(57)【要約】本発明はNPPaseに関するものであり、それは、フォスフォスルフェイトおよびフォスフォジエステラーゼ結合を有する広範囲の小分子、特にADPG（アデノシン・ジフォスフェイト・グルコース）およびAPS（アデノシン5’フォスフォスルフェイト）の加水分解を触媒する酵素である。植物抽出物から得られたこの酵素は、アッセイ装置中において、(i)ヌクレオシド-ジフォスフェイト糖のレベルを、放出された糖-1-フォスフェイトまたはヌクレオシド・モノフォスフェイト（その両者はNPPaseにより触媒された反応によって生成したプロダクトである）のいずれかに基づいて測定するために、加えて、(ii)3’-フォスフォアデノシン5’-フォスフォスルフェイト（PAPS）およびAPSなどのスルフォヌクレオチドを検出するために使用される。更に本発明は、本酵素のアミノ酸配列のみならず、完全cDNAおよび他の不完全cDNAのヌクレオチド配列にも関する。本発明は更に、NPPaseを過剰発現し、糖含量が高く、澱粉および細胞壁多糖の含量が低く、高濃度の塩および高温に対して耐性を有する形質転換植物の作製も述べるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド糖ピロフォスファターゼ/フォスフォジエステラーゼ（NPPase）活性により植物由来の酵素プロダクトをその可溶型アイソフォームで得る方法において、植物由来の材料を緩衝液による蛋白質画分の抽出にかけ、抽出物を濾過し、一連の遠心分離および沈殿による精製の方法が続き、溶媒のpHおよびイオン強度の両者を調整すると共に、好ましくは蛋白質を60℃以上に加熱して氷中で冷却し、およびゲル濾過、等電点電気泳動、変性ゲル電気泳動、または植物組織から抽出された蛋白質を精製する他の同等な方法による精製を含むことを特徴とする上記方法。
【請求項２】
以下の：（１）Mes型抽出緩衝液（Mes 50mM pH6、EDTA 1mM、DTT 2mM）による植物組織のホモゲニゼーション、（２）濾過、（３）100,000gにおける超遠心分離、（４）上清の蛋白質の硫酸アンモニウム中での沈殿、（５）pH4.2の緩衝液中における沈殿物の再懸濁、（６）60と65℃の間の温度における少なくとも15分間の加熱、引き続いての氷中での冷却、（７）30,000gにおける遠心分離、（８）上清の蛋白質の硫酸アンモニウム沈殿による濃縮およびpH6における再懸濁、および（９）ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点および変性ゲル電気泳動による精製、という工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
NPPaseと名付けられた、請求項１または請求項２記載の方法により取得可能な植物由来の酵素プロダクトにおいて、NPPaseは等モル条件中でヌクレオチド糖が糖-フォスフェイトおよび対応するヌクレオシド・モノフォスフェイトへ加水分解することを触媒するフォスフォジエステラーゼであって、フォスフォモノエステル結合を有する分子を加水分解せず、ビス-PNPPを加水分解可能でき、モリブデン酸塩、ヒ酸塩およびリン酸化された分子により阻害され、NPPaseの活性はフォスフォジエステラーゼの阻害剤である還元剤およびキレート剤によって影響されず、NPPaseはやや塩基性のpHに対して感受性であって4と7.5の間のpHで非常に安定であり、NPPaseはグリコシル化を受けことができ、それによってNPPaseはSDS型のイオン性界面活性剤およびプロテアーゼの作用に対して耐性となり、ヌクレオチド糖に加えて、フォスフォジエステルおよびフォスフォスルフェイト結合を有する他の小分子を認識することを特徴とする、上記酵素プロダクト。
【請求項４】
特にG1P、G6P、AMP、3-フォスフォグリセレート、サイクリックAMPを加水分解せず、核酸も加水分解しないことを特徴とする、請求項３記載の酵素プロダクト。
【請求項５】
エフェクターとして、特に二価カチオン、マグネシウム、マンガンまたはコバルトを必要としないことを特徴とする、請求項３および請求項４のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項６】
オルトフォスフェイト、無機ピロフォスフェイト、およびフォスフェイト・エステル、特にAMP、ADP、ATP、または3-フォスフォグリセレートなどより阻害されることを特徴とする、請求項３から請求項５のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項７】
その活性は、特にβ-メルカプトエタノール、EDTA、還元されたシステインまたはアスコルビン酸によって影響されないことを特徴とする、請求項３から請求項６のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項８】
それは、特にプロテイナーゼKまたはプロナーゼに対して耐性であることを特徴とする、請求項３から請求項７のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項９】
特にADPG、UDPG, GDP-グルコース、ADP-マンノース、APS、PAPSまたはビス-PNPPを基質として認識し、好適な基質はADPGであることを特徴とする、請求項３から請求項８のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１０】
65℃の温度に対して30分間耐性であり、モノマー型およびホモポリマー型のアイソフォームについてそれぞれ70と270kDa付近にゲル濾過によって測定されたみかけの分子量を有し、加えて反応のKeq’は110であり、その△G’は-2.9kcal/モルであり、ADPGについてのそれのKmは0.5ミリモルであることを特徴とする、請求項３から請求項９のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１１】
任意の植物種から単離されることを特徴とする、請求項３から請求項１０のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１２】
その配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７で表されるポリペプチド断片の少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項３から請求項１１のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１３】
請求項１２におけるポリペプチド配列の少なくとも一つを含む蛋白質をコードするcDNAから得られたことを特徴とする、請求項３から請求項１２のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクト。
【請求項１４】
配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４によって表されるプライマー。
【請求項１５】
イネまたはオオムギの葉に由来するmRNAと共に、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２４によって表されるプライマーを、RT-PCRにより、cDNAを取得するために使用する方法において、そのcDNAをイネおよびオオムギの葉のcDNAライブラリーのプローブとして使用した後に、配列番号２０、配列番号２２によって配列がそれぞれ表されるcDNAの単離が可能となる、上記方法。
【請求項１６】
NPPase活性を有する酵素プロダクトをコードする、配列番号２０によって表されるcDNA。
【請求項１７】
オオムギの葉に由来するmRNAと共に、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２４によって表されるプライマーを、RT-PCRにより、cDNAを取得するために使用する方法において、そのcDNAをオオムギの葉のcDNAライブラリーのプローブとして使用した後に、配列番号２２によって表される配列のcDNAの単離が可能となる、上記方法。
【請求項１８】
NPPase活性を有する酵素プロダクトをコードする、配列番号２２によって表されるcDNA。
【請求項１９】
NPPase活性を有し、配列番号２１によって表される配列を含むことを特徴とする酵素プロダクト。
【請求項２０】
NPPase活性を有し、配列番号２３によって表される配列を含むことを特徴とする酵素プロダクト。
【請求項２１】
ヌクレオシドジフォスフェイト糖の測定に適用するためのアッセイ装置および/または組成物の調製において、請求項３から請求項１３、請求項１９および請求項２０のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを使用する方法。
【請求項２２】
ヌクレオシドジフォスエフェイト糖の測定のためのアッセイ装置において、該アッセイ装置が請求項３から請求項１３、請求項１９および請求項２０のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを含み、その測定がNPPaseによって触媒される反応の間に遊離した糖-1-フォスフェイトに基づくような方法であることを特徴とする上記アッセイ装置。
【請求項２３】
請求項２２記載のアッセイ装置において、その測定は遊離したグルコース-1-フォスフェイトに基づくものであって、グルコース-1-フォスフェイトはフォスフォグルコムターゼ酵素の作用を受けてグルコース-6-フォスフェイトを産生し、グルコース-6-フォスフェイトは次にNAD+およびNADP+との共役反応を受け、グルコース-6-フォスフェイト・デヒドロゲナーゼ酵素の作用により、6-フォスフォグルコネートおよびNADHまたはNADPHを取得し、そのいずれかが通常の分光測定法または何らかの他の種類の方法で測定されることを特徴とする上記アッセイ装置。
【請求項２４】
ヌクレオシド・ジフォスフェイト糖の測定のためのアッセイ装置において、該アッセイ装置が請求項３から請求項１３、請求項１９および請求項２０のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを含み、その測定がNPPaseによって触媒される反応の間に産生したヌクレオシド・モノフォスフェイトに基づくような方法であることを特徴とする上記アッセイ装置。
【請求項２５】
請求項２４記載のアッセイ装置において、その測定はヌクレオシド・モノフォスフェイトに基づくものであって、ヌクレオシド・モノフォスフェイトは対応する塩基に加えてオルトフォスフェイトを遊離することが可能であり、5’-ヌクレオチダーゼのような酵素の作用により、そのオルトフォスフェイトを例えば比色法などの常法によって容易に測定できることを特徴とする上記アッセイ装置。
【請求項２６】
請求項２２から請求項２５のいずれか一つの請求項記載のアッセイ装置において、その測定が、アルカリフォスファターゼまたは5’-ヌクレオチダーゼのような酵素の作用により、糖-1-フォスフェイトとヌクレオシド-モノフォスフェイトがオルトフォスフェイトを遊離することが可能であって、そのオルトフォスフェイトは比色法などの常法によって容易に測定されるという事実に基づくものであることを特徴とする上記アッセイ装置。
【請求項２７】
アッセイ装置および/または組成物を調製ために請求項３から請求項１３、請求項１９および請求項２０のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを使用する方法において、該アッセイ装置および/または組成物は、3’-フォスフォ-アデノシン5’-フォスフォスルフェイト（PAPS）およびアデノシン5’フォスフォスルフェイト（APS）の存在を測定するために適用されるものである上記方法。
【請求項２８】
NPPaseをコードするcDNAを発現または過剰発現する形質転換植物の作製において、請求項１４記載のプライマーおよび請求項１６または請求項１８記載のcDNAを使用する方法。
【請求項２９】
NPPaseをコードする遺伝子を発現または過剰発現する形質転換植物を作製する方法において、前記NPPaseの遺伝子の配列番号１９で表されるcDNAを含むプラスミドを含んでいる形質転換ベクターを使用することを特徴とする上記方法。
【請求項３０】
NPPaseをコードする遺伝子を発現または過剰発現する形質転換植物を作製する方法において、前記NPPaseの遺伝子の配列番号２２で表されるcDNAを含むプラスミドを含んでいる形質転換ベクターを使用することを特徴とする上記方法。
【請求項３１】
形質転換ベクターがアグロバクテリウム・ツメファシエンスCECT5799であることを特徴とする、請求項２９または請求項３０記載の形質転換植物を作製する方法。
【請求項３２】
請求項３から請求項１３、請求項１９および請求項２０のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを発現または過剰発現し、澱粉および/または細胞壁多糖の含量が低下し、高温および高い塩度に耐性であることを特徴とする、請求項２９から請求項３１のいずれか一つの請求項記載の方法によって取得可能な形質転換植物。
【請求項３３】
スルフォヌクレオチドの測定のためのアッセイ装置において、該アッセイ装置は請求項３から請求項１３、請求項１９および請求項２０のいずれか一つの請求項記載の酵素プロダクトを含み、その測定が遊離した硫酸塩に基づくような方法であることを特徴とする上記アッセイ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特にイネとオオムギの、種々のアイソフォームのヌクレオチドピロフォスファターゼ/フォスフォジエステラーゼ（NPPase）の産生、精製および特性解析の分野に関すものであり、ヌクレオチド糖とスルフォヌクレオチドのレベルの測定におけるこの酵素の応用のみならず、NPPaseの前記アイソフォームをコードする遺伝子のcDNAが過剰発現している形質転換植物の産生にも関するものであり、植物において澱粉と細胞壁多糖の含量の低下と塩分と温度に対する高い耐性を引き起こす。
【背景技術】
【０００２】
澱粉は植物において炭水化物を貯蔵する基本的な形である。それは種子（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンドウ豆など）や塊茎（特にジュガイモやヤマノイモ）などの器官において大量に蓄積され、ヒトの食糧の基本的な構成成分である。一方、澱粉は紙、化粧品、薬剤および食物産業の中でしばしば使用されているポリマーであり、生分解性プラスチックおよび環境親和性の塗料の製造における基本的な成分としても使用されている。他の多糖、セルロースは植物の細胞壁の基本的な構成成分であり、例えば製紙の重要な工程における基本的な原材料を構成する。従って、これらのグルコースのポリマーの合成に関与している過程の研究は工業生産の種々の分野で優先度が与えられている。
【０００３】
UDPグルコース（UDPG）はセルロースと細胞壁多糖の生合成の基本的な前駆体である。それは、蛋白質と脂質のグリコシル化と結びついた過程の前駆体分子でもある。一方、ADPグルコース（ADPG）は植物の貯蔵組織中での澱粉の生合成の普遍的な前駆体である。細胞内におけるその濃度は、植物によって産生される澱粉の量と質を決定するものである。植物細胞内でADPGとUDPGの内在的なレベルを支配する因子を考慮することにより、ADPGピロフォスフォリラーゼ、UDPGピロフォスフォリラーゼおよびスクロース合成酵素など、それらの合成酵素の周辺が基本的に解明された（Preiss, (1988) “Biosynthesis of starch and its regulation” The Biochemistry of Plants. Vol.14, Academc Press, New York, pp182-249; Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T (1999) “Sucrose-starch conversion in heterotrophic tissue”. Crit Rev. Plant Sci. 18, 489-525）。しかしながら、これらのヌクレオチド糖の分解を担っている機構の研究は殆どなかった（Feingold, D.S., Avigad, G. (1980) “Sugar transformation in plants” The Biochemistry of Plants. Vol.3, Stumpf, P.K. and Conn, E.E. eds. Academc Press, New York, pp101-170）。細菌と哺乳類の両者はADPGとUDPGを加水分解できる酵素機構を有することを示す知見がある（Melo, A., Glaser, L. (1966) "Nucleotide diphosphate hexose pyrophosphatases". Biochem. Biophys. Res. Commun. 22, 524-531; Bessman, M.J., Frick, D.N., O'Handley, S.F. (1996) "The MutT proteins or Nudix hydrolases, a family of versatile, widely distributed housecleaning enzymes". J. Biol. Chem. 271, 25059-25062; Rodriguez, P., Bass, S.T., Hansen, R.G. (1968) "A pyrophosphatase from mammalian tissues specific for derivates of ADP". Biochim. Biophys. Acta, 167, 199-201; Gasmi, L., Cartwright, J.L., McLennan, A.G. (1999) "Cloning, expression and characterization of YSA1H, a human adenosine 5'-diphosphosugar pyrophosphatase possessing a MutT motif". Biochem. J. 331-337; Moreno-Bruna, B., Baroja-Fernandez, E., Munoz, F.J., Bastarrica-Berasategui, A., Zandueta-Criado, A., Rodriguez-Lopez, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) "Adenosine diphosphate sugar pyrophosphatase prevents glycogen biosynthesis in Escherichia coli". Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 8128-8132）。植物において、この種類の活性は文献にわずかに述べられているにすぎない(Salvucci, M.E., Crafts-Brandner, S.J. (1995) "Purification and properties of a unique nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase I that accumulates in soybean leaves in response to fruit removal". Plant Physiol. 108, 1269-1276; Rodriguez-Lopez, M., Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) "Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase: a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis". Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 8705-8710; Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A., Rodriguez-Lopez, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2000) "Distinct isoforms of ADPglucose pyrophosphatase and ADPglucose pyrophosphorylase occur in the suspension-cultured cells of sycamore (Acer pseudoplatanus L.). FEBS Lett. 480, 277-282; Rodriguez-Lopez, M., Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A. Moreno-Bruna, B. Munoz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) "Two isoforms of a nucleotide-sugar pyrophosphatase/phosphodiesterase from barley leaves (Hordeum vulgare L.) are distinct oligomers of HvGLP1, a germin-like protein". FEBS Lett. 490, 44-48).
【０００４】
種々の産業において、澱粉は増粘剤およびゲル化剤として基本的に必須である。ADPGから出発する植物細胞における澱粉の生合成はプラスチドと呼ばれるサブ細胞区画において起こる。ADPGはこの区画で合成されかつ使用され、それにより、ADPGレベルを制御する過程を調節することにより澱粉のレベルを調節できる。植物内で産生された澱粉の種々の用途は、澱粉顆粒の構造を決定するアミロースとアミロペクチンの平衡のみならず、水性の懸濁液中でのその粘度に基づいている。アミロースとアミロペクチンの比率は植物細胞中でのADPG濃度に依存する。今日まで、ADPGの分解を制御することによって植物内で産生される澱粉の特性を制御する方法は知られておらず、本発明において述べられている酵素はそれを提供することができる。植物における貯蔵物質として作用するのに加えて、植物が水ストレスの状態に曝されていない環境中で、植物細胞内に澱粉が蓄積する。植物が環境中で高温または高濃度の塩に曝されている状況下では、その植物は澱粉を蓄積することを中止し、液胞中に蓄積する可溶性の糖を大量に産生する(Keeling, P.L., Bacon, P.J., Holt, D.C. (1993) "Elevated temperature reduces starch deposition in wheat endosperm by reducing the activity of soluble starch synthase" Planta 191, 342-348; Geigenberger, P., Geiger, M., Stitt, M. (1998) "High-temperature perturbation of starch synthesis is attributable to inhibition of ADP-glucose pyrophosphorylase by decreased levels of glycerate-3-phosphate in growing potato tubers" Plant Physiol. 117, 1307-1316)。水ストレスに対する炭水化物代謝のこれらの適応性変化に加えて、植物はその硫黄代謝において変化を受け、アデノシン5’-フォスフォスルフェイト（APS）および3’-フォスフォアデノシン5’-フォスフォスルフェイト（PAPS）の変換から生じるアデノシン5’-フォスフェイト（PAP）の蓄積を回避する(Gil-Mascarell, R., Lopez-Coronado, J.M., Belles, J.M., Serrano, R., Rodriguez, P.L. (1999) "The Arabidopsis HAL2-like gene family includes a novel sodium-sensitive phosphatase" Plant J. 17, 373-383)。これらの観察に基づくと、ADPG, APSおよびPAPSの加水分解を担う酵素反応は、水ストレスの状態に対する植物の適応過程を担っている可能性がある。
【０００５】
クロマトグラフィーおよび放射学的な技術は、動物、植物または微生物由来の粗抽出物中の、スルフォヌクレオチド(特にAPSとPAPS; Yoshida, H., Fukui, S., Yamashina, I., Tanaka, T., Sakano, T., Usui, T., Shimotsuji, T., Yabuuchi, H., Owada, M., Kitagawa, T. (1982) "Elevation of nucleotide pyrophosphatase activity in skin fibroblasts from patients with Lowe's syndrome". Biochem. Biophys. Res. Commun. 107, 1144-1150)およびヌクレオシドジフォスフェイト糖（例えばグルコース、リボース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、フルクトースおよびガラクトウロン酸）などのヌクレオチドのレベルを測定するための強力な道具である。非常に一般的に使用されているものの、それらは、装置と試験サンプルの調製にかなりの投資が必要である。残念なことに、僅かの例外を除いては(Puhakainen, E., Saarinen, A., Hanninen, O. (1977) "UDPglucuronic acid pyrophosphatase assay with the aid of alkaline phosphatase" Acta Chem. Scandinavica B31, 125-129) 、簡単で効率の良い方法でヌクレオチド糖とスルフォヌクレオチドの検出と定量ができる可能な代替方法は十分に作られていない。血液、筋肉、腎臓および肝臓で前記のヌクレオチド糖のいくつかのレベルを解析することは臨床の診療において重要である(Cortes, P., Dumler, F., Sastry, K.S., Verghese, C.P., Levin, N.W. (1982) "Effects of early diabetes on uridine diphosphosugar synthesis in the rat renal cortex". Kidney Int. 21, 676-682; Spiro, M.J. (1984) "Effect of diabetes on the sugar nucleotides in several tissues of the rat" Diabetologia 26, 70-75; Sochor, M., Kunjara, S., Baquer, N.Z., McLean, P. (1991) "Regulation of glucose metabolism in livers and kidneys of NOD mice". Diabetes 40, 1467-1471)。例えば、UDPGは動物におけるグリコーゲンの前駆体であるから、この分子のレベルの解析は、種々の型の糖尿病など炭水化物代謝と関連した疾患の研究と診断において重要でありうる。一方、尿中のPAPSレベルの測定は、ロウ症候群または抗リン脂質症候群などの重篤な病気の診断のために必須である(Yoshida, H., Fukui, S., Yamashina, I., Tanaka, T., Sakano, T., Usui, T., Shimotsuji, T., Yabuuchi, H., Owada, M., Kitagawa, T. (1982) "Elevation of nucleotide pyrophosphatase activity in skin fibroblasts from patients with Lowe's syndrome". Biochem. Biophys. Res. Commun. 107, 1144-1150; Amigo, M.C., Garcia-Torres, T. (2000) "Morphology of vascular, renal, and heart lesions in the antiphospholipid syndrome: relationship to pathogenesis" Curr. Rheumatol. Rep. 2000, 2, 262-270)。明らかに、サンプル中のこれらの物質のレベルを簡単に安価に解析する可能性は、クロマトグラフィー技術に対する有利な代替物を示すものである。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、我々がNPPaseと呼ぶ植物由来の酵素プロダクト（product）の精製および応用を述べるものであり、NPPaseはフォスフォジエステルまたはフォスフォスルフェイト結合を有する小分子の加水分解を触媒し、特にADPGとAPSを好適な基質である。最初の優先権主張出願（ES 200201647）において、彼らがその時に入手できる実験データによって、発明者らは単離された酵素プロダクトを暫定的にNSPPaseと名付けたが、その後に、蓄積されたデータにより、第二の優先権主張出願（ES 200202673）においてはその命名を現在と同じNPPaseと変えた。
【０００７】
本発明の植物酵素は、酵素が得られる植物組織中に種々のアイソフォームを有している(Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A., Rodriguez-Lopez, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2000) "Distinct isoforms of ADPglucose pyrophosphatase and ADPglucose pyrophosphorylase occur in the suspension-cultured cells of sycamore (Acer pseudoplatanus L.). FEBS Lett. 480, 277-282)。抽出が最も簡単なアイソフォームは我々が可溶性と呼ぶものであり、一方我々がパーティキュレート（particulate）と呼ぶ他のアイソフォームは澱粉顆粒に堅く付着していることが見出されている。
【０００８】
本発明において我々は、およそ70kDaの大きさを有するオオムギとイネのNPPaseの種々の可溶性アイソフォームを、精製して部分的な配列を決定することに成功した。これらの配列に基づいて、我々はNPPaseをコードするcDNAを単離できた。それらの配列をデータベースで入手可能な配列と比較した後、イネとオオムギのNPPaseはPPDI（キバナルピナスのヌクレオチド・フォスファターゼ/フォスフォジエステラーゼ）と相同性を有することが観察され、それは本発明のNPPaseとは対照的に、ジ-およびトリ-フォスフェイトヌクレオシドはPPDIの最高の基質であるが、ヌクレオチド糖を加水分解することはない(Olczak, M., Olczak, T. (2002) "Diphosphonucleotide phosphatase/phosphodiesterase from yellow lupin (Lupinus luteus L.) belongs to a novel group of specific metallophosphatases". FEBS Lett. 519, 159-163)。更に、それはシロイヌナズナやヒヨコマメなどの双子葉植物の未知の又はあり得る蛋白質をコードする他の配列と相同性を有していた。本発明の一つの目的は、第一には、オオムギ（Hordeum vulgare）とイネ（Oryza sativa）の植物組織から出発して、種々の可溶性の70kDaアイソフォームのNPPaseを実質的に純粋な型で、産生し、特性解析し、配列決定することである。他の目的は、NPPaseをコードする完全なcDNAを産生することであり、それらをデータベースで入手可能な配列と対比することである。可溶性NPPaseのcDNAから得られたコンストラクションの設計は形質転換植物の産生を意図しており、その形質転換植物はNPPase活性が高く、澱粉の含有量と質のみならず細胞壁多糖の含有量と質も対照植物と比較されて改変されており、それについては後に詳しく述べる。前記の植物は浸透圧毒性の指標であるPAPを蓄積せず、そのために、対照植物と比較してそれらは高濃度の塩により耐性である。
【０００９】
本発明の他の目的は、NPPase活性を有する酵素プロダクトの使用に基づいて、ヌクレオシド・ジフォスフェイト糖およびスルフォヌクレオチドを測定するための装置またはキットを作るのに使用される方法である。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明によるNPPase酵素活性を有する植物プロダクトは、任意の種に由来する任意の植物組織から出発して取得して精製でき、その植物種の例には、オオムギ(Hordeum vulgare), 、コムギ(Triticum aestivum)、イネ(Oryza sativa)、コショウ(Capsicum annuum)、トマト(Lycopersicon sculentum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、またはスズカケノキ(Acer pseudoplatanus L.)があり、それらは種々の科および属の多数の代表的な例のほんの数個を挙げただけである。
【００１１】
NPPaseの可溶性アイソフォームの産生および精製
本発明において述べられている可溶性の植物NPPaseを取得して精製するための一般的な方法は、下記の工程を含み、その中で、抽出および精製方法の一般的な枠組みを実質的に変えることがない僅かな変更は許容できる。NPPaseは若い葉の中に特に豊富に存在し、種子の内胚乳や塊茎などの貯蔵組織には実質的には存在せず、従って、NPPaseの抽出には若い葉を使用することが推奨される。
【００１２】
１．抽出緩衝液により植物組織をホモゲナイズする。
２．ミラクロス（登録商標）（チーズ製造で使用するミルクを濾過する布）の4層を通じて濾過する。
３．濾過されたホモジェネートを限外濾過する。
４．硫酸アンモニウム中で上清の蛋白質を沈殿する。
５．pHが4.2の緩衝液中に沈殿物を再懸濁する。
６．60から65℃の間の温度で少なくとも15分間加熱する。
７．遠心分離する。
８．上清を濃縮し、ゲル濾過クロマトグラフィーで蛋白質の精製をする。UDPGまたはADPGなどの基質とインキュベートしたサンプル中でG1PとAMPの産生を検出することにより、NPPaseの酵素活性を検出する。
９．NPPaseをコンカナバリンA型のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにかけ、それはNPPaseがグリコシル化されたことを示す。
１０．3.5から9.5の間のpH範囲でPAGプレートを使用しながら、マルチフォー（Multiphor）IIシステム中で等電点電気泳動法を行なう（アマシャム/ファルマシア）。NPPaseの位置は下記の方法の中の一つにより決定される。
a) 蛋白質の溶出に引き続いて、ADPGまたはUDPGの存在下でG1Pの産生を検出する。
b) ビス-パラニトロフェニルフォスフェイト（bis-PNPP）を含む溶液中でゲルをインキュベートし、NishimuraとBeeversによって述べられた（Nishimura, M., Beevers, H. (1978) Plant Physiol. 62, 44-48）塩基溶液中で現像する。
１１．NuPAGE 4-12％ビス−トリス（ノバックス、サンディエゴ、カリフォルニア）などの中性または僅かに酸性の緩衝液のシステム中で、変性ゲル中で電気泳動により蛋白質を分離する。NPPaseの位置は下記の方法によって容易に決定できる：
a) 蛋白質を溶出に引き続いて、ADPDの存在下でGIPの産生を検出する。
b) ビス-PNPPを含む溶液中でゲルをインキュベートし、塩基性溶液中で現像する。
【００１３】
NPPase酵素活性によるプロダクトの同定
上記で述べた方法または他の等価の方法により得られた酵素プロダクトは、下記の機能を基準とした手段により同定される：
・等モル量のG1PとAMPの中でADPGの加水分解を触媒するのは、ピロフォスファターゼ/フォスフォジエステラーゼである(Rodriguez-Lopez, M., Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) "Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase: a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis". Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 8705-8710)。
・ADPGに加えてそれは、UDPG, GDP-グルコース、GDP-マンノース、ADP-マンノース、ビス-PNPP、PAPSおよびAPSならびに構造が類似する他のものなど、フォスフォジエステルおよびフォスフォスルフェイト結合を有する小分子を認識する。
・それは、G1P、G6P、AMP、3-フォスフォグリセレート、および類似した他のものなど、フォスフォモノエステル結合を有する分子を加水分解しない。それは、文献中で述べる他のフォスフォジエステラーゼの基質である、サイクリックAMPまたはDNAならびにRNAなどの長鎖核酸も加水分解しない。
・細菌と動物の中で述べられたADP-糖のピロフォスファターゼ（EC 3.6.1.13, EC 3.6.1.21）とは対照的に、および他のフォスフォジエステラーゼ（EC 3.6.4）とも対照的に、それのイオン必要性は低下するので、それはマグネシウム、マンガン、コバルト、および他の二価カチオンの非存在下で作用することができる。
・細菌および動物のヌクレオシドジフォスフェイト糖のピロフォスファターゼとは対照的に、NPPaseはビス-PNPPを加水分解する。
・AMP、ADP、ATP、3-フォスフォグリセレート、オルトフォスフェイト、無機ピロフォスフェイト、および類似の性質を有する他のものなど、リン酸化された分子によって阻害される。
・それはモリブデン酸およびヒ酸によって強く阻害される。
・それはSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）などのイオン性界面活性剤に耐性である。
・それは、プロテイナーゼKおよびプロナーゼ（ベーリンガー）などの広範囲のプロテアーゼの作用に対して耐性である。
・その活性は、β-メルカプトエタノール、EDTA、還元されたシステイン、アスコルビン酸および他の還元剤およびキレート剤など、典型的なフォスフォジエステラーゼの阻害剤の作用によって影響されない。
・それはやや塩基性のpHに対して感受性を有し、4から7.5の間のpHで非常に安定である。
【００１４】
可溶性NPPaseをコードする完全なcDNAの産生
精製された種々のNPPaseの既知の内部アミノ酸配列のいくつかを、データベース中に存在する他のものと比較した。この解析の結果から、RT-PCRにより、イネとオオムギのNPPaseをコードするcDNAを取得するために使用される2つのプライマーを設計することが可能となった。得られたcDNAをpGEM-Tベクター中へクローン化し、若いイネの葉のcDNAライブラリー中で完全なcDNAを探索するためのプローブとして使用した。得られた完全なcDNAを、コンストラクションpNPP（図１）を生じさせるプラスミドpSK Bluescript（ストラタジーン）のEcoRV制限部位中へ導入し、それを宿主細菌XL Blue中で増幅した。この細菌の菌株は2002年10月15日に、バレンシア、46100バージャソット、バージャソットキャンパス、研究棟、バレンシア大学のスパニッシュ・タイプ・カルチャー・コレクションにCECT 5739として寄託されている。
【００１５】
可溶性NPPaseのcDNAを過剰発現している形質転換植物の作成
HingIII酵素、T4 DNAポリメラーゼおよびXbaIによりpNPPを連続的に消化した。NcoI酵素、T4 DNAポリメラーゼおよびXbaIにより連続的に消化した後に、遊離した断片（NPPaseのcDNAを含む）をプラスミドpVT’BSP中にクローン化した。このようにして我々は、構成的プロモーター35S、NPPaseのcDNAおよびNOSターミネーターを有する、p35SNPPNOSと名付けられたプラスミドを入手した。
【００１６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介してこのコンストラクションを植物のゲノムに移行できるようにするために、それをバイナリープラスミドに前もってクローン化することが必要である。このために、HingIII酵素、T4 DNAポリメラーゼおよびXbaIによってp35SNPPNOSを連続的に消化し、HingIII酵素、T4 DNAポリメラーゼおよびXbaIにより前もって消化しておいたバイナリープラスミドpBIN20(Hennegan, K.P., Danna, K.J. "pBIN20: An improved binary vector for Agrobacterium-mediated transformation" Plant Mol. Biol. Rep. 16, 129-131) の中にクローン化した。そのようにして得たプラスミドをpBIN20-35S-NPP（図２）と名付けた。大腸菌（XL1 Blue）中で増幅した後に、pBIN20-35S-NPPをアグロバクテリウム・ツメファシエンス中に導入し、それを用いてトマト、タバコ、ジャガイモなどの種の形質転換を行なった（Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., Fraley, R.T. (1985) "A simple and general method for transferring genes into plants" Science 277, 1229-1231）。そのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株は2003年5月16日に、46100バージャソット、バージャソットキャンパス、バレンシア大学（バレンシア、スペイン）の研究棟にあるスパニッシュ・タイプ・カルチャー・コレクションに、寄託番号CECT 5799として寄託されている。
【００１７】
ヌクレオシド・ジフォスフェイト糖およびスルフォヌクレオチドの測定のための装置（アッセイキット）の調製
ヌクレオシド・ジフォスフェイト糖およびスルフォヌクレオチドなどのヌクレオチドの測定のために設計されたキットは、NPPase活性を有するプロダクトが小分子のフォスフォジエステルおよびフォスフォスルフェイト結合へ及ぼす作用に基づいており、その小分子は加水分解された後に検出と定量が容易である他の分子を生じる。
【００１８】
これらのキットを作るための二つの最も適切な戦略は、本発明の酵素（即ちNPPase）によってヌクレオシド・ジフォスフェイト糖を加水分解し、等モル量の糖-1-フォスフェイトおよび対応するヌクレオシド・モノフォスフェイトを生成することから始まる。今後、生成した糖-1-フォスフェイトおよびヌクレオシド・モノフォスフェイトの量の測定に基づいて、サンプル中に最初に存在しているヌクレオチドの量を下記のようにして測定することが考えられる。
・糖-1-フォスフェイトがグルコース-1-フォスフェイト（G1P）である場合には、前記化合物はフォスフォグルコムターゼ酵素の作用にかけられ、グルコース-6-フォスフェイトを生じ、その次にグルコース-6-フォスフェイト・デヒドロゲナーゼ酵素の作用によってNAD+との共役反応を受け、測定が容易な6-フォスフォグルコネートおよびNADHを得る。
・糖-1-フォスフェイトがG1Pでない場合には、それとヌクレオシド・モノフォスフェイトの測定は、これらの化合物をアルカリ・フォスファターゼによって加水分解した後に生成するオルトフォスフェイト（Pi）の比色測定によって行なわれる。代わりに、共役酵素として5’-ヌクレオチダ−ゼを使用することが可能であり、それはヌクレオシド・モノフォスフェイトを等モル量の対応するヌクレオシドとリン酸に加水分解する。２つのいずれかの場合に放出されるリン酸は、既知の比色測定法によって容易に定量できる。
【００１９】
ASPなどのスルフォヌクレオチドのレベルの測定のための戦略は、これらのヌクレオチドの加水分解、および引き続いて当モル量の硫酸塩を産生させることに基づいており、それは濁度測定または比濁法によって測定できる(Sorbo, B. (1987) "Sulfate: turbidimetric and nephelometric methods" Methods Enzymol. 143, 3-6)。
【００２０】
植物NPPaseに対して特異的なポリクローナル抗体の作製
2ミリグラムの精製されたNPPaseをSDS-PAGEによって分離した。溶出した後に、それを完全なフロイドアジュバント（50/50の比で）と混合し、その後に3つの同等の画分に等分し、それらをそれぞれ2週間の間隔でウサギに注射した。最初に注入しておよそ3ヶ月後に、AGPPaseに対する特異的なポリクローナル抗体が含まれているウサギの血清を抽出した。
【００２１】
ウエスタンブロッティングによるプロダクトの同定
野生型植物およびイネのNPPaseをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換植物に由来する蛋白質のサンプルを、SDS-PAGEによって分離する。その後それらをニトロセルロース膜に写し、文献中に述べられている方法論に従って、特異的な抗NPPase抗体を使用してNPPaseを検出した(Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedures and some applications" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354)。
【実施例】
【００２２】
若いオオムギの葉の可溶型NPPaseの産生および精製の方法を詳細に述べる実施例を下記に示す。各々の場合に適切である僅かな改変を伴う同じ方法を任意の他の種に適用することができる。他の実施例はヌクレオチド糖とスルフォヌクレオチドの測定のためのアッセイキットを産生するためのNPPaseの使用を述べるものである。他の実施例は可溶性NPPaseをコードする完全なcDNAの産生を示すものである。
【００２３】
実施例１：オオムギの葉から得られた可溶性NPPaseの抽出および精製
他に示す以外には全ての段階を4℃で行なった。ワーニングブレンダーを用いて、植物組織（900g）を2900mLの抽出緩衝液（Mes 50mM, pH6, EDTA 1mM, DTT 2mM）でホモゲナイズした。ホモジネートを4層のミラクロスを通じて濾過し、100,000gで30分間遠心分離し、上清を50%の硫酸アンモニウムに調整した。30,000gで30分間遠心分離（20℃）を行った後に得られた沈殿物を、2900mLの50mM, pH4.2のMesの中に再懸濁し、水浴上で62℃で20分間加熱し、氷の中で冷却し、30,000gで20分間遠心分離した。50%硫酸アンモニウムを使用して上清の蛋白質を沈殿し、5.7mLの50mM, pH6のMesの中に再懸濁した。そしてそのサンプルを、pH6のMesとNaCl 150mMで予め平衡化したスーパーデックス200カラム（ファルマシアLKBバイオテクノロジー、アプサラ、スウェーデン）中でゲル濾過にかけた。NPPase活性を有する画分を混合し、濃縮し、非変性ゲル中で等電点電気泳動にかけ、蛋白質が均一になるまで精製した（図３）。
【００２４】
実施例２：酵素学的な試験
述べた場合以外には、全ての酵素反応は37℃で行なった。NPPase活性の測定は、Sowokinos（1981）（Sowokinos, 1981, Plant Physiol. 68, 924-929）によって述べられた2段階でのG1Pの分光学的分析を使用して行なわれた。反応混合液の全容量50マイクロリットルの中には、Hepes 50mM, pH7、特定の量のADPG、および蛋白質抽出物が含まれていた。全てのアッセイをADPGのブランクと比較して行なった。20分間インキュベートした後、乾燥浴中で2分間煮沸して反応を停止した。混合溶液を20,000gで5分間遠心分離し、上清を回収した。第二段階においてG1Pを、Hepes 50mM, pH7、EDTA 1mM、MgCl2 2mM、KCl 15mM、NAD+ 0.6mM、フォスフォグルコムターゼを一単位、およびリューコノストク・メゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来のグルコース-6-フォスフェイト・デヒドロゲナーゼを一単位、および第一段階から得られた上清30マイクロリットルを含む300マイクロリットルの混合液中で分光学的に測定した。20分間インキュベートした後、Multiskan EX分光光度計（ラボシステムズ）を使用してNADHの生成を340nmで観測した。第一段階においてADPGの非存在下でいずれの蛋白質抽出物のより産生されたNADHの量も、無視できるものであった。
【００２５】
下記の蛋白質標準の分子量の対数に対する分配係数（Kav）をプロットすることにより、NPPaseの非変性分子量をゲル濾過によって測定した。その蛋白質標準は：ウシのチログロブリン（670kDa）、ウシのガンマグロブリン（158kDa）、オボアルブミン（45kDa）、ミオグロブリン（17kDa）およびビタミンB-12（1.3kDa）である。バイオラッドによって作られた試薬および標準としてのガンマ-グロブリンを使用し、ブラッドフォード法により蛋白質含量を測定した。
【００２６】
下記の表１はオオムギの葉から出発した可溶性NPPaseの精製を示す。単位（U）は1分あたり1μmolのプロダクトの産生を触媒する酵素量として規定される。
【００２７】
【表１】
2005532806.tif 000002
【００２８】
実施例３：得られた酵素活性によるプロダクトの同定
そのように得られたNPPase活性を有するプロダクトは下記の特性に従う。
・それは等モル量のG1PとAMPを産生するADPGの加水分解を触媒する
・ADPGに加えて、UDPG, GDP-グルコース、ビス-PNPPおよび構造が類似する他の小分子など、フォスフォジエステル結合を有する他の小分子をNPPaseは認識する。それは、APSなどのフォスフォスルフェイト結合を有する小分子の加水分解も触媒し、等モル量の硫酸塩およびAMPを遊離する（表２および表３、ADPGに対する％でのVmax）。
・それはG1P、G6P、AMP、3-フォスフォグリセリン酸、および他の類似分子などフォスフォモノエステル結合を有する分子を加水分解しない。それは、文献中で述べられている他のフォスフォジエステラーゼの基質であるサイクリックAMPまたはDNAおよびRNAなどの核酸も加水分解しない。
・それのイオン要求性は低下しており、そのためにNPPaseは、マグネシウム、マンガン、コバルト、および他の二価カチオンの非存在下で作用することができるが、それらは、他のフォスフォジエステラーゼが機能するために必須のエフェクターであると文献中で述べられている。
・細菌および動物のヌクレオシド・ジフォスフェイト糖のピロフォスファターゼとは対照的に、NPPaseはビス-PNPPを加水分解できる。
・AMP、ADP、ATP、3-フォスフォグリセリン酸、オルトフォスフェイト、無機ピロフォスフェイトおよび類似の性質を有する他のものなど、リン酸化された分子によってそれは阻害される。
・それはモリブデン酸塩およびヒ酸塩によって強く阻害される。
・それはSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）などのイオン性界面活性剤に対して耐性である。
・それはプロテイナーゼKやプロナーゼ（ベーリンガー）などの広い範囲のプロテアーゼに対して耐性である。
・その活性はβ-メルカプトエタノール、EDTA、還元されたシステイン、アスコルビン酸および他の還元試薬およびキレート試薬など、典型的なフォスフォジエステラーゼ阻害剤の作用により影響されない。
・それはやや塩基性のpHに対して感受性を有し、pH4から7.5の間において非常に安定である。この特性は、文献中に述べられた大部分のフォスフォジエステラーゼから、NPPaseを完全に異なったものとするものであり、なぜならば、やや塩基性のpH値において後者は安定且つ活性である。
・それは65℃の温度に30分間耐え、以下のデータによって特性化することができる。
・ゲル濾過によって測定されたみかけの分子量が70kDaから270kDaの付近であり、その事から、それは70kDaのモノマー型と他のホモポリマー型を有すると推定される。
・反応のKeq’は110である。
・標準自由エネルギー（△G’）の増加は-2.9kcal/モルである。
・コンカナバリンのカラムに保持されるため、それは糖蛋白質である。
・変性ゲルにおいて精製された蛋白質のみかけの分子量は70kDa付近である。
・取得されたオオムギNPPaseアミノ酸配列は：
−N末端：配列番号１
−内部配列（NPPaseをトリプシンにより部分加水分解した後に得られたもの）：配列番号２,３,４,５および６である。
・取得されたイネNPPaseのアミノ酸配列は：
−N末端：配列番号７
−内部配列（NPPaseをトリプシンにより部分加水分解した後に得られたもの）：配列番号８,９,１０,１１,１２,１３，１４，１５，１６、および１７である。
【００２９】
【表２】
2005532806.tif 000003
【００３０】
【表３】
2005532806.tif 000004
【００３１】
実施例４：イネ由来の可溶性NPPaseをコードする完全なcDNAの取得およびオオムギ由来の可溶性NPPaseをコードする不完全なcDNAの取得
NPPaseの内部配列の知識により、5’から3’の方向のプライマーを設計することが可能となり、それらが配列番号１８と１９である。このプライマーを使用してRT-PCRの常法によってcDNAを増幅し、イネとオオムギの若い葉からcDNAライブラリーを得るためのプローブとして使用した。結果としてイネNPPaseの完全なcDNAが得られ、pSK Bluescriptプラスミド（ストラタジーン）の中に挿入され、それを宿主細菌XL Blue中で増幅した。イネNPPaseの完全なcDNAの配列は配列番号２０であり、その推定アミノ酸は配列番号２１である。オオムギNPPaseの不完全なcDNAの配列も得られ（配列番号２２）、その推定アミノ酸は配列番号２３である。このために、配列番号２４で示されたプライマーは削除された。データベースで入手できる配列と比較した後、イネNPPaseはPPDI（アクセッション番号AJ421009）と60％の相同性を有することが観察され、PPDIはキバナルピナスのヌクレオチド・フォスファターゼ/フォスフォジエステラーゼであって、ヌクレオシドジ-およびトリ-フォスフェイトを加水分解するが、ヌクレオチド糖を加水分解することはできない（Olczak, M., Olczak, T. (2002) "Diphosphonucleotide phosphatase/phosphodiesterase from yellow lupin (Lupinus luteus L.) belongs to a novel group of specific metallophosphates". FEBS Lett. 519, 159-163）。更に図４に見られるように、シロイヌナズナ（アクセッション番号AY099570）やヒヨコマメ（アクセッション番号AJ271664）などの双子葉植物のcDNAが配列決定され、それらはイネNPPaseと高い相同性を示す既知またはあり得る蛋白質をコードする。
【００３２】
実施例５：種々の植物由来のNPPase活性を有するプロダクト
植物の間でNPPase酵素は非常に広い分布を示し、そのために、NPPase活性を有する酵素プロダクトは任意の植物、特に葉や根などの若い植物の組織から得られる。例えば下記の表４は、種々の単子葉植物及び双子葉植物中で得られる比活性（mU/mg蛋白質）を示す。
【００３３】
【表４】
2005532806.tif 000005
【００３４】
実施例６：グルコース-ヌクレオシド・ジフォスフェイトを測定するための酵素キットの調製
ADP、UDPG、CDP-グルコース、GDP-グルコースおよびTMP-グルコースなどのグルコース-ヌクレオシド・ジフォスフェイトの測定のために、下記の要素を含んでいるキットを調製した。
a. NPPase
b. NAD
c. フォスフォグルコムターゼ（PGM）
d. G6P デヒドロゲナーゼ（G6PDH）
e. 緩衝液
【００３５】
試験サンプル中に存在するグルコース-ヌクレオシド・ジフォスフェイトの量の測定は、下記の共役反応に従って生成したNADHの分光学的な測定に基づいている。
(試験サンプル)                          NAD+       NADH
NDP-グルコース → NMP + G1P  →  G6P  →  6-フォスフォグルコネート
NPPase PGM G6PDH
【００３６】
試験サンプル中のNDP-グルコースの量は、下記の組成のカクテルを調製することによって測定できるであろう（1mlあたり）。
・試験サンプル
・1単位のNPPase
・1単位のPGM
・1単位のG6PDH
・0.6mMのNAD
・MesまたはHepes緩衝液、50mM、pH7
・水（1mlとする）
37℃で20分間インキュベートしてサンプルの340nmにおける吸光度の変化を観察する。NPPaseを含んでいないカクテルは、陰性対照として使用できる。
【００３７】
実施例７：グルコース以外の糖のヌクレオシド・ジフォスフェイトの測定のための酵素キットの調製
下記のヌクレオシド・ジフォスフェイト糖の測定のためにキットを調製した。
・リボース-ヌクレオシド・ジフォスフェイト（ADP-リボース、GDP-リボース、UDP-リボース、CDP-リボースまたはTDP-リボース）
・マンノース-ヌクレオシド・ジフォスフェイト（ADP-マンノース、GDP-マンノース、TDP-マンノース、UDP-マンノースまたはCDP-マンノース）
・ガラクトース-ヌクレオシド・ジフォスフェイト（ADP-ガラクトース、GDP-ガラクトース、UDP-ガラクトースまたはCDP-ガラクトース）
・グルクロニック-ヌクレオシド・ジフォスフェイト（グルクロニック-GDP、グルクロニック-UDP、グルクロニック-ADP、グルクロニック-CDPまたはグルクロニック-TDP）
・フルクトース-ヌクレオシド・ジフォスフェイト（GDP-フルクトース、ADP-フルクトース、CDP-フルクトース、UDP-フルクトースまたはTDP-フルクトース）
・ガラクツロニック-ヌクレオシド・ジフォスフェイト（ガラクツロニック-UDP、ガラクツロニック-GDP、ガラクツロニック-CDP、ガラクツロニック-TDPまたはガラクツロニック-ADP）
【００３８】
本キットは下記の要素を有する。
a. NPPase
b. 5’-ヌクレオチダーゼ（または代わりにアルカリフォスファターゼ）
c. 緩衝液
【００３９】
試験サンプル中に存在するヌクレオシド・ジフォスフェイト糖の量の測定は、下記の共役した酵素反応に従って放出されたオルトフォスフェイトの比色測定に基づいている。
(試験サンプル)
NDP-糖  →  糖-P + NMP  →  塩基 + Pi（リン酸塩）
NPPase 5'-ヌクレオチダーゼ
参考文献および市販によって入手できる多数の比色測定法のいずれかによって、リン酸塩を測定することができる。
【００４０】
試験サンプル中のNDP-糖の量は、下記の組成のカクテル（1ml）を調製することによって測定できるであろう。
・試験サンプル
・1単位のNPPase
・1単位の5'-ヌクレオチダーゼ（または代わりに1単位のアルカリフォスファターゼ）
・MesまたはHepes緩衝液、50mM、pH7.5
・水（1mlとする）
37℃で20分間インキュベートし、放出されたリン酸塩の生成を定法により測定する。NPPaseを含んでいないカクテルは、陰性対照として使用できる。
【００４１】
実施例８：PAPSとAPSの測定のための酵素キットの調製
PAPSまたはAPSなどのスルフォヌクレオチドのレベルを測定するための方法は、下記の反応に従った濁度または比濁測定に基づいている。
NPPase
PAPS  →  PAP+硫酸塩
NPPase
APS   →  AMP+硫酸塩
【００４２】
試験サンプル中のスルフォヌクレオチドの量は、下記の組成のカクテル（1ml）を調製することによって測定できるであろう。
・試験サンプル
・1単位のNPPase
・MesまたはHepes緩衝液、50mM、pH7.0
・水（1mlとする）
37℃で20分間インキュベートし、放出された硫酸塩の生成を定法により測定する。NPPaseを含んでいないカクテルは、陰性対照として使用できる。
【００４３】
NPPaseを過剰発現するタバコ、ジャガイモおよびトマトの形質転換植物の産生
アグリバクテリウム・ツメファシエンスCECT5799株を使用し、解析した全ての器官（根、葉、果実および茎）において高いNPPase活性を有するタバコ(Nicotiana tabacum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum) およびトマト(Lycopersicon sculentum)の植物を我々は得た（図５）。これらの植物は、イネNPPaseに対して得られたポリクローナル抗体によって特異的に認識される蛋白質を大量に蓄積し（図６）、下記の特性を有していた。
１．澱粉および細胞壁の炭水化物の含量が低い（この文献中において述べられた市販キットに基づいた測定技術による(Frehner, M., Pozueta-Romero, J., Akazawa, T. (1990) "Enzyme sets of glycolysis, gluconeogenesis, and oxidative pentose phosphate pathway are not complete in nongreen highly purified amyloplasts of sycamore cell suspension cultures" Plant Physiol. 94, 538-544)）。
２．スクロース、グルコース-6-フォスフェイト、グルコースおよびフルクトースなどの可溶性の糖の含量が高い。
３．組織中に蓄積されたPAPのレベルが低下し、非形質転換植物と比較して、生育基質中の高濃度の塩化ナトリウムに対する耐性が付与されている。
４．高温に対する耐性。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１：pNPPの模式図
【図２】図２のＡからＣ：pBIN20-35S-NPPの産生
【図３】図３：非変性ゲル中での等電点電気泳動法（IEF）による、70-kDaのNPPaseの単離。a) それらの等電点（図の最上部において示した値）に対してIEFで分離された後の蛋白質の染色に対応する。陰極は右であり、陽極は左である。1単位のAGPPaseを含む部分精製されたサンプルを、3.5-9の範囲のpHでアンフォラインPAGプレートへかける。b) NPPase活性のプロファイルに対応する。IEFゲルから溶出された各画分のNPPase活性を測定する。c) IEFゲルから溶出された各画分をSDS-PAGEにかけ、クマシーブルーで染色する。70-kDaの蛋白質が濃縮された画分を矢印で示し、酵素的に最も活性であることが証明された。
【図４】図４：イネNPPaseをコードするcDNAから推定されたアミノ酸配列と、キバナルピナスのPPDI（AJ421009）をコードするcDNAから推定されたアミノ酸配列と、シロイヌナズナ（AY099570）およびヒヨコマメ（AJ271664）の未知の蛋白質の間のアミノ酸配列の比較である。
【図５】図５：野生型（WT）およびイネNPPを過剰発現している9個のジャガイモの形質転換株におけるADPグルコースの加水分解活性。
【図６】図６：イネNPPaseを過剰発現している5個のジャガイモの形質転換株のウエスタンブロット。各レーンに50マイクログラムの蛋白質を載せ、SDS-PAGEにかけた。ニトロセルロースフィルターに転写した後、ウサギで得られたNPPに対して特異的なポリクローナル抗体を使用した後に、NPPを特異的に免疫修飾した。
【図１】
2005532806.tif 000006
【図２】
2005532806.tif 000007
【図３】
2005532806.tif 000008
【図４】
2005532806.tif 000009
【図５】
2005532806.tif 000010
【図６】
2005532806.tif 000011
【配列表】
2005532806000001.app
【国際調査報告】
2005532806.tif 000012
2005532806.tif 000013
2005532806.tif 000014
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