(57)【要約】エオタキシンに対するもので、その生物活性を中和する自己抗体を含む、対象において活発な免疫応答を発する免疫原組成物および上記組成物を用いた処置方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エオタキシンが伝達する状態についての対象の処置方法であって、エオタキシンに対する活発な免疫応答を対象において生じさせることを含む方法。
【請求項２】
エオタキシンが伝達する状態が、喘息、アレルギーまたはアレルギー性疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
活発な免疫応答が、上記状態の伝達におけるエオタキシンの影響を中和するのに十分なレベルでエオタキシンに結合している自己抗体を対象において産生させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
エオタキシンに結合する抗体を対象において産生させる免疫原性組成物で対象を免疫化することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
免疫原性組成物が、免疫原性担体に結合したエオタキシンまたはエオタキシンの一部分を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
免疫原性担体が、Ｔ細胞エピトープおよびエオタキシン由来のエピトープを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
免疫原性組成物がエオタキシンの免疫原性類似体を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
免疫原性組成物がＤＮＡワクチンである、請求項４記載の方法。
【請求項９】
免疫原性タンパク質担体にカップリングしたエオタキシンまたはそのペプチドフラグメントを含む免疫原性組成物。
【請求項１０】
Ｔ細胞エピトープおよびエオタキシン由来のエピトープを含む、請求項９記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
ＤＴ、ＴＴまたはＫＬＨから誘導された免疫原性担体にコンジュゲートされたエオタキシンまたはその一部分を含む、請求項９記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
エオタキシンまたはその一部分を免疫原性担体にコンジュゲートすることを含む、請求項９または１１記載の組成物の製造方法。
【請求項１３】
請求項９記載の免疫原性組成物、医薬上許容されるアジュバントおよび医薬上許容される賦形剤を含む、治療用ワクチンとして使用される医薬処方物。
【請求項１４】
配列番号１〜３８および４２〜６１に示されたペプチド配列から選択されるペプチド配列またはその混合物を含む、請求項９記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
エオタキシンに対して免疫応答を発するペプチドをコード化するＤＮＡワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
サイトカインは、免疫系の細胞により生産され、そこで作用するペプチドメッセンジャー分子である。それらはパラ分泌ホルモンまたは自己分泌ホルモンの性質を有し、それらが細胞結合を免れ、リンパまたは血漿を通じて全身循環系に溢れ出た場合には全身的に作用し得る。サイトカインは化学的メッセンジャーとして重大な役割を演じ、正常な免疫機能にとっては不可欠なものであり、ある種の免疫系疾患において特異的サイトカインレベルは異常であり、病状を増強する。
【０００２】
免疫系疾患、例えばアトピー状態、特に喘息、および自己免疫疾患では、ケモカイン類、特定クラスのサイトカイン、およびそれらのサブクラスインターロイキン類は重要な役割を演じる。組織におけるこれらのケモカインの存在およびレベルが生理学的変化を誘発し、特定疾患に苦しむ個体においてそれらが増幅および不滅化される結果、病状として認識される表現型を生じる。ケモカインは、炎症の開始および維持の伝達物質である。中和性抗ケモカイン抗体またはケモカイン受容体アンタゴニストとのケモカイン‐受容体相互作用を破壊することにより、炎症応答が縮小または阻害され得る。ケモカインに対する自己抗体は、ケモカイン並びに免疫系および病気に対するそれらのシグナル伝達および調節効果を有効に中和し得る。標的ケモカインに対する患者の自己抗体レベルの調節による、異常レベルのケモカインに伴う病気についての治療の概念は、事実上、体そのものの病因または病気の調節と競合し得る。
【０００３】
病気におけるケモカイン類の重要な調節的役割により、作用モードが受容体へのケモカインの結合を遮断することである開発中の若干の生成物がもたらされる。これらの生成物の大多数は、その中に臨床試験中のものあるが、ヒト化モノクローナル抗体(「ｍＡｂ」)、非抗原性受容体アンタゴニストまたは可溶性受容体分子または類似体に基いており、それらは全て、多くの反復投与を必要とするため、理論的に言えば長期治療または予防的処置に向いたものではない。例えば、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患用のヒト化抗ＴＮＦアルファｍＡｂ、および喘息処置用の幾つかのヒト化抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−８および抗ＩＬ−９ｍＡｂは開発中である。これらのヒト化ｍＡｂ処置は、急性病状の短期処置についての可能性は有し得るが、それらは理論的に言えば長期維持療法には適していない。その結果、患者自身の免疫系を有効活用することにより、標的ケモカインレベルのポリクローナル自己抗体に基いた制御を展開させる治療法は、現時点では臨床試験において生成物の不利な点の多くを克服する手段として示唆されている(例えば、国際公開第００／６５０５８号および米国特許第６０９３４０５号参照)。
【０００４】
サイトカイン中和
開発中の最も関連性のあるサイトカイン中和方法は、サイトカイン受容体アンタゴニストの投与、サイトカインまたはサイトカイン受容体に対するヒト化モノクローナル抗体の投与、または受容体の切頭化形態の投与によるものであり、これらはサイトカインに結合してそれを中和する。例えば、米国特許第５９１２１３６号、同第５９１４１１０号、同第５９５９０８５号、同第６１６８７９１Ｂ１号および同第６１７１５９０Ｂ１号は全て上記方法を開示している。報告された別のサイトカイン中和方法は、サイトカイン遺伝子のコーディング配列に相補的なアンチセンス分子の使用によるものであり、その目標は遺伝子の発現を阻止することである。
【０００５】
能動免疫化により産生された自己抗体によるサイトカイン中和は、現在病理学的状態の有望な処置方法であると考えられている(Zagury et al.、「新世代のワクチンに向かって：抗サイトカイン治療ワクチン」、PNAS、２００１年７月３日、第９８巻、１４号、８０２４−８０２９、Svenson et al.、Journal of Immunological Methods ２３６(２０００)１−８、Richard et al.、PNAS、２０００年１月１８日、第９７巻、２号、７６７−７７２、Dalum et al.、Nature Biotechnology、第１７巻、１９９９年７月、６６６−６６９)。サイトカイン中和に有用なワクチンは、サイトカイン分子を不活化し、それを免疫原性にすることにより製造され得る、例えば、高い循環レベルのヒトＩＬ−６を有するトランスジェニックマウスにおいて遺伝子操作による抗原性非生物活性ＩＬ−６受容体アンタゴニストを予防接種した後のＩＬ−６の中和を有効に立証した Ciapponi et al.、「遺伝子操作によるＩＬ−６受容体アンタゴニストの予防接種によるインターロイキン−６(ＩＬ−６)の誘導」、Nature Biotechnology、第１５巻、１９９７年１０月、９９７−１００１頁参照。Ciapponi et al.は、免疫または新生物疾患の上記予防接種処置が、連続非経口送達を必要とするモノクローナル抗体(ｍＡｂ)または受容体アンタゴニストによる治療法を凌ぐ利点を有することを推測している。別法として、サイトカインを免疫原性担体にカップリングすることにより、それを免疫原性にさせ得る(例えば、Richard et al.、PNAS、２０００年１月１８日、第９７巻、２号、７６７−７７２、米国特許第６４５５５０４号、米国特許第６４２０１４１号、国際公開第０１／４３７７１号および国際公開第００／６４３９７号参照)。抗サイトカインワクチン方法は、これらの病状に関与するインターロイキンのレベルを制御することによる喘息およびアレルギー性疾患の処置について提案されている(国際公開第００／６５０５８号および米国特許第６０９３４０５号参照)。
【０００６】
アトピー状態：喘息、アレルギーおよびアレルギー性疾患
喘息は最も重要な医学上の問題の一つになっており、米国だけでも約１５００万人の喘息患者が存在する。喘息患者の数は過去１０年において５０％を凌ぐ割合で増加しており、米国では毎年７０００００人が発病し、多くは子供である。
【０００７】
ヒトは全て、肺に入ったアレルゲンに対して防御的免疫応答を生じるが、中には、喘息発作を誘発するケモカインを含む物質を放出する、アレルギー性免疫抗体ＩｇＥを産生する細胞の極度の応答を生じることにより反応する個体もある。喘息症状が少なくとも１週間に２回現れる慢性喘息は、現在２タイプの薬剤(１)炎症を鎮める医薬、例えばコルチコステロイドおよび(２)発作時に収縮した気道を開き、呼吸しやすくするためのレスキュー薬剤により処置されている。現在市販されている薬剤は、喘息症状の軽減を助けるだけで、アレルギーおよびそれに続く喘息を誘発する免疫応答を排除または抑制するわけではない。さらに、現行医薬の大多数は、頻繁に服用しなければならない丸剤であるかまたは吸入器で頻繁にまたは発作中に投与しなければならないものである。大部分のステロイドに基く治療のように、それらはまた、使用増加または長期使用に伴って望ましくない副作用を生じ、効力を低下させ得る。数ヶ月ごとに投与するだけでよい、喘息発作を起すアレルギー様応答を抑制または排除するワクチン型医薬が非常に望ましい。
【０００８】
Ｔ−ヘルパー細胞は、免疫応答の鍵を握る機能を遂行する。一般的に、Ｔ−ヘルパー前駆体(Ｔｈ−ｐ)細胞は、各々が重要な生物学的役割を有するＴ−ヘルパー１(Ｔｈ−１)またはＴ−ヘルパー２(Ｔｈ−２)エフェクター細胞へ免疫応答の一部として分化する。肺へ入った抗原に応答して、個体は防御的Ｔｈ−１またはアレルギー性Ｔｈ−２応答を発し得る。Ｔｈ−２応答の結果、ＩｇＥ抗体が産生し、アレルギー症状が起こる。アレルギー性および喘息個体は、高いレベルのＩｇＥに伴って吸入されたアレルゲンに対して極度のＴｈ−２応答を呈する。
【０００９】
喘息における気道炎症は、Ｔｈ２細胞、好酸球およびマスト細胞による気道壁の浸潤を特徴とする。これらの細胞は各々、喘息を特徴づけ、各細胞型が生じる、限られた一団のサイトカインに対する応答性を示す生理学的変化の一因となっている。
【００１０】
Ｔｈ−１またはＴｈ−２細胞へのＴｈ−ｐ細胞の分化は、主として種々のセットのインターロイキンケモカインから成る異なるホルモンシグナル伝達経路により伝達される。Ｔｈ−２経路は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３により伝達される。これらのインターロイキンは、Ｔｈ−２細胞により産生され、抗体産生およびアレルギー性免疫応答に関与する他の細胞へのシグナル伝達にとって決定的なものである。エオタキシンは、好酸球を調節し、ＩｇＥ抗体の産生に影響を及ぼし、アレルギー応答にとって重大なものである、Ｔｈ−２シグナル伝達カスケードのかなり下方の別のケモカインである。
【００１１】
現在、新たな喘息治療に向けて実質的な研究および開発努力が為されている。これらには、主としてＩＬ−４およびＩＬ−５についてのケモカイン中和療法およびヒト化抗ＩｇＥｍＡｂでの直接遮断または恐らくＩｇＥに対して免疫化するワクチンによるＩｇＥ抗体の中和を目指す他の戦略がある。他に、さらなる慣用的なアレルギーワクチン戦略は、特異的ペプチドアレルゲン、例えばネコ鱗屑またはブタクサ花粉による免疫化または脱感作を中心にしている。これらのさらなる慣用的な研究領域はまた、新たな送達方法およびアレルゲン予防接種へのＤＮＡワクチン技術の適用に向けて努力しながら存続しているが、アレルゲン特異的戦略により、喘息についての一般的治療法がもたらされる訳ではない。
【００１２】
また、非特異的Ｔｈ−１免疫応答の発生、またはＴｈ−１免疫応答を誘発する既知Ｔｈ−１抗原またはＤＮＡワクチンでの免疫化によるＴｈ−１応答への患者のＴｈ−２応答のシフトに焦点を絞った一般的喘息ワクチンについてはかなりの研究努力が為されている(例えば、米国特許第６０８６８９８号参照)。アレルギーおよび自己免疫疾患についての治療法として示唆されている能動免疫化方法は、インターロイキンＩＬ−４およびＩＬ−５のレベル制御に焦点を絞っている。米国特許第６０９３４０５号は、アレルギーまたは自己免疫疾患をそれぞれ処置することを目的とする、免疫原性ＩＬ−４またはＩＬ−５サイトカイン組成物での能動免疫化によるＩＬ−４またはＩＬ−５に対する免疫応答の誘導について開示している。国際公開第００／６５０５８号は、抗ＩＬ−５免疫原の構築および提案された喘息および他の慢性アレルギー疾患の制御方法においてＩＬ−５をダウンレギュレーションする方法におけるそれらの使用について開示している。標的ケモカインの選択は、能動免疫化による病状の処置においては重大なことである。これらの参考文献のどれも、エオタキシンに対する能動免疫化による喘息の制御方法については示唆していない。
【００１３】
エオタキシン
エオタキシンは、好酸球特異的ケモカインであり、好酸球蓄積を刺激するかまたは好酸球を誘引する。エオタキシンは、好酸球の走化性を誘導するが、好中球、単球またはＴ細胞の走化性についてはあまり誘導しない。エオタキシンは、単球化学誘導タンパク質(ＭＣＰ)およびマクロファージ炎症タンパク質(ＭＩＰ)をも含むクラスである、ケモカインのＣＣサブファミリーの要員である、Van Coillie et al.、Cytokine & Growth Factor Reviews、１０(１９９９)６１−８６；Garcia-Zepeda et al.(１９９６)Nat.Med.、２：４４９−４５６参照。
【００１４】
現在、エオタキシンとして分類される少なくとも３種の分子：最初に同定され、依然としてエオタキシンとして称されるエオタキシン−１(Kitaura,M et al.、J.Biol.Chem.、１９９６、２７１；７７２５−３０およびPonath et al.、J.Clin.Invest.１９９６、９７：６０４−１２参照)および後で発見されたエオタキシン−２およびエオタキシン−３(Conroy et al.Respir Res ２００１、２：１５０−１５６；Guiterrez-Ramos et al.Immunology Today、１９９９年１１月、第２０巻、１１号、５００−５０４参照)が存在する。エオタキシンは、ケモカイン受容体３、ＣＣＲ３に結合し、それを通じて作用するもので、比較的高い親和力で好酸球漸増を誘導する。構造およびペプチド配列およびエオタキシンをコード化する遺伝子は公知であり、受容体結合については試験され、特性確認されている(Garcia‐Zepeda et al. Nature Medicine、第２巻、４号、１９９６年４月、４４９−４５６；Ye et al.、The Journal of Biological Chemistry、第２７５巻、３５号、２０００年９月１日、２７２５０−２７２５７；MayerおよびStone、The Journal of Biological Chemistry、第２７６巻、１７号、２００１年４月２７日、１３９１１−１３９１６参照)。
【００１５】
好酸球は、ぜん虫寄生体感染に対する体のＴｈ−２型免疫防御の主成分の一つであり、感染個体の血液および組織に蓄積される。好酸球はカチオン性タンパク質の顆粒を含み、脱顆粒時それらは細胞環境へ放出され、侵入しているぜん虫に損傷を与える。アトピー状態、例えば喘息および慢性アレルギー疾患は、アレルギー性非ぜん虫刺激因子に対する優勢なＴｈ−２型免疫応答を特徴とする。喘息および慢性アレルギー疾患の患者における肺の炎症は、好酸球の肺および気管支粘膜における浸潤および蓄積を特徴とする。ぜん虫感染の不存在下でのこれらの状態においては、脱顆粒時の好酸球カチオン性タンパク質の放出が周辺の細胞に損傷を与える。結果として、エオタキシンは、アトピー状態の処置および予防および特に喘息およびアレルギー疾患の治療について可能性のある標的として認識されている。米国特許第５９９３８１４号および同第６０３１０８０号およびＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７９８５、ＷＯ９７／００９６０、ＷＯ９７／１２９１４およびＷＯ９９／１０５３４は、エオタキシンに対する抗体を含む様々なエオタキシンアゴニストおよびアンタゴニストの治療における使用について示唆している。国際公開第０１／６６７５４号は、受動免疫化方法においてエオタキシンが介する状態の処置を目的とする抗エオタキシンヒト抗体ＣＡＴ２１２および２１３およびそのフラグメントの生産および使用について開示している。
【００１６】
エオタキシンが作用する受容体、ＣＣ、ＣＫＲ３またはＣＸＣＲ３受容体は、既に特性確認されており(国際公開第９７／４１１５４号および米国特許第６１７１５９０Ｂ１号参照)、この受容体のアゴニストおよびアンタゴニストはまた治療について示唆されている(米国特許第６２７１３４７号参照)。米国特許第６１７１５９０Ｂ１号は、受容体から誘導された免疫原性オリゴペプチドが治療効果を目的として受容体に対する能動免疫化で使用され得ることを示唆している。しかしながら、上記で示した出版物または特許のうち、治療方法としてエオタキシン自体に対する能動免疫化を示唆しているものや、上記能動免疫療法に有用な免疫原性組成物を開示しているものは無い。
【００１７】
発明の要約
本発明は、サイトカインエオタキシンを標的とするワクチン製品およびエオタキシン介在好酸球蓄積により生じる炎症状態、例えば喘息およびアレルギー疾患および他のアトピー状態について、ヒトを含む動物対象を処置するためのそれらの使用に関するものである。ワクチンまたは免疫原性製品は、種々の免疫原型および送達方法を採用し、単独または他の治療薬と組合わせて使用され得る。
【００１８】
抗原性ペプチドに基く製品は、不活性および免疫原性にされた修飾エオタキシンを用いて処方され得る。ある種の実施態様において、免疫原は、少なくとも１個のエオタキシン受容体アンタゴニストまたはアゴニスト、または免疫原性担体にコンジュゲートされたエオタキシン由来のエピトープを含む。エオタキシンまたはエオタキシン模擬物質から誘導された免疫原は、当業界でよく知られている方法を用いて構築され、実験動物、例えばマウスまたはウサギにおいて免疫応答を誘導するのに使用され得る。産生した抗体は、臨床開発に最適なエピトープ選択を先導するものとして、インビトロで受容体に結合しているエオタキシンを中和する能力についてスクリーニングされ得る。ＤＮＡに基く製品は、抗原性ペプチド生成物をコード化し、処置対象において生産させるＤＮＡワクチン製品を含んでおり、免疫化対象においてエオタキシンに対する免疫応答を誘導する。特定製品の設計は、一次免疫応答が求められる標的組織および主として発生する免疫応答のタイプにより異なる。
【００１９】
免疫原性組成物は、エオタキシンを免疫中和(immunoneutralize)する、すなわちエオタキシン活性をダウンレギュレーションしてエオタキシン介在好酸球蓄積を低減化させることにより炎症状態を改善するのに十分なレベルでエオタキシンに対し対象または患者において自己抗体応答を発する。免疫原は、免疫原性担体にカップリングされたエオタキシン配列または模擬物質の部分を含む組合わせペプチド免疫原または上記組合わせペプチド免疫原をコード化するＤＮＡワクチンを含み得る。
【００２０】
一実施態様では、エオタキシンに存在するエピトープまたはその免疫模擬物質である特異的ペプチド配列を、免疫原性担体にカップリングさせて抗エオタキシン免疫原を製造させる。免疫原は、適切な処方物、例えば油中水エマルションで注射により対象に投与されることにより、エオタキシンに対して中和する抗体を産生させる体液性免疫応答を誘導する。免疫応答は、ブースター用量の抗エオタキシン免疫原の投与により持続される期間維持され得る。適切な免疫原性担体は、タンパク質またはタンパク質トキソイド、例えばジフテリアトキソイド(ＤＴ)または破傷風トキソイド(ＴＴ)、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、インフルエンザウイルス血球凝集素などを含み得る。特異的ペプチド配列は、二官能性架橋剤とのコンジュゲーションを介して免疫原性担体にカップリングされる。別法として、特異的ペプチドは、特異的Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを担う合成ヘテロ官能性免疫原性ペプチドとして、適切なＴ細胞エピトープ配列(複数も可)と連繋して合成されることにより、所望のエオタキシン標的フラグメントに対する持続的免疫原性応答を誘導し得る。特異的ペプチド配列は、当業界で公知の方法を用いてインビトロで、またはベクターＤＮＡによる予防接種後にインビボでタンパク質を発現させるのに適切なプラスミドベクターを用いることにより融合タンパク質としてＴ細胞エピトープと連繋して発現され得る。
【００２１】
本発明はまた、エオタキシン介在好酸球蓄積に随伴する状態の処置方法であって、本発明免疫原性組成物によるエオタキシンに対する対象の能動免疫化を含む方法に関するものである。本発明処置方法は、抗エオタキシンワクチンを用いた能動免疫化に加えて他の薬剤による対象の処置をも含む治療法を包含する。
【００２２】
発明の詳細な記載
本発明は、エオタキシン介在好酸球蓄積を特徴とする状態の処置に有用な組成物を提供する。喘息および慢性アレルギー疾患が最も一般的であるこれらのアトピー状態には、アトピー性皮膚状態、例えば乾癬および他の状態、例えば好酸球性潰瘍性大腸炎がある。これらの状態の各々において、好酸球は、エオタキシン誘導好酸球漸増を通してかなりの程度罹患組織で蓄積する。高レベルの好酸球が罹患組織に慢性的に存在すると、時間をかけて進行し、不可逆的となり得る顕著な組織損傷が加えられる。先行技術の治療法は、エオタキシン効果の伝達について遂行されているものであり、小分子アンタゴニストによるＣＣＲ受容体に対するケモカインの作用の遮断、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体での受動免疫化によるエオタキシンレベルの低減化、またはＣＣＲ受容体自体に対する受動または能動免疫化に向けられている。小分子および受動免疫化方法は、反復投与を必要とし、患者コンプライアンスという観点についての欠点を有する。さらに、反復治療の結果として投与されたｍＡＢに対する中和性抗体の誘導により、慢性疾患の長期処置についてのｍＡｂによる受動免疫療法の有効性がひどく損なわれ得る(Adair，F.、Drug Discovery World、２００２年夏、５３−５９頁)。他方、ＣＣＲ３受容体自体に対する能動免疫化は、受容体への他のＣＣケモカインの結合を妨害し得るため、予想されず、意図されなかった生物学的結果を生じ得る。
【００２３】
本発明は、能動免疫化に有用であり、ヒト対象を含む動物対象においてエオタキシン自体に対する持続的免疫応答を誘導し得る免疫原性組成物を提供することにより先行技術の短所を克服するものである。エオタキシンに対して対象で誘導される自己抗体は、好ましくは他のＣＣケモカイン、例えばＭＩＰ、ＭＣＰ、エオタキシン−２またはエオタキシン−３と強くは交差反応しない。本発明による様々な免疫原は、特定状態の処置に最適である特異的免疫原を選択するため、興味の対象である病気または炎症状態に適切な動物モデルで製造および分析され得る。喘息および他のアレルギー疾患に適切な動物モデルは、当業界ではよく知られている(Humbles et al.、J.Exp.Med.、第１８６巻、４号、１９９７年８月１８日、６０１−６１２、Corry et al.、J.Exp.Med.、第１８３巻、１９９６年１月、１０９−１１７、Foster et al.、J.Exp.Med.、第１８３巻、１９９６年１月、１９５−２０１、Lukacs et al.、Am.J.Respir. Cell Mol.Bio.、第１０巻、５２６−５３２、１９９４参照)。
【００２４】
本発明免疫原は、当然、エオタキシンに対する特異性および結合親和力が十分に高い抗体を含む対象において免疫応答を誘導することにより、エオタキシンの生物活性を中和または調節することができる。さらに、誘導される抗エオタキシン抗体の力価は、当然、対象における高レベルのエオタキシンを低下させ、アトピー状態に冒されている組織に対し好酸球の漸増を縮小させるのに十分なものである。本発明の抗エオタキシン免疫原性組成物で対象または患者を能動免疫化することにより、エオタキシンと反応する自己抗体のレベルが対象で維持され、アレルギー反応中における好酸球漸増が阻止または改善され得る。この抗エオタキシン自己抗体レベルは、本発明免疫原性組成物のブースター投与により維持され得るため、当然、治療剤レベルのかなりの変動を呈し、患者コンプライアンスにとってあまり有利ではないことを欠点とする小分子エオタキシンアンタゴニストまたは受動抗エオタキシン免疫化で得られるものと比べて慢性的病状の制御について優れた防御力を提供する。さらに、ｍＡｂの受動免疫化は、反復投与時にターゲッティングされたｍＡｂに対する中和性抗体を発現させ易く、長期処置についてのそれらの有効性は制限されている。
【００２５】
成熟ヒトエオタキシンは、開裂されて７４アミノ酸の成熟タンパク質を解離し、ほぼ8.４ｋＤａの分子量となる２３アミノ酸親水性アミノ末端配列を含む９７アミノ酸前駆体タンパク質から誘導される(米国特許第６４０３７８２号、国際公開第９９／１０５３４号、国際公開第９７／００９６０号、Ye et al.、Journal of Biological Chemistry、第２７５巻、３５号、２０００年９月１日、２７２５０−２７２５７、Garcia-Zepeda et al.、Nature Medicine、第２巻、４号、１９９６年４月、４４９−４５６、Ponath et al.、J.Clin.Invest.、第９７巻、３号、１９９６年２月、６０４−６１２、Mayer et al.、Journal Biological Chemistry、第２７８巻、１７号、２００１年４月２７日、１３９１１−１３９１６参照)。成熟ヒトエオタキシンのアミノ酸配列(配列番号１)は以下の通りである(各アミノ酸残基について１文字コードを使用)：
GPASVPTTCC10  FNLANRKIPL20  QRLESYRRIT30  SGKCPQKAVI40 
FKTKLAKDIC50  ADPKKKWVQD60  SMKYLDQKSP70  TPKP74
【００２６】
エオタキシンは通常免疫原性ではない。興味の対象であるエピトープに対応するペプチド自体またはペプチドのフラグメントは、当業界で熟知されている方法により免疫原性にされ得る。使用され得る一方法は、エオタキシン生物活性を失ってはいるが、免疫原形態であり、動物またはヒト対象において抗エオタキシン中和性抗体を誘導し得る不活性エオタキシンまたは不活性エオタキシンフラグメントを製造することである。不活性ではあるが免疫原性のエオタキシンまたはそのフラグメントの製造に有用であり得る若干の化学的、物理的および免疫学的処置が知られている(例えば、米国特許第６０９３４０５号；Zagury et al.、PNAS、２００１年７月３日、第９８巻、１４号、８０２４−８０２９；Gringeri et al.、Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome and Human Retrovirology、第２０巻、４号、１９９９年４月１日；Ciapponi et al.、Nature Biotechnology、１９９７年１０月、第１５巻、９９７−１００１；Raaberg et al.、Pediatric Research、第３７巻、２号、１９９５、１６９−１７４；Raaberg et al.、Pediatric Research、第３７巻、２号、１９９５、１７５−１８１；Gringeri et al.、Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes、第７巻、７号、１９９４、９７８−９８８；Zagury et al.、Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes、第５巻、７号、１９９２、６７６−６８１参照)。
【００２７】
エオタキシンまたはそのフラグメントはまた、公知方法により、ペプチドまたはフラグメントを免疫原性担体タンパク質またはタンパク質トキソイド、例えばジフテリアトキソイド(ＤＴ)、破傷風トキソイド(ＴＴ)、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、ＢＣＧ、ＯＶＡなどにカップリングさせることにより免疫原性または他の点で生物学的不活性にされ得る(例えば、米国特許第６２１７８８１号、同第６１３２７２０号、同第５８９１９９２号、同第５６０９８７０号、同第５６０７６７６号、同第５４６８４９４号、同第５０２３０７７号および同第４２０１７７０号およびRichard et al.、PNAS、２０００年１月１８日、第９７巻、２号、７６７−７７２；Svenson et al.、Journal of Immunological Methods、２３６(２０００)、１−８；Dalum et al.、Nature Biotechnology、第１７巻、１９９９年７月、６６６−６６９；Gonzalez et al.、Annals of Oncology、９：４３１−４３５、１９９８、およびDalum et al.、The Journal of Immunology、１９９６、１５７：４７９６−４８０４参照)。別法として、不活性ではあるが免疫原性である修飾エオタキシン変異型または形態は、国際公開第００／６５０５８号および国際公開第９５／０５８４９号に開示された方法を用いることにより、エオタキシンと連繋してＴヘルパーエピトープを導入することにより製造され得る。
【００２８】
エオタキシンフラグメントコンジュゲート免疫原
本発明の一実施態様は、免疫原性タンパク質担体、例えばＤＴまたはＴＴにコンジュゲートされている、エオタキシン分子上の所望のエピトープに対応するエオタキシンペプチドフラグメントを含むことにより、雑多な(promiscuous)Ｔ細胞エピトープを提供し、長い抗体応答についての免疫記憶を可能にするコンジュゲート免疫原に関するものである。上記免疫原をヒトまたは動物対象に投与することにより、エオタキシンに対する能動体液性免疫応答を発現させ得る。本発明の一実施態様は、免疫原性担体タンパク質、例えばＤＴにコンジュゲートされることにより免疫原性にされた全ヒトエオタキシン分子を含む。本発明の他の実施態様は、免疫原性担体タンパク質にコンジュゲートされた短いエオタキシンペプチドフラグメントを含む。コンジュゲートは、一エピトープまたは複数のエピトープを含むほぼ４〜５０アミノ酸残基のペプチドを用いて構築され得、対象において抗体を誘導し、対象に存在するエオタキシン分子に存在するエピトープと交差反応させる。次いで、エピトープを含む上記一ペプチドまたは複数ペプチドを、一定範囲のペプチド対担体タンパク質モル比でタンパク質担体にコンジュゲートする。ペプチドは、免疫原性タンパク質に直接コンジュゲートされ得るか、またはペプチドスペーサー配列を組込んで、担体分子からの所望のエピトープを伸長させることにより、抗原提示細胞に対するその提示を促し、所望のエピトープの免疫原性を高め得る。担体へのペプチドのコンジュゲーションをホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤により実施することにより、所望のエピトープ含有ペプチドを担体タンパク質に結合させる。二官能性架橋剤の選択は、ペプチドにおける官能部分の利用能により異なる。これらのカップリング方法についての化学作用は、当業界ではよく知られており、米国特許第６１３２７２０号、同第５６０９８７０号および同第５４６８４９４号、およびChemistry of Protein Conjugation and Cross-linking、S.S.Wong(１９９１)ＣＲＣプレス、インコーポレイテッドの開示に示されている。
【００２９】
別法として、免疫原性エオタキシンペプチドは、選択されたエオタキシンエピトープを一Ｔ細胞エピトープまたは複数エピトープと連繋させて製造することにより、選択されたＢ細胞エピトープ(エオタキシンから誘導)をＴ細胞エピトープと共に提示して、免疫化対象において持続免疫応答を提供するように合成ペプチド化学により構築され得る。
【００３０】
また、免疫原性エオタキシンペプチドを組換えＤＮＡ技術により構築することにより、所望のエオタキシンフラグメントがＴ細胞エピトープ(複数も可)に必要なＤＮＡ配列と連繋してコード化されるプラスミドベクターを製造し、それによってＴ細胞エピトープ(複数も可)と共に選択されたＢ細胞エピトープ(エオタキシンから誘導)を含む融合タンパク質が製造され得る。融合タンパク質は、細胞培養／発酵技術を用いてインビトロで発現され得るか、またはＤＮＡワクチンとして使用され、免疫化対象においてエオタキシン特異的持続的免疫応答を提供し得る。
【００３１】
本発明のある種の実施態様において、成熟ヒトエオタキシン配列について言うと、分子のアミノ末端先端部からのアミノ酸残基１〜４５のペプチドフラグメントおよびカルボキシル末端先端部を構成する残基５４〜７４のフラグメントが、本発明免疫原コンジュゲートの構築に有用である。免疫原性コンジュゲートは、同一ペプチドフラグメントまたは同じ免疫原性担体にコンジュゲートされた異なるペプチドフラグメントに存在し得る１個またはそれ以上の異なるエオタキシンエピトープを含み得る。本発明のコンジュゲート免疫原は、当業界で熟知されている方法を用いて上記成分と共に医薬上許容される賦形剤中でアジュバントまたは他の免疫刺激薬剤により処方され得る、(Vaccine Design、The Subunit and Adjuvant Approach、(１９９５)PowellおよびNewman編、プレナム・プレス(ニューヨーク)、Aucouturier et al.、Vaccine １９(２００１)２６６６−２６７２参照)。
【００３２】
本発明の免疫原は、処方物および所望の免疫応答(粘膜、全身、組織特異的など)により異なり得る、若干の異なる投与経路(鼻腔内、経口、筋肉内または皮下注射など)により、一対象、一投与につきほぼマイクログラム〜ミリグラムの範囲における免疫原の様々な投薬量で投与され得る。本発明のペプチドコンジュゲートワクチンは、一投与につきペプチドコンジュゲート約０.１ミクログラム〜１０ミリグラムの用量で適切な処方物での筋肉内注射により投与され得る。処置の目標はエオタキシンの生物活性を中和する抗体を誘導することであると理解した上で、投薬量は、処置されている状態および免疫原に対する患者の応答性に基いて担当医師により調節される必要があり得る。一患者当たりの用量摂取法は、患者の罹患組織におけるエオタキシン濃度レベルおよび免疫原に応答して患者において誘導される抗エオタキシン抗体力価により変動し得る。本発明免疫原はまた、エオタキシンに対する活発な免疫応答を維持するためにブースター摂取法に従って患者に投与され得る。
【００３３】
抗エオタキシン免疫原はまた、他の医薬または抗炎症剤による処置プログラムで投与され得る。例えば、喘息またはアトピー性慢性アレルギー疾患の症例では、罹患組織におけるエオタキシンレベルおよび好酸球蓄積を制御およびダウンレギュレーションするように本発明の抗エオタキシンワクチンにより患者を能動免疫化し得、それと同時に例えば過度のアレルギー刺激因子により誘発された急性の発作に応じてレスキュー医薬または抗喘息または抗アレルギー剤を投与する。組合わせ処置で有用な上記追加薬剤には、コルチコステロイド、クロモグリエート、抗炎症剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ロイコトリエン(受容体)アンタゴニスト、キサンチン、抗ヒスタミン剤および気管支拡張剤が含まれ得る。
【００３４】
本発明免疫原の構築に有用な若干のエオタキシンペプチドフラグメントは以下の通りである：ＧＰＡＳＶＰ(配列番号２)、ＧＰＡＳＶＰＴ(配列番号３)、ＧＰＡＳＶＰＴＴ(配列番号４)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣ(配列番号５)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣ(配列番号６)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦ(配列番号７)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮ(配列番号８)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬ(配列番号９)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡ(配列番号１０)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮ(配列番号１１)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲ(配列番号１２)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫ(配列番号１３)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩ(配列番号１４)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰ(配列番号１５)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ(配列番号１６)、ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬＱ(配列番号１７)、ＦＮＬＡＮＲ(配列番号１８)、ＦＮＬＡＮＲＫ(配列番号１９)、ＦＮＬＡＮＲＫＩ(配列番号２０)、ＦＮＬＡＮＲＫＩＰ(配列番号２１)、ＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ(配列番号２２)、ＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号２３)、ＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号２４)、ＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号２５)、ＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号２６)、ＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号２７)、ＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号２８)、ＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号２９)、ＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号３０)、ＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号３１)、ＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号３２)、ＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号３３)、ＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号３４)、ＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号３５)、ＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号３６)、ＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号３７)およびＳＰＴＰＫＰ(配列番号３８)。ペプチドは、当業界でよく知られている合成または組換え技法により製造され得る。また、当業者であれば、ペプチドフラグメントのアミノ酸配列に修飾を加えることにより、対象においてエオタキシンに対する免疫応答の誘導に寄与する能力を維持しながら、その免疫原性を高めるかまたはフラグメントの他の特性を付与または向上させ得ることは理解しているはずである。上記修飾は、例えばアミノ酸残基の誘導体化により、または特定アミノ酸を別のものに置換することにより、または当業界で公知の他の方法により加えられ得る。
【００３５】
特定動物対象ではエオタキシン生物活性を呈しないペプチドミメティクスまたは免疫模擬物質はまた、コンジュゲート免疫原を構築するのにも使用され得る。ペプチドミメティクスは、本質的にそれ自体免疫原性ではあり得ないが、免疫原性ペプチドにカップリングすることにより免疫原性にされ得る。ある種の実施態様において、ペプチドミメティクスは、他の哺乳類エオタキシン分子、例えばマウスまたはモルモットエオタキシンから誘導され得る(米国特許第６０３１０８０号および同第５９９３８１４号参照)。
【００３６】
エオタキシンペプチドフラグメントまたは免疫模擬物質は、免疫原性タンパク質担体に直接コンジュゲートされ得るか、または別法としてペプチドスペーサー配列を組込ませて、担体分子からの所望のエピトープを伸長させることにより、抗原提示細胞へのその提示を促進し、それによって所望のエピトープの免疫原性を高め得る。様々なペプチドスペーサーが使用され得る。米国特許第５６０９８７０号および同第５４６８４９４号は、ペプチドスペーサーおよび興味の対象であるペプチド、さらには本発明コンジュゲート免疫原の構築に有用であり得る免疫原性タンパク質担体、例えばＤＴまたはＴＴへのスペーサーのコンジュゲート方法を開示している。ペプチドスペーサー；ＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号３９)、ＲＰＰＰＰＣ(配列番号４０)およびＬＰＰＰＰＣ(配列番号４１)は、本発明のエオタキシンペプチドフラグメントに使用され得る。スペーサーペプチドを、エオタキシンペプチドフラグメントのアミノ末端またはカルボキシル末端先端部に組込むことにより、免疫原性タンパク質にカップリングされているペプチド、例えば以下のものが製造され得る：
ＳＳＰＰＰＰＣＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号４２)、
ＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号４３)、
ＣＰＰＰＰＳＳＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号４４)、
ＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰＣＰＰＰＰＳＳ(配列番号４５)、
ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号４６)、
ＳＳＰＰＰＰＣＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ(配列番号４７)、
ＣＰＰＰＰＳＳＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ(配列番号４８)、および
ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号４９)。
【００３７】
典型的には、スペーサー配列は、エピトープ含有ペプチドフラグメントの製造中に合成ペプチド化学により特異的エオタキシン配列に組込まれる。特に、若干の親水性配列を伴う配列を含み、分子の表面に提示されると思われるエオタキシンフラグメントは、本発明に特に有用である。これらには、例えばＳＧＫＣＰＱＫＡＶＩＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号５０)、ＣＰＰＰＰＳＳＳＧＫＣＰＱＫＡＶＩ(配列番号５１)、ＦＫＴＫＬＡＫＤＩＣＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号５２)、ＣＰＰＰＰＳＳＦＫＴＫＬＡＫＤＩＣ(配列番号５３)、ＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号５４)およびＣＰＰＰＰＳＳＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤ(配列番号５５)がある。
【００３８】
一実施態様では、架橋剤の使用による担体タンパク質、例えばＤＴおよびＴＴへの特異的エオタキシンフラグメントのコンジュゲーションを容易にするために、トレオニン残基による置換により天然配列からシステイン残基を排除することが望ましい。それによって、架橋工程中における潜在的に有害な副反応を排除しながらも、ペプチドフラグメントの流体力学的品質は保持される。例としては、ＳＧＫＴＰＱＫＡＶＩＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号５６)、ＣＰＰＰＰＳＳＳＧＫＴＰＱＫＡＶＩ(配列番号５７)、ＦＫＴＫＬＡＫＤＩＴＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号５８)、ＣＰＰＰＰＳＳＦＫＴＫＬＡＫＤＩＴ(配列番号５９)、ＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号６０)およびＣＰＰＰＰＳＳＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤ(配列番号６１)がある。
【００３９】
抗エオタキシン免疫原は、免疫原性担体にコンジュゲートされた一ペプチドフラグメント、例えばＤＴにコンジュゲートされた配列ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ(配列番号１６)のペプチドフラグメントの一またはそれ以上のコピーを含み得る。他の実施態様では、２またはそれ以上の異なるペプチドフラグメントを同一免疫原性担体へコンジュゲートすることにより、対象においてエオタキシン上の２またはそれ以上のエピトープに指向した抗体により活発な免疫応答が誘導され得る。上記免疫原は、例えば、ＤＴにコンジュゲートされたペプチド配列ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ(配列番号１６)およびＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号２３)の各々の多数コピーを含み得る。
【００４０】
別の実施態様において、処方物は、エオタキシン上の２またはそれ以上のエピトープに指向した抗体により対象において活発な免疫応答を誘導するように、２またはそれ以上の異なるペプチド免疫原性担体コンジュゲートを用いて製造され得る。例えば、投与される組成物は、２種の異なる免疫原構築物、すなわち担体にコンジュゲートされた一特異的エピトープを含む第一構築物と、担体の他分子にコンジュゲートされた第二の異なるエピトープを含む第二構築物とを併用した混合処方物である。上記免疫原処方物は、例えばペプチド配列ＤＴコンジュゲート：ＤＴにコンジュゲートされたＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ(配列番号１６)およびＤＴにコンジュゲートされたＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ(配列番号２３)の各々の多数コピーを含み得る。
【００４１】
免疫原性タンパク質担体へのペプチドのコンジュゲーション方法は、当業界では公知である。例えば、トレオニン‐置換エオタキシンエピトープフラグメント：ＳＧＫＴＰＱＫＡＶＩＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号５６)、ＦＫＴＫＬＡＫＤＩＴＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号５８)、ＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号６０)は、ヘテロ二官能性架橋剤を介してＤＴまたはＴＴ担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。これらのエオタキシンフラグメントの一つまたはそれ以上は、ヘテロ二官能性架橋剤、例えばＮ−(イプシロン‐マレイミドカプロイルオキシ)−スクシンイミドエステル(ＥＭＣＳ)またはその水溶性類似体スルホ−ＥＭＣＳとの反応によりＤＴまたはＴＴに架橋している。この実施態様では、ＤＴまたはＴＴを、まず、トキソイドにおけるアミノ基にあるスクシニミジルエステルを介してヘテロ二官能性架橋剤と反応させる。この反応は、好ましくは室温で約１〜３時間にわたってｐＨ６.５±０.３で実施される。例えば５：１、１０：１、１５：１のマレイミジル基対担体タンパク質の比は、トキソイド(ＤＴまたは他の担体タンパク質)を適切な過剰の架橋剤と反応させることにより達成される。実際のモル過剰のクロスリンカーは、滴定により決定される。滴定中トキソイド１モル当たりに組込まれたマレイミドのモル数は、マレイミジル−トキソイドとスルフヒドリル化合物、例えばシステインまたはベータ‐メルカプトエタノールとの後続反応により決定され得る。マレイミジル‐トキソイドと反応したスルフヒドリル化合物の量は、残留スルフヒドリル化合物とビス‐ジチオ‐ニトロベンゾエートの反応により間接的に容易に決定される。ダイアフィルトレーションまたはゲル浸透クロマトグラフィーにより過剰の架橋剤を除去後、マレイミジル‐トキソイドを、その末端スルフヒドリル基を介して、活性化トキソイドのマレイミジル部分に対して１：１モル過剰のエオタキシン‐スペーサーペプチドと反応させる。トキソイドへのペプチドのこのコンジュゲーションは、好ましくは室温で約３〜６時間かけてｐＨ６.０±０.３で実施される。別法として、マレイミジル−トキソイドへのペプチドのこのコンジュゲーション反応は、室温で一晩反応させることにより実施され得る。容器中でマレイミド基を含む架橋剤とのコンジュゲーション反応を実施するのが好ましいものであり得る。ペプチドとの反応後、過剰のペプチドは、ダイアフィルトレーションまたはゲル浸透クロマトグラフィーによりリン酸緩衝食塩水(ｐＨ７.２±０.２)中へと除去される。
【００４２】
エオタキシン‐トキソイドコンジュゲートは、個々に処方するか、または最終処方物において２またはそれ以上のエピトープ特異的コンジュゲートを提供すべく混合するのに適切な単一物体として製造され得る。別法として、２個またはそれ以上のエオタキシン‐特異的ペプチドのカップリングでは、それらの末端スルフヒドリル基を介して単一マレイミジル‐トキソイド調製物にカップリングさせ得る。これは、活性化トキソイドの利用可能なマレイミジル部分に対して合わせて１：１モル過剰のエオタキシン特異的ペプチドの混合物とマレイミジル‐トキソイドを反応させることにより実施される。それによって、多重エオタキシン特異的エピトープをもつ単一トキソイドコンジュゲートが達成される。
【００４３】
ある種の実施態様では、エオタキシン上の多重エピトープに対する免疫応答を免疫化対象で誘導することにより、標的エオタキシンの潜在的に相乗的な結合および中和が誘発され得る。適切なエピトープ配列は、特異的エオタキシンエピトープへの抗体結合間における妨害についての見込みを低減化するように、標的分子において互いに充分離れた配列から選択される。エオタキシンエピトープの上記組合わせの一実施態様は、以下のエオタキシンおよびエオタキシン類似体配列を含む：ＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号６０)またはＣＰＰＰＰＳＳＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤ(配列番号６１)と組合わせたＳＧＫＴＰＱＫＡＶＩＳＳＰＰＰＰＣ(配列番号５６)またはＣＰＰＰＰＳＳＳＧＫＴＰＱＫＡＶＩ(配列番号５７)。
【００４４】
エオタキシン特異的トキソイドコンジュゲートの免疫原提示に適切な処方物には、限定されるわけではないが、アルミニウムまたはアルヒドロゲルへの吸着、微粒子またはナノ粒子を含む、リポソーム、ミクロソームまたは類似ミクロスフェア内での封入、多相エマルションおよびミクロエマルションを含む、水中油または油中水エマルションがある。可能性のある他の適切な処方物には、この場合、好ましいエオタキシン特異的トキソイドコンジュゲートである、含まれている抗原に対する免疫応答を刺激し得るアジュバント性を有するブロック‐コポリマーによる調製物が含まれる。
【００４５】
本発明の一実施態様は、油中水エマルションの水相へのエオタキシン特異的トキソイドコンジュゲートの処方物を含む。エオタキシン特異的トキソイドコンジュゲートの滅菌濾過(０.１〜０.２μｍ)水溶液を、水油混合物のホモジナイゼーション時に安定した油中水エマルションを提供するのに十分な乳化剤を含む適切な滅菌濾過(０.２μｍ)油性混合物と合わせる。ターミナル濾過、加熱殺菌または照射により滅菌され得ない、滅菌エマルションを含む医薬処方物の無菌処方および充填の実施に有用な層流フードまたは適切な滅菌アイソレーター内での感染予防手順として乳化工程は実施される。
【００４６】
水対油混合物は、５０：５０〜１０：９０の範囲で変動し得るが、好ましくは４０：６０〜２０：８０水対油の範囲である。好ましい油中水エマルション製造というこの目的に適した油／乳化剤混合物は、ＳＥＰＰＩＣ、ＳＡ(パリ、フランス国)から入手されるモンタニド製品シリーズから得られる。さらに、乳化工程中に最終エマルションの水相へ水溶性アジュバントをさらに組込むのが望ましいことであり得る(Adams,A. Synthetic Adjuvants、１９８５、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク)。適切なアジュバントの例としては、キル(Quill)Ａ、ＱＳ２１またはムラミルジペプチド(ノル−ＭＤＰ)がある。
【００４７】
抗エオタキシンＤＮＡワクチン
本発明の別の実施態様では、上記エオタキシンペプチドフラグメントをコード化する核酸配列を含み、さらにＴヘルパー細胞エピトープをコード化する核酸配列を含むＤＮＡ構築物は、ＤＮＡワクチンとして使用される。上記ＤＮＡワクチンの構築、処方および投与方法は、当業界では公知であり、本発明のエオタキシンペプチドエピトープに適合される、国際公開第００／６５０５８号、国際公開第９８／３１３９８号、Donnelly et al.、１９９７、Annu.Rev.Immunol.１５：６１７−６４８およびDonnelly et al.、１９９７、Life Sciences ６０：１６３−１７２参照。
【００４８】
参考文献の引用
この明細書全体を通じて様々な出版物および特許文書が参考文献として引用されている。これらの各参考文献については出典明示により援用する。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月14日(2005.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005529091000001.app
【国際調査報告】
2005529091.tif 000018