(57)【要約】本発明は、サーコウイルス、特にブタサーコウイルスを培養するための方法に関する。本発明は、哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現する哺乳動物細胞において、ブタサーコウイルスを培養するための組成物および方法を提供する。本発明の方法は、以下の工程：（ａ）哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現する哺乳動物細胞を獲得する工程であって、該細胞は、哺乳動物サーコウイルス複製について許容性である、工程；（ｂ）該哺乳動物サーコウイルスゲノムまたは複製可能なその一部を、該哺乳動物細胞に導入する工程；および（ｃ）該哺乳動物サーコウイルスの複製に適切な条件下で該哺乳動物細胞を培養する工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物サーコウイルスを培養するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現する哺乳動物細胞を獲得する工程であって、該細胞は、哺乳動物サーコウイルス複製について許容性である、工程；
（ｂ）該哺乳動物サーコウイルスゲノムまたは複製可能なその一部を、該哺乳動物細胞に導入する工程；および
（ｃ）該哺乳動物サーコウイルスの複製に適切な条件下で該哺乳動物細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記培養細胞から前記サーコウイルスを回収する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物サーコウイルスが、ブタサーコウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ブタサーコウイルスが、２型ブタサーコウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ブタサーコウイルスが、１型ブタサーコウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞が、ブタ起源の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物細胞が、ブタ網膜細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物アデノウイルスＥ１機能が、ヒトアデノウイルスＥ１機能である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物アデノウイルＥ１機能が、ブタアデノウイルスＥ１機能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現する前記哺乳動物細胞が、哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子配列によって安定に形質転換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｅ１遺伝子配列が、ヒトアデノウイルスＥ１遺伝子配列である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子配列が、前記哺乳動物細胞にとって異種である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｅ１機能が、Ｅ１Ａ機能および／またはＥ１Ｂ機能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ブタサーコウイルスが、キメラヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現し、かつブタサーコウイルスゲノムまたは複製可能なその一部を含む、組換え哺乳動物細胞であって、該細胞は、該ブタサーコウイルスの複製を許容する、組換え哺乳動物細胞。
【請求項１６】
前記アデノウイルスＥ１機能が、ヒトアデノウイルスＥ１機能である、請求項１５に記載の組換え哺乳動物細胞。
【請求項１７】
前記アデノウイルスＥ１機能が、ブタアデノウイルスＥ１機能である、請求項１５に記載の組換え哺乳動物細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、ブタ起源の細胞である、請求項１５に記載の組換え哺乳動物細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、ブタ網膜細胞である、請求項１８に記載の組換え哺乳動物細胞。
【請求項２０】
哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現する前記哺乳動物細胞が、哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子配列によって安定に形質転換されている、請求項１５に記載の組換え哺乳動物細胞。
【請求項２１】
前記Ｅ１遺伝子配列が、ヒトアデノウイルスＥ１遺伝子配列である、請求項２０に記載の組換え哺乳動物細胞。
【請求項２２】
前記哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子配列が、前記哺乳動物細胞にとって異種である、請求項２０に記載の組換え哺乳動物細胞。
【請求項２３】
哺乳動物アデノウイルスＥ１機能およびブタサーコウイルスゲノムを含む組換え哺乳動物細胞を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現する哺乳動物細胞を獲得する工程；および
（ｂ）該ブタサーコウイルスゲノムまたは複製可能なその一部を、該哺乳動物細胞に導入する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記ブタサーコウイルスの複製に適切な条件下で前記組換え哺乳動物細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養細胞から、前記サーコウイルスを回収する工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ブタサーコウイルスが、２型ブタサーコウイルスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ブタサーコウイルスが、１型ブタサーコウイルスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物細胞が、ブタ起源の細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物細胞が、ブタ網膜細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アデノウイルスＥ１機能が、ヒトアデノウイルスＥ１機能である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記アデノウイルスＥ１機能が、ブタアデノウイルスＥ１機能である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記ブタサーコウイルスが、キメラヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を含む前記哺乳動物細胞が、哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子配列によって安定に形質転換されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子配列が、前記哺乳動物細胞にとって異種である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サーコウイルスの分野に関し、そしてサーコウイルス、特にブタサーコウイルスを培養するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子機能を発現する哺乳動物細胞におけるブタサーコウイルスを培養する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物種および動物種の範囲において見出されＣｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅと命名され、そして一般的にはサーコウイルス科といわれるウイルスの科は、環状の一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）を含む平均直系１７ｎｍ〜２３．５ｎｍを有する円形の非エンンベロープビリオンとして特徴づけられる。サーコウイルスのｓｓＤＮＡゲノムは、既知の最小のウイルスのＤＮＡレプリコンを表す。ＷＯ９９／４５９５６で開示されるように、少なくとも６つのウイルスが、Ｔｈｅ  Ｓｉｘｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓに従ってこの科のメンバーとして同定されている（Ｌｕｋｅｒｔ，Ｐ．Ｄ．ら、１９９５、Ｔｈｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ，１６６〜１６８頁、Ｆ．Ａ．Ｍｕｒｐｈｙら（編）Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｓｉｘｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１０補遺）。
【０００３】
この科に含まれる動物のウイルスとしては、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）；嘴および羽疾患ウイルス（ＢＦＤＶ）；ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）；およびハトサーコウイルスがある。ＰＣＶは、ブタ腎臓細胞培養物で最初に単離された。ＰＣＶは、細胞核中で複製し、そして大きい核内体を生成する。Ｍｕｒｐｈｙら（１９９９、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ  ３５７〜３６１頁、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｅｉｇｏ）を参照のこと。現在２つの認識された型のＰＣＶ、ＰＣＶ１型（ＰＣＶ１）およびＰＣＶ２型（ＰＣＶ２）がある。連続したブタ腎臓細胞株ＰＫ−１５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３１）の残留性の汚染物として単離されたＰＣＶ１は、細胞培養において検出可能な細胞変性効果を生じず、そして実験的な感染後ブタにおける臨床的疾患を生成しない（Ａｌｌａｎ  Ｇ．，１９９５，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：４９〜６４；Ｔｉｓｃｈｅｒ，Ｉ．ら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５：６４〜６６；およびＴｉｓｃｈｅｒ，Ｉら、１９８６，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．９１：２７１〜２７６を参照のこと）。ＰＶＣ１とは対照的にＰＣＶ２は、離乳したブタにおける離乳後多システムるいそう症候群（ｐｏｓｔ  ｗｅａｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰＭＷＳ）と密接に関連する（Ａｌｌａｎ  Ｇら、１９９８，Ｅｕｒｏｐｅ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１０：３〜１０；Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．ら、１９９８，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．３９：４４〜５１およびＭｏｒｏｚｏｖ，Ｉ．ら、１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２５３５〜２５４１を参照のこと）。ＰＣＶ１についてのヌクレオチド配列は、Ｍａｎｋｅｒｔｚ，Ａ．，ら（１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２５６２〜２５６６）およびＭｅｅｈａｎ，Ｂ．Ｍ．，ら（１９９７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２２１〜２２７）に開示され、そしてＰＣＶ２についてのヌクレオチド配列は、Ｈａｍｅｌ，Ａ．Ｌ．ら（１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５２６２〜５２６７）；Ｍａｎｋｅｒｔｚ，Ａ．ら（２０００，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．６６：６５〜７７）およびＭｅｅｈａｎ，Ｂ．Ｍ．ら（１９９８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：２１７１〜２１７９）に開示される。ＰＣＶ２の株は、ＷＯ００／０１４０９に開示され、そしてＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｒｅｓｅａｔｃｈ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ＯＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に保管され、そして寄託番号Ｖ９７１００２１９；寄託番号Ｖ９７００２１８；寄託番号Ｖ９７１００２１７；寄託番号Ｖ９８０１１６０８；および寄託番号Ｖ９８０１１６０９を含む。ＷＯ００／７７２１６はまたＰＣＶ２を開示する。
【０００４】
ＰＣＶ２におけるデータについて公開された研究は、組織均一化または現場の単離体（ｆｉｅｌｄ  ｉｓｏｌａｔｅ）由来の培養されたウイルスのいすれかを使用した。Ｔｉｓｃｈｅｒら（１９８７，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．９６：３９〜５７）は、ブタ腎臓細胞を刺激してＤ−グルコサミン処理により細胞周期をＳ期にすることを報告する。しかし、この処理は、注意深く行われなければならない。なぜならば、Ｄ−グルコサミンは、細胞培養について有毒であるからである（Ａｌｌａｎら（２０００）Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１２：３〜１４）。純粋なサーコウイルスが得られるような、例えばＰＣＶ１およびＰＣＶ２のようなサーコウイルス、ならびに他のサーコウイルスを培養する方法の必要性が残っている。このような方法は、特にＰＭＷＳに対するワクチンとしてＰＣＶ２抗原を調製するために有利である。本発明は、この要求を扱う。
【０００５】
本明細書中の全ての特許および刊行物は、本明細書中でその全体を参考として援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の工程を包含する哺乳動物サーコウイルスを培養する方法を提供する：ａ）哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現する哺乳動物細胞を得る工程であって、上記細胞が哺乳動物サーコウイルス複製について許容性である、工程；ｂ）上記哺乳動物サーコウイルスゲノム、または複製可能なその部分を上記哺乳動物細胞に導入する工程；およびｃ）上記哺乳動物サーコウイルスの復籍に適切な条件下で上記哺乳動物細胞を培養する工程。いくつかの実施形態において、本方法は、上記サーコウイルスを上記培養細胞から回収する工程をさらに包含する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、哺乳動物サーコウイルスは、ブタサーコウイルス（例えば、ブタサーコウイルス１（ＰＣＶ１）またはブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）である。なおさらなる実施形態において、ブタサーコウイルスは、キメラヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、哺乳動物細胞は、ブタ起源である。なお他の実施形態において、哺乳動物細胞はブタ網膜細胞である。
【０００８】
他の実施形態において、哺乳動物アデノウイルスＥ１機能は、ヒトアデノウイルスＥ１機能である。なお他の実施形態において、哺乳動物アデノウイルスＥ１機能は、ブタアデノウイルスＥ１機能である。さらなる実施形態において、Ｅ１機能は、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ機能である。なおさらなる実施形態において、哺乳動物Ｅ１機能を発現する哺乳動物細胞は、哺乳動物Ｅ１遺伝子配列で安定に形質転換される。他の実施形態において、哺乳動物Ｅ１遺伝子配列は、上記哺乳動物細胞に対して異種である。
【０００９】
本発明はまた、哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現し、そして哺乳動物サーコウイルスゲノムまたは複製可能なその部分を含む組換え哺乳動物細胞を提供し、ここで上記細胞は、上記哺乳動物サーコウイルスの複製に許容性である。いくつかの実施形態において、哺乳動物サーコウイルスは、例えば、ブタサーコウイルス１（ＰＣＶ１）またはブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）のようなブタサーコウイルスである。なおさらなる実施形態において、ブタサーコウイルスは、キメラヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１機能は、ヒトアデノウイルスＥ１機能である。他の実施形態において、このＥ１機能は、ブタアデノウイルスＥ１機能である。他の実施形態において、哺乳動物細胞は、ブタ起源である。さらなる実施形態において、哺乳動物細胞は、ブタ網膜細胞である。なおさらなる実施形態において、哺乳動物Ｅ１機能を発現する哺乳動物細胞は、哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子配列で安定に形質転換される。他の実施形態において、哺乳動物Ｅ１遺伝子配列は、上記哺乳動物細胞とは異種である。
【００１０】
本発明はまた、哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現し、そして哺乳動物サーコウイルスゲノムを含む組換え哺乳動物細胞を調製する方法を提供し、以下の工程を包含する：ａ）哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現する哺乳動物細胞を得る工程；およびｂ）上記哺乳動物サーコウイルスゲノム、または複製可能なその部分を、上記哺乳動物細胞に導入する工程。さらなる実施形態において、この方法は、上記哺乳動物サーコウイルスの複製に適した条件下で組換え哺乳動物細胞を培養するさらなる工程を包含する。さらなる実施形態において、この方法は、上記サーコウイルスを上記培養細胞から回収する工程を包含する。いくつかの実施形態において、哺乳動物サーコウイルスは、例えば、ブタサーコウイルス１（ＰＣＶ１）またはブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のようなブタサーコウイルスである。なおさらなる実施形態において、このブタサーコウイルスは、キメラヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、哺乳動物細胞はブタ起源である。なおさらなる実施形態において、哺乳動物細胞は、ブタ網膜細胞である。さらなる実施形態において、アデノウイルスＥ１機能は、ヒトアデノウイルスＥ１機能またはブタアデノウイルスＥ１機能である。なおさらなる実施形態において、哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現する哺乳動物細胞は、哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子配列で安定に形質転換される。他の実施形態において、哺乳動物Ｅ１遺伝子配列は、上記哺乳動物細胞とは異種である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、哺乳動物サーコウイルス、特にブタサーコウイルスを培養する組成物および方法に関する。本発明は、ヒトＥ１機能を発現するブタ細胞をＰＣＶ２ウイルスゲノムでトランスフェクトし得、そして高いウイルス力価でＰＣＶ２ウイルスを生成し得るという発見に基づく。ＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１５５を有するＶＩＤＯ  Ｒ１細胞株は、ヒトアデノウイルス−５（ＨＡＶ５）Ｅ１で形質転換されたブタ網膜細胞株であり、これは細胞周期のＳ期を誘導し、そして転写をトランス活性化することが示されている。Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．（１９９６）「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．第３版．Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ（編）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２１１１〜２１４８頁を参照のこと。本明細書中の実施例３に記載されるように、ＶＩＤＯ  Ｒ１細胞を、ＰＣＶ２ゲノムでトランスフェクトし、そして２×１０７ＩＵ／ｍｌでウイルスを生成した。
【００１２】
本発明の実施は、特に示されない限り、従来の微生物学、免疫学、ウイルス学、分子生物学、および当該分野の技術内である組換えＤＮＡ技術を用いる。これらの技術は、文献中で完全に説明される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｒａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌｓ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，編（１９８４））；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７，１９８８，１９８９，１９９０，１９９１，１９９２，１９９３，１９９４，１９９５，１９９６）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）；ｖｏｌｓ．Ｉ，ＩＩ＆ＩＩＩ（１９８９）。
【００１３】
環状の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む平均直系１７〜２３．５ｎｍを有する円形の非エンベロープヴィリオンを有するウイルスの科である、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅは、Ｔｈｅ  Ｓｉｘｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（前出）に記載される。この群のメンバーとしては、ブタサーコウイルス、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２が挙げられる。ＰＣＶ２のようないくつかのＰＣＶは病原性であることが公知であり、ＰＭＷＳと関連する。
【００１４】
ＰＣＶ１についてのヌクレオチド配列は、Ｍａｎｋｅｒｔｚ，Ａ．ら１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２５６２〜２５６６およびＭｅｅｈａｎ，Ｂ．Ｍ．ら，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２２１〜２２７で提供される。ＰＣＶ２についてのヌクレオチド配列は、Ｈａｍｅｌ，Ａ．Ｌ．ら，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５２６２〜５２６７；Ｍａｎｋｅｒｔｚ，Ａ．ら，２０００，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．６６：６５〜７７およびＭｅｅｈａｎ，Ｂ．Ｍ．ら１９９８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：２１７１〜２１７９で提供される。ＰＣＶ２の代表的な株は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ＯＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍに保管され、そして寄託番号Ｖ９７１００２１９；寄託番号Ｖ９７００２１８；寄託番号Ｖ９７１００２１７；寄託番号Ｖ９８０１１６０８；および寄託番号Ｖ９８０１１６０９を含む。ＷＯ００／７７２１６はまた、ＰＣＶ２を開示する。ＰＣＶ２ヌクレオチド配列はまた、Ｈａｍｅｌら（１９９８）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．７２，６：５２６２〜５２６７（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０２７２１７）およびＭｏｒｏｚｏｖら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂ．ｖｏｌ．３６，９：２５３５〜２５４１、ならびにＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０８６８３４；ＡＦ０８６８３５およびＡＦ０８６８３６で公開されている。ＰＣＶ１およびＰＣＶ２について公開されたヌクレオチド配列の比較は、８０％よりも低い同一性を示すが、ゲノム構成が、特に推定のＤＮＡ複製起点を有する２つの最大のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列に類似する。
【００１５】
本発明は、哺乳動物サーコウイルス、特にブタサーコウイルス（ＰＣＶ）を培養する方法を包含する。本発明は、本明細書で開示されるか、当該分野で公知のＰＣＶヌクレオチド配列、またはそのＯＲＦ、または複製可能であるその部分を含むＰＣＶを培養する方法を包含する。本発明はまた、本明細書中で開示されるか、もしくは当該分野において公知のヌクレオチド配列、またはそのＯＲＦ、または複製可能であるその部分に対する遺伝コードの縮重を介して異なるＰＣＶヌクレオチド配列を有するＰＣＶを培養する方法を包含する。本発明は、ヌクレオチド配列、またはそのＯＲＦ、または複製可能であるその部分の機能性あるいは株特異性を変化しないＰＣＶヌクレオチド配列バリエーションを含むＰＣＶを培養する方法をさらに包含する。本発明はまた、中から高度にストリンジェントな条件下で本明細書中に開示される配列にハイブリダイズし得るＰＣＶヌクレオチド配列を含むＰＣＶを培養する方法、および本明細書中に開示されるか、もしくは当該分野において公知のＰＣＶヌクレオチド配列の変異（例えば、欠損もしくは点変異）またはそのそのＯＲＦまたは複製し得るその部分を含むＰＣＶを培養する方法を包含する。本発明はまた、異種ヌクレオチド配列を含むＰＣＶを培養する方法を包含する。本発明は、例えば、他の病原性ウイルス（例えば、パルボウイルスを含む病原性ブタウイルス）由来のヌクレオチド配列と融合するブタサーコウイルス由来のヌクレオチド配列のようなキメラサーコウイルスヌクレオチド配列を含むＰＣＶを培養する方法を包含する。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、サーコウイルスまたは哺乳動物細胞に関する異種ヌクレオチド配列は、それぞれサーコウイルスゲノムの一部としてサーコウイルス配列と通常関連しない配列か、または哺乳動物細胞と通常関連しない配列である。異種ヌクレオチド配列は、合成配列を含む。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実行され得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加する条件は、広く公知であり、そして当該分野において公開されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）７．５２頁を参照のこと。（ストリンジェンシーを増加するための）適切な条件の例としては、以下が挙げられる：２５℃、３７℃、５０℃および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ここでＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸緩衝液）の緩衝液濃度、および他の緩衝液系を用いる等価物；０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃度；５分間〜２４時間のインキュベーション時間；１回、２回以上の洗浄工程；１分間、２分間または１５分間の洗浄インキュベーション時間；および６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄溶液。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、６８℃かつ０．１×ＳＳＣである。
【００１７】
いくつかのポリペプチド配列をコードするＰＣＶゲノムは、約８〜３５ｋＤの範囲のサイズである。標準的なソフトウェア（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．，ＭＤ２１０３０）を用いてブタサーコウイルスについてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を決定することは慣用的なことと考えられる。２つの型のＰＣＶの最大のＯＲＦ、ＯＲＦ１は、（ｃｌｕｓｔａｌプログラムによって測定される場合）８５％の同一性を有するマイナーバリエーションのみを示し、そしてＰＣＶ１におけるＲｅｐタンパク質であることが実証される（Ｍａｎｋｅｒｔｚ，Ａら，１９９８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：３８１〜３８４）。理論によって制限されることなく、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２のＯＲＦ２配列において提示されるより高い割合のバリエーション（約６５％の同一性）は、ＰＣＶの型特異的特徴がそれぞれのＯＲＦ２タンパク質によって決定され得ることを示唆する。いくつかのＰＣＶ型特異的エピトープが、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２配列にマップされている。Ｍａｈｅ，Ｄ．ら，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１８１５〜２４を参照のこと。別の近年の研究において、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２は、ＯＲＦ２発現組換えバキュロウイルスで感染された昆虫細胞におけるウイルスのカプシド様粒子を形成し得る主用な構造タンパク質として同定されている。Ｎａｗａｇｉｔｇｕｌ，Ｐら，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２２８１〜２２８７を参照のこと。
【００１８】
本明細書中で開示される本発明のいくつかの例示的な実施形態において、ＰＣＶゲノムまたはそのＯＲＦ、またはその部分（例えば、抗原性領域）を含む組換えベクターは、プラスミドとＰＣＶゲノムとの間のインビトロ組換えによって構築される。いくつかの実施形態において、ＰＣＶゲノムは、ＰＣＶ２ゲノムである。他の実施形態において、ＰＣＶゲノムまたはそのＯＲＦ、またはその部分（例えば、抗原性領域）を含む組換えベクターは、インビボ組換えによって構築され得る。インビボ組換えについての方法は、当該分野で公知であり、例えばＣｈａｒｔｉｅｒら（１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４８０５〜４８１０）に開示される方法が挙げられる。サーコウイルスゲノムを構築するためのベクターとしては、例えば、生成されるべきクローン化サーコウイルスヌクレオチド配列の複数のコピーを可能にする細菌プラスミドが挙げられる。いくつかの実施形態において、このプラスミドは、組換えのために適切な宿主細胞中に同時トランスフェクトされる。組換えのための適切な宿主細胞は、ＰＣＶゲノムとＰＣＶ配列を含むプラスミドとの間、またはそれぞれＰＣＶ配列を含む２つ以上のプラスミド間の組換えを支持する任意の細胞を含む。組換えは、一般に原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）で実行されるが、その一方でサーコウイルスの生成は、好ましくは、ＰＣＶ複製について許容性の哺乳動物細胞（例えば、ブタ細胞特に哺乳動物アデノウイルスＥ１機能を発現し得るブタ細胞）で実行される。
【００１９】
本発明は、サーコウイルス複製について許容性の、特にＰＣＶ（例えば、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２）の複製に許容性の任意の哺乳動物宿主細胞の使用を包含する。Ａｌｌａｎら（１９９５，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：４９〜６４）は、ＰＣＶがブタおよびウシ単球／マクロファージ培養物中で複製することを報告している。Ｔｉｓｃｈｅｒら（１９８７，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．９６：３９〜５７）は、ＰＣＶが細胞培養における複製のために細胞を活発に分裂させることを必要とすることが公知であることを報告している。ＰＣＶの複製に有用な細胞または細胞株の例としては、Ｅ１機能を含みかつＰＣＶ複製に許容性の哺乳動物細胞（アデノウイルスＥ１機能を発現する、ブタ単球／マクロファージ細胞およびブタ網膜細胞のようなブタ細胞を含む）が挙げられる。本明細書中で開示される例示的な実施形態において、ヒトアデノウイルスＥ１機能を発現するブタ網膜細胞は、ＰＣＶ２の複製について許容性であることが示され、そして２×１０７ＩＵ／ｍｌでのウイルスを生成することが示されている。ブタ細胞株は、公的な供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））から入手可能である。細菌細胞培養の増殖、ならびに真核生物細胞および哺乳動物細胞株の培養および維持は、当業者に周知の手順である。
【００２０】
本発明は、哺乳動物サーコウイルス、特にブタサーコウイルスを、哺乳動物アデノウイルスＥ１遺伝子配列でトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞において培養する方法を包含する。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、アデノウイルスＥ１遺伝子配列で安定に形質転換される。いくつかの実施形態において、Ｅ１遺伝子配列は、哺乳動物細胞のゲノム中に組み込まれる。他の実施形態において、Ｅ１遺伝子配列は、複製するプラスミド上に存在する。なお他の実施形態において、Ｅ１遺伝子配列は、哺乳動物細胞とは異種である。本明細書中で開示される例示的な実施形態において、ブタ哺乳動物細胞は、ヒトデノウイルス５  Ｅ１遺伝子配列で形質転換される。本発明は、Ｅ１機能を発現する哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株が、サーコウイルス、特にブタサーコウイルス（例えば、ブタサーコウイルス１またはブタサーコウイルス２）の複製について許容性である限り、任意のＥ１機能を発現する哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株の使用を包含する。好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、ブタ細胞またはブタ細胞株である。本発明は、哺乳動物Ｅ１機能を発現する哺乳動物宿主細胞がサーコウイルス、特にＰＣＶ（例えば、ブラサーコウイルス１またはブタサーコウイルス２）の複製について許容性である限り、任意の哺乳動物のＥ１機能の使用を包含する。哺乳動物アデノウイルスゲノムは、当該分野において公知であり、そして例えば、ヌクレオチド配列、ゲノム構成、およびウシアデノウイルス３（ＢＡＶ３）の転写マップを開示するＲｅｄｄｙら（１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２：１３９４）；ならびにＰＡＶ−４のＥ１領域を開示するＫｌｅｉｂｏｅｋｅｒ（１９９５、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３６：２５９〜２６８）に開示される。本発明は、ヒトアデノウイルスの種々の血清型（例えば、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ１２、およびＡｄ４０）のいずれか由来のＥ１機能を包含する。本明細書中の実施例１に開示される例示的な実施形態において、Ｅ１機能は、ヒトＡｄ５  Ｅ１機能である。ヒトＥ１Ａ遺伝子は、ウイルス感染の直後（０〜２時間）および任意の他の遺伝子の前に発現される。Ｆｌｉｎｔ（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６５１：１７５〜２０８；Ｆｌｉｎｔ（１９８６）Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：１６９〜２２８；Ｇｒａｎｄ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４１：２５〜３８．Ａｄ５  Ｅ１Ａの転写開始部位は、ヌクレオチド４９８であり、そしてＥ１Ａタンパク質のＡＴＧ開始部位は、ウイルスゲノムのヌクレオチド５６０である。ｔｒａｎｓにおけるＥ１Ｂタンパク質機能は、核から細胞質への後期ｍＲＮＡを輸送するために必要である。Ａｄ５のＥ１Ｂプロモーターは、Ｓｐ１およびＴＡＴＡボックスについての単一の高親和性認識部位からなる。特に、ヒトアデノウイルス５  Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子配列は、Ｃｈｒｏｂｏｅｚｅｋ，Ｊ．ら（１９９２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１８６：２８０〜２８５）で提供されるヌクレオチド配列のヌクレオチド５０５〜４０３４に配置される。本明細書中の実施例において開示される例示的な実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、ヒ��アデノウイルス５  Ｅ１遺伝子配列でトランスフェクトされたブタ宿主細胞である。
【００２１】
ＰＣＶゲノムは、分子生物学および生物工学の標準的な技術を用いて、ＰＣＶビリオンから単離され得るか、またはプラスミド中に挿入されているＰＣＶゲノムを含み得る。ＰＣＲによる全長ＰＣＶ２ゲノムのＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ製のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＫＳ（＋）へのクローニングが、Ｌｉｕら（２０００，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ  ３８：３４７４〜３４７７）に記載される。全長ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡは、ＳａｃＩＩ消化で生じたプラスミドから放出され得る。
【００２２】
サーコウイルスヌクレオチド配列の許容性哺乳動物宿主細胞への導入は、当該分野において公知の任意の方法によって達成され得、任意の方法としては、トランスフェクションおよび形質転換（マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポソーム、粒子銃などを含むがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。ＰＣＶ２ヌクレオチド配列をＶＩＤＯ  Ｒ１細胞にトランスフェクトする例示的な方法は、本明細書中の実施例３に記載される。
【００２３】
原核生物細胞（例えば、細菌細胞）、および真核生物細胞（例えば、アデノウイルスＥ１機能を発現する哺乳動物宿主細胞）を培養する方法は、当業者にとって慣用的であると考えられる。
【００２４】
以下の実施例は、例示のために提供されるが、本発明を限定しない。本明細書中で開示される全ての参考文献および特許刊行物は、本明細書中でその全体を参考として援用される。
【実施例】
【００２５】
（実施例１：ヒトアデノウイルスＥ１遺伝子配列でトランスフェクトされたブタ網膜細胞（ＶＩＤＯ  Ｒ１細胞）の調製）
ブタ胚性網膜細胞の初代培養物を、リン酸カルシウム技術によって、１０μｇのプラスミドｐＴＧ４６７１（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）でトランスフェクトした。このｐＴＧ４６７１プラスミドは、ＨＡＶ−５のＥ１Ａ配列全体およびＥ１Ｂ配列全体（ヌクレオチド５０５〜４０３４）を、選択マーカーとしてのピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子とともに含む。このプラスミドにおいて、Ｅ１領域は、マウスホスホグリセレートキナーゼ遺伝子由来の構成的プロモーターの制御下に存在し、そしてピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、構成的なＳＶ４０初期プロモーターにより制御される。形質転換された細胞を、７μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地における３回の継代によって選択し、単病巣由来のそれらの形態の変化（すなわち、接触阻害の喪失）に基づいて同定し、そしてそれらを、単細胞クローニングに供した。樹立された細胞株を、まず、その細胞株がＨＡＶ−５のＥ１欠失変異体の増殖を支持する能力について試験した。その後、その細胞株を、ゲノム中のＥ１配列の存在についてＰＣＲによってさらに調査し、Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質の発現についてウェスタンブロットによってさらに調査し、そして細胞培養条件下での倍化時間についてさらに調査した。Ｅ１配列を検出し、そしてＥ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質の産生を、免疫沈降によって示した。倍化時間は、親細胞株の倍化時間と比較して短かった。
【００２６】
Ｅ１発現の安定性を評価するために、ＶＩＤＯ  Ｒ１細胞を、５０回を超える継代（毎週２回１：３分割）を介して培養し、そしてそれらの細胞がＥ１欠失ＨＡＶ−５の複製を支持する能力について試験した。規則的な間隔でのＥ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質の発現もまた、ウェスタンブロットによってモニターした。その結果は、ＶＩＤＯ  Ｒ１株が、Ｅ１欠損ウイルスの増殖を支持する能力を保持したこと、および培養中の５０回を超える継代の間に同様のレベルのＥ１タンパク質を発現したことを示した。従って、ＶＩＤＯ  Ｒ１は、樹立された細胞株であると考えられ得る。ＶＩＤＯ  Ｒ１細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１５５を有する。
【００２７】
（実施例２）
実施例２は、全長ＰＣＶ２ゲノムの分子クローニングの説明を記載する。
【００２８】
最初に、ＰＣＶ２  ＤＮＡを、ＰＭＷＳを含む仔ブタから抽出した全ＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅した。全長ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングすることが、Ｌｉｕら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：３４７４〜３４７７）に記載された。ＰＣＶ２配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録番号ＡＦ０８６３４）に提出された。全長ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡを、ＳａｃＩＩ消化の際に生じたプラスミドから放出させる。
【００２９】
（実施例３）
実施例３は、実施例２において構築されたＰＣＶ２ゲノムを含むプラスミドを用いる、実施例１に記載されたようなＶＩＤＯ  Ｒ１細胞のトランスフェクションを記載する。
【００３０】
（材料および方法）
（細胞培養）
実施例１に記載されるようなブタ胎仔網膜細胞株（ＶＩＤＯ  Ｒ１）およびＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ）を、それぞれ、１０％または５％の熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＥａｇｌｅベースＭＥＭ培地中で、５％  ＣＯ２を伴って３７℃にて維持した。
【００３１】
（トランスフェクションおよび感染）
６ウェルディッシュにおいて増殖させたＶＩＤＯ  Ｒ１細胞の単層を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎを製造業者（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）の推奨に従って使用して、クローン化ＰＣＶ２  ＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの前に、ＰＣＶ２全長ゲノムを、ＳａｃＩＩでの消化によってそのプラスミドから放出させた（Ｌｉｕ，Ｑ．ら、２０００，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：３４７４〜３４７７）。感染のために、トランスフェクトされたＶＩＤＯ  Ｒ１細胞を、３回の凍結（−７０℃）および融解（３７℃）のサイクルに供した。その後、その溶解物を、遠心分離によって清澄化し、そして新鮮なＶＩＤＯ  Ｒ１細胞に感染させるために使用した。公開された報告において、ＰＣＶ１を含まないブタ腎臓細胞株を、ＰＣＶ２ウイルスを培養するために使用する。その細胞周期においてＳ期に入るのを刺激するために、そのブタ腎臓細胞を、常にＤ−グルコサミンにより処理する（Ｔｉｓｃｈｅｒら（１９８７）Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．９６：３９〜５７を参照のこと）。しかし、その処理は、注意を払って実施されなければならない。なぜなら、Ｄ−グルコサミンは、細胞培養にとって毒性であるからである（Ａｌｌａｎら（２０００）Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１２：３〜１４を参照のこと）。対照的に、この研究において使用するＶＩＤＯ  Ｒ１細胞株は、Ｓ期を誘導し得るＨＡＶ５−Ｅ１により形質転換されているので、このＤ−グルコサミン処理は、必要ではなかった。
【００３２】
（実施例４）
（ウイルス精製および力価決定）
ＰＣＶ２ウイルスの精製のために、ＰＣＶ−２感染ＶＩＤＯ  Ｒ１細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４とともに３７℃にて４５分間インキュベートし、その後、Ｆｒｅｏｎ  １１３（１，１，２−トリクロロ−トリフルオロエタン）抽出した。細胞破片および細胞膜を、２０００ｇにて１５分間の遠心分離によって清澄化した。その上清中のウイルスを、２０％ショ糖クッションを介して３５０００ｇにて３時間ペレットにした。そのウイルスペレットを、ＰＢＳ中に懸濁し、そして−７０℃にて貯蔵した。ウイルス力価を、定量的ＯＲＦ２タンパク質イムノペルオキシダーゼ染色によって、感染単位（ＩＵ）として決定した。この目的のために、１２ウェルディッシュ中の細胞単層を、ウイルスの連続希釈物に感染させた。１時間ウイルスを吸着させた後、細胞を洗浄し、そして２％  ＦＢＳおよび０．７％アガロースを含むＭＥＭを重層した。感染後（ｐ．ｉ．）３日目に、そのアガロース重層物を除去し、そして細胞を固定し、そしてメタノール／アセトン（体積で１：１）を−２０℃にて２０分間用いて透過させた。室温にて１時間１％ウシ血清アルブミンでブロックした後、細胞を、ウサギ抗ＯＲＦ２血清（Ｌｉｕら、２００１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２１：１１５〜１２０）とともにインキュベートした。２時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳで洗浄し、その後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して処理した。この反応物を、３，３ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）テトラヒドロクロリドを用いて発色させ、そして顕微鏡下で観察した。ポジティブに染色された細胞を計数することによって、そのウイルス力価を、（３ｄ．ｐ．ｉ．にて１ポジティブ染色細胞／焦点として１ＩＵを規定した）ＩＵとして表した。
【００３３】
（ウイルスＤＮＡ抽出および特徴付け）
ウイルスＤＮＡを、Ｈｉｒｔ（１９６７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３６５−３６９）の方法によってＰＣＶ２感染したＶＩＤＯ  Ｒ１細胞単層から抽出した。その後、ウイルスＤＮＡを、Ｌｉｕら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：３４７４〜３４７７）に記載されるように、制限分析およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって特徴付けた。
【００３４】
感染細胞から抽出したＤＮＡをテンプレートとして使用しそしてＰＣＶ−２特異的プライマーを使用するＰＣＲによって、特定のサイズの生成物が増幅されたが、コントロールの非感染細胞からは、何のＤＮＡも増幅されなかった。予期した制限パターンと一致して、ＮｃｏＩおよびＳｔｕＩによるウイルスＤＮＡの消化は、２つのフラグメント（それぞれ、サイズが１２９１ｂｐおよび４７７ｂｐ）を生じた。ＥｃｏＲＩおよびＳｔｕＩでの消化は、２つのフラグメント（それぞれ、サイズが１４９２ｂｐおよび２７６ｂｐ）を生じた。ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶでの消化は、２つのフラグメント（それぞれ、サイズが１０９４ｂｐおよび６７４ｂｐ）を生じた。このデータは、ＰＣＶ２ウイルスが得られたことを示す。免疫染色アッセイを使用しそしてポジティブ染色細胞を計数することによって、この調製物のウイルス力価が２×１０７  ＩＵ／ｍｌであることを決定した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、ＤＮＡトランスフェクションによって生成されたＰＣＶ２ウイルスの特徴づけおよび力価、ならびにＨｉｒｔ法による感染ＶＩＤＯ  Ｒ１細胞からの抽出を提供する。（Ａ）ＰＣＶ２特異的プライマーおよびＰＣＶ２感染細胞（レーン１）由来ＤＮＡ、および偽感染細胞（レーン２）由来ＤＮＡを用いたＰＣＲ。ＰＣＶ２ゲノムを含むプラスミドを、コントロールとして使用した（レーン３）。ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製の１ｋｂＤＮＡラダーを、レーンＭにロードした。（Ｂ）ＰＣＶ２感染細胞由来のウイルスＤＮＡ（レーン１、３および５）ならびに偽感染細胞由来のウイルスＤＮＡ（レーン２、４および６）を、ＮｃｏＩおよびＳｔｕＩ（レーン１および２）、ＥｃｏＲＩおよびＳｔｕＩ（レーン３および４）、ならびにＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ（レーン５および６）で消化した。ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製の１ｋｂ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡラダーをレーンＭにロードした。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、免疫ペルオキシダーゼ染色によるＰＣＶ２の力価を示す。７２ｈ．ｐ．ｉで、偽感染ＶＩＤＯ  Ｒ１細胞（Ａ）またはＰＣＶ２感染ＶＩＤＯ  ＲＩ細胞（Ｂ）を、ウサギ抗ＯＲＦ２ポリクローナル抗体およびビオチン化二次抗体と共にインキュベートした。アビジンおよびビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体の適用後、単層を、ジアミノベンジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）によって発色させた。１つの暗い細胞が、１つのウイルス粒子感染から生じた。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ａｆ０８６８３４に記載されるブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のヌクレオチド配列（Ａ）ならびにブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のＯＲＦ１（Ｂ）についてのアミノ酸配列およびＯＲＦ２（Ｃ）についてのアミノ酸配列を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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