(57)【要約】磁性材料およびマトリクス材料を含み、磁性材料が磁場への曝露に際して残留性でありマトリクス材料が液相の存在下で粒子の解離を促進する官能基を含む表面を有する、標的物質を結合することができる磁性粒子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性材料およびマトリクス材料を含み、磁性材料が磁場への曝露に際して残留性であり、かつマトリクス材料が液相の存在下で粒子の解離を促進する官能基を含む表面を有する、標的物質を結合することができる磁性粒子。
【請求項２】
磁性材料が磁性金属酸化物を含む、請求項１に記載の磁性粒子。
【請求項３】
磁性金属酸化物が鉄酸化物を含み、任意にその第一鉄のすべてまたは一部が、カドミウム、クロム、コバルト、銅、マグネシウム、マンガン、ニッケル、バナジウム、および／または亜鉛から選択された二価遷移金属で置換されている、請求項２に記載の磁性粒子。
【請求項４】
磁性材料がフェリ磁性材料を含む、請求項１から３のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項５】
フェリ磁性金属酸化物がフェリ磁性磁鉄鉱を含む、請求項４に記載の磁性粒子。
【請求項６】
磁性材料が強磁性材料を含む、請求項１から３のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項７】
長さまたは直径が、０．１ないし５０００(ｍの範囲内である、前記の請求項のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項８】
実質的に球形である、前記の請求項のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項９】
マトリクス材料がポリマーを含む、前記の請求項のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１０】
ポリマーが有機ポリマーまたはシリカベースのポリマーを含む、請求項９に記載の磁性粒子。
【請求項１１】
マトリクス材料の官能基が水系液相との使用のために親水性である、前記の請求項のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１２】
マトリクス材料の官能基が、非極性液相との使用のために疎水性である、請求項１から１０のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１３】
マトリクス材料が標的物質を結合するための親和性物質をさらに含む、前記の請求項のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１４】
標的物質が核酸である、前記の請求項のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１５】
親和性物質が、細胞、タンパク質、ウイルス、またはプリオンを結合することができる、請求項１３に記載の磁性粒子。
【請求項１６】
親和性物質が、抗体、結合タンパク質、抗体または結合タンパク質の断片、またはリガンドを含む、請求項１５に記載の磁性粒子。
【請求項１７】
親和性物質が、ビオチニル化された標的物質への結合のためのアビジンを含む結合タンパク質を含むか、または親和性物質がビオチンを含み、かつ標的物質がアビジン化された、請求項１６に記載の磁性粒子。
【請求項１８】
親和性物質が、標的物質に特異的なオリゴヌクレオチドまたは金属キレートを含むリガンドを含む、請求項１６に記載の磁性粒子。
【請求項１９】
細胞またはタンパク質が微生物起源である、請求項１５から１８のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項２０】
標的物質が金属を含み、かつ親和性物質が金属に対するキレート剤を含む、請求項１３に記載の磁性粒子。
【請求項２１】
疎水性官能基が微生物または疎水性標的物質を結合することができる、請求項１２に記載の磁性粒子。
【請求項２２】
磁化されていない磁性材料を提供すること、および磁性粒子を形成するようにマトリクス材料を提供することを含み、磁性材料は磁場への曝露に際して残留性であり、かつマトリクス材料は液相の存在下で粒子の解離を促進する官能基を含む表面を有する、標的物質を結合することができる磁性粒子の調製のための方法。
【請求項２３】
マトリクス材料がポリマーを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ポリマーが有機ポリマーまたはシリカベースのポリマーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
マトリクス材料が予備成型されて提供され、磁性材料に添加される、請求項２２から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ポリマーが、磁化されていない磁性材料の存在下でのモノマーの重合によって提供され、磁性材料およびポリマー性材料を含む磁性粒子を形成する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
モノマーが有機モノマーまたはシリカベースのモノマーを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
重合の段階が逐次縮合および／またはラジカル反応を含む、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
重合の段階がエマルジョン中で起こり、磁化されていない磁性材料がエマルジョンの不連続相に存在する、請求項２６から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
重合の段階がエマルジョンの不連続相で起こる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
モノマーが重合の前にエマルジョンの連続相に存在する、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
モノマーが有機モノマーを含み、かつエマルジョンが油中水型エマルジョンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
モノマーがシリカベースのモノマーを含み、かつエマルジョンが水中油型エマルジョンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
重合の段階が溶液中で起こる、請求項２６から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
磁性材料が、長さまたは直径が１００ないし３００ｎｍの範囲内である粒子を含む、請求項２２から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
磁性粒子が請求項１から２１のいずれかで定義される通りである、請求項２２から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
標的物質を、そのような標的物質を含む試料から分離するための、請求項１から２１のいずれかに記載の、または請求項２２から３６のいずれかに記載の方法によって入手可能な、磁性粒子の使用。
【請求項３８】
細胞、微生物、またはタンパク質を含む標的物質を、そのような標的物質を含む試料から分離するための、請求項１から１３、または１５から１９のいずれかに記載の磁性粒子の使用。
【請求項３９】
金属を含む標的物質を、そのような標的物質を含む試料から分離するための、請求項１から１３、または２０のいずれかに記載の磁性粒子の使用。
【請求項４０】
有機化合物を含む標的物質を、そのような標的物質を含む試料から分離するための、請求項１から１３、または２１のいずれかに記載の磁性粒子の使用。
【請求項４１】
核酸を含む標的物質を、そのような標的物質を含む試料から分離するための、請求項１から１４のいずれかに記載の磁性粒子の使用。
【請求項４２】
標的物質が試料から単離される、請求項３７から４１のいずれかに記載の使用。
【請求項４３】
標的物質が試料から除去される、請求項３７から４１のいずれかに記載の使用。
【請求項４４】
セルソーティング装置における、請求項１から１３、または１５から１９のいずれかに記載の磁性粒子の使用。
【請求項４５】
（ａ）磁性材料およびマトリクス材料を含み、磁性材料が磁場への曝露に際して残留性である、標的物質を結合する磁性粒子を提供すること；
（ｂ）標的物質を含む試料を含む液相を提供すること；
（ｃ）標的物質を粒子に結合させるように試料を磁性粒子と共に分散すること；および
（ｄ）磁場を粒子に加え、かつ粒子を液相から分離することによって、粒子を試料から単離すること
：を含む、標的物質を、標的物質を含む試料から分離するための方法。
【請求項４６】
試料を磁性粒子と共に分散する段階が、磁性粒子を破壊に供して粒子を解離させることを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
破壊が、ピペッティング、攪拌、ボルテックスおよび／または攪拌、超音波処理またはＵＶ破壊を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
磁性粒子が請求項１から２１のいずれかで定義される通りであるかまたは、請求項２２から３６のいずれかで定義される方法によって得られる、請求項４５から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
磁性粒子が請求項１から１３、または１５から１９のいずれかで定義される通りであり、標的物質が細胞、微生物、またはタンパク質を含む、請求項４５から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
磁性粒子は請求項１から１３、または２０のいずれかで詳述した通りであり、標的物質が金属を含む、請求項４５から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
磁性粒子は請求項１から１３、または２１のいずれかで定義した通りであり、標的物質が有機化合物を含む、請求項４５から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
磁性粒子は請求項１から１４のいずれかで定義した通りであり、標的物質が核酸を含む、請求項４５から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
試料が未分画の核酸を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
標的物質が試料から単離される、請求項４５から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
標的物質が試料から除去される夾雑物である、請求項４５から５３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のような標的物質を結合することができる磁性粒子、そのような磁性粒子を製造する方法、および標的物質を含む試料から標的物質を単離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡおよびＲＮＡといった核酸に関係する処理は、バイオテクノロジーにおいて決定的な役割を担い続けている。ハイブリダイゼーション、増幅、配列決定、およびその他の方法を含む核酸検出および操作は、一般に核酸が夾雑材料から単離されていることを必要とする。核酸を含む試料が生物試料である場合、夾雑材料は、タンパク質、糖質、脂質、およびポリフェノールを含みうる。したがって、さまざまな方法がこれまでにＤＮＡまたはＲＮＡの単離に用いられてきている。
【０００３】
核酸を単離する初期の方法は、核酸のエタノール沈澱および透析を含む、有機溶媒を用いた一連の抽出を含んだ。これらの初期の方法は、比較的労力と時間を要し、結果として低収量である可能性がある。イソプロパノールもまた核酸の沈澱に使用することができる。
【０００４】
アルコール沈澱法は特許文献１に記載されている。核酸は、磁性ビーズの存在下で、高度に濃縮されたアルコールによって沈澱される。沈澱は磁場の適用によって上清から分離することができる。
【０００５】
特許文献２は、電気泳動図上で分離された分子に対する親和性を有する磁性粒子のマトリクスを用いて、生物巨大分子を電気泳動図から単離するための方法を記載する。磁性粒子は、さまざまな磁性物質を使用するものが記載され、本質的に磁性記憶を有しない物質が好ましい。典型的には電気泳動図中のバンドとして分離されている、生物巨大分子の特定の種への磁性粒子の結合のために、磁場を用いて、電気泳動図の特定の位置へ磁性粒子を引きつける。
【０００６】
特許文献３は、シリカベースの核酸結合性固相をカオトロピック剤の存在下で使用して核酸を単離する方法を記載する。この方法によると、シリカベースの固相は磁性であり、それによって、磁場の適用に際して、夾雑物を含む液層からの標的核酸を含む固相の分離を促進する。同様の方法が特許文献４に記載されている。
【０００７】
特許文献５は、カオトロピック剤の存在下でも実施することができる、ＲＮＡを単離するための方法を記載する。試料はリチウム塩、カオトロピック剤、および核酸結合性キャリヤーを含む酸性溶液と混合し、ＲＮＡをキャリヤーに吸収する。ＲＮＡと結合したキャリヤーは液相から単離され、溶出される。シリカ、セルロース、ニトロセルロース、ラテックス、およびヒドロキシアパタイトがすべて、可能なキャリヤーとして言及されているが、磁性シリカ粒子が核酸結合性キャリヤーとして使用される。
【０００８】
特許文献６もまた、磁性粒子を使用して核酸を結合する。この開示では、磁性粒子はポリスチレンベースでポリウレタン被覆されており、カオトロピック剤の代わりに界面活性剤が用いられる。
【０００９】
特許文献７は、ポリヌクレオチドを、官能基で被覆された表面を有する磁性巨大粒子へ結合することによる、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡを分離する方法を開示する。
【００１０】
ここに記載する先行技術文書のすべておよび本出願者らが知るところのそれらの各々の対応する市販品は、磁場の存在下で帯磁することができるが、そのような磁場の非存在下ではそれ自体が磁性ではない、磁性粒子を用いる。常磁性または超常磁性材料はこれらの性質を有する。これまで、磁場の非存在下でそれ自体が磁性である粒子（残留粒子として知られる）は、残留のために不都合に凝集塊を形成するので望ましくないと考えられてきている。これらの凝集塊は試料との密な混合を妨げ、したがって試料由来の核酸の、磁性粒子との結合を部分的に阻害すると考えられている。
【００１１】
この一般的な考えに反して、本出願者らは驚くべきことに残留磁性粒子は核酸およびその他の標的物質の単離において有利に使用されうることを見出している。
【特許文献１】米国特許第５５２３２３１号明細書
【特許文献２】米国特許第５３９５４９８号明細書
【特許文献３】米国特許第６０２７９４５号明細書
【特許文献４】米国特許第５９４５５２５号明細書
【特許文献５】米国特許第５９９０３０２号明細書
【特許文献６】国際公開ＷＯ９６／１８７３１号
【特許文献７】米国特許第５７０５６２８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、最初の態様では、本発明は、磁性材料およびマトリクス材料を含み、磁性材料が磁場への曝露に際して残留性でありマトリクス材料が液相の存在下で粒子の解離を促進する官能基を含む表面を有する、標的物質を結合することができる磁性粒子を提供する。
【００１３】
驚くべきことに、残留磁性粒子は、試料からの標的物質の分離または単離において極めて効果的でありうることが見出されている。本発明に記載の残留磁性粒子は、液相中に懸濁された場合は凝集塊を形成しうるが、凝集塊を破壊する力を加えた際には容易に分散しうる。有利なことに、磁性粒子のマトリクス材料は、液相の存在下で粒子のこの解離を促進する官能基を含む表面を有する。
【００１４】
磁性粒子は残留性であるため、磁場に対して高度に反応性である。その粒子は従来の磁性粒子より小さくすることができ、それでもなお磁場に速やかに反応する。このことは、粒子が小さいほど一般に結合容量が大きいという利点を有する。したがって、本発明はより大きい従来の粒子と比較して、迅速な分離をなお得ることができる、高容量の小さい粒子の使用を可能にする。本発明に記載の粒子は、磁場内の速度に関しては、同じ大きさの常磁性および超常磁性粒子より優れている。これは単離に関しては非常に大きな利点である。自動化系では、分析する試料の数を劇的に増やすことが可能になる。
【００１５】
磁性粒子の一部を形成する磁性材料は、磁場へ曝露することで、磁場の非存在下で材料が残留磁気を有しなければならないという意味で残留性である。したがって、本明細書では残留とは、以前に磁場に曝露され、したがって残留磁気を有する材料、および現在は残留磁気を有しないが磁場への曝露後にこの性質を生じる材料の両方を包含する。本発明に記載の磁性材料のこれらの性質は、磁性粒子が常磁性または超常磁性であって磁場の非存在下ではそれ自体は磁性でない、米国特許６０２７９４５または米国特許５９４５５２５といった先行技術における性質と対照的である。
【００１６】
本発明に記載の磁性材料は、有利にフェリ磁性材料を含む。一部の文献はフェリ磁性材料を鉄を含む磁性材料と定義する一方、本明細書の記載ではフェリ磁性材料は金属または金属酸化物であることができ、および鉄を含むかまたは含まないことできる。一実施形態では、フェリ磁性材料は、好ましくは鉄酸化物を含むフェリ磁性金属酸化物を含む。任意に金属または金属酸化物の第一鉄のすべてまたは一部は、カドミウム、クロム、コバルト、銅、マグネシウム、マンガン、ニッケル、バナジウム、および／または亜鉛から選択された二価遷移金属で置換することができる。特に好ましいフェリ磁性金属酸化物はフェリ磁性磁鉄鉱を含む。
【００１７】
本発明の別の一実施形態では、磁性材料は強磁性であり、好ましくは鉄を含む。強磁性材料は金属または金属酸化物であることができる。任意に、金属または金属酸化物の鉄のすべてまたは一部は、上記の通りの別の二価遷移金属で置換することができる。
【００１８】
磁性粒子の長さまたは直径は、典型的には０．１ないし５，０００(ｍの範囲内であり、好ましくは０．１ないし１，０００(ｍの範囲内であり、より好ましくは０．１ないし５００(ｍの範囲内であり、非常に好ましくは０．１ないし１００(ｍの範囲内である。より小さな粒子は磁場内で速やかに分離することができ、高い結合容量を有することが見出されている。磁性粒子は実質的に球形であることが、この形の粒子はより容易に解離するため、好ましい。
【００１９】
磁性粒子のマトリクス材料は、標的物質の結合を促進するのに適した任意の材料を含むことができる。マトリクス材料の組成は、したがって、磁性粒子によって結合される標的物質の性質にある程度依存する。マトリクス材料は、磁性材料に被覆または殻を提供することができ、磁性材料と結合するかまたは複合体を形成するかまたはそれらの混合物を形成することができる。一方法ではマトリクス材料は、有機ポリマーまたはシリカベースのポリマーといった無機ポリマーであることができるポリマーを含む。マトリクス材料が無機質である場合、これは代替的に塩または分子を含むことができる。
【００２０】
磁性粒子の表面は、液相の存在下で磁性粒子の解離を促進する官能基を含むのが有利である。これらの官能基は、磁性粒子中に使用されるマトリクス材料の性質のために生じうる。または、マトリクス材料は、それらの官能基を導入するために処理する必要がありうる。一方法では、マトリクス材料の官能基は、水系液相との使用のために親水性である。たとえば、水系液相が生物試料から生じる場合、親水性表面を有するマトリクス材料は、疎水性表面を有するマトリクス材料よりも容易に解離しうる。別の方法では、マトリクス材料の官能基が、有機液相、特に非極性液相との使用のために疎水性である磁性粒子を提供することができる。非極性液相が使用される場合は、磁性粒子上の親水性表面は粒子をより解離しにくくする。また、表面が親水性基および疎水性基の両方の組み合わせを持つことも可能である。そのような組み合わせは、たとえばＴＨＦ、ＤＩＧＬＹＭＲ、およびＤＭＳＯといった、水および非極性溶媒の両方と混和可能な溶媒系が使用される場合に好ましい。
【００２１】
官能基もまた、標的物質に対する粒子の結合特性に影響しうる。磁性粒子が標的物質に結合する能力は、マトリクス材料の固体物性によって、または標的物質を結合するための親和性物質をさらに含むマトリクス材料によって与えられる。親和性物質の化学および方法論は、ハーマンソンら（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ）（１９９２）著『固定化アフィニティリガンド技術』（"Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"）でさらに詳細に議論されている。磁性粒子の表面特性および親和性物質としての特性は、さまざまな異なる標的物質に関して下記でさらに詳細に考察する。
【００２２】
別の一態様では、本発明は、磁化されていない磁性材料を提供すること、および磁性粒子を形成するようにマトリクス材料を提供することを含み、磁性材料は磁場への曝露に際して残留性でありマトリクス材料は液相の存在下で粒子の解離を促進する官能基を含む表面を有する、標的物質を結合することができる磁性粒子の調製のための方法を提供する。
【００２３】
マトリクス材料は、上記で考察したように、無機性または有機性であることができるポリマーを含むことができる。本製法はいくつかの方法で実施することができる。一実施形態の記載によると、マトリクス材料は予備成型されて提供され、磁性材料に添加される。別の一実施形態の記載によると、ポリマーは好ましくは、磁化されていない磁性材料の存在下でのモノマーの重合によって提供され、磁性材料およびポリマー性材料を含む磁性粒子を形成する。モノマーは、目的のポリマーに応じて、有機モノマーまたは、シリカベースのモノマーといった無機モノマーを含むことができる。その他の無機モノマーは、有機金属モノマー、スルホニトリドモノマー、ホスホニトリルモノマー、およびカルボラン配位ポリマーを形成するモノマーを含む。この重合は特に制限されないがしかし逐次縮合（重付加反応ともいう）および／またはラジカル反応を含みうる。
【００２４】
重合は、磁化されていない磁性材料が不連続相に存在するエマルジョン中で起こりうる。この実施形態によると、重合の段階は、好ましくはエマルジョンの不連続相で起こり、モノマーもまた典型的には重合の前にエマルジョンの不連続相に存在する。一部の（またはすべての）モノマーは連続相にも存在しうるため、本発明はこの系に制限されない。連続相と非連続相の間の界面で化学反応が起こるその後に、モノマーがエマルジョン小滴（不連続相）に重合前に入ることが可能になる。エマルジョンは、油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンであることができる。エマルジョンが油中水型エマルジョンである場合、モノマーは一般に水溶性の有機および／または無機モノマーを含む。エマルジョンが水中油型エマルジョンである場合、モノマーは一般に非極性の有機および／または無機モノマーを含む。
【００２５】
エマルジョンベースの系の代替として、重合の段階は溶液中で行うことができ、その後、磁性材料の被覆を行うことができる。
【００２６】
磁性材料は、長さまたは直径が０．１ないし５，０００(ｍ、好ましくは０．１(ｍないし５００(ｍ、および非常に好ましくは０．１(ｍないし１００(ｍの範囲内である粒子を含みうる。磁性材料の特に好ましい長さまたは直径は、１００〜３００ｎｍの範囲内である。
【００２７】
使用にあたって、本発明に記載の磁性粒子は、標的物質を、そのような標的物質を含む試料から分離するために提供することができる。標的物質は、細胞；細胞性または非細胞性である微生物；純粋金属または化合物が一部または大部分を成す金属；または環境汚染物質、核酸、またはタンパク質といった有機化合物を含みうる。
【００２８】
一つの重要な標的物質は核酸であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその修飾型であることができる。核酸がＤＮＡである場合、これはｄｓまたはｓｓＤＮＡでありうる。核酸がＲＮＡである場合、これはｒＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは総（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡでありうる。
【００２９】
核酸を含む試料は、典型的には、細胞試料のような生物試料を含む。生物試料は、その構造に応じて、前処理をしてもよく、またはその必要が無い。たとえば、植物または菌類の細胞または動物の固形組織の場合、本分野で既知である通り前処理が必要になる。パラフィン切片のような固相の形で保存された試料もまた前処理を要する可能性がある。試料は、食品、環境試料、または臨床試料由来であることができ、また、原核細胞、真核細胞、またはその他のマイコプラズマ、プロトプラスト、またはウイルスといった部分を含みうる。血液製剤は核酸単離のために重要な領域であり、本発明は特に、全血、ならびに、血漿、血清、およびバフィーコートといったその他の血液製剤に適用可能である。
【００３０】
核酸を精製する場合は、マトリクス材料は、有機ポリマー性材料またはシリカベースの材料といった、核酸を結合することができる任意の材料を含むことができる。一方法では、２００２年５月２０日に本出願会社によって出願されたＧＢ０２１０７６６．２に記載の通り、マトリクス材料は表面上に酸基を有する。酸基は好ましくはカルボン酸表面といった有機酸表面を構成する。
【００３１】
本発明のこの態様に記載の使用可能な酸基として、カルボキシ、スルホ、およびアリールオキシ基を挙げることができる。たとえば、カルボキシ基またはスルホ基は、アルキレン基またはアリーレン基によってカルボン酸またはスルホン酸を形成するように固相に結合することができる。フェノキシ基のようなアリールオキシ基もまたそのように結合することができ、別の芳香族部分または脂肪族部分を組み込むことができる。それぞれの型の有機酸の炭素原子は、ヘテロ原子で置換することができる。そのようなヘテロ原子の存在、および、エステル、アミン、アルコール、カルボン酸、アミド、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、イミン、ニトロ化合物、チオール、チオエステル、ニトリル、酸無水物、およびスルホン酸化合物を含む表面上の別の官能基の随意的な存在は、それぞれ固相の性質、特に固相の親水性に寄与しうる。疎水性が強すぎる固相（たとえば高すぎる濃度のポリスチレンが存在する）は核酸結合に問題を生じる傾向があるため、好ましい固相は親水性である。
【００３２】
または、マトリクス材料は、核酸を結合するためのシリカベースの材料を含むことができる。シリカベースの磁性粒子は、核酸の粒子への結合を促進するための単離処理の一部として、カオトロピック剤の使用を必要とする可能性がある。
【００３３】
カオトロピック剤は一般に、核酸に二次構造を失わせ、および二本鎖核酸の場合には溶解させるために十分高い濃度で提供されるカオトロピックイオンを含む。カオトロピック剤は水中の水素結合を破壊することで、変性した核酸を対応する未変性物よりも安定化すると考えられている。カオトロピック剤は典型的には、グアニジウム塩、尿素、またはヨウ化物、塩素酸塩、過塩素酸塩、または（イソ）チオシアネートを含む。好ましいカオトロピック剤は、グアニジウムチオシアネート、およびグアニジウム塩酸を含む。
【００３４】
試料と接触させる際に存在するカオトロピック剤の濃度は典型的には２Ｍないし８Ｍの範囲内である。
【００３５】
核酸が標的物質である別の一方法では、オリゴヌクレオチドを含む親和性物質を、当該オリゴヌクレオチド配列と相補的な配列を有する核酸のための特異的ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００３６】
液相中の夾雑物を除去するために、核酸が結合した磁性粒子を液相から分離する段階が一般に必要である。さらに洗浄段階をこのとき固相に適用することができる。遠心分離および沈澱した固相から液相をデカントすること、または固相が充填されたカラムを使用し液相を通過させることを含む、液相から固相を分離するための任意の従来の分離段階が適用可能である。磁性固相を使用する場合は、これが分離を促進し、分離は磁場の存在下で実施することができる。
【００３７】
単離された核酸が取る必要がある形に応じて、さらに溶出段階を提供することができる。一部の場合には、核酸が磁性プローブに結合したままで十分である可能性がある。増幅段階といった、固相上の核酸の操作がさらに必要である場合がこれに該当しうる。同様に、溶出溶液を加えることによって核酸は固相から溶出することができ、溶出溶液は単に水または緩衝液であることができる。
【００３８】
本発明の別の実施形態の記載によると、標的物質は、細胞、タンパク質、細菌、ウイルス、または環境汚染物質を含みうる。細胞は原核細胞または真核細胞であることができる。真核細胞は、動物細胞、植物細胞、および菌類細胞を含む。原核細胞は、細菌および藍藻を含む。その他の微生物は、ウイルスおよびプリオンといった非細胞微生物を含む。
【００３９】
これらの標的物質のそれぞれに結合することが知られている適当な親和性物質を選択することができる。一実施形態では、親和性物質は細胞またはタンパク質と結合することができ、好ましくは抗体、結合タンパク質、抗体または結合タンパク質の断片、またはリガンドを含む。結合タンパク質はストレプトアビジンのようなアビジン、またはその他のビオチン結合性親和性物質を含むことができる。この実施形態の記載によると、標的物質はビオチニル化されている。または、アビジンは標的物質と結合しており、磁性粒子はビオチニル化されている。別の方法では、親和性物質は、標的物質に特異的なオリゴヌクレオチドまたは金属キレートを含むリガンドを含む。細胞またはタンパク質は微生物起源であることができる。親和性物質はまた、ウイルスまたはプリオンを結合する能力を有しうる。
【００４０】
標的物質が細胞を含む場合、たとえば、抗体を磁性粒子上に導入することが可能である。抗体は完全であるかまたは活性断片として存在することができる。抗体は典型的には、抗体からのリガンドと磁性粒子の表面との、通常はマトリクス材料を介した共有結合によって、磁性粒子上に導入される。抗体からの適当なリガンドは、？ＯＨ、−ＮＨ2、および？ＳＨを含む。さまざまなカップリング化学を適用して、抗体のリガンドを磁性粒子に結合することができる。？ＯＨについては、たとえばエポキシ、ジビニルスルホン、または塩化シアヌルを用いることが可能である。？ＳＨについては、マレイミド、ヨードアセチル、ピリジルジスルフィド、またはエポキシ活性化マトリクスを用いることが可能である。？ＮＨ2カップリングについては、エポキシ、カルボン酸／ＥＤＣ、アズラクトン、アルデヒド／ＮａＣＮＢＨ3、臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、カルボニルジイミダゾール、有機塩化スルホニル、などを用いることが可能である。
【００４１】
マトリクス材料の化学的性質を調整して、問題の細胞に対する親和性を持たせることもまた可能である。
【００４２】
別の選択肢として、アビジンまたはビオチンの一方を磁性粒子上に導入し、他方を細胞上に導入することによって、粒子がアビジン−ビオチン結合相互作用によって特異的に細胞と結合することが可能になる。典型的にはストレプトアビジンが磁性粒子に導入される。細胞はたとえばビオチニル化ＮＨＳを用いることによって、または抗体のような当該細胞と特異的に反応する部分と結合したビオチンを含む試薬を用いて細胞を選択的に相互作用させることによって、ビオチニル化することができる。
【００４３】
標的物質がタンパク質である場合は、別のタンパク質を特異的に標的とするタンパク質結合性タンパク質を導入することが可能である。一例は、プロテインＢを磁性粒子上に導入し、ヒトＩｇＡを単離することである（Ｆａｕｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ １９９１）。同様に、ヒトＩｇＡを磁性粒子上に導入し、プロテインＢを単離することができる。
【００４４】
別の一実施形態では、磁性粒子の特有の化学的性質を用いてタンパク質を単離することが可能である。たとえば、タンパク質の特定のアミノ酸に対する親和性物質として、オリゴヌクレオチドを磁性粒子上に導入することができる。または、キレートが磁性粒子上に導入され、タンパク質の特異的金属アフィニティドメインを介してタンパク質を単離する、固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィーを用いることが可能である。これの一例は、磁性粒子上の固定化ニッケルに対して親和性を持つ、タンパク質の反復ヒスチジンタグである。
【００４５】
別の一実施形態では、細胞を単離するのと同様の方法で、アビジン／ビオチン結合対を使用することが可能である。
【００４６】
標的物質がウイルス、細菌、またはその他の微生物を含む場合、一つの戦略は、細胞膜または表面上に露出された微生物タンパク質に対する親和性を有する抗体またはタンパク質を磁性粒子上へ導入することである。この方法論はその他の細胞を単離するのに用いられるものと類似している。または、上記の通りタンパク質を単離するのに用いられたのと同じ方法で、微生物タンパク質に対する親和性を有するタンパク質を導入することが可能である。
【００４７】
別の一実施形態では、疎水性表面を用いてその表面から細菌を除去することが可能である。
【００４８】
別の一実施形態では、標的物質は金属を含み、親和性物質は金属に対するキレート剤を含む。
【００４９】
標的物質が、環境上の理由のために試料から除去する必要がある純粋金属または金属化合物といった金属を含む場合、金属キレート剤を磁性粒子上に導入することが可能である。例は、選ばれた金属の特異的結合のためのＩＤＡまたはＮＴＡを含む。キレート化学は当業者によく知られており、ハーマンソンら（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ）（１９９２）の著書で説明されている。
【００５０】
微生物を結合するために親和性物質を用いる代わりに、マトリクス材料は、微生物を結合することができる疎水性官能基を含むことができる。疎水性官能基はまた、環境汚染物質といった疎水性標的物質を結合するためにマトリクス材料上で使用することができる。たとえば、ＰＣＢはマトリクス材料の疎水性表面によって結合されうる疎水性構造を有する。疎水性表面は、たとえば、芳香族基を用いることによって得ることができる。
【００５１】
本発明に記載の磁性粒子は、標的物質のポジティブ選択またはネガティブ選択に使用することができる。ポジティブ選択では、標的物質はさらに使用またはさらに単離およびおそらく精製するために必要である。ポジティブ選択では夾雑材料の非特異的単離を避けることが好ましい。標的物質が結合した粒子の良好な混合を確実にし、および効率的な洗浄を促進するために、磁性粒子の容易な解離がポジティブ選択では極めて重要である。核酸の単離は、標的物質が試料から単離されるポジティブ選択の単なる一例である。
【００５２】
ネガティブ選択では、標的物質は試料から除去される。これの目的は一般に、将来の試料の操作または使用のために、試料をきれいにすることである。環境汚染物質といった汚染物質の除去は、ネガティブ選択の一例である。ネガティブ選択の別の一例は、標的物質がＴ細胞であり試料が血液試料である場合である。
【００５３】
磁性粒子はセルソーティング装置でポジティブ選択またはネガティブ選択に使用することができる。
【００５４】
別の一態様では、本発明は標的物質を含む試料から標的物質を分離するための下記を含む方法を提供する；
（ａ） 磁性材料およびマトリクス材料を含み、磁性材料が磁場への曝露に際して残留性である、標的物質を結合する磁性粒子を提供すること；
（ｂ） 標的物質を含む試料を含む液相を提供すること；
（ｃ） 標的物質を粒子に結合させるように試料を磁性粒子と共に分散すること；および
（ｄ） 磁場を粒子に加え、かつ粒子を液相から分離することによって、粒子を試料から単離すること。
【００５５】
試料を磁性粒子と共に分散する段階は、好ましくは粒子を解離させるために磁性粒子を破壊に供することを含む。破壊は機械的破壊、音波式破壊、またはＵＶ破壊を含む。機械的破壊は、粒子を解離させるようなピペッティング、攪拌、ボルテックスおよび／または攪拌を含む。音波式破壊は、超音波法およびＵＶ破壊を含む。標的物質の粒子への結合を最大化するように、試料が磁性粒子と可能な限り完全に分散することが重要である。
【００５６】
この処理は上記に定義された標的物質を分離するために有用であり、ポジティブ選択またはネガティブ選択に使用することができる。核酸の単離、特に生物試料由来の総核酸のような未分画核酸の単離は、本発明の特に重要な態様である。
【００５７】
本発明の方法は他の段階を含むことができる。たとえば、単離された標的物質がさらに精製されるかまたは以後の操作で使用される場合、磁性粒子への標的物質の結合後の処理に、一回以上の洗浄段階を組み込むことができる。一部の場合には、標的物質は磁性粒子へ結合した状態で使用することができる。別の場合には、たとえば、溶出溶液を用いることによって、標的物質を磁性粒子から溶出する必要がある。
【００５８】
別の一態様では、本発明は標的物質を、そのような標的物質を含む試料から分離するためのキットを提供する。キットは典型的には緩衝水溶液に分散されたここで定義される磁性粒子を含み、任意にアジドのような微生物増殖を防ぐ成分を含む。０．０２%のナトリウムアジドはそのような緩衝水溶液の典型的な添加物である。キットは典型的にはさらに、それぞれが一般に水系である、一種類以上の結合溶液、一種類以上の洗浄溶液、および一種類以上の溶出溶液を含むことができる。溶出溶液は、標的物質に応じて水系または非水系であることができる。試料が前処理を要する場合、たとえば生物試料が細胞溶解すべき材料を含む場合、キットはさらに一種類以上の細胞溶解溶液を含む。核酸が標的物質である場合、キットは、上記の溶液のうち一種類以上と共に、核酸結合磁性粒子を含む標準形式で作られる。核酸結合磁性粒子がシリカ磁性粒子である場合、キットはまたカオトロピック剤も含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
例示のみを目的として、下記の実施例を参照し、本発明をここでさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００６０】
すべての実施例は、適用される磁場の非存在下で実施される。
【００６１】
[実施例１]
この実施例では、フェリ磁性磁鉄鉱粒子のケイ酸ナトリウム溶液（水ガラス）の水系分散液を油相と混合し、磁鉄鉱が水相に存在する油中水型エマルジョンを形成する。酸の存在下で縮重合を実施し、無機ポリマーを用いた磁性粒子を生じる。
【００６２】
フェリ磁性磁鉄鉱粒子（大きさ２００〜３００ｎｍ）２０ｇを、ウルトラツラックス（ｕｌｔｒａｔｕｒａｘ）（商標）ホモジナイザーを用いて４０ｇの水ガラス（ＮＭＤ）に分散した。１分間１６０００ｒｐｍにて混合後、速度を１３０００ｒｐｍに下げ、３%の乳化剤（たとえばスパン８０（ｓｐａｎ ８０）（商標）、スパン６５）を含む３００ｍｌの油相（たとえばトルエンまたはアイソパー（ｉｓｏｐａｒ）（商標））を加えた。速度を１７００ ｒｐｍに１分間上げ、結果として得られた油中水型エマルジョン（水相に磁鉄鉱が分散）を反応槽で１０分間２０℃にて攪拌し、その後２Ｍ ＨＮＯ3（３０ｍｌ）を加えた。１時間攪拌しメタノール（３０ｍｌ）添加後、懸濁液を５０℃にて１６時間攪拌した。磁性粒子を、遠心分離または磁力装置を用いて、メタノール（３ｘ１５０ｍｌ）、水（１ｘ１５０ｍｌ）、および最後にメタノール（２ｘ１５０ｍｌ）で洗浄した。粒子を真空下で乾燥した。粒子径０．３(ｍ〜１．５(ｍ。相対感受性；３５ｘ１０-3ｃｇｓ。
【００６３】
[実施例２]
本実施例では、フェリ磁性磁鉄鉱粒子を有機モノマー（ＥＧＤＭＡ）に分散し、粒子懸濁液を水相と混合することによって水中油型エマルジョンを形成した。モノマーを重合させて有機ポリマー磁性粒子を生じた。
【００６４】
フェリ磁性磁鉄鉱粒子（大きさ２００〜３００ｎｍ）６．６ｇを２０ｇのＥＧＤＭＡに分散した。ＡＩＢＮ（０．４５ｇ）を分散液に加え、磁鉄鉱を含む有機相を、０．５%ポリビニルアルコール（エバノール（Ｅｖａｎｏｌ）（商標））を含む水（１５０ｍｌ）中で、ウルトラツラックス（ｕｌｔｒａｔｕｒａｘ）（１３０００ｒｐｍ、２分間）を用いて乳化した。結果として生じたエマルジョンを反応槽中で２０時間６５℃にて攪拌し、磁性ポリマービーズをメタノール（５ｘ１５０ｍｌ）で洗浄し、８０℃にて６時間乾燥した。粒子径０．７(ｍ〜６(ｍ。相対感受性；１５ｘ１０-3ｃｇｓ。
【００６５】
[実施例３]
本実施例では、フェリ磁性粒子を有機溶媒中にモノマーと共に分散し、モノマーを次いで重合して粒子を形成する。
【００６６】
磁鉄鉱（１ｇ）を、ＴＨＦ、ヘキサン、またはトルエンといった有機溶媒（１０ｍｌ）中に分散し、その後エポキシ樹脂様ビスフェノールＡ（１０ｍｌ）を添加する。攪拌を７０℃にて１６時間続け、磁性粒子をその後５回、遠心分離を用いてＴＨＦ（各回２５ｍｌ）で洗浄する。最後に粒子を真空下で５０℃にて乾燥する。粒子は約０．２５ｍｍｏｌ／ｇのエポキシ基を有する。
【００６７】
[実施例４]
本実施例では、 フェリ磁性 磁性粒子を有機 溶媒中に、予備重合したポリマーと共に分散し、粒子を形成する。
【００６８】
乾燥フェリ磁性 磁鉄鉱 粒子 （大きさ２００〜３００ ｎｍ） １ ｇを 、１０ ｍｌ の０．５% ポリ（エチレン） イミン （アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｍｗ ３５ ０００）含有０．１ Ｍ 炭酸ナトリウム ｐＨ ９．５に分散した。懸濁液を室温で３時間インキュベートし、その後 粒子を２０ｍｌの水で４回洗浄した。
【００６９】
導入されたポリマーは表面電荷測定によって確認された（マルバーン・ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｚｉｓｅｒ）（商標））。磁性 粒子の表面は、等電点が正に１シフトした。
【国際調査報告】
2005532799.tif 000002
2005532799.tif 000003
2005532799.tif 000004