(57)【要約】サンプルと、サンプルの核酸増幅インヒビターを不活化する多孔性支持体とを接触させる工程および流体を多孔性支持体に通し、それによりサンプルの核酸成分が多孔性支持体の少なくとも一部に通す工程を含み、それにより増幅のための核酸成分を調製する、増幅用にサンプルの核酸成分を調製する方法。サンプルは磁性支持体を含む手段により未処理サンプル成分から分離される。本発明の方法を行うのに適した装置も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）多孔性支持体に接触するサンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する薬剤を含む多孔性支持体；
b）開口部を有し、内部を規定するハウジング、該内部は多孔性支持体と液体をやり取りし、それにより開口部を通過した液体の少なくとも一部は多孔性支持体の少なくとも一部を通過し、多孔性支持体から多孔性支持体に接触するサンプルの核酸成分の少なくとも一部を分離し、それにより増幅用核酸成分を調製する；および
c）サンプルの少なくとも一部から核酸成分を分離するため、および多孔性支持体に核酸成分を沈着させるための、磁性基材を含む分離手段
を含有してなる、増幅用にサンプルの核酸成分を調製するための装置。
【請求項２】
前記分離手段が：
a）第１の末端に入り口を有し、該第１の末端の遠位にある第２の末端に出口を有する容器；
ｂ）容器内に含まれる、磁性ビーズを含むアンプル；
ｃ）容器の第２の末端上のバルブ；および
ｄ）該バルブ上に磁石
を含有してなる請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記分離手段が前記アンプル中にバッファーを含んでなる請求項２記載の装置。
【請求項４】
バルブが回転でき、それによりバルブの一方の末端に保持された磁性ビーズをバルブの第２の末端に移動させることができ、それにより多孔性支持体に接触させる請求項２記載の装置。
【請求項５】
磁石がバルブから移動することができ、それによりバルブが一方の位置にある間は、磁性ビーズが容器内の磁石に付着され得、バルブが第２の位置にある間は、磁石は移動することができ、磁性ビーズは放出され、多孔性支持体に接触する請求項４記載の装置。
【請求項６】
容器の第１の末端に取り外し可能なキャップをさらに含んでなる請求項５記載の装置。
【請求項７】
磁石が容器中の磁性ビーズを上方に引き寄せる位置にある請求項５記載の装置。
【請求項８】
ハウジングが取り外し可能である請求項１記載の装置。
【請求項９】
磁性基材がストレプトアビジンで被覆されている請求項１記載の装置。
【請求項１０】
ａ）未処理サンプル成分から、磁性基材を含む手段を介してサンプルを分離する工程；
ｂ）サンプルと、サンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する多孔性支持体とを接触させる工程；および
ｃ）液体を多孔性支持体に通し、それによりサンプルの核酸成分が多孔性支持体の少なくとも一部を通過し、該多孔性支持体から分離され、それにより増幅用に核酸成分を調製する工程
を含む、増幅用にサンプルの核酸成分の調製方法。
【請求項１１】
磁性基材にサンプルを接触させることにより未処理サンプル成分からサンプルを分離し、それにより未処理サンプル成分を除去する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
磁性基材が磁性ビーズの形態である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
磁性基材が疎水性材料で被覆される請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
磁性基材が親水性材料で被覆される請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
磁性基材が二酸化ケイ素で被覆される請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
磁性基材がストレプトアビジンで被覆される請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
磁性基材が、スポア、増殖期の細菌細胞、DNAまたはその組み合わせを含むサンプルに接触する請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
多孔性支持体が、サンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する不活化剤を含み、該不活化剤がカオトロピック塩である請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
未処理成分の少なくとも一部が重力により沈められる請求項１０記載の方法。
【請求項２０】
核酸成分がハウジング内で保存される請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
ハウジング内で核酸成分を保存する工程をさらに含む請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府支援
本発明は、Defense Directorate of Research and EngineeringからLincoln Contract Number FI9628-95-C-0002によって全体的にまたは部分的に支援された。政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
核酸は、一般にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）手順によって解析される。医学的診断のために収集されたサンプル中で、法医学調査の間に、または防衛関連適用において頻繁に直面するPCRインヒビターの存在はPCR-増幅を妨げる。
【０００３】
例えば、土壌またはスラリー未処理サンプル、特に高い有機含量を有する粘土または他の土壌を含むサンプルから増幅可能なDNAを抽出することは困難である。
【０００４】
サンプルから増幅可能な核酸を抽出するための従来の技術は、概して複雑であり、多大な労力を要し、研究施設および設備を必要とする。多くの既存のプロトコルはまた、フェノールおよびクロロホルム等の毒性の試薬を必要とする。
【０００５】
特に血液サンプルの処理と組み合わせた、DNA単離のために開発された１つの材料は、IsoCode（登録商標）の商標でKeene, NHのSchleicher and Schuell, Inc.から入手可能な化学的に処理されたコットンマトリックスである。上記のような未処理サンプルの処理に適合したIsoCode（登録商標）に基づくプロトコルは未だに、研究装置、外部試薬を必要とし、多数の工程（２回のオーブン乾燥サイクルを含む）を必要とする。さらに、他のアプローチと同様に、サンプルはサンプル汚染を受けやすい。
【０００６】
それゆえ、既存のプロトコルよりも迅速であり、複雑でなく、かつ多大な労力を要しない、増幅用にサンプルの核酸成分を調製する方法が必要とされている。また、かかる方法を行うための装置が必要とされている。特に、増幅用にサンプルの核酸成分を調製するのに使用され、生じた核酸成分を解析し、保存し、保管するために使用されうる、野外での使用に適した携帯できる、自己収容デバイスが必要とされている。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、一般に増幅用にサンプルの核酸成分を調製するための方法および装置に関する。
【０００８】
本方法は、磁性基材を含む手段によって未処理サンプルからサンプル成分を分離する工程、サンプルと、サンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する多孔性支持体とを接触させる工程および液体を多孔性支持体に通し、それによりサンプルの核酸成分が多孔性支持体の少なくとも一部を通過し、多孔性支持体から分離される工程を含み、それにより増幅用核酸成分が調製される。
【０００９】
増幅用にサンプルの核酸成分を調製するための装置は、多孔性支持体に接触したサンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する薬剤；開口部を有し、および内部を規定するハウジング、上記内部は多孔性支持体と液体をやり取り(communication)し、それにより開口部を通過した液体の少なくとも一部が多孔性支持体の少なくとも一部を通過し、多孔性支持体から多孔性支持体に接触したサンプルの核酸成分の少なくとも一部を分離し、それにより増幅用核酸成分が調製される；および未処理サンプル成分からサンプルを分離するため、および多孔性支持体に核酸成分を沈着(deposit)するための、磁性基材を含む分離手段を含む。
【００１０】
好ましい態様では、多孔性支持体はカオトロピック塩等の薬剤を含む。磁性基材の表面処理は、増幅用に調製される核酸成分を含むサンプルの優先的な付着を生じ得、それにより未処理の成分（例えば、土壌粒子等）からサンプルを分離しうる。
【００１１】
本発明は多数の利点を有する。例えば、本発明は、野外で収集される未処理サンプルを用いて使用され得、固体、半固体、スラリー、拭き取り物(swipe)、液体またはエアゾールを処理しうる。本発明を使用することにより、未処理サンプル中の核酸成分は、数分で完了しうる少ない工程数で増幅用に調製されうる。溶出液の強制貫流は、核酸増幅インヒビターを不活化する多孔性基材を通過する拡散運動よりも速く、加熱の必要性を回避または最小化する。外部試薬の添加はまた、低減されるか、または完全に排除され、サンプル汚染の可能性は減少する。さらに、本発明の方法は、唯一の試薬として水（または水およびバッファー化合物）を用いて行われうる。本発明の装置を使用することにより、サンプルは、最小限の輸送の考慮をともない野外で収集され、調製され得、収集および調製の工程は重い手袋および防護服を用いて行われうる。調製されたサンプルは、保管されうるか、および／または当該分野で公知である標準的な設備を用いて増幅されうる。本発明の装置は、軽量であり、コンパクトであり、その外部表面を汚染除去に供することができ、経済的に製造されうる。装置のパーツは使い捨てできる。さらに、装置はサンプル収集のための汎用性を提供し、未処理サンプル成分からサンプルを分離することなく、磁性基材を含む手段により、未処理サンプル成分の除去、および収集され、処理されうるサンプルの処理を可能にする。
【００１２】
本発明の前述および他の目的、特徴および利点は、参照文字が異なる図全体で同じパーツに言及する添付の図面で説明されるように、以下の本発明の好ましい態様のより詳細な記載から明らかである。図面は縮尺されている必要はなく、本発明の原理を説明するために強調されている。全ての部およびパーセントは他に示されない限り重量単位である。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様が以下に記載される。
【００１４】
本発明は、一般には増幅用にサンプル中の核酸成分を調製するための方法および装置に関する。
【００１５】
本方法は、核酸成分を含むサンプルと、サンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する多孔性支持体とを接触させる工程、および液体を多孔性支持体に通す工程を含み、それによりサンプルの核酸成分は多孔性支持体の少なくとも一部を通過し、多孔性支持体から分離され、それにより増幅用核酸成分が調製される。サンプルは、磁性基材（例えば、磁性ビーズ）を含む手段を介して未処理サンプル成分から分離される。
【００１６】
サンプルは、核酸成分および核酸増幅インヒビター成分を含む。本明細書中で使用される用語、核酸はポリまたはオリゴヌクレオチドを含む。核酸の例としては、DNA、RNA、その断片、同位体で標識された核酸または任意のその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
核酸増幅インヒビターは、PCRインヒビターまたは核酸を損傷しうる化合物または材料でありうる。例としては、ヘモグロビン、フミン酸、フルボ酸、二価カチオン、キレート分子、酵素、タンパク質等が挙げられるがこれらに限定されない。１つ以上の核酸増幅インヒビターがサンプル中に存在しうる。
【００１８】
サンプルは多孔性支持体に接触される。例えば、液体サンプルは、多孔性支持体上にサンプルを分配することによるか、またはサンプル中に多孔性支持体を浸すことにより多孔性支持体を濡らす。
【００１９】
固体サンプルは、固体サンプル上を、またはサンプルを含む固体表面上を固体支持体で拭き取ることにより多孔性支持体に接触させられ、それにより固体表面上に存在するサンプルを多孔性支持体上に塗り付けるか、または堆積させうる。任意に、多孔性支持体は、液体（例えば、水）で最初に濡らされ、次いで固体サンプル上またはサンプルを含有する固体表面上を拭き取るために使用される。スラリーは、水浸または拭き取りにより多孔性支持体に接触させられうる。
【００２０】
細菌、スポア、ウイルスまたは他の核酸成分を含む気体サンプル（例えば、空気、およびエアゾール）もまた、多孔性支持体に接触させられうる。例えば、気体サンプルは、多孔性支持体に向かって、および多孔性支持体上に気体サンプルを引き寄せるために送風機等の手段によるか、または減圧吸引を用いることにより多孔性支持体に接触させられ得る。多孔性支持体は気体サンプルとの接触の前に濡らされうる。
【００２１】
一般に、多孔性支持体に接触する核酸は、それに可逆的に結合される。例えば、核酸は、多孔性支持体に接触させることにより安定化され得、溶出の間に多孔性支持体から放出されうる。
【００２２】
多孔性支持体に接触する核酸増幅インヒビター（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)インヒビター）は不活化される。本発明の１つの態様では、多孔性支持体はまた、固体汚染物質を保有する。好ましくは、多孔性支持体はまた、細胞、スポア、細菌および他の微生物を溶解もしくは死滅させるか、RNaseもしくはDNaseを不活化するか、または細胞もしくはスポアを溶解することができ、核酸を放出する。多孔性支持体はまた、増幅用核酸成分を調製するために使用される１つ以上の化合物（例えば、塩）に結合しうる。
【００２３】
一般に、多孔性支持体は、水を浸透しうる。多孔性支持体は、剛体であっても柔軟性があってもよく、パッド、マット、ディスク、プラグ、薄層の形態であり得、または別の適切な形態でもよい。多孔性支持体は、絹、紙、綿布、または他の織布または不織布材料、例えば、天然または合成のポリマー（例えば、ポリエステル、ポリプロピレン等）から製造されうる。
【００２４】
一般に、多孔性支持体は、核酸増幅インヒビター（例えば、PCRインヒビター）を不活化する１つ以上の薬剤を含む。上記薬剤は生体分子の二次、三次、または四次構造を変化させうる。上記薬剤は、沈殿、多孔性支持体への非可逆的結合を誘導しうるか、または核酸増幅インヒビターを編成しうる。インヒビターの不活化成分は、多孔性支持体により保持されか、または核酸増幅手順に干渉しない溶解性断片である。
【００２５】
薬剤はまた、標的細胞上または標的細胞内に存在する核酸物質に接近できる細胞膜および細胞性タンパク質を崩壊しうる。
【００２６】
多孔性支持体を形成するために、薬剤は、適切な基材に染み込まされうるか、またはそれに取り込まれるかまたは保持されうる。薬剤で被覆されるか、または化学的に処理された基材がまた使用されうる。基材に染み込ませる方法、基材を化学的に処理する方法または基材を被覆する方法は当該分野で公知である。
【００２７】
好ましい態様では、薬剤はカオトロピック塩である。カオトロピック塩の例としては、グアニジン塩、例えば、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、(イソ)チオシアン酸ナトリウム、尿素、またはその任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
適切な多孔性支持体は、1996年３月５日にBurgoyneに発行された米国特許第5,496,562号；1998年５月26日にBurgoyneに発行された米国特許第5,756,126号；1998年９月15日にBurgoyneに発行された米国特許第5,807,527号；1999年10月26日にBurgoyneに発行された米国特許第5,972,386号；1999年11月２日にBurgoyneに発行された米国特許第5,976,572号；1999年11月16日にBurgoyneに発行された米国特許第5,985,327号；1999年8月17日にHarveyらに発行された米国特許第5,939,259号；および2001年１月２日にHarveyらに発行された米国特許第6,168,922号に記載されている。上記参考特許の全体の教示が参考として本明細書中に援用される。
【００２９】
適切な多孔性支持体の１つの特定の例は、IsoCode（登録商標）の商標で利用可能なペーパーであり、これはSchleicher and Schuell, Inc., Keene, New Hampshireから得られうる。
【００３０】
本発明の方法は、液体を多孔性支持体に通す工程を含む。好ましくは、液体は水であり、バッファー化合物を含みうる。バッファー化合物の例としては、TE(トリス-EDTA)、TAE(トリス-酢酸EDTA)、TBE(トリス-ホウ酸-EDTA)、および脱イオン水が挙げられるがこれらに限定されない。（EDTAはエチレンジアミンテトラ酢酸である。）アルコール等の他の液体もまたは使用されうる。
【００３１】
一般に通す(direct)工程は、多孔性支持体の少なくとも一部を通過する液体の流動条件を生じる能動的手段による。液体は、液体に力を適用することにより、例えば、ピストン、リド、プランジャー、柔軟な膜または他の機械的手段を液体に対して押し進めることにより、多孔性支持体、またはその一部を通過しうる。密閉房では、液体は、液体上にガス、例えば空気を圧縮することにより、例えばプランジャーまたは柔軟な膜を加圧することにより、多孔性支持体を通過しうる。圧力勾配はまた、例えば、ポンプ、減圧または圧縮手段を用いることにより使用され得、液体が多孔性支持体を通って引き抜かれる。核酸成分を伴い、多孔性支持体を介して、生じる液体の流動は、多孔性支持体に関して任意の方向でありうる。好ましい態様では、液体は、サンプルが適用される方から多孔性支持体を通過して反対の方へ方向付けられる。
【００３２】
液体を多孔性支持体またはその一部に通す際に、サンプル中の核酸成分は、多孔性支持体の少なくとも一部を通過する。上記の核酸増幅インヒビターおよび他の汚染物質は、多孔性支持体により不活化されるか、および／または多孔性支持体上に保持されるが、一方、核酸成分は、一般に溶出される液体と共に、支持体から分離される。サンプルの核酸成分は、従って増幅用に調製される。
【００３３】
任意に、未処理のサンプル中に存在しないが、増幅用核酸成分を調製する間に導入されるか、または生じる化合物もまた除去されうる。かかる化合物の例は塩を含む。例えば、塩は、塩除去のために設計された膜により多孔性支持体から溶出される画分を処理することにより除去されうる。このような脱塩膜は当該分野で公知である。適切な例としては、SephadexTMビーズ、SepharoseTMビーズ、またはイオン交換膜が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
タンパク質もまた除去されうる。例えば、タンパク質は、セファロースビーズ、セルロースビーズまたは膜を用いて除去されうる。
【００３５】
さらなる工程は、任意に、とりわけ低い（微量）レベルの核酸を含むサンプルにおいて、多孔性支持体からの核酸成分の分離を増強するために行われうる。
【００３６】
多孔性支持体からの核酸成分の回収を増強する１つの方法は加熱による。加熱は、外部熱浴への浸漬、コイルの加熱、熱風の吹き掛け、または他の適切な手段によりオーブン内で行われうる。サンプルは、約60°摂氏（C）〜約95℃の範囲の温度に加熱されうる。多くの場合において加熱は約95℃で約30分間である。
【００３７】
本発明の別の態様では、多孔性支持体からの核酸成分の回収は、サンプルの核酸成分を含有する多孔性支持体を横断する電場を適用することにより増強される（電気溶出）。例えば、DNAは、溶液中では正味の負の電荷を有する。導電性イオンを有する液体および２つの反対に荷電した電極（ここで陰極はサンプルの核酸成分を含有する多孔性支持体に適用されている）により生じる電場の存在下では、例えば、DNAは多孔性支持体から溶出し、陽極への遊走が生じうる。
【００３８】
好ましくは、電極は、電極上への核酸の不可逆的な付着を防ぐために被覆されている。電場は、好ましくは、サンプルが多孔性支持体に接触している間に印加される。電場は、直流（DC）電源装置により供給されうる。一般に、使用される電圧差は、約0.5ボルト（V）〜約20Vの範囲であり、一般に、約10分未満、好ましくは約５分間である。電流は一般に約１ナノアンペア（nA）未満である。核酸が多孔性支持体から回収された後、電圧極性は、短時間、好ましくは５秒未満逆転され、正の電極上で収集された核酸が分離され、溶出物に懸濁されうる。
【００３９】
上記のように処理されたサンプルは、磁性基材を含む手段により未処理サンプルから分離される。未処理サンプルはしばしば、例えば、法医学調査、防衛関連適用の間または医学的分野において野外で収集される。かかるサンプルとしては、植物または動物組織、血液、体液、排泄物、唾液、尿、頬側塗沫標本、細菌、微生物、病原体、スポア、菌類、ウイルス、食物、細胞、土壌（例えば、粘土）、それらの組み合わせ、および有機物質および無機物質が挙げられる。
【００４０】
本発明の方法は、好ましくは液体、固体、半固体、スラリーまたは拭き取り物である未処理のサンプルを処理するのに特に良好に適する。スラリーまたは液体である未処理サンプルは、さらなる希釈なしで磁性基材に接触させられうる。固体形態のサンプルまたは拭き取りサンプルは、好ましくは、水、バッファー、または他の適切な溶媒と合わされる。生じる溶液または懸濁物は次いで磁性基材に接触させられる。エアゾールであるサンプル中の未処理成分はまた、送風機または当該分野で公知の他の手段により磁性基材上に未処理サンプルを向けることにより除去されうる。
【００４１】
未処理成分としては、例えば、砂、土壌、チリ、粘土粒子、崩壊堆積物、食物粒子、細胞、タンパク質および他の無機物質または有機物質が挙げられる。好ましくは、未処理サンプル成分の除去は、未処理サンプルと比べて核酸成分の濃度が増大しているサンプルを生じる。
【００４２】
使用されうる磁性基材の例としては、磁性ビーズ、シェイビング(shavings)、ペレットまたは永久磁石によるような磁場の適用により未処理サンプルから抽出されうる他の適切な物体が挙げられる。磁性基材を形成するために使用されうる材料としては、希土類ベース磁性材料が挙げられる。ある態様では、磁性基材はマグネタイトとしても知られる酸化鉄である。
【００４３】
ある態様では、磁性基材は、約100ナノメートル〜約１ミリメートルの範囲の球体直径を有しうる磁性ビーズの形態である。好ましい態様では、磁性ビーズは約250ナノメートル〜約10ミクロン(μm)の範囲の直径を有する。磁性基材のサイズは、特定の適用に応じて選択されうる。例えば、いくらかの細菌スポアは約1μmのオーダーのサイズを有する；かかるスポアを捕捉するための好ましいビーズは１μｍよりも大きい直径を有する。
【００４４】
ある態様では、これは、磁性基材上に捕捉され、それにより核酸成分を含むサンプルから分離され、さらに処理される未処理の成分である。好ましくは、核酸成分を含むサンプルは磁性基材上に誘引または捕捉されるが、未処理の成分はそのようにはならない。
【００４５】
未処理サンプル中に存在するいくらかの成分の優先的な捕捉は、磁性基材の表面処理、鋼染作用(impregnation)または被覆により達成されうる。
【００４６】
例えば、疎水性表面を有する磁性ビーズは、スポアを捕捉するために使用されうる。かかる磁性ビーズの例としては、Polysciences, Warrington, PAまたはSpherotech , Libertyville, ILから市販されているもの等のポリスチレンラテックスビーズが挙げられる。
【００４７】
例えば、Polysciences, Warrington, PAから入手可能な、例えば超常磁性シリカビーズ等のシリカ(SiO2)-処理またはシリカベース磁性基材は、核酸（例えばDNA）を捕捉するために使用されうる。
【００４８】
親水性表面を有する磁性基材は、増殖期の細菌細胞、核酸、および他の成分を捕捉するために使用されうる。かかる磁性基材の例としては、BiomagTMカルボキシルの商標でPolysciences, Warrington, PAから市販されているビーズまたはBangs Laboratory, Inc., Fishers, INの名称MC02N/2928を有するビーズが挙げられる。
【００４９】
ある例では、磁性基材はストレプトアビジンで被覆される。ストレプトアビジン被覆磁性ビーズは市販されており、例えば、Stratech Scientific Ltd, Soham, England, 例えばカタログ#BNN1101を有するものである。
【００５０】
他の態様では、未処理サンプル中に存在する特定の材料は、磁性基材上に物理的に吸着されうる。さらに他の態様では、特異的被覆は、未処理サンプル中に存在する１つ以上の材料に化学結合させるために使用されうる。
【００５１】
異なる表面特性を有する磁性ビーズの組み合わせも使用されうる。例えば、未処理のサンプルはシリカ被覆磁性ビーズに接触させられ、DNAを捕捉し得、疎水性磁性ビーズを用いてスポアを捕捉しうる。
【００５２】
攪拌、振盪または他のかき混ぜるための手段が使用され得、例えば、磁性基材への接触および付着が増強される。当該分野で公知であるように手動振盪または適切な器具が使用されうる。
【００５３】
磁性基材は、磁場に磁性基材を配置することにより未処理サンプルから抽出され、それにより未処理のサンプル成分がサンプルから分離される。磁場は、例えば希土類磁石等の永久磁石により発生しうる。
【００５４】
本発明のある態様では、磁場は、重力と組み合わされて使用される。例えば、磁性ビーズに付着した、さらに処理されるサンプルは、未処理サンプル／磁性ビーズ混合物上に位置した磁石の方に押し上げられ、一方、重力は、未処理成分（例えば、砂または土壌粒子）の少なくとも一部の堆積を補助する。
【００５５】
磁場の除去は磁性ビーズを放出する。ある態様では、その表面上に付着したサンプルを有する磁性ビーズは、多孔性支持体に接触させられるか、または多孔性支持体上に沈着する。液体（水またはバッファー溶液）は、ビーズに添加され得、ビーズから多孔性支持体へのサンプルの輸送を増強する。別の態様では、サンプルは磁性基材から洗い落とされ、次いで多孔性支持体に接触させられる。磁性ビーズからサンプルを除去するための他の技術（例えば、脱離、バッファーpHまたはバッファーの塩濃度の変化）もまた使用されうる。
【００５６】
本発明はまた、増幅用に未処理のサンプルの核酸成分を調製するのに適切な装置に関する。
【００５７】
装置は、多孔性支持体に接触するサンプルの核酸増幅インヒビター成分を不活化する多孔性支持体およびハウジングを含む。ハウジングは、開口部を有し、多孔性支持体と液体をやり取りする内部を規定し、それにより開口部を通過する液体の少なくとも一部は多孔性支持体の少なくとも一部を通過し、多孔性支持体から多孔性支持体に接触するサンプルの核酸成分の少なくとも一部を分離し、それにより増幅用核酸成分を調製する。
【００５８】
例えば、多孔性支持体は、例えばカオトロピック塩などのサンプルの核酸インヒビター成分を不活化する薬剤を含む。好ましくは、上記薬剤はまた、細胞またはスポアを死滅させ、DNaseまたはRNaseを不活化し、細胞またはスポアを溶解し、核酸を放出させる。
【００５９】
本発明の装置の１つの態様は、図１Ａに示されるアセンブリ10を含む。アセンブリ10はハウジング12およびコンテナ14を含む。
【００６０】
アセンブリ10は任意の適切なサイズで構築される。本発明の好ましい態様では、アセンブリ10は、手持ち式のように携帯するのに十分に小さく、野外での使用に適する。例えば、アセンブリ10の最大の寸法は約３〜約13センチメートルの範囲でありうる。１つの態様では、アセンブリ10は50マイクロリットルサンプルを処理するのに適切である。より大きいアセンブリ10も構築されうる。別の態様では、アセンブリ10は市販のPCRマシンと適合するよう構築される。
【００６１】
アセンブリ10は、任意の適切な材料、好ましくは、それが接触する物質と反応しない材料から製造される。好ましい態様では、アセンブリ10は、ポリカルボネート、ナイロン、ポリジアルキルシロキサン、ポリエチレンまたはポリプロピレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレン等のプラスチック材料から全てまたは一部が製造される。アセンブリ10はまた、ガラスまたは鉄、アルミニウムおよび他の物質等の金属から全てまたは一部が製造されうる。材料の組み合わせもまたアセンブリ10を製造するのに適する。アセンブリ10は単回使用後、廃棄されうる。
【００６２】
ハウジング12は、内部領域18を規定するチューブ16を含む。チューブ16は、円筒型でありうるが、任意の適切な形状を有しうる。チューブ16は末端20および22を有する。末端20は開放されている。末端22はキャップ24を受け取る手段を備える。キャップ24受け取り手段は、例えば、キャップ24上のネジ溝28と適合するネジ溝26である。
【００６３】
末端22を密閉するための他の手段も使用されうる。例えば、図１Ａには示されていない態様では、末端22は圧入キャップにより密閉される。医薬の分野で公知であるような隔壁封鎖もまた使用されうる。同様に図１Ａに示されていないさらに別の態様では、ハウジングは、１つの密閉末端を有して、統合様式で構築される。例えば、チューブは、医療および医薬の分野で公知であるように、切り離されるか、または破壊されうる狭く、引き伸ばされた密閉末端で終端処理されうる。
【００６４】
好ましい態様では、キャップ24はスポイド30を備える。図１Ａでは、スポイド30は薬剤スポイドであり、チューブ16の内部領域18から液体を回収するために圧迫され、解放されうるバルブ32を含む。当該分野で公知であるような他のスポイドデザインもまた使用されうる。チューブ16の内部領域18への接近はまた、シリンジ針により貫通されうる材料を使用することにより提供されうる。例えば、末端22を密閉する手段は、当該分野で公知のプラスチックフィルムまたは薄いゴム挿入物を含むように製造され、皮下注射針による内部領域18への接近が可能になりうる。
【００６５】
チューブ16のサイズおよび壁の厚さは処理されるサンプルに応じて変化しうる。一般に、チューブ16の長さは、約0.5センチメートル〜約３センチメートルの範囲の直径を有して、最小約１センチメートルおよび最大約12センチメートルでありうる。
【００６６】
チューブ16は末端20に多孔性支持体34を含む。多孔性支持体34は、上記のように核酸増幅インヒビターを不活化する。装置の特定の態様では、多孔性支持体34はIsoCode（登録商標）ペーパーから切り出されたディスクである。
【００６７】
多孔性支持体34は内面36および外面38を有する。
【００６８】
多孔性支持体は、保持手段40および位置決め手段42によりチューブ16の末端20に保持される。ある態様では、保持手段40はチューブ16の末端20に適合したO-リングである。エッジクランプおよび他の適切な手段もまた、保持手段40を製造するために使用されうる。
【００６９】
位置決め手段42は、チューブ16の内壁の出っ張り(lip)、チューブ16の内壁に連結されたクロスバー、または他の手段でありうる。位置決め手段42はチューブ16の末端20付近に多孔性支持体34および下記でさらに考察される任意の他の挿入物の厚さを収容するのに適切な距離を隔てて位置する。
【００７０】
任意に、メッシュ44は多孔性支持体34の外面38に位置する。メッシュ44は、例えば、ナイロン、ポリプロピレン、フルオロカーボン、ポリエステル、ステンレススチールまたは他の金属のより糸から編まれうる。装置の特定の態様では、メッシュ44はナイロンからなり、40μmの孔径である。メッシュ44は多孔性支持体34から固体不純物を除去し、例えば化学処理された綿布またはペーパー等の薄く柔軟な多孔性支持体に剛性および耐摩耗性を付与しうる。
【００７１】
任意の脱塩膜46は、多孔性支持体34の内面36に位置する。脱塩膜46は、当該分野で公知のチオシアン酸グアニジン、マグネシウムイオン、鉄イオン等のイオン塩成分を保持する材料から製造されるがこれらに点綴されない。適切な脱塩膜の例としては、Sephadex/ガラス繊維合成物、カチオン交換膜、アニオン交換膜が挙げられるがこれらに限定されない。１つ以上の脱塩膜が、チューブ16内の多孔性支持体34の内面36上にスタックされ得る。
【００７２】
任意の圧縮バリア48は、位置決め手段42と任意の脱塩膜46または多孔性支持体34の内面36のいずれかとの間に挿入されうる。圧縮バリア48は、好ましくは、プラスチック、Teflon（登録商標）等の非圧縮性材料、ゴム、ポリプロピレン、ポリエチレン等から構築される。圧縮バリア48はチャンネル50を有する。圧縮バリア48は開口部20に挿入物のためのサポートを提供し、通過する間に多孔性支持体から除去される溶出液体積の均一性を改善する。いくらかの態様では、圧縮バリア48はまた、多孔性基材をチューブ16のバレルから外側へ突出させ、それにより多孔性支持体34と固体基材上に沈着する固体サンプルとの間により良好な接触を提供する。
【００７３】
キャップ24、チューブ16、位置決め手段42、圧縮バリア48、脱塩膜46、多孔性支持体34、メッシュ44および保持手段40の側面図が図1Bに示される。
【００７４】
コンテナ14(図1A中に示される)は、通常、ハウジング12の外面に一致する形状を有しており、そのためハウジング12がコンテナ14へ挿入される場合にコンテナ14中に存在する液体は、多孔性支持体34および任意の他の挿入物を介して流れる。
【００７５】
任意にアセンブリ10は、多孔性支持体34により保持される荷電した核酸の放出を増強するために電場を適用する手段と共に提供され得る。一態様において、電極はそれぞれ、バルブ32の末端およびメッシュ44の上方に置かれる。別の態様において、電極は位置決め手段42およびメッシュ44中に埋め込まれる。メッシュ44および位置決め手段42は、DNA非付着性の生物学的に不活性な物質で被覆された金属などの伝導性素材から作製され得る。位置決め手段42への接触は、チューブ16の壁中に埋め込まれ、位置決め手段42からアセンブリ10の外壁へつながる伝導性素材経路によってなされ得る。通常、核酸の電荷と反対の電荷を有する電極は、核酸が多孔性支持体34から離れ、チューブ16の内部領域18に向かうように誘引するために配置される。当該技術分野で公知のとおり、両電極はDC電源に接続され得る。
【００７６】
操作の間、未処理試料、たとえば固体、スラリー、液体またはガス試料は任意にメッシュ44を通って多孔性支持体34と接触する。試料は、短い間隔、たとえば数分間、多孔性支持体と接触したままである。試料はまた、多孔性支持体34に適用された後にハウジング12を保存することにより、後の処理のために保管され得る。次にハウジング12は、チューブ16の末端20がコンテナ14の底52に面するように、使用される液体試薬、たとえば水または水及びバッファー化合物の適量(たとえば、小型で携帯可能なアセンブリ10の場合は約2ミリリットル〜約100マイクロリットル(μl))を含むコンテナ14へ挿入される。ハウジング12は、コンテナ14の底52の方へ押され、それにより液体試薬は多孔性支持体34を通って、任意に脱塩膜46および任意の他の挿入物を通って、チューブ16の内部領域18へ押しやられる。核酸成分は貫流液体と共にチューブ16の内部領域18へ溶出され、増幅ができる状態にある。それは、スポイト30または他の手段、たとえばシリンジによりハウジング12から取り出され得る。核酸成分はまた、アセンブリ10中の溶出液体中で保存または保管される。従って、試料又は核酸成分はすぐに処理され得るか、または所望の期間、たとえば数年もしくは数十年間適切な場所で保存され得る。
【００７７】
本発明の別の態様において、液体は計量式で上記のようなハウジングへ分配される。使用され得るキャップおよびハウジングの側面図が、図2Aおよび2B中にそれぞれ示される。貫通した空孔54およびネジ55とともに提供される分配キャップ53が、図2A中に示される。好ましくは貫通した細い空孔が使用される。
【００７８】
ネジ55は、その側面図が図2B中に示されるハウジング56の末端22のネジ溝付き開先と一致する。ハウジング56は、本質的に図1Aおよび1B中でハウジング12について記載したとおりであり、任意のフィン57を有する。フィン57は、多孔性支持体34への試料適用の間およびハウジング56を図1Aに示されるコンテナ14のようなコンテナ内へ押す場合の操作の間におけるハウジング56の取り扱いを容易にするよう働く。
【００７９】
任意に、分配キャップ53がハウジング56に対して回転する場合の回転の割合を見積もるために、ハウジング56の末端22の外部領域は圧痕または他の印を付けて提供される。
【００８０】
操作の間、ハウジング56は、図1Aについて上記されたコンテナ14などのコンテナとともに使用される。キャップをねじ込むことにより液体はハウジング56の外へ追い出され、それにより貫通した空孔54を介してハウジング56の内部から液体が排出される。一態様において、公知の角度の回転が、公知の量の液体をハウジングの外へ排出するように、ネジ55は空間が取られる。他の態様において、計算表を作成するために、異なる回転弧に対して取り出される液体の量が測定され得る。
【００８１】
本発明の一態様において、上述のように調製された核酸成分は当該技術分野で公知のとおり、例えばPCR手順によって、さらに処理される。たとえば、複数の試料は、それぞれが上述のとおりである複数のアセンブリ10を用いて回収され、処理され得る。たとえば、一度に6個のアセンブリを処理するためには手動のプレスが用いられ得る。たとえば30個のアセンブリの群を処理するためには、自動プレス、たとえばCOTSワットマンミニ‐ユニプレッププロセッサー#PR0000040型(COTS Whatman Mini-Uniprep Processor model #PR0000040)が使用され得る。核酸およびそれらが由来する生物が同定されるシグナル解析および手順はまた、当該技術分野において公知である。
【００８２】
増幅用の核酸成分を調製するための装置の別の態様は、複数のウェルを含むカートリッジ60を含む。カートリッジ60およびその操作は、図3、4および5に関してさらに記載される。
【００８３】
具体的には、カートリッジ60の水平断面図が図3に、平面図が図4に示され、図3の切断線AA’に沿った断面図が図5に示される。
【００８４】
カートリッジ60は、適切な素材、好ましくはたとえばポリカーボネイト、ナイロン、ポリジアルキルシロキサン、ポリエチレンまたはポリプロピレン  テレフタレート、ポリテトラフルオロエチレンおよびその他などのプラスチック素材から作製され得る。カートリッジ60はまた、全体としてまたは部分的に、ガラスまたはスチール、アルミニウムおよび他の素材などの金属から作製され得る。好ましくは、カートリッジ60は単回使用のために作製される。カートリッジ60は、約5センチメートル〜約10センチメートルの範囲内の寸法を有する。カートリッジ60は複数のウェル、すなわち試料ウェル62ならびにチャンバー64、66、68、70、72、74および76を有する。通常、全てのチャンバーがカートリッジ60中に完全に包含されている。図3および4に示される態様において、チャンバー64、66、68、70、72、74、76は試料ウェル62の周囲に配置されている。試料ウェル62に対するチャンバーの他の配置もまた、使用され得る。
【００８５】
入力チャンバー64、66、68、70は、試料ウェル62へ送達される試薬を保存する。たとえば、チャンバー64は洗浄水を、チャンバー66は溶出水を、チャンバー68は緩衝液をそしてチャンバー70は試薬を保存する。試薬および/または緩衝液は液体形態で保存され得るか、または乾燥形態で保存され、使用の直前にさらなる入力貯水容器(図3、4または5に示されない)から水を添加することにより溶解され得る。好ましくは、試料中の核酸成分を増幅用に調製するために必要な全ての試薬または液体は、製造の間にカートリッジ60中に前もって充填される。
【００８６】
出力チャンバー72、74、76は、回収チャンバー74および76(それぞれ生成物および廃棄物)ならびに使用済み洗浄水受け72を含む。特定の試料およびプロトコルによっては、図3および4に示される全てのチャンバーが使用される必要はない。
【００８７】
管78、80、82、および84はそれぞれ、入力チャンバー64、66、68および70から試料ウェル62へ伸びている。試料ウェル62は管78、80、82および84と一列に並べられ得る引き込み口とともに提供され得る。
【００８８】
カートリッジ60は、入力チャンバーおよび試料ウェル62間の選択的なやり取りのための手段と共に提供される。たとえば、試料ウェル62の開口部と他の試薬チャンバーへの管とを一列に並べる１以上の開口部を有する回転可能な壁を用いて選択的なやり取りが達成され得る。好ましい態様において、回転可能な壁は、洗浄水が試料ウェル62中に導入され、管86を介して洗浄水受け72へ試料ウェル62から出ることが可能であるように一列に並べられる2つの開口部を有する。水受け72は、洗浄水のその後の漏れまたはこぼれを予防する超保水剤またはゲル状素材を含み得る。
【００８９】
チャンバーおよび試料ウェル62間の選択的なやり取りを提供するための他の適切な手段として、手動または自動で操作され得るスロットまたはピンが挙げられる。たとえば入力チャンバー64、66、68および70は、圧力下でまたは穿刺された場合に管78、80、82および84における壁部分がそれぞれ破裂するように組立てられ、それにより各チャンバー64、66、68または70および試料ウェル62間の選択的な液体のやり取りが提供され得る。別の例において、チャンバー内に保存された液体は、弾性膜を含むチャンバーの屋根を加圧することにより試料ウェル62中へ放出され得る。加圧により、試料ウェルの壁面上のシール膜に破損が生じる。各入力チャンバーのベースは、弾性膜が押し下げられたときに液体の完全な放出が生じるように形作られる。プランジャー88、90、92および94(図4に示される)はまた、図5でチャンバー64について示されるように、チャンバー64、66、68または70のいずれかから液体を放出するために押し下げられ得る。
【００９０】
試料ウェル62は、任意の適切な寸法を有し得る。一例において、試料ウェル62は、約5mlまでの液体試料を受け容れる大きさに作られる。
【００９１】
試料ウェル62の内部において、試料および水を主材料とした試薬をウェルの低部へ留まらせるのを強化するために、壁面は部分的に疎水性被覆剤で被覆され得る。同様の疎水性被覆が、カートリッジ60内の任意の他のチャンバーに提供され得る。
【００９２】
図5に見られるように、試料ウェル62は核酸増幅インヒビター、たとえばIsoCode(登録商標)ペーパーの挿入物を不活性化する多孔性支持体96を含む。多孔性支持体96は、試料ウェル62の下方末端98に配置される。
【００９３】
試料ウェル62の上方末端100は、覆われているかまたは密閉されている。図4に示される態様において、試料ウェル62は埋め込まれたガス‐透過膜を含む蓋102によって覆われている。蓋は、たとえば留め金閉じおよびO−リングガスケットにより密閉され得る。ガス‐透過膜は、多孔性支持体上に置かれた試料を乾燥させる加熱工程の間に生じる蒸気、たとえば水蒸気を排出させる。試料ウェル62を密閉するためまたは蒸気を排出させるための他の方法もまた、当該技術分野において公知のとおりに使用され得る。たとえば、試料ウェルは安全弁を備えたキャップを用いて密閉され得る。
【００９４】
液体のやり取りはまた、図3に示されるとおり試料ウェル62ならびに回収チャンバー74および76間で確立される。
【００９５】
一態様において、回収チャンバー74および76は真空下にある。たとえばプランジャー手段により、または蓋62中のガス‐透過膜へ力を加えることにより試料ウェル62中の液体上に適用される圧力は、管104部での膜閉鎖に破損を生じさせ得る。試料ウェル62および管104間の膜シールもまた、手動または自動でなされるピンでの穿刺によって破裂し得る。これにより下記で更に述べるように試料ウェル62の内容物は、回収チャンバー74または76中へ移され得る。
【００９６】
操作の間、未処理試料は試料ウェル62中へ導入され、たとえば上記の蝶番が付いた蓋を介して多孔性支持体96と接触する。カートリッジ60への更なる接触は必要ない。
【００９７】
試料ウェル62と入力チャンバー64、66、68および70との間の選択的な液体のやり取りは、使用されるプロトコルによって確立された順序に従って確立される。種々の試薬および液体が、上記のようにプランジャーまたは他の適切な手段を介して試料ウェル62および多孔性支持体96へ向けられる。
【００９８】
未処理試料は、電気溶出電極106および108による電場にかけられ得る。電極は、約20Vまでの図5には示されていない電源に接続される。好ましくは、電極表面は核酸の付着を防止するために処置される。蓋102に位置する電極108は、当該技術分野で公知のとおりに平らでもよく、または電場の増強を提供する尖った先端を有してもよい。
【００９９】
代替的にまたは電場の使用と組合せて、加熱もまた使用され得る。加熱は、外部の加熱手段によるものでもよく、またはカートリッジ設計中に組込まれてもよい。一例において、熱電加熱が使用され得る。熱電加熱は、電極106を用いて使用され得る。多試料に関して、電場非存在下での加熱は約95℃で約30分間である。
【０１００】
溶出は、核酸成分の容積を減少させるために濃縮工程を含み得る。最初の洗浄液体が回収チャンバー76(廃棄物)に向けられる間、核酸を保持するために結合マトリックス110が使用される。次にチャンバー76への経路が閉鎖され、核酸は、結合された核酸を結合マトリックス110から回収チャンバー74(産物)へ溶出するための溶出液体、たとえば水を導入することにより結合マトリックス110から放出される。
【０１０１】
結合マトリックス110を形成するために使用され得る適切な素材としては、限定されないが、シリカまたはガラスが挙げられる。
【０１０２】
さらに、回収チャンバー74および76は、ピンと共に加熱される図3、4または5に示されていない熱密封可能(heat-sealable)な膜により密封され得る。従って産物の核酸成分は、カートリッジ60または120中の懸濁液に保存され得る。
【０１０３】
試料はまた、図3、4または5に示されていないカートリッジ60または120の産物回収口部分を穿刺する皮下注射用針を用いて取り出され得る。
【０１０４】
本質的に上記のような試料ウェル62ならびにチャンバー64、66、68、70、72、74および76は、核酸ハイブリダイゼーションおよび任意に増幅チャンバーと統合され得る。
【０１０５】
統合されたカートリッジ120は、図6、7および8に記載される。
【０１０６】
上記の要素に加えて、統合されたカートリッジは、増幅チャンバー122およびハイブリダイゼーションチャンバー124を含む。液体伝達のための管はそれぞれ、増幅に使用できる状態である核酸成分を含む回収チャンバー74から増幅チャンバー122および増幅チャンバー122からハイブリダイゼーションチャンバー124までの間の液体伝達のために提供される。
【０１０７】
核酸増幅およびハイブリダイゼーションの手順は、当該技術分野において公知である。
【０１０８】
増幅チャンバー122は、必要とされるプライマーおよび酵素を、上記のとおり加圧作動性であり得る分離した入力試薬チャンバー(示されていない)から受容する。必要とされる場合には、増幅反応のための加熱は、外部熱源から加熱器中空部(これもまた示されていない)へ供給される。乾燥試薬130もまた提供され得る。チャンバーは真空状態に前もって作られ、上記のとおり加熱されたピン126および128を用いてアクセスされ、密封される。ハイブリダイゼーションチャンバー124は、チャンバーの基底上にプリントされたDNA/RNAのアレイ132を含む。チャンバー124の内壁は、水和されると溶解しハイブリダイゼーションの検出に使用される測色法的または蛍光的にラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ134で被覆される。代替的に、プローブおよび他の試薬は、試薬を含む乾燥ビーズの形態で提供されることが可能であり、それは回収チャンバー74からの液体試料がハイブリダイゼーションチャンバー124へ導入される場合に再水和され溶解する。チャンバーは、アレイを観察できるように透明な膜で作製された蓋136を有する。
【０１０９】
さらなる態様において、本発明はたとえば野外から収集された土壌試料などの未処理試料を取り扱うための装置に関する。本装置を使用することにより、未処理サンプルから未処理サンプル成分が分離され得、次いでこれは本質的に上記にように使用され、増幅用にサンプルのアミノ酸成分が調製される。
【０１１０】
本発明の装置の一態様が図９中に示される。ハウジング12および容器152を含む装置150が、図9中に示される。ハウジング12は、本質的に図1Aおよび1B、または2Aおよび2Bについて記載されたとおりであり、多孔性支持体34を含む。たとえば図3〜8について上記のとおりの試料処理のための他の手段が、使用され得る。
【０１１１】
容器152は、任意の適切な形状および寸法を有することができ、金属、ガラス、プラスチックまたは他の適切な素材から構成され得る。好ましくは、容器152はプラスチックから作製され、約5センチメートル(cm)〜約20cmの範囲内、より好ましくは約10cm〜約15cmの範囲内の長さを有する。容器152は、好ましくは約2cm〜約5cmの範囲内の最小直径および約3cm〜約8cmの範囲内の最大直径を有する。
【０１１２】
容器152は、栓(closure)158を備えた入力口154および排出口156を有する。栓158は、たとえば蓋、キャップ、ゴムの差込物または入力口154を閉鎖もしくは密封するための他の手段である。一態様において、栓158は、加圧により破損され得る柔軟な層を含む。好ましくは栓158は、容器152中に存在する物質、たとえば液体に関して漏れがない。容器152は、本質的に上記のとおり磁性ビーズ162を含むアンプル160を収容する。一態様において、磁性ビーズ162は、アンプル160内の緩衝液中に保存される。アンプル160は、好ましくはプランジャー、たとえば栓158を介して押し下げられ得るプランジャーによって貫通されるか、または破られ得る素材から作製される。
【０１１３】
アンプル160は、容器壁に構築された圧痕もしくはうねり模様などの位置決め手段、または他の適切な手段により支持され得る。一態様において、アンプルは適切な位置決め手段、たとえば容器152の壁中の支持リングにより容器152中で入力口154近くに保持される。別の態様において、アンプルはたとえばネジ付きキャップである栓158内にチャンバーとして形成される。磁性ビーズ162は、栓158をひねったり回転することにより穿刺され得る破裂可能な膜によりチャンバー内に保持される。栓158はまた、ビーズを放出するために破裂可能膜もしくはアンプル壁に孔を開けるためのプランジャーまたは他の機構と共に提供され得る。
【０１１４】
ハウジング12および容器152は共に、たとえば支持体166および168を介して回転可能なバルブ164にそれぞれしっかりと固定される。任意に、支持体168は容器152の任意の出っ張り172を噛み合わせるための留め金閉じ170を有する。支持体166およびハウジング12についてもまた同様の配置が使用され得る。
【０１１５】
回転可能なバルブ164は、ハンドル170およびバルブボディ172を含む。バルブボディ172は、磁性ビーズ162を受け取るためのウェル174および陥凹部176とともに提供される。一態様において、回転可能なバルブ164は、回転の間に張り出し棚166の出っ張り178および張り出し棚168の出っ張り180を噛み合わせるための溝を有する。
【０１１６】
操作の間、未処理試料は入力口154を通って容器152中に導入される。水、緩衝液または別の溶媒もまた添加され得る。アンプル160の中身は、前に議論されたような手段によりアンプル160から放出され、磁性ビーズ162は未処理試料と接触する。好ましい態様において、磁性ビーズ162は核酸成分を含む試料が優先的に磁性ビーズ162に捕捉されるかまたは付着するような皮膜を有する。たとえば、試料成分のビーズへの接触及び付着を増強するために任意に振盪や撹拌が行われる。手動の振盪または他の撹拌手段が、当該技術分野で公知のとおりに使用され得る。
【０１１７】
図10に示されるように、装置150は反転される。磁性ハンドル184中に保持される磁石182、たとえば希土酸化物磁石は、陥凹部176中に配置される。図10に示されるとおり、磁性ビーズ162は磁石182に向かって上方に移動し、好ましくはウェル174中に集まり、これにより未処理試料成分から試料が分離される。図10に示される配置はまた、容器152の入力口154方向へ沈降され得る残骸、土壌粒子、砂および他の物質などの未処理成分に対する重力を利用している。
【０１１８】
回転可能なバルブ164は次に、たとえばハンドル170を回転することにより、図11に示される配置に回転される。図11に示されるとおり、回転はウェル174中で磁石182によって保持される磁性ビーズ162上に回収された試料をハウジング12の多孔性支持体34に降ろす。試料は次に、たとえば図1Aおよび1Bについて上記のように処理される。試料をさらに処理するための方法および装置に関する態様はまた、「Apparatus and Method for Isolating a Nucleic Acid From a Sample」という表題である2002年7月10日出願の米国出願第10/193,742号中に記載される(その全教示が本明細書中で参考として援用される)。
【０１１９】
本発明の装置の別の態様は、図12、13A、13Bおよび13Cに示される。
【０１２０】
本体192を有する装置190の分解側面図が図12に示される。本体192は、コンテナ194、容器196および部品198を含む。コンテナ194は、本質的に上記のとおり多孔性支持体34を含むハウジング12を保持する。好ましい態様において、ハウジング12は皮下注射針で液体を抜き取るためのセプタム型栓を含むキャップ24を有する。好ましくは、コンテナ194は、図1Aに記載されるコンテナ14の機能を果たす。
【０１２１】
容器196は、上記のとおり磁性ビーズを含むアンプル160を収容する。任意の仕切り200がアンプル160の下に提供され、未処理試料の残骸が回収されハウジング12の多孔性支持体34へ移動するのを防止する。
【０１２２】
容器196はまた、好ましくは破損可能なフィルムまたはプラスチックから作られる分離層204を破損することにより放出され得る廃棄ゲル(waste gel)202を含む。ゲル202は、シリカゲル、粘土、別の乾燥剤または他の吸収性物質であってもよく、所望される場合に未処理試料中の液体を吸収するために放出され得る。たとえば、廃棄ゲル202は、容器196中に液体またはスラリー未処理試料を移動させるのに先立って放出され得る。一態様において、廃棄ゲル202はプラスチック製の袋の中に保持される。袋および/または分離層204は、たとえばキャップ206を締めるもしくは押し下げることにより、捻ることにより、またはプランジャー機構により破裂し得る。キャップ206は、廃棄ゲル202を収容するプラスチック製の袋の上端を保護する隆起壁(raised wall)208とともに提供され得る。
【０１２３】
本体192はまた、回転可能なバルブ212を保持するための開口部210を有する部位198を含む。回転可能なバルブ212は、本質的に上記のとおり磁石182を保持する磁性ハンドル184を受容するための陥凹部214を有する。磁石182を試料成分による汚染から保護するために、薄いプラスチック層が提供され得る。たとえば、保護層は、回転バルブ212の一部であってもよく、または磁石182のカバーであってもよい。回転可能なバルブ212はハンドル216を含み、ウェル218と共に提供される。袋(bag)220は、液体試薬たとえば水、緩衝液、TAE、TBEを含み、ウェル218中に挿入される。
【０１２４】
装置190の側面断面図が、図13Aに示される。層204、ゲル202、および隆起壁208を有するキャップ206を含む容器196の上部の詳細な断面図が、図13Bに示される。回転バルブ212、磁性ハンドル184中の磁石182、袋220および仕切り200の詳細な断面図が、図13Cに示される。
【０１２５】
上記のとおり、操作の間、磁石182の非存在下で磁性ビーズ162が放出され、容器196中において未処理試料と接触する。ビーズ上への試料の接触および捕捉を増強するために任意の振盪が行われ得る。磁性ビーズ162がウェル218中に降ろされるように、磁石182を有する磁性ハンドル184が開口部210中へ挿入される。任意に、ゲル202は層204を破損させることにより放出される。次に回転バルブ212が回され、磁性ビーズ162上に回収された試料が多孔性支持体34の近くへ運ばれる。磁性ハンドル184中の磁石182は、陥凹部214から引き抜かれ得、これにより磁性ビーズが多孔性支持体162上に堆積する。別の態様において、磁石182および磁性ハンドル184が陥凹部214中にある間、磁性ビーズ162は、多孔性支持体34と接触する。ハウジング12をウェル218の方へ押すことで袋220が破られ、それにより液体、たとえば緩衝液が袋220から放出される。本質的に上記のとおり、液体が磁性ビーズに付着した試料と接触し、多孔性支持体34を押し通され、それにより試料中の核酸成分が多孔性支持体を通過し、核酸増幅インヒビターが多孔性支持体により不活性化される。
【０１２６】
本発明の装置のハウジング12はまた、独立して使用され得る。たとえば、ハウジング12は図9〜13について記載される装置から分離され得、試料の上からハウジングの多孔性支持体を強打し、「Apparatus and Method for Isolating a Nucleic Acid From a Sample」という表題である2002年7月10日出願の米国出願第10/193,742号(その全教示が本明細書中で参考として援用される)中に記載されるとおりに試料を処理することにより試料が回収され得る。
【０１２７】
試料は、複数カートリッジカセットおよび/または自動化カートリッジプロセッサー中で処理され得る。市販ユニット、たとえばベックマンコールター(Beckman Coulter、Fullerton、CA)からBeckman SagianTM Core Systemという名称で入手可能な機械ハンドラーが使用され得るか、または試料を適応させるために修正され得る。
【０１２８】
本発明は、制限を意図するものではない以下の実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【０１２９】
実施例１
IsoCode(登録商標)ペーパーの通常の商業的使用方法は、以下の工程を含む。
・試料を直接IsoCode(登録商標)ペーパーに適用する；
・乾燥または焼成を介して乾燥させる；
・脱イオン水(dH2O)中でボルテックスすることによりすすぐ；
・すすいだIsoCodeをdH2O中に浸し、95℃で30分間加熱する；
・DNAをペーパーから外すためにパルスボルテックスする；
・DNAはPCR増幅に使用できる状態にある。
【０１３０】
本発明なしで、IsoCode(登録商標)パーパーを使用することにより、スラリー中に調製され得る増幅用の未処理固形試料(マトリックスとしてが好ましい)のDNA成分を調製するための詳細な方法を、比較プロトコルAのとおりに示す。
【０１３１】
比較プロトコルA
1.  アルミニウム計量皿(または任意の疎水性、非シリカベースの計量コンテナ)中に50mgのマトリックスを計量する。
2.  別の清潔な計量皿へIsoCode(登録商標)ペーパーの三角形片を置く。
3.  試料から15μL取り出せるために必要な量の蒸留水をマトリックスへ添加する。これは通常、砂状土壌に対しては25〜30μL、細粒土壌または粘土含有土壌に対しては35〜40μL、他のマトリックスに対しては様々な量である。
4.  ほぼ均質なスラリーが形成されるまで、水を試料へ添加するのに用いたピペットチップでマトリックスおよび水をよく混合する。可能であれば試料の混合度を増大させるためにぺピットで上げ下げする。ピペット汚染を最小化するためにフィルターチップを用いる。
5.  同じピペットチップで、スラリーから約15μLの液体を抽出する；その中に懸濁された土壌をある程度含んでいてもよい。
6.  その液体をIsoCode(登録商標)へ適用する。
7.  真空下において60℃で最短で15分間(もしくは全体的に乾燥するまで)IsoCoe片を焼成する、または室温で密閉コンテナ内で乾燥剤と共に最短で4時間乾燥させる。
8.  乾燥したIsoCode片をオーブンから出し、各試料に対して500μLの蒸留水入りの1.5mLチューブ(洗浄チューブ)1個および50μLの蒸留水入りの0.5mLチューブ(溶出液チューブ)1個を準備する。溶出液チューブには試料番号を標識する必要があるが、洗浄チューブにはない。
9.  IsoCode(登録商標)片を、それに触れることなく洗浄チューブ内に置く。蓋を閉め、ボルテックスを2〜3回、各1秒間行う。
10.  チューブの蓋を開け、清潔なピペットチップを用いてIsoCode(登録商標)片を取り出し、溶出液チューブへ入れ、チューブを閉める。IsoCode(登録商標)が完全に水に浸っており、それに接触している気泡が無いことをことを確認する。洗浄チューブを廃棄する。各回ごとに新しいピペットチップを用いて残りの試料に対して再度行う。
11.  サーモサイクラーまたはヒーティングブロックを用いて全ての溶出液チューブを95℃で30分間加熱する。この工程の後直ちにチューブを後処理できない場合は、4℃に冷やして保持する。
12.  チューブが冷えたらサーモサイクラーから取り出し、IsoCode片を廃棄する前にそのペーパーからチューブ内へできるだけ多くの液体を抽出するようにピペットチップを用いてチューブから各ペーパーを取り出す。各試料に対して新しいピペットチップを使用する。
13.  溶出液はPCR解析に使用できる状態にある。
【０１３２】
上記で説明し図1Aに図示したアセンブリ10などのアセンブリ中で行うための本発明の方法を含むようにプロトコルBを開発した。
【０１３３】
プロトコルB
1.  液体試料を滴下するかまたはサンプリング対象の表面をぬぐうことにより多孔性支持体(IsoCode(登録商標)ペーパー)に試料を適用する。
2.  5分待つ。
3.  アセンブリのハウジングを既に100〜200マイクロリットルの水またはバッファー含有水を含むコンテナ内へ挿入することにより、水またはバッファー含有水を多孔性支持体に押し通す。
4.  取り外し可能な蓋を外すことによりアセンブリのハウジングを開けた後、ピペットチップで溶出液(試料の核酸成分を含む水)を取り出す。
【０１３４】
二つのプロトコル、比較プロトコルAおよびプロトコルBを比較すると、本発明の方法および本発明の装置の態様を用いる場合、増幅用核酸成分を調製するために必要な時間および工程数が減少することが明らかである。たとえば、加熱サイクルが双方ともに削除されている。最初の乾燥工程は多孔性支持体へのインヒビターの結合の一因であると考えられているため、乾燥工程の削除はサンプルからの核酸抽出効率における損失に関連するかもしれない。従って、その態様のいくつかにおいて本発明の方法は、任意に単回の加熱工程を含み得る。他の態様において、核酸成分の多孔性支持体からの移動を増強するために、本発明の方法では電気溶出を使用することができる。
【０１３５】
プロトコルBの修正版は、同様に使用でき、液体を多孔性支持体に押し通す前に、多孔性支持体上の試料と水またはバッファー含有水とのさらなる接触時間を提供する。これにより核酸の回収効率が増大する。
【０１３６】
修正プロトコルB
1.  液体試料を滴下するかまたはサンプリング対象の表面をぬぐうことにより多孔性支持体(IsoCode(登録商標)ペーパー)に試料を適用する。
2.  5分待つ。
3.  アセンブリのハウジングを、既に100〜200マイクロリットルの水またはバッファー含有水を含むコンテナ内へ多孔性支持体がコンテナ内の液体と接触するまで押す。
4.  5〜10分待つ。
5.  コンテナ内へアセンブリのハウジングを十分に押し込むことにより、水またはバッファー含有水を多孔性支持体に押し通す。
4.  取り外し可能な蓋を外すことによりアセンブリのハウジングを開けた後、ピペットチップで溶出液(試料の核酸成分を含む水)を取り出す。
【０１３７】
実施例２、３および４の材料および方法
PCR増幅操作およびデータ解析
ABI PRISM(登録商標)7700シーケンスデテクションシステム(パート♯7700-01-200/208、Applied Biosystems製、850 Lincoln Centre Drive、Foster City、California、94404)を用いて一連のDNA試料に対して行ったポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅操作(以後、「TaqMan」という)からデータを得た。
【０１３８】
TaqManシステムは、複製されるDNA量をリアルタイムで同時にモニターしながら、試料中に存在するDNAを「通常」のPCR技術で増幅することで機能する。これは、以下のように達成される：
【０１３９】
通常のPCRサイクルを始める。DNAを変性し、複製対象の配列のどちらかの末端に対するプローブを結合させる。このとき、特殊なプローブもまた該配列の中央に結合する。これは、一方の末端を発蛍光団的「レポーター」色素で、もう一方の末端を「クエンチャー」で標識されている。これら二つの分子が極めて接近している(すなわち同じDNA鎖に結合している)場合、蛍光色素はクエンチャー分子によって消光され光を発しない。
【０１４０】
一旦、配列のどちらかの末端にプローブが結合すると、DNAポリメラーゼが一本鎖を二本鎖にしながらDNAに沿って進行する。DNAポリメラーゼが発蛍光団的に標識されたプローブに達すると、鎖を進みながらその5’ヌクレアーゼ活性によりプローブを単独の塩基へと切断する。これにより蛍光物質が遊離し、消光剤から遠く離れて蛍光発光することが可能となる。
【０１４１】
TaqManは、各サイクルでのチューブ内部の蛍光強度を測定し、ソフトウェアによる解析のために記録する。各サイクルで、そのサイクルの終わりにおいて、正しい配列を有するDNA鎖数、およびTaqMqnにより記録される対応する蛍光シグナルは倍増する。
【０１４２】
データをy‐軸に相対的シグナル蛍光レベル(Rn)およびx‐軸に増幅サイクル数(サイクル)を有する対数‐直線プロットの形態で示す。検出域はユーザーが調整し、検出域レベルを超え、続いてプロット中に指数的増幅曲線形状を示す任意のシグナルを、「ポジティブヒット」とした。検出域を超える時のサイクル数をその特定の試料に対するサイクル域という。サイクル域が低いのは、試料中の初期DNA量が多いことを示唆する(試料中の他の全ての因子が等しい)。
【０１４３】
用いた接種操作の説明
増殖期の微生物培養物は、微生物の冷凍ストックから微生物増殖培地中で調製する。培養物を対数増殖後期まで一晩培養し、典型的な培養物は増殖培地中に約108細胞/mLを含む。接種に用いられるストック培養液の希釈液を増殖培地である希釈液または試料が接種される液体中での容積測定希釈により調製する。典型的な一連の希釈は、10倍刻みで1:10(微生物培養物:希釈液)〜1:106の希釈からなる。ボルテックスで試料を混合する。
【０１４４】
実施例２
上記に説明し図1Aに図示したアセンブリ10などのアセンブリ中の多孔性支持体上に乾燥胞子を空気から回収した。
【０１４５】
Microcenter、Cambridge MAから得た市販の小型真空掃除機を、アセンブリを保持するために適合させた。アセンブリの一方の端において気流が、直接多孔性支持体の方へ流れた。
【０１４６】
一旦、多孔性支持体上に試料を回収すると、試料中の核酸成分を実施例１に記載のプロトコルBの工程2〜4を用いて増幅用に調製した。
【０１４７】
15秒〜2分の変動する期間に空気を詰め込むことで回収した試料に対するTaqMan増幅結果を図14に示す。結果から、15秒間という短い詰め込み時間(空気1リットルあたり数千個の粒子という粒子数に換算される)が標的の胞子粒子を検出し同定するのに十分であることが示される。
【０１４８】
実施例３
図1Aについて上記したようなアセンブリを、数個の試料の核酸成分を増幅用に調製するために使用した。様々な希釈度の微生物細胞培養物を含む埃で汚染された水を接種することで試料を調製した。比較プロトコルBおよびIsoCodeの製造業者により提供される一般的プロトコルを用いて試料を処理した。TaqMan増幅結果を図15に示す。結果から、一般的なプロトコルを用いて処理した同一の試料と比較して、図1Aに記載のアセンブリを用いた全ての試料においてサイクル域の低減が得られたことが示唆される。
【０１４９】
実施例４
試料中の核酸増幅化合物を不活性化する能力のある多孔性支持体と共に電場を使用する利点を証明するために、プロトコルCを開発した。プロトコルCは電気溶出デバイスを用いて行った。
【０１５０】
かかるデバイス、電気溶出ジグ240の断面側面図を図16に示す。電気溶出ジグ240は、チャンネル252を介してスクリューやナットを用いて互いに積み重ねて組立てられ得るプレート242、244、246、248および250を含む。プレート242、244、246および250は、プレキシグラス、ポリカーボネイト、またはDNAを付着しない他の不活性な素材などの材料から作られる。プレート248は、金属などの伝導性材料から作られる。
【０１５１】
プレート242は、４つの回収電極254を受容するためにネジ山が付けられる。電極252は、金属などの伝導性材料から作られ、好ましくはネジ山付きスクリューの形状である。1つの電極254の断面図および平面図を、それぞれ図17および図18に示す。
【０１５２】
プレート242、244、246、248および250の各平面図を、それぞれ図19、20、21、22および23に示す。図20には示さない外部電源、たとえばDCバッテリーからプレート248および電極254へ電圧をかけ得る。好ましくは、プレート248は陰極であり、電極254は陽極である。ジグ240において、多孔性支持体、たとえばIsoCode(登録商標)ペーパーをプレート246によって造られたウェルの中に配置することもできるし、またはプレート246および248(陰極)間に締め付けることもできる。試料の核酸成分以外の全ての粒子を排除するためのサイズのサイズ‐排除フィルター(たとえば100ダルトン(Da)サイズ)を、プレート244および246ならびにプレート242および244間に締め付けて、溶出したDNAを電極254(陽極)の方へ通すことができる。
【０１５３】
プロトコルC
1.  基本プロトコル(比較プロトコルAに記載のとおり)の工程1〜7のとおりにIsoCode(登録商標)試料を調製する。
2.  電気溶出ジグ140の下部(プレート150、148、146)を組立てる。DNAを電極152(陽極)へ通す。
3.  IsoCode(登録商標)ペーパーを電気溶出ジグ140のサンプルウェル中に置く。
4.  ウェルの上面までろ過した蒸留水を加える。
5.  100Daセルロースアセテート膜を加える。
6.  ジグ140の上部(プレート144、142)を下部に組込む。ろ過した蒸留水をウェルに加える。
7.  上側電極152をジグ140に挿入する。
8.  電極148(陰極)および152(陽極)へ5分間電圧をかける。
9.  電圧源を外す(代替的に、電極152に付着し得る任意の核酸成分を払い落とすために上側電極に一瞬リバース‐バイアスをかけてもよい)。
10.  電極152を外す。核酸を含む溶出液をウェルから取り出し、0.5mLチューブ内に移す。
11.  ペーパーおよび膜を廃棄する。
12.  溶出液はPCR解析に使用できる状態である。
【０１５４】
以下の電気溶出条件：電圧＝(0.5、1、2、5、10、20V)、溶出時間＝(1、5、10分)、緩衝液＝水、を用いて図18〜23に図示したジグを試験した。
【０１５５】
プロトコルAについて電気溶出を用いるプロトコルCは、30分間の加熱工程を削除した結果、30分を超えるどころか5分以内に完了することができた。予備的結果から、比較プロトコルAにおける洗浄工程(工程9)はプロトコルCを用いる場合、必要とされない可能性があることが示唆された。
【０１５６】
上記で説明し図18〜23に示したような電気溶出ジグを溶出工程に、ABI PRISM 7700シーケンスデテクションシステムをPCR増幅に用いて行った実験結果を図24に示す。試料は、砂状土壌中に接種された増殖期の微生物細胞であった。109細胞/グラムレベルでは、検出サイクル域に7サイクルの改善があった。105細胞/グラム接種レベルでは、この実験で改善が見られなかったが、このことは低接種レベルにおける試料間の統計上の偏差のため時には典型的である。結果を図24に示す。
【０１５７】
均等
本発明は、その好ましい態様を参考と共に詳細に示され、記載されているが、形式および詳細部分における種々の変化が、添付された特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが当業者によって理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１Ａは、本発明の装置のある態様で使用され得、本発明の方法を行うためのアセンブリの態様の縦断面図である。  図１Ｂは、本発明の装置のある態様で使用されうるハウジング、キャップ、多孔性支持体および他の要素の分解斜視図である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の装置のある態様で使用されうるキャップおよびハウジングの各々の側面図である。
【図３】図３は、増幅用のサンプル中の核酸成分を調製するために使用されうる装置の水平断面図である。
【図４】図４は、図３の発明の装置の平面図である。
【図５】図５は、図３の切取線AA1に沿った断面図である。
【図６】図６は、サンプルを処理するために使用されうる装置の水平断面図である。
【図７】図７は、図６の装置の態様の平面図である。
【図８】図８は、図６の切取線BB1に沿った断面図である。
【図９】図９、１０および１１は、本発明の装置の態様およびその操作の説明図である。
【図１０】図９、１０および１１は、本発明の装置の態様およびその操作の説明図である。
【図１１】図９、１０および１１は、本発明の装置の態様およびその操作の説明図である。
【図１２】図１２は、本発明の装置の別の態様の分解側面図である。
【図１３】図１３Ａは、図１２に示される装置の縦断面図である。  図１３Ｂおよび１３Cは、図１２および１３Ａに示される装置の一部の拡大断面図である。
【図１４】図１４は、本発明の多孔性支持体に接触する空気サンプルからの増幅サイクル数に対する相対シグナル蛍光レベルを示す一連のプロットを表す。
【図１５】図１５は、本発明の方法および装置の態様により、ならびに比較技術により調製される種々のサンプルからの増幅サイクル数に対する相対シグナル蛍光レベルを示す一連のプロットを表す。
【図１６】図１６は、多孔性支持体からの核酸の除去を増大するために電流を適用するための電気溶出デバイスの断面図である。
【図１７】図１７および１８は、各々、図１６に示されるデバイスで使用される電極の断面図および平面図である。
【図１８】図１７および１８は、各々、図１６に示されるデバイスで使用される電極の断面図および平面図である。
【図１９】図１９〜２３は、図１６に示されるデバイスにおいて使用される個々のプレートの平面図である。
【図２０】図１９〜２３は、図１６に示されるデバイスにおいて使用される個々のプレートの平面図である。
【図２１】図１９〜２３は、図１６に示されるデバイスにおいて使用される個々のプレートの平面図である。
【図２２】図１９〜２３は、図１６に示されるデバイスにおいて使用される個々のプレートの平面図である。
【図２３】図１９〜２３は、図１６に示されるデバイスにおいて使用される個々のプレートの平面図である。
【図２４】図２４は、図１９〜２３に記載されるようなデバイスで調製されたサンプルの解析における検出の改善を示す一連のプロットである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2005532072.tif 000014
【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
2005532072.tif 000029
2005532072.tif 000030