(57)【要約】ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠陥抗体産生体細胞の使用は、抗体のような高められたタンパク質産生を伴うサブクローンバリアントの生成方法を提供する。ＭＭＲ欠陥細胞および動物を使用して、高められたタンパク質産生のような新規かつ有用な特性を伴う新たな細胞株および動物の変種を天然の突然変異率に頼るよりもより効率的に生成し得る。これらの方法は、増大された力価レベルのタンパク質産生を生じ得る内因性遺伝子を変えるように宿主細胞内の遺伝子の多様性を生成させるのに有用である。本方法を使用することにより、抑制された発現が高められた抗体産生と関連する２種の遺伝子が発見された。多様な方法によるこれらの遺伝子の抑制された発現は製造ならびに免疫学的障害における抗体産生を調節するための戦略のための増大された抗体産生に至る。さらに、宿主細胞中でのこれら２種の遺伝子の抑制は、普遍的な高力価タンパク質産生株を生成させるために有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）高力価抗体産生細胞のミスマッチ修復を不活性化してそれにより超易変細胞を形成すること、
（ｂ）前記抗体産生細胞に比較してより高力価の抗体を産生する細胞について、前記超易変細胞をスクリーニングすること、ならびに
（ｃ）前記抗体産生細胞および前記超易変細胞のゲノムを分析してそれにより高力価抗体産生の原因である遺伝子を同定すること
を含んでなる、高力価抗体産生の原因である遺伝子の同定方法。
【請求項２】
前記抗体産生細胞が完全な抗体を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体産生細胞が内因性の免疫グロブリン遺伝子を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体産生細胞が外因性の免疫グロブリン遺伝子を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体産生細胞が免疫グロブリン遺伝子の誘導体を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ミスマッチ修復を不活性化する前記段階が、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブのアレルを前記抗体産生細胞に導入することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ミスマッチ修復を不活性化する前記段階が、前記抗体産生細胞の最低１種のミスマッチ修復遺伝子をノックアウトすることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ミスマッチ修復を不活性化する前記段階が、前記抗体産生細胞にＲＮＡ干渉分子を導入することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ミスマッチ修復を不活性化する前記段階が、ミスマッチ修復遺伝子に対するアンチセンス分子を前記抗体産生細胞に導入することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アレルが短縮突然変異を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
スクリーニングする段階が、前記細胞のゲノムのヌクレオチド配列を未処理の細胞のゲノムに比較して分析することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
スクリーニングする段階が、前記細胞からのｍＲＮＡの発現レベルおよび構造を未処理の細胞に比較して分析することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
試験する段階が、前記細胞からのタンパク質を未処理の細胞に比較して分析することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
スクリーニングする段階が、前記遺伝子の表現型を分析することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体産生細胞が非ヒト動物のミスマッチ修復欠陥受精卵である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記受精卵を疑似妊娠雌性動物に着床させ、それにより前記受精卵が成熟トランスジェニック動物に発達する段階をさらに含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）高力価抗体産生細胞のミスマッチ修復を不活性化してそれにより超易変細胞を形成する段階；
（ｂ）前記抗体産生細胞と比較してより高力価の抗体を産生する細胞について、前記超易変細胞をスクリーニングする段階；
（ｃ）より高力価の抗体を産生する前記超易変細胞を培養する段階
を含んでなる一方法により製造される高力価抗体産生細胞の均一な培養物。
【請求項１８】
高力価抗体産生細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞および非ヒト霊長類細胞より成る群から選択される、請求項１７に記載の高力価抗体産生細胞の培養物。
【請求項１９】
α１−アンチトリプシンおよび内皮単球活性化ポリペプチドＩを含んでなる抗体産生に関与する最低１種の遺伝子の発現を調節する段階を含んでなる、高力価抗体産生細胞の製造方法。
【請求項２０】
細胞がハイブリドーマである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が上皮細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
細胞が卵巣細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
細胞が腎細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
細胞が骨髄性細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
細胞がリンパ系細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記調節する段階が、前記内皮単球活性化ポリペプチドＩおよびα−１−アンチトリプシン遺伝子の最低１種に対し向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することによる前記遺伝子の発現の抑制を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記調節する段階が、前記内皮単球活性化ポリペプチドＩおよびα−１−アンチトリプシン遺伝子の最低１種に対し向けられたアンチセンス転写物を含んでなる発現ベクターを導入することによる前記遺伝子の発現の抑制を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記調節する段階が、前記内皮単球活性化ポリペプチドＩおよびα−１−アンチトリプシン遺伝子の最低１種の内因性の機能を破壊するためのノックアウトターゲッティングベクターを導入することによる前記遺伝子の発現の抑制を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記調節する段階が、前記内皮単球活性化ポリペプチドＩおよびα−１−アンチトリプシン遺伝子の最低１種に対し向けられたリボザイムを含んでなるポリヌクレオチドを導入することによる前記遺伝子の発現の抑制を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
抑制が、前記内皮単球活性化ポリペプチドＩおよび／若しくはα−１−アンチトリプシン遺伝子の産物に対する細胞内阻害抗体を導入することにより達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
抑制が、成長培地中の前記遺伝子の産物に対し向けられた中和抗体若しくはその誘導体とともに細胞をインキュベートすることにより達成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させて抗体産生体細胞からの抗体産生を減少させることを含んでなる、細胞の抗体産生の調節方法。
【請求項３３】
阻害剤が薬理学的量の天然のプロテアーゼ基質を含んでなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項３４】
前記阻害剤が天然のプロテアーゼ阻害剤に対する阻害抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項３５】
阻害剤がα−１−アンチトリプシンに対する阻害抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項３６】
細胞の成長培地をα−１−アンチトリプシンについて分析し、その低いレベルが高抗体力価と関連付けられる、高力価抗体産生についての細胞の選択方法。
【請求項３７】
α−１−アンチトリプシンＲＮＡ、その低いレベルのＲＮＡが高抗体力価と関連付けられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
α−１−アンチトリプシンタンパク質、その低いレベルのＲＮＡが高抗体力価と関連付けられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
細胞の成長培地を内皮単球活性化ポリペプチドＩについて分析し、その低いレベルが高抗体力価と関連付けられる、高力価抗体産生についての細胞の選択方法。
【請求項４０】
内皮単球活性化ポリペプチドＩ  ＲＮＡ、その低いレベルのＲＮＡが高抗体力価と関連付けられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
内皮単球活性化ポリペプチドＩタンパク質、その低いレベルのＲＮＡが高抗体力価と関連付けられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
内皮単球活性化ポリペプチドＩ発現を増大させる最低１種の化合物と前記細胞を接触させることを含んでなる、高免疫グロブリン疾患発生と関連する抗体産生の抑制方法。
【請求項４３】
α−１−アンチトリプシン発現を増大させる最低１種の化合物と前記細胞を接触させることを含んでなる、高免疫グロブリン疾患発生と関連する抗体産生の抑制方法。
【請求項４４】
α−１−アンチトリプシン発現活性を抑制する最低１種の化合物と前記細胞を接触させることを含んでなる、低免疫グロブリン疾患発生と関連する抗体産生を高める方法。
【請求項４５】
前記化合物が前記細胞中でのα−１−アンチトリプシンタンパク質の活性を低下させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記化合物が前記細胞中でのα−１−アンチトリプシンのレベルを低下させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
単球活性化ポリペプチドＩ発現活性を抑制する最低１種の化合物と前記細胞を接触させることを含んでなる、低免疫グロブリン疾患発生と関連する抗体産生を高める方法。
【請求項４８】
前記化合物が前記細胞中での単球活性化ポリペプチドＩタンパク質の活性を低下させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物が前記細胞中での単球活性化ポリペプチドＩのレベルを低下させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
単球活性化ポリペプチドＩの発現が阻害されるような単球活性化ポリペプチドＩ遺伝子中の欠損を含んでなる、抗体分子若しくはそれらのフラグメントの発現のための宿主細胞。
【請求項５１】
前記欠損が単球活性化ポリペプチドＩの欠失を含んでなる、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
前記欠損が単球活性化ポリペプチドＩ遺伝子中のフレームシフト突然変異である、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
前記宿主細胞が、単球活性化ポリペプチドＩ遺伝子のアンチセンス転写物を含んでなる発現ベクターを含んでなり、それにより前記アンチセンス転写物の発現が単球活性化ポリペプチドＩ遺伝子の発現を抑制する、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５４】
前記宿主細胞が、単球活性化ポリペプチドＩ遺伝子の発現を破壊するリボザイムを含んでなる、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記宿主細胞が、単球活性化ポリペプチドＩタンパク質に対する細胞内中和抗体を含んでなり、それにより前記抗体が単球活性化ポリペプチドＩの活性を抑制する、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
α−１−アンチトリプシンの発現が阻害されるようなα−１−アンチトリプシン遺伝子中の欠損を含んでなる抗体分子若しくはそれらのフラグメントの発現のための宿主細胞。
【請求項５７】
前記欠損がα−１−アンチトリプシンの欠失を含んでなる、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
前記欠損がα−１−アンチトリプシン遺伝子中のフレームシフト突然変異である、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
前記宿主細胞が、α−１−アンチトリプシン遺伝子のアンチセンス転写物を含んでなる発現ベクターを含んでなり、それにより前記アンチセンス転写物の発現がα−１−アンチトリプシン遺伝子の発現を抑制する、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
前記宿主細胞が、α−１−アンチトリプシン遺伝子の発現を破壊するリボザイムを含んでなる、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
前記宿主細胞が、α−１−アンチトリプシンタンパク質に対する細胞内中和抗体を含んでなり、それにより前記抗体がα−１−アンチトリプシンの活性を抑制する、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
抗体分子の少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターをさらに含んでなる、請求項６１に記載の宿主細胞。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも免疫グロブリンＬ鎖若しくはそのフラグメントをコードする、請求項６１に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも免疫グロブリンＨ鎖若しくはそのフラグメントをコードする、請求項６１に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
選択された高力価抗体産生細胞のゲノムを再安定化する段階をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法により作成された安定な高力価抗体産生細胞の培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００２年７月１９日出願の米国仮出願第０６／３９７，０２７号明細書（これによりそっくりそのまま引用することにより組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は抗体および組換えタンパク質産生の分野に関する。具体的には、それは突然変異誘発、遺伝子発見および組換え遺伝子発現の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
外来および／若しくは内因性ポリペプチドの活性を阻害するための抗体の使用は、疾患の根底にある原因を治療するための有効かつ選択的な戦略を提供する。具体的には、ＦＤＡが承認した、Ｃｅｎｔｏｃｏｒからの抗血小板モノクローナル抗体（ＭＡｂ）レオプロ（ＲｅｏＰｒｏ）（非特許文献１）；、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈからの抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＭＡｂハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（非特許文献２）；およびＭｅｄｉｍｍｕｎｅにより製造される抗ＲＳウイルスＭＡｂシナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）（非特許文献３）のような有効な治療薬としてのＭＡｂの使用である。
【０００４】
候補タンパク質標的に対するＭＡｂの標準的生成方法は当業者により既知である。簡潔には、霊長類ならびにマウス若しくはラットのようなげっ歯類にアジュバントの存在下の精製した抗原を注入して免疫応答を生成させる（非特許文献４）。陽性の免疫血清をもつ動物を殺しかつ脾細胞を単離する。単離した脾細胞を骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａｓ）に融合させて不死化細胞株を生じさせ、それをその後抗体産生についてスクリーニングする。陽性株を単離しかつ抗体産生について特徴付けする。ヒト治療薬としてのげっ歯類由来ＭＡｂの直接使用は、げっ歯類由来抗体で治療したかなりの数の患者でヒト抗げっ歯類抗体（ＨＡＲＡ）応答が発生した（非特許文献５）という事実により混乱された。ＨＡＲＡの問題を回避するために、抗原結合ドメインを構成している免疫グロブリン（Ｉｇ）サブユニットのＨおよびＬ鎖可変領域内に見出される重要なモチーフである相補性決定領域（ＣＤＲ）のヒト抗体バックボーンへの移植が、これらのキメラ分子がＨＡＲＡ応答を欠く一方で抗原に対するそれらの結合活性を保持することを見出した（非特許文献６）。げっ歯類由来ＭＡｂの「ヒト化」（この文書にＨＡｂと称される）の間に存在する一般的な問題は、ヒトＩｇバックボーンへの移植に際してのＣＤＲドメインの三次元構造のコンホメーション変化による結合親和性の喪失である（特許文献１）。この問題を克服するために、付加的なＨＡｂベクターは、通常、工作されてそれにより高親和性ＨＡｂを再創製するために枠組み領域および／若しくはＣＤＲコーディング領域それ自身内で付加的なアミノ酸残基を挿入若しくは欠失することが必要とされる（特許文献１）。この過程は、高親和性ＨＡｂに至るとみられる変化を予測するための高価なコンピュータモデル化プログラムの使用を必要とする、非常に時間のかかる処置である。いくつかの例においては、ＨＡｂの親和性はＭＡｂのものまで決して復帰せず、それらを治療上ほとんど有用でなくしている。
【０００５】
抗体工学に存する一問題は臨床材料のための分子の製造に必要とされる安定な高収量産生体（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）細胞株の生成である。この問題を回避するためにいくつかの戦略が当業者により標準的実務において採用されている。一方法は、抗体全体つまりは一本鎖抗体を製造するための、抗原結合ポリペプチドを形成するＬおよびＨ双方の鎖を含有するキメラ分子である移植ヒトＬおよびＨ鎖を含有する外因性Ｉｇ融合遺伝子でトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の使用である（非特許文献７）。
【０００６】
別の方法は、ヒトの移植免疫系を含有するトランスジェニックマウス若しくはヒトＩｇ遺伝子レパートリーを含有するトランスジェニックマウス由来のヒトリンパ球の使用を使用する。なお別の方法はヒト抗サル応答を欠くことが報告されている霊長類ＭＡｂを産生させるためのサルの使用を使用する（非特許文献８）。全部の場合において、十分な量の高親和性抗体を生成させることが可能である細胞株の生成は、臨床研究に十分な材料を製造するための大きな制限を課す。これらの制限により、ヒト化抗体の安定な高レベル産生に至るであろう系として植物のような他の組換え系の有用性が現在探究されている（非特許文献９）。
【０００７】
遺伝子的に変えられた宿主細胞、増大された量の抗体を分泌することが可能である限定されるものでないがＳＰ２０、ＮＳ０、ＣＨＯなどを挙げることができるいずれかの代理哺乳動物細胞の生成方法は、製品開発のための細胞宿主の価値ある創製方法を提供し、ならびに変えられた構造若しくは発現レベルが、変えられた場合に高められたＭＡｂ産生をもたらす下流の遺伝子の発見に有用な試薬の生成を見込むであろう。本明細書に記述される発明は、ＭＭＲの阻害を介する増大された抗体産生を伴う遺伝子的に変えられた細胞宿主の創製に向けられ、それらは、指図された変化および高力価産生株の生成のための変えられた遺伝子座をスクリーニングかつ同定するのに順に使用し得る。
【０００８】
本発明は、遺伝子発現レベル、プロセシングレベル若しくは分泌レベルのいずれかでの抗体の過剰産生に関与する遺伝子の製造ならびに標的発見のための使用のための高められた抗体産生レベルを伴う細胞株の高力価産生の生成を助長する。本発明の他の利点は本明細書に記述される実施例および図に記述される。
【特許文献１】Ｑｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号明細書
【非特許文献１】Ｇｌａｓｅｒ，Ｖ．（１９９６）“Ｃａｎ  ＲｅｏＰｒｏ  ｒｅｐｏｌｉｓｈ  ｔａｒｎｉｓｈｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ？”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２１６−１２１７
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．（１９９９）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ”Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：４３−５１
【非特許文献３】Ｓａｅｚ−Ｌｌｏｒｅｎｓ，Ｘ．Ｅ．ら（１９９８）“Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ”Ｐｅｄｉａｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１７：７８７−７９１
【非特許文献４】Ｓｈｉｅｌｄ，Ｃ．Ｆ．ら（１９９６）“Ａ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＯＫＴ３  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｄａｖｅｒｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２７：８５５−８６４
【非特許文献５】Ｋｈａｚａｅｌｉ，Ｍ．Ｂ．ら、（１９９４）“Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２−５２
【非特許文献６】ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９５中、Ｅｍｅｒｙ，Ｓ．Ｃ．とＨａｒｒｉｓ，Ｗ．Ｊ．“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”ｐｐ．１５９−１８３
【非特許文献７】Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）“Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５７３−５７６
【非特許文献８】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．とＧｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ，Ｍ．（１９９７）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｉｃｅ  ｐｅｒｆｏｒｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ”Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２５−２６
【非特許文献９】Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｕ．とＣｏｎｒａｄ，Ｕ．（１９９５）“Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔａｂａｃｃｏ  ｓｅｅｄｓ”Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１０９０−１０９３
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明は、遺伝子的に変えられた抗体産生細胞宿主をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで生成してそれにより該細胞が所定の抗体分子、免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖若しくはＩｇドメイン（１種若しくは複数）に相同な領域を含有するポリペプチドの高められた産生、プロセシングおよび／若しくは細胞外分泌を表す方法を提供する。本発明はまた、高められた免疫グロブリンの発現、安定性、プロセシングおよび／若しくは分泌の調節に関与する遺伝子を同定するための遺伝子発見のためのこうした高力価抗体産生体細胞の使用方法も提供する。増大された抗体産生を伴う細胞の一同定方法は、抗体、Ｉｇ  Ｌおよび／若しくはＨ鎖またはＩｇドメインを含むポリペプチドを産生するミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠陥細胞のスクリーニングによる。
【００１０】
本発明における使用に適する抗体産生細胞は、限定されるものでないが、げっ歯類、霊長類、ヒトハイブリドーマ若しくはリンパ芽球状；トランスフェクトされかつ外因性Ｉｇ  Ｌおよび／若しくはＨ鎖またはキメラ一本鎖分子を発現する哺乳動物細胞；トランスフェクトされかつ外因性Ｉｇ  Ｌ若しくはＨ鎖またはキメラ一本鎖分子を発現する植物細胞、酵母若しくは細菌を挙げることができる。
【００１１】
従って、本発明は、抗体を産生することが可能である細胞中のミスマッチ修復を阻害することによる超易変（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｂｌｅ）抗体産生細胞の作成方法を提供する。抗体を産生することが可能である細胞は、抗体を天然に産生する細胞、ならびに免疫グロブリンＨおよび／若しくはＬ鎖をコードする配列の導入により抗体を産生するように工作されている細胞を包含する。
【００１２】
本発明はまた、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓらへの米国特許第６，１４６，８９４号明細書に記述されるところの抗体を産生することが可能である細胞にＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２若しくはＭＳＨ２のようなドミナントネガティブのミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子を導入することによる超易変抗体産生細胞の作成方法も提供する。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブのアレルはミスマッチ修復遺伝子の短縮突然変異（好ましくは、野性型ＰＭＳ２のコドン１３４すなわちヌクレオチド４２４のチミジンでの短縮突然変異）であってよい。本発明はまたミスマッチ修復遺伝子活性が抑制される方法も提供する。これは、例えば、ミスマッチ修復遺伝子若しくは転写物に対し向けられたアンチセンス分子；ＲＮＡ干渉、触媒性抗体のようなポリペプチド阻害剤を使用して、またはＰＣＴ公開第ＷＯ  ０２／０５４８５６号明細書に記述されるもののような化学物質阻害剤の使用により達成しうる。
【００１３】
本発明はまた、ヌクレオチド（例えばアンチセンス若しくはターゲッティングノックアウトベクター）、またはポリペプチド（例えばドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子アレル若しくは触媒性抗体）をコードする遺伝子を、動物の受精卵に導入することによる、超易変抗体産生細胞の作成方法も提供する。これらの方法は、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓらへの米国特許第６，１４６，８９４号明細書に記述されるとおり該卵を疑似妊娠雌性動物にその後着床させてそれにより該受精卵が成熟トランスジェニック動物に発達することもまた包含してよい。これらのヌクレオチド若しくはポリペプチド阻害剤は、例えばＰＭＳ２、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３若しくはＭＳＨ６のようなミスマッチ修復に関与する遺伝子のいずれに向けられてもよい。
【００１４】
本発明はまた、細胞が該細胞での抗体のより高い産生の原因である最低１種の遺伝子中の突然変異を含有する、抗体を産生することが可能でありかつ欠陥ミスマッチ修復過程を含有する培養された超易変哺乳動物細胞の均一な組成物も提供する。ＭＭＲ中の欠損は、例えばＰＭＳ２、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ４若しくはＭＳＨ６を包含してよいミスマッチ修復遺伝子内のいずれの欠損によってもよい。培養物の細胞は、ＰＭＳ２若しくはＭＬＨ３のようなドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子アレルを含有してよい（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９８）Ａ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈＰＭＳ２  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｃａｎ  Ｃｏｎｆｅｒ  ａ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｔｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１．１９９７；米国特許第６１４６８９４号明細書；Ｌｉｐｋｉｎ  ＳＭ、Ｗａｎｇ  Ｖ、Ｊａｃｏｂｙ  Ｒ、Ｂａｎｅｒｊｅｅ−Ｂａｓｕ  Ｓ、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ＡＤ、Ｌｙｎｃｈ  ＨＴ、Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＲＭ、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＦＳ．（２０００）ＭＬＨ３：ａ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２７−３５）。
【００１５】
本発明はまた、ミスマッチ修復欠陥細胞への免疫グロブリン遺伝子の導入方法、および、プールにて観察されるより若しくはミスマッチ熟練（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）細胞に比較してより高力価の抗体若しくはＩｇポリペプチドを生じるサブクローンについてのスクリーニング方法も提供する。
【００１６】
本発明はまた、ミスマッチ修復欠陥細胞を培養すること、ならびに該細胞を試験して該細胞が新たな生化学的特徴（例えば抗体若しくは免疫グロブリン遺伝子産物の過剰発現、細胞内安定性、プロセシングおよび／若しくは分泌）が生成されるような目的の遺伝子内の突然変異を担持するかどうかを決定することによる、抗体産生細胞における抗体産生に影響を及ぼす遺伝子（１種若しくは複数）中の突然変異（１個若しくは複数）の生成方法も提供する。該試験は、目的の免疫グロブリン遺伝子の定常状態のＲＮＡ若しくはタンパク質のレベルの分析および／または目的の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる分泌型タンパク質の量の分析を包含しうる。本発明はまた、げっ歯類、非ヒト霊長類およびヒトからの細胞を包含するこの方法により作成されるミスマッチ修復欠陥免疫グロブリン産生原核生物および真核生物トランスジェニック細胞も包含する。
【００１７】
本発明はまた、抗体産生細胞の超易変性を可逆的に変える方法も提供する。ＭＭＲの欠陥が、ドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子が誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されているミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブのアレルを含有する誘導可能なベクター中にあるドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子アレルの使用による場合には、該細胞を誘導剤で処理してドミナントネガティブのミスマッチ修復遺伝子（限定されるものでないがＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３若しくはＰＭＳ１を挙げることができる）を発現させる。あるいは、細胞は、限定されるものでないがＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ４、ＭＳＨ６を挙げることができる内因性のＭＭＲ遺伝子の不活性化によりＭＭＲ欠陥であってもよい。この場合、文献（Ｋｏｉ  Ｍ、Ｕｍａｒ  Ａ、Ｃｈａｕｈａｎ  ＤＰ、Ｃｈｅｒｉａｎ  ＳＰ、Ｃａｒｅｔｈｅｒｓ  ＪＭ、Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ、Ｂｏｌａｎｄ  ＣＲ．（１９９４）“Ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ３  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｈＭＬＨ１  ｍｕｔａｔｉｏｎ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：４３０８−１２）に以前に記述されたところの方法を使用して欠陥ＭＭＲ遺伝子サブユニットの１つを補うことが可能な発現ベクターを導入し、そして細胞中で安定に発現させてそれによりＭＭＲ欠陥表現型を復帰させる。
【００１８】
別の態様において、細胞は、予め選択された免疫グロブリンＬおよび／若しくはＨ鎖遺伝子または目的のｃＤＮＡをコトランスフェクトすることにより、抗体を産生することが可能とされうる。超易変細胞の免疫グロブリン遺伝子若しくはこれらの方法により産生されるタンパク質を所望の特性について分析してよく、そして、上述された方法を使用して宿主細胞の遺伝子の安定性を復帰させるように遺伝子の超易変性の誘導を停止してもよい。
【００１９】
本発明はまた、免疫グロブリンの完全長若しくは部分的Ｌ、Ｈ鎖遺伝子で個別に若しくは組合せでのいずれかで細胞株をトランスフェクトする、ミスマッチ修復欠陥細胞株の使用方法も提供する。
【００２０】
本発明はまた、高められた量の抗原結合ポリペプチドを発現する、遺伝子的に変えられた細胞株の生成方法も提供する。これらの抗原結合ポリペプチドは例えば抗体のＦａｂドメインであってよい。本発明の方法は、高められた量の抗原結合ポリペプチドを分泌する遺伝子的に変えられた細胞株の生成方法もまた包含する。該細胞株は、抗体のような抗原結合ポリペプチドを産生する細胞中での高められた遺伝子超変異率を提供するミスマッチ修復の阻害により超易変とされる。こうした細胞は、限定されるものでないが、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、ＳＰＯ／２のような代理細胞株、ならびにげっ歯類およびヒト由来ハイブリドーマを挙げることができる。高められた量の抗原結合ポリペプチドの発現は、該抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの高められた転写若しくは翻訳、高められた細胞内安定性または該抗原結合ポリペプチドの高められた分泌によることができる。
【００２１】
本発明はまた、抗体産生体細胞中で抑制される場合にその発現が高められた抗体産生をもたらす、上の方法による発見される２種の遺伝子の組成物および使用方法も提供する。親と超易変ＭＡｂ過剰産生体細胞株との間の比較的遺伝子発現分析を使用して、２種の遺伝子（配列番号１および配列番号２）が親前駆細胞株より有意により低い発現を有することを過剰産生体サブクローンで同定した。アンチセンス発現構築物を調製し、そして、アンチセンスベクターを親に導入しかつ高められたＭＡｂ産生についてアッセイした。双方の遺伝子の発現の阻害は有意により高いＭＡｂ産生をもたらした。
【００２２】
本発明はまた、限定されるものでないが、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／若しくはそれらの改変バージョン（例えばチオエート化など）を組込むアンチセンス技術；ＲＮＡ干渉；体細胞若しくは多能性細胞のＤＮＡノックアウト方法；リボザイム；細胞内および／若しくは細胞外抗体；発現および／若しくは機能にを遂げるドミナントネガティブのタンパク質阻害剤；遺伝子産物を結合しうる基質若しくはリガンドの薬理学的飽和；遺伝子の遺伝子発現プロファイルを遂げ得る生物学若しくは化学に基づく分子を挙げることができる、当業者により使用される方法による前記遺伝子の発現および／若しくは機能の阻害方法も提供する。
【００２３】
本発明はまた、免疫グロブリン産生を調節するために遺伝子の経路を調節し得る生物学的若しくは化学的分子を使用することによる遺伝子の生物学的影響（１種若しくは複数）に影響を及ぼし得る分子についてのスクリーニング方法も提供する。これらは、薬理学的量の天然の若しくは合成の基質、または遺伝子の生物学的産生および／若しくは活性を調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅ）し得る分子を導入することの使用によることができる。
【００２４】
本発明はまた、抗体またはＩｇ  Ｈおよび／若しくはＬ鎖遺伝子を産生する細胞のプールのサブクローンを分析することによる前記遺伝子の発現を欠くかもしれない天然のサブクローンバリアントについてのスクリーニング方法も提供する。スクリーニング方法は、細胞クローンの成長培地中でのタンパク質産生、細胞内タンパク質若しくはメッセージの定常状態のレベルについてモニターすることにより、または該遺伝子の遺伝子座のゲノム構造をスクリーニングすることにより実施し得る。
【００２５】
本発明はまた、免疫学的疾患状態における免疫グロブリン産生を抑制してそれにより多様な免疫グロブリンサブタイプの抑制された発現がこうした病理学的疾患状態を軽減、抑制若しくは治癒し得る、前記遺伝子の発現および／若しくは生物学的機能の阻害剤についてのスクリーニング方法も提供する。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の局面は下述される態様の１つ若しくはそれ以上により提供する。
【００２７】
本発明の一態様は、高められた抗体の発現、安定性若しくは分泌に関与する遺伝子を同定するためのミスマッチ修復欠陥細胞の使用方法である。細胞のＭＭＲ活性は抑制された遺伝子でありかつ該細胞は欠陥ＭＭＲの結果として超易変となる。該細胞を増殖させる。該細胞を新たな表現型（ここで該表現型は抗体またはＩｇ  Ｈおよび／若しくはＬ鎖ポリペプチドあるいはそれらの誘導体の高められた発現、プロセシングおよび／若しくは分泌である）の発現について試験する。
【００２８】
本発明の別の態様において、抗体、免疫グロブリン若しくはそれらの誘導体を過剰産生するミスマッチ修復欠陥細胞を親細胞株と比較して遺伝子的に分析して、高められた抗体若しくは免疫グロブリンの発現、安定性、プロセシングおよび／若しくは分泌に関与する変えられた遺伝子を同定する。その後、変えられた遺伝子の遺伝子座若しくは変えられた発現を伴う遺伝子座を、変えられた遺伝子を親株に導入するか若しくは親株中の遺伝子発現を変えることにより検証して、高められた免疫グロブリンおよび／若しくはＭＡｂ産生における役割を確認する。
【００２９】
本発明のなお別の態様は、抑制された発現が高められた抗体産生をもたらす２種の遺伝子（配列番号１および配列番号２）の発見および組成物である。前記遺伝子の発現分析は、親株に比較して過剰産生体亜系統（ｓｕｂｌｉｎｅ）で有意により低いことが見出されている。前記遺伝子発現は親株中で抑制されており、そして株を抗体産生についてスクリーニングする。阻害された遺伝子発現を伴う株は高められた抗体産生を有する。従って、本発明はまた、遺伝子の発現が抑制若しくは阻害されているような２種の遺伝子（α−１−アンチトリプシン（配列番号１）および単球活性化ポリペプチドＩ（配列番号２））の最低１種中に欠損を含んでなる抗体分子若しくはそれらのフラグメントを発現させるための細胞株も含んでなる。該細胞株は、細菌、酵母、植物若しくは限定されるものでないがウサギ細胞、げっ歯類細胞（例えばマウス、ラット、ハムスター）および霊長類細胞（ヒト細胞を包含する）を挙げることができる哺乳動物細胞であってよい。
【００３０】
本発明のなお別の態様は、製造における使用のための抗体、免疫グロブリン若しくはそれらの誘導体の産生を調節するための前記遺伝子産物の生物学的若しくは化学的阻害剤または前記遺伝産物の天然のリガンド／基質の使用である。
【００３１】
本発明のなお別の態様は、高力価産生株の開発のために低下されたタンパク質発現を伴うクローンを同定するための抗体または免疫グロブリンＬおよび／若しくはＨ鎖産生細胞のプールからの細胞のサブクローンにおける前記遺伝子（配列番号１および配列番号２）若しくは相同物の発現のスクリーニング方法である。
【００３２】
本発明のなお別の態様は、限定されるものでないが免疫学的障害を挙げることができる疾患状態における免疫グロブリン産生の調節における使用のための抗体、免疫グロブリン若しくはそれらの誘導体の産生を調節するための前記遺伝子産物の生物学的若しくは化学的阻害剤または前記遺伝子産物の天然のリガンド／基質の使用である。
【００３３】
本発明のこれらおよび他の態様は、原核生物および真核生物細胞ならびに動物における高められた易変性を生成し得る方法、ならびに抗体、免疫グロブリンおよびそれらの誘導体の大スケール生産に潜在的に有用な突然変異をもつ原核生物および真核生物細胞ならびに動物の提供方法を当該技術に提供する。さらに、本発明は高力価の抗体の製造のための有用な組成物を提供する。最後に、本発明は、その調節が製造のための株の開発における使用のための抗体産生の増大ならびに高若しくは低免疫グロブリン状態を伴う免疫学的障害の処置のための前記遺伝子の調節物質を同定するための合理的スクリーニング方法を考案することをもたらし得る、２種の遺伝子およびそれらのそれぞれの相同物の組成物を当該技術に提供する。
［発明の詳細な記述］
本明細書に引用されるＧｅｎＢａｎｋデータベース配列への受託番号を包含する参照研究、特許、特許出願および学術論文は当業者の知識を確立し、かつ、これにより、それぞれが引用することにより組込まれることをとりわけかつ個別に示された場合と同一の程度までそっくりそのまま引用することにより組み込まれる。本明細書に引用されるいかなる参考文献と本明細の特定の教示との間のいかなる衝突も後者に有利に解決されるべきである。同様に、語若しくは句の技術で理解された定義と、本明細でとりわけ教示されるところの語若しくは句の定義との間のいかなる衝突も後者に有利に解決されるべきである。
【００３４】
当業者に既知の組換えＤＮＡ技術の一般的原理を示している標準的な参照研究は、Ａｕｓｕｂｅｌら  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州プレインビュー（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎら編、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボカレイトン（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード（１９９１）を包含する。
【００３５】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）過程に欠損を伴う細胞若しくは動物の使用（順に、ＤＮＡ修復の有効性を低下させることにより上昇された自発的突然変異率をもたらす）を使用することによる高抗体産生細胞の開発方法が発見された。ＭＭＲ欠陥細胞若しくは動物を利用して、目的の遺伝子中に新たな突然変異を発生させる。抗体、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子若しくはそれらの誘導体の産生のための、ハイブリドーマ；Ｉｇ  ＬおよびＨ鎖若しくは誘導体をコードする遺伝子でトランスフェクトした哺乳動物、植物、酵母若しくは細菌細胞のような細胞を包含するＭＭＲ欠陥細胞の使用は、抗体、免疫グロブリン若しくは誘導体ポリペプチドの高められた産生を有するサブクローンをもたらし得る。ミスマッチプルーフリーディングともまた呼ばれるＭＭＲの過程は、細菌から哺乳動物細胞までの範囲にわたる細胞中でタンパク質複合体により実施される（Ｍｕｌｌｅｒ  Ａ、Ｆｉｓｈｅｌ  Ｒ．（２００２）“Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｏｎ−ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＨＮＰＣＣ）”Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０：１０２−９）。ＭＭＲ遺伝子はこうしたミスマッチ修復複合体のタンパク質の１つをコードする遺伝子である。作用機序のいずれかの特定の理論により束縛されることを欲しないとは言え、ＭＭＲ複合体は、ヌクレオチド塩基の非相補的対形成に由来するＤＮＡらせんの歪みを検出すると考えられている。より新たなＤＮＡ鎖上の非相補的塩基が摘除され、そして摘除された塩基はより古いＤＮＡ鎖に相補的である適切な塩基で置き換えられる。こうして、細胞は、ＤＮＡ複製における誤りの結果として生じる多くの突然変異を排除する。
【００３６】
所定のＭＭＲ遺伝子の部位特異的遺伝子突然変異によるドミナントネガティブのアレル若しくは双方のアレルの不活性化はＭＭＲ欠陥表現型を生じ得る。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブのアレルの一例はコドン１３４に短縮突然変異を有するヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４である。該突然変異はこの遺伝子の産物を１３４番目のアミノ酸の位置で異常に終止させ、Ｎ末端の１３３アミノ酸を含有する短縮されたポリペプチドをもたらす。こうした突然変異は、ＤＮＡ複製後に細胞中に蓄積する突然変異率の増大を引き起こす。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブのアレルの発現は、野性型アレルの存在下であってもミスマッチ修復活性の減損をもたらす。こうした影響を生じるいかなるアレルも本発明で使用し得る。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブのアレルはヒト、動物、酵母、細菌若しくは他の生物体の細胞から得ることができる。こうしたアレルは欠陥ＭＭＲ活性について細胞をスクリーニングすることにより同定し得る。さらに、所定のＭＭＲ遺伝子の双方のコピーの不活性化もまた欠陥ＭＭＲにつながり得る。癌を伴う動物若しくはヒトからの細胞を欠陥ミスマッチ修復についてスクリーニングし得る。結腸癌患者からの細胞がとりわけ有用であるかもしれない。ＭＭＲタンパク質をコードするいかなる細胞からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡも野性型配列からの変異について分析し得る。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブのアレル若しくは不活性化されたアレルはまた、例えばｈＰＭＳ２−１３４アレル若しくは他のＭＭＲ遺伝子のバリアントを製造することによっても人工的に創製し得る。部位特異的突然変異誘発の多様な技術を使用し得る。超易変細胞若しくは動物の生成における使用のためのこうしたアレル（天然であれ人工であれ）の適合性は、１種若しくはそれ以上の野性型アレルの存在下で該アレルにより引き起こされるミスマッチ修復活性を試験してそれがドミナントネガティブのアレルであるか不活性化されたアレルであるかを決定することにより評価し得る。
【００３７】
当業者により使用される方法は、高められたＤＮＡ超易変性をもたらすＭＭＲ遺伝子の内因性の活性を抑制するのにもまた使用し得る。こうした方法は、限定されるものでないがＲＮＡ干渉、リボザイム、アンチセンスベクター、体細胞ノックアウト、細胞内抗体などを挙げることができる分子の使用を使用する。
【００３８】
欠陥ミスマッチ修復を伴う細胞若しくは動物は超易変性になることができる。これは、ＭＭＲを巧みに行う細胞若しくは動物に比較してこうした細胞若しくは動物の自発的突然変異率が上昇されていることを意味している。自発的突然変異率の上昇の程度は、正常な細胞若しくは動物のものの最低２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍若しくは１０，０００倍であり得る。限定されるものでないがスルホン酸メタン、スルホン酸ジメチル、Ｏ６−メチルベンザジン、ＭＮＵ、ＥＮＵなどを挙げることができる化学物質変異原の使用をＭＭＲ欠陥細胞で使用して、ＭＭＲ欠陥それ自身のものの追加の１０ないし１００倍に率を増大させ得る。
【００３９】
本発明の一局面により、ドミナントネガティブの形態のＭＭＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入することによりＭＭＲ欠陥抗体産生体細胞を生成させ得る。該遺伝子はＭＭＲ複合体の一部であるタンパク質をコードするいかなるドミナントネガティブのアレル、例えばＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５若しくはＭＳＨ６でもあり得る（Ｂｏｃｋｅｒ  Ｔ、Ｂａｒｕｓｅｖｉｃｉｕｓ  Ａ、Ｓｎｏｗｄｅｎ  Ｔ、Ｒａｓｉｏ  Ｄ、Ｇｕｅｒｒｅｔｔｅ  Ｓ、Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｄ、Ｓｃｈｉｍｉｄｔ  Ｃ、Ｂｕｒｃｚａｋ  Ｊ、Ｃｒｏｃｅ  ＣＭ、Ｃｏｐｅｌａｎｄ  Ｔ、Ｋｏｂａｔｉｃｈ  ＡＪ、Ｆｉｓｈｅｌ  Ｒ．（１９９９）“ｈＭＳＨ５：ａ  ｈｕｍａｎ  ＭｕｔＳ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｗｉｔｈ  ｈＭＳＨ４  ａｎｄ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：８１６−２２）。ドミナントネガティブのアレルは天然に存在し得るか若しくは実験室で作成し得る。ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ若しくは化学的に合成したポリヌクレオチドの形態にあり得る。
【００４０】
本発明の別の局面により、抗体、Ｉｇ遺伝子若しくは誘導体を産生するＭＭＲ欠陥細胞株が生成されて産生体細胞を生じるこうしたタンパク質をコードする遺伝子のトランスフェクションにより高抗体、Ｉｇ若しくは誘導体タンパク質を生成させるのに、ＭＭＲサブユニットの１つ若しくは組合せ中にゲノム欠損を伴う細胞株若しくは組織を使用し得る。その後、産生体細胞のプールをクローン化して高められた産生を伴うサブクローン（高力価株と称される）を同定する。その後、内因性の欠陥ＭＭＲ遺伝子について是正かつ補正してそれにより遺伝子的に安定な高力価産生体株を生成させ得る野性型遺伝子若しくはＤＮＡフラグメントを含有するポリヌクレオチドの導入により、高力価株を遺伝子的に安定にする。
【００４１】
ポリヌクレオチドを、ドミナントネガティブ若しくは野性型ＭＭＲ遺伝子の発現を調節し得る、構成的に活性のプロモーターセグメント（限定されるものでないがＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、ユビキチン若しくはＬＴＲ配列を挙げることができる）またはステロイドで誘導可能なｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターにクローン化し得る。ポリヌクレオチドはトランスフェクションにより細胞に導入し得る。
【００４２】
本発明の別の局面により、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子、一組のＩｇ遺伝子またはＩｇ遺伝子の全部若しくは部分を含有するキメラ遺伝子をＭＭＲ欠陥細胞宿主にトランスフェクトし得、該細胞を増殖させ、そして上昇されたレベルの抗体、Ｉｇ若しくはそれらの誘導体を産生するクローンについてスクリーニングする。ＭＭＲ欠陥細胞はヒト、霊長類、哺乳動物、げっ歯類、植物、酵母若しくは原核生物界のものであってよい。高められた産生を伴う抗体、免疫グロブリン若しくは誘導体タンパク質をコードするＭＭＲ欠陥細胞は、増大された遺伝子発現、安定性、プロセシングおよび／若しくは分泌のためにより高められた産生を有するかもしれない。高産生体サブクローンを遺伝子的に分析して、変えられた機能が高められた抗体若しくはＩｇ産生をもたらす変えられた遺伝子産物を同定し得る。抗体／Ｉｇ増強体（ｅｎｈａｎｃｅｒ）遺伝子の単離方法は当該技術分野で既知のいかなる方法を使用して達成してもよい。候補遺伝子は、トランスフェクションを介して前記遺伝子（１種若しくは複数）を親株に導入して抗体、免疫グロブリン若しくはそれらの誘導体の産生を高める変えられた遺伝子の能力を測定することにより候補遺伝子の発現若しくは機能を変えることにより検証する。
【００４３】
トランスフェクションはポリヌクレオチドを細胞中に導入するいずれかの方法である。トランスフェクションの方法は生存する動物で、例えば遺伝子治療のためのベクターを使用して実施し得るか、または、それはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば培養物中の１個若しくはそれ以上の単離された細胞の懸濁液を使用して実施し得る。細胞は、例えばヒト若しくは他の霊長類、哺乳動物または他の脊椎動物、無脊椎動物、および原生動物、酵母若しくは細菌のような単細胞生物体から単離された細胞を包含するいずれの型の原核生物若しくは真核生物細胞でもあり得る。
【００４４】
一般に、トランスフェクションは細胞の懸濁液若しくは単一細胞を使用して実施することができるか、しかし、トランスフェクトされた細胞が増殖かつ利用されることを可能にするように、処理される細胞若しくは組織の十分な画分がポリヌクレオチドを取り込む限りは、他の方法もまた適用し得る。ポリヌクレオチドのタンパク質産物は細胞中で一過性に発現されても安定に発現されてもよい。トランスフェクションの技術は公知である。ポリヌクレオチドを導入するのに利用可能な技術は、限定されるものでないが、電気穿孔法、形質導入、細胞融合、微小注入法、塩化カルシウムの使用、および目的の細胞との融合のための脂質と一緒のポリヌクレオチドのパッケージングを挙げることができる。細胞が候補遺伝子で一旦トランスフェクトされれば、該細胞を培養物中で増殖かつ再生させ得る。遺伝子が多くの細胞世代の間一貫したレベルで発現されるようにトランスフェクションが安定である場合には、細胞株が生じる。
【００４５】
単離された細胞は、個々の細胞を機械的に分離しかつ酵素例えばコラゲナーゼ若しくはトリプシンでの組織の前処理を伴い若しくは伴わないかのいずれかで適する細胞培地にそれらを移すことにより植物若しくは動物の組織から得られる細胞である。こうした単離された細胞は、典型的には他の型の細胞の非存在下で培養する。候補の抗体／Ｉｇ増強体遺伝子の導入に選択される細胞は、初代細胞培養物若しくは不死化細胞株の形態の真核生物若しくは原核生物生物体に由来してよいか、または、単細胞生物体の懸濁液に由来してよい。
【００４６】
抗体過剰産生細胞中の変異体遺伝子は、例えば目的の遺伝子と関連するゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ若しくはアミノ酸の配列を検査することにより細胞若しくは動物の遺伝子型の変化について分析することにより検出し得る。突然変異はまた抗体の産生若しくはＩｇ力価についてスクリーニングすることによっても検出し得る。変異体ポリペプチドは、電気泳動移動度、分光学的特性、または変異体遺伝子によりコードされるタンパク質の他の物理的若しくは構造的特徴の変化を同定することにより検出し得る。ｉｎ  ｓｉｔｕで、単離された形態で若しくはモデル系においてもまたタンパク質の変えられた機能についてスクリーニングし得る。限定されるものでないがＩｇ分泌を挙げることができる目的の遺伝子の機能と関連する細胞若しくは動物のいずれかの特性の変化についてスクリーニングし得る。
【００４７】
本発明の別の局面は、２種の遺伝子、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）（配列番号１）および内皮単球活性化ポリペプチドＩ（ＥＭＡＰ）（配列番号２）が高力価抗体産生体細胞中で有意に抑制されていることが同定された組成物および使用方法である。機能研究は、アンチセンス技術を使用する親細胞株中でのこれらの遺伝子の低下された発現が高められた抗体産生につながり得ることを示した。逆に、ＡＡＴおよび／若しくはＥＭＡＰのタンパク質若しくは経路のいずれかの活発な発現を欠く高産生体株におけるこれらの遺伝子の過剰発現は抗体発現を抑制し得、産生体細胞からの抗体産生の調節のためのこれらの遺伝子の有用性を示す。
【００４８】
本発明の別の局面は、抗体／Ｉｇ遺伝子産生を高める方法としての遺伝子経路の小分子の使用を示す、増大された抗体産生につながるＡＡＴおよび／若しくはＥＭＡＰ遺伝子産物の生物学的経路を阻害する化学物質阻害剤（第ＷＯ  ０２／０５４８５６号明細書に記述されるもののような）の使用を使用する。
【００４９】
本発明のなお別の局面は、アレルギーおよび炎症のような免疫学に関連した疾患状態における免疫グロブリン遺伝子発現を制御するためのそれらの生物学的経路の調節における使用のための生物学的若しくは化学的剤によるＡＡＴおよび／若しくはＥＭＡＰタンパク質の調節である。
【００５０】
いくつかの態様において、本発明は、単球活性化ポリペプチドＩの発現が阻害されるような単球活性化ポリペプチドＩ遺伝子の欠損を含んでなる抗体分子若しくはそれらのフラグメントの発現のための宿主細胞を含んでなる。これらの細胞は、単球活性化ポリペプチドＩおよび／若しくはα−１−アンチトリプシンの欠失またはこれらの遺伝子の一方若しくは双方中のフレームシフト突然変異のような欠損を有しうる。あるいは、宿主細胞は、単球活性化ポリペプチドＩ遺伝子および／若しくはα−１−アンチトリプシン遺伝子のアンチセンス転写物の発現が該遺伝子の発現を抑制する、前記アンチセンス転写物を含んでなる発現ベクターを含んでもよい。他の態様において、宿主細胞は、単球活性化ポリペプチドＩ遺伝子の発現を破壊するリボザイム、または、タンパク質（１種若しくは複数）の活性を抑制する、単球活性化ポリペプチドＩタンパク質および／若しくはα−１−アンチトリプシンタンパク質に対する細胞内中和抗体（１種若しくは複数）を含んでもよい。
【００５１】
該宿主細胞は抗体分子を高力価で発現するのに有用であり、かつ、従って完全なヒト抗体、ヒト抗体相同物、ヒト化抗体相同物、キメラ抗体相同物、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）抗体フラグメント、一本鎖抗体、ならびに抗体Ｈ若しくはＬ鎖の単量体若しくは二量体またはそれらの混合物をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。
【００５２】
本発明の細胞は哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞および酵母細胞を包含してよい。
【００５３】
本発明の方法はまた、高力価の抗体を発現している本発明の細胞のゲノムを再安定化することも含んでよい。これは、ドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子がクローン化され、Ａｂ産生細胞に導入されかつ該細胞が誘導体（ｉｎｄｕｃｅｒ）分子および／若しくは条件の存在下で培養される、誘導可能なベクターの使用により達成し得る。誘導可能なベクターは、限定されるものでないが、ステロイドで誘導可能なＭＭＴＶ、テトラサイクリンに調節されるプロモーターのような化学物質で調節されるプロモーター、温度感受性のＭＭＲ遺伝子アレル、および温度感受性のプロモーターを挙げることができる。これはまた、選択された細胞からドミナントネガティブのアレルを含有するベクターを取り出すための手順によっても達成されるかもしれない。細胞からプラスミドを取り出すためのこうした手順は当該技術分野で公知である。
【００５４】
本発明の背景に関するさらなる情報について、以下の参考文献を参考にしてよく、それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる：
【００５５】
【表１】
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【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
上の開示は本発明を全般的に記述する。より完全な理解は、具体的説明のみの目的上本明細書に提供されかつ本発明の範囲を制限することを意図していない以下の特定の実施例へに言及により得ることができる。
【実施例】
【００５９】
［実施例１］
高められた抗体／免疫グロブリン産生体株を生成するためのミスマッチ修復欠陥細胞の生成。
【００６０】
それ以外はＭＭＲを巧みに行う細胞におけるドミナントネガティブのアレルの発現はこれらの宿主細胞ＭＭＲを欠陥にし得る。ＭＭＲ欠陥細胞の創製は、宿主生物体の子孫のゲノム全体を通じての遺伝子変化の生成につながり得、変えられた特性を伴う生化学物質を産生するかもしれない遺伝子的に変えられた子孫若しくは同胞の集団を生じる。
【００６１】
ＭＭＲ欠陥細胞が、限定されるものでないがげっ歯類ハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマ、ヒト免疫グロブリン遺伝子産物を産生する代理げっ歯類細胞、免疫グロブリン遺伝子を発現する代理ヒト細胞、一本鎖抗体を産生する真核生物細胞、ならびに哺乳動物免疫グロブリン遺伝子および／若しくは一本鎖抗体内に含有されるもののようなキメラ免疫グロブリン分子を産生する原核生物細胞を挙げることができる高力価抗体産生体細胞を創製するのに有用であることが発見された。抗体を製造するのに使用される上述された細胞発現系は抗体治療薬の当業者により公知である。
【００６２】
ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブのアレルを使用するＭＭＲ欠陥代理細胞株およびハイブリドーマを創製する能力を示すために、われわれは最初に、本明細書でＰＭＳ１３４と呼ばれる以前に公開されたドミナントネガティブのＰＭＳ２変異体を含有する発現ベクター（Ｈ３４と称される細胞株）、若しくは空のベクター（Ｈ６ｖｅｃと称される細胞株）で、ＩｇＥタンパク質に対し向けられた抗体を産生することが既知であるマウスハイブリドーマ細胞株（Ｈ６と称される細胞株）、若しくはげっ歯類、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）株（ＣＨＯ−Ｐと称される親およびＣＨＯ−３４と称されるドミナントネガティブのＭＭＲ細胞）をトランスフェクトした。結果は、ＰＭＳ１３４変異体が、活発なドミナントネガティブの影響を発揮して、ＭＭＲ欠損の特質であるレポーター遺伝子（示されない）のマイクロサテライトの不安定性を高める能力、ならびに当業者により既知の方法（Ｑｉａｎ  Ｙ、Ｙｕ  Ｙ、Ｃｈｅｎｇ  Ｘ、Ｌｕｏ  Ｊ、Ｘｉｅ  Ｈ、Ｓｈｅｎ  Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈＭＳＨ２  ｉｎ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  １９９８  ４１８：６１−７１）を使用して選択的条件下で増殖させ得るサブクローンに至るヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子のような代謝遺伝子中の突然変異の蓄積に至る増大された点突然変異により決定されるところのＭＭＲ欠損の生化学的および遺伝子的明示をもたらすことを示した。表１に示されるとおり、標準的増殖の過程にわたって蓄積した自発的ＨＰＲＴ変異体を除去するようＣＨＯ細胞を予め選択し、そしてその後欠損されたＨＰＲＴについてスクリーニングして突然変異誘発率を決定した。簡潔には、ＣＨＯ−ＰおよびＣＨＯ−３４細胞をその後４０倍加の間増殖させ、そして、１０万個の細胞を、成長培地中６．７μｇ／ｍｌの６−チオグアニンを使用してＨＰＲＴ遺伝子座での突然変異について選択しかつ第１０日に耐性コロニーについて評価した。コロニー数はスクリーニングした１００万個の細胞に基づく。
【００６３】
【表４】
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【００６４】
ＭＭＲ欠陥細胞は今や、免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされかつ高められた力価収量を伴うサブクローンを同定するためスクリーニングされる、または、ハイブリドーマのような発現される免疫グロブリンＬおよびＨ鎖を既に含有する細胞の場合には拡張されかつ高力価産生株について直接スクリーニングされる準備ができている。
［実施例２］
遺伝子発見のための増大された免疫グロブリン産生を伴うハイブリドーマクローンのスクリーニング。
【００６５】
本文書内に提示される方法の一応用は、高力価を生成させるためのＭＭＲ欠陥ハイブリドーマ若しくはＣＨＯ（実施例１、表１を参照されたい）、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰＯ−２などのような免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ得るＭＭＲ欠陥代理細胞の使用である。本応用の一具体的説明すなわちマウスＩｇＧモノクローナル抗体を産生するマウスＭＭＲ欠陥細胞株を２０世代の間増殖しそしてクローンを９６ウェルプレート中で単離しかつ抗体産生をスクリーニングしたＨ３４ハイブリドーマを本実施例内に示す。宿主細胞株のゲノム内の変化によることが推定される高レベルの抗体を産生するクローンを同定するためのスクリーニング手順は、高められた抗体力価を産生するクローンについてスクリーニングするためのプレート酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を使用するアッセイである。Ｈ６親若しくはＨ３４プールからの単一細胞を含有する９６ウェルプレートを、クローンがドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子発現ベクターを保持することを確実にするため成長培地（ＲＰＭＩ  １６４０および１０％ウシ胎児血清）ならびに０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中で９日間増殖させた。９日後に、独立したクローンからの５０μｌの馴化した上清で９６ウェルプレートを４℃で４時間被覆する抗Ｉｇ  ＥＬＩＳＡを使用してプレートをスクリーニングした。カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理的食塩水溶液（ＰＢＳ−／−）でプレートを３回洗浄しかつ５％粉乳を含有する１００μｌのＰＢＳ−／−で室温で１時間ブロッキングした。その後プレートをＰＢＳ−／−で３回洗浄しかつ３０００倍希釈のヒツジ抗マウスワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体を含有する５０μｌのＰＢＳ−／−溶液とともに室温で１時間インキュベートした。その後プレートをＰＢＳ−／−で３回洗浄しかつ５０μｌのＴＭＢ−ＨＲＰ基質（ＢｉｏＲａｄ）とともに室温で１５分間インキュベートして各クローンにより産生される抗体の量を検出した。５０μｌの５００ｍＭ重炭酸ナトリウムを添加することにより反応を停止し、そしてＢｉｏＲａｄプレートリーダーを使用しての４５０ｎｍでのＯＤにより分析した。その後、バックグラウンド細胞（Ｈ６対照細胞）を上回る高められたシグナルを表すクローンを単離しかつ三重の実験での付加的な特徴付けおよびＥＬＩＳＡデータの確認のため１０ｍｌ培養物に拡張した。その後、増大されたＥＬＩＳＡシグナルを生じかつ増大された抗体レベルを有するクローンを、実施例４に記述されるところの抗体を過剰発現および／若しくは過剰分泌するバリアントについてさらに分析した。それぞれＨ６若しくはＨ３４細胞からの５枚の９６ウェルプレートの分析は、より高い至適密度（ＯＤ）値を伴うかなり多数のクローンがＨ６対照に比較してＭＭＲ欠陥Ｈ３４細胞中で観察されることを見出した。図１は高められたレベルの抗体を産生するＨ３４クローンの代表的一例を示す。図１は、Ｈ３４プレートからのクローンが、抗体分子の過剰産生／分泌に至る細胞宿主の遺伝子変化によりより高いＯＤ示度を有することを示す、陰性対照としての線維芽細胞馴化培地（レーン１）、Ｈ６（レーン２）若しくはＨ３４（レーン３）培養物の９６ウェルの分析��らの主データを提供する。
【００６６】
高められた抗体産生によりより高いＯＤ値を生じるクローンをシークエンシングして、Ｌ若しくはＨ鎖ｃＤＮＡ内で突然変異が起こっていなかったことを確認する。簡潔には、１００，０００細胞を収集し、そして上述されたところのトライゾール法を使用してＲＮＡについて抽出する。ＲＮＡを製造元（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により示唆されるとおりＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを使用して逆転写しかつ完全長のＬおよびＨ鎖についてＰＣＲ増幅する。
【００６７】
これらのデータは、増大された遺伝子発現、タンパク質安定性、プロセシング若しくは分泌により抗体産生を高めることに関与する宿主細胞のゲノム内で起こった推定の構造変化による高められた抗体／Ｉｇ産生を伴うサブクローンを同定するための超易変ハイブリドーマ若しくは増殖かつ選択し得る他のＩｇ産生宿主細胞を生成させる能力を示す。クローンはまた、その後の回のｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異のためさらに拡張することもでき、また、産生を高めることに関与する付加的な遺伝子（１種若しくは複数）内の突然変異の蓄積によるなおより高力価のクローンをスクリーニングし得る。さらに、細胞若しくは生物体全体で付加的な遺伝子突然変異を生じさせるための化学物質変異原の使用は、ＭＭＲ欠陥細胞における突然変異の範囲を「正常」細胞に比較して高め得る。ＭＭＲ欠陥生物体におけるＭＮＵのような化学物質変異原の使用ははるかにより耐性であり、ＭＭＲ欠陥単独を上回る遺伝子突然変異の１０ないし１００倍までの増大を生じる（Ｂｉｇｎａｍｉ  Ｍ、（２０００）Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ  ａ  ｋｉｌｌｅｒ：ＤＮＡ  Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１−８２）。この戦略は、なおより高力価産生体株を生じうる宿主のゲノム内の付加的な突然変異の増大方法として、化学物質変異原の使用をＭＭＲ欠陥抗体産生細胞で使用することを可能にする。
［実施例３］
抗体若しくは分泌型タンパク質産生を高めることに関与する遺伝子を同定するための高力価抗体／免疫グロブリン産生体細胞の使用。
【００６８】
ハイブリドーマ若しくは代理抗体／免疫グロブリン遺伝子産生体細胞の高力価サブクローンを、アレルギーおよび炎症のような免疫学的障害の治療薬開発のための免疫グロブリン産生のアップ若しくはダウンレギュレーションに関与する標的遺伝子および経路を製造かつ／若しくは同定するための普遍的な高力価産生株の開発における使用のために抗体力価を高めることに関与する遺伝子を同定するための遺伝子標的発見のための供給源として使用し得る。化学的若しくはイオン化突然変異誘発に比較してのＭＭＲ由来変異体を使用することの利益は、ＭＭＲに関し不完全である細胞は増大された突然変異率を有するがそれでもなおそれらの無傷の染色体プロファイルを保持しているという観察結果である（Ｌｉｎｄｏｒ  ＮＭ、Ｊａｌａｌ  ＳＭ、Ｖａｎ  ＤｅＷａｌｋｅｒ  ＴＪ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＪＭ、Ｄａｈｌ  ＲＪ、Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ  ＳＮ．Ｓｅｒａｃｈ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｇｅｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  １９９８  １０４：４８−５１）。この特徴は、染色体含量の増大および減少全体が突然変異誘発過程と関連する、化学的および放射突然変異誘発と関連する低下されたバックグラウンドノイズのためバリアントのゲノム分析をより平易にする。
【００６９】
高力価抗体／Ｉｇ若しくは誘導体産生体株中のバリアント遺伝子（１種若しくは複数）を同定するために、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を、当業者により使用される変えられた発現若しくは構造パターンについて比較する。こうした技術は、ゲノムの転写物若しくは逆転写されるＲＮＡ鋳型中の単一ヌクレオチド変化を認識し得る単一ポリヌクレオチド分析（ＳＮＰ分析ともまた称される）；ＲＮＡ発現プロファイルの差異を認識し得るマイクロアレイ若しくは減算分析；または親株とバリアント株との間のタンパク質プロファイルの差異を同定し得るプロテオミクス分析を使用する。候補のＤＮＡ、転写物若しくはタンパク質が一旦同定されれば、過剰発現の表現型を繰り返す候補遺伝子（１種若しくは複数）の能力を示すため、候補を：１．）定常状態のＲＮＡおよび／若しくはタンパク質レベル、ならびに２．）親細胞株における候補遺伝子の変化（変異体遺伝子の過剰発現、抑制および／若しくは導入）により、過剰産生におけるそれらの役割について検証する。
【００７０】
多様な代替物のなかでの発現パターンの検出のための一方法、すなわちＨ６親およびＨ３４高力価株の差次的発現分析を、マイクロアレイ法を使用して実施した。定常状態の転写物の分析は、発現が高力価Ｈ３４細胞株で抑制されている２種の遺伝子（配列番号１および配列番号２）を同定した。双方の遺伝子の発現分析は逆転写酵素と組合せたポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して実施した。推定の遺伝子は、マウスα−１−アンチトリプシン（ＡＡＴと称される）（配列番号１、受託番号Ｉ００５５６；米国特許第ＵＳ  ４７３２９７３号明細書；特許：第ＵＳ  ４７３２９７３−Ａ  ２号明細書）およびマウス内皮単球活性化ポリペプチドＩ（ＥＭＡＰＩと称される）（配列番号２  受託番号Ｕ４１３４１）をコードした。ＲＮＡを記述されるとおり（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＰＭＳ２  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０：１９５−２０６）逆転写した。下に列挙されるところのＡＡＴ  ｃＤＮＡを特異的に増幅して５４０ｂｐの産物を生じ得るおよびＥＭＡＰＩ  ｃＤＮＡを特異的に増幅して２７２ｂｐの産物を生じ得るセンスおよびアンチセンスプライマーを生成させた一方、以前に記述されたとおり（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ９：Ａ  ｃａｎｄｉｃａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ａｓｔｈｍａ．１９９７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１３１７５−１３１８０）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡをＲＮＡの完全性およびプライマーを使用する反応の性能をモニターするための対照として使用した。
プライマー  マウスＡＡＴおよびＥＭＡＰ発現分析
配列番号３  ＡＡＴセンス  ５’−ｔｔｇａａｇａａｇｃｃａｔｔｃｇａｔｃｃ−３’
配列番号４  ＡＡＴアンチセンス  ５’−ｔｇａａａａｇｇａａａｇｇｇｔｇｇｔｃｇ−３’
配列番号５  ＥＭＡＰＩセンス  ５’−ａｔｇｃｃｔａｃａｇａｇａｃｔｇａｇａｇ−３’
配列番号６  ＥＭＡＰＩアンチセンス  ５’−ｇａｔｔｃｇｃｔｔｃｔｇｇｇａａｇｔｔｔｇｇ−３’
ＰＣＲ反応を９５℃３０秒間、５８℃１分間、７２℃１分間で１８ないし３３サイクル実施して直線範囲で発現を測定した。図２は、Ｈ６親およびＨ３４過剰産生体株におけるＡＡＴおよびＥＭＡＰＩ遺伝子の定常状態発現の代表的プロファイルを示す。示されるとおり、ＡＡＴおよびＥＭＡＰＩ双方について親対照に比較して発現の有意の喪失がＨ３４過剰産生体株で観察された。ＤＨＦＲ発現レベルは双方のサンプルについて同様であり、双方のサンプルについての無傷のＲＮＡおよび等しい負荷を示す。これらのデータは、哺乳動物細胞における抗体産生の調節におけるＡＡＴおよびＥＭＡＰＩの役割を示唆する。
【００７１】
これらのタンパク質若しくはそれらの欠如が抗体産生の調節に関与していることを確認するために、われわれは、哺乳動物発現ベクターのセンスおよび／若しくはアンチセンスの向きにクローン化されるべき各遺伝子の完全長ｃＤＮＡを単離した。図３は、マウスα−１−アンチトリプシン（図３Ａ）およびマウス内皮単球活性化ポリペプチドＩ（図３Ｂ）の単離されたｃＤＮＡおよび予測されるコードされるポリペプチドを示す。哺乳動物の系における抗体若しくは免疫グロブリン産生の調節におけるそれらの可能な役割のため、われわれはｂｌａｓｔ検索を行い、そしてそれぞれの種のいずれかに由来する細胞からの抗体／免疫グロブリン産生を高めるために役立ち得るハムスター（配列番号７）、ヒト（配列番号８）、ウサギ（配列番号９）、ラット（配列番号１０）およびヒツジ（配列番号１１）（図３Ｃ）からのＡＡＴ相同物、ならびにウサギ（配列番号１２）、イヌ（配列番号１３）、ヒト（配列番号１４）、ラット（配列番号１５）およびブタ（配列番号１６）（図３Ｄ）からのＥＭＡＰＩ相同物を同定した。
【００７２】
抗体産生の調節におけるＡＡＴおよび／若しくはＥＭＡＰＩの関与を直接確認するために、われわれは、親Ｈ６若しくは過剰産生体Ｈ３４細胞株中でセンスおよびアンチセンスＲＮＡを産生させるための哺乳動物発現ベクターを生成させた。いずれか若しくは双方の遺伝子の抑制が抗体産生に関与している場合には、われわれは、ＡＡＴおよび／若しくはＥＭＡＰ発現レベルを抑制し得るアンチセンスベクターで処理される場合に親株における高められた発現を期待するであろう。逆に、われわれは、いずれか若しくは双方の遺伝子の再確立された発現に際して過剰産生体Ｈ３４細胞において抗体産生レベルを抑制することを期待するはずである。発現ベクターは、構成的に活性の伸長因子１プロモーター、次いでＳＶ４０ポリＡシグナルを含有するｐＵＣに基づくベクター中で生成した。加えて、各ベクターについて二重トランスフェクション／選択を見込むため、ＡＡＴベクターはハイグロマイシンで選択可能なマーカーを有した一方、ＥＭＡＰベクターはネオマイシンで選択可能なマーカーを有した。
【００７３】
アンチセンスＡＡＴおよびＥＭＡＰＩベクターの組合せを、製造元（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）により示唆されるとおりポリリポソームを使用して親Ｈ６細胞にトランスフェクトし、そして、０．５ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢおよびネオマイシン類似物Ｇ４１８を使用して、安定株を選択した。２週間の選択後に安定なクローンを生じ、拡張しかつノーザンおよびＲＴ−ＰＣＲ分析を使用してセンス若しくはアンチセンス遺伝子発現について分析した。その後、各ベクターを発現する陽性クローンを拡張しかつ実施例２に記述されるところのＥＬＩＳＡ分析を使用して抗体産生について試験した。簡潔には、安定株若しくは対照を９６ウェルマイクロタイター皿中に三重でウェルあたり０．２ｍｌの成長培地中５０，０００細胞でプレーティングした。細胞は５％ＣＯ２中３７℃で５日間インキュベートし、そして５０μｌの上清を抗体産生についてアッセイした。図４Ａは、アンチセンスＡＡＴおよびＥＭＡＰＩを発現するＨ６細胞が、親対照すなわちセンスＡＡＴおよびＥＭＡＰＩを発現するＨ６細胞と対照的に高められたレベルの抗体を産生することを示す。逆に、センスＡＡＴおよびＥＭＡＰＩを発現するＨ３４細胞（高められた抗体レベルを発現する）はセンスＡＡＴおよびＥＭＡＰＩを発現するＨ６親と対照的に抑制された抗体産生を有することが見出された（表２）。これらのデータは抗体産生の調節におけるＡＡＴおよびＥＭＡＰＩの関与を示す。さらに、これらのデータは、高力価タンパク質製造株の開発における使用、ならびに高若しくは低免疫グロブリン産生を伴う免疫学的障害におけるそれらの使用のための抗体産生を高める若しくは抑制するためのこれらの遺伝子のそれぞれの発現若しくは機能を調節することの使用をわれわれに教示する。
【００７４】
【表５】
2005533499.tif 000006
【００７５】
［実施例５］
抗体産生を調節するためのα−１−アンチトリプシン経路に対し標的を定めた小分子の使用。
【００７６】
α−１−アンチトリプシンのような天然の阻害剤を抑制することを介してプロテアーゼ活性を増大させることが増大された抗体産生につながるかもしれないという、本出願により教示される知見は、プロテアーゼ活性を変える分子が、製造および／若しくは免疫学的疾患の免疫グロブリン調節における使用のための生産性の増大における使用のため産生体株からの高められた若しくは抑制された免疫グロブリン産生を生成させるために有用でありうることを示唆する。該仮説を試験するために、われわれは最初に、強力なトリプシン阻害剤であるフッ化４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）（Ｌａｗｓｏｎ  ＷＢ、Ｖａｌｅｎｔｙ  ＶＢ、Ｗｏｓ  ＪＤ、Ｌｏｂｏ  ＡＰ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ．Ｆｏｌｉａ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｉｎｔ  Ｍａｇ  Ｋｌｉｎ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  Ｂｌｕｔｆｏｒｓｃｈ  １９８２  １０９：５２−６０）と呼ばれる小分子プロテアーゼ阻害剤を使用した。簡潔には、Ｈ３４細胞を９６ウェルプレート中４ｍＭのＡＥＢＳＦの存在下に１〜３日間インキュベートし、そして上清を抗体産生についてＥＬＩＳＡにより試験した。表３に示されるとおり、Ｈ３４細胞は未処理のＨ３４細胞（４．３μｇ／ｍｌ）に比較して抗体産生の有意の抑制（０．０３１μｇ／ｍｌ）を有した。
【００７７】
次に、われわれは、ＡＡＴに対し向けられた抗血清（抗血清の生成については実施例６を参照されたい）のＨ６株からの抗体産生を遂げる能力を試験した。増大されたプロテアーゼ活性が増大された産生と関連している場合には、プロテアーゼ阻害剤の除去が抗体産生を増大させるとみられる。表３に示されるとおり、抗ＡＡＴの存在下で増殖させたＨ６親細胞は、免疫前血清に曝露されたＨ６細胞（１．６μｇ／ｍｌ）に比較して増大された抗体産生（２．６μｇ／ｍｌ）を有した。これらのデータは、製造のためならびに高若しくは低免疫グロブリン産生と関連する免疫障害を治療するために抗体産生を調節するためのプロテアーゼ活性化物質若しくは阻害剤の使用を意味している。
【００７８】
【表６】
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【００７９】
［実施例６］
高められた若しくは抑制された免疫グロブリン産生についての細胞クローンのスクリーニングのためのα−１−アンチトリプシンおよび／若しくは内皮単球活性化ポリペプチドＩに対する抗体の使用。
【００８０】
産生体株からの高められた抗体産生とのＡＡＴおよびＥＭＡＰＩ発現の関連した欠如は高抗体産生株についてのスクリーニングに有用である。この有用性を示すために、われわれは、当業者により使用される方法を使用して、それらのそれぞれの翻訳されたタンパク質由来のポリペプチド（配列番号１７−ＡＡＴ：（Ｃ）ＱＳＰＩＦＶＧＫＶＶＤＰＴＨＫおよび配列番号１８−ＥＭＡＰＩ（Ｃ）ＩＡＣＨＤＳＦＩＱＴＳＱＫＲＩ）を使用して、マウスＡＡＴおよびマウスＥＭＡＰＩタンパク質に対するモノクローナル抗血清を生成させた。われわれは次に、Ｈ６およびＨ３４細胞の馴化培地中のタンパク質を検出するこれらの抗血清の能力を試験した。双方のタンパク質は分泌型ポリペプチドであるためである。簡潔には、１０，０００細胞からの馴化培地を、定常状態のタンパク質レベルについてアッセイするためのウェスタンブロット分析のため調製した（図４）。簡潔には、細胞を遠心分離によりペレットにし、そして１００μｌの馴化した上清を３００μｌのＳＤＳ溶解緩衝液（６０ｍＭトリス、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）に再懸濁しそして５分間沸騰させた。タンパク質をＩｇ  Ｈ鎖の分析のため４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥゲル上での電気泳動により分離した。ゲルを４８ｍＭトリス塩基、４０ｍＭグリシン、０．０３７５％ＳＤＳ、２０％メタノール中でイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気ブロットし、そしてトリス緩衝生理的食塩水（ＴＢＳ）ならびに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および５％コンデンスミルク中室温で１時間ブロッキングした。フィルターをＴＢＳ緩衝液中１０００倍希釈のマウス抗ＡＡＴ若しくはマウス抗ＥＭＡＰ抗血清で室温で１時間プロービングした。ブロットをＴＢＳ緩衝液単独で３回洗浄し、そしてＴＢＳ緩衝液中１００００倍希釈のヒツジ抗マウスワサビペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体でプロービングしかつスーパーシグナル（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ）基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用する化学発光により検出した。実験は二重で反復して再現性を確かめた。図４は、低産生体Ｈ６親細胞（レーン１）が活発な定常状態のＡＡＴタンパク質レベルを有した一方でＨ３４過剰産生体細胞（レーン２）では発現が観察されなかった代表的分析を示す。これらのデータは、高レベルの抗体すなわち組換えポリペプチドを製造するのに使用し得る高力価産生体株を同定するためのＡＡＴ若しくはＥＭＡＰの発現についての細胞株のスクリーニング方法を示唆する。
【００８１】
上述された結果はいくつかの結論に至る。最初に、ミスマッチ修復欠陥細胞の使用は高力価抗体産生体細胞を生成させるのに使用し得る。第二に、本方法を使用する高力価産生体株の生成を使用して、増大された抗体産生に関与する遺伝子（１種若しくは複数）を同定し得る。最後に、α−１−アンチトリプシンおよび／若しくは内皮単球活性化ポリペプチドＩの発現および／若しくは生物学的活性を調節し得る方法を使用して、製造および／または高若しくは低免疫グロブリン産生を伴う免疫学に基づく障害の処置のために細胞における抗体／免疫グロブリンタンパク質の産生をアップ若しくはダウンレギュレートし得る（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｔｉ−ＩｇＥ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｕｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２−４１３）。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】高められた定常状態の抗体レベルを伴うＭＭＲ欠陥クローンの生成を示す。ＥＬＩＳＡを実施して、親Ｈ６細胞株に比較して馴化培地内の高められた抗体力価収量（＞５００ｎｇ／ｍｌ）を伴うＭＭＲ欠陥Ｈ３４ハイブリドーマクローンからの１０，０００細胞の５日齢培養物からの抗体収量を測定した。レーン１：線維芽細胞（陰性対照）；レーン２：Ｈ６細胞；レーン３：Ｈ３４高力価株。
【図２】免疫グロブリン増強体（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）遺伝子の発現分析を示す。ＡＡＴ（図Ａ）およびＥＭＡＰＩ（図Ｂ）の低下された発現を検証するＲＴ−ＰＣＲ。Ｈ６親およびＨ３４高められた産生体クローンからＲＮＡを逆転写し、そしてＡＡＴ（図Ａ）、ＥＭＡＰＩ（図Ｂ）および対照としてはたらいたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（図Ｃ）についてＰＣＲ増幅した。サンプルは変動する周期の間増幅して定常状態の発現を測定した。マイナス（−）レーンは逆転写酵素を伴わないＲＮＡ過程であり、陰性対照としてはたらいた。
【図３】免疫グロブリン増強体遺伝子の構造を示す。α−１−アンチトリプシンおよび内皮単球活性化ポリペプチドＩ遺伝子産物のヌクレオチドおよびタンパク質配列。
【図４】アンチセンス若しくはセンスのα−１−アンチトリプシンおよび内皮単球活性化ポリペプチドＩを発現するＨ６およびＨ３４細胞の抗体産生分析を示す。図Ａ：アンチセンス抗α−１−アンチトリプシンおよび内皮単球活性化ポリペプチドＩを発現するＨ６細胞のＭＡｂ産生は対照細胞に比較して高められたＭＡｂ産生を示す；図Ｂ：センスα−１−アンチトリプシンおよび内皮単球活性化ポリペプチドＩを発現するＨ３４細胞のＭａｂ産生は対照細胞に比較して抑制されたＭＡｂ産生を示す。
【図５】高力価抗体産生体株についてスクリーニングするためのα−１−アンチトリプシン抗体の使用を示す。Ｈ６親（レーン１）；Ｈ３４過剰産生体株（レーン２）；若しくは抗ＡＡＴおよび高ＥＭＡＰを発現するＨ６高力価産生体細胞から上清を単離し、そして抗α−１−アンチトリプシンについてプロービングした。矢印により示されるとおり、α−１−アンチトリプシンの活発な細胞外産生が低抗体産生体株で観察される一方、高産生体株の上清中には非常にわずかしか存在しない。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａａ】
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【図３Ａｂ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃａ】
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【図３Ｃｂ】
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【図３Ｃｃ】
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【図３Ｃｄ】
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【図３Ｃｅ】
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【図３Ｃｆ】
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【図３Ｄａ】
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【図３Ｄｂ】
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【国際調査報告】
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