(57)【要約】本発明はＶＲ系統群の新規遺伝子とポリペプチド、ＤＲＧにて発現されるｔｒｋＡ＋疼痛特異遺伝子の同定、および疼痛処置のための、また疼痛の処置に有用な作用因子の同定のためのこれら遺伝子およびポリペプチドの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含んでなる単離ＴＲＰＶ３核酸分子：
ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜７９１を含んでなるマウスＴＲＰＶ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２〜７９１を含んでなるマウスＴＲＰＶ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｃ）マウスＴＲＰＶ３タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号５のアミノ酸残基１〜７９１を含んでなるヒトＴＲＰＶ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号５のアミノ酸残基２〜７９１を含んでなるヒトＴＲＰＶ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｆ）ヒトＴＲＰＶ３タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
ｇ）ポリヌクレオチドａ）ないしｆ）の１つに相補性のポリヌクレオチド。
【請求項２】
核酸分子がポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項１記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項３】
核酸分子がポリリボ核酸（ＲＮＡ）である請求項１記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項４】
核酸分子がａ）またはｂ）であり、配列番号３に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる請求項１記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項５】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１のヌクレオチド６５〜２４４０に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である請求項４記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項６】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１のヌクレオチド６５〜２４４０に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに９０％以上同一である請求項４記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項７】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１のヌクレオチド６５〜２４４０に示したヌクレオチド配列を含んでなる請求項４記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項８】
核酸分子がｄ）またはｅ）であり、配列番号６に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる請求項１記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項９】
第一のポリヌクレオチドが配列番号４のヌクレオチド５７〜２４３２に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である請求項８記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項１０】
第一のポリヌクレオチドが配列番号４のヌクレオチド５７〜２４３２に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに９０％以上同一である請求項９記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項１１】
第一のポリヌクレオチドが配列番号４のヌクレオチド５７〜２４３２に示したヌクレオチド配列を含んでなる請求項９記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項１２】
核酸分子がｃ）またはｆ）であり、該ポリペプチドが以下のドメインからなる群より選択される１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなる請求項１記載のＴＲＰＶ３核酸分子：
ａ）アンキリンドメイン；
ｂ）膜貫通領域；
ｃ）細孔ループ領域；および
ｄ）多重らせんドメイン。
【請求項１３】
ポリペプチドが２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域を含んでなる請求項１２記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項１４】
ポリペプチドが４つのアンキリンドメインを含んでなる請求項１２記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項１５】
核酸分子がさらに異種核酸を含んでなる請求項１記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項１６】
異種核酸がＴＲＰＶ３ポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターを含んでなる請求項１５記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項１７】
異種核酸が発現ベクターを含んでなる請求項１５記載のＴＲＰＶ３核酸分子。
【請求項１８】
請求項１５記載のＴＲＰＶ３核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項１９】
以下のタンパク質またはドメインからなる群より選択されるタンパク質またはドメインを含んでなる単離ＴＲＰＶ３ポリペプチド：
ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜７９１を含んでなるマウスＴＲＰＶ３タンパク質；
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２〜７９１を含んでなるマウスＴＲＰＶ３タンパク質；
ｃ）マウスＴＲＰＶ３タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン；
ｄ）配列番号５のアミノ酸残基１〜７９１を含んでなるヒトＴＲＰＶ３タンパク質；
ｅ）配列番号５のアミノ酸残基２〜７９１を含んでなるヒトＴＲＰＶ３タンパク質；および
ｆ）ヒトＴＲＰＶ３タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン。
【請求項２０】
ＴＲＰＶ３ポリペプチドがｃ）またはｆ）であり、以下のドメインからなる群より選択される１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなる請求項１９記載のＴＲＰＶ３ポリペプチド：
ａ）アンキリンドメイン；
ｂ）膜貫通領域；
ｃ）細孔ループ領域；および
ｄ）多重らせんドメイン。
【請求項２１】
ポリペプチドが２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域を含んでなる請求項２０記載のＴＲＰＶ３ポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドが４つのアンキリンドメインを含んでなる請求項２０記載のＴＲＰＶ３ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１９記載のＴＲＰＶ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２４】
ＴＲＰＶ３の介在するカチオン膜通過を変調する作用因子の同定方法であって、以下の工程からなることを特徴とする方法：
ａ）請求項１９記載のＴＲＰＶ３ポリペプチドを含んでなる膜を提供する工程；
ｂ）該膜と候補作用因子とを接触させる工程；および
ｃ）１個以上のカチオンの膜通過が、候補作用因子の不存在下での通過に比べて、候補作用因子の存在下で増加するか否かを判断する工程。
【請求項２５】
膜が細胞から成り、カチオンの膜通過を細胞内への膜横断カチオン流入を測定することにより検出する請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、ＴＲＰＶ３ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターを含んでなる請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
カチオンの膜通過を電圧固定により検出することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
カチオンの膜通過をイオン感受性色素または膜電位色素により検出することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
アッセイを少なくとも３３℃の温度で実施することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
アッセイを５２℃未満の温度で実施することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
アッセイを４３℃未満の温度で実施することを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
多穴プレートのウエル内で膜と候補変調作用因子とを接触させることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
多穴プレートが９６穴、３８４穴または１５３６穴プレートである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
カチオン通過を低下させる候補作用因子につき、さらに疼痛処置能について試験するために、該候補作用因子を試験動物に投与し、該候補作用因子が疼痛刺激に対する動物の反応を低下させるか否かを判断することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３５】
疼痛刺激が３３℃以上の温度と接触することである請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
ＴＲＰＶ３活性の関る疼痛の低減方法であって、疼痛を有する被験者に対して、ＴＲＰＶ３の介在するカチオン膜通過を低減するか、またはＴＲＰＶ３ポリペプチドからＤＲＧニューロンへのシグナル伝達を低減する化合物の鎮痛有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項３７】
疼痛が熱との接触、炎症、または組織損傷の１種以上に付随するものである請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
化合物が以下に示す群から選択されるものである請求項３６記載の方法：
ａ）ＴＲＰＶ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体；
ｂ）ＴＲＰＶ３ポリペプチドの発現を低減するアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または妨害性ＲＮＡ；および
ｃ）ＴＲＰＶ３ポリペプチドを含んでなるカチオン膜通過低減化学物質。
【請求項３９】
化学物質が１０００ダルトン以下の分子量を有するものである請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
被験者の疼痛がＴＲＰＶ３の介在によるか否かを判断する方法であって、以下の工程を含んでなることを特徴とする方法：
ａ）被験者が痛みを感じる領域からサンプルを得る工程；および
ｂ）該サンプルにつき試験し、ＴＲＰＶ３ポリペプチドまたはＴＲＰＶ３ポリヌクレオチドがサンプル中に存在するか否かを判断する工程。
【請求項４１】
サンプル中の細胞の膜横断カチオン通過にＴＲＰＶ３ポリペプチドが介在しているか否かを判断することにより、サンプル中のＴＲＰＶ３ポリペプチドの存在を検出する請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
３３℃以上でアッセイした場合の細胞の膜横断カチオン通過の増加を３３℃以下でアッセイした場合のカチオン通過と比較して検出することにより、細胞の膜横断カチオン通過の仲介にＴＲＰＶ３が関与しているか否かを判断する請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＴＲＰＶ３ポリペプチドに特異的に結合する試薬と該サンプルとを接触させることにより、サンプル中のＴＲＰＶ３ポリペプチドの存在を検出する請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
試薬が抗体を含んでなる請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ＴＲＰＶ３ポリヌクレオチドにハイブリッド形成し得る試験ポリヌクレオチドとサンプルからの核酸とを接触させることにより、サンプル中のＴＲＰＶ３ポリヌクレオチドの存在を検出する請求項４０記載の方法。
【請求項４６】
試験ポリヌクレオチドが少なくともヌクレオチド１０個の長さのオリゴヌクレオチドを含んでなる請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
方法が、ＴＲＰＶ３ポリヌクレオチドがサンプル中に存在する場合、それを増幅することからなる請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応からなる請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
試験ポリヌクレオチドが固形支持体に付着しているものである請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
固形支持体がマイクロチップを含んでなる請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
以下のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含んでなる単離ＴＲＰＶ４核酸分子：
ａ）配列番号１４のアミノ酸残基１〜８７１を含んでなるマウスＴＲＰＶ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１４のアミノ酸残基２〜８７１を含んでなるマウスＴＲＰＶ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｃ）マウスＴＲＰＶ４タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１〜８７１を含んでなるヒトＴＲＰＶ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基２〜８７１を含んでなるヒトＴＲＰＶ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｆ）ヒトＴＲＰＶ４タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
ｇ）ポリヌクレオチドａ）ないしｆ）の１つに相補性のポリヌクレオチド。
【請求項５２】
核酸分子がポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項５１記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項５３】
核酸分子がポリリボ核酸（ＲＮＡ）である請求項５１記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項５４】
核酸分子がａ）またはｂ）であり、配列番号１５に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる請求項５１記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項５５】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１３のヌクレオチド１５６〜２７７１に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である請求項５４記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項５６】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１３のヌクレオチド１５６〜２７７１に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに９０％以上同一である請求項５４記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項５７】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１３のヌクレオチド１５６〜２７７１に示したヌクレオチド配列を含んでなる請求項５６記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項５８】
核酸分子がｄ）またはｅ）であり、配列番号１８に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる請求項５１記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項５９】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１６に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である請求項５８記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項６０】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１６に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに９０％以上同一である請求項５８記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項６１】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１６に示したヌクレオチド配列を含んでなる請求項６０記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項６２】
核酸分子がｃ）またはｆ）であり、該ポリペプチドが以下のドメインからなる群より選択される１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなる請求項５１記載のＴＲＰＶ４核酸分子：
ａ）アンキリンドメイン；
ｂ）膜貫通領域；
ｃ）細孔ループ領域；および
ｄ）多重らせんドメイン。
【請求項６３】
ポリペプチドが２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域を含んでなる請求項６２記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項６４】
ポリペプチドが３つのアンキリンドメインを含んでなる請求項６２記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項６５】
核酸分子がさらに異種核酸を含んでなる請求項５１記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項６６】
異種核酸がＴＲＰＶ４ポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターを含んでなる請求項６５記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項６７】
異種核酸が発現ベクターを含んでなる請求項６５記載のＴＲＰＶ４核酸分子。
【請求項６８】
請求項６５記載のＴＲＰＶ４核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項６９】
以下のタンパク質またはドメインからなる群より選択されるタンパク質またはドメインを含んでなる単離ＴＲＰＶ４ポリペプチド：
ａ）配列番号１４のアミノ酸残基１〜８７１を含んでなるマウスＴＲＰＶ４タンパク質；
ｂ）配列番号１４のアミノ酸残基２〜８７１を含んでなるマウスＴＲＰＶ４タンパク質；
ｃ）マウスＴＲＰＶ４タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン；
ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１〜８７１を含んでなるヒトＴＲＰＶ４タンパク質；
ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基２〜８７１を含んでなるヒトＴＲＰＶ４タンパク質；および
ｆ）ヒトＴＲＰＶ４タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン。
【請求項７０】
ペプチドがｃ）またはｆ）であり、以下のドメインからなる群より選択される１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなる請求項６９記載のＴＲＰＶ４ポリペプチド：
ａ）アンキリンドメイン；
ｂ）膜貫通領域；
ｃ）細孔ループ領域；および
ｄ）多重らせんドメイン。
【請求項７１】
ポリペプチドが２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域を含んでなる請求項７０記載のＴＲＰＶ４ポリペプチド。
【請求項７２】
ポリペプチドが３つのアンキリンドメインを含んでなる請求項７０記載のＴＲＰＶ４ポリペプチド。
【請求項７３】
請求項６９記載のＴＲＰＶ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項７４】
ＴＲＰＶ４の介在するカチオン膜通過を変調する作用因子の同定方法であって、以下の工程からなることを特徴とする方法：
ａ）請求項６９記載のＴＲＰＶ４ポリペプチドを含んでなる膜を提供する工程；
ｂ）該膜と候補作用因子とを接触させる工程；および
ｃ）１個以上のカチオンの膜通過が、候補作用因子の不存在下での通過に比べて、候補作用因子の存在下で増加するか否かを判断する工程。
【請求項７５】
膜が細胞から成り、カチオンの膜通過は細胞内への膜横断カチオン流入を測定することにより検出する請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
細胞が、ＴＲＰＶ４ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターを含んでなる請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
カチオンの膜通過を電圧クランピングにより検出することを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７８】
カチオンの膜通過をイオン感受性色素または膜電位色素により検出することを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７９】
多穴プレートのウエル内で膜と候補変調作用因子とを接触させることを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項８０】
多穴プレートが９６穴、３８４穴または１５３６穴プレートである請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
カチオン通過を低下させる候補作用因子につき、さらに疼痛処置能について試験するために、該候補作用因子を試験動物に投与し、該候補作用因子が疼痛刺激に対する動物の反応を低下させるか否かを判断することを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項８２】
疼痛が末梢神経障害痛である請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
ＴＲＰＶ４活性の関る疼痛の低減方法であって、疼痛を有する被験者に対して、ＴＲＰＶ４の介在するカチオン膜通過を低減するか、またはＴＲＰＶ４ポリペプチドからＤＲＧニューロンへのシグナル伝達を低減する化合物の鎮痛有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項８４】
疼痛が末梢神経障害痛である請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
化合物が以下に示す群から選択されるものである請求項８３記載の方法：
ａ）ＴＲＰＶ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体；
ｂ）ＴＲＰＶ４ポリペプチドの発現を低減するアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または妨害性ＲＮＡ；および
ｃ）ＴＲＰＶ４ポリペプチドを含んでなるカチオン膜通過低減化学物質。
【請求項８６】
化学物質が１０００ダルトン以下の分子量を有するものである請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
被験者の疼痛がＴＲＰＶ４の介在によるか否かを判断する方法であって、以下の工程を含んでなることを特徴とする方法：
ａ）患者が痛みを感じる領域からサンプルを得る工程；および
ｂ）該サンプルにつき試験し、ＴＲＰＶ４ポリペプチドまたはＴＲＰＶ４ポリヌクレオチドがサンプル中に存在するか否かを判断する工程。
【請求項８８】
サンプル中の細胞の膜横断カチオン通過にＴＲＰＶ４ポリペプチドが介在しているか否かを判断することにより、サンプル中のＴＲＰＶ４ポリペプチドの存在を検出する請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
ＴＲＰＶ４ポリペプチドに特異的に結合する試薬と該サンプルとを接触させることにより、サンプル中のＴＲＰＶ４ポリペプチドの存在を検出する請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
試薬が抗体を含んでなる請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
ＴＲＰＶ４ポリヌクレオチドにハイブリッド形成し得る試験ポリヌクレオチドとサンプルからの核酸とを接触させることにより、サンプル中のＴＲＰＶ４ポリヌクレオチドの存在を検出する請求項８７記載の方法。
【請求項９２】
試験ポリヌクレオチドが少なくともヌクレオチド１０個の長さのオリゴヌクレオチドを含んでなる請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
方法が、ＴＲＰＶ４ポリヌクレオチドがサンプル中に存在する場合、それを増幅することからなる請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応からなる請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
試験ポリヌクレオチドが固形支持体に付着しているものである請求項９１記載の方法。
【請求項９６】
固形支持体がマイクロチップを含んでなる請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
以下のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含んでなる単離ＴＲＰＭ８核酸分子：
ａ）配列番号８のアミノ酸残基１〜１１０４を含んでなるマウスＴＲＰＭ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号８のアミノ酸残基２〜１１０４を含んでなるマウスＴＲＰＭ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｃ）マウスＴＲＰＭ８タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号１１のアミノ酸残基１〜１２６８を含んでなるヒトＴＲＰＭ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｅ）配列番号１１のアミノ酸残基２〜１２６８を含んでなるヒトＴＲＰＭ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｆ）ヒトＴＲＰＭ８タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
ｇ）ポリヌクレオチドａ）ないしｆ）の１つに相補性のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
核酸分子がポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項９７記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項９９】
核酸分子がポリリボ核酸（ＲＮＡ）である請求項９７記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１００】
核酸分子がａ）またはｂ）であり、配列番号９に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる請求項９７記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１０１】
第一のポリヌクレオチドが配列番号７のヌクレオチド４４８〜３７６２に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である請求項１００記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１０２】
第一のポリヌクレオチドが配列番号７のヌクレオチド４４８〜３７６２に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに９０％以上同一である請求項１００記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１０３】
第一のポリヌクレオチドが配列番号７のヌクレオチド４４８〜３７６２に示したヌクレオチド配列を含んでなる請求項１０２記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１０４】
核酸分子がｄ）またはｅ）であり、配列番号１２に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる請求項９７記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１０５】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１０のヌクレオチド６１〜４８２１に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である請求項１０４記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１０６】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１０のヌクレオチド６１〜４８２１に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに９０％以上同一である請求項１０４記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１０７】
第一のポリヌクレオチドが配列番号１０のヌクレオチド６１〜４８２１に示したヌクレオチド配列を含んでなる請求項１０６記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１０８】
核酸分子がｃ）またはｆ）であり、該ポリペプチドが以下のドメインからなる群より選択される１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなる請求項９７記載のＴＲＰＭ８核酸分子：
ａ）膜貫通領域；
ｂ）細孔ループ領域；および
ｃ）多重らせんドメイン。
【請求項１０９】
ポリペプチドが２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域を含んでなる請求項１０８記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１１０】
核酸分子がさらに異種核酸を含んでなる請求項９７記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１１１】
異種核酸がＴＲＰＭ８ポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターを含んでなる請求項１１０記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１１２】
異種核酸が発現ベクターを含んでなる請求項１１０記載のＴＲＰＭ８核酸分子。
【請求項１１３】
請求項９７記載のＴＲＰＭ８核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項１１４】
以下のタンパク質またはドメインからなる群より選択されるタンパク質またはドメインを含んでなる単離ＴＲＰＭ８ポリペプチド：
ａ）配列番号８のアミノ酸残基１〜１１０４を含んでなるマウスＴＲＰＭ８タンパク質；
ｂ）配列番号８のアミノ酸残基２〜１１０４を含んでなるマウスＴＲＰＭ８タンパク質；
ｃ）マウスＴＲＰＭ８タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン；
ｄ）配列番号１１のアミノ酸残基１〜１２６８を含んでなるヒトＴＲＰＭ８タンパク質；
ｅ）配列番号１１のアミノ酸残基２〜１２６８を含んでなるヒトＴＲＰＭ８タンパク質；および
ｆ）ヒトＴＲＰＭ８タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン。
【請求項１１５】
核酸分子がｃ）またはｆ）であり、機能的ドメインが以下の群より選択される１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなる請求項１１４記載のＴＲＰＭ８ポリペプチド：
ａ）膜貫通領域；
ｂ）細孔ループ領域；および
ｃ）多重らせんドメイン。
【請求項１１６】
ポリペプチドが２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域を含んでなる請求項１１５記載のＴＲＰＭ８ポリペプチド。
【請求項１１７】
請求項１１４記載のＴＲＰＭ８ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１１８】
ＴＲＰＭ８の介在するカチオン膜通過を変調する作用因子の同定方法であって、以下の工程からなることを特徴とする方法：
ａ）請求項１１４記載のＴＲＰＭ８ポリペプチドを含んでなる膜を提供する工程；
ｂ）該膜と候補作用因子とを接触させる工程；および
ｃ）１個以上のカチオンの膜通過が、候補作用因子の不存在下での通過に比べて、候補作用因子の存在下で増加するか否かを判断する工程。
【請求項１１９】
膜が細胞から成り、カチオンの膜通過は細胞内への膜横断カチオン流入を測定することにより検出する請求項１１８記載の方法。
【請求項１２０】
細胞が、ＴＲＰＭ８ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーターを含んでなる請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】
カチオンの膜通過を電圧クランピングにより検出することを特徴とする請求項１１８記載の方法。
【請求項１２２】
カチオンの膜通過をイオン感受性色素または膜電位色素により検出することを特徴とする請求項１１８記載の方法。
【請求項１２３】
多穴プレートのウエル内で膜と候補変調作用因子とを接触させることを特徴とする請求項１１８記載の方法。
【請求項１２４】
多穴プレートが９６穴、３８４穴または１５３６穴プレートである請求項１２３記載の方法。
【請求項１２５】
アッセイ法がＴＲＰＭ８仲介カチオン通過のアンタゴニストを同定するためのものであり、２０℃未満の温度で、および／またはメントールの存在下に実施することを特徴とする請求項１１８記載の方法。
【請求項１２６】
カチオン通過を低下させる候補作用因子につき、さらに疼痛処置能について試験するために、該候補作用因子を試験動物に投与し、該候補作用因子が疼痛刺激に対する動物の反応を低下させるか否かを判断することを特徴とする請求項１２５記載の方法。
【請求項１２７】
疼痛刺激が冷温である請求項１２６記載の方法。
【請求項１２８】
アッセイ法がＴＲＰＭ８仲介カチオン通過のアゴニストを同定するためのものであり、２０℃を超える温度で実施することを特徴とする請求項１１８記載の方法。
【請求項１２９】
ＴＲＰＭ８仲介カチオン通過のアゴニストが芳香または香料増強剤として使用されるものである請求項１２８記載の方法。
【請求項１３０】
ＴＲＰＭ８活性の関る疼痛の低減方法であって、疼痛を有する被験者に対して、ＴＲＰＭ８の介在するカチオン膜通過を低減するか、またはＴＲＰＭ８ポリペプチドからＤＲＧニューロンへのシグナル伝達を低減する化合物の鎮痛有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１３１】
疼痛が冷温との接触、炎症、または組織損傷の１種以上に付随するものである請求項１３０記載の方法。
【請求項１３２】
化合物が以下に示す群から選択されるものである請求項１３０記載の方法：
ａ）ＴＲＰＭ８ポリペプチドに特異的に結合する抗体；
ｂ）ＴＲＰＭ８ポリペプチドの発現を低減するアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または妨害性ＲＮＡ；および
ｃ）ＴＲＰＭ８ポリペプチドを含んでなるカチオン膜通過低減化学物質。
【請求項１３３】
化学物質が１０００ダルトン以下の分子量を有するものである請求項１３２記載の方法。
【請求項１３４】
被験者の疼痛がＴＲＰＭ８の介在によるか否かを判断する方法であって、以下の工程を含んでなることを特徴とする方法：
ａ）患者が痛みを感じる領域からサンプルを得る工程；および
ｂ）該サンプルにつき試験し、ＴＲＰＭ８ポリペプチドまたはＴＲＰＭ８ポリヌクレオチドがサンプル中に存在するか否かを判断する工程。
【請求項１３５】
サンプル中の細胞の膜横断カチオン通過にＴＲＰＭ８ポリペプチドが介在しているか否かを判断することにより、サンプル中のＴＲＰＭ８ポリペプチドの存在を検出する請求項１３４記載の方法。
【請求項１３６】
２０℃以下および／またはメントールの存在下にアッセイした場合の細胞の膜横断カチオン通過の増加を、２０℃以上および／またはメントールの不存在下にアッセイした場合のカチオン通過と比較して検出することにより、細胞の膜横断カチオン通過の仲介にＴＲＰＭ８が関与することを判断する請求項１３５記載の方法。
【請求項１３７】
ＴＲＰＭ８ポリペプチドに特異的に結合する試薬と該サンプルとを接触させることにより、サンプル中のＴＲＰＭ８ポリペプチドの存在を検出する請求項１３４記載の方法。
【請求項１３８】
試薬が抗体を含んでなる請求項１３７記載の方法。
【請求項１３９】
ＴＲＰＭ８ポリヌクレオチドにハイブリッド形成し得る試験ポリヌクレオチドとサンプルからの核酸とを接触させることにより、サンプル中のＴＲＰＭ８ポリヌクレオチドの存在を検出する請求項１３４記載の方法。
【請求項１４０】
試験ポリヌクレオチドが少なくともヌクレオチド１０個の長さのオリゴヌクレオチドを含んでなる請求項１３９記載の方法。
【請求項１４１】
方法が、ＴＲＰＭ８ポリヌクレオチドがサンプル中に存在する場合、それを増幅することからなる請求項１３９記載の方法。
【請求項１４２】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応からなる請求項１４１記載の方法。
【請求項１４３】
試験ポリヌクレオチドが固形支持体に付着しているものである請求項１３９記載の方法。
【請求項１４４】
固形支持体がマイクロチップを含んでなる請求項１４３記載の方法。
【請求項１４５】
哺乳動物の知覚反応の変調に有用な作用因子を同定する方法であって、以下の工程を含んでなることを特徴とする方法：
ａ）ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４からなる群より選択されるレセプターポリペプチドを含んでなる試験系と候補作用因子とを接触させる工程；および
ｂ）候補作用因子の存在下でのレセプターポリペプチドの活性と、候補作用因子の不存在下でのレセプターポリペプチドの活性とを比較して、その変化を検出し、それによってレセプター活性を変調させる作用因子を同定する工程。
【請求項１４６】
知覚反応が冷温に対する反応であり、ポリペプチドがＴＲＰＭ８ポリペプチドである請求項１４５記載の方法。
【請求項１４７】
ＴＲＰＭ８ポリペプチドが配列番号８または配列番号１１に示したアミノ酸配列を含んでなる請求項１４６記載の方法。
【請求項１４８】
知覚反応が暖温または熱温に対する反応であり、ポリペプチドがＴＲＰＶ３ペプチドである請求項１４５記載の方法。
【請求項１４９】
ＴＲＰＶ３ポリペプチドが配列番号２または配列番号５に示したアミノ酸配列を含んでなる請求項１４８記載の方法。
【請求項１５０】
知覚反応が末梢神経障害痛であり、ポリペプチドがＴＲＰＶ４ポリペプチドである請求項１４５記載の方法。
【請求項１５１】
ＴＲＰＶ４ポリペプチドが配列番号１４または配列番号１７に示したアミノ酸配列を含んでなる請求項１５０記載の方法。
【請求項１５２】
レセプター活性を変調する作用因子を投与し、その後に試験被験者の知覚反応の変化を検出することをさらに含む請求項１４５記載の方法。
【請求項１５３】
試験系がレセプターポリペプチドからなる膜を含んでなる請求項１４５記載の方法。
【請求項１５４】
試験系がレセプターポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを発現する細胞を含んでなる請求項１５３記載の方法。
【請求項１５５】
細胞が実質的に単離されたものであり、その接触をインビトロで実施する請求項１５４記載の方法。
【請求項１５６】
細胞が生体に存在するものであり、その接触をインビボで実施する請求項１５４記載の方法。
【請求項１５７】
レセプター活性が、レセプターポリペプチドを含んでなる膜のＣａ２＋通過の増加または減少することからなるものである請求項１４５記載の方法。
【請求項１５８】
膜が実質的に精製された細胞膜である請求項１５７記載の方法。
【請求項１５９】
膜がリポソームからなる請求項１５７記載の方法。
【請求項１６０】
疼痛を有する被験者の処置有効性をモニターする方法であって、以下の工程を含んでなることを特徴とする方法：
ａ）疼痛処置途上の２以上の時点で、患者が疼痛を知覚する領域からサンプルを採取する工程；および
ｂ）当該サンプルを試験し、一時点から他の時点まで、ＴＲＰＶ３ポリペプチド、ＴＲＰＶ３ｍＲＮＡ、ＴＲＰＶ４ポリペプチド、ＴＲＰＶ４ｍＲＮＡ、ＴＲＰＭ８ポリペプチド、およびＴＲＰＭ８ｍＲＮＡからなる群より選択される１種以上の量または活性の減少が観察されるか否かを判断する工程。
【請求項１６１】
一方の時点が疼痛処置投与前である請求項１６０記載の方法。
【請求項１６２】
ヒト組織におけるＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８の１種以上の発現を検出し得るアッセイ法であって、以下の群から選択されるアッセイ法：
ａ）ヒト組織サンプルと、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８に結合するモノクローナル抗体とを接触させ、該抗体がサンプル中のポリペプチドに結合するか否かを判断することからなるアッセイ法；および
ｂ）ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８をコードする核酸にハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチドと、ヒト組織サンプルとを接触させることからなるアッセイ法。
【請求項１６３】
アッセイ法が、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８をコードする核酸にハイブリッド形成し得る一対のオリゴヌクレオチドと、ヒト組織サンプルとを接触させ、該サンプルをポリメラーゼ連鎖反応に付すことからなる請求項１６２記載のアッセイ法。
【請求項１６４】
アッセイ法が、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８をコードする核酸にハイブリッド形成し得る１種以上のオリゴヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列と、ヒト組織サンプルとを接触させることからなる請求項１６２記載のアッセイ法。
【請求項１６５】
ヒト組織サンプルが疼痛部位から得たものである請求項１６２記載のアッセイ法。
【請求項１６６】
疼痛の処置方法であって、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８からなる群より選択される１種以上のポリペプチドが介在する疼痛を有する患者を、かかる患者組織中のポリペプチドの発現を測定することにより確認し、かかる患者に該ポリペプチドを阻害する作用因子の鎮痛有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１６７】
疼痛処置に有用な作用因子を同定する方法であって、以下の工程を含んでなることを特徴とする方法：
ａ）疼痛を有する哺乳動物に候補作用因子を投与する工程；
ｂ）哺乳動物から得たサンプル中に、ＴＲＰＶ３ポリペプチド、ＴＲＰＶ３ｍＲＮＡ、ＴＲＰＶ４ポリペプチド、ＴＲＰＶ４ｍＲＮＡ、ＴＲＰＭ８ポリペプチド、およびＴＲＰＭ８ｍＲＮＡからなる群より選択される１種以上のメンバーの活性または量を検出する工程；および
ｃ）候補作用因子存在下の該メンバーの量または活性と、候補作用因子不存在下で哺乳動物から得られるサンプル中のメンバーの量または活性とを比較し、その場合に、候補作用因子不存在下での量または活性に比較して、候補作用因子存在下の該メンバーの量または活性が低下した場合、当該作用因子を疼痛処置に有用なものであるとする工程。
【請求項１６８】
ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８核酸がコードするｍＲＮＡまたはポリペプチドに結合するか、またはその活性を変調する作用因子を同定する方法であって、以下の工程を含んでなることを特徴とする方法：
ａ）ポリペプチドをコードする異種ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８核酸を発現する単離細胞と、作用因子とを接触させる工程；および
ｂ）該作用因子が該ｍＲＮＡまたはポリペプチドに結合するか、またはその活性を変調すかを判断し、当該ポリペプチドと結合するか、および／またはその活性を変調する作用因子を同定する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は２００１年６月１３日出願の米国仮出願番号６０／２９７,８３５、２００２年１月２２日出願の米国仮出願番号６０／３５１,２３８、２００２年１月２９日出願の米国仮出願番号６０／３５２,９１４、２００２年２月１２日出願の米国仮出願番号６０／３５７,１６１、２００２年５月１５日出願の米国仮出願番号６０／３８１,０８６、および２００２年５月１６日出願の米国仮出願番号６０／３８１,７３９の利益を主張するものである。これらの出願はすべてについて参照により本明細書の一部とする。
【０００２】
著作権通告
３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.１.７１（ｅ）に準拠し、本特許文書の一部は著作権保護の対象となる資料を含んでいる。著作権者は本特許文書または特許開示について、それが特許庁の特許ファイルまたは記録にある限り、だれかがそのファクシミリを複製することに異議を申し立てるものではないが、その他の如何なる場合にもすべての著作権は著作権者に所属する。
【０００３】
発明の背景
発明の分野
本発明は新規バニロイドレセプター（ＶＲ）関連核酸およびポリペプチドに関する。より詳しくは、本発明は既知ＶＲの同族タンパク質、かかるタンパク質をコードする核酸、ｔｒｋＡ＋疼痛特異遺伝子、およびこれら遺伝子およびポリペプチドの疼痛診断法における使用、疼痛処置に有用な化合物の同定法、および疼痛処置法に関する。
【０００４】
背景
疼痛は接触、圧迫、熱および冷温の感覚と区別される神経組織が感知する知覚経験と定義されている。痛みを感じた個々人はその痛みを概して、鋭い、鈍い、ピンと張るような、刺すような、切るような、焼くようななどの表現で記載する。異なる個体によって感覚に幅があり、痛みの知覚に変動があるため、疼痛の正確な定義は難しい。しかし、苦痛となる程の痛みは、一般に、最初の感覚とその感覚に対する反応の両方によるものと考えられる。痛みが侵害受容器の刺激から始まって無傷の神経経路に伝達された場合に、それを侵害受容疼痛と呼ぶ。あるいは、疼痛は神経構造の損傷を原因とすることもあり、多くの場合、神経過敏として現れるが、それを末梢神経障害性疼痛という。
【０００５】
末梢神経障害性疼痛は特別のタイプの疼痛であり、複雑かつ変化し易い病因を有する。一般には慢性の症状で、神経の全体もしくは部分的長軸切断または神経叢もくは軟組織への損傷に起因する。この症状は知覚過敏（自然の刺激に対し感応性上昇）、痛覚過敏（疼痛に対し異常な感応性）、異痛症（広範囲に敏感、触覚刺激に対する過敏症を特徴とする）および／または自然発生的灼熱痛を特徴とする。ヒトにおける末梢神経障害性疼痛は慢性化し、衰弱させる傾向があり、三叉神経痛、糖尿病性末梢神経障害、帯状疱疹後神経痛、後期癌、切断手術、または物理的神経傷害などに際して起こる。
【０００６】
常套のオピオイドおよび抗うつ剤などの殆どの薬物は末梢神経障害性疼痛などの慢性的疼痛に対して実用的ではない、その理由はそれらが有効ではないか、または深刻な副作用を有するからである。そのような理由のために、慢性または末梢神経障害性疼痛を管理する代替療法が広く求められている。
【０００７】
熱、冷温、伸張、および圧迫などの刺激は背根（ＤＲＧ）内の特殊化した知覚ニューロンにより検出される。これらのニューロンはこれら機械的および熱刺激に応答して活動電位に点火するが、かかる検知の分子メカニズムは未知である。最近、２つのチャンネル、すなわちバニロイドレセプター１（ＶＲ１）およびバニロイドレセプター様タンパク質１（ＶＲＬ１）がＤＲＧから単離されたが、これらが異なる閾値の高熱に反応して、その結果疼痛レセプターとして作用する。これらのチャンネルはＴＲＰチャンネル群に属し、Ｃエレガンス（C. elegans）およびＤメラノガスター（D. melanogaster）において機械的および浸透圧制御に関与する。
【０００８】
ＶＲ１は６種の膜貫通ドメインと１つの推定細孔ドメインをもつカルシウムチャンネルである。このチャンネルは多くの異なる試剤、例えば、熱、低ｐＨ（高濃度プロトンが傷害および炎症に際し存在する）およびカプサイシン（チリ唐辛子の有効成分）などにより活性化される。マウスのＶＲ１をノックアウトすることにより、このチャンネルが疼痛の伝播に役割を果たすことが示された；しかし、表現型はむしろ敏感であるため、ＶＲ１が高熱と疼痛に対する唯一のレセプターではないことも暗示する。今日まで、もう一つのＶＲ１が哺乳動物において知られている−ＶＲＬ１。ＶＲＬ−１は構造的にＶＲ１に非常によく似ているが、（ＶＲ１とは対照的に）疼痛受容に関与しないＤＲＧニューロン上に発現される。
【０００９】
体細胞知覚ニューロンは、熱、冷温、有害刺激などの外界からの刺激を、熱および機械的レセプター／チャンネルの活性化を経て検知する。ＶＲ系統群はかかる活性化許容能をもつＤＲＧ内で発現される分子の最初の例示である。これらの分子は知覚ニューロンに対し比較的特異的であるため（例えば、ＶＲ１ノックアウトマウスは疼痛認知以外の表現型をもたない）、疼痛または他の熱有害刺激に対する薬物開発の恰好の目標である。ＶＲ１ノックアウトマウスは疼痛の認知に他の分子が関与しなければならないことを証明している。しかし、この分類のレセプターに関しては多大な興味が科学界に生じているにもかかわらず、これまでこの分類の他のレセプターは確認されていない。
【００１０】
疼痛の認知におけるＶＲメンバーの役割に鑑みて、新しいメンバーのＶＲを同定するならば、これらの新しいＴＲＰチャンネルを遮断するように特別に設計した治療候補の開発が可能となるであろうし、それが慢性の疼痛と関連する種々の疾患の処置を可能とするであろう。さらに、新しいメンバーのＶＲを同定するならば、種々の薬物をスクリーニングにかけ、それを治療に適用するためのさらに綿密な研究に適した化合物の同定も可能となるであろう。
【００１１】
発明の要約
本発明はＶＲ系統群のメンバー、とりわけ、ＴＲＰＶ３（以前にはＶＲＬＳ、ＶＲＬＸ、ＶＲ４およびＴＲＰＶ７として知られる）、ＴＲＰＶ４（以前はＶＲＬ３およびＯＴＲＰＣ４として知られる）およびＴＲＰＭ８（以前はＴＲＰＸとして知られる）の核酸類、ポリペプチド類、組換え物質およびその製造法に関する。もう一つの側面で、本発明はＤＲＧにて発現されるｔｒｋＡ＋疼痛特異遺伝子の同定に関する。さらにもう一つの側面において、本発明はＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＭ８およびｔｒｋＡ＋疼痛特異核酸とポリペプチドの使用方法、例えば、疼痛、炎症、皮膚病および癌の処置法、疼痛、炎症、皮膚病および癌の診断方法、疼痛、炎症、皮膚病および癌の処置において、また疼痛、炎症、皮膚病および癌の処置のための有効性をモニターする方法において有用な作用因子を同定する方法に関する。
【００１２】
ＴＲＰＶ３
本発明は単離および／または精製したＴＲＰＶ３核酸分子に関し、例えば、ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜７９１を含んでなるマウスＴＲＰＶ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２〜７９１を含んでなるマウスＴＲＰＶ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｃ）マウスＴＲＰＶ３タンパク質の機能的ドメインをコードするポリヌクレオチド；ｄ）配列番号５のアミノ酸残基１〜７９１を含んでなるヒトＴＲＰＶ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｅ）配列番号５のアミノ酸残基２〜７９１を含んでなるヒトＴＲＰＶ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｆ）ヒトＴＲＰＶ３タンパク質の機能的ドメインをコードするポリヌクレオチド；およびｇ）ポリヌクレオチドａ）ないしｆ）の１つに相補性のポリヌクレオチド；を提供する。一部の態様において、該核酸分子はａ）またはｂ）であり、配列番号３に示したヌクレオチド配列（マウスＴＲＰＶ３）を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなるか、またはｄ）またはｅ）であり、配列番号６に示したヌクレオチド配列（ヒトＴＲＰＶ３）を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる。該核酸は配列番号３または配列番号６に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに９０％以上または９５％以上同一であるか、またはそれぞれのポリヌクレオチドに一致し得る。本発明ＴＲＰＶ３核酸の例としては、配列番号１のヌクレオチド６５〜２４４０に示したヌクレオチド配列（マウスＴＲＰＶ３）またはポリヌクレオチドが配列番号４のヌクレオチド５７〜２４３２に示したヌクレオチド配列（ヒトＴＲＰＶ３）を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上、９０％以上、または９５％以上同一である。
【００１３】
本発明はまた哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）のＴＲＰＶ３ポリペプチドの１またはそれ以上の機能的ドメインを含むポリペプチドをコードする単離ＴＲＰＶ３核酸分子を提供する。これらの核酸分子がコードするポリペプチドは、例えば、アンキリンドメイン、膜貫通領域、細孔ループ領域、および多重らせんドメインなどの１またはそれ以上の機能的ドメインを含み得る。例示として、該ポリペプチドは２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域、および／または４つのアンキリンドメインを含み得る。
【００１４】
また、本発明が提供するのは、単離および／または精製したＴＲＰＶ３ポリペプチドである。かかるポリペプチドは、例えば、ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜７９１を含んでなるマウスＴＲＰＶ３タンパク質；ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２〜７９１を含んでなるマウスＴＲＰＶ３タンパク質；ｃ）マウスＴＲＰＶ３タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン；ｄ）配列番号５のアミノ酸残基１〜７９１を含んでなるヒトＴＲＰＶ３タンパク質；ｅ）配列番号５のアミノ酸残基２〜７９１を含んでなるヒトＴＲＰＶ３タンパク質；およびｆ）ヒトＴＲＰＶ３タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン；である。例えば、ＴＲＰＶ３ポリペプチドは、アンキリンドメイン、膜貫通領域、細孔ループ領域、および多重らせんドメインからなる群より選択される１またはそれ以上の機能的ドメインを含み得る。一部の態様において、該ポリペプチドは２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域、および／または４つのアンキリンドメインを含む。
【００１５】
本発明はまた、ＴＲＰＶ３の介在するカチオン膜通過を変調する作用因子の同定方法を提供する。当該方法は、ａ）ＴＲＰＶ３ポリペプチドを含んでなる膜を提供する工程；ｂ）該膜と候補作用因子とを接触させる工程；およびｃ）１個以上のカチオンの膜通過が、候補作用因子の不存在下での通過に比べて、候補作用因子の存在下では増加するか否かを判断する工程；からなる。一部態様において、該膜は細胞膜であり、カチオン膜通過は細胞内へまたは細胞外へ膜を横断するカチオンの流入または流出を測定することにより検出する。アッセイは、一部の態様において、少なくとも３３℃の温度で実施する。さらに提供するのは、カチオン通過を低下させる候補作用因子につき、さらに疼痛処置能について試験するために、該候補作用因子を試験動物に投与し、該候補作用因子が疼痛刺激に対する動物の反応を低下させるか否かを判断することを特徴とする方法である。疼痛刺激は、例えば、３３℃以上の温度と接触することである。
【００１６】
本発明はまたＴＲＰＶ３活性の関る疼痛の低減方法を提供する。該方法は疼痛を有する被験者に対して、ＴＲＰＶ３の介在するカチオン膜通過を低減するか、またはＴＲＰＶ３ポリペプチドからＤＲＧニューロンへのシグナル伝達を低減する化合物の鎮痛有効量を投与することからなる。疼痛とは、例えば、熱との接触、炎症、または組織損傷の１種以上によるものである。適切な化合物は、例えば、ＴＲＰＶ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体；ＴＲＰＶ３ポリペプチドの発現を低減するアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または妨害性ＲＮＡ；およびＴＲＰＶ３ポリペプチドを含んでなるカチオン膜通過低減化学物質などである。
【００１７】
本発明はまた被験者の疼痛がＴＲＰＶ３の介在によるか否かを判断する方法を提供する。当該方法は、患者が痛みを感じる領域からサンプルを得る工程；および該サンプルにつき試験し、ＴＲＰＶ３ポリペプチドまたはＴＲＰＶ３ポリヌクレオチドがサンプル中に存在するか、および／または活性であるかを判断する工程からなる。一部の態様においては、サンプル中の細胞の膜横断カチオン通過にＴＲＰＶ３ポリペプチドが介在しているか否かを判断することにより、サンプル中のＴＲＰＶ３ポリペプチドの存在を検出する。例えば、３３℃以上でアッセイした場合の細胞の膜横断カチオン通過の増加を３３℃以下でアッセイした場合のカチオン通過と比較して検出することにより、細胞の膜横断カチオン通過の仲介にＴＲＰＶ３が関与することを判断する。カチオン通過の仲介におけるＴＲＰＶ３の関与と、他のイオンチャンネルの関与とを区別するために（例えば、ＴＲＰＶ１またはＴＲＰＶ２）、ＴＲＰＶ３の活性化閾値を超える温度ではあるが、他のレセプターの活性化閾値を下回る温度でアッセイを実施し得る（例えば、ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＶ２に対して、それぞれ約４３℃以下、または約５２℃以下）。ＴＲＰＶ３仲介イオンチャンネル活性についてアッセイするための代替法として、ＴＲＰＶ３ポリペプチドに特異的に結合する試薬とサンプルとを接触させることによりＴＲＰＶ３ポリペプチドの存在を検出するか、またはサンプルからの核酸をＴＲＰＶ３ポリヌクレオチドにハイブリッド形成し得る試験ポリヌクレオチドと接触させることによりＴＲＰＶ３ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
【００１８】
ＴＲＰＶ４
本発明はまた単離ＴＲＰＶ４核酸分子をも提供する。これらの分子は、例えば、ａ）配列番号１４のアミノ酸残基１〜８７１を含んでなるマウスＴＲＰＶ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｂ）配列番号１４のアミノ酸残基２〜８７１を含んでなるマウスＴＲＰＶ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｃ）マウスＴＲＰＶ４タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１〜８７１を含んでなるヒトＴＲＰＶ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基２〜８７１を含んでなるヒトＴＲＰＶ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｆ）ヒトＴＲＰＶ４タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；およびｇ）ポリヌクレオチドａ）ないしｆ）の１つに相補性のポリヌクレオチド；である。一部の態様において、当該核酸分子はａ）またはｂ）であり、配列番号１５に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる（マウスＴＲＰＶ４）か、またはｄ）またはｅ）であり、配列番号１８に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる（ヒトＴＲＰＶ４）。該核酸は配列番号１５または配列番号１８に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに９０％以上または９５％以上同一であるか、またはそれぞれのポリヌクレオチドに一致し得る。本発明ＴＲＰＶ４核酸の例としては、配列番号１３のヌクレオチド１５６〜２７７１に示したヌクレオチド配列（マウスＴＲＰＶ４）または配列番号１６のヌクレオチド配列（ヒトＴＲＰＶ４）を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上、９０％以上、または９５％以上同一である。
【００１９】
本発明はまた哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）のＴＲＰＶ４ポリペプチドの１またはそれ以上の機能的ドメインを含むポリペプチドをコードする単離ＴＲＰＶ４核酸分子を提供する。これらの核酸分子がコードするポリペプチドは、例えば、アンキリンドメイン、膜貫通領域、細孔ループ領域、および多重らせんドメインなどの１またはそれ以上の機能的ドメインを含み得る。例示として、該ポリペプチドは２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域、および／または３つのアンキリンドメインを含み得る。
【００２０】
また、本発明が提供するのは、単離および／または精製したＴＲＰＶ４ポリペプチドである。かかるポリペプチドは、例えば、ａ）配列番号１４のアミノ酸残基１〜８７１を含んでなるマウスＴＲＰＶ４タンパク質；ｂ）配列番号１４のアミノ酸残基２〜８７１を含んでなるマウスＴＲＰＶ４タンパク質；ｃ）マウスＴＲＰＶ４タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン；ｄ）配列番号１７のアミノ酸残基１〜８７１を含んでなるヒトＴＲＰＶ４タンパク質；ｅ）配列番号１７のアミノ酸残基２〜８７１を含んでなるヒトＴＲＰＶ４タンパク質；およびｆ）ヒトＴＲＰＶ４タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン；である。例えば、ＴＲＰＶ４ポリペプチドは、アンキリンドメイン、膜貫通領域、細孔ループ領域、および多重らせんドメインからなる群より選択される１またはそれ以上の機能的ドメインを含み得る。一部の態様において、該ポリペプチドは２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域、および／または３つのアンキリンドメインを含む。
【００２１】
本発明はまた、ＴＲＰＶ４の介在するカチオン膜通過を変調する作用因子の同定方法を提供する。当該方法は、ａ）ＴＲＰＶ４ポリペプチドを含んでなる膜を提供する工程；ｂ）該膜と候補作用因子とを接触させる工程；およびｃ）１個以上のカチオンの膜通過が、候補作用因子の不存在下での通過に比べて、候補作用因子の存在下では増加するか否かを判断する工程；からなる。カチオンの流入および／または流出はＴＲＰＶ３について記載したのと同様に測定することができる。一部態様において、カチオン通過を低下させる候補作用因子につきさらに疼痛処置能について試験するために、該候補作用因子を試験動物に投与し、該候補作用因子が疼痛刺激に対する動物の反応を低下させるか否かを判断する。
【００２２】
本発明はまたＴＲＰＶ４活性の関る疼痛の低減方法を提供する。該方法は疼痛を有する被験者に対して、ＴＲＰＶ４の介在するカチオン膜通過を低減するか、またはＴＲＰＶ４ポリペプチドからＤＲＧニューロンへのシグナル伝達を低減する化合物の鎮痛有効量を投与することからなる。該化合物は、例えば、末梢神経障害性疼痛の処置に適しており、ａ）ＴＲＰＶ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体；ｂ）ＴＲＰＶ４ポリペプチドの発現を低減するアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または妨害性ＲＮＡ；およびｃ）ＴＲＰＶ４ポリペプチドを含んでなるカチオン膜通過低減化学物質；を包含する。
【００２３】
本発明はまた、被験者の疼痛がＴＲＰＶ４の介在によるか否かを判断する方法を提供する。当該方法は、患者が痛みを感じる領域からサンプルを得る工程；および該サンプルにつき試験し、ＴＲＰＶ４ポリペプチドまたはＴＲＰＶ４ポリヌクレオチドがサンプル中に存在するか、および／または活性であるかを判断する工程からなる。ＴＲＰＶ４ポリペプチドの存在および／または活性は、例えば、サンプル中の細胞の膜横断カチオン通過にＴＲＰＶ４ポリペプチドが介在しているか否かを判断することにより、またはＴＲＰＶ４ポリペプチドに特異的に結合する試薬と該サンプルとを接触させることにより、検出することができる。サンプル中のＴＲＰＶ４ポリヌクレオチドの存在は、例えば、ＴＲＰＶ４ポリヌクレオチドにハイブリッド形成し得る試験ポリヌクレオチドとサンプルからの核酸とを接触させることにより検出することができる。
【００２４】
ＴＲＰＭ８
単離および／または精製したＴＲＰＭ８核酸分子もまた本発明により提供される。当該ＴＲＰＭ８核酸分子は、例えば、ａ）配列番号８のアミノ酸残基１〜１１０４を含んでなるマウスＴＲＰＭ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｂ）配列番号８のアミノ酸残基２〜１１０４を含んでなるマウスＴＲＰＭ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｃ）マウスＴＲＰＭ８タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ｄ）配列番号１１のアミノ酸残基１〜１２６８を含んでなるヒトＴＲＰＭ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｅ）配列番号１１のアミノ酸残基２〜１２６８を含んでなるヒトＴＲＰＭ８タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｆ）ヒトＴＲＰＭ８タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；およびｇ）ポリヌクレオチドａ）ないしｆ）の１つに相補性のポリヌクレオチド；を包含する。一部の態様において、該核酸分子はａ）またはｂ）であり、配列番号９に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる（マウスＴＲＰＭ８）か、またはｄ）またはｅ）であり、配列番号１２に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上同一である第一のポリヌクレオチドを含んでなる（ヒトＴＲＰＭ８）。該核酸は配列番号９または配列番号１２に示したヌクレオチド配列を有する第二のポリヌクレオチドに９０％以上または９５％以上同一であるか、またはそれぞれのポリヌクレオチドに一致し得る。本発明ＴＲＰＭ８核酸の例としては、配列番号７のヌクレオチド４４８〜３７６２に示したヌクレオチド配列（マウスＴＲＰＭ８）またはポリヌクレオチドが配列番号１０のヌクレオチド６１〜４８２１に示したヌクレオチド配列（ヒトＴＲＰＭ８）を有する第二のポリヌクレオチドに８０％以上、９０％以上、または９５％以上同一である。
【００２５】
本発明はまた哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）のＴＲＰＭ８ポリペプチドの１またはそれ以上の機能的ドメインを含むポリペプチドをコードする単離ＴＲＰＭ８核酸分子を提供する。これらの核酸分子がコードするポリペプチドは、例えば、膜貫通領域、細孔ループ領域、および多重らせんドメインなどの１またはそれ以上の機能的ドメインを含み得る。例示として、該ポリペプチドは２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域を含み得る。
【００２６】
本発明はまた単離および／または精製したＴＲＰＭ８ポリペプチドを提供する。該ＴＲＰＭ８ポリペプチドは、例えば、ａ）配列番号８のアミノ酸残基１〜１１０４を含んでなるマウスＴＲＰＭ８タンパク質；ｂ）配列番号８のアミノ酸残基２〜１１０４を含んでなるマウスＴＲＰＭ８タンパク質；ｃ）マウスＴＲＰＭ８タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン；ｄ）配列番号１１のアミノ酸残基１〜１２６８を含んでなるヒトＴＲＰＭ８タンパク質；ｅ）配列番号１１のアミノ酸残基２〜１２６８を含んでなるヒトＴＲＰＭ８タンパク質；およびｆ）ヒトＴＲＰＭ８タンパク質の１またはそれ以上の機能的ドメイン；を包含する。例えば、ＴＲＰＭ８ポリペプチドは、膜貫通領域、細孔ループ領域、および多重らせんドメインからなる群より選択される１またはそれ以上の機能的ドメインを含み得る。一部の態様において、該ポリペプチドは２つの膜貫通領域に隣接した細孔ループ領域を含む。
【００２７】
本発明はまた、ＴＲＰＭ８の介在するカチオン膜通過を変調する作用因子の同定方法を提供する。当該方法は、ａ）ＴＲＰＭ８ポリペプチドを含んでなる膜を提供する工程；ｂ）該膜と候補作用因子とを接触させる工程；およびｃ）１個以上のカチオンの膜通過が、候補作用因子の不存在下での通過に比べて、候補作用因子の存在下では増加するか否かを判断する工程；からなる。一部の態様において、該膜は細胞膜であり、カチオン膜通過は細胞内へまたは細胞外へ膜を横断するカチオンの流入または流出を測定することにより検出する。ＴＲＰＭ８の介在するカチオン通過を低減するアンタゴニストを同定するために、該アッセイは一般にアンタゴニストの不存在下でＴＲＰＭ８がカチオン通過を可能とする条件下、例えば、２０℃以下の温度で、またはメントールの存在下で実施する。さらに提供するのは、カチオン通過を低下させる候補作用因子につき、さらに疼痛処置能について試験するために、該候補作用因子を試験動物に投与し、該候補作用因子が疼痛刺激に対する動物の反応を低下させるか否かを判断することを特徴とする方法である。疼痛刺激は、例えば、２０℃以下の温度と接触することである。
【００２８】
他の態様において、本発明はＴＲＰＭ８の介在するカチオン膜通過を刺激する作用因子を同定する方法を提供する。これらのＴＲＰＭ８アゴニストを同定するスクリーニングは一般にＴＲＰＭ８ポリペプチドがカチオン通過を仲介しない条件下で実施する。かかる条件とは、例えば、約２０℃を超える温度である。ＴＲＰＭ８介在のカチオン通過のアゴニストは芳香増強剤、香料などとして有用である。
【００２９】
本発明はまたＴＲＰＭ８活性の関る疼痛の低減方法を提供する。該方法は疼痛を有する被験者に対して、ＴＲＰＭ８の介在するカチオン膜通過を低減するか、またはＴＲＰＭ８ポリペプチドからＤＲＧニューロンへのシグナル伝達を低減する化合物の鎮痛有効量を投与することからなる。これらの方法は、例えば、冷温との接触、炎症、組織傷害などから生じる疼痛を処置するために有用である。該化合物は、例えば、ａ）ＴＲＰＭ８ポリペプチドに特異的に結合する抗体；ｂ）ＴＲＰＭ８ポリペプチドの発現を低減するアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または妨害性ＲＮＡ；およびｃ）ＴＲＰＭ８ポリペプチドを含んでなるカチオン膜通過低減化学物質などである。
【００３０】
本発明はまた被験者の疼痛がＴＲＰＭ８の介在によるものか否かを判断する方法を提供する。該方法は、患者が痛みを感じる領域からサンプルを得る工程；および該サンプルにつき試験し、ＴＲＰＭ８ポリペプチドまたはＴＲＰＭ８ポリヌクレオチドがサンプル中に存在するか、および／または活性であるかを判断する工程；からなる。一部の態様において、サンプル中のＴＲＰＭ８ポリペプチドの存在は、サンプル中の細胞の膜横断カチオン通過にＴＲＰＭ８ポリペプチドが介在しているか否かを判断することにより検出する。細胞の膜横断カチオン通過の仲介にＴＲＰＭ８が関与することは、例えば、２０℃以下および／またはメントールの存在下にアッセイした場合の細胞の膜横断カチオン通過の増加を、２０℃以上および／またはメントールの不存在下にアッセイした場合のカチオン通過と比較して検出することにより判断する。別法として、またはさらに、サンプル中のＴＲＰＭ８ポリペプチドの存在は、ＴＲＰＭ８ポリペプチドに特異的に結合する試薬と該サンプルとを接触させることにより検出する。サンプル中のＴＲＰＭ８ポリヌクレオチドの存在は、ＴＲＰＭ８ポリヌクレオチドにハイブリッド形成し得る試験ポリヌクレオチドとサンプルからの核酸とを接触させることにより検出する。
【００３１】
本発明はまた哺乳動物の知覚反応の変調に有用な作用因子を同定する方法を提供する。当該方法は、ａ）ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４からなる群より選択されるレセプターポリペプチドを含んでなる試験系と候補作用因子とを接触させる工程；およびｂ）候補作用因子の存在下でのレセプターポリペプチドの活性と、候補作用因子の不存在下でのレセプターポリペプチドの活性とを比較して、その変化を検出し、それによってレセプター活性を変調させる作用因子を同定する工程；からなる。
【００３２】
本発明はまた疼痛を有する被験者の処置有効性をモニターする方法を提供する。当該方法は、ａ）疼痛処置途上の２点以上の時点で、患者が疼痛を知覚する領域からサンプルを採取する工程；およびｂ）当該サンプルを試験し、一時点から他の時点まで、ＴＲＰＶ３ポリペプチド、ＴＲＰＶ３ｍＲＮＡ、ＴＲＰＶ４ポリペプチド、ＴＲＰＶ４ｍＲＮＡ、ＴＲＰＭ８ポリペプチド、およびＴＲＰＭ８ｍＲＮＡからなる群より選択される１種以上の量または活性の減少が観察されるか否かを判断する工程；からなる。一部の態様において、一方の時点は疼痛処置投与前または処置と同時であり、他方の時点は処置が始まった後である。
【００３３】
本発明はヒト組織におけるＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８の１種以上の発現を検出し得るアッセイ法を提供する。当該アッセイ法は、ａ）ヒト組織サンプルと、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８に結合するモノクローナル抗体とを接触させ、該抗体がサンプル中のポリペプチドに結合するか否かを判断することからなるアッセイ法；およびｂ）ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８をコードする核酸にハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチドと、ヒト組織サンプルとを接触させることからなるアッセイ法；からなる群より選択される。
【００３４】
本発明により提供される疼痛処置方法は、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８からなる群より選択される１種以上のポリペプチドが介在する疼痛を有する患者を、かかる患者組織中のポリペプチドの発現を測定することにより確認し、かかる患者に該ポリペプチドを阻害する作用因子の鎮痛有効量を投与することからなる。
【００３５】
本発明はまた疼痛処置に有用な作用因子を同定する方法を提供する。当該方法は、ａ）疼痛を有する哺乳動物に候補作用因子を投与する工程；ｂ）哺乳動物から得たサンプル中に、ＴＲＰＶ３ポリペプチド、ＴＲＰＶ３ｍＲＮＡ、ＴＲＰＶ４ポリペプチド、ＴＲＰＶ４ｍＲＮＡ、ＴＲＰＭ８ポリペプチド、およびＴＲＰＭ８ｍＲＮＡからなる群より選択される１種以上のメンバーの活性または量を検出する工程；およびｃ）候補作用因子存在下の該メンバーの量または活性と、候補作用因子不存在下で哺乳動物から得られるサンプル中のメンバーの量または活性とを比較し、その場合に、候補作用因子不存在下での量または活性に比較して、候補作用因子存在下の該メンバーの量または活性が低下した場合、当該作用因子を疼痛処置に有用なものであるとする工程；からなる。
【００３６】
本発明はまたＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８核酸がコードするｍＲＮＡまたはポリペプチドに結合するか、またはその活性を変調する作用因子を同定する方法を提供する。当該方法は、ａ）ポリペプチドをコードする異種ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８核酸を発現する単離細胞と、作用因子とを接触させる工程；およびｂ）該作用因子が該ｍＲＮＡまたはポリペプチドに結合するか、またはその活性を変調すかを判断し、当該ポリペプチドと結合するか、および／またはその活性を変調する作用因子を同定する工程；からなる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂはチャン（Chung）モデルにおけるＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４遺伝子の特異的発現を示す。図１Ａ：ＴＲＰＶ３のｍＲＮＡレベルは慢性末梢神経障害性疼痛のラットモデルにおいて増加する。ＴＲＰＶ３のヒトｃＤＮＡ配列はセレラ・マウスゲノムＤＮＡデータベースを検索するのに使用し、２つのプライマーはヒトおよびマウスの配列と同一である領域から誘導する。該プライマーは標準的な逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）プロトコールにしたがって、チャンモデル（Ｌ４およびＬ５ＤＲＧ）および擬似手術動物からの全ＲＮＡサンプルからラットＴＲＰＶ３を増幅するために使用する。上のパネルは１つのＲＴ−ＰＣＲ実験からのゲル像を示し、下のパネルは３回の独立した実験からのチャンモデルのＬ４およびＬ５ＤＲＧニューロンにおけるＴＲＰＶ３の平均折りたたみ制御を示す。図１Ｂ：ＴＲＰＶ４は慢性末梢神経障害性疼痛のラットモデルにおいて上方制御される。チャンモデル（２８日および５０日）におけるＴＲＰＶ４発現分析のために、１反応につき全ＲＮＡ３０ｎｇに相当する第一鎖ｃＤＮＡを使用し、より高い発現遺伝子については３２／３５サイクルで、また低い発現遺伝子については３５／３８サイクルで増幅する。利用し得る全ＲＮＡの量には制限があるため、ＰＣＲ反応の半量を取り出して、残りの反応をさらに３サイクル続ける。サンプルはすべて４〜２０％ＴＢＥゲル上で分離し、もっとも明瞭で非飽和バンドについて密度計測を実施する。
【００３８】
【図２】図２Ａ〜２ＦはＴＲＰＶ３の配列とゲノムの存在部位を示す。図２Ａ：ＴＲＰＶイオンチャンネル系統群の異なるメンバーのタンパク質配列関連性を示す系統樹。図２Ｂ：マウス（１１Ｂ４）およびヒト（１７ｐ１３）染色体上の配列をコードするＴＲＰＶ１（ＶＲ１）とＴＲＰＶ３の相対的位置。図２Ｃ：ＴＲＰＶ類に対するマウスＴＲＰＶ３タンパク質配列の比較（膜貫通ドメインを含むＣ末端の半分は除く）。一致する配列は暗灰色で、保存残基は明るい灰色で強調してある。予測多重らせんとアンキリンドメインには標しを付けたが、これはＴＲＰＶ３のみの領域に相当する。タンパク質の整列には、http://biowb.sdsc.edu/CGI/BW.cgiのメガラインとボックスシェイドを用いる。多重らせんドメインはプログラムコイル（http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html）を使用して予測する。アンキリンドメインはＰＦＡＭタンパク質検索（http://pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml）を使用して予測する。図２Ｄ：ＴＲＰＶ３の図解と予測膜トポロジー。図２Ｅ：６回の膜貫通ドメイン（１〜６）と細孔ドメイン（Ｐ）を示すＴＲＰＶ３配列のカイト・ドゥーリットル（Kyte Doolittle）疎水性プロット。図２Ｆ：らせんによるＴＲＰＶ３配列の多重らせんドメインの予測では、アンキリン配列の前に２つの１４マーのピークを示す。
【００３９】
【図３】図３Ａ〜３ＤはＴＲＰＶ３が熱により活性化されることを示す。ＴＲＰＶ３発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において熱により発生する電流。図３Ａ：無カルシウム外部溶液における温度ランプに対する内部への電流、Ｖｈ＝−６０ｍＶ。図３Ｂ：Ｃａ２＋条件における内部への電流増加を示す無Ｃａ２＋溶液中と、引き続くＣａ２＋溶液中での同じ細胞の熱発生電流。図３Ｃ：図３Ａと同じ図形とするための二重指数適合線による電流の半対数プロット。３２℃付近で（矢印）不連続となることに注意。図３Ｄ：室温では示さないが、４８℃でＴＲＰＶ３の顕著な外部整流を示すカルシウム含有外部溶液における電流−電圧の関係。室温でのわずかな外部電流に注意。
【００４０】
４Ａ：２５℃から４５℃への繰り返し実施した熱工程は内部電流の応答を増大させる。図４Ｂ：外部整流は４８℃の外部溶液中での繰り返しランプによりより顕著となる。実験は両方ともに外部溶液中２ｍＭ−ＣａＣｌ２の存在下に実施する。図４Ｃ：アンタゴニスト実験のための対照プロトコール。応答は推定アンタゴニストの存在下に熱工程の繰り返しにより増感し続ける。図４Ｄ：１μＭルテニウムレッドは感作を減衰させ、熱応答を阻害する。
【００４１】
【図５】熱感覚におけるＴＲＰチャンネル。熱感覚に関与する４つのＴＲＰチャンネルが、生理的に関連する温度のすべてではないが殆どに及ぶ。
【００４２】
【図６】図６Ａ〜６ＤはＴＲＰＭ８のヌクレオチドとアミノ酸配列の解析結果を示す。図６Ａ：マウスＴＲＰＭ８タンパク質配列とその幾つかの密接な関連物質、ＴＲＰＭ１（ヒト・メラスタチン、ＧＩ６００６０２３）、ＴＲＰＭ２（ヒト、ＧＩ４５０７６８８）およびＴＲＰＭ７（マウス・チャック、ＧＩ１４２１１３８２）との比較。この整列図はメガラインとボックスシェイドを用いて作成する。一致する残基または保存残基は黒地上に白抜き文字で示す。図６Ｂ：ＴＲＰイオンチャンネル・スーパーファミリーの異なるメンバーのタンパク質配列の関連性を示す系統樹。ＴＲＰ類は３つの主要サブファミリー、ＴＲＰＭ類、ＴＲＰＶ類およびＴＲＰＣ類に下位分類される。ＴＲＰＭ類はそのＮ末端ドメインにアンキリンドメインを含まない。膜貫通ドメインは異なる分類のＴＲＰチャンネルの中でもっとも高い相同性を有する。図６Ｃ：６９５〜１０２４個のアミノ酸に広がるタンパク質の潜在的な膜貫通領域を区別する８つの疎水性ピークを示すＴＲＰＭ８配列のカイト・ドゥーリットル（Kyte Doolittle）疎水性プロット。図６Ｄ：プログラムらせんによるＴＲＰＭ８配列の多重らせんドメインを予測して、膜貫通橋かけドメインのＮ末端およびＣ末端での多重１４マー・ピークを示す（http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html）。
【００４３】
【図７】図７Ａ〜７Ｅ：冷温およびメントールに反応するＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞における細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の増加。図７Ａ：ｍＴＲＰＭ８ＣＨＯ細胞は温度が約１５℃となったときに［Ｃａ２＋］ｉの急速な増加を示す。非形質導入ＣＨＯ細胞は冷温に対し反応しない。外部Ｃａ２＋を除くと、冷却に対しての反応性を完全に失う。図７Ｂ：［Ｃａ２＋］ｉが増加し始める予想平均閾値温度はｍＴＲＰＭ８について約２３℃である。ＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞は３３℃から２２℃に冷却すると、それによるＣａ２＋の増加が観察される。該細胞を継続して２０℃まで冷却すると、Ｃａ２＋の顕著な増加を示し、３３℃に加温したときの略元のレベルに急速に戻る。図７Ｃ：２３℃の温度刺激を繰返し適用することで生じるＴＲＰＭ８の応答は、カルシウム含有標準浴溶液中でわずかな減感作を示す。図７Ｄ：ＴＲＰＭ８は２５℃でメントールに応答する。ＴＲＰＭ８の応答強度はメントール濃度に依存する。メントール濃度を１０倍増加すると、Ｃａ２＋の流入がより大きくなる。この応答は細胞外Ｃａ２＋の不存在下で抑制される。非形質導入ＣＨＯ細胞はメントールを加えることで、［Ｃａ２＋］ｉの増加を示さなくなる。図７Ｅ：３３℃での１０μＭメントールはＣａ２＋の流入を誘発しない。浴溶液の温度を３０℃に下げると、細胞内Ｃａ２＋の顕著な増加が観察される。さらに、メントールを繰返し適用すると、ＴＲＰＭ８発現細胞を減感作しなくなる。これらの実験が示唆することは、メントールがＴＲＰＭ８発現細胞の冷却効果を促進することである。熱受容に関与する冷感ＴＲＰチャンネルをこのように同定すると、体細胞知覚検出におけるこのファミリーのより広い役割が明らかとなる。
【００４４】
【図８】図８Ａ〜８Ｂは冷温に反応するＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞の細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉの増加を示す。図８Ａ：ＴＲＰＭ８形質移入ＣＨＯ細胞は温度を２５℃から１５℃に下げると、急速な［Ｃａ２＋］ｉの増加を示す。この刺激時間は記録を要しない程のものである。非形質移入ＣＨＯ細胞は冷温に反応しない。外部Ｃａ２＋を除去すると、冷却に対する応答を完全に抑制する。代表的な実験は２０〜３０個の細胞の平均応答（±ＳＥＭ）を示す。図８Ｂ：ＴＲＰＭ８＋細胞において温度を３５℃から１３℃に下げたことによる［Ｃａ２＋］ｉの増加。パネルは３４個の細胞の平均±ＳＥＭを示す。増加は２２℃と２５℃の間で起こり始めることに注意。
【００４５】
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、ＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞において電流が温度低下によて発生することを示す。図９Ａ：温度を３５℃から１０℃に低下させることにより＋６０ｍＶで誘発される外部への電流。この細胞において、電流は右手のパネルに示すように１９.３℃で活性化する。図９Ｂ：２０.５℃と３３.５℃で活性化される電流についての電流−電圧の関連性。温度上昇は外部電流の振幅を低下する。
【００４６】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは電流がＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞においてメントールにより引き出されることを示す。図１０Ａ：１ｍＭのメントールにより誘導される内部への電流（Ｖｈ＝−６０ｍＶ）は、温度を２５℃から４５℃に上昇すると不活化される。図１０Ｂ：１ｍＭメントールに応答するための電流−電圧の関連性。電流はメントールの存在下に、本アゴニストの不存在下で認められない顕著な外部への整流を示す。
【００４７】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂ：ＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞におけるメントール刺激電流に対する用量−反応曲線を示す。採用した電圧は＋６０ｍＶであった。図１１Ａ：２つの異なる細胞からの、２２℃および３５℃における０.１、０.５、１および１０ｍＭメントール添加により発生する電流の個々の例。図１１Ｂ：２２℃または３５℃のいずれかでメントールが誘発する電流の応答（平均±ＳＥＭ、すべての点でｎ＝５）の比較。
【００４８】
配列表の記載
配列番号１はマウスＴＲＰＶ３ポリペプチド、および上流と下流領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。読み取り枠はヌクレオチド６５から２４４０に及ぶ。
【００４９】
配列番号２はマウスＴＲＰＶ３ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【００５０】
配列番号３は配列番号２にて示されるマウスＴＲＰＶ３アミノ酸配列をコードするすべてのポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列を提供する。
【００５１】
配列番号４はヒトＴＲＰＶ３ポリペプチド、および上流非コード領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。読み取り枠はヌクレオチド５７から２４３２に及ぶ。
【００５２】
配列番号５はヒトＴＲＰＶ３ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【００５３】
配列番号６は配列番号５にて示されるヒトＴＲＰＶ３アミノ酸配列をコードするすべてのポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列を提供する。
【００５４】
配列番号７はマウスＴＲＰＭ８ポリペプチド、および上流と下流の非コード領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。コード領域はヌクレオチド４４８から３７６２に及ぶ。
【００５５】
配列番号８はマウスＴＲＰＭ８ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【００５６】
配列番号９は配列番号８にて示されるマウスＴＲＰＭ８アミノ酸配列をコードするすべてのポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列を提供する。
【００５７】
配列番号１０はヒトＴＲＰＭ８ポリペプチド、および上流と下流の非コード領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。コード領域はヌクレオチド６１から４８２１に及ぶ。
【００５８】
配列番号１１はヒトＴＲＰＭ８ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【００５９】
配列番号１２は配列番号１１にて示されるヒトＴＲＰＭ８アミノ酸配列をコードするすべてのポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列を提供する。
【００６０】
配列番号１３はマウスＴＲＰＶ４ポリペプチド、および上流と下流領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。読み取り枠はヌクレオチド１５６から２７７１に及ぶ。
【００６１】
配列番号１４はマウスＴＲＰＶ４ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【００６２】
配列番号１５は配列番号１４にて示されるマウスＴＲＰＶ４アミノ酸配列をコードするすべてのポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列を提供する。
【００６３】
配列番号１６はヒトＴＲＰＶ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００６４】
配列番号１７はヒトＴＲＰＶ４ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【００６５】
配列番号１８は配列番号１７にて示されるヒトＴＲＰＶ４アミノ酸配列をコードするすべてのポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列を提供する。
【００６６】
詳細な記載
定義
本明細書にて使用する場合、“宿主細胞”とは、原核細胞または真核細胞であって、その細胞中に異種ＤＮＡを何らかの手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質導入、ウイルス感染などにより導入して含む細胞をいう。
【００６７】
本明細書にて使用する場合、“異種の”とは“異なる天然起源の”を意味するか、または非天然の状態を表す。例えば、もし宿主細胞を他の生物体から、特に他の種から誘導させるＤＮＡまたは遺伝子で形質転換するならば、その遺伝子はその宿主細胞にとて異種であり、またその遺伝子を担持する宿主細胞の子孫にとっても異種である。同様に、異種のとは、同じ天然の元の細胞型から誘導され、挿入されるヌクレオチド配列ではあるが、非天然状態、例えば、異なるコピー数、または異なる調整要素の制御のもとに存在する配列をいう。
【００６８】
“ベクター”分子は核酸分子であって、その中に異種の核酸が挿入されており、さらに適切な宿主細胞に導入し得る核酸分子である。ベクターは、好ましくは１またはそれ以上の複写起源を有し、その１ヶ所以上の部位に組換えＤＮＡを導入し得る。ベクターは多くの場合、ベクターを有する細胞がそれをもたない細胞から選択し得るための簡便な手段をもつ；例えば、それらは薬物耐性遺伝子をコードする。極一般的なベクターはプラスミド、ウイルスゲノム、および（本来酵母および細菌にある）“人造染色体”などである。
【００６９】
本明細書において、“プラスミド”は一般に当業者周知の標準的命名の慣習にしたがって、小文字のｐを先行させ、それに続いて大文字および／または数字が来るように命名する。本明細書に開示した出発プラスミドは市販品として入手し得るか、使用制限なしに公的に入手し得るか、または入手可能なプラスミドから公知の公開された手法を型どおりに適用することにより構築することができる。本発明にしたがって使用し得る多くのプラスミドおよびその他のクローニング・発現用ベクターは当業者周知であり、容易に入手し得る。さらに、当業者は本発明での使用に適した他の如何なるプラスミドも構築することができる。本発明において、かかるプラスミドならびに他のベクターの性質、構築および使用は、本発明の開示から当業者にとって容易に明らかであろう。
【００７０】
“核酸”、“ＤＮＡ配列”または“ポリヌクレオチド”という術語は、一本鎖または二本鎖の形状のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、特に制限しない限り、天然産のヌクレオチドと同様の様式で核酸にハイブリッド形成する天然ヌクレオチドの既知類似体をも包含する。本明細書中で表されるポリヌクレオチド配列では“Ｔ”（チミジンについて）を配列に含めるが、これはＤＮＡにおいてのみ見出されるもので、対応するＲＮＡ分子ではＤＮＡ配列中の各“Ｔ”をウリジンの“Ｕ”に置換えるが、このＲＮＡ分子も当該配列は包含する。
【００７１】
“単離した”という術語は、物質が通常その本来の状態で見出された際に伴う成分を実質的にまたは本質的に含まない物質についていう。したがって、本発明のポリペプチドおよび核酸は、通常その元の環境で会合していた物質を含有しない。単離した核酸は、例えば、他の場合には核酸に隣接するであろう染色体ＤＮＡの全部または一部と会合していない。一般に、本発明の単離したタンパク質は、銀染色ゲル上のバンド強度または他の純度決定方法により測定した場合に、少なくとも約８０％の純度、通常は少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の純度である。タンパク質純度または均一度は技術上既知の多くの手段、例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動法とそに続く染色による可視化により示すことができる。特定の目的のためには、高分解能が必要であり、ＨＰＬＣや精製のための同様の手段が利用される。
【００７２】
２種以上の核酸またはポリペプチド配列との関係において、“同一”またはパーセント“同一性”という術語は、２種以上の配列または部分列を比較し、最大に対応させ整列させて、以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、あるいは目視観察により測定した場合に、それらが同一であるか、またはアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセントを有する場合の配列をいう。
【００７３】
２種類以上の核酸またはポリペプチド配列との関係において、“実質的に同一”という語句は、最大に対応させ整列させて、以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、あるいは目視観察により測定した場合に、少なくとも７０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２種類以上の配列または部分列をいう。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基の長さの配列領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の長さの配列領域にわたって存在し、最も好ましいのは、その配列が少なくとも１５０残基にわたって実質的に同一である場合である。最も好適な態様において、該配列はコード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００７４】
配列比較のためには、一般に、一つの配列を対照配列として、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列および対照配列をコンピューターにインプットし、要すれば部分列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定したプログラムのパラメータに基づき、対照配列に比較した試験配列（単一または複数）についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００７５】
比較のための配列の最適整列は、例えば、局所相同性アルゴリズム（Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)）、相同性整列アルゴリズム（Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)）、類似法検索（Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)）、これらのアルゴリズムのコンピューター処理遂行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ；ウィスコンシン・ジェネティックス・ソフトウエア・パッケージ、ジェネティックス・コンピューター・グループ、５７５サイエンスドライブ、マディソン、ウィスコンシン）、または目視観察（一般参照文献：Crrent Protocols in Molecular Biology（分子生物学における最新のプロトコール）, F.M. Ausubel et al., eds. Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Assocates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement)(Ausubel)）などにより実施し得る。
【００７６】
パーセント配列同一性と配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２.０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ以下の文献に記載されている：Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990) and Altschuel et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1977)。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）経由で公的に入手可能である。このアルゴリズムは問題配列の長さＷの短いワードを同定することにより高評点配列対（ＨＳＰ）を先ず同定し、それをデータベース配列の同じ長さのワードと整列させ、ある正値閾値スコアＴにマッチさせるか、またはそれを満足させる。Ｔは近傍ワードスコア閾値という（Altschul et al.、上記）。これらの初期近傍ワードヒットはそれらを含むより長いＨＳＰを見出すための初期検索のシードとなる。次いで、このワードヒットを、累積整列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸ばす。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対の同一である残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、評点マトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向へのワードヒット伸張は以下の場合に停止する：累積整列スコアがその最大達成値からＸ量落ちた場合；累積スコアが１以上のマイナス評点残基整列の蓄積のために、ゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータ、ワード長（Ｗ）、ＴおよびＸは整列の感度とスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）はデフォルトとしてＷの１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして、Ｗの３、Ｅの１０およびＢＬＯＳＵＭ６２評点マトリックスを使用する（参照：Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989)）。パーセント同一性は、本明細書にて特定する場合、デフォルトパラメータを用いるブラスト２.０インプリメンテーションを使用して計算する。
【００７７】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間類似性の統計的解析をも実施する（参照例：Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する１つの類似性測定法は最小の和の確率（Ｐ（Ｎ））であり、この確率は２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を示すものである。例えば、核酸は、試験核酸と対照核酸との比較において最小和確率が約０.１未満、より好ましくは約０.０１未満、最も好ましくは約０.００１であるならば、対照配列に類似していると考えられる。
【００７８】
２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるというもう一つのしるしは、ポリヌクレオチド同士が特定のハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリッド形成することである。緊縮ハイブリダイゼーション条件の例は以下のとおりである：インキュベーション温度約２５℃から約３７℃；ハイブリダイゼーションのバッファー濃度、約６×ＳＳＣないし約１０×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約０％ないし約２５％；および洗浄液、約６×ＳＳＣ。緩和なハイブリダイゼーション条件の例は以下のとおりである：インキュベーション温度約４０℃から約５０℃；バッファー濃度、約９×ＳＳＣないし約２×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約３０％ないし約５０％；および洗浄液、約５×ＳＳＣないし約２×ＳＳＣ。高緊縮条件の例は以下のとおりである：インキュベーション温度約５５℃から約６８℃；バッファー濃度、約１×ＳＳＣないし約０.１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約５５％ないし約７５％；および洗浄液、約１×ＳＳＣ、０.１×ＳＳＣまたは脱イオン水。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は５分ないし２５時間、洗浄工程１〜２回以上、および洗浄インキュベーション時間は約１、２または１５分である。ＳＳＣとは０.１５Ｍ−ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸バッファーである。当然、他のバッファー系を用いるＳＳＣの等価物を使用し得ることも理解される。
【００７９】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなるしるしは、第一の核酸によりエンコードされるポリペプチドが、以下に記載するように、第二の核酸によりエンコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性である場合である。したがって、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが保存置換によってのみ異なる場合、一般に第二のポリペプチドに実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるもう一つのしるしは、２つの分子が、下記のように、緊縮条件下で互いにハイブリッド形成する場合である。
【００８０】
特定ポリヌクレオチド配列の“保存的修飾変異”とは、本質的に同一のアミノ酸配列に対して同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドがアミノ酸配列をエンコードしない場合をいう。遺伝子コードの縮重のために、多くの機能的に同一の核酸が所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧはすべてアミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、アルギニンがコドンによって特定されるすべての位置において、そのコドンはコードされるポリペプチドを変えることなく、記載した相当するコドンのいずれのものにも変わることができる。かかる核酸の変異は“沈黙変異”であり、“保存的修飾変異”の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書記載のすべてのポリヌクレオチド配列はまた、特に断りをいれる場合は別として、可能な沈黙変異ごとに記載する。当業者は核酸中の（通常メチオニンに対しての唯一のコドンであるＡＵＧを除き）各コドンが標準的技法により機能的に同一の分子を生じるように修飾し得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれの“沈黙変異”はそれぞれ記載した配列に暗示されている。
【００８１】
さらに、当業者は、コード配列中の単一のアミノ酸または僅かなパーセントのアミノ酸（一般には５％未満、より一般的には１％未満）を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加は、アミノ酸の変更が化学的に類似のアミノ酸との置換に至る場合、“保存的修飾変異”である。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は技術上周知である（参照例：Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Company (1984)）。コード配列中の単一のアミノ酸または僅かなパーセントのアミノ酸を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加もまた、“保存的修飾変異”である。
【００８２】
細胞、または核酸、またはベクターに関して用いるとき、“組換え”という術語は、該細胞、または核酸、またはベクターが、異種核酸の導入または本来の核酸の変更によって修飾されているか、または該細胞がそのように修飾された細胞由来のものであることを意味する。したがって、例えば、組換え細胞は細胞の本来の（非組換え）形状内に見出されない遺伝子を含むか、または他の状態では異常に発現が起こるか、発現量が少ないか、または全く発現されない本来の遺伝子を発現させることができる。また、組換え細胞は細胞の本来の形状で見出される遺伝子を含むことも可能であり、その場合、遺伝子は修飾し、人工的手段で細胞に再導入する。この術語はまた細胞から核酸を除かずに修飾した細胞に内在性の核酸を含む細胞も包含する；かかる修飾は遺伝子置き換え、部位特異変異および関連の技法により得られるものを含む。
【００８３】
“変調する”という術語は、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８タンパク質の活性および／または量の変化をいう。例えば、変調はタンパク質の活性、結合特性、またはかかるタンパク質の何らかの他の生物学的、機能的もしくは免疫学的性質の増大または減少を引き起こし得る。“変調”という術語はまたＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８遺伝子がコードするｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの増加または減少における変化をもいう。
【００８４】
本明細書にて使用する場合、“操作可能に連結した”という術語は、機能的に関係する核酸配列をいう。プロモーターは、もしそれがエンコードされたポリペプチドの翻訳を制御するならば、コード配列と操作可能に会合するか、または操作可能に連結する。操作可能に連結した核酸配列は相接して同じ読み取り枠内に存在するが、一方、ある種の遺伝子要素、例えば、リプレッサー遺伝子は当該ポリペプチドをコードする配列に相接して結合してはいないが、さらにポリペプチドの発現を制御するオペレーター配列に結合している。
【００８５】
本明細書にて使用する場合、“アゴニスト”という術語は、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８タンパク質に結合したときに、かかるタンパク質の生物学的または免疫学的活性を増大するか、またはその作用時間を延長する分子をいう。アゴニストはこれらのタンパク質に結合するか、またはその作用を変調するタンパク質、核酸、炭水化物またはその他の分子である。
【００８６】
本明細書にて使用する場合、“アンタゴニスト”という術語は、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８タンパク質に結合したときに、かかるタンパク質の生物学的または免疫学的活性量を低下させるか、またはその作用時間を短縮する分子をいう。アンタゴニストはこれらのタンパク質の作用を低下させるタンパク質、核酸、炭水化物、抗体またはその他の分子である。“アンタゴニスト”という術語はまたＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８遺伝子がコードするｍＲＮＡの発現レベルおよび／またはタンパク質の翻訳レベルを低下させる分子をもいう。かかるアンタゴニストの例はアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイムおよび二本鎖ＲＮＡである。
【００８７】
本発明を実施するに当たっては、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの常套技法を使用する。これらの技法は周知であり、例えば、以下の文献に記載がある：Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I, II and III, F.M. Ausubel, ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II, D.N. Glover, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, M.L. Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins (1985); Transcription and Translation, Hames and Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, R.L. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. (1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.H. Miller and M.P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); and Methods in Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu and Grossman, and Wu, eds.
【００８８】
好適な態様の記載
本発明はＶＲ１と同族のＴＲＰＶ３（以前にはＶＲＬＸ、ＶＲＬ−Ｓ、ＶＲ４およびＴＲＰＶ７として知られる）、ＴＲＰＶ４（以前はＶＲＬ３およびＯＴＲＰＣ４として知られる）およびＴＲＰＭ８（以前はＴＲＰＸとして知られる）として知られる新規の核酸類、これらの核酸がコードするポリペプチド類、組換え物質およびそれらの製造法に関する。これら３種の遺伝子に付与した具体的名称はモンテルら（Montell et al., Molecular Cell, 9:229-231 (2002)）の提案する命名法に従う。これらの遺伝子は角化細胞またはＤＲＧのいずれかに発現されることが判明しており、ＴＲＰＶ３とＴＲＰＭ８タンパク質は共に温度感覚において機能する。さらに、ＴＲＰＶ３とＴＲＰＶ４遺伝子の発現はラット傷害モデルにおいて正の方向に制御される（実施例４および６参照）。また、本発明はＤＲＧにて発現されるｔｒｋＡ＋疼痛特異遺伝子の同定に関する。上記の遺伝子は角化細胞およびＤＲＧにおいて発現され、温度感覚において機能し、かつ傷害に反応して正の方向に制御されるため、これらの遺伝子およびその関連ポリペプチドは慢性および侵害受容疼痛、炎症および皮膚障害を処置する薬物設計のための具体的治療標的として働く。したがって、本発明はまた疼痛、炎症および皮膚障害の処置に有用な作用因子を同定する方法、およびこれらの遺伝子とポリペプチドを利用して処置の有効性をモニターする方法に関する。これらの遺伝子と関連ポリペプチドはまた疼痛、炎症および皮膚障害の検出診断法に利用することもできる。
【００８９】
ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８はＶＲ系統群に属する。ヒトを含む異なる哺乳動物種からの、およびすべて既知のＴＲＰ／ＶＲのトランスメンブラン６（ＴＭ６）ドメインに対するＨＭＭモデルからのＶＲ１およびＶＲＬ１タンパク質のハイデン・マルコフ（Hidden Markov）モデル（ＨＭＭ）が構築されている。ヒューマン・セレラ（Human Celera）データベースの６−フレーム翻訳がＶＲモデルに対して検索されている。既知ＴＲＰのトランスメンブラン４（ＴＭ４）とＴＭ６ドメインに対し高い相同性（異なるＶＲ／ＴＲＰの中の保存領域において７０％の同一性と８２％の類似性）をもつ多重新規推定エキソンが同定されている。これらのエキソンをハイ・スループット・ゲノム配列（ＨＴＧＳ）データベースからの具体的なヒト配列を含む細菌性人工染色体に地図化する。あらたに同定したエキソンはすべてＶＲ系統群の３つの新しい遺伝子に属する。次に、ＲＴ−ＰＣＲにより、これらの遺伝子がＤＲＧまたは角化細胞において発現されることを確認した。既知ＴＲＰチャンネルに対する構造相同性、ＤＲＧまたは角化細胞における遺伝子の発現、それらの温度感受性チャンネルとしての機能、およびＤＲＧにおけるラット傷害モデルに観察されるＴＲＰＶ３とＴＲＰＶ４遺伝子発現の正方向制御は、この新しい遺伝子が重要な知覚レセプターとして作用することを示している。
【００９０】
ＴＲＰＶ３：暖温および熱温に反応するイオンチャンネル
ＴＲＰＶ３は暖温および熱温で活性化され、皮膚細胞にて発現されることが記載された最初の分子である（実施例２および３参照）。ＴＲＰＶ３シグナル伝達は熱との接触により角化細胞における細胞の自律性応答を仲介する。熱誘発ＴＲＰＶ３シグナルは近傍遊離の神経末端に伝達され、それによって暖熱の意識感覚に寄与する。このことは皮膚細胞が熱レセプターとして作用するという間接的証明によって支持される。例えば、解離したＤＲＧニューロンは熱と冷温により直接活性化されるのに対し、暖レセプターは皮膚−神経の結合性が無傷である実験において証明されているだけである（参照：Hensel et al., Pfugers Arch., 329:1-8 (1971), Hensel et al., J. Physio., 204:99-112 (1969)）。ＴＲＰＶ３は３３〜３５℃付近に活性化閾値を有する。皮膚にかかる暖レセプターが存在し（休止温度３４℃）、ＤＲＧニューロン（細胞体での休止温度３７℃）のないことが、中核となる３７℃の温度でＴＲＰＶ３などの暖チャンネルが恒常的に活性となるのを防止する。ＴＲＰＶ１ノックアウトマウスにおける残りの熱感受性もまた皮膚細胞に影響を及ぼす；ＴＲＰＶ１をもたない動物からの解離したＤＲＧニューロンは緩和な有害刺激に全く反応しないが、かかる動物からの皮膚神経調製物は反応する（参照：Caterina et al., Science, 288:306-13(2000); Davis et al., Nature, 405:183-187 (2000); Roza et al., 第３１回神経科学会年会、サンディエゴ、カリフォルニア（２００１））。総合すると、これらのデータは、ＤＲＧ中の熱レセプターに加えて、暖／熱レセプターが皮膚に存在することを示している。角化細胞と知覚末端の間にシナプスは見出されていないが、超微細構造の研究は角化細胞が膜−膜並置を介してＤＲＧ神経線維に接触し、多くの場合それを取り囲んでいることを示した（参照：Hilliges et al., J. Invest. Dermatol., 104:134-137 (1995) and Cauna., J. Anat., 115:277-288 (1973)）。したがって、角化細胞からの熱活性化ＴＲＰＶ３シグナルは直接の化学的シグナル伝達を通してＤＲＧニューロンに導入される。一つの有力なシグナル伝達メカニズムはＡＴＰを必要とする。Ｐ２Ｘ３、ＡＴＰ−ゲートチャンネルが知覚末端に存在し、Ｐ２Ｘ３ノックアウトマウスを分析すると、暖温度のコード化において強い不足を示す（参照：Souslova et al., Nature, 407:1015-1017 (2000); Cockayne et al., Nature, 407:1011-1015 (2000)）。さらに、傷害を受けた角化細胞からのＡＴＰ放出は、Ｐ２Ｘレセプターを介して、侵害受容器において作用潜在能力を引き出すことが示されている（参照：Cook et al., Pain, 95:41-47 (2002)）。ＴＲＰＶ３は無害な暖気温度と有害な熱温度で活性化され、皮膚で発現されるので、この遺伝子は疼痛、炎症および皮膚障害、例えば、日焼けおよび他の過敏状態と関連する障害の処置に有用な薬物設計のための治療標的となり得る。
【００９１】
一側面において、本発明は哺乳動物のＴＲＰＶ３タンパク質をコードする単離した核酸を提供する。これらは配列番号２に示したアミノ酸配列を有するマウスＴＲＰＶ３タンパク質をコードする単離したおよび／または組換え核酸を包含する。例えば、本発明のＴＲＰＶ３−エンコード核酸は配列番号１に示したヌクレオチド配列、ヌクレオチド６５〜２４４０を有する核酸を包含する。本発明の核酸はコード化領域だけでなく、コード化領域の上流および下流である非コード化領域をも含み、配列番号１で示される。本発明はまた配列番号２に示したアミノ酸配列の単離したマウスＴＲＰＶ３ポリペプチドをも提供する。さらに、このマウスＴＲＰＶ３ポリペプチドをコードする数種の他の核酸も提供する；これら核酸のヌクレオチド配列を配列番号３に示す。
【００９２】
ヒトＴＲＰＶ３のポリペプチドおよびポリヌクレオチドも本発明が提供する。例えば、本発明は配列番号５に示したアミノ酸配列を有するヒトＴＲＰＶ３ポリペプチドをコードする単離したおよび／または組換えヒトＴＲＰＶ３エンコードポリヌクレオチドをも提供する。これらの核酸分子は配列番号４のヌクレオチド５７〜２４３２に示したヌクレオチド配列を有する分子を含む。上流と下流の非コード化領域も配列番号４に示す。また、本発明は配列番号５に示したアミノ酸配列を有する単離したＴＲＰＶ３ポリペプチドを提供する。本発明はまたこのヒトＴＲＰＶ３ポリペプチドをコードする数種の他の核酸も提供する；これら核酸のヌクレオチド配列を配列番号６に示す。
【００９３】
ＴＲＰＶ４：疼痛により活性化されるイオンチャンネル
ＴＲＰＶ４は成熟マウスの腎臓、新生児背側根神経節、および成体三叉神経組織にて発現される（実施例５参照）。ＴＲＰＶ４は細胞外浸透圧の減少により活性化され、増加により阻害される非選択性カチオンチャンネルであり、このチャンネルが浸透圧センサーとして機能することを示している（参照：Strotmann et al., Nat. Cell Biol., 2:695-702 (2000)）。さらに、ＴＲＰＶ４遺伝子の発現はラット傷害モデルにおいて正の方向に制御される（実施例６参照）。したがって、ＴＲＰＶ４遺伝子は疼痛、腎臓障害および偏頭痛処置の薬物設計のための治療標的として作用し得る。
【００９４】
本発明は哺乳動物のＴＲＰＶ４タンパク質をコードする単離した核酸を提供する。これらは配列番号１４に示したアミノ酸配列を有するマウスＴＲＰＶ４タンパク質をコードする単離したおよび／または組換え核酸を包含する。これらの核酸分子には、配列番号１３のヌクレオチド１５６〜２７７１に示したヌクレオチド配列を有するものが含まれる。上流および下流の非コード化配列も提供する。また、本発明は配列番号１４に示したアミノ酸配列を有する単離したマウスＴＲＰＶ４ポリペプチドを提供する。本発明はまたこのマウスＴＲＰＶ４ポリペプチドをコードする数種の他の核酸も提供する。かかる核酸のヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。
【００９５】
哺乳動物ＴＲＰＶ４−エンコード核酸はまた配列番号１７に示したアミノ酸配列を有するヒトＴＲＰＶ４タンパク質をコードする単離したおよび／または組換え核酸分子を包含する。かかる核酸分子は配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を有する分子を包含する。さらに、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する単離したヒトＴＲＰＶ４ポリペプチドも提供する。本発明はまたこのヒトＴＲＰＶ４ポリペプチドをコードする数種の他の核酸も提供する。これらの核酸のヌクレオチド配列を配列番号１８に示す。
【００９６】
ＴＲＰＭ８：冷温度およびメントールに反応するイオンチャンネル
ＴＲＰＭ８は冷温刺激および冷却剤（メントール）により活性化し、熱受容ニューロンの特性を共有するＤＲＧニューロン選択群にて発現する（実施例８および９参照）。
【００９７】
ＴＲＰＭ８を過剰発現する細胞は２３℃から１０℃の範囲の冷温度（我々の温度制御灌流システムの最低限界）に曝したときに細胞内カルシウムレベルの増大を示す。以下に記載するカルシウム流入と電気生理学的検討では、ＴＲＰＭ８が冷温度により活性化される非選択的形質膜カチオンチャンネルであることを示している。ＴＲＰＭ８のイオン透過性は他のＴＲＰチャンネルに類似しており、一価およびニ価のカチオン両方に透過性であるが、カルシウムの透過性（ＰＣａ／ＰＮａ）は０.３から１４に変化すると推定される（参照：Harteneck et al., Trends Neurosci., 23:159-166 (2000)）。メントールは内因性冷温感受性チャンネルに作用すると思われる冷却化合物である（参照：Schafer et al., J. Gen. Physiol., 88:757-776 (1986)）。ＴＲＰＭ８−発現細胞がメントールにより活性化され、変調するということは、ＴＲＰＭ８が事実上インビボで冷温感受性チャンネルとして機能するという考えを補強するものである。メントールに対する感受性が温度依存性であるという知見は、メントールの存在下に‘冷温'閾値の上昇を示すサブセットの単離ＤＲＧニューロンの挙動と矛盾がない（参照：Reid and Flonta, Nature, 413:480 (2001)）。ＴＲＰＭ８活性化のメカニズムに関しては、ＴＲＰＭ８がコンホメーションの変化を経て冷温刺激により直接ゲートで制御するか、または冷温度がＴＲＰＭ８を順次活性化する第二のメッセンジャーシステムを介して作用するとされる。メントールによる急速な活性化は、少なくともこの活性化様式に対して、直接のゲート制御メカニズムを示唆している。
【００９８】
ＴＲＰＭ８について観察される発現パターンは冷温度受容における役割と矛盾がない。第一に、ＴＲＰＭ８ｍＲＮＡはＤＲＧニューロンに高度に特異的である。ＤＲＧ内で、ＴＲＰＭ８は小さな径の非有髄ニューロンにて発現されるが、このニューロンはｃ−ファイバー熱レセプターおよび侵害受容器に相当する（参照：Scott, Sensory Neurons: Diversity, Development and Plasticity, Oxford Unversity Press, NY (1992)）。そのＤＲＧが熱受容体と侵害受容ニューロンのすべてを欠くｔｒｋＡノックアウトマウスにおけるＴＲＰＭ８の発現欠如はこの知見を裏付けるものである。さらに、成体でのＶＲ１、ＣＧＲＰまたはＩＢ４との同時発現の欠如は、ＴＲＰＭ８が十分に特性化された侵害受容器とは区別されるＤＲＧニューロンのユニーク集団にて発現されるということを示唆する。ＶＲＬ１を発現するニューロン（中〜大型ニューロン）の細胞体サイズおよびＮＦ２００との同時発現（８０％同時発現（参照：Caterina et al., Nature, 398:436-441 (1999)）の両方が強く示すことは、ＴＲＰＭ８とＶＲＬ１を発現する細胞もまた別個のものであるということである。したがって、種々のマーカーを用いることにより、ＴＲＰＭ８が有害な熱感知ニューロンとは区別される下位分類の侵害受容器／熱受容体に発現されことが下に示されており、このことは冷温感受性ＤＲＧニューロンの生理学的研究と良く相関する（参照：Hensel, Thermoreception and Temperature Regulation, Academic Press, London (1981)）。マウスＴＲＰＭ８に高度の類似性をもつが、機能不明のヒト遺伝子が前立腺組織に発現されていることが最近示された（参照：Cancer Res., 61:3760-3769 (2001)）。
【００９９】
冷温度とメントールに反応する最初の分子として、ＴＲＰＭ８は冷温知覚力の基礎的生物学に興味深い洞察力を与える。ＴＲＰＭ８活性の変調は治療応用にも関連する：冷温処置はしばしば疼痛の軽快法として使用され、ある場合には、冷温に対する過敏症が末梢神経障害性疼痛患者に冷温異痛をもたらし得る。ＴＲＰＭ８活性の変調は急性疼痛、例えば、歯痛およびその他の三叉神経に集束する疼痛の処置に、また、癌、とりわけ前立腺癌およびその他の前立腺障害の処置にも関係する。
【０１００】
本発明はＴＲＰＭ８哺乳動物タンパク質をコードする単離した核酸を提供する。これらは配列番号８に示したアミノ酸配列を有するマウスＴＲＰＭ８タンパク質をコードする単離および／または組換え核酸分子を含む。例えば、本発明は配列番号７のヌクレオチド４４８〜３７６２に示したヌクレオチド配列を有する単離および／または組換え核酸分子を提供する。上流および下流の非コード化領域も提供する。本発明はまた配列番号８に示したアミノ酸配列を含む単離したマウスＴＲＰＭ８ポリペプチドを提供する。さらに、このマウスＴＲＰＭ８ポリペプチドをコードする数種の他の核酸も提供する。これら核酸のヌクレオチド配列は配列番号８に示すとおりである。
【０１０１】
哺乳動物ＴＲＰＭ８タンパク質をコードする核酸はまた、配列番号１１に示したアミノ酸配列を含んでなるヒトＴＲＰＭ８タンパク質をコードする単離および／または組換え核酸分子を包含する。例えば、本発明は配列番号１０のヌクレオチド６１〜４８２１に示したヌクレオチド配列を含む単離および／または組換え核酸分子を提供する。上流および下流の非コード化領域も本発明が提供する。本発明はまた配列番号１１に示したアミノ酸配列を有する単離したヒトＴＲＰＭ８ポリペプチドも提供する。ＴＲＰＭ８タンパク質は冷温およびメントールに反応性である。
【０１０２】
核酸分子
本発明の核酸分子はまた配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸に、それぞれ、全コード化領域にわたり、またはその下位配列にわたり、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは９９％の同一性を有する単離した核酸分子を包含する。かかる核酸分子は上に示したように、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１８に示したヌクレオチド配列を有する核酸を包含する。
【０１０３】
本発明の核酸は配列番号２、配列番号５、配列番号８配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７のアミノ酸配列をそれぞれ含んでなるポリペプチド変異体をコードする単離した核酸分子を包含する。また、本明細書に開示されたプライマー対を用いて増幅される核酸も本発明に包含される。
【０１０４】
さらに、本発明の核酸は上記核酸分子のフラグメントも包含する。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは所望のハイブリダイゼーション条件（例えば、緊縮条件）下に、上に示した対象遺伝子の相補性転写産物にのみ特異的にハイブリッド形成する十分な長さのものである。本明細書にて使用する場合、“オリゴヌクレオチド”という術語は一本鎖核酸をいう。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１６〜２０個のヌクレオチドの長さのものであるが、場合によっては少なくとも２０〜２５ヌクレオチドのより長いプローブが望ましい。
【０１０５】
オリゴヌクレオチドプローブを１種以上の標識化部分で標識することにより、ハイブリッド形成プローブ／標的ポリヌクレオチド複合体の検出が可能となる。標識化部分とは、分光学的、生化学的、光化学的、生物電子的、免疫化学的、電気光学的または化学的手段により検出し得る構成成分である。標識化部分の例は、限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ）、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、分光学的マーカー（蛍光マーカー、色素など）、結合酵素、マススペクトルタグおよび磁気標識である。
【０１０６】
発現モニター用オリゴヌクレオチドプローブ配列は、当業者周知の技法にしたがって調製、使用し得るが、それらについては、例えば、Lockhart et al., Nature Biotech., 14:1675-1680 (1996); McGall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13555-13460 (1996);および米国特許第６,０４０,１３８に記載されている。
【０１０７】
本発明はまた上記の単離した核酸分子に相補性の単離した核酸分子を提供する。
【０１０８】
マウスまたはヒト以外の種からの同族体を含む上記ポリペプチドの一つをコードする単離した核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１８、またはそのフラグメント；および単離全長ｃＤＮＡおよび該ヌクレオチド配列を含むゲノムクローンの配列を有する標識ラベルにより、緊縮条件下に適切なライブラリーをスクリーニングする工程を含んでなる方法により得ることができる。かかるハイブリダイゼーション技法は当業者周知である。
【０１０９】
本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング技法を用い、発現配列タグ（ＥＳＴ）解析によりＤＲＧ細胞中のｍＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡライブラリーから得ることができる（参照：Adams et al., Science, 252:1651-1656 (1991);Adams et al., Nature, 355:632-634 (1992); Adams et al., Nature, 377; Suppl. 3:174 (1995)）。本発明のポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡライブラリーなどの自然源から得るか、または周知の工業的に利用可能な技法により合成することができる。
【０１１０】
単離したｃＤＮＡ配列がそのポリペプチドをコードする領域でＤＮＡの５'側が短く、不完全であり得るということは当業者も認識するところである。このことは、ｃＤＮＡの第一鎖の合成に際し、ｍＲＮＡ転写物のＤＮＡコピーを完成する逆転写酵素の失敗により起こり得る。全長ｃＤＮＡを得る方法、または短いｃＤＮＡを伸張する方法は既知であり、例えば、フローマンらが記載しているＲＡＣＥ法（Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002 (1988)）に基づく方法がある。該ＲＡＣＥ技法はマラソン（Marathon）（商標）工学（クロンテック・ラボラトリー・インク；Clontech Laboratories, Inc.）に代表されるように改変したものであり、そこでは、ｃＤＮＡは選択した組織から抽出されるｍＲＮＡから調製されたものであり、アダプター配列は各末端に結合する。続いて、核酸の増幅（ＰＣＲ）を実施し、遺伝子特異的およびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーを組合わせてｃＤＮＡの欠失５−末端を増幅する。ＰＣＲ反応は増幅産物とアニールするように設計した繰り込みプライマーとして知られるプライマーを用いて繰返すが、該プライマーは一般にアダプター配列の３'とさらにアニールするアダプター特異プライマーであり、また既知遺伝子配列の５'とさらにアニールする遺伝子特異プライマーである。次いで、反応産物につきＤＮＡ配列決定により解析し、全長のｃＤＮＡは、該産物を既存のｃＤＮＡに直接結合して完全な配列とすることにより調製するか、または５'プライマー設計用の新しい配列情報を用いて別個の全長ＰＣＲを実施することにより調製する。
【０１１１】
本発明の核酸分子を本発明ポリペプチドの組換え製造に利用する場合、該ポリヌクレオチドはそれ自体成熟ポリペプチド用のコード化配列を含み得る；あるいはリーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードする配列などの他のコード化配列をもつ読み取り枠中の成熟ポリペプチド用コード化配列を含み得る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列、例えば、ヘキサ−ヒスチジンペプチドなどをエンコードし得る；これらはｐＱＥベクター（キアゲン・インク；Qiagen, Inc.）にて提供され、ゲンツらが記載している（Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824 (1989)）ものか、またはＨＡタグである。核酸分子はまた非コード化５'および３'配列、例えば、転写された非翻訳配列、スプライス化ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列を含む。
【０１１２】
ポリペプチドおよび抗体
他の側面において、本発明は哺乳動物のＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８ポリペプチドに関する。これらポリぺプチドは配列番号２に示したアミノ酸配列を含んでなるマウスＴＲＰＶ３ポリペプチド、配列番号５に示したアミノ酸配列を含んでなるヒトＴＲＰＶ３ポリペプチド、配列番号１４に示したアミノ酸配列を含んでなるマウスＴＲＰＶ４ポリペプチド、配列番号１７に示したアミノ酸配列を含んでなるヒトＴＲＰＶ４ポリペプチド、配列番号８に示したアミノ酸配列を含んでなるマウスＴＲＰＭ８ポリペプチド、および配列番号１１に示したアミノ酸配列を含んでなるヒトＴＲＰＭ８ポリペプチドを包含する。
【０１１３】
本発明のさらなるポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７に記載したアミノ酸配列に対し、これらの配列の全長にわたり、またはその下位配列にわたり、そのアミノ酸配列が少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは９９％の同一性を有する単離したポリペプチド、すなわち変異体を包含する。かかる配列は配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４および配列番号１７の配列である。
【０１１４】
本発明のポリペプチドはまた上記配列のフラグメントを包含する。例えば、本発明のポリペプチドは本発明のＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８ポリペプチドの１またはそれ以上の機能的ドメインを含んでなるアミノ酸を含む。かかるドメインの例は下記のとおりである；他の機能的ドメインは当業者既知の方法により決定し得る。
【０１１５】
上記のＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８ポリペプチドは様々な手段により入手し得る。より小型のペプチド（一般には５０個未満のアミノ酸長）は標準的な化学的技法により簡便に合成し得る。これらのポリペプチドは技術上既知の方法により生物起源から精製し得る（参照：Protein Purification, Principles and Practice, 2nd Edition, Scopes, Springer Verlag, NY (1987)）。これらはまた、その天然産の、短小化した、または融合タンパク質の形状で、技術上周知の技法を用いる組換えＤＮＡ工学により製造し得る。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法およびインビボ遺伝子組換えなどである（参照例：サムブルークら記載の技法（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Press, NY (2001); and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th Edition, John Wiley & Sons, Inc., NY (1999)）。別法として、該タンパク質をコードするＲＮＡを化学的に合成してもよい（参照例：Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed., IRL Press, Oxford (1984) に記載の技法）。これらのポリペプチドを大量に得るには、好ましくはさらに本明細書に記載の組換え技法による。
【０１１６】
したがって、本発明のもう一つの側面はＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８ポリペプチドの製造法に関する。これらの方法は通常以下の工程からなる：
ａ）上記定義のＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を得る工程；および
ｂ）該ＤＮＡを宿主細胞に挿入し、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８ポリペプチドを発現させる工程。
一部の態様において、該方法はさらに以下の工程を含む：
ｃ）ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８ポリペプチドを単離する工程。
【０１１７】
本明細書記載の核酸分子は適切な宿主細胞中で発現し、活性なＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８タンパク質を産生させることができる。発現は、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクターに入れ、この発現ベクターを適切な宿主細胞に導入し、形質転換した宿主細胞を増殖させ、これらのタンパク質の一つを発現に導き、該組換えタンパク質を宿主細胞から精製した、好ましくは活性なＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８タンパク質として得ることにより実施する。適切な発現ベクターは技術上既知である。例えば、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＣＤＮＡ１ＡｍｐおよびｐＶＬ１３９２はノバゲン（Novagen）およびインビトロゲン（Invitrogen）から入手可能であり、それぞれ、大腸菌、ＣＯＳ細胞およびバキュロウイルス感染昆虫細胞にて発現するために適切なベクターである。これらのベクターは技術上既知のベクターの例証である。適切な宿主細胞は適切な培地にて増殖可能であり、発現したＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８タンパク質の精製を可能とする細胞であればいかなるものでもよい。適切な宿主細胞の例は大腸菌、連鎖球菌、ストレプトマイセス、枯草菌細胞などの細菌類細胞；酵母細胞、例えば、ピチア、アスペルギルス細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２，スポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａなどの哺乳動物細胞；および植物細胞である。
【０１１８】
形質転換した宿主細胞の増殖は技術上既知の条件下で起こり得る。当該条件は宿主細胞と使用するベクターのタイプに左右される。適切な誘発条件は温度、試薬類などであるが、利用するプロモーターのタイプにも左右される。
【０１１９】
ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８タンパク質の精製は面倒な実験を行うことなしに、既知の技法を用いて実施し得る。通常、これらのタンパク質の一つを発現する形質転換細胞を破砕し、破砕片と汚染する一部タンパク質を除去するための大雑把な精製を行い、さらに該タンパク質をクロマトグラフィーに付して所望のレベルの純度まで精製する。細胞は既知技法、例えば、ホモジナイゼーション、超音波処理、界面活性剤溶菌および凍結融解技法などにより破砕し得る。大雑把な精製は硫安沈殿、遠心分離またはその他の既知技法により実施し得る。適切なクロマトグラフィーとはアニオン交換、カチオン交換、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどである。該タンパク質が細胞内合成、単離または精製に際して変性した場合には、周知のタンパク質再生技法を用いてタンパク質の活性なコンホメーションを得ることが可能である。
【０１２０】
もう一つの側面において、本発明は配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７に記載したアミノ酸配列内のエピトープを認識する抗体に関する。本明細書にて使用する場合、“抗体”という術語は、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化もしくはキメラ抗体および生物学的に機能する抗体フラグメント、すなわち、該タンパク質に対する抗体フラグメントの結合力が十分なフラグメントである。上記配列によりエンコードされたタンパク質に特異的な抗体は様々なタイプの適用し得る用途をもつ。その用途は、例えば、疼痛の検出および診断、とりわけ異なるタイプの疼痛の識別に使用する診断キットの製造などである。他の用例としては、かかる抗体を化学療法剤などの治療薬に結合し、疼痛を有する対象者に投与することである。その外の用例については以下に詳細に記載する。
【０１２１】
開示した遺伝子の一つによりエンコードされたタンパク質に対する抗体の製造のために、種々の宿主動物にポリペプチドまたはその一部を注射して免疫し得る。かかる宿主動物は、限定されるものではないが、そのニ三を例示すると、ウサギ、マウスおよびラットである。種々のアジュバントを使用して免疫応答を高めることが可能であるが、アジュバントは宿主の種に応じて、限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレクチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性剤、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（Bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）などである。
【０１２２】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物などの抗原、またはその抗原性機能的誘導体で免疫した動物の血清から誘導される抗体分子の不均質集団である。ポリクローナル抗体の製造のためには、上記の種の宿主動物に、エンコードしたタンパク質またはその一部に上に記載のアジュバントを添加してそれを注射し、免疫する。
【０１２３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は特定の抗原に対する均質な抗体集団であり、連続培養細胞株による抗体分子の製造に提供される技法に従い入手し得る。その技法は、限定されるものではないが、コーラーとミルシュタインのハイブリドーマ技法（Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); 米国特許第４,３７６,１１０）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（参照：Kosbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030 (1983)）、およびＥＢＶハイブリドーマ技法（参照：Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 (1985)）などである。かかる抗体はいずれの分類の免疫グロブリンであってもよく、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのサブクラスである。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはインビトロでもインビボでも培養可能である。インビトロでの高力価ｍＡｂの産生はこれを現在好適な製造法とする。
【０１２４】
さらに、“キメラ抗体”産生のたみに開発された技法（参照：Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314:452-454 (1985)）が使用し得るが、この技法では、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子とを継ぎ合わせるものである。キメラ抗体はその異なる部分が異なる動物種から誘導される分子であり、異なる部分は、例えば、マウスｍＡｂから誘導される可変領域または超可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域を有する部分である。
【０１２５】
別法として、一本鎖抗体の産生のために記載された技法（参照：米国特許第４,９４６,７７８；Bird, Science, 242:423-426 (1988); Huston et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988); and Ward et al., Nature, 334:544-546 (1989)）は別個に発現される遺伝子の一本鎖抗体を産生するのに適合する。一本鎖抗体はＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとをアミノ酸ブリッジ経由で連結し、一本鎖のポリペプチドとすることにより形成する。
【０１２６】
最も好ましくは、“ヒト化抗体”の産生に有用な技法は、タンパク質に対する、またはそのフラグメントまたは誘導体に対する抗体の産生に適合させ得る。かかる技法は米国特許第５,９３２,４４８；５,６９３,７６２；５,６９３,７６１；５,５８５,０８９；５,５３０,１０１；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,６６１,０１６；および５,７７０,４２９に開示されている。
【０１２７】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは既知の技法により生成させ得る。例えば、かかるフラグメントは、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により産生させ得るＦ（ａｂ'）２フラグメント、およびＦ（ａｂ'）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成させ得るＦａｂフラグメントである。別法として、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの同定を迅速かつ容易なものとするために、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築するのがよい（参照：Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)）。
【０１２８】
ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８発現のためのアッセイ
もう一つの側面においては、ヒト組織中のＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８の１種以上の発現を検出し得る診断アッセイ法を提供する。かかるアッセイ法は特に疼痛を有する被験者を同定し、異なるタイプの疼痛と区別するのに有用である。上に述べたように、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４遺伝子の発現はラット傷害モデルにおいて正の方向に制御される。したがって、疼痛を有する被験者から得たサンプル中のＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４遺伝子が正方向に制御された場合、これらの遺伝子発現の正常値、例えば、疼痛のない被験者から得たサンプル、または該遺伝子の発現が早い段階で決定された予め確立した対照と比較して、被験者は疼痛を有する被験者であることを示唆する。これら遺伝子の１種以上の発現は、組織サンプル、特に疼痛部位から得たヒト組織サンプル中の該遺伝子がコードするタンパク質または該遺伝子に対応するｍＲＮＡを測定することにより検出することができる。
【０１２９】
ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８タンパク質の発現は、検出可能に標識したプローブ、または事後標識し得るプローブにより検出することが可能である。一般に、該プローブは上に記載した発現タンパク質を認識する抗体、特にモノクローナル抗体である。したがって、一態様において、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８遺伝子の１種以上の発現を検出し得るアッセイ法は、ヒト組織サンプルと、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８ポリペプチドに結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を接触させ、モノクローナル抗体がサンプル中のポリペプチドに結合するか否かを判断することからなる。
【０１３０】
抗体を利用するイムノアッセイ法は、限定されるものではないが、ドットブロッティング、ウエスタンブロッティング、競合および非競合タンパク質結合アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および共通に使用され、科学文献および特許文献に広く記載され、商業的にも多用されているその他の方法である。
【０１３１】
検出の場合に特に好ましいのは、多くの変法の存在するサンドイッチＥＬＩＳＡであり、それらすべての方法を本発明に包含するものとする。例えば、代表的なフォワードアッセイでは、非標識抗体は固形基板に固定し、試験すべきサンプルを結合した分子を接触させ、次いで、抗原−抗体ニ者複合体の形成を可能とするのに十分な時間インキュベーションする。この時点で、検出可能なシグナルを誘発し得るレポーター分子で標識した第二抗体を添加し、抗体−抗原−標識抗体の三者複合体の形成に十分な時間インキュベートする。非反応物質を洗い流し、抗原の存在をシグナルの観察により判断するか、または既知量の抗原を含む対照サンプルと比較することにより定量してもよい。フォワードアッセイ上の変法は同時アッセイ法を含み、その場合、サンプルと抗体の両方を結合した抗体に同時に加える；逆のアッセイ法も含み、その場合は、標識抗体と試験すべきサンプルを先ず組み合わせ、インキュベートし、非標識表面結合抗体に加える。これらの技法は当業者周知であり、僅かな変更の可能性は容易に明らかとなる。本明細書にて使用する場合、“サンドイッチアッセイ”とは基本的ニ側面技法に基づくすべての変法を包含するものとする。本発明のイムノアッセイにとって唯一の制限ファクターは、標識抗体が対象の遺伝子により発現されるタンパク質、例えば、ＴＲＰＶ３またはそのフラグメントに特異的な抗体であらねばならないことである。
【０１３２】
このタイプのアッセイにおいて最も共通して使用されるレポーター分子は、酵素、発蛍光団−または放射核−含有分子のいずれかである。酵素イムノアッセイの場合には、通常、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸により酵素を第二抗体に接合させる。しかし、容易に認識し得るように、多用な異なる結合技法が存在し、それらは当業者周知である。共通に使用される酵素としては、とりわけ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどである。特異的酵素と共に使用される基質は一般に、相当する酵素の水解作用により検出可能な色変化を生成させるために選択する。例えば、リン酸ｐ−ニトロフェニルはアルカリホスファターゼ接合体との使用に適している；ペルオキシダーゼ接合体には、１，２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが共通して使用される。発蛍光基質を使用することも可能であり、この場合は、上記の色素原基質よりもむしろ蛍光産物を生じる。適切な基質含有溶液は次いで三次複合体に添加する。該基質は第二抗体に結合した酵素と反応し、定性的目視シグナルを生じるが、このシグナルをさらに通常は分光学的に定量し、組織サンプル中に存在するＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８タンパク質の量についての評価を得る。
【０１３３】
別法として、蛍光化合物、例えば、フルオレセインおよびローダミンなどを抗体にカップル結合させるが、その際に抗体の結合能力を変えないようにする。特定の波長での照射により活性化したとき、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子に励起状態を誘発し、特徴的な長波長の光を放射する。この放射は光学顕微鏡により目視検出可能な特徴的色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡの技法は共に技術的に十分に確立されており、特に本方法にとって好適である。しかし、他のレポーター分子、例えば、放射性同位体、化学発光または生物発光分子も採用することができる。必要とする用途に適した手法をどのように変えるかについては、当業者にとって容易に理解し得る。
【０１３４】
ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルは、当業者周知の方法、例えば、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ，実時間定量ＰＣＲ、高密度配列およびその他のハイブリダイゼーション法を利用して検出することができる。したがって、もう一つの態様において、組織サンプル、好ましくはヒト組織中のＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８遺伝子の１種以上の発現を検出し得るアッセイ法が提供され、該方法においては、ヒト組織サンプルを、オリゴヌクレオチド、すなわち核酸にハイブリッド形成し得るプライマー、特にＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８をコードするｍＲＮＡと接触させる。オリゴヌクレオチドプライマーは一般に１０〜２０個のヌクレオチドの長さであるが、より長い配列を使用してもよい。
【０１３５】
ＲＮＡは当業者周知の方法により組織サンプルから単離し得るが、該方法は例えば、以下の文献に記載されている：Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., 1:4.1.1-4.2.9 and 4.5.1-4.5.3 (1996)。
【０１３６】
ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８遺伝子から転写されたｍＲＮＡレベルを検出する好適な一方法はＲＴ−ＰＣＲである。この方法において、ｍＲＮＡ種は先ず酵素として使用する逆転写酵素により相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写される。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は周知であり、上記のサムブルーク（Sambrook）らの文献に記載がある。次いで、このｃＤＮＡを標準的なＰＣＲ反応（ＰＣＲという）により増幅するが、ＰＣＲについては米国特許第４,６８３,１９５；４,６８３,２０２および４,８００,１５９に詳細な記載がある。
【０１３７】
簡単に説明すると、ＰＣＲにおいては、標的核酸配列の反対の相補性鎖上の領域に相補性である２種類のプライマー配列を調製する。過剰のトリリン酸デオキシヌクレオシドを、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼと共に反応混合物に加える。プライマーが標的核酸に結合し、ポリメラーゼがヌクレオチド上に付加して標的核酸配列に沿ってプライマーを伸張する。反応混合物の温度を上昇および下降させることによって、伸張したプライマーが標的核酸から解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーが標的核酸と反応産物に結合し、当該工程を繰り返す。
【０１３８】
開示された遺伝子の１またはそれ以上から得られるｍＲＮＡ転写物のレベルを検出するもう一つの好適な方法は、標識したｍＲＮＡを定序配列オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成することである。かかる方法では、遺伝子発現プロフィールまたはパターンを生成させることと同時に、遺伝子の複数の転写レベルを決定することが可能である。特に有用な態様において、疼痛に悩む被験者から得た組織サンプルから誘導される遺伝子発現プロフィールは、正常な被験者、すなわち疼痛をもたない被験者から得たサンプルから誘導される遺伝子発現プロフィールと比較して、１種以上のＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８遺伝子が、正常の被験者から得たサンプル中の遺伝子に比べ、疼痛を有する被験者から得たサンプル中に過剰発現されていないかを判断し、それによってどの遺伝子が疼痛に関係しているかを判断することができる。リガーゼ連鎖反応はもう一つのアッセイ法であり、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８ポリヌクレオチドの存在を検出するのに適している。
【０１３９】
このハイブリダイゼーション法に利用されるオリゴヌクレオチドは、一般に固形の支持体に結合する。固形支持体の例としては、限定されるものではないが、メンブラン、フィルター、スライド、紙、ナイロン、ウエーファ、ファイバー、磁性もくは非磁性ビーズ、ゲル、チューブ、ポリマー、塩化ポリビニル皿などである。オリゴヌクレオチドを直接または間接的に、あるいは共有結合または非共有結合により結合し得る固形表面は、いずれも使用することができる。とりわけ好適な固形基板は高密度アレイまたはＤＮＡチップである。これらの高密度アレイは特定のオリゴヌクレオチドプローブをアレイの予め選択した部位に含む。各予め選択した部位は１分子以上の特定のプローブを含むことができる。オリゴヌクレオチドは基板上の特定の位置にあるため、ハイブリダイゼーションのパターンと強度（これらは共にユニーク発現プロフィールまたはパターンとなる）は、特定遺伝子の発現レベルにより解釈することができる。
【０１４０】
オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは上で同定した対象遺伝子の相補性転写物にのみ特異的にハイブリッド形成するために十分な長さをもつものである。本明細書にて使用する場合、“オリゴヌクレオチド”という術語は一本鎖核酸をいう。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１６〜２０のヌクレオチドの長さであるが、場合によっては少なくとも２０〜２５ヌクレオチドの長さのプローブが望ましい。
【０１４１】
オリゴヌクレオチドプローブはハイブリッド形成プローブ／標的ポリヌクレオチド複合体の検出を可能とするために、１またはそれ以上の標識化部分で標識してもよい。標識化部分とは分光学的、生化学的、光化学的、生物電子的、免疫化学的、電気光学的または化学的手段により検出し得る構成成分である。標識化部分の例は、限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ）、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、分光学的マーカー（蛍光マーカー、色素など）、結合酵素、マススペクトルタグおよび磁気標識である。
【０１４２】
発現モニター用のオリゴヌクレオチドプローブアレイは当業者周知の技法にしたがって、調製、使用することができる。かかる技法は、例えば、Lockhart et al., supra; McGall et al., supra; および米国特許第６,０４０,１３８に記載されている。
【０１４３】
もう一つの側面においては、組織サンプル中、例えば、疼痛部位からのサンプル中のＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８遺伝子の１種以上の発現レベルを検出するためのキットが提供される。例えば、該キットは遺伝子ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８の少なくとも１つによりエンコードされるタンパク質またはそれに対応するｍＲＮＡを検出し得る標識化合物または作用因子；または該タンパク質のフラグメント、該遺伝子によりエンコードされるタンパク質または対応するｍＲＮＡ、または該タンパク質のフラグメントの量を定量する手段；および該遺伝子の標準的発現レベルを有する被験者サンプル、例えば、疼痛のない被験者から得られるサンプルからの遺伝子によりエンコードされるタンパク質または対応するｍＲＮＡ、または該タンパク質のフラグメントの量を比較する手段；からなる。ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８タンパク質の検出に関しての当該作用因子はこれらタンパク質に特異的な抗体でもよい。ｍＲＮＡの検出に関しての当該作用因子は配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１８に対応するｍＲＮＡに選択的にハイブリッド形成する予め選択したプライマー対でもよい。該化合物または作用因子は適切な容器に包装することができる。該キットはさらに該遺伝子によりエンコードされるタンパク質または対応するｍＲＮＡを検出するためのキットの使用についての指示書を含んでもよい。
【０１４４】
もう一つの側面において、本発明はｔｒｋＡ＋疼痛特異ＤＲＧニューロンに特異的な新規遺伝子の同定に基づく。ＤＲＧニューロンは異なる機能的、生化学的および形態学的特性をもつ数種の別個の準集団に分類することができる。ＤＲＧサブタイプが別個に発現する唯一既知の初期マーカーはｔｒｋ系統群のニューロトロフィンレセプターである。マウス・ニュートロフィンとｔｒｋ（レセプター・チロシンキナーゼ）の遺伝子標的欠失は、ニュートロフィンシグナル伝達が、ｔｒｋ特異的にマークするＤＲＧニューロンの異なる準集団の存続にとって必要である。例えば、ｔｒｋＡノックアウトマウスは疼痛と温度を感知する侵害受容および温度受容ニューロンを欠失する。
【０１４５】
アゴニストとアンタゴニストの同定
もう一つの側面において、本発明は疼痛の処置に有用な、または熱および冷温に対する反応を変調するために芳香強調剤（例えば、スクリーニングアッセイにおいてＴＲＰＭ８を用いて同定し得るメントール類似体）および皮膚に冷たい感覚または暖かい感覚を与える化粧料添加物（例えば、スクリーニングアッセイにおいてＴＲＰＭ８またはＴＲＰＶ３を用いて同定されるメントール類似体、カプサイシン類似体または他の化合物）として有用な作用因子の同定法におけるＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８遺伝子の使用に関する。これらの方法は、これらの遺伝子がコードするタンパク質に結合する、および／またはその活性を変調する種々の作用因子、および／またはこれらの遺伝子がコードするタンパク質に対応するｍＲＮＡの発現レベルを低下させるかまたは上昇させる種々の作用因子の能力をアッセイすることからなる。候補作用因子はアンタゴニストまたはアゴニストとして機能する。様々な候補作用因子の例は、限定されるものではないが、抗体、タンパクもしくはそのフラグメント、アンチセンスヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、有機もしくは無機化合物などである。かかる候補作用因子を同定する方法は、細胞に基づくシステムにおいて、また動物モデルにおいて実施し得る。
【０１４６】
例えば、ＣＨＯまたはＣＯＳなどの組換え宿主細胞にて発現されるこれらの遺伝子をコードするタンパク質は、該タンパク質に結合するか、および／またはその活性を変調する候補作用因子、あるいはこれらの遺伝子に対応するかまたはこれらの遺伝子がコードするｍＲＮＡの発現レベルを上昇させるかまたは低下させる候補作用因子を同定するために使用し得る。この点で、該タンパク質に親和性を示す候補作用因子の結合特異性は、該レセプターを発現する細胞またはこれらの細胞からの膜に対する候補作用因子の親和性を測定することにより示すことができる。これは該細胞、細胞膜または単離したタンパク質に対する標識、例えば、放射活性候補作用因子の特異的結合力を測定することにより、あるいは標準的標識リガンドの特異結合に置換わる候補作用因子の能力を測定することにより実施し得る。
【０１４７】
これらの遺伝子によりエンコードされるタンパク質を発現する細胞は、タンパク質活性を変調する作用因子を同定するために利用することもできる。例えば、疼痛の処置に有用な化合物を同定する一方法、または芳香または香料としての使用方法は、これらのタンパク質、例えば、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８の一つを発現する細胞を提供すること、候補作用因子と当該細胞とを組合わせること、およびタンパク質活性に対する候補作用因子の作用を測定することからなる。当該細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞またはＴＲＰＶ３タンパク質を発現する他の細胞でもよい。候補化合物は適切な応答を引き出すその能力、例えば、カルシウムイオン流入による細胞性脱分極の促進または細胞内カルシウムイオンレベルの上昇について評価する。
【０１４８】
細胞内カルシウムレベルは、カルシウムイオン感受性蛍光色素などのカルシウムイオン感受性蛍光指示薬を用いて評価することができる；例えば、これらに限定されるものではないが、キン−２（quin-2）（参照：Tsien et al., J. Cell Biol., 94:325 (1982)）、フラ−２（fura-2）（参照例：Kao et al., J. Biol. Chem., 264:8179 (1989)）およびロド−２（rhod-2）（参照例：Tsien et al., J. Biol. Chem., Abstract 89a (1987)）などである。
【０１４９】
上記タンパク質を発現する組換え細胞の膜脱分極は、膜電位の変化に敏感な蛍光色素を用いてモニターすることができる；該色素は、限定されるものではないが、ヨウ化３，３'−ジペンチルオキサカルボシアニン（ＤｉＯＣ５）およびヨウ化３，３'−ジプロピルチアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）などのカルボシアニン；ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）ペンタメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ４（バイオトレンド・ケミカリエン（Biotrend Chemikalien GmbH）、コローニュ、ドイツ）またはビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）ペンタメチンオキソノールなどのオキソノール類などである。細胞の蛍光は蛍光光度計によりモニターし得る。
【０１５０】
イオンチャンネル活性のアンタゴニストを同定するアッセイ法は、好ましくは、特定のイオンチャンネルが活性である条件下で実施する。逆に、アゴニストの同定を探る場合、好ましくはアゴニストの不存在下にイオンチャンネルが活性ではない条件下でスクリーニングを実施する。例えば、ＴＲＰＶ３は約３３℃以上の温度で活性化される（すなわち、イオン膜通過に介在する）。したがって、ＴＲＰＶ３のアンタゴニストについては３３℃を超える温度（例えば、３５、４０，４５℃またはそれ以上）で選抜するのが好ましく、ＴＲＰＶ３のアゴニストについては、３３℃以下の温度（例えば、３０、２５、２０℃、またはそれ以下）で選抜するのが好ましい。一部のアッセイでは、ＴＲＰＶ３−介在イオン輸送と、異なるＴＲＰイオンチャンネルが介在するイオン輸送とを識別することが望ましい。例えば、ＴＲＰＶ３−介在カチオン輸送と、例えば、ＴＲＰＶ１またはＴＲＰＶ２が介在するカチオン輸送とを識別するために、アッセイは、ＴＲＰＶ３の活性化閾値以上であるが他のレセプターの活性化閾値以下の温度（例えば、ＴＲＰＶ１とＴＲＰＶ２については、それぞれ約４３℃以下または約５２℃以下）で実施することができる。したがって、約３５℃ないし約４０℃のアッセイ温度はＴＲＰＶ３を活性とするが、ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＶ２は不活性とする。
【０１５１】
同様に、ＴＲＰＭ８カチオンチャンネル活性のアンタゴニストを同定するアッセイ法は、好ましくは、ＴＲＰＭ８がアンタゴニストの不存在下でカチオンを伝導する条件下で実施する。例えば、ＴＲＰＭ８の閾値活性化温度は約１５℃なので、１５℃以下の温度でアンタゴニストを選抜できるであろう（例えば、１０、５，０℃など）。ＴＲＰＭ８はメントールによっても活性化されるので、温度による活性制御の代わりに、またはそれに加えて、メントールの存在下でアンタゴニストのアッセイを実施し得よう。ＴＲＰＭ８のアゴニストを同定するために、ＴＲＰＭ８が１５℃以上の温度（例えば、２０℃、２５℃、３０℃など）など、有意なイオンチャンネル活性を示さない条件下でアッセイを実施するのが好ましい。ＴＲＰＭ８−介在カチオンチャンネル活性と、他のＴＲＰイオンチャンネルの活性とを識別するために、アゴニストについてのアッセイは３３℃（ＴＲＰＶ３の活性化温度）以下の温度で実施することができる。例えば、２０℃ないし３０℃の温度はアゴニストの不存在下で不活性であるＴＲＰＭ８に至らしめ、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＶ２も不活性である。
【０１５２】
ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８カチオンチャンネルは二価のカチオン（例えば、Ｃａ２＋）のみならず一価のカチオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋）の輸送のためにも機能する。
【０１５３】
該アッセイは手動で、または自動化システムを用いて実施することができる。かかるタンパク質のリガンドを同定するための高処理スクリーニングアッセイのためには、自動化システムが適している。例えば、１タイプの自動化システムは、９６穴、３８４穴、または１５３６穴の培養プレートを提供するが、このプレート上、かかるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換え細胞を培養し、タンパク質を発現させる。このプレートを蛍光画像プレートリーダー（例えば、市販品として入手し得るフリップル（ＦＬＩＰＲ）（登録商標）；モレキュラー・ディバイス（Molecular Device Corp.）、サニーベイル、カリフォルニア）に載置し、それぞれのウエル中の細胞内カルシウム流入速度を測定する。フリップル（登録商標）はプレートの各ウエルにおいて定量的に液体を出入輸送することが可能であり、したがって、カルシウムイオン感知蛍光インディケーター色素、候補作用因子などの添加に利用することができる。高処理量アッセイに適した膜電位色素はモレキュラー・ディバイスが販売するフリップル（登録商標）膜電位アッセイキットなどである。
【０１５４】
候補化合物をアゴニストとして同定した場合、かかるアゴニストはかかるタンパク質を発現する細胞に加え、種々の候補作用因子を添加し、どの作用因子がアンタゴニストとして機能するかを判断する。
【０１５５】
本発明の核酸とポリペプチドを利用し、これらのタンパク質を発現する細胞においてｍＲＮＡとタンパク質の発現レベルを変調する、すなわち上昇または低下させる候補作用因子を同定することができる。例えば、ＴＲＰＶ４遺伝子の発現はラット傷害モデルにおいて上方制御されることが示されている（実施例３参照）。ｍＲＮＡとタンパク質の発現レベルは上記のように当業者周知の方法を利用して検出することができる。
【０１５６】
タンパク質の活性およびｍＲＮＡとタンパク質の発現レベルを阻害する作用因子を当初のスクリーニングアッセイ法により同定した後、これらの作用因子を通常の生きている動物の疼痛モデルにてアッセイし、これらのモデルにて生じる病理学的作用を向上させる作用因子の能力および／またはｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを阻害する作用因子の能力を評価することができる。例えば、ラット傷害モデルにおいて正の方向に制御されることが示されているＴＲＰＶ４の場合には、疼痛処置に有用な作用因子を同定する一方法は以下の工程からなる：
ａ）候補作用因子、例えば、ＴＲＰＶ４遺伝子の配列から誘導されるアンチセンスヌクレオチドをラット疼痛モデルなどの被検体に投与する工程；および
ｂ）当該動物にて慢性となった疼痛の反転を判断する工程。
末梢神経障害性疼痛に利用される種々の動物モデルが技術上周知である；例えば、部分的坐骨神経結紮モデル、すなわち、セルツァー（Seltzer）モデル、慢性狭窄傷害モデル、すなわち、ＣＣＩモデル、および脊髄神経結紮モデル、すなわち、チャン（Chung）モデルなどである。
【０１５７】
例えば、部分的坐骨神経結紮（参照：Seltzer et al., Pain, 43:205-218 (1990) に記載のセルツァーモデル）では、ラットを麻酔し、大腿の少し上（通常は左）に小さな切開を施し、坐骨神経を露出する。後部二頭筋半腱様神経が共通の坐骨神経からの分岐点末端の転子に近い部位で、当該神経を周囲の結合組織から注意深く取り出す。７−０絹縫合糸を３／８曲率逆カッティング小針で神経に挿入し、神経の太さの背側１／３または１／２が結紮内に保持されるようにしっかりと結紮する。筋肉と皮膚を縫合糸とクリップで閉じ、傷口に抗生剤粉末を振り掛ける。対照の擬動物では、坐骨神経は露出するが、結紮はせず、同様に傷を閉じる。
【０１５８】
慢性狭窄モデル（Bennett et al., Pain, 33:87-107 (1988) に記載のＣＣＩモデル）では、ラットを麻酔し、大腿の少し上に小さな切開を施し、坐骨神経を露出する。神経から周囲の結合組織を除き、クロムガット線の４箇所の結紮をそれぞれ約１ｍＭ間隔で神経の周囲をゆるく結び、結紮が僅かに神経表面を構成するようにする。傷口を縫合糸とクリップで閉じる。対照の擬動物では、坐骨神経は露出するが、結紮はせず、傷を閉じる。
【０１５９】
脊髄神経結紮の場合には（参照：Kim et al., Pain, 50:355-363 (1992) に記載のチャンモデル）、ラットを麻酔して腹臥位に置き、背柱の左にＬ４−Ｓ２レベルの切開を施す。脊髄近傍筋を深く離断し、Ｌ４−Ｓ２レベルでの脊髄突起から筋肉を分離し、坐骨神経の部分を分岐するように露出して、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６の脊髄神経を形成する。Ｌ６横突起を小型の骨鉗子で注意深く取り出し、これらの脊髄神経を目視可能とする。Ｌ５脊髄神経を７−０絹縫合糸にてきつく結紮する。傷口を一本の筋縫合糸（６−０絹）と１または２個の閉鎖クリップで閉じ、抗生剤粉末を振り掛ける。対照の擬動物では、Ｌ５神経を同様に露出するが結紮せず、傷口を同様に閉じる。
【０１６０】
３種のモデルのそれぞれについてオス・ウィスターラット（１２０〜１４０ｇ）を使用する。機械的痛覚過敏については、次いで、アナルゲシメータ（Analgesymeter）(ウゴ−バシル（Ugo-Basile）、ミラノ)を用いてラットの圧迫刺激を増大し、両後肢の足の引っ込め閾値を測定することにより評価する。熱過敏症は、各後肢の下側に加えた有害熱刺激に対する引っ込め潜伏時間を測定することにより評価する。すべてのモデルについて、機械的過敏症および異痛症と温度過敏症は術後１〜３日内に発生し、少なくとも５０日間は持続する。機械的過敏症および異痛症と温度過敏症の復帰は、作用因子、例えば、ＴＲＰＶ４遺伝子に特異的なアンチセンスヌクレオチドの投与後に評価する。
【０１６１】
疼痛処置に有用な作用因子同定法の他の一例は、以下の工程からなる：
ａ）ラットの疼痛モデルなどの被検体に候補作用因子を投与する工程；
ｂ）被検体から得られるサンプル中の本明細書記載の遺伝子の一つ、例えば、ＴＲＰＶ４がコードするタンパク質またはそれに対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出すること；および
ｃ）該作用因子存在下のサンプル中のタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルと、該作用因子不存在下の被検体のサンプルから得られたタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルとを比較するが、その場合に、作用因子不存在下のタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルに相対的に、該作用因子存在下のサンプル中のタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルの低下が、該作用因子が疼痛処置に有用であることを示すものであるとする工程。
【０１６２】
本発明はまた哺乳動物の知覚反応の変調に有用な作用因子の同定法を提供する。当該方法は以下の工程からなる：
ａ）ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４からなる群より選択さえるレセプターポリペプチドを含んでなる試験システムと候補作用因子とを接触させる工程；および
ｂ）候補作用因子存在下のレセプターポリペプチドの活性と、候補作用因子不存在下のレセプターポリペプチドの活性とを比較し、その変化を検出して、それによりレセプター活性を変調する作用因子を同定する工程。
【０１６３】
本方法の特に有用な態様において、知覚反応は冷温に対する反応であり、該ポリペプチドは、好ましくは、配列番号８および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＴＲＰＭ８ポリペプチドである。本方法はさらに試験被験者にレセプター活性を変調する作用因子を投与し、その後に試験被験者の知覚反応の変化を検出する工程を含むことができる。
【０１６４】
候補作用因子と接触させる試験システムは、例えば、レセプターポリペプチドを含んでなる膜または該レセプターポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを発現する細胞を含んでなる。有用な態様において、異種ポリヌクレオチドは配列番号７のヌクレオチド４４８〜３７６２に示したヌクレオチド配列または配列番号１０のヌクレオチド６１〜４８２１に示したヌクレオチド配列を含んでなり、該レセプターポリペプチドはＴＲＰＭ８ポリペプチドである。該細胞は実質的に単離することが可能であり、その場合、細胞と候補作用因子との接触工程はインビトロで実施する；あるいは細胞は生体に存在するものとし得るが、その場合の接触工程はインビボで実施する。
【０１６５】
特に有用な態様において、レセプター活性はレセプターポリペプチドからなる膜を通過するＣａ２＋の増加または減少からなり、その場合の膜は、例えば、実質的に精製した細胞膜でもよいし、またはリポソームを含んでなる膜であってもよい。
【０１６６】
医薬組成物および方法
本発明は上記遺伝子、すなわち、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４およびＴＲＰＭ８を利用する疼痛を有する被験者の処置治療法をも提供する。適切な治療剤の例は、限定されるものではないが、以下に詳述するアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡ、アンタゴニストおよびアゴニストである。
【０１６７】
本明細書にて使用する場合、“アンチセンス”という術語は、開示された遺伝子の少なくとも１つのＲＮＡ発現産物の一部に相補性であるヌクレオチド配列をいう。“相補性”ヌクレオチド配列は標準的なワトソン−クリック相補性規則にしたがって塩基対を形成し得るヌクレオチド配列をいう。すなわち、プリンはピリミジンとの塩基対として、ＤＮＡの場合には、グアニン：シトシンおよびアデニン：チミンの組合わせ、ＲＮＡの場合にはアデニン：ウラシルの組合わせを形成する。その他の余り一般的ではない塩基、例えば、イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチン等々がハイブリッド形成配列に含まれ、対形成を阻害しない。
【０１６８】
アンチセンスヌクレオチド配列が宿主細胞に導入された場合、当該遺伝子に対応する細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリッド形成し、結果としてエンコードされたタンパク質の発現を、例えば、細胞内での転写および／または翻訳を阻害することにより阻害する。
【０１６９】
アンチセンスヌクレオチド配列を含んでなる単離した核酸分子は、例えば、発現ベクターとして誘導化することが可能でりあり、細胞中でそれを転写する場合、該遺伝子のエンコードｍＲＮＡの少なくともユニーク部分に相補性のＲＮＡを生じる。別法として、アンチセンスヌクレオチド配列を含んでなる単離した核酸分子は、エキソビボで調製されるオリゴヌクレオチドであり、これを細胞に導入した場合、遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリッド形成することにより、エンコードされたタンパク質の発現を阻害するに至る。
【０１７０】
好ましくは、オリゴヌクレオチドはアンチセンス分子をエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対し抵抗性とする人工的ヌクレオチド間結合を含み、その結果、細胞中で安定となる。アンチセンスヌクレオチド配列として使用するための修飾核酸分子の例は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート類似体であり、これらは例えば米国特許第５,１７６,９９６；５,２６４,５６４；および５,２５６,７７５に記載されている。アンチセンス療法に有用なオリゴマーの一般的調製法は、例えば、Van der Krol., BioTechniques, 6:958-976 (1988); Stein et al., Cancer Res., 48:2659-2668 (1988) に記載されている。
【０１７１】
代表的なアンチセンス方法は、遺伝子のエンコードｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡの調製からなる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは遺伝子のエンコードｍＲＮＡにハイブリッド形成し、翻訳を妨げる。所望の遺伝子とハイブリッド形成するアンチセンスヌクレオチド配列の許容能はアンチセンスヌクレオチド配列の相補性の程度および長さに依存する。一般に、ハイブリッド形成核酸の長さが増加するにつれ、ＲＮＡとのより多くの塩基誤対合を含む可能性があり、なお安定な二重鎖または三重へリックスを形成する。当業者はハイブリッド形成複合体の融点を決定する常套の手法を用いることにより、かなりの程度の誤対合を判断することができる。
【０１７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ｍＲＮＡの５'末端に相補性となるように設計する；例えば、ｍＲＮＡ開始部位、すなわち、ＡＵＧに相補的な領域まで、またはその領域を含む５'非翻訳配列に相補性とする。しかし、ｍＲＮＡの３'非翻訳配列に相補性であるオリゴヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに有効であることが示されている（記載例：Wagner, Nature, 372:333 (1994)）。アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡコード化領域に相補性となるように設計し得るが、かかるオリゴヌクレオチドは翻訳の阻害剤として有効性が低い。
【０１７３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成するｍＲＮＡの領域にかかわらず、一般に１５ないし２５個のヌクレオチドの長さである。
【０１７４】
アンチセンスヌクレオチドは少なくとも１個の修飾塩基部分、例えば、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、７−メチルグアニン、５−フルオロフラシル、５−ブロモウラシルなどを含んでいてもよく、また、少なくとも１個の修飾糖部分、例えば、アラビノース、ヘキソース、２−フルオルアラビノースおよびキシルロースなどを含んでいてもよい。
【０１７５】
もう一つの態様において、アンチセンスヌクレオチド配列はアルファ−アノマーヌクレオチド配列である。アルファ−アノマーヌクレオチド配列は相補性ＲＮＡとの特異的ニ本鎖ハイブリッドを形成し、その場合、通常のベータ−単位とは対照的に、鎖が互いに並行に走る（記載例：Gautier et al., Nucl. Acids Res., 15:6625-6641 (1987)）。
【０１７６】
アンチセンスヌクレオチドはインビボで、記載の遺伝子を発現する細胞に様々な技法、例えば、目標の組織部位への直接注射、アンチセンスヌクレオチドをリポソームに包み込むなどの技法により、または標的とするアンチセンスヌクレオチドを、細胞表面で発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合して修飾し、そのアンチセンスヌクレオチドを標的細胞に投与することにより、送達することができる。
【０１７７】
しかし、上記の送達方法では、内在ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに十分な細胞内濃度を達成することが困難である可能性がある。したがって、好適な態様において、アンチセンスヌクレオチド配列を含んでなる核酸は、プロモーター（すなわち、特定遺伝子の転写を開始するのに必要なＤＮＡ配列）の転写制御下に置き、発現構築物を形成させる。かかる構築物を細胞の形質移入に使用すると、記載された遺伝子の内在ｍＲＮＡとハイブリッド形成するのに十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写が起こり、それによって該遺伝子のエンコードｍＲＮＡの翻訳を阻害する。例えば、ベクターは細胞によって取り込まれ、アンチセンスヌクレオチド配列の転写を指令するようにインビボで導入することができる。かかるベクターは標準的な組換え工学技法により構築することができる。代表的な発現ベクターは細菌のプラスミドまたはファージ、例えば、ｐＵＣまたはブルースクリプト（商標）プラスミドシリーズ、またはウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルスおよびレトロウイルスなど、真核細胞での使用に適合するものである。アンチセンスヌクレオチド配列の発現は哺乳動物細胞にて作用する技術上既知のプロモーターにより達成し得る。かかるプロモーターの例は、これらに限定されるものではないが、ラウス肉腫ウイルスの３'長鎖繰返しに含まれるプロモーター（記載例：Yamamoto et al., Cell, 22:787-797 (1980)）；ヘルペスチミジンキナーゼ・プロモーター（記載例：Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1441-1445 (1981)）；ＳＶ４０初期プロモーター領域（記載例：Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310 (1981)）；およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列（記載例：Brinster et al., Nature, 296:39-42 (1982)）などである。
【０１７８】
リボザイムはＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと同様の様式で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に開裂するＲＮＡ分子である。ＲＮＡをコードするアンチセンスヌクレオチド配列を修飾することにより、リボザイムは分子中の特異ヌクレオチド配列を認識し、それを開裂するように合成することができる；記載例：Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030 (1988)。したがって、特異配列をもつｍＲＮＡのみが開裂され、不活化される。
【０１７９】
２つの基本型のリボザイムは、“ハンマーヘッド”型（記載例：Rossie et al., Pharmac. Ther., 50:245-254 (1991)）およびヘアピンリボザイム（記載例：Hampel et al., Nucl. Acids Res., 18:299-304 (1999); 米国特許第５,２５４,６７８）である。開示遺伝子の少なくとも１つに対応するｍＲＮＡを標的とするハンマーヘッドとヘアピン・リボザイムの細胞内発現は、当該遺伝子がコードするタンパク質を阻害するために利用することができる。
【０１８０】
リボザイムはリボザイム配列を包含するＲＮＡオリゴヌクレオチドの形状で、細胞に直接送達するか、または所望のリボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞内に導入することができる。リボザイム配列はアンチセンスヌクレオチドについて記載したのと本質的に同じ様式で修飾することができる；例えば、リボザイム配列は修飾塩基部分を含んでなり得る。
【０１８１】
少なくとも１つの開示遺伝子に相当する二本鎖ＲＮＡ、すなわち、センス−アンチセンスＲＮＡは、少なくとも１つの開示遺伝子の発現を阻害するために利用することができる。二本鎖ＲＮＡによる内在遺伝子の機能と発現の妨害は、様々な生体、例えば、Ｃエレガンス（C. elegans）(記載例：Fire et al., Nature, 391;806-811 (1998))；ショウジョウバエ（記載例：Kennerdell et al., Cell, 23:95(7):1017-1026 (1998)）；およびマウス胎児（記載例：Wianni et al., Nat. Cell Biol., 2(2):70-75 (2000)）などで示されている。かかる二本鎖ＲＮＡは、鋳型を両方向から読み取った一本鎖ＲＮＡのインビトロ転写およびセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖のインビトロ・アニーリングによって合成することができる。二本鎖ＲＮＡもまた対象遺伝子が逆転繰返しにより分けられた反対方向にクローン化されているｃＤＮＡベクター構築物から合成することができる。細胞形質導入に続き、該ＲＮＡが転写され、相補性鎖が再アニールする。少なくとも１つの開示遺伝子に相当する二本鎖ＲＮＡは、上記のような構築物の細胞形質導入により細胞中に導入することが可能となる。
【０１８２】
処置方法に関する術語“アンタゴニスト”とは、当該遺伝子がコードするタンパク質に結合し、その活性を阻害する分子をいう。アンタゴニストは限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、炭水化物および小分子（一般に、分子量約１０００ダルトン以下の分子）である。
【０１８３】
処置方法に関する術語“アゴニスト”とは、当該遺伝子がコードするタンパク質に結合し、その活性を活性化する分子をいう。アゴニストは限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、炭水化物および小分子などである。
【０１８４】
特に有用な態様において、アンタゴニストは該遺伝子の一つ、例えば、ＴＲＰＶ３が発現する細胞表面タンパク質に特異的な抗体である。治療薬として有用な抗体は上記の抗体を包含し、好ましくはモノクローナル抗体である。該抗体は単独で治療のエフェクターとして働き得るし、あるいは実際に細胞殺滅を行う他の細胞を供給することができる。該抗体はまた化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳き毒素などの試薬に接合可能であり、標的剤として作用する。あるいは、該エフェクターは腫瘍標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球である。様々なエフェクター細胞が細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞である。
【０１８５】
治療に使用し得る抗体−治療剤復合体の例は、これらに限定されるものではないが、以下のとおりである：１）放射性核種、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅなどとカップル結合した抗体である（記載例：Goldenberg et al., Cancer Res., 41:4354-4360 (1981); Carrasquillo et al., Cancer Treat. Rep., 68:317-328 (1984); Zalcberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 72:697-704 (1984); Jones et al., Int. J. Cancer, 35:715-720 (1985); Lange et al., Surgery, 98:143-150 (1985); Kaltovich et al., J. Nucl. Med., 27:897 (1986); Order et al., Int. J. Radiother. Oncol. Biol. Phys., 8:259-261 (1982); Courtenay-Luck et al., Lancet, 1:1441-1443 (1984) and Ettinger et al., Cancer Treat. Rep., 66:289-297 (1982)）；２）薬物または生物応答調節剤、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびリンホカイン、インターフェロンなとにカップル結合した抗体（記載例：Chabner et al., Cancer, Principles and Practice of Oncology, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA, 1:290-328 (1985); Oldham et al., Cancer, Principles and Practice of Oncology, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA, 2:2223-2245 (1985); Deguchi et al., Cancer Res., 46:3751-3755 (1986); Deguchi et al., Fed. Proc., 44:1684 (1985); Embleton et al., Br. J. Cancer, 49:559-565 (1984); and Pimm et al., Cancer Immunol. Immunother., 12:125-134 (1982)）；３）毒素にカップル結合した抗体（記載例：Uhr et al., Monoclonal Antibodies and Cancer, Academic Press, Inc., pp.85-98 (1983); Vitetta et al., Biotechnology and Bio. Frontiers, P.H. Abelson, Ed., pp. 73-85 (1984); and Vitetta et al., Science, 219:644-650 (1983)）；４）異種機能抗体、例えば、もう一つの抗体とカップル結合させて、または組合わせて該複合体が癌腫およびエフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞などのキラー細胞の両方に結合するようにした抗体（記載例：Perez et al., J. Exper. Med., 163:166-178 (1986); and Lau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8648-8652 (1985)）；および５）本来の抗体、すなわち、非共役または非複合抗体（記載例：Herlyn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4761-4765 (1982); Schulz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:5407-5411 (1983); Capone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:7328-7332 (1983); Sears et al., Cancer Res., 45:5910-5913 (1985); Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2864-2867 (1984); Koprowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:216-219 (1984); and Houghton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1242-1246 (1985)）。
【０１８６】
上に記載した治療剤に抗体またはそのフラグメントをカップル結合させる方法は技術上周知であり、例えば、上記文献に記載された方法に記載されている。さらにもう一つの態様において、疾患処置用治療剤として有用なアンタゴニストは、開示遺伝子の１つがコードするタンパク質の阻害剤でもよい。
【０１８７】
アンチセンスヌクレオチドで処置する場合、当該方法は開示遺伝子の少なくとも１つから誘導したアンチセンスヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸分子の治療有効量を投与することからなり、その場合のアンチセンスヌクレオチドは当該遺伝子の１つの転写／翻訳を増加させる能力を有する。“単離した”核酸分子という術語は、該核酸分子がその当初の環境（例えば、それが自然に存在するならば、自然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、自然に存在する核酸分子は単離されていないが、同じ核酸分子は自然界の共存する物質の一部または全部から分離され、引き続き自然界に戻すとしても、単離されている。かかる核酸分子はベクターの部分であるかまたは組成分の部分であるが、さらに、かかるベクターまたは組成分がその自然環境の部分ではない状態に単離し得る。
【０１８８】
リボザイムまたは二本鎖ＲＮＡ分子での処置に関しては、当該方法はリボザイムをコードするヌクレオチド配列または二本鎖ＲＮＡ分子の治療有効量を投与することからなり、その場合のリボザイムをコードするヌクレオチド配列／二本鎖ＲＮＡ分子は当該遺伝子の１つの転写／翻訳を減少させる能力を有する。
【０１８９】
アンタゴニストでの処置の場合、該方法はこれら遺伝子の１つがコードするタンパク質を阻害するアンタゴニストの治療有効量を被験者に投与することからなる。
【０１９０】
アゴニストでの処置の場合、該方法はこれら遺伝子の１つがコードするタンパク質を阻害するアゴニストの治療有効量を被験者に投与することからなる。特に有用な態様において、該遺伝子はＴＲＰＶ８であり、アゴニストはメントールの誘導体である化合物および冷感剤であることの知られたその他の化合物であり、限定されるものではないが、カンファー、チモール、ペパーミント油、チモールなどである。かかる化合物は皮膚に冷感を与えることにより、皮膚の炎症と関連する疼痛を軽減するのに特に有用である。
【０１９１】
アンチセンスヌクレオチド、リボザイムをコードするヌクレオチド配列、二本鎖ＲＮＡ、アゴニストまたはアンタゴニストからなる単離核酸分子の“治療有効量”は、疼痛を有する被験者を処置するためのこれら治療剤の１つの十分な量をいう。治療有効量の決定は当業者の能力範囲内で対応し得る。いずれの治療薬についても、治療有効用量は当初細胞培養アッセイによるか、または動物モデル、通常、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたはブタなどにて評価する。動物モデルは適切な濃度範囲および投与経路決定のためにも使用し得る。かかる情報はヒトでの投与に有用な用量および経路を決定するために次いで使用し得る。
【０１９２】
本発明はまた疼痛処置方法を提供するが、該方法はＴＲＰＶ３−、ＴＲＰＶ４−またはＴＲＰＭ８−介在の疼痛を有する患者について、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４またはＴＲＰＭ８遺伝子がコードするタンパク質またはそれに対応するｍＲＮＡの発現を測定し、次いで、これら遺伝子の１つの活性または発現を増加または減少させる作用因子の鎮痛剤としての有効量をかかる患者に投与することからなる。当該作用因子は上記の治療剤でもよい。
【０１９３】
“鎮痛剤としての有効量”とは上記のような治療有効量のことである。
【０１９４】
治療有効性および毒性、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％での治療有効用量）およびＬＤ５０（集団の５０％での致死量）は細胞培養または実験動物における標準薬学手法により決定し得る。毒性作用と治療作用間の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０により表される。アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡ、アゴニスト、アンタゴニスト、および治療指数の大きいその他の作用因子が好適である。細胞培養アッセイおよび動物での検討から得られるデータは、ヒトで使用する場合の用量範囲を定める際に使用する。かかる組成物に含まれる投与量は、好ましくは毒性が僅かであるかまたは毒性をもたないＥＤ５０からなる循環濃度の範囲内である。投与量はこの範囲内で、採用する投与形態、患者の感受性および投与経路により変わる。
【０１９５】
正確な投与量は処置を必要とする被験者に関るファクターを勘案して担当医が決める。投与量と投与は活性部分の十分なレベルを提供するために、または所望の効果を維持するために調整する。考慮すべきファクターは、疾患状態の重症度、被験者の全身健康状態、被験者の年齢、体重および性別、食事、投与の時間と頻度、薬物の組合わせ、反応感受性および治療に対する耐性／応答などである。
【０１９６】
通常の投与量は０.１〜１００,０００ｍｇと多様であり、投与経路により約１ｇの全用量までである。特定の投与量と送達方法に関する手引きは文献に提供されており、一般に技術担当医に入手可能である。当業者はアンタゴニストに対してよりもヌクレオチドに対して異なる剤形を採用するであろう。
【０１９７】
治療に適用する場合、アンチセンスヌクレオチド、リボザイムをコードするヌクレオチド配列、二本鎖ＲＮＡ（リポソームに取込まれているか、またはウイルスベクターに含まれているかにかかわらず）、抗体またはその他の薬剤が、１種以上の医薬的に許容し得る担体と組合わせて、治療薬を含む医薬組成物として好適に投与される。該組成物は単独で、または少なくとも１種の他の作用因子、例えば、安定化化合物、と組合わせて投与し得る；これらは無菌の生体適合性医薬担体と共に投与可能であり、当該担体は限定されるものではないが、塩溶液、緩衝塩溶液、デキストロースおよび水である。該組成物は単独で、または他の作用因子、薬物またはホルモンと組合わせて患者に投与し得る。
【０１９８】
該医薬組成物は様々な経路、例えば、これらに限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、鞘内、心室内、皮内、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下または直腸投与手段により投与し得る。
【０１９９】
有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物を医薬的に使用し得る製剤に加工処理するのを容易にする賦形剤および補助剤を含んでなる適切な医薬的に許容し得る担体を含んでいてもよい。製剤化および投与のための技法についてのさらなる詳細は、レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co., Easton, PA）の最新版に見出し得る。
【０２００】
経口投与用医薬組成物は、経口投与に適した剤形において技術上周知の医薬的に許容し得る担体を使用して製剤化することができる。かかる担体は患者が摂取するための、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液などとして該医薬組成物の製剤化を可能とする。
【０２０１】
経口用の医薬製剤は、活性化合物と固形の添加物と組合わせ、得られる混合物を任意に粉砕し、要すれば適当な補助剤を加えた後に該顆粒混合物を加工処理して錠剤もしくは糖衣錠核を得る。適切な添加物は、炭水化物またはタンパク質賦形剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、バレイショ、または他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはナトリウム・カルボキシメチルセルロースなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントなどのガム；およびゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質である。要すれば、崩壊剤または溶解剤、例えば、架橋性ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などを添加してもよい。
【０２０２】
糖衣錠核は適切なコーティング剤と共に使用する；コーティング剤は、例えば、濃厚糖溶液で、この溶液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタンなどを含んでいてもよい；また、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物である。錠剤または糖衣錠コーティング剤には、製品確認のため、または活性化合物の量、すなわち、投与量を特徴付けるために染料または色素を加えてもよい。
【０２０３】
経口的に使用し得る医薬製剤は、ゼラチンでできた押しばめカプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどのコーティング剤でできたソフトシールカプセルである。押しばめカプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど滑沢剤、および任意の安定剤などと混合した有効成分を含む。ソフトカプセルでは、活性化合物を適切な液体、例えば、脂肪油、液体または液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁することができる；安定剤はあってもなくてもよい。
【０２０４】
非経口投与に適する医薬処方は水溶液として、好ましくは生理的に両立し得るバッファー、例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理的緩衝塩溶液などで製剤化するとよい。注射水性懸濁液は懸濁液の粘性を増す物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は適切な油性注射懸濁液として調製し得る。適切な親油性溶媒または媒体は、ゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソームなどである。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーは補給のためにも使用し得る。選択肢として、該懸濁液は、化合物の溶解性を増し、高濃度溶液の調製を可能とする適切な安定剤または作用因子を含有してもよい。
【０２０５】
局所または鼻内投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適切な浸透剤を製剤化において使用する。かかる浸透剤は一般に技術上既知である。
【０２０６】
本発明の医薬組成物は技術上既知の方法、例えば、常套の混合、溶解、顆粒化、糖衣化、微粒子化、乳化、被包形成、封入化または凍結乾燥工程により製造し得る。
【０２０７】
医薬組成物は塩として提供してもよく、多くの酸、例えば、これらに限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などと形成することができる。塩は対応する遊離の塩基の形状にあるよりも、水性または他のプロトン性溶媒に溶け易い傾向がある。他の場合にも、好適な製剤は凍結乾燥粉末であり、以下のもののいずれかまたはすべてを含んでもよい：１〜５０ｍＭヒスチジン、０.１〜２％スクロース、および２〜７％マンニトール；ｐＨ範囲４.５〜５.５で使用前に組合わせる。
【０２０８】
医薬組成物を調製した後、それを適切な容器に容れ、指定条件で処置するためのラベルを貼る。アンチセンスヌクレオチドまたはアンタゴニストの投与のために、かかるラベルには投与量、投与回数および方法を記載する。当業者はアンタゴニスト、例えば、抗体または阻害剤、に対してよりもアンチセンスヌクレオチドについて異なる剤形を採用するだろう。タンパク質の経口投与に適する医薬剤形については以下の特許に記載がある：米国特許第５,００８,１１４；５,５０５,９６２；５,６４１,５１５；５,６８１,８１１；５,７００,４８６；５,７６６,６３３；５,７９２,４５１；５,８５３,７４８；５,９７２,３８７；５,９７６,５６９；および６,０５１,５６１。
【０２０９】
もう一つの側面において、被検体、例えば、ラット傷害モデルを上記のような治療剤での処置は、開示遺伝子の少なくとも１つによりエンコードされたｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの検出、または該遺伝子によりエンコードされたタンパク質の活性を検出することによりモニターすることができる。これらの測定はその処置が有効であるかどうか、またはそれを調整または最適化すべきかを示す。したがって、臨床治験に際して、本明細書に記載の遺伝子の１またはそれ以上を薬物の有効性についてのマーカーとして使用することができる。
【０２１０】
特に有用な態様において、疼痛を有する被験者を作用因子（例えば、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイにより同定されるアンタゴニスト、タンパク質、核酸、小分子またはその他の治療剤または候補作用因子）による処置の有効性をモニターする方法が提供される。当該方法は以下の工程からなる：
ａ）該作用因子の投与前に被検体から投与前サンプルを得る工程；
ｂ）投与前サンプル中の該遺伝子がコードするｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを検出、または該遺伝子がコードするタンパク質の活性を検出する工程；
ｃ）被検体から１またはそれ以上の投与後サンプルを得る工程；
ｄ）１つまたは複数の投与後サンプル中の該遺伝子がコードするｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを検出、または該遺伝子がコードするタンパク質の活性を検出する工程；
ｅ）投与前サンプル中の該遺伝子がコードするｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、または該遺伝子がコードするタンパク質の活性と、１つまたは複数の投与後サンプル中の該遺伝子がコードするｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、または該遺伝子がコードするタンパク質の活性とを比較する工程；および
ｆ）その結果にしたがって、作用因子の投与を調整する工程。
【０２１１】
例えば、当該遺伝子の発現または活性のレベルを、検出されたよりも低いレベルに低下させるためには、すなわち、作用因子の有効性を上昇させるためには、作用因子の増量投与が望ましい。あるいは、当該遺伝子の発現または活性を検出されたよりも高いレベルに上昇させるためには、すなわち、作用因子の有効性を低下させるためには、作用因子の減量投与が望ましい。
【０２１２】
実施例
以下の実施例は説明のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０２１３】
新規ＶＲの同定
Ａ．ＶＲ検索
戦略：既知ＶＲ配列をＮＣＢＩからダウンロードし（ＧＩ Ｎｏ．６７８２４４、５３０５５９８、７１０６４４５、４５８９１４３、６６３５２３８、２５７０９３３、５２６３１９６および４５８９１４１）、クラスタル（Clustal）（メガライン−ＤＮＡスター（Megalign-DNAstar）、マディソン、ウィスコンシン）を用い、以下のパラメータによりまとめる：ギャップ・ペナルティ１０、ギャップ・レンス・ペナルティ１０、Ｋタプル１、ウインドウ５および保存対角線５。この整列は＊.ＭＳＦファイルとして保存される。
【０２１４】
この＊.ＭＳＦファイルはＨＭＭＢＵＩＬＤ２.０（シーン・エディ（Sean Eddy）、ワシントン大学、セントルイス）により隠れマルコフ（Markov）モデルに変換し、次いで、ＨＭＭＣＡＬＩＢＲＡＴＥ２.０（シーン・エディ）により校正し、デフォルトパラメータを用いセレラ・ヒトゲノムデータの６フレーム翻訳（Ｆｅｂ２０放出）の検索に使用する。これらファイルのタンパク質配列を回収し、ＮＲのＢＬＡＳＴＰの対象として用いる。このファイルを手作業で詳細に調べ、ＶＲに対する３つの新規候補を同定する。
【０２１５】
Ｂ．ＶＲ ＴＲＰＶ３の同定
機械的刺激または熱刺激は、毛嚢のようなまたは遊離の神経末端としてのレセプター構造で皮膚に終結する特殊化した知覚ニューロンを活性化する。疼痛および温度感知ニューロンは後者の範疇に属し、したがって直接刺激を感知すると考えられる。疼痛ニューロンに発現されるＴＲＰチャンネル、ＶＲ１は部分的に有害な熱に対する役割を持つ。本実施例では有害な熱により活性化されるＶＲ１の密接な一族であるＴＲＰＶ３のクローニングについて記載する。驚くべきことに、ＴＲＰＶ３は皮膚細胞において最も高く発現する。ＴＲＰＶ３を発現する角化細胞は有害な熱に対し反応してカルシウム流入を示す。したがって、皮膚細胞は熱を“知覚する”知覚ニューロンに類似の分子的手段をもつ。
【０２１６】
体細胞知覚システムにおいて最も良く解明されているレセプターのＶＲ１（ＴＲＰＶ１）は有害な熱による直接のゲートとなる。ＶＲ１は有害な熱を検出するために遊離の神経末端として皮膚に終結する小径の侵害受容ＤＲＧニューロンに発現される。ＶＲ１ノックアウトマウスを分析すると、このチャンネルが熱感知に対して部分的役割を担うことが分かる。ＶＲ１は細胞内カルシウム貯留の機械的感覚、浸透度調節および再貯留において機能する６つの膜貫通含有ＴＲＰ非選択的カチオンチャンネルの系統群に属する。このＴＲＰＶ系統群は少なくとも５種のメンバーを含み、その中の３種はＤＲＧニューロンで発現される。これらの内の１つ、ＶＲＬ１（ＴＲＰＶ２）は熱によるゲートとして働くが、ＶＲ１よりも高い閾値（４３℃の代わりに５２℃）をもち、ＶＲ１と同時には発現されない。最近の実験では、ＶＲＬ１の発現がＶＲ１ノックアウトマウスにおける熱感知ニューロンと相関しないことが暗示されており、さらにもう一つの熱感知チャンネルの存在を示唆する。
【０２１７】
ＶＲ１関連ＴＲＰチャンネルについての公開およびセレラデータベースは、異なる哺乳動物種からのＶＲ１およびＶＲＬ１タンパク質配列のハイデン・マルコフ（Hidden Markov）モデル（ＨＭＭ）を構築することにより検索する。このモデルにより、ヒト配列の６−フレーム翻訳について質問し、ＶＲ１のアンキリンおよび膜貫通ドメインに対すし高度の配列類似性を有する複数の新規推定エキソンを同定した。これらのエキソンを２つの遺伝子に地図化するが、その１つは文献記載どおりのＴＲＰＶ４である（例えば、Liedtke et al., Cell, 103:525-35 (2000); and Strotmann et al., 上記）。他の新規遺伝子はＴＲＰＶ３として知られる。
【０２１８】
マウスＴＲＰＶ３の全長配列は、エキソン予測ソフトウエア、新生児マウスＤＲＧと皮膚ｃＤＮＡからのＰＣＲおよびＲＡＣＥの組合わせから導く。ＰＣＲクローニング用には、プライマー（５'−ＴＧＡＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＧ−３'（配列番号１９）および５'−ＡＣＧＡＧＧＣＡＧＧＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＴＴ−３'（配列番号２０））を、アンキリンと膜貫通ドメインに対する幼若細胞ヒットの結果として、ＴＲＰＶ３についてＨＭＭ配列から設計し、新生児ＤＲＧｃＤＮＡからのＴＲＰＶ３の６９９−ヌクレオチドフラグメントの増幅に使用する。この最初のフラグメントから、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）ＰＣＲ（クロンテック（Clontech））を用いて、マウス新生児皮膚とＤＲＧｃＤＮＡからＴＲＰＶ３の５'および３'末端を得る。ＶＲ１とＴＲＰＶ３のゲノム位置を特定するために、予測したＨＭＭのＴＲＰＶ３エキソン配列からプライマーを設計し、ゲノムＢＡＣマウス（ＲＰＣＩ２２）ライブラリー（ロスウエル・パーク癌研究所）をスクリーニングするのに使用する。利用したプライマーを表１に示す。さらに、マウスＶＲ１ＢＡＣは、マウスＶＲ１アンキリン領域にわたる３２０ｂｐのプローブを同じＢＡＣライブラリーにハイブリッド形成させることにより同定する。陽性のＢＡＣクローンについて、さらに制限消化マッピング、パルスフィールドゲル電気泳動法、およびＶＲ１およびＴＲＰＶ３遺伝子の５'と３'末端に特異的なプローブを用いる前記同様のサザーンブロッティング法により特性化する。ＴＲＰＶ３に陽性のＢＡＣクローンは５Ｊ３を含んでいた。ＶＲ１とＴＲＰＶ３の双方に陽性のＢＡＣクローンは、９ｅ２２、２７Ｉ１４、８２ｃ１および１１２ｇ１７を含んでいた。ＶＲ１に陽性のＢＡＣは、１３７Ｎ１３、１３７Ｏ１３、２３４Ｊ２３、２４６Ｄ９および２８５Ｇ１１を含んでいた。
【表１】2005500028.tif 000002
【表２】2005500028.tif 000003
【表３】2005500028.tif 000004
【０２１９】
マウス皮膚組織からの数種のＥＳＴは３'ＵＴＲ ＴＲＰＶ３配列（ＢＢ１４８７３５、ＢＢ１５１４３０およびＡＩ６４４７０１）含んでおり、最近、ヒトのＴＲＰＶ３配列には注釈が付いた（参照：ＧＩ：１８５８７７、１８５８７７０５；および Peng et al., Genomics, 76:99-109 (2001)）。
【０２２０】
ヌクレオチド配列から予測されるように、ＴＲＰＶ３は７９１個のアミノ酸残基からなる。マウスＴＲＰＶ３の全体の配列はＴＲＰＶ１（ＶＲ１）とＴＲＰＶ４に対し４３％の同一性；ＴＲＰＶ２（ＶＲＬ１）に対して４１％；およびＴＲＰＶ５（ＥＣＡＣ）とＴＲＰＶ６に対して２０％の同一性を有する（図２Ｃ参照）。ＴＲＰＶ３は、通常は３種であるが、この場合は４種の、タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると考えられる予測されるＮ末端アンキリンドメイン、ＴＭ６ドメインおよび最終の２つの膜貫通領域間の細孔ループ領域を有する。ＴＲＰＶ３のアンキリンドメインのＮ末端側の２つの多重らせんドメインも同定されている（図２Ｆ参照）。多重らせんドメインはＧＡＢＡ−Ｂチャンネルのオリゴマー形成に関係しており、すでに一部のＴＲＰチャンネルに存在するが、ＴＲＰＶには存在しないことが報告されている。さらなる実験では、ＶＲ１が、ＴＲＰＶ系統群の他の膜にはないが、同じＮ末端位置に推定多重らせんドメインを有する。系統発生分析は、ＴＲＰＶ３は事実上ＯＴＲＰ／ＴＲＰＶサブファミリーのメンバーであり、大型ＴＲＰイオンチャンネル系統群の一部であることを示す（図２Ａ参照）。公的データベースにおいて同じＢＡＣゲノムクローンはＴＲＰＶ３およびＶＲ１の配列を含む。両方の遺伝子がヒト染色体１７ｐ１３とマウス染色体１１Ｂ４に書き込まれている。これらＢＡＣクローンを位置づけ分析し、ヒトおよびマウスのゲノム配列を統合すると、２つの遺伝子間には約１０ｋｂの距離のあることが分かる（図２Ｂ参照）。このことは、ＴＲＰＶ３とＶＲ１が１回の複製事象から誘導されることを示唆している。
【実施例２】
【０２２１】
ＴＲＰＶ３発現の局在化
Ａ．ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析するために、成熟マウスと新生児組織から抽出した３μｇのポリＡ＋ＲＮＡを１％グリオキサールゲル上で電気泳動し、移行して、全鎖長のＴＲＰＶ３配列を表す３２Ｐ標識プローブで高緊縮にハイブリッド形成させる。市販のノーザンブロット（クロンテック）は同じＴＲＰＶ３全長プローブとハイブリッド形成させる。ヒト皮膚特異的発現のために、ノーザンブロットを一時角化細胞および細胞株ＣＲＬ−２３０９とＣＲＬ−２４０４（ＡＴＣＣ）からの全ＲＮＡ２０μｇから、またはポリＡ＋成熟および胎児皮膚ＲＮＡ（ストラタジーン（Stratagene））２μｇから調製した。ブロットをＴＲＰＶ３ヒト配列のアンキリン１−ＴＭ２配列に相当するプローブとハイブリッド形成させる。ＶＲ１ハイブリダイゼーションのために、ラットＶＲ１のアミノ末端をコードするヌクレオチド６０〜６０５に相当するプローブをマウスブロット上で用いる。ヒトＶＲ１の全コーディング配列をヒト・ノーザンブロット上のプローブとして使用する。
【０２２２】
上に述べたように、ＴＲＰＶ３の全組織分布を決定するために、全長マウスＴＲＰＶ３配列をノーザンブロット分析用のプローブとして使用する。市販のノーザンブロットを用いてはＴＲＰＶ３の発現は検出されない。次いで、ＤＲＧ、脊髄および皮膚の異なる起源を含む、体細胞感覚に関係する組織を含む成熟ラットからのブロットを使用する。約６.５ｋｂのｍＲＮＡは皮膚由来の組織には存在するが、ＤＲＧには存在しない。同じ成熟ブロットをＴＲＰＶ１−特異プローブでプローブすると、ＤＲＧにおいてその強い発現を確認するが、一方、皮膚組織での発現は欠いていることを示す。ヒト成人および胎児の皮膚のノーザンブロット分析でも、ＴＲＰＶ３の発現を示す。培養した一次マウス角化細胞ならびに数種の表皮細胞株はノーザンブロットによりＴＲＰＶ３発現は示さない。これらの知見は、ＴＲＰＶ３の発現が組織の分離と長時間の培養により下方に制御される可能性のあることを示唆する。ＤＲＧ、脊髄および皮膚の異なる起源を含む、体細胞感覚に関係する組織を含む新生児および成熟マウスからのノーザンブロットは、ＤＲＧにおける弱い発現と共に皮膚組織においてＴＲＰＶ３の発現を示す。
【０２２３】
Ｂ．組織中ハイブリダイゼーション
組織中ハイブリダイゼーションのために、新生児および成熟組織を切除し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、凍結保護して、ＯＣＴ封入剤中に液体窒素で凍結する。クリオスタット切片（１０μｍ）を加工処理、ジゴキシゲニンｃＲＮＡプローブまたは文献記載どおりのインビトロ転写により生成させた３５Ｓ−標識プローブでプローブする（Wilkinson, Essential Developmental Biology, A Practical Approach, C. Stern, P. Holland, eds., Oxford Univ. Press, NY, pp.258-263 (1993)）。２つのマウスＴＲＰＶ３−特異アンチセンスリボプローブを用いる；その一つは第三のアンキリンとＴＭ４ドメイン間の領域に相当するアミノ末端をコードするヌクレオチド２３５〜１０２０に相当し、他方はヌクレオチド９８０〜１６７５に及ぶプローブである。
【０２２４】
ジゴキシゲニン−標識プローブは、新生児および成熟マウス両方において、毛嚢などの特殊化した皮膚組織で特異発現を示す。表皮での発現は評価が困難である；その理由はセンスプローブによりこの組織で観察されるバックグランドが高いからである。この問題を回避するために、またより以上の感度を得るために、新生児マウスの切断面上、３５Ｓ−放射活性組織内ハイブリダイゼーションを実施する。明瞭な発現が表皮と毛嚢に検出される。ＤＲＧでは有意な発現を検出しない。
【０２２５】
Ｃ．免疫組織化学染色アッセイ
免疫組織化学のために、マウスＴＲＰＶ３のＮ末端（ＣＤＤＭＤＳＰＱＳＰＱＤＤＶＴＥＴＰＳＮ（配列番号７７））またはＣ末端ペプチド（ＫＩＱＤＳＳＲＳＮＳＫＴＴＬ（配列番号７８））に対応するＫＬＨ接合ペプチドでウサギを免疫する（アニマルファーム・サービス（AnimalPharm Services）、ヒールズバーグ（Healdsburg）、カリフォルニア）。アフィニティ精製した抗血清は、マウスＴＲＰＶ３で安定に形質移入したＣＨＯ細胞から調製した全細胞抽出物に、相対分子質量約８５ｋＤａのバンドを認識する（非開示）。ペプチド競合のために、組織断片とのインキュベーションの前に、ＴＲＰＶ３の希釈抗体溶液（１：５０００）をＴＲＰＶ３抗原ペプチド（９μｇｍＬ−１）と予めインキュベートする（室温、２時間）。免疫蛍光法は固定凍結パラフィン切片上で、ウサギ抗ＴＲＰＶ３（１：５０００）、パンサイトケラチン（アブカム（Abcam））サイトケラチン（１：３００、アブカム）、サイトケラチン１０（Ｋ８.６０、シグマ）、パンベイサル・サイトケラチン（アブカム）、ＰＧＰ９.５（アブカム）を用い、次いで、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗ウサギ抗体（１０μｇ／ｍＬ）およびＣｙ−３−標識ロバ抗マウス抗体（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immunoresearch））を用いて実施する。
【０２２６】
Ｎ末端またはＣ末端からのＴＲＰＶ３ペプチドに対して生成させたポリクローナル抗体を用いると、新生児および成熟げっ歯動物組織からの表皮層の殆どの角化細胞および毛嚢に、強いＴＲＰＶ３の免疫反応が観察される。表皮では、染色は最外層（角質層および淡明層）ならびに基底膜には存在しない。毛嚢では、外部毛根鞘に発現が局在し、基質細胞、内部毛根鞘および皮脂腺からは発現しない。新生児から成熟段階への成長にともなって、毛嚢での発現は増大する。これらの画像を高倍率とすると、細胞質での染色が認められ、形質膜ではそれが高レベルである。
【０２２７】
種々の角質細胞特異マーカーとの同時発現は、ＴＲＰＶ３が、未分化状態を維持するためにインビトロで低カルシウム濃度を必要とする基底角質細胞で発現され、同様に表皮のより分化した基底層上の一部に発現されることを示す。温度感知ニューロンは主として真皮レベルで遊離の神経末端として終結していると考えられるが、一部の突起は表皮に伸びている（参照：Hilliges et al., supra; and Cauna, supra）。皮膚末端は免疫組織化学マーカータンパク質遺伝子産物９.５（ＰＧＰ９.５）で標識し得る；これらの表皮末端は事実上ＴＲＰＶ３と同時に局在化することが観察される。
【０２２８】
Ｄ．ＧＦＰ−融合構築物
全長マウスＴＲＰＶ３を増幅し、ｐｃＤＮＡ３.１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（インビトロゲン）にサブクローンする。インビトロ転写／翻訳（ＴｎＴシステム、プロメガ（Promega））は構築物の完全さを確認する。細胞は形質導入の４８〜７２時間後に生きたままで見るか、または４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヨウ化プロピジウムで対比染色し、スロウフェイド（Slowfade）(モレキュラープローブ)に載置する。
【０２２９】
Ｃ−末端にＧＦＰ−タグを付したＴＲＰＶ３タンパク質構築物を一次的に移入した細胞について共焦点蛍光顕微鏡観察を行い、該タンパク質が主に形質膜に局在していることが判明する。細胞膜でのこの発現パターンはイオンチャンネルとしての役割をもつＴＲＰＶ３と矛盾しない。まとめると、発現の解析は、げっ歯類とヒトの両方で角質細胞の形質膜に最も顕著に発現することを示唆する。
【実施例３】
【０２３０】
熱によるＴＲＰＶ３タンパク質の活性化
Ａ．コンダクタンスに対する熱、カプサゼピンおよびルテニウムレッドの影響
ＴＲＰＶ３がＴＲＰＶ系統団のメンバーに高度の相同性を仮定し、ＴＲＰＶ３が他の密接に関連する系統団メンバーを活性化することが知られている刺激に反応するかどうかを判断するために試験する。したがって、コンダクタンスを仲介するに際してのＴＲＰＶ３活性に対する熱の影響について、ＴＲＰＶ３発現形質移入ＣＨＯ細胞の全細胞パッチクランプ分析法を用いて試験する。
【０２３１】
マウスＴＲＰＶ３およびラットＴＲＰＶ１ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ５（インビトロゲン）にサブクローンし、フュージーン６（Fugene）（ロシュ）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１／ＦＲＴ細胞に移入する。形質移入した細胞は２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（ギブコＢＲＬ）含有ＭＥＭ培地にて増殖することにより選択する。集団を初期継代で凍結し、これらのストックをさらなる検討に使用する。ｍＲＮＡを発現する安定なクローンをノーザンブロット分析ならびにサザーンブロッティング法により同定し、組込み部位を確認する。長期間の培養は引き続き３３℃で維持する。
【０２３２】
ＴＲＰＶ３発現ＣＨＯ細胞を全細胞電圧クランプ技法により電気生理学的にアッセイする。電流はアキソパッチ（Axopatch）２００Ａ経由ｐＣＬＡＭＰ８総合ソフトウエアを介して記録し、５ｋＨｚのフィルターに掛ける。すべての実験で直列抵抗補償は２〜５ＭΩ抵抗、火炎処理ピペットを用い、８０％である。断りのない限り、殆どの実験での維持電位は−６０ｍＶであるが、ただし、電流−電圧関係の検討（−１００ないし＋８０ｍＶの２秒のランプ）は例外とする。細胞は通常１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ−ＣａＣｌ２、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含有し、ＮａＯＨでｐＨ７.４に滴定した培地中に漬ける；ただし、一価の透過性検討の場合はＮａＣｌを等モル量のＫＣｌまたは５ｍＭ−ＫＣｌを除いてＣｓＣｌに置き換える。ニ価の透過性検討には、当該溶液は、スクロースを含まない上記溶液に、１ｍＭのＣａ２＋またはＭｇ２＋、および１００ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、８０ｍＭスクロース、または３０ｍＭテストイオンを含む。無カルシウム培地での実験では１００μＭのＥＧＴＡを加えて、ＣａＣｌ２は加えない。ピペット溶液は常に１４０ｍＭ−ＣｓＣｌ、１ｍＭ−ＣａＣｌ２、１０ｍＭ−ＥＧＴＡ、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ−ＭｇＡＴＰからなり、ＣｓＯＨでｐＨ７.４に滴定する。透過性については、Ｎａ（Ｐｘ／ＰＮａ）に対する一価カチオンの相対比を以下のように計算する：
Ｐｘ／ＰＮａ＝Ｅshift＝｛ＲＴ／Ｆ｝ｌｏｇ（Ｐｘ／ＰＮａ［Ｘ］０／［Ｎａ］０）
ただし、式中、Ｆはファラデー定数、Ｒは気体定数、およびＴは絶対温度を示す。ニ価イオンについては、ＰＣａまたはＰＭｇ／ＰＮａを以下のように計算する：
Ｅshift＝｛ＲＴ／Ｆ｝log｛[Ｎａ]０＋４Ｂ'[Ｘ]０(２)｝／｛[Ｎａ]０４Ｂ'[Ｘ]０(１)｝
ただし、式中、Ｂ'＝Ｐ'ｘ／ＰＮａおよびＰ'ｘ＝Ｐｘ／（１＋ｅＥＦ／ＲＴ）および[Ｘ]０(１)および[Ｘ]０(２)は、試験したニ価イオンの２つの異なる濃度をいう。
【０２３３】
全細胞電圧クランプ技法により電気生理学的にアッセイした形質移入細胞からの結果を以下に記載する。ＴＲＰＶ１の活性化剤であるカプサイシン（１μＭ）はＴＲＰＶ３発現細胞において応答を引き出さない。同様に、７０ｍＭ−ＮａＣｌ含有または低ｐＨ（５.４）とした低浸透圧性溶液でＴＲＰＶ３発現細胞を誘発した場合、電流応答は見られない。しかし、灌流外部溶液の温度を室温から４５℃に上昇させると、ＴＲＰＶ３発現細胞において電流が発生する。約１５℃から約４８℃の温度ランプにより発生する電流を分析すると、温度が約３３℃以上に上昇するまで殆ど電流を発生しないが、有害温度範囲（＞４２℃）においては電流が上昇し続けることを示す（図３Ａ参照）。これらの知見に基づき、ＴＲＰＶ３発現細胞は引き続き３３℃に維持し、構成的活性化を回避する。電流の振幅は外部培地中のＣａ２＋の有無に影響を受け、無Ｃａ２＋溶液に事前のチャレンジ後、２ｍＭ−Ｃａ２＋が存在すると電流の振幅は低下する（図３Ｂ参照）。この知見はＴＲＰＶ５およびＴＲＰＶ６のチャンネルの性質を思い出させる（参照：Nilius et al., J. Physiol., 527:239-248 (2000)）。図３Ｃに示すように、ＴＲＰＶ３発現ＣＨＯ細胞の熱誘発電流は３５℃以上の温度で指数的に増加し、６.６２の平均Ｑ１０に対応して、５.２９±０.３５℃（ｎ＝１２）当たりｅ倍の増加となる。この温度依存性は殆どのイオンチャンネル電流に見られるよりも相当に大きく、一般に１.５〜２.０の範囲のＱ１０値を有するが、ＴＲＰＶ１について記した値よりも低い（ＶＲ１、Ｑ１０＝１７.８）（参照：Vyklicky et al., J. Physiol., 517:181-192 (1999)）。一部の細胞では、シャープな閾値温度を見ることは困難である。しかし、３０℃以下の測定可能な温度依存性電流は、温度２２.７２±３.３１℃（ｎ＝１２）の上昇（Ｑ１０＝１.６９）に対しｅ倍の上昇を示す。
【０２３４】
上昇温度発生電流は、ＴＲＰＶ３発現細胞において、−１.２２±１ｍＶの標準記録溶液中、逆電位の顕著な外方向整流を示す（図３Ｄ参照）。外部溶液のＮａＣｌを（１４０ｍＭから）７０ｍＭに減少させると、カチオン選択コンダクタンス（シフト＝−１７.５ｍＶ）として予測されるように、逆電位を−１９ｍＶシフトさせる。逆電位における差はＴＲＰＶ３チャンネルのイオン選択性を決定するために使用する。単純化した外部溶液において、熱活性化電流の逆電位はＮａＣｌ（Ｅｒｅｖ＝−１.２２±１.０８ｍＶ、ｎ＝５）をＫＣｌ（Ｅｒｅｖ＝−０.４０±０.７７ｍＶ、ｎ＝６）またはＣｓＣｌ（Ｅｒｅｖ＝−１.１４±０.５３ｍＶ、ｎ＝６）と置換えたときに非常に類似しており、相対透過性比ＰＫ／ＰＮａおよびＰＣｓ／ＰＮａは１に接近する（参照：Funayama et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 43:259-266 (1996)。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋の相対透過性は、研究中ながら、二価カチオンを含む１００ｍＭ−ＮａＣｌ溶液での濃度を１ｍＭから３０ｍＭに上昇させたときの逆電位のシフトから推算する。当該逆電位シフト（Ｃａ＋２については−９.１＋１.４０ｍＶから＋１１.２９＋０.３８ｍＶに、またＭｇ２＋については−８.４１±０.５ｍＶから＋１０.３４±２.３８ｍＶに）はＰＣａ／ＰＮａ＝２.５７およびＰＭｇ／ＰＮａ＝２.１８に相当する。これらのデータは、ＴＲＰＶ３が試験した一価のカチオン間の識別力に乏しい非選択的カチオンチャンネルであり、かつ有意なニ価カチオン透過性を有することを示す。
【０２３５】
ＴＲＰＶ３の熱活性化は繰返しの熱刺激により顕著な増感を示す。この研究は−６０ｍＶの定常膜電位で、また電圧ランプにより実施する。室温から約４８℃への段階的上昇に対する最初の反応は多くの場合非常に小さいが、電流反応は熱工程の繰返しにより増大する（図４Ａ参照）。熱に対する増感はＴＲＰＶ１およびＴＲＰＶＬについても観察されている（参照：Caterina et al., supra and Jordt et al., Cell, 108:421-430 (2002)）。電圧ランプの適用は、増感が外方向への整流の増大と関連のあることを示す（図４Ｂ参照）。繰返しの温度攻撃のプロトコールを用い、ＴＲＰＶ１（ＶＲ１）のアンタゴニストがＴＲＰＶ３の阻害剤であるか否かを検討する。正常条件下、４〜５回の増感加熱工程の２分後に加えられた熱攻撃は、先行応答の振幅の１.５７±０.２５（ｎ＝４）倍の電流を発生する（図４Ｃ参照）。ＴＲＰＶ１での競合カプサイシンアンタゴニストであるカプサゼピン１０μＭを、試験熱攻撃の前に２分間適用しても、電流の振幅は低下しない（先行反応の振幅の２.３１±０.３６倍；ｎ＝４）。対照的に、他のＴＲＰＶチャンネルの非競合的阻害剤であるルテニウムレッド１μＭに同様に接触すると、熱反応の相対振幅を０.３４±０.０３（ｎ＝５）に低下させる（図４Ｄ参照）。まとめると、これらの結果はＴＲＰＶ３は暖温および熱温により活性化されるカチオン透過性チャンネルであり、他のＴＲＰＶチャンネルを思わせるチャンネルの性質を有することを示す。
【実施例４】
【０２３６】
ラット・チャン・モデルにおけるＴＲＰＶ３の遺伝子発現解析
以下に考察するこれらの研究では、チャン（Chung）の神経障害性疼痛モデルにおけるＴＲＰＶ３についてのＲＮＡ発現の相対レベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定する。
【０２３７】
Ａ．脊髄神経結紮（チャン）モデル
このモデルはキムおよびチャン（Kim and Chung）（上記、１９９２）が記載した方法にしたがって確立する。ラットを麻酔して腹臥位に置き、背柱の左にＬ４−Ｓ２レベルの切開を施す。脊髄近傍筋を深く離断し、Ｌ４−Ｓ２レベルでの脊髄突起から筋肉を分離し、坐骨神経の部分を分岐するように露出して、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６の脊髄神経を形成する。Ｌ６横突起を小型の骨鉗子で注意深く取り出し、これらの脊髄神経を目視可能とする。Ｌ５脊髄神経を７−０絹縫合糸にてきつく結紮する。傷口を一本の筋縫合糸（６−０絹）と１または２個の閉鎖クリップで閉じ、抗生剤粉末を振り掛ける。対照の擬動物では、Ｌ５神経を同様に露出するが結紮せず、傷口を同様に閉じる。
【０２３８】
各手法についてオス・ウィスターラット（１２０〜１４０ｇ）を使用する。機械的痛覚過敏については、次いで、アナルゲシメータ（Analgesymeter）(ウゴ−バシル（Ugo-Basile）、ミラノ)を用いてラットにおいて圧迫刺激を増大することで、両後肢の足の引っ込め閾値を測定することにより評価する。機械的異痛症は両後肢の足底表面にフライ（von Frey）刺激毛にて加えた非有害刺激に対する引っ込め閾値を測定することにより評価する。温度過敏症は、各後肢の下側に加えた有害熱刺激に対する引っ込め潜伏時間を測定することにより評価する。すべてのモデルについて、機械的過敏症および異痛症と温度過敏症は術後１〜３日内に発生し、少なくとも５０日間は持続する。薬物は外科手術の前後に投与し、過敏症の発症に対する薬物の影響を評価するか、または外科手術後約１４日間、確立した過敏症を逆転する能力を判断する。
【０２３９】
Ｂ．ＲＴ−ＰＣＲｍＲＮＡ解析
チャンモデル（Ｌ４およびＬ５ＤＲＧ）および擬似手術動物からの全ＲＮＡサンプル１μｇを、２００単位スーパースクリプトＩＩ（ＬＴＩ）との２０μＬ全反応物中でのオリゴ（ｄｔ）２４プライマー５０ｐｍｏｌを用いる第一鎖ｃＤＮＡ合成に用いる。ｃＤＮＡを次いでトリス−ＥＤＴＡバッファー（１０ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ８.０および１ｍＭ−ＥＤＴＡ）で希釈して１００μＬとする。希釈したｃＤＮＡ３μＬを用いて、遺伝子特異プライマー（５'から３'方向における配列：ＴＲＰＶ３前進プライマー、ＣＴＣＡＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴ（配列番号７９）；ＴＲＰＶ３逆プライマー、ＡＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧ（配列番号８０））により１５μＬの反応物中、ノットスタートタック（NotStart Taq）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Qiagen））を用いて、ＴＲＰＶ３のメッセージにつき２５〜３８サイクルの増幅を行う。神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）を陽性対照として用いる。
【０２４０】
正常化のために希釈したｃＤＮＡ１μＬを用いて、以下のプライマーによりアクチンを増幅する：
５'アクチンプライマー：ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＡ（配列番号８１）
３'アクチンプライマー：ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＡＣＧ ＣＡ（配列番号８２）
【０２４１】
次いで、サンプルの一部を４−２０ＴＢＥクライテリオン（Criterion）ポリアクリルアミドゲル（バイオラッド（BioRad））上で分析し、ＳＹＢＲグリーンＩ（モレキュラープローブ）で染色し、りん光発光器上可視化する。
【０２４２】
３回の独立した実験におけるチャンモデルからのＬ４およびＬ５ＤＲＧニューロンのＴＲＰＶ３（ＶＲＬｘ）の平均折りたたみ制御を示す。図１Ａに示すように、陽性対照、ＮＰＹおよびＴＲＰＶ３メッセージは、擬似および非結紮ＤＲＧに相対的に傷害ＤＲＧの上昇を示す。
【実施例５】
【０２４３】
ＴＲＰＶ４の同定
プライマーはコンピューターモデルを介して同定した候補遺伝子の特徴的な領域を増幅するように設計する。得られたヒト配列に基づき、ＴＲＰＶ４のマウス相同体（ｍＴＲＰＶ４）を増幅するためにプライマーを設計する（ＴＲＰＶ４前進：ＣＴＣＡＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴ（配列番号８３）；ＴＲＰＶ４逆：ＡＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧ（配列番号８４））。これらのＰＣＲ産物を引き続き配列決定し、これらの配列を用いてマウスＥＳＴデータベースを検索する。１つのＥＳＴクローン（ＩＤ番号ＡＩ５１０５６７）を確認し、イメージ（ＩＭＡＧＥ）国際共同事業体から入手する。ＥＳＴについてさらに特性化し、約２.４ｋｂの挿入断片を含むことを見出し、その配列を決定する。この配列からプライマーを設計し、ＲＡＣＥプロトコール（クロンテック）により全長のｃＤＮＡを得るために使用する。５'および３'ＲＡＣＥ産物両方を得て、配列決定する。この方法により、ＲＡＣＥ産物の最小の５'および３'末端から設計したプライマーを用いて、マウス腎臓からのｍＴＲＰＶ４の全長ｃＤＮＡおよびＤＲＧｃＤＮＡを増幅する。ｍＴＲＰＶ４の特性化に利用したプライマーのすべてを表２に示す。約３.２ｋｂの新規全長ｃＤＮＡを同定したが、このｃＤＮＡは約２.５ｋｂのオープンリーディングフレーム、約１４５ｂｐからなる５'ＵＴＲおよび約４００〜５００ヌクレオチドを包含する３'ＵＴＲを含む。該遺伝子は３種のアンキリン繰返し領域およびＴＭ６ドメインを含む３.４ｋｂ転写物をコードする。このタンパク質配列は約１０００のアミノ酸からなり、配列番号１４で示される。ラットＶＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２９３１０）に対しクラスタルＷ整列すると、ＴＭ４領域を経てＡｎｋ２におよぶ領域において、ＶＲ１に対して３４％の同一性および６４％の類似性を示す。
【表４】2005500028.tif 000005
【０２４４】
ＲＴ−ＰＣＲとノーザンブロット分析を組合わせて利用し、ＴＲＰＶ４の発現を特性化する。全ＲＮＡを成熟マウス腎臓、新生児ＤＲＧおよび成熟三叉神経組織から調製する。ＲＴ−ＰＣＲはこれら３種のマウス組織から調製したｃＤＮＡおよびｍＴＲＰＶ４のアンキリンとＴＭドメイン内のプライマーを用いて実施する。予測される４０３ｂｐの産物は３種の組織すべてに観察される。このＰＣＲ産物をプローブとしても用い、ノーザンブロットを行う（クロンテックＭＴＮブロット）。予測される３.４ｋｂの転写物が腎臓と他の組織に観察される。
【０２４５】
ｈＴＲＰＶ４のゲノム構造は高処理ゲノム配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ００７８３４）から予測する。ＨＶＲ３は約１７のエキソンを包含する。ラットＶＲ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２９３１０）とマウスＶＲ３タンパク質を比較すると、アンキリン２領域とＴＭ４ドメインにまたがる配列において、３４％の同一性および６４％の類似性を示す。ｈＴＲＰＶ４のヌクレオチドとアミノ酸配列を配列番号１６と配列番号１７にそれぞれ示す。
【実施例６】
【０２４６】
ラットチャンモデルにおけるＴＲＰＶ４の遺伝子発現解析
以下に考察するこれらの検討では、チャン神経障害性モデルにおけるＴＲＰＶ４のＲＮＡ発現の相対的レベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定する。
【０２４７】
Ａ．脊髄神経結紮（チャン）モデル
このモデルはキムおよびチャン（Kim and Chung）（上記）が記載した方法にしたがって確立し、また実施例４の記載どおりである。
【０２４８】
Ｂ．ＲＴ−ＰＣＲｍＲＮＡ分析
チャンモデル（Ｌ４およびＬ５ＤＲＧ）および擬似手術動物からの全ＲＮＡサンプル１μｇを、２００単位スーパースクリプトＩＩ（ＬＴＩ）との２０μＬ全反応物中でのオリゴ（ｄｔ）２４プライマー５０ｐｍｏｌを用いる第一鎖ｃＤＮＡ合成に用いる。ｃＤＮＡを次いでトリス−ＥＤＴＡバッファー（１０ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ８.０および１ｍＭ−ＥＤＴＡ）で希釈して１００μＬとする。希釈したｃＤＮＡ３μＬを用いて、遺伝子特異プライマー（５'から３'方向における配列：ＴＲＰＶ４前進プライマー、９９ＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴＡＧＧＴＧＡＴＧＡＧ１２０（配列番号９６）；ＴＲＰＶ４逆プライマー、２５５ＣＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣ２３６（配列番号９７））により１５μＬの反応物中、ノットスタートタック（NotStart Taq）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン（Qiagen））を用いて、ＴＲＰＶ４のメッセージにつき２５〜３８サイクルの増幅を行う。ＮＰＹを陽性対照として用いる。
【０２４９】
正常化のために希釈したｃＤＮＡ１μＬを用いて、以下のプライマーによりアクチンを増幅する：
５'アクチンプライマー：ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＡ（配列番号８１）
３'アクチンプライマー：ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＡＣＧ ＣＡ（配列番号８２）
【０２５０】
次いで、サンプルの一部を４−２０ＴＢＥクライテリオン（Criterion）ポリアクリルアミドゲル（バイオラッド（BioRad））上で分析し、ＳＹＢＲグリーンＩ（モレキュラープローブ）で染色し、りん光発光器上可視化する。
【０２５１】
チャンモデル（結紮後５０日）からの第一鎖ｃＤＮＡを自家保有遺伝子ベータ−アクチンにより正常化する。図１Ａおよび１Ｂはチャンモデル（それぞれ、結紮後５０日および２８日目）におけるＴＲＰＶ４とＮＰＹの発現を示す。陽性対照、ＮＰＹおよびＴＲＰＶ４は擬似および非結紮ＤＲＧに比べて傷害のあるＤＲＧで上昇する。したがって、ＴＲＰＶ４は神経障害性疼痛の標的として作用する。
【実施例７】
【０２５２】
ＶＲ ＴＲＰＭ８の同定
新規ＴＲＰチャンネルを同定するために、異なる哺乳動物種の既知ＴＲＰタンパク質配列からＨＭＭを構築することにより、ゲノムＤＮＡデータベースを検索する。このモデルにより、入手可能なすべてのヒト配列の６−フレーム翻訳について質問し、ＶＲ１のＴＭ４およびＴＭ６に類似性をもつ複数の新規推定エキソンを同定する。１つの新規ＴＲＰチャンネルのマウス相同体フラグメントをマウスＤＲＧ ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより増幅する。この遺伝子の全長配列は、エキソン予測ソフトウエア、ＰＣＲおよびＲＡＣＥ増幅を組合わせることにより、新生児マウスＤＲＧから誘導する。
【０２５３】
ＰＣＲクローニングのために、幼若細胞ヒットの結果としてのＴＲＰＭ８のＨＭＭ配列から、プライマー１６３ｆ（５'−ＣＡＡＧＴＴＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＣ（配列番号９８））および１６４ｒ（５'−ＡＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＴ（配列番号９９））を設計し、新生児ＤＲＧ ｃＤＮＡからＴＲＰＭ８の６９９ヌクレオチドフラグメントを増幅するために使用する。この当初の配列とエキソン予測プログラムから、ＲＡＣＥ ＰＣＲ（クロンテック）を用い、製造業者のプロトコールに従い、マウス新生児ＤＲＧ ｃＤＮＡからのＴＲＰＭ８の５'および３'末端を得る。これらの実験に使用したプライマーを表３に示す。
【表５】2005500028.tif 000006
【０２５４】
タンパク質ＴＲＰＭ８はクラファムら（Clapham et al., Cell, 108:595-598 (2001)）が示唆した命名法に従い命名する。数種のヒトＥＳＴは、その多くが種々の癌組織から単離されたものであるが、ＴＲＰＭ８のフラグメントを含む（ＧｅｎＢａｎｋＧＩ番号：８７５０４８９、９１４９３９０、９３３５９９２および２２２３３５３）。
【０２５５】
ＴＲＰＭ８のヌクレオチド配列の翻訳は１１０４個のアミノ酸残基からなるタンパク質（配列番号８参照）を予見する。マウスＴＲＰＭ８の全体配列はヒト遺伝子に９３％同一である（図６Ａ参照）。その最も近い同族はＴＲＰＭ２である（４２％同一性）（図６Ａおよび６Ｂ）。ＴＲＰＭ８は、Ｎ末端にアンキリンドメインを欠失することを特徴とするＴＲＰ群、ＴＲＰチャンネルの“長鎖”またはメラスタチンのサブファミリーに属する。ＴＲＰチャンネルはＴＭ６ドメインを含むと予測されるが、少なくとも１つは７つの膜貫通ドメインをもつと予測される（参照：Nagamine et al., Genomics, 54:124-131 (1998)）。カイト・ドゥーリットル（Kyte Doolittle）プロットはＴＲＰＭ８配列中に８つの顕著な疎水性ピークの存在することを示唆し、それが６ないし８つの予測される膜貫通ドメインを表すものとする。全体として、予測された膜貫通ドメインはＴＲＰＭ８のアミノ酸６９５〜１０２４内に在る。この領域の外側は、予測されるものとしてその二次構造が当該タンパク質のＮ末端とＣ末端の両方に存在する多重らせんドメインである（データ非開示）（参照：Burkhard et al., Trends Cell Biol., 11:82-88 (2001)）。多重らせんドメインはＧＡＢＡ−Ｂチャンネルのオリゴマー形成に関係しており、以前に一部のＴＲＰチャンネルで予測されている（参照：Funayama et al., 上記；Margeta-Mitrovic et al., Neuron, 27:97-106 (2000)）。
【実施例８】
【０２５６】
ＴＲＰＭ８発現の局在化
Ａ．ノーザンブロット分析
ノーザンブロットは以下のように行う：全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ ＬＳ（インビトロゲン／ギブコ・ライフ・テクノロジー（Invitrogen/Gibco Life technologies）によりマウス新生児および成熟組織から精製し、次いで、オリゴテックス（Oligotex）（キアゲン）により製造業者のプロトコールにしたがってポリＡ＋精製する。サンプル約３ｍｇを１％グリオキサールゲル上で電気泳動し、転移して、マウス全長ＴＲＰＭ８配列のヌクレオチド１４１０〜１９８０を提示する３２Ｐ−標識プローブと高緊縮状態でハイブリッド形成させる。市販のノーザンブロット（クロンテック）を同じＴＲＰＭ８プローブとハイブリッド形成させる。ブロットはエキスプレスハイブ（ExpressHyb）ハイブリダイゼーション溶液（クロンテック）中、６８℃で３時間ハイブリッド形成させ、製造業者の高緊縮洗浄プロトコールにしたがって洗浄し、りん光発光スクリーンに１〜３日間露光する。
【０２５７】
この分析結果を以下に記載する。市販ノーザンブロットの使用によりＴＲＰＭ８の発現は検出されない。新生児および成熟マウスからのブロットには、ＤＲＧ、脊髄および異なる皮膚起源を含め、体感覚に関係する組織を含むものを使用する。約６.３ｋｂの一つのｍＲＮＡ種は主にＤＲＧに存在する。
【０２５８】
Ｂ．体組織ハイブリダイゼーション
体組織ハイブリダイゼーションのために、新生児および成熟組織を切除し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、凍結保護して、ＯＣＴ封入剤中に液体窒素で凍結する。クリオスタット切片（１０μｍ）を加工処理、インビトロ転写により生成させたジゴキシゲニンｃＲＮＡプローブ（ロシュ・バイオケミカルス）とハイブリッド形成する。マウスＴＲＰＭ８ｍＲＮＡ特異アンチセンスリボプローブはｍＴＲＰＭ８配列のヌクレオチド１４１０〜１９８０に相当する。蛍光検出および二重標識実験は、以前に記載したように、本質的にチラミドシグナル増幅キット（ＴＳＡ；ＮＥＮ）により実施する（参照：Dong et al., Cell, 106:610-632 (2001)）。
【０２５９】
ジゴキシゲニン−標識プローブは、新生児および成熟マウスにおいて、ＤＲＧと三叉神経節（口と顎の神経を支配する頭蓋知覚ニューロン）に特異発現を示すが、１３日目の胎児ではこれがない。ＴＲＰＭ８の発現は成熟ＤＲＧニューロンの約５〜１０％に限定される。ＴＲＰＭ８に陽性のニューロンの平均サイズは１８±３.１μｍ（平均±標準偏差、ｎ＝６９）であり、小径ｃ−ファイバー含有ニューロンとして分類され、マウスでは２５μｍ未満と定義される。ＴＲＰＭ８は神経フィラメント（ＮＦ）抗体によりマークされる高密度有髄ニューロンには発現されず、小径ニューロンにおけるＴＲＰＶ８発現とよく相関する。ＴＲＰＭ８＋ニューロンはしたがって、成長に際し、ＮＧＦレセプター、ｔｒｋＡを発現する侵害受容または熱受容ニューロンのサブセットに属すると思われる（参照：Huang and Reichardt, Ann. Rev. Neurosci., 24:677-736 (2001)）。ＮＧＦまたはｔｒｋＡの不在下、通常このレセプターを発現するＤＲＧニューロンは胎児成長に際し、アポトーシスにより死滅する（Huang and Reichardt、上記）。ＴＲＰＭ８がｔｒｋＡ依存性ニューロンにて発現されることを証明するために、新生児ｔｒｋＡのないマウスからのＤＲＧにてＴＲＰＭ８発現を評価する。ＴＲＰＭ８の発現は変異神経節では完全に消滅している。さらに、ＴＲＰＭ８はＶＲ１と同時発現せず、カプサイシンおよび有害熱に反応する一群の侵害受容器を特徴付ける。この観察は、侵害受容ニューロン上に見出される２つのよく解明された抗原マーカー、ＣＧＲＰまたはＩＢ４とのＴＲＰＭ８同時発現の欠失により確認される（参照：Snider and McMahon, Neuron, 20:629-632 (1998); Tominaga et al., Neuron, 21:531-543 (1998)）。このデータはＴＲＰＭ８がＶＲ１、ＣＧＲＰまたはＩＢ４によりマークされるよく解明された熱および疼痛感知ニューロンとは異なる熱受容／侵害受容ニューロンの下位集団において発現されることを示している。
【０２６０】
組織内ハイブリダイゼーションに続いて、抗−ＣＧＲＰ（１：１００；バイオジェネシス）、ＩＢ−４（１０μｇ／ｍＬ；シグマ）、抗−ＶＲ１（１／２０００；アブカム（Abcam））、抗−ＮＦ１５０（１／１０００；ケミコン）により免疫蛍光法を実施し、ＦＩＴＣまたはＣＹ３（１０μｇ／ｍＬ；ジャクソン・イムノリサーチ）にて検出する。これらの検討に示されるパネルはすべて同時発現を欠くことを示しているが、これは技術上の問題に起因するものではない、というのは追加のプローブ／抗体は、ＴＲＰＭ８組織内プローブによる我々の二重標識プロトコールが機能していることを確認するために対照として使用されるからである。
【実施例９】
【０２６１】
冷温およびメントールによるＴＲＰＭ８タンパク質の活性化
Ａ．細胞内カルシウムに対する熱、カプサイシン、冷温およびメントールの影響
ＴＲＰＶ系統群メンバーとそのユニークな発現パターンに対しＴＲＰＭ８タンパク質の類似性を仮定して、カルシウム流入の仲介における熱、カプサイシン、冷温およびメントールの影響について、ＴＲＰＭ８タンパク質を発現する形質移入ＣＨＯ−Ｋ１／ＦＲＴ細胞および以下に詳細に記載した蛍光カルシウムイメージ法を用いて試験する。
【０２６２】
マウスＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞株を生成させるために、マウスＴＲＰＭ８ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ５（インビトロゲン）にサブクローンし、フュージン（Fugene）（ロシュ）によりＣＨＯ−Ｋ１／ＦＲＴ細胞に移入する。移入細胞は２００μｇ／μＬのハイグロマイシン（ギブコＢＲＬ）を含むＭＥＭ培地中で増殖することにより選択する。個体集団を初期継代数段階で凍結し、これらのストックをさらなる検討に使用する。ｍＲＮＡを発現する安定なクローンをノーザンブロット分析ならびにサザーンブロッティングにより同定し、組込み部位を確認する（非開示）。ＣＨＯ細胞は内在性ＴＲＰＭ８イソ型を発現せず、したがって、ＶＲ１発現プラスミドを安定的に移入した細胞株と共に対照として働く。
【０２６３】
カルシウム画像化実験は本質的に以前の記載どおりに実施する（参照：Savidge et al., Neuroscience, 102:177-184(2001)）。簡単に説明すると、細胞をガラスカバースリップに塗布し、フラン−２・アセトキシメチルエステル（２.５〜５ｍＭ）を負荷し、ＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液（２ｍＭ−Ｃａ２＋）中１.５ｍＭのプルロン酸（モレキュラープローブ、ユージン、オレゴン）にて室温で３０〜６０分間インキュベートする。カバースリップを層流灌流チャンバー（ワーナーインスツルーメント（Warner Instrument Corp.））に容れ、局部灌流ピペット経由でＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液（２ｍＭ−Ｃａ２＋）を定常的に灌流し、該ピペットからバッファーおよび冷却溶液も供給する。冷却刺激は灌流温度３３℃から１０℃の直線的下降（約１〜１.５℃ｓｅｃ−１）とする。灌流温度は制御ペルチエ（Peltier）装置によりコントロールし、細胞チャンバー中ミニ熱電対によりモニターする。別法として、細胞を２４穴組織培養プレートに塗布し、フラン−２を負荷し、溶液の添加は３ｃｃシリンジにより１０秒間で実施する。３４０ｎＭと３８０ｎＭの励起波長間で変化させたときのフラン−２負荷細胞のイメージを冷気ＣＣＤカメラで捉える。バックグランド蛍光を差し引いた後、２つの波長での蛍光強度比を計算する。２０〜４０個の細胞群の比のレベルをメタフルオア（MetaFluor）（ユニバーサル・イメージング・コーポレーション）により分析する。グラフはすべて代表的な単回実験における２０〜３０個の細胞群からの平均的応答である。実験はすべてそれぞれ３回繰返し、同様の結果を得る。ハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）および細胞培養試薬のすべてはギブコ（Gibco BRL）から入手する。ルテニウムレッド、カプサイシンおよびメントールはシグマ（Sigma）から入手する。
【０２６４】
上記のカルシウム画像化実験の結果を以下に記載する。ＶＲ１の活性化剤、カプサイシン（１０μＭ）はＴＲＰＭ８発現細胞において応答を発しない。ＴＲＰＶ３発現細胞においてＣａ２＋応答を生成することが分かっている低浸透圧性溶液も、あるいは高調バッファーも、ＴＲＰＭ８発現細胞株において応答を発しない（参照：Liedtke et al., 上記；Strotmann et al., 上記）。ＶＲ１にとって強力な刺激である温度上昇（２５〜５０℃）もまた細胞内カルシウムレベルを変化させない。しかし、温度を２５℃から１５℃に低下させると、細胞内カルシウムの増加がＴＲＰＭ８発現細胞において観察される（図７Ａおよび８Ａ）。この応答は非形質移入ＣＨＯ細胞またはＶＲ１発現細胞株において観察されない（図７Ａおよび８Ａ）。１０℃の刺激付加もＣａ２＋の流入を誘発する。この反応はバッファー中Ｃａ２＋に依存するが、その理由は細胞外カルシウムの除去が温度応答を抑制するからである（（図７Ａおよび８Ａ）。外部カルシウムへの依存は、カチオン透過チャンネルが原形質膜に局在することを意味している。ＶＲ１に対する熱応答の強力なブロッカーであるルテニウムレッド（５μＭで）は熱応答を抑制しない。
【０２６５】
ＴＲＰＭ８が温度低下に反応するため、細胞内カルシウム（[Ｃａ２＋]ｉ）がＴＲＰＭ８発現細胞中に生じ始める温度閾値を検討するために、さらなる実験を実施する。細胞を数分間３５℃（正常皮膚温度）でインキュベートし、次いで温度を１３℃に低下させる。マウスＴＲＰＭ８−ＣＨＯ細胞における温度応答は、[Ｃａ２＋]ｉが増加し始める２２〜２５℃の閾値を示し（図７Ｂ）、次いで、バッファー温度が約１５℃に達したときに顕著に増大する。これらの実験は、生理的に関連する温度で、ＴＲＰＭ８に対する上方活性化閾値が約２３℃であることを示している（図７Ｃ）。
【０２６６】
その冷感性のために一般に使用される化合物であるメントールにつき、ＴＲＰＭ８発現ＣＨＯ細胞に対する刺激として試験する。非形質移入ＣＨＯ細胞はメントールに対して完全に無感受性である（１ｍＭまで試験）（図７Ｄ）。しかし、ＴＲＰＭ８細胞の処理に対し（２５℃で培養）、細胞内蛍光は１０μＭと１００μＭのメントール濃度に応答して数秒内に有意に増加する（図７Ｄ）。さらに、温度刺激と共に、細胞外バッファーからのカルシウム枯渇がカルシウムの応答を抑制する（図７Ｄ）。メントールが異なる温度で示す作用についても試験する。ＴＲＰＭ８発現細胞を３３℃でインキュべションすると、１０μＭのメントールは２５℃で観察されたカルシウム応答を誘発しないが、温度を３０℃に下げると、細胞内カルシウムレベルが上昇する（図７Ｅ）。したがって、メントールはＴＲＰＭ８発現細胞に対して温度降下の効果に似せているように思われる。
【０２６７】
Ｂ．コンダクタンスに対する冷温とメントールの影響
冷温およびメントールに対する膜応答を検討するために、上記のように調製されるＴＲＰＭ８発現細胞について電圧クランプ実験を実施する。
【０２６８】
細胞を記録目的のポリ−Ｄ−リジン被覆カバースリップに塗布し、１８〜２４時間後に記録を実施する。実験は、アキソパッチ（Axopatch）２Ｂ増幅器、５ｋＨｚフィルター、およびｐクランプ総合ソフトウエア（アキソン（Axon）インスツルーメンツ）による全細胞電圧クランプ技法を用い、室温で実施する。すべての実験で直列抵抗補償は２〜５ＭΩ抵抗、火炎処理ピペットを用い、８０％である。記録溶液は以下のとおりである：すべての実験についてピペット溶液は、１４０ｍＭ−ＣｓＣｌ、１ｍＭ−ＣａＣｌ２、１０ｍＭ−ＥＧＴＡ、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ−ＭｇＡＴＰからなり、ＣｓＯＨでｐＨ７.４に滴定する。メントールおよび冷温活性化電流のため、浴溶液は、１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ−ＣａＣｌ２、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２からなり、ＮａＯＨでｐＨ７.４に滴定する。電流−電圧の関係を用い、−１００ないし＋８０ｍＶ（２秒間）の電圧ランプにより逆転電位を評価する。一価のイオンの透過性検討のために、単純化した浴溶液（１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ−ＣａＣｌ２、１ｍＭ−ＭｇＣｌ２）中のＮａＣｌを等モルのＣｓＣｌまたはＫＣｌと置き換える（ＣｓＯＨまたはＫＯＨで滴定）。カルシウム透過性推定のために、該浴溶液は１００ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨで滴定）および１もしくは３０ｍＭ−ＣａＣｌ２を含有する。溶液の浸透圧はスクロースの添加により調整する。Ｎａ（Ｐｘ／ＰＮａ）に対する一価カチオンの透過性比を以下のように計算する：
Ｐｘ／ＰＮａ＝Ｅshift＝｛ＲＴ／Ｆ｝ｌｏｇ（Ｐｘ／ＰＮａ［Ｘ］０／［Ｎａ］０）
ただし、式中、Ｆはファラデー定数、Ｒは気体定数、およびＴは絶対温度を示す。カルシウム透過性測定のために、ＰＣａ／ＰＮａを以下のように計算する：
Ｅshift＝{ＲＴ／Ｆ}log｛[Ｎａ]０＋４Ｂ'[Ｃａ]０(２)｝／｛[Ｎａ]０４Ｂ'[Ｃａ]０(１)｝
ただし、式中、Ｂ'＝Ｐ'Ｃａ／ＰＮａおよびＰ'ｘ＝ＰＣａ／（１＋ｅＥＦ／ＲＴ）および[Ｃａ]０(１)および[Ｃａ]０(２)は、２つの異なるカルシウム濃度をいう。メントールの局所灌流はＴＣ２ｂｉｐ温度コントローラー経由とする。マーロウ（Marlow）温度コントローラーを冷却ランプに使用する。
【０２６９】
ＴＲＰＭ８発現細胞で実施した電圧クランプの検討結果を以下に記載する。３５℃から７〜１３℃への温度ランプは−６０ｍＶの維持電位で内方向への電流を発生し、＋４０または＋６０ｍＶで外方向への電流を発生する。温度の低下につれて電流は振幅が増大し、通常＜１０℃でテストした最も低い温度で多少の脱感作を示す。電流活性化の温度閾値は膜電位に依存性を示さず、個々の細胞は１９℃と２５℃の間の温度で活性化され、平均閾値は２１.７９±０.６４℃（ｎ＝５）である。ＣｓＣｌ充填記録ピペットおよび典型的なＮａＣｌベースの外部溶液による冷温刺激に対する応答の電流−電圧の関連性を解析すると、非選択カチオンチャンネルの典型である０ｍＶに近い逆電位（Ｅｒｅｖ）をもつ外方向への整流電流が明らかとなる（図９Ｂ）。
【０２７０】
ＴＲＰＭ８発現においてメントールを添加すると、冷温活性化の閾値以上の温度（＞２３℃、図１０Ａ）では迅速に活性化する電流を発生するが、非形質移入ＣＨＯ細胞では発生しない。メントール活性化電流は、Ｅｒｅｖ−９.２８±０.７５ｍＶ（ｎ＝１２）の顕著な外方向への整流（図１０Ｂ）を示し、これは同じイオン条件下での冷温活性化電流におけるＥｒｅｖに類似している。これらの電流は温度上昇により活性化されて（図１０Ａ参照）、メントールが閾値をより高い温度にシフトすることを示唆し、カルシウム画像化実験と一致する。この考えをさらに試験するために、電流サイズを大きくするための正の膜電位を用い、２点の温度（２２℃および３５℃）でのメントール発生電流の濃度−応答曲線を得る（図１１Ａおよび１１Ｂ）。濃度−応答の関係は低温度で左にシフトし、最大振幅の顕著な増大を伴う（図１１Ａおよび１１Ｂ）。Ｅｒｅｖの変化を用いてメントール活性化電流のイオン選択性を決定する。溶液中におけるＮａＣｌをＫＣｌまたはＣｓＣｌと等張置換すると、Ｅｒｅｖにわずかな正のシフトを起こし、ＴＲＰＭ８がこれらのカチオン間の識別を十分には行わないことを示す（データ非開示）。個々の細胞について測定したＥｒｅｖの変化から（外部ＮａＣｌをＫＣｌとすると、＋７.３８±１.４３ｍＶシフトする（ｎ＝７）；ＮａＣｌをＣｓＣｌとすると、＋９.０９±０.３６ｍＶシフトする（ｎ＝５））、Ｃｓ＞Ｋ＞Ｎａの透過性配列は、ＰＣａ／ＰＮａ＝１.４３およびＰＫ／ＰＮａ＝１.３４で計算する。相対的カルシウム透過性は異なるカルシウム濃度で測定したＥｒｅｖ値から計算する。外部Ｍｇ２＋イオンの不存在下に、外部カルシウムを１ｍＭから３０ｍＭに増加すると、Ｅｒｅｖが＋１１.６７±１.２０ｍＶシフトし、これはＰＣａ／ＰＮａ＝０.９７に相当する。したがって、ＴＲＰＭ８は一価のカチオン、Ｎａ、ＫおよびＣｓならびにニ価カチオン、カルシウムに透過性である。
【０２７１】
本明細書に記載の例示および態様は説明のみを目的とすること、そしてその観点からの修飾または変更は当業者に示唆を与えるものであり、かつ本出願の精神と権限の範囲に、また添付の請求項の範囲に包含されるものであることは理解されよう。本明細書に引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべてを目的として参照により本明細書の一部とする。
【図１】
2005500028.tif 000007
【図２Ｂ】
2005500028.tif 000008
【図２Ｄ】
2005500028.tif 000009
【図２Ｅ】
2005500028.tif 000010
【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500028.tif 000224
【国際調査報告】
2005500028.tif 000225
2005500028.tif 000226
2005500028.tif 000227
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