(57)【要約】標的分子と相互作用する参照化合物を供し、標的分子の存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、少なくとも一種の化合物を包含する試験サンプルを供し、試験サンプルと標的分子の存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、少なくとも一種の試験化合物が、参照化合物の結合親和性より密接な結合親和性を示す標的分子と相互作用するかどうかを判定することを包含する、標的分子に対するリガンドを同定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子と相互作用する参照化合物を供し、
標的分子の存在下で、参照化合物の第一のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、
少なくとも一種の化合物を包含する試験サンプルを供し、
試験サンプルと標的分子の存在下で、参照化合物の第二のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、
少なくとも一種の試験化合物が、第一および第二のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、参照化合物を置換することによって標的分子と相互作用するかどうかを判定することを包含する、標的分子に対するリガンドを同定する方法。
【請求項２】
試験化合物が、参照化合物の結合親和性より緊密な標的分子に対する結合親和性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的分子の不在下で、参照化合物の第三のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、
第一、第二、および第三のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、試験化合物の解離定数を決定することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的化合物が、巨大分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
巨大分子が、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
巨大分子が、タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
試験化合物が、約１０マイクロモルより高くない水における溶解性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
参照化合物が、マイクロモル範囲で結合親和性を示す標的分子と相互作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試験化合物が、１マイクロモルより高い結合親和性を示す標的分子と相互作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、少なくとも一種の試験化合物が、標的分子と相互作用するかどうかを判定することは、信号における変化について少なくとも一種の参照化合物共鳴を評価することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、少なくとも一種の試験化合物が、標的分子と相互作用するかどうかを判定することは、シグナル強度の低下について少なくとも一種の参照化合物共鳴を評価することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
標的分子の不在下で、有望な参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、
標的分子の存在下で、有望な参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、
標的分子の存在および不在下で、有望な参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、有望な参照化合物が標的分子と相互作用するかどうかを同定することを包含し、参照化合物を同定する段階をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
参照化合物が、メチル基を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
試験サンプルが、二種またはそれより多くの試験化合物の混合物を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
試験サンプルを提供することが、複数の試験サンプルを供し、各試験サンプルが、一種またはそれより多くの試験化合物を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
各試験サンプルが、二種またはそれより多くの試験化合物の混合物を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
比較段階で使用するための標的分子の存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集する前に、
標的分子の様々な濃度で、または参照化合物の様々の濃度で、標的分子の存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、
標的分子と相互作用する少なくとも一種の試験化合物を同定するための最適な実験条件を決定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は、２００２年６月５日に出願された米国仮出願第６０／３８６，８９６号および２００３年３月９日に出願された米国仮出願第６０／４５３，５０４号の利点を特許請求し、両仮出願はそれらを全体として参照してここに組み込まれる。
【０００２】
核磁気共鳴ベース（ＮＭＲ−ベース）のスクリーニングは、タンパク質薬剤標的と相互作用する小型分子の同定のための有望な技法として生じた。この方法論は、固有の低感度に悩まされ、したがって、他のスクリーニング法より著しく多くのタンパク質材料を必要とするが、ＮＭＲで得られる結果は、より信頼できる。該方法は、他の技法で観察されるアーチファクトの種類の傾向が低い。低温ＮＭＲプローブ技法での最近の改善は、スクリーニングのために必要とされるタンパク質の量を減らすことができ、したがって、ＮＭＲを他のスクリーニングアッセイと競合させうる。
【０００３】
ＮＭＲベースのスクリーニングは、タンパク質標的シグナルまたはリガンドシグナルのいずれかを監視することにより行われうる。タンパク質シグナルの観察は、リガンド結合形態の有用な構造的情報を提供する。さらに、該技法は、リガンドのサイズまたはリガンド解離結合定数の上限により制限されない。しかし、緩和最適化技法（ＴＲＯＳＹ）が、１００キロダルトン（ｋＤａ）を越えてＮＭＲを扱いやすい分子サイズに拡大できるが、該方法は、多量のアイソトープ標識タンパク質を必要とし、その使用は、小型タンパク質の観察に限定される。
【０００４】
リガンドで観察されるスクリーニングは、タンパク質のサイズに限定されず、アイソトープ標識タンパク質を必要としない。リガンド観察に基づいたいくつかの方法が、文献で提案されている。これらの技法の内の１つは、多量の水の磁性化が、タンパク質リガンド複合体を介して、遊離リガンドに部分的に移動されるＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ（グラジエントスペクトロスコピーを介して観察される水−リガンド）実験である。ある種の方法は、遅い解離速度で強力に結合するリガンドを検出する能力に限度がある。１０８Ｍ−１ｓ−１の拡散−限定オン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）の仮定で、検出の上限は、１００ナノモル（ｎＭ）範囲で解離結合定数ＫＤを示す分子によって表される。
【０００５】
タンパク質に緊密に結合する化合物、または遅いオン速度を示す化合物は、タンパク質内のこれらの化合物の滞留時間が、従来のＮＭＲ実験で使用される混合時間枠（例えば、１から２秒まで）より長いので検出されない。したがって、必要とされるものは、比較的強力な結合剤、および必ずしもそのように強力ではない他の結合剤を検出するために使用されうる別のＮＭＲ法である。
【０００６】
本発明は、合理的な薬剤デザインに関する。特に、本発明は、標的分子（例えば、典型的にはタンパク質）と相互作用する化合物をスクリーニングする核磁気共鳴（ＮＭＲ）法を提供する。該方法は、結合相互作用を検出するＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ（グラジエントスペクトロスコピーを用いた水−リガンド観察）実験の使用を含む。
【０００７】
好ましくは、本発明は、競合結合実験（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）でのＷａｔｅｒＬＯＧＳＹの使用に関する。競合結合実験は、競合分子の存在下で、参照化合物の置換を含む。好ましくは、参照化合物は、マイクロモル範囲で結合親和性を示す標的分子と相互作用する。好ましくは、試験化合物は、１マイクロモル（例えば、ナノモル範囲で）より強力な（すなわち、より低い）結合親和性を示す標的化合物と相互作用する。試験化合物（すなわち、有望なリガンド）は、それが、標的分子から参照化合物を置換する場合、リガンドとして同定される。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、標的分子に対するリガンドを同定する方法を提供する。該方法は、標的分子と相互作用する参照化合物を供し、標的分子の存在下で、参照化合物の第一のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、少なくとも一種の試験化合物を包含する試験サンプルを供し、試験サンプルおよび標的分子の存在下で、参照化合物の第二のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、第一および第二のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを比較して、参照化合物を置換することによって、少なくとも一種の試験化合物が、標的分子と相互作用するかどうかを判定することを含む。好ましくは、試験化合物は、参照化合物の結合親和性より密接な標的分子に対する結合親和性を示す。
【０００９】
別の実施形態では、該方法は、任意に、標的分子の不在下で、参照化合物の第三のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、標的分子の存在下で、標的分子の不在下で、および試験サンプルと標的分子（すなわち、第一、第二、および第三のスペクトル）の存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較し、試験化合物の解離定数を決定することをさらに含む。
【００１０】
好ましくは、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、少なくとも一種の試験化合物が、標的分子と相互作用するかどうかを判定する段階は、信号における変化について（すなわち、水−リガンド核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）の反対信号（ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｉｇｎ）により）、少なくとも一種の参照化合物共鳴を評価することを包含する。代わりに、これは、少なくとも一種の参照化合物を、シグナル強度の低下について評価することを含みうる。
【００１１】
好ましくは、参照化合物を同定する段階は、標的分子の不在下で、有望な参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、標的分子の存在下で、有望な参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、標的分子の存在および不在下で、有望な参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、有望な参照化合物が標的分子と相互作用するかどうかを同定することを含む。
【００１２】
本発明は、植物および真菌抽出物のような化学的混合物（すなわち、二種またはそれより多くの試験化合物の混合物）の高速スクリーニングに有用な使用法も見出しうる。高速スクリーニング法は、通例、複数の試験サンプルを提供することを包含し、各試験サンプルは、一種またはそれより多くの試験化合物（しばしば化学的混合物）を包含する。
【００１３】
本発明は、競合結合実験でのＷａｔｅｒＬＯＧＳＹの使用法に関する。競合結合実験は、競合分子の存在下で、参照化合物の置換を包含する。好ましくは、参照化合物は、マイクロモルの範囲で結合親和性を示す標的分子と相互作用する。好ましくは、試験化合物は、１マイクロモル（例えば、ナノモル範囲で）より強力な（すなわち、より低い）結合親和性を有する標的分子と相互作用する。
【００１４】
この方法は、特に標的分子に対して比較的強い結合剤であるリガンドを同定するために有用であるが、広範な結合親和性のリガンドを同定するために使用できうる。比較的強力な結合剤は、一般に、約１マイクロモル未満、好ましくは約５００ｎＭ未満、さらに好ましくは約１００ナノモル（ｎＭ）未満の解離結合定数ＫＤを有するものとして定義される。
【００１５】
ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ法（グラジエントスペクトロスコピーを介した水−リガンド観察とも称される）は、大量の水のプロトンから、標的分子（例えば、タンパク質）と相互作用する化合物のプロトンへの磁性化の移動に基づく。ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ技法を使用して、結合化合物を、それらの水−リガンド核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）の反対の信号により、非結合剤と区別する。ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ法は、国際公開第０１／２３３３０号（２００１年４月５日公開）、およびＣ．Ｄａｌｖｉｔら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ、第１８巻、６５〜６８頁（２０００年）でさらに詳細に記述されている。
【００１６】
この説明は、「標的分子」（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）と考えることができる他の巨大分子にも使用するが、標的分子としてタンパク質に焦点を当てる。さらに詳細には、このＮＭＲ実験は、選択的手段で、タンパク質−リガンド複合体を介して、遊離リガンド（または有望なリガンド）に、磁性化を移動するために、多量の水磁性化を利用する。この実験では、非相互作用化合物のプロトン共鳴は、反対の信号とともに現れ、そして相互作用中のリガンドのものより弱い傾向にある。
【００１７】
ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ法は、水分子が、リガンドをタンパク質と連結させ、ほとんどの水分子が、３つまたはそれより多くの水素結合を作るという事実に基づく。これらの架橋水分子に加えて、他の水分子は、結合部位で識別される。水分子のプロトンの選択的励起、続いて混合時間は、大量の水から、開始磁性化（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）と同じ信号を伴うタンパク質−リガンド複合体に磁性化を有効に移動する。すなわち、この方法は、結合水から、「タンパク質−リガンド」複合体でのタンパク質と相互作用する化合物の近傍のプロトンへの磁性化の移動を含む。水から、タンパク質−リガンド複合体への磁性化移動を、不安定な官能基のプロトンとの化学的交換により補完しうる。両方の方法は、大量の水から、タンパク質−リガンド複合体に磁性化を移動するために構造的に作用する。
【００１８】
典型的には、選択的デカップリングまたは水シグナルの反転のいずれかにより、１Ｄ  ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験を行う。非相互作用の化合物は、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルでの負の強度によって特徴づけられ、一方で、タンパク質と相互作用する化合物は、正の強度によって特徴づけられる。
【００１９】
ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ法のパルス配列は、典型的に、９０°非選択的ＲＦパルス、１８０°選択的ＲＦパルス、および９０°非選択的ＲＦパルスの第一の要素、続いて、磁性化移動のための特定混合時間（典型的に１〜２秒）の第二の要素、続いて、シグナル検出のための第三の要素を包含する。第一の要素は、単に、単独の１８０°選択的ＲＦパルスも含むことができる。他のパルス配列も、水が選択的に励起される限り、第一の要素として使用されうる。「選択的」パルスは、特定の核スピン（すなわち、それは、特定のプロトンに特異的である）、この場合には、水のプロトン核に適合する特定の周波数に理想的に調整されるものである。「非選択的」パルスは、特定の周波数に調整されないが、しかし広範な周波数を励起するものである。シグナル検出の第三の要素は、水シグナルを減らすために別の高周波（ＲＦ）パルスを含みうる。水シグナルを抑制するための例示的なパルス配列は、例えば、Ｗ．Ｓ．Ｐｒｉｃｅ、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｏｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、１９９９年、第３８巻、２８９〜３５４頁に開示されている。
【００２０】
ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ法は、一種またはそれより多くの化合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを発生すること、標的分子を添加すること、および混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを発生することを含む。典型的には、２Ｄ  ＮＭＲ実験を行うことができるが、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験は、１Ｄ  ＮＭＲの使用を含む。このような２Ｄ実験は、２Ｄ同種核１Ｈ／１Ｈ実験を含み、そしてそれは、当業者に周知である。
【００２１】
ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹは、タンパク質およびＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを含めた巨大分子と相互作用する化合物の同定における一次ＮＭＲスクリーニングのための強力な方法である。例えば、その方法は、μＭ範囲で結合親和性を示すレセプターに結合する化合物の検出のために有用である。しかし、その方法はリガンド共鳴を検出する全ての技法と同様に、強力に結合するリガンド（すなわち、遅い解離速度を示すもの）を検出する能力において、ある程度限定される。本発明は、適切に設計された競合結合実験（ｃ−ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ）と共に、μＭ範囲で既知ＫＤを示す参照化合物の使用を通してこの問題を克服し、それは強力な結合剤の検出を可能にする。
【００２２】
一般に、本発明の方法は、標的分子と相互作用する参照化合物を供給すること、標的分子の存在下で参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集すること、少なくとも一種の試験化合物を含む試験サンプルを供すること、試験サンプルおよび標的分子の存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集すること、およびＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、参照化合物を置換することによって、少なくとも一種の試験化合物が標的分子と相互作用するかどうかを決定することを含む。好ましくは、試験化合物は、参照化合物のものより密接な標的分子に対する結合親和性を示す。
【００２３】
実験の節で示されるとおり、数学的表現は、適切なＮＭＲ実験条件を決定するために、および結合定数（すなわち、解離定数）の近似測定のために使用されうる。
【００２４】
リガンドの解離定数の任意の実験的測定については、その方法は、さらに、以下の段階を含む。すなわち、標的分子の不在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、標的分子の存在下、標的分子の不在下、および試験サンプルと標的分子の存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較することである。
【００２５】
上記のように、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、少なくとも一種の試験化合物が、標的分子と相互作用するかどうかを決定する段階は、信号における変化（すなわち、それらの水−リガンド核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）の反対の信号により）について少なくとも一種の参照化合物共鳴を評価することを含む。しかし、代わりに、これは、シグナル強度における減少（すなわち、結合参照化合物の分画が減ったことにより）について、少なくとも一種の参照化合物共鳴を評価することを包含できる。
【００２６】
ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ、および当業者に周知である分光学または生化学的アッセイのような他の方法を使用して、参照化合物を、同様に同定できる。好ましくは、参照化合物を以下の段階によって同定できる。すなわち、標的分子の不在下で、有望な参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、標的分子の存在下で、有望な参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを比較して、有望な参照化合物が標的分子と相互作用するかどうかを識別することである。
【００２７】
任意に、比較段階で使用するために、標的分子の存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集する前に、その方法は、様々の濃度の標的分子で、または様々の濃度の参照化合物で、標的分子の存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ核磁気共鳴スペクトルを収集し、標的分子と相互作用する少なくとも一種の試験化合物を同定するために最適な実験条件を決定することを含む。
【００２８】
本発明の方法で使用できる標的分子は、広範な分子、特にポリペプチド（好ましくは、タンパク質）、ポリヌクレオチド、有機高分子などのような巨大分子を含む。
【００２９】
ここで使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、あらゆる長さの高分子形態のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかに該当し、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。ポリヌクレオチドは、コード領域および非コード領域の両方を含む可能性があり、天然源（例えば、微生物）から直接的に得ることができるか、または組換え、酵素的、もしくは化学的技法の支援で調製できる。ポリヌクレオチドは、トポロジー上、線状または環状でありうる。ポリヌクレオチドは、例えば、発現もしくはクローニングベクターのようなベクターの一部、またはフラグメントでありうる。
【００３０】
ここで使用される場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸の高分子に該当し、特定の長さのアミノ酸の高分子を言及するものではない。したがって、例えば、用語のペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、および酵素は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含む。
【００３１】
参照化合物は、標的分子の存在下で、容易に観察され、正の強度のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルを生じるのに十分に低い結合親和性を示す選択標的分子と相互作用するものである。好ましくは、弱く結合する参照化合物を使用する。比較的弱く結合する参照化合物は、典型的には、少なくとも約１０マイクロモルまたはそれより高い解離結合定数ＫＤを示すものと定義される。
【００３２】
参照化合物は、好ましくは、メチル基を含み、それは典型的には強力なＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルを供する。そのようなメチル基は、しばしば、あまり水和せず、溶液中で遊離している場合、これらの参照化合物についてのより小さなＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルを生じる。
【００３３】
評価されうる試験化合物は、広範な化合物のいずれでもよく、それは標的に対して広範な結合親和性を潜在的に示す。本発明の方法は、比較的強い結合剤である化合物を検出する能力を有意に有する。比較的強力な結合剤は、典型的には、約１マイクロモルより少ない解離結合定数ＫＤを示すものと定義される。本発明の方法を使用してスクリーニングされうる化合物としては、例えば、植物抽出物、真菌抽出物、他の天然産物、および小型有機分子のライブラリーが挙げられる。
【００３４】
本発明は、広い範囲の溶解度を示す化合物のライブラリーからリガンドをスクリーニングできる（その方法は、特に、非常に低い溶解度を示す化合物に修正できる）。有意に、かつ有利に、特定の実施形態については、本発明は、好ましくは、比較的低い濃度の標的（すなわち、標的分子）、および標的に対する低い比の試験化合物で、結合アッセイを行うことを包含する。したがって、本発明の好ましい実施形態は、極僅かに溶解性がある化合物の検出に対処する。典型的に、かつ好ましくは、試験化合物は、約１０μＭより高くない水の中での溶解性を示す。
【００３５】
所望の場合、高い濃度を使用できるが、好ましくは、各サンプルでの各試験化合物の濃度は、約１００μＭより高くない。しかし、本発明の方法の有意な利点は、非常に低いリガンド濃度（例えば、約１０μＭより大きくない）を使用できるということである。好ましくは、標的分子の濃度は、約１μＭから約１０μＭまでである。
【００３６】
使用される試験化合物と標的化合物の正確な濃度および比は、標的分子のサイズ、利用可能な標的分子の量、所望の結合親和性検出限度、およびデータ収集の所望の速度により変動しうる。強力に結合するリガンドを検出する本発明の方法を使用することは、望ましいが、中程度およびいっそう弱く結合しているものも、所望の場合、検出されうる。以下でより詳細に記述されるとおり、検出のための親和性強度における下限は、方程式（２）により参照化合物（すなわち、様々のＫＤ）および／または様々の［ＩＴＯＴ］／［ＬＴＯＴ］比を適切に選択することによって調整されうる。
【００３７】
本発明は、化学的混合物（すなわち、二種またはそれより多くの試験化合物の混合物）の高速スクリーニングについて有用な使用も見出しうる。高速スクリーニング技法は、通例、複数の試験サンプルを供給することを包含し、各試験サンプルは、一種またはそれより多くの試験化合物（しばしば、二種またはそれより多くの試験化合物の混合物）を包含する。
【００３８】
いったんリガンド（好ましくは、高親和性リガンド）を、同定し、確認したら、その構造は、活性または親和性について分析されるべき類似の構造を有する利用可能な化合物を同定するために、または活性または親和性について分析されるべき構造的に関連のある化合物の合成を指示するために使用される。その後、これらの化合物は、在庫品から得られるか、または合成されるかのいずれかである。最も頻繁には、その後、それらは、酵素的アッセイを使用して活性について分析される。酵素でないか、または酵素的アッセイを利用可能にしない分子標的の場合に、これらの化合物は、上に記述されるものに類似のＮＭＲ技法を使用して、または等温変性熱量測定法のような他の物理的方法により、親和性について分析されうる。
【００３９】
ある種の例では、リガンド結合を、より複雑なＮＭＲ実験、または熱量測定法もしくはＸ線結晶学のような他の物理的方法を使用してさらに検討する。
【００４０】
本発明の目的および利点を、さらに以下の実施例によって示すが、しかしこれらの実施例で引用される特定の材料および量、並びに他の条件および詳細は、本発明を不必要に限定すると見なされるべきでない。
【００４１】
（実験的プロトコール）
脂肪酸遊離ヒト血清アルブミン（Ａ−３７８２）を、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）から購入し、さらなる精製なしに使用した。ショ糖（Ｓ７９０３）および７−ＣＨ３−Ｄ，Ｌ−Ｔｒｐ（Ｍ８３７９）を、シグマ社から購入し、５−ＣＨ３−Ｄ，Ｌ−Ｔｒｐ（６９５６０）および６−ＣＨ３−Ｄ，Ｌ−Ｔｒｐ（６９５７０）を、フルカ社（Ｆｌｕｋａ）から購入した。ジアゼパムを、カルロ・エルバ社（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ）から購入した。ＮＭＲサンプルは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（シグマ社）ｐＨ７．４中にあった。ロックシグナルのための溶液（８％最終濃度）に、Ｄ２Ｏを添加した。
【００４２】
ＮＭＲ実験。全てのスペクトルを、５ミリメーター（ｍｍ）三重共鳴逆プローブおよびオートサンプラーを装備したＶａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計を用いて、２９３Ｋで記録した。各サンプルについて、参照スペクトルおよび１Ｄ  ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを記録した。ここに記録したＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験のために使用されるパルス配列版の詳細は、文献で見ることができる（Ｃ．Ｄａｌｖｉｔら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ、第２１巻、３４９〜３５９頁（２００１年））。第一の水選択的１８０°パルスは、長さ２５ミリ秒（ｍｓ）であった。全長の混合時間（１．５秒（ｓ））の間、弱い矩形ＰＦＧを使用する。２ｍｓの短い傾斜回復時間を、検出パルスの前の混合時間の終わりに導入した。二重スピン−エコー・スキーム（Ｔ−Ｌ．Ｈｗａｎｇら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ａ、１９９５年、第１１２巻、２７５〜２７９頁）の２つの水選択的１８０°平方パルスは、長さ２．６ｍｓであった。傾斜回復時間は、０．２ｓであった。７４０７Ｈｚの掃引幅、０．６４８ｓの補足時間（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）、および２．６４８ｓの緩和遅延で、データを収集した。フーリエ変換の前に、１Ｈｚの線状の広がりを示す指数関数で、データを掛けた。
【００４３】
ＩＴＣ実験。ＶＰ−ＩＴＣ滴定熱量計（マイクロカル社（ＭｉｃｒｏＣａｌ））を使用して、３０μＭのタンパク質濃度および１．５ｍＭのリガンド濃度で、ＰＢＳ緩衝液（シグマ）中で、２９８Ｋで、熱量測定を行った。タンパク質を、特定の実験で使用される緩衝液に注入することによって、ブランク滴定で、希釈熱を測定し、結合熱から引いた。オリジン・ソフトウエア・パッケージ（マイクロカル社）に含まれるルーチンを使用して、非線形最小二乗法によって、熱力学的パラメータを測定した。
【００４４】
（結果および検討）
同定されたＮＭＲヒット（ＮＭＲ−ｈｉｔ）の特異性を決定するために、既知の阻害剤で行われるＮＭＲ競合結合実験を使用した。適切に設計されたこれらの競合結合ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験を、目的のタンパク質に対する強力なリガンドの検出のための化学的混合物をスクリーニングするために使用できる。これらの実験は、ｃ（競合）−ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験と称される。
【００４５】
参照化合物のプロトンｉについての実験的ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルＩＷＬの強度は、式
【００４６】
【数１】
2005529337.tif 000002
によって供される。
σは、それぞれ、結合および遊離状態でのプロトンｉに関与する異なる交差緩和速度である。指数ｊは、リガンド交換可能なプロトンであり、ｋは、リガンド近傍のタンパク質プロトンであり、ｗは、リガンド近傍の水分子である。量「Ｌ」および「ＥＬ」は、それぞれ、遊離および結合リガンドの濃度に対応する。２つの濃度は、方程式［Ｌ］＝［ＬＴＯＴ］−［ＥＬ］（式中、［ＬＴＯＴ］は、総リガンド濃度である）を介して互いに関連する。［ＬＴＯＴ］＞＞［ＥＴＯＴ］（総タンパク質濃度）である場合、［ＬＴＯＴ］は、方程式（１）で［Ｌ］を置換できる。用語
【００４７】
【数２】
2005529337.tif 000003
は、タンパク質の不在下で参照化合物のプロトンｉの実験的水和に対応する。ここで、用語ＩＷＬＯＧＳＹは、測定されたＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルＩＷＬの強度に該当し、実験から得られる補正条件は、タンパク質の不在下でリガンドについて記録した。
【００４８】
競合分子の存在下で、参照化合物のタンパク質結合濃度は低下する（Ａ．Ｆｅｒｓｈｔ、「酵素の構造および機構」（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５年、９８〜１２０頁）。競合相手の存在および不在下で、参照化合物についてのＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナル強度比は、方程式（２）、
【００４９】
【数３】
2005529337.tif 000004
（式中、ＩＷＬＯＧＳＹ（＋）およびＩＷＬＯＧＳＹ（−）は、それぞれ、競合相手の存在および不在下で、参照化合物の強度である。）により示される。量［ＥＴＯＴ］、［ＬＴＯＴ］および［ＩＴＯＴ］は、それぞれ、タンパク質、参照化合物および競合相手の濃度である。量ＫＤおよびＫＩは、それぞれ、参照化合物と競合相手についての解離結合定数である。方程式（２）を導く上で、正および負の協同作用効果の不在を仮定した。
【００５０】
図１は、競合相手のＫＩの関数として参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルのシミュレーションを示す。シミュレーションについては、それぞれ、５０μＭおよび２μＭの参照化合物およびタンパク質濃度を推定した。２つの異なる濃度５μＭと１０μＭが競合相手について考慮された。
【００５１】
このシミュレーションから、競合相手の存在下で、参照化合物のシグナル減衰は、ＫＤ、ＫＩおよび［ＩＴＯＴ］によることは明らかである。したがって、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルを単に監視することによって、化学的混合物中の強力な阻害剤の存在を間接的に検出することが可能である。検出のための親和性強度における下限は、方程式（２）により、参照化合物（すなわち、様々なＫＤ）および／または様々な［ＩＴＯＴ］／［ＬＴＯＴ］比を適切に選択することによって調整されうる。
【００５２】
このアプローチは、第一に、目的のタンパク質標的に対して弱い親和性リガンドをＮＭＲまたは他の技法を使用して同定することを必要とする。この化合物についての結合定数は、方程式（２）および図１により、実験を適切に設計するために、計算されるべきである。可能な場合、メチル基を有する化合物が、実験の感度を最大限にするために選択されるべきである。これは、タンパク質消費の低下を可能にする。
【００５３】
十分に特徴づけられたタンパク質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、ｃ−ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹの使用を示すための試験例として選択した。例えば、ナプロキセン、ジアゼパムおよびイブプロフェンのような薬剤は、部位ＩＩでＨＳＡに結合することが知られている（Ｐｅｔｅｒｓ  Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｊｒ．「アルブミンの生化学、遺伝学および医療への応用のすべて」（Ａｌｌ  ａｂｏｕｔ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６年、１０９〜１１６頁）。内生的アミノ酸トリプトファンも、ＨＳＡの部位ＩＩで結合する（ＭｃＭｅｎａｍｙ，Ｒ．Ｈ．、Ｏｎｃｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．「血清アルブミンへのＬ−トリプトファンの特異的結合」（Ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｔｏ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９５８年、第２３３巻、１４３６〜１４４７頁）。
【００５４】
したがって、有望な参照分子を同定する目的で、３つのメチル−トリプトファン誘導体、すなわち５−ＣＨ３、６−ＣＨ３、および７−ＣＨ３  Ｔｒｐを選択した。図２で示される３つの誘導体のスペクトルは、ＨＳＡについてのリガンドとして６−ＣＨ３  Ｔｒｐを同定した。他の２つの誘導体５−ＣＨ３、および７−ＣＨ３  Ｔｒｐは、図２での負のシグナルによって示されるとおり、タンパク質と相互作用しない。環の５位または７位でメチル基によるプロトンの簡単な置換は、ＨＳＡへの結合を完全に破壊する。図３で示されるとおりＩＴＣ測定により、これらの成果を確認した。さらに、この技法は、２．７±０．２  １０４モル−１であると決定された選択の参照化合物（すなわち、６−ＣＨ３Ｔｒｐ）についての会合結合定数（ＫＢ）を提供した。
【００５５】
ｃ−ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹアプローチでは、タンパク質の不在下で、選択された参照化合物についてのスペクトルを最初に獲得する。これは、上記の水和補正条件を引き出すことを可能にする。その後、タンパク質の存在下で、参照化合物についての同一のスペクトルを獲得する。ただ１回、これらの２つのスペクトルを獲得し、その後、全てのスクリーニング済み化学的混合物の分析のために使用する。ＨＳＡの不在および存在下で、６−ＣＨ３  Ｔｒｐのメチル基を含む小さなスペクトル領域は、それぞれ、図４ａ、ｂで示される。続いて、図４ｃで示されるとおり、タンパク質および参照化合物の存在下で、化合物混合物（本実施例でショ糖、７−ＣＨ３  Ｔｒｐおよびジアゼパム）についてのＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを獲得する。その後、混合物の不在および存在下で、参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルを比較した。混合物の存在下で記録されたスペクトルでの参照化合物共鳴の信号の変化または実質的なシグナル減少（図４ｃに示されるとおり）は、混合物を含む１つまたはそれより多くの化合物が、有望なリガンドであり、そして参照化合物（６−ＣＨ３  Ｔｒｐ）をタンパク質から置換することを示すものである。参照化合物の存在下で行われた化学的混合物のデコンボリューションは、図５に示される。６−ＣＨ３Ｔｒｐのシグナル強度変化で、ショ糖（図５ｂ）および７−ＣＨ３Ｔｒｐ（図５ｃ）の存在下で観察されたものはないのに対して、劇的なシグナル減少が、ジアゼパム（図５ｄ）の存在下で観察された。このデコンボリューションにより、混合物に存在する高親和性リガンドとしてジアゼパムの同定が可能になる。
【００５６】
シグナル減少の計算（適切な補正と共に）および参照化合物（６−ＣＨ３Ｔｒｐ）のＫＤの知識は、方程式（２）により同定済みリガンド（ジアゼパム）の解離結合定数の概算または下限を供する。方程式（２）が、タンパク質濃度条件から誘導する効果も考慮するため、これは、単独点測定で達成される。この寄与は、両方のリガンドの濃度が、タンパク質濃度およびＫＤに比較して遥かに高いと考えられ、文献から得られ（Ｙ．−Ｃ．Ｃｈｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９７３年、第２２巻、３０９９〜３１０８頁）、ＮＭＲ研究で使用される（Ｍ．Ｍａｙｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１年、第１２３巻、６１０８〜６１１７頁）ＩＣ５０方程式で軽視されている。
【００５７】
方程式（２）は一般的な式であり、競合結合実験で検討された他のＮＭＲパラメータに利用可能であるべきである。６−ＣＨ３  Ｔｒｐについて６５％のシグナル減少および３７μＭのＫＤで、２μＭ＋／−１μＭのジアゼパムについての結合定数を概算し、それは、文献（Ｕ．Ｋｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９９１年、第２７３巻、６４１〜６４４頁）で報告される２．６μＭの値に近い。方程式（２）で、ｎＭ範囲で、結合定数を用いて、非常に強力な結合リガンドを測定することが可能であることに注目すべきである。この目的のために、低い競合阻害剤濃度（ｎＭ）さえ使用することが必要である。
【００５８】
ここで記述される方法は、植物または真菌抽出物に存在する高親和性リガンドの同定にも使用できる。抽出物に存在する様々の成分の組成および濃度は知られていない。それにもかかわらず、抽出物での強力な結合リガンドの存在の知識は、活性化合物の分離および単離で化学者を導くことができる。
【００５９】
弱く結合する参照化合物を、全てのＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験で使用することが、推奨される。弱い、および中程度の強度の阻害剤を調べることにおいて、混合物構成要素の濃度は、参照化合物についてと同じであるべきである（例えば、５０μＭのＫＤ）。混合物の化合物についての正のシグナルの特徴的外観は、目的の標的に対するリガンドとしてその分子を同定する。これが、参照化合物についてのシグナル減少がないことと関連する場合、方程式（２）により、化合物は、参照分子と競合せず、タンパク質の異なる部位で結合すると結論づけることが可能である。しかし、参照化合物についての正のシグナルの不在または強度の減少は、混合物を含む分子の内の１つが、高い親和性リガンドであることを示す。その後、混合物のデコンボリューションは、分子の同定を可能にする。このアプローチを使用して、弱い、および強力な阻害剤の両方を検出する。ＡＴＰ結合部位で結合する強力なキナーゼ阻害剤の探索において、ｃ−ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ技法がうまく適応された。それぞれ、２μＭおよび５μＭほどの低いタンパク質およびリガンド濃度を、これらの研究で使用し、したがって、僅かに可溶性である（データは示されず）強力な阻害剤の同定を可能にした。
【００６０】
（結論）
このデータは、適切に設計されたｃ−ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験と共に中程度−低い親和性参照化合物の使用が、高い親和性リガンドの間接的検出を可能にすることを示した。同定分子の解離結合定数の近似値または下限は、単独点測定で引き出されうる。該技法は、化学的混合物および天然産物の抽出物の高速スクリーニングのために特に適切である。最後に、該実験は、タンパク質と小型分子の相互作用に限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントと相互作用する分子の同定でも有効に使用されうる。
【００６１】
ここで引用される特許、特許文献、および公報の完全な開示は、各々が個々に組み込まれるかのように全体として参照して組み込まれる。本発明に対する種々の変更および改変は、本発明の範囲および概念から逸脱することなく、当業者に明らかになる。本発明は、ここに示される例示の実施形態および実施例により過度に限定されることが意図されないと理解されるべきである。このような実施例および実施形態は、以下のとおりここに示される特許請求の範囲によってのみ限定されることを意図する本発明の範囲で、実施例によって示される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１Ａおよび１Ｂ。競合相手の解離結合定数ＫＩの関数としての参照化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナル減衰。方程式２を使用し、５μＭ（図１Ａ）および１０μＭ（図１Ｂ）の競合相手の濃度で、シミュレーションを行った。タンパク質および参照化合物濃度は、それぞれ、２および５０μＭであった。競合相手の存在および不在下での参照化合物についてのＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルの比は、Ｙ軸上に表示され、競合相手についての解離結合定数（μＭで）は、Ｘ軸上に表示される。Ｙ軸上の値１は、競合相手、それに加えて、遊離リガンドの水和から生じるオフセット（ｏｆｆｓｅｔ）の不在下で観察される参照化合物のシグナルに対応する。Ｙ軸上の値０は、参照化合物についてのただ１つのタンパク質結合部位の近傍で、タンパク質の不在下で化合物のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルに対応する。参照化合物の４つの異なる結合定数ＫＤ（グラフで示された値）について、シミュレーションを行った。
【図２】５０μＭ５−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ（上部）、５０μＭ６−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ（中央）および５０μＭ７−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ（下部）の存在下で、５μＭヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液について記録された一次元ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトル。表示の拡張スペクトル領域は、メチル基シグナルを含む。スペクトルを、２０４８スキャン、２．６秒の反復時間および１．５秒の混合時間で記録した。正および負のシグナルは、それぞれ、ＨＳＡ結合および非相互作用分子を識別する。
【図３】ＨＳＡに対するトリプトファン類似体の結合で測定された等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）データ。上部パネルは、ＨＳＡへの７−ＣＨ３  Ｔｒｐ（ａ）、５−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ（ｂ）、および６−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ（ｃ）の一連の注入より得られる生の熱データを示す。図の上部パネルで示される集積された熱シグナルは、下部パネル（７−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ：白抜き円、６−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ：塗潰し四角、５−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ：塗潰し三角）で示される正常化結合等温線を生じた。希釈熱を、ブランク滴定で収集し、データから引いた。最終結合熱効果で、それぞれ、５−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐおよび７−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐについて観察されたものはなく、これらの化合物は、ＨＳＡと相互作用しないのに対して、６−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐを使用して、負の結合熱を観察したことを示した。実線は、測定データに適した非線形最小二乗によって得られる最適合パラメータを使用して、計算した曲線を示す。計算した結合パラメータは、化学量論（Ｎ）：０．９８、ＫＢ：２．７±０．２  １０４モル−１、ΔＨｏｂｓ：１．９±０．１キロカロリー／モル、ΔＳ：１３．７９ｃａｌ／（モルＫ）であった。
【図４】５０μＭ６−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ（ａ）について、３つの化合物混合物（１０μＭショ糖、１０μＭ  ７−ＣＨ３  Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐおよび１０μＭジアゼパム）の不在下（ｂ）で、および存在下（ｃ）での５μＭ  ＨＳＡを伴う５０μＭ６−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐについて記録された一次元ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトル。表示のスペクトル領域は、トリプトファン誘導体の６−ＣＨ３シグナルを含む。スペクトルを、４０９６スキャン、２．６秒の反復時間および１．５秒の混合時間で獲得した。二重スピン−エコーの長さは、ほとんどのタンパク質シグナルを破壊し、したがって平坦な基本線を得るために、２５．２ミリ秒（ｍｓ）だった。
【図５】１０μＭショ糖（ｂ）、１０μＭ  ７−ＣＨ３  Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐ（ｃ）および１０μＭジアゼパム（ｄ）の不在下（ａ）および存在下で５０μＭ６−ＣＨ３Ｄ，Ｌ  Ｔｒｐを伴う５μＭ  ＨＳＡ溶液について記録された一次元ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトル。表示のスペクトル領域は、トリプトファン誘導体の６−ＣＨ３シグナルを含む。他の実験条件は、図４と同じである。
【図１】
2005529337.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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