(57)【要約】  本発明は、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＨＡ、ＦＬＡＧおよびＳＴＲＥＰのようなタグ、好ましくは、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）、より好ましくは前記ＩｇのＦｃ部分と、コラーゲンへの結合であるＧＰＶＩの生物学的活性を有するタンパク質またはオリゴペプチド（ＧＰＶＩ様タンパク質）とを含む、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）融合タンパク質（ＧＰＶＩ−融合タンパク質）に関し、並びにＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングのための方法およびキットでのそれらの使用を開示する。さらに、ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用に関連する血栓性および心臓血管性イベントおよび疾患の処置のための、かかるＧＰＶＩ融合タンパク質を含む薬学的組成物および治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タグ分子と、非免疫グロブリン分子とを含む融合タンパク質であって、該非免疫グロブリン分子が、糖タンパク質ＶＩの生物学的活性を有するタンパク質またはオリゴペプチド（ＧＰＶＩ様タンパク質）である、前記融合タンパク質。
【請求項２】
タグ分子が、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）またはそのフラグメントである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
リーダー配列を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
タグ分子が、そのＣ末端により、ＧＰＶＩ様タンパク質のＮ末端に共有結合している、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
タグが、そのＮ末端により、ＧＰＶＩ様タンパク質のＣ末端に共有結合している、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項６】
リンカー分子が、タグ分子とＧＰＶＩ様タンパク質との間に融合される、請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＧＰＶＩ様タンパク質が、２１番目のアミノ酸グルタミンで始まり、そして、２６９番目のアミノ酸アスパラギンで終わる、ヒト成熟ＧＰＶＩの細胞外ドメインである、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ｉｇ分子が、Ｆｃ部分である、請求項２〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列１または配列２のアミノ酸配列を含む、請求項２〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
リーダー配列を有しない、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項１２】
（ａ）リーダー配列、
（ｂ）タグ分子をコードする配列、および
（ｃ）ＧＰＶＩの生物学的活性を有するタンパク質をコードする配列、
を含む、請求項１１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
【請求項１４】
ベクターが、ｐｄＣ−Ｆｃ−Ｘベクターである、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
ベクターが、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターである、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のベクターを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質を発現するのに好適な宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質を産生するための方法であって、
ａ）随意に、分泌のためのリーダー配列、タグまたはＩｇ分子、ＧＰＶＩ様タンパク質および随意にリンカー配列を含む、タンパク質をコードするＤＮＡの構築、
ｂ）適切な発現ベクターへの前記融合ＤＮＡの設置、
ｃ）真核細胞での前記融合タンパク質の発現、および
ｄ）前記分泌された融合タンパク質の精製、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
活性剤としての、請求項２〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項２〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、医薬。
【請求項２０】
少なくとも１つの、付加的な薬学的に効果的な活性物質を含む、請求項１９に記載の医薬。
【請求項２１】
付加的な活性物質が、アスピリン、ヘパリン、サラチンまたはストレプトキナーゼあるいはこの組み合わせから選択される、請求項２０に記載の医薬。
【請求項２２】
請求項１９に記載の医薬およびアスピリン、ヘパリン、サラチンまたはストレプトキナーゼあるいはこの組み合わせからなる群から選択される活性物質を含む医薬を含む、同時的なまたは時間的にずらした投与のための薬学的パック。
【請求項２３】
コラーゲンにより増大した血小板の活性化、動脈硬化性プラークの破裂、不安定狭心症を含む、または経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）などの外科的処置中の、ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用に関連する、血栓性および心臓血管性イベントおよび疾患の処置のための医薬の製造への、請求項２〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２４】
血小板−コラーゲン相互作用に関連する、血栓性および心臓血管性イベントおよび疾患を処置するための方法であって、前記疾患に苦しむ対象に、請求項１９〜２２のいずれかに記載の医薬または薬学的パックを投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法のための、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２６】
コラーゲンがコートされた表面、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質、前記融合タンパク質の認識部位を含む二次抗体、および酵素、有色色素、蛍光物質、化学発光物質、生物発光物質および放射性同位体からなる群から選択される検出可能なラベルを含むキット。
【請求項２７】
結合または機能的な応答の刺激もしくは阻害の観察による、ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニング方法。
【請求項２８】
ａ）コラーゲンがコートされた表面と、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質およびＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用の潜在的なアンタゴニストまたはアゴニストとを、該アンタゴニストまたはアゴニストが不在の場合に、確実に前記融合タンパク質とコラーゲンがコートされた表面とが結合する条件下で接触させる工程、
ｂ）コラーゲンに結合した融合タンパク質と、融合タンパク質への結合親和性を有する認識部位を含む抗体および検出可能なラベルとを、該融合タンパク質のコラーゲンがコートされた表面への結合に影響を与えることなく、該抗体が該融合タンパク質に確実に結合する条件下で接触させる工程、
ｃ）コラーゲンに結合した残存融合タンパク質を検出するための検出工程を実行する工程、
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載の方法により同定される、ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用のアンタゴニストまたはアゴニスト。
【請求項３０】
人工的な表面をコーティングするための、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３１】
レンズ材料の血栓形成性を減少させるために、眼内レンズを改善するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３２】
レンズ表面を接触させるための、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３３】
レンズ材料を改良するために、共有結合的に架橋させるための、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＨＡ、ＦＬＡＧおよびＳＴＲＥＰのようなタグ、好ましくは、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）、より好ましくは前記ＩｇのＦｃ領域、およびコラーゲンへの結合であるＧＰＶＩの生物学的活性を有するタンパク質またはオリゴペプチド（ＧＰＶＩ様タンパク質）を含む、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）融合タンパク質（ＧＰＶＩ−融合タンパク質）に関する。
前記融合タンパク質の産生および精製手順を開示する。
ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用のための潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法およびキットを提供する。
ＧＰＶＩ融合タンパク質は、ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用に関連する血栓性および心臓血管性のイベントおよび疾患の処置に有用である。さらに、該融合タンパク質は、天然のまたは人工の表面のコーティングに有用であり、それらを細胞に接着しないようにさせ、細胞の活性化を妨げる。
【背景技術】
【０００２】
循環している静止血小板の血管傷害部位における接着および活性化は、止血栓に転換される血栓の形成を導くプロセスの第１段階である。コラーゲンは、血小板の活性化に関わる血管壁の主要な成分の１つである。コラーゲンには多くのタイプが存在し、これらのうちの７つが内皮下層で見出されている。ＣＤ３６ (Matsuno, et al., Br. J. Haematol. 92, 960-967, 1996) および ｐ６５Ｉ型コラーゲン特異的受容体 (Chiang et al., J. Clin. Invest. 100, 514-521, 1997)を含むコラーゲンに対するいくつかの異なる受容体が血小板において同定されているが、主要な受容体は、現在、インテグリンα2β1および非インテグリンのＧＰＶＩであるとみなされている。ＧＰＶＩは、分子量が６０ｋＤａ〜６５ｋＤａの範囲にあり、酸性のｐＩを有する主要な血小板糖タンパク質であることが約２０年前に明らかにされ(Clemetson et al., J. Clin. Invest. 70, 304-311, 1982)、これは、共通のＦｃγサブユニットと複合体を形成する。ＧＰＶＩサブユニットは、コラーゲン結合部位を含有し、そして、Ｆｃγサブユニットシグナル伝達に関与する。その複合体は、コラーゲンに対する血小板の活性化に重要な、主要なコラーゲン受容体の１つを血小板表面で形成する。
【０００３】
推定的なコラーゲン受容体としてのその役割は、血小板がコラーゲンに対して特異的な障害を示し、この受容体を有しない、軽度の出血異常患者が日本で確認された後に確立された(Moroi et al., J. Clin. Invest. 84, 1440-1445, 1989)。この患者は欠損受容体に対する自己抗体をも産生していたので、この自己抗体を使用してこの分子の特徴付けがさらに行われた(Sugiyama et al., Blood 69, 1712-1720, 1987)。ＧＰＶＩに対するコラーゲン上の認識配列が、コラーゲンの三重らせん構造内の反復したＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（Ｈｙｐ＝ヒドロキシプロリン）トリプレットであること、そしてこの構造に基づく合成ペプチドがＧＰＶＩに対する特異的なアゴニストとして使用され得ることもまた明らかにされた(Mortonet al., Thromb. Res. 72, 367-372, 1993)。ＧＰＶＩ／Ｆｃγ複合体は、ｐ７２SYKの活性化を伴い、キナーゼ／ホスファターゼ／アダプタータンパク質相互作用のカスケードによりＰＬＣγ２を活性化させ、従って顆粒の放出および血小板の凝集に至る免疫受容体様の機構によって血小板内部にシグナル伝達することが明らかにされた。
【０００４】
したがって、ＧＰＶＩ様タンパク質は、ＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングのためのツールとして或いは活性成分として非常に興味深い化合物であることは、従来の技術から明らかである。
【０００５】
WO 00/68377には、ＧＰＶＩまたはその生理学的なフラグメントをコードするＤＮＡ、組換えヒトＧＰＶＩおよびその薬学的組成物が開示されている。さらに、該出願には、血小板−コラーゲン相互作用の特異的なインヒビターまたはアクティベーターを検出するためのスクリーニングツールとしての組換えＧＰＶＩの使用について記載されている。しかしながら、その膜貫通領域のため、該組換えタンパク質は、細胞外媒体へ分泌されず、精製が困難である。したがって、このタンパク質を発現する細胞全体を、スクリーニングアッセイに用いなければならない。さらに、活性成分としてのＧＰＶＩの観点から見ると、組換えタンパク質は、しばしば、低減した循環半減期を有することが知られており、これは、頻繁な薬剤の適用を必要とし、結果として、治療の費用を高めることとなる。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、次の改良された特性を持ち、ＧＰＶＩの生物学的活性を有する分子を提供することにあった：宿主細胞における高い発現レベル、細胞外媒体への分泌および容易な精製、増大した循環半減期、並びにスクリーニングツールとしての使用に関しては、市販の抗体による容易な検出性。
【０００７】
発明の開示
したがって、本発明の目的は、融合タンパク質、並びに活性剤としての、およびＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用および血小板−コラーゲン相互作用の特異的なインヒビターまたはアクティベーターを検出するためのスクリーニングツールとしてのそれらの使用を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子、前記ＤＮＡ分子を含むベクター、前記ベクターを含む宿主細胞および前記融合タンパク質を産生するための方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、ＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用および／または血小板−コラーゲン相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングのための、かかる融合タンパク質を含むキットおよび方法を提供することである。
【００１０】
さらに、本発明の目的は、ＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用および／または血小板−コラーゲン相互作用に関連する血栓性のおよび心臓血管性のイベントおよび疾患の処置における使用のための前記融合タンパク質、並びに前記融合タンパク質を含む医薬および薬学的パックを提供することである。
【００１１】
さらに、本発明の目的は、細胞に接着しないようにさせ、細胞の活性化を妨げるために、天然のまたは人工の表面をコーティングするための、およびレンズ材料の血栓形成性を低減させるために眼内レンズを改良するための前記融合タンパク質を提供することである。
本発明の他の目的は、以下の詳細な記載から当業者に明らかになる。
【００１２】
これらの目的は、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＨＡ、ＦＬＡＧおよびＳＴＲＥＰのようなタグ、好ましくは、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）、より好ましくは前記ＩｇのＦｃ領域と、ＧＰＶＩの生物学的活性を有するタンパク質またはオリゴペプチドとを含む融合タンパク質が、宿主細胞において多量に発現し、細胞外媒体に分泌され、したがって精製が容易であることを見出したことに基づいて達成された。開示される分子は、増大した循環半減期を有し、市販の抗体により容易に検出することができる。
【００１３】
容易な生産性のため、これらは、ＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用および／または血小板−コラーゲン相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに用いることができる。本明細書中の定義のとおりの融合タンパク質を含む、アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニのための方法およびキットを提供する。
【００１４】
本発明の融合タンパク質は、コラーゲンにより増大した血小板の活性化、例えば、動脈硬化性プラークの破裂、不安定狭心症などを含む、または、経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）などの外科的処置中のＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用に関連する、血栓性および心臓血管性イベントおよび疾患の防止、予防、治療および処置に有用である。ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用に関連する血栓性および心臓血管性イベントおよび疾患の処置のための、前記融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。
【００１５】
さらに、該融合タンパク質は、体液と接触する天然のまたは人工の表面、例えば、プロテーゼ、人工臓器、眼用レンズ(ocular lenses)、縫合糸、人工脈管セグメント、カテーテル、透析装置、チューブおよび血液を運ぶ容器などのコーティングに用いることができ、これにより、それらを細胞に対し、非接着性にし、細胞の活性化を妨げる。
【００１６】
人工の表面が血液と接触する場合には、次いで、血小板の活性化および／または凝固の誘発による血栓性イベントを誘発する傾向が増大する。これらの効果は、代用血管、心臓弁、ステント、カテーテル或いはその他の血液と接触するデバイスまたは材料の失敗の原因となり得る。従って、非血栓性表面を創出するための本明細書に開示される融合タンパク質の能力を、上記材料およびデバイスへの融合タンパク質の固定化によりさらに活用することができる。かかる処理は、かかる材料またはデバイスに生物学的適合性および抗血栓性を与えるであろう。
【００１７】
発明の詳細な説明
融合タンパク質は、当該技術分野で周知である。例えば、融合タンパク質は、タンパク質分解酵素がタンパク質主鎖自体と物理的に接触するのを効果的にブロックし、従って、分解を妨げる。さらなる利点としては、ある状況下において、特定の発現系での改良された収率、細胞外媒体への分泌、容易な精製、標的タンパク質の適切なフォールディング、および治療的タンパク質の安定性、循環時間および生物学的活性の増大を含む。
【００１８】
かかる改良の１つは、免疫グロブリンのＦｃ領域の利用である。抗体は、２つの機能的に独立した部分、抗原と結合し、「Ｆａｂ」として知られている可変領域および補体または食細胞などのエフェクター機能とのリンクを提供する「Ｆｃ」として知られている定常領域を含む。
【００１９】
免疫グロブリンのＦｃ領域は、特に短い半減期を有するある種のタンパク質に融合した場合に、長い血漿半減期を誘導し、一方、単なるＦａｂフラグメントは、短い半減期である  (Capon et al., Nature, 337: 525-531, 1989)。例えば、抗炎症および拒絶反応抑制剤であるＩＬ−１０は、マウスＦｃγ２ａのＮ末端に融合させて、サイトカインの短い循環半減期を増大させる（Zheng, X. et: al., The Journal of Immunology, 154: 5590-5600, 1995）。さらに、インターロイキン２のＮ末端もまた、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ領域に融合させ、インターロイキン２の短い半減期およびその全身毒性を克服する (Harvill et al., Immunotechnology, 1: 95-105,1995)。 
【００２０】
治療的および分析的融合タンパク質もまた、Ｆｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合および胎盤通過など、すべて免疫グロブリンのＦｃタンパク質に存在する機能を組み込むＦｃドメインを利用することによって構築される。例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域は、ホジキン病腫瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞および他の悪性細胞種で発現されるＣＤ３０受容体と結合する分子であるＣＤ３０−ＬのＮ末端と融合された(米国特許第 5,480,981号) 。さらに、ある非突然変異標的タンパク質の効果的な発現および分泌は、ＩｇのＦｃ領域と、前記標的タンパク質とを含む融合タンパク質の発現、続いて、該標的タンパク質のタンパク分解性の切断により達成されることが１９９６年に報告されている（WO 96/08570、米国特許第 5,541,087号）。
【００２１】
本発明は、コラーゲンと結合する能力におけるＧＰＶＩ様活性および改良された収率、細胞外媒体への分泌、容易な精製、長い血清半減期および容易な検出性などのさらなる有利な特性を有する新規な融合タンパク質を開示する。したがって、ＧＰＶＩ融合タンパク質は、スクリーニングの目的に容易に用いることができる。本発明の分子は、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＡ、ＳＰＲ、フィルターアッセイおよびホモジニアスアッセイのような標準的なスクリーニングアッセイの多くに用いることができる。これらは、市販の抗体により容易に検出することができる。
【００２２】
これらの新規な融合タンパク質は、本質的に、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＨＡ、ＦＬＡＧおよびＳＴＲＥＰのようなタグ、好ましくはＩｇ、より好ましくは前記ＩｇのＦｃ領域と、ＧＰＶＩ様タンパク質とを含み、ここで、ＧＰＶＩの活性を有する融合タンパク質の部分は、そのグリコシル化のパターンにおいて改変されていることができ、またはそのアミノ酸配列に関して、ヒトＧＰＶＩと異なってもよい（例えば、突然変異または切断）。また、免疫グロブリン部分、好ましくは、ＩｇのＦｃ部分は、修飾または変異され、例えば低いＦｃ受容体親和性を有していてもよい。
【００２３】
このように、本発明の目的は、上記の改良された特性を有するＧＰＶＩ様活性を有する融合タンパク質を提供することであり、ここで、前記融合タンパク質は、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ＳＴＲＥＰのようなタグ、好ましくは、抗体全体、Ｉｇ重鎖または軽鎖或いは該重鎖のフラグメント（例えば、ＣＨまたはＦｃ部分）などのＩｇ分子と、ＧＰＶＩ様タンパク質とを含み、ここで、前記タグまたはＩｇ部分は、前記ＧＰＶＩ様タンパク質に直接的または間接的に（リンカー分子を介して）共有結合的に融合され、そして、該Ｉｇ部分および／またはＧＰＶＩ部分は修飾または変異されていることができ、以下の群から選択される：
【００２４】
【化１】
2005511005.tif 000002
本明細書において、ＧＰＶＩは、哺乳類、好ましくはヒト起源から自然に生じるＧＰＶＩの意味を有し、自然源から操作された組換えＧＰＶＩもまた包含する。    
【００２５】
ＧＰＶＩｔｒｕｎcは、本発明によるＧＰＶＩであって、そのアミノ酸配列を変異させたものではなく、切断したものである。切断型（Truncated form）は、本質的に全てのまたは低減したＧＰＶＩの生物学的活性を有するタンパク質フラグメントである。好ましい本発明のＧＰＶＩの切断型は、コラーゲンによる血小板の活性化を妨げることができるコラーゲン結合部位を含む、ＧＰＶＩの可溶性細胞外ドメインである。特に好ましい切断型は、WO 00/68377に記載されるような、２１番目のアミノ酸グルタミンに始まり、そして、２６９番目のアミノ酸アスパラギンで終わるヒト成熟ＧＰＶＩの細胞外ドメインの一部である（配列ＩまたはＩＩを参照）。
【００２６】
ＧＰＶＩｍは、本発明のＧＰＶＩであって、そのアミノ酸配列を先端を切断したものではなく、突然変異させたものである。突然変異の数は限定されないが、分子の生物学的活性の欠損に制限されているか、グリコシル化されていないか、部分的にグリコシル化されているか、またはそのグリコシル化パターンにおいて他の修飾がなされている。
【００２７】
本明細書中、タグは、任意のペプチドまたはタンパク質を意味し、これは、ＧＰＶＩと融合し、ＧＰＶＩの同定に用いることができるものであり、例えば、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ＳＴＲＥＰであるが、好ましくは抗体全体、Ｉｇ重鎖または軽鎖または重鎖のフラグメント（ＣＨまたはＦｃ部分）のようなＩｇ分子の意味を有する。より好ましくは、ＩｇのＦｃ部分、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡのＦｃ、ラムダまたはカッパー、或いはこれらのアナログまたはフラグメントが用いられる。
【００２８】
本明細書中、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＨＡ、ＦＬＡＧおよびＳＴＲＥＰは、十分に定義されたペプチドであるｃ−ｍｙｃエピトープタグ、ＨＡタグ（ヘマグルチニンタグ）、ＦＬＡＧエピトープタグ（バクテリオファージＴ７によるｇｅｎｅ−１０産物のリーダーペプチドまたはそのフラグメント）およびＳＴＲＥＰタグ（ストレプトアビジンに対して高い親和性を有する短いペプチド）の意味を有する。ＧＳＴは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの意味を有する。
【００２９】
免疫グロブリンのＦｃ領域は、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分である。Ｆｃ領域は、免疫グロブリンの生物学的機能の決定に特に重要であり、そして、これらの生物学的機能は、エフェクター機能と称される。周知のとおり、免疫グロブリンのサブクラスの重鎖は、４つまたは５つのドメインを含む：ＩｇＭは５つの重鎖ドメイン、そして、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧは、４つの重鎖ドメインを有する。ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧのＦｃ領域は、ヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３ドメインの二量体であり、ＩｇＭにおいては、それは少なくともヒンジ−ＣＨ２-ＣＨ３-ＣＨ４ドメインの二量体である(W.E.Paul, ed.,1993, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, New Yorkを参照)。
【００３０】
本発明のＦｃ領域は、そのアミノ末端でペプチド結合により、ＧＰＶＩ様タンパク質のカルボキシ末端に結合することができるか（ＧＰＶＩ−ＦＣ）、または、そのカルボキシ末端でペプチド結合により、ＧＰＶＩ様タンパク質のアミノ末端アミノ酸に結合することができる（Ｆｃ−ＧＰＶＩ）。
【００３１】
本発明の特に好ましい態様においては、ＧＰＶＩ−融合タンパク質は、ＩｇＧのＦｃ部分と、２１番目のアミノ酸のグルタミンで始まり、そして、２６９番目のアミノ酸のアスパラギンで終わる（配列ＩまたはＩＩを参照）、高い親和性でコラーゲンと結合する、ヒト成熟ＧＰＶＩの細胞外ドメインとを含む。
【００３２】
Ｆｃ部分を用いることにより、該分子は、プロテインＡアフィニティーカラムを用いて容易に精製することができる。ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＨＡ、ＦＬＡＧまたはＳＴＲＥＰのようなタグを用いることにより、融合タンパク質は、グルタチオンまたはビオチンを用いた、またはｍｙｃ、ＨＡまたはＦＬＡＧの場合には、このドメインに向けられた抗体を用いたアフィニティー精製によって精製することができる。さらに、本発明の融合タンパク質は、これらの部分に向けられり、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、７ーアミノー４ーメチルークマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン、ビオチンまたは放射性マーカーなどの検出ラベルを有する、市販の抗体によって容易に検出することができる。かかる抗体は、例えばICN Biomedicals GmbH, Germanyから入手できる。
【００３３】
したがって、ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用における潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングアッセイは、かかる融合タンパク質により容易に確立することができる。
【００３４】
活性剤としてのＧＰＶＩ融合タンパク質の使用に関し、免疫グロブリンのＦｃ部分は、特に短い半減期を有するあるタンパク質と融合する場合に、長い血漿半減期を誘導することが知られている (Capon et al., Nature, 337: 525-531, １９８９)。例えば、インターロイキン２のＮ末端もまた、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分と融合され、インターロイキン２の短い半減期およびその全身毒性を改善する（Harvill et al., Immunotechnology, 1: 95-105,1995）。
【００３５】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ３融合タンパク質のインビボ循環半減期のさらなる増大は、Ｆｃ受容体に対するこれらのアイソタイプの結合親和性を低減する、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３重鎖の定常領域の１つまたは２つ以上のアミノ酸の遺伝子的な変更を導入することにより得ることができる（WO 99/43713）。かかる変更は、先ず、ＩｇＧ１定常領域において、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ａｓｎ２９７およびＰｒｏ３３１から選択される１つまたは２つ以上のアミノ酸に突然変異、欠失または挿入を導入し、次いで、結果として得られるＩｇまたはその一部を、ＧＰＶＩ様タンパク質と連結する。ＩｇＧ３の場合には、突然変異、欠失または挿入は、Ｌｅｕ２８１、Ｌｅｕ２８２、Ｇｌｙ２８３、Ｇｌｙ２８４、Ａｓｎ３４４およびＰｒｏ３７８から選択される１つまたは２つ以上のアミノ酸に導入することができ、結果として得られる免疫グロブリンまたはその一部を、ＧＰＶＩ様タンパク質と連結する。
【００３６】
本発明の別の態様においては、抗体に基づく融合タンパク質の血漿半減期は、Ｆｃ受容体への結合親和性が低減されたまたは全くない、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ部分を用いることによって、増大させることができる。
【００３７】
Ｆｃ受容体へのＩｇＧの結合のための重要な配列は、ＣＨ２ドメインにあると報告されている。したがって、かかる融合タンパク質は、少なくともＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインを、ＧＰＶＩ様タンパク質に連結することによって得ることができる。
【００３８】
したがって、タグがＩｇを意味する場合には、ｔａｇｍはＩｇ、好ましくは、Ｆｃフラグメントであり、これは、上記のとおり、そのアミノ酸配列での突然変異および／またはそのグリコシル化のパターンでの修飾がなされる。
【００３９】
本発明のタグ分子およびＧＰＶＩ様タンパク質はまた、リンカー分子により連結することができ、化学的なまたはアミノ酸リンカーは、様々な長さである。化学的なリンカーは当該分野においては十分に周知である。ペプチドリンカーが好ましい。
【００４０】
ペプチドリンカー（Ｌ）は、しばしば、例えば、グリシンおよび／またはセリンなどの一連のペプチドである。用いることができるアミノ酸リンカーは、以下の配列を含むことができる：
【化２】
2005511005.tif 000003
【００４１】
好ましいアミノ酸リンカーは、
（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｘ
式中、Ｘは、１〜５である、
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  および
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
である。
さらに、好適なリンカーは、Robinson等によるProc. Natl. Acad. Sci. USA; 95, 5929, 1998に開示されている。
【００４２】
したがって、本発明は、新規なＧＰＶＩ融合タンパク質、好ましくはＦｃ融合タンパク質を提供し、これは、対応するＧＰＶＩの天然形態よりも、改良された収率、細胞外媒体への分泌、例えばプロテインＡカラムによる容易な精製、より長い血清半減期、市販の抗体による容易な検出性を有するといった重要な利点を有する。
本発明はまた、本明細書に開示された、および特許請求の範囲に記載された該融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ分子にも関する。
【００４３】
好ましい態様として、以下のものを含む、本明細書および特許請求の範囲に記載された融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を開示する：
（ａ）リーダー配列、
（ｂ）Ｉｇ分子のＦｃ領域、
（ｃ）ＧＰＶＩの生物学的活性を有する標的タンパク質の配列。
【００４４】
本明細書に記載の本発明のリーダー配列は、小胞体の膜を横切るタンパク質の移送を開始するリーダーアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明に有用であるであろうリーダー配列は、抗体の軽鎖シグナル配列、例えば抗体１４．１８  (Gillies et. al., Jour. of Immunol. Meth., 125:191, 1989)、抗体の重鎖シグナル配列、例えばＭＯＰＣ１４１抗体の重鎖シグナル配列（Sakano et al., Nature 286:5774, 1980）および当該技術分野において周知のその他のシグナル配列（例えばWatson, Nucleic Acids Research 12:5145, 1984を参照）を含む。これらの文献の各々は、参照として本明細書に組み込まれる。リーダー配列は、当該技術分野において十分に特徴付けられ、典型的に１６〜３０のアミノ酸残基を含有し、そして、より多くのまたはより少ないアミノ酸残基を含有することができる。典型的なリーダーペプチドは、次の３つの領域からなる：基本的なＮ末端領域、中心の疎水性領域、より極性のあるＣ末端領域。中心の疎水性領域は、未完成ポリペプチドの移送の際に脂質二分子膜を横切ってシグナルペプチドを固定する４〜１２の疎水性残基を含有する。開始後、シグナルペプチドは、通常、小胞体の内腔内で、シグナルペプチダーゼとして知られる細胞酵素により切除される。好ましいポリヌクレオチドリーダー配列は、アミノ酸配列
【化３】
2005511005.tif 000004
を有するペプチドをコードする。
【００４５】
リーダーペプチドの潜在的な切除部位は、一般に、「（−３、−１）ルール」に従う。したがって、典型的なリーダーペプチドは、−１および−３番目に小さい、中性アミノ酸残基を有し、この領域においては、プロリン残基を欠く。シグナルペプチダーゼは、−１および＋１のアミノ酸の間のかかるシグナルペプチドを切除するであろう。したがって、リーダー配列をコードするＤＮＡの一部は、分泌の際に、融合タンパク質のアミノ末端から切除することができる。この結果、Ｉｇ領域とＧＰＶＩ様タンパク質とからなる融合タンパク質の分泌をもたらす。シグナルペプチド配列の詳細な説明は、von Heijne, Nucleic Acids Res., 14:4683, 1986に記載されている。当業者に明らかなように、分泌カセットでの使用のための特定のリーダー配列の適合性は、いくつかの慣用の実験を必要とするかもしれない。リーダー配列はまた、「シグナルペプチド」、「シグナル配列」または「リーダーペプチド」と呼ばれ、そして、本明細書中、シグナル配列の類義語の意味を有するこれらの用語の各々を用いることができる。
【００４６】
本発明のリーダー配列、ＧＰＶＩ様タンパク質およびタグ分子は、それぞれ、上記定義のリンカー分子により連結することもできる。
【００４７】
本発明はまた、ＧＰＶＩ融合タンパク質の発現を促す、前記ＤＮＡ分子を含む発現ベクターに関する。
本明細書中、「ベクター」という用語は、宿主細胞に導入され、並びに宿主細胞ゲノムに組み換えられおよび組み込まれるか、またはエピソームとして自発的に複製するのに適したヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味する。かかるベクターは、線状の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなど含む。ウイルスベクターの非限定的な例は、バキュロ、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスを含む。本明細書中、「標的タンパク質の発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳および正確な活性構造にフォールディングされるタンパク質産物の分泌を意味する。
本発明によれば、真核生物、好ましくは哺乳類の宿主細胞が用いられ、これは、本明細書に定義される融合タンパク質の発現に好適である。かかる宿主細胞の前記ベクターによるトランスフェクション、本発明の融合タンパク質の発現、精製および単離の方法は、当該技術分野で十分に周知である。
【００４８】
したがって、本発明の融合タンパク質を産生するための方法は、
ａ）随意に、分泌のためのリーダー配列、タグまたはＩｇ分子、ＧＰＶＩ様タンパク質および随意にリンカー配列を含む、融合タンパク質をコードするＤＮＡの構築、
ｂ）適切な発現ベクターへの前記融合ＤＮＡの設置、
ｃ）真核細胞での前記融合タンパク質の発現、および
ｄ）前記分泌された融合タンパク質の精製、
を含む。
【００４９】
本発明は、さらに、結合または機能的な応答の刺激もしくは阻害の観察により、ＧＰＶＩとコラーゲンの結合のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法を提供する。
例えば、該スクリーニング方法は、以下の工程を含むことができる：
ａ）コラーゲンが塗布された表面と、本発明の融合タンパク質およびＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用の潜在的なアンタゴニストまたはアゴニストとの、該アンタゴニストまたはアゴニストが不在の場合には、確実に前記融合タンパク質とコラーゲンが塗布された表面が結合する条件下での接触、
ｂ）コラーゲンに結合した融合タンパク質と、融合タンパク質への結合親和性を有する認識部位および検出可能なラベルを含む抗体との、該融合タンパク質のコラーゲンが塗布された表面への結合に影響を与えることなく、該抗体が該融合タンパク質に確実に結合する条件下での接触、
ｃ）コラーゲンに結合した残存融合タンパク質を検出するための検出工程の実行。
【００５０】
本発明は、さらに、ＧＰＶＩ−コラーゲンおよび／または血小板−コラーゲン相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングのための成分を含有するキットを提供する：
これらは、
ａ）本明細書中で定義されるとおりの融合タンパク質、
ｂ）融合タンパク質のタグ／Ｉｇ部分に向けられた、検出可能なラベルを担持する第二抗体、
ｃ）コラーゲンがコートされた表面、
ｄ）適切な緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩またはＨＥＰＥＳ緩衝液）
であることができる。
【００５１】
本発明はまた、随意に、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を共に有する活性剤としての、本明細書で定義されるとおりの少なくとも１つのＧＰＶＩ融合タンパク質、好ましくは、Ｆｃ−ＧＰＶＩ融合タンパク質を含む医薬に関する。これらの医薬は、例えば、動脈硬化性プラークの破裂、不安定狭心症などの、コラーゲンにより増大した血小板の活性化を含む、または、経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）などの外科的処置中の血小板−コラーゲン相互作用に関連する血栓性および心臓血管性イベントおよび疾患の処置に有用である他の活性剤を含有することができる。好ましいさらなる活性剤は、アスピリン、ヘパリン、サラチン(saratin)またはストレプトキナーゼあるいはこれらの組み合わせである。
【００５２】
本発明は、さらに、活性剤として本明細書で定義されるＧＰＶＩ融合タンパク質を含む医薬と、アスピリン、ヘパリン、サラチンまたはストレプトキナーゼあるいはこれらの組み合わせを含む医薬とを含む、同時的な(joined)または時間的にずらした(timely shifted)投与のための薬学的パックを提供する。
【００５３】
かかる医薬および薬学的パックは、非経口投与であっても、または経口、経肺、経鼻、経皮または他の投与形態であってもよい。一般に、本発明に含まれるのは、本発明のタンパク質または派生産物の効果的な量を、随意に、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む医薬である。
【００５４】
用語「非経口」は、本明細書中では、皮下、静脈内、関節内および気管内への注射技術および注入技術を含む。非経口用の組成物および配合物は、最も好ましくは、知られている手法により、ボーラスの形態でまたは持続注入として静脈内投与される。
【００５５】
本明細書中で使用されている用語「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、不活性で非毒性液体の充填剤、界面活性剤などの添加剤、種々の緩衝剤内容（例えば、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）、可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、アジュバント、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、異性重亜硫酸ナトリウム）、溶剤または溶液および充填物質（ラクトース、マンニトール）を意味し、これは、活性化合物または患者と不都合には反応しない。
【００５６】
好適な液体担体はこの分野ではよく知られており、例えば、滅菌水、生理食塩水、デキストロース水溶液、糖の溶液、エタノール、グリコールおよびオイル（石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のものを含み、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油およびミネラルオイル）などである。
【００５７】
局所適用剤は、水性または油状の懸濁物、溶液、エマルション、ゼリー、または好ましくはエマルション軟膏の形態であり得る。
【００５８】
前記好適な製剤に関して、本発明による融合タンパク質は、変更された溶解性を示す、任意の非毒性の有機酸または無機酸との薬学的に許容される塩を最終的に形成し得る。無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸、ならびにオルトリン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの酸金属塩である。有機酸の例には、酢酸、グルコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸およびスルホン酸などのモノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸がある。カルボキシ末端アミノ酸部分の塩には、任意の好適な無機塩基または有機塩基によって形成される非毒性のカルボン酸塩が含まれる。これらの塩は、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムを含むＩＩＩＡ族の軽金属、ならびにトリエチルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、１−エテンアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミンおよびＮ−アルキルピペリジンを含む、トリアルキルアミンなどの、有機の第一級、第二級、および第三級アミンを含む。
【００５９】
効果的な投薬量は、先行技術により周知の診断用ツールを用いて決定することができる。一般に、上記範囲内における特定の患者に対する最適な治療的に受け入れられる投薬量および投薬割合(dose rate)は、用いられる特定の活性物質の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間および投与経路、クリアランス速度、処置目的（すなわち、治療または予防）、ならびに処置される血栓性疾患の性質などの様々な要因に依存する。当業者は、効果的な投薬量を、投与および所望の治療的効果を観察することにより確かめることができる。投薬量はまた、治療的な利益が見られるまで、初期に用いられる比較的多量の投薬量から、治療的な利益を維持するためのより少量の投薬量によって、治療の経過とともに変えることもできる。
【００６０】
本発明はまた、デバイス表面に実質的な抗血栓性を付与するために、本明細書で定義される固定化ポリペプチドでコートされた、体液と接触する移植可能なデバイスまたは体外用医療デバイスを提供する。本発明のポリペプチドは、医療デバイスの表面に固定化され、その表面に生物学的適合性および抗血栓性を付与する。かかるデバイスは、時折、体液または他の体液と接触する、移植可能なデバイスおよび体外用デバイスの意図された用途においては欠点となる、典型的に血小板凝集を引き起こす表面特性を有する。一般にプラスチック材料および合成繊維から作製されるかかるデバイスの例としては、プロテーゼ、人工臓器、眼用レンズ、縫合糸、人工脈管セグメント、カテーテル、透析装置、チューブ、血液を運ぶ容器などである。
【００６１】
後嚢混濁（ＰＣＯ）は、近代的な外科技術およびこの手順に用いられるレンズにもかかわらず、白内障手術後の一般的な合併症である。ＰＣＯは、後嚢にわたる、水晶体上皮細胞の増殖および移動により引き起こされ、視力を低下させる。物理的な処置並びに化学的に改良されたレンズは、ＰＣＯの形成の低減を目的としたものである。ヘパリンレンズコーティングまたは局所的なヘパリン点眼は、ＰＣＯの低減に用いられ、これは、血栓形成性機構が、ＰＣＯの形成に関与することを示す。したがって、本発明で開示される融合タンパク質は、ＰＣＯの低減または抑制に用いることができる。
【００６２】
配列情報
配列１
ＳＫ９にコードされるとおりのＦｃ−ＧＰＶＩ融合タンパク質の配列（リーダー配列を含む）である。
【００６３】
【化４】
2005511005.tif 000005
【００６４】
【化５】
2005511005.tif 000006
【００６５】
【化６】
2005511005.tif 000007
配列２
ＫＬ７４ＡにコードされるとおりのＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質の配列（リーダー配列を含む）である。
【００６６】
【化７】
2005511005.tif 000008
【００６７】
【化８】
2005511005.tif 000009
【００６８】
【化９】
2005511005.tif 000010
【００６９】
以下の例は、本発明をより詳細に説明するものであるが、これを制限するものではない。
例１：
Ｆｃ−ＧＰＶＩ融合タンパク質（配列１）の構築および発現
該融合タンパク質を構築するために、ベクターｐｄＣ−Ｆｃ−Ｘ（K-M Lo et al, Protein Engineering 11: 495-500, 1998に記載されている）を用いた。このベクターは、マウス抗体のシグナル・ペプチドを有するヒトＩｇＧ１のＦｃをコードする。転写には、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを利用した。構築のため、先ず、リーダー配列（aa 21〜aa 269）を有しないＧＰＶＩの細胞外部分を、標準のＰＣＲ法を用いてＴｏｐｏベクターにサブクローン化した。この工程においては、ＸｍａＩ側を、該遺伝子の５’部分に、そして、ＨｉｎｄＩＩＩ側を、該遺伝子の３’部分に導入した。さらに３つのアミノ酸Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙのリンカーを、Ｆｃ−ＧＰＶＩ融合タンパク質のＦｃ部分の終わりとＧＰＶＩのコード領域の始まりとの間の位置に導入した。最終工程として、変更したＧＰＶＩの細胞外部分をコードするＸｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントの後にインフレームでＸｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより切断したｐｄＣｓ−Ｆｃ−Ｘベクターにクローン化した。
【００７０】
選択マーカーとしてジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有する最終的なベクターを、細胞に単独でまたはネオマイシンなどの第二選択マーカーを含有するさらなるベクターと共に導入した。１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および２０ｍＭのグルタミンが添加されたＤＭＥＭ（登録商標）培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）で培養した、ＢＨＫ２１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）へのトランスフェクションを、１０７個の細胞に対し無傷のプラスミド１０〜２０μｇを用い、Graham, F.L. and van der Ebb, A.J. (Virology 52: 456, 1973)によるリン酸カルシウムトランスフェクション法により実施した。安定したトランスフェクタントを、最終濃度として１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）および５０〜２００ｎＭのメトトレキサートを含有し、ネオマイシン遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子を発現する細胞のみが増殖できる培地中で選択した。２〜３週間後、増殖細胞をクローン化し（０．５細胞／ウェル）、そして、クローンの上清を、ウェスタン分析により融合タンパク質の産生についてテストした。最適なプロデューサーを、タンパク質の産生に用いた。
【００７１】
例２：
ＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質（配列２）の構築および発現
構築のために、標準の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋（Invitrogen）を用いた。第一工程においては、ＰＣＲで両側に導入されたＮｈｅＩ制限部位を有する、オンコスタチンＭのリーダー配列(DNA Seq.Acc. M27286)を、ｐｃＤＮＡ３．１のＮｈｅＩ部位にクローン化した。次いで、コード領域の５’末端にＮｏｔＩ部位および３’末端にＸｈｏＩ部位を有するｃＤＮＡ (DNA Seq.Acc. X81695 およびZ17370)からのＩｇγ１のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３部分を、ＰＣＲにより該リーダー配列を含有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ部位に導入した。Ｉｇヒンジのシステインを、セリン残基に突然変異させた。同時に、リーダー配列（aa 21〜aa 269）を有しないＧＰＶＩの細胞外部分を、標準のＰＣＲ法を用いてＴｏｐｏベクターにサブクローン化した。この工程においては、コード領域の５’部分にＨｉｎｄＩＩＩ部位をおよび該遺伝子の３’部分にＸｈｏＩ部位を導入した。さらに、７つのアミノ酸（Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ）のリンカーを、リーダー配列とＧＰＶＩのコード領域の始まりとの間に、並びに、さらなる３つのアミノ酸Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇのリンカーを、ＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質におけるＧＰＶＩのコード領域の終わりとＦｃ部分の始まりとの間の位置に導入した。最終工程において、ＧＰＶＩの変更された細胞外部分を有するＨｉｎｄＩＩＩ-ＮｏｔＩフラグメントを、オンコスタチンＭのリーダーおよびＩｇＧ１のＦｃのコード部分を含有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ-ＮｏｔＩ部位にクローン化した。
【００７２】
選択マーカーとしてネオマイシン遺伝子を含有する最終的なベクターを、細胞に単独で、またはジヒドロ葉酸還元酵素などの第二選択マーカーを含有するさらなるベクターと共に導入した。１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および２０ｍＭのグルタミンが添加されたＤＭＥＭ（登録商標）培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）で培養した、ＢＨＫ２１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）へのトランスフェクションを、１０７個の細胞に対し無傷のプラスミド１０〜２０μｇを用い、Graham, F.L. and van der Ebb, A.J. (Virology 52: 456, 1973)による、リン酸カルシウムトランスフェクション法により実施した。安定したトランスフェクタントを、最終濃度として１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）および５０〜２００ｎＭのメトトレキサートを含有し、ネオマイシン遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子を発現する細胞のみが増殖できる培地中で選択した。２〜３週間後、増殖細胞をクローン化し（０．５細胞／ウェル）、そして、クローンの上清を、ウェスタン分析により融合タンパク質の産生についてテストした。最適なプロデューサーを、タンパク質の産生に用いた。
【００７３】
例３：
Ｆｃ−ＧＰＶＩの産生および精製
Ｆｃ−ＧＰＶＩ融合タンパク質の産生のために、安定した細胞クローンを、インテグラミニファーメンター（Integra Minifermenter）で、細胞コンパートメントにおいて、無血清培地を用いて培養した。無細胞上清を、該融合タンパク質の精製に用いた。該上清を、ｐＨ７．４に調整し、そして、該融合タンパク質を、０．１ｍＭクエン酸、ｐＨ２．８を用いるプロテインＡアフィニティーカラム（Pharmacia（登録商標））を用いて精製した。タンパク質を含有するフラクションを、ｐＨ９．０のＴｒｉｓ緩衝液を用いて中和した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５カラムを用いる最終工程において、緩衝液の、ｐＨ７．４のＰＢＳへの変更を実施した。上清からの精製したタンパク質を、ウェスタン分析、ＢｉｏｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡを用いて分析した。該タンパク質を、−７０℃で保存した。
【００７４】
例４：
Ｆｃ−ＧＰＶＩのウェスタン分析
ＳＤＳおよびメルカプトエタノールを含有する試料緩衝液中で５分間煮沸した後、プローブを、１０％Ｔｒｉｓグリシンアクリルアミドゲルのスロットに負荷する。電気泳動の後、タンパク質を、ファストブロットマシーン(Fast Blot machine)を用いて（Ｂｉｏｍｅｔｒａ（登録商標））、ＰＶＤＦメンブレン（ＢｉｏＲａｄ（登録商標））に移した。ブロッティングの後、ＰＶＤＦメンブレンを、ブロッキング剤を有するブロッキング緩衝液中でインキューベートした（Boehringer Mannheim, No.: 1096176）。融合タンパク質のＧＰＶＩ部分の検出のために、該メンブレンを、ウサギ抗ＧＰＶＩポリクローナル抗血清を用いて室温で２時間インキューベートした。該メンブレンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびブロッキング剤を含有する緩衝液で洗浄し、そして、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ（登録商標））を用いて室温で１時間インキューベートした。該融合タンパク質のＦｃ部分の検出のために、該メンブレンを、Ｆｃフラグメント特異抗血清であるペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immuno Laboratories, Inc.）を用いて、室温で１時間インキューベートした。
【００７５】
該メンブレンを洗浄し、ＢＭケミルミネサンスブロッティング基質(Boehringer Mannheim)を用いて１分間インキューベートした。該メンブレンを上にハイパーフィルム（Hyperfilm）ＥＣＬ(Amersham)を有するハイパーカセット（Hypercassette）に設置した。該フィルムを、約１分間露光後に現像した。
【００７６】
例５：
インビトロにおけるＦｃ−ＧＰＶＩとコラーゲンの結合
ＧＰＶＩ−Ｆｃのコラーゲンとの特異的な結合は、比色酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定する。基本的には、コラーゲンがコートされたマイクロタイタープレートをマトリックスとして、およびＧＰＶＩ−Ｆｃをリガンドとして用いる。結合したＧＰＶＩ−Ｆｃの検出は、Ｆｃ部分に特異的に結合する、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗Ｆｃ抗体により実施する。ペルオキシダーゼ基質を加えた後、結合したＧＰＶＩ−Ｆｃの量は、吸光度の増加に反映される。
【００７７】
コラーゲンによるマイクロタイタープレートのコーティング
ポリスチロールマイクロタイタープレートを、トリス緩衝生理食塩水ｐＨ８．０で１２時間懸濁した２０μｇ／ｍｌのコラーゲンタイプＩＩＩ ５０μｌでコーティングする。結合していないコラーゲンを、洗浄によって除去する。次いで、フリーのタンパク質結合部位を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した５％（ｗ／ｖ）の粉乳および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０によりブロッキングする。
【００７８】
結合アッセイ
濃度範囲０．１〜１００ｎＭのＧＰＶＩ−Ｆｃを、結合緩衝液（ＨＥＰＥＳ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）に溶解する。非特異的な結合の評価のために、ＧＰＶＩ−Ｆｃの代わりに、コラーゲン非特異Ｆｃ融合タンパク質を用いる（図４）。
各ウェルにＧＰＶＩ−Ｆｃ溶液５０μｌを与える。２時間放置し、ＧＰＶＩ−Ｆｃを結合させる。次いで、コラーゲンに結合したＧＰＶＩ−Ｆｃの固定を、２０ｍＭのグルタルジアルデヒド５０μｌを加えて、１０分間で実施する。洗浄後、２時間、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗Ｆｃ抗体を加える。最後に、結合したＧＰＶＩ−Ｆｃの量を、比色的に、ペルオキシダーゼ反応により検出する。
【００７９】
ＧＰＶＩ受容体アンタゴニストの検出
１０ｎＭのＧＰＶＩ−Ｆｃ２５μｌおよび薬液２５μｌを、ともに結合緩衝液に溶解し、各ウェルに与える。マイクロタイタープレートの発色は、上記のとおりに実施する。ＧＰＶＩ−Ｆｃ／コラーゲン結合のアンタゴニストは、吸光度の減少により容易にモニターすることができ、一方、アゴニストは、吸光度の増加により反映される、結合したＧＰＶＩ−Ｆｃの割合を増強する。ＥＬＩＳＡにより、ＧＰＶＩ−Ｆｃ結合のミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ）などの標準のパラメータの計算およびアンタゴニストの阻害定数（Ｋｉ）の決定を可能にする。
【００８０】
特異的なＧＰＶＩ−Ｆｃ結合の検証
ＧＰＶＩ−Ｆｃのコラーゲンとの結合の特異性は、以下によって示される：
（ｉ）ＧＰＶＩ−Ｆｃのコラーゲンとの結合の飽和曲線は、コラーゲン結合部位が、１００ｎＭ以上の濃度では、完全にＧＰＶＩ−Ｆｃで満たされることを示す（図４）、
（ｉｉ）コントロールとしてＧＰＶＩ−Ｆｃの代わりに用いられるコラーゲン非特異Ｆｃ融合タンパク質および西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗体は共に、コラーゲンには結合しない（図４）、
（ｉｉｉ）ＧＰＶＩ受容体に特異的に結合することが十分に知られているコラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）(Knight, et al., Cardiovasc. Res. 41, 450-457, 1999)によるＧＰＶＩ−Ｆｃ結合の阻害。ＣＲＰアミノ酸配列は、血小板ＧＰＶＩ受容体と相互作用をなすコラーゲン結合ドメインを模倣する。現行のアッセイにおいては、ＣＲＰは、ＧＰＶＩ−Ｆｃに対して、コラーゲンと競合し、次にコラーゲンに結合したＧＰＶＩ−Ｆｃの減少を導く（図５）、
（ｉＶ）ヒト血小板から精製されたＧＰＶＩ受容体タンパク質により免疫されたウサギから得られるポリクローナル抗ＧＰＶＩ血清によるＧＰＶＩ−Ｆｃ結合の阻害。該抗血清は、ＧＰＶＩ−Ｆｃのコラーゲンへの結合を、濃度依存的に減少させる（図５）。
【００８１】
ＧＰＶＩ拮抗作用の治療的関連
コラーゲンにより誘発される血栓塞栓性合併症を抑制するためのＧＰＶＩアンタゴニストの治療的関連は、ＧＰＶＩ−Ｆｃ滴定曲線により示される（図６）。すなわち、コラーゲンによるヒト血小板の刺激は、数分以内に凝集を誘発する。コラーゲンの前のＧＰＶＩ−Ｆｃの添加は、血小板凝集の濃度依存的な減少をもたらす。これらは、ＧＰＶＩ−Ｆｃが、コラーゲンに対して、血小板ＧＰＶＩ受容体と競合することを示す。したがって、ＧＰＶＩ−Ｆｃに捕らえられたコラーゲンは、もはや血小板凝集を引き起こすことはできない。ＧＰＶＩ受容体拮抗作用の治療的関連に関ししては、上記に示す結果から以下の結論を導き出すことができる：
（ｉ）ＧＰＶＩ−Ｆｃ自体を、コラーゲンにより誘発される血栓塞栓性合併症を予防する薬剤として用いることができる、
（ｉｉ）低分子薬剤による血小板ＧＰＶＩ受容体の拮抗作用は、コラーゲンにより誘発される凝集を予防するであろう。
【００８２】
例６：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定されたＧＰＶＩとコラーゲンタイプＩＩＩ（ヒト）の結合
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００による結合試験を展開するために、ＧＰＶＩのコラーゲンへの周知の相互作用を用いた。タンパク質の固定化されたリガンドへの結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を利用して観察することができる。この技術は、溶液中の相互作用する分子の親和性および動力学に関する結果を示すことができる。このアッセイにおいては、ヒトコラーゲンタイプＩＩＩを、該方法の記載のとおりにセンサー表面に固定化し、そして、精製した可溶性のＧＰＶＩを、コラーゲン表面に通過させた。
【００８３】
タンパク質の相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００装置(BIAcore（登録商標）、Freiburg、Germany)および手順(Johnsson and Lindqvist, 1992; Johnsson et al., 1991)を用いるＳＰＲ技術により同定し、特徴付けた。業者により開発された手順に従い、カップリング試薬を用いた。ＣＭ５センサーチップへのカップリングを、活性化したカルボキシレート基を介してヒトコラーゲンタイプＩＩＩ(Sigma(登録商標))のフリーのアミン基に対して行った。ｐＨスカウティングおよびカップリング化学を、標準の条件下で実施した(Johnsson and Lindqvist, 1992; Johnsson et al., 1991)。カップリングのためにコラーゲンを、０．１２５μｇ／ｍｌとなるように、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、結果として３３１ＲＵの固定化材料が得られる。
【００８４】
結合実験のために、精製した組換え糖タンパク質ＶＩを用いた。該タンパク質を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０で希釈した。全ての結合実験は、２５℃で行い、ディプリケートで実施した。糖タンパク質ＶＩによる滴定を、０．２μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの濃度範囲で実施した。
全タンパク質濃度を、ＢＣＡ法（Pierce）により決定した。ＧＰＶＩとコラーゲンとの相互作用の動力学は、図７で示されるセンサグラムで観察することができる。該実験において、増加する濃度の精製したＧＰＶＩを、コラーゲンタイプＩＩＩ表面に通過させた。ＧＰＶＩと表面に結合したコラーゲンと会合速度は、センサを通過するＧＰＶＩの濃度に伴って増加する。結合は、約２００秒後に飽和となる。コラーゲン表面からのＧＰＶＩの解離速度定数は、計算により０．００３ｓ−１となり、これは、２３０ｓの複合体の半減期に対応する。
【００８５】
結合反応の平衡における結合シグナルにより、親和性を導くことが可能であり、またはその場合には、ＧＰＶＩ／コラーゲン相互作用の飽和の半最大濃度を導くことが可能である。図８には、結合シグナルが平衡に達したときの結合シグナルに対するＧＰＶＩ濃度形態で、得られたデータがプロットされている。１：１の結合モデルを想定した双曲線関数への非線形フィットにより、９μｇ／ｍｌの半最大濃度を決定することができる。７５０００Ｄａの分子量および十分に活性なタンパク質を仮定すれば、平衡定数は、およそ１．２ｘ１０−７Ｍであると見積もることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】Ｆｃ−ＧＰＶＩをコードするＳＫ９のベクターマップを示す図である。
【図２】ＧＰＶＩ−ＦｃをコードするＫＬ７４のベクターマップを示す図である。
【図３】例に記載のＦｃ−ＧＰＶＩのウエスタンブロット分析を示す図である。１０％アクリルアミドゲルでのＳＤＳゲル電気泳動の後、融合タンパク質を、ポリクローナル抗ＧＰＶＩ抗血清（Ａ）またはポリクローナル抗ＦｃＩｇＧフラクション（Ｂ）のいずれかにより検出した。陽性コントロールプローブとしてブロットＡには血小板からの抽出物（１）を、およびブロットＢにはｈｕ−ＩｇＧ抗体に用いた。陰性コントロールとしてＢＨＫ細胞の上清を用いた。プローブ２〜７は、２つの異なるトランスフェクション実験からの異なるクローンを示す。約９０ＫＤのサイズのバンドは、完全なＦｃ−ＧＰＶＩである。
【図４】コラーゲンとのＧＰＶＩ−Ｆｃ結合を示す図である。１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した、ＧＰＶＩ−Ｆｃを、コラーゲンがコートされたマイクロタイタープレートに結合させた。コラーゲンと結合したＧＰＶＩ−Ｆｃの量を、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗Ｆｃ抗体により、比色分析的に検出した。非特異的な結合を、ＧＰＶＩ−Ｆｃの代わりに適用したコラーゲン非特異的Ｆｃ融合タンパク質により評価した。データは平均値として示される（ｎ＝２）。
【図５】ＧＰＶＩに特異的なアンタゴニストによるＧＰＶＩ結合の阻害を示す図である。ＧＰＶＩの結合を、それぞれ、コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）および抗ＧＰＶＩ血清の存在下で実施した。ＣＲＰは、ＧＰＶＩ受容体とコラーゲンとの結合を一意的に媒介するコラーゲン結合ドメインを模倣する。ＧＰＶＩ−Ｆｃに対するＣＲＰおよびコラーゲンの競合により、コラーゲンに結合したＧＰＶＩ−Ｆｃの量は、ＣＲＰの濃度が増大するとともに減少する。ＧＰＶＩ−Ｆｃ結合の阻害は、ヒト血小板から調製されたＧＰＶＩ受容体タンパク質により免疫されたウサギから得られる抗ＧＰＶＩ血清により示すことができた。抗ＧＰＶＩ抗体の力価は該血清中では決定しなかったので、該血清の希釈が記載される。データは、平均値として示される（ｎ＝２）。
【図６】ＧＰＶＩ−Ｆｃによるコラーゲン誘発性血小板凝集の抑制を示す図である。血小板凝集は、１０μｇ／ｍｌコラーゲン（コントロール）の添加の後、異なるＧＰＶＩ−Ｆｃ濃度の存在下で比濁法により決定する。データは、平均値として示される（ｎ＝４）。
【図７】ＧＰＶＩとコラーゲン表面との相互作用のセンサグラムを示す図である。コラーゲンタイプＩＩＩ（ヒト）を、方法に記載のとおりにセンサー表面に連結させ、ＧＰＶＩを、０．２μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で表面を通過させた。
【図８】ＧＰＶＩのタンパク質濃度に対する平衡結合データのプロットを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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