(57)【要約】ヒトミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は超変異性の細胞および生物体を創成するために使用できる。これらの遺伝子を哺乳動物細胞内に導入することにより、新規で有用な性質を有する新しい細胞系統が、天然の変異速度または化学的変異原による変異の導入によるよりもさらに効率的に調製できる。これらの方法は、新規で高度に活性の抗菌性分子ならびに優れた抗微生物剤を既存薬剤より創成するために有用である。これらの方法は、薬剤製造のために有用な新規の抗微生物剤を発現する細胞系統を創成するためにも有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含むポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入することを含んでなり、これにより該細胞が超変異性となる、超変異性哺乳動物細胞の作製方法。
【請求項２】
該ポリヌクレオチドが生体外でのトランスフェクションにより該細胞内に導入される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ポリヌクレオチドが生体外での付着細胞のトランスフェクションにより該細胞内に導入される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ２である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＭＬＨ１である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ１である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＭＳＨ２である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該対立遺伝子が末端短縮変異を含んでなる、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
該対立遺伝子がコドン１３４における末端短縮変異を含んでなる、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
該末端短縮変異が野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４におけるチミジンである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなる培養された超変異性哺乳動物細胞を含んでなる均質組成物。
【請求項１３】
該ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ２である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＭＬＨ１である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ１である、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＭＳＨ２である、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
該細胞がｈＰＭＳ２の最初のアミノ酸１３３個よりなるタンパク質を発現する、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
細胞がミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を有する該哺乳動物細胞の培養物を培養し、
選択された微生物に該細胞を暴露し、そして
選択された該微生物に耐性である該哺乳動物細胞を選択する
ことを含んでなる、選択された微生物に耐性である哺乳動物細胞を得るための方法。
【請求項２０】
該超変異性細胞がグラム陰性微生物への耐性について選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該超変異性細胞がグラム陽性微生物への耐性について選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
該超変異性細胞が原生動物への耐性について選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
該超変異性細胞が細菌への耐性について選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
該超変異性細胞が真菌への耐性について選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
抗微生物活性についての選択の該段階が、条件調製された媒体を該超変異性細胞より単離および試験することを含んでなる、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
抗微生物活性をコードする遺伝子、およびミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を有する哺乳動物細胞の培養物を培養し、
該抗微生物活性を含んでなる細胞を選択し、そして
該遺伝子が変異を含んでなるかどうかを決定する
ことを含んでなる抗微生物活性をコードする遺伝子内に変異を含んでなる細胞を得るための方法。
【請求項２７】
該超変異性細胞がグラム陰性微生物に対する耐性について選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該超変異性細胞がグラム陽性微生物への耐性について選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
該超変異性細胞が原生動物への耐性について選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
該超変異性細胞が細菌への耐性について選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
該超変異性細胞が真菌への耐性について選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
抗微生物活性についての選択の該段階が、該超変異性細胞より条件調製された媒体を単離および試験することを含んでなる、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
該遺伝子が変異を含むかどうかを決定するために該細胞を試験する該段階が、該遺伝子のヌクレオチド配列を分析することを含んでなる、請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
該遺伝子が変異を含むかどうかを決定するために該細胞を試験する該段階が、該遺伝子より転写されたｍＲＮＡを分析することを含んでなる、請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
該遺伝子が変異を含むかどうかを決定するために該細胞を試験する該段階が、該遺伝子によりコードされるタンパク質を分析することを含んでなる、請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
該遺伝子が変異を含むかどうかを決定するために該細胞を試験する該段階が、該遺伝子の表現型を分析することを含んでなる、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、抗微生物剤およびこれらの薬剤の細胞産生の分野に関する。具体的には、これは微生物の存在下での選択下に哺乳動物細胞を置くことによる新規の抗微生物剤の同定の分野に関する。
【０００２】
【発明の背景】
人間が微生物とこの惑星を共有する間は、感染性疾患の広範な発生およびそれに続くそれと関連する多数の死亡があった。微生物と人間とはしばしば共生関係にあるけれども、微生物は、ある条件下では、疾患および死亡に導くこともできる。過去１００年ばかりの間の人間および動物集団双方における微生物感染を治療するための抗生物質の発見、広範な使用および散布は制御と大いに関係があり、そしてある場合には、ある種の微生物および関連する感染性疾患を根絶した。しかし、微生物は、これらを生命および破滅の選択圧力下に置く毒性物質に対抗させると、進化しそしてそれらの遺伝子構成を変更する強い性向を有する。従って、感染性疾患の出現は、発展を遂げた国および発展途上国の双方で、重要な公共健康問題を現在提出している。微生物は現在の抗微生物治療薬を回避および無効をするように進化するだけでなく、過去２０年間に出現した新規でこれまで認識されずそして／または特性が知られている細菌、真菌、ウイルス、および寄生疾患もある（Ｓａｓｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ． ２０００， ３（５）：６４６−６５４） 。
【０００３】
フレミングによるペニシリン産生かびの偶然の発見以来、新規でさらに有効なベータ−ラクタム抗生物質の合成、単離および特性検討が着実に進行している。抗生物質のベータ−ラクタムファミリーの大きい成功に加えて、さらに新しいフルオロキノロン類は殺菌活性の広範なスペクトルならびに優れた経口生物利用性、組織浸透および有利な安全性および許容性プロフィールを有する（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｆａｍ． Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ， ２０００， ６１， ２７４１−２７２８）。最近考案されたキノロン薬剤の４世代分類は、より最近導入されたフルオロキノロン類の増殖した抗微生物スペクトルおよびそれらの臨床面への適応を取り扱っている。ナリジクス酸を含むいわゆる第一世代薬は、最低血清レベルを達成できた。第二世代キノロン、例えばシプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ） は、増加したグラム陰性および全身活性を有する。第三世代薬はレボフロキサシン（ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ）などの医薬を含んでなりそしてグラム陽性細菌および非定型病原体に対して顕著で拡大された作用を有する。最後に、これまでトロボフロキサシン（ｔｒｏｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ） のみを含む第四世代キノロン薬は、第三世代薬に記載された活性に加えて嫌気菌に対して高度に活性である。さらに、抗微生物薬のキノロン類は、それらの薬動力学的性質および生物利用能に基づいても分類できる。
【０００４】
哺乳動物の上皮面は、頻繁な微生物攻撃に直面すると重要な生理学的機能を提供するそれらの能力で顕著である。これらの粘膜面が正常の宿主内で感染を受けないままであるという事実は、宿主防御の高度に有効な機構が、これらの環境に暴露された組織を保護するように進化したことを示唆する。動物および植物界を通じて、内因的に遺伝子にコードされた抗微生物性ペプチドは、上皮の妥協性および微生物進入への応答に鍵となる要素であることが知られている（Ｚａｓｌｏｆｆ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９２， ４，３−７；  およびＢｅｖｉｎｓ， Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ． Ｓｙｍｐ．， １９９４， １８６， ２５０−６９） 。哺乳動物においては種々のかかるペプチドが同定され、これには良く特性が知られたデフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）およびカテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）などが含まれる（アンドロピン（ａｎｄｒｏｐｉｎ）、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）、気管抗微生物性ペプチド、およびＰＲ−３９、Ｂｅｖｉｎｓ， Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ． Ｓｙｍｐ．， １９９４， １８６， ２５０−６９およびその中の引用文献参照）。これらの宿主防御分子の主要な起源は、循環貪食細胞である。しかし、さらに最近、皮膚および気管、消化管、および泌尿管のレジデント上皮細胞も抗微生物性ペプチドを合成および放出することが知られた。生体外および生体内の双方のデータが、これらの分子が固有の粘膜免疫性への重要な貢献者であるという仮説を支持している。発現または生物学的活性のこれらのレベルの改変が、生物体を微生物感染にかかる傾向を与える（Ｈｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｒｅｓ． １９９９， ４５， ７８５−９４）。
【０００５】
進化段階を通過する間に、昆虫から哺乳動物への種は、植物に対して、宿主に対して毒性を発揮することなく微生物を迅速に殺す陽イオン性抗微生物性ペプチドを用いることにより侵入する病原性微生物に対して自身を防御する。物理化学的ペプチド−脂質相互作用は、以下に考察するように、生来の免疫性に関する魅力的な機構を提供する。多数のこれらペプチドは、陽イオン性両親媒性二次構造、典型的にはアルファ−らせんおよびベータ−されんを形成し、これらは静電的相互作用を介して陰イオン性細菌膜と選択的に相互作用できる。迅速なペプチド誘導膜浸透およびこれに続く細胞溶解がもたらされる（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９９， １４６２， １−１０） 。
【０００６】
多数のこれら宿主防御ペプチドの一次構造が決定されている。一次構造相同性はないけれども、ペプチドは陽イオン性で疎水性のアミノ酸の優越により特徴付けられる。多数の宿主防御ペプチドの二次構造は、種々の技術により決定されている（Ｓｉｔａｒａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９９， １４６２， ２９−５４） 。非環状ペプチドは、特に誘電率が低い媒体内でらせん構造を取る傾向があり、一方１個を越えるジスルフィド架橋を有するペプチドはベータ構造をとる。
【０００７】
上記のように、今日の標準使用において第一線の抗微生物治療に対する微生物医薬抵抗性の上昇の一つの理由は、処方される抗生物質の不適当および過剰使用である。細菌は医薬耐性を発生する最も普通の生物体でああるけれども、真菌、ウイルスおよび寄生体内でも実証された耐性の多数の例がある。耐性表現型の発生は、微生物、環境、および患者を個別ならびに組み合わせた相互作用を含む複雑な現象である（Ｓｉｔａｒａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９９， １４６２， ２９−５４） 。問題となる微生物は抗生物質選択の間に耐性を発生するかまたはこれは与えられた薬剤に暴露される前に微生物の特性である場合もある。報告された抗生物質に対する耐性の多数の機構があり、これには染色体外プラスミドに内包されている抗生物質耐性酵素をコードする遺伝子ならびに染色体外または宿主ゲノム内に存在できるＤＮＡ要素（例えば転位可能な要素）が含まれる。
【０００８】
抗生物質に対する耐性を発生する能力を取得する微生物の能力により、新規の抗生物質を常に開発する必要がある。新規の抗生物質を開発する伝統的な方法には、現存する抗生物質を変性する医薬品化学的方法（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２０００， １０， ９５−９９） ならびに新規の生物体より抗生物質の単離（Ａｌｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９３， １４４， ６６５−７２） が含まれる。しかし、これらのいずれの方法も限界を有する。伝統的な医薬品化学的方法は、さらに効果的な活性を与えるような現存する分子の変性を引き起こす。化学者は、分子のどの部分を改変するべきかに関して「最善の推測」を行い、次いで合成戦略を立て、分子を合成し、次いで試験しなければならない。この方法は手数がかかり、多数の医薬品化学者を必要としそしてしばしば最初の抗生物質よりも活性が低い分子となる。第二の方法、すなわち新規の抗微生物剤の単離は、新規の抗微生物活性のために多数の各種生物体のスクリーニングを必要とする。次いで、活性を微生物から単離しなければならない。これは簡単な仕事ではなく、そして活性分子を単離するために多年の勤勉な作業を必要とすることも多い。分子が同定された後でも、分子の複雑さのために、医薬品化学者にとって合成戦略を効果的に樹立することが可能とは限らない。さらに、この合成戦略はコストがかかる合成を許容しなければならない。従って、現存する分子からさらに効果的な抗生物質を創成することを可能とするかまたは新規抗微生物剤の迅速な単離を可能とする方法が抗生物質耐性生物体の常に増殖する群と戦うために必要である。本明細書中に記載する本発明は、宿主細胞の内在性ミスマッチ修復活性をブロックすることにより新規の抗生物質を生成する細胞のランダム遺伝子変異の使用を目指す。細胞は、天然に抗微生物剤を産生する哺乳動物細胞、または特定の微生物を攻撃する新規の抗微生物分子を得るような選択圧力下に置かれた細胞であることができる。さらに、本発明は、組換え発現により、またはかかる活性を内包する細胞の生来の能力の一部分としての抗微生物活性を生成する細胞系統の増強された抗微生物活性を得るための方法を記載する。
【０００９】
さらに、タンパク質または非タンパク質ベースであってもよい抗微生物活性を分泌できる遺伝子改変宿主細胞の創成は、臨床研究のための現物を製造するための価値ある薬剤であろう。本明細書中に記載する本発明の態様は、ミスマッチ修復の高度に汎用性でそして系統発生学的に保存されたプロセスを妨害する方法により生成された新規および／または増加した抗微生物産生を有する遺伝子改変宿主細胞の創成を目指す。
【００１０】
本発明は、新規の抗微生物剤の創成および高い抗微生物活性レベルを発現する細胞系統の製造を容易とする。本発明の利点は、本明細書中に記載された実施例および図中にさらに記載される。
【００１１】
【発明の要旨】
本発明の一つの態様は、遺伝的に改変された哺乳動物細胞を創成し、そして新規の抗微生物剤を単離するための手段として細胞を直接微生物選択するための方法を提供する。他の態様は、ＤＮＡ複製のプロセスの間にＤＮＡ内に起きる自然の欠陥を修正するための細胞の能力を改変することによる新規の微生物特異性毒性分子を同定するための方法を提供する。ミスマッチ修復と呼ばれるこのプロセスの妨害は、遺伝子的に異なる子孫細胞に導く。これらの遺伝子に異なる細胞は、ゲノム当たりに変異１個からゲノムあたりに変異２個またはそれを越える変異を含み、特異性アウトプット形質、例えば微生物の攻撃に抵抗する新しい能力について選択する細胞の豊かな集団をもたらす。次いで、ミスマッチ修復プロセスの操作により創成された遺伝子改変細胞を、正常では細胞に対して毒性である微生物と一緒にインキュベーションする。大部分の細胞は急速に生存可能性を失って死ぬが、しかし耐性細胞のサブセットは微生物障害に抵抗する能力を有するであろう。これらの細胞は、構造内に新たに選択された哺乳動物クローンに抗微生物活性を吹き込む分子、タンパク質または非タンパク質を発現する。これらの新規に創成された細胞は、生体外で増殖できそして新しい分子を単離しそして当該技術分野では周知の標準的方法により特性決定される。次いで当該技術分野では周知の標準的方法により、新規の分子を微生物を殺すかまたはその増殖を阻害するそれらの能力に関して試験する。最後に、創成された新規の細胞系統は、臨床研究に使用するための新規の抗微生物剤の大量生産の追加の供給源として役立つ。本明細書中に記載するプロセスは、抗微生物剤が探究されているあらゆる哺乳動物細胞およびあらゆる微生物に適用できる。
【００１２】
本発明は、抗微生物剤を創成するための手段として哺乳動物細胞に超変異性を与えるための方法を提供する。
【００１３】
本発明は、大量の既知または新規の抗微生物性ポリペプチドを分泌する遺伝子改変細胞系統を創成するための方法も提供する。
【００１４】
本発明は、既知または新規の抗微生物性非−ポリペプチドに基づく大量の分子を分泌する遺伝子改変細胞系統を創成するための方法も提供する。
【００１５】
本発明は、抗微生物性のペプチドまたは非−ポリペプチドの大量の分子は分泌しないが、しかし試験する微生物を解毒する細胞表面活性分子を有する遺伝子改変細胞系統を創成するための方法も提供する。
【００１６】
本発明は、哺乳動物細胞内の遺伝子超変異化の増大した割合を生成するための方法および抗微生物性細胞系統について選択するための基礎としてのこれらの使用も提供する。
【００１７】
本発明は、増強された殺菌活性を有する分子を得るための手段として哺乳動物細胞内に関係する遺伝子をコードする既知の抗微生物体を変異させる方法も提供する。
【００１８】
本発明は、遺伝的に改変された抗微生物分子を生体内で創成するための方法も提供する。
【００１９】
本発明は、宿主哺乳動物細胞内のミスマッチ修復系を改変することにより分子の生来の酵素的または結合能力を改変して、既に存在している抗微生物分子より新規の抗微生物分子を創成するための方法も提供する。
【００２０】
本発明は、微生物に不可逆的な様式で結合する能力を有しそしてこれにより宿主標的生物体への病原性微生物の結合をブロックしそして微生物の生存可能性の喪失をもたらす、新規の抗微生物性ポリペプチドまたは非−ポリペプチドに基づく分子を創成するための方法も提供する。
【００２１】
本発明は、微生物細胞の増殖および／または生存をブロックできる新規の抗微生物性ポリペプチドまたは非−ポリペプチドに基づく小分子を創成するための方法も提供する。
【００２２】
本発明は、病原性微生物により産生される毒性化合物に不可逆的に結合できる新規の抗微生物性ポリペプチドまたは非−ポリペプチドに基づく生化学物質を創成するための方法も提供する。
【００２３】
本発明は、宿主生物体内に増強された薬動力学的性質を有する、ペプチドまたは非−ペプチドのいずれかに基づく遺伝的に改変された抗微生物性分子を創成するための方法も提供する。
【００２４】
本発明は、臨床研究のための抗微生物剤の大規模生産に使用するための、ペプチドまたは非−ペプチドのいずれかに基づく抗微生物分子を製造する遺伝的に改変された細胞系統を創成するための方法も提供する。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の局面の目的は、下記の態様中に記載される。記載された一つの態様中では、細胞系統に超変異性を与えることにより微生物感受性哺乳動物細胞を微生物抵抗性とするための方法が提供される。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞内に導入される。細胞は、遺伝子の導入の結果として超変異性となる。
【００２６】
本発明の他の態様では、単離された超変異性細胞が提供される。細胞はミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなる。細胞は超変異性化の増大した割合を示す。
【００２７】
本発明の別の態様では、単離された超変異性細胞が提供される。細胞は、ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなる。細胞は超変異性の増大した割合を示す。ミスマッチ修復遺伝子の導入により産生された細胞の集団は、野生型非変異細胞に対して毒性である微生物の存在下で増殖する。微生物に耐性である細胞を選択しそして新規分子を単離しそして当該技術分野では周知の標準方法により抗微生物活性を特性検討する。
【００２８】
本発明の他の態様では、分子の生来の酵素的または結合能力を改変することにより既に存在している抗微生物性分子より新規の抗微生物性分子を創成する、単離された超変異性細胞を記載する。
【００２９】
本発明の他の態様では、微生物に不可逆的な様式で結合する能力を有しそしてこれにより宿主標的生物体への病原性微生物の結合をブロックしそして微生物の生存可能性の喪失をもたらす、新規の抗微生物性ポリペプチドまたは非−ポリペプチドに基づく分子を創成する方法。
【００３０】
本発明の他の態様では、微生物細胞増殖および／または生存をブロックできる、新規の抗微生物性ポリペプチドまたは非−ポリペプチドに基づく小分子を創成する方法を記載する。
【００３１】
本発明の別の態様では、病原性微生物により産生された毒性化合物に不可逆的に結合できる、新規の抗微生物性ポリペプチドまたは非−ポリペプチドに基づく生化学物質を創成する方法を記載する。
【００３２】
本発明の別の態様では、さらに効力が高い抗微生物剤を創成するための手段として抗微生物性ポリペプチドまたは非−タンパク質に基づく抗微生物性分子をコードする既知の内因性遺伝子内に変異を導入するための方法が提供される。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入される。細胞は遺伝子の導入の結果、超変異性となる。細胞はさらに関係する抗微生物遺伝子を含んでなる。細胞を培養しそして抗微生物性をコードする遺伝子が改変されたかどうかおよび新規分子が当該技術分野で周知の標準微生物学アッセイによりさらに活性であるかどうかを決定するために試験する。
【００３３】
本発明の他の態様では、抗微生物分子をコードする遺伝子または複数の遺伝子をミスマッチ修復欠陥である哺乳動物細胞宿主内に導入する。細胞を培養し、次いでクローンを増強された抗微生物特性について分析する。
【００３４】
本発明の他の態様では、細胞の新規の表現型を産生するための方法が提供される。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入する。細胞は、遺伝子の導入の結果、超変異性となる。細胞を培養しそして表現型が新規または既知の抗微生物性ポリペプチドの増強された分泌である新規の表現型の発現について試験する。
【００３５】
本発明の別の態様では、細胞の新規表現型を生成するための方法が提供される。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入する。細胞は、遺伝子の導入の結果、超変異性となる。細胞を培養しそして表現型が新規または既知の抗微生物性非ペプチドに基づいた分子の増強された分泌である新規の表現型の発現について試験する。
【００３６】
本発明の別の態様では、細胞の新規の表現型を生成するための方法が提供される。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入する。細胞は、遺伝子の導入の結果、超変異性となる。細胞を培養しそして表現型が分泌されなかった新規または既知の抗微生物性ポリペプチドの増強された抗微生物活性である新規の表現型の発現について試験する。
【００３７】
本発明の別の態様では、細胞の新規の表現型を生成するための方法が提供される。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入する。細胞は、遺伝子の導入の結果、超変異性となる。細胞を培養しそして表現型が分泌されなかった新規または既知の抗微生物性非−ポリペプチドの増強された抗微生物活性である新規の表現型の発現について試験する。
【００３８】
本発明の他の態様では、ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む細胞内に遺伝子安定性を回復するための方法が提供される。優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子の発現は抑制されそして細胞はその以前の遺伝子安定性を回復する。
【００３９】
本発明の他の態様では、ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子および新規に選択された表現型をコードするポリヌクレオチドを含む細胞内の遺伝子安定性を回復するための方法が提供される。優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子の発現は抑制されそして細胞はその以前の遺伝子安定性を回復しそして新規の表現型は安定である。
【００４０】
本発明のこれらおよびその他の態様は、細胞および動物内の増強された変異可能性を生成する方法を提供しならびに潜在的に有用な変異および新規のタンパク質および非タンパク質に基づく分子を内包する細胞および動物を提供する。
【００４１】
本発明は、その一部分は宿主細胞の保存されたミスマッチ修復プロセスを利用して超変異性哺乳動物細胞を発生させるための方法を目指す。ミスマッチ修復プロセスは数々の文献に記載されている（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９５，８２，３０９−３１９； Ｂｒｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９４， ３６８，２５８−２６１； ｄｅ Ｗｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． １９９５， ８２，３２１−３３０；  およびＤｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ２６８，１９０９−１９１２）。かかる遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、細胞またはトランスジェニック動物内に導入されると、ＤＮＡ修復の有効性を低下することにより自発変異の速度を上昇しこれにより細胞または動物を超変異性とする。次いで、超変異性細胞または動物は、関係する遺伝子内またはその機能がこれまで報告されていない遺伝子内に新しい変異を発生するために使用できる。細胞、例えば哺乳動物細胞または特異性抗微生物性ペプチドまたは非ペプチドに基づく抗微生物体をコードする遺伝子を用いてトランスフェクションされた哺乳動物細胞内のミスマッチ修復をブロックすることは、これらの細胞内の変異の速度を増大でき、従って新規または増強された抗微生物活性または産生を有するクローンおよび／または一連の日和見的微生物に対する増強された生化学的活性を有する遺伝子改変抗微生物体を含む細胞に導く。
【００４２】
ミスマッチプルーフリーディングとも呼ばれるミスマッチ修復のプロセスは、細菌から哺乳動物細胞にわたる細胞内のタンパク質複合体により遂行される（Ｍｏｄｒｉｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９４， ２６６，１９５９−１９６０） 。ミスマッチ修復遺伝子は、かかるミスマッチ修復複合体のタンパク質の一つをコードする遺伝子である（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９５， ８２，３０９−３１９； Ｂｒｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３６８， ２５８−２６１； ｄｅ Ｗｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９５， ８２， ３２１−３３０； Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ２６８，１９０９−１９１２；およびＭｏｄｒｉｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９４， ２６６，１９５９−１９６０）。特定の作用の理論に縛られることは望まないが、ミスマッチ修復複合体は、ヌクレオチド塩基の非−相補的対形成よりもたらされるＤＮＡらせんの乱れを検出すると考えられる。新しい方のＤＮＡ鎖上の非相補的塩基を切除し、そして切除された塩基を古い方のＤＮＡ鎖に相補的な適当な塩基を置換する。この方法で、ＤＮＡ複製の間の過誤の結果として起きる多数の変異を細胞を取り除く。
【００４３】
優性ネガティブ対立遺伝子は、同じ細胞内で野生型対立遺伝子の存在下でも、ミスマッチ修復欠陥表現型の原因となる。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子の例は、ヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４であり、これはコドン１３４において末端短縮変異を有する（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９９８， １８，１６３５−１６４１）。変異は、この遺伝子の産物に第１３４番目のアミノ酸の位置で異常な終止を起こして、Ｎ−末端１３３アミノ酸を含む短縮されたポリペプチドをもたらす。かかる変異は、ＤＮＡ複製の後の細胞内に蓄積する変異の割合に増加を起こさせる。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子の発現は、野生型対立遺伝子の存在下でも、ミスマッチ修復活性に障害をもたらす。かかる効果を生むあらゆる遺伝子を本発明内で使用できる。
【００４４】
ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、ヒト、動物、酵母、細菌、またはその他の生物体の細胞より得ることができる（Ｐｒｏｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９４， ２６４．１０９１−１０９３； Ｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９３， ３６５，２７４−２７６； およびＳｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８８， ２６３，６８２９−６８３５） 。欠陥ミスマッチ修復活性についての細胞のスクリーニングは、かかる対立遺伝子を同定できる。ガンを有する動物またはヒトよりの細胞は、欠陥ミスマッチ修復についてスクリーニングできる。結腸ガン患者よりの細胞が特に有用である（Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９３， ７５，１２２７−１２３６；  およびＰａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３， ２６３，１６２５−１６２９）。ミスマッチ修復タンパク質をコードするいかなる細胞からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡでも野生型配列よりの変動について分析できる（Ｐｅｒｕｃｈｏ， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９６， ３７７，６７５−６８４）。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、例えばｈＰＭＳ２−１３４対立遺伝子またはその他のミスマッチ修復遺伝子の変種を作製することにより人工的に創成もできる。部位特異的突然変異誘発の種々の技術が使用できる。天然でも人工であっても超変異性細胞または動物の創成に使用するためのかかる対立遺伝子の適合性は、１種またはそれ以上の野生型対立遺伝子の存在下で対立遺伝子により起こるミスマッチ修復活性を試験して、これが優性ネガティブ対立遺伝子であるかどうかを決定して評価できる。
【００４５】
ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子がその中に導入された細胞または動物は、超変異性となる。これは、かかる細胞または動物の自発変異速度がかかる対立遺伝子を持たない細胞または動物と比較して高いことを意味する。自発変異速度の上昇の程度は、正常の細胞または動物のものの少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍であることができる。。
【００４６】
本発明の一つの局面によると、ミスマッチ修復タンパク質の優性ネガティブ形をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入する。遺伝子は、ミスマッチ修復複合体の一部分、例えばＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＭＬＨ１、またはＭＳＨ２であるタンパク質をコードするいかなる優性ネガティブ対立遺伝子であることもできる。優性ネガティブ対立遺伝子は、天然に存在するかまたは実験室内で作製できる。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学的に合成されたポリヌクレオチドの形であることができる。
【００４７】
ポリヌクレオチドは、構成的活性プロモーターセグメント（例えば、これらに限定はされないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子またはＬＴＲ配列）を含む発現ベクター内に、または誘導性プロモーター配列、例えばステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローンでき、ここで、優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子の発現は調節できる。ポリヌクレオチドはトランスフェクションにより細胞内に導入できる。
【００４８】
トランスフェクションは、ポリヌクレオチドを細胞内に導入するあるプロセスである。トランスフェクションのプロセスは、生きている動物内で、例えば遺伝子治療のためのベクターを用いて行うことができ、または生体外で、例えば培養物内の１種またはそれ以上の単離された細胞の懸濁液を用いて行うことができる。細胞は、例えばヒトまたはその他の霊長類、哺乳動物またはその他の脊椎動物、非脊椎動物より単離された細胞を含む真核生物細胞、および単細胞生物体、例えば原生動物、酵母、または細菌のいかなるタイプであってもよい。
【００４９】
一般に、トランスフェクションは細胞の懸濁液または単細胞を用いて行われるが、しかし処理された細胞または組織の十分なフラクションが、トランスフェクションされた細胞が増殖および利用できるようにポリヌクレオチドを組み込んでいる限り、他の方法も適用できる。ポリヌクレオチドのタンパク質産物は、一時的または安定に細胞内に発現されてもよい。トランスフェクションの技術は周知であり、ポリヌクレオチドを導入するめに利用できる各種技術には、エレクトロポレーション、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの利用、および関係する細胞との融合のために脂質と一緒のポリヌクレオチドのパッケージングが含まれ、これらの限定はされない。細胞がミスマッチ修復遺伝子を用いてトランスフェクションされると、細胞は培養でき、培養物内に再生成できる。遺伝子が多数の細胞世代にわたって一定のレベルで発現されるようにトランスフェクションが安定である場合には、一つの細胞系統がもたらされる。
【００５０】
単離された細胞は、個別の細胞を機械的に分離して取り出しそして酵素、例えばコラゲナーゼまたはトリプシンを用いる組織の前処理を行うかまたは行わないかのいずれかで適当な細胞培養物媒体に移した、ヒトまたは動物の組織から得られた細胞である。かかる単離された細胞は、典型的には細胞の他のタイプの非存在下で培養される。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子の導入のために選定された細胞は、一次細胞培養物または不死化細胞系統の形の真核生物体から誘導してもよく、または単細胞生物体の懸濁液から誘導してもよい。
【００５１】
本明細書中に記載する本発明は、性質がタンパク質でも非タンパク質であっても、新規の抗微生物生化学剤を分泌する抗微生物性哺乳動物細胞の懸濁液を創成するために有用である。さらに、本発明は、抗微生物剤の生化学活性を増強するための手段として既知の抗微生物剤を発現する細胞系統に適用できる。
【００５２】
トランスフェクションされた細胞系統が産生されると、これは、関係する１種もしくはそれ以上の遺伝子内または以前に報告されていない遺伝子内に新規の変異を生成するために使用できる。関係する遺伝子は、細胞系統により天然に所有されるかまたは当該技術分野で既知の標準方法により細胞系統内に導入されるあらゆる遺伝子であることができる。トランスフェクションされた細胞の使用または抗微生物活性をコードする関係する遺伝子または多数の遺伝子内に変異を誘導する一つの長所は、細胞を変異原性薬品または放射線に暴露しなくてもよいことであり、これらは暴露の対象物および実験者の双方に対して二次的な有害作用を有することがある。さらに、化学的および物理的変異原は、これらがＤＮＡの構造を改変する様式に特異性の塩基対であることが実証されている。本明細書中に記載する本発明は、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの特定の鎖に依存しない変異をもたらし、そして真にランダムな遺伝子的方法である。従って、新規または既知の抗微生物性遺伝子内に変異を得るための本発明の使用は、化学的または照射を用いる従来の変異発現とは対照的に、さらに効率的でありそしてより高い成功の可能性を有するに違いない。新規の抗微生物形質が子孫細胞内に確認されると、優性ネガティブ対立遺伝子は、当該技術分野には既知の種々の標準方法により細胞から除去できる。例えば、誘導性発現系の使用の分野の熟練者により使用される技術により遺伝子を対立遺伝子から直接ノックアウトできる。優性ネガティブ対立遺伝子はインデューサーの包含により調節される標準プロモーターにより駆動され、インデューサーの取り除きは優性ネガティブミスマッチ修復変異の発現の減衰をもたらしそして正常のＤＮＡ修復プロセスが続くであろう。
【００５３】
新規の抗微生物剤は、優性ネガティブミスマッチ修復プロセスに暴露され、次いで新規の抗微生物剤が探索される微生物の存在下で変異細胞をインキュベーションされた細胞から選択される。新規の抗微生物剤は、当該技術分野で既知で特性が知られている標準方法により精製される。抗微生物剤は、新規抗微生物剤の比活性を決定しするために再スクリーニングされ、ならびに活性スペクトルを決定するために広範な範囲の微生物に対して試験される。新規の抗微生物剤をコードする遺伝子は、当該技術分野の熟練者に周知の標準方法により単離される。変異は、関係する遺伝子に関連するゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、またはアミノ酸の配列を検査して細胞のゲノタイプ中の改変を分析して検出できる。変異ポリペプチドは、改変を受けた細胞が、さらに有効な抗微生物剤を得るために、本発明内に記載の手段により改変された既知抗微生物剤をコードする場合に、変異遺伝子によりコードされるタンパク質の電気泳動移動度、分光分析特性、またはその他の物理的および構造的特性の変化を同定して検出できる。
【００５４】
ミスマッチ修復タンパク質および核酸配列の例は、下記を含む。
【００５５】
【表１】
2005502302.tif 000002
【００５６】
【表２】
2005502302.tif 000003
【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【００５９】
【表５】
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【００６０】
【表６】
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【００６１】
【表７】
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【００６２】
上記の開示は一般的に本発明を説明するものである。さらに完全な理解は、下記の特定の実施例を参照して得ることができ、これらは本明細書中に説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００６３】
【実施例】
実施例１：優性ネガティブ対立ミスマッチ修復タンパク質をコードするｈＰＭＳ２−１３４
ＭＭＲ中の大きい欠陥が二人のＨＮＰＣＣ患者の正常細胞中に見いだされた。この欠陥が生体内で作用することは、かかる患者の非−新生細胞内でのマイクロサテライト不安定性の広範な存在により証明された。二人の患者のなかの一人は、コドン１３４でｈＰＭＳ２遺伝子の生殖細胞系末端短縮変異（ｈＰＭＳ２−１３４変異）を有し、一方、他の患者はｈＭＬＨ１遺伝子内に小さい生殖細胞系欠失を有していた（Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９３， ７５， １２１５−１２２５） 。これらのデータは、ＨＮＰＣＣ患者の生化学的および生物学的特徴を説明すると一般に信じられていたツーヒット（ｔｗｏ−ｈｉｔ） モデルと矛盾する。これらの患者の正常細胞内のこのＭＭＲ欠陥の基礎は明瞭ではなく、そして数種の可能な説明が提出された。例えば、関連ＭＭＲ遺伝子の第二対立遺伝子が未解明機構を介してこれらの患者の生殖細胞内で不活性化されたこと、またはＭＭＲプロセス内に含まれる他の遺伝子の未知変異が既知生殖細胞変異と協力して存在することが可能であった。マウスにおけるノックアウト実験より、ＭＭＲ欠陥が正常な生育および発生と両立しそしてこれらの可能性を支持することは明らかである（Ｅｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９６， ８５， １１２５−１１３４）。あるいは、変異対立遺伝子が優性ネガティブ作用を及ぼし、相当するＭＭＲ遺伝子の野生型対立遺伝子およびＭＭＲプロセス中に含まれるすべての他の遺伝子の存在下でもＭＭＲ欠陥をもたらすことも可能であった。これらの可能性を識別するために、ｈＰＭＳ２−１３４変異によりコードされた末端短縮ポリペプチドをＭＭＲに習熟した細胞系統内に発現しそしてＭＭＲ活性に対するその効果を分析した。その結果は、この変異体が優性ネガティブ対立作用を及ぼすことができ、ＭＭＲ欠陥の生化学的および遺伝子的表現をもたらすことを示した。本発明の一つの態様を表１に示し、この表で、選択マーカーとしてＮＥＯ遺伝子も含むｈＰＭＳ２−１３４（ＴＫ−ＰＭＳ２−１３４）を含む発現ベクターまたは空発現ベクター（ＴＫｖｅｃｔ）を用いて、シリアンハムスター（Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ）繊維芽細胞系統（ＴＫ）をトランスフェクションした。ウエスタンブロット分析を介して遺伝子を安定に発現することについてＴＫ−ＰＭＳ２−１３４細胞を決定した（データは記載しない）。ｈＰＭＳ２−１３４および対照細胞からの核溶解物を、ミスマッチしたＤＮＡ基体を修正する能力について測定した。表１に示すように、ＴＫ−ＰＭＳ２−１３４細胞は修復活性の劇的な低下を有し、一方ＴＫｖｅｃｔ対照細胞は、ミスマッチしたＤＮＡ二本鎖を約４．０ｆｍｏｌ／１５分の速度で修復できた（ｐ＜．０１）。
【００６４】
表１：異所的に発現されたモルフォゲンまたは空発現ベクターを発現するＭＭＲに習熟した細胞の相対内因性ＭＭＲ活性
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これらのデータは、ＴＫ−ＰＭＳ２−１３４の発現が宿主生物体に抑制されたＭＭＲをもたらしそしてそれぞれの有糸分裂を伴って遺伝子座の変異速度の増大を可能とすることを示す。
実施例２：ｈＰＭＳ２−１３４は生体内で遺伝子を改変できる
ミスマッチ修復を改変する能力の例は、ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４変異体を発現するミスマッチ修復ＴＫ細胞（上記）の操作を用いる実験からもたらされ、これは上記のＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４またはＴＫｖｅｃｔ細胞内にトランスフェクションされた欠陥性β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐＣＡＲ−ＯＦと呼ぶ）を含む哺乳動物発現構築物のトランスフェクションに使用される。ｐＣＡＲ−ＯＦベクターは、そのコード領域の５’末端に挿入された２９塩基対−ＣＡ領域を含むβ−ガラクトシダーゼ遺伝子より成り、これは野生型リーディングフレームをアウトオブフレームにシフトさせる。このキメラ遺伝子をｐＣＥＰ４中にクローニングし、ｐＣＥＰ４はクローニング部位の上流に構成的活性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含みそしてこのベクターを含む細胞の選択を可能とするハイグロマイシン耐性遺伝子も含む。ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターは、宿主内へのトランスフェクションの後にフレーム回復変異（すなわち挿入または欠失）が起きない限り、β−ガラクトシダーゼ活性を発揮できない。ｐＣＡＲ−ＩＦと呼ばれる別のレポーターベクターは、２７−ｂｐポリ−ＣＡ反復をｐＣＡＲ−ＯＦ遺伝子と同じ部位内にクローニングされたβ−ガラクトシダーゼを含むが、単一反復の除去がオープンリーディングフレームを回復しそして機能性キメラβ−ガラクトシダーゼポリペプチドを産生するので生物学的に活性である（記載しない）。これらの実験において、ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４およびＴＫｖｅｃｔ細胞をｐＣＡＲ−ＯＦレポーターベクターを用いてトランスフェクションしそしてネオマイシンにハイグロマイシンを加えた選択媒体中で１７日間選択する。１７日後に、耐性コロニーをβ−ガラクトシダーゼ産生について染色して、遺伝子改変されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むクローンの数を決定する。すべての条件で相対的に同数のネオマイシン／ハイグロマイシン耐性細胞が産生されたが、しかし、ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４を発現する細胞のみがβ−ガラクトシダーゼ活性について陽性であるクローンのサブセットを含んでいた。代表的な結果を表２に示し、この表は、細胞コロニーがその場でβ−ガラクトシダーゼ活性について染色されそして活性と評価されたデータを示したものである。細胞は、Ｘ−ｇａｌ基体の存在下でコロニーが青色に変化した場合に陽性と評価され、そしてコロニーが白色のままである場合に陰性と評価された。３回の実験の分析は、機能性β−ガラクトシダーゼ陽性細胞の数の著しい増加がＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４培養物内で見いだされ、一方対照ＴＫｖｅｃｔ細胞中ではβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞は見いだされなかったことを示した。
表２：機能性β−ガラクトシダーゼ活性を含むＴＫｍｏｒｐｈおよびＴＫｖｅｃｔ細胞の数
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プールして増殖させＴＫ−ＰＭＳ２−１３４／ｐＣＡＲ−ＯＦクローンも、機能性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む多数の細胞を示した。ｐＣＡＲ−ＯＦベクターを用いてトランスフェクションされたＴＫｖｅｃｔ細胞中で、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞は観察されなかった。これらのデータを図１に示し、この図において、パネルＢ中の暗い着色は、ＴＫ−ＰＭＳ２−１３４／ｐＣＡＲ−ＯＦ培養物中に存在するβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞を示し、一方同様の条件下で培養したＴＫｖｅｃｔ細胞中にはなにも見いだされなかった（パネルＡ）。これらのデータは、生体内で遺伝子改変を生成する変異ミスマッチ修復遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４の能力を実証し、これは、新しい生化学的特徴を示す改変されたポリペプチドを用いるクローンの迅速なスクリーニングを可能とさせる。
【００６５】
β−ガラクトシダーゼ遺伝子のヌクレオチド配列内の改変が、本当にＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４クローン内に存在する生体内β−ガラクトシダーゼ活性に責任を有するかを確認するために、ＲＮＡをＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４／ｐＣＡＲ−ＯＦおよびＴＫｖｅｃｔ／ｐＣＡＲ−ＯＦより単離し、そしてβ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡ一次構造を逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅および配列決定により試験した。ＴＫｖｅｃｔ細胞からのβ−ガラクトシダーゼメッセージの配列分析は、最初の遺伝子配列と構造的な改変がないことを見いだした。ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４細胞からのβ−ガラクトシダーゼメッセージの分析は、遺伝子のコーディング配列内に数カ所の変化を見いだした。これらの配列改変は、予想りに、アミノ末端内のポリＣＡ領域の挿入および欠失を含んでいた。その他の改変には、ポリＣＡ反復の外部での配列の挿入、ならびに遺伝子の全長にわたって含まれる一連の単一塩基改変が含まれていた。
【００６６】
遺伝子改変の纏めを図２に示し、この図において、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の概略図示が、下に記載の遺伝子改変の領域およびタイプで示される。
【００６７】
プラスミド：全長の野生型ｈＰＭＳ２  ｃＤＮＡは、ストランドら（Ｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９３， ３６５， ２７４−２７６、これは引用することによりその全体を本明細書中に編入される）中の記載のようにしてヒトＨｅｌａ  ｃＤＮＡライブラリーから得た。アミノ酸１３４に終止コドンを含むｈＰＭＳ２  ｃＤＮＡは、変異が発見された患者からのＲＴ−ＰＣＲを介して得られた（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９８， １８， １６３５−１６４１ 、これは引用することによりその全体を本明細書中に編入される）。ｃＤＮＡ断片をｐＳＧ５ベクター内でＢａｍＨＩ部位内にクローニングし、これはＳＶ４０プロモーターおよび続いてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １９９５， ２９， ３２９−３３４）、これは引用することによりその全体を本明細書中に編入される）。図１に記載のｐＣＡＲレポーターベクターは、パロンボらによる記載のようにして構築した（Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９４， ３６， ４１７ 、これは引用することによりその全体を本明細書中に編入される）。
【００６８】
β−ガラクトシダーゼアッセイ：ｐＣＡＲを用いるトランスフェクションの７日後に、４５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、０．１Ｍ  ＮａＰＯ４ および０．６ｍｇ／ｍｌクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラトピラノシド（ＣＰＲＧ，Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） 中のタンパク質２０μｇを用いてβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った。反応物を１時間インキュベーションし、０．５Ｍ  Ｎａ２ ＣＯ３ を加えて停止し、そして５７６ｎｍでの分光分析により分析した（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．， １９９８， １８， １６３５−１６４１） 。その場でのβ−ガラクトシダーゼの染色のために、ＰＢＳ中の１％グルタルアルデヒド中に細胞を固定しそして０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、３．３ｍＭ  Ｋ４ Ｆａ（ＣＮ）６ 、３．３ｍＭ  Ｋ３ Ｆａ（ＣＮ）６ 、０．２％Ｘ−Ｇａｌ中で１時間、３７℃でインキュベーションした。
実施例３：ｈＰＭＳ２−１３４がＭＭＲ活性中に欠陥を発生する
ＰＭＳ２−ＷＴとＰＭＳ２−１３４トランスフェクション細胞との間のβ−ガラクトシダーゼ活性の差は、ｐＣＡＲ−ＯＦレポーター内の変異の高い頻度、ＯＲＦの再確立をもたらすＭＭＲ活性およびＰＭＳ２−１３４タンパク質によるものである。ＭＭＲが改変されたかどうかを直接試験するために、実施例１に記載の個別クローンを用いるＭＭＲについての生化学アッセイを用いた。核抽出液をクローンから調製し、そして／ＣＡ＼挿入−欠失またはＧ／Ｔミスマッチのいずれかを含むヘテロ二本鎖基体を用いて上記の条件下でインキュベーションした。／ＣＡ＼およびＧ／Ｔヘテロ二本鎖は、それぞれ３’および５’方向からの修復を試験するために使用した。これらのアッセイにおいて、ＰＭＳ２−１３４発現クローンとその他のクローンの間に劇的な差があった（表３）。
表３：ＳＨクローンまたはプールした培養物からの核抽出液のＭＭＲ活性ａ
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【００６９】
すべてのクローンが３’方向から基体を修復したが（／ＣＡ＼ヘテロ二本鎖）、ＰＭＳ２−１３４ポリペプチドを発現する細胞は５’修復活性がほとんどなかった。ミスマッチ修復での同様の方向性欠陥は、ＰＭＳ２−１３４トランスフェクションから得たプールしたクローンでも、またはヘテロ二本鎖が２−４塩基対ループを含む場合にも明らかであり、これらの例を表３に示した。ＭＭＲ活性における小さい低下が３’／ＣＡ＼ＰＭＳ２−ＷＴ修復アッセイで観察され、多分、ＰＭＳ２タンパク質の過剰発現による生化学的アッセイ中の妨害の結果であろう。その場でのβ−ガラクトシダーゼアッセイで、著しい活性はＰＭＳ２−ＷＴにより起きず、これは生体内条件を反映する結果であるらしい。
【００７０】
ミスマッチ修復のための生化学的アッセイ：核抽出液中のＭＭＲ活性を記載のようにして基体２４ｆｍｏｌを用いて行った（Ｂｒｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９４， ３６８， ２５８−２６１ およびＮｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９８， １８， １６３５−１６４１、これらはそれぞれ引用することによりその全体を本明細書中に編入される）。補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ） アッセイは、精製ＭｕｔＬαまたはＭｕｔＳα成分の約１００ｎｇを核抽出液１９９μｇに加え、最終ＫＣｌ濃度を１００ｍＭに調整して行った（Ｂｅｖｉｎｓ，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ． Ｓｙｍｐ． １９９４， １８６， ２５０−６９ およびＡｌｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９３， １４４， ６６５−７２）。これらの実験に使用した基体は、ミスマッチまで鎖切断を１８１ヌクレオチド５’または１２５ヌクレオチド３’の鎖切断を含む。これらの値は、少なくと２回行った実験を表す。
実施例４：ｈＰＭＳ２のＣ−末端はｈＰＭＳ２とｈＭＬＨ１との間の相互作用を媒介する。
【００７１】
ｈＰＭＳ２−１３４がＭＭＲに影響を与える機構を解明するために、ｈＰＭＳ２とｈＭＬＨ１との間の相互作用を分析した。従来の研究は、これらの２種のタンパク質が二量体化して機能的に活性な複合体を形成することを示した（Ｂｒｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９４， ３６８， ２５８−２６１）。クローニングした鋳型より生成したＲＮＡを利用し、網状赤血球溶解物を用いて生体外でタンパク質を合成した。全長のｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ２タンパク質はたがいに結合しそして予想通りにいずれのタンパク質への抗体を用いてでも同時沈降した（データは記載しない）。ｈＭＬＨ１に結合したｈＰＭＳ２のドメインを決定するために、ｍｕｔＬタンパク質内で最もよく保存されたドメインを含むアミノ末端（コドン１−１３４）（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８８， ２６３， ６８２９−６８３５ およびＥｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９６， ８５， １１２５−１１３４） 、およびカルボキシル末端（コドン１３５−８６２）を別個にクローニングしそしてカプルした転写−翻訳反応物内で生体外でタンパク質を産生した。図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、生体外翻訳されたｈＰＭＳ２およびｈＭＬＨ１タンパク質の代表的な免疫沈降を示す。図３Ａは、標識付（星印で表示）または非標識タンパク質であって、レーン１〜３はｈＰＭＳ２のＣ末端への抗体を用いてインキュベーションし、レーン４〜６はｈＭＬＨ１へのものの場合を示す。レーン７は、プログラムされない網状赤血球溶解物を含む。ＰＭＳ２−１３５は、ｈＰＭＳ２のコドン１３５〜８６２を含む。ｈＰＭＳ２およびｈＭＬＨ１の主要な翻訳産物を示す。図３Ｂは、非標識ｈＭＬＨ１の存在下または非存在下でｈＭＬＨ１への抗体を加えてインキュベーションした標識ｈＰＭＳ２−１３４（ｈＰＭＳ２のコドン１−１３４を含む）を示す（それぞれレーン１および２）。レーン３は、プログラムされない網状赤血球からの溶解物を含む。図３Ｃは、ｈＰＭＳ２のＮ−末端への抗体を用いてインキュベーションした標識タンパク質を示す。レーン６は、プログラムされない網状赤血球溶解物を含む。バネルＡおよびＢの双方で、免疫沈降した産物のオートラジオグラフを示す。３５Ｓ標識、全長ｈＭＬＨ１タンパク質（図３Ａ、レーン５）を非標識カルボキシル末端ｈＰＭＳ２ポリペプチドと混合すると、ｈＰＭＳ２のカルボキシル末端に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が標識ＭＬＨ１タンパク質を効率的に免疫沈降させた（レーン１）。ｈＰＭＳ２が存在しないと、ｈＭＬＨ１タンパク質は沈降しなかった（レーン２）。反対に、ｈＰＭＳ２の３５Ｓ標識、カルボキシル末端（レーン３）を非標識、全長ｈＭＬＨ１タンパク質とインキュベーションすると、抗−ｈＭＬＨ１ｍＡｂがｈＰＭＳ２ポリペプチドを沈降させた（レーン４）。非標識ｈＭＬＨ１タンパク質が存在しないと、ｈＰＭＳ２タンパク質はこのｍＡｂでは沈降しなかった（レーン６）。同じ抗体は、非標識ｈＭＬＨ１タンパク質と混合された場合に、ｈＰＭＳ２のアミノ末端（アミノ酸１−１３４）を免疫沈降しない（図３Ｂ、レーン１）。この知見は、Ｎ−末端ｈＰＭＳ２抗体を用いて沈降を行った場合には放射能標識ｈＰＭＳ２−１３４（図３Ｃ、レーン１）は放射能標識ＮＬＨ１と同時沈降できず（図３Ｃ、レーン２）、一方、野生型ｈＰＭＳ２と混合した場合には、この抗体はＭＬＨ１と同時沈降できることが知られた（図３Ｃ、レーン４）逆実験により確立された。
【００７２】
ＭＭＲの初期段階は、ＭｕｔＳαおよびＭｕｔＬαと呼ばれる２種のタンパク質複合体に依存する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ２６８， １９０９−１９１２）。ｈＰＭＳ２のアミノ末端はｈＰＭＳ２のｈＭＬＨ１への結合を媒介しないので、これがその代わりにＭｕｔＬα複合体（ｈＭＬＨ１とｈＰＭＳ２とより成る）およびＭｕｔＳα複合体（ＭＳＨ２とＧＴＢＰとから成る）の間の相互作用を媒介するかどうかを決定することは興味がある。以前の研究がＭＳＨ２およびＭｕｔＬα成分が溶液中で会合しないことを実証したので、直接のｈＰＭＳ２−１３４：ＭｕｔＳα相互作用はアッセイできなかった。この問題に取り組むために異なる方法を使用し、そしてＭｕｔＳαまたはＭｕｔＬαを用いて種々のＳＨ細胞系統よりの核抽出液を補完することを試みた。ＰＭＳ２−１３４発現ＳＨ細胞中に存在する末端短縮タンパク質がＭｕｔＳαに結合しそして抽出液中のその有効濃度を低下させるならば、不変のＭｕｔＳαの添加はかかる抽出液中のＭＭＲ欠陥を救助するはずである。図４は、末端短縮ＳＨ細胞中のＭＭＲ活性の補完を示す。ＰＭＳ２−ＮＯＴ、ＰＭＳ２−ＷＴ、またはＰＭＳ２−１３４を用いて安定に形質導入されたプールしたクローンからの溶解物を５’Ｇ／Ｔヘテロ二本鎖基体を用いることにより精製ＭｕｔＳαまたはＭｕｔＬαＭＭＲ成分で補完した。値は、種々の溶解物バックグラウンド中の修復効率について正規化するために、それぞれの場合の修復活性を、精製ＭｕｔＬαおよびＭｕｔＳαの双方の成分を用いて補完した溶解物のものと比較した百分率として表す。表示した値は、少なくとも３回の異なる測定の平均を表す。かかる抽出液に加えられた精製ＭｕｔＳαは、効果を持たなかった（図４）。反対に、抽出液に不変のＭｕｔＬαを加えるとＰＭＳ２−１３４細胞からの抽出液を方向性をもって完全に回復した（図４）。
【００７３】
上記の結果は、幾つかの結論に導く。第一に、ｈＰＭＳ２のアミノ末端の発現は、マイクロサテライト不安定性の上昇をもたらし、これは複製誤り（ＲＥＲ）表現型と一致する。この上昇したマイクロサテライト不安定性がＭＭＲ欠陥によることは、安定に形質導入された細胞からの抽出液の評価により証明された。興味あることに、ＰＭＳ２−１３４の発現はＭＭＲ中の極性欠陥をもたらし、これは５’方向からの修復を試験するために設計されたヘテロ二本鎖を用いてのみ観察された（同じ抽出液中で、３’方向からの修復における顕著な欠陥は観察されなかった）。興味あることに、ｈＭＬＨ１を欠失する細胞もＭＭＲに極性欠陥を有するが、しかしこの場合には３’方向からの修復に優先的に影響する（Ｈｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｒｅｓ．， １９９９， ４５， ７８５−９４） 。原核生物および真核生物双方における以前の研究から、別個の酵素成分が２種の異なる方向からの修復を媒介することが知られている。我々の結果は、５’修復が主としてｈＰＭＳ２に依存し、他方で３’修復は主としてｈＭＬＨ１に依存するモデルを示す。ＰＭＳ２とＭＬＨ１との間の二量複合体がこの方向性をどのように設定するかを想像することは容易である。複合した結果は、方向性ＭＭＲの欠陥は、ＲＥＲ＋表現型を産生するために十分であることも実証する。
【００７４】
ＰＭＳ２−１３４ポリペプチドの優性ネガティブ機能は、ＭＬＨ１へのその結合およびその結果としてのＭｕｔＬα機能の抑制よりもたらされることができる。これは、ＰＭＳ２遺伝子の最もよく保存されたドメインがそのアミノ末端に存在し、そしてＰＭＳ２に対する唯一の既知生化学的パートナーがＭＬＨ１である事実に一部分は基づく。しかし、結合研究は、よく保存されたアミノ末端ではなくて、ＰＭＳ２のカルボキシル末端がＭＬＨ１への結合を実際には媒介することを明らかにした。この結果は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｃｉａｅで最近得られたものと一致し、ここでＰＭＳ１（ＰＭＳ２の酵母同族体）のＭＬＨ１−相互作用ドメインはそのカルボキシル末端に位置していた（Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９３， ７５， １２１５−１２２５） 。アッドバック（ａｄｄ−ｂａｃｋ）実験は、追加的に、ｈＰＭＳ２−１３４変異体はＭｕｔＳα複合体との相互作用を媒介しないらしいことを示した（図４）。ｈＰＭＳ２−１３４ポリペプチドは、ＭＭＲ内の初期段階を抑制しないが、しかし経路の下流成分、多分５’方向からの修復のために必要なヌクレアーゼと相互作用して抑制する。
【００７５】
ｈＰＭＳ２−１３４変異が優性ネガティブＭＭＲ欠陥をトランスフェクションされた細胞に与えることができる証明は、この変異体が発見された家系の表現型を説明することを助ける。この家系からの３つの個体、父およびその２人の子供が変異を有することが見いだされた。両方の子供は、それらの正常の組織内にマイクロサテライト不安定性を示しそして双方共にその幼年で腫瘍を発生し、一方、父はその正常細胞内にマイクロサテライト不安定性の徴候を持たずそして３５歳まで完全に健康であった。この家族中のＭＭＲ遺伝子に関して我々が知っている唯一の差異は、リンパ球からのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定により評価して、父の変異体対立遺伝子が野生型対立遺伝子よりも低いレベルで発現されたことであった。子供達は両方の対立遺伝子をほぼ同様のレベルで発現した。ｈＰＭＳ２−１３４変異体の優性ネガティブ属性は、これが十分な濃度（少なくとも等モル）で存在する場合にのみ表れるであろうし、従ってこれが父におけるＭＭＲ欠陥の不在を説明する。この家系におけるｈＰＭＳ２−１３４対立遺伝子の異なる発現の理由は、インプリンティングが一つの可能性ではあるが、明確ではない。かかる変異を有する追加的なさらに大きい家系の確認がこの問題の探究を助けるであろう。
【００７６】
ウエスタンブロット：同数の細胞を溶解緩衝液（６０ｍＭトリス、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノール・ブルー）中に直接溶解し、そして５分間煮沸した。溶解タンパク質を４−１２％トリス−グリシンゲル（全長ｈＰＭＳ２の分析のため）または４−２０％トリス−グリシンゲル（ｈＰＭＳ２−１３４の分析のため）上の電気泳動により分離した。４８ｍＭトリス塩基、４０ｍＭグリシン、０．０３７５％ＳＤＳ、２０％メタノール内のインモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ） −Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ） 上にゲルをエレクトロブロットし、トリス緩衝生理食塩水に０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ） −２０および２０％濃縮牛乳を加えたものの中で４℃で一晩ブロックした。ｈＰＭＳ２の残留物２−２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）に対して生成したポリクローナル抗体およびホースラディシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ラビット二次抗体を用い、検出のために化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてフィルターをプローブした。
【００７７】
生体外翻訳：ｈＰＭＳ２およびｈＭＬＨ１  ｃＤＮＡ配列を含む線状ＤＮＡ断片を、センスプライマー中の生体外転写および翻訳のためのの配列を組み込んでＰＣＲにより作製した。全長ｈＭＬＨ１断片は、センスプライマー５’−ｇｇａｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａ  ｃｃａｃｃａｔｇｔｃｇｔｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇ−３’（配列番号１）（コドン１−６）、およびアンチセンスプライマー５’−ｔａａｇｔｃｔｔａａｇｔｇｃｔａｃｃａａｃ−３’（配列番号２）（３’非翻訳領域内に位置、ｎｔ２４１１−２４３３）を用い、野生型ｈＭＬＨ１  ｃＤＮＡクローンを鋳型として用いて調製した。全長ｈＰＭＳ２断片は、センスプライマー５’−ｇｇａｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇ  ａｃｃａｃｃａｔｇｇａａｃａａｔｔｇｃｃｔｇｃｇｇ−３’（配列番号３）（コドン１−６）およびアンチセンスプライマー５’−ａｇｇｔｔａｇｔｇａａｇａｃｔｃｔｇｔｃ−３’（配列番号４）（３’非翻訳領域内に位置、ｎｔ２６７０−２６９０）を用い、クローニングしたｈＰＭＳ２  ｃＤＮＡを鋳型として用いて調製した。ｈＰＭＳ２のアミノ末端１３４アミノ酸をコードする断片は、同じセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー５’−ａｇｔｃｇａｇｔｔｃｃａａｃｃｔｔｃｇ−３’（配列番号５）を用いて調製した。ｈＰＭＳ１３５のコドン１３５−８６２を含む断片は、センスプライマー５’−ｇｇａｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａｃｃａｃｃａｔｇａｔｇｔｔｔｇａｔｃａｃａａｔｇｇ−３’（配列番号６）（コドン１３５−１４１）および全長ｈＰＭＳ２タンパク質に使用したと同じアンチセンスプライマーを用いて精製した。これらの断片は、組となった転写−翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ） を介してタンパク質を生成するために使用した。テキストに記載のように、反応を３５Ｓ標識したメチオニンまたは非標識メチオニンを用いて補完した。ＰＭＳ１３５およびｈＭＬＨ１ タンパク質は同時には放射能標識および免疫沈降できなかったが、それはそれらの類似した分子量が分解を妨げたからである。さらに低い分子量バンドは、別の内部メチオニンより翻訳された分解生成物および／またはポリペプチドであると想定される。
【００７８】
免疫沈降：免疫沈降は、翻訳反応物をＭＬＨ１特異性モノクローナル抗体（ｍＡＢ）ＭＬＨ１４（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．）１ μｇ 、上記のｈＰＭＳ２のコドン２−２０に対して生成したポリクローナル抗体、またはｈＰＭＳ２のコドン８４３−８６２に対して生成したポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）とＥＢＣ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０）４００μｌ中で混合して生体外翻訳タンパク質上で行った。１時間、４℃でインキュベーションした後、タンパク質Ａセファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度１０％まで加えそして反応物を４℃で１時間インキュベーションした。タンパク質Ａに結合したタンパク質をＥＢＣ中で５回洗浄しそして４−２０％トリス−グリシンゲル上の電気泳動により分離し、次いでこれを乾燥およびオートラジオグラフィーした。
実施例５：シリアンハムスターＴｋ−ｔｓ１３細胞は新規の抗微生物性ポリペプチドを産生し、枯草菌の増殖を抑制できる
抗微生物性哺乳動物細胞を創成する実現可能性を以下のように実証する。シリアンハムスターＴＫ繊維芽細胞を、ｍｇｌ１と呼ばれる新規の抗微生物ポリペプチドまたはｐｓｇと呼ばれる空発現ベクターを含む哺乳動物発現ベクターを用いてトランスフェクションした。ｍｌｇポリペプチドを発現する細胞（ＴＫ−ｍｇｌ１と呼ぶ）を枯草菌（Ｂａｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の存在下で培養すると、これらの細胞は微生物の増殖を抑制でき、そしてＴＫ宿主を生存可能状態のままとし、これは枯草菌が哺乳動物細胞に対して有する毒性作用によりすべて死亡する空ベクターを用いてトランスフェクションしたＴＫ細胞（ＴＫ＝ｐｓｇ）の場合と対照的である。図５には、枯草菌の存在下で４日間培養したＴＫ−ｍｇｌ１およびＴＫ＝ｐｓｇ培養物の写真を示す。シリアンハムスターＴｋ−ｔｓ１３細胞を、ｍｌｇ１と呼ばれる新規の抗微生物性ポリペプチドを産生する真核性発現ベクター（パネルＡ）または発現のための挿入されたｃＤＮＡを欠失する発現ベクター（ＴＫ＝ｐｓｇ、パネルＢ）を用いてトランスフェクションした。１０ｃｍファルコン（ｆａｌｃｏｎ）パイロジェン不含ペトリ皿中、増殖培地中で５ｘ１０５ の密度で２４時間細胞をプレーティングしそして次いで枯草菌の指数関数的に増殖する培養物の１０μｌを用いて接種した。次いで培養物を４日間インキュベーションし、その間に枯草菌は増殖しそしてパネルＢに示すようにＴｋ−ｔｓ１３親培養物を溶解し始め（矢印で示す）、一方、抗微生物ｍｌｇ１ポリペプチドを発現する細胞（パネルＡ）は枯草菌の存在下でも生存可能のままであった（パネルＡおよびＢ中に存在する小さい顆粒状構造）。これらのデータは、細胞が抗微生物剤を産生する場合には、枯草菌汚染の存在下でも生き残るその生存可能性を実証する。これらのデータは、抗微生物剤産生哺乳動物細胞が増殖可能でありそして毒性微生物の存在下でも生き残ることを示す。
【００７９】
細胞系統およびトランスフェクション：シリアンハムスター繊維芽細胞Ｔｋ−ｔｓ１３細胞をＡＴＣＣより入手しそして記載のようにして培養した（Ｍｏｄｒｉｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９４， ２６６， １９５９−１９６０）。ＰＭＳ２発現ベクターおよびハイグロマイシン耐性遺伝子をコードするｐＬＨＬ４プラスミドを３：１の割合（ｐＣＡＲ：ｐＬＨＬ４）で同時トランスフェクションしてｈＰＭＳ２を発現する安定にトランスフェクションされた細胞系統を創成し、ハイグロマイシンを用いて選択した。ネオマイシン耐性プラスミドをコードするｐＮＴＫプラスミドまたはｐＬＨＬ４のいずれかを一緒にｐＣＡＲベクターを同時トランスフェクションして、ｐＣＡＲレポーターを含む安定にトランスフェクションされた細胞系統を創成した。すべてのトランスフェクションは、引用することによりその全体を本明細書中に編入されるＭｏｄｒｉｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９４， ２６６， １９５９−１９６０にすでに記載のようにしてリン酸カルシウムを用いて行った。
実施例６：ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４細胞は、生体外で大腸菌の増殖を抑制できる
ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４  ＴＫ−ｔｓ１３細胞はすでに生体外で遺伝子を改変できることを示したけれども（表２および図１参照）、「天然の抗微生物性」クローンを創成する能力は、文献には報告されていない。抗微生物性ＴＫ細胞を創成するために、優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子を構成的に発現するＴＫ−ｔｓ１３細胞、ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４または３カ月以上培養（約６０パッセージ以上）していた空ベクター（ＴＫｖｅｘｔ）を、ダルベッコの変更イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ， ＤＭＥＭ） に１０％ウシ胎児血清（ＰＢＳ）を加えたもの中に５ｘ１０５ 細胞／ｍｌで接種し、そして２系列の１０ｃｍ皿（Ｆａｌｃｏｎ）内にプレーティングした。これらの細胞を一晩、３７℃、５％ＣＯ２ 中で培養して細胞をプラスティックに粘着させた。次の日に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の指数関数的に増殖している培養物１０μｌをＴＫ培養物に接種した。次いで培養物を３７℃、５％ＣＯ２ 中で培養しそして抗微生物性細胞クローンを７および１４日目に観察した。これらの細胞はプレート上の「クリア化」した領域により囲まれた細胞のクローンとして現れた。７日目に、対照トランスフェクションされたＴＫｖｅｃｔ培養物内のすべての細胞は死亡し、一方細胞のサブセットはＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４をトランスフェクションされた細胞中で生存可能であった。１４日目に、対照トランスフェクションされたＴＫｖｅｃｔ培養物内にはクローンは存在せず、一方ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４トランスフェクションされた培養物中には形成された大腸菌耐性コロニー３４および４０個が形成された。次いでそれぞれの皿からの培養中のクローンを個別の培養物としてプールしそして集密状態となるまで培養した。これらの培養物をＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４（Ｒ１）およびＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４（Ｒ２）と名付けた。１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を加えて培養物を大腸菌から救助し、その中でＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４細胞は細胞を創成するために使用した哺乳動物発現ベクター上に含まれたネオマイシン耐性遺伝子の発現により耐性であった。
【００８０】
ＴＫｖｅｃｔ、ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４（Ｒ１）およびＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４（Ｒ２）細胞を１０ｍｌ中に５ｘ１０５ 細胞／ｍｌで接種しそして２系列で１０ｃｍペトリ皿上にプレーティングした。次の日に、対数段階の大腸菌培養物１０μｌをそれぞれのＴＫ培養物に加えそして培養物を４８時間、３７℃で５％ＣＯ２ 中で培養した。それぞれの培養物からの上清の試料を接種の直後に採取してそれぞれの培養物に対する細菌の基礎密度を確定した。４８時間後に、上清２ｍｌをそれぞれの培養物よりならびに非感染ＴＫ培養物より採取した。次いで、それぞれの上清の内の１ｍｌを分光測定によりＯＤ６００ で細菌密度を測定した。非感染培養物よりの上清は、バックグラウンドを補正するためのブランクとして使用した。図６に示すように、ＴＫｖｅｃｔ対照細胞とは対照的に、細菌増殖はＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４（Ｒ１）およびＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４（Ｒ２）培養物中で著しく抑制された。これらのデータは、微生物増殖を抑制できる分子を産生できる遺伝子改変クローンを産生するために哺乳動物細胞上の優性ネガティブミスマッチ修復変異体ｈＰＭＳ２−１３４を用いることの実現可能性を証明する。
【００８１】
当該技術分野の熟練者は認めるように、本発明の精神から外れることなく、多数の変化および変更を本発明の好ましい態様に加えてもよい。かかる変化は本発明の範囲内に入ると考える。さらに、本明細書中に引用したそれぞれの刊行物は、引用することにより本明細書中に編入される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
遺伝子改変されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む細胞を測定するためのＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４またはＴＫｖｅｃｔ細胞の代表的なイン・サイチューβ−ガラクトシダーゼ染色である。矢印は青色（β−ガラクトシダーゼ陽性）細胞を示す。
【図２】
ＴＫ細胞中のＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４宿主細胞の発現により産生されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の改変の配列の略図である。
【図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ】
生体外で翻訳されたｈＰＭＳ２およびｈＭＬＨ１タンパク質の代表的な免疫沈降を示す。
【図４】
形質導入されたＳＨ細胞中のＭＭＲ活性の代表的な補完を示す。
【図５】
新規の抗微生物性ポリペプチドを産生する真核性発現ベクターを用いてトランスフェクションされたシリアンハムスターＴＫ−ｔｓ１３細胞の代表的な写真である。
【図６】
ＴＫ−ｈＰＭＳ２−１３４トランスフェクションされたＴＫ細胞が生体外で細菌の増殖を抑制できることを示す代表的な写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2005502302.tif 000083
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