(57)【要約】尿路上皮は、哺乳類尿路の大半を内張りしている分化上皮である。本発明は、インビトロ尿路上皮培養の分野に関する。以前の方法は、自然尿路上皮の機能性の大半が欠如する組織を生成する。本発明では、血清を含有する栄養培地中で尿路上皮細胞を継代培養し、そして前記尿路上皮を形成するために同様の培地中へ入れる前に再分散させることによって重層化および分化した哺乳類尿路上皮（１）が生成される。
2005533514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重層化および分化した哺乳類尿路上皮の生成方法であって、哺乳類の身体から単離した尿路上皮細胞を血清成分含有栄養培地中で継代培養し、前記尿路上皮を形成するために類似培地中に入れる前に再分散させる方法。
【請求項２】
該哺乳類尿路上皮がヒト尿路上皮である、請求項１の方法。
【請求項３】
該血清がウシ血清である、請求項１または請求項２のいずれかの方法。
【請求項４】
該血清がウシ成体血清である、請求項３の方法。
【請求項５】
最終量の栄養培地の比率としての血清成分の濃度が、全血清中の前記成分の濃度に関連して約１％〜約３０％である、先行請求項のいずれかの方法。
【請求項６】
最終量の栄養培地の比率としての血清成分の濃度が、全血清中の前記成分の濃度に関連して約３％〜約１０％である、請求項１から請求項４のいずれかの方法。
【請求項７】
最終量の栄養培地の比率としての血清成分の濃度が、全血清中の前記成分の濃度に関連して約４％〜約６％である、請求項１から請求項４のいずれかの方法。
【請求項８】
該栄養培地がＭＣＤＢ−１５３培地またはその誘導体である、先行請求項のいずれかの方法。
【請求項９】
該栄養培地がＫＳＦＭ（角化細胞無血清培地）である、請求項１〜請求項７のいずれかの方法。
【請求項１０】
該栄養培地に上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）；コレラ毒素（ＣＴ）のうちの１つ以上が補給される、先行請求項のいずれかの方法。
【請求項１１】
実質的に本明細書に記載した重層化および分化した哺乳類尿路上皮の生成方法。
【請求項１２】
上記の請求項のいずれかの方法により生成された尿路上皮。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類尿路上皮のインビトロ培養方法に関する。本発明は、さらに本明細書に記載した方法により生成される物質にも関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の膀胱および関連尿路は、尿と身体の基礎組織との間の有効な障壁を提供する高度に分化した上皮である尿路上皮によって内張りされている。図１を参照すると、この図は典型的な機能的尿路上皮の断面の略図を示しており、尿路上皮１は基底細胞６、中間細胞５および表層細胞４からなる重層上皮である。能動輸送される物質を除いて、尿路上皮は尿中または血液中に存在する全ての物質に対して不透過性でなければならない。上皮を越える移動は、細胞（細胞内経路）並びに密着帯７および外側細胞間隙（傍細胞経路）を通る２つの平行経路によって発生する。高度に分化した表層細胞もしくはいわゆる「アンブレラ」細胞４は組織−尿界面を形成し、ａ）細胞間密着帯、およびｂ）頂端（すなわち、尿に面する）面を被覆する非対称性単位膜（ＡＵＭ）のプラークの存在によって透過性障壁を提供する。ＡＵＭプラークは尿路上皮に固有であり、ひとまとめにしてウロプラキンとして知られる４種の主要な尿路上皮特異的タンパク質から構成される。これらのタンパク質は単離およびクローン化されている。２種の４膜貫通領域タンパク質（４ＴＭタンパク質）であるＵＰＩａおよびＵＰＩｂ、そしてさらに２種の１型タンパク質ＵＰＩＩおよびＵＰＩＩＩがある。近年、第３の１型タンパク質が同定されている。名称は完全には定着していないが、これらのタンパク質はＵＰＩＩ、ＵＰＩＩＩａおよびＵＰＩＩＩｂと呼ばれると思われる（Ｄｅｎｇ  ＦＭ，Ｌｉａｎｇ  ＦＸ，Ｔｕ  Ｌ，Ｒｅｓｉｎｇ  ＫＡ，Ｈｕ  Ｐ，Ｓｕｐｉｎｏ  Ｍ，Ｈｕ  ＣＣ，Ｚｈｏｕ  Ｇ，Ｄｉｎｇ  Ｍ，Ｋｒｅｉｂｉｃｈ  Ｇ，Ｓｕｎ  ＴＴ，「Ｕｒｏｐｌａｋｉｎ  ＩＩＩｂ，ａ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ，ｄｉｍｅｒｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ｕｒｏｐｌａｋｉｎ  Ｉｂ  ａｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｓｔｅｐ  ｏｆ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ」，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２  Ｎｏｖ．２５；１５９（４）：６８５−９４を参照）。
【０００３】
上皮のイオン透過性を測定するための極めて高感受性の方法であって明確に確立された手段は、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）法である。一般に、漏出性上皮は典型的には５００Ωｃｍ２未満の抵抗を有するが、密着性上皮は５００Ωｃｍ２を超える抵抗を有する。基礎にある組織を尿から保護するために重要な要件の結果として、尿路上皮は特徴的に高いＴＥＲを有する。
【０００４】
尿素、アンモニア、水、およびプロトン等の低分子、並びにさらにデキストラン等の高分子に対する極めて低い受動的透過性とは別に、尿路上皮は能動的経上皮イオン輸送系もさらに有する。特に重要であるのは、能動的ナトリウム輸送系である。図１を参照すると、尿路上皮１の頂端（尿に面する）面２上にはアミロライド感受性ナトリウムチャンネル８が位置する。尿路上皮１の基底外側面３上には、ウアバインの作用によって阻害され得るＮａ＋−Ｋ＋ＡＴＰアーゼ対向輸送系９が位置する。これらのイオン輸送系の存在および正確な空間位置は、電気化学的試験を通して単離尿路上皮の内外でのアミロライド感受性およびウアバイン感受性電位差を測定することにより決定できる。
【０００５】
そこで、下記の特徴は機能的尿路上皮の指標である。
（１）  基底細胞、中間細胞、および「アンブレラ」細胞の重層形態、
（２）  膜の頂端面上のウロプラキンタンパク質プラークの存在、
（３）  膜の細胞間における密着帯の存在、
（４）  アミロライド感受性ナトリウムチャンネルの空間的に正確な位置、およびＮａ＋        −Ｋ＋ＡＴＰアーゼの基底外側発現、
（５）  高い経上皮抵抗、
（６）  他の低分子量種および高分子量種に対する低い受動的透過性。
【０００６】
膀胱上皮（尿路上皮）に関する現状の知識水準に関する概観はＬｅｗｉｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，２７８：Ｆ８６７−Ｆ８７４）によって提供されている。
【０００７】
インビトロで培養された尿路上皮を生成することができれば、多くの理由から相当に大きな利益が得られるであろう。インビトロで培養された尿路上皮は、正常生理学的機能および病態生理的機能の両方について試験するためのモデルを提供するであろう；例えば新薬発見の工程の一部として、医薬化合物の作用を試験するためのモデルを提供するであろう（現在の方法には、未分化もしくは腫瘍細胞培養の使用が含まれるが、どちらも自然組織にとっての良好なモデルとは見なされていない）；物質の発癌性を評価することを含むがそれに限定されない毒物学的試験のためのモデルも提供するであろう；さらに、再建手術に使用するための材料も提供するであろう。
【０００８】
尿路上皮細胞の未分化一次培養は１９８０年代初頭に初めてインビトロで増殖させられ、さらにその後、機能的な哺乳類の尿路上皮細胞培養モデルを開発するために無数の努力が積み重ねられてきた。しかし多数の進歩を遂げてきたにもかかわらず、インビトロで生成された尿路上皮が上記で考察したように形態学的および機能的に自然尿路上皮を模倣する系についてはこれまで報告されていない。
【０００９】
１９９３年に、尿路上皮組織培養のための１つの方法が開示された（Ｋ．Ｒ．Ｈｕｔｔｏｎら，ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５０，７１−７５，Ａｕｇｕｓｔ  １９９３）。尿路上皮は、顕微解剖およびタンパク質分解酵素の使用によって臨床組織サンプルから単離された。剥離した尿路上皮シートをさらにコラゲナーゼ処理することにより単細胞懸濁液が生成された。これらの細胞は、少なくとも７継代に渡り無血清培地上で良好に培養することができた。この方法により尿路上皮細胞の融合性（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）シートを生成することはできたが、上皮の重層化の証拠は観察されず、実際に分化関連抗体マーカーを用いての免疫標識は培養した細胞が基底／中間細胞表現型を発現することを証明したが、末端分化の証拠は得られなかった。
【００１０】
１９９４年に公表された試験で、Ｓｏｕｔｈｇａｔｅら（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．７１，Ｎｏ  ４，Ｐａｇｅ  ５８３）は、カルシウム濃度の上昇がインビトロ培養ヒト尿路上皮細胞の重層化に及ぼす作用について開示した。この試験では、生後３ヵ月から２３．２歳までの年齢範囲の患者計６２例から腎盂、膀胱、および輸尿管からの組織サンプルが入手された。尿路上皮の単細胞培養はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いた組織の処理、それに続く酵素消化によって入手された。無血清増殖培地中の細胞外カルシウム濃度の上昇は、試験した全細胞系において尿路上皮細胞形態に顕著な作用を及ぼすことが見いだされた。０．０９ｍＭから２．０ｍＭへのカルシウム濃度の上昇は培養細胞の重層化を誘導したが、多層形成および密着帯形成の証拠にもかかわらず、表在性に位置する細胞内でＡＵＭは所見されず、これは後期または末期分化が入手されなかったことを示唆していた。しかしこの試験は、ドナーの年齢が尿路上皮細胞培養に成功するための重要な因子ではないことを証明した。さらに、様々な領域の尿路由来の組織サンプルから開始された培養尿路上皮の成長特性および表現型において認識できる差は観察されなかった。
【００１１】
１９９７年に公表された試験では、Ｌｉｅｂｅｒｔと同僚ら（Ｌｉｅｂｅｒｔら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，１９９７，６１：１７７−１８５）は、無血清増殖培地上で尿路上皮細胞を培養し、次に２％ウシ胎児血清および８％ウシ新生児血清を補給した増殖培地へ移した後にそれらの特徴について試験した。この試験は高い経上皮電気抵抗を証明したと思われたが（信頼性が特に高くはない「チョップスティック」電極法を使用したにもかかわらず）、認識された尿路上皮特異的マーカーを使用しても細胞分化は報告されなかった。
【００１２】
Ｌｉｅｂｅｒｔらにおいて開示された方法と本発明との相対有効性を比較するために、下記の試験を実施した。ヒト尿路上皮細胞の一次培養を下記のように無血清培地中で株化した。細胞サンプルは、メンブレンフィルター上でプレーティングし、ウシ血清を含有する細胞培養培地へ移した。これは本質的にＬｉｅｂｅｒｔらのプロトコールである。第２細胞サンプルは、スナップウェルメンブレン上でプレーティングする前に、下記のように本発明の好ましい実施形態によって血清含有培地内で継代培養し、再び下記のように血清含有培地内でインキュベートした。細胞を７日間増殖させた後、修飾Ｕｓｓｉｎｇチャンバーおよび電子電圧抵抗計を使用して生成した組織の経上皮電気抵抗を評価した。本質的にＬｉｅｂｅｒｔらのプロトコールによって培養した組織のＴＥＲは１８．６Ωｃｍ２のＴＥＲを示した。これとは対照的に、本発明の方法により生成された尿路上皮組織の複製サンプルは３０２３．４Ωｃｍ２の平均ＴＥＲを示した。したがって、前者の方法は機能的尿路上皮に特徴的な高い経上皮抵抗を生成することができなかった。
【００１３】
２０００年にＳｕｇａｓｉおよび同僚ら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６４，９５１−９５７，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０００）は、ヒト尿路上皮のインビトロ工学技術について報告した。尿路上皮細胞は、基礎の間質から尿路上皮を分離し、コラゲナーゼを使用して細胞を分離し、さらに組換え上皮細胞増殖因子、ウシ下垂体抽出物、コレラ毒素および抗生物質を補給した角化細胞無血清培地（ＫＳＦＭ）中で細胞を培養することによって組織サンプルから入手した。１００％コンフルエンスに到達すると、無血清培地のカルシウム濃度は重層化を誘導するために１．５ｍＭの最終濃度へ強化した。この方法は既に、Ｓｏｕｔｈｇａｔｅら，１９９４（上記参照）によって重層化を誘導することが証明されているが、尿路上皮分化は誘導しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の極めて広範囲の定義において、重層化した分化哺乳類尿路上皮を生成する方法であって、哺乳類身体から単離された尿路上皮細胞が血清成分を含有する栄養培地で継代培養され、前記尿路上皮を形成するために同類の培地中に入れる前に再分散させられる方法が提供される。好ましくは、哺乳類尿路上皮はヒト尿路上皮である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
さらに好ましくは血清はウシ血清であり、より好ましくは血清はウシ成体血清である。
【００１６】
有益には、最終量の栄養培地の比率としての血清成分の濃度は、全血清中の前記成分の濃度に関連して約１％〜約３０％である。より有益には、最終量の栄養培地の比率としての血清成分の濃度は、全血清中の前記成分の濃度に関連して約３％〜約１０％である。最も有益には、最終量の栄養培地の比率としての血清成分の濃度は、全血清中の前記成分の濃度に関連して約４％〜約６％である。
【００１７】
好ましくは、栄養培地はＭＣＤＢ−１５３培地またはその誘導体である。より好ましくは、栄養培地はＫＳＦＭ（角化細胞無血清培地）である。
【００１８】
有益には、下記の理由から、栄養培地には１種以上の上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）；コレラ毒素（ＣＴ）が補給される。
【００１９】
本発明の範囲内には、本明細書に記載するように、実質的に重層化および分化した哺乳類尿路上皮を生成する工程が含まれる。
【００２０】
本発明のまた別の態様は、上記のように本方法により生成される尿路上皮である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下では、本方法の各段階を説明することによって本発明の好ましい実施形態について記載する。
【００２２】
組織の起源
尿路上皮は、腎盂から輸尿管および膀胱を通って尿道の最初の部分まで尿路を内張りしている。尿路上皮細胞培養は、これらの領域の各々から容易に生成することができ、成人または小児ドナーの尿路の様々な領域から株化された細胞培養中で大きな相違は見いだされなかった。好ましくは、尿路上皮細胞培養のための組織は、局所麻酔下で採取された生検標本、または手術時に切除された組織から入手できる。ジアテルミーは、細胞生育性に有害な影響を及ぼすので採取される組織の周囲領域では回避すべきである。あるいは、尿路上皮細胞は、採取された細胞の起源が実際に尿路上皮であることを保証するために、細胞同定、細胞選択またはセルソーティングのいずれかの適切な方法を使用して尿サンプルから入手することもできる。同様に、尿路上皮組織はＳｃｈｍｉｄｔおよび同僚ら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，１９８４，１３２：１２６２−１２６４）によって記載されているように、死体から採取することもできる。
【００２３】
尿路上皮は、任意の付着した間質から当業者に認識された数多くの方法のいずれかによって分離される。好ましくは、尿路上皮の標本は、漿膜、脂肪、または他の挫滅組織片を除去するためにトリミングされ、そしてＨＥＰＥＳバッファー、アプロチニン等のプロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）並びにカルシウムおよびマグネシウムを含まないＨＢＳＳ（ハンクス平衡食塩液）を含む剥離液内に移される。この方法についての詳細な説明は、Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ  Ｊ．，Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｊ．Ｒ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｔｒｅｊｄｏｓｉｅｗｉｃｚ  Ｌ．Ｋ．，「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ」，Ｉｎ：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．ａｎｄ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｍ．Ｇ．（編集），「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ」，第２版，２００２，Ｊｏｈｎ  Ｗｙｌｉｅ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．に記載されている。
【００２４】
あるいは、尿路上皮細胞は組織サンプルの尿路上皮表面の機械的掻爬によって基礎の間質から分離することもできる。
【００２５】
一次尿路上皮細胞培養
尿路上皮細胞物質が上記のセクションで記載したように尿路上皮シートとして単離されている場合、または尿から単離された凝集細胞の形状にある場合、分散細胞の培養を当技術分野において周知の方法のいずれかによって入手できる。必要であれば、コラゲナーゼを使用して細胞を基礎の組織から解放することができる。
【００２６】
尿路上皮細胞の培養および継代培養のために適切な培地にはＫＳＦＭ（角化細胞無血清培地）；ＭＥＭ（最小必須培地）；および角化細胞の培養に適合するその他の類似の低カルシウム培地、および好ましくはＭＣＤＢ−１５３培地に基づき、そして任意で、しかし好ましくは下記のリストから引き出されるＳｏｕｔｈｇａｔｅら（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７１（４），５８３−５９４，１９９４）に記載された補給物を含有する培地が含まれる。
【００２７】
（ｉ）  最終濃度が約０．０５〜約０．５ｎｇ／ｍＬでの、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、好ましくはヒト組換えＥＧＦ。尿路上皮細胞はＥＧＦ受容体に対する遺伝子を発現し、さらにＥＧＦは尿路上皮細胞のための増殖因子であることが証明されており、さらに細胞系に長命を与える。
（ｉｉ）  尿路上皮細胞系の長期間生存のために必要とされる、濃度が約１０〜約５０μｇ／ｍＬのウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）。
（ｉｉｉ）  一次培養のプレーティング効率を向上させる、濃度が約１０〜約７５、好ましくは約３０ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素（ＣＴ）。
【００２８】
汚染している生物の成長を制御するために適切な抗生物質もまた添加することができるが、そのような添加はそのような汚染している生物を排除せずにその存在を遮蔽することがあるので、それらが存在しないことが好ましい。
【００２９】
次に尿路上皮細胞を実質的に便宜的方法で増殖させ、最も好ましくは細胞が１００％コンフルエンスに達する前に連続的二次培養、もしくは継代培養によって維持することができる。このように達成された一次細胞培養、および実質的に未分化細胞培養はそのような連続的二次培養、もしくは継代培養によって長期間にわたり維持することができる。
【００３０】
重層化および末端分化の誘導
細胞培養の重層化および末端分化を誘導するために、上記の一次細胞培養からの細胞を、本発明の方法により分化培地を通して継代培養した。本発明の分化培地は、標準細胞培地（ＫＳＦＭ、ＭＥＭおよびその他の角化細胞を培養するために適切な類似の低カルシウム培地、および好ましくはＭＣＤＢ−１５３培地に基づく培地等）に加えて血清、好ましくはウシ血清、より好ましくはウシ胎児血清、および最も好ましくはウシ成体血清の成分を、量で約１％〜約３０％、好ましくは約５％の濃度で含んでいる。前記パーセンテージは分化培地の総量に基づいており、全血清中の前記血清成分の濃度に関連している。前記血清は、最も好ましくは尿路上皮細胞を分化培地内に導入する前に前記分化培地の一成分として組み込まれているが、任意で尿路上皮細胞を培地内へ導入して約５時間後までのいずれかの時点に培地に添加されてよい。
【００３１】
血清、特別にはウシ血清は上記のように標準細胞培地へ補給するために使用される。胎児、新生児もしくは成体ウシ血清は必要な分化を引き起こすが、分化を誘導するには成体血清が特に有効である。これは極めて驚くべきことである。増殖培地中で血清を使用するだけではなく血清を含有する分化培地を通して細胞を継代培養することが教示されてきたので、当業者はきっとおそらく、胎児血清が分化に役立つ発生因子を含有するとしばしば考えられているので、胎児血清を使用する可能性が極めて高いであろう。
【００３２】
さらに、前記分化培地は任意で、しかし好ましくはＳｏｕｔｈｇａｔｅら（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７１（４），５８３−５９４，１９９４）に記載されているように下記のリストから引き出された補給物を含有していてよい。
【００３３】
（ｉ）  最終濃度が約０．０５〜約０．５ｎｇ／ｍＬの、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、好ましくはヒト組換えＥＧＦ。尿路上皮細胞はＥＧＦ受容体に対する遺伝子を発現し、さらにＥＧＦは尿路上皮細胞のための増殖因子であることが証明されており、さらに細胞系に長命を与える。
（ｉｉ）  尿路上皮細胞系の長期間生存のために必要とされる、約１０〜約５０μｇ／ｍＬの濃度のウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）。
（ｉｉｉ）  一次培養のプレーティング効率を向上させる、約１０〜約７５、および好ましくは約３０ｎｇ／ｍＬの濃度でのコレラ毒素（ＣＴ）。
【００３４】
汚染している生物の成長を制御するために適切な抗生物質もまた添加することができるが、そのような添加はそのような汚染している生物を排除せずにその存在を遮蔽することがあるので、それらが存在しないことが好ましい。
【００３５】
本発明の方法によって重層化および分化を誘導するためには、上記の一次細胞培養からの細胞は、例えばトリプシンおよびＥＤＴＡを使用することによって当技術分野において周知の手段によって分解される。分解のために適切なプロトコールの例については、Ｓｏｕｔｈｇａｔｅら（「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ」、上記）を参照。分解した細胞は前記分化培地へ移され、そしてそれらがコンフルエンスに近づくまで実質的に慣習的方法でインキュベートされる。前記血清含有分化培地を通してのこの継代培養に続いて、細胞はもう一度実質的に慣習的な方法で分解され、そして再び新鮮血清含有分化培地へ移される。尿路上皮細胞を播種したこの培地は、次にいずれかの実質的に慣習的な細胞培養装置内でインキュベートされる、またはポリカーボネート製スナップウェル・フィルター等の任意の適切な支持装置上でプレーティングすることができる。約１時間から約４８時間、好ましくは約２４時間のインキュベーション後、増殖培地中のカルシウム濃度は約０．２ｍＭから約５ｍＭ、好ましくは約２ｍＭへ上昇する。その後の数日間にわたって、典型的には７日後には、細胞は増殖して実質的に機能的および末端分化尿路上皮を形成するであろう。この段階で、尿路上皮は下記のように形態学的および機能的基準によって特徴付けることができる。
【実施例】
【００３６】
本発明の方法によるヒト尿路上皮の生成および特性解析
ヒト尿路上皮の生成。Ｓｏｕｔｈｇａｔｅら（「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ」、上記）が記載しているように、多数のヒト起源由来のドナー組織を使用して、無血清低カルシウムＫＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、英国ペイズリー）培地中での連続継代培養を通してヒト尿路上皮細胞のインビトロ一次未分化培養を株化および増殖させた。十分な細胞が生成した（２〜４継代）後、細胞を採取し、量で５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給したＫＳＦＭ培地内へ播種した。コンフルエンスな状態で尿路上皮細胞を採取し、スナップウェル・フィルター上に播種し、５％  ＦＢＳを補給したＫＳＦＭ培地内で維持した。２４時間後、培地のカルシウム濃度は０．０９ｍＭから２ｍＭへ上昇した。尿路上皮細胞培養の表現型および様々な機能的特性は、フィルター上への播種から７日後に評価した。これらの特性解析の結果は下記に記載した。
【００３７】
表現型の特性解析。培養した尿路上皮の顕微鏡検査によって、本発明の方法により生成された尿路上皮の重層化および末端分化した特性が明らかになった。哺乳類組織学の当業者にとって極めて明らかな特定の特徴には、基底細胞、中間細胞およびアンブレラ細胞の重層の存在、並びに尿路上皮細胞間の密着帯の存在が含まれた。間接的免疫蛍光アッセイを使用することにより、密着帯タンパク質オクルディンの存在によって指示された細胞間密着帯の形成がさらに確証された。
【００３８】
経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）。本発明の方法により生成されたインビトロ尿路上皮の経尿路上皮電気抵抗は、修飾Ｕｓｓｉｎｇチャンバーおよび電子電圧抵抗計を使用して測定した。本発明の方法により生成されたインビトロ培養尿路上皮のＴＥＲは、７回の別個の機会に生成されたサンプルについて測定した。平均ＴＥＲは３０２３．４±５６４．４Ωｃｍ２であることが見いだされた。これとは対照的に、ＫＳＦＭ培地単独上で培養した尿路上皮細胞のコンフルエント層は１２．７±１．９Ωｃｍ２のＴＥＲを有することが見いだされた。
【００３９】
経尿路上皮の透過性。本発明の方法により生成された尿路上皮細胞シートの拡散性の水および尿素の透過性は放射性同位元素トレーサー法を使用して決定した。尿素および水に対する平均透過性は、各々１０．１×１０−５ｃｍ／秒および４．５×１０−４ｃｍ／秒であった。これらの透過性の測定値は、ＫＳＦＭ培地単独上で培養した尿路上皮細胞シートについて入手した透過性値より統計的有意に小さく、これらは尿素および水について各々１２．７×１０−５ｃｍ／秒および５．２×１０−４ｃｍ／秒であった。
【００４０】
分極したナトリウムイオンチャンネルの分布。ナトリウムイオンチャンネルの存在および正確な空間的位置を決定するために、短絡電流および経上皮電位差を電圧および電流の固定条件下で各々測定した。尿路上皮組織の頂端面のアミロライドへの暴露は、用量依存性方法で電圧および電流の両方を低下させた。図２は、頂端面でのアミロライド濃度の関数として短絡電流における用量依存性低下を示している。アミロライドへの尿路上皮膜の基底面の暴露は電圧または電流のいずれにも影響を及ぼさなかった。これらの結果は、アミロライド感受性ナトリウムチャンネルが、機能的尿路上皮において必要とされるために頂端膜に位置してそこに限定されたことを示唆している。インビトロ培養尿路上皮の頂端面のウアバインへの暴露は、測定された電圧および電流にほんの小さな影響しか及ぼさなかった。対照的に、膜の基底面をウアバインへ暴露させると、電圧および電流の両方の顕著な減少が生じたが、これはＮａ＋−Ｋ＋ＡＴＰアーゼの正確な基底外側位置を指示している。
【００４１】
ＡＵＭタンパク質の発現。本発明のインビトロ培養尿路上皮におけるウロプラキンであるＵＰＩａ、ＵＰＩｂ、ＵＰＩＩ、およびＵＰＩＩＩ遺伝子の発現は、適切なプライマーを用いる逆転写酵素ＰＣＲの使用によってｍＲＮＡレベルで確証された。
【００４２】
本発明の方法により生成された尿路上皮組織の表現型および機能的特性についての上記の特性解析は、このように生成された尿路上皮が先行技術において知られている任意の方法で証明されているより多くの自然尿路上皮の機能的特性を示すことを証明している。哺乳類細胞培養、およびより特別には尿路上皮細胞培養の当分野の研究者がほぼ２０年間にわたり機能的インビトロ尿路上皮を生成することを試みて成功が得られていないという観察は、本明細書に記載した本発明の発明性に対する証拠である。
【００４３】
本明細書に記載した本発明は、ヒト尿路上皮を含む哺乳類の生成に適用できると想定されている。
【００４４】
本明細書には様々な出版物を言及したが、それらの開示は全体が参照して組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】上記で言及したように、典型的な機能的尿路上皮の断面の略図である。
【図２】頂端面へアミロライドを添加した際の尿路上皮を越える短絡電流における用量依存性低下を示しているグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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