(57)【要約】固相アッセイが、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド、島新生関連性タンパク質（ＩＮＧＡＰ）の生物学的に活性な部分である１５アミノ酸ペプチドに対する抗体を検出するために使用される。ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体のアイソタイプが決定され得る。キットはまた、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の検出において使用され得る。内因性自己抗体又はＩＮＧＡＰ104-118での哺乳動物の治療的処置の間の抗体産生がモニターされ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中のＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体を検出するための方法であって：
哺乳動物からの試験サンプルを、固体支持体に結合されたＩＮＧＡＰ104-118ペプチドと接触する工程であって、この接触は前記ペプチドに抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を結合するために十分な条件下にある工程；
該固体支持体を、哺乳動物の全てのアイソタイプの抗体分子を特異的に結合する検出抗体と接触する工程；及び
固体支持体に結合された検出抗体を測定する工程であって、固体支持体に結合された検出抗体は試験サンプルがＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体を含むことを示す工程、
を含む方法。
【請求項２】
結合された検出抗体の量が、抗ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド抗体の既知の量を使用して作成される標準曲線に比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出抗体が検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出可能な標識が蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、及び色素分子からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試験サンプル中のＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体を検出するため、及び該抗体のアイソタイプを決定するための方法であって：
哺乳動物からの試験サンプルを、固体支持体に結合されたＩＮＧＡＰ104-118と接触する工程であって、この接触はＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を結合するために十分な条件下にある工程；
該固体支持体を、哺乳動物の１つのアイソタイプの抗体分子を特異的に結合するアイソタイプ特異的検出抗体と接触する工程；及び
固体支持体に結合されたアイソタイプ特異的検出抗体を測定する工程であって、固体支持体に結合されたアイソタイプ特異的検出抗体は試験サンプルがＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体を含むこと、及びＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体が検出されたアイソタイプであることを示す工程、
を含む方法。
【請求項６】
検出抗体が、蛍光分子、化学発光分子、放射活性分子、及び色素分子からなる群より選択される検出可能な標識で標識される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド；及び
検出抗体
を含む、哺乳動物の試験サンプル中の抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を検出するためのキット。
【請求項８】
ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドは固体支持体に結合される、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
試験サンプル中の抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の量を算定するのに使用する標準曲線をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体のためのアッセイの分野に関する。具体的には、本発明は、投与された治療薬剤に対して哺乳動物で惹起される抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓ランゲルハンス島は、身体におけるインスリン産生の唯一の器官である。しかし、それらは制限された再生能力を有する。この制限される再生能は、哺乳動物が真性糖尿病を発症する素因である。島新生関連性タンパク質（ＩＮＧＡＰ、配列番号２）は、島新生の刺激において、特に導管細胞からのβ細胞再生において、役割を果たす。ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド（ＩＧＬＨＤＰＳＨＧＴＬＰＮＧＳ、配列番号１）、ＩＮＧＡＰのアミノ酸１０４−１１８を含有する１５アミノ酸ペプチドは、生物学的に活性であり、動物モデルにおいて島細胞再生を誘導し得る。哺乳動物のＩＮＧＡＰ104-118ペプチドを含有する薬学的組成物は、真性糖尿病から生じ得る内分泌性膵臓機能不全の処置のために使用され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体は、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドの反復投与後に患者において生成され得るか、又は内因性タンパク質に対する自己抗体として生成され得、これはＩＮＧＡＰの作用を低減し得るか又は糖尿病についての診断マーカーとして作用し得る。従って、当該分野において、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドでの処置後に被験体において惹起され得る抗体を検出するための簡便なアッセイへの必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の１つの実施態様は、試験サンプル中のＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体を検出するための方法である。この方法は、哺乳動物の血清を含有する試験サンプルと、固体支持体に結合されるＩＮＧＡＰ104-118ペプチドとを接触する工程を含む。接触は、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体がＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに結合するために十分な条件下で行われる。固体支持体を、哺乳動物の全アイソタイプの抗体分子を特異的に結合する検出抗体と接触させる。固体支持体に結合される検出抗体が測定される。固体支持体に結合される検出抗体は、試験サンプルがＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体を含むことを示す。
【０００５】
本発明の第２の実施態様は、試験サンプル中のＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体を検出し、当該抗体のアイソタイプを決定するための方法である。この方法は、哺乳動物の血清を含む試験サンプルと、固体支持体に結合されるＩＮＧＡＰ104-118とを接触する工程を含む。接触は、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体をＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに結合するのに十分な条件下で行われる。固体支持体を、哺乳動物の１つのアイソタイプの抗体分子を特異的に結合するアイソタイプ特異的抗体と接触させる。固体支持体に結合されるアイソタイプ特異的抗体が決定される。固体支持体に結合される検出抗体は、試験サンプルがＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体を含むこと、及びＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体が１つのアイソタイプであることを示す。
【０００６】
本発明のさらなる実施態様は、哺乳動物血清中の抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を検出するためのキットである。キットは、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド及び検出抗体を含む。
【０００７】
本発明のこれらの及び他の実施態様は、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドでの処置の間に被験体をモニタリングするために、ならびにＩＮＧＡＰ自己抗体を伴う患者を同定するために有用である、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに結合された抗体を検出するための道具及び方法を当該分野に提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
インビボで生成される抗ＩＮＧＡＰ抗体が、固相アッセイにおいて、高感度で、特異的に検出され得ることが本発明の発見である。抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体は、哺乳動物の血清の成分による妨害を伴わないで、検出され得る。正常なヒト血清は、擬陽性シグナルを生じる因子を含まず、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体と、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドとの相互作用も阻害しない。
【０００９】
哺乳動物からのサンプルにおける抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体のアッセイは、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドの治療的投与の間の中和抗体の生成をモニターするために有用である。中和抗体は、内因性の自己抗体又はＩＮＧＡＰ104-118ペプチドでの単回又は反復投与後に被験体において生成される抗体であり得る。抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体は、高感度で特異的に検出され得る。
【００１０】
固相アッセイにおいて、精製されたＩＮＧＡＰ104-118ペプチドは、固体支持体上に固定化され得る。固相免疫アッセイは、未結合の成分から結合された成分を分離させる容易さにおいて便利である。工程間にリンスする工程、及び検出抗体を結合する工程、及び指標反応を進行させる工程を含む連続的な免疫アッセイ工程は、高価な自動化及び能力への必要性を伴うことなく容易に行われ得る。
【００１１】
血液、血漿、又は血清を含むがこれらに制限されない任意の試験サンプルが使用され得る。本発明は特に、血清を含む試験サンプルを意図する。血清は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、及びヒトを含む任意の哺乳動物から得ることができる。
【００１２】
試験サンプルは、血清の単一の濃度にて、又は血清の連続希釈によって得ることができる複数の濃度にて、アッセイされ得る。希釈血清は、試験サンプルの供給源である同じ種に由来し得る。緩衝液及び通常の生理食塩水のような他の希釈剤も使用され得る。シグナルが検出され得る最も高い連続希釈も、試験サンプルを特徴づけるために使用され得る。例えば、第１の哺乳動物と第２の哺乳動物における抗体力価の相対的な測定を得るために、シグナルが第１の哺乳動物について検出され得る最も高い連続希釈は、第２の哺乳動物の最も高い連続希釈と比較され得る。
【００１３】
ＩＮＧＡＰ104-118、ＩＮＧＡＰ、又はそれらの誘導体の任意の免疫反応性の形態が使用され得る。全ＩＮＧＡＰペプチドのネイティブな、合成の、もしくは組換えの形態、又はＩＮＧＡＰ104-118配列もしくはＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対する抗体と免疫反応性の部分を含むか、もしくは含むように改変される関連性のタンパク質が使用され得る。従って、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドの部分、又はこのような部分及び他の残基もしくは部分を含むペプチドが使用され得る。誘導体は、ペプチドのＣ末端、Ｎ末端、及び／又はアミノ酸側鎖の修飾を含むがこれらに制限されない。Ｃ末端カルボン酸修飾の例は、エステル化（例えば、ベンジル、メチル、又はエチルエステル）及びアミド化を含む。Ｎ末端修飾の例は、アセチル化及びアルコキシカルボニル化を含む。アミノ酸側鎖修飾は、メチル化、ベンジル化、ｔ−ブチル化、トシル化、アルコキシカルボニル化などを含む。
【００１４】
ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド、ＩＮＧＡＰ、又はその誘導体は、当該分野におけるどの既知の方法によっても生成され得る。これらの方法としては、哺乳動物膵細胞をセロファンラッピングの手段によってＩＮＧＡＰタンパク質を発現するように誘導すること（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｌ．，Ｂｒｏｗｎ、Ｒ．Ａ．及びＤｕｇｕｉｄ，Ｗ．Ｐ．（１９８２）．Ｓｕｒｇ．Ｆｏｒｕｍ  ３３、２２７−２３０）を含むがこれに制限されない。原核生物又は真核生物宿主細胞における標準的な組換え技術も、ＩＮＧＡＰ又はＩＮＧＡＰ104-118ペプチドの完全長もしくは部分を作製するために使用され得る。適切な宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞を含む。当該分野において既知の任意の発現ベクターが使用され得る。酵素が、完全長又は部分タンパク質の酵素的タンパク質分解によって完全長よりも短いタンパク質を作製するために使用され得る。固相ペプチド合成のような、合成化学的な方法が、タンパク質及びポリペプチドを合成するために使用され得る。ポリペプチドは本発明の免疫アッセイのために使用される固体支持体上に直接的に合成され得る。
【００１５】
ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド、ＩＮＧＡＰタンパク質、又はその部分は、タンパク質精製の当該分野において既知の任意の技術手段によって精製され得る。例示的な技術は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び免疫親和性方法を含む。
【００１６】
ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドは、固体支持体に結合される。これは固相支持体に吸着されるか、又は化学的にカップリングされ得る。固体支持体にタンパク質又はペプチドを固定化するための当該分野において既知の任意手段が使用され得る。ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドは、アミドもしくはエステル結合を介する共有結合、又は吸着のような技術によって固相支持体に共有結合的に又は非共有結合的のいずれかで結合され得る。これは、ビオチン及びアビジン、又は抗体及び抗原のような結合対を使用して結合され得る。ＩＮＧＡＰ104-118が固相に固定された後、固相支持体は、支持体表面に対する試験サンプル中の抗体の非特異的な吸着を減少するために、ブロッキング溶液（ウシ血清アルブミンのようなブロッキングタンパク質を含む）とともにインキュベートされ得る。
【００１７】
種々の固相支持体が使用され得、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ニトロセルロース、デキストラン、又は他の材料を含むがこれに制限されない。固相支持体の適切な形態は、これらの材料から形成される、又はこれらの材料でコートされるビーズ、微小粒子、チューブ、繊維、又はプレートを含む。好ましい実施態様において、固体支持体は、９６−ウェルマイクロタイタープレートのような、マイクロタイターウェルを含む。
【００１８】
検出抗体は、固相支持体に結合される抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を評価するために使用される。検出抗体は標識され得る。標識は検出可能である任意の組成物であり得る。当該分野において既知の任意の分析手段が、検出抗体を測定又は検出するために使用され得る。これらの手段は、分光法、化学、光化学、生化学、免疫化学、又は光学の使用を含む。標識は、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される他のもの）、放射性標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、又は32Ｐ）、化学発光化合物（例えば、ルシフェリン、及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、ルミノールなど）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、又は当該分野において既知の任意の他色素であり得る。
【００１９】
標識は、当該分野において周知の方法に従って、検出抗体に直接的に、又は間接的に（例えば、ビオチン及びアビジンのような結合対を介して）結合され得る。上述で示されるように、広範多種標識が使用され得る。標識の選択は、必要とされる感度、化合物との接合の容易さ、安定性要件、利用可能な装置、又は廃棄の設備に依存し得る。使用され得る種々の標識又はシグナル産生系の概説については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【００２０】
検出抗体は、当該分野において既知の任意の適切な方法によって検出又は測定され得る。抗体における標識は、標識が放射活性なγエミッタである場合、γカウンターによって、又は標識が蛍光材料である場合、フルオロメータによって検出され得る。酵素の場合において、標識は酵素のための基質を比色定量的に使用して、検出され得る。好ましい実施態様において、検出抗体は、アルカリホスファターゼが接合される、種特異的免疫グロブリンを使用して検出される。アルカリホスファターゼの任意の基質が使用され得る。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）が基質であり得、そして反応生成物の、ｐ−ニトロフェノールが光学的に検出され得る。
【００２１】
アッセイの結果は定性的又は定量的であり得る。支持体と連結された標識の量は、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の存在を決定するためにポジティブ又はネガティブコントロールと比較され得る。コントロールは、典型的に試験されるサンプルと同時に行われる。ポジティブコントロールは、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドと免疫反応性である抗体を含有する血清であり得る。ネガティブコントロールは、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドと免疫反応性である抗体を含まない血清であり得る。定量のために、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の既知の量を使用する標準曲線が作成及び／又は使用され得る。
【００２２】
ポジティブコントロールとしての使用のための抗体は、ＩＮＧＡＰタンパク質のアミノ酸配列の全て又はフラグメントを使用して生成され得る。本明細書中で使用される「抗体」は、完全な免疫グロブリン分子、及びＩＮＧＡＰ104-118ペプチドのエピトープを結合し得るＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｖのようなそのフラグメントを包含する。当該分野において既知の抗体の任意のタイプが、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドのエピトープに特異的に結合されたように作製され得る。モノクローナル又はポリクローナル抗体は、当該分野において周知であるように作製され得る。
【００２３】
当該分野において利用可能であるような、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を精製するための任意の技術が使用され得る。例えば、抗体は、タンパク質Ａを使用する親和性分離、逆相アルキル化シリカゲルに対する高圧液体クロマトグラフィー、又はゲルろ過のような既知の方法によって精製され得る。抗体はまた、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドが結合される固相上を通過され得る。抗ＩＮＧＡＰ抗体は、固体支持体に結合されるＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに結合し、そして混入物は洗浄されて除かれ得る。結合される抗体は、例えば、高塩濃度を有する緩衝液で、溶出され得る。
【００２４】
本発明のアッセイにおいて用いられる特定のパラメータは、サンプル中の抗体の濃度、サンプルの性質、用いられる免疫アッセイのタイプなどのような種々の因子に依存して広範に変化し得る。光学条件は、当業者によって容易に確立され得る。典型的なアッセイ条件は、約４℃〜約４５℃、及び約５〜９のｐＨ値の範囲を含む。インキュベーション時間は、アッセイの性質に依存して広範に変化し得、そして一般的に約０．１分から約２４時間の範囲である。広範に多様な緩衝液、例えばＴＲＩＳ−緩衝化生理食塩水が用いられ得、イオン強度を増強するための塩、血清アルブミンのようなタンパク質、安定化剤、及び非イオン性洗浄剤のような他の試薬がまた含まれ得る。例示的な条件は実施例２において与えられる。
【００２５】
抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＭが決定され得る。アイソタイプの生物学的機能及び生化学的特徴は異なり、試験サンプル中に存在する抗体のアイソタイプは、被験体における免疫応答のタイプを特徴づけ得る。従って、サンプル中に存在する免疫グロブリン分子のアイソタイプを区別することは有用であり得る。抗体のアイソタイプを決定するための当該分野において任意の既知の方法が意図される。例えば、アイソタイプ決定は、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドと結合される固体支持体上で行われ得る。試験されるサンプルは、ペプチド結合された固体支持体と接触させることができ、検出抗体を使用することができる。。この目的のために使用される検出抗体は、アイソタイプ特異的であってもよい。アイソタイプ特異的検出抗体は、上記のように標識され得、及び検出される。抗体のサブアイソタイプも、当該分野において既知の任意の方法によって決定され得る。
【００２６】
本発明の別の実施態様は、哺乳動物血清において抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を検出するためのキットである。キットは、特に、自然に生じるか、又はＩＮＧＡＰ104-118での、個体の単回の又は反復投与を含む治療の間に生成される、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体をモニタリングするために有用である。キットは典型的に、使用され得るＩＮＧＡＰ104-118ペプチドを、特に、固体支持体にコートするために、分割された又は未分割の容器中に含む。あるいは、キットは、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドで既にコートされた固体支持体を含み得る。キットはまた、ポジティブコントロールとして作用するための、及び標準曲線における使用のための抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を含み得る。種特異的であるが、アイソタイプジェネリックである検出抗体も含まれ得る。検出抗体は検出可能に標識され得る。キットはまた、抗体アイソタイプ決定のためのアイソタイプ特異的検出抗体を含み得る。説明書、標準曲線、及び緩衝液が、キット中に必要に応じて含まれ得る。
【００２７】
以下の例は、単なる例示であり、本発明の範囲を制限するとして意図されない。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）
（抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の特異性）
ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の特異性を試験するために、ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体が、ＩＮＧＡＰ104-118、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＩＮＧＡＰ151-164（Ｃｔｅｒｍ）、又はＩＮＧＡＰ139-152（Ｃｓｅｑ）で予めコートされたマイクロタイターウェル中でインキュベートされた。ペプチドでコーとされたウェルは全て、等価なペプチド濃度を有していた。抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体結合が、抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体検出抗体を使用して評価された。サンプルはｐＮＰＰとともにインキュベートされ、そして光学密度（ＯＤ）が４０５ｎｍでモニターされた。図２は、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を含有するウェルのみがｐＮＰＰとのインキュベーションの際に有意なＯＤ405を示したので、ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体がＩＮＧＡＰ104-118に特異的に結合されたことを実証する。この抗体が、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに特異的に結合し、アッセイ開発におけるその使用を可能にすることが結論された。
【００２９】
（抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の感度）
ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の感度は、種々の濃度のＩＮＧＡＰ104-118ペプチドで予めコートされたマイクロタイターウェル中でＩＮＧＡＰ104-118ペプチドの種々の濃度とともにウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体をインキュベートすることによって決定された。データは図３において示される。このアッセイにおけるＩＮＧＡＰ104-118ペプチドについてのＥＣ50は、１５０ｐｇ／ウェルであるように決定され、そしてゼロよりも有意に大きい最も低い量は、１８ｐｇ／ウェルであった。
【００３０】
正常なヒト血清は、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体検出アッセイに影響を及ぼすことは見出されなかった。ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドで予めコートされたマイクロタイタープレートのウェルに、種々の濃度のウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体が添加された。抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体は、０％（コントロール）、５％、１０％、１５％、３０％、又は５０％のいずれかで正常なヒト血清を含有する緩衝液中で連続希釈された。図４Ａを参照のこと。ウサギ抗体の結合が、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に抱合された抗ウサギＩｇＧで検出された。５％と５０％との間の血清において、アッセイ感度における減少は観察されなかった。しかし、５０％を超える濃度でのヒト血清の存在は、３倍までアッセイ感度を減少し得た。このデータから、正常なヒト血清に、抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体とＩＮＧＡＰ104-118ペプチドとの間の相互作用を有意に妨害する因子は存在しないことが結論づけられた。
【００３１】
正常なヒト血清に、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドと相互作用する抗体は存在しないことも決定された。上記と同じ実験プロトコルの後、正常なヒト血清がＡＰ−結合された抗ヒト免疫グロブリンでスクリーニングされた。検出抗体は検出されず、正常なヒト血清には、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに結合し得る抗体が存在しないことを示す。図４Ｂを参照のこと。
【００３２】
データに基づいて、アッセイは、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド特異的抗体をうまく検出する。さらにアッセイは、正常ヒト血清の存在下で機能的である。それゆえ、このアッセイは、患者の血清中の抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の存在についてスクリーニングすることに適切である。アッセイは単純であり、及びサンプルの高速大量処理スクリーニングに適応した媒体に容易に合理化され得る。
【００３３】
（実施例２）
（ヒト血清における抗ＩＮＧＡＰ104-118についての免疫アッセイプロトコル）
本実施例において使用された試薬は以下のようである：ＴＢＳ（０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７ＫＣｌ、２５℃にてｐＨ８．０）、ＴＢＳ−ＴＷ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン−ボルビタンモノラウレート）を含有するＴＢＳ）、マトリックス希釈緩衝液（Ｍａｔｒｉｘ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）についてのブロッキング溶液（１％  ｗ／ｖウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳ−ＴＷ）、ヒト血清についての二次抗体検出（ブロッキング溶液中のＡＰ結合された抗ヒトＩＧｇ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−１５４３）の１：５０００希釈）、ウサギ抗体についての二次抗体検出（ブロッキング溶液中のＡＰ結合された抗ウサギＩＧｇ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−２５５６）の１：５０００希釈、マトリックス希釈緩衝液（１：２５  ヒト血清：ブロッキング溶液、ｖ／ｖ）、及びｐＮＰＰ基質緩衝液（５ｍＬ脱イオン水中の１セットのパラ−ニトロフェニルホスフェート錠剤（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−１８９１）。
【００３４】
ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体は、Ｓｔｒｅｌｉｔｚ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって供給された。
【００３５】
標準曲線対標準曲線は、以下の表に従って調整された：
【００３６】
【表１】
2005519276.tif 000002
アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレート中で行われた。標準は上述で示される表において示されるように調製され、各所望されるプレートウェルに対して二連に１００μＬを添加するのに十分な標準をつくった。所望される標準の濃度は、ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体標準をマトリックス希釈緩衝液で連続希釈することによって作製された。
【００３７】
コントロール血清サンプルは、調製サンプルと同じ希釈範囲において、ブランクのヒト血清から調製された。擬陽性の結果は、血清の濃度、又はＩＮＧＡＰ104-118ペプチドと交差反応する正常なヒト血清中の任意のタンパク質に起因して、生成されなかった。
【００３８】
プレートブランクは、それぞれ順次のプレート上のＨ１及びＨ２ウェルに、１００μＬの最も高い濃度標準を添加することによって調製された。これらのウェルは、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドでコートされなかった。全ての試薬はこれらのサンプルに添加されるべきである。プレートのデザインによって設計されるウェルは、そのバッチにおいて使用される全てのウェルについてのブランクサブトラクション値として作用した。プレートブランクが、同じプレート上で分析される第２のバッチに起因して利用可能でない場合、コントロールブランクが使用された。図６は、代表的なサンプルアッセイプレートレイアウトを示す。
【００３９】
全ての質コントロールサンプルは二連で調製された。全ての未知のサンプルは、二連で調製され、そして１００μＬの各サンプルが、マイクロタイタープレート分析の前に２４００μＬマトリックス希釈緩衝液で希釈された。
【００４０】
マイクロタイタープレート分析は、以下のように行われた；１００μＬの標準、コントロールブランク、質コントロールサンプル、又は未知のサンプルのいずれかが、各プレートウェルに添加された。ウェルはマイラーカバーで覆われ、そして室温で少なくとも１時間、又は４℃にて一晩、室温でインキュベートされた。ウェルは、各ウェルを３回、ＴＢＳ−ＴＷで充填することによって洗浄され、洗浄間で全ての過剰な液体を除去することを確実にした。１００μＬの抗ヒトＩｇＧ  Ａｐ−結合抗体が、血清サンプル及びコントロール血清のみに添加された。１００μＬの抗ウサギＩｇＧ  Ａｐ−結合抗体が、検定標準及び質コントロール標準に添加された。これらは、室温で１〜２時間インキュベートされた。各ウェルは、ＴＢＳ−ＴＷで１回、次いでＴＢＳで２回洗浄され、再度、洗浄間で全ての過剰な液体を除去することを確実にした。各ウェルに、１００μＬのｐＮＰＰ基質緩衝液が添加された。色素は、約３０分間、又は所望される色強度に呈色させた。最大の色呈色についての標的値は、最も高い検定標準について２．５ＯＤであり、従って呈色は頻繁にモニターされた。複数のプレート読み取りが、呈色をモニターするために獲得された。呈色は、約３０分間読み取られた（呈色は条件とともに変化する）。過剰呈色は、高い標準が装置の線形範囲を超える場合に生じる。
【００４１】
標準曲線は、４０５ｎｍでのＯＤに基づく点間適合を使用して算定された。ＯＤが標準曲線の最も高い点を超える全てのサンプルは、適切な希釈に再調製された。サンプルの結果は、得られる点間曲線に対して算定された。２つまでの不連続な点は、明白な分析ミス又は非典型的な呈色に基づいて曲線から脱落され得る。
【００４２】
質コントロールサンプルは、それらが理論値の２０％以内にある場合、受容可能であると考えられた。
【００４３】
陽性の血清は、１：２５の希釈にて、０．８００よりも大きいＯＤ405を伴うそれらのサンプルとして規定された。陽性患者のサンプル間の血清比較は、標準シグナル読み取り（すなわち０．８００  ＯＤ405単位）を与えるために必要とされる力価（血清の希釈）に基づいた。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】抗ＩＮＧＡＰ104-118直接検出アッセイの例示的な模式図。マイクロタイターウェルの底へのペプチドチドの不可逆的なコーティング後（１）、試験サンプルはウェルに添加される（２）。ペプチドに特異的な抗体が試験サンプル中に存在する場合、それらはペプチドに結合し、そして洗浄工程後にウェル中に保持される。ペプチドと接触する抗体は、続いてウェルに添加されるタグ付二次抗体によって検出される（３）。洗浄工程は、抗体−ペプチド複合体と接触しないタグ付抗体を除去する。ペプチドが結合される抗体の存在は、ウェルにおけるタグ−シグナルを読み取ることによって決定される（４）。
【図２】ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対して生成されたウサギ抗体の特異性。ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドは、ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド（配列番号１）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＩＮＧＡＰ151-164（Ｃｔｅｒ配列番号３）、又はＩＮＧＡＰ139-152（Ｃｓｅｑ配列番号４）のいずれかで予めコートされたマイクロタイターウェルにおいて、インキュベートされた。全てのウェルは、タンパク質の等価な濃度でコートされた。抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートと組み合わせて、アルカリホスファターゼ結合された抗ウサギＩｇＧ、及び４０５ｎｍでのＰ−ニトロフェノールの光学的検出を使用して検出された。横線は、アッセイについてのバックグラウンドシグナルの限界を示す。
【図３】ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドに対して生成されたウサギ抗体の感度。ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体は、種々の濃度のＩＮＧＡＰ104-118ペプチドで予めコートされたマイクロタイターウェル中でインキュベートされた。結合されたウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の検出は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートと組み合わせて、アルカリホスファターゼ結合された抗ウサギＩｇＧ、及び４０５ｎｍでのＰ−ニトロフェノールの光学的検出を使用してモニターされた。ＥＣ50は１５０ｐｇであり、及びゼロから有意に異なった最も低い検出可能な量は、１８ｐｇであった。
【図４Ａ】抗ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド抗体の検出に対するヒト血清の影響。各データ点は、マイクロタイターウェルにおける２〜１０００ｎｇ/ｍＬ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体、及び０（◆）、５（■）、１０（  ）、１５（×）、３０（※）、又は５０（●）％の正常なヒト血清を示す。結合されるウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体の検出は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートと組み合わせて、アルカリホスファターゼ結合された抗ウサギＩｇＧ、及び４０５ｎｍでのｐ−ニトロフェノールの光学的検出を使用してモニターされた。
【図４Ｂ】抗ＩＮＧＡＰ104-118ペプチド抗体の検出に対するヒト血清の影響。反応は（Ａ）におけるように行われたが、ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体はなんら添加されなかった。データ点は、０（◆）、５（  ）、１０（※）、１５（＋）、３０（−）、又は５０（●）％の正常なヒト血清に対応する。
【図５】抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体アッセイサンプルプレートのレイアウト。（１）患者血清サンプルの希釈物。（２）標準化されたヒト血清の希釈物。（３）ウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体標準曲線。（４）ＩＮＧＡＰ104-118ペプチドでコートされないウェルにおける最も高い濃度のウサギ抗ＩＮＧＡＰ104-118抗体を使用して調製されたプレートブランク。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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