(57)【要約】  １以上の感染性因子または標的細胞をターゲティングするための組成物であって、アデノウイルスベクターの相補的なセットを含み、それぞれのベクターが複製に関して他のものに依存している、組成物。対のうちの第１のベクターはＥ１発現カセットを含んでいてもよく、ここで、Ｅ１が、１以上の感染性因子または標的細胞の中でプロモーターから発現し、そして他のアデノウイルスタンパク質を発現させることはない。第２のベクターは、パッケージングおよび複製に必要なアデノウイルスタンパク質を提供する。従って、この組成物は、予防用遺伝子および／または治療用遺伝子の送達および発現に有用であり、そのうちのいくつかは、直接的な細胞毒性、間接的な細胞毒性を示すか、またはその他の治療の効果に対して標的細胞を敏感にする。この組成物は、免疫調節遺伝子と共にまたはこれを含むことなく、１以上の抗原をコード化していてもよく、それによりコード化された（単数または複数の）抗原に対する１以上の免疫応答を誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
相補的な機能を有し、そして１以上の宿主生物および／または標的細胞内での複製に関して互いに依存している、第１のおよび第２のアデノウイルスベクターを含む、生物学的組成物。
【請求項２】
第１のアデノウイルスベクターが、宿主生物および／または標的細胞内でのアデノウイルスベクターの増殖をコントロールする初期遺伝子の発現を制御するプロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
プロモーターが１以上の宿主生物または標的細胞内でのみ活性を示し、そして増殖が１以上の宿主生物および／または標的細胞に限定されている、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
第２のアデノウイルスベクターが、１以上の宿主生物および／または標的細胞内でのアデノウイルスの複製を支持することができるアデノウイルスゲノムの一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１以上の宿主生物および／または標的細胞内での第１のおよび第２のアデノウイルスベクターの複製によって、１以上の宿主生物および／または標的細胞の生長、機能および／またはその他の活性を改変することができる１以上の免疫応答が直接的におよび／または間接的に誘導される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
１以上の宿主生物および／または標的細胞内での第１のおよび第２のアデノウイルスベクターの複製によって、１以上の宿主生物および／または標的細胞に影響を及ぼす１以上の病原体および／または感染性因子に関して、１以上の宿主生物および／または標的細胞の生長、機能および／またはその他の活性を改変することができる１以上の免疫応答が直接的におよび／または間接的に誘導される、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
宿主生物、標的細胞、病原体および／または感染性因子が、感染症、癌、自己免疫疾患および心血管疾患からなる群より選択される１以上の病気の状態に関係し得る、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
１以上の感染性因子および／または標的細胞をターゲティングするための生物学的組成物であって、前記組成物が第１のアデノウイルスベクターおよび第２のアデノウイルスベクターを含み、それぞれのベクターが複製に関して他のものに依存している、生物学的組成物。
【請求項９】
第１のアデノウイルスベクターが、１以上の感染性因子および／または標的細胞の中で、プロモーターから始まってその発現カセットからＥ１が発現するところのＥ１発現カセットを含むことができ、そして第１のアデノウイルスベクターがその他のアデノウイルスタンパク質を発現しない、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
第２のアデノウイルスベクターが、パッケージングおよび複製に必要なアデノウイルスタンパク質を提供する、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が、１以上の予防用遺伝子および／または治療用遺伝子の送達および発現のために用いられ、そして１以上の予防用遺伝子および／または治療用遺伝子のいくつかが直接的な細胞毒性、間接的な細胞毒性を発揮し、および／またはそれらがその他の治療の影響に対して標的細胞を敏感にする、前記のいずれかの請求項に記載の組成物。
【請求項１２】
第１のまたは第２のアデノウイルスベクターが、免疫調節性の遺伝子と共にまたはこれを含むことなく１以上の抗原をコード化しており、それにより、コード化された抗原（単数または複数）に対する１以上の免疫応答を誘導する、請求項１から１０のいずれかの請求項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００１年１０月１６日に出願された米国特許出願第６０／３２９，７９８号を基礎とする優先権を主張する。本明細書にて言及される、すべての特許、公開された特許出願および非公開の特許出願、ならびにその他の科学的、技術的および一般的な文書のあらゆるものは、引用することによって、矛盾が生じない程度に取り込まれる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターならびにワクチンおよび免疫療法の応用分野におけるそれらの使用に関する。さらに具体的には、本発明は、外因性の配列を含みかつ発現し、しかもなお適切な宿主生物または宿主細胞に導入された時には複製する能力を保持する、相補的なＡｄベクターに関する。このＡｄベクターを含む予防用製剤／組成物および治療用製剤／組成物、ならびにこのＡｄベクターを用いた予防方法および治療方法もまた、検討されている。
【０００３】
関連技術についての説明
基礎的なアデノウイルスベクターの技術
アデノウイルス（Ａｄ）は、直径が６０〜９０ｎｍの、エンベロープを持たない二十面体（２０の面と１２の頂点）のタンパク質のキャプシドと、内部のＤＮＡ／タンパク質コアとからなる（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．）（１９９０）、「アデノウイルス科およびそれらの複製（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」Ｉｎ：「ウイルス学の基礎（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」（第２版）、Ｆｉｅｌｄ，Ｂ．Ｎ．ら編、ｐ７７１〜８１３、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：ＮＹ、ＮＹ）。外側のキャプシドは、２４０のヘキソン（面あたり１２のヘキソン）と１２のペントンベースを形成するように幾何学的に配置された２５２のカプソマーから構成されている；後者はそれぞれの頂点に位置し、その頂点からアンテナ様のファイバーが突き出ている。この構造が、感染の際にＡｄが細胞に付着する原因である。野生型Ａｄは、８７％のタンパク質および１３％のＤＮＡを含み、そしてＣｓＣｌ中での密度は１．３４ｇ／ｍｌである。
【０００４】
Ａｄの二本鎖の直鎖状ＤＮＡゲノムは概算で３６ｋｂであり、従来より１００マップユニット（ｍｕ）に分割されている。ウイルスゲノムのそれぞれの末端には、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と呼ばれる、１００〜１５０ｂｐの反復ＤＮＡ配列がある。左端（１９４〜３８５ｂｐ）には、キャプシド形成のためのシグナル（パッケージング・シグナル）が含まれる。ＩＴＲおよびパッケージング・シグナルの両方は、アデノウイルスのＤＮＡ複製およびパッケージングに必要な、シスに作用するエレメントである（Ｓｕｓｓｅｎｂａｃｈ，Ｊ．Ｓ．（１９８４）、「ゲノムの構造（Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ）」Ｉｎ：「アデノウイルス（Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）」、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．編、ｐ３５〜１２４、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．：ＮＹ、ＮＹ；Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ，Ｌ．（１９８４）、「アデノウイルスの組立て（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）」Ｉｎ：「アデノウイルス（Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．編、ｐ３０９〜３３７、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．：ＮＹ、ＮＹ」。
【０００５】
アデノウイルス５型（Ａｄ５）のゲノムの、いくつかの鍵となる目印を伴う、簡略化した地図を図１に表す（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｌ．およびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｍ．（１９９１）「動物への遺伝子の導入（Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ａｎｉｍａｌｓ）：アデノウイルスの展望（ｒｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）」Ｉｎ：ヒト遺伝子の導入（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）、Ｃｏｈｅｎ−Ｈａｇｕｅｎａｕｅｒ，Ｏ．およびＢｏｉｒｏｎ，Ｍ．編、ｐ５１〜６１、Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｅｕｒｏｔｅｘｔ：Ｆｒａｎｃｅ；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびＰｒｅｖｅｃ，Ｌ．（１９９１）「アデノウイルスベクターの操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」Ｉｎ：分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（第７巻）：遺伝子の導入と発現のプロトコール（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．Ｊ．編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．：Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）。ゲノムの初期領域（Ｅ）および後期領域（Ｌ）にはいくつかの転写単位が含まれ、そしてこれらの領域は、ウイルスＤＮＡの複製の開始に従って分割される。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、いくつかの細胞性遺伝子ばかりでなく、ウイルスゲノムの転写の制御を担うタンパク質をコード化する（Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９９０）「アデノウイルスＥ１Ａに依存する転写のトランス活性化（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）」Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．１、ｎｏ．１、ｐ５９〜６８；Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９９３）「アデノウイルスＥ１Ａタンパク質による転写の活性化（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．４、ｐ２５〜３１）。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現によって、ウイルスＤＮＡの複製に必要なタンパク質の合成が導かれる（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．（１９８６）「アデノウイルスの遺伝子発現と複製：歴史的な概説（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ａ  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ）」Ｉｎ：癌細胞（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ）（第４巻）：ＤＮＡ腫瘍ウイルス（ＤＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）Ｂｏｔｃｈａｎ，Ｍ．ら編、ｐ３７〜５７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。Ｅ３領域に由来するタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防止する（Ｗｏｌｄ，Ｗ．Ｓ．Ｍ．およびＧｏｏｄｉｎｇ，Ｌ．Ｒ．（１９９１）「アデノウイルスのＥ３領域：宿主の免疫監視機構およびウイルス細胞の相互作用に関係する遺伝子カセット（Ｒｅｇｉｏｎ  Ｅ３  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ａ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｏ���  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｓ−ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８４、ｐ１〜８）。Ｅ４タンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子の発現およびスプライシング、ならびに宿主細胞の停止に関与している（Ｈａｌｂｅｒｔ，Ｄ．Ｎ．ら（１９８５）「アデノウイルスの初期領域４は、効率的なＤＮＡの複製、後期遺伝子の発現、および宿主細胞の停止に必要な機能をコード化している。」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．５６、ｐ２５０〜２５７）。主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって作動する２０ｋｂの一次転写物のプロセシングの後に、ウイルスのキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の産物が発現する（Ｓｈａｗ，Ａ．Ｒ．およびＺｉｆｆ，Ｅ．Ｂ．（１９８０）「アデノウイルス−２の主要後期プロモーターの転写から、３’末端が共通するｍＲＮＡの１つの初期ファミリーおよび５つの後期ファミリーが生じる。」Ｃｅｌｌ、ｖｏｌ．２２、ｐ９０５〜９１６）。ＭＬＰ（１６．８ｍｕに位置する）は、感染の後期を通して特に有効であり、そしてこのプロモーターに由来するｍＲＮＡは、５’トリパータイトリーダー（ＴＬ）配列を有し、このものは、宿主細胞が、宿主細胞のｍＲＮＡに対立するそのような転写物を選択する傾向を高める。
【０００６】
非相同の遺伝子を発現させるためのベクターとしてＡｄを用いることは、１９６０年代にＡｄとシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）との間のハイブリッドが観察された後まもなく始まった。それ以来、Ａｄベクターは徐々に開発されて、現在の遺伝子治療の分野における主要なウイルスベクターの１つとなった。というのは：（ａ）Ａｄは広く研究され、そして真核生物の遺伝子の制御についてのモデルシステムとして、十分に特徴解析されてきており、このことはベクターの開発のための信頼できる基礎として役に立つ；（ｂ）ベクターは簡単に新個体を生み、操作できる；（ｃ）Ａｄは、インビトロおよびインビボでの広い範囲の宿主であって分裂中ではない細胞を含む宿主に，強い感染力を示す；（ｄ）Ａｄ粒子は比較的安定であり、そして高力価のもの（たとえば１０１０〜１０１２プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌ）を得ることができる；（ｅ）アデノウイルスのライフサイクルには、宿主細胞のゲノム内への組込みが要求されず、従って、Ａｄベクターによって送達される外来の遺伝子はエピソームのように発現し、それ故に、インビボで適用されても遺伝毒性は低い；（ｆ）米国の新兵に野生型Ａｄのワクチン接種を行った後、副作用は報告されておらず、このことが、インビボでの遺伝子導入の安全性を実証するものである，という理由があるからである。さらに、Ａｄベクターは、真核生物の遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ，Ｍ．ら（１９９１）「外来の遺伝子をインビトロおよびインビボで発現させるための、アデノウイルスの欠損ベクターおよび完全ベクター（Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）」Ｇｅｎｅ、ｖｏｌ．１０１、ｐ１９５〜２０２；Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｇ．ら（１９８６）「感染性細菌のプラスミドを基礎とするヒトアデノウイルスのクローニングベクター（Ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）」Ｇｅｎｅ、ｖｏｌ．５０、ｐ１６１〜１７１）に、ワクチンの開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ，Ａ．およびＨｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．（１９９２）「クローニングベクターとしてのアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．３、ｐ２３７〜２５２；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびＰｒｅｖｅｃ，Ｌ．（１９９２）「アデノウイルスを基礎とする発現ベクターおよび組換えワクチン（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｉｎ：ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ）：免疫学上の課題に対する新しいアプローチ（Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ）、Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｖ．編、ｐ３６３〜３９０、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−ｈｅｉｎｅｍａｎｎ：Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に、および、動物モデルにおける遺伝子導入（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｌ．およびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｍ．（１９９１）「動物への遺伝子導入：アデノウイルスの展望（Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ａｎｉｍａｌｓ：ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）」Ｉｎ：ヒト遺伝子の導入（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）、Ｃｏｈｅｎ−Ｈａｇｕｅｎａｕｅｒ，Ｏ．およびＢｏｉｒｏｎ，Ｍ．編、ｐ５１〜６１、Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｅｕｒｏｔｅｘｔ：Ｆｒａｎｃｅ；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｌ．ら（１９９２）「マウスの骨格筋および心臓への広範囲におよぶ長期間の遺伝子導入（Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ）」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、ｖｏｌ．９０、ｐ６２６〜６３０；Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｐ．ら（１９９３）「嚢胞性線維症の遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの開発と分析（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、ｖｏｌ．４、ｐ４６１〜４７６）に、うまく用いられている。組換えＡｄを異なる組織にインビボで投与するための試験的な経路としては、気管内注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら（１９９２）「ヒト嚢胞性線維症の膜貫通伝導調節遺伝子を気道上皮にインビボで導入すること」Ｃｅｌｌ、ｖｏｌ．６８、ｐ１４３〜１５５）、筋肉注射（Ｑｕａｎｔｉｎ，Ｂ．ら（１９９２）「筋肉細胞中のインビボでの発現ベクターとしてのアデノウイルス」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．８９、ｐ２５８１〜２５８４）、末梢静脈への注射（Ｈｅｒｚ，Ｊ．およびＲ．Ｄ．Ｇｅｒａｒｄ（１９９３）「低密度リポタンパク質レセプター遺伝子をアデノウイルスが介在して導入することにより、正常マウスにおけるコレステロールのクリアランスが急激に加速される。」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．９０、ｐ２８１２〜２８１６）、脳への定位接種（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｇ．ら（１９９３）「脳内のニューロンおよびグリアへ遺伝子導入するためのアデノウイルスベクター」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２５９、ｐ９８８〜９９０）、および経口（Ｈｉｌｌｅｍａｎ，Ｍ．Ｒ．（１９５８）「アデノウイルスワクチンを使用することの有効性と適応症（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）」Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、ｖｏｌ．４８、ｐ１５３〜１５８；Ｇａｙｄｏｓ，Ｃ．Ａ．およびＪ．Ｃ．Ｇａｙｄｏｓ（１９９５）「米軍におけるアデノウイルスワクチン（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．ｍｉｌｉｔａｒｙ）」Ｍｉｌ．Ｍｅｄ．、ｖｏｌ．１６０、ｎｏ．６、ｐ３００〜３０４；Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｃ．ら（１９９９）「米軍の全将兵における呼吸器疾患：新たに生まれた脅威への対抗（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｍｏｎｇ  Ｕ．Ｓ．��ｉｌｉｔａｒｙ  ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ：ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｇ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｈｒｅａｔｓ）」Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、ｖｏｌ．５、ｎｏ．３、ｐ３７９〜３８７）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ヒトにおけるＡｄが介在する遺伝子治療の最初の試みは、嚢胞性線維症の膜貫通伝導調節（ＣＦＴＲ）遺伝子を肺へ導入することであった（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．ら（１９９４）「ヒトＣＦＴＲのｃＤＮＡを含むアデノウイルスの、嚢胞性線維症患者の気道への投与（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＦＴＲ  ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ｖｏｌ．８、ｎｏ．１、ｐ４２〜５１）。
【０００７】
ワクチン療法への典型的なアプローチには、感染性因子−宿主間の関係を変化させること、ならびに宿主の免疫システムによる感染性因子の認識および破壊を促進することが含まれる。近年は、多数のサイトカイン遺伝子が単離され、クローン化され、そして特徴解析されてきた。臨床上の効果を生じさせるのに必要な高い濃度が原因で、これらの生物製剤の多数のものの使用には、顕著な毒性が伴った。全身投与に由来する、明らかに望ましくない結果と治療によるわずかな結果との組み合わせが、サイトカインそのものを産生させるための標的細胞を遺伝子工学で改変するという努力を加速させてきた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８９）「６５２人の癌患者の治療に高用量インターロイキン−２を用いたことに関する経験内容（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ６５２  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、ｖｏｌ．２１０、ｐ４７４〜４８４）。
【０００８】
動物モデルにおいて、遺伝子改変を受けた標的細胞をワクチンとして用いて、標的細胞に対する応答を刺激することがなされてきた（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｒ．ら（１９９４）「サイトカインが介在する、癌の遺伝子治療（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ）」Ａｎｎ．ｏｆ  Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃ．、ｖｏｌ．１、ｐ４３６〜４５０；Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．およびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９５）「癌治療としての遺伝子導入（Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ）」Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．５８、ｐ４１７〜４５４）。標的細胞を指向するサイトカイン遺伝子を導入することは、局所的に産生するサイトカインが免疫学的により効果的であり、そして、全身毒性を引き起こさない、ということから魅力的である。感染性細胞で発現される抗原は、局所での高濃度のサイトカイン（単数または複数）と組み合わせて、外因性のサイトカインの投与によって再現することが事実上不可能である免疫学的な微小環境を作製するために、利用できるかもしれない。このようなサイトカインを産生する標的細胞によって作製されるこの免疫学的な微小環境は、結果的に、細胞傷害性Ｔ細胞を生じさせるであろう。多数の異なる動物モデルにおいて、サイトカインを産生する標的細胞が、特定の標的細胞の破壊可能性を減少させること、および免疫学的に重要な分子の発現を増大させることに、有効であることが示されてきた（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９４）上記；Ｄｒａｎｏｆｆ，ＧおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９５）、上記）。標的細胞の初期の拒絶は、非特異的な炎症反応を伴って起こるもののようである。しかしながら、ほとんどの例において、サイトカインを分泌する標的細胞の拒絶は、全身性で標的細胞に特異的な、Ｔ細胞依存性の免疫を生じさせていた。
【０００９】
さらに、新たな証拠から、共刺激分子Ｂ７によるＴ細胞の共刺激が、Ｔ細胞の活性化に正の効果および負の効果の両方を与えることが、示唆されている（Ｌｅａｃｈ，Ｄ．Ｒ．ら（１９９６）「ＣＴＬＡ−４の遮断による抗腫瘍免疫の強化（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ＣＴＬＡ−４  ｂｌｏｃｋａｄｅ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２７１、ｐ１７３４〜１７３６）。ＩＣＡＭ−Ｉ、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−Ｉなどの、Ｔ細胞についてのその他の共刺激分子もまた、標的細胞に対する応答を誘導することに関与している（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．（１９９０）「免疫システムの接着レセプター（Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．３４６、ｐ４２５〜４３４）。Ｔ細胞上のＣＤ２８と、抗原提示細胞の表面上にある、その主要なリガンドＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）のいずれかまたは両方との相互作用によって、これらの共刺激シグナルで最も強力なものが提供される（Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９６）「Ｔ細胞の共刺激のＣＤ２８／Ｂ７システム（ＣＤ２８／Ｂ７  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１４、ｐ２３３〜５８）。種々のモデルシステムにおいて、Ｂ７のｃＤＮＡが形質導入された標的細胞は、改変を受けた標的細胞および改変を受けていない標的細胞の両方に対する、強力な抗標的細胞応答を誘導した（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｓ．およびＡｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．（１９９３）「Ｂ７の形質導入を受けたメラノーマ細胞による、ＣＤ８＋細胞の直接的な共刺激の後における腫瘍の拒絶（Ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８＋  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｂ７−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２５９、ｐ２６８〜３７０）。
【００１０】
クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子が異なる経路を利用しているにもかかわらず、この２つのクラスの分子の両方が抗原提示に関与していることは、かなり前から知られていた。クラスＩのＭＨＣが、標的細胞に特異的なＣＴＬをインビトロで活性化させることが示されている。標的細胞のワクチン接種に関する初期の研究には、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の形質導入が含まれており、そしてその研究の結果、標的細胞が抑制された（Ｈｕｉ，Ｋ．ら（１９８４）「ＭＨＣ  ＤＮＡが介在する細胞の形質転換後の、移植可能なＡＫＲ白血病細胞の拒絶（Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  ＡＫＲ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＭＨＣ  ＤＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．３１１、ｐ７５０〜７５２；Ｗａｌｌｉｃｈ，Ｒ．ら（１９８５）「Ｈ−２遺伝子の形質導入後のＨ−２Ｋ抗原の新規発現による、腫瘍細胞の転移する性質の喪失（Ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅ  ｎｏｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈ−２Ｋ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｈ−２  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．３１５、ｐ３０１〜３０５）。ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子が標的細胞に特異的なヘルパーＴ細胞の活性化に関与することが示され、そして、クラスＩＩ遺伝子を標的細胞内に導入した結果、標的細胞が病気になる可能性が低下し、標的細胞に対する全身性免疫応答が生じた（Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．ら（１９９０）「ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の形質導入後のマウスの肉腫細胞の拒絶（Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｇｅｎｅ）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１４４、ｐ４０６８〜４０７１）。これらの肯定的な結果にもかかわらず、ＭＨＣの発現レベルと免疫原性との関係は、種々のモデルの間で矛盾している。最近では、研究者は、この矛盾がＢ７共刺激分子などのその他の補因子によって引き起こされ、この補因子がＭＨＣ／ペプチド複合体による抗原提示に影響を及ぼすものと仮定している。
【００１１】
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）は多面的なサイトカインであり、たとえばマクロファージを活性化したり、炎症反応において重要な役割を演じたりする（Ｂｉｌｌｉａｕ，Ａ．（１９９６）「インターフェロン−γ：生態と病原における役割（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ：ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）」Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．６２、ｐ６１〜１３１）。この多面的なサイトカインは、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの抗原の強力なインデューサーでもあり、従って免疫応答を強化させる能力を有する（Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ．ら（１９８２）「ヒトの細胞におけるＨＬＡ抗原とそれらのｍＲＮＡとの合成に与えるインターフェロン−γの選択的な影響（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＨＬＡ−ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｍＲＮＡｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ）」Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．２９９、ｐ８３３〜８３６；Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｋ．ら（１９８６）「インターフェロン：細胞傷害性Ｔ細胞の分化シグナル（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ：ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１６、ｐ７６７〜７７０）。ＭＨＣクラスＩを低濃度で発現するネズミの非免疫原性の標的細胞株内への、ネズミのＩＦＮ−γをコード化するｃＤＮＡのレトロウイルス導入によって、ＭＨＣクラスＩ抗原の発現のアップレギュレーションがわずかに弱く誘導され、そして抗腫瘍性のＣＤ８＋  ＴＩＬが産生した。標的細胞の拒絶後、親細胞を用いた再攻撃（ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）からの長期に亘る保護が誘導された（Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．ら（１９９２）「インターフェロン−γについてのｃＤＮＡが形質導入された非免疫原性の肉腫は、野生型の腫瘍に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘導する：抗原提示能力との相関関係」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、ｖｏｌ．１７５、ｐ１４２３〜１４３１）。さらに、多量のＩＦＮ−γを産生する標的細胞を、微小転移を有するマウスに接種することによって、ＣＴＬが誘導され、これらのマウスはほぼ完治した（Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．ら（１９９３）「腫瘍を有するマウスへの、２つのタイプのＩＦＮ−γ遺伝子が挿入された腫瘍細胞を用いた、転移抑制性のワクチン接種（Ａｎｔｉｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ＩＦＮ−γ  ｇｅｎｅ−ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１５０、ｐ１４５８〜１４７０）。ヒトＩＦＮ−γについてのｃＤＮＡもまた、ヒトの標的細胞内に導入した（Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ，Ｂ．ら（１９９２）「レトロウイルス遺伝子の導入によって、照射されたヒトメラノーマ細胞において、インターロイキン−２またはインターフェロン−γの構成性の発現が誘導された。」Ｂｌｏｏｄ、ｖｏｌ．８０、ｐ２８１７〜２８２５；Ｇａｓｔｌ，Ｇ．ら（１９９２）「レトロウイルスベクターが介在するリンホカイン遺伝子のヒト腎臓癌細胞への導入（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖ���ｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．５２、ｐ６２２９〜６２３６）。ＩＦＮ−γを分泌するこのような細胞は、ＭＨＣクラスＩ抗原、β２−ミクログロブリンおよび細胞内接着分子Ｉの発現の増加、ならびに、ＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現の誘導を示した。しかしながら、ｎｕ／ｎｕマウス内に移植されたヒトの標的細胞株による新生物の形成はＩＦＮ−γの分泌に影響を及ぼさなかったのに対して、ＩＬ−２の産生は新生物の生長を阻害した。
【００１２】
その他の多くのサイトカイン、ケモカインおよびインタークライン（ｉｎｔｅｒｃｒｉｎｅｓ）が、標的細胞に対する免疫の惹起においていくつかの異なる役割を演じることが知られている（Ａｌｌｉｏｎｅ，Ａ．ら（１９９４）「インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子α、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、およびγ−インターフェロン遺伝子または通常のアジュバントと混合したもので処理された、複製可能および複製不可能な、マウスの乳腺腫瘍細胞の免疫化と治癒の可能性」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．５４、ｐ６０２２〜６０２６；Ｐｌａｔａ−Ｓａｌａｍａｎ，Ｃ．Ｒ．およびＢｏｒｋｏｓｋｉ，Ｊ．Ｐ．（１９９４）「ケモカイン／インタークラインおよび摂食の中枢性制御」Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、ｖｏｌ．２６６、ｐ．Ｒ１７１１〜１７１５；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．−Ｗ．およびＦａｎｇ，Ｘ．（１９９５）「癌に対する遺伝子治療の戦略（Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ）」Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ、ｖｏｌ．４、ｐ４８７〜５１４）。多数のサイトカインまたは免疫刺激性遺伝子の遺伝子導入を用いるさらなる研究から、標的細胞に対するより強い免疫を誘導することが達成できた（Ｖａｇｌｉａｎｉ，Ｍ．ら（１９９６）「インターロイキン１２は、インターロイキン２が形質導入された腫瘍細胞に基づくワクチンの治療効果を強化する」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．５６、ｐ４６７〜４７０）。サイトカインまたは免疫調節性の遺伝子は、その他の遺伝子導入と組み合わせて、特定の標的細胞に対する遺伝子治療へのより効果的なアプローチを開発するために用いられてきた（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．−Ｗ．およびＦａｎｇ，Ｘ．（１９９５）、上記）。
【００１３】
アデノウイルスのワクチンへの利用
そのサイズと、非相同ＤＮＡの大きい断片を運搬する能力とに起因して（上記を参照）、アデノウイルスおよびアデノウイルスを基礎とするベクターは、種々のワクチンがそれに基づいて作られるところの基盤としての有力な候補となる（Ｆｏｏｋｓ，Ａ．Ｒ．（２０００）「ヒトに用いるための経口ワクチンの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｕｓｅ）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、ｖｏｌ．２、ｎｏ．１、ｐ８０〜８６；Ｂａｂｉｕｋ，Ｌ．Ａ．およびＴｉｋｏｏ，Ｓ．Ｋ．（２０００）「ワクチンを粘膜表面に送達するためのベクターとしてのアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｏ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ）」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、ｖｏｌ．８３、ｎｏ．１〜２、ｐ１０５〜１１３；Ｈｏｆｌｉｎｇ，Ｋ．ら（２０００）「心臓病を引き起こすウイルスに対するワクチンに向けての進展（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）」Ｈｅｒｚ．、ｖｏｌ．２５、ｎｏ．３、ｐ２８６〜２９０；Ｐａｏｌａｚｚｉ，Ｃ．Ｃ．ら（１９９９）「狂犬病ワクチン。分子生物学の方法を用いた開発。」Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、ｖｏｌ．１１、ｎｏ．２、ｐ１３７〜１４７；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｊ．（１９９８）「フラビウイルス科に対する新規ワクチンとしての欠損アデノウイルス（Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）」Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．１０、ｎｏ．２〜３、ｐ１８７〜１９４；Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ，Ｋ．ら（１９９８）「獣医が用いるためのウイルスワクチンの開発への新たなアプローチ（Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｕｓｅ）」Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．、ｖｏｌ．１７、ｎｏ．３、ｐ６４１〜６５３；Ｒｏｌｐｈ，Ｍ．Ｓ．およびＲａｍｓｈａｗ，Ｉ．Ａ．（１９９７）「ワクチンおよび免疫学的ツールとしての組換えウイルス（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｏｏｌｓ）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．９、ｎｏ．４、ｐ５１７〜５２４；Ｂａｂｉｕｋ，Ｌ．Ａ．ら（１９９６）「家畜用の新規ウイルスワクチン（Ｎｏｖｅｌ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）」Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、ｖｏｌ．５４、ｎｏ．１〜４、ｐ３５５〜３６３；Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．およびＸｉａｎｇ，Ｚ．（１９９６）「新規ワクチンのアプローチ（Ｎｏｖｅｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１５６、ｎｏ．１０、ｐ３５７９〜３５８２；Ｉｍｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．（１９９５）「組換えウイルスワクチンとしてのアデノウイルスベクター（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎ���ｎｔ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｖａｃｃｉｎｅ、ｖｏｌ．１３、ｎｏ．１３、ｐ１１４３〜１１５１；Ｒａｎｄｒｉａｎａｒｉｓｏｎ−Ｊｅｗｔｏｕｋｏｆｆ，Ｖ．およびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｍ．（１９９５）「ワクチンとしての組換えアデノウイルス（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ｖｏｌ．２３、ｎｏ．２、ｐ１４５〜１５７；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．およびＢｏｒｙｓｉｅｗｉｃｚ，Ｌ．Ｋ．（１９９５）「遺伝子治療およびウイルスワクチンの接種：その境界面（Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）」Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．、ｖｏｌ．５１、ｎｏ．１、ｐ２０５〜２１６；Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｎ．ら（１９９２）「新しい側面を持つ従来からの微生物：分子生物学と新しいワクチンの設計（Ｏｌｄ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ｆａｃｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．４、ｎｏ．４、ｐ４４２〜４４８；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびＰｒｅｖｅｃ，Ｌ．（１９９２）「アデノウイルスに基づく発現ベクターおよび組換えワクチン（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２０、ｐ３６３〜３９０；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．Ｊ．（１９９２）「エプスタイン・バーウイルスのワクチン（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｖａｃｃｉｎｅ、ｖｏｌ．１０、ｎｏ．９、ｐ５６３〜５７１；Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，Ａ．Ｄ．およびｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｐ．（１９９２）「ヒトにおける急性呼吸器疾患ウイルスの感染症とはしかに対するワクチン接種（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｉｎ  ｍａｎ）」Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８４、ｎｏ．２〜３、ｐ１８０〜１９２；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９１）「単純ヘルペスウイルスに対する潜在的なワクチンとしてのアデノウイルスベクター（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）」Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、ｖｏｌ．１３、ｓｕｐｐｌ．１１、ｐ．Ｓ９１２〜Ｓ９１６；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．（１９９０）「発現ベクターおよび組換えワクチンとしてのアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、ｖｏｌ．８、ｎｏ．４、ｐ８５〜８７；Ｈｕｎｇ，Ｐ．Ｐ．ら（１９９０）「組換え型の生ワクチンとして用いるための、ＨＩＶ−１抗原またはＨＢＶ抗原を発現するように遺伝子改変を受けた、アデノウイルスワクチン株（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅ���ｅｄ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＨＩＶ−１  ｏｒ  ＨＢＶ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｌｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．Ｃｅｌｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．、ｖｏｌ．９、ｎｏ．３、ｐ１６０〜１６４；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．（１９９０）「ヘルパー非依存性の組換えアデノウイルスベクター：ＨＩＶ  ｅｎｖまたはＨＢＶ表面抗原の発現（Ｈｅｌｐｅｒ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｅｎｖ  ｏｒ  ＨＢＶ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）」Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．７、ｎｏ．１、ｐ６７〜７７；Ｇｕｒｗｉｔｈ，Ｍ．Ｊ．ら（１９８９）「アデノウイルスワクチンの現在の使用と将来の方向（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｓｅｍｉｎ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．、ｖｏｌ．４、ｎｏ．４、ｐ２９９〜３０３；Ｔｉｋｃｈｏｎｅｎｋｏ，Ｔ．Ｉ．（１９８９）「遺伝情報を運搬するための、および新しいタイプのワクチンを構築するための、ベクターとしてのアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．２５７、ｐ１９３〜２０４；ならびに上記の任意の参考文献）。
【００１４】
米国特許第５，６４３，５７９号および第４，９２０，２０９号には、その他の感染性の生物体の異種抗原をコードしている組換えアデノウイルスを用いる、経口ワクチンが記載されている。そこに開示されたワクチンは、アデノウイルスが腸管に感染し、そしてアデノウイルス抗原だけでなく異種抗原をも発現するように、腸溶性コーティング製剤の中に含まれている。
【００１５】
本明細書で開示された本発明は、ワクチンの基盤として相補的なデュアルＡｄシステムを提供することによって、当該技術分野で知られたアデノウイルスワクチンを改良するものである。このようなシステムには、その他のウイルスシステムよりも、多数の抗原と免疫刺激性ＤＮＡとを組込むことが可能になる、大きな遺伝子送達能力がある。このようなシステムでは機能を構成要素に分割することができ、そしてさらに、治療が必要な患者または対象に導入する際の完全な機能も保持されている。
【００１６】
発明の概要
本発明は、新規のベクター、組成物、および病気またはその他の病態を治療する方法を提供する。１つの実施態様において、本発明は組成物を提供する。組成物の１つの実施態様において、第１のおよび第２のアデノウイルスベクターは提供され、それらは、相補的な機能を有し、そして宿主生物または標的細胞内での複製に関して互いに依存している。１つの実施態様において、前記アデノウイルスベクターの１つは、宿主生物または標的細胞内でのアデノウイルスベクターの増殖をコントロールする初期遺伝子の発現を制御する、プロモーターを含む。別の実施態様において、前記アデノウイルスベクターの１つは、宿主生物または標的細胞が活性化するプロモーターを含み、そして、アデノウイルスベクターの増殖を特定の宿主生物または標的細胞に限定している。さらに、組成物の別のアデノウイルスベクターは、宿主生物または標的細胞内でのＡｄの複製サイクルを支持することができるＡｄゲノムの一部を含む。宿主生物または標的細胞内でのこれらのベクターの複製によって、宿主生物、標的細胞、病原体および／または感染性因子の生長、機能またはその他の活性を改変しうる１以上の免疫応答が、直接的にまたは間接的に誘導される。宿主生物、標的細胞、病原体および／または感染性因子は、感染症、癌、自己免疫疾患、心血管疾患、または当業者が承知しているその他の病態（単数または複数）を含むがこれらには限定されない、病態と関わってもよい。
【００１７】
本発明は、次の公開された国際出願（および、それらの国際出願によって主張される優先権の基礎となるあらゆる出願）において記載された発明に関する：１９９７年５月３０日に出願され、１９９７年１２月４日にＷＯ９７／４５５５０号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０２１８号；１９９７年１２月１９日に出願され、１９９８年７月３０日にＷＯ９８／３２８６０号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／２３６８５号；１９９８年１月２３日に出願され、１９９８年８月１３日にＷＯ９８／３５０２８号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１３０１号；１９９８年２月２３日に出願され、１９９８年９月１１日にＷＯ９８／３９４１１号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３４７３号；および１９９８年５月１９日に出願され、１９９８年１２月３日にＷＯ９８／５４３４５号として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０３３０号。
【００１８】
本発明が、本明細書に記載された特定の実施態様に限定されないことは、当業者であれば理解するだろう。本発明のその他の応用が検討される。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明によって、現在のワクチンおよび免疫療法の技術と、感染症およびその他の病態を治療するのに有用な応用とを実質的に改良する試薬および方法が提供されることは、当業者であれば理解できるだろう。本発明によって、相互依存的な相補性を有し、感染症およびその他の病態を治療するのに有用な、複製可能なアデノウイルス（Ａｄ）ベクターシステムが提供される。１つの実施態様において、このシステムは、「コントロールドＡｄ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ａｄ）」ベクターおよび「サプリメンタルＡｄ（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｄ）」ベクターを含む。コントロールドＡｄは、最小限のＡｄ−シスエレメント（逆方向末端反復（ＩＴＲ）とパッケージング・シグナル）と、標的細胞が活性化能力を有するかまたは全身性の「ハウスキーピング（ｈｏｕｓｅ−ｋｅｅｐｉｎｇ）」遺伝子のプロモーターを介して遍在的に活性化される、転写制御配列とを有する。特定の実施態様において、転写制御領域は、ＡｄのＥ１遺伝子の発現を作動させる、細胞に特異的なまたは組織に特異的な転写制御領域でもよい。その他の実施態様において、転写制御領域は、ＡｄのＥ１遺伝子の発現を作動させる、遍在する、全身性の「ハウスキーピング」転写制御領域でもよい。コントロールドＡｄベクターは、免疫調節遺伝子またはＡｄの初期領域の遺伝子などの対象遺伝子の発現を提供するような発現カセットをさらに含む。サプリメンタルＡｄは、パッケージング・シグナル、Ｅ１領域の欠失、および、置換または非置換のＡｄゲノムの残りを含んでいてもよい。このシステムを用いてこのように作製されるＡｄベクターには、互いに依存し合う一対の組換えアデノウイルスが含まれ、そしてこのベクターを「相補的なＡｄベクター（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ａｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」と称する。単一のタイプのサプリメンタルＡｄベクターと共に、１以上のタイプの相補的なＡｄを含む組成物を、本発明の実施の際に利用してもよい。
【００２０】
１つの実施態様において、このシステムは、それにおいて特定の感染性因子または標的細胞が関与することが知られている、病態を治療するのに有用である。たとえば、感染性因子または標的細胞集団を処置するために局所的にまたは全身的に注入すると、ベクターは、宿主生物または標的細胞内で複製し、抗原、免疫原、エピトープまたは免疫調節性タンパク質などのエフェクタータンパク質を発現させ、その結果、局所的および／または全身的な予防効果および／または治療効果が発揮され、ならびに、局所的および／または全身的な予防免疫応答および／または治療免疫応答が誘導される。相補的なＡｄシステムによって、局所的におよび／または全身的に、たとえば宿主生物内で複製するか、またはコントロールドＡｄベクターのＥ１発現カセットを利用する能力を有する感染性因子もしくは標的細胞（たとえば樹状細胞が挙げられるが、これに限定されるわけではない）の直近で複製する、Ａｄベクターが提供される。
【００２１】
関連分野の当業者であれば、本発明を実施するのに有用な技術を認識するだろう。これらの技術は、多数の一般的な参考文献：分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）；遺伝子発現の技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、ｖｏｌ．１８５、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．編（１９９１）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＰＣＲプロトコール：方法および応用の手引書（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｉｎｎｉｓら編（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；動物細胞の培養：基本技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）（１９８７）第２版、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）；抗体：実験室のマニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）；タンパク質精製の手引書（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、酵素学の方法、ｖｏｌ．１８２（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；キューバイの免疫学（Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｒ．Ａ．ら（２０００）、第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．）；免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．ら（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）；免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．ら（２００１）第５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）；細胞および分子の免疫学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．ら（２０００）第４版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．）；ロアットの必須免疫学（Ｒｏｉｔｔ’ｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（Ｒｏｉｔｔ，Ｌ．およびＤｅｌｖｅｓ，Ｐ．Ｊ．（２００１）第１０版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）；ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ）（Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ら（１９９９）第３版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．）；サイトカインハンドブック（Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ａ．（１９９８）第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）などを含む参考文献；ならびに、上記の任意のものに記載されている参考文献に記載されている（それらに限定されるわけではない）。ここに列挙されたもの以外のその他の適切な参考文献もまた���当業者に知られており、利用することができる。列挙されたすべての参考文献は、引用することによってここに取り込まれる。
【００２２】
本明細書で用いられる「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、プラスミド、ウイルス、自己複製配列、ファージまたは任意の源に由来する一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの直鎖の断片と定義される。「転写制御領域（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、サイレンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含んでもよく、そして、この領域は本発明の核酸と機能的な関連がある。別途の記載がない限り、転写制御領域を代替的にプロモーターまたはエンハンサーと称してもよい。好ましくは、転写制御領域は、標的細胞中で高レベルの遺伝子発現を作動させる。本発明で用いるのに適する転写制御領域の具体例としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、およびＣＭＶエンハンサーに結合したニワトリβ−アクチンプロモーター（Ｄｏｌｌ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９６）「ＡＡＶベクターを用いる、哺乳動物の脳細胞内への遺伝子の送達に関するプロモーターの強さの比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｔｒｅｎｇｔｈｓ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、ｖｏｌ．３、ｎｏ．５、ｐ４３７〜４４７）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、チロシンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、ＤＦ−３  ムチンエンハンサー、チロシナーゼプロモーター、ガン胎児性（ＣＥＡ）プロモーター、チロシナーゼプロモーター、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーター、Ｈ１パルボウイルスプロモーター、またはその他の適切なプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。その他の多数の適切なプロモーターが当業者に利用可能であること、および、かかるプロモーターは本明細書にて記載されたベクターの範囲内で      有用であろうということに、留意すべきである。「発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、適切なタイプの細胞中においてコード化されたタンパク質が発現するのに十分な、転写制御領域または転写調節領域に作動可能に連結した、１以上のレポーター遺伝子および／または１以上のエフェクター遺伝子についてのコード配列を含む、ＤＮＡ断片であってもよい。
【００２３】
「レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）」または「レポーター構築物（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、分析可能な産物をコード化している遺伝子を含有する、サブ染色体の、および精製したＤＮＡ分子であってもよい。「エフェクター遺伝子（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ）」とは、その遺伝子がコード化するポリペプチドが発現する際に生物体、組織または細胞に影響を与える、任意の遺伝子を指す。「トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」とは、生物体のゲノム内に通常存在する遺伝子以外の、生物体のゲノム内に挿入された遺伝子を指す。「組織特異的（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「腫瘍特異的（ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」な様式で発現される遺伝子は、１つの生物体において、ある組織内の発現量が、１以上の第２の組織内のそれに対してより多量であること（すなわち、別の細胞または組織と比べて、ある組織内で優先的に発現すること）を示すものを指す。次いで、同様に、組織特異的、細胞特異的または腫瘍特異的なプロモーターは、それぞれ、ある組織、細胞または腫瘍内での活性が、別の組織、細胞または腫瘍内でのそれよりも高いことを示す。
【００２４】
「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」、または「免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）」とは、免疫応答を誘導する能力を持つ任意の分子を指す。このような分子としては、細胞が介在する抗原、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導するもの、Ｔ細胞レセプターおよび／またはＢ細胞レセプターと相互作用するもの；先天性免疫応答を誘導するものなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
「免疫調節遺伝子（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ）」とは、その核酸またはタンパク質産物が発現した際に、免疫応答の活性化と免疫応答の抑制または抑圧との両方を含めた免疫反応を変化させるのに役立つ、任意の遺伝子を指す。
【００２６】
「腫瘍サプレッサー遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）」とは、そのタンパク質産物が発現した際に、生長の抑圧または細胞死の誘導を含めた（これらには限定されない）腫瘍の進行を抑圧するのに役立つ、遺伝子を指す。「生長サプレッサー遺伝子（ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）」は、そのタンパク質産物が発現した際に、細胞の生長を抑圧するのに役立つ遺伝子と定義される。「オンコジーン（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」は、癌を生じさせる遺伝子と定義される。
【００２７】
「アデノウイルス粒子（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」とは、野生型または組換え型の両方を含めた感染性アデノウイルスを指す。アデノウイルスには、アデノウイルスゲノム内にコード化されたタンパク質被膜によってキャプシド形成がなされたＤＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００２８】
「非相同のＤＮＡ（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ）」とは、アデノウイルスゲノム以外の源から単離されたアデノウイルス構築物内に導入されたＤＮＡ、または、その自然の状態もしくは組換え体としての状態のいずれかであって宿主細胞にとっては外来のものである、その他のＤＮＡを指す。「組換えアデノウイルス粒子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」は、アデノウイルスの遺伝物質とアデノウイルスの遺伝物質以外の遺伝物質との両方を含む、少なくとも１つの他の源に由来するそのゲノムの少なくとも一部を有する、感染性アデノウイルスと定義される。
【００２９】
「治療可能な病態（ｔｒｅａｔａｂｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、薬効のある起源のものとして一般に定義されている処置を含む（これに限定されない）処置の一形態の施与によって変化するかもしれない、生物体の病態を指す。「遺伝子の状態（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、本出願では、その遺伝子の野生型およびその遺伝子の任意の変異型を含むがこれらには限定されない、少なくとも１つの特定の遺伝子の発現または抑圧の、少なくとも部分的な結果であるところの生物体の状態と定義される。
【００３０】
当業者によって現在用いられているほとんどのアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域が欠失しており、そして喪失したＥ１機能を提供しうる許容性の細胞株において増殖する（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら（１９７７）「ヒトアデノウイルス５型に由来するＤＮＡにより形質転換されたヒト細胞株の特性（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．３６、ｐ５９〜７２）。あるいは、そのシステムのいくつかのその他の構成要素（たとえばヘルパーＡｄが挙げられるが、これに限定されない）を介して、Ｅ１の機能（単数または複数）がトランスで提供されうる。その他の場合において、ヘルパーウイルスを用いて、ウイルスゲノムの大きな欠失を含むベクターのパッケージングがなされてきた。しかしながら、このようなシステムの主な欠点は、パッケージングされたウイルスの大部分がヘルパーウイルス（本発明では、サプリメンタルＡｄと同様）であることである。パッケージング・シグナルを部分的に欠失したヘルパーベクターによってなされた、Ａｄベクターのゲノム中にある大規模な欠失部の相補性が、既に示されている（たとえば上記の関連出願を参照すること）。
【００３１】
本明細書にて検討されている相補的なＡｄシステムにおいて、サプリメンタルベクターは、β−ｇａｌ発現カセットまたはその他のカセットで置換されているＥ１領域を有していてもよく、そして、相補的なＡｄシステムを用いて準備を行っている間に、Ａ５４９細胞などのＥ１を発現する細胞株内でこのベクターが増殖してもよい。サプリメンタルベクターは、アデノウイルスの遺伝子が欠失されたベクターを有するコントロールドＡｄベクターを補完する。
【００３２】
本発明において、「コントロールドＡｄベクター（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ａｄ  ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、Ｅ１遺伝子領域を除いて、アデノウイルスのコード配列が欠失しているベクターを意味する。さらに、コントロールドＡｄベクターは、複製およびパッケージングに必要な最小限の遺伝子エレメントを保持する。「サプリメンタルＡｄベクター（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ−Ａｄ  ｖｅｃｔｏｒ）」は、コントロールドＡｄベクターとサプリメンタルＡｄベクターとの両方の複製およびパッケージングを維持するのに必要なタンパク質を提供する。本発明において、サプリメンタルＡｄベクターのゲノム内には存在しない、１以上のＡｄの初期遺伝子（Ｅ１、Ｅ４またはＥ２など）を含む、コントロールドＡｄベクターが提供される。従って、コントロールドＡｄはまた、サプリメンタルＡｄの複製を支えてもよい（ヘルパーのヘルパーとして作用する）。それゆえ、２つのベクター、サプリメンタルＡｄおよびコントロールドＡｄは、増殖に関して互いに依存し合っている。
【００３３】
構成的に活性を示す、すなわち「一般的な（ｇｅｎｅｒａｌ）」プロモーターによって、相補的なＡｄベクターからのＥ１の発現を作動させてもよい。このプロモーターは多くのタイプの細胞中で活性を示し、具体的には、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、ＣＭＶエンハンサーに結合したニワトリβ−アクチンプロモーター（Ｄｏｌｌ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９６）上記）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびチロシンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターである。このようなやり方で、相補的なＡｄシステムを用いて、標的細胞の特定の集団を具体的に特定したり標的化したりすることが困難な、病態を処置してもよい。このような病態には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたは「狼瘡（ｌｕｐｕｓ）」）、関節炎または感染症などの、自己免疫性の病態が含まれるだろう。関節炎の場合、たとえば、コントロールドＡｄ内の構成的プロモーターによって、関節炎の「再発（ｆｌａｒｅ−ｕｐ）」する局所的な環境内（すなわち、患者が痛みを経験している領域）内で、有益な免疫抑制性サイトカインの発現が可能となる。このような場合、発現を特定のタイプの細胞に制限する必要はないが、しかし、より重要なことは、局所の環境の範囲内で、サイトカインが可能な限り効果的に発現することである。しかしながら、相補的なＡｄシステムは局所的な領域において、ある程度の複製をまだ提供してもよく、従って、免疫調節性のタンパク質の発現をかなりの時間に亘って提供する。
【００３４】
あるいは、Ｅ１の発現が特定のタイプの細胞または組織に制限されてもよい。特定の組織または細胞内で、サプリメンタルＡｄおよびコントロールドＡｄの両方に、標的細胞に特異的な増殖を行わせるために、アデノウイルスの複製に必要な１以上の初期遺伝子のプロモーターは、細胞特異的または組織特異的なプロモーターと作動可能に連結される。複製に必要なあらゆるアデノウイルス遺伝子は、標的細胞に特異的なプロモーター、たとえばＥ１、Ｅ２およびＥ４と、作動可能に連結されてもよい。特に、標的細胞が感染性細胞の場合、標的細胞内で活性を示すあらゆるプロモーターが適したものであり、その上、たとえば、α−フェトプロテイン、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノトランスフェリン、Ｅｒｂ−Ｂ２、チロシナーゼ、ＭＵＣ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、オステオカルシン（肉腫、前立腺癌）、チロシナーゼプロモーター、ＤＦ３プロモーター、クロモグラニンＡ（神経内分泌腫瘍、ＳＭＬＣ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）プロモーター、またはグリア繊維性タンパク質（ＧＦＰ）プロモーターなどの、プロモーターによって提供される細胞特異的な活性が好ましい。その他の適切なプロモーターは当該技術分野において知られており、それらは本発明に包含される。１つの実施態様において、本発明は、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターで置換されたＥ１Ａプロモーターを有するＥ１領域を含有する、コントロールドＡｄベクターを含んでもよい。α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターを利用することが可能であってコントロールドＡｄとサプリメンタルＡｄとの両方に同時に感染した（すなわち注入部位にて）細胞だけが、コントロールドＡｄおよびサプリメンタルＡｄの増殖を支える。両方のウイルスが同程度の量にて産生するため（サプリメンタルＡｄのパッケージング・シグナルにおける部分的な欠失または修飾の影響の故に）、周辺の細胞は同時に感染することになり、そして、これらの細胞が、肝細胞癌の細胞などのようにＡＦＰプロモーターからＥ１の発現を作動させることが可能であれば、両方のウイルスは増殖し続けるだろう。注入部位（腫瘍または手術後の腫瘍床（ｔｕｍｏｒ  ｂｅｄ））からの距離が遠くなるほど、同時感染の機会が低下し、従ってベクターの拡散が停止する。もし漏出性の腫瘍特異的プロモーターを利用するのであればベクターは全身に拡散し患者にとって有害となる、という腫瘍細胞崩壊性のシングルベクターのシナリオにとって、このことは、重要な安全面での優位性である。
【００３５】
現在利用できるベクターに勝る本発明の別の長所は、２つの欠損ベクターを組み合わせることで、治療用の非相同ＤＮＡを収容する能力を増やすことができる。Ａｄ  Ｅ１プロモーターを置換した腫瘍特異的プロモーターを運搬する典型的なＡｄベクターを用いることによって、そのベクター内に追加するエフェクター遺伝子として、４ｋｂ未満のものを利用できる。本発明において、外因性の非ウイルスＤＮＡのためのコントロールドＡｄベクターの収容能力は、最大で３６ｋｂである。抗原としての可能性を有するあらゆる遺伝子は、コントロールドＡｄの中に組み込んでもよい。１つの実施態様において、Ｂ７．１（共刺激分子）およびインターフェロン（ＩＦＮ−γ）をコード化する免疫刺激性遺伝子は、２つの別個の発現カセットとして、単一のコントロールドＡｄ内に組込まれる。その他の多数の発現カセットも、このシステムでの使用に適するだろう。
【００３６】
１．相補的なＡｄベクターシステム
ａ．システムの構成：相補的なＡｄベクターシステムは、２つの主要な部分からなる：（１）Ｅ１欠失であるか別の方法で置換された、パッケージングが減弱化された、サプリメンタルＡｄベクター、および（２）Ｅ１のようなＡｄウイルスゲノム、またはＥ２もしくはＥ４などの初期段階の遺伝子の、最小限のシスエレメントのみを含むコントロールドＡｄベクター。Ａ５４９細胞のようにＥ１がトランス活性化すること、および／またはＥ１がサプリメンタルＡｄのためのパッケージング・シグナルを制御することを可能にする、Ａｄヘルパー細胞株の中で、これらのベクターは増殖することができる。あるいは、細胞株以外のシステムの構成要素によって、Ｅ１の機能を提供してもよい。サプリメンタルＡｄベクターがＥ１欠失またはＥ１置換であることを除いて、サプリメンタルＡｄは、コントロールドＡｄベクターの複製とトランス補完（ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に必要な、すべてのウイルスの遺伝子とエレメントとを有する。さらに、修飾されたサプリメンタルＡｄベクターは、コントロールドＡｄベクターのパッケージングを優先的に選択する、（効果が弱くなる）変異を受けたパッケージング・シグナルをさらに含んでもよい。他方、コントロールドＡｄベクターは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）と野生型パッケージング・シグナル（Ａｄ  ＤＮＡの複製およびパッケージングについてはシスエレメント）とを有する。少なくとも２つの異なる方法（プロモーター置換および／または機能的欠失）を用いて、コントロールドＡｄを制御してもよい。その他の適切な制御方法は、当業者によって理解されるだろう。
【００３７】
（１）プロモーターの置換：１つの実施態様において、天然のウイルスプロモーターのＡｄＥ１Ａは、ＡｄＥ１の発現を宿主細胞中で作動させる構成的プロモーター、たとえばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーで置換する。その他の適切なプロモーターとしては、たとえばＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーターおよびＣＭＶエンハンサーに結合したニワトリβ−アクチンプロモーター（Ｄｏｌｌ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９６）上記）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターならびにチロシンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターが挙げられる。Ｅ１を作動させる構成的プロモーターを有するコントロールドＡｄを、サプリメンタルＡｄと組み合わせて用いることは、上記のように、特定のタイプの細胞をターゲティングすることが望ましくないか実現できないかのいずれかであるような、病態を処置することに対して有用である。
【００３８】
別の実施態様において、ウイルスの複製を制御するための初期遺伝子の天然のウイルスプロモーターを、非相同のプロモーターによって置換してもよく、そして、このプロモーターは、標的細胞または産生細胞中でのみ活性化するかまたは誘導性を示す。たとえば、アデノウイルスのＥ１ａプロモーターは、ウイルス複製サイクルのイニシエーターである。Ｅ１ａプロモーターは、α−フェトプロテインプロモーターで置換されてもよく、そして、このプロモーターは、主に肝細胞癌の細胞中で活性を示す。系統特異的なものまたは腫瘍細胞中で特異的に活性を示しうるものといった、プロモーターのその他の例は本明細書に記載されている。
【００３９】
（２）機能改変：標的細胞中でのウイルスの複製サイクルには必須でないアデノウイルスの遺伝子を削除することができ、これによって、標的細胞中でのウイルスの特定の増殖を、非標的細胞中での非許容性の増殖とを見分けることができる。たとえば、腫瘍細胞は、非腫瘍細胞よりも周期が多いようである。それはそうとして、細胞の正常な静止期を誘導する、典型的なアデノウイルスの機能は必要ではない。細胞周期を誘導するＡｄの細胞タンパク質をコード化しているアデノウイルスの遺伝子を削除することは、正常の静止細胞におけるＡｄの複製能力を捨てることになる。このようなタンパク質の２つの例は、Ａｄ  Ｅ１ｂ−ｐ５５とＥ１ｂであり、それぞれ、ｐ５３が削除された（または変異を受けて機能を消失した）腫瘍細胞、あるいは網膜芽腫が除かれた（または変異を受けて機能を消失した）腫瘍細胞において、ウイルスの増殖にとっては不要である。従って、Ｅ１ｂ−ｐ５５またはＥ１ｂを削除することによって、サプリメンタルＡｄベクターを設計してもよい。あるいは、Ａ５４９細胞に類似するＡｄヘルパー細胞株を利用して、サプリメンタルＡｄの転写と複製とをトランス活性化させてもよい。コントロールドＡｄの助けを借りずに、これらの細胞を用いて、サプリメンタルＡｄを増殖させてもよい。細胞株はまた、サプリメンタルＡｄのパッケージングを減弱化させるための制御機構を含んでもよい。このような機構としては、サプリメンタルＡｄパッケージング・シグナルと結合するか、またはその他のこのような機能を妨害する、タンパク質を発現させることが挙げられよう。
【００４０】
ｂ．システムの運用メカニズム：このシステムは、Ａｄの複製を、身体の特定の領域または特定の標的細胞もしくは組織、またはその両方のいずれかに、局所的に制限するように設計する。特定の細胞または組織をターゲティングすることが望ましくないか実現できないかのいずれかであるような病態を処置するために、複製は、相補的なＡｄと構成的プロモーターを用いて、相補的なＡｄシステムによってさらに制限してもよい。相補的なＡｄベクターの混合物は局所的に注入され、ここで、特定の標的細胞は利用可能であり、複製は、局所投与または全身投与のいずれかで標的細胞特異的プロモーターを使用することによって制限されうる。転写的に標的化されたベクターを全身投与することによって、標的細胞特異的プロモーターからＥ１を発現させることができる細胞のみにおいて複製が行われる。Ｅ１を作動させる構成的プロモーターと共に相補的なＡｄシステムを用いることは、局所的な注入にとって、より適切なものであり、必ずしも全身投与のための最適な試薬ではない。従って、１つの実施態様において、このシステムは、ヘルパー細胞中または標的腫瘍細胞中で活性化される、組織特異的プロモーターまたは腫瘍活性化プロモーターを含む。コントロールドＡｄは、Ｅ１遺伝子の転写を作動させるプロモーターを含むのが好ましい。Ｅ１遺伝子産物は、サプリメンタルＡｄゲノムおよびコントロールドＡｄゲノムについて同時に、転写と複製とを順番に作動させてもよい。
【００４１】
上記のように、サプリメンタルＡｄのパッケージング・シグナルを修飾して、コントロールドＡｄベクターを優先的にパッケージングすることは、有益だろう。Ａｄのパッケージングタンパク質は、感染細胞中にわずかな量だけ存在する、トランスに作用する因子であり、そして、Ａｄのパッケージングに関しての律速段階である。野生型パッケージング・シグナルは、操作を受けたシグナルよりも高い親和性をもってパッケージングタンパク質に認識されるので、野生型パッケージング・シグナルを持つコントロールドＡｄウイルスのゲノムが存在する場合、変異を受けたパッケージング・シグナルを有するサプリメンタル  ウイルスゲノムのパッケージングは、部分的にまたは完全に抑圧される。これによって、コントロールドＡｄベクターの優先的なパッケージングが提供される。従って、２つのウイルスベクターは相互に依存し合っている。
【００４２】
その他の初期領域（Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４）におけるサプリメンタルＡｄを、さらに削除または置換してもよい。コントロールドＡｄにおける対応する欠失遺伝子を組込むことによって、パッケージングとコントロールドＡｄの力価が向上し、そしてサプリメンタルＡｄがコントロールドＡｄに依存するようになる。このことは、たとえば抗腫瘍性の相補的なＡｄベクターの開発にとって特に有用である。相補的なＡｄ組成物を相補的Ａｄ／サプリメンタルＡｄの組成物から調製する際に、標準的な生化学的技術を利用してもよい。応用のためにＡｄベクターの精製が必要な場合においては、たとえば、生物学的、生化学的または物理学的な方法、具体的にはＣｓＣｌ勾配を介する超遠心分離法などによって、相補的なＡｄベクターをサプリメンタルＡｄベクターからさらに精製してもよい。
【００４３】
ｃ．システムの能力：遺伝子を送達する能力が高いことは、この相補的なＡｄベクターシステムの主要な特徴の１つである。相補的なＡｄベクターとサプリメンタルＡｄベクターとの両方を利用して、非相同ＤＮＡを細胞または組織へ送達してもよく、またはそれらを利用して、細胞または組織中での遺伝子の発現を増加したり減らしたりしてもよい。種々のエフェクター遺伝子配列またはレポーター遺伝子配列をコード化している核酸を、コントロールドＡｄまたはサプリメンタルＡｄのいずれかの中に組込んでもよく、それによって、感染細胞中でのその遺伝子配列の発現を提供する。Ａｄのパッケージング能力の最大値はゲノムの約１０５％、すなわち概算で３８ｋｂである（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｇ．ら（１９８７）「ヒトアデノウイルスキャプシドの少量成分である、タンパク質ＩＸは、完全長ゲノムのパッケージングに必須である。」ＥＭＢＯ  Ｊ．、ｖｏｌ．６、ｐ１７３３〜１７３９）。コントロールドＡｄベクターにおけるウイルスのシスエレメントのサイズは、１ｋｂ未満のものを含んでもよい。サプリメンタルＡｄにおいてＥ１遺伝子とＥ３遺伝子を欠失することによって、さらに８ｋｂの収容能力が提供される。相補的なＡｄベクターシステムの、非相同ＤＮＡについての総収容能力それ自体は、最大で４２ｋｂである。非相同ＤＮＡとしては、トランスジーン発現カセットまたは調節エレメントのいずれかで可能である。発現カセットは、単一のものでも複合的なものでもよく、バイシストロン性のものでもポリシストロン性のものでもよい。調節エレメントは、トランスジーンの保持、転写およびベクターのターゲティングを制御するためのＤＮＡ配列であってよい。
【００４４】
多数の遺伝子を相補的なＡｄベクター内に組込んでもよく、それによって１以上のサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンおよび／または免疫調節剤を提供し、相補的なＡｄベクターの感染に起因する全身の標的細胞に対する免疫応答を最適化する。１以上の細胞毒性および／または免疫刺激性遺伝子を単独でまたは組み合わせて送達し、細胞毒性を高めるような、相補的なＡｄシステムを構築することもまた可能である。
【００４５】
免疫調節遺伝子に関しては、相補的なＡｄシステムを利用して、免疫応答を１型ヘルパーT細胞の方へ移行させて、抗体がウイルスの拡散を封鎖するのを妨害してもよく、それによって、転移の阻止を支援する。抗原の共刺激性分子Ｂ７のようなトランスジーンを、細胞溶解性の免疫応答が最適となるように惹起することに活用してもよい。特定の実施態様において、相補的なベクターの１つ（すなわちコントロールドＡｄまたはサプリメンタルＡｄのいずれか）を形質導入した標的細胞は、相補的なベクターによる同時感染が起こるまで溶解されず、そしてこの細胞によって、免疫調節性の分子が発現し提示される。単一または相補的な自己複製可能なベクターによる感染と、治療用試薬として最高の可能性を持つ相補的なＡｄベクターとして確認されたものによる感染とを、免疫適格性のモデル細胞における安全性と有効性について比較することは重要である。
【００４６】
さらに、免疫調節性タンパク質をコード化している核酸を標的細胞内に導入した結果、いくつかの動物モデルにおいて、標的細胞に対して明らかに免疫応答が導かれた。たとえば、ＩＦＮ−γの免疫調節に関する多数の役割は十分に実証されており、そしてその役割には、クラスＩ  ＭＨＣ分子およびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子のアップレギュレーションにより抗原提示が強化されることも含まれる（たとえば、Ｂｏｅｈｍ，Ｕ．ら（１９９７）「インターフェロン−γに対する細胞性応答（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１５、ｐ７４９〜７９５を参照すること）。重要なことは、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現によって、二次的な処置の影響に対してヒトおよびその他の哺乳動物の標的細胞が感作したことが示されたことである（たとえば、Ｇｒｕｎｉｎｇｅｒ，Ｌ．ら（１９９９）「インターフェロンβまたはγによる、インビトロでの、電離放射線に対するヒトの子宮頸癌細胞への感作性の付与（Ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｏ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  β  ｏｒ  γ）」Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．１５２、ｐ４９３〜４９８；Ｊａｎｓｓｅｎｓ，Ｍ．Ｙ．ら（１９９８）「一酸化窒素が介在する低酸素ＥＭＴ−６腫瘍細胞の放射線増感における、誘導可能な一酸化窒素シンターゼの活性化（Ａｃｔｉｖａｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ＥＭＴ−６  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．５８、ｐ５６４６〜５６４８を参照すること）。
【００４７】
当業者は、抗原認識だけでは、エフェクター作用に対するＴ細胞の活性化には十分ではないという事実について、ますます認識を深めている。補助的分子のコライゲーション（ｃｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）などの「セカンドシグナル（ｓｅｃｏｎｄ  ｓｉｇｎａｌｓ）」もまた、Ｔ細胞が介在する免疫が生じるのに重要である（Ｍｏｎｄｉｎｏ，Ａ．およびＪｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．（１９９４）「Ｔ細胞の共刺激に関与する表面タンパク質（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．５５、ｎｏ．６、ｐ８０５〜８１５；Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．ら（１９９０）「Ｔ細胞活性化に関するＣＤ２８レセプターの役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ２８  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、ｖｏｌ．１１、ｎｏ．６、ｐ２１１〜２１６）。これらのセカンドシグナルが存在しない場合、抗原認識は、寛容または「アネルギー（ａｎｅｒｇｙ）」の原因となり得る。特に、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対するリガンドである、２つの共刺激分子、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）は、最近、Ｔ細胞作用についての強力な共刺激物質として、極めて多くの注目を集めている。Ｂ７．１（ＣＤ８０）共刺激分子には、Ｔ細胞抗原提示細胞の相互作用およびＴ細胞の効率的な応答の産生に関する、劇的な役割がある（たとえば、Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９６）「Ｔ細胞の共刺激のＣＤ２８／Ｂ７システム（ＣＤ２８／Ｂ７  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１４、ｐ２３３〜２５８を参照すること）。ヒトにおいては、ＣＤ８０は樹状細胞上で発現し、そして活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージ上に誘導される（Ａｚｕｍａ，Ｍ．ら（１９９３）「活性化Ｔリンパ球上でのＢ７／ＢＢ１の機能的発現（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ７／ＢＢ１  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、ｖｏｌ．１７７、ｐ８４５〜８５０；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら（１９８９）「活性化された、および新生物のＢ細胞上で独自に発現する性質を伴う、Ｉｇスーパーファミリーの新規メンバーである、Ｂ７（Ｂ７，ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｑｕｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１４３、ｐ２７１４〜２７２２）。ＣＤ８０のｍＲＮＡ発現についてのノーザン分析から、ほとんどの悪性腫瘍、Ｂ細胞が起源の白血病（非Ｔ細胞  ＡＬＬを含む）、前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病および慢性リンパ球性白血病では、ＣＤ８０陰性であったのに対して、いくつかの非ホジキンリンパ腫では陽性だったことが、明らかになった（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら（１９８９）上記）。これらの結果は、多数の標的細胞によるＣＤ８０の発現を欠くことは、それらの低い免疫原性に寄与しうることを示唆している。
【００４８】
ＩＦＮ−γおよびＣＤ８０を含むがこれらに限定されない免疫調節性のタンパク質をコード化している核酸を相補的なＡｄシステムの中に含め（すなわち相補的なＡｄの中に発現カセットを挿入することによって）、標的細胞に対する免疫応答（単数または複数）を誘導することは、好都合であろう。
【００４９】
相補的なＡｄシステムは、たとえば、コントロールドＡｄが、細胞特異的プロモーターの転写制御下におけるＥ１と、免疫調節性のタンパク質、たとえばＩＦＮ−γおよび／またはＣＤ８０をコード化している１以上のヌクレオチド配列とを含む場合、溶解すなわち細胞の破壊にとって有用である。相補的なＡｄを、機能せず実質的に能力がないパッケージング・シグナルか、または野生型パッケージング・シグナルのいずれかを有するサプリメンタルＡｄと組み合わせて投与することにより、直接的におよび免疫刺激を介して標的細胞の溶解を引き起こしうるシステムが提供される。重要なことは、この免疫刺激はまた、離れた標的細胞を溶解することにも提供されることである。従って、１つの実施態様において、相補的なＡｄシステムは、コントロールドＡｄベクター内に、細胞特異的もしくは組織特異的または非特異的Ｅ１発現カセット、免疫調節性エフェクター遺伝子の発現カセット、およびコントロールドＡｄによってコード化されていないＡｄタンパク質を補完するためのサプリメンタルＡｄベクターを組込むことによって、標的細胞を溶解するためのシステムとして完成させてもよい。
【００５０】
しかしながら、別の実施態様において、たとえば細胞周期を阻害するかまたはアポトーシスを引き起こすことによって細胞溶解を促進するような相補的ＡｄまたはサプリメンタルＡｄ内に、種々の遺伝子をコード化している核酸を組込むことは有用でありうる。相補的なＡｄシステムそれ自体を利用して、インビボで標的細胞の機能を修飾するか、または標的細胞の生長を制御してもよい。Ａｄベクターには、インビボで遺伝子治療を行うためのベクターを調製するのに有用な、高力価のものを産生しうるという点で、その他のウイルスベクター（すなわちレトロウイルス、ＨＳＶ）に勝る明確な長所がある。相補的なＡｄベクターは、局所投与後の、細胞特異的または組織特異的な増殖を一時的に抑圧することに有用でありうる。従って、相補的なＡｄシステムは、インビボで標的細胞の機能を修飾すること、または標的細胞の生長を制御することに有用でありうる。
【００５１】
相補的なＡｄシステムはまた、ベクターの表面を修飾することによって、トランスジーンをインビボで標的細胞または組織に選択的に送達することに有用でありうる。１つの実施態様において、サプリメンタルＡｄベクターがコード化しているキャプシドタンパク質（すなわちヘキソンとファイバー）を修飾して、標的細胞表面タンパク質に対する親和性を高めてもよく、それによって特定の標的細胞または組織の複製に対してターゲティングする。たとえば、ヘキソンまたはファイバーを操作して、特定のエピトープまたはリガンドと結合してもよい（すなわち、ＩｇＧ分子のＦｃ部位に結合するためのプロテインＡ）。修飾を受けたヘキソンおよびファイバー遺伝子それ自体は、ターゲティング物質として特定のリガンドと相互作用する表面部位を有する相補的なＡｄ調製品を作製するために、組換えウイルスのゲノム内に組込んでもよい。このようにして産生したウイルス粒子は、組織または細胞を認識する能力を提供することになるだろう（たとえば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．（１９９９）「送達を標的化するためにアデノウイルスベクターを適合させる計画（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ａｄａｐｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．；ｖｏｌ．８８６、ｐ１５８〜１７１を参照すること）。
【００５２】
別の実施態様において、直接的なインビボアプローチを経由する、Ａｄが介在するワクチン接種のために、相補的なＡｄシステムを用いてもよい。ワクチン接種の目的のために、Ｅ１が置換されたＡｄベクターの免疫原性が有益なものとなるだろう。そして、Ａｄに基づく組換えワクチンの開発において、このことを巧みに利用してきた。このタイプの応用のためのコントロールドＡｄベクターの貢献は、ヘルパーウイルスとしてのＥ１置換Ａｄベクターを用いて、そして抗原と免疫を増強するタンパク質とをコード化している遺伝子を同時送達（ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）することによって、実現されるであろう。上記のように、誘導性プロモーターなどの特別なプロモーター／エンハンサーを用いてＥ１の発現を制御するために、Ｅ１発現カセットを設計することが可能である。
【００５３】
相補的なＡｄシステムはその他の遺伝子導入および／または遺伝子治療の方法と組み合わせて用いてもよいということに、言及することは重要である。従来型のＡｄベクターは、遺伝子送達用複合体としてのポリリジン、リポソームおよびその他の複合化用材料と組合わせて用いてきた。相補的なＡｄベクターはまた、これらのタイプの組合わせにおいて用いてもよい。このような多数の組み合わせは当業者に知られており、そして本発明に応用できるだろう。
【００５４】
従って、相補的なＡｄシステムは、次の１以上の免疫調節遺伝子をコード化している核酸を送達するために利用してもよい（たとえば、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７またはＩＬ−１８など）、インターフェロン（たとえばＩＦＮ−α、−β、−γ）、共刺激分子（たとえばＢ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２）、ケモカイン（ＣＣＲ５）、自殺遺伝子（たとえばＨＳＶ−ＴＫ、ＣＤＡなど）；細胞周期遺伝子（たとえば、ｐ１６、ｐ１５、ＷＡＦ１／ＣＩＰ１／ｐ２１、ｐ２７、毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴＭ）、ｐ５３、ＧＡＤＤ４５、ｐ５７／Ｋｉｐ２、Ｒｂ、ｐ１０７、ｐ１３０、ＴＯＲファミリーのメンバー、ユビキチン、ＩｋＢなどの、細胞周期の進行に影響を及ぼす遺伝子）；細胞の分化遺伝子（たとえば細胞の分化を誘導するか阻害する遺伝子）；ＤＮＡ合成遺伝子（たとえば、細胞によるＤＮＡの合成に関与する遺伝子）、ＤＮＡ修復遺伝子（たとえば、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＰＣＮＡなどの、細胞内でＤＮＡ修復経路に関連する遺伝子）；抗増殖性遺伝子；腫瘍サプレッサー遺伝子（たとえば、ｐ５３、Ｒｂ、ＰＴＰａｓｅ）；血管形成を阻害する血管形成遺伝子（たとえば、エンドスタチン、アンギオスタチン、プロテアーゼ（ＭＭＰ−２など）、腫瘍サプレッサー遺伝子／アポトーシス誘導遺伝子（たとえばｐ５３）などの、抗血管形成遺伝子）；増殖因子遺伝子（たとえばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ）、アポトーシス遺伝子（たとえばＩＣＥファミリーのメンバー、毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴＭ）、ｃ−ｍｙｃ、ｆａｓ、ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リーパー遺伝子、ｈｉｄ遺伝子、ｐ５３、ｂａｘ、ｂａｄ、ｂａｋ、ｎｂｋ、ｂｃｌ−Ｘｓ、ＩＣＥｒｄＩＩＩ、ＭＣＨ−２、ＣＰＰ３２、ＩＣＨ−ＩＬ、Ｎｅｄｄ２、ＴＸ、ＩＣＥｒｅＩＩＩ、ＩＣＨ−２、ＩＣＥ、ラミン、ＰＡＲＰ、ＪＧＩＰ、ｃ−ｊｕｎ）；ならびに腫瘍抗原（たとえば、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、ＣＤ８０、ＣＤ８６）が挙げられるが、これらに限定されない。上記に列挙した核酸のそれぞれのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびにその他の適切な多数の配列は、当該技術分野において知られており、そして当業者が広く利用することができる（たとえばＧｅｎＢａｎｋ）。これらの配列を用い、本明細書で提供される試薬および方法を用いた、相補的なＡｄ（たとえばコントロールドＡｄまたはサプリメンタルＡｄ）の構築物を作製する方法は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【００５５】
相補的なＡｄシステムによって、配列特異的リボザイム、配列特異的ＲＮａｓｅ  Ｐまたはアンチセンス構築物を規定しているヌクレオチド配列を供給してもよい。適切なエフェクター配列は、タンパク質をコード化している標的配列またはタンパク質そのものの発現または機能を阻害するだろう。ここで、このようなタンパク質の発現または機能によって、患者または対象における免疫応答の惹起に有害な影響が生じる（たとえばＴＮＦベータ（ＴＮＦβ）、その他の免疫応答性タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない）。本明細書で記載された標的のそれぞれのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびにその他の多数の適切な標的配列は、当該技術分野において知られており、当業者が広く利用することができる。リボザイムの作製方法（Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｈ．ら（２０００）「アデノウイルスがコード化する、Ｂｃｌ−２に対するハンマーヘッド型リボザイムは、新生内膜過形成を阻害し、血管平滑筋細胞をアポトーシスに誘導する。」Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．４５、ｎｏ．３、ｐ５７０〜５７８）、Ｒｎａｓｅ  Ｐ分子（Ｃｏｂａｌｅｄａ，Ｃ．およびＳａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｃｉａ，Ｉ．（２０００）「ＢＣＲ−ＡＢＬオンコジーン産物に対して設計されたＲＮａｓｅ  Ｐの部位特異的な触媒性ＲＮＡサブユニットによるインビボ阻害：癌の治療のための新規アプローチ」Ｂｌｏｏｄ、ｖｏｌ．９５、ｎｏ．３、ｐ７３１〜７３７）、ならびにアンチセンス構築物（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｈ．ら（２０００）「アンチセンスｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子のオリゴデオキシヌクレオチドをラットの頸動脈に形質導入した結果、血管平滑筋細胞の生長が不正常となる。」）はまた、広く利用することができ、そして十分に当業者の能力の範囲内である（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、ｖｏｌ．１０１、ｎｏ．１２、ｐ１４４７〜５２）。
【００５６】
２．サプリメンタルＡｄベクター
ａ．サプリメンタルＡｄの基本構造：最も基本的な形態において、サプリメンタルＡｄベクターは、コントロールドＡｄベクターの複製に必要なタンパク質を供給し、ここでコントロールドＡｄベクターは、Ａｄの構造タンパク質とその他の複製に必要なタンパク質とをコード化しているＤＮＡを欠いている。野生型または操作を受けたパッケージング・シグナルのいずれかを有するサプリメンタルＡｄベクターを利用することができる。１つの実施態様において、サプリメンタルＡｄベクターには、２つの主たる構造上の特徴がある：すなわち、一部が野生型のＡｄゲノムと操作されたパッケージング・シグナルである。さらに、サプリメンタルＡｄは複製に欠陥があるものが好ましく、たとえばＥ１の欠失または置換によるものである。コントロールドＡｄベクターの存在下においてサプリメンタルＡｄのパッケージングを制限する目的で、このサプリメンタルとしては、パッケージングが減弱化されたものが好ましい。次いで、１つの実施態様において、サプリメンタルＡｄの一般的な構造は、改変されたＥ１領域とパッケージング・シグナル以外の野生型Ａｄゲノムを含むＡｄベクターとして、要約してもよい。しかしながら、Ｅ２およびＥ４などのＡｄのその他の不可欠な調節遺伝子を、これらの配列を改変または置換することによって、操作することもまた可能である。ウイルスゲノムはまた、断片化されていてもよく、そして、別々のサプリメンタルＡｄベクター内に組込まれて、サプリメンタルＡｄの自己複製の可能性をさらに阻害したり、またはサプリメンタルＡｄゲノムのサイズを小さくしてもよい。これらの操作によって、ストック試薬の調製中に、サプリメンタルＡｄの力価を有意に変化させないことが重要である。ただし、ベクターを設計する際に、サプリメンタルＡｄの複製と、サプリメンタルＡｄパッケージングの減弱化との両方に影響を与える修飾について熟考すべきである。
【００５７】
ｂ．サプリメンタルＡｄの機能：サプリメンタルＡｄの主要な機能は、コントロールドＡｄベクターのパッケージングのためのキャプシドを供給することと、ウイルスの増殖を介して標的細胞を溶解させることである。コントロールドＡｄによって供給されるＥ１の発現を作動させる標的細胞によるプロモーターの活性化に依存するにもかかわらず、この機能を実行するためには、サプリメンタルＡｄは、自己を複製することが可能でなければならない。サプリメンタルＡｄのゲノムのＤＮＡ複製および転写は、コントロールドＡｄベクターの力価が高く維持できるような、機能的な量の後期遺伝子産物（キャプシドタンパク質）を産生するのに、十分であることが好ましい。
【００５８】
野生型またはわずかに減弱化されただけのパッケージング・シグナルを有するサプリメンタルＡｄベクターを利用することも可能である。コントロールドＡｄから発現するものに加えて、サプリメンタルＡｄそれ自体は、エフェクター遺伝子の同時発現にとってさらに有用なものになるだろう。たとえば、コントロールドＡｄベクターが、最大限の収容能力に近くなるように、いくつかのエフェクタータンパク質に加えてＥ１をコード化しているＤＮＡを含む場合、適度に無能力化されただけのパッケージング・シグナルを有するサプリメンタルＡｄを利用することは好都合となろう。このようにして、相補的なＡｄとサプリメンタルＡｄとの力価を併合したものは十分であり、そしてこのシステムは、エフェクタータンパク質が機能する量を発現させるためのさらに高い能力を有する。
【００５９】
ｃ．パッケージングの減弱化の設計：サプリメンタルＡｄのパッケージングを減弱化する１つの目的は、コントロールドＡｄベクターと比べてサプリメンタルＡｄが過剰に増殖する可能性を小さくすることである。特定の応用面のために、比較的高い力価のコントロールドＡｄベクターが必要となる場合に、このことは重要である。サプリメンタルＡｄのパッケージング機能は、不完全であるが完全には無能力化されないように設計される。というのは、サプリメンタルＡｄがコントロールドＡｄベクターと一緒に維持されることが好ましく、その結果、相補的なＡｄベクターシステムが形成されるからである。下記のように、サプリメンタルＡｄのパッケージングの減弱化を結果的にもたらすであろういくつかの設計の可能性がある：
【００６０】
１．パッケージング・シグナルの変異：Ａｄ５パッケージング・シグナルは、機能的に余分な反復エレメントから構成される（Ｈｅａｒｉｎｇら（１９８７）「アデノウイルス５型のゲノムの効率的なキャプシド形成に必要な反復配列エレメントの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５  ｇｅｎｏｍｅ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．６７１、ｐ２５５５〜２５５８）。パッケージング・シグナルエレメントを部分的に削除することで、野生型パッケージング・シグナルを持つＡｄの収量と比べて、変異を受けたＡｄの収量は数倍から約１００倍低下することが示されている（Ｇｒａｂｌｅ，Ｍ．およびＨｅａｒｉｎｇ，Ｐ．（１９９２）「アデノウイルス５型のＤＮＡの選択的なパッケージングのための、シスおよびトランスの要件（ｃｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５  ＤＮＡ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．６、ｐ７２３〜７３１）。次いで、１つの実施態様においては、野生型Ａｄパッケージング・シグナルの１以上のＡ−リピートにおいて、パッケージング・シグナルを部分的に削除する。
【００６１】
２．パッケージング・シグナルの合成：上記のように、Ａｄ５パッケージング・シグナルにはＡ（アデノシン）に富むコンセンサスモチーフ（たとえば、Ａ−リピート：ＴＡＡＡＴＴＴＧ）がある。したがって、選択されたＡ−リピートの縦列反復のアレイ、またはその他の任意の合成ＤＮＡモチーフのアレイを組込むことによって、人工のパッケージング・シグナルのパッケージングタンパク質への親和性、そしてその結果としてのサプリメンタルＡｄのパッケージングを変化させることができる。
【００６２】
３．パッケージング・シグナルの干渉：パッケージング・シグナルに干渉するためのメカニズムを設計することもできる。パッケージングタンパク質がシグナルに効果的に結合することに干渉するために、ＤＮＡ結合配列は、サプリメンタルＡｄのパッケージング・シグナルのＡ−リピートアレイ内またはアレイ近傍に組込むことができる。挿入された結合部位によって、それぞれのＤＮＡ結合タンパク質による高い親和性結合が提供され、その結果、Ａｄパッケージングタンパク質のＡｄパッケージング・シグナルへの位置的な競争がもたらされる。特定の実施態様において、機能を低下させるために修飾を受けたパッケージング・シグナル構造内に、結合部位を組込んでもよい。
【００６３】
４．パッケージング・シグナルの再配置：その自然な配向においては、Ａｄパッケージング・シグナルは、野生型Ａｄゲノムの左端に位置している。パッケージング・シグナルは右端に位置してもよく、それでも機能を維持していることが報告されている。パッケージング・シグナルそのものは再配置可能である。次いで、１つの実施態様において、操作を受けたパッケージング・シグナルを非野生型の位置に挿入してもよく、サプリメンタルＡｄのパッケージングの効率がさらに減弱化する。このことは、サプリメンタルＡｄの操作されたパッケージング・シグナルと、コントロールドＡｄベクターの野生型パッケージング・シグナルとの間の相同組換えによって、サプリメンタルＡｄの、野生型Ａｄへの復帰突然変異を最小限にするのに、役立つであろう。
【００６４】
従って、サプリメンタルＡｄのパッケージングを減弱化する際には、少なくとも２つの基本的な側面：シスエレメントおよびトランス作用因子を検討してもよい。有用な設計それ自体が、これらの２つの基本的な側面またはこれらの２つの配置のいくつかの組合わせの影響を小さくしうる。パッケージング・シグナルのシスエレメントはＡ−リピートであり、そしてトランス作用因子はパッケージングタンパク質であると考えられている。当業者であれば、その他の多数の方法が、サプリメンタルＡｄのパッケージング・シグナルを無力化するのに適していること、そしてこのような方法が本発明の一部として検討されていることを理解するだろう。
【００６５】
ｄ．野生型パッケージング・シグナルを有するサプリメンタルＡｄベクター：上記のように、少し無能力化しただけのパッケージング・シグナルをサプリメンタルＡｄに組込むことが好ましいだろう。別の実施態様において、サプリメンタルＡｄベクターは、野生型パッケージング・シグナルを含んでもよい。このプロセスの最終結果は、腫瘍細胞に対する相補的なベクターの相対的な増殖速度に依存する。サプリメンタルＡｄベクターの増殖速度は、感染細胞あたりのウイルス産生数によって制限されており、そしてサプリメンタルベクター内で野生型パッケージング・シグナルを用いて、増殖速度を上昇させることができるであろう。複製能を持たないミニＡｄベクターシステムとは対照的に、このシステムにおいて、コントロールドベクターとサプリメンタルベクターとの両方について野生型パッケージング・シグナルを用いることは都合がよい。というのは、サプリメンタルベクターの増殖はコントロールドＡｄベクターに依存し、逆も同様だからである。野生型パッケージング・シグナルを用いることは、相補的なベクターの増殖効率を高めるはずであり、そしてそれ故に、相補的なＡｄシステムを用いる治療の有効性も高まるはずである。
【００６６】
３．コントロールドＡｄベクター
最も基本的な実施態様において、コントロールドＡｄベクターを利用して、相補的なＡｄベクターの発現を制限するエフェクター遺伝子（たとえばＥ１が挙げられるが、これには限定されない）を細胞に送達する。ここで、この細胞は、コントロールドＡｄに保持されたエフェクター遺伝子のコード配列を発現させることができる細胞である。たとえば、コントロールドＡｄは、Ｅ１のコード配列と作動可能に連結した、全身に遍在する「ハウスキーピング」プロモーターまたは細胞特異的もしくは組織特異的なプロモーターなどの、組織特異的プロモーターを含む構築物を提供しうる。次いで、全身に遍在する「ハウスキーピング」プロモーターまたは細胞特異的もしくは組織特異的なプロモーターを利用する能力を持つ細胞の中で、Ｅ１のみが発現するだろう。サプリメンタルＡｄは、複製に関してＥ１に依存し、従って、Ｅ１を提供するための相補的なＡｄに依存する。サプリメンタルＡｄは、Ｅ１の不存在下では複製せず、そして相補的なＡｄは、サプリメンタルＡｄベクターによってのみ発現されるタンパク質の不存在下では複製しないだろう。従って、ＡＦＰプロモーターを利用する能力を有する細胞内でのみ、複製が起こるだろう。さらに、コントロールドＡｄは、エフェクタータンパク質をコード化するＤＮＡを含む。
【００６７】
ａ．コントロールドＡｄベクターの基本構造：Ａｄベクターは通常、ＩＴＲの融合を介する環状化プラスミドの形態で利用される（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．（１９８４）「ヒトアデノウイルスＤＮＡの共有結合による閉環（Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｌｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ）」ＥＭＢＯ  Ｊ．、ｖｏｌ．３、ｐ２９１７〜２９２２）。Ａｄベクターはまた、直鎖状ＤＮＡとして利用してもよい。コントロールドＡｄベクターの基本的な形態は環状ＤＮＡであり、このものは、ＩＴＲ融合、プラスミドＤＮＡ複製起点、Ａｄ  Ｅ１遺伝子、および１以上のポリクローニング部位を含む。ＩＴＲ融合としては、マップユニット０〜１からの野生型Ａｄの左端と、マップユニット９９〜１００からの右端を含むものが好ましく、この中で、ＡｄのＤＮＡ複製起点は、ＩＴＲと、左のＩＴＲに隣接した野生型パッケージング・シグナルとの両方に位置している。しかしながら、多数のＩＴＲ構造は、本発明の実施に適しており、本明細書で検討される。少なくとも２つの基本的な機構：プロモーターの置換と機能的欠失によって、コントロールドＡｄベクターを制御してもよい。
【００６８】
天然型または修飾型のいずれかのＡｄ  Ｅ１領域の遺伝子は、プロモーター配列を含む発現カセットの範囲内のコントロールドＡｄ内に組込む。１つの実施態様において、プロモーターは、細胞特異的でも、組織特異的でも、腫瘍活性化型でもよく、またはＥ１遺伝子の発現を制御するために特定の細胞において活性化するその他の型でもよい。あるいは、プロモーターは、多くの細胞および／または組織のタイプにおいて活性を示す、全身に遍在する「ハウスキーピング」遺伝子のプロモーターであってもよい。また、プロモーターはアデノウイルスのプロモーターであってもよい。
【００６９】
ｂ．コントロールドＡｄベクターの構造的および機能的可能性：コントロールドＡｄベクターの構造を改変することもまた、可能である。追加的なＤＮＡ配列およびエレメントを、下記のように改変したり誘導したりしてもよい：
【００７０】
１．トランスジーンの発現カセット：当該技術分野において理解されているように、発現カセットは基本的な転写単位である。基本的な発現カセットとしては、プロモーター、対象遺伝子およびポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルを含む、直鎖状ＤＮＡ構造が典型的である。発現カセットは、バイシストロン構造またはポリシストロン構造として配置される２以上の対象遺伝子を含んでもよく、ＲＮＡの翻訳またはスプライシングのために与えられた追加的なエレメントを、これらの遺伝子の間に設ける。たとえば、複合的な発現カセットは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）構築物（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ，Ｅ．（１９９９）「配列内リボソーム進入部位の生物学と発現ベクターにおけるその使用（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、ｖｏｌ．１０、ｎｏ．５、ｐ４５８〜４６４）を用いて、連結してもよい。一般的に、コントロールドＡｄベクターは、１つまたは多数のトランスジーン発現カセットを含んでもよい。上記のように、本発明を実施するためには、広範囲の遺伝子配列が有用であろう。このような遺伝子配列を、発現カセットの一部としての相補的Ａｄベクター内に組込んでもよく、したがって、相補的Ａｄベクターシステムのベクターが感染した後、細胞内で発現が生じる。
【００７１】
２．ベクターＤＮＡを保持するための機能性エレメント：たとえばアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復（ＡＡＶ−ＩＴＲ）などの、発現カセットを標的細胞のゲノム内に組込むのを助けるエレメントや、発現カセットを宿主細胞ゲノム内に組換えるのを促進するＤＮＡの相同領域を含めることも、可能である。複製起点などの標的細胞中のエピソーム形態としてコントロールドＡｄベクターを保持するエレメントも、さらに含まれる可能性がある。
【００７２】
３．ＤＮＡの転写を制御するための調節エレメント：エンハンサー、リプレッサーまたはアクチベーター結合部位、イントロン、５’または３’−非翻訳領域（たとえば構成的プロモーター）などの転写制御機能を有するＤＮＡエレメントはまた、相補的なＡｄベクター内に組込んでもよい。調節エレメントは、多数のタイプの細胞内での発現を作動させてもよく、または特定のタイプの細胞に発現を制限してもよい（すなわち細胞特異的または組織特異的なプロモーター）。弱いプロモーター、サイレンサーなどの種々の調節エレメントを利用して、特定のタイプの細胞中の発現を制御してもよい。
【００７３】
調節エレメントはまた、転写に干渉するリガンドと結合する能力を持つＤＮＡ配列が存在することによって、たとえばコントロールドＡｄベクターからのＥ１の発現を制限してもよい。多量のＥ１が発現することは、特定の宿主細胞にとって有毒となる可能性がある；細胞内で発現するＥ１の量を制御する方法が望まれる。さらに、このようなシステムは、インビボでのＡｄ粒子の拡散を制限することにとって、有用となるだろう。
【００７４】
たとえば、ＣＭＶプロモーターを操作して、生産株内で発現されるｔｅｔＲ／ＫＲＡＢタンパク質が結合しうる、ｔｅｔＯ配列を含むようにしてもよい。テトラサイクリンはｔｅｔＲ／ＫＲＡＢに結合する。従って、細胞培養物にテトラサイクリンを添加すると、結果的に不活性のｔｅｔＲ／ＫＲＡＢタンパク質が生じ、そしてＣＭＶプロモーターからの転写が生じるだろう。細胞培養物からテトラサイクリンを取り除くと、結果的に、フリーのｔｅｔＲ／ＫＲＡＢが生じ、このものは、プロモーター中のｔｅｔＯ配列と結合し、転写が阻害される。従って、コントロールドＡｄのコード配列の発現を、「テトラサイクリンリバースト抑制システム（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）」を用いて制御してもよい。
【００７５】
テトラサイクリンリバースト抑制システムにおいて用いるためのコントロールドＡｄ構築物の例には、Ａｄ  ５’ＩＴＲ／パッケージング・シグナル、スタッファーＤＮＡ、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂコード配列に作動可能に連結した反復数が１−１０の、好ましくは７のｔｅｔＯ配列を含有するｔｅｔＯ／ＣＭＶプロモーター、原核生物の宿主細胞中でのプラスミドの増殖に対応した抗生物質選択マーカー、および発現カセットが含まれてもよい。このような発現カセットの一例には、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの転写制御下にあるヒトＩＬ−３が含まれる。ｔｅｔＲ／ＫＲＡＢを構成的に発現する生産株を用いて、このベクターの増殖が成し遂げられるだろう。ここで、ｔｅｔＲ／ＫＲＡＢは、ｔｅｔＯ／ＣＭＶプロモーターと結合し、そしてＥ１ａ／Ｅ１ｂの転写物の転写を抑制する。テトラサイクリンの添加によって、ＴｅｔＲ／ＫＲＡＢがｔｅｔＯＣＭＶプロモーターに結合することが抑制され、そしてｔｅｔＯ／ＣＭＶプロモーターの転写制御下の配列が発現する。
【００７６】
４．ベクターおよびトランスジーンのターゲティングのためのエレメント：少なくとも２つの段階：ベクター表面の修飾と組織特異的発現において、ターゲティングを達成することができる。組織特異的プロモーターを利用して、インビボでの送達のために標的化した細胞以外の、あらゆるタイプの細胞中での発現を避けることができる。
【００７７】
５．その他のエレメント：さらなるエレメントには、原核生物または真核生物の細胞のＤＮＡ複製起点、プラスミドまたはベクターの選択マーカー、およびベクターのバックボーンなどが含まれてもよい。また、本明細書では、１以上の免疫に影響を与える非哺乳動物の核酸配列の組込みを検討している（たとえばＣｐＧ島などが挙げられるが、これに限定されない）。
【００７８】
ｃ．コントロールドＡｄベクターを高力価で産生するための設計：本発明によって、コントロールドＡｄベクターを高力価で産生することを検討する。従来のベクターに勝る相補的なＡｄベクターシステムの長所には、高力価の調製品を得る能力が含まれる。このことは、主に、サプリメンタルＡｄによって供給される多量のウイルスのキャプシドタンパク質と、コントロールドＡｄウイルスゲノムの高コピー数とに起因する。次に、高力価のコントロールドＡｄベクターの作製方法の例を提供する：
【００７９】
１．強化されたＤＮＡ複製：Ａｄには、ＤＮＡ複製のための独自の酵素系がある。Ｅ２領域のタンパク質は、ウイルスのＤＮＡ複製を担い、トランスに作用する主要なエレメントである。複製起点は、ウイルスゲノムの両端に位置するシスエレメントである。コントロールドＡｄゲノムの複製を強化するために、サプリメンタルウイルスから発現する十分な量のＥ２タンパク質を与えることが好ましい。サプリメンタルウイルスにだけでなく、コントロールドＡｄゲノムの範囲内にＥ２遺伝子を盛り込むことによって、Ｅ２領域のタンパク質を高レベルで発現することを実現させてもよい。コントロールドＡｄゲノムのコピー数を増加させるためのその他のメカニズムは、当業者であれば理解できるだろうし、以下のものを含めてもよい：
【００８０】
２．強化されたパッケージング・シグナル：追加のまたは強化されたパッケージング配列を利用して、一端または両端に縦列反復をさらに追加するか、または合成パッケージング・シグナルを作製することによって、パッケージングを強化してもよい。
【００８１】
３．強化されたパッケージング工程：Ａｄのパッケージングプロセスは、今のところ完全には理解されてはいない。Ａｄのパッケージング・シグナル以外の部位においてＤＮＡに結合するタンパク質が、パッケージングに関して相乗的な役割を演じるかどうかについては、今のところはっきりしない。もしそうであるなら、Ａｄゲノム内に自然に存在する、パッケージングのアンカー部分（ａｎｃｈｏｒａｇｅ  ｐｏｉｎｔｓ）と称される、ＤＮＡ結合タンパク質に対する配列は、コントロールドＡｄゲノムに戻す必要があるかもしれない。
【００８２】
さらに、コントロールドＡｄとサプリメンタルＡｄはまた、細胞内で発現するエフェクタータンパク質をコード化しているＤＮＡを含んでもよく、ここで、細胞でのウイルスの複製は、コントロールドＡｄベクターとサプリメンタルＡｄベクターとによる細胞の同時感染に起因するものである。コントロールドＡｄまたはサプリメンタルＡｄにより別々に細胞が感染した場合、それでも結果的に、コード化された抗原が細胞内で発現し、そして発現した抗原タンパク質に対する免疫を誘導する一因となる。要するに、デュアルベクターワクチンシステムには、コード化された抗原に対する免疫応答の惹起に関していくつかの都合のよい特徴がある。
【００８３】
第１に、このようなシステムは、標準的なアデノウイルスベクターシステムの能力を超える多数の抗原および免疫調節性のタンパク質の発現に対応する大変大きな能力を持っている。感染性病原体に対してより適切な保護または治療を行うために、あるいは多数の抗原性の標的を含有する腫瘍細胞を破壊するために多数の抗原に対する免疫応答が望まれているような、種々の臨床状況において免疫応答を高めるためには、多数の抗原および免疫調節遺伝子の発現が望ましい。
【００８４】
第２に、ベクターシステムには複製する能力があり、そして「生きている（ｌｉｖｅ）」複製能を有するワクチンは、複製能を有しないワクチンよりも典型的にはより有効であることが、一般的に理解されている。この有益な効果は、自己複製するベクターによって供給される抗原の発現量の増幅に部分的に起因すると思われる。複製能を調整して、所望の程度に複製を弱めてもよい。
【００８５】
第３に、それぞれのベクターは、抗原を発現する別個のアデノウイルスベクターとして機能してもよく、ここで、この抗原は、抗原の追加的な供給源を提供するものであり、それによって免疫応答が誘導される。ベクターのうちの１つだけが感染した細胞によって、数日から数週間の間に亘って抗原が発現し、免疫がさらに発達する。
【００８６】
１）大きな遺伝子の送達および発現能力；２）自己複製可能なベクターによる抗原／免疫調節遺伝子の発現、および３）複製能力がないベクターによる抗原／免疫調節遺伝子の発現、という特徴の組合わせの、すべてが一体に組込まれたワクチン接種システムは、自己複製可能なシングルシステムおよび自己複製不可能なシングルシステムの能力を超えている。さらに、デュアルＡｄベクターはその複製に必要な遺伝子のすべてを含んでいるので、ベクターを産生させるためのアデノウイルス遺伝子を含む産生株の遺伝子操作を行う必要がなく、そして、ワクチン生産の目的に適う安全な歴史を持ち、十分に特徴解析されているワクチン生産を含むがこれらに限定されない、ワクチンの生産が許容された細胞株内（具体的には、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ５細胞、ＶＥＲＯ細胞、胎児性細胞および細胞株などが挙げられるが、これらに限定されない）では、生産のためにデュアルＡｄベクターを容易に適応させることができる。さらに、デュアルａｄベクターシステムは、高効率の遺伝子導入と発現、感染可能なヒト細胞のタイプの宿主範囲の広さ、経口、経鼻、粘膜、皮内、筋内、腹腔内および全身投与に適した製剤化の容易さを含むがこれらには限定されない、標準的なアデノウイルスベクターの好都合な特徴もなお保持している。
【００８７】
その他の多数のウイルスおよび非ウイルスのベクターシステムと同様の構築物を含む、その他の実施態様が有用であることにも、注目すべきである。一般的に、ベクターは相補的となり、そして１以上の構成成分ベクターの複製に必要な遺伝子の完全な必要量を、互いに含むようになる。１以上のベクターの増幅に必要な完全な遺伝子の機能を互いに提供し合う限り、補完を行うベクターは同一のタイプでも異なるタイプでもよい。サプリメンタルベクターによって補完されるベクターの削除された領域は置換されて、種々の医療目的に応じた発現カセットを送達するものとなっていてもよい。
【００８８】
４．Ａｄヘルパー細胞株
コントロールドＡｄおよびサプリメンタルベクターは、任意の適切な細胞株中で増殖させてもよい。Ａｄヘルパー細胞株を用いて、相補的なＡｄベクターを効率よく産生させる。サプリメンタルベクターは、Ａ５４９細胞、ＶＩＲＯ細胞などを含むがこれらには限定されない、アデノウイルスの産生のための標準的な細胞株で増殖する。あるいは、細胞は、Ｅ１を発現しないタイプのものでもよい。相補的なＡｄベクターは、ヘルパー細胞株中で産生してもよい。上記の関連出願の欄にて言及された、公開された出願においても、適切な細胞株が記載されている。
【００８９】
ヘルパー細胞株は、コントロールドＡｄのＡｄＥ１遺伝子の転写をトランス活性化させてもよく、その結果、サプリメンタルＡｄゲノムの転写と複製が活性化する。１つの実施態様において、ヘルパー細胞は、サプリメンタルＡｄゲノムと重複する配列がないコントロールドＡｄゲノムの範囲内にＥ１断片が保持されているという点で、２９３細胞とは異なっている。適切に機能するための相補的なＡｄシステムについてのコントロールドＡｄ内に、ＡｄＥ１遺伝子を制御するプロモーターを活性化する能力を持つヘルパー細胞が好ましいだろう。たとえば、Ｅ１がＰＳＡプロモーターの転写調節下にある場合、産生に用いられる細胞株は、ＰＳＡを産生し腫瘍細胞崩壊性のアデノウイルスの産生を支持する細胞株である、ＬＮＣａＰでもよい。ヘルパー細胞はまた、コントロールドＡｄベクターの高コピー数の産生を支持し、コントロールドＡｄベクターのパッケージングを促進し、そしてサプリメンタルＡｄのパッケージングを減弱化させる、遺伝子を封入することによって修飾してもよい。たとえば、上記のように、細胞株を操作してｔｅｔＲ／ＫＲＡＢ、またはプロモーター構築物からの転写に干渉する能力を持つその他のタンパク質を発現させてもよい。当業者であれば、当該技術分野において標準的な技術を用いて、その他の適切なヘルパー細胞株を構築してもよいことを理解するであろう。
【００９０】
細胞株は、外来性の物質、マイコプラズマおよびその他のウイルス性のもしくは感染性の汚染物質の存在の可能性を排除するように、特徴づけられるのが好ましい。血清フリーかつ抗生物質フリーな培地を用いて、細胞銀行が行われることが好ましい。細胞は、懸濁培養（スピナーフラスコまたは懸濁用のバイオリアクター）または粘着細胞として大容量のバイオリアクター（たとえばＧＭＰ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ社のＣｅｌｌＣｕｂｅシステム）のいずれかで、十分な量にまで増殖する。主たる細胞銀行を作製し、そして作業用の細胞銀行はそこから派生させてもよい。次いで、作業法の銀行からの細胞内で増殖したウイルスから、主たるウイルス銀行が作られてもよい。
【００９１】
ウイルスの産生方法は、粘着細胞または非粘着細胞のいずれの培養が用いられるかに依存する。培養のタイプは、得ることのできる（バーストサイズ）ウイルスの産生量に依存するだろう。好ましい実施態様において、大規模生産のために、通常の懸濁用のバイオリアクターを利用する。
【００９２】
ウイルスの調製品もまた、ＩＬ−３の発現について、および抗原と、特定のレポーター遺伝子またはエフェクター遺伝子の発現を検出するのに適切なインビトロでの機能アッセイとによって求められる比活性について、試験すべきである。アッセイはまた、特定の調製品において、自己複製可能なアデノウイルス（ＲＣＡ）の量を測定するために実施してもよい。調製品中ではＲＣＡが全く検出されないことが好ましい。ウイルスはまた、ゲノムの完全性について、試験してもよい。臨床応用のために、動物モデルシステムを用いて、それぞれのロットについて有効性および毒性の研究がなされるべきである。たとえば、臨床試験のために指定された製剤に関して、安定性の試験もまた実施すべきである。
【００９３】
次の実施例は例証のみを目的とするものであり、いかなる方法によっても本発明を制限する意図もなく、解釈すべきでもない。当業者であれば、権利を主張する発明の精神または範囲に背くことなく変形および修飾を行うことができることを、認識できるだろう。
【００９４】
実施例
実施例１  ワクチンおよび免疫療法に応用するための、Ｅ１以外を削除した自己複製可能なアデノウイルスベクター
ここでは、当該技術分野において知られた技術を用いて構築されたアデノウイルスベクター、ならびに、Ｅ１遺伝子における機能の欠失以外にアデノウイルスゲノムにおける１以上の欠失を伴って導かれたアデノウイルス粒子について検討する。このような欠失が、ウイルスが複製する能力またはウイルスが子孫を形成する能力に著しい影響を与えることはないだろう。
【００９５】
一例は、Ｅ３遺伝子の部分的なまたは完全な欠失だろう。Ｅ３は、免疫システムへの抗原提示の重要な部分、すなわちＭＨＣクラスＩの発現を抑える（Ｂｕｒｇｅｒｔ，Ｈ．Ｇ．およびＢｌｕｓｃｈ，Ｊ．Ｈ．（２０００）「アデノウイルスのＥ３転写単位によってコード化された免疫調節機能（Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅ３  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）」Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、ｖｏｌ．２１、ｎｏ．１〜２、ｐ１３〜２５；Ｓｐａｒｅｒ，Ｔ．Ｅ．およびＧｏｏｄｉｎｇ，Ｌ．Ｒ．（１９９８）「ヒトアデノウイルスによるＭＨＣクラスＩ抗原提示の抑制（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）」Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．２３２、ｐ１３５〜１４７）。機能性Ｅ３の欠失によって、アデノウイルスのゲノム内に挿入された免疫原（単数または複数）（すなわち抗原（単数または複数））の免疫認識がより向上するであろう。このような挿入は、Ｅ３の欠失部位でなされてもよい。Ｅ３遺伝子の完全な欠失によって、その中に非相同のＤＮＡ配列（単数または複数）が挿入される、概算で２ｋｂのスペースが生じるであろう。
【００９６】
別の例は、Ｅ４遺伝子の完全なまたは部分的な欠失だろう。Ｅ４の欠失が、ウイルスが複製する能力またはウイルスが子孫を形成する能力に影響を与えることはないだろう。そしてこの欠失によって、Ｅ４について報告された発癌の潜在能力（Ｎｅｖｅｌｓ，Ｍ．ら（２０００）「２つの異なる活性がアデノウイルス５型のＥ４タンパク質またはｆ６タンパク質の発癌の潜在能力に寄与する」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．７４、ｎｏ．１１、ｐ５１６８〜５１８１）が、完全にまたは部分的に無力化されうる。Ｅ４領域の完全な欠失によって、その中で非相同のＤＮＡ配列（単数または複数）が挿入される、約２ｋｂのスペースが生じるであろう。
【００９７】
その他の潜在的な標的が存在し、そして同様に活用されるだろう。
【００９８】
実施例２  非相同のＤＮＡ配列を含む野生型アデノウイルス
自己複製可能なアデノウイルスベクターを産生するための別の可能性は、非相同の配列（単数または複数）を野生型アデノウイルスゲノム内に挿入すること（いわゆる「ａｄｄ−Ａｄ」）であろう。このことは、アデノウイルスの複製およびパッケージングが、最大で野生型アデノウイルスゲノムのサイズの約１０５％まで収容することが知られているので、あり得ることである（上記）。従って、約２ｋｂの非相同の配列（単数または複数）を、野生型アデノウイルスのゲノムに添加してもよい。
【００９９】
実施例３  自己複製可能なアデノウイルスベクターの試験
インビボの動物実験の前に、自己複製可能なアデノウイルスベクターの形質導入の能力（すなわち感染力）について、適切な初代細胞および細胞株中で試験を行ってもよい。当該技術分野において知られた技術を用いて、形質導入された細胞または細胞株の生存度の試験だけでなく、形質導入の能力を試験することも可能である。たとえばトリパンブルー排除法を用いて、生存度を評価してもよい。アデノウイルスが感染することが知られている細胞および／または細胞株のあらゆるものを、これらの分析のために用いてもよい。また、アデノウイルスベクター（単数または複数）に挿入されている、非相同のＤＮＡ配列（単数または複数）の発現についての試験を、既知の技術を用いて行うことも可能である。たとえば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降およびゲル電気泳動は、遺伝子発現およびタンパク質の定量について分析するための、当該技術分野において知られている技術である。形質導入された細胞または細胞株の形態の変化に注目することによって、発現した非相同のＤＮＡ配列の効果を評価してもよい。
【０１００】
一旦、特定の自己複製可能なアデノウイルスベクターを産生して特徴づけすれば、適切な宿主生物（たとえば、マウス、ウサギおよび／または非ヒトの霊長類）を用いて、それらのベクターのインビボでの試験を行うことだろう。上記の任意の経路（たとえば、経口、経粘膜、筋肉注射、皮下など）によって、宿主生物をアデノウイルスに曝露してもよい。次いで、アデノウイルスの感染および非相同のＤＮＡ配列の発現について、当該技術分野において知られている何種類もの技術によって、曝露された宿主を分析してもよい。非相同ＤＮＡ配列の発現が示す、前記非相同ＤＮＡ配列が由来するところの病原体によるその後の感染から宿主生物を保護するという能力は、宿主生物を無傷の病原体に曝露することと、（もしあれば）宿主生物における病原体の感染の経過を観察することとによって、評価してもよい。
【０１０１】
実施例４  自己複製可能なアデノウイルスベクターについてのワクチンおよび免疫療法への応用
当該技術分野において知られた技術および方法を用いて、自己複製可能なアデノウイルスベクターを含む免疫学的組成物および製剤を調製してもよい（たとえば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．Ｗ．（編）、最新版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡなどを参照すること）。当該技術分野において知られている技術を用いて、アデノウイルスワクチンを調製してもよい（たとえば、Ｈｉｌｌｅｍａｎ，Ｍ．Ｒ．（１９５８）「アデノウイルスワクチンを使用することの有効性と適応症（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｄ  Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）」Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、ｖｏｌ．４８、ｐ１５３〜１５８；Ｇａｙｄｏｓ，Ｃ．Ａ．およびＪ．Ｃ．Ｇａｙｄｏｓ（１９９５）「米軍におけるアデノウイルスワクチン（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．ｍｉｌｉｔａｒｙ）」Ｍｉｌ．Ｍｅｄ．、ｖｏｌ．１６０、ｎｏ．６、ｐ３００〜３０４；Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｃ．ら（１９９９）「米軍の全将兵における呼吸器疾患：新たに生まれた脅威への対抗」Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、ｖｏｌ．５、ｎｏ．３、ｐ３７９〜３８７；および上記の任意のものに記載の参考文献などを参照すること）。本発明によるアデノウイルスワクチンの有効性もまた、当該技術分野において知られている技術を用いて評価してもよい（たとえば、Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．およびＭａｒｓｈａｌｌ，Ｅ．（２００１）「免疫制御、記憶およびワクチン」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ２３３；Ｅｎｓｅｒｉｎｋ，Ｍ．（２００１）「復活したＴＢへの杭の打ち込み（Ｄｒｉｖｉｎｇ  ａ  ｓｔａｋｅ  ｉｎｔｏ  ｒｅｓｕｒｇｅｎｔ  ＴＢ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ２３４〜２３５；Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．（２００１）「新しいワクチンのための『ブリーディング』抗原（‘Ｂｒｅｅｄｉｎｇ’  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ２３６〜２３８；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．（２００１）「有望な技術：適応免疫システムにおけるシステム制御（Ｔｈｅ  ａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｂａｂｌｅ：ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ２４０〜２４５；Ｓｐｒｅｎｔ，Ｊ．およびＴｏｕｇｈ，Ｄ．Ｆ．（２００１）「Ｔ細胞の死と記憶（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ２４５〜２４８；Ｆｅａｒｏｎ，Ｄ．Ｔ．ら（２００１）「分化の停止、自己複製する記憶リンパ球およびワクチン接種（Ａｒｒｅｓｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｔｈｅ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｍｅｍｏｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ２４８〜２５０；Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｒ．Ｍ．およびＨｅｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｈ．（２００１）「抗原による免疫応答の制御（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓ��ｏｎｓｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｇｅｎ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ２５１〜２５３；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｂ．ら（２００１）「病原体の感知と免疫応答の調節（Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｔｕｎｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ２５３〜２５６；Ｄｕｐｕｉｓ，Ｓ．ら（２００１）「生殖細胞系列のヒトＳＴＡＴ１の突然変異による、ウイルス免疫ではなくマイコバクテリア免疫の機能障害（Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＳＴＡＴ１  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ３００〜３０３；Ｂｉｎｄｅｒ，Ｇ．Ｋ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｄ．Ｅ．（２００１）「インターフェロン−γが介在する、ＣＮＳニューロンからのアルファウイルスの部位特異的なクリアランス（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ＣＮＳ  ｎｅｕｒｏｎｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ３０３〜３０６；Ｌｕ，Ｑ．およびＬｅｍｋｅ，Ｇ．（２００１）「Ｔｙｒｏ  ３ファミリーのレセプター型チロシンキナーゼによる免疫システムの恒常的制御（Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｙｒｏ  ３  ｆａｍｉｌｙ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２９３、ｐ３０６〜３１１；および上記の任意のものに記載の参考文献などを参照すること）。
【０１０２】
実施例５  ワクチンおよび免疫療法に応用するための自己複製可能なデュアルアデノウイルスベクター
本発明は、２つの相補的なアデノウイルスベクター構築物の混合物と、複製に関してそれぞれに依存する、誘導されたアデノウイルスとを含む。これらの２つの相補的なアデノウイルスベクター粒子は、１つもしくは多数の免疫原および／または免疫調節遺伝子を細胞に送達するする能力を有する。第１のベクターは、機能性Ｅ１の発現が欠失した野生型アデノウイルス構築物の形態のヘルパーベクターである。追加的な修飾は、米国特許出願ＵＳ０８／６５８，９６１号に記載されたいくつかの修飾体を伴うヘルパーウイルスにおいて生じてもよい。第２のベクターは、ＩＴＲおよびパッケージング・シグナルの両方を保持するがＥ１を除くすべての機能性アデノウイルスタンパク質が欠失した、「弱い（ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスベクターからなる。このような第２のベクターの一般的な記述は、ベクターが機能性Ｅ１を同様にコードするであろうことを除いては、上記の関連する出願の欄にて言及された公開された出願に詳述された例に従えばよい。Ｅ１は、それ自身のプロモーター、任意の非相同の構成的プロモーター、任意の誘導性／抑制性プロモーターまたは組織特異的プロモーターのいずれかによって、作動させることができる。免疫原（単数または複数）および／または免疫調節遺伝子（単数または複数）は、弱いアデノウイルスまたはヘルパーウイルスによって、Ｅ１が欠失した領域内またはＥ１が与えられれば複製には必要とならないその他のあらゆる領域内において、コード化されてもよい。
【０１０３】
このデュアルＡｄシステムは、アデノウイルス構築物または誘導されたウイルスの両方を収容する細胞内で自己複製可能であり、従って、このシステムは、インビボでこれらのベクターの増幅を導くデュアルＡｄ産生細胞に変化する。デュアルＡｄベクターは、ワクチンおよび免疫療法に応用するための、免疫原およびその他の免疫調節遺伝子についての強力な遺伝子送達システムに変化することもできる。現在のワクチンのためのアデノウイルスベクターは、通常シングルアデノウイルスシステムである。上記の自己複製可能なシステムには、いくつかの考えられる長所が存在する。第１に、強い免疫応答の誘導に至ると、複製型ベクターは一般的にさらに強力になる。第２に、自己複製可能なデュアルＡｄベクターでは、投与量がより少量でも、投与量がより多量の自己複製不可能なＡｄベクターで見られる結果に匹敵する結果が得られる可能性が高く、このことは次にはコストの低下に役立つ。第３に、特定のアデノウイルスタンパク質（たとえばキャプシドタンパク質）は免疫原性を示し、そして先天性免疫応答を誘導することが知られている（Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．３：７０８，２００１；Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．３：６９７，２００１；Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．３：７５７，２００１）。これらのアデノウイルスタンパク質を新規に作製することによって、一般的な非特異的な免疫応答が誘導されうるし、このことは、送達された免疫原（単数または複数）の免疫認識に役立つであろう。第４に、このワクチン／免疫療法剤は、アデノウイルスの増殖、およびＥ１配列を発現させる必要がないワクチン／免疫療法剤の生産に適した、哺乳動物の細胞株のあらゆるものにおいて、作ることができる。誘導性／抑制性プロモーターによってＥ１が作動する場合、Ｅ１を誘導／抑制するように改変した産生株が必要である。組織特異的プロモーターによってＥ１が作動する場合、産生株は、組織特異的プロモーターによって作動するＥ１の発現を可能にする成分を供給することができなければならない。このようなシステムの別の長所は、システムの相補的な性質と構成部分間において分割された機能とに起因する、毒性が減少するであろうということである。このようなシステムのさらに別の長所は、ベクターの複製が長期間の抗原の発現および／または免疫調節遺伝子の発現と合わさって、一体となる利益が得られるであろうということである。
【０１０４】
自己複製不可能なアデノウイルスベクターによって送達された免疫原に対する免疫応答は、自己複製可能なデュアルＡｄアデノウイルスベクターを用いることによって、強くなりうる。
【０１０５】
本発明によって検討される潜在的な抗原標的は、ＨＩＶウイルスがコード化する遺伝子、すなわちＨＩＶｇａｇ遺伝子、ＨＩＶｐｏｌ遺伝子、ＨＩＶｔａｔ遺伝子、ＨＩＶｒｅｖ遺伝子、ＨＩＶｅｎｖ遺伝子、ＨＩＶｖｉｆ遺伝子、ＨＩＶｎｅｆ遺伝子、ＨＩＶｖｐｕ遺伝子およびＨＩＶｖｐｒ遺伝子ならびにＨＩＶ  ＲＲＥ配列およびそれらを組み合わせたものを含む、種々の非相同遺伝子である。ｔａｔのトランス活性化作用の欠損（たとえば、Ｃａｐｕｔｏら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１６２、ｐ５６３１〜、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｄ．ら（１９９８）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ．１７、ｐ９〜を参照すること）のような、特定の作用が無能力化されたこれらの遺伝子の改変、ならびに、逆転写酵素、インテグラーゼおよびポリメラーゼなどの、ＨＩＶｐｏｌがコード化する酵素などについてもまた、検討されている。また、部分的な遺伝子配列（エピトープ、ペプチド）ならびにそれらの融合タンパク質なども検討されている。
【０１０６】
その他の非相同遺伝子としては、種々のＨＰＶ株（たとえば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２を伴うＨＰＶ−１６）、ＨＳＶ（たとえば、糖タンパク質のｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＭ＋キャプシドタンパク質）、ＲＳＶ（タンパク質：ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２、Ｌ）、ＨＣＶ（タンパク質／糖タンパク質：Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）およびクラミジア（ＭＯＭＰ、６０Ｋｄａのシステインに富む膜タンパク質、プロテインＥ、ＯＭＰ、Ｎｐｔ２ｃｐ、ＩｐｄＡ、ＯＭＰＢ）に由来する遺伝子が挙げられる。
【０１０７】
一般的に、本明細書で開示された発明では、Ｐａｖｌａｋｉｓら（たとえば、米国特許第５，９６５，７２６号；米国特許第６，１７４，６６６号；米国特許第６，２９１，６６４号などを参照すること）ならびにＳｅｅｄ，Ｂ．ら（たとえば、米国特許第５，７８６，４６４号；米国特許第５，７９５，７３７号；米国特許第６，１１４，１４８号などを参照すること）によって記載されたように、コドンの利用を最適化することによって遺伝子の発現量を増加させるような、当業者に知られているその他のものと同様に、上記の非相同遺伝子のあらゆるものの改変について検討している。また、免疫誘導には必要でない、これらの遺伝子の既知のあらゆる発癌性の性質と活性は、遺伝子のそれぞれの領域での突然変異によって排除されうる。
【０１０８】
実施例６  ワクチンおよび免疫療法に応用するための典型的なデュアルＡｄシステム
図８では、デュアルＡｄシステムが表現されており、そのＭａｘＡｄコントロールドベクターにおいて：１）ＰＳＡプロモーターを用いてＥ１の発現を作動させている、２）ＲＳＶプロモーターを用いて免疫調節遺伝子のＣＤ８０（ｂ７．１）の発現を作動させている、３）ＥＦ２プロモーターを用いて免疫調節遺伝子のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮガンマまたはＩＦＮγ）の発現を作動させている、そして４）ＳＶ４０プロモーターを用いて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）抗原の発現を作動させている（図８）。
【０１０９】
このようなデュアルＡｄシステムの複製は、Ｅ１の発現を許容する許容性細胞（図９：ＬＮＣａＰ細胞はＰＳＡ陽性であり、そしてＰＳＡプロモーターからのＥ１の発現を許容する）、およびＥ１を構成的に発現する２９３コントロール細胞において証明されている。より高レベルのインターフェロン−ガンマはＰＳＡ陽性のＬＮＣａＰ細胞（図１０）内で観察され、そこでは、ＰＳＡ陰性であってウイルスの複製を支持していないＤＵ１４５細胞と比較して、ウイルスは自己複製することができる。しかしながら、インターフェロン−ガンマの発現は、ＰＳＡ陰性のＤＵ１４５細胞株中でもなお観察され、このことは、複製がない場合でも、Ｍａｘ−Ａｄが標的遺伝子を発現できることを示唆する。免疫調節遺伝子ＣＤ８０の発現は、ＬＮＣａＰ細胞株において表現されている（図１１）。
【０１１０】
その後の研究から、Ｍａｘ−Ａｄが、ＧＦＰ抗原に対する粘膜性の体液性免疫および細胞性免疫、ならびに全身性の体液性免疫および細胞性免疫の両方を惹起させる能力を有することが実証された。
【０１１１】
実施例７  ＭａｘＡｄ／ＧＦＰベクターを利用するインビボでのネズミの研究
インビボでの予備的な研究において、全身性の経路および粘膜を経る経路でワクチン接種した後の、ＭａｘＡｄシステムが免疫応答を誘導する能力を調べた。モデル抗原として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコード化したＭａｘＡｄ／ＧＦＰによってマウスを免疫化した結果、ＧＦＰに対する体液性免疫応答（図１２および図１３）および細胞性免疫応答（図１４）の両方が誘導された。
【０１１２】
マウスを免疫化し、そして２週間後に、鼻腔内（ｉ．ｎ．）の経路または腹腔内（ｉ．ｐ．）の経路にて、ＭａｘＡｄ／ＧＦＰで追加免疫した。コントロールの動物を、ＦＶＩＩＩタンパク質を発現するＭａｘＡｄウイルスで、鼻腔内（ｉ．ｎ．）にて免疫化した。一次免疫の５週間後に、ＥＬＩＳＡを用いて、抗ＧＦＰ  ＩｇＧ抗体について血清を調べた（図１２）。鼻腔内での免疫化および腹腔内での免疫化の両方によって、ＧＦＰに対する高レベルの血清ＩｇＧ抗体が産生するという結果になった。粘膜を経る免疫化経路または全身性の免疫化経路のどちらが、結果として粘膜組織内に抗体をもたらすかどうかを調べるために、生殖管の洗浄を毎日行って、ＧＦＰに対する抗体について調べた。免疫化のための鼻腔内の経路および腹腔内の経路の両方が、生殖管内に同程度のレベルのＧＦＰ特異的ＩｇＧ抗体を存在させる結果となった（図１３）。対照的に、鼻腔内での免疫化によって、粘膜の洗浄液におけるＧＦＰに対するＩｇＡ抗体のレベルははるかに高いものとなり（図１３）、粘膜へのワクチン接種によってさらなる免疫の要素を誘導するというＭａｘＡｄの能力を強調するものとなった。これらの結果は、鼻腔内での免疫化によって同様の全身性に特有の体液性免疫応答および粘膜性に特有の体液性免疫応答が誘導される、第１世代のベクターを用いて観察された結果と一致する。
【０１１３】
鼻腔内および腹腔内で免疫化されたマウスにおける細胞性免疫応答を調べるために、一次免疫の５週間後および二次免疫の３週間後に脾細胞を単離し、そしてインビトロで展開した。免疫化の経路の両方において、コントロールの標的ではなく、ＧＦＰを発現する標的の高レベルの溶解によって見られるような強いＣＴＬ応答が誘導されることが見出された（図１４）。粘膜経由の免疫化の後にＧＦＰに特異的な強いＣＴＬ応答を誘導するという能力は、デュアルＡｄシステムワクチンのプラットフォーム（たとえば、コントロールドＡｄとしてＭａｘＡｄを含むシステムが挙げられるが、これに限定されるわけではない）についての原理を証明するものである。
【０１１４】
従って、上記の研究から、デュアルＡｄシステムが、許容性細胞において複製する能力、多数の標的抗原および免疫調節遺伝子を発現する能力、ならびにベクターシステムの構成要素であるコントロールドＡｄ（たとえばＭａｘ−Ａｄ）が運搬する標的抗原に対する免疫応答を誘導する能力を持つことが、証明される。
【０１１５】
インビトロの研究において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化するというＭａｘＡｄシステムの能力が調べられてきた（表１）。インビトロにて、２４時間かけて正常なネズミの脾細胞にＭａｘＡｄ／ＧＦＰを形質導入し、そして、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＩＣＡＭの発現ならびにＢ７．１およびＢ７．２などの共刺激分子の発現を、フローサイトメトリーによってモニタリングした。これらのデータから、ＭａｘＡｄ／ＧＦＰはＡＰＣにより取り上げられ、そしてこのプロセスの間、抗原提示（ＭＨＣクラスＩＩ）、共刺激（Ｂ７．１および２）およびシグナル伝達（ＣＤ４０およびＩＣＡＭ）を助ける細胞表面分子は、アップレギュレートされていたことが示唆される。
【表１】
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【０１１６】
表１：抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表現型。脾細胞にＭａｘＡｄ／ＧＦＰを形質導入し、そして上記に示したように、ＰＥが結合したマクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞の表面分子、ならびにアロフィコシアニンで標識化した細胞表面分子に対する抗体で、二重染色した。フローサイトメトリーによって、ＡＰＣ（Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞）上での細胞表面マーカーの発現を測定した。
【０１１７】
実施例８  ＨＩＶワクチンのためのコントロールドＡｄベクター（たとえばＭａｘＡｄ）構築物
ＮＬ４−３株（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１９９２１）に由来するＨＩＶ−１免疫原は安全であり、そしてＨＩＶに特異的なＣＴＬ応答をインビトロで惹起する。ＨＩＶ−１誘導免疫原のＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌ／ｔａｔｎｆ／ｒｅｖは、ＥＦ１ａプロモーターによって作動し、感染のリスクを伴わない弱毒化ウイルスを模倣したウイルス粒子を産生する。アクセサリー遺伝子のｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆならびにエンベロープ遺伝子ｅｎｖを削除することによって、感染性ウイルスの出現に関する安全性が保証される。さらに、ＨＩＶ  ＬＴＲおよびパッケージング・シグナルの両者などのシスに作用するすべてのエレメントは、完全に除かれる。
【０１１８】
ＨＩＶ−１免疫原は、調節タンパク質のＨＩＶ  Ｒｅｖをコード化しており、このタンパク質によってＨＩＶのｍＲＮＡの細胞質への輸送が保証され、そしてこのタンパク質そのものがＨＩＶ感染への対抗に役立つ免疫応答を惹起させることができる。第２の調節タンパク質であるトランス活性化因子のＴａｔは、同様に強力な免疫原であることが知られており、従って、このものはＭａｘＡｄ／ＨＩＶ内に保持される。しかしながら、Ｔａｔのトランス活性化の可能性によるいくつかの望ましくない影響については、その免疫原としての可能性をなお保持するＴａｔの非機能的な型を発現させることによって回避した。
【０１１９】
ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌ／ｔａｔ／ｒｅｖについてのｃＤＮＡを、既述のＨＩＶ−１に基づくレンチウイルスベクターＨＩＶ−１ＤＥＮ（３）（Ｂｌｏｏｄ、ｖｏｌ．９６、ｐ１３２７〜１３３３、（２０００））から単離し、そして真核生物の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１の誘導体にクローン化した。安全性を目的とするために、ｅｎｖ配列、ｖｉｆ配列、ｖｐｒ配列およびｖｐｕ配列内の領域を含む、機能しないＨＩＶ配列の最大量を削除し、その一方、ｇａｇ／ｐｏｌ／ｔａｔ／ｒｅｖの全配列は維持させた。
【０１２０】
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１における改変して安全を図ったこのＨＩＶ−１免疫原の発現レベルが、オリジナルのＨＩＶ−１ＤＥＮ（３）構築物の発現レベルに匹敵することを実証するために、両方のプラスミドを２９３細胞の中に形質導入し、そして、細胞溶解物からの抗ＨＩＶ  ｐ２４のウェスタンブロットを利用して、ＨＩＶ  ｐ２４の細胞内のレベルを測定した（図１５）。
【０１２１】
実施例９  ヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ異種移植腫瘍でのＧＴＶ８０６３の試験
材料と方法：
実験計画：ヌードマウスにおいてＬＮＣａＰ異種移植腫瘍モデルを用い、ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄウイルス複製の腫瘍退縮効果を明らかにする。１００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ中に、１つの注入部位あたり１．５×１０６のＬＮＣａＰ細胞を用い、ＬＮＣａＰ腫瘍を形成させる。  
グループＡ：１００μｌのＰＢＳ＋１０％グリセロール中に、５×１０１０ｖｐ／腫瘍にて、一箇所にＧＴＶ８０６３を注入したもの。  
グループＢ：１００μｌのＰＢＳ＋１０％グリセロール中に、５×１０１０ｖｐ／腫瘍にて、一箇所にＡｄＴＫを注入したもの。  
グループＣ：１００μｌのＰＢＳ＋１０％グリセロールを一箇所に注入したもの。
【０１２２】
材料：
１５匹のヌードマウス、オス、４週齢（Ｈａｒｌａｎ社）。  
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ベースメント・メンブレン・マトリックス、カタログ番号３５４２３４、ロット００５１１０（生物医学用の共同商品／ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。  
１．３６×１０８個のＬＮＣａＰ「ファスト（ｆａｓｔ）」細胞、ヒト前立腺癌細胞株、継代数３８；ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で培養。「ファスト」細胞はＬＮＣａＰ細胞のサブクローンであり、ＧｅｎＳｔａｒ社によって選別された、ＡＴＣＣから入手されるＬＮＣａＰ細胞よりも生長がはるかに速いものである。  
５×１０１１ｖｐのＧＴＶ８０６３デュアルＡｄウイルス、第２ロット（化学的な溶解）、０１年３月３０日に調製されたもの、参照番号００９１−１００；濃度１．１×１０１２ｖｐ／ｍｌ；５００μｌのストックを用い、６００μｌのＰＢＳ＋１０％のグリセロールを添加して、５×１０１１ｖｐ／ｍｌに希釈した。  
５×１０１１ｖｐのＡｄＴＫヘルパーウイルス、参照番号００５７−００５−００３；濃度５×１０１１ｖｐ／ｍｌ；希釈する必要はない。  
ＰＢＳ＋１０％のグリセロール。  
１８ゲージの注射針。  
２５ゲージの注射針。  
１ｍｌの注射器。
【０１２３】
方法：
０１年３月２７日にＨａｒｌａｎ社から受け取った、出生日が０１年２月２６日の１５匹のヌードマウスすべてにおいて、０１年４月３日に予備的な採血を行う。  
０１年４月３日にＬＮＣａＰ細胞を１：４に分割し、２２５ｃｍのフラスコ内でＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳにて培養した。  
０１年４月９日に、フラスコあたり５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡを用いて３個のフラスコ（２２５ｃｍ）のＬＮＣａＰ細胞を注入用に回収し、１０ｍｌのＤＭＥ＋１０％ＦＢＳにて停止させた。ＬＮＣａＰ細胞を１つの５０ｍｌのコニカルチューブ内にプールし、Ｍｅｇａｆｕｇｅ卓上遠心装置で室温下、１０００ｒｐｍにて１０分間回転させた。培地を吸引して取り除き、次いで２５ｍｌのＰＢＳで１回、粉砕することにより（ｂｙ  ｔｉｔｕｒａｔｉｏｎ）細胞を洗浄した。計数のために分取した。残りの細胞を１０００ｒｐｍにて１０分間、再度回転させた。  
細胞を１／１０に希釈した後、血球計で細胞を計数した。  
平均値：５４細胞／区画×１０×１０４＝５４×１０５細胞／ｍｌ＝５．４×１０６細胞／ｍｌ。  
５．４×１０６細胞／ｍｌ×２５ｍｌ＝１３６×１０６個の細胞（総数）。  
１．５×１０６細胞／注入剤とするために：１３６×１０６／１．５×１０６＝９０．６の注入剤。  
１００μｌの注入のために、９．１ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌを用いて細胞を再懸濁させる。  
ＰＢＳを吸引して取り除き、氷上にて細胞を９．１ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌに（フェノールレッドと共に）再懸濁させた。注入するまで、常に氷上で保持し続けた。  
０１年４月９日に、１本の脚あたり１００μｌ、すなわち１本の脚あたり１．５×１０６細胞のＬＮＣａＰ「ファスト」細胞、継代数３８を含むものを、両脚の皮下（Ｓ．Ｑ．）に注入することによって、１５匹のヌードマウスに腫瘍を形成させた。大腿直筋の前部近傍に、細胞を皮下注射した。  
ウイルスまたはコントロールで処置する前に、マウスにおいて腫瘍を５週間生長させた。週ごとの腫瘍のサイズをカリパスで測定した。測定して、長さ×幅×深さ×０．５２とすることによって、体積を計算した。５週目に、それらのそれぞれの腫瘍の体積の平均値に基づいて、１５匹のマウスを５匹のマウスの３グループにランダム化した。ランダム化は、それぞれのグループの腫瘍サイズの平均値を同一にするように試みた。  
ウイルスを１００μｌのコントロール溶媒（ＰＢＳ＋１０％グリセロール）で適切に希釈することによって、ウイルスまたはコントロールで腫瘍を処置した。腫瘍（グループＡ、Ｂ、Ｃ）あたり一箇所の腫瘍内に、ウイルスまたはコントロールを注入した。  
その後、二元配置反復測定分散分析（ＲＭ−ＡＮＯＶＡ）によって統計分析を実施した。
【０１２４】
結果：
ＧＴＶ８０６３は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーターのコントロール下で、ヒトＩＬ−３遺伝子に加えてアデノウイルスＥ１遺伝子を発現する治療用ベクターを含む、デュアルアデノウイルス（デュアルＡｄウイルス）である。ＧＴＶ８０６３は、Ｅ１遺伝子に代えてヘルパーウイルスＡｄＴＫを削除した、第２のベクターからも構成されている。
【０１２５】
ＬＮＣａＰ異種移植腫瘍モデルにおいて、オスのヌードマウスの側腹部内に腫瘍細胞を注入してから５週間以内に、触知可能で治療可能な腫瘍ができた。腫瘍細胞を注入してから１２週間、すなわちウイルスの処置から７週間で、ＰＢＳコントロール溶媒またはＡｄＴＫヘルパーウイルスのいずれかで腫瘍内に処置を行ったマウスは、死亡、すなわちその全身総腫瘍量が原因で終了した。対照的に、ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄウイルスを受け入れたマウスは生き延び、その腫瘍は、ＡｄＴＫまたはＰＢＳで処置されたコントロールグループよりも有意に小さいものであった。サイズが大きくなり、さらには生長速度も高まったコントロールグループとは異なり、ウイルス処置後の最初の３週間の間に、ＧＴＶ８０６３で治療を受けた腫瘍のサイズは小さくなった。図１のグラフに見られるように、ＡｄＴＫまたはＰＢＳで処置したグループの腫瘍の平均サイズには、実験の過程全体を通して差がなかった。ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄで治療されたマウスは、コントロールグループで経験した全身総腫瘍量を伴うことなく、腫瘍細胞を注入してから１２週間の実験期間中生存し続けた。図１は、実験期間中においてグループＡ、ＢおよびＣについて注入された腫瘍の体積を表す。矢印は、ウイルスまたはコントロールで処置した時点を示す。
【表２】
2005511534.tif 000003
【０１２６】
統計分析
グループと週を分類変数とする二元配置反復測定分散分析（ＲＭ−ＡＮＯＶＡ）を実施した。この分析からの出力を表１に示す。交互作用項は有意であり、ｐ＜０．０００１であった。この表において、対を成すグループの対照を行に、週を列に取り、表の値はｐ値である。表１から、２つのコントロールグループ、ＢおよびＣの間には、すべての時点において差がないことが示される。グループＡおよびＢと、グループＡおよびＣとの比較から、８週目から実験の最後まで、ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄグループＡには、２つのコントロールグループとの統計的な差があった。
【表３】
2005511534.tif 000004
【０１２７】
コメント：
このＬＮＣａＰ腫瘍モデルにおいて、本発明者らは、デュアルＡｄウイルスＧＴＶ８０６３が腫瘍の生長に与える影響について測定した。ヒトの細胞についてのウイルスの生物学的特異性が原因で、本発明者らは、ヒトのＬＮＣａＰ腫瘍上のみにおいてウイルスの複製の影響を観察した。ヒトアデノウイルスがマウスの細胞内で複製することはないので、ウイルスの体内分布について、結果に関する要素として考慮することはなかった。サイトカインの種特異性の故に、ヒトＩＬ−３についての治療用遺伝子の発現が、このマウスのモデルにおける腫瘍に影響を及ぼすことはないであろう。ヒトＩＬ−３タンパク質がそれだけで腫瘍に影響を及ぼすことは予想できない。
【０１２８】
これまでの実験からの組織学的な分析によって、アデノウイルスのヘキソンタンパク質が実験の終了時点において腫瘍内になお存在することが実証された。この実験では、ウイルス複製の長期に亘る反応速度論を扱っていなかった。
【０１２９】
ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄは、ヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ異種移植モデルでの抑制されていない腫瘍の生長を抑制することにより、その腫瘍退縮効果を実証した。ヘルパーウイルスＡｄＴＫ単独も緩衝液も、腫瘍サイズを小さくする効果はなかった。ウイルス処置後の１週間という早期でも、ＧＴＶ８０６３で処置されたグループとＰＢＳで処置されたグループとの間の腫瘍サイズには差があった。ウイルス処置の３週目から実験の終了時までにおいて、ＧＴＶ８０６３で処置したグループとコントロールグループの両方との間では、有意な差が明白になった。ＡｄＴＫまたはＰＢＳで処置されたグループの腫瘍は、実験の進行中は生長を続け、１２週目の実験の終了時まで急激にサイズが大きくなり続けた。しかしながら、ＧＴＶ８０６３で処置した腫瘍のサイズは、ウイルス処置から３週間の間に小さくなり、１２週目まで小さいままであった。
【０１３０】
ＡｄＴＫヘルパーウイルスは、Ｅ１の欠失のせいでそれ自身を複製することができなかったので、ＡｄＴＫヘルパーウイルスで腫瘍を処置することは、ＰＢＳで処置したコントロールグループと同様に、腫瘍の生長に影響を及ぼさなかった。従って、ＧＴＶ８０６３で処置されたグループにて腫瘍の生長を抑制するデュアルＡｄウイルスを除いて、腫瘍退縮効果を発揮するような、複製能を持たないアデノウイルスは存在しなかった。これは、腫瘍内でのウイルス複製の特性である。
【０１３１】
実施例１０  ヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ異種移植腫瘍でのＧＴＶ８０６３の試験
材料と方法：
実験計画：ヌードマウスにおいてＬＮＣａＰ異種移植腫瘍モデルを用い、ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄウイルスの複製の腫瘍退縮効果を明らかにする。１００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ中に一箇所の注入部位あたり１．５×１０６個のＬＮＣａＰ細胞を用い、ＬＮＣａＰ腫瘍を形成させる。  
グループＡ：１００μｌの製剤用緩衝液中に５×１０１０ｖｐ／腫瘍にて、一箇所にＧＴＶ８０６３を注入したもの。  
グループＢ：１００μｌの製剤用緩衝液中に２．５×１０１０ｖｐ／腫瘍にて、一箇所にＡｄＴＫを注入したもの。  
グループＣ：１００μｌの製剤用緩衝液を一箇所に注入したもの。
【０１３２】
材料：
１５匹のヌードマウス、オス、４週齢（Ｈａｒｌａｎ社）。  
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ベースメント・メンブレン・マトリックス、カタログ番号３５４２３４、ロット００５１１０（生物医学用の共同商品／ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。  
３×１０８個のＬＮＣａＰ「ファスト」細胞、ヒト前立腺癌細胞株、継代数３７；ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で培養。「ファスト」細胞はＬＮＣａＰ細胞のサブクローンであり、ＧｅｎＳｔａｒ社によって選別された、ＡＴＣＣから入手されるＬＮＣａＰ細胞よりも生長がはるかに速いものである。  
５×１０１１ｖｐのＧＴＶ８０６３デュアルＡｄウイルス、参照番号００５４−１１１；濃度５×１０１１ｖｐ／ｍｌ；希釈する必要はない。  
２．５×１０１１ｖｐのＡｄＴＫヘルパーウイルス、参照番号００５４−１１５；濃度２．４×１０１１ｖｐ／ｍｌ。  
製剤用緩衝液：４０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１０ｍｇ／ｍｌのスクロース、１０ｍＭのトリス、０．００１％のルトロール（Ｌｕｔｒｏｌ）Ｆ−６８、ｐＨ７．２。追跡番号１１１−１８４−００１。  
１８ゲージの注射針。  
２５ゲージの注射針。  
１ｍｌの注射器。
【０１３３】
方法：
出生日が０１年１１月１６日の１５匹のオスのヌードマウスを、０１年１２月１１日にＨａｒｌａｎ社から受け取った。すべてのマウスについて、０１年１２月１２日に予備的な採血を行う。  
０２年１月１６日にＬＮＣａＰ細胞を１：５に分割し、２２５ｃｍのフラスコ内でＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳにて培養した。  
０２年１月２２日に、フラスコあたり４ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡを用いて、７個の２２５ｃｍのフラスコを注入用に回収し、１０ｍｌのＤＭＥ＋１０％ＦＢＳにて停止させた。ＬＮＣａＰ細胞を１つの５０ｍｌのコニカルチューブ内にプールし、Ｍｅｇａｆｕｇｅ卓上遠心装置で室温下、１２００ｒｐｍにて７分間回転させた。培地を吸引して取り除き、次いで２５ｍｌのＰＢＳで１回、粉砕することにより（ｂｙ  ｔｉｔｕｒａｔｉｏｎ）細胞を洗浄した。計数のために分取した。  
１．５×１０６細胞／注射剤とするために：
１００匹のマウス（２００回の注入）に十分な量の３×１０８細胞を５０ｍｌの試験管内に移した。Ｍｅｇａｆｕｇｅを用い、１２００ｒｐｍにて７分間回転させた。ＰＢＳを吸引して取り除いた。１００μｌの注入のために、２０ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌを用いて細胞を再懸濁させる。注入するまで、常に氷上で保持し続けた。  
０２年１月２２日に、１本の脚あたり１００μｌ、すなわち１本の脚あたり１．５×１０６細胞のＬＮＣａＰ「ファスト」細胞、継代数３７を含むものを、両脚の皮下（Ｓ．Ｑ．）に注射することによって、１５匹のヌードマウスに腫瘍を形成させた。大腿直筋の前部近傍に、細胞を皮下注射した。  
ウイルスまたはコントロールで処置する前に、マウスにおいて腫瘍を３週間生長させた。週ごとの腫瘍のサイズをカリパスで測定した。測定して、長さ×幅×深さ×０．５２とすることによって、体積を計算した。３週目に、それらのそれぞれの腫瘍の体積の平均値に基づいて、１５匹のマウスを５匹のマウスの３グループにランダム化した。  
ウイルスを１００μｌの製剤用緩衝液コントロール溶媒で適切に希釈することによって、ウイルスまたはコントロールで腫瘍を処置した。腫瘍（グループＡ、Ｂ、Ｃ）あたり一箇所の腫瘍内に、ウイルスまたはコントロールを注入した。  
その後、二元配置反復測定分散分析（ＲＭ−ＡＮＯＶＡ）によって統計分析を実施した。
【０１３４】
結果：
ＧＴＶ８０６３は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーターのコントロール下で、ヒトＩＬ−３遺伝子に加えてアデノウイルスＥ１遺伝子を発現する治療用ベクターを含む、デュアルアデノウイルス（デュアルＡｄウイルス）である。ＧＴＶ８０６３はまた、Ｅ１遺伝子に代えてヘルパーウイルスＡｄＴＫを削除した、第２のベクターからも構成されている。
【０１３５】
ＬＮＣａＰ異種移植腫瘍モデルにおいて、オスのヌードマウスの側腹部内に腫瘍細胞を注入してから３週間以内に、触知可能で治療可能な腫瘍ができた。腫瘍細胞を注入してから１２週間、すなわちウイルスの処置から９週間で、製剤用緩衝液コントロール溶媒またはＡｄＴＫヘルパーウイルスのいずれかで腫瘍内に処置を行ったマウスは、死亡、すなわちその全身総腫瘍量が原因で終了した。対照的に、ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄウイルスを受け入れたマウスは生き延び、その腫瘍は、ＡｄＴＫまたは溶媒で処置されたコントロールグループよりも有意に小さいものであった。サイズが大きくなり、さらには生長速度も高まったコントロールグループとは異なり、ウイルス処置後の最初の３週間の間に、ＧＴＶ８０６３で治療を受けた腫瘍のサイズは小さくなった。図１のグラフに見られるように、ＡｄＴＫまたは溶媒で処置したグループの腫瘍の平均サイズには、差がなかった。ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄで治療されたマウスは、コントロールグループで経験した全身総腫瘍量を伴うことなく、腫瘍細胞を注入してから１２週間の実験期間中生存し続けた。図１は、実験期間中においてグループＡ、ＢおよびＣについての腫瘍の体積を表す。
【表４】
2005511534.tif 000005
【０１３６】
統計分析
方法
グループと週を分類変数とする二元配置反復測定分散分析（ＲＭ−ＡＮＯＶＡ）を実施した。この分析からの出力を表１に示す。交互作用項は有意であり、ｐ＜０．０００１であった。この表において、対を成すグループの対照を行に、週を列に取り、表の値はｐ値である。表１から、２つのコントロールグループ、ＢおよびＣの間には、すべての時点において有意な差がないことが示される。グループＡおよびＢと、グループＡおよびＣとの比較から、８週目から実験の最後まで、ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄグループＡには、２つのコントロールグループとの統計的な差があった。
【表５】
2005511534.tif 000006
【０１３７】
コメント：
このＬＮＣａＰ腫瘍モデルにおいて、本発明者らは、デュアルＡｄウイルスＧＴＶ８０６３が腫瘍の生長に与える影響について測定した。ヒトの細胞についてのウイルスの生物学的特異性が原因で、ウイルスの複製により細胞を溶解させる効果は、この異種移植モデルにおいては、ヒトのＬＮＣａＰ腫瘍内でのみ予想される。ヒトアデノウイルスがマウスの細胞内で複製することはないので、ウイルスの体内分布について、結果に関する要素として考慮することはなかった。サイトカインの種特異性の故に、ヒトＩＬ−３についての治療用遺伝子の発現が、このマウスのモデルにおける腫瘍に影響を及ぼすことはないであろう。ヒトＩＬ−３タンパク質がそれだけで腫瘍に影響を及ぼすことは期待できない。
【０１３８】
これまでの実験からの組織学的な分析によって、アデノウイルスのヘキソンタンパク質が実験の終了時点において腫瘍内になお存在することが実証された。この実験では、ウイルスの複製以降の長期に亘ることを扱っていなかった。
【０１３９】
ＧＴＶ８０６３デュアルＡｄは、ヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ異種移植モデルでの抑制されていない腫瘍の生長を抑制することにより、その腫瘍退縮効果を実証した。ヘルパーウイルスＡｄＴＫ単独も製剤用緩衝液も、腫瘍のサイズを小さくする効果はなかった。ウイルス処置後の第２週目という早期から実験の終了時までにおいて、ＧＴＶ８０６３で処置されたグループと溶媒で処置されたグループとの間の腫瘍サイズには差があった。腫瘍への注入から５週間後には、この差は統計的に有意なものとなった。ＡｄＴＫまたは溶媒で処置されたグループの腫瘍は、実験の進行中は生長を続け、それらの全身総腫瘍量からの病的状態が原因の、１２または１３週目の動物の終了時まで急激にサイズが大きくなり続けた。しかしながら、ＧＴＶ８０６３で処置した腫瘍を持つマウスは、研究の終了時において、全身総腫瘍量がかなり小さくなった状態で生きていた。
【０１４０】
ＡｄＴＫヘルパーウイルスは、Ｅ１の欠失のせいで、それ自身で複製することができなかったので、ＡｄＴＫヘルパーウイルスで腫瘍を処置することは、溶媒で処置したコントロールグループと同様に、腫瘍の生長に影響を及ぼさなかった。従って、ＧＴＶ８０６３のグループにて腫瘍の生長を抑制するデュアルＡｄウイルスの複製との組み合わせを除いて、腫瘍退縮効果を発揮するような、複製能を持たないアデノウイルスは存在しなかった。
【表６】
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2005511534.tif 000008
2005511534.tif 000009
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【０１４１】
本明細書にて言及される、すべての特許、公開された特許出願および非公開の特許出願、ならびにその他の科学的、技術的な文書のあらゆるものは、引用することによって、矛盾が生じない程度に明白に取り込まれる。
【０１４２】
本発明の好ましい実施態様をここに記載し示したうえに、好ましい形態における変形は当業者にとって明白であることから、示され記載された特定の実施態様に制限されるものとして本発明を解釈すべきではなく、むしろ請求の範囲に述べられたように解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】Ａｄ５のゲノムと転写単位。Ａｄ５のゲノムの長さは約３６ｋｂであり、１００マップユニット（ｍｕ）に分割されている。点付きの矢印は初期（Ｅ）転写を表し、そして無地の矢印は後期（Ｌ）転写を表す。転写の方向は矢印によって示される。矢印の間のギャップは介在配列を示す。四角形の部分は主要後期プロモーターとトリパータイトリーダー配列（ＭＬＰ）の位置を表す。１ｍｕにおける無地の三角形は、パッケージング・シグナルの位置を表す。
【図２】相補的なＡｄベクターシステムの原理。このシステムの２つの主要な構成要素：サプリメンタルＡｄベクターおよびコントロールドＡｄベクターが示されている。コントロールドＡｄが運搬する特定のプロモーター／エンハンサーの活性化によるヘルパー細胞からのＥ１−トランス活性化に伴い、サプリメンタルＡｄが自己複製し、そしてキャプシドを形成する後期タンパク質を産生する。しかしながら、この図の中で示される実施態様において、パッケージングがサプリメンタルＡｄに関連して減弱することから、サプリメンタルＡｄゲノムがキャプシド内にパッケージングされることは役に立たない。コントロールドＡｄベクターゲノムの存在下、サプリメンタルＡｄはまた、コントロールドＡｄベクターゲノムのＤＮＡ複製をも支える。ここで、量が制限されているパッケージングタンパク質に高い親和性を有する野生型のパッケージング・シグナルが原因で、そのゲノムが優先的にパッケージングされる。生化学的または物理的な方法、たとえば超遠心分離法によって、Ａｄベクターのさらなる精製を行うことができる。
【図３】サプリメンタルＡｄベクターとコントロールドＡｄベクターのプロトタイプ。ヘルパーウイルスとコントロールドＡｄベクターの一般的な構造が示されている。後者のものは、単一のまたは複合的な遺伝子発現カセットを備えることができる３６ｋｂまでの遺伝子を送達する能力を有する。
【図４】相補的なデュアルＡｄベクターシステムの基本構成。このシステムの基本的な構成要素は、サプリメンタルＡｄベクターとコントロールドＡｄベクターである。（Ａ）サプリメンタルＡｄは、Ｅ１置換された最初の世代のＡｄに類似しており、そしてこの実施態様において、そのパッケージング・シグナルの一部が欠失している。Ｅ１領域はレポーター遺伝子で置換されており、そしてこの実施態様においては、β−ｇａｌタンパク質についてのｌａｃＺ遺伝子である。（Ｂ）Ａｄゲノムの最小限のシスエレメント（パッケージング・シグナルを伴う２つのＩＴＲ）のみを含むコントロールドＡｄは、プロモーター／エンハンサーを運搬して、Ａｄ  Ｅ１遺伝子（Ａｄ５Ｅ１）を作動させる。プロモーター／エンハンサーは、癌性の細胞または形質転換細胞などの標的細胞内で、特異的に活性化される。このエレメントのコントロール下にあるＡｄＥ１遺伝子は、腫瘍細胞の中で特異的に転写される。次いで、Ｅ１タンパク質は、レポーター遺伝子によって置換されたＥ１領域と、コントロールドＡｄのパッケージングが細胞内で優先されるように操作されたパッケージング・シグナルとを有する、サプリメンタルウイルスのゲノムをトランス活性化する。Ｅ１タンパク質によって活性化するサプリメンタルウイルスは、腫瘍細胞内で自己複製することができ、その結果、これらの細胞を溶解させる。
【図５】相補的なＡｄベクターの変形の可能性。応用の必要性に基づいて設計することができるサプリメンタルＡｄ（Ａ）およびコントロールドＡｄ（Ｂ）の可変構造を示す。変形物の重要な側面は、Ｅ１遺伝子および／またはその他の初期遺伝子などのＡｄゲノムの機能に関して、２つのベクターが相補的となるということである。２つのベクターの相補的なエレメントを表（Ｃ）に列挙する。トランスジーンおよび支持エレメントは、主にコントロールドＡｄベクター内に含まれていたが、しかし、このことは、ある特定の環境において、サプリメンタルＡｄにとってこれらのエレメントが必要となることを排除するものではない。細胞周期を進行させるインデューサーをコード化するＡｄの初期遺伝子の欠失によって、正常な静止細胞でのアデノウイルスの複製能力を捨てることになるものの、欠失したウイルス遺伝産物に対応して欠陥がある腫瘍細胞において、コントロールドＡｄが、相補的なＡｄベクターの複製および増殖を特異的に作動させることが可能になる。２つの例は、それぞれ、ｐ５３が削除された（または変異を受けた）腫瘍細胞、あるいは網膜芽腫が除かれた（または変異を受けた）腫瘍細胞においてウイルスの増殖にとっては重要ではない、ウイルスタンパク質Ｅ１ｂ−ｐ５５とＥ１ｂである。
【図６】相補的なＡｄベクターシステムの作製方法。相補的なウイルスのベクターシステムを作製するために、同様の収率が得られる２つの異なる相補的なプロトコールを採用してもよい。第１の方法においては、ＡｄＨβからのｖＤＮＡによってコントロールドＡｄプラスミドをコトランスフェクトし、そして、ＣＰＥが観察されるまでヘルパー細胞を培養する。第２の方法においては、ｐＢＨＧ１０によるコントロールドＡｄベクタープラスミドを最初にコトランスフェクトしてから３日後に、ＡｄＨβをサプリメンタルウイルスとして添加して、ＣＰＥが観察されるまでその細胞を培養する。
【図７】相補的なＡｄベクターシステムの臨床応用のためのアプローチ。１つのヘルパー細胞株内に２つのプラスミドをコトランスフェクトすることによって、コントロールドＡｄを作製する：コントロールドＡｄプラスミドは、細胞活性化プロモーター／エンハンサーによって制御される１以上のＡｄ遺伝子を含んでもよく、サプリメンタルＡｄプラスミドは、Ａｄ遺伝子の残りを含んでもよく、そしてヘルパー細胞株は、コントロールドＡｄの細胞活性化プロモーターがその中で機能を示す、腫瘍由来の細胞株である。サプリメンタル細胞株では、コントロールドＡｄおよびサプリメンタルＡｄは互いに相補性であり、そして、これらはウイルス混合物として増殖する。ＣｓＣｌ勾配を介してベクター混合物を精製することができ、そして、減量手術後、腫瘍の塊または腫瘍床に局所的または全身的に注入する。細胞活性化プロモーター／エンハンサーは、標的細胞内でＡｄＥ１遺伝子を特異的に転写して、サプリメンタルＡｄの転写および複製をトランス活性化するＥ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質を産生する。サプリメンタルＡｄの増殖に伴って、コントロールドＡｄベクターもまた自己複製する。コントロールドＡｄの複製によって、多数のコントロールドＡｄゲノムのコピーが産生し、このものは、免疫調節遺伝子の高レベルの発現を支持して、特異的な抗癌免疫を誘導する。標的細胞中でサプリメンタルＡｄが増殖した結果、標的細胞が溶解する。このシステムによって、局所的な標的細胞の破壊効果と、遠くにある標的細胞を結果的に排除する、全身性の標的細胞の破壊反応とを引き起こすであろう。
【図８】４つの発現カセットを含むＭａｘＡｄベクター。本発明による、例示としての非限定的なベクターであるＧＴＶ８０５３の概略図が示される。
【図９】許容性細胞におけるデュアルＡｄの複製。ＬＮＣａＰ細胞、Ａ５４９細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈ３５８細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＤＵ１４５細胞、ＳＫＨｅｐ−１細胞、２２３７細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、２９３細胞、Ｈｅｐ−２細胞およびＨｅｐＧ２細胞を含む、１３のタイプの細胞におけるデュアルＡｄの複製を表示したものである。
【図１０】ＰＳＡデュアルＡｄ感染細胞におけるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮガンマまたはＩＦＮγ）の発現。
【図１１】ＰＳＡデュアルＡｄ感染細胞におけるＢ７．１（ＣＤ８０またはｂ７．１）の発現。
【図１２】ＭａｘＡｄ／ＧＦＰでマウスを免疫化した後での、ＧＦＰに対する血清ＩｇＧ抗体のレベル。マウスは、鼻腔内（ｉ．ｎ．）の経路または腹腔内（ｉ．ｐ．）の経路にて２回免疫化し（５×１０９ｖｐ）、ＧＦＰに対するＩｇＧ抗体について、血清を調べた。コントロールの動物は、ＦＶＩＩＩタンパク質を発現するＭａｘＡｄウイルスで鼻腔内にて免疫化した。
【図１３】ＭａｘＡｄ／ＧＦＰで免疫化したマウスの生殖管におけるＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体の誘導。マウスは、鼻腔内（ｉ．ｎ．）の経路または腹腔内（ｉ．ｐ．）の経路にて２回免疫化し（５×１０９ｖｐ）、３週間後に生殖管を洗浄し、そしてＧＦＰに対するＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体について調べた。コントロールの動物は、ＦＶＩＩＩタンパク質を発現するＭａｘＡｄウイルスで、鼻腔内にて免疫化した（５×１０９ｖｐ）。
【図１４】ＭａｘＡｄ／ＧＦＰ（５×１０９ｖｐ）で鼻腔内または腹腔内にて２回の免疫化を受けた個々のマウスに由来する脾細胞による、ＧＦＰ発現細胞およびコントロール細胞の溶解。
【図１５】ＨＩＶ−１ＤＥＮ（３）またはｐｃＤＮＡ３．１における改変して安全を図ったＨＩＶ−１免疫原を形質導入した２９３細胞の、抗ＨＩＶ  ｐ２４（キャプシド）によるウェスタンブロット。一次抗体は１：２，０００に希釈したマウスの抗ｐ２４抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）であり、次いで、１：１０，０００に希釈した抗マウスＨＲＰ標識化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。
【図１】
2005511534.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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