(57)【要約】本発明は、生物的ストレス、塩誘導、乾燥誘導、酸化、浸透圧ストレスに対して耐性の植物の作出についての、Y11414遺伝子又はその機能性ホモログの使用、及び前記遺伝子配列を含む生成物、例えば、トランスジェニック植物の作出に有用な発現カセット及び生物学的ベクターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Y11414遺伝子又は他の種におけるその機能性ホモログの、生物的、塩誘導、乾燥誘導、酸化及び浸透圧ストレスに対して耐性のトランスジェニック植物の作出における使用。
【請求項２】
生物的、塩誘導、乾燥誘導、酸化及び浸透圧ストレスの予防及び／又は処置に関する請求項１記載の使用。
【請求項３】
遺伝子が、Y11414遺伝子、その機能性変異体、相補的配列、及びその転写生成物である請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
機能性ホモログが、Y11414遺伝子の可変領域との少なくとも７０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列である請求項１又は２記載の使用。
【請求項５】
Y11414遺伝子の可変領域との少なくとも７０％の相同性によって特徴付けられるポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
Y11414遺伝子によって、他の種におけるその機能性ホモログによって、又はY11414遺伝子の可変領域との少なくとも７０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項７】
Y11414遺伝子によって、他の種におけるその機能性ホモログによって、又はY11414遺伝子の可変領域との少なくとも７０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの、生物的、塩誘導、乾燥誘導、酸化及び浸透圧ストレスの防止及び／又は処置における使用。
【請求項８】
Y11414遺伝子、他の種におけるその機能性ホモログによって、又はY11414遺伝子の可変領域との少なくとも７０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列を含む発現（ボックス）カセットの、生物的、塩誘導、乾燥誘導、酸化及び浸透圧ストレスに対して耐性のトランスジェニック植物の作出における使用。
【請求項９】
請求項５によるポリヌクレオチド配列に動作可能なように結合したプロモーターを含む発現（ボックス）カセット。
【請求項１０】
請求項５によるポリヌクレオチド配列又は請求項９による発現（ボックス）カセットを含む生物学的ベクター。
【請求項１１】
請求項１０による生物学的ベクターにて形質転換した植物宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１による植物宿主細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１３】
生物的、塩、乾燥、酸化及び浸透圧ストレスによって、植物において引き起こされる傷害を処置及び／又は防止する方法であって、前記植物を、Y11414遺伝子を含む宿主細胞にて形質転換することを含む植物の傷害の処置及び／又は予防法。
【請求項１４】
塩、乾燥、酸化及び浸透圧ストレスによって、植物において引き起こされる傷害を処置及び／又は防止する方法であって、前記植物を、請求項１１による宿主細胞にて形質転換することを含む植物の傷害の処置及び／又は予防法。
【請求項１５】
生物的、塩誘導、乾燥誘導、酸化及び浸透圧ストレスに対して耐性のトランスジェニック植物を作出する方法であって、Y11414遺伝子、その機能性ホモログ、又は請求項５によるポリヌクレオチド配列を使用することを含むトランスジェニック植物の作出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある種の生物的及び非生物的ストレスに耐えることができる植物の作出に関するMybファミリーの特殊な遺伝子の使用、特に、各種の悪環境条件に対する植物の防御に関与するR2R3クラスのある種Myb遺伝子及びこれらと結合したタンパク質の使用に関する。本発明は、前記遺伝子の配列を含む生成物、例えば、発現ボックス（カセット）及びトランスジェニック植物の作出において有用な生物学的ベクターの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、莫大な量の微生物（例えば、真菌類、細菌、ウイルス）及び病原体の攻撃を絶えず受けており、これに対して、植物は、植物自体で利用できるオペレーション防御機構に身を置くことによって、自身を防御している。このような防御プロセスは、病原体と効果的に戦うことに関して、常に充分であるとは言えず、その結果、被害植物に対して悪影響を及ぼす。
【０００３】
生物的ストレス以外にも、植物は、植物が生存する環境の変性（時には、妥当なもの）の原因となる各種の環境的攻撃を受ける。このように、例えば、寒さ、土壌の高塩濃度又は乾燥が、植物に対するストレス及び被害を引き起こす。
【０００４】
生物的又は非生物的ストレスは、植物の生長及び発達に関する強力な制限ファクターであり、対象の種の生産性、農産物の質及び栄養価に関する傷害の重大な原因であり、良好な耐性植物の獲得は、多くの国において、公然かつ公共の研究プログラムにおける重要な目的である。
【０００５】
このような研究は、過去数年の間に、生物的及び非生物的の両方の環境ストレスに対する応答として活性化された遺伝子の発見及びこの遺伝子の２つの大きなクラス、特に、耐性の獲得に直接関与する遺伝子の発現を活性化及び調節するストレスシグナルの認知、変換及び増幅に関与するレギュレータータンパク質をコードする遺伝子のクラス（Zhu, J.K., Hasegawa, P.M. and Bressan, R., 1997, Critical review in Plant Sci. 16: 253; Gu, Y.Q., Wildermuth, M.C., Chakravarthy, S., Lho, Y.T., Yang, C., HeX., Han, Y. and Martin, G.B., 2002, Plant Cell, 14, 817）及び基本的な生物学的プロセスに対して、直接の保護／シェルター機能を発揮する遺伝子（その発現は、生化学的及び生理学的応答及び、その結果として、ストレスに対する耐性を基礎とする）のクラス（Thomashow, M.F., 1999, Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol., 50: 571; schenk, P.M., Kazan, K., Wilson, I., Anderson, J.P., Richmond, T., Somerville, S.C. and Manners, J.M., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 11655）への分類をもたらしている。
【０００６】
後者のクラスの遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物は、このアセンブリーの１つのシングル遺伝子のみが、環境ストレスに対する耐性の獲得に、極めて部分的に、かつ、わずかに寄与する点を明らかにし、一方、前者のクラスの転写ファクター（当該ファクターは、耐性の獲得に関与するいくつかのダウンストリーム遺伝子の同時共同発現を制御、調節しうる）をコードする遺伝子を過剰発現する植物は、シングル転写ファクターのみを持つ形質転換植物が、一連の遺伝子にて形質転換された植物と同様に挙動するため、非形質転換（「野生形」）植物と比べて、誘導状態において、より良好な能力を発揮する（Jaglo-ottosen, K.R., Gilmour, S.J., Zarka, D.G., Schbenberger, O. 及びThomashow, M.F., 8, Science, 28: 104; Liu, Q., Kasuga, M., Sakuma, Y., Abe, H., Miura, S., Yamaguchi, K., and Shinozaki, K., 1998, Plant Cell, 10: 1391; Schenk, P.M., Kazan, K., Wilson, I., Anderson, J.P., Richmond, T., Somerville, S.C. 及びManners, J.M., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 11655）。
【０００７】
発明者らは、最近、Mybタイプの転写ファクターをコードするコメ（オリザ・サティバ(Oryza sativa)）のcDNAクローンを単離し、これらのいくつかについて、ストレスの応答における機能を実証した。植物組織では、転写ファクターのMybファミリーは、細胞増殖及び形態形成、細胞代謝、ストレス応答の如きいくつかの植物細胞プロセスの制御及び調節における関与のため特に興味深い。
【０００８】
よく知られているように、Myb遺伝子の配列は、Ｎ-末端保存領域（続いて、各種の長さ又は配列の領域が存在する）の存在によって特徴付けられる。保存領域は、ターゲット遺伝子のプロモーターにおける特殊な配列を認識及び結合する機能を有し、特定位置のトリプトファン（トリプトファンドメイン）によって特徴付けられるアミノ酸約５６個を含むブロックでなる。存在するトリプトファンドメインの数及びタイプに従って、Myb遺伝子は、R1R2R3、R1/R2、R2R3タイプと称される。可変のＣ-末端領域は、通常、転写活性、細胞の局在化、ポスト転写調節及び他のタンパク質との相互作用を担う。異なる生物のMyb遺伝子におけるこの領域の配列相同性は、機能的同一性の証拠である。
【０００９】
特に、発明者らは、コメから、クラスR2R3のMybファクターをコードする特殊なcDNAを単離した（その配列を受託番号 Y11414 (EMBL)にて寄託している）。Y11414遺伝子は、元来、最適温度条件下、コメの子葉鞘において低レベルで発現され、その発現は、低温、１０℃（コメにとって致死下の温度である）処理によって、強く誘導される。この条件下で誘導される遺伝子は、最も極度の低温下におけるストレス防御にとって重要と考えられる。異種システム（タバコプロトプラスト）及び同種システム（コメカルス）のいずれにおいても、Y11414は、１）低温誘導ビーンPAL遺伝子、２）ジャガイモのデサチュラーゼＤ９のプロモーター（この酵素は低温誘導性であり、細胞膜脂肪酸における二重結合の形成に触媒作用を発揮し、二重結合の形成は、低温に対する主要な応答の１つである）を転写促進する。元来、Y11414遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（同型接合及びシングル導入の両方）は、「野生形」植物と比較する場合、−１０℃までの低温での処理に対して例外的な耐性を発揮し、このようにして、トランスジェニック植物シロイヌナズナに低温及び凍結ストレスに対する耐性を付与する現実かつ効果的な能力を実証する（Osnato M.ら, Proceedings of the XLV Italian Society of Agricultural Genetics-SIGM Annual Congress Salsomaggiore Terme, Italy-26/29 September 2001; Pandolfiら, Plant Physiology, 114, p747, PGR97-079）。
【００１０】
特に、Y11414遺伝子の発現は、低温ストレスによって誘導されるが、酸素欠乏、高塩濃度、乾燥の如き他の環境ストレスによって誘導されず、また、ABAでのホルモン処理によっても誘導されない（Pandolfiらの上記文献）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明者らは、驚くべきことには、Y11414遺伝子及び他の種の機能性ホモログは、このような遺伝子が、生物的及び非生物的ストレス（例えば、高塩濃度、乾燥、浸透圧ストレス、酸化ストレス）によって、本質的に、直接的には誘導されないとしても、これらのストレスに対する耐性を付与することを新たに見出した。
【００１２】
さらに、このような遺伝子にて形質転換した植物は、病原体に対する耐性に関連する各種の遺伝子の重要な発現を示すとの知見を得た。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このように、１態様によれば、本発明は、生物的ストレスに対して耐性のトランスジェニック植物の作出についてのY11414遺伝子又は他の種の機能性ホモログの使用に関する。
【００１４】
１態様によれば、本発明は、塩ストレス、乾燥ストレス、酸化ストレス、及び浸透圧ストレスに対して耐性のトランスジェニック植物の作出についてのY11414又は他の種の機能性ホモログの使用に関する。
【００１５】
上記の非生物的ストレスに対する良好な耐性は、上記のように、Y11414及びその機能性ホモログが、本質的に、このようなストレスによって誘導されないことを考慮すると、特に驚くべきことである。
【００１６】
本明細書において使用する用語「遺伝子」は、単離されたポリヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列（DNA）の単離されたフラグメントを意味する。
【００１７】
「単離されたヌクレオチド配列」は、通常、天然産物と結合される生物学的物質を、本質的に含まないことを意図するものである。
【００１８】
本発明による遺伝子は、自然界から入手可能な、単子葉タイプ又は双子葉タイプの両方の植物から単離される。
【００１９】
本発明において使用されるように、用語「生物的ストレス」は、真菌類、細菌、ウイルス又は他の病原体のような病原性生物の攻撃によって引き起こされる悪環境条件を意味する。
【００２０】
本発明において使用されるように、用語「生物的及び非生物的ストレスに対する耐性のトランスジェニック植物」は、遺伝子的に変性され、対応する「野生形」植物と比較して、生物的及び非生物的ストレスに直面して、より大きい適合性及び生存能力を発揮する植物を意味する。
【００２１】
本発明において使用されるように、用語「機能性ホモログ」は、Y11414遺伝子によってコメ植物において発揮されるものと類似の機能を植物において発揮する遺伝子及びポリヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、ホモログは、Y11414遺伝子の可変領域と、少なくとも７０％、有利には、少なくとも８０％、例えば９０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列である。
【００２２】
他の態様によれば、本発明の目的は、上記のストレスに対する耐性のトランスジェニック植物の作出についての、Y11414遺伝子の可変領域との少なくとも７０％、有利には、少なくとも８０％、例えば９０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列の使用にある。
【００２３】
他の態様によれば、本発明は、生物的ストレスの予防及び／又は処置、及び、植物において、高塩濃度、乾燥、酸化ストレス、及び浸透圧ストレスによって引き起こされる傷害の予防及び／又は処置についての、Y11414遺伝子又は他の種の機能性ホモログの使用に関する。
【００２４】
本発明は、生物的ストレス、及び高塩濃度、乾燥によって引き起こされるストレス、酸化ストレス、及び浸透圧ストレスに対して耐性のトランスジェニック植物の作出についての、Y11414遺伝子の機能変異体、相補性配列、及び転写生成物、又はその機能性ホモログの使用にも関する。
【００２５】
本発明による使用に関して有利な遺伝子は、Y11414遺伝子自体である。
【００２６】
本発明は、Y11414遺伝子によって、他の種の機能性ホモログによって、その機能変異体によって、又はY11414遺伝子の可変領域との少なくとも７０％、有利には、少なくとも８０％、例えば９０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、及び本発明による前記ポリペプチドの使用を包含する。
【００２７】
Y11414遺伝子の他の種の機能性ホモログ、及び、有利には、Y11414遺伝子の可変領域との少なくとも７０％、有利には、少なくとも８０％、例えば９０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列（Y11414遺伝子自体を除く）は本発明の一部である。
【００２８】
さらに、発現ボックス（カセット）、生物学的ベクター、宿主細胞、及びY11414遺伝子の前記機能性ホモログを含む、有利には、Y11414遺伝子の可変領域との少なくとも７０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列（Y11414遺伝子自体を除く）を含むトランスジェニック植物も本発明の一部である。
【００２９】
本発明による使用について、従来の遺伝子操作法を介して、選択した遺伝子を「野生形」植物（又は、任意に、既に形質転換した植物）に導入する。
【００３０】
本発明による使用に関して形質転換される農学的に興味深い植物の例としては、穀類（例えば、コメ、トウモロコシ及びデュラム小麦）、果物及び野菜（例えば、トマト、ジャガイモ、リンゴ及び他の果樹）、豆果（例えば、豆、エンドウ）、観賞植物だけでなく、優れたストレス耐性を付与するために本発明に従って形質転換される他の植物が挙げられる。
【００３１】
このような目的のため、例えば、選択された遺伝子のcDNAを、動作可能なように、好適なプロモーターに結合し、このようにして得られた発現カセットを、生物学的ベクターに導入し、このベクター自体を、形質転換される植物の細胞に導入する。
【００３２】
好適なプロモーターの例は、例えば、Osnatoらの上記文献（双子葉植物に関する構成プロモーターCaMV35Sの使用が開示されている）に記載されている。
【００３３】
他の好適なプロモーターは、例えば、単子葉植物にとって本来的なものであるUbil（Christen及びQuail, Transgenic Research, 5, 213-218, 1996）又はCor15（Bakerら, 1994, Plant Mol. Biol., 24: 701-713）である。
【００３４】
本発明は、植物において、生物的、塩、乾燥、酸化及び浸透圧ストレスによって引き起こされる傷害を処置及び／又は予防する方法にも関し、該方法は、前記植物に、Y11414遺伝子、他の種におけるその機能性ホモログ、及びY11414遺伝子との少なくとも７０％、有利には、少なくとも８０％又は９０％の配列相同性を示すポリヌクレオチド配列から選ばれるポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を導入することを包含する。
【００３５】
本発明による使用に関する代表的な遺伝子の発現の効果を証明するため、表現型耐性効果、及びコメ転写ファクターY11414の過剰発現によってトランスジェニック植物シロイヌナズナにおいて誘導される転写の変化（「マイクロアレイ」分析による）を検査した。
【００３６】
本発明を証明及び説明するために行った実験を、下記の実験の部に示すが、これらは、いずれにしても、本発明を限定するものではない。
【００３７】
実験の部
トランスジェニック植物の作出
Y11414遺伝子のcDNAを、CaMV35Sプロモーターの下及び遺伝子番号のターミネーターの上流側に置き、このようにして得られた発現カセットを、二元性ベクター（大腸菌（E. coli）−アグロバクテリウム（Agrobacterium））PGA470に導入した。二元性ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のGV3101菌株に、エレクトロポレーションによって導入し、ついで、「floral dip」法により植物シロイヌナズナ（cv Wassilewskija）を形質転換するために使用した。
【００３８】
結果
得られた結果のコンピューターによる分析は、病原体に対する植物の防御において極めて重要であると考えられるいくつかの遺伝子、特に、SAR（システミック・アクワイヤード・レスポンス）として知られた防御応答事象に関与するものの重要な発現を示した。特に、フェニルプロパノイド及びリグニンの生合成に関与する遺伝子の多く又は全て（デヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、ケイ皮酸-４-ヒドロキシラーゼ、PAL、シトクローム P450、EPSP、カフェオイル-CoA メチルトランスフェラーゼ、シンナモイル CoA リラクラーゼ）が誘導されることが分かった。微生物の攻撃を受けた際、フェノール化合物である安息香酸（ＢＡ）及びサリチル酸（ＳＡ）が、高濃度で蓄積され、これらは、防御応答の重要なメディエーターと考えられる。ＢＡ及びＳＡは、いずれも、スチルベン及び他のフィトアレキシンと共に、フェニルプロパノイドの代謝誘導体である。
【００３９】
また、各種のＰＲ（病原体関連物）、例えば、ある種の「ヒドロキシプロリン富有糖タンパク質」（HRGPs、エクステンシン）、プロテイナーゼインヒビター、ペルオキシダーゼ、グルタチオン S-トランスフェラーゼ及び「脂質移動タンパク質」をコードする遺伝子の転写が誘導されることも究明された。
【００４０】
最後に、両エチレン誘導遺伝子及び前記遺伝子を活性化する少なくとも１つの転写ファクターの転写が誘導されることも分かった。
【００４１】
マイクロアレイ分析から、活性酸素種に対する解毒作用に関与する酵素（カタラーゼ、グルタチオン S-トランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ）をコードするいくつかの遺伝子の発現も誘導されることが判明した。
【００４２】
これらの知見に基づき、生物的及び非生物的ストレスに対する耐性についてのY11414遺伝子の影響をチェックすることが適切であることを記憶した。
【００４３】
生物的ストレスに対する耐性
病原体に対する耐性レベルを、それぞれ、ウイルス（TNV、タバコ壊死ウイルス）、細菌（Pseuidomonas syringae pv. Tomato）及び真菌類（ボトリティス・シネレア（Botrytis cinerea））を機械的に接種し、続いて、感染の発展を毎日１５日間行うことによって評価した。兆候の発展の終了時、感染した葉の組織のコンピューター化分析によって及び／又はTNVの場合には傷害の数を計数することによって評価した。テストした３種の病原体の全てに関して、Y11414を発現する植物は、野生型と比較して、高い耐性レベルを示した。
【００４４】
非生物的ストレスに対する耐性
乾燥ストレスに対する耐性
Y11414にて形質転換したトランスジェニック植物を、水やり中止処理に供した。特に、１０日、２０日及び３０日間水やりを中止した「野生型」植物及び形質転換植物の状態を観察した。１０日及び２０日では、「野生型」植物は、退緑及び脱水の重大な兆候を示したが、形質転換植物は、傷害を受けているとは認められなかった。３０日では、「野生型」は完全に乾燥したが、形質転換植物は、傷害を示したが、生存していた。
【００４５】
塩ストレスに対する耐性
300mM NaClでの１及び２週間の処理により示されるように、生存率の１２％（「野生型」）から２９％（Y11414にて形質転換したもの）への増大及び１０％（「野生型」）から２７％（形質転換したもの）への増大、又は600mM NaClでの１時間の処理により示されるように、生存率の２０％から６０％への増大によって、Y11414にて形質転換した植物は、塩ストレスに対してより良好な耐性を有することが証明された。
【００４６】
酸化ストレスに対する耐性
野生型植物及びY11414にて形質転換した植物を、紫外線処理及びオゾンくん蒸に供することによって、酸化ストレスに対する耐性を評価した。両処理を行った場合、形質転換植物は、両処理のため、野生型植物において高い細胞致死を生じた線量においても、高度に耐性であることが分かった。
【００４７】
上記の事実から、特に、実施した実験の結果から、病原体に対する植物の保護及び高塩濃度、浸透圧ストレス及び乾燥のような非生物的ストレスからの植物の保護に関して、上記遺伝子によって発揮される基本的な役割が明らかになり、その結果、本発明は、特に農業の分野において重要であることが明白になった。
【国際調査報告】
2005533498.tif 000002
2005533498.tif 000003
2005533498.tif 000004
2005533498.tif 000005
2005533498.tif 000006