(57)【要約】本発明は、インスリンＡ鎖またはその類似体を患者に送達して神経疾患、注意障害、または記憶障害を緩和し、学習及び認知を改善するための組成物及び方法を提供する。２１個のアミノ酸配列（配列番号１の配列）を含むインスリンＡ鎖ペプチド及びその機能的類似体を患者に投与して神経活性を調節できることを開示する。本発明の方法を用いて、神経疾患を予防または治療したり、記憶の保持及び獲得を改善することができる。本発明は、治療効果または予防効果のある量のインスリンＡ鎖ペプチドまたはその機能的類似体を含む薬学的組成物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的組成物であって、
薬学的に許容される担体と神経疾患を緩和するのに有効な量の精製されたＡ鎖ペプチドまたはその機能的類似体とを含み、
前記Ａ鎖ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１の配列または保存的にアミノ酸が置換された配列番号１の配列を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２】
前記神経疾患が記憶障害であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記薬学的に許容される担体が、鼻腔内投与、腹膜内投与、脳室内投与、皮内投与、筋内投与、静脈内投与、または皮下投与できるように調製された担体であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記担体が鼻腔内投与できるように調製されていることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記担体がシクロデキストリンを含むことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
神経疾患を緩和するための請求項１に記載の薬学的組成物の使用方法であって、
患者に治療に有効な量の前記薬学的組成物を投与するステップを含むことを特徴とする使用方法。
【請求項７】
前記投与により前記患者の記憶保持を改善することを特徴とする請求項６に使用方法。
【請求項８】
前記投与により前記患者の連想的学習を改善することを特徴とする請求項６に使用方法。
【請求項９】
前記投与によりチロシンキナーゼ結合受容体の活性を調節することを特徴とする請求項６に使用方法。
【請求項１０】
前記投与が鼻腔内投与であることを特徴とする請求項６に使用方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２００２年５月６日出願の米国仮特許出願第６０／３７８，３１８号（名称「脳の健康のためのインスリン関連ペプチド（Insulin-Associated Peptides For Cerebral Health）」）の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、神経学の分野に関連し、詳細には、認知増強活性を有するペプチド及びその類似体の構造及び使用に関する。
【０００３】
発明の背景
３０歳以上の約８０％の人が記憶力低下を訴えている。通常の記憶力低下には、物の置忘れや会った直後にその人の名前を思い出せないことなどが含まれる。痴呆症ではないが記憶力低下という特徴をもつ軽度の認知障害（ＭＣＩ）に関連した記憶力低下は、通常の記憶力低下よりも深刻であり、情報を引き出すのに時間がかかるという持続的な問題を伴う場合が多い。痴呆症を発症した大抵の人は、軽度の認知障害の段階を経験し、一部の人は、ＭＣＩからアルツハイマー病（ＡＤ）の臨床病期に発展する。
【０００４】
知的機能の永続的または進行性の低下を構造的に引き起こす痴呆症は、老齢者が直面する最も深刻な疾患の１つである。通常は短期記憶及び／または長期記憶が低下する痴呆症は、社会活動及び経済活動を大きく妨げるものである。記憶力低下は、正常な加齢過程の特徴というだけでなく多くの神経障害の特徴でもある。痴呆症のリスクは、年齢に相関し、６０歳を超えると５歳毎にリスクが２倍になる。研究結果によると、８５歳を超える老人の最大５０％がこの疾患に罹っている。老人介護施設では、推定で６０％〜８０％がこの病気に罹っている。
【０００５】
注目すべきは、痴呆症には様々な形態があり、様々な原因がある。アルツハイマー病などの多くの神経疾患は痴呆症になる可能性がある。例えば、アルツハイマー型痴呆では、特定の細胞及び組織の変性が起こり、脳が萎縮したり、基底前脳、大脳皮質、及び他の脳の領域の細胞が失われる。卒中、頭部外傷、及び癲癇により記憶障害が起こることがある。神経信号が異常な脳障害である癲癇は、異常な感覚、感情、及び行動を引き起こしたり、時には痙や筋痙を引き起こし、意識を失うこともある。
【０００６】
６５歳を超えるＭＣＩ患者は、最も一般的な痴呆の形態の１つであるアルツハイマー病を年率１２％〜１５％で発症し、正常な健康な人の１％〜２％の発症率を著しく上回っている。従って、ＭＣＩ患者の早期治療により、アルツハイマー病の発症を含む更なる認知能力の低下を防止することができると思われる。アルツハイマー病は、全世界で数百万人を苦しめている変性脳疾患である。アルツハイマー病は、記憶、気分、人格、及び認知能力に影響を与える。人の平均寿命が延びるにつれ、人生のある時点でアルツハイマー病を発症する人が急速に増えている。現在、推定で６５歳を超える人の２０人に１人がある種の痴呆に罹っている。８０歳を超えると、５人に１人に上昇する。
【０００７】
神経疾患及び記憶力低下の既存の治療法は、必ずしも十分に容認されるものではなく、症状を効果的に改善することが証明されていない。加えて、抗癲癇薬などの薬物は、経口避妊薬などの他の薬物の効果を阻害し得る。更に、イチョウ、ピラセタム、及び他の様々な「頭の良くなる薬」が一般にかなり普及しているが、効果が証明された記憶増強薬は存在しない。
【０００８】
人の寿命が延び、神経疾患や記憶障害の生化学的原因を治療する薬物がないことが大きな問題になってきた。従って、当分野では、ＭＣＩ及び痴呆を緩和し、認知及び記憶力を改善する薬物が要望されている。
【０００９】
発明の要約
本発明は、インスリンＡ鎖またはその類似体を患者に送達して神経疾患、注意障害、または記憶障害を緩和し、学習及び認知を改善するための組成物及び方法を提供する。２１個のアミノ酸配列（配列番号１の配列）を含むインスリンＡ鎖ペプチド及びその機能的類似体を患者に投与して神経活性を調節できることを開示する。本発明の方法を用いて、神経疾患を予防または治療したり、記憶の保持及び獲得を改善することができる。本発明は、治療効果または予防効果のある量のインスリンＡ鎖ペプチドまたはその機能的類似体を含む薬学的組成物を含む。
【００１０】
一態様では、本発明は、神経疾患の進行を緩和する或いは発症を遅らせる組成物及び方法を提供する。一実施形態では、神経疾患には、限定するものではないが、記憶障害、頭部外傷、脊髄損傷、発作、卒中、癲癇、及び虚血が含まれる。このような神経疾患には、限定するものではないが、癲癇、ハンチントン病、パーキンソン病、多動症候群（ＡＤＤ）、神経精神症状、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性疾患が含まれる。更に、神経疾患には、ウイルス脳炎、細菌またはウイルス髄膜炎などの感染症によるＣＮＳ（中枢神経系）の損傷や、腫瘍によるＣＮＳ損傷が含まれる。別の実施形態では、本発明は、患者の神経疾患を緩和する方法を開示する。この方法は、Ａ鎖ペプチドまたはその機能的類似体がチロシンキナーゼ結合受容体の活性を調節するように、治療効果のある量のＡ鎖ペプチドまたはその機能的な類似体を含む薬学的組成物を患者に投与することを含む。
【００１１】
別の態様では、本発明は、患者の記憶障害を緩和する方法を提供する。この方法は、記憶障害が緩和されるように、治療効果のある量のインスリンＡ鎖ペプチドまたはその機能的な類似体を患者に投与することを含む。一実施形態では、この方法は更に、記憶障害の発症の前に、治療効果のある量のインスリンＡ鎖ペプチドまたはその機能的な類似体を患者に投与することを含む。更に別の実施形態では、治療効果のある量のインスリンＡ鎖ペプチドまたはその機能的な類似体の投与により、患者の記憶保持を改善する。本発明は、患者の記憶障害を予防する或いは発症を遅らせる方法を開示する。この方法は、薬学的に許容される担体に含めた予防効果のある量のインスリンＡ鎖またはその機能的類似体を患者に投与することを含む。
【００１２】
別の態様では、本発明の組成物及び方法を用いて記憶障害を軽減することができる。記憶障害は、過去の経験、知識、アイデア、感覚、考え、及び印象の精神的記録、保持、想起のレベルの低下を指す。記憶障害は、短期及び／または長期の情報保持、空間的関係の機能、記憶（暗唱）方法、及び言語の引き出し及び作成に影響を与える。本発明の組成物及び方法を用いて、限定するものではないが、過去の経験、知識、アイデア、感覚、考え、または印象の記録、保持、または想起する精神的能力を改善または増強する、或いは記憶能力を増強することを含め、記憶障害を緩和することができる。一実施形態では、本発明を軽度の認知障害（ＭＣＩ）の治療に用いることができる。疾患初期のＭＣＩの治療により、アルツハイマー病（ＡＤ）への進行を低減することができる。
【００１３】
好適な実施形態では、本発明の方法及び組成物を用いてアルツハイマー病を治療または軽減することができる。アルツハイマー病（ＡＤ）は、変性脳疾患であり、加齢と共に発症率が急激に上昇する。脳細胞の一定の集団が徐々に死滅する。近年、最新のイメージ技術により、アルツハイマー病が進行するにつれて海馬（一般的にはヒトの学習及び記憶、そして動物のある種の空間的学習にとって必須の構造）を含む内側側頭葉領域がどのように徐々に収縮するかが明らかにされた。
【００１４】
本発明は、強力で持続性の認知増強剤としてのインスリンＡ鎖ペプチド及び類似体の使用を支援し包含する。インスリンＡ鎖の効果は、１回の投与の２４時間後に確認され、１週間後にも確認された。更に、インスリンＡ鎖ペプチド及び類似体を投与しても、異常な行動や自発運動が起こらず、また血糖値にも影響を及ぼさない。従って、記憶増強に限られると思われる。
【００１５】
本発明は、薬学的に許容される担体と、治療効果のある量の配列番号１の配列を含む精製されたＡ鎖ペプチドまたはその機能的類似体、或いはそのアミノ酸が保存的に置換された配列を含む薬学的組成物を開示する。一実施形態では、Ａ鎖またはその類似体の薬学的組成物を患者に投与することができる。本発明で実証するように、本ペプチドがインスリン分子の一部に相同であるにもかかわらず、本ペプチドを患者に投与しても全身性代謝副作用が生じない。高架式十字迷路法及び赤外線運動ボックスで検査したように、本ペプチドが、活動、摂食、または不安に対して一般的な神経的影響がないことが示されている。ここに開示するように、本発明は、脳で高度に発現するオーファンインスリン関連受容体に対する明確な特異性を実証しているが、全身毒性及び中枢毒性がない。
【００１６】
治療効果のあるインスリンＡ鎖ペプチドまたは機能的類似体の投与方法は、腹膜内投与、脳室内投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、及び鼻腔内投与からなる群から選択することができる。好適な実施形態では、治療効果のある量のインスリンＡ鎖またはその類似体を鼻腔内投与によって送達することができる。本ペプチドの鼻腔内送達により、本ペプチドが効率的に脳内に進入することができる。本発明において、本ペプチドの鼻腔内送達により、受動的回避実験で成績が向上し、モリス水迷路実験で空間的学習が大幅に改善されたことが示されている。
【００１７】
詳細な説明
本発明は、認知増強及び／または神経保護活性を有するペプチド及びその誘導体の構造及び使用に関する。本発明の実施形態は、分子生物学、神経学、及びペプチド合成の方法を利用する。
【００１８】
本発明をより良く理解できるように、一部の用語について以下のように定義する。
【００１９】
本明細書で交換可能に用いられる用語「Ａ鎖」及び「インスリンＡ鎖」は、配列表の配列番号１の配列を含むペプチドや、保存されたアミノ酸置換または非アミノ酸置換、または後述するようにその機能的切断断片または追加断片を有する配列番号１の配列を含むペプチドに実質的に相同または機能的に同等なあらゆる起源の神経疾患緩和因子を指す。この定義に含まれるインスリンＡ鎖の配列は当分野で周知である。哺乳動物Ａ鎖の例として、限定するものではないが、ウシＡ鎖、ブタＡ鎖、ヒトＡ鎖、マウスＡ鎖、ヒツジＡ鎖、ウサギＡ鎖、サルＡ鎖、及びイヌＡ鎖を挙げることができ、これらのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はそれぞれ、Ｐ０１３１７、Ｐ０１３１５、Ｐ０１３０８、Ｐ０１３２５、Ｐ０１３１８、Ｐ０１３１１、Ｐ３０４０７、及びＰ０１３２１である。用語「Ａ鎖」は、本発明によって実証する記憶増強活性を有する保存されたアミノ酸置換を伴うＡ鎖を含むものとする。用語「Ａ鎖」は、脊椎動物及び無脊椎動物の双方における内在性インスリンＡ鎖を含むものとする。インスリンは、約５８００Ｄａの分子量を有する膵島のβ細胞によって産生される２本鎖ポリペプチドホルモンである。α鎖（Ａ鎖）とβ鎖（Ｂ鎖）は、２本鎖間ジスルフィド結合によって結合している。Ａ鎖は、鎖間ジスルフィド結合を含む。インスリンは、細胞によるグルコース、アミノ酸、及び脂肪酸の取込み、利用、及び貯蔵、並びにグリコーゲン、タンパク質、及び脂肪の分解の阻害を制御する。インスリンＡ鎖ペプチドは、生理学的に活性な形態で単量体、二量体、及び他の多量体で存在することができる。従って、本明細書で用いる用語「Ａ鎖」は、活性な単量体Ａ鎖、活性な多量体Ａ鎖、活性なグリコシル化及び非グリコシル化型のＡ鎖、活性な切断型のＡ鎖分子、及び配列番号１の配列を含む活性な大きなペプチドを含む。用語「Ａ鎖」は、翻訳後に修飾された配列番号１の配列を有するペプチドを含むものとする。本明細書で用いる用語「機能的に等価」は、必ずしも同程度である必要はないが、天然のＡ鎖ペプチドと同様の神経疾患緩和特性の一部または全てを有するＡ鎖ペプチドを指す。Ａ鎖ペプチドまたはその類似体は、アミノ酸５０個よりも短い長さを有することができる。Ａ鎖ペプチドまたはその類似体はまた、アミノ酸４０個未満、好ましくはアミノ酸３０個未満、より好ましくはアミノ酸２０個未満、更に好ましくはアミノ酸１５個未満の長さを有することができる。更に好ましくは、Ａ鎖ペプチドまたはその類似体は、アミノ酸１２個未満、好ましくはアミノ酸９個未満の長さを有することができる。最も好ましくは、Ａ鎖ペプチドまたはその類似体は、アミノ酸２２個未満の長さを有することができる。Ａ鎖ペプチドまたはその類似体をコードするポリヌクレオチドを生成する方法は、当分野で周知であり後述する。
【００２０】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチドの部分間のパーセント類似性を指す。２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の「実質的に相同」は、その分子の所定の長さに対して、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜約８５％、更に好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜約９９％、或いはそれ以上の配列類似性すなわち配列同一性を有する。本明細書で用いる用語「実質的に相同」はまた、特定のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を有する配列も指す。
【００２１】
一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列それぞれのヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の正確な一致を指す。パーセント同一性は、配列を整列させて２つの分子間の配列情報を直接比較して決定することができる。すなわち、２つの整列された配列間の正確な一致の数をカウントし、これを短い方の配列の長さで除し、この値に１００を乗じたものである。現在利用できるコンピュータプログラムを、類似性及び同一性の分析に用いることができる。このようなプログラムには、例えば、ペプチド分析のためにアプライド・マセマティクス（Appl. Math.）、1981年、2:482-489のスミス・アンド・ウォーターマン・アドバンス（Smith and Waterman Advances）の局所相同性アルゴリズムを採用した、「タンパク質の配列及び構造のアトラス（Atlas of Protein Sequence and Structure）」（エム・オー・デイホフ（M. O. Dayhoff）編集、ワシントンＤＣに所在のナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデーション（National biomedical Research Foundation）、増刊５、3:353-358）におけるＡＬＩＧＮ、Ｄａｙｈｏｆｆ, Ｍ. Ｏ.を挙げることができる。ヌクレオチド配列の類似性及び同一性を決定するためのプログラムは、例えば、スミス・アンド・ウォーターマン・アルゴリズム（Smith and Waterman algorithm）に依存するＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＧＡＰプログラムなどのウイスコンシン・シーケンス・アナライシス・パッケージ（Wisconsin Sequence Analysis Package）（第８版）（ウイスコンシン州マジソンのジェネティック・コンピュータ・グループ（Genetics Computer Group, Madison, Wis.）が販売）で利用することができる。これらのプログラムは、上記したウイスコンシン・シーケンス・アナライシス・パッケージに記載され、製造者が推奨するデフォルトパラメータで容易に利用することができる。例えば、基準配列に対する特定のヌクレオチド配列のパーセント類似性は、デフォルトスコア表及び６個のヌクレオチド位置のギャップペナルティーを有するスミス・アンド・ウォーターマンの相同性アルゴリズムを用いて決定することができる。
【００２２】
本発明の文脈におけるパーセント類似性を確立する別の方法は、ジョン・エフ・コリンズ（John F. Collins）及びシェーン・エス・スターロック（Shane S. Sturrok）が開発し、エジンバラ大学（University of Edinburgh）が著作権を有し、カリフォルニア州マウンテン・ビュー（Mountain View, Calif.）に所在のインテリジェネリック社（IntelliGenetics, Inc.）が販売するＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを用いることである。このパッケージ一式により、スミス・アンド・ウォーターマン・アルゴリズムを用いることができる。この場合、デフォルトパラメータがスコア表に対して用いられる（例えば、ギャップ・オープン・ペネルティー（gap open penalty）が１２、ギャップ伸長ペナルティーが１、ギャップが６）。データから得た「一致」の値が「配列類似性」を反映する。配列間のパーセント同一性及びパーセント類似性の計算に適した別のプログラムも当分野で知られており、例えば、別のアライメントプログラム「ＢＬＡＳＴ」があり、デフォルトパラメータと共に用いられる。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを、次のデフォルトパラメータで用いることができる。
genetic code=standard
filter=none
strand=both
cutoff=60
expect=10
Matrix=BLOSUM62
Descriptions=50 sequences
sort by=HIGH SCORE
Databases=non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR
これらのプログラムの詳細については、インターネットアドレス：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLASTを参照されたい。
【００２３】
別法では、相同領域間で安定した二重鎖が形成される条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼにより消化、及びその消化された断片の大きさを決定することで相同性を決定することができる。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定のシステムによって定義されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーションで特定することができる。好適なハイブリダイゼーション条件の定義は当分野の技術範囲である。例えば、上記したサンブルック（Sambrook）ら、上記したＤＮＡクローニング、上記した核酸ハイブリダイゼーションを参照されたい。
【００２４】
本発明では、用語「類似体」、「誘導体」、または「断片」は交換可能に用いられ、別の化学物質に構造的及び機能的に類似している化学物質を意味する。類似体、誘導体、または断片は、この場合は細胞モデル及び動物モデルにおけるインスリンＡ鎖の生理学的機能や活性である元の物質とは異なる改変構造を含む。類似体の生物学的活性には、改善された所望の活性及び低減された不所望の活性が含まれ得る。類似体は、必ずではないが、他の物質から合成することができる。例えば、インスリンＡ鎖類似体は、インスリンＡ鎖に構造的に類似した化合物であるが、インスリンＡ鎖から精製する必要はない。本発明の類似体は、限定するものではないが、インスリンＡ鎖の類似体や、インスリンＡ鎖に実質的に相同な合成ペプチドの類似体を含む。用語「インスリンＡ鎖類似体」は、限定するものではないが、インスリン様成長因子Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３５６３）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３５６２）、ＩＮＳＬ３またはＬｅｙｄｉｇインスリン様ペプチドまたはリラキシン様因子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７３６３７）、インスリン様ペプチド、リラキシン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ００９４９、Ｘ００９４８，ＢＤ１０３２３６、Ｖ００５７７、Ｖ００５７８）、初期胎盤インスリン様成長因子（プロＥＰＩＬ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ１４６４１）の断片が含まれる（バーネット及びオーウェンズ（Barnett and Owens）著、「インスリン類似体（Insulin analogues）」、ランセット（Lancet）、１９９７年１月４日、349(9044):47-51）、（クマガイら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケイミストリー（J Biol. Chem）」、２００２年８月３０日、277(35):31283-31286）、（ブラント（Brandt）ら著、「カンサー・リサーチ（Cancer Res）」、２００２年２月１５日、62(4):1020-1024）、（リー（Li）ら著、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・ダイアベティス・リサーチ（Int J Exp Diabetes Res」）、２００２年１０月〜１２月、3(4):241-245）。用語「類似体」は、様々なインスリンスーパーファミリーに由来するペプチドを含むものとする。インスリンスーパーファミリーには、限定するものではないが、インスリン、リラキシン、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ、哺乳動物Ｌｅｙｄｉｇ細胞特異的インスリン様ペプチド（遺伝子ＩＮＳＬ３）、及び初期胎盤インスリン様ペプチド（ＥＰＩＬ）（遺伝子ＩＮＳＬ４）、昆虫前胸腺刺激ホルモン（ボンビキシン）、バッタインスリン関連ペプチド（ＬＩＲＰ）、軟体動物インスリン関連ペプチド１−５（ＭＩＰ）、及び線虫インスリン様ペプチドが含まれ、これらの配列は当分野で周知である（例えば、クラエイ（Claey）ら著、「ペプチド（Peptides）」、２００２年、23:807-816）。これらの活性型では、これらのペプチドホルモンは、２つのジスルフィド結合により連結されたＡ鎖とＢ鎖の２本の鎖からなる。４つのシステインの構成が、Ａ鎖で保存され、Ｃｙｓ１がＣｙｓ３にジスルフィド結合により結合し、Ｃｙｓ２及びＣｙｓ４がＢ鎖のシステインに鎖間ジスルフィド結合により結合している（シュワーベ（Schwabe）ら著、「ファセブ・ジャーナル（FASEB J.）���、１９９４年１１月、8(14):1152-60、ブランデル（Blundell）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９８０年１０月３０日、287(5785):781-7、マーレイ‐ラスト（Murray-Rust）ら著、「バイオエッセイ（Bioessays）」、１９９２年５月、14(5):325-31、ベダルカル（Bedarkar）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９７７年１２月１日、270(5636):449-51）。
【００２５】
本明細書で用いる用語「類似体」は更に、Ａ鎖ペプチドの生物学的に活性な誘導体、またはここに記載するアッセイで増大した記憶保持活性などの所望の活性を保持したこのような誘導体の断片も指す。一般に、本明細書に用いる用語「類似体」は、別の物質に構造的及び機能的に関連した機能的誘導体または断片を意味するものである。類似体は、この場合はインスリンＡ鎖である元の物質から改変された構造を含み、細胞モデル及び動物モデルにおけるこの場合はインスリンＡ鎖の生理学的機能や活性である元の物質の機能を実質的に維持している。この類似体の生物学的活性には、改善された所望の活性や低減された不所望の活性が含まれ得る。類似体は、必ずではないが、他の物質から合成することができる。類似体は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２５４４などの当分野で周知の方法で化学的または組換え的に合成することができる。例えば、Ａ鎖類似体は、インスリンＡ鎖に構造的に関連した化合物とすることができるが、ヒトインスリンＡ鎖と同じアミノ酸を含まなくても良い。一般に、用語「類似体」は、改変が記憶増強活性を破壊しないのであれば、自然のポリペプチド配列、及び自然の分子に対して１または複数のアミノ酸の付加、置換（事実上、概ね保存的）、及び／または欠失を有する構造を含む化合物を指す。好ましくは、類似体は、自然の分子と少なくとも同じ記憶増強活性を有する。用語「類似体」は、１または複数のアミノ酸が好ましくは保存的に置換された配列番号１の配列を含むペプチド、並びにアミノ酸または非アミノ酸が置換された配列番号１の配列を含むペプチドを含むものとする。Ａ鎖ペプチドまたはその類似体は、アミノ酸５０個よりも短い長さを有することができる。Ａ鎖ペプチドまたはその類似体はまた、アミノ酸４０個未満、好ましくはアミノ酸３０個未満、より好ましくはアミノ酸２０個未満、更に好ましくはアミノ酸１５個未満の長さを有することができる。更に好ましくは、Ａ鎖ペプチドまたはその類似体は、アミノ酸１２個未満、好ましくはアミノ酸９個未満の長さを有することができる。最も好ましくは、Ａ鎖ペプチドまたはその類似体は、アミノ酸２２個未満の長さを有することができる。Ａ鎖ペプチドまたはその類似体をコードするポリヌクレオチドを生成する方法は、当分野で周知であり後述する。
【００２６】
Ａ鎖付加類似体の場合、アミノ酸配列付加は通常、約１個〜１００個またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のＮ末端融合及び／Ｃ末端融合、並びに１または複数のアミノ酸残基の内側付加を含む。内側付加は通常、約１個〜１０個のアミノ酸残基、より一般的には約１個〜５個の残基、更に一般的には約１個〜３個のアミノ酸残基、またはこれらの範囲内の整数個のアミノ酸残基を含む。Ｎ末端付加変異体の例として、Ａ鎖のＮ末端への異種Ｎ末端シグナル配列の融合、並びに他の神経保護因子の配列に由来するアミノ酸配列の融合を挙げることができる。
【００２７】
Ａ鎖置換類似体は、配列番号１の配列の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その代わりに別のアミノ酸残基が挿入されている。このような置換変異体には、アミノ酸が変化するまたは変化しない種固体群における天然のヌクレオチド配列の変化という特徴を有するアレル変異体が含まれる。特に好ましい置換は、事実上保存的であり、側鎖に関連したアミノ酸ファミリー内での置換である。具体的には、アミノ酸は通常、（１）酸性のアスパラギン酸及びグルタミン酸、（２）塩基性のリシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性のアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、（４）非荷電のグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンの４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として分類される場合もある。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、及びトレオニンとセリンの隔離置換（isolated replacement）、またはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸との類似的かつ保存的な置換が、生物学的活性に大きな影響を与えるものではないと当然推定できる。
【００２８】
例えば、Ａ鎖分子は、分子の所望の機能がそのまま保持されれば、最大約１０個の保存的または非保存的なアミノ酸置換、好ましくは最大約５個の保存的または非保存的なアミノ酸置換を含むことができる。当業者であれば、当分野で周知の技術を用いて変化を許容できる目的の分子の領域を容易に決定することができる。
【００２９】
用語「Ａ鎖類似体」は、ここに開示する完全長天然配列Ａ鎖ポリペプチド配列またはここに開示する完全長Ａ鎖ポリペプチド配列の任意の他の断片に対して少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性を有する前記または下記のように定義される活性なＡ鎖ポリペプチドを意味する。このようなＡ鎖ポリペプチド変異体には、例えば、完全長の天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端で、１または複数のアミノ酸残基が付加または欠失したＡ鎖ポリペプチドが含まれる。通常は、Ａ鎖ポリペプチド変異体は、ここに開示する完全長の天然配列Ａ鎖ポリペプチド配列またはここに開示する完全長のＡ鎖ポリペプチド配列の任意の他の具体的に定義された断片に対して、少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約５５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。Ａ鎖類似体ポリペプチドの長さは、通常は少なくとも約６個のアミノ酸、或いは少なくとも約１０個のアミノ酸、或いは少なくとも約１５個のアミノ酸、或いは少なくとも約２０個のアミノ酸、或いは少なくとも約２５個のアミノ酸、或いは少なくとも約３０個のアミノ酸、或いは少なくとも約３５個のアミノ酸、或いは少なくとも約４０個のアミノ酸、或いは少なくとも約４５個のアミノ酸、或いは少なくとも約５０個のアミノ酸、或いは少なくとも約５５個のアミノ酸、或いは少なくとも約６０個のアミノ酸、或いは少なくとも約６５個のアミノ酸、またはそれ以上である。
【００３０】
ここで特定されるＡ鎖ポリペプチド配列に対する用語「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインメントしてから、最大のパーセント配列同一性を得るべく、必要に応じてギャップを導入し、保存的な置換は何れも配列同一性の一部としては含めない、特定のＡ鎖ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一な候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの一般が利用できるコンピュータソフトウエアを用いて当分野の技術内の様々な方法で行うことができる。当業者であれば、比較する完全長の配列に対して最大のアラインメントを得るために必要なあらゆるアルゴリズムを含め、アラインメント評価のための適当なパラメータを決定できる。
【００３１】
パーセントアミン酸配列同一性の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（アルトシュル（Altschul）ら著、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、１９９６年、266:460-480）を用いて後述するように求めることができる。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは、デフォルト値に設定されている。デフォルト値に設定されていないパラメータ、すなわち調節できるパラメータは、以下の値に設定することができる。
overlap span=1
overlap fraction=0.125
word threshold (T)=11
scoring matrix=BLOSUM62
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を用いる場合、パーセントアミノ酸配列同一性の値は、天然Ａ鎖ペプチドに由来する配列を有する目的のＡ鎖類似体のアミノ酸配列とＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定された目的の比較アミノ酸配列との間で一致した同一アミノ酸残基数（ａ）を、目的のＡ鎖類似体のアミノ酸合計残基数（ｂ）で除して決定することができる。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列Ａを含むポリペプチド」の句において、アミノ酸配列Ａが目的の比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが目的のＡ鎖類似体のアミノ酸配列である。
【００３２】
パーセントアミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（アルトシュル（Altschul）ら著、「ニュークリック・アシッヅ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１９９７年、25:3389-3402）を用いて決定することもできる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、インターネットアドレス：http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードするか、或いはメリーランド州ベセスダ（Bethesda）の米国保険研究所（National Institute of Health）から入手することができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、複数の検索パラメータ用い、それらの検索パラメータは、例えば以下のデフォルト値に全て設定されている。
unmask=yes
strand=all
expected occurrences=10
minimum low complexity length=15/5
multi-pass e-value=0.01
constant for multi-pass=25
dropoff for final gapped alignment=25
scoring matrix=BLOSUM62
【００３３】
本明細書で用いる用語「緩和する」は、疾患の改善、低減、抑制、発症の遅延、及び／または他の調節を意味する。
【００３４】
本明細書で用いる用語「Ａ鎖ペプチド」または「Ａ鎖ポリペプチド」は、交換可能に用いられ、インスリンＡ鎖の生物活性または機能を維持した、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または化学合成したアミノ酸を含むインスリンＡ鎖の機能的または活性な類似体、誘導体、または断片を指す。
【００３５】
本明細書で用いる用語「アミノ酸」は、特段の記載がない限り、Ｌ型アミノ酸及びＤ型アミン酸を含む２０種類の天然アミノ酸の１つを指す。用語「アミノ酸」はまた、生物学的活性を維持するようにペプチド内で置換できる、アミノ酸類似体を含む化学修飾されたアミノ酸などの化合物、ノルロイシンなどのペプチドに通常は含まれない天然アミノ酸、及び当分野で周知のアミノ酸特性を有する化学合成された化合物を指す。細胞モデル及び動物モデルにおいて生物活性または機能を保持するＡ鎖の活性な断片、誘導体、または類似体の中で置換できるのあれば、例えば、グルタミンは、アスパラギンのアミノ酸類似体とすることができる。アミノ酸及びアミノ酸類似体の他の例は、言及することを以って本明細書の一部とする、グロス（Gross）及びメインホファー（Meienhofer）著、「ザ・ペプチド：分析、合成、生物学（The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology）」、ニューヨークのアカデミック・プレス社（Academic Press, Inc.,）、１９８３年に列記されている。アミノ酸はまた、アミノ酸のαアミノ基及びαカルボキシル基の両方を有する必要はないが実質的に同様の空間的構造またはアミノ酸としての官能基を有する構造のアミノ酸様物質とすることができる。
【００３６】
本明細書で用いる用語「機能的」または「生物学的に活性な」は、交換可能に用いられ、細胞モデル及び動物モデルにおいてインスリンＡ鎖の生理活性及び機能を少なくとも５０％維持し、Ａ鎖の構造に類似した化学構造を有するペプチドを意味する。機能には、改善された所望の活性及び低減された不所望の活性が含まれ得る。このような類似は通常、インスリンＡ鎖またはインスリン様ペプチド対応物における同様の空間的構造の大きさ、電荷、または疎水性などの類似の物理的特性を有するという特徴がある。ペプチド様物質の例として、１または複数のアミノ酸のアミド結合が炭素‐炭素結合または当分野で周知の他の結合に置換された化合物を挙げることができる（例えば、言及することを以って本明細書の一部とする、ソーヤー（Sawyer）著、「ペプチドベースのドラッグデザイン（Peptide Based Drug Design）」、ワシントン州のＡＣＳ、１９９５年を参照されたい）。機能的インスリンＡ鎖の非限定検査を後述する。本発明のペプチドは、少なくとも１つの生理活性アッセイで機能的である。具体的には、ペプチドをインビボ及び／またはインビトロの検査条件にさらすと改変が起こる。機能の検査は、本明細書の例のセクションに記載する。例えば、本ペプチドの付加により、記憶保持力を高めることができる。
【００３７】
用語「神経疾患」または「ＣＮＳ疾患」は、交換可能に用いられ、患者における正常な神経機能の障害や喪失、または異常な神経機能の存在を指す。例えば、神経疾患は、疾患、傷害、及び／または加齢などが原因である。本明細書で用いられる神経疾患はまた、神経細胞または神経細胞集団の形態学的及び／または機能的な異常を引き起こす神経変性を含む。形態学的及び機能的異常には、限定するものではないが、神経細胞の物理的変質及び／または死、神経細胞の異常な成長パターン、神経細胞間の物理的結合における異常、神経細胞による物質（例えば、神経伝達物質）の過剰または過少な産生、神経細胞によって通常は産生される物質の産生不良、異常なパターンまたは異常な時間での物質（例えば、神経伝達物質）及び／または電気インパルスの生成が含まれる。神経疾患には、限定するものではないが、記憶障害、頭痛、脊椎損傷、卒中、脳卒中、痴呆、記憶喪失、多動症候群（ＡＤＤ）、癲癇、及び虚血が含まれる。神経疾患には、神経変性疾患も含まれる。神経変性は、患者の脳のあらゆる領域で起こる可能性があり、限定するものではないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、及びアルツハイマー病を含む多くの疾患に見られる。
【００３８】
神経疾患には更に、ウイルス脳炎及び細菌またはウイルス髄膜炎などの感染症によるＣＮＳ（中枢神経系）の損傷や、腫瘍によるＣＮＳ損傷が含まれる。また、本発明の神経保護及び／または神経再生の方法を用いて、ペリツェウス‐メルツバッハー病、多発性硬化症、様々な白質萎縮症、外傷後脱髄、及び脳血管障害などの様々な脱髄疾患及び髄鞘形成障害性疾患を治療または防止する細胞を用いた置換治療を改善することができる。中枢神経系の疾患には更に、気分障害（すなわち、うつ病、双極性障害）、不安障害、記憶障害、及び精神分裂病などの精神障害が含まれる。加えて、本発明は、脊髄傷害を受けて損傷した脊髄組織を修復する細胞を用いた治療を改善するために使用できることも分かった。
【００３９】
本明細書で用いる用語「記憶障害」は、すなわち過去の経験、知識、アイデア、感覚、考え、及び印象の精神的記録、保持、想起の低下を指す。記憶障害は、短期及び／または長期の情報保持、空間的関係の機能、記憶（暗唱）方法、及び言語の引き出し及び作成に影響を与える。用語「記憶障害」には、痴呆、学習遅滞、及び集中困難が含まれる。記憶障害の一般的な原因は、加齢、重度の頭部傷害、脳無酸素症、脳虚血または虚血、アルコール性栄養障害、薬物中毒、及び神経変性疾患である。例えば、記憶障害は、アルツハイマー病（すなわち、アルツハイマー型痴呆）などの神経変性疾患の一般的な特徴である。記憶障害はまた、ＡＩＤＳ痴呆、ウェルニッケ‐コルサコフ関連痴呆（アルコール誘発性痴呆）、加齢関連痴呆、多発梗塞性痴呆、脳血管障害による老人性痴呆、及びパーキンソン病に関連した或いは関連しないアルツハイマー病のレーヴィ小体変異などの他の種類の痴呆でも起こる。プリオンタンパク質による海綿状変性脳症であるクロイツフェルト‐ヤコブ病は、記憶障害が関連する珍しい痴呆である。記憶の喪失はまた、脳損傷患者の一般的な特徴である。用語「記憶障害」は、記憶の喪失という症状はあるが、言語、人格、行動の変化の問題などの他の痴呆の症状がない軽度の認知障害（ＭＣＩ）も含むものとする。ＭＣＩ患者は、アルツハイマー病などの他の神経疾患を発症するリスクが高い。記憶障害を引き起こし得る脳損傷の原因には、限定するものではないが、発作、卒中、麻酔事故、虚血、無酸素症、低酸素症、脳水腫、動脈硬化症、血腫、または癲癇、脊髄細胞喪失、末梢神経疾患、頭部外傷、低血糖症、一酸化炭素中毒、リチウム中毒、ビタミン（Ｂ１、チアミン、及びＢ１２）欠乏、または過度のアルコール摂取が含まれる。コルサコフ健忘性精神病（Korsakoff's amnesic psychosis）は、深刻な記憶喪失及び作話症であり、記憶喪失を隠すために話を作るという特徴を持つ珍しい疾患である。この疾患は、過度のアルコール摂取に関連する場合が多い。記憶障害は更に、加齢に関連し、名前、場所、及び単語などの情報を思い出す能力が加齢と共に低下するようである。重度の抑うつ障害の患者では、電気ショック療法の後で一時的な記憶喪失が起こることもある。
【００４０】
用語「治療効果のある量」は、所望の治療結果を得るために、服用時及び必要な期間に亘って有効な服用量を指す。インスリンＡ鎖ペプチドの治療効果のある量は、疾患のステージ、年齢、性別、及び個人（個体）の体重などの因子や、本薬物が個人（個体）に所望の応答を引き出す能力によって様々である。治療効果のある量はまた、本薬物のあらゆる有毒または有害な影響を治療効果が上回る量である。
【００４１】
用語「予防効果のある量」は、所望の予防結果を得るために、服用時及び必要な期間に亘って有効な服用量を指す。通常は、予防量は疾患の前または初期に患者に投与されるため、予防効果のある量は治療効果のある量よりも少ない。
【００４２】
本明細書に用いる「患者」または「被検動物」は、免疫反応を引き起こすことができるあらゆる生物を指す。用語「患者」または「被検動物」は、限定するものではないが、ヒト、チンパンジー及び他の類人猿並びにサル類などのヒト以外の霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなどの食用家畜、イヌ及びネコなどの家畜、マウス、ラット、及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物が含まれる。この用語は、年齢や性別については言及しない。従って、雄雌にかかわらず成人（成体）及び新生児（新生仔）、並びに胎児（胎仔）が含まれるものとする。
【００４３】
本明細書で用いる用語「薬学的に許容される担体」は、調節剤の蓄積、投与、及び／または生物学的活性を促進するために当分野で従来から用いられている担体を指す。担体はまた、調節剤の不所望の副作用を低減させることができる。好適な担体は、安定性すなわち製剤の他の成分と反応できない特性を有するべきである。担体はまた、治療に用いられる服用量及び濃度でレシピエントに著しい局所的副作用または全身性副作用を起こすものであってはならない。このような担体は当分野で周知である。本発明に好適な担体には、大きい安定した巨大分子に従来から用いられているアルブミン、ゼラチン、コラーゲン、多糖、単糖、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグルコール酸、高分子アミノ酸、固定油、オレイン酸エチル、リポソーム、グルコース、スクロース、ラクトース、マンノース、ブドウ糖、デキストラン、セルロース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、シクロデキストリン、及び（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリンなどが含まれる。水、生理食塩水、ブドウ糖水、及びグリコールが、特に（等張の場合）溶剤に好適な水性担体である。担体は、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、及びゴマ油などの石油、動物、野菜、または合成起源の油を含む様々な油から選択することができる。好適な薬学的に許容される賦形剤には、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノアセタート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、及びエタノールなどが含まれる。組成物は、滅菌などの従来の薬学的に都合の良い処理を施し、保存剤、安定剤、保湿剤、乳化剤、浸透圧を調節する塩、及び緩衝などの従来の薬学的添加物を含むことができる。薬学的組成物における他の許容される組成物には、限定するものではないが、水、生理食塩水、及び緩衝剤（リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、及び他の有機酸またはそれらの塩）などの等張性改質剤が含まれる。一般に、薬学的に許容される担体には、１または複数の安定剤、還元剤、抗酸化剤、及び／または抗酸キレート剤も含まれる。蛋白系組成物、特に薬学的組成物の製剤における緩衝剤、安定剤、還元剤、抗酸化剤、及びキレート剤の使用は当分野で周知である。例えば、ワン（Wang）ら著、「ジャーナル・オブ・ペアレント・ドラッグ・アソシエーション（J. Parent. Drug Assn）」、１９８０年、34(6):452-462、ワン（Wang）ら著、「ジャーナル・オブ・ペアレント・サイエンス・テクノロジー（J. Parent. Sci. Tech.）」、１９８８年、42:S4-S26 (付録)、ラッチマン（Lachman）ら著、「Drug and Cosmetic Industry」、１９８８年、102(1):36-38,40,146-148、エーカーズ（Akers）著、「ジャーナル・オブ・ペアレント・サイエンス・テクノロジー（J. Parent. Sci. Tech.）」、１９６８年、36(5):222-228、コニスバーグ（Konigsberg）著、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、第２５巻、クロウイック及びカプラン（Colowick and Kaplan）編集、「ジチオスレイトールでのタンパク質のジスルフィド結合の還元（Reduction of Disulfide Bonds in Proteins with Dithiothreitol）」、p185-188を参照されたい。
【００４４】
好適な緩衝剤には、酢酸塩、アジパート、安息香酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、ホウ酸塩、トリ（ヒドロキシメチルアミノメタン）、コハク酸塩、グリシン、ヒスチジン、及び様々なアミノ酸塩など、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、ワン（Wang）著、前出、１９８０年、ｐ455を参照されたい。好適な塩及び等張剤（isotonicifiers）には、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、スクロース、またはトレハロースなどが含まれる。担体が液体である場合、担体は、口腔液、結膜液、または皮膚液に対して低張性または等張性であってｐＨが４．５〜８．５の範囲であるのが好ましい。担体が粉末状である場合、担体は許容される非有毒ｐＨ範囲であるのが好ましい。
【００４５】
還元型システインの還元型を維持する好適な還元剤には、０．０１％〜０．１％（ｗｔ／ｗｔ）のジチオトレイトール（ＤＴＴ）（クリーランド試薬としても知られている）またはジチオエリトリトール、０．１％〜０．５％（ｐＨ２〜３）のアセチルシステインまたはシステイン、及び０．１％〜０．５％（ｐＨ３．５〜７．０）のチオグリセロール及びグルタチオンを含む。例えば、エーカーズ（Akers）著、前出、１９８８年、ｐ225-226を参照されたい。好適な抗酸化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、及びアスコルビン酸が含まれる。例えば、エーカーズ（Akers）著、前出、１９８８年、ｐ225を参照されたい。微量金属をキレート化させてその微量金属を触媒とした還元型システインの酸化を防止する好適なキレート剤には、クエン酸塩、酒石酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、四ナトリウム、カルシウムジナトリウム塩（calcium disodium salts）、及びジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）が含まれる。例えば、ワン（Wang）著、前出、１９８０年、ｐ457-458およびｐ460-461、エーカーズ（Akers）著、前出、１９８８年、ｐ224-227を参照されたい。
【００４６】
Ｉ．インスリン
インスリンは、抹消及び中枢の受容体を介して血糖、食物摂取、及び体重などの様々な生理機能を調節することが分かっているペプチドホルモンである（ウッズ（Woods）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９７９年、282:503-505、ブルーニング（Bruning）ら著、「サイエンス（Science）」、２０００年、289:2122-2125、シュバルツ（Schwartz）ら著、「ネイチャー（Nature）」、２０００年、404:661-671を参照されたい）。インスリンの構造は、少なくとも１００種の脊椎動物で同定されている。４つのインバリアントなシステインに加えて、わずか１０個の他のアミノ酸が保存されているようである。これらのインバリアントなアミノ酸には、ＧｌｙＡｌ、ＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３、ＴｙｒＡ１９、ＬｅｕＢ６、ＧｌｙＢ８、ＬｅｕＢｌｌ、ＶａｌＢ１２、ＧｌｙＢ２３、及びＰｈｅＢ２４が含まれる（コンロン・ジェイ・エム（Conlon, J. M.）著、「ペプチド（Peptides）」、２００１年、22(7):1183-1193)）。インスリン分子は、Ａ鎖とＢ鎖の２本のペプチド鎖からなる。Ａ鎖とＢ鎖は２つのジスルフィド結合により結合され、Ａ鎖内には更なるジスルフィド結合が形成されている。Ｂ鎖は様々な生理効果を有するが、Ａ鎖は有していないことが分かっている（ソン（Song）ら著、「ダイアベティス・リサーチ・アンド・クリニカル・プラクティス（Diabetes Res Clin Pract）」、１９９９年、46:109-114）。インスリンを用いた研究の殆どが、糖尿病における役割及びグルコース調節についてである。しかしながら、近年の研究結果から、インスリンが学習及び記憶を促進することが分かった。
【００４７】
本発明は、２１個のアミノ酸からなるインスリンＡ鎖が記憶の獲得及び引き出しを促進するという発見に部分的に基づいている。不可欠な生物活性を保持する小ペプチドが好ましい。なぜなら、このような小ペプチドは、より安定で血液脳関門（ＢＢＢ）を容易に通過できるからである。本発明において、Ａ鎖ペプチド及び類似体は、抹消投与すると、認知促進効果があることが示された（例のセクションを参照）。
【００４８】
Ａ．インスリンスーパーファミリー
インスリン遺伝子スーパーファミリーホルモンは、細胞増殖、代謝、及び組織特異的機能を調節する。このインスリンスーパーファミリーは、インスリン、リラキシン、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ、哺乳動物Ｌｅｙｄｉｇ細胞特異的インスリン様ペプチド（遺伝子ＩＮＳＬ３）、及び初期胎盤インスリン様ペプチド（ＥＬＩＰ）（遺伝子ＩＮＳＬ４）、昆虫前胸腺刺激ホルモン（ボンビキシン）、バッタインスリン関連ペプチド（ＬＩＲＰ）、軟体動物インスリン関連ペプチド１−５（ＭＩＰ）、及び線虫インスリン様ペプチドを含む進化に関連した多数の活性なペプチドに分類される。これらの活性型では、これらのペプチドホルモンは、２つのジスルフィド結合によって結合されたＡ鎖とＢ鎖の２本の鎖からなる。４つのシステインの構成が、Ａ鎖で保存され、Ｃｙｓ１がＣｙｓ３にジスルフィド結合により結合し、Ｃｙｓ２及びＣｙｓ４がＢ鎖のシステインに鎖間ジスルフィド結合により結合している（シュワーベ（Schwabe）ら著、「ファセブ・ジャーナル（FASEB J.）」、１９９４年１１月、8(14):l152-60、ブランデル（Blundell）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９８０年１０月３０日、287(5785):781-7、マーレイ‐ラスト（Murray-Rust）ら著、「バイオエッセイ（Bioessays）」、１９９２年５月、14(5):325-31、ベダルカル（Bedarkar）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９７７年１２月１日、270(5636):449-51）。本発明の一態様では、インスリンスーパーファミリーのＡ鎖または機能的類似体を、神経疾患を改善するために用いることができる。
【００４９】
図１に例示されているヒトインスリンは、２本のポリペプチド鎖（Ａ鎖及びＢ鎖）を含む非ステロイドホルモンである。全ての脊椎動物において、Ａ鎖は２１個のアミノ酸残基を含み、Ｂ鎖は３０個のアミノ酸残基を含む。Ａ鎖とＢ鎖は、Ａ鎖の７番目のシステインとＢ鎖の７番目のシステイン及びＡ鎖の２０番目のシステインとＢ鎖の１９番目のシステインの２つの分子間ジスルフィド結合によって結合されている。第３の分子内ジスルフィド結合が、Ａ鎖の６番目のシステインと１１番目のシステインで形成されている。ヒトインスリンは、膵臓においてランゲルハンス島のβ細胞によって、１１０個のアミノ酸からなる前駆体ポリペプチド（プレプロインスリン）を経て自然に産生される（チャン・エス・ジェイ（Chan, S. J. ）ら著、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）」、米国、１９７６年、73:1964-1968、シールズ及びブローベル（Sheilds and Blobel）著、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）」、米国、１９７７年、74:2059-2063）。プレプロインスリンの構造は、（ＮＨ２）プレペプチド‐Ｂ鎖‐Ｃペプチド‐Ａ鎖（ＣＯＯＨ）である。ＩＮＳ遺伝子は、１１ｐ１４.１にマッピングされる（チャガンティ（Chaganti）ら著、「ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティックス（Somat. Cell Molec. Genet.）」、１９８５年、11:197-202）。最大４個のアミノ酸の変化を含むヒトインスリンの約１６の突然変異型が、ヒト膵臓内で生成されているのが見出された。
【００５０】
ヒトプレプロインスリン（前駆体）は、様々な翻訳後修飾及び事象を受けて成熟インスリンになる。第１のステップは、プレペプチド（ベル・ジー・アイ（Bell, G. I.）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９７９年、282:525-527）の除去である。プレペプチドは、シグナル配列として合成時に分子（プロインスリン）を小胞体（ＥＲ）、そして分泌経路に案内する役割を果たす。小胞体内に入ると、結果として生じたプロインスリンが折りたたまれ、３つのジスルフィド結合が形成される。次いで、プロインスリンがゴルジ体に送られ、分泌顆粒内にパッケージングされ、内部蛋白分解によって切断され、成熟インスリンになる（ステイナー・ディー・エフ（Steiner, D. F.）ら著、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J. Cell. Biol.）」、１９８４年、24:121-130）。
【００５１】
ヒト起源のインスリンは、膵臓で産生される量が少く分解するため以前から実用的でない。しかしながら、インスリンの構造は、他の動物で高度に保存されているため、インスリン源として他の動物を用いることが可能である。例えば、ウシ及びブタのインスリンはそれぞれ、ヒトインスリンと３個のアミノ酸及び１個のアミノ酸が異なるが、一般にヒトの治療に用いることができる。これにより、ウシ及びブタのインスリンが開発された。多数の合成インスリン相同体が開発された。例えば、ＤＮＡ組換え技術によって作製されたｈｕｍｕｌｉｎは、構造はヒトインスリンと同一であるが作用が遅い。迅速合成インスリン、ｈｕｍａｌｏｇが、特定のリシンとプロリンを交換する或いはＡｓｐ残基をＰｒｏ残基と置換し、溶解性を改善して新規に開発された（ノボ・ノルディック（Novo Nordik）を参照されたい）。ＤＮＡ組換え法により、様々な型の組換えヒトインスリンを合成することができる。これは、線虫及びサッカロミセス‐セレビジエを用いて達成された。初期の技術では、Ａ鎖とＢ鎖を別々に作製する（ゴーデル・ディー（Goeddel, D.）ら著、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）」、米国、１９７９年、76:106-110、チャンスアール・イー（Chance, R. E.）ら著、リック・ディー・エッチ及びグロス・イー（Rich, D. H. & Gross, E.)編集、「ペプチド：合成‐構造‐機能（Peptides: Synthesis-Structure-Function）」、第７回アメリカ・ペプチド・シンポジウム（Proc. Seventh American Peptide Symposium）、１９８１年、pp 721-728、イリノイ州ロックフォードに所在のピアース・ケイミカル社（Pierce Chemical Co.）、フランク・ビー・エッチ（Frank, B. H.）ら著、リック・ディー・エッチ及びグロス・イー（Rich, D. H. & Gross, E.)編集、「ペプチド：合成‐構造‐機能（Peptides: Synthesis-Structure-Function）」、第７回アメリカ・ペプチド・シンポジウム（Proc. Seventh American Peptide Symposium）、１９８１年、pp 729-738、イリノイ州ロックフォードに所在のピアース・ケイミカル社（Pierce Chemical Co.）、スタイナー・ディー・エフ（Steiner, D. F.）ら著、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）」、米国、１９６８年、60:622及びEP-A-0 090 433）。
【００５２】
Ｂ．ＣＮＳにおけるインスリン前駆体
以前はインスリン非依存性器官と考えられていたが、近年の研究結果から、脳内におけるインスリン及び関連分子機構が重要な生理的役割を果たし、学習及び記憶過程に不可欠であろうことが実証された。哺乳動物中枢神経系でインスリンが発見されてから、中枢神経系におけるこのペプチドの役割についての研究が始まった。エネルギー安定性、食欲制御、及び糖尿病におけるインスリン作用の生理的役割は十分に確立されている。しかしながら、インスリンはエネルギー代謝に役割を果たすだけでなく、中枢神経系の機能においても役割を果たしている。
【００５３】
研究結果によれば、インスリンは成人（成体）の脳で産生されるが、その量は多くはない。インスリンの中枢神経への集中は、特定の輸送機構によってＣＮＳ内に進入できる循環ペプチドに依存する（シュワルツ（Schwartz）ら著、「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Am J Physiol）」、１９９０年、E378-83、バンクス（Banks）ら著、「ペプチド（Peptides）」、１９９７年、28:1257-1262）。インスリンはまた、視床下部を介して、または内皮細胞の密着結合の欠乏が血液脳関門で見られる正中隆起などの室周囲器官によって転位する。高レベルのインスリン受容体が、ＣＮＳ全体、特にニューロンに分布する（アンガー（Unger）ら著、「プログレス・イン・ニューロバイオロジー（Prog Neurob）」、１９９１年、36:343-362）。特に濃度が高いのは、学習及び記憶を仲介する構造である海馬である（ハブランコフ（Havrankova）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９７８年、272:827-829、アンガー（Unger）ら著、「ニューロサイエンス（Neuroscience）」、１９８９年、31:143-157、アンガー（Unger）ら著、「ニューロサイエンス（Neuroscience）」、１９９１年、36:343-362）。インスリン結合が、海馬内の例えば歯状回及びＣＡ１錐体細胞で検出され、ホスホチロシン及びインスリン受容体基質１（ＩＲＳ‐１）に結合している（バスキン（Baskin）ら著、「エンドクリノロジー（Endocrinology」、１９９４年、134:1952-1955）。インスリン受容体は、辺縁系、特に学習及び記憶過程に著しく関与する脳領域である海馬内及び内側側頭領域に高度に局在化している（ハフランコフ（Havrankova）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９７８年、272:827-829、ワーザー（Werther）ら著、「エンドクリノロジー（Endocrinology」、１９７年、121:1562-1570、セーラ（Sara）ら著、「ニューラルサイエンス・レターズ（Neuralscience Letters）」、34:39-44）。
【００５４】
脳におけるインスリン受容体局在化プロフィールが、インスリンが認知増強特性を有するためインスリン受容体の破壊またはその活性の低下により学習の低下が起こり得ることを示唆している。実際に、学習及び記憶の深刻な低下が、薬物誘発糖尿病動物（ビーセルズ（Biessels）ら著、「ダイアベティス（Diabetes）」、１９９６年、45:1259-1266）及びＩ型及びＩＩ型糖尿病患者（リャン（Ryan）著、「ダイアベティス・ケアー（Diabetes Care）」、１９８８年、11(1):86-93、オット（Ott）ら著、「ニューロロジー（Neurology）」、１９９９年、53(9):1937-42）で観察された。更に、脳脊髄インスリン及びインスリン受容体のレベルが、加齢により低下し（フローリック（Frolich）ら著、「ジャーナル・オブ・ニューラル・トランスミッション（Journal of Neural Transmission）」、１９９８年、105:423-438）、痴呆患者が極めて高いインスリン血漿レベルを有すること（ストーク（Stolk）ら著、「ダイアベティス・ケアー（Diabetes Care）」、１９９７年、20:792-795）が分かっている。更に、非糖尿病患者の高インスリン血症は、認知障害に関連する（カルミン（Kalmijn）ら著、「ダイアベトロジア（Diabetologia）」、１９９５年、38:1096-1102）。この血漿インスリンの増大は、抹消から脳へのインスリン輸送の異常によると推測される（クラフト（Craft）ら著、「ニューロロジー（Neurology）」、１９９８年、50:164-168、フローリック（Frolich）ら著、「ジャーナル・オブ・ニューラル・トランスミッション（Journal of Neural Transmission）」、１９９８年、105:423-438）。興味深いことに、突発性アルツハイマー病の場合、インスリン受容体伝達機構に障害が起きている（フローリック（Frolich）ら著、「ニューヨーク・アカデミーの科学年代記（Annals of the New York Academy of Sciences）」、１９９９年、893: 290-293）。そして、上記した研究結果に一致して、アルツハイマー病患者の脳脊髄液中のインスリンレベルはコントロールに比べて低いが血漿中のレベルは高い（クラフト（Craft）ら著、「ニューロロジー（Neurology）」、１９９８年、50:164-168）。更に、静脈インスリン投与によりアルツハイマー病に関連した記憶の低下が逆行することが分かった（クラフト（Craft）ら著、「アーク・ゲン・フィジアトリ（Arch Gen Psychiatry）」、１９９９年、56(12):1135-40）。完全長のインスリンは、学習及び記憶に関係するが、本発明の前には、この分子のどの部分がこの活性を引き起こすかは見出されていなかった。本発明は、２１個のアミノ酸からなるＡ鎖が学習と記憶を改善できることを示す。本発明に従えば、Ａ鎖及び／または機能的類似体を患者に投与して神経疾患を緩和できる。一実施形態では、本発明の方法及び組成物で記憶障害を緩和できる。本発明は、インスリンＡ鎖が強力な記憶増強効果を有することを実証する（例４及び例５を参照されたい）。インスリンＡ鎖及び機能的類似体は、学習、記憶、及び認知を改善するために哺乳動物に用いることができる。インスリンＡ鎖及び機能的類似体はまた、学習、記憶、及び認知の障害に関連した神経系疾患を治療するために哺乳動物に用いることができる。更に、インスリンＡ鎖及び機能的類似体はまた、限定するものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、多動症候群（ＡＤＤ）、及び神経精神���状を含め、神経細胞の欠損や機能不全に関連した神経系または神経の疾患を治療するために哺乳動物に用いることができる。
【００５５】
α２‐Ｈｅｒｅｍａｎｓ Ｓｃｈｍｉｄ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ(α２‐ＨＳＧ)またはヒトフェチュインは、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性（ＩＲ‐ＴＫＡ）の内在インヒビターであって、インスリンシグナル伝達の代謝部分に影響を与えることなく、マイトジェン経路（mitogenic pathway）を阻害することが分かっている。α２ＨＳＧは、インスリンシグナル伝達経路に関与する細胞内タンパク質であるＳｈｆのインスリン誘発チロシンリン酸化の強力なインヒビターである。例６に示すように、インスリンアゴニストα２ＨＳＧは、インスリン及びインスリンＡ鎖による連想的学習の促進を阻害し、インスリンＡ鎖の投与に関連した効果がチロシンキナーゼ結合受容体に関係することを実証する。一実施形態では、インスリンＡ鎖及び誘導体は、脳で発現するチロシンキナーゼ結合受容体と相互作用する。インスリンまたはＩＧＦ受容体が形質導入された細胞系を用いて行った実験結果が、Ａ鎖ペプチドがインスリン受容体やＩＧＦ受容体を介して作用しないことを示唆している。従って、インスリンＡ鎖またはその類似体が、脳で高度に発現されるオーファンインスリン受容体関連受容体のリガンドとなり得る。
【００５６】
完全長のインスリンに結合すると、インスリン受容体は自己リン酸化する。インスリン受容体の少なくとも２つのイソ型が同定されている（ウルリック（Ullich）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９８５年、313:756-761）。活性化されると、インスリン受容体が、ＩＲＳタンパク質及びＳｈｃをリン酸化し、これによりＧｒｂ２／ＳＯＳ及びＲａｓ／Ｒａｆ／Ｍｅｋ／ＭＡＰＫ経路が活性化する。インスリンシグナル伝達経路は、限定するものではないが、ＩＲＳ（インスリン受容体基質）、Ｓｈｃタンパク質、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）‐キナーゼ、ＰＫＢ（プロテインキナーゼＢ）などの十分に研究されたタンパク質が関係する。脳におけるインスリンＡ鎖の受容体は、標識されたＡ鎖の投与の後でインサイツでの実験などの当分野で周知の方法で検出することができる。更に別の実施形態では、Ａ鎖または類似体は、インスリンシグナル伝達に関与する下流の受容体或いはタンパク質、例えばＳｈｃと相互作用可能である。
【００５７】
インスリン受容体は、活性化にＩＲＳｓ（インスリン受容体基質１‐３）を必要とする。これらの基質は、中枢神経系内のシナプスの成分であり、細胞内シグナル伝達に一定の役割を果たすであろう。ＩＲＳ‐１及びインスリンｍＲＮＡメッセージは、ニューロン海馬細胞体（neuronal hippocampal cell bodies）及び嗅球で共存し、タンパク質レベルがこれらのニューロンの樹状突起及びシナプス突起で濃縮している（バスキン（Baskin）ら著、「エンドクリノロジー（Endocrinology」、１９９４年、134:1952-1955）。研究結果が、インスリン分子の保存されたアミノ酸５個（ＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３、ＴｙｒＡ１９、ＧｌｙＢ２３、ＰｈｅＢ２４）がインスリン受容体に直接作用し、他のインバリアントなアミノ酸（ＬｅｕＢ６、ＧｌｙＢ８、ＬｅｕＢ１１、ＧｌｕＢ１３、ＰｈｅＢ２５）が受容体結合構造を維持する可能性が高い（コンロン・ジェイ・エム（Conlon J. M.）著、「ペプチド（Peptides）」、２００１年、22(7):1183-1193）。脳におけるＡ鎖ペプチドと類似体と相互作用して神経疾患を緩和する本発明によって実施したチロシンキナーゼ受容体の特定のアイデンティティが特定され、Ａ鎖アミノ酸（ＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３、ＴｙｒＡ１９）が結合に重要である可能性がある。従って、一実施形態では、類似体は、これら３つのアミノ酸（ＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３、ＴｙｒＡ１９）が維持されるように作製する。
【００５８】
長期記憶過程に重要な役割を果たすＲａｓ依存性マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの活性化で、インスリン受容体の刺激が最大になると思われる。自身に対するインスリンの強力な認知増強特性に加えて、このペプチドは、学習及び記憶過程で重要な役割を演じる様々な神経伝達物質を調節する。例えば、インスリンが、シナプトソーム調製物が解離した脳細胞及びニューロン培地でノルエピネフリンの再摂取をブロックする。ソーターら（Sauter）（「ブレイン・リサーチ（Brain Res）」、１９８３年、260:330-333）が、インスリンを誘発する視床下部の切片を用いて中枢カテコールアミンの放出を増大できることを示した。ストレプトゾトシン誘発低インスリン血症により、改変したノルエピネフリン輸送体及びチロシンヒドロキシラーゼｍＲＮＡ（カテコールアミン合成での律速酵素）になる。更に、ストレプトゾトシン誘発糖尿病により、脳の特定の領域におけるエピネフリン及びドーパミンが減少する（パーク（Park）ら著、「２００１・フィジオル・ビヘイブ（2001 Physiol Behav）」、２０００年、68:509-514）。
【００５９】
一実施形態では、Ａ鎖及び類似体が海馬で相互作用し神経疾患が改善される。この相互作用は、記憶障害を改善させ得る。インスリンは、海馬に影響を及ぼすことが知られている。海馬におけるα１アドレナリン性受容体のインスリン刺激により、学習及び記憶に極めて重要な細胞内カスケードに関与するプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化するイノシトールリン酸が蓄積される。
【００６０】
ＩＩ．記憶増強
一態様では、本発明は、記憶障害を改善する方法及び組成物を提供する。従って、本発明の組成物及び方法を用いて、記憶障害の予防、発症の遅延、または治療を行うことができる。本発明は、過去の経験、知識、アイデア、感覚、考え、または印象の精神的記録、保持、または想起を改善することができる。好適な実施形態では、本発明は、短期及び／または長期の情報保持、空間的関係の機能、記憶（暗唱）方法、及び言語の引き出し及び作成能力を改善することができる。インスリンＡ鎖ペプチド及び類似体は、連想的学習及び空間的記憶の両方を改善することが分かった（例４及び例５）。
【００６１】
脊椎動物及び無脊椎動物の学習及び記憶は、一般にシナプス可塑性と呼ばれる、与えられた入力により出力が増強される機構が関係している。このような学習の最も一般的に確立された生理学的モデルが、繰り返される興奮性パルスすなわちチタン刺激（titanic stimuli）により刺激されたシナプスの持続的な増強が起こる長期記憶増強（ＬＴＰ）である。このシナプス増強及びシナプス可塑性の分子機構が解明され始め、データが遺伝子発現の変化が転写活性によって仲介されることを示している。最も確かで裏づけになるデータをもつ転写因子が、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）ファミリーのメンバーである。可塑性の喪失と学習及び記憶障害が、モデル系へのミュータントＣＲＥＢの導入を含む研究及びＣＲＥＢノックアウトマウスの研究で実証された。これとは逆に、ＣＲＥＢの活性化またはＣＲＥＢの過度の発現により、超学習表現型が現れることが分かった。更に、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）は、短期記憶を長期記憶に変換するのに必須であることが示された（フォックス・ケー（Fox,K.）、「ニューロサイエンス（Neuroscience）」、２００２年、111(4):799-814、ジャン（Zhang）ら著、「ニューロサイエンス（Neuroscience）」、２００３年、117(3)707-713、スコット・アール（Scott R.）ら著、「ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（J Mol Neurosci）」、２００２年、19(1-2):171-177）。要するに、ｃＡＭＰ調節性ＣＲＥＢ及びＣＲＥＢが、発現がＬＴＰと学習により開始される転写因子、Ｚｉｆ２６８の発現を調節し得る（例えば、シルバ・エー・ジェイ（Silva AJ.）著、「ジャーナル・オブ・ニューロバイオロジー（J Neurobiol）」、２００３年、54(1):224-237を参照されたい）。従って、本発明に従えば、Ａ鎖ペプチド及びその機能的類似体がｃＡＭＰを増大させることができる。
【００６２】
哺乳動物モデル系において学習及び記憶に影響を与える多数の内在性ペプチドが存在する。その中には、血管作用性小腸タンパク質（ＶＩＰ）、バソプレシンすなわち抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、及び副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）が含まれる。しかしながら、これらの天然ペプチドはそれぞれ、神経内分泌機能に対する影響、及び適用の可能性を制限するような潜在的な不安惹起作用または覚醒効果を含む多形質発現作用を保持する。更に、これらのペプチドは通常、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接送達された場合にのみ効果的である。
【００６３】
ＭＡＰＫファミリーは、増殖信号及びストレス信号の両方に対する細胞内応答を調節することが知られている主な調節タンパク質からなる。ＭＡＰＫｓは、細胞外信号活性化キナーゼ（ＥＰＫ１及びＥＰＫ２）及びストレス活性化ＭＡＰＫｓのサブファミリーを含む複数の酵素からなる。哺乳動物細胞には、（ａ）細胞外信号調節性キナーゼ（ＥＲＫｓ）、（ｂ）ｃ‐Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫｓ）、及び（ｃ）ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫｓ）の３つの異なるＭＡＰＫｓのグループが存在する。
【００６４】
ＰＫＣ活性化因子または他の因子（例えば、遊離細胞内Ｃａ２＋の増大）が、Ｒａｓ／Ｒａｆ‐１と呼ばれる小タンパク質を活性化し、この小タンパク質がＭＥＫｓと呼ばれるＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼを活性化する。そして、ＭＥＫｓがＥＲＫＳを活性化する。ＥＲＫＳが細胞核に対して転位し、そこで、転写因子を活性化させ細胞増殖を調節する。このようなプロテインキナーゼの調節により、ＭＡＰＫカスケードの調節と同様に、神経保護及びニューロン治療効果が生まれる。このようなキナーゼの例として、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１及び２及びそれらの相同体やイソ型、細胞外信号調節性キナーゼ（ＥＲＫｓ）及びそれらの相同体やイソ型（ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＥＲＫ３、ＥＲＫ４）、及びＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼ１及び２またはＭＥＫ１／２として知られるキナーゼ群を挙げることができる。
【００６５】
細胞がストレスを受けると、様々な機構によってプロテインキナーゼが活性化される。例えば、虚血、ＮＭＤＡ（Ｎ‐メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸）、及びアミロイドペプチドがＭＡＰＫを活性化させる。神経組織におけるＭＡＰＫｓの機能的役割の研究結果が、ＭＡＰＫが神経細胞の死及び可塑性の重要な制御因子であることを示唆している。従って、ＭＡＰＫ活性化が、海馬の長期記憶増強（ＬＴＰ）に必要である。本発明のＡ鎖ペプチド及び類似体は、ＭＡＰキナーゼの産生、分泌、及び／または脳における活性を増大させたり、長期記憶に関連した、ｐ４２ＭＡＰキナーゼの核転位を伴う細胞外信号調節性プロテインキナーゼ（ＥＲＫ）／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰ）キナーゼ経路を活性化させることができる。
【００６６】
従って、本発明の組成物及び方法は、海馬依存性の学習を改善することができる。一実施形態では、本発明の組成物及び方法は、連想的学習を改善することができる。別の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、空間的記憶を改善することができる。例４及び例５に示されているように、共に海馬依存性である連想的学習及び空間的記憶に対する中枢に投与されたＡ鎖の影響を、ラットで受動的回避（ＰＡ）及びモリス水迷路試験（Morris Water Maze）パラダイムを用いて調べた。Ｂ鎖及び担体のみのコントロールに比べ、鼻腔内投与されたＡ鎖がＰＡ課題における滞在時間を改善した。ＭＷＭにおける空間的記憶に対するＡ鎖の影響の評価から、このペプチドが、トレーニングの４８時間後にコントロールラットに比べて台に到達する時間を有意に短縮したことが分かった。
【００６７】
薬物の中枢投与は、臨床応用に対する並進運動の大きな問題を提起する。全身投与によって起こる副作用の可能性は、鼻腔投与によって回避することが可能である（ボーン・ジェイ（Born J）ら著、「ネイチャー・ニューロサイエンス（Nat Neurosci.）」、２００２年６月、5(6):514-6）。作業記憶を仲介する脳の領域が、インパルス及び自発運動の制御も行う。例４及び例５に示されているように、Ａ鎖ペプチド及び類似体の鼻腔内投与によりＰＡ検査で滞在時間が改善された。有毒全身作用は全く観察されなかった。例３及び例７に示されているように、Ａ鎖は血糖値及び歩行活動に影響を及ぼさなかった。
【００６８】
ＩＩＩ．Ａ鎖ペプチド及び類似体
一実施形態では、配列番号１の配列を含むＡ鎖ペプチド及びその活性な類似体は、限定するものではないが、溶解性、安定性、及び親油性などの薬学的に適切な特性を改善することができるアミノ酸残基及び非アミノ酸残基と合成することができる。好適な実施形態では、Ａ鎖は、親油性を改善するべくＮ末端に付加されるステアリン酸残基（例えば、遊離脂肪酸、アダマンタン、またはジヒドロピリジン）と合成することができる。追加のアミノ酸残基及び非アミノ酸残基は、当分野で周知であり上記の通りである。Ａ鎖ペプチド及び類似体の生物学的活性は、例のセクションに記載され確認することができる。
【００６９】
本発明は、Ａ鎖と、Ａ鎖の生物学的活性または機能を示すＡ鎖ペプチド変異体に関する。この生物学的活性または機能には、改善された活性または低減された不所望の活性を含み得る。Ａ鎖の機能のアッセイは、例のセクションに記載する。Ａ鎖変異体には、Ａ鎖の機能的な類似体、誘導体、断片、及び擬似体（mimetics）が含まれる。本発明は更に、ランダムに得られた化合物及び合理的にデザインされた候補化合物の群からＡ鎖の機能的な類似体、断片、及び擬似体を選択する方法を含む。ここに開示する方法によって選択される化合物は、Ａ鎖の生物学的活性または機能を有する。
【００７０】
Ａ鎖ペプチドの断片、誘導体、類似体、または擬似体は、（１）１または複数のアミノ酸残基が保存されたアミン酸残基または保存されていないアミノ酸残基で置換されたもの、（２）１または複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、（３）成熟ペプチドがその半減期を長くする化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物に融合されたもの、（４）追加のアミノ酸が、リーダー配列または分泌配列、或いは成熟ペプチドまたはプロペプチド配列の精製に用いられる配列などの成熟ペプチドに融合されたもの、（５）配列番号１よりもアミノ酸残基の数が少ないまたは多く、Ａ鎖の活性特性を有するものとすることができる。このような断片、誘導体、類似体、または擬似体は、本明細書の説明から当業者の範囲内と見なす。
【００７１】
本発明は、相同なＡ鎖を含むものとする。一態様では、リラキシンのＡ鎖または類似体を用いて神経疾患を緩和することができる。リラキシンは、妊娠中に卵巣の黄体で合成及び貯蔵され、分娩の前に血流に放出される。卵巣の入手し易さにより、ブタ、ラット、及びサメなどの異なる種からリラキシンの単離及びアミノ酸配列決定を行うことができた。生物学的に活性なホルモンは、２つのペプチド間ジスルフィド結合と１つのペプチド内ジスルフィド結合によって互いに結合された２つのペプチド鎖（Ａ鎖及びＢ鎖として知られている）からなる。従って、この構造は、ジスルフィド結合の配置がインスリンに極めて類似しているため、これらのホルモンが共通の祖先をもつ遺伝子であると推測される（ジェームス（James）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９７７年、267,544-546）。例えば、本発明に有用なヒトリラキシンＨ１の配列は、添付の配列表に示されている配列番号２の配列を含む。配列番号２の配列の類似体も本発明に包含される。
【００７２】
ＤＮＡ組換え技術を用いて、ラットとブタのリラキシンの両方についてｃＤＮＡクローンを単離した（ハドソン（Hudson）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９８１年、291,127-131、豪州特許出願第１１８３４/８３号（ＰＦ ２６９６/８２）を参照されたい）。リラキシン構造遺伝子は、両方のリラキシンについて、全体の構造がプレプロインスリンに類似した１本鎖前駆体すなわちシグナルペプチド／Ｂ鎖／Ｃペプチド／Ａ鎖をコードすることが分かった。豪州特許出願第１７９０６／８３号（１９８２年８月１２日出願、ＰＦ５３５２／８２）に、ヒトリラキシンをコードする遺伝子配列の分子クローニング及び特徴付けが開示されている。米国特許第４，７５８，５１６号に、ヒトプロリラキシン、プレプロリラキシン、及びヒトリラキシンのＡペプチド鎖、及び／またはＢペプチド鎖、及び／またはＣペプチド鎖の発現のための遺伝子及びＤＮＡ伝達ベクターが開示されている。別の態様では、インスリン様タンパク質のＡ鎖を用いて神経疾患を緩和することができる。インスリン様タンパク質（ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５、ＩＮＳＬ６、及びＩＮＳＬ７／Ｈ３ Ｒｅｌａｘｉｎ）は、インスリン、リラキシン、及びインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ１）及びＩＩ（ＩＧＦ２）を含むインスリン様ホルモンスーパーファミリーに属する。
【００７３】
Ａ．Ａ鎖類似体の同定
当業者であれば、Ａ鎖ペプチドのこのような断片、誘導体、類似体、または擬似体を、１または複数のアミノ酸を置換、付加、または欠失するように天然の配列を改変して作製することができるであろう。このような改変は、このペプチドの折りたたみや活性に著しい影響を与えないような保存的なアミノ酸置換などの軽度のものが好ましい。例えば、トレオニンなどの１つの極性アミノ酸を、セリンなどの別の極性アミノ酸に置換したり、アスパラギン酸などの１つの酸性アミノ酸をグルタミン酸などの別の酸性アミノ酸に置換したり、リシン、アルギニン、またはヒスチジンなどの１つの塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置換したり、アラニン、ロイシン、またはイソロイシンなどの１つの非極性アミノ酸を別の非極性アミノ酸に置換することができる。どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントになるかについては、ボーイ・ジェイ・ユー（Bowie, J. U.）ら著、「タンパク質配列のメッセージの解析：アミノ酸置換の許容（Deciphering the Message in Protein Sequences : Tolerance to Amino Acid Substitutions）」、サイエンス（Science）、１９９０年、247:1305-1310に記載されている。もちろん、当業者が行うアミノ酸置換の数は様々な因子による。
【００７４】
更に、機能に必須のＡ鎖アミノ酸を特定することができ、変異体は、オリゴヌクレオチド仲介性（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ変異誘発などの当分野で周知の方法で作製することができる。部位特異的変異誘発（カーター（Carter）ら著、「ニュークリック・アシッヅ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１９８６年、13:4331、ゾーラー（Zoller）ら著、「ニュークリック・アシッヅ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１９８７年、10:6487）、カセット変異誘発（ウェルズ（Wells）ら著、「ジーン（Gene）」、１９８５年、34:315）、制限選択変異誘発（ウェルズ（Wells）ら著、「Philos. Trans. R. Soc. London Ser. A」、１９８６年、317:415）、または他の既知の技術をクローンＤＮＡに対して行ってＡ鎖変異体ＤＮＡを作製することができる。
【００７５】
変異誘発のためのＡ鎖アミノ酸残基または領域を特定するためのある周知の方法は、「アラニンスキャニング変異誘発（alanine scanning mutagenesis）」として知られている（例えば、カニンハム及びウェルズ（Cunningham and Wells）著、「サイエンス（Science）」、１９８９年、244:1081-1085を参照されたい）。この方法では、アミノ酸残基または標的残基の群を特定し（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置換し、細胞内または細胞外の周囲の水環境とアミノ酸との相互作用に影響を与える。置換に対して機能的感受性を示すこれらのドメインを、置換部位に追加の残基または代替の残基を導入して精製する。従って、アミノ酸配列変異体を導入する標的部位を決定し、対応するＤＮＡ配列の標的コドンまたは領域に対してアラニンスキャニングまたはランダム変異誘発を実施し、発現したＡ鎖類似体を、所望の活性と活性の程度の最適な組み合わせについてスクリーニングする。
【００７６】
アミノ酸スキャニング分析を用いて、連続した配列に沿って１または複数のアミノ酸を特定することができる。スキャニングに好ましいアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインが含まれる。この中で、通常はアラニンがスキャニングするアミノ酸として好ましい。なぜなら、アラニンは、βカーボンの先の側鎖を除去し、変異体の主鎖の高次構造を変化させる可能性が低いからである（カニンハム及びウェルズ（Cunningham and Wells）著、「サイエンス（Science）」、１９８９年、244:1081-1085）。アラニンが好ましい理由はまた、アラニンが最も一般的なアミノ酸だからである。更に、アラニンは、埋没した位置及び露出した位置の両方で頻繁に発見される（クレイトン（Creighton）著、「ザ・プロテインズ（The Proteins）」、ニューヨーク州のダブリュウ・エッチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W. H. Freeman & Co.)、コーシア（Chothia）著、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）」、１９７６年、150:1）。アラニンの置換で十分な量の変異体が得られなかった場合は、イソテリック（isoteric）アミノ酸を用いることができる。
【００７７】
初めは、部位を比較的保存的な形で置換することができる。このような置換により生物学的活性に変化があったら、更なる変化（典型的には置換）を導入し、かつ／または他の付加や欠失を実施し、得られた物質を活性についてスクリーニングする。非保存的な置換には、これらのクラスの１つのメンバーを他のクラスに変えることが含まれる。このような置換された残基は、保存的な置換部位、より好ましくは残りの（非保存的）部位に導入することもできる。
【００７８】
本発明のペプチドは、任意の好適な方法で作製することができる。このようなペプチドには、単離された自然発生のペプチド、組換えにより作製されたペプチド、合成により作製されたペプチド、またはこれら３つの方法の組み合わせにより作製されたペプチドが含まれる。このようなペプチドを作製する方法は当分野で周知である。
【００７９】
本発明のペプチドは、ランダムなペプチドまたは対象のペプチドの大きな集団すなわちライブラリーをスクリーニングして同定することができる。ペプチドのライブラリーには、例えば、ペプチド及びペプチド擬似分子を含む標識化学ライブラリーが含まれる。ペプチドライブラリーには、ファージディスプレイ技術によって生成されたペプチドも含まれる。ファージディスプレイ技術には、ファージ表面におけるペプチド分子の発現、並びにタンパク質リガンドがペプチドをコードする核酸に結合する或いは結合可能な他の方法も含まれる。発現するペプチドの集団を多様化させる方法及びベクターを含むファージディスプレイライブラリーの作成方法は当分野で周知である（例えば、言及することを以って本明細書の一部とするヒュース（Huse）によるＷＯ９１／０７１４１及びＷＯ９１／０７１４９、スミス及びスコット（Smith & Scott）著、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol）」、１９９３年、217:228-257、スミス及びスコット（Smith & Scott）著、「サイエンス（Science）」、１９９０年、249:386-390を参照されたい）。これらの方法または他の周知の方法を用いて、例えば後述する方法でディスプレイされたペプチドを活性のために切断及びアッセイできるファージディスプレイライブラリーを作成することができる。所望に応じて、ペプチドの集団を活性についてアッセイし、活性な集団を分類し、このアッセイを繰り返して集団から活性なペプチドを単離することができる。ペプチドを作製する本発明に有用な他の方法には、例えば、Ａ鎖の活性な断片のアミノ酸配列に基づいた変異誘発及び合理的な設計が含まれる。
【００８０】
研究結果により、Ａ鎖アミノ酸であるＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３、及びＴｙｒＡ１９が結合に重要であることが示された。従って、一実施形態では、３つのアミノ酸残基ＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３、及びＴｙｒＡ１９が残るように類似体を作製することができる。完全長インスリンの構造と活性の関係に基づいて、Ａ鎖の８番目のアミノ酸（Ａ８）すなわち（ＴｈｒＡ８）アミノ酸を、受容体基質親和性を調節するために重要であることを見出した。ＴｈｒＡ８をＨｉｓＡ８またはＡｒｇＡ８に置換した置換類似体が改善された安定性を示し、ＬｙｓＡ８に置換した類似体は改善された活性を示した（ウェイス（Weiss）ら著、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）」、２００２年、315(2):103-11）。従って、ＨｉｓＡ８、ＡｒｇＡ８、またはＬｙｓＡ８アミノ酸で置換した類似体は本発明に包含される。加えて、ＳｅｒＡ７、ＳｅｒＡ２０、ＣｙｓＡ６、及びＣｙｓＡ１１を含むインスリン類似体（リ・フレム（Le Flem）ら著、「バイオオーガニック・アンド・メディカル・ケミストリー（Bioorg. Med Chem.）」、２００２年、10, 2111-2117）も本発明に包含される。添付の配列表に示されている配列番号３の配列すなわちヒトインスリンＡ鎖の配列を含む類似体を本発明に用いることができる。
【００８１】
加えて、限定するものではないが、モルモット（Caviaporcellus）、チンチラ（Chinchilla brevicaudata）、カシラグア（casiragua）（Proechimys guairae）、ヌートリア（Myocastor coypus）、ヤマアラシ（Hystrix cristata）、クイ（cuis）（Galea musteloides）、デグー（Octodon degus）、硬骨魚類：コイ（Cyprinus carpio）、パク（Piaractusmesopotamicus）、ヒラメ（Platichtllysflesus）、ティラピア（Oreochromisnilotica）、エンゼルフィッシュ（Lophius americanus）、タラ（Gaduscallarias）、トードフィッシュ（Opsanus tau）、カジカ（Cottusscorpius）、ギンザケ（Oncorhynchus kisutch）、エレファントノーズフィッシュ（Gnathonemus petersii）、ウナギ（Anguilla anguilla）、レピゾステウス目：ガー（Lepisosteus spatula）、アミア目：ボウフィン（Amia calva）、チョウザメ目：ヘラチョウザメ（Polyodon spatula）、チョウザメ（Scaphirhynchus albus及びAcipenser guldenstaedti）、多鰭目：ビチャー（Polypterus senegalis）、ギンザメ類：ギンザメ（Hydrolaguscolliei）、アイゴ（Chimaera monstrosa）、ゾウギンザメ（Callorhynchusmilii）、板鰓類：シビレエイ（Torpedo marmorata）、アブラツノザメ（Squalus acanthias）、トラザメ（Scyliorhiraus canicula）、シュモクザメ（Sphyrna lewinii）、無顎類：例えばヤツメウナギ（Petromyzon marinus）、カワヤツメ（Lampetra fluviatilis）、タイセイヨウメクラウナギ（Myxine glutinosa）を含め、本発明に有用な更なるＡ鎖ペプチドの配列を当分野で見つけることができる（コンロン・ジェイ・エム（Conlon J. M.）著、「ペプチド（Peptides）」、２００１年、22:1183-1193を参照されたい）。加えて、本発明に有用なインスリンスーパーファミリーに属するペプチドの配列は当分野で見出すことができる（クレー（Claey）ら著、「ペプチド（Peptides）」、２００２年、23:807-816を参照されたい）。
【００８２】
本発明に有用なＡ鎖の活性な類似体は、当分野で周知の方法で単離または合成することができる。このような方法には、ＤＮＡ組換え法及びペプチド生成のための化学合成法が含まれる。好適な宿主細胞におけるペプチドをコードする核酸配列の発現によりペプチドを生成する組換え法は当分野で周知である（例えば、言及することを以って本明細書の一部とする、サンブルック（Sambrook）ら著、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第２版、第１−３巻、ニューヨーク州のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）１９８９年を参照されたい）。
【００８３】
Ｂ．Ａ鎖及び類似体の生成
本発明に有用なＡ鎖ペプチドまたはその機能的な類似体は、例えば固相ペプチド合成法（言及することを以って本明細書の一部とする、メリーフィールド（Merrifield）ら著、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（J. Am. Chem. Soc.）」（１９６４年、85:2149）を用いて化学合成により生成することができる。当分野で周知の標準液法を用いても、本発明に有用なペプチドを合成することができる（例えば、言及することを以って本明細書の一部とする、ボダンスキー（Bodanszky）著、「ペプチド合成の原理（Principles of Peptide Synthesis）」（ベルリンのスプリンガー‐ベーラグ（Springer-Verlag, Berlin）、１９８４年）、及びボダンスキー（Bodanszky）著、「ペプチド化学（Peptide Chemistry）」（ベルリンのスプリンガー‐ベーラグ（Springer-Verlag, Berlin）、１９９３年）。新規に合成したペプチドは、例えば高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって精製し、例えば質量分析またはアミノ酸配列分析で特徴付けることができる。
【００８４】
加えて、Ａ鎖の機能的な類似体、誘導体、断片、または擬似体もペプチドシンセサイザーによって合成することができる。更に、所望に応じて、非典型的なアミノ酸または化学アミノ酸類似体を、Ａ鎖配列への置換または付加として導入することができる。非典型的なアミノ酸には、限定するものではないが、一般的なアミノ酸のＤ型異性体、αアミノイソブチル酸、４アミノブチル酸、Ａｂｕ,２アミノブチル酸、γＡｂｕ,εＡｈｘ,６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ,２アミノイソブチル酸、３アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔブチルグリシン（t-butylglycine）、ｔブチルアラニン（t-butylalanine）、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン（cyclohexylalanine）、βアラニン、フルオロアミノ酸や、βメチルアミノ酸、Ｃ‐αメチルアミノ酸、及びＮ‐αメチルアミノ酸などの「デザイナー」アミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体が含まれる。更に、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）のどちらでも良い。
【００８５】
生物学的機能を損なわずにＡ鎖の機能的な類似体、誘導体、断片、または擬似体に限定的な改変を行うことができることを理解されたい。従って、活性や機能を損なわないＡ鎖の機能的な類似体、誘導体、断片、または擬似体の改変は、Ａ鎖の機能的な類似体、誘導体、断片、または擬似体の定義に含まれる。改変には、例えば、アミノ酸残基の付加、欠失、または置換、アミノ酸の構造または機能に似せた化合物の置換、及びアミノ基やアセチル基などの化学成分の付加などが含まれる。
【００８６】
特に有用な改変は、例えば安定性を増大させる改変である。例えば、１または複数のＤ型アミノ酸の付加、またはリシンの置換や欠失により、ペプチド分解を保護してＡ鎖の活性な類似体、誘導体、断片、または擬似体の安定性を増大させることができる。リシン残基の置換や欠失により、当分野で周知のようにトリプシン様プロテアーゼに対する耐性を増大させることができる（パートリッジ（Partridge）著、「脳へのペプチド薬物送達（Peptide Drug Delivery to the Brain）」、ニューヨーク州のレイブン・プレス（Raven Press, New York）、１９９１年）。このような置換により安定が増大し、従ってペプチドの生物学的利用能が増すが、活性には影響を与えない。
【００８７】
有用な改変には、親油性を増大させるすなわち水素結合を減少させる改変などの血液脳関門を通るペプチドの通過を促進する改変もある。例えば、ペプチドのＣ末端に付加されるチロシン残基は、疎水性及び血液脳関門に対する通過性を増大させ得る（例えば、言及することを以って本明細書の一部とするバンクス（Banks）ら著、「ペプチド（Peptides）」、１９９２年、13:1289-1294、パートリッジ（Partridge）、前出、１９９１年、を参照されたい）。例えば、生物学的安定性が増大した或いは血液脳関門に対する通過性が増大したキメラペプチド医薬品は本発明の方法に有用となり得る。
【００８８】
市販のＤＮＡシンセサイザーで十分に自動化されたペプチド合成のような固相合成を含め、ペプチドを化学的に合成する様々な方法が知られている（例えば、イタクラらによる米国特許第４，５９８，０４９号、カルーザーズ（Caruthers）らによる米国特許第４，４５８，０６６号、及びイタクラらによる米国特許第４，４０１，７９６号及び同第４，３７３，０７１号を参照されたい）。例えば、１９８４年に、宣伝広告に示されているようにアプライド・バイオシステムズ・モデル３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー（Applied Biosystems Model 380A DNA Synthesizer）を用いて１００塩基を超えるヌクレオチド配列が容易に合成された（例えば、「ジェネティック・エンジニアリング・ニュース（Genetic Engineering News）」、１９８４年１１月／１２月、ｐ３）。このようなオリゴヌクレオチドは、とりわけ本明細書で後述する技術を用いてスプライシングして、ここに開示する全てのヌクレオチド配列を作製することができる。例えば、３’または５’セグメントが相補配列を越えて延びた比較的短い相補オリゴヌクレオチドを合成することができる。次の短いオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする「粘着」端部を備えた、複数のこのような短いセグメントを作製し、リガーゼを用いて連続的なオリゴヌクレオチドを互いに接合して、直接合成の範囲を越えた長さの長いオリゴヌクレオチドを作製することができる。更に、ここに開示したあらゆるペプチドを直接合成できる自動化装置を利用することもできる。このような装置により、直接合成して或いは複数の断片を合成してこれらを他の周知の技術で結合して本発明のペプチドを作製することができる。
【００８９】
配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示されている特定のペプチド配列に加えて、これらの配列に基づきこれらの変異体である他のペプチドもＡ鎖に類似した生物学的活性を有し得る。更なる外来アミノ酸を、コアタンパク質の両末端または一方の末端或いはその切断部に付加することができる。このように追加する配列は、例えば精製を促進することができたり、新規の活性を有する融合タンパク質の作製に用いることもできる。
【００９０】
分子のＡ鎖配列を含む部分内では、生物学的活性を維持するために、アミノ酸の置換はより制限される。しかしながら、前記したペプチド及びＤＮＡ分子の変異体もまた、当業者には明らかなように、詳細を後述するこれらのペプチド及びＤＮＡ分子の等価物と考えられる。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、またはトレオニンとセリンの１つの置換や、あるアミノ酸と構造的に関連したアミノ酸（すなわち、保存的な変異）との類似の置換が得られる分子の生物学的活性に大きな影響を及ぼさないと推定するのが合理的である。保存的な置換は、側鎖が関連したアミノ酸ファミリー内で行うことができる。遺伝子コードされるアミノ酸は、（１）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性：リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、（４）非荷電：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンの４つのファミリーに分類することができる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることもある。同様に、アミノ酸はまた、（１）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性：リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）脂肪族：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン（但し、セリンとトレオニンは脂肪族水酸基として別に分類することもできる）、（４）芳香族：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、（５）アミド：アスパラギン、グルタミン、（６）硫黄含有：システイン、メチオニンに分類することもできる（例えば、エル・ストライヤー（L. Stryer）著、「生化学（Biochemistry）」、第２版、ダブリュウ・エッチ・フリーマン・アンド・カンパニー（WH Freeman and Co）、１９８１年を参照されたい）。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的なＡ鎖配列になるか否かは、そのペプチドをコードする対応ＤＮＡが、真核細胞によって発現される場合にＡ鎖ペプチドを含む形態のペプチドを発現できるかの評価によって簡単に決定することができる。２つ以上置換されたペプチドも同様の方法で検査することができる。
【００９１】
ペプチド配列、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列における「精製された」とは、他のタンパク質などの同じ種類の他の生体巨大分子が実質的に含んでいないことを指す。本明細書に用いる用語「精製された」は、同じ種類の生体巨大分子が、好ましくは少なくとも８０ｗｔ％、より好ましくは少なくとも９５ｗｔ％、最も好ましくは少なくとも９９ｗｔ％存在することを意味する（但し、水、緩衝剤、及び他の小分子、特に分子量が１０００未満の分子が存在してもよい）。本明細書に用いる用語「純粋な」は、上記した「精製された」と同様に数値的な制限を有する。本明細書に用いる用語「単離された」は、ペプチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子が、天然起源の巨大分子に存在する他のペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡから分離されたことを指す。「単離された」及び「精製された」は、自然の状態の天然物質や、成分に分離されていても（例えば、アクリルアミドゲル中で）純粋物質または純粋溶液ではない天然物質を含まない。
【００９２】
２つのタンパク質配列が相同（本明細書では好んでこの「相同」を用いる）であるとは、ギャップペナルティーが６（またはそれ以上）で、変異データマトリックスを備えたプログラムＡＬＩＧＮによるアラインメントスコア＞５（標準偏差単位）の場合である。これについては、「タンパク質の配列及び構造のアトラス（Atlas of Protein Sequence and Structure）」（デイホフ・エム・オー（Dayhoff, M. O.）著、１９７２年、第５巻、ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデーション（National biomedical Research Foundation）、ｐ101-110）及びこの巻の付録２のｐ1-10を参照されたい。２つの配列（またはその一部：恐らく少なくともアミノ酸３０個の長さ）は、上記したＡＬＩＧＮプログラムで最適にアラインメントされたときにそれらのアミノ酸が５０％以上の同一性を有する場合に、より好ましい相同である。２つのＤＮＡ配列（またはＤＮＡ配列とＲＮＡ配列）は、４０％〜５０％ホルムアミド、３７℃〜４２℃、４×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件、１×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ、３７℃に等しいストリンジェントな洗浄条件（２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ、室温で複数回洗浄した後）の下で、ニトロセルロースフィルター・ハイブリダイゼーション（一方の配列がフィルターに結合され、他方の配列は３２Ｐ標識プローブとして）で互いにハイブリダイズした場合に相同である。
【００９３】
ここに開示したあらゆる巨体分子の塩は、このような分子が様々なｐＨの溶液に存在する時（または溶液から単離された時）に自然に発生する。示された生物学的活性を有するペプチド及び他の巨大分子のあらゆる塩は、本発明の範囲に包含されるものとする。このような塩として、カルボン酸残基のアルカリ塩、アルカリ土類塩、及び他の金属塩、アミノ酸残の酸付加塩（例えば、ＨＣｌ）、同じ分子内のカルボン酸とアミノ残基との間の反応によって形成される双性イオンを挙げることができる。
【００９４】
本発明は、具体的には、配列番号１‐３に示されているアミノ酸配列及び可能な保存的なアミノ酸置換に基づいた組み合わせの選択によって得られる全ての可能なペプチド変異体を含む。このような変異体については既に具体的に説明した。
【００９５】
本発明の範囲内には、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知のブロック／保護基による誘導体化、蛋白分解切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などによって、翻訳中または翻訳後に差次的に修飾されたＡ鎖の活性な類似体、誘導体、断片、または擬似体が含まれる。このような全ての化学修飾は、限定するものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特殊な化学切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンなどの存在下での代謝合成を含め、従来の技術で実施することができる。本明細書に用いる用語「Ａ鎖」及び／または「Ａ鎖ペプチド」は、本アミノ酸配列（配列番号１）のみならず、その様々な誘導体及び変異体を含むものとする。
【００９６】
更に、本発明のペプチドは、アミノ末端またはカルボキシ末端が別のタンパク質のアミノ酸配列にペプチド結合によって結合したＡ鎖またはその類似体、誘導体、断片、擬似体を含むキメラタンパク質または融合タンパク質とすることができる。一実施形態では、このようなキメラタンパク質は、このタンパク質をコードする核酸の組換え発現によって作製することができる。このようなキメラ産物は、当分野で周知の方法で所望のアミノ酸配列をコードする好適な核酸配列を適切な遺伝子のエキソンフレームになるように互いに結合させて、当分野で周知の方法でキメラ産物を発現させて得ることができる。別法では、このようなキメラ産物は、例えばペプチドシンセサイザーを用いるタンパク質合成技術によって作製することもできる。
【００９７】
ＩＶ．治療への使用
本発明の一態様では、Ａ鎖及び類似体は、神経疾患の治療及び予防的治療に用いることができる。神経疾患は、限定するものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、癲癇、多動症候群（ＡＤＤ）、及び神経精神症状を含め、神経細胞の欠損や機能不全に関連し得る。一実施形態では、神経疾患は神経変性疾患である。別の実施形態では、神経疾患は、発作、卒中、脳虚血、癲癇を含む群から選択される。好適な実施形態では、神経疾患は記憶障害である。本発明はまた、注意障害を緩和するために用いることができる。作業記憶を仲介する脳の領域は、注意を持続する能力（すなわち覚醒状態）も調節している。
【００９８】
本発明の化合物は、（１）限定するものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、多動症候群（ＡＤＤ）、及び神経精神症状を含め、神経細胞の欠損や機能不全に関係する疾患、障害、または症状、または（２）インビトロ（またはインビボ）アッセイが本発明のペプチドが有用であると示す疾患、障害、または症状の治療または予防のために投与することができる。
【００９９】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、変性脳疾患であって、加齢と共に発症率が急速に上昇する。脳細胞の一定集団が徐々に死滅する。死滅するのは、特に、神経伝達物質としてアセチルコリンを使用する脳細胞であるが、これに限定されるものではない。近年、最新のイメージ技術により、アルツハイマー病が進行するにつれて海馬（一般的にはヒトの学習及び記憶、そして動物のある種の空間的学習にとって必須の構造）を含む内側側頭葉領域がどのように徐々に収縮するがが明らかにされた。アルツハイマー病の原則的な症状は、記憶（特に最近のエピソード記憶）などの認知機能の着実かつ漸次的喪失、適切な語を探す能力などの言語及び会話の問題、及び注意力の問題である。別の最も一般的な痴呆である多発梗塞性痴呆は、同様の病像を有する場合が多いが、一連の小さな卒中によるため、その進行がより段階的である。本発明の一態様では、Ａ鎖ペプチドまたは機能的類似体を用いて、発症を遅らせたり、症状を緩和したり、アルツハイマー病を治療することができる。一実施形態では、本発明の方法及び組成物を用いて、ＭＣＩからアルツハイマー病への移行を遅らせる或いは止めることができる。
【０１００】
本発明の別の態様では、Ａ鎖及び機能的類似体を、記憶障害の治療及び予防的治療に用いることができる。Ａ鎖及び類似体は、記憶障害を緩和するために用いることができる。Ａ鎖または類似体で学習及び／または認知を改善できるのが好ましい。記憶障害は、過去の経験、知識、アイデア、感覚、考え、または印象の精神的記録、保持、想起の低下を指す。記憶障害は、短期及び／または長期の情報保持、空間的関係の機能、記憶（暗唱）方法、及び言語の引き出し及び作成能力に影響を与える。用語「記憶障害」は、痴呆、学習遅滞、及び集中困難が含まれる。記憶障害の一般的な原因は、加齢、重度の頭部傷害、脳無酸素症、脳虚血、アルコール性栄養障害、薬物中毒、及び神経変性疾患である。例えば、記憶障害は、アルツハイマー病（すなわち、アルツハイマー型痴呆）などの神経変性疾患の一般的な特徴である。記憶障害はまた、ＡＩＤＳ痴呆、ウェルニッケ‐コルサコフ関連痴呆（アルコール誘発性痴呆）、加齢関連痴呆、多発梗塞性痴呆、脳血管障害による老人性痴呆、及びパーキンソン病に関連した或いは関連しないアルツハイマー病のレーヴィ小体変異などの他の種類の痴呆でも起こる。記憶の喪失はまた、脳損傷患者の一般的な特徴である。記憶障害を引き起こし得る脳損傷の原因には、限定するものではないが、発作、卒中、麻酔事故、虚血、無酸素症、低酸素症、脳水腫、動脈硬化症、血腫、または癲癇、脊髄細胞喪失、末梢神経疾患、頭部外傷、低血糖症、一酸化炭素中毒、リチウム中毒、ビタミン（Ｂ１、チアミン、及びＢ１２）欠乏、または過度のアルコール摂取が含まれる。
【０１０１】
Ａ．送達方法
様々なデリバリーシステムが知られており、本発明の治療薬の投与に用いることができる。このようなデリバリーシステムには、リポソーム封入、微小粒子、微小カプセル、組換え細胞による発現、受容体仲介性エンドサイトーシス（例えば、ウー及びウー（Wu & Wu）著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケイミストリー（J Biol. Chem）」、１９８７年、265:4429-4432）を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療用核酸の構造が含まれる。導入する方法には、限定するものではないが、皮内投与、筋内投与、腹膜内投与、静脈内投与、皮下投与、鼻腔内投与、及び経口投与がある。本化合物はあらゆる便利な経路で投与することができ、例えば、注入または大量瞬時投与、または上皮や粘膜皮膚（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、及び小腸粘膜）から吸収されるように投与し、他の生物学的に活性な作用物質と共に投与することもできる。投与は、全身または局所とすることができる。加えて、脳室内注入及びクモ膜下注入を含む任意の好適な経路から本発明の薬学的組成物を中枢神経に送達するのが好ましい。脳室内注入は、例えば、オマヤレザバーなどのレザバーに取り付けられた脳室カテーテルを用いると容易に行うことができる。
【０１０２】
ある実施形態では、本発明の薬学的組成物を治療が必要な領域に局所的に投与するのが理想的である。これは、限定するものではないが、例えば、手術中の局所注入、手術後に例えば創傷包帯で局所適用、注射、カテーテル投与、座薬式、またはインプラントによって達成することができる。インプラントは、シアラスティック膜などの膜や繊維を含め、多孔性、非多孔性、またはゲル状材料とすることができる。
【０１０３】
治療薬がＡ鎖ペプチドをコードする核酸または類似体治療薬である実施形態では、この核酸をインビボ投与して、その核酸によってコードされるＡ鎖ペプチドの発現を促進することができる。これは、この核酸を好適な核酸発現ベクターの一部とし、例えば、レトロウイルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、直接注入、微小粒子照射（例えば、遺伝子銃：Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、デュポン社）、脂質、細胞表面受容体、または形質転換剤によるコーティング、核内に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドに結合させた投与（例えば、ジョリオット（Joliot）ら著、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）」、米国 、１９９１年、88:1864-1868）などによって、細胞内に入るようにして達成できる。別法では、核酸治療薬を細胞内に導入して、宿主細胞のＤＮＡ内に組み込んで相同組換えによって発現させることもできる。
【０１０４】
本発明の薬物の改善された送達及び投与の別の方法として、この薬物が膜、具体的には血液脳関門を通過する能力を改善するための手段を挙げることができる。当業者であれば、例えば、脳微小血管内皮細胞培養系に基づいた血液脳関門のモデル（例えば、言及することを以って本明細書の一部とする、ボーマン（Bowman ）ら著、「アナルズ・オブ・ニューロロジー（Ann. Neurol.）」、１９８３年、14:396-402、またはタカフラ（Takahura）ら著、「アドバンス・イン・ファーマコロジー（Adv. Pharmacol.）」、１９９２年、22:137-165）を用いて、インビボで血液脳関門を通過するＡ鎖の活性な類似体、誘導体、断片、または擬似体の能力を容易にアッセイすることができる。一実施形態では、この薬物を血液脳関門を通過する能力を高めるために改変することができる。代替の実施形態では、この薬物を、例えば、この薬物の血液脳関門の通過能力を改善する抗菌化合物（パードリッジ・ダブリュウ・エム（Pardridge W. M.）著、「ニューロン（Neuron）」、２００２年、36:555-558を参照されたい）などの添加剤と共に同時投与することができる。別法では、脳の特定部位への正確なこの薬物の送達は、定位微量注入法を用いて行うことができる。例えば、治療する患者を、定位フレームベース（ＭＲＩ適合性）内に入れ、高解像度ＭＲＩを用いてイメージングして治療する特定の領域の３次元位置を決定することができる。次いで、ＭＲＩイメージを好適な定位ソフトウエアがインストールされたコンピュータに送り、複数のイメージを用いて標的部位及び薬物微量注入の経路を決定する。このソフトウエアが、経路を定位フレームに正確に記録される３次元座標に変換する。頭蓋内送達の場合、頭蓋を露出させ、進入部位の上に骨孔を穿孔し、定位装置を用いて針の位置を合わせ、所定の深さに移植できるようにする。この薬物は、疾患または障害に関連した脊髄、脳幹、または脳の細胞などの領域に送達することができる。例えば、標的領域には、髄質、脳橋、中脳、小脳、間脳（例えば、視床や視床下部）、終脳（例えば、線条体、大脳皮質またはその内部、後頭、側頭、頭頂葉、または前頭葉）、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【０１０５】
好適な実施形態では、鼻腔内投与経路を用いることもできる。インスリン、グルカゴン、及び成長ホルモン放出ホルモンなどのペプチドホルモンの改善された鼻腔内送達法が開発されている（ポンチロール・エー・イー（Pontiroli, A. E.）著、「アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・リビュー（Advanced Drug Delivery Reviews）」、１９９８年、29:81-87）。最近の２つの研究で、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病の治療としてのインスリンの鼻腔内投与が肯定的に評価された（スカイラー・ジェイ・エス（Skyler, J. S.）ら著、「ランセット（Lancet）」、２００１年、357:331-335、チェファルー・ダブリュウ・ティー（Cefalu, W. T.）ら著、「アナルズ・オブ・インターナル・メディスン（Annals of Internal Medicine）」、２００１年、134:203-207）。抹消のグルコース値を変えるためにはインスリンの多量の投与が必要であるが、本発明に例示したように神経弛緩を緩和するため、または学習及び記憶を改善するために必要なＡ鎖または類似体の投与量は遥かに少ない。
【０１０６】
一実施形態では、本薬物は、Ａ鎖または類似体を含む５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリンである。インスリン及び他のペプチドが嗅上皮を通過するのを促進する担体として十分に研究されたシクロデキストリン（マーカス（Merkus）ら著、「ファーマコロジカル・リサーチ（Pharmacological Research）」、１９９１年、8:588-592、シャオ（Shao）ら著、「ファーマコロジカル・リサーチ（Pharmacological Research）」、１９９２年、9:1157-1163、シャオ（Shao）ら著、「ファーマコロジカル・リサーチ（Pharmacological Research）」、１９９４年、11:1174-1179、シッパー（Schipper）ら著、「カルシファイド・ティシュー・インターナショナル（Calcified Tissue Internation）」、１９９５年、56:280-282、シッパー（Schipper）ら著、「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（British Journal of Pharmacology）」、１９９３年、110:1335-1340）は、安全で（マーティン（Marttin）ら著、「ジャーナル・ドラッグ・ターゲット（Journal Drug Target）」、１９９８年、6:17-3）、ヒトで実験された（ポンティローリ・エー・イー（Pontiroli, A. E.）著、「アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・リビュー（Advanced Drug Delivery Reviews）」、１９９８年、29:81-87）。
【０１０７】
Ｂ．治療のモニタリング
ニューロンの再生すなわち疾患の治療は、症状を変化させることが分かっている特定の神経伝達物質を測定することでモニタリングすることができる。例えば、Ａ鎖及び／または類似体の投与後に既知の方法でドーパミンのレベルをモニタリングすることができる。ドーパミン量を測定するために、標識トレーサーを患者に投与する。検出したレベルがドーパミン活性を示す。標識トレーサーは、例えばポジトロンエミッショントモグラフィ（ＰＥＴ）スキャニングまたは他のＣＮＳイメージング技術を用いて、あらゆる動物の脳においてインビボで観察できるものが好ましい。例えば、インビボのドーパミン量を測定する方法についての米国特許第６，３０９，６３４号を参照されたい。本明細書で用いる「疾患の治療」は、対象の疾患の症状の低減すなわち緩和並びにニューロンの再生を指す。従って、治療前と治療後のドーパミンレベルをニューロン再生の指標として比較することができる。
【０１０８】
別法では、疾患の目に見える症状を治療の指標として用いることができる。例えば、治療後の改善を調べるために記憶検査をモニタリングすることができる。痴呆をモニタリングするために用いる一般的な検査には、ウェクスラー成人知能検査とケンブリッジ認知検査（ＣＡＭＣＯＧ：Cambridge Cognitive Test）の２つがある。これらの検査には、新しいことを学習する能力、数学的及び言語的な理解能力を含め、多数の異なったセクション及び多様な検査が含まれる。
【０１０９】
Ｃ．薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、薬学分野で周知の様々な方法で調製することができる。担体または賦形剤は、活性な処方成分の輸送手段すなわち媒体として機能し得る固体、半固体、または液体とすることができる。好適な担体または賦形剤は当分野で周知であり、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせが含まれる。薬学的組成物は、経口用、吸引用、非経口用、または塗布用に調製することができ、錠剤、カプセル、エアロゾル、吸入薬、坐薬、溶液、懸濁液、粉末、及びシロップなどの形態で患者に投与することができる。本明細書で用いる用語「薬学的担体」は、１または複数の賦形剤を含むことができる。本発明の化合物の調製では、作用物質の有効量の生物学的利用能が保証されるように注意を払わなければならない。好適な薬学的担体及び調製法は、「レミントンズ・ファーマスーティカル・サイエンシズ（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、ペンシルバニア州イーストンのマック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Co.）の標準テキストに記載されている。
【０１１０】
組成物は、治療に有効な量すなわち目的の症状を低減或いは緩和するのに十分な量または所望の利点を付与するのに十分な量のＡ鎖ペプチドまたは類似体を産生するのに十分な遺伝子物質を含む。この組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。このような担体には、この組成物が投与される個人（個体）に有害な抗体の産生を誘発せず、過度の毒性を伴わずに投与できるあらゆる医薬物質が含まれる。薬学的に許容される担体には、限定するものではないが、シクロデキストリン、（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物の任意のもの、並びに水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールなどの液体が含まれる。薬学的に許容される塩を組成物に含めることができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩などの鉱酸塩や、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。更に、保湿剤や乳化剤、及びｐＨ緩衝物質などの補助物質をこのような担体に含めることができる。薬学的に許容される担体及び賦形剤の詳細については、「レミントンズ・ファーマスーティカル・サイエンシズ（Remington's Pharmaceutical Sciences）」（ニュージャージー州のマック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Co.）、１９９１年）を参照されたい。
【０１１１】
経口投与の場合、本化合物を、カプセル、ピル、錠剤、トローチ、粉末、溶液、懸濁液、または乳濁液などの不活性な希釈剤または食用担体を含む或いは含まない固体製剤または液体製剤に調製することができる。錠剤、ピル、カプセル、及びトローチなどは、１または複数のアジュバントを含むことができる。アジュバントの例として、微結晶性セルロース、トラガント、またはゼラチンなどの結合剤や、スターチやラクトースなどの賦形剤や、アルシニック酸（alsinic acid）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（登録商標）、及びコーンスターチなどの崩壊剤や、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、またはＳｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標）などの潤滑剤や、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤や、スクロースやサッカリンなどの甘味剤や、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはフルーツフレーバーなどの着香料を挙げることができる。単位剤形がカプセルの場合、ポリエチレングリコールや脂肪油などの液体担体を含むこともできる。使用する物質は、薬学的に純粋であって、使用量では非毒性とすべきである。これらの調製物は、治療薬を少なくとも０．０５ｗｔ％含むべきであるが、形態によって様々にすることができ、単位の０．０５％〜約９０％の範囲にできるという利点を有する。組成物中の治療薬の量は、投与に適した単位剤形が得られるようにする。
【０１１２】
非経口投与の場合は、治療薬を溶液または懸濁液に含めることができる。このような製剤は、その少なくとも０．１ｗｔ％の活性処方成分を含むべきであり、０．１ｗｔ％〜約５０ｗｔ％の様々な範囲にすることができる。このような組成物に含める活性処方成分の量は、適切な用量になるようにする。
【０１１３】
溶液または懸濁液は、治療薬の可溶性及び他の特性によって１または複数のアジュバントを含むことができる。このようなアジュバントとして、注入用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤や、ベンジルアルコールやパラオキシ安息香酸メチルなどの抗菌剤や、アスコルビン酸や亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤や、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤や、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤や、塩化ナトリウムやブドウ糖などの毒性調節剤を挙げることができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスやプラスチックの多用量バイアルに封入することができる。
【０１１４】
本化合物は、活性処方成分の放出が持続されるように製剤された皮膚パッチ、蓄積注射、またはインプラント製剤の形態で投与することができる。活性処方成分は、ペレットまたは小さな円筒状に圧縮して、蓄積注射またはインプラントとして皮下または筋内に移植することができる。インプラントには、生体分解性ポリマーや合成シリコーンなどの不活性物質を用いることができる。好適な薬学的担体及び製剤方法についての更なる情報は、レミントンズ・ファーマスーティカル・サイエンシズ（Remington's Pharmaceutical Sciences）などの標準テキストに記載されている。
【０１１５】
特定の疾患または障害の治療に有効な本発明の薬物の正確な量は、当分野で一般的な技術を有する所属診断医が従来の技術を用いて類似の条件下で得た観察結果から容易に決定できる多数の因子に左右される。用量を決定するのに重要な因子には、用量、種類、患者のサイズ、年齢、及び一般的な健康状態や、関係する疾患の種類、疾患の程度、個々の患者の反応、投与される化合物の種類、投与形態、投与される製剤の生物学的利用能特性、選択された投与計画、併用薬、及び患者に特有の他の関連条件が含まれる。有効用量は、インビトロまたは動物モデル検査系から得た用量反応曲線から推定することができる。一般論として、１日に全身投与される本発明のペプチドの有効量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、最も好ましくは約５μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇの範囲である。
【０１１６】
本発明はまた、１または複数の本発明の組成物の成分で満たされた１または複数の容器を含む医薬パックまたは医薬キットを提供する。薬剤または生体産物の製造、使用、または販売を管理する政府機関によって定められた形態の通知（人体への投与に対する製造、使用、または販売の許可を示す）を随意選択でこのような容器に添付することができる。
【０１１７】
好適な形態は、意図する投与及び治療の形式によって異なる。好適な投与形式は、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内、鼻腔内）である。好適な実施形態では、本薬物は鼻腔内投与される。
【０１１８】
治療用組成物は通常、製造及び保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム、または高濃度に適した他の規則的な構造として調製することができる。必要量の活性な化合物（すなわち本薬物）を上に列記した１つの成分またはそれらの組み合わせを含む適当な溶媒に入れてからフィルター滅菌し、無菌注射溶液を得ることができる。
【０１１９】
一般に、分散剤は、基本分散媒体と上に列記した成分のうち必要な成分を含む滅菌媒体に活性な化合物を入れて調製することができる。滅菌凍結乾燥粉末を無菌注射溶液に用いる場合は、好適な調製方法は、活性成分と前記した滅菌フィルター溶液の別の所望の成分を粉末にできる真空乾燥及びスプレー乾燥である。溶液の適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いて、分散剤の場合に必要な粒度を維持して、または界面活性剤を用いて維持することができる。注入可能な化合物の吸収を長期化するために、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を組成物中に含めることができる。
【０１２０】
本発明のＡ鎖ペプチドまたは類似体は、当分野で周知の様々な方法で投与することができる。当業者には明らかなように、投与の経路及び／または方法は望む結果によって異なる。ある実施形態では、活性な化合物は、急速な放出を防止する担体、例えばインプラント、経皮パッチ、及び微小カプセルデリバリーシステムを含む放出が制御された製剤などを用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル（polyorthoesters）、及びポリ乳酸などの生体分解性かつ生体適合性のポリマーを用いることができる。このような製剤を調製する様々な方法が、特許文献に記載されており、当分野で周知である。（例えば、「放出が持続及び制御されたドラッグデリバリーシステム（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems）」、ジェイ・アール・ロビンソン（J. R. Robinson）編集、ニューヨーク州のマーセル・デッカー社（Marcel Dekker, Inc.）、１９７８年、カバノフ（Kabanov）らに付与された米国特許第６，３３３，０５１号及び同第６，３８７，４０６号を参照されたい）。
【０１２１】
ある実施形態では、本発明のＡ鎖ペプチドまたは類似体は、例えば不活性な希釈剤や吸収食物担体と共に経口投与することができる。化合物（所望に応じて他の成分を含む）を、硬質または軟質のシェルゼラチンカプセルに入れて錠剤に圧縮したり、直接患者の食事に含めることができる。治療薬を経口投与する場合、本化合物を賦形剤に含めることができ、経口摂取錠剤（ingestible tablets）、口腔錠、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、及びウエハなどの形態で用いることができる。非経口投与によって本発明の化合物を投与する場合は、不活性化を防止する物質で化合物をコーティングするか、或いはその物質と共に化合物を投与する必要があろう。
【０１２２】
ある実施形態では、本発明のＡ鎖ペプチドまたは類似体を液体の形態で投与することができる。本発明の薬物は、例えばメタノール、エタノール、及びイソプロパノールなどの様々な溶媒に溶解し易い。しかしながら、本薬物は、高度に親油性であるため水には溶解しない。本薬物の水や他の水性溶液への溶解性を改善する様々な方法が当分野で知られている。例えば、アル‐ラザック（Al-Razzak）らによる米国特許第６，００８，１９２号に、本発明の薬物などの親油性化合物の投与を改善する親水性２成分系が開示されている。この親水性２成分系は、親水性相と界面活性剤または界面活性剤混合物を含む。
【０１２３】
本組成物に補助的な活性化合物も含めることができる。ある実施形態では、本発明のＡ鎖ペプチドまたは類似体は、その薬物動態を改善するのに有用な１または複数の追加薬物を用いて調製したり、その追加薬物と共に投与することができる。本発明の薬物の薬物動態を改善する様々な方法が当分野で知られている。例えば、ノルベック（Norbeck）らによる米国特許第６，０３７，１５７号に、例えばＰ４５０のアイソザイム３Ａ４などのチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによって代謝される薬物と本薬物とを同時投与して本薬物の薬物動態を改善する方法が開示されている。
【０１２４】
Ａ鎖ペプチドまたは類似体の薬物動態を改善する他の方法が、例えば、マスターズ（Masters）による米国特許第６，３４２，２５０号、及びカバノフ（Kabanov）らによる同第６，３３３，０５１号、ストラウブ（Straub）らによる同第６，３９５，３００号、カバノフ（Kabanov）らによる同第６，３８７，４０６号、及びリード（Reed）らによる同第６，２９９，９００号に開示されている。マスターズ（Masters）による特許文献には、薬学的活性物質の放出を制御する薬物送達装置及び方法が開示されている。この薬物送達装置はフィルムであって、１または複数の生体分解性ポリマー材料、１または複数の生体適合性溶媒、及びフィルムに均一に分散された１または複数の薬学的活性物質を含む。カバノフ（Kabanov）らによる米国特許第６，３３３，０５１号には、少なくとも１つの架橋結合ポリアミンポリマー断片、少なくとも１つの非イオン水溶性ポリマー断片、及び本発明の薬物を含む少なくとも１つの好適な生物学的物質を含むコポリマーネットワーク（copolymer networking）が開示されている。この特許文献の開示によると、ナノゲルネットワーク（nanogel network）と呼ぶこのネットワークは、副作用を低減すると共に治療作用を増大させることで本薬物の治療効果を改善する。カバノフ（Kabanov）らによる別の米国特許第６，３８７，４０６号には、様々な薬物の経口投与を改善するための別の組成物が開示されている。この送達担体は、生物学的物質及びポリ（オキシエチレン）‐ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーを含む。ストラウブ（Straub）らによる特許文献には、水溶液における薬物の溶解性を改善するために、特に低水溶性薬物などの薬物と共に用いる多孔性薬物基質が開示されている。リード（Reed）らによる特許文献には、患者の皮膚表面や粘膜を介して様々な生理活性物質を輸送するために皮膚刺入エンハンサーを用いるドラッグデリバリーシステムが開示されている。
【０１２５】
本発明のＡ鎖ペプチドまたは類似体は、神経変性疾患を治療するために単独で、或いは相乗効果を得るために組み合わせて用いることもできる。同様に、本薬物は単独で用いても、或いは治療用組成物に利点を付与する物質や治療用組成物の粘度を有効にする物質などの追加物質と共に用いてもよい。このような組み合わせは、得られる組成物が意図する機能を果たすことができる場合、例えば２または３種類の２種以上の追加物質を含むことができる。
【０１２６】
本発明の薬学的組成物は、本発明の薬物を「治療効果のある量」または「予防効果のある量」含むことができる。「治療効果のある量」は、所望の治療結果を得るために、服用時及び必要な期間に亘って有効な服用量を指す。本薬物の治療効果のある量は、疾患のステージ、年齢、性別、及び個人（個体）の体重などの因子や、本薬物が個人（個体）に所望の応答を引き出す能力によって様々である。治療効果のある量はまた、本薬物のあらゆる有毒または有害な影響を治療効果が上回る量である。「予防効果のある量」は、所望の予防結果を得るために、服用時及び必要な期間に亘って有効な服用量を指す。通常は、予防量は疾患の前または初期に患者に投与されるため、予防効果のある量は治療効果のある量よりも少ない。
【０１２７】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）が得られるように調整することができる。例えば、１回の大量瞬時投与をしたり、時間をかけた複数回に分けて投与したり、または治療の緊急性に比例して投与を増大または減少したりできる。投与を容易にするため及び用量を均一にするために、非経口組成物を単位剤形に製剤することが特に有利である。本明細書で用いる単位剤形は、治療する被検哺乳動物に単位用量として適した物理的に別々の単位を指し、それぞれの単位は、必要な医薬担体に関連した所望の治療効果を得るために計算した所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）本活性化合物に固有の特性と達成すべき所定の治療効果または予防効果、及び（ｂ）このような活性化合物を個人（個体）の感受性に対処する製剤分野に固有の制限に支配され直接的に依存する。
【０１２８】
本発明のＡ鎖ペプチドの治療効果または予防効果のある量は、限定するものではないが、一例では、１日２回投与する場合、体重１ｋｇ当たり０．１ｐｇ〜１，０００μｇの範囲である。治療効果のある量のＡ鎖ペプチドの投与によって、血流中の薬物の濃度が約０．１μＭ〜１０００μＭの範囲となるのが好ましい。より好ましくは、血流中の薬物の濃度は約０．１μＭ〜１００μＭの範囲である。更に好ましくは、血流中の薬物の濃度は約０．１μＭ〜１０μＭの範囲である。用量の値は、緩和する症状の種類及び程度によって異なることに留意されたい。更に、特定の患者にとっての投与計画は患者の要求と組成物の投与を行う或いは監視する人間の職業的判断とに従って、時間の経過と共に調整すべきものであり、ここに記載した用量範囲は、単に例示目的であって請求した組成物の範囲や実施を制限することを意図するものではないことを理解されたい。
【０１２９】
例
以下に示す例は、本発明の方法及び組成物を用いて神経疾患を緩和したり、認知、学習、及び記憶を改善したり、記憶障害を緩和できることを例示する。以下に示す例を用いて本発明を実証する。以下に示す例は、単に本発明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０１３０】
例１．物質と方法
（ｉ）物質
全ての研究に、光を調節し食餌を自由に与えて飼育したオスＳＤラット（最大３００ｇｍ）を用いた。全てのマウスは８週齢で実験した。インスリン、インスリンＡ鎖、及びインスリンＢ鎖は、ミズーリー州セントルイスに所在のシグマ（Sigma, St. Louis, MO）から入手した。特段の記載がない限り、ウシ膵由来の酸化インスリンＡ鎖（SigmaI-1633）アンモニウム塩（Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys(SO3H)-Cys(SO3H)-Ala-Ser-Val-Cys(S03H)-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys(SO3H)-Asn）、ウシ膵由来の酸化インスリンＢ鎖（Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(S03H)-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys(S03H)-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala）、及びウシ膵由来のインスリン（C254H377N65075S6）を用いた。
【０１３１】
（ｉｉ）インスリンまたはインスリン関連ペプチドのラットへの鼻腔内投与
インスリン、インスリンＡ鎖、またはインスリンＢ鎖を、（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン濃度が５％〜１０％の生理食塩水で希釈した。様々な用量のインスリン、インスリンＡ鎖、またはインスリンＢ鎖を、麻酔したラットの鼻腔内にピペット先端で投与した。
【０１３２】
（ｉｉｉ）受動的回避実験
受動的回避実験は、ビロチンドアで分離された１つの暗い部屋と１つの明るい部屋とかなる装置（バーモント州セントアルバンズに所在のＭＥＤアソシエイツ社（MED Associates Inc. , St. Albans, VT））で実施した。訓練方法は、記載されているように実施した（エヌ・ベナブル（N. Venable）ら著、「サイコファーマコロジー（Psychopharmacology）」、１９９０年、100,215）。ラットには１．０ｍＡの電気ショックを３秒間与え、マウスには０．５ｍＡの電気ショックを５秒間与える。保持検査は、ペアリング後１日、３日、または７日目に実施した。最大滞在時間は、ラットで６００秒、マウスで３００秒であった。ペアリングの際、２分以内に暗い部屋に入らなかったラットやマウスは実験から除外した。
【０１３３】
１回のトライアルの受動的回避法では、ラットをイソフルオレン（isofluorane）で麻酔し、次いで様々な用量のインスリン、Ａ鎖、またはＢ鎖を鼻腔内投与した。２０分前処置時間の後、ラットを２部屋明／暗Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ受動的回避装置（ＭＥＤアソシエイツ社（MED Associates Inc.））の明るい部屋に入れた。ラットが暗い部屋に入ったら、ギロチンドアを閉めて１．０ｍＡの電気ショックを３秒間与えた。次いで、ドアを持ち上げて、ラットが再び明るい部屋に入れるようにした。暗い部屋に入るまでの滞在時間（最大６００秒）を連想的学習の指標とした。コントロールとして、訓練前（ＰＲＥ）滞在時間と訓練後（ＰＯＳＴ）滞在時間の比較により、訓練により全ての群の滞在時間が増大することを示した。
【０１３４】
（ｉｖ）モリス水迷路試験（Morris Water Maze）を用いた空間的学習の評価
空間的学習は、モリス水迷路試験（モリス（Morris）ら著、「ネイチャー（Nature）」、１９８２年、297:681）を用いて評価した。情報はトラッカー（英国ハンプトンのエッチ・エス・ブイ・イメージ（HSV Image, Hampton, UK））を介してパーソナルコンピュータに送られ、特殊なコンピュータプログラム（英国ハンプトンのウォーター２０２０（Water 2020））で定量化される。獲得実験を上記したように実施した。実験動物をイソフルオレン（isofluorane）で麻酔し、実験の２０分前にペプチドを鼻腔内投与した。ラットには４回の訓練トライアルが行われている。この訓練の４８時間後に、保持検査を実施した。このとき１回のトライアルで、ラットが沈んでいる台を見つけることができるようにした。マウスには、実験に慣れるように処置を施さずに６回のトライアルを行った。次の日に、担体または様々な用量のインスリン、インスリンＡ鎖、またはインスリンＢ鎖を鼻腔内投与し、台を新しい場所に移して更に４回のトライアルを行った。保持検査のに備えて、次の日に台を見つけることができるようにマウスにトライアルを１回行った。台を見つけるまでの到達時間を空間的学習保持の指標とした。
【０１３５】
（ｖ）高架式十字迷路法（Elevated Plus Maze）
高架式十字迷路法は、２つの開いたアームと２つの閉じたアームとからなり、開いたアーム内にいた時間及び進入回数が、ラットのネオフォビック（新しいものを嫌う）不安の指標である。開いたアームに進入した回数及びそのアームに滞在した合計時間を、実験条件を知らされていない観察者が５分間の表に作成した。装置から落下した実験動物は実験から除外した。１日２回、合計５日間の訓練をする２５分前に、合計２μｌ（１μｌ ｍｉｎ‐１）のペプチドを注入した。視覚的台実験を、５日目の最後の訓練の後、プールの異なった位置で実施した。
【０１３６】
例２．鼻腔内インスリンの記憶増強効果
図２に、ラットの鼻腔内インスリンが連想的学習を改善することが示されている。ラットをイソフルオレン（isofluorane）で麻酔した後、様々な用量のインスリンを鼻腔内投与した（前処置時間：２０分）。次いで、ラットを２部屋明／暗室の明るい部屋に入れ、ギロチンドアを閉じて１．０ｍＡのショックを３秒与えた。次いで、ドアを持ち上げて、ラットが明るい部屋に再び入ることができるようにした。暗い部屋に入るまでの滞在時間（最大６００秒）を、連想的学習の指標とした。鼻腔内インスリン（３μｇ〜３０μｇ、２８ＵＳＰ単位／ｍｇ）での前処置により、担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）単独の場合に比べ、投与量１０μｇで滞在時間が有意に（Ｐ＜０．０５）改善された。
【０１３７】
図２に示されているように、鼻腔内インスリン（用量１０μｌ）により、受動的回避行動パラダイムによって測定される連想的学習が改善されている。この結果が、インスリンを鼻腔内投与したことを除き、侵襲的な脳室内（ＩＣＶ）経路で投与した以前の研究と同一であった。
【０１３８】
次いで、空間的記憶作業に対する鼻腔内インスリンの効果を、この種の学習及び記憶の測定に用いられる標準的な検査であるモリス水迷路（ＭＷＭ）で決定した。図３Ｂに示されているように、最初の訓練から４８時間後に実験すると、インスリン（３μｇ）により、沈んでいる台を見つけるまでの到達時間が著しく低下した。図３Ｂは、因子として用量が大きな影響を与えることを示す保持検査のグラフである（１元配置分散分析：Ｆ＝３．０６８（３,３７）；Ｐ＝０．０４）。ダネット検定（Dunnett's test）での更なる分析により、用量３μｇのインスリンで、担体のみの場合よりも到達時間が有意に短縮されたことが示された（Ｐ＜０．０５＊）。
【０１３９】
図３Ａは、インスリン投与及び訓練の後に、ラットがモリス水迷路パラダイムにおいて沈んでいる台を見つけるまでの獲得時間である平均値（±ＳＥＭ）到達時間のグラフである。ラットに、インスリン（３μｇ〜３０μｇ、２８ＵＳＰ単位／ｍｇ）または担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）を投与し、４回のトライアルの訓練を行った。訓練の４８時間後に、ラットを検査した。訓練中の群間には獲得時間に有意差はなかった（図３Ａ）。
【０１４０】
例３．血糖値に影響を与えない鼻腔内インスリン、Ａ鎖、及びＢ鎖
血糖値に対する影響を検査するために、ラットに様々な用量のインスリン、Ａ鎖、またはＢ鎖を投与してから屠殺し、血糖値測定装置グルコメーター（Ｅｌｉｔｅ ＸＬ、ベイヤー（Bayer））を用いて血糖値を測定した。学習及び記憶を改善した用量のインスリン及びインスリンＡ鎖は、抹消血糖値に影響を及ぼさず（図４）、鼻腔内インスリンが強力な記憶増強効果を生むことを示している。ラット（Ｎ‐５／群）を、まずイソフルオレン（isofluorane）麻酔で感覚を麻痺させ、担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）またはインスリン（３μｇ〜３０μｇ、２８ＵＳＰ単位／ｍｇ）を鼻腔内投与した。２０分後に、ラットを屠殺し、グルコメーター（Ｅｌｉｔｅ ＸＬ、ベイヤー（Bayer））で血糖値を迅速に測定した。図４に示されているように、処置した群間には有意差がなかった。
【０１４１】
例４．鼻腔内Ｂ鎖にはない鼻腔内Ａ鎖の記憶増強
学習及び記憶に対するインスリンＡ鎖及びＢ鎖の効果を、受動的回避法と獲得時間及び保持時間を測定するモリス水迷路（ＭＷＭ）の両方で検査した。
【０１４２】
ラットをイソフルオレン（isofluorane）で麻酔してから、様々な用量のＡ鎖を鼻腔内投与した（前処置時間：２０分）。平均値（±ＳＥＭ）滞在時間を、１回のトライアルの受動的回避法を用いて測定した。鼻腔内Ａ鎖（３μｇ〜３０μｇ）による前処置により、図５に示されているように、担体のみの場合に比べ、全ての用量の検査で滞在時間が有意に＊＊（Ｆ＝１０．００５（３,３７）；Ｐ＜０．００１）改善された。加えて、ラットがモリス水迷路パラダイムにおいて沈んでいる台を見つけるまでの平均値（±ＳＥＭ）到達時間を比較した。ラットに、Ａ鎖（３μｇ〜３０μｇ）または担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）を鼻腔内投与し、４回のトライアルの訓練を行った。訓練の４８時間後、ラットを検査した。訓練中の群間には獲得時間に有意差はなかった（図６Ａ）。しかしながら、訓練後４８時間の保持検査の分析（図６Ｂ）により、鼻腔内Ａ鎖が空間的記憶を改善することを示す有意な効果（Ｆ−３．５５１（３,３９）；Ｐ−０．０２３）が生まれることが示された。ダネット検定を用いた更なる分析により、用量３μｇと用量１０μｇのＡ鎖を投与した後の到達時間が、担体のみの場合よりも有意に短縮されたことが示された（Ｐ＜０．０５＊）。
【０１４３】
インスリンＢ鎖も、受動的回避及びＭＷＭ行動検査の両方について検査した。平均値（±ＳＥＭ）滞在時間を、１回のトライアルの受動的回避法を用いて、イソフルオレン（isofluorane）で麻酔してから様々な用量のＢ鎖を鼻腔内投与したラットで測定した。Ｂ鎖（３μｇ〜３０μｇ）による鼻腔内前処置では、全ての用量の検査において滞在時間の有意な改善が見られなかった（Ｆ＝０．９０６（３,３９）；Ｐ＝０.４４７）（図７）。Ｂ鎖（３μｇ〜３０μｇ）または担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）を鼻腔内投与し、４回のトライアルの訓練をしたラットで、モリス水迷路パラダイムにおいて沈んでいる台を見つけるまでの平均値（±ＳＥＭ）到達時間を比較した。訓練の４８時間後に、ラットを検査した。訓練中の群間には、検査した用量における獲得時間（図８Ａ）または保持検査（図８Ｂ）に有意差はなかった（Ｆ＝０．７０２（３,３８）；Ｐ＝０．５５７）。図９に、インスリン及びＡ鎖が２４時間後の連想的学習の保持を改善し、Ｂ鎖が改善しないことが示されている。
【０１４４】
Ａ鎖は、受動的回避（図５）及びＭＷＭ（図６）行動パラダイムの両方において強力な記憶増強効果を示した。これとは対照的に、Ｂ鎖は、何れのパラダイムにおいても学習及び記憶を増強しなかった。
【０１４５】
例５．Ａ鎖による受動的回避反応の改善
受動的回避反応におけるインスリンＡ鎖の効果を検査するために、ラットを、５％βシクロデキストリンに含めた３つの内の１つ用量レベル（３μｇ、１０μｇ、または３０μｇ）のＡ鎖で鼻腔内前処置した。コントロール群には、担体（５％シクロデキストリン）のみを投与した。各ペプチドに対して３つの用量レベルで、合計で７群（１群のラット数が８〜１３匹）を用い、合計４１匹のラットで検査した。訓練の最初の日に、前処置したラットが暗い部屋に入った後、足に１回の電気ショックトライアル（０．１ｍＡ、３秒間）を行った。ラットを検査装置に移して、有害刺激の後、１日目、３日目、及び７日目に滞在時間を測定した。
【０１４６】
推定したとおり、コントロール群（Ｎ＝１３）は、１回の弱いショックを与える前は、暗い部屋に入るまでの滞在時間が短かった。同様に、全ての他の群は滞在時間が増大した（図１０）。最初の検査及び１回の電気ショックの２４時間後（１日目）に、実験動物を検査装置に移し、滞在時間を再び測定した。有害刺激が暗い部屋への進入に関連していることを学習したコントロールラットは、平均滞在時間が３００秒未満であった。Ａ鎖を投与された他の全ての群の滞在時間は４７５秒を越えていた。
【０１４７】
３日目に、ラットを再び装置で検査した。コントロールラットが有害刺激を忘れ始める頃になると、図１０に示されているように滞在時間が１５０秒未満になった。他の全ての群では、滞在時間の減少は僅かであった（図１０を参照）。
【０１４８】
本ペプチドの投与後７日目に、ラットを再び検査装置に移した。Ａ鎖が投与されたラットは、コントロール群よりも有意に高い平均滞在時間を維持していた。興味深いことに、Ａ鎖を３μｇ投与されたラットの滞在時間が最も長く、最も持続した。従って、図１０に示されているように、インスリンＡ鎖の鼻腔内投与により連想的学習が改善された。
【０１４９】
例６．インスリンＡ鎖のチロシンキナーゼ結合受容体との相互作用
インスリンまたはＡ鎖によって改善された学習に対するインスリンアンタゴニストα２ＨＳＧの影響を研究した。イソフルオレン（isofluorane）で麻酔してから、インスリン（１０μｇ）のみと、インスリン（１０μｇ）と様々な用量のインスリンアンタゴニストα２ＨＳＧを組み合わせたものを鼻腔内投与したラットで測定した。１回のトライアルの受動的回避法での検査から、インスリン（１０μｇ）のみの前処置では、担体のみの場合に比べ、滞在時間が有意に（Ｐ＜０．０５）改善されつ一方、α２ＨＳＧ（３μｇ〜３０μｇ）の前処置によりインスリンによる滞在時間の改善（Ｆ＝３．７００（４,３５）；Ｐ＝０．０１）が阻害された（図１１を参照）。
【０１５０】
加えて、平均値（±ＳＥＭ）滞在時間を、１回のトライアルの受動的回避法を用いて、イソフルオレン（isofluorane）で麻酔してから、Ａ鎖（３μｇ）のみ、インスリンアンタゴニストα２ＨＳＧ（３０μｇ）のみ、または両方組み合わせを鼻腔内投与したラットで測定した（図１２）。Ａ鎖（３μｇ）のみの前処置では、担体のみの場合に比べ、滞在時間が有意に（＊＊ｔ＝４．６３４（２１）；Ｐ＜０．０１）改善された。α２ＨＳＧ（３０μｇ）の前処置では、Ａ鎖による滞在時間の改善（＊＊ｔ＝６．３４５（１５）；Ｐ＜０．０１）が阻害された。アンタゴニストのみの場合と担体のみの場合には差異がなかった（ｔ＝０．９１５（１８）；Ｐ＝０．３７２）。
【０１５１】
図１１に示されているように、インスリンによる学習及び記憶の大きな改善が、Ｓｈｃのインスリン誘発チロシンリン酸化の強力なインヒビターであるチロシンキナーゼインヒビターα２ＨＳＧ（３μｇ）によって阻害された。このような影響は、主にインスリン受容体によって仲介される。また、高用量のα２ＨＳＧ（３μｇ）でも、Ａ鎖の効果を中和することができた（図１２）。ここに記載する基本のペプチドであるインスリンＡ鎖は、ニューロンの喪失や機能不全に関連した神経系や神経の疾患の治療的または予防的な治療、並びに学習、記憶、及び認知の改善に用いることができるペプチドの代表例である。本発明の範囲は、この例に限定されるものではなく、この例は本発明の技術を例示するために用いた。当業者であれば、ペプチド合成技術は周知であり、細胞モデル及び動物モデルにおいてインスリンＡ鎖の生物学的活性を保持する任意の類似体、誘導体、断片、または擬似体を本発明の目的のために用いることができる。
【０１５２】
例７．インスリン、Ａ鎖、及びＢ鎖の自発運動に対する影響
覚醒及び注意に効果のある薬物が通常は精神運動興奮薬であるため、インスリン、インスリンＡ鎖、及びインスリンＢ鎖を完全に自動化された総合自発運動装置で検査した。ラットを、５％βシクロデキストリンに含めた３μｇ〜３０μｇ／ｋｇのインスリン、Ａ鎖、またはＢ鎖、或いは担体（５％βシクロデキストリン）で鼻腔内前処置した。前処置に続いて、ラットをオープンフィールド検査室（約４３ｃｍ×約４３ｃｍ×約３０ｃｍ（高さ）（１７インチ×１７インチ×１２インチ））に３０分間入れ、ラットの動きを、赤外線ビーム放射装置と検査室の底部から約２．５ｃｍ（１インチ）の検出ストリップ及び約２５ｃｍ（１０インチ）の検出ストリップで５０ｍｓ毎に検出した。活動室がＰＣコンピュータに接続されており、データがアクティブ・モニター・ソフトウエア４．０（Activity Monitor Software 4.0）（バーモント州セントアルバンズに所在のＭＥＤアソシエイツ社（MED Associates Inc. , St. Albans, VT））によって編集される。移動距離は、処置による差がなかった（データは不図示）。鼻腔内のインスリン、Ａ鎖、またはＢ鎖は、担体と比べても、スイミング速度に影響を及ぼさない。
【０１５３】
同等物
当業者であれば、ルーチンの以外の実験を用いて、上記した実施形態に基づいて本発明の更なる特徴及び利点を得ることができることを理解できよう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除き、上記説明及び図示に限定されるものではない。全ての刊行物及び参照文献は、言及することを以って内容の全てを本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】インスリンＡ鎖の２１個のアミノ酸及びインスリンＢ鎖の３０個のアミノ酸を示すヒトインスリンの模式図である。
【図２】１回のトライアルの受動的回避法を用いた平均値（±ＳＥＭ）滞在時間の棒グラフであって、鼻腔内インスリン（３μｇ〜３０μｇ、２８ＵＳＰ単位／ｍｇ）での前処置により、担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）のみの場合に比べ、投与量１０μｇでラットの連想的学習が有意に改善されたことを示す（Ｐ＜０．０５）。
【図３Ａ】インスリン（３μｇ〜３０μｇ、２８ＵＳＰ単位／ｍｇ）または担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）を鼻腔内投与し、４回のトライアルの訓練を行った後に、ラットがモリス水迷路パラダイムにおいて沈んでいる台を見つけるまでの平均値（±ＳＥＭ）到達時間のグラフであって、インスリン投与によって獲得時間が影響されなかったことを実証している。
【図３Ｂ】インスリン（３μｇ〜３０μｇ、２８ＵＳＰ単位／ｍｇ）または担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）を鼻腔内投与した後、ラットがモリス水迷路パラダイムにおいて沈んでいる台を見つけるまでの平均値（±ＳＥＭ）到達時間の棒グラフであって、インスリン投与後に保持時間が改善されたことを実証している。
【図４】インスリンＡ鎖の鼻腔内投与（３μｇ〜３０μｇ、２８ＵＳＰ単位／ｍｇ）が、コントロール（担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）との比較から分かるように血糖値に影響を及ぼさないことを実証する血中グルコース濃度の棒グラフである。
【図５】１回のトライアルの受動的回避法を用いた平均値（±ＳＥＭ）滞在時間の棒グラフであって、鼻腔内Ａ鎖（３μｇ〜３０μｇ）による前処置により、担体のみの場合に比べ、全ての用量の検査で連想的学習に起因する滞在時間が有意に改善されたことを示している（Ｆ＝１０．００５（３,３７）；Ｐ＜０．００１）。
【図６Ａ】Ａ鎖（３μｇ〜３０μｇ）または担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）を鼻腔内投与した後のラットがモリス水迷路パラダイムにおいて沈んでいる台を見つけるまでの平均値（±ＳＥＭ）到達時間のグラフであって、訓練中の群間における獲得時間に有意差がないことを示している。
【図６Ｂ】訓練の４８時間後に測定したＡ鎖（３μｇ〜３０μｇ）または担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）を鼻腔内投与した後のラットがモリス水迷路パラダイムにおいて沈んでいる台を見つけるまでの平均値（±ＳＥＭ）到達時間の棒グラフであって、担体のみの場合に比べて、用量３μｇと１０μｇのＡ鎖の投与が、保持時間を有意に改善し、到達時間を有意に短縮していることを実証している（Ｐ＜０．０５＊）。
【図７】Ｂ鎖（３μｇ〜３０μｇ）を鼻腔内投与する前に１回のトライアルの受動的回避法を用いた平均値（±ＳＥＭ）滞在時間の棒グラフであって、Ｂ鎖（３μｇ〜３０μｇ）による鼻腔内前処置では、コントロール（担体のみ）の場合に比べて、滞在時間の有意な改善が見られなかったことを実証している（Ｆ＝０．９０６（３,３９）；Ｐ＝０.４４７）。
【図８Ａ】Ｂ鎖（３μｇ〜３０μｇ）または担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）を鼻腔内投与したラットがモリス水迷路パラダイムにおいて沈んでいる台を見つけるまでの平均値（±ＳＥＭ）到達時間のグラフであって、訓練中の群間における獲得時間に有意差がないことを示している。
【図８Ｂ】Ｂ鎖（３μｇ〜３０μｇ）または担体（５％（２,６‐ジ‐Ｏ‐メチル）β‐シクロデキストリン）を鼻腔内投与したラットがモリス水迷路パラダイムにおいて沈んでいる台を見つけるまでの平均値（±ＳＥＭ）到達時間の棒グラフであって、群間における保持時間に有意差がないことを示している。
【図９】インスリン及びＡ鎖が２４時間後の連想的学習の保持を改善し、Ｂ鎖が改善しないことを示す棒グラフである。
【図１０】受動的回避実験における滞在時間の延長により実証されているように、インスリンＡ鎖（３μｇ〜３０μｇ）の鼻腔内投与が、コントロール（担体のみ）に比べて連想的学習を改善していることを示す棒グラフである。
【図１１】１回のトライアルの受動的回避法を用いた平均値（±ＳＥＭ）滞在時間の棒グラフであって、インスリン（１０μｇ）のみの鼻腔内前処置では、担体のみの場合に比べて、滞在時間が有意に（Ｐ＜０．０５）改善される一方、インスリン（１０μｇ）と様々な用量のインスリンアンタゴニストα２ＨＳ‐Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（α２ＨＳＧ）（３μｇ〜３０μｇ）を組み合わせた鼻腔内投与前処置では、インスリンによる滞在時間の改善（Ｆ＝３．７００（４,３５）；Ｐ＝０．０１）が阻害されたことを示している。
【図１２】１回のトライアルの受動的回避法を用いた平均値（±ＳＥＭ）滞在時間の棒グラフであって、Ａ鎖（３μｇ）のみの鼻腔内投与では、担体のみの場合に比べ、滞在時間が有意に（＊＊ｔ＝４．６３４（２１）；Ｐ＜０．０１）改善され、α２ＨＳＧ（３μｇ〜３０μｇ）の前処置では、Ａ鎖による滞在時間の改善（＊＊ｔ＝６．３４５（１５）；Ｐ＜０．０１）が阻害されたことを示している。
【図１】
2005532309.tif 000002
【図２】
2005532309.tif 000003
【図３Ａ】
2005532309.tif 000004
【図３Ｂ】
2005532309.tif 000005
【図４】
2005532309.tif 000006
【図５】
2005532309.tif 000007
【図６Ａ】
2005532309.tif 000008
【図６Ｂ】
2005532309.tif 000009
【図７】
2005532309.tif 000010
【図８Ａ】
2005532309.tif 000011
【図８Ｂ】
2005532309.tif 000012
【図９】
2005532309.tif 000013
【図１０】
2005532309.tif 000014
【図１１】
2005532309.tif 000015
【図１２】
2005532309.tif 000016
【配列表】
2005532309000001.app
【国際調査報告】
2005532309.tif 000017
2005532309.tif 000018