(57)【要約】【課題】核酸のための新規非ウイルス性送達システム、より具体的には、宿主組織に投与すると、その組織内の細胞への核酸の導入を助長するシステムを提供する。【解決手段】重量分率２０％未満の重合度（ＤＰ）＜１０のオリゴマーを重量分率２０％未満のＤＰ＞５０のオリゴマーに加えて含有するカチオン性オリゴマーであるカチオン性多糖類キトサン由来のカチオン性キトサンオリゴマーと核酸との複合体を含む組成物を提供する。一定の鎖長分布を有するよく定義されたカチオン性キトサンオリゴマーと核酸を含むこれらの組成物は、選択された組織の細胞への核酸の送達を達成するために、およびその核酸分子による、その核酸をコードしている所望の分子のインビボでの発現を達成するために有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）重量分率２０％未満の重合度（ＤＰ）＜１０のオリゴマーを、重量分率２０％未満のＤＰ＞５０のオリゴマーに加えて含有するカチオン性オリゴマーである、カチオン性多糖類キトサン由来のカチオン性キトサンオリゴマーと、
（ｂ）核酸との複合体からなることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記カチオン性キトサンオリゴマーが、化学的または酵素的方法を使用してキトサンから得られる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記カチオン性オリゴマーが、好ましくは、重量分率２０％未満のＤＰ＜１２のオリゴマーを、重量分率２０％未満のＤＰ＞４０のオリゴマーに加えて含有し、最も好ましくは、重量分率２０％未満のＤＰ＜１５のオリゴマーを、重量分率２０％未満のＤＰ＞３０のオリゴマーに加えて含有する請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記キトサンオリゴマーのＮ−アセチル化単位（ＦＡ）の分率が、０．６０未満、好ましくは０．３５未満、さらに好ましくは０．１未満、最も好ましくは０．０１未満である請求項１〜３のいずれか１つの項記載の組成物。
【請求項５】
正味正電荷比を本質的に有する請求項１〜４のいずれか１つの項記載の組成物。
【請求項６】
前記キトサンオリゴマーが、ターゲッティングリガンドおよび安定剤を用いて誘導体化される請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記複合体が前記核酸が宿主細胞に導入された時にその機能を発現することとなるコード配列を含む請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記核酸がＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子から成る群より選択される請求項７記載の組成物。
【請求項９】
３．５〜８の範囲のｐＨを有する請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
エーロゾル化後、前記組成物が、同等核酸濃度の核酸のみから成る組成物に匹敵する液滴サイズを本質的に有する請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
（ａ）前記カチオン性キトサンオリゴマーを水性溶媒に暴露する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の水性溶液を水性溶媒中の前記核酸と混合する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で得られた生成物溶液の体積を減少させて、所望の前記組成物濃度を達成する段階とを含む、請求項１〜１０のいずれか１つの項記載の組成物を製造する方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１つの項記載の組成物を使用し、そして該組成物を哺乳動物に導入する、哺乳動物へ核酸を投与する方法。
【請求項１３】
前記組成物が、経肺経路、経鼻経路、経口経路、口腔内経路、舌下経路、直腸内経路または経膣経路による粘膜組織への投与により哺乳動物に導入される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、非経口経路、すなわち、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与もしくは心臓内投与による粘膜下組織への投与によって、または外科手術中に漏出される内臓、血管または他の体表もしくは腔への投与によって哺乳動物に導入される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸が、前記細胞内でその機能を発現することができる、請求項１〜１０のいずれか１つの項記載の組成物を含む請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
哺乳物の予防的または療法的治療用の薬剤の製造における、またはインビボもしくはインビトロでの診断法において使用するのための診断薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか１つの項記載の組成物の用途。
【請求項１７】
悪性疾患、自己免疫疾患、遺伝性疾患、病原感染および他の病理学的疾患の予防的または療法的治療のための遺伝子療法、アンチセンス療法または遺伝学的ワクチン接種において使用するための薬剤の製造における、請求項１６記載の組成物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のための新規非ウイルス性送達システムに関し、より具体的には、宿主組織に投与すると、その組織内の細胞への核酸の導入を助長するシステムに関する。このシステムは、所望の産物をコードしている、およびその組織内に存在する細胞における所望の産物の発現を助長するオリゴまたはポリヌクレオチドなどの生物学的活性核酸を効率的に送達する、生体分解性キトサン多糖類由来の化学的および物理化学的によく定義されたカチオン性キトサンオリゴマーを含む組成物をベースにしたものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法の概念は、核酸ＤＮＡ、ＲＮＡが、適切な部位において治療用蛋白質をインビボ生産させるための医薬品として使用できることに基づく。核酸の送達システムは、多くの場合、ウイルス性送達システムおよび非ウイルス性送達システムとして分類される。それらの非常に進化し、特殊化された成分のため、ウイルス性システムは、送達においても発現においても非常に高い効率を達成する、ＤＮＡ送達の現在最も有効な手段である。しかし、ウイルス性送達システムについては、安全性が案じられる。毒性、免疫抗原性、特定の細胞タイプに制限されたターゲッティング、限定されたＤＮＡ収容力、生産およびパッケージングの問題、組換え、ならびに非常に高い生産コストが、それらの臨床使用を妨げている（非特許文献１）。これらの理由のため、基礎研究室においても、臨床環境においても、非ウイルス性送達システムが益々望ましくなってきている。しかし、製薬学的見地から、ウイルス性送達システムに比べ、非ウイルス性送達システムでは、インビボで得られる発現が比較的低いので、核酸の送達法には、未だ課題が残る（非特許文献２）。
【０００３】
プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）との複合体の形態のカチオン性脂質、ペプチドまたはポリマーを含む様々な非ウイルス性送達システムは、先行技術分野において説明されている（非特許文献３）（非特許文献４）（非特許文献５）。負電荷の核酸は、主としてイオン−イオン相互作用によりカチオン性分子と相互作用し、遊離形から緊密状態に転移することとなる。この状態で、カチオン性分子は、ヌクレアーゼ分解に対する保護を確保することができ、また、細胞との相互作用および細胞による取り込みに有利な核酸−カチオン性分子複合体表面特性も得ることができる（非特許文献６）。
【０００４】
これらのカチオン性分子の中で、合成ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、ｐＤＮＡと安定な複合体を形成し、インビトロでもインビボでも比較的高いトランスジーン発現を媒介することが示されている（非特許文献７）（非特許文献８）（非特許文献９）。このため、ＰＥＩは、実験設定の際の基準系としてよく用いられる。しかし、ＰＥＩについての毒性と有効性の間のおおまかな相関関係が示され（非特許文献１０）、最近の研究は、ＰＥＩの使用に関わる毒性の懸念に取り組んでいる（非特許文献１１）（非特許文献１２）。ＰＥＩに伴うもう一つの欠点は、それが生体分解性でなく、そのため長期にわたって体内に蓄積されうるということである。それ故、有効で非毒性の生体分解性非ウイルス性送達システムについての研究は、非常に望ましい。
【０００５】
最も一般的には、非ウイルス性送達システムは、非経口経路によりインビボ送達されている。マウスに静脈内投与すると、核酸−カチオン性分子緊密複合体は、主として肺毛細血管内に堆積し、遺伝子は、その肺胞中隔の毛細血管内皮において（非特許文献１３）（非特許文献１４）（非特許文献１５）または肺胞細胞においてでさえ発現した（非特許文献１６）（非特許文献１７）が、上皮においては発現しなかった。しかし、配合されていない裸のＤＮＡは、その標的に到達する前に血液循環において急速に分解し、その結果、一般には遺伝子の発現は生じなかった。対照的に、骨格筋への裸のＤＮＡの注入は、結果として用量依存性の遺伝子発現を生じ（非特許文献１８）、それは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などの緊密化しないが「相互作用する」ポリマーと複合した時にさらに増進された（特許文献１）（非特許文献１９）（非特許文献２０）。このように、インビボでの遺伝子トランスフェクションは、予測できない方法で組織依存性であり、故に課題が残る。
【０００６】
胃腸管、鼻および気道への送達である非ウイルス送達システムの粘膜送達も記載されている（非特許文献２１）（非特許文献２２）（特許文献２）。非緊密形のＤＮＡが最良の遺伝子発現をもたらす鼻組織への送達（特許文献３）を除き、粘膜組織での高い発現が求められる時には核酸−カチオン性分子緊密複合体のほうが非緊密ＤＮＡより好ましい。
【０００７】
先行技術では、非ウイルス性送達システムは、どちらかと言えば高分子量、多くの場合、数百キロダルトン（ｋＤａ）で下限５ｋＤａのキトサンなどのカチオン性ポリマーをベースにしている。例えば、（非特許文献２３）（非特許文献２４）および（特許文献４）。低分子量（＜５ｋＤａ）のポリマーは、ＤＮＡと不安定な複合体を形成し、その結果生じる遺伝子発現が低いというのが、その主な理由である（非特許文献２５）。しかし、高分子量のカチオンの使用には、核酸−カチオン性分子緊密複合体の凝集増加および溶解度の問題などの多くの欠点がある（非特許文献２６）。さらに、低分子量のカチオン性分子の使用には、幾つかの生物学的利点がある。すなわち、それらは、一般に、より高分子量のカチオンに比べて低減された毒性および低減された補体活性化を示す（非特許文献２７）（非特許文献２８）。
【０００８】
先行技術分野において、核酸と複合体を形成するための低分子量カチオンの使用に関する幾つかの例が説明されている（非特許文献２９）（非特許文献３０）（非特許文献３１）（非特許文献３２）（非特許文献３３）。しかし、これらの低分子量カチオンは、電場において分離し（アガロースゲル電気泳動）、その結果、インビトロで遺伝子発現を全く生じないか、より高分子量のカチオンと比べて生じる遺伝子発現が非常に低い不安定な緊密体をＤＮＡと形成する。これは、ＤＮＡと低分子量のカチオンとで形成される複合体が一般に不安定で、容易に解離することによって説明することができる（非特許文献３４）。実際、アガロースゲル電気泳動中のカチオン性分子−ＤＮＡ緊密体の解離および裸のＤＮＡの遊離は、文献（非特許文献３５）（非特許文献３６）（非特許文献３７）において無効な配合と有効な配合とを識別するためのアッセイとしてよく利用されている。それにまた、ＤＮＡとカチオンの複合体が高い遺伝子発現を媒介するために安定でなければならないことは、先行技術からわかっている。
【０００９】
先行技術には、非ウイルス性ベクターを使用して核酸を気道に送達するための方法の様々な例が含まれている（非特許文献３８）（非特許文献３９）（非特許文献４０）。本発明者らは、最近、ＤＮＡと複合体を形成するポリマーキトサン（非特許文献４１）、キチンから誘導することができる線状多糖類、をベースにした、そうしたシステムの一つを特定し、特性付けした。キトサンをベースにした遺伝子送達システムは、（特許文献５）、（特許文献６）および（特許文献７）にも記載されている。
【００１０】
キトサンは、上皮関門を越える薬剤送達の改善のための密着結合改変薬剤として導入されている（非特許文献４２）。キトサンは、ヒトに経口投与しても毒性が無いと考えられ、食品添加物として認可されており、創傷治癒用製品にも組み込まれている（非特許文献４３）。
【００１１】
キトサンは、様々な組成および配列の（１→４）結合した２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース（ＧｌｃＮＡｃ、Ａ単位）と２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース（ＧｌｃＮ、Ｄ単位）から成る水溶性線状多糖類のファミリーを含む（図１）。キチンとキトサンを識別するために本明細書で採用した定義は、希酸溶液へのキチンの不溶性と同希酸溶液へのキトサンの溶解性に基づく（非特許文献４４）。
【００１２】
Ａ単位とＤ単位の相対含有率は、Ａ単位の分率として表現することができる：
ＦＡ＝Ａ単位の数／（Ａ単位の数＋Ｄ単位の数）
ＦＡは、下記の関係による脱Ｎアセチル化単位のパーセンテージに関する：
％脱Ｎアセチル化単位＝１００％・（１−ＦＡ）
【００１３】
各Ｄ単位は、親水性でプロトン化可能なアミノ基を含有し、これに対して各Ａ単位は、疎水性のアセチル基を含有する。これら二つのモノマーの相対量（すなわち、Ａ／Ｄ＝ＦＡ／（１−ＦＡ））は、広範に変化させることができ、その結果、それらの化学的、物理的および生物学的特性に幅広い多様性が生じる。これには、溶液での、ゲル状態でのおよび固体状態でのキトサンの特性、ならびに他の分子、細胞および他の生物学的・非生物学的物質とそれらの相互作用が挙げられる。
【００１４】
キトサンの化学構造の影響は、キトサンが、非ウイルス性遺伝子送達システムにおいて使用された最近になって証明された（非特許文献４５）。異なる化学組成のキトサンは、遺伝子送達システムとして構造に依存した効率を示した。ｐＤＮＡと安定な複合体を形成したキトサンのみが、有意なトランスジーン発現を生じた。そうした複合体には、キトサンモノマーの少なくとも６５％が脱アセチル化されていることが必要であった。
【００１５】
キトサンを化学的または酵素的に解重合して、所望の分子サイズのキトサンポリマーまたはオリゴマーを得ることができる。様々な化学的分解メカニズム（すなわち、酸水解、亜硝酸および酸化−還元解重合）を利用して、キトサンを解重合することができる。あるいは、ポリマーの超音波解重合を利用してもよいが、これらの方法は、超低分子量を生じるには非常に不便である。例えば、（特許文献８）および（特許文献９）に記載されているように、亜硝酸の使用によるキトサンの解重合は、低分子量のキトサンの便利な調製方法である。このメカニズムは、図２に示されているような、新しい還元末端に２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース単位を形成し、ＮａＢＨ４を使用してそれを２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンニトールに還元することができるＤ単位の脱アミノ化を含む。あるいは、様々な酵素、例えば、（特許文献１０）、キトサナーゼ、キチナーゼおよびリゾチームを利用して、キトサンを解重合することもできる。酸水解を利用して、キトサンを解重合してもよい（非特許文献４６、およびその中の参考文献）。
【００１６】
先行技術分野において、キトサン−ｐＤＮＡ複合体のインビトロでのトランスフェクション効率に対するキトサンの分子量の影響に関する研究により、サイズ範囲２０〜２００ｋＤａの分子量に対しては有意な依存性がないことが示された（非特許文献４７）（非特許文献４８）。しかし、別の研究（非特許文献４９）では、１５ｋＤａおよび５２ｋＤａのキトサンは、キトサン＞１００ｋＤａより高い遺伝子発現を示した一方で、１．３ｋＤａのキトサンでは遺伝子発現が検出されなかった。さらに、一連の低分子量のキトサン（１．２ｋＤａ、２．４ｋＤａおよび４．７ｋＤａ）を使用したインビトロでの遺伝子発現および肺組織におけるインビボでの遺伝子発現の研究により、４．７ｋＤａのキトサンのみが、有意な遺伝子発現を媒介することが示された（非特許文献５０）。
【００１７】
異なる分子量のキトサンが、非ウイルス性遺伝子送達のための複合体の成分として使用されている。例えば、（特許文献１１）号は、送達システムの成分として小さな分子量のキトサン、すなわち２〜４ｋＤａ  Ｍｗ範囲のキトサンの使用に言及しており、これは、結果として、最小粒子の遺伝子送達システムを生じ、また、インビトロでの縮合送達システムでの細胞のトランスフェクションの増加ももたらした。
【００１８】
遺伝子送達システムにおいて使用される、異なる分子量のキトサンは、通常、市場の供給業者から入手した未分画サンプルであり、有機酸もしくは無機酸、硝酸またはキトサン分解酵素などの分解剤を使用して部分分解することによって、前記サンプルからより低い分子量が得られる。すべての場合、分子量分布は、比較的高いままである。一例として、平均分子量（Ｍｗ）１８０．０００の市販のキトサンは、屈折率検出器およびマルチアングルレーザー光散乱検出器を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。図３Ａは、溶離プロフィール、すなわち、キトサンの濃度に比例する屈折率検出器シグナルと、溶離体積の関数として計算される分子量（酢酸塩形態のキトサンとして表される）のプロットとを併せたものを示す。そのサンプルが、ピークの開始時点で１０６ｇ／ｍｏｌ（１０００ｋＤａ）と高く、ピークの終了時点で１０４（１０ｋＤａ）と低い分子量を有することは、明らかである。これらのデータを再計算することによって、累積分子量分布が得られる（図３Ｂ）。これらの計算から、サンプルの１２％（重量／重量）は、４０ｋＤａ未満の分子量を有し、サンプルの３８％は、１００ｋＤａ未満の分子量を有すると推論できる。同様に、サンプルの１８％は、３００ｋＤａより大きな分子量を有し、９％は、４００ｋＤａより大きな分子量を有する。このように、サンプルは、異なる分子量または鎖長のポリマーを含有するので、多分散性である。
【００１９】
キトサンは、遊離アミン形で、またはキトサン塩化物、キトサングルタミン酸塩およびキトサン酢酸塩などの異なる塩として供給されうる。塩形態は、分子量（Ｍ）とＤＰ（１分子あたりの糖残基の数）の関係に影響を及ぼす。次の方程式は、ＤＰとＭの関係を示すものである：
遊離塩基：  Ｍ＝ＤＰ（１６１（１−ＦＡ）＋２０３ＦＡ）  ＝ＤＰ（１６１＋４２ＦＡ）
キトサン塩化物：  Ｍ＝ＤＰ（１９７．４５（１−ＦＡ）＋２０３ＦＡ）  ＝ＤＰ（１９７．４５＋５．５５ＦＡ）
キトサン酢酸塩：  Ｍ＝ＤＰ（２２１（１−ＦＡ）＋２０３ＦＡ）  ＝ＤＰ（２２１−１８ＦＡ）
キトサングルタミン酸塩：  Ｍ＝ＤＰ（３０８（１−ＦＡ）＋２０３ＦＡ）  ＝ＤＰ（３０８−１０５ＦＡ）
【００２０】
多分散性サンプルの重量平均分子量（Ｍｗ）は、Ｍｗ＝ΣｃｉＭｉ／Σｃｉ（式中、ｃｉは、その分布中の特定の分子量（Ｍｉ）の濃度（ｇ／Ｌ）である）と表すことができる（非特許文献５１）。同様に、数平均分子量（Ｍｎ）は、Ｍｎ＝Σｃｉ／Σ（ｃｉ／Ｍｉ）と表すことができる。上を参照した場合、Ｍｗ＝１８０ｋＤａおよびＭｎ＝８４．５ｋＤａ、ならびにＭｗ／Ｍｎと定義される多分散性指数は、２．１である。２近傍の多分散性は、ランダム解重合を受けた線状ポリマーの特徴である（非特許文献５２）。
【００２１】
キトサンなどの線状ポリマーのランダム解重合後の鎖長分布は、下記方程式（Ｔａｎｆｏｒｄ（１９６１））によって与えられる：
Ｗｘ＝ｘｐｘ−１（１−ｐ）２
Ｗｘは、ｘモノマー（キトサンについては、前記モノマーは糖残基である）を含有する鎖の重量分率であり、ｐは、無傷の連鎖の分率であり、１−ｐは、切断された連鎖の分率である。数平均重合度（Ｘｎ）は、１／（１−ｐ）である。Ｍｎ＝Ｍ０ｘｎ（式中、Ｍ０は、モノマー当量である）であるので、キトサン鎖内で発生した時のＮ−アセチル−グルコサミンの残基についてのモノマー当量は、２０３ｇ／ｍｏｌであり、キトサン鎖内で発生した時の遊離塩基形のグルコサミンの残基についてのモノマー当量は、１６１ｇ／ｍｏｌである。所定のＦＡについての平均Ｍ０は、２０３・ＦＡ＋１６１・（１−ＦＡ）となる。
【００２２】
図４は、４１．５５０から１３．４００までの範囲の異なる重量平均分子量を得るために亜硝酸によって解重合したキトサンのＳＥＣ−ＭＡＬＬＳクロマトグラム（４Ａ）ならびに示差（４Ｂ）および累積（４Ｃ）分子量分布を示す。計算分子量分布が広いままであることを、明らかに示している。これらのデータは、部分解重合によって高分子量のキトサンから生成される、異なる分子量のキトサンが、多分散性のままであり、幅広く異なる分子量の鎖を含有することを、明らかに実証している。
【００２３】
ポリマーの分子量分布は、その分布の一定部分を選択的に除去することにより変更することができる。比較的短い鎖を有するキトサンサンプルをゲル濾過によって分画して、比較的狭い分子量分布を有する個々のオリゴマーまたは画分を得ることができる。一例が、（非特許文献５３）によって与えられており、彼らは、一鎖あたり残基数２〜１０の範囲の精製キトサンオリゴマーを得た。
【００２４】
（非特許文献５４）がキトサンについて実証したように、より高分子量のサンプルをゲル濾過によって分画することもできる。典型的には、セファロースＣＬ−４ＢおよびセファロースＣＬ−６Ｂを含有するゲル濾過カラムを使用し、Ｍｗ＝２７０．０００の正常多分散性サンプルを分画することによって、ＭＷ／Ｍｎ値が１．２〜１．５の画分が得られた。
【００２５】
別の方法では、最も短い鎖を選択的に除去することができる透析または膜技術によって多分散性キトサンを分画することができ、この場合、得られる分布は、初期分布ならびに膜特性多孔度および輸送率、およびその動作条件に依存する。
【００２６】
本発明に従って、驚くべきことに、単一鎖長のキトサンまたは狭い分子量分布を有するキトサンは、同等のＭｗまたはＭｎだがより広い分子量分布を有する他のサンプルに比べ、遺伝子送達における複合体形成剤として異なる特性を有することが見出された。
【００２７】
核酸の複合体形成に使用される多くのカチオン、例えば、ＰＥＩ、ポリリシンおよびキトサンのもう一つの不利点は、それらが、広い分子量分布を有するおおざっぱに処理されたバルクの化学物質であり、それ故、どちらかというと定義を与えられないことである（非特許文献５５）。そうした化学物質がバッチ間変動を示しうることは、充分立証されている。従って、製薬学的見地から、狭い分子量分布を有するよく定義されたポリカチオンが好ましい。
【００２８】
核酸の複合体形成およびその後のトランスフェクションに広い分子量のポリカチオンを使用するもう一つの不利点は、鎖長が異なると、複合体形成およびトランスフェクション有効度も異なることがあることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は、
（ａ）重量分率２０％未満の重合度（ＤＰ）＜１０のオリゴマーを、重量分率２０％未満のＤＰ＞５０のオリゴマーに加えて含有するカチオン性オリゴマーである、カチオン性多糖類キトサン由来のカチオン性キトサンオリゴマーと、
（ｂ）核酸
の複合体を含む組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明に従って、一定の鎖長分布を有するよく定義されたカチオン性キトサンオリゴマーと核酸とを含む組成物は、選択された組織の細胞への核酸の送達を達成するために、および核酸によってコードされた所望の分子のインビボでの発現を達成するために有利であることが、意外にも見出された。
【００３１】
本発明のもう一つの目的は、
（ａ）前記カチオン性キトサンオリゴマーを水性溶媒に暴露する段階；
（ｂ）段階（ａ）の水性溶液を水性溶媒中の前記核酸と混合する段階；および
（ｃ）段階（ｂ）で得られた生成物溶液の体積を減少させて、所望の前記組成物濃度を達成する段階
を含む、本発明の組成物の調製方法を提供することである。
【００３２】
本発明のさらにもう一つの目的は、本発明の組成物を哺乳動物に導入することによる、哺乳動物への核酸の投与方法を提供することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、哺乳物の予防的または療法的治療用の薬剤の製造における、またはインビトロもしくはインビボでの診断法のための診断薬の製造における、本発明の組成物の使用である。
【００３４】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載する一つ以上の実施形態によって提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の組成物は、化学的または酵素的方法によってカチオン性多糖類キトサンから誘導することができる。
【００３６】
本発明の好ましい組成物は、前記カチオン性オリゴマーが、好ましくは、重量分率２０％未満のＤＰ＜１２のオリゴマーを、重量分率２０％未満のＤＰ＞４０のオリゴマーに加えて含有し、最も好ましくは、重量分率２０％未満のＤＰ＜１５のオリゴマーを、重量分率２０％未満のＤＰ＞３０のオリゴマーに加えて含有する組成物である。
【００３７】
よく定義された鎖長、狭い鎖長分布およびよく定義された化学組成を有する低分子量のカチオン性キトサンオリゴマーと核酸との複合体を含む組成物を記載する。典型的には、前記カチオン性オリゴマーは、５００Ｄａと１０，０００Ｄａの間、好ましくは１，２００Ｄａと５，０００Ｄａの間、最も好ましくは３，０００Ｄａと４，７００Ｄａの間の分子量を有する。典型的には、前記カチオン性オリゴマーは、０〜０．３５（脱−Ｎ−アセチル化単位６５〜１００％）、好ましくは０〜０．１の間（脱−Ｎ−アセチル化単位９０〜１００％）、最も好ましくは０〜０．０１の間（脱−Ｎ−アセチル化単位９９〜１００％）のＡ単位の分率（ＦＡ）を有する。適切には、前記核酸は、前記核酸が宿主細胞に導入された時にその機能を発現することとなるコード配列を含む。
【００３８】
本発明の一つの実施形態によると、前記オリゴマーは、カチオン性多糖類キトサンから誘導し、その後、多分散性オリゴマープールを分画して、よく定義された鎖長、狭い鎖長分布および０〜０．３５（脱−Ｎ−アセチル化単位６５〜１００％）、好ましくは０〜０．１の間（脱−Ｎ−アセチル化単位９０〜１００％）、最も好ましくは０〜０．０１の間（脱−Ｎ−アセチル化単位９９〜１００％）のＡ単位の分率（ＦＡ）を有するオリゴマーにする。典型的に、前記オリゴマーは、６〜５０のモノマー単位、好ましくは１０〜３０のモノマー単位、最も好ましくは１５〜２５のモノマー単位から成り、３，０００Ｄａと４，７００Ｄａの間の分子量および０．０１未満のＦＡ（９９％より多くの脱−Ｎ−アセチル化単位）を有する。
【００３９】
本発明の組成物のもう一つの実施形態によると、前記核酸は、ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子から成る群より選択される。これらのＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子は、環状分子、線状分子または両者の混合物から成りうる。好ましくは、前記核酸は、プラスミドＤＮＡから成る。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態によると、前記核酸は、前記核酸が宿主細胞に導入された時にその機能を発現することとなるコード配列を含む。例えば、それは、治療活性、診断活性、免疫原活性または抗原活性を有する蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドなどの生物学的活性産物をコードすることができる。
【００４１】
本発明は、前記核酸が、蛋白質、酵素、ポリペプチド抗原もしくはポリペプチドホルモンをコードしているコード配列を含むか、前記核酸が、ＲＮＡなどのアンチセンス分子として機能するヌクレオチド配列を含む、上に記載したような組成物にも関する。
【００４２】
好ましくは、本発明の組成物は、３．５と８の間のｐＨ範囲を有する。
本発明の組成物は、好ましくは、ターゲッティングリガンドおよび／または安定剤を用いて誘導体化することもできる。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、噴霧後の前記組成物の液滴サイズに関する。好ましくは、本発明の組成物の液滴サイズは、噴霧後の裸のｐＤＮＡの液滴サイズと本質的に等しい。
【００４４】
本発明は、上に記載したような本カチオン性キトサンオリゴマーを提供する段階；（ａ）前記カチオン性キトサンオリゴマーをｐＨ範囲３．５〜８．０の水性溶媒に暴露する段階；（ｂ）段階（ａ）の水性溶液と水性溶媒中の前記核酸とを混合する段階；および（ｃ）段階（ｂ）で得られた生成物溶液を脱水して、インビボでの投与前に高い組成物濃度を達成する段階を含む、本組成物の調製方法にも関する。段階（ｃ）は、（１）段階（ｂ）において生成物溶液の液体を蒸発させて、所望の濃度を得ることによって、または（２）段階（ｂ）において生成物溶液を凍結乾燥し、その後、その凍結乾燥物を再構成して所望の組成物濃度を得ることによって、達成することができる。典型的に、前記核酸は、段階（ｂ）では１ｎｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０〜５０μｇ／ｍＬの濃度で存在し、蒸発法（１）を使用する段階（ｃ）では、１０ｎｇ／ｍＬ〜３，０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１，０００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００４５】
当業者には、負、中性または正の電荷比を含む、異なるアミン／リン酸塩電荷比で本組成物を生成できることは、ご理解いただけよう。しかし、好ましい実施形態は、本発明の組成物が正味正電荷を有するものである。
【００４６】
本発明は、さらに、本発明の組成物を使用し、哺乳動物に本組成物を導入する、哺乳動物への核酸の投与方法に関する。好ましくは、前記組成物は、経肺経路、経鼻経路、経口経路、口腔内経路、舌下経路、直腸内経路または経膣経路による粘膜組織への投与によって哺乳動物に導入される。もう一つの好ましい実施形態によると、前記組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与または心臓内投与などの非経口経路によって哺乳動物に導入される。
【００４７】
本発明は、哺乳物の予防的または療法的治療用の薬剤の製造、またはインビボもしくはインビトロでの診断法において使用するための診断薬の製造、および特に、悪性疾患、自己免疫疾患、遺伝性疾患、病原感染および他の病理学的疾患の予防的または療法的治療のための遺伝子療法、アンチセンス療法または遺伝学的ワクチン接種において使用するための薬剤の製造における本発明の組成物の使用にも関する。
【００４８】
本発明の他の目的、特徴および利点は、後続の詳細な説明から明らかとなろう。しかし、そうした詳細な説明および特定の実施例は、本発明の精神および範囲内での様々な変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、本発明の好ましい実施形態を示しているとはいえ、単に実例として与えるものである。
【００４９】
インビボ肺モデルにおける治療用蛋白質についてのモデルとしてレポーター蛋白質、ルシフェラーゼの発現を利用して、プラスミドＤＮＡと、よく定義された鎖長、鎖長分布および化学組成を有する一定の組成のキトサンオリゴマーとを含む配合物は、選択された組織の細胞への核酸の送達を達成するために、且つ核酸にコードされた所望の分子のインビボでの発現を達成するために有利であることが見出された。
【００５０】
キトサンから調製され、数平均重合度１８（ＤＰｎ＝１８、１３Ｃ−ＮＭＲ分光分析によって判定した）を有し、キューン分布と比べて比較的狭いサイズ分布を示し、９９％より多くのＤ単位（ＦＡ＜０．０１）を有するキトサンオリゴマー画分は、６０：１（＋／−）のアミン／リン酸塩電荷比でｐＬｕｃと安定な複合体を形成することが見出された（アガロースゲル電気泳動によって示される）。６０：１（＋／−）のアミン／リン酸塩電荷比でｐＬｕｃと不安定な複合体を形成した６、１０および１２のモノマー単位を有する単分散性キトサンオリゴマーと比較して、有意に高いインビボ肺ルシフェラーゼ遺伝子発現が、多分散性ＤＰｎ＝１８サンプルで得られた。不安定な複合体より安定な複合体のほうが高い遺伝子発現を生じたことは、先行技術と一致する（非特許文献５６）（非特許文献５７）（非特許文献５８）。しかし、ＤＰｎ１８サンプルより高い平均分子サイズを有するキトサンオリゴマーとで形成された安定な複合体で、ルシフェラーゼ発現の低下が検出された。その画分ＤＰｎ１８を、より狭い分布を有する画分、すなわち、モノマー単位１０〜１４（Ｎ４）、モノマー単位１５〜２１（Ｎ３）、モノマー単位２２〜３５（Ｎ２）およびモノマー単位３６〜５０（Ｎ１）へとさらに分画した。１５〜２１のモノマー単位を有する画分とｐＬｕｃとの複合体は、６０：１（＋／−）のアミン／リン酸塩電荷比で不安定な複合体を形成したが、結果として意外にも最高のインビボ肺遺伝子発現を生じた。１０〜１４のモノマー単位の画分もｐＬｕｃと不安定な複合体を形成し、結果的にわずかなルシフェラーゼ発現しか生じなかった。
【００５１】
また、１５〜２１のモノマー単位を有する画分とｐＬｕｃとの複合体のエーロゾル化は、結果として、裸のｐＬｕｃのエーロゾル化溶液に匹敵する液滴サイズを生じた。対照的に、ｐＬｕｃと複合体を形成した、３６〜５０のモノマー単位を有する画分、およびｐＬｕｃと複合体形成したＵＰＣ（約１０００量体）のエーロゾル化は、結果として、それぞれ２倍よび３倍大きい液滴サイズを生じた。この液滴サイズに対する配合依存性作用は、カチオンの分子量増加に伴う溶液の粘度増大によって説明され、従って、生じる液滴サイズが大きくなる。
【実施例１】
【００５２】
低分子量キトサンの調製
キトサンＰｒｏｔａｓａｎ  ＵＰ  Ｇ２１０（ＦＡ＝０．１７、重量平均分子量１６２，０００）は、Ｐｒｏｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙから入手した。Ｎ−グルコサミンの低分子量オリゴマーは、（非特許文献５９）が記載しているようにＮａＮＯ２を使用するキトサンの化学的解重合およびその後のＮａＢＨ４による還元によって得て、この場合、分子量は、キトサンの量に対するＮａＮＯ２の量によって制御した。アセチル化単位の分率は、以前に記載された（非特許文献６０）ように、プロトンＮＭＲ分光分析によって判定して０．００１未満のＦＡを達成するように不均一脱アセチル化を行うことによって制御した。典型的には、１．０グラムのキトサンを１００ｍＬの２．５％酢酸水溶液に溶解して、その溶液に５分間、窒素ガスを通してバブリングすることにより溶解している酸素を除去し、蒸留水中のＮａＮＯ２の溶液（調製したてのもの、１０ｍｇ／ｍＬ）を５ｍＬ添加した。その反応を暗所で４時間、放置して進行させ、その後、その解重合したキトサンを、３グラムのＮａＢＨ４の添加により暗所で一晩、適便に還元した。酢酸を使用してｐＨを４．５に調節した。その溶液を、０．２Ｍ  ＮａＣｌに三回および蒸留水に六回透析（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ透析管、ＭＷＣＯ  １２０００−１４０００）し、凍結乾燥させて、低分子量オリゴマーを塩酸塩として得た。あるいは、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）からのキトサナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ  ９８３０またはＳｉｇｍａ  Ｃ  ０７９４）を使用する酵素的解重合によって低分子量オリゴマーを得た。この場合、分子量は、キトサンの量に対する酵素の量およびインキュベーション時間によって制御する。０．５グラムのキトサンを、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、０．１Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸バッファ（ｐＨ５．５）に溶解し、０．６５単位のキトサナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ  ０７９４）をそのキトサン溶液に添加して、１８時間、３７℃でインキュベートした。ｐＨを２に下げ、その後、５分間沸騰させることによってその酵素反応を停止させた。その解重合したキトサンを、上記のように透析し、凍結乾燥させて、酵素分解された低分子量のキトサンを塩酸塩として得た。
【実施例２】
【００５３】
分画サンプルの調製および特性付け
実施例１で説明したとおり調製した低分子量キトサンを、以前に記載された（非特許文献６１）ように直列に連結させた二本の２．５ｘ１００ｃｍカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。図６（ａおよびｂ）に示されているクロマトグラムに従って、４ｍＬの画分を回収し、プールして、以下に示す分子量の異なる４つの画分を得た：
【００５４】
Ｎ１（亜硝酸分解されたもの）またはＥ１（キトサナーゼ分解されたもの）
Ｎ２（亜硝酸分解されたもの）またはＥ２（キトサナーゼ分解されたもの）
Ｎ３（亜硝酸分解されたもの）またはＥ３（キトサナーゼ分解されたもの）
Ｎ４（亜硝酸分解されたもの）またはＥ４（キトサナーゼ分解されたもの）
表１  サンプルをＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって分析し、以下の鎖長分布を得た（注入３回の平均）：
【００５５】
【表１】
2005533016.tif 000002
【実施例３】
【００５６】
配合およびインビボ肺遺伝子発現
６〜５０の間の重合度（ＤＰ）（１３Ｃ−ｎｍｒスペクトルにおいて非還元末端から判定すると１８の数平均ＤＰ、Ｎ０）を有する多分散性カチオン性キトサンオリゴマー画分、および６、１０、１２、１０〜１４（Ｎ４）、１５〜２１（Ｎ３）、２２〜３５（Ｎ２）、３６〜５０（Ｎ１）のＤＰを有する、よく定義されたカチオン性オリゴマーを、実施例１および実施例２において説明した方法に従ってキトサンから調製した。発光性飛翔昆虫ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＬｕｃ）をＡｌｄｅｖｒｏｎ，Ｆａｒｇｏ，ＮＤ，ＵＳＡから購入した。カチオン性キトサンオリゴマーの保存溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を滅菌蒸留脱イオン水（ｐＨ６．２±０．１）で調製し、その後、滅菌濾過した。ボルテックスミキサー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＲＥＡＸ  ２０００，ＫＥＢＯ  Ｌａｂ，Ｓｐａｎｇａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で激しく攪拌しながら滅菌水にカチオン性オリゴマーを添加し、その後、ｐＬｕｃを添加することによって、カチオン性キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの複合体を６０：１（＋／−）の電荷比で配合した。１５分後、ＳｐｅｅｄＶａｃ  Ｐｌｕｓ遠心分離機（Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）において約９０分間、真空下で穏やかに蒸発させることによりその複合体を濃縮して、約２５０μｇ／ｍＬのｐＬｕｃ濃度を得た（非特許文献６２）。加えて、以前に最適化された条件、それぞれ電荷比５：１（＋／−）および３：１（＋／−）で、ｐＬｕｃをＰＥＩ  ２５ｋＤａ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｗｅｄｅｎ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）および超純粋キトサン、Ｐｒｏｔａｓａｎ  ＵＰＧ２１０（Ｐｒｏｎｏｖａ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）と配合した（非特許文献６３）（非特許文献６４）。
【００５７】
マウス（雄Ｂａｌｂ／ｃ、週齢６〜８週、１群あたり動物４匹、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、ケタミン／キシラジン（５／２０容量％、体重１０ｇにつき０．１ｍＬ）で麻酔し、頚部の皮膚を長さ０．５ｃｍ切開することで気管を外科的に漏出させた。上記の複合体１００μＬを一滴ずつゆっくりと気管に投与し、マウスを縫合した。投与から７２時間後、それらの動物を二酸化炭素により犠牲にし、肺を外科的に取り出して、ＰＢＳ中で洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ  ＡＢ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含有する氷冷ルシフェラーゼ溶解バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）０．３ｍＬを添加した。それらの組織サンプルを液体窒素で急速冷凍し、分析するまで−８０℃で保管した。
【００５８】
冷蔵室においてそれらの組織サンプルをビードビーター（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，ＯＫ）で均質化し、その後、４℃で１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離（Ｃｅｎｔｉｆｕｇｅ  ５４０３、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｎｅｔｈｅｌａｒ−Ｈｉｎｚｅ  ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）した。各試験管からの透明な上清５０μＬ量を５０μＬのルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、積分時８秒で照度計（Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ＰｈＬ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）により分析した。ルシフェラーゼ発現を定量するために、未治療の対照動物由来の均質化組織の上清に定量のルシフェラーゼ標準物質を加えることによって、ルシフェラーゼの標準曲線（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）を作成した。各サンプルにおける全蛋白質含量をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって分析し、基準蛋白質としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を使用して定量した。マイクロプレート・リーダー（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＭＣＣ／３４０，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用い、５４０ｎｍでの吸収を測定した。
【００５９】
様々な重合度（分子量）のカチオン性キトサンオリゴマーと複合体を形成したｐＬｕｃの投与から７２時間後のマウスの肺における遺伝子トランスフェクション効率の結果を図９に示す。驚くべきことに、有意に最も高いルシフェラーゼ発現が、数平均重合度として１８を有するキトサンオリゴマーＮ０と複合体を形成したｐＬｕｃで得られた。
【００６０】
様々な重合度（分子量）のカチオン性キトサンオリゴマーと複合体を形成したｐＬｕｃの投与から７２時間後のマウスの肺における遺伝子トランスフェクション効率の結果を図１０に示す。数平均重合度として１８を有するキトサンオリゴマーＮ０を、よく定義された、狭い重合度分布を有する４つのサンプルに、実施例２において説明したようにして分画した。驚くべきことに、１５〜２１の間のモノマー単位の鎖長を有するキトサンオリゴマーを含有する画分（Ｎ３）は、ＰＥＩより高い遺伝子発現を示し、且つ、数平均重合度として１８を有する未分画サンプルＮ０と比較して有意に高い遺伝子発現を示した。
【００６１】
アガロースゲル遅延アッセイの結果を図１１に示す。キトサンオリゴマーの分子量（重合度）が増加すると、形成される複合体の安定性が増す。従って、１０〜１４（Ｎ４）および１５〜２１（Ｎ３）のモノマー単位とで形成された複合体と比較すると、２２〜３５（Ｎ２）および３６〜５０（Ｎ１）のモノマー単位を含有する画分とで形成された複合体では、ｐＬｕｃのほぼ完全な保持が検出された。数平均重合度として１８を有する未分画サンプルＮ０も、ｐＤＮＡと安定な複合体を形成した。驚くべきことに、ＤＰｎ１８（Ｎ０）とで形成された安定な複合体と比較して、安定性が劣る１５〜２１（Ｎ３）の複合体で、より高いインビボ遺伝子発現が得られた（図１０）。
【実施例４】
【００６２】
インビトロ遺伝子発現
分画された低分子量のカチオン性キトサンオリゴマーの二つの異なるバッチ；実施例２で説明したような、９ヶ月あけて調製したＮ１およびＥ１と、３年あけて注文した市販のキトサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ  ＵＰＧ  ２１０、バッチ１：見掛け粘度７０ｍＰａｓ、バッチ２：見掛け粘度１４６ｍＰａｓ）を、実施例２で説明したように、それぞれ１０：１（＋／−）と２．４：１（＋／−）の電荷比でｐＬｕｃと複合体を形成させた。安定なｐＤＮＡ複合体を使用した。
【００６３】
トランスフェクションの２４時間前、ヒト胎児腎臓上皮細胞系統２９３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、９６ウエル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に７０％の集密度で播種した。トランスフェクション前に細胞を洗浄して、次に１ウエルにつき５０μＬ（０．３３μｇのｐＬｕｃに対応する）のポリプレックス配合物を添加した。５時間インキュベートした後、それらの配合物を除去し、０．２ｍＬの新鮮培地を添加した。その培地を、二日を越える実験では一日おきに充填した。９６時間および１４４時間の時点で、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄して、溶解し（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ルシフェラーゼ遺伝子発現を照度計（Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ＰｈＬ）で測定した。発現されたルシフェラーゼの量は、発光飛翔昆虫ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて作成した標準曲線から決定し、総細胞蛋白は、ビシンコニン酸試験（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて判定した。
【００６４】
分画された低分子量のカチオン性キトサンオリゴマーの二つのバッチ：Ｎ１およびＥ１と市販のキトサンＰｒｏｔａｓａｎ  ＵＰＧ  ２１０、それぞれとともに２９３細胞をインキュベートした後のインビトロでのルシフェラーゼ遺伝子発現の結果を図１２に示す。遺伝子発現は、Ｐｒｏｔａｓａｎ  ＵＰＧ  ２１０の二つのバッチ間では１０倍異なったが、分画された低分子量のキトサンオリゴマーＮ１とＥ１の二つのバッチ間では有意には異ならなかった。
【実施例５】
【００６５】
エーロゾル化後の液滴サイズ
カチオン性キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの複合体を、実施例３で説明したとおり調製して、５００μｇ／ｍＬのｐＬｕｃ濃度を得た。対照として、ｐＬｕｃと複合体を形成した超純粋キトサン（ＵＰＣ、重合度約１０００）を最適条件、電荷比３：１（＋／−）（非特許文献６５）で使用した。液体およびガス（気体）チャネルを具備する噴霧カテーテル（Ｔｒｕｄｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、カチオン性キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの複合体を含有するエーロゾルが生じた。先ず、１００μＬのその複合体溶液を、その噴霧カテーテルに連結した液体レザバ（液体入口）に装入した。次に、エーロゾルを得るために、加圧空気（３．５ｂａｒ）のパルスを短時間、その液体レザバ（２０ｍｓ）および噴霧カテーテルのガスチャネル（５０ｍｓ）に掛けた。生じたエーロゾルの液滴サイズをＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  Ｘ（Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．,ａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）で測定した。
【００６６】
ｐＬｕｃと複合体を形成したカチオンを含有する組成物をエーロゾル化した後の液滴サイズ（質量中位径、ＭＭＤ）を図１３に示す。ＭＭＤは、明らかに組成物に依存していた。最小の液滴サイズは、「裸の」ｐＬｕｃ、およびｐＬｕｃと複合体を形成した１５〜２１のモノマー単位（Ｎ３）を含有する組成物で得られた。
【００６７】
引用文献一覧
【特許文献１】国際公開公報第９６／２１４７０号公報
【特許文献２】国際公開公報第０１／４１８１０号公報
【特許文献３】国際公開公報第０１／４１８１０号公報
【特許文献４】国際公開公報第９７／４２９７５号公報
【特許文献５】米国特許第５，９７２，７０７号明細書
【００６８】
【特許文献６】国際公開公報第９８／０１１６０号公報
【特許文献７】米国特許出願第２００１／００３１４９７号明細書
【特許文献８】米国特許第３，９９２，２６０号明細書
【特許文献９】米国特許第５，３１２，９０８号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，４８２，８４３号明細書
【特許文献１１】米国特許出願第２００１／００３１４９７号明細書
【００６９】
【非特許文献１】Luo D and Saltzman WM (2000) Synthetic DNA delivery systems. Nat Biotechnol 18:33-37
【非特許文献２】Saeki Y, Matsumoto N, Nakano Y, Mori M, Awai K and Kaneda Y, (1997) Development and characterization of cationic liposomes conjugated with HVJ (Sendai Virus)
【非特許文献３】Boussif O, Lezoualch F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B and Behr JP (1995) A versatile vector for gene and oligo nucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyetylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92:7297-7301
【非特許文献４】Felgner JH, Kumar R, Sridhar CN, Wheeler CJ, Tsai YJ, Border R, Martin M and Felgner PL (1994) Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. Journal of Biological Chemistry 269:2550-2561
【非特許文献５】Hudde T, Rayner SA, Comer RM, Weber M, Isaacs JD, Waldmann H, Larkin DF and George AJ (1999) Activated polyamidoamine dendrimers, a non-viral vector for gene transfer to the corneal endothelium. Gene Ther 6:939-943
【００７０】
【非特許文献６】Ｌedley FD (1996) Pharmaceutical approach to somatic gene therapy, Pharm Res 13:1595-1614
【非特許文献７】Boussif O, Lezoualch F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B and Behr JP (1995) A versatile vector for gene and oligo nucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyetylenimine . Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92:7297-7301
【非特許文献８】Ferrari S, Moro E, Pettenazzo A, Behr J, Zacchello T and Scarpa M (1997) ExGen 500 is an efficient vector for gene delivery to lung epithelial cells in vitro and in vivo. Gene Therapy 4:1100-1106
【非特許文献９】Gautam A, Densmore CL, Golunski E, Xu B and Waldrep JC (2001) Transgene expression in mouse airway epithelium by aerosol gene therapy with PEI-DNA complexes. Mol Ther #:551-556
【非特許文献１０】Luo D and Saltzman WM (2000) Synthetic DNA delivery systems. Nat Biotechnol 18:33-37
【００７１】
【非特許文献１１】Godbey WT, Wu KK and Mikos AG (2001) Poly (ethylenimine)-mediated gene delivery affects endothelial cell function and viability. Biomaterials 22:471-480
【非特許文献１２】Putnam D, Gentry CA, Pack DW and Langer R (2001) Polymer-based gene delivery with low cytotoxicity by a unique balance of side-chain termini. Proc Natl Acad Sci U S A
【非特許文献１３】LiS and Huang L (1997) In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther 4:891-900
【非特許文献１４】LiS, Tan Y, Viroonchatapan E, Pitt BR and Huang L (2000) Targeted gene delivery to pulmonary endothelium by anti-PECAM antibody. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 278:L504-511
【非特許文献１５】Song YK, Liu F, Chu S and Liu D (1997) Characterization of cationic liposome-mediated gene transfer in vivo by intravenous administration. Hum Gene Ther 8:1585-1594
【００７２】
【非特許文献１６】Bragonzi A, Dina G, Villa A, Calori G, Biffi A, Bordignon C. Assael BM and Conese M (2000) Biodistribution and transgene expression with non-viral cationic vector/DNA complexes in the lungs. Gene Ther 7:1753-1760
【非特許文献１７】Griesenbaqch U, Chann A, Cassady R, Hannam V, Ackerley C, Post M, Tanswell AK, Olek K, O'Brodovich H and Tsui LC (1998) Comparison between intra tracheal and intravenous administration of liposome-DNA complexes for cystic fibrosis lung gene therapy. Gene Ther 5:181-188
【非特許文献１８】Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A and Felgner PL (1990) Direct gene transfer into mouse in vivo. Science 247:1465-1468
【非特許文献１９】Mumper RJ, Duguid JG, Anwer K, Barron MK, Nitta H and Rolland AP (1996) Polyvinyl derivatives as novel interactive polymers for controlled gene delivery to muscle. Pharm Res 13:701-709
【非特許文献２０】Mumper RJ, Wang J, Klakamp SL, Nitta H, Anwer K, Tagliaferri F and Rolland AP (1998) protective interactive noncondensing (PINC) polymer fpr enhanced plasmid distribution and expression in rat skeletal muscle. J Control Release 52:191-203
【００７３】
【非特許文献２１】Koping-Hoggard M, Melnikova, Y., Varum K. M., Lindman, B. and Artursson, P. (2001) Chitosan polyplexes as a gene delivery system. Characterization of structure-activity relationships from surpramolecular sharpe. Unpublished
【非特許文献２２】Roy K, Mao HQ, Huang SK and Leong KW (1999) Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy. Nat Med 4:387-391
【非特許文献２３】MacLaughlin FC, Mumper RJ, Wang J, Tagliaferri JM, Gill I, Hinchcliffe M and Rolland AP (1998) Chitosan and depolymerized chitosan oligomers as condensing carriers for in vivo plasmid delivery [In Process Citation]. J Controlled Release 56:259-272
【非特許文献２４】Roy K, Mao HQ, Huang SK and Leong KW (1999) Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy. Nat Med 4:387-391
【非特許文献２５】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121.
【００７４】
【非特許文献２６】MacLaughlin FC, Mumper RJ, Wang J, Tagliaferri JM, Gill I, Hinchcliffe M and Rolland AP (1998) Chitosan and depolymerized chitosan oligomers as condensing carriers for in vivo plasmid delivery [In Process Citation]. J Controlled Release 56:259-272
【非特許文献２７】Fisher D, Bieber T, Li Y, Elsasser HP and Kissel T (1999) A novel non-viral vector for DNA delivery based on low molecular weight, branched polyethylenimine: effect of molecular weight on transfection efficiency and cytotoxicity. Pharm Res 16:1273-1279.
【非特許文献２８】Plank C, Tang MX, Wolfe AR and Szoka FC, Jr. (1999) Branched cationic peptides for gene delivery: role of type nd number of cationic residues in formation and in vivo activity of DNA polyplexes [published erratum appears in Hum Gene Ther 1999 Sep 1:10(13): 2272]. Hum Gene Ther 10:319-332
【非特許文献２９】Florea B, Thanou, M., Geldof, M., C., Junginger, H.E. and Borchard, G. (2001) Modified chitosan oligosaccharides and polyethylenimine as transfection agents for gene therapy in cystic fibrosis. Journal
【非特許文献３０】Godbey WT, Wu KK nd Mikos AG (1999) Size matters: Molecular weight affects the efficiency of poly (ethylenimine) as a gene delivery vehicle. J Biomed Mater Res 45:268-275.
【００７５】
【非特許文献３１】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121
【非特許文献３２】MacLaughlin FC, Mumper RJ, Wang J, Tagliaferri JM, Gill I, Hinchcliffe M and Rolland AP (1998) Chitosan and depolymerized chitosan oligomers as condensing carriers for in vivo plasmid delivery [In Process Citation]. J Controlled Release 56:259-272
【非特許文献３３】Sato T, Ishii T and Okahata (2001) In vitro gene delivery mediated by chitosan. Effect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection efficiency. Biomaterials 22:2075-2080
【非特許文献３４】Koping-Hoggard M, Melnikova, Y., Varum K. M., Lindman, B. and Artursson, P. (2001) Chitosan polyplexes as a gene delivery system. Characterization of structure-activity relationships from surpramolecular sharpe. Unpublished
【非特許文献３５】Fisher D, Bieber T, Li Y, Elsasser HP and Kissel T (1999) A novel non-viral vector for DNA delivery based on low molecular weight, branched polyethylenimine: effect of molecular weight on transfection efficiency and cytotoxicity. Pharm Res 16:1273-1279.
【００７６】
【非特許文献３６】Gebhart CL and Kabanov AV (2001) Evalution of polyplexes as gene transfer agents. J Control Release 73:401-416.
【非特許文献３７】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121
【非特許文献３８】Deshpande D, Blezinger P. Pillai R, Duguid J, Freimark B and Rolland A (1998) Target specific optimization of cationic lipid-based systems for pulmonary gene therapy. Pharm Res 15:1340-1347.
【非特許文献３９】Ferrari S, Moro E, Pettenazzo A, Behr J, Zacchello T and Scarpa M (1997) ExGen 500 is an efficient vector for gene delivery to lung epithelial cells in vitro and in vivo. Gene Therapy 4:1100-1106
【非特許文献４０】Gautam A, Densmore Cl, Xu B and Waldrep JC (2000) Enhanced gene expression in mouse lung after PEI-DNA aerosol delivery. Mol Ther 2:63-70
【００７７】
【非特許文献４１】Koping-Hoggard M, Melnikova, Y., Varum K. M., Lindman, B. and Artursson, P. (2001) Chitosan polyplexes as a gene delivery system. Characterization of structure-activity relationships from surpramolecular sharpe. Unpublished
【非特許文献４２】Artursson P, Lindmark T, Davis SS and Illum L (1994) Effect of chitosan on the permeability of monolayers of intestinal epithelial cells (Caco-2). Pharm Res 11:1358-1361.
【非特許文献４３】Illum L (1998) Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharm Res 15:1326-1331.
【非特許文献４４】Roberts G.A.F., "Chitin Chemistry" (1992), Macmillan, London, page 6-7.
【非特許文献４５】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121
【００７８】
【非特許文献４６】Varum, KM, Ottoy, MH and Smidsrod, O (2001) Acid hydrolysis of chitosans
【非特許文献４７】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121
【非特許文献４８】MacLaughlin FC, Mumper RJ, Wang J, Tagliaferri JM, Gill I, Hinchcliffe M and Rolland AP (1998) Chitosan and depolymerized chitosan oligomers as condensing carriers for in vivo plasmid delivery [In Process Citation]. J Controlled Release 56:259-272
【非特許文献４９】Sato T, Ishii T and Okahata (2001) In vitro gene delivery mediated by chitosan. Effect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection efficiency. Biomaterials 22:2075-2080
【非特許文献５０】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121
【００７９】
【非特許文献５１】C. Tanford (1961) Physical chemistry of macrolecules, John Wiley and Sons, New York, Section 8b and 33a.
【非特許文献５２】C. Tanford (1961) Physical chemistry of macrolecules, John Wiley and Sons, New York, Section 8b and 33a.
【非特許文献５３】Tommeraas K, Varum KM, Christensen BE and Smidsrod O (2001) Preparation and characterization of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerization of chitosans. Carbohvdr Res 333:137-144.
【非特許文献５４】Ottoy MH, Varum KM, Christensen BE, Anthobsen MW & Smidsrod O (1996) Preparative and analytical size-exclusion chromatography of chitosans
【非特許文献５５】Godbey WT, Wu KK and Mikos AG (1999) Size matters: Molecular weight affects the efficiency of poly (ethylenimine) as a gene delivery vehicle. J Biomed Mater Res 45:268-275.
【００８０】
【非特許文献５６】Fisher D, Bieber T, Li Y, Elsasser HP and Kissel T (1999) A novel non-viral vector for DNA delivery based on low molecular weight, branched polyethylenimine: effect of molecular weight on transfection efficiency and cytotoxicity. Pharm Res 16:1273-1279.
【非特許文献５７】Gebhart CL and Kabanov AV (2001) Evalution of polyplexes as gene transfer agents. J Control Release 73:401-416.
【非特許文献５８】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121
【非特許文献５９】Tommeraas K, Varum KM, Christensen BE and Smidsrod O (2001) Preparation and characterization of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerization of chitosans. Carbohvdr Res 333:137-144.
【非特許文献６０】Varum KM, Anthonsen MW, Grasdalen H and Smidsrod O (1991) Determination of the degree of N-acetylation and the distribution of N-acetyl groups in partially N-deacetylated chitins (chitosans) by high-field n.m.r. spectroscopy. Carbohydr Res 211-17-23.
【００８１】
【非特許文献６１】Tommeraas K, Varum KM, Christensen BE and Smidsrod O (2001) Preparation and characterization of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerization of chitosans. Carbohvdr Res 333:137-144.
【非特許文献６２】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121
【非特許文献６３】Bragonzi A, Dina G, Villa A, Calori G, Biffi A, Bordignon C. Assael BM and Conese M (2000) Biodistribution and transgene expression with non-viral cationic vector/DNA complexes in the lungs. Gene Ther 7:1753-1760
【非特許文献６４】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121
【非特許文献６５】Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Varum K. and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】キトサン鎖のフラグメントがＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基（Ａ単位）１個とβ−Ｄ−グルコサミン残基（Ｄ単位）３個を含有する、キトサンの化学組成を示す図である。Ｄ単位のアミノ基は、ｐＨに依存してプロトン化形であることもあり、非プロトン化形であることもある。
【図２．Ａ】酸またはキトサナーゼによるキトサンの解重合後に得られる化学構造を示す図である。酸は、Ａ単位（新たに形成された還元末端のＡ単位）の次にくるグルコシド結合を優先的に切断する。酵素は、両方の種類の残基を加水分解することによって、特異性が変化する。
【図２．Ｂ】Ｄ残基のみを攻撃する（Ｄ残基を転位させて、２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノースを形成する）、硝酸によるキトサンの解重合を示す図である。
【図３】重量平均分子量（Ｍｗ）１８０．０００の市販のキトサンを、屈折率検出器およびマルチアングルレーザー光散乱検出器を使用し、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した結果を示す図である。カラム：ＴＳＫ  Ｇ６０００ＰＷＸＬ、５０００ＰＷＸＬおよび４０００ＰＷＬＸ（直列連結した）。溶離剤：０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５。ＲＩ検出器：Ｏｐｔｏｍｅｄ  ＤＳＰ（Ｗｙａｔｔ）。光散乱検出器：ＤＡ  ＷＮ  ＤＳＰ（Ｗｙａｔｔ）。処理パラメータ（Ａｓｔｒａソフトウエア  ｖ．４．７０．０７）：ｄｎ／ｄｃ＝０．１４２ｍＬ／ｇ（キトサン酢酸塩についてはオフラインで判定。その値は、ＦＡに依存しないことが見出された）。Ａ２：５．０・１０−３ｍｏｌ・ｍＬ・ｇ−２。  ３Ａ：溶離プロフィール、すなわち、キトサン濃度に比例する屈折率検出器シグナルと、溶離体積の関数として計算された分子量のプロット（この場合、酢酸塩形態のキトサンとして表される）とを併せたもの。  ３Ｂ：３Ａで得られたデータから計算した累積分子量分布。
【図４】４１．５００から１３．４００までの範囲の異なる重量平均分子量を得るために亜硝酸によって解重合したキトサンのＳＥＣ−ＭＡＬＬＳクロマトグラム（４Ａ）ならびに示差（４Ｂ）および累積（４Ｃ）分子量分布を示す図である。実験条件は、図３の場合と同じであった。
【図５】１００、５０、２０および１０残基（ＤＰｎ）を得るべく解重合されたキトサンについてのキューン分布に対応する計算累積（Ａ）および示差（Ｂ）分子量分布である。
【図６】ａ）亜硝酸によって解重合し、ＮａＢＨ４（Ｎ１−Ｎ４）で還元し、またはｂ）キトサナーゼ（Ｅ１−Ｅ４）によって解重合した完全脱−Ｎ−アセチル化キトサン（ＦＡ＜０．００１）のサイズ排除クロマトグラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ３０；直列の２．５ｘ１００ｃｍカラム２本；溶離剤：０．１５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．５、流量：０．８ｍＬ／分）である。ＤＰ＝６は、完全脱−Ｎ−アセチル化キトサン六量体の溶離体積を示す。
【図７】亜硝酸によって解重合して、ＮａＢＨ４で還元した完全脱−Ｎ−アセチル化キトサン（ＦＡ＜０．００１）（未分画サンプル）、および図６に関して説明したようにして得られた画分Ｎ１−Ｎ４のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳクロマトグラム（７Ａ）である。実験条件は、単一カラム（ＴＳＫ  Ｇ３０００  ＰＷＸＬ）を使用したことを除き、図３の場合と同じであった。図７Ｂは、７Ａで得られたデータから計算した、対応する累積分子量分布を示す図である。
【図８】キトサナーゼによって解重合したキトサン（未分画サンプル）および図６に関して説明したようにして得られた画分Ｅ１−Ｅ４のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳクロマトグラム（８Ａ）である。実験条件は、単一カラム（ＴＳＫ  Ｇ３０００  ＰＷＸＬ）を使用したことを除き、図３の場合と同じであった。図８Ｂは、７Ａで得られたデータから計算した、対応する累積分子量分布を示す図である。
【図９】マウス（１群あたり動物４匹）における２５μｇのｐＬｕｃの気管内投与から３日後のインビボ肺ルシフェラーゼ発現（ｐｇ／ｍｇ）を示す図である。キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの複合体を、６０：１（＋／−）のアミン／リン酸塩電荷比で調製した。１３Ｃ−ＮＭＲ−分光分析によって判定して、数平均重合度として１８を有するキトサンオリゴマーＮ０と複合体を形成したｐＬｕｃで、有意に高いルシフェラーゼ発現が得られた。平均値間の統計学的相違を、ＡＮＯＶＡを使用して検討した。群平均間の相違は、ｐ＜０．０５で有意と見なした。
【図１０】マウス（１群あたり動物４匹）における２５μｇのｐＬｕｃの気管内投与から３日後のインビボ肺ルシフェラーゼ発現（ｐｇ／ｍｇ）を示す図である。数平均重合度として１８を有するキトサンオリゴマーＮ０を、よく定義された、狭い重合度分布を有する４つの異なるサンプルに分画した。キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの複合体を、６０：１（＋／−）のアミン／リン酸塩電荷比で調製した。モノマー単位１５〜２１の間の鎖長を有するオリゴマーを含有する画分（Ｎ３）をベースにした複合体は、数平均重合度として１８を有する未分画サンプルＮ０をベースにした複合体と比較して、有意に高い（ｐ＜０．０５）遺伝子発現を示した。平均値間の統計学的相違を、ＡＮＯＶＡを使用して検討した。群平均間の相違は、ｐ＜０．０５で有意と見なした。
【図１１】アガロースゲル遅延アッセイの結果を示す図である。キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの複合体を、６０：１（＋／−）のアミン／リン酸塩電荷比で調製した。キトサンオリゴマーの分子量（重合度）が増加するほど、形成される複合体の安定性が高いことが認められた。従って、３６〜５０のモノマー単位（Ｎ１）を含有する画分とで形成された複合体では、１５〜２１のモノマー単位（Ｎ３）とで形成された複合体と比較して、完全なｐＬｕｃ保持が検出された。
【図１２】９ヶ月あけて調製した分画低分子量カチオン性キトサンオリゴマー（Ｎ１およびＥ１）と３年あけて注文した市販のキトサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ  ＵＰＧ  ２１０）、それぞれの二つのバッチとともに２９３細胞をインキュベートした後のインビトロでのルシフェラーゼ遺伝子発現を示す図である。遺伝子発現は、２．４：１（＋／−）のアミン／リン酸塩比でｐＬｕｃと複合体を形成したＰｒｏｔａｓａｎ  ＵＰＧ  ２１０の二つのバッチ間では１０倍異なったが、１０：１（＋／−）のアミン／リン酸塩電荷比でｐＬｕｃと複合体を形成した分画低分子量カチオン性キトサンオリゴマー（Ｎ１およびＥ１）の二つのバッチ間では有意には異ならなかった。平均値間の統計学的相違を、ＡＮＯＶＡを使用して検討した。群平均間の相違は、ｐ＜０．０５で有意と見なした。
【図１３】ｐＬｕｃと複合体形成したカチオンを含有する組成物のエーロゾル化後の液滴サイズ（質量中位径、ＭＭＤ）を示す図である。１５〜２１（Ｎ３）および３６〜５０（Ｎ１）のモノマー単位を含有するキトサンオリゴマーの画分ならびに超純粋キトサン、Ｐｒｏｔａｓａｎ  ＵＰＧ  ２１０（ＵＰＣ）を、それぞれ６０：１（＋／−）および３：１（＋／−）のアミン／リン酸塩電荷比で、ｐＬｕｃと複合体形成させた。ＭＭＤは、明らかに組成物に依存していた。最小液滴サイズは、裸のｐＬｕｃ、およびｐＬｕｃと複合体形成した１５〜２１のモノマー単位（Ｎ３）を含有する組成物で得られた。平均値間の統計学的相違を、ＡＮＯＶＡを使用して検討した。群平均間の相違は、ｐ＜０．０５で有意と見なした。
【図１】
2005533016.tif 000003
【図２．Ａ】
2005533016.tif 000004
【図２．Ｂ】
2005533016.tif 000005
【図３】
2005533016.tif 000006
【図４】
2005533016.tif 000007
【図５】
2005533016.tif 000008
【図６】
2005533016.tif 000009
【図７】
2005533016.tif 000010
【図８】
2005533016.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2005533016.tif 000013
【図１１】
2005533016.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
2005533016.tif 000016
【国際調査報告】
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