(57)【要約】本発明は、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つフィブリンナノ粒子を提供する。本発明は、フィブリンナノ粒子およびフィブリンマイクロビーズを包含する種々の大きさのフィブリン粒子を調製する方法も提供する。本発明は更に、フィブリン粒子および物質を含む組成物を提供し、ここで該物質は、該フィブリン粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合される。加えて本発明は、物質を細胞中へ導入する方法、生物学的試料から幹細胞および／または始原細胞を単離する方法、ならびに幹細胞および／または始原細胞に結合されたフィブリン粒子を含む組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つ、単離されたフィブリンナノ粒子。
【請求項２】
１．３２±０．２ｇ／ｍＬの密度を持つ、請求項１に記載のフィブリンナノ粒子。
【請求項３】
フィブリンナノ粒子を調製する方法であって、該方法は：
（ｉ）フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液を、５０〜８０℃の温度にて油エマルジョン中、外因性化学架橋剤の添加なしに、フィブリンマイクロビーズがこの混合物中で形成されるまで混合し；
（ｉｉ）該混合物を均一化して、該混合物中で２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つフィブリンナノ粒子を形成させ；および
（ｉｉｉ）該混合物から、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つフィブリンナノ粒子を単離する
段階を含む方法。
【請求項４】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、内因性第ＸＩＩＩ因子を含有する精製されたフィブリノーゲンとトロンビンを接触させることにより調製される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、内因性フィブリノーゲンおよび内因性第ＸＩＩＩ因子を含有する冷却沈降物とトロンビンを組み合わせることにより調製される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、別々の量のフィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを加えることにより調製される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記水溶液中のフィブリノーゲン：トロンビン：第ＸＩＩＩ因子の比が、５〜１００ｍｇ／ｍＬ：１〜１００Ｕ／ｍＬ：１〜５０Ｕ／ｍＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶液中のフィブリノーゲン：トロンビン：第ＸＩＩＩ因子の比が、２０〜４０ｍｇ／ｍＬ：５〜１０Ｕ／ｍＬ：２〜２０Ｕ／ｍＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液が、少なくとも１つの物質を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記物質が、薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、抗原、ハプテン、アルギン酸塩、生分解性ポリマー、ポリエチレングリコールまたは糖である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを含む前記水溶液が、該水溶液の調製後約３０秒以内に前記油中へ導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記油エマルジョン中の前記油が、コーン油、オリーブ油、大豆油、ひまし油、鉱油およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記油がコーン油である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｉ）中の前記混合物が、約３〜９時間混合される、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つ前記フィブリンナノ粒子が、濾過および沈降により単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
段階（ｉｉｉ）において単離された前記フィブリンナノ粒子が、１．３２±０．２ｇ／ｍＬの密度を持つ、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
フィブリンナノ粒子を調製する方法であって、該方法は：
（ｉ）フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液を、外因性化学架橋剤の添加なしに、フィブリン血餅を得る様式で混合し；
（ｉｉ）架橋されたフィブリン血餅を得るに充分な時間の期間、室温にて該フィブリン血餅をインキュベートし；
（ｉｉｉ）５０〜８０℃の温度にて油中、この架橋されたフィブリン血餅を混合して、フィブリン粒子を得；
（ｉｖ）該フィブリン粒子を均一化して、所望の大きさのフィブリン粒子を得；および
（ｖ）この所望の大きさの該フィブリン粒子を単離する
段階を含む方法。
【請求項１８】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、内因性第ＸＩＩＩ因子を含有する精製されたフィブリノーゲンとトロンビンを接触させることにより調製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、内因性フィブリノーゲンおよび内因性第ＸＩＩＩ因子を含有する冷却沈降物とトロンビンを組み合わせることにより調製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、別々の量のフィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを加えることにより調製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記水溶液中のフィブリノーゲン：トロンビン：第ＸＩＩＩ因子の比が、５〜１００ｍｇ／ｍＬ：１〜１００Ｕ／ｍＬ：１〜５０Ｕ／ｍＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記水溶液中のフィブリノーゲン：トロンビン：第ＸＩＩＩ因子の比が、２０〜４０ｍｇ／ｍＬ：５〜１０Ｕ／ｍＬ：２〜２０Ｕ／ｍＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記フィブリノーゲンが、前記トロンビンと混合される前に振盪される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、少なくとも１つの物質を更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記物質が、薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、抗原、ハプテン、アルギン酸塩、生分解性ポリマー、ポリエチレングリコールまたは糖である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記フィブリン血餅が、約４５分〜約２時間、段階（ｉｉ）においてインキュベートされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
段階（ｉｉｉ）中の前記油が、コーン油、オリーブ油、大豆油、ひまし油、鉱油およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記油がコーン油である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記の架橋されたフィブリン血餅が、約３〜９時間、段階（ｉｉｉ）において油中で混合される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記フィブリン粒子が段階（ｉｖ）において均一化され、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つフィブリンナノ粒子を得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つ前記フィブリンナノ粒子が、濾過および沈降により単離される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
単離された前記フィブリンナノ粒子が、１．３２±０．２ｇ／ｍＬの密度を持つ、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記フィブリン粒子が段階（ｉｖ）において均一化され、３０〜３００μｍの平均直径を持つフィブリンマイクロビーズを得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
３０〜３００μｍの平均直径を持つ前記フィブリンマイクロビーズが、濾過および沈降により単離される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
フィブリン粒子を調製する方法であって、該方法は：
（ｉ）フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液を、外因性化学架橋剤の添加なしに、フィブリン血餅を得る様式で混合し；
（ｉｉ）架橋されたフィブリン血餅を得るに充分な時間の期間、室温にて該フィブリン血餅をインキュベートし；
（ｉｉｉ）５０〜８０℃の温度にて、この架橋されたフィブリン血餅を加熱して、フィブリン粒子を得；
（ｉｖ）該フィブリン粒子を均一化して、所望の大きさのフィブリン粒子を得；および
（ｖ）この所望の大きさの該フィブリン粒子を単離する
段階を含む方法。
【請求項３６】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、内因性第ＸＩＩＩ因子を含有する精製されたフィブリノーゲンとトロンビンを接触させることにより調製される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、内因性フィブリノーゲンおよび内因性第ＸＩＩＩ因子を含有する冷却沈降物とトロンビンを組み合わせることにより調製される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、別々の量のフィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを加えることにより調製される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記水溶液中のフィブリノーゲン：トロンビン：第ＸＩＩＩ因子の比が、５〜１００ｍｇ／ｍＬ：１〜１００Ｕ／ｍＬ：１〜５０Ｕ／ｍＬである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記水溶液中のフィブリノーゲン：トロンビン：第ＸＩＩＩ因子の比が、２０〜４０ｍｇ／ｍＬ：５〜１０Ｕ／ｍＬ：２〜２０Ｕ／ｍＬである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、少なくとも１つの物質を更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記物質が、薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、抗原、ハプテン、アルギン酸塩、生分解性ポリマー、ポリエチレングリコールまたは糖である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記フィブリン血餅が、約４５分〜約２時間、段階（ｉｉ）においてインキュベートされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記の架橋されたフィブリン血餅が、約３〜９時間、段階（ｉｉｉ）において加熱される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記フィブリン粒子が段階（ｉｖ）において均一化され、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つフィブリンナノ粒子を得る、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つ前記フィブリンナノ粒子が、濾過および沈降により単離される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
単離された前記フィブリンナノ粒子が、１．３２±０．２ｇ／ｍＬの密度を持つ、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記フィブリン粒子が段階（ｉｖ）において均一化され、３０〜３００μｍの平均直径を持つフィブリンマイクロビーズを得る、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
３０〜３００μｍの平均直径を持つ前記フィブリンマイクロビーズが、濾過および沈降により単離される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
フィブリン粒子を調製する方法であって、該方法は：
（ｉ）フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液を、外因性化学架橋剤の添加なしに、噴霧乾燥器中へ導入し；
（ｉｉ）この混合物を噴霧乾燥させて、噴霧乾燥されたフィブリン粒子を得；
（ｉｉｉ）５０〜８０℃の温度にて、この噴霧乾燥された粒子を加熱して水を除去し；および
（ｉｖ）所望の大きさのフィブリン粒子を単離する
段階を含む方法。
【請求項５１】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、内因性第ＸＩＩＩ因子を含有する精製されたフィブリノーゲンとトロンビンを接触させることにより調製される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、内因性フィブリノーゲンおよび内因性第ＸＩＩＩ因子を含有する冷却沈降物とトロンビンを組み合わせることにより調製される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む前記水溶液が、別々の量のフィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを加えることにより調製される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記水溶液中のフィブリノーゲン：トロンビン：第ＸＩＩＩ因子の比が、５〜１００ｍｇ／ｍＬ：１〜１００Ｕ／ｍＬ：１〜５０Ｕ／ｍＬである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記水溶液中のフィブリノーゲン：トロンビン：第ＸＩＩＩ因子の比が、２０〜４０ｍｇ／ｍＬ：５〜１０Ｕ／ｍＬ：２〜２０Ｕ／ｍＬである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記水溶液が、少なくとも１つの物質を更に含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記物質が、薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、抗原、ハプテン、アルギン酸塩、生分解性ポリマー、ポリエチレングリコールまたは糖である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
噴霧乾燥器が１５０〜２３０℃のチャンバー温度を持つ、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
噴霧乾燥器が８５〜１２０℃の出口温度を持つ、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
段階（ｉｖ）において単離された前記フィブリン粒子が、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つフィブリンナノ粒子である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つ前記フィブリンナノ粒子が、濾過および沈降により単離される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記フィブリンナノ粒子が、１．３２±０．２ｇ／ｍＬの密度を持つ、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
段階（ｉｖ）において単離された前記フィブリン粒子が、３０〜３００μｍの平均直径を持つフィブリンマイクロビーズである、請求項５０に記載の方法。
【請求項６４】
３０〜３００μｍの平均直径を持つ前記フィブリンマイクロビーズが、濾過および沈降により単離される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
フィブリンナノ粒子および物質を含む組成物であって、ここで該物質が該フィブリンナノ粒子と混合される組成物。
【請求項６６】
前記物質が、薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、抗原、ハプテン、アルギン酸塩、生分解性ポリマー、ポリエチレングリコールまたは糖である、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
フィブリン粒子および物質を含む組成物であって、ここで該物質が、該フィブリン粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合される組成物。
【請求項６８】
前記フィブリン粒子が、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つフィブリンナノ粒子である、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記フィブリン粒子が、３０〜３００μｍの平均直径を持つフィブリンマイクロビーズである、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７０】
前記物質が、薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、抗原またはハプテンである、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７１】
物質をフィブリン粒子に結合させる方法であって、該方法は、該物質および該フィブリン粒子間の複合体の形成を許容する条件下に、該フィブリン粒子を該物質と接触させ、該複合体を単離することを含む方法。
【請求項７２】
前記フィブリン粒子が、２００〜２０００ｎｍの直径を持つフィブリンナノ粒子である、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記フィブリン粒子が、３０〜３００μｍの平均直径を持つフィブリンマイクロビーズである、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７４】
前記物質が、薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、抗原またはハプテンである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記物質が、前記フィブリン粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記物質が、リンカーを介して前記フィブリン粒子に結合される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記リンカーが、前記フィブリン粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
物質を細胞中へ導入する方法であって、該方法は該細胞を、フィブリンナノ粒子および物質を含む組成物と接触させ、ここで該物質は該フィブリンナノ粒子と混合されるか、あるいは該フィブリンナノ粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合され、それで該ナノ粒子および該物質が該細胞中へ導入される方法。
【請求項７９】
前記物質が、薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原またはハプテンである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記物質が、前記フィブリンナノ粒子と混合される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記物質が、前記フィブリンナノ粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞が、初代上皮細胞、平滑筋細胞、樹状細胞、線維芽細胞、軟骨細胞および骨芽細胞、骨原骨随由来始原細胞、３Ｔ３ガン細胞株、ならびにマウス哺乳類ガン細胞株からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
幹細胞および／または始原細胞を含む生物学的試料から、該幹細胞および／または始原細胞を単離する方法であって、該方法は、フィブリン粒子が該生物学的試料中に存在する該幹細胞および／または始原細胞に結合するように、該生物学的試料を該フィブリン粒子と接触させ、該生物学的試料から該幹細胞および／または始原細胞に結合された該フィブリン粒子を単離する段階を含む方法。
【請求項８４】
幹細胞および／または始原細胞に結合されたフィブリン粒子を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリンナノ粒子、フィブリンナノ粒子およびフィブリンマイクロビーズを包含する種々の大きさのフィブリン粒子を調製する方法、およびこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノーゲンは、血餅の主要な構成タンパク質であり、フィブリン膠または密封剤として集約された形態で開発されて来た。フィブリノーゲンの構造、血餅形成の生化学的な機構、および血小板とのフィブリンの相互作用が解き明かされ、よく文書化されている。止血の他に、フィブリンは暫定的なマトリックスとしても働き、肉芽組織の再生に必要とされる細胞を動員する。異なるタイプの細胞が、この傷を取り巻く組織から血餅中へ引き込まれる。究極的には、血餅中へ引き込まれたこれらの細胞は、新たなコラーゲンおよび他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分泌する。
【０００３】
フィブリノーゲンは、臨床的適用のための貯蔵されたフィブリン膠の使用により証明されたように、同種内では免疫原性でない（Radosevich M., Goubran H. A. & Burnouf T. , Fibrin sealant: Scientific rationale, production methods, properties and current clinical use. Vox Sang., 72: 133-143,1997 ; Marx G. Kinetic and mechanical parameters of fibrin glue. Symposium on Surgical Tissue Adhesives: Atlanta GA. In: Current Trends in Surgical Tissue Adhesives, Sierra D. & Saltz R. (Eds) (1996) ）。フィブリノーゲンの止血活性に加えて、フィブリン（フィブリノーゲン）（フィブリンおよび／またはフィブリノーゲンへの言及として、当業界において知られる）が、マウスおよびヒトの線維芽細胞（ＭＦおよびＨＦ）、牛大動脈上皮（ＢＡＥＣ）および平滑筋細胞（ＳＭＣ）を包含する異なるタイプの細胞を伴って、細胞接着（走触性）および遊走（走化性）応答を惹起することが示されている（Gorodetsky, R., et al. J. Lab. Clin. Med., 131: 269-280, 1998）。
【０００４】
フィブリノーゲンは熱感受性であり、５０℃を上回ると変性する。対照的に、内因性の第ＸＩＩＩ因子はより熱感受性ではなく、より高温においてさえ架橋反応を誘導し得る。フィブリノーゲンおよび第ＸＩＩＩ因子のこれらの特性に基づき、本発明者らは、フィブリンマイクロビーズ（「ＦＭＢ」）を調製する特許された方法を創出した（２０００年１１月２１日に発行された米国特許第６，１５０，５０５号参照）。該方法は、内因性の第ＸＩＩＩ因子の存在下に、加熱された植物油（７０〜８０℃）中で、フィブリノーゲンおよびトロンビンを反応させることを含んでいた。この手順から単離された粗ＦＭＢは、細かいメッシュのフィルターを通して濾過され、９５％エタノール中で沈降させられた。顕微鏡による評価は、該ＦＭＢが直径５０〜２００μｍであることを指し示した（Gorodetsky, et al., J. Invest. Dermatol., 112(6): 866-872, June 1999）。ショ糖溶液を用いた試験は、該ＦＭＢが１．３２＋０．１ｇｍ／ｍＬの密度を持つことを指し示した。
【０００５】
該ＦＭＢは、先行技術のフィブリンマイクロビーズを凌駕した有意な改良を提供した。特に、グルタルアルデヒドのような（フィブリンビーズの調製において典型的に使用された（Ho, et al., Drug Dev. and Ind. Pharm. 20 (4): 535-546,1994 参照））外因性化学架橋剤よりもむしろ、該架橋剤として第ＸＩＩＩ因子が使用されたので、該ＦＭＢは、種々のタイプの細胞に関して、フィブリン（フィブリノーゲン）の走触性および走化性の特性を維持した。グルタルアルデヒドのような外因性化学架橋剤の使用は、ある生物学的に活性な部位を破壊し、これにより該マイクロビーズの細胞への結合を妨げるだけでなく、該マイクロビーズを免疫原性にすることもあると思われている。
【０００６】
加えて、該ＦＭＢの調製方法における熱および第ＸＩＩＩ因子の組み合わせは、生理学的なフィブリン、または Senderoff, et al., (J. Parenteral Sci. & Tech., 45 (1) : 2-6,1991) に記載されるような、フィブリンを主体とした薬剤送達系（ドラッグデリバリーシステム、ＤＤＳ）において他に起こるであろうよりも、有意により大きな度合いのフィブリン（フィブリノーゲン）が架橋するようにしたと思われている。これは該ＦＭＢを、水溶液中で延長された期間安定にし、これは、他の使用にとってと同様、細胞を培養するためのビヒクルとしての使用にとって特に望ましい特性である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［本発明の要約］
本発明は、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つフィブリンナノ粒子（ＦＮＰ）を指向するものである。本発明の該ＦＮＰは、米国特許第６，１５０，５０５号のＦＭＢのように、ある生物学的に活性な部位を傷付け得、それらの酵素分解速度に影響を及ぼし、これ故にＦＮＰが種々のタイプの細胞と反応性になるグルタルアルデヒドのような如何なる外因性架橋剤をも含有しない。更に、本発明のＦＮＰは、加熱下にフィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を反応させることにより調製され、ここで第ＸＩＩＩ因子は、該架橋剤として作用する。本調製法の結果として、本発明のＦＮＰはフィブリン（フィブリノーゲン）の更なる架橋を含有し、これはこのフィブリン粒子を、水溶液中延長された期間安定にする。
【０００８】
しかしながら、本発明のＦＮＰが、より大きなＦＮＰとは違って、細胞の細胞質中へ取り込まれることが予期せず見出された。これ故に、本発明のＦＮＰは、細胞により正常では取り込まれない物質を包含する物質を細胞中へ選択的に送達するための、革新的で独特の解決法を提供する。本発明のＦＮＰは非毒性、最小限に非免疫原性および生分解性でもあるので、ＦＮＰは薬剤送達の分野における有意な進歩である。
【０００９】
ＦＮＰに加えて、本発明はＦＮＰを調製する方法も提供し、該方法は：
（ｉ）フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液を、５０〜８０℃の温度にて油エマルジョン中、外因性化学架橋剤の添加なしに、フィブリンマイクロビーズがこの混合物中で形成されるまで混合し；
（ｉｉ）該混合物を均一化して、該混合物中で２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つＦＮＰを形成させ；および
（ｉｉｉ）該混合物から、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つＦＮＰを単離する段階を含む。
【００１０】
加えて、本発明は、如何なる大きさのフィブリン粒子をも調製するもう１つ別の方法を提供する。この方法は：
（ｉ）フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液を、外因性化学架橋剤の添加なしに、フィブリン血餅を得る様式で混合し；
（ｉｉ）架橋されたフィブリン血餅を得るに充分な時間の期間、室温にて該フィブリン血餅をインキュベートし；
（ｉｉｉ）５０〜８０℃の温度にて油中、この架橋されたフィブリン血餅を混合して脱水されたフィブリン片を得；
（ｉｖ）該フィブリン片を均一化または砕いて所望の大きさのフィブリン粒子を得；および
（ｖ）この所望の大きさのフィブリン粒子を単離する
段階から構成される。この方法は、ＦＮＰおよびＦＭＢを包含する如何なる大きさの粒子をも調製するのに用いられてもよい。
【００１１】
本発明は、如何なる大きさのフィブリン粒子をも調製するもう１つ別の方法も提供する。この方法は：
（ｉ）フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液を、外因性化学架橋剤の添加なしに、フィブリン血餅を得る様式で混合し；
（ｉｉ）架橋されたフィブリン血餅を得るに充分な時間の期間、室温にて該フィブリン血餅をインキュベートし；
（ｉｉｉ）５０〜８０℃の温度にて、この架橋されたフィブリン血餅を加熱してフィブリン片を得；
（ｉｖ）該フィブリン片を均一化して所望の大きさのフィブリン粒子を得；および
（ｖ）この所望の大きさのフィブリン粒子を単離する
段階を含む。この方法は、ＦＮＰ、ＦＭＢおよび他の大きさのフィブリン粒子を調製するのにも用いられてもよい。
【００１２】
本発明は、如何なる大きさのフィブリン粒子をも調製する尚もう１つ別の方法を提供し、それは：
（ｉ）フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液を、外因性化学架橋剤の添加なしに、噴霧乾燥器中へ導入し；
（ｉｉ）該混合物を噴霧乾燥し、噴霧乾燥されたフィブリン粒子を得；
（ｉｉｉ）５０〜８０℃の温度にて、この噴霧乾燥された粒子を加熱して、脱水または水を除去し；および
（ｉｖ）所望の大きさのフィブリン粒子を単離する
段階を含む。ここで再び、この方法は、ＦＮＰおよびＦＭＢを包含する種々の大きさのフィブリン粒子を調製するのに用いられてもよい。
【００１３】
尚更に、本発明は、フィブリンナノ粒子および物質を含む組成物を提供し、ここで該物質は、該フィブリンナノ粒子と混合される。
【００１４】
加えて、本発明は、フィブリン粒子および物質を含む組成物を提供し、ここで該物質は、該フィブリン粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合される。該フィブリン粒子は、ＦＮＰおよびＦＭＢを包含する如何なる大きさであってもよい。
【００１５】
本発明により、物質をフィブリン粒子に結合させるための方法も提供され、該方法は、該物質および該フィブリン粒子の間で複合体を形成することを許容する条件下に該フィブリン粒子を該物質と接触させ、該複合体を単離することを含む。ここで再び、該フィブリン粒子は、ＦＮＰおよびＦＭＢを包含する如何なる大きさであってもよい。
【００１６】
加えて、本発明は、細胞中へ物質を導入する方法を提供し、ここで該方法は、該細胞をフィブリンナノ粒子および物質を含む組成物と接触させ、ここで該物質は、該フィブリンナノ粒子と混合されるか、あるいは該フィブリンナノ粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合され、それで該ナノ粒子および該物質は、該細胞中へ導入される。
【００１７】
本発明は、幹細胞および／または始原細胞を含む生物学的試料から、該幹細胞および／または始原細胞を単離する方法も提供し、該方法は、該フィブリン粒子が該生物学的試料中に存在する該幹細胞および／または始原細胞に結合するように、該生物学的試料をフィブリン粒子と接触させ、該生物学的試料から該幹細胞および／または始原細胞に結合されたフィブリン粒子を単離することを含む。
【００１８】
尚更に、本発明は、幹細胞および／または始原細胞に結合されたフィブリン粒子を含む組成物を提供する。
【００１９】
追加の目的は、以降の記載から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つフィブリンナノ粒子（ＦＮＰ）を指向したものである。本発明のＦＮＰは、フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子の加熱下での反応により調製されることでも特徴付けられ、ここで第ＸＩＩＩ因子は、グルタルアルデヒドのような外因性架橋剤の代わりに架橋剤として作用する。好ましい実施形態において、ＦＮＰは１．３２±０．２ｇ／ｍＬの密度を持つ。ＦＮＰは脱水もされ、架橋されたフィブリン（フィブリノーゲン）および好ましくは更に架橋されたフィブリン（フィブリノーゲン）を含む。尚更に、本発明のＦＮＰは、生物学的に活性である。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、「生物学的に活性な」は、ＦＮＰが、該ＦＮＰが誘引して種々のタイプの細胞中へ取り込むことを許容する生物学的に活性な部位を保有することを意味する。これは、グルタルアルデヒドのような外因性架橋剤で処理され、これがこのようなフィブリンマイクロビーズを細胞に対して非誘引性に、生物学的に不活性に、およびより分解可能でなくする先行技術のフィブリンマイクロビーズとは異なる。
【００２２】
「更に架橋された」は、フィブリン（フィブリノーゲン）が少なくとも３０％の架橋されたフィブリン（フィブリノーゲン）、より好ましくは少なくとも５０％の架橋されたフィブリン（フィブリノーゲン）のαおよびγ鎖を含有することを意味する。本発明のＦＮＰの更なる架橋は、それらの製造中で起きると思われ、これは天然のフィブリン（フィブリノーゲン）構造、特にそのＤ−ドメインを変性させるのを助ける高温を利用し、これにより第ＸＩＩＩ因子による架橋部位を曝し、これは室温にて天然のコンホマーのフィブリン（フィブリノーゲン）により正常に架橋されない。ＦＭＢに関して米国特許第６，１５０，５０５号の図１において説明されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのパターンは、このような第ＸＩＩＩ因子媒介反応による更なる架橋を示す。同様の更なる架橋も、本発明のＦＮＰを、有機溶媒中同様水性環境中でも不溶性および安定にし、これ故に物質を細胞へ送達するために、および他の使用のために、エタノールまたは等価な溶液中で保管される場合、あるいは水溶液中で調製される場合、ＦＮＰを安定にする。
【００２３】
他に指し示されなければ、本発明の方法を使用して調製されるフィブリン粒子は、前記のＦＮＰの同じ特性を持つが、該フィブリン粒子は如何なる大きさであってもよい。
【００２４】
他に指し示されなければ、「ＦＮＰ」は、２０〜２０００ｎｍの直径を持つフィブリン粒子に関するが、一方「ＦＭＢ」は、３０〜３００μｍの直径を持つフィブリン粒子に関する。
【００２５】
ＦＮＰは４つの基本的な工程により調製されてもよく、これらはこの後１）フィブリン／油エマルジョン；２）フィブリン／油；３）フィブリン／乾燥；４）フィブリン／噴霧乾燥／加熱工程として言及される。該１）フィブリン／油エマルジョン工程は、米国特許第６，１５０，５０５号に記載の工程に似ており、これはその全体を引用することにより本明細書中で援用される。該）フィブリン／油、フィブリン／乾燥、およびフィブリン／噴霧乾燥／加熱工程も、ＦＮＰおよびＦＭＢを包含する種々の大きさのフィブリン粒子を調製するのに使用されてよい。特に各工程は、更に以下に記載される。
【００２６】
この点において、該フィブリン／油エマルジョン工程では、フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液が調製される。この溶液は、内因性第ＸＩＩＩ因子を含有するフィブリノーゲンをトロンビンと組み合わせることにより、内因性フィブリノーゲンおよび内因性第ＸＩＩＩ因子を含有する冷却沈降物をトロンビンと組み合わせることにより、またはフィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを別個に水溶液中へと組み合わせることにより調製されてもよい。この加熱乾燥工程も、縮合反応による追加的な架橋を包含する。ヘビ毒プロテアーゼ（例えばレプチラーゼ）のような等価なプロテアーゼがトロンビンに対する代替物として使用されてもよいことも、本発明の範囲内である。前記水溶液中でのフィブリノーゲン：トロンビン：第ＸＩＩＩ因子の比は、好ましくは５〜１００ｍｇ／ｍＬ：１〜１００Ｕ／ｍＬ：１〜５０Ｕ／ｍＬ、最も好ましくは２０〜４０ｍｇ／ｍＬ：５〜１０Ｕ／ｍＬ：２〜２０Ｕ／ｍＬである。これらのタンパク質に加えて、該水溶液は、前記フィブリノーゲン単離のコース中の冷却沈降出発原料中に存在することがあるフィブロネクチンおよび他の血液由来タンパク質をも含有してもよい。ＦＮＰが以降で議論されるような如何なる物質をも含有することが所望される場合、その時はそれらの物質はそれらの混合前に該フィブリノーゲンまたはトロンビン溶液中へ、またはこの水溶液へ直接加えられ得る。
【００２７】
次に、実質的な凝集の開始前に、該水溶液は、エマルジョンを形成するように機械的に攪拌されながら、約５０〜８０℃の範囲中の温度へ加熱される油中へ導入される。イソオクタンのような疎水性有機溶媒も、該油中に包含されてもよい。本発明者らは、以下の実施例１中のフィブリノーゲンおよびトロンビンの濃縮物を使用して、フィブリノーゲンおよびトロンビンが組み合わされた後約１０〜４５秒にて、凝集が通常起きることを見出している。しかしながら、フィブリノーゲンおよびトロンビンの他の濃縮物に関しては、この凝集の開始は、既知の凝集アッセイを使用することにより決定され得る。
【００２８】
適切な油は、植物油（コーン油、オリーブ油、大豆油、およびひまし油のような）、石油を主体とした油、シリコーン油、鉱油、およびこれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。殆どの油がこの加工段階の間に除かれる一方、如何なる残渣の植物油も細胞により代謝され得るので、植物油が好ましい。最も好ましい実施形態では、該油はコーン油である。本発明者らは、不飽和結合を含有する油（すなわちキャノーラ油）はそれらが酸化されることがあるので、避けられるべきであると思っている。
【００２９】
水溶液がこの加熱された油中に導入された後、このエマルジョンはその後約５０〜８０℃の温度にて維持され、更に架橋されたフィブリン（フィブリノーゲン）を含むフィブリンマイクロビーズ（およびナノ粒子）が該エマルジョン中で得られるまで、適切なスピードにて混合される。この混合スピードは、該エマルジョンの体積および該粒子の所望の大きさに依存するであろう。１Ｌフラスコ中の４００ｍＬの油および１００ｍＬの水相の体積に関しては、好ましい混合スピードは３００〜５００ｒｐｍである。該エマルジョンは一般に約３〜９時間混合されるが、実際の時間は温度、気流、初期の反応剤の濃度、および該エマルジョンの体積に依存して変動するであろう。前記のように、約５０〜８０℃の温度にて、天然のフィブリン（フィブリノーゲン）構造は部分的に変性し、第ＸＩＩＩ因子による架橋のための部位を曝し、これは室温にて正常には架橋されないと思われている。このような架橋は、前記混合／加熱サイクルの第１相の間に起こる。この加熱は前記マトリックスを脱水する目的にも寄与し（乾燥工程）、これにより一緒に粘着したり癒着したりしない（このような粒子が、それらが多過ぎる水を保有する場合そうするように）解離した架橋されたフィブリン（フィブリノーゲン）粒子を産生する。
【００３０】
該油から取り出し、油を除去するよう溶媒で洗い、風乾させた後に、得られた固体の粒子（マトリックス）はその後、その「細かい」設定へと設定された粉砕器、粉挽き装置もしくは臼、または該混合物中で２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つＦＮＰを得る乳棒
を使用して、均一化されるか砕かれる。好ましくは、該ＦＮＰは、該混合物を２０ミクロン未満の通過を許すフィルターまたは篩を通過させることにより分離される。該ＦＮＰは、細かいメッシュのフィルターを通じての濾過および／またはアルコールもしくは他の液体中での分別沈降を包含する技術の組み合わせにより、より大きな粒子から引き続き分離され、ここでより大きな粒子は重力により沈降され、残った漂っているＦＮＰは遠心分離されて集められる。好ましくは、これらの通過された粒子は９５％エタノール中懸濁され、振盪される。６０秒以内に沈降する材料は除去される。得られた上清中のＦＮＰは、その後更に濾過または遠心分離により単離される。該ＦＮＰの大きさは、Coulter 粒子計数器または顕微鏡を使用して決定され得る。
【００３１】
前記フィブリン／油工程において、フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液は、外因性化学架橋剤の添加なしに、フィブリン血餅を得る様式で混合される。特に、該フィブリン血餅は、該水溶液を激しく振盪することにより得られ得る。このフィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液は、前記フィブリン／油エマルジョン工程中と同じ様式で調製され、そう望まれる場合は物質を包含してもよい。該物質の泡立ち作用を増加させるために、該フィブリノーゲンも、この追加的な物質と混合される前に振盪されてもよい。該フィブリン血餅はその後、架橋されたフィブリン血餅を得るに充分な時間の期間、室温にてインキュベートされる。本発明者らは、約４５分〜約６時間のインキュベーション期間が充分であることを見出している。次に、この架橋されたフィブリン血餅は、変性および乾燥されたフィブリン片が得られるまで、５０〜８０℃の温度にて油と混合される。該油および混合期間（すなわち約３〜９時間）は、前記フィブリン／油エマルジョン工程に関して前記されたような同様の様式で達成される。フィブリンの粒子は、その後溶媒で洗われて残った油を除去し、均一化または砕かれて所望の大きさのフィブリン粒子を得、これは更に濾過、沈降および／または遠心分離により単離されてもよい。特に、２００〜２０００ｎｍの平均直径を持つＦＮＰが、前記油エマルジョン工程に関して前記されたのと同じ粉砕および大きさの分離手続きを使用して得られてもよい。約３０〜３００μｍのＦＭＢは、１０〜２０秒後９５％エタノール中で沈降した該粒子を単離し、直径３０〜３００μｍのＦＭＢについて選択するワイヤメッシュを使用することにより得られてもよい。
【００３２】
前記フィブリン／乾燥工程において、フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液は、外因性化学架橋剤の添加なしに、フィブリン血餅を得る様式でまず混合される。ここで再び、このフィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液は、前記と同様の様式で調製され、そう望まれる場合は物質を包含してもよい。該フィブリン血餅はその後、架橋されたフィブリン血餅を得るに充分な時間の期間、室温にてインキュベートされる。約４５分〜約２時間のインキュベーション期間が通常充分である。次に、この架橋されたフィブリン血餅は、脱水されたマトリックスを得るに必要な時間の期間（約３〜９時間）、真空オーブン中５０〜８０℃の温度にて加熱される。このフィブリンマトリックスの粒子は、その後均一化されて所望の大きさの粒子を得る。ＦＮＰ、ＦＭＢまたは他の粒子を包含する所望の粒子は、前記と同じ手続きを使用して単離されてもよい。
【００３３】
フィブリン／噴霧乾燥／加熱工程において、フィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子を含む水溶液は、外因性化学架橋剤の添加なしに、噴霧乾燥器中へまず導入される。適切な噴霧乾燥器は、Buchi 噴霧乾燥器および他の商業的に入手可能な噴霧乾燥器を包含する。好ましくは、前記物質は以下のパラメーターにて噴霧乾燥される：供給温度３７℃、入口の温度１５０〜２３０℃、出口の温度８５〜１２０℃、および噴霧圧３ミリバール。この噴霧乾燥された粒子は、好ましくは減圧トラップまたは類似の装置中で集められる。この噴霧乾燥された粒子はその後、５０〜８０℃の温度にて加熱され、水を除去する。ＦＮＰ、ＦＭＢまたは他の粒子を包含する所望の大きさのフィブリン粒子は、前記と同じ手続きを使用して単離されてもよい。
【００３４】
本発明は、フィブリンナノ粒子および物質を含む組成物も提供し、ここで該物質は該フィブリンナノ粒子と混合される。この点では、該物質は、該物質が該ＦＮＰを調製する工程においてフィブリノーゲン、トロンビンおよび第ＸＩＩＩ因子（またはフィブリノーゲンのようなその成分の１つ）を含む水溶液中に包含される場合、該フィブリンナノ粒子と混合されてもよい。この結果得られるＦＮＰは、該ＦＮＰの生分解時に放出されるであろう該物質を含有するであろう。
【００３５】
本発明は、ＦＮＰおよびＦＭＢを包含する如何なる大きさのフィブリン粒子、ならびに物質を含む組成物も提供し、ここで該物質は、該フィブリン粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合されている。この点では、該物質（例えば、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、ハプテンまたは薬剤）は、それらのカルボキシまたはアミノ基を通じて結合することによるような、所望のリガンドを該ＦＮＰへ結合させる架橋試薬を使用することのような表面化学により、該ＦＮＰへ結合され得た。
【００３６】
適切な物質は、薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、ハプテン、神経学的物質、ビタミン、ビタミン誘導体、成長因子、グルココルチコステロイド、ステロイド、抗生物質、殺菌および静菌化合物を包含する抗菌剤、抗ウィルス化合物、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物、殺腫瘍化合物、静腫瘍化合物、毒素、酵素、酵素阻害剤、タンパク質、ペプチド、ミネラル、神経伝達物質、リポタンパク質、糖タンパク質、免疫調節物質、イムノグロブリンおよびこれらの断片、染料、放射線標識、放射線不透過化合物、蛍光化合物、脂肪酸誘導体、糖類、多糖類、細胞受容体結合分子、抗炎症剤、抗緑内障化合物、散瞳化合物、麻酔薬および同様のものを包含するが、これらに限定されない。本明細書中で使用されるように、物質は、アルギン酸塩、生分解性ポリマー、ポリエチレングリコール、糖、およびマトリックス成分または分子も包含する。
【００３７】
本発明は、細胞中へ物質を導入するための方法も提供し、該方法は、該細胞をフィブリンナノ粒子および物質を含む組成物と接触させることを含み、ここで該物質は該フィブリンナノ粒子と混合されるか、あるいは該フィブリンナノ粒子の表面上のアミンまたはカルボキシ部分に結合され、それで該ナノ粒子および該物質は、該細胞中へ導入される。ここで再び、該物質は薬剤、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、抗原またはハプテンであってもよい。適切な細胞は、初代上皮細胞、平滑筋細胞、樹状細胞（抗原提示細胞）、線維芽細胞、軟骨細胞および骨芽細胞、骨原骨随由来始原細胞、３Ｔ３ガン細胞株、ならびにマウス哺乳類ガン細胞株を包含する。
【００３８】
本発明は、幹細胞および／または始原細胞を含む生物学的試料から、該幹細胞および／または始原細胞を単離するための方法も提供する。該方法は：フィブリン粒子が該生物学的試料中に存在する該幹細胞および／または始原細胞に結合するように、該生物学的試料を該フィブリン粒子と接触させ、該生物学的試料から該幹細胞および／または始原細胞に結合された該フィブリン粒子を単離する段階を含む。この方法において、該生物学的試料は、骨髄、胎盤血および脊髄血を包含する該幹細胞および／または始原細胞を含有する如何なる生物学的試料であってもよい。該フィブリン粒子は、如何なる大きさであってもよいが、好ましくは３０〜３００μｍの直径を持つＦＭＢである。該フィブリン粒子は、その維持に要求される既知の成分を含有し、該幹細胞および／または始原細胞が良く存在する培養中、該生物学的試料と接触されてもよい。接触後の所望の時間に、該幹細胞および／または始原細胞に結合された該フィブリン粒子は、該培養から除去され、更なる研究または操作のためにもう１つ他の環境中へ導入されてもよい。該幹細胞および／または始原細胞が、もし所望されれば該フィブリン粒子から除去されてもよいことも、本発明の範囲内である。
【実施例】
【００３９】
本発明は、本発明の理解における補助について説明される以下の実施例に記載され、如何なる方式においても、この後に伴う請求項において定義されるように本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【００４０】
［実施例１］
［フィブリン油エマルジョン工程によるＦＮＰの調製］
ＦＭＢの調製に使用されたもの（米国特許第６，１５０，５０５号）と同様の油エマルジョン工程が、粗産生物を調製するのに使用されてもよい。この点においては、５００ｍＬの植物油（コーン油、大豆油、ひまし油）が、３５０ｒｐｍにて攪拌しながら、６０〜７５℃へと加熱される。フィブリノーゲン（２５ｍｇ／ｍＬ）およびトロンビン（５Ｕ／ｍＬ）の混合物（まだ凝固していない）が、その後この熱い油へ加えられる。フィブリンの水性の小滴が、内因性第ＸＩＩＩ因子の活性により架橋し続けるであろう。４〜６時間後、この結果得られた固体粒子が集められ、ヘキサンおよびアセトンで洗われて油を除去し、風乾される（収量１．１グラム）。これは結果的にＦＭＢの形成をもたらし、残りのＦＮＰは遠心分離され「細かなもの」として集められる。ＦＮＰの収量の比率を増加させるには、より大きなＦＭＢが、以下のように砕かれ得る。
【００４１】
粉砕段階：この粗ＦＮＢ産生物は、直径１０〜３００ミクロンの粒子の不均一な集まりを含有する。粒子の大きさを小さくするためには、この全体の混合物は、その「細かい」設定に設定された粉砕器を通じての粉砕に付されるか、あるいは粉挽き装置、または臼および乳棒を有する機械的粉砕、または代わりの装置に付される。
【００４２】
大きさの分離段階：この結果得られる粉末は、篩一式を通過させることにより、異なる大きさの粒子へと分離される。２０ミクロン未満の通過を許す篩を通過する最小の粒子が、９５％エタノール中で懸濁され振盪される。１２０秒以内に沈降する材料は除去され、得られた上清はＦＮＰを含有する。より大きな粒子の更なる除去には、ＦＮＰを有する該エタノール溶液は沈降するまで遠心分離されて全てのＦＮＰを集め、この大きさは Coutler 粒子計数器中または顕微鏡中で決定され得る（すなわち、２００〜２０００ｎｍの平均直径）。
【００４３】
［実施例２］
［フィブリン／油工程によるＦＮＰの調製］
凝集段階：２５ｍＬのフィブリノーゲン（４０ｍｇ／ｍＬ）が、５０ｍＬのキャップされた試験管中に導入され、激しく振盪されて多量の泡立ちを確実なものとする。１ｍＬのトロンビン（４００Ｕ／ｍＬ）が加えられ、この混合物は激しく攪拌されて約０．５分以内に凝固を達成する。この全体の混合物は、血餅になる。該混合物は、その後室温にて１時間固められ、良い架橋を確実なものとする。
【００４４】
油段階：該フィブリン血餅はその後除去され、より小さな粒子へと砕かれ、３０〜８０ｒｐｍにて攪拌しながら６０〜７０℃へ加熱された植物油（５００ｍＬのコーン油、大豆油、またはひまし油）中へ設置される。この大きなフィブリン片は、その後より小さな片へと砕かれ得る。この加熱はその後、４〜６時間７５℃くらいにてゆっくり（〜２０ｒｐｍ）攪拌しながら続く。この結果得られる脱水され縮合されたフィブリン片が集められ、ヘキサンおよびアセトンで洗われて油を除去し、風乾される（粗収量：２．４グラム）。この結果得られる脱水されたフィブリンマトリックスはその後、実施例１に記載された粉砕および大きさの分離段階へ付される。
【００４５】
［実施例３］
［フィブリン／乾燥工程によるＦＮＰの調製］
２５ｍＬのフィブリノーゲン（４０ｍｇ／ｍＬ）が、５０ｍＬのキャップされた試験管中で混合され、１ｍＬのトロンビン（４００Ｕ／ｍＬ）が加えられる。この混合物はその後穏やかに振盪され、非粘着性パラフィルムシート上へ注がれ、凝固が約１分中に達成される。該混合物は、その後約１時間静置され、良い架橋を達成する。この材料はその後スパーテルで砕かれる。これらの片はその後アルミニウム箔上に置かれ、６０〜７０℃にて真空オーブン中加熱される。数時間後、フィブリン血餅の塊は脱水し固化する。フィブリノーゲンおよびトロンビンの出発混合物が熱に脆弱な添加物を含有する場合、該フィブリン塊は、この熱に脆弱な添加物の活性を保持するために、５０℃を下回って真空オーブン中加熱されることが示唆される。この脱水段階を伴って、該フィブリン血餅の片はその後、実施例１に記載された粉砕および大きさの分離段階へ付される。
【００４６】
［実施例４］
［フィブリン／噴霧乾燥／加熱工程によるＦＮＰの調製］
フィブリノーゲン（２５ｍｇ／ｍＬ）が、２０秒間トロンビン（２０Ｕ／ｍＬ）と混合され、このまだ液体の混合物は、噴霧乾燥器中へと注入された（Buchi 噴霧乾燥器；供給温度３７℃、入口温度１５０〜２３０℃、および出口温度８５〜１２０℃）。これらの粒子は、以下の噴霧乾燥パラメーターを使用して、減圧トラップ中で集められた：チャンバー温度１５０〜２３０℃、出口温度：８５〜１２０℃、および噴霧圧：３ミリバール。該減圧トラップ中で得られた粉末は、その後水を除去するために６時間８０℃にてオーブン中で硬化された。引き続き、該粉末は、その後９５％エタノール中で懸濁され、振盪された。６０秒以内に沈降した材料は除去され、この結果得られた上清はＦＮＰを含有し、この大きさは実施例１に記載のように決定され得る。
【００４７】
［実施例５］
［ＦＮＰの特徴付け］
ＦＮＰの溶解性。該ＦＮＰは、位相差顕微鏡によりモニターされ、トリス（Tris）／生理食塩水中または４Ｍ尿素中で、溶解性に関して試験された。該トリス緩衝液も該４Ｍ尿素も、いずれも室温にて１週間までＦＮＰを溶解しなかった。
【００４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＦＮＰは、０．１ＮのＮａＯＨ中部分的に消化され、フィブリノーゲンまたは正常に凝固されたフィブリンをコントロールとして用いて、４〜１２％勾配に抑えられたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Nova, Encino, CA）に付された。結果は、該ＦＮＰが更に架橋されることを指し示す。
【００４９】
ＦＮＰの密度。ＦＮＰは我々の実験室で調製され、密度評価のためショ糖密度沈降に付された。われわれが作製したこの調製物は、約１．３２±０．２ｇ／ｍＬの密度を呈することが見出された。
【００５０】
ＦＮＰの大きさ。Coulter ミクロ以下の粒子分析器は、異なるバッチのＦＮＰが２００〜９９５ｎｍの範囲中の平均直径を呈することを指し示した。２バッチのＦＮＰの大きさの分布は、それぞれ３０５および９９４ｎｍの平均粒子直径を有し、図１に示される。
【００５１】
［実施例６］
［ＦＮＰの誘導体化］
該ＦＮＰは、それらの表面アミン（ＮＨ２）基を通じて以下のように誘導体化された：ＦＮＰ（１００μＬのパックされた体積）が、２ｍｇのフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を有するｐＨ８．２の２ｍＬの炭酸緩衝液中で懸濁され、暗所で室温にて２時間攪拌しながらインキュベートされた。この反応は、１００μＬのトリス／生理食塩水緩衝液を加えることにより止められ、該粒子は遠心分離により単離され、混合および音波にかざすことにより分解された。この結果得られたＦＩＴＣ−ＦＮＰは、非常に蛍光を発していた。
【００５２】
タンパク質は、水溶性カルボジイミド試薬である塩酸１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（ＭＷ１９１．７、Pierce Co.）を用いることにより、以下のように該ＦＮＰに結合された：２ｍＬの共役緩衝液（０．１ＭのＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、ｐＨ４．５〜５）中に懸濁されたＦＮＰ（１００μＬ）をパックした。ＦＩＴＣ−アルブミン（１００μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）が加えられ、この混合物は軌道振盪器上で攪拌された。ＥＤＣ（２ｍｇ）が加えられ、この混合物全体は、２時間室温にて振盪された。この反応は、１００μＬのトリス／生理食塩水緩衝液を加えることにより止められた。この結果得られた粒子が３０００ｒｐｍでの遠心分離により単離され、混合および音波をかざすことにより分解された。この結果得られた上清の残ったＯＤ２８０に基づき、７０％より多い該ＦＩＴＣタンパク質が該ＦＮＰに結合されるようになった。他のカップリング化学反応も知られ、異なる基またはタンパク質をＦＮＰ（またはＦＮＢおよび他の大きさのフィブリン粒子）に結合させるのに使用され得た。
【００５３】
ＦＩＴＣまたはＦＩＴＣ−アルブミンを結合させるのに使用されたものに似た化学を使用して、他のタンパク質またはポリマーまたは抗原が、該ＦＮＰの表面に結合されてもよい。あるいは、グルタルアルデヒドのような他の架橋試薬が、材料を該ＦＮＰの表面上へ結合させるのに用いられてもよい。当業者に知られている他の架橋試薬も、用いられてもよい。ＦＮＰも、該ＦＮＰを前記工程のいずれかにより産生する前に、タンパク質（またはハプテン）をフィブリノーゲン、トロンビンまたはフィブリノーゲン／トロンビン混合物に加えることにより、該タンパク質（またはハプテン）で誘導体化されてもよい。このような反応は、これからＦＮＰが作られる全体のフィブリンマトリックス中へ、該タンパク質（またはハプテン）をトラップして架橋させるのに使用され得た。
【００５４】
［実施例７］
［ＦＩＴＣ−ＦＮＰの細胞取り込み］
４つの異なるタイプの培養細胞が、除去されてスライド上に固定された分取物と共に、３日間までＦＩＴＣ−ＦＮＰと共にインキュベートされた。蛍光顕微鏡検査による光または２重の光（蛍光および光）は、１日以内に該蛍光ＦＮＰが、ヒト線維芽細胞（ＨＦ）、牛上皮細胞（ＥＣ）、３Ｔ３線維芽細胞、およびＥＭＴ６タイプの細胞の細胞質内に観察されたことを示した（図２）。これらの結果は、ＦＮＰがタンパク質またはハプテンで誘導体化され得、標的細胞（大部分が間葉起源）中への取り込み用の担体として作用し得ることを論証する。
【００５５】
［実施例８］
［ＦＭＢを有する幹細胞の単離］
骨髄（ＢＭ）は、マウスの大腿骨から取り除かれ、単細胞懸濁を得るために、Ｇ２３まで小さくされた一連の直径を有する針を通じて移された。この新鮮なＢＭ細胞（１５〜２０×１０７細胞／ｍＬ）は、２０％ＦＣＳ、１％の抗生物質、１％のグルタミン、１％のアミノ酸、および１％のピルビン酸塩を有する１０ｍＬのα−ＭＥＭ中で懸濁され、２００μＬのパックされたフィブリンマイクロビーズ（ＦＭＢ）（５０〜１００ミクロンの直径で、前記フィブリン／油工程により調製された）と混合され、ポリカーボネートの５０ｍＬチューブ中で懸濁された。該チューブは、ガス交換するように孔を開けられたキャップで閉じられてアルミニウム箔で覆われ、〜３０°の角度にてゆっくりと回転するスタンド（〜１０回転／分）上に設置され、それでこの培地がこの孔を開けられたキャップに届かないようにされた。４８時間後、この未付着細胞は、簡便で穏やかなボルテックス攪拌により分離され、付着された細胞（ＦＭＢ＋ＢＭ細胞）を有するフィブリンマイクロ粒子が６０〜９０秒間沈降するようにされ、未付着細胞を含有する上清は除去され、新鮮な培地が加えられ、このチューブはインキュベーター中の回転器上に再び設置された。全ＢＭと共にインキュベーションすることは、結果的に該ＦＭＢの急速な分解に至り、これは恐らくこの細胞混合物の高いタンパク質分解酵素活性およびフリー・ラジカル活性によるものであった。これ故に、このＦＭＢ  ＢＭ細胞抽出手順は、４８時間に限られた。
【００５６】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色された細胞核を有するＦＭＢの共焦点顕微鏡検査により、ＦＭＢに関する細胞数の継続された増加が、１日目〜７日目に観察された（図３）。ＦＭＢ＋ＢＭ細胞（＞２０×１０６細胞／ｍＬ（パックされたＦＭＢ）の濃度まで成長された）の分取物が、無菌のＰＢＳで１回洗われ、プラスチックのフラスコ上に設置され、骨原性の補助成分を有する、および有さない標準的な条件培地中でインキュベートされた。３〜４日までに細胞は、このプラスチック表面上のＦＭＢからダウンロードしているのが見られた。約１０日後、このダウンロードされた細胞は、線維芽細胞様細胞の合流層を形成した。数多くの領域で、高い細胞密度、直径０．５〜４ｍｍの組織化された巣状物（小島状のもの）を観察することが出来た。これらの巣状物では、多層の細胞が、不透明な細胞外マトリックスの付着を伴って形成された。この培養培地への骨原性補助成分の混合物の添加は、このような小島状のものの発生および大きさを増加させた。図４は、白い斑点として未染色フラスコ上に顕微鏡で見られた大きな石灰化された小島状のものを示す。ＤＸＳ元素分析（Gorodetsky, et al., Direct multi-elemental analysis of platelets in relation to their homologous plasma, as determined by X-ray fluorescence spectrometry. Am. J. Haematol. 42: 278, 1993）は、これらの領域における極めて高いレベルのＣａの存在を証明した（（データーは）示さず）。これらの知見は、ＦＭＢと共に抽出されＦＭＢ上で成長されるＢＭからの前駆細胞が、骨原性を有する細胞へと in vitro で分化され得ることを指し示す。
【００５７】
以上本明細書中で述べられた全ての刊行物および特許は、それらの全体における言及によりここで援用される。以上の本発明は、明確性および理解目的のために幾分詳細に記載されて来たが、その開示を読み取ることから、当業者により、形態および詳細における種々の変化が、添付の請求項中の本発明の本当の範囲から逸脱することなくなされ得ることが認められるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】それぞれ３０５および９９４ｎｍの平均粒子直径を有する、２バッチのＦＮＰの大きさの分布。
【図２】１日のインキュベーション後の、４タイプの細胞によるＦＩＴＣ−ＦＮＰの取り込みを示す蛍光マイクログラフ。Ａ：ヒト線維芽細胞（ＨＦ）、Ｂ：牛上皮細胞（ＥＣ）、Ｃ：３Ｔ３マウス線維芽細胞株、Ｄ：ＥＭＴ６細胞。これらのマイクログラフは、派生されたＦＮＰが、標的細胞の細胞質中へ吸着され得ることを論証する。
【図３】付着され（１日目）、７日目までにＦＭＢ上で成長したＢＭ由来細胞のＰＩ染色細胞核。画像は、共焦点顕微鏡により撮影された多区画から構成された。細胞が該表面上に付着され、幾つかが該ＦＭＢ中へ侵襲しているのが見られた。
【図４】方法２により産生されたＦＭＰにより抽出されたＢＭ細胞により in vitro において骨化され、プラスチックのフラスコ上へダウンロードされた小島状のものの誘導。２週間の培養後、石灰化された細胞外マトリックスを分泌した骨原細胞のコロニー様の巣状物が形成された。
【図１】
2005527481.tif 000002
【図２】
2005527481.tif 000003
【図３】
2005527481.tif 000004
【図４】
2005527481.tif 000005
【国際調査報告】
2005527481.tif 000006