(57)【要約】本発明は、細胞における遺伝子発現を、遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を利用して減衰させる方法を提供する。このｄｓＲＮＡは、阻害すべき遺伝子(「標的」遺伝子)の少なくとも一部分のヌクレオチド配列と、細胞の生理的条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を宿主細胞に、標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含み、該ｄｓＲＮＡが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする当該方法。
【請求項２】
宿主細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を宿主細胞に、標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含み、該ｄｓＲＮＡが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする当該方法。
【請求項３】
標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を含む当該組成物。
【請求項４】
標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を、発現時に生成する発現ベクターを含む当該組成物。
【請求項５】
標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を含む当該組成物。
【請求項６】
標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を、発現時に生成する発現ベクターを含む当該組成物。
【請求項７】
ｄｓＲＮＡがハイブリダイズする標的遺伝子の非翻訳配列を、プロモーター配列及びエンハンサー配列よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法又は請求項３若しくは４に記載の組成物。
【請求項８】
宿主細胞を培養に懸濁させる、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が一動物個体内にある、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
標的遺伝子が、宿主細胞のゲノムに組み込まれた遺伝子である、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
標的遺伝子が、異種遺伝子である、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
標的遺伝子が、ウイルス遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、霊長類細胞である、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞が、ヒトの細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｄｓＲＮＡが、短い干渉性の二本鎖ＲＮＡであって、該ＲＮＡが宿主細胞において、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で有意のＰＫＲ依存性応答を生じないことを特徴とする、請求項１及び２の何れかに記載の方法又は請求項３若しくは５に記載の組成物。
【請求項１６】
ｄｓＲＮＡが、１５〜４５塩基対長である、請求項１５に記載の方法又は組成物。
【請求項１７】
ｄｓＲＮＡが、１９〜３０塩基対長である、請求項１５に記載の方法又は組成物。
【請求項１８】
ｄｓＲＮＡが、少なくとも一の転写産物を生成するコード配列を有する発現ベクターによって細胞内で生成され、該転写産物が宿主細胞によりプロセッシングを受けてｓｉＲＮＡになることを特徴とする、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
ｄｓＲＮＡが、ヘアピンＲＮＡであって、該ＲＮＡが宿主細胞によりプロセッシングを受けてｓｉＲＮＡ種になることを特徴とする、請求項１及び２の何れかに記載の方法又は請求項３若しくは５に記載の組成物。
【請求項２０】
標的遺伝子の発現が、少なくとも１０倍減衰される、請求項１及び２の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
下記：
哺乳動物細胞内の短い干渉性二本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)であり又は該ＲＮＡを生じさせて標的遺伝子の発現を減衰させる二本鎖ＲＮＡ(ＤＳＲＮＡ)の医薬製剤；及び
該製剤を患者に投与するためのラベル又は使用説明書(書面及び／又は図解)
を含む医薬パッケージであって、このｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞において、標的遺伝子の発現を減衰させるのに効果的な濃度で有意のＰＫＲ依存性応答を生じない当該医薬パッケージ。
【請求項２２】
ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子の非転写配列又は非コード配列にハイブリダイズする、請求項２１に記載の医薬パッケージ。
【請求項２３】
請求項３〜６の何れかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の細胞内の標的遺伝子の発現を減衰させる方法。
【請求項２４】
標的遺伝子の発現を減衰させることが、細胞の望ましくない増殖又は分化を減少させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
短い干渉性二本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)を生成する方法であって、下記を含む当該方法：
(ｉ)下記：
相補的なセンス及びアンチセンス標的配列を含む二本鎖核酸
ＲＮＡポリメラーゼ
を含むイン・ビトロ転写系を用意し、
該標的配列は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターと隣接し、センス及びアンチセンス標的配列は転写されてアニールしてｓｉＲＮＡを形成することができ；そして
(ｉｉ)該ｓｉＲＮＡを該イン・ビトロ転写系から単離する。
【請求項２６】
ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＮＡポリメラーゼを、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ及びＳＰ６ポリメラーゼよりなる群から選択する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
イン・ビトロ転写系が、ｓｉＲＮＡ種の多彩なライブラリーを生成する標的配列の多彩なライブラリーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
短い干渉性二本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の送達事業を行なう方法であって、下記を含む当該方法：
(ｉ)ユーザーにより指名された配列を有するｓｉＲＮＡ種の注文を受理し；
(ｉｉ)下記：
該ユーザーが指名したｓｉＲＮＡ種についての相補的なセンス及びアンチセンス配列の標的配列を有する二本鎖核酸、及び
ＲＮＡポリメラーゼ
を含むイン・ビトロ転写系を用意し、該標的配列は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターと隣接し、センス及びアンチセンス標的配列は転写され、アニールしてｓｉＲＮＡを形成することができ；
(ｉｉｉ)該ｓｉＲＮＡを該イン・ビトロ転写系から単離し；そして
(ｉｖ)該ｓｉＲＮＡを梱包して該ユーザーに送付する。
【請求項３０】
ドナー幹細胞又はその子孫のＭＨＣ表現型を変える方法であって、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を幹細胞に、該ＲＮＡを導入しなければ該幹細胞又はその子孫によって発現されたＭＨＣ遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含む当該方法。
【請求項３１】
ｄｓＲＮＡが、少なくとも一つのヒト白血球抗原(ＨＬＡ)の発現を減少させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも一つのＭＨＣ遺伝子の発現の、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)のドナー幹細胞への導入による安定な減衰から生じる変化したＭＨＣ表現型を有するドナー幹細胞又はその子孫の培養物。
【請求項３３】
患者の移植の方法であって、下記を含む当該方法：
(ｉ)少なくとも一つのＭＨＣ遺伝子の発現の、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)のドナー幹細胞への導入による安定な減衰から生じた変化したＭＨＣ表現型を有するドナー幹細胞又はその子孫のエキス・ビボ細胞又は組織培養を生成し
(ｉｉ)該患者に、該細胞又は組織培養物を移植する。
【請求項３４】
患者への移植のための細胞性医薬の製造における幹細胞の利用であって、該細胞性医薬が、幹細胞又はその子孫を含み、それらが、少なくとも一つのＭＨＣ遺伝子の発現の、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の幹細胞への導入による安定な減衰から生じた変化したＭＨＣ表現型を有する当該利用。
【請求項３５】
請求項３〜６の何れかに記載の組成物の、少なくとも一つの遺伝子の発現をイン・ビボで減衰させる医薬の製造における利用。
【請求項３６】
宿主細胞の病原体の感染に対する罹病性を低下させる方法であって、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を該宿主細胞に、該病原体の発現に必要な少なくとも一つの遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含む当該方法。
【請求項３７】
病原体がウイルスであり、ｄｓＲＮＡが、該ウイルスの宿主細胞への感染に必要な細胞表面タンパク質の発現を減衰させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
二本鎖ＲＮＡ転写産物をコードする導入遺伝子を含む生殖細胞系列及び／又は体細胞を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、該転写産物は、プロセッシングを受けて短い干渉性の二本鎖ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)種になり、該導入遺伝子の転写が、該動物の少なくとも一つの細胞型において、内因性標的遺伝子の発現を減衰させることを特徴とする当該トランスジェニック動物。
【請求項３９】
前記の導入遺伝子についてキメラである、請求項３８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４０】
前記の導入遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項３８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４１】
導入遺伝子が、別個の相補的転写物を転写し、該転写物はアニールして前記のｓｉＲＮＡを形成し、該ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で、有意のＰＫＲ依存性応答を生じないことを特徴とする、請求項３８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４２】
導入遺伝子が、ヘアピンＲＮＡを転写し、該ＲＮＡがプロセッシングを受けて前記のｓｉＲＮＡになる、請求項３８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４３】
ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第一のヌクレオチド配列、及び該第一のヌクレオチド配列の相補的逆向き反復であって該第一のヌクレオチド配列とハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第二のヌクレオチド配列を含むヘアピンＲＮＡであって、このヘアピンＲＮＡは、該標的遺伝子の発現を減衰させて、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で有意のＰＫＲ依存性応答を生じないことを特徴とする当該ヘアピンＲＮＡ。
【請求項４４】
ヘアピンＲＮＡが、化学合成されたものである、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４５】
ヘアピンＲＮＡが、イン・ビトロで酵素により合成されたものである、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４６】
ヘアピンＲＮＡが、イン・ビトロでＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成されたものである、請求項４５に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４７】
ヘアピンＲＮＡが、イン・ビボで酵素により合成されたものである、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４８】
ヘアピンＲＮＡが、イン・ビボでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより合成されたものである、請求項４７に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項４９】
ヘアピンＲＮＡが、ベクターにより生成されたものである、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項５０】
ヘアピンＲＮＡが、約２０〜５０ヌクレオチドのサイズを有する、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項５１】
ヘアピンＲＮＡが、約５０〜１００ヌクレオチドのサイズを有する、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項５２】
ヘアピンＲＮＡが、約１００〜５００ヌクレオチドのサイズを有する、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【請求項５３】
ヘアピンのループ内に制限酵素部位を含む、請求項４３に記載のヘアピンＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
「ＲＮＡ干渉」「転写後遺伝子サイレンシング」「抑止（quelling）」とは、導入遺伝子の過剰発現又は誤発現、あるいは細胞内への二本鎖ＲＮＡの意図的な導入が原因で起こる、同様の効果の異なる名称である［Fire A（1999）Trends Genet 15：358-363；Sharp PA（1999）Genes Dev 13：139-141；Hunter C（1999）Curr Biol 9：R440-R442；Baulcombe DC（1999）Curr Biol 9：R599-R601；Vaucheret他（1998）Plant J 16：651-659参照］。二本鎖ＲＮＡを例えば線虫Ｃ．エレガンス（Caenorhabditis elegans）に注入すると、相同な内因性ＲＮＡの転写後喪失が全身で起こる［Fire他（1998）Nature 391：806-811；及びMontgomery他（1998）PNAS 95：15502-15507参照］。ＲＮＡ干渉（しばしばＲＮＡｉと称される）は、クローン化遺伝子を特異的かつ強力に不活性化する方法を提供し、又、遺伝子機能を研究するための強力な手段であることが判明しつつある。たとえその現象がそれ自体興味深いものであっても、その機能はまだ解明されていないが、例えばSmardon他（2000）Curr Biol 10：169-178などの近年の研究によって、ＲＮＡｉの根底にある生物学的過程における性質と進化について、明らかになりつつある。
【０００２】
ＲＮＡｉは、アンチセンスＲＮＡを用いてＣ．エレガンス遺伝子を不活性化する研究において、センス鎖ＲＮＡを注入したところ、遺伝子機能の阻害についてアンチセンスＲＮＡと同様に効果的であったという知見を得たことに基づいて、発見されたものである［Guo他（1995）Cell 81：611-620］。更なる研究の結果、イン・ビトロでのＲＮＡ調製に混入した少量の二本鎖ＲＮＡが活性物質であることが判明した。その後間もなく研究者によってＲＮＡｉの「法則」及び効果が判明しているが、これは、この効果を媒介する機構について考えるための模範となっている。エキソン配列が必須である一方、イントロン及びプロモーター配列はＲＮＡｉを弱めることも影響を与えることもない（ただしこの法則には遺伝子特異的な例外もありうる）。ＲＮＡｉは全身に作用する。即ち、ある組織に注入するだけで、動物全身にわたって細胞内の遺伝子機能を阻害する。Ｃ．エレガンス及び他の生物体を用いた様々な実験の結果、ＲＮＡｉは、ＲＮＡプロセッシング後の細胞ＲＮＡを不安定にするように作用することが示されている。
【０００３】
ＲＮＡｉの効力に注目した簡単な実験で、顕著な結果が得られている［Timmons及びFire（1998 Nature 395：854）］。Ｃ．エレガンスのｕｎｃ−２２遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡを発現するように遺伝子工学処理されたバクテリアを線虫に餌として与えたところ、驚くべきことに、これらの線虫は、食物源に依存するｕｎｃ−２２突然変異体の表現型と同様の表現型を示した。大量の線虫を遺伝子特異的二本鎖ＲＮＡに条件付きで接触させることができるので、これを用いて、ＲＮＡｉ欠陥を有するＣ．エレガンス突然変異体を選択し次いで相当する遺伝子を同定する、非常に強力なスクリーニングの基礎を構築することができた。
【０００４】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ショウジョウバエ、Ｃ．エレガンス、プラナリア、ヒドラ、トリパノソーマ、菌類及び植物といった多くの生体内で遺伝子サイレンシングを誘発することができる。しかし、当業者がこの現象を高等真核生物、特に哺乳類細胞において再現するには至っていない。あるいは、培養された真核細胞においてこの現象を観察できるということが、先行技術で実証されたことはない。加えて、先行技術により確立された「法則」は、ＲＮＡｉがエキソン配列を必要とするということを教示しており、それ故、イントロン又はプロモーター配列よりなる構築物は、ＲＮＡｉの媒介において効果的な試薬であるとは考えられなかった。本発明は、これらの従来技術の欠陥の各々を扱うことを目的としており、ＲＮＡｉが培養親核生物細胞において観察されうるということと非エキソン配列よりなるＲＮＡｉ構築物が効果的に遺伝子発現を抑制しうるということの両方の証拠を提供する。
【０００５】
発明の概要
本発明の一つの特徴は、標的遺伝子の発現を減衰させるのに充分な量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入することを包含する、培養細胞において標的遺伝子の発現を減衰させる方法にして、前記ｄｓＲＮＡが、標的遺伝子のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含することを特徴とする方法を提供する。
【０００６】
本発明の別の特徴は、哺乳類細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法にして、
（ｉ）細胞内でＤｉｃｅｒ活性又はＡｒｇｏｎａｕｔ活性の片方又は両方を活性化し、そして
（ｉｉ）標的遺伝子の発現を減衰させるのに充分な量のｄｓＲＮＡを細胞に導入する（ここでｄｓＲＮＡは、標的遺伝子のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する）
ことを含む方法を提供する。
ある態様においては、細胞は培養に懸濁される。他の態様においては、細胞は例えば非ヒト哺乳動物等の動物一個体内にある。
【０００７】
ある好ましい態様においては、細胞は（ｉ）Ｄｉｃｅｒ活性をコードする組換え遺伝子、（ｉｉ）Ａｒｇｏｎａｕｔ活性をコードする組換え遺伝子、又は（ｉｉｉ）その両方で遺伝子工学処理される。例えば組換え遺伝子は、配列番号２又は４と、少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよい；あるいは２×ＳＳＣ、２２℃の洗浄条件下で配列番号１又は３とハイブリダイズするコード配列、と定義されるものであってもよい。ある態様においては、組換え遺伝子は例えば、図２４に示すＡｒｇｏｎａｕｔ配列と、少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよい。ある具体例において、組換え体遺伝子は、配列番号２又は４に対する少なくとも６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、８５パーセント、９０パーセント又は９５パーセントのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすることができる。ある具体例において、組換え体遺伝子は、０．２×から２．０×ＳＳＣ(５０〜６５℃)より選択する洗浄ステップを含むストリンジェントな条件化で配列番号１又は３とハイブリダイズするコード配列により規定される。
【０００８】
ある態様においては、（複数の）異種発現構築物を用いないで、例えば遺伝子活性化技術、活性化転写因子の発現、又は遺伝子の発現を誘導する他のシグナル変換タンパク質によって、あるいはタンパク質発現のレベルをアップレギュレートする又はタンパク質の分解を阻害する内因性因子で処理することによって、内因性Ｄｉｃｅｒ遺伝子又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子を活性化することができる。
【０００９】
ある好ましい態様においては、標的遺伝子は細胞の内因性遺伝子である。他の態様においては、標的遺伝子は、病原体遺伝子（例えばウイルス遺伝子）等の、細胞ゲノムに対して異種の遺伝子である。
【００１０】
ある態様においては、細胞は、プロテインキナーゼＲＮＡ活性化（ＰＫＲ）アポトーシスを阻害する作用物質で処理される。例えばＰＫＲの発現の阻害、ＰＫＲの破壊、及び／又はＰＫＲのキナーゼ活性の阻害をする作用物質で処理される。
【００１１】
ある好ましい態様においては、細胞は霊長類細胞、例えばヒト細胞である。
【００１２】
ある好適具体例において、ｄｓＲＮＡの長さは、少なくとも２０、２１又は２２ヌクレオチド長であり、サイズにおいて、例えば、Ｄｉｃｅｒ依存性の開裂により生じるＲＮＡ産物に対応している。ある具体例において、このｄｓＲＮＡ構築物は、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００又は４００塩基である。ある具体例において、このＲＮＡ構築物は、４００〜８００塩基長である。
【００１３】
ある好適具体例において、標的遺伝子の発現は、例えば、未処理の細胞又は標的遺伝子に対応しないｄｓＲＮＡ構築物で処理した細胞と比較して、少なくとも５倍、一層好ましくは少なくとも１０、２０又は５０倍さえ減衰する。
【００１４】
本発明の更に別の面は、培養細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、該細胞中で転写時に標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を生成する「コード配列」を有する発現ベクターを導入することを含み、ｄｓＲＮＡが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む当該方法を提供する。ある具体例において、このベクターは、両方向の転写を引き起こしてコード配列の相補的転写物を形成する(２つの)転写調節配列に操作可能に結合されたｄｓＲＮＡの一本鎖コード配列を含む。他の具体例において、このベクターは、２つのコード配列を含み、それらは、それぞれ、アニールしたときにｄｓＲＮＡを形成する２つの相補的配列を生じさせる。更に別の具体例において、このベクターは、ヘアピンを形成するコード配列を含む。ある具体例において、これらのベクターは、例えばエピソーム性であり、トランスフェクションは、一過性である。他の具体例においては、これらのベクターは、染色体に組み込まれて、例えば、安定にトランスフェクトされた細胞株を生じる。かかる安定な細胞株を形成するための好適なベクターは、米国特許第６，０２５，１９２号及びＰＣＴ公開ＷＯ／９８１２３３９に記載されている(これらを、参考として本明細書中に援用する)。
【００１５】
本発明の他の面は、培養細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、転写時に該細胞において二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で生成する「非コード配列」を有する発現ベクターを導入することを含む当該方法を提供する。この非コード配列は、関心ある標的遺伝子のイントロン又はプロモーター配列を含むことができ、このｄｓＲＮＡは、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のプロモーター又はイントロンのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。ある具体例において、このベクターは、両方向の転写を引き起こして配列の相補的転写物を形成する(２つの)転写調節配列に操作可能に結合されたｄｓＲＮＡのための単一の配列を含む。他の具体例において、このベクターは、２つの配列を含み、それらは、それぞれ、アニールしたときにｄｓＲＮＡを形成する２つの相補的配列を生じさせる。更に別の具体例において、このベクターは、ヘアピンを形成するコード配列を含む。ある具体例において、これらのベクターは、例えばエピソーム性であり、トランスフェクションは、一過性である。他の具体例において、これらのベクターは、染色体に組み込まれて、例えば安定にトランスフェクトされた細胞株を生成する。かかる安定な細胞株の形成に好適なベクターは、米国特許第６，０２５，１９２号及びＰＣＴ公開ＷＯ／９８１２３３９に記載されている(これらを、参考として、本明細書中に援用する)。
【００１６】
本発明の他の面は、哺乳動物の遺伝子の発現を阻止するための二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡを提供する。このｄｓＲＮＡは、０．２×ＳＳＣ、６５℃での洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第一のヌクレオチド配列及び該第一のヌクレオチド配列に相補的な第二のヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
一具体例において、前記の二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも２０、２１、２２、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、８００ヌクレオチド長である。
【００１８】
他の具体例において、前記の二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子と同じである。他の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、一つの哺乳動物遺伝子と同じである。更に別の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で少なくとも一つのヒト遺伝子とハイブリダイズする。更に別の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒト遺伝子と同じである。更に別の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、一つのヒト遺伝子と同じである。
【００１９】
この二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ又はヘアピンであってよく、一時的に発現されても、安定に発現されてもよい。一具体例において、この二本鎖ＲＮＡは、ストリンジェントな条件下で少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第一のヌクレオチド配列、及び第一のヌクレオチド配列の相補的逆向き反復であって且つ該第一のヌクレオチド配列とハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第二のヌクレオチド配列を含むヘアピンである。
【００２０】
該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のコード配列又は非コード配列の何れかとハイブリダイズすることができる。一具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のコード配列とハイブリダイズする。他の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒトの遺伝子のコード配列とハイブリダイズする。他の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のコード配列と同じである。更に別の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒトの遺伝子のコード配列と同じである。
【００２１】
他の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子の非コード配列とハイブリダイズする。他の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒトの遺伝子の非コード配列とハイブリダイズする。他の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子の非コード配列と同じである。更に別の具体例において、該二本鎖ＲＮＡの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒトの遺伝子の非コード配列と同じである。前記の具体例の何れかにおいて、非コード配列は、非転写配列であってよい。
【００２２】
本発明の更に別の面は、細胞において特定の表現型を与える原因である核酸配列を、コード配列であれ非コード配列であれ、同定するためのアッセイであって、該アッセイは、下記：
(ｉ)二本鎖ＤＮＡを生成するためのプロモーターに対して一つの方向性を有する、細胞に由来する核酸配列の多彩なライブラリーを構築し；
(ｉｉ)該多彩なｄｓＲＮＡライブラリーを標的細胞の培養物に導入し；
(ｉｉｉ)該細胞に特定の表現型を与えるライブラリーのメンバーを同定する
ことを含み、該ライブラリーのメンバーに対応する(同一又は相同であるなど)、細胞由来の配列を同定することを特徴とする当該アッセイを提供する。
【００２３】
本発明の更に別の面は、薬物送達事業を行なう方法であって、下記：
(ｉ)ＲＮＡｉにより阻害されたときに表現型として望ましい応答を与える標的遺伝子を、主題のアッセイにより同定し；
(ｉｉ)標的遺伝子の発現又は標的遺伝子の発現産物の活性を阻害する能力により薬剤を同定し；
(ｉｉｉ)工程(ｂ)で同定された薬剤又はその類似体の、動物における効力及び毒性についての治療剤プロファイリングを行ない；そして
(ｉｖ)工程(ｉｉｉ)で許容しうる治療剤プロフィルを有するとして同定された少なくとも一種の薬剤を含む医薬組成物を配合する
ことを含む当該方法を提供する。
【００２４】
この方法は、医薬製剤を販売のために分配するための分配システムを確立する更なる工程及び(適宜)該医薬製剤のマーケティングのための販売グループを確立する工程を含むことができる。
【００２５】
本発明の他の面は、標的を定めた送達の事業を行なう方法であって、下記を含む当該方法を提供する：
(ｉ)ＲＮＡｉにより阻害されたときに表現型として望ましい応答を与える標的遺伝子を主題のアッセイにより同定し；
(ｉｉ)(適宜)該標的遺伝子の治療剤プロファイリングを、動物における効力と毒性について行ない；そして
(ｉｉｉ)該標的遺伝子の素外在の更なる開発の権利を第三者に許諾する。
【００２６】
本発明の別の特徴は、ＲＮＡｉ酵素の発現又は活性を阻害することによって、ＲＮＡｉを阻害する方法を提供する。従って、主題の方法は、Ｄｉｃｅｒ及び／又は２２量体ＲＮＡの活性を阻害することを含んでいてもよい。
【００２７】
更に別の特徴は、ＲＮＡｉ酵素のＲＮＡ成分の配列を改変することによって、ＲＮＡｉの特異性を変える方法に関する。
【００２８】
他の面において、未分化幹細胞又は分化したその子孫における遺伝子発現は、本発明のｄｓＲＮＡの導入により変化される。一具体例において、これらの幹細胞は、胚性幹細胞である。好ましくは、これらの胚性幹細胞は、哺乳動物に由来し、一層好ましくは、非ヒト霊長類に由来し、最も好ましくは、ヒトに由来する。
【００２９】
これらの胚性幹細胞は、当業者に公知の方法によって、胚盤胞ステージの胎児の内部細胞塊(ＩＣＭ)から単離することができる。一具体例において、これらの胚性幹細胞は、以前に樹立された細胞株から得られる。第二の具体例において、これらの胚性幹細胞は、標準的方法によって、デ・ノボで得られる。
【００３０】
他の面において、これらの胚性幹細胞は、核トランスファーの結果である。ドナーの核は、任意の成体、胎児又は胎児組織から、当分野で周知の方法により得られる。一具体例において、ドナーの核は、予め改変されたレシピエントの卵母細胞にトランスファーされる。一具体例において、卵母細胞を、少なくとも一のｄｓＲＮＡを利用して改変する。レシピエントの卵母細胞の典型的な改変には、改変卵母細胞に由来する胎児の子宮壁への上首尾の移植を阻害する、遺伝子又はタンパク質発現における任意の変化が含まれる。子宮壁への移植は、受精した哺乳動物胎児が胚盤胞ステージを超えて進行するのに必須であるので、かかる改変を受けた卵母細胞から生成した胎児は、生存力のある生物体を生じさせることができない。かかる改変の非制限的例には、胚盤胞と子宮壁との間での認識に必要な細胞表面レセプター(例えば、インテグリン)の発現を減じ又は排除するもの、子宮内層のマトリクスを消化し、そうして、適当な移植を可能にするのに必要なプロテアーゼ(即ち、コラゲナーゼ、ストロメリシン及びプラスミノーゲンアクチベーター)の発現を減じ又は排除する改変、並びに胚盤胞が透明帯から孵化するのに必要なプロテアーゼ(即ち、ストリプシン)の発現を減じ又は排除する改変が含まれる。かかる孵化は、移植に必要である。
【００３１】
他の具体例において、胚性幹細胞(改変卵母細胞の受精から得られた胚性幹細胞)、又はそれらの分化した子孫は、少なくとも一のｄｓＲＮＡを利用して改変し又は更に改変することができる。好適具体例において、この改変は、ＭＨＣ発現を減じ又は排除する。この方法で改変された細胞は、レシピエントに許容され、そうして、移植片の拒絶により生じる合併症を回避することができる。かかる改変細胞は、血縁のある又はない患者に移植して細胞の損傷又は喪失により特徴付けられる状態を治療するのに適している。
【００３２】
この発明の他の面において、未分化幹細胞は、成体の幹細胞である。典型的な成体幹細胞には、造血幹細胞、間充織幹細胞、心臓幹細胞、膵臓幹細胞、及び神経幹細胞が含まれるが、これらに限られない。典型的な成体幹細胞には、分化した外胚葉、中胚葉又は内胚葉性派生物を形成することのできる任意の幹細胞が含まれる。成体幹細胞から生じる分化した細胞型の非制限的例には、血液、骨格筋、心筋、心内膜、心膜、骨、軟骨、腱、靭帯、結合組織、脂肪組織、肝臓、膵臓、皮膚、神経組織、肺、小腸、大腸、胆嚢、直腸、肛門、膀胱、雌性及び雄性生殖管、性器及び体腔内層が含まれる。
【００３３】
一具体例において、未分化成体幹細胞、又は分化したその子孫を、少なくとも一のｄｓＲＮＡを用いて変化させて、ＭＨＣ発現を減じ又は排除する。この方法で改変された細胞は、レシピエントに許容され、そうして、移植片拒絶により生じる合併症を回避することができる。かかる改変細胞は、血縁のある又はない患者に移植して、細胞の損傷又は喪失により特徴付けられる状態を治療するのに適している。
【００３４】
この発明の他の面において、胚性幹細胞、未分化成体幹細胞、又は胚性幹細胞若しくは成体幹細胞の分化した子孫を、少なくとも一のｄｓＲＮＡを用いて変化させて、ＨＩＶ感染に必要な遺伝子の発現を減じ又は排除する。好適具体例において、この幹細胞は、造血幹細胞を生じさせることのできるものである。潜在的造血能力を有する改変細胞を、ＨＩＶ又はＡＩＤＳの予防又は治療として患者に移植することができる。
【００３５】
本発明の別の特徴は、ＲＮＡｉ酵素又はその成分の、精製又は半精製調製物に関する。ある態様においては調製物は、ＲＮＡｉ活性を阻害する又は強化する化合物（特に、小型有機分子）の同定に用いられる。例えば、二本鎖ＲＮＡを産生するウイルスで意図的にトランスフェクトした細胞において、低分子の阻害剤を用いて、ｄｓＲＮＡ応答を阻害することができる。
【００３６】
ｄｓＲＮＡ構築物は、１種以上の重合リボヌクレオチド鎖を包含してもよい。リン酸−糖主鎖又はヌクレオシドのどちらかの改変を含んでいてもよい。二本鎖構造は、一本の自己相補的ＲＮＡ鎖で構成されてもよいし、二本の相補的ＲＮＡ鎖で構成されてもよい。ＲＮＡ二本鎖の形成は、細胞内で開始してもよいし、細胞外で開始してもよい。ｄｓＲＮＡ構築物は、細胞１個につき少なくとも１コピーの構築物となる量で導入することができる。二本鎖物質の投与量が多いほど、より効力のある阻害を得ることができる。ＲＮＡの二本鎖領域に相当するヌクレオチド配列が、遺伝子阻害の標的となるという点において、阻害は配列特異的である。ある具体例において、標的遺伝子の一部分と同一のヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ構築物が、阻害には好ましい。標的配列と比べて挿入、欠失及び点突然変異を有するＲＮＡ配列(即ち、標的配列に類似するＲＮＡ配列)も、阻害に有効であることが判明している。従って、当分野で公知のアラインメントアルゴリズムを用い、ヌクレオチド配列間の差異パーセントを計算することによって、配列同一性を最適化することができる。或はＲＮＡの二本鎖領域は、その機能から、標的遺伝子転写物の一部分にハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列として定義することができる。他の具体例において、標的遺伝子の非コード部分と同一のヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ構築物は、阻害に好適である。典型的な非コード領域には、イントロン及びプロモーター領域が含まれる。標的の非コード配列に対して挿入、欠失及び点突然変異を有する配列も又、利用することができる。
【００３７】
この発明の更に別の面は、ｄｓＲＮＡ構築物をコードする導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック哺乳動物であって、該ｄｓＲＮＡが、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列の何れかと同じか又は類似しており、好ましくは細胞のゲノムに安定に組み込まれる当該非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関係する。これらの動物は、例えば、卵母細胞マイクロインジェクションにより得ることができ、その場合、その動物のすべての有核細胞は、導入遺伝子を含み、或は、導入遺伝子をトランスフェクトされた胚性幹(ＥＳ)細胞を利用して得ることができ、この場合、その動物はキメラであって、その有核細胞の一部のみが導入遺伝子を含む。ある場合には、配列依存性ｄｓＲＮＡ応答(例えば、ＰＫＲ応答)も又、導入遺伝子を含む細胞において阻害される。
【００３８】
更に別の具体例において、ｄｓＲＮＡ自体を、遺伝子スプライシングを遂行するためにＥＳ細胞に導入することができ、その表現型は、少なくとも数回の分裂につき、その細胞の子孫に運ばれる。
【００３９】
図面の簡単な説明
図１：Ｓ２細胞におけるＲＮＡｉ。(ａ)ショウジョウバエＳ２細胞を、コピアプロモーターからのｌａｃＺ発現を指示するプラスミドと、図に示すようにヒトＣＤ８又はｌａｃＺのいずれかに相当するｄｓＲＮＡとで、又はｄｓＲＮＡ無しで、トランスフェクトした。(ｂ)Ｓ２細胞を、ＧＦＰ−ＵＳ９融合タンパク質の発現を指示するプラスミドと、図に示すようにｌａｃＺ又はサイクリンＥのいずれかのｄｓＲＮＡとで同時トランスフェクトした。上段は細胞群全体のＦＡＣＳプロファイルを示し、下段はＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。(ｃ)図に示すようにｌａｃＺ、サイクリンＥ、ｆｉｚｚｙ又はサイクリンＡｄｓＲＮＡでトランスフェクトした細胞から全ＲＮＡを抽出した。ノーザンブロットは、トランスフェクトしたｄｓＲＮＡに存在しない配列とハイブリダイズした。
図２：イン・ビトロＲＮＡｉ。(ａ)ショウジョウバエサイクリンＥの最初の６００ヌクレオチド（Ｅ６００）又はｌａｃＺの最初の８００ヌクレオチド（Ｚ８００）のいずれかに相当する転写物を、図に示すようにｌａｃＺ又はサイクリンＥ（ｃｙｃＥ）ｄｓＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした細胞に由来する溶解物中でインキュベートした。インキュベート時間はサイクリンＥについては０、１０、２０、３０、４０及び６０分、ｌａｃＺについては０、１０、２０、３０及び６０分とした。(ｂ)転写物を、サイクリンＥｄｓＲＮＡ（図下部の斜線部分）でトランスフェクトしたＳ２細胞抽出物内でインキュベートした。図に示すように、転写物はｌａｃＺの最初の８００ヌクレオチドあるいはサイクリンＥの最初の６００、３００、２２０又は１００ヌクレオチドに相当した。 Ｅｏｕｔは、トランスフェクトしたｄｓＲＮＡに含まれていない、サイクリンＥｃＤＮＡの一部に由来する転写物である。Ｅ−ｄｓはＳ２細胞にトランスフェクトしたｄｓＲＮＡと同一である。インキュベート時間は０及び３０分とした。(ｃ)サイクリンＥｃＤＮＡ全体に相補的な合成転写物（Ｅａｓ）、最後の６００ヌクレオチドに相補的な合成転写物（Ｅａｓ６００）又は３００ヌクレオチドに相補的な合成転写物（Ｅａｓ３００）を抽出物中で０又は３０分間インキュベートした。
図３：ＲＩＳＣの基質必要条件。サイクリンＥｄｓＲＮＡでトランスフェクトした細胞から抽出物を調製した。アリコートを、サイクリンＥ（Ｅ６００）又はｌａｃＺ（Ｚ８００）基質いずれかを加える前に、３０℃で３０分間インキュベートした。２０μｌのアリコートをそれぞれ、図に示すように、１ｍＭ  ＣａＣｌ2及び５ｍＭ  ＥＧＴＡ；１ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び６０Ｕ小球菌ヌクレアーゼ；１ｍＭ  ＣａＣｌ2及び６０Ｕ小球菌ヌクレアーゼ；又は１０ＵデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び５ｍＭ  ＥＧＴＡと共に予備インキュベートした。３０分の予備インキュベートの後、ＥＧＴＡを含まない試料にＥＧＴＡを添加した。全ての試料に酵母ｔＲＮＡ（１μｇ）を添加した。インキュベート時間は０及び３０分とした。
図４：ＲＩＳＣは潜在的なガイドＲＮＡを含む。(ａ)未加工溶解物又はＳ１００画分（可溶性ヌクレアーゼ活性物質を含む。「方法」の項参照）由来のＲＮＡのノーザンブロットを、サイクリンＥｍＲＮＡのセンス鎖に由来するリボプローブとハイブリダイズさせた。(ｂ)「方法」の項に記載するように可溶性サイクリンＥ特異的ヌクレアーゼ活性物質を分別した。陰イオン交換樹脂で得た画分を、ｌａｃＺ、対照基質（図上部）又はサイクリンＥ基質（図中央）と共にインキュベートした。サイクリンＥｃＤＮＡのセンス鎖に由来する、一様に標識付けした転写物を用いたノーザンブロット法によって、各画分から得たＲＮＡを分析した（図下部）。サイズマーカーとしてＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。
図５：２２量体の産生及びｍＲＮＡの分解は、異なる酵素複合体によって行われる。(ａ)０−１２時間のショウジョウバエ胚又はショウジョウバエＳ２細胞のいずれかから調製した抽出物（「方法」の項参照）を、ショウジョウバエサイクリンＥコード領域の最初の５００ヌクレオチドに相当する二本鎖ＲＮＡに一様に標識付けしたものと共に、０、１５、３０又は６０分間（左から右）インキュベートした。Ｍは合成テンプレートのイン・ビトロ転写によって調製されたマーカーを示す。テンプレートは２２ヌクレオチド転写物を産生するように設計されている。ダブレットの最も可能性のある原因としては、＋１位置における不適当な開始が考えられる。(ｂ)ルシフェラーゼコード領域の最初の５００ｎｔに相当するｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたＳ２細胞から、全細胞抽出物を調製した。Ｓ１０抽出物を３０，０００ｘｇで２０分間回転させ、これを本願明細書における標準ＲＩＳＣ抽出物とした。Ｓ１０抽出物を更に６０分間、１００，０００ｘｇで遠心分離して、Ｓ１００抽出物を調製した。図に示すように、一本鎖ルシフェラーゼｍＲＮＡ又は一本鎖サイクリンＥｍＲＮＡのそれぞれについて、（各組において左から右の順で）０、３０又は６０分間の、ｍＲＮＡ分解アッセイを前述のように実施した。(ｃ)Ｓ１０又はＳ１００抽出物を、（左から右の順で）０、６０又１２０分間、サイクリンＥｄｓＲＮＡと共にインキュベートした。
図６：組換えＣＧ４７９２／Ｄｉｃｅｒによる２２量体の生成。(ａ)Ｔ７エピトープ標識付けされたＤｒｏｓｈａ、ＣＧ４７９２／Ｄｉｃｅｒ−１及びＨｏｍｅｌｅｓｓの発現を誘導するプラスミドで、ショウジョウバエＳ２細胞をトランスフェクトした。標識タンパク質を免疫沈降により細胞溶解物から精製し、サイクリンＥｄｓＲＮＡとインキュベートした。対照として、ショウジョウバエ胚及びＳ２細胞抽出物内でも反応を行った。負の対照として、β−ガラクトシダーゼ発現ベクターでトランスフェクトした細胞から免疫沈降物を調製した。各対のレーンは、０又は６０分で行った反応を示す。合成マーカー（Ｍ）は、図５における符号の説明と同様である。(ｂ)ＣＧ４７９２／Ｄｉｃｅｒ−１、Ｄｒｏｓｈａ及びＨｏｍｅｌｅｓｓのドメイン構造の概略図を示す。(ｃ)ショウジョウバエＤｉｃｅｒ−１（ＣＧ４７９２）のＣ末端８アミノ酸に対して作製した抗血清を用いて、Ｓ２細胞の洗浄剤溶解物から免疫沈降物を調製した。対照として、予免疫血清、並びに過剰の抗原性ペプチドで予備インキュベートした免疫血清を用いて、類似の調製物を作製した。これらの沈降物それぞれとショウジョウバエサイクリンＥの〜５００ｎｔ断片とを共にインキュベートした開裂反応を示す。比較として、ショウジョウバエ胚抽出物内の基質をインキュベートしたものを、平行に電気泳動した。(ｄ)ＡＴＰの存在下又は非存在下で、Ｄｉｃｅｒ免疫沈降物をｄｓＲＮＡ基質と共にインキュベートした。比較として、同一の基質を、ＡＴＰを付加したかあるいはグルコース及びヘキソキナーゼでＡＴＰを枯渇させたＳ２抽出物と共にインキュベートした（「方法」の項参照）。(ｅ)ＧＦＰの最初の５００ｎｔに相当するｄｓＲＮＡに一様に32Ｐ標識付けしたもので、ショウジョウバエＳ２細胞をトランスフェクトした。ヒスチジン標識したショウジョウバエＡｇｏ−２［最近同定されたＲＩＳＣ複合体成分の一つ（Hammond他、in prep）］を用いて、ＲＩＳＣ複合体をアフィニティー精製した。リボソームに連結したままの条件下（ｌｓ、低塩分）又はリボソームからｉ+を可溶性の形状で抽出する条件下（ｈｓ、高塩分）のいずれかで、ＲＩＳＣを単離した。比較として、全溶解物中の標識ＲＮＡのスペクトルを示す。(ｆ)ｄｓＲＮＡをＤｉｃｅｒ免疫沈降と共にインキュベートして作製したガイドＲＮＡを、アフィニティー精製したＲＩＳＣ複合体に存在するガイドＲＮＡと比較した。これらは１種類のヌクレオチドを分離することのできるゲル上で完全に一致して移動した。「対照」と記したレーンは、標識ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたがエピトープ標識付けされたショウジョウバエＡｇｏ−２ではトランスフェクトしていない細胞から、ＲＩＳＣについてアフィニティー精製したものである。
図７：ＤｉｃｅｒはＲＮＡｉに関与する。（ａ）ショウジョウバエＳ２細胞を、２種のショウジョウバエＤｉｃｅｒ（ＣＧ４７９２及びＣＧ６４９３）に相当するｄｓＲＮＡで又はマウスカスパーゼ９に相当する対照ｄｓＲＮＡでトランスフェクトした。これらの細胞の細胞質抽出物を、Ｄｉｃｅｒ活性について調べた。Ｄｉｃｅｒ  ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたものについては、溶解物における活性が７．４分の１に低下した。（ｂ）Ｄｉｃｅｒ−１抗血清（ＣＧ４７９２）を用いて、上記したように処理したＳ２細胞から免疫沈降物を調製した。このアッセイにおいては、Ｄｉｃｅｒ  ｄｓＲＮＡはＤｉｃｅｒ−１の活性を６．２分の１に低下させた。（ｃ）マウスカスパーゼ９  ｄｓＲＮＡ又はＤｉｃｅｒ  ｄｓＲＮＡのいずれかで２日前にトランスフェクトした細胞を、ＧＦＰ発現プラスミドと、ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（対照）又はＧＦＰ  ｄｓＲＮＡのいずれかとで同時トランスフェクトした。３つの異なる実験をＦＡＣＳで定量化した。対照（カスパーゼ９）又はＤｉｃｅｒ  ｄｓＲＮＡのいずれかで予めトランスフェクトした細胞中の、対照（ＧＦＰプラスミド＋ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ）又は発現抑制（ＧＦＰプラスミド＋ＧＦＰｄｓＲＮＡ）細胞数を、ＧＦＰ陽性細胞の相対百分率の比較で示す。
図８：Ｄｉｃｅｒは、進化的に保存されたリボヌクレアーゼである。（ａ）Ｄｉｃｅｒによる２２量体作製のモデル。リボヌクレアーゼＩＩＩの作用について提案されている機能に基づいて、本発明者らはＤｉｃｅｒが基質に対して二量体として作用すると想定した。従って、酵素内での２個のリボヌクレアーゼドメイン（ＲＩＩＩａ及びＲＩＩＩｂ）の位置が、開裂産物の寸法を決めると考えられる。同様に妥当と思われる別のモデルとして、各Ｄｉｃｅｒ酵素のＲＩＩＩａ及びＲＩＩＩｂドメインが、連動して単一位置で開裂するものが考えられる。このモデルにおいては、２個の隣接するＤｉｃｅｒ酵素間の相互作用によって、開裂産物の寸法が決定される。（ｂ）様々な生物体（ショウジョウバエ−ＣＧ４７９２、ＣＧ６４９３、Ｃ．エレガンス−Ｋ１２Ｈ４．８、シロイヌナズナ−ＣＡＲＰＥＬ  ＦＡＣＴＯＲＹ、Ｔ２５Ｋ１６．４、ＡＣ０１２３２８＿１、ヒトヘリカーゼ−ＭＯＩ及びＳ．ｐｏｍｂｅ−ＹＣ９Ａ＿ＳＣＨＰＯ）において想定されるＤｉｃｅｒ同族体のドメイン構造の比較。Ｐｆａｍによる各配列の分析及びＰｓｉ−ｂｌａｓｔ検索の両方によって、ＺＡＰドメインを同定した。推定Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ＤｉｃｅｒにおけるＺＡＰドメインは、Ｐｆａｍによって検出されなかったが、Ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔによって同定された（異なる色で示す）。比較として、ＲＤＥ１／ＱＤＥ２／ＡＲＧＯＮＡＵＴＥファミリーのドメイン構造を示した。なおＺＡＰドメインは、Ｄｉｃｅｒ及びＡＲＧＯＮＡＵＴＥファミリーそれぞれの内部において比較した方が、異なる２ファミリーからのＺＡＰドメインを比較した場合よりも類似している。（ｃ）選択されたＤｉｃｅｒ及びＡｒｇｏｎａｕｔｅファミリーにおけるＺＡＰドメインの整列を示す。整列は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いて行った。
図９：ＲＩＳＣの精製方法。（ＲＮＡｉモデルの第２段階）
図１０：サイジングカラムによるＲＩＳＣ活性の分画。活性は、５００ＫＤ複合体として分別された。又、ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２に対する抗体も、活性と共に分別された。
図１１〜１３：ｍｏｎｏＳ、ｍｏｎｏＱ、ヒドロキシアパタイトカラムによるＲＩＳＣの分画。ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２タンパク質も同時に分画された。
図１４：ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２と他ファミリーメンバーとのアラインメント。
図１５：ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２の確認。Ｓ２細胞を、標識ｄｓＲＮＡ及びＨｉｓ標識ａｒｇｏｎａｕｔｅでトランスフェクトした。ａｒｇｏｎａｕｔｅをニッケルアガロース上で分離し、ＲＮＡ成分を１５％アクリルアミドゲル上で同定した。
図１６：Ｓ２細胞及び胚抽出物を、２２量体産生活性についてアッセイした。
図１７：ＲＩＳＣは、２２量体産生活性分画（Ｄｉｃｅｒ）から分離することができる。回転抽出物（Ｓ１００）では、上清からＲＩＳＣ活性が除去されていたが（左パネル）、Ｓ１００回転抽出物は依然としてＤｉｃｅｒ活性を含んでいた（右パネル）。
図１８：ＤｉｃｅｒはｄｓＲＮＡに対して特異性を有しており、長い基質を好む。
図１９：Ｄｉｃｅｒを幾つかのカラムに分画した。
図２０：ｄｓＲＮＡを２２量体に加工することのできる酵素としてのＤｉｃｅｒの同定。様々なリボヌクレアーゼＩＩＩファミリーのメンバーをＮ末端標識と共に発現させ、免疫沈降して、２２量体産生活性について調べた（左パネル）。右パネルにおいて、Ｄｉｃｅｒに対する抗体は、２２量体産生活性を沈降させた。
図２１：ＤｉｃｅｒはＡＴＰを必要とする。
図２２：Ｄｉｃｅｒは、ＲＩＳＣに存在するＲＮＡと同じサイズのＲＮＡを産生した。
図２３：発現され免疫沈降されたヒトＤｉｃｅｒ同族体は、２２量体産生活性を有する。
図２４：ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２の配列。マイクロシーケンシングによって同定したペプチドを下線で示した。
図２５：ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２の分子特性。イントロンプローブを用いるノーザンブロット法によって、コード配列中のイントロンの存在を調べた。その結果、公知のゲノム配列のものとは異なる５’読み枠が確認された。ポリグルタミン反復配列の数は、ゲノムＰＣＲによって調べた。
図２６：Ｄｉｃｅｒ活性物質は、ヒト細胞においてヒトＤｉｃｅｒ遺伝子を発現させることによって作り出すことができる。宿主細胞を２９３とした。粗抽出物はＤｉｃｅｒ活性を示したが、未トランスフェクト細胞は活性を示さなかった。活性は、ショウジョウバエ胚抽出物に観察されるものと異ならない。
図２７：発現抑制される遺伝子の約５００ｎｔの断片（Ｘ）を、標準的クローニング法を用いて、安定した直列反復として改変ベクター内に挿入した。市販のｃｒｅレコンビナーゼで処理してｌｏｘＰ部位（Ｌ）内で配列を反転し、逆向きの反復配列を作製した。これはｓｂｃ突然変異細菌株（ＤＬ７５９）内で安定に保持され増幅されうる。選択したプロモーター（Ｐ）からのイン・ビボでの転写により、サイレンシングを引き起こすヘアピンＲＮＡが得られる。直接及び逆向き反復構造の保持を確実にするためにゼオシン耐性マーカーを含有させたが、これはイン・ビボでは必須条件ではなく、所望であれば、予じめｍＲＮＡスプライシングして除去することができる［Smith他（2000）Nature 407、319-20］。
図２８：胎生期癌細胞Ｐ１９におけるＲＮＡｉ。１０センチメートルのプレート中のＰ１９細胞を、５μｇのＧＦＰプラスミド及び４０μｇの示したｄｓＲＮＡを利用して(又は、ＲＮＡなしで)、トランスフェクトした。細胞を、蛍光により(上段パネル)及び位相差顕微鏡により(下段パネル)、トランスフェクションの７２時間後に写真撮影し、サイレンシングも又、トランスフェクションの４８時間後に明らかであった。
図２９：ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼのＰ１９細胞におけるＲＮＡｉ。(Ａ及びＢ) Ｐ１９細胞を、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発現を指示するプラスミド及びｄｓＲＮＡ５００量体(Ａ及びＢでそれぞれ示したように２５又は２５０ｎｇ)でトランスフェクトした(それらは、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡに相同であり(ｄｓＦＦ)又は相同でなかった(ｄｓＧＦＰ))。ルシフェラーゼ活性を、示したように、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイした。ホタル対ウミシイタケの活性の比は、ｄｓＧＦＰ対照に対して標準化してある。(Ｃ及びＤ) １２ウェルの培養ディッシュ(２ｍｌの培地)中のＰ１９細胞を、ｐＧＬ３−ＣｏｎｔｒｏｌとｐＲＬ−ＳＶ４０の９：１混合物０．２５μｇ及び示したＲＮＡ２μｇでトランスフェクトした。抽出物をトランスフェクションの９時間後に調製した。(Ｃ)ホタル対ウミシイタケルのシフェラーゼの比を示してある。(Ｄ)ウミシイタケ対ホタルのルシフェラーゼの比を示してある。値は、ｄｓＧＦＰに対して標準化してある。３つの独立した実験の平均を示してあり；エラーバーは、標準偏差を示している。
図３０：右側のパネルは、野生型Ｐ１９細胞への一時的トランスフェクション後のＲＦＰ又はＧＦＰの発現を示している。左側のパネルは、５００ｎｔの二本鎖ＧＦＰヘアピンを安定に発現するＰ１９クローンにおけるＧＦＰ発現の特異的抑制を示している。二本鎖ＧＦＰヘアピンを安定に発現するＰ１９クローンを、ＲＦＰ又はＧＦＰで一時的にトランスフェクトして、ＲＦＰ又はＧＦＰの発現を視覚的検査により評価した。
図３１：マウス胚性幹細胞におけるルシフェラーゼ発現のｄｓＲＮＡによる特異的サイレンシング。１２ウェル培養ディッシュ(１ｍｌの培地)中のマウス胚性幹細胞を、１．５μｇのｄｓＲＮＡと、レポータープラスミドｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ及びｐＲＬ−ＳＶ４０の１０：１混合物０．２５μｇとでトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後に、抽出物を調製してアッセイした。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ比を、ＦＦｄｓ５００につき示してあり；ウミシイタケ対ホタルの比をＲｅｎ  ｄｓ５００につき示してある。両方とも、ｄｓＧＦＰトランスフェクションからの比に対して標準化してある。３つの独立した実験の平均を示してあり;エラーバーは、標準偏差を示している。
図３２：Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞におけるＲＮＡｉ。(Ａ)１２ウェル培養ディッシュ(１ｍｌの培地)中のマウスＣ２Ｃ１２細胞を、１μｇの示したｄｓＲＮＡと、０．２５０μｇのレポータープラスミドｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ及びｐＲＬ−ＳＶ４０とでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、抽出物を調製してアッセイした。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼの比を示してあり；値は、ｄｓＲＮＡなしの対照からの比に対して標準化してある。３つの独立した実験の平均を示してあり；エラーバーは、標準偏差を示している。(Ｂ)１μｇのプラスミドだけで又はワクシニアウイルスＫ３Ｌの活動亢進変異体(Kawagishi-Kobayashi等、2000, Virology 276:424-434)を含むプラスミドで同時トランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞。ウミシイタケ及びホタルのルシフェラーゼ活性の絶対計数を示している。(Ｃ)ｄｓＲＮＡなしの対照に対して標準化したＢからのホタル／ウミシイタケ活性の比。
図３３：フォティナス・ピラリス(ホタル)及びレニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)ルシフェラーゼを発現するプラスミドと、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡと相同な(ｄｓＬＵＣ)又は相同でない(ｄｓＧＦＰ)ｄｓＲＮＡ５００量体(４００ｎｇ)とでトランスフェクトしたＨｅｌａ、チャイニーズハムスター卵巣、及びＰ１９(多能性のマウス胎生期癌)細胞株。二連のルシフェラーゼアッセイを、アナリティカル・サイエンティフィック・インストゥルメンツモデル３０１０ルミノメーターを利用して行なった。このアッセイにおいて、ウミシイタケルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ活性のｄｓＲＮＡ特異的抑制についての内部対照として役立つ。これらのデータは、５００量体ｄｓＲＮＡが、同起源の遺伝子のイン・ビボでの発現を特異的に抑制することができることを示している。
図３４：ヘアピンＲＮＡの発現は、ＧＦＰを安定にサイレントにするＰ１９ＥＣ細胞株を生成する。(Ａ)ＧＦＰヘアピンを構築するのに用いたＦＬＩＰカセットの略画。ＧＦＰは、ＧＦＰは、ＥＧＦＰの第一の５００のコード塩基対を表している。Ｚｅｏ、ゼオシン耐性遺伝子；Ｌ，Ｌｏｘ；Ｐ、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３中のサイトメガロウイルスプロモーター。相同なＧＦＰ断片が、先ず、直列反復としてＦＬＩＰカセット中にクローン化される。ヘアピン生成のための逆向き反復を造るために、第二の反復をＣｒｅレコンビナーゼを利用することによりひっくり返す。転写されたときに、この逆向き反復は、ヘアピンループを有するＧＦＰｄｓＲＮＡを形成する。(Ｂ)このＧＦＰヘアピンプラスミドを安定に発現するＰ１９細胞株。ＧＦＰｈｐ.１(クローン１０)及びＧＦＰｈｐ.２(クローン１２)を、ｗｔＰ１９と共に、０．２５μｇの各ＧＦＰ及びＲＦＰレポーター遺伝子でトランスフェクトした。蛍光顕微鏡写真を、ＧＦＰ及びＲＦＰに適したフィルターを利用して撮った。倍率は、２００×である。(Ｃ)Ｐ１９ ＧＦＰｈｐ.１細胞を、ｐＥＧＦＰ及び０、０．５又は１μｇのＤｉｃｅｒ又はホタルｄｓＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に蛍光顕微鏡写真を撮って、明視野イメージと重ねて、ＧＦＰを発現していない細胞を示した。倍率は、１００×である。(Ｄ)Ｐ１９細胞のｄｓＲＮＡのイン・ビトロ及びイン・ビボでのプロセッシング。イン・ビトロＤｉｃｅｒアッセイを、Ｓ２細胞及び３つの独立に調製したＰ１９抽出物について、32Ｐ標識したｄｓＲＮＡを利用することにより行なった(３０℃、３０分間)。対照及びＧＦＰｈｐ.１ Ｐ１９細胞から抽出したＲＮＡのノーザンブロットは、約２２量体のＲＮＡ種の生成をヘアピン発現細胞において示しているが、対照用細胞では示していない。ブロットを、32Ｐ標識した「センス」ＧＦＰ転写物によりプローブ検査した。
図３５：ｄｓＲＮＡは、転写後レベルでサイレンシングを誘導する。Ｐ１９細胞抽出物を、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡ(各１００ｎｇ)のイン・ビトロ翻訳のために利用した。翻訳反応を、様々な量のホタルルシフェラーゼｍＲＮＡと相同な(ｄｓＬＵＣ)又は相同でない(ｄｓＧＦＰ)ｄｓＲＮＡ５００量体を用いて計画した。ルシフェラーゼアッセイを、１時間、３０℃でのインキュベーション後に行なった。ホタル及びウミシイタケの活性の比は、ｄｓＲＮＡ対照に対して標準化してある。平均からの標準偏差を示してある。
図３６：Ｐ１９細胞溶解物に由来するＳ１０画分を、フォティナス・ピラリス(ホタル)及びレニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)のルシフェラーゼｍＲＮＡのイン・ビトロ翻訳に利用した。翻訳反応は、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡに相補的なｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ又はａｓＲＮＡ５００量体(ｄｓＦＦ、ｓｓＦＦ、又はａｓＦＦ)、ウミシイタケルシフェラーゼに相補的なｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ又はａｓＲＮＡ５００量体(ｄｓＲＥＮ、ｓｓＲＥＮ又はａｓＲＥＮ)又は相補的でないｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ又はａｓＲＮＡ５００量体(ｄｓＧＦＰ)を用いて計画した。反応を、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ又はａｓＲＮＡとの３０分間の予備インキュベーションの後に、３０℃で１時間行なった。二連のルシフェラーゼアッセイを、アナリティカル・サイエンティフィック・インストゥルメンツモデル３０１０ルミノメーターを利用して行なった。左側において、ウミシイタケルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ活性のｄｓＲＮＡ特異的な抑制についての内部対照として役立つ。右側において、ホタルルシフェラーゼは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性のｄｓＲＮＡ特異的な抑制についての内部対照として役立つ。これらのデータは、５００量体の二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)が、同起源の遺伝子の発現をイン・ビトロで、転写後遺伝子サイレンシングと一致する方法で抑制するが、一本鎖(ｓｓＲＮＡ)又はアンチセンスＲＮＡ(ａｓＲＮＡ)は抑制しないことを示している。
図３７：Ｐ１９細胞を、６ウェル組織培養プレート中で、約６０％集密まで生育させた。様々な量のｄｓＲＮＡ{ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡに相同なもの(ｄｓＬＵＣ)又は相同でないもの(ｄｓＧＦＰ)}を各ウェルに加えて、１２時間、通常の組織培養条件下でインキュベートした。次いで、細胞を、フォティナス・ピラリス(ホタル)及びレニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)ルシフェラーゼを発現するプラスミドとｄｓＲＮＡ５００量体(５００ｎｇ)とでトランスフェクトした。二連のルシフェラーゼアッセイを、トランスフェクションの１２時間後に、アナリティカル・サイエンティフィック・インストゥルメンツモデル３０１０ルミノメーターを利用して行なった。このアッセイにおいて、ウミシイタケルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ活性のｄｓＲＮＡ特異的な抑制についての内部対照として役立つ。これらのデータは、５００量体ｄｓＲＮＡが、同起源の遺伝子の発現を、通常の組織培養条件下でトランスフェクションなしで、イン・ビボで特異的に抑制することができることを示している。
図３８：ｓｉＲＮＡを生成する以前の方法は、高価な化学合成を要した。この発明は、ｓｉＲＮＡ合成のための、標準的ＲＮＡ転写反応を利用するイン・ビトロの方法を提供する。
図３９：短いヘアピンは、ショウジョウバエのＳ２細胞において、遺伝子転写を抑制する。(Ａ)典型的な化学合成されたＲＮＡの配列及び予想される二次構造。ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ上に担われるホタルルシフェラーゼの１１２〜１３４位(ｓｉＲＮＡ)及び４６３〜４９１位(ｓｈＲＮＡ)に対応する配列。このルシフェラーゼ配列の４６３〜４８５位を標的とするｓｉＲＮＡは、発現の抑制において事実上１１２〜１３４ｓｉＲＮＡと同じであったが、示さない。(Ｂ)外因的に供給された短いヘアピンは、標的のホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現をイン・ビボで抑制する。６ウェルプレートのＳ２細胞を、２５０ｎｇ／ウェルの、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発現を指示するプラスミド及び５００ｎｇ／ウェルの示したＲＮＡを用いてトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの４８時間後にアッセイした。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比を、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)に向けられたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした対照に対して標準化した。３つの独立した実験の平均を示してあり；エラーバーは、標準偏差を示している。(Ｃ)短いヘアピンは、ショウジョウバエのＤｉｃｅｒ酵素により処理される。Ｔ７転写されたヘアピンｓｈＦｆＬ２２、ｓｈＦｆＬ２９及びｓｈＦｆＳ２９を、０−２−ｈショウジョウバエ胚抽出物を伴って(＋)又は伴わないで(−)インキュベートした。抽出物とインキュベートされたものは、約２２ｎｔのｓｉＲＮＡを生成し、これは、これらのヘアピンのＲＮＡ干渉を誘導する能力と一致する。長いｄｓＲＮＡ投入物(サイクリンＥ５００量体)を対照として利用した。開裂反応を、Bernstein等、2001, Nature, 409:363-366に記載されたように行なった。
図４０：哺乳動物細胞における短いヘアピンの機能。ＨＥＫ ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−１及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、図１におけるように、プラスミド及びＲＮＡを用いてトランスフェクトして、トランスフェクションの４８時間後に二連のルシフェラーゼアッセイにかけた。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比は、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)に向けられたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした対照に対して標準化してある。３つの独立した実験の平均を示してあり；エラーバーは、標準偏差を示している。
図４１：イン・ビトロで転写されたｓｉＲＮＡ及び短いヘアピンは、哺乳動物細胞中で遺伝子発現を抑制する。(Ａ)代表的なイン・ビトロ転写されたｓｉＲＮＡの配列及び予想された二次構造。ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ上に担われるホタルルシフェラーゼの１１２〜１３４位(ｓｉＲＮＡ)及び４６３〜４９１位(ｓｈＲＮＡ)に対応する配列。(Ｂ)イン・ビトロ転写されたｓｉＲＮＡは、標的のホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現をイン・ビボで抑制する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、図２におけるように、プラスミドでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡの５’末端の塩基対形成してないグアノシン残基の存在は、予想された末端構造を有意に変えて、ｓｉＲＮＡ活性を完全に破壊する。(Ｃ)典型的なイン・ビトロ転写されたｓｈＲＮＡの配列及び予想された二次構造。ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ上に担われたホタルルシフェラーゼの１１２〜１４１位に対応する配列。(Ｄ)イン・ビトロで転写された短いヘアピンは、標的のホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現をイン・ビボで抑制する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、図２におけるように、プラスミドでトランスフェクトした。
図４２：機能的ｓｈＲＮＡのイン・ビボでの転写。(Ａ)ｐＳｈｈ１ベクターの概略図。標的遺伝子に相同な１９〜２９塩基を有するｓｈＲＮＡをコードする配列を、６０〜７５ｂｐの二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして合成して、Ｕ６プロモーターの直ぐ下流のＥｃｏＲＶ部位に連結する。(Ｂ)Ｆｆ１ヘアピンの配列及び予想された二次構造。(Ｃ)ｐＳｈｈ１ベクターから発現されたｓｈＲＮＡは、ルシフェラーゼの哺乳動物細胞における発現を抑制する。ＨＥＫ ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−１及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、図１におけるようなレポータープラスミドと、示したようなｐＳｈｈ１ベクター、ホタルｓｉＲＮＡ又はｐＳｈｈ１ホタルｓｈＲＮＡ構築物とでトランスフェクトした。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比を、トランスフェクションの４８時間後に測定し、３つの独立した実験の平均を示してあり；エラーバーは、標準偏差を示している。
図４３：Ｄｉｃｅｒは、ｓｈＲＮＡ媒介の遺伝子サイレンシングに必要である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ルシフェラーゼレポータープラスミド並びにｐＳｈｈ１−Ｆｆ１及びヒトのＤｉｃｅｒを標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした(示したように、単独で又は組み合わせて)。このＤｉｃｅｒｓｉＲＮＡ配列(TCA ACC AGC CAC TGC TGG A)は、ヒトのＤｉｃｅｒ配列の対応する３１３７〜３１５５に対応する。ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比を、トランスフェクションの２６時間後に測定して、３つの独立した実験の平均を表し；エラーバーは、標準偏差を示している。
図４４：内因性遺伝子の安定なｓｈＲＮＡ媒介の遺伝子サイレンシング。(Ａ)ｐ５３ヘアピンの配列及び予想された二次構造。５’ｓｈＲＮＡ幹は、マウスｐ５３に由来する２７ｎｔ配列(ヌクレオチド１６６〜１９２)を含み、３’幹は、相補的なアンチセンス配列を有する。(Ｂ)ｐ５３を標的としたｓｈＲＮＡを発現する初代マウス繊維芽細胞(ＭＥＦ)は、老化を回避する。野生型ＭＥＦ(５回継代)を、対照用プラスミド又はｐ５３と共にｐＢａｂｅ−ＲａｓＶ１２でトランスフェクトした(各５μｇ、ＦｕＧＥＮＥ；Roche使用)。トランスフェクションの２日後に、細胞をトリプシン処理し、計数して、２．０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む培地に１×１０5／１０ｃｍプレートの密度でプレートした。対照用細胞は、増殖を止めて、老化した表現型を示している(左側パネル)。ｐ５３ヘアピンを発現している細胞は、成長し続けている(右側パネル)。写真を、トランスフェクションの１４日後に撮った。
図４５：２つの短いヘアピン(共に、ホタルのルシフェラーゼに対応)の混合物は、遺伝子発現の相乗的な抑制を生じない。ホタルのルシフェラーゼ遺伝子の発現の、２つの異なる短いヘアピン(ＨＰ＃１及びＨＰ＃２)の混合物のトランスフェクションによる抑制を調べた。ＨＰ＃１及びＨＰ＃２の混合物は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制に対してＨＰ＃１だけの発現よりも一層強い効果を有しなかった。
図４６：コードされた短いヘアピンは、遺伝子発現をイン・ビボで特異的に抑制する。ホタルルシフェラーゼに対応する２９ヌクレオチドのヘアピンをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｕ６プロモーターを含むベクターに挿入した。３つの独立した構築物を、２９３Ｔ細胞におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を特異的に抑制するそれらの能力について調べた。ｓｉＯｌｉｇｏ１−２、ｓｉＯｌｉｇｏ１−６及びｓｉＯｌｉｇｏ１−１９(正しい向きの構築物)の各々は、遺伝子発現を、ｓｉＲＮＡと同じくらい効果的に抑制した。対照的に、ｓｉＯｌｉｇｏ１−１０(正しくない向きの構築物)は、遺伝子発現を抑制しなかった。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の異なる部分を標的とする独立した構築物は、何れの向きであっても遺伝子発現を効果的に抑制しなかった(ｓｉＯｌｉｇｏ２−２３、ｓｉＯｌｉｇｏ２−３６)。
図４７〜４９：短いｄｓＲＮＡの安定な発現のためのストラテジー。
図５０：二連のルシフェラーゼアッセイを、図２８〜３５で詳細に記載したように行なったが、これらの実験で用いた細胞は、ＰＫＲ−／−マウス胎児繊維芽細胞(ＭＥＦ)であった。簡単にいえば、長いｄｓＲＮＡを利用するＲＮＡｉは、典型的に、ＭＥＦにおいて非特異的応答を引き起こす(ＰＫＲ活性のために)。長いｄｓＲＮＡ構築物の、ＭＥＦにおける遺伝子発現を特異的に阻害する効果を評価するために、ＲＮＡｉを、ＰＫＲ−／−ＭＥＦにて調べた。かかる細胞は、非特異的応答を伴うｄｓＲＮＡに応答しない。この図にまとめたデータは、非特異的ＰＫＲ応答の非存在下では、長いｄｓＲＮＡ構築物は、ＭＥＦにおける遺伝子発現を特異的に抑制することを示している。
図５１：マウスチロシナーゼプロモーターの概略的表示である。プライマーを利用して、近いプロモーター中の３つの別々の領域を増幅し、又は約１２ｋｂ上流に位置するエンハンサーに対応する配列を増幅した。
図５２：図Ｘ及びＹにおいて用いたレポーター発現用プラスミド及びｓｉＲＮＡ配列。ＰＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ及びＰｌｕｃ−ＮＳ５Ｂは、マウス肝臓へのトランスフェクションに用いた発現用プラスミドである。この研究で用いたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を、下に示してある。
図５３：ｓｉＲＮＡを利用する成体マウスにおけるＲＮＡ干渉。(ａ)ルシフェラーゼプラスミドｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌだけをトランスフェクトされたマウス又は、ルシフェラーゼプラスミドｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌと、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ若しくは未処理ｓｉＲＮＡとを同時トランスフェクトされたマウスから放出された光の代表的イメージ。グレースケール参照イメージ(基準用)の上に重ねた放射光の強さ(赤が最も強く；青は最も弱い)を表す擬似色彩イメージは、ＲＮＡｉが成体マウスにおいて機能することを示している。アニールした２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ(４０μｇ；Dharmacon)を、マウスの肝臓に、２μｇのｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ(Promega)及び８００単位のＲＮａｓｉｎ(Promega)(１．８ｍｌＰＢＳ緩衝液中)と同時に注入した(５−７ｓ)。７２時間後に、マウスを麻酔して、３ｍｇのルシフェリンをイメージングの１５分前に腹腔内投与した。(ｂ)ｓｉＲＮＡが、典型的実験から生じる(グループ当たり６匹のマウス)。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを受けたマウスは、レポーターだけの対照より有意に弱い光を放出した(ポストホック フィッシャー検定を用いる一方向ＡＮＯＶＡ)。レポーターだけの及び無関係ｓｉＲＮＡについての結果は、統計的に同じであった。動物を、動物の世話に関する米国立衛生研究所のガイドライン及びスタンフォード大学のガイドラインに従って処理した。
図５４：成体マウスにおけるｓｈＲＮＡを利用するＲＮＡ干渉。(ａ)ルシフェラーゼプラスミドｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１及びｐＳｈｈ１−Ｆｆ１ｒｅｖを同時トランスフェクトされたマウスから放出された光の典型的イメージ。ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１は、マウスにおけるルシフェラーゼ発現をレポーターだけの対照と比較して低下させたが、ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１ｒｅｖは、該発現を低下させなかった。ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１又はｐＳｈｈ１−ｒｅｖ(１０μｇ)を、２μｇのｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ(１．８ｍｌＰＢＳ緩衝液中)と同時に注射した。(ｂ)３つの独立したｓｈＲＮＡ実験(ｎ＝５)の平均。レポーターだけのグループの平均値を、３つの実験の各々において１００％と称する。動物を、動物の世話に関する米国立衛生研究所のガイドライン及びスタンフォード大学のガイドラインに従って処理した。
図５５：幾つかの組織におけるＲＮＡｉによるＮｅｉｌ１発現の遺伝的抑制。(ａ)３匹のＮｅｉｌ１ ｓｈＲＮＡ導入遺伝子を含むマウス(ｓｈＲＮＡ陽性)又は該導入遺伝子を欠く３匹の兄弟(ｓｈＲＮＡ陰性)の肝臓におけるＮｅｉｌ１ｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした(最上段は、Ｎｅｉｌ１)。β−アクチンのＲＴ−ＰＣＲを行なって、等量のｍＲＮＡが各マウスにつき試験されたことを確実にした(第二段)。ｓｈＲＮＡベクターに担われるネオマイシン耐性遺伝子(ｎｅｏ)の発現を同様に試験した(第三段)。最後に、これらのマウスの遺伝子型を、ベクター特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅されたゲノムＤＮＡを利用して分類した(最下段)。(ｂ)同様の研究を心臓において行なった。(ｃ)同様の研究を脾臓において行なった。動物の処置は、SUNY, Stony Brook Institutional Animal Care and Use Comunittee (IACUC)により承認されたものである。
図５６：Ｎｅｉｌ１タンパク質の減少は、ｓｉＲＮＡの存在と相関する。(ａ)Ｎｅｉｌ１タンパク質の発現を、ｓｈＲＮＡ導入遺伝子を有するマウス(ｓｈＲＮＡ陽性)又は該導入遺伝子を欠く兄弟(ｓｈＲＮＡ陰性)の肝臓に由来するタンパク質抽出物にて、Ｎｅｉｌ１特異的抗血清を用いるウエスタンブロットにより調べた。ＰＣＮＡのウエスタンブロットを、ローディングを標準化するために利用した。(ｂ)トランスジェニックマウスの肝臓に由来するＲＮＡ中のｓｉＲＮＡの存在(一部がｓｈＲＮＡ配列と相補的である３００ｎｔプローブを利用するノーザンブロッティングによりアッセイ)。我々は、ｓｈＲＮＡ発現カセットにつきトランスジェニックなマウスにおいてのみｓｉＲＮＡに注目する。
【００４０】
ある好適な具体例の詳細な説明
１．概観
本発明は、遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて、細胞における遺伝子発現を減衰させる方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、阻害対象となる遺伝子（「標的」遺伝子）の少なくとも一部分のヌクレオチド配列に、細胞の生理的条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列にハイブリダイズすることができる。
【００４１】
本発明の特定の態様にとって重要な特徴は、培養哺乳動物細胞内及び生物体一個体内の両方で実際にＲＮＡｉを実施することができることを実証したことにある。これは、当分野で以前には報告されていない。
【００４２】
本発明の他に顕著な特徴は、高等真核生物、特に哺乳類の非卵母細胞（例えば哺乳動物成体由来の細胞）においてＲＮＡｉの実施が可能なことにある。
【００４３】
更に、従来技術の教示と対照的に、我々は、哺乳動物の系におけるＲＮＡｉが、標的遺伝子の非コード配列と同じか又は類似するｄｓＲＮＡにより媒介されうるということを示す。以前は、非コード配列(即ち、プロモーター、エンハンサー又はイントロン配列)と同じか又は類似するｄｓＲＮＡはＲＮＡｉを阻害しなかったが、かかるｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを媒介するとは考えられないと考えられていた。
【００４４】
以下に詳述するように、植物から哺乳動物にわたる真核生物中に進化上保存された必須ＲＮＡ成分を含む、一連の酵素活性物質によって、ＲＮＡｉ現象が媒介される、という発見に本発明は基づいている。
【００４５】
１個の酵素は必須ＲＮＡ成分を含んでいる。複成分ヌクレアーゼ（以下「ＲＩＳＣヌクレアーゼ」と称する）は部分的精製の後、基質ｍＲＮＡに対する相同性によってヌクレアーゼに特異性を与えることのできる、別の２２-ヌクレオチドＲＮＡ種と共に分別される。短いＲＮＡ分子は、長い材料ｄｓＲＮＡから、処理反応によって得られる。ｄｓＲＮＡ配列に相当する特定のｍＲＮＡを破壊するようにＲＩＳＣヌクレアーゼを誘導するガイド配列として、上記２２量体ガイドＲＮＡが機能することが考えられる（ただしこの仮説に本発明が制限されるべきではない）。
【００４６】
説明したように、二本鎖形態の２２量体のガイドＲＮＡは、遺伝子発現の配列依存性のｄｓＲＮＡ阻害を誘導するのに十分な長さであってよい。説明のための例において、ｄｓＲＮＡ構築物を、組換えルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する細胞に投与する。対照用細胞(例えば、外因性ＲＮＡを加えてないもの)において、ルシフェラーゼレポーターの発現レベルは、値「１」に規格化される。説明したように、ルシフェラーゼ遺伝子に相補的な長い(５００量体)及び短い(２２量体)ｄｓＲＮＡ構築物は、両方とも、遺伝子産物の発現を対照用細胞と比較して阻害することができた。他方、他のタンパク質であるグリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)のコード配列と相補的な類似のサイズのｄｓＲＮＡは、ルシフェラーゼの発現を有意に達成しなかった(これは、阻害現象が、各々の場合において配列依存性であったことを示している)。同様に、ルシフェラーゼの一本鎖の２２量体は、その遺伝子の発現を阻害しなかった(これは、阻害現象が、二本鎖依存性であることを示している)。
【００４７】
付属の実施例では、推定ガイドＲＮＡを産生することのできる酵素、Ｄｉｃｅｒも同定している。Ｄｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡを特異的に開裂する、ヌクレアーゼのリボヌクレアーゼＩＩＩファミリーの１種であり、蠕形動物、ハエ、植物、菌類からここに記載するように哺乳類にわたって進化上保存されている。この酵素は、ヘリカーゼドメイン及び２個のリボヌクレアーゼＩＩＩモチーフを含む、特有の構造を有している。Ｄｉｃｅｒは更に、これまでに下等真核生物におけるＲＮＡｉに遺伝上関連があるとされているＲＤＥ１／ＱＤＥ２／ＡＲＧＯＮＡＵＴＥファミリーに対して相同な領域を含んでいる。実際に多くの場合、Ｄｉｃｅｒの活性化又は過剰発現が、そのほかの非受容性細胞［例えば培養された真核細胞或いは培養基内の又は生物体一個体内の哺乳類細胞（非卵母細胞）］において十分ＲＮＡ干渉を起こしうる。
【００４８】
ある態様においては、配列依存性アポトーシスを生じさせうるような、宿主細胞による一般的二本鎖ＲＮＡ応答を阻害する（複数の）作用物質で細胞を処理することができる。例えば、これらの細胞を、ＰＫＲ（プロテインキナーゼＲＮＡによって活性化される）として知られるｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼを阻害する作用物質で処理することができる。哺乳類細胞における二本鎖ＲＮＡは一般に、プロテインキナーゼＰＫＲを活性化して、アポトーシスへと導く。ＰＫＲの作用機構は、ｅＩＦ２αをリン酸化し不活化することを含む［Fire（1999）Trends Genet15：358］。ＰＫＲによるＮＦ−κＢの誘導がアポトーシス拘束に関与し、この過程はＩＫＫ複合体の活性化により媒介されるということも報告されている。ｄｓＲＮＡの存在はウイルス生活環の一般的な特徴であるので、この配列非依存性応答は、免疫応答の原始的な一形態を反映したものであろう。
【００４９】
本明細書に記載するように、ＰＫＲ応答を押さえて配列特異的ＲＮＡｉ応答が起こりうることを本発明者らは実証している。しかしある場合においては、ＰＫＲ発現の阻害、破壊、及び／又はＰＫＦのキナーゼ活性の阻害をする作用物質で細胞を処理するのが望ましいことがあり、本発明の方法においてはこれを使用することが特に企図されている。同様に、ＩＦ２αを異所的に活性化する過剰発現又は作用物質を用いることができる。ＰＫＲ応答を抑制するために用いることのできる他の薬剤には、ＩκＢのＩＫＫリン酸化のインヒビター、ＩκＢユビキチン化のインヒビター、ＩκＢ分解のインヒビター、ＮＦ−κＢ核トランスファーのインヒビター、及びＮＦ−κＢのκＢ応答エレメントとの相互作用のインヒビターが含まれる。
【００５０】
他の細胞における配列依存性ｄｓＲＮＡ応答のインヒビターには、ワクシニアウイルスＥ３Ｌの遺伝子産物が含まれる。このＥ３Ｌ遺伝子産物は、２つの別個のドメインを含んでいる。保存されたカルボキシ末端ドメインは、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)に結合して、細胞による抗ウイルス性ｄｓＲＮＡ応答を阻害することが示されている。宿主細胞におけるＥ３Ｌ遺伝子の少なくともその部分の発現(又は、そのポリペプチド又はペプチド模倣物)を利用して、一般的ｄｓＲＮＡ応答を抑制することができる。カスパーゼインヒビターは、細胞を二本鎖ＲＮＡによって殺されるように感作する。従って、宿主細胞におけるカスパーゼの異所的発現又は活性化を利用して、一般的ｄｓＲＮＡ応答を抑制することができる。
【００５１】
他の具体例において、主題の方法を、二本鎖ＲＮＡに対する一般的応答を殆ど又は全く有しない(例えば、少なくとも培養条件下でＰＫＲ依存性ｄｓＲＮＡ応答を有しない)細胞において実施する。図２８〜３２で説明したように、ＣＨＯ及びＰ１９細胞は、ＰＫＲ又は他の一般的ｄｓＲＮＡ応答を阻害することなく利用することができる。
【００５２】
従って本発明は、細胞（特に哺乳類細胞）における標的遺伝子の発現を阻害する方法及び組成物を提供する。ある態様においては本発明の方法は、部分又は全体が二本鎖であるＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ構築物」と称する）を細胞内に又は細胞外部環境に導入することを包含する。標的遺伝子の部分からヌクレオチド配列を選択してｄｓＲＮＡ構築物を作製するという点で、阻害は特異的である。このｄｓＲＮＡは、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列と同じものであっても類似するものであってもよい。好ましい態様においては本発明の方法は、Ｄｉｃｅｒ及び／又はＡｒｇｏｎａｕｔｅ活性が組換えで発現される又はさもなくば異所で活性化される細胞を利用する。この方法は（１）遺伝子発現の減衰に有効性を有し、（２）標的となる遺伝子に特異性を有し、そして（３）様々な種類の標的遺伝子を阻害できるという点で汎用性を有することが可能である。
【００５３】
ＩＩ．定義
簡便のために、本願明細書、実施例及び付属の請求項で用いた特定の用語をここにまとめる。
【００５４】
本願明細書でいう「ベクター」とは、それに結合した別の核酸を、運搬することのできる核酸分子のことを言う。ベクターの一つとして、宿主細胞の染色体ＤＮＡに統合することのできる、ゲノム統合ベクター又は「統合ベクター」がある。別種のベクターには、エピソームベクター、すなわち染色体外での複製が可能な核酸がある。操作可能に遺伝子に結合し、その遺伝子の発現を誘導することのできるベクターを、本願明細書では「発現ベクター」と称する。本願明細書において「プラスミド」及び「ベクター」は、文脈から明らかに使い分けているとわかる場合を除いては、特に区別をしていない。
【００５５】
本願明細書でいう「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）や、適当な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などの、ポリヌクレオチドを意味する。この言葉は更に、本明細書に記載された態様に用いられているように、一本鎖（例えばセンス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと解されるべきである。
【００５６】
本願明細書でいう「遺伝子」又は「組換え遺伝子」とは、エキソン及び（任意に）イントロン配列の両方を含む、本発明のポリペプチドをコードする、開いた読み枠を含む核酸を意味する。この核酸は又、適宜、非コード配列例えばプロモーター又はエンハンサー配列を含むことができる。「組換え遺伝子」とは、染色体ＤＮＡに由来するイントロン配列を任意に含む、上記のような調節ポリペプチドをコードする核酸を意味する。「イントロン」の語は、所与の遺伝子内において、タンパク質に翻訳されない、一般にエキソンの間に存在するＤＮＡ配列を意味する。
【００５７】
「タンパク質コード配列」又は特定のポリペプチド又はペプチドを「コードする」配列とは、適当な調節配列の制御下に置かれたとき、イン・ビトロで又はイン・ビボで、転写される（ＤＮＡの場合）及びポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列のことである。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンと、３’（カルボキシ）末端における翻訳停止コドンとで定義される。コード配列としては原核又は真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核又は真核ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。転写終結配列は通常、コード配列の３’側に位置する。
【００５８】
同様に「コードする」とは、文脈から使い分けていると明らかに分かる場合を除いては、一般によく用いられているように、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、並びに抑制性のアンチセンス分子に転写されるＤＮＡ配列を含むものとする。
【００５９】
主題のＲＮＡｉ方法によって阻害される遺伝子について用いられているように、「機能喪失」の語は、ｄｓＲＮＡ構築物が存在しない場合のレベルと比較して、遺伝子の発現レベルが少なくとも一つのｄｓＲＮＡ構築物の存在下で減少することを意味する。
【００６０】
遺伝子配列に関して用いる「発現」の語は、遺伝子の転写及び、適当な場合には、得られたｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳のことをいう。従って文脈からも明らかとなるように、タンパク質コード配列の発現は、コード配列の転写及び翻訳が原因で起こる。
【００６１】
本願明細書において「細胞」、「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」の語は区別せずに用いられる。これらの語は特定の主題の細胞を意味するだけでなく、その細胞の後代又は潜在的後代をも意味することは理解されよう。突然変異や環境の影響によって、後の世代に何らかの変異が起こる可能性があり、そのような後代は親細胞と実際には同一ではないと思われるが、本願明細書で用いる語の範囲に含まれる。
【００６２】
用語「培養細胞」は、培養中に懸濁された(例えば、培養又は形態組織中に分散された)細胞をいう。しかしながら、それは、培養にて供給しうる卵母細胞又は胎児全体(胚盤胞などを含む)を含まない。ある具体例において、これらの培養細胞は、成体細胞(例えば、非胎児性)である。
【００６３】
「組換えウイルス」の語は、例えば異種核酸構築物をウイルス粒子内に付加又は挿入することによって、遺伝子的に改変されたウイルスを意味する。
【００６４】
本願明細書でいう「形質導入」及び「トランスフェクション」とは、公知の手法であり、核酸を媒介する遺伝子移入による、受容細胞内への核酸（例えば発現ベクター）の導入を意味する。本願明細書でいう「形質転換」とは、外因性ＤＮＡ又はＲＮＡを細胞内へ取り込んだ結果、細胞の遺伝子型が変化する工程のことをいい、例えば形質転換細胞がｄｓＲＮＡ構築物を発現することをいう。
【００６５】
「一過的トランスフェクション」とは、外因性ＤＮＡがトランスフェクト細胞のゲノムと一体化しない場合、例えばエピソームＤＮＡがｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳される場合をいう。
【００６６】
細胞が核酸構築物で「安定的にトランスフェクトされた」とは、核酸構築物が娘細胞に受け継がれることができる場合をいう。
【００６７】
本願明細書でいう「レポーター遺伝子構築物」とは、少なくとも１個の転写調節配列に操作可能に連結した「レポーター遺伝子」を含む核酸のことをいう。レポーター遺伝子の転写は、レポーター遺伝子が連結したこれらの配列に制御される。少なくとも１個以上のこれらの制御配列の活性は、標的受容体タンパク質によって、直接的又は間接的に調節することができる。転写制御配列の例としては、プロモーター配列が挙げられる。レポーター遺伝子は、細胞内で異種発現されるプロモーター-レポーター遺伝子構築物を含むものとする。
【００６８】
本願明細書でいう「形質転換細胞」とは、無制限の成長状態に自然に変換された細胞、すなわち、培養基内で無限回分裂して成長する能力を備えるようになった細胞のことをいう。形質転換細胞は、成長制御を失ったということについて、新生物形成性、未分化性及び／又は増殖性といった用語で特徴付けることができる。本発明の目的からは、「悪性哺乳類細胞の形質転換された表現型」及び「形質転換された表現型」の表現は、細胞培養における成長の持続、半固体培養基での成長、又は免疫不全の又は同質遺伝的な動物における腫瘍形成性成長として観察される、不死化、形態又は成長形質転換、及び腫瘍原性などの、哺乳類細胞の細胞形質転換に関する表現型特性全てを含むことを企図するが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
本願明細書でいう「増殖する」及び「増殖」は、有糸分裂中の細胞についての説明である。
【００７０】
本願明細書でいう「不死化細胞」とは、化学的、遺伝子的及び／又は組換え的手段によって改変され、培養基中で無限回分裂して成長する能力を備えるようになった細胞のことをいう。
【００７１】
細胞の「成長状態」とは、細胞の増殖率、及び細胞の分化状態を意味する。
【００７２】
「ＭＨＣ抗原」は、ここで用いる場合、少なくとも一つのＭＨＣ遺伝子のタンパク質産物をいい；この用語は、レシピエント生物体において免疫応答を引き起こすことのできるＭＨＣ遺伝子産物の断片及び類似体を包含する。ＭＨＣ抗原の例には、ヒトのＭＨＣ遺伝子即ちＨＬＡ遺伝子の産物(及びその断片又は類似体)が含まれる。
【００７３】
用語「組織適合性」は、異なる個体間の組織の類似性をいう。組織適合性のレベルは、患者とドナーが、どれ程よく一致しているかを記述する。主要組織適合性決定基は、ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)である。ＨＬＡ型分類を、潜在的骨髄ドナーと潜在的移植レシピエントとの間で行なって、これらの二者が、どれ程近いＨＬＡマッチかを測定する。このマッチが近いほど、提供された骨髄と患者の身体が互いに反応することが少ない。
【００７４】
用語「ヒト白血球抗原」又は「ＨＬＡ」は、白血球細胞及び他のドナーと患者をマッチさせるために利用される組織の表面で見出されるタンパク質(抗原)をいう。例えば、患者と潜在的ドナーは、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＤＲなどのＨＬＡ抗原について試験された白血球細胞を有しうる。各個人は、これらの抗原を二組有する(一組は、一方の親から遺伝したものである)。この理由のために、患者とマッチすることは、無関係の個人よりも兄弟姉妹について一層ありそうなことであり、同じ人種及び民族的背景の人について互いにマッチすることは、一層ありそうなことである。
【００７５】
ＩＩＩ．単離方法の典型的具体例
本発明の一つの特徴は、（イン・ビボ又はイン・ビトロの）細胞において又は細胞を含まない混合物において、ＲＮＡｉ酵素を誘導する又は異所的に活性化することによって、ＲＮＡｉを強化する方法を提供する。好ましい態様においては、ＲＮＡｉ活性物質は、活性化されるか、イン・ビトロで又は生物体一個体の部分として供することのできる哺乳類細胞（例えばヒト細胞）に添加される。他の態様においては、培養中の真核細胞一般（卵母細胞を除く）を用いて主題の方法を実施する。例えば、組換えを行って発現することによって、Ｄｉｃｅｒ酵素を活性化することもできるし、あるいは、（ｉ）内因性遺伝子の発現を誘導し、（ｉｉ）分解を防ぐようにタンパク質を安定させ及び／又は（ｉｉｉ）（Ｋｃａｔ、Ｋｍ又はその両方を変化させることによって）活性を増加するようにアロステリックに酵素を改変する、作用物質を用いて活性化することもできる。
【００７６】
Ａ．Ｄｉｃｅｒ及びＡｒｇｏｎａｕｔ活性物質
ある態様においては、活性化されたＲＮＡｉ酵素の少なくとも１個がＤｉｃｅｒ又はその同族体である。ある好ましい態様においては本発明の方法は、Ｄｉｃｅｒの異所的活性化を提供する。ここでいう「Ｄｉｃｅｒ」とは、（ａ）ＲＮＡｉ応答の媒介となり、（ｂ）配列番号２又は４に対して少なくとも５０％の、より好ましくは少なくとも７５、８５、９０又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、及び／又は２×ＳＳＣ、２２℃さらに好ましくは０．２×ＳＳＣ、６５℃の洗浄条件下で配列番号１又は３で表されるヌクレオチドとハイブリダイズする核酸によってコードされうるタンパク質のことをいう。従って本方法は、Ｄｉｃｅｒが組換えにより発現されたさもなくば異所的に活性化された細胞に、ｄｓＲＮＡ構築物を導入することを包含する。
【００７７】
ある態様においては、活性化されたＲＮＡｉ酵素の少なくとも１個がＡｒｇｏｎａｕｔ又はその同族体である。ある好ましい態様においては本発明の方法は、Ａｒｇｏｎａｕｔの異所的活性化を提供する。ここでいう「Ａｒｇｏｎａｕｔ」とは、（ａ）ＲＮＡｉ応答の媒介となり、（ｂ）図２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の、より好ましくは少なくとも７５、８５、９０又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質のことをいう。従って本方法は、Ａｒｇｏｎａｕｔが組換えにより発現されたさもなくば異所的に活性化された細胞に、ｄｓＲＮＡ構築物を導入することを包含する。
【００７８】
本発明は更に、少なくとも１個の転写調節配列に操作可能に連結した、Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。「操作可能に連結した」とは、ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節配列に連結されることを意味する。調節配列は当分野で公知のものであり、主題のＤｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔタンパク質を直接発現するものが選択される。従って「転写調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素を含む。そのような調節配列については、Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA（1990）に記載がある。例えば、様々な発現制御配列、すなわち操作可能に連結したときにＤＮＡ配列の発現を制御する配列を、これらのベクター内で用いて、本発明のＤｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。そのような有用な発現制御配列の例としては、ウイルス性ＬＴＲ（モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲなど）、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、アデノウイルス又はサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外殻タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（Ｐｈｏ５など）、酵母菌α−交配因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、原核細胞又は真核細胞あるいはそれらのウィルスの遺伝子発現を制御することが知られている他の配列、及びそれらの様々な組合せが挙げられる。なお、形質転換される宿主細胞の選択及び／又は発現されるべきタンパク質の種類といった要因に応じて、発現ベクターの設計が変わることは理解されよう。
【００７９】
その上更に、ベクターの複製数、その複製数を制御する能力、及びベクターによってコードされる他のタンパク質（例えば抗生物質マーカー）の発現も、考慮に入れられるべきである。
【００８０】
組換えＤｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子は、原核細胞、真核細胞又はその両方での発現に好適なベクター内に、Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔポリペプチドをコードする核酸を連結することによって作製することができる。主題のＤｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔポリペプチドの組換え体の作製に用いられる発現ベクターとしては、プラスミド及び他のベクターが挙げられる。例えば、Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔポリペプチドの発現に好適なベクターの例として、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド及びｐＵＣ由来プラスミドなどの、原核細胞（大腸菌など）での発現に用いられるプラスミドが挙げられる。
【００８１】
酵母菌内には、組換えタンパク質発現用のベクターが数多く存在する。例えばＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２及びＹＲＰ１７は、遺伝子構築物をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入するのに有用なクローニング及び発現手段である［例えばBroach他（1983）、Experimental Manipulation of Gene Expression、M. Inouye編、Academic Press, p.83参照。参照して説明に代える］。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２ｏｒｉの存在によって大腸菌内で、又、酵母菌２ミクロンプラスミドの複製決定因子によってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で、複製することができる。加えて、アンピシリンなどの薬剤耐性マーカーを用いることができる。例証的な態様においては、Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子のコード配列をサブクローン化することによって作製した発現ベクターを利用して、Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔポリペプチドを組換え技術で作製することができる。
【００８２】
好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌内でのベクターの増殖を促進する原核細胞配列と、真核細胞内で発現される１種以上の真核細胞転写ユニットとの両方を含む。真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来ベクターが挙げられる。これらのベクターの幾つかは、原核細胞と真核細胞との両方における複製及び薬剤耐性選択性を促進するために、菌プラスミド（例えばｐＢＲ３２２）由来の配列で改変することができる。或いは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）又はエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）等のウイルスの派生物を、真核細胞におけるタンパク質の一過的発現に用いることができる。プラスミドの調製と、宿主生物の形質転換に用いられている様々な方法は、当分野で公知である。原核細胞及び真核細胞に好適な他の発現系並びに遺伝子組換え法については、Sambrook、Fritsch及びManiatis篇、Molecular Cloning A Laboratory Manual第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989）第１６章及び第１７章を参照できる。
【００８３】
更に別の態様においては主題の発明は、ゲノムＤＮＡの相同組換えによって、内因性Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子の転写調節配列を変える「遺伝子活性化」構築物を提供する。例えば、遺伝子活性化構築物は、Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子の内因性プロモーターを異種プロモーター（例えばＤｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子の構成的発現を引き起こす、或いはＤｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔの正常な発現パターンとは異なる条件下で、遺伝子の誘導発現を引き起こすプロモーター）に置き換えることができる。遺伝子活性化構築物については様々なタイプが可能である［例えばthe Transkaryotic Therapies, IncのＰＣＴ公報ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９５／３１５６０、ＷＯ９６／２９４１１、ＷＯ９５／３１５６０及びＷＯ９４／１２６５０参照］。
【００８４】
好ましい態様においては、遺伝子活性化構築物として用いられるヌクレオチド配列は、（１）組換えを誘導する、内因性Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子のある部分からのＤＮＡ（エキソン配列、イントロン配列、プロモーター配列等）と、（２）遺伝子活性化構築物の組換えに際して、ゲノムＤｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子のコード配列に操作可能に連結される（複数の）異種転写調節配列とを包含しうる。Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ産生細胞培養の作製用としては、細胞内のノックアウト構築物を検出するために、構築物がレポーター遺伝子を更に含んでいてもよい。
【００８５】
遺伝子活性化構築物は細胞に挿入され、天然Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子と操作可能に関連するように異種調節配列を提供するような位置関係で、細胞のゲノムＤＮＡと統合される。そのような挿入は、相同組換えによって得られる。すなわち、内因性Ｄｉｃｅｒ又はＡｒｇｏｎａｕｔ遺伝子配列と相同性を有する活性化構築物の組換え領域が、ゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、ゲノムＤＮＡの相当部位に構築物が統合されるようにゲノム配列と結合する。
【００８６】
「組換え領域」又は「標的配列」の語は、ゲノム遺伝子配列（例えばゲノム遺伝子の５’フランキング配列を含む）に実質的に同一な又は実質的に相補的であり、かつゲノム配列と標的導入遺伝子構築物との間の相同組換えを促進することのできる配列を有している、遺伝子活性化構築物の断片（すなわち部分）のことをいう。
【００８７】
ここでいう「交換領域」の語は、組換え領域とゲノム配列との相同組換えに続いて、内因性染色体位置内に統合される活性構築物の部分を意味する。
【００８８】
異種調節配列（例えば交換領域内に提供される異種調節配列）は、プロモーター（例えば構成又は誘導プロモーター）、エンハンサー、負の調節因子、遺伝子座制御領域、転写因子結合部位、又はそれらの組合せから選択される、１種以上の要素を含むことができる。
【００８９】
標的遺伝子の発現をイン・ビボで制御するのに用いることのできるプロモーター／エンハンサーの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー［Karasuyama他（1989）J. Exp. Med.,169：13］、ヒトβ−アクチンプロモーター［Gunning他（1987）PNAS 84：4831-4835］、マウス乳癌ウイルス末端反復配列（ＭＭＴＶ  ＬＴＲ）に存在するグルココルチコイド誘導性プロモーター［Klessig他（1984）Mol. Cell Biol.4：1354-1362］、モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列（ＭｕＬＶ  ＬＴＲ）［Weiss他（1985）RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York］、ＳＶ４０初期又は後期領域プロモーター［Bernoist他（1981）Nature 290：304-310；Templeton他（1984）Mol. Cell Biol. 4：817；及びSprague他（1983）J. Virol. 45：773］、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’末端反復配列に含まれているプロモーター［Yamamoto他（1980）Cell 22：787-797］、単純性疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター／エンハンサー［Wagner他（1981）PNAS 82：3567-71］及び単純性疱疹ウイルスＬＡＴプロモーター［Wolfe他（1992）Nature Genetics 1：379-384］が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
更に他の態様においては、交換領域は（例えば発現を活性化するために）天然遺伝子の負の転写制御因子を単に除去するか、（例えば標的遺伝子の発現を阻害するために）正の制御因子を除去する。
【００９１】
Ｂ．細胞／生物体
標的遺伝子を有する細胞は、あらゆる生物体（例えば植物、動物、原生動物、ウイルス、バクテリア又は真菌）に由来するものであってもよいし、あるいはあらゆる生物体に含んだ状態で用いてもよい。ｄｓＲＮＡ構築物はイン・ビボ又はイン・ビトロのいずれで合成してもよい。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼはイン・ビボでの転写を媒介することができるし、あるいはクローニングしたＲＮＡポリメラーゼを用いてイン・ビボ又はイン・ビトロで転写することもできる。イン・ビボで導入遺伝子から二本鎖転写物を作製する際には、調節領域を用いて（複数の）ＲＮＡ鎖を転写してもよい。その上、ｄｓＲＮＡは、ヘアピンを形成するＲＮＡ鎖を転写し、そうして、ｄｓＲＮＡを生成することによって生成することができる。
【００９２】
古典的な遺伝子モデルではなかった生物体内での遺伝子操作が可能になる。特異的な標的遺伝子破壊物を迅速に検定することができるので、育種及びスクリーニングプログラムをより早く行うことが可能になる。遺伝子破壊を用いて、標的遺伝子の機能を発見したり、標的遺伝子が病理状況の原因又は回避に関与している疾病モデルを構築したり、費用の面で改良された生物体の産生することが可能である。
【００９３】
標的遺伝子を有する細胞は、あらゆる生物体に由来するものであってもよいし、あるいはあらゆる生物体に含んだ状態で用いてもよい。生物体は植物、動物、原生動物、バクテリア、ウイルス又は真菌であってもよい。植物は単子葉植物、双子葉植物又は裸子植物であってもよい；動物は脊椎動物又は無脊椎動物であってもよい。好ましい微生物には、農業に用いられているもの、工業的に用いられているものが含まれ、植物又は動物の病原となるものがある。真菌には、糸状菌と酵母菌の形態両方の生物体が含まれる。
【００９４】
植物の例として、シロイヌナズナ；農作物（例えばアルファルファ、大麦、豆、トウモロコシ、綿、アマ、エンドウ、セイヨウアブラナ、イネ、ライ麦、ベニバナ、モロコシ、ダイズ、ヒマワリ、タバコ及び小麦）；野菜（例えばアスパラガス、ビート、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、コショウ、ジャガイモ、パンプキン、ハツカダイコン、ホウレンソウ、カボチャ、タロイモ、トマト及びズッキーニ）；果物及び堅果（例えばアーモンド、リンゴ、アプリコット、バナナ、セイヨウヤブイチゴ、ブルーベリー、カカオ、サクランボ、ココナッツ、ツルコケモモ、ナツメヤシ、フェイジョア、ハシバミ、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、キーウィ、レモン、ライム、マンゴ、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、トケイソウ、モモ、ピーナツ、ナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、キイチゴ、イチゴ、タンジェリン、クルミ及びスイカ）；及び観賞植物（例えばハンノキ、トネリコ、ポプラ、ツツジ、カバノキ、ツゲ、ツバキ、カーネーション、キク、ニレ、モミ、キヅタ、ジャスミン、ビャクシン、カシ、ヤシ、ポプラ、マツ、アカスギ、ロドデンドロン、バラ及びゴム）が挙げられる。
【００９５】
脊椎動物の例としては、魚類及び哺乳類（ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、齧歯類、ハムスター、マウス、ラット、霊長類及びヒト）が挙げられる。
【００９６】
無脊椎動物の例としては、線虫、その他の寄生虫、ショウジョウバエ及び他の昆虫が挙げられる。代表的な線虫の属としては、動物に寄生するもの（例えば鉤虫属、アスカリジア属、回虫属、ブノストムム属、線虫属、毛細線虫属、シャベルティア属、クーペリア属、ディクチオカウルス属、ハエルノンカス属（Haernonchus）、ヘテラキス属、ネマトジルス属、腸結筋虫属、オステルタジア属、蟯虫属、ウマカイチュウ属、円虫属、イヌカイチュウ属、鞭虫属、毛様線虫属、トリコネマ属（Tflichonema）、トキソカラ属、ウンシナリア属）及び植物に寄生するもの［例えばマツノザイセンチュウ属、クリコネリエラ属（Criconerriella）、クキセンチュウ属、ジャガイモシストセンチュウ属、ナミラセンチュウ属（Helicotylenchus）、シストセンチュウ属、土壌線虫属（Longidorus）、キタネコブセンチュウ属、ニセネコブセンチュウ属、ピンセンチュウ属（Paratylenchus）、ネグサレセンチュウ属、ネモグリセンチュウ属（Radopholus）、ニセフクロセンチュウ属（Rotelynchus）、ハリセンチュウ及びジフィネマ属（Xiphinema）］が挙げられる。代表的な昆虫の目としては、コウチュウ目、ハエ目、チョウ目及びヨコバイ亜目が挙げられる。
【００９７】
標的遺伝子を有する細胞は、生殖細胞由来又は体細胞由来であってもよく、全能性又は多能性であってもよく、分割性又は非分割性であってもよく、柔組織性又は上皮性のものであってもよく、不死化した又は形質転換を起こしたものであってもよい。細胞は幹細胞又は分化細胞であってもよい。分化した細胞の種類としては例えば含脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア、血球、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、角化細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺又は外分泌腺の細胞が挙げられる。
【００９８】
Ｃ．標的となる遺伝子
標的遺伝子は、細胞由来の遺伝子、内因性遺伝子、導入遺伝子であってもよいし、或いは病原体に感染した後の細胞内に存在する、病原体の遺伝子であってもよい。本方法を行うと、標的遺伝子の種類及び運搬される二本鎖ＲＮＡ物質の量に応じて、標的遺伝子の機能が部分的に又は完全に喪失しうる。物質投与をより少ない量で行い、ｄｓＲＮＡ投与後により長い時間置くことで、より少ない量の細胞が阻害される。細胞内における遺伝子発現を定量することによって、標的ｍＲＮＡの蓄積レベル又は標的タンパク質の翻訳のレベルにおける阻害量が同様に示されうる。
【００９９】
「遺伝子発現の阻害」とは、標的遺伝子に由来するタンパク質及び／又はｍＲＮＡ産物の量における不在（又は観察可能な減少）のことをいう。「特異性」とは、細胞の他の遺伝子に明らかな影響を与えることなく標的遺伝子を阻害する能力のことをいう。阻害の結果は、細胞又は生物体の外的な特性を調べることによって（下記実施例参照）、又は以下のような生化学的方法によって確認することができる。ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロ・アレイを用いた遺伝子発現のモニタリング、抗体結合、酵素結合免疫収着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ及び蛍光励起細胞分析（ＦＡＣＳ）などである。細胞系又は生物体一個体におけるＲＮＡ媒介阻害については、タンパク質産物を容易に検定することのできる遺伝子発現レポーター又は薬剤耐性遺伝子を用いて、有利に調べることができる。そのようなレポーター遺伝子の例としては、アセトヒドロキシ酸生成酵素（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリン生成酵素（ＮＯＳ）、オクトピン生成酵素（ＯＣＳ）及びそれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに耐性を与える、複数の選択マーカーを用いることができる。
【０１００】
遺伝子発現を定量することによって、用いたアッセイの種類に応じて、本発明の処理を行っていない細胞と比較して１０％、３３％、５０％、９０％、９５％又は９９％を超える阻害度を測定することが可能になる。物質投与をより少ない量で行い、ｄｓＲＮＡ投与後により長い時間置くことで、より少ない量の細胞が阻害される（例えば少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％又は９５％の標的細胞）。細胞内における遺伝子発現を定量することによって、標的ｍＲＮＡの蓄積レベル又は標的タンパク質の翻訳レベルにおける阻害量が同様に示されうる。例えば、細胞における遺伝子産物の量を調べることによって、阻害効率を検定することができる。抑制性二本鎖ＲＮＡに用いられる領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによってｍＲＮＡを検出することもできるし、あるいは翻訳されたポリペプチドを、その領域のポリペプチド配列に対して作製した抗体を用いて検出することもできる。
【０１０１】
ここに記載するように、本発明は特定の標的遺伝子又はヌクレオチド配列に限定されるものではない。しかし例として以下の標的遺伝子類が可能である。発生遺伝子（例えば接着性分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｒｉｔファミリー、Ｐａｘファミリー、Ｗｉｎｇｅｄ  ｈｅｌｉｘファミリー、Ｈｏｘファミリー、サイトカイン／リンフォカイン及びそれらの受容体、増殖／分化因子及びそれらの受容体、神経伝達物質及びそれらの受容体）；癌遺伝子（例えばＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３及びＹＥＳ）；癌抑制遺伝子（例えばＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３及びＷＴＩ）；及び酵素（例えばＡＣＣシンターゼ及びオキシダーゼ、ＡＣＰ不飽和化酵素及び水酸化酵素、ＡＤＰ−グルコースピロフォリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコン生成酵素、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合澱粉生成酵素、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリン生成酵素、オクトピン生成酵素、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調整物質生成酵素、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プラナーゼ（pullanase）、レコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲｕＢｉｓＣｏ、トポイソメラーゼ及びキシラナーゼ）などである。
【０１０２】
Ｄ．ｄｓＲＮＡ構築物
ｄｓＲＮＡ構築物は、１種以上の重合リボヌクレオチド鎖を包含してもよい。構築物は、リン酸−糖主鎖又はヌクレオシドのどちらかの改変を含んでいてもよい。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を改変して、少なくとも１個の窒素又は硫黄ヘテロ原子を含ませるようにすることができる。ｄｓＲＮＡによってある種の生物体中に起こる一般的なパニック応答を回避しつつ、特異的な遺伝子阻害を可能にするように、ＲＮＡ構造の改変を調整することができる。同様に、アデノシンデアミナーゼの活性物質を阻害するように、塩基を改変してもよい。ｄｓＲＮＡ構築物は、酵素によってあるいは部分的／全体的有機合成によって産生することもできる。イン・ビトロの酵素的又は有機的合成によって、あらゆる改変リボヌクレオチドを導入することができる。
【０１０３】
ｄｓＲＮＡ構築物は、細胞の中に（すなわち細胞内に）直接導入してもよいし、あるいは細胞外の腔や間隙内、物体の循環系内に導入してもよいし、経口で導入してもよいし、或いはＲＮＡを含む溶液に生物体を浸して導入してもよい。経口導入法の例としては、生物体用の食物にＲＮＡを直接混合する方法や、食物として用いられる種を、ＲＮＡを発現するように遺伝工学的に処理して、対象の生物体に食物として与える方法が挙げられる。核酸を導入する物理的な方法としては、ＲＮＡ溶液の、細胞内への直接注射又は生物体への細胞外注射が挙げられる。
【０１０４】
二本鎖構造は、１種の自己相補的ＲＮＡ鎖で構成されてもよいし、２種の相補的ＲＮＡ鎖で構成されてもよい。二本鎖の形成は、細胞内で誘導されてもよいし、細胞外で誘導されてもよい。ＲＮＡは、細胞１個につき少なくとも１個の構築物となる量で導入することができる。二本鎖物質の投与量が多いほど（例えば細胞１個につき少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００個）、より効力のある阻害が得られる。少ない投与量も、特定の用途には有用である。ＲＮＡの二本鎖領域に相当するヌクレオチド配列が、遺伝子阻害の標的となるという点において、阻害は配列特異的である。
【０１０５】
標的遺伝子のコード配列又は非コード配列の一部分と同一のヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ構築物が、阻害には好ましい。標的配列と比べて挿入、欠失及び一点突然変異を含むＲＮＡ配列(標的遺伝子に類似するｄｓＲＮＡ)も、阻害に有効であることが判明している。従って、公知の配列比較及び整列アルゴリズム［Gribskov及びDevereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press（1991）参照.。ここに参照して説明に代える］を用い、ヌクレオチド配列間の差異百分率を計算することによって［例えばＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムに用いられているスミス−ウォーターマンアルゴリズムにおいてデフォルト値を用いて（ウィスコンシン大学遺伝計算グループ）］、配列同一性を最適化することができる。抑制性ＲＮＡと標的遺伝子の部分との配列同一性が９０％を超える又は１００％であることが好ましい。あるいは、ＲＮＡの二本鎖領域は、その機能から、標的遺伝子転写物の一部分とハイブリダイズする（例えば４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、１２−１６時間の５０℃又は７０℃ハイブリダイゼーションを行い、次いで洗浄を行う）ことのできるヌクレオチド配列として定義することができる。ある好適具体例において、ｄｓＲＮＡの長さは、少なくとも２０、２１又は２２ヌクレオチド長であり、例えば、Ｄｉｃｅｒ依存性開裂により生成されるＲＮＡ産物の大きさに対応している。ある具体例において、ｄｓＲＮＡ構築物の長さは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００又は４００塩基である。ある態様においては、ｄｓＲＮＡ構築物は４００−８００塩基の長さである。
【０１０６】
ＲＮＡと標的遺伝子との配列同一性が１００％であることは、本発明の実施には必須条件ではない。従って、遺伝子突然変異、株の多型性又は進化上の発散などを原因として起こりうる、配列上の変異を許容できるという利点を本発明は有する。
【０１０７】
ｄｓＲＮＡ構築物はイン・ビボ又はイン・ビトロのいずれで合成してもよい。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼはイン・ビボでの転写を媒介することができ、あるいはクローニングしたＲＮＡポリメラーゼを用いてイン・ビボ又はイン・ビトロで転写を行うこともできる。イン・ビボでの導入遺伝子又は発現構築物からの転写に際しては、調節領域（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライシングドナー及びアクセプター、ポリＡ）を用いて（複数の）ｄｓＲＮＡ鎖を転写してもよい。阻害の標的化を、器官、組織又は細胞種における特異的な転写；環境条件による刺激（例えば感染、ストレス、温度、化学的誘発物質）；及び／又はある成長段階又は成長時期における遺伝子工学的転写によって、行うことができる。ＲＮＡ鎖はポリＡ化されていてもいなくてもよい。又、ＲＮＡ鎖は、細胞の有する翻訳系によってポリペプチドに翻訳されることができてもできなくてもよい。ｄｓＲＮＡ構築物は手動又は自動の反応により、化学的に又は酵素的に合成されてもよい。ｄｓＲＮＡ構築物は細胞のＲＮＡポリメラーゼによって合成されてもよいしバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ３、Ｔ７、ＳＰ６）によって合成されてもよい。発現構築物の使用と作製については、当分野で公知である（更にＷＯ９７／３２０１６；米国特許第５，５９３，８７４号、第５，６９８，４２５号、第５，７１２，１３５号、第５，７８９，２１４号及び第５，８０４，６９３号；及び本願明細書に引用した文献参照）。化学的に合成する場合又はイン・ビトロで酵素によって合成する場合、細胞に導入する前にＲＮＡを精製してもよい。例えば溶媒又は樹脂を用いる抽出、沈降、電気泳動、クロマトグラフィー又はそれらの組合せによって、混合物からＲＮＡを精製することができる。あるいは、試料の処理による構築物の損失を避けるために、ｄｓＲＮＡ構築物に全く精製を行わなくてもよいし、最少限の精製を行ってもよい。ｄｓＲＮＡ構築物は貯蔵のために乾燥してもよいし、水溶液に溶解してもよい。二本鎖のアニーリング及び／又は安定化を促進するために、溶液が緩衝液又は塩を含んでいてもよい。
【０１０８】
核酸を導入する物理的な方法の例としては、ｄｓＲＮＡ構築物を含む溶液の注入、ｄｓＲＮＡ構築物で被覆された粒子の打ち出し、ＲＮＡ溶液中への細胞又は生物体の浸漬、又はｄｓＲＮＡ構築物の存在下における細胞膜の電気穿孔が挙げられる。ウイルス粒子に封入したウイルス性構築物は、細胞内への発現構築物の効率的な導入と、発現構築物によりコードされるｄｓＲＮＡ構築物の転写との両方を達成しうる。脂質を媒介する担体輸送、化学物質（リン酸カルシウムなど）を媒介する輸送など、当分野で他に知られる、細胞への核酸導入方法を用いてもよい。従って、細胞によるＲＮＡ吸収量の増加；二本鎖アニーリングの促進；アニールした鎖の安定化；又は標的遺伝子阻害の促進から選ばれる１種以上の動作を行う成分と共に、ｄｓＲＮＡ構築物を導入してもよい。
【０１０９】
Ｅ．用途例
本発明の１つの用途としては、二本鎖ＲＮＡを用いて未知の機能を有する標的遺伝子の活性を阻害することを包含する、生物体、特に高等真核生物における遺伝子機能を同定する方法が挙げられる。突然変異体の単離に時間と手間のかかる従来の遺伝子スクリーニングの代わりに、本発明を用いて標的遺伝子活性の量を低減し及び／又はその活性の時期を変えることによって、機能ゲノム化学から未知の遺伝子機能を調べることができる。本発明を用いることで、製薬の潜在的な標的の調査、発生に関連した通常及び病理事象の理解、出生後発達／エイジングに関与するシグナル経路の決定などが可能になる。哺乳動物ゲノムの全配列などの、ゲノム及び発現遺伝子源からのヌクレオチド配列情報が急速に解明されているが、細胞又は生物体一個体における遺伝子機能の調査に、本発明を組み合わせることができる。特定のコドンを用いるのに適した生物体を選択し、配列データベースから関連の遺伝子産物を探し出し、遺伝特性の連鎖地図をヌクレオチド配列の由来する物理的地図に関連させ、人工知能法を用いることによって、そのような配列決定で得られたヌクレオチド配列から、推定の開いた読み枠を定義することができる。
【０１１０】
単純な検定としては、発現された配列標識（ＥＳＴ）から得られる部分配列に従って、遺伝子発現を阻害するものがある。成長、発生、代謝、病害抵抗性、又は他の生物学的プロセスにおける機能上の改変は、ＥＳＴの遺伝子産物の有する通常の役割を示す。
【０１１１】
標的遺伝子を含む未処理細胞／生物体内へのｄｓＲＮＡ構築物の導入が容易なので、本発明を高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）に用いることができる。例えば、標的細胞／生物体に由来する遺伝子ライブラリーの挿入物の両脇をはさむプライマーを用いた増幅反応によって、二本鎖ＲＮＡを産生することができる。挿入物は、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡに由来するもの（例えばｃＤＮＡ及びｃＲＮＡ）であってもよい。ライブラリーからの個々のクローンは、別々の反応で複製して単離することができるが、本発明の実施に必要な工程数を最小限におさえ、工程の自動化をはかるために、好ましくはライブラリーを別個の反応容器（例えば９６ウェルミクロ滴定プレート）に保持する。
【０１１２】
典型的具体例において、主題の発明は、ＲＮＡｉ構築物のアレイに整列されたライブラリーを提供する。このアレイは、マルチウェルプレートなどの溶液の形態であってよいし、又は細胞が成長することのできる固体基質上に「プリント」されたものであってもよい。説明のために、異なる発現遺伝子を阻害することのできる二本鎖ＲＮＡを含む溶液をミクロ滴定プレート上の整列した各ウェルに入れることができ、各ウェル内において、標的遺伝子活性を阻害したことによって未処理の細胞／生物体に起こる、動作又は発達における変化を調べることができる。増幅されたＲＮＡは標的遺伝子を含む細胞／生物体に直接に投与又は注入することができる。
【０１１３】
一具体例において、主題の方法は、ＲＮＡｉ構築物の整列されたライブラリーを利用して、宿主細胞に致死的なＲＮＡｉの組合せをスクリーニングする。致死性は、実験遺伝学の根本原理である。合成致死性は、個別的には生物体に許容されるが組み合わさると致死的となる２つの突然変異の特性を述べるものである。主題のアレイを利用して、他の遺伝子の変化(例えば、活性化されたオンコジーン又は腫瘍サプレッサーに対する機能喪失変異)と組み合わさると致死的である機能喪失変異を同定することができる。これを達成するために、培養細胞を利用して「表現型アレイ」を造ることができる。遺伝子のセット例えば宿主細胞ゲノムの各々の発現を、ＲＮＡ干渉を利用して個別に組織的に破壊することができる。オンコジーン及び腫瘍サプレッサー経路における変化との組合せを利用して、合成致死的相互作用を同定することができ、それは、新たな治療標的を同定することができる。
【０１１４】
ある具体例において、これらのＲＮＡｉ構築物は、標的遺伝子を含む細胞／生物体に直接供給又は注射することができる。あるいは二本鎖ＲＮＡは、ライブラリーを作製するのに用いた発現構築物からイン・ビボ又はイン・ビトロで転写することによって産生することもできる。構築物はライブラリーの個別のクローンとして複製することができ、転写されてＲＮＡを産生する。次いで標的遺伝子を含む細胞／生物体に各クローンを投与又は注入することができる。遺伝子活性が阻害された際に標的遺伝子が細胞／生物体に与えた影響から、標的遺伝子の機能を検定することができる。このスクリーニングを調整して、小さな対象物（哺乳類、特に霊長類、及び最も好ましくはヒト由来の組織培養細胞）を大量に処理することができる。
【０１１５】
ＲＦＬＰ又はＱＴＬ分析によって生物体の特性が遺伝的多型に関連していると判明した場合には、本発明を用いて、遺伝的多型が特性の直接的原因となっているかどうかについて調べることができる。例えば、そのような遺伝的多型の付近に遺伝的多型又は配列を定義する断片を増幅してＲＮＡを産生し、二本鎖ＲＮＡを生物体又は細胞に導入して、特性における変化が阻害に相関しているかどうかを調べることができる。もちろんこの種の検定には、例えば、標的遺伝子の阻害は致死を引き起こす、標的遺伝子の阻害からは観察可能な結果が得られないことがある、断片は標的遺伝子を阻害することのできないヌクレオチド配列を含む、あるいは標的遺伝子の活性物質は重複する、など細かなことであるが負の結果も生じうる。
【０１１６】
本発明は必須遺伝子の阻害に有用である。そのような遺伝子は特定の発達段階又は特別の細胞区画若しくは組織のみにおいて、細胞又は生物体の生存能力に必要とされていると考えられる。標的遺伝子の活性物質が生存能力に必要でない時点又は場所において、その活性物質を阻害することによって、条件突然変異の機能的同等物を産生することができる。本発明によって、標的ゲノム内に恒久突然変異を導入することなく、発達の特定の時点でかつ生物体の特定の場所において、ＲＮＡを付加することができる。
【０１１７】
本発明は、遺伝子重複のために他の方法を利用して阻害するのが困難であった遺伝子の阻害を可能にするのに有用でありうる。本発明を利用して複数のｄｓＲＮＡを細胞又は生物体に送達することができるので、複数の遺伝子と同一又は類似のｄｓＲＮＡ(該遺伝子は、正常な発生において重複する機能を有する)を送達することができる。
【０１１８】
特徴的なエキソンを用いることによって区別可能な転写物ファミリーが、選択的スプライシングによって産生される場合、本発明は適当なエキソンを通じた阻害を標的とし、転写物ファミリーの機能を特異的に阻害する又は特異的に区別するすることができる。例えば、選択的にスプライシングされた膜貫通ドメインを含むタンパク質因子は、膜結合の形態と分泌形態との両方で発現される可能性がある。膜貫通ドメインの前で翻訳を終結させるナンセンス突然変異を単離するかわりに、本発明に従い、膜貫通ドメインを含むエキソンを標的として膜結合ホルモンの発現を阻害することによって、分泌ホルモンのみを有する機能的産物を調べることができる。即ち、主題の方法を、スプライシング変異体の選択された消耗につき利用することができる。
【０１１９】
本発明は単独で用いてもよいし、試料又は被験体を調べるためのイン・ビトロ又はイン・ビボでのＲＮＡ導入を実施するのに必要な少なくとも１種の試薬を含むキットの一部として用いてもよい。好ましい成分はｄｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの導入を促進するビークルである。そのようなキットは、ユーザーが本発明を実施するために更に説明書を含んでいてもよい。
【０１２０】
あるいは商業的又は医療的に有益な結果（例えば病原体又はその発病効果に対する耐性、改良された発達、又は新規な発達パターン）を得るために、生物体を遺伝子工学処理してｄｓＲＮＡを産生するようにしてもよい。
【０１２１】
ＩＶ．実施例
ここまで一般的に説明した本発明を、下記実施例を参照してより詳しく説明するが、実施例は単に本発明の特定の特徴及び態様を例証するのが目的であって、本発明を限定すると解されるべきではない。
【０１２２】
実施例１：ＲＮＡに誘導されるヌクレアーゼはＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングの媒介となる
Ｃ．エレガンス、ショウジョウバエ、プラナリア、ヒドラ、トリパノソーマ、菌類及び植物を含む様々な生物体において、二本鎖ＲＮＡを導入すると配列特異的に遺伝子発現が阻害される(Sharp (1999) Gene and Development 13, 139-141；Sanchez-Alvarado 及び Newmark (1999) PNAS 96, 5049-5054；Lohmann等 (1999) Developmental Biology 214, 211-214；Cogoni及びMacino (1999) Nature 399, 166-169；Waterhouse等 (1998) PNAS 95, 13959-13964；Montgomery及びFire (1998) Trends Genet. 14, 225-228；Ngo等 (1998)PNAS 95, 14687-14692)。ＲＮＡ干渉又は転写後遺伝子サイレンシングと呼ばれるこれらの応答は、ウイルスに対する防御を提供するか、転位を調節するか、あるいは遺伝子発現を調節する(Sharp (1999) Gene and Development 13, 139-141；Montgomery及びFire (1998) Trends Genet. 14, 225-228；Tabara等 (1999) Cell 99, 123-132；Ketting等 (1999) Cell 99, 133-141；Ratcliff等 (1997) Science 276, 1558-1560)。この遺伝子現象の機構を解明するために、本発明者らは生化学的方法を用いた。本実施例では、特異的な二本鎖ＲＮＡでショウジョウバエ培養細胞をトランスフェクトすることによって「機能損失」表現型が得られることを示す。これは同族の細胞メッセンジャーＲＮＡのレベルが顕著に低減することに一致する。トランスフェクト細胞の抽出物は、トランスフェクト二本鎖ＲＮＡに相同性を有する外因性転写物を特異的に分解するヌクレアーゼ活性物質を含む。この酵素は必須ＲＮＡ成分を含む。部分的に精製した後、基質ｍＲＮＡとの相同性を通じて酵素に特異性を与える別個の〜２５ヌクレオチドＲＮＡと共に、配列特異的ヌクレアーゼを分別した。
【０１２３】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はショウジョウバエを含む数多くの生物体において遺伝子サイレンシングを誘導することができるが(Kennerdell等 (1998) Cell 95, 1017-1026；Misquitta及びPaterson (1999) PNAS 96, 1451-1456)、この現象を説明する機構のほとんどは解明されていない。従って本発明者らはこの機構を研究することのできる、生化学的取り扱いが可能なモデルの作製を試みた。
【０１２４】
ｌａｃＺ発現ベクターを用いてショウジョウバエＳ２培養細胞を一過的にトランスフェクトした結果、β−ガラクトシダーゼ活性が原位置検定によって容易に検出された（図１ａ）。この活性は、ｌａｃＺ配列の最初の３００ヌクレオチドに相当するｄｓＲＮＡを用いた同時形質移入によって顕著に減少したが、一方、対照ｄｓＲＮＡ（ＣＤ８）（図１ａ）あるいはセンス又はアンチセンスいずれかの方向の一本鎖ＲＮＡ（データ示さず）を用いた同時形質移入では、影響がほとんど又は全く見られなかった。これは、培養細胞における遺伝子発現をｄｓＲＮＡが配列特異的に阻害しうることを示している。
【０１２５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて内因性遺伝子が標的化できるかどうかを調べるために、ショウジョウバエサイクリンＥ（細胞周期のＳ期への進行に必須の遺伝子）の最初の５４０ヌクレオチドに相当するｄｓＲＮＡでＳ２細胞をトランスフェクトした。対数期成長の間、未処理のＳ２細胞は主にＧ２／Ｍにとどまっていた（図１ｂ）。ｌａｃＺｄｓＲＮＡでトランスフェクトした場合には細胞周期分布に影響はなかったが、サイクリンＥｄｓＲＮＡでトランスフェクトした場合にはＧ１期細胞周期で停止した（図１ｂ）。サイクリンＥｄｓＲＮＡにより引き起こされるこの応答は、長さに依存していた。５４０及び４００ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡによる影響は大きかったが、それに比較して２００及び３００ヌクレオチドのｄｓＲＮＡによる影響は低かった。５０又は１００ヌクレオチドの二本鎖サイクリンＥＲＮＡは本発明者らによる検定では不活性であり、一本鎖アンチセンスサイクリンＥＲＮＡによるトランスフェクションは実質的に影響がなかった。
【０１２６】
ＲＮＡｉの顕著な特徴のひとつとして、ｄｓＲＮＡに相同性を有するｍＲＮＡ量の低減が挙げられる。サイクリンＥｄｓＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（複数個集団）では、対照細胞と比較して、内因性サイクリンＥｍＲＮＡが減少していた（図１ｃ）。同様に、ｆｉｚｚｙ（後期移行促進複合体（ＡＰＣ）の成分）又はサイクリンＡ（Ｓ、Ｇ２及びＭで作動するサイクリン）に相同性を有するＲＮＡでトランスフェクトしたところ、同族のｍＲＮＡ量が減少した（図１ｃ）。サイクリンＡｄｓＲＮＡでトランスフェクトした細胞においてｆｉｚｚｙｍＲＮＡが少量の低減をみせたが、これはおそらく、分裂周期中のｆｉｚｚｙ転写量の低い時点で停止したことが原因と思われる(Wolf及びJackson(1998) Current Biology 8, R637-R639；Kramer等 (1998) Current Biology 8, 1207-1210)。これらの結果は、ショウジョウバエ培養細胞における遺伝子機能を探求する方法として、ＲＮＡｉが一般的に適用可能であることを示している。
【０１２７】
特定のｄｓＲＮＡをショウジョウバエ細胞にトランスフェクトした際に観察されるｍＲＮＡ量の減少については、転写又は転写後レベルでの影響によって説明できる。他の系から得られたデータは、ｄｓＲＮＡ応答の幾つかの因子がｍＲＮＡに直接影響を与えていることを示している（Sharp (1999) Gene and Development 13, 139-141；Montgomery及びFire (1998) Trends Genet. 14, 225-228）。従ってＲＮＡｉを少なくとも部分的に利用した、細胞を用いないアッセイの構築を試みた。
【０１２８】
サイクリンＥ又はｌａｃＺのいずれかに相当するｄｓＲＮＡでＳ２細胞をトランスフェクトした。細胞抽出物をｌａｃＺ又はサイクリンＥの合成ｍＲＮＡと共にインキュベートした。５４０ヌクレオチドサイクリンＥｄｓＲＮＡでトランスフェクトした細胞から調製した抽出物は、サイクリンＥ転写物を効率的に分解した。一方、ｌａｃＺ転写物はこれらの溶解産物において安定していた（図２ａ）。それとは逆に、ｌａｃＺｄｓＲＮＡでトランスフェクトした細胞から得た溶解産物は、ｌａｃＺ転写物を分解したが、サイクリンＥｍＲＮＡは未反応のままであった。これらの結果は、ＲＮＡｉが配列特異的ヌクレアーゼ活性物質の産生を通じて、標的ｍＲＮＡを分解することを示している。この酵素をＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と称する。分解過程において、中間物と思われるものが何度か観察されたが（図２参照）、開裂による最終生成物で安定したものが存在しないということは、それがエキソヌクレアーゼ（おそらくエンドヌクレアーゼに結合している）であることを示している。しかし、ＲＮＡｉヌクレアーゼが内ヌクレオチド結合分解性の切断を最初に行い、抽出物中の非特異的エキソヌクレアーゼが分解過程を完了させるということもありうる(Shuttleworth及びColman (1988) EMBO J. 7, 427-434)。加えて、ｌａｃＺをイン・ビトロで標的にする抽出物を作製できるということは、内因性遺伝子の存在がＲＮＡｉ応答には必要ないことを意味している。
【０１２９】
ｄｓＲＮＡ誘導の配列特異的ヌクレアーゼ活性物質に必要な基質条件を調べるために、５４０ヌクレオチドサイクリンＥｄｓＲＮＡでトランスフェクトした細胞由来の抽出物と共に、様々なサイクリンＥ由来転写物をインキュベートした（図２ｂ、ｃ）。トランスフェクトされたｄｓＲＮＡについて、長いものが必須条件であることが上記で観察されたのと同様に、ＲＮＡｉヌクレアーゼ活性も、ＲＮＡ基質の寸法に依存することが示された。標的となる領域を僅かに伸長した６００ヌクレオチド転写物（図２ｂ）と全コード配列を含む〜１キロベース（ｋｂ）の転写物（データ示さず）との両方が、抽出物によって完全に破壊された。驚くべきことに、短い基質は効率的には分解されなかった。３００又は２２０ヌクレオチド転写物のいずれかにおいて活性の減少が観察され、本検定においては１００ヌクレオチド転写物はヌクレアーゼに対して耐性を有していた。これは位置効果のみによるものではない。というのはトランスフェクトしたｄｓＲＮＡの他の部分に由来する〜１００ヌクレオチド転写物が同様の動作を見せた（データ示さず）からである。予測される通りに、抽出物中に存在する（複数の）ヌクレアーゼ活性物質は、サイクリンＥｍＲＮＡアンチセンス鎖を認識することもできた。ここでも又、標的となる領域の実質的部分を含む基質は効率的に分解されたが、一方、短い相同配列鎖（〜１３０ヌクレオチド）を含むものは、効率的に認識されなかった（図２ｃ、ａｓ６００）。センス及びアンチセンス鎖の両方について、トランスフェクトされたｄｓＲＮＡと相同性を有さない転写物（図２ｂ、Ｅｏｕｔ；図２ｃ、ａｓ３００）は分解されなかった。標的となる領域を超えてヌクレアーゼの特異性が移動したという可能性を否定できないが、ｄｓＲＮＡに相同性を有さない転写物の耐性は、Ｃ．エレガンスから得たデータに一致した。未反応の多シストロン性ｍＲＮＡが容易に検出できるにもかかわらず、上流シストロンに相同性を有する二本鎖ＲＮＡは、結合した下流シストロンにほとんど又は全く影響を与えなかった(Tabara等 (1998) Science 282, 430-432；Bosher等 (1999) Genetics 153, 1245-1256)。その上更に、イン・ビボでのＲＮＡｉ応答を誘導するのに用いられたものと同一のｄｓＲＮＡに対して、ヌクレアーゼは不活性であった（図２ｂ）。イン・ビトロ系において５’キャップとポリＡ末端を有する転写物はキャップを有さない又はポリＡを有さないＲＮＡの場合と同様に効率的に分解され、従ってイン・ビトロ系において、５’キャップとポリＡ末端のどちらも必要ではなかった。
【０１３０】
ｄｓＲＮＡによって誘導される遺伝子サイレンシングは、配列特異的である。特異性を決定する機構について妥当と思われるものとして、サイレンシングを遂行する複合体内に核酸ガイド配列が合体することが考えられる(Hamilton及びBaulcombe (1999) Science 286, 950-952)。この考えに一致して、抽出物をＣａ2+依存性ヌクレアーゼ（小球菌ヌクレアーゼ）で予め処理すると、これらの抽出物の、同族ｍＲＮＡを破壊する能力が失われる（図３）。非特異的ＲＮＡ（酵母菌運搬ＲＮＡなど）を添加しても、活性は回復しなかった。小球菌ヌクレアーゼはＤＮＡとＲＮＡの両方を分解できるが、ＤＮアーゼＩで抽出物を処理しても影響はなかった（図３）。しかし配列特異的ヌクレアーゼ活性は、タンパク質を必要とした（データ示さず）。これらの結果は、ＲＮＡｉヌクレアーゼが、ＲＮＡとタンパク質成分との両方を必要とするリボ核タンパク質であるという可能性を支持している。生化学分画法の結果（下記参照）は、これらの成分が添加後に標的ｍＲＮＡ上に蓄積されず抽出物に結合するという点で一致する。
【０１３１】
植物において、相互抑制効果の現象は、発現抑制される遺伝子に相当する小さな（〜２５ヌクレオチド）ＲＮＡの存在に関連していた(Hamilton及びBaulcombe (1999) Science 286, 950-952)。同様のＲＮＡがショウジョウバエに存在し、基質の選択に際して配列特異的ヌクレアーゼを誘導するという可能性を調べるために、複数の分画段階で本発明の活性物質を部分的に精製した。未処理の抽出物は、配列特異的ヌクレアーゼ活性物質と、トランスフェクトされたｄｓＲＮＡに相同性を有する多量の異種ＲＮＡとの両方を含んでいた（図２及び図４ａ）。高速遠心分離段階で、ＲＮＡｉヌクレアーゼがリボソームと共に分別された。活性物質は高塩分で処理することで抽出することができ、リボソームは遠心分離を更に行うことによって除去できる。陰イオン交換カラムを用いたクロマトグラフィーを可溶性ヌクレアーゼについて行ったところ、はっきりとした活性物質のピークが得られた（図４ｂ、サイクリンＥ）。この特異性は異種ｍＲＮＡに対しては不活性だった（図４ｂ、ｌａｃＺ）。活性画分は更に、サイクリンＥ標的に相同性を有する、２５ヌクレオチドのＲＮＡ種を含んでいた（図４ｂ、ノーザン分析）。ノーザンブロットで観察されたバンドは、センス及びアンチセンスサイクリンＥ配列の両方に特異的なプローブを用いて、ならびにｄｓＲＮＡに独特な部分に由来するプローブを用いて検出することができる（データ示さず）ので、別個のＲＮＡファミリーを表すと考えられる。現在のところ、２５ヌクレオチドＲＮＡがヌクレアーゼ複合体中に二本鎖の形状で存在するのか一本鎖の形状で存在するのかは判明していない。
【０１３２】
ＲＮＡ干渉は、ｄｓＲＮＡ免疫応答に類似した、外因性及び内因性両方のｄｓＲＮＡに対する適応性の防御を可能にする。本発明者らによるデータ及び他の研究者らによるデータ(Hamilton及びBaulcombe (1999) Science 286, 950-952)は、抗原のプロセッシングと類似した方法で、細胞中に存在するｄｓＲＮＡが、プロセッシング又は複製のいずれかを通じて、個別の寸法を有する小さな特異的決定子に変換されるというモデルと一致する。ｄｓＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングの転写後成分は、配列認識に基づく特異的メッセージを標的とするガイドとしてこれらの小さなＲＮＡを組み込む、配列特異的ヌクレアーゼによって達成されるということを、本発明者らによる結果は示唆している。様々な植物・動物において、同一寸法の推定特異性決定子が存在する(Hamilton及びBaulcombe (1999) Science 286, 950-952)ということから、ｄｓＲＮＡに誘導される転写後遺伝子サイレンシングの機構及び成分の両方が様々な生物体に保存されていると思われる。植物において、ｄｓＲＮＡは転写後遺伝子サイレンシングを誘導するだけでなく、クロマチンリモデリングと転写抑制も誘導する(Jones等 (1998) EMBO J. 17, 6385-6393；Jones等 (1999) Plant Cell 11, 2291-2301)。遺伝子サイレンシング機構の保存が転写レベルにおいても存在するのかどうか、これらの同じｄｓＲＮＡ由来ガイド配列によって配列特異的にクロマチンリモデリングが誘導できるのかどうか、という点について調べるのが課題である。
【０１３３】
方法
細胞培養及びＲＮＡ法  Ｓ２細胞(Schneider (1972) J. Embryol. Exp. Morpho. 27, 353-365)を、９０％シュナイダー昆虫培養基（Ｓｉｇｍａ）、１０％熱不活化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）において２７℃で培養した。リン酸カルシウム共沈によって、細胞をｄｓＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡでトランスフェトした(Di Nocera及びDawid (1983) PNAS 80, 7095-7098)。脂質試薬（例えばＳｕｐｅｒｆｅｃｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞をトランスフェクトした場合と、同一の結果が得られた。ＦＡＣＳ分析用に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−ＵＳ９融合タンパク質の発現を誘導するベクターで細胞を更にトランスフェクトした(Kalejta等 (1999) Exp. Cell. Res. 248, 322-328)。これらの細胞を９０％氷冷エタノール内で固定し、ヨウ化プロピジウムで２５μｇ／ｍｌにて染色した。Ｅｌｉｔｅフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＦＡＣＳを行った。ノーザンブロット用に、対照の相補的ＤＮＡ（ＲＰ４９）を用いたオーバープローブ（over-probing）ブロットによって等量を保持した。ｄｓＲＮＡの作製では、テンプレートの各末端にＴ７プロモーター配列を含むように、ポリメラーゼ連鎖反応によって転写テンプレートを作製した。ＲＮＡはＲｉｂｏＭａｘキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて調製した。ＲＮＡが二本鎖であることを、リボヌクレアーゼＩＩＩ（Ａ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎによる寄贈）に対して完全な感応性を有することから確認した。標的ｍＲＮＡ転写物を、リボプローブキット（Ｐｒｏｍｇｅｇａ）を用いて合成し、使用前にゲルで精製した。
【０１３４】
抽出物の調製  対数期のＳ２細胞を１５ｃｍ組織培養皿に入れ、３０μｇのｄｓＲＮＡ及び３０μｇの担体プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を５ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＰＢＳ中に採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、低張性緩衝液［１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、６ｍＭ  β−メルカプトエタノール］で１回洗浄した。完全プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）及び０．５単位／ｍｌのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｇｅｇａ）を含む０．７充填細胞容積の低張性緩衝液に細胞を懸濁した。Ｂ型ペッスルを備えるダンス型ホモジェナイザーで細胞を破壊し、溶解産物を３０，０００ｇで２０分間遠心分離にかけた。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ  ＫＯＡｃ、１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2、３ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴを含むイン・ビトロアッセイに、上澄みを用いた。１０，０００ｃ．ｐ．ｍ．の合成ｍＲＮＡ基質を更に含む１０μｌアッセイに、５μｌの抽出物を用いた。
【０１３５】
抽出物分画法  抽出物を２００，０００ｇで３時間遠心分離にかけ、得られたペレット（リボソームを含む）を１ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び３００ｍＭ  ＫＯＡｃを含む低張生緩衝液で抽出した。抽出した物質を１００，０００ｇで１時間回転させ、得られた上澄みを、緩衝液Ａ［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2］におけるＫＣｌ勾配を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分別した。画分を、上記したようにヌクレアーゼ活性について調べた。ノーザンブロット法として、画分をプロテイナーゼＫ／ＳＤＳで処理し、フェノールで抽出し、１５％アクリルアミド８Ｍ尿素ゲル上で分解した。ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋上に電気ブロッティングし、サイクリンＥｍＲＮＡに由来する鎖特異的リボプローブの存在を調べた。５００ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１５％ホルムアミド、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ中でハイブリダイゼーションを実施した。ブロットを１ＳＳＣ中にて３７−４５℃で洗浄した。
【０１３６】
実施例２：ＲＮＡ干渉の開始段階における二座（bidentate）リボヌクレアーゼの役割
蠕虫、菌類及び植物における遺伝子学的研究によって、二本鎖ＲＮＡに誘導される遺伝子サイレンシングに必須のタンパク質群がこれまでに同定されている。これらには、ＡＲＧＯＮＡＵＴＥファミリー（例えばＲＤＥ１、ＱＤＥ２）(Tabara等 (1999) Cell 99, 123-132；Catalanotto等 (2000) Nature 404, 245；Fagard等 (2000) PNAS 97, 11650-11654)、ｒｅｃＱファミリーヘリカーゼ（ＭＵＴ−７、ＱＤＥ３）(Ketting等 (1999) Cell 99, 133-141；Cogoni及びMacino. (1999) Science 286, 2342-2344)及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＥＧＯ−１、ＱＤＥ１、ＳＧＳ２／ＳＤＥ１）(Cogoni及びMacino (1999) Nature 399, 166-169；Smardon等 (2000) Current Biology 10, 169-178；Mourrain等 (2000) Cell 101, 533-542；Dalmay等 (2000) Cell 101, 543-553)がある。これらの役割と考えられるものがこれまでに提案されてはいるが、これらの遺伝子のいずれについてもサイレンシング工程における機能は確定していない。これまでの生化学的研究では、ｍＲＮＡを標的として分解する多成分ヌクレアーゼによってＰＴＧＳが行われるということが示唆されている(Hammond等 (2000) Nature 404,293-296；Zamore等 (2000) Cell 101, 25-33；Tuschl等 (1999) Genes and Development 13, 3191-3197)。本発明者らは、この複合体の特異性が、ｍＲＮＡ基質に相同な性を有する小さなガイド配列の組み込みに由来するであろうことを示した(Hammond等 (2000) Nature 404,293-296)。元々は植物において、積極的な発現抑制導入遺伝子であると同定された(Hamilton及びBaulcombe (1999) Science 286, 2950-2)これらの〜２２ｎｔＲＮＡを、ショウジョウバエ胚から調製した抽出物を用いてイン・ビトロＲＮＡｉの間に作製することが行われている(Zamore等 (2000) Cell 101, 25-33)。推定ガイドＲＮＡもショウジョウバエＳ２細胞からの抽出物内に作製することができる（図５ａ）。転写後遺伝子サイレンシングの機構を理解するという目的から、ＲＮＡｉの各段階を実施する酵素を同定するために、生化学分画と候補遺伝子の両方の方法を用いた。
【０１３７】
本発明者らによるこれまでの研究では、ＲＮＡ干渉を実施する物質であるヌクレアーゼ（ＲＩＳＣ）の部分的精製に成功している（実施例１参照）。この酵素はｄｓＲＮＡを用いたトランスフェクションによってイン・ビボでＲＮＡｉが誘導された、ショウジョウバエＳ２細胞から単離された。従ってまず、ＲＩＳＣ酵素とｄｓＲＮＡから２２ｍｅｒへのプロセッシングを通じてＲＮＡｉを誘導する酵素とが別の活性物質であるかどうかを調べた。ＲＩＳＣ活性物質は高速遠心分離（１００，０００ｘｇ、６０分間）によって抽出物から区別されたが、２２ｍｅｒを産生する活性物質は上澄みに残っていた（図５ｂ、ｃ）。この単純な分画法の結果は、ＲＩＳＣと２２ｍｅｒ産生活性物質とは分離でき、従って別の酵素であることを示している。しかしこれらはサイレンシング過程のある時点で相互に作用するようである。
【０１３８】
リボヌクレアーゼＩＩＩファミリーは、二本鎖ＲＮＡに特異性を示す数少ないヌクレアーゼの一つである(Nicholson (1999) FEMS Microbiol Rev 23, 371-390)。ショウジョウバエ及びＣ．エレガンスのゲノムを分析したところ、リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素には数種類あることがわかった。１種類目は、１個のリボヌクレアーゼＩＩＩシグナチャーモチーフと１個の二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ；例えばＲＮＣ＿ＣＡＥＥＬ）を含む標準的なリボヌクレアーゼＩＩＩである。２種類目は、Ｄｒｏｓｈａに代表される(Filippov等 (2000) Gene 245, 213-221)、２個のリボヌクレアーゼＩＩＩモチーフと１個のｄｓＲＢＤを含むショウジョウバエ酵素である（Ｃ．エレガンスのＣｅＤｒｏｓｈａなど）。３種類目は、２個のリボヌクレアーゼＩＩＩシグナチャーと１個のアミノ末端ヘリカーゼドメインを含むものである（例えばショウジョウバエＣＧ４７９２、ＣＧ６４９３、Ｃ．エレガンスＫ１２Ｈ４．８など）。これらはＢａｓｓによってＲＮＡｉヌクレアーゼ候補として提案されているものである(Bass (2000) Cell 101, 235-238)。これら３種類の代表的なものが、ｄｓＲＮＡ基質から別個の〜２２ｎｔのＲＮＡを産生する能力を有するかどうかを調べた。
【０１３９】
精製された菌リボヌクレアーゼＩＩＩで５００ｎｔサイクリンＥｄｓＲＮＡを部分消化することによって、生成物の塗沫を作製した。又、ほぼ完全な消化を行って〜１１−１７ヌクレオチドＲＮＡの異種群を作製した（図示せず）。二重のリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素を調べるために、Ｔ７エピトープ標識付けされたＤｒｏｓｈａ及びＣＧ４７９２を調製した。トランスフェクトされたＳ２細胞内でこれらを発現し、抗体アガロース複合体を用いた免疫沈降反応によって単離した。ｄｓＲＮＡをＣＧ４７９２免疫沈降で処理したところ、Ｓ２又は胚抽出物において産生されたものと類似の〜２２ｎｔ断片が得られた（図６ａ）。数種の遺伝子に由来するｄｓＲＮＡを同等に処理したので、抽出物中の活性物質と免疫沈降中の活性物質とのいずれとも、ＲＮＡ基質の配列に依存していなかった（付録１参照）。ＤｒｏｓｈａとＤＥｘＨボックスヘリカーゼ（Ｈｏｍｅｌｅｓｓ(Gillespie等 (1995) Genes and Development 9, 2495-2508)；図６ａ、ｂ参照）の免疫沈降とにおいて、負の結果が得られた。ウエスタンブロット法によって、各標識タンパク質が同様に発現され免疫沈降することが確認された（付録２参照）。従ってＣＧ４７９２が、ｄｓＲＮＡから〜２２ｎｔガイド配列を産生することによって、ＲＮＡ干渉の開始段階を誘導するとの結論を得た。ｄｓＲＮＡを均一寸法の小さなＲＮＡに消化する能力から、この酵素をＤｉｃｅｒ（Ｄｃｒ）と称する。ＤｉｃｅｒｍＲＮＡは胚、Ｓ２細胞及びハエ成虫において発現されるが、これはこれらの生物体全てにおいて機能的ＲＮＡｉ機構が存在することと一致する（付録３参照）。
【０１４０】
Ｄｉｃｅｒが、ｄｓＲＮＡからガイドＲＮＡを産生する役割を果たすヌクレアーゼである、という可能性があることから、Ｄｉｃｅｒタンパク質（Ｄｉｃｅｒ−１、ＣＧ４７９２）のカルボキシ末端に対する抗血清を作製した。この抗血清を用いると、ｄｓＲＮＡ基質から〜２２ｎｔＲＮＡを産生した、ショウジョウバエ胚抽出物又はＳ２細胞溶解産物のいずれかから、ヌクレアーゼ活性物質を免疫沈降することができる（図６Ｃ）。Ｄｉｃｅｒ−１酵素によって産生される推定ガイドＲＮＡは、抽出物内に産生される２２ｍｅｒ及びＲＩＳＣ酵素に関連する２２ｍｅｒと完全に一致して移動した（図６Ｄ、F）。ショウジョウバエ胚抽出物においてガイドＲＮＡ産生する酵素がＡＴＰ依存性であることが、これまでの研究で示されている(Zamore等 (2000) Cell 101, 25-33)。この補因子を喪失させたところ、ｄｓＲＮＡ消化量は〜６分の１と低くなり、移動度が少し低いＲＮＡが産生された。興味深いことに、Ｄｉｃｅｒ−１免疫沈降とＳ２細胞からの抽出物との両方が、〜２２ｍｅｒの産生にＡＴＰを必要とした（図６Ｄ）。ＡＴＰを枯渇させた胚抽出物においては移動度の低い生成物の蓄積が繰り返し観察されたが、上記の場合においては観察されなかった。ヌクレアーゼがＡＴＰを必要とするということは非常に希な特性である。この必要性から、ガイドＲＮＡの展開と基質に沿った転座との両方ににおいてヘリカーゼドメインがＡＴＰ加水分解のエネルギーを利用することで、酵素がｄｓＲＮＡに積極的に作用しているという仮説がたてられる。
【０１４１】
Ｃ．エレガンス及びショウジョウバエにおけるＲＮＡ干渉の効率的な誘導には、幾つかの必要条件がある。例えば、開始ＲＮＡは二本鎖であり数百のヌクレオチド長でなければならない。これらの必須条件がＤｉｃｅｒによるものかどうかを調べるために、抽出物と免疫沈降した酵素との有する、様々なＲＮＡ基質を消化する能力について特徴を調べた。Ｄｉｃｅｒは、長さにかかわらず一本鎖ＲＮＡに対して不活性であった（付録４参照）。酵素は２００及び５００ヌクレオチドｄｓＲＮＡの両方を消化したが、短い基質については顕著に低い活性を示した（付録４参照）。３５ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡは、非常に非効率的ではあったが、酵素で切断することが可能であった（データ示さず）。これに対して、大腸菌リボヌクレアーゼＩＩＩはｄｓＲＮＡを３５又は２２ヌクレオチドに完全に消化することができた（データ示さず）。これらの結果は、Ｄｉｃｅｒ酵素が有する基質の選択性が、ＲＮＡｉの寸法依存性に、完全にではないとはいえ寄与していることを示唆している。
【０１４２】
Ｄｉｃｅｒ酵素が実際に、イン・ビボでのＲＮＡｉに役割を果たしているかどうかを調べるために、 Ｄｉｃｅｒ活性物質をＳ２細胞から枯渇させるとｄｓＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシングにどのような影響があるかを調べた。２種のショウジョウバエＤｉｃｅｒ遺伝子（ＣＧ４７９２及びＣＧ６４９３）に相同性を有するｄｓＲＮＡの混合物で、Ｓ２細胞をトランスフェクトしたところ、全細胞溶解産物とＤｉｃｅｒ−１免疫沈降とのいずれにおいても、Ｄｉｃｅｒ活性物質の量が〜６−７分の１に減少した（図７Ａ、Ｂ）。対照ｄｓＲＮＡ（マウスカスパーゼ９）によるトランスフェクションでは影響が見られなかった。Ｄｉｃｅｒをノーザンブロット法で調べた場合にも、数量的に同様の結果が得られた（図示せず）。このようにＤｉｃｅｒを喪失させた場合、それに引き続いて、ＲＮＡｉによる外因性ＧＦＰ導入遺伝子を発現抑制する、細胞の能力が実質的に失われた（図７Ｃ）。これらの結果は、Ｄｉｃｅｒがイン・ビボＲＮＡｉに関与していることを示している。サイレンシングの完全な阻害が得られなかったということは、Ｄｉｃｅｒ（それ自身がＲＮＡｉに必須である）の不完全な抑制に由来すると考えられる。あるいはイン・ビボにおいてガイドＲＮＡが１種以上の機構によって（例えばＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用を通じて）産生されうることを示している。
【０１４３】
本発明者らの研究結果は、ＲＮＡ干渉の工程が少なくとも２つの異なる段階に分けられることを示している。このモデルによると、Ｄｉｃｅｒによって二本鎖ＲＮＡが〜２２ヌクレオチドガイド配列にプロセスされることでＰＴＧＳは始まると考えられるが、別のＤｉｃｅｒ関連ヌクレアーゼがこの工程に関与しているという可能性をはっきりと除外できない。これらのガイドＲＮＡは一本鎖ｍＲＮＡを分解の標的とする別のヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ）内に組み込まれると考えられる。このモデルの意味するところは、ガイド配列それ自体は、応答を誘導するｄｓＲＮＡに直接に由来しているということである。このモデルと一致して、トランスフェクションでＳ２細胞に導入した32Ｐ標識外因性ｄｓＲＮＡが、２２ｍｅｒとしてＲＩＳＣ酵素に組み込まれることを本発明者らは実証した（図７Ｅ）。しかしＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、一度産生されると２２ｍｅｒを増幅する、あるいはガイドＲＮＡを産生する別の方法を提供する、という可能性を除外できない。
【０１４４】
Ｄｉｃｅｒ酵素の構造から、ｄｓＲＮＡの配列に関係なく、酵素が別個の寸法の断片を産生するという機構が考えられる（付録１、図８ａ参照）。菌リボヌクレアーゼＩＩＩは、基質に対して二量体として作用することがこれまでに確認されている(Nicholson (1999) FEMS Microbiol Rev 23, 371-390；Robertson等 (1968) J Biol Chem 243, 82-91；Dunn (1976) J Biol Chem 251, 3807-3814)。同様に、二量体のＤｉｃｅｒ酵素が、ｄｓＲＮＡを〜２２ｎｔ断片に開裂するのに必要であると考えられる。ある１つのモデルによると、開裂間隔は、Ｄｉｃｅｒ酵素内の２個のリボヌクレアーゼＩＩＩドメインの物理的な配置によって決定される（図８ａ）。もっともらしい別のモデルからは、１個のＤｉｃｅｒタンパク質における２個のＲＩＩＩドメインによって、単一位置で開裂が誘導されうるということが考えられる。２２ヌクレオチド間隔は、隣接するＤｉｃｅｒ酵素の相互作用によって、あるいはｍＲＮＡ基質に沿った転座によって起こると考えられる。一体的なヘリカーゼドメインの存在は、Ｄｉｃｅｒ開裂の産物が、ＲＩＳＣ酵素それ自体に組み込まれた一本鎖２２ｍｅｒである可能性を示唆している。
【０１４５】
Ｄｉｃｅｒファミリーの顕著な特徴として、進化上の保存が挙げられる。同族体がＣ．エレガンス（Ｋ１２Ｈ４．８）、シロイヌナズナ（例えばＣＡＲＰＥＬ  ＦＡＣＴＯＲＹ(Jacobsen等 (1999) Development 126, 5231-5243)、Ｔ２５Ｋ１６．４、ＡＣ０１２３２８＿１）、哺乳類（ヘリカーゼ−ＭＯＩ(Matsuda等 (2000) Biochim Biophys Acta 1490, 163-169)）及びＳ．ｐｏｍｂｅ（ＹＣ９Ａ＿ＳＣＨＰＯ）に見られる（図８ｂ参照、配列の比較について付録６、７参照）。実際に、ヒトＤｉｃｅｒファミリーはｄｓＲＮＡ基質から〜２２ｎｔＲＮＡを産生することができるが（付録５）、このことは、これらの構造的に類似したタンパク質は全て、類似した生化学的機能を有している可能性を示唆している。外因性ｄｓＲＮＡがマウス初期胚の遺伝子機能に影響を与えることがこれまでに実証されており(Wianny等 (2000) Nature Cell Biology 2,70-75)、本発明者らの研究結果は、進化上保存されたＲＮＡｉ機構によって上記調節が遂行されることを示唆している。
【０１４６】
リボヌクレアーゼＩＩＩ及びヘリカーゼのモチーフに加えて、Ｐｆａｍデータベースを研究した結果は、各Ｄｉｃｅｒファミリーが更にＺＡＰドメインを含んでいることを示している（図８ｃ）(Sonnhammer等 (1997) Proteins 28, 405-420)。この配列は、Ｃ．エレガンス（Ｒｄｅ−１）及びアカパンカビ（Ｑｄｅ−２）(Tabara等 (1999) Cell 99, 123-132；Catalanotto等 (2000) Nature 404, 245)における突然変異によるＲＮＡｉに関係があるとされてきたＺｗｉｌｌｅ／ＡＲＧＯＮＡＵＴＥ／Ｐｉｗｉファミリーにおける保存のみに基づいて定義されていた。このドメインの機能は解明されていないが、興味深いことにこの相同的領域は、ｄｓＲＮＡ依存性サイレンシングに関与する２つの遺伝子ファミリーに限定されている。ＡＲＧＯＮＡＵＴＥファミリー及びＤｉｃｅｒファミリーの両方は、一般的な生物学的工程、主に幹細胞の予定運命の決定に関係があるとされている。シロイヌナズナにおけるＤｉｃｅｒファミリーである、ＣＡＲＰＥＬ  ＦＡＣＴＯＲＹの低次形態対立遺伝子は、花の分裂組織における増殖率の増加によって特徴付けられる(Jacobsen等 (1999) Development 126, 5231-5243)。この表現型と他の多くの特徴が、シロイヌナズナＡＲＧＯＮＡＵＴＥ（ａｇｏ１−１）突然変異体と共通している(Bohmert等 (1998) EMBO J 17, 170-180)（C. Kidner及びR. Martiennsen, pres. comm.）。これらの遺伝子分析は、ＲＮＡｉが異常なＲＮＡに対する防御応答応答以上のものであり、内因性遺伝子の調節において重要な役割も果たしているということの証拠にもなっている。
【０１４７】
ここまで、ＲＮＡｉ開始段階における触媒としてＤｉｃｅｒを同定し、この非常に変わった遺伝子調節機構の、生化学的な原理を解明してきた。他の生物体から、特に哺乳類から保存されているファミリーのメンバーが、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子調節においても重要な役割を果たしているかどうかを調べるのが重要であると考えられる。
【０１４８】
方法
プラスミド構築物。バークレー・ショウジョウバエゲノム計画で配列決定されたＥＳＴから、Ｄｒｏｓｈａをコードする全長ｃＤＮＡをＰＣＲによって得た。ＨｏｍｅｌｅｓｓクローンはＧｉｌｌｅｓｐｉｅ及びＢｅｒｇ（ワシントン大学）により寄贈されたものを用いた。Ｔ７エピトープ標識をＰＣＲにより各アミノ末端に添加し、特に昆虫細胞内での発現用として企図されたレトロウイルスベクター（Ｅ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、未発表）であるｐＲＩＰ内に、標識ｃＤＮＡをクローンした。このベクターでは、発現はＯｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａＩＥ２プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって誘導される。ＣＧ４７９２／ＤｉｃｅｒのｃＤＮＡが入手できないので、ゲノムクローンをバクミド（ＢＡＣＲ２３Ｆ１０；ロズウエルパーク癌研究所人類遺伝学部のＢＡＣＰＡＣリソースセンターより入手）から増幅した。ここでも増幅中に、Ｔ７エピトープ標識をコード配列のアミノ末端に付加した。ＨａＣａＴ細胞（ＧＪＨ、未発表）より調製したｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＤｉｃｅｒ遺伝子を単離した。Ｔ７標識付けされた全コード配列を、ヒト細胞（ＬｉｎＸ−Ａ）内で発現するために、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローンした。
【０１４９】
細胞培養及び抽出物の調製。Ｓ２及び胚の培養。１０％熱不活化胎児ウシ血清（Ｇｅｍｉｎｉ）及び１％抗生物質−抗真菌性溶液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を添加したシュナイダー昆虫培養基において、Ｓ２細胞を２７℃、５％ＣＯ2中で培養した。１０×１０6細胞／ｍｌにて抽出調製物から細胞を回収した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、低張性緩衝液［１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、６ｍＭ  βＭＥ］中に再懸濁し、ダンス型ホモジェナイザーで細胞を破壊した。細胞溶解産物を２０，０００ｘｇで２０分間回転させた。抽出物を−８０℃で貯蔵した。標準的な方法を用いてショウジョウバエ胚をハエ飼育容器内で飼育し、１２時間ごとに回収した。５０％Ｃｈｌｏｒｏｘ漂白剤中で胚膜を除去し、蒸留水で徹底的に洗浄した。細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）を胚に添加し、組織破砕器内で破砕して抽出物を調製した。溶解産物を２００，０００ｘｇで２時間回転させ、−８０℃で冷凍した。ヒト２９３細胞由来の高度にトランスフェクト可能なＬｉｎＸ−Ａ細胞（Ｌｉｎ  Ｘｉｅ及びＧＪＨ、未発表）をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに保持した。
【０１５０】
トランスフェクション及び免疫沈降。リン酸カルシウム法(Hammond等 (2000) Nature 404,293-296)を用いてＳ２細胞をトランスフェクトした。インシトゥβ−ガラクトシダーゼ検定を用いて対照をモニターしたところトランスフェクション率は〜９０％であった。リン酸カルシウムを用いた共沈によって、ＬｉｎＸ−Ａ細胞もトランスフェトした。免疫沈降反応については、様々なクローンで細胞（〜５×１０6／ＩＰ）をトランスフェクトし、３日後にＩＰ緩衝液［１２５ｍＭ  ＫＯＡｃ、１ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％ＮＰ−４０に完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を加えたもの］中で溶解した。溶解産物を１４，０００ｘｇで１０分間回転させ、上澄みをＴ７抗体−アガロースビーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に添加した。抗体結合を４℃にて４時間進行させた。ビーズを遠心分離にかけ、溶解緩衝液で３回洗浄し、反応緩衝液で１回洗浄した。ショウジョウバエＤｉｃｅｒ−１（ＣＧ４７９２）のＣ末端８アミノ酸に相当するＫＬＨ−複合ペプチドを用いて、Ｄｉｃｅｒ抗血清をウサギ内で作製した。
【０１５１】
開裂反応。ＲＮＡの調製。Ｔ７プロモーター配列をそれぞれ含む正方向及び逆方向プライマーを用いたＰＣＲによって、ｄｓＲＮＡ内に転写されるテンプレートを作製した。リボプローブ（Ｐｒｏｍｅｇａ）キットを用いてＲＮＡを産生し、32Ｐ−ＵＴＰを用いた転写反応で均一に標識化した。一本鎖ＲＮＡを１％アガロースゲルから精製した。ｄｓＲＮＡ開裂。２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ及び５％Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ）を含む反応溶液中でｄｓＲＮＡと共に、５μｌの胚又はＳ２抽出物を３０℃で１時間インキュベートした。最小体積の反応緩衝液（ＡＴＰ及びＳｕｐｅｒａｓｉｎを含む）とｄｓＲＮＡとを、反応緩衝液で予め洗浄したビーズ（上記参照）に添加したことを除いては、同様に免疫沈降を処理した。ＡＴＰを喪失させるために、ｄｓＲＮＡの付加前に、２ｍＭグルコース及び０．３７５Ｕヘキソキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と共にショウジョウバエ胚抽出物を３０℃で２０分間インキュベートした。
【０１５２】
ノーザン及びウエスタン分析。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）を用いて、ショウジョウバエ胚（０−１２時間）、ハエ成虫及びＳ２細胞から全ＲＮＡを調製した。磁性オリゴｄＴビーズ（Ｄｙｎａｌ）を用いる親和性選択によって伝達ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを変性ホルムアルデヒド／アガロースゲル上で電気泳動し、ブロットし、Ｄｉｃｅｒに相当するランダムに用意されたＤＮＡをプローブとして調べた。ウエスタン分析用に、ＩＰ緩衝液中で抗Ｔ７抗体−アガロース複合体を用いて、全細胞溶解産物からＴ７標識タンパク質を免疫沈降した。レムリ緩衝液中で沸騰させることによってビーズからタンパク質を剥離し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動によってタンパク質を分離した。ニトロセルロース上に移転させた後、ＨＲＰ結合抗Ｔ７抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）と化学発光検出（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質を可視化した。
【０１５３】
ＤｉｃｅｒのＲＮＡｉ。マウスカスパーゼ９に相当するｄｓＲＮＡ又はショウジョウバエＤｉｃｅｒ−１及びＤｉｃｅｒ−２（ＣＧ４７９２及びＣＧ６４９３）に相当する２種のｄｓＲＮＡの混合物のいずれかで、ショウジョウバエＳ２細胞をトランスフェクトした。最初のトランスフェクションから２日後、ＧＦＰ発現プラスミドと、ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ又はＧＦＰ  ｄｓＲＮＡのいずれかとの混合物を用いて上記した方法で細胞を再度トランスフェクトした(Hammond等 (2000) Nature 404,293-296)。第２のトランスフェクションから３日後にＤｉｃｅｒ活性又は蛍光について細胞を検定した。蛍光細胞を固定した後、細胞の定量化をＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ細胞選別機で行った。対照トランスフェクションを行ったところ、Ｄｉｃｅｒ活性物質は、カスパーゼ９ｄｓＲＮＡの導入による影響をうけなかった。
【０１５４】
実施例３：ＲＮＡ干渉用ヘアピン構築物作製の単純化した方法
多くのモデル生物体において、二本鎖ＲＮＡが効率的で特異的に遺伝子機能を抑制することが示されている（Bosher及びLabouesse (2000) Nature Cell Biology 2, E31-E36）。ＲＮＡ干渉又は転写後遺伝子サイレンシングと称されるこの応答は、Ｃ．エレガンス、ショウジョウバエ、植物及び他の数多くの系において、非常に効率的な逆遺伝学的手段として用いられている。これらの場合において、二本鎖ＲＮＡは注入、トランスフェクション又は食物供給として導入することができる。しかし全ての場合において、応答は一過的かつ全身性である。近年、遺伝子発現を用いた安定した干渉が、スナップバック又はヘアピン構造を形成するＲＮＡ発現によって達成されている（Fortier及びBelote (2000) Genesis 26, 240-244；Kennerdell及びCarthew (2000) Nature Biotechnology 18, 896-898；Lam及びThummel (2000) Current Biology 10, 957-963；Shi等 (2000) RNA 6, 1069-1076；Smith等 (2000) Nature 407:319-320；Tavernarakis等 (2000) Nature Genetics 24:180-183）。この構造は、遺伝子発現の安定したサイレンシングを可能にするだけでなく、トリパノソーマ及びショウジョウバエ成虫について報告されている誘導性サイレンシングを可能にする潜在能力がある（Fortier及びBelote (2000) Genesis 26, 240-244；Lam及びThummel (2000) Current Biology 10, 957-963；Shi等 (2000) RNA 6, 1069-1076）。サイレンシング誘導に必要な長い逆向き反復配列を含む菌プラスミドの作製が困難なことから、この方法は幾分実施しにくい。最近の報告では、望ましい構築物を同定するために１，０００個以上の推定クローンをスクリーンしたとある（Tavernarakis等 (2000) Nature Genetics 24:180-183）。
【０１５５】
ヘアピン構造が存在するとしばしばプラスミド組換えが誘導されるが、これは部分的には、十字型ＤＮＡ構造を認識し開裂する大腸菌ｓｂｃタンパク質によるものである（Connelly等 (1996) Genes Cell 1, 285-291）。本発明者らは本質的に逆向き反復配列のクローニングを必要としないヘアピンの作製方法を開発した。その代わりに、発現抑制される遺伝子断片を直列反復としてクローン化し、イン・ビトロ（又は潜在的にはイン・ビボのいずれか）で、部位特異的レコンビナーゼを処理することによって逆転を得る（図２７参照）。組換えに続いて、未処理のＳＢＣ系を欠く菌株（ＤＬ７５９）中で、逆向き反復配列構造は安定である。本発明者らはこの方法を用いて数多くのヘアピン発現構築物を作製したが、いずれもショウジョウバエ細胞における遺伝子サイレンシングを誘導した。
【０１５６】
下記の実施例において、我々は、この方法を利用して、長いｄｓＲＮＡを様々な哺乳動物細胞型において発現させる。我々は、かかる長いｄｓＲＮＡが、様々な細胞型においてＲＮＡｉを媒介することを示す。加えて、図２７に記載したベクターは選択マーカーを含むので、この方法で生成されたｄｓＲＮＡは、細胞中で安定に発現されうる。従って、この方法は、細胞におけるＲＮＡ抑制の一過性の効果の試験だけでなく、安定で且つ長期的なＲＮＡ抑制の効果の試験をも可能にする。
【０１５７】
方法：
ヘアピンＲＮＡを発現するプラスミドを、ＧＦＰコード領域の最初の５００塩基対をｐＲＩＰ−ＦＬＩＰのＦＬＩＰカセット中に直列反復としてクローン化することによって構築した。このＦＬＩＰカセットは、２つの有向クローニング部位を含み、その２番目のものはＬｏｘＰ部位と隣接している。これらのクローニング部位の間に存在するゼオシン遺伝子は、選択及び安定性を維持する。ヘアピン生成のための逆向き反復を造るために、直列反復クローンを、イン・ビトロでＣｒｅレコンビナーゼ(Stratagene)に曝し、その後、ＤＬ７５９大腸菌にトランスフォームした。これらの細菌は、十字形構造を含むＤＮＡの複製を可能にし、それらは、逆向き反復を形成する傾向がある。
【０１５８】
実施例４：長いｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞における遺伝子発現を抑制する
以前の実験は、ヘアピンの構築によるものを含む様々な方法を利用して生成されたｄｓＲＮＡがショウジョウバエ細胞における遺伝子発現を抑制することができることを示した。我々は、今や、ｄｓＲＮＡが培養哺乳動物細胞における遺伝子発現をも抑制することができるということを示す。加えて、ＲＮＡｉの遺伝学的ツールとしての力は、遺伝子発現の安定なサイレンシングを工学処理する能力によって大いに増進される。それ故、我々は、長いｄｓＲＮＡをＲＮＡｉトリガーとして利用することのできる哺乳動物細胞を同定する努力を、それらの同じ細胞株が安定なサイレンシングストラテジーの開発の基盤を提供することを期待して引き受けた。我々は、ＲＮＡ抑制が、長いヘアピンの哺乳動物細胞株における安定な発現によって媒介されうることを示す。培養哺乳動物細胞における遺伝子発現の安定なサイレンシングを工学処理する能力は、一時的な遺伝子発現のサイレンシングを引き起こす能力に加えて、多くの重要な応用を有する。
【０１５９】
Ａ．多能性マウスＰ１９細胞におけるＲＮＡｉ
我々は、先ず、このアプローチを遺伝子機能を調べるためのツールとして開発すること及びｄｓＲＮＡに誘導されるサイレンシングの機械論的研究が哺乳動物の系に広がること可能にすることの両方のために、長いｄｓＲＮＡトリガーが、培養マウス細胞において配列特異的なサイレンシングを誘導することができるかどうか測定することを探索した。それ故、我々は、前のマウス胎児における研究(Wianny等、2000, Nat. Cell Biol. 2:70-75
；Svoboda等、2000, Development 127:4147-4156)を、多能性の胎児細胞型におけるＲＮＡｉ様機構を探索することにより広げることを試みた。我々は、胎児起源の多くの細胞株を、遺伝子発現の一般化された抑制がｄｓＲＮＡの導入に際して起きる程度について調べた。アッセイ時に、我々は、ｄｓＲＮＡの、ＧＦＰの発現に対する効果を試験した(蛍光細胞の計数によりイン・シトゥーで測定)。予想されるように、ヒト胎児の腎臓細胞(２９３)及びマウス胎児繊維芽細胞の両者において、ＧＦＰ発現が、同時トランスフェクトされたｄｓＲＮＡの配列に関係なく、事実上排除された。幾つかの多能性の奇形癌腫及び奇形腫細胞株(例えば、Ｎ−Ｔｅｒａｌ、Ｆ９)において、ＰＫＲ応答が減衰されたが、依然として明らかであった。しかしながら、対照的に、非相同性のｄｓＲＮＡのトランスフェクションは、マウス胎児幹細胞又はｐ１９胎児癌細胞において、レポーター遺伝子(例えば、ＧＦＰ又はルシフェラーゼ)の発現に対して効果を有しなかった(図２８)。
【０１６０】
Ｐ１９胎児癌細胞の、ＧＦＰのコード鎖の最初の約５００ｎｔに対応する同起源のｄｓＲＮＡの存在下でのＧＦＰによるトランスフェクションは、著しく異なる効果を有した。ＧＦＰ発現は、同時トランスフェクトされた細胞の殆どにおいて排除され(図２８)、これは、これらの培養マウス細胞が、我々が前に培養ショウジョウバエＳ２細胞で示したもの(Hammond等、2000, Nature 404:293-296)と似た方法でｄｓＲＮＡに応答しうることを示唆している。
【０１６１】
ｄｓＲＮＡが配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導することのできる程度を定量するために、我々は、最初にショウジョウバエ胚抽出物においてＲＮＡｉを示すのに利用されたもの(Tuschl等、1999, Genes Dev. 13:3191-3197)に類似した二連のルシフェラーゼレポーターアッセイを利用した。Ｐ１９ＥＣ細胞を、別個にホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの発現を指示する２つのプラスミドの混合物でトランスフェクトした。これらをｄｓＲＮＡを伴わずに、ホタルルシフェラーゼの最初の約５００ｎｔに対応するｄｓＲＮＡを伴って、又は対照としてのＧＦＰの最初の約５００ｎｔに対応するｄｓＲＮＡを伴って同時トランスフェクトした。ＧＦＰｄｓＲＮＡを伴う同時トランスフェクションは、ホタル／ウミシイタケ活性比及び両活性の絶対値の両方でｄｓＲＮＡなしの対照と類似したルシフェラーゼ活性を与えた。対照的に、ホタルルシフェラーゼｄｓＲＮＡを受けた細胞において、ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比は、最大で３０倍減少した(２５０ｎｇ、図２９Ｂ)。比較のために、我々は、ショウジョウバエＳ２細胞において同じ実験のセットを行なった。定性的に類似の結果が得られたが、サイレンシング応答は、一層強かった。同レベルのｄｓＲＮＡにおいて、Ｓ２細胞は、ホタルルシフェラーゼ活性を事実上バックグラウンドレベルまで抑制した。
【０１６２】
ｄｓＲＮＡがウミシイタケルシフェラーゼと相同である相補性実験をも行なった。再び、この場合、ウミシイタケ酵素の発現の抑制は、約１０倍であった(図２９Ｄ)。従って、Ｐ１９細胞におけるｄｓＲＮＡ応答は、弾力的であり、サイレンシング機構は、試験したレポーターの何れかに対するｄｓＲＮＡに順応した。
【０１６３】
我々は、この応答がｄｓＲＮＡに特異的であるかどうかを試験するために２つのアプローチを採用した。精製ＲＮアーゼＩＩＩ(ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ)による、トリガーのトランスフェクション前の前処理は、サイレンシングを引き起こすその能力を大いに減少させた。その上、ホタル又はウミシイタケルシフェラーゼに対する一本鎖アンチセンスＲＮＡによる細胞のトランスフェクションは、レポーターの発現に対して殆ど又は全く効果を有しなかった(図２９Ｃ及びＤ)。総合して考えると、これらの結果は、二本鎖ＲＮＡは、強く且つ特異的なサイレンシング応答をＰ１９胎生期癌細胞において引き起こすという強い指示を与えた。効率的なサイレンシングは、比較的低濃度のｄｓＲＮＡによって引き起こすことができた(培養培地１ｍｌ当たり２５ｎｇ；図２９Ａ参照)。この応答は、濃度依存性であり、約２０倍の最大抑制が培養培地１ｍｌ当たり１．５μｇの投与量で達成された。サイレンシングは、迅速に確立されて、トランスフェクションの９時間後まで明らかであった(最初期の試験時点)。その上、この応答は、抑制の程度を有意に変えることなく、ｄｓＲＮＡの単一投与後に、最大で７２時間持続した。
【０１６４】
図３０は、更に、ＲＦＰ又はＧＦＰを同時トランスフェクトされた野生型Ｐ１９細胞を示している(右パネル)。ＲＦＰ又はＧＦＲの強い発現は、それぞれ、トランスフェクションの約４２時間後であることに注意されたい。我々は、５００ｎｔ．ＧＦＰヘアピンを安定に発現するＰ１９クローンを単離した。かかるクローンを、次いで、ＲＦＰ又はＧＦＰでトランスフェクトして、ＲＦＰ又はＧＦＰの発現をこれらの細胞の視覚的検査により評価した。左パネルは、５００ｎｔＧＦＰヘアピンがＰ１９細胞におけるＧＦＰの発現を特異的に抑制することを示している。
【０１６５】
Ｂ．胎児幹細胞におけるＲＮＡｉ
ｄｓＲＮＡに対する配列特異的応答の存在がＰ１９細胞の特性であるのかどうか、又はそれは正常なマウス胎児細胞にも拡張されるのかどうかを評価するために、我々は、類似のサイレンシングアッセイをマウス胎児幹細胞において行なった。同起源でないｄｓＲＮＡ(例えば、ＧＦＰ)による胎児幹細胞の同時トランスフェクションは、再び、絶対値においても、ウミシイタケのホタルに対するルシフェラーゼ活性の比についても劇的効果を有しなかった(図３１)。しかしながら、ホタル又はウミシイタケの何れかのルシフェラーゼｄｓＲＮＡのトランスフェクションは、劇的且つ特異的に、標的酵素の活性を減少させた(図３１)。
【０１６６】
この結果は、ＲＮＡｉが正常な胎児幹細胞を含む胎児起源の多数のマウス細胞型において機能しうることを示唆している。通常、遺伝的モザイク動物の生成のために利用される細胞型においてサイレンシングを引き起こす能力は、培養又は再構成動物モデルの両者におけるサイレンシングの生物学的効果を結局試験する可能性を示唆する。ＥＳ細胞をＲＮＡｉによって上首尾に操作する我々の能力は、トランスジェニック及びノックアウトマウスの生成におけるＲＮＡｉの利用を可能にする。
【０１６７】
Ｃ．マウス体細胞におけるＲＮＡｉ
ＲＮＡｉエフェクター経路が哺乳動物の体細胞に存在することは、ｓｉＲＮＡの一過性サイレンシングを誘導する能力に基づいて、ありそうなことである(Elbashir等、2001, Nature 411:494-498)。その上、我々は、ＲＮＡｉイニシエーター及びエフェクター経路が長いｄｓＲＮＡトリガーに応答してサイレンシングを実施することのできる胎児細胞に明らかに存在することを示した。それ故、我々は、ＲＮＡｉ機構が幾つかの体細胞株において無傷で存在しうるかどうかを試験することを求めている。
【０１６８】
ルシフェラーゼレポーターを長いｄｓＲＮＡトリガーと共に有するＨｅＬａ細胞のトランスフェクションは、ＲＮＡ配列に関係なく活性の殆ど完全な抑制を生じた。マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２において、我々は、２つの応答の混合に注意した。ホタルルシフェラーゼに相同なｄｓＲＮＡは、配列特異的な効果を引き起こし、同起源の約２１ｎｔのｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに際して認められたもの(Elbashir等、2001, Nature 411:494-498)より僅かに強い程度の抑制を生じた(図３２Ａ参照)。しかしながら、長いｄｓＲＮＡトリガーを用いた場合には、特異的効果が、おそらく、ＰＫＲ活性化の故に、レポーター遺伝子発現の一般化された抑制に重ねられた(図３２Ｂ)。
【０１６９】
多くの哺乳動物ウイルスは、効率的感染の助けとして、ＰＫＲをブロックする能力が進化した。例えば、アデノウイルスは、結合に関してｄｓＲＮＡを模倣するがＰＫＲの活性化に関しては模倣しないＶＡ ＲＮＡを発現する(Clarke等、1995, RNA 1:7-20)。ワクシニアウイルスは、２つのストラテジーを利用してＰＫＲを回避する。第一のストラテジーは、ｄｓＲＮＡに結合してマスクするＥ３Ｌの発現である(Kawagishi-Kobayashi等、2000, Virology 276:424-434)。第二のストラテジーは、ＰＫＲに結合し、この酵素、ｅＩＦ２αの天然の基質を模倣する能力によって阻害するＫ３Ｌの発現である(Kawagishi-Kobayashi等、2000, 前出)。
【０１７０】
Ｋ３Ｌ発現を指示するベクターでのＣ２Ｃ１２細胞のトランスフェクションは、ｄｓＲＮＡに応答してのレポーター遺伝子の一般化された抑制を減衰させる。しかしながら、このタンパク質は、ＲＮＡｉによる特異的阻害の大きさに影響を有しなかった(図３２Ｃ)。
【０１７１】
図３３は、更に、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、及びＰ１９細胞において行なった一過性同時トランスフェクションアッセイの結果を示している。これらの細胞株を、各々、フォティナス・ピラリス(ホタル)及びレニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)ルシフェラーゼを発現するプラスミドでトランスフェクトした。これらの細胞株を、更に、ホタルルシフェラーゼ(ｄｓＬＵＣ)又はｄｓＧＦＰに対応する４００ｎｇの５００ｎｔ ｄｓＲＮＡでトランスフェクトした。その結果は、ｄｓＲＮＡが、多くの培養哺乳動物細胞方において抑制を特異的に媒介することができることを示している。
【０１７２】
これらの結果は、少なくとも幾つかの細胞株及び／又は細胞型においてｄｓＲＮＡに対する応答の非特異的ブロッキングが遺伝子機能の研究のために長いｄｓＲＮＡを利用することを可能にするという可能性を高めた。これは、ここに記載したように、ウイルスインヒビターの利用により、又は望ましくない応答を欠くように遺伝的に改変された動物から単離された細胞の利用によって達成されうる。
【０１７３】
Ｄ．ＲＮＡｉを利用する遺伝子発現の安定した抑制
今日まで、ｄｓＲＮＡは、培養哺乳動物細胞又は胎児において、配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導するために一過性の様式でのみ利用されてきた。しかしながら、遺伝子操作の最も強力な応用は、安定な変異体の創生によってのみ実現される。長いｄｓＲＮＡの利用によってサイレンシングを誘導する能力は、ヘアピンＲＮＡの強化された発現によって安定なサイレンシグが達成されたショウジョウバエ、植物及びＣ．エレガンスなどのモデル系(Kennerdell等、2000, Nat.Biotechnol.18:896-898；Smith等、2000, Nature 407:319-320；Tavernarakis等、2000, Nat.Genet.24:180-183)から哺乳動物細胞の仕事へ移行する機会を与える。
【０１７４】
Ｐ１９ＥＣ細胞を、対照用ベクターにより、又は約５００ｎｔのＧＦＰヘアピンＲＮＡの、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター(サイトメガロウイルス)からの発現を指示する発現ベクターによってトランスフェクトした。何れかの構築物を安定に組み込んだ細胞から生じたコロニーを選択して、クローン性細胞株へと拡大させた。各細胞株を、持続的ＲＮＡｉにつき、２つのレポーター遺伝子(トランスフェクトされた細胞を示すためのｄｓＲＥＤ及び安定なサイレンシングについて試験するためのＧＦＰ)の混合物による一過性の同時トランスフェクションによってアッセイした。
【０１７５】
対照用ベクターを安定に組み込んだクローン化Ｐ１９ＥＣ細胞のトランスフェクションは、何ら特異的なサイレンシング応答の存在しない場合に予想されるように、等しい数の赤色細胞と緑色細胞を生じたが(図３４Ｂ)、ＧＦＰヘアピンＲＮＡを発現する細胞は、非常に異なる結果を与えた。これらの細胞は、ｄｓＲＥＤタンパク質を、対照用ベクターを含む細胞で認められたものに匹敵する効率で発現した。しかしながら、これらの細胞は、同時トランスフェクトされたＧＦＰレポーターを発現することができなかった(図３４Ｂ)。これらのデータは、ヘアピンｄｓＲＮＡの連続的発現が、標的遺伝子の安定な配列特異的なサイレンシングを引き起こすことができるという強い指示を与える。
【０１７６】
ショウジョウバエＳ２細胞及びＣ．エレガンスにおいて、ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡを約２２ｎｔのｓｉＲＮＡに処理するＤｉｃｅｒ酵素(Bernstein等、2001, Nature 409:363-366；Grishok等、2001, Cell 106:23-34；Hutvagner等、2001, Science 293:834-838；Ketting等、2001, Genes Dev.15:2654-2659；Knight等、2001, Science 293:2269-2271)により開始される。両方において、標的Ｄｉｃｅｒに対するｄｓＲＮＡの利用によるＳ２細胞及びＣ．エレガンス実験は、ＲＮＡｉ応答を抑制する。ＤｉｃｅｒがＰ１９細胞におけるヘアピン誘導される遺伝子サイレンシングにおいて中心的役割を演じるかどうかを、ＧＦＰヘアピン構築物で安定にトランスフェクトされたＰ１９細胞に、マウスＤｉｃｅｒ ｄｓＲＮＡをトランスフェクトすることによって試験した。Ｄｉｃｅｒ ｄｓＲＮＡによる処理は、ＧＦＰの抑制解除を生じたが、対照用ｄｓＲＮＡでは生じなかった(図３４Ｃ)。
【０１７７】
Ｅ．ｄｓＲＮＡは、転写後サイレンシングを誘導する
ＲＮＡｉの鍵となる特徴は、それが、その効果を、標的ｍＲＮＡの破壊によって、転写後レベルで発揮することである(Hammond等、2001, Nat.Rev.Genet.2:110-119)。ｄｓＲＮＡがマウス細胞において転写後機構によってサイレンシングを誘導したかどうかを試験するために、我々は、最初にショウジョウバエ胚抽出物におけるＲＮＡｉ応答を特性決定するために用いられたもの(Tuschl等、1999, Genes Dev.13:3191-3197)と同じアッセイを利用した。我々は、ウミシイタケ及びホタルのルシフェラーゼに対応するキャップを有するｍＲＮＡのイン・ビトロ翻訳についてコンピテントなＰ１９細胞ＥＣから溶解物を調製した。これらの抽出物への非特異的ｄｓＲＮＡの添加は、ルシフェラーゼ発現の絶対量又はホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼの比に対して実質的な効果を有しなかった(図３５)。対照的に、ホタルルシフェラーゼと相同なｄｓＲＮＡの添加は、劇的な投与量依存性の抑制活性を誘導した。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖にのみ対応するＲＮＡの添加は、殆ど効果を有しなかったし(非特異的ｄｓＲＮＡ対照に匹敵)、ｄｓＲＮＡサイレンシングトリガーのＲＮアーゼＩＩＩによる前処理は、イン・ビトロでサイレンシングを誘導するその潜在能力を大いに低下させた。ＲＮＡｉの第二の顕著な特徴は、サイレンシングの特異性を決定する小さいｓｉＲＮＡ(約２２ｎｔ)の生成である。我々は、かかるＲＮＡ種がＰ１９細胞抽出物においてｄｓＲＮＡから生成されることを見出した(図３４Ｄ、イン・ビトロ)が、これは、マウスのＤｉｃｅｒ活性の存在を示している。これらの種は又、ＧＦＰヘアピンＲＮＡを安定に発現する細胞においても生成された(図３４Ｄ、イン・ビボ)。総合して考えると、ｄｓＲＮＡ誘導されるサイレンシングの転写後の性質(サイレンシングの約２２ｎｔのｓｉＲＮＡの生成との関連、及びこの応答の、ＲＮＡｉ経路の重要な参加者であるＤｉｃｅｒに対する依存性)は、ｄｓＲＮＡがマウス細胞において月並みなＲＮＡｉ機構によって遺伝子発現を抑制することを強く示唆する。
【０１７８】
Ｆ．ＲＮＡｉ媒介の遺伝子サイレンシングは、特異的でありｄｓＲＮＡを必要とする
我々は、実験を行なって、イン・ビトロ系で認められた抑制的効果が二本鎖ＲＮＡに特異的であることを確認した。簡単にいえば、上で概説した方法に従って実験を行なった。ホタル(ＦＦ)又はウミシイタケ(Ｒｅｎ)ルシフェラーゼに対応するｄｓＲＮＡ(ｄｓ)、一本鎖ＲＮＡ(ｓｓ)又はアンチセンスＲＮＡ(ａｓ)の何れかを翻訳反応に加えた。３０℃で１時間行なった反応の後に、二連のルシフェラーゼアッセイを、アナリティカル・サイエンティフィック・イントゥルメンツ・モデル３０１０ルミノメーターを利用して行なった。
【０１７９】
図３６は、これらの実験の結果をまとめたものであり、このイン・ビトロアッセイで認められた遺伝子発現の抑制がｄｓＲＮＡに特異的であることを示している。これらの結果は、更に、ｄｓＲＮＡが、この哺乳動物のイン・ビトロ系における遺伝子発現を、転写後サイレンシングと一致する仕方で抑制するという結論を支持する。
【０１８０】
Ｇ．ｄｓＲＮＡに浸した哺乳動物細胞は、遺伝子サイレンシングを生じる
無脊椎動物における転写後サイレンシングの研究は、ｄｓＲＮＡのトランスフェクション又はインジェクションが抑制作用を達成するのに必須でないはことを示した。例えば、Ｃ．エレガンスにおけるｄｓＲＮＡ抑制は、線虫をｄｓＲＮＡに浸すか又は関心あるｄｓＲＮＡを発現する細菌を給餌することによって認められうる。我々は、哺乳動物細胞におけるｄｓＲＮＡ抑制がｄｓＲＮＡのトランスフェクションなしで認められうるかどうかの問題を扱った。かかる結果は、ｄｓＲＮＡ抑制を哺乳動物細胞において容易に利用するための更なる潜在的能力を与え、トランスフェクトするのが困難であった細胞型(即ち、低いトランスフェクション効率を有する細胞型、又はトランスフェクトするのが全く困難であることが判明した細胞型)における遺伝子発現を抑制するためのｄｓＲＮＡの利用をも可能にするであろう。
【０１８１】
Ｐ１９細胞を、６ウェル組織培養プレート中の培地(αＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ)中で約６０％集密まで生育させた。ホタルｄｓＲＮＡの濃度を変化させてこれらの培養物に加えて、細胞を、生育培地＋ｄｓＲＮＡ中で、１２時間にわたって培養した。次いで、細胞をホタル又はウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミドで、上で詳述したように、トランスフェクトした。二連のルシフェラーゼアッセイを、トランスフェクションの１２時間後に、アナリティカル・サイエンティフィック・インストゥルメンツ・モデル３０１０ルミノメーターを利用して行なった。
【０１８２】
図３７は、これらの結果をまとめたものであり、それは、ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞においてトランスフェクションなしで遺伝子発現を抑制することができることを示している。ｄｓＲＮＡの存在下での細胞培養は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の投与量依存性の抑制を生じた。
【０１８３】
方法：
細胞培養。Ｐ１９マウス胎生期癌細胞(American Type Culture Collection, CRL-1825)を１０％熱不活化ＦＢＳ及び１％抗生物質／抗真菌性溶液(GIBCO/BRL)を補ったα−ＭＥＭ(GIBCO/BRL)中で培養した。マウス胚性幹細胞(Ｊ１、S.Kim, Cold Spring Harbor Laboratory提供)を、ＥＳｇｒｏ(Chemicon)を含むＤＭＥＭ中で、製造者の指示に従って培養した。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞(N.Tonks, Cold Spring Harbor Laboratory寄贈)を１０％熱不活化ＦＢＳ及び１％抗生物質／抗真菌性溶液(GIBCO/BRL)を補ったＤＭＥＭ(GIBCO/BRL)中で培養した。
【０１８４】
ＲＮＡ調製法。ｄｓＲＮＡの生成のために、転写のためのテンプレートをＰＣＲにより生成した；それらは、Ｔ７プロモーター配列をテンプレートの各末端に含んだ(Hammond等、2000, Nature 404:293-296参照)。ｄｓＲＮＡを、ＲｉｂｏＭａｘキット(Ambion, テキサス、Austin在)を利用して調製した。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼのｍＲＮＡ転写物を、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅキット(Promega)を利用して合成し、使用前にゲル精製した。
【０１８５】
トランスフェクション及び遺伝子サイレンシングアッセイ。細胞を、示した量のｄｓＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡで、ＦｕＧＥＮＥ６(Roche Biochemicals)を利用して、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。細胞を、５０〜７０％集密で、ウェル当たり１又は２ｍｌの培地を含む１２ウェルプレート中でトランスフェクトした。二連のルシフェラーゼアッセイ(Promega)を、細胞を、ホタルルシフェラーゼをＳＶ４０プロモーター(ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、Promega)の制御下に含むプラスミド及びウミシイタケルシフェラーゼをＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター領域(ｐＳＶ４０、Promega)の制御下に含むプラスミドで同時トランスフェクトすることにより行なった。これらのプラスミドを、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ(２５０ｎｇ／ウェル)対ｐＲＬ−ＳＶ４０の比１：１又は１０：１を利用して同時トランスフェクトした。両比とも同じ結果を生じた。幾つかの実験について、細胞を、増進されたグリーン蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)−ＵＳ９融合タンパク質(Kalejta等、1999, Exp.Cell Res.248:322-328)又はレッド蛍光タンパク質(ＲＦＰ)(ｐＤｓＲｅｄ Ｎ１、CLONTECH)の発現を指示するベクターでトランスフェクトした。Ｓ２細胞におけるＲＮＡｉを記載されたように(Hammond等、2000, Nature 404:293-296)行なった。
【０１８６】
ヘアピンＲＮＡ(自己相補的幹ループを有するＲＮＡ)を発現するプラスミドを、ＥＧＦＰコード領域(CLONTECH)の最初の５００ｂｐをｐＲＩＰ−ＦＬＩＰのＦＬＩＰカセット中に直列反復としてクローン化することにより構築した。このＦＬＩＰカセットは、２つの向きのクローニング部位を含み、その２番目のものは隣接ＬｏｘＰ部位に変異を生じさせる(図３５Ａ)。ゼオシン遺伝子(Stratagene)(これらのクローニング部位の間に存在する)は、選択を維持し、そうして、ＦＬＩＰカセットの安定性を維持する。このＥＧＦＰ直列反復を含むＦＬＩＰカセットを、ｐｃＤＮＡ３(Invitrogen)中にサブクローン化した。ヘアピン生成のために逆向き反復を造るために、ＥＧＦＰ直列反復クローンをＣｒｅレコンビナーゼ(Stratagene)にイン・ビトロで曝し、その後、ＤＬ７５９大腸菌(Connelly等、1996, Genes Cells 1:285-291)にトランスフォームした。これらの細菌は、十字形構造を含むＤＮＡの複製を可能にし、該構造は、逆向き反復から形成される傾向がある。ＤＬ７５９トランスフォーマントを、逆向き反復を含むプラスミド(約５０％)につきスクリーニングした。
【０１８７】
Ｄｉｃｅｒのサイレンシングを、マウスＤｉｃｅｒ遺伝子のエキソン２５を含み、ヒトＤｉｃｅｒｃＤＮＡのヌクレオチド５２８４〜５５５２に対応するｄｓＲＮＡを利用して達成した。
【０１８８】
イン・ビトロ翻訳及びイン・ビトロＤｉｃｅｒアッセイ。対数増殖期の細胞を、５ｍＭ ＥＧＴＡを含むＰＢＳ中に採集してＰＢＳ中で２回洗い、低張緩衝液(１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３／６ｍＭ β−メルカプトエタノール)で一回洗った。細胞を、完全プロテアーゼインヒビター(Roche Molecular Biochemicals)及び０．５単位／ｍｌのＲＮアーゼ(Promega)を含む低張緩衝液の０．７充填細胞容積で懸濁させた。細胞をＢ型ペッスルを備えたダンス型ホモジェナイザー内で破壊し、溶解物を３０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を、キャップ付きｍ７Ｇ(５’)ｐｐｐＧホタル及びウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡを含むイン・ビトロ翻訳アッセイ又は、32Ｐ標識ｄｓＲＮＡを含むイン・ビトロＤｉｃｅｒアッセイで利用した。イン・ビトロ翻訳アッセイについて、５μｌの抽出物を、１μｇのｄｓＲＮＡ(又は緩衝剤)／１０ｍＭ ＤＴＴ／０．５ｍＭ スペルミジン／２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３．３ｍＭ ＭｇＯＡｃ／８００ｍＭ ＫＯＡｃ／１ｍＭ ＡＴＰ／１ｍＭ ＧＴＰ／４単位のＲｎａｓｉｎ／２１５μｇのクレアチンホスフェート／１μｇのクレアチンホスフェートキナーゼ／１ｍＭ アミノ酸(Promega)と共に、１００ｎｇのホタル及びウミシイタケｍＲＮＡと混合した。反応を１時間３０℃で行ない、１×受動溶解緩衝液(Promega)の添加により止めた。次いで、抽出物を、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。Ｄｉｃｅｒ活性についてのイン・ビトロアッセイを、記載されたように(Bernstain等、2001, Nature 409:363-366)行なった。
【０１８９】
安定なサイレンシング株の構築。Ｐ１９細胞の１０センチメートルプレートを、５μｇのＧＦＰヘアピン発現プラスミドでトランスフェクトし、安定なインテグラントを１４日間Ｇ−４１８(３００ｎｇ／ｍｌ)を利用することにより選択した。クローンを選択してＧＦＰのサイレンシングにつきスクリーニングした。
【０１９０】
実施例５：ｓｉＲＮＡ合成のための組成物及び方法
以前の結果は、短い合成ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)が効率的にＲＮＡ抑制を誘導することができるということを示していた。短いＲＮＡは非特異的ＰＫＲ応答を活性化しないので、それらは、ある範囲の細胞型における遺伝子発現を効率的にスクリーニングする手段を提供する。しかしながら、ｓｉＲＮＡに関する当分野の現状は、幾つかの制約を有している。第一に、ｓｉＲＮＡは、現在、高いコスト(約４００ドル／ｓｉＲＮＡ)で化学合成されている。かかる高コストは、ｓｉＲＮＡを、小さい研究室又は大規模なスクリーニングにとって実際的でないものにしている。従って、当分野には、ｓｉＲＮＡを低コストで生成する方法に対する要求がある。
【０１９１】
我々は、ｓｉＲＮＡの、Ｔ７ポリメラーゼによる合成のための組成物及び方法を提供する。このアプローチは、標準的ＲＮＡ転写反応と一致するコスト(１６ドル／ｓｉＲＮＡ)でのｓｉＲＮＡの効率的合成を可能にする。この大いに低減されたコストは、ｓｉＲＮＡの利用を、小さい研究室にとって妥当なアプローチとし、大規模なスクリーニングプロジェクトにおけるそれらの利用をも容易にする。
【０１９２】
図３８は、Ｔ７ポリメラーゼを利用するｓｉＲＮＡの製造方法を示している。簡単にいえば、Ｔ７ポリメラーゼを利用して、センス及びアンチセンス転写物の両方を転写する。次いで、これらの転写物をアニールさせて、ｓｉＲＮＡを与える。当業者は、任意の利用可能なＲＮＡポリメラーゼ(即ち、Ｔ３、Ｓｐ６など)を容易にＴ７の代わりに利用してこの発明を行なうことができるということを認めるであろう。
【０１９３】
このアプローチは、単一のｓｉＲＮＡ種の生成並びにｓｉＲＮＡライブラリーの生成に従順である。かかるｓｉＲＮＡのライブラリーは、細胞ベースの表現型スクリーニング及び遺伝子アレイベースのスクリーニングを含む多くの高スループットスクリーニングにおいて利用することができる。
【０１９４】
実施例６：短いヘアピンＲＮＡの生成及びかかる短いヘアピンを利用する遺伝子発現の抑制
小さい、内因的にコードされるヘアピンＲＮＡは、ＲＮＡｉ機構のエレメントによって遺伝子発現を調節することができるという理解の後に、我々は、この生物学的機構を所望の標的遺伝子の調節のために利用することを探求してきた。ここに、我々は、短いヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)が配列特異的な遺伝子サイレンシングを哺乳動物細胞において誘導することができることを示す。これは、通常、ｓｉＲＮＡを用いて行なわれるので、サイレンシングを、外因的に合成されたヘアピンを細胞にトランスフェクトすることによって引き起こすことができる。しかしながら、サイレンシングは又、ｓｈＲＮＡの内因性の発現によっても引き金を引かれうる。この観察は、哺乳動物細胞における遺伝子発現を安定に抑制するためにＲＮＡｉが利用される連続的細胞株の生成への扉を開く。その上、類似のアプローチが、トランスジェニック動物の創出に効力があること及び、潜在的に、所望の効果を生じるために遺伝子機能の長期間の抑制が必須である治療ストラテジーにおいて効力があることが判るであろう。
【０１９５】
幾つかのグループ(Grishok等、2001, Cell 106:23-24；Ketting等、2001, Genes & Dev.15:2654-2659；Knight等、2001, Science 293:2269-2271；Hutvagner等、2001, Science 293:834-838)は、遺伝子サイレンシングの内因性トリガー、特に、小さい一過性のＲＮＡ(ｓｔＲＮＡ)ｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４が、少なくとも部分的に、ＲＮＡｉ経路を介して機能することを示している。特に、これらの小さいＲＮＡｉは、Ｄｉｃｅｒにより処理されて成熟型の約２１ｎｔ形態になるヘアピン前駆体によってコードされる。その上、Ｃ．エレガンスにおける遺伝学的研究は、ｓｔＲＮＡ機能におけるＡｒｇｏｎａｕｔｅファミリータンパク質の必要性を示している。特に、ａｌｇ−１及びａｌｇ−２(ＥＩＦ２ｃサブファミリーのメンバー)は、ｓｔＲＮＡプロセッシング及びそれらの下流のエフェクターの機能の両方に関係する(Grishok等、2001, 前出)。我々は、最近、ＲＩＳＣ(ＲＮＡｉのエフェクターヌクレアーゼ)の構成要素がＡｒｇｏｎａｕｔｅファミリーのメンバーであることを示したが、これは、ｓｔＲＮＡが、ｍＲＮＡ安定性よりもｍＲＮＡ翻訳を調節するＲＩＳＣ様複合体を介して機能しうるモデルを思いつかせる(Hammond等、2001, Science 293:1146-1150)。
【０１９６】
Ａ．短いヘアピンＲＮＡが引き金を引く、ショウジョウバエ細胞における遺伝子サイレンシング
我々は、我々がこれらの小さい、内因的にコードされたヘアピンＲＮＡを新しい目標として、選択した遺伝子を調節することができる可能性を試験することを望んだ(哺乳動物細胞株及びトランスジェニック動物において安定に遺伝子発現を操作するためのこの調節システムを打倒する最終的ゴールを伴って)。長いｄｓＲＮＡが引き金を引くかｓｉＲＮＡが引き金を引くかによらず、一般に、ＲＮＡｉは、哺乳動物細胞よりもショウジョウバエＳ２細胞での遺伝子発現の抑制において一層強力である。それ故、我々は、このモデル系を、短いヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)の遺伝子サイレンシングのインデューサーとしての効力を試験するために選択する。
【０１９７】
ｓｔＲＮＡも最近発見されたｍｉＲＮＡの兄弟グループも、完全なヘアピン構造を形成する。実際、これらのＲＮＡの各々は、幾つかの突き出たヌクレオチドをそれらのむしろ短い(約３０ｎｔ)幹構造中に含むことが予想されている。これらの突き出たヌクレオチドの位置及び特性は、進化を通して保存され、少なくともｍｉＲＮＡのサブセット中で保存されてきたので、我々は、これらの予想される構造的特長を保存する新たに目標とされたｍｉＲＮＡ模倣物をデザインすることを探求した。これらのｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４ｍｉＲＮＡのみが、公知のｍＲＮＡ標的を有する(Wightman等、1993, Cell 75:855-862；Slack等、2000, Mol.Cell 5:659-669)。両方の場合において、調節された転写物中の結合部位に対する対合は不完全であり、ｌｉｎ−４の場合には、突き出たヌクレオチドの存在は、抑制に対して臨界的である(Ha等、1996, Genes & Dev.10:3041-3050)。それ故、我々は、標的基質と不完全に対合するｓｈＲＮＡをもデザインした。これらのｓｈＲＮＡのサブセットは、図３９Ａに描いてある。
【０１９８】
多数のｓｈＲＮＡ変異体の迅速な試験及び抑制の効力の定量的比較を可能にするために、我々は、ショウジョウバエ抽出物(Tuschl等、1999, Genes & Dev.13:3191-3197)及び哺乳動物細胞(Caplen等、2001, Proc.Natl.Acad.Sci.98:9742-9747；Elbashir等、2001, Nature 411:494-498)の両方におけるＲＮＡｉのアッセイのために前に記載したように、二連のルシフェラーゼレポーターシステムを利用することを選択する。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドの、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と相同な長いｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡとの同時トランスフェクションは、ホタルルシフェラーゼの約９５％の抑制を、ウミシイタケルシフェラーゼに対する影響を伴わずに生じた(図３９Ｂ；データは示さない)。ホタルルシフェラーゼは又、相同なｓｈＲＮＡとの同時トランスフェクションによっても特異的に発現抑制されえた。最も強力なインヒビターは、基質に対する完全な相同性を有する単一のヘアピン構造よりなるものであった。幹内の又は基質認識配列内のＧ−Ｕ塩基対の導入は、殆ど又は全く効果を有しなかった(図３９Ａ及びＢ；データは示さない)。
【０１９９】
これらの結果は、短いヘアピンＲＮＡが、ショウジョウバエＳ２細胞において、ｓｉＲＮＡと類似の能力を有して、遺伝子サイレンシングを誘導することができることを示している(図３９Ｂ)。しかしながら、我々のショウジョウバエＳ２細胞におけるＲＮＡ干渉の初期の観察において、我々は、サイレンシングの、ｄｓＲＮＡトリガーの長さへの深い依存性に注意した(Hammond等、2000, Nature 404:293-296)。実際、約２００ｎｔより少ないｄｓＲＮＡは、非常に効率悪く引き金を引いた。サイレンシングは、長いｄｓＲＮＡを約２２ｎｔのｓｉＲＮＡに処理するＲＮアーゼＩＩＩファミリーのヌクレアーゼであるＤｉｃｅｒによって開始される。サイレンシングのイニシエーターとしての変化する能力と合致して、長いｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素によって、短いＲＮＡよりずっと容易に処理される(Bernstein等、2001, Nature 409:363-366)。それ故、我々は、ｓｈＲＮＡがＤｉｃｅｒ酵素の基質であるかどうかを試験した。
【０２００】
我々は、前に、ｌｅｔ−７(Ketting等、2001, Genes & Dev.15:2654-2659)及び他のｍｉＲＮＡ(E.Bernstein, 未公開データ)がＤｉｃｅｒにより、短い、ヘアピンでないｄｓＲＮＡと比べて予想外の高効率で処理されることに注意した。同様に、Ｄｉｃｅｒは、ホタルルシフェラーゼを標的とするｓｈＲＮＡを、それらが天然のＤｉｃｅｒ基質(ｌｅｔ−７)を模倣するようにデザインされたか単なるヘアピン構造であるかにかかわらず、効率的に処理した(図３９Ｃ)。これらのデータは、組換えｓｈＲＮＡがＤｉｃｅｒによってｓｉＲＮＡへと処理されうること及びこれらの短いヘアピンがＲＮＡｉを介する遺伝子サイレンシングの引き金を引くという考えと一致することを示唆している。
【０２０１】
Ｂ．短いヘアピンＲＮＡは、哺乳動物細胞において遺伝子サイレンシングを活性化した
哺乳動物細胞は、ＲＮＡｉの適用を妨げることが予想される幾つかの内因性システムを含んでいる。これらの内の主たるものは、ｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ、ＰＫＲであり、これは、ＥＩＦ−２αのリン酸化によって翻訳の一般的抑制を達成する(Williams 1997, Biochem.Soc.Trains.25:509-513；Gil等、2000, Apoptosis 5:107-114)。これらの活性化及び他のｄｓＲＮＡ応答性経路は、一般に、おそらくアロステリックアクチベーター上での二量体形成を可能にする３０ｂｐを超える長さの二本鎖を必要とする(例えば、Clarke等、1995, RNA 1:7-20)。Ｄｉｃｅｒ生成物を模倣する小さいＲＮＡのｓｉＲＮＡは、おそらく、少なくとも部分的にそれらのサイズの故に、この制限を逃れて、特異的サイレンシングの引き金を引く。しかしながら、ｓｉＲＮＡの特徴を欠く短い二本鎖ＲＮＡは、効率的に、ショウジョウバエＳ２細胞においてサイレンシングを誘導することができるが、哺乳動物細胞ではできない(A.A. Caudy, 未公開データ)。内因的にコードされたｍｉＲＮＡも又、ので、それらのサイズの故に、そしておそらくそれらの二本鎖構造の不連続性の故にも、ＰＫＲ監視機構を回避することができる。３０ｂｐ未満のｓｈＲＮＡがショウジョウバエＳ２細胞におけるＲＮＡｉの効果的なインデューサーであると仮定して、我々は、これらのＲＮＡが配列特異的なサイレンシングを哺乳動物細胞においても誘導することができるかどうかを試験した。
【０２０２】
ヒトの胎児の腎臓細胞(ＨＥＫ２９３Ｔ)を、化学合成したｓｈＲＮＡとホタル及びウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミド混合物とで同時トランスフェクトした。Ｓ２細胞で認められたように、ｓｈＲＮＡは、遺伝子サイレンシングの効果的なインデューサーであった。もう一度、ｌｅｔ−７を模倣するようにデザインされたヘアピンは、一貫して単なるヘアピンＲＮＡより効果的でなく、ｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖とｍＲＮＡ標的の間のミスマッチの導入は、サイレンシングを完全に破壊した(図４０Ａ；データは示さない)。全体的に、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡより幾らか低強度のサイレンシングトリガーであった。ホタルルシフェラーゼに相同なｓｉＲＮＡは、日常的に、遺伝子発現の約９０〜９５％の抑制を生じたが、ｓｈＲＮＡにより達成された抑制レベルは、平均８０〜９０％に及んだ。我々は、ｓｉＲＮＡについても認めたが、このサイレンシングトリガーの能力の最も重要な決定基は、その配列である。我々は、ｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡの両者の凡そ５０％が遺伝子発現の抑制に関して有能であることを見出す。しかしながら、標的ｍＲＮＡの予想された構造の分析もｓｉＲＮＡ二本鎖若しくはｓｈＲＮＡヘアピン中の別の構造の分析も、遺伝子発現の効果的なインヒビターの選択のための予測値であると判明した。
【０２０３】
我々は、２９ｂｐを含むｓｈＲＮＡ二本鎖を標準として採用した。しかしながら、へリックスのサイズは、能力の有意の喪失を伴わずに約２５ｎｔに減少しうる。２２ｂｐほどの短い二本鎖でも、依然として、検出可能なサイレンシングを引き起こすことができるが、一層長い二本鎖ほど効率的ではない。何れの場合でも、我々は、内部対照レポーター(ウミシイタケルシフェラーゼ)の減少を観察しなかったが、これは、非特異的ｄｓＲＮＡ応答の誘導と合致する。
【０２０４】
ｓｈＲＮＡの遺伝子サイレンシングを誘導する能力は、２９３Ｔ細胞に限られなかった。同様の結果が、ヒト癌細胞(ＨｅＬａ)、トランスフォームされたサルの上皮細胞(ＣＯＳ−１)、マウス繊維芽細胞(ＮＩＨ３Ｔ３)及び二倍体ヒト繊維芽細胞(ＩＭＲ９０；図４０；データは示さない)を含む様々な他の哺乳動物細胞株においても認められた。
【０２０５】
Ｃ．Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを利用する遺伝子発現の効果的インヒビターの合成
遺伝子サイレンシングを引き起こすためのｓｉＲＮＡの利用は、哺乳動物細胞における遺伝子機能を研究するための標準的方法論に発展しつつある。今まで、ｓｉＲＮＡは、専ら化学合成により生成されてきた(例えば、Caplen等、2001, Proc.Natl.Acad.Sci.98:9742-9747；Elbashir等、2001, Nature 411:494-498)。しかしながら、このアプローチに関するコストは、重大であり、多数の遺伝子の機能を並行して研究するためのツールとしてのその潜在的有用性を制限している。短いヘアピンＲＮＡは、おそらくイン・ビボでＤｉｃｅｒによりプロセッシングを受けて活性なｓｉＲＮＡになる。そうして、これらは、ヌクレオチドオーバーハング及びホスフェート末端の両者に関して、一層許容されうる末端構造でありうる。それ故、我々は、ｓｈＲＮＡが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるイン・ビトロ転写によって調製されうるかどうかを試験した。
【０２０６】
化学的ＲＮＡ合成により調整されたものに類似したｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを生成することが予想される転写のためのテンプレートをＤＮＡ合成によって調製した(図４１Ａ、Ｃ)。これらを、Ｓ２細胞(データは示さない)及びヒト２９３細胞(図４１Ｂ、Ｄ)の両者における効力につき試験した。全体的に、Ｔ７で合成されたヘアピン又はｓｉＲＮＡの性能は、化学合成により生成されたものの性能と、阻害の程度に関しても異なる配列の相対的効率に関してもぴったり一致した。しかしながら、Ｔ７ポリメラーゼは、２つのグアノシン残基から開始することを好むので、イン・ビトロ転写されるｓｉＲＮＡをデザインする場合には、開始のコンテキストを考えることは重要であった(図４１Ｂ)。対照的に、ｓｈＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒにより処理されるが(図３９Ｃ参照)、転写物の５’末端へのこれらの塩基の添加に耐性である。
【０２０７】
ショウジョウバエ胚抽出物における研究は、ｓｉＲＮＡが、ＲＮアーゼＩＩＩファミリーヌクレアーゼによる生成と一致して、５’リン酸化末端を有することを示している。イン・ビトロで、この末端は、合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドによるＲＮＡｉの誘導に臨界的である(Elbashir等、2001, EMBO J.20:6877-6888；Nykanen等、2001, Cell 107:309-321)。化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、リン酸化されておらず、トランスフェクション前のイン・ビトロでの５’ホスフェート基の酵素的付加は、サイレンシング効果の能力を増大させない(A.A. Caudy, 未公開データ)。これは、リン酸化末端の必要性が哺乳動物細胞では一層厳しくないこと又はキナーゼがイン・ビボでｓｉＲＮＡを効率的にリン酸化することを示唆する。しかしながら、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成されたＲＮＡは、５’三リン酸化末端を有する。それ故、我々は、Ｔ７ポリメラーゼによってｓｉＲＮＡを合成した後に、イン・ビトロでピロホスファターゼで処理して該末端を改変してｓｉＲＮＡのそれに似させる可能性を調べた。驚くべきことに、一リン酸化ｓｉＲＮＡ(データは示さない)は、遺伝子サイレンシングの誘導において、三リン酸末端を有する転写産物と同じくらい強力であった(図４１Ｂ)。これは、一リン酸化末端の必要性が哺乳動物細胞においては一層厳しくないこと又はｓｉＲＮＡが適当な末端構造を達成するようにイン・ビボで改変されていることを示唆しうる。
【０２０８】
総合すると、我々のデータは、ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ二本鎖の両者が、イン・ビトロでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる合成によって調製されうることを示唆している。これは、哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉのコストを有意に減少させ且つＲＮＡｉの全ゲノム規模に対する応用への道を舗装する。
【０２０９】
Ｄ．小さいヘアピンＲＮＡのイン・ビトロでのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写
ｓｉＲＮＡが哺乳動物細胞における遺伝子機能をプローブ検査するための紛れもなく有効なツールであるにもかかわらず、それらの抑制効果は、限られた持続時間の限定によるものである。ｓｉＲＮＡの送達は、多くの一過性トランスフェクション方法論の何れかにより達成することができ、抑制ピークのタイミング及びサイレンシングが崩壊するにつれてのタンパク質レベルの回復の両者は、細胞型及び標的遺伝子の両者によって変化しうる。それ故、ｓｉＲＮＡに対する一つの限界は、所望の標的の発現が安定に抑制される連続的細胞株の開発である。
【０２１０】
長い二本鎖構造よりなるヘアピンＲＮＡは、植物、Ｃ．エレガンス、及びショウジョウバエにおいて、安定な遺伝子サイレンシングの有効なトリガーとして明らかとなってきた(Kennerdell等、2000, Nat.Biotechnol.18:896-898；Smith等、2000, Nature 407:319-320； Tavernarakis等、2000, Nat.Genet.24:180-183)。我々は、最近、培養哺乳動物細胞における遺伝子発現の、長いヘアピンＲＮＡの連続的発現による安定な抑制を示した(Paddison等、2002, Proc.Natl.Acad.Sci.99:1443-1448)。しかしながら、このアプローチの範囲は、かかるヘアピンの、検出可能なＰＫＲ応答のない細胞だけでの発現の必要性により制限された。原則として、ｓｈＲＮＡは、かかる制限を回避して、哺乳動物体細胞におけるＲＮＡによる安定な抑制を引き起こすためのツールを提供することができた。
【０２１１】
この可能性を試験するために、我々は、最初に、ホタルルシフェラーゼｓｈＲＮＡをコードする配列をＣＭＶベースの発現用プラスミド内にクローン化した。これは、ヘアピンが、ベクター配列及びポリ(Ａ)によって５’及び３’末端の両方に及んでいるキャップ付きポリアデニル化ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物を生成することを予想させた。この構築物は、２９３Ｔ細胞でのサイレンシングアッセイにおいて完全に不活性であった。
【０２１２】
化学的に及びＴ７により合成されたｓｈＲＮＡについての我々の研究において、我々は、有意の一本鎖の伸長(二本鎖の５’又は３’)の存在がｓｈＲＮＡの効力を低下させることに気付いた。それ故、我々は、一層限定されたヘアピンＲＮＡを生成する努力において選択的プロモーターストラテジーの利用を探究した。特に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、よく規定された開始部位及び停止部位を有しており、様々な小さい安定なＲＮＡ種を自然に生成する。多くのＰｏｌＩＩＩプロモーターは、転写される領域に必須エレメントを含んでいるが、それらの有用性を我々の目的に限るならば、クラスＩＩＩプロモーターは、専ら転写されないプロモーター配列を利用する。これらの内で、Ｕ６ｓｎＲＮＡのプロモーター及びＨ１ＲＮＡのプロモーターは、よく研究されている(Lobo等、1990, Nucleic Acids Res.18:2891-2899；Hannon等、1999, J.Biol.Chem.266:22796-22799；Chong等、2001, J.Biol.Chem.276:20727-20734)。
【０２１３】
便利なクローニング部位をＵ６ｓｎＲＮＡプロモーターの直後に位置させることにより、我々は、遺伝子サイレンシングのために短いヘアピンを利用する発現ベクターのｐＳｈｈ−１を構築した。このベクター内に、ホタルルシフェラーゼに由来する２つのｓｈＲＮＡ配列の何れかを合成オリゴヌクレオチドからクローン化した。これらを、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ発現用プラスミドと共に２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトした。これら２つのコードされたｓｈＲＮＡの一方は、ホタルルシフェラーゼの効果的サイレンシングを、内部対照の発現を変えることなく引き起こした(図４２Ｃ)。第二のコードされたｓｈＲＮＡも又、生成した(弱い抑制であったが)。両方の場合において、サイレンシングは、ｓｈＲＮＡのプロモーターに対して正しい向きでの挿入に依存していた(図４２Ｃ；データは示さない)。ｓｈＲＮＡ自体は左右対称であっても、正しくない向きでの挿入は、ＰｏｌＩＩＩ停止に影響を与え、５’及び３’側の両方に一本鎖伸長を有するヘアピンの生成が予想される。同様の結果が、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−１、ＮＩＨ３Ｔ３及びＩＭＲ９０を含む多くの他の哺乳動物細胞においても得られた(図４２；データは示さない)。しかしながら、ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１は、ヒトＵ６プロモーターが不活性なショウジョウバエ細胞において、ルシフェラーゼレポーターの抑制を達成することができなかった。
【０２１４】
Ｅ．Ｄｉｃｅｒは、ｓｈＲＮＡ媒介の遺伝子サイレンシングに必要である
プラスミドにコードされたｓｈＲＮＡが哺乳動物ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子サイレンシングをもたらすかどうかの限定試験として、我々は、抑制の、ＲＮＡｉ経路の必須構成要素への依存性を評価した。我々は、ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１を、ヒトのＤｉｃｅｒと相同なｓｉＲＮＡと共にトランスフェクトした。図４３は、Ｄｉｃｅｒ ｓｉＲＮＡによる細胞の処理が、ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１により誘導されたサイレンシングを完全に低下させることができることを示している。無関係のｓｉＲＮＡの添加は、ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１による抑制の程度に影響を有しなかった。重要なことに、Ｄｉｃｅｒ ｓｉＲＮＡは、ホタルルシフェラーゼのｓｉＲＮＡ誘導されたサイレンシングに対して何の効果も有しなかった。これらの結果は、ｓｔＲＮＡ及び長いｄｓＲＮＡにより引き起こされるものと類似するＲＮＡｉ経路を介したｓｈＲＮＡの作用と一致している。その上、それは、ｓｉＲＮＡ媒介のサイレンシングがＤｉｃｅｒ酵素の涸渇に対して一層感受性でないことを示唆している。
【０２１５】
Ｆ．ｓｈＲＮＡ媒介の内因性遺伝子の安定な遺伝子サイレンシング
コードされた短いヘアピンの最終的有用性は、生じた表現型の研究を可能にする安定な変異体の創出にある。それ故、我々は、我々が、安定な抑制によって細胞表現型を造ることができるかどうかを試験した。一次マウス胎児繊維芽細胞(ＭＥＦ)におけるｒａｓオンコジーンの活性化されたアレルの発現は、最終的表現型としての複製老化に似た安定な成長停止状態を誘導する(Serrano等、1997, Cell 88:593-602)。細胞は、分裂を止めて、典型的な大きい平らな形態を呈している。老化は、ｐ５３腫瘍サプレッサー経路を不活性化する突然変異によって計数することができる(Serrano等、1997, 前出)。ベクターにコードされたｓｈＲＮＡの内因性細胞遺伝子を安定に抑制する能力の試験として、我々は、マウスｐ５３遺伝子を標的とするヘアピンを生成した。図４４に示したように、ｐＢａｂｅ−ＲａｓＶ１２をトランスフェクトしたＭＥＦは、空の対照用ベクターを同時トランスフェクトした場合、増殖できず、老化した形態を示している。Serrano等によって以前に注意されたように、最終的に停止した状態は、培養において薬物選択した細胞の１００％において、トランスフェクション後８日までに達成される。しかしながら、活性化ｒａｓ発現用構築物のｐＳｈｈ−ｐ５３との同時トランスフェクションに際しては、細胞は、培養において、老化した形態を採用できないだけでなく増殖する能力を最低数週間維持する薬物選択から現れた(図４４)。これらのデータは、ｓｈＲＮＡ発現構築物を、選択した標的遺伝子が安定に抑制される連続的哺乳動物細胞株の創出のために利用することができることを強く示唆している。
【０２１６】
Ｇ．複数のヘアピンＲＮＡの同時導入は、相乗作用を生じない
短いヘアピンが遺伝子発現を抑制する機構を更に理解することを意図して、我々は、細胞を、ホタルルシフェラーゼに対応する２つの異なる短いヘアピンの混合物でトランスフェクトすることの効果を調べた。図４５は、細胞をかかる短いヘアピンの混合物に曝した場合に得られるホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制に対する相乗作用がないことを示唆する実験結果をまとめたものである。
【０２１７】
方法：
細胞培養。ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−１、ＭＥＦ及びＩＭＲ９０細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)及び１％抗生物質／抗真菌性溶液(GIBCO BRL)を補ったＤＭＥＭ(GIBCO BRL)中で培養した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％熱不活化仔ウシ血清及び１％抗生物質／抗真菌性溶液を補ったＤＭＥＭ中で培養した。
【０２１８】
ＲＮＡの調製法。ｓｈＲＮＡとｓｉＲＮＡの両方を、イン・ビトロで、化学合成したＤＮＡオリゴヌクレオチドテンプレート(Sigma)及びＴ７メガショートスクリプトキット(Ambion)を利用して生成した。転写用テンプレートを、それらがＴ７プロモーター配列を５’末端に含むようにデザインした。イン・ビトロＤｉｃｅｒプロセッシングにかけられるｓｈＲＮＡ転写物をリボプローブキット(Promega)を利用して合成した。化学合成されたＲＮＡは、Dharmacon, Inc.から得た。
【０２１９】
トランスフェクション及び遺伝子サイレンシングアッセイ。細胞を、示した量のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡで、標準的リン酸カルシウム手順を６ウェルプレート中で５０〜７０％集密で利用してトランスフェクトした。二連のルシフェラーゼアッセイ(Promega)を、細胞を、ホタルルシフェラーゼをＳＶ４０プロモーターの制御下に含むプラスミド(ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、Promega)及びウミシイタケルシフェラーゼをＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター領域の制御下に含むプラスミド(ｐＳＶ４０、Promega)で同時トランスフェクトすることにより行なった。プラスミドを、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ(２５０ｎｇ／ウェル)対ｐＲＬ−ＳＶ４０の比１：１を利用して同時トランスフェクトした。Ｓ２細胞におけるＲＮＡｉを、以前に記載された(Hammond等、2000, Nature 404:293-296)ように行なった。安定なサイレンシングのために、一次ＭＥＦ(S.Lowe, Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨークより寄贈)を、製造者の奨めに従って、ｐＢａｂｅ−Ｈａ−ｒａｓＶ１２及びｐＳｈｈ−ｐ５３(耐性マーカーなし)と共にＦｕｇｅｎｅ６を利用して同時トランスフェクトした。選択を、活性化Ｈａ−ｒａｓＶ１２プラスミド(ピューロマイシン耐性マーカーを有する)の存在について行なった。ｐＳｈｈ−ｐ５３プラスミドは、過剰に存在した(同時トランスフェクション実験では、標準的である)。我々は、今や、ＧＡＴＥＷＡＹシステム(Invitrogen)と両立するＵ６プロモーターベクター(ｐＳＨＡＧ−１)を生成したが、これを利用して、ｓｈＲＮＡ発現カセットを、シス結合した選択マーカーを有する様々なレシピエントベクター中に運ぶことができる。その上、我々は、レトロウイルスベクターを利用するｓｈＲＮＡの送達を確認した。最新のプラスミド情報は、http://www.cshl.org/public/science/hannon.html.で得ることができる。
【０２２０】
ヘアピンＲＮＡを発現するプラスミド。−２６５から＋１までのＵ６プロモーター領域をＰＣＲにより増幅し、ｐＢＳＳＫ＋中へのクローニングのために、５’ＫｐｎＩ及び３’ＥｃｏＲＶ部位を付加した。リンカー／ターミネーターオリゴヌクレオチドセット(Ｕ６ターミネーター配列並びに５’ＥｃｏＲＶ及び３’ＮｏｔＩリンカー末端を有する)を、プロモーター構築物中にクローン化して、新たな配列の挿入のためのＥｃｏＲＶ部位を有するＵ６カセットを生じた。このベクターは、ｐＳｈｈ１と命名された。標的遺伝子と相同な１９〜２９塩基を有するｓｈＲＮＡをコードする鈍端の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＥｃｏＲＶ部位に連結して発現構築物を生成させた。このＦｆ１を構築するために利用したオリゴヌクレオチド配列は：TCCAATTCAGCGGGAGCCACCTGATGAAGCTTGATCGGGTGGCTCTCGCTGAGTTGGAATCCATTTTTTTTであった。この配列は、配列GGATが先行しており、ベクターによって供給され、ＰｏｌＩＩＩターミネーターとして５つより多くのTの領域を含んでいる。
【０２２１】
イン・ビトロＤｉｃｅｒアッセイ。Ｄｉｃｅｒ活性についてのイン・ビトロアッセイを、記載された(Bernstein等、2001, Nature 409:363-366)ように行なった。
【０２２２】
実施例７：コードされた短いヘアピンは、イン・ビボで機能する
本発明の目的は、遺伝子発現の特異的抑制において利用するためのｓｉＲＮＡ及び短いヘアピンを生成する方法を改良することである。実施例６は、ｓｉＲＮＡ及び短いヘアピンが、遺伝子発現の特異的抑制に大いに効果的であることを示している。従って、短いヘアピン及びｓｉＲＮＡを利用して達成することのできる遺伝子発現の効率的抑制を、かかるＲＮＡをプラスミド上にコードして一時的又は安定に発現させる方法と合わせることは有利であろう。
【０２２３】
図４６は、プラスミド上にコードされた短いヘアピンが遺伝子発現の抑制に有効であることを示している。ホタルルシフェラーゼに対応する２９ヌクレオチドのヘアピンをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｕ６プロモーターを含むベクターに挿入した。３つの独立した構築物を、２９３Ｔ細胞におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子発現を特異的に抑制する能力について調べた。ｓｉＯｌｉｇｏ１−２、ｓｉＯｌｉｇｏ１−６及びｓｉＯｌｉｇｏ１−１９(正しい向きの構築物)は、各々、ｓｉＲＮＡと同じくらい効果的に、遺伝子発現を抑制した。対照的に、ｓｉＯｌｉｇｏ１−１０(正しくない向きの構築物)は、遺伝子発現を抑制しなかった。加えて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の異なる部分を標的とする独立した構築物は、何れの無機の遺伝子発現をも効果的に抑制しなかった(ｓｉＯｌｉｇｏ２−２３、ｓｉＯｌｉｇｏ２−３６)。
【０２２４】
図４６にまとめた結果は、プラスミド上にコードされたｓｉＲＮＡ及び短いヘアピンの一過性の発現が、遺伝子発現を効率的に抑制することができることを示している。当業者は、ある範囲のベクターから一過性又は安定した発現のためにｓｉＲＮＡ又は短いヘアピンを選択することができる。短いｄｓＲＮＡを安定に発現させるためのベクター及びストラテジーの非制限的例を図４７〜４９に与える。
【０２２５】
実施例８：ＰＫＲ応答の非存在下でのｄｓＲＮＡ抑制
幾つかの細胞型における遺伝子発現を抑制するためのＲＮＡｉの利用に対する一つの潜在的障害は、長いｄｓＲＮＡによって引き金を引かれうる非特異的ＰＫＲ応答である。多くの哺乳動物ウイルスは、潜在的宿主細胞への感染を助けるために、ＰＫＲをブロックする能力を隠してきた。例えば、アデノウイルスは、ｄｓＲＮＡを模倣するがＰＫＲ応答を活性化しないＲＮＡを発現する。ワクシニアウイルスは、次の２つのストラテジーを利用してＰＫＲを回避する：ｄｓＲＮＡに結合してマスクするＥ３Ｌの発現；天然のＰＫＲ基質のｅＩＦ２αを模倣するＫ３Ｌの発現。
【０２２６】
ウイルスがＰＫＲ応答を回避する機構の我々の理解は、我々が、遺伝子発現を長いｄｓＲＮＡによって抑制するのが有利でありうる細胞型におけるＰＫＲ応答を回避するアプローチをデザインすることを可能にする。可能なアプローチは、細胞を、プロテインキナーゼＲＮＡ活性化(ＰＫＲ)アポトーシスを阻害する薬剤で処理すること例えばＰＫＲの発現を阻害し、その破壊を引き起こし、及び／又はＰＫＲのキナーゼ活性を阻害する薬剤での処理を含む。従って、かかる細胞型における遺伝子発現のＲＮＡｉ抑制は、先ずＰＫＲ応答を阻害し、その後、標的遺伝子と同じか又は類似のｄｓＲＮＡを送達することを含みうる。
【０２２７】
Ａ．マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２において、我々は、これらの細胞が、特異的又は非特異的な(たぶんＰＫＲ)応答の混合物を有する長いｄｓＲＮＡに応答するということに注意した。非特異的ＰＫＲ応答を減衰させるために、一方で、長いｄｓＲＮＡのために、丈夫な、特異的な抑制を維持しつつ、Ｃ２Ｃ１２細胞は、Ｋ３Ｌ発現を指示するベクターをトランスフェクトされた。この更なるステップは、ＰＫＲ応答を上首尾に減衰させたが、Ｋ３Ｌタンパク質の発現は、特異的阻害の程度に影響を有しなかった。
【０２２８】
Ｂ．しかしながら、かかる２ステップのアプローチの効力は、以前には示されなかったので、ｄｓＲＮＡ抑制がＰＫＲ応答を有する細胞において可能でないということが、以前は可能であった。図５０は、かかる２ステップのアプローチが可能であり、丈夫な、特異的なｄｓＲＮＡが媒介する抑制が、前に丈夫なＰＫＲ応答を有した細胞において可能であるということを示す結果をまとめてある。
【０２２９】
簡単にいえば、二連のルシフェラーゼアッセイを、上に詳述したように行なった。これらの実験を、Ｅ１３．５ＰＫＲ−／−マウス胎児から収穫したＰＫＲ−／−ＭＥＦを利用して行なった。ＭＥＦは、典型的に、丈夫なＰＫＲ応答を有し、それ故、長いｄｓＲＮＡでの処理は、典型的に、遺伝子発現及びアポトーシスの非特異的抑制を生じる。しかしながら、トランスフェクションの１２、４２及び８２時間後に調べたＰＫＲ−／−細胞において、ｄｓレニラルシフェラーゼＲＮＡの発現は、レニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)ルシフェラーゼの発現を特異的に抑制する。この抑制は、経時的に安定である。
【０２３０】
これらの結果は、非特異的ＰＫＲ応答を、ｄｓＲＮＡにより媒介される遺伝子発現の特異的抑制に影響を与えずにブロックできることを示している。これは、長いｄｓＲＮＡに対する非特異的ＰＫＲ応答の混乱した影響のために以前には扱いににくかったものを含む種々の細胞型範囲において遺伝子発現を抑制するための長いｄｓＲＮＡの利用を可能にする。
【０２３１】
実施例９：非コード配列に対応するｄｓＲＮＡを利用する遺伝子発現の抑制
ＲＮＡｉを駆動する機構の現在のモデルは、ｄｓＲＮＡ構築物が、関心ある遺伝子に対応するコード配列を含まなければならないことを示唆してきた。証拠は、かかるコード配列が内因性コード配列に対して完全にマッチする必要はない(即ち、類似でよい)ことを示してきたが、ｄｓＲＮＡ構築物がコード配列に対応しなければならないと広く考えられてきた。我々は、従来技術の教示に反対する証拠を提供し、遺伝子の非コード領域に対応するｄｓＲＮＡが遺伝子機能をイン・ビボで抑制することができることを示す。これらの結果は、それらが非コード配列(即ち、プロモーター配列、エンハンサー配列又はイントロン配列)と同じか又は類似するｄｓＲＮＡが抑制を媒介することができることを示すからだけでなく、我々がｄｓＲＮＡ技術をマウスモデルにおいて利用して遺伝子発現のイン・ビボでの抑制を示すので重要である。
【０２３２】
我々は、マウスチロシナーゼ遺伝子プロモーターの４つのセグメントに対応する二本鎖ＲＮＡを生成した。これらのセグメントの３つは、近位プロモーターに対応し、１つは、エンハンサーに対応している(図５１)。このチロシナーゼ遺伝子は、メラニン生合成経路に含まれる速度制限酵素をコードする(Bilodeau等(2001) Pigment Cell Research 14:328-336)。従って、チロシナーゼ遺伝子の抑制は、色素形成を阻害することが予想される。
【０２３３】
上記のプロモーターセグメントの各々に対応する二本鎖ＲＮＡを、受精卵の前核に注入した。１９日後に仔マウスが生れた。全部で、４２／１３６(３１％)の胎児が分娩に至った。この数は、導入遺伝子について予想された範囲(３０〜４０％)内である。４２匹中の２匹の仔マウス(５％)は、誕生時に全く色素がなく、これは、チロシナーゼ機能の抑制と一致している。
【０２３４】
方法：
チロシナーゼ遺伝子の非コードプロモーター領域からのｄｓＲＮＡ。マウスチロシナーゼ遺伝子プロモーターの４つのセグメントを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをＰＣＲ生成物に組み込むプライマー(太字で表示−図５１)を利用してＰＣＲによって増幅した。マウスチロシナーゼ遺伝子の５’隣接領域の配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋから得た(受入れ番号Ｄ００４３９及びＸ５１７４３)。チロシナーゼエンハンサーの配列(転写開始部位の約１２ｋｂ上流に位置)も又、ＧｅｎＢａｎｋから得た(受入れ番号Ｘ７６６４７)。
【０２３５】
用いたプライマーの配列は、次の通りであった：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列は、太字で示されていることに注意されたい
(ａ)チロシナーゼエンハンサー(約１２ｋｂ上流)：
【化１】
2005533484.tif 000002
(ｂ)−１４０４〜−１００７：
【化２】
2005533484.tif 000003
(ｃ)−１００３〜−５０６：
【化３】
2005533484.tif 000004
(ｄ)−５０５〜−８５：
【化４】
2005533484.tif 000005
【０２３６】
ＰＣＲ生成物を、１％ ＴＡＥアガロースゲルから、ＱｉａＥｘＩＩＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット(Qiagen)を利用して精製した。二本鎖ＲＮＡを、これらのテンプレートから、Ｔ７−メガショートスクリプトキット(Ambion)を利用して生成した。酵素及び組み込まれなかったヌクレオチドを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キットを利用して除去した。ＲＮＡを２回フェノール／クロロホルム抽出して、エタノール沈殿させた。ペレットを、注射用緩衝液(１０ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)、０．１５ｎＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０))に２０ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁して、１％ ＴＡＥアガロースゲル上で泳動して完全性を確認した。
【０２３７】
マウスの作成：上記のプライマーセットの各々からの二本鎖ＲＮＡの等量混合物を、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスからの受精卵の前核に注入した。全部で１３６の注入を行ない、３４の胎児を４匹の偽妊娠ＣＤ−１雌の各々に移植した。１９日後に仔マウスが生れた。全部で、４２／１３６(３１％)の胎児が分娩に至った。２／４２匹の仔マウス(５％)が、誕生時に全く色素を有しなかった。
【０２３８】
非コード配列と同じか又は類似のｄｓＲＮＡにより媒介されたＲＮＡｉが、コード配列と同じか又は類似のｄｓＲＮＡの存在下で認められたＰＴＧＳと同じ機構によって作動するのかどうかは明らかでない。しかしながら、これらの結果が、最終的に、類似の機構であることが明らかとなっても異なる機構であることが明らかになっても、イン・ビトロ又はイン・ビボで少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する本発明の組成物及び方法のすばらしい有用性は減少しない。
【０２３９】
本発明は、２０〜５００ｎｔに及ぶ長さのｄｓＲＮＡが、標的遺伝子の発現を、イン・ビトロ及びイン・ビボで、容易に抑制することができることを示している。その上、本発明は、ｄｓＲＮＡを、ヘアピンの形成を含む様々な方法を利用して生成することができること及びこれらのｄｓＲＮＡが、安定に又は一過性で発現されうることを示している。最終的に、本発明は、非コード配列と同じか又は類似のｄｓＲＮＡが標的遺伝子発現を抑制することができることを示している。
【０２４０】
実施例１０：成体マウスにおけるＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉は、相同な遺伝子の配列特異的サイレンシングによって二本鎖ＲＮＡに応答する進化的に保存された監視機構である。ここで、我々は、導入遺伝子の発現を成体マウスにおいて、合成の小型干渉性ＲＮＡにより及びＤＮＡテンプレートからイン・ビボで転写された小さいヘアピンＲＮＡによって抑制することができることを示す。我々は又、イン・ビボでのＲＮＡ干渉によりＣ型肝炎ウイルスに由来する配列の効果的なターゲティングを示すことにより、この技術の治療用潜在能力をも示す。
【０２４１】
小型の干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)は、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)経路の中間体を模倣し、遺伝子を体細胞において非特異的抑制を活性化することなく二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼにより発現抑制することができる(Elbashir等、2001, Nature 411:494-498)。ｓｉＲＮＡも又、遺伝子発現をイン・ビボで阻害するかどうかを研究するために、我々は、流体力学的トランスフェクション法(Zhang等、1999, Hum.Gene Therapy 10:1735-1737；Liu等、1999, Gene Therapy 6:1258-1266；Chang等、2001, J.Virol.75:3469-3473)の改変を利用して、裸のｓｉＲＮＡを成体マウスの肝臓へ送達した。ホタルルシフェラーゼから送達されたｓｉＲＮＡ又は無関係のｓｉＲＮＡを、ルシフェラーゼ発現プラスミドと同時注入した(構築物の説明及び配列は、図５２を参照されたい)。我々は、ルシフェラーゼ発現を生きた動物において全身イメージング(Contag等、1997, Photochem.Photobiol.66:523-531)を利用してモニターし(図５３ａ、５４ａ参照)、それがレポータープラスミド投与量に依存するということを見出した。
【０２４２】
各実験において、同時注入したヒトα−１アンチトリプシン(ｈＡＡＴ)プラスミド(Yant等、2000, Nature Genet.25:35-41)の血清測定値は、トランスフェクション効率を標準化するのと非特異的翻訳阻害をモニターするのに役立った。７２時間後のｈＡＡＴの平均血清濃度は、すべてのグループにおいて同様であった。
【０２４３】
我々の結果は、成体マウスにおけるルシフェラーゼ発現の特異的なｓｉＲＮＡ媒介の阻害(Ｐ＜０．０１１５)があること及び無関係のｓｉＲＮＡが何の効果も有しないこと(Ｐ＜０．８６４；図５３ａ、５３ｂ)を示している。１１の独立した実験において、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡは、ルシフェラーゼ発現を平均８１％(±２．２％)だけ減らした(放射光により判定)。これらの発見は、ＲＮＡｉが遺伝子発現を成体マウスにおいてダウンレギュレートできることを示している。
【０２４４】
ＲＮＡｉは、培養においてＲＳウイルスＲＮＡを分解するので(Bitko等、2001, BMC Microbiol.1:34)、我々は、ＲＮＡｉがマウスで発現されたヒトの病原性ＲＮＡ即ちＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)に向けられるかどうかを研究した。ＨＣＶ(世界中で４０人に１人が感染しているＲＮＡウイルス)の感染は、米国及び欧州における肝臓移植の最も一般的な理由である。我々は、このウイルスのＮＳ５Ｂ領域(非構造タンパク質５Ｂ、ウイルス性ポリメラーゼコード領域)をルシフェラーゼＲＮＡと融合させて、ＲＮＡｉを同時トランスフェクションによってイン・ビボでモニターした。ＮＳ５Ｂ領域を標的とするｓｉＲＮＡは、キメラのＨＣＶ ＮＳ５Ｂタンパク質−ルシフェラーゼ融合物からのルシフェラーゼ発現を７５％(±６．８％；６動物／グループ)だけ減少させた。この結果は、ＲＮＡｉを他の重大なヒト病原体に対する治療として利用することが可能であることを示唆している。
【０２４５】
我々の結果は、ｓｉＲＮＡがマウスにおいて機能的であることを示しているが、送達には、主要な障害が残っている。ｓｉＲＮＡと異なり、機能的な小さいヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)は、イン・ビボで、ＤＮＡテンプレートから、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを利用して発現されうるし(Paddison等、2002, Genes Dev.16:948-958；Tuschl 2002, Nature Biotechnol.20:446-448)；それらは、遺伝子抑制の誘導において、ｓｉＲＮＡほどに効果的である。同起源のｓｈＲＮＡ(ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１)の発現は、ルシフェラーゼの発現を、３つの独立した実験で、最大で９８％(±０．６％)阻害し、平均で９２．８％(±３．３９％)抑制した(図５４ａ、５４ｂ参照)。空のｓｈＲＮＡ発現ベクターは何の効果も有しなかったし；ｓｈＲＮＡ挿入物の向きの逆転(ｐＳｈｈ１−Ｆｆ１ｒｅｖ)は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる停止を変化させて不適当に構造化されたｓｈＲＮＡを生成するので、遺伝子サイレンシングを妨げる。これらの発見は、プラスミドにコードされたｓｈＲＮＡは、強力且つ特異的なＲＮＡｉ応答を成体マウスにおいて誘導することができることを示している。
【０２４６】
ＲＮＡｉは、機能的ゲノミクスにおいて及びデザイナードラッグの標的の同定において応用を見出しうる。それは、遺伝子のグループを同時に、時間を浪費する交配を必要とせずに無力にすることができるので、遺伝子破壊マウスよりも一層将来有望なシステムである。遺伝子治療は、現在、外因性タンパク質の異所的発現に依存しているが、ＲＮＡｉは、最終的に、この機能獲得アプローチを、疾病関連遺伝子をｓｈＲＮＡの発現を指示するＤＮＡ構築物によって発現抑制することにより補完することができる。ＲＮＡｉ送達の我々の方法は又、臨床関連において、ウイルス性及び非ウイルス性の遺伝子トランスファー用ベクターの開発を利用するようにあつらえることもできよう。
【０２４７】
実施例１１：マウスにおけるＲＮＡｉの生殖細胞系列への伝達
マイクロＲＮＡ分子(ｍｉＲＮＡ)は、哺乳動物を含む多くの真核生物で見出されている小さい、非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、特徴的な二次構造を共有し、短い「ヘアピン」ＲＮＡを形成している。遺伝学的及び生化学的研究は、ｍｉＲＮＡがＤｉｃｅｒ(ＲＮアーゼＩＩＩファミリーのヌクレアーゼ)により処理されて成熟型になり、ＲＮＡに媒介される干渉(ＲＮＡｉ)及び関連する経路によって機能して、標的遺伝子の発現を調節するということを示してきた(Hannon 2002, Nature 418:244-251；Pasquinelli等、2002, Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.18:495-513)。最近、我々及び他の研究者は、ｍｉＲＮＡを改造して、哺乳動物細胞における遺伝子発現の実験操作をできるようにし、これらの合成のサイレンシングトリガーを「短いヘアピンＲＮＡ」(ｓｈＲＮＡ)と名付けた(Paddison等、2002, Cancer Cell 2:17-23)。ｓｈＲＮＡによるサイレンシングは、ＲＮＡｉ機構を必要とし、ＲＮＡｉの特徴である小さい干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の生成と相関する。
【０２４８】
ｓｈＲＮＡの発現は、一過性の又は安定なサイレンシングを誘出することができる(発現カセットがレシピエントの培養細胞のゲノムに組み込まれるかどうかに依存する)( Paddison等、2002, Cancer Cell 2:17-23)。ｓｈＲＮＡ発現ベクターは又、遺伝子サイレンシングを、一過性送達後に成体マウスにおいても誘導する(Lewis等、2002, Nat.Genet.32:107-108；McCaffrey等、2002, Nature 418:38-39)。しかしながら、ｓｈＲＮＡがマウスにおいて存続可能な遺伝学的ツールであるためには、遺伝子発現の安定な操作が必須である。Hemannとその同僚は、ｓｈＲＮＡ発現カセットの造血幹細胞へのレトロウイルスによる送達後に、イン・ビボでの遺伝子発現の長期間の抑制を示した(Hemann等、2003, Nat.Genet.印刷中)。ここで、我々は、マウス生殖細胞系列を通過したｓｈＲＮＡ発現カセットが遺伝性の遺伝子発現抑制を強制できるかどうかを試験することを追求した。
【０２４９】
我々は、チロシナーゼ(アルビノ)、ミオシンＶＩＩａ(震盪)、Ｂｍｐ−５(捲縮耳)、Ｈｏｘ ａ―１０(肢欠損)、ホモゲンチザーテ １，２−ジオキシゲナーゼ(空気に曝すと尿が黒くなる)、Ｈａｉｒｌｅｓｓ(無毛)及びメラノコルチン１レセプター(黄色)をコードする遺伝子を含む、予想された表現型を有する様々な標的に向けたｓｈＲＮＡを利用して標準的遺伝子導入アプローチ(Gordon等、1993, Methods Enzymol.225:747-771)により始めた。遺伝子当たり３つの構築物を線状化して、前核に注入してトランスジェニック創出動物を生成した。我々は幾らかの動物における導入遺伝子の存在に注意したが、事実上、何れも、標的遺伝子の低次形態対立遺伝子について予想された明確な又は再生可能な表現型を示さなかった。
【０２５０】
それ故、我々は：培養胚性幹(ＥＳ)細胞における標的遺伝子に対するｓｈＲＮＡ及びその活性の存在を確認してから、それらの細胞がキメラ動物においてイン・ビボで抑制を維持したかどうかを問うという別のアプローチをとることを決定した。我々は又、かかる細胞が、機能的ＲＮＡｉ誘導性構築物を、マウス生殖細胞系列を通して送ることができるかどうかを試験することを計画した。これらの研究のために、我々は、ＤＮＡ修復において一つの役割を有することが提案されている新規な遺伝子Ｎｅｉｌ１を調べることを選択する。酸化によるダメージは、ヒトにおける毎日細胞当たり１０，０００箇所のＤＮＡ損傷を説明し、発癌、加齢及び虚血後の組織損傷に寄与していると考えられている(Ames等、1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7915-7922；Jackson等、2001, Mutat.Res.477:7-21)。酸化によるＤＮＡ損傷は、無塩基部位、鎖切断及び少なくとも２０の酸化された塩基を含み、これらの多くは、細胞障害性であり前突然変異誘発性である(Dizdaroglu等、2002, Free Radic.Biol.Med.32:1102-1115)。ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼは、特異的塩基の認識及び糖塩基結合の開裂による損傷塩基の解離により塩基切除修復経路を開始する(David等、1998, Chem.Rev.98:1221-1262)。
【０２５１】
Ｎｅｉｌ遺伝子は、大腸菌に由来するタンパク質のＦｐｇ／Ｎｅｉファミリーと関連する哺乳動物のＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼの新たに発見されたファミリーである(Hazra等、2002, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:3523-3528；Bandaru等、2002, DNA Repair 1:517-529)。Ｎｅｉｌは、ＤＮＡから、チミジングリコール(Ｔｇ)、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン(ＦａｐｙＧ)及び４，６−ジアミノ−５−ホルミドピリミジン(ＦａｐｙＡ)を含む酸化されたピリミジン及び開環したプリンの広いスペクトルを認識して除去する。Ｔｇ、ＦａｐｙＧ及びＦａｐｙＡは、電離放射線により生成される最も一般的な酸化された塩基中にあり(Dizdaroglu等、2002, Free Radic.Biol.Med.32:1102-1115)、複製ＤＮＡポリメラーゼをブロックし、更に、細胞死を引き起こすことができる(Asagoshi等、2002, J.Biol.Chem.277:14589-14597；Clark等、1989, Biochemistry 28:775-779)。
【０２５２】
Ｎｔｈ１及びＯｇｇ１グリコシラーゼは、各々、Ｎｅｉｌの基質と重複する酸化されたＤＮＡ塩基のサブセットを除去する(Nishimura 2002, Free Radic.Biol.Med.32:813-821；Asagoshi等、2000, Biochemistry 39:11389-11398；Dizdaroglu等、1999, Biochemistry 38:243-246)。しかしながら、Ｎｔｈ１(Ocampo等、2002, Mol.Cell.Biol.22:6111-6121；Takao等、2002, EMBO J.21:3486-3493)又はＯｇｇ１(Klungland等、1999, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:13300-13305；Minowa等、2000, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:4156-4161)にヌル変異を有するマウスは、生存可能であり、Ｎｅｉｌ１活性が、Ｎｔｈ１又はＯｇｇ１の喪失を軽減している可能性を高めている。最近、Ｎｔｈ１-/-マウスの残留Ｔｇ−ＤＮＡグリコシラーゼ活性が、Ｎｅｉｌ１として同定された(Takao等、2002, J.Biol.Chem.277:42205-42213)。
【０２５３】
我々は、Ｎｅｉｌ１コード領域の５’末端の近くの配列を標的とする単一のｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築した。このベクターを、マウスの胚性幹細胞にエレクトロポレーションにより導入して、個々の安定なインテグラントを、Ｎｅｉｌ１タンパク質の発現について試験した(詳細な手順については、ウェブリンク：http://www.cshl.edu/public/SCIENCE/hannon.html を参照されたい)。大多数の細胞株は、Ｎｅｉｌタンパク質の約８０％減少を示したが、これは、Ｎｅｉｌ１ｍＲＮＡレベルにおける同様の変化と相関している。これらの細胞は、電離放射線に対する感受性において約２倍の増加を示したが、これは、ＤＮＡ修復におけるＮｅｉｌ１の役割と一致する。２つの独立のＥＳ細胞株を、ＢＬ／６胚盤胞に注入して、幾らかの高いパーセンテージのキメラが得られた。これらのキメラを異系交配させて、ｓｈＲＮＡ発現構築物の生殖細胞系列への伝達が、多くのＦ1子孫において記録された(一系列は、１３／２７、他系列では１２／２６であった)。
【０２５４】
ＥＳ細胞で認められたＮｅｉｌ１のサイレンシングが正確に伝達されたかどうかを決定するために、我々は、Ｎｅｉｌ１ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを調べた。両方とも、工学処理されたＥＳ細胞において認められたものとほぼ同じ程度減少した(図５５、５６)。ＲＮＡｉ経路で認められたこれと一致して、我々は、ｓｈＲＮＡ発現ベクターを有するＦ1動物においてｓｈＲＮＡ配列に対応するｓｉＲＮＡの存在を検出したが、このベクターを欠くものにおいては検出しなかった(図５６ｂ)。
【０２５５】
前述のデータは、ｓｈＲＮＡを利用して、ＲＮＡｉが標的遺伝子を発現抑制した生殖細胞系列のトランスジェニックマウスを造ることができることを示している。これらの観察は、標準的なノックアウト方法論に対する補完としてのＲＮＡｉの利用への扉を開き、生きた動物において感心ある遺伝子の抑制の結果を迅速に評価する手段を提供する。アクチベーター依存性Ｕ６プロモーターと組み合わせて、ｓｈＲＮＡの利用は、最終的に、マウスにおける遺伝子発現の組織特異的な、誘導性のそして可逆的な抑制のための方法を与えるであろう。
【０２５６】
Ｖ．同等物
当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認識し、日常的実験を利用して確認することができよう。かかる同等物は、後記の請求の範囲に包含されるものである。
上で引用した参考文献及び刊行物のすべてを、参考として、本明細書中に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】Ｓ２細胞におけるＲＮＡｉを表す図である。
【図２】イン・ビトロＲＮＡｉを表す図である。
【図３】ＲＩＳＣの基質必要条件を表す図である。
【図４】ＲＩＳＣは潜在的なガイドＲＮＡを含むことを示す図である。
【図５】２２量体の産生及びｍＲＮＡの分解は、異なる酵素複合体によって行われることを示す図である。
【図６−１】組換えＣＧ４７９２／Ｄｉｃｅｒによる２２量体の生成を表す図である。
【図６−２】組換えＣＧ４７９２／Ｄｉｃｅｒによる２２量体の生成を表す図である。
【図７】ＤｉｃｅｒはＲＮＡｉに関与することを示す図である。
【図８】Ｄｉｃｅｒは、進化的に保存されたリボヌクレアーゼであることを示す図である。
【図９】ＲＩＳＣの精製方法を表す図である。
【図１０】サイジングカラムによるＲＩＳＣ活性の分画を表す図である。
【図１１】ｍｏｎｏＳカラムによるＲＩＳＣの分画を表す図である。
【図１２】ｍｏｎｏＱカラムによるＲＩＳＣの分画を表す図である。
【図１３】ヒドロキシアパタイトカラムによるＲＩＳＣの分画を表す図である。
【図１４】ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２と他ファミリーメンバーとのアラインメントを示す図である。
【図１５】ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２の確認を表す図である。
【図１６】Ｓ２細胞及び胚抽出物を、２２量体産生活性についてアッセイしたことを示す図である。
【図１７】ＲＩＳＣは、２２量体産生活性分画（Ｄｉｃｅｒ）から分離することができることを示す図である。
【図１８】ＤｉｃｅｒはｄｓＲＮＡに対して特異性を有しており、長い基質を好むことを示す図である。
【図１９】Ｄｉｃｅｒを幾つかのカラムに分画したことを示す図である。
【図２０】ｄｓＲＮＡを２２量体に加工することのできる酵素としてのＤｉｃｅｒの同定を表す図である。
【図２１】ＤｉｃｅｒはＡＴＰを必要とすることを示す図である。
【図２２】Ｄｉｃｅｒは、ＲＩＳＣに存在するＲＮＡと同じサイズのＲＮＡを産生したことを示す図である。
【図２３】発現され免疫沈降されたヒトＤｉｃｅｒ同族体は、２２量体産生活性を有することを示す図である。
【図２４】ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２の配列を表す図である。
【図２５】ショウジョウバエ  ａｒｇｏｎａｕｔｅ２の分子特性を表す図である。
【図２６】Ｄｉｃｅｒ活性物質は、ヒト細胞においてヒトＤｉｃｅｒ遺伝子を発現させることによって作り出すことができることを示す図である。
【図２７】発現抑制される遺伝子の約５００ｎｔの断片（Ｘ）を、標準的クローニング法を用いて、安定した直列反復として改変ベクター内に挿入したことを示す図である。
【図２８】胎生期癌細胞Ｐ１９におけるＲＮＡｉを表す図である。
【図２９】ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼのＰ１９細胞におけるＲＮＡｉを表す図である。
【図３０】野生型Ｐ１９細胞への一時的トランスフェクション後のＲＦＰ又はＧＦＰの発現(右側パネル)及び５００ｎｔの二本鎖ＧＦＰヘアピンを安定に発現するＰ１９クローンにおけるＧＦＰ発現の特異的抑制(左側パネル)を示している図である。
【図３１】マウス胚性幹細胞におけるルシフェラーゼ発現のｄｓＲＮＡによる特異的サイレンシングを表す図である。
【図３２】Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞におけるＲＮＡｉを表す図である。
【図３３】フォティナス・ピラリス(ホタル)及びレニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)ルシフェラーゼを発現するプラスミドと、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡと相同な(ｄｓＬＵＣ)又は相同でない(ｄｓＧＦＰ)ｄｓＲＮＡ５００量体(４００ｎｇ)とでトランスフェクトしたＨｅｌａ、チャイニーズハムスター卵巣、及びＰ１９(多能性のマウス胎生期癌)細胞株についてのアッセイ結果を示した図である。
【図３４−１】ヘアピンＲＮＡの発現は、ＧＦＰを安定にサイレントにするＰ１９ＥＣ細胞株を生成することを示した図である。
【図３４−２】ヘアピンＲＮＡの発現は、ＧＦＰを安定にサイレントにするＰ１９ＥＣ細胞株を生成することを示した図である。
【図３５】ｄｓＲＮＡは、転写後レベルでサイレンシングを誘導することを示した図である。
【図３６】Ｐ１９細胞溶解物に由来するＳ１０画分を、フォティナス・ピラリス(ホタル)及びレニラ・レニフォルミス(ウミシイタケ)のルシフェラーゼｍＲＮＡのイン・ビトロ翻訳に利用したアッセイ結果を示す図である。
【図３７】Ｐ１９細胞を、６ウェル組織培養プレート中で、約６０％集密まで生育させて行なったアッセイ結果を示した図である。
【図３８】ｓｉＲＮＡを生成する以前の方法は、高価な化学合成を要したが、この発明は、ｓｉＲＮＡ合成のための、標準的ＲＮＡ転写反応を利用するイン・ビトロの方法を提供することを示した図である。
【図３９】短いヘアピンは、ショウジョウバエのＳ２細胞において、遺伝子転写を抑制することを示す図である。
【図４０】哺乳動物細胞における短いヘアピンの機能を表す図である。
【図４１】イン・ビトロで転写されたｓｉＲＮＡ及び短いヘアピンは、哺乳動物細胞中で遺伝子発現を抑制することを示す図である。
【図４２】機能的ｓｈＲＮＡのイン・ビボでの転写を表す図である。
【図４３】Ｄｉｃｅｒは、ｓｈＲＮＡ媒介の遺伝子サイレンシングに必要であることを示す図である。
【図４４】内因性遺伝子の安定なｓｈＲＮＡ媒介の遺伝子サイレンシングを表す図である。
【図４５】２つの短いヘアピン(共に、ホタルのルシフェラーゼに対応)の混合物は、遺伝子発現の相乗的な抑制を生じないことを示す図である。
【図４６】コードされた短いヘアピンは、遺伝子発現をイン・ビボで特異的に抑制することを示す図である。
【図４７】短いｄｓＲＮＡの安定な発現のためのストラテジーを表す図である。
【図４８】短いｄｓＲＮＡの安定な発現のためのストラテジーを表す図である。
【図４９】短いｄｓＲＮＡの安定な発現のためのストラテジーを表す図である。
【図５０】二連のルシフェラーゼアッセイを、図２８〜３５で詳細に記載したように行なった結果を示した図である。
【図５１】マウスチロシナーゼプロモーターの概略的表示である。
【図５２】図Ｘ及びＹにおいて用いたレポーター発現用プラスミド及びｓｉＲＮＡ配列を表す図である。
【図５３】ｓｉＲＮＡを利用する成体マウスにおけるＲＮＡ干渉を表す図である。
【図５４】成体マウスにおけるｓｈＲＮＡを利用するＲＮＡ干渉を表す図である。
【図５５】幾つかの組織におけるＲＮＡｉによるＮｅｉｌ１発現の遺伝的抑制を表す図である。
【図５６】Ｎｅｉｌ１タンパク質の減少は、ｓｉＲＮＡの存在と相関することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【国際調査報告】
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