(57)【要約】本発明は、ビオチン化色素の存在下で、ビオチン標識したオリゴヌクレオチドが、そのアビジンまたはストレプタビジンとの複合体から置き換わることを含む、ホモジニアスな相において核酸依存性トランスロカーゼの阻害剤を検出するための方法に関する。
2005502364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン化色素の存在下で、ビオチン標識したオリゴヌクレオチドがそのアビジンまたはストレプタビジンとの複合体から置き換わることを含む、ホモジニアスな相において核酸依存性トランスロカーゼの阻害剤を検出する方法。
【請求項２】
核酸依存性トランスロカーゼが、ヘリカーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ビオチン標識したオリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖または部分的に二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１および２に記載の方法。
【請求項４】
ビオチン単位が前記オリゴヌクレオチドの５'または３'末端に結合する、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
ビオチン化色素がビオチン化されたフルオレセインである、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
自動化されたまたはハイスループットスクリーニングの環境における、請求項１〜５に記載の方法の使用。
【請求項７】
トランスロカーゼおよびヘリカーゼの阻害剤の発見のための請求項１〜６に記載の方法の使用。
【請求項８】
医薬組成物の製造のための請求項１〜７に記載の方法によって見いだされたトランスロカーゼおよびヘリカーゼの阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチン化色素の存在下で、ビオチン標識したオリゴヌクレオチドが、そのアビジンまたはストレプタビジンとの複合体から置き換わることを含む、１つのホモジニアスな相において核酸依存性トランスロカーゼの阻害剤を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬学的に活性な化合物が見つかるまでに試験される化合物の数は徐々に増加しているので、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）技術の応用の成功は、現代の薬物の発見にとって不可欠である。
【０００３】
これには、標準的な実験室の技術を自動化されたプロセスに変換する必要があり、それ故に、複数回の洗浄、廃棄、またはクロマトグラフィーによる分離などの工程を省くかまたは回避する必要が増えてきているが、そのすべてを容易に自動化することはできない。放射能標識された化合物の使用も、機械が汚染されることを防ぐために避けるべきである。
【０００４】
ＨＴＳにおける成功にさらに必要なのは、アッセイの設計が、大量のデータが誤って陽性となるのを避けるのに十分に大きなシグナル対ノイズ比を実現することである。これには、試験化合物とその標的との間の特異的な相互作用を直接測定することが理想的であり、非特異的な相互作用によって誘発されない検出工程を組み込む必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記を企図として、本発明の目的は、原核および真核核酸トランスロカーゼ、例えばポリメラーゼ、特にへリカーゼなど、のホモジニアスなハイスループットのマイクロプレートアッセイを開発することである。
【０００６】
ヘリカーゼは、二本鎖の核酸をほどいて、その後の核酸修飾または転写活性に対する一本鎖の基質を生じる核酸依存の転位酵素である。核酸がほどかれる課程の間に、ヘリカーゼは、その核酸に沿って転位をおこない、両プロセスはヌクレオシド三リン酸の加水分解と共役している。ヘリカーゼは、原核および真核生物に存在し、ウイルスによってもコードされる。したがって、ヘリカーゼは、病原性の感染および癌における治療的介入の実行可能な標的である。
【０００７】
ヘリカーゼ活性を評価する初期のアッセイはＨＩＳには適しておらず、ＮＴＰアーゼ活性とヘリカーゼ転位との相関関係に依存するものか、用いた放射能標識された部分的な二本鎖の基質に依存するものであり、その二本鎖の基質はほどかれると電気泳動により検出されることもあった。より現代的なアッセイ法は、二本鎖ＤＮＡの一本鎖特異的ヌクレアーゼに対する感受性、蛍光エネルギー遷移、すでに形成している二本鎖からの蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの置き換わり、二本鎖特異的色素の置き換わりおよびシンチレーション近似アッセイを用いるものである。
【０００８】
例えば、Alaoui-Ismailiら（2000; Antiviral Research 46: 181-193）には、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ活性のための自動化されたスクリーニングアッセイが記載されているが、シグナル対ノイズ比が小さく、９６ウェル方式の、扱いにくい放射能シンチレーション近似アッセイを用いている。
【０００９】
Sivarajaら（1998; Analytical Biochemistry 265: 22-27）には、ヘリカーゼ酵素のスクリーニングアッセイが記載されているが、このアッセイはELISA方式のものであり、複数回の洗浄工程が必要であり、放射能標識された化合物を使用するものである。
【００１０】
Egglestonら（1996; Nucleic Acids Research 24: 1179-1186）には、ヘリカーゼ活性の結果として二本鎖の核酸からの挿入された蛍光色素の放出を測定することによる、蛍光の、核酸が結合したリガンドの置き換えに基づくヘリカーゼアッセイが記載されている。但し、結合した色素と放出された色素との間の報告されているシグナル対ノイズ比は、ハイスループットスクリーニング環境でのヘリカーゼ阻害剤についての実験データの有効な統計解析には不十分である。
【００１１】
結論として、理想的なＨＴＳアッセイは、ホモジニアスで、安価で、正確であり、活性が陽性のシグナルによって示されることが特徴となるため、文献公知の分析法は、これまでのところ、遅く、高価で、扱いにくく、ハイスループットスクリーニングが容易になるというものではない。
【００１２】
以上を考慮すると、ＨＴＳを用いた工業的スケールでのヘリカーゼ活性の評価に適した利用可能なアッセイはこれまでなかったと言うことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明はここに、ヘリカーゼおよび関連の核酸転位酵素の阻害剤のハイスループットスクリーニングのための、新規の、ホモジニアスアッセイ法を含んでなり、これは、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドをそのアビジンまたはストレプタビジンとの複合体から置き換えるヘリカーゼの能力と、その検出のための、ビオチン標識されたフルオレセインなどの色素がフリーのアビジンまたはストレプタビジン結合部位に結合する能力とを組み合わせることにより達成される。
【００１４】
周知のとおり、ＤＮＡヘリカーゼは、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドを、そのストレプタビジンとの複合体から置き換えることが可能である（Morris and Raney (1999), Biochemistry 38: 5164- 5171）が、この置き換えは、溶液中ではなく古典的なゲルに基づくアッセイにおいて実験室スケールで実証されただけであり、その置き換えの検出に関して、放射能標識されたオリゴヌクレオチドの移動は、そのストレプタビジンまたはアビジンとの複合体と比較してより速く動くことが測定された。
【００１５】
さらに知られているように、ビオチンに対するアビジンまたはストレプタビジンの結合部位は、ある特定のビオチン−フルオレセインコンジュゲートを用いれば粗製の生物流体中（biofluid）で定量することができる（Kada, G. et al. (1999), Biochimica et Biophysica Acta 1427: 33-43）。
【００１６】
そのような知識を、ホモジニアスな相で実行されるアッセイの設計のための解決方法へとつながるように転換することで、ここに、優れたシグナル／ノイズ比が実現される。工業的スケールでのヘリカーゼの阻害剤の発見のためにうまく応用することができ、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドは、アビジン（ストレプタビジン）結合部位から置き換わり、小さいビオチン標識されたフルオレセインのフリーの部位への結合が可能になる。図１。
【００１７】
実験
実施例１
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）によるヘリカーゼアッセイ
ヘリカーゼ基質は、試験においてヘリカーゼの方向に適当な末端でビオチン化される試験でヘリカーゼに適した長さのオリゴヌクレオチドの形態をとっている。本実施例では、以下の配列ＧＡＣＧＴＡＴＴＣＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＧＴＡＣＴＧＡＣＴＧＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧを有する一本鎖の６０マー（Eurogentec, Belgiumより入手）を５'末端でビオチンにより標識し、３'−５'ヘリカーゼであるＳＶ４０ラージＴ抗原のヘリカーゼ機能に対する基質として用いることができるようにした。
【００１８】
同体積の、反応緩衝液（以下参照）に溶解した、ストレプタビジンおよびビオチン標識したオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオドがストレプタビジンの少なくとも４倍モル過剰になるように混合した。これにより、ストレプタビジン分子に対するビオチン結合部位のすべて（ストレプタビジン１分子あたり４つのビオチン結合部位）の飽和を確実にする。この混合物をアッセイに使用する前に、少なくとも１５分間インキュベーションした。
【００１９】
次いで、オリゴヌクレオチド／ストレプタビジン複合体（オリゴ／ＳＡ）のアリコートを、適当な緩衝液（この場合、３ｍＭのＭgＣl2、５ｍＭジチオスレイトールおよび１００μg／ｍLウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣl（ｐＨ７．５））中でＳＶ４０ラージＴ抗原およびビオチン−４−フルオレセインと混合し、ピペットで３８４ウェルマイクロプレートに加えた。
【００２０】
酵素反応は、適当な量のアデノシン三リン酸を添加して、プレートを３７℃でインキュベーションすることにより開始した。測定は、マイクロプレート蛍光光度計を用い、４８５ｎｍの励起波長と５３５ｎｍの発光波長にて行った。ＳＶ４０ラージＴ抗原との典型的な反応のデータを図２にまとめたが、フリーのストレプタビジン結合部位に結合するときのビオチン−フルオレセインの消光により引き起こされるシグナルの消失により示されるように、ヘリカーゼ活性を示している。
【００２１】
実施例２
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）によるヘリカーゼアッセイ
ヘリカーゼ基質は、試験下でヘリカーゼの方向に適当な末端でビオチン化される試験下でヘリカーゼに適した長さのオリゴヌクレオチドの形態をとっている。本実施例では、以下の配列ＧＡＣＧＴＡＴＴＣＡＡＧＡＴＡＣＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＧＴＡＣＴＧＡＣＴＧＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧを有する一本鎖の６０マー（Eurogentec, Belgiumより入手）をビオチンで５'末端にて標識した。次いで、これをＴＣＴＧＴＡＣＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＧＡＡＴＡＣＧＴなる配列（Eurogentec, Belgium）を有する相補鎖にアニーリングして、３'−５'ヘリカーゼであるＳＶ４０ラージＴ抗原のヘリカーゼ機能に対する二本鎖の基質として用いることができるようにした。
【００２２】
同体積の、反応緩衝液（以下参照）に溶解したストレプタビジンおよびビオチン標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオドがストレプタビジンに対して少なくとも４倍モル過剰になるように混合した。これにより、ストレプタビジン分子に対するビオチン結合部位のすべて（ストレプタビジン１分子あたり４つのビオチン結合部位）の飽和を確実にする。この混合物をアッセイに使用する前に、少なくとも１５分間インキュベーションした。
【００２３】
次いで、二本鎖／ストレプタビジン複合体（オリゴ／ＳＡ）のアリコートをＳＶ４０ラージＴ抗原と混合し、適当な緩衝液（この場合、３ｍＭのＭgＣl2、５ｍＭジチオスレイトールおよび１００μg／ｍLウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣl（pH７．５））中でＳＶ４０ラージＴ抗原およびビオチン−４−フルオレセインと混合し、ピペットを用いて３８４ウェルマイクロプレーに加えた。
【００２４】
酵素反応は、適当な量のアデノシン三リン酸を添加して、プレートを３７℃でインキュベーションすることにより開始した。測定は、マイクロプレート蛍光光度計を用い、４８５ｎｍの励起波長と５３５ｎｍの発光波長にて行った。ＳＶ４０ラージＴ抗原との典型的な反応のデータを図３にまとめたが、二本鎖ＤＮＡ基質に対するＳＶ４０ラージＴ抗原のヘリカーゼ活性の作用により結合可能になったストレプタビジン結合部位に結合したときのビオチン−フルオレセインの消光により引き起こされるシグナルの消失を示している。
【００２５】
実施例３
ヘリカーゼアッセイを用いる既知のヘリカーゼ阻害剤のキャラクタリゼーション
ヘリカーゼ活性の既知の阻害剤、ディスタマイシンＡ（Soderlind, K. J. et al. (1999; Anti-Cancer Drug Design 14: 19-36）はＤＮＡマイナーグローブバインダーであるが、上記のようにヘリカーゼアッセイに加えとところ、ヘリカーゼ活性の用量依存的な減少が認められた。即ち、ビオチン標識した基質からのストレプタビジンの置き換わりが阻害され、測定した時点でシグナルがそれに従って増加している（図４）。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
（原文に記載なし）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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