(57)【要約】本発明は、宿主におけるＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤と一緒に、治療的核酸をコードする核酸を投与することによって、宿主への核酸の送達を増加させる方法および組成物を提供する。具体的には、被験体における治療的遺伝子産物のレベルを増加させるための方法であって、この方法が、この被験体に、この治療的遺伝子産物をコードする治療的核酸を含む第１のウイルスベクター、および該被験体におけるＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤を投与する工程を包含し、この薬剤が、この治療的核酸を含まない第２のウイルスベクターである、方法を提供する。
2005502585.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における治療的遺伝子産物のレベルを増加させるための方法であって、該方法が、該被験体に、該治療的遺伝子産物をコードする治療的核酸を含む第１のウイルスベクター、および該被験体におけるＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤を投与する工程を包含し、該薬剤が、該治療的核酸を含まない第２のウイルスベクターである、方法。
【請求項２】
被験体における治療的遺伝子産物のレベルを増加させるための方法であって、該方法が、該被験体に、該治療的遺伝子産物をコードする治療的核酸を含む第１のウイルスベクター、および該被験体におけるＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤を投与する工程を包含し、該薬剤が、該ウイルスベクターを投与する１時間前より後に投与される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記薬剤が、前記ウイルスベクターを投与する５分前より後に投与される、方法。
【請求項４】
被験体における治療的遺伝子産物のレベルを増加させるための方法であって、該方法が、該被験体に、該治療的遺伝子産物をコードする治療的核酸を含むウイルスベクター、および該被験体におけるＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤を投与する工程を包含し、該薬剤が、該ウイルスベクターと同時に投与される、方法。
【請求項５】
被験体における治療的遺伝子産物のレベルを増加させるための方法であって、該方法が、該被験体に、該治療的遺伝子産物をコードする治療的核酸を含むウイルスベクター、および該被験体におけるＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤を投与する工程を包含し、該薬剤が、食作用のために十分な粒子であり、かつ約１０ｎｍから約１０００ｎｍの直径を有する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記第１のウイルスベクターおよび／または第２のウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、方法。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記被験体が、げっ歯目である、方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、前記被験体が、霊長類である、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記霊長類が、ヒトである、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記第１のウイルスベクターが、以下：
経口投与、鼻経由投与、非経口投与、経皮投与、局所的投与、眼内投与、気管内投与、腹膜経由投与、細胞、組織、器官または腫瘍への直接注射、静脈内投与、皮下投与、および筋内送達、
からなる群より選択される経路によって投与される、方法。
【請求項１２】
請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記ウイルスベクターが、以下：
経口投与、鼻経由投与、非経口投与、経皮投与、局所的投与、眼内投与、気管内投与、腹膜経由投与、細胞、組織、器官または腫瘍への直接注射、静脈内投与、皮下投与、また筋内送達、
からなる群より選択される経路によって投与される、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、前記薬剤が、以下：
経口投与、鼻経由投与、非経口投与、経皮投与、局所的投与、眼内投与、気管内投与、腹膜経由投与、細胞、組織、器官または腫瘍への直接注射、静脈内投与、皮下投与、また筋内送達、
からなる群より選択される経路によって投与される、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、前記ウイルスベクターが、複製欠損ウイルスベクターである、方法。
【請求項１５】
ウイルス性のコードされた導入遺伝子に関連する毒性を調節する方法であって、該方法が、被験体に、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞レベルまたは該被験体におけるＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記薬剤が、治療的遺伝子産物をコードする治療的核酸の投与の前に投与される、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記毒性が、肝毒性である、方法。
【請求項１８】
被験体への、ウイルス性のコードされた導入遺伝子の送達を調節するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）該被験体における、ウイルスの投与量の変曲点を同定する工程であって、該ウイルスが、該ウイルス性のコードされた導入遺伝子を含む、工程；
（ｂ）該被験体における、該変曲点と該ウイルス性のコードされた導入遺伝子の産物のレベルとを比較する工程
（ｃ）必要とする場合に、該被験体に投与されるウイルスの用量を調整する工程であって、これにより、該ウイルス性のコードされる導入遺伝子の投与量を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
被験体への、ウイルス性のコードされた導入遺伝子の送達を調節するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）該被験体における、第１のウイルスの投与量の第１の変曲点を同定する工程であって、該ウイルスが、該ウイルス性のコードされた導入遺伝子を含まず、これによって、Ｋｕｐｕｆｆｅｒ細胞の機能を飽和させる工程；
（ｂ）該被験体における、第２のウイルスの投与量の第２の変曲点を同定する工程であって、該ウイルスが、該ウイルス性のコードされた導入遺伝子を含み、該投与量の曲線が、非線形である、工程；
（ｃ）該被験体における、該第２の変曲点と該ウイルス性のコードされた導入遺伝子の産物のレベルとを比較する工程；および
（ｄ）必要とする場合に、該被験体に投与される第１のウイルスの用量および第２のウイルスの用量を調整する工程であって、これにより、該ウイルス性のコードされる導入遺伝子の投与量を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
薬学的組成物であって、治療的遺伝子産物をコードするウイルス性核酸、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤、および薬学的に受容可能なキャリアを、含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の薬学的組成物であって、前記ウイルス性核酸が、ウイルス粒子中に提供される、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願番号第６０／２６３，４１６号（２００１年１月２２日出願）（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に対して優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、宿主への核酸の送達を増強するための方法および組成物に関し、より詳細には、宿主への、ウイルス性のコードされた導入遺伝子の送達および発現を増強するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
アデノウイルスベクター（複製欠損アデノウイルスベクターを含む）は、多くの病理学的適用にわたる前臨床研究および臨床研究において、広範な導入遺伝子についての遺伝子送達ビヒクルとして用いられている。組みかえアデノウイルスベクターの静脈内投与は、肝細胞の形質導入を生じ、コードされた導入遺伝子を発現し、そして検出可能な循環レベルの分泌された導入遺伝子産物を生じる。
【０００４】
少量の組換えアデノウイルス粒子の送達は、コードされた導入遺伝子の低レベルまたは検出不可能なレベルの産物を生じ得る。治療的核酸を含む大量のアデノウイルス粒子は、高レベルの発現された導入遺伝子を生じ得る。治療的導入遺伝子を含む高発現レベルのアデノウイルス粒子は、肝臓毒性などの合併症を導き得る。従って、当該分野において、組換えウイルスベクターにより処置される被験体における、導入遺伝子発現のより良好な制御が必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトインターフェロン−β（「ＩＦＮ−β」）をコードするアデノウイルスの用量のわずかな増加が、そのコードされたヒトＩＦＮ−βの量の大きな（すなわち、非線形の）増加を導き得るという発見に部分的に基づく。対照的に、マウスにおけるヒトＩＦＮ−βをコードする低用量の単一アデノウイルスの投与後の導入遺伝子発現は、ヒトＩＦＮ−βを欠失する組みかえアデノウイルスの同時投与によって、同時投与されない「空の」組換えウイルスを用いる同じウイルス用量と比較して、劇的に増加される。ＩＦＮ−β導入遺伝子発現の増加はまた、リポソームドキソルビシン（これは、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞として公知の肝臓のマクロファージを除去することが公知である）により処置されたマウスにおいて観察された。従って、本発明は、治療的核酸（例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）中に提供される治療的核酸）の投与量を最適化するための方法および組成物を提供する。
【０００６】
理論に束縛されることを望まないが、被験体における低用量のアデノウイルスの送達が、被験体のＫｕｐｆｆｅｒ細胞による、アデノウイルスの優先的な取り込みを生じると考えられる。このＫｕｐｆｆｅｒ細胞は、導入遺伝子を発現することなく、低用量のウイルスを分離し、そしてウイルス性形質導入の遮断を生じる。一旦この遮断が飽和すると、被験体への、ウイルス性のコードされた治療的遺伝子産物（例えば、ＩＦＮ−β）の効率的な遺伝子送達が、達成され得る。従って、例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）中に提供される治療的核酸は、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞のウイルス取り込み能力を飽和する薬剤と共に投与される場合か、またはＫｕｐｆｆｅｒ細胞のレベルを低下させることによって、被験体に効率的に送達され得る。１つの実施形態において、この送達は、静脈内送達である。さらに、この被験体は、この導入遺伝子を発現し得る細胞を含む。
【０００７】
従って、１つの局面において、本発明は、被験体に、この治療的遺伝子産物をコードする治療的核酸および被験体においてＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤を投与することによって、被験体中の治療的遺伝子産物（例えば、ウイルス性のコードされた治療的遺伝子産物）のレベルを増加させるための方法を特徴とする；いくつかの実施形態において、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）は、この治療的核酸を含む；いくつかの実施形態において、この治療的核酸を含むこのウイルスベクターは、ウイルス粒子（例えば、アデノウイルス粒子）中に提供される。
【０００８】
１つの実施形態において、飽和剤（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は、組み換えウイルス粒子である。別の実施形態において、この飽和剤は、粒子状物体である。いくつかの実施形態において、この薬剤は、被験体中のＫｕｐｆｆｅｒ細胞のレベルを低下させることによって、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する。この型の薬剤の１つの例は、リポソームドキソルビシンである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、この薬剤によって調節されるこのＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能は、取り込みである（例えば、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞による、この治療的核酸を含む粒子の食作用）。他の実施形態において、この薬剤によって調節されるこのＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能は、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞による、この治療的核酸を含む粒子のレセプターを介する取り込みである。Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞によって取り込まれる薬剤の１つの例は、この治療的核酸を含まないウイルス性粒子である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、この薬剤は、ウイルス性核酸（例えば、この治療的核酸を欠失するか、またはこの治療的核酸の機能的コピーをコードする核酸を欠失するウイルス性核酸）として提供され得る。他の実施形態において、この薬剤は、被験体のＫｕｐｆｆｅｒ細胞による食作用の取り込みに適するサイズのものである。さらなる実施形態において、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞によって取り込まれるこの薬剤は、粒子状物体であり、その成分の粒子は、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの直径を有する。特定の実施形態において、この粒子状物体は、この治療的導入遺伝子産物をコードするウイルスベクターとほぼ同じ直径である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、この薬剤は、この治療的核酸の投与の前に投与される。例えば、この薬剤は、この治療的核酸の投与の、２４時間前より後、１０時間前より後、８時間前より後、４時間前より後、２時間前より後、１時間前より後、および１０分前より後に投与される。他の実施形態において、この薬剤は、この治療的核酸の投与の５分前より後に投与される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）は、この治療的核酸を含む；いくつかの実施形態において、この治療的核酸を含むこのウイルスベクターは、ウイルス粒子（例えば、アデノウイルス粒子）中に提供される。
【００１２】
他の実施形態において、この薬剤は、この治療的核酸と同時に投与される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）は、この治療的核酸を含む；いくつかの実施形態において、この治療的核酸を含むこのウイルスベクターは、ウイルス粒子（例えば、アデノウイルス粒子）中に提供される。
【００１３】
他の実施形態において、この薬剤は、この治療的核酸と同時に投与されるか、またはこの治療的核酸の投与の前に投与されるが、この治療的核酸の投与後には投与されない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）は、この治療的核酸を含む；いくつかの実施形態において、この治療的核酸を含むこのウイルスベクターは、ウイルス粒子（例えば、アデノウイルス粒子）中に提供される。
【００１４】
この治療的核酸、もしくはこの薬剤、またはそれらの両方は、当該分野において公知の任意の経路によって被験体に投与され得る。例えば、この治療的核酸および薬剤は、経口送達、鼻経由送達、非経口送達、経皮送達、局所的送達、眼内送達、気管内送達、腹膜経由送達、細胞、組織、器官もしくは腫瘍への直接注射、静脈内送達、皮下送達、または筋内送達で投与され得る。特定の実施形態において、静脈内投与としては、門脈経由または肝臓の動脈の融合による投与が挙げられる。
【００１５】
特定の実施形態において、ウイルス性のコードされた核酸は、アデノウイルス中に提供される。
【００１６】
別の局面において、本発明は、肝細胞集団におけるウイルス性のコードされた治療的遺伝子産物のレベルを増加させるための方法を特徴とする。本方法は、この肝細胞集団と、治療的遺伝子産物をコードする治療的核酸およびこの被験体中でのＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤とを接触させる工程を包含する。調節される、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の１つの機能は、この薬剤の取り込みである。この薬剤の取り込みは、非特異的（例えば、食作用）でも、特異的（例えば、レセプターを介する取り込み）でもよい。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、ウイルス性のコードされた導入遺伝子に関連する毒性（例えば、肝毒性）の調節を必要とする被験体に、この被験体におけるＫｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬物を投与することによって、それらを調節をする方法を提供する。いくつかの実施形態において、この薬剤は、治療的遺伝子産物をコードする治療的薬剤の投与の前に投与される。他の実施形態において、この薬剤は、この治療的遺伝子産物をコードする治療的核酸の投与と同時に投与される。この核酸によってコードされる治療的遺伝子産物は、ポリペプチドでも、アンチセンス核酸でも、抗体でもよい。
【００１８】
遺伝子治療を必要とする被験体に、この治療的遺伝子産物の発現に関するポリヌクレオチドを欠失する少なくとも１用量のウイルスベクターを、この治療的遺伝子産物の発現に関するポリヌクレオチドを有する少なくとも１用量のウイルスベクターの投与の前にか、またはその投与と同時に投与することによって、肝臓における治療的タンパク質の高レベル（例えば、毒性レベル）の発現を調節する方法もまた、本発明によって提供され得る。いくつかの実施形態において、この治療的遺伝子産物のレベルは、その投与された治療的核酸のレベルに対応する。
【００１９】
治療的遺伝子産物をコードするウイルス性核酸、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の機能を調節する薬剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた、本発明によって提供される。
【００２０】
本発明は、ウイルス用量とこの核酸によってコードされる治療的遺伝子産物の発現との間の線形に近い相関を可能とする方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物はまた、このウイルスタンパク質またはこのコードされた治療的遺伝子産物の発現に関連する毒性効果の最小化も可能とする。
【００２１】
他に規定されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の関連する分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および物質に類似するかまたは等価である方法および物質が、本発明の実施または試験において用いられ得るが、適切な方法または物質は、以下に記載される。すべての出願、特許出願、特許、および本明細書中に記述される他の参考文献は、その全体が、参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む、本明細書が、支配する。
さらに、これらの物質、方法、および実施例は、例示的のみであり、限定することは意図されない。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２３】
（詳細な説明）
本発明は、被験体のＫｕｐｆｆｅｒ細胞機能に負に影響する薬剤と共に核酸を送達することによって治療的遺伝子産物（例えば、ウイルスにコードされた治療的遺伝子産物）をコードする核酸の送達を改善する方法を提供する。
【００２４】
一般に、この方法は、被験体に任意の治療的核酸を送達するために使用され得る。治療的核酸の例としては、ポリペプチドをコードする核酸、アンチセンス核酸、リボザイムをコードする核酸、およびスプライセオソームの構成要素をコードする核酸が挙げられる。治療的核酸がポリペプチドをコードする場合、そのコードされるポリペプチドは、例えば、以下であり得る：インターフェロン−α、インターフェロン−β、またはインターフェロン−γ、インターロイキンのようなサイトカイン、エリスロポイエチンのように増殖因子、ヒト成長ホルモン、インシュリン、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、ならびに第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子のような凝固因子。
【００２５】
特定の実施形態において、治療的核酸は、粒子中へのコードされた治療的産物の遺伝子のカプセル化を可能にするベクター中に提供される。特定の実施形態において、粒子はＫｕｐｆｆｅｒ細胞によって取り込まれ得る。適切な粒子は、ウイルス粒子、例えば、アデノウイルス粒子である。
【００２６】
ベクターへのポリヌクレオチド配列の挿入のための当該分野で公知の任意の方法が、使用され得る。このような方法は、例えば、以下に記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９２  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）。ベクターは、特定の治療的遺伝子についてのポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された、適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含み得る。プロモーターおよびエンハンサーはまた、治療的タンパク質または遺伝子産物の発現を制御するために使用され得る。プロモーター活性化は、組織特異的であり得るか、あるいは代謝産物または投与される物質によって誘導可能であり得る。このようなプロモーターおよびエンハンサーとしては、限定されないが、以下が挙げられる：ネイティブＥ２Ｆプロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｋａｒａｓｕｙａｍａら、１９８９  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９：１３）；ヒトβ−アクチンプロモーター（Ｇｕｎｎｉｎｇら、１９８７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：４８３１）；マウス乳腺癌ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ  ＬＴＲ）に依存するグルココルチコイド誘導性プロモーター（Ｋｌｅｓｓｉｇら、１９８４  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：１３５４）；モロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復配列（ＭｕＬＶ  ＬＴＲ）（Ｗｅｉｓｓら、１９８５  ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；ＳＶ４０初期領域プロモーター（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１  Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０  Ｃｅｌｌ，２２：７８７）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１４４１）；アデノウイルスプロモーター（Ｙａｍａｄａら、１９８５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３５６７）。
【００２７】
遺伝子移入系における使用のための特定のウイルスベクターは、現在十分確立されている。例えば、以下を参照のこと：Ｍａｄｚａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１５３３−３６（１９９２：パポバウイルスＳＶ４０）；Ｍｏｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：２５−３８（１９９２：ワクシニアウイルス）；Ｍａｒｇｕｌｓｋｅｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：６７−９３（１９９２：単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ））；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１−２４（１９９２：レトロウイルス）；Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：７４９−７５４（１９８４：レトロウイルス）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５−４５０（１９９２：レトロウイルス）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：８０８−８１３（１９９２：レトロウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルスベースのベクター）およびパルボウイルス（例えば、「欠損性」または非自律性パルボウイルスベースのベクター）（これらの全ては、本明細書中で参考として援用される）。様々の実施形態において、遺伝子治療における使用のために設計された組換えウイルスベクターが、本発明で使用される。例えば、ＨｕおよびＰａｔｈａｋ  ２０００  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５２：４９３−５１２；ＳｏｍｉａおよびＶｅｒｍａ  ２０００  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．１：９１−９９；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら、２０００  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１９４０−１９４６；Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、２００１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：３３−４０を参照のこと。さらに、ウイルスベクターは、一過的な免疫抑制治療または免疫調節治療との組み合わせで投与され得る。例えば、Ｊｏｏｓｓら、１９９６  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１５５５−１５６６；Ｋａｙら、Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４６８６−４６９１を参照のこと。
【００２８】
特定の実施形態において、使用される特定のウイルス型は、治療的遺伝子産物を含むウイルスベクターおよび治療的遺伝子産物を含まないウイルスベクター薬剤の両方に対して同じものである。任意または全てのウイルスベクターは、複製欠損であり得る。
【００２９】
他の実施形態において、ウイルス血清型（例えば、一般的なアデノウイルス２型および５型（それぞれＡｄ２およびＡｄ５））が、複数の処置が投与される、交互の投与計画で投与され得る。ウイルスベクターに対する免疫応答が予想される場合、特定の投薬レジメンが、数日の過程にわたり投与され得る。特定の実施形態の限定されない例において、Ａｄ５に基づくウイルスベクターが、１日目に使用され得、Ａｄ２に基づくウイルスベクターが２日目に使用され得るか、またはその逆で使用され得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、治療的核酸は、複製欠損組換えウイルスまたはウイルスベクターでさらに提供される。これらは、複製欠損ウイルスのみを産生するパッケージング細胞株において生成され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８９  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓを参照のこと。
【００３１】
（アデノウイルスベクター）
いくつかの実施形態において、治療的核酸を送達するためのベクターは、アデノウイルスに基づくベクターである。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：３９−６１（１９９２）を参照のこと。いくつかの実施形態において、アデノウイルスに基づくベクターは、Ａｄ−２またはＡｄ−５に基づくベクターである。例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２３，１９９２；Ａｌｉら、１９９４  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３６７−３８４；米国特許第４，７９７，３６８号および同第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【００３２】
アデノウイルスは、種々の細胞型へ治療的導入遺伝子またはレポーター導入遺伝子を効率的に送達するために改変され得る。例えば、ヒトの呼吸器疾患の原因である、一般的なアデノウイルス２型および５型（それぞれ、Ａｄ２およびＡｄ５）は、現在、臨床試験（癌または他の細胞増殖疾患および障害の処置を含む）ならびにデュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）および嚢胞性線維症（ＣＦ）の遺伝子治療のために開発されている。Ａｄ２およびＡｄ５の両方は、ヒト悪性腫瘍に関係しないアデノウイルスのサブクラスに属する。細胞の有糸分裂状態にかかわらず、アデノウイルスベクターは、様々な細胞型への高いレベルの導入遺伝子送達を提供し得る。組換えウイルスの高いタイター（１０１３プラーク形成単位／ｍｌ）は、２９３細胞（アデノウイルスで形質転換された、相補的ヒト胚性腎臓細胞株：ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）において容易に産生され得、そして明らかな損失なしで、長期間、寒冷貯蔵され得る。遺伝的不均衡を相補するインビボでの治療的導入遺伝子の送達におけるこのシステムの効率は、様々な障害の動物モデルで実証された。例えば、以下を参照のこと：Ｗａｔａｎａｂｅ，１９８６  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，３６：２６１−２６８；Ｔａｎｚａｗａら、１９８０  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１８（１）：８１−８４；Ｇｏｌａｓｔｅｎら、１９８３  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０９：２８８−２９６；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、１９９３  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９２：８８３−８９３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、１９９４  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３：１８８９−１８９３（これらの全ては、本明細書中で参考として援用される）。嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子産物のｃＤＮＡをコードする組換え複製欠損アデノウイルスが、少なくとも２つのヒトＣＦ臨床試験における使用について承認された。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３  Ｎａｔｕｒｅ，３６５：６９１−６９２を参照のこと。
【００３３】
臨床試験のために開発されたいくつかの複製欠損アデノウイルスは、Ｅ１ａ全体およびＥ１ｂ領域の一部の欠失を含んでいる。この複製欠損ウイルスは、トランス作用性Ｅ１ａタンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１ａ遺伝子を含む２９３細胞で増殖される。Ｅ１欠損ウイルスは、Ｅ１ａ領域遺伝子産物およびＥ１ｂ領域遺伝子産物をトランスで提供する特定の細胞（例えば２９３細胞）において複製し得、そして感染性ウイルスを産生し得る。得られたウイルスは、多くの細胞型に感染し得、導入された遺伝子を発現し得る（その遺伝子がそれ自身のプロモーターを保持する場合）。しかし、このウイルスは、Ｅ１領域ＤＮＡを保持しない細胞中では、その細胞が非常に高い感染効率で感染されない限り、複製し得ない。臨床試験のために開発された他のアデノウイルスベクターが、本発明で使用され得る。例としては、以下が挙げがれる：改変された親和性のための組換えファイバータンパク質を有するＡｄベクター（例えば、ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら、２０００  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１９４０−１９４６）、プロテアーゼ前処理したウイルスベクター（例えば、Ｋｕｒｉｙａｍａら、２０００  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：２２１９−２２３０）、Ｅ２ａ温度感受性変異体Ａｄベクター（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、１９９４  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１２１７−１２２９）、および「ｇｕｔｌｅｓｓ」Ａｄベクター（例えば、Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、１９９７  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２４０８−２４１６；Ｃｈｅｎら、１９９７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１６４５−１６５０；Ｓｃｈｉｅｄｅｒら、１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８：１８０−１８３）。
【００３４】
広い宿主領域を有するアデノウイルスは、静止状態または最終分化された細胞（例えば、ニューロン）に感染し得、そして基本的に非腫瘍形成であるように思われる。アデノウイルスは、さらに、宿主ゲノムに組み込まないようである。それらは染色体外に存在するので、挿入性の変異誘発の危険は大いに減少される。例えば、Ａｌｉら、１９９４，前出３７３頁を参照のこと。組換えアデノウイルス（ｒＡｄＶ）は、非常に高いタイターを生じ、そのウイルス粒子は、中程度に安定であり、発現レベルは高く、そして広い範囲の細胞が感染され得る。
【００３５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、体細胞遺伝子治療的のためのベクターとして使用されている。ＡＡＶは、それを遺伝子工学のための理想的な基質とする、単純なゲノム構造（４．７ｋｂ）を有する小さい一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡウイルスである。２つのオープンリーディングフレームが、一連のｒｅｐポリペプチドおよびｃａｐポリペプチドをコードする。ｒｅｐポリペプチド（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ６２およびｒｅｐ４０）は、ＡＡＶゲノムの複製、レスキュー、および組み込みに関与する。ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）は、ウイルス粒子キャプシドを形成する。ｒｅｐおよびｃａｐオープンリーディングフレームの５’末端および３’末端には、１４５ｂｐの逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接し、これらの最初の１２５ｂｐは、Ｙ型またはＴ型の二重鎖構造形成し得る。ｒｅｐドメインおよびｃａｐドメインの全体が、切除され得、治療的導入遺伝子またはレポーター導入遺伝子と置きかえられ得ることが、ＡＡＶベクターの開発のために重要である。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｔｉｊｓｓｅｒ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５−１６８（１９９０）を参照のこと。ＩＴＲが、ＡＡＶゲノムの複製、レスキュー、パッケージング、および組み込みのために必要な最小の配列を表すことが示されている。
【００３６】
代替的な実施形態において、薬剤は、被験体のＫｕｐｆｆｅｒ細胞のレベルを下げることによってＫｕｐｆｆｅｒ細胞機能を調節する。この型の薬剤の例としては、リポソーム性のドキソルビシンである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞機能は、治療的核酸を含むウイルス粒子の代わりに、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞によって取り込まれる薬剤によって調節される。Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞によって食作用される薬剤の例は、治療的核酸を欠くウイルス粒子（例えば、アデノウイルス粒子）である。このウイルス粒子は、完全に治療的核酸を欠き得るか、あるいは、機能的タンパク質をコードしない治療的核酸の改変体を含み得る。いくつかの実施形態において、容易に検出可能なマーカータンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼ）をコードするウイルス性導入遺伝子を含むことが所望される。
【００３８】
Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞によって食作用される薬剤のさらなる例は、粒子状物質であり、ここで、この粒子状物質としては、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの直径を有する粒子が挙げられる。特定の実施形態において、粒子は、被験体に投与され、そして治療的導入遺伝子産物をコードする、ウイルスベクターとほとんど同じ直径である。いくつかの実施形態において、粒子状物質を構成する粒子は、有機成分、無機成分、または両方の組み合わせで構成され得る。さらなる実施形態において、粒子状物質の成分粒子は、生物分解性であるか、またはインビボでの分解に耐性であり得る。いくつかの実施形態において、成分粒子は、それ自体で、処置される被験体において、ほとんどまたは全く生物学的活性を誘発しない。Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞による取り込みのために当業者によって利用される任意の型および成分の物質が、本発明によって企図される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、治療的遺伝子産物をコードする核酸は、ウイルス粒子の一部として提供され得る。従って、ウイルス性調節領域を含みそして構造タンパク質をコードする核酸、および治療的核酸は、ウイルス粒子を産生するために使用され得、次いでこれらの粒子が被験体に導入される。いくつかの実施形態において、核酸は、直接に被験体に導入される。
【００４０】
一般的に、薬剤は、治療的核酸の送達前に投与され得る。あるいは、薬剤は、治療的核酸と共に同時に投与され得る。例えば、薬剤は、治療的核酸を投与する２４時間未満前、１０時間未満前、８時間未満前、４時間未満前、２時間未満前、１時間未満前、１０分未満前、およびさらには５分未満前に、投与され得る。他の実施形態において、薬剤は、治療的核酸を投与する５分未満前に投与され得る。
【００４１】
上記の方法において、被験体は、外来核酸の導入が所望される任意の動物であり得る。従って、被験体は、例えば、哺乳動物、爬虫類、あるいは鳥類を含み得る。特定の例としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、あるいは非ヒトの霊長類が挙げられる。投与は、全身的または局所的であり得、そして予防的または治療的であり得る。
【００４２】
被験体へのウイルスにコードされた導入遺伝子の送達を改変するための方法もまた、本発明によって提供される。この方法において、投与量変曲点が、被験体における、そのウイルスにコードされた導入遺伝子を含むウイルスについて同定される。本明細書中に使用される場合、「投与量変曲点（ｄｏｓａｇｅ  ｉｎｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）」は、被験体に送達されるウイルスの量の小さい増分変化が、ウイルス遺伝子産物の量における実質的な変化を生じる点である。この変曲点は、被験体における、そのウイルスにコードされ遺伝子産物のレベルと比較される。次いで、導入遺伝子を含むウイルスの用量は、所望の用量のそのウイルスにコードされた導入遺伝子を生じる、適切な量のウイルス性核酸を送達するために、必要な場合、調節される。
【００４３】
（薬学的組成物）
本発明はまた、治療的遺伝子産物コードするウイルス核酸、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞機能を調節する薬剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む、少なくとも１つの薬学的組成物を包含する。所望ならば、ウイルス核酸は、ウイルス粒子の一部として提供され得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、薬学的有効量で提供される。用語「薬理学的有効量または薬学的有効量」は、研究者あるいは臨床医に要求される組織、系、動物、またはヒトの生物学的反応または医学的反応を誘発する、薬物または薬学的薬剤の量を意味する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、組成物は、内服に適切であり、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアと共に、単独または組み合わせで、有効量の本発明の薬理学的に活性な化合物を含む。この化合物は、（存在するとしても）非常に低い毒性を有するという点で、特に有用である。
【００４５】
本明細書に記載される化合物は、薬学的組成物の活性成分を形成し得、そして代表的に、意図された投与の形態（すなわち、経口錠剤、カプセル、エリキシル剤、シロップ剤など）に関して適切に選択された、適切な薬学的希釈剤、賦形剤またはキャリア（まとめて、本明細書中で「キャリア」材料といわれる）との混合物で投与され得る。組成物は、代表的に、有効量の活性化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩を含み、そしてさらに、薬学で習慣的に使用されるような任意キャリア材料を含み得る。投与の意図された様式に依存して、組成物は、例えば、単位投薬量の、固体、半固体または液体の投与形態（例えば、注射剤、錠剤、坐剤、丸剤、時間放出カプセル、粉末、液体、懸濁液などであり得る。
【００４６】
本明細書中に記載の活性化合物および塩の投与は、治療薬剤についての投与の公認（ａｃｃｅｐｔｅｄ）形態のいずれかを経由し得る。これらの方法は、全身投与または局所投与（例えば、経口投与形態、経鼻投与形態、非経口投与形態、経皮投与形態、皮下投与形態、または局所投与形態）を含む。
【００４７】
例えば、錠剤またはカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル剤）の形式での経口投与について、活性薬物成分は、経口の、非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と組み合わされ得る。さらに、所望されるかまたは必要とされる場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた、混合物中に組み込まれ得る。適切な結合剤としては、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプン糊、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、天然の糖質（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース、コーン甘味料、天然および合成の粘剤（ｇｕｍ）（例えば、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックスなど）が挙げられる。これらの投薬形態で使用される滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、滑石粉、ステアリン酸、そのマグネシウム塩またはカルシウム塩および／あるいはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、アルギン酸またはそのナトリウム塩、あるいは発泡性の混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンが挙げられる。
【００４８】
本発明の化合物はまた、徐放性（ｔｉｍｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）および持続放出性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）の錠剤またはカプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁液、シロップ剤およびエマルジョンのような経口投薬形態で投与され得る。
【００４９】
液体、特に注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。その活性化合物は、薬学的に純粋な溶媒（例えば、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなど）に溶解されるかまたはそれらと混合され、それによって注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射前に液体中での溶解に適した固体形態が、処方され得る。注射可能な組成物は、例えば、等張性の水溶液または懸濁液である。その組成物は、滅菌され、そして／またはアジュバンド（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶液促進因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、浸透圧（ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）および／または緩衝剤を調節するための塩）を含み得る。さらに、それらはまた、他の治療上有益な物質を含み得る。
【００５０】
本発明の化合物は、静脈内形態（ボーラスと注入の両方）、腹腔内形態、皮下形態、または筋内形態、薬学分野において当業者に周知の全ての使用形態で投与され得る。注射可能物質は、液性溶液または懸濁液のいずれかの慣用的な形態で調製され得る。
【００５１】
非経口の注射可能な投与は、一般に、皮下、筋内または静脈内の注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与についての１つのアプローチは、米国特許番号第３，７１０，７９５号（本明細書中にその全てが参考として援用される）に従って、一定レベルの投薬量が確実に維持される徐放性放出系または持続放出系の移植を使用する。
【００５２】
さらに、本発明の特定の化合物は、適切な鼻腔内ビヒクルの局所的な使用を介する鼻腔内形態で、または当業者に周知の経皮性皮膚パッチの形態を用いる経皮経路を介して、投与され得る。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬投与は、当然ながら、投薬レジメンの全体にわたって断続的ではなく持続的である。いくつかの実施形態において、他の局所的な調製物としては、クリーム、軟膏、ローション剤、エアロゾル噴霧およびゲルが挙げられ、ここで、活性成分の濃度は、０．１％〜１５％（ｗ／ｗ）または０．１％〜１５％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【００５３】
固体組成物のために、賦形剤が（薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる）使用され得る。上記に定義される活性化合物はまた、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）をキャリアとして用いて、坐剤として処方され得る。いくつかの実施形態において、坐剤は、脂肪性エマルジョンまたは脂肪性懸濁液から有利に調製される。
【００５４】
本発明の化合物はまた、リポソーム送達系の形態（例えば、小さな単層の小胞、大きな単層の小胞および多重層の小胞）で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン（ｓｔｅａｒｙｌａｍｉｎｅ）またはホスファチジルコリンを含む、多様なリン脂質から形成され得る。いくつかの実施形態において、脂質成分の薄膜を、米国特許番号第５，２６２，５６４号に記載されるように、薬物の水溶液を用いて水和し、カプセル化した薬物を成形する。
【００５５】
本発明の化合物はまた、化合物分子が結合する個々のキャリアとしてのモノクローナル抗体の使用によって、送達され得る。本発明の化合物はまた、標的可能薬剤のキャリアとして、水溶性ポリマーと結合され得る。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌａｓｐａｎａｍｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンが挙げられる。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出の達成において有用な生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋コポリマーまたは両親媒性遮断コポリマー）のクラスと結合され得る。
【００５６】
所望される場合、投与される薬学的組成物はまた、少量の非毒性の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、および他の物質（例えば、酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレアートなど））を含み得る。
【００５７】
化合物を利用する投薬レジメンは、多様な因子によって、選択される。多様な因子としては、以下が挙げられる：患者の型、種、年齢、体重、性別および病状；処置されるべき状態の重症度；投与経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに使用される特定の化合物またはそれらの塩。通常の熟練した医師または獣医師は、状態の進行を防止するか、対抗するか、または阻止するために必要とされる薬物の有効量を容易に決定し、処方し得る。
【００５８】
本発明の化合物は、単一用量で投与され得る。あるいは、本発明の化合物は、単一の日用量で投与され得るか、または全日用量が、１日に２回、３回、または４回の分割用量で投与され得る。さらに、本発明の化合物は、数日または数週間にわたって投与され得る。治療投与のための投薬レジメンは、当業者に周知である。
【００５９】
上記の任意の薬学的組成物は、活性成分として、０．１−９９％、１−７０％、または１−５０％の本発明の活性化合物を含み得る。
【００６０】
本発明の化合物は、１つ以上の薬学的組成物として、別の治療剤と一緒に投与され得る。その他の治療剤は、本発明の化合物の投与前、投与と同時に、あるいは投与後に投与され得る。他の治療剤は、例えば、特定の徴候に関する、当該分野で公知の治療剤であり得る。
【００６１】
本明細書および請求の範囲にわたり、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、明白に規定された整数または整数群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数群の排除を意味しないことが理解される。
【実施例】
【００６２】
本発明は、以下の非限定的な実施例において説明される。
【００６３】
（実施例１：ヒトインターフェロン−βの核酸を含むアデノウイルス粒子と一緒にレポーター核酸を含むアデノウイルス粒子を用いるマウスへの注入は、ヒトインターフェロン−βの発現促進を生じる）
循環するインターフェロン−βレベルに関して、ヒトインターフェロン−βの核酸を含むアデノウイルス粒子と一緒にレポーター核酸を含むアデノウイルス粒子の投与の効果を、調べた。
【００６４】
（アデノウイルスベクター）
Ｅ１を欠失した、Ｅ２ａ−温度感受性アデノウイルスＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βおよびＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺは、それぞれ、ヒトＩＦＮ−βおよびβ−ガラクトシダーゼをコードし、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターによって駆動される。例えば、Ｑｉｎら、１９９８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９５：１４４１１−１４４１６を参照のこと。Ｅ１、Ｅ３を欠失したアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶｈα１ＡＴおよびＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺは、それぞれ、ＣＭＶの初期プロモーターによってまた駆動される、ヒトα１−アンチトリプシン（「α１ＡＴ」）およびβ−ガラクトシダーゼ（「ｌａｃＺ」）をコードする。例えば、Ｊｏｏｓｓら、１９９８  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３０９−３１９を参照のこと。全てのウイルス調製物を、２回の塩化セシウムバンド形成によって高度に精製し、そして粒子力価を前述のように決定した。例えば、Ｎｙｂｅｒｇ−Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９７  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：８０８−８１１；Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｓ、１９７０  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７を参照のこと。
【００６５】
５つのマウスの群（指定したような、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｂａｌｂ／ｃマウス、Ｃ３Ｈマウス、ＮＣＲヌードマウス、Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６  ｒａｇ−１マウス、またはＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス）に、全ての実験において、１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中の種々の用量の組換えアデノウイルスを、尾静脈を介して静脈内に（「ｉ．ｖ．」）注射した。用量およびウイルスの構築物は、以下に記載した。血液を、α１ＡＴアッセイ用に１日目に、そしてｈＩＦＮ−βアッセイ用に３日目に、尾静脈出血または心穿刺によって採取し、血清を調製し、そして、サンプルを−８０℃で保存した。尾静脈注射の後のアデノウイルスの体内分布を調査するため、１×１０１０、３×１０１０、１０×１０１０および３０×１０１０粒子のＣｙ３で標識したＨ５．０１０ＣＭＶｅＧＦＰウイルスを、１群あたり９匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。コントロールとして、１００μｌのフルオロフォア  Ｃｙ３（２×１０１３）を、２匹の動物内に注射した。動物を屠殺して、ベクター注射の３０分後、４時間後および２４時間後で、肝組織、脾臓組織、肺組織、および腎組織を回収した。このコントロール群由来の動物は、３０分のみで採取した。
【００６６】
レポーターとしてβ−ガラクトシダーゼを使用した動物研究のために、Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺの投与３日後にマウスを屠殺し、そして肝臓を全葉摘出した。肝組織をＰＢＳ中で簡単に洗浄し、次いで、２ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含む４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で４℃で４時間固定した。組織をＰＢＳ／２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で４℃にて一晩洗浄し、次いで、２ｍｍの厚切片にスライスした。次いで、これらの厚切片を再びＰＢＳ／２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で４℃にて一晩洗浄し、次いでＸ−ｇａｌ（それぞれ５ｍＭのフェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウムを含む上記の洗浄緩衝液中に、１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で３７℃にて４時間染色した。組織を再び簡単に洗浄し、写真を撮り、次いでパラフィン包埋し、薄切し（１０μｍ）、そして以下に記載されるように、Ｆ４−８０抗体を使用してＫｕｐｆｆｅｒ細胞に関して染色した。切片をニュークリアファストレッド（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｓｔ  ｒｅｄ）で対比染色した。
【００６７】
インターフェロン−βのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイの使用によって定量化した。９６ウェルプレートを、抗ヒトＩＦＮ−β抗体（ＢＯ−２；Ｓｕｍｍｉｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｏｒｔ  Ｌｅｅ，ＮＪ）で４℃にて一晩コートした。この抗体を、５０ｍＭ  重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ９．６）を含むコーティング緩衝液中に１０μｇ／ｍｌで使用した。ＰＢＳ中の脂肪を含まない０．５％の粉ミルクで、プレートを１時間室温でブロックした後、次いでＰＢＳ中、ＩＦＮ−βサンプルまたはＩＦＮ−βタンパク質スタンダード（ＡＶＯＮＥＸＴＭ、Ｂｉｏｇｅｎ）、希釈した１０％の正常マウス血清、０．５％の脂肪を含まない粉ミルク、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を加えた。１．５時間、室温で捕獲した後、プレートを洗浄し、そして抗ＩＦＮ−βウサギ血清（Ｂｉｏｇｅｎ  サンプル番号４４７、１：２，０００希釈）と共に連続的に室温で１時間インキュベートし、再び洗浄し、そして次いで西洋わさびペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）−結合体化ロバ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：５，０００希釈）と共に１時間インキュベートした。次いで、最後の洗浄後、基質溶液（４．２ｍＭ  テトラメチルベンジジン、０．１Ｍ  酢酸ナトリウムクエン酸、ｐＨ４．９）を加えた。２Ｍ  過硫酸水素（「Ｈ２ＳＯ４」）の添加によってこの反応を停止し、そして、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００６８】
ヒトＩＦＮ−βを発現する、Ｅ１を欠失した、Ｅ２ａ温度感受性アデノウイルスベクター（Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−β）を、雌性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（ｎ＝５／群）に尾静脈を介してｉ．ｖ．注射した。その結果を図１に示す。ｈＩＦＮ−βの血清中での濃度（黒四角、ｎｇ／ｍｌで表わす）および肝臓ホモジネート濃度（黒丸、ｎｇ／ｇ肝臓の湿重量で表わす）との両方を、７日目にＥＬＩＳＡによって定量した。平均の血清ｈＩＦＮ−βレベルを±ＳＥＭで表わす。
【００６９】
ｈＩＦＮ−β発現の非直線的な用量応答を、Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−β単独のｉ．ｖ．投与後に観察した。高用量のベクター（マウス１匹につき１×１０１１粒子）は、低用量（１×１０１０粒子）と比較して、高レベルのｈＩＦＮ−β発現を偏って示した。比較的低レベルのウイルス（すなわちマウス１匹につき１〜３×１０１０のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βウイルス粒子）は、非常に低レベルのＩＦＮ−βのみを、マウスの血清および肝臓中において検出した（代表的に、注射の３日後と７日後との間でピーク発現を伴う）。
【００７０】
しかし、１×１０１１粒子までの用量の増加は、代表的には、たった３倍増加したウイルス用量から、１０〜１００倍に増加したＩＦＮ−βレベルで、ＩＦＮ−βレベルの大幅な増加を偏って生じた。この非直線的な用量応答が血清中と肝組織抽出物内との両者のＩＦＮ−βレベルで見られたので、この非直線的な用量応答は、低レベルのＩＦＮ−β発現での肝臓におけるＩＦＮ−βの保持にも、そして高レベルの発現での循環中にだけの分泌にも起因されない。同様の非直線的な用量応答は予め観察されたが、これに対する基準は、決定されていなかった。例えば、Ｍｏｒｒａｌら、１９９８  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２７０９−２７１６；Ｓｈｉｒｌｅｙら、１９９８  Ｂｌｏｏｄ  ９２：２９６ａを参照のこと。
【００７１】
マウスにまた、高用量（１×１０１１粒子）または低用量（２×１０１０粒子）のいずれかのＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−β、あるいは、２×１０１０粒子のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βと、種々の量のＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする、当量のアデノウイルス）との混合物を含む用量を注射した。この結果を、図２Ａに示す。再び、高用量群（５００ｎｇ／ｍｌを越える血清のＩＦＮ−βレベル）と低用量群（３．８ｎｇ／ｍｌの血清のＩＦＮ−βレベル）との間のＩＦＮ−β発現レベルの差異は、ウイルス用量の差異より遙かに大きかった。しかし、ｌａｃＺをコードしているアデノウイルスの同時投与は、生じるＩＦＮ−βの発現レベルを著しく劇的に増強した。このＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺ  ヘルパーアデノウイルスを滴定して、固定された低用量の２×１０１０粒子のレポーターＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βが最大の発現を生ずるに必要とされる最適な用量を決定した。増大したＩＦＮ−βの発現は、全てのＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺ用量で見られ、２×１０１０粒子ほどの少ない量のＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺで１０倍の増加（４０ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−β）が観察された。ＩＦＮ−β発現は、４×１０１０粒子のＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺで約１３０ｎｇ／ｍｌでプラトーに達した。従って、４×１０１０粒子またはそれ以上のＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺの同時処置で用量応答はより比例し、２×１０１０粒子のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−β用量（高用量の１／５で）は、１×１０１１粒子のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−β用量により観察されるＩＦＮ−βレベルの約１／４を生じる。
【００７２】
これらの結果は、非直線的な関連性が、ウイルス用量とそのウイルスによって産生されたコードされたタンパク質との間に存在することを実証する。これらの結果はまた、ウイルス用量とそのウイルスによって産生されるコードされたタンパク質との間に存在するおおよそ非直線的な関連性が、タンパク質をコードしているウイルスと一緒に、タンパク質をコードしていないアデノウイルスベクターの投与によって得られ得ることも、実証する。
【００７３】
（実施例２：ヒトＩＦＮ−βを用いてマウス中で観察される投薬量応答は、マウス中のヒトＩＦＮ−βの生物学的効果に起因しない）
ヒトＩＦＮ−βは、マウスにおいて検出可能な異種間活性（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有さないので、ヒトＩＦＮ−βはマウス系において生物学的効果を有しそうでない。例えば、Ｊｏｋｌｉｋ、１９９１、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓ  ＆  Ｋｎｉｐｅ編（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．２８１〜３０７を参照のこと。しかし、この可能性およびヒトＩＦＮ−βの薬物動態が部分的にこれらの現象を担い得るという可能性を除外するために、実施例１における実験を、Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの代わりにＨ５．０１０ＣＭＶｈα１ＡＴ（ヒトα１ＡＴ  ｃＤＮＡ（「ｈα１ＡＴ」）を発現する、Ｅ１およびＥ３を欠損したアデノウイルス）を使用して、繰り返した。
【００７４】
α１−ＡＴのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを使用することで定量化した。９６ウェルのプレートを、ウサギ抗ヒトα１−抗トリプシン（「α１−ＡＴ」）抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム／炭酸ナトリウムを含むコーティング緩衝液（ｐＨ  ９．５）中で１０ｍｇ／ｍｌで使用される）を用いて、４℃にて一晩コーティングした。このプレートを、室温で１時間、３％のＢＳＡを用いてブロッキングし、洗浄し、そして、α１−ＡＴタンパク質標準（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、またはＰＢＳ中の０．５％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０中で希釈した血清サンプルと共にインキュベートした。３７℃で２時間または４℃で一晩のインキュベーションに続いて、このプレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗−ヒトα１−ＡＴ抗体（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）の１：５０００の希釈液を用いて、室温にて２時間インキュベートした。次いで、このプレートを、ペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ）と共に室温でインキュベートし、そして、吸光度を、３０分以内に４５０ｎｍで測定した。
【００７５】
非線形の用量応答が再び観察された。この結果を、図２Ｂに示す。低用量の１×１０１０粒子は、２．８μｇ／ｍｌのα１−ＡＴの血清レベルを生じた一方、８×１０１０粒子は、１５２μｇ／ｍｌのα１−抗トリプシンの血清レベルを生じ、再度線形用量反応に近いレベルに達した。８×１０１０粒子Ｈ５．０００ＣＢＬａｃＺと共に混合した低用量の１×１０１０粒子Ｈ５．０１０ＣＭＶｈα１ＡＴは、２３．８μｇ／ｍｌのα１−抗トリプシンレベルを生じた。従って、非線形用量応答および別のアデノウイルスを用いた処置による増強は、ＩＦＮ−βレポータータンパク質に特異的ではない。一連の他の実験は、異なる複製欠損（例えば、Ｅ１欠損、Ｅ１欠損およびＥ２ａ温度感受性、ならびにＥ１欠損およびＥ４欠損）を有する種々のアデノウイルス構築物を、レポーターウイルスまたは非レポーターウイルスのいずれかとして比較した。非線形投薬量応答および非レポーターアデノウイルスによる増強が、ウイルスの３世代全てで観察されて、これは、これらのウイルスの欠損の程度が、この現象の根底にある重要なパラメーターでないことを示す。同様の結果がまた、レポーター遺伝子の発現を指向する異なるプロモーターを評価した場合に得られた。
【００７６】
（実施例３：ｌａｃＺをコードするアデノウイルスは、ＩＦＮ−βをコードするアデノウイスルの前、または同時に投与された場合、アデノウイルスＩＦＮ−β遺伝子発現を増強する）
ｌａｃＺをコードするアデノウイルスの用量を変化させる効果、およびｈＩＦＮ−βをコードするアデノウイルスの前または後にレポーター遺伝子アデノウイルスを添加する効果を、決定した。
【００７７】
用量応答実験および同時投与の研究を、最初に、組織培養細胞で実施した。この実験を、レポーターウイルスとしてＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺ、非レポーターウイルスとしてＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βを使用し、そして導入遺伝子の発現レベルを決定するようなｌａｃＺ活性についてルミネセンスアッセイを使用して、Ｈｕｈ７細胞中で実施した。
【００７８】
ヒト肝細胞癌細胞株Ｈｕｈ７（ＡＴＣＣ）を、１ウェルあたり７×１０４細胞で、２４ウェルのプレート中にプレーティングした。細胞を、６時間〜８時間後に、３０、１０、３および１の感染効率（ＭＯＩ）でのＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺか、または、示されるようなＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺおよびＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの混合物のいずれかを用いて感染させた。２４時間後、細胞をレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で溶解させ、そして、細胞細片を短時間の遠心分離によって除去した。細胞溶解物を、９６ウェルのプレート中で、室温にて１時間、反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共にインキュベートし、次いで、βガラクトシダーゼ活性をルミノメーターで測定した。この結果を図２Ｃ中に示す。
【００７９】
これら全てのインビトロ実験において、ほぼ線形の用量応答が観察され、そして、非レポーターウイルスの添加による増強は観察されなかった。これは、非線形用量応答が、インビボの現象であることを示す。
【００８０】
次に、アデノウイルスの投与の経時変化を、インビボで試験した。実施例１中で記載された２つのウイルス調製物を、静脈注射の前に混合した。レポーターウイルスの注射の前または後の、非レポーターウイルスの投与を、比較した。この結果を、図３に示す。Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの５分程度後でのＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺの注射は、ＩＦＮ−β血清レベル（３〜８ｎｇ／ｍｌ）の増強を示さなかった。ｌａｃＺウイルスがレポーターウイルスの複製に必要な機能を提供することによってＩＦＮ−βの発現を増大するならば、この極めて短い分離時間の劇的な効果は予想できないだろう。以前のデータと一致して、アデノウイルスの同時投与は、約１０倍高いＩＦＮ−βレベル（４２ｎｇ／ｍｌ）を生じた。驚くことに、Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βよりも前にＨ５．１１０ＣＭＶＡｌａｃＺを投与した動物は、同時投与したマウスよりもなお高いＩＦＮ−β発現を有し、本実験において、４時間〜８時間の予備投薬が最適でありそうで、そして、約３００ｎｇ／ｍｌの血清ＩＦＮ−βを生じた。ＩＦＮ−βレベルの増加は、Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺをＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの２４時間〜４８時間前に投与した場合、観察されなかった（データは示さない）。
【００８１】
これらの実験を、Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺを用いた予備投薬を行ったかまたは行っていない動物の、完全な用量応答曲線を網羅するために拡大適用した。この結果を図４中に示す。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに、０．３×１０１０粒子と１０×１０１０粒子との間の用量で、Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βを単独（黒丸）でか、またはＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺの飽和用量（８×１０１０粒子）注射の４時間後にＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−β（黒四角）のいずれかで注射した。ｈＩＦＮ−βの血清濃度（ｎ＝５／群、平均±ＳＥＭを示す）を、ＥＬＩＳＡによって３日目に決定した。以前に見られたように、Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺの予備処置がない場合での極めて低用量のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−β（０．３〜３．０×１０１０粒子）は、検出不可能な極めて低血清レベルのＩＦＮ−βを導いた一方、血清ＩＦＮ−βにおける非線形的な増加が、４×１０１０粒子以上で見られた。Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺ予備投薬を実施した場合、有意なＩＦＮ−β血清レベルが、極めて低用量のＨ５．１１０ＣＭＶＩＦＮ−βの投与の後に観察され、そして、ウイルス用量と血清ＩＦＮ−βとの間の関係は、ほぼ直線形であった。
【００８２】
（実施例４：用量応答の調節は、プロモーター依存性でない）
これらのデータを説明するための別の可能な機構は、レポーター導入遺伝子の発現を指向するために使用されるウイルス性プロモーターの、サイトカイン媒介性の活性化である。例えば、炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）因子であるＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢ結合部位を有するプロモーターを刺激し得る。例えば、Ｌｉｅｂｅｒら、１９９７  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８７９８〜８８０７；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９２６７〜９２７７を参照のこと。しかし、ＮＦ−κＢ結合部位を含むプロモーター、またはＮＦ−κＢ結合部位が欠如するプロモーター（すなわち、各々ＣＭＶ  ＩＥプロモーターおよびα１ＡＴプロモーター）のいずれを使用しても、関係なく、類似の結果を得た。インビトロでのこの効果の欠如を考えると、宿主の生理学または免疫系のさらに複雑な成分が、本明細書で示される効果を媒介しそうである。
【００８３】
（実施例５：ドキソルビシン／リポソームを用いたマウスの処置は、引き続き投与されたアデノウイルス  ｈＩＦＮ−β導入遺伝子の発現を増強する）
種々のウイルス遺伝子治療ベクター（特にアデノウイルス）の静脈内投与は、肝臓を標的化し、肝細胞の効率的な注入、続く導入遺伝子の発現を生じることが報告されている。静脈内投与はまた、肝臓中のＫｕｐｆｆｅｒ細胞への取り込みを生じることが報告されている。
【００８４】
この知見を検証するために、蛍光標識したアデノウイルス粒子を調製し、そして、マウス中に導入した。アデノウイルスのカプシドタンパク質に共有結合されたＣｙ３カルボシアニン色素を有する、アデノウイルスを調製するために、Ｃｙ３標識キットを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬから購入した。例えば、Ｌｅｏｐｏｌｄら、１９９８  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．９：３６７〜３７８を参照のこと。ＰＢＳ中の高度に精製された組換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶＥＧＦＰストックを、５×１０１２粒子／ｍｌの濃度に調整した。１ｍｌのウイルスストックを、製造者の説明書に従って、標識反応のために使用した。遊離したＣｙ３色素を、透析チャンバ（６，０００〜８，０００  ＭＷカットオフ、Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｓｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中で、４ＬのＰＢＳに対して４℃で一晩、反応混合物を透析することによって除去した。Ｃｙ３色素濃度を製造者による指示の通りにアッセイした。
【００８５】
Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞を、Ｆ４／８０抗マクロファージ抗体を使用して、免疫組織化学的に標識した。５μｍのパラフィン切片を切断し、被膜されたスライド上に置き、洗浄しそして再水和させた。ＰＢＳ中で平衡にした後、切片を、メタノール中で１％の過酸化水素（「Ｈ２Ｏ２」）を用いて処理し、ＰＢＳ中でリンスし、そして、ブロックして非特異的結合を妨げた（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ，Ｐｉｅｒｃｅ）。Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞を、Ｆ４／８０抗マクロファージポリクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）およびビオチン化ヤギ抗ラット二次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して標識した。二次抗体およびアビジン−ＨＲＰ検出（ＤＡＢ基質）を、ＮｅｘＥＳ自動免疫染色器（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ）（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。
【００８６】
Ｃｙ３標識されたベクターの取込およびマクロファージの同時染色を可視化するために、肝臓組織のブロックを、門脈注入の３０分後に取り出した。この組織を凍結し、そして切片化のＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ）中に包埋した。８μｍ厚の凍結切片をスライド上に配置し、−２０℃にて１５分間アセトン中で固定化し、そして、風乾させた。切片を、１×Ｍｏｒｐｏ−Ｓａｖｅ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中に１５分間、後固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘ）し、そして、ＰＢＳ中で洗浄した。マクロファージを、抗マクロファージ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ラット抗マウス、クローンＦ４／８０）を用いて、室温にて１時間検出した。スライドをＰＢＳ中で洗浄し、室温で１５分間、１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）でブロックした。ＰＢＳ中での洗浄に続き、１次抗体を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ラット抗体（Ｍｏｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて蛍光標識した。画像を、Ｌｅｉｔｚ  ＤＭＲ蛍光顕微鏡およびＳＰＯＴ−ＲＴ  ＣＣＤカメラを用いて撮り、そして、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）中で合わせた。
【００８７】
蛍光標識されたアデノウイルスの静脈内注射を観察し、処理した肝臓切片中の陽性の免疫染色によって示されるように、肝臓Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞を標的化した。低レベルの染色がまた、脾臓および肺において観察された。優勢なＫｕｐｆｆｅｒ細胞の取込にもかかわらず、高ウイルス用量が、肝臓中の実質的に全ての細胞への送達を生じ得、そして、肝細胞中で極めて高い比率（ほぼ１００％）で導入遺伝子の発現を生じ得る（データは示さない）。肝臓組織、脾臓組織、肺組織および腎臓組織を、２つの方法を介して処理した。各組織の半分を瞬間凍結し、そして、クリオスタットを使用して切片化した。この組織のもう半分を、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）中４％のパラホルムアルデヒド中で、室温にて４時間固定し、次いで、７０％のエタノールに移し固定化を停止し、パラフィン中に包埋し、そして、切片化した。
【００８８】
次に、肝細胞の有効な形質転換を制限する際のＫｕｐｆｆｅｒ細胞の潜在的関与を、ドキソルビシン含有リポソーム（「リポソーマルドキソルビシン」）を用いて試験した。これらのリポソームは、肝臓中のＫｕｐｆｆｅｒ細胞を枯渇させることが報告された。Ｄａｅｍｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６１：７１６〜２１、１９９５；Ｌｏｎｇｍａｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７５：１１７７〜１１８４、１９９５；Ｐａｒｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１６８：２４９〜２５２を参照のこと。この現象は、Ｒａｇ−１マウス中では、現在のところ原因は不明であるが、観察されなかった。
【００８９】
０．１３２μｍｏｌ／０．１ｍｌおよび０．２６４μｍｏｌ／０．２ｍｌのリポソーム捕捉ドキソルビシン（０．２の脂質に対する薬物のモル比で、ジステアリン酸ホスファチジルコリン／コレステロール  ５５／４５から構成される１００ｎｍの単層リポソーム（Ｄｒ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｂ．Ｂａｌｌｙ，ＢＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｃｙからの贈与））の静脈内注射を、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の一時的な枯渇のための低用量のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの注射の２４時間前に、投与した。図５中に示すように、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス中のｈＩＦＮ−βの発現を、以下を比較することで評価した：（ａ）２×１０１０粒子単独のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの注射、（ｂ）０．１３２ｍｍｏｌのリポソーム捕捉ドキソルビシンの注入によるＫｕｐｆｆｅｒ細胞の枯渇、もしくは（ｃ）０．２６４ｍｍｏｌのリポソーム包含ドキソルビシンを用いた枯渇の２４時間後に注射された２×１０１０粒子のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの注射；または（ｄ）８×１０１０のＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺを用いた予備投薬の４時間後の注入。マウスの各系統に、示されたようなアデノウイルス構築物を注射し、そして、末端出血（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）によって、血清を２４時間後に収集した。Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの２×１０１０粒子の投与の前のドキソルビシン／リポソームを用いたマウスの処置は、劇的により高いＩＦＮ−βの発現レベルを引き起こし、そして、高用量のＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺの予備処置の効果とほぼ同等になった。この結果を、図４および図５に示す。
【００９０】
蛍光標識したウイルスを脾臓のそばから回収したので、ウイルスを隔絶するような脾臓マクロファージの可能性を考慮して、用量応答を、脾臓摘出したマウスで試験した。レポーターの発現に関して、脾臓の除去の効果は観察されなかった。
【００９１】
観察された増強された導入遺伝子の発現が肝細胞由来であることを確認するため、そして、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞自身が有意なレベルの導入遺伝子を発現しているかどうかを決定するために、Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺレポーターウイルスを使用した。マウスに、Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βウイルスを用いた予備投薬とともに、またはそれなしに、一定の範囲のウイルス濃度で注入した。３日後、肝臓を取り出し、ｌａｃＺ活性について染色した。
【００９２】
得られた組織切片の実験に関して見られるように、組織染色レベルは、可視的に以前の実験と一致し、そして、予備投薬の後の最低用量（１×１０１０粒子）でさえも、ｌａｃＺ染色が増強されていることを示した。薄い切片を試験した場合、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞は、それらの効率的なウイルスの取込みにもかかわらず、検出可能なｌａｃＺ活性を発現しないこと、そして、予備投薬が、実際に、肝細胞発現の劇的な増強を生じたということは、明白であった。
【００９３】
非線形用量応答、およびコントロールアデノウイルスを用いた同時投与、予備処置または後処置の効果を、ヒトα１抗トリプシン発現アデノウイルス（Ｈ５．０１０ＣＭＶｈ  α１ＡＴ）を使用して、５匹の異なるマウス系統において試験した。この結果を、図６に示す。５つのマウス系統のうち４系統が、非線形投与速度論と本質的に類似の結果、および非レポーターウイルスの同時投与または予備投与による増強を与えた。アデノウイルス用量における８倍の増加は、血清α１ＡＴレベルにおいて、１０２倍の増加（ＮＣＲヌード）、２２８倍の増加（Ｂａｌｂ／ｃ）、１６０倍の増加（Ｃ３Ｈ）および２６倍の増加（Ｃ５７ＢＬ／６）を生じた。これらの４つのマウスの系統全てにおいて、低用量のＨ５．０１０ＣＭＶｈα１ＡＴとＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺとの同時投与は、得られたα１ＡＴ血清レベルを増加し、そして、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを用いた予備処置は、ＮＣＲヌードマウス、Ｃ３ＨマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおける同時処置よりも高いα１ＡＴレベルを与えた。４つのマウス系統全てにおいて、Ｈ５．０１０ＣＭＶｈα１ＡＴ後のＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺの投与は、最小の効果であった。系統間で、わずかではあるが再現性のある差異が存在した（Ｃ５７ＢＬ／６は、低用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスまたはヌードマウスよりも一貫して高い発現レベルを示した）。
【００９４】
（実施例６：非線形用量依存性ｈＩＦＮ−βアデノウイルス導入遺伝子発現はまた、霊長類で観察される）
研究をまた、アカゲザルにおけるアデノウイルスｈＩＦＮ−β導入遺伝子の発現を測定することによって、実施した。用量を、体重あたりのウイルス粒子を算出することで決定した。応答をまた、これらの実験中において、１匹のマウス中で測定した。
【００９５】
体重あたりのウイルス粒子に関する投薬量（粒子／ｋｇ）を、マウスあたり２０ｇの質量を仮定することで、算出した。
【００９６】
検出不可能なほど非常に低いウイルスにコードされた導入遺伝子の発現が、２×１０１０粒子（１×１０１２ｐ／ｋｇの最終用量）をマウスに投与した場合に観察された。おおよその変曲点（すなわち、非線形増加が検出される点）が、４×１０１０〜５×１０１０粒子（２×１０１２ｐ／ｋｇ〜２．５×１０１２ｐ／ｋｇ）を投与した場合、観察された。全てのマウスにおいて、極めて高い発現が、１×１０１１粒子（５×１０１２ｐ／ｋｇ）の投与に続いて観察された。
【００９７】
類似の実験をまた、アカゲザル（ｎ＝３）において実施した。おおよその変曲点が、２×１０１２ｐ／ｋｇ〜４×１０１２ｐ／ｋｇの中程度のウイルス用量で、観察された。中程度のウイルス用量の投与後、いくつかのサルは極めて低い発現を示した一方、同一の用量で処置した他のサルは、極めて高い非線形の発現レベルを示した。これらの中程度の用量群における結果とは対照的に、低用量群（１×１０１２ｐ／ｋｇ）のサル全てが、検出不可能な極めて低いＩＦＮ−β発現を示し、そして、高用量群（１×１０１３ｐ／ｋｇ）における全てのサルは、低用量群における発現レベルの１０倍よりはるかに高く増加した非常に高い発現を有した。これは、これらの研究において以下のことを示した：（１）サルにおける変曲点は、中程度の用量あたりである、そして、（２）増加の正確な点において、サルによって可変性が存在する。
【００９８】
これらの結果は、ウイルスベクターに対する非線形応答が、遺伝子産物の発現によってモニタリングされるように、霊長類ならびにマウスにおいて観察されるということを示す。
【００９９】
（等価物）
前述した本発明の特定の実施形態の詳細な記述から、核酸、ポリペプチドならびに遺伝子治療および遺伝子処置に関与する新規な組成物および方法を記載してきたことは、明白である。これらの特定の実施形態を、本明細書中で詳細に開示するが、これは、説明の目的のためだけの例としてなされ、そして、続く添付の特許請求の範囲に関して限定することを意図しない。特に、発明者らは、種々の置換、変更および改変が、特許請求の範囲によって定義されるような本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本発明に対して、当業者にとって日常的な様式でなされ得るということを意図する。実際に、本明細書中で記載した改変に加えて、本発明の種々のものは、前述の説明および添付の図面から、当業者に明白になる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、ヒトインターフェロン−βを発現するＥｌ欠損性、Ｅ２ａ温度感受性アデノウイルスベクター（「Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−β」）の静脈内投与後の、ｈＩＦＮ−β発現の非線形用量応答を図示するグラフである。
【図２】図２Ａは、Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺと低用量のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの共投与が、ＩＦＮ−β発現を増強することを図示するグラフである。
図２Ｂは、レポーターウイルスとしてのＨ５．０１０ＣＭＶｈα１−ＡＴを用いた非線形用量応答を図示するグラフである。
図２Ｃは、示された感染多重度（「ＭＯＩ」）でＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺ単独またはＨ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺおよびＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βの混合物のいずれをインビトロでＨｕｈ７細胞に感染させた場合の、Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺの線形用量応答を図示するグラフである。
【図３】図３は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを、低用量のＨ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βで処置した（Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺの投与後ではなく、投与前に）場合に示された、増強された発現を図示するグラフである。
【図４】図４は、Ｈ５．１１０ＣＭＶｌａｃＺを用いた前投与の後の、Ｈ５．１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−βと血清ｈＩＦＮ−βとの間の線形関係性を図示したグラフである。
【図５】図５は、肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞の枯渇が導入遺伝子ｈＩＦＮ−β発現を増強することを図示したグラフである。
【図６】図６は、Ｈ５．０１０ＣＭＶｈα１−ＡＴの送達の後の、導入遺伝子発現におけるマウス系統特異的差異を示すグラフである。示されるマウス系統に、以下を静脈的に注射した：低用量（１×１０１０粒子）Ｈ５．０１０．ＣＭＶｈα１ＡＴレポーターベクター単独（ａ）、高用量（８×１０１０粒子）Ｈ５．０１０．ＣＭＶｈα１ＡＴレポーターベクター単独（ｂ）、８×１０１０粒子のＨ５．１１０．ＣＭＶｌａｃＺとともに共投与される１×１０１０粒子のＨ５．０１０．ＣＭＶｈα１ＡＴ（ｃ）、あるいはＨ５．１１０．ＣＭＶｌａｃＺレポーターの３０分前（ｄ）または３０分後（ｅ）に投与されるＨ５．０１０ＣＭＶｈα１ＡＴウイルス。ウイルス投与２４時間後のヒトα１ＡＴの血清濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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