(57)【要約】本発明は、属Ｉｓａｔｉｓおよび属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択された少なくとも１つの種の草本からの有効成分を含む草本組成物でウイルス感染を治療し；抽出物を医薬上許容される処方物に処方し；および該処方物をウイルス感染に罹った哺乳動物に投与する方法を提供する。また、本発明は草本組成物でウイルス感染を治療する方法を提供し、ここに、当該処方物は粉末、シロップ、煎じ汁、チンキ、注射液、局所溶液、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、噴霧剤、坐薬またはマイクロカプセルの形態である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
属Ｉｓａｔｉｓおよび属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択された少なくとも１つの種の草本から有効成分を抽出し；前期抽出物を医薬上許容される処方に処方し；次いで、前期処方をウイルス感染に罹った哺乳動物に投与することを含む草本組成物でウイルス感染を治療する方法。
【請求項２】
属Ｉｓａｔｉｓから選択される種がＩｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ ＬおよびＩｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択される種がＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓ ｃｕｓｉａ Ｂｒｅｍｅｋを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
ウイルス感染がインフルエンザウイルスでの感染を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
ウイルス感染が肝炎ウイルスでの感染を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
ウイルス感染がヒト免疫不全ウイルスでの感染を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
さらに、抽出を有機溶媒の存在下で行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
さらに、抽出をエタノールエーテルまたはアセトンの存在下で行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
さらに、抽出を水の存在下で行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前期処方が粉末、シロップ、煎じ汁、チンキ、注射剤、局所溶液、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、噴霧剤、坐薬またはマイクロカプセルの形態である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前期処方が、１日当たり５０ないし５０，０００ミリグラムの投与量範囲で投与される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前期抽出工程が、ＩｓａｔｉｓおよびＢｓｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せを得；前期固体組合せを粉砕し；還流下で４０％ないし９０％のアルコールで前期固体組合せを抽出し；前期アルコールおよび抽出物組合せを蒸発させて液体を生じさせ；水およびマクロ分子沈殿剤を前期液体に添加し；次いで、ロジンクロマトグラフィーカラムを通して前期液体混合物を精製することによって行う請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前期精製が、ロジンカラムを蒸留水で溶出させ；溶出剤から蒸留水を蒸発させて、第１の抽出物が得られ；ロジンカラムを７０％ないし９８％アルコールで溶出させて、第２の抽出物が得られ；次いで、第１および第２の抽出物を合わせることによって行われる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前期抽出工程が、ＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せを粉砕し；前期固体を水で少なくとも２回沸騰させ、沸騰した水を濾過して濾液が得られ；マクロ分子沈殿剤を濾液に添加し；濾液を２回目の濾過をし；次いで、濾液を真空下において溶媒を蒸発させることによって行われる請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前期抽出工程が、ＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せを得；前期固体組合せを粉砕し；還流下で前期固体組合せを４０％ないし９０％アルコールで抽出し；前期アルコールおよび抽出物組合せを蒸発させて液体が得られ；水およびマクロ分子沈殿剤を液体に添加し；次いで、さらに、ロジンクロマトグラフィーカラムを通して液体混合物を精製することによって行われる草本抽出物の製法。
【請求項１６】
前期精製工程が、蒸留水でロジンカラムを連続的に溶出させ；溶出物から蒸留水を蒸発させて、第１の抽出物が得られ；ロジンカラムを７０％ないし９８％エタノールで溶出させ、第２の抽出物が得られ；次いで、第１および第２の抽出物を合わせることによって行われる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前期抽出工程が、ＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せを粉砕し；前期組合せを水で少なくとも２回沸騰させ、前期水を濾過して濾液が得られ；マクロ分子沈殿剤を濾液に添加し；濾液を２回目に濾過し；次いで、濾液を真空下に置いて溶媒を蒸発させることによって行われる草本抽出物の製法。
【請求項１８】
請求項１５から１７の方法による草本抽出物生成物。
【請求項１９】
属Ｉｓａｔｉｓおよび属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択された少なくとも１つの種の有効量の抽出物および医薬上許容される処方を含む医薬組成物。
【請求項２０】
感染した細胞中でウイルス複製を阻害するにおける、またはウイルス非感染にするにおける有効量の属Ｉｓａｔｉｓおよび属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択される少なくとも１つの種の抽出物および医薬上許容される処方を含む医薬組成物。
【請求項２１】
属Ｉｓａｔｉｓから選択される種がＩｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｓ ＬおよびＩｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔを含む請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択される種がＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓ ｃｕｓｉａ Ｂｒｅｍｅｋを含む請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ウイルス感染がインフルエンザウイルスでの感染を含む請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ウイルス感染が肝炎ウイルスでの感染を含む請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ウイルス感染が、ヒト免疫不全ウイルスでの感染を含む請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ａ．水中である量のＩｓａｔｉｓ種を適当な時間煎じ；
ｂ．残渣から水性相を分離し；
ｃ．適当な凝集剤溶液を前期溶液に添加し；
ｄ．透明な溶液および沈殿を分離し；次いで
ｅ：分離された透明な溶液を真空乾燥してＩｓａｔｉｓ抽出物を得る；
工程を含むＩｓａｔｉｓから抽出物を製造する方法。
【請求項２７】
前期凝集剤がキトサンである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７によって製造された抽出物
【請求項２９】
請求項２８の抽出物を含む組成物。
【請求項３０】
請求項２８記載の有効量の抽出物を含む抗―ウイルス組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、２００１年６月１５日に出願された米国シリアル番号６０／２９８，０７７号、および２００２年６月１３日に出願された米国シリアル番号未知の優先権を主張し、その内容をここに引用して本出願に一体化させる。
【０００２】
本出願を通じ、種々の文献を引用する。それらの刊行物のその全体の開示をここに引用することにより本出願に一体化させて、本発明が属する分野の状態をより十分に記載する。
【０００３】
本発明は、草本医薬処方の分野に関する。特に、本発明の草本医薬組成物は、属Ｉｓａｔｉｓおよび属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓからの抽出された草本の投与を通じてのインフルエンザウイルスの治療に関する。
【０００４】
【従来の技術】
天然に由来する活性組成物は、ますます増大する数の病気および疾患の予防および治療で普通に用いられる。天然に由来する活性化合物に興味をもち、世界は伝統的な東洋の治療薬に注目している。この分野においてまず重要なのは中国およびその草本からとり出す組成物の豊富なことである。これらの治療薬の多くは、伝統的な西洋の合成により製造した医薬と同程度に効果的であることが示されているが、通常、合成生成物で通常に経験する有害な副作用はない。伝統的には非常に多数の天然治療薬によって治療されてきた１つの病気は、インフルエンザウイルスでの感染によってもたらされるインフルエンザである。
【０００５】
インフルエンザは呼吸器官のウイルスであり、急性気管支炎、肺炎、喉頭炎およびインフルエンザの病因である。インフルエンザウイルスは、２０世紀初期の間に、歴史上最悪な流行病の１つを引き起こした。インフルエンザは、可溶性核たんぱく質抗原を含有するラセン対称のコアを有する大きなＲＮＡウイルスである。ビリオンは、２つのウイルス糖蛋白質（１つは血球凝集活性（ＨＡ）を有し、１つはノイラミニダーゼ活性を有する）を含むスパイクを持つ膜エンベロープを有する。インフルエンザウイルスは、細胞膜への血球凝集のために特異的糖蛋白質受容体に付着する。該ウイルスはＲＮＡセグメントの異常な幾何学的構造を有し、それは、感染の各サイクルに際して再編される。この編成は非常に素早く起こり、治療するのを極端に困難とする。そのような迅速な変化のため、ヒト免疫系はそれに対して作用するのが困難である。現在の療法は医薬アマンタジンの使用を含み、これは、食欲不振、船酔い、頭痛、眩暈、不眠症および運動失調を含めた種々の望ましくない副作用を有する。
【０００６】
通常の風邪およびインフルエンザは、病気の主な原因であり、世界中で生産性の喪失を招く。Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓは、１９９２年に、米国における通常の風邪の６２００万ケースは医療的注意を必要とし、風邪は１億５７００万日の制限された活動、１５００万日の失われた仕事を引き起こしたと推定する。ほぼ成人の風邪の７５ないし８０％が、インフルエンザＡおよびＢを含めたウイルスによって引き起こされる。ウイルス誘導の風邪の症状はヒト集団に対する主な不便の原因のみならず、全体として世界に対する巨大な経済的損失の原因でもある。
【０００７】
インフルエザおよびその症状の治療において、天然草本化合物を配合しようとする試みがなされてきた。例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ａｎｄ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」と題された米国特許第４，８８６，６６６号は、４つの有効成分：１）Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ ＢｇｅまたはＡｓｔｒａｇａｌｕｓの他の種から抽出されたＷａｎｇ Ｑｉの多糖；２）Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ Ｌ， Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ ＦｏｒｔまたはＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓ ｃｕｓｉａ Ｂｒｅｍｅｋの中でのＢａｎｌａｎｋｅｓｕ抽出形態；３）Ｃｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｌから抽出されたＹｅｊｕｈｕａ−フラボノイド；および４）Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ ｃｒａｓｓｉｒｈｉｚｏｍａ Ｎａｋａｉ， Ｏｓｍｕｎｄａ Ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ， Ｌｕｎａｔｈｙｒｉｕｍ ａｃｒｏｓｔｉｃｈｏｉｄｅｓ ｃｈｉｎｇまたはＭａｔｔｅｕｃｃｉａ ｓｔｕｔｈｉｏｐｔｅｒｉｓ Ｔｏｄａｒｏから抽出されたＧｕａｎａｈｏｎｈｓｕ、の医薬組成物を開示する。該組成物は、ウイルスによって引き起こされた感染の治療および予防で用いられ、免疫機能を増大させる。そのような処方はウイルスによって引き起こされた感染の治療を助けることができるが、それは、この効果を達成するのに多数の成分の使用を必要とする。哺乳動物に投与される処方中の多数成分はいくつかの欠点をもっている。まず、もし各成分の機能が理解されなければ、それらの個々の効果を決定するのは不可能である。成分の組合せは一緒になって効果が低く働くのみならず、いくつかのものの活性は特定の患者では示すことができない。そのような処方の多くの使用者は他の疾患に悩んでおり、例えば、免疫機能のブースティングにおいて機能する組成物の成分の投与は、有害効果を有するかもしれない。
【０００８】
また、天然草本化合物を用いて、肝炎およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含めた他のウイルス病を治療してきた。肝炎はヒト肝臓の病気である。それは肝臓の炎症で現れ、通常、ウイルス感染によって、時々は、毒性剤から引き起こされる。肝炎は肝硬変、肝臓癌および結局は死亡まで進行し得る。肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧのごときいくつかのウイルスが種々のタイプのウイルス性肝炎を引き起こすことが知られている。それらの内、ＨＢＶおよびＨＣＶが最も深刻である。ＨＢＶは４２ｎｍのビリオンサイズを持つＤＮＡウイルスである。ＨＣＶは３０ないし６０ｎｍのビリオンサイズを持つＲＮＡウイルスである。現在用いられている医薬はインターフェロン、アシクロビール（ＡＣＶ）およびインターロイキンを含む。インターフェロンの副作用は発熱、寒気、筋肉痛、頭痛、造血機能障害および恐らくはＩＦＮ抗体である。アシクロビールの使用は、腎臓毒性および神経系障害のような副作用の欠点を持つ。インターロイキンは発熱、寒気、低血圧をもたらしかねない。
【０００９】
ヒト免疫不全ウイルス、およびその結果としての病気である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は最初１９８１年に報告され、その病原体であるＨＩＶは１９８３年に発見された。今日、ＡＩＤＳは１９９３年には世界中で１３００万人のヒトが感染し、１９９６年には２１００万人が感染した世界的な流行病となり、その数は警戒すべき速度で上昇しているように見える。ＡＩＤＳ患者を治療するのに用いられる最も普通の医薬は、通常ＡＺＴとして知られるアジドブジンである。他の医薬も存在し、通常、ＡＺＴと組み合わされて薬物カクテルを生じさせる。これらの医薬は過剰な出血障害、肝臓毒性および髄質機能緊張を引き起こすのみならず、それらの高い価格は開発途上国の住人がそれにアクセスするのを妨げる。
【００１０】
［Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅｒｂａｌ Ｅｘｔｒａｃｔｓ Ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ ＨＩＶ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ］と題された米国特許第５，１７８，８６５号は、ＨＩＶに感染したＴリンパ球細胞および単核食作用系列細胞においてイン・ビトロＨＩＶ感染を阻害するための種々の草本の使用を開示する。提案されている草本の１つは、Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｃｔｏｒｉａからの抽出物よりなり、Ｔ細胞毒性テストのための標準実験室的方法によって抗−ＨＩＶ活性につきテストされた。提案された草本の全ては抽出物形態で中国から得られ、非経口使用のためアンプルにパッキングされていたが、有機抽出手法に従って抽出することができる。
【００１１】
【発明が解決する課題】
ウイルス病の治療のために天然草本産物を生産しようとする試みがあるが、これらは、それらの天然源からの有効成分の不適切な抽出のため、余り成功していない。従って、本発明の目的は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、肝炎および他のウイルス感染の治療のための草本治療薬を提供することにある。本発明のさらなる目的は、合成により生産された医薬が利用される場合に通常経験する副作用がないウイルス感染の治療を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらにもう１つの目的は、ウイルス感染の治療でより効果的な天然草本産物を抽出するための改良された方法を利用することによって、前記目的を達成することにある。
【００１３】
本発明の前記目的および利点は、本発明によって達成するものの例示であって、実現可能な利点を排除または限定するものではない。かくして、本発明のこれらおよび他の目的および利点は、共にここに具体化され、当業者に明らかな観点で修正されるので、本明細書中の記載から明らかであり、また、本発明を実施することから学ぶことができる。従って、本発明は、本明細書中に示し記載された新規な方法、配置、組合せおよび改良にある。
【００１４】
【課題を解決する手段】
本発明のこれらおよび他の目的に従い、本発明の簡単な概要を提示する。いくつかの単純化および省略を以下の概要でなすことができ、概要は本発明のいくつかの態様を強調し、それを紹介する意図であるが、本発明の範囲を限定するものではない。当業者が発明概念を創造し使用するのを可能とするのに適した好ましい例示的具体例の詳細な記載を後のセクションに掲げる。
【００１５】
本発明の広い態様に従うと、草本組成物でウイルス感染を治療する方法が開示される。該方法は、属Ｉｓａｔｉｓおよび属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択された少なくとも１つの種の草本から有効成分を抽出することを含む。
【００１６】
本発明のもう１つの広い態様に従うと、次いで、抽出物を医薬上許容される処方物に処方し、ウイルス感染に罹った哺乳動物に投与する。
【００１７】
【発明の実施の態様】
本発明は、属Ｉｓａｔｉｓおよび属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択された少なくとも１つの種の草本から有効成分を抽出し；該抽出物を医薬上許容される処方物に処方し；次いで、該処方物をウイルス感染に罹った哺乳動物に投与することから成る草本組成物でウイルス感染を治療する方法を提供する。
【００１８】
具体例において、該種はＩｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ ＬおよびＩｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔを含めた属Ｉｓａｔｉｓから選択される。もう１つの具体例において、該種はＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓ ｃｕｓｉａ Ｂｒｅｍｅｋを含めた属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択される。
【００１９】
別の具体例において、ウイルス感染は、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス感染、肝炎ウイルス感染およびヒト免疫不全ウイルスを含む。エンテロウイルス感染のごとき他のウイルス感染も適用できる。
【００２０】
前記方法の具体例において、抽出は有機溶媒の存在下で行われることを特徴とする。該有機溶媒は、限定されるものではないが、エタノール、エーテルまたはアセトンを含む。
【００２１】
異なる具体例において、抽出は水の存在下で行うことを特徴とする。
【００２２】
もう１つの具体例において、処方物は粉末、シロップ、煎じ薬、チンキ、注射剤、局所溶液、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、噴霧剤、坐薬またはマイクロカプセル剤の形態である。他の医薬上適当な担体も使用することもできる。
【００２３】
前記具体例において、該処方物は１日当たり１ないし５０，０００ミリグラムの投与量範囲で投与される。もう１つの具体例において、該範囲は１日当たり１ないし１０，０００ミリグラムである。さらにもう１つの具体例において、該範囲は１０ないし１０，０００である。さらなる具体例において、該範囲は１０ないし１，０００である。
【００２４】
もう１つの具体例において、抽出工程は、ＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せを得；該固体組合せを粉砕し；還流下で該固体組合せを４０％ないし９０％のアルコールで抽出し；該アルコールおよび抽出物組合せを蒸発させて液体が得られ；水およびマクロ分子沈殿剤を該液体に添加し；次いで、ロジンクロマトグラフィーカラムを通して該液体混合物を精製することによって行う。
【００２５】
具体例において、該精製は、ロジンカラム（ｒｏｓｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）を蒸留水で溶出させ；溶出物から蒸留水を蒸発させ、第１の抽出物が得られ；ロジンカラムを７０％ないし９８％アルコールで溶出させて第２の抽出物が得られ；次いで、第１および第２の抽出物を合わせることによって行う。
【００２６】
前記具体例から、抽出工程は、ＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せを粉砕し；水で少なくとも２回該固体を沸騰させ、沸騰した水を濾過して濾液が得られ；マクロ分子沈殿剤を濾液に添加し；濾液を第２回目の濾過をし；次いで、濾液を真空下において溶媒を蒸発させることによって行う。
【００２７】
本発明は草本抽出物の製造方法を提供し、ここに、該抽出工程は、ＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せを得；該固体組合せを粉砕し；還流下で該固体を４０％ないし９０％アルコールで抽出し；該アルコールおよび抽出物組合せを蒸発させて液体が得られ；水およびマクロ分子沈殿剤を液体に添加し；次いで、さらに、ロジンクロマトグラフィーカラムを通じて液体混合物を精製することによって行う。
【００２８】
もう１つの具体例から、精製工程は、ロジンカラムを蒸留水で連続的に溶出させ；溶出物から蒸留水を蒸発させて第１の抽出物が得られ；ロジンカラムを７０％ないし９８％エタノールで溶出させて第２の抽出物が得られ；次いで、第１および第２の抽出物を合わせることによって行う。
【００２９】
本発明は草本抽出物の製造方法を提供し、ここに、抽出工程は、ＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せを粉砕し；水で少なくとも２回該組合せを沸騰させ、該水を濾過して濾液が得られ；マクロ分子沈殿剤を濾液に添加し；濾液を２回目に濾過し；次いで、濾液を真空下において溶媒を蒸発させることによって行う。
【００３０】
草本抽出物生成物は前記方法によって製造する。本発明は、有効量の、属Ｉｓａｔｉｓおよび属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択された少なくとも１つの種の抽出物および医薬上許容される処方物を含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
本発明は、感染した細胞においてウイルス複製を阻害し、またはウイルスを非感染性とするにおいて有効な量の、属Ｉｓａｔｉｓおよび属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓから選択された少なくとも１つの種の抽出物、および医薬上許容される処方物を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
別の具体例において、ウイルス感染は、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス感染、肝炎ウイルス感染またはヒト免疫不全ウイルス感染を含む。
【００３３】
前記の具体例において、ウイルス感染は感染ウイルスでの感染を含む。
【００３４】
さらなる具体例において、ウイルス感染はヒト免疫不全ウイルスでの感染を含む。
【００３５】
ａ．水中のある量のＩｓａｔｉｓ種を適当な時間煎じ；ｂ．残渣から水性相を分離し；ｃ．適当な凝集剤溶液を該溶液に添加し；ｄ．透明な溶液および沈殿を分離し；次いで、ｅ．分離された透明な溶液を真空乾燥してＩｓａｔｉｓ抽出物を得る工程を含むＩｓａｔｉｓから抽出物を製造する方法。
【００３６】
具体例において、該凝集剤はキトサンである。また、本発明は前記方法から製造された抽出物を提供する。本発明は、前記抽出物を含む組成物を提供する。最後に、本発明は前記抽出物を含む抗−ウイルス組成物を提供する。
【００３７】
実験の第１のシリーズ
属Ｉｓａｔｉｓからの草本はアブラナ科に属し、それらの起源は２０００年以上遡ることができる。世界のある地域においては、該植物は青色色素の源として用いるために栽培されてきた。Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａは、例えば、アレロパシー化合物を含有する大量の種子を生産し、無性的に再生する能力を有する。Ｉ． ｔｉｎｃｔｏｒｉａの根系は、土壌深く進入する（１．５ｍまで）大きな直根よりなる。Ｉｔｉｎｃｔｏｒｉａの葉は２つのタイプ；基部性および茎生のものである。基部性座葉は有柄であり、３．５ないし１５ｃｍの長さであり、０．８ないし４ｃｍの幅であり、倒披針形ないし楕円形である。基部性座葉は直径が３．５ないし１８ｃｍの範囲である。茎生葉は無柄であり、交互に配置し、披針形である。該葉は通常青色ないし緑色で、クリーム色の中央葉脈をもち、細かな毛で覆われている。ほぼ２０の大きな木質の紫色の茎が抽薹の後に生じるが、典型的には、７より少数しか成熟するまで成長しない。これらの茎は高さが１Ｍまで成長し、無毛であるが、基部には少数の長い単純な毛を有し得る。
【００３８】
Ｉｓａｔｉｓ Ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ
Ｉ． ｔｉｎｃｔｏｒｉａの花部は、約３ｍｍ長さまで成長する個々の花を持つ傘形状の繖房花であり、色は明るい黄色である。開花は春終盤に起こり、開花の正確なタイミングは海抜に依存する。各々が１つの種子を含有する数百の短角果（裂開果）が、開花開始後４ないし６週間で至るところに生じる。Ｉ．ｔｉｎｃｔｏｒｉａの種子は黄色であり、長さは３ないし３．５ｍｍであり、フックとして働く小花柄を有し、動物の毛、衣類、または機械およびタイヤでの輸送を可能とする。また、それらは、風および水での分散を助ける平らな翼を有する。
【００３９】
属Ｉｓａｔｉｓについての草本は医薬特性を保有することが知られており、特に、中国において数世紀の間用いられてきた。本発明によると、有効成分を抽出する改良された方法が開発され、これは、ウイルス感染の治療および予防においてＩｓａｔｉｓ抽出物のより大きな効率を可能とする。属Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓからの草本は、浅く鋸状の縁をもつ楕円形の葉を有し、通常、長さは５および１２ｃｍの間の範囲である。属Ｉｓａｔｉｓからの草本と同様に、Ｂａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓは、癌を含めた多くの治療の病気において中国で長い間用いられてきた。
【００４０】
実施において、本発明は、ＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓ植物の有効成分を濃縮するために単一の抽出プロセスを用いる。このプロセスは、適当な時間、例えば、２時間および４時間の間、属Ｉｓａｔｉｓおよび／またはＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓからの草本のほぼ２キログラムを４０％ないし９０％エタノールと還流することによって行うことができる。より詳しくは、１９００グラムのＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せが得られ、粉砕または破砕する。次いで、還流下で該固体を４０％ないし９０％エタノール、好ましくは５０％ないし８５％エタノールで抽出する。得られた溶液を、好ましくは、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させるのに十分な時間真空下において、シロップ−様液体が得られる。蒸留水およびマクロ分子沈殿剤をシロップに添加する。次いで、抽出物を濾過し、ロジンクロマトグラフィーカラムを通じてさらに精製する。溶出物がほぼ無色になるまで蒸留水でロジンカラムを溶出させる。溶媒を溶出物から蒸発させ、抽出物Ａ（３５０グラム）が得られる。次いで、溶出物がほとんど無色となるまでロジンカラムを７０％ないし９８％エタノールで溶出させる。エタノール溶媒を第二の溶出物から蒸発させ、抽出物Ｂ（２３．５グラム）が得られる。抽出物Ａ（２０ないし８０重量％）およびＢ（８０ないし２０重量％）を合わせて、抽出物Ｃが得られる。
【００４１】
１００グラムのＩｓａｔｉｓおよびＢａｐｈｉｃａｃａｎｔｈｕｓの固体組合せを粉砕または破砕することによって、より少量の抽出物を得ることができる。次いで、固体を水で３回沸騰させ、濾過する。マクロ分子沈殿剤を濾液に添加する。得られた溶液を再度濾過し、溶媒を蒸発させるのに十分な時間真空下に置き、乾燥した残渣（抽出物Ｄ）が得られる。次いで、そのような抽出を、粉末、シロップ、煎じ薬、チンキ、注射剤、局所溶液、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、噴霧物、坐薬およびマイクロカプセル剤処方物のごとき種々の投与可能な組成物に処方することができる。また、該処方物を、草本および栄養補給物の処方で通常用いられる賦形剤、バインダーおよびアジュバントと組み合わせることができる。
【００４２】
本発明をその好ましい具体例を特に参照して詳細に記載してきたが、本発明は他の異なる具体例も可能であり、その詳細は種々の明白な点で修正することができるのは理解されるべきである。当業者に容易に明らかなごとく、本発明の精神および範囲内に留まりつつ、変形および修正を行うことができる。従って、前記開示、記載および図面は単に例示的目的であり、請求の範囲によってのみ定義される本発明を断じて制限するものではない。
【００４３】
実験の第２シリーズ
試料ＨＲ３についての抽出プロセス
中国特許薬物の非常に多くは、Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔの根からのＢａｎｌａｎｇｅｎに由来する。それを用いて、体内熱を軽減し、解毒し、血液を冷却する。臨床的実行において、それは抗−ウイルス性、抗−エンドトキシンおよび抗菌活性であることが示されている。本研究の目的は、良質の生草本からの抽出が抗−ウイルスに効果的である、有用な抽出プロセスを見出すことである。産業分野における適用の可能性に基づき、該プロセスは単純であるべきであり、必要なユニット器具は入手できるべきである。最も重要なファクターは、最終抽出が臨床的実践で十分効果的であるべきことである。
【００４４】
文献のデータおよび我々の分析によると、Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ中の有効成分は水に可溶性である。有効成分についてのフルスケールの比較研究では、７つの異なる抽出プロセスがデザインされており；かくして、７試料が抗−ウイルス−効率−スクリーニングのためにＣｈｅｎ教授（北京）に提供される。実験結果は試料ＨＲ３の満足すべき効果を示す。
【００４５】
考察
通常、エタノール沈殿の技術を用いて、水およびエタノールへのＴＣＭのある有効部分の異なる溶解度に基づいて漢方薬製剤を精製する。しかしながら、以下に記載するように、この技術についてはいくつかの欠点がある。
【００４６】
水抽出溶液中の溶質または標的成分の濃度は、エタノール沈殿プロセスの間にかなり低下した。かくして、製剤の質を維持するのは困難である。溶解度が小さい物質は完全に失われる。コストがより高くなる。エタノールの回収のために特殊な器具を用いなければならず、エタノールの廃棄量は約２０％となろう。
【００４７】
生成物の質の安定性は不良である。親水性成分の回収は液体製剤を容易に沈殿させ、容器の壁へ付着させる。長時間の製造時間は経済的利益を改良するのに反する。
【００４８】
コスミック膜、凝集沈殿などを用いる限外濾過のごとき、新しい分離および精製技術に関する多量の研究報告が文献中に見出すことができる。凝集沈殿は、以下のごとく、水抽出溶液の精製で多くの利点を有する。
【００４９】
少量の凝集剤の消費および簡単な設備が必要である。短い製造時間。凝集剤ユニットは３ないし６時間を要し、以前の製造時間の約半分である。生成物の良好な品質が達成できる。有効成分のパーセンテージを向上させて、治癒効果が確認できる。液体製剤の安定性は良好である。沈殿は生じない。
【００５０】
凝集プロセスは、凝集剤を用いて伝統的漢方薬を精製することである。凝集剤であるキトサンを水抽出溶液中に添加し；蛋白質、粘質のごときコロイドペレットを吸収物質から除去する。次いで、濾過してそれを精製する。その原理は：伝統的漢方薬の水抽出溶液は粘液、蛋白質、澱粉等のごとき多くの成分ポリマーを有する。それは不安定な系であり、高い表面エネルギーを有する。キトサンを添加すると、吸収ブリッジおよび電気的中和の機能によって、大きなペレットが除去される。
【００５１】
Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ．の根はＢａｎｌａｌｇｅｎとして用いられ、これは熱水で溶ける澱粉を大量に含有する。通常、エタノール沈殿技術を用いて、漢方薬製剤を精製する。この実験において、凝集技術はＨＲ３調製で適用した。試料ＨＲ３抗−ウイルスの効果は、Ｃｈｅｎ Ｈｏｎｇｓｈａｎによって行われた治癒実験によって確認される。
【００５２】
ＲＡＤＩＸ  ＩＳＡＴＩＤＩＳについての抽出プロセスの文献
［１］．Ｚｈａｎｇ Ｒｕｎｚｈｅｎ， Ｚｈａｎｇ Ｙｕｗｅｎ．”Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｎ Ｒａｄｉｘ Ｉｓａｔｉｄｉｓ”， ２０００， ３１（６）， ４７４
［２］． Ｌｉｕ Ｓｈｅｎｇ， Ｃｈｅｎ Ｗａｎｓｈｅｎｇ， Ｑｉａｏ Ｃｈｕａｎｚｈｕｏ， Ｚｈｅｎ Ｓｈｕｉｑｉｎｇ， Ｚｅｎｇ Ｍｉｎｇ， Ｚｈａｎｇ Ｈａｎｍｉｎｇ， Ｓｏｎｇ Ｚｈａｏｊｕｎ．  “Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｄｉｘ Ｉｓａｔｉｄｉｓ ａｎｄ Ｆｏｌｉｕｍ Ｉｓａｔｉｄｉｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ａｇａｉｎｓｔ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２０００， ２１（３）， ２０４
［３］． Ｗａｎｇ Ｌｉｘｉａ， Ｈｅ Ｙａｎ， Ｃｈｅｎ Ｙｏｎｇｇａｎ， Ｗａｎ Ｌｉ．  “Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｆ Ｒａｄｉｘ Ｉｓａｔｉｄｉｓ ａｎｄ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｋａｉ Ｆｅｎｇ， １９９９， １８（３）， ５２
［４］． Ｄｅｎｇ Ｈｕｉｍｉｎ， Ｓｕ Ｂｉｒｕ， Ｃｈｅｎ Ｙａｎｙａｎｇ．  “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｏｓｓ−ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ｉｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｒａｄｉｘ Ｉｓａｔｉｄｉｓ ａｎｄ Ｒｈｉｚｏｍａ ｅｔ Ｒａｄｉｘ Ｂａｈｉｃａｃａｎｔｈｉｓ Ｃｕｉｓｉａｅ”， Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １９９９， １８（３）， ５２
［５］． Ｗａｎｇ Ｌｉ， Ｌｕ Ｊｉａｎｊｉａｎｇ， Ｇｕ Ｃｈｅｎｚｈｉ， Ｃｈｅｎｇ Ｙｕｈｕａｉ． “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｗａｖｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｒａｄｉｘ Ｉｓａｔｉｄｉｓ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ”， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｈｅｒｂａｌ Ｄｒｕｇｓ， ２００１， ２４（３）， １８０
［６］ Ｚａｎｇ Ｔｏｎｇ， Ｘｕ Ｌｉａｎｙｉｎｇ， Ｃａｉ Ｚｈｅｎｚｈｅｎ． “Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｌａｒｉｆｉｃａｎｔ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ Ｚｉｎｃ， Ｍａｎｇａｎｅｓｅ， Ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｌｅａｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ−ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅｒｂａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ”， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２００１， ２３（４）， ２４３
［７］． Ｌｉｕ Ｓｉｚｈｅｎ， Ｚｈｕ Ｘｉｘｉａｎ， Ｓｈａｏ Ｙｕｇｉｎ， Ｍａ Ｔｉａｎｂｏ．  “Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐａｒｔ ａｇａｉｎｓｔ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎ Ｒａｄｉｘ Ｉｓａｔｉｄｉｓ”， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｈｅｒｂａｌ Ｄｒｕｇｓ， １９９９， ３０（９）， ６５０
【００５３】
実験の第３シリーズ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 北京、中国による、インフルエンザに対する中国草本Ｉｓａｔｉｓ Ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ．のイン・ビトロおよびイン・ビボ抗−ウイルス活性
Ｉｓａｔｉｓ Ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔは広く分布したある種類の中国草本であり、中国においてはインフルエンザに対する民間療法として用いられ、その通常の名称は「Ｂａｎ  Ｌａｎ  Ｇｅｎ」である。その薬理学的機能は、明らかな「除熱および解毒」として中国の伝統的な医療書籍に記録されている。Ｂａｎ  Ｌａｎ  Ｇｅｎ製剤：経口液体、丸剤および顆粒剤が市販されており、中国においては主として診療所で用いられる。いくつかの論文は、ＢＬＧがインフルエンザの予防および治療で効果的であったと報告している（１，２，３，４）。Ｓｈｅｎｇｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ中国における９９９医薬会社はそれを抗−インフルエンザ草本薬剤として開発することを意図し、その抗−インフルエンザ活性成分を研究し、その抗ウイルス活性を確認するプロジェクトをデザインした。
【００５４】
Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｇｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ．はＣｒｕｃｉｆｅｒａｅに属し、その水煎じ汁は感染したニワトリ胚においてインフルエンザウイルスＡ／８６−１を阻害したと報告されている（５，６，７）。この報告は、該草本の３つの抽出物が、ＭＤＣＫ細胞培養においてインフルエンザウイルスＡおよびＢ型を阻害したことを示した（８）。
【００５５】
この研究においては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， 上海、中国によって、Ｂａｎ Ｌａｎ Ｇｅｎ（ＢＬＧ）草本が収集され、同定され、抽出され、ＢＬＧ抽出試料がイン・ビトロおよびイン・ビボ抗インフルエンザウイルス実験に供された。
【００５６】
抗−インフルエンザ薬物リバビリン（９，１０）およびアマンタジン（１１，１２）が、各々、イン・ビトロおよびイン・ビボテストで陽性対照として用いられた。
【００５７】
材料および方法
１．材料：
１．１  Ｂａｎ Ｌａｎ Ｇｅｎ（ＢＬＧ）抽出物：水抽出物：ＨＲ１、ＨＲ２、ＨＲ３、ＨＲ４、アルコールおよび水抽出物ＭＷ２、ＡＴ１およびＡＡ２、全ては凍結乾燥して乾燥した粉末とされ、室温で保存された。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， 上海、中国によって調製された。
【００５８】
１．２  ウイルス：インフルエンザウイルス株：型Ａ／９０−１５株、型Ｂ／９７−１３および型Ａ／ＦＭ１−マウス肺適合株。ニワトリ胚に接種し、感染したニワトリ胚尿膜液を収集し、冷蔵庫中にて８０℃にて貯蔵した。
【００５９】
１．３  細胞培養：ＭＤＣＫ細胞は９６穴プレートで培養し、インキュベーター中、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。
【００６０】
１．４  マウス：ＫＭ種、ＳＰＦ３グレード、雌、体重：１４−１６グラム。Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎから購入した。
【００６１】
１．５  抗−インフルエンザ薬物： リバビリン（１−β−Ｄ−リバフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミド）およびアマンタジン。Ｚｈｅｊｉａｎｇ州のＹｕｋａｎｇ製薬会社から購入した。
【００６２】
２．方法：
２．１  ウイルスストックの調製
細胞培養実験では：インキュベーション尿膜液を収集した後、インフルエンザウイルスＡ型（Ｈ３、Ｎ２）株Ｊｉｆｅｎｇ  Ａ／９０−１５、インフルエンザウイルスＢ型株Ｊｉｆｅｎｇ  Ｂ／９７−１３をニワトリ胚ないし尿膜包を感染させた。インフルエンザウイルスＡおよびＢをＭＤＣＫ細胞培養に接種し、ウイルス細胞感染性につきＴＣＩＤ５０を滴定した。
【００６３】
マウス実験では：インフルエンザウイルスＡ型（Ｈ１，Ｎ１）ＦＭ１マウス肺適用株感染マウス肺を粉砕し、懸濁液をニワトリ胚に接種し、尿膜液を収集し、麻酔下でマウス外鼻腔に摂取して、マウスにおいてウイルス感染性につきＮＤ５０を滴定した。
【００６４】
２．２  試料の調製
ＭＤＣＫ細胞培養では：抽出物ＨＲ１、ＨＲ２、ＨＲ３、ＨＲ４、ＭＷ２およびＡＴ１を培養基に溶解させて、１０ｍｇ／ｍｌの溶液を作成し、ＡＡ２をＤＭＳＯに溶解させ、培養基で希釈して、０．２ｍｇ／ｍｌの３０％ＤＭＳＯ懸濁液を作成した。
マウスについては：抽出物ＨＲ１、ＨＲ２、ＨＲ３、ＨＲ４、ＭＷ２およびＡＴ１を０．３％オキシ−メチル−セルロースで調製して、均質懸濁液を作成した。抽出物ＡＡ２をＤＭＳＯに溶解させ、次いで、水で希釈して、３０％ＤＭＳＯ均質懸濁液を作成した。
【００６５】
２．３  イン・ビトロ：細胞培養における抗−インフルエンザウイルスアッセイ
２．３．１
細胞培養における薬物毒性：９６穴プレート中２４時間ＭＤＣＫ細胞培養、薬物試料を６濃度の二倍希釈にて添加した（濃度当たり３穴）。ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７２時間培養した。細胞病理効果（ＣＰＥ）の程度を記録し：グレード評価は「０」：ＣＰＥ無し：、「０．５」：５ないし１０％ＣＰＥ：、「１」：１０ないし２５％ＣＰＥ：、「２」：２５ないし５０％ＣＰＥ：、「３」：５０ないし７５％ＣＰＥ、「４」：７５ないし１００％ＣＰＥ：５０％毒性濃度（ＴＣ５０）および最大非毒性濃度（ＴＣ０）を計算した。
【００６６】
２．３．２
感染したＭＤＣＫ細胞培養におけるインフルエンザウイルスＡおよびＢ型についての薬物阻害アッセイ：
初期処理アッセイ：細胞培養を１０−３ないし１０−４濃度のインフルエンザウイルスＡおよびＢ型で感染させ、２時間後、ウイルス液を洗い流し、培地で洗浄した。ＴＣ０濃度の薬物試料の２倍希釈を感染した細胞プレートに添加した（濃度当たり３穴）。インキュベートし、７２時間後にＣＰＥを記録した。ウイルス対照、溶媒対照および陽性薬物対照としての異なる濃度のリバビリンを設定した。溶媒対照と比較して、薬物試料のウイルスＣＰＥの阻害％を計算した。阻害％＞５０％は効果的と考えられた。
【００６７】
予防アッセイ：異なる濃度の試料溶液で細胞培養プレートを２４時間予備処理し、薬物で洗い流し、次いで、ウイルスで感染させ、インキュベートし、洗浄し、観察し、前記したごとき阻害％を計算した。
【００６８】
２．２．４
イン・ビボ：マウスにおける抗−インフルエンザウイルス実験
２．２．４．１
マウスにおける急性経口毒性：異なる容量のＢＬＧ試料をマウスに経口的に与え、観察し、７日間、毒性反応および死亡率を記録した。
【００６９】
２．２．４．２
インフルエンザウイルス感染マウスにおける肺病巣の阻害。インフルエンザウイルスＡ型ＦＭ１マウス適合株でマウスを鼻腔内感染させ、２時間後、ＢＬＧ試料を、経口経路によって、２ないし３の異なる非毒性用量で感染したマウスの群に与え、４日間放置した。ウイルス対照、ビヒクル対照および陽性薬物：アマンタジン対照を設定した。第４日に、全てのマウスを殺し、全肺を摘出した。各群において肺病巣を記録した。溶媒群におけるそれと比較して、薬物処理群のマウスにおける肺病巣の阻害％を計算した。阻害％＞５０％を効果的と考えた。
【００７０】
２．２．４．３
インフルエンザウイルス感染マウスにおけるＢＬＧ試料による死亡率の保護および生存日数の延長
マウスを感染させ、ＢＬＧ試料を与えた。しかしながら、処理は１４日まで延長され、死亡率および死亡日数を記録した。前記したごとく対照を設定した。ビヒクル対照と比較して、平均死亡率の保護の％およびＢＬＧ試料の平均生存日数の延長を計算した。効果的な％は＞５０％であった。
【００７１】
結果
１．イン・ビトロ実験
１．１  ＭＫＣＤ細胞培養における７種類のＢＬＧ試料の毒性
７ＢＬＧ試料を細胞毒性につきまずＭＤＣＫ細胞培養においてテストして、５０％毒性濃度（ＴＣ５０）および最大許容濃度（ＴＣ０）を見出した。結果を表１に示す。
【００７２】
１．２  ＭＤＣＫ細胞培養における７種類のＢＬＧ試料のインフルエンザウイルスＣＰＥの阻害
ＭＫＣＤ細胞培養をインフルエンザウイルスＡ／９０−１５およびＢ／９７−１３で感染させ、２時間後、最大許容濃度から開始したこれらの７試料の６濃度の２倍希釈物を添加した。
【００７３】
ウイルス感染ビヒクル対照と比較し、ＨＲ３、ＨＲ４およびＭＷ２はウイルスＣＰＥを阻害すると判明し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）およびＨＲ３の選択指数（ＳＩ）を表１に示す。結果は以下のごとくまとめられた：
ＨＲ３：インフルエンザウイルスＡ／９０−１５について：ＩＣ５０：０．９４±０．１１、ＳＩ：４．９３
インフルエンザウイルスＢ／９７−１３について：ＩＣ５０：１．１３±０．１３、ＳＩ：４．１０
ＨＲ４：インフルエンザウイルスＡ／９０−１５について：ＩＣ５０：＞１．２１±０．２５、ＳＩ：＜３．９４
インフルエンザウイルスＢ／９７−１３について：ＩＣ５０：＞１．３５±０．２５、ＳＩ：＜３．９０
ＭＷ２：インフルエンザウイルスＡ／９０−１５について：ＩＣ５０：０．２０±０．０４、ＳＩ：３．９８
インフルエンザウイルスＢ／９７−１３について：ＩＣ５０：＞０．２０±０．０４、ＳＩ＜３．９０
ＨＲ４  ＩＣ５０はその最大許容濃度に近かった。全ての他の４つの試料は、それらの最大許容濃度に対する阻害を示さなかった。
【００７４】
抗−インフルエンザウイルス薬物リバビリン：
インフルエンザウイルスＡ／９０−１５について：ＩＣ５０：０．０７±０．０４、ＳＩ：＞１４．２９
インフルエンザウイルスＢ／９７−１３について：ＩＣ５０：０．０６±０．０３、ＳＩ：＞１６．６７
ＨＲ３はより高いＳＩを持つ最良の抽出物であり、ＭＷ２は２番目であった。全ての他の５つの抽出物は弱いかまたは全くない抗−インフルエンザウイルス活性を示した。
【表１】インフルエンザウイルス感染ＭＤＣＫ細胞培養のＣＰＥの細胞毒性および阻害
2005502602.tif 000002
＊： 最大許容濃度ＴＣ０効果なし
【００７５】
１．３  新しいバッチの試料でのＨＲ３、ＨＲ４およびＭＷ２の反復抗−インフルエンザウイルス活性
抗−インフルエンザウイルス活性を確認するために、３バッチのＨＲ３および２バッチのＭＷ２を、再度、異なる用量のウイルスで感染させたＭＤＣＫ細胞培養中でテストした。結果を表２および３に示した。
【００７６】
結果は、抗−ウイルス実験の規則的ルールを示し；ウイルス−感染濃度は抗−ウイルス活性に逆比例した。ウイルス−感染投与量が減少すると、ＩＣ５０値は減少し、ＳＩ値は増加した。
【００７７】
１０ないし２０ＴＣＩＤ５０インフルエンザウイルス感染につき、
ＨＲ３：バッチ１および２はＡ型に対してより高い抗−ウイルス活性を示し、Ｂ型に対してはより低い活性を示した。
【００７８】
Ａ／９０−１５につき：ＩＣ５０：０．６９±０ｍｇ／ｍｌ、ＳＩ：６．９３
Ｂ／９７−１３：ＩＣ５０：１．１９±０ｍｇ／ｍｌ、ＳＩ：３．８９
バッチ３はより低い抗−ウイルス活性を示した。
【００７９】
ＭＷ２：バッチ１および２は、インフルエンザウイルスＡおよびＢ型に対して同一の抗−ウイルス活性を示した。
Ａ／９０−１５およびＢ／９７−１３双方については：ＩＣ５０：０．１８ｍｇ／ｍｌ、ＳＩ：４．４３
【表２】ＭＤＣＫ細胞培養におけるインフルエンザウイルスＡおよびＢに対する３バッチのＨＲ３の阻害
2005502602.tif 000003
＊： 最大許容濃度ＴＣ０効果なし
【表３】ＭＤＣＫ細胞培養におけるインフルエンザウイルスＡおよびＢに対する２バッチのＭＷ２の阻害
2005502602.tif 000004
＊： 最大許容濃度ＴＣ０効果なし
【００８０】
２．イン・ビボ実験：
２．１  経口投与によるマウスにおける７種類のＢＬＧ抽出物の急性毒性
経口投与によって、１回、異なるソージの７ＢＬＧ試料懸濁液をマウスの群に与え、毒性反応およびマウスの死亡を第７日に観察した。結果は以下の通りであった：
2005502602.tif 000005
【００８１】
２．２  感染したマウスにおけるインフルエンザウイルス肺病巣に対する７ＢＬＧ抽出物の阻害
インフルエンザウイルスＡ／ＦＭ１マウス適合株で鼻腔内経路によってマウスを感染させ、全ての７ＢＬＧ抽出物を、２ないし３の異なる非毒性用量にて、経口によって感染マウスに与え、４日間放置した。マウスを犠牲にし、肺を取り出し、病巣をスコア取りした。
【００８２】
処理したマウスの平均病巣スコアをビヒクル対照のそれと比較し、阻害％を計算した。５０％を超える阻害は効果的であると考えられた。
【００８３】
ＨＲ３、ＨＲ４およびＭＷ２のみが約５０％以上マウス肺病巣を阻害した。結果を表４に示した。インフルエンザ肺病巣に対するＨＲ３、ＨＲ４およびＭＷ２の阻害％は以下のごとくまとめられた：
2005502602.tif 000006
他の５つのＢＬＧ抽出物の全ての許容投与量はインフルエンザ肺病巣に対して低い阻害％を示すかまたは示さず、効果的でないと考えられる。
【表４】Ａ型／ＦＭ１マウス適合インフルエンザウイルス感染マウスにおける肺病巣に対する７種類のＢＬＧ試料の初期治療効果
2005502602.tif 000007
【００８４】
２．３  マウスにおけるＭＲ３およびＭＷ２の抗−インフルエンザウイルス活性の確認。マウスにおけるＨＲ３およびＭＷ２のイン・ビボ抗−インフルエンザウイルス活性を確認するために、二種類の実験を行った。
【００８５】
２．３．１
マウスにおけるインフルエンザマウス肺病巣の阻害：効果を評価するために前記実験を反復
【００８６】
２．３．２
死亡率の保護の％および寿命の延長を計算するための、インフルエンザウイルス肺炎マウスにおける死亡の保護。
【００８７】
結果は以下のごとくまとめられた：
ＨＲ３について（表５）
肺病巣の阻害％：
１０ｇ／ｋｇ：実験１：５５．３６％、実験２：３０．６３％；
平均：４３．００±１７．４９％
５ｇ／ｋｇ：実験１：５０．００％、実験２：６０．８６％；
平均５５．４３±７．６８％
２．５ｇ・ｋｇ：実験１：２８．５７％
死亡の保護および寿命の延長：
１０ｇ／ｋｇ：実験１：５０．００％および５１．８５％
５ｇ／ｋｇ：実験１：５０．００％および５５．５６％、実験２：５０．００％および５５．８３％
平均：５０．００±０％および５５．７０±０．１９％
【００８８】
ＭＷ２について（表６）
肺病巣の阻害％：
５ｇ／ｋｇ：実験１：４９．０９％、実験２：５１．３５％；
平均：５０．２３±１．６１％
２．５ｇ／ｋｇ：実験１：３４．５５％、実験２：３６．５８％；
平均：３５．５７±１．４４％
１．２５ｇ／ｋｇ：実験１：５６．３６％
死亡の保護および寿命の延長：
１０ｇ／ｋｇ：実験１：０、および１２．９６％
５ｇ／ｋｇ：実験１：３７．５０％および４０．７４％、実験２：１２．５０％および１３．４６％
平均：２５．００±１７．６８％および２７．１０±１９．２９％
２．５ｇ／ｋｇ：実験２：０、−１．９２％
【００８９】
アマンタジンについて：（表５，６）
肺病巣の阻害％：
０．１ｇ／ｋｇ：実験１：１００．００％、実験２：７４．５４％；
実験４：９５．１４％
平均：８９．８９％１３．５３％
０．０５ｇ／ｋｇ：実験１：８５．７１％
０．０２５ｇ／ｋｇ：実験１：７８．５７％
死亡の保護および寿命の延長
０．１ｇ／ｋｇ：実験１：８５．７１％および７６．６７％、実験２：７５．００％および７２．７５％、実験３：３７．５０％および６３．４６％
平均：０．１ｇ／ｋｇ：死亡の保護：６６．０７±２５．３２％、寿命の延長：７０．９６±６．７８％
【表５】マウス適合インフルエンザウイルスＡ／ＦＭ１感染マウスにおける肺病巣に対するＨＲ３の阻害、死亡率の保護および寿命の延長
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【表６】マウス適合インフルエンザウイルスＡ／ＦＭ１感染マウスの肺における肺病巣に対するＭＷ２の阻害、死亡率の保護および寿命の延長
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【００９０】
結論
Ｉｓａｔｉｓ  ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ  Ｆｏｒｔ．は中国においては「Ｂａｎ Ｌａｂ Ｇｅｎ」と呼ばれる中国の草本であり、インフルエンザに対する民間療法として用いられる。
【００９１】
７種類のＢａｎ Ｌａｂ Ｇｅｎ（ＢＬＧ）抽出物：ＨＲ１、ＨＲ２、ＨＲ３、ＨＲ４、ＭＷ２、ＡＴ１およびＡＡ２は、上海、中国のＮａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ によって調製された。
【００９２】
インフルエンザウイルスＡ型／９０−１５およびＢ型／９７−１３のＭＤＣＫ細胞培養を、７つのＢＬＧ抽出物の抗−インフルエンザウイルス活性のイン・ビトロ実験で用いた。３バッチのＨＲ３および２バッチのＭＷ２は、感染２時間後に薬物を添加した場合、ＡおよびＢ型インフルエンザウイルスを共に阻害するが、２４時間の予備処理では活性でないことが証明された。
【００９３】
ＨＲ３については：インフルエンザウイルスＡ／９０−１５につき：ＩＣ５０は０．６９±０ｍｇ／ｍｌであり、ＳＩは６．９３であった。
インフルエンザウイルスＢ／９７−１３につき：ＩＣ５０は１．１９±０ｍｇ／ｍｌであり、ＳＩは３．８９であった。
ＭＷ２については：インフルエンザウイルスＡ／９０−１５およびＢ／９７−１３につき：双方のＩＣ５０は０．１８±０ｍｇ／ｍｌであり、ＳＩは４．４３であった。
【００９４】
マウスモデルをインフルエンザウイルスＡ型／ＦＭ１マウス適合株で鼻腔内感染させ、ビヒクル対照と比較した、ＢＬＧ試料の肺病巣の阻害の％、死亡率の保護および寿命の延長を評価基準として用いて、イン・ビボでの抗−インフルエンザウイルス活性を評価した。ＢＬＧ抽出物試料ＨＩ３およびＭＷ２を許容投与量にて感染２時間後に経口的に与え、４ないし１４日間放置し、効果的であることが判明した。
【００９５】
ＨＲ３については：５ないし１０ｇ／ｋｇが効果的であった。
１０ｇ／ｋｇ：肺病巣の阻害％（４日間の処置）：４３．００±１７．４９％
死亡率の保護（１４日間の処置）：５０．００％
寿命の延長（１４日間の処置）：５１．８５％
５ｇ／ｋｇ：肺病巣の阻害％（４日間の処置）：５５．４３±７．６８％
死亡率の保護（１４日間の処置）：５０．００±０％
寿命の延長（１４日間の処置）：５０．７０±０．１９％
【００９６】
ＭＷ２については：１０ｇ／ｋｇは毒性であって効果はなく、５ｇ／ｋｇは肺病巣を阻害したが、死亡率は保護しなかった。
５ｇ／ｋｇ：肺病巣の阻害％４日間の処置）：５０．２３±１．６１％
死亡率の保護（１４日間の処置）：２５．００±１７．６８％
寿命の延長（１４日間の処置）：２７．１０±１９．２９％
【００９７】
５．公知の抗ウイルス薬物：インフルエンザウイルスＡおよびＢ型用のリバビリンをＭＤＣＫ細胞培養における陽性対照として用いた。
抗−インフルエンザＡ型薬物：アマンタジンをマウスにおけるＡ型インフルエンザウイルス感染において陽性対照として用いた。
【００９８】
結果は以下を明らかにした：
リバビールは、感染２４時間前または２時間後に細胞培養に添加することによって、ＡおよびＢ型インフルエンザウイルス双方に対して効果的であった。
【００９９】
感染２時間後に経口による４ないし１４日間放置したアマンタジン０．０２５ないし０．１ｇ／ｋｇは効果的であった。
【０１００】
文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は抽出手法を示し、
１．ある量のＩｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ．を秤量し、８倍容量の水（Ｖ／Ｗ）を秤量した草本に添加し、次いで、それを２時間煎じ、濾過後に溶液Ｉを得た；
２．濾過の固体残渣を６倍の水（Ｖ／Ｗ）で１時間煎じ、同濾過後にＩＩを得た。
３．溶液ＩおよびＩＩを合わせ、それを、比重が１．０１から１．１０に変化するまで真空条件下で濃縮した；
４．凝集剤溶液（１ないし５％Ｗ／Ｗ）の調製：ある量のキトサンを秤量し、水を設定した容量まで添加し、適当な容量の氷酢酸を添加し、水バッチ中で温度を６０℃に維持し、溶液が透明で懸濁物質を含まなくなるまで溶液を間歇的に攪拌した。
５．凝集剤溶液（２０ないし８０％容量の濃い溶液）を添加し、同時に、溶液を攪拌し、２時間放置した後、遠心器を用いて懸濁溶液を分離し、透明な上層溶液が得られ、沈殿が沈積した。
６．透明な上層溶液を真空条件下で濃縮し、真空乾燥機にて６０℃で濃縮された溶液を乾燥し、最後に、乾燥粉末が得られた。収率は１５ないし２５％と予測された。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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