(57)【要約】本発明はキジ目の鳥類における毒性マイコプラズマ・ガリセプチクム感染を防止する防御用配合物を提供する。配合物は生ＭＧ株Ｋ５０５４の防御量または医薬的に受容可能なキャリアにおけるその誘導体を含む。また、キジ目の鳥類における毒性マイコプラズマ・ガリセプチクム感染を防止するワクチンも記載される。さらに、配合物およびワクチンの投与方法も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キジ目の鳥類に対する防御用配合物であって、マイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株の防御量と、医薬的に受容可能なキャリアとを含み、前記マイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株が、
図１、図２および図３に示されるようにＡＴＣＣに寄託されたＫ５０５４（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）のバンドパターンの少なくとも１つに実質的に対応するＲＡＰＤパターンを有し、
図１におけるＫ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして配列番号４を使用して得られ、
図２におけるＫ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして、配列番号５、配列番号６および配列番号７を使用して得られ、
図３におけるＫ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして配列番号８を使用して得られる、
防御用配合物。
【請求項２】
防御量が、鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項１記載の配合物。
【請求項３】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項１記載の配合物。
【請求項４】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項１記載の配合物。
【請求項５】
マイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株が、図１、図２および図３に示されるように、Ｋ５０５４のバンドパターンの少なくとも２つに実質的に対応するＲＡＰＤパターンを有する請求項１記載の配合物。
【請求項６】
防御量が、鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項５記載の配合物。
【請求項７】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項５記載の配合物。
【請求項８】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項５記載の配合物。
【請求項９】
マイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株が、図１、図２および図３に示されるように、Ｋ５０５４の全ての三つのバンドパターンに実質的に対応するＲＡＰＤパターンを有する請求項１記載の防御配合物。
【請求項１０】
防御量が、鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項９記載の配合物。
【請求項１１】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項９記載の配合物。
【請求項１２】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項９記載の配合物。
【請求項１３】
キジ目の鳥類に対する防御用配合物であって、配列番号１と少なくとも９８％の相同性を示すヌクレオチド配列を有するＰｖＰ表面アドヘシン遺伝子を有するマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株の防御量と医薬的に受容可能なキャリアとを含む防御用配合物。
【請求項１４】
防御量が、鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項１３記載の配合物。
【請求項１５】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項１３記載の配合物。
【請求項１６】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項１３記載の配合物。
【請求項１７】
キジ目の鳥類に対する防御用配合物であって、配列番号２と少なくとも９８％の相同性を示すヌクレオチド配列を有する表面リポタンパク質遺伝子を有するマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株の防御量と医薬的に受容可能なキャリアとを含む防御用配合物。
【請求項１８】
防御量が、鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項１７記載の配合物。
【請求項１９】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項１７記載の配合物。
【請求項２０】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項１７記載の配合物。
【請求項２１】
キジ目の鳥類に対する防御用配合物であって、ＡＴＣＣに寄託されたＫ５０５４のマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）と類似する同定特徴を有するマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株の防御量と医薬的に受容可能なキャリアとを含む防御用配合物。
【請求項２２】
防御量が、鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項２１記載の配合物。
【請求項２３】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項２１記載の配合物。
【請求項２４】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項２１記載の配合物。
【請求項２５】
キジ目の鳥類に対するワクチンであって、マイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株の防御量と、医薬的に受容可能なキャリアとを含み、前記マイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株が、
図１、図２および図３に示されるようにＡＴＣＣに寄託されたＫ５０５４（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）のバンドパターンの少なくとも１つに実質的に対応するＲＡＰＤパターンを有し、
図１におけるＫ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして配列番号４を使用して得られ、
図２におけるＫ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして、配列番号５、配列番号６および配列番号７を使用して得られ、
図３におけるＫ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして配列番号８を使用して得られる、
ワクチン。
【請求項２６】
防御量が、各鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項２５記載のワクチン。
【請求項２７】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項２５記載のワクチン。
【請求項２８】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項２５記載のワクチン。
【請求項２９】
マイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株が、図１、図２および図３に示されるように、Ｋ５０５４のバンドパターンの少なくとも２つに実質的に対応するＲＡＰＤパターンを有する請求項２５記載のワクチン。
【請求項３０】
防御量が、各鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項２９記載のワクチン。
【請求項３１】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項２９記載のワクチン。
【請求項３２】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項２９記載のワクチン。
【請求項３３】
マイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株が、図１、図２および図３に示されるように、Ｋ５０５４の全ての三つのバンドパターンに実質的に対応するＲＡＰＤパターンを有する請求項３１記載のワクチン。
【請求項３４】
防御量が、各鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項２５記載のワクチン。
【請求項３５】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項３３記載のワクチン。
【請求項３６】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項３３記載のワクチン。
【請求項３７】
キジ目の鳥類に対するワクチンであって、配列番号１と少なくとも９８％の相同性を示すヌクレオチド配列を有するＰｖＰ表面アドヘシン遺伝子を有するマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株の防御量と医薬的に受容可能なキャリアとを含むワクチン。
【請求項３８】
防御量が、各鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項３７記載のワクチン。
【請求項３９】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項３７記載のワクチン。
【請求項４０】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項３７記載のワクチン。
【請求項４１】
キジ目の鳥類に対する防御用配合物であって、配列番号２と少なくとも９８％の相同性を示すヌクレオチド配列を有する表面リポタンパク質遺伝子を有するマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株の防御量と医薬的に受容可能なキャリアとを含むワクチン。
【請求項４２】
防御量が、各鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項４１記載のワクチン。
【請求項４３】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項４１記載のワクチン。
【請求項４４】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項５１記載のワクチン。
【請求項４５】
キジ目の鳥類に対する防御用ワクチンであって、ＡＴＣＣに寄託されたＫ５０５４のマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）と類似する同定特徴を有するマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株の防御量と医薬的に受容可能なキャリアとを含むワクチン。
【請求項４６】
防御量が、各鳥の上部気道に定着するために要求されるマイコプラズマ・ガリセプチクム株の量である請求項４５記載のワクチン。
【請求項４７】
防御量が約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥である請求項４５記載のワクチン。
【請求項４８】
防御量が約５，０００ｃｃｕ／鳥である請求項４５記載の配合物。
【請求項４９】
ＡＴＣＣに寄託されたＫ５０５４のマイコプラズマ・ガリセプチクム株（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）と類似する同定特徴を有するマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌の本質的に生物学的に純粋な培養物。
【請求項５０】
請求項１に記載のマイコプラズマ・ガリセプチクム配合物をふ化後の鳥に投与することを含むキジ目の鳥類を保護する方法。
【請求項５１】
配合物がふ化後の最初の約１８週間の間に投与される請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
配合物がふ化後の少なくとも約２週間目で投与される請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
鳥が鶏である請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
鳥が七面鳥である請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
配合物が呼吸器粘膜へ投与される請求項５０記載の方法。
【請求項５６】
配合物が点眼により投与される請求項５０記載の方法。
【請求項５７】
配合物が鼻腔投与される請求項５０記載の方法。
【請求項５８】
配合物がエアロゾルにより投与される請求項５０記載の方法。
【請求項５９】
配合物が水を飲むことにより投与される請求項５０記載の方法。
【請求項６０】
約５０ｃｃｕ〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥の配合物が各鳥に投与される請求項５０記載の方法。
【請求項６１】
約５，０００ｃｃｕ／鳥の配合物が各鳥に投与される請求項５０記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも１つの追加抗原刺激配合物を鳥に投与する工程をさらに含む請求項５０記載の方法。
【請求項６３】
キジ目の鳥をマイコプラズマ・ガリセプチクムから保護するための方法であって、
非免疫病原性のマイコプラズマ・ガリセプチクム株をふ化後の鳥に投与し、その結果、この菌株が鳥の呼吸器の上皮に持続し、他のマイコプラズマ・ガリセプチクム株を呼吸器の上皮から追い出すようにすること
を含む方法。
【請求項６４】
非免疫病原性のマイコプラズマ・ガリセプチクム株がＡＴＣＣに寄託されたＫ５０５４株（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）と類似する同定特徴を有する株である請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
非免疫病原性のマイコプラズマ・ガリセプチクム株がＡＴＣＣに寄託されたＫ５０５４株（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）である請求項６３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には家禽の保護に関し、詳細にはマイコプラズマ・ガリセプチクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）（ＭＧ）防御用配合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ・ガリセプチクムは鳥類の気道の病原体であり、モリクト綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｒｅｓ）、マイコプラズマ類（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔｅｌｅｓ）、マイコプラズマ科（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）に属する。ある種の状況下では、ＭＧは、鶏および七面鳥において、特に幼鳥において急性の呼吸器疾患に関連する場合がある（七面鳥の方が感受性が大きい）。ＭＧはまた、狩猟鳥において上部気道疾患を生じさせ得る。感染の初期における浮腫性の様々な変化により、免疫病理学的応答が、観測された病理のいくつかの原因であり得ることが示される。より近年には、ＭＧが、北アメリカのメキシコマシコにおける結膜炎の原因の１つとして認められている。疾患の重篤度は、ニューカッスル病および感染性気管支炎などのウイルス二次感染、ならびに／または、大腸菌などの細菌二次感染の程度によって大きく影響を受ける。疾患のより慢性的な形態が生じる場合があり、そのような形態は繁殖用および採卵用の鳥において卵産生の低下を生じさせ得る。感染は、感染した卵を介して垂直的に広がり、そして、密な接触によって水平的に広がる。他の拡大法はあまりよく報告されていない。ＭＧは２つの方法で検出することができる。ＭＧの存在を、生物を無細胞培地において単離することによって、または、そのＤＮＡを感染組織もしくは塗抹サンプルから直接検出することによって確認することができる。結果が疑わしいときには、鶏胚または鶏に、疑わしい検体が接種される場合がある。感染が、生物もしくはそのＤＮＡを明らかにすることによって、または、特異的な体液性の抗体を検出することによって診断される。
【０００３】
単離用のサンプルは、器官もしくは組織の塗抹物、滲出物、または希釈された組織ホモジネートからなる。培養もまた、眼窩下洞または関節腔からの吸引物から、そして、卵黄または胚から試みられることがある。選択されたサンプルは、臨床的徴候により、また、存在する何らかの病変により影響を受ける。培養液および寒天が単離のために使用され、しかし、通常の場合、同定を試みる前にマイコプラズマのコロニーを寒天上に得ることが必要である。困難である場合、マイコプラズマ非感染鶏胚またはマイコプラズマ非感染鶏を介した検体の最初の継代培養が役立つことがある。
【０００４】
いくつかの基本的な生化学試験がマイコプラズマ単離体の予備的分類において役立ち得るが、最終的な同定は血清学的試験またはＤＮＡ試験によらなければならない。これらの中で最も満足できるものは、ＰＣＲ、蛍光抗体試験、および免疫ペルオキシダーゼ試験である。
【０００５】
様々なＤＮＡ検出法（これらは主としてポリメラーゼ連鎖反応に基づいている）が専門の研究室では使用され始めている。商業的なキットがいくつかの国では上市されており、このキットは、野外株を検出するために、また、それらをワクチンＦ株から区別するために使用することができる。
【０００６】
いくつかの血清学的試験が、ＭＧ抗体を検出するために使用されているが、それらは、中でも、特異性および感度がやや欠落している。血清学的試験は、個々の鳥を試験するためよりも、集団スクリーニングするために申し分ない。最も一般的に使用されているものは、迅速血清凝集（ＲＳＡ）試験、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および赤血球凝集阻害（ＨＩ）試験である。ＲＳＡ試験では、個々の鳥から得られた血清が、市販の染色されたＭＧ抗原を使用して凝集について試験される。抗原との凝集反応を２分以内にもたらす鶏または七面鳥の血清は、５６℃で３０分間、加熱され、再試験されなければならない。依然として反応する血清は、特に希釈されたときには、陽性であると見なされる。これらは、その後、ＥＬＩＳＡまたはＨＩ試験によって確認され得る。
【０００７】
マイコプラズマ・ガリセプチクム（ＭＧ）は、慢性の呼吸器疾患による鶏および七面鳥における著しい経済的損失、食肉用鳥類における肉の規格低下、ならびに、採卵用の鳥における生産低下を生じさせ得る。散発的な発生（これは重要な経済的結果を有する）が七面鳥およびブロイラーにおいて生じ、これは、商業的な採卵用の鳥では依然として費用のかかる風土病的感染症である。
【０００８】
ＭＧ蔓延防止の好ましい方法はＭＧ非感染集団の維持であるが、生ワクチンおよび不活化ワクチンの両方が使用されている。
【０００９】
ワクチンは、原理的には、２つのグループに、すなわち、生（弱毒化）ワクチンおよび不活化ワクチンに分けることができる。生ワクチンの長所には、感染性媒介因子の関連する免疫原性決定基のすべてをその天然の形態で宿主の免疫系に提示すること、および、ワクチンが接種された宿主において増殖するその固有的な性質のために、比較的少量の免疫化因子しか必要でないことが含まれる。生ワクチンの大きな短所は、その安全性に関する問題である。すなわち、生ワクチンは（免疫低下動物において）疾患を誘導することがあるか、または、生菌微生物が毒性に復帰し得ることさえあり、その結果として、動物が毒性感染を受ける。
【００１０】
安全性の局面に関するこの短所は、不活化ワクチンでは示されず、従って、生ワクチンを上回る大きな長所となっている。しかしながら、不活化ワクチンの大きな短所がその固有的に低い免疫原性によって表される。すなわち、不活化された免疫原はそれだけでは、宿主の免疫系を始動させる能力が限られている。従って、適切な手段が、これらの不活化された免疫原の免疫原性を増強するために必要である。このタイプのワクチンは、通常、疾患を防止する際に最小限の潜在的能力に達するために十分な免疫刺激能を有するアジュバントを必要とする。従って、その固有的に低い免疫原性を増強するために不活化免疫原との組合せで使用されるさらなる免疫刺激剤（特に、２つ以上の免疫原に対して適用可能な免疫刺激剤）が望ましいことは明らかである。
【００１１】
ＭＧワクチンは、家禽での汎用的使用のために承認されていないという点で異例な状況となっている。ＭＧワクチンは、野生型株により引き起こされる卵産生低下を防止するために、１年以上の採卵用鳥の飼育場の鳥では一般に使用されている。ＭＧ感染が集団に一旦生じると、ＭＧ感染は永続的に持続するので、このことは重要である。現在、合衆国では、商業的な採卵用の鳥の２／３がワクチン接種されている。国際的には、生ワクチンに対する需要は大きい。オーストラリアなどの国々では、ブロイラー繁殖用鳥の代替ストック全体が、生ワクチンを使用してワクチン接種されている。
【００１２】
現在の実施では、ＭＧ関連疾患に対する家禽の予防的免疫化は、弱毒化されたワクチン株に対する管理された暴露、または不活化された全細胞のオイルエマルジョンワクチンの使用のいずれかを伴う。これらの方法はそれぞれがある種の短所を有している。例えば、生ワクチンは疾患を生じさせ得るか、または生殖機能を損ない得る。不活化ワクチンは、免疫化された鳥において疾患を防止することにおいて一般に効果的である一方で、感染を確実に防止せず、ワクチン非接種の鳥への感染および疾患の拡大を許す場合がある。
【００１３】
合衆国では、ワクチン接種は、一般には、集団が感染することが避けられない多年飼育場でのみ使用されている。ワクチン接種の通常的な目的は、商業的な採卵用の鳥における卵の生産低下を防止することである。だが、ワクチンはまた、繁殖中のストックにおける卵伝染レベルを低下させるために、または、多年生産場所でのＭＧ根絶のための手段として使用されることもある。生ワクチンまたは死菌ワクチンのいずれかを、集団がＭＧによる野外感染にさらされる前に投与することが重要である。
【００１４】
利用可能な生ワクチンは、一般には、ＭＧのＦ株から製造され、より近年には、改善された安全性特性を有する非病原性株であるｔｓ−１１株および６／８５株から製造されている。鼻内経路または点眼経路によるＦ株の投与が好ましいが、エアロゾルまたは飲料水による投与が使用されることがある。点眼法がｔｓ−１１には勧められ、一方、微細なスプレーが６／８５には勧められる。雌鶏が、一般には、１２週齢〜１６週齢の間でワクチン接種される。１回の投薬が十分であり、ワクチン接種された鳥は永続的なキャリアであり続ける。多年飼育場でのＦ株の長期間の使用は、ワクチン株による野生株の排除をもたらす。Ｆ株は、６／８５またはｔｓ−１１よりも効率的に、毒性の野生型ＭＧ株を追い出すが、ｔｓ−１１を使用して、多年の商業的な採卵用の鳥においてＭＧのＦ株を根絶することにも成功している。多年生産場所はまた、６／８５の長期間の使用の後ではＭＧについて血清学的に陰性で試験されることが知られている。Ｆ株は、七面鳥に対しては完全に毒性である。
【００１５】
米国特許第５，０６４，６４７号（Ｐａｕｌ  Ｋ．Ｓｔｏｒｍに対して１９９１年１１月１２日に発行）は、６／８５株に基づくマイコプラズマワクチンに関する。６／８５株が、培地における連続した継代培養によって弱毒化されている。鶏の場合、６／８５株は極めて弱毒化されている。６／８５は、鶏では効果的に使用され得るが、七面鳥ではその弱毒化された状態を保っていない。
【００１６】
他方で、ｔｓ−１１は、化学的に突然変異させた温度感受性変異体である。ｔｓ−１１は、オーストラリア、ラテンアメリカおよびアジアでは広く使用されている。ｔｓ−１１はまた、合衆国市場の２／３で使用されている。６／８５と同様に、ｔｓ−１１は、ＭＧに対する鶏へのワクチン接種には有用であるが、七面鳥へのワクチン接種には有用ではない。
【００１７】
従って、現在の生ＭＧワクチンは問題である。Ｆ株は七面鳥では毒性である。また、６／８５およびｔｓ−１１の両方の弱毒化は、これらのワクチン株は、疾患を引き起こす毒性の野生型に復帰する不安定なゲノムを有しているので、不安定である。しかし、時間の経過とともに、七面鳥はワクチンが効かなくなり、毒性の野外ＭＧ感染が優勢になる。そのため、現在の生ＭＧワクチンは、大きな七面鳥集団に関して、ノースカロライナ州およびミネソタ州などの州では許可されていない。同様に、イスラエル国でも生ＭＧワクチンの使用は認可されていない。
【００１８】
また、６／８５株およびｔｓ−１１株は鶏では持続しない。事実、先行技術は、保護機構として持続することとは逆のことを教示している。米国特許第５，０６４，６４７号（Ｐａｕｌ  Ｋ．Ｓｔｏｒｍに対して１９９１年１１月１２日に発行）は、６８５株の利点が、この株は接種後４週間で鶏においてもはや検出され得ないということであることを教示している。最終的には、野生型株が復帰し、疾患および生産低下を生じさせる。他方で、あまり弱毒化されていない生ワクチン株は疾患を十分に防止しない。従って、ワクチン接種の持続と、疾患の軽さとの間には逆の関係があるようである。
【００１９】
ＭＧを防止するための生菌生物によるワクチン接種に対する代わりの方法は、バクテリンの使用である。バクテリンは、オイルエマルジョンにおけるＭＧ生物の高濃度懸濁物からなる。これらは、通常、１２週齢〜１６週齢のときに成長中の雌鶏に投与される。バクテリンは、非経口的に、通常的には首の皮下に投与される。２回の投薬が望ましいが、通常、１回の投薬が、コストおよび労力の事情のために施される。バクテリンは、卵生産の低下および呼吸器疾患を防止することにおいて効果的であるが、野生型ＭＧによる感染を防止しない。
【００２０】
従って、ＭＧに感染しやすい鳥を保護するための、安全で、効き目のある配合物が依然として求められている。最適には、そのような配合物は、鶏および七面鳥の両方において持続し、それにもかかわらず、最小限の病理を生じさせる生菌株を含まなければならない。そのような防御用配合物はまた、七面鳥において安定かつ非毒性でなければならない。本発明により、この長年の要求が解決される。
【発明の開示】
【００２１】
発明の要約
本発明は、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥類に適用するための、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、２０１１０−２２０９、米国）に寄託されているＭＧ株Ｋ５０５４（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）から形成されるＭＧ防御用配合物を有するワクチンに関する。好ましい実施形態において、防御量が鳥に投与される。従って、本発明の１つの局面は、キジ目の鳥類に対する防御用配合物であって、図１、図２および図３に示されるように、Ｋ５０５４のバンドパターンの少なくとも１つに実質的に対応するＲＡＰＤパターンを有するマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株（これはＡＴＣＣに寄託されている；特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）の防御量と、医薬的に受容可能なキャリアとを含む防御用配合物を提供することである。この場合、図１におけるＫ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして配列番号４を使用して得られ、Ｋ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして、配列番号５、配列番号６および配列番号７を使用して得られ、Ｋ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして配列番号８を使用して得られる。
【００２２】
本発明の別の局面は、キジ目の鳥類に対するワクチンであって、図１、図２および図３に示されるように、Ｋ５０５４のバンドパターンの少なくとも１つに実質的に対応するＲＡＰＤパターンを有するマイコプラズマ・ガリセプチクム細菌株（これはＡＴＣＣに寄託されている；特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）の防御量と、医薬的に受容可能なキャリアとを含むワクチンを提供することである。この場合、図１におけるＫ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして配列番号４を使用して得られ、Ｋ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして、配列番号５、配列番号６および配列番号７を使用して得られ、Ｋ５０５４のバンドパターンが、プライマーとして配列番号８を使用して得られる。
【００２３】
本発明のなおさらに別の局面は、キジ目の鳥をマイコプラズマ・ガリセプチクムから保護するための方法であって、非免疫病原性のマイコプラズマ・ガリセプチクム株をふ化後の鳥に投与し、その結果、この菌株が鳥の呼吸器の上皮に持続し、他のマイコプラズマ・ガリセプチクム株を呼吸器の上皮から追い出すようにすることを含む方法である。
【００２４】
本発明のさらに別の局面は、本発明のワクチンを鳥に投与する方法である。好ましくは、ワクチンは鳥の呼吸器粘膜に投与される。より好ましくは、本発明の防御用配合物は鶏に投与される。さらに、本発明の防御用配合物は七面鳥に投与することができる。
【００２５】
本発明のこれらの局面および他の局面が、好ましい実施形態の下記の説明を読んだ後、当業者には明らかになる。
図面の簡単な記述
図１はＣｈａｒｌｔｏｎプライマーを使用するＲＡＰＤゲルである。
図２はＦａｎプライマー（Ｍ１６ＳＰＣＲ５’、Ｍ１３Ｆ、Ｓ１ＯＬＩＧＯ３’）を使用するＲＡＰＤゲルである。
図３はＧｅａｒｙの１２５４プライマーを使用するＲＡＰＤゲルである。
図４は実験結果を示す表である。
図５は実験結果を示す表である。
図６は実験結果を示す表である。
図７は実験結果を示す表である。
図８は実験結果を示す表である。
図９は実験結果を示す表である。
図１０は実験結果を示す表である。
図１１は表４．１．直腸（Ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅ）である。
図１２は表４．２．直腸（Ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅ）である。
図１３は表５．１．免疫性の持続および持続期間である。
図１４は表５．２．免疫性の持続および持続期間である。
図１５は表６．１．伝染性である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明はＭＧ細菌およびその誘導体を提供する。本発明によるＭＧ細菌およびその誘導体は、メキシコマシコ（Ｃａｒｐｏｄａｃｕｓ  ｍｅｘｉｃａｎｕｓ）に由来するＭＧのスズメ（ｐａｓｓｅｒｉｎｅ）株に由来する。この菌株（現在はＫ５０５４と呼ばれる）は、商業的な七面鳥事業における特殊なＭＧ発生の時に発見された。七面鳥における通常のＭＧ発生とは異なり、この特別な発生では、疾患の徴候がほとんど現れなかった。この徴候には、繁殖用鳥における洞炎、ならびに、ＥＬＩＳＡを使用する感染の血清学的証拠が含まれた。
【００２７】
この感染の初期段階において、血清平板凝集（ＳＰＡ）および赤血球凝集阻害（ＨＩ）ではマイコプラズマ・ガリセプチクムを検出することができなかった。気管塗抹物培養およびＰＣＲもまた、不確かな結果をもたらし、感染を確認することができなかった。単離体を得る可能性を高めるために、また、感染の影響を観測するために、バイオアッセイが行われた。疑いのある七面鳥に洞液が接種され、疾患および血清学についてモニターされた。すべての鳥がセロコンバージョンをもたらしたが、疾患の臨床的徴候は全く観測されなかった。しかしながら、１羽の鳥が、わずかに炎症を起こした洞を示した。この七面鳥から得られた洞滲出液を集めて、増殖培地に接種した。このように、Ｋ５０５４株がこの様式で得られた。
【００２８】
ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）技術によるＤＮＡフィンガープリンティング、および配列決定により、この菌株は、メキシコマシコにおけるＭＧ株と類似しているが、先行技術のワクチン株とは異なることが示された。Ｋ５０５４株、メキシコマシコＭＧおよびワクチン株（ＴＳ−１１、６／８５）、野外株（Ｆ）、ならびに毒性ＭＧ株（Ｒ）のＲＡＰＤパターンが、図１、図２および図３に示される。Ｓ６は、平板凝集試験で抗原として使用されたＭＧ株である。Ａ５９６９は、赤血球凝集阻害試験で抗原として使用されたＭＧ株である。ＲＡＰＤ技術のために、異なる３組のプライマーが使用された。配列表が参考としてここに組み込まれる。図１において認められるようなＲＡＰＤ＃１では、使用されたプライマーは配列番号４であった。図２において認められるようなＲＡＰＤ＃２では、使用されたプライマーは、配列番号５、配列番号６および配列番号７であった。図３において認められるようなＲＡＰＤ＃３では、使用されたプライマーは配列番号８であった。
【００２９】
図１において、Ｋ５０５４における最も優勢なＰＣＲ産物がメキシコマシコの対応するＰＣＲ産物よりもわずかに小さいことを除いて、メキシコマシコ株（レーン２）とＫ５０５４（レーン３）との間におけるバンドパターンが類似している。この同じ産物は、ワクチン株ではさらに小さい分子量である。図２では、メキシコマシコ株（レーン１）とＫ５０５４（レーン２）との間におけるバンドパターンが類似しているが、Ｋ５０５４には、メキシコマシコ株には存在する、約７００ｋｂおよび２０００ｋｂでの２つの主要なバンドが存在しない。他の野外株またはワクチン株を表すそれ以外のバンドパターンは、Ｋ５０５４よりも、メキシコマシコのパターンと大きく異なっている。図３において、メキシコマシコ株（レーン２）およびＫ５０５４（レーン３）のＲＡＰＤパターンは類似しているが、それ以外のＭＧ株とは異なっている。これらの結果から、Ｋ５０５４が、おそらくはメキシコマシコＭＧに由来する菌株として同定される。これらの結果はまた、この菌株が、ワクチン株（ｔｓ−１１および６／８５）、野外株（Ｆ）、毒性ＭＧ株（Ｒ）および抗原株（Ｓ６およびＡ５９６９）などの他のＭＧ株と異なることを示している。
【００３０】
３つの重要な遺伝子の部分ＤＮＡ配列決定により、相同性がＫ５０５４株と現在のワクチン株との間で明らかにされた。３つの遺伝子は、ＰｖｐＡ表面シトアドヘジン（ｃｙｔａｄｈｅｓｉｎ）、表面リポタンパク質遺伝子およびｍｇｃ１／ＧａｐＡシトアドヘジン遺伝子である（それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３）。Ｋ５０５４におけるＧａｐＡ遺伝子配列は６／８５のＧａｐＡ遺伝子配列と１００％の相同性を示した。ＰｖｐＡ表面シトアドヘジン遺伝子配列は、６／８５のＰｖｐＡ表面シトアドヘジン遺伝子配列とは９７．３％の相同性を示し、ｔｓ１１のＰｖｐＡ表面シトアドヘジン遺伝子配列とは９２．６％の相同性を示し、Ｆ株とは９５．２％の相同性を示し、ＨＦ５１株とは９８．２％の相同性を示した。表面リポタンパク質遺伝子配列は、６／８５の表面リポタンパク質遺伝子配列とは９７．３％の相同性を示し、ｔｓ−１１の表面リポタンパク質遺伝子配列とは９７．９％の相同性を示し、Ｆ株の表面リポタンパク質遺伝子配列とは９７．０％の相同性を示し、ＨＦ５１株とは１００％の相同性を示した。
【００３１】
本発明のＭＧ防御用配合物は、キジ目の鳥における使用のために意図される。これらには、鶏および七面鳥が含まれるが、これらに限定されない。鶏には、ブロイラー、繁殖用ストックおよび採卵用ストックが含まれる。七面鳥には、繁殖用ストックおよび消費用の鳥が含まれる。本発明の防御用配合物は、保護免疫性を刺激するためにワクチンとして作用することによって、また、呼吸器粘膜に、特に、ワクチン接種された鳥の上部気道に持続し、従って、鳥の免疫抵抗性および生来の抵抗性が、毒性の野外株を独力で呼吸器粘膜から追い出すために十分になるまで、毒性の野外株をこの領域に定着させないことによって、その両方で鳥を保護する。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態は、２００２年６月２７日にＡＴＣＣに寄託されたＫ５０５４株（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）から形成される、キジ目の鳥に対するＭＧ防御用配合物である。好ましい実施形態において、防御用配合物は鶏において使用される。別の好ましい実施形態において、防御用配合物は七面鳥において使用される。前記Ｋ５０５４株のような特徴的な血清学的特性を有する菌株もまた本発明に属する。これには、メキシコマシコから単離されたスズメ感染性株が含まれる。より詳細には、Ｋ５０５４株に由来し、その特に有利な防御特性を保持する菌株は本発明に属する。好ましくは、配合物において使用される生物は生菌である。
【００３３】
１つの好ましい実施形態において、防御量は、毒性の野生型株による侵入からの防御をもたらすために十分な期間にわたって鳥の上部気道に定着するために要求されるＭＧ株のそのような量である。一般に、本発明によるＭＧ株は鳥の気道に定着する必要がある。最適には、ＭＧ株は、少なくとも１年間、鳥の気道に持続しなければならない。しかしながら、短い定着期間も依然として有用である。例えば、鳥の気道に８週間にわたって定着することにすら、保護がもたらされる。別の好ましい実施形態において、そのような防御量は約１滴／眼／鳥であり、この場合、１滴は約０．０５ｍｌであり、約１ｘ１０３〜約１ｘ１０６コロニー変化ユニット／ｍｌ（ｃｃｕ／ｍｌ）の濃度である。これは約５０〜約５０，０００ｃｃｕ／鳥と等価である。さらにより好ましい実施形態において、そのような防御量は１ｘ１０５ｃｃｕ／ｍｌ溶液の約１滴であり、これは約５，０００ｃｃｕ／鳥に対応する。
【００３４】
本発明はさらに、本明細書中に記載されるＭＧ防御用配合物をふ化後の鳥に投与することによって鳥を保護する方法を包含する。好ましくは、配合物は、ふ化後の最初の約１８週間の間に投与される。より好ましくは、配合物は、ふ化後の少なくとも約２週間目で投与される。
【００３５】
本発明による配合物は、呼吸器粘膜への投与のために好適な形態である。呼吸器粘膜投与は、配合物が、直ちに、または最終的に、鳥の呼吸器粘膜と接触させられるように投与されることを意味する。従って、配合物は、鼻腔内、経口的および／または眼内に適用され得る。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、鼻腔内投与または経口投与される配合物は、それぞれ、エアロゾルを含むスプレーによる投与、または水を飲むことによる投与のために好適な形態である。これらの送達システムに関して、これらは点眼送達よりも効率が低いので、各鳥に送達される実際の量は、点眼送達によるよりも少ない。個々の鳥に基づく投与は本発明に従って可能であるが、配合物は、好ましくは、鳥をＭＧから保護するために一般的に使用されている安価な集団適用経路によって投与され、そのような集団適用経路は投与のための商業的に効率的な手段をもたらす。
【００３７】
本発明によるスプレー法またはエアロゾル法では、小さい液体粒子に取り込まれた本発明によるＭＧ配合物を投与することが伴う。前者の方法では、粒子は、通常、約１０ミクロン〜約１００ミクロンに及ぶ初期液滴サイズを有し、後者の方法では、約１ミクロン未満〜約５０ミクロンに及ぶ初期液滴サイズを有する。小さい粒子を生じさせるために、従来のスプレー装置およびエアロゾル発生器を使用することができ、例えば、背負いスプレー、ふ化場スプレーおよび霧吹きのための市販のスプレー発生器を使用することができる。また、水を飲むことによる配合物の投与も、従来の装置を使用して行うことができる。
【００３８】
ＭＧ細菌を含有する本発明による配合物は、懸濁物の形態で、または凍結乾燥された形態で調製および販売することができ、さらには、そのような組成物のために慣用的に使用されている医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤を含有することができる。キャリアには、この分野では一般に知られている安定化剤、保存剤および緩衝剤が含まれる。配合物は、保存のために凍結され、好ましくは、最適な保存のためには−７０℃で凍結される。凍結されたときの安定性を高めるために、グリセロールを培養培地に加えることができる。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明によるワクチンの約５０ｃｃｕ〜約５０，０００ｃｃｕが鳥に投与される。より好ましくは、約５，０００ｃｃｕの配合物が鳥に投与される。別の実施形態において、少なくとも１回の追加抗原刺激ワクチンが、必要ならば、その後、例えば、最初のワクチン投与の後、約１２週間〜約２０週間の間で鳥に投与される。
【００４０】
ＡＴＣＣに寄託されたＫ５０５４生菌のＭＧ菌株（特許寄託表示ＰＴＡ−４５０７）およびその誘導体を使用することにより、好都合なことに、野生型株による侵入から鳥を保護する競合的排除剤として持続する生ワクチンが提供される。鶏および七面鳥における実験結果から、Ｋ５０５４株が持続し、非免疫病原性であり、かつ最小限の疾患を生じさせ、また、安全で、効き目があり、これにより、競合的排除剤作用を効果的に提供することが示される。Ｋ５０５４株と類似する同定特徴および機能的特徴を有する菌株は本発明の範囲に含まれる。そのような菌株には、連続した継代培養により自然に、または人為的に変異しているＫ５０５４の誘導体および野外単離体の誘導体が含まれる。これらの誘導体は、本発明の本質から逸脱しておらず、本発明において意図される。
【００４１】
ＭＧ株を成長させるためのプロトコル
本発明によるＭＧは、下記のプロトコルに従って培養で成長させることができる：
培地：鳥マイコプラズマを単離するためのＦｒｅｙ培地
マイコプラズマ培養液基剤  ２２．５ｇ
デキストロース  ３ｇ
ブタ血清  １２０ｍｌ
酵母抽出物  ３５ｍｌ
フェノールレッド（１％）  ２．５ｍｌ
酢酸タリウム（１０％）Ａ  ６ｍｌ
アンピシリン  １ｇ／リットルＡ
【００４２】
試薬を一緒にして、蒸留水で１０００ｍｌにする。Ａ−酢酸タリウムおよびアンピシリンは、純粋ＭＧ培養の場合、例えば、商業的なワクチン生産などでは省くことができる。
【００４３】
ｐＨを２０％ＮａＯＨで７．８に調節し、ろ過滅菌する。他の増殖因子および保存剤を、本発明の範囲から逸脱することなく、上記に示された増殖因子および保存剤の代わりに使用することができる。
【００４４】
寒天培地の場合、１％の精製寒天（例えば、イオン寒天＃２、Ｎｏｂｌｅ寒天またはＤｉｆｃｏ精製寒天など）を使用する。血清およびアンピシリンを除くすべての成分は、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理される。５０℃に冷却し、その後、ろ過により事前に滅菌され、かつ５０℃に加温された血清およびアンピシリンを無菌的に加える。混合して、約５ｍｍの深さにプレートに注ぐ。
【００４５】
下記の実施例は本発明を例示しているが、本発明を実施例に限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例Ｉ：七面鳥でのバイオアッセイ
感受性の七面鳥に、４つの異なる罹患した商業的な七面鳥の群れから得られた洞滲出物を接種した。ＭＧの単離が、七面鳥に抗原投与するために使用された滲出物の１つから行われ、これはＫ５０５４と呼ばれた。
【００４７】
農場の１つから得られた洞滲出物（Ｋ５０５４）による抗原投与を受けた七面鳥は、非常に軽い臨床的徴候を有し（８羽中１羽の七面鳥が接種後４２日目に一側性洞炎を発症し）、軽度の病変を有した。これらの七面鳥はセロコンバージョンをもたらし、毒性ＭＧ株によるその後の抗原投与に対する免疫性を発達させた。
【００４８】
実施例ＩＩ
試験Ａ
８羽の七面鳥の４群に対して、４カ所の異なる農場における罹患した商業的七面鳥から採取された洞滲出物を抗原投与した（１つの農場がＫ５０５４滲出物を有していた）。５番目の群が陰性コントロールとして使用された。七面鳥は臨床的徴候について観察され、血清学のために採血され、そして、気管塗抹物がマイコプラズマ培養のために得られた。この実験の結果が図４に示される。
【００４９】
抗原投与後４９日目に、Ｋ５０５３４洞滲出物が接種された鳥（８羽の感染元）を感受性の七面鳥（８羽の接触鳥）と混ぜた。七面鳥は、一緒にされた後、臨床的徴候について観察され、血清学のために採血され、そして、気管塗抹物がマイコプラズマ培養のために得られた。接触した七面鳥の２羽が抗原投与後５６日目に検死された。
【００５０】
Ｋ５０５４洞滲出物接種群が、セロコンバージョンを起こした唯一の群であった。それらは接種後２１日目に陽性であり、研究終了まで陽性のままであった。Ｋ５０５４洞滲出物が接種された８羽の七面鳥のうちの１羽が接種後４９日目に一側性洞炎を示した。Ｋ５０５４がその七面鳥の洞滲出物から再び単離された。これは、研究期間中におけるＫ５０５４の唯一の再単離であった。これらの結果は、七面鳥におけるＫ５０５４株の持続およびそれにより引き起こされる軽度の疾患症状を示している。
【００５１】
試験Ｂ
試験Ａからの残る七面鳥（８羽の感染元および６羽の接触鳥）を試験Ｂで使用した。Ｋ５０５４洞滲出物接種後８８日目に、７羽の七面鳥（４羽の感染元および３羽の接触鳥）に対して、ＭＧのＲ株をエアロゾルによって抗原投与した。残る７羽の七面鳥（４羽の感染元および３羽の接触鳥）がコントロールとして使用された。すべての七面鳥が、Ｒ株による抗原投与の１０日後に検死された。それらは血清学のために採血され、気管塗抹物および気嚢塗抹物が培養のために得られた。気道切片が、気管粘膜厚測定のためにホルマリン中で固定された。
【００５２】
試験Ｂの結果が図５にまとめられる。Ｋ５０５４が以前に接種された七面鳥は、Ｒ株による抗原投与の後、気嚢の病変を何ら有していなかった。これらの七面鳥についての平均気管粘膜厚さもまた、抗原投与コントロールよりも著しく小さく、また、抗原投与されていない七面鳥と著しく異なっていなかった。Ｒ株は、抗原投与後のこれらの七面鳥から再単離されなかった。これらの結果は、Ｋ５０５４により、七面鳥がＭＧ感染から保護されることを示している。
【００５３】
実施例ＩＩＩ
Ｋ５０５４洞滲出物による接種は、このバイオアッセイでは、七面鳥において臨床的反応をほとんど生じさせなかった。Ｋ５０５４株の安全性をさらに調べるために、予備的調査が鶏および七面鳥において行われた。これらの鳥に対して、Ｆｒｅｙ培地で増殖されたＫ５０５４を粗粒スプレーによって抗原投与した。
【００５４】
鶏および七面鳥におけるＫ５０５４抗原投与は、疾患をほとんど示すことなく、セロコンバージョンをもたらした。
【００５５】
試験１：鶏における安全性
商業用の採卵用鶏に対して、粗粒スプレーによるＫ５０５４、ｔｓ−１１およびＲ株を抗原投与した。鶏は、抗原投与後１０日目に、血清学、気嚢病変部の全体的な評価、および気管粘膜の厚さの測定によって評価された。この実験の結果が図６および図７に示される。
実験計画
【表１】
2005533116.tif 000002
【００５６】
Ｔｓ−１１群およびＫ５０５４群はともに全体的な気嚢病変を全くもたらさなかった。これらの群についての平均気管粘膜厚さは、陰性コントロールと著しく異なっていなかったが、抗原投与コントロールよりも著しく小さかった。
【００５７】
試験２：七面鳥における安全性
市販元から入手した七面鳥にＫ５０５４およびＲ株を４週齢のときに粗粒スプレーによって接種した。七面鳥は、陰性コントロール群と一緒に、１０日後に検死された。結果が図８に示される。
実験計画
【表２】
2005533116.tif 000003
【００５８】
Ｋ５０５４群についての平均気嚢病変スコアおよび平均気管粘膜厚さは、抗原投与コントロールよりも著しく小さく、陰性コントロールとは著しくは異なっていなかった。
【００５９】
実施例ＩＶ：効力
Ｋ５０５４洞滲出物が接種され、その後、Ｒ株が抗原投与されたバイオアッセイ中の七面鳥は、疾患に対する優れた防御を示した。ＭＧに対する生ワクチンとしてのＫ５０５４の効力が、Ｋ５０５４が以前に接種された鶏および七面鳥に毒性ＭＧ株（Ｒ）を抗原投与することによって評価された。
【００６０】
Ｋ５０５４によるワクチン接種は、Ｒ株による抗原投与の後、疾患に関連するＭＧ病変の著しい減少をもたらした。
【００６１】
試験１：鶏における効力
商業的な採卵用鶏にＫ５０５４またはｔｓ−１１を接種した。鶏は、５週間後にＲ株が抗原投与された（粗粒スプレー）。抗原投与後１０日目に、鶏は、血清学、気嚢病変部の全体的な評価、および気管粘膜の厚さの測定によって評価された。実験計画が下記に示される。この試験の結果が図９に示される。
実験計画；
【表３】
2005533116.tif 000004
【００６２】
Ｔｓ−１１群およびＫ５０５４群は、抗原投与コントロールと著しく異なった平均気嚢病変スコアをもたらした。ワクチン接種群についての平均気管粘膜測定値もまた、抗原投与コントロールの平均気管粘膜測定値と著しく異なっていたが、陰性コントロール群とは著しくは異なっていなかった。
【００６３】
試験２：七面鳥における効力
Ｋ５０５４によるワクチン接種を以前に受けた１８羽の七面鳥に、Ｒ株（１．３８ｘ１０９ｃｃｕ／ｍｌ）をワクチン接種後６週間目に粗粒スプレーによって抗原投与した。七面鳥は、陰性コントロール群と一緒に、１０日後に検死された。七面鳥は、血清学、気嚢病変部、および気管粘膜厚さによって評価された。この試験の結果が図１０に示される。
【００６４】
Ｋ５０５４接種群についての平均気嚢病変スコアおよび平均気管粘膜厚さは、抗原投与コントロールと著しく異なっていたが、陰性コントロールとは著しくは異なっていなかった。
【００６５】
下記の実施例は、本発明をさらに例示しているが、本発明を実施例に限定することを意図するものではない。
【００６６】
商業的な七面鳥における特殊な発生に由来するマイコプラズマ・ガリセプチクム（ＭＧ）のメキシコマシコ様単離体を用いた以前の研究は、商業的な家禽における生ワクチンとしてのこの菌株（Ｋ５０５４）の使用について、勇気づける結果を与えた。
【００６７】
実施例Ｖ：鶏における安全性および安定性
さらなる研究が、鶏における単離体の安全性および安定性を明らかにするために行われた。
【００６８】
試験１：Ｋ５０５４の安全性および安定性をさらに評価するために、単離体が鶏において１０回継代培養された。
【００６９】
Ｋ５０５４の鶏での継代培養の後の単離体は、Ｋ５０５４および毒性のＲ株と比較したとき、毒性の増大が著しくなかった。
【００７０】
実験計画：
商業的な採卵用鶏に対して、３週齢のときにＫ５０５４を点眼によって抗原投与した。１週間後、これらの鶏から得られた気管塗抹物を使用して、さらに１５羽の鶏（３週齢）に接種した。このプロセスを、単離体が１０回継代培養されるまで繰り返した。１０回目の継代培養から得られた単離体を抗原投与試験で使用した。３０羽の鶏からなる群に対して、Ｋ５０５４、Ｋ５０５４＋１０またはＲ株をエアロゾルによって抗原投与した。抗原投与に対する応答が、抗原投与後１０日目に、全体的な病変および組織病理学的病変、ならびに血清学的反応によって、陰性コントロールと比較され、評価された。
【表４】
2005533116.tif 000005
【００７１】
結果。この抗原投与研究の結果が図１１および図１２にまとめられる。Ｋ５０５４＋１０群の気嚢病変スコアは、Ｋ５０５４群または陰性コントロール群とは著しく異なっていなかった。
【００７２】
実施例ＶＩ．免疫性の持続および持続期間
鶏の気道におけるＫ５０５４の持続、および１回のＫ５０５４ワクチン接種により誘発される免疫性の長さが、７ヶ月の期間にわたって評価された。
【００７３】
結果は、今までのところ、ワクチン接種後１６週間まで、Ｋ５０５４が、ワクチン接種された鶏の気管に持続し、保護免疫性を誘発したことを示している。
【００７４】
実験計画。商業的な採卵用鶏に対して、３週齢のときにＫ５０５４をエアロゾルによってワクチン接種した。これらの鶏は、マイコプラズマについての血清学および気管培養のための５回の定期的なサンプリングによって７ヶ月の期間にわたって評価された。１０羽のワクチン接種された鶏をそれぞれのサンプリング期間のときに取り出し、これらに毒性のＲ株を抗原投与した。抗原投与に対する応答が、抗原投与後１０日目に、全体的な病変および組織病理学的病変、ならびに血清学的反応によって評価された。
【表５】
2005533116.tif 000006
【００７５】
結果。この試験の予備的な結果が図１３および図１４にまとめられる。Ｋ５０５４は、Ｋ５０５４によるワクチン接種を受けた鳥の気管に持続した。Ｋ５０５４が、ワクチン接種後１２週間までに採取された気管塗抹物の１００％から単離された。Ｋ５０５４がワクチン接種され、抗原投与された鶏は、陰性コントロールと著しく異なった病変スコアを有していなかった。
【００７６】
実施例ＶＩＩ．伝染性
Ｋ５０５４の伝染性を評価するために、鶏にＫ５０５４を抗原投与して、未処置の鳥との直接的接触状態および間接的接触状態に置いた。
【００７７】
実験計画。５羽の鶏に対して、３週齢のときにＫ５０５４を点眼によって抗原投与した（接種体）。これらは２５羽の直接接触鶏と一緒に小屋に入れられ、かつ、金網越しで接触する３０羽の鶏を含む小屋の隣に置かれた。空の小屋によって、接種体および直接接触体が、空小屋越しの接触体からなる第３の群から隔てられた。Ｒ株が、類似する設計でのコントロールとして使用された。ＭＧの伝染率が、抗原投与後１２週間の期間にわたって気管培養および血清学によって評価された。
【表６】
2005533116.tif 000007
【００７８】
結果。結果が図１５にまとめられる。Ｒ株は、抗原投与後２週間までに直接の接触体に広がった。それ以外の群は、抗原投与後４週間目においてＭＧについて陰性のままであった。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態および代わりの実施形態が前記には記載されているが、本発明は、開示されたこれらの実施形態に限定されず、しかし、構成部分および構成要素の数多くの改変、再配置および置換が、本発明の精神から逸脱することなく可能であることが、当業者によって理解される。
【００８０】
特定の改変および改善が、前記の説明を読んだとき、当業者には想起される。すべての改変および改善は、簡潔さおよび読みやすさのために本明細書中では削除されており、しかし、下記の請求項の範囲には適切に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】Ｃｈａｒｌｔｏｎプライマーを使用するＲＡＰＤゲルである。
【図２】Ｆａｎプライマー（Ｍ１６ＳＰＣＲ５’、Ｍ１３Ｆ、Ｓ１ＯＬＩＧＯ３’）を使用するＲＡＰＤゲルである。
【図３】Ｇｅａｒｙの１２５４プライマーを使用するＲＡＰＤゲルである。
【図４】実験結果を示す表である。
【図５】実験結果を示す表である。
【図６】実験結果を示す表である。
【図７】実験結果を示す表である。
【図８】実験結果を示す表である。
【図９】実験結果を示す表である。
【図１０】実験結果を示す表である。
【配列表】
2005533116.tif 000008
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
2005533116.tif 000021
2005533116.tif 000022
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