(57)【要約】対象とする生体素材を、ポリヌクレオチド抽出、増幅および解析にかける、発現プロファイリング解析のための装置。本装置は、ポリヌクレオチドを増幅させる増幅装置、および前記増幅したポリヌクレオチド産物の量を定量する解析装置を含む。本装置の増幅装置はさらに、定量化ポリヌクレオチド産物の増幅または配列同定ための、鋳型を調製するために、ポリヌクレオチド抽出を可能にしうる。本装置内には、その配列が同定される前に、定量したポリヌクレオチド産物を回収するための、自動分取機が含まれうる。解析装置はさらにデータの生成が可能であるか、または本装置にて提供される分離データ生成装置によるデータの生成が可能である。本装置内の装置は、増幅および解析のために、流体または信号を送達させる連結手段によって連結される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅産物を生成するために反応混合物中でポリヌクレオチドを増幅する増幅装置と、
前記増幅装置から、前記増幅産物を検出し定量化する解析装置へ、前記反応混合物の定分量を送達させる第一連結手段により、前記増幅装置に連結される解析装置であって、前記第一連結手段がロボットアームである解析装置
とを備える、発現プロファイリングのための装置。
【請求項２】
抽出したポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から前記増幅装置へ送達させる第二連結手段により、前記増幅装置に連結された前記ポリヌクレオチド抽出装置をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
自動分取装置をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記自動分取装置が、定量された産物を回収させる第四連結手段により、前記解析装置に連結される、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、定量された産物を前記解析装置から前記配列同定機へ送達させる第五連結手段により、前記解析装置に連結される配列同定機を、さらに備える請求項１に記載の装置。
【請求項６】
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、回収した産物を前記自動分取装置から前記配列同定機へ送達させる第五連結手段により、前記自動分取装置に連結される配列同定機を、さらに備える請求項３に記載の装置。
【請求項７】
増幅産物を生成するために、反応混合物中でポリヌクレオチドを増幅する増幅装置と、
前記反応混合物の定分量を前記増幅装置から、前記増幅産物を検出して定量化する解析装置へ送達させる第一連結手段により、前記増幅装置に連結前記解析装置と、
抽出したポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から前記増幅装置へと送達させる第二連結手段により、前記増幅装置に連結された前記ポリヌクレオチド抽出装置
とを備える、発現プロファイリングのための装置。
【請求項８】
自動分取装置をさらに備える、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
定量された産物を回収させる第四連結手段により、前記自動分取機が前記解析装置に連結される、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、回収した産物を前記キャピラリー電気泳動装置から前記配列同定機へと送達させる第五連結手段により、前記解析装置に連結される配列同定機を、さらに備える請求項７に記載の装置。
【請求項１１】
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、回収した産物を前記自動分取装置から前記配列同定機へと送達させる第五連結手段により、前記自動分取装置に連結される配列同定機を、さらに備える請求項８に記載の装置。
【請求項１２】
増幅産物を生成するために反応混合物中でポリヌクレオチドを増幅する増幅装置と、
前記反応混合物の定分量を前記増幅装置から前記増幅産物を検出して定量化する解析装置へと送達させる第一連結手段により、前記増幅装置に連結された解析装置と、
信号を前記解析装置からデータ生成装置へと送達させる第三連結手段により、前記解析装置に連結された前記データ生成装置
とを備える、発現プロファイリングのための装置。
【請求項１３】
抽出されたポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から前記増幅装置へと送達させる前記第二連結手段により、前記増幅装置に連結された前記ポリヌクレオチド抽出装置を、さらに備える請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
自動分取装置をさらに備える、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
前記自動分取装置が、定量された産物を回収させる第四連結手段によって前記解析装置に連結される、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、定量された産物を前記解析装置から前記配列同定機へ送達させる第五連結手段により、前記解析装置に連結される配列同定機を、さらに備える請求項１２に記載の装置。
【請求項１７】
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、回収した産物を前記自動分取装置から前記配列同定機へ送達させる第五連結手段により、前記自動分取装置に連結される配列同定機を、さらに備える請求項１２に記載の装置。
【請求項１８】
増幅産物を生成するために反応混合物中でポリヌクレオチドを増幅する増幅装置と、
前記反応混合物の定分量を前記増幅装置から、前記増幅産物を検出および定量化する前記解析装置へ送達させる第一連結手段により、前記増幅装置に連結された前記解析装置と、
定量された産物を回収させる自動分取装置
とを含む、発現プロファイリングのための装置。
【請求項１９】
定量された産物を回収させる第四連結手段により、前記自動分取装置が前記解析装置に連結される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
抽出したポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から前記増幅装置へ送達させる前記第二連結手段により、前記増幅装置に連結された前記ポリヌクレオチド抽出装置を、さらに備える請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、回収した産物を前記自動分取装置から前記配列同定機へ送達させる第五連結手段により、前記自動分取機に連結される前記配列同定機を、さらに備える請求項１８に記載の装置。
【請求項２２】
増幅産物を生成するために反応混合物中でポリヌクレオチドを増幅する増幅装置と、
前記反応混合物の定分量を、前記増幅装置から前記増幅産物を検出および定量化する解析装置へ送達させる第一連結手段により、前記増幅装置に連結された前記解析装置と、
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、定量された産物を前記解析装置から前記配列同定機へ送達させる第五連結手段により、前記解析装置に連結される前記配列同定機
とを含む、発現プロファイリングのための装置。
【請求項２３】
抽出されたポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から前記増幅装置へ送達させる第二連結手段により、前記増幅装置に連結された前記ポリヌクレオチド抽出装置を、さらに備える請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
自動分取装置をさらに備える、請求項２２に記載の装置。
【請求項２５】
定量された産物を回収させる第四連結手段により、前記解析装置に連結される前記自動分取装置であり、回収した産物を前記自動分取機から前記配列同定機へ送達させる別の第五連結手段により、前記配列同定機にも連結される前記自動分取装置である、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記増幅装置および前記解析装置でもポリヌクレオチドの配列同定が可能である、請求項１、７、１２、１８および２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
増幅産物を生成するために反応混合物中でポリヌクレオチドを増幅する増幅装置と、
前記増幅産物を検出および定量化するキャピラリー電気泳動装置であって、前記増幅装置から前記キャピラリー電気泳動装置へ前記反応混合物の定分量を送達するために、前記キャピラリー電気泳動装置のキャピラリーが前記反応混合物中に浸されるキャピラリー電気泳動装置
とを備える、発現プロファイリングのための装置。
【請求項２８】
抽出したポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から前記増幅装置へ送達させる第二連結手段により、前記増幅装置に連結された前記ポリヌクレオチド抽出装置を、さらに備える請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
自動分取装置をさらに備える、請求項２７に記載の装置。
【請求項３０】
定量された産物を回収させる第四連結手段により、前記自動分取装置が前記キャピラリー電気泳動装置に連結される、請求項２７に記載の装置。
【請求項３１】
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、定量された産物を前記キャピラリー電気泳動装置から前記配列同定機へ送達させる第五連結手段により、前記キャピラリー電気泳動装置に連結される前記配列同定機を、さらに備える請求項２７に記載の装置。
【請求項３２】
前記反応混合物中に浸された前記キャピラリー電気泳動装置のキャピラリーが、前記増幅装置から前記キャピラリー電気泳動装置へ前記反応混合物の定分量を送達するために、キャピラリー電気泳動装置の電極に電流を流す、請求項２７に記載の装置。
【請求項３３】
前記増幅装置および前記キャピラリー電気泳動装置もポリヌクレオチドの配列同定を可能にする、請求項２７に記載の装置。
【請求項３４】
定量された産物の配列を同定する配列同定機であって、前記自動分取装置から回収した産物を前記配列同定機へ送達させる第五連結手段により、前記自動分取装置に連結される前記配列同定機を、さらに備える請求項２９に記載の装置。
【請求項３５】
前記増幅装置がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅装置である、請求項１、７、１２、１８、２２および２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３６】
前記第一連結手段が、各ＰＣＲサイクルの最後に、前記反応混合物の定分量を前記増幅装置から前記解析装置へ送達させる、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記増幅装置が、ｃＤＮＡ生成のための逆転写を実施できる、請求項１、７、１２、１８、２２および２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３８】
逆転写に使用された１またはそれ以上のプライマーが、反応管の内壁またはマイクロタイタープレートの壁に化学的に連結する、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記装置が、１またはそれ以上の蛍光標識によって生成される信号を検出および定量できる、請求項１、７、１２、１８、２２および２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４０】
前記第一、第二、第四または第五連結手段がロボットアームである、請求項１、７、１２、１８、２２および２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４１】
前記第一、第二、第三、第四または第五連結手段が、管もしくはチャネルである、請求項１、７、１２、１８、２２および２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４２】
前記第一、第二、第四または第五連結手段が単一連結手段である、請求項１、７、１２、１８、２２および２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４３】
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送達を可能にするために、前記第一、第二、第四または第五連結手段に電流が流される、請求項１、７、１２、１８、２２および２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４４】
前記解析装置が、キャピラリー電気泳動装置である、請求項１、７、１２、１８および２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチド抽出装置が、１またはそれ以上の生体素材から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離可能である、請求項２、７、１２、２０、２３、および２８のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの検出および定量に用いられる自動装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム導入は、薬剤の開発を早める一助となってきた。ゲノム技術は新規の薬剤標的の発見においてその価値を高めた。この分野でのさらなる改良によって、よりに効率的な装置が得られ、それにより、より迅速かつ費用効果の高い、潜在的な薬剤の開発が行われるであろう。
【０００３】
薬剤の開発過程にはいくつかのステップがある。疾病に関連している潜在的な生化学標的の同定、活性化合物の検索およびさらなる化学作用の企図、前臨床試験、そして最終的には臨床試験である。この開発過程の効率は未だ完璧にはほど遠い。調査、開発過程の資金として費やされた費用の約７５％が、失敗プロジェクトに回されていたとされる。さらに、失敗が製品の開発過程の後期になるほど、その開発計画による損失は大きくなる。それゆえに、薬剤開発過程全体にかかる費用を大幅に削減するために、早い段階での将来的な失敗予測が必要とされる。したがって、初めの分子標的の性質が費用効果の高い薬剤開発を行なうための決定的な因子となる。
【０００４】
標的の同定および検証過程に影響すると思われる方法の１つが、転写プロファイリングである。この手法では特定の条件下での遺伝子の発現を比較する。例えば、疾病細胞と正常細胞とでの比較、対照細胞と薬剤処理した細胞とでの比較、または処理に応答している細胞と抵抗している細胞とでの比較を行なう。この手法によって得られる情報により、治療の標的となる特定の遺伝子を直接同定することができ、かつ重要なことに、疾病と治療に関連している生化学的な経路を明らかにすることができる。要するに、転写プロファイリングにより、生化学的な標的が得られるだけでなく、同時にそれらの標的の性質を評価する手段も得ることができる。さらに、細胞に基づく探索とともに、転写プロファイリングは薬剤開発分野を劇的に変化させることができる。歴史的に、潜在的な薬剤の探索は、表現型の変化を機能細胞系のマーカーとして用いてうまく行なわれてきた。例えば、培養組織におけるがん細胞の増殖を観測することで抗がん剤を同定した。同様に、抗生物質の同定を目的としたアッセイに細菌の生育能を利用した。このような探索は一般的には、標的とした生化学経路に関しての知識が得られていない状態で実行された。実際、そのような経路が明らかにされ、真の分子標的であるとされた有効化合物により、その後の薬剤の産生計画が可能になった。
【０００５】
転写プロファイリングを行なうための最新の装置は、新規の探索法を設計するのに用いてよく、その探索法では表現型の変化の代わりに遺伝子発現を利用して薬剤の有効性を評価する。例えば、それらの手法は米国特許第５，２６２，３１１号、５，６６５，５４７号、５，５９９，６７２号、５，５８０，７２６号、６，０４５，９８８、および５，９９４，０７６号、およびＬｕｅｈｒｓｅｎら（１９９７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：１６８−７４）、ＬｉａｎｇとＰａｒｄｅｅ（１９９８年、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２６１−７）に記載されている。このような手法は、表現型による探索が不適当であるが、望ましい転写プロファイリングを容易に確立して特定の疾患に関連付けることができるような、痴呆、軽度の認識障害、鬱などの中枢神経系（ＣＮＳ）疾患分野における薬剤の発見にとって非常に貴重でありうる。同定された有効化合物により根本的な分子作用が明らかにされると考えられる。さらに、この手法は、いくつかの生化学的な標的に同時に作用して望ましい薬理学的な効果を生じるような、現存薬剤の改良物の開発において一助となりうる。そのような場合では、多種の標的への結合の最適化に基づく選別よりも転写応答の方が薬剤作用のよりよいマーカーとなりうる。
【０００６】
本発明以前では、最も進歩した転写プロファイリングは、ＤＮＡマイクロアレイを用いた技術に基づいており、例えばＧｒｅｅｎｂｅｒｇ、２００１年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５７：７５５−６１；Ｗｕ、２００１年、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９５：５３−６５；Ｄｈｉｍａｎら、２００１年、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２２−３０；Ｂｉｅｒら、２００１年  Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｊ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．３７１：１５１−６；Ｍｉｌｌｓら、２００１年、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：Ｅ１７５−８で概説されており、また米国特許第５，５９３，８３９号、５，８３７，８３２号、５，８５６，１０１号、６，２０３，９８９号、６，２７１，９５７号、および６，２８７，７７８号に開示されている。ＤＮＡマイクロアレイは、ｍＲＮＡの逆転写により得られた、標識したポリヌクレオチド試料のハイブリッド形成を評価することにより、与えられた試料中の何千の遺伝子発現と、評価アレイの表面に付着したＤＮＡ分子との同時比較を行なう手法である。公知の技術から転写変化についての貴重な情報が得られるが、それは完璧からはほど遠く、問題点および欠点がある。
【０００７】
第一に、この技術はマイクロアレイ中に存在する遺伝子プールに限定される。現行の印刷法では単一のチップ上に配置できる遺伝子は１０，０００から１５，０００であり、それは基本的に、特定の細胞種で発現している遺伝子のうちのいくらかである。細胞種は多様であるため、特定の細胞種に対する特定のアレイの開発が必要である。これは理論的には可能であるが、細胞中に発現している遺伝子プールについての情報を、マイクロアレイの製造前に得ることが必要なために、この課題を達成するのはほぼ不可能である。
【０００８】
さらに、組織試料中の転写物の数は、細胞試料中のものよりもはるかに多く、マイクロアレイの容量を越えると思われる。加えて、代替的なスプライシングに起因する遺伝子発現の変化により、評価が必要な転写物の数が増加する。これらの問題を克服できる唯一の可能性は、代替的にスプライシングされた遺伝子も含む、ゲノム全体を扱えるような複合的なアレイを開発することである。この方法では一回の実験にかかる費用がかなり増大し、また大きな生体試料、おそらく理論的に入手可能なものよりも大きな試料を必要とすると考えられる。
【０００９】
第二に、従来のＤＮＡマイクロアレイでは量的に正確なデータを得ることができず、また遺伝子発現において観察される変化について、独立した手法（例えば定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ））で確認しなければならない。
【００１０】
最後に、従来の検出技術を用いたマイクロアレイでは、特に重要となりうる稀な転写物が検出できない。
【００１１】
遺伝子発現の定量的検出にはキャピラリー電気泳動が用いられてきた。Ｒａｊｅｖｉｃら（２００１年、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．４４２（６増補１）：Ｒ１９０−２）は、多数の腫瘍遺伝子における発現の相違を検出するために７対のプライマーを用いて、腫瘍遺伝子の異なる発現を検出する手法を開示している。センスプライマーは蛍光色素で５’末端を標識した。複合蛍光ＲＴ−ＰＣＲの結果をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０  遺伝子解析装置でのキャピラリー電気泳動により解析した。Ｂｏｒｓｏｎら（１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５：１３０−７）は、定量的競合逆転写ＰＣＲ（ＱＣ−ＲＴ−ＰＣＲ）とキャピラリー電気泳動（ＣＥ）の組み合わせに基づいて産物の迅速な分離および検出を行なう手法を記載している。Ｇｅｏｒｇｅら、（１９９７年、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ  ６９５：９３−１０２）に、キャピラリー電気泳動システム（ＡＢＩ３１０）を用いた、ＥＳＴパターンが出た蛍光の異なる表示の同定に関するキャピラリー電気泳動の適用を記述している。Ｏｄｉｎら（１９９９年、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ  ７３４：４７−５３）は、ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡを分離、および定量するための、多色検出による自動キャピラリー電気泳動を記述している。
【００１２】
ＰＣＲ増幅およびＣＥを行なうために、別々の装置が入手可能である。例えば、ＰＣＲ機はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ニューヨーク州）、Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）から市販されている。ＣＥ装置はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、カリフォルニア州）、およびＳｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ペンシルベニア州）から市販されている。
【００１３】
米国特許第６，１２６，８０４号に、統合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）酵素反応ウェルを含有し、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）チャンネル、検出器、および読み出し器が、全て手持ちサイズのパッケージ上／パッケージ中に付属しているような、微生物およびＤＮＡ断片の野外同定のための、小さくまたディスポーザブルな装置の使用を開示している。しかし、この装置は、野外での使用に特定して設計されている。さらに、従来の装置には、１またはそれ以上の試料における遺伝子発現のプロファイルを定量的に検出できる、簡便で高感度な装置がなかった。
【００１４】
これらの制限を克服するためには、本技術分野にて転写プロファイリングを行なう代替的な装置を開発する必要性が存在する。その代替的な装置は次のようであることが望まれる。（１）アッセイを行なう前に発現遺伝子プールの配列を知っておく必要はなく、アッセイ中またはアッセイ後にその情報を装置自身から得ることができる。（２）発現した転写物のレベルの定量変化を測定できる。（３）稀な遺伝子の発現を検出できる。および（４）自動化されている。本技術分野にて、１またはそれ以上の試料における遺伝子発現のプロファイルを定量的に検出できる簡単で感度の高い装置の必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、反応混合物中のポリヌクレオチドを増幅させて増幅産物を生成させる増幅装置と、反応混合物の定分量を、増幅された産物を検出および定量化する増幅装置から解析装置へ送達させる第一連結手段により、増幅装置に連結される解析装置で、第一連結手段はロボットアームである、解析装置とを備える、発現プロファイリングのための装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
１つの実施形態において、本装置にはさらに、抽出されたポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から増幅装置へ送達させる第二連結手段により、増幅装置に連結されるポリヌクレオチド抽出装置を備える。
【００１７】
他の実施形態において、本装置はさらに自動分取機を備える。
【００１８】
好ましい実施形態において、定量された産物を回収させる第四連結手段により、自動分取機が解析装置に連結される。
【００１９】
別の実施形態において、本装置はさらに、定量化された産物の配列を同定するための配列同定機であって、定量化された産物を解析装置から配列同定機へ送達させる、第五連結手段により、解析装置に連結される配列同定機を備える。
【００２０】
別の実施形態において、本装置はさらに、定量化された産物の配列を同定するための配列同定機であって、回収された産物を自動分取装置から配列同定機へ送達させる第五連結手段により、自動分取装置に連結される配列同定機を備える。
【００２１】
本発明はまた、反応混合物中のポリヌクレオチドを増幅させて、増幅産物を生成させる増幅装置と、反応混合物の定分量を増幅装置から、増幅された産物を検出および定量化する解析装置へ送達させる第一連結手段により、増幅装置に連結される解析装置と、抽出されたポリヌクレオチド試料を、ポリヌクレオチド抽出装置から増幅装置へ送達させる第二連結手段により、増幅装置に連結されるポリヌクレオチド抽出装置とを備える、発現プロファイリングを行なうための装置を供給する。
【００２２】
１つの実施形態において、本装置はさらに自動分取装置を備える。
【００２３】
好ましい実施形態において、自動分取機は、定量化された産物の回収を可能にする第四連結手段により、解析装置に連結される。
【００２４】
別の実施形態において、本装置はさらに、定量化された産物の配列を同定するための配列同定機であって、定量化された産物を解析装置から配列同定機へ送達させる第五連結手段により、解析装置に連結される配列同定機を備える。
【００２５】
別の実施形態において、本装置にはさらに、定量化された産物の配列を同定するための配列同定機が備えられており、前記配列同定機は、回収された産物を、自動分取装置から配列同定機へ送達させる第五連結手段により、自動分取装置に連結される。
【００２６】
本発明は、反応混合物中のポリヌクレオチドを増幅させて、増幅産物を生成させる増幅装置と、反応混合物の定分量を増幅装置から、増幅された産物を検出および定量化する解析装置へ送達させる第一連結手段により、増幅装置に連結される解析装置と、信号を解析装置からデータ生成装置へ送達することができる第三連結手段により、解析装置に連結されるデータ生成装置とを備える、発現プロファイリングを行なうための装置を供給する。
【００２７】
１つの実施形態において、本装置はさらに、抽出されたポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から増幅装置へ送達させる第二連結手段により、増幅装置に連結されるポリヌクレオチド抽出装置を備える。
【００２８】
別の実施形態において、本装置はさらに自動分取装置を備える。
【００２９】
好ましい実施形態において、自動分取装置は、定量化された産物が回収可能な第四連結手段により、解析装置に連結される。
【００３０】
別の実施形態において、本装置はさらに、定量化された産物の配列を同定するための配列同定機であって、定量化された産物を解析装置から配列同定機へ送達させる第五連結手段により、解析装置に連結される配列同定機を備える。
【００３１】
別の実施形態において、本装置はさらに、定量化された産物の配列を同定するための配列同定機であって、回収された産物を自動分取機から配列同定機へ送達させる第五連結手段により、自動分取機に連結される配列同定機を備える。
【００３２】
本発明は、反応混合物中のポリヌクレオチドを増幅させて増幅産物を生成させる増幅装置と、反応混合物の定分量を増幅装置から、増幅された産物を検出および定量化する解析装置へ送達させる第一連結手段により、増幅装置に連結される解析装置と、定量化された産物が回収可能な自動分取機とを備える、発現プロファイリングを行なうための装置を提供する。
【００３３】
好ましい実施形態において、自動分取機は、定量化された産物が回収可能な第四連結手段により、解析装置に連結される。
【００３４】
１つの実施形態において、本装置はさらに、抽出されたポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から増幅装置へ送達させる第二連結手段により、増幅装置に連結されるポリヌクレオチド抽出装置を備える。
【００３５】
別の実施形態において、本装置はさらに、定量化された産物の配列を同定するための配列同定機であって、回収された産物を自動分取機から配列同定機へ送達させる第五連結手段により、自動分取機に連結される配列同定機を備える。
【００３６】
本発明は、反応混合物中のポリヌクレオチドを増幅させて増幅産物を生成させる増幅装置と、反応混合物の定分量を増幅装置から、増幅された産物を検出および定量化する解析装置へ送達させる第一連結手段により、増幅装置に連結する解析装置と、定量化された産物の配列を同定する配列同定機であって、定量化された産物を解析装置から配列同定機へ送達させる第五連結手段により、解析装置に連結する配列同定機とを備える、発現プロファイリングを行なうための装置を提供する。
【００３７】
１つの実施形態において、本装置はさらに、抽出されたポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から増幅装置へ送達させる第二連結手段により、増幅装置に連結するポリヌクレオチド抽出装置を備える。
【００３８】
別の実施形態において、本装置はさらに自動分取装置を備える。
【００３９】
好ましい実施形態において、自動分取装置は、定量化された産物が回収可能な第四連結手段により、解析装置に連結され、回収された産物を自動分取機から配列同定機へ送達させる別の第五連結手段により、配列同定機にも連結される。
【００４０】
１つの実施形態において、増幅装置および解析装置もポリヌクレオチドの配列を同定することができる。
【００４１】
本発明はさらに、反応混合物中のポリヌクレオチドを増幅させて増幅産物を生成させる増幅装置と、増幅された産物を検出および定量化するキャピラリー電気泳動装置であって、反応混合物の定分量を、増幅装置からキャピラリー電気泳動装置へ送達させるために、キャピラリー電気泳動装置のキャピラリーが反応混合物に浸されるキャピラリー電気泳動装置とを備える、発現プロファイルを行なうための装置を提供する。
【００４２】
１つの実施形態において、本装置はさらに、抽出されたポリヌクレオチド試料をポリヌクレオチド抽出装置から増幅装置へ送達させる第二連結手段により、増幅装置に連結するポリヌクレオチド抽出装置を備える。
【００４３】
別の実施形態において、本装置はさらに自動分取装置を備える。
【００４４】
好ましい実施形態において、自動分取装置は、定量化された産物を回収させる第四連結手段によってキャピラリー電気泳動装置に連結される。
【００４５】
別の実施形態において、本装置はさらに、定量化された産物の配列を同定する配列同定機であって、定量化された産物をキャピラリー電気泳動装置から配列同定機へ送達させる第五連結手段により、キャピラリー電気泳動装置に連結される配列同定機を備える。
【００４６】
別の実施形態において、本装置はさらに、定量化された産物の配列を同定する配列同定機であって、回収された産物を自動分取装置から配列同定機へ送達させる第五連結手段により、自動分取装置に連結される配列同定機を備える。
【００４７】
別の実施形態において、増幅装置およびキャピラリー電気泳動装置もポリヌクレオチドの配列を同定することができる。
【００４８】
本発明の装置において、増幅装置は、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅装置である。
【００４９】
同様に好ましくは、各ＰＣＲサイクルの最後に、第一連結手段は、反応混合物の定分量を、増幅装置から解析装置に送達させることができる。
【００５０】
好ましくは、反応混合物は、反応管の内壁またはマイクロタイタープレートの壁に化学的に結合する、１またはそれ以上のＰＣＲ増幅プライマーを含む。
【００５１】
本発明の装置において増幅装置は、好ましくは逆転写を行ないｃＤＮＡを生成することもできる。
【００５２】
好ましくは、逆転写に用いる１またはそれ以上のプライマーは、反応管の内壁または微量滴定プレートの壁に化学的に結合される。
【００５３】
好ましくは、本装置は、１またはそれ以上の蛍光標識から生じる信号を検出、および定量化することができる。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態において、第一、第二、第四、または第五連結手段はロボットアームである。
【００５５】
本発明の別の実施形態において、第一、第二、第四、または第五連結手段は管またはチャネルである。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態において、第一、第二、第四、および第五連結手段は、試料を１つの装置から別の装置へ送達させる、例えばロボットアームのような、単一連結手段である。
【００５７】
１つの実施形態において、送達を可能にするため、電流が第一、第二、第四、または第五連結手段に送られる。
【００５８】
本発明の装置において、解析装置は、好ましくはキャピラリー電気泳動装置である。
【００５９】
好ましくは、本装置のポリヌクレオチド抽出装置は、１またはそれ以上の生体素材から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離することができる。
【発明の効果】
【００６０】
本発明は、生物学的および生物医学的な調査、治療剤および診断マーカーの同定、遺伝子組換えをうけた細胞および器官の性質決定、不明な疾患の同定、およびＤＮＡの特徴付けや生体試料の性質決定など、広い範囲にわたる適用における使用が理解されるであろう。そのような応用の例としては、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、転写プロファイリングおよび遺伝子型決定が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明についてさらに、添付の図面を参照しながら説明する。図面では、複数の図面で、同様の構造は同様の数字で示している。表示した図面は必ずしも縮尺ではなく、本発明の原理を図解するのに強調を用いる。
【００６２】
図面は本発明の好ましい実施形態を示しているが、考察に記載したように、本発明のその他の実施形態をも企図している。本明細書は、本発明の実施形態について例証しているが、それらは代表的なものであって、それらに限定されるものではない。多数のその他の改変および実施形態が、当業者により、本発明の原理の範囲内で考案されうる。
【００６３】
本明細書中では以下の用語および定義を用いる。
【００６４】
本明細書中で用いるところの「試料」とは、自然な環境で単離された生体試料を意味し、ポリヌクレオチドを含む。本発明による「試料」は、精製または単離されたポリヌクレオチドからなりえ、またポリヌクレオチドを含有する組織試料、生体液体試料、または細胞試料などの生体試料を含有し得る。生体液体試料としては、血液、血漿、唾液、尿、髄液、洗浄液、および白血球送達試料などが挙げられるが、それらに限定されない。本発明における試料はポリヌクレオチドを含有する任意の植物、動物、細菌性またはウイルス性素材、またはそれら由来の任意の素材でありうる。
【００６５】
本明細書中で用いるところの「調製試料」とは、ポリヌクレオチドを単離または合成するために試料から得た調製物を意味し、すなわちＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を意味する。
【００６６】
本明細書中で用いるところの「定分量」とは、調製試料または反応混合物全体から取り出した試料の量を意味する。１つの定分量は試料または反応混合物の全量よりも少なく、好ましくは１μｌから５μｌである。本発明の１つの実施形態において、取り除かれた各定分量に関して、等量の、反応に必要な試薬を含有する反応緩衝液（例えば、緩衝液、塩、ヌクレオチド、およびポリメラーゼ酵素）が加えられる。
【００６７】
本明細書中で用いるところの「連結手段」とは、二つの装置を連結して、流体および／または信号をある装置から別の装置へ送達させる手段を意味する。
【００６８】
本明細書中で用いるところの「ロボットアーム」とは、好ましくはマイクロプロセッサーで制御できる装置で、試料、管、または試料を収納したプレートを、ある場所から違う場所へ物理的に送達させる装置を意味する。それぞれの場所は、本発明による有用なモジュール装置のユニットでありうる。本発明による有用なロボットアームの例として、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲＶ−Ｅ２ロボットアームが挙げられる。ロボットアームを制御するためのソフトウエアは、一般にそのアームの製造者から入手可能である。
【００６９】
本明細書中で用いるところの「反応チャンバー」とは、反応進行中の反応物、または反応を起こす直前の反応物を入れるための流体チャンバーを意味する。反応とは、例えば、増幅反応、または抽出工程である。「反応チャンバー」は、例えば、限定はされないが、ガラス、プラスチック、ナイロン、セラミック、またはそれらを組み合わせたものを含む、任意の適切な物質、すなわち最小限の非特異的な吸着性を示す物質、または最小限の非特異的な吸着性になるように処理された物質で作成され得る。「反応チャンバー」は、物質を反応チャンバーから出し入れするために少なくとも１つの連結手段に連結され得る。
【００７０】
本明細書中で用いるところの「発現」とは、１つの細胞中または無細胞系中のタンパク質、またはヌクレオチド配列の製造を意味し、可能な翻訳後修飾と同様に、ＲＮＡ産物への転写、転写後修飾および／または、その産物をコードするＤＮＡ由来のタンパク質産物またはポリペプチドへの翻訳が含まれる。
【００７１】
本明細書中で用いるところの「発現プロファイリング」とは、複数の試料間で発現プロファイルの違いを検出することである。
【００７２】
本明細書中で用いるところの「発現プロファイルの違い」とは、遺伝子の発現における定量的な（すなわち、存在量）および定性的な違いを意味する。ポリヌクレオチド検出のための公知の手法（例えば、電気泳動）により、遺伝子発現がある試料で検出されたが、別の試料では検出されなかったという場合、「発現プロファイルの違い」があるという。あるいは、二つの試料間における遺伝子発現の定量的な違い（すなわち、増加または減少）が約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約９０％から約１００％（約２倍）またはそれ以上、約１．２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍まで、およびそれらを含む場合に、「発現プロファイルの違い」があるという。二つの試料間において異なる発現プロファイルを持つ遺伝子は、すなわちその二つの試料において異なる発現をする遺伝子である。
【００７３】
本明細書中で用いるところの「複数」とは、２、またはそれ以上を指す。複数とは、本発明おいて、３またはそれ以上、１００またはそれ以上、あるいは１０００またはそれ以上であり得、例えば試料中の全ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの数までであり得る。
【００７４】
本明細書中で用いるところの「増幅産物」とは、特定のポリヌクレオチド配列および／またはそれに相補的な配列の一定分量であるか、鋳型ポリヌクレオチド配列およびそれに相補的な配列に対して、ヌクレオチド配列にて対応しているポリヌクレオチドを意味する。本発明による、「増幅産物」は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、またそれは二本鎖または一本鎖であり得る。
【００７５】
本明細書中で用いるところの「合成」および「増幅」は相互互換的に使用され、特定のポリヌクレオチド配列の複製を生成させる、または特定のポリヌクレオチド配列の複製数または量を増加させるような反応をさす。この反応は例えば、限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチド特異性に基づく増幅反応（ＮＳＢＡ）といったｉｎ  ｖｉｔｒｏ手法、またはその他の本技術分野で公知の手法を用いて行い得る。例えば、任意の特定のポリヌクレオチド配列、すなわち標的のポリヌクレオチド配列または標的のポリヌクレオチドを、当初存在していた量よりも多く産生させるために、ポリメラーゼおよび一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリヌクレオチド増幅を行い得る。
【００７６】
本明細書中で用いるところの語句「自動分取（画分回収）」とは、クロマトグラフィーカラムまたは電気泳動装置などの、時間で流体の構成が変化するようなゆっくり流れる供給源から流体試料を回収することを企図した装置を意味する。一般的に、自動分取機は複数の別々の回収管を支えることのできる支持外部、および流体試料をそれぞれの回収管に選択的に注ぐことのできる分配頭部からなり得る。このように、試料の分離した流体画分を別々の管に回収してその後の解析または別の用途に用い得る。キャピラリー電気泳動において、キャピラリーおよび電極の末端を流体の入った回収管に浸し、ポリヌクレオチドが回収管の中に溶出するまで電流を流すことにより、自動分取を行い得る。
【００７７】
本明細書中で用いるところの語句、「配列同定機」とは、ポリヌクレオチドのヌクレオチドの性質、すなわちＤＮＡ配列を同定することができる装置を意味する。
【００７８】
本明細書中で用いるところの「標識」または「検出標識」とは、（好ましくは定量的に）検出可能な信号を発し、およびポリヌクレオチドに効果的に結合する、任意の原子または分子を指す。標識からは、蛍光、放射能、比色定量、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素活性、質量解析、結合親和性、ハイブリダイゼーションしたものの放射性、微小結晶などにより、検出可能な信号が得られうる。増幅産物を、検出標識を「検出する」ことにより「検出される」ように、本発明のプライマーを標識し得る。「定性的または定量的」検出とは、標識から生じる信号の大きさ（強さ）または数を目で見て、または自動的に査定することを指す。
【００７９】
ポリヌクレオチドに関して、本明細書中で用いるところの「単離した」または「精製した」とは、天然に存在する配列を、天然の細胞環境（例えば染色体）から取り除いた、または、天然でない環境で合成した（例えば、人工合成）ことを意味する。したがって、「単離した」または「精製した」配列は無細胞系溶液中にあり得、または異なる細胞環境に置かれ得る。「精製した」という言葉は、該配列がそこにあるヌクレオチドのみであること意味するのではなく、非ヌクレオチドまたは天然では伴われるポリヌクレオチド素材が基本的にない（約９０から９５％、９９から１００％純粋）ことを意味し、よって単離された染色体から識別できる。
【００８０】
本明細書中で用いるところの、「ｃＤＮＡ」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）の働きにより、ＲＮＡ鋳型から生成された相補的な、または複製のポリメラーゼである。「ｃＤＮＡクローン」とは、クローニングベクター中に存在する、対象のＲＮＡ分子に相補的な二本鎖ＤＮＡ配列を指す。
【００８１】
本明細書で使用するところの「ゲノムＤＮＡ」は、ＲＮＡ転写物から複製された相補的ＤＮＡと対立する、染色体ＤＮＡを意味する。本明細書で使用するところの、「ゲノムＤＮＡ」は、単一の細胞内に存在するすべてのＤＮＡであり得、または単一細胞中のＤＮＡの一部分であり得る。
【００８２】
本発明は、遺伝子発現プロファイリングを行なうための自動装置に関する。この装置により、単一の試料と同様に複数の試料について、ハイスループット発現解析を行なうことができる。単一の自動装置はしたがって、従来、技術者がピペット、インキュベーター、ポリヌクレオチド増幅装置、解析装置（例えば、ゲル電気泳動システム）、およびデータ取得システムを用いて行っていた働きを単一のシステムに含める、本発明の装置により、増幅産物の検出、解析、定量化、および／または視覚化を行なうことができる。
【００８３】
本発明で用いる実施は、特に示さなければ、分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術の従来の技術を用い、これらは、当業者に公知であり、また文献に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８９年、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第二版；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４年）；ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（Ｂ．Ｄ．ＨａｒｎｅｓとＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４年）；分子クローニングの実用解説（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｏｎｇ）（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、１９８４年）；およびシリーズ、酵素学における手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；分子生物学における簡略プロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ａｕｓｕｂｅｌら編．，１９９５年）を参照のこと。本発明の実施はまた、米国特許第５，９６５，４０９号、第５，６６５，５４７号、第５，２６２，３１１号、第５，５９９，６７２号、第５，５８０，７２６号、第６，０４５，９９８号、第５，９９４，０７６号、第５，９６２，２１１号、第６，２１７，７３１号、第６，００１，２３０号、第５，９６３，４５６号、第５，２４６，５７７号、第５，１２６，０２５号、第５，３６４，５２１号、および第４，９８５，１２９号に開示されている技術および組成物も含む。本明細書中で挙げたすべての特許、特許出願、および出版物は、上記、下記にかかわらず、参照として本明細書中に組み込まれる。
【００８４】
本発明における、遺伝子発現プロファイリングを行なうための装置は、図１の１０に、一般的に図示される。装置１０は、増幅装置６４、および第一連結手段６６により増幅装置６４に連結される解析装置６８からなる。対象の試料から抽出したポリヌクレオチドは増幅装置６４にて増幅される。次に、増幅産物の定分量が第一連結手段６６を通して解析装置６８へ送達される。解析装置６８により、増幅産物の検出および定量化が行われる。
【００８５】
１つの実施形態において、本装置を用いてポリヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を行い、増幅産物を電気泳動により解析することができる。好ましくは、増幅産物の解析にはキャピラリー電気泳動を用いる。
【００８６】
図２に示される、本発明における遺伝子発現プロファイリングを行なうための装置を用いて、増幅反応に用いるＤＮＡ鋳型の調製を行なうことができる。装置１０には、ポリヌクレオチド抽出装置２０、増幅装置６４および解析装置６８が含まれる。第一連結手段６６により増幅装置６４が解析装置６８と連結され、第二連結手段４０によりポリヌクレオチド抽出装置２０と増幅装置６４が連結される。生体試料をポリヌクレオチド抽出装置２０に導入すると、この生体試料からポリヌクレオチドが抽出される。次に、増幅装置６４でポリヌクレオチドを増幅させるために、抽出されたポリヌクレオチドは第二連結手段４０を通して増幅装置６４へ送達される。次に、増幅産物の定分量が第一連結手段６６を通して解析装置６８へ送達される。解析装置６８により、増幅産物の検出および定量化が行われる。
【００８７】
好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド抽出装置により生体試料からＲＮＡが抽出される。さらに好ましい実施形態において、ＲＮＡはポリヌクレオチド抽出装置２０により生体試料から抽出される。
【００８８】
本装置の解析装置６８により、図５に一般的に示されるように、望ましい発現プロファイリングデータを生成可能であり得る。装置１０は、増幅装置６４、および第一連結手段６６により増幅装置６４に連結される解析装置６８からなる。対象の試料から抽出したポリヌクレオチドは増幅装置６４にて増幅される。ついで、増幅産物の定分量が第一連結手段６６を通して解析装置６８へ送達される。解析装置６８により、増幅産物の検出および定量化が行われ、かつ、発現プロファイリングのデータが生成される。
【００８９】
あるいは、本発明における遺伝子発現プロファイリングを行なうための装置にはさらに、図３に示されるように個別のデータ生成装置が含まれうる。装置１０は、増幅装置６４、解析装置６８、およびデータ生成装置１２０からなる。第一連結手段６６により、増幅装置６４が解析装置６８と連結されており、第三連結手段８０により解析装置６８がデータ生成装置２０と連結される。
【００９０】
図４に示されるように、発現プロファイリングを行なうための装置に備えられている増幅装置を用いて、逆転写によってｃＤＮＡの生成を行なうことができる。装置１０は、増幅装置６４および解析装置６８からなる。第一連結手段６６により増幅装置６４が解析装置６８を連結される。抽出されたＲＮＡ（例えば、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を増幅装置６４に導入すると、増幅装置６４内でＲＮＡからｃＤＮＡが合成される。ついで、合成されたｃＤＮＡが増幅装置６４で増幅される。ついで、増幅されたポリヌクレオチド産物の定分量が、第一連結手段６６を通して解析装置６８へ送達される。解析装置６８により、増幅産物の検出および定量化が行われる。
【００９１】
ポリヌクレオチド抽出装置２０
図２および図７に示されるように、本発明によるポリヌクレオチド抽出装置２０により、生体試料（例えば細胞試料または組織試料）からポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を直接抽出することができる。
【００９２】
好ましくは、ポリヌクレオチド抽出装置２０は、増幅装置６４における逆転写反応および／またはＰＣＲ増幅反応のための鋳型として使用されるポリヌクレオチドを抽出できるように設計されている。１つの実施形態において、ポリヌクレオチド抽出装置２０により、ポリヌクレオチドの増幅に関して必要とされている、またはさらなるシステムで必要とされることに対応できる質および量のポリヌクレオチドを調製することができる。市販されている増幅体系としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）製のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州製のｉＣｙｃｌｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ；Ｃｅｐｈｅｉｄ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）製のＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＤ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎｐｏｌｉｓ、インディアナ州）製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ；ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）自動化ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎｐｏｌｉｓ、インディアナ州）、およびそれらの機種の後継機が挙げられるが、それらに限定されない。抽出装置は、抽出されたポリヌクレオチドを含有する流体を、任意の適した出量で供給するように設計され得る。出量としては例えば、約１００ｍｌから約７５０μｌ、好ましくは約５００ｍｌから約５００μｌ、さらに好ましくは約１μｌから２５０μｌ、さらに好ましくは約１μｌから約１００μｌである。
【００９３】
１つの実施形態において、ポリヌクレオチド抽出装置２０により、単一の生体試料からｍＲＮＡの単離を行なうことができる。別の実施形態において、ポリヌクレオチド抽出装置２０により、複数の生体試料からｍＲＮＡを単離することができる。
【００９４】
ポリヌクレオチドを抽出するための技術および試薬は本技術分野で公知であり、例えば、分子生物学における基本手法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９８６年、Ｄａｖｉｓら、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク州）；および分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９７７年、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｅｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載されている。
【００９５】
様々な、上記のポリヌクレオチド抽出技術を用いたポリヌクレオチド抽出装置を本発明と共に用い得る。例えば、日本の公開特許公報平成３−１２５９７２号には、ウイルス感染を予防するために、および抽出の効率を向上させるために設計された、ＤＮＡの抽出および精製に必要とされる複数に組織化された工業用ロボットおよび周辺装置を備えたポリヌクレオチド抽出装置が開示されている。日本の公開特許公報平成４−１３１０７６号には、遠心機へのポリヌクレオチド抽出容器の送達のためのコンパクトな器具配置を介して、少量の血液またはその他の生体試料からのポリヌクレオチド抽出の効率を向上させるために設計された抽出装置が開示されている。日本の公開特許公報平成９−４７２７８号には、遠心機の代わりに、真空ポンプを備えた濾過系を用いた抽出装置が開示されている。完全に自動化された抽出装置を実現するために、遠心機または真空ポンプおよびそれに関連するハードウェアを装置の中に組み込んでよい。
【００９６】
１つの実施形態において、ポリヌクレオチド抽出装置２０はポリヌクレオチド抽出装置である。本発明におけるポリヌクレオチド抽出装置には以下が備えられ得る。（１）すべて土台に固定されている、単一の生体試料、単一の試薬溶液、および磁性担体がこの中で混合され反応する反応管、好ましくない組成物溶液を溜めるための廃液カップ、およびポリヌクレオチド回収管をそれぞれ含む抽出容器の一群、（２）抽出容器それぞれに溶液を入れるための分配器具、（３）反応管中の溶液と磁性担体を混合させるための撹拌器具、（４）磁性担体を容器内に固定した状態に保つための保持器具、（５）磁性担体は固定したまま、反応管から溶液を排出するための排出器具、（６）反応管内の溶液および磁性担体を加熱するための加熱器具、および（７）容器を特定の位置に連続して送達させるための送達器具。そのような装置は、その全体が参照として本明細書中に組み込まれている米国特許第６，２８１，００８号に開示されている。
【００９７】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド抽出装置２０は自動ポリヌクレオチド単離装置である。この装置には取り外し可能なカセットが備えられており、そのカセットには試料を分離できる送達／貯蔵ストリップが備えられている。カセットは密閉されているか、または開いていてもよく、好ましくは密閉されている。好ましいカセットにはまた、取り外し可能な投入送達棒も備えられており、容器に入れられている。この装置にはさらに、上側、外側、内側、カセットを配置するための少なくとも１つのスロット、および試料容器を配置するため少なくとも１つのウェルを持つ、くぼみ体が備えられている。さらに、カセットには、カセットを容器に出し入れするための器具、ならびに試料の投入送達棒を動かすための器具も備えられている。好ましい装置にはまた、加圧した空気を、接続し、貯蔵し、または発生させるための器具に関連する空気ノズル、およびカセットの試料投入チャネルを密閉するための器具も備えられている。さらにこの装置には、内部に配置されていて、カセットのバルブを開閉するためのバルブ作動器、およびカセットの中の流体容器に流体を出し入れするための、１またはそれ以上のポンプ作動器が備えられている。この装置にはまた、好ましくは磁石、電源、ユーザーインターフェース、およびバーコード読みとり器も備えられている。好ましくは、この装置にはまた、スロットまたはウェルの中にセンサー器が備えられており、カセットまたは試料容器がスロットまたはウェルにそれぞれ入り、スロットまたはウェルがいっぱいになると信号が送られる。そのような装置は、その全体を参照として組み込まれている、米国特許第６，２８１，００８号に開示されている。
【００９８】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド抽出装置２０にはさらに、記憶装置が備えられている。別の実施形態において、ポリヌクレオチド抽出装置２０にはさらに、カセットの残余からストリップを分離するための分離手段が備えられている。この分離手段は、好ましくはそれに連結した加熱手段を備えたナイフであり、その使用によってストリップとカセットの残余の両方を密閉する。好ましい装置には１つ以上のウェルが備えられており、さらに好ましくは、装置には約２４ウェル、または４８ウェル、または９６ウェル、または３８６ウェルが備えられている。本装置は好ましくは、さらに以下のものが備えられているカセットを含有する。（１）装置の同じ数のウェルに連続的および個別に連結される、試料の投入送達試料棒上に配置された、１またはそれ以上の試料ポートあって、カセットの投入試料貯蔵器にも連結される前記試料ポート、（２）流体交換チャンネルを介して、同じ数の試料投入貯蔵器に連続的および個々に連結される、１またはそれ以上の反応の流動経路、（３）流体交換チャンネルに連結される流体チャンバーであって、試薬の供給チャンバー、試料の貯蔵器、または反応チャンバーである流体チャンバー、（４）流体交換チャネル中の流体の流動を調整するためのバルブ、（５）反応流動経路に連結される少なくとも１つの流体チャンバーを持つ、試料送達／貯蔵ストリップ。
【００９９】
ポリヌクレオチド抽出装置２０は、任意の生体試料からポリヌクレオチドを調製するために設計されている。本発明において用いるところの生体試料とは、ポリヌクレオチド、すなわちＲＮＡまたはＤＮＡを含有する任意の物質である。そのような試料は、昆虫のような、１つの生物体全体であり得、または細菌または酵母の解析においてなどでは、多数の生物体であり得、または、組織、体液、または排出物のような、生物体の一部であり得る。ポリヌクレオチド組成物を得るのに好適な組織としては、皮膚、骨、肝臓、脳、葉、根などの、すなわち任意の、生きている生物体または死亡した生物体の組織が含まれるが、これらに限定されない。組織は本質的に、供給源の生物体の他の組織が混入しなくても、または混在していてもよく、さらには違う生物体由来の組織が混在し得る。生物体、または特定の生体試料を取り出した生物体の供給源は、本発明の手法に適用以前に既知であることが好ましいが、しかしながら、法医学的試料の場合のように、そのような情報は常に入手できるものではない。
【０１００】
生体試料はまた、臨床的な試料または検体であってもよい。例えば、外因性の原因による疾患または病気の徴候は、特定の病原体の存在下に関して、例えば、そのような病原体の中に含有される特徴的なポリヌクレオチド配列の調製における同定によって証明されるような、尿、糞便、髄液、唾液、血液または血液組成物、またはその他の任意の適した検体のような、臨床的な検体から取り出したポリヌクレオチドを解析することのより評価できる。個々の、先天性の遺伝疾患または病気の存在または傾向もまた解析し得る。そのような遺伝疾患としては、ハンチントン病、テイ−サックス病、およびその他が挙げられるが、それらに限定されない。解析する個体の任意の細胞性物質などの、適切な臨床的試料から単離したポリヌクレオチドにおけるそのような遺伝疾患またはその傾向を特徴づけるポリヌクレオチド配列を解析するが、生殖系列幹細胞のＤＮＡに関する、再編成されたかまたはより少量を検出可能なＤＮＡを持つ、赤血球および抗体産生細胞等のような細胞は、そのような解析に用いるのには単独では不十分である。
【０１０１】
ポリヌクレオチド抽出装置により抽出された、すなわち単離されたポリヌクレオチドはしたがって、任意の好適なポリヌクレオチドであり、好適性は望ましい試験により決定される。例えば、個体中のある病原体の存在を解析するために、好ましくは、公知の病原体と宿主の生物学により、解析される個体が感染していた場合に、病原体が見つかることが示唆されているような、臨床的な試料から取り出したポリヌクレオチド配列またはＤＮＡ組成物中に見られる配列を同定するための解析を行なう。あるいは、個体において特定の遺伝子が発現しているかどうかを試験するために、ポリヌクレオチド配列、または試験しようとする病気または疾患において発現が特有にみられるか、またはみられないことが基礎的な生物学的／病理学的で示されているような組織から取り出したＲＮＡ組成物中の、配列の同定の根拠を探すことにより、そのような発現を試験可能である。発現を観察する遺伝子によっては、ＲＮＡ組成物は、本技術分野で公知の手法を用いて、優位にポリアデニル化された、またはポリアデニル化されていないＲＮＡ種を含有するようにさらに精製し得る。あるいは、またはさらに、本発明において、また、ＲＮＡ種の大きさの階級を選択し得る。
【０１０２】
生体試料は、個体から新鮮に取り出し得、または自然から単離し得、またはそのような試料は、氷上などの適切な条件下で保管し得る。例えば血液の試料は、個体の静脈に配置し、例えば個体から管へ血液を吸い出すために標準排出管に連結される、皮下注射器のような標準的な手法を用いて、個体から採取し得る。採取された血液はそのまま使用可能であり、または氷上で保管し得、好ましくはヘパリン、クエン酸塩、またはＥＤＴＡなどの抗凝固剤の存在下で保管し得る。長期保存のためには、試料は好ましくは冷凍、凍結乾燥し、または例えばＤＮＡの保管のためには、適切な基質に適応させて乾燥させる。そのような好適な基質としてはＷｈａｔｍａｎ濾紙などの吸収性の紙、または遊離可能なようにＤＮＡを結合させるように処理した膜物質が挙げられる。好ましい膜としては、工業用の商品名ＩｓｏＣｏｄｅ．ＴＭ．Ｓｔｉｘ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｋｅｅｎｅ、ニューハンプシャー州）が挙げられ、遊離可能なＤＮＡ結合に加えて、不可逆性にヘモグロビン（あるポリヌクレオチド増幅法の阻害剤）が結合する。本発明にしたがって、基質に結合したポリヌクレオチドは、ここで基質から抽出し、新鮮な試料と同様に精製できる。
【０１０３】
好ましくは、ポリヌクレオチド抽出装置２０によって、１またはそれ以上の生体試料から核酸を抽出することができる。１つの実施形態において、装置のスロットに挿入可能な、取り外し可能なカセットが備えられた装置により、実行できる。好ましくは、その装置には、四つの異なるカセット（例えば、１つの試料に１つのカセット）のためのスロットが備えられており、同時に、連続的に、または時差式に動作させることができる。
【０１０４】
試料調製装置もまた、増幅産物の各解析装置への送達が行われるごとに、送達された増幅産物の定分量と同量が、反応混合物に補充されるように、増幅反応混合物の貯蔵器として役に立ちうる。
【０１０５】
増幅装置６４
図１に示されるように、本発明による増幅装置６４は、ポリヌクレオチドを増幅させることのできる任意の装置であり得、好ましくはポリヌクレオチド連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅が行われる。一般に、ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーを用いて行われる。有用なサーマルサイクラーとしては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）製のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００；Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）製のｉＣｙｃｌｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ；Ｃｅｐｈｅｉｄ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）製のＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＤ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ；ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）自動化ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）が挙げられるが、それらに限定されない。本発明において有用なＰＣＲ装置としては、その全てが、本明細書にて参考文献として組み込まれている、以下の米国特許第５，４７５，６１０号、第５，６０２，７５６号、第５，７２０，９２３号、第５，７７９，９７７号、第５，８２７，４８０号、第６，０３３，８８０号、および第６，３２６，１４７号、第６，１７１６，７８５号に開示されている装置が挙げられるが、それらに限定はされない。
【０１０６】
ポリメラーゼ連鎖反応の目的は、初めに得られた少量の「鋳型」ＤＮＡと同一のＤＮＡを大量に生産することである。この反応は、ＤＮＡ鎖を複製し、次にその複製体を用いて一連の周期で他の複製体を作製することからなる。理想的な条件下では、それぞれの周期でＤＮＡの量が倍になり、その結果、反応混合物中に存在する「標的」または「鋳型」ＤＮＡ鎖の複製体の量が幾何学級数的に増加する。
【０１０７】
例えば、一般的なＰＣＲ温度サイクルでは、反応混合物について、指示時間それぞれのインキュベート温度に正確に保つことが必要であり、同一の周期または同様の周期を何回も繰り返すことが必要である。一般的なＰＣＲプログラムは、約９４℃の温度で開始され、約３０秒保って反応混合物の変性を行なう。ついで、反応混合物の温度を約３０℃から約６０℃に下げて１分間保ち、プライマーハイブリッド形成させる。ついで、反応混合物の温度を約５０℃から約７２℃の範囲まで上昇させ、約２分間保って伸長産物の合成を促進させる。これで１周期が完了する。続いて反応混合物の濃度を再び約９４℃に上昇させることにより次のＰＣＲ周期を開始させ、前周期で形成された伸長産物の鎖を分離（変性）させる。一般に、周期は２５から３０回繰り返す。ＰＣＲ周期の温度およびＰＣＲ反応における周期の回数は、反応の目的や、例えば  （登録商標）のような鋳型の性質にしたがって変更されることは、当業者に公知である。基礎的なＰＣＲ工程および戦略は当業者に公知であり、例えば分子生物学における基本手法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９８６年、Ｄａｖｉｓら、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク州）；および分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９７年、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｅｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載されている。
【０１０８】
１つの実施形態において、反応混合物はフタで閉められる使い捨てのプラスチック管中に保存する。そのような管に入る一般的な試料の量は５０〜１００マイクロリットルである。一般に、そのような装置では、試料ＤＮＡおよび反応混合物で満たされたたくさんの管が金属ブロックの、ウェルと呼ばれる穴に挿入されて利用される。ＰＣＲ工程を行なうために、金属ブロックの温度を、使用者がＰＣＲプロトコールファイルに指定した指示温度および指示時間に調節する。ついでコンピューターおよび関連する電子装置により、時間、温度および周期の回数などが決められたＰＣＲプロトコールファイル中の、使用者提供データにしたがって金属ブロックの温度が調節される。金属ブロックの温度が変化するにともなって、様々な管中の試料についても同様に温度が変化する。
【０１０９】
一般に、金属ブロックの金属内で温度勾配が存在することにより、周期の特定の時間においていくつかの試料で他の試料と温度が違ってしまうということが起こるために、金属ブロック中ではどの位置でも同一の温度にすることが望ましい。また、試料片から試料への熱送達の遅延が、すべての試料で同じではないため、これを最小にすることも望ましい。これらの因子は、本発明のＰＣＲ装置を設計する際に検討する。
【０１１０】
１つの実施形態において、ＰＣＲ装置には、工業的に標準のマイクロタイタープレートの様式で配置された９６試料管に合わせるのに十分なおおきさの金属ブロックが備えられている。マイクロタイタープレートは、生化学および生物工学分野において、多数の微小試料を取り扱うため、加工するため、および解析するための器具である。有用なマイクロタイタープレートには２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、１９６ウェル、または３８４ウェルが含まれ得る。一般に、マイクロタイタープレートは幅が３と５／８インチ、長さが５インチのトレイで、９ミリメートルの中心部に８ウェル×１２ウェルの長方形配列で、９６の同一の試料ウェルが含まれる。マイクロタイタープレートは素材、形状、および試料ウェルの容量について様々なものが入手可能であり、多くの異なる目的に最適化してある。好ましくは、マイクロタイタープレートには総合的な外形寸法および９ミリメートルの中心部上に同様の８×１２配列ウェルが含まれる。標準のマイクロタイタープレート様式における試料の取り扱い、加工および解析を自動化するための様々な器具が入手可能である。マイクロタイタープレートは本技術分野で例えば、ＭＷＧ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＩＮＣ．（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ、ノースカロライナ州）から市販されている。マイクロプレートは、例えば、参考文献にて本明細書に組み込まれている、米国特許第５，６０２，７５６号に開示されているような、本技術分野で公知の手法で作製し得る。
【０１１１】
好ましくは、マイクロタイタープレートに使用されている管は、試料片の試料温度の変化とそれに伴う反応混合物中の温度変化の間の遅延を減少させるために、壁の薄い試料管である。どのような熱交換が使われようとも、試料管の一部の壁の薄さは、ＰＣＲ周期における熱の力、および通常使用における圧力に耐えられるに十分な強度を持つ範囲でできるだけ薄くあるべきである。一般に、試料管はＨｉｍｏｎｔ  ＰＤ７０１のような、オートクレーブ対応のポリプロピレンで作られていて、円錐形の壁の薄さが、０．００９から０．０１２インチ±０．００１インチの範囲である。
【０１１２】
別の実施形態において、ＰＣＲ装置には試料片の加熱および冷却装置が備えられており、急速な熱サイクル速度、周囲温度の非制御変化、および、送電線の電圧および冷却液の温度のような他の運用状態の変化に関わらず、試料間で同一の温度を可能にする。以下に記載のように、凝縮および試料量の低下を防ぐために、加熱したカバーを利用してもよい。
【０１１３】
別の実施形態において、ＰＣＲ装置は、試料がその沸点に近い温度でインキュベートされている際に反応混合物から溶媒が減ってしまうことを防ぐ。加熱された熱板で試料管の先端を覆い、その熱板は個々のフタに連結されていて、それぞれの試料管にガスタイトシールを提供している。熱板からの熱により、それぞれの試料管の上部およびフタが凝縮点以上まで熱せられ、どの試料管においても凝縮および還流が起こらない。蒸発の熱と同等の熱量が、水蒸気が凝縮する際に放たれるため、凝縮は相対的に大きな熱送達を示す。凝縮が均一に起こらない場合に、試料間での温度差が大きくなりうる。加熱された熱板により、任意の試料管内で任意の凝縮が起こるのを防ぐことができ、したがって起こりうる温度エラーのうち、この原因によるものを最小限にすることができる。また、加熱された熱板の利用により、試薬の消費を抑えることもできる。
【０１１４】
好ましい実施形態において、本発明における増幅装置６４は、ｃＤＮＡ合成のための逆転写を行なうことができる。逆転写反応とは、ＲＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ鎖の鋳型依存重合化が起こる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの酵素反応を意味する。逆転写はＲＮＡ鋳型にアニーリングされたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長により行われ、ＡＭＶ（鳥類骨髄芽細胞症ウイルス）逆転写酵素またはＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素のような、ウイルス性逆転写酵素が最もよく用いられる。逆転写の条件および手法は本技術分野で公知である。逆転写の典型的な条件としては以下が挙げられる。ＡＭＶ逆転写酵素に関しては、約３７℃にて、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．８ｍＭのｄＮＴＰ、５０ユニットの逆転写酵素、および１〜５μｇの鋳型ＲＮＡを含有する緩衝液中での反応。ＭＭＬＶ逆転写酵素に関しては、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＴｒｉ−ＨＣｌ、３０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．８ｍＭのｄＮＴＰ、５０ユニットの逆転写酵素、および１〜５μｇの鋳型ＲＮＡを含有する緩衝液中で反応。
【０１１５】
別の好ましい実施形態において、逆転写は９６ウェルのプレートを用いて行われ、プレートのウェルの内壁に化学的に結合した、１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてｃＤＮＡが合成される。そのような化学的に結合したオリゴヌクレオチドの合成技術については、その全文が参考文献にて本明細書に組み込まれている、ＭｃＧａｌｌら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３７６７号；Ｐｅａｓｅら、（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：５０２２−５０２６；ＳｏｕｔｈｅｎとＭａｓｋｏｓ、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１１１４号；ＭａｓｋｏｓとＳｏｕｔｈｅｒｎ（上記）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、（１９９２年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：１００８−１０１７；およびＭａｓｋｏｓとＳｏｕｔｈｅｒｎ、（１９９３年）Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：４６６３−４６６９に記載されている。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、逆転写は、マイクロタイタープレートのウェルの内壁に化学的に結合した１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを用いて行われる。別の実施形態において、増幅反応は、マイクロタイタープレートのウェルまたは反応管の内壁に化学的に結合した１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。結果として、容易な分離、精製のために、合成されたｃＤＮＡまたは増幅されたポリヌクレオチド産物はマイクロタイタープレートの内壁に結合している。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドはまた、単一の（または少数の）、マイクロタイタープレートのウェルまたは反応管の内壁のような固相支持体上で合成して、合成されたオリゴヌクレオチドで均一に覆われた領域のアレイを形成させ得る。そのようなアレイの合成技術は、ＭｃＧａｌｌら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３７６７号、Ｐｅａｓｅら、（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：５０２２−５０２６，ＳｏｕｔｈｅｎとＭａｓｋｏｓ、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１１１４号、ＭａｓｋｏｓとＳｏｕｔｈｅｒｎ（上記）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、（１９９２年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：１００８−１０１７、およびＭａｓｋｏｓとＳｏｕｔｈｅｒｎ（１９９３年）Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：４６６３−４６６９に記載されている。
【０１１８】
１つの実施形態において、増幅装置により、標識された増幅産物が産生される。例えば、増幅産物は標識されたプライマーを用いることにより産生され得る。本発明の手法にしたがった、標識されたポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）は５’末端、３’末端、または両方の末端を、または内部を、標識される。標識は、例えば色素、放射能のように「直接的（ｄｉｒｅｃｔ）」であり得る。また標識は、例えば抗体エピトープ、ビオチン、ジゴキシン、アルカリホスホターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のように「間接的（ｉｎｄｉｒｅｃｔ）」であってもよい。「間接的標識（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｓ）」を検出するためには、標識された抗体、または酵素基質のような付加的な組成物を加えて、捕捉、放出、標識されたポリヌクレオチド標識を視覚化する必要がある。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは蛍光標識によって標識される。好適な蛍光標識としては、ローダミンおよびその誘導体（例えばテキサスレッド）、フルオレセインおよびその誘導体（例えば５−ブロモメチルフルオレセイン）、ルシファーイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート、７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビマン、カスケードブルーなどのピレントリスルホン酸、およびモノブロモリメチル−アンモニオビマンなどの蛍光色素が挙げられる（例えば、参照として本明細書中に組み込まれている、ＤｅＬｕｃａ、免疫蛍光解析、抗体内での道具として（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ）、Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，（１９８２年）を参照のこと）。
【０１１９】
解析装置６８−キャピラリー電気泳動装置
キャピラリー電気泳動は、本発明における増幅産物を解析するために好ましい手法である。図１に示されるように、本発明は、増幅装置６４と解析装置６８、例えばキャピラリー電気泳動装置、の両方を備えた単一の装置を提供する。キャピラリー電気泳動装置は本技術分野で公知である。本発明において有用なキャピラリー電気泳動装置としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）製のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）製のＭｅｇａＢＡＣＥ１０００Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ａｒｒａｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、カリフォルニア州）製のＣＥＱ（登録商標）８０００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）製のＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ；Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）製のｉＣＥ２８０  Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。有用なキャピラリー電気泳動反復装置は、米国特許第６，２１７，７３１号、第６，００１，２３０号、第５，９６３，４５６号、第５，２４６，５７７号、第５，１２６，０２５号、第５，３６４，５２１号、第４，９８５，１２９号、第５，２０２，０１０号、第５，０４５，１７２号、第５，５６０，７１１号、第６，０２７，６２４号、第５，２２８，９６９号、第６，０４８，４４４号、第５，６１６，２２８号、第６，０９３，３００号、第６，１２０，６６７号、第６，１０３，０８３号、第６，１３２，５８２号、第６，０２７，６２７号、第５，９３８，９０８号、および第５，９１６，４２８号に開示されており、その全てが参考文献にて、本明細書に組み込まれている。
【０１２０】
キャピラリー電気泳動において、バックグラウンド電解溶液を収納する二つの貯蔵器が、同じ溶液を含むキャピラリーと相互連結される。それぞれの貯蔵器には電極が備えられている。解析する試料を、短い帯状にしてキャピラリーの一端に注入する。試料の注入のために、通常キャピラリーの末端を１つの貯蔵器中に送達させ、望ましい量の試料溶液をキャピラリーに注入し、その後キャピラリーの末端をバックグラウンド溶液中に戻す。貯蔵器中の電極を用いて、キャピラリーに通常２００から１０００Ｖ／ｃｍの範囲の電場をかけ、その効果で電荷を帯びた粒子がキャピラリー中を送達する。異なる粒子が電場で異なる速さを持てば、互いに分離する。帯状の粒子は、キャピラリーの逆末端の検出器を異なる時間に通過し、その信号が計測される。
【０１２１】
１つの実施形態において、キャピラリー電気泳動装置には複数のキャピラリー、１つの電極／キャピラリーアレイ、マルチルーメン管類、管類の支持体、視覚検出領域、キャピラリー束、および高圧Ｔ−調整具（ｆｉｔｔｉｎｇ）が備えられている。キャピラリーは、電極／キャピラリーアレイに配置されている試料末端と、高圧Ｔ−調整具に支えられている第二の末端を持つ。
【０１２２】
好ましくは、電極／キャピラリーアレイには、電極およびキャピラリーの試料末端が備えられており、キャピラリーの試料末端はキャピラリー電気泳動装置の底面から突き出ている。電極およびキャピラリーの試料末端は９６−ウェルまたは３８４−ウェルのマイクロタイタープレートの対応する試料ウェルに浸るように配置されている。マイクロタイタープレート上のすべてのウェルを完全に利用するためには、それぞれ９６または３８４のキャピラリーを必要とする。
【０１２３】
同様に好ましくは、キャピラリーは、対応するマルチルーメン管の中を通っている。マルチルーメン管は管支持体によってしっかり固定されている。キャピラリーの一部が露出され、並んで配列し、マルチルーメン管の保護なしで、次いでカメラ集合体を含む視覚検出領域を通る。カメラ集合体は露出したキャピラリーの中を送達する試料の画像をとらえる。キャピラリーの露出した第二の末端は次いで互いに束ねられ、高圧Ｔ−調整具中にはめ込まれる。
【０１２４】
１つの実施形態において、図６に示されるように、増幅装置６４および解析装置６８は同一の筐体６０に配置されている。筐体６０の中にある第一連結手段６６によって、増幅装置６４と解析装置６８が連結される。
【０１２５】
データ生成１２０
図５に示されるように、本発明の解析装置６８によりデータ生成が実施されうる。あるいは、図３に示されるように、別個のデータ生成装置１２０によりデータ生成を行い得る。
【０１２６】
データ生成は、例えば、その全てが参考文献にて本明細書に組み込まれている米国特許第６，２１７，７３１号、第６，００１，２３０号、第５，９６３，４５６号、第５，２４６，５７７号、第５，１２６，０２５号、第５，３６４，５２１号、第４，９８５，１２９号、第５，２０２，０１０号、第５，０４５，１７２号、第５，５６０，７１１号、第６，０２７，６２４、第５，２２８，９６９号、第６，０４８，４４４号、第５，６１６，２２８号、第６，０９３，３００号、第６，１２０，６６７号、第６，１０３，０８３号、第６，１３２，５８２号、第６，０２７，６２７号、第５，９３８，９０８号、第５，９００９３４号、第６，１８４，９９０号、および第５，９１６，４２８号に開示されているような、本技術分野で公知の方法によって実施しうる。
【０１２７】
１つの実施形態において、データ生成装置には、信号検出器、ディスプレイモニターおよび、制御回路およびディスプレイモニターに接続されているコンピュータープロセッサが備えられている。コンピュータープロセッサには、制御回路と通じるように設定された入力／出力（Ｉ／Ｏ）インターフェース、およびディスプレイモニター上にグラフィカルユーザーインターフェースを表示する表示プログラムを保存する第一のコンピューターメモリが含有されている。
【０１２８】
好ましくは、データ生成装置により、蛍光プローブから発せられる蛍光信号を検出および定量化することができる。蛍光プローブとしては、ローダミンおよびその誘導体（例えばテキサスレッド）、フルオレセインおよびその誘導体（例えば５−ブロモメチルフルオレセイン）、ルシファーイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート、７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビマン、カスケードブルーなどのピレントリスルホン酸、およびモノブロモリメチル−アンモニオビマンなどの蛍光色素が挙げられる。
【０１２９】
１つの実施形態において、本装置には、第一の高数値の絞り（Ｎ．Ａ．）の集光器としての、キャピラリーフローセルの片側に配置された凹面の反射体、第二のＮ．Ａ．の集光器としての、フローセルの反対側に配置されたレンズ集光器、およびフローセルに含まれる試料から放出光を放出させる、励起光を送達のためのフローセルに近接して配置された光ファイバー、が含まれる。反射体の表面は放出光を反射させるために凹面であり、集光器の基部の表面は放出光を集光するために凸面であり、先端の表面は放出光を平行にするために凸面である。この組成により、フローセルの両側からのより大きな立体集光角度を得ることができ、それによって集光効率を高めることができる。異なる放出源からの放出光を送達するために、二つまたはそれ以上の光ファイバーが用いられる。光ファイバーを反射体および集光器の光軸に直行する平面に配置することで、背景光の散乱による障害を減少させ、それによって信号対ノイズ比を改善することができる。平行励起光は、たとえば、フォト乗算器管検出器によって、検出可能である。
【０１３０】
自動分取機１６０
本発明において装置には、解析装置に連結されていて、解析装置から任意の望ましい試料を回収するような、自動分取機が備えられ得る。図８に示されるように、自動分取機１６０は第四連結手段１４０により解析装置６８に連結され得る。さらに、図１０に示されるように、自動分取機１６０は第五連結手段１８０によって配列同定機２００に連結され得る。
【０１３１】
従来の自動分取機は大きく二つの群に分類しうる。第一の群において、回収管は一般に長方形のアレイ内に配置され、分注ヘッドは個々の回収管に選択的に供給するように操作される。第二の群において、回収管はらせん状に配置され、一般的な丸い回転台の上に備え付けられている。回転台は、らせん状に沿って、個々の回収管を通るように、分注ヘッドが放射状に動くように回転する。これらの自動分取機の任意のものを本発明で用い得る。そのような画分集装置の例には、それぞれその全体が、参考文献として本明細書に組み込まれている、米国特許第４，８６２，９３２号、第３，００４，５６７号、第３，９４５，４１２号、第４，４９５，９７５号、第４，１７１，７１５号に開示されている装置が含まれる、それらに限定されない。
【０１３２】
自動分取機は、高処理能を持つ解析系の必要に見合うように開発されてきており、これらの自動分取機はまた、本発明の装置に統合され得る。例えば、米国特許第６，３０９，５４１号（その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に、固定位置にマイクロタイタープレートを保有し、マイクロタイタープレート中の選択されたウェルに試料の一部が分注されるような自動分取機が開示されている。自動分取機には、分注針が備えられており、それを通して試料の一部が、使い捨ての拡張チャンバー中に分注され、ついでマイクロタイタープレート中に分注される。分注針は分注ヘッド上に取り付けられており、使い捨ての拡張チャンバー中に拡張できるようになっており、試料の一部が拡張チャンバー中に凝縮され、ついでマイクロタイタープレート内に分注される。
【０１３３】
本発明において有用な別の種類の自動分取機は電気泳動を用いた自動分取機であって、例えば、米国特許第５，５４１，４２０号、第５，６３５，０４５号、第５，４３９，５７３号、第４，９６４，９６１号、第４，６０８，１４７号、第４，０４９，５３４号、第４，０４０９４０号、第３，９８９，６１２号（その全てが参考文献にて、本明細書に組み込まれている）に開示されている。１つの実施形態において、本発明による自動分取機には、電気泳動によって試料を分離するために、特定の隙間に１またはそれ以上の電気泳動トラックが備えられており、分離された組成物がついで電気泳動トラックから抽出される。１またはそれ以上のキャピラリー試料送達管が、その末端を特定の隙間にある電気泳動軌道の末端に近接して配置されており、それぞれの電気泳動トラックから抽出される、分離された組成物を送達させる。任意に、隙間に緩衝液を供給して、緩衝液のシース流（ｓｈｅａｔｈｆｌｏｗ）により分離された組成物を試料送達管に運ぶために接続器具を用いている。
【０１３４】
その他の有用な自動分取機としては、その全てが参考文献として、本明細書に組み込まれている、米国特許第６，１０６，７１０号、第６，００４，４４３号、第５，２０５，１５４号、および第６，３３５，１６４号が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３５】
配列同定機２００
本発明の装置にはさらに、望ましいポリヌクレオチド、例えば解析装置により同定された所望のポリヌクレオチドの配列を得るための、配列同定機を備え得る。図１０に示されるように、配列同定機２００は、それぞれの回収画分中のポリヌクレオチドの配列を同定するために、自動分取機１６０に連結され得る。別の実施形態において、図９および１２に示されるように、配列同定機２００は第五連結手段１８０により解析装置に連結される。別の実施形態において、図１１に示されるように、解析装置６８自体が配列同定機として作動し得る。好ましくは、重要なポリヌクレオチドを含む試料について、その配列を同定するために再度解析装置にかける。ＤＮＡ配列決定は一般に、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３、１９７７年）の手法により行われ、一本鎖ＤＮＡ鋳型とプライマーからの一本鎖ＤＮＡの合成を伴う。一本鎖の鋳型は、鋳型にハイブリッド形成するプライマーとともに調製される。プライマーはＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、それぞれの反応を、例えばジオキシヌクレオチドなどの適切な連鎖終結剤により特定の塩基（グアニン，Ｇ、アデニン，Ａ、チミン，Ｔ、またはシトシン，Ｃ）で終結させる。ついで、ポリヌクレオチドのそれぞれの箇所に組み込まれた連鎖終結剤にしたがって、ポリヌクレオチドのヌクレオチドを決定する。しかしながら、その他のＤＮＡ配列決定装置および手法も開発されており、本発明における配列同定機として用い得る。
【０１３６】
好ましい実施形態において装置には、別個の配列同定機が備えられていない。増幅装置および解析装置（例えば、キャピラリー電気泳動装置）が配列同定の機能を果たす。配列決定反応を行なうために、配列決定試薬混合物を増幅装置に添加し得、ついで配列同定のために、配列決定反応液の定分量が解析装置（例えば、キャピラリー電気泳動装置）へ送達される。配列決定反応および配列同定に用いる試薬は本技術分野で公知であり、例えば、分子生物学における簡略プロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５年、前記）に記載されている。
【０１３７】
本発明において有用な配列同定機としては、その全てが参考文献にて、本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２７０，９６１号、第６，０２５，１３６号、第５，９５５，０３０号、第５，８４６，７２７号、第５，８２１，０５８号、第５，６０８，０６３号、第５，６４３，７９８号、第５，５５６，７９０号、第５，５４３，２４７号、第５，３３２，６６６号、第５，３０６，６１８号、第５，２８８，６４４号、第５，２４２，７９６号、第５，２２１，５１８号、および第５，１２２，３４５号に開示されているものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３８】
決定された重要なポリヌクレオチドの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋなどの様々なデータベースから入手可能な配列との比較に用い得る。
【０１３９】
連結手段４０、６６、８０、１４０または１８０
本発明の連結手段４０、６６、８０、１４０または１８０により、図１−１２に示されるように、流体および／または信号を二つの装置間で連絡することが可能になる。好ましくは、本発明の連結手段は、流体を送達させるために水平にも垂直にも動かすことが可能である。連結手段は管またはチャンネル、またはロボットアームであり得る。連結手段には二つまたはそれ以上の管が備えられ得る。２またはそれ以上の管が互いに結合され得る。連結手段を取り付ける区画、例えば、増幅装置の反応チャンバーは、連結手段のあるところ以外は閉じられ得るか、または１またはそれ以上の開かれた部分があってよいが、そこでさらに本発明の目標および目的に合った有効体積を決める。試料は連結手段を通して導電学的に、例えば、選択的な電圧量を適用できるような電圧調整器を用いて、送達させることができる。そのような電圧調整器には、選択的な電圧量を得るために、多様な電圧分割器および多様な継電器を用い得る。動電学的な送達を利用することは、試料取り扱いのための実行可能なアプローチであり、ポンピング機構として実行可能である。本発明はまた、混合された様々な流体への電気浸透流を、制御および再生可能な様式で利用することも含有する。適切な流体を、対応する適切な物質でできた管に入れる際、管の表面の官能基がイオン化され得る。電気浸透流は、プログラム可能なポンピング機構として使用できる。
【０１４０】
ポンピングの働きは、例えば、蠕動ポンプ、流体チャンバーの弾力性のフィルムにローラーが押し下げられることでチャンバーの体積を減らすという仕組み、プランジャにより流体チャンバーの弾力性のフィルムが押されることでチャンバーの体積を減らすという仕組み、およびその他の本技術分野で公知であるポンピングの仕組みを用いて得られてもよい。そのような仕組みとしては、Ｓｈｏｊｉら、「総合的化学分析システムのためのポンプの製作（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｕｍｐ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，）」Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ，Ｐａｒｔ２，７０，５２−５９（１９８９年）、またはＥｓａｓｈｉら、「通常閉じているマイクロバルブと、シリコンウェハー上に製作されたポンプ（Ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｖａｌｖｅ  ａｎｄ  ｐｕｍｐ  ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｏｎ  ａ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｗａｆｅｒ）」Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，２０，１６３−１６９（１９８９年）によって報告されているような微小電気機械装置が挙げられる。
【０１４１】
本発明に有用な連結手段４０、６６、１４０または１８０はロボットアームであり得る。ロボットアームにより試料、試料を含む管またはプレートを、ある場所から別の場所へ物理的に送達させることができる。自動試料回収工程を、プログラムされた機械的な作業として容易に行なうことができ、試料回収における人為的なミス（すなわち、試料の大きさ、および試料の同一性のトラッキングにおけるミス）および、人が試料回収することによる汚染の可能性をどちらも避けることが可能である。サーマルサイクラーから定分量を回収させることができるロボットアームが本技術分野にて入手可能である。例えば、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲＶ−Ｅ２  Ｒｏｂｏｔｉｃ  Ａｒｍを、ＳｃｉＣｌｏｎｅ（登録商標）Ｌｉｑｕｉｄ  ＨａｎｄｌｅｒまたはＲｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｙｄｒａ  ９６  ｐｉｐｅｔｔｏｒと組み合わせて用い得る。好ましくは、本発明のロボットアームにはまた、試料を送達させるために、水平および垂直のどちらにも動かすことのできるモーター駆動ステージも備えられている。
【０１４２】
１つの実施形態において、第一連結手段６６により増幅装置６４と解析装置６８が連結されており、それによって流体が送達されて特定の解析にかけられる。好ましい実施形態において、第一連結手段６６により、流体試料を解析装置６８の内部にある取り込みウェルに自動的に取り込むことができる。取り込みウェルに取り込まれた試料の体積または「プラグ」はそのあと望ましい解析にかけられるとすぐに解析チャンネルに引き下ろされる。好ましい実施形態において、解析装置６８はキャピラリー電気泳動装置である。したがって、そのような工程において、本管または解析チャンネルには一般的にふるいマトリックス、そこに処理される緩衝液または溶剤が含有され、試料の構成要素の電気泳動による分離を最適化している。しかし、本明細書を読めば、解析装置６８は多種多様の非ＣＥ装置であってもよく、試料に対して任意の、多くの解析反応を行なってよいことが理解いただけるだろう。
【０１４３】
好ましくは、試料を送達させるため連結手段６６により、増幅反応の最中に増幅反応物から定分量を回収することができる。連結手段６６には、単一の試料が回収された後に捨てられるか、またはそれぞれの試料が取り込まれた後に針またはチップを洗浄する一工程またはそれ以上の工程を組み入れることによるかいずれかの、ピペットチップまたは針が備えられている。あるいは、キャピラリーに定分量を取り込むために、連結手段が、キャピラリー電気泳動のために使用されるべきキャピラリーを、増幅反応液に直接接触させることが可能である。
【０１４４】
１つの実施形態において、第一連結手段６６により、ＰＣＲ増幅反応混合物の定分量が、増幅装置から解析装置へ、それぞれのＰＣＲ周期の終わりに送達される。
【０１４５】
別の実施形態において、第二連結手段４０によりポリヌクレオチド抽出装置と増幅装置が連結される。別の実施形態において、第二連結手段により、増幅反応混合物に、ｓＮＴＰ、プライマー、必要な試薬、およびＤＮＡポリメラーゼを含む混合物を、始めの反応混合物と同じ濃度になるように補充することもできる。さらに別の実施形態において、別の連結手段を増幅反応混合物の補充に用いる。この連結手段は、本明細書に記載したものと同様の手法で、流体を送達させるように作製し得る。
【０１４６】
好ましくは、本発明の第一連結手段により、増幅反応混合物の定分量を、解析装置、例えばキャピラリー電気泳動装置に供給することができる。そのような供給機能は、たとえば以下の、その全てが参考文献にて、本明細書に組み込まれている、米国特許第６，２８０，５８９号、第６，１９２，７６８号、第６，１９０，５２１号、第６，１３２，５８２号、および第６，０３３，５４６号に開示されているような、本技術分野で公知の方法によって達成可能である。
【０１４７】
１つの実施形態において、試料は試料プラグとして、少なくとも電解質緩衝液のためのチャンネルおよび、試料のための供給および排出チャンネルを備えた連結手段に注入される。供給および排出チャンネルは、解析装置６８のそれぞれの供給および排出ポートにおいて電解質チャンネル内に放出される。供給ポートと排出ポートの間の距離により幾何学的に試料体積が決まる。電解質チャンネルへの試料プラグの注入は、供給および排出チャンネルに、少なくとも、幾何学的に決められた体積内に電気泳動移動度が最も低い試料組成物が含まれるのに十分な時間だけ電場を適用することにより、動電学的に行われる。供給および排出チャンネルはそれぞれ電解質チャンネルの方に傾いている。試料を試料体積に動電的に注入する手法が提供されている。電解質緩衝液に対する供給および排出チャンネルの流動抵抗は、電解質チャンネルの流動へのそれぞれの抵抗より少なくとも約５％低い。
【０１４８】
別の実施形態において、試料は、本技術分野にて公知の流体力学的な手法を用いて、第一連結手段により、注入される。試料は圧力の違いによりキャピラリー中に注入される。圧力の違いは、キャピラリーの両端を異なる高さに置き、それによって流体静力学的な圧力の違いを生じさせるか、またはガスにより、密閉できる試料貯蔵器に高圧を生じさせることのいずれかにより得られ、その高圧によって試料溶液がキャピラリー中に注入される。キャピラリーを通る試料の量は、圧力の違いの選択およびその効果時間により調節される。
【０１４９】
別の実施形態において、試料は、固定または可動の試料注入キャピラリーを用いて、試料注入キャピラリーをキャピラリー電気泳動装置のキャピラリーの注入口側の先端周辺に配置することにより、試料が注入口側の先端全体を覆うように注入され、そして試料は、電気泳動電流を用いて、またはその他の手法により分離キャピラリー内へ送達され、そして所定の時間後、溶液は注入口側の先端周辺から回収され、試料溶液はバックグラウンド溶液と交換される。
【０１５０】
しかしながら、別の実施形態において、増幅装置とキャピラリー電気泳動解析装置を連結させるために第一連結手段を用いない。その代わりに、増幅されたポリヌクレオチド試料の画分は、電気泳動装置のキャピラリーおよび電極に直接浸されることにより電気泳動装置へ取り込まれ、ＰＣＲ反応にかけられる。好ましくは、電流を一定時間電極に流して、上記の動電的な力によりポリヌクレオチド試料をキャピラリーの中に注入する。電流を流す時間は、例えば約０．００１秒、０．０１秒、０．１秒、１秒、または１０秒、またはそれ以上で、キャピラリー電気泳動による解析のためにキャピラリーに取り込む試料の必要量に依存する。この実施形態により解析装置上への試料の取り込みに関して、より単純な工程が提供される。
【０１５１】
第三連結手段８０により、解析装置６８と、解析装置の外側に配置されたデータ生成装置１２０が連結される。
【０１５２】
第四連結手段１４０は１つの実施形態において、解析装置６８を自動分取機１６０と連結するために用いられる。しかし、本発明の別の実施形態において、解析装置と自動分取機間には連結手段が用いられない。
【０１５３】
第五連結手段１８０は、１つの実施形態において、配列同定機２００を解析装置６８、または自動分取機１６０と連結するために用いられ、それにより対象のポリヌクレオチドの配列同一性がえられうる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、第一の、第二の、第四の、および第五連結手段は単一の連結手段、例えば、流体をある装置から別の装置へ送達させるロボットアームであり得る。単一のロボットアームにより第一の装置から第二の装置へ流体が送達され、そのあと第一の装置から第三の装置へ流体が送達される前に、自身の洗浄および消毒が行われる。
【０１５５】
本発明における連結手段の作製に適切な基質は、多種の物質のうち任意の１つの物質から、または物質を組み合わせて加工し得る。しばしば、連結手段は、例えば、ガラス、石英、シリコン、またはポリシリコンなどの石英系基質、ならびにその他の公知の基質、すなわちガリウムヒ素のような、本技術分野でよく知られている固体基質を用いて製造される。あるいは、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体）、および類似の素材を含む、重合体基質素材を本発明の連結手段を作製するために用い得る。
【０１５６】
本発明により、転写プロファイリングのために用いる自動装置が可能になる。本装置により、標的ポリヌクレオチドの増幅、および標的ポリヌクレオチドから増幅された産物の定量的な解析を行なうことが可能になる。また本装置により、ポリヌクレオチド抽出および逆転写も可能になる。本装置によりさらに、対象のポリヌクレオチドの同定（例えば、二つまたはそれ以上の試料で異なる発現をしている遺伝子）、ならびに対象のポリヌクレオチドの配列同定が可能になる。
【０１５７】
図１３は本発明の装置を用いた発現プロファイリング工程の概略図を示している。例えば、この工程は図１０に示した装置を用いて行い得る。好ましい実施形態において、図１０の全ての装置は単一の筐体の中に配置されている。ＲＮＡは、独立して抽出してよく、または、図２に示したような、増幅装置に連結されたポリヌクレオチド抽出装置により抽出（ステップ１）し得る。増幅装置６４により、ｃＤＮＡ合成および増幅（例えば、ＰＣＲによって。ステップ２）を行なうことができる。それぞれのＰＣＲ周期の終わりに、増幅産物の定分量が送達され、解析装置６８において解析される（例えば、キャピラリー電気泳動。ステップ３）。異なる発現をしているポリヌクレオチドを自動分取機１６０により回収してよく（ステップ４）、１またはそれ以上の、異なる発現をしているポリヌクレオチドについて配列同定機２００により同定してよい（ステップ５）。ステップ５については、配列決定試薬マスター混合物を加えてよく、配列決定反応混合物を本技術分野で公知の手法にしたがってインキュベートし得る。１つの実施形態において、配列決定反応混合物をそのあと解析装置６８（例えば、キャピラリー電気泳動装置）に取り込んで配列決定を行い得る。別の実施形態において、自動分取機１６０により回収された画分の定分量を、増幅装置６４に戻して反応を実施し得る。反応産物をついで解析装置６８に送達して配列決定を行い得る。
【０１５８】
１つの実施形態において、本発明における装置は、ゲノムのＤＮＡ試料の解析（例えば、遺伝子のゲノム複写物の定量）に用いられる。そのような技術により、ゲノム全体において、プローブに基づいた解析または遺伝子型特定に比べ、低コストで高度な解析結果が得られる。ゲノムＤＮＡ解析の工程は、ＲＮＡ解析の工程（例えば、上記）と同様に行なってよいが、ゲノムＤＮＡを用いた場合には逆転写およびｃＤＮＡ合成の必要はない。ゲノムＤＮＡ解析の工程は、比較する二つまたはそれ以上の試料からゲノムＤＮＡを単離することから始め得る。試料は複数の定分量に分割してよい（例えば、５、１０、２０、または３０、またはそれ以上の定分量）。それぞれの定分量を、異なるプライマーセット（例えば、解析すべきすべての定分量に関して、５、１０、２０、または３０、またはそれ以上のプライマーセット）により増幅され得る。それぞれのプライマーセットにおいて、１つのプライマーは一般的な反復配列に相補的であるか、または単なるランダム配列であり、試料特異的にするための試料特異的配列タグを持つ。もう一方のプライマーはランダムプライマーであり得る。１つの実施形態において、二つまたはそれ以上の試料は同じ条件下で、同じプライマーを用いて増幅され、ついで、ＰＣＲ産物のはしごが、ゲノムの中に無作為に展開した遺伝子座から形成される。ついでそれぞれのＰＣＲ産物の量を測定し、試料間で比較する。異なる遺伝子座での複製数における全ゲノム相違が、それによって同定できる。これらの相違により、局所的な重複または増幅、トリソミー、およびヘテロ接合性の消失が示される。
【０１５９】
あるいは、遺伝子座に特異的なプライマーセット（すなわち、標的とする遺伝子座の特異的な配列を認識するプライマー）を、二つまたはそれ以上の試料間での、特定の遺伝子座の複製数の変化を決定するために、ＰＣＲ増幅反応に用い得る。
【０１６０】
上記の実施形態は、本発明を作製および実行する際に、本発明によって行った実験、および検討された技術を実証するものである。これらの実施形態には、本発明の実施の技術を知らせる、およびその有効性を実証する、技術の開示が含有されていると信じられる。当業者には、本明細書中に開示された技術および実施形態は好ましい実施形態ということであって、一般に多数の同等な手法および技術を用いて同様の結果を得てもよいことを理解されたい。
【０１６１】
本明細書中に前記した参考文献は全て、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、および第一連結手段６６により増幅装置６４に連結される解析装置６８からなる。
【図２】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０はポリヌクレオチド抽出装置２０、増幅装置６４、および解析装置６８からなる。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結し、第二連結手段４０はポリヌクレオチド抽出装置２０と増幅装置６４を連結する。
【図３】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、解析装置６８、およびデータ生成装置１２０からなる。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結し、第二連結手段４０はポリヌクレオチド抽出装置２０と増幅装置６４を連結し、そして第三連結手段８０は解析装置６８とデータ生成装置１２０を連結する。
【図４】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、および解析装置６８からなる。増幅装置６４は増幅反応の前にポリヌクレオチドの逆転写を行なうことができる。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結する。
【図５】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、および解析装置６８からなる。解析装置６８によりデータ生成が可能である。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結する。
【図６】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、および解析装置６８  ６８からなり、それらは同じ筐体６０の中に位置する。筐体６０の中にある第一連結手段６６は、増幅装置６４と解析装置６８を連結する。
【図７】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０はポリヌクレオチド抽出装置２０、増幅装置６４、解析装置６８、およびデータ生成装置１２０からなる。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結し、第二連結手段４０はポリヌクレオチド抽出装置２０と増幅装置６４を連結し、そして第三連結手段８０は解析装置６８とデータ生成装置１２０を連結する。
【図８】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、解析装置６８、および自動分取装置１６０からなる。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結し、第四連結手段１４０は解析装置６８と自動分取装置１６０を連結する。
【図９】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、解析装置６８、および配列同定機２００からなる。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結し、第五連結手段１８０は増幅装置６４と配列同定機２００を連結する。
【図１０】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、解析装置６８、画分検出装置、および配列同定機２００からなる。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結し、第四連結手段１４０は解析装置６８と自動分取装置１６０を連結し、そして第五連結手段１８０は自動分取装置１６０と配列同定機２００を連結する。
【図１１】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、および解析装置６８からなり、解析装置６８がまた、配列同定機２００の役割もする。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結する。
【図１２】本発明の１つの実施形態による、発現プロファイリングを行なう装置の概略図である。装置１０は増幅装置６４、解析装置６８、配列同定機２００、およびデータ生成装置１２０からなる。第一連結手段６６は増幅装置６４と解析装置６８を連結し、第五連結手段１８０は増幅装置６４と配列同定機２００を連結し、そして第三連結手段８０は配列同定機２００とデータ生成装置１２０を連結する。
【図１３】本発明のいくつかの実施形態による装置を用いた発現プロファイルの工程の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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