(57)【要約】超音波診断における物体、特にバブルの定量化においては、物体、特にバブルの濃度がしばしば高く、その結果、可視化のために得られる像データが飽和状態になり、従って定量化が不可能である問題が存在する。この問題を解決するために、試験下の目的物の断面層に含まれる物体がまず、特徴的なシグナルを生成し、そしてそれらのシグナルを採集し、そのシグナルからデータ組を形成し、試験下の目的物における物体配置の像に前記データ組を転換し、そしてそれから、物体の数を決定し、それにより、試験下の目的物におけるオーバーラップする断面層からの少なくとも２つの超音波シグナル組が採集されることが提案されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験下の目的物に含まれる物体を定量するための装置であって、
ａ）超音波フィールドを発するための少なくとも１つの変換器、この超音波フィールドにより、試験下の目的物中の層に含まれる物体が、特徴的な超音波シグナルを発し、そして特徴的なシグナルを受けるために励起され得る、
ｂ）特徴的シグナルから成る層における物体の数を決定するための少なくとも１つのデータ処理システム、及び
ｃ）超音波フィールドが、試験下の目的物中の第１層における物体の励起の後、シフトされ、その結果、物体が第２層中へのシフトの後、励起され、ここで前記第１層及び第２層がオーバーラップし、そしてお互い、平行で且つ定義された態様で配置されている手段を含んで成る装置。
【請求項２】
前記物体がバブルを表す請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記超音波フィールドが少なくとも５μm、シフトされ得る請求項１又は２記載の装置。
【請求項４】
前記少なくとも１つの変換器がピエゾ結晶の二次元又は三次元アレイを示す請求項１〜３のいずれか１項記載の装置。
【請求項５】
前記試験下の目的物及び前記二次元アレイがお互いに対してシフトされている手段が提供される請求項４記載の装置。
【請求項６】
前記三次元アレイにおけるピエゾ結晶のための対照が供給され、これにより、アレイにおけるピエゾ結晶列におけるピエゾ結晶から発する隣接する音フィールド又はアレイにおける隣接するピエゾ結晶から発する音フィールドがオーバーラップされ得る請求項４記載の装置。
【請求項７】
試験下の目的物及び少なくとも１つの変換器がお互いに対してシフトされている手段が供給される請求項４記載の装置。
【請求項８】
少なくとも１つのモータードライブが、試験下の目的物又は少なくとも１つの変換器をお互いに対してシフトするために供給される請求項１〜７のいずれか１項記載の装置。
【請求項９】
試験下の目的物が固定されている保持装置、及び少なくとも1つの変換器のための移動可能保持装置が供給される請求項１〜８のいずれか１項記載の装置。
【請求項１０】
データ処理及び像表示のための像評価システムが供給され、これにより、物体の定量化がビデオ濃度計により実行される請求項１〜９のいずれか１項記載の装置。
【請求項１１】
前記物体がバブルを示す請求項10記載の装置。
【請求項１２】
ヒト又は動物における超音波診断及び/又は超音波治療のための請求項１〜11のいずれか１項記載の装置の使用。
【請求項１３】
後−胚固体発生から出発して器官及び組織における生理学的に上方又は下方に調節できる分子マーカーのインビボ及びエクスビボマッピングのための、病原の間、器官及び組織における生理学的に上方又は下方に調節できる分子マーカーのインビボ及びエクスビボマッピングのためへの、及び細胞の上方及び下方に調節できる分子マーカーのインビトロマッピングによる細胞培養物の特徴づけのための(それにより前記物体が前記マーカーのための特異的結合分子を有する)請求項１〜11のいずれか１項記載の装置の使用。
【請求項１４】
前記抗体がバブルを表す請求項13記載の装置の使用。
【請求項１５】
試験下の目的物に含まれる物体を定量するための方法であって、
ａ）試験下の目的物中の層に含まれる物体が超音波フィールドにより特徴的な超音波シグナルを生成するために励起され、
ｂ）前記超音波シグナルが受信され、
ｃ）物体の数が、受信された超音波シグナルから決定され、そして
ｄ）物体が試験下の目的物中の第１層において励起された後、前記超音波フィールドがシフトされ、その結果、バブルが、第２層中への置換の後、励起され、ここで、前記第１層及び第２層がオーバーラップし、そして平行し、且つ定義された態様でお互いに対してシフトされることを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記物体がバブルを表す請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記バブルが、励起される場合、破壊され、そしてこの場合、特徴的なシグナルを発するために励起される請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記超音波フィールドが少なくとも５μmシフトされる請求項15〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
前記試験下の目的物及び超音波フィールドを放す少なくとも１つの変換器がお互いに対してシフトされる請求項15〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
前記試験下の目的物が少なくとも１つの固定された変換器に対してシフトされるか、又は少なくとも１つの変換器が試験下の固定された目的物に対してシフトされる請求項19記載の方法。
【請求項２１】
ヒト又は動物における超音波診断及び/又は超音波療法のための請求項15〜20のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
後−胚固体発生から出発して器官及び組織における生理学的に上方又は下方に調節できる分子マーカーのインビボ及びエクスビボマッピング、病原の間、器官及び組織における生理学的に上方又は下方に調節できる分子マーカーのインビボ及びエクスビボマッピング、及び細胞の上方及び下方に調節できる分子マーカーのインビトロマッピングによる細胞培養物の特徴づけ (それにより前記物体が前記マーカーのための特異的結合分子を有する)を実行するための請求項15〜20のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、独立した特徴的なシグナル、特に物体、好ましくはバブルの破壊に伴うそれらのシグナルを生成するために、診断用超音波により励起され得る試験下の目的物に含まれる物体を定量するための装置及び方法に関する。本発明はまた、ヒト又は動物における超音波診断及び/又は治療のための装置の使用、及び後−胚固体発生から出発して器官及び組織における生理学的に上方又は下方に調節できる分子マーカーのインビボ及びエクスビボマッピングのための、病原の間、器官及び組織における生理学的に上方又は下方に調節できる分子マーカーのインビボ及びエクスビボマッピングのためへの、及び細胞の上方及び下方に調節できる分子マーカーのインビトロマッピングによる細胞培養物の特徴づけのためへの前記装置及び方法の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波診断は、規則的な臨床学的実施に固有の場所を見出した。より強い超音波シグナルが結果的に生成され得るので、詳細は、コントラスト媒体の注入により改良される超音波像に示され得る。コントラスト媒体として、組織シグナルとは区別され得る検出可能なシグナル、特に非常に小さな気体封入（微小）バブルを生成するすべての非常に小さな物体（微小物体が）適切である。それらの物体は、試験下の目的物に供給され、そして例えばバブルの場合、超音波フィールドにおいて一定の条件下で破壊され得る。この場合、それらの気泡は独立した特徴的な超音波シグナルを放す。バブルが超音波フィールドにより破壊される場合、独立した特徴的なシグナルは、“刺激されたアコースティックエミッション（SAE）”として言及される。
【０００３】
独立した特徴シグナルを放すことができるバブルは、例えばEPO398935B1号、EP0644777B1号、EP0458745A1号及びWO01/68150A1号に記載されている。
刺激されたアコースティックエミッション（SAE）は、下記に図示されている。
図１においては、第１の低−振幅音波１及び第２の高−振幅音波２が示されている。低−振幅音波１が照射される場合、それに対してゆだねられる気泡３は損なわれないまま存続する。この場合、錯乱されたシグナル生成される。それとは対照的に、高−振幅音波が照射される場合、気泡４は破壊され、それによりSAEシグナルが生成される。
【０００４】
最も変更されたバブルのSEAシグナルは、アメリカ特許第5,425,366A号、アメリカ特許第6,186,951B1号及びDE19813174A1号に従って、色ドップラーモードにより検出され得る。
シフトを主に可視化するために、元来開発された他の超音波装置方法によってされ、SAEシグナルは、バブルのシフトに関係なく示され得る。例えば、スペクトルドップラー方法、パワードップラー方法、色ドップラー方法及び調和方法（第２方法、副方法、ワイドバンド方法、パルス−逆転方法、超調和方法、色ドップラー方法及び調和−パワードップラー方法）が言及されている。
【０００５】
SAEシグナル強度は、個々のバブルがそれら自体、検出され得るほど高い。この場合、個々のSAEシグナルは、破壊されていないバブルの実際のサイズ（＜10μm）に対応するサイズよりも、モニター上で相当に大きく可視化される（装置、変換器及び設定に依存して約0.5〜1mmの直径）。図２においては、SAEシグナルの値は、横断像で再生される。現在入手できる多くの超音波−診断装置においては、装置の設定した依存して個々の像の層厚さは、約1mmである。これは図３に示されている。従来の横断像の層厚さはここで検出され得る。組織/血液1m当たり約2,000〜3,000のバブルの濃度が一般的に、ソノグラフ横断像における滑らかなSAE対比をもたらす。
【０００６】
二次元超音波横断像においては、飽和バブル濃度は、超音波横断像の層厚（図３に例により示される）、及び単一のバブルが破壊される場合、超音波横断像において可視化されるSAEシグナルの値により決定される（いくつかの個々バブルが図２に示されている）。
定性的な像に関しては、低飽和濃度/飽和バブル濃度が好都合である。なぞならば、特に低いバブル濃度でさえ、滑らか対比が横断像をもたらすからである。
しかしながら、物体の定量化に関しては、低飽和濃度/飽和バブル濃度は好都合ではない。なぜならば、特に低濃度の物体、特にバブルは、像における対比飽和をもたらし、そして像における飽和濃度以上のそれらの濃度をもはや絶対的に決定することができず、又は物体、特にバブルをもはや区別することができないからである。
【０００７】
物体、特にバブルが血液において単に末結合のまま分散されるまで、それらの濃度は、飽和濃度/飽和バブル濃度が達成されないような手段で、用量により調節され得る。
しかしながら、例えば細胞、組織、器官又は他の蓄積する構造体における特定又は非特定濃度の物体がもたらされる場合、飽和濃度/飽和バブル濃度は一般的に卓越する。なぜならば、蓄積する組織又は蓄積する構造体は、物体が飽和濃度/飽和バブル濃度以上の濃度で蓄積するよう強くパッケージングされるからである。
【０００８】
用量の低下により、一定の環境下での標的領域における飽和濃度/飽和バブル濃度以下にたぶん進行するが、しかし物体、特にバブルの累積数は、最大飽和に対して未知の比で存在した。従って、そのような測定は、再生できず、又はそこに存在する濃度因子の数に相互関係する値を生成もしなかった。
従って、飽和濃度/飽和バブル濃度以上の物体の数（バブル数）の決定のための方法が所望される。
【０００９】
物体、特にバブルは、例えば細胞、組織、器官又は他の構造体上に又はその中に、非特異的に又は特異的に蓄積することができる。この蓄積機構はしばしば、受動的又は活性的標的化として文献においては言及されている（Lanza, G., Wickline, S.:“Targeted Ultrasonic Contrast Agents for Molecular Imaging and Therapy,“ Prog. Cardiovasc. Dis., 2001 44: 13-31; Dayton, P.A., Frrara, K. W.: “Targeted Imaging Using Ultrasound,” J. Magn. Reson. Imaging, 2002, 16: 362-377）。
【００１０】
物体、特にバブルの非特異的蓄積は、例えば下記により生じる：
ａ）細網内皮系統（RES）の器官、又は疾病に関連する他の細胞、例えば腫瘍−関連のマクロファージ又は動脈硬化工程におけるマクロファージ、又は腫瘍細胞自体又はファゴサイトーシスに対して刺激される細胞、例えば肝臓の一定疾患における肝臓の内皮細胞における物体/バブルのファゴサイトーシスにより；
ｂ）血管内皮上への物体/バブルの付着又はそれに沿ってのゆっくりした回転により；
【００１１】
ｃ）“血管閉鎖末端”又は“ブラインド−アレイ”血管における内皮中への又は内皮の開窓を通しての物体/バブルの移動により；これは、強い水腫性又は炎症性工程、出血、血腫又は血管膨張、例えば動脈癌、血管−形成性腫瘍、例えば血管腫における壊死への遷移領域において、又は壊死中へのフラッシングにより生じることができ；
ｄ）単球により食作用されるか、又は血液の細胞、例えば白血球に付着する、食作用された又は付着性物体/バブルの内皮バリヤー、例えば血液−脳バリヤーによる、例えば病理学的領域への輸送による。
【００１２】
物体、特にバブルの特定濃度は、生理学的には病理生理学的構造体への共有又は非共有結合、例えば静電結合、水素結合又はファンデルワールス結合により達成され得る。それらの場合、特にバブルは一般的に、それらの表面に標的−特異的に結合する分子を担持する。
超音波対比を測定するために、ビデオ像をデジタル化し、そして時間に対して定義され得る像領域における明るさ（灰色又は明度）を測定する可能性が存在する。しかしながら、このタイプの測定は、高濃度の物体/バブルでの対比飽和の問題を解決しない。定量化は、あったとしても、非常に低い濃度の物体、特にバブルでのみ可能である。
【００１３】
３D−Echotech, Halbergmoos, Germanyはまた、血液におけるバブルシグナルを定量化するために超音波装置によりバブルの定量化能力の必要性を満たすために試みて来た。この装置により、超音波装置のビデオ像がデジタル化され、明度及び灰色度に分離され、そして任意には、平均明度に従って、又は定義された測定窓（ROI）内のスクリーン画素の数に従って評価される。この測定システムの適用は、定義できるROI内の明度に基づいて血管中へバブルの注入を定量化することである。この工程はまた、1ml当たり約3,000個の粒子又はバブルの濃度以上のバブルを定量化するには適切でない。この濃度以下でさえ、再生できる測定は、この装置により不可能である。
【００１４】
Kretztechnik, Zipf, Austriaは、ZD（二次元）アレイ（2D−ソノグラフにおけるように、線状アレイ、セクターアレイ、相化されたアレイ）が変換器内の一定角度で自動的に回転される3D（三次元）超音波工程を提案する。この装置により、バブルの定量化は、非再生手段で行われ得る。これは、異なった患者が試験され、そして/又は種々の試験者が試験を行う場合、特に適用できる。
物体、特にバブルを、インビボ、エクスビボ又はインビトロで上記装置により定量化することは不可能であり、特に約3,000個のバブル/ml組織又は血液の濃度以上の濃度では不可能である。この濃度以下で、空間解像度は、mmの範囲においてのみ可能である。この問題を解決するための他の測定方法は、今日まで知られていない。
【００１５】
従って、既知方法及び装置の欠点は、小さな構造体の可視化が、変換器から発する音ローブが解決を制限する最小拡張レベルを有するので、不可能であることから成る。例えば、音波により検出される測定層の厚さが約１mmのサイズである場合でさえ、そのような細かな構造体はもはや、解決され得ない。
上記理由のために、例えば分子マーカーを検出するために超音波技法を用いることは不可能である。
【００１６】
生物学的キー技法、例えばGenomics/Bioinformatics and Protocomicsが、新規分子マーカーを同定するために使用される（Yao, T.: “Bioinformatics for the Genomic Sciences and Towards System Biology. Japanese Activities in the Post-Genome Era” Prog. Biophys. Mol. Biol., 2002, Jul-Aug., 80 (1-2): 23-42; Wu, W.; Hu, W.: Kavanagh, J.J.: “Proteconics in Cancer Research.” Int. J. Gynecol. Cancer, 2002, Sep.-Oct., 12 (5): 409-423）。この技法により、例えばヒト遺伝子の配列が、薬理学的に好都合なタンパク質ファミリーに属するタンパク質、特に受容体及び酵素を同定し、そしてそれを詳細に記載するための特別な生物情報手段により分析される。
【００１７】
インビトロ工程においては、例えば新しく単離された（一次）細胞及び（不滅化された）細胞培養物（疾病又は健康な組織からの）が使用される。しかしながら、それらの細胞培養物は好都合ではない。なぜならば、分子マーカーの発現範囲は、例えば単離工程により変更することができるからである。そのような試験された細胞培養物は、分子マーカーが単離された正確な時点で、その発現パターンのみを明らかにする。さらに、細胞培養物は一般的に、真インビボ状態を表すことができない不滅化された細胞（特別な操作によりインビトロで明確に増殖され得る）である。
【００１８】
分子マーカーを同定するためのもう１つの非常に知られた方法は、組織の免疫組織化学研究である。これに関しては、腫瘍からの特に好都合な組織は、それらの除去の後、組織学的に作業され、そして特に１又は複数の分子マーカーの発現について免疫組織学的試験される。そのようなマーカーの組織学的同定の後でのみ、後者はまた、対応するシグナルトランスミッターに結合される対応する抗体を用いることによってインビボで表され得る。そのような像は一般的に、単に定量的に可能であり、そしてほとんどの場合、またそれが抗体−担持シグナルトランスミッターの非常に強い濃縮をもたらす場合のみ可能である（Fonsatti, E.; Jckunen, A.P.; Kairemo, K.J. A. など.: “Endoglin is a Suitable Target for Efficient Imaging of Solid Tumors: In-Vivo Evidence in a Caninc Mammary Carcinoma Model,” Clinical Cancer Research, Vol. 6, May 2000: 2037-2043）。
【００１９】
この時点で、分子マーカーを検出するための多くの診断方法また、インビボで試験される。既知診断方法による既知分子マーカーの検出は可能であるが、この工程は一般的に高い空間解像度を欠いている。これは、例えばPET（陽電子放射断層撮影法）、NIRF（赤外線に近い蛍光イメージング）及びシンチグラフィーによる場合である。他の場合、高濃度のシグナルトランスミッターが、例えばMRI（磁気共鳴イメージング）及びCT（コンピューター断層撮影法）に関して、必要とされる。さらに、それは、受動標的化（抗体接合体、例えば分子マーカーに対する特異的結合を有する）への超音波コントラスト媒体の使用のための文献を提供する。しかしながら、現在まで記載されている診断方法のどれも、それらはDE10215335A号から知られている装置の使用、すなわちμm範囲での空間解像度、及び標的領域におけるシグナルトランスミッターの高い感受性の定量化により達成され得るので、基準に達しない。
【００２０】
従って、本発明の目的は、試験下の目的物における物体を定量するための方法及び装置を見出すことであり、これにより、飽和バブル濃度以上の濃度の物体のインビボ、エクスビボ及びインビトロでの決定が可能になる。前記方法及び装置により、要素量を再生可能な態様で定量化し、そしてそれらの濃度を決定することが可能である。さらに、例えば分子マーカーを標的物−特異的に同定できるよう、組織学的領域において空間解像度を可能にすることが、ビデオ像において可視化される独立した特徴的シグナル、例えばSAEシグナルに関して可能にされる。
【００２１】
前記目的は、請求項１に従っての試験下の目的物に含まれる物体を定量するための装置、請求項10に従ってのヒト又は動物における超音波診断及び/又は超音波療法へのそれらの使用、請求項11に従っての器官及び組織における分子マーカーのインビボ及びエクスビボマッピング及び細胞培養物の特徴化のための細胞のインビトロマッピングのためへのそれらの使用、及び請求項12に従っての試験下の目的物に含まれるバブルを定量するための方法により達成される。
【００２２】
定義：
これに関しては、下記に説明される図面がさらに言及される。
ａ）物体：
本出願における物体とは、10μm以下の直径を有する固体粒子及び/又はバブルである。固体粒子は、少なくとも１つの表面活性物質（例えば、界面活性剤）、少なくとも１つの炭水化物、タンパク質、脂質及び/又は天然及び/又は合成ポリマーを含む。
【００２３】
ｂ）バブル：
本出願におけるバブルとは、被覆されていないか又は被覆されている、10μm以下の直径を有するガス含有相である。前記相は実質的に球体であり得る。被覆されたバブルの場合、被膜は少なくとも１つの表面活性物質（例えば、界面活性剤）、少なくとも１つのタンパク質、脂質及び/又は合成ポリマーを含むことができる。本出願のバブルはまた、ガス充填されたマイクロカプセル、ガス充填された微粒子、ガス充填された微小球体、微小バルーン、及び界面活性剤−安定化された微小バブルでもあり得る。
ｃ）超音波コントラスト媒体：
超音波コントラスト媒体は、超音波診断及び/又は超音波療法への使用のための物体、特にバルブを含む媒体である。
【００２４】
ｄ）独立した特徴的なシグナル：
独立した特徴的なシグナル（CSシグナル、CS効果）は、散乱されたシグナルとは無関係である物体、特にバブルのエコーシグナルである。それらはまた、それらが例えば、超音波フィールドにおけるバブルの破壊において生成されるので、すべての非線状シグナル、例えば二次調和、副調和、又は超−調和、及び特にSAEシグナルを包含する。
【００２５】
ｅ）刺激されたアコースティックエミッション（SAE）：
本発明に従っての好ましいバブルは、超音波により励起される場合、一定の条件下で破壊され得る。この場合、伝達シグナルから逸脱する独立したシグナルは、バブルの分散及びシフトに関係なく生成される。この独立した特徴的なシグナルは、刺激されたアコースティックエミッション（SAE）（類似語：相互関係の損失（LOC））として言及される。
【００２６】
ｆ）飽和濃度/飽和バブル濃度：
飽和濃度/飽和バブル濃度は、試験下の目的物、例えば組織又は血液1ml当たりの物体/バブルの濃度であり、それ以上で、それは音フィールト内で独立した特徴的なシグナル、特にSAEシグナルの重ね合わせをもたらし、そしてそれ以上で、バブルの定量化は、物体/バブルの数がコンピューター補正式を用いてさえ、CSシグナルの合計からもはや誘導され得ないことにおいて不可能である。
【００２７】
ｇ）CS/SAE層厚：
バブルが破壊される場合、これに関しては、これは超音波横断像（断面層）当たりの層の厚さであり、これから、横断面像において可視化されるCSシグナル（この場合、SAEシグナル）が平行したオーバーラッピングを伴って走査において生じる。生物/バブルがCSシグナルによる照射において破壊されない場合、これは超音波横断像当たりの層の厚さであり、これから、横断像において可視化されるCSシグナルが、個々の場合、超音波フィールドのシフトにおいて新しく付加されるバブルの平行したオーバーラッピングを伴って走査において生じる。
【００２８】
CS/SAE層厚は、超音波横断層当たりの移動の距離と同じである。この層厚は好ましくは、断面層よりも有意に薄い。断面層は、音ローブ（音フィールド）の照射により、試験下の目的物において生成される。これは、照射される媒体への適切な媒体によりカップリングされ、そして焦点を合わせられる音パルスを発するピエゾ結晶要素により、従来の手段で生じる。試験下の目的物の表面に沿って実施される試験下での目的物中に放される音ローブを有することによって、その音ローブからの断面層が少しづつ被覆され、そしてその対応する像が受信器に達する音シグナルから生成され得る。上記の両者の場合、層厚は、２つの像間の供給量により定義される。
【００２９】
ｈ）興味ある領域（ROI）：
これに関しては、これは、横断像における測定窓である。
ｉ）体型測定単位（MU）：
体型測定単位は、可視化されたCSシグナルがビデオ像において支配する、スクリーン画素数で表される断面層に対応する表面積の尺度である。スクリーン画素は一般的に、ビデオ濃度計により自動的に計数される。個々のCSシグナルのスクリーン画素が知られている場合、物体数/バブル数は、体型測定単位から推定され得る。
【００３０】
ｊ）補正されたSAE（SAEcorr.）又は補正されたMU（MUcorr.）:
物体/バブルが超音波横断像についての層の厚さよりも薄い場合、重ねられたCSシグナルがビデオ像をもたらすことができる。そのような重なりの可能性が、物体/バブルの濃度及び超音波横断像の層厚の上昇と共に上昇する。なぜならば、この場合、多数の物体/バブルが検出されるからである。両パラメーターは、ビデオ像におけるCSシグナルの色彩表面積の％に対する直接的な影響を有する。試験される体積での物体/バブルのランダム分散の場合、MUの補正は、CSシグナルが重ねられる場合、次の通りにして行われ得る：完全な色彩飽和がROIにおいて存在しないまで：
【００３１】
【数１】
2005527270.tif 000003
【００３２】
FP：可視化されたCS効果の領域における測定窓（ROI）内に存在する色彩画素、
MU：測定窓（ROI）内のΣFP
GP：窓（ROI）内であるが、但し可視化されたCS効果の外部に存在する灰色画素。
CSシグナルの補正された数（SAEcorr.）における補正されたMU（MUcorr.）は、色彩画素の合計及びROI内のCSシグナルの合計（Fsae＝ΣFP/Σsae）の商を通して計算され得る：
SAEcorr.＝MUcorr./Fsae.
【００３３】
この補正式の適用は、試験される体積における物体/ランダム分散を必要とする。
ｋ）2D−アレイ：
2D−アレイは、ピエゾ要素の一次元列から成る。
ｌ）3D−アレイ：
3D−アレイは、ピエゾ要素のいくつかの隣接する列から成る。
ｍ）変換器（超音波変換器）：
ピエゾ要素を含むソノグラフィーのための装置。
ｎ）変換器に関する指図：
【００３４】
図６においては、変換器23が図示されている。変換器に関する指図は次の通りに定義される：
ｘ＝変換器に対する横断（参照番号24：2D−アレイ）
ｙ＝側部（参照番号25）
ｚ＝軸（音の成長方向）（参照番号26）
ｏ＝分子マーカー：
細胞内、細胞間及び/または細胞外分子構造体、例えば受容体、リガンド、酵素又はそれらの構造成分。
【００３５】
試験下の目的物における物体、好ましくはバブルを定量するためには、独立した特徴的なシグナル、及び主に照射において破壊されるハブルを生成するために励起され得るそれらのバブルが使用される。
【００３６】
本発明の装置及び方法は、試験下の目的物に含まれる物体、好ましくはバブルの定量化のために使用される。装置は、特徴的な超音波シグナルを発するよう、試験下の目的物における層に含まれる物体、好ましくはバブルを励起する超音波フィールドを放すための少なくとも１つの変換器を含んで成る。少なくとも１つの変換器はまた、特徴的なシグナルを受けるためにも使用される。また、少なくとも１つのデータ処理システムが、特徴的なシグナルから成る層における物体、好ましくはバブルの数を決定するために供給される。
【００３７】
また、本発明の手段においては、超音波フィールドが試験下の目的物における第１層における物体、好ましくはバブルの励起の後、励起され得、それにより、第１層及び第２層がオーバーラップし、そして平行し、且つ定義された態様でお互いに対してシフトされる。試験下での目的物における異なった断面層から成る超音波データ組が得られ、これは、特に断面層におけるバブルの空間的配置を伴って、個々の断面層における物体/バブルの存在に対する情報を含む。横列に配置されるピエゾ結晶を有する変換器に関しては、層に好ましくは、ピアゾ結晶列が横断方向（ｘ−方向）にオーバーラップするよう、お互いに対して配置される。
【００３８】
変換器は、超音波シグナルを発し、そして物体、好ましくはバブルに起因するシグナルを受けるよう企画され得る。他方では、変換器はまた、独占的に超音波シグナルを発するよう企画され得る。この場合、物体、好ましくはバブルからの入力超音波シグナルを検出するためのもう１つの受容器ヘッドが必要である。
【００３９】
試験下の目的物に含まれる物体、好ましくはバブルの定量化のために本発明の方法を行うためには、層に含まれる超音波フィールドを有する物体/バブルが、特徴的な超音波シグナルを生成するために励起される。物体/バブルから送られる特徴的な超音波シグナルが受動され、そして物体/バブルの数が受け入れられる超音波シグナルから決定され、それにより、個々の場合、物体/バブルが試験下の目的における第１層において励起された後、超音波フィールドの置換が、第１層をオーバーラップし、そして平行し且つ定義された態様でこの層に関して、置換される第２層における物体/バブルを励起する。
【００４０】
本発明の装置及び方法は、イメージング又はビデオ像を用いる態様を制限するものではない。興味ある領域（ROI）内のCSシグナルは、受信するシグナル（高周波（RF）データ）に基づいてすでに計数され得るが、但し受信シグナルのレベルに基づいてCSシグナルを計数する場合の飽和バブル濃度は、CSシグナルが二次元超音波横断像において計数される場合の飽和バブル濃度とは異なる。本発明の装置及び受信シグナルの計数は、超音波装置に組込まれ得る。
既知の装置及び方法に比較して、1000〜3000個の物体（バブル）/mlの範囲の限界以上にある物体、好ましくはバブルの濃度を決定することがまた、本発明の装置及び方法により可能である。
【００４１】
好ましくは2.5〜12MHzの周波数範囲で作動する既知の放射線学的及び心臓学的装置に関しては、飽和は約1000個の物体（バブル）/ml以上の濃度ですでに観察され得、その結果、定量化は不可能である。これは、この場合、十分ではない空間解像度に依存し：超音波変換器の空間的分離能はすなわち、それらの周波数により決定される。しかしながら、同時に、音波圧及び従って、試験下の組織における超音波の波長の侵入の深さが減じられる。より大きな侵入深さが必要とされる医学的診断に関しては、約2.5MHz（約30cmの組織侵入深さ）〜12MHz（約7cmの組織侵入深さ）の周波数範囲の超音波変換器が使用される。x−方向又はx−及びｙ−方向（音ローブに対して垂直な平面）における空間解像度は、それらの場合、丸の横断面を有する単一結晶−超音波変換器を用いる場合、mm範囲で存在する。
【００４２】
従って、変換器により放される音ローブにおける最も狭い点での音フィールドの厚さはまた、mm範囲で存在する。この理由のために、そのような超音波装置により解像され得る最小体積は約１mm3である。物体、好ましくはバブルが超音波によりこの体積において破壊される場合、その対応するCSシグナルの正確な空間位置は、この体積内で正確には決定され得ない。従って、このシグナルは、mm範囲でまた存在する値で像において示される。少なくとも２つの物体、好ましくはバブルがこの体積において見出される場合、後者は、空間解像度の欠失のために、超音波装置によりもはや区別され得ない。従って、約1000よりも多くの物体（バブル）/mlの濃度の物体、好ましくはバブルが飽和をもたらす。これはまた、3D−Echotechの上記装置が、音フィールドの厚さが約１〜2mmの範囲であるので、物体、特にバブルを定量化するためには適切でない理由である。
【００４３】
この装置が物体、特にバブルの定量化の不適切でない理由である。この装置が物体、特にバブルの定量化のために不適切である事実のもう１つの理由は、変換器の手動的にガイドされ、その結果、試験下のいくらかの領域が数回、音波発生されるか、又は種々の程度のオーバーラップにより音波発生され、ところが他の領域はまったく音波発生されないことから成る。この問題はまた、3D−Echotechにより開発される変換器の電磁位置決定の可能性により解決されない。なぜならば、後者は、例えばmm範囲以下でのみ正確であるからである。
【００４４】
本発明によれば、既知の方法及び装置よりも有意に高い空間解像度が最初に可能にされる。同時に、計算され得る体積は基線として取られる。結果として、試験下の体積での物体、特にバブルの定量化はまた、飽和濃度/飽和バブル濃度が通常、限界を超える場合、最初に可能される。
Kretztechnik装置はまた、抽方向（ｚ）での音フィールドのオーバーラップが均等でないので、定量化のためには不適切である。非常に接近すると、隣接する音フィールドはほどんど完全にオーバーラップし、ところが変換器への距離が上昇すると、ギャップが進行し、これは続いて、補正される。これは、試験される組織におけるシグナル生成が変換器への距離に依存する結果を有する。
【００４５】
上記目的は、本発明により達成される。
本発明の方法の原理は、個々の超音波横断像における完全なバブル破壊の例において、特に単純に例示され得る：
図４、５b）及びｃ）の助けにより、本発明の操作の態様は下記のように示され得る：
ａ）第１の像においては、対比−飽和された超音波横断像が得られる（図４）。
ｂ）バブルが照射により破壊される（図５ａ）。次に、SAEシグナルは検出され得ない。独立した特徴的なシグナルを発するバブルは６として言及され；非励起断面層における破壊されていないバブルは５として言及されている。
【００４６】
ｃ）下記に、２種の像間の音フィールドは、定義された移動距離により組織に対して置換され、その結果、試験下での目的物の照射された体積がお互いオーバーラップし、それにより両軸の縦軸はお互いに対して平行である。その縦軸は、音フィールドの中央を通して音の増強方向（図６の方向z；図５bにおける上部から下部まで）に流れるラインとして定義される（これに関しては、また図７を参照のこと）。従って、本発明に関しては、オーバーラップし、そして超音波横断像が得られる、２つの層の平行したシフトとして、２つの層の縦軸がお互い平行であることが提供され得る。
【００４７】
ｄ）すべてのバブルが第１像において破壊される場合、新規バブルのみが第２像及び続くすべての像に検出され得る。例えば、10μmの試験下の目的物に対しての音フィールドの平行したシフトにおいては、これは、第２において新しく添加されるバブルが10μmの層厚を有する体積に起因することを意味する。上記に定義されるような置換は平行な態様で行われ得るので、まだ破壊されていないバブルが、音形の形状に関係なく見出される体積の完全層厚は、拡張し、すなわち10μmである。それらのまだ破壊されていないバブルは定量化され得る（図５b及びｃ））。破壊されたバブルは、７として言及される。
本発明の方法の原理はまた、破壊に関係なく、独立し且つ特徴的なシグナルを生成するために診断用超音波により励起され得るそれらの物体、好ましくはバブルのためにも使用され得る。そのようなシグナルは例えば、調和又は副調和シグナルであり得る。
【００４８】
ここで、前記方法は、SAEシグナルを伴っての方法に類似する：
バブルの場合：
ａ）第１像/第１層においては、すべてのバブルは破壊され、
ｂ）続く像/層においては、バブルは励起され、その結果、それらの独立した特徴的なシグナルを発し、
ｃ）累積走査距離が音フィールドの層厚以下であるか又は等しい限り、新しく添加されたシグナルは、個々の場合、個々の追加の像/個々の層において決定され、
ｄ）累積走査距離が音フィールドの層厚よりも大きい場合、又はシグナル飽和が像/層において達成される場合、音フィールドに見出されるバブルは破壊される。
【００４９】
固体粒子の場合：
ａ）第１像/第１層においては、固体粒子の独立した特徴的なシグナルは、励起の後、検出され得る；これは、例えば走査が粒子を有さない位置で開始されるか、又は走査の開始の前、変換器が、固体粒子の独立した特徴的なシグナルが、これが問題でない隣接する領域への励起の後、検出され得る領域から除去されることにおいて達成され得、
ｂ）次の像/層においては、固体粒子が励起され、その結果、それらは独立した特徴的なシグナルを生成し、
ｃ）累積走査距離が音フィールドの層厚以下であるか又は等しい限り、新しく添加されたシグナルは、個々の場合、個々の追加の像/個々の層において決定される。
【００５０】
新しく添加されるシグナルの決定は、シグナルの放出が物体、好ましくはバブルの完全な破壊を伴わない場合、それぞれのこれまでの値を控除することによって、又は破壊するパルスに送った後、シグナルの単純な、好ましくは自動計数によって行われ得る。
独立した特徴的なシグナルが物体、好ましくはバブルの破壊により付随される場合、オーバーラップ領域のシグナルの数は、一般的に、SAEシグナルの場合におけるように、単純な、好ましくは自動計数により決定され得る。
【００５１】
組織から10μmの平行した移動距離、及び1mmの音フィールドの層厚においては、横断像（断面層）が99％までオーバーラップする。第２の横断像においては、10μmの層に見出される、新しくは添加される物体、好ましくはバブルのみが検出される。
２種の像間のシフトの距離は、少なくとも5μm、好ましくは少なくとも10μm、及び特に好ましくは少なくとも20μmである。特に好ましい態様においては、移動距離は少なくとも50μmである。移動距離は、走査（約１〜2mm）よりも短い。最適移動距離は、走査される体積における再考の物体濃度/ml、好ましくはバブル濃度/mlに依存する。20％〜99.99％、好ましくは40％〜99.9％及び特に好ましくは70％〜99％の体積のオーバーラップを設定することが好都合である。
【００５２】
移動距離が高過ぎるように選択されるか、又は超音波横断像がまったくオーバーラップしない場合（図5a）、絶対的定量化はまた、超音波横断像において、補正され得ないCSシグナルの重ね合わせが生じるので、本発明の方法により不可能である。
移動距離は、例えば長過ぎるように選択され得るか、又は超音波横断像は任意には、物体、好ましくはバブルの濃度の程度が過小評価される場合、まったくオーバーラップし得ない。それらの場合、超音波横断像当たりの移動距離は、絶対的定量化を確めるために減じられるべきである。図９〜11は、移動距離と体型測定単位（MU）又は横断像における独立的な、特徴的シグナルの数との間の関係を示す。
【００５３】
物体、好ましくはバブルの濃度は好ましくは、個々の場合、横断像が20〜80％、好ましくは30〜70％の色の飽和を有するそれらのCS/SAE層厚さにおいて決定される。低められた試験時間のために、移動距離は、飽和バブル濃度がいずれかの横断像において到達されないまで、高められ得る。CS/SAE層厚を変更する定義されたプログラムが、試験時間と測定の正確性との間の最適な妥協性を提供することができる。プログラムにより制御される最適移動距離は例えば、最適に大きな集団の患者（試験下の目的物）に基づいて、決定され得る。
【００５４】
しかしながら、個々の対比−飽和された横断像が偶然に生じる場合、絶対的な定量化能力はもはや提供されない。しかしながら、非対比−飽和された横断像に対する定量化能力は、可能のまま存続する。
色彩飽和が試験領域中の一定領域に存在する場合、再生される測定は、本発明の方法の音フィールドの定義された平行シフト及びより高い空間解像度を伴って、標準化された走査方法により可能である。そのような測定は、例えば異なった患者間の比較のために、又は同じ患者における治療の間のモニターリングのために十分であり得る。
【００５５】
すべてのバブルが横断像において破壊されるとは限らない場合、１又は複数の追加の破壊パルスがまた、次の位置に近づく前、伝送され得る。
断面層の体積のオーバーラッピング及び置換は、変換器及び試験下の目的物がお互いに対して（お互いに関して）シフトされることにおいて達成され得る。
【００５６】
定義される平行置換が達成され得、ここで、
I. 組織又は試験下の目的物、例えば患者は、固定された変換器に対してシフトされ、又は
II. 変換器は、試験下での固定された目的物、たとえば試験されるべき組織に対してシフトされ、又は
III . 連続的にオーバーラップし、そして横断像を生成できる変換器が使用され、すなわち体積が変換器によりシフトされ、そしてオーバーラップが引き起こされ、それにより、変換器自体はオーバーラッピング及び平行−シフトされた超音波像を受け；これに関しては、変換器は、オーバーラッピング及び特に交叉するようシフトされた超音波横断像又は断面層の音ローブが取られるように調節され得る。
【００５７】
種々のシフト可能性がまた組み合わされ得る。
例によれば、平行シフトの次の変法が記載され得る：
I.試験下の目的物（患者、動物、除臓された又は単離された器官又は細胞培養皿）は、固定された変換器を通り越して自動的に移動される（例えば、サーボモーター又はDCモーターにより）。
【００５８】
II. 変換器は、試験下の目的物（患者、動物、除臓された又は単離された器官又は細胞培養皿）上の又はそれに対する特定装置の助けにより自動的にシフトされる。装置は、フレームであり得、この内部に、変換器が保持装置により固定され、そしてモーターにより平行したガイドに沿って移動される。
最も単純な場合、個々の結晶は、定義されたオーバーラッピング領域によりx−及びy−方向にシフトされ得る。この変法は、例えば細胞の培養皿のために提供され、その表面上に、物体、特にバブルが特異的に蓄積しており、又はその内部に、物体が例えば、ファゴサイトーシスにより非特異的に蓄積されている。ここで、いかに多くの物体、特にバブルが表面領域又は体積当たりに蓄積しているかの言及は十分である。データは、像に転換されるべきではない。
【００５９】
さらに、２D−アレイを含む変換器により、ライン内の隣接する音ローブが、走査を方向づけることによって、定義された態様で、交叉するような方向でのオーバーラップを引き起こされ得る。
【００６０】
III ．さらに、３D−アレイを含む変換器により、ライン内の隣接する音ローブが、走査を方向づけることによって、定義された態様で、交叉するような方向でのオーバーラップを引き起こされ得る。この変法においては、変換器又は試験下の目的物のもう1つの移動は、もはや必要ではない。
変換器はまた、定義されたオーバーラップを伴って、変換器内の交叉できるような方向（x−方向）で平行に移動されるID−アレイを含む。側面解像度は、横断像が構築される個々の走査線がまた、定義された態様でオーバーラップする場合、２D−断面像内で高められ得る。個々の場合、隣接するピエゾ要素のグループから生成される個々の音フィールドは、この場合、従来の対照に比較して強く、そして主に、選択される小さな段階幅（下方のピエゾ要素の方向）により、定義された態様でのオーバーラップを引き起こされる。
【００６１】
これは図7に示され：個々のピエゾ要素11のアレイから、少数のアレイ要素を含んで成るピエゾ要素のより小さな領域12が、振動を生成するために励起される（図7a）。結果として、音ローブ９の形での音波が、試験下の目的において発せられる。
音ローブ内に見出される、破壊されていないハブル８が破壊され、そして従って、独立した特徴的なシグナル９を放す。破壊されたバブルは、参照番号10により示される。次に、アレイのピエゾ要素の新しく形成されたグループは、１つのピエゾ要素によってのみ、第１の励起に使用されるグループと区別される振動を生成するために励起され、これにより、前記グループは現在、オフセットされる（図7b）。前もって放された音ローブによる、このようにして生成された音ローブのオーバーラッピングにより、新しく検出されるバブルは、独立した特徴的なシグナルを生成するために、単に励起される。
【００６２】
変換器に対して交叉するような方向での定義されたオーバーラッピング走査におけるように、解像度は、置換がピエゾ−要素のグループの幅に存在する因子により高められる。
従って、変換器及び/又は試験下の目的物をシフトするために、少なくとも１つのモータードライブが、試験下の目的物又は少なくとも１つの変換器を、お互いに対してシフトするために供給される。
【００６３】
変換器が試験下の目的物に対してシフトされる場合、後者は定義された手段で移動されるべきである。これに関しては、変換器のための移動可能保持装置が供給される。試験下の目的物は、保持装置に取り付けられる。もちろん、保持装置により固定し、取り付けるか、又は他の類似する結合により試験下の目的物を固定することは、絶対的に必要ではない。目的物は保持装置により実質的に固定して保持されることはまた十分である。例えば、患者は、試験の間、ソファー上に置かれ、この上で休息する。次に、そのような保持装置は、目的物が試験の間、除去されないで、むしろ変換器のみが除去される場合、及び試験下の目的物が除去され、そして変換器は除去されない場合、試験下の目的物を保持するために使用され得る。変換器及び試験下の目的の両者がお互い同時に除去される場合、上記保持装置は試験下の目的物のために使用され得る。
【００６４】
物体、好ましくはバブルを定量化するために、定量化がビデオ濃度計により実施され得る、データ処理及び像表示のための像評価システムが、好ましい態様において提供される。これに関しては、超音波シグナル組から形成されるデータ組が、既知手段により転換され、この結果、個々の断面層のビデオ像が生成され、それにより、個々の断面層は、前記励起された断面層（達成される新規断面層領域（CS/SAE層）の置換による）をオーバーラップしない領域からの情報を含む。次に個々のビデオ像において可視化される物体、特にバブルが手動的に計数されるか、又は色彩画素のビデオ濃度計測定、及びそれらから得られた値のバブル可視化当たりの色彩画素の平均数による割り算により得られる。
【００６５】
物体、好ましくはバブルの数は上記方法に従って決定されたので、次の式：
【数２】
2005527270.tif 000004
【００６６】
[ここで、FPは、オーバーラッピング層内の局部解像度を有するスクリーン可視化において、物体シグナル、特にバブルシグナルを可視化する色彩画素であり、そして
GPは、物体、特にバブルを可視化した画素ではない、局部解像度を有するスクリーン表示における灰色画素である]に従って補正を行うことが、数の補正された決定のために必要である。
【００６７】
本発明の装置は、ヒト又は動物において、特に超音波診断及び/又は超音波療法のために適切である。
新規可能な研究達成方法は、臨床学的診断の領域においてのみならず、また、基本的な医学的及び生物学的研究及び前臨床学的研究及び開発においても開かれている。
物体、好ましくはバブルは、分子レベルで病理学的又は生理学的工程を解明するために、動物試験においてインビボで、除去される器官又は組織においてエクスビボで、及び例えば細胞培養においてインビトロで定量化され得る。
【００６８】
活性成分の発見及び特異的結合システムの開発においては、試験は、本発明の方法により行われ得、これに関して、結合システムが完全に機能し、この結合分子は、影響変数が結合能力及び濃度、物体、好ましくはバブルが有する運動学、又は超音波−誘発された活性成分が、包入された活性成分をいかにして多く放出するかを決定する、点及び量での条件下で存在する。
【００６９】
本発明の装置及び方法は、後−胚性固体発生（固体発生：自然な死まで、受精されていない/受精された卵母細胞からの独立した化合物の進行の完全性：後者は次の４期を含んで成る：１．胚の成長、２．後−胚性成長、３．性的熟性及び生殖の時間、及び４．老化の時間）から開始する、器官及び組織における生理学的に上方又は下方に調節できる分子マーカーのインビボマッピングのために使用される。
【００７０】
これに関しては、受動的に及び活動的に蓄積する物体、好ましくはバブル使用され得る：このためには、物体は、表面上に見出されるマーカー（活動的に蓄積することができる物体/バブル）のための特異的結合分子を供給される。本発明の他の態様においては、受動的に蓄積する物体、すなわちそのような特異的結合分子を有さない物体/バブルがまた使用され得る。
【００７１】
この方法に関しては、分子マーカーは、ヒト及び動物における異なった細胞上にインビボで位置し、そして固体発生に対するそれらの影響が決定され得る。
インビボでの全生物における既知の及び新しく同定された分子マーカーの時間−調節されたマッピングがまた行われ得る。結果として、インビボでの固体発生における分子マーカーのまだ知られいる機能が決定され得る。
【００７２】
老年医学に関しては、固体発生の第４期（老化の時期）における分子マーカー及び老化工程に対するその影響の同定は特に好都合である。これに関して、本発明の高い空間的解像度ソノグラフィーにより、それは試験され得、この年齢から、それらの分子マーカーは起因し、そして後者がもたらされ、または、これに基づいて、それらの受容体が、年齢−誘発された変化又は全体の生物の疾病、及び医薬の開発のための発見がそれらに起因するか、年齢−誘発された徴候を緩和するか又はさらに、それらの回避を助けるかどうかを示す。
【００７３】
本発明の装置及び方法のもう１つの好都合な使用においては、器官及び組織における生理学的に上方に又は下方に調節できる分子マーカーのインビボマッピングが、受動的に及び誘導的に蓄積され得る物体、特にバブルの使用により、病因の間、実施され得る。
この方法に関しては、疾病関連分子マーカーは、ヒト及び動物における異なった細胞上にインビボで位置し、そして従って、疾病の病因に対するそれらの影響がまた、インビボで決定され得る。
さらに、既知の及び新しく同定された疾病関連分子マーカーの時間−調節されたマッピングは、病因の間、全生物においてインビボで行われ得る。結果として、さらにまだ知られていない、病因における分子マーカーの機能が、インビボで決定され得る。
【００７４】
また、新規治療用医薬及び/又は処理方法が、それらの発見から誘導され、その結果、一定時間で、細胞の決定された表面状態（活性化/休止位置に関する細胞の状態）が調節され、そしてそれらの状態は、本発明の方法により）追跡される。
上記方法はまた、除去された器官及び組織に対してエクスビボで行われ得る。
【００７５】
もちろん、後−胚固体発生から出発して及び病因の間、器官及び組織における分子マーカーのインビボマッピングが、異なった動物型及び/又は動物モデルに対して、特に老年医学において、又は疾因モデルのために使用され得る。前記マッピングは一般的に、また、すべての動物型、例えば農業用動物、家畜及びペット、並びに野生動物及びヒトのためにも使用され得る。マッピングはインビボで使用され得るので、正確に時間の１点で分子マーカーを同定し、そして特徴づけることが必要である欠点の他に、しばしば関連する、時間−強調の及び高価な従来のインビトロ工程、例えば免疫組織化学を使用することが、多くの場合、不必要である。
【００７６】
さらに、本発明の装置及び方法は、種々の起源の、例えば種々の培養条件下で細胞の上方に調節できる分子マーカーのインビトロマッピングによる細胞培養物の特徴づけるために、又は新規細胞系の特徴づけるために、又は特にマウス、ラット及び他の動物モデルにおける腫瘍細胞の移植において、種々の継代の後、又はその使用の直前、存在する細胞系の新規特徴づけのためにも使用され得る。この場合、動物及びヒト細胞の他に、植物細胞がまた、特徴づけられ得る。
また、この場合、物体、好ましくはバブルは、マーカーに対して特徴的である結合分子を供給される。
【００７７】
使用のそれぞれの領域において分子マーカーを同定するためには、本出願の開示内容において引例として本明細書に包含される次の出版物が特に言及され、それにより、本明細書に記載される問題提示が本発明の装置及び方法により試験され得る：
１．Phelps. M.; “Positron Emission Tomography Provides Molecular Imaging of Biological Processes.” Proc. Natl. acad. Soc., USA 200, 97: 9226-9233.
２．Weissleder, R., “Molecular Imaging: Exploring the Next Frontier. “Radiology, 1999, 212: 609-614.
３．Bremer, C., Tung, C.H., Weissleder, R., “In Vivo Molecular Target Assessment of Matrix Metalloproteinase Injhibition.” Nat.Med., 2001, 7:743-748.
４．Anderson, S.A., Rader, R.K., Westlin, W.F., など., “Magnetic Resonance Contrast Enhancement of Neovasculature with Alphavβ3-Targeted Nanoparticles.” Magn. Reson. Med., 2000, 44: 433-439.
【００７８】
５．Sipkins, D.A., Cheresh, D.A., Kazemi, M.R., Nevin, L.M., Bednarski, M.D., Li, K.C., “Detection of Tumor Angiogenesis In Vivo by alpha V beta3-Targeted Magnetic Resonance Imaging. “Nat. med., 1998, 4:623-626.
６．Bredow, S., Lewin, M., Hofmann, B., Marecos, E., Weissleder, R., “Imaging of Tumour Neovasculature by Targeting the TGF-[beta] binding Receptor Endoglin.” Eur. J. Cancer, 2000, 36: 675-681.
７．Sipkins, D.A., Gijbels, K., Tropper, F.D., Bednarski, M., Li, K.C.P., Steinman, L., “ICAM-1 Expression in Autoimmune Encephalitis Visualized Using Magnetic Resonance Imaging.” J. Neuroimmunol., 2000, 104:1-9.
８．Lindner, J.R., Song, J., Christiansen, J., Klibanov, A. L., Xu, F., Ley, K., “Ultrasound Assessment of Inflammation and Renal Tissue Injury with Microbubbles Targeted to P-Selectin,” Circulation, 2001, 104: 2107-2112.
【００７９】
10．Klibanov, A.L., Hughes, M.S., Marsh, J.N., など., “Targeting of Ultrasound Contrast Material: An In-Vitro Feasibility Study.” Acta Radiol. Suppl., 1997, 38: 113-120.
11. Demos, S.M., Dagar, S., Klegerman, M., Nagaraj, A., Mcpherson, D.D., Onyuksel, H., “In Vitro Targeting of Acoustically Reflective Immunoliposomes to Fibrin under Various Flow Conditions.” J. Drug Target., 1998, 5: 507-518.
12. Villanueva, F.S., Jankowski, R.J., Klibanov, S., など., “Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. “Circulation, 1998, 98: 1-5.
【００８０】
前記装置及び方法は、物体、好ましくはバブルの定量化能力及び従ってまた、下記のことを可能にするか又は支持する：
−腫瘍段階の決定、
−腫瘍の程度、
−例えば、化学療法の場合における治療の間のモニターリング、
−再生能力、及び従って、異なった試験者の発見を比較する能力の上昇、
−患者に負担を与える生検の回避、
−超音波像において可視化されるCSシグナルが起因する層厚の低下、これにより、μm範囲内での高い空間的解像度を伴って、mm範囲でのバブル濃度フィールドが映像化され、そしてバブル濃度に対して定量化される。
【００８１】
物体、特にバブルは一般的に、超音波コントラスト媒体に含まれ、そして好ましくは、懸濁液の形で投与される。
【００８２】
原則的に、超音波コントラスト媒体としての使用のために適切であるすべての物体、特に（微小）バブルが、CS効果を生成するために、診断用超音波により励起され得る。ガラクトース及びパルミチン酸からの微粒子を含み、そして水が添加された後、安定化されたガスバブルの懸濁液を生成する、市販の超音波コントラスト媒体Levovist（商標）(Schering AG, Berlin) に関しては、CS効果がまた、肝臓における非特異的濃度の後、観察された（Blomley, M. J.など. : “Stimulated Acoustic Emission to Imugea Late liver and Spleen-Specific Phase of Levovist in Normal Volunteers and Patients With and without Liver Disease”, Ultrasound Mes. Bio., 1999 November: 25 (9): 1341）.
【００８３】
ガス充填されたマイクロカプセス又はガス充填された微粒子（このシェルはポリアルキルシアノアクリレートから成る）の形でバブルを含む特定の超音波コントラスト媒体は、本発明のために好ましい。後者は、EP064477B1号, 特に例に記載されている：次に、シアノアクリル酸アルキルエステル、例えばシアノアクリル酸ブチルエステルが、さらに界面活性剤を含む酸性水溶液に分散される。生成される微粒子が遠心分離により得られる。WO01/68150A1号に記載される方法に従って生成される、官能化されたポリアルキルシアノアクリレートを含むバブルが特に好ましい。従って、そこに記載される方法は、本出願の開示内容中に組込まれる。本発明に従って好ましいバブルの生成に関しては、WO01/68150A1号に記載されるポリマーが使用される。従って、バブルの生成のためのそれらの出発物質はまた、本出願の開示内容において明確に記録される。
【００８４】
本発明の方法はまた、種々の型の物体、好ましくはバブル型を含む超音波コントラスト媒体のためにも使用され得る。
前記物体は、次の特徴の少なくとも１つにおいて変化することができる：
−固体材料の型、
−サイズ、
−それらの表面上での結合分子、
−種々のパルス形による励起能力、
−音による破壊能力、
−特徴的シグナルの型、
−物体/バブルにおけるガスの型、
−物体/バブルのシェルの型、例えば材料の厚さ、弾性。
【００８５】
例えば、試験下の目的物におけるようなバブル混合物又はその分布パターンが、より高い空間的解像度を有する本発明の方法により定量化され得る：
ａ）お互い後部の位置で伝達される種々のパルス形及び/又は受容される種々の特徴的シグナルによる；この場合、これは、バブルの完全な破壊をもたらすのみならず、また、破壊パルスが次の位置に移動する前、伝達され得、又は
ｂ）相応じて定義されたシフトを伴って、数度、走査され、試験されるべきフィールドによる；これにより、個々の走査は、それぞれの型のバブルに必要であるもう１つのパルス形により行われる。
【００８６】
種々のパルス形、及び種々の音フィールドシフトの両者は、その音フィールドの得られるオーバーラップが定義され、そしてそれらの空間的拡張に関して計算できる態様で行われるまで、及び使用されるバブルが特徴的シグナルに基づいて検出され得るまで、お互い組み合わされ得る。
バブルが、試験領域における結合部位のインビボ、エクスビボ及びインビトロ分散性を決定するために、表面上の結合分子及び音によるそれらの破壊能力において、同時に区別される場合、方法は次の通りであり得る：
【００８７】
ａ）次の２種の異なったタイプのバブルが注入される：
ｉ. 低い音圧力により、及び表面上のインビボ結合部位Xに対する結合分子抗−Xにより破壊され得るバブル型A、及び
ii. 高い音圧力により、及び表面上のインビボ結合部位Yに対する結合分子抗−Yにより破壊され得るバブル型B。
ｂ）計算された位置へのアプローチ、
ｃ）低音圧力による１又は複数の像の記録、及びデータ貯蔵、
ｄ）高音圧力による１又は複数の像の記録、及びデータ貯蔵、
ｅ）音フィールドの定義されたシフト、
ｆ）走査の最後まで、段階ｃ）−ｅ）の反復、
ｇ）結合分子X及びY、モニター及び貯蔵に基づくそれらのインジケーターについてのデータの評価。
【００８８】
上記変法のすべてにおいては、飽和バブル濃度は、個々の場合、２種の像又は音ローブ間の距離が完全な音フィールドの層厚に関する倍率、高められる。10μmのシフト及び1mmの層厚の場合、飽和バブル濃度は、100倍、高められる。同時に、新しく添加されたバブルが起因する組織の層厚は同じ倍率、低められる。
従って、組織学的解像度が達成され得る。この原理はまた、インビボで適用され得るので、“インビボ音−組織学”又は特定のバブル蓄積の場合、可視化されたシグナルに関してソノグラフ“インビボ免疫−組織学”を言及することが可能である。
【００８９】
測定されたMUはまた、次の通りに、診断のためにも評価され得る：
A. CS/SAE層厚、及び治療の間の個々内のモニターリングのために一定に保持される用量での測定されたMUの比較。
B. １）できるだけ大きな集団に基づいてのCS/SAE層厚及び/又は特定の測定窓（肝臓、腫瘍表面領域、血管の内皮、等）における用量に対する測定されたMUに依存性の第１の決定。前記集団は、測定窓におけるバブルの分散及びその濃度の程度に関して区別されない個人から成り、すなわちそれは同種であるか又は他に、これに関しては、グループ分けされている。それらの依存性は一般的に、種々の超音波装置（変換器、検出モード、等）で決定されるべきである。
【００９０】
２）20〜80％、好ましくは30〜70％の色彩飽和での線状相関関数の決定。
３）任意には、超音波装置の評価ソフトウェアへの前記線状相間関数の組込み。
４）試験下の目的物、例えば患者のその対応する測定窓におけるCSシグナルの計数。
５）前記線状相関関数に基づいて、色彩飽和が線状相関関数の範囲にある場合、患者の特定の測定窓におけるバブルの絶対数又はバブル濃度の決定。
【００９１】
C. １) できるだけ大きな集団に基づいてのCS/SAE層厚及び/又は特定の測定窓（肝臓、腫瘍表面領域、血管の内皮、等）における用量からの計数された絶対シグナルの依存性の第１の決定。前記集団は、測定窓におけるバブルの分散及びその濃度の程度に関して区別されない個人から成り、すなわちそれは同種であるか又は他に、これに関しては、グループ分けされている。それらの依存性は一般的に、種々の超音波装置（変換器、検出モード、等）で決定されるべきである。
2）曲線適合の実施、それぞれの曲線により記載される相関関数の決定。
3) 任意には、超音波装置の評価ソフトウェアへの前記線状相間関数の組込み。
4) 患者のその対応する測定窓におけるCSシグナルの計数。
5）前記線状相関関数に基づいて、患者の特定の測定窓におけるバブルの絶対数又はバブル濃度の決定。
【００９２】
本発明は、次の例により確められるべきであるが、それらは本発明を制限するものではない。このために、下記に図が説明される。
さらなる詳細を伴わないで当業者は、前述の記載を用いて、本発明をその十分な程度、利用できると思われる。従って、次の好ましい特定の態様は、単なる例示であって、本発明を制限するものではない。
前述及び次の例において、すべての温度は、特にことわらない限り、℃で示され、そしてすべての部及び％は重量によってである。
【実施例】
【００９３】
例１．１ml当たり30,000のバブルを含む転換シルエット
（ａ）バブルの生成：
バブルを、例４（ａ）に従って生成する。
【００９４】
（ｂ）１ｍｌ当たり30,000のバブルを含む寒天シルエットの生成：
665mlの水（Ampuwa（商標), Fresenius）を、ボイラー（Braun, Type32WK210）において煮沸し、そして1000mlのビーカーに移した。1.7gの安息香族（Merck）を、保存するために添加し、そして10gの寒天（Merdu）を、攪拌しながら添加した。寒天溶液を、電子レンジ(Bosch HMT702C， 8000W)において再び煮沸し、そして油に、40℃に冷却した。
バブルが寒天溶液に添加される前、バブル濃度を、0.02％（m/m）のTriton X100溶液により、６×108個のバブル/mlに調節した。それからの33μl（２×107個のバブル）を、空気バブルを導入しないで、寒天溶液中に注意して攪拌した。次に、その寒天溶液を、ゲル（寒天シルエット）として固化されているガラス皿（14cm×19cm×4cm）中に注いだ。
【００９５】
（ｃ）実験設定及び実施：
前記寒天シルエットの約4cmのストリップを、水により満たされたプラスチック深皿中に配置した。変換器（L 10-4, ATL UM9, 色ドップラーモード、MI：1.1、持続性：0、優先：最大、色彩ボックスのサイズ：最大、侵入深さ：3cm、焦点：2cm）を、それが水に浸没されるような手段で、前記シルエットを通して支持スタンドに垂直に固定した。
【００９６】
深皿を、前記シルエットと共に、
１．約1mm/フレームの移動距離に対応する、約2cm/秒の速度で変換器を、交叉するような方向に手動的にシフトするか、又は
２．サーボモーター（Lines 150, OWIS GmbH, MotorコントローラーDC500）上に固定し、そして固定された変換器下で異なった速度で自動的に移動した。速度を、この場合、5.8の像/秒の超音波装置の与えられた像速度及び寒天シルエットの連続運動を考慮することによって、像当たりの次の移動距離をもたらすよう選択した：10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100μm/フレーム。このために必要である速度（μm/秒）を、次の通りにして計算した：
速度（μm/秒）＝移動距離/像（μm/フレーム）×超音波装置の像速度（フレーム/秒）。
【００９７】
（ｄ）SAEシグナルの定量化：
生成されたビデオ像を、QuantiCon（商標）(Echotech 3D Imaging Systems GmbH) を用いてビデオ濃度計により次の通りにして評価した：
走査の間、ビデオ像を、超音波装置（5.8像/秒）（QuantiCon）により提供される像属度に対応するサンプル速度でデジタル化した。このためには、172ms（1000ms/5.8）のトリガー遅延を、QuantiCon中にあらかじめ入力した。
【００９８】
SAEシグナルから着色されたノイズシグナルを分離するために、最初に、40の限界値を、３D−データ記録の評価の前、着色のために定義した。この限界値以上に残る“セグメント化された着色”（40〜255）を、評価のために使用した。図８は、QuantiConにおける3Dデータ記録から生成されるように、走査された寒天シルエットの3D−図を示す。灰色値の画素数及びデータ記録のすべての像のセグメント化された着色力の画素数の両者を獲得し、そしてさらに、MS-Excel（商標）(Microsoft) により処理した。
セグメント化された着色力（MU）のMS−Excel（商標）において製造されたダイアグラムを、SAE層厚に基づいて図９に示す。“補正されたMU”下で定義される補正式に対応して、それぞれ個々の着色力を補正した。その得られるSAE層厚に対する依存性を図10に示す（MUcorr.）。
【００９９】
セグメント化された着色力の合計を個々のSAEシグナル又は個々のバブルに転換するために、第１の計算因子Fsacを決定した。このためには、最初に、SAEシグナルの合計を、手動的に計数することにより、20の横断像において決定した。次に、セグメント化された色彩画素の合計を、その対応する像において手動的に計数されるSAE効果の合計により割り算した。SAEシグナル当たり44の色彩画素の平均値を決定した。そのMUcorr. の因子により、補正されたSAEシグナル（SAEcorr.）の数に転換されるダイアグラムを、図11に示す。
【０１００】
表１は、図９〜11が基づくデータを列挙する：
【表１】
2005527270.tif 000005
【０１０１】
30〜70μmのSAE層厚（約37〜81％の色彩飽和）間の曲線領域は、線上相関関数により記載され得る。0.990の相関係数は補正されていないMUのためであり、又は0.996の相関係数が補正されたMU/SAEのためである。
線状相関におけるこの領域外の点がまた、考慮される場合、相関係数は、MUに関して、0.971又は補正されたMU/SAEに関して、0.981になる。
【０１０２】
（ｅ）結果：
（ａ）手動的にシフトされるシルエットにより生成されたすべての像、及び約1mm/フレームの移動距離は、SAEシグナルにより完全に飽和される。飽和バブル濃度は限度を越え、そして定量化は不可能である。
（ｂ）音フィールドのオーバーラッピングを伴っての自動シフトにおいては、個々のシグナルのみが10μm/フレームのシフトにより検出された（図８）。速度が早まると、SAEシグナル/フレームの数が高まる。100μm/フレームのシフトでの開始のみが、像結果における色彩飽和をもたらした。
従って、100μmの層厚を伴っての30,000バブル/mlのバブル濃度が、SAE飽和をもたらす。これから、約3,000バブル/mlの飽和バブル濃度が、1mmの層厚に関して結論づけられ得る。
【０１０３】
（ｆ）議論：
通常使用される走査方法とは対照的に、3,000バブル/ml以上のバブル濃度でのバブル定量化自体は、本発明の方法により可能である。
変換器からの目的物の定義されたオーバーラッピングシフトにより、個々の横断像において、オーバーラップしない体積からの新しく添加されたバブルのみが検出される。従って、像当たりのそれぞれの移動距離におけるSAE層厚は減じられ得る。飽和バブル濃度は、音フィールドの実際の層厚が移動距離又はSAE層厚を表す比で高められる。像から像への10μmのシフトは、空間的解像度、及び1mmの音フィールドの層厚で100倍、飽和バブル濃度を同時に高める。
【０１０４】
例２．ラットの肝臓における非特異的に濃縮されたバブルのエクスビボ定量化
（ａ）バブルの生成：
バブルを、例４（ａ）に従って生成した。
（ｂ）試験：
２匹のラット（Wistar SCHOE, 220g, 雌）を試験した。ａ）に従って生成された、種々の用量のバブル懸濁液を、ラットの尾の静脈にi.v. 注入した。ラット１に関しては、１×108バブル/mlの希釈溶液を生成し、そしてラット２に関しては、0.02％のTriton ×100を含む0.9％NaCl溶液中、１×107バブル/mlの希釈溶液を生成した。
【０１０５】
ラット１：１×108バブル/kg（１×108バブル/ml、220μl i.v.）
ラット２：１×107バブル/kg（１×107バブル/ml、220μl i.v.）
注入の30分後、ラットを、Rompun（商標）2% (20mgのキシラジン/ml)及びKetavet（商標）100mg/ml (100mgのケタミン塩基/ml)から成る１：１の体積比の混合物/mlのi.p. 注射により殺害した。
肝臓の右葉を、個々の場合、除去し、そして0.9％（m/m）の塩化ナトリウム溶液により満たされた容器中に置いた。
【０１０６】
前記肝臓の右葉を含む容器を：
１．約1mm/フレームの移動距離に対応する、約２cm/秒の速度で変換器下の交叉するような方向に手段的にシフトするか、又は
２．セルボモーター（Limes 150, OWIS GmbH, Motor コントローラーDC500）上にセットし、そして固定された変換器下で種々の速度で自動的に移動し；速度を、5.8の像/秒の超音波装置の所定の像速度及び容器の連続運動を考慮することによって、像当たり次の移動距離がもたらされる手段で選択した：
【０１０７】
ラット１（１×108バブル/kg）：15, 20, 30μm/フレーム、
ラット２（１×107バブル/kg）：20, 40, 80, 120μm/フレーム。
超音波研究を、同じ装置設定を用いて、例１に類似して行った。肝臓を、変換器上に、2cmの距離で移動した。すべての測定に関して、同じROIを使用した。ROIの値（約2mm×6mm、超音波装置の規模で測定される）を、すべての評価された像において、ROIが肝臓組織の領域に完全に向けられるような手段で選択した。すべての測定においては、同じ拡大がQuanticon（商標）において選択された。
【０１０８】
目的物の長さ（mm）に対するスクリーン画素の比を決定するために、2mmの縁長の二次ROI（超音波像に示される縦の測定尺度に基づいて決定された）を、超音波像において測定した。このためには、像を、Quanticon（商標）に存在する拡大機能により相応じて拡大した。これから、EINBETTEN 56.25画素/mm2（225/4）の比を計算した。最終的に、肝臓１ml当たりのバブル濃度を、測定された体積（ROIの表面積×移動距離/フレーム）を通して計算した。組織におけるバブル濃度Cにおける生データ（FP、GP及びS）を転換するために、次の式を用いた：
【０１０９】
【数３】
2005527270.tif 000006
【０１１０】
式中、C：（バブル/ml）又は（SAEcorr./ml）でのバブル濃度、
S：２種の像間でのSAE層厚又はシフト（mm）、
FP：示されるSAE効果の領域における測定窓（ROI）の内部に存在するスクリーン画素、
GP：示されるSAE効果の外部の測定窓（ROI）の内部に存在するスクリーン画素、
Σsae：超音波像において示されるSAEシグナルの合計：
Fsae：ΣFP/Σsae,
Ff：mm2でのすべてのスクリーン画素の合計（超音波像において示される縦方向尺度に基づいて測定される）。
【０１１１】
（ｃ）結果：
表２は、ラットのバブル濃度を比較し、そして対比する。さらに、表２は、それぞれのSAE層厚の場合、％色彩飽和の平均値を含む。
【０１１２】
【表２】
2005527270.tif 000007
【０１１３】
１．手動的にシフトされる、肝臓により生成されるすべての像、及び約1mm/フレームの移動距離を、SAEシグナルにより完全に飽和した（図12a, 図13a）。飽和バブル濃度は限界を越え、そして定量化は不可能であった。
２．音フィールドのオーバーラッピングを伴っての自動シフトにおいては、定量化できる数のSAEシグナルを、20〜120μm/フレームのSAE層厚でラット１（用量：１×108バブル/kg）において（図12b：SAE層厚：20μm）及び10〜30μm/フレームのSAE層厚でラット２（用量：１×107バブル/g）において（図13b：SAE層厚：20μm）検出した。速度の上昇で、フレーム当たりのSAEシグナルの数はまた上昇した。
【０１１４】
３．ラット１の場合、1,000の線状相関係数を、SAE層厚に対する補正されていないMUの依存性について計算した（図14）。15μm〜30μmのSAE層厚に対する補正されたMU（MUcorr.）又は補正されるSAE（SAEcorr.）の依存性の線状相関係数は、好ましくは約0.995であった（図15及び16）。
４．ラット２においては、0.984の線状相関係数を、SAE層厚に対する補正されていないMUの依存性について計算した（図17）。20μm〜120μmのSAE層厚に対する補正されたMU（MUcorr.）又は補正されるSAE（SAEcorr.）の依存性の線状相関係数は、好ましくは約0.995であった（図18及び19 ）。
５．バブル数は、SAE層厚に対して線状比で存在する。
【０１１５】
（ｄ）議論：
本発明の方法はまた、バブルが非特異的に蓄積する、除去される器官に使用され得る。横断像に示されるSAEシグナルの数とその対応するSAE層厚との間に狭い相関性が存在する。試験下のラットの肝臓におけるバブル濃度は、投与される用量に基づいて明確に区別される。
【０１１６】
例３．マウスのF3−Ter Atomにおける特異的に濃縮されたUSKMのインビボ定量
例１の方法に従って、表面抗−CD105−抗体が結合された、特異的バブルの蓄積を、インビボでのi.v.注射の後、F9−腫瘍−担持のマウス（Swissヌード）の腫瘍において試験した。対照物質として、表面IgG2a−抗体（アイソタイプ対照）が結合されているバブルを用いた。
【０１１７】
（ａ）特異的バブルの生成：
特異的バブルを、例４（ａ）〜４（ｅ）に従って生成し、そして特徴づけた。抗体結合を、例４（ｆ）に従って行った。
（ｂ）アイソタイプ対照の生成：
アイソタイプ−対照バブルを、例４（ａ）〜（ｅ）に従って生成し、そして特徴づけた。アイソタイプ結合を、例４（ｇ）に従って行った。
【０１１８】
（ｃ）腫瘍接種：
培養において副集密的に増殖されたF9−腫瘍細胞を、トリプシン処理し、遠心分離し、そしてCa2+/Mg2+と共にPBSに再懸濁した。トリプシンブルーによる染色及び細胞濃度の計算の後、細胞懸濁液を、６×107細胞/mlの濃度で設定した。その細胞懸濁液を、それを使用するまで、氷上で冷却した。10匹の雌ヌードマウス（Swissヌード、18〜20gの体重）を、動物当たりそれぞれ50μlのこの細胞懸濁液（＝３×106細胞/動物）により、Hamilton注射器及び27Gのカニューレを用いて、左横腹の領域に皮下接種した。
【０１１９】
腫瘍の増殖（長さ及び幅）を、スライド規則による測定により制御し、そして腫瘍の体積を、次の式に従って決定した：
LxB2/2
式中、L：長さ（mm）；B：幅（mm）。
動物を、腫瘍接種の12〜14日で試験した。この試験においては、この時点での腫瘍サイズは、230〜1600mm3であった。
【０１２０】
（ｄ）特異的バブル及びアイソタイプ対照の適用：
蝋質状態で特異的バブル（例４（ａ）〜（ｅ）に従って生成され、そして特徴づけられる）及び例４（ｆ）に従って結合する抗体を含む超音波コントラスト媒体を、kg体重当たり１〜109バブルの用量(それぞれ20ｇのマウスに関して、例４（ｇ）に従っての懸濁液200μｌに対応した）で、４匹のマウス中に、i.v.注射した。特異的バブルは、ガス充填された微小カプセルであり、このシェルは、官能化されたポリブチルシアノアクリレートから成り、そして抗−CD105−抗体をそれらの表面に結合した。
【０１２１】
対照物質として、四匹の追加のマウスを、非特異的バブル（例４（ａ）〜（ｅ）に従って生成され、そして特徴づけられる）及び例４（ｇ）に従って結合するアイソタイプを含む超音波コントラスト媒体により同じ手段で注射した。非特異的バブルは、ガス充填されたマイクロカプセルであり、このシェルはまた、官能化されたポリブチルシアノアクリルレートから成るが、しかしIgG2a（アイソタイプ対照）は、それらの表面に結合された。
すべての動物の腫瘍を、例１の方法により、濃度の程度に関して、それぞれの超音波コントラスト媒体の投与の60分後、試験した。
【０１２２】
（ｅ）超音波試験：
試験のために、マウスを、Rompun（商標）2% (20mgのキシラジン/ml)の希釈溶液（１＋９）及び100mg/mlのKetavet（商標）(100mgのケタミン塩基/ml)の希釈溶液（１＋４）（それぞれの場合、生理食塩溶液中）から成る１：１体積の混合物により麻酔した。この麻酔混合物から、20gのマウス当たりそれぞれ200μlをi.p.注射した。
【０１２３】
マウスを、サーボモーター（Limes150, OWIS GmbH, Motor コントローラーDC500）の移動可能部分に結合されたキャリヤーに、接着剤ストリップにより固定した。サーボモーターを、マウスを有するキャリヤーが水深皿（四角のプラスチックフラスコ）中に拡張するような手段で支持スタンドにより垂直に調節した。個々の走査の前、深皿を、37℃に調節された新鮮な水により充電した。変換器（L10-5、ATL UM9）は、結合ゲルにより供給され、そして水深皿の側壁に対して水平な支持スタンドにより重ねられた。可視的に且つソノグラフィー的にモニターしながら、マウスを、腫瘍が音フィールドに出現する点で深皿中を移動した。空気バブルが皮膚に付着する場合、後者は、皮膚上の液体石鹸により被覆された、丸くて、曲がったワイヤを注意して伸ばすことにより除去された。
【０１２４】
次に、マウスを、数ミリ引き戻した。走査の前、必要な装置設定を、超音波装置（色ドップラーモード、MI：1.1、持続性：0、優先：最大、侵入深さ：3cm、焦点：2cm）に対して行った。走査を、フレーム当たり285μmの一定SAE層厚で行った。この場合、腫瘍は、焦点の領域に存在する。走査の後、像を“凍結し”、その結果、変換器はいずれのシグナルも伝達しなかった。マウスを出発位置に引き戻した。変換器を再び、スイッチを入れ、そして動物を再び、同じ装置設定及び同じSAE層厚で走査した。第２捜査は、SAEシグナルにより引き起こされなかった、及び対照値として使用された色彩シグナルを同定するために必要とされた。そのようなシグナルは、血液又はより大きな空気バブルを流動することによって生成され得る。
【０１２５】
本明細書において使用された麻酔においては、動物の呼吸速度は一般的に、運動の人口産物を伴わないで呼吸についての小休止内で使用されるSAE層厚において約3cmの走査を行うことができるほど十分に低かった（図20b）。長い試験時間（例えば、薄いSAE層厚を有する）の場合、又は高い吸収速度で、呼吸人口産物は次の通りにして回避され得る：
ａ）少なくとも腫瘍サイズを有するプラスチックキャリヤー上に動物を固定し、その結果、腫瘍はそのくぼみに配置され、
ｂ）動物の呼吸運動の測定（例えば、ワイヤー−歪ゲージ、力学的圧力測定工程、等を用いての）、及び超音波装置及びサーボモーターの両者を調節するためのトリガーシグナルの使用。
【０１２６】
（ｆ）評価：
横断像を走査方向に生成し（図20ｂ）、そして後者を同じ尺度で、測定された値のその対応するダイアグラム上に重ねた（図20ｂ）。腫瘍内の着色されたスクリーン画素の合計を、Quantican（商標）(3D-Echotech) により評価した。評価に関しては、腫瘍に存在する色彩シグナル（MUpp:20）のみが考慮され、そして灰色シグナル（MUGP：21）は考慮されなかった。図20a/bに示されたライン16及び17は、第１走査の間、腫瘍領域の限界を定める。第２走査の領域は、ライン18と19との間に示されている。
さらに、詳細には、参照番号20は色彩シグナル（MUFP）を意味し；参照番号21は灰色シグナル（MUGP）を意味し；参照番号22はMUFP及びMUGP又は組織体積の合計を意味する。
【０１２７】
（ｇ）結果：
アイソタイプ対照に関しては、相当に少ない色彩シグナル（MU）が腫瘍において測定された（図21）。
（ｈ）議論：
結果は、本発明の方法がまた、生存生物における特異的に蓄積されるバブルを定量化するためにも適切であることを示す。有意な差異が、最大の空間的解像度により走査されない場合、本発明の自体の方法により検出され得、そしてSAE飽和は、いくつかの横断像のいくらかの領域をもたらす。特異的バブル濃度におけるシグナルの数は、血管系の残留シグナル及び/又は非特異的バブル濃度のシグナルから区別され得る。
【０１２８】
例４．超音波コントラスト媒体の生成
（ａ）マイクロカプセル懸濁液の生成：
円柱状の鋼製反応器（内径：高さ＝37cm、直径＝29cm）において、1％（m/m）オクトキシノール溶液７Lを、2.5のpHで導入し、そしてミキサー（溶解機ディスク：直径＝60mm、攪拌シャフト：長さ＝30cm、浸没角度＝10°）により、高い剪断グラジエント（4000rpm）で混合し、そして調整し（溶液の温度＝32℃）、その結果、自己ガス抜き（すなわち、強い気泡形成を伴って、分散により生成される媒体中への空気の導入）が生じた。
【０１２９】
100gのシアノアクリル酸ブチルエステルをすばやく添加し（３分以下）、そして分散した（添加の前、ミキサーの回転速度は8,000rpmに高められた）。それを60分間、自己ガス抜きにより重合せしめ、それにより、ガス充填されたマイクロカプセル（本出願に基づく定義に関しては、バブル）を形成した。球形の分離用漏斗において、浮遊する材料を、重力場において３日間、分離し、上清液を排水し、そして浮遊する材料を、0.02％（m/m）のオクトキシノール水溶液3Lにより再懸濁した。このようにして得られたマイクロカプセル懸濁液は、9.46mg/mlのポリマー含有率、0.943g/mの密度及び3.5のpHを有した。
【０１３０】
（ｂ）ガス充填されたマイクロカプセルの粒子サイズ及び粒子濃度：
例４（ａ）に従ってのマイクロカプセル懸濁液の粒子サイズ分布を、Particle Systems Company, AccuSizer 770タイプ（測定媒体：0.02％（m/m）Triton X100水溶液）の粒子カウンターにより決定した。体積−計算された粒子サイズ分布は、0.8から10μmに拡大し、そして最大1.8μmであり、そしてマイクロカプセル濃度は、１ml当たり7.2×109（±１×108）個の粒子であった。
【０１３１】
（ｃ）部分的側鎖加水分解によるガス充填されたマイクロカプセルの官能化：
例４（ａ）のマイクロカプセル懸濁液2500ｇを、８×10-2モル/ｌの濃度の水酸化ナトリウム溶液501ｇと共に、攪拌しながら混合した。12のpHを、反応バッチにおいて設定した。それを、室温で20分間、攪拌した。次に、pHを、1Nの塩酸により3.5に設定した。
【０１３２】
（ｄ）ガス充填されたマイクロカプセルの粒子サイズ及び粒子濃度：
例４（ａ）に従ってのマイクロカプセル懸濁液の粒子サイズ分布を、Particle Systems Company, AccuSizer 770タイプ（測定媒体：0.02％（m/m）Triton X100水溶液）の粒子カウンターにより決定した。体積−計算された粒子サイズ分布は、0.8から10μmに拡大し、そして最大1.8μmであり、そしてマイクロカプセル濃度は、１ml当たり6.0×109（±１×108）個の粒子であった。
【０１３３】
（ｅ）官能化されたガス充填されたマイクロカプセルに対するストレプタビジンの結合：
例４（ｃ）のマイクロカプセル懸濁液を、0.02％（m/m）のTriton−X100溶液（pH＝4.5、塩酸により設定される）からの少なくとも５倍の浮選により精製した。精製された懸濁液の7.5×108個の粒子を、シンチレーションバイアルにおける酢酸ナトリウム緩衝液15ml添加し、そして磁気攪拌器上で攪拌した。（酢酸ナトリウム緩衝液＝溶液A：1.36gのNaCH3C00・3H2O, M＝水500ml当たり136.08g/モルのRiedle-de Haen, 溶液B:571μlの氷酢酸、M＝水500ml当たり60.65g/モル、400mlの溶液Aを導入し、そして4.5のpHで溶液Bにより設定した）。
【０１３４】
300μgのストレプタビジン（SIGMA Company）を、濾過により殺菌された水300μlに溶解した。その溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液−マイクロカプセル緩衝液に添加した。pHは4.5±0.2であるべきである。次に、750μgのEDC（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（SIGMA））を、濾過により殺菌された水750μlにすばやく溶解し、そして緩衝溶液に添加した。
次に、攪拌を断続的pH制御下で１時間、続けた。さらに、それを４℃で一晩（約17時間）、攪拌した。
【０１３５】
最後に、水3.75ml中、１Mのエタノールアミノ溶液（SIGMA）188μlから成る溶液を、バッチに添加した。
浮選（24時間）の後、バッチを、上清液を1mlの体積に排水し、蒸発することによって濃縮した。次に、10mlのHepes緩衝液/0.01％（m/m）Triton溶液（5MのNaCl溶液30ml＋0.01％（m/m）Triton溶液（pH7.4）1000ml当たり１MのHepes溶液（Gibco15630-056）10ml）を添加し、再び浮選し、おして上清液を再び排水し、1mlの体積にした。濃縮された懸濁液を、シリコーン処理されたEppendorf反応容器中に移し、そして冷蔵庫に貯蔵した。
結合の成功を、FITC-ビオチンを用いてFACS（Becton Dickinsonの流動細胞計測計）により調べた。一連の飽和の助けにより、マイクロカプセル当たり200,000のストレプタビジン分子を定量化した。
【０１３６】
（ｆ）官能化されたガス充填されたマイクロカプセルへのビオチニル化された抗−CD105抗体の結合：
ストレプタビジンが例（ｅ）に従って結合されている、例４（ａ）〜（ｄ）に従ってのガス充填されたマイクロバブルの懸濁液を、ビオチニル化された抗−CD105−抗体（ラット抗−マウスCD105/エンドグリン、ビオチン接合体、Southern Biotechnology Associates, Inc., カタログ番号1860−08）と共に、１×106個のマイクロバブルに対して0.5μgの割合で、室温で10分間インキュベートした。インキュベーションの後、懸濁液を、0.02％（m/m）のTriton X100を含むPBS緩衝液により１×108のバブル/mlに希釈した。CD105結合及び希釈を、個々の動物のために新しく生成した。
【０１３７】
（ｇ）官能化されたガス充填されたマイクロカプセルへのビオチニル化されたIgG2aの結合：
ストレプタビジンが例（ｅ）に従って結合されている、例４（ａ）〜（ｄ）に従ってのガス充填されたマイクロバブルの懸濁液を、ビオチニル化されたIgG2aアイソタイプ対照（ラットIgG2aアイソタイプ対照、ビオチン接合体、Southern Biotechnology Associates, Inc., カタログ番号0117−08）と共に、１×106個のマイクロバブルに対して0.5μgの割合で、室温で10分間インキュベートした。
【０１３８】
インキュベーションの後、懸濁液を、0.02％（m/m）のTriton X100を含むPBS緩衝液により１×108のバブル/mlに希釈した。アイソタイプ結合及び希釈を、個々の動物のために新しく生成した。
本明細書に引用されるすべての出願、特許及び出版物、及び2002年５月28日に出願された対応するドイツ特許出願番号第10215335.3号及び2002年５月８日に出願されたアメリカ仮出願第60/378,358号の全開示は、引用により本明細書に組込まれる。
前述の例は、本発明の一般的に又は特異的に記載された反応体/又は操作条件を、前述の例に使用されるそれらに代わって用いることによって、類似する成功を伴って反復され得る。
前述の記載から、当業者は本発明の実質的な特徴を、容易に確めることができ、そして本発明の範囲内で、本発明の種々の変更及び修飾を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、超音波にゆだねられるバブルに基づいての“刺激された音放出”の原理を示す。
【図２】図２は、SAEシグナルの値が明白である超音波横断像を示す。
【図３】図３は、従来の記録、された横断像を示す。
【図４】図４は、色彩−飽和された横断像を示す。
【図５】図５は、本発明の方法の原理を示す：ａ：移動の距離：100μm、ｂ：移動の距離：50μm、ｃ：移動の距離：10μm。
【図６】図６は、変換器に関する方法性を示す。
【図７】図７は、定義されたオーバーラップする音フィールドを有する多要素変換器（２D-アレイ）を示す：ａ：わずかなビーム−オーバーラップを伴っての像蓄積、ｂ：重度のビーム−オーバーラップを伴っての像蓄積。
【図８】図８は、異なった移動距離により走査された例１の寒天シルエットの３−D図：ａ：SAE層厚さ＝10μm〜100μm：横断像13：移動距離：10μm；ｂ：SAE層厚さ＝50μm〜100μm：横断像14：移動距離：50μm；ｃ：SAE層厚さ＝100μm；横断像15：移動距離：100μm。
【図９】図９は、SAE層厚さに対するMUの依存性を示す（寒天シルエット、例１）。
【図１０】図１０は、SAE層厚さに対するMUcorr. の依存性を示す（寒天シルエット、例１）。
【図１１】図１１は、SAE層厚さに対するSAEcorr. の依存性を示す（寒天シルエット、例１）。
【図１２】図１２は、肝臓におけるバブル蓄積を示す、ラット１（例２）：１×108個のバブル/ml；エクスビボ測定、30分のp.i.：ａ：SAE層厚＝約1mm、ｂ：SAE層厚＝20μm。
【図１３】図１３は、肝臓におけるバブル蓄積を示す、ラット２（例２）：１×108個のバブル/ml；エクスビボ測定、30分のp.i.：ａ：SAE層厚＝約1mm、ｂ：SAE層厚＝20μm。
【図１４】図１４は、SAE層厚に対するMUの依存性を示す、ラット１（例２）：１×108個のバブル/ml、エクスビボ測定、30分。
【図１５】図１５は、SAE層厚に対するMUcorr.の依存性を示す、ラット１（例２）：１×108個のバブル/ml、エクスビボ測定、30分。
【図１６】図１６は、SAE層厚に対するSAEcorr.の依存性を示す、ラット１（例２）：１×108個のバブル/ml、エクスビボ測定、30分。
【図１７】図１７は、SAE層厚に対するMUの依存性を示す、ラット２（例２）：１×107個のバブル/ml、エクスビボ測定、30分。
【図１８】図１８は、SAE層厚に対するMUcorr.の依存性を示す、ラット２（例２）：１×107個のバブル/ml、エクスビボ測定、30分。
【図１９】図１９は、SAE層厚に対するSAEcorr.の依存性を示す、ラット２（例２）：１×107個のバブル/ml、エクスビボ測定、30分。
【図２０】図２０は、表面抗−CD−105抗体がマウスのF9−ter Atomにおいて結合されている特定のバブルの蓄積を示す（例３）：ａ：グラフ可視化、ｂ：走査方向における腫瘍のソノグラフ縦断面、ライン16と17の間の領域：第１走査の間の腫瘍、ライン18と19の間の領域：第２走査の間の腫瘍。
【図２１】図２１は、アイソタイプ対照（４匹のマウス、例３）に比較しての、腫瘍に蓄積される特定バブルの色シグナル（４匹のマウス、例３）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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