(57)【要約】本発明はIBC-1(浸潤乳癌-1)に特異的な抗体、転移乳癌と変性神経症状の診断と予後の方法、治療化合物の同定および製造法および浸潤乳癌または変性神経症状の患者の治療法を包含している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：5（pro-IBC-1のアミノ酸20-42位）の配列内のエピトープに特異的に結合する精製された抗体。
【請求項２】
抗体がモノクロナール抗体である、請求項1に記載した抗体。
【請求項３】
配列番号：6（pro-IBC-1のアミノ酸43-64位）の配列内のエピトープに特異的に結合する精製された抗体。
【請求項４】
抗体がモノクロナール抗体である、請求項3に記載した抗体。
【請求項５】
エピトープが配列番号：7（pro-IBC-1のアミノ酸53-64位）の配列内にある、請求項3に記載した抗体。
【請求項６】
抗体がモノクロナール抗体である、請求項5に記載した抗体。
【請求項７】
試験試料がIBC-1の受容体を含むか否かを測定する方法であって、
（a）ヒトの患者からの試験試料を提供する段階、
（b）試験試料をIBC-1の10-91位の連続したアミノ酸を含むポリペプチドと接触する段階、および
（c）ポリペプチドが試験試料と結合するか否かを測定する段階を含み、
陰性対照よりも多い量で試験試料と結合したポリペプチドの検出が、試験試料がIBC-1の受容体を含むことを示す方法。
【請求項８】
ポリペプチドがIBC-1である、請求項7に記載した方法。
【請求項９】
試験試料が乳癌、黒質、橋または視床下部の組織試料から調製される、請求項7に記載した方法。
【請求項１０】
患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するかまたは発症する可能性が高い、請求項7に記載した方法。
【請求項１１】
患者が変性神経症状を患っているか、または発症する危険性があると疑われる、請求項7に記載した方法。
【請求項１２】
患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するかまたは発症する可能性が高いか否かを測定する方法であって、
（a）乳癌患者からの試験試料を提供する段階、および
（b）試験試料中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1を検出する段階を含み、
試験試料中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1が対照試料中よりも多い量で検出される段階が、患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するかまたは発症する可能性が高いことを示す方法。
【請求項１３】
試験試料が乳癌組織試料から調製される、請求項12に記載した方法。
【請求項１４】
試験試料が体液から調製される、請求項12に記載した方法。
【請求項１５】
患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するかまたは発症する可能性が高いか否かを測定する方法であって、
（a）乳癌患者のからのゲノムDNAを含む試験試料を提供する段階、および
（b）試験試料中のゲノムIBC-1 DNAが増幅されているか否かを測定する段階を含み、
試験試料中の増幅されたゲノムIBC-1 DNAの存在が、患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するかまたは発症する可能性が高いことを示す方法。
【請求項１６】
試験試料が乳癌組織試料から調製される、請求項15に記載した方法。
【請求項１７】
患者が変性神経症状を患っているか、または発症する危険性があるか否かを測定する方法であって、
（a）変性神経症状を患っているか、または発症する危険性があると疑われるヒトの患者のからの試験試料を提供する段階、および
（b）試験試料中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1を検出する段階を含み、
試験試料中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1の量が正常対象試料中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1よりも少ない量である段階が、患者が変性神経症状を患っているか、または発症する危険性があることを示す方法。
【請求項１８】
試験試料が乳癌、黒質、橋または視床下部の組織試料から調製される、請求項17に記載した方法。
【請求項１９】
試験試料が体液から調製される、請求項17に記載した方法。
【請求項２０】
IBC-1のその受容体への結合を遮断する化合物を同定する方法であって、
（a）IBC-1の10−91の連続したアミノ酸を含むポリペプチドであって、ポリペプチドがIBCの受容体に結合しているポリペプチドを提供する段階、
（b）IBC受容体を発現している細胞を提供する段階、
（c）細胞を試験化合物の存在下でポリペプチドと接触する段階、および
（d）試験化合物がIBCのその受容体への結合を遮断する指標として、この化合物が細胞へのポリペプチドへの結合を遮断するか否かを測定する段階を含む方法。
【請求項２１】
ポリペプチドがIBC-1である、請求項20に記載した方法。
【請求項２２】
細胞が乳癌細胞である、請求項20に記載した方法。
【請求項２３】
細胞が神経細胞である、請求項20に記載した方法。
【請求項２４】
試験化合物が抗体である、請求項20に記載した方法。
【請求項２５】
抗体がIBC-1に結合している、請求項24に記載した方法。
【請求項２６】
抗体が受容体に結合している、請求項24に記載した方法。
【請求項２７】
試験化合物がペプチドである、請求項20に記載した方法。
【請求項２８】
試験化合物が非ペプチドの小分子である、請求項20に記載した方法。
【請求項２９】
化合物を製造する方法であって、
（a）IBC-1のその受容体への結合を遮断する化合物を同定する、請求項20に記載した方法を実施する段階と、
（b）化合物を製造する段階とを含む方法。
【請求項３０】
癌を治療する方法であって、
（a）IBC-1またはIBC-1受容体を発現している浸潤乳癌および転移乳癌を有する患者を同定する段階と、
（b）IBC-1のその受容体への結合を遮断する化合物で患者を治療する段階とを含む方法。
【請求項３１】
化合物がIBC-1に結合する抗体である、請求項30に記載した方法。
【請求項３２】
化合物が受容体に結合する抗体である、請求項30に記載した方法。
【請求項３３】
患者が悪液質を患っていると診断されていない、請求項30に記載した方法。
【請求項３４】
患者が悪液質の明白な症状を示していない、請求項30に記載した方法。
【請求項３５】
癌の治療法であって、その方法が
（a）IBC-1またはIBC-1受容体を発現している浸潤乳癌および転移乳癌を有する患者を同定する段階と、
（b）IBC-1またはその受容体の発現を阻害する化合物で患者を治療する段階とを含む方法。
【請求項３６】
患者が悪液質を患っていると診断されていない、請求項35に記載した方法。
【請求項３７】
患者が悪液質の明白な症状を示していない、請求項35に記載した方法。
【請求項３８】
神経症状を治療する方法であって、
（a）黒質、橋または視床下部の細胞の変性を含む神経症状を患っているか、または発症する危険性のある患者を同定する段階と、
（b）患者にIBC-1またはIBC-1のアゴニストを投与する段階とを含む方法。
【請求項３９】
（a）生物学的試料中のIBC-1のレベルを測定するための試薬と
（b）患者において浸潤乳癌および転移乳癌を検出するための試薬の使用説明書とを含むキット。
【請求項４０】
（a）生物学的試料中でゲノムIBC-1 DNAが増幅されているか否かを測定するための試薬と
（b）患者において浸潤乳癌および転移乳癌を検出するための試薬の使用説明書とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は2001年10月26日出願の米国特許仮出願第60/343,154号および2002年2月12日出願の米国特許仮出願第60／356,301号に対する優先権を主張するものである。これらの内容は、本明細書に参照として組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は癌と神経変性疾患に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
乳癌は世界的に女性の癌による死亡の主な原因である。最近の癌治療の改善にもかかわらず、進行した段階の癌は未だに殆ど致死的である（Albergら（2000)Curr Opin Oncol 12:515-520）。従って、特に最近の治療に反応性が乏しいエストロゲン受容体陰性および転移腫瘍における新しい治療標的を同定する必要がある。
【発明の開示】
【０００４】
概要
本発明は、浸潤乳癌の攻撃的な亜群および脳の橋で発現するが、75の他の正常なヒト成人および胎児組織では発現しないヒト遺伝子の同定に基づいている。この遺伝子はIBC-1（浸潤乳癌（Invasive Breast Cancer-1）と命名された。IBC-1 cDNAによってコードされた予想アミノ酸配列は、(a)以前に同定されたヒト悪液質関連蛋白質（Akerblomら、米国特許第5,834,192号）、(b)PIF（蛋白質分解誘導因子（Proteolysis Inducing Factor）、癌の悪液質因子とも呼ばれる）から誘導される蛋白質断片、(c)推定される分泌神経生存ペプチド（Conninghamら（1998）J Neurosci 18: 7047-7060）、およびTodorovら（1996)Nature379: 739-742）、および（d）皮膚の汗腺に発現したダームシジン（dermcidin）蛋白質（Schttekら（2001) Nature Immunology 2：1133-1137）のそれと類似のまたは同一の配列を含んでいる。IBC-1はN末端に予想された19のアミノ酸のシグナルペプチドを有する110のアミノ酸のプロ蛋白質（即ち、「pro-IBC-1」配列番号：3）をコードしているが、これは蛋白質が成熟すると取り除かれると思われる。
【０００５】
本明細書中で使用するように、「pro-IBC-1」は推定されるシグナルペプチドを有する110のアミノ酸蛋白質を意味し、「IBC-1」は91のアミノ酸の成熟蛋白質（即ちpro-IBC-1、アミノ酸20-110、配列番号：4）を意味する。
【０００６】
本発明はIBC-1に特異的に結合している抗体、癌および神経疾患の診断法および予後判定法、治療化合物の同定および製造法、ならびに癌および神経疾患の治療法に関する。癌は、例えば乳癌、膵臓癌、脳腫瘍、胃癌、肺癌、リンパ腫または浸潤性および転移性であり、かつ悪液質に関連しても関連しなくてもよい、他の型の癌であることができる。
【０００７】
より具体的には、本発明はIBC-1の断片、例えば配列番号：5(pro-IBC-1のアミノ酸20-42)、配列番号：6(pro-IBC-1のアミノ酸43-64)、または配列番号：7(pro-IBC-1のアミノ酸53-64)内のエピトープに特異的に結合している精製された抗体を含む。この抗体はモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体であってもよい。これらの抗体は患者からの試験試料中のIBC-1の検出、治療化合物の同定およびIBC-1の過剰発現に関連した疾患の治療に用いることができる。
【０００８】
本明細書中で用いられているように、「抗体」という用語は抗体分子全体を意味するだけでなく、例えばFab、F(ab')2、Fvおよび一本鎖Fv(ScFv)断片のような抗原結合断片も意味する。また、ヒト化された抗体のようなキメラ抗体も含まれる。
【０００９】
本明細書中で用いられているように、「精製された抗体」という用語は、自然に生じた一対の一方を有さないか、または例えば血液細胞のような、自然に随伴している成分から分離された抗体を意味する。
【００１０】
診断および予後判定の方法もまた本発明の範囲内である。そのような1つの方法は試験試料がIBC-1に対する受容体を含むか否かの測定に基づいている。その方法は、（a）ヒトの患者からの試験試料を提供する段階、（b）試験試料をIBC-1の10-91の連続したアミノ酸を含むポリペプチドと接触する段階、および（c）このポリペプチドが試験試料と結合するか否かを測定する段階を含む。陰性対照よりも多い量でこの試験試料と結合したポリペプチドの検出が、試験試料がIBC-1の受容体を含む事とを示す。ポリペプチドは例えばIBC-1自体または長さが10-91個のアミノ酸（例えば10-50個のアミノ酸、好ましくは12-40個のアミノ酸、より好ましくは15-30個のアミノ酸）であるIBC-1の断片であってもよい。患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するか又は発症の可能性が高いと疑われる場合には、試験試料は乳癌組織から調製できる。そのような場合、対照試料よりも多い量で試験試料中の受容体の存在が、患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するか又は発症の可能性が高いことを示す。患者が変性神経症状を患っているかまたは発症の危険性の疑いがある場合は、この試験試料は黒質、橋または視床下部の組織試料のような脳組織試料から調製できる。そのような場合、正常なヒト（即ち、変性神経症状がない人）からの試料中の受容体の量よりも少ない試験試料中の受容体の量が、患者が通常IBC-1の存在によって保護される黒質、橋または視床下部の細胞又は他の神経細胞の変性を含む神経症状を患っているか又は発症の危険性があることを示す。
【００１１】
他の診断および予後判定の方法は試験試料がIBC-1 mRNAまたはIBC-1を含むか否かを判定することに基づいている。この方法は（a）患者からの試験試料を提供する段階、（b）この試験試料中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1を検出する段階を含む。患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するか又は発症の可能性が高いと疑われる場合は、試験試料は乳癌組織試料または体液（例えば尿、母乳、唾液または血液）から調製できる。試験試料中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1が対照レベルより高いことが、患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するか又は発症の可能性が高いことを示す。患者が変性神経症状を患っているかまたは発症の危険性の疑いがある場合は、試験試料は通常黒質、橋または視床下部の組織試料または体液（例えば尿、脳脊髄液、唾液または血液）から調製される。試験試料中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1の量が比較試料中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1の量より低いことが、患者が通常IBC-1発現している黒質、橋または視床下部の細胞又は他の型の神経細胞の変性を含む神経症状を患っているか又は発症の危険性があることを示す。
【００１２】
診断および予後判定の第三の方法は試験試料中にゲノムIBC-1 DNAが増幅さているか否かを判定することに基づいている。この方法はa）乳癌患者からのゲノムDNAを含む試験試料を提供する段階、および（b）この試験試料中でゲノムIBC-1 DNAが増幅されているか否かを判定する段階を含む。患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するかまたは発症する可能性が高いとの疑いがある場合は、この試験試料は乳癌組織試料から調製される。試験試料中での増幅されたゲノムIBC-1 DNAの存在が、患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するかまたは発症する可能性が高いことを示す。本明細書中で用いられているように、「増幅」は機能的IBC-1蛋白質分子をコードしているmRNA分子に転写され得る細胞中のゲノムDNA配列の量が対照の人（例えば乳癌のない人）よりも高いことを意味する。
【００１３】
本発明にはまたIBC-1のその受容体への結合を遮断する化合物を同定する方法が含まれる。この方法は(a)IBC-1の10−91の連続したアミノ酸を含み、IBC-1受容体を結合しているポリペプチドを提供する段階、(b)IBC-1受容体を発現している細胞を提供する段階、（c）試験化合物の存在下で細胞をポリペプチドと接触する段階、（d）化合物がIBC-1のその受容体への結合を遮断する指標として、試験化合物がポリペプチドの細胞への結合を遮断するか否かを測定する段階を含む。ポリペプチドは例えばIBC-1自体または少なくとも長さが10個のアミノ酸（好ましくは少なくとも12個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも15個のアミノ酸、例えば長さが少なくとも20個または少なくとも50個のアミノ酸）であるIBC-1の断片であってもよい。細胞は乳癌細胞（例えば浸潤乳癌細胞）または神経細胞（例えば黒質、橋または視床下部の細胞）、又は受容体を発現している任意の他の細胞であり得る。試験化合物は、例えば、ペプチド、非ペプチドの低分子、またはIBC-1またはその受容体に結合する抗体であってもよい。このように同定された化合物はIBC-1の過剰発現に関連した疾患の治療に使用できる。それがIBC-1と結合して遮断する場合には、それはまた試料中のIBC-1の検出するためにも使用できる（例えば上に記載したように診断と予後判定のために）。それがIBC-1受容体と結合して遮断する場合には、細胞上の受容体の存在を検出するためにも使用できる（例えば上に記載したように診断と予後判定のために）。IBC-1のその受容体への結合を遮断する化合物が同定されると、それは大規模で製造できる。
【００１４】
本発明の他の局面において、本発明は癌の治療法を提供する。その方法は(a)IBC-1またはIBC-1受容体を発現している浸潤乳癌および転移乳癌を有するかまたは発症する可能性の高い患者を同定する段階、(b)患者を(i)IBC-1の受容体への結合を遮断する化合物（例えばIBC-1またはその受容体に結合するアンタゴニストでない抗体）または(ii)IBC-1またはその受容体の発現を阻害する化合物（例えばRNAi分子）で治療する段階を含む。患者は悪液質を患っているかまたは明らかな悪液質の症状を示していると診断されていても診断されていなくてもよい（例えば、短期間に少なくとも10%の自然な体重減少）。
【００１５】
本発明の他の局面は、(a)通常IBC-1を発現している黒質、橋または視床下部の細胞、または他の型の神経細胞の変性を含む神経症状を患っているか発症する危険性のある患者を同定する段階と(b)患者にIBC-1またはIBC-1のアゴニストを投与する段階とによる神経症状を治療する方法である。
【００１６】
また、浸潤乳癌および転移乳癌を検出するキットも本発明の範囲内にある。そのキットは(a)生物学的試料中のIBC-1レベルを測定するための試薬または(b)生物学的試料中でゲノムIBC-1 DNAが増幅されているか否かを判定するための試薬を含む。
【００１７】
別に定義しない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。係争の場合は、定義を含め本明細書が管理することとする。本明細書に記載する方法と物質に類似または同等の方法と物質は本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法と物質を以下に記載する。本明細書中に挙げるすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献を参照としてその全体を組み入れる。本明細書中に開示する物質、方法および実施例は単に例示のためであり、制限することを意図しない。本発明の他の特徴、目的および利点は記載およびそれに随伴する図面および請求項から明らかであると思われる。
【００１８】
詳細な発明
本発明はIBC-1をコードしている遺伝子の同定と特徴付けに基づいている。IBC-1はUnigeneデータベースおよびGenbankデータベースと対応しないSAGEタグとして同定された。それは浸潤乳癌および転移乳癌から生成したそれらのSAGEライブラリー中だけで示された。その後の解析でIBC-1蛋白質の予想されるアミノ酸配列は以前に同定されたヒト悪液質関連蛋白質、以前に記載した蛋白質分解／悪液質誘導因子（PIF）由来のトリプシンペプチド、神経生存ペプチドおよびデルミシジン（dermcidin）蛋白質と同一の配列を含むことを示した。
【００１９】
試験した乳癌のパネルにおいて、IBC-1を発現したすべての腫瘍は高核グレード（high-nuclear grade）で、erbB2を過剰発現していることが認められた。このような特徴を有する腫瘍は臨床の予後が不良で、閉経後の女性にはあまり一般的ではない。IBC-1蛋白質が検出された原発性腫瘍は第1期の乳癌よりもむしろ第2期または第3期の乳癌である可能性が高かったことは重要である。腫瘍の段階は腫瘍サイズ（T）、リンパ節（N）および遠位転移（M）に基づいて与えられる3つのスコアの概要に従って決定される。第1期の腫瘍はT1NOMO腫瘍である。第2期の腫瘍はリンパ節および遠位転移（T2NOMO）のない大きな侵食腫瘍またはリンパ節(T1N1MO)のある小さな侵食腫瘍のいずれかである。第3期の腫瘍はリンパ節があるが、遠位転移(T2-3N1-2MO)のない原発性の侵食腫瘍である。従ってIBC-1の発現は腫瘍の臨床的に関係のある腫瘍のサブグループを定義し、これらの腫瘍および癌に関連した悪液質の治療の新しい治療標的を表す。
【００２０】
浸潤乳癌の亜群に加えて、IBC-1はまた脳の橋と中央部の回に発現するが、試験した他の正常な成人または胎児の組織では発現しない。制限された発現のパターンによって、IBC-1は癌診断の優れた候補マーカーおよび治療標的になる。分泌された性質およびIBC-1の細胞外の作用機序によって、それはそのような潜在的な用途にさらにより魅力的になる。これと一致して、本発明者等はインビボで乳癌および神経細胞中で細胞表面細胞IBC-1結合蛋白質（即ち、推定されるIBC-1受容体）の存在を証明した。更に、IBC-1を発現している腫瘍は細胞表面上により多い、または親和性の高いIBC-1結合蛋白質を有すると思われ、このためにこれらの細胞中でIBC-1経路を潜在的な治療標的にすることをさらに助長することができる。
【００２１】
以前の試験は予想されたIBC-1アミノ酸配列の一部に対応した30のアミノ酸ペプチドが酸化傷害誘導アポトーシスから細胞を保護していると思われることを示した(Cunninghamら（1998)J Neurosci 18: 7047-7060)。神経細胞は特に反応性酸素種(ROS)に敏感であるが、腫瘍細胞自体は大量のROSを産生する(SzatrowskiおよびNathan(1991)Cancer Res 51: 794-798)。従ってこれらの細胞型におけるIBC-1の高い発現がそれらの生存に必須であると思われる。
【００２２】
脳内でIBC-1と強く結合するすべての神経細胞がエネルギーのホメオスタシスの調節に直接的または間接的な役割を果たしていることは興味深い。青斑核のノルアドレナリン神経細胞は脳と脊髄のすべての主要部分に突出を有し、覚性（覚醒）状況の維持に関与している。同様に黒質のドーパミン作動性神経細胞は皮質、脊髄および視床下部と連結し、端緒の挙動応答を制御している。最後に、最も興味深いことに、側方視床下部は「供給センター」と考えられ、その神経細胞の障害が摂食障害を招く(Inui(1999)Cancer Res 59：4493-4501)。これらの細胞へIBC-1の強い細胞表面結合はIBC-1の摂食挙動の制御における役割を裏づけている。
【００２３】
更に、これらの神経伝達物質のチロシンからの生合成には分子状酸素が必要であるため、カテコールアミン作動性（ノルアドレナリン作動性およびドーパミン作動性）神経細胞は特に酸化ストレスに敏感である。更にカテコールアミンの自動酸化の最終産物であるメラニンの黒質および青斑核中の蓄積はROS(H2O2,O2-およびOH-)の生成につながる。これらの神経細胞へのIBC-1の強い結合は酸化ストレスに対して保護する神経生存因子としてのその推定される役割と一致する。その低く、制限された正常な発現パターンと対照的に、ある癌によるIBC-1の異常な過剰発現は循環型IBC-1蛋白質レベルの上昇を招く(Wigmoreら（2000)Br J Surg 87：53-58;およびCabal-Manzanoら（2001)Br.J.Cancer 84: 1599-1601)。そのサイズが小さいためにIBC-1蛋白質は脳血管関門を通過できる(Cunninghamら（1998)J Neurosci 18:7047-7060）。従って、全身のIBC-1レベルの上昇はIBC-1の橋、中脳および視床下部への結合を増加し、その結果、筋肉の消耗の増加と共に癌に関連した体重減少を招く摂食挙動の変化をもたらす。悪液質を伴った乳癌患者の腫瘍は顕著な体重低下がない患者と比べて化学療法により抵抗性であることが見出された(Dewysら（1980)Am J Med 69: 491-497)が、これはIBC-1が乳癌細胞の生存および摂食挙動の制御に役割を果たしていることと一致している。
【００２４】
IBC-1抗体
本発明はIBC-1蛋白質の断片内のエピトープ、例えば配列番号：5（
2005511552.tif 000002
、pro-IBC-1のアミノ酸20-42位）、配列番号：6（
2005511552.tif 000003
、pro-IBC-1のアミノ酸43-64位）、または配列番号：7（
2005511552.tif 000004
、pro-IBC-1のアミノ酸53-64位）に結合する抗体を特徴とする。これらの断片は、抗原性であり、MacVectorを用いた解析により、蛋白質表面に局在すると予測され、このためIBC-1抗体産生に特に有用である。
【００２５】
そのような抗体は当技術分野で知られている方法と任意のアジュバントを用いて関連したIBC-1のエピトープを含む完全なIBC-1またはその一部で免疫された動物（例えば、マウス、ハムスター、アレチエズミ、ウサギ、ラット、モルモット、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウシまたはブタ）の血清由来または血漿由来のポリクロナール抗体であってもよい。そのようなポリクロナール抗体は当技術分野で知られている方法によって血清または血漿から単離することができる。
【００２６】
上に記載したIBC-1断片に結合しているモノクロナール抗体もまた本発明に包含される。モノクロナール抗体の作成およびスクリーニングの方法は当技術分野で周知である。
【００２７】
所望の抗体を生産するハイブリドーマが選択され、クローニングされると、得られた抗体は当技術分野で周知の多数の方法によって作製できる。例えばそのハイブリドーマをインビトロで適した時間、適した培地中で培養し、ついで上清液から所望の抗体を回収できる。培養時間と培地は周知であるか、または容易に決定できる。
【００２８】
更に、例えばヒトおよび非ヒト部分を含むキメラのおよびヒト化したモノクローナル抗体のような上記のIBC-1断片に特異的な組換え抗体もまた本発明の範囲内である。そのようなキメラのおよびヒト化したモノクロナール抗体は、例えばAkiraら、欧州特許出願第184,187号；Taniguchi、欧州特許出願第171,496号; Morrisonら、欧州特許出願第173,494号 Neubergerら、国際公開公報第86/01533号;Cabillyら、米国特許第4,816,567号、Cabillyら、欧州特許出願第125,023号; Betterら、（1988）Science 240:1041-43；Liuら（1987)J Immunol 139：3521-26; Sunら（1987) PNAS USA 84:214-18；Nishimuraら（1987)Canc Res 47:999-1005; Woodら (1985) Nature 314:446-49; Shawら（1988）J Natl Cancer  Inst 80: 1553-59; Morrison (1985)Science 229:1202-1207；Oiら（1986)BioTechniques 4:214；Winter、米国特許第5,225,539号; Veroeyanら（1988)Science 239、1534；およびBeidlerら（1988)J Immunol 141:4053-60に記載されている方法を用いて、当技術分野で周知の組換えDNA技術によって製造できる。
【００２９】
本発明の範囲には上に記載したIBC-1断片に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインの少なくとも機能性部分を含む抗体断片および抗体誘導体も含まれる。分子の結合ドメインを含む抗体断片は周知の技術で生成できる。例えば、抗体分子のペプシン消化によって作製できるF(ab')2断片、F(ab')2のジスルフィド架橋を還元して生成できるFab断片、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理して生成できるFab断片を含むが、これらに限定されない（例えば、National Institute of Health、1 Current Protocols In Immunology、Coliganら編、2.8および2.10(Wiley Interscience、1991)参照のこと）。抗体断片にはFv（例えば、一本鎖Fv(scFv)）断片、即ち一定領域のアミノ酸残基がないか非常に少ない抗体産物も含まれる。ScFv断片はScFvが由来する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の両方を含む一本鎖ポリペプチドである。そのような断片は例えば、本明細書にその全体を組み入れる米国特許第4,642,334号に記載されているように作製できる。
【００３０】
診断法および予後判定法
本発明はまた診断および予後アッセイ法を特徴とする。そのようなアッセイ法は(a)IBC-1遺伝子は乳癌の攻撃的な亜群においておよび橋、視床下部および中脳においてのみ発現している。(b)IBC-1遺伝子はIBC-1遺伝子を発現している同じ乳癌で増幅されている。(c)IBC-1が発現している細胞中で細胞表面IBC-1結合蛋白質（即ちIBC-1受容体）の存在の証拠があるという所見に基づいている。従って(a)乳癌組織試料または体液（例えば尿、血液）中で対照試料中よりも多い量のIBC-1 mRNAまたはIBC-1、(b)乳癌組織試料中の増幅されたゲノムIBC-1 DNAまたは（c）乳癌組織試料中での対照試料よりも多い量のIBC-1受容体のいずれかの検出は、患者が浸潤乳癌および転移乳癌を有するか発症する可能性が高いことを示す。対照試料は乳癌のない正常被験者から得るのが好ましい。しかし、対照試料は非浸潤性乳癌(DCIS)で得ることもできる。（a）黒質、橋または視床下部の組織試料中または体液（例えば尿、CSF、または血液）中での、正常対照試料中よりも少ない量のIBC-1 mRNAまたはIBC-1の検出または（b）黒質、橋または視床下部の組織試料中でIBC-1受容体が検出されないか、正常のIBC-1受容体の量よりも低い量の検出のいずれかは患者が黒質、橋または視床下部の細胞の変性を含む神経症状を患っているか発症の危険性があることを示す。そのような検査は、それ自体で、または他の手順と併用して、例えばヒト乳癌患者または黒質、橋または視床下部の細胞の変性を含む神経症状を患っているか、発症の危険性が疑われる患者のような適切な被験者における浸潤乳癌および転移乳癌または変性神経疾患を検査するために用いることができる。これらの患者は乳癌、パーキンソン病または他の神経症状の症状を有する。すべてのヒト検体（例えば生検または外科的に切除された原発性乳癌および剖検による脳試料）は施設内審査委員会承認プロトコールを用いて収集し、ドライアイス上で瞬間冷凍し、−80°Cで保存できる。
【００３１】
試験細胞または体液中のmRNAレベルの測定法は当技術分野で知られている。mRNAレベルを測定するために、試験試料中の細胞を可溶化し、溶解産物または溶解産物からRNA精製または半精製されたRNA中のIBC-1  mRNAのレベルが当業者になじみのある種々の方法で測定できる。そのような方法には、検出できるように標識されたIBC-1特異的なDNAまたはRNAプローブおよび適切なIBC-1遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いる定量的または半定量的なRT-PCR法を用いるハイブリダイゼーションアッセイ法が含まれるが、これらに限定されない。または、例えば組織切片または非溶解細胞懸濁液および検出できるように（例えば蛍光または酵素）標識されたDNAのプローブまたはRNAプローブを用いて定量的または半定量的インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法を実施できる。mRNAを定量する他の方法にはRNAプロテクションアッセイ法（RPA）、cDNAおよびオリゴヌクレオチドのマイクロアッセイ法、遺伝子サブトラクション（representation difference）分析（RDA）、ディファレンシャル  ディスプレイ（differential display）、EST配列分析およびSAGEが含まれる。
【００３２】
試験細胞または試験体液中の蛋白質レベルを測定する方法は当技術分野でおなじく周知である。多くのそのような方法はIBC蛋白質に特異的に結合する抗体（例えばモノクロナールまたはポリクロナール抗体）を採用する。そのようなアッセイ法において、抗体自体またはそれに結合する二次抗体は検出できるように標識できる。または、抗体はビオチンと結合でき、検出できるように標識したアビジン（ビオチンに結合するポリペプチド）をビオチン化抗体の存在を検出するために使用できる。当業者になじみのあるこれらの手法の組み合わせ（「多層サンドイッチ」アッセイ法を含む）を用いて方法の感度を増強することができる。蛋白質測定アッセイ法（例えばELISAまたはウエスタンブロット）のいくつかは体液または試験細胞の溶解産物に適用でき、その他（例えば免疫組織学的方法または 蛍光フローサイトメトリー）は組織切片または非溶解細胞懸濁液に適用できる。標識の量を測定する方法は標識の性質に依存し、当技術分野で知られている。適切な標識には、放射核種（例えば125I、131I、35S、3Hまたは32P）、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼまたはβガラクトシダーゼ）、蛍光部分または蛋白質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、GFPまたはBFP）またはルミネセント部分（例えばQuantum Dot Corporation、Palo Alto、CA製のナノ粒子Odot(商標)）が含まれるが、これらに限定されない。その他の利用できるアッセイ法には定量免疫沈降または補体固定アッセイ法が含まれる。
【００３３】
遺伝子座の増幅は当技術分野で周知の種々の方法で検出できる。例えば、遺伝子座のコピー数は試験試料と対照試料から調製したゲノムDNAのPCR増幅によって測定し比較できる。遺伝子座の増幅はまたサザンブロット分析でも同定できる。分裂中期の染色体の広がり（spread）へのDNA配列の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）は正確な染色体の位置と染色体中に存在するDNA配列の量を提供するために更に使用できる。
【００３４】
試験細胞の表面上のIBC-1受容体の存在は細胞に結合したIBC-1の量を測定して決定できる。試験細胞中のリガンド−受容体結合の測定法も当技術分野で周知である。そのような方法の多くはリガンドを受容体（例えば細胞の表面に発現した受容体）に接触する段階、リガンドと受容体の間に複合体を形成する段階、および結合したリガンドを上に記載したように検出する段階を含む。本発明のリガンドはIBC-1蛋白質自体またはIBC-1蛋白質の受容体結合部分であってよい。本明細書中に使用するように、IBC-1蛋白質の「受容体結合部分」は完全長の蛋白質よりも短い（例えばIBC-1の10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個または90個の連続アミノ酸を有する）蛋白質の断片であり、完全長の蛋白質の受容体への結合能（例えば競合性アッセイ法で測定）の少なくとも5%（例えば10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%またはそれ以上）を有する。関心のある断片は組換え、合成または蛋白質分解消化法で作ることができる。そのような断片はついで単離でき、IBC-1受容体の結合能が試験できる。
【００３５】
一般に、疾患試料中のIBC-1またはその受容体のレベルは正常の対試料のそれと少なくとも2倍（例えば少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、15倍、20倍、40倍、60倍、80倍、100倍、500倍、1000倍またはそれ以上）異なる（即ち、浸潤乳癌患者からの試料でより高く、黒質、橋または視床下部の細胞の変性を含む神経症状の患者の試料でより低い）。
【００３６】
スクリーニングアッセイ法
本発明はIBC-1のその受容体への結合を遮断する試験化合物（例えば、蛋白質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、抗体、小分子またはその他の薬物）を同定するための方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ法」とも云う）を提供する。そのように同定した化合物は例えば浸潤乳癌のようなIBC-1またはその受容体の過剰活性によって特徴づけられる状態の治療に使用できる。
【００３７】
本発明の試験化物は当技術分野で周知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のいずれかの手法を用いて得ることができる。そのようなライブラリーにはペプチドライブラリー、ペプトイド ライブラリー（ペプチドの機能を有する分子のライブラリーであるが、酵素分解に抵抗性の新しい非ペプチド骨格を有する、例えばZuckermannら（1994）J Med Cem 37;2678-85参照）、空間的にアドレス指定可能な平行（spacially addressable parallel）固相ライブラリーまたは液相ライブラリー解析または、逆重畳アフィニティークロマトグラフィー選択によって得られる合成ライブラリー、および「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリーが含まれる。最後の3つのライブラリーの中の化合物はペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子であってもよい（Lam(1997)Anticancer Drug Des 12:145）。試験化合物は分子モデリングまたは変異分析によって、IBC-1のその受容体への結合に重要であることが同定されたIBC-1の断片に対して生成した抗体でもあってよい。
【００３８】
分子ライブラリーの合成法の例は、例えば、DeWittら（1993)PNAS USA 90:6909; Erbら（1994)PNAS USA 91:11422; Zuckermannら（1994)J Med Chem 37:2678; Choら (1993) Science 261:1303、Carrelら（1994) Angew Chem Int Ed Engl 33:2059; Carellら（1994)Angew Chem Int Ed Engl  33:2061;およびGallopら（1994)J Med Chem 37:1233)のような当技術分野に見出される。
【００３９】
化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Houghten(1992)Biotechniques 13:412-421）またはビーズ(Lam(1991)Nature 354:82-84)、チップ(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、細菌(Ladner、米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladner,米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cullら（1992)PNAS USA 89:1865-1869)またはファージ(ScottおよびSmith(1990)Science 249:386-390；Devlin(1990)Science 249:404-406; Cwirlaら（1990)PNAS USA 87:6378-6382;Felici(1991)J Mol Biol 222：301-310;およびLadner前記)に提示されてもよい
【００４０】
IBC-1とその受容体の間の相互作用を遮断する化合物を同定するために、IBC-1（またはその受容体結合部分）とIBC-1の受容体を発現している細胞（または細胞膜画分または細胞ゴーストまたは脂質小胞）を2つの試薬が複合体を形成することができる条件下で且つ十分な時間に亘って調製される。IBC-1の受容体を発現している細胞にはある乳癌細胞（例えば浸潤乳癌細胞）およびある神経細胞（例えば黒質、橋または視床下部の細胞）が含まれる。そのような細胞は本明細書中に記載した技術によって、または標識されたIBC-1が細胞に結合するか否かを測定することによって容易に同定できる。IBC-1を発現している細胞はIBC-1受容体も発現していることが認められている。または、培養細胞中で受容体の組換え体を発現することによってそのような細胞を調製できる。
【００４１】
試験化合物は最初に反応混合物に含めるかまたはIBC-1およびその受容体を追加した後で一度に加えることができる。対照の反応混合物は試験化合物なしに培養される。IBC-1とその受容体の間の複合体の形成は、ついで、例えば上に記載したように、その受容体に結合したIBC-1を検出することによって検出される。試験化合物を含む反応混合物中での複合体の形成はないが、対照反応中で複合体の形成があることは、その化合物がIBC-1とその受容体の相互作用を遮断することを示す。
【００４２】
一般に、その存在によって、IBC-1のその受容体への結合が少なくとも1.5倍（例えば、少なくとも、2倍、4倍、6倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍または100,000倍）低減する試験化合物は癌治療剤として有用であることができる。2つの型のIBC-1受容体が同定された。1つは低親和性であり、1つは高親和性である（図2C）。低親和性のIBC-1受容体を発現している細胞は、低親和性の受容体へのIBC-1の結合を遮断する化合物を同定するために使用できる。高親和性のIBC-1受容体を発現している細胞は、高親和性の受容体へのIBC-1の結合を遮断する化合物を同定するために使用できる。高親和性の受容体へのIBC-1の結合を遮断する化合物は癌治療剤になる可能性がより高い。
【００４３】
癌および変性神経疾患の治療法
本発明は浸潤乳癌および転移乳癌の治療または予防法を提供する。「予防」は疾患（例えば、浸潤乳癌および転移乳癌）の症状が本質的にないことを意味する。治療される患者は、例えば患者から調製した試料中のIBC-1 mRNA、IBC-1蛋白質またはゲノムIBC-1 DNA濃度を測定することによって同定できる。患者に乳癌があり、乳癌組織試料または体液中のIBC-1 mRNAまたはIBC-1蛋白質のレベルが対照試料中より高い場合、または乳癌組織試料中でIBC-1遺伝子が増幅されている場合、患者はIBC-1の受容体へのIBC-1の結合を遮断する有効量の化合物による治療対象の候補である。
【００４４】
本発明は変性神経症状を患っているか発症の危険性にある患者の治療法も提供する。IBC-1 mRNAまたはIBC-1蛋白質のレベルが患者からの神経組織試料（例えば、黒質、橋または視床下部の組織試料）または体液中に正常よりも低い場合には、患者はIBC-1またはそのアゴニストを投与して、IBC-1またはアゴニストが神経変性を遅らせる、予防する、または回復するのに有効な量で脳内の患部組織に達するように治療される。 
【００４５】
試験試料中のIBC-1 mRNA、IBC-1蛋白質またはゲノムIBC-1 DNAは上に記載した方法、または当技術分野で周知の他の方法で測定できる。
【００４６】
治療法はインビボまたはエクスビボで、単独または他の薬物および／または放射線治療と併用して行うことができる。
【００４７】
（1）浸潤乳癌および転移乳癌の治療または予防法
1つのインビボの手法では、治療化合物（例えばIBC-1のその受容体への結合を遮断する化合物）自体が被験者に投与される。本明細書中に用いられるように、「治療化合物」はその投与によって疾患の症状の完全な消失または疾患の症状の重症度が低下する化合物を意味することができる。一般に、化合物は薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）に懸濁し、経口または静脈内（i.v.）注入、または皮下、筋肉内、くも膜下、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内または肺内に注入または移植される。浸潤乳癌および転移乳癌の治療のために、化合物は残存している腫瘍細胞を殺すために、腫瘍の外科的切除後に腫瘍細胞、例えば腫瘍または腫瘍床に直接送達されることが好ましい。乳癌の侵食および転移を予防するために、化合物は（上記の任意の経路）、例えば、検出できる侵食および転移を未だ発症していないが、原発癌にIBC-1の発現が認められた患者に投与できる。必要な用量は投与経路の選択、製剤の性質、患者の病気の性質、被験者の身長、体重、体表面積、年齢および性別、併用薬、および担当医の判断に依存する。適した用量は0.01 mg/kgから100.0 mg/kgの範囲内である。利用できる化合物の多様性および多様な投与経路の効率の違いという観点で必要な用量の大幅な変化が予想される。例えば経口投与では静脈内投与におけるよりも高い用量が予想される。これらの用量レベルの変化は当技術分野で十分理解されているように、至適化のための標準的経験的日常手法を用いて調整できる。投与は単回または反復（例えば2倍、3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍またはそれ以上）であってもよい。化合物を適した送達担体（例えば高分子の微粒子または移植可能な器具）にカプセル化することによって、特に経口送達の効率を増加できる。
【００４８】
転移乳癌の治療または予防に有用な治療化合物はIBC-1のアンタゴニスト断片、IBC-1に特異的な抗体、および／またはIBC-1受容体に特異的な抗体を含むが、これらに限定されない。これらの抗体は勿論アンタゴニスト作用に関してスクリーニングされ、アゴニスト作用が欠失していなければならない。
【００４９】
または、IBC-1 mRNA（完全長mRNA配列またはその適した部分）に相補的なアンチセンスRNAに転写される核酸配列を含むポリヌクレオチドを乳癌細胞中にデリバーできる。ポリヌクレオチドは、例えば当技術分野で周知の高分子の生分解性の微粒子またはマイクロカプセルを用いて乳癌細胞中にデリバーできる。核酸を取り込みを達成する他の方法は標準的な方法で調製されたリポソームを用いることである。ベクターをこれらの送達担体に単独で組み込むこと、又は組織特異的もしくは腫瘍特異的抗体と共に組み込むことができる。またはポリ-L-リジンに静電力または共有結合力で結合したプラスミドまたは他のベクターから構成される分子結合体を調製できる。ポリ-L-リジンは標的細胞上の受容体に結合できるリガンドに結合する(Cristianoら(1995)  J Mol Med 73:479)。組織特異的標的化は、当技術分野で周知の組織特異的転写制御領域（TRE）を用いて達成できる。「裸の DNA」（即ち、送達担体のない）を筋肉内、皮内又は皮下部位に送達することはインビボ発現を達成するための別法である。
【００５０】
ポリヌクレオチドはIBC-1 DNAのセンス鎖に相補的な1つまたは複数の配列およびmRNAの開裂の原因であることが知られている触媒配列を含むことができる(例えば、米国特許第5,093,246号およびHaselhoffおよびGerlach(1998)Nature334：585-591参照）。例えば活性部位のヌクレオチド配列がIBC-1 mRNA中で開裂されるヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナL-19IVS RNAの誘導体を構築できる。例えば米国特許第4,987,071号および米国特許第5,116,742号を参照のこと。または、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的RNAを選択するためにIBC-1 mRNAを用いることができる。例えばBartelおよびSzostak(1993)Science261:1411-1481参照のこと。
【００５１】
関連したポリヌクレオチド（例えば発現ベクター）において、アンチセンスRNAをコードしている核酸配列をプロモーターまたはエンハンサープロモーターの組み合わせと機能的に連結している。エンハンサーは時間、位置およびレベルに関する発現の特異性を与える。プロモーターと異なり、エンハンサーはプロモーターが存在すれば、転写開始部位から様々な距離に位置している場合に機能できる。エンハンサーはまた転写開始部位の下流に位置することができる。
【００５２】
適した発現ベクターはヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス、その他のようなプラスミドおよびウイルスベクターを含む。
【００５３】
IBC-1 DNAに相同性のある二本鎖干渉性RNA（RNAi）もまたIBC-1の産生を減らすのに使用できる。例えばFireら（1998)Nature 391:806-811、RomanoおよびMasino(1992)Mol.Microbiol.6:3343-3353、Cogoniら、EMBO J. 15:3153-3163、CogoniおよびMasino(1999)Nature 399:166-169、MisquittaおよびPaterson(1999)Proc.Acad.Sci.USA 96:1451-1456、並びにKennerdellおよびCarthew(1998) Cell 95:1017-1026を参照のこと。
【００５４】
センスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖は当技術分野で周知の手順を用いて化学合成および酵素ライゲーション反応によって個々に構築できる。例えば各々の鎖は、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドのような、分子の生物学的安定性またはセンス鎖とアンチセンス鎖の間に形成される二重鎖の安定性を増加するために天然に生じたヌクレオチドまたは多様の修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成される。センス鎖またはアンチセンス鎖は、標的IBC-1配列（完全長または断片）がセンスまたはアンチセンスの方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に製造できる。センスRNA鎖またはアンチセンスRNA鎖はdsRNAを乳癌細胞に送達する前にインビトロでアニールできる。または、センス鎖とアンチセンス鎖が連続して癌細胞に送達された後にインビボでアニーリングが起きることができる。
【００５５】
二本鎖RNAの干渉はまた、それからセンスRNAまたはアンチセンスRNAが別のプロモーターの指示の下に転写され得るポリヌクレオチドまたはそれからセンス配列とアンチセンス配列の両方を含む単一のRNA分子が単一のプロモーターの指示の下に転写され得るポリヌクレオチドを乳癌細胞中に導入することによって、達成できる。
【００５６】
ポリヌクレオチドは薬学的に許容される担体中で投与できる。薬学的に許容される担体は、例えば生理食塩水またはリポソームのようなヒトへの投与に適した生物学的に調和した担体である。治療的に有効な量は治療された患者において医学的に望ましい結果（例えばIBC-1の発現の低下）を生じ得るポリヌクレオチドの量である。医学分野で周知のように、任意の1人の患者の用量は患者の背丈、体表面積、年令、投与される特別な化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康および投与されている併用薬を含む多くの因子に依存する。用量は変化するが、ポリヌクレオチドの好ましい投与量はポリヌクレオチド分子の約106コピーから1012コピーである。この用量は、必要に応じて繰り返し投与できる。投与経路は上に示した経路のいずれであってもよい。
【００５７】
（2）変性神経症状の治療法
A．インビボ手法
変性神経症状があるか発症する可能性が高い患者にIBC-1またはIBC-1アゴニストを投与できる。一般に、IBC-1またはIBC-1アゴニスト（例えばアゴニスト的IBC-1受容体抗体）は薬学的に許容できる担体（例えば生理食塩水）に懸濁し、経口、または吸入または静脈内（i．v．）注入、または皮下、筋肉内、くも膜下、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内または肺内に注射または移植される。変性神経症状の治療には、IBC-1および脳血管関門を通過するために十分小さいIBC-1アゴニストは、脳内の薬物の注入または薬物放出バリアーデバイスまたは細胞の移植は選べるが、神経細胞に直接送達する必要はない。必要な用量は投与経路の選択、製剤の性質、患者の疾患の性質、患者の背丈、体重、表面積、年令および性別、投与されている他の薬物および医師の判断に依存する。適した用量は0.01mg/kgから100mg/kgの範囲である。利用できる化合物および様々な投与経路の異なる効率から、必要な用量の範囲は広いことが予想される。例えば経口投与は静脈内注入による投与よりもより高い用量が必要であると予想される。これらの用量のレベルの変化は当技術分野でよく理解されているように、最適化のための標準的日常手法を用いて調整できる。投与は単回または反復（例えば2倍、3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍、またはそれ以上）であってよい。適した送達担体（例えば高分子微粒子または移植可能なデバイス）中への化合物のカプセル化は、特に経口送達の送達効率を増加する可能性がある。
【００５８】
変性神経症状の患者のエクスビボでの治療方針には、被験者から得られた細胞をIBC-1、pro-IBC-1またはIBC-1アゴニストをコードしているポリヌクレオチドでトランスフェクトまたは形質導入することを含むことができる。または、細胞はインビボで、細胞のゲノム中で自然に発生した内因性IBC-1遺伝子の転写出発部位の上流の新しい作用性プロモーターである、相同組換えによって挿入するために設計されたベクターを用いてトランスフェクトすることができる。他の点では、主としてサイレント遺伝子を「スイッチオン」するそのような方法は当技術分野で周知である。IBC-1を所望のレベルで発現している細胞を選択し拡大後、トランスフェクトまたは形質導入された細胞が再び被験者に戻される。細胞は造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、T細胞またはB細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイトまたは筋肉細胞を含む広範な型のいずれでもよいが、これらに限定されない。そのような細胞は被験者中で生存する限りの間分泌されるIBC-1またはIBC-1アゴニストの源として作用する。
【００５９】
エクスビボ法は被験者から細胞を採取する段階、細胞を培養する段階、発現ベクターで細胞を形質導入する段階および細胞をIBC-1またはIBC-1アゴニストの発現に適した条件下に維持する段階を含む。これらの方法は分子生物学の技術分野で知られている。形質導入段階は、燐酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染およびパーティクルガンによる遺伝子移入を含むエクスビボ遺伝子治療に用いられる標準的な任意の手段で達成される。または、リポソームまたは高分子の微粒子を用いることができる。形質導入が成功した細胞はついで、例えばIBC-1またはIBC-1アゴニストの発現に関して選択できる。細胞はついで患者に注入または移植してもよい。
【００６０】
次の実施例は本発明の説明のためのもので、制限することを意味するものではない。
【００６１】
実施例
材料と方法
（1）細胞系と組織検体
乳癌の細胞系はAmerican Type  Culture Collection(Manassas、Virginia)から入手したか、またはSteve Ethier博士(University of Michigan)、Gail Tomlinson博士(University of Texas)およびArthur Pardee博士(Dana-Farber Cancer Institute)の好意により提供された。細胞は提供者によって推奨された培地で増殖させた。原発乳癌試料はBrigham and Women's Hospital、Massachusetts General Hospital、University Hospital Zagreb(Zagreb、Croatia)またはDuke University Medical Centerから入手した。患者から除去した直後、試料はドライアイス上で瞬間冷凍され、-80°Cで保存された。脳試料はBrigham and Women's HospitalまたはDuke University Medical Centerで行われた剖検から集められた。すべてのヒト検体はInstitutional Review Boardが承認したプロトコールを用いて収集し、すべての患者を特定するものは研究所に輸送される前に取り除いた。
【００６２】
(2) RNAの調製、mRNAのインサイチューハイブリダイゼーションおよびノザンブロット分析
RNAの単離、PT-PCRおよびノザンブロット分析は（Polyakら（1997)Nature 389:300-305）に記載されたように実施した。ヒトの多数の組織のノザンブロットはClontech(Palo Alto、California)から購入した。パラフィン切片とジギトニン標識リボプローブを用いたmRNAのインサイチューハイブリダイゼーションはSt. Croixら（2000)Science 289:1197-1202が開発したプロトコールに従って実施した。冷凍切片はQiufu Ma博士(Dana-Farber Cancer Institute)から入手し、僅かに改変したプロトコール(Qianら（2001)Genes Dev15:2533-2545)に従ってハイブリダイゼーションを行った。
【００６３】
(3) 哺乳動物細胞および細菌中のIBC-1の発現
哺乳動物細胞中で大量に組換えIBC-1蛋白質を生成するために、シグナル配列のないヒトIBC-1をコードしているcDNAをPCRによって作製した。PCR断片をpSGHVOベクターにクローニングした。この結果、ヒスチジン親和性タグとタバコエッチ（etch）ウイルスプロテアーゼ部位（Leahyら（2000)Protein Expr Purif 20:500-506）を含むリンカーによってIBC-1に結合したアミノ酸末端融合パートナーとしてヒト成長ホルモン(hGH)をコードしているベクターが得られた。リガンド結合アッセイ法のために、AP-TAG-5発現ベクター(GenHunte RNAshville、Tennessee）を用いてアルカリホスファターゼ(AP)-IBC-1融合蛋白質を作製した。哺乳動物細胞をフュージーン（Fugene）6（商標）(Roche、Indianapolis、Indiana)またはリポフェクタミン（Lipofectamine）（商標） (Life Technologies、Rockville、Maryland)試薬でトランスフェクトした。
【００６４】
細菌の発現について、IBC-1 cDNAがPCR増幅され、N末端のヘキサヒスチジンのタグを有し、インフレームでpQE-30にクローニングされた。構築物はMJ15[pREP4]細菌（Qiagen、Valencia、California）に形質転換され、組換えIBC-1蛋白質は変性性緩衝剤およびNi-NTAビーズ(Qiagen、Valencia、California）を用いて精製した。
【００６５】
(4) 抗体、免疫ブロット分析およびインビトロ翻訳
Pro-IBC-1のアミノ酸53-64位(Zymed、San Francisco、California)に対応した合成ペプチド
2005511552.tif 000005
に対するポリクロナール抗IBC-1抗体を作製した。アルカリホスファターゼおよび悪液質性因子―1に対する抗体はそれぞれGenHunter(Nashville、Tennessee)およびAlpha Diagnostic(San Antonia、Texas)から購入した。免疫ブロット分析は記載したように実施した（Kropら（2001)PNAS USA 98:9796-9801）。インビトロ転写/翻訳共役反応はC末端ヘキサヒスチジンタグを含むIBC-1断片をコードしているPCRで作製した核酸、T7TNTキット(Promega、Madison、Wisconsin）および35S標識プロミックス（Promix)（商標）アミノ酸混合物(Amersham、Piscataway、New Jersey)を用いて行った。蛋白質はNi-NTAビーズ(Qiagen、Valencia、California)を用いて精製し、16 % トリス-トリシン（Tris-tricine）ゲル(Invitrogen、Carlsbad、California)に溶解した。
【００６６】
(5) リガンド結合アッセイ法
AP-IBC-1を用いた一次組織および細胞系のインビボおよびインビトロのリガンド結合アッセイ法は本質的に記載されたように実施した(FlanaganおよびLeder(1990)Cell 63:185-194)。簡単に言えば、種々のヒト組織検体の冷凍切片を固定し、AP-IBC-1融合蛋白質またはAP対照の条件培地のいずれかと培養し、すすぎ、ついで青／紫の沈殿を形成するAP基質とインキュベートした。インビトロアッセイ法のために、細胞をAP単独またはAP-IBC-1融合蛋白質のいずれかを含む条件培地との懸濁物中でインキュベートし、すすぎ、ついで結合APの活性をアッセイした。リガンド競合実験のために、G361細胞を精製した組換えHis-HID-5/ソリアシン（psoriasin）(1.93μM)またはHis-IBC-1(0.567μM）とインキュベートし、ついでAPまたはAP-IBC-1を加えた。
【００６７】
実施例1
ヒト蛋白質分解および悪液質誘導因子をコードしているIBC-1遺伝子の同定
正常哺乳類上皮細胞とインサイチュー浸潤乳癌および転移乳癌由来のSAGEライブラリーの解析により浸潤乳癌および転移乳癌から生じたライブラリーだけに存在するSAGEタグが同定された。(Porterら（2001)Cancer Res  61:5697-5702)。このタグは種々のヒト正常および癌組織型から生じた96の他のSAGEライブラリーに存在しなかった（Lalら（1999)Cancer Res 59:5403-5407）。このSAGEタグに対応する遺伝子はIBC-1と命名された。
【００６８】
IBC-1SAGEタグおよび隣接したNIaIII部位
2005511552.tif 000006
を含む15bp配列を有するヒトゲノム配列を検索して、本発明者等はこのタグを含むゲノムのクローンを同定した。GenScanプログラムを用いて、このゲノム領域が最後のNIaIII部位後の最後のエクソン中のIBC-1SAGEタグを有する4つのエクソンの遺伝子をコードすることが予想された(BurgeおよびKarlin(1997)J Mol Biol 268:78-94)。予想されたコード配列に基づいて、cDNAの殆どの5’端および3’端のプライマーが設計され、SAGEに使用する乳癌由来のRNAのmRT-PCR分析を実施した。この手法を用いて400bpの断片が得られ、これによりこの領域が転写された遺伝子をコードしていることが確認された。この400bpの断片の配列がゲノムのクローンの配列と対応していることを確認するために、断片の配列決定をした。配列はGenScanプログラムによって同定されなかった小さな、付加的な転写されたエクソンがあることを示した。従って、完全なIBC-1遺伝子は5つのエクソンを含み、N末端シグナルペプチドを含む110アミノ酸の蛋白質をコードしている（図1Aおよび1B）。
【００６９】
IBC-1 cDNA配列は次の通りである。
2005511552.tif 000007
【００７０】
IBC-1 cDNA(配列番号：1)は長さが405塩基である。核酸配列は下線を引いた上に示した開始コドン(ATG)と停止コドン(TAG)を含む。開始コドンと停止コドンの間の領域（両コドンを含む）は停止コドンを含む333のヌクレオチドのメチオニン開始コード配列である。このコード配列は所与の配列番号：2である。このコード配列は110のアミノ酸蛋白質(配列番号：3)をコードする。
2005511552.tif 000008
【００７１】
IBC-1 cDNA(配列番号：1)のコード領域はヒト悪液質関連蛋白質をコードしている以前に同定された核酸配列の中に含まれていることが見いだされた(HCAP；Akerblomら、米国特許第5,834,192号)。しかしこの2つの配列は3’−非翻訳領域の1つのヌクレオチドによって相違している。配列番号：1（上に太文字で示した）の388番目の位置の塩基はシトシンであるが、hcap cDNAは対応した位置にチミンを有する。更に、予想されるIBC-1蛋白質は大脳皮質(図1C)由来のラクリチン蛋白質および翻訳されたESTとの相同性は非常に限られている。ラクリチンは最近ヒト涙液腺から同定された分泌亢進因子および成長促進因子である(Sanghiら（2001)J Mol Bio 310:127-139)。大脳皮質に発現しているESTはシアリダーゼおよびニューロフィラミン（neurofilamine）Hを含む複数の分泌蛋白質に見出される繰り返し配列ETPAを含む特徴付けされていない蛋白質をコードしている。
【００７２】
更に、予想されたIBC-1アミノ酸配列を用いてUnigeneデータベースおよびGenbankデータベースの低ストリンジェンシー検索でIBC-1の1部がマウスPIF（蛋白質分解誘導因子）または悪液質性因子(CF)由来の20アミノ酸ペプチドとほぼ対応しており、重複部分は30アミノ酸の推定される神経生存促進ペプチド(Cariukら（1997)Br J Cancer 76:606-613.およびCunninghamら（1998)J Neurosci 18:7047-7060))と正確に対応している。これらのポリペプチドは生物学的活性および生化学的活性を有するとして特徴付けされているが、これらをコードしている遺伝子は同定されていない。神経生存促進ペプチドはマウスHN33.1の海馬神経細胞の中間からおよび過酸化水素で処理されたヒトY79網膜芽から同定され、その後、酸化傷害後に神経生存を増強することが示された。悪液質および蛋白質分解の誘導因子はマウスで悪液質誘導MAC16 ネズミ結腸腺癌によって産生される24-kDaの糖蛋白質として同定され、後に悪液質癌患者の尿中に存在することが示された（McDevittおよびTisdale(1992)  Br J Cancer 66：815―820；Todorovら（1996） Cancer Res 56:1256-1261;およびTodorovら（1996）Nature 379: 739-742 ）。その後の試験で24-kDaの悪液質因子はインビボのマウスおよびC2C12マウス筋芽細胞で筋肉蛋白質の分解を誘導することが示された（Todorovら（1996） Cancer Res 56:1256-1261;およびSmithら（1999) Cancer Res 59:5507-5513）。
【００７３】
IBC-1 cDNAは11kDa蛋白質をコードすると予想され、これはインビトロ翻訳反応によって確かめられた。ネズミの24-kDa蛋白質分解誘導/ 悪液質性因子
2005511552.tif 000009
から得られたトリプシンのペプチドのアミノ酸配列は殆ど正確に予想されたIBC-1配列の20-39位のアミノ酸に対応するが、UnigeneデータベースおよびGenbankデータベースの他の特徴付けされ又は予測された蛋白質のいずれにも対応しない。しかし、IBC-1のアミノ酸配列は予想されたN-グリコシル化部位を含まないが、一方蛋白質分解および悪液質性誘導蛋白質は非常にグリコシル化されていると報告された。
【００７４】
IBC-1および蛋白質分解誘導/悪液質性因子が抗原的に関係があるか否かを決定するために、細菌および哺乳類の細胞から精製された種々のIBC-1融合蛋白質の免疫ブロット分析をあつらえた抗IBC-1ペプチド抗体および市販の抗悪液質性因子のペプチド抗体を用いて実施した。これらの分析によって、IBC-1および蛋白質分解誘導/悪液質因子は同一であるか、または、少なくとも抗原に関係している可能性が高いが、報告された天然（〜24kDA）と組換え(〜11-13kDa）蛋白質サイズの差は不明である。1つの可能性としては、本試験に用いられた抗IBC-1抗体および市販の抗CFペプチド抗体は蛋白質分解誘導/悪液質蛋白質のグリコシル化または二量形成型を認識しないことである。更に、本発明者等は殆どの細胞型で検出できるレベルでIBC-1蛋白質を発現することができていない。従って、それは細胞型特異的に翻訳されるか、又は非常に不安定である可能性がある。
【００７５】
実施例2  正常組織および癌組織におけるIBC-1の発現パターン
IBC-1 cDNAプローブを用いた多数の乳癌のノザンブロット分析で1bpから400bpのハイブリダイズしているmRNAが同定され、これは上に記載した400bpのcDNA断片が完全長の転写物に対応することを示している。正常乳房小器官（哺乳類の管から直前に単離した）、原発乳癌および乳癌細胞系のノザンブロット分析、RT-PCR分析およびmRNAインサイチューハイブリダイゼーション分析はIBC-1が正常哺乳類上皮および大多数の乳癌細胞系でも腫瘍中でも発現していないことを示した。興味深いことに、高いIBC-1発現レベルを示したすべての乳癌（全55個中6個）は分化不良（段階III）およびerbB2を強く発現している腫瘍であり、6つのIBC-1陽性腫瘍の中のうち5つが多数の転移リンパ節を有した。しかし、試料サイズが比較的小さいため、これらの腫瘍特性の内、erbB2の過剰発現だけがIBC-1の発現とほぼ有意な（Fisher正確検定  p=0.06）関連性を示した。これらのデータはIBC-1の発現は乳癌において、共通の事象ではなく、特に攻撃的な腫瘍の表現型を定義していることを示す。
【００７６】
多数の正常および癌のヒト組織由来ならびに細胞系由来の100種のSAGEライブラリーの解析はIBC-1が乳癌の亜群においてだけ発現していることを示唆した。IBC-1の発現を更に調べるために、IBC-1 cDNAが76種の正常成人型および胎児組織型からのmRNAを含む組織発現アレイパネルに対してハイブリダイズされた。IBC-1は脳の2つの領域、即ち、橋とより低い濃度で大脳皮質の中央回にだけ発現が認められた。この制限された発現のパターンはIBC-1が乳癌の診断または予後マーカーとして有用であることを示唆している。更に、これらの観察はIBC-1を発現している腫瘍は神経細胞の表現型を獲得している可能性があることを意味している。後者の仮説を検証するために、乳癌試料中の複数の神経マーカー（即ち、クロモグラニンA、シナプトゲニン、神経細胞エノラーゼ）をノザンブロット分析またはSAGE分析で解析したが、これらの遺伝子の発現とIBC-1の発現の間に相関は認められなかった。
【００７７】
IBC-1が同定されたSAGEライブラリーは間質線維芽細胞、リンパ球、内皮細胞および他の細胞型を含む精製されていない浸潤乳癌および転移乳癌から作製された。細胞レベルでのIBC-1の発現を特徴づけるために、ノザンブロット分析に基づいてIBC-1を発現していることが知られている2個の腫瘍と、発現のプロファイリング分析とクラスター形成分析に基づいてそれらと類似している10個の追加の腫瘍の切片について、mRNAインサイチューハイブリダイゼーションを行った。後者の10個の腫瘍の4個は幾つかのIBC-1陽性腫瘍細胞を含み、これはIBC-1の発現は乳癌の生物学的に関係のある亜群を定義していることをさらに示唆した。アンチセンスのスライドにおける強い赤色または黒色（用いたmRNAインサイチューハイブリダイゼーション法に依存した）の染色は、IBC-1が線維芽細胞、内皮細胞、リンパ様細胞中に発現せず、腫瘍細胞中で発現していることを示している。隣接した正常な哺乳類の上皮細胞にはシグナルは認められなかった。興味深いことに、幾つかの試料中で、すべての腫瘍は強いIBC-1陽性で、一方、他の腫瘍では腫瘍細胞の亜群だけがIBC-1の高い発現を示したが、これはIBC-1が腫瘍内クローンの不均一性を同定するのに有用であることを示した。
【００７８】
蛋白質レベルでのIBC-1の発現を解析するために、合成IBC-1ペプチドを免疫原に用いてウサギポリクロナール抗IBC-1抗体を作製し、アフィニティー精製した。IBC-1の発現が乳癌の組織病理的または臨床的な特徴と相関するか否かを決定するために、8つの異なるコホートから集めた722個の乳癌の免疫組織化学的解析をポリクロナール抗IBC-1抗体を用いて行った。その結果、これらの腫瘍の6-11%（患者のコホートに依存して）だけがIBC-1陽性であった。免疫組織学化学的データの統計解析はIBC-1の発現は、上皮内腫瘍（in situ tumor）と遠位転移の数が比較的低く、非浸潤性乳癌(DCIS)の1つだけがIBC-1陽性と認められたが、(a)上皮内腫瘍および原発侵食腫瘍と(b)遠位転移の間でIBC-1の発現に顕著な差がないことを示した。同様に(a)IBC-1の発現と(b)エストロゲンおよびプロゲステロン受容体の状態、腫瘍の大きさ、陽性のリンパ節数および患者の年令の間に関係は認められなかった。しかし、IBC-1の発現はある腫瘍の亜群中でerbB2の発現と正に相関した。重要なことは、ロジスティック回帰モデルに基づいて、IBC-1陽性原発腫瘍は第1期(LR検定、p値=0．007)よりも第2期および第3期の可能性が高かった。これは腫瘍の進行におけるIBC-1の役割を示唆している。最後にIBC-1陽性腫瘍の患者はIBC-1陰性腫瘍の患者よりも短い無疾患生存（遠位転移までの時間として計算された）および全般的生存がいくらか短い可能性が多少高かった。臨床データのあるIBC-1陽性腫瘍の数が比較的低いために、この関係に統計的有意性はなかった（全般的生存に対するp値=0.8および無疾患生存に対するp値=0.43）が、これはIBC-1の発現が予後不良の独立した指標になりうることを示唆している。
【００７９】
実施例3  推定される細胞表面IBC-1結合蛋白質の同定
悪液質因子および神経生存ペプチドの両方が分泌蛋白質として同定された。これと一致して、IBC-1 cDNAは予想された19アミノ酸の分泌シグナルペプチドを有する110アミノ酸の蛋白質をコードしている。これらのデータはIBC-1は細胞表面受容体への結合によってその機能を行う可能性が高いことを示している。IBC-1結合細胞表面蛋白質があるか否かを決定するために、受容体結合アッセイ法においてリガンドとして用いられるアルカリホスファターゼIBC-1（AP-IBC-1）融合蛋白質を生成した（FlanaganおよびLeder(1990)Cell 63：185-194；図2A）。AP-IBC-1の条件培地または対照のAPを発現している細胞が正常および癌の哺乳類組織切片を染色するために、より抗体に似た、アフィニティー試薬として用いられた。強い紫色の染色は高い内因性IBC-1発現のある浸潤乳癌中のIBC-1結合蛋白質の存在を示すが、正常な哺乳類上皮および間質細胞中では示さない。興味深いことに、IBC-1を発現している腫瘍は内因性のIBC-1の発現が低いかまたは検出されない腫瘍よりもより強い染色を示した。これらの結果は、細胞表面IBC-1結合蛋白質がインビボで癌の上皮細胞中に存在し、正常な哺乳類の上皮細胞に存在しないこと、およびIBC-1作用のオートクリン機構を示した。
【００８０】
IBC-1が橋、視床下部および中脳の神経細胞で発現しているので、また悪液質におけるIBC-1の役割のために、これらの組織のIBC-1への結合能を試験した。驚くべきことに、殆どすべての神経細胞へのIBC-1の結合は低いことが見られた。最も強力なアルカリホスファターゼ染色（即ち、最も強力なIBC-1結合）が青斑核、核橋縫線（nucleus raphe pontis）、黒質および側方視床下部領域または側方視床下部帯として知られる側方視床下部核の神経細胞で検出された。
【００８１】
AP-IBC-1の結合特性を更に試験するために、インビトロのリガンド結合アッセイ法を種々の細胞系で行った（図2B）。低レベルのAP-IBC-1結合が試験したすべての細胞系で検出され、より強い結合がヒト21NT乳癌、G361メラノーマ、マウスC2C12筋芽細胞およびCATH.a カテコールアミン作動性神経細胞に観察された。IBC-1結合活性は細胞をトリプシンで前処理することによって、完全に消失したが、これはIBC-1結合活性が細胞表面蛋白質の存在による可能性が高いことを示した。HID-5／ソリアシンの添加では起きないが、精製した組換えIBC-1の添加はAP-IBC-1のG361細胞への結合を顕著に減少したが、これは結合がIBC-1特異的であることを示している。21NT細胞およびG361細胞はIBC-1を発現している。IBC-1はC2C12において蛋白質分解を誘導することが示された(Smithら（1999)Cancer Res 59:5507-5513;およびTodorovら (1999)Br J Cancer 80:1734-1737)。CATH.a 細胞が、ラットのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子プロモーターの制御下でSV40T抗原を発現しているトランスジェニックマウスの脳腫瘍から得られた(Suriら（1993)J Neurosci 13:1280-1291)。CATH.a 細胞はカテコールアミン作動性神経細胞の 表現型を有し、ドーパミンおよび過酸化水素によって誘導されるアポトーシスに感受性が高い(Masseranoら（1996)Mol Pharmacol 50:1309-1315)。結合AP-IBC-1の量は細胞の大きさによって影響される可能性があるが、これらの細胞の大きさの差がAP-IBC-1結合の観測された差違を完全に説明するとは思えない。従ってIBC-1に応答する細胞は増加した数のIBC-1結合蛋白質またはより高親和性のIBC-1結合蛋白質を発現している可能性が高い。
【００８２】
AP-IBC-1の推定されるIBC-1受容体相互作用を更に特徴付けするために、G361メラノーマ細胞でより詳細な結合アッセイ法を行った（図2C）。スキャッチャードプロット解析は2つの結合の傾斜を示す。1つは中等度の高い親和性（Kd=37.5 nM、1.7x104結合部位／細胞）であり、他の1つはより低い親和性（Kd=360 nM、3.5x105結合部位／細胞）である。
【００８３】
実施例4  乳癌におけるIBC-1遺伝子の増幅
IBC-1遺伝子は、以前に種々の悪性疾患において関連のある領域である染色体 12q13に局在している。本発明者等のSAGEデータに基づいて、IBC-1を高く発現している同じ腫瘍試料中にIBC-1に最も近い2つの遺伝子（LACRTおよびPPPIRIA）も同様に高く、特異的に発現していた。このことから、本発明者等はこれらの乳癌におけるIBC-1の過剰発現は遺伝子の増幅による可能性があると仮定した。この仮説を検定するために、IBC-1遺伝子を含む細菌の人工染色体(BAC)を単離し、正常な乳房組織およびIBC-1を過剰発現した（SAGEまたはノザンブロット／mRNAインサイチューハイブリダイゼーションによって測定された）4つの乳癌のFISH（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）分析に用いた。この分析はIBC-1を過剰発現している腫瘍中でIBC-1ゲノム遺伝子座の中レベルから高レベルの増加を示した。CDK4、SAS、GL1およびMDM2を含む複数の周知の癌遺伝子もまた染色体 12q13-15に局在しているので、これらの遺伝子に対応したBACを用いてFISH分析を行い、それらがIBC-1と共に増幅されているか否かを決定した。MDM2およびGLIIはこれらの腫瘍で増幅されていなかったが、この細胞の亜群ではCDK4およびIBC-1は両方とも増幅されていた。しかし、IBC-1を過剰発現している腫瘍中において、CDK4の過剰発現の証拠はなかった。これらのデータは浸潤乳癌の亜群がIBC-1を過剰発現し、IBC-1を増幅していることを示している。
【００８４】
その他の実施例
本発明の多数の実施例が記載されている。それにもかかわらず、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の改変ができることが理解されると思われる。従って他の態様は添付の特許請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】IBC-1遺伝子のゲノム構造の略図である。IBC-1の同定に導いたエクソンーイントロン境界、開始コドンおよび停止コドンおよびSAGEタグと隣接するNlaIII部位(配列番号：8)を示してある。図1Bは、pro-IBC-1およびpro-IBC-1の予想されるアミノ酸配列(配列番号：3)をコードするcDNA(配列番号：1)の核酸配列の代表例である。悪液質性因子および神経生存ペプチド由来のペプチドの配列はそれぞれ太いおよび薄い下線で示す。予想される分泌シグナルペプチダーゼ開裂部位を矢印で示す。図1Cは、IBC-1（即ち、pro-IBC-1；配列番号：3）蛋白質、ラクリチン(配列番号：10)蛋白質およびEST-AL12471(配列番号：11)蛋白質のアミノ酸のアライメントである。共通配列と同一のアミノ酸は影をつけてある。比較はDNAStarとクラスタルアルゴリスムを用いて行った。
【図２】対照アルカリホスファターゼ（AP）蛋白質、アルカリホスファターゼ−IBC-1融合（AP-IBC-1）蛋白質および推定膜蛋白質へのAP-IBC-1リガンドの結合の概略図の例を示す。図2Bは、AP-IBC-1蛋白質の形の各種ヒト細胞系に結合したAP活性の相対的なレベルを示す棒グラフである。細胞系はx軸に示し、y軸はOD／時間／mlで表した結合したアルカリホスファターゼ活性を示す。x軸上の「G361＋HID-5」および「G361＋IBC-1」はAP-IBC-1(25nM)の結合に先立って、G361細胞がそれぞれ精製した組換えHID-5／ソリアシン（1.93mM）およびIBC-1（0.567mM）とあらかじめ培養されたことを示す。HID-5／ソリアシンの存在下で起きないが、IBC-1の存在下でのAP-IBC-1結合の低下は、結合がIBC-1に特異的であることを示す。図2Cは、AP-IBC-1の種々の濃度におけるAP-IBC-1のG361細胞への結合を示す線グラフである。
【配列表】
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2005511552.tif 000012
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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