(57)【要約】  ナノ粒子と、活性な薬剤と、核局在化シグナルとを含むナノ粒子送達ビヒクル、ならびにそのようなナノ粒子送達ビヒクルを用いた遺伝子発現およびタンパク質発現の調節方法。代表的な方法では、直径が約30nm以下であるナノ粒子と、活性な薬剤と、核局在化シグナルとを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；および、標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルとを接触させ、それにより、活性な薬剤を標的細胞の核に送達させることが含まれる。別の代表的な方法では、直径が約30nm以上であるナノ粒子と、活性な薬剤と、核局在化シグナルとを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；および、標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルとを接触させ、それにより、活性な薬剤を細胞の細胞質に送達させることが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）ナノ粒子；
（b）活性な薬剤；および
（c）核局在化シグナル
を含むナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２】
ナノ粒子が、金属、セラミック、半導体およびポリマーからなる群から選択される材料を含む、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３】
ナノ粒子が、セレン化カドミウム、チタン、二酸化チタン、スズ、酸化スズ、ケイ素、二酸化ケイ素、鉄、酸化鉄III、銀、ニッケル、金、銅、アルミニウム、スチール、コバルトクロム合金、チタン合金、ブルッシャイト、リン酸三カルシウム、アルミナ、シリカ、ジルコニア、ダイアモンド、ポリスチレン、シリコーンゴム、ポリペプチド、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリエーテルおよびポリエチレンからなる群から選択される材料を含む、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４】
ナノ粒子が生分解性である、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項５】
ナノ粒子は直径が約1nm〜約1,000nmの範囲である、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項６】
ナノ粒子は直径が約30nm以下である、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項７】
活性な薬剤が、二本鎖核酸、一本鎖核酸、化学修飾された核酸、ペプチド核酸のオリゴマー、タンパク質および小分子からなる群から選択される、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項８】
活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項９】
薬学的に受容可能な希釈剤に配置された、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１０】
検出可能な成分をさらに含む、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１１】
検出可能な成分が蛍光性化合物である、請求項10に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１２】
1つ以上の細胞外標的化媒介因子をさらに含む、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１３】
それぞれの配列が独立してナノ粒子と結合している、請求項12に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１４】
細胞外標的化媒介因子がRMEモチーフである、請求項12に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１５】
細胞外標的化媒介因子が、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、コレラ毒素、リシン、コンカナバリンA、ラウス肉腫ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、トランスコバラミン、卵黄タンパク質、IgE、ポリマー状IgA、母体IgG、インスリン、上皮増殖因子、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、神経増殖因子、カルシトニン、グルカゴン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、甲状腺ホルモン、血小板由来増殖因子、インターフェロン、核局在化シグナル、およびカテコールアミン類からなる群から選択される、請求項12に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１６】
細胞外標的化媒介因子が、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、コレラ毒素、リシン、コンカナバリンA、ラウス肉腫ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、トランスコバラミン、卵黄タンパク質、IgE、ポリマー状IgA、母体IgG、インスリン、上皮増殖因子、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、神経増殖因子、カルシトニン、グルカゴン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、甲状腺ホルモン、血小板由来増殖因子、インターフェロン、およびカテコールアミン類からなる群から選択される分子のフラグメントを含む、請求項12に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１７】
核局在化シグナルが、配列番号4〜6およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１８】
2つ以上の異なる活性な薬剤をさらに含む、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項１９】
生体適合性増強剤をさらに含む、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２０】
送達ビヒクルの少なくとも一部分を覆う保護被覆をさらに含む、請求項1に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２１】
送達ビヒクル全体を覆う保護被覆をさらに含む、請求項20に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２２】
保護被覆がポリマーを含む、請求項20に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２３】
保護被覆が生物学的材料を含む、請求項20に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２４】
生物学的材料が、タンパク質、脂質、炭水化物、またはそれらの組合せである、請求項20に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２５】
（a）多数の異なる標的化媒介因子；
（b）ナノ粒子足場；および
（c）活性な薬剤
を含むナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２６】
多数の異なる標的化媒介因子が、1つの核局在化シグナルと、1つ以上の異なる細胞外標的化媒介因子とを含む、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２７】
それぞれの標的化媒介因子が独立してナノ粒子と結合している、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２８】
細胞外標的化媒介因子がRMEモチーフである、請求項26に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項２９】
細胞外標的化媒介因子が、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、コレラ毒素、リシン、コンカナバリンA、ラウス肉腫ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、トランスコバラミン、卵黄タンパク質、IgE、ポリマー状IgA、母体IgG、インスリン、上皮増殖因子、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、神経増殖因子、カルシトニン、グルカゴン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、甲状腺ホルモン、血小板由来増殖因子、インターフェロン、核局在化シグナル、およびカテコールアミン類からなる群から選択される、請求項26に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３０】
細胞外標的化媒介因子が、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、コレラ毒素、リシン、コンカナバリンA、ラウス肉腫ウイルス、セムリキ森林ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、トランスコバラミン、卵黄タンパク質、IgE、ポリマー状IgA、母体IgG、インスリン、上皮増殖因子、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、神経増殖因子、カルシトニン、グルカゴン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、甲状腺ホルモン、血小板由来増殖因子、インターフェロン、およびカテコールアミン類からなる群から選択される分子のフラグメントを含む、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３１】
核局在化シグナルが、配列番号4〜6およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項26に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３２】
ナノ粒子足場が、金属、セラミック、半導体およびポリマーからなる群から選択される材料を含む、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３３】
ナノ粒子が、セレン化カドミウム、チタン、二酸化チタン、スズ、酸化スズ、ケイ素、二酸化ケイ素、鉄、酸化鉄III、銀、ニッケル、金、銅、アルミニウム、スチール、コバルトクロム合金、チタン合金、ブルッシャイト、リン酸三カルシウム、アルミナ、シリカ、ジルコニア、ダイアモンド、ポリスチレン、シリコーンゴム、ポリペプチド、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリエーテルおよびポリエチレンからなる群から選択される材料を含む、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３４】
ナノ粒子足場が生分解性である、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３５】
ナノ粒子は直径が約1nm〜約1,000nmの範囲である、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３６】
ナノ粒子は直径が約30nm以下である、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３７】
活性な薬剤が、二本鎖核酸、一本鎖核酸、化学修飾された核酸、ペプチド核酸のオリゴマー、タンパク質および小分子からなる群から選択される、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３８】
活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項３９】
2つ以上の異なる活性な薬剤をさらに含む、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４０】
薬学的に受容可能な希釈剤に配置された、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４１】
検出可能な成分をさらに含む、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４２】
検出可能な成分が蛍光性化合物である、請求項41に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４３】
生体適合性増強剤をさらに含む、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４４】
送達ビヒクルの少なくとも一部分を覆う保護被覆をさらに含む、請求項25に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４５】
送達ビヒクル全体を覆う保護被覆をさらに含む、請求項44に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４６】
保護被覆がポリマーを含む、請求項44に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４７】
保護被覆が生物学的材料を含む、請求項44に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４８】
生物学的材料が、タンパク質、脂質、炭水化物、またはそれらの組合せである、請求項44に記載のナノ粒子送達ビヒクル。
【請求項４９】
活性な薬剤を細胞の核に送達する方法であって、
（a）直径が約30nm以下であるナノ粒子と、活性な薬剤と、核局在化シグナルとを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；および
（b）標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させ、それにより、活性な薬剤を標的細胞の核に送達させること
を含む方法。
【請求項５０】
活性な薬剤を細胞の核に送達する方法であって、
（a）直径が約30nm以下であるナノ粒子足場と、活性な薬剤と、多数の標的化媒介因子とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；および
（b）標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させ、それにより、活性な薬剤を標的細胞の核に送達させること
を含む方法。
【請求項５１】
活性な薬剤を細胞の細胞質に送達する方法であって、
（a）直径が約30nm以上であるナノ粒子と、活性な薬剤と、核局在化シグナルとを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；および
（b）標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させ、それにより、活性な薬剤を細胞の細胞質に送達させること
を含む方法。
【請求項５２】
活性な薬剤を細胞の細胞質に送達する方法であって、
（a）直径が約30nm以上であるナノ粒子と、活性な薬剤と、多数の標的化媒介因子とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；および
（b）標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させ、それにより、活性な薬剤を細胞の細胞質に送達させること
を含む方法。
【請求項５３】
標的核酸配列の発現を調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、核局在化シグナルと、その発現が調節されることになる標的核酸配列と相互作用することができる活性な薬剤とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）標的核酸配列を含む標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）標的核酸配列の発現を工程（b）の接触によって調節し、それにより、標的核酸配列の発現が調節されること
を含む方法。
【請求項５４】
標的核酸配列が発現される程度を測定することをさらに含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
標的核酸配列の発現を調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、多数の標的化媒介因子と、その発現が調節されることになる標的核酸配列と相互作用することができる活性な薬剤とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）標的核酸配列を含む標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）標的核酸配列の発現を工程（b）の接触によって調節し、それにより、標的核酸配列の発現が調節されること
を含む方法。
【請求項５７】
標的核酸配列が発現される程度を測定することをさらに含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項56に記載の方法。
【請求項５９】
標的タンパク質の発現を調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、核局在化シグナルと、標的タンパク質をコードする核酸配列に対して相補的な一本鎖アンチセンス核酸配列とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）標的タンパク質をコードする核酸配列を含む標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）標的タンパク質の発現を工程（b）の接触によって調節し、それにより、標的タンパク質の発現が調節されること
を含む方法。
【請求項６０】
標的タンパク質が発現される程度を測定することをさらに含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項59に記載の方法。
【請求項６２】
標的タンパク質の発現を調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、多数の標的化媒介因子と、標的タンパク質をコードする核酸配列に対して相補的な一本鎖アンチセンス核酸配列とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）標的タンパク質をコードする核酸配列を含む標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）標的タンパク質の発現を工程（b）の接触によって調節し、それにより、標的タンパク質の発現が調節されること
を含む方法。
【請求項６３】
標的タンパク質が発現される程度を測定することをさらに含む、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項62に記載の方法。
【請求項６５】
サンプルにおける転写を調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、核局在化シグナルと、リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）を含む活性な薬剤とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）野生型転写成分を含むサンプルをナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）サンプルにおける転写を工程（b）の接触によって調節し、それにより、サンプルにおける転写が調節されること
を含む方法。
【請求項６６】
前記リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）がモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
前記リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）が修飾型ホスホジエステル結合を含む、請求項65に記載の方法。
【請求項６８】
前記リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）は、調節タンパク質をコードする核酸配列と相互作用し、それにより、（a）転写不能な三次元構造および（b）翻訳不能な三次元構造の少なくとも1つを形成する能力を有する、請求項65に記載の方法。
【請求項６９】
ナノ粒子送達ビヒクルは、リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）およびナノ粒子に結合した連結配列で、該リガンドと該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む、請求項65に記載の方法。
【請求項７０】
転写が調節される程度を測定することをさらに含む、請求項65に記載の方法。
【請求項７１】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
サンプルにおける転写を調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、多数の標的化媒介因子と、リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）を含む活性な薬剤とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）野生型転写成分を含むサンプルをナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）サンプルにおける転写を工程（b）の接触によって調節し、それにより、サンプルにおける転写が調節されること
を含む方法。
【請求項７３】
前記リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）がモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項72に記載の方法。
【請求項７４】
前記リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）が修飾型ホスホジエステル結合を含む、請求項72に記載の方法。
【請求項７５】
前記リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）は、調節タンパク質をコードする核酸配列と相互作用し、それにより、（a）転写不能な三次元構造および（b）翻訳不能な三次元構造の少なくとも1つを形成する能力を有する、請求項72に記載の方法。
【請求項７６】
ナノ粒子送達ビヒクルは、リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）およびナノ粒子に結合した連結配列で、該リガンドと該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む、請求項72に記載の方法。
【請求項７７】
転写が調節される程度を測定することをさらに含む、請求項72に記載の方法。
【請求項７８】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
サンプルにおけるRNAスプライシングを調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、核局在化シグナルと、標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列、または標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが疑われる核酸配列とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）標的遺伝子を含むサンプルをナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）サンプルにおけるRNAスプライシングを工程（b）の接触によって調節し、それにより、サンプルにおけるRNAスプライシングが調節されること
を含む方法。
【請求項８０】
標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列、または標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが疑われる核酸配列がモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列、または標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが疑われる核酸配列が修飾型ホスホジエステル結合を含む、請求項79に記載の方法。
【請求項８２】
ナノ粒子送達ビヒクルは、標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列、または標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが疑われる核酸配列およびナノ粒子に結合した連結配列で、該核酸配列と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む、請求項79に記載の方法。
【請求項８３】
サンプルにおけるRNAスプライシングが調節される程度を測定することをさらに含む、請求項79に記載の方法。
【請求項８４】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
サンプルにおけるRNAスプライシングを調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、多数の標的化媒介因子と、標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列、または標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが疑われる核酸配列とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）標的遺伝子を含むサンプルをナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）サンプルにおけるRNAスプライシングを工程（b）の接触によって調節し、それにより、サンプルにおけるRNAスプライシングが調節されること
を含む方法。
【請求項８６】
標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列、または標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが疑われる核酸配列がモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項85に記載の方法。
【請求項８７】
標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列、または標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが疑われる核酸配列が修飾型ホスホジエステル結合を含む、請求項85に記載の方法。
【請求項８８】
ナノ粒子送達ビヒクルは、標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列、または標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが疑われる核酸配列およびナノ粒子に結合した連結配列で、該核酸配列と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む、請求項85に記載の方法。
【請求項８９】
サンプルにおけるRNAスプライシングが調節される程度を測定することをさらに含む、請求項85に記載の方法。
【請求項９０】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の翻訳を調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、核局在化シグナルと、目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）目的とするタンパク質をコードするmRNA配列を含むサンプルをナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の翻訳を工程（b）の接触によって調節し、それにより、目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の翻訳が調節されること
を含む方法。
【請求項９２】
ナノ粒子は直径が1,000nm以下である、請求項91に記載の方法。
【請求項９３】
ナノ粒子は直径が約30nm〜約1,000nmである、請求項91に記載の方法。
【請求項９４】
目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列がモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項91に記載の方法。
【請求項９５】
目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列が修飾型ホスホジエステル結合を含む、請求項91に記載の方法。
【請求項９６】
目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列は、目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列と相互作用し、それにより、（a）転写不能な三次元構造および（b）翻訳不能な三次元構造の少なくとも1つを形成する能力を有する、請求項91に記載の方法。
【請求項９７】
ナノ粒子送達ビヒクルは、目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列およびナノ粒子に結合した連結配列で、該一本鎖核酸配列と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む、請求項91に記載の方法。
【請求項９８】
溶液中の調節タンパク質の濃度が調節される程度を測定することをさらに含む、請求項91に記載の方法。
【請求項９９】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項98に記載の方法。
【請求項１００】
目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の翻訳を調節する方法であって、
（a）ナノ粒子と、多数の標的化媒介因子と、目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列とを含むナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；
（b）目的とするタンパク質をコードするmRNA配列を含むサンプルをナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および
（c）目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の翻訳を工程（b）の接触によって調節し、それにより、目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の翻訳が調節されること
を含む方法。
【請求項１０１】
ナノ粒子は直径が1,000nm以下である、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
ナノ粒子は直径が約30nm〜約1,000nmである、請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列がモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、請求項100に記載の方法。
【請求項１０４】
目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列が修飾型ホスホジエステル結合を含む、請求項100に記載の方法。
【請求項１０５】
目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列は、目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列と相互作用し、それにより、（a）転写不能な三次元構造および（b）翻訳不能な三次元構造の少なくとも1つを形成する能力を有する、請求項100に記載の方法。
【請求項１０６】
ナノ粒子送達ビヒクルは、目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列およびナノ粒子に結合した連結配列で、該一本鎖核酸配列と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む、請求項100に記載の方法。
【請求項１０７】
溶液中の調節タンパク質の濃度が調節される程度を測定することをさらに含む、請求項100に記載の方法。
【請求項１０８】
測定が、SDS−PAGE、酵素活性アッセイ、ELISAに基づくアッセイ、分光学的アッセイ、ノーザンブロット、サザンブロット、および放射線学に基づくアッセイからなる群から選択される技術によって行われる、請求項100に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、米国仮特許出願第60/304,236号（2001年7月10日出願；これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に基づいており、それに対する優先権を主張する。
【０００２】
補助金に関する言及
本研究はNSF補助金NSF−DMR（9900073）および同NSF−MDB（9874895）によって援助された。従って、合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、活性な薬剤を細胞または細胞内に送達するための組成物、および活性な薬剤を細胞または細胞内に送達する方法に関する。より詳細には、本発明の方法では、ナノ粒子送達ビヒクルが、タンパク質、核酸、タンパク質アナログ、核酸アナログ、小分子、および他の化合物を細胞の表面または細胞の細胞質内または細胞の核内に運ぶためのビヒクルとして用いられる。
【０００４】
背景技術
略号表
【表１】
2005511761.tif 000002
【表２】
2005511761.tif 000003
【表３】
2005511761.tif 000004
【０００５】
アミノ酸略号
【表４】
2005511761.tif 000005
【表５】
2005511761.tif 000006
【０００６】
（背景技術）
タンパク質または核酸などの高分子を治療剤として使用する新しい形態の治療法の開発では、そのような高分子をその適切な細胞標的に送達する新しい効果的な方法を開発する必要がある。欠損遺伝子もしくは不完全な遺伝子にとって代わるか、または欠損遺伝子もしくは不完全な遺伝子を補うために、特異的なポリペプチド増殖因子または特異的な遺伝子のいずれかを使用することに基づく治療法は、そのような新しい送達システムを必要とし得る治療法の例である。遺伝子または他のDNAセグメントの発現を調節するためにDNAと相互作用するオリゴヌクレオチドを伴う治療法ではまた、新しい送達システムが必要とされ得る。そのような治療の臨床的適用は、新しい送達システムの確実性および効率だけでなく、その安全性、そしてこれらのシステムの基礎となる技術が、治療用配合物の大規模な薬学的製造および貯蔵および配布のために適合化され得る容易さにも依存する。
【０００７】
遺伝子治療は、様々な遺伝的障害を処置するますます重要な様式になってきている。効果的な処置を提供することに対する潜在的可能性により、精力的な努力が、効果的な処置がこれまで行われなかった疾患に対してこの技術を適用するために刺激されてきた。この領域における近年の進歩により、遺伝子治療は、単一遺伝子障害の処置だけでなく、ガンなどの他のより複雑な疾患に対してもまた顕著な影響を有し得ることが示されている。しかし、効率的な遺伝子治療法を得ることにおける著しい障害の1つが、治療核酸を細胞および細胞内標的に送達するための新しい効果的な方法を設計することが困難であるということである。実際、核酸またはタンパク質を細胞内または組織内に送達するための理想的なビヒクルは、非常に効率的かつ安全に使用することができ、大量生産が容易であり、そして医薬品送達ビヒクルとして実施可能であるために十分な安定性を有しなければならない。
【０００８】
核酸が遺伝子治療法における「活性な薬剤」として使用されるとき、本質的には、この分野で記載される、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに基づく2つのシステムが存在する：（1）レトロウイルス、アデノウイルスおよびヘルペスウイルス（またはそれらの組換え体）が、現在、ウイルスベクターとしてインビボで研究中である；（2）リポソーム、および細胞表面の特異的な受容体のリガンドが、非ウイルスベクターとしてインビボで研究中である（Wu＆Wu、（1991）Biotherapy、3：87〜95；Ledley、（1993）Clin.Invest.Med.、16：78〜88）。ナノ結晶性粒子もまた調べられている（米国特許第5,460,831号、Kossovsky）。これらの方法はすべてが、インビボでの望ましくない分解、そして所与の標的構造体（例えば、特定タイプの構造体を発現する細胞の核または細胞の表面）に対する特異性がないことを含む様々な欠点に悩まされている。
【０００９】
ナノ粒子技術は、様々な研究分野で応用されているが、薬理学および薬物送達ではあまり応用されていない。治療用ナノ粒子の開発が1970年頃に最初に試みられた。提案されたナノ粒子は、抗ガン薬および他の薬物のキャリアとして機能させるためのものであった（Couvreur他、（1982）J.Pharm.Sci.、71：790〜92）。様々な試みがまた、細網内皮系（RES）の細胞によるナノ粒子の取り込みが最小限に抑えられる方法を解明するためにも行われた（Couvreur他、（1986）、Polymeric Nanoparticles and Microspheres（Guiot＆Couvreur編）、CRC Press、Boca Raton、27頁〜93頁）。他の試みでは、ナノ粒子の使用が、特異的な障害を処置するために追求された。例えば、Labhasetwar他、（1997）Adv.Drug.Del.Rev.、24：63〜85を参照のこと。
【００１０】
ナノ粒子は、薬物送達システムに対する有用なツールとして有望であることが示されているが、多くの問題が依然として存在する。未解決の問題のいくつかは、様々な粒子サイズの制御、選択および挙動、ならびに、治療法で粒子の充填にまつわる様々な問題に関連する。また、適切な細胞部位へのナノ粒子の標的化は依然として問題のままである。従って、これらの問題に取り組むナノ粒子送達ビヒクルの設計および提供は、この分野における、今も継続し、待ち望まれている要求である。
【００１１】
発明の開示
ナノ粒子送達ビヒクルが開示される。1つの実施形態において、ナノ粒子送達ビヒクルは、（a）ナノ粒子；（b）活性な薬剤；および（c）核局在化シグナルを含む。別の実施形態において、ナノ粒子送達ビヒクルは、（a）多数の標的化媒介因子；（b）ナノ粒子足場；および（c）活性な薬剤を含む。
【００１２】
好ましくは、活性な薬剤は、二本鎖核酸、一本鎖核酸、化学修飾された核酸、ペプチド核酸、タンパク質および小分子からなる群から選択される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは、活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは細胞表面認識配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは薬学的に受容可能な希釈剤に配置される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは検出可能な成分をさらに含む。
【００１３】
必要な場合には、ナノ粒子送達ビヒクルは2つ以上の異なる活性な薬剤をさらに含むことができる。また、必要な場合には、ナノ粒子送達ビヒクルは生体適合性増強剤をさらに含むことができる。さらなる選択肢として、ナノ粒子送達ビヒクルは、送達ビヒクルの少なくとも一部分を覆う保護被覆をさらに含むことができる。1つの実施形態において、保護被覆は、活性な薬剤（1つまたは複数）および標的化媒介因子（1つまたは複数）を含む送達ビヒクル全体を覆うことができる。保護被覆はポリマーを含むことができる。保護被覆はまた生物学的材料を含むことができる。生物学的材料は、タンパク質、脂質、炭水化物、またはそれらの組合せであり得る。
【００１４】
活性な薬剤を細胞の核に送達する方法が開示される。この方法は、（a）直径が約30nm以下であるナノ粒子を含む本発明のナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；および（b）標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させ、それにより、活性な薬剤を標的細胞の核に送達させることを含む。好ましくは、活性な薬剤は、二本鎖核酸、一本鎖核酸、化学修飾された核酸、ペプチド核酸、タンパク質および小分子からなる群から選択される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは、活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは細胞表面認識配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは薬学的に受容可能な希釈剤に配置される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは検出可能な成分をさらに含む。
【００１５】
活性な薬剤を細胞の細胞質に送達する方法が開示される。この方法は、（a）直径が約30nm以上であるナノ粒子を含む本発明のナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；および（b）標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させることを含む。好ましくは、活性な薬剤は、二本鎖核酸、一本鎖核酸、化学修飾された核酸、ペプチド核酸、タンパク質および小分子からなる群から選択される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは、活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは細胞表面認識配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは薬学的に受容可能な希釈剤に配置される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは検出可能な成分をさらに含む。
【００１６】
標的核酸配列の発現を調節する方法が開示される。この方法は、（a）その発現が調節されることになる標的核酸配列と相互作用することができる活性な薬剤を含む本発明のナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；（b）標的核酸配列を含む標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および（c）標的核酸配列の発現を工程（b）の接触によって調節することを含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは、活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは細胞表面認識配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは薬学的に受容可能な希釈剤に配置される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは検出可能な成分をさらに含む。
【００１７】
標的タンパク質の発現を調節する方法が開示される。この方法は、（a）標的タンパク質をコードする核酸配列に対して相補的である一本鎖アンチセンス核酸配列を含む本発明のナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；（b）標的タンパク質をコードする核酸配列を含む標的細胞をナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および（c）標的タンパク質の発現を工程（b）の接触によって調節することを含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは、活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは細胞表面認識配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは薬学的に受容可能な希釈剤に配置される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは検出可能な成分をさらに含む。
【００１８】
サンプルにおける転写を調節する方法が開示される。この方法は、（a）リガンド（ただし、このリガンドに対する野生型転写成分は該野生型転写成分の天然リガンドよりも大きい親和性を有する）を含む活性な薬剤を含む本発明のナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；（b）野生型転写成分を含むサンプルをナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および（c）サンプルにおける転写を工程（b）の接触によって調節することを含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは、活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは細胞表面認識配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは薬学的に受容可能な希釈剤に配置される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは検出可能な成分をさらに含む。
【００１９】
サンプルにおけるRNAスプライシングを調節する方法が開示される。この方法は、（a）標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列、または標的遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが疑われる核酸配列を含む本発明のナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；（b）標的遺伝子を含むサンプルをナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および（c）サンプルにおけるRNAスプライシングを工程（b）の接触によって調節することを含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは、活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは細胞表面認識配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは薬学的に受容可能な希釈剤に配置される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは検出可能な成分をさらに含む。
【００２０】
目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の翻訳を調節する方法が開示される。この方法は、（a）目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列を含む本発明のナノ粒子送達ビヒクルを提供すること；（b）目的とするタンパク質をコードするmRNA配列を含むサンプルをナノ粒子送達ビヒクルと接触させること；および（c）目的とするタンパク質をコードするmRNA配列の翻訳を工程（b）の接触によって調節することを含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは、活性な薬剤およびナノ粒子に結合した連結配列で、該活性な薬剤と該ナノ粒子との間に配置された連結配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは細胞表面認識配列をさらに含む。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは薬学的に受容可能な希釈剤に配置される。好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルは検出可能な成分をさらに含む。
【００２１】
従って、ナノ粒子送達ビヒクルを提供することは本発明の目的の1つのである。この目的および他の目的は、本発明によって全体または一部が達成される。
【００２２】
本明細書中上記で言及された本発明の目的のいくつか、他の目的は、本明細書中下記に最も良く記載されるように、添付された図面と一緒にされたとき、説明が進むに従って明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】5nmのナノ粒子を含む培地で増殖させた肝細胞の透過電子顕微鏡写真である。核の領域が挿入図に強調される。
【図１Ｂ】30nmのナノ粒子を含む培地で増殖させた肝細胞の透過電子顕微鏡写真である。小胞を含む細胞質の領域が挿入図に強調される。
【００２４】
発明の詳細な記載
本発明は、タンパク質、核酸、タンパク質アナログ、核酸アナログ、小分子および他の化合物を細胞の表面および／または細胞の細胞質内および／または細胞の核内に運ぶためのビヒクルとしてのナノ粒子送達ビヒクルを提供する。多数の配列をナノ粒子送達ビヒクルと結合させることができ、好ましくは、RME配列およびNLS配列などの多数の異なる配列をナノ粒子送達ビヒクルと結合させることができる。これらの配列は、細胞の核膜または細胞の外膜などの様々な膜を横断するビヒクルの輸送を助けることができる。従って、細胞内または細胞表面の所与の場所へのビヒクルの輸送を一般には阻害する膜および他の構造体が「錠」として類比されるならば、NLS配列およびRME配列は「鍵」として類比することができる。従って、好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、多数の異なる配列または「鍵」を含むことができ、これらにより、所与のナノ粒子送達ビヒクルは、様々な異なる細胞タイプにおける輸送に対する様々な潜在的なバリアを通過することができるようになり得る。
【００２５】
I．  定義
長年の特許法の慣例に従い、用語“a”および用語“an”は、請求項を含めて本明細書で使用されるとき、“one or more”（1つまたは2つ以上）を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「活性な薬剤」は治療剤を意味し、これには、化学療法剤、放射線療法剤もしくは放射線増感剤；造影剤；診断剤；または、細胞内タンパク質、核酸、可溶性もしくは不溶性のリガンドと相互作用することが知られている他の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列、およびそれらのフラグメント、ならびに天然に存在する分子または合成された分子を意味する。その場合、「アミノ酸配列」は、合成ペプチド分子または天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列、およびアミノ酸配列などを示すために本明細書中では列挙される。この用語は、アミノ酸配列を、列挙されたタンパク質分子と関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定することを意味せず、本来のアミノ酸配列に対する様々な変化体をも包含することが意図される。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「生分解性（の）」は任意の構造体を意味し、これには、生理学的条件に長期間さらされた後に分解するか、またはそうでなければ崩壊するナノ粒子が含まれるが、これに限定されない。生分解性であるためには、構造体は、体内に導入された後、数週間以内に実質的に崩壊しなければならない。ブルッシャイトは、好ましい生分解性ナノ粒子材料である。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「細胞外標的化媒介因子」および用語「細胞表面認識配列」は交換可能に使用され、特定の細胞の表面に存在する1つまたは2つ以上の受容体が認識および結合する小分子またはタンパク質配列を示す。細胞表面認識配列には、HIVコートタンパク質（gp160、gp41、gp120）、コロナウイルスコートタンパク質、EBVコートタンパク質（gp350）およびペプチドを挙げることができる。他の代表的な、しかし非限定的な細胞表面認識配列には、炭水化物および脂質、炭水化物、ペプチド核酸、モルホリノオリゴヌクレオチドおよびポリマーが含まれ得る。用語「細胞表面認識配列」は、細胞表面受容体が認識および／または結合する任意の配列または分子を包含することが意図される。細胞表面受容体が認識および／または結合する「細胞表面認識配列」により、受容体媒介エンドサイトーシス（RME）がもたらされることは、必要ではないが、好ましいことである。RMEによる取り込みのために標的化媒介因子として用いられ得る代表的な成分の一覧が表1に示される。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「化学的修飾」は、第1の成分に第2の成分を共有結合的または非共有結合的またはイオン的に結合させることによって第1の成分を変化させることを意味する。化学的修飾では、検出可能な成分をペプチドまたはタンパク質に付加することが伴い得る。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「検出（すること）」は、標的実体の存在下でもっぱら現れる電気的シグナルまたは放射線学的シグナルまたは分光学的シグナルなどの検出可能なシグナルの発生を観測することによって標的実体の存在を確認することを意味する。この用語は、電気泳動技術およびブロッティング技術（ノーザンブロット、サザンブロット、ウエスタンブロットおよぴファーウエスタンブロットを含む）の使用を包含する。用語「検出（すること）」にはまた、透過電子顕微鏡観察などの顕微鏡観察技術の使用が含まれる。事象、または化合物の存在を「検出すること」は、例えば、転写因子の存在を検出するために転写速度をモニターすることによって直接的または間接的に行うことができる。従って、用語「検出（すること）」は、広義には、事象、化合物、分子などの存在または非存在を同定することを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「遺伝子」は、簡略化のために使用され、機能的なタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドをコードするユニットを意味する。当業者によって理解されるように、この機能的な用語には、ゲノム配列およびcDNA配列の両方が含まれる。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「金」は、化学記号Auを有する79番元素を意味する。従って、この用語には、具体的には、色または他の色彩的性質に関連する何らかの第二義的意味は含まれない。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「相同性」は相補性の程度を意味する。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）が存在し得る。ある同一配列が標的核酸にハイブリダイゼーションすることを少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列は、「実質的に相同的」であると見なすことができる。完全に相補的な配列の標的配列に対するハイブリダイゼーションの阻害は、低いストリンジェンシーの条件のもとでのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、および溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して調べることができる。実質的に相同的な配列またはハイブリダイゼーションプローブは、低いストリンジェンシーの条件のもとで、完全に相同的な配列が標的配列に結合することに対して競合し、その結合を阻害する。このことは、低いストリンジェンシーの条件が、非特異的な結合が許されるような条件であるということではなく、従って、低いストリンジェンシーの条件では、2つの配列の相互の結合が特異的（すなわち、選択的）な相互作用であることが要求される。非特異的な結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性さえもない（例えば、同一性が約30％未満である）第2の標的配列を使用することによって調べることができる。非特異的な結合が存在しない場合、プローブは第2の非相補的な標的配列にハイブリダイゼーションしない。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、プローブサンプルが標的サンプルに結合することを意味する。プローブサンプルは、検出可能な成分が結合し、それにより、プローブサンプルの存在または非存在を検出することを可能にする分子を含むことができる。
【００３６】
本明細書中で使用される用語「相互作用する」は、例えば、透過電子顕微鏡観察または蛍光顕微鏡観察を使用して検出することができるような、分子間の検出可能な相互作用を意味する。用語「相互作用する」はまた、分子間の「結合」相互作用を含むことが意味される。相互作用は、実際には、例えば、核酸−核酸、タンパク質−タンパク質、またはタンパク質−核酸であり得る。
【００３７】
本明細書中で使用される用語「単離された」は、会合し得る他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に含まないオリゴヌクレオチドを意味する。この場合、そのような会合は細胞性物質または合成媒体のいずれかにおいてである。この用語はまた、ポリペプチドに対しても適用され得る。そのような場合、ポリペプチドは、核酸、炭水化物、脂質および他の望ましくないポリペプチドを実質的に含まない。
【００３８】
本明細書中で使用される用語「標識された」は、電気化学的方法、分光学的方法、放射線学的方法または他の方法によって検出することができる成分がプローブ分子に共有結合的または非共有結合的またはイオン的に結合していることを意味する。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「修飾（改変）された」は、実体の通常的に存在する状態から変化していることを意味する。実体は、別個の化学的ユニットを除くことによって、または別個の化学ユニットを付加することによって修飾することができる。用語「修飾（改変）された」は、検出可能な標識、ならびに精製の際に補助として付加されるそのような実体を包含する。通常的に存在する状態からの何らかの変化は、程度にかかわらず、用語「修飾（改変）された」によって包含される。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「調節する」は、核酸配列またはペプチドまたは小分子によって媒介されるサンプルの、任意またはすべての化学的および生物学的な活性または性質の増大または減少または他の変化を意味する。本明細書中で使用される用語「調節する」は、応答または性質のアップレギュレーション（すなわち、活性化または刺激）およびダウンレギュレーション（すなわち、阻害または抑制）の両方を示すために本明細書中では使用される。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「変異」は、その従来の第二義的意味を有し、核酸配列またはポリペプチド配列における変化（遺伝的変化、天然に存在する変化、または導入された変化）を意味しており、当業者には一般に知られているその意味で使用される。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「ナノ」、用語「ナノスコピック」、用語「ナノメートルサイズの」、用語「ナノ構造の」、用語「ナノスケール」、用語「DNA−ナノ粒子複合体」およびそれらの文法的派生表現は、同義的かつ交換可能に使用され、直径が約1000ナノメートル（nm）以下であり、好ましくは直径が約30nm未満であり、より好ましくは約10nm未満であるナノ粒子およびナノ粒子コンポジットおよび中空ナノカプセルを意味する。ナノ粒子は任意の材料から作製することができる。好ましいナノ粒子は半導体材料または金属から作製され、好ましくは、金、TiO2、金含有材料またはTiO2含有材料から作製される。生分解性材料（例えば、ポリペプチド）もまた好ましい。これらの用語は、ナノ粒子の金属成分だけでなく、金属および他の成分要素のコンポジットもまた示すことができる。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「ナノ粒子」は、十分な量のナノ粒子が血流内への注射の後に実質的に無傷であり続けるように、使用環境との生体適合性を有し、かつ使用環境による化学的分解および／または物理的分解に対して十分な抵抗性を有するキャリア構造体で、細胞の核または特定の他の細胞構造体に到達することができるように腹腔内もしくは経口的に投与されるか、またはインビトロサンプルと一緒にインキュベーションされるキャリア構造体を示す。薬物が、ナノ粒子に吸着される形態で細胞内に進入し得る場合、ナノ粒子はまた、細胞内に進入するために十分な完全性を維持しなければならない。ナノ粒子の生分解は、細胞の核に進入したときには許される。ナノ粒子は、サイズが1nm〜1000nmの範囲にある固体のコロイド状粒子であり得る。ナノ粒子は、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、50nm、100nm、500nmおよび750nmを含む、1000nm以下の任意の直径を有することができる。薬物、活性な薬剤、生物活性な物質、または他の関連する物質をナノ粒子とインキュベーションすることができ、それにより、ナノ粒子に吸着または付着させることができる。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「ナノ粒子金属成分」は、核局在化シグナル、薬物、生物活性な物質および他の関連する物質が結合している本発明のナノ粒子送達ビヒクルの成分を意味する。典型的には、しかし、必ずしも必要ではないが、ナノ粒子金属成分は、金属原子を含むほぼ球状の実体を含む。好ましくは、ナノ粒子金属成分は元素状金属または半導体材料であり、例えば、金粒子またはTiO2粒子などである。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「核局在化シグナル」は、細胞の細胞質内に配置されたタンパク質を、核膜を横断して細胞の核内にインビボで誘導することが知られているアミノ酸配列を意味する。核局在化シグナルはまた、細胞の外表面を標的化することができる。従って、1個の核局在化シグナルにより、核局在化シグナルが結合している実体を細胞の外側および細胞の核に誘導することができる。そのような配列は任意のサイズおよび組成（例えば、25個以上、25個、15個、12個、10個、8個、7個、6個、5個または4個のアミノ酸）を有することができ、しかし、好ましくは、核局在化シグナル（NLS）として知られている、少なくとも4アミノ酸〜8アミノ酸の配列を含む。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能な」およびその文法的派生表現は、組成物、キャリア、希釈物および試薬を示すとき、その材料が、望ましくない生理学的作用（悪心、めまい、胃の不調および発熱など）を生じさせることなく脊椎動物対象に投与または塗布することができることを意味する。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」、用語「タンパク質」、用語「遺伝子産物」および用語「ペプチド」は交換可能に使用され、そのサイズにかかわらず、20個のタンパク質アミノ酸のいずれかを含む任意のポリマーを意味する。「タンパク質」は、比較的大きいポリペプチドを参照して使用されることが多く、そして、「ペプチド」は、小さいポリペプチドを参照して使用されることが多いが、この分野におけるこれらの用語の使用法は重なっており、一定していない。本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、別途示されない限り、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を示す。本明細書中で使用される用語「タンパク質」、用語「ポリペプチド」および用語「ペプチド」は、遺伝子産物を示すとき、本明細書中では交換可能に使用される。
【００４８】
本明細書中で使用される用語「配列決定する」は、この分野で知られている手作業による実験室技術または自動化された実験室技術を使用して、DNA標的サンプルまたはペプチド（もしくはタンパク質）標的サンプルの核酸またはアミノ酸の順序づけられた一次配列を決定することを意味する。
【００４９】
本明細書中で使用される用語「小分子」は、分子量が5000ダルトン以下である分子を意味する。
【００５０】
本明細書中で使用される用語「実質的に純粋な」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その天然の状態においてそれらが結合する配列および分子、ならびに分離手順の際に使用されたそのような分子を実質的に含まないことを意味する。用語「実質的に含まない」は、サンプルが、実際にそれらが結合する物質および化合物の少なくとも50％（好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは90％）を含まないことを意味する。
【００５１】
本明細書中で使用される用語「標的媒介因子」は、標的媒介因子と結合した成分を細胞の表面または特定タイプの細胞の表面または細胞の核に誘導する能力を有する任意の因子を意味する。標的媒介因子には、タンパク質、ペプチド、小分子、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸が含まれ得るが、これらに限定されない。標的媒介因子は、標的媒介因子と結合した成分を細胞の表面または特定タイプの細胞の表面に誘導するその能力を保持する限り、任意のサイズにすることができる。
【００５２】
本明細書中で使用される用語「治療剤」は、治療効果を有する任意の薬剤を意味し、これには、化学療法剤、毒素、放射線療法剤、または放射線増感剤が含まれるが、これらに限定されない。また、この用語には、遺伝子治療ベクター、アンチセンス核酸構築物、および転写因子デコイも含まれる。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「転写因子」は、DNAの転写に関与するポリペプチドを意味する。転写因子は、DNAと結合することができるが、DNAと結合することは要求されない。転写因子は外部の刺激に応答して機能することができ、または転写因子の作用は構成的であり得る。
【００５４】
本明細書中で使用される用語「転写因子デコイ」および用語「デコイ」は交換可能に使用され、転写因子に結合するか、もしくは転写因子と相互作用し、かつ／または本来のエンハンサー配列に対するその結合を妨げる分子を意味する。デコイには、本来のエンハンサーに対応する（すなわち、同一であるか、または本質的に同一である）オリゴヌクレオチド（これに限定されない）を含む核酸配列が含まれる。そのようなオリゴヌクレオチドには、エンハンサー配列の1回または2回以上の反復を含む一本鎖の回文状オリゴヌクレオチド；エンハンサー配列の1回または2回以上の反復を含むセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド；転写因子に対する二重鎖結合部位が生じるようにヘアピン構造を形成するオリゴヌクレオチド；転写因子に対する1つまたは2つ以上の結合部位が生じるように十字型構造を形成する1つまたは2つ以上のオリゴヌクレオチド；そして転写因子のゲノム結合部位に対する親和性が天然型DNA配列よりも大きい二本鎖DNA配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「野生型」は、タンパク質配列または核酸配列の天然に存在する形態を意味する。この用語は、変異が明らかにされる基準を示すためには使用されない。用語「野生型」は、タンパク質配列または核酸配列が自然界において最も一般的に見出されるようなタンパク質配列または核酸配列の形態を記載することが意味される。
【００５６】
II．  一般的な考慮すべき事項
本発明は、部分的には、遺伝子発現の調節および調整に関する。遺伝子発現は、（a）ゲノム内への取り込み、（b）遺伝子の発現（これはときには「一過性トランスフェクション」と見なされることがある）、（c）調節タンパク質の濃度を変化させること（この場合、ビヒクルが転写因子デコイとして作用し得る）、（d）RNAスプライシングを変化させること、（e）細胞質内においてメッセンジャーRNAを組み立てること、（f）RNA干渉、または（g）三重らせんなどの転写不能な構造の形成を誘導することによってDNAセグメントの発現を変化させることのために、外部のDNAオリゴヌクレオチドまたはRNAオリゴヌクレオチド（またはホスホロチオナートDNA／RNAなどのアナログ）を細胞に入れることによって調節することができる。（a）、（b）および（g）に対する方法では、比較的長い二本鎖DNAオリゴマーを核に送達することが一般には伴う。（c）〜（g）に対する方法では、特定の調節タンパク質に対するオペレーター（すなわち、結合部位として作用することが知られているDNA配列）である短いDNAオリゴマーが伴い得る。
【００５７】
（d）および（e）に対する方法では、RNA、DNA、またはペプチド核酸およびモルホリノDNA／RNAオリゴヌクレオチドなどのアナログ、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が伴い得る。しかしながら、非常に多くの困難が、アンチセンス方法を実施する際には存在している。現在、おそらくは、このことは送達問題に関連すると考えられているか、あるいは、細胞が、特定メッセージの濃度の低下を抑えるための機構を有すると考えられている。いずれの場合にせよ、核へのオリゴヌクレオチドの送達は、依然として、（a）〜（d）の方法に対する必要条件である。
【００５８】
（e）および（f）の方法の場合、オリゴヌクレオチドを細胞質に送達することが必要であるにすぎないと考えられるが、これは、オリゴヌクレオチドがどのように途中で妨げられることになるかに依存する。従って、オリゴヌクレオチドの制御された送達は、遺伝子発現の機構を理解し、かつ遺伝子発現の制御を達成することに対する手段である。本発明は、直接、この歴史的なアンチセンス問題に取り組んでいる。
【００５９】
本発明の1つの目的は、遺伝子発現の調節および／または混乱である。これは、研究のために、そしてまた治療適用においてともに有用である。送達は、これらの適用に対するオリゴヌクレオチドおよび化学修飾オリゴヌクレオチドの使用における主要な障害である。様々な組成のナノ粒子を、所望する結果を達成するために使用することができる。チタン、二酸化チタン、スズ、酸化スズ、ケイ素、二酸化ケイ素、鉄、酸化鉄III、銀、ニッケル、金、銅、アルミニウムおよび他の材料などの材料を使用することができる。しかしながら、金が、好ましい材料である。金ナノ粒子には、利点がいくつかある。第1に、金ナノ粒子では、ナノ粒子のサイズ、そして下記に説明されるように、細胞レベル以下での局在化を容易に調節することができる。また、そのようなナノ粒子の合成は容易であり、そしてこの分野で認められている多くの技術を利用することができる。
【００６０】
ナノ粒子は、連続水相における乳化重合、連続有機相における乳化重合、界面重合、溶媒析出、溶媒蒸発、有機ポリマー溶液の溶解、乳化状態での水溶性ポリマーの架橋、高分子の溶解、および炭水化物の架橋を含む様々な知られている方法によって都合よく製造することができる。これらの製造方法は広範囲の材料とともに行うことができる。金属原子および金属原子を含む構造体もまた、効果的なナノ粒子として役立ち得る。ナノ粒子は、固体であり得るか、または材料を含有することができる中空構造体を含むことができる。
【００６１】
本発明の送達ビヒクルは、1つまたは2つ以上の適切なオリゴヌクレオチドをナノ粒子と結合させて含むことができる。次に、輸送を助け、ナノ粒子を核に誘導する核局在化シグナルまたは他の局在化ペプチドがナノ粒子に結合させられる。ナノ粒子のサイズは、核への輸送を妨げるために、このことが望ましいときには使用することができる。最後に、適切なタンパク質もまた粒子の表面に局在化させることができる。適切なタンパク質には、所与の適用に対して有用なリガーゼまたは制限酵素または他のDNAプロセシング酵素を含むことができる。送達ビヒクルの局在化および効果を、その後、活性なナノ粒子の細胞内の濃度および局在化を明らかにするために、透過電子顕微鏡観察、ラマン顕微鏡観察、共焦点顕微鏡観察および他の分析技術を使用して確認することができる。5nmもの小さいナノ粒子を含む送達ビヒクルでさえ、上記の分析技術の1つまたは2つ以上を使用して確認することができる。
【００６２】
従って、本発明は、この分野で遭遇する薬物送達ビヒクルのようなナノ粒子の問題を解決するための新規な方法を提供する。具体的には、本発明は、生物学的に活性な構造体を必ずしもカプセル化する必要がなく、むしろ、生物学的に活性な構造体をナノ粒子の表面に結合させるための足場として役立つナノ粒子を開示する。重要なことに、本発明のナノ粒子はまた、治療剤を細胞の核に標的化することができる核局在化シグナルをも含むことができる。本発明が開示されるまでは、核局在化シグナルは、形質膜および核膜の両方を横断してナノ粒子を誘導するためには使用されていなかった。
【００６３】
本発明の別の局面において、多数の配列をナノ粒子送達ビヒクルと結合させることができる。RME配列などの様々な配列もまたビヒクルと結合させることができる。これらのさらなる配列は、細胞の核膜または細胞の外膜などの様々な膜を横断するビヒクルの輸送を助けることができる。従って、細胞内または細胞表面の所与の場所へのビヒクルの輸送を一般には阻害する膜および他の構造体が「錠」として類比されるならば、NLS配列およびRME配列は「鍵」として類比することができる。従って、好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子送達ビヒクルは多数の異なる配列または「鍵」を含むことができ、これらにより、所与のナノ粒子送達ビヒクルは、輸送に対する様々な潜在的なバリアを通過することができるようになり得るし、そして様々な異なる細胞タイプの標的化がもたらされ得る。
【００６４】
本発明は、温血動物を含む様々な対象、特に哺乳動物（これには、ヒト、イヌ、ネコおよび他の小動物、ならびに農場動物が含まれる）に関して使用され得るナノ粒子送達ビヒクルを記載する。また、本発明のナノ粒子は、原核生物微生物および真核生物微生物とともに、ならびにインビトロ培養物とともに使用することができる。本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、上記対象のすべてにおける診断剤として、ならびに治療剤として使用することができる。生物学的に活性な構造体のタイプ、本発明のナノ粒子が導入され得る対象については何ら制限されない。例えば、米国特許第5,783,263号および同第6,106,798号を参照のこと。また、Colloid Drug Delivery Systems（1994）（Kreuter編）、Marcel Dekker,Inc.、New York、219頁〜342頁；Kreuter、（1994）Eur.J.Drug Metab.Ph.、3：253〜56を参照のこと。
【００６５】
IV．  標的化可能なナノ粒子送達ビヒクルの選択および調製
本発明の標的化可能なナノ粒子送達ビヒクルは、好ましくは、少なくとも3つの成分、すなわち、ナノ粒子と、1つまたは2つ以上の標的化媒介因子（例えば、核局在化シグナルおよび細胞表面標的化シグナルなどの「鍵」）と、1つまたは2つ以上の活性な薬剤とを含む。活性な薬剤は、任意の化学的実体の1つまたは2つ以上であり、例えば、ペプチド配列、一本鎖核酸オリゴマー、二本鎖核酸オリゴマー、ペプチド核酸または小分子の1つまたは2つ以上であり得る。これらの3つの成分は、核局在化シグナルによって細胞の核が標的化され得る送達ビヒクルとして機能するように調製され、一緒に連結される。活性な薬剤および核局在化シグナルは、ナノ粒子と前もって結合させたプライマーまたはテンプレートを使用して合成することができる。核局在化シグナルにより、細胞の核への送達ビヒクルの輸送が誘導され、その結果、活性な薬剤は1つまたは2つ以上のタンパク質または核酸と相互作用して、所望する作用を促進させることができる。大きいサイズ（例えば、約30nm以上）のナノ粒子が選択された場合、送達ビヒクルは細胞の細胞質に輸送される。
【００６６】
本発明の標的化可能なナノ粒子送達ビヒクルはさらに細胞外標的化媒介因子を含むことができる。この実施形態において、ナノ粒子送達ビヒクルは2つの標的化シグナルを含むことができる。第1には、選択された標的化媒介因子を認識する標的構造体の表面に送達ビヒクルを誘導することができる標的化媒介因子を選択することができる。第2には、送達ビヒクルを標的構造体の核に誘導する核局在化配列を含めることができる。
【００６７】
IV．A．  ナノ粒子の選択および調製
本発明のナノ粒子成分の物理的パラメーターについては何ら制限されない。だが、送達ビヒクルの設計では、適する場合にはナノ粒子ビヒクルの生体適合性を考慮に入れなければならない。ナノ粒子ビヒクルの物理的パラメーターは最適化することができ、所望する効果により、サイズ、形状および材料の選択が左右される。細胞の核への輸送のための好ましい粒子サイズは5nm程度である。だが、下記で議論されるように、それよりも大きい粒子が特定の適用のためには所望されることがある。また、直径が約25nmよりも小さい粒子が、核孔を介した核内への進入を容易にするための核標的化における使用のためには好ましい（Feldherr＆Akin、（1990）Electron Microsc.Rev.、3（1）：73〜86；Feldherr他、（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、89：11002〜5；Feldherr＆Akin、（1999）J.Cell Sci.、112：2043〜48；Feldherr＆Akin、（1994）Exp.Cell Res.、215：206〜10）。
【００６８】
ナノ粒子送達ビヒクルのナノ粒子は、ナノ粒子送達ビヒクルの足場としてもまた示され得るが、金属、半導体材料またはセラミック（これらに限定されない）を含む様々な無機材料を含むことができる。ナノ粒子を製造するための好ましい金属系化合物には、チタン、二酸化チタン、スズ、酸化スズ、ケイ素、二酸化ケイ素、鉄、酸化鉄III、銀、金、銅、ニッケル、アルミニウム、スチール、コバルトクロム合金、カドミウム（好ましくは、セレン化カドミウム）およびチタン合金が含まれる。好ましいセラミック材料には、ブルッシャイト、リン酸三カルシウム、アルミナ、シリカおよびジルコニアが含まれる。ナノ粒子は、炭素（ダイヤモンド）を含む有機材料から作製することができる。好ましいポリマーには、ポリスチレン、シリコーン、ゴム、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリエーテルおよびポリエチレンが含まれる。生分解性のバイオポリマー（例えば、BSAなどのポリペプチド、多糖類など）、他の生物学的材料（例えば、炭水化物）および／またはポリマー化合物もまた、ナノ粒子足場としての使用のために好適である。金は、その広く知られている反応性プロフィルおよび生物学的不活性のために特に好ましい。
【００６９】
上記の材料を含み、1,000nm未満の直径を有するナノ粒子が市販されているか、あるいは、そのようなナノ粒子を、（例えば、コロイド反応による）溶液での進行性核形成から、またはスパッター蒸着などの様々な物理的および化学的な気相成長プロセスによって製造することができる。例えば、Hayashi、（1987）Vac.Sci.Technol.、1987年7月／8月、A5（4）：1375〜84；Hayashi、（1987）Physics Today、1987年12月、44頁〜60頁；MRS Bulletin、1990年1月、16頁〜47頁を参照のこと。
【００７０】
あるいは、ナノ粒子は、この分野で知られている方法を使用して、HAuCl4およびクエン酸還元剤を使用して製造することができる。例えば、Marinakos他、（1999）Adv.Mater.、11：34〜37；Marinakos他、（1998）Chem.Mater.、10：1214〜19；Enustun＆Turkevich、（1963）J.Am.Chem.Soc.、85：3317を参照のこと。約140nmの（H2Oでの）分散凝集物粒子サイズを有する酸化物ナノ粒子が真空冶金（株）（日本、千葉）から市販されている。様々な組成およびサイズ範囲を有する他の市販されているナノ粒子を、例えば、Vector Laboratories,Inc.（Burlingame、California）から入手することができる。生分解性のセラミックナノ粒子およびポリマーナノ粒子が当業者に知られており、これらは生分解性組成物を含むことができる。
【００７１】
スパッター蒸着の他に、プラズマ補助化学気相成長（PACVD）が、好適なナノ粒子を調製するために使用され得る別の技術である。PACVDは、（1torr以上の程度での）比較的高い雰囲気圧で機能し、約1000nm以下の直径を有する粒子を作製するために有用である。例えば、直径が1000nm未満である窒化アルミニウム粒子を、Al（CH3）3およびNH3を反応物として使用するPACVDによって合成することができる。PACVDシステムは、典型的には、関連するポンプシステムおよびガス供給システムを伴う水平に取り付けられた石英管を含む。サセプターが石英管の中心部に位置し、60kHzの高周波供給源を使用して加熱される。合成された窒化アルミニウム粒子が石英管の壁面に集められる。窒素ガスが、通常、Al（CH3）3のキャリアとして使用される。反応チャンバーにおけるAl（CH3）3：NH3の比率は、チャンバー内へのN2／Al（CH3）3およびNH3のガス流速を変化させることによって制御される。10torrの反応チャンバー内での一定した圧力が、一般には、極微細の窒化アルミニウムナノ粒子の堆積および形成をもたらすために維持される。PACVDは、様々な他の好適な生分解性ナノ粒子を調製するために使用することができる。
【００７２】
ナノ粒子のサイズは重要な検討事項であり得る。約30nm以上の程度でのより大きいナノ粒子は、図1Bに示されるように、細胞内に進入することが認められるが、核膜を横断して細胞の核の中には輸送されない。おそらくは、この作用は、ナノ粒子のサイズに直接的に関連する。これは、図1Aに示されるように、5nmのナノ粒子が核膜を横断し、核内に輸送されるからである。従って、適切な送達ビヒクルサイズを選択することは重要であり、しかしまた、そのような選択は、さらなるレベルの標的化性を提供し、そして核ではなく、細胞質に存在させる必要がある活性な薬剤を運ぶナノ粒子の設計および使用を容易にする。
【００７３】
IV．B．  活性な薬剤の選択および調製
少なくとも核局在化シグナルと、好ましくは別の異なる標的化媒介因子とが結合しているナノ粒子が選択および調製されると、所望する活性な薬剤が選択および調製される。適切な活性な薬剤には、任意の小分子またはタンパク質配列または核酸配列が含まれ得るが、その選択は送達ビヒクルの意図された適用によって左右される。本発明のナノ粒子送達ビヒクルの様々な適用が下記において詳細に議論されており、これには、遺伝子治療、遺伝子発現の調節、RNAスプラシングを変化させること、およびタンパク質−タンパク質相互作用の調節が含まれる。適切な活性な薬剤は、本開示を検討したとき、当業者には明かであり、所望する実験目的または臨床目的に関して選択される。
【００７４】
2つ以上の異なる活性な薬剤（例えば、2つ、3つ、4つ、5つまたは他の所望する数の異なる活性な薬剤）を含むナノ粒子送達ビヒクルを提供することもまた本発明の1つの局面である。従って、そのような異なる活性な薬剤の送達を、用いられる標的化配列に依存して、同じ細胞位置もしくは組織位置において、または2つ以上の異なる細胞位置もしくは組織位置において達成することができる。
【００７５】
本明細書中に開示される活性な薬剤のいずれかの任意の組み合わせが提供され得る。例えば、治療剤および造影剤を含むナノ粒子送達ビヒクルが、例えば、腫瘍への送達における使用のために提供され得る。別の一例として、化学療法剤および放射線増感剤を含むナノ粒子送達ビヒクルが提供され得る。さらに別の一例として、同じ遺伝子または異なる遺伝子の転写および／または翻訳の調節において使用される種々のポリヌクレオチド配列を含むナノ粒子送達ビヒクルが提供され得る。
【００７６】
IV．B．1．  活性な薬剤の選択
一般に、本発明における活性な薬剤としての使用に適切な一本鎖核酸配列は、本発明が用いられる状況に基づいて選択することができる。1つの実施形態において、適切な一本鎖DNAは、疾患状態で存在することが知られている核酸配列に対して、または疾患状態で存在することが疑われる核酸配列に対して相補的である。別の実施形態において、適切な一本鎖DNAは、過剰に発現する遺伝子に対して相補的である。知られている配列の機能的等価体もまた、活性な薬剤として使用することができ、これは、本発明の1つの局面であると見なされる。任意の処理しやすい長さの核酸配列を活性な薬剤として使用することができる。典型的には、そのような薬剤は、長さが約20ヌクレオチド〜約50ヌクレオチドの間であり、だが、それよりも長い配列を使用することができる。さらに別の実施形態において、全長の遺伝子に対応する核酸配列またはそのフラグメントを活性な薬剤として使用することができる。
【００７７】
様々な長さおよび組成の二本鎖DNAが、本発明における活性な薬剤としての使用に好適である。二本鎖DNAは、数塩基対から全長遺伝子の長さまでの任意の長さが可能である。下記で議論されるように、長い長さのDNA、特に全長の遺伝子は、遺伝子治療適用において有用である。この実施形態において、全長の遺伝子を宿主細胞のゲノムに取り込ませることができ、または細胞内において一過性に発現させることができる。この実施形態において、細胞は特定の遺伝子を有しておらず、そして活性な薬剤として選択された適切な二本鎖DNA配列は、細胞のゲノムに存在しない遺伝子である。
【００７８】
核酸アナログもまた、本発明における活性な薬剤として使用することができる。本発明の1つの局面において、ペプチド核酸アナログ（PNA）を活性な薬剤として使用することができる。ペプチド核酸アナログは、アナログの骨格（通常的には、DNAにおける糖骨格）がプソイドペプチドであるDNAアナログである。PNA骨格は、反復したN−（2−アミノエチル）グリシンユニットの配列を含むことができる。ペプチド核酸アナログは、DNAが所与の環境で反応するように反応し、そして相補的な核酸配列とさらに結合することができる。ペプチド核酸アナログは、アナログのペプチド骨格が中性荷電であるために、より強い結合が形成されるという、非修飾型DNAを上回る潜在的な利点を提供し、そして非修飾型DNAによって達成され得るよりも大きな程度の特異性をもたらし得る。
【００７９】
様々なPNAが、配列マッピングを含む、本発明に適用可能な広範囲の様々な生化学的役割において用いられている。インビトロ研究により、PNAは、PNAがその相補的な配列によって操作されている遺伝子の転写および翻訳の両方を阻害し得ることが示されている。このことは、PNAが抗遺伝子治療およびアンチセンス治療において有用であり得ることを示唆している。例えば、Norden他、（2000）FASEB J.、14（9）：1041〜60を参照のこと。しかしながら、今日まで、研究者は、そのような配列を形質膜の外側から細胞の核に再現性良く標的化することができていない。
【００８０】
本発明はこの問題に取り組んでおり、そして、PNAのこれまでに得ることができなかった適用に対する可能性を提供する。従って、本発明における活性な薬剤としての使用に好適なPNAは、目的とする配列に対して相補的な配列を含む。本発明に関連して有用な他の核酸アナログには、モルホリノ核酸アナログが含まれる。モルホリノアナログは、核酸配列の代わりに置換することができ、そして、相補性と、天然の核酸配列において見出されない化学的反応および結合の他にないプロフィルとの両方の利点を有している。例えば、Chakhmakhcheva他、（1999）Nucleos.Nucleot.、18：1427〜28を参照のこと。
【００８１】
また、タンパク質は、本発明における活性な薬剤としての使用に適している。1つの実施形態において、適切なタンパク質には、DNAの複製および発現に関連するタンパク質（例えば、リガーゼ）と相互作用することが知られているタンパク質が含まれる。この実施形態において、ナノ粒子に結合したタンパク質は、おそらくは転写プロセスまたは翻訳プロセスまたはその両方のアップレギュレーション因子またはダウンレギュレーション因子として、DNA配列またはRNA配列と相互作用するタンパク質であり得る。別の実施形態において、本発明は、推定されるタンパク質−タンパク質相互作用を立証するために、または推定されるタンパク質−タンパク質相互作用に反証するために使用することができる。この場合、ナノ粒子に結合した配列はプローブタンパク質であり、本発明の適用により、十分に特徴づけられている酵母ツーハイブリッドシステムおよび他の分析システムを使用して達成され得るデータに類似するデータを得ることができる。だが、本発明は、そのような相互作用をその場で調べる機会を提供する。より詳細には、核の調節タンパク質に対する受容体と相互作用することができるタンパク質を活性な薬剤として用いることができる。
【００８２】
最後に、ナノ粒子に結合させた小分子を本発明における活性な薬剤として使用することができる。適切な小分子は、酵素、補因子、核酸および他の細胞内構造体と相互作用する能力を有する。小分子は、天然のリガンド、阻害剤（競合的、不競合的および非競合的）、または設計された調節因子として同定された分子であり得る。化学療法剤、放射線療法剤もしくは放射線増感剤；造影剤；診断剤；または、細胞内タンパク質、核酸、可溶性リガンド、もしくは不溶性リガンドと相互作用することが知られている他の薬剤もまた、活性な薬剤として使用することができる。
【００８３】
上記の活性な薬剤のいずれかの使用は、異なる活性な薬剤をナノ粒子に結合することを除外せず、従って、いくつかの活性な薬剤が1つのナノ粒子に連結され得ることに留意しなければならない。さらに、活性な薬剤は多価および／または多機能的であり得る。
【００８４】
IV．B．2．  活性な薬剤の調製
本発明の関連における活性な薬剤として有用な核酸配列は様々な方法で調製することができ、本開示を検討したとき、当業者には明らかになる。例えば、適切なDNA配列を、知られている配列のところで核酸配列を切断するエンドヌクレアーゼを使用して、より大きいDNAサンプルから切り出すことができる。切り出された核酸配列は、この分野で知られている方法を使用して切り出しおよび精製を行うことができる。例えば、クローニング方法の一般的な議論については、Sambrook他、（1992）Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor、New York）を参照のこと。あるいは、そしてより好ましくは、核酸配列は、広く知られている手動核酸合成法および自動核酸合成法を使用して合成することができる。活性な薬剤として使用されるすべての核酸配列は、それらが切り出されたか、または合成されたか、または他の方法で調製されたとしても、実質的に純粋でなければならない。核酸またはタンパク質の活性な薬剤の合成は、ナノ粒子と前もって結合させたテンプレートを使用して進めることができる。
【００８５】
タンパク質の単離および精製は、所与のタンパク質の調製について確立された技術と一致する。従って、精製されていない目的とするそのようなタンパク質は、当業者に知られている方法を使用して単離することができ、そのため、ここでは議論されない。同様に、小分子を合成および精製する様々な方法をこの分野において見出すことができ、そのような方法は、有機化学および他の化学分野の当業者には明かである。
【００８６】
IV．C．  核局在化シグナルの選択および調製
核局在化シグナル（NLS）を送達ビヒクル成分として含めることは本発明の1つの局面である。代表的な核局在化シグナルは、配列が発現させられる細胞の核にタンパク質を誘導するペプチド配列である。核局在化シグナルは、主として塩基性であり、タンパク質のアミノ酸配列においてほとんど任意のところに配置することができ、一般には、4アミノ酸（Autieri＆Agrawal、（1998）J.Biol.Chem.、273：14731〜37）から8アミノ酸の短い配列を含み、典型的には、リジン残基およびアルギニン残基が多い（Magin他、（2000）Virology、274：11〜16）。核局在化シグナルは、多くの場合、プロリン残基を含む。様々な核局在化シグナルがこれまでに同定されており、生物学的分子を細胞の細胞質から核に輸送するために使用されている。例えば、Tinland他、（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、89：7442〜46；Moede他、（1999）FEBS Lett.、461：229〜34を参照のこと。輸送には、現在、核孔タンパク質が伴うと考えられている。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態において、核局在化シグナルがナノ粒子に結合させられる。核局在化シグナルは合成することができ、またはより大きい配列から切り出すことができる。示されたように、様々な核局在化シグナルが知られており、適切な配列の選択をこれらの様々な配列の知られている性質に基づいて行うことができる。代表的なNLSには、単極性（monopartile）配列PKKKRKV（配列番号1）および二極性（bipartile）配列KRPAAIKKAGQAKKKK（配列番号2）が含まれる。
【００８８】
核局在化シグナルは、タンパク質のアミノ酸配列において様々な位置に出現する。様々なNLSがタンパク質のN末端およびC末端および中央領域に同定されている。従って、選択された配列は、より長いペプチド配列の機能的成分として役立ち得る。NLS成分の残基として機能しないより長い配列の残基は、核局在化シグナルそのものを、例えば、イオン的または立体的に妨害しないように選択されなければならない。従って、NLSを含む配列の組成に対する厳密な制限はないが、実際には、そのような配列は、長さおよび組成において機能的に制限され得る。
【００８９】
本発明の別の局面において、多数の配列をナノ粒子送達ビヒクルと結合させることができる。RME配列などの様々な配列もまたビヒクルと結合させることができる。これらのさらなる配列は、細胞の核膜または細胞の外膜などの様々な膜を横断するビヒクルの輸送を助けることができる。従って、細胞内または細胞表面の所与の場所へのビヒクルの輸送を一般には阻害する膜および他の構造体が「錠」として類比されるならば、NLS配列およびRME配列は「鍵」として類比することができる。従って、好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子送達ビヒクルは多数の異なる配列または「鍵」を含むことができ、これらにより、所与のナノ粒子送達ビヒクルは、輸送に対する様々な潜在的なバリアを通過することができるようになり得る。
【００９０】
IV．D．  細胞表面受容体認識成分の選択および調製
本発明の1つの局面において、細胞表面受容体によって認識および／または結合される能力をもたらす成分がナノ粒子に結合させられる。このような成分は、一般には、細胞表面受容体によって認識されることが知られているタンパク質配列を含む。好ましくは、細胞表面受容体認識成分はさらに、単独で、または核酸−タンパク質ハイブリッドの一部としてのいずれかでの核酸配列、あるいはペプチドアナログを含むことができる。非常に多数の細胞表面受容体が知られており、本発明において有用であり得る。そのような細胞表面受容体には、マクロファージのマンノース受容体およびその様々なホモログ、ならびにHIVなどのレトロウイルスに関連する受容体が含まれる。
【００９１】
本発明における標的化媒介因子として用いられ得る成分の代表的な、しかし非限定的な列挙が表1に示される。示された成分のホモログもまた用いることができる。これらの標的化媒介因子は、ナノ粒子と結合させることができ、そしてナノ粒子が続いて取り込まれ得る標的構造体にナノ粒子を誘導するために使用することができる。完全な成分が標的化媒介因子として使用される必要はない。特定の受容体または他の構造体と相互作用することが知られているこれらの成分のより小さいフラグメントもまた標的化媒介因子として使用することができる。表1の標的化媒介因子は、標的化媒介因子と相互作用する送達因子を（例えば、受容体媒介エンドサイトーシスによって）取り込むように機能し得る。
【００９２】
【表６】
2005511761.tif 000007
【表７】
2005511761.tif 000008
【００９３】
認識成分はさらに、酵素切断または電気化学的切断を受ける配列を含むことができる。従って、認識成分は、細胞の内部の様々な場所に存在する酵素（プロテアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼ（例えば、DNAseまたはRNAse）など）による切断を受けやすい配列を含むことができる。
【００９４】
細胞表面認識配列は本発明にとって絶対的に必要なものでないことを強調しておかなければならない。実際、図1Aに示されるように、細胞表面認識配列を有しないナノ粒子を含有する培地で増殖させた肝細胞は、そのような配列が存在しない場合、細胞膜を横断して輸送された。従って、細胞表面受容体配列は、所与の細胞タイプを標的化するために、または細胞表面とのナノ粒子の会合を誘導するために有用であり得るが、本発明を実施するために、細胞表面認識配列をナノ粒子の表面に存在させる必要はない。
【００９５】
所与の細胞タイプに対して特有な細胞表面受容体の存在は、活性な薬剤の選択およびそのような細胞タイプへの活性な薬剤の送達を助けることができる。例えば、マクロファージは、マンノースを含む粒子の飲作用を炭水化物認識ドメインにより媒介する細胞表面受容体（マクロファージのマンノース受容体）を発現する。Mullin他、（1997）J.Biol.Chem.、272：5668〜81を参照のこと。従って、適切な細胞表面受容体の選択は、ナノ粒子送達ビヒクルによる細胞特異的な選択、およびその結果として、細胞特異的な相互作用を容易にし得る。
【００９６】
IV．E．  連結配列の選択および調製
本発明の別の局面において、短い連結配列を本発明のナノ粒子送達ビヒクルのナノ粒子および細胞表面認識配列の間に配置することができる。連結は、細胞内環境と適合し得るタンパク質配列または核酸配列または任意の他の組成であり得る。本発明において、タンパク質配列および核酸配列が、それらの酵素切断性のために好ましい。例えば、標的化された細胞に見出される制限エンドヌクレアーゼに対する知られている切断部位を含む核酸連結を用いることができる。あるいは、標的化された細胞タイプにおいて一般に見出されるプロテアーゼに対する切断部位を含むタンパク質連結を用いることができる。最後に、化学的または電気化学的に切断され得る連結を設計することができる。
【００９７】
連結の切断は、活性な薬剤および核局在化シグナルを含むナノ粒子を遊離させて、核膜を横断して細胞の核内に輸送させることができる1つの方法である。1つの例において、本発明の送達ビヒクルのナノ粒子の表面に配置された細胞表面認識配列と細胞表面受容体が会合したとき、実際に、ナノ粒子送達ビヒクルが細胞表面に結合する。送達ビヒクルがエンドサイトーシスまたは他の機構によって細胞の内部に輸送されたとき、ナノ粒子送達ビヒクルは受容体に結合したままである。ナノ粒子送達ビヒクルおよびその結合している活性な薬剤を遊離させるために、連結は内因性のプロテアーゼまたはヌクレアーゼまたは他の化学的技術もしくは電気化学的技術によって切断され得る。連結配列の切断により、ナノ粒子送達ビヒクルが遊離し、そしてナノ粒子表面に配置された核局在化シグナルによる核への送達ビヒクルのその後の誘導が可能になる。
【００９８】
IV．F．  ナノ粒子送達ビヒクルの組立て
本発明のナノ粒子送達ビヒクルの様々な個々の成分が選択および調製されると、その後、送達ビヒクル作用因そのものが組み立てられる。組立て順序は重要ではなく、所望する化学反応の要件によって主に左右され得る。活性な薬剤、NLS、ナノ粒子の化学的性質、ならびに生理学的事項および様々な他の事項もまた考慮しなければならない。従って、本明細書中下記に記載される組立て手順は任意の順序で示される。さらに、記載された材料、すなわち、ナノ粒子の成分などは、例としてのみ示されるだけであり、決して限定的であることを意味しない。好適な材料および配列は、本開示、ならびに適用可能な分野における研究者が利用できる知識および資源を考慮して評価されたとき、当業者には理解される。
【００９９】
IV．F．1．  ナノ粒子との活性な薬剤の結合
ナノ粒子および好適な活性な薬剤の選択および調製が行われた後、これらの2つの成分は連結され、複合体が形成される。1つの実施形態において、ナノ粒子は金から製造される。金は、その広く知られている反応性プロフィルおよび生物学的システムの状況におけるその相対的不活性さのために本発明では特に有用である。コロイド状の金を使用することができ、だが、金の一般的な調製物の全体的な負荷電により、コロイド状の金はある種のタンパク質に対する大きい非特異的親和性を有するという特性がもたらされる。調製物の負荷電は、金分子が、クエン酸塩またはビス−スルホナトトリフェニルホスフィンなどの負荷電リガンドと会合することによってもたらされ得る。これらの負荷電リガンド、従って、コロイド状の金調製物に伴う全体的な負荷電は、好ましくは、何らかの負荷電リガンドを中性リガンド（ポリエチレングリコールなど）または正荷電リガンド（アミンなど）で交換することによって低下または除去される。
【０１００】
あるいは、コロイド状金の使用では、望ましくない非特異的なタンパク質結合を阻止するために、BSAなどの別のタンパク質で調製プロセスにおける特定の時点でコロイド状金が被覆され得るようなさらなる処理が付随し得る。小分子被覆およびペプチド被覆もまた、細胞タンパク質との特異的な相互作用を避けるために使用することができる。例えば、コロイド状の金がグルタチオンの被覆とともに調製されている。グルタチオン（中性の抗酸化剤）は細胞における最も多量に存在するペプチドの1つであるので、この被覆は、ナノ粒子にカモフラージュ様の効果をもたらし得る。あるいは、いくつかの金クラスターおよび金粒子が市販されており、本発明において使用することができる。例えば、NANOGOLD（登録商標）金粒子をNanoprobes,Inc.（Yaphank、New York）から入手することができる。また、本発明における使用のために好適なものには、適切なポリマーまたは他の材料から製造され得る生分解性粒子がある。いくつかの市販のナノ粒子が、標識化のために調製され、その後、出荷されており、様々な実体をナノ粒子に結合させるために好都合である。
【０１０１】
1つの実施形態において、ナノ粒子としての金ナノ粒子と、活性な薬剤としての一本鎖核酸または二本鎖核酸とを使用することによって、チオール化反応を行い、チオール基を核酸オリゴマーの5’末端に付加することができる。あるいは、アミン化反応を行うことができ、アミン化反応は、本明細書中に記載されるチオール化反応に対して必要に応じて変更を加えて進行する。この反応の一般的な目的は、所望する成分を用いて続いて機能化することができる求核性中心を導入することである。代表的なチオール修飾剤のホスホルアミダイト試薬が下記の化合物1として表され、これはGlen Research,Inc.（Sterling、Virginia）から入手することができる。
【０１０２】
【化１】
2005511761.tif 000009
化合物１
【０１０３】
様々な核酸オリゴマーが、プローブDNAの5’末端へのホスフィンの結合を可能にする条件のもとでチオール修飾剤ホスホルアミダイトとインキュベーションされる。この反応は、標準的な条件を使用するDNA合成機で行うことができる。化合物1は、ABITM3900ハイスループットDNA合成機（Applied Biosystems、Foster City、California）などの自動化された装置を使用する自動化されたDNA合成における工程として加えることができる。チオール修飾剤はオリゴヌクレオチドの最後の合成工程で加えられる。ホスフィンは、ヨウ素を使用して酸化され、そして精製は、非標識のオリゴヌクレオチドについて使用される精製と全く同じである。精製プロセスは、標識されたオリゴヌクレオチドは著しくより疎水性であり、従って、典型的なHPLC条件のもとでははるかにより遅く溶出する傾向があるので、標識されたオリゴヌクレオチドの方が容易である。このホスホルアミダイトはDNAの5’ヒドロキシルと自発的に反応し、これはアセトニトリルにおいて処理することができる。この反応において、チオール基は、保護用のトリチル基または酢酸チオエステル基によって保護され、様々な長さの炭素リンカーによって5’−ホスホジエステルから隔てられる。6炭素のリンカーが化合物1には存在する。
【０１０４】
核酸複合体は、その後、トリチル基を除去するためにチオールの脱保護に付される。具体的には、保護しているトリチル基が、硝酸銀およびジチオスレイトール（DTT）を用いた処理によって除去される。核酸複合体はナノ粒子金属成分とインキュベーションされる。これらの2つの実体が、脱保護反応のとき、トリチル基の除去によって露出したチオールにおいて連結される。活性な薬剤−ナノ粒子の形成された複合体（この実施形態では、核酸−ナノ粒子複合体）は、使用まで反応容器中に維持することができる。
【０１０５】
IV．F．2．  核局在化シグナルのナノ粒子との結合
好適な核局在化シグナルが、活性な薬剤−ナノ粒子複合体に連結される。核局在化シグナルは、標準的なペプチド化学技術を使用して合成することができ、またはより大きいタンパク質からのタンパク質分解的な切断によって単離することができる。単離または合成された核局在化シグナルは、配列が少なくとも知られているNLSを含むということを必要とするのみで、任意の長さを有することができ、典型的には長さが4アミノ酸〜8アミノ酸である。より大きいタンパク質から単離される核局在化シグナルを調製するために好適な、タンパク質およびペプチドの様々な精製方法がこの分野では知られている。一般的には、Protein Purification Applications：A Practical Approach、（1989）（Harris＆Angal編、IRL Press）；Protein Purification：Principles,High Resolution Methods,Applications、（1989）（Janson＆Ryden編、VCH Publishers）を参照のこと。
【０１０６】
本発明はまた、ナノ粒子を伴うタンパク質−ペプチドコンジュゲートの調製および結合を包含する。そのようなコンジュゲートは、例えば、比較的大きいタンパク質および比較的小さいNLSを含むことができる。両者ともアミノ酸を含むが、タンパク質およびペプチドの区別は、他の基準の中でも、それぞれの実体の機能性に基づいて行われる。具体的な一例では、タンパク質−ペプチドコンジュゲートはBSAおよびNLSを含むことができる。タンパク質−ペプチドコンジュゲートは、続いて、金ナノ粒子に結合させることができる。
【０１０７】
タンパク質およびペプチドを金ナノ粒子に結合する化学反応は、核酸を金ナノ粒子に結合させるために要求される化学反応と類似している。1つの局面において、チオール反応が行われる。その反応では、核局在化シグナルに配置されたチオール基（これは末端のシステイン残基もしくはメチオニン残基の形態を取ることができる）、またはナノ粒子に配置されたチオール基が伴い得る。チオール基は、もう一方の実体における一級アミンと都合良く反応し得る。一級アミンは、核局在化シグナルにおける末端のリジン残基またはアルギニン残基の形態を都合良く取ることができるが、ナノ粒子の表面にもまた配置することができる。例えば、Hainfeld＆Furuya、（1992）J.Histochem.Cytochem.、40：177〜84；Hainfeld、（1992）Ultramicroscopy、46：135〜44を参照のこと。
【０１０８】
IV．F．3．  ナノ粒子との細胞表面認識配列の結合
適切な細胞表面認識配列を選択することができ（例えば、表1に示された配列から選択される配列、または表1に示された配列に基づく配列）、そして上記のIV．D節において上記に記載されるように調製することができる。配列は、本質的には、所与の細胞タイプの表面に発現する受容体に結合することが知られているタンパク質またはペプチドであり得る。従って、核局在化シグナルまたはタンパク質（活性な薬剤）をナノ粒子と結合させるために行われるのと同じ化学反応を、細胞表面認識配列をナノ粒子と結合させるために行うことができる。上記のIV．F．2節からの例とともに続けることによって、チオール−アミンの反応を、ナノ粒子または細胞表面認識配列のいずれかに配置されたチオールを、チオール−アミンの反応対のもう一方のメンバーに配置された一級アミンと結合させるために行うことができる。反応性プロフィル、およびナノ粒子送達ビヒクルのそれぞれの成分要素がナノ粒子に結合される順序に依存して、部位ブロッキングのスキームを開発することができる。そのようなスキームにより、ナノ粒子上の望ましくない部位または成分要素そのものにおける望ましくない部位への実体の結合を妨げることができる。
【０１０９】
IV．F．4．  ナノ粒子との連結配列の結合
連結配列もまたナノ粒子に結合することができる。そのような配列は、ナノ粒子と、ナノ粒子と結合する細胞表面認識配列または他の実体との間に配置することができる。その目的を果たすために、連結配列は、好ましくは、化学的切断または電気化学的切断または酵素的切断が生じ得る部位を含む。連結配列が一本鎖核酸配列または二本鎖核酸配列を含むとき、その配列は、送達ビヒクルが導入されている細胞に存在することが知られているヌクレアーゼに対する切断部位を含むことができる。連結がタンパク質であるとき、タンパク質はタンパク質分解部位を含むことができる。最後に、連結が光分解的に切断されることが所望されるとき、連結は、光切断を受けやすい材料を含むことができる。市販されている光切断可能な連結配列には、Glen Research（Sterling、Virginia）から入手可能な様々なスペーサーホスホルアミダイトが含まれる。
【０１１０】
IV．F．5．  送達ビヒクルの生体適合性および保護
ナノ粒子が金などの金属成分を含む場合、ナノ粒子と、送達ビヒクルが投与されている対象との間における生体適合性を保証することが望ましい。金は比較的不活性であり、かつ他の金属よりも生理学的な浸食性が小さく、しかし、金属またはポリマーの任意のナノ粒子材料の有害な作用は、ナノ粒子を生体適合性物質で全体的または部分的に被覆することによって、または他の方法によって最小限に抑えることができる。生体適合性を達成するために使用され得る化合物には、ポリマー（ポリエチレングリコール−PEGなど）、タンパク質（BSAなど）、脂質（これには、膜エンベロープが含まれる）、および炭水化物が含まれる。これらの生体適合性化合物の付加は、それ以外の送達ビヒクル成分を付加した後に行うことができ、そして送達ビヒクルを対象またはシステムに導入する前の最後の合成段階として役立ち得る。
【０１１１】
これらの材料はまた、免疫系または他の生物学的システム（例えば、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、DNAseもしくはRNAse）、または望ましくない分解に関連する他の酵素もしくは生物学的実体）による認識を妨げるための、送達ビヒクルならびにそれに結合した活性な薬剤（1つまたは複数）および標的化媒介因子（1つまたは複数）に対する保護剤または遮蔽剤であり得る。従って、保護的な被覆または外皮は、活性な薬剤（1つまたは複数）および標的化媒介因子（1つまたは複数）を無傷のまま、送達ビヒクルが所望の細胞または組織に到達することを容易にするための秘匿性またはステルス性の特徴を提供する。
【０１１２】
IV．F．6．  多数の配列を送達ビヒクルと結合させること
多数の配列を本発明の送達ビヒクルと結合させることができる。多数の配列を1つのビヒクルと結合させることによって、ビヒクルは、細胞膜または核膜などの様々な細胞バリアを通過させるために適合化され得る。例えば、ナノ粒子ビヒクルはNLS配列およびRME配列を含むことができる。RME配列は、細胞の膜を横断するビヒクルの輸送を助けることができる。細胞の中に入ると、NLSにより、ビヒクルは細胞の核に対して標的化され得る。
【０１１３】
好ましくは、ナノ粒子送達ビヒクルと結合させられる配列はどれも、1つの長い配列の成分が形成させられるのではなく、独立してビヒクルと結合させられる。実施例1に開示される結果によって示されるように、多数の配列（好ましくは、多数の異なる配列）を独立的に結合することは、ナノ粒子送達ビヒクルを所望の細胞構造体に標的化する一層効率的な方法である。しかし、多数の配列を連続して結合させることもまた、ナノ粒子送達ビヒクルを所与の部位に誘導する効果的な方法であり、この方法により、本発明の別の局面が形成される。
【０１１４】
V．  対象またはサンプルへのナノ粒子送達ビヒクルの導入
十分に純粋なナノ粒子送達ビヒクル（これは、好ましくは、ナノ粒子、活性な薬剤およびNLSを含む）が調製された後、ビヒクルを、対象またはサンプルに投与され得る薬学的組成物で調製することが望ましいと考えられる。好ましい投与技術には、非経口投与、静脈内投与、および、充実性腫瘍または他の新生物組織（これらに限定されない）を含む任意の所望する標的組織の中への直接的な注入が含まれる。これは、好適な薬学的組成物を含む媒体にビヒクルが配置される最後の精製工程を用いることによって達成され得る。
【０１１５】
本発明による好適な薬学的組成物は、一般には、投薬情報（これは個々別々に決定される）に従う一定量の所望する送達ビヒクル−活性な薬剤を含み、この場合、そのような組成物は、活性な薬剤に関して上記に示された投薬情報に従う適切な最終濃度を得るために、受容可能な薬学的希釈剤または賦形剤（無菌の水溶液など）と混合されている。そのような配合物は、典型的には、リン酸緩衝化生理的食塩水（PBS）などの緩衝剤、あるいは薬学的な賦形剤、安定化剤（BSAもしくはHSAなど）、または塩（塩化ナトリウムなど）などのさらなる添加剤を含む。
【０１１６】
非経口投与の場合、さらにそのような組成物を、その無菌性を保証することにより薬学的に受容可能にし、かつ非免疫原性および非発熱性にすることは一般的に望ましい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences、（1980）（Osol編、第16版、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）によって例示されるように、この分野では一般に広く知られている。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、FDA生物学的基準部によって要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【０１１７】
送達ビヒクルが、細胞培養物に懸濁された細胞に導入されているとき、適切な増殖培地（例えば、Luria培養液（LB））または好適な細胞培養培地においてナノ粒子送達ビヒクルと一緒に細胞をインキュベーションすることは十分である。他の導入方法が可能であるが、これらの導入処理が好ましく、送達ビヒクルの表面に存在する実体にかかわらず行うことができる。
【０１１８】
インビトロ実験が行われるとき、送達ビヒクルは、細胞が培地に導入される前の選択された細胞増殖培地に直接加えることができる。そのような培地は、明らかなことではあるが、細胞の生理学的要件だけでなく、送達ビヒクルの化学的プロフィルおよび反応性プロフィルにも適合しなければならない。送達ビヒクルのプロフィルは、本開示を検討したとき、そしてナノ粒子に結合した成分を考慮して当業者には明らかになる。
【０１１９】
V．A．  送達ビヒクルの受容体媒介エンドサイトーシス
本発明のナノ粒子送達ビヒクルに配置された細胞表面認識配列の認識および結合は本発明の1つの局面である。本発明は、細胞表面での結合事象が、多くの場合には、様々な事象、とりわけ、受容体媒介エンドサイトーシスを生じさせる細胞カスケードにおける開始段階であるという理解を利用している。
【０１２０】
上記の方法では、送達ビヒクルがサンプルまたは対象に導入され得る方法が記載される。これらの薬剤は、様々な様式で細胞膜を横断して輸送される。しかしながら、細胞認識配列がナノ粒子に結合しているとき、異なるタイプの取り込み、すなわち、受容体媒介エンドサイトーシスが生じ得る。
【０１２１】
用語「受容体媒介エンドサイトーシス」（「RME」）により、一般には、細胞の表面に配置された受容体にリガンドが結合することによって触媒されて、受容体に結合したリガンドが細胞内に取り込まれる機構が記載される。多くのタンパク質および他の構造体が受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞内に進入する。これらには、表1に示されるものを含めて、インスリン、上皮増殖因子、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、神経増殖因子、カルシトニン、グルカゴンなどが含まれる。本発明に関連して、受容体媒介エンドサイトーシスにより、都合のよい機構が、ナノ粒子を細胞の内部に輸送するためにもたらされる。
【０１２２】
RMEにおいて、細胞の表面に配置された受容体によるリガンドの結合は、エンドサイトーシス応答を含み得る細胞内シグナルを開始させることができる。従って、細胞の表面に結合している媒介物が細胞内に陥入させられ、取り込まれる。続いて、ナノ粒子に存在する何らかの連結配列が細胞の内因性酵素によって切断され、それにより媒介物を遊離させて、その活性な薬剤を適切な構造体に送達することができる。
【０１２３】
RMEは、送達ビヒクルが細胞内に輸送される唯一の方法でないことを再強調しなければならない。適切な実体をナノ粒子に結合することによって利用され得る他の取り込み方法には、膜孔の好都合な使用が含まれる。食作用機構および飲作用機構もまた、ナノ粒子送達ビヒクルが取り込まれ得る好都合な機構を提供する。
【０１２４】
VI．  ナノ粒子送達ビヒクルの検出
本発明のナノ粒子送達ビヒクルは様々な方法で細胞の内部および外部の両方で検出することができる。実際、いくつかの検出方法の1つを選択することができることは、本発明の1つの局面である。ナノ粒子送達ビヒクルの存在を検出する1つの方法は、ナノ粒子送達ビヒクルがもたらすように設計されている恒常性維持の変化についてサンプルをモニターすることによる。しかしながら、いくつかの適用の場合には、異なる方法によってナノ粒子送達ビヒクルの存在をモニターすることが望ましい場合がある。ナノ粒子送達剤の存在を検出する、すべてではないが、いくつかの方法には、透過電子顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察および他の顕微鏡観察の様々な技術；分光法に基づく検出；ならびに、タンパク質を伴う検出方法（免疫学的方法など）を挙げることができる。他の様々な方法が可能であり、これらは実験プロトコルまたは処理プロトコルの特定の環境に依存する。
【０１２５】
VI．A．  ナノ粒子送達ビヒクルの透過電子顕微鏡観察による検出
透過電子顕微鏡観察（TEM）を、ナノ粒子送達ビヒクルの存在を明らかにするために使用することができる。5nm以上のナノ粒子を含むナノ粒子送達ビヒクルを、図1Aおよび図1Bに示されるTEM像によって明らかにされるようにTEMによって明瞭に可視化することができる。図1Aには、5nmのナノ粒子を含むナノ粒子送達ビヒクルが示される。図1Bには、30nmのナノ粒子を含むナノ粒子送達ビヒクルが示される。両方の図において、ナノ粒子送達ビヒクルは核局在化シグナルを含む。図1Aおよび図1Bは、TEMが、ナノ粒子送達ビヒクルの存在および細胞レベル以下での局在化を検出する有用な方法であることを示している。5nmもの小さいサイズのナノ粒子を含むナノ粒子送達ビヒクルを、図1Aに示されるように認めることができる。
【０１２６】
図1Aおよび図1Bは、TEMが、細胞の核におけるナノ粒子送達ビヒクルの存在を検出するために使用できることを明らかにしている。5nmのナノ粒子を含むナノ粒子送達ビヒクルが、図1Aに示されるように細胞の核に突き止められる。30nmのナノ粒子を含むナノ粒子送達ビヒクルは、図1Bに示されるように細胞の細胞質に留まっている。従って、TEMにより、ナノ粒子送達ビヒクルの検出、および送達ビヒクルの細胞レベル以下での局在性決定が容易に行われる。
【０１２７】
TEMはまた、ある領域におけるナノ粒子送達ビヒクルの密度を推定するために使用することができる。密度計算は、TEMによって走査される所与の領域における観測された粒子数を計数することによって行うことができる。細胞の核または細胞質などの規定された領域におけるナノ粒子送達ビヒクルの密度を理解することにより、ナノ粒子に対するサイズ要件、所与の核局在化シグナルの有効性、および他のパラメーターに関する情報を得ることができる。
【０１２８】
VI．B．  ナノ粒子送達ビヒクルの分光学的検出
本発明のナノ粒子送達ビヒクルはまた分光学的に検出することができる。UV、可視およびIRの分光学的方法を本発明において用いることができる。検出方法の選択は、典型的には実験的設計に依存する。1つの実施形態において、本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、蛍光分光法を使用して間接的に検出することができる。
【０１２９】
本発明のナノ粒子送達ビヒクルの活性な薬剤により提供されるGFPおよび他の蛍光マーカータンパク質の発現を蛍光によって検出することができ、それらの発現はナノ粒子送達ビヒクルの存在の指標として作用し得る。あるいは、蛍光性成分をナノ粒子送達ビヒクルのナノ粒子成分と結合させることができ、このようにして、ナノ粒子送達ビヒクル自体の存在を同定することができる。
【０１３０】
VI．C．  ナノ粒子送達ビヒクルの顕微鏡観察に基づく検出
上記のVI．A節に記されたように、TEMは、送達ビヒクルを検出するために有用な顕微鏡観察の1つの形態である。しかしながら、顕微鏡観察の他の形態もまた用いることができる。様々な顕微鏡観察技術、例えば、明視野顕微鏡観察、位相差顕微鏡観察、共焦点顕微鏡観察および他の技術などを、送達ビヒクルの存在を検出するために用いることができる。
【０１３１】
位相差顕微鏡観察は、典型的には、細胞のオルガネラを可視化するために使用されているが、送達ビヒクルの存在を検出するために用いることができる。共焦点顕微鏡観察もまた、送達ビヒクルを検出するために有用であり得る。上記顕微鏡観察技術のいずれかの分解能は、像を精緻化し、分解能を増大させるために知られている様々なコントラスト増強剤または他の薬剤を導入することによって高めることができる。
【０１３２】
VI．D．  ナノ粒子送達ビヒクルの、タンパク質に基づく検出
ナノ粒子送達ビヒクルの、タンパク質に基づく検出もまた可能である。例えば、ナノ粒子に結合している第1のタンパク質と会合することが知られている第2のタンパク質を、プローブとして標識し、使用することができる。好適な標識には、蛍光性成分および他の標識が含まれる。第1および第2のタンパク質が会合したとき、従って、標識された第2のタンパク質と、ナノ粒子送達ビヒクルとが会合したとき、ナノ粒子送達ビヒクルの存在が、プローブの存在を検出することによって検出可能である。任意の好適なタンパク質対を、本発明のナノ粒子送達ビヒクルを検出するために使用することができる。この場合、好ましくは、第1のタンパク質がナノ粒子と結合させられ、第2のタンパク質が検出可能な標識で標識され、そしてこれらの2つのタンパク質は、会合することが知られている。
【０１３３】
VII．  本発明のナノ粒子送達ビヒクルの適用
本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、様々な活性な薬剤を様々な異なる細胞位置および細胞レベル以下の位置に送達するために用いることができる。より詳細には下記に記載されるように、本発明は、遺伝子発現の分析；核酸配列、または核酸アナログを含む配列を細胞のゲノムに取り込ませること；細胞内の調節タンパク質の濃度を変化させること；RNAスプライシングパターンを変化させること；そして細胞の細胞質においてmRNAと相互作用させることのために有用である。
【０１３４】
一般則として、核酸配列が選択および操作されているとき、可能である場合には常に、自身にアニーリングした構造体の形成に対する潜在的可能性を最小限にするように注意しなければならない。自身にアニーリングする構造を生じさせることが予測される何らかの化学的組成の配列は、本発明を実施するときには避けなければならない。
【０１３５】
また、標的配列の50％が完全一致のプローブにハイブリダイゼーションする（規定されたイオン強度およびpHでの）温度である二重鎖の予測Tmの約10℃以内に温度が維持されるという一般則とともに、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることができる。約100個を越える相補的な残基を有する相補的な核酸を分析するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例が、1mgのヘパリンとともに42℃での50％ホルムアルデヒドにおける一晩のインキュベーションである。高ストリンジェンシーの洗浄の前に、低いストリンジェンシーの洗浄を、バックグラウンドのプローブシグナルを除くために行うことができる。約100ヌクレオチドを越える二重鎖に対する中程度のストリンジェンシーの洗浄条件の一例が、45℃での1XSSCにおける15分間のインキュベーションである。約100ヌクレオチドを越える二重鎖に対する低いストリンジェンシーの洗浄の一例が、40℃での4XSSC〜6XSSCにおける15分間のインキュベーションである。短いプローブ（例えば、約10ヌクレオチド〜50ヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件には、典型的には、pH7.0〜8.3で、少なくとも約30℃の温度での、約1.0M未満のナトリウムイオンの塩濃度（典型的には、約0.01M〜1.0Mのナトリウムイオン（または他のイオン）濃度）におけるインキュベーションが伴う。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によって達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブについて観測されるシグナル対ノイズ比の2倍（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比により、特異的なハイブリダイゼーションの検出が示される。
【０１３６】
VII．A．  遺伝子発現の調節および分析
本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、モデルシステムにおける遺伝子発現を調節および分析するために使用することができる。目的とする遺伝子の発現が、遺伝子のDNA配列から転写されたmRNAの産生と相関することは基本的なことである。転写されたmRNAは標準的なワトソン−クリック塩基対形成則に従う。従って、1つの実施形態において、ナノ粒子送達ビヒクルは、何らかの発現阻害構造を除く活性な薬剤、または発現増強構造を導入する活性な薬剤を選択することによって遺伝子の発現を直接的に調節するために使用することができる。別の実施形態において、本発明の送達ビヒクルは、細胞の天然の第二メッセンジャーシステムの構成要素を模倣し、それにより、所与遺伝子の転写および翻訳を調節するために用いられる。
【０１３７】
1つの実施形態において、本発明のナノ粒子送達ビヒクルによって細胞の細胞質または核に提示された、タンパク質発現を調節する能力を有する転写因子または他のタンパク質により、遺伝子発現が調節される。調節には、遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方が包含される。この実施形態において、ナノ粒子送達ビヒクルは、活性な薬剤の役割で、適格な転写調節因子もしくは翻訳調節因子（例えば、転写因子）、または転写調節因子もしくは翻訳調節因子をコードする核酸配列のいずれかを含む。適格な調節因子は、ナノ粒子に結合している形態で活性であり得るか、あるいは、標的細胞の細胞質または核におけるタンパク質分解的処理もしくは他の酵素的処理または化学的処理によって活性化される形態であり得る。同様に、転写調節因子または翻訳調節因子をコードする核酸配列は、標的細胞の翻訳装置によって翻訳され得る。これは、フィードバック阻害ループに類似する方法で使用することができる。すなわち、標的細胞の発現装置を、送達ビヒクルによって導入された核酸を発現させるために使用することができ、これにより、その後、さらなるタンパク質発現を阻害し得るタンパク質がもたらされる。
【０１３８】
別の実施形態において、遺伝子発現は、その発現が所与のスプライシングパターンに依存しているタンパク質を有する細胞において調節される。この実施形態において、スプライシングを変化させる適切な配列のモルホリノオリゴヌクレオチドまたはPNAまたは他の修飾オリゴヌクレオチドを含む本発明のナノ粒子送達ビヒクルが、その発現が所与のスプライシング事象に依存している遺伝子を含む標的細胞に導入される。緑色蛍光タンパク質（「GFP」）をコードする遺伝子が、そのようなモルホリノオリゴヌクレオチドの非存在下で、本発明のこの実施形態を検出可能に明らかにするために用いられるとき、GFPの発現が見られない。本発明の送達ビヒクルによって送達されたモルホリノオリゴヌクレオチドが存在する細胞では、代わりのスプライシング事象が生じ、GFP遺伝子が発現し、GFP遺伝子を分光光度法で検出することができる。この例は、活性な薬剤として役立つ適切なヌクレオチドが送達ビヒクルに結合しているので、機能的なタンパク質を生じさせるためにスプライシングされ得る任意の遺伝子に拡張することができる。
【０１３９】
VII．B．  タンパク質の翻訳調節
本発明の送達ビヒクルは、標的細胞のゲノムに取り込ませるための核酸配列を送達するために使用することができる。この概念は、ときには、「アンチセンス」または「遺伝子治療」として示されることがある。分子生物学およびヒトゲノム計画における様々な進展により、遺伝子発現に関する標的化された介入のための以前には予期されなかった様々な可能性が開かれている。これらには、遺伝子導入による特異的な遺伝子の過剰発現または組換え破壊などの永続的な方法、ならびに、遺伝子機能を一時的に抑制するための新規な方法が含まれる。標的化されたmRNA内の特異的な配列とハイブリダイゼーションするように設計された短い合成アンチセンス（AS）オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）は後者の部類に属する。欠失遺伝子を宿主のゲノムに組み込むこともまた非常に注目されている。
【０１４０】
特異的な遺伝子の発現におけるAS介入が、合成されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（AS−ODN）の使用によって達成され得る。一般的なアンチセンス総説については、一般には下記を参照のこと：Agrawal、（1996）Trends Biotechnol.、14（10）：376〜87；Lev−Lehman他、（1997）Antisense Therapeutics（Cohen＆Smisek編）、Plenum Press、New York；Lefebvre−D'Hellencourt他、（1995）Eur.Cytokine Netw.、6：7〜19；Oligonucleotide＆Gene Therapy−Base Antisense Therapeutics、（1997）（Mori編）、Drug＆Market Development Publications、Westborough、Massachusetts；Antisense Therapeutics、（1996）（Agrawal編）、Humana Press、Totowa、New Jersey。AS−ODNは、典型的には長さが15塩基〜25塩基である短いDNA配列であり、目的とする標的mRNAに対して相補し、かつRNA：ODN二重鎖を形成するように設計される。この二重鎖形成により、関連するmRNAのプロセシング、スプライシング、輸送または翻訳が妨げられ得る。さらに、ある種のAS−ODNは、その標的mRNAとハイブリダイゼーションしたとき、細胞のRnase H活性を誘発し、これによりmRNAの分解をもたらすことができる。Calabretta他、（1996）Semin.Oncol.、23：78〜87。その場合、RNaseHは、二重鎖のRNA成分を切断し、そして潜在的には、AS−ODNを放出して、標的RNAのさらなる分子とさらにハイブリダイゼーションすることができる。さらなる作用モードは、転写的に不活性であり得る三重らせんを形成するための、AS−ODNとゲノムDNAとの相互作用に由来する。
【０１４１】
本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、上記の議論を一般的な指針として使用して標的細胞の発現プロフィルを変化させるために使用することができる。1つの実施形態において、少なくとも1つのAS配列、ODN配列、AS−ODN配列、他の核酸配列または修飾された核酸配列を含むナノ粒子送達ビヒクルを調製することができる。この配列は、ナノ粒子送達ビヒクルにおける活性な薬剤として役立ち得る。ナノ粒子送達ビヒクルはまた、送達ビヒクルを細胞の核に対して標的化する核局在化シグナルをも含む。あるいは、ナノ粒子送達ビヒクルが細胞質内に留まることが所望される場合、より大きいサイズ（例えば、30nm）のナノ粒子を用いることができる。活性な薬剤の精密な配列および／または組成はナノ粒子送達ビヒクルの役割（1つまたは複数）に反映する。例えば、活性な薬剤は、目的とする遺伝子に対して相補的であり得る。
【０１４２】
実際、標的細胞のタンパク質翻訳プロフィルを変化させるために設計されたナノ粒子送達ビヒクルを注射によって対象に投与することができ、または、標的細胞がインビトロ環境で存在する場合、ナノ粒子送達ビヒクルを細胞の増殖培地に直接加えることができる。両方の導入手順が本明細書中上記に記載されており、そして他の手順が、本開示を検討したとき、当業者には明らかになる。
【０１４３】
VII．C．  調節タンパク質の濃度の調節
本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、細胞の様々な調節タンパク質の濃度を調節するために使用することができる。調節の具体的な一例が、転写因子デコイを使用することとして知られている。本明細書中上記で述べられたように、用語「デコイ」および用語「転写因子デコイ」は、転写因子に結合するか、または転写因子と相互作用し、かつ本来のエンハンサー配列に対するその結合を妨げる分子を示す。転写因子と特異的に相互作用し、そして、特定の転写因子に対するその自然のゲノム結合部位を模倣するか、またはそのような結合部位に似せる転写因子デコイを設計することが可能である。いくつかの転写因子デコイが、自然のゲノム結合部位に対するその親和性に近い親和性で、または自然のゲノム結合部位に対するその親和性を越える親和性で転写因子と結合することができる。
【０１４４】
いくつかの転写因子は、内因性のゲノム結合部位と結合することに加えて、細胞内の可溶性リガンドにもまた結合することができる。適切なリガンドに対するそのような転写因子の結合は、続いて、そのゲノム結合部位（1つまたは複数）に対する転写因子の結合プロフィルを変化させる。再度ではあるが、転写因子によるリガンド結合は、その意図されたゲノム部位に結合する転写因子の能力を調節することができる。そのような転写因子は、可溶性リガンドに対する細胞内受容体または核受容体としてこの分野では示される。
【０１４５】
転写因子デコイは、様々な様式で機能することができ、従って、様々なエレメントを含むことができる。例えば、核酸配列は、1つまたは2つ以上の転写因子に結合することに関して細胞の標的DNAと競合し得る。この例において、核酸配列は標的配列との二重鎖を形成し、そして標的配列を効果的に不活性化することができる。他の二重鎖型の構造（細胞の標的DNAを効果的に不活性化するヘアピンまたは十字型または他の構造など）を形成する核酸配列を導入することができる。
【０１４６】
細胞の標的DNAに対して導入される配列は非修飾の核酸を必ず含まなければならないということは要求されない。配列は、修飾されたホスホジエステル結合を含有する核酸分子を含むことができる。修飾されたホスホジエステル結合には、例えば、ホスホロチオアート、ホスホルアミダイト、およびメチルホスホナート誘導体が含まれ得る。
【０１４７】
本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、調節タンパク質の濃度の調節を容易にすることができる。調節は、適切な活性な薬剤をナノ粒子と結合させることによって達成され得る。例えば、所与の調節タンパク質（例えば、転写因子）がそれに対する高い親和性を有する二本鎖DNAの短い配列を、本明細書中上記に記載されたように、転写因子デコイとして使用することができる。本発明の送達ビヒクルに対するさらなる調節タンパク質調節適用が、本開示を考慮して検討されたとき、当業者には明らかになる。
【０１４８】
VII．D．  RNAスプライシングの調節
一般に、特定遺伝子の発現は、活性なタンパク質を産生する過程における任意の段階で調節することができる。全体的なタンパク質活性の調節が、転写機構、転写プロセシング機構、翻訳機構または翻訳後機構によって生じ得る。本発明のナノ粒子送達ビヒクルの1つの役割は、核酸配列の転写を調節することである。
【０１４９】
転写は、RNAポリメラーゼと、遺伝子のコード領域に存在する構造情報のRNAとしての発現を行わせる遺伝子との相互作用を伴う細胞プロセスを意味する。このプロセスには、限定されないが、下記の段階が含まれる：（1）転写の開始、（2）転写物の伸長、（3）転写物のスプライシング、（4）転写物のキャッピング、（5）転写物の終結、（6）転写物のポリアデニル化、（7）転写物の核外輸送、（8）転写物の編集、および（9）転写物の安定化。転写は、RNAポリメラーゼの転写開始速度または進行を変化させることによって調節することができる（Maniatis他、（1987）Science、236：1237〜45）。転写物のプロセシングは、RNAスプライシングパターン（1つまたは複数のmRNA種を生じさせるためのRNAのスプライシング）、細胞質へのmRNA輸送速度、またはmRNA安定性などの状況によって影響され得る。
【０１５０】
また、真核生物のmRNA転写物の一部は直接的に翻訳されるが、多くは、翻訳される前に転写物から切り出される、「イントロン」として知られている1つ以上の領域を含有する。残った領域（従って、翻訳された領域）は「エキソン」として知られており、連続したmRNA配列を形成するために連続してスプライシングされる。mRNAのスプライス部位、すなわち、イントロン−エキソンの接合部は、本発明の活性な薬剤に対する標的領域にすることができ、そして、異常なスプライシングが疾患に関係している状況、または特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾患に関係している状況では特に有用であり得る。再配置または欠失による異常な融合接合部もまた標的にすることができる。
【０１５１】
本発明は、RNAスプライシングを調節するために用いることができる。本発明のこの局面は、適切な活性な薬剤、例えば、所与の遺伝子に対するスプライシングパターンを変化させることが知られている核酸配列などを選択することによって達成され得る。適切な配列（例えば、DNA、RNA、モルホリノヌクレオチドなど）の使用は、スプライシングパターン、その結果として、細胞に対するタンパク質発現プロフィルに影響を及ぼし得る。適切な配列の送達は、核標的化能力を含むナノ粒子送達ビヒクルを用いることによって克服され得る、RNAスプライシングの治療的適用における主要な障害である。
【０１５２】
VII．E．  細胞質におけるmRNAとの相互作用
本発明は、転写物が細胞質に存在している間に所与のタンパク質に対するmRNA転写物と相互作用させるために使用することができる。相互作用は、細胞によって産生される所与タンパク質の量の調節を含む様々な形態を取ることができる。本発明の1つの局面において、本発明のナノ粒子送達ビヒクルでは、アンチセンスヌクレオチドを、細胞質に輸送されているmRNAと相互作用させるために用いることができる。例えば、Bassell他、（1999）FASEB J.、13：447〜54を参照のこと。
【０１５３】
本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、細胞の細胞質におけるmRNAと相互作用させるために設計することができる。mRNAとのオリゴマー化合物の特異的なハイブリダイゼーションにより、mRNAの正常な機能が妨げられ得る。核酸に特異的にハイブリダイゼーションする化合物による核酸の機能のこのような調節は、一般には「アンチセンス」と呼ばれ、本明細書中上記で議論されている。アンチセンス化合物はRNAの様々な機能を妨げることができ、そのような機能には、生命維持に必要なすべて機能、例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの輸送、RNAからのタンパク質の翻訳、1つ以上のmRNA種を生じさせるRNAのスプライシング、および、RNAがかかわり得るか、またはRNAによって促進され得る触媒活性が含まれ得る。mRNA機能に関するそのような妨害の全体的な作用は、mRNAがコードするタンパク質の発現の調節である。
【０１５４】
アンチセンス化合物の、例えば、mRNAとの会合は、診断剤、治療剤、予防のために、そして研究試薬およびキットとして利用することができる。治療剤として使用されるとき、所与のタンパク質の発現を調節することによって処置され得る疾患または障害を有することが疑われる対象を、アンチセンスの活性な薬剤を含む本発明のナノ粒子送達ビヒクルを投与することによって処置することができる。本発明のナノ粒子送達ビヒクルの使用は、アンチセンス化合物が活性な薬剤として含まれるときには、例えば、感染、炎症または腫瘍形成を、例えば、防止または遅らせるために予防的にも使用することができる。
【０１５５】
アンチセンスを有する本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、研究および診断剤のために有用である。これは、アンチセンス化合物が、目的とする特定のタンパク質をコードする核酸とハイブリダイゼーションすることができ、これにより、サンドイッチアッセイおよび他のアッセイを容易に構築して、この事実を利用することができるからである。
【０１５６】
また、本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、適切なサイズを有するナノ粒子の選択によって細胞レベル以下に局在化させることができる。図1Bに示されるように、30nm以上のナノ粒子を含む送達ビヒクルは、核局在化シグナルの存在または非存在にかかわらず、細胞の細胞質に局在化したままであり、細胞の核に局在化していない。この観測結果は、より大きいナノ粒子は、翻訳されないmRNAが局在化する細胞質に標的化され得ることを示している。より小さいナノ粒子は、核内のプレmRNAを標的化するために使用することができる。従って、本発明の送達ビヒクルは、細胞内に配置されたRNA配列と送達ビヒクルが相互作用し得る細胞の細胞質に対して標的化することができる。
【０１５７】
VIII．  本発明の送達ビヒクルの利点
この分野で現在知られている送達方法を上回る本発明の利点が多数ある。第1に、核局在化シグナルの使用には明かな利点がある。NLSをナノ粒子送達ビヒクルの成分要素として含めることにより、他の変数が最適化されていることを仮定すると、ナノ粒子送達ビヒクルが細胞の核に対して直接的に標的化されることが保証される。この利点は、核の構造体と相互作用させるために設計された活性な薬剤の効力を、標的細胞の核に送達される物質量を増大させることによって大きく増大させる；NLSを含めることにより、より短い期間について細胞質に配置される物質がより少なくなり、そして最終的には物質の分解がより少なくなる。NLSにより、核で生じる細胞プロセス、例えば、DNA複製、転写および様々なスプライシング事象などを効果的に標的化する能力がさらにもたらされる。
【０１５８】
さらなる標的化媒介因子の結合は、細胞の核膜または細胞の外膜などの様々な膜を横断するビヒクルの輸送を助けることができ、従って、別の利点を提供する。細胞内または細胞表面の所与の場所へのビヒクルの輸送を一般には阻害する膜および他の構造体が「錠」として類比されるならば、NLS配列およびRME配列は「鍵」として類比することができる。従って、好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子送達ビヒクルは多数の異なる配列または「鍵」を含むことができ、これらにより、所与のナノ粒子送達ビヒクルは、輸送に対する様々な潜在的なバリアを通過することができるようになり得る。
【０１５９】
本発明のナノ粒子送達ビヒクルの好ましい実施形態の別の利点は、生物学的に不活性である材料を含むナノ粒子を作製することができるということである。例えば、金および他の材料からナノ粒子を製造することが可能である。金は、いくつかの他の材料とは異なり、生物学的に不活性であり、かつ、生物学的システムによる著しい有害な作用を伴うことなく、生理学的に許容され得る。さらに、ナノ粒子は、分解したときにナノ粒子送達ビヒクルの各成分要素（そのすべてがそれ自体、生分解性である）をもたらし得る生分解性材料を含むことができる。
【０１６０】
本発明のナノ粒子送達ビヒクルの好ましい実施形態のさらに別の利点は、活性な薬剤に対する制限がないために、様々な役割のいずれかで機能するその能力である。従って、本発明のナノ粒子送達ビヒクルは、必要性に合わせるために活性な薬剤を単に変化させることによって様々な役割を果たすことができる。従って、細胞の核にアンチセンス鎖を送達することによって遺伝子発現を調節するために設計されたナノ粒子送達ビヒクルはまた、アンチセンス鎖の活性な薬剤を二本鎖のDNA配列で置換することによって転写因子デコイとして機能し得る。
【０１６１】
最後に、ナノ粒子のサイズを変化させることができる。これにより、ナノ粒子送達ビヒクルの示差的な標的化がもたらされ得る。ナノ粒子のサイズは送達ビヒクルの標的化に影響を及ぼし得る。約30nm以上のナノ粒子を含むナノ粒子送達ビヒクルは、NLSが存在する場合でさえ、細胞の核の中に輸送されず、細胞の細胞質に留まる。しかしながら、そのようなナノ粒子送達ビヒクルは細胞の核に輸送されないかもしれないが、そのナノ粒子送達ビヒクルは細胞によって取り込まれ、細胞質内に局在化したままにすることができる。従って、そのようなビヒクルは、翻訳および輸送などの、細胞質で生じるプロセスを調節するために有用であり得る。
【０１６２】
実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい態様を例示するために含められている。下記の実施例のいくつかの局面は、本発明の実施において十分に機能するために本発明者らによって見出されたか、または考えられた技術および手順に関して記載される。本実施例は、本発明者らの標準的な実験室操作の使用によって例示される。本開示およびこの分野における一般的な技術レベルに照らして、当業者は、下記の実施例が例示にすぎないことが意図され、そして多数の変化および改変および変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく用いられ得ることを理解する。
【０１６３】
実施例
細胞内への標的化された進入はますます重要な研究領域である。核は、細胞および転写装置の遺伝的情報がそこに存在するので望ましい標的である。疾患表現型の診断、潜在的な薬物候補物の同定、およびアンチセンス治療などの新規な方法による疾患の処置は、生細胞の核への効率的な物質輸送によって大きく高まると考えられる（Kole＆Sazani、（2001）Curr.Opin.Mol.Ther.、3：229〜234）。生細胞の外側から核内に移行させるために化学的に設計された金ナノ粒子の細胞内での運命が本実施例に報告される。
【０１６４】
金属、半導体、ポリマーおよび磁性体の様々な粒子が以前には細胞内に導入されている（Liu他、（2001）Biomacromolecules、2：362〜368；Marinakos他、（2001）J.Phys.Chem.B.、105：8872〜8876；West＆Halas、（2000）Curr.Opin.Biotech.、11：215〜217；Hogemann他、（2002）Bioconjugate Chem.、13：116〜121）が、生細胞の形質膜の外側から核を標的化するための包括的な細胞化学的方法は存在しない。ナノメートルサイズの粒子の細胞内への輸送を可能にする方法の開発は、細胞の発達および分化を研究するためのツールとして細胞生物学において重要な用途を有する。
【０１６５】
数多くの技術が、細胞での粒子の軌跡を明らかにするために以前から使用されている。実際には、コロイド状金での染色を用いた電子顕微鏡観察の使用が、おそらくは、細胞構造の特徴づけを行う最初の現代的方法であった（Hayat（編）、（1998）Colloidal Gold.Principles,Methods,and Applications；Academic Press,Inc.：San Diego、第1巻）。より近年には、蛍光顕微鏡観察が、発光性CdSeナノ粒子を含む蛍光団を細胞内で突き止めるために使用されている（Bruchez他、（1998）Science、281：2013〜2016；Nie＆Chan、（1998）Science、281：2016〜2018）。しかし、ナノ粒子の核輸送の以前の研究は、顕微注入または化学的に改変された細胞を使用して行われており、従って細胞の膜進入を迂回していた。核への取り込みと共役した標的化されたエンドサイトーシスの組み合わせは、本開示以前には、無傷の細胞を使用するナノ粒子ベクターでは明らかにされていない。
【０１６６】
核への標的化された送達は、細胞特異的な核プローブはいずれも下記の要件を最低限満たさなければならないので難しい課題である（Hallenbeck＆Stevenson、（2000）Targetable Gene Delivery Vectors（Habib編）、Kluwer Academic/Plenum Publishers：New York、37頁〜36頁）。すなわち、細胞特異的な核プローブは、（i）細胞内に進入し、かつ核膜を横断するために十分に小さくなければならない；（ii）例えば、受容体媒介エンドサイトーシス（RME）によって細胞特異的な形質膜受容体に結合しなければならない；（iii）エンドソーム／リソソーム経路を回避しなければならない；（iv）核孔複合体を通過しなければならない；そして（v）低い毒性を有しなければならない。本実施例では、これらの機能および他の機能を行うために設計されたナノ粒子の細胞内輸送研究の結果が報告される。
【０１６７】
本実施例のナノ粒子ベクターは、20nmの金粒子のコアと、代表的なペプチド配列の下記の表に示される様々な細胞標的化ペプチドにコンジュゲート化されたウシ血清アルブミン（BSA）の外皮とを含む。
【０１６８】
代表的なペプチド配列の表
【表８】
2005511761.tif 000010
【０１６９】
代表的なペプチド配列の表に開示されるペプチドを調製するとき、ペプチドは、3−マレイミド安息香酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステルのリンカーを用いてBSAにコンジュゲート化された。ゲル電気泳動（SDS−PAGEおよびIEF）を使用して、ペプチド：BSA比を定量した。各ペプチドは、ある種の課題（例えば、RME）を行うために選ばれた。個々のペプチドは治療用送達ベクターとして以前から調べられている（Morris他、（2000）Curr.Opin.Biotech.、11：461〜466）。しかし、生物学における高効率の核標的化が、上記で述べられたそれぞれのバリアに対して異なるペプチドを利用するウイルスによって達成されている。本実施例の重要な観測結果は、ナノ粒子の表面においてタンパク質にコンジュゲート化されたウイルスペプチドは、細胞進入および核標的化を促進するその機能を維持しているということである。さらに、1つの粒子における隔てられた短いペプチドは、単一の長いペプチドよりも効率的な核標的化をもたらす。金のコアと、多機能性のペプチド外皮とを一緒にすることにより、核内アッセイまたは治療的送達のための特定の細胞を標的化するために調整することができる柔軟な足場が提供される。
【０１７０】
金が、主に3つの理由のために、細胞内標的化ベクターとして選ばれた。第1に、金は、5％未満のサイズ分散度で0.8nmから200nmまで連続的に変化するサイズで日常的に合成することができる。第2に、金は、小分子、ペプチド、タンパク質、DNAおよびポリマーの大きなコレクションで修飾することができる。さらに、これらの機能的エレメントのすべてを、多くの場合には簡便なワンポット手順によって、1つの粒子上に組み合わせることができる。最後に、金粒子は、偏光条件下で細胞内部におけるそれらの軌跡をモニターするために使用することができる強い可視光の吸光を有している。これらの性質は、ビデオ強化型カラー（VEC）顕微鏡観察および微分干渉コントラスト顕微鏡観察（DIC）の新規な組み合わせにおいて都合よく用いられ、これにより、細胞内部における20nmの金ナノ粒子の軌跡の観察が容易になった。
【０１７１】
動的光散乱および透過電子顕微鏡観察により、BSA−ペプチドのコンジュゲートは、ナノ粒子複合体の半径を2nm以上大きくさせないことが見出された。BSAが金粒子のサイズを大きく増加させないという事実は、核標的化ベクターを構築する際におけるその使用において重要である。これは、核孔複合体の直径が、細胞株に依存して20nm〜50nmであるからである（Feldherr＆Akin、（1990）J.Cell Biol.、111：1〜8）。本実施例で使用される20nm金粒子は、研究されたBSA−ペプチドコンジュゲートのいずれかと複合体化されたとき、最大直径が25nmである（裏付け情報を参照のこと）。
【０１７２】
核孔複合体を通過する核への輸送が、SV−40ウイルス（ラージT抗原）由来のNLSで標識された金ナノ粒子を使用して以前から研究されている。このような古典的な研究では、核標的化が、細胞内への顕微注入の後の透過電子顕微鏡観察（TEM）によって観察されていた（Feldherr他、（1992）Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.、89：11002〜11005）。試験事例として、ペプチドN0を含むナノ粒子複合体がHepG2細胞の増殖培地に導入された。驚くべきことに、N0複合体がHepG2細胞の細胞質の内部で観察され、しかしながら、N0は核に進入していなかった。4℃での実験は、細胞進入がエネルギー依存経路を介してであることを示していた。この観察結果は、N0が受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に進入したが、エンドソームを回避し、かつ核を標的化することができなかったことを示唆している（TEMおよび共焦点蛍光顕微鏡観察により、ナノ粒子がエンドソームに限定されたことが確認された）。これらの結果は、核標的化に関連する課題を強調している：知られているNLSペプチドはHepG2細胞に進入させることができるが、エンドソームの回避ができない場合には核を標的化することができない。
【０１７３】
HepG2細胞における核標的化効率を高める努力において、アデノウイルス由来ペプチドが調べられた。アデノウイルスは遺伝子送達で広く使用されており、潜在的に感染性および免疫原性である完全なウイルスを、アデノウイルスのファイバータンパク質に由来するペプチド配列で置換することが非常に注目されている（Seth、（2000）Adenoviral Vectors：（Habib編）、Kluwer Academic/Plenum Publishers：New York、13頁〜22頁；Bilbao他、（1998）Targeted Adenoviral vectors for Cancer Gene Therapy、Plenum Press：New York、第57巻、365頁〜374頁）。このタンパク質は、RME配列およびNLS配列の両方を含有することが知られている（代表的なペプチド配列の表におけるN1およびN2）。RMEおよびNLSの両方を含有する全長のファイバーは、代表的なペプチド配列の表におけるペプチドN3である。金ナノ粒子に複合体化されたときにおけるこれらの標的化ペプチドの機能の比較は下記の通りである。N1は細胞内に進入させない。N2は細胞内に進入させるが、エンドソーム内に捕捉されたままであり、核に達しない。N3は核を標的化し、しかしながら、N1／N2は、N1またはN2またはN3よりも大きい核標的化傾向を有する。これらの結果は下記のように解釈される。N1はアデノウイルスのNLSを提示するだけである（代表的なペプチド配列の表）。このペプチドは、RMEとして機能せず、細胞進入を可能にする他の化学的成分を何ら有していない。N2はRME（NPXY（配列番号7）モチーフ）を提示し、細胞内に進入させるが、核標的化を行うことができない（Chen他、（1990）J.Biol.Chem.、265：3116〜3123）。
【０１７４】
これらの結果は、細胞内への進入および核局在化の達成がともに行われるためには、ナノ粒子複合体はRMEおよびNLSの両方を提示しなければならないことを示している。VEC−DICの結果は、このペプチドを使用した遺伝子送達研究と一致して、核におけるN3の数が著しいことを明瞭に示している（Zhang他、（1999）Gene Ther.、6：171〜181）。N1／N2で標識されたナノ粒子は、VEC−DIC顕微鏡観察によって認められるようにさらにより効率的である。
【０１７５】
行われる別の比較は、別個のBSAバイオコンジュゲートにおいてRMEおよびNLSを提示する多機能的なナノ粒子N1／N2と、全長のアデノウイルスのファイバーペプチドを提示するN3との間である。N1／N2は、N3よりも多い数で核に存在した。1つの長い配列に対して、2つの短いペプチドを有する粒子におけるこのより大きい核標的化効率の原因は構造的または空間的であり得ると考えられる。赤外分光法は、本実施例で用いられたペプチドのすべてが、ナノ粒子に結合したときには、広がった立体配座を取っていることを示している。しかし、1つの長いペプチドが、2つのシグナルを連続させて合成されたとき、シグナルの一方が細胞の受容体に接近しにくくなることが考えられる。このことは、例えば、NPXY（配列番号7）モチーフについては重要である。これは、2つのNPXY（配列番号7）領域が縦列的に相互作用することにより、RMEが促進されることが示されているからである（Hussain、（2001）Front.Biosci.、6：417〜428）。2つのペプチドからなるシグナルをナノ粒子に別個のものとして結合させたとき、構成要素がより短くなると、細胞の受容体に対する等しい接近がもたらされ得る。
【０１７６】
本実施例で使用された方法により、ナノ粒子複合体を核標的化のために使用して、標的化ペプチドの様々な組み合わせの効力を迅速に評価するための方法が提供される。VEC−DICの組み合わせによる顕微鏡観察は、1日あたり数百のサンプルの試験を可能にする。これは、費用および時間がかかる電子顕微鏡観察および共焦点顕微鏡観察の技術を上回る改善である。
【０１７７】
アデノウイルスの標的化配列を使用して明らかにされた多機能的方法により、様々な科学的適用および医学的適用のための効果的かつ細胞特異的な標的化を可能にする個々のペプチド配列の機能の試験が提供される。
【０１７８】
参考文献
下記に示される参考文献、ならびに本明細書中に引用されたすべての参考文献は、それらが、本明細書中で用いられた方法論、技術および／または組成物に対する背景を補足、説明または提供するか、あるいはそのような方法論、技術および／または組成物を教示する程度に、参考として本明細書中に組み込まれる。
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【０１７９】
本発明の様々な細部は、本発明の範囲から逸脱することなく変化させ得ることが理解される。さらに、前記の説明は、例示のためだけであり、限定のためではない。従って、本発明は請求項によって規定される。
【配列表】
2005511761.tif 000011
2005511761.tif 000012
2005511761.tif 000013
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月5日(2004.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005511761000001.app
【国際調査報告】
2005511761.tif 000016