(57)【要約】【課題】ある種の癌、ウィルス感染およびアレルギーに対する新規な全身性または粘膜性ワクチン治療。【解決手段】２つの異なる標的、すなわち、原因となる病原性抗原構造と血管形成性または免疫毒性間質疾患の原因となる局所で産生される因子とを標的とする免疫応答を誘発することができる二価官能性複合超免疫原化合物のワクチンでの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)と(b)の２つのポリペプチド：
(a)  不活性または活性な細胞、微生物または粒子の病原性抗原構造に対して細胞免疫反応または細胞／液性免疫反応を誘発する第１の免疫原性ポリペプチド、
(b)  サイトカイン因子または免疫毒性または血管形生性（angiogenique）を有する細胞調節因子の中から選択される間質局所循環タンパク（proteine circulante local du stroma）に対して中性またはブロックする抗体の産生を誘発する第２の免疫原性ポリペプチド[上記の因子はガン細胞、ウイルス感染細胞またはリンパＴ細胞を含む間質細胞 (cellules stromales) および抗原を有する細胞（APC）によって産生されるか、病原性粒子構造、特にアレルギー性粒子によって誘発される]
で構成される物理的に互いに結合した２つの異なる免疫原性ポリペプチドから成る二官能性複合超免疫原 (composite superimmunogens) の、病原性抗原構造および間質局所循環タンパクの両方に対して抗ガン性、抗ウイルス性または抗アレルギー性免疫作用を粘膜または全身で誘発する医薬の製造での使用。
【請求項２】
第１の免疫原性ポリペプチド(a)が(i)ガン細胞により選択的に発現された免疫原性タンパク、ウイルス感染細胞により選択的に発現された免疫原性タンパクまたはアレルギー性病原構造を構成するタンパク（必要に応じて無毒化されていてもけよい）および(ii)上記のタンパク(i)に由来するタンパクの中から選択される請求項1に記載の使用。
【請求項３】
免疫原性ポリペプチド(b)が(i)間質の局所循環タンパク（必要に応じて無毒化されていてもけよい）および(ii)このタンパク(i)由来のタンパクの中から選択される請求項1または２に記載の使用。
【請求項４】
第１の免疫原性ポリペプチド(a)がＨＩＶの免疫原タンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来するタンパクの中から選択される請求項1〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
第１の免疫原性ポリペプチド(a)がＴＡＡまたはＹＳＡの免疫原タンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来するタンパクの中から選択される請求項1〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
第１の免疫原性ポリペプチド(a)がBetv1a、Der p 1およびFel d 1の免疫原タンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来するタンパクの中から選択される請求項1〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ポリペプチド(a)およびポリペプチド(b)の組合せを下記ａ）〜ｇ)の中から選択する請求項1〜３のいずれか一項に記載の使用：
ａ）ＡＩＤＳの予防および治療用
ポリペプチド(a)：ＨＩＶ1ウイルスのgp160、p12、p17、nefまたはTat、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ポリペプチド(b)： Tat、IFNα、TGFβ、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ｂ）子宮癌の予防および治療用
ポリペチド(a)：乳頭腫ウイルス、好ましくは乳頭腫ウイルス株16または18のLI、L2およびE7タンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ポリペチド（b）：E7、lFNα、TGFβ、TNFαおよびVEGFタンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ｃ）HTL V１または2ウィルスに起因するATL白血病の予防および治療用
ポリペチド(a)：HTLVIまたは2ウィルスのgp6IおよびTaxタンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ポリペチド（b）：無毒化されたTax、IL10、lFNαまたはTGFβタンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、
ｄ）  大腸癌の予防または処理用
ポリペチド(a)：CEAおよびp53タンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ポリペチド（b）：無毒化されたTGFβ、IL10、p53、FasLおよびVEGFタンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ｅ）  乳癌の予防または処理用
ポリペチド(a)：Di12タンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、
ポリペチド（b）：TGFβ、TNFαおよびVEGFタンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ｆ）膵臓癌の予防または処理用
ポリペチド(a)：CaSmタンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ポリペチド（b）：VEGFおよびTNFaタンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ｇ）前立腺癌の予防または処理用
ポリペチド(a)：OSAおよびETS2タンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
ポリペチド（b）：lL6およびTGFI3タンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来する免疫原タンパク、必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい、
【請求項８】
ポリペプチド(b)がＩＬ４またはＩＬ５のタンパク、このタンパクの免疫断片またはそれに由来するタンパクの中から選択される請求項６に記載の使用。
【請求項９】
複合超免疫原を下記の中から選択する請求項７に記載の使用：
1）  複合超免疫原  (a) gp160−（b）Tatトキソイド、
2）  複合超免疫原（b）Tatペプチド[1-15、46-60]−(a)gp160、
3）  複合超免疫原  (a) Tatトキソイド−（b）IFNα、
4）  複合超免疫原  (a) Tatトキソイド−（b）Tatペプチド[1-15、46-60]
【請求項１０】
複合超免疫原を下記の中から選択する請求項７に記載の使用：
1）  複合超免疫原  (a)  L1−（b）E7、
2）  複合超免疫原  (a)  E7−（b）VEGF、
【請求項１１】
複合超免疫原が(a)  Betvlａ−（b）1L4からなる請求項３〜６のいずれか一項に記載の使用：
【請求項１２】
ポリペチド(a)および（b）が共有結合で互いに直接接合している請求項１〜11のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
ポリペチド(a)および（b）が複合超免疫原のところでスペーサ鎖によって互いに分離されている請求項１〜11のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
スペーサ鎖が直鎖スペーサーペプチドである請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
スペーサ鎖が分岐鎖のスペーサーペプチドである請求項13に記載の使用。
【請求項１６】
スペーサ鎖がSlABまたはSMMC型の鎖である請求項13に記載の使用。
【請求項１７】
複合超免疫原を下記の中から選択する請求項16に記載の使用：
1）  複合超免疫原  (a) E7 −SlAB −（b）VEGF、
2）  複合超免疫原  (a) Betvla −SlAB −（b）1L4
【請求項１８】
ポリペチド(a)とポリペチド（b）の両方が同一のナノ粒子に固定されているか、同一のミクロ粒子中または同一のナノ粒子中に埋め込まれている請求項１〜8のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
下記(a)と(b)の２つのポリペプチド：
(a)  不活性または生きた細胞、微生物または粒子の病原性抗原構造に対して細胞免疫反応または細胞および液性免疫反応を誘発する第１の免疫原性ポリペプチド、
(b)  サイトカイン因子または免疫毒性または血管形生性を有する細胞調節因子[この因子はガン細胞、ウイルス感染細胞またはリンパＴ細胞を含む間質細胞および抗原を有する細胞（APC）によって産生されるか、病原性粒子構造、特にアレルギー性粒子によって誘発される]の中から選択される間質の局所循環タンパク（preteine circulante local du stroma）に対して中世またはブロックする抗体の産生を誘発する第２の免疫原性ポリペプチド、
で構成される物理的に互いに結合した２つの異なる免疫原性ポリペプチドから成る二官能性複合超免疫原。
【請求項２０】
(a) gp16O−（b）Tatトキソイドコンジュゲートからなる請求項19に記載の複合超免疫原。
【請求項２１】
(a) Tatトキソイド−（b）lFＮαコンジュゲートからなる請求項19に記載の複合超免疫原。
【請求項２２】
(a) E7−SlAB（b）−VEGFコンジュゲートからなる請求項19に記載の複合超免疫原。
【請求項２３】
(a) BetV1a−SlAB−（b）IL-4コンジュゲートからなる請求項19に記載の複合超免疫原。
【請求項２４】
請求項19〜23のいずれか一項に記載の複合超免疫原をコードする配列から成る核酸。
【請求項２５】
哺乳類、特にヒトの機能制御ポリヌクレオチドの制御下に請求項19に記載の複合超免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む形質発現カセット。
【請求項２６】
請求項24に記載の核酸または請求項25に記載の形質発現カセットから成る組換え型ベクター。
【請求項２７】
請求項25に記載の形質発現カセット、請求項24に記載の核酸請求項26に記載の組換え型ベクターの抗癌、抗ウイルス性または抗アレルギー作用を有する医薬品の製造での使用。
【請求項２８】
免疫的に有効な量の請求項19〜23のいずれか一項に記載の複合超免疫原を、生理的に許容される賦形剤とを組み合わせた免疫原の組成物。
【請求項２９】
請求項19〜23のいずれか一項に記載の複合超免疫原を主成分とし、生理的に許容される賦形剤を組み合わせたもので構成されるワクチン。
【請求項３０】
請求項24に記載の核酸、請求項25に記載の形質発現カセットまたは請求項26に記載の組換え型ベクターを治療に有効な量だけ含む免疫原組成物。
【請求項３１】
請求項24に記載の核酸、請求項25に記載の形質発現カセットまたは請求項26に記載の組換え型ベクターを治療に有効な量だけ含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染、ある種のガンおよびアレルギーを含む、病原性抗原構造の局所組織での発現、免疫毒性または新血管形成（neoangiogenese）の原因となる免疫または脈管の間質異常を伴う発現に起因する疾患の予防および治療に関するものである。
【０００２】
本発明は、病原性抗原構造と間質組織障害の原因タンパクとの両方に対して免疫反応を誘導する複合超免疫原（superimmunogenes composites）とよばれる新規な予防手段または治療手段を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ルイ・パスツールの最初の実験研究以来、免疫機構を解明してより高度な特異性と有効性を持つワクチンを作る試みが２０世紀を通じて行なわれてきた。大規模に用いられた最初のワクチンは弱毒化した生きた細菌か、免疫アジュバントとして作用する組成が明らかでないタンパク性または膜の不純物を伴う免疫原性製剤から成るものであった。
【０００４】
その後、有効で毒性の無いより優れた免疫アジュバントと組み合わされたタンパクのサブユニットまたはタンパクトキソイド等の精製抗体から、病原体に対する免疫反応スクリーニングによって主として感染性疾患の治療および予防のためのワクチンが開発された。
【０００５】
過去２０年間、免疫反応のメカニズムの理解が進み、遺伝子工学技術の利用を含む大規模ワクチンの開発が成功したことによって、研究者は異種抗原または異常発現抗原を含む生体構造物（環境的に不活性または活性な細菌、細胞または粒子）に関係する慢性疾患、例えばAIDS、ガン、アレルギーおよび自己免疫疾患等の疾患の治療にワクチン接種を広く用いることができるようになった。
【０００６】
これらの疾患をワクチン接種によって予防または治療するために、ウイルス感染細胞が選択的に発現するウイルスタンパク、ガン細胞が選択的に発現するウイルスタンパクまたはアレルゲンタンパク（これらは上記疾患の一次的病原体である）のような病原構造体を標的とする免疫反応を誘発する試みが組織的に行なわれてきた。
例えば、AIDSウイルス感染、特にＨＩＶ1の感染を克服するために最近開発されたワクチン候補は、一定のウイルスタンパクまたはペプチドだけを標的とする免疫反応を誘発させる。
【０００７】
同様に、最先端臨床研究の対称となっている抗ガンワクチンはガンに関係する抗原を発現する細胞の破壊だけを行なうことを目的とした免疫反応を誘発する。例えばある種のパピローマウイルスが原因となるガンの場合にはウイルスタンパクの破壊のみを行ない、AIDS疾患の場合にはＨＩＶ1等のウイルスに感染した細胞の破壊のみを行なう免疫反応を誘発する。
現在の抗アレルギーワクチンは、同様なワクチン戦略によって一次アレルゲンを標的とする免疫反応だけを誘導する。
【０００８】
ガンは細胞の増殖であり、それが体内に分散して転移巣を形成する。正常なヒトでは免疫系が初発性ガン細胞を定期的に排除していることは知られている。また、ガンの発生が（１）局所免疫監視システムを逃れた後、ガンの進行段階で全身性免疫抑制に進み、（２）血管内皮細胞が増殖して腫瘍細胞へ栄養分が供給されるということも知られている。この腫瘍細胞の増殖は新血管形成とよばれる。
【０００９】
細胞（in situ）で麻痺を起こさせて宿主細胞の免疫防御から免れるという現象は多くのガンが採用する戦略であり、この戦略はガンが生き残るのに必要である。初期段階では、患者には感染症等の他の侵襲（agression）に対する自衛能力があるため、免疫抑制は腫瘍部位に局在したままである。
【００１０】
しかし、後期になるとこの免疫抑制は拡大し、全身性的になり、転移が分散し、ガン患者は感染に対して脆弱になる。この免疫抑制にはガン細胞やその周囲の細胞が生成する麻痺因子が関与している。従って、免疫系すなわち免疫抑制の細胞の局所的麻痺はガン細胞がその宿主細胞の免疫系を逃れるための主要な武器である。AIDSのようなある種の感染症ウイルスの侵襲にもこの免疫戦略が用いられている。従って、ＨＩＶ1感染細胞が放出したタンパクは周囲の免疫細胞に対して毒素として作用し、その結果、免疫細胞を阻害し、感染細胞を保護し、ウイルスの増殖を防ぎ、その転移を防御する免疫系をin situでブロックする。
【００１１】
本出願人は、ＡＴＬ白血病、子宮頚ガンおよびカポジ肉腫の場合には下記３種のタンパク：
ＨＴＬＶ１ウイルスのＴａｘタンパク、
パピローマウイルスのＥ７タンパク、
ＶＩＨ−１ウイルスのＴａｔタンパク、
が腫瘍またはＶＩＨ１感染細胞における局所的免疫抑制にれ関与していることを下記の特許明細書に記載している：
【特許文献１】
国際特許出願第WO 00/03732号公報
【００１２】
本出願人はさらに、これら免疫性タンパクの一部、例えばＨＩＶ1のTaxタンパクおよびHPV（16および18菌株）のE7タンパクが血管内皮細胞に対する活性作用を有することも明らかにした。
【００１３】
その結果、本出願人は元来局所的作用に対して免疫抑制的および／または血管原性のガン細胞、ウイルス感染細胞または間質性免疫細胞から合成されるタンパク、例えば不活性状態のＨＩＶ1ウイルスのTatタンパク、HTLV1ウイルスのTaxタンパク、パピローマウイルスのE7タンパク等に由来する無毒化された免疫原性化合物とマンナン依存性のレクチンとから成る抗ガンワクチンまたは抗ウイルスワクチンの開発を提案した。
【００１４】
上記特許文献１および下記文献：
【非特許文献１】
ZAGURY D wt al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98[14] 2001
【００１５】
で提案したワクチンの原理と同様な原理をベースにしたAIDS、ガンおよびアレルギーを克服するための治療戦略の別の観点から、細胞の増殖、分化またはプログラム死の因子として細胞内で局所的に物理的に作用するインターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロンを含む上記病理状態で見られる一部のサイトカインの異常産生を相殺する患者の抗サイトカイン免疫を誘発することが示唆される。
【００１６】
上記文献の筆者達が記載しているように、今日までのワクチン治療戦略は微生物、細胞またはアレルゲン等の抗原性侵襲体（aggressor）を標的としたもので、侵襲体の効果でサイトカイン誘発性の障害を克服しようと試みたことはなかった。筆者達が提案しているワクチンは間質の免疫毒性を中和またはブロックして抗原性侵襲体に合った免疫反応を正常に進められるようにすることを目的とする従来のワクチンである。ZAGURY他(2001)達の上記文献にはウイルス感染患者、ガン患者、重篤なアレルギー反応（例えば全身性の）を起こしやすい患者に与える免疫反応の誘発の利点を示具体的な実験証拠を示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ある種のガン、ウイルス感染、特にＨＴＬＶ−１またはＨＩＶ-1ウイルスによる感染または重篤なアレルギーの予防または治療に従来法より安全性と有効性の両面で改善されたワクチン治療が求められている。
本発明は、２つの互いに異なる標的、すなわち病原性抗原構造および免疫毒性または新血管形生性の間質障害（stroma disorder）の原因となる局所的に産生される因子に対する免疫反応を生じる二官能性ワクチン（vaccinal bifonctionnel）を用した複合超免疫原性化合物の形をした、ある種のガン、ウイルス感染およびアレルギーに対する新規な全身性または粘膜性ワクチン治療手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の対象は、互いに物理的に結合した２つの異なる免疫原性ポリペプチドから成る二官能性の超免疫原複合体であって、２つのポリペプチドはそれぞれ下記の(a)と(b)で構成される、病原性抗原構造と間質の局所循環タンパクの両方に対して抗ガン性、抗ウイルス性または抗アレルギー性の粘膜または全身免疫作用を誘発する薬剤を得ることにある：
【００１９】
(a)  不活性細胞または活性細胞、微生物または粒子状の病原性抗原構造に対して細胞免疫反応または細胞・液性免疫反応を誘発する第１の免疫原性ポリペプチド；
(b)  免疫毒性または血管形生性を有するサイトカイン因子または細胞調節因子[この因子はガン細胞、ウイルス感染細胞またはリンパＴ細胞および抗原を有する細胞（APC）を含む間質細胞のいずれかによって産生されるか、病原性（アレルギー性を含む）の粒子構造によって誘発される]の中から選択される間質の局所循環タンパク（a local circulating protein of the stroma）に対して中和またはブロックする抗体の産生を誘発する第２の免疫原性ポリペプチド。
【００２０】
本発明の第１の観点では、上記のポリペプチド(a)はガン細胞、ウイルス感染細胞または粒子構造物の抗原成分によって発現する抗原に対して細胞免疫反応を誘導し、必要に応じてさらに液性免疫反応を誘導する。粒子構造物には花粉、ダニおよびリーシュマニア(Leishmania major)等のある種の寄生虫のような生きた粒子構造物と塵ま、ネコの毛等の死んだ粒子構造とが含まれる。
【００２１】
第１の免疫原性ポリペプチド(a)は(i)ガン細胞によって選択的に発現された免疫原性タンパク、ウイルス感染細胞によって選択的に発現された免疫原性タンパクまたはアレルギー性病原構造を構成するタンパクと、(ii)このタンパク(i)に由来するタンパクの中から選択され、これらは必要に応じて無毒化されていてもよい。
【００２２】
本発明の第２の観点では、上記ポリペプチド(b)は間質組織（stroma tissulaire）内で局所的に異常に放出される循環タンパク(proteine circulante)に対して液性免疫反応を誘発する。
この第２の観点での上記免疫原性ポリペプチド(b)は(i)間質の局所循環タンパクおよび(ii)このタンパク(i)に由来するタンパクの中から選択され、必要に応じて無毒化されていてもよい。
【００２３】
細胞の病原性構造の構成成分で且つ間質中に放出される免疫原性または血管形生性のある種のタンパクを本発明の超免疫原複合体のポリペプチド(a)またはポリペプチド(b)として用いることができる。これはＨＩＶのＴａｔタンパク、ＨＰＶのＥ７タンパクおよび細胞調節因子ｐ５３の場合である。
【００２４】
下記ａ）〜ｃ)の超免疫原化合物を用いるのが好ましい：
ａ）抗ウイルスワクチン用
超免疫原複合体(a)gp160-(b)ＨＩＶ1のTatトキソイド；
超免疫原複合体(b)Tatペプチド[1-15；46-60]-(a) ＨＩＶ1のgp160；
超免疫原複合体(a) ＨＩＶ1のTatトキソイド-(b)IFNα；
超免疫原複合体(a)Tatトキソイド-(b) ＨＩＶ1のTatペプチド[1-15；46-60]
【００２５】
ｂ）抗ガンワクチン用
超免疫原複合体(a)L1-(b) HPVのE7;
超免疫原複合体(a)HPVのE7-(b)VEGF;
【００２６】
ｃ）抗アレルギーワクチン用
超免疫原複合体(a)Betv1a-(b)IL4ヘテロログ。
【００２７】
本発明ではポリペプチド(a)と(b)は互いに物理的に結合して、全ての場合に、単一坦体（carrier）上に免疫形の細胞と一緒に存在する。ポリペプチド(a)と(b)は同じ分子構造上に共有結合で結合されていてよい。
【００２８】
本発明ではポリペプチド(a)と(b)は例えば直径が10〜500ナノメートル、好ましくは10〜1000ナノメートル、最も好ましくは10〜100ナノメートルの単分子上で同一物理構造として互いに結合しており、例としては生分解性粒子[Baras達(1999)]のようなIMSナノ粒子、キトサン[Aucouturier達(2001)]、リポゾーム[Sjaugrud達(1999)]、ポリラクチド(PLA)、ポリ-ε-カプロラクタム（PCL）またはポリ(ラクチド-コグリコリド(PLG) [Baras達(1999)]等を挙げることができる。
【００２９】
本発明の第１の観点ではポリペプチド(a)と(b)が共結合で互いに直接されたものを用いる。
【００３０】
本発明の第２の観点ではポリペプチド(a)と(b)をペプチド性超免疫原を有するスペーサ鎖で互いに分離する。このスペーサ鎖は例えば直鎖スペーサペプチド、分岐鎖スペーサペプチドおよびＳＭＣＣまたはＳＩＡＢ等の二官能性スペーサ化合物で構成される。
【００３１】
本発明の第３の観点ではポリペプチド(a)と(b)をナノ粒子上に固定するか、微粒子またはナノ粒子中に埋め込む。ポリペプチド(a)と(b)を同じナノ粒子上に一緒に固定するか、同じナノ粒子中に埋め込むのが好ましい。
【００３２】
本発明はさらに、上記定義のポリペプチド(a)と(b)が互いに結合した２つの異なるポリペプチドから成る免疫原性ペプチド複合体（コンジュゲート、conjugate）に関するものである。
【００３３】
本発明はさらに、上記定義の複合超免疫原化合物をコードする核酸と、この核酸から成る発現カセットと、組換えベクターと、抗ガン作用、抗ウイルス作用または抗アレルギー作用を有する医薬を得るためのこれら核酸、発現カセットまたは組換えベクターの使用に関するものである。
【００３４】
本発明はさらに、上記定義の免疫原化合物を免疫学的に有効な量含む、生理的に許容される免疫賦活剤等の賦形剤と組み合わされた免疫原性組成物に関するものである。
【００３５】
アジュバントは使用目的に従って全身性または粘膜性のものを用いる。例えば粘膜性アジュバントは上皮組織のガンの予防に用いるのが好ましく、全身性アジュバントはＨＩＶ1およびＨＴＬＶ１等のウイルスによる感染の予防または治療、アレルギーの予防または治療に用いるのが好ましい。
【００３６】
全身性アジュバントの中では、ＩＦＡ（フロイドの不完全アジュバント）型のアジュバント、リン酸カルシウムまたは酸化アンチモンを用いるのが好ましい。
【００３７】
粘膜性アジュバントではコレラ毒（CTB）または不安定な大腸菌LTの毒素の変異体(LTμ)を用いるのが好ましい。
【００３８】
本発明はさらに、上記定義の免疫原化合物を有効成分として含み、生理的に許容される免疫賦活剤等の賦形剤と君合わされた粘膜性または全身性ワクチンに関するものである。
【００３９】
本発明の別の対象は、治療有効量の核酸、発現カセットまたは組換えベクターを含む粘膜または全身に用いられる免疫原性組成物およびワクチンにある。
【００４０】
［図１］は本発明の複合超免疫原性化合物を用いたワクチン開発戦略の一般的スキームを示すためのもので、［図1］の左側に示した矢印は抗ガン、抗ウイルスおよび抗アレルギー用ワクチン製剤が標的とする構造、すなわちガン細胞、ＨＩＶ感染細胞または花粉アレルギー原等の疾患を発現させる一次的病原体を有する病原性抗原構造を示している。
【００４１】
［図１］の右側に示した二重矢印は下記２つのタイプから成る本発明のワクチンが標的とする構造を示している：
（a）上記と同じ病原性抗原構造、
（b）ある種のガン、重篤なウイルス感染またはアレルギー症状に見られる免疫性または血管性組織間質障害に関与する間質ミクロ環境での循環タンパク因子。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明者は、ＶＩＨ−１のようなある種のウイルスに感染した細胞のミクロ環境およびガン細胞のミクロ環境での免疫抑制および血管新生の研究から、従来のワクチン戦略（ミクロ環境の破壊ではなくて、主としてガン細胞を標的とした戦略）のワクチンは有効性に欠けるということの合理的な説明ができるということを見出した。
【００４３】
本発明者の研究から、VIH-1感染細胞、特にTatタンパクまたはVIH感染患者の免疫細胞、特にIFN-αおよびTGF-βから分泌される可溶性因子またはガン細胞、例えば子宮頚部のガンに見られるHPVのE7タンパクまたはATL白血病のHTLV1のTaxタンパクが産生する可溶性因子は感染組織または腫瘍での細胞免疫反応を抑制する免疫抑制性があり、このことからガン細胞、VIH感染細胞等の病原性抗原構造が有する免疫原を主として用いる従来のワクチンには有効性が無いということが説明できる。
【００４４】
本発明者のこの考えは悪性腫瘍の細胞外媒体中に放出された免疫抑制因子の存在を確認した文献の研究によって裏付けられる。
上記のある種因子（まだ同定されていない）は下記によって産生される：
１）結腸直腸ガン細胞
【非特許文献２】
Ebert EC, Robert Al, O'Connell SM, Robertson FM, Nagase H.，J. Immune ol. (1987)138.2161-8，「結腸ガン細胞由来の免疫抑制因子の特徴付け」、
【００４５】
【非特許文献３】
Remacle-Bonn, Pommier FJ, Kaplanski S, Rance RJ, Depieds RC.，J. Immunol.(1976)117：1O145-51，「ヒト結腸ガンから抽出した可溶性抑制剤による正常な同種リンパ細胞の有糸分裂誘発の抑制」
【００４６】
２）膠芽細胞
【非特許文献５】
29-Fontana A, Hengartner H, de Tribolet N, Weber E.，J. Immunol.(1984)132：1837-44），「膠芽細胞放出インターロイキン１とインターロイキン２介在効果を抑制する因子」、
【００４７】
３）黒色腫
【非特許文献６】
30．Hersey P. Bindon, Cherniecki M, Spurling A, Wass J, McCarthy WH.，J. Immunol.(1983)131：2837-42), 「腫瘍細胞から放出される因子によるインターロイキン２産生の抑制」、
【００４８】
４）悪性の腹水
【非特許文献７】
Tamura K, Shibata Y, Matsuda Y, Ishida N，Cancer Res.(1981)41:3244-52,「ガン患者の腹水からの免疫抑制性の酸性タンパクの分離および特徴付け」
【００４９】
【非特許文献８】
Oh SK, Moolten FL., J. Immunol (1981) 127:2300-7、「悪性の腹水の非特異的な免疫抑制因子: 特性とヒト末梢神経のT細胞の赤血球受容体との関係」、「悪性の腹水の非特異的な免疫抑制因子: 特性とヒト末梢神経の赤血球受容体との関係」、
【００５０】
上記の転写調節因子はある種の悪性腫瘍、特に結腸直腸中に蓄積したp53タンパクのような細胞から生じる：
【非特許文献９】
Remvikos Y. Tominaga O, Hammel P, Laurent-Puig P, Salmon RJ, Dutrillaux B, Thomas G、Br J. Cancer 1992 66:758-64, Gan H, Ouyang Q, Wang Y、「結腸直腸腫瘍のp53タンパク含有量の増加は生存率の低下と相関」
【００５１】
【非特許文献１０】
Chung Hua Chung Liu Tsa Chih (1996)、「結直腸癌のp53タンパクの発現と細胞増殖活性および予後への関係」
【００５２】
シグナルペプチドを用いない分泌経路によるか、受動拡散による活性輸送で放出されるp53タンパクは細胞外媒体中に存在し、癌性患者の血清からガラス繊維のクロマトグラフィによって単離された。
【００５３】
【非特許文献１１】
Zusman I, Sandier B, Gurevich P, zusman R, Smirnoff P, Tendler Y, Bass D, Shani A, ldeievich E, Pfefferman R, Davidovich B, Huszar M, Glick J. Hum Antibodies Hybridomas. (1996): 123-8,「p53の血清レベルの役割の比較検討と大腸癌検出でのその腫瘍濃度テスト」
【００５４】
【非特許文献１２】
SandIer B, Smirnoff P, Tendeir Y, Zinder O, Zusman R, Zusman I，Int J. Moi. Med. 1998 1:767-70,「ヒト血清からの可溶性p53テストの単離のためのポリクローン坑p53 lgGの特異性」
【００５５】
免疫抑制薬TGFβのようなサイトカイン、血管成長因子VEGF、プロインフラマトリ（proinflammatoriy）IL-6またはLlOも免疫抑制薬で、ある種の癌細胞の細胞外培地で異常分泌され、放出される。、本出願人はSIHA癌株からの細胞、前立腺癌細胞からのDU145および白血病株からのMT2細胞が細胞外培地でVEGFおよび／または1L6のようなサイトカインを異常産生し、放出することを示した。白血病株のRAJI細胞はILIOの細胞外倍地で分泌する。
【００５６】
本発明は、ある種の癌、ウィルス感染およびアレルギー、特に重度のアナフィラキシーショックアレルギーの予防または治療のためには下記の両方に対して免疫反応を同時に誘発することが重要であることを示したものである：
（a）  疾患の一次的な原因作因である抗原性、病原性、細胞、微生物または粒状構造、および
（b）  疾患に関連する免疫性または血管の組織間質外乱の原因とろなる間質の局所循環タンパク。
【００５７】
本発明では、上記定義の免疫反応が本発明の複合超免疫原とよばれる化合物を使用することによって高い刺激作用レベルで免疫系細胞に誘導される。この複合超免疫原は病原抗原構造に対して免疫反応を誘発する第1のポリペチドと、間質の局所循環タンパクに対して免疫反応を誘発する第２のポリペチドとから成る互いに物理的に結合した二官能性化合物である。
【００５８】
「間質（ストローマ）」とは、所定組織の細胞のミクロ環境を表す細胞間空間を意味する。肝組織の場合には肝細胞のコルドンを取り囲んだ間質は両方の免疫細胞（リンパ球TおよびB、抗原またはAPC）の栄養培地（リンパともよばれる）、多核細胞（polynuclears）、肥満細胞、繊維芽細胞および血管内皮細胞が並んでいる毛細血管を含む。粘膜または皮膚上皮組織の場合には、副上皮の間質（真皮とよばれる）がマトリックスである結合組織に固定した細胞間空間から成る。ここでは免疫系および毛細血管の細胞が循環する。
【００５９】
ある種の癌を予防または治療するために本発明の複合超免疫原は下記を同時に誘導する：
（a）  Ｔ補助細胞（ＴヘルパーまたはＴｈ細胞）の活性化および／または癌細胞によって発現される病原抗原構造、例えばＴＭまたはＴＳＡ腫瘍の抗原に特異なＴ細胞障害能細胞（ＣＴＬ）の生産、癌細胞を殺すいわゆる「ナチュラルキラー」または「ＮＫ」細胞の生産による細胞免疫反応。
（b）  異常に生じる間質循環タンパク、主として免疫毒性または血管性を有するタンパクを中和またはブロックする特異抗体の生産の誘導による液性免疫反応。
【００６０】
ある種のウィルス感染の予防または治療では、必要な場合には癌の発達と関連して本発明複合体超免疫原が下記を同時に誘導する：
（a）  補助Ｔ細胞の活性化および／またはHIVIまたは乳頭腫ウイルスタンパクのようなウィルス感染細胞が発現するウイルスの病原抗原構造の細胞障害性Ｔ細胞（CTL）の生産、ウィルス感染細胞を選択的に殺す「ナチュラルキラー」「NK」とよばれるキラー細胞の生産を誘導する細胞免疫反応、
（b）  ウイルス循環タンパクまたはサイトカインを含む異常に生じる間質循環タンパク、主として免疫抑制またはアポトジェニック（毒性）および血管性を有するタンパクを中和またはブロックする特異抗体の生産の誘導による液性免疫反応。
【００６１】
本発明者はさらに、VIHIウィルスまたはHTLVIウイルス感染の場合の免疫毒性の観察データと、下記文献に報告された花粉、ダニまたは寄生生物、例えばLeishmania majorの粒子構造の免疫時にlL4 サイトカイン因子の異常生産で生じる免疫反応のズレの観察データとの関係を検討期した。
【非特許文献１３】
Sadick et al. 1990, J. Exp. Med., jfl: 115-127
【００６２】
アレルギー、特に重症アレルギーの予防または治療では、本発明の複合超免疫原は以下を同時に有する誘導する：
（a）  助剤Ｔ細胞の活性化によるによる細胞免疫反応と、アレルギー粒子を構成するアレルギー病原構造の特異抗体の誘導による液性免疫反応、
（b）  異常に生じる間質循環タンパク、主としたTh2型Ｔリンパ球によって合成される1L4 サイトカイン因子を中和またはブロックする特異抗体の生産の誘導による液性免疫反応。lL4の過剰生産はＢリンパ球による免疫グロブリンE生産の共同刺激であり、免疫毒性で、アレルギー煽動的型の病原免疫応答を誘発する。
【００６３】
本発明の対象は、物理的に互いに結合した下記の２つの別個の免疫原ポリペチドから成る複合超免疫原の使用にある：
(a)  不活性または生きた細胞、微生物、粒状病原抗原構造に対して細胞免疫反応または細胞／液性免疫反応を誘導する第１の免疫原ポリペチド、
(b)  サイトカイン因子または免疫毒性または血管形生性（angiogenique）を有する細胞調節因子の中から選択される間質の局所循環タンパク（proteine circulante local du stroma）に対して中性またはブロックする抗体の産生を誘発する第２の免疫原性ポリペプチド、上記の因子はガン細胞、ウイルス感染細胞またはリンパＴ細胞を含む間質細胞 (cellules stromales) および抗原を有する細胞（APC）によって産生されるか、病原性粒子構造、特にアレルギー性粒子によって誘発される。
本発明で使われる複合超免疫原の２つのポリペチド(a)および（b）は「二価官能性」とよばれ、その２つの主用部分は２つの別個の標的すなわち病原抗原構造および間質局部循環タンパクに対する免疫反応を同時に誘導する。しかし、本発明の二価官能性複合体超免疫原はその構造中にポリペチド(a)および／またはポリペチド（b）の複数のコピーを含んでいてもよい。
【００６４】
本発明の複合超免疫原の２つのポリペチド(a)およびポリペチド（b）は「物理的に結合」されている。これは両方が同じ物理構造、分子、粒子（ミクロ粒子またはナノ粒子）中でで同時に誘導される。これらの内部では互いにある程度離れている。複合超免疫原の２つのポリペチド(a)およびポリペチド（b）は物理的に互いに結合し、同じ免疫細胞、免疫応答細胞、マクロファージおよびTまたはＢリンパ球と一緒に存在する。
【００６５】
「細胞」免疫反応とは以下の活性化を意味する：
1）  主組織適合コンプレックス（ＣＭＨ）のクラスＩＩの抗原と組み合わせたポリペチド (a) またはポリペチド（b）を認識するリセプタを有する補助的Ｔリンパ球（Th）、または
2）  ＭＨＣ（場合によってはＮＫ細胞）のクラスＩＩの抗原と組み合わせたポリペチド(a)を認識する抗原リセプタを有するＴリンパ球（ＣＴＬ）
【００６６】
細胞反応は脾細胞によるチェモキン（chemokins）（MIP1αおよびMlPlβ）の生産か、この種の免疫原の存在下での活性脾細胞の増殖か、または、この種の細胞、例えば細胞毒のT活性によるIFNγの生産の増加をハツカネズミでインビトロに測定できる。
【００６７】
「液性」免疫反応とは複合超免疫原を形成するポリペチド(a)またはポリペチド（b）に特異な抗体の生産を意味する。
【００６８】
「細胞、微生物または粒状病原抗原構造」とは以下を意味する：
（1）  抗原（「腫瘍抗原」とよぶことができる）を選択的に発現し、細胞免疫反応、好ましいくは癌細胞に選択的に担持された抗原を認識する細胞障害細胞（CTL）、または、ＮＫ細胞によって殺すことができるする癌細胞、または
（2）  ウイルスの抗原を選択的に発現し、細胞免疫反応、好ましくは特に感染細胞によって選択的に節減される抗原を認識する細胞障害能細胞（CTL）、または、活性なＮＫ細胞で殺すことができるウィルス感染細胞、または、
（3）  アレルギー発生抗原に対する抗体（この抗体は液体免疫反応時に作られる）によってブロックまたは不活性化できるアレルギー抗原から成るアレルギー粒子。このアレルギー粒子は生きているアレルギー粒子、例えばダニ、Leishmaniaメジャーのような寄生生物、非活性アレルギー粒子、例えばダスト、ネコの毛および花粉。
【００６９】
間質中に異常に放出される「免疫毒性を有する」タンパクは以下を含む：
（1）  HIV1のTatタンパク、乳頭腫ウイルスのE7タンパク、αインターフェロン（lFNα）、TGFC3またはlLlO、p53タンパクの循環形またはFasリガンドアポプトジェニックなサイトカイン（Fasl）のような免疫抑制特性を有するタンパク、
（2）  有害作用へ免疫反応を逸脱させるタンパク、例えばアナフィラキシーショック形の強い炎症有害物、肥満細胞によるヒスタミンを放出させるＩgEアイソ抗体の生産を刺激する1L4 サイトカイン因子。
【００７０】
「血管性（angiogenic）を有する」タンパクとは血管内皮細胞、例えばVEGFサイトカイン因子の増殖を誘発しているタンパクを意味する。癌細胞の腫瘍の場合、腫瘍を局部的に囲んだ間質の血管性を有するタンパクの放出によって「新生血管形成（neoangiogenen）」とよばれる血管内皮細胞のある種の増殖を誘発し、腫瘍を形成する癌細胞の生育および増殖に必要な栄養を腫瘍の血管系へ供給し、腫瘍は生き残る。
【００７１】
「粘膜」免疫性とは上皮組織に局在するＢリンパ球が作るＩｇＡアイソトープ抗体（分泌型ＩｇＡ抗体（s-lgA）とよばれる）の産成を誘導する液性細胞免疫反応の誘導と、粘膜（腸間膜の神経節、膣の腸骨神経節）から水を抜く神経節内の細胞免疫反応の誘導をいう。
【００７２】
「全身」免疫性とは全身に循環する、特にセリック（seric）経路を介して順間する主としてlgGアイソトープ抗体の生産を誘導する液性反応と、末梢神経節または脾臓内の細胞免疫反応を意味する。
【００７３】
本発明は上記定義の各種の複合超免疫原化合物が示すインビボでの免疫応答レベルは、各ポリペチド(a)および（b）を互いに物理的に結合させずに投与した場合の免疫応答よりもはるかに高いということを証明している。
【００７４】
本発明者は、本発明ではポリペチド(a)が複合超免疫原内に補助的Tエピトープをもたらし、それが「ヘルパー」効果を刺激し、ポリペチド（b）に対する液性免疫反応を活性化し、増加させると考える。しかし、この理論に拘束されるものではない。免疫原ポリペチド(a)の上記の補助的作用は、ポリペチド（b）が自己由来のサイトカイン因子、例えばヒトへの投与用に設計された複合免疫原中のヒト1L4である場合にポリペチド（b）に対する抗体の産成を誘導するために特に必要である。
【００７５】
不活化したgp160−Tat ペプチドコンジュゲート共役（トキソイド）をインビボでが投与した場合の天然のTatタンパクに対するlgG型抗体の産成は不活化したTatタンパク（トキソイド）をフリーな形で投与した場合に比べて2倍以上に高くなることが本発明によって明らかにされた。さらに、gpl6O-Tat複合超免疫原（トキソイド）に誘導される生産力を有する抗体は天然のTatタンパクの活性を100%中性化できる。これに対して、Tatタンパク（トキソイド）をフリーな形で投与した場合に抗体がTatタンパクの活性を中和できるのは最高で75%であることがかん観察されている。
【００７６】
動物の脾細胞にgpl 60−Tat複合超免疫原（トキソイド）を免疫した実施例の結果から、動物をTat(トキソイド)で免疫した動物細胞よりも高いMIP1α、MIP1βケミオキン（chemiokins）レベルが産成されることが示され、免疫細胞の最適刺激作用が本発明の複合超免疫原によって得られることが示された。
【００７７】
gpl6O-Tat複合超免疫原（トキソイド）で免疫した動物の脾細胞はインビトロで天然のTatタンパクで活性化した時に多量のインターフェロン−γを産成する。
【００７８】
同様な結果は本発明の他の複合超免疫原、例えばE7-SIAB-VEGFコンジュゲートやBetvla-1L4コンジュゲートでも得られ。
【００７９】
従って、上記定義の複合超免疫原を使用することによって、少なくともある種の症例では、各々のポリペチド(a)、（b）を別々に使用した時、さらにはポリペチド(a)と（b）を互いに結合させずに使用した時よりもよりよい（potentialize）治療効果が観察される。その理由は少なくとも以下の２つである：
【００８０】
(i)  免疫抑制、免疫細胞のアポプトーシスまたは血管内皮細胞の増殖が減少または同時遮断されるために生じる腫瘍細胞またはウィルス感染細胞が発現する抗原に対する細胞または液性型（場合によって異なる）の有効な免疫応答の誘導、または、1L4によって誘導されるＩgE抗体の産成へのアイソタイプのスイッチの減少または遮断によるアレルゲンに対する有害でない有効な免疫応答、
(ii)   gpl 60−Tat複合超免疫原（トキソイド）のの場合見られるように、免疫系の細胞へ新しい補助的部位を送る第２の免疫原ポリペチドが同時に存在することによって、多くの症例で、ペプチドコンジュゲート中に存在する免疫性ポリペチドの一つに対する免疫応答が良くなる（potentialization）ことが観察された。
【００８１】
一部のガンと一部のウイルス感染症の治療に用いられる超免疫原複合体
本発明で用いられる複合超免疫原の第１の主要な特徴は、免疫原性ポリペプチド(a)を(i)ガン細胞によって選択的に発現した免疫原性タンパク、ウイルス感染細胞によって選択的に発現した免疫原性タンパクまたはアレルギー性病原構造を構成するタンパクと、(ii)これらのタンパク(i)に由来するタンパクの中から選択することである。これらは必要に応じて無毒化されていてもよい。
【００８２】
本発明で用いられる複合超免疫原の第２の主要な特徴は、免疫原性ポリペプチド(b)を (i)間質の局所循環タンパクと(ii)タンパク(i)由来のタンパクの中から選択することにある。これらは必要に応じて無毒化されていてもよい。
ガン細胞により選択的に発現した免疫原性タンパク、ウイルス感染細胞により選択的に発現した免疫原性タンパクまたはアレルギー性病原構造を構成するタンパクが「毒性」、「免疫毒性」である場合または間質の局所循環タンパクが「毒性」、「免疫毒性」である場合でも、予めその毒性、例えば免疫毒性を減らしたり、ブロックしたりしなくても、そのタンパク自体が本発明の複合超免疫原のポリペプチド(a)またはポリペプチド(b)に含まれることはない。免疫原性は維持される。
【００８３】
ヒトまたは動物に投与した時にヒトまたは動物の健康に重篤な有害作用を引き起こす（例えば防御免疫反応を麻痺または逸脱させる免疫毒性を誘発する）場合にはその免疫原性タンパクは一次的に「毒性」である。
ヒトまたは動物に投与した時に下記作用の1つを引き起こす場合、その免疫原性タンパクは一次的に「免疫毒性」である:
１）ＨＩＶ1のTatタンパク、パピローマウイルスのE7、IFN痾、TGF竈または IL10 サイトカイン因子またはp53 細胞調節因子の場合のように、免疫細胞の細胞死を含む間質中を循環する免疫抑制;
２）IL4の場合のように、液性免疫反応の逸脱、例えばIgEの産生に関与するBリンパ細胞のアイソタイプのスイッチ(「スイッチ」)
【００８４】
こうした一次的に毒性である免疫原性は、例えば免疫毒性のタンパクを修正、特に物理的修正、化学的修正または遺伝子工学の技術を用いた修正によって無毒化することができる。この点については以下で詳細に説明する。
ポリペプチド(a)および/またはポリペプチド(b)の無毒化方法、特に化学的方法を一次的に毒性または免疫毒性ではないタンパクから生成されるポリペプチド(a)またはポリペプチド(b)に行なうこともできる。この処理によってより優れたワクチン保存のためポリペプチドを安定させることができる。
【００８５】
トキソイドや、抗テタヌスワクチンまたは抗ジフテリアワクチンから得られる無毒化化毒素と同様に、無毒化化したタンパクはその免疫原性を保持し、下記を誘発する能力を保持できる。
１）病原性抗原構造に対する細胞性または細胞性および液性の免疫反応（無毒化化したタンパクをガン細胞により選択的に発現した免疫原性タンパク、ウイルス感染細胞により選択的に発現した免疫原性タンパクまたはアレルギー性病原構造を構成するタンパクから生成する場合）;
２）例えば上記定義の間質の局所循環タンパクに対する液性免疫反応（無毒化化したタンパクを間質の局所循環タンパクから生成する場合）。
【００８６】
標的となる病原性抗原構造内に含まれる免疫原性タンパクまたは標的となる間質の局所循環タンパクに《由来》または《由来する》とは、免疫原性ポリペプチド(a) または (b) が最初の免疫原性タンパクに含まれるペプチド断片から作られること、またはポリペプチド(a) または (b)が本明細書でさらに説明される最初の免疫原性タンパクのアミノ酸配列の1つまたはそれ以上ののアミノ酸の置換、欠失または付加を含むことを意味する。どのような場合でも最初の免疫原性タンパクに《由来する》ポリペプチド(a) または (b)は、標的となる病原性抗原構造または標的となる間質の局所循環タンパクに対する免疫反応を誘発する性質を維持する。最初の免疫原性タンパクが《毒性》の場合、そのタンパクに由来するポリペプチド(a) または (b)の毒性は減少するか、失われ、タンパクは最初の免疫原性タンパクの非毒性断片になるか、毒性が減少またはブロックした最初の免疫原性タンパクのアミノ酸配列を修飾したアミノ酸を含む。
【００８７】
一部のガンまたは一部のウイルス感染症の予防または治療に用いられる本発明で複合超免疫原の第一実施例では、複合超免疫原がポリペプチド(a)が特にガン細胞またはウイルス感染細胞によって発現される抗原に対する細胞免疫反応を誘発する特徴を有している。
《細胞免疫反応の誘発》とは、超免疫原複合体構造内のポリペプチド(a)が有効な免疫反応を開始するのに有用であり、ガン細胞またはウイルス感染細胞の場合、特にガン細胞またはウイルス感染細胞の表面に主要組織適合複合体(MHC)のクラス1抗原の形で見られる標的となる病原性抗原構造、例えば液性抗原またはウイルス抗体を認識する細胞毒性細胞(CTL)または好ましくはガン細胞を破壊するNKキラー細胞のいずれかの産生に関与しているということを意味する。
【００８８】
免疫原性ポリペプチド(a)に誘発される細胞免疫反応は、免疫原性ポリペプチド(b)をベースとする液性反応の誘発を促進または可能にし、特に間質循環タンパクを標的とする補助的Ｔ細胞（《Ｔヘルパー》)を活性化する。これはポリペプチド(a)に対する液性免疫反応が誘発されないという意味ではない。ガンおよびウイルス感染の場合のポリペプチド(a)に対する液性反応の誘発は細胞免疫反応と同時に生じる場合には重要ではない。
【００８９】
子宮頸ガンのガン細胞またはＨＩＶ感染細胞またはＡＴＬ白血病細胞によって発現された抗原をそれぞれ(i)パピローマウイルスのL1、L2およびE7タンパク、(ii) ＨＩＶ-1ウイルスのGp160、p24、pl7、NefおよびTatタンパク、(iii) Taxタンパク、(iv) HTLV1またはHTLV2ウイルスのgp61タンパクまたはgagタンパク、或いはすなわち、これらのタンパクに由来するタンパクから選択するのが好ましい。これらは必要に応じて無毒化化されていてもよい。
ポリペプチド(a)をＨＩＶ1の免疫原性タンパク、前記タンパクの免疫原性断片またはそのタンパクに由来するタンパクから選択するのが好ましい。
【００９０】
最初の免疫原性ポリペプチド(a)は(i)パピローマウイルスのL1、L2およびE7タンパク、(ii) ＨＩＶ-1ウイルスのGp160、p24、pl7、NefおよびTatタンパク、(iii) HTLV1または免疫反応を誘発するHTLV2ウイルスのTaxタンパクまたはそのタンパクに由来するタンパクから選択するのが好ましい。これらは必要に応じて無毒化化されていてもよい。
病原性抗原構造に対して免疫反応を誘発する場合にはポリペプチド(a)自体に病原性タンパクが含まれていてもよい。
【００９１】
上記の病原性タンパクの一部、例えばＨＩＶ1ウイルスのTatタンパク、パピローマウイルスのE7タンパクまたはHTLV1ウイルスのTaxタンパクには免疫毒性があるため、それ自体を複合超免疫原のポリペプチド(a)としては用いない。
この場合、ポリペプチド(a)を初期の免疫毒性の無い(i)不活性化した状態の、例えば無毒化化した病原性タンパク、(ii)病原性タンパクの不活性断片および(iii) 突然変異遺伝子（genetic 突然変異体）等に由来する病原性タンパク由来のタンパクまたはこのようなタンパクの断片から選択するのが好ましい。
上記ポリペプチド(a)の各種製造方法をさらに詳細に説明する。
【００９２】
ポリペプチド(a)とポリペプチド(b)は下記a)〜g)の中から選択するのが好ましい:
a)  AIDSの予防または治療用
ポリペプチド(a):  ＨＩＶ-1ウイルスのGp160、p24、pl7、NefまたはTatタンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク(Zagury 他、1998)。これらは必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい;
ポリペプチド(b):  Tat、IFN痾、およびTGF竈タンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク。これらは必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい;
【００９３】
b)  子宮頸ガンの予防または治療用
ポリペプチド(aパピローマウイルス、好ましくは16または18菌株のパピローマウイルスのL1、L2およびE7タンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク(Le Buanec 他、1999)。これらは必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい;
ポリペプチド(b):  E7、IFN痾、TGF竈、TNF痾またはVEGFタンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク;
【００９４】
c)  HTLV1またはHTLV2ウイルスに誘発されるATL白血病の予防または治療用;
ポリペプチド(a):  HTLV1またはHTLV2ウイルスのgp61およびTaxタンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク(Cowan 他、1997 ; Mori 他、1996)。これらは必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい;
ポリペプチド(b):  Tax、IL10、IFN痾またはTGF竈タンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク。これらは必要に応じて無毒化されていてもよい;
【００９５】
d)  大腸ガンの予防または治療用
ポリペプチド(a):  CEAおよびp53タンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク(Zusman 他、1996)。これらは必要に応じて無毒化されていてもよい;
ポリペプチド(b):   TGF竈、IL10、p53、FasL and VEGFタンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク。これらは必要に応じて無毒化されていてもよい;
【００９６】
e)  乳ガンの予防または治療用
ポリペプチド(a): Di12タンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク(Yoshiji 他、1996);
ポリペプチド(b):  TGF竈、TNFαおよびVEGFタンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク。これらは必要に応じて無毒化されていてもよい;
【００９７】
f)  膵臓ガン予防または治療用
ポリペプチド(a):  CaSm タンパク、このタンパクの免疫原性断片またはタンパクに由来する免疫原性タンパク。これらは必要に応じて無毒化されていてもよい;
ポリペプチド(b):  タンパクVEGFおよび TNF痾タンパク。前記タンパクの免疫原性断片または免疫原性タンパクはそのタンパクに由来する。これらは必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい;
【００９８】
g)  前立腺ガンの予防または治療
ポリペプチド(a):  OSAおよびETS2タンパク。前記タンパクの免疫原性断片または免疫原性タンパクはそのタンパクに由来する(Sementchenko Vl 他、1998) 。これらは必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい;
ポリペプチド(b):  IL6およびTGF竈タンパク、前記タンパクの免疫原性断片またはそのタンパクに由来する免疫原性タンパク(Adler 他、1999。これらは必要に応じて無毒化または安定化されていてもよい。
その他のガンの予防または治療にも免疫原性ポリペプチド(a)としてTSA抗原 (《腫瘍特異性抗原型》)またはTAA抗原(《腫瘍関連抗原》)、タンパクの免疫原性断片またはこのタンパクに由来する免疫原性タンパクを用いることができる。
Gp160、Tat、Taxおよびp53タンパクの天然型は毒性である。この毒性のタンパクから免疫原性ポリペプチド(a)を製造する場合には、必ずこれらのタンパクを無毒化化するか、毒性のタンパクから非毒性免疫原性ペプチド断片またはそのタンパクに由来する非毒性タンパクを例えば未変性タンパク配列の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加によって製造しなければならない。
【００９９】
IFN痾、Tat、TGF竈、E7、Tax、p53および FasLタンパクの天然型は高濃度で免疫毒性である。免疫毒性タンパクから免疫原性ポリペプチド(b)を製造する場合には必ずこれらのタンパクを無毒化化するか、免疫毒性タンパクから非毒性免疫原性ペプチド断片またはそのタンパクに由来する非毒性タンパクを例えば未変性タンパク配列の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加によって製造しなければならない。天然型または化学的処理、好ましくはタンパクの無毒化に用いられるタイプの化学的処理によって安定化した形の複合超免疫原を構成するポリペプチド(b)としてVEGF免疫原性タンパクを用いることもできる。
【０１００】
上記に挙げた免疫原性ポリペプチド(b)は免疫毒性または血管形成性のサイトカイン因子または細胞調節因子で構成され、下記の特徴を有する。
1）  TGF竈タンパク:  TGF竈は多くのガン細胞によって産生される主要な免疫抑制サイトカインである;
2）  IL10 タンパク:  このIL 10はFasL(Fas配意子)であると同時に主要な免疫抑制サイトカインである;
【０１０１】
3）  p53タンパク:  ガン細胞によって不正に産生されたp53調節タンパクは、従来技術に示されるように腫瘍関連抗原(TAA)である。p53タンパクが異常細胞から放出され、間質の細胞外区画に蓄積すると、間質の免疫抑制因子およびapotogenic因子(免疫毒性)が免疫細胞すなわち免疫毒性の間質循環タンパクに作用する。本発明ではポリペプチド(b)として無毒化化したp53タンパクまたはそのタンパクに由来するタンパクを含む複合超免疫原によって液性免疫反応を誘発することが求められ、最初のタンパクの免疫毒性は失われている。
4）  VEGF、内皮細胞の成長因子:  VEGFサイトカインは内皮細胞の増殖を活性化する血管形成の主要なサイトカインである;
5）  IL6、I'IFN繃およびTNF痾、炎症誘発性サイトカインも内皮細胞の粘着分子(ICAM、VCAMおよびEセレクチン)の発現を活性化し、血管形成プロセスに関与する。
【０１０２】
本発明の複合超免疫原を構成するポリペプチド(b)によって誘発される液性免疫反応によってポリペプチド(a)の特異免疫反応は効率が良くなり、:
(i)  産生された一部の間質の局所的循環タンパク、例えばIFNチまたはTatタンパクの免疫抑制性(免疫毒性)が中和またはブロックされるか、
(ii)  異常に産生された一部の間質循環タンパク、例えば p53 細胞調節因子によって誘発される免疫細胞に対するapoptogenic特性(免疫毒性) が中和またはブロックされるか、
(iii) 異常に産生された一部の間質循環タンパク、例えばVEGFによって誘発される腫瘍の新血管形成を含む血管形成が中和またはブロックされる。
【０１０３】
一部のガンと一部のウイルス感染症の予防または治療に有用な超免疫原複合体の第１の好ましいグループは以下の超免疫原複合体から成る:
1）  複合超免疫原 (a) Gp160 - (b) トキソイドTat;
2）  複合超免疫原 (b) Tatペプチド [1-15 ;46-60] - (a) Gp160;
3）  複合超免疫原 (a) トキソイドTat  - (b) IFN畚och;
4）  複合超免疫原 (a) トキソイドTat  - (b) Tatペプチド [1-1 5 ;46-60]
超免疫原複合体の第２の好ましいグループは以下の超免疫原複合体から成る:
5）  複合超免疫原 (a) L1 - (b) E7;
6）  複合超免疫原 (a) E7 - (b) VEGF;
【０１０４】
上記の《(a)》はポリペプチド(a)、《(b)》はポリペプチド(b)を示す。上記の超免疫原複合体の構造は左から右、NH2-末端領域からCOOH-末端領域へ進む。
複合超免疫原：(a) Gp160 - (b) トキソイドTatでは、Gp160タンパクがVIH1感染細胞に対する細胞免疫反応を誘発する。この免疫反応はIFN痾、免疫抑制サイトカイン因子を産生させることで知られているＨＩＶ1のTatタンパクの免疫毒性を中和またはブロックする抗体を誘発することによって容易になる。
【０１０５】
複合超免疫原：(a) L1 - (b) E7では、HPVのL1タンパクがガン性の可能性があるHPV感染細胞に対して細胞免疫反応を誘発する。この免疫反応はHPVのE7タンパクの免疫毒性を中和またはブロックする抗体を誘発することによって容易になる。
E7タンパクは子宮頸ガンのガン細胞によって発現されるため病原性抗原構造を認識する細胞毒性T細胞またはNK細胞の標的となり、無毒化化したE7タンパクまたはE7タンパク由来のタンパクのいずれかの形で複合超免疫原のポリペプチド(a) にも用いることができる。その免疫毒性は失われている。
複合超免疫原：・・・・・・・・・・・・・・・・・・ではE7タンパクがガン性の可能性があるHPV感染細胞に対して細胞免疫反応を誘発する。VEGFサイトカイン因子の血管形成性を中和またはブロックする抗体が誘発されるため、前記免疫反応がより有効になる。
【０１０６】
アレルギーの予防または治療に用いられる超免疫原複合体
アレルギーの予防または治療に用いられる複合超免疫原では、ポリペプチド(a)が粒状病原性抗原構造（例えば花粉、ダニ、塵またはネコの毛）を構成するアレルギー性病原性タンパクに対して液性免疫反応を誘発する。
アレルギー性病原性タンパクは当業者に公知のBetv1a、Der p 1およびFel d 1タンパクの中から選択するのが好ましい。
ポリペプチド(a)はBetv1a、Der p 1およびFel d 1タンパク、その免疫原性ペプチド断片またはそのタンパクに由来する免疫原性タンパクから選択するのが好ましい。
Betv1抗原はFerreira達によって開示され(1993)、Der p 1抗原はTovey達によって開示され (1981)、Fel d 1抗原はMorgenstern 達によって開示されている (1991) 。
【０１０７】
複合超免疫原のポリペプチド(b)はIL4サイトカイン因子に対して中和またはブロックする抗体の産生を誘発する。IL4サイトカイン因子はIgE イソタイプ抗体の産生に対する液性免疫反応を誘導するTh2型のリンパT細胞によって一次的に産生される。
ポリペプチド(b)は化学的、物理的または遺伝子学的処理によって無毒化化した自家性IL4タンパク、このタンパクの免疫原性ペプチド断片またはこのタンパクに由来するタンパクにするのが好ましい。
他の実施例ではポリペプチド(b)はTh2型のリンパ細胞Tによって一次的に産生されるIL5サイトカイン因子に対して中和またはブロックする抗体を誘発する。
【０１０８】
第２実施例では、ポリペプチド(b)を好ましくは無毒化化した自家性IL5タンパク、このタンパクの免疫原性ペプチド断片またはこのタンパクに由来するタンパクにする。
複合超免疫原：  (a) Betv1a - (b) IL4 (マウス)では、Betv1a タンパクがIgGまたはIgA isotope 抗体、好ましくは分泌性IgAの産生によって液性、全身性または粘膜性免疫反応アレルギー性の病原性抗原構造に対する液性、全身性または粘膜性免疫反応を誘発する。IL4タンパクは、原因となるアレルゲンに対する有効な免疫反応を誘発しながら、アレルギー症状の初期においてIgE抗体産生を誘導するアイソタイプのスイッチを抑制またはブロックさせるサイトカイン因子に対する免疫反応を誘発する。自家性タンパクであるIL4に対する液性免疫反応は、複合超免疫原を構成するポリペプチド(a)とIL4で誘導されるＢ細胞の液性免疫反応に必要な補助的Ｔ細胞の活性を誘発する補助的Ｔエピトープから成るポリペプチド(a)とが同時に存在することによって可能になる。
【０１０９】
《補助的Ｔエピトープ》は、補助的Ｔリンパ細胞の少なくとも1つのクローンの抗原によって選択的に認識される免疫原性ポリペプチドの一領域であり、Ｔリンパ細胞クローンを活性化するエピトープの領域を特異的に認識するＴリンパ細胞の受容体に免疫原性ポリペプチドの事象を結合する。Ｔリンパ細胞クローンは次第に増殖し、IL2等のサイトカインを産性する。サイトカインもまた、本発明の複合超免疫原におけるIL4と同様自家性タンパクに対する液性免疫反応を含む液性免疫反応を発現させる。
【０１１０】
本発明の複合超免疫原を構成するポリペプチド(a)またはポリペプチド(b)の無毒化化による免疫抑制性またはapoptogenic特性の不活性化
既に説明した通り、本発明で用いられる複合超免疫原は毒性があってはならず、特にその成分の１つ、より具体的にはポリペプチド(a)またはポリペプチド(b)に固有の特性のために標的となる免疫系の反応を抑制または逸脱させてはならない。
【０１１１】
従って、ポリペプチド(a)が一次的に免疫毒性のポリペプチド(a)である場合、ポリペプチド(a)は本発明の複合超免疫原に入れる前にまず不活性にしなければならない。
同様に、本発明の免疫原性ペプチドコンジュゲートを構成するポリペプチド(b)が免疫毒性（免疫抑制性、アポプトジエニック（apoptogenic）特性、免疫反応を逸脱させる反応、例えば補助的Ｔ細胞《Ｔヘルパー》の反応をIL4の場合と同様にTh2型細胞の産性に向ける特性）を有するサイトカインまたは細胞調節因子である場合には、その特性のため、本発明の複合超免疫原に入れる前にまずこれを不活性にしなければならない。
【０１１２】
一つまたは複数の有害なポリペプチド(a)および/または(b)を未変性の形ではなく物理的、化学的および／または遺伝子学的に修飾された形(不活性であるが免疫原性である)か、それ以上免疫毒性作用を発揮しないか、未変性タンパクの免疫反応を逸脱させない適切な生薬状態（galenic form）で、その免疫原性を維持しながら用いることが重要である。
逆に、非免疫毒性のポリペプチド(a)またはポリペプチド(b)、例えばVEGFは未変性の状態または安定化処理後の修飾された形で用いることもできる。
【０１１３】
物理的処理は熱、紫外線、X線またはO2に豊んだ空気との接触によって実施できる。化学部分[化学的moieties](例えばチオール基)で分子内修飾を産生する物理的処理によって、その免疫原性を維持しながら分子の高次構造を適切に変性したり、機能的に不活性にすることができる。
化学的処理はジアルデヒド等のカップリング剤、またはジアルデヒド、好ましくはグルタルアルデヒドを用いた前処理によって活性化した担体タンパクを用いて実施される。モノアルデヒド、特にホルムアルデヒドを用いて化学的処理が行われる。この課題については下記特許文献に記載の教示が参照される。
【特許文献２】
国際特許出願第WO-A-96/27389号公報
【０１１４】
化学的処理はカルボキシメチル化またはカルボキサミド化等の他の方法を用いて実施される。カルボキシメチル化方法の一実施例は下記文献に記載されている。
【特許文献３】
国際特許出願WO-A-99/33872号公報
【０１１５】
グルタルアルデヒド化と関連性があってもなくても、化学的処理をＮエチルマレイミド化によって実施することもできる。
不活性方法としてタンパクの少なくとも１つのチオール基と、アンモニウム4-クロロ-7-スルホベンゾフラザン、N-[ヨードエチル]-トリフルオロアセトアミドまたはN-(6-[7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセトアミド]ヘキシル)-3'-(2'-ピリジルジチオ)-プロピオンアミドとの反応、およびタンパクの少なくとも１つのアミノ基と、エチルアセチミダート、無水物、２-イミノソラン塩酸（iminotholane hydrochlorate）、N-コハク酸イミジル S-アセチルチオ酢酸、スルホスクシンイミジル酢酸、スルホスクシンイミジル-4-0-[4,4-ジメトキシトリチル]ブチレート、スクシンイミジル 7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセテート、スルホスクシンイミジル 7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセテートまたはフェニオグリオキサールとの反応が挙げられる。
【０１１６】
油性液体、例えばフロイドの不完全アジュバント内でガレヌス製剤を用いて免疫原を不活化することもできる。またその毒性作用に必要な共有結合(静電力、ファンデルワース力、または水素結合)をそうでないものに変えることもできる。
遺伝子修飾（genetic modification）は残基の挿入、欠失または置換を実施する遺伝子工学によって実施できる。操作は未変性の分子の有害な機能部位を減少または抑制するように設計されている。突然変異遺伝子（genetic 突然変異体）に相補的な化学的処理および/または物理的処理を施すことができる。
【０１１７】
上記の修飾されたタンパクは例えば免疫病原性タンパクのペプチド配列と同一または同様の配列を有するタンパク、特に免疫抑制性または血管形成性のタンパクから製造することができる。このタンパクは例えばVIH-1 Tatタンパク、パピローマウイルスのE7タンパクまたはHTLV1 Taxタンパクまたはこれらのタンパクの断片にすることができ、例えば従来の樹脂上でのペプチド合成または遺伝子工学によって得ることができる。これらの方法は全て公知である。不活性で免疫原性のある突然変異体はその産生をコードする少なくとも１つのDNA分子である。これらのDNA分子は本発明で特に重要である。
【０１１８】
本発明によって免疫毒性および/または血管形成性の未変性タンパクが上記の修飾タンパク（処理によって無毒化化または安定化した）またはその修飾または非修飾断片に抗体によって適切に認識されるかどうかを確認するために、例えばELISA法によって、固有の抗体の存在下で免疫学的に抗原-抗体複合体の形成を確認できる。
アルデヒド、カルボキサミド、カルボキシメチルまたはマレイミドで処理された変性化合物(タンパクまたはポリペプチド断片)に由来する免疫原性化合物にするのが好ましい。
【０１１９】
未変性タンパクの作用をブロックする抗体を製造するに免疫毒性および／または血管形成性の修飾タンパクまたはこうしたタンパクの断片の免疫原性が十分に維持されているかどうか(すなわち未変性のまま不活性化されているかどうか)を調べるために、例えば本発明の免疫原性化合物を用いて哺乳類(ウサギ、ラット、マウス)を免疫化し、産生された抗体がタンパクの免疫抑制性、アポプトジェニック（apoptogenic）特性または血管形成性中和するかどうかを確認する。
修飾された免疫毒性タンパクまたは断片から少なくとも望ましい割合の免疫毒性が失われているかどうかを測定するには、例えばTh2 (lL4)およびThl(IFNY)サイトカインの産生および／または追加抗原、例えばPPDまたは破傷風トキソイド抗原等で刺激されたヒト末梢血(PBMC)の単核細胞の培養液の免疫抑制に対する修飾タンパクの作用を調べることができる。
【０１２０】
修飾された血管形成性の免疫毒性の(免疫抑制性またはapoptogenicまたは免疫反応の逸脱を促す)または血管形成性のタンパクは任意のタンパク、特にAIDS患者の感染細胞から形成される腫瘍細胞によって誘発される局所活性の免疫毒性タンパクに由来する。特にVIH-1 ウイルスのTatタンパク、パピローマウイルスのE7タンパクまたはHTLV1ウイルスのTaxタンパクが挙げられる。また活性化された免疫細胞から産生されたマンナン依存性のレクチンも挙げられる。血管形成性を有するVEGFと免疫毒性を有し、免疫反応をTh2反応の方へ逸脱させるL4も挙げられる。
【０１２１】
既に説明した通り、本発明の複合超免疫原のポリペプチド(a)またはポリペプチド(b)は、標的となる病原性抗原構造を構成する最初の免疫原性タンパクの断片またはこの免疫原性タンパクのアミノ酸が修飾されたポリペプチドから成る。
修飾が上記定義の関係(毒性の非存在、免疫学的特性)内にとどまる程度にタンパクまたはその断片の一つまたは複数の修飾、例えば欠失、置換、付加または官能化、例えばアミノ酸のアシル化を行なうことができる。例えば一般に、イソロイシン残基によるロイシンの置換はこのような性質を修飾しない;修飾は一般に40％以下のアミノ酸、好ましくは20％以下、さらに好ましくは10％以下の免疫病原性、特に免疫毒性または血管形成性のタンパクであるべきである。例えば加熱等の物理的処理を用いると生じる可能性があるが、修飾タンパクまたは断片は変性しないようにしないようにして、高次構造の領域を保持し、修飾された誘導体によって誘発された抗体が未変性タンパクに対して活性になるようにする。
【０１２２】
好ましい条件では本発明の免疫原性化合物は全体または一部の免疫病原性のタンパク、特に免疫毒性または血管形成性のタンパクの少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、特に少なくとも90％、特にタンパクの全てまたはほとんど全てを構成する。
一般に修飾された免疫原と未変性タンパクまたは未変性タンパクの一部との間の相同性または類似性、並びに免疫原性ポリペプチドの寸法、さらには本発明の複合超免疫原を構成する免疫原性ポリペプチドの使用または免疫原性タンパク、例えば破傷風トキソイドに対する結合に関しては下記文献を参照できる。これらの文献は同じもので、その内容は本明細書の一部を成す。
【特許文献４】
国際特許第WO−Ａ−86/06 414号公報
【特許文献５】
欧州特許出願第EP−Ａ−0,220,273号公報
【特許文献６】
PCT/US第86/00831号
【０１２３】
上記定義の通り、好ましい免疫原性化合物は、遺伝子組み換えによってＨＩＶ1のTatタンパク、HTLV1のTaxタンパクまたはL2およびHPVのE7タンパクまたは活性化された免疫細胞によって産生されたマンナン依存性のレクチンまたはこれらのタンパクの一部と少なくとも70％のペプチド相同性を有する生成物である。
【０１２４】
上記定義の通り、好ましい免疫原性化合物はカルボキサミド、カルボキシメチルまたはマレイミド等のアルデヒドで処理する。
上記定義の通り、好ましい免疫原性化合物は生物学的に不活性にさせるアジュバントの調節によって、例えば油性乳剤をフロイドの不完全アジュバント(IFA)に入れて特徴付けられる。
また所望の免疫原性化合物を相同の突然変異体から得ることができる。
【０１２５】
物理的に活性のタンパクをガレヌス状にすると、その免疫原性を維持しながら生物学的活性を隠すことができる。
カルボキシメチル反応によりアミノ酸配列のシステイン残基の位置でチオール基 (スルフヒドリル基)を修飾することができる。 当業者に周知の方法であるカルボキシメチル化は、Frankel他(Cell, vol. 55 ,1988)により開示されたTatタンパクに関する方法に従ってSH基依存性の一部の毒性機能を不活性化する。
【０１２６】
カルボキシメチル化し、カルボキサミド化またはマレイミド化をしてSH基をブロックし、S-カルボキシエチル、S-カルボキサミドまたはS-マレイミド複合体にすることもできる。
例えばTatタンパクは７つのシステインを有する。これらのシステインは、鎖間および鎖内におけるジスルフィド架橋の形成に関与し、オリゴマーの産生に寄与している。
反応生成物はそれぞれ、S-カルボキシメチルシステイニルまたはS-カルボキシメチルアミドシステイニル残基である。
【０１２７】
1つの断片には例えば8〜110個のアミノ酸、好ましくは12〜60個のアミノ酸、特に12〜40個のアミノ酸が含むことができる。このような断片には１つまたはそれ以上のＣ末端側またはＮ末端側に１〜５個のさらなるアミノ酸が含まれることもある。すなわち元の断片とは異なる。少なくとも例えばカルボキシメチル化を受けるに、1つの断片にさらに1つのシステインが含まれる必要がある。断片自体を不活性化する場合には、その断片に必要に応じて同じタンパクの全体またはほぼ全体と同じ不活性処理を施す必要がある。
【０１２８】
他の化学物質、例えば過ギ酸、3-ブロモピオン酸、エチレンイミン、(2-ブロモエチル)トリメチルアンモニウムブロミド、2-ブロモエタンスルホネート、 1,3-プロパンスルホネート等を用いて上記のカルボキシメチル反応を行なうこともできる。
上記プロセスの好ましい実施条件では出発タンパクまたは出発断片には、マーカーと融合したタンプ(FP)か非融合タンプ(P)がある。FP型はそれ自体が分子の高次構造を修飾し、これによりその活性を修正することができる。
この方法の出発タンパクまたは断片は周知の物質であり、その不活性化方法は下記特許文献に記載されている。
【特許文献７】
国際特許第WO-A-99/33872号公報
【０１２９】
出発タンパクは市販されている(immunodiagnostics Inc., Cat # I 002-2)か、従来法で生成できる。
特に、上記の出発タンパクまたは断片は下記方法によって生成できる:
1)  遺伝子工学または生化学合成による合成;
2)  精製。
遺伝子工学を用いると、例えばタンパクまたはその断片に対して生じた抗体を用いたアフィニティによって産生したタンパクを精製できる。また、アフィニティカラムに付着させる役割をするマーカーと融合したタンパク(FP)を合成することもできる。
【０１３０】
本発明の複合超免疫原の好ましい実施例
本発明の複合超免疫原を製造するためにポリペプチド(a)とポリペプチド(b)とを化学的手段または遺伝子組み換えによって結合する。
本発明の好ましいペプチドコンジュゲートの実施例では、ポリペプチド(a)および(b)をその免疫毒性を不活性化し、および/または、カルボキサミド化、カルボキシメチル化、マレイミド化または酸素バブリングによる酸化で安定化する。
別の観点では、ポリペプチド(a)および(b)は、遺伝子組み換えによってその免疫毒性または血管形成性が不活性化されると、ポリペプチドも不活性化される。
【０１３１】
本発明の免疫原性ペプチドコンジュゲートの一実施例では、ポリペプチド(a)および(b)が例えば-CO-NH-ペプチド結合によって互いに直接的に共有結合している。
しかし、免疫原性ペプチドコンジュゲートの構造に柔軟性を与え、特に免疫原性ペプチドコンジュゲート内で互いに関連するポリペプチド(a)および(b)の空間を免疫原性ペプチドコンジュゲート内である程度可動にするために、ポリペプチド(a)および(b)が互いにコンジュゲート内でスペーサ鎖によって分離したペプチドコンジュゲートにするのが好ましい。
【０１３２】
本発明の免疫原性ペプチドコンジュゲートの第1の好ましい実施例では、ポリペプチド(a)および(b)は前記コンジュゲート内で共に二官能性化合物であるＳＭＣＣまたはＳＩＡＢの中から選択されるスペーサ鎖によって互いに分離している。
ＳＩＡＢ化合物は下記文献に記載される下記式(I)で表される化合物である：
【非特許文献１４】
Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego: Academic Press, pp 239-242):
【０１３３】
【化１】
2005502647.tif 000002
【０１３４】
ＳＩＡＢ化合物は２つの活性基、ヨード酢酸基とエステルスルホ-NHS基から成り、これらの基はそれぞれアミノ基およびスルフヒドリル基に対して反応する。
ＳＭＣＣ化合物は下記文献に開示された下記式(II)で表される化合物である:
【非特許文献１９】
Samoszuk M.K. 他 (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm.,2（1）: 37-46)
【０１３５】
【化２】
2005502647.tif 000003
【０１３６】
ＳＭＣＣ化合物２つの活性基、それぞれエステルスルホ-NHS基とマレイミド基から成り、それぞれアミノ基とスルフヒドリル基と反応する。
第２の好ましい実施例では、複合超免疫原が直鎖のスペーサペプチド内にあるスペーサ鎖から成る。直鎖のスペーサペプチドは3〜30アミノ酸長、有利には5〜20アミノ酸長、最も好ましくは7 〜15アミノ酸長である。
直鎖のスペーサペプチドは、複合超免疫原全体の親水性を増加させるためにpH 7.0で正または負に荷電したアミノ酸から成るのが好ましい。疎水性アミノ酸から成るスペーサペプチドは避けなければならないことは理解できよう。スペーサペプチドはポリ(リジン)鎖を３〜30個のリジン残基、より好ましくは5〜20個、最も好ましくは7〜1 5個のリジン残基長にするのが好ましい。
【０１３７】
本発明の複合超免疫原の別の実施例では、ポリペプチド(a)および(b)はペプチドコンジュゲートの所でスペーサペプチド、好ましくはBasak達(1995)が開示したポリ(リジン)のオリゴデンドリマー(oligodendrimeric)構造から成るスペーサ鎖によって互いに分離されているのが好ましい。
本発明の複合超免疫原のこの実施例では、１つのコンジュゲート分子につき複数のポリペプチド(a)および(b)のコピー、有利には２〜８つのポリペプチド(a)および(b)のコピー、好ましくは１つのコンジュゲート分子につきポリペプチド(a)および(b)のそれぞれのコピーを最大４つ含まれる。
【０１３８】
ポリペプチド(a)および(b)は例えば直径が約10〜500ナノメートル、好ましくは10〜1000ナノメートル、最も好ましくは10〜100ナノメートルの単一粒子、例えばIMSナノ粒子（例えばAucouturier達、2001）、 例えばキトサン[Aucouturier達、2001]、リポゾーム[Sjaugrud達、1999]またはポリラクチド(PLA)、ポリ-ε-カプロラクタム（PCL）またはポリ(ラクチド-コグリコリド(PLG)等の生分解性粒子[Baras達、1999]等のIMSナノ粒子上の単一の物理構造上に単一の物理構造として両者が一緒に含まれることができる。
【０１３９】
さらに別の実施例では、ポリペプチド(a)および(b)は単一の担体構造内で物理的に結合され、ポリペプチドが免疫系の細胞に同時に現れる。この実施例では、ポリペプチド(a)と(b) がナノ粒子、例えば直径が約100〜300ナノメートルのリピッドナノ粒子から成るキトサンナノ粒子、IMSナノ粒子(France、Societe Seppic Corporation社から市販の修飾因子)またはリポゾーム上に固定される。
【０１４０】
このようなナノ粒子の寸法を小さくして、２つのポリペプチドが単一分子と共有結合されてポリペプチド(a)および(b)が同時に細胞に現れるのが好ましい。有利にはナノ粒子の直径を約10〜1000 nm、好ましくは10 〜500 nm、より好ましくは10 〜300 nm 、最も好ましくは10〜200nmにする。
上記定義の免疫原性ペプチドコンジュゲートは主としてAIDS、ガンおよびアレルギーの治療に用いられている。
【０１４１】
本発明の別の対象は、下記（a）、(b)で構成される互いに物理的に結合した２つの異なる免疫原性ポリペプチドから成る複合超免疫原化合物にある：
(a)  不活性細胞または活性な細胞、微生物または粒子状の病原性抗原構造に対して細胞免疫反応または細胞／液性免疫反応を誘発する第１の免疫原性ポリペプチド；
(b)  免疫毒性または血管形生性を有するサイトカイン因子または細胞調節因子[因子はガン細胞、ウイルス感染細胞またはリンパＴ細胞および抗原を有する細胞（APC）を含む間質細胞によって産生されるか、病原性（アレルギー性を含む）の粒子構造によって誘発される]の中から選択される間質の局所循環タンパクに対して中和またはブロックする抗体の産生を誘発する第２の免疫原性ポリペプチド。
【０１４２】
複合超免疫原の詳細な特徴は既に上記で説明し、当業者は本願明細書を参照することができる。
本発明の第１の好ましい実施例では免疫原性ペプチドコンジュゲートがGp160 -トキソイドTatコンジュゲートである。
本発明の第２の好ましい実施例ではペプチドコンジュゲートがトキソイドTat-IFN痾コンジュゲートである。
本発明の第３の好ましい実施例では免疫原性ペプチドコンジュゲートがE7-SIAB-VEGFである。
本発明の第４の好ましい実施例では免疫原性ペプチドコンジュゲートがBetV1a-SIAB-II-4である。
【０１４３】
本発明の複合超免疫原をコードする核酸の使用
本発明の別の対象は、本発明の複合超免疫原化合物すなわち主として直接または直鎖ペプチドスペーサ鎖を介して互いに結合したポリペプチド(a)および(b)から成る単一の直鎖のペプチド鎖のペプチド超免疫原をコードする核酸にある。
【０１４４】
本発明の別の対象は、哺乳類、好ましくはヒトの官能性調節ポリヌクレオチドの制御下にある哺乳類、好ましくはヒトの上記核酸から成る発現カセットにある。
本発明の別の対象は、本発明の複合超免疫原を哺乳類、好ましくはヒトに発現させることができる上記核酸または発現カセットから成る組み換えベクターにある。
【０１４５】
本発明の別の対象は、上記定義の核酸、発現カセットまたは組み換えベクターを用いて抗ガン作用、抗ウイルス作用または抗アレルギー作用を有する薬剤を作ることにある。
一般に、ＤＮＡ（プロモータを有するプラスミド）は裸のＤＮＡの形て、例えばカチオンリポゾーム状て、金粒子の周りに密集した状態て、小型球形状に調製して粘膜表面に送ることができる。これをアジュバント、特に細菌性毒素、例えばCTB(コレラ毒)またはLT(不安定な大腸菌エンテロトキシン)、適当に変異させた(LTμ)等の存在下で用いるのが有利である。ＤＮＡ分子をベースとするワクチンを用いたこの種の粘膜性免疫方法は下記文献に記載されている
【非特許文献１５】
「Microbes and Infection」, 1999, 685-698 by McCluskie et al.
【０１４６】
本発明の有利な実施例では、本発明の組換えベクターは下記要素から成る：
(1)  複合超免疫原、例えばプロモータや促進配列("エンハンサー")をコードする核酸を発現させる調節因子;
(2)  複合超免疫原をコードする核酸に含まれるコード化配列で前記ベクターに挿入されるもの。このコード化配列は(1)に記載の調節信号とフェーズをそろえて位置している；
(3)  転写の開始および停止配列。
【０１４７】
本発明の組み換えベクターは１つまたは複数の複製開始点が宿主細胞内にあり、その増幅または発現がマーカーまたは選択マーカーである。
本発明の組換えベクターはレトロウイルスまたはＤＮＡ関連ベクター(AAV)にすることもできる。ＤＮＡ関連ベクター例えばFlotte 達（1992）、Samulski達(1989)およびMcLaughlin BA 達(1996)によって開示されている。
ポリヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞に導入する方法は当業者に種々知られている。例えばリン酸カルシウム沈降法(Graham 他、1973; Chen達、1987)、デキストランDEAE(Gopal, 1985)、電気穿孔法(Tur-Kaspa, 1896 ; Potter達、1984)、 直接的な微量注入(Harland達、1985)、DNA搭載リポゾーム(Nicolau達、1982, Fraley達、1979).
【０１４８】
本発明の一実施例では、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞、特に哺乳類の宿主細胞にin vivoで導入する。この導入段階では医薬として許容される適当なベクターと本発明の「裸」のポリヌクレオチドとからなる調節物が選択された組織、例えば平滑筋組織の位置で局部注射で適当な調節配列の制御下に導入される。「裸」のポリヌクレオチドは組織の細胞に吸収される。
in vitro および in vivoで用いられる"裸"のポリヌクレオチドから成る組成物は例えば下記特許文献およびによる文献（Tacson達、1996）やHuygen 達、1996）に記載されている。
【特許文献８】
国際特許出願第95/11307号
【０１４９】
ヒトの２型また５型アデノウイルス等のアデノウイルスベクターにすることもできる。
選択される宿主生物に注射されるベクターの量は注射部位によって異なる。指標としては動物、好ましくは患者の体内で複合超免疫原をコードするポリヌクレオチドを約10〜1,000μm注射する。
【０１５０】
複合超免疫原またはこれをコードする核酸から成る免疫原性組成物またはワクチン組成物
本発明の他の対象は、超免疫原複合体を有効成分とし、それに上記定義の１種または複数の生理学的に許容される賦形剤を組み合わせた免疫原性組成物にある。本発明は、有効量の免疫学的に活性な上記超免疫原複合体を含む免疫原性組成物に関するものである。
【０１５１】
この対象では全身性または粘膜性のアジュバントを用いる。例えば粘膜性アジュバントは上皮組織のガンの予防に用いるのが好ましく、全身性アジュバントはＨＩＶ1およびＨＴＬＶ１等のウイルスによる感染の予防または治療、アレルギーの予防または治療に用いるのが好ましい。
全身性アジュバントの中ではIFA型のアジュバント（フロイドの不完全アジュバント）、リン酸カルシウムまたは酸化アンチモンを用いるのが好ましい。
粘膜性アジュバントではコレラ毒（CTB）または不安定な大腸菌LTの毒素の変異体(LTμ)を用いるのが好ましい。
【０１５２】
本発明はさらに、上記定義の複合超免疫原を有効成分として含み、生理学的に許容される免疫賦活剤のような賦形剤を1種または複数含む粘膜性または全身性ワクチンに関するものである。
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは例えば治癒およびウイルス誘発性のガン、例えばHTLV1により引き起こされるATL (急性Ｔ細胞白血病)またはパピローマウイルスにより引き起こされる子宮頚ガン、ヘルペス族のウイルスにより引き起こされるバーキットリンパ腫またはカポジ肉腫の治療を含むガン治療、AIDSの治療およびアレルギー性炎症反応の予防または治療に有用である。
【０１５３】
本発明の複合超免疫原は下記のように用いられる:
全身投与または粘膜投与用に調整された本発明の複合超免疫原化合物またはDNA分子を患者に、例えば鼻腔内に、治療を必要としている患者の治療有効量に十分な量投与する。投与量は、例えば10〜100Oμgを鼻腔内に１週間に１度で２ヶ月間投与し、次に、誘発される分泌性抗体の量によって例えば2-6 ヵ月置きに投与する。
１つの単分子が全ての過剰に産生された毒素または中和されるべきサイトカインを担持しない場合、２種または複数の複合超免疫原性分子および／またはDNA分子を１回分の単一製剤として投与して有害な全ての官能部位を中和する抗体を誘発することもできる。
【０１５４】
本発明の他の対象は、上記免疫原性ペプチドコンジュゲートまたはDNA分子の少なくとも１つを有効成分として含む粘膜性医薬組成物にある。
医薬として用いる場合、本発明の免疫原性ペプチドコンジュゲートまたはDNA分子を口腔粘膜投与、特に鼻腔内投与または膣内投与を含む全身投与または粘膜投与用に設計された製剤中に組み込むことができる。投与は単一投与でも、一定期間の後にもう１回または複数回繰返して投与してもよい。
【０１５５】
本発明はさらに、治癒または予防用の医薬組成物に関するものである。この医薬組成物は有効成分として克服すべき未変性タンパクに対応する1つまたは複数の上記超免疫原複合体またはその断片またはDNA分子を含む。免疫原性化合物、DNA断片または分子は単独または賦形剤または薬剤で許容される賦形剤、例えばアジュバントとの混合物して調整される。鼻腔内用または経口用に設計される賦形剤としては特にGATTEFOSSE CorporationからLabrasol(登録商標)の名称で市販のカプリルカプロイルマクロゴルグリセリドまたは水酸化アルミナ (Alhydragel, Superfos, Denmark)が挙げられる。
【０１５６】
従来の経口剤として投与する場合、本発明の主成分を不活性にする。
本発明で経口投与する場合には主成分がCT、LTまたはCTB 突然変異体等のアジュバントと組み合わせる。
下記文献(Institut Pasteur, Inserm, Ottawa University)に記載のガレヌス形の製剤を挙げることもできる。
【特許文献９】
国際特許出願第95/11307号
【非特許文献１６】
Boyaka達、Am. J. Trop. Med. Hyg. 60(4),1999, pages 35-45. 「粘膜性ワクチン開発の戦略」
【０１５７】
さらに、下記文献に記載のバイオ接着剤を含む胃液耐性の（gastro resistant）微粒剤にすることもできる。
【非特許文献１７】
Rojas 達、Pharmaceutical Research、vol. 16, no. 2, 1999, page 255
【０１５８】
特定の条件下では、CT突然変異体(コレラ毒)またはLT突然変異体(不安定な大腸菌エンテロトキシン)等の粘膜性免疫アジュバントを含むワクチン製剤が挙げられる。
他の特定の条件下では、水酸化アルミナまたは金粒子等の主成分を吸収するアジュバントを含むことワクチン製剤が挙げられる。
さらに他の好ましい条下では、遺伝子組換えによって免疫原性ペプチドコンジュゲートが得られる製剤が挙げられる。
【０１５９】
さらに他の好ましい条件下では、ペプチドコンジュゲートを構成するポリペプチド(a)および／またはポリペプチド(b)がアルデヒド化、カルボキシメチル化、カルボキサミド化またはマレイミド化された製剤が挙げられる。
本発明のさらに別の対象は、主成分を周知方法で賦形剤（必要に応じてさらに全身性または粘膜免疫アジュバント）と一緒に混合する医薬組成物の製造方法にある。
好ましい実施条件下では、バイオ接着性の胃液耐性微粒剤を免疫原性主成分を含む経口消化経路用製剤（必要に応じてさらにアジュバントを含むことができる）に調製する。
【０１６０】
本発明の他の対象は、本発明の上記複合超免疫原をコードする核酸の治療有効量と、この核酸を含む発現カセットまたは核酸または発現カセットから成る組換えベクターとを含む免疫原性組成物にある。
本発明はさらに、治療有効量の核酸と、発現カセットまたは組換えベクターとから成るワクチンに関するものである。
【実施例】
【０１６１】
複合超免疫原の調整
実施例1
[gp160-トキソイドTat]コンジュゲートの製造
このコンジュゲートは、ワクチン内にgpl60を発現する感染細胞に対して起こる細胞反応(chemiokins; 補助的T細胞, CTL)と細胞外Tatタンパクに対して産生される抗体反応とを主として誘導できる複合ワクチンの有効成分である。
【０１６２】
１mlのPBSで溶解した810μgのgpl60タンパクを透析で活性化した。この活性化は上記タンパクをPBSで溶解した0.2％のグルタルアルデヒド溶液100mlに対して一晩透析した後、100mlのPBSに対してそれぞれ２時間の透析を３回連続して行い、過剰なグルタルアルデヒドを除去して行なった。
１mlのgpl60を活性化するために1mlあたり1.55mlのトキソイドTat溶液を522μl(すなわち810μgのトキソイドTat)添加した。この混合物を4℃で一晩混合してから、2.5Mのグリシン溶液を50μl加えて反応をブロックした。最後に反応混合物を排除クロマトグラフィで精製した。Tatタンパクおよびgpl60タンパクに対する製剤の抗原性は個々に同定されるタンパクのそれぞれの抗原性に対応する。
実施例２
【０１６３】
[トキソイドTat‐IFNα]コンジュゲートの製造
本実施例はTatタンパクを発現する感染細胞に対して引き起こされる細胞免疫反応(chemiokins; 補助的T細胞, CTL)と、IFNαに対して引き起こされる液性免疫反応を主として誘導できる複合ワクチンの製造に関するものである。このコンジュゲートは細胞外Tatタンパクに対して産生される抗体の形成も誘発できる。
還元したIFNαをSIABで活性化されたトキソイドTat分子との反応によって結合させた(cf.２参照)。
【０１６４】
1.トキソイドTat（Tx）の活性化
5mMのPBSと5mMのEDTA混合物3mlで溶解した5mgのTxを187μlのSIAB溶液(1.7 mg/ml)に加えた。実験室温度で1時間反応させた後、反応混合物をSephadex G25 カラム（0.1M-EDTA 5mMのホウ酸緩衝液で平衡化した、pH8.5）で濾過した。
【０１６５】
2. IFNαの還元
条件は実施例３と同じである。2.6mgの還元IFNαを回収した。
撹拌しながら5 mgのTx-SIABを2.6 mgの還元IFNαと混合し、実験室温度で１時間、次に４℃で一晩撹拌を続けた。Cysと5mMの最終濃度のHClを加えて反応をブロックし、３０分反応させた。
反応混合物を排除クロマトグラフィで精製した。トキソイドとIFNαの抗原性はコンジュゲート無しで維持できることが分かった。
実施例３
【０１６６】
[Tatペプチド  SIAB()‐Tat()]コンジュゲートの製造（1-15）（46-60）
本実施例はTatタンパクを発現する感染細胞に対して引き起こされる細胞免疫反応(chemiokins; 補助的T細胞, CTL)と、細胞外Tatタンパクに対して引き起こされる液性免疫反応を主として誘導することができる複合ワクチンの製造に関するものである。このコンジュゲートは細胞外Tatタンパクに対して産生される抗体の形成を誘発することもできる。
1.  TatペプチドのSIABによる活性化
600μlの水で溶解した各ペプチド（1‐15および46‐60）の混合物1.5mgを500μlのPBSで溶解したSIAB溶液 (1.7 mg/ml)を用い、実験室温度において1時間処理した。次に反応混合物をPBS緩衝液で平衡化したSephadex G25（1×15cmのカラム）で濾過した。
【０１６７】
2.  Tatタンパクの還元
Tatを2メルカプトエチルアミンで還元した(実施例3の条件を参照)。
3.  TatタンパクのTatペプチドへの結合
SIABで活性化した0.75mgのTatペプチドを1.25mgの還元Tatと混合し、混合物を実験室温度で45分撹拌し、4℃で一晩保存した。最終濃度が5mMのCys、HClを添加した反応をブロックしてから、較正された膜で濾過して混合物を精製した。コンジュゲート内のTatタンパクをカルボキサミド化して不活化した。
トキソイドTatと比較したペプチドTat-トキソイドTatコンジュゲートの抗原性を従来の非直接酵素免疫抗体法（ELISA）を用いて決定した。ペプチドTat-トキソイドTatコンジュゲートの抗原性はトキソイドTatタンパクの抗原性に等しい。
実施例４
【０１６８】
[E7-SIAB-VEGF]コンジュゲートの製造
このコンジュゲートは、ワクチン内にE7タンパクを発現する感染細胞に対して引き起こされる細胞反応(chemiokins;補助的T細胞, CTL)とVEGFタンパクに対して引き起こされる抗体反応とを主として誘導する複合ワクチンの有効成分である。このコンジュゲートは細胞外E7タンパクに対して産生される抗体の形成を誘発することもできる。
【０１６９】
1.  E7タンパクの活性化
1 mgの E7タンパクを20 ％のジオキサンを含む0.1M -EDTA 5 mMのホウ酸緩衝液1ml（pH8.5）に溶解した。この溶液に、同じ緩衝液に溶解した1.7 mg/ml のSIAB溶液400ミュウリットルを加えた。反応を実験室温度で１時間続け、反応混合物をホウ酸-EDTA-ジオキサン緩衝液で緩衝したSephadex G25カラム(1 x 1 6 cm) に投入し、タンパクに対応する画分を回収して、貯蔵した。
2.  VEGFタンパクの還元
実施例３に記載の条件で2-メルカプトエチルアミンとの反応によって還元が生じる。
【０１７０】
3.  還元VEGFのE7-SIABへの結合
1 mgの還元VEGFをスルホ-SIAB で活性化した1mgの E7と反応させる。実験室温度で1時間反応させた後、最終濃度が5mlのシステインを加えて反応をブロックし、固形のショ糖に対する拡散によって反応混合物を縮合した。最終的に縮合溶液を排除クロマトグラフィで精製した。E7とVEGFの抗原性はコンジュゲート内に維持される。
実施例５
【０１７１】
[Bet V 1a−SIAB−II-4(マウスの)]コンジュゲートの製造
このコンジュゲートは、Bet V I a カバノキ（bouleau）アレルゲンに対してもはやIgEではなくIgGクラスの抗体の形成への反応を配向するよう設計された複合ワクチンの有効成分を有する。
【０１７２】
1.  II-4の還元
250ミュウリットルの10 mMリン酸緩衝液（pH 7.2）+ I mM EDTA 2-メルカプトエチルアミンで溶解した1 mgのII-4 を実施例３の条件に従って還元し、 Sephadex G25上でゲル化して還元サイトカインを回収した。
2.  SIAB によるBet V 1aタンパクの活性化
500ミュウリットルの10 mM - EDTA 1 mMリン酸緩衝液に溶解した1 mgの Bet V 1aタンパクを1.7 mg/mlのスルホ-SIAB溶液80ミュウリットルで2時間、実験室温度で希釈した。反応混合物を排除クロマトグラフィで精製した。
【０１７３】
3.  還元IL4のBet V 1a-SIABへの結合
1 mgの還元IL4を0.5 mgの スルホ-SIABで活性化したBet V 1aと反応させた。実験室温度で1時間反応させた後、最終濃度が5mMのシステインを加えて反応をブロックし、固形のショ糖に対する拡散によって反応混合物を縮合した。最終的に縮合溶液を排除クロマトグラフィで精製した。IL4とBet V 1aの抗原性はコンジュゲート内に維持される。
超免疫原の免疫原性の活性度
実施例６
【０１７４】
gp160-トキソイドTatコンジュゲートの免疫原性
A.  材料と方法
gpl60-トキソイドTat製剤の免疫原性をトキソイドTat単独の免疫原性と比較し、18-20gのBalb c マウスに毒性の非存在を決定した。
【０１７５】
1．免疫化:
０日目に、３匹のマウスから成る一群に筋肉内経路で0.2 ml (50 μg)のACF乳剤を注射した。21日目および60日目に５μgのAIFを追加免疫注射した。
２日目、最初の注射の前に各マウスから球後部位の血液サンプルを取った。
３匹の対照マウスには免疫原無しの同じ製剤を与えた。
マウスは最後の免疫化から12日後に犠牲にした。
【０１７６】
2．毒性:
薬局方に従って、1ヒト投与量(100μg)を摂取した３匹のマウスの異常毒性を研究した。コンジュゲートの存在下で培養され、PPDまたはトキソイドTetanosに刺激されたPBMCSに対して実施した細胞増殖テストを用いて、超免疫原の免疫毒性の非存在をin vitroで評価した。
【０１７７】
B.  結果:
1．in vivoおよびin vitroで超免疫原は毒性無し
gp160-トキソイドTat製剤とトキソイドTat単独で免疫化したマウスは臨床的徴候および解剖学的創傷は全く示さない。
免疫抑制テストから、3 μg /mlのgpl60-トキソイドTatに100ng/ml投与量ではリンパ細胞の増殖が減少されないことが分かった。
100μgの製剤で免疫化した３匹のマウスは全て注射後7日間、毒性徴候(温度、皮膚異常、全身性または局所性の徴候)を全く示さない。
【０１７８】
2．液性反応
液性反応は自然Tat組換えタンパクに対して産生されたIgG型抗体の有無によって測定する。酵素免疫抗体法（ELISA）で測定し、滴定値(0.3以上の光学密度を示す稀釈度の逆数)で表す。
【０１７９】
【表１】
2005502647.tif 000004
【０１８０】
gpl60-トキソイドTat製剤で免疫化されたマウスはトキソイドTat単独で免疫化されたマウスよりIgG 抗-Tat型の抗体滴定値が高い。
この抗体の中和活性はCatアッセイによって測定された。d-2およびd-72で得られた種々の血清稀釈液(1/50- 1/400)を50 ng/mlの自然Tatを用いて2時間培養する。稀釈液をHeLa細胞上に戻す。細胞にはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)のプロモータとしてVIH-1のLTRを含むプラスミドが安定して形質移入されている。24時間培養した後細胞を溶解し、産生されるCATタンパクの量をELISAテスト、Catアッセイで測定する(Boehringer Mannheim)。中和血清はTatタンパクによるCATタンパク発現の誘発を防止し、逆に非中和血清はCATタンパクを合成させる。結果を中和率(％)で示す。
【０１８１】
【表２】
2005502647.tif 000005
【０１８２】
【表３】
2005502647.tif 000006
【０１８３】
Gpl60-トキソイドTatコンジュゲートで誘発される抗体はトキソイドTatに誘発される抗体より中和力が高い。
3.  細胞反応
3.1  脾細胞の培養上澄中におけるMP1αおよびMP1βの産生
免疫化したマウスと対照マウスの脾細胞を単離した後、100,000 cells/wellの速度のマイクロカルチャープレートの丸底ウェル(round-bottomed wells of a micro-culture plate)中で5μg/mlのp24、gpl60、自然Tatおよび5μg/mlのgpl60と5μg/mlの自然Tatの混合物と一緒に培養する。24時間培養した後上澄みを取り、上澄み中のMP1αおよびMP1βの有無をR&DのELISAテストで測定した。結果をμg/mlで示す。 .
【０１８４】
【表４】
2005502647.tif 000007
【０１８５】
【表５】
2005502647.tif 000008
【０１８６】
【表６】
2005502647.tif 000009
【０１８７】
gpl60-トキソイドTatコンジュゲートで免疫化したマウスの脾臓は、免疫化中に用いられる免疫原によってin vitroで活性化されると、トキソイドTat単独で免疫化したマウスの細胞より多くのMP1αおよびMP1βchemiokinsを産生する。
【０１８８】
3.2  脾臓の培養上澄中のガンマIFNの産生
5μg/mlのp24、gpl60、自然Tatおよび5μg/mlのgpl60と5μg/mlの自然Tatの混合物と共に72時間培養した後、脾臓の培養上澄中のガンマIFNの有無をR&DのELISAテストで測定した。結果をμg/mlで示す。
【０１８９】
【表７】
2005502647.tif 000010
【０１９０】
【表８】
2005502647.tif 000011
【０１９１】
【表９】
2005502647.tif 000012
【０１９２】
gpl60-トキソイドTat コンジュゲートで免疫化したマウスの脾臓は、免疫化中に用いられる免疫原によってin vitroで活性化されると多量のガンマIFNを産生する。
【０１９３】
3.3  免疫化したマウスの脾細胞（CMI）の増殖
免疫化したマウスと対照マウスの脾細胞を単離した後、100,000 cells/wellの速度のマイクロカルチャープレートの丸底ウェル(round-bottomed wells of a micro-culture plate)内で、5μg/mlのp24、gpl60、自然Tatおよび5μg/mlのgpl60と5μg/mlの自然Tatの混合物と共に培養する。55％のCO2を添加した37℃の湿った空気内で6日間、細胞の培養を続ける。培養終了18日前に、0.5μCiのトリチウム標識したチミジン／wellを加える。免疫反応強度は下記の増殖指数Ｉpに比例する。
Ｉp＝各抗原のcpm(毎分量)／対照cpm
【０１９４】
【表１０】
2005502647.tif 000013
【０１９５】
【表１１】
2005502647.tif 000014
【０１９６】
【表１２】
2005502647.tif 000015
【０１９７】
gpl60-トキソイドTat コンジュゲートで免疫化したマウスの脾臓は、免疫化中に用いられる免疫原によってin vitroで活性化されると増殖する。
実施例７
【０１９８】
[Tatペプチド（1-15；46-60）]SIAB-[トキソイドTat]コンジュゲートの免疫原性
A.  材料と方法
gpl60-トキソイドTat製剤の免疫原性を単独のトキソイドTatの免疫原性と比較し、18-20gのBalb c マウスに毒性が無いことを決定した。
B.  結果
【０１９９】
1．  超免疫原はin vivoおよびin vitroで毒性無し
Tatペプチド-トキソイドTat製剤とトキソイドTat単独で免疫化したマウスは臨床的徴候や解剖学的創傷は全く示さない。免疫抑制テストから、3μg/mlのペプチド-トキソイドTatに100ng/ml投与量ではリンパ細胞の増殖も減少しないことが分かった。
100μgの製剤で免疫化した３匹のマウスは全て注射後7日間、毒性徴候(温度、皮膚異常、全身性または局所性の徴候)を全く示さない。
【０２００】
2．液性反応 
液性反応は自然Tat組換えタンパクに対して産生されたIgG型抗体の有無によって測定した。酵素免疫抗体法（ELISA）で測定し、滴定値(0.3以上の光学密度を示す稀釈の逆数)で表す。
【０２０１】
【表１３】
2005502647.tif 000016
【０２０２】
Tatペプチド-トキソイドTatコンジュゲートで免疫化されたマウスはトキソイドTat単独で免疫化されたマウスよりIgG 抗-Tat型の抗体滴定値が高い。
この抗体の中和活性はCatアッセイによって測定した。結果を中和率(％)で示す。
【０２０３】
【表１４】
2005502647.tif 000017
【０２０４】
【表１５】
2005502647.tif 000018
【０２０５】
Tatペプチド-トキソイドTatコンジュゲートで誘導される抗体はトキソイドTatに誘発される抗体より中和力が高い。
実施例８
【０２０６】
E7-SIAB-VEGF コンジュゲートの免疫原性
A.  材料と方法
E7-SIAB-VEGF コンジュゲートの免疫原性をE7タンパクのVEGFの免疫原性と比較し、生後６週間の黒いC57 6 マウスで毒性が無いことを確認した。
B.  結果:
【０２０７】
1．in vivoおよびin vitroにおける超免疫原の毒性無し
E7-SIAB-VEGF製剤とE7タンパクまたはVEGFで免疫化したマウスは臨床的徴候や解剖学的創傷は全く示さない。免疫抑制テストから、3μg/mlのペプチド-トキソイドTatに100ng/ml投与量ではリンパ細胞の増殖を減少しないことが分かった。
100μgの製剤で免疫化した３匹のマウスは全て注射後７日間、毒性徴候(温度、皮膚異常、全身性または局所性の徴候)を全く示さない。
【０２０８】
2．液性反応
液性反応を自然Tat組換えタンパクに対して産生されたIgG型抗体の有無によって測定した。酵素免疫抗体法（ELISA）で測定し、滴定値(0.3以上の光学密度を示す稀釈の逆数)で表す。
【０２０９】
【表１６】
2005502647.tif 000019
【０２１０】
【表１７】
2005502647.tif 000020
【０２１１】
【表１８】
2005502647.tif 000021
【０２１２】
【表１９】
2005502647.tif 000022
【０２１３】
E7-SIAB-VEGFコンジュゲートで免疫化されたマウスはVEGF単独で免疫化されたマウスよりIgG 抗-VEGF型の抗体滴定値が高い。
3.  細胞反応
3.1 免疫化したマウスの脾細胞（CMI）の増殖
免疫化したマウスと対照マウスの脾細胞を単離した後、100,000 cells/wellの速度のマイクロカルチャープレートの丸底ウェル(round-bottomed wells of a micro-culture plate)内で自然Ｅ７と一緒に培養する。5％のCO2を添加した37℃の湿った空気内で6日間、細胞の培養を続ける。培養終了18時間前に、well１つにつき0.5μCiのチミジン/wellを加える。免疫反応の強度は下記の増殖指数lpに比例する。
Lp＝各抗原のcpm(毎分量)/対照cpm
【０２１４】
【表２０】
2005502647.tif 000023
【０２１５】
E7-SIAB-VEGFコンジュゲートで免疫化したマウスの脾細胞はE7タンパクを用いてin vitroで活性化すると増殖する。
実施例９
【０２１６】
Betv1a-SIAB-lL4（マウス）の免疫原性
A.  材料と方法
Betv1a-SIAB-lL4コンジュゲート（マウス）の免疫原性をBetv1aとlL4コンジュゲート（マウス）の免疫原性と比較し、実施例6に記載したプロトコルに従って18-20gcマウスに毒性が無いことを確認した。
【０２１７】
B.  結果:
1．超免疫原はin vivoおよびin vitroで毒性無し
Betv1a-SIAB-lL4コンジュゲートとIL4単独で免疫化したマウスは臨床的徴候や解剖学的創傷は全く示さない。免疫抑制テストから、3μg/mlのBetv1a-SIAB-lL4コンジュゲートに100ng/ml投与量ではリンパ細胞の増殖を減少しないことが分かった。
100μgの製剤で免疫化した３匹のマウスは全て注射後７日間、毒性徴候(温度、皮膚異常、全身性または局所性の徴候)を全く示さない。
【０２１８】
2．液性反応
液性反応は自然Tat組換えタンパクに対して産生されたIgG型抗体の有無によって測定する。酵素免疫抗体法（ELISA）で測定し、滴定値(0.3以上の光学密度を示す稀釈の逆数)で表す。
【０２１９】
【表２１】
2005502647.tif 000024
【０２２０】
【表２２】
2005502647.tif 000025
【０２２１】
【表２３】
2005502647.tif 000026
【０２２２】
Betv1a-SIAB-lL4コンジュゲートで免疫化されたマウスはIL4単独で免疫化されたマウスよりIgG 抗-VEGF型の抗体滴定値が高い。また、その坑Betv1a応答はBetv1a単独で免疫化てた場合と同じままであった。
【０２２３】
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【０２２４】
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【０２２５】
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【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】複合超免疫原性化合物を用いたワクチン開発戦略の一般的スキーム。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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