(57)【要約】精子を含む精液サンプルから運動精子を分離するためのデバイス（１２）は、内部に狭窄部（２０）を備えた管状の導管（１４）を含む。狭窄部は、そこを通過する流体の毛細管流を生成するような寸法にされる。サンプルは、精液を同伴して狭窄部を通過する流体培地とともに、より大きい断面積を有するデバイスの上流側端部（１６）に入れられる。運動精子は、狭窄部を通過して、流れに逆らって泳ぎ、導管の遠位端部の採取ゾーンで収集され、この採取ゾーンからそれらは吸引され得る。非運動精子は、デバイスから流出させられる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
精液を受け入れる上流ゾーンおよび精子が整列させられて採取される下流ゾーンを規定する管状の導管を含む精子分離デバイスであって、上流および下流ゾーンは導管内の狭窄手段によって分離されており、狭窄手段は、上流ゾーンから下流ゾーンに向かって流体培地の毛管流を形成するために配置されており、それによって、狭窄手段よりも上流側で導管に注入され、流体培地のフローに付される精液中の運動精子が、狭窄手段を通過して、採取のために下流ゾーンにおいて位置を維持することが可能となる、デバイス。
【請求項２】
導管が相対的に大きい断面の上流側端部と相対的に小さい断面の下流側端部とを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
狭窄手段が実質的に砂時計形状の通路を導管内に規定している、請求項１または請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
狭窄手段が導管の下流側端部に隣接して設けられている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項５】
導管がプラスチック材料から成る請求項１〜４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項６】
導管がガラスから成る請求項１〜４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項７】
導管がベースプレートに支持されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項８】
上流ゾーンおよび下流ゾーンがベースプレート中の凹部によって規定されている、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
上流ゾーンがくぼみによって規定され、下流ゾーンが細長いグルーブによって規定されている請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
導管が実質的に円筒形の断面を有している、請求項１〜９のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１１】
導管が実質的に半円形である断面を有している、請求項１〜９のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１２】
導管の上流ゾーンが導管の上流側端部から狭窄手段に向って実質的に漏斗形状である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１３】
精子を含む精液を、管状の導管に、当該導管の内部にあり、毛管流を内部に形成するように配置された狭窄手段よりも上流側にて注入すること、狭窄手段よりも上流側で導管を流体で満たし、それにより狭窄手段を通過する精液および流体のフローを生じさせること、および運動精子を狭窄手段の下流側から採取することを含む、精子を分離する方法。
【請求項１４】
運動精子の群が導管からピペットを用いて吸引される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の精子分離デバイスおよび運動精子を採取するためのピペットを含んで成るパーツのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、該して、不妊治療に関し、より特には卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に用いる精子を前処理する装置および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
精子を卵母細胞（または卵子もしくは卵）に直接的に注入することを伴うＩＣＳＩの導入は、受精能力のある精子を選択する自然のメカニズムを回避した。ＩＣＳＩを実施する場合、種々の前処理方法を用いて、精子の群が未加工の精液から選択される。この個体群は、正常な形態を有する運動精子の割合が多いものでなければならない。しかしながら、観察される数百もの精子からどれが注入に最も適しているかは明確ではない。
【０００３】
ＩＣＳＩ用の精子の前処理は、ＩＶＦに用いられているのと同じ常套の方法を用い、当該方法には、「パーコール」濃度勾配法および「スイムアップ」法が含まれる。これらの方法は、遠心分離または化学薬品の使用を伴うことがある。これまでに、遠心力は、精子にダメージを与え、その生殖能力を損なうことがある反応性酸素種の生成をもたらすことが示されてきた（Ｒ．Ｊ．ＡｉｔｋｅｎおよびＪ．Ｓ．Ｃｌａｒｋｓｏｎ「欠陥のある精子の機能の細胞基礎およびヒトの精子による反応性酸素種の生成との関連（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ」）、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．１９９１；６：第１７３〜１７６頁）。しかしながら、「パーコール」は研究室での研究のセッティングでは広く使用されており、その臨床上の利用はある不都合を伴っている。あるバッチは、高いレベルのエンドトキシンを含んでいることが判明した。エンドトキシンは、バッチを臨床上使用するのに不適当なものとする。１９９６年の後半に、「パーコール」は、精子分離培地として臨床的に使用することから撤退させられた（Ｇｕｎｅｅｔ  Ｍａｋｋａｒ、Ｈｕｎｇ−Ｙｕ  Ｎｇら、「２つのコロイダルシリカベースの精子分離培地と、非シリカベースの培地との比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｓｉｌｉｃａ−ｂａｓｅｄ  ｓｐｅｒｍ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｎ−ｓｉｌｉｃａ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）」Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．１９９９；７２：第７９６頁〜第８０２頁）。
【０００４】
精子が流体のフロー中に置かれると、運動精子（または運動能力を有する精子）は急速に整列して、フローに逆らって泳ぐことが報告されている（Ｆ．Ａｂｅｄ．「精子の運動能力に関する現象の新しい発見：精子はフローに逆らって泳ぐ（Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｆｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ  ｉｎ  ｓｐｅｒｍ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ：ｔｈｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ  ｓｗｉｍｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｆｌｏｗ）」−「体外受精および生殖補助（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」から、Ｖ．ＧｏｍｅｌおよびＰ．Ｃ．Ｋ．Ｌｅｕｎｇ編、Ｍｏｎｄｕｚｚｉ  Ｅｄｉｔｏｒｅ，１９９７：第１３〜１５頁）。非運動性の鈍い精子は他の細胞成分とともに下流側に流されて、運動精子から離れる。多くの哺乳動物の子宮内膜の細胞に繊毛が存在することが示されている。繊毛の流れは卵管および子宮の両方において同じ方向に動き、外子宮口に向って延びている。この流れは２つの機能を果たしていると予想され得る。第一に、このフローは精子のガイドとして作用し、正しい運動パラメータを有する精子を卵管のアンプルにて受精の位置に向かわせる。第二に、このフローは受精の位置に達することができる精子の質を最適化する自然の選択メカニズムとして作用する。
【０００５】
米国特許第４３２６０２６においては、層状フローを生成する複数の分画カラムが説明されている。養分が垂直ピペット中に注入され、層状フローが確立すると、精子がシリンジから注入される。精子はそれからカラム全体にわたって均一に分配され、サンプルを異なるレベルにて取り出すことができる。
【０００６】
米国特許第４７５９３４４号は、精液から運動精子を分離するための基本的なアレンジメントを説明している。しかしながら、流体のフローを確立する手段も、毛管流を生成する狭窄部も開示されていない。
【０００７】
米国特許第５２９６３７５号は、精子サンプルを臨床学的に分析するデバイスおよび方法を説明している。デバイスは、導入ポートおよびメソスケール・フロー・チャンネルと称されるフロー・チャンネルを有する。
【０００８】
米国特許第５６８６３０２号は、精子分離デバイスであって、精子が通過できる流体のブリッジは生成されるが、流体のフローは生成されないデバイスを示している。
【０００９】
（発明の概要）
本発明の目的は、精子が流体のフローに逆らって整列することを利用して、ＩＣＳＩに適した、運動能力を有する、形態学的に（または形状が）正常である精子を、精液から分離することである。加えて、本発明の方法および装置は、常套の方法に対して幾つかの利点を有する：
−本発明は、フローに逆らって精子が整列するという現象を利用する；
−処理は遠心分離も化学薬品も必要としないために、それは精子にダメージを与えない；
−それは迅速であって、且つシンプルである；
−精子の分離プロセスは、直接観察下にあり、容易に制御することができる。他の方法は、目に見えない（またははっきりしない、もしくは隠される）傾向にあり、プロセスを実施している間、ほとんど又は全く制御されず、精子の質は、プロセスの終わりまで評価できない。
【００１０】
本発明の一つの要旨によれば、精液を受け入れる上流ゾーンおよび精子が整列させられて採取される下流ゾーンを規定する管状の導管を含む精子分離デバイスであって、上流および下流ゾーンは導管内の狭窄（またはくびれ）手段によって分離されており、狭窄手段は、上流ゾーンから下流ゾーンに向かって流体培地の毛管流を形成するために配置されており、それによって、狭窄手段よりも上流側で導管に注入され、流体培地のフローに付される精液中の運動精子が、狭窄手段を通過して、採取のために下流ゾーンにおいて位置（または姿勢）を維持することが可能にされるデバイスが提供される。
【００１１】
導管は好ましくは相対的に大きい上流側端部および相対的に小さい下流側端部を有する。
【００１２】
好ましくは、狭窄手段は、導管内に実質的に砂時計形状である、精液および流体のための通路を規定する手段を含んで成る。狭窄手段は好ましくは導管の下流側端部に隣接して設けられる。
【００１３】
また、本発明によれば、精子を分離する方法であって、精子を含む精液を、管状の導管に、当該導管内にあり、毛管流を内部に形成するように配置された狭窄手段よりも上流側にて注入すること、狭窄手段よりも上流側で導管を流体で満たし、それにより狭窄手段を通過する精液および流体のフローを生じさせること、および運動精子を狭窄手段の下流側から採取することを含む方法が提供される。
【００１４】
好ましくは、運動精子の群は、ピペットを用いて導管から吸引される。
【００１５】
好ましくは管状（またはチューブ状）の導管は、精液または流体培地と反応しないガラスから成る。
【００１６】
本発明は、添付した図面を参照して、より詳細に説明される。幾つかの図面を通じて、同じ参照番号は同じ部品を指す。
【００１７】
（好ましい形態の詳細な説明）
最初に図１および図２に示す態様に言及すると、図１は、本発明の精子分離デバイス１２が配置されている、顕微鏡用スライド１０を示す。当該デバイスは、相対的に大きい導入（または入口）端部１６および相対的に小さい導出（もしくは出口）または遠位端部１８を有するガラス・チューブ１４を含む。チューブ１４内には、遠位端部１８に隣接して、狭窄部２０が設けられている。チューブ１４は、導入部１６から狭窄部２０にかけて漏斗形状であり、狭窄部２０から導出端部１８にかけて円筒形状である。チューブの導入端部１６は実質的に半円形状であり、スライド１０に支えられているフラットなエッジを有する。
【００１８】
狭窄部２０は、導管を取り囲む凸面の隆起部２２を導管内に含んで成る。これは、テーパーを有する（または先細りした）上流ゾーン２４、テーパーを有する（または先細りした）下流ゾーン２６、および実質的に円筒形である短い中央ゾーン２８を規定する。
【００１９】
図２は、導管の遠位端部に挿入されたマイクロピペット３０の端部であって、その入口が下流ゾーン２６に隣接して配置されている様子を示している。
【００２０】
好ましくは、チューブ１４およびマイクロピペット３０はガラスから成り、顕微鏡用スライド１０はガラスまたはプラスチック材料から成っていてよい。
【００２１】
精子分離処理を実施するために、管状の導管１２が最初にスライド１０の上に配置される。約３μＬの精液がニードルを使って、狭窄部２０のテーパーを有する上流ゾーン２４内に配置される。チューブ１４の上流側端部はそれから、導入端部１６を経由させて、温かい流体培地（または流動性を有する培養基もしくは媒体）で満たされる。流体培地は、毛管流として、狭窄部２０を通過して、遠位端部１８に向って流れる。精液は、流体のフローによって狭窄部を経由して運ばれる。例えば２分後、狭窄部のテーパーを有する下流ゾーン２６を倒立顕微鏡下で観察すると、テーパーを有する下流ゾーン２６にて精子の集積が観察される。これらは狭窄部を通過し、培地のフローに逆らって泳ぎ、狭窄物の下流ゾーン内で位置を維持している、運動精子である。これらの運動精子の数は、時間が経つにつれて次第に増加することが観察されるであろう。精漿、非運動性の鈍い精子、他の細胞成分、およびバクテリアは、通りすぎて、ゾーン２６からチューブの遠位端部１８を経由して出ていく。活発な運動精子はフローに逆らって泳ぎ、下流ゾーン２６にて群を形成する。
【００２２】
図３を参照すると、好ましくはプラスチック材料から成る、薄いプレート３２が示されており、その上側表面３４には、概して３６にて示されている凹部が形成されている。この凹部は、一方の端部が細長いグルーブ４０に通じているくぼみ３８を含む。くぼみ３８とグルーブ４０との間には、毛細管４２のピースが挿入されている。毛細管４２のピースは、そこを通過する流体のフローに狭窄部４４を提供するように、その内部が砂時計のように形作られている。毛細管４２のピースは、短い中間セグメントで結合された、上流側の円錐形セグメントおよび下流側の円錐形セグメントで構成することができる。これは、当該ピースがテーパーを有する上流ゾーン、テーパーを有する下流ゾーン、および実質的に円筒形である短い中央ゾーンを有することを意味する。
【００２３】
図４は、毛細管チューブ４２の遠位端部に挿入されたマイクロピペット４６の端部であって、その口が下流側ゾーンに配置されている様子を示している。
【００２４】
プレート３２および毛細管チューブ４２はガラスまたはプラスチック材料から形成することができるが、プレートはプラスチック材料で形成し、毛細管チューブはガラスで形成することが好ましい。
【００２５】
一つの実用的な例において、約３μＬの精液が、ニードルを使って、毛細管チューブ４２の上流側の円錐形セグメント内に配置された。くぼみ３８はそれから５０μＬの温かいＨａｍ’ｓ  Ｆ−１０培地で満たした。培地は、毛細管チューブ４２に入って、砂時計状の狭窄部４４内を流れた。２分後、テーパーを有する下流側セグメントを、高倍率の視野を用いて倒立顕微鏡で観察した。十分な数の精子が下流側の円錐セグメント、即ち、採取ゾーン内に集積していることが観察された。それらは、培地のフローに逆らって泳いで、その数は時間の経過とともに次第に増加した。マイクロピペット４６を使用して、この精子の群を吸引して評価した。
【００２６】
両方の態様において、狭窄部の最も狭い部分を流れる流体の速度は、狭窄部の最も狭い部分の寸法を変化させることによって変えることができる。この狭窄部の直径を増加させると、速度は減少し、逆の場合には増加する。狭窄部の寸法および流体培地の速度は、運動精子が砂時計の狭窄部のくびれから出ていく培地とちょうど同じペースとなる（または歩調を合わせる）ことを許容する、狭窄部を通過する培地のフローの速度が存在するように、アレンジされる。マイクロピペットを用いて、精子の群を吸引することができる。このようにして、ＩＣＳＩに適した、適当な数の運動能力を有する、形態学的に正常である精子を回収することが容易となる。
【００２７】
本発明によれば、最も資質のある精子だけが選択され、デバイスは流体のフローよりも速く動くことのできる精子がチューブの遠位端の採取ゾーンに達することを許容するのみである。精漿および非運動性の精子はチューブから流出させられる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、顕微鏡用スライドに配置した本発明の精子分離デバイスの一態様を示す模式図である。
【図２】図２は、図１に示すデバイスの遠位端部を拡大し、ピペットを使用して運動精子を吸引することを示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の精子分離デバイスの第２の態様を示す模式図である。
【図４】図４は、図３に示すデバイスの遠位端部を拡大し、ピペットを使用して運動精子を吸引することを示す模式図である。
【図２】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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