(57)【要約】本発明は、植物病原菌を用いる生化学農薬に関し、更に詳細には、WT#3（Erwinia pyrifoliae WT#3）［ＫＣＣＭ  １０２８３］から分離した遺伝子を用いることによって、従来の火傷病菌（Erwinia amylovora  ＡＴＣＣ１５５８０）から分離した植物過敏感反応タンパク質（ＨｒｐＮ）よりも、植物病害抵抗性及び植物成長促進効果が優れている生化学農薬に関し、該生化学農薬は、肥料剤として使用することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病害防除および植物生長促進に有効なErwinia属の病原菌である、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3, KCCM 10283）。
【請求項２】
枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）に由来する非感染形態のポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子（KCCM 10282）であり、該遺伝子は、植物細胞を該遺伝子と接触させるか、または該遺伝子で処理する場合、植物において有害生物に対する過敏感反応または耐性を誘導することを特徴とする、該遺伝子。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子は、配列番号５の核酸配列を有することを特徴とする、請求項２記載の遺伝子（KCCM 10282）。
【請求項４】
前記ポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号６に該当するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項２記載の遺伝子。
【請求項５】
前記枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）は、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3, KCCM 10283）であることを特徴とする、請求項２記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項２記載の遺伝子を含有することを特徴とする、組換え発現ベクターシステム。
【請求項７】
前記遺伝子は、配列番号５の核酸配列を有することを特徴とする、請求項６記載の発現ベクターシステム。
【請求項８】
請求項２記載の遺伝子を含有することを特徴とする、形質転換体。
【請求項９】
前記形質転換体は、植物および細菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
植物細胞と接触させる場合、植物において病原菌に対する過敏感反応または耐性を誘導することを特徴とする、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）に由来する非感染形態のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１１】
前記枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）は、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）［ＫＣＣＭ  １０２８３］であることを特徴とする、請求項１０記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１２】
前記ポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号６の核酸配列を有することを特徴とする、請求項１０記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１３】
前記ポリペプチドまたはタンパク質は、組換え体であることを特徴とする、請求項１０記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１４】
請求項１１記載のポリペプチドまたはタンパク質と担体を含むことを特徴とする、生化学農薬組成物。
【請求項１５】
請求項１１記載のポリペプチドまたはタンパク質と担体を用いる、農薬。
【請求項１６】
請求項１１記載のポリペプチドまたはタンパク質と担体を用いる、植物生長促進剤。
【請求項１７】
請求項１１記載のポリペプチドまたはタンパク質と担体を用いる、種子処理剤。
【請求項１８】
請求項１１記載のポリペプチドまたはタンパク質と担体を用いる、害虫忌避剤。
【請求項１９】
請求項１１記載のポリペプチドまたはタンパク質と担体を用いる、肥料。
【請求項２０】
枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3、ＫＣＣＭ  １０２８３）の培養物、および枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3、ＫＣＣＭ  １０２８３）由来の菌株の植物過敏感反応誘導遺伝子を含む形質転換体（ＫＣＣＭ  １０２８２）から、過敏感反応又は耐性を誘導するポリペプチドまたはタンパク質を分離、精製して、前記ポリペプチドまたはタンパク質を大量生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、韓国の江原道春川地方で単離された新規植物病原菌である枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）［ＫＣＣＭ  １０２８３］由来の遺伝子を用いた新規生化学農薬に関する。本病原菌は、韓国に固有のものである。本新規生化学農薬は、韓国に存在しない火傷病菌（Erwinia amylovora  ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ）から分離された過敏感反応誘導タンパク質であるＨｒｐＮよりも、植物病害抵抗性、植物成長促進及び害虫忌避の向上などの効果に優れている。したがって、本新規生化学農薬は、病原菌および害虫によって引き起こされる植物病害を防ぐのに効果的な生化学農薬のみならず植物の成長を促進するのに有効な肥料として利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
人類が当面している様々な問題のうち、食糧不足の現象は最も深刻な問題として台頭している。しかし、食糧の増大のために栽培した作物は、病原菌や害虫などの有害生物の発生によってその生産量が大きく減少し、非常に深刻な問題として指摘されている。現在、有害生物の蔓延を防除するための方法としては、殺菌剤と殺虫剤を直接散布して有害生物の拡散を阻止するか、または死滅させる化学的防除が最も広く利用されている。しかし、このような殺菌剤や殺虫剤の場合、有害生物を直接殺すので可視的な効果が早く現れ、利用方法が容易であるが、持続的にかつ過剰に使用すると、各種の有害生物において化学的農薬に対する耐性が誘導される。さらに、毒性が強く、最も効果が優れている農薬の場合、深刻な土壌汚染および水質汚染などの環境破壊によって社会的不安が生じている。したがって、有効な農薬活性を有しながら薬剤に対する何らかの耐性を誘導するおそれがなく、環境に優しい生化学農薬の開発が切実に求められている状態である。
【０００３】
生化学農薬を用いる最も一般的な目的は、有害生物に敵対する微生物自体を植物に直接撒布して、有害生物の防除効果を得ようとするものであるが、この方法は、その効能面において人類が所望する水準に達していない。したがって、近来は、敵対する微生物自体を撒布する代わりにそのような微生物が生産する物質を用いて植物の自己防衛システムを刺激するという方法によって有害生物を防除する方向に研究が進められている。すなわち、微生物由来の物質で植物体を処理して、植物体の自己免疫機能を活性化させることにより、有害生物の発生および拡散を防止しようとするものである。
【０００４】
主に、植物表皮細胞のクチン質、ワックス層および気孔の模様などの構造的障壁による植物の防御システムによって、植物は病害に対して抵抗する。病原菌が植物細胞内に侵入した場合、植物によって分泌されるサポニンやレクチン等の様々な化学物質が、侵入した病原菌の拡散を阻止する。［Agrios, G. N. 1997. Plant Pathology.4th ed. Academic Press, New York; Dong, X. 1998. SA. JA, ethylene, and disease resistance in plants. Curr. Opin. Plant. Biol.1:316-323; Feys, B. J. & Parker, J. E. 2000. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance. Trends Genet. 16:339-455］。
【０００５】
さらに重要な植物の病害に対する抵抗は、過敏感反応（HR）と呼ばれ、病原菌の拡散を防ぐための迅速かつ局所的な壊死であり、いくつかの微生物由来物質により、多くの病原菌に対する植物の積極的な防御を伴って、自己防御システムを刺激する。［Richberg, M. H., Aviv, D. H. & Dangl, J. L. 1998. Dead cells do tell tales. Curr. Poin. PlantBiol. 1:480-485］。過敏感反応の誘導を伴う植物の病害に対する第一の抵抗方法は、病原菌に感染した部位の周辺の細胞に早期に知らせるシステムを植物が発動して、周辺の細胞が病原菌に対する抵抗性を増大させることができるようにするという方法であり、このような防御システムは、局部獲得抵抗性（local acquired resistance、ＬＡＲ）と呼ばれている。
【０００６】
反面、第二の方法は、植物の感染していない部分においても防御システムが活性化して植物全体においてさらに強い防御システムがニ次感染に対して作動するようになるものである。このような防御システムは、全身獲得抵抗性（systemic acquired resistance、ＳＡＲ）と呼ばれ、このＳＡＲは数週間或いはそれ以上持続することがあり、しばしば関連しない他の種々の病原菌に対しても抵抗性を示すようになる［Hunt, M. D., Neuenschwander, U. H., Delaney, T. P., Weymann, K. B., Friedrich, L. B., Lawton, K. A., Steiner, H. Y. and Ryals, J. A. 1996. Recent advances in systemic acquired resistance research-a review. Gene 179:89-95］。
【０００７】
さらに、全身誘導抵抗性（induced systemic resistance、ＩＳＲ）や、害虫に対する傷反応（wound response)など、植物抵抗の他の形態も報告されている［Pieterse, C. M., van Wees, S. C., van Pelt, J. A., Knoester, M., Laan, R., Gerrits, H., Weisbeek, P. J. and van Loon, L. C. 1998. A novel signaling pathway controlling induced systemic resistance in Arabidopsis. Plant Cell 10:1571-1580; Ryan, C. A. and Pearce, G. 1998. SYSTEMIN: a polypeptide signal for plant defensive genes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14:1-17］。
【０００８】
このような植物の病害に対する抵抗機構は、すべて植物生体防御システムを誘導する誘導因子によって引き起こされる［Kessmann, H., Staub, T., Hofmann, C., Maetzke, T., Herzog, J., Ward, E., Uknes, S. and Ryals, J. 1994. Induction of systemic acquired disease resistance in plants by chemicals. Annu. Rev. Phytopathol. 32:439-459］。典型的なＳＡＲの誘導因子には、植物によって生産されるフェノール系の情報伝達物質であるサリチル酸（ＳＡ）、病原菌から分離されたエリシチン及びハーピンなどがある［Ponchet, M., Panabieres, F., Milat, M. L., Mikes, V., Montillet, J. L., Suty, L., Triantaphylides, C., Tirilly, Y. and Blein, J. P. 1999. Are elicitins cryptograms in plant-oomycete communications. Cell Mol. Life Sci. 56:1020-1047］。
【０００９】
ハーピンは、植物病原菌のｈｒｐ遺伝子集団（gene island）から生産される蛋白質の一般名であり、ハーピンの１種であるＨｒｐＮは、韓国に存在しない火傷病菌であるエルウィニア属アミロボーラ（Erwinia amylovora）の約４０ｋｂのhrp遺伝子集団に位置するｈｒｐＮ遺伝子から生産されるタンパク質である。ＨｒｐＮを、リンゴなどの寄主植物に接種すると、ＨｒｐＮは、火傷病を引き起こす病原性因子として作用するが、非寄主植物に与えると植物内で異物として認識され、過敏感反応（ＨＲ）である抵抗性機構を作動する。
【００１０】
ＨｒｐＮタンパク質は、酸性で、かつ熱（１００℃）に対して安定であり、４４ｋＤaの分子量［アクリルアミドゲル上で電気泳動した後、０．０２５％のCoomassie Blue R-250で染色し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のMolecular Weight Standard（Catalog# 161-0305, Bio-Rad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Drive Hercules, CA 94547, USA）と比較するという方法で測定した分子量］を有し、グリシン含量は多いがシステインはないことが報告されている［Zhong-Min, W., Laby, R. J., Zumoff, C. H., Bauer, D. W., He, S. Y., Collmer, A. and Beer, S. V. 1992. Harpin, elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora. Science 257:85-88；米国特許第６，００１，９５９号;米国特許第５，８５０，０１５号;米国特許第６，１７２，１８４，Ｂ１号；米国特許第６，１７４，７１７Ｂ１号；米国特許第５，８４９，８６８号；米国特許第６，９７７，０６０号；米国特許第５，８５９，３２４号；米国特許第５，７７６，８８９号；韓国特許公開番号第１９９９−０２２５７７号；韓国特許公開番号第２０００−０７５７７１号；韓国特許公開番号第２０００−０７０４９５号；韓国特許公開番号第２０００−０５７３９５号］。
【００１１】
これらの植物生体防御システムを誘導する物質は、現在各種の製剤の形態で市販されている。すなわち、サリチル酸（ＳＡ）が、ＳＡＲの誘導物質であることが報告されてから、ＳＡと類似する構造を有するＩＮＡ（２，６−ジクロロイソニコチン酸、2,6-dichloroisonicotinic acid）とＢＴＨ（ベンゾチアジアゾール、benzothiadiazole）もＳＡＲを誘導するということが発見され、植物活性物質として登録された後、現在Actigard（商標）とＢＩＯＮ（登録商標）という名前で、観葉植物、トマト、タバコの病気を防ぐために、米国やヨーロッパなどで販売されている。また、日本では、ＰＢＺ（プロベナゾール、probenazole）が、オリゼメート（Oryzemate；登録商標）という名前でイネいもち病と白葉枯病の防除薬剤として販売されている［Yoshioka, K., Nakashita, H., Klessig, D. F. and yamaguchi, I. 2001. Probenazole induces systemic acquired resistance in Arabidopsis with a novel type of action. Plant J. 25:149-157］。
【００１２】
特に、バラ科の植物の火傷病を引き起こすグラム陰性細菌である火傷病菌（Erwinia amylovora）においてその存在が初めて明らかにされたハーピンは、化学物質ではなく、タンパク質であり、植物に直接噴霧したとき、様々な植物の病気、いくつかの害虫、ダニ及び線虫を防除するＳＡＲ誘導因子として作用し、光合成と栄養分吸収を促進して植物の栄養生長および生殖生長を増進させる植物生長促進（PGP; plant growth prompting）効果があると報告されている［Dong, H. S., Delaney, T. P., Bauer, D. W. and Beer, S. V. 1999. Harpin induces disease resistance in Arabidopsis through the systemic acquired resistance pathway mediated by salicylic acid and the NIM1 gene. Plant J. 20:207-215］。また、ハーピン（ＨｒｐＮ）タンパク質は毒性がほとんどなく、タンパク質であるため、使用後早く生物学的に分解されるので、環境を汚染するおそれがないことが特徴であり、高温処理（１００℃）しても破壊されないため、製剤化が容易であることが報告されている［Zhong-Min, W., Laby, R. J., Zumoff, C. H., Bauer, D. W., He, S. Y., Collmer, A. and Beer, S. V. 1992. Harpin, elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora. Science 257:85-88］。
【００１３】
したがって、2000年に、米国の新生ベンチャー会社であるエデン・バイオサイエンス（Eden Bioscience）社は、火傷病菌由来の植物過敏感反応誘導タンパク質であるＨｒｐＮタンパク質をメッセンジャー（Messenger；登録商標）という商標で商品化するのに成功し、ワタ、トマト、タバコ、トウガラシ、キュウリ、イチゴ及び小麦などの作物の病害防除を対象として米国で市販している。すなわち、ＨｒｐＮタンパク質は、抗真菌剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤、防虫剤及び植物生長促進剤などの生物農薬として認められている［米国特許第６，１７４，７１７  Ｂ１号；米国特許第５，８４９，８６８号；米国特許第６，９７７，０６０号；米国特許第５，８５９，３２４号；米国特許第５，７７６，８８９号；韓国特許公開番号第１９９９−０２２５７７号；韓国特許公開番号第２０００−０７５７７１号；韓国特許公開番号第２０００−０７０４９５号；韓国特許公開番号第２０００−０５７３９５号］。
【特許文献１】
米国特許第６，００１，９５９号
【特許文献２】
米国特許第５，８５０，０１５号
【特許文献３】
米国特許第６，１７２，１８４Ｂ１号
【特許文献４】
米国特許第６，１７４，７１７Ｂ１号
【特許文献５】
米国特許第５，８４９，８６８号
【特許文献６】
米国特許第６，９７７，０６０号
【特許文献７】
米国特許第５，８５９，３２４号
【特許文献８】
米国特許第５，７７６，８８９号
【特許文献９】
韓国特許公開番号第１９９９−０２２５７７号
【特許文献１０】
韓国特許公開番号第２０００−０７５７７１号
【特許文献１１】
韓国特許公開番号第２０００−０７０４９５号
【特許文献１２】
韓国特許公開番号第２０００−０５７３９５号
【非特許文献１】
Agrios, G. N. 1997. Plant Pathology.4th ed. Academic Press, New York
【非特許文献２】
Dong, X. 1998. SA. JA, ethylene, and disease resistance in plants. Curr. Opin. Plant. Biol.1:316-323
【非特許文献３】
Feys, B. J. & Parker, J. E. 2000. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance. Trends Genet. 16:339-455
【非特許文献４】
Richberg, M. H., Aviv, D. H. & Dangl, J. L. 1998. Dead cells do tell tales. Curr. Poin. PlantBiol. 1:480-485
【非特許文献５】
Hunt, M. D., Neuenschwander, U. H., Delaney, T. P., Weymann, K. B., Friedrich, L. B., Lawton, K. A., Steiner, H. Y. and Ryals, J. A. 1996. Recent advances in systemic acquired resistance research-a review. Gene 179:89-95
【非特許文献６】
［Pieterse, C. M., van Wees, S. C., van Pelt, J. A., Knoester, M., Laan, R., Gerrits, H., Weisbeek, P. J. and van Loon, L. C. 1998. A novel signaling pathway controlling induced systemic resistance in Arabidopsis. Plant Cell 10:1571-1580
【非特許文献７】
Ryan, C. A. and Pearce, G. 1998. SYSTEMIN: a polypeptide signal for plant defensive genes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14:1-17
【非特許文献８】
Kessmann, H., Staub, T., Hofmann, C., Maetzke, T., Herzog, J., Ward, E., Uknes, S. and Ryals, J. 1994. Induction of systemic acquired disease resistance in plants by chemicals. Annu. Rev. Phytopathol. 32:439-459
【非特許文献９】
Ponchet, M., Panabieres, F., Milat, M. L., Mikes, V., Montillet, J. L., Suty, L., Triantaphylides, C., Tirilly, Y. and Blein, J. P. 1999. Are elicitins cryptograms in plant-oomycete communications. Cell Mol. Life Sci. 56:1020-1047
【非特許文献１０】
Zhong-Min, W., Laby, R. J., Zumoff, C. H., Bauer, D. W., He, S. Y., Collmer, A. and Beer, S. V. 1992. Harpin, elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora. Science 257:85-88
【非特許文献１１】
Yoshioka, K., Nakashita, H., Klessig, D. F. and yamaguchi, I. 2001. Probenazole induces systemic acquired resistance in Arabidopsis with a novel type of action. Plant J. 25:149-157
【非特許文献１２】
Dong, H. S., Delaney, T. P., Bauer, D. W. and Beer, S. V. 1999. Harpin induces disease resistance in Arabidopsis through the systemic acquired resistance pathway mediated by salicylic acid and the NIM1 gene. Plant J. 20:207-215
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、本発明者らは、韓国の春川地方のリンゴ、ナシ栽培地において枝が枯れる症状を示す植物体の罹病組織から病原菌を分離、同定して研究した結果、ドイツの研究者によって最近報告された枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）と形態学的に異なる新規な枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３（ＫＣＣＭ  １０２８３）を発見した。すなわち、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３（ＫＣＣＭ １０２８３）は鞭毛を有していないが、ドイツの研究チームによって報告された枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）は周毛性の鞭毛を有しており、また枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３（ＫＣＣＭ １０２８３）は公知の火傷病菌（Erwinia amylovora）とも異なっていた。この新種の菌株から非宿主植物において植物過敏感反応を誘導する遺伝子およびタンパク質を単離して、火傷病菌（Erwinia amylovora）由来のＨｒｐＮより、病原菌及び害虫に対する植物病害抵抗性および植物生長促進効果に優れていることを明らかにすることによって本発明を完成するに至った。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、新規枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３（ＫＣＣＭ１０２８３）およびそれを用いた有効な生化学農薬、植物生長促進剤、種子処理剤、害虫忌避剤及び肥料などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一実施態様では、植物細胞を該遺伝子と接触させたとき、又は該遺伝子で処理したときに、非宿主に過敏感反応を、又は植物において病原菌に対する抵抗を誘導する枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）に由来する非感染形態のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子（ＫＣＣＭ１０２８２）を提供する。
【００１７】
また、本発明の他の実施態様では、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）［ＫＣＣＭ１０２８３］由来の非感染形態のポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換体を提供する。
【００１８】
さらに、本発明の他の実施態様では、前記ポリペプチドまたはタンパク質、および担体を含有する生化学農薬組成物を提供する。
【００１９】
さらに、本発明の他の実施態様では、農薬、植物生長促進剤、種子処理剤、害虫忌避剤、肥料などに使用することができる前記組成物を提供する。
【００２０】
さらに、本発明の他の実施態様では、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3、ＫＣＣＭ  １０２８３）の菌株および枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3、ＫＣＣＭ  １０２８３）由来の菌株の植物過敏感反応（HR）誘導遺伝子を含む形質転換体（ＫＣＣＭ  １０２８２）から、過敏感反応または耐性を誘導するポリペプチドまたはタンパク質を分離し、精製して、過敏感反応または耐性を誘導する該ポリペプチドまたは該タンパク質を大量生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明における新規な枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3、ＫＣＣＭ１０２８３）を分離同定し、植物過敏感反応誘導遺伝子（ＫＣＣＭ１０２８２）から翻訳された新しいタンパク質またはポリペプチドを精製して、このタンパク質を分析した結果、該タンパク質は、火傷病菌（Erwinia amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ由来のタンパク質（ＨｒｐＮ）よりも、植物病害抵抗性の誘導、植物生長促進、害虫忌避効果、光合成及び葉緑素の増加、並びに種子処理効果に優れ、低濃度で早く植物の過敏感反応を誘導するため、新規かつ優れた植物過敏感反応誘導性生化学農薬の開発に非常に適している。
【００２２】
したがって、本発明は、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）またはそれに由来する植物過敏感反応誘導タンパク質（以下、「パイオニア（Pioneer）」と称する）を含有する新規かつ改良された生化学農薬および肥料などを開発するのに非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。本発明に係る新規枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae  ＷＴ＃３）［ＫＣＣＭ  １０２８３］を、韓国の江原道春川地方のリンゴ、ナシ栽培団地で枝が枯れる症状を示す罹病した幹から分離・同定した結果、火傷病菌であるErwinia amylovora及び枝黒枯病菌であるErwinia pyrifoliae（リンゴ・ナシ枝黒枯病；1999年にドイツの研究チームによって報告されたErwinia pyrifoliae）と同じErwinia属に属する新種と同定した。火傷病菌（Erwinia amylovora）とドイツの研究チームによって報告された枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）は周毛性の鞭毛を有している反面、新規枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）［ＫＣＣＭ  １０２８３］は鞭毛を有しておらず、韓国にのみ存在する枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）と形態学的に大きな相違点がある。前記新規菌株を、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）［ＫＣＣＭ  １０２８３］と命名し、韓国微生物保存センターに２００１年６月１１日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ  １０２８３が付された。
【００２４】
特に、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）から、非宿主植物において過敏感反応を誘導するタンパク質（エリシター; インデューサー）をコードする遺伝子を分離し、米国コーネル大学によって発見され、エデン・バイオサイエンス社（Eden Bioscience co.）によって市販されているＨｒｐＮタンパク質をコードするｈｒｐＮ遺伝子と比較し、分析した結果、ＨｒｐＮをコードするｈｒｐＮ遺伝子と類似度が低い新たな種類の遺伝子であることが分かった。特に、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）由来の非宿主植物において過敏感反応を誘導するタンパク質をコードする遺伝子には、いくつかの核酸配列断片が挿入されており、該核酸配列断片は、火傷病菌（E. amylovora）由来のｈｒｐＮ遺伝子に存在しないものであった。より詳細には、上記断片は、２２２〜２３０ｂｐ、２４９〜２６３ｂｐ、３４８〜３７１ｂｐおよび３９７〜４１１ｂｐの位置に挿入されていた。したがって、この遺伝子から産生されるポリペプチドまたはタンパク質は、ＨｒｐＮペプチドのアミノ酸配列及び分子量と異なるアミノ酸配列及び分子量を有している。
【００２５】
なお、前記菌株（Erwinia pyrifoliae WT#3）由来の遺伝子を含む高発現ベクターであるｐＫＥＰ３を構築し、これを大腸菌に形質転換した。この形質転換体を、韓国微生物保存センターに２００１年６月１１日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１０２８２が付された。
【００２６】
前記発現ベクターを含有する形質転換体を大量培養することによって、従来のE. amylovosa由来のＨｒｐＮよりも、植物病害抵抗性、植物生長促進及び害虫忌避の向上などの効果に優れた植物過敏感反応及び病害抵抗性を誘導するポリペプチドまたはタンパク質を大量に生産できる。
【００２７】
植物過敏感反応又は植物病害抵抗性を誘導するポリペプチドまたはタンパク質の生物活性効果を検定した結果、キュウリうどん粉病、トウガラシ炭疽病、トウガラシ疫病、マクワウリ（oriental melon）べと病、ピーマン疫病、イネいもち病におけるその有効性が、火傷病菌由来の植物過敏感反応タンパク質（HrpN）よりも向上したことが明らかとなった。さらに、キュウリ、トウガラシ、ピーマン及びイチゴの収穫量増大実験においても、本タンパク質は、HrpNタンパク質よりもそれらの収穫量を増大させた。また、新規枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）由来の非宿主植物において植物過敏感反応を誘導するポリペプチドまたはタンパク質は、キュウリ、トウガラシの光合成および葉緑素の含量を増加させることにも優れていることが証明された。したがって、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）由来の前記ポリペプチドまたは前記タンパク質は、農薬、植物生長促進剤および肥料として使用可能である。
【００２８】
さらに、本発明の枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）由来の植物過敏感反応誘導ポリペプチドまたはタンパク質は、例えばアブラムシなどに対する害虫忌避効果にも優れており、通常の茎葉処理による方法で害虫忌避剤として使用することができ、さらに、本発明のタンパク質又はポリペプチドで浸漬処理したイネの種子は育苗期に急成長したことから、本発明のタンパク質又はポリペプチドは、種子処理剤としても通常の種子浸漬方法で植物に使用することができる。
【００２９】
以下、本発明を下記実施例および試験例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【実施例１】
【００３０】
（新規な菌株の分離および同定）
１）Schaadの指針書およびBergey’s Manualに準じた生理学・生化学実験
韓国の江原道春川近郊の栽培地に由来するナシにおいて枝が枯れる症状を示す罹病組織から病原菌を分離し、同定するために、Schaadの指針書［Schaad, N. W. 1988. Initial identification of common genera. In: Laboratory Guide for Identification of a plant Pathogenic Bacteria, ed. by N. W. Schaad. American Phytopathological Society., Minnesot. pp. 44-59］およびBergey's Manual[Lelliott, R. A. and Dickey, R. S. 1984. Genus Erwinia. In: Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology. vol. 1, pp. 469-476, Williams and Willkins Co., Baltimore/London]を参考にして、本病原菌を含むErwinia属の種々の生理・生化学実験を行った結果を下記表１に示す。
【００３１】
【表１】
2005500062.tif 000002
【００３２】
前記分離菌株は、ゼラチン液化、３％寒天における運動性およびペクテート（pectate）分解などの生理学実験においては全般的に枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）の代表菌種であるＥＰ１６Ｔとよく一致した。これに対し、炭素源の利用度を調べるための生化学的要求度実験では、特にトレハロースとＬ−アラビノースにおいて異なる結果が得られた。すなわち、このことから、本発明における分離菌株の生理学的・生化学的特性は、枝黒枯病原菌（Erwinia pyrifoliae）の代表菌種であるＥＰ１６Ｔ及び火傷病菌（Erwinia amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔのものと異なることが分かる。
【００３３】
２）分離菌ＷＴ＃３株の形態学的特性
枝黒枯病原菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae）の形態学的特性を、透過電子顕微鏡（transmitted electro microscope、ＴＥＭ）を用いて観察した結果、該枝黒枯病原菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae）の形態学的特性は、ナシの木において懐死性の疾患を引き起こすと最近報告された枝黒枯病菌ＥＰ１６Ｔ（Erwinia pyrifoliae EP16T）株とリンゴおよびナシに火傷病を引き起こす火傷病菌ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ（Erwinia amylovora ATCC15580T）と異なっていることを確認した［図１］。
【００３４】
すなわち、枝黒枯病原菌（Erwinia pyrifoliae）ＥＰ１６Ｔと火傷病菌（Erwinia amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔが属するErwinia属は、一般的に鞭毛の数が多い周毛性の鞭毛を形成している桿菌であるのに対し、新規枝黒枯病原菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３は、鞭毛を有しておらず、形態も若干の楕円形を示す桿菌であった。
【００３５】
３）種々の温度における分離菌ＷＴ＃３株の成長
枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３株の生理学的特性及び生化学的特性を調べるために、種々の温度における成長曲線を描き、Bioscreen Cを用いて濁度を測定した。  １２℃〜３９℃の範囲内の温度について３℃間隔で測定し、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３と火傷病菌（Erwinia amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔの種々の温度における倍加時間と比成長速度を計算した［図２］。
【００３６】
その結果、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３は、２７〜３０℃において、火傷病菌（Erwinia amylovora）よりも比成長速度が高くて倍加時間が短く、最適温度は２７℃であった。２０℃以下の低温でも、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３は、火傷病菌（Erwinia amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔよりも遥かに早く成長した。このことから、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３は、冬季に他の地域に比べて比較的寒い地方であり、かつ火傷病菌（Erwinia amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔの環境条件と異なる環境条件を有する春川近郊によく適応しているので、耐寒性を有していることが示唆される。
【００３７】
４）種々のｐＨ値における分離菌ＷＴ＃３株の成長
枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３株の生理学的特性及び生化学的特性のうち、成長に対するｐＨの効果を調べるために、種々のｐＨ値における成長について、Bioscreen Cを用いて濁度を測定した。ｐＨ５．５〜ｐＨ９．５の範囲内において０．５間隔で、温度を２８℃で一定にして測定し、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３と火傷病菌（Erwinia amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔの種々のｐＨにおける倍加時間と比成長速度を計算した［図３］。
【００３８】
その結果、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の最適ｐＨ範囲はｐＨ７．０〜ｐＨ８．０であり、アルカリ条件であるｐＨ７．５以上において急速な成長が見られ、火傷病菌（Erwinia amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔとは異なっていた。
【００３９】
５）バイオログシステム（Biolog System）を用いた分離菌ＷＴ＃３株の特性
９６個の種々の炭素源および窒素源の利用をモニターするように設計されたバイオログシステム［BIOLOG, Hayward, CA 94545, USA］を用いて、分離菌ＷＴ＃３株の生化学的特性を詳細に調べた。
【００４０】
まず、ＴＳＡ（triptic soy agar）培地にて２８℃で２４時間培養した後、菌体を、０．４％塩化ナトリウム、０．０３％プルロニック（Pluronic）Ｆ−６８及び０．０１％ジェランガム（Gellan Gum）を含む溶液に濁度が６３％になるように懸濁した後、９６個の種々の炭素源および窒素源が入っているウェルに載せた。
【００４１】
その後、分離菌ＷＴ＃３株を、さらに３５〜３７℃の恒温培養器で２４時間培養し、炭素源および窒素源を利用して紫色に変化したものを、リーダーを用いて記録し、その値を数理分類学的に区分した。
【００４２】
図４から分かるように、火傷病菌（Erwinia amylovora）であるＡＴＣＣ１５５８０、ＬＭＧ２０６８、ＬＭＧ１８７７、ＬＭＧ１９４６およびｅａ２４６（米国）株は、同一のグループであることが示された。これに対して、前記分離菌ＷＴ＃３株は、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae、EP4、EP8、EP16T）と同一のグループであった。すなわち、分離菌ＷＴ＃３株は、火傷病菌であるErwinia amylovoraと異なる種であることが分かった。
【００４３】
６）分離菌ＷＴ＃３株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の分析
前記分離菌株の系統分類学的位置を調べるために、生命現象において必須であり、その核酸配列が比較的よく保存され、かつ系統学的に分析するのが容易な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列を分析した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、配列番号１のｆＤ１プライマーと配列番号２のｒＰ２プライマーを用いてＰＣＲ法で増幅して得た。その後、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングしてその核酸配列を分析した。
【００４４】
前記分析した１６ｓ  ｒＲＮＡの核酸配列に基づいて、メガプログラム（mega program）［Kumar, S., Tamura, K. and Nei, M. 1993. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis, version 1.0. The Pennsylvania State University, University Park.］を用いて作成した系統樹を図５に示す。
【００４５】
類似度からみると、分離菌ＷＴ＃３株は、枝黒枯病菌（E. pyrifoliae Ep16T）と火傷病菌（Erwinia amylovora ATCC 15580T）に類似しており、枝黒枯病菌（E. pyrifoliae Ep16T）と９８．９％の配列同一性を、火傷病菌（Erwinia amylovora ATCC 15580T）とは９７．５％の配列同一性を有しており、火傷病菌よりも枝黒枯病菌（E. pyrifoliae Ep16）に類似していた。各菌株間の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の類似度を下記表２に示す。
【００４６】
【表２】
2005500062.tif 000003
【００４７】
また、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を分析した結果、分離菌ＷＴ＃３株は、枝黒枯病菌であるE. pyrifoliaeと同じグループに属するが、火傷病菌であるE. amylovoraおよび数年前に韓国のリンゴ・ナシに感染することが報告されたリンゴ褐斑病菌（Enterobacter pyrinus）のグループと異なるグループに属することが明らかとなった。
【００４８】
７）分離菌ＷＴ＃３株の１６Ｓ−２３Ｓの遺伝子間転写スペーサー（Intergenic Transcribed Spacer、ＩＴＳ）領域の分析
韓国の枝黒枯病菌および韓国外の火傷病菌のＩＴＳを分析するために、１６Ｓ−２３ＳのＩＴＳ領域を、配列番号３のＲ１６−１Ｆプライマーと配列番号４のＲ２３−１Ｒプライマーを用いて、ＰＣＲ法で増幅して得た。その後、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした後、１６Ｓ−２３ＳのＩＴＳ領域の核酸配列を分析した。その結果、１６Ｓ−２３ＳのＩＴＳ領域は、二つのグループに分けられた。すなわち、火傷病菌（E. amylovora）は、大きさが約１２１５、９７０及び７２０ｂｐの３種類のバンドパターンを有し、一方で韓国内の病原菌である枝黒枯病菌（E. pyrifoliae）は、９７０及び７２０ｂｐの２種類のバンドパターンのみが現れた。
【００４９】
これまでのところ、この二つのグループのすべての菌株では、９７０ｂｐのバンドパターンは大きさが約７０ｂｐのｔＲＮＡＡｌａ領域を有しており、７２０ｂｐのバンドパターンはｔＲＮＡＧｌｕ領域を有していることが示された。
【００５０】
図６は、火傷病菌E. amylovora  ＡＴＣＣ１５５８０Ｔと分離菌Erwinia pyrifoliae  ＷＴ＃３株の１６Ｓ−２３Ｓ  ＩＴＳ領域の核酸配列を分析して作成した系統樹を示す。
【００５１】
ＩＴＳ領域のうち、７０ｂｐのｔＲＮＡＡｌａ領域をコードする９７０ｂｐのバンドの核酸配列を分析して系統樹を作成した結果、分離菌ＷＴ＃３株は、火傷病菌（Erwinia amylovora）のグループとは異なり、火傷病菌と４７．４％の類似度を示した。しかしながら、ドイツの研究者らによって命名された枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）のｔＲＮＡＡｌａ領域はジェンバンク（GenBank）に登録されていないので、比較できなかった。
【００５２】
ｔＲＮＡＧｌｕ領域をコードする７２０ｂｐのバンドの核酸配列を分析した結果、分離菌Erwinia pyrifoliae  ＷＴ＃３株は、ドイツの研究者らが発表した枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）のものと８５．２〜９２．７％の配列同一性を示し、同じグループであることが示唆された［図７］。
【００５３】
８）プラスミドプロファイルによる枝黒枯病原菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の分析
韓国の枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）および韓国外の火傷病菌（Erwinia amylovora）のプラスミドを分離し、その様相を分析した結果、韓国の枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）および韓国外の火傷病菌（Erwinia amylovora）は以下の２種類のグループに分けられた［図８］。
グループI - 火傷病菌E. amylovora (ATCC15580, LMG1877, 10296)(1個のプラスミド> 29 kb)
グループII - 枝黒枯病菌E. pyrifoliae (Ep1, Ep16, WT#3) ( 1個のプラスミド> 29 kb, 5 kbの大きさのプラスミドが1個, 大きさが2-4 kbである3個のプラスミド)
【００５４】
すなわち、火傷病菌（Erwinia amylovor）のグループには２９ｋｂよりも大きいプラスミドが１個存在するのみであるが、分離菌ＷＴ＃３株を含むナシの木の枝黒枯病菌（E. pyrifoliae）のグループには５個のプラスミドが存在することが示された。
【００５５】
９）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによるＤＮＡの関連性の分析
韓国の枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）と韓国外の火傷病菌（Erwinia amylovora）との間の全ゲノムの関連性を調べた。その方法としては、純粋に分離した全ＤＮＡを、１００μｌのＴＥ緩衝液に溶かして１ｎｇ／μｌの濃度に定量し、１０Ｎ  ＮａＯＨを添加した後、８０℃で１０分間煮沸してＤＮＡを変性させた。変性したＤＮＡを、HyBond-N+ナイロン膜にslot-blot装置を用いてアプライした。その後、ＤＩＧ−ハイプライム（Dig-High Prime）システム［Roche Molecular Biochemicals, Sandhofer Strasse 116, Germany］を用いて、プローブとして用いる天然ＤＮＡを標識して、ナイロン膜に固定したＤＮＡとともに４９℃で３時間プレハイブリダイゼーションを行い、その後、同じ温度で１６時間ハイブリダイズした。反応が終了した膜は、ＤＩＧ蛍光検出キット（DIG Luminescent Detection Kit）［Roche Molecular Biochemicals, Sandhofer Strasse 116, Germany］を用いて発色させ、その反応を検定した。
【００５６】
その結果、グループＩには韓国外の火傷病菌（E. amylovora ATCC15580T, LMG1877, LMG1946, LMG2068）が属し、グループＩＩには韓国の枝黒枯病菌（E. pyrifoliae Ep16T, WT#3）が属していた。すなわち、韓国外の火傷病菌（Erwinia amylovora）がグループＩに属し、韓国の枝黒枯病原菌（Erwinia pyrifoliae）はグループＩＩに属していた。このことは、ＷＴ＃３株を含む韓国の枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）と韓国外の火傷病菌（Erwinia amylovora）は別個のものであり、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）は韓国の土着菌であることを明らかに示している。関連菌株の類似度を表３に示す。
【００５７】
【表３】
2005500062.tif 000004
【００５８】
以上の分離菌ＷＴ＃３株の生化学的、生理的及び遺伝的特性を総合すると、分離菌ＷＴ＃３株は、Ｓｃｈａａの指針書およびBergey’s manualに準じた生理的特性、生化学的特性、温度およびｐＨ値に関連した特性、バイオログシステム（Biolog system）、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ−２３Ｓ  ＩＴＳ、プラスミドプロファイル、並びにＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによる関連性の実験の結果、１９９９年に韓国にのみ存在すると報告された枝黒枯病菌（E. pyrifoliae）と同じグループであることが示されたが、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３とＥｐ１６Ｔとの間にはいくつかの異なる特性があった。特に、分離菌株ＷＴ＃３は形態学的に鞭毛を有しておらず、この鞭毛を有していないことはErwinia属で初めて報告されたことなので、ドイツの研究者らによって報告された枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）及び火傷病菌（Erwinia amylovora）と異なることは明らかである。そこで、前記分離菌ＷＴ＃３株を枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）と命名した。これを韓国微生物保存センターに２００１年６月１１日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ  １０２８３が付された。
【００５９】
なお、前記枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3）由来の遺伝子を含む高発現ベクターであるｐＫＥＰ３を構築し、これを大腸菌に形質転換し、この形質転換体を、韓国微生物保存センターに２００１年６月１１日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１０２８２が付された。
【実施例２】
【００６０】
（枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応を誘発する特異的なタンパク質の特性と該タンパク質をコードする遺伝子）
１）枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導遺伝子の分析
植物過敏感反応を誘導する特異的なタンパク質をコードする遺伝子を分析するために、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の全ＤＮＡを、Ｓａｕ３ＡＩ酵素で部分的に消化されるように３７℃でインキュベートした。その後、前記ＤＮＡ  １μｌを、１時間ごとに電気泳動してＤＮＡの分解の程度を調べた結果、最も適切な消化時間は約６時間であることが明らかとなった。このように処理した全ＤＮＡを挿入ＤＮＡとして準備し、１４℃で１２時間培養して、ｐＬＡＦＲ３クローニングベクターのＢａｍＨＩポリリンカー部位にＤＮＡリガーゼを用いて連結した。挿入ＤＮＡとベクターで連結した完全なプラスミドＤＮＡを、塩化カルシウムによる形質転換方法によって大腸菌（E. coli ＨＢ１０１）に形質転換した。その後、大腸菌（E. coli）株を、テトラサイクリン（３０ｍｇ／ｍｌ）を含むＬｕｒｉａ寒天培地上で、３７℃で２４時間培養して、形成した２，０００個のコロニーを選別して、ゲノムＤＮＡライブラリーを作成した。
【００６１】
２０００個の選別された枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３のゲノムＤＮＡライブラリーのクローンから、植物過敏感反応を誘導する特異的なタンパク質をコードするクローンを選別するために、各クローンから全タンパク質を以下の手順で抽出した。ＬＢ培地で１２時間培養した培養液を遠心分離して、得られたペレットに５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液と０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ溶液を入れて懸濁した後、超音波処理して溶解し、１００℃で１０分間煮沸した。その後、遠心分離して得られた上澄液のみを回収し、各々の葉が１５ｃｍ以上の直径を有する４葉以上の本葉に成長したタバコ（Nicotiana tabacum L. Samsun）の葉の裏面の主脈に注射器を用いて注入した。注射してから２４時間後にタバコの葉に現れた懐死を過敏感反応（ＨＲ）とみなし、次にＨＲを示すゲノムＤＮＡライブラリークローンを選別した［図９］。
【００６２】
選別したクローンｐＣＥＰ３３から、植物過敏感反応を誘導する遺伝子を含む８．５ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターにクローニングした後、制限酵素を用いて物理地図を作成した［図１０］。
【００６３】
図１１は、選別した遺伝子の核酸配列を分析して、本発明に係る枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３（ＫＣＣＭ１０２８３）由来の植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子を火傷病菌ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ由来の過敏感反応誘導遺伝子（ｈｒｐＮ）と比較したものである。
【００６４】
本発明に係る枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３から、植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする１２８７ｂｐの遺伝子が得られた。そこで、前記１２８７ｂｐの遺伝子を「ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導遺伝子」と命名し、火傷病菌（E. amylovora ATCC15580T）のｈｒｐＮ遺伝子（１２１２ｂｐ）との類似度を調査した。
【００６５】
その結果、５個の新規な核酸配列断片が、前記ＷＴ＃３の植物過敏感反応誘導遺伝子の２２２〜２３０ｂｐ（ＴＴＴＡＡＣＧＧＧ）、２４９〜２６３ｂｐ（ＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＴＧＣＴ）、３２７〜３３３ｂｐ（ＴＣＴＧＧＧＴ）、３４８〜３７１ｂｐ（ＣＧＧＣＡＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＴＴＧＧＴＧＧ）及び３９７〜４１１ｂｐ（ＡＣＣＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＣＴ）の位置に挿入されており、その結果、該遺伝子の分子量が増加していることが示された。一方、前記ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導遺伝子は、火傷病菌（Erwinia amylovora）のｈｒｐＮ遺伝子との相同性が８３．２％であり、該ｈｒｐＮ遺伝子との配列類似度は低くかった。したがって、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子は、従来の火傷病菌（Erwinia amylovora）のｈｒｐＮ遺伝子と異なる核酸配列を有するだけでなく、数個の新しい核酸配列断片が挿入されていることによって、火傷病菌（Erwinia amylovora）のｈｒｐＮ遺伝子からは発見できない新しい遺伝子構造を有していることが示された。枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列を配列番号５に示す。
【００６６】
２）枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導タンパク質の発現ベクターの構築
前記選別された枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子から植物過敏感反応タンパク質を大量に抽出し、精製するために、前記選別された遺伝子を含む発現ベクターｐＫＥＰ３を次のように構築した。
【００６７】
発現ベクターｐＫＥＰ３を構築するために、大腸菌（E.coli）組換えタンパク質発現システム（Novagen, Inc. Madison, WI53711 USA）を用いた。本システムは、ｐＢＲ３２２プラスミドに由来し、ｐＢＲ３２２プラスミドにおける外来遺伝子挿入部位の前にあるｌａｃリプレッサーにＴ７プロモータとオペレータを結合させる。この構造によって、宿主の大腸菌のゲノムで作られるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる外来挿入遺伝子の大量発現が容易となる。特に、基質として用いられるＩＰＴＧを培養から３時間後に添加すると、ｌａｃＩ遺伝子から生産されるｌａｃリプレッサーとこのＩＰＴＧが結合して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現を抑制できなくなるため、多量のタンパク質が合成されるようになる。また、連結していないもの又は大腸菌内に形質転換されていないものと区別するために、ｐＫＥＰ３にはアンピシリン耐性遺伝子が含まれている。これにより、完全な形質転換体を選別するとき、選別マーカーとして培地にアンピシリンを添加して使用できる。
【００６８】
枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子と上記大腸菌組換えタンパク質システムのプラスミドを、制限酵素であるＮｄｅＩとＢａｍＨＩの存在下において３７℃で１２時間消化して、同一の形態のＤＮＡ５’末端と３’末端を生成した。その後、１４℃で１６時間、ＤＮＡリガーゼを用いてそれらを制限部位に連結させ、塩化カルシウムによる形質転換によって大腸菌内に形質転換した。
【００６９】
前記ｐＫＥＰ３は、（１）アンピシリン耐性遺伝子を選別マーカーとして用いることができる、（２）Ｈｉｓタグを有しており、精製が容易である、（３）強力なＴ７  ｌａｃプロモーターを有しており、連結された挿入ＤＮＡから多量のタンパク質を生産できるといった多くの利点を有する。
【００７０】
前記発現ベクターｐＫＥＰ３を導入して形質転換した大腸菌の形質転換体を、韓国微生物保存センターに２００１年６月１１日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１０２８２が付された。
【００７１】
一方、火傷病菌E. amylovora  ＡＴＣＣ１５５８０ＴのｈｒｐＮ遺伝子を、同一の大腸菌組換えタンパク質発現システム（Novagen, Inc. Madison, WI53711 USA）を用いてクローニングし、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の新規な植物過敏感反応誘導遺伝子を含むｐＫＥＰ３の生物活性試験の対照群として本研究に用いた。
【００７２】
３）植物過敏感反応誘導タンパク質の発現
大腸菌の形質転換体（ｐＫＥＰ３；ＫＣＣＭ  １０２８２）からタンパク質を大量生産するために、選別マーカーとしてアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、及び大腸菌自体のゲノムから作られる他のタンパク質の合成を阻害するためにクロラムフェニコール（３３μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ液体培地に細菌体を接種して、３７℃で１２時間二次培養した後、本発明の細菌形質転換体（ＫＣＣ１０２８２）を、同じ培地を用いて３０℃で７時間本培養した。培養から約３時間後に形質転換体（ＫＣＣ１０２８２）のＯＤ値が０．６になったとき、０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３０℃に温度を下げて４時間培養した。総計して７時間の本培養を行った後、混合物の遠心分離（６，０００ｒｐｍ，１５分）を行って、上澄液を捨て、ペレットのみを、５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液と０．１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む溶液によく懸濁した。形質転換体（ＫＣＣＭ  １０２８２）の懸濁液を、該懸濁液が透明になるまで超音波処理して溶解させ、１００℃で１０分間煮沸した。その後、混合物を、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を捨てた。タンパク質阻害カクテル（protein inhibitory cocktail）を１／１，０００の比率で添加した後、０．４５μｍのフィルタで濾過し、抽出されたタンパク質の量を定量した。
【００７３】
枝黒枯病菌（E. pyrifoliae WT#3；ＫＣＣＭ  １０２８３）由来の植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子を含むｐＫＥＰ３プラスミドを含有する形質転換体（ＫＣＣＭ  １０２８２）から上記の工程を通じて生産された植物過敏感反応誘導タンパク質をパイオニア（Pioneer）と命名した。
【００７４】
一方、本発明において、火傷病菌（E. amylovora）ATCC15580TのｈｒｐＮ遺伝子を、ｐＫＥＰ３で用いたのと同じ大腸菌組換えタンパク質発現システム（Novagen, Inc. Madison, WI53711 USA）でクローニングし、パイオニアの生物活性試験の対照タンパク質として、発現したＨｒｐＮタンパク質を同一の条件で実験に用いた。
【００７５】
その結果、図１２から分かるように、発現ベクターであるｐＫＥＰ３にクローニングした火傷病菌（E. amylovora ATCC15580T）と本発明に係る枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子の両方とも、組換えタンパク質発現システムによる発現に成功し、多量の植物過敏感反応誘導タンパク質が合成されることを確認できた。
【００７６】
４）枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の植物過敏感反応誘導タンパク質（パイオニア、Pioneer）の類似度の分析
精製した植物過敏感反応誘導タンパク質（パイオニア、Pioneer）のアミノ酸配列を分析して、火傷病菌（E. amylovora ATCC15580T）の植物過敏感反応誘導タンパク質と比較して、その類似度を調査した［図１３］。
【００７７】
その結果、Ｎ末端から７６〜７９（Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）、８８〜９２（Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、１０２〜１１３（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）、および１３１〜１３７（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）の位置にパイオニアの新規タンパク質ドメインが作られたことが明らかになった。また、ＨｒｐＮタンパク質のアミノ酸配列との相同性は８５．９％であり、アミノ酸配列の同一性は低く、分子量においても、パイオニアの分子量は４１．１ｋＤである反面、ＨｒｐＮタンパク質の分子量は３９．７ｋＤであり、差があった［これはアクリルアミドゲル上で分子量標準（molecular weight standard）と比較したものではなく、遺伝子の塩基配列からWinstarプログラムを用いて推論したアミノ酸の分子量をそれぞれ示したものである］。
【００７８】
したがって、本タンパク質（パイオニア、Pioneer）は、新たな核酸配列断片の挿入によって新たな形態のタンパク質ドメインが形成されており、このような変化によって、パイオニアはＨｒｐＮタンパク質よりも優れた生物活性を示すことが考えられる。
【００７９】
５）植物過敏感反応誘導タンパク質の過敏感反応（ＨＲ）
現在まで、植物過敏感反応誘導タンパク質は、寄主植物においては病原性要因となり、非寄主植物においてはＨＲを誘導する物質であることが知られている。すなわち、過敏感反応が誘導されるということは、寄主植物において病原性を有していることを示すと間接的に解釈できる。そこで、枝黒枯病菌（E. pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導タンパク質（パイオニア、Pioneer）、火傷病菌（E. amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ由来の植物過敏感反応誘導タンパク質（ＨｒｐＮ）、および対照群としてタンパク質溶解緩衝液であるＭＥＳ緩衝液を、非寄主植物であるタバコの葉脈に注射器を用いて接種した［図１４］。
【００８０】
図１４に示すように、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の植物過敏感反応誘導タンパク質であるパイオニア（Pioneer）では、タバコの葉の表を観察した結果、１０μｇ／ｍｌの用量でＨＲが明確に観察された反面、火傷病菌（E. amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ由来の植物過敏感反応誘導タンパク質であるＨｒｐＮでは、２０μｇ／ｍｌの用量でＨＲ反応が明確に観察された。同じ葉の裏では、パイオニアの場合、５μｇ／ｍｌの用量でＨＲ反応が明確に観察され、ＨｒｐＮタンパク質では、１０μｇ／ｍｌの用量でＨＲが明確に観察された。すなわち、パイオニアは、ＨｒｐＮタンパク質よりも低濃度かつ短時間でＨＲ反応を誘導することが示された。
【００８１】
下記の表４から分かるように、パイオニア（Pioneer）を５μｇ／ｍｌの用量で接種した場合は接種してから２４時間後に、１０μｇ／ｍｌの用量で摂取した場合は接種してから１４時間後にＨＲが明確に観察されたが、ＨｒｐＮは、５μｇ／ｍｌの用量では接種してから４８時間後に、１０μｇ／ｍｌの用量では接種してから１８時間後にＨＲを明確に誘導した。すなわち、このことは、５μｇ／ｍｌの濃度では、パイオニアはＨｒｐＮタンパク質よりも２４時間も早くＨＲを示し、一方１０μｇ／ｍｌの濃度では４時間早くＨＲを示したことを明示している。
【００８２】
本実験を３回繰り返して行った結果から、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質よりも早く、低い濃度で植物の免疫システムを誘導することが示唆された。
【００８３】
【表４】
2005500062.tif 000005
【００８４】
６）枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導タンパク質（パイオニア、Pioneer）のナシに対する病原性検定
精製したパイオニア（Pioneer）を、５００μｇ／ｍｌの濃度で未熟なナシの果実表面に直径０．５ｍｍ、深さ１０ｍｍの孔をあけて接種した。
【００８５】
図１５から分かるように、緩衝液のみで処理した対照群の表面と比べて、処理から４日経過後に、未熟な果実の表面が黒く変化する病徴を観察することができた。したがって、さらなる調査が必要であるが、パイオニア（Pioneer）は、寄主植物に対して強力な病原性を有している可能性があることが立証された。
【００８６】
以上のパイオニアの特性とそれをコードする遺伝子の特性をまとめると、以下の通りである。
（１）枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３の植物過敏感反応誘導タンパク質であるパイオニア（Pioneer）をコードする遺伝子では、パイオニア（Pioneer）遺伝子のいくつかの部位にいくつかの新規な核酸配列断片が挿入されているのに対して、ｈｒｐＮ遺伝子からはこれらを発見できず、ｈｒｐＮ遺伝子の大きさは１，２１２ｂｐである反面、パイオニア（Pioneer）の遺伝子の大きさは１，２８７ｂｐであり大きかった。
（２）タンパク質の構造において、種々の部分において新たな形態のペプチド・ドメインが形成されることによりパイオニア（Pioneer）の分子量が増加し、ＨｒｐＮタンパク質が３９．７ｋＤである反面、４１．１ｋＤであった。［これはアクリルアミドゲル上で分子量標準（molecular weight standard）と比較したものではなく、遺伝子の核酸配列からWinstarプログラムを用いて各々のアミノ酸の分子量を推論したものである］。
（３）特に、タバコの葉で観察されたＨＲにおいて、本タンパク質（パイオニア、Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質よりも早く、低い濃度で植物の免疫システムを誘導することが示された。したがって、枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導タンパク質であるパイオニア（Pioneer）は、火傷病菌（Erwinia. amylovora  ）由来のタンパク質であるＨｒｐＮよりも優れた植物過敏感反応を誘導する、より良い生化学農薬の開発に適していると考えられる。
【実施例３】
【００８７】
（枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導タンパク質（パイオニア、Pioneer）を用いた生物活性研究）
１）キュウリうどん粉病（Sphaerotheca fuliginea）に対する防除効果の検定
キュウリうどん粉病に対する枝黒枯病菌（Erwinia pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導タンパク質（パイオニア、Pioneer）の防除効果を検定するために、該植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子をｐＫＥＰ３ベクターにクローニングして、該タンパク質を精製した。
【００８８】
キュウリは、農家で通常行われている方法である雨を遮る（rain-protecting）方法によって栽培し、試験物質は、乱塊法（randomized complete block design, RCB）に準じて３回繰り返し塗布した。EDEN Bioscience社が推薦する濃度に従って、２０μｇ／ｍｌの濃度の過敏感反応誘導タンパク質であるパイオニア（Pioneer）を用いて、キュウリの茎葉処理を行った。
【００８９】
対照群として、EDEN Bioscience社の製剤であるメッセンジャー（Messenger；登録商標）を、同じ濃度で使用した。また、既に韓国においてキュウリうどん粉病に対する薬剤として登録されているフェナリモル (Fenarimol、化学農薬)を用いて、使用指針に準じて茎と葉を処理した。
【００９０】
処理方法は次の通りである;
（１）３回処理群−キュウリうどん粉病（Sphaerotheca fuliginea）の発病初期の段階から１０日間隔で、パイオニア（Pioneer）、EDEN Bioscience社の製剤であるメッセンジャー（Messenger、登録商標）及び化学農薬であるフェナリモル(Fenarimol）を各々キュウリの茎と葉に３回スプレーした。
（２）４回処理群−定植してから７日目、２１日目、３５日目及び４９日目に、パイオニア（Pioneer）、EDEN Bioscience社の製剤であるメッセンジャー（Messenger；登録商標）及び化学農薬であるフェナリモル(Fenarimol）を各々キュウリの茎と葉に３回スプレーした。
【００９１】
前記のように処理したキュウリの、上は８葉から下は３葉までに自然発生したキュウリうどん粉病（Sphaerotheca fuliginea）の発病指数を、発病無しを０、１〜５％を１、５．１〜２０％を２、２０．１〜４０％を３、４０％以上を４とする判定基準に基づいて、最後に薬剤処理してから７日後にそれらの発病度を測定した。
【００９２】
【表５】
2005500062.tif 000006
【００９３】
前記表５に示すように、パイオニア（Pioneer）は、３回処理群と４回処理群のいずれにおいても、EDEN Bioscience社の製剤であるメッセンジャー（Messenger（登録商標））よりも防除効果がそれぞれ１２２．６％及び１８７．０％増加したので、優れた農薬としての使用が期待される。
【００９４】
２）キュウリの収穫量増大の検定
パイオニア（Pioneer）処理によるキュウリの収穫量増大を確認するために、定植する７日前から１４日間隔で、２０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）を用いてキュウリの茎と葉を５回処理した。また、対照群として、同じ濃度の火傷病菌（Erwinia amylovora ATCC15580T）に由来するタンパク質（ＨｒｐＮ）でキュウリの茎と葉を処理した。
【００９５】
本実験用のキュウリを、定植後８日目、１０日目、１２日目、１４日目、１６日目、１８日目、２１日目、２３日目、２５日目及び３０日目に収穫して調査した。収穫されたキュウリの長さが２０ｃｍ以上であるキュウリを商品化できると判断し、結果を商品果率として以下に表記した。
【００９６】
【表６】
2005500062.tif 000007
【００９７】
その結果、パイオニア（Pioneer）では、商品果率が、無処理のものに比べて８．１％、ＨｒｐＮタンパク質で処理したものに比べて４．６％増加した。したがって、前記組成物（パイオニア、Pioneer）は、植物生長促進剤および肥料としてＨｒｐＮよりもさらに有効に使用できる。
【００９８】
３）キュウリの光合成量および葉緑素含量の増大の検定
パイオニア（Pioneer）で処理した場合のキュウリの生理反応の変化、すなわち、光合成量および葉緑素含量の増大を確認するために、キュウリの茎と葉を、定植する７日前から１４日間隔で、２０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）を用いて５回処理した。また、対照群として、ＨｒｐＮタンパク質も上記と同じ濃度でキュウリの茎と葉に与えた。
【００９９】
本実験用のキュウリは、定植後３４日目、４２日目及び５６日目に収穫し、携帯用光合成測定器（LCA-4 system, ADC BioScientific Ltd., UNK；光源：1,500マイクロ・モル）と葉緑素測定器（Chlorophyll meter SPAD-502, Minolta, Japan）を用いて調査した。
【０１００】
【表７】
2005500062.tif 000008
【０１０１】
上記の表から分かるように、キュウリをパイオニア（Pioneer）で処理した場合、無処理のものと比べて、光合成量は１６．２％、葉緑素含量は５．４％増加し、ＨｒｐＮタンパク質よりも、光合成量は９．８％、葉緑素含量は２．０％高かった。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質よりも植物生長促進剤および肥料剤として遥かに有用である可能性がある。
【０１０２】
４）トウガラシ疫病（Phytophthora capsici）に対する防除効果の検定
トウガラシ疫病に対するパイオニア（Pioneer）の防除効果を検定するために、植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子をｐＫＥＰ３ベクターにクローニングして、該タンパク質を精製した。
【０１０３】
トウガラシを、農家で通常行われている方法である露地栽培法（open field culture method）に従って栽培した。トウガラシの茎と葉を、４０、２０、１０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）で処理した。また、対照群として、ＨｒｐＮタンパク質も上記と同一の濃度でトウガラシの茎と葉に与えて比較した。
【０１０４】
処理方法は、次の通りである。
（１）定植後８日目および１２日目に、各濃度のパイオニア（Pioneer）とＨｒｐＮタンパク質でトウガラシの茎と葉を処理した。前記のように処理したトウガラシに、２×１０６細胞／ｍｌのトウガラシ疫病菌（Phytophthora capsici）を接種した後、処理から６３日後に発病度を測定した。
【０１０５】
【表８】
2005500062.tif 000009
【０１０６】
前記表８から分かるように、パイオニア（Pioneer）（１０μｇ／ｍｌ濃度）は、ＨｒｐＮタンパク質（４０μｇ／ｍｌ濃度）よりも高い防除値を示した。
【０１０７】
したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質よりも低濃度で優れた防除効果を示す農薬としてさらに有効に使用することができる。
【０１０８】
５）トウガラシ炭疽病（Colletotrichum orbiculare）に対する防除効果の検定
トウガラシ炭疽病（Colletotrichum orbiculare）に対するパイオニア（Pioneer）の防除効果を検定するために、植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子をｐＫＥＰ３ベクターにクローニングして、該タンパク質を精製した。
【０１０９】
トウガラシを、農家で通常行われている方法である露地栽培法（open field culture method）に従って栽培した。トウガラシの茎と葉を、処理する７日前から定植後１４日目までの間に１０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）で５回処理した。また、対照群として、ＨｒｐＮタンパク質も上記と同一の濃度でトウガラシの茎と葉に与えて比較した。
【０１１０】
処理方法は次の通りである。
（１）定植してから８日目及び１２日目に各濃度のパイオニアとＨｒｐＮタンパク質でトウガラシの茎と葉を処理した。定植してから２０日目、２７日目、３４日目及び４０日目に、前記のように処理し、定植したトウガラシの実を罹病果と健全果で表して罹病果率で示した。
【０１１１】
【表９】
2005500062.tif 000010
【０１１２】
表９から分かるように、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質に比べて１４．３％高いトウガラシ炭疽病（Colletotrichum orbiculare）に対する防除値を示した。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質よりも農薬としてさらに有効に使用できる。
【０１１３】
６）トウガラシの収穫量増大の検定
パイオニア（Pioneer）処理によるトウガラシの収穫量の増大を確認するために、パイオニア（Pioneer）を、１０μｇ／ｍｌの濃度で定植後８日目及び１２日目にトウガラシの茎と葉に５回噴霧した。また、対照群として、ＨｒｐＮタンパク質も同じ濃度で茎と葉に接種して比較した。
【０１１４】
処理方法は次の通りである。
（１）浸漬＋噴霧方法：パイオニア（Pioneer）とＨｒｐＮタンパク質を、ＭＥＳ緩衝液を用いて１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、それぞれにトウガラシを２８℃で２４時間浸漬した後、床土が入っている植木鉢に播種し、４６日間生育して露地に定植した。その後８日目及び１２日目に、パイオニア（Pioneer）及びＨｒｐＮタンパク質をそれぞれトウガラシの茎と葉に噴霧した。本実験用のトウガラシを、定植後１８日目、２５日目、３２日目、３９日目及び４６日目に収穫して調査した。
【０１１５】
【表１０】
2005500062.tif 000011
【０１１６】
表１０から分かるように、パイオニア（Pioneer）では、収穫量がＨｒｐＮタンパク質よりも２２．７％多いことが示された。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質よりも植物生長促進剤および肥料としてさらに有用である。
【０１１７】
７）トウガラシの光合成量および葉緑素含量の増大の検定
パイオニアで処理した場合のトウガラシの生理反応の変化、すなわち、光合成量および葉緑素含量の増大を確認するために、２０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）でトウガラシの茎と葉を定植７日前から１４日間隔で５回処理した。また、対照群として、ＨｒｐＮタンパク質も上記と同一の濃度でトウガラシの茎と葉に与えた。
【０１１８】
本実験用のトウガラシを、定植後３４日目、４２日目および５６日目に収穫し、携帯用光合成測定器（LCA-4 system, ADC BioScientific Ltd., UNK；光源：1,500マイクロ・モル）と葉緑素測定器（Chlorophyll meter SPAD-502, Minolta, Japan）を用いて測定した。
【０１１９】
【表１１】
2005500062.tif 000012
【０１２０】
前記表から、トウガラシをパイオニア（Pioneer）で処理した後、光合成量および葉緑素の含量を測定した結果、無処理のものに比べて光合成量は１６．０％、葉緑素の含量は６．７％増加し、ＨｒｐＮタンパク質よりも光合成量は７．５％、葉緑素の含量は４．９％増加したことが認められた。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質よりも植物生長促進剤および肥料としてさらに有用である。
【０１２１】
８）マクワウリ（oriental melon）べと病（Pseudoperonospora cubensis）に対する防除効果の検定
マクワウリ（oriental melon）べと病（Pseudoperonospora cubensis）に対するパイオニア（Pioneer）の防除効果を検定するために、植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子をｐＫＥＰ３ベクターにクローニングして、該タンパク質を精製した。
【０１２２】
マクワウリ（oriental melon）の茎と葉を、４０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）で５回処理した。また、対照群として、同一の濃度のＨｒｐＮタンパク質をマクワウリ（oriental melon）の茎と葉に与えて比較した。
【０１２３】
処理方法は次の通りである；
（１）浸漬＋噴霧方法：パイオニア（Pioneer）とＨｒｐＮタンパク質をＭＥＳ緩衝液で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈して、マクワウリ（oriental melon）の種子をそれぞれに２８℃で２４時間浸漬した後、これを植木鉢に播種し、１７日目及び２８日目に、マクワウリ（oriental melon）の茎と葉をパイオニア（Pioneer）とＨｒｐＮタンパク質で処理した。
（２）噴霧方法：播種後１７日目及び２８日目に、マクワウリ（oriental melon）の茎と葉をパイオニア（Pioneer）とＨｒｐＮタンパク質で処理した。
【０１２４】
前記のように処理したマクワウリ（oriental melon）に自然発生したマクワウリ（oriental melon）べと病の発病度を処理してから５５日後に測定した。
【０１２５】
【表１２】
2005500062.tif 000013
【０１２６】
前記表１２から分かるように、ＨｒｐＮタンパク質に比べて、パイオニア（Pioneer）の噴霧群においては９６．０％、浸漬＋噴霧群においては４４．６％防除効果が増大した。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質と比べて農薬としてさらに有用である。
【０１２７】
９）ピーマン疫病（Phytophthora capsici）に対する防除効果の検定
ピーマン疫病に対するパイオニア（Pioneer）の防除効果を検定するために、植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子をｐＫＥＰ３ベクターにクローニングして、該タンパク質を精製した。
【０１２８】
ピーマン疫病に対する防除効果の検定用のピーマンは、直径２５ｃｍのポットに定植してガラス温室で栽培した。ピーマンの茎と葉を、ナス科作物に対して適正濃度であるとEDEN Biosciences社が推薦する２０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）で処理した。また、対照群として、同一の濃度のＨｒｐＮタンパク質をピーマンの茎と葉に与えて比較した。
【０１２９】
処理方法は次の通りである；
（１）定植してから８日後に、パイオニア（Pioneer）とＨｒｐＮタンパク質でピーマンの茎と葉を処理した。前記のように処理したピーマンに、２×１０６細胞／ｍｌのピーマン疫病菌（Phytophthora capsici）を接種した後、処理から４５日後に発病度を測定した。
【０１３０】
【表１３】
2005500062.tif 000014
【０１３１】
表１３から分かるように、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質に比べて防除効果が８７．１％優れていた。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質に比べて農薬としてさらに有用である。
【０１３２】
１０）ピーマンの収穫量増大の検定
パイオニア（Pioneer）で処理したピーマンの収穫量の増大を確認するために、４０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）でピーマンの茎と葉を定植から８日後に処理した。また、対照群として、ＨｒｐＮタンパク質を同一の濃度で茎葉処理した。
【０１３３】
ピーマンを直径２５ｃｍのポットに定植し、ガラス温室で栽培した。前記のように処理したピーマンを定植してから４１日目及び４５日目に調査した。
【０１３４】
【表１４】
2005500062.tif 000015
【０１３５】
パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質に比べて、収穫量の増大効果が２１．６％優れていた。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質に比べて植物生長促進剤および肥料剤としてさらに有用である。
【０１３６】
１１）イチゴの収穫量増大の検定
パイオニア（Pioneer）で処理したイチゴの収穫量の増大を確認するために、ビニルハウスで栽培したイチゴの茎と葉を、２０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）で処理した。また、対照群として、ＨｒｐＮタンパク質を同一の濃度で茎と葉に与えた。
【０１３７】
前記のように処理したイチゴの収穫量の増大を調べるために、定植してから３０日目、３３日目、３８日目、４１日目、４８日目及び５５日目にイチゴを収穫して、総重量値（ｇ）で表した。
【０１３８】
【表１５】
2005500062.tif 000016
【０１３９】
表１５から分かるように、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質に比べてイチゴの収穫量の増大効果が１３．８％優れていた。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質よりも植物生長促進剤および肥料剤として有用である。
【０１４０】
１２）イネいもち病菌（Magnaporthe grisea）に対する防除効果の検定
イネいもち病菌（Magnaporthe grisea）に対するパイオニア（Pioneer）の防除効果を検定するために、植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子をｐＫＥＰ３ベクターにクローニングして、該タンパク質を精製した。
【０１４１】
イネを、農家で通常行われている方法である露地栽培（open field culture）法に従って栽培した。パイオニア（Pioneer）を、ＭＥＳ緩衝液を用いて１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈して、２８℃で２４時間浸漬した。イネの種子を苗床に播種し、１６日間生育し、試験圃場に定植した。その後、４５日目及び５２日目に、パイオニア（Pioneer）をイネの茎と葉に噴霧した。また、対照群として、ＨｒｐＮタンパク質を、上記と同一の濃度及び同一の方法で稲の茎と葉に与えて比較した。
【０１４２】
前記のように処理したイネに自然発生したイネいもち病の発病度を処理から８５日後に測定した。
【０１４３】
【表１６】
2005500062.tif 000017
【０１４４】
表１６から分かるように、パイオニア（Pioneer）（１０μｇ／ｍｌの濃度）は、ＨｒｐＮタンパク質（２０μｇ／ｍｌの濃度）よりも高い防除値を示した。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮタンパク質よりも低い濃度でも優れた農薬としてさらに有効に使用できる。
【０１４５】
１３）アブラムシに対する忌避効果の検定
アブラムシに対するパイオニア（Pioneer）の忌避効果を検定するために、植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子をｐＫＥＰ３ベクターにクローニングして、該タンパク質を精製した。
【０１４６】
アブラムシに対する忌避効果を検定するために、アブラムシの宿主作物としてはキュウリを選択し、農家で通常行われている方法である雨を遮る（rain-protecting）方法によって栽培し、キュウリの茎と葉を、２０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）で処理した。また、対照群として、同一の濃度及び同一の方法でＨｒｐＮタンパク質をキュウリの茎と葉に与えて、比較した。キュウリの丈が１ｍのとき、キュウリの茎と葉を、パイオニア（Pioneer）とＨｒｐＮで、１０日間隔で３回処理した。
【０１４７】
前記のように処理したキュウリに自然発生したアブラムシの個体数を処理してから７日後に計数した。
【０１４８】
【表１７】
2005500062.tif 000018
【０１４９】
表１７から分かるように、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮに比べて、低い濃度で優れたアブラムシ忌避効果を有し、アブラムシ忌避効果が２９．４％増大した。したがって、パイオニア（Pioneer）は、ＨｒｐＮよりもアブラムシに対する害虫忌避剤としてさらに有用である。
【０１５０】
１４）イネの育苗期における伸長増大効果の検定
パイオニア（Pioneer）で処理したイネの育苗期における伸長増大効果を検定するために、植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子をｐＫＥＰ３ベクターにクローニングして、該タンパク質を精製した。
【０１５１】
パイオニア（Pioneer）を、４０、２０及び１０μｇ／ｍｌの濃度にＭＥＳ緩衝液で希釈して、イネの茎と葉を２８℃で２４時間浸漬した後、苗床に播種して、１６日間生育し、試験圃場に定植した。また、対照群として、ＨｒｐＮタンパク質を、同一の濃度及び同一の方法でイネの茎と葉に与えて比較した。
【０１５２】
その結果、パイオニア（Pioneer）で処理したイネの苗において、無処理のものに比べて約３〜４ｃｍ、ＨｒｐＮタンパク質処理群に比べて１ｃｍ丈が伸長したことを確認できた。また、濃度が高いほど丈の伸長がよく、その結果、４０μｇ／ｍｌの濃度のパイオニア（Pioneer）において、イネ育苗期の伸長が最も良好であった。したがって、パイオニア（Pioneer）は、種子に直接処理して生長促進をもたらす種子処理剤としてＨｒｐＮよりもさらに有効に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、本発明に係る枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３）［ＫＣＣＭ  １０２８３］と韓国の枝黒枯病原菌（E. pyrifoliae  Ｅｐ１６Ｔ）および火傷病菌ＡＴＣＣ  １５５８０Ｔ（E. amylovora  ＡＴＣＣ  １５５８０Ｔ）の透過型電子顕微鏡（Transmitted Electro Microscope、TEM）の写真である。
【図２】図２は、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３）と火傷病菌ＡＴＣＣ  １５５８０Ｔ（E. amylovora  ＡＴＣＣ  １５５８０Ｔ）の温度に応じた成長曲線を示す図である。
【図３】図３は、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３）と火傷病菌ＡＴＣＣ  １５５８０Ｔ（E. amylovora  ＡＴＣＣ  １５５８０Ｔ）のｐＨに応じた成長曲線を示す図である。
【図４】図４は、バイオログシステム（Biolog system）を用いた本発明に係る枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３）の数値解析の結果を示す図である。
【図５】図５は、本発明に係る枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３、  ＫＣＣＭ  １０２８３）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子による系統学的分析の結果を示す図である。
【図６】図６は、本発明に係る枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３、  ＫＣＣＭ  １０２８３）のＩＴＳ領域のうち、ｔＲＮＡＡｌａをコードする領域を系統学的に分析した結果を示す図である。
【図７】図７は、本発明に係る枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３、  ＫＣＣＭ  １０２８３）のＩＴＳ領域のうち、ｔＲＮＡＧｌｕをコードする領域を系統学的に分析した結果を示す図である。
【図８】図８は、５個のプラスミドを有する枝黒枯病菌（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３、Ｅｐ１，Ｅｐ１６）と、１個のプラスミドを有する火傷病菌（E. amylovora、  ＡＴＣＣ１５５８０T、ＬＭＧ１８７７、ＬＭＧ１９４６）のプラスミドのプロファイルを分析した結果を示す図である［レーン1: 1kb ラダー, 2: E. pyrifoliae Ep1, 3: E. pyrifoliae Ep16T, 4: E. pyrifoliae WT#3, 5: E. amylovora ATCC15580T, 6: E. amylovora LMG1877, 7: E. amylovora LMG1946］。
【図９】図９は、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３  ＫＣＣＭ１０２８３）から構築したゲノムライブラリーのクローンをタバコの葉に接種してから２４時間後に現れる過敏感反応（ＨＲ）を示す図である［Ｂ：MES緩衝液、Ｃ：火傷病菌（E. amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ由来の植物過敏感反応誘導タンパク質（ＨｒｐＮ）、１：クローン１由来の植物過敏感反応誘導タンパク質、２：クローン２由来の植物過敏感反応誘導タンパク質、３：ｐＣＥＰ３３由来の植物過敏感反応誘導タンパク質、４：クローン４由来の植物過敏感反応誘導タンパク質、及びＮＣ：ｐＬＡＦＲ３ベクター由来のタンパク質］。
【図１０】図１０は、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３）由来の過敏感反応（ＨＲ）が現れるゲノムライブラリーのクローン（ｐＣＥＰ３３）に由来する植物過敏感反応誘導遺伝子をコードする領域の物理地図を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明に係る枝黒枯病菌ＷＴ＃３（E. pyrifoliae  ＷＴ＃３、  ＫＣＣＭ１０２８３）由来の植物過敏感反応誘導タンパク質をコードする遺伝子（ＫＣＣＭ１０２８２）を、火傷病菌（E. amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ由来の過敏感反応誘導遺伝子（ｈｒｐＮ）と比較した図である［Ａ：枝黒枯病菌（E. pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導遺伝子、Ｂ：火傷病菌（E. amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ由来の植物過敏感反応誘導遺伝子（ｈｒｐＮ）］。
【図１２】図１２は、プラスミドベクターであるｐＫＥＰ３にクローニングした枝黒枯病菌（E. pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導遺伝子から発現した植物過敏感反応誘導タンパク質（パイオニア（Pioneer））を示す図である［M:タンパク質サイズマーカー, 1: パイオニア（Pioneer）-41.1kD, 2: HrpN-39.7kD, 3: pET15bベクター］。
【図１３】図１３は、本発明に係る枝黒枯病菌（E. pyrifoliae）ＷＴ＃３（ＫＣＣＭ１０２８３）由来の植物過敏感反応誘導タンパク質であるパイオニア（Pioneer）のアミノ酸配列と、火傷病菌（E. amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ由来の植物過敏感反応誘導タンパク質（ＨｒｐＮ）のアミノ酸配列を比較した図である［A:パイオニア（Pioneer）, B:HrpN］。
【図１４】図１４は、種々の濃度の枝黒枯病菌（E. pyrifoliae）ＷＴ＃３（ＫＣＣＭ１０２８３）由来の植物過敏感反応誘導タンパク質であるパイオニア（Pioneer）と、対照群である火傷病菌（E. amylovora）ＡＴＣＣ１５５８０Ｔ由来の植物過敏感反応誘導タンパク質（ＨｒｐＮ）で処理したタバコの葉の植物過敏感反応を示す図である。
【図１５】図１５は、対照である緩衝液と本発明に係る枝黒枯病菌（E. pyrifoliae）ＷＴ＃３由来の植物過敏感反応誘導タンパク質であるパイオニア（Pioneer）を接種してから４日後の未熟なナシ果実の表面の病徴を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年4月2日(2004.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病害防除および植物生長促進に有効なErwinia属の病原菌である、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3, KCCM 10283）。
【請求項２】
配列番号５の核酸配列を含むことを特徴とする、遺伝子。
【請求項３】
配列番号６に該当するアミノ酸配列で表されるポリペプチド又はタンパク質を含むことを特徴とする、遺伝子。
【請求項４】
前記核酸配列は、枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3, KCCM 10283）に由来することを特徴とする、請求項２記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項２記載の遺伝子を含有することを特徴とする、組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項２記載の遺伝子を含有することを特徴とする、形質転換体。
【請求項７】
前記形質転換体は、植物およびバクテリアからなる群から選択されることを特徴とする、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
配列番号６のアミノ酸配列を含み、植物細胞と接触させる場合、植物において病原菌に対する過敏感反応または耐性を誘導することを特徴とする、非感染性形態のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項９】
前記アミノ酸配列は、前記枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3, KCCM 10283）に由来することを特徴とする、請求項８記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１０】
前記ポリペプチドまたはタンパク質は組換え体であることを特徴とする、請求項１０記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１１】
請求項８または請求項９記載のポリペプチドもしくはタンパク質と担体を含有することを特徴とする、生化学農薬組成物。
【請求項１２】
請求項８または請求項９記載のポリペプチドもしくはタンパク質と担体を用いる、農薬。
【請求項１３】
請求項８または請求項９記載のポリペプチドもしくはタンパク質と担体を用いる、植物生長促進剤。
【請求項１４】
請求項８または請求項９記載のポリペプチドもしくはタンパク質と担体を用いる、種子処理剤。
【請求項１５】
請求項８または請求項９記載のポリペプチドもしくはタンパク質と担体を用いる、害虫忌避剤。
【請求項１６】
請求項８または請求項９記載のポリペプチドもしくはタンパク質と担体を用いる、肥料。
【請求項１７】
枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3、ＫＣＣＭ  １０２８３）の培養物、および枝黒枯病菌ＷＴ＃３（Erwinia pyrifoliae WT#3、ＫＣＣＭ  １０２８３）由来の菌株の植物過敏感反応誘導遺伝子を含む形質転換体（ＫＣＣＭ  １０２８２）から、過敏感反応又は耐性を誘導するポリペプチドまたはタンパク質を分離、精製して、前記ポリペプチドまたはタンパク質を大量生産する方法。
【国際調査報告】
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