(57)【要約】相補的なポリプリン配列に連結した少なくとも１個のポリピリミジン配列であって該ポリプリン配列が８−アミノアデニン、８−アミノグアニン及び８−アミノヒポキサンチンのような少なくとも１個の８−アミノプリンを含むものと、該ポリプリン配列に対して相補的且つ逆平行である少なくとも１個のポリピリミジン標的配列とを含むヘアピンを含む三重鎖を提供する。該ポリプリン配列は三重らせんを形成することによって該ポリピリミジン標的配列に結合する。また、該ヘアピンの製造方法及び該三重鎖を安定化させるための方法も提供する。さらに、本発明のヘアピン及び三重鎖を使用した単鎖オリゴヌクレオチド及びＤＮＡのターゲティング方法も説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個のポリプリン配列とを含むヘアピンあって該ポリプリン配列の少なくとも１個が該第１ポリピリミジン配列に対して相補的且つ平行でありそして該ポリプリン配列が少なくとも１個の８−アミノプリンを含むもの、及び、
少なくとも１個のポリピリミジン標的配列であって該ポリピリミジン標的配列の少なくとも１個が該ポリプリン配列に対して相補的且つ逆平行であるもの
を含む三重鎖であって、該ポリピリミジン標的配列及び該ヘアピンが互いに結合している、三重鎖。
【請求項２】
ポリピリミジン標的配列が少なくとも１個のプリン中断を含む請求項１に記載の三重鎖。
【請求項３】
ヘアピンのポリプリン配列が少なくとも１個のピリミジン中断を含む請求項１に記載の三重鎖。
【請求項４】
ヘアピンの第１ポリピリミジン配列が少なくとも１個のプリン中断又は脱塩基中断又は脱塩基モデル化合物中断を含む請求項１に記載の三重鎖。
【請求項５】
リンカーがヘキサエチレングリコール、テトラチミン、ＣＴＴＴＧ又はＧＧＡＧＧのうちの少なくとも一つである請求項１に記載の三重鎖。
【請求項６】
８−アミノプリンが８−アミノグアニンを含む請求項１に記載の三重鎖。
【請求項７】
８−アミノプリンが８−アミノアデニンを含む請求項１に記載の三重鎖。
【請求項８】
８−アミノプリンが８−アミノヒポキサンチンを含む請求項１に記載の三重鎖。
【請求項９】
少なくとも１個の８−アミノプリンを含むヘアピンの製造方法であって、
ピリミジン鎖を準備し、
該ピリミジン鎖の３'末端にリンカーを結合させ、
少なくとも１個の８−アミノプリンを含むプリン鎖を準備し、そして
該プリン鎖の３'末端を該リンカーに結合させることによって該ヘアピンを製造すること
を含む、少なくとも１個の８−アミノプリンを含むヘアピンの製造方法。
【請求項１０】
少なくとも１個の８−アミノプリンを含むヘアピンの製造方法であって、
少なくとも１個の８−アミノプリンを含むプリン鎖を準備し、
該プリン鎖の５'末端にリンカーを結合させ、
ピリミジン鎖を準備し、そして
該ピリミジン鎖の５'末端を該リンカーに結合させることによって該ヘアピンを製造すること
を含む、少なくとも１個の８−アミノプリンを含むヘアピンの製造方法。
【請求項１１】
少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個のポリプリン配列とを含むヘアピンであって、該ポリプリン配列の少なくとも１個が少なくとも１個の８−アミノプリンを含み、そして該ポリプリン配列が該第１ポリピリミジン配列に対して相補的且つ平行であるヘアピン。
【請求項１２】
三重鎖を安定化させるための方法であって、
少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個の８−アミノプリンを含む少なくとも１個のポリプリン配列とを含むヘアピンを含む三重鎖を得、そして
該三重鎖と塩化ナトリウム溶液とを接触させること
を含む、三重鎖を安定化させるための方法。
【請求項１３】
塩化ナトリウム溶液が約１Ｍの濃度を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
三重鎖を安定化させるための方法であって、
少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個の８−アミノプリンを含む少なくとも１個のポリプリン配列とを含むヘアピンを含む三重鎖を得、そして
該三重鎖とマグネシウム含有溶液とを接触させること
を含む、三重鎖を安定化させるための方法。
【請求項１５】
マグネシウム濃度が約１０ｍＭ以下である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、該第１ポリピリミジン配列に対して相補的且つ逆平行でしかも少なくとも１個の８−アミノプリンを含む少なくとも１個の第１ポリプリン配列とを含むヘアピン、及び、
該ヘアピンに対してＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型配向で配列した標的配列
を含む三重鎖。
【請求項１７】
標的配列がＧ及びＴ塩基を含む請求項１６に記載の三重鎖。
【請求項１８】
標的配列がＧ及びＡ塩基を含む請求項１６に記載の三重鎖。
【請求項１９】
２個の相補オリゴヌクレオチド鎖を逆平行Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型配置で配列してなるオリゴヌクレオチド二重鎖。
【請求項２０】
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型二重鎖を安定化させるための方法であって、
少なくとも１個のプリンを含むＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型二重鎖を得、そして
該プリンの少なくとも１個を少なくとも１個の８−アミノプリンで置換することによって該Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型二重鎖を安定化させること
を含む、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型二重鎖を安定化させるための方法。
【請求項２１】
単鎖オリゴヌクレオチドをターゲティングするための方法であって、
第１ポリプリン配列の標的又は第１ポリピリミジン配列の標的のいずれかを有する単鎖オリゴヌクレオチド上の領域を選択し、
第２ポリピリミジン配列と第２ポリプリン配列とを含むヘアピンであって該第２ポリプリン配列が少なくとも１個の８−アミノプリンを含み且つ該第２ポリピリミジン配列に対して相補的なものを準備し、そして、
該ヘアピンと該第１ポリプリン配列標的又は該第１ポリピリミジン配列標的とを接触させることによって該単鎖オリゴヌクレオチド上の該領域をターゲティングすること
を含む、単鎖オリゴヌクレオチドをターゲティングするための方法。
【請求項２２】
単鎖オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡよりなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡをターゲティングするための方法であって、
第１ポリプリン配列の標的又は第１ポリピリミジン配列の標的のいずれかを有するＤＮＡ上の領域を選択し、
第２ポリピリミジン配列と第２ポリプリン配列とを含むヘアピンであって該第２ポリプリン配列が少なくとも１個の８−アミノプリンを含み且つ該第２ポリピリミジン配列に対して相補的なものを準備し、
該ヘアピンと該第１ポリプリン配列標的又は該第１ポリピリミジン配列標的とを接触させることによって該ＤＮＡ上の該領域をターゲティングすること
を含む、ＤＮＡをターゲティングするための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリピリミジン配列と、リンカーと、該ポリピリミジン配列に対して相補的且つ平行なポリプリン配列とを含む新規な三重鎖であって、該ポリプリン配列が少なくとも１個の８−アミノプリンと該ポリプリン配列に対して相補的且つ逆平行であるポリピリミジン標的配列とを含むものに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術の説明
ＤＮＡは、二重鎖、三重鎖及び四重鎖を含む多様ならせん構造を形成し得る。右巻きのＢ型二重鎖はＤＮＡの最も一般的な構造であるが、Ｂ型ＤＮＡの発見後数１０年たった今なお、新規なＤＮＡ二重らせんコンフォメーションが説明されつつある。しかして、当業者であれば、ＤＮＡが大きな柔軟性を有し、しかも配列、化学的修飾又はＤＮＡの環境の変化に依存して大きな多形性を示すことが分かる。
【０００３】
周知のＢ型及びＡ型を含め、多くのＤＮＡ二重鎖は逆平行である（即ち、一方の鎖が５'→３'へと続き、他方が３'→５'へと続く）が、平行な配列がヘアピン及び線状ＤＮＡの両方で見出されている。平行なＤＮＡを形成する傾向のある配列が特定の染色体領域で見出され、そしてこれは進化的な役割を果たし得る。さらに、あるタイプの平行鎖ＤＮＡは、三重鎖の形成のための優れた鋳型であり得る。これは、アンチジーン治療（人工オリゴヌクレオチドによる遺伝子ＤＮＡのターゲティング）及びアンチセンス治療（人工オリゴヌクレオチドによる自然メッセンジャーＲＮＡのターゲティング）を含め、生物工学的目的にとって非常に有用である。
【０００４】
平行ＤＮＡ二重鎖は、プロフラビンが介在した非常に短いミスマッチＤＮＡ配列の結晶構造において最初に発見された。平行二重鎖の低分解能データが、アデニンの２位が嵩高基の付加によって修飾された配列［ｄ（Ａ・Ｕ）］の長いＲＮＡ断片について見出された。高分子平行二重鎖ＤＮＡの第１の構造モデルは、Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎによって得られ、彼は、理論計算に基づき、逆ワトソン・クリックモチーフに基づくポリ［ｄ（Ａ・Ｔ）］二重鎖の平行対合のモデルをデザインした。このモデルは、ｄ（Ａ・Ｔ）リッチ配列についての低及び高分解能実験技術によって確認されている。
【０００５】
Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎによって初期に説明され且つＮＭＲデータによってさらに洗練された平行二重鎖モデルは、標準的な逆平行Ｂ型らせんとはさほどかけ離れていない一般構造を示している。それらの塩基は大部分がらせん軸に対して垂直であり、２個の同等の溝が存在し、糖単位はサウス領域においてパッカリングを与え、そしてＡ・Ｔ対合は逆ワトソン・クリック（図１）である。この構造（平行逆ワトソン・クリック（ｒＷＣ）二重鎖）は、Ｊｏｖｉｎ外により様々な熱力学的技術及びスペクトル技術を使用して示されているように、ｄ（Ａ・Ｔ）対がリッチな平行鎖らせんにとって最も安定なコンフォメーションである。このｒＷＣ二重らせんは、同等の逆平行らせんよりも安定性に劣るが、逆平行ｄ（Ａ・Ｔ）らせんの形成を妨げるようにデザインされたヘアピン及び線状ＤＮＡにおいて見出され得る。このｒＷＣ二重らせんに数個のｄ（Ｇ・Ｃ）ステップが存在することは許容されるかもしれないが、このものは二重鎖を不安定化させる。
【０００６】
また、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ（Ｈ）認識形態を基にした平行二重鎖のための別の構造も可能である（図１）。これは、三重鎖形成のための鋳型として作用するかもしれない二重らせんに至るであろう（今までのところ構造の観点からは説明されていない）。Ｈ対合に基づく平行鎖ＤＮＡの二重鎖は、プリンが２位で修飾され、しかもワトソン・クリック及び逆ワトソン・クリック対合の両方を阻害する二重鎖、又はｄ（Ｇ・Ｃ）（若しくはｄ（Ｇ・Ｇ））対がリッチな二重鎖で生じる。これら後者の二重鎖は、中性のｐＨで存在できるが、これらのものはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型シトシン（図１）をプロトン化させる必要があるため低いｐＨで特に安定である。また、この二重鎖の安定性は、ベンゾピリドインドール誘導体のようなＤＮＡ結合性の薬剤によって向上し得る。最後に、Ｌａｖｅｌｌｅ及びＦｒｅｓｃｏ外によって示されたように、Ｈ型平行二重鎖は、ある条件下では標準的なＢ型逆平行二重鎖よりも安定であることができる。
【０００７】
オリゴヌクレオチドは、配列に特異的な態様で二重鎖並びに単鎖ＤＮＡ及びＲＮＡのホモプリン−ホモピリミジン配列に結合して三重鎖を形成する。核酸三重鎖は、診断、遺伝子分析及び遺伝子治療における幅広い用途、即ち、特定のヌクレオチド配列の抽出及び精製、遺伝子発現の調節、遺伝子ＤＮＡのマッピング、遺伝子ＤＮＡへの変異導入、ホモプリンＤＮＡ配列における変異の検出、部位特異的突然変異誘発、ウイルスＤＮＡ組込の三重鎖仲介抑制、二重らせんＤＮＡの非酵素的連結及びポリメラーゼ連鎖反応の定量化の用途を有する。
【０００８】
これらの用途の主な欠点の一つは、特に中性の条件において、またホモプリン−ホモピリミジントラックが中断を有するときに、三重らせんの安定性が低いことである。修飾オリゴヌクレオチドをデザインし、しかしてホモプリン−ホモピリミジントラック中に中断を有するホモポリマー及び三重鎖において三重らせんの安定性を向上させるために多大な努力がなされてきた。成功した核酸塩基の修飾としては、５−メチルシチジン、５−メチル−２，６−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン及び２'−Ｏ−メチルプセウドイソシチジンのような分子が挙げられる。
【０００９】
三重鎖は、典型的には、三重鎖形成用オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を二重鎖ＤＮＡに付加させることによって形成される。しかしながら、別のアプローチは、平行鎖の二重鎖の使用に基づく。それによって、プリン残基が３'−３'又は５'−５'ヌクレオチド間連結によって逆極性のピリミジン鎖に連結する。当業者に知られている折り畳まれた全ピリジンヘアピンに類似するこのような平行鎖ＤＮＡヘアピンが合成され、そして単鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ標的を三重鎖形成により結合させる。
【００１０】
当業者であれば、平行鎖ＤＮＡの構造は非常に柔軟であり且つ配列、ｐＨ及び薬物の存在に依存してＨからｒＷＣモチーフに変化し得ることが分かるであろう。低いｐＨ及びｄ（Ｇ・Ｃ）対の高含量はＨ型構造に有利に働くが、ｒＷＣらせんはｄ（Ａ・Ｔ）リッチ配列及び中性又は塩基性のｐＨが有利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の要約
本発明では、従来技術の理論計算及びスペクトル技術を使用して混合ｄ（Ａ・Ｔ）及びｄ（Ｇ・Ｃ）配列における平行二重鎖の構造を分析した。本発明は、ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡの三重らせんの形成用の鋳型として使用でき且つ生物工学的及び薬学的研究に大きな影響を与える平行二重鎖を安定化させるための８−アミノ誘導体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一具体例では、少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個のポリプリン配列とを含むヘアピンであって該ポリプリン配列の少なくとも１個が該第１ポリピリミジン配列に対して相補的且つ平行でありそして該ポリプリン配列が少なくとも１個の８−アミノプリンを含むもの、及び、少なくとも１個のポリピリミジン標的配列であって該ポリピリミジン標的配列の少なくとも１個が該ポリプリン配列に対して相補的且つ逆平行であるものを含む三重鎖であって、該ポリピリミジン標的配列と該ヘアピンが互いに結合している三重鎖を提供する。本発明の好ましい具体例では、該三重鎖は、ポリピリミジン標的配列が少なくとも１個のプリン中断を含むものを包含する。本発明の別の具体例では、該三重鎖は、ヘアピンのポリプリン配列が少なくとも１個のピリミジン中断を含むものを包含する。本発明のさらに別の具体例では、該三重鎖は、ヘアピンの第１ポリピリミジン配列が少なくとも１個のプリン中断又は脱塩基中断又は脱塩基モデル化合物中断を含むものを包含する。本明細書で説明するときに、三重鎖は、ヘキサエチレングリコール、テトラチミン、ＣＴＴＴＧ又はＧＧＡＧＧのうちの少なくとも一つであるリンカーを包含する。
【００１３】
本発明の好ましい具体例では、三重鎖は、８−アミノプリンが８−アミノグアニンを含むものを包含する。
【００１４】
本発明の別の好ましい具体例では、三重鎖は、８−アミノプリンが８−アミノアデニンを含むものを包含する。
【００１５】
本発明の別の好ましい具体例では、三重鎖は、８−アミノプリンが８−アミノヒポキサンチンを含むものを包含する。
【００１６】
本発明の別の具体例は、ピリミジン鎖を準備し、該ピリミジン鎖の３'末端にリンカーを結合させ、少なくとも１個の８−アミノプリンを含むプリン鎖を準備し、そして該プリン鎖の３'末端を該リンカーに結合させることによってヘアピンを製造することを含む少なくとも１個の８−アミノプリンを含有するヘアピンの製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の具体例では、少なくとも１個の８−アミノプリンを含むプリン鎖を準備し、該プリン鎖の５'末端にリンカーを結合させ、ピリミジン鎖を準備し、そして該ピリミジン鎖の５'末端を該リンカーに結合させることによってヘアピンを製造することを含む、少なくとも１個の８−アミノプリンを含有するヘアピンの製造方法を提供する。
【００１８】
本発明の別の具体例は、少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個のポリプリン配列とを含むヘアピンであって、該ポリプリン配列の少なくとも１個が少なくとも１個の８−アミノプリンを含み、そして該ポリプリン配列が該第１ポリピリミジン配列に対して相補的且つ平行であるものを包含する。
【００１９】
また、本発明は、少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個のアミノプリンを含む少なくとも１個のポリプリン配列とを含むヘアピンを含む三重鎖を得、そして該三重鎖と塩化ナトリウム溶液又はマグネシウム若しくはその誘導体を含有する溶液とを接触させることを含む、三重鎖を安定化させるための方法も提供する。
【００２０】
本発明の別の具体例では、少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個の第１ポリプリン配列とを含むヘアピンであって該ポリプリン配列が該第１ポリピリミジン配列に対して相補的且つ逆平行でしかも少なくとも１個の８−アミノプリンを含むもの、及び、該ヘアピンに対してＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型配向で配列した標的配列を含む三重鎖を提供する。
【００２１】
本発明の別の具体例では、２個の相補オリゴヌクレオチド鎖を逆平行Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型配置で配列してなるオリゴヌクレオチド二重鎖を提供する。
【００２２】
また、本発明は、少なくとも１個のプリンを含むＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型二重鎖を得、そして該Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型二重鎖を、該プリンの少なくとも１個を少なくとも１個の８−アミノプリンで置換することによって安定化させることを含む、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型二重鎖を安定化させるための方法も提供する。
【００２３】
本発明のさらに別の具体例では、第１ポリプリン配列の標的又は第１ポリピリミジン配列の標的のいずれかを有する単鎖オリゴヌクレオチド上の領域を選択し、第２ポリピリミジン配列と第２ポリプリン配列とを含むヘアピンであって該第２ポリプリン配列が少なくとも１個の８−アミノプリンを含み且つ該第２ポリピリミジン配列に相補的なものを準備し、そして該ヘアピンと該第１ポリプリン配列標的又は該第１ポリピリミジン配列標的とを接触させることによって該単鎖オリゴヌクレオチド上の該領域をターゲティングすることを含む、単鎖オリゴヌクレオチドのターゲティング方法を提供する。好ましい具体例では、この方法は、単鎖オリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡよりなる群から選択することを含む。
【００２４】
本発明の別の具体例は、第１ポリプリン配列標的又は第１ポリピリミジン配列標的のいずれかを有するＤＮＡ上の領域を選択し、第２ポリピリミジン配列と第２ポリプリン配列とを含むヘアピンであって該第２ポリプリン配列が少なくとも１個の８−アミノプリンを含み且つ該第２ポリピリミジン配列に相補的なものを準備し、そして該ヘアピンと該第１ポリプリン配列標的又は該第１ポリピリミジン配列標的とを接触させることによって該ＤＮＡ上の該領域をターゲティングすることを含む、ＤＮＡのターゲティング方法を提供する。
【００２５】
図面の簡単な説明
図１は、ワトソン・クリック、逆ワトソン・クリック及びＨｏｏｇｓｔｅｅｎのＡ・Ｔ対合の略図である。
【００２６】
図２は、８−アミノ誘導体の導入によって誘導された平行二重鎖の安定化を計算するために使用した熱力学サイクルを示している。
【００２７】
図３は、Ａ及びＢトラジェクトリーで得られたＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型二重鎖のＭＤ平均構造を示している。Ｂ型三重鎖におけるＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型二重鎖のコンフォメーションを比較のために示している。
【００２８】
図４は、逆ワトソン・クリック型二重鎖の３つのトラジェクトリーで得られた最終的な構造を示している。実験に基づくＮＭＲ構造（表１の参照ｆ）から生み出された構造を比較のために示している。
【００２９】
図５は、標準的な逆平行二重鎖（左）及びＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型平行二重鎖（右）についての古典的な分子相互作用ポテンシャル（ｃＭＩＰ：上）及び溶媒和マップ（下）を表している。ｃＭＩＰの外形は、−５〜５ｋｃａｌ／モルの相互作用エネルギーに相当する（Ｏ+をプローブとして使用した）。溶媒和の外形は、２ｇ／ｍＬの密度に相当する。平行二重鎖について、ｃＭＩＰ及び溶媒和マップは、Ａ及びＢトラジェクトリーを同時に平均して決定された。
【００３０】
図６は、プロトン化及びゆらぎＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型８ＡＧ−Ｃ２量体を示したものである。
【００３１】
図７は、本発明の８−アミノプリン：８−アミノアデニンＡN、８−アミノグアニンＧN、８−アミノヒポキサンチンＩN及び（ＥＧ）6ヘキサエチレングリコールリンカーを有する平行鎖ヘアピンの配列を表している。また、コントロールとして使用した２種の逆平行二重鎖も示している。
【００３２】
図８は、Ｒ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２（配列番号１、配列番号２）並びに２種の逆平行二重鎖Ｄ１（配列番号１、配列番号２）及びＤ２（配列番号１、配列番号９）についてのｐＨによるＴmの依存性を示している。
【００３３】
図９は、（Ａ）ヘアピンＢ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）、Ｂ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）、Ｂ−ＡＴ（配列番号６、配列番号７）、及びＢ−２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８）（ピリミジン鎖配列がランダムであるＢ−２２ヘアピン）と好適な単鎖オリゴヌクレオチド（Ｓ１１ＷＣ）（配列番号１６）とによって形成された逆平行二重鎖のＣＤスペクトル、並びに（Ｂ）Ｂ２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８）単独及び逆平行相補ピリミジン鎖の付加後のＣＤスペクトルを示している（０．１Ｍ燐酸ナトリウム，ｐＨ６．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）。
【００３４】
図１０は、Ｔ＝５０℃でのｄ（３'−ＡＧＡNＧＧＡNＧＧＡＡＧ−５'−（ＥＧ）6−５'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ−３'）のＮＭＲスペクトルの交換性プロトン領域を示している。
【００３５】
図１１は、Ｇ：８−アミノＧ：Ｃ及びＴ：８−アミノＡ：Ｔの塩基対合スキームを示している。
【００３６】
図１２は、ｓ11−ＧＡ（配列番号１４）及びｓ11−ＧＴ（配列番号１５）、ｈ26（配列番号１１）、ｈ26−３ＡＧ（配列番号１２）及びｈ26−３ＡＡ（配列番号１３）で実行されたゲルシフト分析を示している。
【００３７】
図１３は、ヘアピンＲＥ−２ＡＧ（配列番号４、配列番号１４）及びそのポリピリミジン標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）で実行されたゲルシフト分析を示している。
【００３８】
図１４は、ポリピリミジン単鎖核酸を本発明のヘアピンと結合させるスキームを示している。下部分：８−アミノプリンを含有する３回軸の塩基対合スキーム。
【００３９】
図１５は、本発明の８−アミノプリンである８−アミノアデニンＡN、８−アミノグアニンＧN、８−アミノヒポキサンチンＩN、及びヘキサエチレングリコールリンカー（ＥＧ）6、及びＧＴＴＴＣ、ＧＧＡＧＧ及びＴＴＴＴリンカーを有する平行鎖ヘアピンの配列を示している。また、脱塩基モデル化合物を含有する本発明のヘアピンも示している。
【００４０】
図１６は、平行Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ（Ｈｏ）及び逆平行ワトソン・クリック（ＷＣ）二重鎖のトラジェクトリーと、それらの各ＭＤ平均構造との間の２乗平均平方根偏差（Ａで表すＲＭＳｄ）（上）、及び、その同一のトラジェクトリーと、逆平行三重鎖における両二重鎖のＭＤ平均構造との間の２乗平均平方根偏差（下）を表している。両末端の塩基は、ＲＭＳｄ計算のために除去した。
【００４１】
図１７は、Ｒ２２（配列番号１、配列番号２）、Ｒ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）のＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）への結合を示している（１００ｍＭＮａ+イオン強度のクエン酸−燐酸塩緩衝液ｐＨ６）。放射性同位元素標識したＤＮＡ標的（１０ｎｍｏｌ）を室温で２〜２００当量のコールドヘアピンＲ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｒ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）と共にインキュベートし、そしてこれらの混合物を室温で１５％の未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【００４２】
図１８は、ヘアピンＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）の単鎖標的Ｔ31（配列番号３２）へのｐＨ５．０での結合を示している。左側：32Ｐ標識オリゴヌクレオチドは標的Ｔ31（配列番号３２）であり、そして増加量（２×、２０×、２００×）のコールドＢ−２２Ｇを添加した。右側：32Ｐ標識オリゴヌクレオチドはヘアピンＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）であり、そして増加量（２×、２０×、２００×）のコールドＴ31（配列番号３２）を添加した。インキュベーション時間は室温で１時間である。
【００４３】
図１９は、ヘアピンＢ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）及びＢ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）単独の及びそれらのピリミジン標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）とのＣＤスペクトルを示している（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１Ｍの燐酸ナトリウムｐＨ６）。
【００４４】
図２０は、Ｂ２２Ａ：ｄ（３'−ＡＧＡNＧＧＡNＧＧＡＡＧ−５'−（ＥＧ）6−５'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ−３’）（配列番号３、配列番号２）及びＷＣ−１１ｍｅｒ（３'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ−５'）（配列番号１６）によって形成された三重鎖のＴ＝５℃でのＮＭＲスペクトルの交換性プロトン領域を示している。
【００４５】
図２１は、ヘアピンＢ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）によって形成された三重鎖の様々な塩濃度での融解温度を示している。
【００４６】
図２２は、ヘアピンＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）の単鎖及び二重鎖標的への結合をゲルシフト実験により示している。
【００４７】
図２３は、ＣＤに従うＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）及びＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号）によって形成された三重鎖についての融解実験を示している。
【００４８】
図２４は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対及び平行鎖ＤＮＡを示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも１個のポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個のポリプリン配列とを含むヘアピンであって該ポリプリン配列が該ポリピリミジン配列に対して相補的且つ平行でありそして少なくとも１個のアミノプリンを含むもの、及び、該ポリプリン配列に対して相補的且つ逆平行なポリピリミジン標的配列を含む三重鎖を提供する。このポリピリミジン標的配列とヘアピンは互いに結合している。この三重鎖は、ポリピリミジン標的配列が少なくとも１個のプリン中断を含むものを包含する。本発明の別の具体例では、三重鎖は、ヘアピンのポリプリン配列が少なくとも１個のピリミジン中断を含むものを包含する。別の具体例では、ここに記載されるような三重鎖は、ヘアピンの第１ポリピリミジン配列が少なくとも１個のプリン中断又は脱塩基中断又は脱塩基モデル化合物中断を含むものを包含する。
【００５０】
本発明の少なくとも１個の８−アミノプリンを含有するヘアピンの製造方法は、ピリミジン鎖を準備し、該ピリミジン鎖の３'末端にリンカーを結合させ、少なくとも１個の８−アミノプリンを含むプリン鎖を準備し、そして該プリン鎖の３'末端を該リンカーに結合させることによってヘアピンを製造することを含む。別の具体例では、少なくとも１個の８−アミノプリンを含有するヘアピンの製造方法は、少なくとも１個の８−アミノプリンを含むプリン鎖を準備し、該プリン鎖の５'末端にリンカーを結合させ、ピリミジン鎖を準備し、そして該ピリミジン鎖の５'末端を該リンカーに結合させることによってヘアピンを製造することを含む。
【００５１】
本発明は、少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個のポリプリン配列とを含むここに説明されるようなヘアピンであって該ポリプリン配列の少なくとも１個が少なくとも１個の８−アミノプリンを含みそして該ポリプリン配列が該第１ポリピリミジン配列に対して相補的且つ平行であるものを包含する。
【００５２】
本発明の別の具体例は、少なくとも１個の第１ポリピリミジン配列と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個の第１ポリプリン配列とを含むヘアピンであって該ポリプリン配列が該第１ポリピリミジン配列に対して相補的且つ逆平行でしかも少なくとも１個の８−アミノプリンを含むもの、及び、該ヘアピンに対してＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型配置で配列した標的配列を含む三重鎖を提供する。本発明の好ましい具体例では、この三重鎖は、標的配列がＧ及びＴ塩基又はＧ及びＡ塩基を含むものを包含する。
【００５３】
本発明の好ましい具体例では、ポリピリミジン配列と、リンカーと、ポリプリン配列とを含むヘアピンであって該ポリプリン配列が該ポリピリミジン配列に対して相補的且つ平行でしかも少なくとも１個の８−アミノプリンを含むもの、及び、該ポリプリン配列に対して相補的且つ逆平行なポリピリミジン標的配列を含む三重鎖を提供する。本発明では、三重鎖において天然のプリンを８−アミノプリンを含有するオリゴヌクレオチドで置き換えている。アデニン及びグアニンの８位でのアミノ基の導入は、１個のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型プリン−ピリミジンＨ結合の増加という結合効果（図１４）のため及び該アミノ基が三重鎖構造の副−主溝に位置した「水和骨格」に組み込まれ得るために、三重らせんの安定性を増大させる。８−アミノプリンを含有するオリゴヌクレオチドの調製及び結合特性は、当業者に周知である。しかしながら、８−アミノプリンを含有する天然オリゴヌクレオチドは、二重鎖ＤＮＡ配列の特異的な結合のためには直接使用できない。というのは、この修飾塩基は、標的配列中に存在するが通常の三重鎖ストラテジーにおいて二重鎖ＤＮＡの特異的認識のために使用されるＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖中には存在しないプリンだからである。
【００５４】
本発明者らは、例えば、８−アミノアデニン、８−アミノグアニン及び８−アミノヒポキサンチンのような（これらに限定されない）、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型ピリミジン鎖に直接連結した８−アミノプリンを有するヘアピンの結合特性を説明する（図１４）。８−アミノプリンを有するヘアピンは、安定なＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型平行鎖構造を形成する。本発明者らは、本発明のこれらの修飾ヘアピンが、特に中性の条件で、天然塩基のみを含有するヘアピンよりも大きい親和性を有する三重らせんを介してワトソン・クリック型ピリミジン鎖に結合することを示す。また、ここでは、三重鎖の安定性に及ぼすｐＨ、塩濃度及びループ構造の影響も分析している。さらに、本発明の平行鎖ヘアピンがポリピリミジン標的配列中に塩基中断を有する三重鎖を形成することも示す。中性条件での三重らせんの安定性の増大及びポリピリミジン標的配列中で中断に対抗する可能性は、三重らせんの形成に基づく新規な用途、例えば、構造研究、ＤＮＡをベースにした診断ツール、アンチジーン治療及びアンチセンス治療を創出する。
【００５５】
方法
分子力学（ＭＤ）シミュレーション
本発明者らは、一般に同一のｄ（Ｇ・Ｃ）及びｄ（Ａ・Ｔ）対含量を有する１１−ｍｅｒ平行ＤＮＡ二重鎖（ｄ（５'−ＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡ−３'）ｄ（５'−ＣＴＴＣ−ＣＴＣＣＴＣＴ−３'）（配列番号１、配列番号２）の安定性を、この塩基対合がｒＷＣ及びＨモチーフの両方に相当するときに室温の水中で分析した。２種及び３種の出発モデルをそれぞれＨ二重鎖及びｒＷＣ二重鎖とした（表１）。このＨ二重鎖についての２種の出発モデルは、Ａ型及びＢ型三重鎖のピリミジンワトソン・クリック鎖を除去することによって得た（シミュレーションＨA及びＨB）。ｒＷＣ二重鎖についての３種の出発モデルは、（ｉ）ＮＭＲモデル、（ii）Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎによって報告された標準的なモデル及び（iii）平衡化ＭＤｒＷＣｄ（Ａ・Ｔ）二重鎖に相当する（表１を参照）。これらの出発構造は、それぞれシミュレーションｒＷＣ1、ｒＷＣ2及びｒＷＣ3をもたらす。比較する目的のために、同一配列の逆平行Ｂ型二重鎖を標準的な構造的パラメーターを使用して生成した。全ての場合において、この二重鎖を２２００〜２７００の水分子を含有するボックス中に浸漬させ、そしてナトリウムイオンを添加してこの系を中性にした。先の結果に基づき、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型シトシンをプロトン化させた。次いで、水和した二重鎖を最適化し、熱運動化させ、そして１３０ｐｓにわたって平衡化させた。次いで、これらの系の全てを、周期的境界条件及び当業者に周知の粒子メッシュエワルド法を使用して一定の圧力（１気圧）及び温度（２９８ケルビン）で１〜５ｎｓ（ナノ秒）の無制限のＭＤシミュレーションに付して広範囲にわたる静電効果を明らかにした。ＳＨＡＫＥ（Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｐｈｙｓ．１９７７，第２３巻，ｐ．３２７）を使用して全ての結合をそれらの平衡間隔で保持したが、これにより積分のための２ｆｓ時間ステップの使用が可能となった。ＡＭＢＥＲ−９８／ＴＩＰ３Ｐ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，第１１７巻，第５１７９頁）と、プロトン化シトシン及び８−アミノプリンのために予め作製されたパラメーターとを使用した。
【００５６】
【表１】
2005527219.tif 000002
【００５７】
これらのトラジェクトリーの幾何学的分析を、もっぱら中心の９−ｍｅｒ二重鎖を使用して実行した。Ｈ型二重鎖の２種のトラジェクトリーを平均して該二重鎖の良好な（１０ｎｓ）図を得た。見込まれるＤＮＡの分子相互作用の分析を、ＣＭＩＰプログラム（バルセロナ大学，スペイン国バルセロナにより入手可能となったＣＭＩＰコンピュータープログラム）を使用して実施し、そしてこれらのトラジェクトリーの構造分析を実行した。
【００５８】
自由エネルギー計算
分子力学シミュレーションと一体になった熱力学積分技術（ＭＤ／ＴＩ）を使用して、２'−デオキシアデノシン、２'−デオキシグアノシン及び２'−デオキシイノシンのそれらの８−アミノ誘導体による置換がｄ（５'−ＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡ−３'）・ｄ（５'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ−３'）（配列番号１、配列番号２）平行二重鎖に及ぼす影響を分析した。本発明のこの具体例では、二重鎖と単鎖オリゴヌクレオチドの両方において、変異を８−アミノ−２'−デオキシアデノシンと２'−デオキシアデノシンとの間（８ＡＡ→Ａ）、８−アミノ−２'−デオキシグアノシンと２'−デオキシグアノシンとの間（８ＡＧ→Ｇ）及び８−アミノ−２'−デオキシイノシンと２'−デオキシイノシンとの間（８ＡＩ→Ｉ）で実行した。８ＡＸ→Ｘ変異による安定化自由エネルギーの変化を、当業者に知られているような標準的な熱力学サイクルを使用して決定する（図２）。
【００５９】
ＭＤ／ＴＩシミュレーションを、ｒＷＣ二重鎖が不安定なためＨ二重鎖のみを考慮して行った。これらの計算の出発系を、Ｈ二重鎖のＢトラジェクトリーに相当するＭＤシミュレーション二重鎖の３ナノ秒で得られたものと定義した。次いで、８−アミノ誘導体をプリン鎖の５位（８ＡＧ及び８ＡＩ）又は６位（８ＡＡ）でモデル化し、そして得られた構造を０．５ｎｓにわたってさらに平衡させて該計算におけるいかなる偏りも回避した。２種の追加のシミュレーションを、５位でのｄ（Ｇ・Ｃ）／ｄ（Ｉ・Ｃ）対が正常のプロトン化対であるｄ（Ｇ・Ｃ）+／ｄ（Ｉ・Ｃ）+ではなくゆらぎ中性対合ｄ（Ｇ・Ｃ）w／ｄ（Ｉ・Ｃ）wを示すことを考慮して実行した。この場合には、１種の追加的なナトリウムイオンを該モデル化された系に添加し、次いで１ｎｓにわたってさらに平衡させた。単鎖を配列５'−ＡＧＧＡＧ−３'、５'−ＡＧＩＡＧ−３'及び５'−ＧＧＡＧＧ−３'の５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドとしてモデル化した。
【００６０】
それぞれ１０及び２０ｐｓである２１倍幅のウインドーを使用して変異を実行し、４２０又は８２０ｐｓのトラジェクトリーをもたらした。自由エネルギーの推定値は、全てのシミュレーションについての自由エネルギー変化の２つの独立した推定を可能にするそれぞれのウインドーの前半及び後半を使用して得た。ここで与えられる値は、その平均値の統計上の不確定性を推定するために、４つの独立した推定値の平均に相当する。ＭＤ／ＴＩシミュレーションの他の全ての技術的詳細はＭＤ計算のものと同一である。ここで与えられるシミュレーションは、水中での１１−ｍｅｒＨ二重鎖の３０ｎｓ以上の無制限のＭＤシミュレーションに相当する。
【００６１】
ＭＤ及びＭＤ／ＴＩシミュレーションの全ては、ＡＭＢＥＲ−５．１コンピュータープログラムを使用して実施した。全てのシミュレーションは、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔａｃｉｏ  ｄｅ  Ｃａｔａｌｕｎｙａ（ＣＥＳＣＡ）のスーパーコンピューターで行った。
【００６２】
８−アミノプリンを含むオリゴマーの調製
オリゴヌクレオチドを、標準的な２−シアノエチルホスホラミダイト及び逆２−シアノエチルホスホラミダイトと８−アミノプリンの相当するホスホラミダイトとを使用して自動ＤＮＡ合成装置で調製した。保護された８−アミノ−２'−デオキシイノシンのホスホラミダイトを乾燥ジクロルメタン中に溶解させて０．１Ｍ溶液を作製した。このホスホラミダイトの残余を乾燥アセトニトリルに溶解させた（０．１Ｍ溶液）。ヘキサエチレングリコールリンカーのホスホラミダイトを斯界に周知の商業的供給源から得た。３'−３'結合ヘアピン（Ｒ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｒ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）、Ｒ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）及びＲ−２２Ｇ（配列番号５、配列番号２））の調製を３部に分けて実施した。第１は、逆Ｃ及びＴホスホラミダイト並びに逆Ｃ支持体を使用したピリミジン部分の調製であった（５'末端を介して該支持体に結合させた）。次に、該ピリミジン部分の結合の後に、当業者に周知の市販のホスホラミダイトを使用してヘキサエチレングリコールリンカーを付加させた。最後に、修飾８−アミノプリンを有するプリン部分を、天然の塩基のための標準的なホスホラミダイトと８−アミノプリンホスホラミダイトとを使用して結合させた。５'＜５'結合ヘアピンであるＢ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）、Ｂ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）、Ｂ−２２ＡＧ（配列番号５、配列番号２）、Ｂ−ＡＴ（配列番号６、配列番号７）及びＢ−２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８）の調製のために、同様の手法を使用した。この場合には、プリン部分をまず結合させ、その後ヘキサエチレングリコールリンカーを結合させた。ピリミジン部分は、逆ホスホラミダイトを使用して結合されるべき最後の部分であった。また、天然塩基を含有する相補オリゴヌクレオチドも当業者に周知の市販の化学物質を使用し且つ標準的なプロトコルに従って調製した。これらの配列の結合の後に、オリゴヌクレオチド支持体を５５℃の３２％水性アンモニアで１６時間にわたって処理した（ただし、８−アミノグアニンを有するオリゴヌクレオチドを除く）。この場合には、０．１Ｍの２−メルカプトエタノールの３２％水性アンモニア溶液を使用し、そしてこの処理を５５℃で２４時間に延長した。アンモニア溶液を乾燥状態にまで濃縮し、そして該生成物を逆相ＨＰＬＣで精製した。オリゴヌクレオチドを０．２μｍｏｌスケールで且つ最後のＤＭＴ基と共に５'末端で合成（ＤＭＴオンプロトコル）して逆相精製を促進させた。集められた精製生成物の全てが主ピークを示した。収量（ＨＰＬＣ精製後、０．２μモルの２６０ｎｍでのＯＤ単位）は、５〜１０ＯＤの間であった。ＨＰＬＣ条件：ＨＰＬＣ溶液は次の通りである。溶媒Ａ：５％ＡＣＮの１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ６．５）及び溶媒Ｂ：７０％ＡＣＮの１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ６．５）。カラム：ＰＲＰ−１（ハミルトン社）、２５０×１０ｍｍ。流速：３ｍＬ／分。１０〜８０％Ｂの３０分直線勾配（ＤＭＴオン）又は０〜５０％Ｂの３０分直線勾配（ＤＭＴオフ）。
【００６３】
融解実験
融解実験は次のように行った。ヘアピン及び二重鎖の溶液を、１ＭのＮａＣｌ，１００ｍＭの燐酸塩／クエン酸緩衝液中に溶解させた。これらの溶液を９０℃に加熱し、次いでゆっくりと室温にまで冷却し、次いで試料を一晩冷蔵庫内で保持した。ＵＶ吸収スペクトル及び融解実験（吸光度対温度）を、プログラムされた０．５℃／分の温度上昇を伴う温度制御器を有する分光光度計を使用して１ｃｍ経路長のセル中で記録した。融解は、２６０ｎｍで３〜４μＭの二重鎖濃度で行った。
【００６４】
円二色性（ＣＤ）
オリゴヌクレオチドを１００ｍＭ燐酸塩緩衝液，ｐＨ６．０，５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭ塩化マグネシウムに溶解させた。それぞれの鎖の等モル濃度は４〜５μＭであった。該溶液を９０℃に加熱し、ゆっくりと室温にまでもっていき、そしてＣＤの測定を実行するまで４℃で保存した。ＣＤスペクトルを、Ｎｅｓｌａｂ  ＲＰ−１００循環ウォーターバスに取り付けたＪａｓｃｏＪ−７２０分光偏光計で１ｃｍ経路長の石英円筒形セル中で記録した。スペクトルを室温で１０ｎｍ／分のスキャン速度、１ｎｍのスペクトル帯幅及び４ｓの時定数を使用して記録した。ＣＤ融解曲線を、２０℃／時間の加熱速度及び１００ｎｍ／分のスキャン速度を使用して２８０ｎｍで記録した。全てのスペクトルを緩衝液のブランクで引き算し、比較を容易にするために標準化し、そしてＭｉｃｒｏｃａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ５．０ソフトウェアを使用してノイズ除去した。
【００６５】
ＮＭＲ分光法
ＮＭＲ実験のためのオリゴヌクレオチドｄ（３'−ＡＧＮＧＧＮＧＧＡＡＧ−５'−（ＥＧ）6−５'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ−３'）（Ｎ＝８−アミノ−Ａ）（配列番号３、配列番号２）の試料を２５０ｐＬの９：１Ｈ2Ｏ／Ｄ2Ｏ，２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液及び１００ｍＭのＮａＣｌ中で調整した。ｐＨは、少量の濃ＨＣｌを添加することによって調整した。最終オリゴヌクレオチド濃度は、ほぼ１ｍＭであった。スペクトルをブルーカーＡＭＸ分光計で６００ＭＨｚで操作して取得し、そしてＵＸＮＭＲソフトウェアで処理した。ウォーターサプレッションを、ウォーターシグナルにおいてゼロ励起を有するジャンプ・アンド・リターンパルスシーケンスを使用することによって実行した。全ての実験は、５℃で実行した。
【００６６】
分子力学シミュレーション
Ｈ二重鎖のＭＤシミュレーションは、トラジェクトリーと個々のＭＤ平均コンフォメーション（シミュレーションＨA及びＨBについてはそれぞれ１．４Å及び１．５Å）との間の二乗平均平方根偏差（ｒｍｓｄ）で示されるように、５ｎｓシミュレーション時間に沿う安定なトラジェクトリーを示す（図３）。ただ一つの顕著な歪みは、ｄ（Ｇ・Ｃ）末端での僅かな屈曲であり、またｄ（Ａ・Ｔ）末端での部分的なすり切れ現象の存在である。同様の特徴がコントロールの逆平行らせんで生じた。また、２個の連続したプロトン化対ｄ（Ｇ・Ｃ）+の存在が該らせんに大きな構造的変化を導入しなかったことも注目に値する。
【００６７】
異なるＨ型二重鎖モデルから始まる２個のシミュレーションは、合理的に収束し、そしてコンフォメーション空間の同様の領域のサンプルを抽出する。これは、それぞれのトラジェクトリーとその他のＭＤ平均コンフォメーション：１．９Å（シミュレーションＨAにおける平均構造に対するＢトラジェクトリー）及び（シミュレーションＨBにおける平均構造に対するＡトラジェクトリー）との間のｒｍｓｄで示される。両方のトラジェクトリーは、三重鎖ＤＮＡのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖の典型的なコンフォメーション領域に近いもののサンプルを抽出する（図３）。当業者であれば、このＭＤシミュレーションは、三重鎖のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖の構造がピリミジンワトソン・クリック鎖を除去したときに大きく歪まないことを示唆していることを容易に認識するであろう。従って、２つのトラジェクトリーとシミュレーションＨBの出発モデル（Ｂ型三重鎖ＤＮＡから直接得られる）との間のｒｍｓｄは、シミュレーションＨB及びＨAではそれぞれ１．４Å及び１．８Åである。このｒｍｓｄは、シミュレーションＨAの出発モデル（Ａ型三重鎖）のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖に対して僅かに大きい：２．０Å（ＨA）及び２．１Å（ＨB）。
【００６８】
これらの結果とは対照的に、高分解能ＮＭＲから始まるｒＷＣ二重鎖又は基準モデルのシミュレーション（シミュレーションｒＷＣ1及びｒＷＣ2）は、非常に早く発散する。この系と塩基間の対合との平衡を一層強力にするための全ての試みは、安定な構造を与えることができなかった（シミュレーションの終了時に標準構造からのｒｍｓｄ３．４Å〜３．９Å）。多くの鎖間水素結合とスタッキング相互作用がシミュレーションに従って保存されているという事実に加えて、それらの幾何学的配置は１ｎｓ以下で大いに歪み（図４参照）、そしてそのときにこれらの構造のらせん構造は完全に失われる。予め１ｎｓで平衡化されたｄ（Ａ・Ｔ）ｒＷＣ二重鎖のトラジェクトリーから誘導されるモデルから始まった第３シミュレーション（ｒＷＣ3）は長時間にわたって安定であったが、そのらせんも５ｎｓシミュレーション時間後に大きく歪んだ（ｒｍｓｄ３．２Å）。特定の理論に拘泥されるのを望むものではないが、トラジェクトリーの分析から、ＧとＣの間のアミノ反発が、ゆらぎｄ（Ｇ・Ｃ）対合を促進させることによって該アミノ反発を低減させようとする本発明者らの試みにもかかわらず、らせんの不安定化を生じさせる主な因子であることが示唆される。
【００６９】
ＭＤシミュレーションから、ｒＷＣ二重鎖は安定でないことが示唆される。これに反して、Ｈ型コンフォメーションは全てのシミュレーション時間中に安定であるように思われる。従って、これらの結果は、同様のｄ（Ａ・Ｔ）及びｄ（Ｇ・Ｃ）母集団を有するＤＮＡに平行二重鎖のためのＨ型モチーフが存在すること、及びｒＷＣらせんが、高含量のｄ（Ｇ・Ｃ）対が存在するときには安定ではないことを裏付けている。
【００７０】
Ｈ型シミュレーションの安定性により、Ｈ型平行二重鎖の構造の分析が可能になる。上に示したように、このらせんは、ＤＮＡ三重鎖のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖の構造に類似する。平均ねじれは３１°であり、その垂直高さは３．４Åである。塩基は、一般にらせん軸に対して垂直である。糖は、サウス及びサウス・イースト領域に存在し、ｒＷＣ平行二重鎖及び三重鎖について実験的に見出されるように、１２４°の平均位相角を有する。ＤＮＡ三重鎖の主溝のマイナー部分に相当する狭い溝（以下、「副」という。）と、ＤＮＡ三重鎖の副溝及び主溝のマイナー部分の両方に相当する広い溝（以下、「主」という。）が存在する（図３）。これら２種の溝に沿う最も短いＰ−Ｐの平均間隔は、「主」及び「副」溝についておおよそ９（±０．６）及び２５（±２）Åである。その結果、２つの同等の溝が見出されたｒＷＣ二重鎖とは大きな相違がある。
【００７１】
古典的な分子相互作用ポテンシャルマップ（ＣＭＩＰ、図５）により、ＤＮＡが小さい陽イオン性プローブと相互作用する強い傾向を有する領域を突き止めることが可能になった。ＤＮＡ三重鎖についての本発明者らの先の研究から予期されるように、「副」溝は、相互作用に対して最も活性な領域である。Ｈ二重鎖が陽イオン性プローブと相互作用する能力は、全てのＨｏｏｇｓｔｅｅｎシトシンがＨ二重鎖ではプロトン化されているという事実にかかわらず、同一の配列を有するＢ型逆平行二重鎖のその能力とは違いがない。Ｈ二重鎖の短いＰ−Ｐ間隔がＨｏｏｇｓｔｅｅｎシトシンの近辺に強い負の電位を創り出し、しかしてそれらの正電荷を遮蔽することは明らかである。
【００７２】
Ｈ二重鎖は、図５に表された溶媒和外形で示されるように、非常に良く水和する。最も大きな水の見掛密度は、規則正しい水の鎖の挿入を可能にする程度に広い副溝中で見出される。また、副溝のホスフェート基の近辺にも大きな（２ｇ／ｍＬ以上の）水密度の領域が存在する。興味深いことに、Ｈ二重鎖及び参考の逆平行らせんの周囲での見掛水密度は非常に類似しているため、これはＣＭＩＰ計算から得られた知見を裏付けるものである。
【００７３】
逆平行Ｈ二重鎖は、ＤＮＡ三重鎖と多くの特性を共有するが、主として２つの非常に異なる溝の存在に由来する一連のユニークな分子認識特性をも示す新規な構造である。
【００７４】
自由エネルギー計算
一連のプリン塩基の８−アミノ誘導体のデザイン、合成及び評価は、当業者であれば周知である。これらの分子は、ＤＮＡ三重鎖を強く安定化させるが、これはとりわけプリンの８−アミノ基とＨｏｏｇｓｔｅｅｎシトシン又はチミンのカルボニル基との間の余分の水素結合に関わっていた。また、本発明者らは、８−アミノ基が、ワトソン・クリック対合の強力な不安定化を、少なくともｄ（Ｇ・Ｃ）及びｄ（Ｉ・Ｃ）対について促進させることを見出した。従って、本発明者らは、８−アミノ基の存在がｒＷＣ二重鎖を不安定化させ、Ｈ二重鎖の安定性を増大させるはずであると予想することができた。Ｈ二重鎖の安定性が平行二重鎖を三重鎖形成用の鋳型として使用するために極めて重要であることは注目に値する。ＭＤ／ＴＩ計算をＨ二重鎖でのみ実行した。というのは、ｒＷＣ二重鎖の不安定性は、いかなるＴＩ計算をも不可能にするからである。関連した系についての先の計算で見出されるように、変異プロフィルは、いかなる明白な不連続性もなく滑らかであり、これは、ヒステレシスの存在を示し得る。自由エネルギーの推定値の標準誤差は０．２〜０．３ｋｃａｌ／モルであるため、これはこれらの結果が良好に収束していることを示している（表２）。
【００７５】
Ｈ二重鎖は、Ａ→８ＡＡ変異によっておおよそ２．７ｋｃａｌ／モル安定化するが（表２）、これはポリｄ（Ａ−Ｔ−Ｔ）三重鎖のためのさほど厳密でないシミュレーションプロトコルを使用して予め見出されたのと同様の値である。ｄ（Ｇ−Ｃ）+モチーフにおける変異Ｇ→８ＡＧは、Ｈ二重鎖の安定性をおおよそ１ｋｃａｌ／モル増大させる（表２）と同時に、ｄ（Ｉ−Ｃ）+モチーフにおけるＩ→８ＡＩ変異は、安定性をおおよそ１．４ｋｃａｌ／モル増大させる（表２）。また、これら２つの後者の値は、ＤＮＡ三重鎖における先の推定値とも一致する。
【００７６】
ここで言及した結果は、８−アミノプリンの導入によるＨ二重鎖の強力な安定化を指摘していることが明らかであり、そしてこれらの分子が平行Ｈ二重鎖に基づくヘアピンの安定化を助成し得ることを示唆している。しかしながら、本発明者らは、Ｇ→８ＡＧ変異がＡ→８ＡＡ変異よりもＨ二重鎖を安定化しないという事実に関心を抱いている。というのも、三重鎖における先の計算と一致するこの知見は、Ｈヘアピンでの融解実験とは一致しないからである（以下に示す）。特定の理論に拘泥されることを望まないが、これは、８ＡＧ（又は８ＡＩ）が存在するときに、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ認識が必ずしもｄ（８ＡＧ・Ｃ）+モチーフではないかもしれないが、ゆらぎ対ｄ（８ＡＧ・Ｃ）wであり得ることを示唆している（図６参照）。ｄ（Ｇ／Ｉ・Ｃ）+→ｄ（８ＡＧ／８ＡＩ・Ｇ）w変異は、正味電荷の消滅のため技術的に非常に困難であるので、本発明者らは、間接的な証拠の手段により、相補Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ位置での中性シトシン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎシトシンの残余はプロトン化されていた）の存在下に変異Ｇ→８ＡＧ及びＩ→８ＡＩを行うことによってｄ（８ＡＧ−Ｃ）wの見込まれる役割を調査した。これらの結果（表２参照）から、８−アミノ誘導体の存在は、ゆらぎ対合を強く安定化させる（Ｉ及びＧについてはぞれぞれ３．１及び３．２ｋｃａｌ／モル）ことが示唆される。この自由エネルギーの相違は、Ａ→８ＡＡ変異で見出されるものよりも０．５ｋｃａｌ／モル大きく、そしてＨｏｏｇｓｔｅｅｎシトシンがプロトン化されているときの同一の変異による安定化よりも２ｋｃａｌ／モル以上大きいことに留意されたい。これらの結果によれば、８ＡＧ及び８ＡＩの存在は、プロトン化されたものよりも中性Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎモチーフの存在に有利に働く（以下参照）。これは、８−アミノが陽イオンよりも中性分子とよく相互作用する水素結合供与体であるという事実のためである。
【００７７】
【表２】
2005527219.tif 000003
【００７８】
オリゴヌクレオチド誘導体の構造
ＭＤ及びＭＤ／ＴＩ誘導仮説を調査するために、８−アミノアデニン（８ＡＡ＝ＡN）、８−アミノグアニン（８ＡＧ＝ＧN）及び８−アミノヒポキサンチンＮ（８ＡＩ＝ＩN）を有する数種の平行鎖ＤＮＡヘアピンを調製した。そのオリゴヌクレオチドの配列を図７に示す。
【００７９】
オリゴマーの第１群は、３'末端を介してヘキサエチレングリコールリンカー［（ＥＧ）6］と連結した平行鎖ヘアピンである。２個のアデニンがオリゴヌクレオチドＲ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）において２個の８−アミノアデニン（ＡN）によって置換されており、オリゴヌクレオチドＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）において２個のグアニンが２個の８−アミノグアニン（ＧN）によって置換されており、そしてオリゴヌクレオチドＲ−２２Ｉ（配列番号５、配列番号２）において２個のグアニンが２個の８−アミノヒポキサンチン（ＩN）によって置換されている。オリゴヌクレオチド（Ｒ−２２）（配列番号１、配列番号２）は、修飾されていない中性塩基のみを含有する。
【００８０】
【表３】
2005527219.tif 000004
【００８１】
オリゴマーＢ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）、Ｂ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）の第２群は、その組成の点で先のオリゴマーと類似するが、そのポリプリン及びポリピリミジン部分は、５'末端を介してヘキサエチレングリコールリンカー［（ＥＧ）6］と連結している。さらに、２個の８−アミノグアニン及び２個の８−アミノアデニンを有するオリゴマーを調製して（Ｂ−２２ＡＧ）（配列番号３４、配列番号２）両方の８−アミノプリンの安定化特性が付加的かどうか試験した。ｄ（Ａ・Ｔ）塩基対のみを有する平行鎖ヘアピン（Ｂ・ＡＴ）（配列番号６、配列番号７）を調製した。最後に、Ｂ２２Ａ（配列番号３、配列番号２）と同一のプリン配列を有するが相補的でないピリミジン配列を有するコントロールのヘアピン（Ｂ−２２Ａコントロール）（配列番号３、配列番号８）も調製した。
【００８２】
８−アミノプリンを含有するオリゴヌクレオチド配列は、ホスホラミダイト化学を使用して自動ＤＮＡ合成装置で調製した。平行鎖オリゴマーは、当業者であれば周知のプロトコルを使用して調製した。８−アミノアデニン、８−アミノグアニン及び８−アミノヒポキサンチンのホスホラミダイトは、当業者であれば周知のプロトコルを使用して調製した。
【００８３】
融解実験
平行鎖ヘアピンの相対的安定性を異なるｐＨ（ｐＨ４．６〜７．０）で分光光度計で測定した。ほとんどの場合に、単一の転移が平行鎖ヘアピンの変性に由来する酸性ｐＨでほぼ１５％及び中性ｐＨで１０％の深色効果により観察された。表３に、３'＞３'結合を有するヘアピンの融解温度を示す。
【００８４】
ヘアピンが天然塩基（Ｒ−２２）（配列番号１、配列番号２）によって形成されるときに、ｐＨ４．６及びｐＨ６．０で明らかな転移が観察されるが、６．０以上のｐＨでは転移は観察されなかった。融解温度はｐＨ依存性であり、より低いｐＨでは、融解温度はｐＨ７．０のときよりも高い。これらの結果は、Ｃがプロトン化していなければならない（即ち、Ｈ型二重鎖が支持される）Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対と一致する。このｐＨ依存性のプロフィルは、逆ワトソン・クリック平行二重鎖では説明できず、また、これは短い逆平行二重鎖（７−ｍｅｒ二重鎖ｄ（−ＡＧＧＡＧＧＡ−）・ｄ（−ＴＣＣＴＣＣＴ−）のようなもの。このものは配列の中央部分で形成され得る。）の存在とも一致しない。後者の点を検証するために、本発明者らは、配列ｄ（ＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡ）・ｄ（ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ）（配列番号１、配列番号２）（Ｄ１）及びｄ（ＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡ）・ｄ（ＴＣＣＴＣＣＴ）（配列番号１、配列番号９）（Ｄ２）の２種の逆平行二重鎖を合成し、そしてそれらの融解温度をｐＨ４．５、６．０及び７．０で測定した。両者の逆平行二重鎖について見出される温度によるｐＨ依存性のプロフィルを図８においてＲ−２２（配列番号１、配列番号２）及びＢ−２２（配列番号１、配列番号２）について見出されたものと比較している。これらのプロフィルから、逆平行二重鎖が有意に母集団をなしていないことが強く支持されることは明らかである。
【００８５】
２個の８ＡＡによる２個のＡの置換は、ｐＨ４．６及び６．０での高い融解温度（ΔＴm１６〜１８℃）とｐＨ６．５での転移の観察とから分かるように、平行鎖構造を安定化させる。２個の８ＡＧによる２個のＧの置換は、ヘアピンの融解温度をさらに高く上昇させる。Ｂ−２２（配列番号１、配列番号２）に関する融解温度の差は２１〜２５℃の間である。また、約ｐＨ７．０及び６．５で転移を観察することも可能である。２個の８ＡＩによる２個のＧの置換は平行鎖構造を安定化させるが、この安定化は強さが小さい（ｐＨ４．６〜６．０でΔＴm６〜９℃）。８ＡＧ及び８ＡＩを有するヘアピンの融解温度は、中性のｐＨではそれほど迅速には低下しない。これは、これらのヘアピンがおそらく８−アミノプリンの８−アミノ基とＣの２−ケト基との間の余分な水素結合のためにＣのプロトン化に対して他のヘアピンと同様に左右されないことを示している。
【００８６】
ここで述べたように、３'＜３'結合によって連結したヘアピン（Ｒ−２２（配列番号１、配列番号２）誘導体）に加えて、本発明者らは、５'＜５'結合によって連結したヘアピン（Ｂ−２２（配列番号１、配列番号２）誘導体）を調製した。表４は、これらのヘアピンの異なるｐＨでの融解温度を示している。
【００８７】
【表４】
2005527219.tif 000005
【００８８】
結果は、３'−３'結合を有するヘアピンについてここに説明したのと同様である。Ａ又はＧの相当する８−アミノプリン誘導体による置換は、天然塩基のみを有するヘアピンでは観察することができない酸性のｐＨでの高いＴm及び中性ｐＨでの転移の観察によって分かるようにヘアピンの強い安定化を誘導する。また、８ＡＡ及び８ＡＧの両方の同一のオリゴヌクレオチドへの付加（Ｂ−２２ＡＧ）（配列番号３４、配列番号２）が付加的な影響を及ぼすことに留意することも重要である。例えば、ｐＨ６．０では、２個の８ＡＡの存在がＴmについて１３℃の上昇を与え、２個のＡＧが１９℃の上昇を与え、そして２個の８ＡＡ及び２個の８ＡＧの両方の付加が２７℃の上昇を与える。８ＡＧ（Ｒ−２２Ｇ）（配列番号４、配列番号２）及び８ＡＩ（Ｒ−２２Ｇ（配列番号５、配列番号２）を有するヘアピンに関してｐＨ７．０に近い値について見出されるｐＨによる融解温度の低い依存性は、ヘアピンＢ−２２ＡＧ（配列番号３４、配列番号２）については観察されるが、ヘアピン（Ｂ−２２Ｇ配列番号４、配列番号２）については観察されない。Ａ−Ｔ対のみを含有する平行ヘアピン（Ｂ−ＡＴ（配列番号６、配列番号７））は、約ｐＨ＝５．５から７．０に至るまで同一の融解温度（Ｔm＝４２℃）を有していた。コントロールのヘアピン（Ｂ−２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８））は、いかなるｐＨでも転移を有しなかった。
【００８９】
表３及び４に記載した融解実験の全ては、ここに示される方法に基づいて説明したように、約１ＭのＮａＣｌで実行した。さらに、本発明者らは、約０〜１ＭのＮａＣｌで融解実験を実行している。融解温度は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ対合における塩の影響に関する先の結果と一致して、１度の誤差内で変化しない状態を保持している。
【００９０】
Ｈ型平行二重鎖の仮説から導かれるＭＤ／ＴＩ計算と実験測定値との間には優れた一致がある。また、アミノ基について理論的に見出される大きな安定化は、置換当たりほぼ１０℃のＴmの上昇で実験的にも見出される。興味深いことに、Ａ→８ＡＡ変異によって得られる安定性と比較してＧ→８ＡＧ変異のために得られる大きな安定性及び８ＡＧを含有する二重鎖の安定性の小さなｐＨ依存性から、中性のゆらぎ対合は、ｄ（８ＡＧ・Ｇ）対を含有する平行二重鎖において重要な役割を果たし得ることが示唆される。最後に、Ｇ→８ＡＩ変異のために得られる小さな安定性は、Ｉ→８ＡＩ変異によって誘導されるＨ二重鎖の安定化とＧ→Ｉ変化によって誘導される安定化との間の平衡の結果である。
【００９１】
８−アミノ基は、ワトソン・クリック対合をＧ及びＩについて安定化させ、そしてそのときに逆ワトソン・クリック対合を不安定化させることが予期される。従って、実験的に見出される二重鎖構造の安定化は、ここで研究されたヘアピンがＨｏｏｇｓｔｅｅｎを有し且つ逆ワトソン・クリックの二次構造を有しないことのみを考慮すると、理解できる。また、Ｇ→８ＡＧ又はＡ→８ＡＡ置換によって誘導される二重鎖安定性の変化は、７−ｍｅｒ逆平行二重鎖のかなりの量の存在をも強く示していることに留意されたい。従って、２個の８ＡＧによる２個のＧの変化（５位及び８位）は、コントロールとして使用される２種の逆平行二重鎖ｄ（ＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡ）・ｄ（ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ）（配列番号１、配列番号２）及びｄ（ＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡ）・ｄ（ＴＣＣＴＣＣＴ）（配列番号１、配列番号９）に対して７℃のＴmの上昇に至るが、Ｒ−２２（配列番号１、配列番号２）及びＢ−２２（配列番号１、配列番号２）については、同一の変化が２１℃以上のＴmの上昇を誘導する。
【００９２】
円二色性
ヘアピン構造に関する情報を得るために、円二色性（ＣＤ）スペクトルを測定した。図９Ａは、ヘアピンＢ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）並びにｄ（Ａ・Ｔ）塩基対を有する平行鎖ヘアピン（Ｂ−ＡＴ（配列番号６、配列番号７））のＣＤスペクトルを示している。追加のコントロールとして、本発明者らは、平行二重鎖が形成され得ないことを保証するためにピリミジン鎖の配列がランダムである修飾Ｂ２２ヘアピン（Ｂ−２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８））を導入した。この後者のオリゴヌクレオチドをＷＣプリン鎖に相補的な相当する１１−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（Ｓ１１ＷＣ）（配列番号１６）と対合させた。図９Ｂに示されるように、Ｂ−２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８）は構造を有しないが、好適な単鎖オリゴヌクレオチド鎖（Ｓ１１ＷＣ）（配列番号１６）を添加すると逆平行二重鎖を生成する（Ｂ−２２Ａコントロール＋Ｓ１１ＷＣ）（配列番号３、配列番号８、配列番号１６）。
【００９３】
ヘアピンＢ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）のＣＤスペクトルの形状（図９Ａ参照）は類似し、そしてＢ−ＡＴ（配列番号６、配列番号７）及び逆平行二重鎖（Ｂ−２２Ａコントロール＋Ｓ１１ＷＣ（配列番号３、配列番号８、配列番号１６）とは明らかに異なる（図９Ｂも参照）。ヘアピンＢ−ＡＴ（配列番号６、配列番号７）のＣＤスペクトルは、２４８ｎｍで最小値、２０６ｎｍで準最小値、そして２１８及び２８０ｎｍで２つの最大値を有する。このスペクトルは、逆ワトソン・クリック対合のためのモデルとみなされるＡ−Ｔリッチ平行鎖ＤＮＡについて斯界に知られているものと同様である。Ｂ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）のＣＤスペクトルは、２７０〜２９０ｎｍの間に強い最大値を有し、２４２ｎｍで第１の及び２１２ｎｍ周辺でさらに強い第２の最小値の２つの最小値を有する。２１２ｎｍ周辺の最小値及び２８０ｎｍ周辺の最大値は、８−アミノプリンを含有するヘアピン（Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２））ではさらに強い。このタイプのスペクトルは、ＤＮＡ三重鎖の特徴である。要するに、ＣＤスペクトルから、Ａ（８ＡＡ）−Ｔ及びＧ（８ＡＧ／８ＡＩ）−Ｃステップの混合物を含有する本発明のヘアピンは、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型構造を有し且つ逆ワトソン・クリック平行二重鎖又はワトソン・クリック逆平行二重鎖ではないことが証明される。
【００９４】
ＮＭＲスペクトル
異なるｐＨでのＤＮＡヘアピンｄ（３'−ＡＧＡNＧＧＡNＧＧＡＡＧ−５'−（ＥＧ）  6−５'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ−３'）（配列番号３、配列番号２）の一次元1ＨＮＭＲスペクトルのイミノ領域を図１０に示している。不運にも、観察された広いシグナル（おそらくＮＭＲ実験の濃度ではＨｏｏｇｓｔｅｅｎ平行分子間二重鎖の形成のため）により、質の高い二次元スペクトルの取得が妨害されたため、引き続き研究を行うことができなかった。しかしながら、１４．５〜１６．０ｐｐｍのイミノシグナルの存在は、いくらかのシトシンがプロトン化されていることを明らかに示している。また、１０ｐｐｍ周辺のシグナルは、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対を形成するシトシンのアミノプロトンに相当する。１３ｐｐｍ周辺の共鳴はＨｏｏｇｓｔｅｅｎチミンのイミノプロトンに由来する可能性が高い。逆ワトソン・クリック塩基対における交換性プロトンの化学シフトは、標準的な逆平行二重鎖で観察されるものに非常に類似するため、この種の塩基対合は除外され得る。最後に、交換性プロトンスペクトルの特徴の大部分がさらに中性ｐＨでも観察され得ることから、平行二重鎖が中性ｐＨで著しく安定であることが示唆されることも注目に値する。
【００９５】
概して、ＮＭＲ実験は、ＭＤ、ＭＤ／ＴＩ及びＣＤの結果を確認するものであり、そしてこれらの結果は、ここで研究した平行二重鎖が安定であり且つＤＮＡ三重鎖と同様のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型水素結合パターンを示すことを証明する。平行二重鎖の逆ワトソン・クリックモデル又は標準的な逆平行二重鎖は除外される。
【００９６】
非常に広範囲の分子力学シミュレーションでは、逆ワトソン・クリック構造内に配置される同様の数のｄ（Ａ・Ｔ）及びｄ（Ｇ・Ｃ）対を含有する配列のために安定ならせん構造を与えることができない。これに反して、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ対合を前提にすると、安定なトラジェクトリーが見出される。これらのトラジェクトリーで得られた構造により、Ｈ型平行二重鎖であってその全体的なコンフォメーションがＤＮＡ三重鎖のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖によって示されるコンフォメーションに近いものを説明することが可能となった。ＣＤスペクトルはこれを裏付けており、またこれは予備的なＮＭＲ実験とも一致している。
【００９７】
８−アミノプリン誘導体は、平行配列を有するようにデザインされるほぼ同数のｄ（Ａ・Ｔ）及びｄ（Ｇ・Ｃ）二重鎖を含有するＤＮＡヘアピンの安定性を大きく増大させることができる。この安定性の増大は、ヘアピンについてＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型二次構造をとるときに従来技術のＭＤ及びＭＤ／ＴＩ計算の状態によって正確に表される。
【００９８】
当業者であれば、本発明は平行鎖Ｈ型二重鎖の安定化のための新規な方法を提供するものであることが分かるであろう。少なくとも１個の８−アミノプリン誘導体の導入は、さもなくばらせんが不安定になるであろうｐＨ及び温度条件下でＨ二重鎖を安定にする。これらの構造は、生理的条件でのＤＮＡ−ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ三重鎖の形成のための鋳型として作用し、このものは生物工学的目的並びにアンチジーン及びアンチセンス治療に役立つ。
【実施例】
【００９９】
全プリンヘアピン
プリン：ピリミジン：ピリミジン（Ｉ型）３回軸に加えて、プリン：ピリミジン：プリン（II型）３回軸を観察することも可能である。II型３回軸の構造の観察により、８−アミノグアニン（ワトソン・クリック）とグアニンの６−ケト（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）との間に余分の水素結合を描くことが可能である（図１１）。また、いわゆるＧ−Ｔモチーフでは、８−アミノグアニンとチミンの２−ケト（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）との間に余分の水素結合を描くことが可能である。この方法では、８−アミノグアニンは、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖がＧ及びＡによって形成される場合にプリン：ピリミジン：プリン（II型）三重鎖を安定化させ、そして８−アミノグアニンと８−アミノアデニンの両者は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖がＧ及びＴによって形成される場合にII型三重鎖を安定化し得る。両方の場合において、８−アミノプリンは、ワトソン・クリックのプリンの位置を占めるであろう。II型三重鎖の安定性は、ｐＨに依存しない。これらの理由のために、これらのものは生理的ｐＨでの三重鎖の用途のために一般的に使用される。
【０１００】
次のオリゴヌクレオチドを調製した。
ｈ26：５'ＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡ−ＴＴＴＴ−ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ３'（配列番号１１）、
ｈ26−３ＡＧ：５'ＧＡＡＧＧNＡＧＧNＡＧNＡ−ＴＴＴＴ−ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ３'（配列番号１２）、
ｈ26−３ＡＡ：５'ＧＡＡNＧＧＡNＧＧＡNＧＡ−ＴＴＴＴ−ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ３'（配列番号１３）、
ｓ11−ＧＡ：５'ＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧ３'（配列番号１４）、
ｓ1l−ＧＴ：５'ＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧ３'（配列番号１５）、
ＲＥ−２ＡＧ：５'ＧＡＡＧＧNＡＧＧNＡＧＡ−（ＥＧ）6−ＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧ３'（配列番号４、配列番号１４）、
ＷＣ：−１１ｍｅｒ：５'ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ３'（配列番号１６）。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドｓ11−ＧＡ（配列番号１４）及びs11−ＧＴ（配列番号１５）をｈ26誘導体（ｈ26（配列番号１１）、ｈ26−３ＡＧ（配列番号１２）及びｈ26−３ＡＡ（配列番号１３））と１０ｍＭのカコジル酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化マグネシウム及び０．１ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ７．３溶液中で混合した。得られた混合物をアニーリングさせ、そして（１５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって非変性条件（９０ｍＭのトリス−ボレート、５０ｍＭのＭｇＣｌ2、ｐＨ８．０）下で分析した。三重鎖の存在をより遅いバンドの出現によって監視した（図１２）。修飾されていないヘアピン（配列番号１１）及び８−アミノグアニンを有するヘアピン（配列番号１２）は、ＧＡ−及びＧＴ−Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎオリゴヌクレオチド（ｓ11−ＧＡ（配列番号１４）及びｓ11−ＧＴ（配列番号１５））の両方を有する三重鎖を与えた。８−アミノアデニンを有するヘアピン（配列番号１３）は、ｓ11−ＧＴ（配列番号１５）を有する三重鎖のみを与えた。予期されるように、ｓ11−ＧＡ（配列番号１４）を有する三重鎖は観察されなかった。また、融解実験も１０ｍＭのカコジル酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化マグネシウム及び０．１ｍＭのＥＤＴＡの溶液中で実行した。２つの転移が観察された：８０〜８５℃で一方の転移（ヘアピンからランダムコイルへの転移）及び２５〜３０℃周辺での他方の転移（三重鎖の解離）。三重鎖から二重鎖への転移は低い深色効果を有しており、正確に測定するのが困難であった。II型の三重鎖が吸光度の変化を殆ど又は全く伴わないことが斯界に知られている。
【０１０２】
さらに、ゲルシフト分析もヘアピンＲＥ−２ＡＧ（配列番号４、配列番号１４）及びそのポリピリミジン標的であるＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）について上記した同一の条件で実行した。また、三重鎖の形成をゆっくりと移動するバンドの出現により観察した（図１３）。
【０１０３】
また、ヘアピンＲＥ−２ＡＧ（配列番号４、配列番号１４）単独及びヘアピンＲＥ−２ＡＧ（配列番号４、配列番号１４）＋ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）の融解実験も０．１Ｍ燐酸ナトリウムｐＨ７．２で実行した。これらの条件では、明白な転移（三重鎖からランダムコイルへの）が融解温度Ｔm＝４２℃で観察された。ヘアピン単独は、いかなる転移も示さなかった。対照実験として、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ部分を有さない二重鎖（５'ＧＡＡＧＧNＡＧＧNＡＧＡ３'：３'ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ５'）（配列番号４、配列番号１６）は、３１℃の融解温度を示した。
【０１０４】
さらに、８−アミノグアニンの三重鎖安定化特性を、Ｐｉｌｃｈ外により説明されたモデル系（Ｐｉｌｃｈ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｅｖｅｎｓｏｎ，Ｃ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ．Ｈ．（１９９１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３０巻，ｐ．６０８１−６０８７）を使用して分析した。所望ならばこれを参照されたい。ｄ（Ｃ3Ｔ4Ｃ3）.２［ｄ（Ｇ3Ａ4Ｇ3）］（配列番号１７、配列番号１８）及びｄ（Ｃ3Ｔ4Ｃ3）.２［ｄ（ＧＧNＧNＡ4ＧNＧNＧ）］（配列番号１７、配列番号１９）によって形成された三重鎖を融解実験によって分析した。結果を表５に示している。４個のグアニンの８−アミノグアニンへの置換は、二重鎖からランダムコイルへの転移のΔＧを−１２．６ｋｃａｌ／モルから−１０ｋｃａｌ／モルへと変化させる（２．６ｋｃａｌ／モルの減少）。これに反して、同一の置換は、三重鎖からランダムコイルへの転移のΔＧを−２６．３ｋｃａｌ／モルから−２８．４ｋｃａｌ／モルへと変化させる（２．１ｋｃａｌ／モルの増加）。本発明者らの結論は、８−アミノグアニンは二重鎖を不安定化させるが、II型三重鎖を安定化させるというものである。
【０１０５】
【表５】
2005527219.tif 000006
【０１０６】
本発明者らの結論は、８−アミノグアニンがプリン：ピリミジン：プリン三重鎖を安定化させるというものである。これらの三重鎖は、生理的ｐＨで形成される。８−アミノアデニンは、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖がＧ及びＴ塩基から作られる場合にII型三重鎖を安定化させる。８−アミノグアニンを有するヘアピンは三重鎖形成によってポリピリミジン標的を結合し、そして三重鎖は生理的ｐＨで安定である。
【０１０７】
８−アミノプリンを含むヘアピンの調製
オリゴヌクレオチドを自動アプライドバイオシステムズ３９２ＤＮＡ合成装置で調製した。平行鎖ヘアピンを、当業者に知られた方法を使用して調製した。５'−５'ヘアピン（Ｒ−２２誘導体）を３段階で調製した。第１に、ピリミジン部分を逆Ｃ及びＴホスホラミダイトと逆Ｃ支持体を使用して調製した（該支持体に５'末端を介して連結させた）。第２に、例えば、ヘキサエチレングリコールリンカー（これに限定されない）のようなリンカーを市販のホスホラミダイトを使用して付加させた。第３に、修飾８−アミノプリンを有するプリン部分を天然塩基のために標準的なホスホラミダイト及び８−アミノプリンホスホラミダイトを使用して組み立てた。８−アミノアデニン、８−アミノグアニン及び８−アミノヒポキサンチンのホスホラミダイトを当業者に知られた方法を使用して調製した。３'−３'ヘアピン（Ｂ−２２誘導体）の調製については、同一の手法を使用した。この場合には、プリン部分をまず組み立て、その後ヘキサエチレングリコールを組み立てた。ピリミジン部分は、逆ホスホラミダイトを使用して最後に組み立てた。保護された８−アミノ−２'−デオキシイノシンのホスホラミダイトを乾燥ジクロルメタンに溶解させて０．１Ｍ溶液を生じさせた。残りのホスホラミダイトを乾燥アセトニトリルに溶解させた（０．１Ｍ溶液）。天然塩基を含むオリゴヌクレオチドを市販の化学物質を使用し且つ標準的なプロトコルに従って調製した。これらの配列を組み立てた後に、オリゴヌクレオチド−支持体を３２％水性アンモニアで５５℃で１６時間にわたって処理した（ただし、８−アミノグアニンを有するオリゴヌクレオチドを除く）。この場合には、０．１Ｍの２−メルカプトエタノール３２％水性アンモニア溶液を使用し、そして処理を５５℃で２４時間に延長した。アンモニア溶液を乾燥状態にまで濃縮し、そして産物を逆相ＨＰＬＣによって精製した。オリゴヌクレオチドを０．２μモルのスケールで且つ最後のＤＭＴ基により５'末端で合成して（ＤＭＴオンプロトコル）逆相精製を助成した。精製された全ての産物が主ピークを示し、これを集めた。収量（ＨＰＬＣ精製後の２６０ｎｍ、０．２μモルでのＯＤ単位）は５〜１０ＯＤであった。ＨＰＬＣ条件：ＨＰＬＣ溶液は次の通りであった。溶媒Ａ：５％ＡＣＮの１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ６．５）。溶媒Ｂ：７０％ＡＣＮの１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ６．５）。カラム：ＰＲＰ−１（ハミルトン）、２５０×１０ｍｍ。流速：３ｍＬ／分、１０〜８０％Ｂの３０分直線勾配（ＤＭＴオン）又は０〜５０％Ｂの３０分直線勾配（ＤＭＴオフ）。
【０１０８】
融解実験によるヘアピンの標的配列への結合
三重らせんについての融解実験を次のように実行した。ヘアピン及び標的ワトソン・クリックピリミジン鎖（１１−ｍｅｒ）の等モル量の溶液を５．５〜７．０の範囲のｐＨのＮａＣｌ又はＭｇＣｌ2を有する又はそれを有しない０．１Ｍ燐酸ナトリウム／クエン酸緩衝液中で混合した。ＤＮＡ濃度は、ＤＮＡコイルの状態に対して次の消衰係数：Ｃ、Ｔ、Ｇ、８−アミノ−Ｇ、Ａ及び８−アミノ−Ａについて、それぞれ７５００、８５００、１２５００、１２５００、１５０００及び１５０００Ｍ-1ｃｍ-1を使用して、９０℃でのＵＶ吸光度測定（２６０ｎｍ）によって決定した。これらの溶液を約９０℃に加熱し、ゆっくりと室温にまで冷却し、そしてＵＶを測定するまで約４℃で保存した。ＵＶ吸収スペクトルと融解実験（吸光度対温度）を１ｃｍ経路長のセル中で温度制御器及び０．５℃／分のプログラムされた温度上昇速度を有する分光光度計を使用して記録した。融解は、２６０ｎｍで４μＭの二重鎖濃度で実施した。熱力学研究のために使用される試料を同様の方法で調製したが、融解実験は２６０ｎｍで且つ０．１、０．５及び１ｃｍの経路長のセルを使用して記録した。
【０１０９】
熱力学データを当業者であれば周知の方法を使用して分析した。融解曲線を三重鎖の０．５〜２５μＭの範囲の濃度で得た。融解温度Ｔmを融解曲線の一次導関数の最大値で測定した。１／Ｔｍ対ＩｎＣのグラフは直線的であった。このデータの直線回帰は傾き及びｙ切片を与え、それからΔＨ及びΔＳを得た。自由エネルギーを基準方程式：ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳから得た。
【０１１０】
ゲルシフト実験によるヘアピンの標的配列への結合
ヘアピンのそれらのポリピリミジン標的への結合をゲルシフト法によって分析した。次の標的物を研究した。ＷＣ−１１ｍｅｒ：5'ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＣＴＴＣ3'（配列番号１６）及びＴ３１−ＰＹＲ：5'ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＴＴ ＧＴＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＡＴ ＣＧＡ Ｇ3'（配列番号２０）。
【０１１１】
標的オリゴヌクレオチド又はヘアピンのいずれかを、オリゴヌクレオチドの３５〜５０μモルを２０μＬのキナーゼ緩衝液に溶解させた状態で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び［γ−32Ｐ］−ＡＴＰによってその５'末端に放射性同位元素標識した。３７℃で４５分間インキュベートした後、この溶液を７０℃で１０分間加熱して酵素を変性させ、そしてこの溶液を室温にまで冷却した。６０μＬの５０ｍＭ酢酸カリウムエタノール溶液を該溶液に添加し、そしてこの混合物を−２０℃で少なくとも３時間放置した。この混合物を４℃で４５分間にわたって遠心分離し（１４０００ｒｐｍ）、そして上澄み液を除去した。ペレットを６０μＬの８０％エタノールで洗浄し、そして４℃で２０分間遠心分離した。上澄み液を除去し、そしてペレットを０．２ｍＬの水に溶解させた。
【０１１２】
放射性同位元素標識された標的物を５．５〜７．０の範囲のｐＨの０．１Ｍ燐酸ナトリウム／クエン酸緩衝液中で室温で３０〜６０分間ヘアピンと共にインキュベートした。ヘアピンを２〜２００モル当量の増加量で添加した。インキュベーション後に、この混合物を、インキュベーションに使用したのと同一の緩衝液：５．５〜７．０の範囲の０．１Ｍ燐酸ナトリウム／クエン酸緩衝液を使用して室温で１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより分析した。三重鎖の形成を標的物単独に相当するバンドよりも移動度が小さい放射活性バンドの出現により監視した。
【０１１３】
放射性同位元素標識されたヘアピンにより実施する実験を同様の方法で実行した。この場合には、２〜２００モル当量の増加量の標的オリゴヌクレオチドをヘアピンに添加した。
【０１１４】
円二色性
オリゴヌクレオチドを１００ｍＭ燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．０、５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭ塩化マグネシウム）に溶解させた。それぞれの鎖の等モル濃度は４〜５μＭであった。これらの溶液を約９０℃に加熱し、ゆっくりと室温にまで冷却し、そしてＣＤを測定するまで約４℃で保存した。ＣＤスペクトルを１ｃｍ経路長の石英円筒形セル中でＮｅｓｌａｂ  ＲＰ−１００循環ウォーターバスに取り付けられたＪａｃｏ  Ｊ−７２０分光偏光計により記録した。スペクトルを、１０ｎｍ／分のスキャン速度、１ｎｍのスペクトルバンド幅及び４ｓの時定数を使用して室温で記録した。ＣＤ融解曲線を２０℃／時間の加熱速度及び１００ｎｍ／分のスキャン速度を使用して２８０ｎｍで記録した。全てのスペクトルを緩衝液のブランクで減じ、比較を容易にするために標準化し、そしてＭｃｒｏｃａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ５．０ソフトウェアを使用してノイズ除去した。
【０１１５】
ＮＭＲ分光分析
ヘアピンの等モル混合物ｄ（３'−ＡＧ ＡN ＧＧ ＡN ＧＧＡ ＡＧ−５'−（ＥＧ）6−５'−ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＴ−３'）（ＡN＝８−アミノ−Ａ）（配列番号３、配列番号２）及びＷＣ−１Ｉｍｅｒ：5'ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＣ3'（配列番号１６）を２５０μＬの９：１Ｈ2Ｏ／Ｄ2Ｏ、２５ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液及び１００ｍＭのＮａＣｌ溶液中で調製した。ｐＨを少量の濃ＨＣｌを添加することによって調整した。最終オリゴヌクレオチド濃度はほぼ１ｍＭであった。スペクトルをＢｒｕｋｅｒＡＭＸ分光計で６００ＭＨｚで操作して取得し、そしてＵＸＮＭＲソフトウェアで処理した。ウォーターサプレッションを、ウォーターシグナルにおいてゼロ励起を有するジャンプ・アンド・リターンパルス系列を使用して実行した。全ての実験は５℃で実施した。
【０１１６】
分子モデリング
２つのタイプの計算を行って平行鎖ヘアピンが三重鎖形成のための鋳型として作用するかどうかを試験した：（ｉ）量子力学及び（ii）古典的分子力学。
【０１１７】
量子力学計算
アデニン（又は８−アミノアデニン）とチミン及びグアニン（８−アミノグアニン）とシトシンのワトソン・クリック水素結合のエネルギーを、単離されたプリンについて及び予備形成されたＨｏｏｇｓｔｅｅｎ二量体のアデニン（又は８−アミノアデニン）−チミン又はグアニン（又は８−アミノグアニン）−シトシン+についてＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ）レベルで計算した（図１４）。単量体（Ａ、ＡN、Ｇ、ＧN、Ｃ、Ｔ及びＣ+）、二量体（Ａ−Ｔ、Ａ.Ｔ、ＡN−Ｔ、ＡN.Ｔ、Ｇ−Ｃ+、ＧN−Ｃ+、Ｇ.Ｃ及びＧNＣ）及び三量体（Ｔ−Ａ.Ｔ、Ｔ−ＡN.Ｔ、Ｃ+−Ｇ.Ｃ及びＣ+−ＧN.Ｃ）の幾何学的配置をＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ）理論レベルで完全に最適化させた（ワトソン・クリック塩基対を点「．」で示し、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対をダッシュ「−」で示している。）。最適化された幾何学的配置を周波数分析に付した。基底関数重ね合わせ誤差（ＢＳＳＥ）をＢｏｙｓ＆Ｂｅｒｎａｒｄｉに従って補正した。
【０１１８】
分子力学
ポリｄ（Ｔ−Ａ.Ｔ）、ポリｄ（Ｔ−Ａ）及びポリ（Ａ.Ｔ）についてのトラジェクトリーを古典的分子力学によって得た。本発明者らのシミュレーションのついての出発構造を、当業者に周知の標準的な多段階プロトコールに従って、中性を達成させるために陽イオンで取り囲み、水和させ（ほぼ２〜３０００分子）、最適化し、熱化させ、そして平衡化させた。シミュレーションを、粒子・メッシュエワルト技術（ＰＢＣ−ＰＭＥ）を使用して１．５ｎｓにわたって一定の圧力及び温度（Ｐ＝１気圧、Ｔ＝２９８°Ｋ）で周期的境界条件で実施した。分析については、これらのトラジェクトリーの最後の１ｎｓのみを考慮した。ＳＨＡＫＥを使用してバンドの全てを最適な長さにし、これによりニュートンの法則の積分のための２ｆｓ時間ステップを使用することが可能になった。プロトン化されたシトシン及び８−アミノプリンに対して特異的なパラメーターが追加されたＴＩＰ３Ｐ及びＡＭＢＥＲ−９８力場を使用して分子相互作用を描写した。量子力学計算を、Ｇａｕｓｓｉａｎ−９４コンピュータープログラムを使用して行った。分子力学シミュレーションを、ＡＭＢＥＲ−９５のプログラム一式を使用して実行した。
【０１１９】
オリゴヌクレオチド誘導体の構造
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎピリミジン鎖に直接連結した８−アミノアデニン（ＡN）、８−アミノグアニン（ＧN）及び８−アミノヒポキサンチン（ＩN）を有するヘアピンの結合特性を検討した。これらのオリゴヌクレオチドの配列を図１５に示している。標的ＤＮＡ配列は、Ｘｏｄｏ外によって特徴付けられた三重鎖を含む。ここでは、ポリピリミジンＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖をワトソン・クリックポリプリン鎖に結合させた。
【０１２０】
ヘアピンの第１群（Ｒ−２２Ａ（配列番号１、配列番号２）、Ｒ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）、Ｒ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）、Ｒ−２２Ｉ（配列番号５、配列番号２））は平行鎖であり、そしてそれらの３'末端を介してヘキサエチレングリコールリンカー［（ＥＧ）6］と連結している。これらのものは、２２個の塩基と相当する８−アミノプリンによって置換される２個のプリンとを含む。ヘアピンＲ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）では２個のアデニンが２個の８−アミノアデニン（ＡN）で置換されており、ヘアピンＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）では２個のグアニンが２個の８−アミノグアニン（ＧN）で置換されており、そしてヘアピンＲ−２２Ｉ（配列番号５、配列番号２）では２個のグアニンが２個の８−アミノヒポキサンチン（ＩN）で置換されている。ヘアピンＲ−２２（配列番号１、配列番号２）は、修飾されていない天然塩基のみを含むコントロール配列である。他の部分で説明したように、それぞれのヘアピン中の修飾塩基の数を、最大数の修飾塩基により安定性を最適化させるように選択した。
【０１２１】
ヘアピンの第２群（Ｂ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）、Ｂ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２））は同様の組成を有するが、ポリプリン及びポリピリミジン部分は、それらの５'末端を介してヘキサエチレングリコールリンカー［（ＥＧ）6］と連結している。さらに、２個の８−アミノグアニンと２個の８−アミノアデニンとを有するヘアピンを調製して（Ｂ−２２ＡＧ（配列番号３４、配列番号２））これら２個の８−アミノプリンの安定化特性が付加的かどうか試験した。Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）と同一のポリプリン部分の配列を有する（ただし、ランダムポリピリミジン配列を有する）コントロールのオリゴヌクレオチド（Ｂ−２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８））を調製した。最後に、オリゴマーであるＢ−２２ＡＭＭＴ（配列番号２１、配列番号２２）、Ｂ−２２ＡＭＭＣ（配列番号２１、配列番号２）、Ｂ−２２ＡＭＭＧ（配列番号２１、配列番号２３）、Ｂ−２２ＡＭＭＡ（配列番号２１、配列番号２４）、Ｂ−２２ＡＭＭｐｄ（配列番号２１）、Ｂ−２２ＡＭＭＣＡ（配列番号２５、配列番号２）、Ｂ−２２ＡＭＭＴＡ（配列番号２５、配列番号２２）、Ｂ−２２ＡＭＭＧＡ（配列番号２５、配列番号２３）、Ｂ−２２ＡＭＭＡＡ（配列番号２５、配列番号２４）及びＢ−２２ＡＭＭｐｄＡ（配列番号２５）を調製して三重らせんの安定性に及ぼす中断の影響を検討した。これらのヘアピンでは、２個のアデニンが２個の８−アミノアデニンで置換されている。ピリミジン（Ｃ又はＴ）は、プリン部分の中間位置に局在しており、天然塩基及び脱塩基部位モデル化合物（プロパンジオール：ｐｄ）のそれぞれはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖での相当する位置に局在している。
【０１２２】
オリゴマーの第３群（Ｂ−２２ＡＬＴ１（配列番号３、配列番号２６）、Ｂ−２２ＡＬＴ２（配列番号２７、配列番号２）、Ｂ−２２ＡＬＧＡ（配列番号２８、配列番号２）、Ｂ−２２ＡＬＴＧ（配列番号２９、配列番号２）及びＢ−２２Ｎ）は、Ｂ−２２Ａと同一のヌクレオチド配列を有するが、ポリプリン部分とポリピリミジン部分との間のループがヘキサエチレングリコール架橋の代わりにヌクレオチド（−ＴＴＴＴ−、−ＧＧＡＧＧ−、−ＣＴＴＴＧ−）から作られている。
【０１２３】
３'−３'結合で連結したヘアピンにより形成された三重鎖の熱安定性
Ｒ−２２ヘアピン誘導体及びポリピリミジン標的配列（ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）によって形成された三重らせんの相対的安定性を様々なｐＨ（ｐＨ４．５〜７．０）で分光光度法で測定した。殆ど全ての場合において、ある単一の転移が酸性ｐＨでは２５％周辺及び中性ｐＨでは２０％周辺の深色性で観察された。融解曲線を三重らせんからランダムコイルへの転移に割り当てた。例外的に、約ｐＨ５．５〜６での三重鎖Ｒ−２２Ｉ：ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号５、配列番号２、配列番号１６）の融解曲線は、２つのｐＨ依存性転移を示した。三重らせんにおいてＡ及びＢを８−アミノアデニン（ＡN）及び８−アミノグアニン（ＧN）で置換したときに、このものは非常に安定化した（約ｐＨ４．５〜ｐＨ７．０の範囲で１０〜１８℃：表６）。グアニンを８−アミノヒポキサンチン（ＩN）で置換したときに、三重らせんの安定性は酸性ｐＨでのみ僅かに増大したが、ＩNを含む三重鎖は中性ｐＨでその安定性を保持し、その一方で非修飾三重鎖の安定性は急速に低下した。
【０１２４】
転移が三重らせんの形成によるものかどうかを試験するために、融解曲線を、ポリピリミジン標的配列（ＷＣ−１１ｍｅｒ）（配列番号１６）の非存在下に、ヘアピン（Ｒ−２２（配列番号１、配列番号  ２）、Ｒ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）、Ｒ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）、Ｒ−２２Ｇ（配列番号５、配列番号２）単独で得た。また、単一の転移がより低い温度でそしてほぼ１０〜１５％の深色性により観察されたが、これは、ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）（三重らせん）で観察された転移がＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）なしで観察された転移とは異なることを示している。ヘアピン単独で観察された転移は平行二重鎖からランダムコイルへの転移に相当する。
【０１２５】
３'−３'結合によって連結したヘアピン対５'−５'結合を有するヘアピン
３'−３'結合によって連結したヘアピン（Ｒ−２２誘導体）に加えて、５'−５'結合によって連結したヘアピン（Ｂ−２２誘導体）を調製した。Ｂ−２２オリゴヌクレオチド誘導体及びポリピリミジン標的配列（ＷＣ−１１ｍｅｒ）（配列番号１６）によって形成された三重らせんの相対的安定性を測定した。ここで説明されるように、一つの単一転移が２５％周辺の深色性で観察されたが、これは三重らせんの融解に相当していた。三重らせんにおける８−アミノアデニン（ＡN）によるＡの置換及び８−アミノグアニン（ＧN）によるグアニンの置換は、三重らせんを大きく安定化させた（表７）。さらに、ヘアピンの融解曲を標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）なしで分析したときに、その平行構造は８−アミノプリンの存在によって安定化した。酸性のｐＨでは、両者のタイプのヘアピンによって形成された三重鎖は同様の安定性を有する。中性のｐＨでは、３'−３'結合によって連結したヘアピン（Ｒ−２２誘導体）は、５'−５'結合によって連結したヘアピン（Ｂ−２２誘導体）よりも安定な三重鎖を形成する。それにもかかわらず、８−アミノプリンによる安定性の増大は両者の系において同様であった。
【０１２６】
次に、本発明者らは、８−アミノアデニン及び８−アミノグアニンの安定化特性が付加的かどうかを試験した。２個の８−アミノアデニン及び２個の８−アミノグアニン置換を有するヘアピンを調製した（Ｂ２２ＡＧ）（配列番号３４、配列番号２）。融解曲線を４．５〜７．０のｐＨ（０．１Ｍの燐酸ナトリウム、クエン酸、１ＭのＮａＣｌ）で好適なヘアピン及び標的ＷＣ−１１ｍｅｒについて得た。８−アミノプリンの安定化特性は付加的であることが分かった（表７）。例えば、ｐＨ６．０では、２個の８−アミノグアニン及び２個の８−アミノアデニンの付加は融解温度を２０℃上昇させるが、２個の８−アミノアデニンは６℃の増大を誘導し、そして２個の８−アミノグアニンは１４℃の上昇を誘導する。
【０１２７】
ヘアピンの三重鎖形成に果たすＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖の役割
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖の役割をさらに調査した。本発明者らは、同一のプリン配列を有するが、２個の８−アミノアデニン置換及び非相補的ピリミジン鎖を有するヘアピンプローブを調製した。このオリゴヌクレオチド（Ｂ−２２Ａコントロールという（配列番号３、配列番号８））は、標的配列（ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６））とのワトソン・クリック相互作用のみを形成し得る。
【０１２８】
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖が非相補的配列で置換されるときに、平行二重鎖の構造は、その融解曲線が標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）なしで得られるときに観察される転移の消失によって明らかにされるように、失われる（表８）。
【０１２９】
Ｂ２２−Ａコントロール：ＷＣ−１１ｍｅｒによって形成される二重鎖（配列番号３、配列番号８、配列番号１６）で観察される転移は、より低いＴm及び深色性を示した。Ｂ−２２Ａコントロール：ＷＣ−１１ｍｅｒによって形成される二重鎖（配列番号３、配列番号８、配列番号１６）の転移に関わる深色性は１１％であったが、これは二重鎖から単鎖への転移を示している。
【０１３０】
Ｂ−２２Ａ：ＷＣ−１１ｍｅｒによって形成された複合体（配列番号３、配列番号２、配列番号１６）で観察される転移は２２％の深色性を示したが、これは三重鎖から単鎖への転移を示している。Ｂ−２２Ａコントロール二重鎖とＢ−２２Ａ三重鎖とのＴmの間の相違は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖の付加によって得られる利益である。約ｐＨ６．０では、この相違は１１℃（１塩基当たり１．０℃）であり、ｐＨ５．５では１６℃（１塩基当たり１．４℃）である。
【０１３１】
三重鎖の安定性に及ぼす塩の影響
次に、本発明者らは、ｐＨ６．０での三重鎖安定性に及ぼすＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2及びスペルミンの影響を調査した（図２１）。本発明者らは、ヘアピンＢ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）によって形成された三重鎖並びにヘアピンＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）及びＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）によって形成された三重鎖を使用した。ＮａＣｌについては、使用した緩衝液は０．１Ｍ燐酸ナトリウム−クエン酸ｐＨ６．０であった。ＭｇＣｌ2及びスペルミンについては、使用した緩衝液は０．１Ｍ燐酸ナトリウムｐＨ６．０であった。
【０１３２】
塩化ナトリウムは、僅かな安定化効果を有していた（約４９℃（ＮａＣｌなし）〜５１℃（１ＭのＮａＣｌ）。低濃度のＭｇＣｌ2は三重鎖を安定化させる。例えば、三重鎖Ｂ−２２Ｇ：ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号４、配列番号２、配列番号１６）及びＢ−２２Ａ：ＷＣ−１１ｍｅｒの融解温度は、ＭｇＣｌ2なし〜１０ｍＭのＭｇＣｌ2で５度ずつ上昇した。１０ｍＭ〜５０ｍＭのＭｇＣｌ2では、融解温度の上昇はゼロ又は１度未満である。本発明の好ましい具体例では、マグネシウムの存在は、マグネシウムの濃度が好ましくは１０ｍＭであることを含め、三重鎖の安定性を向上させるために使用される。スペルミンは、一般に三重鎖の安定性に影響を及ぼさない。
【０１３３】
ポリピリミジン標的配列内での中断の存在
また、本発明者らは、標的のポリピリミジントラックに及ぼす中断の影響も調査した。この目的のために、配列の中央部にプリンを有する２種のポリピリミジン標的を調製した（ｓ11−ＭＭＧ：5'ＴＣＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＣ3'（配列番号：３０）及びｓ11−ＭＭＡ：5'ＴＣＴ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＣ3'（配列番号：３１））。次に、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ位置に４個の天然塩基及び脱塩基モデル化合物、例えば、限定されないがｐｄ（プロパンジオール）を有するヘアピンを調製した（図１５）。さらに、２個の８−アミノアデニンをプリン部分に導入した。これらのオリゴマーは、該中断の反対側のワトソン・クリック位置に相補的な塩基を有し、しかも該中断の反対側のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖にＴ、Ｃ、Ｇ、Ａ又はｐｄを有している。融解曲線は、ｐＨ６．０、１Ｍ燐酸ナトリウム、１ＭＮａＣｌで得た。
【０１３４】
ポリピリミジン標的にシトシンの代わりにグアニンを有する三重鎖の融解温度を表９に示している。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎピリミジン部分にシトシンを有するヘアピンは最良の結合を与えた。ヘアピンＢ−２２ＡＭＭＣ（配列番号２１、配列番号２）はその標的（ｓ11−ＭＭＧ）（配列番号３０）に結合したが、Ｔmは４℃低下した（５１℃のＢ−２２Ａ：ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号３、配列番号２、配列番号１６）と比較して４７℃のＢ−２２ＡＭＭＣ：ｓ11−ＭＭＧ（配列番号２１、配列番号２、配列番号３０））。新規なヘアピンのその新規な標的への結合は、三重鎖Ｂ−２２ＡＭＭＣ（配列番号２１、配列番号２）のＴmの旧来の標的に対する著しい低下（３３℃のＢ−２２ＡＭＭＣ：ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号２１、配列番号２、配列番号１６）対４７℃のＢ−２２ＡＭＭＣ：ｓ11−ＭＭＧ（配列番号２１、配列番号２、配列番号３０））によって明らかにされるように、非常に選択的である。
【０１３５】
アデニンをポリピリミジン標的に導入したときにも同様の結果が得られた（表１０）。この場合には、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ位置での最良の塩基はＧであった。Ａ．Ｔ中断への結合にはＧが優先されること及びＧ．Ｃ中断への結合にはＣが優先されることは当業者であれば周知である。しかしながら、平行ヘアピン内での中断は、プリンワトソン・クリック部分のために、克服するのがより容易である。従って、平行ヘアピン、特に８−アミノプリンを有するヘアピンは、短い中断を有するポリピリミジン標的に効率的に結合するように再設計され得る。
【０１３６】
三重鎖安定性に果たすループの役割
最後に、三重鎖の安定性に果たすループの役割を、様々なループを有するＢ−２２Ａの誘導体を調製することによって分析した。ヘキサエチレングリコールリンカーに加えて、ヌクレオチドループ−ＴＴＴＴ−、ＧＧＡＧＧ−及びＣＴＴＴＧ−を調査した。２種のテトラチミンループを調製した：プリン鎖に対して逆に配向する第１のもの（Ｂ−２２ＡＬＴ１０（配列番号３、配列番号２６）及びプリン鎖と同一の配向の第２のもの（Ｂ−２２ＡＬＴ２（配列番号２７、配列番号２））。ＧＧＡＧＧ及びＣＴＴＴＧループは、プリン鎖と同一の配向であった（Ｂ−２２ＡＬＧＡ（配列番号２８、配列番号２）及びＢ−２２ＡＬＴＧ（配列番号２９、配列番号２）。ヘアピン及び標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）によって形成された三重鎖の融解曲線をｐＨ６．０、０．１Ｍの燐酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌで得た。融解温度を以下に示す。
Ｂ−２２Ａ  3'ＡＧＡNＧＧＡNＧＧＡＡＧ5'−（ＥＧ）6-5'-ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ3'-  Ｔm＝５１℃（配列番号３、配列番号２）、
Ｂ−２２ＡＬＴ１  3'ＡＧＡNＧＧＡNＧＧＡＡＧ5'−5'ＴＴＴＴ−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ3'  Ｔm＝５７℃（配列番号３、配列番号２６）、
Ｂ−２２ＡＬＴ２  3'ＡＧＡNＧＧＡNＧＧＡＡＧ−ＴＴＴＴ5'−5'ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ3'  Ｔm＝５５℃（配列番号２７、配列番号２）、
Ｂ−２２ＡＬＧＡ  3'ＡＧＡNＧＧＡNＧＧＡＡＧ−ＧＧＡＧＧ5'−5'ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ3'  Ｔm＝５４℃（配列番号２８、配列番号２）、
Ｂ−２２ＡＬＴＧ  3'ＡＧＡNＧＧＡNＧＧＡＡＧ−ＣＴＴＴＧ5'−5'ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ3'  Ｔm＝５４℃（配列番号２９、配列番号２）。
【０１３７】
ヌクレオチドループの使用は、三重鎖の安定性にとってより好ましい。最良の結果が逆ＴＴＴＴリンカー（ヘアピンＢ−２２ＡＬＴ１（配列番号３、配列番号２６）、ΔＴm６℃）で得られ、次いでＴＴＴＴリンカー（ヘアピンＢ−２２ＡＬＴ２（配列番号２７、配列番号２）、ΔＴm４℃）並びにＧＧＡＧＧ及びＣＴＴＴＧリンカー（ヘアピンＢ−２２ＡＬＧＡ（配列番号２８、配列番号２）、Ｂ−２２ＡＬＴＧ（配列番号２９、配列番号２）、ΔＴm３℃）で得られた。特定の理論に拘泥されることを望まないが、本発明者らは、ヌクレオチドループを有するヘアピンで見出される向上した安定性が融解実験で使用した高塩濃度によるものであることを提案する。融解実験をより低い塩濃度で実行したときに、ヘキサエチレングリコールリンカーを有するヘアピンとヌクレオチドリンカーを有するヘアピンとの間の相違はさほど顕著でないことが分かった。
【０１３８】
分子モデリング
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ平行二重鎖の単鎖オリゴヌクレオチドへの結合による三重らせんの形成は、ワトソン・クリック様Ｈ−結合の形成によって左右される。相補Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基の存在は、ワトソン・クリック相互作用の大きさを変化させ得る。これらの結果は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基の存在ではワトソン・クリック相互作用に劇的な変化が予期され得ないことを示している。従って、ＴのＨｏｏｇｓｔｅｅｎＡ−Ｔ（又はＡN−Ｔ）二量体への結合は、Ａへの結合よりも悪い１ｋｃａｌ／モル未満であり、そしてＣのプロトン化Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ二量体Ｇ−Ｃ（又はＧN−Ｃ）への結合は、単離Ｇへの結合よりも良好な２〜３ｋｃａｌ／モルである。別の部分で報告したように、８−アミノプリンの存在はワトソン・クリック相互作用の強さを僅かに減少させたかもしれないが、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖からの三重鎖の形成に影響を及ぼさなかった。
【０１３９】
計算から、予備構成されたＨｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖は三重鎖を誘導することが示唆される。しかしながら、単離されたＨｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖は十分には予備構成され得ない。予備構成の作用の強さは、単離された二重鎖のトラジェクトリー中にサンプル抽出された構造と三重鎖構造内の二重鎖の平均構造との間の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳｄ）によって推定できる。図１６は、ワトソン・クリック二重鎖及びＨｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖の両方のトラジェクトリーと三重鎖内部に取り込まれたときの両方の二重鎖の平均構造（三重鎖のＭＤトラジェクトリーの分析によって得られた平均構造）との間のＲＭＳｄを示している。遊離のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖と三重鎖予備構成Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖との間のＲＭＳｄは、単離二重鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ又はワトソン・クリック）のトラジェクトリーと相当するＭＤ平均構造との間のＲＭＳｄが約０．８Åであるという事実によって明らかにされるように、シミュレーションの熱雑音に近いわずか約１Åにすぎない。対称的に、遊離のワトソン・クリック二重鎖と三重鎖予備構成ワトソン・クリック二重鎖との間のＲＭＳｄは、約２Åである。ＭＤシミュレーションから、遊離の平行Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖は、ワトソン・クリック逆平行二重鎖よりも良好に予備形成されて三重鎖を形成することが強く示唆される。この知見は、スペクトルがＨｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖から相当する三重鎖への転移よりもワトソン・クリック二重鎖から三重鎖への転移で変化することを示すＣＤデータと一致する。従って、当業者であれば、本発明のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ平行ヘアピンは、三重らせんの形成にとって非常に効率的な鋳型であることが分かるであろう。
【０１４０】
熱力学研究
三重鎖からランダムコイルへの転移のＤＮＡ濃度依存性をいくつかの三重鎖について調査した（表１２）。全ての場合において、三重鎖からランダムコイルへの転移の融解温度は、生体分子の転移について予期されるように、その濃度と共に低下する。１／Ｔm対濃度のグラフは直線的であったが、これは傾き及びｙ切片を与え、これらからΔＨ、ΔＳ及びΔＧを得た（表１２）。
【０１４１】
三重鎖解離についてのΔＧは、非修飾三重鎖については−５８ｋＪ／モルであり、２個のＡNを有する三重鎖については−７６ｋＪ／モルであり、そして２個のＧNを有する三重鎖については−８８ｋＪ／モルであった。これらの値の比較から、２個のＡ→ＡN置換についてほぼ１７ｋＪ／モルのΔＧの差が得られる（置換当たり７．５ｋＪ／モル、２．０ｋｃａｌ／モル）。ＧNを有する三重鎖については、ΔＧの差は３０ｋＪ／モル（置換当たり１５ｋＪ／モル、３．６ｋｃａｌ／モル）である。その他の塩基のアナログと比較すると、本発明者らはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対とワトソン・クリック塩基対の安定性を一緒に測定したが、これらのものは、修飾塩基について報告した最も高い三重鎖安定化特性の中にある。
【０１４２】
ゲルシフト法
また、ヘアピンのそれらの標的への結合もゲルシフト実験によって分析した。標的を［γ−32Ｐ］−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼで放射性同位元素標識し、そして増加量のヘアピンを添加した。室温で約３０分〜１時間１００ｍＭのＮａ+イオン強度のクエン酸−燐酸塩緩衝液ｐＨ６中でインキュベートした後、この混合物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。三重鎖の形成を標的単独に相当するバンドよりも移動度の小さい放射活性バンドの出現によって監視した（図１７）。
【０１４３】
図１７は、ヘアピン（Ｒ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｒ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２））の単鎖標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（5'ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ3'）（配列番号１６）への結合を示している。全ての場合において、より小さい移動度の新たな放射活性バンドが出現した。この新たなバンドの相対強度は、融解実験と一致している。例えば、修飾プリン（ＡN及びＧN）を有するヘアピンは、非修飾ヘアピン（０．５μＭ、図１７）よりも低い濃度（０．０２〜０．１μＭ、図１７）で新たなバンドの形成を完成させた。また、ＧNを有するヘアピンも、融解実験と一致して、ＡNを有するヘアピンよりも良好な結合特性を示した。さらに、結合は、ｐＨ７．０よりもｐＨ５．０で効率的である。また、本発明者らは、非機能性Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖を有するヘアピンＢ−２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８）とその標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）との結合がヘアピンＢ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）よりも１００倍高い濃度で低い移動度のバンドを与えることを見出した。これらのデータの全ては、ヘアピンで検出されたより低い移動度のバンドが三重鎖に相当することを示している。
【０１４４】
また、ヘアピンＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）の単鎖標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）及び標識されたＷＣ−１１ｍｅｒ（5'ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣ3'）（配列番号１６）とその相補プリン鎖（3'ＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧ5'）（配列番号１）とによって形成された二重鎖標的への結合も試験した（図２２）。標識されたオリゴヌクレオチドが標的ピリミジン鎖（ＷＣ−１１ｍｅｒ）（配列番号１６）であるときに、より小さい移動度の新たな放射活性バンドが単鎖及び二重鎖標的の両方に出現するが、これは三重鎖の形成を示している。対称的に、標識オリゴヌクレオチドがプリン鎖であるときには新たなバンドは観察されないが、これはヘアピンが単に標的ピリミジン鎖に結合しているにすぎないことを示している。
【０１４５】
さらに、約１１塩基よりも長い第２の単鎖及び二重鎖ＤＮＡ標的のセットへのヘアピンの結合を調査した。二重鎖ＤＮＡ標的は、分子の中央に本研究において説明されるヘアピンに相補的な１１塩基のピリミジントラックを含む３１塩基対を有していた：
Ｔ31  ５'ＣＧＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＣＡＴＣＧＡＧ３'（配列番号３２）、
Ｔ31相補  ３'ＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＴＡＧＣＴＣ５'  （配列番号３３）。
【０１４６】
ヘアピンの単鎖標的（Ｔ31）（配列番号３２）への結合が明らかに検出された（図１８）。対称的に、ヘアピンは二重鎖ＤＮＡには結合しなかった。特定の理論に拘泥されることを望まないが、二重鎖ＤＮＡ標的への結合の相違は、小さな二重鎖がその二重鎖の形態と平衡状態にある単鎖分子の大きなポピュレーションを含有するという事実に由来し得る。ヘアピンは、おそらく単鎖の形態に結合し、しかしてその二重鎖の形態を三重鎖に置換させる。それよりも長い二重鎖では、単鎖の形態が少ないため、ヘアピンは二重鎖に結合し且つそれを開いてその相補鎖を置換しなければならない。ここで説明されるヘアピンに関しては、この現象は非常に緩やかであり又は実現不可能である。
【０１４７】
結合実験を、過剰のコールド標的Ｔ31（配列番号３２）を放射性同位元素標識ヘアピン（Ｒ２２Ｇ）（配列番号４、配列番号２）に付加させることによって実行したときに、三重鎖の形成も観察された（図５）。放射性同位元素標識ヘアピン（Ｒ２２Ｇ）（配列番号４、配列番号２）単独は、非変性ゲルにおいて２つのバンドを示した。速く流れるバンドは、２２塩基のオリゴヌクレオチドについて予期される移動度を示した。ゆっくりと流れるバンドは、二量体の移動度を有していた。この第２のバンドは、平行二量体に相当すると思われる。従って、平行ヘアピンは、分子内ヘアピンと分子間二量体との間の平衡状態にある。ポリピリミジン標的が付加されたときに、この二量体の移動度は、三重鎖に相当するバンドの完全な形成を示す程度に変化した。平行二量体の三重鎖の形成は観察されなかった。
【０１４８】
円二色性
三重鎖形成を確認し且つヘアピン構造についてのさらなる情報を得るために、円二色性（ＣＤ）スペクトルを得た。この技術は、偏光の吸収の差を測定する。核酸のコンフォメーション変化はＣＤによって検出でき、また該スペクトルと既知の構造のスペクトルとの比較は、特定のコンフォメーションの存在を示唆する。ＣＤスペクトルにおける強い負の短波長（２１０〜２２０ｎｍ）バンドは、三重鎖複合体の形成を示す。ヘアピンＢ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）とそれらの標的との間で形成される三重鎖のＣＤスペクトル並びにヘアピン単独のＣＤスペクトルを図１９に示している。全ての場合において、本発明者らは、ヘアピンと標的分子との結合に基づく強い負のバンド（ほぼ２１５ｎｍ）を観察した。この負のバンドの強さは、相互作用の強さと相関する。というのは、負のバンドは、融解実験でより安定な修飾ヘアピン（Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２））によって形成される三重鎖で、より強いからである。
【０１４９】
また、ヘアピンＢ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＢ−２２Ｇによってそれらのポリピリミジン標的（ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６））と共に形成された三重鎖の融解曲線もＣＤ分光分析によって分析した。ＣＤ実験によって得られた融解曲線は、ＵＶ吸収によって観察された温度と同様であった（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１Ｍの燐酸ナトリウム溶液ｐＨ６．０中で、三重鎖Ｂ−２２Ａ：ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号３、配列番号２、配列番号１６については５３．０℃、三重鎖Ｂ−２２Ｇ：ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号４、配列番号２、配列番号１６）については５６．５℃）（図２３参照）。
【０１５０】
ＮＭＲスペクトル
２種のｐＨでのヘアピンＢ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びポリピリミジン標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）によって形成された三重鎖の一次元1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのイミノ領域を図２０に示している。予期されたイミノプロトンシグナルの大部分が１２〜１６ｐｐｍではっきりと観察される。１５〜１６．０ｐｐｍの４つのイミノシグナルの存在は、シトシンがプロトン化されていることを明確に示している。このスペクトルは三重らせんと一致する。この交換性プロトンスペクトルの特徴の大部分は約ｐＨ６．６で観察されるが、これは中性ｐＨでの三重鎖の高い安定性を示す。この三重鎖における交換性プロトンのラインは、単離されたＢ−２２Ａヘアピン（配列番号３、配列番号２）よりもかなり狭い。平行Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎヘアピンでのラインの広がりは、コンフォメーション変化又は溶媒交換によるものかもしれない。この力学的効果は三重鎖形成では観察されない。
【０１５１】
当業者であれば、本発明は、本発明のヘアピンが三重鎖形成によって特定の単鎖ポリピリミジン標的に結合することを示すことを理解するであろう。これらのヘアピンの結合は、８−アミノプリンを含有するときにより強い。８−アミノグアニンは最も強い安定化効果を示し、８−アミノアデニンがそれに続く。８−アミノヒポキサンチンは、中性ｐＨでのみ非修飾ヘアピンよりも効率的である。８−アミノプリンを有するヘアピンによって形成される本発明の三重鎖の安定性はｐＨ依存性であるが、修飾ヘアピンとそれらの標的との相互作用は、三重鎖が、例えば約１１塩基を有するような短いモデル配列について中性のｐＨでさえも観察されるほど強力である。８−アミノアデニン及び８−アミノグアニンの両方は、三重鎖の安定性について付加的な効果を有する。また、ホモプリン配列とホモピリミジン配列とを連結させるループは、ヌクレオチドから作られる場合には、追加の安定化効果をも有する。
【０１５２】
修飾ヘアピンは、ポリピリミジン標的配列内にある小さな中断に対抗するように再設計され得る。これは、特に単鎖標的に対する三重鎖の分野、例えば、アンチセンス分野及びＲＮＡ検出における用途のために大きな可能性を提供する。また、８−アミノプリンの使用は、三重鎖の分野において説明されている開発の大部分とも一致しているため、本発明者らは、８−アミノプリンが三重鎖形成に基づく任意の既存の手法を改善させるであろうと考えている。
【０１５３】
【表６】
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【０１５４】
【表７】
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【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
【表９】
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【０１５７】
【表１０】
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【０１５８】
【表１１】
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【０１５９】
【表１２】
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【０１６０】
本発明の特定の具体例を例示の目的のために説明してきたが、当業者であれば、本発明の詳細の多数の変形例を、添付した請求の範囲及び配列表に規定されるような発明から逸脱することなくなし得ることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】ワトソン・クリック、逆ワトソン・クリック及びＨｏｏｇｓｔｅｅｎのＡ・Ｔ対合の略図である。
【図２】８−アミノ誘導体の導入によって誘導された平行二重鎖の安定化を計算するために使用した熱力学サイクルを示す図である。
【図３】Ａ及びＢトラジェクトリーで得られたＨｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖のＭＤ平均構造を示している。Ｂ型三重鎖におけるＨｏｏｇｓｔｅｅｎ二重鎖のコンフォメーションを比較のために示している。
【図４】逆ワトソン・クリック二重鎖の３つのトラジェクトリーで得られた最終的な構造を示す図である。
【図５】標準的な逆平行二重鎖（左）及びＨｏｏｇｓｔｅｅｎ平行二重鎖（右）についての伝統的な分子相互作用ポテンシャル（ｃＭＩＰ：上）及び溶媒和マップ（下）を表す図である。
【図６】プロトン化及びゆらぎＨｏｏｇｓｔｅｅｎ８ＡＧ−Ｃ２量体を示す図である。
【図７】本発明の８−アミノプリン：８−アミノアデニンＡN、８−アミノグアニンＧN、８−アミノヒポキサンチン及び（ＥＧ）6ヘキサエチレングリコールリンカーを有する平行鎖ヘアピンの配列を表す図である。
【図８】Ｒ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２（配列番号１、配列番号２）並びに２種の逆平行二重鎖Ｄ１（配列番号１、配列番号２）及びＤ２（配列番号１、配列番号９）についてのｐＨによるＴｍの依存性を示す図である。
【図９】（Ａ）ヘアピンＢ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）、Ｂ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）、Ｂ−ＡＴ（配列番号６、配列番号７）、及びＢ−２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８）（ピリミジン鎖配列がランダムであるＢ−２２ヘアピン）と好適な単鎖オリゴヌクレオチド（Ｓ１１ＷＣ）（配列番号１６）によって形成された逆平行二重鎖のＣＤスペクトル、並びに（Ｂ）Ｂ２２Ａコントロール（配列番号３、配列番号８）単独及び逆平行相補ピリミジン鎖の付加後のＣＤスペクトルを示す図である（０．１Ｍ燐酸ナトリウム，ｐＨ６．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）。
【図１０】Ｔ＝５０℃でのｄ（３'−ＡＧＡＮＧＧＡＮＧＧＡＡＧ−５'−（ＥＧ）6−５'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ−３'）のＮＭＲスペクトルの交換性プロトン領域を示す図である。
【図１１】Ｇ：８−アミノＧ：Ｃ及びＴ：８−アミノＡ：Ｔの塩基対合スキームを示す図である。
【図１２】ｓ11−ＧＡ（配列番号１４）及びｓ11−ＧＴ（配列番号１５）、ｈ26（配列番号１１）、ｈ26−３ＡＧ（配列番号１２）及びｈ26−３ＡＡ（配列番号１３）で実行されたゲルシフト分析を示す図である。
【図１３】ヘアピンＲＥ−２ＡＧ（配列番号４、配列番号１４）及びそのポリピリミジン標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）で実行されたゲルシフト分析を示す図である。
【図１４】ポリピリミジン単鎖核酸を本発明のヘアピンと結合させるスキームを示す図である。
【図１５】本発明の８−アミノプリンである８−アミノアデニンＡN、８−アミノグアニンＧN、８−アミノヒポキサンチンＩN、及びヘキサエチレングリコールリンカー（ＥＧ）6、及びＧＴＴＴＣ、ＧＧＡＧＧ及びＴＴＴＴリンカーを有する平行鎖ヘアピンの配列を示す図である。
【図１６】平行Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ（Ｈｏ）及び逆平行ワトソン・クリック（ＷＣ）二重鎖のトラジェクトリーと、それらの各のＭＤ平均構造との間の２乗平均平方根偏差（Ａで表すＲＭＳｄ）（上）、及び、その同一のトラジェクトリーと、逆平行三重鎖における両二重鎖のＭＤ平均構造との間の２乗平均平方根偏差（下）を表す図である。
【図１７】Ｒ２２（配列番号１、配列番号２）、Ｒ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）のＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）への結合を示す図である（１００ｍＭＮａ+イオン強度のクエン酸−燐酸塩緩衝液ｐＨ６）。
【図１８】ヘアピンＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）の単鎖標的Ｔ31（配列番号３２）へのｐＨ５．０での結合を示す図である。
【図１９】ヘアピンＢ−２２（配列番号１、配列番号２）、Ｂ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）及びＢ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）単独の及びそれらのピリミジン標的ＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号１６）とのＣＤスペクトルを示す図である（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１Ｍの燐酸ナトリウムｐＨ６）。
【図２０】Ｂ２２Ａ：ｄ（３'−ＡＧＡＮＧＧＡＮＧＧＡＡＧ−５'−（ＥＧ）6−５'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ−３’）（配列番号３、配列番号２）及びＷＣ−１１ｍｅｒ（３'−ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ−５'）（配列番号１６）によって形成された三重鎖のＴ＝５℃でのＮＭＲスペクトルの交換性プロトン領域を示す図である。
【図２１】ヘアピンＢ−２２Ａ（配列番号３、配列番号２）及びＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）によって形成された三重鎖の様々な塩濃度での融解温度を示す図である。
【図２２】ヘアピンＲ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）の単鎖及び二重鎖標的への結合をゲルシフト実験により示した図である。
【図２３】ＣＤに従うＢ−２２Ｇ（配列番号４、配列番号２）及びＷＣ−１１ｍｅｒ（配列番号）よって形成された三重鎖についての融解実験を示す図である。
【図２４】Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対及び平行鎖ＤＮＡを示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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