(57)【要約】本発明は、タンパク質トランスロケーション／再分布および／またはタンパク質間相互作用に干渉する化合物または薬物を発見するための、相補するタンパク質のタンパク質断片の様々な使用に関する。多くの相互作用するタンパク質が、彼らがその作用を発揮するシグナル伝達経路の活性化前に、分離し且つ別個の位置に存在するとの事実を、本発明は利用するものである。また、本発明は、誘導されて相互作用可能な相互作用ドメイン（ＦＲＢＰ、ＦＫＢＰ１２）を利用する。特に開示される事項は、ＧＦＰ（ＥＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ変異したＥＹＦＰ）相補性である。
2005527210.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下を具備する細胞：  
第一タンパク質および相補性タンパク質のＮ末端断片を具備する第一抱合体；および  
第二タンパク質および相補性タンパク質のＣ末端断片を具備する第二抱合体；  
ここで前記第一抱合体は、前記第二抱合体が優先的に位置する位置とは、異なる細胞位置に優先的な位置を有しており、  
ここで前記第一タンパク質および前記第二タンパク質は、互いに結合し、  
ここで前記相補性タンパク質は、前記相補性タンパク質の２断片が近い位置関係（ｃｌｏｓｅ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）に移動し、前記相補性タンパク質の２断片が完全に機能的なタンパク質を形成する場合に、変化特性（ａｌｔｅｒｅｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を提示する。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞であって、前記第一抱合体の細胞区画（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）が前記第一タンパク質の素質（ｎａｔｕｒｅ）により決定される細胞。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細胞であって、前記第二抱合体の細胞区画（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）が前記第二タンパク質の素質（ｎａｔｕｒｅ）により決定される細胞。
【請求項４】
請求項１〜２の何れか１項に記載の細胞であって、前記第二抱合体は更にアンカータンパク質を具備し、前記アンカータンパク質は前記第一タンパク質が優先的に位置する位置とは異なる細胞区画にアンカーする、細胞。
【請求項５】
少なくとも以下を具備する細胞：  
第一タンパク質、相互作用パートナーＡおよび相補性タンパク質の第一末端断片（ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を具備する第一抱合体；および  
相互作用パートナーＢおよび相補性タンパク質の第二末端断片を具備する第二抱合体；  
ここで前記第一抱合体は、前記第二抱合体が優先的に位置する位置とは異なる細胞区画に優先的な位置を有しており、  
ここで前記相補性タンパク質は、前記相補性タンパク質の２断片が近い位置関係（ｃｌｏｓｅ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）に移動し、前記相補性タンパク質の２断片が完全に機能的なタンパク質を形成する場合に、変化特性（ａｌｔｅｒｅｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を提示する。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞であって、前記相互作用パートナーＡおよび相互作用パートナーＢが互いに結合する細胞。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞であって、前記相互作用パートナーＡおよび相互作用パートナーＢが、相互作用刺激が適用されている場合のみ、互いに結合する細胞。
【請求項８】
請求項５〜７の何れか１項に記載の細胞であって、前記第二抱合体は更にアンカータンパク質を具備し、前記アンカータンパク質は前記第一タンパク質が優先的に位置する位置とは異なる細胞区画にアンカーする、細胞。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の細胞であって、相補性タンパク質がジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である細胞。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れか１項に記載の細胞であって、前記相補性タンパク質がユビキチンである細胞。
【請求項１１】
請求項１〜８の何れか１項に記載の細胞であって、相補性タンパク質がβ―ラクタマーゼである細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８の何れか１項に記載の細胞であって、相補性タンパク質がβ―ガラクトシダーゼである細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８の何れか１項に記載の細胞であって、相補性タンパク質が蛍光タンパク質である細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞であって、前記相補性タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞であって、前記相補性タンパク質がエクオリア  ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の細胞であって、前記相補性タンパク質のＮ末端断片はＧＦＰのＮ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号１からアミノ酸番号Ｘまでのアミノ酸の連続的なストレッチを具備する）であり、ここでアミノ酸番号Ｘおよびアミノ酸番号Ｘ＋１間のペプチド結合はＧＦＰのループ内である、および前記相補性タンパク質のＣ末端断片はＧＦＰのＣ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号Ｘ＋１からアミノ酸番号２３８までのアミノ酸の連続的なストレッチを具備する）である細胞。
【請求項１７】
請求項１４に記載の細胞であって、前記相補性タンパク質のＮ末端断片はＧＦＰのＮ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号１からアミノ酸番号Ｘまでのアミノ酸の連続的なストレッチを具備する）であり、ここでアミノ酸番号Ｘおよびアミノ酸番号Ｘ＋１間のペプチド結合はＧＦＰのループ内である、および前記相補性タンパク質のＣ末端はＧＦＰのＣ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号Ｙ＋１からアミノ酸番号２３８までのアミノ酸の連続的なストレッチを具備する）であり、ここでＹ＜Ｘは２つのＧＦＰ断片のオーバーラップを生じ、およびアミノ酸Ｙおよびアミノ酸Ｙ＋１間のペプチド結合はＧＦＰのループ内である、細胞。
【請求項１８】
請求項１４〜１７の何れか１項に記載の細胞であって、ＧＦＰがＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ｄｓＲｅｄおよびＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰからなる群から選択される細胞。
【請求項１９】
前記ＧＦＰがＥＧＦＰである、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記ＧＦＰがＥＹＦＰである、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１４〜２０の何れか１項に記載の細胞であって、発色団に先行するポジション１におけるアミノ酸が変異して蛍光強度の増加を提供する細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の細胞であって、発色団に先行するポジション１におけるアミノ酸ＦがＬに置換された細胞。
【請求項２３】
請求項１４〜２２の何れか１項に記載の細胞であって、前記ＧＦＰが変異して更にＳ７２Ａ変異を有する細胞。
【請求項２４】
請求項１６〜２３の何れか１項に記載の細胞であって、Ｘは、Ｔｈｒ９〜Ｖａｌ１１ループ内の９と１０との間；又はＡｓｎ２３〜Ｈｉｓ２５ループ内の２３と２４との間；又はＴｈｒ３８〜Ｇｌｙ４０ループ内の３８と３９との間；又はＣｙｓ４８〜Ｐｒｏ５６ループ内の４８と５５との間；又はＳｅｒ７２〜Ａｓｐ７６ループ内の７２と７５との間；又はＨｉｓ８１〜Ｐｈｅ８３ループ内の８１と８２との間；又はＭｅｔ８８〜Ｇｌｕ９０ループ内の８８と８９との間；Ｌｙｓ１０１〜Ａｓｐ１０３ループ内の１０１と１０２との間；又はＰｈｅ１１４〜Ｔｈｒ１１８ループ内の１１４と１１７との間；又はＩｌｅ１２８〜Ｔｙｒ１４５ループ内の１２８と１４４との間；又はＡｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループ内の１５４と１５９との間；又はｌｌｅ１７１〜Ｓｅｒ１７５ループ内の１７１と１７４との間；又はｌｌｅ１８８〜Ａｓｐ１９７ループ内の１８８と１９６との間；又はＡｓｐ２１０〜Ａｒｔ２１５ループ内の２１０と２１４との間である細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載の細胞であって、ＸはＡｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループ内の１５４と１５９との間である細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の細胞であって、ＸはＡｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループ内の１５７である細胞。
【請求項２７】
請求項２４に記載の細胞であって、Ｘはｌｌｅ１７１〜Ｓｅｒ１７５ループ内の１７１と１７４との間である細胞。
【請求項２８】
請求項２７に記載の細胞であって、Ｘはｌｌｅ１７１〜Ｓｅｒ１７５ループ内の１７２である細胞。
【請求項２９】
請求項１７に記載の細胞であって、ＹはＡｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループ内の１５４と１５９との間である細胞。
【請求項３０】
請求項２９に記載の細胞であって、ＹはＡｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループ内の１５７である細胞。
【請求項３１】
請求項１６〜３０の何れか１項に記載の細胞であって、Ｘはｌｌｅ１７１〜Ｓｅｒ１７５ループ内の１７２であり、ＹはＡｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループ内の１５７である細胞。
【請求項３２】
請求項１〜３１の何れか１項に記載の細胞であって、前記相補性タンパク質のＮ末端断片がフレーム内で対象の第一タンパク質と融合される細胞。
【請求項３３】
請求項１〜３２の何れか１項に記載の細胞であって、前記第一タンパク質が前記相補性タンパク質のＮ末端断片のＮ末端と融合される細胞。
【請求項３４】
請求項１〜３３の何れか１項に記載の細胞であって、前記第一タンパク質が前記相補性タンパク質のＮ末端断片のＣ末端と融合される細胞。
【請求項３５】
請求項１〜３４の何れか１項に記載の細胞であって、前記相補性タンパク質のＣ末端断片がフレーム内で、前記第二タンパク質と融合される細胞。
【請求項３６】
請求項１〜３５の何れか１項に記載の細胞であって、対象の前記第二タンパク質が、前記相補性タンパク質のＣ末端断片のＮ末端と融合される細胞。
【請求項３７】
請求項１〜３６の何れか１項に記載の細胞であって、対象の前記第二タンパク質が、前記相補性タンパク質のＣ末端断片のＣ末端と融合される細胞。
【請求項３８】
請求項１〜３７の何れか１項に記載の細胞であって、前記相補性タンパク質のＮ末端断片（フレーム内で第一タンパク質と融合された）は、更にリンカー配列を、前記相補性タンパク質のＮ末端断片と前記第一タンパク質との間に具備する細胞。
【請求項３９】
請求項１〜３８の何れか１項に記載の細胞であって、前記相補性タンパク質のＣ末端断片（フレーム内で対象の第二タンパク質と融合された）は、更にリンカー配列を、前記相補性タンパク質のＣ末端断片と前記第二タンパク質との間に具備する細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３９の何れか１項に記載の細胞であって、前記ＧＦＰはＥＹＦＰ（更にＦ６４Ｌ変異を有する）であり、Ｘは１７２であり、前記第一タンパク質（ＧＦＰのＮ末端断片と融合された）はＧＦＰのＮ末端断片のＣ末端と融合され、及び前記第二タンパク質（ＧＦＰのＣ末端断片と融合された）はＧＦＰのＣ末端断片のＮ末端と融合される、細胞。
【請求項４１】
請求項１〜４０の何れか１項に記載の細胞であって、前記ＧＦＰはＥＹＦＰ（更にＦ６４Ｌ変異を有する）であり、Ｘは１５７であり、前記第一タンパク質（ＧＦＰのＮ末端断片と融合された）はＧＦＰのＮ末端断片のＣ末端と融合され、及び前記第二タンパク質（ＧＦＰのＣ末端断片と融合された）はＧＦＰのＣ末端断片のＮ末端と融合される、細胞。
【請求項４２】
請求項１〜４１の何れか１項に記載の細胞であって、前記第一抱合体が前記細胞において発現される細胞。
【請求項４３】
請求項１〜４２の何れか１項に記載の細胞であって、前記第二抱合体が前記細胞において発現される細胞。
【請求項４４】
請求項１〜４３の何れか１項に記載の細胞であって、相互作用パートナーＡはＦＫＢＰ１２であり、相互作用パートナーＢはＦＲＡＰであり（又は逆（ｏｒ  ｖｉｓｅ  ｖｅｒｓａ））、および前記相互作用刺激はラパマイシンである細胞。
【請求項４５】
請求項１〜４４の何れか１項に記載の細胞であって、相互作用パートナーＡはＦＫＢＰ１２であり、相互作用パートナーＢはＦＲＢ（Ｔ２０９８Ｌ）であり（又は逆（ｏｒ  ｖｉｓｅ  ｖｅｒｓａ））、および前記相互作用刺激はラパマイシンである細胞。
【請求項４６】
請求項１〜４５の何れか１項に記載の細胞であって、相互作用パートナーＡはＦＫＢＰ１２であり、相互作用パートナーＢはＦＲＢ（Ｔ２０９８Ｌ）であり（又は逆（ｏｒ  ｖｉｓｅ  ｖｅｒｓａ））、および前記相互作用刺激はＡＰ２１９６７である細胞。
【請求項４７】
請求項１〜４６の何れか１項に記載の細胞であって、相互作用パートナーＡはＦＫＢＰ１２であり、相互作用パートナーＢはＦＫＢＰ１２であり（又は逆（ｏｒ  ｖｉｓｅ  ｖｅｒｓａ））、および前記相互作用刺激はＡＰ２１９６７である細胞。
【請求項４８】
請求項１〜４７の何れか１項に記載の細胞であって、相互作用パートナーＡはＦＫＢＰ１２であり、相互作用パートナーＢはＦＫＢＰ１２であり（又は逆（ｏｒ  ｖｉｓｅ  ｖｅｒｓａ））、および前記相互作用刺激はＡＰ２１９６７である細胞。
【請求項４９】
請求項１〜４８の何れか１項に記載の細胞であって、相互作用パートナーＡおよびＢはステロイドホルモンレセプターであり、二量体化因子（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）ホルモンリガンドである細胞。
【請求項５０】
請求項１〜４９の何れか１項に記載の細胞であって、相互作用パートナーＡおよびＢはエストロゲンレセプターであり、相互作用刺激因子はエストロゲンである細胞。
【請求項５１】
請求項１〜５０の何れか１項に記載の細胞であって、前記アンカータンパク質は、上皮細胞成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の膜貫通ドメインを含んでいる、又はインテグリンタンパク質ファミリーの１つの膜貫通ドメインを含んでいる、又はｃ−Ｓｒｃのミリストイル化配列（残基１〜１４）を含んでいるタンパク質である、細胞。
【請求項５２】
請求項１〜５１の何れか１項に記載の細胞であって、前記アンカータンパク質はヒストンタンパク質又は核小体に通常限定されるタンパク質（例えば、ｐ１２０核小体タンパク質）である、細胞。
【請求項５３】
請求項１〜５２の何れか１項に記載の細胞であって、前記アンカータンパク質は、ミトコンドリアの外側または内側の膜に通常限定されるタンパク質（例えば、ＶＤＡＣ、ＡＴＰ−ａｓｅのＦｏサブユニット、またはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ）である、細胞。
【請求項５４】
請求項１〜５３の何れか１項に記載の細胞であって、前記アンカータンパク質は、ゴルジ体の様々な異なる領域に通常限定されるタンパク質（例えば、ＴＧＮ３８またはＡＤＡＭ１２−Ｌ）である、細胞。
【請求項５５】
請求項１〜５４の何れか１項に記載の細胞であって、前記アンカータンパク質は、焦点結合複合体（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に通常限定されるタンパク質（例えば、Ｐ１２５、ＦＡＫ、インテグリン  アルファまたはベータ、またはパキシリン）である、細胞。
【請求項５６】
請求項１〜５５の何れか１項に記載の細胞であって、前記アンカータンパク質は、細胞骨格構造に通常関連するタンパク質（例えば、Ｆ−アクチン鎖または微小管束、例えば、ＭＡＰ４、アルファ−アクチニンのアクチン結合ドメイン、キネシン、ミオシンまたはダイネイン）である、細胞。
【請求項５７】
請求項１〜５６の何れか１項に記載の細胞であって、前記アンカータンパク質は、核の物質（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）または核のコンポーネントと通常関連するタンパク質〔例えば、ヒストンタンパク質（ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、およびその変種を含む）〕である、細胞。
【請求項５８】
請求項１〜５７の何れか１項に記載の細胞であって、前記アンカータンパク質は、核膜（例えば、ＡおよびＢ型ラミン）と、または核小体（例えば、スプライシングボディー、カハールボディー、ＰＭＬ核小体（ＰＭＬ発癌性ドメイン、ＰＯＤＳ）と通常関連するタンパク質、または転写エンジン（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ  ＰＯＬ−ＩＩ）である、細胞。
【請求項５９】
請求項１〜５８の何れか１項に記載の細胞であって、真核細胞である細胞。
【請求項６０】
請求項１〜５８の何れか１項に記載の細胞であって、原核細胞である細胞。
【請求項６１】
タンパク質間相互作用を検出するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）少なくとも以下を具備する細胞を提供することと：  
対象の前記第一タンパク質および相補性タンパク質の第一末端断片（ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を具備する第一抱合体；および  
対象の前記第二タンパク質および相補性タンパク質の第二末端断片を具備する第二抱合体；  
ここで対象の前記第二タンパク質は、対象の前記第一タンパク質が優先的に位置する位置とは、異なる細胞位置に優先的な位置を有している、  
（ｂ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢ間の相補性が次のこと、即ち、対象の前記第一タンパク質が、この対象の第一タンパク質の優先的な位置から、対象の前記第二タンパク質が位置する細胞区画にトランスロケーションしていること、および対象の２つのタンパク質が相互作用すること、の指標（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ）である方法。
【請求項６２】
タンパク質間相互作用を検出するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）請求項１〜６０の何れかに記載の細胞を提供することと、および  
（ｂ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢ間の相補性が次のこと、即ち、対象の前記第一タンパク質が、この対象の第一タンパク質の優先的な位置から、対象の前記第二タンパク質が位置する細胞区画にトランスロケーションしていること、および対象の２つのタンパク質が相互作用すること、の指標（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ）である方法。
【請求項６３】
化合物がタンパク質間相互作用を阻止するかどうかを試験するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）請求項１〜６０の何れかに記載の細胞を提供することと；  
（ａ１）前記化合物を工程（ａ）の細胞に添加することと；  
（ａ２）トランスロケーション刺激を工程（ａ１）の細胞に添加することと、  
ここで前記トランスロケーション刺激は２つの抱合体に作用して、同じ細胞局在を生じさせる；  
（ｂ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
低い相補性（工程（ａ１）を省略したシステムと比較して）が、前記化合物が２つのタンパク質間の相互作用を阻止する能力を有すること、の指標である方法。
【請求項６４】
請求項６１〜６３の何れか１項に記載の方法であって、前記第二抱合体は更にアンカータンパク質を具備し、前記アンカータンパク質は、対象の前記第一タンパク質が優先的に位置する位置とは異なる細胞区画にアンカーする、方法。
【請求項６５】
タンパク質のトランスロケーションを検出するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）少なくとも以下を具備する細胞を提供することと：  
前記タンパク質、相補性タンパク質の第一末端（ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｅｒｍｉｎａｌ）、および相互作用パートナーＡを具備する第一抱合体；および  
アンカータンパク質、相補性タンパク質の第二末端、および相互作用パートナーＢを具備する第二抱合体；  
ここで前記アンカータンパク質は前記タンパク質が優先的に位置する細胞区画とは異なる細胞区画にアンカーする、および  
ここで前記相互作用パートナーＡおよび相互作用パートナーＢは互いに結合する；  
（ｂ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢ間の相補性が次のこと、即ち、前記タンパク質が、前記タンパク質の優先的な位置から、前記アンカータンパク質がアンカーする細胞区画にトランスロケーションしていること、の指標である方法。
【請求項６６】
タンパク質のトランスロケーションを検出するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）請求項６〜６０の何れかに記載の細胞を提供することと、および  
（ｂ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢ間の相補性が次のこと、即ち、前記タンパク質が、前記タンパク質の優先的な位置から、前記アンカータンパク質がアンカーする細胞区画にトランスロケーションしていること、の指標である方法。
【請求項６７】
化合物がタンパク質のトランスロケーションを誘導するかどうかを試験するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）請求項６〜６０の何れかに記載の細胞を提供することと；  
（ａ１）前記化合物を工程（ａ）の細胞に添加することと；  
（ｂ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
増加した相補性（工程（ａ１）を省略したシステムと比較して）が、前記化合物が前記タンパク質のトランスロケーションを誘導すること、の指標である方法。
【請求項６８】
化合物がタンパク質のトランスロケーションを阻止するかどうかを試験するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）請求項６〜６０の何れかに記載の細胞を提供することと；  
（ａ１）前記化合物を工程（ａ）の細胞に添加することと；  
（ａ２）トランスロケーション刺激を工程（ａ１）の細胞に添加することと：  
（ｂ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
低い相補性（工程（ａ１）を省略したシステムと比較して）が、前記化合物が前記タンパク質のトランスロケーションを阻止すること、の指標である方法。
【請求項６９】
タンパク質のトランスロケーションを検出するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）少なくとも以下を具備する細胞を提供することと：  
前記タンパク質、相補性パートナーＡ、および相互作用パートナーＡを具備する第一抱合体；および  
アンカータンパク質、相補性パートナーＢ、および相互作用パートナーＢを具備する第二抱合体；  
ここで前記アンカータンパク質は、前記タンパク質が優先的に位置する細胞区画とは異なる細胞区画にアンカーする、  
ここで前記相互作用パートナーＡおよび相互作用パートナーＢは、相互作用刺激が適用されている場合のみ互いに結合する；  
（ｂ）相互作用刺激を添加することと；  
（ｃ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢ間の相補性が次のこと、即ち、前記タンパク質が、前記タンパク質の優先的な位置から、前記アンカータンパク質がアンカーする細胞区画に、前記相互作用刺激の添加後にトランスロケーションしていること、の指標である方法。
【請求項７０】
タンパク質のトランスロケーションを検出するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）請求項７〜６０の何れかに記載の細胞を提供することと、および  
（ｂ）相互作用刺激を添加することと；  
（ｃ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢ間の相補性が次のこと、即ち、前記タンパク質が、前記タンパク質の優先的な位置から、前記アンカータンパク質がアンカーする細胞区画に、前記相互作用刺激の添加後にトランスロケーションしていること、の指標である方法。
【請求項７１】
化合物がタンパク質のトランスロケーションを誘導するかどうかを試験するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）請求項７〜６０の何れかに記載の細胞を提供することと；  
（ａ１）前記化合物を工程（ａ）の細胞に添加することと；  
（ｂ）相互作用刺激を添加することと；  
（ｃ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
増加した相補性（工程（ａ１）を省略したシステムと比較して）が、前記化合物が前記タンパク質のトランスロケーションを誘導すること、の指標である方法。
【請求項７２】
化合物がタンパク質のトランスロケーションを阻止するかどうかを試験するための方法であって、以下の工程を含み：  
（ａ）請求項７〜６０の何れかに記載の細胞を提供することと；  
（ａ１）前記化合物を工程（ａ）の細胞に添加することと；  
（ａ２）トランスロケーション刺激を工程（ａ１）の細胞に添加することと：  
（ｂ）相互作用刺激を添加することと；  
（ｃ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
低い相補性（工程（ａ１）を省略したシステムと比較して）が、前記化合物が前記タンパク質のトランスロケーションを阻止すること、の指標である方法。
【請求項７３】
抗原を検出するためのキットであって、以下を具備し：  
（ａ）前記抗原に結合する第一抗体；  
（ｂ）前記第一抗体に結合するタンパク質と相補性タンパク質のＮ末端とを具備する第一抱合体；  
（ｃ）前記第一抗体に結合するタンパク質と前記相補性タンパク質のＣ末端とを具備する第二抱合体；  
前記第一および第二抱合体の前記第一抗体に対する結合が、前記相補性タンパク質の２つの末端を機能的なタンパク質が形成されるように近接させる、キット。
【請求項７４】
細胞におけるカスパーゼ活性を決定するための方法であって、少なくとも以下の工程を含み、  
（ａ）少なくとも以下を具備する細胞を提供することと：  
相補性タンパク質の第一末端、相互作用パートナーＡ、核局在化配列（ＮＬＳ）、バリン−アラニン−アスパルテート（ＶＡＤ）配列およびアンカータンパク質を具備する第一抱合体；  
相補性タンパク質の第二末端、相互作用パートナーＢおよびアンカータンパク質を具備する第二抱合体；  
ここで前記第一抱合体の前記アンカータンパク質は核とは異なる細胞位置に存在し、前記第二抱合体の前記アンカータンパク質は前記核に存在する、および  
ここで相互作用パートナーＡ、前記ＮＬＳおよび前記相補性タンパク質の第一末端は、ＶＡＤ配列の同じ側（ｓａｍｅ  ｓｉｄｅ）に全て位置しており、前記アンカータンパク質は、前記ＮＬＳの他の側に位置している、
（ｂ）前記相補性タンパク質が相補するかどうかを決定することと  
相補性が次のこと、即ち、カスパーゼが前記第一抱合体を切断し、自由な部分が前記核にトランスロケーションし、パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補すること、の指標である方法。
【請求項７５】
任意の前記抱合体、断片または融合タンパク質をコード化している核酸。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質トランスロケーションおよび／またはタンパク質間相互作用に干渉する化合物または薬物を発見するための、相補するタンパク質のタンパク質断片の様々な使用に関する。多くの相互作用するタンパク質が、彼らがその作用を発揮するシグナル伝達経路の活性化前に、分離し且つ別個の位置に存在するとの事実を、本発明は利用するものである。本発明は、特定の刺激を適用することにより相互作用できる、ある種の相互作用ドメインを利用するものである。この手段により、相補性シグナルが、それらの相補性コンポーネントに関して増強され得る。このコンポーネントは、彼らが作用するシグナル伝達経路の活性化に引き続き、同じ細胞内位置（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）に案内される。
【発明の背景】
【０００２】
互いの及び他の細胞コンポーネントとのタンパク質の相互作用は、殆ど全ての細胞プロセスに本質的資質（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐａｒｔ）であり、このことは細胞内シグナル伝達系で特に真実である。情報は、典型的には、一連の係る相互作用により、シグナル伝達系を通して及びその間を通過する。
【０００３】
相互作用する種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を同定するための現存している方法は、２つの群に分けられる、即ち：第一は、多少精製されたコンポーネントをインビトロで近接させる（ｂｒｏｕｇｈｔ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ）作業のみでできる方法であり、例えば、表面プラズモン共鳴（エバネッセント波法）、タンパク質の質量分光学法（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、蛍光相関分光法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）および異方性測定（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）であり、全てが共通の特性（即ち、対象のコンポーネントが細胞環境（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｔｅｘｔ）から分離されたとの特性）を具備している。第二の群は、生細胞（ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）内で働くように設計された全ての方法を含む。それらの中で、多くは酵母細胞（酵母二重ハイブリッド、リバース  酵母二重ハイブリッド及びその変法）で働くよう開発されているが、しかし、いくつかのものは哺乳類の細胞システムにおける使用に適用されている。タンパク質相互作用の検出のための細胞方法（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ）は、文献〔Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，  Ａ．  Ｒ．  ，  Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．  （１９９９）  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４  （５４２２）：  １９４８）〕に詳細に総説が記載されている。その方法の多くは、従来の二重ハイブリッド法から派生したものである。これら方法において、転写活性は、二部に分かれた（ｂｉ−ｐａｒｔｉｔｅ）転写制御因子を、付着した「ベイト（ｂａｉｔ）」および「プレイ（ｐｒｅｙ）」コンポーネントの相互作用を介して、近接させることにより開始される。一方、他の方法は、インビボでの生化学的な機能の再構成に依存する。Ｒｏｓｓｉ等（２０００）（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：  １１９−１２２）は、哺乳類細胞に基づいたタンパク質相互作用アッセイを開発している。このアッセイではリードアウト（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）は転写性のものではなく、変異したベータガラクトシダーゼ酵素の再構成である。四量体酵素の再構成に際し、酵素活性をモニターできる。加えて、タンパク質相互作用をモニターするための方法は、光学的なリードアウトに基づくものであり、即ち蛍光共鳴伝達（ＦＲＥＴ）、又はコインシデンス分析（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ；蛍光相関分光法の変法）、又は蛍光寿命変化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌｉｆｅｔｉｍｅ  ｃｈａｎｇｅｓ）である。最後の３つのカテゴリーは、単純化されたインビトロ条件下で一般的に適用されるが、それらを生細胞の更に複雑な環境に移行するための試みがなされている。
【０００４】
完全な酵素（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｅｎｚｙｍｅ）の特定の酵素断片の再構成（ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）を、タンパク質間相互作用として使用することが示唆されている。ＪｏｈｎｓｓｏｎおよびＶａｒｓｈａｖｓｋｙ（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｎ．，  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，  Ａ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９１，１０３４０−１０３４４）は、ユビキチンの再構成を開示している。この再構成は、融合のユビキチンプロテアーゼによる不可逆的な切断およびレポーターの放出を介して検出される。二重ハイブリッド技術と対照的に、この技術は、タンパク質―タンパク質相互作用を、時間の関数として、生細胞における該相互作用の天然部位（ｎａｔｕｒａｌ  ｓｉｔｅｓ）で、モニターする可能性を有するものである。
【０００５】
同様のシステムが他のタンパク質の再構成に関して示唆されており、これにはβガラクトシダーゼ（Ｒｏｓｓｉ，  Ｆ．，  Ｃｈａｒｌｔｏｎ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｂｌａｕ，  Ｈ．  Ｍ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９４，８４０５−８４１０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ，  Ｗ０９８／３４１２０）、およびラクタマーゼ  （Ｗｅｈｒｍａｎ，  Ｔ．，  Ｋｌｅａｖｅｌａｎｄ，  Ｂ．  ，  Ｈｅｒ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｂａｌｉｎｔ，  Ｒ．  Ｆ．，  Ｂｌａｕ，  Ｈ．  Ｍ．  （２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９９，３４６９−３４７４）が含まれる。基礎的概念は、機能的タンパク質を２つの断片に分割（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）することにより、その機能が損失されるということである。その２つの断片は、それぞれタンパク質ＸおよびＹにインフレームで融合され、細胞に形質転換または形質移入される。タンパク質ＸおよびＹ間の結合は２つの断片を共に近接させ、これにより相補する断片の局所濃度が増加し、これらの断片のフォールディングを誘導し、そして活性（非断片化タンパク質の活性と類似する）を有する機能的なタンパク質を産生する。前記機能がＤＨＦＲ活性である場合、前記細胞は、タンパク質ＸおよびＹが互いに結合するときのみ生存する。
【０００６】
最近、蛍光タンパク質の断片の補助された（ａｓｓｉｓｔｅｄ）再構成およびフォールディングに関する、多少類似するシステムを使用することが記載された。前記機能は蛍光なので、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙが互いに結合する場合のみ、前記細胞は励起に際して光を発して、これにより相補性を補助する。Ｇｈｏｓｈ（Ｉ．  Ｇｈｏｓｈ，  Ａ．  Ｄ．  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｌ．  Ｒｅｇａｎ  （２０００）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２，５６５８−５６５９，  Ｗ００１／８７９１９）は、ｓｇ１００と称されるＧＦＰ変種（Ｆ６４Ｌ，  Ｓ６５Ｃ，  Ｑ８０Ｒ，  Ｙ１５１Ｌ，  Ｉ１６７ＴおよびＫ２３８Ｎ）の使用を記載している。本ＧＦＰは、単一の蛍光励起（ｓｉｎｇｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）並びにそれぞれ４７５ｎｍおよび５０５ｎｍでの放射ピーク（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｐｅａｋｓ）を有している〔Ｐａｌｍにより記載されたｓｇ２５に類似する（Ｐａｌｍ，  Ｇ．  Ｊ．  ，  Ｚｄａｎｏｖ，  Ａ．  ，  Ｇａｉｔａｎａｒｉｓ，  Ｇ．  Ａ．  ，  Ｓｔａｕｂｅｒ，  Ｒ．，  Ｐａｖｌａｋｉｓ，  Ｇ．  Ｎ．，  Ｗｌｏｄａｗｅｒ，  Ａ．  （１９９７）  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ４，３６１−３６５）〕。機能的なＧＦＰ断片の相補性は、２つの独立したペプチドであって、本ＧＦＰの最初の１５７  Ｎ末端アミノ酸（ＮｔｅｒｍＧＦＰ１５７）および本ＧＦＰの残りの８１  Ｃ末端アミノ酸（残基１５８から開始される）から構成されるペプチドを共発現することにより達成され、各々の前記ＧＦＰペプチド断片は該断片を相互作用させる、相互作用するロイシンジッパーペプチドと融合されている。
【０００７】
タンパク質の補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）または再局在化（ｒｅ−ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ）は、多くの重要なシグナル伝達系において重要な役割を担っている。この事項は以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）において明らかである、（ｉ）プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化、この活性化において、形質膜への補充は、本酵素の活性化プロセスの生来の資質（ｉｎｈｅｒｅｎｔ  ｐａｒｔ）である；（ｉｉ）複数のタンパク質（これらのタンパク質のサイトゾールから膜部位への転移が中心的役割を有する）に依存するｐ４２／４４ＭＡＰキナーゼの活性化；および（ｉｉｉ）ｒａｐ１の環状ＡＭＰ駆動性の再局在化は、その活性化に決定的である。タンパク質トランスロケーションを潜在的な医薬（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）の同定に関して使用することは、Ｗ０９８／４５７０４に開示されている。しかしながら、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）生細胞におけるタンパク質の局在化および任意の再局在化を検出するための代替的な技術に対する必要性がなおも存在する。現行の検出技術は、一般に低いスループットおよび高価な検出機器を必要とすることから特徴づけられるものである。
【発明の概要】
【０００８】
２つの独立したタンパク質半分（ｔｗｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｈａｌｖｅｓ）として発現された場合、特定のＧＦＰｓが再構成され、機能的な蛍光タンパク質を形成することを、本出願は開示する。例えば、ＥＧＦＰが哺乳類細胞において発現される場合、ＧＦＰβ−バレルのベータシート構造を形成する残基間のループ領域に位置する、分割部位（ａ  ｓｐｌｉｔ  ｓｉｔｅ）を選択することにより、強い蛍光を生じる（実施例５および実施例７）。更に、本出願は、ＥＹＦＰも再構成され、驚くことに、再構成されたタンパク質からの蛍光が著明に増強される（それがＦ６４Ｌ変異を有している場合）ことを記載する（実施例９）。
【０００９】
モデルＧＦＰ相補性システム（条件的に相互作用するよう作出できるコンポーネントを用いる）が、予期されるとおり、用量依存的な様式で、相互作用刺激に応答すること、また重要なことに  殆ど自発性の再構成（相補性）が観察されないようなタンパク質の相補性半分（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｈａｌｖｅｓ）と融合させたタンパク質の条件的な相互作用をブロックする化合物を検出するために使用できる（例えば、ＧＦＰ相補性システム）（実施例１１）こと、を本出願は実証している。
【００１０】
自発性に相互作用するタンパク質に関して、相補性システムを、生細胞における、それらのタンパク質間の相互作用の程度をレポートするように設計できることを、本明細書中に開示される実施例は開示している。これは、前記細胞の分離した位置に２つのタンパク質を保持すること、これにより相互作用を１又は双方のタンパク質のトランスロケーション後にのみ発生させることを認容して、それらを前記細胞内の１つの区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）または位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）において近接させること、により達成される。
【００１１】
本発明の一側面は次に示す概念に基づいて構成される；即ち、シグナル伝達タンパク質（このタンパク質は、活動的な場合、互いに相互作用する）が、大抵は別個の且つ空間的に分離された細胞内位置に、それらが作用するシグナル伝達経路の活性化前に存在し、それゆえに、それらのタンパク質の相互作用をモニターするために使用される、相補的システムの自発性の再構成が回避されるとの概念である。これは実施例１４で明瞭に記載される；ここでは１つの局在部位から別の局在部位へのトランスロケーションの誘導が、相補性タンパク質のＮおよびＣ末端を再構成させ、機能を発揮させる（このケースでは蛍光）ことが記載される。同様のシステムは実施例１６に記載され；ここでは構成的に相互作用するタンパク質が、誘導性に相互作用を生じるタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）と置換される。
【詳細な開示】
【００１２】
本発明は、細胞内のタンパク質の局在化の知識に基づき達成され、これを用いて酵素の２つの半分を、制御された様式で、それらが元のように近接する（ｂｒｏｕｇｈｔ  ｂａｃｋ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ）まで離しておくものである。従って、本発明の主要な態様は細胞に関し、該細胞は少なくとも以下を含み：  
第一タンパク質および相補性タンパク質のＮ末端断片を具備する第一抱合体（ｆｉｒｓｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）；および  
第二タンパク質および相補性タンパク質のＣ末端断片を具備する第二抱合体（ｓｅｃｏｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）；  
ここで前記第一抱合体は、前記第二抱合体が優先的に位置する位置とは別個で且つ空間的に分離した細胞位置に優先的な位置を有しており、  
ここで条件が許容された場合、前記第一タンパク質および前記第二タンパク質は互いに結合し、および  
ここで前記相補性タンパク質は、前記相補性タンパク質の２断片が近い位置関係（ｃｌｏｓｅ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）に移動し、前記相補性タンパク質の２断片が完全に機能的なタンパク質を形成する場合に、変化特性（ａｌｔｅｒｅｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を提示する。
【００１３】
本発明の一使用（Ｏｎｅ  ｕｓｅ）によって、薬物を同定することが可能であり、該薬物は第一タンパク質と第二タンパク質との間の相互作用を阻止し得るものである。係る薬物適用前の相互作用を避けるための、本発明の１つの重要な特性は、２つの抱合体を異なる細胞位置に保持することである。大抵の（全てではないが）タンパク質は、様々な状態の間で平衡状態にある。このような関係において、この平衡は、細胞内で１つの位置での存在及び別の位置での存在の間のバランスを提示するものである。本出願の課題に関して、２つの異なる細胞位置は、２つのタンパク質の優先的な又は好適な位置と理解され、これにより２つのタンパク質間の相互作用が生じないようにするものであり、即ち、それらの会合が促進されない（ｎｏｔ  ｆａｖｏｒｅｄ）ための条件である。２つの位置間のバランスが一方に大きくシフトする場合、前記タンパク質はそれらの位置の一方に優先的に存在するだろう。システムの活性化は、本明細書において、トランスロケーションを開始させる、システムの任意の処理の結果；又は２つの抱合体の相補性を形成する、即ち、システムの活性化が前記タンパク質のうち少なくとも１つの平衡を、他のタンパク質とは異なる細胞位置から、他のタンパク質と同じ細胞位置にシフトする、任意の他の細胞シグナル伝達プロセスの結果を意味する。例として、ＰＫＣβは細胞質に優先的に認められるが、独占的（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）に認められるわけではない、一方、相互作用パートナータンパク質（ＲＡＣＫ１）は形質膜（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に優先的に局在している。刺激（例えば、ホルボールエステル  ＰＭＡ）の適用に際して、ＰＫＣβタンパク質は形質膜に優先的に局在し、ここで彼らはＲＡＣＫ１と近接する。形質膜へと及び形質膜からトランスロケーションする、シグナル伝達タンパク質の別の例は、ＳＴＡＴ転写制御因子およびＡＫＴ／ＰＢＫキナーゼである。細胞質と核との間をトランスロケーションするシグナル伝達タンパク質の例は、ＮＦカッパＢ転写制御因子、アンドロゲンレセプター、ＭＡＰキナーゼｐ３８、ＥＲＫおよびＪＮＫ、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２並びにＦｏｒｋｈｅａｄ転写制御因子である。
【００１４】
従って、本発明の大抵の使用に関して、前記第一抱合体の細胞位置は、前記第一タンパク質の素質（ｎａｔｕｒｅ）により決定される。同様に、前記第二抱合体の細胞位置は、前記第二タンパク質の素質により決定される。
【００１５】
現在既知の相補性タンパク質は不可逆的な相補性を生じる、なぜなら相補する断片の正確にフォールドした複合体はエネルギー論的に有利であり、即ち、フォールドした断片は解離するとしても（ｉｆ  ａｔ  ａｌｌ）非常に緩徐に解離するからである。従って、タンパク質は同じ位置に存在すると共に相補性が開始する場合（これは前記第一抱合体における第一タンパク質と前記第二抱合体における第二タンパク質との間の自然発生的な結合によるものである）、有利ではない位置でのタンパク質の小さい部分（ｓｍａｌｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）は不可逆的に結合するだろう。不可逆的に結合する場合、それは最早、不利な（ｕｎｆａｖｏｒｅｄ）および有利な（ｆａｖｏｒｅｄ）位置の間の自由なタンパク質抱合体の平衡に関与しない。究極的には、前記タンパク質抱合体の殆ど又は全ては、不利な位置に対する平衡化によって引きつけられる（ｄｒａｗｎ）。これはシンク効果（ｓｉｎｋ  ｅｆｆｅｃｔ）と称される。２つのタンパク質間の自然発生的な会合を最小化する一方法は、前記タンパク質の１つとアンカータンパク質（細胞内でのその可動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）を厳密に制限する）とが相互作用することである。この場合において、１つのタンパク質は１つの局在部位に固定され、そして相補する断片間の会合は、他のタンパク質がアンカーした位置に移動する場合のみ生じる。
本発明の本側面において、前記第二抱合体は更にアンカータンパク質を具備し、前記アンカータンパク質は前記第一タンパク質が優先的に位置する位置とは異なる細胞区画にアンカーする。
【００１６】
位置情報の別の使用（ここで構成的に相互作用するタンパク質は、２つの抱合体が故意に（ｐｕｒｐｏｓｅｌｙ）引き合わされるまで離される）は、タンパク質のトランスロケーションを測定することである。このことは特定の細胞において実施でき、該細胞は少なくとも以下を具備する：  
タンパク質、相互作用パートナーＡおよび相補性タンパク質の第一末端断片（ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を具備する第一抱合体；および  
相互作用パートナーＢおよび相補性タンパク質の第二末端断片を具備する第二抱合体；  
ここで前記第一抱合体は、前記第二抱合体が優先的に位置する位置とは別個で且つ空間的に分離した細胞位置に優先的な位置を有しており、  
ここで前記相補性タンパク質は、前記相補性タンパク質の２断片が近い位置関係（ｃｌｏｓｅ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）に移動し、前記相補性タンパク質の２断片が完全に機能的なタンパク質を形成する場合に、変化特性（ａｌｔｅｒｅｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を提示し、および
ここで前記相互作用パートナーＡおよび相互作用パートナーＢは互いに結合する。
【００１７】
係る細胞において、前記タンパク質の、それによる前記第一抱合体の、前記第二抱合体と同じ細胞位置へのトランスロケーションは、相補性タンパク質の第一および第二末端断片の相補性を生じる。
【００１８】
２つのタンパク質間の自発性の相補性の効果（シンク効果、これにより望まれないバックグラウンドシグナルが発生する）を最小化するための１方法は、抱合体に相互作用パートナーＡおよびＢ〔これらは特異的な相互作用刺激が適用された場合のみ結合する（条件的な相互作用パートナー）〕を具備させることである。この方法において、相互作用刺激が相互作用パートナーを結合させた場合のみ、タンパク質間の自発性の会合（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅｅｔｉｎｇ）が２つの相補性断片の相補性を発生させ、それによって相補性断片を機能的なタンパク質の再会合および形成に関して近い位置関係に近接させる。本態様において、相互作用パートナーＡおよび相互作用パートナーＢは、相互作用刺激が適用されている場合のみ互いに結合する。
【００１９】
前記抱合体の位置の更なるコントロールを得て、２つの抱合体間の自然発生的な会合を最小にすることは、前記抱合体の１つとアンカータンパク質とが相互作用すること（これは細胞内でのその可動性を厳密に制限する）である。この場合において、１つのタンパク質は１つの局在部位に固定され、そして相補する断片間の会合は、他のタンパク質がアンカーした位置に移動する場合のみ生じる。本発明の本側面において、前記第二抱合体は更にアンカータンパク質を具備し、前記アンカータンパク質は前記第一タンパク質が優先的に位置する位置とは異なる細胞区画にアンカーする。
【００２０】
本発明の一態様において、相補性タンパク質の第一末端断片は、相補性タンパク質のＮ末端断片であり、また相補性タンパク質の第二末端断片は、相補性タンパク質のＣ末端断片である。本発明の別の態様において、相補性タンパク質の第一末端断片は、相補性タンパク質のＣ末端断片であり、また相補性タンパク質の第二末端断片は、相補性タンパク質のＮ末端断片である。
【００２１】
本発明の単純性は、相補性タンパク質に部分的に由来する。
【００２２】
相補性タンパク質の２つの断片が近い位置関係（ｃｌｏｓｅ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）に移動し、相補性タンパク質の２つの断片が完全に機能的なタンパク質を形成する場合、相補性タンパク質が変化特性（ａｌｔｅｒｅｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を提示するとの事実は、相補性タンパク質の２つの断片間の近い位置関係の検出を容易にする。
【００２３】
原則的に、結合した集合（ａ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｍａｓｓ）の任意の検出可能な特性（分離した組成部分のものとは測定可能に異なる）を、それらの分離した部分の相補性のシグナルとして使用し得る。係る特性には、生物物理学的な特性、例えば、回転性の（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ）又は並進性の（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）拡散係数、蛍光特性、例えば、ピーク励起（ｐｅａｋ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）または放射波長（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ）、又は蛍光寿命（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。また、潜在的に有用で検出可能な特性には、より生化学的な素質、例えば、触媒効率または酵素的活性、または相補性パートナーの１つに固有のポリペプチド配列の、蛍光または発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）を発する能力を獲得した形態への転換効率に関する特性が含まれる。前記組成部分が相補性を介して構成される際に、触媒活性を獲得するように作出できるタンパク質の例は、ユビキチン（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｎ．，  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，  Ａ．  （１９９４））、βガラクトシダーゼ  （Ｒｏｓｓｉ，  Ｆ  ｅｔ  ａｌ  （１９９７）  ）およびβ−ラクタマーゼ（Ｗｅｈｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  ）である。
【００２４】
以下に、如何にＧＦＰを分離して、２つの相補する断片を形成できるかについての詳細を記載する、係るデータは本発明の優先日に利用可能ではない。
【００２５】
しかしながら、当業者に明らかであるように、他のタンパク質も同様に分離できる。
【００２６】
結合して１つの機能的な蛍光単位を形成できる、蛍光タンパク質の非蛍光断片は、１つの蛍光タンパク質のコード化ヌクレオチド配列を適切な部位で分割することと、および各ヌクレオチド配列断片を独立に（融合タンパク質として）相補性タンパク質のＮ末端断片およびＣ末端断片（ここではＧＦＰ）として発現させることと、により通常産生される。
【００２７】
本発明の一態様において、前記相補性タンパク質は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））である。
【００２８】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は２３８アミノ酸の長さのタンパク質であって、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（配列番号１）に由来するものである。しかしながら、蛍光タンパク質は、他のメンバーの腔腸動物から分離されたものであり、例えば、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．からの赤色蛍光タンパク質（Ｍａｔｚ，  Ｍ．  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：  ９６９−９７３）、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＭｕｅｌｌｅｒｉからのＧＦＰである、または他の動物、真菌または植物からの蛍光タンパク質である。ＧＦＰは、様々に修飾された形態〔Ｈｅｉｍ等（Ｈｅｉｍ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９１：  ２６，  ｐｐ  １２５０１−１２５０４）により開示されたＧＦＰの青色蛍光変種（ＢＦＰ）を含む〕で存在する；これは、野生型ＧＦＰのＹ６６Ｈ変種；ＧＦＰの黄色蛍光変種（ＹＦＰ）であって、Ｓ６５Ｇ、Ｓ７２Ａ、およびＴ２０３Ｙ変異を有する（Ｗ０９８／０６７３７）；ＧＦＰのシアン蛍光変種（ＣＦＰ）であって、Ｙ６６Ｗ色変異および任意にＦ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｎ１４６Ｉ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａフォールディング／溶解度変異を有する（Ｈｅｉｍ，  Ｒ．，  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｙ．  （１９９６）  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ６，１７８−１８２）ものである。最も広範に使用されるＧＦＰの変種（ｖａｒｉａｎｔ）は、ＥＧＦＰであって、Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔ変異（ＷＯ  ９７／１１０９４およびＷ０９６／２３８１０）および最初のＭｅｔの後に１バリン残基の挿入を有するものである。前記Ｆ６４Ｌ変異は、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）からポジション１  上流のアミノ酸である。
【００２９】
このフォールディング変異を有しているＧＦＰは、ＧＦＰが約３０℃以上の温度で細胞中に発現される場合に、蛍光強度の増加を提供する（ＷＯ  ９７／１１０９４）。
【００３０】
野生型のＧＦＰにおいて蛍光は、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）の存在に依存することは既知であり、これはポジション６５−６７（予想された一次アミノ酸配列における）でのＳＹＧの環化（ｃｙｃｌｉｓａｔｉｏｎ）および酸化により産生され、同様に他のＧＦＰアナログにおけるＳＨＧ配列（ポジション６５−６７）でも同じ理由から産生される。
【００３１】
この例は、明瞭に再構成したタンパク質からの蛍光強度が、Ｆ６４Ｌ変異を有しているＧＦＰにおいて増強しているかを説明するものである（この変異を有さないＧＦＰと比較して）。従って、ＧＦＰがＦ６４Ｌ変異を有することが好ましく、本変異を有するＧＦＰ（例えば、ＥＧＦＰ）を選択するか又は本変異を特別のＧＦＰ（例えば、実施例９に記載されるＹＦＰ）に導入することによりなされる。
【００３２】
ＧＦＰの命名法において、「Ｅ」はＧＦＰの前に配置されることにより（ＥＧＦＰ，  ＥＹＦＰ，  ＥＣＦＰ）、この特定のＧＦＰが哺乳類細胞に対して最適化されたコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を有する核酸によりコード化されることを示す。また、これらのタンパク質の多くは、開始メチオニン残基（Ｍｅｔ）の後に挿入された、余分なバリン残基を有している。この余分なバリン残基は、残基のナンバリングには考慮されない。以上のように、好適な態様において、本発明のＧＦＰはＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ｄｓＲｅｄおよびＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰからなる群から選択される。
【００３３】
本出願の例のいくつかには、ＥＧＦＰが使用される。従って、本発明の好適な態様において、前記ＧＦＰはＥＧＦＰである。しかしながら、実施例９および実施例１１は、ＥＹＦＰが特定の利点を有していることを示している。従って、本発明の別の好適な態様において、前記ＧＦＰはＥＹＦＰである。また、発色団に先行するポジション１において変異したＥＹＦＰ（Ｅ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ）が、特定の利点を有していることが示される。従って、好適な態様において、ＧＦＰはＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰである、またはＧＦＰはＥ［Ｓ７２Ａ］ＧＦＰ（これはＦ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ７２Ａ  ＧＦＰ）である。
【００３４】
本発明の一側面は上記の細胞に関し、この細胞において、前記相補性タンパク質のＮ末端断片はＧＦＰのＮ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号１からアミノ酸番号Ｘまでのアミノ酸の連続的なストレッチを具備する）であり、ここでアミノ酸番号Ｘおよびアミノ酸番号Ｘ＋１間のペプチド結合はＧＦＰのループ内である、および前記相補性タンパク質のＣ末端断片はＧＦＰのＣ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号Ｘ＋１からアミノ酸番号２３８までのアミノ酸の連続的なストレッチを具備する）である。  
本発明において、野生型ＧＦＰ（配列番号１）（Ｃｈａｌｆｉｅ，  Ｍ．，  Ｔｕ，  Ｙ．，  Ｅｕｓｋｉｒｃｈｅｎ，  Ｇ．，  Ｗａｒｄ，  Ｗ．Ｗ．，  Ｐｒａｓｈｅｒ，  Ｄ．Ｃ．  （１９９４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３，８０２−８０５，  ＧＦＰの本変種はポジション２３１にヒスチジン残基を有する）のナンバリングが使用される。ＧＦＰの結晶構造（Ｙａｎｇ，  Ｆ．，  Ｍｏｓｓ，  Ｌ．  Ｇ．，  Ｐｈｉｌｉｐｓ，  Ｇ．Ｎ．  （１９９６）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １４，１２４６−１２５１）、図５、表１および実施例中に提示されるデータに基づくと、大抵の任意のループにおける分割が、抱合されたタンパク質の相互作用により援助（ａｓｓｉｓｔｅｄ）された、相補性断片に対する適切な空間的な接近の後に再構成することは明らかである。本出願の目的に関し、「ループ（ｌｏｏｐ）」の用語は、不規則な二次構造のターンまたはエレメント（ｅｌｅｍｅｎｔ）と理解される。
【００３５】
従って、一側面において、前記相補性タンパク質は２つのＧＦＰ断片であり、  
ここでＸは７、８、１１または１２、好ましくはＸはＴｈｒ９〜Ｖａｌ１１ループ内の９または１０であるか；或いは  
ここでＸは２１、２２、２５または２６、好ましくはＸはＡｓｎ２３〜Ｈｉｓ２５ループ内の２３または２４であるか；或いは  
ここでＸは３６、３７、４０または４１、好ましくはＸはＴｈｒ３８〜Ｇｌｙ４０ループ内の３８または３９であるか；或いは  
ここでＸは４６、４７、５６または５７、好ましくはＸは４８および５５の間、即ち、ＸはＣｙｓ４８〜Ｐｒｏ５６ループ内の４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５であるか；或いは  
ここでＸは７０、７１、７６または７７、好ましくはＸは７２および７５の間、即ち、ＸはＳｅｒ７２〜Ａｓｐ７６ループ内の７２、７３、７４または７５であるか；或いは  
ここでＸは７９、８０、８３または８４、好ましくはＸはＨｉｓ８１〜Ｐｈｅ８３ループ内の８１または８２であるか；或いは  
ここでＸは８６、８７、９０または９１、好ましくはＸはＭｅｔ８８〜Ｇｌｕ９０ループ内の８８または８９であるか；或いは  
ここでＸは９９、１００、１０３または１０４、好ましくはＸはＬｙｓ１０１〜Ａｓｐ１０３ループ内の１０１または１０２であるか；或いは  
ここでＸは１１２、１１３、１１８または１１９、好ましくはＸは１１４および１１７の間、即ち、ＸはＰｈｅ１１４〜Ｔｈｒ１１８ループ内の１１４、１１５、１１６または１１７であるか；或いは  
ここでＸは１２６、１２７、１４５または１４６、好ましくはＸは１２８および１４４の間、即ちＸはｌｌｅ１２８〜Ｔｙｒ１４５ループ内の１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４であるか；或いは  
ここでＸは１５２、１５３、１６０または１６１、好ましくはＸは１５４および１５９の間、即ちＸはＡｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループ内の１５４、１５５、１５６、１５７、１５８または１５９であるか；或いは  
ここでＸは１６９、１７０、１７５、１７６、好ましくはＸは１７１および１７４の間、即ちＸはｌｌｅ１７１〜Ｓｅｒ１７５ループ内の１７１、１７２、１７３または１７４であるか；或いは  
ここでＸは１８６、１８７、１９７または１９８、好ましくはＸは１８８および１９６の間、即ちＸはｌｌｅ１８８〜Ａｓｐ１９７ループ内の１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５または１９６であるか；或いは  
ここでＸは２０８、２０９、２１５または２１６、好ましくはＸは２１０および２１４の間、即ちＸはＡｓｐ２１０〜Ａｒｔ２１５ループ内の２１０、２１１、２１２、２１３または２１４である。
【００３６】
表１  ＧＦＰ二次構造、ＧＦＰ野生型配列アミノ酸ナンバリング。αおよびβは、それぞれαラセンおよびβシート二次構造を示す。
【表１】
2005527210.tif 000003
【００３７】
実施例に開示された所見に基づいて、ＧＦＰにおける適切な分割部位が、ＧＦＰ  βバレルのβシート構造形成する残基間のループ領域に位置することが結論付けられる。それに応じて、ＧＦＰにおける分割は、好ましくはＡｓｎ２３〜Ｈｉｓ２５ループ、Ｔｈｒ３８〜Ｇｌｙ４０ループ、Ｌｙｓ１０１〜Ａｓｐ１０２ループ、Ｐｈｅ１１４〜Ｔｈｒ１１８ループ、ｌｌｅ１２８〜Ｔｙｒ１４５ループ、Ａｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループ、ｌｌｅ１７１〜Ｓｅｒ１７５ループ、ｌｌｅ１８８〜Ａｓｐ１９７ループまたはＡｓｐ２１０〜Ａｒｇ２１５ループにおいて成される（表１、図５）。
【００３８】
本実施例のデータは、Ａｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループがＧＦＰ再構成に関して非常に良く適合していることを明瞭に記載している。このことは特に、ＧＦＰがアミノ酸Ｑ１５７とＫ１５８との間（即ち、Ｘが１５７である場合）で分離される場合である。従って、本発明の好適な態様は、２つのＧＦＰ断片（ここでＸはＡｌａ１５４〜Ｇｌｙ１６０ループ内の１５７である）に関する。
【００３９】
また、本実施例のデータは、ｌｌｅ１７１〜Ｓｅｒ１７５ループがＧＦＰ再構成に関して非常に有用であることを記載している。このことは特に、ＧＦＰがアミノ酸Ｅ１７２とＤ１７３との間（即ち、Ｘが１７２である場合）で分離される場合である。従って、本発明の好適な態様は、２つのＧＦＰ断片（ここでＸはｌｌｅ１７１〜Ｓｅｒ１７５ループ内の１７２である）に関する。
【００４０】
本発明の１つの代替的な側面は上記に記載された細胞に関し、この細胞において、前記相補性タンパク質のＮ末端断片はＧＦＰのＮ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号１からアミノ酸番号Ｘまでのアミノ酸の連続的なストレッチを具備する）であり、ここでアミノ酸番号Ｘおよびアミノ酸番号Ｘ＋１間のペプチド結合はＧＦＰのループ内であり、並びに前記相補性タンパク質のＣ末端はＧＦＰのＣ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号Ｙ＋１からアミノ酸番号２３８までのアミノ酸の連続的なストレッチを具備する）であり、ここでＹ＜Ｘは２つのＧＦＰ断片のオーバーラップを生じ、ここでアミノ酸Ｙおよびアミノ酸Ｙ＋１間のペプチド結合はＧＦＰのループ内である。
【００４１】
実施例９に記載されたとおり、オーバーラップ配列を有する断片は、特定の利点を有している。従って、本発明の一側面は２つのＧＦＰ断片に関し、該断片は以下を具備する、（ａ）ＧＦＰのＮ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号１からアミノ酸番号Ｘまでのアミノ酸の連続的なストレッチを具備し、ここでアミノ酸番号Ｘおよびアミノ酸番号Ｘ＋１間のペプチド結合はＧＦＰのループ内である）、並びに（ｂ）ＧＦＰのＣ末端断片（ＧＦＰのアミノ酸番号Ｙ＋１からアミノ酸番号２３８までのアミノ酸の連続的なストレッチを具備し、ここでＹ＜Ｘは２つのＧＦＰ断片のオーバーラップを生じ、ここでアミノ酸Ｙおよびアミノ酸Ｙ＋１間のペプチド結合はＧＦＰのループ内である）。
【００４２】
これらのオーバーラップするＧＦＰ断片（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＧＦＰ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）は、例えば、機能的なクローニングシステムであって、高度に可撓性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）のリンカー配列が融合パートナーの構造の非常に多様な素質に起因して必要とされるクローニングシステムにおいて非常に魅力的である。前記オーバーラップする断片により、融合パートナーの何れかに、長いリンカー配列を有することが許容される。
【００４３】
上記で定義された、ＧＦＰのＣ末端断片における前記Ｙの素質を決定する目的に関して、Ｘの値に関する議論と同じ考慮が適用される。
【００４４】
本発明の一態様において、前記オーバーラップはほんの数個のアミノ酸残基であり、例えばＸ−Ｙ＝１、Ｘ−Ｙ＝２、Ｘ−Ｙ＝３、Ｘ−Ｙ＝４、Ｘ−Ｙ＝５、Ｘ−Ｙ＝６、Ｘ−Ｙ＝７、Ｘ−Ｙ＝８、Ｘ−Ｙ＝９またはＸ−Ｙ＝１０である。
【００４５】
ＧＦＰのフォールディングのフォールディング特性によって、本発明の好適な態様はＧＦＰのＮ末端およびＣ末端断片のオーバーラップに関し、ここでアミノ酸Ｙとアミノ酸Ｙ＋１との間のペプチド結合およびアミノ酸Ｘとアミノ酸Ｘ＋１との間のペプチド結合は、ＧＦＰのループ内である。それによって得られるオーバーラップは、完全な１つのαラセンまたはβシート二次構造である。本発明の典型的な態様において、上記の抱合されたタンパク質〔ここで前記相補性タンパク質のＮ末端断片（前記相補性タンパク質の第一末端断片）は、対象のタンパク質と抱合される〕は、前記相補性タンパク質の断片と対応する対象のタンパク質との間にリンカー配列を更に具備する。
【００４６】
リンカーの長さおよび組成は、実施者が相補性タンパク質断片と抱合したいと望む、タンパク質に依存して選択されなければならない。リンカーの主な機能は、可撓性を提供して、相補性の立体傷害（ｓｔｅｒｉｃ  ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を避けることである。相互作用するタンパク質は自由に相互作用すべきであり、また同時に相補する断片は自由にフォールドすべきである。これは長いリンカー配列（例えば、２０以上の残基のリンカー）により促進される。しかしながら、短いリンカー配列は、相補性タンパク質断片を互いに近接させたまま維持する、即ち、相補する断片の局所濃度を増加させ、相補性のエントロピーコスト（ｅｎｔｒｏｐｙ  ｃｏｓｔ）を減少させる。相互作用するタンパク質またはホモロガスタンパク質の構造に関する情報への及び相互作用するタンパク質間の相互作用に関する情報へのアクセスは価値がある、なぜなら、それにより５〜１０残基（タンパク質の相互作用または相補性を歪める（ｄｉｓｔｏｒｔ）ことがない）の短いリンカーの設計を促進し得るからである。相補性タンパク質断片を、相互作用タンパク質の末端（これらは相互作用の間に最も近くに引き合わされる）に融合することは、有利である。しかしながら、１５〜２０残基のリンカー配列が使用され、相互作用タンパク質の末端が４０Åを超えて離される場合でさえも、優れた相補性が観察される。
【００４７】
前記リンカーは、特定のアミノ酸残基（即ち小さく、親水性で、非反応性で、および不十分な（ｐｏｏｒ）プロテアーゼ切断部位を構成する、例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ）から主に構成されるべきである。
【００４８】
本発明の好適な態様は、任意の抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、断片または上記の融合タンパク質をコード化している核酸に関する。一態様において、上記の本発明による任意のタンパク質をコード化している、核酸構築物はＤＮＡ構築物である。別の態様において、上記の本発明による任意のタンパク質をコード化している、核酸構築物はＲＮＡ構築物である。
【００４９】
当業者には明らかなとおり、前記抱合体は選択して（ｂｙ  ｃｈｏｉｃｅ）構成することが可能であり、また前記タンパク質は、相補性タンパク質の第一末端と、Ｎ末端またはＣ末端において抱合される。しかしながら、実施例に記載されるとおり、対象の第一タンパク質とＧＦＰのＮ末端断片との抱合は、好ましくはＧＦＰのＮ末端断片のＣ末端に対して実施される。同様に、対象の第二タンパク質とＧＦＰのＣ末端断片との抱合は、好ましくはＧＦＰのＣ末端断片のＮ末端に対して実施される。
【００５０】
本実施例から明らかなように、対象のタンパク質は、タンパク質、ペプチドまたは非蛋白質性パートナー（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｐａｒｔｎｅｒ）である。
【００５１】
従って、本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、前記相補性タンパク質のＮ末端断片はフレーム内で対象の第一タンパク質と融合される。
【００５２】
本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、前記第一タンパク質は前記相補性タンパク質のＮ末端断片のＮ末端と融合される。
【００５３】
本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、前記第一タンパク質は前記相補性タンパク質のＮ末端断片のＣ末端と融合される。
【００５４】
本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、前記相補性タンパク質のＣ末端断片はフレーム内で前記第二タンパク質と融合される。
【００５５】
本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、対象の前記第二タンパク質は前記相補性タンパク質のＣ末端断片のＮ末端と融合される。
【００５６】
本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、対象の前記第二タンパク質は前記相補性タンパク質のＣ末端断片のＣ末端と融合される。
【００５７】
本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、前記相補性タンパク質のＮ末端断片（フレーム内で第一タンパク質と融合された）は、更にリンカー配列を、前記相補性タンパク質のＮ末端断片と前記第一タンパク質との間に具備する。
【００５８】
本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、前記相補性タンパク質のＣ末端断片（フレーム内で第二タンパク質と融合された）は、更にリンカー配列を、前記相補性タンパク質のＣ末端断片と前記第二タンパク質との間に具備する。
【００５９】
本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、前記ＧＦＰはＥＹＦＰ（更にＦ６４Ｌ変異を有する）であり、Ｘは１７２であり、前記第一タンパク質（ＧＦＰのＮ末端断片と融合された）はＧＦＰのＮ末端断片のＣ末端と融合され、前記第二タンパク質（ＧＦＰのＣ末端断片と融合された）はＧＦＰのＣ末端断片のＮ末端と融合される。
【００６０】
本発明の一態様は特定の細胞に関し、該細胞において、前記ＧＦＰはＥＹＦＰ（更にＦ６４Ｌ変異を有する）であり、Ｘは１５７であり、前記第一タンパク質（ＧＦＰのＮ末端断片と融合された）はＧＦＰのＮ末端断片のＣ末端と融合され、前記第二タンパク質（ＧＦＰのＣ末端断片と融合された）はＧＦＰのＣ末端断片のＮ末端と融合される。
【００６１】
前記抱合体は前記細胞内で発現されることは必須（ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ）ではないが、しかし、前記第一抱合体は前記細胞において発現されることが好ましい。同様に、好適な態様において、前記第二抱合体は前記細胞において発現される。
【００６２】
本発明の一連の態様において、前記抱合体のうち少なくとも１つは、アンカータンパク質を有する。本発明において、アンカータンパク質は、規定の細胞分布（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を有する、任意の及び全ての細胞コンポーネント、好ましくは遺伝的にコード化可能な細胞コンポーネントを意味する。
【００６３】
前記アンカーを選択する場合、システムの素質を考慮することが重要である。例として、いくつかのタンパク質は、形質膜の平面に隔離された（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ）酵素により、リン酸化または脱リン酸化される必要がある；対象の係るタンパク質に関して、形質膜に限定（ｃｏｎｆｉｎｅｄ）されることが予期されるであろうアンカーコンポーネントを選択して、相互作用するタンパク質をタンパク質間相互作用を測定する際に適切に修飾すること、又はその位置へのトランスロケーションの測定を可能にすること、が適切である。従って、一態様において、前記抱合体に形質膜を標的とさせる、好適なアンカーコンポーネントは、上皮細胞成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の膜貫通ドメインを含んでいる、又はインテグリンタンパク質ファミリーの特定のタンパク質の膜貫通ドメインを含んでいる、又はｃ−Ｓｒｃのミリストイル化配列（残基１〜１４）を含んでいるタンパク質である。
【００６４】
別の態様において、ヒストンタンパク質が前記アンカーとして使用されるか、又は通常核小体に限定されるタンパク質（例えば、ｐ１２０核タンパク質）が、アンカーする抱合体を核に方向付けるために使用され、それによって核におけるタンパク質間相互作用の測定、又は核へのトランスロケーションの測定を可能にする。
【００６５】
別の態様において、前記アンカータンパク質は、ミトコンドリアの外側または内側の膜に通常限定される（ｃｏｎｆｉｎｅｄ）タンパク質（例えば、ＶＤＡＣ、ＡＴＰ−ａｓｅのＦｏサブユニット、またはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ）から選択される。別の態様において、前記アンカータンパク質は、ゴルジ体の多様な異なる領域に通常限定されるタンパク質（例えば、ＴＧＮ３８またはＡＤＡＭ１２−Ｌ）の群から選択される。別の態様において、前記アンカータンパク質は、焦点結合複合体に通常限定されるタンパク質（例えば、Ｐ１２５、ＦＡＫ、インテグリン  アルファもしくはベータ、またはパキシリン）のグループから選択される。別の態様において、前記アンカータンパク質は、細胞骨格構造に通常関連するタンパク質の群（例えば、Ｆ−アクチン鎖または微小管束、例えば、ＭＡＰ４、アルファアクチニンのアクチン結合ドメイン（ａｃｔｉｎＰａｉｎｔ）、キネシン、ミオシンまたはダイネイン）から選択される。
【００６６】
別の態様において、前記アンカータンパク質は、核の物質（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）または核のコンポーネントと通常関連するタンパク質〔例えば、ヒストンタンパク質（ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、およびその変種を含む）〕である。
【００６７】
別の態様において、前記アンカータンパク質は、核膜（例えば、ＡおよびＢ型ラミン）と、または核小体（例えば、スプライシングボディー、カハールボディー（Ｃａｊａｌ  ｂｏｄｉｅｓ）、ＰＭＬ核小体（ＰＭＬ発癌性ドメイン、ＰＯＤＳ））と通常関連するタンパク質、または転写エンジン（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ  ＰＯＬ−ＩＩ）である。
【００６８】
記載したとおり、本発明のいくつかの構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ）は、自発性の相互作用タンパク質（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を必要とする。自発性の相互作用を生じさせるために使用し得る、タンパク質ドメインの例は、一般に、ロイシンジッパーおよびコイルドコイルドメインである。これらのドメインは、多くの異なるタンパク質において同定されており、また自己相互作用（ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の特性がアミノ酸の直線配列（ｌｉｎｅａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）から高い精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）で予測された。
【００６９】
ロイシンジッパーを有しているタンパク質の例は、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓである。コイルドコイルドメインおよび他の自己相互作用するドメインは、Ｒｈｏキナーゼ  ＲＯＣＫ、Ｂｃｒ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、全ての既知のＡＫＡＰｓにおいて及び調節性サブユニットＰＫＡにおいて認められている。他の自発性の結合タンパク質は、ＪＮＫのｃ−Ｊｕｎにおけるデルタ領域への結合およびベータカテニン（ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ）のＴｃｆ−４転写因子への結合である。
【００７０】
刺激誘導性の相互作用の特別な有用性は次のこと、即ち、同一の細胞において、以前には非常に弱い相互作用のみ存在するか又は相互作用が存在しなかったところに、区別可能な（ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ）相互作用のスイッチを入れることが可能であるということである。これにより、事前に（ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅ）、区別可能な相互作用が純粋に２つの相互作用パートナー間の特異的な相互作用の結果であることが保証される。特定の抱合体（該抱合体は、特異的なアンカータンパク質であって、固定された抱合体を特定の細胞位置に位置づけるアンカータンパク質を含む）の場合において、刺激誘導性の相互作用の使用は次のこと、即ち本相互作用が、相補性産物の予期（ｅｘｐｅｃｔｅｄ）される位置を検出するために構成されたアッセイ機器により測定可能なシグナルを提供することを保証する。
【００７１】
相互作用パートナーＡおよびＢを用いた態様において、それらの性状（ｔｈｏｓｅ  ａｓｐｅｃｔｓ）の特異性および有用性は、相互作用刺激（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ）の非存在下において互いに対して測定可能な親和性を有さない相互作用パートナーＡおよび相互作用パートナーＢに依存する。従って一態様において、インタラクター（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ）ＡおよびＢは、免疫抑制因子（例えば、これらに限定されないが、シクロスポリンＡ、ラパマイシンおよびＦＫ５０６）により標的とされるタンパク質のなかの適切なペアにおいて選択される。これらのタンパク質には、ＦＫＢＰ１２、ＦＲＡＰおよびサイクロフィリンが含まれるが、これらに限定されない。好適な態様において、インタラクターＡおよびＢは、ＦＫＢＰ１２およびＦＲＡＰの変異した断片（ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ、ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）により代表され、このインタラクターペアに関する相互作用刺激は、ラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）ＡＰ２１９６７（ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）により代表される。
【００７２】
相互作用タンパク質Ａおよび相互作用タンパク質Ｂおよび相互作用刺激の適切な組み合わせの例は、以下に記載される：  
【表Ａ】
2005527210.tif 000004
別の態様において、ステロイドホルモン  レセプタ（例えば、これに限定されないが、エストロゲンレセプタ）のリガンド結合ドメインが、インタラクターＡおよびＢの双方として使用される。係るリガンド結合ドメインは、その同族のホルモンリガンド（このケースではエストロゲン）の添加に際して、ホモ二量体化する（図２２を参照されたい）。
【００７３】
別の態様において、ステロイドホルモン  レセプタの完全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）またはリガンド結合ドメインがインタラクターＡとして選択され、インタラクターＢはステロイドホルモンレセプタ  コアクチベーターのファミリー（ＳＲＣ−１、ＧＲＩＰ−１、ＡＣＴＲ、ＡＩＢ−１が含まれるが、これらに限定されない）のなかから選択される上記のとおり、同族のホルモン（ｃｏｇｎａｔｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ）が相互作用刺激として選択される。
【００７４】
本システムの１つの主要な利点は、タンパク質間相互作用を光強度における単純な変化として測定する能力である。従って、本発明の一側面は、タンパク質間相互作用を検出するための方法に関し、該方法は以下の工程を具備し：  
（ａ）少なくとも以下を具備する細胞を提供することと：  
対象の前記第一タンパク質および第一末端  相補性タンパク質（ａ  ｆｉｒｓｔ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を具備する第一抱合体；および  
対象の前記第二タンパク質およびの前記第二末端  相補性タンパク質を具備する第二抱合体；  
ここで前記第一抱合体は、前記第二抱合体が優先的に位置する位置とは別個で且つ空間的に分離した細胞位置に優先的な位置を有しており、  
（ｂ）相補性パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補するかどうかを決定することと；  
前記第一末端および第二末端  相補性タンパク質間の相補性が次のこと、即ち、対象の前記第一タンパク質が、対象の前記第一タンパク質の優先的な位置から、対象の前記第二タンパク質が位置する細胞位置にトランスロケーションしていること、および対象の２つのタンパク質が相互作用すること、の指標（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ）である方法である（図２１）。
【００７５】
タンパク質間相互作用を検出するための本方法の典型的な使用において、工程（ｂ）前に、前記第一抱合体のトランスロケーションを生じることが既知の刺激が適用される。この刺激は、ストレス、光、化合物または他の手段であってもよい。また、（しかし、トランスロケーション刺激を添加する前に）試験される化合物が添加される。この化合物が相補性を阻止する能力を有する場合、対象の２つのタンパク質間の相互作用を阻止すること、相補性それ自体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ｓｕｃｈ）を阻止すること、或いは前記第一抱合体のトランスロケーションを阻止すること、が可能である。
【００７６】
この方法の例は、レセプター間の相互作用（二量体化）を、前記第一タンパク質を１つのレセプターとして保有させ、前記第二タンパク質を他のレセプターとして保有させることにより決定することである（任意に、同一レセプター：ホモ二量体化）。
【００７７】
上記のとおり、係るアッセイの典型的な構成において、前記第二抱合体は更にアンカータンパク質（上記で詳細に記載したような）を具備し、前記アンカータンパク質は対象の前記第一タンパク質が優先的に位置する位置とは異なる細胞位置にアンカーする。
【００７８】
本発明の別の利点は、測定されるトランスロケーションを、光強度の変化にできることである。従って、本発明の一側面は、タンパク質のトランスロケーションを検出するための方法に関し、該方法は以下の工程を具備し：  
（ａ）少なくとも以下を具備する細胞を提供することと：  
前記タンパク質、相補性タンパク質の第一末端、および相互作用パートナーＡを具備する第一抱合体；および  
アンカータンパク質、前記相補性タンパク質の第二末端、および相互作用パートナーＢを具備する第二抱合体；  
ここで前記第一抱合体は、前記第二抱合体が優先的に位置する位置とは別個で且つ空間的に分離した細胞位置に優先的な位置を有しており、および  
ここで前記相互作用パートナーＡおよび相互作用パートナーＢは互いに結合する；  
（ｂ）前記相補性タンパク質の前記末端が再構成するかどうかを決定することと；  
前記２つの末端間の再構成（相補性）が次のこと、即ち、前記タンパク質が、前記タンパク質の優先的な位置から、前記アンカータンパク質がアンカーする細胞位置にトランスロケーションしていること、の指標である方法（図２１）である。
【００７９】
タンパク質のトランスロケーションを検出するための本方法の典型的な使用において、工程（ｂ）前、前記第一抱合体のトランスロケーションを生じることが既知の刺激が適用される。この刺激は、ストレス、光、化合物または他の手段であってもよい。また、（しかし、トランスロケーション刺激を添加する前に）試験される化合物が添加される。この化合物が相補性を阻止する能力を有する場合、２つの相互作用パートナー間の相互作用を阻止すること、相補性それ自体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ｓｕｃｈ）を阻止すること、或いは前記第一抱合体のトランスロケーションを阻止すること、が可能である。  
実施例に示されるとおり、ある程度の自発性の蛍光が出現する。このことは、多様な細胞位置の間での１つ又は双方の抱合体の平衡に起因するとの仮説が現在たてられている。従って、他の相互作用パートナーと同じ空間を占めた場合、相互作用および結果的な相補性が発生する。相補したタンパク質は解離しないので、これによりシンク効果が構成される（上記で詳細に記載したように）。この効果が、問題のシステムに依存して、むしろ顕著である可能性がある。任意の自然にトランスロケーションするタンパク質の自然のシャットリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）により、アンカーされた相互作用パートナー構築物が結合パートナーのコンスタントな供給へと暴露され、これにより明らかに不可逆的な結合および早発性のフルオロフォア形成が生じる、との問題が考えられる。
【００８０】
この問題を解決する１つの方法は、結合する相互作用パートナーを、相互作用にするのに相互作用刺激を必要とする相互作用パートナー（しばしばブリッジング分子と称される）で置換することである。係るシステムは、例えば、トランスロケーションするタンパク質の核画分をアンカータンパク質に、任意の特定時間に相互作用させる簡便な手段を提供する。
【００８１】
係る相互作用ペアの一例は、ＦＫＢＰ１２：ＦＲＢシステム（上記で詳細に記載された）である。従って、本発明の一側面は、タンパク質のトランスロケーションを検出するための方法に関し、該方法は以下の工程を具備し：  
（ａ）少なくとも以下を具備する細胞を提供することと：  
前記タンパク質、相補性タンパク質の第一末端、および相互作用パートナーＡを具備する第一抱合体；および  
アンカータンパク質、前記相補性タンパク質の第二末端、および相互作用パートナーＢを具備する第二抱合体；  
ここで前記第一抱合体は、前記第二抱合体が優先的に位置する位置とは別個で且つ空間的に分離した細胞位置に優先的な位置を有しており、  
ここで前記相互作用パートナーＡおよび相互作用パートナーＢは、相互作用刺激が適用されている場合のみ互いに結合する；  
（ｂ）相互作用刺激を添加することと；  
（ｃ）前記相補性タンパク質の前記第一および第二末端が相補するかどうかを決定することと；  
前記２つの末端間の相補性が次のこと、即ち、前記タンパク質が、前記タンパク質の優先的な位置から、前記アンカータンパク質が相互作用刺激の添加後にアンカーする細胞位置に、トランスロケーションしていること、の指標である方法（図２１）である。
【００８２】
タンパク質のトランスロケーションを検出するための本方法の典型的な使用において、工程（ｂ）前に、前記第一抱合体のトランスロケーションを生じることが既知の刺激が適用される。この刺激は、ストレス、光、化合物または他の手段であってもよい。また、（しかし、トランスロケーション刺激を添加する前に）試験される化合物が添加される。この化合物が相補性を阻止する能力を有する場合、２つの相互作用パートナー間の相互作用を阻止すること、相補性それ自体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ｓｕｃｈ）を阻止すること、或いは前記第一抱合体のトランスロケーションを阻止すること、が可能である。  
実施例１１に示されるとおり、ＦＲＡＰシステムを用いた場合、自発性の相互作用は観察されない（たとえ２つの抱合体が細胞質に存在したとしても）。上記で議論したとおり、前記タンパク質を離しておくことにおける努力（ｅｆｆｏｒｔｓ）は、タンパク質の位置間の自然バランスが決定（ｄｉｃｔａｔｅ）することを超えるものを必要としない。
【００８３】
時折、トランスロケーションの測定それ自体が実際興味深いことがある。しかしながら、典型的にトランスロケーションは、基礎に存在する細胞プロセスの結果である。これらの基礎に存在するプロセスのいくつかを使用して、他のプロセスに関する情報を取得することが可能である。例えば、細胞がアポトーシスを経験する場合、カスパーゼ酵素の活性が増加する。ペプチド配列（カスパーゼに対するコンセンサス切断部位）が切断される場合、本発明の方法および材料（ｍａｔｅｒｉａｌｓ）により、検出が可能となる（図２２を参照されたい）。細胞におけるアポトーシス／カスパーゼ活性を決定するための方法であって、少なくとも以下の工程を含み：  
（ａ）少なくとも以下を具備する細胞を提供することと：  
相補性タンパク質の第一末端、相互作用パートナーＡ、核局在化配列（ＮＬＳ）、バリン−アラニン−アスパルテート（ＶＡＤ）配列およびアンカータンパク質を具備する第一抱合体；  
相補性タンパク質の第二末端、相互作用パートナーＢおよびアンカータンパク質を具備する第二抱合体；  
ここで前記第一抱合体の前記アンカータンパク質は核とは異なる細胞位置に存在し、前記第二抱合体の前記アンカータンパク質は前記核に存在する、および  
ここで相互作用パートナーＡ、前記ＮＬＳおよび前記相補性タンパク質の第一末端は、ＶＡＤ配列の同じ側（ｓａｍｅ  ｓｉｄｅ）に全て位置しており、前記アンカータンパク質は、前記ＮＬＳの他の側に位置している；  
（ｂ）前記相補性タンパク質が相補するかどうかを決定することと  
相補性が次のこと、即ち、カスパーゼが前記第一抱合体を切断し、自由な部分が前記核にトランスロケーションし、パートナーＡおよび相補性パートナーＢが相補すること、の指標である方法；  
抗原を検出するためのキットであって、以下を具備し：  
（ａ）前記抗原に結合する第一抗体；  
（ｂ）前記第一抗体に結合するタンパク質と相補性タンパク質のＮ末端とを具備する第一抱合体；  
（ｃ）前記第一抗体に結合するタンパク質と前記相補性タンパク質のＣ末端とを具備する第二抱合体；  
前記第一および第二抱合体の前記第一抗体に対する結合が、前記相補性タンパク質の２つの末端を機能的なタンパク質が形成されるように近接させる、キット。
【００８４】
本発明において有用なプローブを、如何に構築する及び試験するかに関する考え（ｔｈｏｕｇｈｔ）が、（特定の実施例として）ＧＦＰを相補するタンパク質として用いて、以下に記載される。当業者に明らかであるように、類似する考えが、他の相補性タンパク質及びその相補する断片の使用に適用される。
【００８５】
一般的に、プローブ（即ち、「ＧｅｎｅＸ」−ＧＦＰ融合またはＧＦＰ「ＧｅｎｅＸ」融合）は、ＰＣＲに「ＧｅｎｅＸ」特異的なプライマーを用いて、クローニング工程を引き続いて実施して、「ＧｅｎｅＸ」をフレーム内でＧＦＰに融合して構築される。この融合体は、「ＧｅｎｅＸ」およびＧＦＰ間に特定の短いベクター由来配列（例えば、前記プラスミドにおける複数のクローニング部位）を含有し得るもので、作出される融合タンパク質において「ＧｅｎｅＸ」およびＧＦＰ間のペプチドリンカーを生じている。
【００８６】
段階的手順の詳細：  
［遺伝子の配列の同定］  これは遺伝情報の保管機関を検索することにより非常に容易に実施される、このような保管機関としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースがあり、これは広く利用可能であり、分子生物学者により日常的に使用される。以下の特定の実施例において、問題の遺伝子のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が提供される。
【００８７】
［遺伝子特異的なプライマーのデザイン］  遺伝子配列の点検により、ＰＣＲ反応に使用される遺伝子特異的なプライマーのデザインが可能となる。典型的には、トップ鎖プライマーは遺伝子のＡＴＧ開始コドンと以下のｃａ．２０ヌクレオチド２０を含むが、遺伝子をＧＦＰの後に融合する場合（即ち、ＧＦＰ‐「ＧｅｎｅＸ」融合体）、ボトム鎖プライマーは終止コドンとｃａ．２０の先行するヌクレオチドとを含む。遺伝子がＧＦＰの前に融合される場合（即ち、「ＧｅｎｅＸ」−ＧＦＰ融合）、終止コドンを除かなければならない。
【００８８】
随意に、ＧｅｎｅＸの全長配列を融合に使用しなくてもよく、シグナルに応答してＧｅｎｅＸのように局在化および再分布する単なる部分であってもよい。
【００８９】
遺伝子特異的な配列に加えて、前記プライマーは、制限酵素に対する少なくとも１つの認識配列を含み、ＰＣＲ産物の引き続くクローニングを可能とする。前記部位は、それらがＰＣＲ産物においてユニークで、クローニングベクターと適合するよう選択される。さらにまた、制限酵素部位と遺伝子特異的配列との間に正確な数（ｅｘａｃｔ  ｎｕｍｂｅｒ）のヌクレオチドを、融合遺伝子の正確な読み枠および／または翻訳開始共通配列を達成するために、具備することが必要であろう。最後に、前記プライマーは、制限酵素部位の前に少数のヌクレオチドを、前記酵素での効率的な消化を可能とするために、常に具備している。
【００９０】
［増幅すべき遺伝子の供給源の同定］  特定の産物（遺伝子特異的なプライマーを具備する）を産生するＰＣＲ反応のために、遺伝子配列は反応に最初に存在していなければならない（例えば、ｃＤＮＡの形態で）。ＧｅｎＢａｎｋでの情報または科学的な文献により、どの組織に遺伝子が発現しているかが示され、また様々な種の非常に多様な組織または細胞タイプからのｃＤＮＡライブラリーが市販されている（例えば、クロンテック（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）、ストラタジーン（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）およびインビトロゲン（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）より）。また、多くの遺伝子が、クローン化された形態で、アメリカンタイプティッシュカルチャーコレクション（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）より利用可能である。
【００９１】
［ＰＣＲ反応の最適化］  いくつかの因子がＰＣＲ反応の効率および特異性に影響することが知られており、これにはプライマーのアニーリング温度、反応において存在するイオンの濃度（特にＭｇ２＋およびＫ＋）、同様に反応のｐＨが含まれる。ＰＣＲ反応の結果が不満足な場合、上記で述べたパラメータが至適ではない可能性がある。多様なアニーリング温度を試験すべきであり（例えば、一体型の温度勾配を有するＰＣＲ機械において、ストラタジーン（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）などから利用可能）、および／または多様な緩衝剤組成物を試行すべきである（例えば、ＯｐｔｉＰｒｉｍｅ緩衝システム、ストラタジーン（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）より）。
【００９２】
［ＰＣＲ産物のクローニング］  ベクター（該ベクター中で増幅した遺伝子産物がクローン化され、ＧＦＰと融合される）は、プライマーがデザインされた時には既に考慮されているだろう。ベクターを選択する場合、実施者は、どの細胞タイプにプローブを続いて発現させるかについて、少なくとも考慮すべきであり、プローブのプロモータに制御された発現が前記細胞に適合するように考慮されるべきである。また、大抵の発現ベクターは１以上の選択マーカー（例えば、薬物に対する抵抗性を供与する）を含み、このことは実施者が安定な形質移入体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）を作出する場合に有用な特性である。また、前記選択マーカーは、使用される細胞に適合すべきである。
【００９３】
ＰＣＲ産物の実際のクローニングは困難性を伴わないはずである、なぜなら典型的には、２つの異なる制限酵素で消化した断片の、同じ２つの酵素で消化したベクターへの１工程クローニングで実施できるからである。クローニングに問題があると判明した場合、それは前記制限酵素が前記ＰＣＲ断片にうまく作用しなかったからであると思われる。この場合、実施者は、前記プライマー端に、より長い拡張部（ｌｏｎｇｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）を付加して、断片端に近接した消化の潜在的な困難性を克服できるだろう、又は実施者は中間クローニング工程（制限酵素消化に基づかない）を導入できるだろう。いくつかの会社により、このアプローチに関するシステムが提供されている〔例えば、インビトロゲン（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）およびクロンテック（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）〕。
【００９４】
遺伝子をクローン化し、このプロセス中で、ＧＦＰ遺伝子と融合した場合、結果的に生じる産物（通常はプラスミド）が予期したとおりであるかチェックして確かめるべきである。最も正確な試験は、融合遺伝子のヌクレオチド配列を取得することであろう。
【００９５】
プローブの試験  
特定のプローブに関してＤＮＡ構築物を作出したら、その機能性および有用性を試験し得る。典型的なシナリオにおいて、２つの構築物を個々に全長ＧＦＰを用いて、以下の試験にそれを供試することにより確認される：それを前記プローブを発現する能力を有する細胞に形質移入すること。細胞の蛍光を直後に点検（ｉｎｓｐｅｃｔ）する（典型的には翌日）。この点において、細胞蛍光の２つの特性が注目される、即ち：強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）および亜細胞位置（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）である。
【００９６】
その強度は、通常は細胞内において、非融合ＧＦＰの強度と少なくとも同程度強いものであるべきである。そうではない場合、プローブＤＮＡの配列または質は誤っていると思われ、慎重にチェックすべきである。
【００９７】
亜細胞位置は、前記プローブが良好に作動し得るかどうかの指標（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）である。
【００９８】
それが問題の遺伝子に関して予期したとおり局在化する場合（例えば、それが核から排除される）、それは即時に機能試験に移される。前記プローブが形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）手順の直後に局在しない場合、このポイントで時間内に（ｉｎ  ｔｉｍｅ）過剰発現することが原因である可能性がある、というのも一般的に細胞は非常に多くのコピーのプラスミドを得て、そして局在化は時間内に（例えば、数週間内に）発生し、それにしたがってプラスミドコピー数および発現レベルが減少していくからである。
【００９９】
局在化が長時間（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｔｉｍｅ）経た後でも発生しない場合、ＧＦＰとの融合により局在化機能が破壊されている（例えば、その通常の細胞のアンカータンパク質との相互作用に関して必須であるタンパク質配列をマスクする）ことが原因である可能性がある。この場合、逆の融合は機能する可能性がある（例えば、ＧｅｎｅＸ−ＧＦＰが機能しない場合、ＧＦＰ−ＧｅｎｅＸは機能する可能性がある）、というのもＧｅｎｅＸの２つの異なる部分はＧＦＰとの近接度（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）により影響されるからである。これが機能しない場合、何れかの端へのＧＦＰの近接度が問題であると思われ、より長いリンカーをＤＮＡ構築物におけるＧｅｎｅＸとＧＦＰとの間に導入することにより、距離を増加させることを試みることができるであろう。
【０１００】
局在化の予備的知識がなく、局在化が観察されない場合、プローブがこのポイントに局在すべきではないことが原因である可能性がある、なぜなら係る事象はＧＦＰに融合したタンパク質の素質に依存するからである。それは次に機能試験に供試されるべきである。
【０１０１】
機能試験において、プローブを発現している細胞が少なくとも１つの化合物で処理される、この化合物はシグナル伝達経路を撹乱する（通常は活性化することによって）ものであり、該シグナル伝達経路においてプローブは細胞内でそれ自身が再分布されることによって提示されることが期待される。再分布が期待されたとおりである場合、例えば、予備的知識によりそれが位置Ｘから位置Ｙへとトランスロケートすると指摘されている場合、第一の重大な試験をパスする。この場合、それを更に応答の特徴付け及び定量化へと進行させる。
【０１０２】
それが期待通り機能しない場合、細胞がシグナル伝達経路の少なくとも１つのコンポーネント（例えば、細胞表面レセプター）を欠損しているか、又は種不適合性が存在することが原因である可能性がある（例えば、プローブがヒトの遺伝子産物の配列情報に基づいて設計され、細胞がハムスター起源である場合）。両方の例において、実施者は、試験するプロセスのために他の細胞タイプ（ここでは潜在的な問題が適用されないであろう）を認定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）すべきである。
【０１０３】
これを充足する場合、前記抱合体は、全長に代わって前記相補性タンパク質の断片で構築され、そして同じ細胞において発現された際に試験される。再分布の特性を同定できない場合、問題は上記のとおりである可能性があり、プローブを更に至適な細胞条件下で再試験すべきである。
【０１０４】
プローブが至適な細胞条件下で機能しない場合は、最初からやり直す。
【０１０５】
形質移入のための存在する多くの細胞システム。哺乳類細胞の少数の例は、健常な又は罹患した動物（初代細胞）、或いは細胞培養条件下で無期限（ｉｎｄｅｆｉｎｉｔｅ）に複製する能力を有する、形質移入した哺乳類細胞（細胞株）から直接的に分離された。「哺乳類細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）」の用語は、哺乳類起源の任意の生細胞を意味する。前記細胞は樹立された細胞株であってもよく、その多くはアメリカンタイプティッシュカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ＵＳＡ）または類似のカルチャーコレクション（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）から入手可能である。前記細胞は、限定された寿命を有し、トランスジェニック動物に由来する組織を含む、哺乳類組織に由来する初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ）、又は哺乳類組織（トランスジェニック組織を含む）に由来する、新しく樹立された不死の細胞株、又は哺乳類由来の異なる細胞タイプを融合することに由来する、雑種細胞もしくは細胞株（例えば、ハイブリドーマ細胞株）であってもよい。前記細胞は、１以上の非自然の（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）遺伝子産物（例えば、レセプター、酵素、酵素基質）を、蛍光プローブの前に（ｐｒｉｏｒ  ｔｏ）又は蛍光プローブに加えて（ｉｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｏ）、自由選択（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）で発現してもよい。好適な細胞株は次を含む（しかし、それらに限定されることはない）、即ち、線維芽細胞起源のもの（例えば、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＢＡＬＢ、ＮＩＨ−３Ｔ３）または内皮起源のもの〔例えば、ＨＵＶＥＣ、ＢＡＥ（ウシ動脈内皮）、ＣＰＡＥ（雌ウシ肺動脈内皮）、ＨＬＭＶＥＣ（ヒト肺微小血管性の内皮細胞）〕、または気道上皮起源のもの（例えば、ＢＥＡＳ−２Ｂ）、または膵臓起源のもの（例えば、ＲＩＮ、ＩＮＳ−１、ＭＩＮ６、ｂＴＣ３、ａＴＣ６、ｂＴＣ６、ＨＩＴ）、または造血性起源のもの〔例えば、ヒトから分離された初代細胞であって、モノサイト、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球およびリンパ球の集団（ＡＭＬ−１４、ＡＭＬ−１９３、ＨＬ−６０、ＲＢＬ−１、Ｕ９３７、ＲＡＷ、ＪＡＷＳ）〕、または脂肪細胞起源のもの（例えば、３Ｔ３−Ｌ１、ヒトのプレ脂肪細胞）、または神経内分泌起源のもの（例えば、ＡｔＴ２０、ＰＣ１２、ＧＨ３）、筋肉起源（例えば、ＳＫＭＣ、Ａ１０、Ｃ２Ｃ１２）、腎臓起源のもの（例えば、ＨＥＫ２９３、ＬＬＣ−ＰＫ１）、またはニューロン起源のもの〔例えば、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＨＣＮ−１Ａ、ＮＴ２／Ｄ１〕を含む。
【０１０６】
本発明の例は、ＣＨＯ細胞に基づく。従って、線維芽細胞に由来する細胞株（例えば、ＢＡＬＢ、ＮＩＨ−３Ｔ３およびＢＨＫ細胞）が好適である。
【０１０７】
異種性の抱合体を細胞にプラスミドとして導入することが好適であり、例えば、個々のプラスミドを、細胞に適用する際に適切な形質移入薬剤（例えば、ＦｕＧＥＮＥ）と混合して、形質移入した細胞に全ての異種性の抱合体（またはＧＦＰ断片）を同時に発現および統合させる。各抱合体をコード化しているプラスミドは、異なる遺伝的な抵抗性マーカーを具備することから、それらの抱合体を発現している細胞の選択が可能となる：また、各々の抱合体は別個のアミノ酸配列（例えば、ＨＡまたはｍｙｃまたはＦｌａｇマーカー）を具備することが好ましく、これは免疫細胞化学的に検出し得るので、細胞におけるこれらの抱合体の発現が容易に確認し得る。１または両方の抱合体を導入するための、多くの他の手段は、平等に実施可能であり、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、アデノウイルスおよびレトロウイルスの方法、両方の抱合体をコード化している２シストロン性のプラスミドなどがある。
【０１０８】
本発明において、「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」の用語は、一般的な意味を有すべき用語である。
【０１０９】
これには、翻訳されたタンパク質、ペプチドまたはタンパク質断片のみならず、化学的に合成されたタンパク質も含まれる。細胞内で翻訳されたタンパク質に対して、自然の又は誘導された翻訳後修飾〔例えば、グリコシレーションおよびリピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）〕が発生することが予期され、それらの産物はなおもタンパク質であると考えられる。
【０１１０】
「細胞内タンパク質相互作用（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」の用語は、上記のとおり、同じ細胞内での２つのタンパク質間の相互作用を一般的に意味する。前記相互作用は、タンパク質コンポーネント間の、最も一般的には各タンパク質における１以上の領域またはドメイン（これらの物理化学的特性は多少の特異的な認識を可能とする）間の、共有結合性および／または非共有結合性の力、および関与する２つのタンパク質コンポーネント間の引き続く相互作用、に依存する。好適な態様において、前記細胞内相互作用はタンパク質間相互作用である。
【０１１１】
蛍光の記録は、問題となる方法の課題により変化する。一態様において、放射される光は、当該技術における当業者に既知の様々な装置で測定される。典型的には、係る装置は、以下のコンポーネントを具備する：  （ａ）光源、  
（ｂ）光源からの光の波長（発光団の発光を励起させる）を選択するための方法、  
（ｃ）励起光のシステムの残りの部分への流入を迅速にブロックまたは通過させる装置、  
（ｄ）励起光を検体に伝達し、放射された蛍光を空間的に分離した（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）様式で集光し、および像をこの蛍光放射から形成するための一連の光学的なエレメント（又は、検出および測定の方法に関連する別のタイプの強度マップ（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｍａｐ））、  
（ｅ）一連の光学的エレメントに関して、既定の幾何学（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）で測定される、細胞の容器を保持するベンチまたはスタンド、  
（ｆ）光強度（好ましくはイメージの形態）を記録するための検出器、  
（ｇ）記録された情報および／またはイメージを獲得（ａｃｑｕｉｒｅ）および貯蔵（ｓｔｏｒｅ）するための、および記録されたイメージからの再分布の程度を計算するための、コンピュータまたは電気的システムおよび関連するソフトウェア。
【０１１２】
本発明の好適な態様において、前記装置システムは自動化されたものである。一態様において、上記の（ｄ）および（ｅ）におけるコンポーネントは、蛍光顕微鏡を含む。一態様において、上記の（ｆ）における前記コンポーネントはＣＣＤカメラである。
【０１１３】
一態様において、上記の（ｆ）における前記コンポーネントは、一列の（ａｎ  ａｒｒａｙ  ｏｆ）光電子倍増管／装置である。
【０１１４】
本発明の一態様において、実際の蛍光測定は、マイクロタイター型のプレートに対する蛍光光度計（蛍光プレートリーダー）の標準型においてなされる。
【０１１５】
一態様において、光学的な走査システムを使用して、マイクロタイター型プレートの底面が次のとおり照射される。即ち、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）または蛍光における変化の時間分解記録（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）を、同時に全ての空間的な制限から取得できるように照射される。
【０１１６】
一態様において、前記イメージは、光学的な走査システムにより形成され、記録される。
【０１１７】
光強度を測定するための様々な器械（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）が存在する。一態様において、蛍光プレートリーダーが使用される（例えば、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ（Ｔｅｃａｎ）、Ｆｌｅｘ  ｓｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｃｕｍｅｎ））。別の態様において、イメージングプレートリーダーが使用される〔例えば、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＬｅａｄＳｅａｋｅｒ（アマシャム）、ＶＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）〕。別の態様において、自動化されたイメージャー（ｉｍａｇｅｒ）が使用される〔Ａｒｒａｙｓｃａｎ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）、Ｉｎｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（アマシャム）、Ｏｐｅｒａ（Ｅｖｏｔｅｃ）のような〕。なお更なる態様において、共焦点蛍光顕微鏡が使用される（例えば、ＬＳＭ５１０（ツァイス））。
【０１１８】
本方法の１つの特定の利点は、不均一な細胞集団において実施できることである。これにより、とりわけクローン細胞を取得するために必要な工程が回避される。
【０１１９】
これは、試験前の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により達成される。そのプロセスにおける一工程は最も緑色の細胞（ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｇｒｅｅｎ  ｃｅｌｌｓ）の除去であり、この細胞は機能的な蛍光が達成される細胞である（たとえ対象の２つのタンパク質が相互作用すると仮定されなくとも）。別の工程は黒色細胞の除去であり、この細胞は２つの異種性の抱合体が相互作用しない細胞である（例えば、機能的な相補性が、発生しないか又は若干発生する）。この事象は、これらの細胞における形質移入の欠如（ｌａｃｋ）、２つの構築物間の不十分な（ｐｏｏｒ）発現比率、又は何れかの構築物の機能的な発現の欠如による可能性がある。最も緑色の細胞および黒色細胞の双方において、形質移入は所望のとおりに発生しないことが現在予想（ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ）されており、異種性の抱合体の相補性が存在しない、乏しい、または過剰となる。これによって取得された「中等度から低度に緑色」の細胞は、次に上記の任意の方法、または他の相補性に基づく方法に使用される。それぞれ「最も緑色」、「中等度に緑色」、「低度に緑色」および「黒色」の細胞は、互いに比較して、蛍光のレベルが減少している。これらのレベルは、当業者により、相対比（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）に既定されたものである。対象のタンパク質間の相互作用を検出するための好適な方法は、付加的にＦＡＣＳを含む。この第二のＦＡＣＳ工程の目的は、大きいダイナミックレンジで細胞を分離することである。付加的なＦＡＣＳにおける第一の動作（ａｃｔｉｏｎ）は、「中等度から低度の緑色」のＦＡＣＳ細胞を化合物（該化合物は対象の２つのタンパク質間の相互作用を誘導する）で刺激することであり、そしてその後に十分な時間を経過させ、タンパク質を相互作用させ、そして蛍光タンパク質断片をフォールドさせ、蛍光を放射させる（ｂｅｃｏｍｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）。次の動作は、それらを第二のＦＡＣＳに供試して、黒い細胞（ｄａｒｋ  ｃｅｌｌｓ）を除去し、中等度の緑色細胞を除去することである。
【０１２０】
細胞の残りの集団〔最も緑色の細胞または非常に緑色細胞（ＶＧＣ；ｖｅｒｙ  ｇｒｅｅｎ  ｃｅｌｌｓ）〕は、低度から中等度のバックグラウンドを有し、対象の２つのタンパク質間の相互作用に際して、蛍光タンパク質を形成する能力をなおも有している。細胞が十分な数に増殖し、そして多くの世代数が経過して蛍光が希釈された場合、細胞は上記で概説した任意の方法に即座に使用できる（例えば、対象の２つのタンパク質間の相互作用を誘導する化合物を検出すること及び２つのタンパク質コンポーネント間の条件的な相互作用に干渉する化合物を選別すること）。
【０１２１】
本方法の好適な側面において、少なくとも１つの細胞は哺乳類細胞である。
【０１２２】
「化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」の用語は任意のサンプルを意味し、これは細胞システム（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ）において生物学的な機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有するか又は生物学的な効果（ｅｆｆｅｃｔ）を発揮する。前記サンプルは、生物学的な物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）のサンプルであってもよく、それは例えば、体液（血液、血漿、唾液、ミルク、尿を含む）のサンプル、又は微生物または植物の抽出物、汚染物（重金属または毒物を含む）を含有している環境的なサンプル（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓａｍｐｌｅ）である、又はそれは有機物合成または遺伝的技術によって調製された、化合物または化合物の混合物を含有しているサンプルであってもよい。前記化合物は、小さい有機化合物またはバイオポリマー（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）であってもよく、これにはタンパク質およびペプチドが含まれる。
【０１２３】
本方法の別の好適な側面において、前記異種性の抱合体は、融合タンパク質である。
【０１２４】
本発明の一側面は、異なる色を用いた、多重化分割フルオロフォア相補性（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  ｓｐｌｉｔ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）に関する。２つの潜在的に蛍光性の複合体が、別個の蛍光の励起または放射（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）の特性または両方を有する場合、１つの蛍光タンパク質断片を２以上の適切な相補的な断片と連結すること（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）により、第一の蛍光タンパク質断片（ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）と２つの他の相補的な断片の何れかとの結合の程度を決定することが可能である。典型的には、第一の蛍光タンパク質断片は特定のタンパク質と融合され、該タンパク質は３つの他のタンパク質の何れかと結合し得るものであり、それらの各々は別個の相補的な断片と適切に融合されている。例えば、第一の蛍光タンパク質断片は、ＥＧＦＰを残基８０の後で分割することにより取得された、増強されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ、配列番号１）のＣ末端断片であってもよい。３つの相補性断片は、ＥＧＦＰの、ＥＧＦＰ  Ｙ６６Ｗ（配列番号２）およびＥＧＦＰ  Ｙ６６Ｈ（配列番号３）の適切なＮ末端断片であってもよい。３つのＥＧＦＰ変種は、異なるスペクトル特性を有する、即ち：  
【表Ｂ】
2005527210.tif 000005
文献：  Ｈｅｉｍ，  Ｒ．，  Ｐｒａｓｈｅｒ，  Ｄ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｙ．  （１９９４）  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９１，１２５０１−１２５０４。
【０１２５】
例えば、ＧＦＰのＣ末端半分（例えば、残基１５８から２３８）と対応するＧＦＰ、ＧＦＰ  Ｙ６６ＷまたはＧＦＰ  Ｙ６６ＨのＮ末端半分（例えば、残基１から１５７）とを構成することにより産生された蛍光複合体は、明瞭に別個の蛍光特性を有するであろう。また、混合物中での複合体の相対的な量を計算できる。
【０１２６】
様々な色を上記に例示したとおり使用できるのみならず、フルオロフォアの他の物理的なパラメーターをも変更できる（例えば、強度、蛍光寿命、フォールディング時間など）。
【０１２７】
２色の多重化分割には、いくつかの使用が含まれる：  多くの場合（上記のとおり）、対象のタンパク質はフルオロフォアの「一定（ｃｏｎｓｔａｎｔ）」の半分に連結される、他方でその相互作用パートナーの各々はフルオロフォアの「変異（ｖａｒｉａｂｌｅ）」部分に連結される（例えば、融合に際して、緑色のフルオロフォアを生じるもの及び青色のフルオロフォアを生じるもの）。これにより空間的な情報（即ち、２つの異なる相互作用パートナーが異なる位置に存在すること）が、色によって対象とするタンパク質がどこに存在するかが示されることにより与えられる。また、相互作用パートナーは同じ位置に存在でき、ここで色は、どの相互作用パートナーを貴方のタンパク質が任意の特定の時間に優先するかについての指標を与える。最後に、後者の特殊な場合として、貴方のタンパク質の異なるパートナーとの相互作用が例えば翻訳後修飾により調節され、色によって貴方のタンパク質が修飾されたか又はされないかが示される。これら３つの異なるセットアップ（ｓｅｔｕｐｓ）は、可能な最も広義の意味（ｔｈｅ  ｂｒｏａｄｅｓｔ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｓｅｎｓｅ）において、貴方のタンパク質の物理的状態に関するセンサーとして使用できる、或いはそれらをスクリーニングアッセイに使用できる（このアッセイにおいて、貴方は試験化合物の２つの色のリードアウト間の比率を変更する能力を測定する）。
【０１２８】
最後に、色はＧＦＰｓのただ１つの物理的パラメータである。他の物理的パラメーター（これらはＧＦＰ配列における特定のアミノ酸に対応させることが可能で、またこれらは容易に検出可能であり、例えば、吸収スペクトル、蛍光寿命、フルオロフォアの成熟に関する時間などである）を、色と全く同じ様式で使用できる。異なる相互作用パートナーの数は、２つに限定される必要はない。
【０１２９】
１つの特殊な例により、如何に本方法が、スクリーニングに関する空間的な情報を使用するための道具として使用し得るかについて示される。これは、たとえ異なる細胞位置における特定のタンパク質の相互作用パートナーについて全く知られていない場合であっても（又は１以上のそれらの区域において、いかなる相互作用パートナーも有していない場合であっても）使用し得る。嚢胞性線維症は、おそらく最も頻繁に詳細に研究されたタンパク質輸送疾患である。嚢胞性線維症  膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）は、複数膜貫通型のタンパク質（ｍｕｌｔｉ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である（このタンパク質は通常はＣｌ流出チャンネルとして、気道の上皮細胞の先端の形質膜で機能する）。最も共通する変異（ＤｅｌｔａＦ５０８）は、前記タンパク質を小胞体（ＥＲ）に停留させ、そして上皮細胞の形質膜において発現されるＣＦＴＲの量を減少させ、これにより細胞からのＣｌ流出を減少させる。このＤｅｌｔａＦ５０８のＥＲ保持欠陥は可逆的であること、また温度の減少、いくつかの小さい分子、および「シャペロン」の誘導により、ＤｅｌｔａＦ５０８を原形質膜へと往来させ、そしてＣｌ透過性を増加させることが多くの研究から明らかとされた。変異体ＣＦＴＲの行動を修飾する化合物に関するスクリーニングの一方法は、分割されたフルオロフォア／複数の色の概念を用いる。変異体ＣＦＴＲを細胞内で、ジッパー断片（フルオロフォアの「一定」半分に融合させた）との融合体として発現できる。ＥＲおよび形質膜マーカーとジッパー（異なる色と融合された）との同じ細胞融合体における発現により、ＣＦＴＲ変異体がＥＲに達した際にこれが１色を生じることが示される。ＣＦＴＲはＰＭに移動する場合（例えば、薬刺激により）、これにより異なる色を発生させる。従って、「ＰＭ色（ＰＭ  ｃｏｌｏｕｒ）」の産生を促進（ｆａｖｏｕｒｓ）する化合物に関するスクリーニングによって、ＣＦ患者のＥＲ保持欠陥を特異的に補正（ｃｏｒｒｅｃｔ）する分子を発見できる。
【０１３０】
本発明の一側面は、それゆえに生細胞内で相互作用するタンパク質のライブラリーを産生するための方法に関し、該方法は以下から成る：  
１．  細胞のプールに２セットのプラスミドを、同時に又は連続して導入すること（１つのセットのプラスミドは、タンパク質Ａのライブラリーをコード化し、各々は相補するフルオロフォアのＮ末端半分に融合される；および第二のセットのプラスミドは、タンパク質Ｂのライブラリーをコード化し、各々は相補するフルオロフォアのＣ末端半分に融合される）。
２．  前記細胞をイメージングにより、機能的なフルオロフォアが正しい位置で形成される場所及び機能的なフルオロフォアが形成されない場所または機能的なフルオロフォアが形成されるが、誤った細胞区画に形成される場所、にソーティングすること（前記機能的なフルオロフォアの形成が、相互作用が正しい細胞区画内においてタンパク質ＡとＢとの間で発生することの指標である）。
【０１３１】
例えば、刺激に応答して、１つの細胞位置から別の細胞位置へと移動するタンパク質に関して、各位置における結合パートナーを同定できる。
【０１３２】
本発明の一態様において、前記方法は、１つの細胞区画または位置に位置するが、別の細胞区画または位置には位置しない場合に、２つのタンパク質間の結合の崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を生じさせる、薬物の同定に関する。本態様は基本的に上記のとおりに実行されるが、次の点においてのみ相違する。その相違点は、前記細胞を強度に基づいてソーティングする代わりに、前記細胞を標準のイメージング設備でイメージして、結合が発生することのみならず、どこで係る結合が発生するかについても決定することである。
【０１３３】
また、このシステムは、新規の特性を有するフルオロフォア（例えば、上記の分割されたフルオロフォア相補性の利用において使用できるもの）に関するスクリーニングに関して有用である。
【０１３４】
このシステムにおいてＧＦＰのＮおよびＣ末端の双方を変異させることにより、前記システムを使用して、新規の特性を有するフルオロフォアの二重（またはそれ以上の）変異体を組み合わせの様式で選別する。これにより、対象を選択するための、より広範な選択が得られる。さらにまた、２つの変異体は前記分子の異なる半分に存在するので、彼らは付加的（ａｄｄｉｔｉｖｅ）または代償的（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ）または両方であり得る。最後に、彼らが分割されたフルオロフォア相補性システムを用いて発見されたとの事実は、彼らが本システムにおいてセンサーとして使用できることを直ちに意味している。
【０１３５】
本発明は、以下の非限定的な実施例において更に具体的に説明される。
【実施例】
【０１３６】
実施例１：  蛍光タンパク質のアライメント  
【表Ｃ】
2005527210.tif 000006
アライメントは図１６に記載される。
【０１３７】
実施例２：  ＥＧＦＰ相補性断片プローブの構築  
原核および真核の中で互いに結合できる、逆平行ロイシンジッパー（ＮＺおよびＣＺと称される）を、ＧＦＰの異なる断片に融合して、分割するＧＦＰの至適な部位を評価した（係る断片の分子相補性実験（蛍光再構成実験を含む）における使用を目的として）。ＮＺおよびＣＺロイシンジッパーを、リン酸化されたオリゴヌクレオチド２１１０−２１１５（ＮＺジッパーに関して、表２を参照されたい）またはリン酸化されたオリゴヌクレオチド２１１６−２１２１（ＣＺジッパーに関して）を、アニーリングおよびライゲーションすることにより、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断したｐＴｒｃＨｉｓ−Ａベクター（インビトロゲンから利用可能）産生ベクターＰＳ１５１５（ＮＺジッパーをコード化している発現ベクター）またはＰＳ１５１６（ＣＺジッパーをコード化している発現ベクター）中に調製した。ＮＺおよびＣＺアニーリング混合物１にライゲーションされたオリゴにより、ＮＺおよびＣＺジッパーのＮ末端部分のコード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）が産生された。ＮＺおよびＣＺアニーリング混合物２にライゲーションされたオリゴにより、ＮＺおよびＣＺジッパーの中間部分（ｍｉｄｄｌｅ  ｐａｒｔｓ）のコード配列が産生された、そしてＮＺおよびＣＺアニーリング混合物３にライゲーションされたオリゴにより、ＮＺおよびＣＺジッパーのＣ末端部分のコード配列が産生された。
【０１３８】
ＮＺジッパーに関するアニーリングプライマーペア  
ＮＺアニーリング混合物１  
フォワードオリゴ２１１０（１μＭ）                                ５μｌ  
リバースオリゴ２１１１（１μＭ）                                  ５μｌ  
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０      ２μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                            ８μｌ  
【０１３９】
ＮＺアニーリング混合物２  
フォワードオリゴ２１１２（１μＭ）                                ５μｌ  
リバースオリゴ２１１３（１μＭ）                                  ５μｌ  
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０        ２μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                              ８μｌ  
【０１４０】
ＮＺアニーリング混合物３  
フォワードオリゴ２１１４（１μＭ）                                  ５μｌ  
リバースオリゴ２１１５（１μＭ）                                    ５μｌ  
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０        ２μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                              ８μｌ  
【０１４１】
各々のアニーリング混合物を８０℃で２分間、予熱したＨｙｂａｉｄ  ＯｍｎｉＧｅｎｅ  ＰＣＲ機械で熱し、引き続いて停止させ、そして室温で冷やす（約１０分）。断片を引き続いて氷上に置いた。
【０１４２】
ＣＺジッパーに関するアニーリングプライマーペア  
ＣＺアニーリング混合物１  
フォワードオリゴ２１１６（１μＭ）                                ５μｌ  
リバースオリゴ２１１７（１μＭ）                                  ５μｌ  
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０        ２μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                              ８μｌ  
【０１４３】
ＣＺアニーリング混合物２  
フォワードオリゴ２１１８（１μＭ）                                ５μｌ  
リバースオリゴ２１１９（１μＭ）                                  ５μｌ  
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０        ２μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                              ８μｌ  
【０１４４】
ＣＺアニーリング混合物３  
フォワードオリゴ２１２０（１μＭ）                                  ５μｌ  
リバースオリゴ２１２１（１μＭ）                                    ５μｌ  
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０        ２μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                              ８μｌ  
【０１４５】
各々のアニーリング混合物を８０℃で２分間、予熱したＨｙｂａｉｄ  ＯｍｎｉＧｅｎｅ  ＰＣＲ機械で熱し、引き続いて停止させ、そして室温で冷やす（約１０分）。断片を引き続いて氷上に置いた。
【０１４６】
ｐＴｒｃＨｉｓ−Ａ原核生物発現ベクターの制限酵素消化  
ｐＴｒｃＨｉｓ−Ａ原核生物発現ベクター（ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、ゲル精製した）を使用して、調製したＮＺおよびＣＺロイシンジッパーコード配列をクローニングした：
【０１４７】
ｐＴｒｃＨｉｓ−Ａベクターの制限酵素消化  
ｐＴｒｃＨｉｓ−Ａ（１μｇ／μｌ）                                ２μｌ  
ＮｃｏＩ（１０Ｕ／μｌ）                                          １μｌ  
Ｎｈｅｌ（５Ｕ／μｌ）、任意                                  ０．５μｌ  
ＢａｍＨＩ（２０Ｕ／μｌ）                                        １μｌ  
１００ｘＢＳＡ                                                ０．４μｌ  
１０ｘＮＥＢ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  ＮＥＢ）ＢａｍＨＩバッファー
３μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                            ２３μｌ  
子ウシ腸ホスファターゼ（任意、最後の２０ｍｉｎのみ）            ０．５μｌ  
【０１４８】
ベクターを約１時間３７℃で消化し、そしてアガロースゲル電気泳動で精製した。所望のベクター断片を、ゲルからキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（スピンカラム）を用いて回収し、５０μｌの溶出バッファーに回収した。Ｎｈｅｌ（これはＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩの間を切断する）を含ませて、非切断の及びセルフライゲーションしたベクターの量を最小化した。  
【０１４９】
アニールしたＮＺオリゴペアのライゲーションおよび形質転換  
３つのＮＺアニーリング混合物１〜３の各々を、５０倍に希釈（１μｌの混合物を５０μｌのＨ２Ｏに）し、混合し、切断したベクターに以下のとおりライゲーションした（２０〜２４℃で３時間）：
【０１５０】
ＮＺジッパー断片のｐＴｒｃＨｉｓ−Ａベクターへのライゲーション  
アニーリング混合物１                                                １μｌ  
アニーリング混合物２                                                １μｌ  
アニーリング混合物３                                                １μｌ  
１０ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
１μｌ  
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
０．５μｌ  
ｐＴｒｃＨｉｓ−Ａ（ＮｃｏＩ＋ＢａｍＨＩ切断）                  ０．５μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                              ５μｌ  
【０１５１】
或いは、ＮＺアニーリング混合物１、２、および３中の断片を、ベクターの非存在下でライゲーションし、そしてアガロースゲル電気泳動で精製できる（ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断ベクターへとライゲーションする前に）。アニーリング混合物１〜３からのアニールおよびライゲーションしたオリゴヌクレオチドは一本鎖の末端オーバーハングを有していた、該オーバーハングはｐＴｒｃＨｉｓ−ＡのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素消化により形成されたオーバーハングと適合性のものであった。断片を切断されたｐＴｒｃＨｉｓ−Ａへとライゲーションした後、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位を再形成（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）した。
【０１５２】
前記ベクターへのライゲーションに続いて、２μｌのライゲーション混合物を、５０μｌのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  大腸菌細胞（インビトロゲン）へと形質転換した（製造者のプロトコールに従い）。ライゲーションは、異なる量または容量の断片およびバッファーを用いて実行できる。挿入したＤＮＡ配列（配列番号７）およびコード化されたＮＺジッパーペプチド（配列番号８）は以下のとおりである：
【０１５３】
【化１】
2005527210.tif 000007
【０１５４】
末端におけるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸配列はリンカー配列の一部であり、これはＮＺジッパーペプチドとＥＧＦＰのＮ末端断片（ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ）との間に挿入された。また、ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺ融合タンパク質におけるジッパー配列もＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙであり、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙコード配列はＮｔｅｒｍＥＧＦＰリバース増幅プライマー２１２９、２１３０、および２１３１（表３）において反復されている。下線はユニークなＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）、Ａｇｅｌ（ＡＣＣＧＧＴ）およびＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）サイトであり、これらはジッパーペプチドのｐＴｒｃＨｉｓ−Ａへの及びＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺ断片のＮＺジッパーベクターＰＳ１５１５（以下を参照）へのクローニングに使用された。アステリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【０１５５】
アニールしたＣＺオリゴペアのライゲーションおよび形質転換  
３つのＣＺアニーリング混合物４〜６の各々を、５０倍に希釈（１μｌの混合物を５０μｌのＨ２Ｏに）し、以下のとおりに混合した：
【０１５６】
ＣＺジッパー断片のｐＴｒｃＨｉｓ−Ａベクターへのライゲーション  
ＣＺアニーリング混合物１                                            １μｌ  
ＣＺアニーリング混合物２                                            １μｌ  
ＣＺアニーリング混合物３                                            １μｌ  
１０ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
１μｌ  
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
０．５μｌ  
ｐＴｒｃＨｉｓ−Ａ（ＮｃｏＩ＋ＢａｍＨＩ切断）                  ０．５μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                              ５μｌ  
【０１５７】
或いは、ＣＺアニーリング混合物１、２、および３中の断片を、ベクターの非存在下でライゲーションし、そしてアガロースゲル電気泳動で精製できる（ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断ベクターへとライゲーションする前に）。アニーリング混合物１〜３からのアニールおよびライゲーションしたオリゴヌクレオチドは一本鎖化の末端オーバーハングを有していた、該オーバーハングはｐＴｒｃＨｉｓ−ＡのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素消化により産生されたオーバーハングと適合性のものであった。断片の切断されたｐＴｒｃＨｉｓ−Ａへのライゲーション後、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位を再形成した。
【０１５８】
前記ベクターへのライゲーションに続いて、２μｌのライゲーション混合物を、５０μｌのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  大腸菌細胞（インビトロゲン）へと形質転換した（製造者のプロトコールに従い）。ライゲーションは、異なる量または容量の断片およびバッファーを用いて実行できる。挿入したＤＮＡ配列（配列番号９）およびコード化されたＣＺジッパーペプチド（配列番号１０）は以下のとおりである：
【０１５９】
【化２】
2005527210.tif 000008
【０１６０】
末端におけるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙアミノ酸配列はリンカー配列の一部であり、これはＣＺジッパーペプチドとＥＧＦＰのＣ末端断片（ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ）との間に挿入された。また、ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ融合タンパク質におけるジッパー配列もＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙであり、Ｔｈｒ−Ｇｌｙコード配列はＣｔｅｒｍＥＧＦＰフォワード増幅プライマー２１３３、２１３４、および２１３５（表３）において反復されている。下線はユニークなＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）、Ａｇｅｌ（ＡＣＣＧＧＴ）およびＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）サイトであり、これらはジッパーペプチドのｐＴｒｃＨｉｓ−Ａへの及びＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ断片のＣＺジッパーベクターＰＳ１５１６（以下を参照）へのクローニングに使用された。アステリスク（＊）は、終止コドンを示す。
【０１６１】
実施例３：  大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）コロニーＰＣＲ選別、プラスミド  ミニプレップおよびＤＮＡシークエンシング  
形質転換した細菌をルリア  ブロス（ＬＢ）寒天プレート上で平板培養（ｐｌａｔｅｄ）した。該プレートは１００μｌ／ｍｌのカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を選択薬として含有している（使用した大腸菌培地に存在する）。所望のＮＺまたはＣＺ構築物を含有している形質転換体を迅速に同定するため、コロニーＰＣＲスクリーニングをオリゴ２１１０（５’フォワードＮＺオリゴ）および２１１５（３’リバース  ＮＺオリゴ）を用いて又はオリゴ２１１６（５’フォワード  ＣＺオリゴ）および２１２１（３’リバースＣＺオリゴ）を用いて実行した：  
【０１６２】
サンプルごと（１５μｌ反応容量）  
１０ｘＴａｑポリメラーゼバッファー（パーキンエルマー）        １．５μｌ  
ｄＮＴＰ（５ｍＭヌクレオチド、各々）                          ０．３μｌ  
５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２                                          ０．６μｌ  
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）                              ０．３μｌ  
Ｔａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー）                        ０．２μｌ  
５’フォワードプライマー（１０μＭ）                          ０．５μｌ  
３’リバースプライマー（１０μＭ）                            ０．５μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                        ６．１μｌ  
Ｈ２Ｏに再懸濁された形質転換体                                ５．０μｌ  
【０１６３】
サイクリングパラメーター（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ９６、ストラタジーン）  
開始時変性を９４℃で３分間、続いて２５サイクルの以下に記載する工程（全ての工程は１分間）、即ち：  
変性を９４℃、プライマーアニーリングを５３℃およびプライマー伸長を７２℃で実施する。
最終的に、付加的な伸長工程の７２℃での実施を含めた（５分間）。
１６のＮＺ形質転換体および１６のＣＺ形質転換体を選別した。約１２０塩基対の予想された産物サイズを有するＰＣＲ断片を、１４のＮＺクローンおよび１５のＣＺクローンから増幅した（アガロースゲル電気泳動分析により決定された）。
【０１６４】
３つの陽性コロニーを各々の形質転換（ＮＺおよびＣＺ）から採取して、５ｍｌの液体ＬＢ培地に播種した。３７℃で一晩培養した後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐキット（キアゲン）を用いたミニプレパレーションにより精製した。
【０１６５】
正しいＮＺ（ＰＳ１５１５）またはＣＺ（ＰＳ１５１６）断片挿入物を含んでいるプラスミドを、ＤＮＡシークエンシング（ＡＢＩプリズムモデル３７７  ＤＮＡ配列決定装置でフォワード配列決定プライマー１２８２を用いて）で同定した。
【０１６６】
実施例４：  ＥＧＦＰ断片およびジッパーの融合タンパク質をコード化している原核生物性の発現ベクター  
それぞれの原核生物性の発現ベクターＰＳ１５１５およびＰＳ１５１６中の、ＮＺおよびＣＺジッパーをコード化しているＤＮＡ配列を、所望のＥＧＦＰ断片（ＥＧＦＰのＮ末端断片はＮｔｅｒｍＥＧＦＰと称され、ＥＧＦＰのＣ末端断片はＣｔｅｒｍＥＧＦＰと称される）又は他の断片をコード化しているＤＮＡ配列へと、ロイシンジッパーコード配列の５’端（ＮＺベクターＰＳ１５１５における）または３’端（ＣＺベクターＰＳ１５１６における）の何れかにおけるリンカー配列に適切に配置されているユニークなＡｇｅＩ制限酵素認識部位とジッパーコード化断片のクローニングに使用されたユニークなＮｃｏＩまたはＢａｍＨＩ部位の何れかとを組み合わせて用いることにより融合できる（ＤＮＡおよびアミノ酸配列は上記に示される）。
【０１６７】
融合タンパク質コード配列の一般的な構造は、図１に示される。
【０１６８】
例えば、原核生物の発現ベクター〔該ベクターは融合タンパク質をコード化しており、該融合タンパク質はＮｔｅｒｍＥＧＦＰ断片（例えば、残基１−１７２（ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ１７２））のＮ末端を介して（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ）融合されたＮＺジッパー（即ち、ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ断片のＣ末端に融合される）からなる〕を調製するために、市販の発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック）におけるＥＧＦＰコード配列の本領域を、表３のとおりフォワードオリゴ２１２８（ユニークなＮｃｏＩ部位を含んでいる）およびリバースオリゴ２１３１（ユニークなＡｇｅｌ部位を含んでいる）を用いたＰＣＲにより増幅した。
【０１６９】
サンプルごと（５０μｌ反応容量）  
１０ｘＰｆｕポリメラーゼバッファー（ストラタジーン）            ５．０μｌ  
ｄＮＴＰ（５ｍＭヌクレオチド、各々）                            １．０μｌ  
Ｐｆｕ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（ストラタジーン）        １．０μｌ  
５’フォワードプライマー（１０μＭ）                            １．０μｌ  
３’リバースプライマー（１０μＭ）                              １．０μｌ  
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（１０ｎｇ／μｌ）                      ２．０μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                        ３９．０μｌ  
【０１７０】
サイクリングパラメーター（Ｈｖｂａｉｄ  ＯｍｎｉＧｅｎｅ  ＰＣＲ機械）  
開始時変性を９４℃で３分間、続いて２５サイクルの以下に記載する工程（全ての工程は１分間）、即ち：  
変性を９４℃、プライマーアニーリングを５３℃およびプライマー伸長を７２℃で実施する。
最終的に、付加的な伸長工程の７２℃での実施を含めた（５分間）。
【０１７１】
所望のＥＧＦＰ断片（例えば、残基１−１７２から構成される上記の断片）をコード化しているＰＣＲ断片（前記プライマー配列に含まれる、適切に設計（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）した末端の制限酵素認識部位を有する）を、次にゲル精製を上記のとおり、ＮｃｏＩおよびＡｇｅｌまたはＡｇｅｌおよびＢａｍＨＩで切断し、構築したＮＺまたはＣＺ原核生物のロイシンジッパー発現ベクターＰＳ１５１５またはＰＳ１５１６（同じ酵素で切断された）へとライゲーションし、ゲル精製した：  
【０１７２】
ＮｔｅｒｍＥＧＦＰおよびＣｔｅｒｍＥＧＦＰ  ＰＣＲ断片の制限酵素消化  
ＥＧＦＰ断片（ゲル精製された）                                    ２６μｇ  
ＮｃｏＩ（１０Ｕ／μｌ）またはＢａｍＨＩ（２０Ｕ／μｌ）        ０．５μｌ  
Ａｇｅｌ（１０Ｕ／μｌ）                                        １．０μｌ  
１０ｘＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓバッファー２            ３μｌ  
【０１７３】
ＮＺ（ＰＳ１５１５）およびＣＺ（ＰＳ１５１６）ベクターの制限酵素消化  
ベクター（１μｇ／μｌ）                                        １．０μｌ  
ＮｃｏＩ（１０Ｕ／μｌ）またはＢａｍＨＩ（２０Ｕ／μｌ）      ０．３３μｌ  
Ａｇｅｌ（１０Ｕ／μｌ）                                      ０．６６μｌ  
１０ｘＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓバッファー２            １μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                              ７μｌ
【０１７４】
全ての酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。ＤＮＡ調製物を１時間、３７℃で消化し、ゲル精製した。
【０１７５】
ＥＧＦＰ断片の切断したＰＳ１５１５またはＰＳ１５１６ベクターへのライゲーション  
切断および精製したベクター                                          ２μｌ  
切断および精製したＮｔｅｒｍＥＧＦＰまたはＣｔｅｒｍＥＧＦＰ断片    ４μｌ  
１０ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
１μｌ  
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
０．５μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                          ２．５μｌ  
【０１７６】
ライゲーションを３０分間、２２℃で進行させ、その後に２μｌの各ライゲーション混合物を、５０μｌのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  大腸菌細胞（インビトロゲン）へと形質転換した（製造者のプロトコールに従い）。
【０１７７】
形質転換した細胞をＬＢプレート（カルベニシリンを含有している）に平板培養し、プラスミドを各形質転換の２つのコロニーから上記のとおりに調製した。
【０１７８】
実施例５：  大腸菌におけるＥＧＦＰに基づく再構成  
機能的なＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺまたはＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ相補性構築物を発現したプラスミドを、１０μｌのＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  大腸菌細胞（インビトロゲン）に１μｌの各々適切に適合（ｍａｔｃｈｅｄ）したＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺまたはＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰプラスミド〔即ち、ＥＧＦＰ断片を発現するプラスミド、該プラスミドは同一の分割部位（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ｓｉｔｅ）の後（ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ断片）または前（ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ断片）で切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）される〕を共形質転換することと、および共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）した細胞をＬＢプレート（カーベニシリンおよび５ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有する）上で平板培養することと、により同定した。
【０１７９】
形質転換した細胞を一晩、３７℃で培養した。青色光源（Ｆｉｂｅｒｏｐｔｉｃ−Ｈｅｉｍ  ＬＱ２６００）で照らし、黄色フィルター眼鏡を通して確認した際に、ＥＧＦＰに基づく再構成のために緑色蛍光であった大腸菌コロニーは、形質転換後（蛍光は、５℃で１日以上プレートを保存している間に更に発生した）の約１０〜２０時間で拡大することなしに寒天プレート上で可視であった。
【０１８０】
機能的な相補性を、残基１５７および１５８間または残基１７２および１７３間の何れかでの分割に基づいた相補性構築物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）で共形質転換した細胞において明瞭に目視できた、また機能的なＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺまたはＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ相補性断片（ＰＳ１５９４、ＰＳ１５９５、ＰＳ１５９６、ＰＳ１５９７と称される、表４を参照されたい）を産生する発現ベクターのＤＮＡ配列を、プライマー１２８２を用いたＤＮＡシークエンシングで検証した（以前に記載されたとおり）。
【０１８１】
驚くことに、ｌｌｅ１７１−Ｓｅｒ１７５ループ（すなわち残基１７２および１７３の間、ベクターＰＳ１５９５およびＰＳ１５９７）に分割を有するＥＧＦＰ相補性断片を発現するベクターで共形質転換した細胞の大腸菌コロニーは、Ａｌａ１５４−Ｇｌｙ１６０ループ（すなわち残基１５７および１５８の間、ベクターＰＳ１５９４およびＰＳ１５９６）に分割を有するＥＧＦＰ相補性断片を発現するベクターで共形質転換した細胞のコロニーよりも有意に蛍光が強かった。
【０１８２】
機能的な相補性を、残基１４４および１４５間の分割に基づく相補性構築物で共形質転換した細胞において明瞭に目視できなかった。ＤＮＡシークエンシングにより、発現ベクターＰＳ１６１４およびＰＳ１６１５が、それぞれ正しいＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺおよびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ再構成断片をコード化していることが確認された。
【０１８３】
実施例６：  ＥＧＦＰ断片およびジッパーの融合タンパク質をコード化している真核生物性の発現ベクター  
１４４／１４５分割断片に基づいた相補性断片により産生された蛍光シグナルが低いので、残基１５７／１５８または１７２／１７３での分割に基づいた相補性断片のみが、真核生物性の発現系へと移され、哺乳類細胞における断片相補性を評価することが認可された。
【０１８４】
ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺ断片（ＰＳ１５９６およびＰＳ１５９７における）、およびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ断片（ＰＳ１５９４およびＰＳ１５９５における）は、ＮｃｏＩ部位（開始コドンに対して５’）およびＢａｍＨＩ部位（終始コドンに対して３’）が両側に配置される（ｆｌａｎｋｅｄ）。前記断片を、ブラントエンド化されたＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として、哺乳類発現ベクター（Ｅｃｏ４７ＩＩＩ／ＢａｍＨＩで切断された）へと導入した。ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺおよびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰの双方を発現するプラスミドの安定的発現に関して選択するために、ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺ断片およびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ断片に関する発現ベクターは、それぞれネオマイシン／ジェネテシン／Ｇ４１８およびゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）に対する選択マーカーを含有している。
【０１８５】
プラスミドＰＳ１５９４、ＰＳ１５９５、ＰＳ１５９６、およびＰＳ１５９７を、ＮｃｏＩ制限酵素で切断し、クレノー断片でブラントエンド化し、ゲル精製し、ＢａｍＨＩで切断し、そしてゲル精製した（以下に記載のとおり）。
【０１８６】
ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺおよびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ原核生物性の発現ベクターの制限酵素消化  
ＰＳ１５９４、ＰＳ１５９５、ＰＳ１５９６、またはＰＳ１５９７（１μｇ／μｌ）
１μｌ  
ＮｃｏＩ（１０Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓより）
１μｌ  
１０ｘバッファー４（ＮＥＢ）                                      ３μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                          ２５μｌ  
【０１８７】
前記プラスミドを約１時間、３７℃で消化した。１μｌの１ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物および１ユニットのクレノー断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、反応を３０分間、室温でインキュベートした。直鎖状プラスミド断片を、アガロースゲル電気泳動で精製し、ゲルからキアゲンのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（スピンカラム）を用いて回収し、５０μｌの溶出バッファー中に回収した。５μｌのＢａｍＨＩバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および１０ユニットＢａｍＨＩ酵素を添加した。前記プラスミドを約１時間、３７℃で消化した。所望のプラスミド断片を、アガロースゲル電気泳動で精製し、ゲルからキアゲンのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（スピンカラム）を用いて回収し、５０μｌの溶出バッファー中に回収した。
【０１８８】
ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺおよびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ断片を同じ哺乳類細胞において安定的に共発現させるために、異なる選択マーカーを保持している哺乳類発現ベクターが必要とされる。これを実現するため、発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１におけるカナマイシン／ネオマイシン選択マーカーをゼオシン抵抗性マーカーで置換した、このプラスミドをＰＳ０６０９と命名した。
【０１８９】
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１におけるカナマイシン／ネオマイシンマーカーのゼオシンマーカーでの置換  
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１をＡｖｒＩＩで消化（カナマイシン／ネオマイシン選択マーカーが摘出される）し、次にゲル精製し、ベクター断片を約０．５ｋｂｐのＡｖｒＩＩ断片（ゼオシン抵抗性をコード化している）とライゲーションした。この断片を、プラスミドｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン）におけるゼオシン選択マーカーをプライマー９６５５および９６５８を用いてＰＣＲ増幅することにより分離した（表２を参照されたい）。両方のプライマーは、ＡｖｒＩＩクローニング部位を有し、プラスミドｐＺｅｏＳＶ（自身の大腸菌プロモーターを含んでいる）上のゼオシン抵抗性遺伝子の両側に接している（ｆｌａｎｋ）。トッププライマー（ｔｏｐ  ｐｒｉｍｅｒ）９６５８はゼオシンの開始部位のＡｓｅＩ部位を含み、これを利用してＡｖｒＩＩ挿入物の、ＳＶ４０プロモータ（哺乳類細胞における耐性を発揮させる）に対する方向性を決定することができる。生じたプラスミドをＰＳ０６０９と称する。
【０１９０】
プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック）及びそのゼオシン耐性派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）ＰＳ０６０９を、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素で切断し、ゲル精製し、ＢａｍＨＩで切断し、そしてゲル精製した（以下に記載のとおり）。これらの工程により、ＥＧＦＰが摘出され、前記ベクターの残りの部分が無傷（ｉｎｔａｃｔ）で残される。
【０１９１】
真核生物性の発現ベクターの制限酵素消化  
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１またはＰＳ０６０９  ＤＮＡ（１μｇ／μｌ）      ０．５μｌ  
Ｅｃｏ４７ＩＩＩ（１０Ｕ／μｌ、プロメガより）                      １μｌ  
１０ｘバッファーＤ（プロメガ）                                      ３μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                        ２５．５μｌ  
【０１９２】
前記プラスミドを約１時間、３７℃で消化した。直鎖状プラスミド断片を、アガロースゲル電気泳動で精製し、ゲルからキアゲンのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（スピンカラム）を用いて回収し、５０μｌの溶出バッファー中に回収した。５μｌ  ＢａｍＨＩバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および１０ユニットＢａｍＨＩ酵素を添加した。前記プラスミドを約１時間、３７℃で消化した。所望のベクター断片を、アガロースゲル電気泳動で精製し、ゲルからキアゲンのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（スピンカラム）を用いて回収し、５０μｌの溶出バッファー中に回収した。
【０１９３】
ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺ断片のｐＥＧＦＰ−Ｃ１へのライゲーションおよびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ断片のＰＳ０６０９へのライゲーション  
切断および精製したベクター断片                                      １μｌ  
切断および精製したＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺまたはＣｔｅｒｍＥＧＦＰ断片
３μｌ  
１０ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
１μｌ  
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
０．５μｌ  
Ｈ２Ｏ                                                              ５μｌ  
【０１９４】
ライゲーション反応を１６℃で一晩インキュベーションする。３μｌをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌細胞（インビトロゲン）へと形質転換し、形質転換体をカナマイシン添加ｉｍＭｅｄｉａまたはゼオシン添加ｉｍＭｅｄｉａ（両方ともインビトロゲン）上で、それぞれｐＥＧＦＰ−Ｃ１およびＰＳ０６０９派生物に関して選択した。
【０１９５】
４つの形質転換体（各形質転換プレートからの）を、ｉｍＭｅｄｉａ培地に適切な選択（カナマイシンまたはゼオシン）を加えたものに入れて、３７℃で６時間成長させた。
【０１９６】
プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐスピンカラム法（キアゲン）により分離し、ＡｓｅＩおよびＭｌｕＩでの制限酵素消化で分析した。前記挿入物のＤＮＡ配列を、最終的にはシークエンシングにより検証した（上記のとおり）。結果的に生じたプラスミドをＰＳ１５５７、ＰＳ１５５８、ＰＳ１５５９、およびＰＳ１５６０（表４）と命名した。
【０１９７】
実施例７：  哺乳類細胞におけるＥＧＦＰに基づく再構成  
ＥＧＦＰ断片／ジッパー融合タンパク質を発現する細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）を樹立するため、ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞をプラスミドペアで形質転換して、２つの細胞株  １）ＣＨＯ−ｈＩＲ  ＰＳ１５５９＋ＰＳ１５５７、および２）ＣＨＯ−ｈＩＲ  ＰＳ１５６０＋ＰＳ１５５８が作出された。ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞株はＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）細胞からなり、該細胞はヒトインシュリンレセプターを安定的に形質移入されている（（ｈＩＲ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ＃；  Ｍ１００５１）  次の文献に記載されている：Ｈａｎｓｅｎ，  Ｂ．Ｆ．，  Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｄｒｅｊｅｒ，  Ｋ．，  Ｓｒｅｎｓｅｎ，  Ａ．Ｒ．，  Ｗｉｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｃ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｈ．Ｈ．，  Ｌｕｎｄｅｍｏｓｅ，  Ａ．Ｇ．  （１９９６）  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｆｔｅｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  Ａｐｒ  １；  ３１５  （Ｐｔ  １）：  ２７１−２７９）＜。前記ベクターに対する選択マーカーは、メトトレキセート（ＭＴＸ）である。ｈＩＲ発現はＣＨＯ−ｈＩＲ細胞において非常に安定であり（淘汰圧なしで）、というのも前記細胞株がインシュリン感受性であるためであり、非常に安定な表現型を淘汰圧なしで維持できる。
【０１９８】
安定な細胞は、選択培地（ジェネテシンおよびゼオシンを含有している）において細胞成長させることにより取得された。
【０１９９】
ＣＨＯ−ｈＩＲをＦｕｇｅｎｅ（ロシュ）を用いて形質移入した（製造者の指示にしたがって）。形質移入の次の日、細胞を一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に関して検査し、分割（１：１０）し、選択培地（５００μｇ／ｍｌのジェネテシン（インビトロゲン）および１ｍｇ／ｍｌのゼオシン（Ｃａｙｌａ）を添加した、成長培地）に暴露した。前記細胞株は、選択培地における培養の２〜３週後に安定であった。
【０２００】
使用された成長培地（ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ）は、ＮＵＴ．ＭＩＸ  Ｆ−１２（Ｈａｍ’ｓ）ｗｉｔｈＧＬＵＴＡＭＡＸ−１（ギブコ／インビトロゲン）に１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１％ペニシリン―ストレプトマイシン（１０，０００ＩＵ／ｍｌ、ギブコ／インビトロゲン）とを添加した培地であった。前記ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞を成長培地中で培養し、分割（１：４から１：１６）した（週に２回、標準の細胞培養プロトコールにしたがって）。前記ＣＨＯ−ｈＩＲ  ＰＳ１５５９＋ＰＳ１５５７およびＣＨＯ−ｈＩＲ  ＰＳ１５６０＋ＰＳ１５５８を同様に処理した（前記成長培地が５００μｇ／ｍｌのジェネテシン（インビトロゲン）および１ｍｇ／ｍｌゼオシン（Ｃａｙｌａ）を常に添加されていることを除いて）。
【０２０１】
３つのＣＨＯ−ｈＩＲ細胞株〔該細胞株は、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（１つの短いＣ末端の伸長部（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を有するＥＧＦＰを発現する）、ＰＳ１５５９＋ＰＳ１５５７（１５７−１５８で分割されたＥＧＦＰ相補性断片、ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ１５７−ＮＺ＋ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ１５８を発現する）およびＰＳ１５６０＋ＰＳ１５５８（１７２−１７３で分割されたＥＧＦＰ相補性断片、ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ１７２−ＮＺ＋ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ１７３を発現する）で別々に形質移入された〕のイメージを、形質移入後の１日、２日および１０日で収集し、異なる相補性構築物を発現している細胞の相対的輝度（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）を評価した。イメージをＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ３００（エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の作業に対する装備を有する）上で収集した。エピ蛍光に関する光源は、Ｎｉｋｏｎ  １００Ｗ  Ｈｇアークランプを使用した、これは顕微鏡にカスタムの石英線維イルミネーター（ＴＩＬＬ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ，  Ｐｌａｎｅｇｇ，  ドイツ）を通して連結されていた。励起光は、４５０−４９０ｎｍバンドパスフィルター（Ｄｅｌｔａ  Ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ，  Ｌｙｎｇｂｙ，  デンマーク）を通過し、そして検体にＣｈｒｏｍａ  ７２１００  ５０５ｎｍカットオン（ｃｕｔ−ｏｎ）二色性ミラー（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，  ＶＴ，  ＵＳＡ）を介して向けられた。Ａｘ４０  ＮＡ１．３油浸レンズが、全イメージに関して使用された。放射された光は、５４０−５５０バンドパスフィルター（Ｃｈｒｏｍａ）を通じてＨａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  ＥＲカメラへと到達した。全イメージを、５０ミリ秒照射時間で収集し、イメージの非飽和が各々の光学的なフィールドにおける最大輝度（ｂｒｉｇｈｔｅｓｔ）（ＥＧＦＰ発現）の細胞（最大画素数＜４０９５）に対してまでも保証されるように選択された。このシステムにおいてイメージを獲得するために使用されたイメージングソフトウェアは、ＩＰＬａｂ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ，  ＵＳＡ）であった。
【０２０２】
イメージの提示（Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）および分析  
顕微鏡イメージをＩｍａｇｅＪソフトウェアパッケージを用いて分析した、これはパブリックドメインのイメージ分析ソフトウェアであって、米国国立保健研究所（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．  ｉｎｆｏ．  ｎｉｈ．  ｇｏｖ／ｉｊ／）のＷａｙｎｅ  Ｒａｓｂによって作製されたものである、そしてデータ分析をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで実行した。
【０２０３】
図２に示されるイメージは、異なるＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺおよびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ発現ベクターで共形質移入した又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１で形質移入した、蛍光性のＣＨＯ−ｈＩＲ細胞のイメージである。前記イメージは、個々に測定され（ｓｃａｌｅｄ）、前記細胞及びその中の蛍光分布が視覚化される。このスケーリング（ｓｃａｌｉｎｇ）のため、相対的な蛍光レベルはイメージ間で比較できない。同じイメージが同様に（ｉｄｅｎｔｉｃａｌｌｙ）測定される際には、それらは図３のように現される。また、残基１７２および１７３間の分割に基づく相補性構築物で形質移入した細胞が、残基１５７および１５８間の分割に基づく相補性構築物で形質移入した細胞よりも有意に蛍光が強いことは明白である。しかしながら、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１構築物で形質移入した細胞は、有意により強い蛍光を２日目に呈する。
【０２０４】
同じイメージを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアパッケージを用いて、バックグラウンドおよび最大の蛍光強度に関して分析した（図４）。図から次のことが明らかである、それは残基１７２および１７３間（および、多分このループ内の別領域（ａｎｙｗｈｅｒｅ  ｅｌｓｅ））での分割が、残基１５７および１５８間での分割（および、多分このループ内の別領域での分割）と比べて非常に優れているということである。
【０２０５】
実施例８：  ＥＹＦＰおよびＥＹＦＰ変種Ｆ６４Ｌ  断片／ジッパー  融合タンパク質をコード化している真核生物性の発現ベクター  
真核生物性のＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺ発現ベクターＰＳ１５５９（ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ１５７−ＮＺ）およびＰＳ１５６０（ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ１７２−ＮＺ）の対応するＮ末端ＥＹＦＰ（配列番号５）断片（ＮｔｅｒｍＥＹＦＰ−ＮＺ）変種への突然変異誘発（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）並びに真核生物性のＣｔｅｒｍＥＧＦＰ発現ベクターＰＳ１５５７（ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ１５８）およびＰＳ１５５８（ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ１７３）の対応するＣ末端ＥＹＦＰ断片（ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ）変種への突然変異誘発は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットを用いた部位特異的突然変異誘発により、製造者の指示（ストラタジーン）にしたがって達成された。プライマー２３３３および２３３４を使用して、発現ベクターＰＳ１５５９（ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ１５７−ＮＺ）およびＰＳ１５６０（ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ１７２−ＮＺ）をＮ末端ＥＹＦＰ断片発現ベクターＰＳ１６３９（ＮｔｅｒｍＥＹＦＰ１５７−ＮＺ）およびＰＳ１６４２（ＮｔｅｒｍＥＹＦＰ１７２−ＮＺ）に変換（ｃｏｎｖｅｒｔ）した。導入した変異は：Ｌ６４Ｆ：Ｔ６５Ｇ：Ｖ６８Ｌ：Ｓ７２Ａであった。更に、プライマー２３３５および２３３６を使用して、発現ベクターＰＳ１５５９（ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ１５７−ＮＺ）およびＰＳ１５６０（ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ１７２−ＮＺ）をＦ６４Ｌ変異したＮ末端ＥＹＦＰ断片発現ベクターＰＳ１６４０（ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１５７−ＮＺ）およびＰＳ１６４１（ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−ＮＺ）に変換（ｃｏｎｖｅｒｔ）した。導入した変異は：Ｔ６５Ｇ：Ｖ６８Ｌ：Ｓ７２Ａであった。従って、発現したＮｔｅｒｍＥＹＦＰ断片は、次のアミノ酸配列（残基６４−７２のみが示される）を有する：  
【０２０６】
【化３】
2005527210.tif 000009
【０２０７】
最後に、プライマー２３３７および２３３８を使用して、発現ベクターＰＳ１５５７（ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ１５８）およびＰＳ１５５８（ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ１７３）をＣ末端ＥＹＦＰ断片発現ベクターＰＳ１６３７（ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１５８）およびＰＳ１６３８（ＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）に、Ｔ２０３Ｙ変異を導入することにより変換（ｃｏｎｖｅｒｔ）した。全配列を、前記ベクターをＤＮＡシークエンシングすることにより検証した。全プライマー配列を表２に示す。
【０２０８】
実施例９：  哺乳類細胞におけるＥＹＦＰに基づく再構成  
構築されたＥＹＦＰに基づく分割蛍光タンパク質発現ベクターＰＳ１６３７からＰＳ１６４２（上記）を、ＥＧＦＰに基づく分割蛍光タンパク質発現ベクターＰＳ１５５７からＰＳ１５６０（実施例７に記載）と並行して哺乳類細胞中で調査した、ここで同じ実験セットアップ（同じフィルターセットを含む）および処理（イメージ分析処理を含む）を用いたが、全てのイメージは１０ｍｓ暴露時間（５０ｍｓ暴露時間の代わりに）用いて作製された、というのもプローブの輝度が増加し、より多くの細胞をイメージするために２０ｘ対物レンズを４０ｘ対物レンズの代わりに使用したからである。他の適切なフィルターセットを使用できるだろう。イメージを形質移入の翌日（１日目）取得する。
【０２０９】
同様に測定された形質移入された細胞の蛍光イメージ（図６）から、残基１７２および１７３間の分割部位（ｓｐｌｉｔ  ｓｉｔｅ）が、残基１５７および１５８間の分割部位より優れていることが再び示されていることは明らかである。そのうえ、ＥＹＦＰ断片に基づく相補性がＥＧＦＰ断片に基づく相補性よりも優れていることは明らかである。驚くことに、ＥＧＦＰからのＦ６４Ｌ変異をＮ末端ＥＹＦＰ断片に導入することにより、相補する断片の蛍光が更に多大に増強された。イメージから認められるように、至適な分割部位（残基１７２および１７３間）を用いたこと、至適な蛍光タンパク質色変種（ＥＹＦＰ）を用いたこと及びＦ６４Ｌフォールディング変異をＮｔｅｒｍＥＹＦＰ断片に導入すること、のポジティブ効果は付加的なものである。これらの観察の定量化を、図６に示されるイメージを分析することにより実施した（数値の出力を図７に表す）。
【０２１０】
【表Ｄ】
2005527210.tif 000010
【０２１１】
【表Ｅ】
2005527210.tif 000011
【０２１２】
【表Ｆ】
2005527210.tif 000012
【０２１３】
最適な構築物（ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−ＮＺおよびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７３）が、再構成された際に、ＥＹＦＰ自身と同様の強度であることは興味ぶかい。蛍光強度を大きく増加させることは、多くのタイプの定量的な細胞分析（例えば、ハイスループットなスクリーニングおよび顕微鏡観察）において、シグナルに対するノイズ量（ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏｎｓ）を増加させるため、低い量のプローブのインビボまたはインビトロにおける検出を促進するため、等々において重要である。
【０２１４】
また、ＮｔｅｒｍＥＹＦＰをＣｔｅｒｍＥＧＦＰと又はＮｔｅｒｍＥＧＦＰをＣｔｅｒｍＥＹＦＰ断片と混合することにより、機能的な蛍光複合体（潜在的に異なる色の）を産生することができる（図８および９）。
【０２１５】
オーバーラップする配列を有する断片は、同様に機能的であり、そして例えば、機能的なクローニングシステムであって、高度に可撓性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）のリンカー配列が融合パートナーの非常に多様な素質に起因して必要とされるシステムにおいて非常に魅力的である。前記オーバーラップする断片は、融合パートナーの何れかに、長いリンカー配列を有することを許容する（図８、図９に定量化される）。
【０２１６】
実施例１０：  ＰＳ１７６９、１７６７、１７７１、１７６８の構築  
プラスミドＰＳ１７６９は、ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２とＦＫＢＰとがリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧＤＩＴＳＬＹＫＫＡＧＳＴ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号１１）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結された、融合体をコード化する。
【０２１７】
プラスミドＰＳ１７６７は、ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２とＦＲＡＰのＦＫＢＰ結合部分〔ＦＲＢ（ＦＲＡＰのアミノ酸２０２５−２１１４）〕とがリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧＤＩＴＳＬＹＫＫＡＧＳＴ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号１２）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結された、融合体をコード化する。
【０２１８】
プラスミドＰＳ１７７１は、ＦＲＢとＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３とがリンカー配列ＤＰＡＦＬＹＫＶＶＩＳＧＳＧＳＧＳＧ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号１３）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結された、融合体をコード化する。
【０２１９】
プラスミドＰＳ１７６８は、ＦＫＢＰとＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３とがリンカー配列ＤＰＡＦＬＹＫＶＶＩＳＧＳＧＳＧＳＧ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号１４）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結された、融合体をコード化する。
【０２２０】
プラスミドＰＳ１７６９の構築  
【０２２１】
プラスミドＰＳ１７６９は、ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２とＦＫＢＰとが、リンカー配列により連結され、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、カナマイシンおよびネオマイシン抵抗性をそれぞれ大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化している。
【０２２２】
プラスミドＰＳ１７６９は、プラスミドＰＳ１７７９（エントリークローン）およびＰＳ１６７９（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１６７９は、プラスミドＰＳ１６７２およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック）に由来した。プラスミドＰＳ１６７２は、上記のプラスミドＰＳ１６４１に由来した。
【０２２３】
中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）ＰＳ１６７２の構築  
【０２２４】
ＰＳ１６４１をプライマー２２１９および２２２２（表２）でのＰＣＲに供試し、ｃａ  ０．５ｋｂ  Ｎｈｅ１−ＢａｍＨ１断片をＮｈｅ１およびＢａｍＨ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック）へとライゲーションした。これによりＮｔｅｒｍＥＧＦＰがＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２で置換され、これに続いてリンカー配列（これはフレーム内（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）のリンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙをコード化している）およびユニークなＥｃｏＲＶ部位（ＢａｍＨ１のちょうど上流）が配置される。このプラスミドは、ＰＳ１６７２と称される。
【０２２５】
デスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）ＰＳ１６７９の構築  
【０２２６】
プラスミドＰＳ１６７２を、Ｇａｔｅｗａｙ適合性のデスティネーションベクターへと、前記ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断すること及びそれをＧａｔｅｗａｙカセット読み枠Ａとライゲーションすることにより変換した〔Ｇａｔｅｗａｙ製造者（インビトロゲン）の指示にしたがって〕。このデスティネーションベクターは、ＰＳ１６７９と称される。
【０２２７】
ＧａｔｅｗａｙエントリークローンＰＳ１７７９の構築  
【０２２８】
ＦＫＢＰのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  ＸＭ＿０１６６６０）を、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲおよびプライマー２４４２および１２７２（表２）を用いて分離した。ｃａ  ０．４ｋｂ産物を、ＢＰ反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０７へと転移させ（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）、エントリークローンＰＳ１７７９を産生した。
【０２２９】
最終的に、発現ベクターＰＳ１７６９を、ＦＫＢＰをエントリークローンＰＳ１７７９からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１６７９へと転移させることにより産生した（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）。
【０２３０】
プラスミドＰＳ１７６７の構築  
【０２３１】
プラスミドＰＳ１７６７は、ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２とＦＲＡＰのＦＫＢＰ結合部分〔ＦＲＢ（ＦＲＡＰのアミノ酸２０２５−２１１４）〕とが、リンカー配列により連結され、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、カナマイシンおよびネオマイシン抵抗性をそれぞれ大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化している。
【０２３２】
プラスミドＰＳ１７６７は、プラスミドＰＳ１７８１（エントリークローン）およびＰＳ１６７９（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１６７９を上記のとおり構築した。
【０２３３】
ＧａｔｅｗａｙエントリークローンＰＳ１７８１の構築  
【０２３４】
ＦＲＡＰのＦＫＢＰ結合部分（アミノ酸２０２５−２１１４、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  ＸＭ＿００１５２８）を、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲおよびプライマー２４４４および１２６８（表２）を用いて分離した。ｃａ  ０．３ｋｂ産物を、ＢＰ反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０７へと転移させ（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）、エントリークローンＰＳ１７８１を産生した。
【０２３５】
最終的に、発現ベクターＰＳ１７６７を、ＦＲＢをエントリークローンＰＳ１７８１からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１６７９へと転移させることにより産生した（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）。
【０２３６】
プラスミドＰＳ１７７１の構築  
【０２３７】
プラスミドＰＳ１７７１は、ＦＲＢと称されるＦＲＡＰのＦＫＢＰ結合部分（ＦＲＡＰのアミノ酸２０２５−２１１４）とＥＹＦＰのＣ末端（ＦＲＢ−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）とが、リンカー配列により連結され、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、ゼオシン抵抗性を大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化している。
【０２３８】
プラスミドＰＳ１７７１は、プラスミドＰＳ１７８２（エントリークローン）およびＰＳ１６８８（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１６８８は、上記のプラスミドＰＳ１６７４およびＰＳ６０９に由来した。プラスミドＰＳ１６７４は、上記のプラスミドＰＳ１６３８に由来した。
【０２３９】
中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）ＰＳ１６７４の構築  
【０２４０】
ＰＳ１６３８をプライマー２２２５および２１３２（表２）でのＰＣＲに供試し、ｃａ  ０．２５ｋｂ  Ｎｈｅ１−ＢａｍＨ１断片をＮｈｅ１およびＢａｍＨ１で消化したＰＳ６０９へとライゲーションした。これによりＥＧＦＰがＥＹＦＰ（１７３−２３８）で置換され、これに先行してリンカー配列（これはフレーム内（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）のリンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙをコード化している）およびユニークなＥｃｏＲＶ部位（Ｎｈｅ１のちょうど下流）が配置される。このプラスミドは、ＰＳ１６７４と称される。
【０２４１】
デスティネーションベクターＰＳ１６８８の構築  
【０２４２】
プラスミドＰＳ１６７４を、Ｇａｔｅｗａｙ適合性のデスティネーションベクターへと、前記ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断すること及びそれをＧａｔｅｗａｙカセット読み枠Ａとライゲーションすることにより変換した〔Ｇａｔｅｗａｙ製造者（インビトロゲン）の指示にしたがって〕。このデスティネーションベクターは、ＰＳ１６８８と称される。
【０２４３】
ＧａｔｅｗａｙエントリークローンＰＳ１７８２の構築  
【０２４４】
ＦＲＡＰのＦＫＢＰ結合部分（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  ＸＭ＿００１５２８、アミノ酸２０２５−２１１４）を、ヒト  ｃＤＮＡからＰＣＲおよびプライマー２４４４および２４４５（表２）を用いて分離した。ｃａ  ０．３ｋｂ産物を、ＢＰ反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０７へと転移させ（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）、エントリークローンＰＳ１７８２を産生した。
【０２４５】
最終的に、発現ベクターＰＳ１７６８を、ＦＲＢをエントリークローンＰＳ１７８２からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１６８８へと転移させることにより産生した（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）。
【０２４６】
プラスミドＰＳ１７６８の構築  
【０２４７】
プラスミドＰＳ１７６８は、ＦＫＢＰとＥＹＦＰ（１７３−２３８）（ＦＫＢＰ−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）とが、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、ゼオシン抵抗性を大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化する。
【０２４８】
プラスミドＰＳ１７６８は、プラスミドＰＳ１７８０（エントリークローン）およびＰＳ１６８８（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１６８８を上記のとおり構築した。
【０２４９】
ＧａｔｅｗａｙエントリークローンＰＳ１７８０の構築  
【０２５０】
ＦＫＢＰのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  ＸＭ＿０１６６６０）を、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲおよびプライマー２４４２および２４４３（表２）を用いて分離した。ｃａ  ０．４ｋｂ産物を、ＢＰ反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０７へと転移させ（製造者（インビトロゲン）の推奨にしたがって）、エントリークローンＰＳ１７８０を産生した。
【０２５１】
最終的に、発現ベクターＰＳ１７６８を、ＦＫＢＰをエントリークローンＰＳ１７８０からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１６８８へと転移させることにより産生した（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）。
【０２５２】
実施例１１：  ＧＦＰ相補性方法を用いる誘導性の相互作用システムの構築（タンパク質間相互作用を阻害する化合物に関するスクリーニングにおいて、該方法の有用性を実証する）。
【０２５３】
免疫抑制化合物  ラパマイシンは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）と結合し、同時に大きいＰｌ３キナーゼホモログＦＲＡＰ（ｍＴＯＲまたはＲＡＦＴとしても知られる）と結合し、これら２つのタンパク質に対するヘテロ二量体化因子（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｓｅｒ）として作用する。ラパマイシンを使用して所望のタンパク質間のヘテロ二量体を誘導するために、前記タンパク質のうち１つをＦＫＢＰドメインに、そして他をＦＲＡＰの９０アミノ酸部分（ＦＲＢと呼ばれ、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合に関して十分である）に融合する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ  ９２，４９４７  （１９９５））。本実施例において、ＦＲＢおよびＦＫＢＰの融合体は、分割されたＥＹＦＰ（これにはＥＹＦＰ（１−１７２）配列におけるＦ６４Ｌ変異が含まれる（ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２））の相補性半分へと、相補性反応がラパマイシンの添加によりコントロールできるように作出される。
【０２５４】
条件的に相互作用するよう作出できるコンポーネントを用いた、モデルＧＦＰ相補性システムが、期待どおり用量依存的な様式で相互作用刺激に対して応答することを、本実施例は実証（ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ）する。また、前記実施例は、Ｅ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ相補性システムに関する蛍光発生（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の速度（ｒａｔｅ）についての情報も提供する。更に、前記システムを使用して、Ｅ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ相補性システムの相補性半分に融合された、タンパク質の相互作用をブロックする化合物を検出できることが実証される。
【０２５５】
以下の融合構築物を実施例１０に記載のとおり作出した：  
【０２５６】
ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−ＦＫＢＰ＝プラスミドコードＰＳ１７６９  
ＦＲＢ−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３＝ＰＳ１７７１  
ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−ＦＲＢ＝ＰＳ１７６７  
ＦＫＢＰ−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３＝ＰＳ１７６８  
プローブをペアで（ｉｎ  ｐａｉｒｓ）ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞（上記（ｓｕｐｒａ））中に共形質転換した、この際、ＰＳ１７６９にＰＳ１７７１およびＰＳ１７６７にＰＳ１７６８とし、形質移入因子  ＦｕＧＥＮＥＴＭ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ，  ＵＳＡ）を供給者（ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ）が推奨する方法に準拠して用いた。細胞を成長培地（ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物に、Ｇｌｕｔａｍａｘ−１、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００μｇ  ペニシリン−ストレプトマイシン混合物  ｍｌ−１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより供給された，  デンマーク）を有する）中で培養した。形質移入した細胞を、この培地に、使用されているプラスミドに対して適切な２つの選択薬、１ｍｇ／ｍｌゼオシン  プラス  ０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８硫酸塩を添加して培養した。細胞を３７℃で１００％湿度、および通常の大気に５％ＣＯ２を補充した条件で培養した。
【０２５７】
選択薬の継続的な存在下で１０から１２日培養した後、生じた細胞株が安定的に形質移入されたかについて判断した。蛍光顕微鏡に関して、細胞のアリクウォット（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を、Ｌａｂ−Ｔｅｋチェンバード（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）カバーグラス（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ  ＵＳＡ）に移し、少なくとも２４時間約８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達するまで付着させておいた。イメージは、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ３００倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）、ｘ２０（ドライ）および／またはｘ４０（油浸）対物レンズを用いて規定通りに収集され、そしてＯｒｃａ  ＥＲチャージド（ｃｈａｒｇｅｄ）連結装置（ＣＣＤ）カメラ（Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｋ．Ｋ．，  Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｃｉｔｙ，  Ｊａｐａｎ）へと連結された。細胞を１００Ｗ  ＨＢＯアークランプで照らした、この際に４７０±２０ｎｍ励起フィルター、５１０ｎｍ二色性ミラーおよび５１５±１５ｎｍ放射フィルターを介した（最小のイメージバックグラウンドに関して）。イメージ収集、引き続く蛍光強度の測定および分析は、全て特定のソフトウェア（ＩＰＬａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ，  Ｆａｉｒｆａｘ，  ＶＡ  ＵＳＡ）によりコントロールされた。
【０２５８】
また、細胞を１６時間培養して、約１．０ｘ１０５細胞／４００μＬをプラスチック９６ウェルプレート（Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ  Ｐａｃｋａｒｄ  ９６−Ｖｉｅｗ  ＰｌａｔｅまたはＣｏｓｔａｒ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｌａｔｅ，  ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ；両タイプは組織培養処理された）中に有する播種濃度（ｓｅｅｄｉｎｇ  ｄｅｎｓｉｔｙ）から、イメージング目的と蛍光プレートリーダーにおける蛍光強度の測定との双方に使用した。実験に先立ち、前記細胞を、選択薬剤なしでハムＦ−１２培地（ｇｌｕｔａｍａｘ、１００μｇ  ペニシリン−ストレプトマイシン混合物  ｍｌ−１および１０％ＦＢＳを有する）中で一晩培養する。細胞において、インキュベーターからの直接的な（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）蛍光測定を可能にする、低い自己蛍光を本培地は有する。エンドポイント測定に関して、プレート中の細胞を規定通りに固定（４％ホルムアルデヒドをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に含むもの＋１０μＭのヘキスト２２５３８で１０分間）し、次にＰＢＳを用いた３回の洗浄工程を実施した。核（ｎｕｃｌｅａｒ）の色素ヘキスト２２５３８を使用することにより、各ウェルからのＥＹＦＰ蛍光シグナルを細胞密度に対して補正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）することが可能となる。この様式（ｗａｙ）で調製したプレートを、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＣＦプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，  フィンランド）に適切なフィルターセット（ＥＹＦＰ：励起４８５ｎｍ、放射５２７ｎｍ；ヘキスト２２５３８：励起３５５ｎｍ、放射４６０ｎｍ）を装備した装置上で測定した。
【０２５９】
両方の細胞株ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６９＋ＰＳ１７７１］およびＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６７＋ＰＳ１７６８］は、ラパマイシンに応答し、ＥＹＦＰ蛍光の実質的な増加を数時間のインキュベーション後に予想どおり示した（図１０）。これらの細胞に対する開始条件で（ｔ＝０）、蛍光は大抵の細胞において僅かに（ｂａｒｅｌｙ）可視であるが、それにもかかわらず集団中のいくつかの細胞（＜５％）が、低い（しかし、感知できる（ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅ））蛍光を処理前に有していたことが注目された（図１０ａ）。４時間後（図１０ｂ）、多くの細胞（約４０％）は、有意に高いＥＹＦＰ蛍光を細胞質及び核の区画の全体（ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ）に発生させた。１６時間後（図１０ｃ）、細胞毎の応答は、更に増加し、そして細胞集団の多くの割合（約７０％）を包含するものであった。結果は、第二の細胞株ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６９＋ＰＳ１７７１］に関して基本的に同一であった。
【０２６０】
図１１のグラフは、細胞のＥＹＦＰ蛍光の発生の速度（ｒａｔｅ）を、ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６７＋ＰＳ１７６８］株のラパマイシン処理後に示したものである。細胞を９６ウェルプレート中で３μＭラパマイシンで処理し、様々な時間で蛍光を測定した。処理および測定を、ハムの培地＋１０％ＦＢＳ中で成長させた細胞で実施し、蛍光測定値を本培地からのバックグラウンド蛍光に対して補正した。前記グラフは、蛍光の発生に関する半減時間（ｈａｌｆ−ｔｉｍｅ）が約５時間であることを実証する。蛍光の発生の速度には、二量体化因子（ｄｉｍｅｒｉｓｅｒ）  ラパマイシンにより媒介されるＦＫＢＰおよびＦＲＢ間の相互作用に対する時間、加えてＥＹＦＰ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のアニーリングに対する時間、および首尾よくアニールしたＥＹＦＰタンパク質内のフルオロフォアの成熟に関して必要な（おそらく非常に長い）時間が含まれる。
【０２６１】
図１２は、異なるラパマイシン用量のＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６９＋ＰＳ１７７１］細胞株に対する応答曲線である。細胞を９６ウェルプレート中で培養し、様々なラパマイシン用量で１６時間処理し、次に固定し、ＥＹＦＰ蛍光／細胞（任意のユニット）をＡｓｃｅｎｔプレートリーダー上で決定する前にヘキストで染色した。値は、ＰＢＳバックグラウンドおよび細胞数に関して補正される。前記細胞株は、本実験に使用されたラパマイシン用量範囲に対して、ＥＹＦＰ強度／細胞が約３倍増加することを示している。
【０２６２】
応答のダイナミックレンジを増加させ、これらの細胞株からの固有の（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）ＥＹＦＰバックグラウンドシグナルを減少させる一様式は、ＥＹＦＰの輝き（ｂｒｉｇｈｔ）を放つ細胞の一部（ｆｒａｃｔｉｏｎ）をラパマイシン刺激前に除去することである。これは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法により容易に達成される。各々の細胞株は、この方法により３つの群に選別された：  （ｉ）最も緑色の群（ｉｉ）中等度から低度に緑色の群および（ｉｉｉ）黒色の群である。「最も緑色」は各ケースにおいて廃棄されたが、他の２群は更に使用するために培養された。図１３（ａ）および図１３（ｂ）は、ソーティング手順後の細胞株ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６７＋ＰＳ１７６８］の１００ｎＭラパマイシンに対する改善された応答を示す。
【０２６３】
図１４（ａ）および（ｂ）は、ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６７＋ＰＳ１７６８］親株に由来する、「中等度から低度の緑色」および「黒色」のＦＡＣＳ群（それぞれ）の応答を示す。ラパマイシンに対する用量反応を、各細胞株に関し７時間（ａ）および３０時間（ｂ）後に測定した。
【０２６４】
蛍光の値を、プレート＆培地のバックグラウンドに対して補正した。ＥＹＦＰ蛍光の増加は、各ケースで非刺激の値の２０倍を超えるものである。
【０２６５】
予想外なことに、前記細胞はこの期間なおも生存しているが、絶対的な蛍光シグナルは７および３０時間の間に有意に変化しないように思われる。さらにまた、各細胞株に関する７および３０時間での用量反応曲線は、非常に近接して類似しており、約０．２５μＭを「中等度から低度の緑色」群、および０．１μＭを「黒色」群におけるＥＣ５０として有するものである。このデータは、一度二量体化が生じると、ＥＹＦＰ相補性は３０時間以上細胞内で安定であることを示唆する。「中等度から低度の緑色」群は、より大きな全体の応答範囲を有しており、最大ラパマイシン濃度で黒色群よりも３倍高い強度に達する。両方のＦＡＣＳ群は、親（非ＦＡＣＳ’ｄ）株と比較して、有意に低いプレ刺激蛍光強度を有している  
【０２６６】
図１５（ａ）および（ｂ）は、ＦＫ５０６対１００ｎＭラパマイシンに関して、２つのＦＡＣＳ’ｄ株、ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６８＋ＰＳ１７６７］「中等度から低度の緑色」群（図１５（ａ））およびＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６９＋ＰＳ１７７１］「黒色」群（図１５（ｂ））における用量反応競合曲線を示す。双方のケースのＥＣ５０値は、約１．２μＭ  ＦＫ５０６である。細胞を一晩（１６時間）２つの化合物の混合物とインキュベーションし、次に固定し、Ａｓｃｅｎｔプレートリーダー上でＥＹＦＰ蛍光／細胞の決定前にヘキストで染色した。プレートおよび溶液のバックグラウンドが差し引かれ；各グラフ上の点線はこれらの実験における各細胞株に関する刺激前の蛍光レベルを示す。ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２およびＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３に対する融合体を使用する、ＧＦＰ相補性法を使用して、２つのタンパク質コンポーネント間の条件的な相互作用間に干渉する化合物を首尾よく選別し得ることを、これらの結果は指摘している。
【０２６７】
実施例１２：  ＰＳ１７３６、ＰＳ１７５８、ＰＳ１７０６、ＰＳ１８１０、ＰＳ１８０９、およびＰＳ１８２７の構築  
プラスミドＰＳ１７３６は、Ｆ６４Ｌ，ＮＹ１７２−ＮＺおよびＨ２Ｂがリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧＤＩＴＳＬＹＫＫＡＧＳＴ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号７４）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結された、融合体をコード化する。
【０２６８】
プラスミドＰＳ１７５８は、ベータカテニンとＣＺ−ＣＹ１７３とがリンカー配列ＤＰＡＦＬＹＫＶＶＩＳＧＳＧＳＧＳＧ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号６９）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結された、融合体をコード化する。
【０２６９】
プラスミドＰＳ１７０６は、Ｆ６４Ｌ、ＮＹ１７２（＝ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２）およびベータカテニンがリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧＤＩＴＳＬＹＫＫＡＧＳＴ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号７０）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結された、融合体をコード化する。  
プラスミドＰＳ１８１０はＨ２ＢおよびＴＣＦ４（１−７０）およびＣＹ１７３（ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）の融合体をコード化する、ここでＨ２ＢおよびＴＣＦ４（１−７０）はリンカー配列ＤＩＴＳＬＹＫＫＡＧＳＴ（配列番号７５）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結され、ここでＴＣＦ４（１−７０）およびＣＹ１７３（ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）はリンカー配列ＤＰＡＦＬＹＫＶＶＩＳＧＳＧＳＧ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号７１）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結される。
【０２７０】
プラスミドＰＳ１８０９はＦ６４Ｌ、ＮＹ１７２（ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２）およびＦＫＢＰおよびベータカテニンの融合体をコード化する、ここでＦ６４Ｌ、ＮＹ１７２（ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２）およびＦＫＢＰはリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧＤＬ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号７２）により連結され、ここでＦＫＢＰおよびベータカテニンはリンカー配列ＧＴＧＴＧＴＧＤＩＴＳＬＹＫＫＡＧＳＴ（配列番号７６）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結される。
【０２７１】
プラスミドＰＳ１８２７はＨ２ＢおよびＦＲＡＰのＦＫＢＰ結合部分（アミノ酸２０２５−２１１４）およびＣＹ１７３  （ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）の融合体をコード化する、ここでＨ２ＢおよびＦＲＡＰのＦＫＢＰ結合部分（アミノ酸２０２５−２１１４）はリンカー配列ＤＰＡＦＬＹＫＶＶＩＳＧＴＧＴＧＴＧ（１文字表記のアミノ酸コード、配列番号７３）であって、部分的にＧａｔｅｗａｙ組換え配列に由来するリンカー配列により連結され、ここでＦＲＡＰのＦＫＢＰ結合部分（アミノ酸２０２５−２１１４）およびＣＹ１７３（ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）はリンカー配列ＬＰＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号７７）により連結される。
【０２７２】
プラスミドＰＳ１７３６の構築  
【０２７３】
プラスミドＰＳ１７３６は、Ｆ６４Ｌ、ＮＹ１７２−ＮＺおよびＨ２Ｂが、リンカー配列により連結され、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、カナマイシンおよびネオマイシン抵抗性をそれぞれ大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化している。
【０２７４】
プラスミドＰＳ１７３６は、プラスミドＰＳ１６６７（エントリークローン）およびＰＳ１６９５（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１６９５はプラスミドＰＳ１６７３に由来した。プラスミドＰＳ１６７３は、上記のプラスミドＰＳ１６４１およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック）に由来した。プラスミドＰＳ１６７２は、上記のプラスミドＰＳ１６４１に由来した。
【０２７５】
中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）ＰＳ１６７３の構築  
【０２７６】
ＰＳ１６４１をプライマー２２１９および２３８７（表２）でのＰＣＲに供試し、ｃａ  ０．５ｋｂ  Ｎｈｅ１−ＢａｍＨ１断片をＮｈｅ１およびＢａｍＨ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック）へとライゲーションした。これによりＥＧＦＰがＦ６４Ｌ，ＥＹＦＰ（１−１７２）で置換され、これに続いてリンカー配列（これはフレーム内（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）のリンカー配列ＧＧＴＧＳＧ−ＮＺ−ＧＳＧＳＧＳＧをコード化している）およびユニークなＥｃｏＲＶ部位（ＢａｍＨ１のちょうど上流）が配置される。このプラスミドは、ＰＳ１６７３と称される。
【０２７７】
デスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）ＰＳ１６９５の構築  
【０２７８】
プラスミドＰＳ１６７３を、Ｇａｔｅｗａｙ適合性のデスティネーションベクターへと、前記ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断すること及びそれをＧａｔｅｗａｙカセット読み枠Ａとライゲーションすることにより変換した〔Ｇａｔｅｗａｙ製造者（インビトロゲン）の指示にしたがって〕。このデスティネーションベクターは、ＰＳ１６９５と称される。
【０２７９】
ＧａｔｅｗａｙエントリークローンＰＳ１６６７の構築  
【０２８０】
Ｈ２Ｂのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  ＮＭ＿００３５１８）を、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲおよびプライマー２３６７および２３６８（表２）を用いて分離した。ｃａ  ０．４ｋｂ産物を、ＢＰ反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０７へと転移させ（製造者（インビトロゲン）の推奨にしたがって）、エントリークローンＰＳ１６６７を産生した。
【０２８１】
最終的に、発現ベクターＰＳ１７３６を、Ｈ２ＢをエントリークローンＰＳ１６６７からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１６９５へと転移させることにより産生した（製造者にしたがって）。
【０２８２】
プラスミドＰＳ１７５８の構築  
【０２８３】
プラスミドＰＳ１７５８は、ベータカテニンとＣＺ−ＣＹ１７３とが、リンカー配列により連結され、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、ゼオシン抵抗性を大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化している。
【０２８４】
プラスミドＰＳ１７７１は、プラスミドＰＳ１７６２（エントリークローン）およびＰＳ１６９６（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１６９６はプラスミドＰＳ１７２６に由来した。プラスミドＰＳ１７２６は、上記のプラスミドＰＳ１６３８およびＰＳ６０９に由来した。
【０２８５】
中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）ＰＳ１７２６の構築  
【０２８６】
ＰＳ１６３８をプライマー２３８８および２１３２（表２）でのＰＣＲに供試し、ｃａ  ０．３５ｋｂ  Ｎｈｅ１−ＢａｍＨ１断片をＮｈｅ１およびＢａｍＨ１で消化したＰＳ６０９へとライゲーションした。これによりＥＧＦＰがＥＹＦＰ（１７３−２３８）で置換され、これに先行してリンカー配列（これはフレーム内（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）のリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧ−ｚｉｐをコード化している）およびユニークなＥｃｏＲＶ部位（Ｎｈｅ１のちょうど下流）が配置される。このプラスミドは、ＰＳ１７２６と称される。
【０２８７】
デスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）ＰＳ１６９６の構築  
【０２８８】
プラスミドＰＳ１７２６を、Ｇａｔｅｗａｙ適合性のデスティネーションベクターへと、前記ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断すること及びそれをＧａｔｅｗａｙカセット読み枠Ａとライゲーションすることにより変換した〔Ｇａｔｅｗａｙ製造者（インビトロゲン）の指示にしたがって〕。このデスティネーションベクターは、ＰＳ１６９６と称される。
【０２８９】
ＧａｔｅｗａｙエントリークローンＰＳ１７６２の構築  
【０２９０】
ベータカテニンのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  Ｘ８７８３８）を、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲおよびプライマー２３５９および２４３９（表２）を用いて分離した。ｃａ  ２．３ｋｂ産物を、ＢＰ反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０７へと転移させ（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）、エントリークローンＰＳ１７６２を産生した。
【０２９１】
最終的に、発現ベクターＰＳ１７５８を、ベータカテニンのコード配列をエントリークローンＰＳ１７６２からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１６９６へと転移させることにより産生した（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）。
【０２９２】
プラスミドＰＳ１７０６の構築  
【０２９３】
プラスミドＰＳ１７０６は、Ｆ６４Ｌ、ＮＹ１７２およびベータカテニンが、リンカー配列により連結され、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、カナマイシンおよびネオマイシン抵抗性をそれぞれ大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化している。
【０２９４】
プラスミドＰＳ１７０６は、プラスミドＰＳ１６６４（エントリークローン）およびＰＳ１６７９（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１６７９は上記に記載される。
【０２９５】
ＧａｔｅｗａｙエントリークローンＰＳ１６６４の構築  
【０２９６】
ベータカテニンのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  Ｘ８７８３８）を、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲおよびプライマー２３５９および２３６０（表２）を用いて分離した。ｃａ  ２．３ｋｂ産物を、ＢＰ反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０７へと転移させ（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）、エントリークローンＰＳ１６６４を産生した。
【０２９７】
最終的に、発現ベクターＰＳ１７０６を、ベータカテニンをエントリークローンＰＳ１６６４からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１６７９へと転移させることにより産生した（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）。
【０２９８】
プラスミドＰＳ１８１０の構築  
【０２９９】
プラスミドＰＳ１８１０は、Ｈ２Ｂ−ＴＣＦ４（１−７０）とＣＹ１７３とが、リンカー配列により連結され、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、ゼオシン抵抗性を大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化している。
【０３００】
プラスミドＰＳ１８１０は、プラスミドＰＳ１６６９（エントリークローン）およびＰＳ１８０６（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１８０６はプラスミドＰＳ１７９０に由来した。プラスミドＰＳ１７９０は、上記のプラスミドＰＳ１６７４に由来した。
【０３０１】
中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）ＰＳ１７９０の構築  
【０３０２】
Ｈ２Ｂのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  ＮＭ＿００３５１８）を、ヒトｃＤＮＡからプライマー２３８９および２３９０（表２）を用いて分離し、ｃａ  ０．４ｋｂ  Ｎｈｅ１−ＥｃｏＲＶ断片をＮｈｅ１およびＥｃｏＲＶで消化したＰＳ１６７４へとライゲーションした。これによりＥＹＦＰ（１７３−２３８）のＨ２Ｂ上流が置換され、これに先行してリンカー配列（これはフレーム内（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）のリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧ−ｚｉｐをコード化している）、並びにＨ２ＢおよびリンカーＥＹＦＰ（１７３−２３８）間のユニークなＥｃｏＲＶ部位が配置される。このプラスミドは、ＰＳ１７９０と称される。
【０３０３】
デスティネーションベクターＰＳ１８０６の構築  
【０３０４】
プラスミドＰＳ１７９０を、Ｇａｔｅｗａｙ適合性のデスティネーションベクターへと、前記ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断すること及びそれをＧａｔｅｗａｙカセット読み枠Ａとライゲーションすることにより変換した〔Ｇａｔｅｗａｙ製造者（インビトロゲン）の指示にしたがって〕。このデスティネーションベクターは、ＰＳ１８０６と称される。
【０３０５】
ＧａｔｅｗａｙエントリークローンＰＳ１６６９の構築  
【０３０６】
ＴＣＦ４のＮ末端７０アミノ酸のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  Ｙ１１３０６）を、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲおよびプライマー２３６４および２３６６（以下に記載される）を用いて分離した。ｃａ  ０．２５ｋｂ産物を、ＢＰ反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０７へと転移させ（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）、エントリークローンＰＳ１６６９を産生した。
【０３０７】
最終的に、発現ベクターＰＳ１８１０を、ＴＣＦ４（１−７０）のコード配列をエントリークローンＰＳ１６６９からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１８０６へと転移させることにより産生した（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）。
【０３０８】
プラスミドＰＳ１８０９の構築  
【０３０９】
プラスミドＰＳ１８０９は、Ｆ６４Ｌ、ＮＹ１７２およびＦＫＢＰ−ベータカテニンが、リンカー配列により連結され、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、カナマイシンおよびネオマイシン抵抗性をそれぞれ大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化している。
【０３１０】
プラスミドＰＳ１８０９は、上記のプラスミドＰＳ１６６４（エントリークローン）およびＰＳ１８０５（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１８０５はプラスミドＰＳ１７８９に由来した。プラスミドＰＳ１７８９は、上記のプラスミドＰＳ１６７２および上記のＰＳ１７６８に由来した。
【０３１１】
中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）ＰＳ１７８９の構築  
【０３１２】
ＰＳ１７６８をプライマー２４６２および２４６３でのＰＣＲに供試し、ｃａ  ０．３５ｋｂ断片をＰｖｕ２およびＢａｍＨ１で消化し、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨ１で消化したＰＳ１６７２にライゲーションした。これにより、Ｆ６４Ｌ、ＮＹ１７２およびＦＫＢＰがＧＳＧＳＧＳＧＤＬリンカーにより連結された融合体が産生され、これはＧＴＧＴＧＴＧリンカー配列（ＦＫＢＰの後ろに）およびユニークなＥｃｏＲＶ部位（ＧＴ３リンカーのちょうど下流）を有する。このプラスミドは、ＰＳ１７８９と称される。
【０３１３】
デスティネーションベクターＰＳ１８０５の構築  
【０３１４】
プラスミドＰＳ１７８９を、Ｇａｔｅｗａｙ適合性のデスティネーションベクターへと、前記ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断すること及びそれをＧａｔｅｗａｙカセット読み枠Ａとライゲーションすることにより変換した〔Ｇａｔｅｗａｙ製造者（インビトロゲン）の指示にしたがって〕。このデスティネーションベクターは、ＰＳ１８０５と称される。
【０３１５】
最終的に、発現ベクターＰＳ１８０９を、ベータカテニンをエントリークローンＰＳ１６６４からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１８０５へと転移させることにより産生した（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）。
【０３１６】
プラスミドＰＳ１８２７の構築  
プラスミドＰＳ１８２７は、Ｈ２ＢおよびＦＲＡＰのＦＫＢＰ結合部分（アミノ酸２０２５−２１１４）およびＣＹ１７３が、リンカー配列により連結され、ＣＭＶプロモーターのコントロール下に配置され、ゼオシン抵抗性を大腸菌および哺乳類細胞における選択可能なマーカーとして有している、融合体をコード化している。
【０３１７】
プラスミドＰＳ１８２７は、プラスミドＰＳ１７３２（エントリークローン）およびＰＳ１８２６（デスティネーションベクター）に由来した。プラスミドＰＳ１８２６はプラスミドＰＳ１７８８に由来した。プラスミドＰＳ１７８８は、上記のプラスミドＰＳ１６７４およびＰＳ１７６７に由来した。
【０３１８】
中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）ＰＳ１７８８の構築  
【０３１９】
ＰＳ１７６７をプライマー２４６４および２４６５でのＰＣＲに供試し、ｃａ  ０．３５ｋｂ産物をＮｈｅ１−Ｓｍａ１で消化し、Ｎｈｅ１およびＥｃｏＲＶで消化したＰＳ１６７４にライゲーションした。
【０３２０】
これによりＦＲＡＰ（２０２５−２１１４）とＥＹＦＰ（１７３−２３８）とがリンカー配列（ＧＳＧＳＧＳＧ）で連結された融合体が産生され、これはＧＴＧＴＧＴＧリンカー配列（ＦＲＡＰの前に）およびユニークなＥｃｏＲＶ部位（ＧＴＧＴＧＴＧリンカーのちょうど上流）を有している。このプラスミドは、ＰＳ１７８８と称される。
【０３２１】
デスティネーションベクターＰＳ１８２６の構築  
【０３２２】
プラスミドＰＳ１７８８を、Ｇａｔｅｗａｙ適合性のデスティネーションベクターへと、前記ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断すること及びそれをＧａｔｅｗａｙカセット読み枠Ａとライゲーションすることにより変換した〔Ｇａｔｅｗａｙ製造者（インビトロゲン）の指示にしたがって〕。このデスティネーションベクターは、ＰＳ１８２６と称される。
【０３２３】
ＧａｔｅｗａｙエントリークローンＰＳ１７３２の構築  
【０３２４】
Ｈ２Ｂのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ  ｎｏ  ＮＭ＿００３５１８）を、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲおよびプライマー２３６７および２４０７（表２）を用いて分離した。ｃａ  ０．４ｋｂ産物を、ＢＰ反応によりドナーベクターｐＤＯＮＲ２０７へと転移させ（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）、エントリークローンＰＳ１７３２を産生した。
【０３２５】
最終的に、発現ベクターＰＳ１８２７を、Ｈ２ＢをエントリークローンＰＳ１７３２からＬＲ反応によりデスティネーションベクターＰＳ１８２６へと転移させることにより産生した（製造者の推奨（インビトロゲン）にしたがって）。
【０３２６】
実施例１３：  標的タンパク質のペアの１つ若しくは両方のメンバーのトランスロケーション行動及び／又はそれらのタンパク質間の相互作用、を修飾する化合物に関して生細胞内でスクリーニングするためのアッセイ。
【０３２７】
本実施例はＧＦＰ相補性方法を用いたタンパク質トランスロケーションアッセイの構築を示し、これにより標的タンパク質のペアの１つ若しくは両方のメンバーのトランスロケーション行動を及び／又はそれらのタンパク質間の相互作用を修飾する化合物に関する、生細胞内でのスクリーニングにおける、前記方法の有用性が実証される（トランスロケーションおよび相互作用依存的な相補性、ＴＩＤＣ）。
【０３２８】
本実施例は次のことを実証する、即ち、ＧＦＰ相補性システムをデザインして、生細胞内での１つのタンパク質とパートナータンパク質との間の相互作用の程度をレポートできることである、具体的には、係る相互作用を１つ若しくは両方のタンパク質のトランスロケーション（両方のコンポーネントを前記細胞内の１つの区画もしくは位置に近接させる）が発生した後にのみ生じさせることが可能である。蛍光シグナルが取得され、これはパートナータンパク質間で生じた相互作用の程度に対応し、これは通常は適切なトランスロケーションを誘導する刺激の後に続く。係るアッセイシステムを使用して、関与するトランスロケーションプロセスまたは相補性プローブの構築に使用された標的タンパク質間の相互作用、のうち何れかを修飾する化合物もしくは処理に関して選別することが可能である。
【０３２９】
βカテニンは、多機能性のタンパク質であり、ある種のヒトの癌（最も著しいのは大腸の癌）の発生および進行に重要な役割を担っている。非分裂性の結腸の上皮細胞において、βカテニンは、形質膜で細胞接着分子との複合体中に認められ、また、その標的とする破壊（細胞のユビキチン結合システムによる）を共にコントロールする、いくつかのタンパク質（Ａｘｉｎ、大腸腺腫様ポリポーシス  タンパク質、またはＡＰＣ、およびプロテインキナーゼＧＳＫ３β）との複合体中にも認められる。また、βカテニンは転写のアクチベーターとして機能する。その機能に関して、βカテニンが、核にトランスロケーションし、他のプロ転写性の（ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ）コファクター（大腸細胞において、最も顕著なものはＴＣＦ４である）と二量体を形成することが必要である。非分裂細胞におけるβカテニンのレベルは、ユビキチン結合および引き続くプロテオソームによる破壊により低く維持されている、また、若干のβカテニンが核で発見されるか又は発見されないので、若干のβカテニン誘導性の遺伝子転写が生じているか又は生じていない。癌性の及び特定の前癌性の大腸上皮細胞において、βカテニン自身における又はその調節性のタンパク質の１つにおける変異により、前記タンパク質の細胞質における蓄積が誘導され、引き続く核へのトランスロケーションおよびβカテニン：ＴＣＦ４因子によりコントロールされる遺伝子の構成的な活性化が付随して発生する。係る細胞における癌性の表現型（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を誘導するものは、これらの遺伝子の連続的な発現である。
【０３３０】
本実施例において、ＧＦＰの相補性半分は、βカテニンと及びヒストンＨ２Ｂを転写コアクチベータ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）ＴＣＦ４のβカテニン結合断片に連結したものと、別々に融合される。両方の構築物を、次に哺乳類細胞内に共形質移入し、発現させる。βカテニン構築物は、細胞の細胞質内の全体に低いレベルで局在化されることが予期され、その濃度はプロテインキナーゼＧＳＫ３βの活性化により効果的にコントロールされる。Ｈ２Ｂ−ＴＣＦ４構築物は、高度に塩基性のヒストン部分により、細胞の核に局在する。それ故、２つのコンポーネントは、通常の成長条件下で互いに出会わないはずである。しかしながら、ＧＳＫ３βがリチウムイオンにより阻害される場合、βカテニン構築物の細胞質レベルが、細胞質において増加し、核に有意な様式（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｆａｓｈｉｏｎ）でトランスロケーションすることが予期される。前記構築物がβカテニンのトランスロケーションの結果として核で共に混合される場合、２つのタンパク質間（βカテニンおよびＴＣＦ４）の自然な相互作用は、相補的なＧＦＰ半分を近い位置関係に近接させ、それに際してアニーリングプロセスが開始されるはずであり、これにより最終的に完全に蛍光な（ｆｕｌｌｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）ＧＦＰ分子の発生が誘導される。リチウム処理された細胞における核の蛍光の発生により、βカテニンの核へのトランスロケーションおよびβカテニンとＴＣＦ４のβカテニン結合ドメインとの間の引き続く相互作用が統合された結果が効果的にレポートされる。
【０３３１】
以下の融合構築物を作出した（実施例１２を参照されたい）：  
ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−βカテニン＝プラスミドコードｐｓ１７０６  
Ｈ２Ｂ−ＴＣＦ４（ｆｒａｇ）−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３＝ｐｓ１８１０  
プラスミドｐｓ１７０６とｐｓ１８１０を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に、形質移入薬剤  ＦｕＧＥＮＥＴＭ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ，  ＵＳＡ）を用いて共形質移入した（供給者が推奨する方法にしたがって）。細胞を成長培地（ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物に、Ｇｌｕｔａｍａｘ−１、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００μｇ  ペニシリン−ストレプトマイシン混合物  ｍｌ−１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより供給された，  デンマーク）を有する）中で培養した。形質移入した細胞を本培地に、使用しているプラスミドに適切な２つの選択薬（１ｍｇ／ｍｌゼオシン  プラス  ０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８硫酸塩）を付加した培地で培養した。細胞を３７℃で１００％湿度、および通常の大気に５％ＣＯ２を補充した条件で培養した。
【０３３２】
選択薬の継続的な存在下で１０から１２日培養した後、生じた細胞株が安定的に形質移入されたかについて判断した。  
蛍光顕微鏡に関して、細胞のアリクウォット（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を、Ｌａｂ−Ｔｅｋチェンバード（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）カバーグラス（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ  ＵＳＡ）に移し、少なくとも２４時間約８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達するまで付着させておいた。イメージを、ツァイスＬＳＭ４１０倒立共焦点蛍光顕微鏡（ツァイス，  Ｊｅｎａ，  ドイツ）にｘ４０（油浸）対物レンズを用いたものを用いて収集した。４８８ｎｍレーザーライトをＧＦＰの励起に使用し、放射はＦＴ５１０二色性および５１０−５２５ｎｍバンドパスフィルターを介してフィルタ処理された。
【０３３３】
処理後（しかし、顕微鏡観察前に）、細胞を規定通りに４％ホルムアルデヒドをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に含むもので１０分間固定し、次にＰＢＳを用いた３回の洗浄工程を実施した。
【０３３４】
図１８（Ａ）は、安定なＣＨＯ［ｐｓ１７０６＋ｐｓ１８１０］における、前記細胞に何らかの処理を施す前の蛍光のレベルを示す。蛍光のレベルは、多くの細胞において非常に弱く、これはフラボノイド（例えば、ＦＡＤ）からの細胞の自己蛍光に完全に依存したものであろう（使用された励起フィルターは、ＦＡＤ自己蛍光の一部を一般的に通過させる）。ときおり細胞（Ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ）（図１８（Ａ）の上部右隅）は、弱いＧＦＰ蛍光を核および細胞質の区画において示し、これは明らかに自発性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）の相補性の結果である。これらの細胞の多くはクラスターを形成しており、おそらくこれは発現（又はおそらく細胞分裂）の間に相補性が起こりえる同じ区画へと彼らが近接するような、導入したコンポーネントの不正確なプロセッシングをもたらすだろうクローンの行動（ｃｌｏｎａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）を指摘するものである。しかしながら、１６時間、５ｍＭ  ＬｉＣｌで処理した場合、蛍光ＧＦＰを含有している細胞の数は非常に増大し、それらの多くはもっぱらそれらの核に限定されたＧＦＰ蛍光を有しており、この結果はこのペアの融合構築物から予期されたＧＦＰ相補性の分布と矛盾のないものだった（図１８（Ｂ））。
【０３３５】
これらの結果は次のことを指摘する、即ち、分離した細胞の区画または位置に通常存在するタンパク質コンポーネントのＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２およびＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３に対する融合体を使用する、ＧＦＰ相補性方法を使用して、それらのコンポーネント間のタンパク質間相互作用（これは双方のコンポーネントを１区画内または１共有位置に近接させるトランスロケーションプロセスの結果である）をモニターできる。この原理に基づいた、単純な強度またはイメージに準拠した（ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ）蛍光アッセイを使用して、特定の細胞コンポーネントに関連のあるトランスロケーションプロセスまたは係るタンパク質コンポーネント間の相互作用（生きた哺乳類細胞内での）の何れかに影響する、化合物を選別し得る。関与するトランスロケーションプロセスのみをレポートするためにデザインされた、類似するアッセイと組み合わせた使用により（例えば、実施例１４または実施例１６に記載されたものと類似するアッセイ）、任意の化合物が特異的にトランスロケーションを又は相互作用を標的とするかどうかを明らかにする（ｄｅｆｉｎｅ）ことが可能である。
【０３３６】
実施例１４：  ＧＦＰ相補性を用いたタンパク質トランスロケーションアッセイ  
本方法は、化合物（該化合物は標的タンパク質のトランスロケーション行動を修飾する化合物である）の生細胞内でのスクリーニングにおける、前記方法の有用性を実証するものである（トランスロケーション依存的な相補性、ＴＤＣｚｉｐ）。
【０３３７】
本実施例は、ＧＦＰ相補性システムをデザインして、生細胞内での標的蛋白質のトランスロケーション行動をレポートできることを実証する。蛍光シグナルが取得され、これは生じたトランスロケーションの程度に直接的に対応する。係るアッセイシステムを使用して、標的タンパク質のトランスロケーション行動を修飾する化合物もしくは処理に関して選別することが可能である。
【０３３８】
βカテニンは、多機能性のタンパク質であり、ある種のヒトの癌（最も著しいのは大腸の癌）の発生および進行に重要な役割を担っている。非分裂性の結腸の上皮細胞において、βカテニンは、形質膜で細胞接着分子との複合体中に認められ、また、その標的とする破壊（細胞のユビキチン結合システムによる）を共にコントロールする、いくつかのタンパク質（Ａｘｉｎ、大腸腺腫様ポリポーシス  タンパク質、またはＡＰＣ、およびプロテインキナーゼＧＳＫ３β）との複合体中にも認められる。また、βカテニンは転写のアクチベーターとして機能する。その機能に関して、βカテニンが、核にトランスロケーションし、他のプロ転写性の（ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ）コファクター（大腸細胞において、最も顕著なものはＴＣＦ４である）と二量体を形成することが必要である。非分裂細胞におけるβカテニンのレベルは、ユビキチン結合および引き続くプロテオソームによる破壊により低く維持されている、また、若干のβカテニンが核で発見されるか又は発見されないので、若干のβカテニン誘導性の遺伝子転写が生じているか又は生じていない。癌性の及び特定の前癌性の大腸上皮細胞において、βカテニン自身における又はその調節性のタンパク質の１つにおける変異により、前記タンパク質の細胞質における蓄積が誘導され、引き続く核へのトランスロケーションおよびβカテニン：ＴＣＦ４因子によりコントロールされる遺伝子の構成的な活性化が付随して発生する。係る細胞における癌性の表現型を誘導するものは、これらの遺伝子の連続的な発現である。
【０３３９】
本実施例において、ＧＦＰの相補性半分は、βカテニンと及びヒストンＨ２Ｂと別々に融合され、細胞内で共発現される。βカテニン構築物は、細胞の細胞質内の全体に低いレベルで局在化されることが予期され、その濃度はプロテインキナーゼＧＳＫ３βの活性化により効果的にコントロールされる。Ｈ２Ｂ構築物は、高度に塩基性のヒストン部分により、細胞の核に局在する。それ故、２つのコンポーネントは、通常の成長条件下で互いに出会わないはずである。しかしながら、ＧＳＫ３βがリチウムイオンにより阻害される場合、βカテニン構築物の細胞質のレベルが、細胞質において増加し、核に有意な様式（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｆａｓｈｉｏｎ）でトランスロケーションすることが予期される。両方の構築物を設計して、ロイシンジッパードメインを含有させた。前記構築物がβカテニンのトランスロケーションの結果として核で共に混合される場合、ロイシンジッパーは、二量体化して相補的なＧＦＰ半分を近い位置関係に近接させ、それに際してアニーリングプロセスが開始され、これにより最終的に完全に蛍光な（ｆｕｌｌｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）ＧＦＰ分子の発生が誘導される。リチウム処理された細胞における核の蛍光の発生により、βカテニンの核へのトランスロケーションが効果的にレポートされる  
【０３４０】
以下の融合構築物を作出した（実施例１２を参照されたい）：  
ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−Ｚｉｐ−Ｈ２Ｂ＝プラスミドコードｐｓ１７３６  
βカテニン−Ｚｉｐ−ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２＝ｐｓ１７５８  
【０３４１】
プラスミドｐｓ１７３６とｐｓ１７５８を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に、形質移入薬剤  ＦｕＧＥＮＥＴＭ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ，  ＵＳＡ）を用いて共形質移入した（供給者が推奨する方法にしたがって）。細胞を成長培地（ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物に、Ｇｌｕｔａｍａｘ−１、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００μｇ  ペニシリン−ストレプトマイシン混合物  ｍｌ−１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより供給された，  デンマーク）を有する）中で培養した。形質移入した細胞を本培地に、使用しているプラスミドに適切な２つの選択薬（１ｍｇ／ｍｌゼオシン  プラス  ０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８硫酸塩）を付加した培地で培養した。細胞を３７℃で１００％湿度、および通常の大気に５％ＣＯ２を補充した条件で培養した。
【０３４２】
選択薬の継続的な存在下で１０から１２日培養した後、生じた細胞株が安定的に形質移入されたかについて判断した。蛍光顕微鏡に関して、細胞のアリクウォット（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を、Ｌａｂ−Ｔｅｋチェンバード（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）カバーグラス（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ  ＵＳＡ）に移し、少なくとも２４時間約８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達するまで付着させておいた。イメージは、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ３００倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）、ｘ２０（ドライ）および／またはｘ４０（油浸）対物レンズを用いて規定通りに収集され、そしてＯｒｃａ  ＥＲチャージド（ｃｈａｒｇｅｄ）連結装置（ＣＣＤ）カメラ（Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｋ．Ｋ．，  Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｃｉｔｙ，  Ｊａｐａｎ）へと連結された。細胞を１００Ｗ  ＨＢＯアークランプで照らした、この際に４７０±２０ｎｍ励起フィルター、５１０ｎｍ二色性ミラーおよび５１５±１５ｎｍ放射フィルターを介した（最小のイメージバックグラウンドに関して）。イメージ収集、引き続く蛍光強度の測定および分析は、全て特定のソフトウェア（ＩＰＬａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ，  Ｆａｉｒｆａｘ，  ＶＡ  ＵＳＡ）によりコントロールされた。
【０３４３】
処理後、細胞を規定通りに４％ホルムアルデヒドをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に含むもので１０分間固定し、次にＰＢＳを用いた３回の洗浄工程を実施した。
【０３４４】
図１９（Ａ）は、安定なＣＨＯ［ｐｓ１７３６＋ｐｓ１７５８］における、前記細胞に何らかの処理を施す前の蛍光のレベルを示す。蛍光のレベルは、非常に弱く、これはフラボノイド（例えば、ＦＡＤ）からの細胞の自己蛍光に完全に依存したものであろう（使用された励起フィルターは、ＦＡＤ自己蛍光の一部を一般的に通過させる）。また、この蛍光の分布は、ＦＡＤ自己蛍光と一致するものであり、それは主に細胞質に存在しており、どちらかといえば点状に現れる。１６時間、５ｍＭ  ＬｉＣｌで処理した場合、これらの細胞はＧＦＰで輝く核を呈し、この結果はこのペアの融合構築物から予期されたＧＦＰ相補性の分布と矛盾のないものだった（図１９（Ｂ））  
【０３４５】
これらの結果は次のことを指摘する、即ち、分離した細胞の区画または位置に通常存在するタンパク質コンポーネントのＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２およびＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３に対する融合体を使用する、ＧＦＰ相補性方法を使用して、双方のコンポーネントが１区画内（ｗｉｔｈｉｎ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）または１共有位置（ａｔ  ｏｎｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）に近接する結果を生じるような、トランスロケーションプロセスをモニターできる。この原理に基づいた、単純な強度またはイメージに準拠した（ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ）蛍光アッセイを使用して、特定の細胞コンポーネントに関連のあるトランスロケーションプロセス（生きた哺乳類細胞内での）に影響する、化合物を選別し得る。
【０３４６】
実施例１５：  誘導性のＦＲＢＰ１２：ＦＲＢ相互作用の開発  
実施例１４で説明したとおり、いくつかのアッセイはシンク効果を経験し、即ち：任意の自然にトランスロケーションするタンパク質の自然のシャットリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）により、アンカーされたジッパー構築物が結合パートナーのコンスタントな供給へと暴露され、これにより不可逆的な結合および早発性のフルオロフォア形成が生じる、との問題が考えられる。同じ問題にＴＩＤＣシステムにおいても直面する可能性がある、このシステムは構成的な自然の相互作用（β−カテニンおよびＴＣＦ−４間の相互作用に類似する）に依存する（実施例１４）。
【０３４７】
ＦＫＢＰ１２：ＦＲＢシステムは、例えば、トランスロケーションするタンパク質の核画分（相補性パートナーＡに融合されている）を、アンカータンパク質（相補性パートナーＢに融合されている）に、任意の特定時間に相互作用させる簡便な手段である。
【０３４８】
最も適切であると思われる融合体は、ＦＫＢＰ１２：ラパマイシン：ＦＲＢ（図１７）の共結晶構造に基づいたものであり、これは両方の分割したＥＹＦＰ  Ｆ６４Ｌ断片をＦＫＢＰ１２およびＦＲＢのＣ末端に融合したものであり、なぜならそれらは互いに近接しているからである。しかしながら、我々はＮ末端分割断片を融合パートナーおよびｖｉｓａ  ｖｅｒｓａと融合することを一般的に好むので、この方向性を実施例１６で選択した。これは部分的に我々の経験に基づいており、末端間の少なくとも４０Åの距離は相補性を限定（ｌｉｍｉｔ）しない（ＧＦＰは約４０Åの長さである）。ＦＫＢＰ１２およびＦＲＢを用いる場合、１０〜１５残基のリンカーがＦＫＢＰ１２およびＦＲＢの両側に必要である。リンカー長は、残基ごとに１．５Å（αヘリックス）および３．５Å（βシート）の間である（図１７を参照されたい）。
【０３４９】
実施例１６：  誘導可能な相互作用パートナーでのタンパク質トランスロケーションアッセイ  
本実施例は誘導性のＧＦＰ相補性方法を用いたタンパク質トランスロケーションアッセイの構築を示し、これにより標的タンパク質のトランスロケーション行動を修飾する化合物に関する、生細胞内でのスクリーニングにおける、前記方法の有用性が実証される（ラパマイシンによるトランスロケーション依存的な相補性、ＴＩＤＣ）。
【０３５０】
本実施例は、誘導性のＧＦＰ相補性システムをデザインして、生細胞内での標的蛋白質のトランスロケーション行動を、改善されたシグナル・バックグラウンド比（ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｒａｔｉｏ）でレポートできることを実証する。トランスロケーションプロセスの誘導に続いて、相補性を相互作用するタンパク質を近接させることにより刺激し、蛍光シグナル（これは発生したトランスロケーションの程度に直接的に対応する）を取得する。係るアッセイシステムを使用して、標的タンパク質のトランスロケーション行動を修飾する、化合物もしくは処理に関して選別することが可能である。
【０３５１】
付加的なリンカー配列を各々に付加した。なぜならば我々はもはや関連する緊密に相互作用するジッパーペプチドを有していないからである。Ｇａｔｅｗａｙ組換え配列は約１０残基であり、これは挿入された融合タンパク質とＦＫＢＰ１２／ＦＲＢとの間に十分なはずである。分割する断片に対する連結部（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）は、１２〜２０残基であるべきである。
【０３５２】
βカテニンは、多機能性のタンパク質であり、ある種のヒトの癌（最も著しいのは大腸の癌）の発生および進行に重要な役割を担っている。非分裂性の結腸の上皮細胞において、βカテニンは、形質膜で細胞接着分子との複合体中に認められ、また、その標的とする破壊（細胞のユビキチン結合システムによる）を共にコントロールする、いくつかのタンパク質（Ａｘｉｎ、大腸腺腫様ポリポーシス  タンパク質、またはＡＰＣ、およびプロテインキナーゼＧＳＫ３β）との複合体中にも認められる。また、βカテニンは転写のアクチベーターとして機能する。その機能に関して、βカテニンが、核にトランスロケーションし、他のプロ転写性の（ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ）コファクター（大腸細胞において、最も顕著なものはＴＣＦ４である）と二量体を形成することが必要である。非分裂細胞におけるβカテニンのレベルは、ユビキチン結合および引き続くプロテオソームによる破壊により低く維持されている、また、若干のβカテニンが核で発見されるか又は発見されないので、若干のβカテニン誘導性の遺伝子転写が生じているか又は生じていない。癌性の及び特定の前癌性の大腸上皮細胞において、βカテニン自身における又はその調節性のタンパク質の１つにおける変異により、前記タンパク質の細胞質における蓄積が誘導され、引き続く核へのトランスロケーションおよびβカテニン：ＴＣＦ４因子によりコントロールされた遺伝子の構成的な活性化が付随して発生する。係る細胞における癌性の表現型を誘導するものは、これらの遺伝子の連続的な発現である。
【０３５３】
本実施例において、ＧＦＰの相補性半分は、βカテニンと及びヒストンＨ２Ｂと別々に融合され、細胞内で共発現される。βカテニン構築物は、細胞の細胞質内の全体に低いレベルで局在化されることが予期され、その濃度はプロテインキナーゼＧＳＫ３βの活性化により効果的にコントロールされる。Ｈ２Ｂ構築物は、高度に塩基性のヒストン部分により、細胞の核に局在する。それ故、２つのコンポーネントは、通常の成長条件下で互いに出会わないはずである。しかしながら、ＧＳＫ３βがリチウムイオンにより阻害される場合、βカテニン構築物の細胞質レベルが、細胞質において増加し、核に有意な様式（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｆａｓｈｉｏｎ）でトランスロケーションすることが予期される。両方の構築物を設計して、誘導可能な相互作用ドメインを含有させた。βカテニン構築物は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含む。Ｈ２Ｂ構築物はＦＲＢ（これはＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である）、大きいＰｌ３キナーゼホモログＦＲＡＰ（ｍＴＯＲまたはＲＡＦＴとしても知られる）を含む。免疫抑制化合物  ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび同時にＦＲＢと結合し、これら２つのタンパク質に対するヘテロ二量体化因子（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｓｅｒ）として作用する。ＧＦＰの分離された半分（これら２つの構築物に含まれる）の間の相補性反応をラパマイシンの添加により誘導できる、しかし、タンパク質構築物が同じ細胞位置で互いに出会うことが可能な場合に限る。ＦＫＢＰおよびＦＲＢはラパマイシンの非存在下では相互作用しないので、「シンク効果」は大きく減少または排除される。
【０３５４】
前記構築物がβカテニンのトランスロケーションの結果として核で共に混合される場合、ラパマイシンの添加により、相補的なＧＦＰ半分を近い位置関係に誘導性のＦＫＢＰ：ＦＲＢ相互作用を介して近接させ、それに際してアニーリングプロセスが開始されるはずであり、これにより最終的に完全に蛍光な（ｆｕｌｌｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）ＧＦＰ分子の発生が誘導される。本実施例において、核のＧＦＰ蛍光の発生（相補性の後に生じる）は、ラパマイシンにより誘導され、結果的にラパマイシン付加時のβカテニン構築物の核へのトランスロケーションの程度がレポートされる。
【０３５５】
以下の融合構築物を作出した（実施例１２を参照されたい）：  
ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−ＦＫＢＰ−βカテニン＝プラスミドコードｐｓ１８０９  
Ｈ２Ｂ−ＦＲＡＰ（２０２４−２１１４）−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３＝ｐｓ１８２７  
【０３５６】
プラスミドｐｓ１８０９とｐｓ１８２７を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に、形質移入薬剤  ＦｕＧＥＮＥＴＭ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ，  ＵＳＡ）を用いて共形質移入した（供給者が推奨する方法にしたがって）。細胞を成長培地（ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物に、Ｇｌｕｔａｍａｘ−１、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００μｇ  ペニシリン−ストレプトマイシン混合物  ｍｌ−１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより供給された，  デンマーク）を有する）中で培養した。形質移入した細胞を、本培地に、使用しているプラスミドに適切な２つの選択薬（１ｍｇ／ｍｌゼオシン  プラス  ０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８硫酸塩）を付加した培地で培養した。細胞を３７℃で１００％湿度、および通常の大気に５％ＣＯ２を補充した条件で培養した。
【０３５７】
選択薬の継続的な存在下で１０から１２日培養した後、生じた細胞株を安定的に形質移入されたかについて判断した。蛍光顕微鏡に関して、細胞のアリクウォット（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を、Ｌａｂ−Ｔｅｋチェンバード（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）カバーグラス（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ  ＵＳＡ）に移し、少なくとも２４時間約８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達するまで付着させておいた。全ての処理を完全なハム培地（ｆｕｌｌ  ＨＡＭ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）＋１０％ＦＢＳにおいて実施した。
【０３５８】
イメージを、ツァイスＬＳＭ４１０倒立共焦点蛍光顕微鏡（ツァイス，  Ｊｅｎａ，  ドイツ）にｘ４０（油浸）対物レンズを用いたものを用いて収集した。４８８ｎｍレーザーライトをＧＦＰの励起に使用し、放射（ｅｍｉｓｓｉｏｎｓ）はＦＴ５１０二色性および５１０〜５２５ｎｍバンドパスフィルターを介してフィルタ処理された。
【０３５９】
処理後（しかし、顕微鏡観察前に）、細胞を規定通りに４％ホルムアルデヒドをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に含むもので１０分間固定し、次にＰＢＳを用いた３回の洗浄工程を実施した。
【０３６０】
図２０は、ＣＨＯ細胞（ｐｓ１８０９とｐｓ１８２７を発現する）のモンタージュ（ｍｏｎｔａｇｅ）を示し、これは４つの別々の処理からイメージされたものである。最上部横列（ｔｏｐ  ｒｏｗ）（図２０ａ−ｄ）は、ＧＦＰ蛍光のイメージである。ＧＦＰはこれらの細胞の核のみに局在する。このことは下部横列（ｌｏｗｅｒ  ｒｏｗ）のイメージ（図２０ｅ−ｈ）において実証されているとおりであり、ここでは通過した光イメージを、それに対応するＧＦＰ蛍光でオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙｅｄ）している。図２０ｃ＆ｄにおいて、Ｌａｂ−Ｔｅｋチェンバード（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）カバーグラスへと移動させた直後、細胞を１６時間、５ｍＭリチウムクロライドで処理することにより、キナーゼＧＳＫ３が阻害される；図２０ａ＆ｂにおける細胞は、この期間にリチウムを受け取っていなかった。図２０ｂ＆ｄの細胞は、次に３μＭラパマイシン（エタノール貯蔵物中のエタノール終濃度は０．６％ｖ／ｖであった）で処理されたが、一方で図２０ａ＆ｃの細胞は０．６％エタノールのみで処理された。両方の処理を更に６時間継続した（細胞を固定し、イメージする前）。
【０３６１】
リチウム処理なしの場合（図２０ａ＆ｂ）、蛍光のレベルは多くの細胞において非常に弱く、これはフラボノイド（例えば、ＦＡＤ）からの細胞の自己蛍光に完全に依存したものであろう（使用された励起フィルターは、ＦＡＤ自己蛍光の一部を一般的に通過させる）。
【０３６２】
ときおり細胞（Ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ）は、弱いＧＦＰ蛍光を核において示し、これは明らかに、細胞分裂時の核膜崩壊に伴うであろう、自発性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）の相補性の結果である。１６時間、５ｍＭ  ＬｉＣｌで処理した場合、蛍光ＧＦＰを含有している細胞の数は非常に増大し、それらの多くはもっぱらそれらの核に限定されたＧＦＰ蛍光を有しており、この結果はこのペアの融合構築物から予期されたＧＦＰ相補性の分布と矛盾のないものだった（図２０ｃ＆ｄ）。Ｌｉ処理された細胞における核の蛍光のレベルは、ラパマイシン処理（図２０ｄ）で実質的に増加する、また二量体化因子は、各々の応答する細胞において、輝く核（ｂｒｉｇｈｔ  ｎｕｃｌｅｉ）を有する細胞数およびＧＦＰの平均強度の双方を増加させる。
【０３６３】
スクリーニングの状況において、本実施例は無処置細胞において（ａ）自発性の相補性は発生しない（図１９（Ａ）と比較）ことを示しており、このことにより「シンク」効果が回避される。
【０３６４】
これらの結果は次の事項を指摘する、即ち、ＧＦＰ相補性方法を構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒｅｄ）することにより、タンパク質コンポーネントのトランスロケーションを生細胞内でモニターすることが可能であること、および前記方法の効率（シグナル・バックグラウンド比により測定されるような）を誘導性のタンパク質間相互作用の連関（例えば、ラパマイシンの存在下においてＦＫＢＰ：ＦＲＢにより提供される）を包含させることにより有意に改善することが可能であること。このようなシステムの構成を使用して、高いスループットの、強度に基づく蛍光アッセイを構築し、細胞コンポーネントのトランスロケーションを調節するよう作用する化合物（または他の作用（ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ））を同定することが可能であろう。
【０３６５】
表  
【０３６６】
表２  クローニングに使用されたオリゴヌクレオチド。Ｐ＊で始まるオリゴヌクレオチドは、ライゲーションを許容するために５’端がリン酸化される。
【表２−１】
2005527210.tif 000013
【表２−２】
2005527210.tif 000014
【０３６７】
表３  ＥＧＦＰ断片増幅に使用されたプライマーペア
【表３】
2005527210.tif 000015
【０３６８】
表４  クローニングおよび発現ベクター
【表４】
2005527210.tif 000016
【０３６９】
表５  配列の名称および番号
【表５】
2005527210.tif 000017
【０３７０】
本出願中で参照された、全ての引用特許、文献、同時係属出願（ｃｏｐｅｎｄｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、および仮出願（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）は、参照によって本明細書中に援用される。
【０３７１】
記載された本発明が、多くの様式に変化し得ることは明白である。このような変化は、本発明の意図（ｓｐｉｒｉｔ）および範囲（ｓｃｏｐｅ）から逸脱するものとは認識されない。また、当業者には自明であろう全てのこのような修正は、本願に添付した特許請求の範囲の請求項の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３７２】
【図１】融合タンパク質コード配列の一般的な構造。
【図２】ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺおよびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ発現ベクターで共形質移入されるか又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１で形質移入された、蛍光ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞の１６ビットのイメージ。該イメージが個々に取得され、測定（ｓｃａｌｅｄ）されて、細胞及びその中の蛍光分布が可視化される。ピクセル強度スケーリング（ｐｉｘｅｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｓｃａｌｉｎｇ）のため、相対的な蛍光レベルはイメージ間で比較できない。分割部位は、残基１５７／１５８間（最上部横列、プラスミドＰＳ１５５７およびＰＳ１５５９）または残基１７２／１７３間（中央横列、プラスミドＰＳ１５５８およびＰＳ１５６０）の何れかに存在する。ＥＧＦＰ発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１を、最下部横列（ｂｏｔｔｏｍ  ｒｏｗ）の細胞に形質移入した。イメージを、形質移入後の１日目（左の縦列（ｃｏｌｕｍｎ））、２日目（中央の縦列）、または１０日目（右の縦列）に取得した。細胞のイメージは、機能的に相補する断片を発現する細胞の代表的なものである。
【図３】ＮｔｅｒｍＥＧＦＰ−ＮＺおよびＣＺ−ＣｔｅｒｍＥＧＦＰ発現ベクターで共形質移入されるか又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１で形質移入された、蛍光ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞の１６ビットのイメージ。該イメージは図２で示したものと同様であるが、図３では蛍光強度の比較を可能にするため、同じ強度スケーリングで示される。残基１７２および１７３間の分割に基づく相補性構築物で形質移入した細胞（中央横列）は、残基１５７および１５８間の分割に基づく相補性構築物で形質移入した細胞（最上部横列）よりも明らかにより蛍光が強い。しかしながら、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１構築物（最下部横列）で形質移入された細胞は、有意により強い蛍光を２日目に呈する。
【図４】図３で示された未操作の顕微鏡イメージをＩｍａｇｅＪソフトウェアパッケージを用いて分析し、データ分析をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで実行した。各１６ビットの単色のＩＰ  Ｌａｂ顕微鏡イメージに対して、ピクセル強度データをＩｍａｇｅＪで作製し、データ分析のためにＥｘｃｅｌスプレッドシートにエクスポートした。最も暗い（ｄａｒｋｅｓｔ）および最も明るい（ｂｒｉｇｈｔｅｓｔ）０．５％のピクセルを、各イメージにおいて同定し、これら２つの群のピクセルの平均強度を計算した。０．５％の最も暗いピクセルの平均強度を、バックグラウンド蛍光強度（白色バーとして、ヒストグラム中で示される）と定義し、０．５％の最も明るいピクセルの強度を最大強度と定義した。最大強度およびバックグラウンド強度の間の強度の差を、レスポンス（応答）（クロスハッチバーとして、ヒストグラム中で示される）と定義した。バックグラウンド強度およびレスポンスの和は、最大強度と等しい（ｅｑｕａｌ）。図から次のことが明らかである、それは残基１７２および１７３間（および、多分このループ内の別領域（ａｎｙｗｈｅｒｅ  ｅｌｓｅ））での分割を用いたＥＧＦＰに基づく蛍光相補性が、残基１５７および１５８間での分割（および、多分このループ内の別領域での分割）を用いたＥＧＦＰに基づく蛍光相補性に対して非常に優れているということである。
【図５】適切な蛍光タンパク質の分割部位を、ＧＦＰのリボンおよびワイヤーフレーム表示で示す。２つの表示は、２つの面（垂直軸の周りを約１８０度回転させた分子）からの同じ部位を示している。
【図６】ＥＧＦＰおよびＥＹＦＰに基づく相補性断片を発現する発現ベクターの共形質移入。図３に記載されたように、様々な相補性断片の能力を比較するため、細胞中で組み合わされ、機能的な複合体を産生させる。全イメージが同様に測定されて（ｓｃａｌｅｄ）、イメージ間の蛍光強度の直接的な比較が可能となる。Ｎ末端断片での単一の形質移入により、バックグラウンドレベルを超える、如何なる検出可能な蛍光をも生じなかった（データ示さず）。これらのＮ末端断片は、完全長のＧＦＰにおいて発色団を形成する、アミノ酸残基６５−６７を含有する。
【図７】図６に示したイメージの定量分析。結果は、細胞の視覚的な調査の印象と一致する。データは、図４の説明文に記載したように得られた。
【図８】ＥＧＦＰおよびＥＹＦＰに基づく相補性断片を発現する発現ベクターの共形質移入。図３に記載されたように、異なる色のＥＧＦＰ、ＥＹＦＰおよびＥＹＦＰ  Ｆ６４Ｌ断片を混合した効果を比較するため、および断片をオーバーラップさせること（例えば、残基１−１７２および１５８−２３８をコード化している断片を組み合わせること）の影響を決定するために実施された。全ての、色の組み合わせは相補したが、しかし概して正しい組み合わせよりは効率が低い。オーバーラップ領域を有する断片も機能的であり、これは立体障害が原因でより長いリンカー配列が、融合パートナーにより要求される（又は要求されるであろう）実験において有利であろう。この事項は、融合パートナーがロイシンジッパーである本実験においてはあてはまらない。例（中央の縦列）において、残基１５８〜１７２は両方の断片に存在した。全ての状況において、Ｆ６４Ｌは蛍光強度に好ましい効果を有している。全イメージが同様に測定され（ｓｃａｌｅｄ）、イメージ間の蛍光強度の直接的な比較が可能となる。
【図９】図８に示したイメージの定量分析。結果は、図７に示された結果と直接的に比較することができる。また、それらは細胞の視覚的な調査の印象と一致する。データは、図４の説明文に記載したように得られた。
【図１０】１μＭラパマイシン処理後の３タイムポイントでのＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６７＋ＰＳ１７６８］細胞。イメージ（ｃ）は２５ｍｓｅｃの露出、前の２イメージは各々１００ｍｓｅｃの露出で取得した。（ａ）は、これらの細胞に対する開始条件であり（ｔ＝０）、蛍光は大抵の細胞において僅かに（ｂａｒｅｌｙ）可視であるが、それにもかかわらず集団中のいくつかの細胞（＜５％）が、低い（しかし、感知できる（ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅ））蛍光を処理前に有していたことが注目された。（ｂ）、４時間後、多くの細胞（約４０％）は、有意に高いＥＹＦＰ蛍光を細胞質及び核の位置の全体に発生させた。（ｃ）、１６時間後、細胞毎の応答は、更に増加し、そして細胞集団の多くの割合（約７０％）を包含するものであった。
【図１１】ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６７＋ＰＳ１７６８］株のラパマイシン処理後の、細胞ＥＹＦＰ蛍光の発生の速度（ｒａｔｅ）。細胞を９６ウェルプレート中で３μＭラパマイシンで処理し、蛍光を測定した。処理および測定を、ハムの培地＋１０％ＦＢＳ中で成長させた細胞で実施し、蛍光測定値を本培地からのバックグラウンド蛍光に対して補正した。前記グラフは、蛍光の発生に関する半減時間（ｈａｌｆ−ｔｉｍｅ）が約５時間であることを実証する。値はハム（ＨＡＭ’ｓ）のバックグラウンドに対して補正された、各値は８測定の平均値＋ｓｄである。
【図１２】ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６９＋ＰＳ１７７１］細胞株に対する異なるラパマイシン用量の応答曲線。細胞を９６ウェルプレート中で培養し、様々なラパマイシン用量で１６時間処理し、次に固定し、ＥＹＦＰ蛍光／細胞（任意のユニット）をＡｓｃｅｎｔプレートリーダー上で決定する前にヘキストで染色した。値は、ＰＢＳバックグラウンドおよび細胞数に関して補正される。前記細胞株は、本実験に使用されたラパマイシン用量範囲に対して、ＥＹＦＰ強度／細胞が約３倍増加することを示している。
【図１３】各々の細胞株は、蛍光活性化細胞選別され３つの群に選別された、即ち：（ｉ）最も緑色の群（ｉｉ）中等度から低度に緑色の群および（ｉｉｉ）黒色の群である。「最も緑色」は各ケースにおいて廃棄されたが、他の２群は更に使用するために培養された。Ａ：  ＣＨＯ−ｈＩＲ［ｐｓ１７６８＋ｐｓ１７６７］ＦＡＣＳ群「黒色」刺激前（ｉ）、および１００ｎＭラパマイシン（ｉｉ）＆（ｉｉｉ）で１６時間刺激後。イメージ（ｉ）および（ｉｉ）は１００ｍｓｅｃ露出され、イメージ（ｉｉｉ）は２５ｍｓｅｃ露出された。Ｂ：  ＣＨＯ−ｈＩＲ［ｐｓ１７６８＋ｐｓ１７６７］ＦＡＣＳ群「中等度〜低度に緑色」刺激前（ｉ）、および１００ｎＭラパマイシン（ｉｉ）＆（ｉｉｉ）で１６時間刺激後。イメージ（ｉ）および（ｉｉ）は１００ｍｓｅｃ露出され、イメージ（ｉｉｉ）は２５ｍｓｅｃ露出された。
【図１４】ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６７＋ＰＳ１７６８］親株に由来する、「中等度から低度の緑色」（ａ）および「黒色」（ｂ）のＦＡＣＳ群（それぞれ）の応答を示す。ラパマイシンに対する用量反応を、各細胞株に関して７時間（ｉ）および３０時間（ｉｉ）後に測定した。蛍光に関する値を、プレート＆培地のバックグラウンドに対して補正した。ＥＹＦＰ蛍光の増加は、各ケースで非刺激の値の２０倍を超えるものである。
【図１５】ＦＫ５０６  対  １００ｎＭラパマイシンに関して、２つのＦＡＣＳ’ｄ株、（ａ）ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６８＋ＰＳ１７６７］「中等度から低度の緑色」群、および（ｂ）ＣＨＯ−ｈＩＲ［ＰＳ１７６９＋ＰＳ１７７１］「黒色」群における用量反応競合曲線を示す。双方のケースのＥＣ５０値は、約１．２μＭ  ＦＫ５０６である。細胞を一晩（１６時間）２つの化合物の混合物とインキュベーションし、次に固定し、Ａｓｃｅｎｔプレートリーダー上でＥＹＦＰ蛍光／細胞の決定前にヘキストで染色した。プレートおよび溶液のバックグラウンドが差し引かれ；各グラフ上の点線（ｄａｓｈｅｄ  ｌｉｎｅｓ）は、これらの実験における各細胞株に関する刺激前の蛍光レベルを示す。
【図１６−１】蛍光タンパク質のアライメント
【図１６−２】蛍光タンパク質のアライメント
【図１７】ＦＲＢ（右）へのＦＲＢＰ１２（左）のラパマイシン誘導した結合の結晶構造。分子のＣ末端は、互いに１５Å以内である。一方の分子のＮ末端は、他の分子のＣ末端から３２〜３６Å離れている。
【図１８】（Ａ）は、安定なＣＨＯ［ｐｓ１７０６＋ｐｓ１８１０］（ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−βカテニン＋Ｈ２Ｂ−ＴＣＦ４（ｆｒａｇ）−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）における、前記細胞に何らかの処理を施す前の蛍光のレベルを示す。蛍光のレベルは、多くの細胞において非常に弱く、これはフラボノイド（例えば、ＦＡＤ）からの細胞の自己蛍光に完全に依存したものであろう（使用された励起フィルターは、ＦＡＤ自己蛍光の一部を一般的に通過させる）。ときおり細胞（Ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ）（（Ａ）の上部右隅）は、弱いＧＦＰ蛍光を核および細胞質の位置において示し、これは明らかに自発性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）の相補性の結果である。これらの細胞の多くはクラスターを形成しており、おそらくこれは発現（又はおそらく細胞分裂）の間に相補性が起こりえる同じ位置へと彼らが近接するような、導入したコンポーネントの不正確なプロセッシングをもたらすだろうクローンの行動（ｃｌｏｎａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）を指摘するものである。しかしながら、１６時間、５ｍＭ  ＬｉＣｌで処理した場合、蛍光ＧＦＰを含有している細胞の数は非常に増大し、それらの多くはもっぱらそれらの核に限定されたＧＦＰ蛍光を有しており、この結果はこのペアの融合構築物から予期されたＧＦＰ相補性の分布と矛盾のないものだった（Ｂ）。
【図１９】（Ａ）は、安定なＣＨＯ［ｐｓ１７３６＋ｐｓ１７５８］（ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−Ｚｉｐ−Ｈ２Ｂ＋βカテニン−Ｚｉｐ−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）における、前記細胞に何らかの処理を施す前の蛍光のレベルを示す。１６時間、５ｍＭ  ＬｉＣｌで処理した場合、これらの細胞はＧＦＰで輝く核を呈し、この結果はこのペアの融合構築物から予期されたＧＦＰ相補性の分布と矛盾のないものだった（Ｂ）。
【図２０】ｐｓ１８０９とｐｓ１８２７を発現するＣＨＯ細胞（ＮｔｅｒｍＥ［Ｆ６４Ｌ］ＹＦＰ１７２−ＦＫＢＰ−β−カテニン＋Ｈ２Ｂ−ＦＲＡＰ（２０２４−２１１４）−ＣｔｅｒｍＥＹＦＰ１７３）のモンタージュ（ｍｏｎｔａｇｅ）を示し、これは４つの別々の処理からイメージされたものである。最上部横列（ｔｏｐ  ｒｏｗ）（ａ−ｄ）は、ＧＦＰ蛍光のイメージである。下部横列（ｌｏｗｅｒ  ｒｏｗ）のイメージ（ｅ−ｈ）は、通過した光イメージを、それに対応するＧＦＰ蛍光でオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙｅｄ）している。  ａ＆ｅ：  未処理。  ｂ＆ｆ：  ３μＭラパマイシン（＋６時間）。    ｃ＆ｇ：  １６時間を５ｍＭリチウムクロライド（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）処理。    ｄ＆ｈ：  １６時間を５ｍＭリチウムクロライド処理  ３μＭラパマイシン（＋６時間）。
【図２１】様々なアッセイの構成（ａｓｓａｙ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ）。ＩＤＣ（相互作用依存的な相補性）は通常の構成である。この構成において２つのタンパク質（ここではＢｅｔａＣａｔおよびＴｃｆ４と記載される）間の相互作用が、ＮおよびＣ末端のＸＦＰ相補性パートナーに作用して、再構成させ、検出可能になる。ＩＤＣペアの１つの具体的な利点は、選択されたタンパク質ペアから発生するＴＩＤＣアッセイを確認（ｖａｌｉｄａｔｅ）することである。ラパマイシン誘導性のＦＫＢＰ−ＦＲＢ相互作用ペアを使用して、確認すること及び更にＩＤＣの利用を開発することが可能である。ＴＤＣｒａｐシステムの記述をも参照されたい。ＴＩＤＣ（トランスロケーションおよび相互作用依存的な相補性）は、再分布（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ）および相互作用が光強度（ｌｉｇｈｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の増加として測定される構成である。相補性断片と融合されたβ−カテニンは、細胞質に優先的に位置する。刺激に際して、β−カテニンは核にトランスロケーションする。ここで、それは天然での相互作用パートナーＴＣＦ−４（相補する断片と融合された）を発見する。２つの相補性パートナーは、会合（ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、蛍光性となる。β−カテニン  トランスロケーションまたはβ−カテニン−ＴＣＦ−４相互作用の何れかを阻害する、化合物は、相補性および蛍光複合体の形成を阻害する。ＴＤＣ（トランスロケーション依存的な相補性）は、再分布（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ）のみが光強度（ｌｉｇｈｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の増加として測定される構成である。例えば、ＸＦＰ相補性断片およびロイシンジッパー配列と融合されたβ−カテニンは、細胞質に優先的に位置する。刺激に際して、β−カテニン融合体は核にトランスロケーションする。ここで、ロイシンジッパーは、他のロイシンジッパー配列（該ロイシンジッパー配列は、相補するＸＦＰ断片およびアンカータンパク質または核局在化シグナルと融合されている）を発見する。２つの相補性パートナーは、前記ジッパーの相互作用が起因して会合（ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、蛍光性となる。β−カテニン  トランスロケーションを阻害する化合物は、相補性および蛍光複合体の形成を阻害する。ＴＤＣｒａｐ（ラパマイシンにより誘導された、トランスロケーション依存的な相補性）は基本的にＴＤＣと同じであるが、しかし誘導性の相互作用ペア（例えば、ラパマイシン誘導性のＦＫＢＰおよびＦＲＢ相互作用ペア）は、「シンク効果」を非常に減少させ、他のタイプのトランスロケーション（例えば、細胞質から原形質膜又はその逆（ｏｒ  ｖｉｓａ  ｖｅｒｓａ））に基づくアッセイの開発を促進する。
【図２２】本図の左手部分は、レセプターの二量体化（この場合、ホモ二量体化）を決定するためのアッセイの構成を示す。レセプターおよび相補性タンパク質のＮ末端（ここではＹＮ）又は相補性タンパク質のＣ末端（ここではＹＣ）を具備する２つの抱合体が、細胞で発現される。リガンドでの細胞の刺激に際してのみ、レセプターは近い位置関係に近接し、ＹＮおよびＹＣ末端断片が機能的なタンパク質を形成する。図の右手側は、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）活性に関するアッセイの構成を説明する。第一抱合体は、相補性タンパク質のＮ末端（ＹＮ）、構成的な相互作用パートナー（ロイシンジッパー）、核局在化配列（ＮＬＳ）、カスパーゼのコンセンサス切断部位（例えば、ＶＡＤ＝バリン−アラニン−アスパルテート）を具備し、アンカータンパク質（ここでは、細胞膜）に融合される。第二抱合体は、相補性タンパク質のＮ  Ｃ末端（ＹＣ）、相互作用パートナー（ロイシンジッパー）および核におけるアンカー（ここでは円として示してある）を具備する。カスパーゼ活性が増加した場合、カスパーゼはＹＮ融合体をＶＡＤ部位で切断し、第一抱合体はＮＬＳにより核にトランスロケーションする、ここで相互作用パートナー（ジッパー）との結合により蛍光が生じる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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