(57)【要約】本発明は、細胞によって生成される分泌ポリペプチドを検出する方法、ならびに高レベルの分泌ポリペプチドを生成する細胞を選択するための方法に関する。このような方法は、細胞に導入された異種核酸によってコードされる、高レベルの分泌ポリペプチドを生成する細胞を選択するために使用され得る。本発明は、分泌ポリペプチドを生成する細胞を選択する方法を提供し、この方法は、細胞集団を提供する工程であって、ここで該細胞集団は、分泌ポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞を含む、工程；該細胞集団と、該分泌ポリペプチドに特異的に結合する化合物とを接触させる工程；該化合物の、該細胞の表面上の該分泌ポリペプチドへの結合を検出する工程；および該細胞の表面上の該分泌ポリペプチドに結合した該化合物の存在または量に基づいて、該細胞を選択する工程；を包含する。
2005526517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌ポリペプチドを生成する細胞を選択する方法であって、該方法は、以下の工程：
細胞集団を提供する工程であって、ここで該細胞集団は、分泌ポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞を含む、工程；
該細胞集団と、該分泌ポリペプチドに特異的に結合する化合物とを接触させる工程；
該化合物の、該細胞の表面上の該分泌ポリペプチドへの結合を検出する工程；および
該細胞の表面上の該分泌ポリペプチドに結合した該化合物の存在または量に基づいて、該細胞を選択する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞は形質転換細胞である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞は真核生物細胞である、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記細胞は哺乳動物細胞である、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞であって、前記細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞は、B細胞でも、B細胞と別の細胞との融合によって形成された細胞でもない、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記分泌ポリペプチドは抗体である、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記抗体はヒト化抗体である、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は標識されている、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記化合物は蛍光標識されている、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は抗体である、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記細胞の表面上の前記分泌ポリペプチドへの前記抗体への結合は、フローサイトメトリーにより検出される、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記細胞は、蛍光活性化セルソーティングにより選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記細胞は、前記細胞集団中の複数の細胞の表面上の前記分泌ポリペプチドに結合した化合物を呈示する該複数の細胞とともに選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記複数の細胞は、前記細胞集団のうちの少なくとも１％を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記複数の細胞は、前記細胞集団のうちの少なくとも５％を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法であって、前記細胞は、該細胞に加えて、全く細胞を含まない血管に投入される、方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の方法であって、該方法は、さらに以下の工程：
前記選択された細胞を培養して、前記分泌ポリペプチドを生成する第２細胞集団を生成する工程；
該第２細胞集団と、前記抗体とを接触させる工程；
該第２細胞集団中の細胞の表面上の該分泌ポリペプチドへの該抗体の結合を検出する工程；ならびに
該第２細胞集団中の細胞を、該細胞の表面上の該分泌ポリペプチドに結合した該抗体の存在または量に基づいて、蛍光活性化セルソーティングにより選択する工程を包含する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法であって、前記細胞集団と前記抗体とを接触させる工程は、４℃〜１０℃の間で行われる、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記細胞と前記抗体とを接触させる工程は、約４℃で行われる、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、さらに以下の工程：
前記選択された細胞を、前記分泌ポリペプチドの培養培地への分泌を可能にする条件下で、該培養培地中で培養する工程；および
該分泌ポリペプチドを、該培養培地から精製する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
分泌ポリペプチドを生成する細胞を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
細胞に、分泌ポリペプチドをコードする異種核酸を導入する工程；
該分泌ポリペプチドの合成を可能にする条件下で該細胞を培養する工程；
該細胞と、該分泌ポリペプチドに特異的に結合する化合物とを接触させる工程；
該分泌ポリペプチドの発現を、該細胞の表面上の該分泌ポリペプチドへの該化合物の結合によって検出する工程；ならびに
該細胞を、蛍光活性化セルソーティングにより選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
細胞によって生成される分泌ポリペプチドの存在または量を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
分泌ポリペプチドを生成する細胞と、該分泌ポリペプチドに特異的に結合する細胞とを接触させる工程であって、ここで該細胞は、B細胞でも、B細胞と別の細胞との融合によって形成される細胞でもない、工程；および
該細胞の表面上の該分泌ポリペプチドへの該化合物の結合を検出して、それにより、該細胞によって生成された該分泌ポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記細胞は、前記分泌ポリペプチドをコードする異種核酸を含む、方法。
【請求項２５】
細胞を選択する方法であって、該方法は、以下の工程：
分泌ポリペプチドをコードする核酸を含むように遺伝的に操作された複数の細胞を含む細胞集団を提供する工程；
該細胞集団と、該分泌ポリペプチドに特異的に結合する化合物とを接触させる工程；および
表面に該化合物が結合した該細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分泌性ポリペプチドを検出する方法に関し、より具体的には、分泌性ポリペプチドを高レベルで産生する細胞を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
分泌タンパク質は、一般に、そのアミノ末端に、これらを合成するリボゾームから小胞体（ＥＲ）へ導くシグナル配列を含む。タンパク質合成は、粗面小胞体膜に結合するリボゾーム上で完了する。完成したポリペプチド鎖は、ゴルジ複合体に移動し、そしてその後種々の目的に分類される。分泌経路において、合成され、分類されたタンパク質は、細胞から分泌されるものだけでなく、また、小胞体、ゴルジ体、およびリソソームの内腔に常在するタンパク質、ならびにこれらのオルガネラの膜および原形質膜に不可欠なタンパク質も含む。
【０００３】
ＥＲ内で最も新規に作製されたタンパク質は、輸送小胞に組み込まれ、この輸送小胞は、シス−ゴルジと融合するか、または互いに融合してシス−ゴルジ細網として知られる膜積重（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｔａｃｋ）を形成するかのどちらかである。シス−ゴルジから、特定のタンパク質が、異なるセットの逆行性輸送小胞を介してＥＲに回収される。大槽移動（ｃｉｓｔｅｒｎａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）として知られるプロセスにおいて、その内腔タンパク質の荷物を含む新規のシス−ゴルジ積重は、物理的に、シス位置（ＥＲに最も近い）からトランス位置（ＥＲから最も遠い）へと移動し、連続的に、まずは中間（ｍｅｄｉａｌ）ゴルジ槽に、次いでトランス−ゴルジ槽となる。このプロセスの間、膜および内腔タンパク質は、逆方向性の輸送小胞によって、後者から前者のゴルジ槽に絶えず回収される。このプロセスにより、酵素および他のゴルジ常在タンパク質は、シス−ゴルジ槽もしくは中間ゴルジ槽またはトランス−ゴルジ槽のいずれかに局在する。
【０００４】
細胞から分泌されることが運命付けられたタンパク質は、大槽移動によってゴルジのトランス面に移動し、次いで、トランスゴルジ細網と呼ばれる小胞のネットワーク複合体内に移動する。ここから、分泌性タンパク質は、分泌小胞に分配される。全ての細胞型において、少なくとも幾つかの分泌性タンパク質が、絶え間なく分泌される。これらのタンパク質は、トランス−ゴルジネットワーク内で、輸送小胞内へと分配され、この輸送小胞は、直ちに原形質膜に移動してこれに融合し、その内容物をエキソサイトーシスによって放出する。幾つかの細胞において、タンパク質の特定の組の分泌は、連続的ではない。これらのタンパク質は、トランス−ゴルジネットワーク内で分泌小胞へと分配され、この分泌小胞は、刺激（例えば、レセプターに対するホルモンの結合）を待ち受ける細胞内に、エキソサイトーシスのために貯蔵される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は、少なくとも部分的に、分泌性ポリペプチドが、このポリペプチドを産生する細胞表面上で検出され得ることの発見に基づく。細胞表面上における分泌性ポリペプチドの検出は、細胞の、分泌性ポリペプチドの産生能力についてのマーカーとして、使用され得る。従って、このような方法は、所定の分泌ポリペプチドを高レベルで産生する細胞を選択するために、使用され得る。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、分泌ポリペプチドを産生する細胞を選択する方法を特徴とし、この方法は、以下を包含する：細胞集団を提供する工程であって、ここでこの細胞集団は、分泌タンパク質をコードする異種核酸を含む細胞を含む、工程；細胞集団と、分泌ポリペプチドに特異的に結合する化合物とを接触させる工程；化合物の、細胞の表面上の分泌ポリペプチドへの結合を検出する工程；および細胞の表面上の分泌ポリペプチドに結合した化合物の存在または量に基づいて、細胞を選択する工程。
【０００７】
別の局面において、本発明は、分泌ポリペプチドを産生する細胞を選択する方法を特徴とし、この方法は、以下を包含する：細胞に、分泌ポリペプチドをコードする異種核酸を導入する工程；分泌ポリペプチドの合成を可能にする条件下で細胞を培養する工程；細胞と、分泌ポリペプチドに特異的に結合する化合物とを接触させる工程；分泌ポリペプチドの発現を、細胞の表面上の分泌ポリペプチドへの化合物の結合によって検出する工程；ならびに細胞を、蛍光活性化セルソーティングにより選択する工程。
【０００８】
「分泌ポリペプチド」は、合成され、そして細胞の分泌経路内で分類され、その後細胞から可溶形態で放出されるタンパク質を言う。「分泌ポリペプチド」は、代表的に、アミノ末端シグナル配列を含み、このシグナル配列は、細胞からのポリペプチドの放出に先立って、切断される。「分泌ポリペプチド」は、不可欠な膜タンパク質として存在する種類のタンパク質、または不可欠な膜タンパク質の切断によって細胞から放出される（例えば、ここでこの切断現象が、不可欠な膜タンパク質の可溶性細胞外領域を放出する）種類のタンパク質のことを言及しない。
【０００９】
「細胞の選択」は、細胞に、所定の物理的位置を割り当てるプロセスを言う。本発明の文脈において、細胞は、細胞表面上で分泌ポリペプチドに結合する化合物の存在または量に基づき、物理的位置を割り当てられる。所望の特徴を有さない細胞は、代表的に、選択された細胞と同じ物理的位置を割り当てられない。語句「細胞の選択」としては、例えば、細胞の蛍光特性（フローサイトメトリによって同定される）に基づく、収集管における細胞の投入（ｄｅｐｏｓｉｔ）（必要に応じて、同じまたは類似の特徴を有する他の細胞と一緒である）が、挙げられる。細胞を選択する方法の他の例としては、磁気分離およびパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）技術が挙げられる。
【００１０】
「異種核酸」は、組換え技術を用いて細胞に導入されているヌクレオチド配列を言う。従って、所定の細胞に存在する「異種核酸」は、細胞内に天然に存在しない（例えば、細胞のゲノム中に対応する同一の配列を有さない）か、および／または細胞内で、対応する同一の配列が天然に存在する位置と異なった位置に存在する（例えば、このヌクレオチド配列は、細胞のゲノム中の異なった位置に存在するか、構築物がゲノム中に組み込まれない場合の細胞内に存在する）。「異種核酸」は、２つ以上の細胞間の細胞融合現象の結果として細胞内に存在するヌクレオチド配列を言及しない。
【００１１】
細胞は、例えば、真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞のような哺乳動物細胞）または原核細胞であり得る。この細胞は、細胞株に由来するか、または初代細胞であり得る。１つの実施形態において、細胞は、形質転換細胞ではない。別の実施形態において、細胞は、Ｂ細胞でも、Ｂ細胞と別の細胞との融合によって形成される細胞でもない。
【００１２】
分泌ポリペプチドは、抗体（例えば、ヒト化抗体）であり得る。
【００１３】
この化合物は、標識（例えば、蛍光標識）され得る。この化合物は、抗体（例えば、蛍光標識化抗体）であり得る。
【００１４】
１つの実施形態において、細胞表面上の分泌ポリペプチドへの抗体の結合は、フローサイトメトリによって検出され得る。細胞は、必要に応じて、蛍光活性化セルソーティングによって、選択され得る。
【００１５】
細胞は、複数の細胞表面上で分泌ポリペプチドへの化合物の結合を示す細胞集団中で、複数の細胞と共に選択される。複数の細胞は、必要に応じて、細胞集団中の、例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより多くの細胞を含み得る。複数の細胞は、必要に応じて、細胞集団中の、例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下の細胞を含み得る。
【００１６】
細胞は、その細胞に加えて細胞を含まない管の中に投入され得る。
【００１７】
本明細書中で記載される方法は、以下の工程をさらに包含する：選択された細胞を培養して、分泌ポリペプチドを生成する第２細胞集団を生成する工程；第２細胞集団と、抗体とを接触させる工程；第２細胞集団中の細胞の表面上の分泌ポリペプチドへの抗体の結合を検出する工程；ならびに第２細胞集団中の細胞を、細胞の表面上の分泌ポリペプチドに結合した抗体の存在または量に基づいて、蛍光活性化セルソーティングにより選択する工程。１つの実施形態において、細胞集団を抗体に接触させる工程は、４℃〜１０℃（例えば、約４℃）で実施される。
【００１８】
本明細書中で記載される方法は、選択された細胞を、分泌ポリペプチドの培養培地への分泌を可能にする条件下で、培養培地中で培養する工程；および分泌ポリペプチドを、培養培地から精製する工程を、さらに包含し得る。
【００１９】
別の局面において、本発明は、細胞によって産生された分泌ポリペプチドの存在または量を決定する方法を特徴とし、この方法は、以下の工程を包含する：分泌ポリペプチドを生成する細胞と、分泌ポリペプチドに特異的に結合する細胞とを接触させる工程であって、ここで細胞は、Ｂ細胞でも、Ｂ細胞と別の細胞との融合によって形成される細胞でもない、工程；および細胞の表面上の分泌ポリペプチドへの化合物の結合を検出して、それにより、細胞によって生成された分泌ポリペプチドの存在または量を決定する工程。
【００２０】
１つの実施形態において、細胞は、分泌ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。
【００２１】
細胞は、例えば、真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞のような哺乳動物細胞）または原核細胞であり得る。この細胞は、細胞株に由来するか、または初代細胞であり得る。１つの実施形態において、細胞は、形質転換細胞ではない。
【００２２】
分泌ポリペプチドは、抗体（例えば、ヒト化抗体）であり得る。
【００２３】
この化合物は、標識（例えば、蛍光標識）され得る。この化合物は、抗体（例えば、蛍光標識化抗体）であり得る。
【００２４】
１つの実施形態において、細胞表面上の分泌ポリペプチドへの抗体の結合は、フローサイトメトリによって検出され得る。細胞は、必要に応じて、蛍光活性化セルソーティングによって、選択され得る。
【００２５】
別の局面において、本発明は、細胞を選択する方法を特徴とし、この方法は、以下の工程を包含する：分泌ポリペプチドをコードする核酸を含むように遺伝的に操作された複数の細胞を含む細胞集団を提供する工程；細胞集団と、分泌ポリペプチドに特異的に結合する化合物とを接触させる工程；および表面に化合物が結合した細胞を選択する工程。
【００２６】
細胞は、例えば、真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞のような哺乳動物細胞）または原核細胞であり得る。この細胞は、細胞株に由来するか、または初代細胞であり得る。１つの実施形態において、細胞は、形質転換細胞ではない。別の実施形態において、細胞は、Ｂ細胞でも、Ｂ細胞と別の細胞との融合によって形成される細胞でもない。
【００２７】
分泌ポリペプチドは、抗体（例えば、ヒト化抗体）であり得る。
【００２８】
この化合物は、標識（例えば、蛍光標識）され得る。この化合物は、抗体（例えば、蛍光標識化抗体）であり得る。
【００２９】
１つの実施形態において、細胞表面上の分泌ポリペプチドへの抗体の結合は、フローサイトメトリによって検出され得る。細胞は、必要に応じて、蛍光活性化セルソーティングによって、選択され得る。
【００３０】
細胞は、複数の細胞の表面上で分泌ポリペプチドへの化合物の結合を示す細胞集団中で、複数の細胞と共に選択される。複数の細胞は、必要に応じて、細胞集団中の、例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより多くの細胞を含み得る。複数の細胞は、必要に応じて、細胞集団中の、例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下の細胞を含み得る。
【００３１】
細胞は、その細胞に加えて細胞を含まない管の中に投入され得る。
【００３２】
本明細書中で記載される方法は、細胞表面上の分泌ポリペプチドの、単純、迅速かつ直接の検出を可能にし、必要に応じて、その後セルソーティングを行う。高速セルソーターは、何億もの細胞を、非常に優れた正確性で選別し、高生産性集団を大いに富化する。
【００３３】
本発明の利点は、細胞表面上の分泌ポリペプチドの存在を、細胞選択の指針のために使用することにより、この方法が、所定の分泌ポリペプチドを産生する細胞を選択するプロセスを、大いに容易にし得ることである。例えば、本発明の方法は、細胞培養培地中に分泌されたポリペプチドを検出するために、非常に骨の折れる集約的な高価なアッセイを実施する必要性を低減し得る。さらに、本発明の方法は、高産生性細胞株の同定のための細胞選択プロセスの間に分析される、個々のクローンの数を減少させ得る。
【００３４】
本発明の方法の別の利点は、標的細胞集団全体を包括的に調査するために使用され得、その理由で、形質転換細胞集団または増幅細胞集団に存在し得る全ての細胞が、分泌ポリペプチドの産生のために試験され得ることである。例えば、クローニングに頼る方法は、集団内の全ての細胞によって分泌されるポリペプチドの相対量の、直接の検出を提供しない。本発明の方法は、多数の細胞の直接の分析および所定の分泌ポリペプチドの相対発現レベルの決定を可能にする。
【００３５】
本発明の方法の別の利点は、クローニング（クローニングが所望される場合）の時点まで、標的細胞集団（例えば、分泌ポリペプチドにコードされる核酸でトランスフェクトされる細胞）における全ての細胞が、単回バッチにおいて扱われ得ることである。標的細胞集団の細胞の、比較的少ない操作しか必要とされないので、従って、多くの細胞株の産生が、容易にされる。免疫アッセイの手間および支出もまた、最初のスクリーニング工程が、フローサイトメーターを用いることにより実施され得るため、大いに低減される。
【００３６】
本発明の別の利点は、この方法が、所定の分泌ポリペプチドの産生を、直接検出することである。代わりに、選択可能マーカーまたはレポータータンパク質のような代理マーカーの検出に頼る方法は、分泌ポリペプチドをコードする核酸の転写のよい尺度を提供するが、分泌ポリペプチドの分泌のよい尺度を、必ずしも提供しない。例えば、核酸の転写の上昇は、必ずしも翻訳の上昇およびコードポリペプチドの分泌の上昇と相関しない。本発明の方法は、適切な細胞機構および高レベルの分泌ポリペプチドの産生を導く状態を保有する細胞の直接検出を可能にする。
【００３７】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および化学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と、同じ意味を有する。本明細書中で記載されるものと類似または等価である方法および材料が、本発明を実施または試験するために使用され得るが、代表的な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中で述べた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合は、本出願が、定義を含めて、支配する。材料、方法、および実施例は、単に例示的であるのみであり、限定を意図しない。
【００３８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白である。
【００３９】
（詳細な説明）
本発明は、ポリペプチドを産生する細胞表面上の分泌ポリペプチドを検出する方法を提供する。細胞表面上における分泌ポリペプチドの検出は、細胞によって産生される、所定の分泌ポリペプチドの存在または量に基づいて細胞を選択するために使用され得る。
【００４０】
本明細書中で記載されるスクリーニング方法（例えば、異種ポリペプチドの比較的高い産生細胞である細胞について、形質転換細胞株をスクリーニングすること）は、タンパク質分泌の間に、一時的に原形質膜に結合する分泌ポリペプチドを検出する。このように、分泌ポリペプチドは、化合物（例えば、タンパク質特異的抗体などの蛍光薬剤）で標識され得る。付属の実施例に記載のように、細胞表面上の標識化分泌ポリペプチドの蛍光強度は、クローンの選択のための優れた判断基準として使用され得、分泌ポリペプチドの比較的高い特異的産生性を有するクローンの選択をもたらす。
【００４１】
本明細書中で記載される方法は、細胞表面上の分泌ポリペプチドの単純かつ直接の検出を提供し、必要に応じて、その後にセルソーティングを行う。高速セルソーターは、何億もの細胞を、非常に優れた正確性で選別し、高生産性集団を大いに富化し、そして９６ウェルプレートのようなプレート内に、１ウェルにつき１細胞を投入し得る。付属の実施例に記載のように、３回の繰り返し（ｒｅ−ｉｔｅｒａｔｉｖｅ）選別に続けて１回の細胞シーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）は、非選別形質転換細胞集団よりも２０倍高い、特異的産生能力を有するクローンを生じることが見出された。さらに、セルソーティングによるクローンの選択後、メトトレキサート増幅を行うことは、特異的産生能力の１００倍を超える強化をもたらした。
【００４２】
（分泌ポリペプチド）
本発明は、分泌ポリペプチドを発現する細胞を、同定しそして選択する方法を含む。分泌ポリペプチドは、天然に存在するか、または天然に存在しないタンパク質である。分泌ポリペプチドは、細胞により自然に産生され得るか（例えば、細胞の遺伝子操作を一切無しで）、細胞に導入された異種核酸によってコードされ得るか、または分泌ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御する配列の挿入または活性化後、細胞によって産生され得る。
【００４３】
細胞から分泌される任意のポリペプチドが、本明細書中の方法において使用される。例えば、サイトカイン、リンホカインおよび／または増殖因子のような分泌ポリペプチドが産生され得、そしてこのようなポリペプチドを産生する細胞は、本明細書中に記載の方法に従って選択され得る。このような分泌ポリペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：エリスロポエチン、インターロイキン１−α、インターロイキン１−β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、リンホタクチン、リンホトキシンα、単球走化性物質タンパク質−１、単球走化性物質タンパク質−２、単球走化性物質タンパク質−３、メガポエチン（Ｍｅｇａｐｏｉｅｔｉｎ）、オンコスタチンＭ、Ｓｔｅｅｌ因子、トロンボポエチン、血管内皮細胞増殖因子、骨形成タンパク質、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、顆粒球コロニー刺激因子、白血病抑制因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンγ、インターフェロンβ、線維芽細胞増殖因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、トランスフォーミング成長因子α、ゴナドトロピン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、マクロファージ炎症タンパク１α、マクロファージ炎症タンパク１β、およびＦａｓリガンド。天然に存在しない、上記の任意のポリペプチドの分泌改変体を産生する細胞もまた、本明細書中に記載の方法に従い、同定され、そして選択され得る。
【００４４】
上記の分泌ポリペプチドに加えて、本明細書中に記載の方法はまた、所定のタンパク質の全てまたは一部を含む融合タンパク質を生成するために使用され得、この所定のタンパク質は、融合タンパク質の細胞からの分泌を指向するアミノ酸の配列に融合されている。いくつかの場合において、このような融合タンパク質は、代表的には細胞から分泌されないポリペプチド配列の分泌を可能にし得る。例えば、タンパク質の全てまたは一部（例えば、レセプターまたは細胞内タンパク質のような膜会合タンパク質）は、免疫グロブリン分子の一部に(例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖のヒンジ領域ならびに定常領域ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに）融合され得る。さらに、タンパク質の全てまたは一部は、異種シグナル配列に融合され得る。融合タンパク質の分泌を指向する配列に融合され得るタンパク質の例としては、本明細書中に記載の天然に存在する分泌ポリペプチドのいずれかに対するレセプターを含む、レセプター(例えば、リンホトキシン−βレセプター)が挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質をコードする核酸を調製するにあたって、細胞表面レセプターの天然に存在する膜貫通セグメントは、その核酸によってコードされる融合タンパク質の分泌を容易にするように除去され得る。
【００４５】
分泌ポリペプチドは、抗体または抗体の抗原結合フラグメントであり得る。その抗体は、抗原（例えば、タンパク質抗原（例えば、可溶性ポリペプチドまたは細胞表面レセプター））に対して指向され得る。例えば、その抗体は、免疫細胞活性化に関与する細胞表面レセプター（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４０、またはインテグリン（例えば、α１β１インテグリン））、疾患関連抗原(例えば、癌関連抗原（例えば、ＨＥＲ２または前立腺特異的膜抗原））、または病原体によって生成される抗原(例えば、ウイルス抗原または細菌抗原)に対して指向され得る。その抗体によって結合される特定のエピトープは、アミノ酸、炭水化物（例えば、糖）、無機部分（例えば、リン）、またはこれらの組み合わせによって形成され得る。このようなエピトープは、NまたはO結合型糖タンパク質、プロテオグリカン、およびリン酸化タンパク質中に見出され得る。
【００４６】
用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子またはその抗原結合部分をいう。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つ、例えば、２つの重鎖可変領域（「ＶＨ」）、ならびに少なくとも１つ、例えば、２つの軽鎖可変領域（「ＶＬ」）を含むタンパク質をいう。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）といわれる、より保存された領域が差し挟まった、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）といわれる、超可変性の領域にさらに細分化され得る。この抗体はさらに、重鎖および軽鎖の定常領域を含み得、これによって、それぞれ重鎖および軽鎖の免疫グロブリン鎖を形成する。一実施形態において、その抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖の４量体であり、ここでその免疫グロブリンの重鎖および軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって互いに連結される。重鎖定常領域は、３つのドメインである、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００４７】
分泌ポリペプチドは、完全なヒト抗体(例えば、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を生成するように遺伝的に操作されたマウスにおいて生成される抗体)、または非ヒト抗体（例えば、齧歯類（マウスまたはラット）、ヤギ、または霊長類（例えば、サル）の抗体であり得る。
【００４８】
抗体は、可変領域またはその一部（例えば、ＣＤＲ）が、非ヒト生物（例えば、ラットまたはマウス）において生成される抗体であり得る。キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体またはヒト化抗体は、本明細書中に記載の方法において分泌ポリペプチドとして使用され得る。
【００４９】
抗体は、当該分野で公知の方法によってヒト化され得る。例えば、ヒト化抗体は、抗原結合に直接は関与しないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域由来の等価な配列と置換することによって生成され得る。ヒト化抗体を生成するための一般的方法は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７により記載される。
【００５０】
（分泌ポリペプチドをコードする核酸）
本発明は、分泌ポリペプチドを発現する細胞を同定および選択する方法を包含する。いくつかの実施形態において、分泌ポリペプチドは、細胞に導入される異種核酸によってコードされるか、またはこの分泌ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節する配列の挿入または活性化後の細胞によって生成される。
【００５１】
細胞に核酸を導入するための任意の方法は、異種核酸によりコードされる分泌ポリペプチドを生成するために使用され得る。この核酸は、裸であり得るか、または送達ビヒクルと会合され得るかもしくは複合体化され得る。裸のＤＮＡの使用の説明については、例えば、米国特許第５，６９３，６２２号を参照のこと。
【００５２】
核酸は、トランスフェクション法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを使用するトランスフェクション、エレクトロポレーションによるトランスフェクション、またはカチオン性脂質試薬を使用するトランスフェクション）によって細胞に導入され得る。適切なトランスフェクション法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに記載される。
【００５３】
核酸は、送達ビヒクル（例えば、脂質、デポーシステム、ヒドロゲルネットワーク、粒子、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、マイクロスフェアまたはナノスフェア、マイクロカプセル、微粒子、金粒子、ウイルス様粒子、ナノ粒子、ポリマー、縮合剤（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ポリサッカリド、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、吸着増強物質、コロイド懸濁液、分散剤、粉末または脂肪酸）を使用して細胞に送達され得る。
【００５４】
ウイルス粒子（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ＳＶ４０ウイルス、アルファウイルス、レンチウイルス、またはヘルペスウイルス）はまた、異種核酸を細胞に導入するために使用され得る。
【００５５】
微粒子またはナノ粒子は、核酸を細胞に送達するためのビヒクルとして使用され得る。微粒子は、ポリマーマトリクスに埋め込まれるか、またはポリマーの殻に封じ込められた高分子を含み得る。微粒子は、例えば、ＤＮＡを非分解状態に維持することによって、高分子の完全性を維持するように作用する。
【００５６】
分泌ポリペプチドをコードする核酸構築物は、必要に応じて、選択マーカーまたはレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合において、選択マーカーまたはレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、分泌ポリペプチドをコードする核酸構築物とともに、細胞に同時導入される第２の核酸構築物中に含まれる。選択マーカーまたはレポータータンパク質は、分泌ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を同定するために、本明細書中に記載のスクリーニング法に加えて、さらなる機構を提供し得る。選択マーカーとしては、例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートに対する耐性を付与するタンパク質が挙げられる。レポータータンパク質としては、例えば、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）が挙げられる。本明細書中に記載の検出法および選択法は、選択マーカーまたはレポータータンパク質の存在下または非存在下で行われ得る。
【００５７】
（分泌ポリペプチドを生成する細胞の選択）
分泌ポリペプチドを生成する細胞は、その細胞と、分泌ポリペプチドに特異的に結合する化合物とを接触させること、およびその細胞の表面上の分泌ポリペプチドへの化合物の結合を検出することによって同定され得る。さらに、その細胞は、その細胞の表面上の分泌ポリペプチドに結合した化合物の存在または量に基づいて、他の細胞から選択され得る。細胞を「選択すること」は、単一の細胞を、その細胞のみを含む容器へと単離すること(例えば、細胞をクローニングするための単一の細胞をソートすること)、およびその細胞を、その細胞の表面上の分泌ポリペプチドへの化合物の結合に関するその細胞の類似の特徴に基づいて、複数の細胞とともに単離することを含む。
【００５８】
細胞は、フローサイトメトリーおよび細胞ソーティング技術によって、細胞集団中の他の細胞から選択され得る。フローサイトメトリーにおいて、細胞の測定は、光学センサおよび／または電気センサを通った流体流れの中の単一の列をなした細胞流として行われる。フローサイトメーターは、代表的には、光源としてレーザーを使用し、細胞により散乱した光を測定する。この散乱した光は、細胞のサイズおよび内部構造についての情報、ならびに細胞成分（例えば、抗原）に特異的かつ化学量論的に結合する色素もしくは標識されたプローブまたは試薬によって放出されたいくつかのスペクトル領域にある蛍光を提供する。フローソーティングは、さらなる分析のために、所定の特徴を有する細胞が、流れからそらされ、回収されるようにする。フローサイトメーターのオプティクスは、蛍光顕微鏡のオプティクスと類似である。フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングは、例えば、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら（２０００）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第３版，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；およびＧｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｆｉｒｓｔ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，第２版，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓに詳細に記載される。
【００５９】
フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングについて、分泌ポリペプチドに特異的に結合する化合物は、タンパク質（例えば、抗体）であり得る。その抗体は、この抗体に結合した標識（例えば、蛍光標識）を有し得る。あるいは、一次抗体に特異的に結合する二次化合物(例えば、二次抗体)が、使用され得る。ここでこの二次化合物は、標識を含むか、または標識を含む別の化合物によって結合されるかのいずれかである。例えば、分泌ポリペプチドに結合する抗体は、標識され得（例えば、ビオチン化され得）、次いで、分泌ポリペプチドに接触され得る。この抗体−分泌ポリペプチド複合体は、例えば、蛍光標識にカップリングしたアビジンで検出され得る。
【００６０】
本明細書中に記載される方法に従って、細胞は、１回以上のソーティングに供され得る。複数回のソーティングは、特に高レベルの分泌ポリペプチドを生成する細胞を富化するために使用され得る。細胞は、何回かの細胞ソーティングの間に培養され得るか、または細胞は、ソーティング手順の間に任意の培養器官を設けることなく再ソートされ得る。細胞は、必要に応じて、それらの２つ以上の異なる分泌ポリペプチドまたは１つの分泌ポリペプチドおよびレポータータンパク質の発現に基づいてソートされ得る。さらなるパラメーター（細胞のサイズ、細胞の生存度、または他の細胞表面マーカーの発現が挙げられるが、これらに限定されない）はまた、そのソーティング手順において使用され得る。
【００６１】
フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングに加えて、細胞は、細胞の表面の上の分泌ポリペプチドに特異的に結合した化合物を有する細胞の選択を可能にする種々の技術によって選択され得る。このような選択法の例としては、磁気分離技術(例えば、磁気標識化合物（例えば、磁性ビーズに特異的に引きつけられる抗体）を使用して)またはパニング技術が挙げられる。磁気分離およびパニング技術の説明については、例えば、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９２  １０２：７８９−９８を参照のこと。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の方法は、細胞の表面上の分泌ポリペプチドへの化合物の結合を、細胞をカプセル化する（例えば、細胞の周りにマトリクスを形成する）物質を細胞に添加し、そして／または細胞付近に分泌ポリペプチドを固定化することなく、検出することを包含する。例えば、化合物を細胞に接触させ、結合していない化合物を細胞から洗うために使用される緩衝液は、フローサイトメトリーおよび細胞ソーティング(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、必要に応じて、ウシ胎仔血清を含む)のための標準的な緩衝液であり得る。
【００６３】
本明細書中に記載の方法に従って検出および／または選択されるべき細胞は、その細胞が、分泌ポリペプチドに結合する化合物と接触されている間、ならびに関連づけられたインキュベーションおよび細胞洗浄期間の間に、約４℃〜１０℃（例えば、約４℃）の温度範囲において維持され得る。比較的低温で細胞を扱うことは、その分泌ポリペプチドの細胞表面でのそれらの保持、および化合物の特異的結合による、その後の細胞の検出を容易にし得る。
【００６４】
（分泌ポリペプチドの検出および精製）
本明細書中に記載の細胞関連スクリーニング法に加えて、分泌ポリペプチドは、所定の細胞からポリペプチドが分泌された後に、組織培養培地中で検出され得る。このような方法は、所定の細胞によって生成される分泌ポリペプチドの量を定量するために使用され得る。例えば、本明細書中に記載のようにソートされた細胞を含む細胞培養物に由来する組織培養培地のアリコートは、そこに含まれる所定の分泌ポリペプチドの量を決定するために使用され得る。このような測定は、本明細書中に記載の方法に従って選択される細胞が、分泌ポリペプチドを分泌しているか、または分泌ポリペプチドの規定の濃度を分泌しているかを確認するために使用され得る。分泌ポリペプチドを検出するための方法としては、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光法、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、およびウェスタンブロット分析が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的アッセイはまた、分泌ポリペプチドの生体活性を決定するために行われ得る。生物学的アッセイの性質は、分泌ポリペプチドの生物学的機能に従って変動し得る。
【００６５】
分泌ポリペプチドは、必要に応じて、分泌ポリペプチドを生成する細胞を含む組織培養培地から精製され得る。精製は、その培養培地と、分泌ポリペプチドに特異的に結合するアフィニティー因子（例えば、抗体）とを接触させることにより達成され得る。この分泌ポリペプチドは、必要に応じて、均一になるまで精製され得る。
【００６６】
本発明は、以下の実施例によりさらに例示されるものの、本発明の範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６７】
（実施例１：蛍光標識抗体を用いた形質膜での分泌組換えタンパク質の直接的生成物特異的染色）
ＣＨＯ細胞を、プラスミドベクターｐＡＮＤ１６２およびｐＡＮＤ１６０（それぞれ、α１β１インテグリンに対するヒト化モノクローナル抗体（ＡＱＣ２  ｍＡｂ）の軽鎖および重鎖をコードする）でトランスフェクトした。プラスミドｐＡＮＤ１６２は、ネオマイシン耐性選択マーカーをコードし、プラスミドｐＡＮＤ１６０は、野生型ＤＨＦＲをコードする。これらのプラスミドはともに、ＣＭＶ中間−初期プロモーターを使用し、このプロモーターは、ネイティブＣＭＶ中間初期遺伝子の開始コドン付近にあるポリリンカーに対してＴＡＴＡボックスの約５００ｂｐ上流の制限部位から伸びる。このプロモーター領域は、５’非翻訳領域にスプライスドナー部位およびアクセプター部位を含む。ポリアデニル化部位は、ヒト成長ホルモン改変体配列に由来する。
【００６８】
ＤＨＦＲ欠損ＤＧ４４  ＣＨＯ宿主細胞を、ヌクレオシドを含む無血清培地中のスピナー培養物として維持した。トランスフェクションを、エレクトロポレーションにより行った。トランスフェクト細胞株を、１０％  透析ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）および２ｍＭ  グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充したαマイナスＭＥＭ中で増殖させた。エレクトロポレーションの後、細胞を、６ウェル組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で培養した。感染の３日後、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を、１０％  透析ＦＢＳおよび２ｍＭ  グルタミンを補充したαマイナスＭＥＭを含む培地に添加した。一旦細胞が、約８０％コンフルエンスに達したら、ウェルをプールおよびソートした。
【００６９】
ヒト化ＡＱＣ２抗体をコードするｐＡＮＤ１６２プラスミドおよびｐＡＮＤ１６０プラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、蛍光標識抗ヒト抗体を用いて標識した。次いで、細胞の染色を、レーザー共焦点顕微鏡を用いて観察した。細胞を、共焦点分析するまで氷上に維持した。蛍光および微分干渉顕微鏡写真（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）を、赤色レーザーダイオードおよびＬｅｉｃａ共焦点ソフトウェアＶ２．００  ｂｕｉｌｄ  ０３６８（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ共焦点顕微鏡で獲得した。４０×油浸対物レンズを通して観察した細胞の顕微鏡写真を撮った。抗ヒト抗体でのトランスフェクト細胞の形質膜の強い染色が検出された。トランスフェクトしていないＤＧ４４  ＣＨＯ宿主細胞の形質膜の染色は、検出されなかった。フローサイトメトリーにおいて使用される検出器は、レーザー共焦点顕微鏡で使用される検出器より感度が高いので、フローサイトメトリーもまた、分泌ヒト化ＡＱＣ２抗体に対する蛍光試薬で標識されたトランスフェクトＣＨＯ細胞の集団を試験するために使用した（実施例３を参照のこと）。
【００７０】
（実施例２：メトトレキサートの非存在下での高生成組換えＣＨＯ細胞株の生成）
プラスミドｐＸＬＴＢＲ．９は、野生型ＤＨＦＲをコードするヌクレオチド配列、ならびにヒトＩｇＧドメインであるＣＨ２およびＣＨ３に融合されたリンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ−Ｉｇ）をコードするヌクレオチド配列を含む（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３３）。ｐＸＬＴＢＲ．９は、ｐＡＮＤ１６２およびｐＡＮＤ１６０について実施例１に記載されるように、ＣＭＶ中間−初期プロモーターを使用する。
【００７１】
ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を、実施例１に記載の方法に従って、エレクトロポレーションによりｐＸＬＴＢＲ．９でトランスフェクトした。このｐＸＬＴＢＲ．９トランスフェクト細胞株を、ＨＹＱＰＦ−ＣＨＯ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）（無血清培地）または無血清αプラスＭＥＭ培地（αプラスＭＥＭＳＦ）（ＦＢＳ非含有の富化αプラスＭＥＭ）中で増殖させた。
【００７２】
ｐＸＬＴＢＲ．９トランスフェクト体の１４日間を超える選択および結果の後に、細胞をプールし、ヤギ抗ヒトＩｇＧ分子のＲＰＥ標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを用いて４℃で標識した。これらの細胞を、染色されたネガティブコントロールＣＨＯ細胞とともに、分取用ソートの前に分析的フローサイトメトリーに供した。図１Ａは、ネガティブコントロール、非トランスフェクトＣＨＯ細胞のヒストグラムを示す。このＦＬ−２ヒストグラムは、生細胞ゲート（ＰＩ排除に基づく（左上）、および二重弁別ゲート（パルス幅  対  ＦＳＣ、ダブレットを排除する、右上）の組み合わせから得た。Ｒ２は、ソーティングゲートを示す。図１Ｂは、ｐＸＬＴＢＲ．９でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のヒストグラムを示す。ソートゲートＲ２を設定して、全ての３つの反復ソートについて、Ｒ−ＰＥポジティブ細胞の最も明るい５％を収集した。トランスフェクト細胞（図１Ｂ）は、蛍光強度が、ネガティブコントロールの蛍光強度を大きく超える細胞の集団（図１Ａ）を含む。トランスフェクト細胞の分取用ソーティングについて、ゲートを、細胞集団の蛍光強度の上から５％内の細胞を含むように設定した。このゲートにかけられた細胞をソートして、それらの細胞数を、選択条件下での培養によって増やし、このプロセスを２回より多く繰り返した。
【００７３】
ＬＴβＲ−Ｉｇ生成細胞株については、分析スキャンをソート後に行って、ソートの性能を評価した。分析スキャンおよび実験的に決定したプール中のＬＴβＲ−Ｉｇの特異的生成速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｅ）（ＳＰＲ）を、図２Ａ〜２Ｃに示す。ソートしていないトランスフェクト細胞は、約０．５ｐｇ／細胞／日（ｐｃｄ）のＳＰＲを有した。図２Ａの、最初のソート後に収集されたＬＴβＲ−Ｉｇ生成細胞のサンプルの分析スキャンは、そのソートが、増大した平均蛍光強度を有する集団を生じ、特異的生成性（ＳＰＲ値を、培養物中の細胞を増やした後に決定した）における対応する増大を生じたことを示す。図２Ｂの、第２のソート後に収集したＬＴβＲ−Ｉｇ生成細胞のサンプルの分析スキャンは、反復ソーティング後の蛍光強度および特異的生成性の両方において漸増的な増加を示す。図２Ｃは、第３のソート後に回収したＬＴβＲ−Ｉｇ生成細胞のサンプルの分析スキャンである。その細胞の３回のソーティングは、プールのＳＰＲ平均を、約１０倍、５．１ｐｃｄへと改善した（表１）。
【００７４】
表１：ＬＴβＲ−Ｉｇ発現細胞のソートされていないＣＨＯプールおよび連続してソートされたＣＨＯプールの特異的生成速度は、特異的生成性が反復ソーティングとともに増加することを示す

ＬＴβＲ−Ｉｇプール        平均ＳＰＲ（ｐｇ細胞−１日−１）±Ｓ．Ｄ．
ソートしていない                            ０．５±０．０
最初のソート                                ３．１±０．１
第２のソート  ２                            ４．５±０．３
第３のソート  ３                            ５．１±０．７          
表１に示されるＳＰＲアッセイ結果について、２×１０５細胞を、２ｍｌの血清含有培地中、９．６ｃｍ組織培養ディッシュ中で培養した。細胞および上清を、培養して３日後に採取した。ＳＰＲアッセイを、各サンプルについて三連で行った。
【００７５】
第３のソートの間に、クローンを、サイトメーターから９６ウェルプレートへと直接単離した。数週間後、４ｐｃｄと１１．５ｐｃｄとの間の範囲の特異的生成性を示すアッセイしたクローンを、維持した（表２）。最も生成性のクローンは、メトトレキサート増幅の必要なしに、特異的生成性において２３倍の富化を示した。５０クローンを、富化プロセスの間にＥＬＩＳＡによってアッセイした。タイムラインは、トランスフェクションから最も良好なクローンの同定まで、約９週間であった。
【００７６】
表２：３回の反復ＦＡＣＳソートに供されたプールから単離されたＬＴβＲ−Ｉｇ発現ＣＨＯクローンの特異的生成速度

ＬＴβＲ−Ｉｇクローン              平均ＳＰＲ（ｐｇ細胞−１日−１）  
１                                  ３．６±０．１
３                                  ５．６±０．６
５                                １１．５±０．２
８                                  ７．５±０．１
２１                                ９．９±１．４
２２                                ７．５±０．７
２４                                ９．３±０．８
２５                              １０．５±１．１              
表2に示される実験において、三連の３日間のＳＰＲアッセイを、各サンプルについて、血清含有培地中で行った。
【００７７】
本明細書中に記載の実験において、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によってソーティング前に採取し、次いで、全てのその後の取り扱いの間０〜４℃で維持した。これらの細胞を、７０μｍのナイロンメッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に通過させ、冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）で２回洗浄し、次いで、生存性について計数し、評価した。これらの細胞を、１０００ＲＰＭ、４℃で５分間の遠心分離によって再びペレットにし、蛍光標識抗体を含む冷ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中に再懸濁した。
【００７８】
最小限の１×１０７細胞を、形質膜表面ＬＴβＲ−Ｉｇ（または実施例３におけるヒト化ＡＱＣ２  ｍＡｂ）の検出のために、０．２〜１μｇ抗体／１×１０５細胞の濃度（２％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）中）のＲ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）結合体化ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色した。氷上で１５分間インキュベートした後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）中に再懸濁した。約５×１０５細胞を、ソーティング前に、ＦＡＣＳｃａｎサイトメーターにより分析前に除去した。トランスフェクトされていないＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。
【００７９】
分析フローサイトメトリースキャンを、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  ｖ３．０ソフトウェアおよび空冷アルゴンレーザー（４８８ｎｍの放射）を備えたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で実施した。５８５ｎｍバンドパスフィルタを使用して、ＰＥ発光をＦｌ−２で検出し、ＰＩ発光をＦｌ−３で検出した。
【００８０】
高速細胞ソートを、Ｓｕｍｍｉｔ  ３．０ソフトウェアおよびアルゴンレーザー（蛍光励起について４８８ｎｍで発光）を装備したＭｏｆｌｏフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）で実施した。ＰＥ発光を、６７０／４０ｎｍバンドパスフィルタを使用してＦｌ−２で検出した。ＰＩ発光を、６７０／４０バンドパスフィルタを使用してＦｌ−４で検出した。ＰＥ／ＰＩ発光スペクトルの重なり合いの比較を、ＳｕｍｍｉｔにおけるＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ’ｓ  ＤＳＰ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）ボードを用いて達成した。死細胞を、ＦＳＣ  対  Ｆｌ−４ドットプロットにおいて排除し、ダブレットを、ＦＳＣ幅  対  面積ドットプロットにおいて排除した。ＰＥ標識シグナルゲートを、生細胞をゲートにかけたＦｌ−２ヒストグラムに対して行った。ソーティングゲートは、生細胞ゲート、ダブレット弁別ゲート、およびＦｌ−２でのヒストグラムゲートの組み合わせであった。
【００８１】
ＬＴβＲ−Ｉｇ力価を、ＥＬＩＳＡにより組織培養上清から決定した。アッセイプレートを、ＬＴβＲ−Ｉｇ抗体でコーティングし、結合したＬＴβＲ−Ｉｇを、抗ヒトＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）によって検出した。ＬＴβＲ−Ｉｇの濃度を、標準物質の線形回帰分析によって決定した。
【００８２】
各集団またはクローンについて、１×１０５細胞を、２ｍｌの培養培地中、６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の１ウェルあたりに播種した。アッセイを、三連で行った。細胞を、３日間増殖させ、馴化培地を、分析のために採取し、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅにより取り出し、計数した。特異的ＬＴβＲ−Ｉｇ（または実施例３におけるように、ＡＱＣ２抗体）力価を、ＥＬＩＳＡにより、培養培地から定量的に決定された。ピコグラムの特異的タンパク質／細胞／日（ｐｇ細胞−１日−１）で測定されたこのＳＰＲは、増殖速度および生成性両方の関数であり、以下の式によって表される：
ＳＰＲ＝総タンパク質質量／積分細胞面積（ＩＣＡ）＝ｑＰ
ＩＣＡ＝（最終細胞数−最初の細胞数）×培養日数／ＬＮ（最終細胞数／最初の細胞数）。
【００８３】
（実施例３：メトトレキサート増幅組換えＣＨＯ細胞株の生成）
α１β１インテグリンに対するヒト化抗体（ＡＱＣ２  ｍＡｂ）の軽鎖および重鎖を、（実施例１に記載されるように）別個のプラスミドｐＡＮＤ１６２およびｐＡＮＤ１６０から、ＣＨＯ細胞において発現させた。ＤＨＦＲおよびＧ４１８の選択の下でトランスフェクションし、増やした後に、トランスフェクトした細胞集団全体（０．３ｐｃｄの特異的生成性を有する）を、ヤギ抗ヒトＩｇＧの蛍光Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで標識し、蛍光強度により測定された、上から２〜５％の発現細胞を、細胞ソーティングにより収集した。約１週間増やした後、ソートした細胞を、第２のソートに供した。細胞を、再び増やし、次いで、第３のソートの間、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１細胞で入れた。ＬＴβＲ−Ｉｇの場合（実施例２）のように、ソーティングは、標識細胞の蛍光強度、ならびにプールおよびクローン両方の測定された特異的生成性の安定した増加を生じた。
【００８４】
ＥＬＩＳＡによるＡＱＣ２  ｍＡｂの定量について、アッセイプレートを、ＡＱＣ２特異的抗原融合タンパク質でコーティングした。結合したＡＱＣ２  ｍＡｂを、ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出した。
【００８５】
約１１７クローンを、２４ウェルプレートへと拡大し、抗体力価についてスクリーニングした。その上位の発現クローンを、ＳＰＲアッセイにおいてさらに分析した。Ｇ４１８を、最も高い１０の発現クローンから除去し、次いで、これらのクローンを、１００ｎＭまたは２５０ｎＭいずれかのメトトレキサートを含む培地中でさらに増幅した。増幅したプールを、抗体力価についてスクリーニングした。１３．５ｐｃｄ以上のｑＰを示す集団を、高速細胞ソーティングおよび９６ウェルプレートへの上方の２％の発現集団の自己クローニングに供した。上から抗体生成クローンののうちの２つ（クローン５Ａおよび１１Ｂ）は、それぞれ、３．３ｐｃｄおよび８．０ｐｃｄの非増幅ｑＰを有した（表３）。クローン５Ａを、２５０ｎＭ  メトトレキサートの存在下で増幅した場合、１６．６  ｐｃｄの特異的生成性のプールを生成した。蛍光活性化細胞ソーティングおよびクローニングの後に、アッセイした５２クローンからの最高の生成クローン（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）は、４１．０ｐｃｄおよび３２．３ｐｃｄのｑＰを示した。同様に、クローン１１Ｂについては、１００ｎＭ  メトトレキサート中でのみ増幅した細胞は、１８ｐｃｄの特異的生成性を有し、スクリーニングした約１２６クローンから、３２．５ｐｃｄまでのクローンを生成した（表３）。
（表３：メトトレキサート（ＭＴＸ）増幅の前および後に、３回の反復ＦＡＣＳソートに供したプールから単離されたＡＱＣ２  ｍＡｂ発現ＣＨＯ細胞の特異的生成速度）
【００８６】
【表３】
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表２に示される実験については、各サンプルについて血清含有培地中、三連で、３日のＳＰＲアッセイを行った。
【００８７】
図３は、ＡＱＣ２  ｍＡｂをコードするプラスミドでトランスフェクトした非ソートＣＨＯ細胞（左）  対  増幅クローン１１ＢＡ−１００（右）の分析スキャンを示し、メトトレキサート増幅、ソートおよびクローニング後の後の平均蛍光強度および特異的生成性の両方における増加を示した。ＦＬ−２ヒストグラムを、生細胞ゲート内のＰＥシグナルの分析によって得た。図３は、トランスフェクト体の最初のプールと比較して、上位の１００ｎＭ  メトトレキサート増幅クローン１１ＢＡ−１００の平均蛍光強度において３２倍の増加を示す（これはまた、高レベルの生成物分泌に相関する）。２５０ｎＭ  メトトレキサート増幅プールは、１３．５ｐｃｄのｑＰを有し、類似のサイズスクリーニングで２７ｐｃｄまでのクローンを生成した（表３）。蛍光強度の増加は、タンパク質分泌における有意な増加と相関する。ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の場合において認められるように（実施例２）、蛍光強度は、分泌タンパク質の特異的細胞生成性についての有用な代理マーカーであった。
【００８８】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と共に記載されてきたが、前述の説明は、本発明の範囲を例示するのであって、限定することは意図されない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定される。他の局面、利点および改変は、添付の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＲＰＥ標識化ヤギ抗ヒト抗体で染色したトランスフェクトされないＣＨＯ細胞を示す度数分布図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐＸＬＴＢＲ．９でトランスフェクトし、ＲＰＥ標識化ヤギ抗ヒト抗体で染色したＣＨＯ細胞を示す度数分布図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ｐＸＬＴＢＲ．９でトランスフェクトし、１回の選別後、ＲＰＥ標識化ヤギ抗ヒト抗体で染色したＣＨＯ細胞を示す度数分布図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｐＸＬＴＢＲ．９でトランスフェクトし、２回の選別後、ＲＰＥ標識化ヤギ抗ヒト抗体で染色したＣＨＯ細胞を示す度数分布図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｐＸＬＴＢＲ．９でトランスフェクトし、３回の選別後、ＲＰＥ標識化ヤギ抗ヒト抗体で染色したＣＨＯ細胞を示す度数分布図である。
【図３】図３は、ＡＱＣ２  ｍＡｂをコードするプラスミドでトランスフェクトし、セルソーティング前（左）およびセルソーティング後（右）にＲＰＥ標識化ヤギ抗ヒト抗体で染色したＣＨＯ細胞を示す、度数分布図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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