(57)【要約】  本発明は、デンプンを含む飼料の使用に対する酵素を含む成分に関する：ここでこの酵素は、アミラーゼ活性を有し、耐性デンプンを分解し得る。広範な局面において、本発明は、デンプンを含む飼料の使用のための酵素を含む成分の使用に関する。本発明はまた、その成分と混合される飼料に関する。１つの局面において、本発明は、デンプンを含む飼料の使用のための、アミラーゼ活性を有し耐性デンプンを分解し得る酵素を含む成分の使用に関する。本発明はまた、その成分と混合される飼料にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプンを含む飼料の使用のための成分であり、ここで該成分は、酵素を含み；該酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得る、成分。
【請求項２】
前記酵素が熱安定性である、請求項１に記載の成分。
【請求項３】
前記酵素がｐＨ安定性である、請求項１または２に記載の成分。
【請求項４】
前記酵素が未加工のデンプン分解酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の成分。
【請求項５】
前記酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  Ｆ２のアミラーゼ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓアミラーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｓ−２アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｋ−２７アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼおよびＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼからなる群より選択されるアミラーゼ酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の成分。
【請求項６】
前記飼料がブタおよび家禽のための飼料である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の成分。
【請求項７】
前記飼料がマメ科植物または穀物のような未加工の材料である、請求項６に記載の成分。
【請求項８】
デンプンおよび酵素を含む飼料であって；該酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得る、飼料。
【請求項９】
前記酵素が熱安定性である、請求項８に記載の飼料。
【請求項１０】
前記酵素がｐＨ安定性である、請求項８または９に記載の飼料。
【請求項１１】
前記酵素が未加工デンプン分解酵素である、請求項８〜１０に記載の飼料。
【請求項１２】
ブタまたは家禽のための飼料である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の飼料。
【請求項１３】
マメ科植物または穀物のような未加工の材料である、請求項１２に記載の飼料。
【請求項１４】
飼料中の耐性デンプンを分解する方法であって、該方法は、該耐性デンプンと酵素とを接触する工程であって、該酵素がアミラーゼ活性を有しかつ該耐性デンプンを分解することができる工程を包含する、方法。
【請求項１５】
前記酵素が熱安定性熱安定性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素がｐＨ安定性である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素が未加工デンプン分解酵素である、請求項１４〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記飼料がブタおよび家禽のための飼料である、請求項１４〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記飼料がマメ科植物または穀物のような未加工の材料である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
デンプンを分解するための、デンプンを含む飼料の調製における酵素の使用であって、該酵素は、アミラーゼ活性を有しかつ該耐性デンプンを分解し得る、酵素の使用。
【請求項２１】
前記飼料のカロリー価を改善するための、飼料の調製における酵素の使用であって、該酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得る、酵素の使用。
【請求項２２】
動物効率を改善するための、飼料の調製における酵素の使用であって、該酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得る、酵素の使用。
【請求項２３】
前記酵素が熱安定性である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記酵素がｐＨ安定性である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
飼料を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、デンプンと酵素とを混合する工程を包含し、ここで、該酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得る、プロセス。
【請求項２６】
飼料における使用のための成分を同定するためのプロセスであって、該成分は、酵素を含み、該プロセスは、耐性デンプンと候補成分とを接触させる工程、および該耐性デンプンの分解の程度を決定する工程を包含し；該酵素がアミラーゼ活性を有し、かつ該耐性デンプンを分解し得る、プロセス。
【請求項２７】
前記酵素が熱安定性である、請求項２５または２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記酵素がｐＨ安定性である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２９】
実質的に本明細書中に記載され、かつ添付の実施例に参照される、成分。
【請求項３０】
実質的に本明細書中に記載され、かつ添付の実施例に参照される、飼料。
【請求項３１】
実質的に本明細書中に記載され、かつ添付の実施例に参照される、使用。
【請求項３２】
実質的に本明細書中に記載され、かつ添付の実施例に参照される飼料を調製するためのプロセス。
【請求項３３】
実質的に本明細書中に記載され、かつ添付の実施例に参照される飼料の使用に対する成分を同定するためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、飼料に関する。
【０００２】
特に、本発明は、動物の食用に適したデンプンを含む飼料に関する。いくつかの実施形態にとって、その動物は、家禽またはブタである。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
飼料中のデンプンの消化性は、非常に変動しやすく、多くの要因に依存しており、この要因は、デンプンおよび飼料基質の両方の物理的構造を含む。植物細胞全体の中または飼料基質および完全にゼラチン化されていないいくつかのデンプン粒内にトラップされたデンプンは、α−アミラーゼにより非常にゆっくりと加水分解されるだけであり、従って、小腸内での完全な消化を逃れ得る。小腸内のアミラーゼによる消化に対して高い耐性であるデンプンおよびデンプン分解産物は、大腸における微生物の発酵に対する基質になる。大腸で発酵されたデンプンからの発熱収量は、デンプンが、小腸で消化および吸収される場合に提供される収量より少なく、その結果、動物において重大なエネルギー損失を生じる。
【０００４】
微生物分解の前に、小腸で分解されたデンプンは、腸管上皮により直接吸収され、それによって動物に飼料のエネルギーが効率的に放出される。微生物の群集により分解されたデンプンのうち、エネルギーの画分だけが、動物により吸収される。このことは、容易に分解可能なデンプンおよび耐性デンプン分解酵素により分解された耐性デンプンが、微生物叢により分解される耐性デンプンよりも効率的に利用されることを示す。
【０００５】
Ｄｅ  Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒら（６）は、耐性デンプンの量が食餌全体の約６％の量しか存在しない場合でさえも、耐性デンプンを与えたラットおよびブタが、容易に分解可能なデンプンを与えたそれらと比較して、有意に低い明らかな回腸（ｉｌｅａｌ）エネルギー消化性を有することを報告する。
【０００６】
食物繊維および耐性デンプンは、単胃動物の結腸内の微生物叢に対する基質である。ヒトの健康に対するこれらの基質の重要性に起因して、ヒトの小腸で吸収されない耐性デンプンの量を推定するために大規模な研究が実行されてきた。耐性デンプンの最も認められた効果は、結腸癌を予防する揮発性脂肪酸ＶＦＡの形成であるが、しかし、耐性デンプンはまた、他の有益な効果を有し得る（１６）。報告されたほとんどの試行は、ヒトにおいてなされてきた（例えば、（１１）に概説されている）が、ブタおよびラットによる試行もまたなされてきた。
【０００７】
異なる型のデンプンのインビボ（ヒト）消化およびインビトロ消化を比較する研究によって、そのインビトロモデル分解が信頼性の結果を与えることを実証する。例えば、Ｓｉｌｖｅｓｔｅｒら（２４）は、回腸における小腸で吸収されない耐性デンプンの量を定量し、そしてその量とインビトロ消化とをＥｎｇｌｙｓｔら（８）により記載される方法に基づいて比較した。Ｓｉｌｖｅｓｔｅｒらは、総耐性デンプンの９７％が小腸で吸収されないことを見出した。
【０００８】
同様に、Ｅｎｇｌｙｓｔらによる調査は、９１％を超える耐性デンプンが、小腸での消化を逃れることを示した。
【０００９】
耐性デンプンは、いくつかの異なる型のデンプン（その１つは未加工のデンプンである）からなると定義され得る。このことは、例えば、耐性デンプンの例として未加工のデンプンを同定したＭｕｉｒら（２０）により実験的に示される。
【００１０】
Ｄｅ  Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒら（６）は、耐性デンプンを受け取るラットにおいて有意により低かった、糞便消化可能でかつ代謝可能なエネルギー値を報告する。さらに、逆行した高アミローストウモロコシデンプンを与えられた場合、ブタによる耐性デンプン吸収は、明らかな回腸エネルギー消化性を有意に低くした。
【００１１】
Ｒａｎｈｏｔｒａら（２２）は、耐性デンプンを与えられたラットが、容易に分解可能なデンプンを与えられた群より有意に少ない体重を得ることを見出した。
【００１２】
Ｉｔｏら（１５）は、通常のデンプン、処理されていない高度に耐性なトウモロコシデンプンおよび処理された高度に耐性なトウモロコシデンプンを含む３つの異なる食餌を与えられたラットの消化器系の異なる部分におけるデンプンの量を定量した。Ｉｔｏらは、耐性デンプン、特に処理された耐性デンプンを含む食餌を与えられたラットが、盲腸におけるデンプンのより高い含有量を有することを見出した。さらに、ヒトおよびラットにおいて、耐性デンプンの消化を比較することにより、Ｒｏｅら（２３）は、ラットが耐性デンプンおよび非デンプン多糖類を利用する際にヒトよりも効率的であることを見出した。
【００１３】
対照的に、Ｍｏｒａｎ（１９）は、デンプン消化が、家禽において問題はなく、すべてのデンプンが家禽（例えば、ニワトリ）の消化器系において分解および吸収され得ることが示されることを報告する。
【００１４】
本発明は、デンプンを含み得る動物消化に対する飼料を調製するのに有用な方法を提供するために努力する。
【００１５】
（本発明）
広範な局面において、本発明は、デンプンを含む飼料の使用のための酵素を含む成分の使用に関する。本発明はまた、その成分と混合される飼料に関する。
【００１６】
１つの局面において、本発明は、デンプンを含む飼料の使用のための、アミラーゼ活性を有し耐性デンプンを分解し得る酵素を含む成分の使用に関する。本発明はまた、その成分と混合される飼料にも関する。
【００１７】
（発明の記述）
本発明の局面は、添付の特許請求の範囲および以下の記載に存在する。
【００１８】
例示目的で、第１の局面において、本発明は、デンプンを含む飼料の使用に対する成分に関し、その成分は、酵素を含む；ここでその酵素は、アミラーゼ活性を有し、耐性デンプンを分解し得る。
【００１９】
第２の局面において、本発明は、デンプンおよび酵素を含む飼料に関し、ここでこの酵素は、アミラーゼ活性を有し、耐性デンプンを分解し得る。
【００２０】
第３の局面において、本発明は、耐性デンプンを分解するために、デンプンを含む飼料の調製における酵素の使用に関し、ここで、その酵素は、酵素は、アミラーゼ活性を有し、耐性デンプンを分解し得る。
【００２１】
第４の局面において、本発明は、耐性デンプンを分解するための、デンプンを含む飼料の調製における酵素の使用に関し、ここでその酵素は、アミラーゼ活性を有しかつその耐性デンプンを分解し得る。
【００２２】
第５の局面において、本発明は、飼料の発熱量を改善するための、飼料の調製における酵素の使用に関し、ここで、その酵素はアミラーゼ活性を有しかつその耐性デンプンを分解し得る。
【００２３】
第６の局面において、本発明は、動物効率を改善するための飼料の調製における酵素の使用に関し、ここで、その酵素はアミラーゼ活性を有しかつその耐性デンプンを分解し得る。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、飼料を調製するプロセスに関し、このプロセスは、デンプンと酵素を混合する工程を包含し、ここでその酵素は、アミラーゼ活性を有しかつその耐性デンプンを分解し得る。
【００２５】
なおさらなる局面において、本発明は、飼料の使用についての成分を同定する方法に関し、その成分は酵素を含み、そのプロセスは、耐性デンプンと候補成分とを接触させる工程およびその耐性デンプンの分解の程度を決定する工程を包含し；ここでその酵素は、アミラーゼ活性を有しかつその耐性デンプンを分解し得る。
【００２６】
（いくつかの好ましい局面）
好ましい局面において、本発明における使用についての酵素は、アミラーゼ酵素である。
【００２７】
好ましい局面において、本発明における使用についての酵素は、熱安定性である。
【００２８】
好ましい局面において、本発明における使用についての酵素は、ｐＨ安定性である。
【００２９】
好ましい局面において、本発明における使用についての酵素は、未加工のデンプンを分解する酵素である。
【００３０】
好ましい局面において、本発明における使用についての酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  Ｆ２アミラーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓアミラーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｓ−２アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｋ−２７アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼおよびＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼからなる群より選択されるアミラーゼ酵素である。
【００３１】
本発明の好ましい局面において、飼料は、ブタ用または家禽用である。
【００３２】
本発明のより好ましい局面において、飼料は、未加工の材料（例えば、マメ科植物または穀物）を含む。
【００３３】
（いくつかの利点）
本発明のいくつかの利点は、以下の注釈に存在する。
【００３４】
例示の目的で、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得る酵素を含む成分の使用は、デンプンの分解および／または動物内のデンプン分解産物の顕著な増加が存在するので、有益である。
【００３５】
さらに、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得る酵素を含む成分の使用は、動物によるデンプンの消化性および／またはデンプン分解産物の顕著な増加が存在するので、有益である。
【００３６】
さらなる例示の目的で、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得る酵素を含む成分の使用は、動物による飼料からの効率的なエネルギー吸収を増強する方法を提供するので、有益である。
【００３７】
さらに、アミラーゼ活性を有し耐性デンプンを分解し得る酵素を含む成分を使用することは、有利である。なぜなら、これは、耐性デンプンのバイオアベイラビリティーを増強するための手段を提供するからである。
【００３８】
（飼料）
本発明において使用するための動物用飼料は、特定の動物群の特定の必要性に合い、そして動物によって代謝され得る形態で、必要な炭水化物、脂質、タンパク質および他の栄養素を提供するように処方され得る。
【００３９】
好ましくは、動物用飼料は、ブタまたはアヒルに対する飼料である。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」は、非反芻性雑食性動物（例えば、ブタ（ｐｉｇ）、雄ブタ（ｈｏｇ）、イノシシ）に関係する。代表的には、ブタ飼料は、約５０％の炭水化物、約２０％のタンパク質および約５％の脂質を含有する。高いエネルギーのブタ飼料の例は、しばしば、飼料補充物（例えば、タンパク質、鉱質、ビタミン、およびアミノ酸（例えば、リジンおよびトリプトファン））と合わされたコーンに基づく。ブタ飼料の例としては、動物性タンパク質製品、海産物、乳製品、穀物製品および植物タンパク質製品が挙げられ、これらの全ては、天然香料、人工香料、微量無機質および多量無機質、動物性脂肪、植物性脂肪、ビタミン、保存料または薬物（例えば、抗生物質）をさらに含有し得る。
【００４１】
「ブタ飼料」に対する参考が、添付の特許請求の範囲を含む本明細書中でなされる場合、このような参考は、「トランジション（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）」飼料または「スターター（ｓｔａｒｔｅｒ）」飼料（幼若ブタに対して使用される）および「フィニッシング（ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ）」飼料または「飼育（ｇｒｏｗｅｒ）」飼料を含むことが意味される（市場に適した年齢および／またはサイズへのブタの成長についての移行期の後に使用される）。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）」は、家禽（ｆｏｗｌ）（例えば、ニワトリ、ブロイラー、雌鶏、雄鶏、食用雄鶏、シチメンチョウ、カモ類、狩猟用家禽、若雌鳥またはヒヨコ）に関する。家禽飼料は、「完全」飼料といわれ得る。なぜなら、これらは、タンパク質、エネルギー、ビタミン、鉱質、および他の適切な成長、産卵、および鳥の健康に必要な栄養素を含む。しかし、家禽飼料は、ビタミン、鉱質または薬物（例えば、コシディオスタット（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｔａｔ）（例えば、モネシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）ナトリウム、Ｌａｓａｌｏｃｉｄ、Ａｍｐｒｏｌｉｕｍ、Ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ、およびＳｕｌｆａｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ）および／または抗生物質（例えば、ペニシリン、バシトラシン、クロロテトラサイクリン、およびオキシテトラサイクリン））をさらに含有し得る。
【００４３】
肉製品について維持される若ニワトリまたはブロイラー、シチメンチョウおよびカモは、卵製品のために保存される若雌鳥と異なるように餌を与えられる。ブロイラー、カモ、およびシチメンチョウは、卵産生型のニワトリより、大きな体を有し、迅速に体重を増やす。従って、これらの鳥は、より高いタンパク質レベルおよびエネルギーレベルを含有する飼料を与えられる。
【００４４】
「家禽飼料」に対する参考が、添付の特許請求の範囲を含む本明細書中でなされる場合、このような参考は、「スターター」飼料（孵化後）、「フィニッシャー（ｆｉｎｉｓｈｅｒ）」飼料、「飼育」飼料または「グロアー」飼料（６〜８週齢から屠殺のサイズに到達するまで）および「産卵」飼料（産卵の間与えられる）を含むことを意味することが理解される。
【００４５】
本発明において使用するための動物用飼料は、例えば、肉製品、乳製品、卵製品、再生およびストレスに対する応答に関して、動物の栄養の必要性に会うように処方される。さらに、本発明において使用するための動物用飼料は、肥料の品質を改善するように処方される。
【００４６】
好ましい局面において、動物用飼料が、未加工の材料（例えば、マメ（例えば、エンドウもしくはダイズ）または穀物（例えば、コムギ、コーン（トウモロコシ）、ライムギまたはオオムギ））を含む。適切には、未加工の材料は、ジャガイモであり得る。
【００４７】
（デンプン）
デンプンは、植物の優先的な食物保存物質であり、全世界のヒトによって消費されるカロリーの７０〜８０％を提供する。デンプン、デンプンに由来する製品、およびスクロースは、動物食餌において消化可能な炭水化物のほとんどを構成する。食品産物の調製において使用されるデンプンの量は、合わされた全ての他の食品成分の量を大いに超過する。
【００４８】
デンプンは、デンプン粒と呼ばれる別々の粒子として天然に存在し、これは、比較的密集しており不溶性である。ほとんどのデンプン粒は、以下の２つのポリマーの混合物から構成される：アミロースと呼ばれる本質的に直鎖状のポリサッカリドおよびアミロペクチンと呼ばれる高度に分枝されたポリサッカリド。
【００４９】
アミロペクチンは、非常に大きな分枝した分子であり、これは、（１→４）結合によって結合されたα−Ｄ−グルコピラノシル単位の鎖から構成され、ここで、この鎖は、α−Ｄ−（１→６）結合によって結合され、分枝を形成する。
【００５０】
アミロペクチンは、全ての天然のデンプン中に存在し、これは、約７５％のほとんど共通するデンプンを構成する。完全にアミロペクチンからなるデンプンは、ｗａｘｙデンプン（例えば、ｗａｘｙコーン（ｗａｘｙトウモロコシ））として公知である。
【００５１】
アミロースは、本質的に、わずかなα−Ｄ−（１→６）分枝を有する（１→４）結合α−Ｄ−グルコピラノシル単位の直鎖である。ほとんどのデンプンは、約２５％のアミロースを含む。
【００５２】
損傷していないデンプン粒は、冷水中で可溶性ではないが、可逆的に水を吸収し得る。しかし、水の存在下で、加熱の際に、デンプン粒内の分子の順番は、破壊される。このプロセスは、ゼラチン化として公知である。過剰の水中でのデンプン粒の連続的な加熱によって、可溶性成分のさらなる膨潤およびさらなる浸出が生じる。剪断の適用の際に、顆粒が破壊され、ペーストが形成される。冷却の際に、いくつかのデンプン分子は、再結合し、沈殿またはゲルを形成し始める。このプロセスは、退化または後退（ｓｅｔｂａｃｋ）として公知である。
【００５３】
他のポリサッカリド分子のようにデンプン分子は、加水分解によって脱重合され、モノサッカリドおよびオリゴサッカリド（例えば、グルコースおよびマルトース）を形成する。アミラーゼおよびアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）のような酵素は、デンプンをＤ−グルコースへと加水分解する。イソアミラーゼまたはプラナーゼのような脱分枝酵素は、アミロペクチン中の（１→６）結合を加水分解する。シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼは、アミロースおよびアミロペクチンから（１→４）結合α−Ｄ−グルコピラノシル単位の環を形成する。
【００５４】
ネイティブなデンプンの機能的特性（例えば、ゼラチン化、退化およびペースト形成）は、改変によって改善され得る。改変は、プロセシング条件に関係する熱および酸に耐えるための、デンプンペーストの能力を増大し、特定の官能基を導入する。改変されたデンプンは、機能的であり、大量の食物マクロ成分および添加物である。
【００５５】
代表的には、改変は、例えば、架橋またはポリマー鎖、非架橋性誘導体化および前ゼラチン化を、単独でまたは組み合わせて作成され得る。得られ得る特定の改善としては、溶解度の増加、ゲル形成の阻害、他の材料との相互作用の改善および安定化特性の改善が挙げられる。
【００５６】
「デンプン」に対する参考が、添付の特許請求の範囲を含む本明細書中でなされる場合、このような参考は、ネイティブのデンプンおよび部分的にまたは全体的に改変された（例えば、安定化された、架橋された、前ゼラチン化されたまたは誘導体化された）デンプンを含むことを意味することが理解される。
【００５７】
（耐性デンプン）
耐性デンプンは、「デンプンと健康な個体の小腸において吸収されないデンプン分解生成物との和」として定義される（３）。
【００５８】
耐性デンプンは、少なくとも４つの主な型との異種混合物である：
耐性デンプン１−粗く挽かれたかまたは噛まれた穀物（ｃｅｒｅａｌ）、マメおよび穀物（ｇｒａｉｎ）において見出された、物理的に捕捉されたデンプン；
耐性デンプン２−ゼラチン化されるまでα−アミラーゼによる消化に高度に耐性である耐性デンプン粒またはゼラチン化されないデンプン粒（例えば、未加工デンプン（例えば、調理されないジャガイモ、緑バナナおよび高アミロースデンプン）；
耐性デンプン３−ゼラチン化後にデンプンが冷却される場合、産生される退行デンプンポリマー（主に、アミロース）。退行アミロースは、酵素的攻撃に対して高度に耐性であり、一方、退行アミロペクチンは、より耐性がひくく、再加熱によってゼラチン化され得る；および
耐性デンプン４−化学的に改変されたデンプン。
【００５９】
食物中の４つの型全ての耐性デンプンの量は、食物加工技術および植物交配の実施によって操作され得る（例えば、穀類および穀物の高アミロース改変体および低アミロース改変体）。
【００６０】
大腸（結腸）に到達するデンプンの量は、動物の飼料（すなわち、デンプンの量および所空物性供給源）の性質およびデンプンを含む飼料の調製におけるプロセシングの影響によって大きく影響される。調理されない飼料材料中の耐性デンプンの量の例として、Ｇｏｎ〜ｉら（１０）によって以下のように分類された：
【００６１】
【数１Ａ】
2005511071.tif 000002
【００６２】
。
【００６３】
本発明における使用のための飼料は、デンプンを含み得、このデンプンは、上記されるような４つの型の耐性デンプン１〜４のいずれか１つ以上であり得る。さらに、本発明における使用のための飼料は、カプセル化されたデンプンまたは未加工デンプンのような容易に分解され得るデンプンおよび／または耐性デンプンを含み得る。
【００６４】
現在までのところ、アミラーゼ活性を有する酵素およびデンプンを含む飼料における使用のための耐性デンプンを分解し得る酵素を含む成分の使用を誰も示唆しなかった。例によって、参考は、以下の教示に対してなされ得る。
【００６５】
Ｍｕｉｒら（Ａｍ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９９５、第６１巻、第８２頁−第８９頁）は、小腸における消化を逃れるデンプンの量に影響する、食物プロセシングおよび種々のトウモロコシ種の効果を教示する。特に、彼らは、例えば、穀物の正常種ではない高アミロースを使用することによって、または穀物をより粗く挽くことによって、デンプン含有食物が、消化を逃れるデンプンの量を増加するように操作され得る。
【００６６】
（アミラーゼ）
本発明における使用に適切な酵素は、デンプン（例えば、耐性デンプンおよび／またはデンプン分解産物）を加水分解し得るか、または分解し得る。
【００６７】
１つの局面において、本発明における使用のための酵素は、アミラーゼであり、すなわち、デンプンをモノサッカリドおよび／またはオリゴサッカリドならびに／あるいはこれらの誘導体（例えば、デキストリン）を加水分解し得る酵素である。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、用語「アミラーゼ」は、糖（例えば、モノサッカリドまたはオリゴサッカリド（例えば、ジサッカリド（例えば、マルトース）））を還元するために、デンプンの切断を担う経路に関与する、α−アミラーゼのような細胞内酵素に関する。特に、α−アミラーゼは、アミロース（α（１→４結合）によって結合されるグルコースのホモポリマー）またはアミロペクチン由来のα−マルトースを主に産生する、１，４−α−グルコシド結合の細胞内分解を触媒する。
【００６９】
α−アミラーゼは、かなりの市販価値があり、デンプンプロセシングの最初の段階（液化）；アルコール製造において；界面活性剤マトリクス中の清浄剤として；およびデンプン糊ぬきのための繊維工業において使用される。
【００７０】
α−アミラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓを含む広範な種々の微生物によって産生される。ほとんどの市販のアミラーゼは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから産生される。最近の数年において、市販使用される好ましい酵素は、これらの熱安定性および性能に起因して、少なくとも中性ｐＨおよびわずかにアルカリ性のｐＨでは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来の酵素である。
【００７１】
好ましくは、アミラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  Ｆ２アミラーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓアミラーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｓ−２アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｋ−２７アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼおよび／またはＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼから選択される。
【００７２】
組換えＤＮＡ技術は、どの残基がアミラーゼの触媒活性について重要であるかを調査するために、そして／または種々のアミラーゼの活性部位内の特定のアミノ酸を改変する効果を調査するために（Ｖｉｈｉｎｅｎ，Ｍ．ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｃｈｅｍ．１０７：２６７−２７２；Ｈｏｌｍ，Ｌ．ら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３：１８１−１９１；Ｔａｋａｓｅ，Ｋ．ら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１２０：２８１−２８８；Ｍａｔｓｕｉ，Ｉ．ら（１９９２）Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  第３１０巻，第３号，第２１６−第２１８頁）；どの残基が熱安定性に重要であるかを調査するために（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８９３３−１８９３８）使用され、そして１つの群が、このような方法を使用し、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎｉｓアミラーゼ（熱安定であることが公知）中の種々のヒスチジン残基に変異を導入する。他の類似するＢａｃｉｌｌｕｓアミラーゼと比較された場合、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎｉｓアミラーゼは、過剰のヒスチジンを有し、従って、ヒスチジンを置換することが酵素の熱安定性に影響し得ることが示唆された（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ，Ｎ．ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５４８１−１５４８８；ＦＲ  ２  ６６５  １７８−Ａ１；Ｊｏｙｅｔ，Ｐ．ら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１５７９−１５８３）。
【００７３】
市販されるように、α−アミラーゼ酵素は、市販適用に依存して、高ｐＨ条件および低ｐＨ条件のような劇的に異なる条件下で、使用され得る。例えば、α−アミラーゼは、デンプンの液化において使用され得、プロセスは、好ましくは、低ｐＨ（ｐＨ＜５．５）で実施される。他方、アミラーゼは、市販の皿洗い用界面活性剤または洗濯用界面活性剤において使用され得、これは、しばしば、漂白剤または過酸のような酸化剤を含み、さらによりアルカリ条件で使用される。
【００７４】
種々の条件下で、アミラーゼ酵素の安定性プロフィールまたは活性プロフィールを変更するために、酸化可能なアミノ酸（例えば、メチオニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはシステイン）の選択的交換、置換、または欠失が、その前駆体に比べて改変体酵素の変更されたプロフィールを生じることが見出されている。現在市販されるアミラーゼが種々の条件下で受容可能（安定）ではないので、変更された安定性プロフィールおよび／または活性プロフィールを有するアミラーゼに対する必要性が存在する。この変更された安定性（酸化プロフィール、熱プロフィールまたはｐＨ性能プロフィール）は、野生型酵素または前駆体酵素と比較した場合、十分な酵素活性を維持する一方で達成され得る。このような変異を導入することによって影響される特徴は、熱安定性を維持する一方で酸化安定性を変更するか、またはその逆であり得る。さらに、α−アミラーゼ前駆体配列における酸化可能なアミノ酸の代わりの種々のアミノ酸での置換または１つ以上の酸化可能なアミノ酸の欠失は、前駆体α−アミラーゼに対して最適であると考えられる以外のｐＨで、変更された酵素活性を生じ得る。言い換えると、本発明の変異型酵素はまた、ｐＨ性能プロフィールを変更し得、これは、酵素の増大した酸化活性に起因し得る。
【００７５】
本明細書中で用いられる場合、用語「アミラーゼ」はまた、α−アミラーゼをコードする変異ＤＮＡ配列の発現産物であるα−アミラーゼ変異体を含め、全ての形態のα−アミラーゼ酵素に関し、ここで、この変異体α−アミラーゼは、一般に、天然に存在するα−アミラーゼまたは組換えα−アミラーゼをコードする前駆体ＤＮＡ配列をインビトロで改変して前駆体アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸残基の置換または欠失をコードするようにすることによって入手される。
【００７６】
アミラーゼ産生生物としては、動物、植物、藻類、真菌、古細菌および細菌が挙げられる。α−アミラーゼをコードする遺伝子は、単離および特徴付けされている。例としては、ＥＰ−Ｂ−０４７０１４５は、ジャガイモ植物体におけるα−アミラーゼのヌクレオチド配列を開示する。α−アミラーゼは、少なくとも５個の個々の遺伝子からなる遺伝子ファミリーによってコードされ、これらの遺伝子は、それらの相同性に基づいて、以下の２つのサブファミリーに分類され得る：３型アミラーゼおよび１型アミラーゼ。例えば、ジャガイモ植物体中では、２つの群のα−アミラーゼが異なって発現される；３型α−アミラーゼは、根、塊茎、芽および茎の組織において発現される；一方、１型α−アミラーゼは、芽および茎の組織において発現される。
【００７７】
今日まで、デンプン含有飼料において使用するための、アミラーゼ活性を有しかつ耐性デンプンを分解し得る酵素を含む成分の使用を誰も示唆していない。例として、以下の教示が参照され得る。
【００７８】
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（２６）は、生（ｎａｔｉｖｅ）ジャガイモデンプンを３７℃にて分解する際に、ブタ膵臓アミラーゼおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓアミラーゼ（これらは両方とも、未加工デンプンに対する高い活性を有すると言及される）よりもずっとより効率的である、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  Ｆ２アミラーゼ記載する。３つ全ての酵素は、トウモロコシデンプンに対して非常に同様に作用する。このＢａｃｉｌｌｕｓアミラーゼは、生（ｒａｗ）デンプン結合ドメインを有し、そしてこのドメインのタンパク質分解除去は、生ジャガイモデンプンに対するこの活性を１７％まで低下させる（１７）。
【００７９】
同様に、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｓ−２アミラーゼの未加工デンプン結合ドメインは、未加工デンプンに結合して未加工デンプンを分解するその能力に必須である（１４）。生コムギデンプンおよび生トウモロコシデンプンに対して、このＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓアミラーゼは、ブタ膵臓アミラーゼと同じ活性を有し、他方、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアミラーゼは、１５分の１の活性を有する。生ジャガイモデンプンに対して、このＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓアミラーゼは、ブタ膵臓アミラーゼよりも３倍高い活性を有し、そしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアミラーゼよりも７０倍を超えて高い活性を有する。このＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓアミラーゼは、熱安定性（基質なしで２ｍＭ  ＣａＣｌ２ありで８０℃にて３０分後、５０％残存）であり、そしてｐＨ３にて５０％を超える活性を有する（ｐＨは６が最適）。
【００８０】
１９９２年には、ＧｒｕｃｈａｌａおよびＰｏｍｅｒａｎｚ（１２）は、異なるアミラーゼの耐性デンプン分解能力の差を示した。アミロトウモロコシ（ａｍｙｌｏｍａｉｚｅ）を、老化耐性デンプンの量を増加させるために調理した。ここではその後、既知量の耐性デンプンを、２つの異なるアミラーゼを６０℃で１２時間処理し、懸濁物を濾過し、そしてデンプン残存量を測定してコントロール（アミラーゼの添加なしでの処理）と比較した。
彼らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来の熱安定性α−アミラーゼが、耐性デンプンの１６％を可溶化し得、一方、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．Ｋ−２７由来のアミラーゼが耐性デンプンの４１％を可溶化することを見出した。
【００８１】
（未加工デンプン分解性アミラーゼ）
本発明において使用するためのアミラーゼとしては、未加工デンプン分解性アミラーゼが挙げられる。
【００８２】
未加工デンプン分解性アミラーゼは、デンプン結合ドメインを含み得、そして未加工デンプン（例えば、未加工トウモロコシデンプンおよび未加工コムギデンプンに見出される未加工デンプン）を分解する場合にブタ膵臓アミラーゼと同等であり得るが、分解に対してより耐性であるジャガイモデンプンまたは他のデンプンに対しては優れていることが見出されている。
【００８３】
シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）は、従来のアミラーゼと同様に、シクロデキストリンの形成、加水分解および不均化／トランスグリコシル化によって、デンプンを分解する。ＣＧＴａｓｅは、未加工デンプン分解性であると報告されている（２５）（２７）。
【００８４】
ＣＧＴａｓｅ関連マルトース産生性アミラーゼＮｏｖａｍｙｌＴＭ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）は、未加工デンプンからのマルトース産生のために用いられ得る（４）。
【００８５】
さらに、いくつかの適用において、ＣＧＴａｓｅは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼ（ＴｅｒｍａｍｙｌＴＭ，Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）または使用されるＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼのような液化アミラーゼの代わりに、デンプン液化のために用いられ得る。
【００８６】
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ（ＴｏｒｕｚｙｍｅＴＭ  Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）由来のＣＧＴａｓｅは、高度に熱安定性であり、デンプンの存在下で９０℃で何時間も残存し得る。
【００８７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．Ｋ−２７アミラーゼおよびブタ膵臓アミラーゼは、未加工コムギデンプンおよびトウモロコシデンプンを同様に分解し、一方、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．Ｋ−２７アミラーゼは、未加工ジャガイモデンプンおよび高アミローストウモロコシデンプンを分解する際に、後者の酵素よりもずっと効率的である（２１）。
【００８８】
適切なアミラーゼとしてはまた、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラオース（ｍａｌｔｏｔｅｔｒｏａｓｅ）産生性アミラーゼおよび相同なＥＣ  ３．２．１．６０のグルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼが挙げられ得る。
【００８９】
好ましくは、このアミラーゼ酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  Ｆ２アミラーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓアミラーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｓ−２アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｋ−２７アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼおよびＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼから誘導および／または単離される。
【００９０】
Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９６０１３２３およびＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２），１４，１１２−１１６に開示される。
【００９１】
（アミラーゼ活性）
本明細書中で用いられる場合、用語「アミラーゼ活性」は、デンプン（例えば、耐性デンプンおよび／またはデンプン分解産物）を加水分解または分解し得る任意の酵素に関する。
【００９２】
異なるアミラーゼが耐性デンプンを分解する能力は、当該分野で周知の技術（例えば、ＧｒｕｃｈａｌａおよびＰｏｍｅｒａｎｚ（１２）の方法）によって測定され得る。ＧｒｕｃｈａｌａおよびＰｏｍｅｒａｎｚ（１２）の方法では、異なるアミラーゼでの分解後のデンプンの残存量が測定されて、有意な差を提供した。
【００９３】
代表的には、耐性デンプンに対するアミラーゼ活性は、例えば、Ｅｎｇｌｙｓｔら（９）；（８）、Ｓｉｌｖｅｓｔｅｒら（２４）およびＭｏｒａｌｅｓら（１８）に基づく方法を用いて測定され得る。このような方法は、大腸の前のヒトの消化系を刺激するインビトロ消化方法を用いる。
【００９４】
（デンプン結合ドメイン）
本発明において使用するためのアミラーゼは、デンプン結合ドメインを含み得る。
【００９５】
用語「デンプン結合ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、デンプンに結合するための親和性を有するすべてのポリペプチド配列またはペプチド配列を定義するように意図される。
【００９６】
デンプン結合ドメインは、単一ユニットのデンプン結合ドメイン、微生物（例えば、細菌、糸状菌または酵母）から単離されるデンプン結合ドメイン、あるいはデンプン結合タンパク質またはデンプンに結合し得るように設計および／もしくは操作されたタンパク質のデンプン結合ドメインを含み得る。
【００９７】
デンプン結合ドメインは、単一ドメインポリペプチドとして、または二量体、三量体、もしくはポリマーとして、または、タンパク質ハイブリッドの一部として有用であり得る。単一ユニットデンプン結合ドメインはまた、「単離デンプン結合ドメイン」または「分離デンプン結合ドメイン」といわれ得る。
【００９８】
単一ユニットデンプン結合ドメインは、酵素（例えば、多糖加水分解酵素）を含み、本質的に触媒ドメインを含まないが、デンプン結合ドメインを保持する、単一ユニットデンプン結合ドメインのアミノ酸配列の全体部分までを含む。従って、デンプン分解酵素（例えば、グルコアミラーゼ）または１つ以上のデンプン結合ドメインを含む他の酵素の完全な触媒的アミノ酸配列は、単一ユニットデンプン結合ドメインとはみなされない。
【００９９】
単一ユニットデンプン結合ドメインは、１つ以上の多糖加水分解酵素のデンプン結合ドメイン、１つ以上のデンプン結合タンパク質のデンプン結合ドメイン、またはデンプンに結合し得るように設計および／操作されたタンパク質を構成要素とする。
【０１００】
（熱安定性）
好ましくは、アミラーゼ活性を有し、耐性デンプンを分解し得る酵素は、熱安定性である。
【０１０１】
用語「熱安定性」は、本明細書中で使用される場合、上昇した温度への曝露の後に、活性を保持する酵素の能力に関する。
【０１０２】
好ましくは、本発明における使用のためのアミラーゼ活性を有する酵素は、約２０℃〜約５０℃の温度で耐性デンプンを分解し得る。適切には、この酵素は、約９５℃までの温度への曝露の後に、その活性を保持する。
【０１０３】
（ｐＨ安定性）
好ましくは、アミラーゼ活性を有し、耐性デンプンを分解し得る酵素は、ｐＨ安定性である。
【０１０４】
用語「ｐＨ安定性」とは、本明細書中で使用される場合、広範囲のｐＨにわたって活性を保持する酵素の能力に関する。
【０１０５】
好ましくは、本発明の使用のためのアミラーゼ活性を有する酵素は、約３〜約７のｐＨで耐性デンプンを分解し得る。
【０１０６】
（アミラーゼ阻害に対して実質的に耐性）
アミラーゼ活性を有し、耐性デンプンを分解し得る酵素は、アミラーゼ阻害に実質的に耐性であり得る。
【０１０７】
デンプン消化におけるアミラーゼの効率についての重要な因子は、供給材料からのアミラーゼインヒビターに対するその感受性である。Ａｌ−Ｋａｈｔａｎｉは、市販のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアミラーゼおよびブタ膵臓アミラーゼの、ダイズ由来の抽出物による有意な阻害を報告した（１）。ライムギは、高用量のアミラーゼインヒビターを含み、そして、このアミラーゼインヒビターは、ブタ膵臓アミラーゼおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼに対して有効であることが示されている（７）。構造的に、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼは、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ飼料アミラーゼに密接に関連する。同様に、トウモロコシまたはほとんどの他の飼料植物におけるアミラーゼインヒビターの存在が報告されている（２）。
【０１０８】
用語「アミラーゼ阻害に対して実質的に耐性」とは、本明細書中で使用される場合、デンプンを含有する飼料の分解物から生成されるように、耐性デンプンを部分的にかまたは全体的に分解するのに十分な活性のレベルを維持する、酵素の活性に関する。
【０１０９】
（耐性デンプンを分解し得る）
本発明における使用のための酵素は、耐性デンプンを分解し得る。
【０１１０】
用語「分解する」とは、本明細書中で使用される場合、耐性デンプンの、単糖（例えば、グルコースおよび／またはオリゴ糖（例えば、マルトースおよび／またはデキストリンのような二糖））への部分的または完全な加水分解または分解に関する。
【０１１１】
本発明における使用のための酵素は、動物アミラーゼによって完全には分解されない残存耐性デンプンを分解し得る。一例として、本発明における使用のための酵素は、動物のアミラーゼ（例えば、膵臓α−アミラーゼのような膵臓アミラーゼ）を補助し、耐性デンプンの分解を改善し得る。
【０１１２】
膵臓α−アミラーゼは、動物による消化系で排泄される。膵臓α−アミラーゼは、飼料中のデンプンを分解する。しかし、一部のデンプン、耐性デンプンは、膵臓α−アミラーゼによって完全には分解されず、従って、小腸で吸収されない（耐性デンプンの定義を参照のこと）。
【０１１３】
本発明における使用のための酵素は、消化系において膵臓α−アミラーゼのデンプンの分解を補助し、従って、動物によるデンプンの利用を増加する。
【０１１４】
耐性デンプンを分解する酵素の能力は、例えば、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．によって、耐性デンプン、可溶化されたデンプンおよびサンプルの総デンプン含有量の測定のために開発および開示された方法（Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｒｃｈ  Ａｓｓａｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ＡＯＡＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２００２．０２，ＡＡＣＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ３２−４０）によって、解析され得る。
【０１１５】
（成分）
適切には、本発明における使用のための酵素を含む成分は、栄養素である。用語「栄養素」とは、本明細書中で使用される場合、動物消費に適した食品成分を含み得る。
【０１１６】
代表的な食品成分としては、動物性脂肪もしくは植物性脂肪、天然もしくは合成の調味料、抗酸化剤、粘度調整剤、精油、および／もしくは甘味料、染料および／もしくは着色料、ビタミン、ミネラル、天然アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸、栄養物、付加的な酵素（遺伝子操作した酵素を含む）、結合剤（例えば、グアールガムまたはキサンタムガム（ｘａｎｔｈｕｍ  ｇｕｍ））、緩衝液、乳化剤、滑沢剤、アジュバント、懸濁剤、保存剤、コーティング剤または可溶化剤などのような１つ以上の任意の添加剤が挙げられ得る。
【０１１７】
本発明における使用のための成分は、アミラーゼ活性を有するかまたは耐性デンプンを分解し得る酵素を含む。
【０１１８】
代表的には、本発明の成分は、本発明の成分の、飼料への間接的または直接的な適用による、動物消費のための飼料の調製において使用される。
【０１１９】
本発明において使用され得る適用方法の例としては、この成分を含む物質中で食物をコーティングする工程、この成分を食物と混合することによる直接的な適用、食物の表面にこの成分を塗布する工程、または食物をこの成分の調製物中に浸漬する工程、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２０】
本発明の成分は、好ましくは、食物と成分を混合することによってか、動物消費のために食物粒子状に塗布することによって、適用される。あるいは、この成分は、食物の乳剤にか、または注入もしくはタンブルすることによって固体生成物の内部に含まれ得る。
【０１２１】
（成分の適用）
本発明の成分は、制御された量の、アミラーゼ活性を有するかまたは耐性デンプンを分解し得る酵素を有する食物を散らばせるか、コーティングするか、および／または浸漬するために適用され得る。酵素を含む成分の混合物はまた、別々に、同時にまたは連続して、使用され得、そして適用され得る。キレート剤、結合剤、乳化剤および他の添加剤（例えば、微量無機質および多量無機質、アミノ酸、ビタミン、動物性脂肪、動物性脂肪、保存剤、矯味剤、着色剤）は、同様に、食物に（混合物としてかまたは別々にかのいずれかで）同時に適用され得るかまたは連続して適用され得る。
【０１２２】
（成分の量）
本発明において使用されるべき至適量の成分は、処理される飼料および／または飼料を成分と接触させる方法および／または飼料に対する使用が意図される使用に依存する。この成分中で使用される酵素の量は、食物の摂取後および消化の間に耐性デンプンを実質的に分解するのに有効である十分量であるべきである。
【０１２３】
有利なことには、酵素を含む成分は、食物の完全な消化が得られるまで（すなわち、食物の総発熱量が放出されるまで）は、動物消費に関して食物の摂取後およびに食物の消化の間に有効なままである。
【０１２４】
（飼料の調製）
飼料は、当該分野で周知の技術（例えば、本明細書中の実施例７に記載される技術）によって調製され得る。
【０１２５】
本発明における使用のために特に適した飼料は、ペレットの形態の飼料である。
【０１２６】
本発明における使用のために特に適したアミラーゼ酵素は、耐性デンプンを含むペレット状食物を分解するのに有効でなければならない。
【０１２７】
（耐性デンプンの測定）
加水分解耐性のデンプンの量を決定するための方法は、当該分野で周知である。
【０１２８】
例えば、酵素的加水分解に耐性のデンプン画分の存在は、まず、１９８２年のＥｎｇｌｙｓｔら（Ａｎａｌｙｓｔ，１０７，ｐ．３０７〜３１８，１９８２）によって、非デンプン多糖の測定についての彼らの研究の間に認識された（１）。この研究は、Ｂｅｒｒｙ（Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４，ｐ．３０１〜３０４，１９８６）によって拡張され、彼は、耐性デンプンの測定のための手順を開発した。この手順は、Ｅｎｇｌｙｓｔら（Ａｎａｌｙｓｔ，１０７，ｐ．３０７〜３１８，１９８２）によって使用されたα−アミラーゼ／プルラナーゼ処理を組み込むが、これは１００℃での最初の加熱工程を省略し、従って、より密接に生理条件を模倣した。これらの条件下で、サンプルの測定される耐性デンプン含有量は、非常に高かった。この発見は、その後、Ｅｎｇｌｙｓｔら（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ，４２，ｐ．７７８〜７８７，１９８５；Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．４４，ｐ．４２〜５０，１９８６；Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．４５，ｐ．４２３〜４３１，１９８７）によって、健康な回腸フィステル形成術の被験体での研究を通じて検証された。
【０１２９】
１９９０年代初期までに、耐性デンプンの生理学的重要性は完全に理解された。いくつかの新しい／改変した方法が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＥＵＲＥＳＴＡ（Ｅｎｇｌｙｓｔら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ，４６，ｓｕｐｐｌ．２，Ｓ３３〜Ｓ５０）の間に開発された。Ｃｈａｍｐ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．４６，ｓｕｐｐｌ．２，Ｓ５１〜Ｓ６２）の方法は、Ｂｅｒｒｙ（Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４，ｐ．３０１〜３０４，１９８６）の方法への改変に基づき、膵臓α−アミラーゼを使用して、耐性デンプンの直接的な測定を与え、ここで、インキュベ−ションはｐＨ６．９で実施された。
【０１３０】
ＭｕｉｒおよびＯ’Ｄｅａ（Ｍｕｉｒ，Ｊ．Ｇ．およびＯ’Ｄｅａ，Ｋ．（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５６，１２３〜１２７）は、サンプルが咀嚼され、ペプシンで処理され、次いで膵臓α−アミラーゼおよびアミログルコシダーゼの混合物によって、ｐＨ５．０の温浴中、３７℃で１５時間振盪する手順を開発した。残査ペレット（耐性デンプンを含む）は、遠心分離によって回収され、遠心分離によって酢酸緩衝液で洗浄され、そして、耐性デンプンは、熱、ＤＭＳＯおよび熱安定性α−アミラーゼの処理の組み合わせによって消化された。
【０１３１】
より最近では、これらの方法は、Ｆａｉｓａｎｔら、（Ｆａｉｓａｎｔ，Ｎ．，Ｐｌａｎｃｈｏｔ，Ｖ．，Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ，Ｆ．，Ｍ．−Ｐ．Ｐａｃｏｕｒｅｔ，Ｐ．Ｃｏｌｏｎｎａ．およびＭ．Ｃｈａｍｐ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｅｓ  Ａｌｉｍｅｎｔｓ，１５，８３〜８９），Ｇｏｎｉら、（Ｇｏｎｉ，Ｉ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｄｉｚ，Ｅ．，Ｍａｎａｓ，Ｅ．およびＳａｕｒａ−Ｃａｌｉｘｔｏ，Ｆ．（１９９６），Ｆｄ．Ｃｈｅｍ．，５６，４４５〜４４９），Ａｋｅｒｂｅｒｇら、．（Ａｋｅｒｂｅｒｇ，，Ａ．Ｋ．Ｅ．，Ｌｉｌｊｂｅｒｇ，Ｇ．Ｍ．，Ｇｒａｎｆｅｌｄｔ，Ｙ．Ｅ．Ｄｒｅｗｓ，Ａ．Ｗ．およびＢｊｏｒｃｋ，Ｍ．Ｅ．（１９９８），Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１２８，６５１〜６６０）およびＣｈａｍｐら、（Ｃｈａｍｐ，Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｌ．，Ｎｏａｈ，Ｌ．および「Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄｓ（Ｓ．Ｓ．Ｃｈｏ，Ｌ．ＰｒｏｓｋｙおよびＭ．Ｄｒｅｈｅｒ，編）におけるＧｒａｔａｓ，Ｍ．（１９９９）ｐｐ．１６９〜１８７．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）によって改変されている。これらの改変としては、使用される酵素濃度の変化、使用される酵素の型、サンプルの前処理（咀嚼）、インキュベーションのｐＨおよびα−アミラーゼインキュベーション工程後のエタノールの添加（または添加しない）が挙げられた。これらの改変は全て、サンプルにおける耐性デンプンの決定されたレベルに、いくらかの効果を有する。
【０１３２】
さらに、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．は、耐性デンプン、可溶性デンプンおよびサンプル中の総デンプン含有量の測定のためのアッセイを開発した（Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｒｃｈ  Ａｓｓａｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ＡＯＡＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２００２．０２，ＡＡＣＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ３２〜４０）。
【０１３３】
（動物効率）
さらなる局面において、本発明は、動物効率を改善するための飼料の調製における、本明細書中に記載されるような酵素の使用に関する。
【０１３４】
用語「動物効率を改善する」とは、本明細書中で使用される場合、例えば、動物の１つ以上の特性を改善すること（例えば、増殖の改善または飼料変換の改善）をいう。
【０１３５】
動物効率は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、増殖、飼料変換率、および／または飼料摂取の測定）を使用して測定され得る。糞の質、死の発生、骨におけるリン酸の含量などもまた、動物効率のパラメータとして測定され得る。
【０１３６】
ここで、本発明は、さらに、実施例の目的で記載され、これは、本発明を実施する当業者を補助するのに役立つように意味され、本発明の範囲を限定する目的は意図されない。
【実施例】
【０１３７】
（１．デンプンを含有する飼料に対するアミラーゼ活性を有する、候補酵素の活性を決定するためのアッセイ）
飼料原料（例えば、コムギ、ダイズまたはトウモロコシ）を採取し、そして代表的な消化酵素に加えて、候補酵素を添加した。
【０１３８】
インビトロ消化に続いて、耐性デンプンの量を、残余の（消化されていない）デンプンの量から決定し、そして候補アミラーゼ酵素の非存在下でのコントロールの量と比較した。
【０１３９】
（２．飼料原料におけるアミラーゼインヒビターの存在の決定）
アミラーゼ候補のサンプルの阻害のレベルを、飼料原料からの抽出物および標準的なアミラーゼアッセイを使用して決定した。飼料原料からの増加した量の抽出物をアッセイに添加し、そして阻害のレベルを、アミラーゼ活性の減少として計算した。
【０１４０】
（α−アミラーゼインヒビターのアッセイのためのプロトコル）
（定義）
１単位のアミラーゼ活性は、記載される条件下で、１マイクロモルのグリコシド結合の加水分解を、１分で触媒する。
【０１４１】
阻害は、％で測定され、そして阻害されていないアミラーゼ溶液の活性と比較した場合の、活性の相対的減少である。
【０１４２】
（試薬）
基質：インビトロ消化用途のための、Ｐｈａｄｅｂａｓ  Ａｍｙｌａｓｅ  Ｔｅｓｔ錠剤（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
試薬溶液：（総容量１０００ｍｌになるように蒸留水に溶解した、９．０ｇの塩化ナトリウム、２．０ｇのウシ血清アルブミンおよび２．２ｇの塩化カルシウム）。
二倍濃縮した試薬溶液：（総容量５００ｍｌになるように蒸留水に溶解した、９．０ｇの塩化ナトリウム、２．０ｇのウシ血清アルブミンおよび２．２ｇの塩化カルシウム）。
可能なインヒビターを含有する試験材料からの抽出物：（サンプルを微細に粉砕し、そして約２ｇを、１０ｍｌの冷水と１０分間混合し、その後、このスラリーを濾過する。）
０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液
濾紙
６４０ｎｍでの吸光度を測定するための分光光度計
試験される酵素のサンプル。
【０１４３】
（手順）
（試験酵素サンプル）
試薬溶液中の０．２ｍｌの希釈酵素および４．０ｍｌの試薬溶液を、試験管中にピペッティングし、そして＋３７℃で５分間平衡化した。基質錠剤をピンセットで添加し、１０秒間よく撹拌し、そして＋３７℃で１５分間インキュベートした。この反応の開始時間を錠剤の添加の際に記録した。１．０ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を添加し、そしてよく撹拌した。この溶液を、濾過するかまたは３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そしてその吸光度を、試薬ブランクに対して６２０ｎｍで測定した。酵素サンプルの吸光度は、一般に、０．３〜０．５の間であった。
【０１４４】
（阻害の試験：）
上記と同じ手順を、試験酵素サンプルに対して実施したが、２．０ｍｌの二倍濃縮した試薬溶液および可能なインヒビターを含有する試験材料からの２．０ｍｌの抽出物を、４．０ｍｌの試薬溶液の代わりに使用した。
【０１４５】
（試薬ブランク）
４．２ｍｌの試薬溶液を、＋３７℃で５分間平衡化した。基質錠剤をピンセットで添加し、１０秒間よく撹拌し、次いで、＋３７℃で１５分間インキュベートした。１．０ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を添加し、そしてよく撹拌した。この溶液を、濾過するかまたは３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【０１４６】
（計算）
サンプルの吸光度は、α−アミラーゼ活性に比例した。各酵素希釈物のアミラーゼ活性を、錠剤キットに同封された較正表から決定した。サンプルのアミラーゼ活性を、以下のように計算した：
活性（Ｕ／ｇ）＝（Ａｃｔ×Ｄｆ）／１０００
ここで、
Ａｃｔ＝Ｐｈａｄｅｂａｓ  Ａｍｙｌａｓｅ  Ｔｅｓｔ表から読み取られる、酵素希釈物のアミラーゼ活性値（Ｕ／リットルで表される）
Ｄｆ＝希釈因子（ｍｌ／ｇ）
１０００＝リットルをｍｌに換算するための因子。
【０１４７】
活性を、純粋な酵素についてと、材料抽出物を含有する試験サンプルについてとの両方で計算した。抽出物の阻害を、抽出物が添加された場合の活性の減少として、純粋な酵素の活性の百分率として決定した。
【０１４８】
阻害＝（抽出物を含む酵素の活性／純粋な酵素の活性）×１００％。
【０１４９】
（３．耐性デンプンの量の決定）
低い含水量を有するデンプンサンプルを、１ｍｍの篩を通るように粉砕した。５％を超える脂肪含有量を有するサンプルを、粉砕の前に脱脂した（石油エーテル抽出物を用いる）。次いで、これらのサンプルを直接均質化し、そして分析のために遠心管に入れた。
【０１５０】
１００ｍｇの乾式粉砕したサンプルを、５０ｍｌの遠心管に入れ、そして１０ｍｌのＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１．５）を添加した（２Ｍ  ＨＣｌまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨで調整）。湿潤サンプルについては、１００ｍｇの乾燥物質と等価な重量の部分を、ＫＣＬ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ１．５）に添加し、均質化し、そして遠心管に入れた。０．２ｍｌのペプシン溶液（１ペプシン／１０ｍｌ緩衝液ＫＣｌ−ＨＣｌ）を添加し、混合し、そしてチューブを、絶えず振盪しながら４０℃の水浴中に６０分間維持した。４０℃でのインキュベーションに続いて、これらのサンプルを取り出し、そして放置して、室温に冷却した。９ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．９）を添加し（２Ｍ  ＨＣｌまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを調整した）、そして１ｍｌのα−アミラーゼ溶液（Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液１ｍｌあたり４０ｍｇ  α−アミラーゼ）を添加した。混合後、このサンプルを３７℃の水浴中で１６時間、絶えず振盪しながらインキュベートした。引き続いて、これらのサンプルを遠心分離し（１５分間、３０００ｇ）、そして上清を処分した。
【０１５１】
３ｍｌの蒸留水を残留物に添加し、このサンプルを注意深く湿らせた。３ｍｌの４Ｍ  ＫＯＨを添加し、そしてこのサンプルを混合し、そして室温で３０分間、絶えず振盪しながら放置した。５．５ｍｌの２Ｍ  ＨＣｌおよび３ｍｌの０．４Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７５）を添加し（２Ｍ  ＨＣｌまたは０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを調整した）、次いで、８０μｌのアミログルコシダーゼを添加した。混合に続いて、このサンプルを、６０℃の水浴中に、絶えず振盪しながら５６分間放置した。
【０１５２】
これらのサンプルを遠心分離し（１５分間、３０００ｇ）、そして上清を収集した。残留物を、１０ｍｌの蒸留水で少なくとも１回洗浄し、再度遠心分離し、そして上清を、先に得られた上清と合わせた。
【０１５３】
（３．１  グルコース濃度を決定するための標準曲線の調製（１０〜６０ｐｐｍ））
０．５ｍｌの水、サンプルおよび標準物質を、試験管内にピペッティングした。グルコース決定キット（ＧＯＤ−ＰＡＰ）からの１ｍｌの試薬を添加した。この溶液を混合し、そして３７℃の水浴中で３０分間放置した。  
【０１５４】
インキュベーション後５分と４５分との間で、サンプルおよび標準物質の吸光度を、試薬ブランクに対して、５００ｎｍで読み取った。サンプルのグルコース濃度を、既知のグルコース濃度（１０〜６０ｐｐｍ）を有する標準物質の吸光度から構築した標準曲線を使用して計算した。試験サンプルの耐性デンプン濃度を、グルコースのｍｇ数×０．９として計算した。
【０１５５】
（４．純粋なデンプンおよび植物材料における、耐性デンプンの測定）
（４．１  試験サンプルの調製）
穀物または麦芽の５０ｇのサンプルを、粉砕ミルにおいて、１．０ｍｍの篩を通過するように粉砕した。新鮮なサンプル（例えば、缶詰のマメ、バナナ、ジャガイモ）を手動ひき肉機で、４ｍｍの篩を通過するようにすりつぶした。乾燥サンプルの水分含有量を。ＡＯＡＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９２５．１０（１４）によって決定し、そして新鮮なサンプルの水分含有量を、ＡＯＡＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９２５．１０に従って、凍結乾燥し引き続いてオーブンで乾燥することによって、決定した。
【０１５６】
（４．２  耐性デンプンの測定）
１００ｍｇのサンプルを、ねじ式キャップのチューブ内に直接秤量した。ＡＭＧ（３Ｕ／ｍｌ）を含有する、マレイン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中の４．０ｍｌの膵臓α−アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、各チューブに添加した。混合に続いて、これらのサンプルを、絶えず振盪しながら（２００行程／分）３７℃でインキュベートした。１６時間後、これらのサンプルを、４．０ｍｌのＩＭＳ（９９％ｖ／ｖ）で処理し、そして３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をデカンテーションし、そしてペレットを、ボルテックスミキサーで激しく攪拌しながら、２ｍｌの５０％  ＩＭＳ中に再懸濁させた。６ｍｌの５０％  ＩＭＳを添加し、そして混合し、そしてこれらのチューブを、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。懸濁および遠心分離の工程を繰り返した。
【０１５７】
２ｍｌの２Ｍ  ＫＯＨを、各チューブに添加し、そしてペレットを、約２０分間、氷／水浴中で攪拌することによって、再懸濁させた（耐性デンプンを溶解する）。各チューブを、攪拌しながら８ｍｌの１．２Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）で処理し、そして０．１ｍｌのＡＭＧ（３２００Ｕ／ｍｌ）をすぐに添加し、そしてこれらのチューブを、５０℃の水浴中に３０分間、絶えず混合しながら入れた。
【０１５８】
１０％より多い耐性デンプンを含有するサンプルを、１００ｍｌの容量フラスコに（水の洗瓶を使用して）移し、そして水で容量を調節した。この溶液のアリコートを、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【０１５９】
１０％未満の耐性デンプンを含有するサンプル（希釈なし）を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【０１６０】
希釈上清または非希釈上清のいずれかの、０．１ｍｌのアリコート（二連）を、ガラス試験管（１６×１００ｍｍ）に移し、３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬（グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ−アミノアンチピリン緩衝混合物（グルコースオキシダーゼ＞１２０００Ｕ／Ｌ；ペルオキシダーゼ＞６５０Ｕ／Ｌ；およびリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４−アミノアンチピリン０．４ｍＭの混合物））で処理し、そして５０℃で２０分間インキュベートした。
【０１６１】
試薬ブランク溶液を、０．１ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）および３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を混合することによって、調製した。グルコース標準物質を、０．１ｍｌのグルコース（１ｍｇ／ｍｌ）および３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を混合することによって、（四連で）調製した。５０℃で２０分間のインキュベーション後、各溶液の吸光度を、試薬ブランクに対して、５１０ｎｍで測定した。
【０１６２】
（４．３  計算）
試験サンプル中の耐性デンプンの含有量（乾燥重量に基づく％）を、以下のように計算した：
１０％を超える耐性デンプンを含有するサンプルについて：
＝ΔＥ×Ｆ×１００／０．１×１／１０００×１００／Ｗ×１６２／１８０
＝ΔＥ×Ｆ／Ｗ×９０。
１０％未満の耐性デンプンを含有するサンプルについて：
＝ΔＥ×Ｆ×１０．３／０．１×１／１０００×１００／Ｗ×１６２／１８０
＝ΔＥ×Ｆ／Ｗ×９．２７。
ここで：
ΔＥ＝試薬ブランクに対して読み取られた吸光度（反応）；
Ｆ＝吸光度からマイクログラムへの換算＝１００（グルコースのμｇ数）／１００μｇのグルコースの吸光度；
１００／０．１＝体積補正（１００ｍｌから０．１ｍｌをとる）；１／１０００＝マイクログラムからミリグラムへの換算；
Ｗ＝分析したサンプルの乾燥重量［＝「そのままの」重量×（１００−水分含有量）／１００］；
１００／Ｗ＝サンプル重量の百分率としての、存在するデンプンの因子；
１６２／１８０＝決定された遊離グルコースから、デンプン中に存在する無水グルコースへの換算の因子
１０．３／０．１＝インキュベーション溶液が希釈されず、最終体積が約１０．３ｍｌである場合の、０〜１０％の耐性デンプンを含有するサンプルについての体積補正（１０．３ｍｌから０．１ｍｌをとる）。
【０１６３】
（５．分解した未加工デンプンの測定）
この実施例において、未加工デンプンの分解において膵臓α−アミラーゼを補助する、アミラーゼ活性を有する２つの酵素の能力を決定した。これらの酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｏｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼ（ＬＴＡＡ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）およびＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼ（ＷＯ９６０１３２３に開示される）であった。
【０１６４】
（５．１．原理）
この分析は、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎｉａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）製のＲｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｒｃｈ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ−ＲＳＴＡＲ）に基づく。Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｒｃｈ  Ａｓｓａｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＡＯＡＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２００２．０２  ＡＡＣＣ  Ｍｅｔｈｏｓ  ３２−４０）の原理を、この実施例の目的で改変し、その結果、インキュベーション時間は、１６時間ではなく、ほんの１．５時間である。
【０１６５】
サンプルを、振盪水浴中で、膵臓α−アミラーゼおよびアミログルコシダーゼ（ＡＭＧ）、および必要に応じて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｏｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼ（ＬＴＡＡ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）またはＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼとともに、３７℃で１．５時間インキュベートし、この時間の間、デンプンは溶解し、そして酵素の組み合わせ作用によって、グルコースに加水分解した。この反応を、等容量の産業用メチル化アルコール（ｓｐｉｒｉｔ）（ＩＭＳ、変性エタノール）の添加によって終結させた。上清中の可溶化したデンプンを、ＡＭＧで定量的にグルコースに加水分解した。グルコースを、オキシダーゼ／ペルオキシダーゼ試薬（ＧＯＰＯＤ）で測定した。これは、サンプルの可溶化デンプン含有量の直接測定である。
【０１６６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｏｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼ（ＬＴＡＡ）またはＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼの単位を、Ｐｈａｄｅｂａｓ（登録商標）アミラーゼ試験（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）によって測定した。
【０１６７】
（５．２．容易に分解可能なデンプンの測定）
１００ｍｇのサンプルを、ねじ式キャップのチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ培養チューブ；１６×１２５ｍｍ）内に直接秤量した。ＡＭＧ（３Ｕ／ｍｌ）、および必要に応じて、合計０．４ＵのＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｏｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼまたはＴ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼを含有する、マレイン酸ナトリウム緩衝液中の４．０ｍｌの膵臓α−アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、各チューブに添加した。混合に続いて、これらのサンプルを、絶えず振盪しながら（２００行程／分）３７℃で１．５時間インキュベートした。１．５時間後、これらのサンプルを、ボルテックスミキサーで激しく攪拌しながら、４．０ｍｌのＩＭＳ（９９％ｖ／ｖ）で処理し、そして３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を１００ｍｌの容量フラスコにデカンテーションし、そして脱鉱物質水で１００ｍｌに満たした。２ｍｌのサンプルをとり、そして０．２ｍｌのＡＭＧ（３２００Ｕ／ｍｌ）をこれに添加した。これらのチューブを、５０℃の水浴中に、絶えず混合しながら３０分間入れた。
【０１６８】
希釈上清または非希釈上清のいずれかの、０．１ｍｌのアリコートを、ガラス試験管（１６×１００ｍｍ）に入れ、３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬で処理し、そして５０℃で２０分間インキュベートした。試薬ブランク溶液を、０．１ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）および３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を混合することによって、調製した。グルコース標準物質を、０．１ｍｌのグルコース（１ｍｇ／ｍｌ）および３．０ｍｌのＧＯＰＯＤ試薬を混合することによって、（四連で）調製した。５０℃で２０分間のインキュベーション後、各溶液の吸光度を、水に対して５１０ｎｍで測定した。
【０１６９】
（５．３  計算）
サンプル中の可溶化デンプンの含有量（乾燥重量に基づく％）を、以下のように計算した：
＝ΔＥ×Ｇ×Ｄ×１００／０．１×１．１×１／１０００×１００／Ｗ×１６２／１８０
＝ΔＥ×（Ｇ×Ｄ）／Ｗ×９９。
ここで：ΔＥ＝試薬ブランクに対して読み取った吸光度（反応）；
Ｇ＝吸光度からマイクログラムへの換算＝１００（グルコースのμｇ数）／１００μｇのグルコースの吸光度；
Ｄ＝上清の希釈；１００／０．１＝体積補正（１００ｍｌから０．１ｍｌをとる）；１．１＝１．５時間のインキュベーション後にＡＭＧをサンプルに添加した場合の希釈
１／１０００＝マイクログラムからミリグラムへの換算；
１６２／１８０＝決定された遊離グルコースから、デンプン中に存在する無水グルコースへの換算の因子。
【０１７０】
（５．４  結果）
第１に、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｏｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼの作用を分析し、そして、膵臓α−アミラーゼおよびアミログルコシダーゼを（ＡＭＧ）のみを含む参照と比較した。処理後のサンプル中における可溶性デンプンの量（％）を、表１に示す。
【０１７１】
【表１】
2005511071.tif 000003
【０１７２】
これらの結果は、ＬＴＡＡが、膵臓αアミラーゼおよびＡＭＧ単独と比較して不溶性のデンプンを分解することにおける任意の付加的な効果を有さないことを示す。
【０１７３】
第２に、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｏｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼの作用を分析し、そして、Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓアミラーゼの作用と比較した。Ｂ．ａｍｙｌｏｌｏｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼおよびＴ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓのアミラーゼによる処理後のサンプル中における可溶性デンプンの量（％）を、表２に示す。
【０１７４】
【表２】
2005511071.tif 000004
【０１７５】
これらの結果は、Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓのアミラーゼが、不溶性のデンプンを分解することにおける任意の相加的な効果を有する（この意味は、信頼水準９９％の有意な差異である）ことを示す。
【０１７６】
（６．動物用飼料の調製）
代表的な飼料は、以下の成分から調製される：
トウモロコシ                ５７．７１％
ダイズミール４８            ３１．５２％
ダイズ油                      ６．３０％
ＮａＣｌ                      ０．４０％
ＤＬメチオニン                ０．２０％
リン酸二カルシウム            １．４６％
ビタミン／ミネラルミックス    １．２５％
合計                      １００．００％
飼料混合物を、蒸気を注入することによって加熱し、温度を３０秒間で８０℃とし、そして、さらにペレット処理機（ｐｅｌｌｅｔｉｓｅｒ）中でペレット化する。次いで、これらのペレットを、乾燥する。
【０１７７】
このプロセスは、ペレット化した飼料を取得するための飼料製造にとって代表的なものである。
【０１７８】
（７．デンプンを含む動物用飼料にアミラーゼ酵素することの効果）
（７．１  給餌実験−ブタ）
（食餌）
コントロールブタに、市販の食餌を与え、他方、５つの実験的食餌を、家畜飼料の１グラムあたり１〜１０Ｕの異種アミラーゼを供給した。食餌を、制約することなく与えた。水分もまた、檻の各々に設置されたニップルドリンカーから制約なしに利用可能とした。各々の食餌において、スターター期（ｓｔａｒｔｅｒ  ｐｈａｓｅ）およびグロアー期（ｇｒｏｗｅｒ  ｐｈａｓｅ）がある。ブタを、６つの処理のうち１つに配分し、食餌の各々の組み合わせ（スターター期およびグロアー期）を、６回実験まで供給した。
【０１７９】
（動物／ハウジング）
市販のユニットからのウィーニング時に得られた３６頭の雌性仔ブタ（生体重量範囲７．５〜９ｋｇ）を、使用した。ブタを個々の檻に囲った。
【０１８０】
（手順）
動物を、到着時に、個々に体重を量り、実験ユニットに直ちに移動させ、適切な番号がふられた囲い檻に囲い込み、そして、コントロール食餌または実験スターター期食餌に配分した。その後、ブタを、７日ごとに体重を量った。
【０１８１】
ブタに、制限することなく食餌を与え、そして第０日目から消費された家畜用飼料を１週間ベースで記録した。これらのブタが１６．０ｋｇ以上の体重であるとき、これらのブタを、グロアー期食餌に移行させた。飼料摂取量および体重を、１週間ごとに記録した。動物たちを、給餌時間において１日に２回、検査した。健康状態、清潔性、および他の関連性のある観察結果を記録した。仔ブタが２７．５ｋｇの体重となったときに、この試験を完結させた。
【０１８２】
従って、これらの成長速度、飼料摂取量および飼料変換率は、生体重にして約１０ｋｇと２５ｋｇとの間の仔ブタにおいて決定した。
【０１８３】
（結論）
耐性デンプン分解アミラーゼを含有する動物給餌実験の食餌は、飼料変換率（ＦＣＲ）における顕著な減少を示し、これは、コントロールと比較して、所定の体重増加を達成するために、より少ない飼料が必要とされることを示している。ブタ給餌実験の食餌はまた、成長速度の顕著な増進および飼料摂取量の減少を示した。
【０１８４】
（７．２  給餌試験−ブロイラー）
（食餌）
コントロール動物に、市販の食餌を与え、他方、５つの実験的食餌を、家畜飼料の１グラムあたり１〜１０Ｕの異種アミラーゼを供給した。食餌を、制約することなく与えた。水分は、制約なしに利用可能とした。各々の食餌において、スターター期およびグロアー期を設けた。
【０１８５】
（動物）
ブロイラーを、６つの食餌のうち１つに配分し、食餌の各々の組み合わせ（スターター期およびグロアー期）を、４２個体の各々において８回実験まで供給した。動物を、定期的に検査した。健康、清潔性、および任意の他の関連性のある観察結果を記録した。
【０１８６】
（手順）
動物を、個々に体重を量り、実験ユニットに直ちに移動させ、適切な番号がふられた囲い檻に囲い込み、そして、コントロール食餌または実験スターター期食餌に配分した。２０日後および４０日後に、ブロイラーの体重を量った。この２０日間および４０日間の後の家畜飼料の使用量もまた、記録した。成長速度、飼料摂取量、および飼料変換率を、決定した。
【０１８７】
（結論）
耐性デンプン分解アミラーゼを含有する動物給餌実験の食餌は、飼料変換率（ＦＣＲ）における顕著な減少を示し、これは、コントロールと比較して、所定の体重増加を達成するために、より少ない飼料が必要とされることを示している。
【０１８８】
ブロイラー給餌実験の食餌はまた、成長速度の顕著な増進および飼料摂取量の減少を示した。
【０１８９】
（本発明の概説的局面）
広範な局面において、本発明は、デンプンを含む飼料の使用のための成分に関し、ここで、その成分は酵素を含み、その酵素は、アミラーゼ活性を有し、デンプンを含む飼料の使用のために耐性デンプンを分解し得る。
【０１９０】
別の広範な局面において、本発明は、飼料中の耐性デンプンを分解する方法に関し、この方法は、この耐性デンプンを酵素に接触させる工程を包含して、その酵素は、アミラーゼ活性を有し、デンプンを含む飼料の使用のために耐性デンプンを分解し得る。
【０１９１】
（本発明の他の局面）
本発明の他の局面は、ここで、以下のようなパラグラフによって記述される。
１．  デンプンを含む飼料の使用のための成分であり、ここでその成分は、酵素を含み；その酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得、そして、ここで、その酵素は、以下の特徴：
ａ．デンプン結合ドメイン
ｂ．熱安定性であること
ｃ．ｐＨ安定性であること
ｄ．アミラーゼインヒビターに対して実質的に耐性であること
のうち１つ以上を含む、成分。
２．  上記酵素がデンプン結合ドメインを含む、パラグラフ１に記載の成分。
３．  上記酵素が熱安定性である、パラグラフ１またはパラグラフ２に記載の成分。
４．  上記酵素がｐＨ安定性である、パラグラフ１、パラグラフ２またはパラグラフ３に記載の成分。
５．  上記酵素がアミラーゼインヒビターに対して実質的に耐性である、パラグラフ１〜パラグラフ２のいずれか１項に記載の成分。
６．  上記酵素が未加工のデンプン分解酵素である、パラグラフ１〜５のいずれか１項に記載の成分。
７．  上記酵素がシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）である、パラグラフ１〜６のいずれかに１つに記載の成分。
８．  上記ＣＧＴａｓｅがＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓから誘導可能である、パラグラフ７に記載の成分。
９．  上記ＣＧＴａｓｅがＴｏｒｕｚｙｍｅＴＭである、パラグラフ７またはパラグラフ８に記載の成分。
１０．  上記ＣＧＴａｓｅがＮｏｖａｍｙｌＴＭである、パラグラフ７に記載の成分。
１１．  上記酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  Ｆ２アミラーゼ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓアミラーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｓ−２アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｋ−２７アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアミラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼからなる群より選択されるアミラーゼ酵素である、パラグラフ１に記載の成分。
１２．  パラグラフ１１に記載の成分であり、ここで、上記酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼのような溶解性アミラーゼである、成分。
１３．  上記飼料がブタまた家禽類のための飼料である、パラグラフ１〜１２のうちのいずれか１つに記載の飼料における使用のための成分。
１４．  上記飼料がマメ科植物または穀物のような未加工の材料である、パラグラフ１３に記載の飼料における使用のための成分。
１５．  デンプンおよび酵素を含む飼料であり、ここで、その酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得、そして、ここで、その酵素は、以下の特徴：
ａ．デンプン結合ドメイン
ｂ．熱安定性であること
ｃ．ｐＨ安定性であること
ｄ．アミラーゼインヒビターに対して実質的に耐性であること
のうち１つ以上を含む、飼料。
１６．  上記酵素がデンプン結合ドメインを含む、パラグラフ１５に記載の飼料。
１７．  上記酵素が熱安定性である、パラグラフ１５またはパラグラフ１６に記載の飼料。
１８．  上記酵素がｐＨ安定性である、パラグラフ１５、１６、または１７に記載の飼料。
１９．  上記酵素がアミラーゼインヒビターに対して実質的に耐性である、パラグラフ１５〜パラグラフ１８のいずれか１項に記載の飼料。
２０．  上記酵素が未加工のデンプン分解酵素である、パラグラフ１５〜１９に記載の成分。
２１．  ブタまた家禽類のための飼料である、パラグラフ１５〜２０のうちのいずれか１つに記載の飼料における使用のための飼料。
２２．  マメ科植物または穀物のような未加工の材料である、パラグラフ２１に記載の飼料における使用のための飼料。
２３．  飼料中の耐性デンプンを分解するための方法であって、この方法は、この耐性デンプンと酵素を接触させる工程を包含し、この酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得、そして、ここで、その酵素は、以下の特徴：
ａ．デンプン結合ドメイン
ｂ．熱安定性であること
ｃ．ｐＨ安定性であること
ｄ．アミラーゼインヒビターに対して実質的に耐性であること
のうち１つ以上を含む、方法。
２４．  上記酵素がデンプン結合ドメインを含む、パラグラフ２３に記載の方法。
２５．  上記酵素が熱安定性である、パラグラフ２３またはパラグラフ２４に記載の方法。
２６．  上記酵素がｐＨ安定性である、パラグラフ２３、２４または２５に記載の方法。
２７．  上記酵素がアミラーゼインヒビターに対して実質的に耐性である、パラグラフ２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
２８．  上記酵素が未加工のデンプン分解酵素である、パラグラフ２３〜２７に記載の方法。
２９．  上記飼料がブタまた家禽類のための飼料である、パラグラフ２３〜２８に記載の飼料における使用のための方法。
３０．  上記飼料がマメ科植物または穀物のような未加工の材料である、パラグラフ２９に記載の方法。
３１．  耐性デンプンを分解するための、デンプンを含む飼料の調製方法における酵素の使用であって、ここで、この酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつこの耐性デンプンを分解し得、そして、ここで、その酵素は、以下の特徴：
ａ．デンプン結合ドメイン
ｂ．熱安定性であること
ｃ．ｐＨ安定性であること
ｄ．アミラーゼインヒビターに対して実質的に耐性であること
のうち１つ以上を含む、方法。
３２．上記飼料から誘導可能なエネルギーの量を改善するための、飼料の調製における酵素の使用であって、ここで、上記酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得る、使用。
３３．飼料を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、デンプンおよび酵素を混合する工程を、包含し、この酵素は、アミラーゼ活性を有し、耐性デンプンを分解し得る、プロセス。
３４．  飼料中の耐性デンプンを同定するための、デンプンを含む飼料のプロセスであって、ここで、上記プロセスは、候補成分と耐性デンプンとを接触させる工程、および上記耐性デンプンの分解の程度を決定する工程を包含し、ここで、その酵素は、アミラーゼ活性を有し、かつ耐性デンプンを分解し得、そして、ここで、その酵素は、以下の特徴：
ａ．デンプン結合ドメイン
ｂ．熱安定性であること
ｃ．ｐＨ安定性であること
ｄ．アミラーゼインヒビターに対して実質的に耐性であること
のうち１つ以上を含む、プロセス。
【０１９２】
上記の明細書において言及された刊行物のすべては、本明細書中で、参考として援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の改変物およびバリエーションは、本発明の範囲およびその精神を逸脱することなしに、当業者にとって明確である。本発明は、具体的な好ましい実施例と併せて記載されるが、特許請求される本願発明は、このような具体的な実施例に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者にとって明瞭な本発明を実施するための記載された様式の種々の改変物は、上記の特許請求の範囲内にあることが理解され得る。
【０１９３】
【数１】
2005511071.tif 000005
【０１９４】
【数２】
2005511071.tif 000006
【０１９５】
【数３】
2005511071.tif 000007
【国際調査報告】
2005511071.tif 000008
2005511071.tif 000009
2005511071.tif 000010
2005511071.tif 000011