンサンプルを0.2％蟻酸ナトリウムで希釈した後、DMMB試薬を加え、直ちに535nmで吸収を読んだ。Softmaxソフトウェアを使用して標準曲線を作成し、ペプタカン中のS-GAGの濃度を計算した。
【００７７】
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用するCaPの分析
ペプタカン中のコンドロイチン-4-硫酸（Ch4S）とコンドロイチン-6-硫酸（Ch6S）異性体の比を、基本的にLeeとTieckelman (Lee GJL とTieckelman H. 正常尿中のコンドロイチン硫酸異性体の酵素アッセイにおける高速液体クロマトグラフィーの応用. J Chromatography. 222: 23-31, 1981）が記載した高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して測定した。凍結乾燥したCaPを水に溶解し、次に0.125単位のコンドロイチナーゼABC（SKK、東京、日本）と37℃で一晩インキュベートして消化させた。不飽和の二糖を、高性能アミノカラムで0.2Ｍ酢酸アンモニウム（pH5.5）を移動相として使用して分離し、232nmで比色法で検出した。コンドロイチン硫酸A（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、アメリカ合衆国）のピークと比較してピークを同定した。各ピークの面積をNIH Image1.61.1ソフトウェアを使用して測定した。
【００７８】
ヒドロキシプロリンのアッセイによる調製物中のコラーゲンまたはコラーゲンペプチド含量の測定
軟骨粉末、凍結乾燥ペプタカンまたは抽出後の軟骨残渣のコラーゲン含量を、このタンパク質にユニークなアミノ酸ヒドロキシプロリンの濃度を測定することにより推定した。各凍結乾燥したペプタカンサンプルを直接水に溶解（10mg/ml）し、次に5N HClで110℃で24時間加水分解した。未処理の軟骨粉末または残渣をまずパパインで24時間消化し、次に遠心分離して上清を採取し、次にこれを前記のように5N HClで加水分解した。加水分解したサンプル溶液をpH7に中和した後、希釈と分析を行った。これらの溶液中のヒドロキシプロリン濃度を、StegmanとStalder (Stegman H とStalder K. ヒドロキシプロリンの定量. Clin. Chim. Acta 18: 267-273, 1967）の方法を使用して、L-ヒドロキシプロリン標準物質を使用して、クロラミンTとp-ジメチルアミノベンズアルデヒドを加えて発色させた後、562nmで吸収を測定することにより測定した。ヒドロキシプロリン濃度に7.4を掛けてコラーゲン含量の推定値を得た。
【００７９】
ビシンコニン酸（BCA）アッセイによる調製物のタンパク質含量の測定
軟骨粉末、凍結乾燥した乾燥ペプタカンまたは抽出後の軟骨残渣の総タンパク質含量を、BCAアッセイ（Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ と Klenk DC. Anal. Biochem. 150, 76 - 85, 1985）を使用して測定した。軟骨粉末と軟骨残渣をパパインで16時間消化し、遠心分離して清澄な上清を得た。各凍結乾燥したペプタカンを直接水に溶解して2.0mg/ml溶液を得た。各サンプル溶液20μlを96ウェルプレートのウェルに加えた。アッセイの直前に、50部の試薬１（0.4％ NaOH；1.7％ Na2CO3；0.95％ NaHCO3；1.0％ ビシンコニン酸；0.16％ Na2酒石酸）を試薬２（４％ CuSO4・5H2O）と混合した。このワーキング試薬200μlをサンプル溶液に加えた。37℃で60分間インキュベーション後、Thermomaxマイクロプレートリーダーを使用して吸光度A562を読んだ。ウシ血清アルブミン（BSA）または高度に精製したゼラチン（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））を０〜10μg／ウェルで使用して、標準曲線を作成した。
【００８０】
複合アガロースポリアクリルアミドゲル電気泳動（CAPAGE）
ChSAとペプタカンサンプル（CaP、pCaPまたはパパイン消化CaP）のそれぞれを水に1.0〜3.0mg/mlの濃度で溶解し、次にCAPAGEサンプル添加バッファー（20 mM トリス酢酸, pH6.3, 1 mM Na2SO4, 60% ショ糖および 0.01% ブロモフェノールブルー）と１：１で混合した。10μgのGAGに等しい各サンプル20μlを、２mm厚のCAPAGEゲル（0.6% アガロース, 1.2% アクリルアミド, 10 mM トリス酢酸、pH 6.3 および 0.25 mM 硫酸ナトリウム）のウェルに添加し、CAPAGEランニングバッファー（10 mM トリス−酢酸、 pH 6.3, 0.25 mM Na2SO4）で150Ｖで２時間電気泳動した。ゲルを0.1Ｍ酢酸中の0.02％トルイジンブルーの溶液で１時間染色し、0.5Ｍ酢酸で２時間脱色させ、アガロースゲル結合フィルム上で乾燥させた。乾燥ゲルを水で洗浄し、再度乾燥した。
【００８１】
ゲルろ過クロマトグラフィーを使用するペプタカンの平均分子サイズの測定
HiLoadスーパーデックス200プレップグレードのプレ充填カラム（16mm×60mm）とあらかじめ解析したChS標準物質を使用して、種々のペプタカンとその消化産物の分子サイズを測定した。カラムを0.25Ｍ NaClで少なくとも３時間平衡化させた後、サンプルを添加した。あらかじめ調製したセファデックスG200でクロマトグラフィーをしたウシ気管コンドロイチン硫酸画分（CS1〜CS7）を、分子サイズ標準物質として使用した（Melrose J とGhosh P, ファストプロテイン液体クロマトグラフィーによるグリコサミノグリカンの平均分子サイズの測定. J Chromatography, 1993, 637; 91-95）。1.0mlの標準物質（0.5mg/ml）またはペプタカン（CaP、H2OPおよびpCaP）（1.0mg/ml）をカラムに添加し、0.25Ｍ NaCl溶液を使用して１ml／分の流速でクロマトグラフィーを行った。画分（1.0ml）を５mlのプラスチックチューブに集めた。各画分のGAG含量をS-GAGアッセイで測定した。CS1〜CS7の分子量対分配係数（Kav）を使用して標準曲線を構築した。
【００８２】
SDS-PAGE電気泳動によるペプタカン中のタンパク質の分析
ChSA（シグマ（Sigma））とCaPを水に溶解し、次に２×サンプル添加バッファー（0.07 M トリス塩酸, 1.5% SDS, 20% グリセロール, 0.2M DTT および 0.1% BPB）と１：１で混合して、最終濃度4.0〜20mg/mlを得た。サンプルを水浴中で５分間沸騰させた。上記サンプル20μlを８〜16％の成形済みのトリス−グリシンゲル（ノルベックス（Norvex））のウェルに添加した。SeeBlue前染色低分子量範囲のタンパク質マーカー（ノルベックス（Norvex））をゲルの左側のウェルに添加し、125Vで２時間電気泳動を行った。ゲルをクマシーブルーR250溶液（40％エタノール、10％酢酸、および0.2％クマシーR250）中で30分間染色し、10％エタノールと7.5％酢酸を含有する溶液中で16時間脱色した。ゲルをバイオラッド（BioRad）Gelairドライヤーで乾燥した。
【００８３】
UV分光法を使用するペプタカンと市販のコンドロイチン硫酸中のDNAの測定
コンドロイチン硫酸（ビオイベリカ（Bioiberica）またはシグマ（Sigma））およびペプタカン（CaP、NaPおよびH2OP）を水で1.0mg/mlで調製した。100μlの各サンプルをマイクロキュベットに入れ、220〜320nmの波長範囲で分光光学的にスキャンした。各サンプルについて三重測定で吸光度曲線、A260とA280を記録した。UVスペクトルで260nmの波長でこれらの調製物の濃縮水溶液による光の吸収は、存在するDNAレベルの尺度を与え、280nmでのこれらの溶液の吸収は、タンパク質含量の尺度と考えられる。A260対A280値の比は一般的に、DNA純度の指数として使用され、比が1.5より大きい時は、DNAの多い調製物を示すと考えられる。
【００８４】
ヘキスト33258色素結合アッセイを使用するペプタカンと市販のコンドロイチン硫酸中のDNAの測定
コンドロイチン硫酸（ビオイベリカ（Bioiberica）またはシグマ（Sigma））およびペプタカン（CaP、NaPおよびH2OP）を水で1.0mg/mlで調製し、蛍光アッセイ（ヘキスト33258色素がDNAに結合すると蛍光が変化する）を使用して二重測定でDNA含量を測定した（Kim YJ, Sah RLY, Doong J-YH, Grodzinsky AJ. ヘキスト33258を使用する軟骨外植片中のDNAの蛍光アッセイ. Anal Biochem. 1988;174:168-176）。軟骨調製物のために、上記文献でKimら（1988）が記載したように、パパインによるプレ消化を使用した。簡単に説明すると、96ウェルプレートの各ウェルにヘキスト33258色素溶液を100μl／ウェル加えて、次に100μlのChSまたはペプタカンまたはパパイン消化したサンプルを加えて測定した。プレートを静かに５分間攪拌した後、励起波長と測定波長をそれぞれ350nmと450nmでスリット幅10nmと15nmを使用して蛍光を測定した。UVスペクトル比A260対A280が1.85の子ウシ胸腺DNA（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））（０〜25μg/ml）を使用して標準曲線を作成し、この標準物質に対して調製物のDNA含量を測定した。DNAの結果はサンプルの乾燥重量の％として示した。
【００８５】
BIAcore2000を使用するリゾチーム、エラスターゼおよびヒアルロニダーゼに対するCaPとChSAの結合親和性の測定
CaPまたはChSAとリゾチーム、エラスターゼまたはヒアルロニダーゼの分子的相互作用を、表面プラスモン共鳴（SPR）バイオセンサー装置（BIAcore2000システム、ファルマシアバイオセンサー（Pharmacia Biosensor）AB）を使用して調べた。リゾチーム（ニワトリ卵白、シグマ（Sigma））、エラスターゼ（ヒト好中球、ICN）、またはヒアルロニダーゼ（ウシ睾丸IV型、シグマ（Sigma））を、10mM酢酸ナトリウム（pH6.0）に100μg/mlで溶解し、アミンカプリング法を使用してCM5センサーチップに固定化した。まずCaPまたはChSAを水に溶解し、次に標準的HBSランニングバッファー（10 mM ヘペス, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% 界面活性剤 P20）で希釈して2.5μg/mlとした。バックグラウンドのセンサグラムを記録するのに使用される１つのフローセル（リガンドを引く）を含む４つのセルで別々に、固定化酵素へのCaPまたはChSAの結合を測定した。200μlのCaPまたはChSA溶液を、固定化チップ表面に個々に注入し、流速50μg／mlで25℃で分子相互作用を追跡した。センサグラムを記録し、システムに取り付けたBIAevcaluation3.1ソフトウェアを使用して評価した。
【００８６】
ペプタカンとコンドロイチン硫酸Aによるヒト好中球エラスターゼ（HNE）の阻害
コンドロイチン硫酸A（ChSA）とペプタカンのストック溶液を、HNEアッセイバッファー（50 mM リン酸ナトリウム, pH 7.4, 0.1% BSA, 0.025% Triton X-100）で2.5mg/mlで調製し、4.9〜1250μg/mlの範囲の濃度を有する溶液が得られるように連続希釈した。三重で希釈したサンプル（100μl）をマイクロタイタープレートのウェルに移し、ここにHNEアッセイバッファー中の2.0μg/mlヒト好中球エラスターゼ（HNE）50μlを加え、プレートを37℃で10分間インキュベートした。基質溶液（12.5% DMSOおよび 87.5% アッセイバッファー中100μlの0.5 mM SAAVNA）を各ウェルに加え、吸光度を405nmで４回30分間隔で読んだ。エラスターゼ阻害速度を対照速度のパーセントとして表し、阻害アッセイの％残存HNE活性対インヒビター濃度のプロットを作成した。
【００８７】
ヒツジ軟骨細胞培養物
新たに調製したまたは低温保存した初代ヒツジ関節軟骨細胞を液体窒素保存から取り出し、直ちに水浴で37℃で融解し、50μg/mlのゲンタマイシンを含有する培地で２回洗浄した。細胞を２×105 細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、空気中５％ CO2の雰囲気で37℃で４日間増殖させた。培地を２日毎に交換した。
【００８８】
3H-メチルチミジン取り込みアッセイを使用するヒツジ軟骨細胞によるDNA合成に対するペプタカンとコンドロイチン硫酸の作用
コンドロイチン硫酸A（ChSA）またはペプタカン（CaP、NaPまたはH2OP）で刺激したヒツジ軟骨細胞中のDNA合成を、この核酸への3H-メチルチミジンの取り込みにより二重測定した。細胞培養物を、10％FCSと50μg/mlゲンタマイシンを含有するDMEM/F12培地2.0ml中の単層培養で３日間維持した後、サンプルを加えた。ChSAまたはペプタカンを、上記培地中1.95、3.91、7.81、15.6、31.3、62.5、125、250、500 および 1000 μg/mlの濃度で加え、空気中５％ CO2の雰囲気で37℃で24時間（短期）または６日間（長期）インキュベートし、次に0.25μCi／ウェル 3H-メチルチミジンでさらに24時間インキュベートした。次に細胞を採取し、DNA中の放射活性をベータカウンターを使用して測定した。データは平均値±SEMとして表した。
【００８９】
蛍光アッセイを使用するDNAに対するペプタカンとコンドロイチン硫酸の作用
ヒト滑膜繊維芽細胞（HSF）中のDNA合成を、ヘキスト33258色素を用いた蛍光アッセイを使用して二重測定により測定した。骨関節炎患者の関節からのHSFを、６ウェルプレート中単層で24時間培養した。次にChSAまたはペプタカンの連続濃度を、10％ FCSと50μg/mlゲンタマイシンを含有するDMEM培地中62.5、125、250、500、1000および2000μg/mlで加えた。培養物を空気中５％ CO2の雰囲気で37℃でさらに24時間維持した。トリプシン／EDTA（0.2％／0.1％）処理により細胞をはがし、次にパパイン消化した。96ウェルプレートにヘキスト33258色素溶液100μl／ウェルを加え、次にパパイン消化サンプル100μlを加えた。プレートを静かに５分間攪拌した後、励起波長と測定波長をそれぞれ350nmと450nmでスリット幅10nmと15nmを使用して蛍光を測定した。子ウシ胸腺DNA（０〜25μg/ml）を標準物質として使用した。
【００９０】
35SO4取り込みアッセイを使用するヒツジ軟骨細胞によるプロテオグリカン（PG）合成に対するペプタカンとコンドロイチン硫酸A（ChSA）の作用
上記のように調製した初代ヒツジ関節軟骨細胞を、２×105 細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、４日間増殖させた後、10％ FCSと50μg/mlゲンタマイシンを含有するDMEM/F12培地中2.0mlの異なる濃度のChSAまたはペプタカン（CaP、NaPまたはH2OP）を加えた。10ng/mlの組換えヒトIL-1の存在下または非存在下で化合物を加えた。培養物をさらに３日間増殖させた。次に40μCi／ウェルの35SO4を加え、24時間後培養を停止させた。37℃でさらに24時間インキュベート後、マイクロフュージチューブ中に馴化培地を集めた。細胞を冷PBSで２回洗浄し、次に0.2％トリプシン／0.1％ EDTA溶液でトリプシン処理した。細胞懸濁液を採取し、1310×ｇで５分間遠心分離した。
【００９１】
0.5mlの馴化培地に0.5mlのパパイン消化バッファー（２μg/mlパパイン懸濁液、PBS（pH6.2）中５mMシステイン）を加えて、35SO4標識GAGを放出するためのパパイン消化を行い、細胞ペレットとその細胞外マトリックスを0.5mlのパパイン消化バッファーに直接再懸濁し、60℃で一晩インキュベートした。以下の方法により新たに合成した35硫酸化PG（35S-GAG）を遊離の35SO4から分離した：各パパイン消化サンプル0.4mlに、0.2mlの0.2M Na2SO4プラス50mg/ml CSA（１：１）を加えボルテックス混合した。次に0.1mlの0.4M BaCl2を各チューブに加えボルテックス混合した。混合物を1310×ｇで10分間遠心分離し、0.4mlの上清を別のチューブに移した。0.1mlの50mg/ml CSAプラス0.4M BaCl2（２：５）ミックスを加えた。次に0.1mlの0.2M Na2SO4を加え、1310×ｇで10分間遠心分離した。最後の工程を１回繰り返した。0.1mlの上清をポニーバイアルに移し、次に３ml/バイアルのEco-liteシンチレーション液を加え、完全に混合した。次にサンプルを自動β-カウンター（Canberra Packard 1500 液体シンチレーションアナライザー)で計測した。
【００９２】
ヒツジ線維軟骨細胞培養物
ヒツジ後膝関節の皮膚と重なる筋系を取り出し、外部関節嚢に70％エタノールを噴霧した。次に関節を層流フード中で開いた。半月板を取り出し、無菌PBSで洗浄し、２つの部分に切断した（内部と外部領域）。内部および外部半月板組織を個々に小片に切り裂き、培地（10％ FCSと50μg/mlゲンタマイシンを含有するDMEM）中の0.2％プロナーゼで２時間別々に消化し、次に0.04％コラゲナーゼ消化を一晩行った。
【００９３】
消化物を70μmメッシュで３回ろ過し、50μgのゲンタマイシンを含有するDMEM培地で洗浄した。細胞を75cmのフラスコに接種し、空気中５％ CO2の雰囲気で37℃で７日間インキュベートしてコンフルエンスにした。細胞を無菌PBSで２回洗浄し、0.2％トリプシン／0.1％EDTA溶液でトリプシン処理し、培地で２回洗浄した。細胞を２×105 細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに継代し、空気中５％ CO2の雰囲気で37℃で２日間増殖させた。
【００９４】
35SO4取り込みアッセイを使用する線維軟骨細胞によるプロテオグリカン（PG）合成に対するペプタカンとコンドロイチン硫酸の作用
ヒツジ半月板の内部または外部領域からの初代継代線維軟骨細胞を２×105 細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、２日間増殖させた後、DMEM/F12中の2.0mlの異なる濃度のコンドロイチン硫酸A（ChSA）またはペプタカン（CaP、NaPまたはH2OP）を加えた。培養物をさらに３日間増殖させ、次に40μCi／ウェルの35SO4を加えて24時間後、培養を停止した。37℃で24時間インキュベート後、馴化培地をマイクロフュージチューブに集めた。細胞を冷PBSで２回洗浄し、次に0.2％トリプシン／0.1％EDTA溶液でトリプシン処理した。細胞懸濁液を集め、1310×ｇで５分間遠心分離した。
【００９５】
0.5mlのパパイン消化バッファー（PBS（pH6.2）中２μg/mlパパイン、５mMシステイン）を0.5mlの馴化培地に加えてパパイン消化を行い、細胞ペレットを0.5mlのパパイン消化バッファーに直接再懸濁し、60℃で一晩インキュベートした。以下の方法により新たに合成した35硫酸化PG（35S-GAGとして）を遊離の35SO4から分離した：各パパイン消化サンプル0.4mlに、0.2mlの0.2M Na2SO4プラス50mg/ml CSA（１：１）を加えボルテックス混合した。次に0.1mlの0.4M BaCl2を各チューブに加えボルテックス混合した。混合物を1310×ｇで10分間遠心分離した。0.4mlの上清を別のチューブに移した。0.1mlの50mg/ml CSAプラス0.4M BaCl2（２：５）ミックスを加えた。次に0.1mlの0.2M Na2SO4を加え、1310×ｇで10分間遠心分離した。最後の工程を１回繰り返した。0.1mlの上清をポニーバイアルに移し、次に３ml/バイアルのEco-liteシンチレーション液を加え、完全に混合した。次にサンプルを自動β-カウンター（Canberra Packard 1500 液体シンチレーションアナライザー)で計測した。
【００９６】
ヒト滑膜繊維芽細胞培養物
骨関節炎患者の関節から得られた低温保存したヒト滑膜繊維芽細胞（HSF）を、直ちに水浴で37℃で融解した。層流フード中で、ピペットを使用してクリオバイアル中の全細胞懸濁液を15mlの無菌遠心分離管に移した。遠心分離管を室温で800ｇで10分間遠心分離した。上清を捨て、無菌ピペットで吸引することにより10％ FCSと50μg/mlゲンタマイシンを含有する10mlのDMEM培地中に、細胞ペレットを完全に再懸濁した。チューブを再度室温で800ｇで10分間遠心分離した。再度上清を捨て、細胞ペレットを10mlのDMEM完全培地に再懸濁した。細胞懸濁液を、適当な数の表示を付けたフラスコに接種し、次に15mlのDMEM完全培地を加えた。細胞を空気中５％ CO2の雰囲気で37℃でコンフルエンスになるまでインキュベートした。培地を２日毎に交換した。細胞を継代するために、フラスコを37℃のインキュベーターから取り出し、細胞を室温でPBSで２回洗浄した。トリプシン／EDTA（0.2%／0.1%）溶液を加え、細胞層の上で回転させた。フラスコに再度キャップをし、37℃で３〜５分間維持した。細胞を顕微鏡下ではがれていないかチェックした。DMEM完全培地（フラスコ当たり２〜３ml）を加え、フラスコの表面を洗浄して放出された細胞を集めた。細胞を遠心分離管に移し、800ｇで10分間室温で遠心分離した。細胞を２回洗浄し、10mlのDMEM完全培地中に再懸濁した。次に血球計数器を使用して細胞を計数した。細胞を1.5×105 細胞／２ml／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、空気中５％ CO2の雰囲気で37℃で24時間増殖させた。
【００９７】
3H-グルコサミン取り込みアッセイを使用するヒト滑膜繊維芽細胞（HSF）によるヒアルロナン（HA）に対するペプタカンとコンドロイチン硫酸Aの作用
HSF細胞を1.5×105 細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し24時間付着させた後、化合物を添加した。コンドロイチン硫酸A（ChSA）とペプタカン（CaPとH2OP）溶液を、10％ FCSと50μg/mlゲンタマイシンを含有するDMEM培地で、培養物で必要な濃度の２倍で調製した。調製した最も高い濃度は4.0mg/mlであり、これは0.22μmフィルターで滅菌し次に連続希釈して、最終濃度2000、1000、500、250、125μg/ml、62.5μg/mlの化合物を得た。各薬剤溶液１mlを６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ストック3H-グルコサミンを培地で希釈して１μCi／ml溶液にして、これを直ちに各ウェルに加えた（１μCi／ウェル）。プレートをさらに24時間インキュベートした。培養が停止後、培地を５mlのキャップ付きチューブに採取し、3H-HA分析のために−20℃で保存した。
【００９８】
スーパーローズ6ゲルろ過クロマトグラフィーを使用する培養物中の3H-ヒアルロナン（3H-HA）の単離と定量
各培地サンプルからの0.5mlの２つのアリコートをAとBとした。すべてのアリコートに20μlの1M酢酸（pH6.0）を加えた。50μlの反応バッファー（20mM 酢酸ナトリウムと0.15M NaCl、pH6.0）をアリコートAに加え、反応バッファー中50μlのTRUストレプトミセス（Streptomyces）ヒアルロニダーゼをアリコートBに加えた。すべてのサンプルを60℃で３時間インキュベートし、次に５分間沸騰させてヒアルロニダーゼを不活性化させた。サンプルを、ゲルろ過するまで−20℃に保存した。
【００９９】
スーパーローズ6をあらかじめ充填したゲルろ過カラムを使用して、培地中に3H-HAを単離し同定した。培地サンプルを高速でベンチマイクロフュージで10分間遠心分離した後、直ちにカラムに添加した。サンプル（各200μl）をサンプルループからカラムに注入し、カラムをPBSバッファー（0.15M NaCl、0.05M Na2PO4、pH7.2）で流速0.2ml／分で溶出した。カラム溶出液を0.5ml/画分で全部で46画分集め、βシンチレーションカウンターを使用して放射活性を測定した。
【０１００】
ウサギ関節炎モデルにおける関節炎症性メディエーター、白血球数およびヒアルロナンのex vivo滑膜繊維芽細胞生合成に対するコンドロイチン硫酸またはカルシウムペプタカンの経口投与の作用についての試験
本実験で使用したウサギ関節炎モデルについて得られた理論、方法および病的結果は、別のところで詳細に記載されている（Page-Thomas DP: 滑膜分解の状況. Bayer-Symposium, 慢性炎症性疾患の実験モデル, 353-365 (1977), Springer-Verlag, Berlin; Cambrayら, 増殖性関節炎のウサギの関節からの滑膜および軟骨外植片によるコラゲナーゼとインヒビター産生に対するデキサメタゾンのin vitroの作用, Rheumatol Int, 1981, 1: 69-72;  Smithら, ヒアルロン酸−ポリリジン複合体の動脈内注入によるウサギ関節で発生する炎症と軟骨分解に対する経口投与カルシウムペントサンポリ硫酸の作用. Arthritis and Rheumatism, 1994, 37: 125-136）。本試験では、約４ヶ月齢のオスのニュージーランド白色ウサギを使用し、収容ケージ中で７日間馴化させた。次に以下のプロトコールに示す基準に従って動物を５つの実験群に分けた。
【０１０１】
実験プロトコール：
A群（n=4）非薬剤処理、７日目にポリ陽イオン（ポリリジン）−ヒアルロナン複合体（PC）をウサギの１つの膝関節に動脈内注入し、等量の等張食塩水を反対側の膝関節に注入した。
【０１０２】
B群（n=4）PCを１つの膝関節に動脈内注入し、等張食塩水を反対側の膝関節に注入したが、PC注入前７日目に開始して14日間毎日、300mg/kg（体重）のコンドロイチン硫酸（ビオイベリカ（Bioiberica）、バッチ#18/11/99）を動物に経口投与した。
【０１０３】
C群（n=4）PCを１つの膝関節に動脈内注入し、等張食塩水を反対側の膝関節に注入したが、PC注入前７日目に開始して14日間毎日、300mg/kg（体重）のCaPを動物に経口投与した。
【０１０４】
D群（n=4）PCを１つの膝関節に動脈内注入し、等張食塩水を反対側の膝関節に注入したが、PC注入前７日目に開始して14日間毎日、200mg/kg（体重）のCaPを動物に経口投与した。
【０１０５】
E群（n=4）PCを１つの膝関節に動脈内注入し、等張食塩水を反対側の膝関節に注入したが、PC注入前７日目に開始して14日間毎日、100mg/kg（体重）のCaPを動物に経口投与した。
【０１０６】
B群〜E群の動物に７日間薬剤処理をした後、ハロタン／亜酸化窒素／酸素（２：１：２、O2とN2Oの流速＝それぞれ１および２リットル／分）で麻酔した。各動物を、動脈内注入する前に少なくとも５分間麻酔し、以後全部で10分間麻酔した。動物に、１mlの無菌の発熱性物質を含まない等張食塩水中のポリ-D-リジン（7.5mg）とヒアルロナン（HA）（7.5mg）の成形済不溶性複合体（PC）を、片方の膝に単回動脈内注入した。この調製物は、注入直前に0.5mlの無菌15mg HA／mlを0.5mlの無菌ポリ-D-リジン／mlとを２mlの無菌シリンジ中で混合して調製した。内部対照とするために、各動物の反対側の膝関節に1mlの無菌等張食塩水を注入した。PC注入後さらに７日間毎日、B群〜E群の動物に薬剤調製物の経口投与を続けた。
【０１０７】
関節炎誘導の７日後、ウサギを前述のようにハロタン／亜酸化窒素／酸素で麻酔し、無菌の14ゲージカテーテルと50mlのシリンジを使用して直接心臓から血液（20〜40ml）を得た。この血液10mlを無菌ガラスEDTA(K3)バキュテイナーチューブに入れて最終希釈を0.7％ EDTAとした。１mlの５％(w/v)クエン酸３ナトリウムにさらに９mlを加え、残りを血清チューブに加えた。血液採取の２時間以内に、後述するように遠心分離法を使用して単核細胞と好中球を分離した。すべての血液サンプルは、絶えず室温で維持した。
【０１０８】
分離と血液白血球数の測定
上記のように採取したEDTA含有血液を使用して、白血球画分を調製した。1.070〜1.072g/mlの密度範囲のパーコール（Percoll）（AMRAD pharmacia、ボローニア、メルボルン、オーストラリア）20mlを、無菌の40ml ソーバル（Sorvall）遠心分離管中に調製した。この最適密度は、まず９部のパーコール原液に１部の無菌1.5M NaClを加えて調製した。次にこのストック溶液を、所望の密度が得られるまで、0.15M NaClで希釈した。
【０１０９】
パーコールと血液の遠心分離
最適密度範囲1.070〜1.072g/mlのパーコールを、ソーバルRC-5遠心分離機で固定アングルロータを使用して室温で10,000×ｇで20分間遠心分離してゲルを形成させ、これは白血球の良好な分離を与える。次に、採取した血液4mlをあらかじめ形成した密度勾配の上に重層し、ベックマン（Beckman）TJ-6遠心分離機でスイングバケットロータを使用して室温で1000×ｇで20分間遠心分離した。密度バイアル１〜７（AMRAD、ファルマシア（Pharmacia））のそれぞれから40μlを3720μlの無菌0.15M NaClに加えて、総容量4mlを得た。各AMRADバイアルは、ある密度の着色密度マーカービーズを含有した。７つのバイアルの密度範囲は1.017〜1.102g/mlであった。次に、4mlの密度ビーズ溶液を、20mlのあらかじめ形成したパーコール密度勾配（1.07〜1.072g/ml）の上に重層し、上記のように調製したサンプルチューブを用いて、ベックマン（Beckman）TJ-6遠心分離機でスイングバケットロータを使用して室温で1000×ｇで20分間遠心分離した。この密度マーカーチューブは、サンプルチューブ中で形成された勾配を較正するのに機能する。ウサギの血液について以下の密度範囲を使用した（これらは、ヒト血液についての製造業者の指示とは異なる）：
1. 単核細胞：1.04〜1.06g/ml
2. 好中球：1.06〜1.08g/ml
3. 赤血球：1.08〜1.09g/ml
各サンプルチューブを遠心分離後、記載の密度範囲で吸引して単核細胞と好中球を分離し、別々の遠心分離管に入れた。これらの細胞を３容量の0.15M NaClを用いて、ベックマン（Beckman）TJ-6遠心分離機でスイングバケットロータを使用して室温で1000×ｇで10分間遠心分離して洗浄した。単核細胞と好中球の細胞ペレットを500μl PBSで再懸濁した。各細胞懸濁液から50μlを50μlのトリパンブルー溶液に加え、血球計数器を使用して細胞数を定量した。単核細胞から50μlアリコートを使用して100分画スライドを作成した。この方法は、好中球、リンパ球および単核細胞のパーセントの測定を可能にした。サイトスピン遠心分離を使用してスメアを作成した。
【０１１０】
細胞培養のための関節からの滑膜の切開と採取
関節に70％(v/v)エタノールを充分噴霧し、層流キャビネットの無菌環境への輸送のために、４℃のきれいなプラスチックバッグに入れた。ラット歯状のピンセットと22番メスを使用して、腱と過剰の筋肉組織を、嚢を開くことなく関節から除去した。
【０１１１】
小さいラット歯状のピンセットと11番メスを使用して、後から無菌的に関節嚢を開き、十字靭帯の後部挿入部を切断して関節離断を行った。滑膜の膝蓋骨と結合した膝蓋骨上マウンドを、11番メスを使用して完全に除去した。次に、この組織を組織学的処理のために10％(v/v)中性バッファー化ホルムアルデヒドを充填した標識試料容器に入れた。次に、過剰の滑膜下組織が入るのを避けながら、小さいラット歯状のメスと11番の刃による切開を用いて関節裏層の片を切り出して、残りの滑膜を採取した。次に、採取した片を、10mlの無菌PBSを含有する表示したシャーレ中に浮かせた。
【０１１２】
滑膜繊維芽細胞単離
シャーレ中の滑膜を細かく切り、次に細い先端（無菌22番の刃を使用して）を有する無菌のプラスチックピペットを使用して、5mlの無菌遠心分離管に移した。チューブを1500〜2000rpmで20℃で10分間遠心分離し、細胞ペレットを５mlの無菌T&E［PBS中0.2％(w/v)トリプシン／0.1％(w/v) EDTA］に再懸濁した。チューブを一晩４℃（冷トリプシン処理）に入れ、次に37℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、５mlのDMEM／10％ FCSを加え（トリプシンを不活性化するため）、次にチューブを20℃で2000rpmで10分間再度遠心分離し、ペレットと浮遊脂肪層の間のトリプシン／FCS溶液を除去した。総量10mlになるように無菌DMEM／10％ FCSを加え、ペレットを再懸濁した。チューブを2000rpmで20℃で10分間再遠心分離した。DMEM／10％ FCS溶液を除去し、ペレットをDMEM／10％ FCS中２mg/mlのコラゲナーゼに再懸濁した。チューブを37℃のインキュベーターに３時間入れ、次にコラゲナーゼ溶液（脂肪層を含む）を取り出し廃棄した。沈殿ペレットを、無菌プラスチックピペットを使用して10mlのDMEM／10％ FCSに再懸濁した。２×５mlアリコートの細胞懸濁液を２×25cm2の組織培養フラスコ中に入れ37℃でインキュベートした。２〜３日毎に培地をルーチンに交換した。フラスコの１つが〜90％コンフルエントになった時、HA合成を測定するのにこれを使用した。他のフラスコがコンフルエントになった時、細胞を継代した。
【０１１３】
滑膜繊維芽細胞によるin vitroのHA生合成
上記で調製した滑膜繊維芽細胞を６ウェルプレートに200,000細胞／ウェルで蒔き、24時間付着させた。各ウェルに２mlのDMEM＋10％(v/v) FBS、次に3H-グルコサミン（ストックは１μCi／μl）を加え、プレートを24時間インキュベートした。その後、フラスコをインキュベーターから取り出し、４℃で冷却し、培地を除去して、表示した15mlの遠心分離管に入れた。培地を除去しながら、各フラスコを0.5mlの非無菌PBSで２回静かに洗浄し、これを同じ表示した15mlの遠心分離管に加えた。PBS洗浄後、1mlのT&Eを各ウェル中の細胞層に直接加えた。プレートを37℃で10分間インキュベートした。放出された細胞懸濁液を表示した５mlのチューブに移し、フラスコを0.5mlのパパインバッファーで洗浄し、洗浄液を同じチューブに加えた。
【０１１４】
細胞により合成された放射能標識HAの測定
各培地サンプルの２×0.5ml アリコートをAとBとした。すべてのアリコートに20μlの１Ｍ酢酸（pHを約4.0に調整するために）を加えた。Aと表示した各サンプルに、50μlの20mM 酢酸ナトリウム／0.15M NaCl（pH6.0）を加えた。Bと表示した各サンプルに、５TRUのストレプトミセス（Streptomyces）ヒアルロニダーゼ（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））を含む50μlの20mM 酢酸ナトリウム／0.15M NaCl（pH6.0）を加えた。すべてのサンプルを60℃で３時間インキュベートし、５分間沸騰させて、ストレプトミセス（Streptomyces）ヒアルロニダーゼを不活性化した。次にサンプルを−20℃で保存した後、スーパーローズ6ゲルクロマトグラフィーとヒト滑膜繊維芽細胞によるHA合成についてすでに上記したように、HAに取り込まれた放射活性の測定を行った。
【０１１５】
滑膜組織の免疫組織化学
上記切開法を使用して関節から滑膜の膝蓋骨と膝蓋骨上マウンド全体を取り出し、膝蓋骨と接着している滑膜（および任意のパンヌス）を半分に切断し、各半分を中性バッファー化ホルマリンを有する試料容器に入れた。染色した組織切片と染色していない組織切片の処理と調製は、上記したように行った。
【０１１６】
誘導性亜酸化窒素シンターゼ（iNOS）の免疫局在化
４ミクロンの膝蓋骨／滑膜切片を水に脱パラフィン化した。内因性ペルオキシダーゼを３％ H2O2で５分間ブロックした。抗原性部位を暴露するために、10mMクエン酸バッファー（pH6.0）を使用して高温熱修復を行った。非特異結合を無血清タンパク質ブロックを用いて10分間ブロックした。次に切片をiNOSに対する１次抗体ポリクローナル抗血清（ケイマンケミカルズ社（Cayman Chemicals In.））１：1000と４℃で一晩インキュベートした。使用した陰性対照試薬は、タンパク質濃度が一致した非免疫ウサギ血清である。検出系は、酵素標識として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ダコビオロジクスPty社（Dako Biologics Pty Ltd））とともに市販のアビジン−ビオチンを使用した。ビオチン化ヤギ抗ウサギおよびビオチン化ヤギ抗マウス（ダコビオロジクスPty社（Dako Biologics Pty Ltd））の２次抗体カクテルを、室温で15分間適用した。次にペルオキシダーゼ（ダコビオロジクスPty社（Dako Biologics Pty Ltd））に結合したストレプトアビジン中でスライドを15分間インキュベートした。ペルオキシダーゼ活性を3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）を使用して検出した。切片をMayerのヘマトキシリンで１分間対染色し、脱水し、キシレンで洗浄し、Euckittにマウントした。
【０１１７】
ニトロチロシンの免疫局在化
使用した方法は、別の関節炎モデルのウサギ軟骨についてKobayashiら（2001）が記載したものと同じである（Kobayashi K,ら, 部分的関節半月板摘除後の内側半月板における軟骨細胞アポトーシスと亜酸化窒素の領域差別的発現. J Orthopaedic Res, 2001, 19: 802-808）。
【０１１８】
統計的方法
PCと食塩水注入関節データの差を、対応のあるｔ検定（paired t-test）を使用して評価した。未処理、薬剤処理および非薬剤処理PCもしくは食塩水関節データを、対応の無いｔ検定を使用して毎日比較した。組織学的スコア（ノンパラメトリックデータ）は、Wilcoxonの符号付き順位検定を使用して解析した。解析は、アップルマッキントッシュのパワーPCでMicrosoft Excel 98またはStatview 5.0 を使用して行った。0.05より小さいP値を有意と見なした。
【０１１９】
結果と考察
本発明者らは、pH範囲4.0〜7.0特に4.5に37℃で最大36時間、特に16時間または24時間維持した水性バッファー中で、軟骨粒子を自己溶解に付すと、GAG-ペプチド複合体とマトリックス由来ポリペプチドを溶液中に特異的に放出するが、組織細胞およびその細胞内巨大分子成分は基本的にそのまま残すという、予想外かつ驚くべき発見をした。この点で我々は、細胞内巨大分子成分のマーカーとしてDNAを使用し、本発明により得られた自己溶解培地はDNAを実質的に含まないことを証明した。さらにこれらの放出されたGAG-ペプチド複合体（任意にペプタカンと定義する）は、単独または他の同時放出ポリペプチドとともに使用すると、市販のChSより薬剤学的に活性がより高い。
【０１２０】
これらの軟骨産物の放出は、大きい粒子より小さい粒子でより迅速であった（図１）。しかし、この成分についての分析により証明されるように、粒子サイズに無関係にいずれの軟骨を37℃で24時間インキュベートしても、総組織硫酸化GAGの75〜83％が溶液中に放出された（図１）。
【０１２１】
この方法の効率と選択性はまた、軟骨粒子を本発明の方法に付す前および後の組織学的分析により確認された。図２は、37℃で100mM 酢酸カルシウムバッファー（pH4.5）を使用して自己溶解法に付す前および後の、３μmのウシ気管軟骨粉末の組織学的切片の顕微鏡写真を示す。パネルAとCは、自己溶解処理前の軟骨切片であり、パネルBとDは後の切片である。パネルAとBは、トルイジンブルー（TB）（グリコサミノグリカン（GAG）に結合する色素）による染色の結果であり、CとDは、マッソントリクローム（マッソンTC）（未変性のコラーゲン繊維をマゼンタ色に染色することが知られている色素）で染色した切片を示す。自己溶解後に切片BでGAGの染色の喪失が見られるが、Dに示すようにGAGのほとんどを除去するとコラーゲンの染色強度がわずかに上昇することに注意されたい。これらの切片で緑の対染色で同定される細胞核は、自己溶解処理により明らかに変化しない。すべての切片は倍率×400で示す。
【０１２２】
図２から明らかなように、これらの分子に対する陽イオン性染色（トルイジンブルー）を使用した、軟骨粒子中の硫酸化GAGの存在についての染色レベルは、処理前は広範であるが、処理後は低下している。一方、未変性のコラーゲン繊維のマッソントリクローム染色は、自己溶解処理により基本的に変化しない（図２）。重要なことは、上清の除去後およびインキュベーションバッファーによる洗浄後に残存している細胞および核（残存軟骨の両方の染色法を使用して明らかに認識できた）は、大きな影響を受けていないことが観察されたことである（図２）。
【０１２３】
自己溶解プロセスはpHと温度の両方により影響を受けた。図３から明らかなように、ウシ気管軟骨からのペプタカンの最も迅速な放出は、pH範囲4.0〜7.0内で起きた。ペプタカン放出を促進するのに、正常な哺乳動物血液温度の37℃が低温（特に４℃）より有効であり、放出の中間的なレベルは25℃で起きた（図４）。温度とpHの両方のこの放出プロセスへの影響は、自己溶解が、その触媒活性がpH範囲4.0〜7.0で37℃で最適である内因性酵素によるマトリックスプロテオグリカンおよび他の構造タンパク質の切断を介して進むという考えと一致する。この説明は、放出プロセスが、自己溶解バッファー中の軟骨粒子を４℃で維持することにより実質的に遅くなったという観察結果、ならびに放出速度が、37℃でバッファーのインキュベーションにプロテイナーゼの特異的インヒビターを含めることにより顕著に低下したという観察結果（図５）により確認された。図５から明らかなように、自己溶解プロセスの約50％の阻害は、システインプロテイナーゼインヒビターであるN-エチルマレイミドをバッファー溶液に添加することにより達成された。軟骨の主要なシステインプロテイナーゼは、最適pHが3.5〜6.0であるカテプシン（Dingle JT, 細胞周辺環境への酵素の分泌. Phil Trans Royal Soc (London), 1975, 271: 315-324; Barrett AJ と McDonald JK, Mammalian Proteases, Academic Press, London, New York, 1980, pp338-350; Barrett AJ ら, リソソームシステインプロテイナーゼ, ISC Atlas Sci Biochemistry, 1988,1: 256-260, Muller-Ladner U, Gay RE, Gay S, 関節炎と炎症におけるシステインプロテイナーゼ, Perspectives in Drug Discovery and Design, 1996, 6:87-98）であるため、これらの酵素が本発明のマトリックス成分の自己溶解的分解の大きな原因である可能性が高い。しかしマトリックス成分の分解は、N-エチルマレイミドによっては完全にはなくならないため、他のクラスのプロテイナーゼが明らかに関与している。セリンプロテイナーゼインヒビターであるベンズアミジンは放出に対して観察し得る効果は無かったため、このクラスのプロテイナーゼは排除されるようである。しかし、すでに中性pHで軟骨マトリックス成分を分解することが証明されているマトリックス金属プロテアーゼ（Birkedal Hansen H, et al., マトリックス金属プロテアーゼ：総説. Critical Rev Oral Bio Med, 1993, 197: 197-250）とアグレカナーゼ（Ilic MZC, Handley CJ, Robinson HC, Mok MT, 関節軟骨によるアグレカン異化の機構, Arch Biochem Biophys, 1992, 294:115-122）が、可能性のある候補である。
【０１２４】
本明細書ですでに記載したように、これらの内因性酵素により産生されるマトリックス分解産物は、結合組織をパパインまたは他の起源のプロテイナーゼで消化して産生されるものとは構造的に異なる。薬剤と生物薬剤の薬理活性はその組成と構造に決定的に依存するため、我々は本発明の方法により作成されるペプタカンと他の自己溶解産物は、内因性酵素（例えば、パパイン、キモパパイン、ブロモライン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼまたは組織自体から特異的には得られない他の酵素）により軟骨を消化するのみでは再現することができないと考えている。
【０１２５】
本発明の自己溶解プロセスの効率はまた、軟骨が得られる動物種とその解剖学的位置により影響される。以下の表１から明らかなように、ウシ気管軟骨と鼻軟骨は、37℃で24時間以上インキュベートすると最高収率のペプタカンを与えた。しかし、シカの枝角軟骨と鳥類（ニワトリ）胸骨は、同じ条件下で60％を超える収率のペプタカンを与えた。驚くべきことに、部位が未知で調製法が未知のサメの軟骨の市販のサンプルは、非常に低収率のペプタカンを与えた。それにもかかわらず、これらの例から本発明の方法は、広範囲の結合組織に適用できるが、水性培地へのペプタカンの放出の効率は、その超微細構造アセンブリーに関係し、自己溶解処理前の調製手段に関係することは、明らかである。
【表１】
2005519914.tif 000003
【０１２６】
0.1Ｍ酢酸カルシウムでインキュベートした気管軟骨から得られた上清をスーパーデックスゲルろ過カラムに適用し、画分を硫酸化GAGとタンパク質について追跡すると、GAG-ペプチドとポリペプチドに対応する２つの分離したピークが得られた（図６）。GAG-ペプチドがChSであるのみでなく２つ以上の硫酸化GAG鎖を含むという証拠は、純粋なChSを同じ条件下でクロマトグラフィーを行ったときに得られた同じカラム画分にDMMB陽性ピークを移動させたタンパク質分解酵素パパインによる消化により提供された（図７）。0.1Ｍ酢酸カルシウム（pH4.5）（CaP）と希酢酸（pH4.5）（H2OP）のインキュベーションから得られた上清をスーパーデックス200カラム上で同じ条件下でクロマトグラフィーを行うと、酢酸カルシウムバッファーで得られたGAG-ペプチドは、酢酸消化物により放出されるものより分子サイズが小さかった。しかし両方とも２つの市販のChSより大きかった（図８）。次に、CaP、H2OP、精製CaP（pCaP）および２つの市販のChSの重量平均分子量を、セファデックス-G 200高分解ゲル排除カラムと以前調製され解析された７つのChS標準物質（Melrose J とGhosh P, ファストタンパク質液体クロマトグラフィーによるグリコサミノグリカンの平均分子サイズの測定. J Chromatography, 1993, 637; 91-95）を使用して評価した。これらのChS標準物質とセファデックスカラムを使用して得られたMWとKavの相関を図９に示し、未知の調製物について得られた結果を以下の表２に示す。これらの実験は、CaP中のGAG-ペプチドが２つのChS鎖を含有し、一方H2OP中のそれは３つのChS鎖からなることを確認した。
【表２】
2005519914.tif 000004
【０１２７】
CaP、pCaPおよびパパイン消化CaPのCAPAGEは、存在する唯一の硫酸化GAGはChSであることを示した（図10）。しかしSDS-PAGEは、CaPがまた、精製CaP中に存在しないMWが21KDaまたはそれ以下の多くのペプチドを含有することを示した（図11）。図11は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用したペプタカン中のタンパク質とペプチドの分析を示す。レーン１＝記載の分子量を有するタンパク質マーカー、レーン２＝CaP、レーン３＝精製CaP、レーン４＝コンドロイチナーゼ-ABC消化および精製CaP。
【０１２８】
これらのサンプルのコラーゲンのマーカーとしての総タンパク質とヒドロキシプロリン含量の分析は、放出される優勢なポリペプチドが主にコラーゲン鎖の切断から得られることを示唆した。
【表３】
2005519914.tif 000005
【０１２９】
ペプタカン（CaP、NaPまたはH2OP）と市販のChS（図12）およびペプタカンから得られたChSの濃縮水溶液（1.0mg/ml）の分光学的分析は、ペプタカンとそこから得られたChSについて280nMでのタンパク質と260nMでのDNAの低い吸収を示した。これに対して、市販のChS調製物では、そのUVスペクトルのA260／A280の比（1.85またはそれ以上のオーダー）により示されるように、DNAについて高値であった（図12）。同じサンプルと標準物質としての子ウシ胸腺DNAのDNAについての公表された蛍光色素結合アッセイは、ペプタカン調製物とそこから得られたChSはDNAを実質的に含まず、一方調べた薬剤学的品質の市販のChSは約0.3％のDNAを含有することを確認した（表３）。酵素であるリゾチーム、ヒアルロニダーゼおよびヒト好中球エラスターゼ（これらは、関節炎におけるマトリックス破壊のメディエーターである）へのCaPとChSの相対的結合のBIAcore2000を使用した分析は、CaPはChSより強くリゾチームおよびエラスターゼと相互作用したが、ヒアルロニダーゼについては２つの調製物の間にほとんど差は無いことを示した（図13）。ヒト好中球から得られたタンパク質分解酵素エラスターゼについてのCaPのより強い結合親和性は、従来の機能アッセイと合成エラスターゼ基質であるスクシニル-アラニン-アラニン-バリン-ニトロアニリン（SAAVN）を使用して確認された。このアッセイ系を使用して、エラスターゼの50％阻害を与えたChSの濃度範囲（IC50）は４〜５μg/mlであり、一方CaP調製物のIC50は１〜３μg/mlであることがわかった。
【０１３０】
短期間（２日間）の軟骨細胞培養物では、250μg/mlおよびそれ以上の濃度のCaPは、DNAへのトリチウム化チミジンの取り込みにより示されるように細胞分裂を刺激したが、ChSは効果がなかった（図14）。より長期間（７日間）の軟骨細胞培養物では、62.5μg/mlのCaPはDNA合成を刺激した（図15）。これらのデータは明らかに、CaPの同化作用を特定し、これは結合組織の修復と再生を支持するであろう。
【０１３１】
すでに記載したように、PGは軟骨の細胞外マトリックスの基本的成分であり、そのユニークな生化学的性質の原因である。これらの分子は関節炎関節の軟骨では分解され枯渇するため、これを妨害するかまたは軟骨細胞および他の細胞によるその生合成を刺激することができる物質は、関節機能の回復と患者の症状の軽減に有用であろう。
【０１３２】
ChSと比較して、CaPは軟骨細胞によるプロテオグリカン合成の濃度依存性刺激を示し、1.0と2.0mg/mlのCaP濃度で、細胞外マトリックスへのPGの沈着は150％より大きかった（図16）。62.5〜500μg/mlの濃度ではChSは、CaPよりわずかに多くのPGを培地中に放出したが、これは2.0mg/mlでは逆転した（図16）。重要なことは、軟骨細胞によるPG合成へのCaPとChSの作用を炎症促進性サイトカインであるインターロイキン-1（IL-1）を加えた培養物で調べると、CaPは1.0mg/mlの濃度で合成を500％増加させ、一方ChSは効果はなかった（図17）。興味深いことに、PG合成へのCaPのこの刺激作用は、細胞をIL-1の非存在下で培養するとより大きかった（図17）。
【０１３３】
膝半月板は、構造的に複雑な繊維軟骨であり、可動関節の重量支持機能の基本的な役割を果たす。これは三日月型であり、外縁は強い引張応力を受け、内部領域はより大きな圧縮負荷を受ける。従ってこれらの２つの領域からの繊維軟骨細胞は代謝的に異なり、このため別々に研究された。ヒツジの半月板の内部領域からの繊維軟骨細胞を、種々の濃度のChSとペプタカンと培養すると、CaPのみがPG合成を刺激した（図18と19）。2.0mg/mlではCaPについてPG合成の200％の刺激が得られ、ChSについては130％の増加であったが、培地に放出されたPGについてはほんのわずかであった（図20と21）。CaPは、半月板の外部領域から単離された繊維軟骨細胞で同様のPG刺激プロフィールを与えることが観察された（図22、23および24）が、これらの培養ChSは、培地PGレベルで大きな上昇を示さなかった（図25）。
【０１３４】
関節滑液の主要な非タンパク質性成分はヒアルロナン（HA）である。既に記載したようにHAは滑液にそのユニークな流動学的性質（関節軟骨と関節周囲組織との極めて効率的な潤滑を含む）を与える。リウマチや骨関節炎関節では、滑液HA濃度や分子量が低下している（Dahl LB, Dahl IMS, Engstrom-Laurent A, Granath K. リウマチ様関節炎および他の関節炎患者からの滑液中のヒアルロン酸ナトリウムの濃度と分子量. Ann Rheum Dis 1985;44:817-22）。HAの流動学的作用はその分子量と濃度に依存するため、これらのパラメータのいずれかまたは両方の低下は、関節表面を効率的に潤滑し防御する滑液の能力を低下させる。しかしHAはまた抗炎症性であり、関節生理に基本的な多くの他の重要な機能を示す（Ghosh P とGuidolin D, 骨関節炎における関節内ヒアルロナン療法の可能な作用機序：作用は分子量依存性か?, Seminars in Arthritis and Rheumatism 2002, 32: 10-37）。従ってHA濃度の低下と分子量の低下は、滑液の流動学的性質のみでなく、滑膜および炎症性細胞機能およびその巨大分子発現にも大きな影響を与えるかも知れない。滑液HAは、ほとんど滑膜裏層のB型細胞によってのみ合成される。これらの繊維芽細胞（滑膜細胞）は、滑膜関節から単離され培養で樹立されると、その表現型発現と培地への複雑なHAを維持する。リウマチまたは骨関節炎関節から得られた繊維芽細胞培養物は、これらが得られた関節の異常代謝状態を反映して、HAの異常な生合成を示す（Smith MM, Ghosh P. ヒト滑膜繊維芽細胞によるヒアルロン酸の合成は細胞外環境中のヒアルロン酸塩の性質により影響される. Rheumatol Int 1987;7:113-22）。一般的に合成されるHAの量は、正常な滑膜細胞から得られるものより少なく、その分子量は低下している。
【０１３５】
本実験においてペプタカンとChSを、OA患者の関節から得られた滑膜繊維芽細胞によるDNAと高分子量HAの生合成を促進するそれぞれの能力について調べた。得られた結果を図26〜29に示す。図26から明らかなように、CaPのみが最大250μg/mlまでの濃度でDNA合成への有意な作用を示した。しかしこれらの細胞によるHA合成は、250μg/mlで230％上昇（図27）し、2.0μg/mlで380％上昇（図28）した。合成されたHAの分子量は、クロマトグラフィー（図27）とアガロースゲル電気泳動（結果は示していない）により確認された。2.0mg/mlの濃度で細胞とインキュベートした時のChS、CaPおよびH2OPの相対的活性を、図28に示す。これらの細胞によるHA合成に対するCaPとH2OPの有意な作用の差の理由は現在不明であるが、驚くべき知見である。
【０１３６】
同じ条件下で試験したCaP、pCaPおよびpH2OPの相対的活性を、図29に示す。この結果は、ヒトOA滑膜繊維芽細胞によるHA合成の刺激について、カラム精製した（pCaP）調製物に対して、CaPのより高い活性を示す。この結果は、CaP中のポリペプチドが、カルシウムGAG-ペプチド複合体と相乗的に作用していることを示唆する。
【０１３７】
CaPによる骨関節炎のヒトの関節から得られた滑膜繊維芽細胞によるHAの生合成のin vitro刺激もまた、関節炎の動物モデルを使用してin vivoでも起きることが証明された。これらの後者の実験において、PC-複合体の動脈内注入により１関節増殖性関節炎を誘導されたウサギに、300mg/kgのChSまたは100、200または300mg/kgのCaPを経口投与した。調製物は、関節炎を誘導する前７日間毎日、および以後７日間毎日与えた。動物を安楽死させ、14日目に血液と組織を分析のための採取した。これらの動物の関節からの滑膜繊維芽細胞を非薬剤処理関節炎対照群のものとともに、初代細胞培養で樹立し、放射能標識HAの生合成をin vitro試験で記載したように調べた。これらの実験の結果を図30と31に示す。非薬剤処理対照群と比較して、CaP処理群のすべての動物からの滑膜繊維芽細胞は、より高いHA合成（図30）を示したが、動物の生物学的変動のために、300mg/kg用量を投与されている群のみが、非薬剤処理群（図31）と比較して統計的に有意（ｐ＜0.05）であった。処理によるHA刺激の比較がその各硫酸化GAG含量に基づくなら、CaPはChSより３×以上活性が強かった。関節炎関節の滑膜細胞によるHA合成の促進は、本開示の別のところで詳述したように、関節潤滑性の改善と軟骨分解の低下に寄与するであろう。
【０１３８】
関節炎誘起物質（PC複合体）の動脈内注入によりウサギ関節で誘発される広範な滑膜の炎症は、滑膜の組織学的切片から明らかであり、これは広範な細胞浸潤、結合組織増殖、肥厚および血管新生を示した。非薬剤処理対照群では、これらの炎症イベントは、関節縁での滑膜組織に由来する侵襲性パンヌスの存在によりさらに特徴付けられた。このパンヌスの下およびこれに隣接して、軟骨と軟骨下骨の組織破壊が明らかであった（図32と33）。薬剤処理群では、滑膜炎はなくならなかったが、パンヌス形成の程度は低下し、軟骨の構造はほとんど保持された。さらに誘導性亜酸化窒素シンターゼ（iNOS）（亜酸化窒素フリーラジカルの産生に寄与する細胞内酵素）の膝蓋骨軟骨中の軟骨細胞による発現は、高用量CaP処理マウスで特に低下した（図32）。この観察結果は、ニトロチロシンの免疫組織化学的染色レベルと一致し、これは、細胞内タンパク質に対する亜酸化窒素の化学的作用の特徴的な生成物マーカーである（Kobayashi K, ら, 関節半月板摘除後の軟骨細胞アポトーシスと内側半月板における亜酸化窒素の領域差別的発現. J Orthopaedic Res, 2001,19: 802-808）。図33から明らかなように、この生成物の染色はCaP処理動物の関節の軟骨からの軟骨細胞で実質的に低下した。CaP処理によるiNOSの軟骨細胞産生と従って亜酸化窒素フリーラジカルの低下は、in vitro実験により示唆されるように炎症促進性サイトカイン（例えば、インターロイキン-1）の作用を調節する能力に由来すると考えられる。インターロイキン-1は、関節炎関節内の亜酸化窒素および他のフリーラジカル産生、滑膜炎症、および組織破壊の主要な開始物質であることが知られている（Taskiran D, Stefanovic-Racic M, Georgescu H, Evans C. 亜酸化窒素はインターロイキン-1による軟骨プロテオグリカン合成の抑制を仲介する. Biochem Biophys Res Commun 1994;200:142-8）。しかしCaPは、亜酸化窒素ラジカル活性または滑膜細胞および軟骨細胞（これ自体は、関節炎関節の炎症と組織破壊を抑制する有用な手段となるであろう）によるその産生に直接の阻害作用を有する可能性がある。そのような方策は、合
成iNOSインヒビターを使用して、他の研究者によりすでに示唆されている（US Patent 6,346,519, February 2002）。
【０１３９】
上記のウサギ関節炎モデルの関節組織に対するCaPに仲介される有効な作用以外に、これは関節炎動物の血液中を循環する好中球と単核細胞の両方のレベルを抑制することもわかった（図34と35）。薬剤処理対照群としてChS処理動物を使用すると、CaPのこの抑制作用は用量依存性であり、特に循環好中球数に対して、300mg/kgの用量がより有効であることが明らかであった（図34）。これらの血液が担う白血球は、進入する病原体に対して重要な前衛になるが、炎症状態（例えば、リウマチ様関節炎と骨関節炎、肺気腫、炎症性腸疾患、血管炎など）で起きるように、いったん活性化されると、破壊的プロテイナーゼ、酸素由来フリーラジカル、および炎症促進性サイトカイン（これらのすべては、疾患プロセスの開始と持続に寄与する）の進行中の供給源となる。これらの炎症性状態における免疫抑制は、その治療の重要な治療目的となり、かつ治療目的であり続ける（St. Georgiev V, 免疫調節薬剤：研究と開発の大きな進歩. Immunomodulating drugs中, 編者: St. Georgiev V と Yamaguchi H, Ann NY Acad Science, 1993, 685, 1-10）。さらに、免疫抑制療法は、30年以上慢性リウマチ様関節炎の管理のために広く使用されている（Weinblatt ME, リウマチ様関節炎における免疫抑制療法, Therapeutic control of inflammatory disease, new approaches to antirheumatic drugs中, 編者: Otterness I, Lewis A, Capetola R, Advances in inflammation research , Vol 11, Raven Press, New York, 1986, pp265-276）。ここで使用した１関節増殖性関節炎のウサギモデルで高経口投与CaPについて観察される白血球に対する抑制作用は、ニュートラシューティカルズ調製物の新規知見のようであるが、軟骨由来抗原（例えばII型コラーゲンペプチド）の経口投与は、クローン選択と抗炎症性サイトカイン（例えばインターロイキン-4と10およびトランスフォーミング増殖因子−ベータ（TGF-ベータ））の分泌を促進することにより、細胞アレルギーおよび／または免疫応答の活性細胞抑制を誘導することができる。さらに、これらの軟骨抗原の経口投与は、リウマチ様関節炎のような炎症性関節疾患を治療するために使用される（Kagnoff MF, 経口耐性：炎症性関節疾患における機序と可能な役割, Baillieres's Clinical Rheumatology, 1996, 10: 41-54; Weiner HL と Komagata Y,. リウマチ様関節炎の経口耐性と治療. Sem Immunopathol, 1998, 20: 289-308）。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】１mmと３mmのウシ気管軟骨の粉末から、100mMの自己溶解バッファー、100mMの酢酸カルシウム（pH4.5）で37℃で放出される、グリコサミノグリカン−ペプチド（GAG-ペプチド）の動態。
【図２】37℃で100mMの酢酸カルシウムバッファー（pH4.5）を使用して、自己溶解法に付す前および後の、３mmのウシ気管軟骨の粉末粒子の組織学的切片の顕微鏡写真。パネルAとCは、自己溶解処理前の軟骨の切片であり、BとDは後の切片である。パネルAとBは、トルイジンブルー（TB）（グリコサミノグリカン（GAG）に結合する色素）で染色した結果を示し、CとDは、マッソントリクローム（マッソンTC）（未変性のコラーゲン繊維をマゼンタ色に染色することが知られている色素）で染色した切片を示す。自己溶解後の切片B中にGAGの染色が無くなり、Dに示すようにGAGの大半の除去後にコラーゲンの染色強度がわずかに上昇していることを注目されたい。緑の対染色によりこれらの切片で同定される細胞核は、自己溶解法により明らかに変化していない。すべての切片は、×400の倍率で示す。
【図３】100mMの酢酸カルシウム（pH4.5）の存在下で37℃で種々のpHでの、ウシ気管軟骨の粉末からのグリコサミノグリカン−ペプチド（GAG-ペプチド）の放出の動態。
【図４】100mMの酢酸カルシウム（pH4.5）の存在下で種々の温度での、ウシ気管軟骨の粉末からのグリコサミノグリカン−ペプチド（GAG-ペプチド）の放出の動態。
【図５】タンパク質分解性インヒビターの非存在下および存在下での、100mMの酢酸カルシウムバッファー（pH4.5）で37℃でのグリコサミノグリカン−ペプチド（GAG-ペプチド）の放出。システインプロテアーゼインヒビターであるN-エチルマレイミドは最も有効なインヒビターであり、インヒビターを含まない対照インキュベーション物の約50％だけ放出を低下させた。
【図６】本文に記載のアッセイを使用した、硫酸化GAG（A535）とタンパク質（A562）プロフィールを示すカルシウムペプタカン（Calcium Peptacan）（CaP）のスーパーデックス-200ゲルろ過。
【図７】コンドロイチン硫酸と比較して分子サイズの低下を示す、カルシウムペプタカン（CaP）とパパイン消化CaPのスーパーデックス-200ゲルろ過プロフィール。
【図８】ペプタカン（CaPとH2OP）とChSA（シグマ（Sigma）とビオイベリカ（Bioiberica））のスーパーデックス-200ゲルろ過クロマトグラム。
【図９】本文に記載のようにMelroseとGhosh（1993）の方法を使用して、セファデックス-G200で測定した、ChS標準物質の分配係数（Kav）対分子量の標準曲線。
【図１０】コンドロイチン硫酸（ChS）とカルシウムペプタカン（CaP）の複合アガロースポリアクリルアミドゲル（CAPAGE）分析。レーン１：ChS（シグマ（Sigma））、レーン２：CaP、レーン３：精製CaP、レーン４：パパイン消化CaP。
【図１１】SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用するペプタカン中のタンパク質とペプチドの分析。レーン１＝記載の分子量を有するタンパク質マーカー、レーン２＝CaP、レーン３＝精製CaP、レーン４＝コンドロイチナーゼ−ABC消化および精製CaP。
【図１２】UVスペクトルからのChSAとペプタカン中のDNA混入の測定。DNAの存在は、A260の吸収で、タンパク質はA280の吸収で示される。
【図１３】BIAcore2000法を使用する、固定化リゾチーム、ヒアルロニダーゼ、およびヒト顆粒球エラスターゼからのコンドロイチン硫酸A（ChSA）とカルシウムペプタカン（CaP）の結合と放出。固定化酵素に対する薬物の結合親和性の程度は、応答単位（RU）として記録される。
【図１４】単層培養においてヒツジ軟骨細胞のDNAへの3H-メチルチミジンの取り込みに対する、コンドロイチン硫酸A（ChSA）とカルシウムペプタカン（CaP）の短期（２日）濃度依存性作用。
【図１５】単層培養においてヒツジ軟骨細胞のDNAへの3H-メチルチミジンの取り込みに対する、コンドロイチン硫酸A（ChSA）とカルシウムペプタカン（CaP）の長期（７日）濃度依存性作用。
【図１６】ヒツジ軟骨細胞によるプロテオグリカン（PG）合成に対する、コンドロイチン硫酸A（ChSA）とカルシウムペプタカン（CaP）の濃度依存性作用。
【図１７】インターロイキン-1ベータ（IL-1ベータ）の非存在下および存在下での、ヒツジ軟骨細胞によるプロテオグリカン（PG）合成に対する、コンドロイチン硫酸A（ChSA）とカルシウムペプタカン（CaP）の作用。
【図１８】ヒツジの半月板の内部領域から単離された線維軟骨細胞の細胞外マトリックスのPGへの35S取り込みに対するChSAとペプタカンの濃度作用。
【図１９】ヒツジの半月板の内部領域から単離された線維軟骨細胞の細胞外マトリックスから、調整培地へ放出される35S-PGに対するChSAとペプタカンの濃度作用。
【図２０】ヒツジの半月板の内部領域から単離された線維軟骨細胞の細胞外マトリックスのPGへの35S取り込みに対するChSAとペプタカン（2.0mg/ml）の相対的作用。
【図２１】ヒツジの半月板の内部領域から単離された線維軟骨細胞の細胞外マトリックスから、調整培地へ放出される35S-PGに対するChSAとペプタカン（2.0mg/ml）の相対的作用。
【図２２】ヒツジの半月板の外部領域から単離された線維軟骨細胞の細胞外マトリックスのPGへの35S-取り込みに対するChSAとペプタカンの濃度作用。
【図２３】ヒツジの半月板の外部領域から単離された線維軟骨細胞から、調整培地へ放出される35S-PGに対するChSAとペプタカンの濃度作用。
【図２４】ヒツジの半月板の外部領域から単離された線維軟骨細胞の細胞外マトリックスのPGへの35S取り込みに対するChSAとペプタカン（2.0mg/ml）の相対的作用。
【図２５】ヒツジの半月板の外部領域から単離された線維軟骨細胞の細胞外マトリックスから、調整培地へ放出される35S-PGに対するChSAとペプタカン（2.0mg/ml）の相対的作用。
【図２６】骨関節炎患者の関節からのヒト滑膜繊維芽細胞（HSF）の培養物によるDNA合成に対する、コンドロイチン硫酸A（ChSA）とカルシウムペプタカン（CaP）の濃度作用。62〜250μg/mlのCaP濃度は、合成を有意に刺激した（p＜0.05）。
【図２７】スーパーローズ6ゲルろ過クロマトグラフィーで得られた放射能プロフィールにより証明された、ヒト滑膜繊維芽細胞（HSF）によるHA合成に対するChSA、CaPおよびH2OP（2.0mg/ml）の作用。
【図２８】骨関節炎患者の関節からのヒト滑膜繊維芽細胞（HSF）によるヒアルロナン（HA）合成に対する、コンドロイチン硫酸A（ChSA）とカルシウムペプタカン（CaP）の相対的作用。
【図２９】骨関節炎患者の関節から得られるヒト滑膜繊維芽細胞（HSF）によるヒアルロナン（HA）合成に対する、コンドロイチン硫酸A（ChSA）とペプタカンおよび高度に精製されたペプタカン（2.0mg/ml）の相対的作用。CaPと比較してpCaPの活性低下に注意されたい。
【図３０】非薬剤処理対照（波線）の関節炎ウサギと300mg/kgのCaPで14日間毎日処理した４匹の動物（実線）の関節から得られた滑膜繊維芽細胞の培養物から得られた培地のスーパーローズ6ゲルろ過クロマトグラムであり、放射能標識HAの合成の上昇を示す。
【図３１】ウサギ関節からの滑膜繊維芽細胞による放射能標識HAのex vivo合成に対する、ChSとCaP処理の平均（±SEM）群作用。300mg/kgでCaP処理した群からの細胞のみが、非薬剤処理対照群に対して合成の有意な上昇を示した（p＜0.05）。
【図３２】ウサギPC関節炎モデルの関節からの膝蓋骨軟骨（AC）と隣接滑膜の組織学的切片の顕微鏡写真であって、広範な滑膜炎症とパンヌス形成が、軟骨細胞中の誘導性亜酸化窒素シンターゼ（iNOS）についての抗体染色を伴うことを示す。パネルAとB：本文に記載のように食塩水を注入した関節からの、しかし処理し、iNOS１次および２次抗体で染色した切片。これらの対照切片中では滑膜組織の強い非特異的褐色の染色があるが、軟骨細胞（対染色により青で現れる）や、軟骨マトリックスでは無いことに注意されたい。A=100×、B=400×倍率。パネルCとDは、PCを注入した非薬剤処理関節からの切片である。C=100×、D=400×倍率。これらの切片では軟骨細胞中のiNOSの強い染色が明らかである。パネルEは、ChS処理動物のPC注入関節からの切片である。倍率×400。軟骨細胞によるiNOSの発現の染色は、非薬剤処理対照より小さいが、まだ明らかである。パネルFは、CaP処理動物（300mg/kg）のPC注入関節からの代表的切片であり、軟骨細胞中のiNOSの染色は、対照やChS処理群に比較して低下している。倍率×400。
【図３３】ウサギPC関節炎モデルの関節からの膝蓋骨軟骨と隣接滑膜の組織学的切片の顕微鏡写真であって、広範な滑膜炎症とパンヌス形成が、亜酸化窒素シンターゼ酸化生成物（ニトロチロシン）についての軟骨細胞での褐色の抗体染色を伴うことを示す。パネルAに示す切片は、PCを注入した非薬剤処理ウサギ関節からの、しかし本文に記載のように処理し、ニトロチロシンについて１次および２次抗体で染色した切片である。図32と同様に、滑膜組織の強い褐色の非特異的染色があるが、軟骨細胞、特に軟骨浅在性ゾーンでは抗原の特異的染色があることに注意されたい。倍率400×。パネルBは、ChS処理動物のPC注入関節からの代表的切片であり、染色は強度は低下しているが、欠如してはいないことを示す。倍率×400。パネルCは、CaP（300mg/kg）を投与した動物のPC注入関節からの切片である。倍率×200。軟骨細胞中および軟骨浅在性ゾーン中のニトロチロシンの染色はわずかであり、非薬剤処理対照より小さい。パネルCは、PC注入関節からの陰性対照切片であり、これは、滑膜組織へのニトロチロシン抗体の非特異的結合があるが、軟骨または軟骨細胞には無いことを確認する。
【図３４】ChSおよびCaP処理ウサギ群からの動物の血液中の好中球についての平均値（±SEM）を示すヒストグラム。高用量CaP処理群からの血液中の好中球レベルの抑制に注意されたい。
【図３５】ChSおよびCaP処理ウサギ群からの動物の血液中の単核細胞についての平均値（±SEM）を示すヒストグラム。300および200mg/kg CaP処理群の単核細胞レベルの低下に注意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月5日(2004.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合組織由来のGAG-ペプチド複合体とポリペプチドを含む組成物の調製法であって：
約2.5〜約8.0のpHと有効な温度で２価の塩を含有する自己溶解培地に接触させることにより、結合組織の粒子を酵素介在自己溶解に付して、内因性酵素のタンパク質分解作用により、組織粒子内から自己溶解培地中に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体と少なくとも１つのポリペプチドを放出させ、残存組織粒子を残す工程；および自己溶解培地から少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体と少なくとも１つのポリペプチドとを回収する工程、を含んでなる方法。
【請求項２】
２価の塩は、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
２価の塩が、カルシウムである請求項１の方法。
【請求項４】
pHが、3.5〜8.0、好ましくは４〜７、最も好ましくは4.5〜７の範囲である、請求項１の方法。
【請求項５】
温度が、20〜45℃、好ましくは25〜45℃、さらに好ましくは32〜45℃、最も好ましくは37℃である、請求項１の方法。
【請求項６】
結合組織は、皮膚、骨、腱、靭帯および軟骨よりなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
結合組織は、ウシ、ヒツジ、ブタ、シカおよびウマの結合組織からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項８】
結合組織は、耳、関節、気管または鼻の軟骨からなる群から選択される請求項７の方法。
【請求項９】
さらに、ポリペプチドからGAG-ペプチド複合体を分離し、GAG-ペプチド複合体を回収することを含む請求項１の方法。
【請求項１０】
DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体もしくはその塩ならびにDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物であって、該GAG-ペプチド複合体およびポリペプチドが、請求項１〜８のいずれか１項の方法により得られる組成物。
【請求項１１】
DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体またはその塩を含む組成物であって、該GAG-ペプチド複合体が、請求項９の方法により得られる組成物。
【請求項１２】
DNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体から得られるDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸またはその塩を含む組成物であって、該GAG-ペプチド複合体が、請求項９の方法により得られる組成物。
【請求項１３】
塩が、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１１または１２の方法。
【請求項１４】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体もしくはその塩ならびにDNAを実質的に含まない少なくとも１つのポリペプチドの使用であって、GAG-ペプチド複合体およびポリペプチドが、有効なpHと温度で１価または２価の塩を含有する自己溶解培地に接触させることにより、結合組織の粒子を酵素介在自己溶解に付して、内因性酵素のタンパク質分解作用により、組織粒子内から自己溶解培地中に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体と少なくとも１つのポリペプチドを放出させ、残存組織粒子を残す工程；および自己溶解培地からDNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体とポリペプチドとを回収する工程、により得られるものである使用。
【請求項１５】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体またはその塩の使用であって、GAG-ペプチド複合体が、有効なpHと温度で１価または２価の塩を含有する自己溶解培地に接触させることにより、結合組織の粒子を酵素介在自己溶解に付して、内因性酵素のタンパク質分解作用により、組織粒子内から自己溶解培地中に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体と少なくとも１つのポリペプチドを放出させ、残存組織粒子を残す工程；および自己溶解培地からGAG-ペプチド複合体とポリペプチドとを回収し、ポリペプチドからGAG-ペプチド複合体を分離し、GAG-ペプチドを回収する工程、により得られるものである使用。
【請求項１６】
任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症の治療のための、および癌の治療のための薬剤を製造するための、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのコンドロイチン硫酸またはその塩の使用であって、コンドロイチン硫酸が、請求項９の方法で得られるDNAを実質的に含まないGAG-ペプチド複合体由来である使用。
【請求項１７】
塩が、カルシウム、マグネシウム、銅、亜鉛、およびこれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１３〜１６のいずれか１項の使用。
【請求項１８】
塩が、カルシウムである、請求項１７の使用。
【請求項１９】
GAG-ペプチド複合体およびポリペプチドが、請求項１〜９のいずれか１項の方法により得られる、請求項１８の使用。
【請求項２０】
治療が必要な被験体に、少なくとも１つの結合組織由来のGAG-ペプチド複合体もしくはその塩ならびに少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与することを含んでなる、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法であって、GAG-ペプチド複合体およびポリペプチドが、有効なpHと温度で１価または２価の塩を含有する自己溶解培地に接触させることにより、結合組織の粒子を酵素介在自己溶解に付して、内因性酵素のタンパク質分解作用により、組織粒子内から自己溶解培地中に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体と少なくとも１つのポリペプチドを放出させ、残存組織粒子を残す工程；および自己溶解培地からGAG-ペプチド複合体とポリペプチドとを回収する工程、により得られるものである方法。
【請求項２１】
治療が必要な被験体に、少なくとも１つの結合組織由来のGAG-ペプチド複合体またはその塩の有効量を投与することを含んでなる、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法であって、GAG-ペプチド複合体が、有効なpHと温度で１価または２価の塩を含有する自己溶解培地に接触させることにより、結合組織の粒子を酵素介在自己溶解に付して、内因性酵素のタンパク質分解作用により、組織粒子内から自己溶解培地中に、DNAを実質的に含まない少なくとも１つのGAG-ペプチド複合体と少なくとも１つのポリペプチドを放出させ、残存組織粒子を残す工程；および自己溶解培地からGAG-ペプチド複合体とポリペプチドとを回収し、ポリペプチドとGAG-ペプチド複合体を分離し、GAG-ペプチド複合体を回収する工程、により得られるものである方法。
【請求項２２】
治療が必要な被験体に、請求項１〜９のいずれか１項の方法により得られる少なくとも１つのDNAを実質的に含まないコンドロイチン硫酸塩の有効量を投与することを含んでなる、任意の多様な型のリウマチ様関節炎や骨関節炎のような炎症性および変性組織疾患、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血、変性および糖尿病性動脈症、血栓症および塞栓症、高脂肪血症、および癌の治療方法。
【国際調査報告】
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