(57)【要約】本発明は、新規、持続放出ＩＧＦ−Ｉ治療用組成物、その調製および製造方法、ならびに神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病または小脳性運動失調症の治療および予防のための薬剤の製造におけるその使用に関する。本発明の組成物は、数ある特徴のなかで特に、５μｍ未満のサイズを有する微小球、および皮下移植カプセルの形態をとる。
2005529083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高粘度、０．５ｄｌ／ｇ〜１．５ｄｌ／ｇで、直径が５μｍ未満のコポリマー微小球により構成されることを特徴とする、無傷で機能的に活性なＩＧＦ−Ｉの持続放出が可能な、天然神経保護因子ＩＧＦ−Ｉを含む治療用製剤。
【請求項２】
前記コポリマー微小球が、０．８ｄｌ／ｇの粘度、および約１．３μｍの直径を有することを特徴とする請求項１に記載の治療用製剤。
【請求項３】
以下のように、
−使用するコポリマーは高粘度であり、０．５ｄｌ／ｇ〜１．５ｄｌ／ｇ、好ましくは０．８ｄｌ／ｇであり、
−高ホモジナイゼーション速度、好ましくは１３５００ｒｐｍを使用し、
−使用する溶液は非アルカリ性ｐＨであり、
−高分子量蛋白質、例えば、特にアルブミンおよびゼラチンは使用しない、
ことによりなされることを特徴とする、三成分エマルジョン技術および溶媒抽出による請求項１または請求項２に記載の治療用製剤の調製および製造のための手順。
【請求項４】
前記コポリマーが、とりわけ乳酸およびグリコール酸の５０：５０コポリマー（ＰＬＧＡ  ５０：５０）である請求項３に記載の治療用製剤の調製および製造のための手順。
【請求項５】
アルツハイマー病のような神経変性疾患、小脳性運動失調症、運動失調−毛細血管拡張症、血管性痴呆、多発性硬化症、脳卒中、末梢神経障害、および脳外傷または脊髄外傷の治療および予防のための医薬品の生産または調製における請求項１または請求項２に記載の治療用製剤の使用。
【請求項６】
以下示す技術のように、
−ＩＧＦ−Ｉを０．０１ｍＭ酢酸に溶解し、
−この溶液にシクロスポリンを添加し、懸濁液のままとし、
−この混合物を乳酸およびグリコール酸のコポリマー（レソマー５０３Ｈ、べーリンガーインゲルハイム）に添加し、穏やかに混練し、その後、生成物を２−ｍｍメッシュのふるいにかけ、
−３時間室温で乾燥させ、再び２−ｍｍメッシュのふるいにかけ、
−室温でさらに１５時間乾燥させ、直径６ｍｍの凹状パンチで圧縮する、
ことに基づく方法により調製することを特徴とするＩＧＦ−Ｉの長期放出能力を有する錠剤。
【請求項７】
アルツハイマー病のような神経変性疾患、小脳性運動失調症、運動失調−毛細血管拡張症、血管性痴呆、多発性硬化症、脳卒中、末梢神経障害、脳外傷または脊髄外傷の治療および予防のための医薬品の生産または調製における請求項６に記載の錠剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＩＧＦ−Ｉを含む活性物質を投与するための新規製剤（微小球およびカプセル）の調製および製造、ならびに、神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病または小脳性運動失調症の治療および予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
現在のところ、神経変性疾患を防ぐ薬剤または方法は存在しない。この型の疾患は先進国で、人口の段階的高齢化により重要性が増大している。というのも、そのような疾患の多くは年齢と関連するからである（アマダッシ（Ａｍａｄｕｃｃｉ）Ｌおよびテスコ（Ｔｅｓｃｏ）Ｇ、中枢神経系の変性疾患に対する主リスクとしての老化（Ａｇｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、７：２８３−２８６［１９９４］）。それでもなお、アルツハイマー性痴呆またはパーキンソン病のような疾患の原因は熱心に研究され、重要な遺伝要素が認識され始めている（ハインツ（Ｈｅｉｎｔｚ）Ｎ、およびゾギビー（Ｚｏｇｈｂｉ）ＨＹ、マウスモデルからの神経変性の分子的基本に対する洞察（Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、６２：７７９−８０２［２０００］）が、依然として効果的な治療はなく、そのため予防が非常に重要である。これらの疾患多くが明白な遺伝的要素を有するという事実により、神経変性疾患の発現、または発現傾向を予測することができる。これは、その疾患が現れる前にその疾患に対し予防手段をとることができることを意味する。例えば、アルツハイマー病のリスクのある群において試験が目前となっている予防手段は、予防接種である（グルウィッツ（Ｇｕｒｗｉｔｚ）Ｄ、アルツハイマー病に対する予防接種（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）：臨床試験にさらに迫る（ｙｅｔ  ｃｌｏｓｅｒ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５４２−５４３［２００１］）。というのは、その疾患に苦しむ遺伝的傾向のある被験者が存在し、老化がリスク因子であるからである。
【０００３】
一連の天然蛋白質は治療的な栄養ホルモン活性を有し、非経口経路により投与しなければならない。というのは、そのような蛋白質は消化系により分解されるからである。これらの蛋白質のうち最もよく知られているのはインスリンであり、他の投与系が何年もの間、探し続けられている。毎日の注射は、皮下注射であっても２つの主な問題がある：患者が注射を避ける傾向があり（コンプライアンスの減少）、このためバイオアベイラビリティ（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）が減少、治療効力が減少する。栄養因子ＩＧＦ−Ｉの場合、広範囲にわたる疾患におけるその治療効力が現在試験されており（現在、合衆国で進行中の臨床試験のリストでは：ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ／ｇｕｉ／ｃ／ａ２ｂ／ａｃｔｉｏｎ／ＧｅｔＳｔｕｄｙ？ＪＳｅｒｖＳｅｓｓｉｏｎＩｄｚｏｎｅ＿ｃｔ＝１ｂｆｙ４ｑａ８ｈ１）、１日を通して繰り返し皮下注射すると、１回の注射よりも効果的であることが見出されている（ウッダール（Ｗｏｏｄａｌ）ＳＭ、ブレイヤ（Ｂｒｅｉｅｒ）ＢＨ、オスリバン（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ）Ｕ、グルックマン（Ｇｌｕｃｋｍａｎ）ＰＤ．成長ホルモン欠乏マウスにおける体重増加に対するインスリン様成長因子Ｉの皮下投与頻度の効果（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ）Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ１２：５８１−５８４［１９９１］）。おそらく、血液レベルの上昇がより持続するからである。
【０００４】
この問題に対する１つの解決策は、ＩＧＦ−Ｉを含む栄養因子に対する持続放出系（デポー（ｄｅｐｏｔ））の開発に求められている（ラム（Ｌａｍ）ＸＭ、デュエナス（Ｄｕｅｎａｓ）ＥＴ、ドーエルティ（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ）ＡＬ、レヴィ（Ｌｅｖｙ）Ｎ、およびクレランド（Ｃｌｅｌａｎｄ）ＪＬ「糖尿病の治療のための組み換えヒトインスリン様成長因子−Ｉの持続放出」“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ”Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ６７：２８１−２９２［２０００］；シン（Ｓｉｎｇｈ）Ｍ、シャーリー（Ｓｈｉｒｌｅｙ）Ｂ、バジャ（Ｂａｊｗａ）Ｋ、サマラ（Ｓａｍａｒａ）Ｅ、ホラ（Ｈｏｒａ）Ｍ、およびオハガン（Ｏ’Ｈａｇａｎ）Ｄ、「ポリラクチド−コ−グリコリド微粒子の新規製剤からの組み換えインスリン様成長因子の制御放出」“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：２１−２８［２００１］；メイネル（Ｍｅｉｎｅｌ）Ｌ、イリ（Ｉｌｌｉ）ＯＥ、ザフ（Ｚａｐｈ）Ｊ、マルファンティ（Ｍａｌｆａｎｔｉ）Ｍ、マークル（Ｍｅｒｋｌｅ）ＨＰ、ガンダー（Ｇａｎｄｅｒ）Ｂ、「ポリ［Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド］微小球におけるインスリン様成長因子Ｉの安定化」“Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｉｎ  ｐｏｌｙ［Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ］ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ”Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：１９２−２０２［２００１］）。栄養因子を専門とする製薬会社は、そのような製剤の開発に取り組んでいる。前の研究により、皮下投与される制御放出浸透性系で製剤化されたＩＧＦ−Ｉの有用性が証明されている。これらの系はいくつかの病理的過程で治療効果を形成する（フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）ＡＭ、ゴンザレスデラヴェーガ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｅｇａ  Ａ）、トレス−アレマン（Ｔｏｒｒｅｓ−Ａｌｅｍａｎ）Ｉ、「インスリン様成長因子は小脳性運動失調症ラットモデルにおいて運動協調性を回復させる」“Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｍｏｔｏｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９５：１２５３−１２５８［１９９８］）。しかしながら、嵩高い（結果として、ヒトでは移植が困難である）、および薬物の放出が停止すると浸透性装置を除去する必要があるという欠点がある。この欠点を避けるために、小さな徐放性生物分解性調製物を開発することができる。吸収可能な縫合糸の製造において使用されるものと類似の、生物分解性の乳酸およびグリコール酸コポリマーが、この目的のために使用されることが多くなっている。ポリ乳酸およびポリグリコール酸の比率および粘度を変えることができる異なるコポリマーが存在する。これにより、薬物放出速度を制御することができ、その結果、薬物吸収およびその有効期間を長くすることができる。普通、ポリグリコール酸に対しポリ乳酸の比率が大きくなると、薬物放出速度が遅くなる。他方、ポリマーの固有粘度が大きくなると、放出速度が遅くなる。特に、ＩＧＦ−Ｉの３つの研究が最近出版されており（ラムＸＭ、デュエナスＥＴ、ドーエルティＡＬ、レヴィＮ、およびクレランドＪＬ「糖尿病の治療のための組み換えヒトインスリン様成長因子−Ｉの持続放出」Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ６７：２８１−２９２［２０００］；シンＭ、シャーリーＢ、バジャＫ、サマラＥ、ホラＭ、およびオハガンＤ、「ポリラクチド−コ−グリコリド微粒子の新規製剤からの組み換えインスリン様成長因子の制御放出」Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：２１−２８［２００１］；メイネルＬ、イリＯＥ、ザフＪ、マルファンティＭ、マークルＨＰ、ガンダーＢ、「ポリ［Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド］微小球におけるインスリン様成長因子Ｉの安定化」Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：１９２−２０２［２００１］）、ここで、５０：５０の乳酸およびグリコール酸のコポリマー（レソマー（Ｒｅｓｏｍｅｒ）５０２Ｈ、ベーリンガーインゲルハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）が使用された。調製手順は、噴霧化または三成分エマルジョン技術のいずれかを必要とする。得られる微小球のサイズを増加させるために、三成分エマルジョン技術においては異なる系が使用される。このように、Ｍ．シンらの研究（シンＭ、シャーリーＢ、バジャＫ、サマラＥ、ホラＭ、およびオハガンＤ、「ポリラクチド−コ−グリコリド微粒子の新規製剤からの組み換えインスリン様成長因子の制御放出」Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：２１−２８［２００１］）では、ＩＧＦ−Ｉの一部沈澱を生成するためにｐＨの変化が誘発されるが、Ｌ．メイネルの研究（メイネルＬ、イリＯＥ、ザフＪ、マルファンティＭ、マークルＨＰ、ガンダーＢ、「ポリ［Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド］微小球におけるインスリン様成長因子Ｉの安定化」Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：１９２−２０２［２００１］）では、遅い撹拌速度が使用され、大きなサイズの微小球を得るためにゼラチンおよびアルブミンのような蛋白質が添加される。これらの系全てにおいて、得られた微小球の直径が３０μｍを超え、研究によって３０〜１２５μｍの範囲となる。
【０００５】
【非特許文献１】Ａｍａｄｕｃｃｉ  Ｌ，ａｎｄ  Ｔｅｓｃｏ  Ｇ，Ａｇｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、７：２８３−２８６［１９９４］
【非特許文献２】Ｈｅｉｎｔｚ  Ｎ，ａｎｄ  Ｚｏｇｈｂｉ  ＨＹ，Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、６２：７７９−８０２［２０００］
【非特許文献３】Ｇｕｒｗｉｔｚ  Ｄ，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｙｅｔ  ｃｌｏｓｅｒ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５４２−５４３［２００１］
【非特許文献４】Ｗｏｏｄａｌ  ＳＭ，Ｂｒｅｉｅｒ  ＢＨ，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｕ，Ｇｌｕｃｋｍａｎ  ＰＤ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ１２：５８１−５８４［１９９１］
【非特許文献５】Ｌａｍ  ＸＭ，Ｄｕｅｎａｓ  ＥＴ，Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ＡＬ，Ｌｅｖｙ  Ｎ，ａｎｄ  Ｃｌｅｌａｎｄ  ＪＬ，“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ”Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ６７：２８１−２９２［２０００］
【非特許文献６】Ｓｉｎｇｈ  Ｍ，Ｓｈｉｒｌｅｙ  Ｂ，Ｂａｊｗａ  Ｋ，Ｓａｍａｒａ  Ｅ，Ｈｏｒａ  Ｍ，ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｇａｎ  Ｄ，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：２１−２８［２００１］
【非特許文献７】Ｍｅｉｎｅｌ  Ｌ，Ｉｌｌｉ  ＯＥ，Ｚａｐｈ  Ｊ，Ｍａｌｆａｎｔｉ  Ｍ，Ｍｅｒｋｌｅ  ＨＰ，Ｇａｎｄｅｒ  Ｂ，“Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｉｎ  ｐｏｌｙ［Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ］ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ”Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：１９２−２０２［２００１］
【非特許文献８】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＡＭ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｅｇａ  Ａ，Ｔｏｒｒｅｓ−Ａｌｅｍａｎ  Ｉ，“Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｍｏｔｏｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９５：１２５３−１２５８［１９９８］
【発明の開示】
【０００６】
簡単な説明
本発明はＩＧＦ−Ｉの緩やかな投与のための新規治療用製剤、これらの製剤の調製および製造手順、および、神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病または小脳性運動失調症の治療および予防のための医療品の製造におけるそれらの使用に関する。これらの製剤は、数ある特徴のなかで特に、直径５μｍ未満の微小球、および皮下移植用のカプセルに対応する。
【０００７】
詳細な説明
本発明は、遺伝的または散発性のいずれかのニューロンの損失により引き起こされる神経系の疾患を予防するように設計される。本発明は、長く持続し、生物分解可能な治療用製剤の皮下投与により構成され、そのような製剤は本発明で開発され、天然の神経保護因子ＩＧＦ−Ｉを含む。この出願の新規性は、遺伝性の小脳性運動失調症およびアルツハイマー病の動物モデル、および老齢ラットにおいて評価されるように、この長期持続性製剤を周期的に投与することにより神経変性疾患の症状の出現を阻止することである（実施例２、３および４を参照のこと；図２）。さらに、この製剤の投与は非常に好都合であり（１月に１または２回）（図１Ｂ）、その治療効力はＩＧＦ−Ｉを毎日皮下注射した場合（図１Ａ）よりも大きい。治療レベルがよりいっそう持続されるからである。投与経路は皮下であり、そのため注射針を容易に通過するようにより小さな粒子（５μｍ未満）が開発されている。
【０００８】
このように、本発明の１つの目的は、天然神経保護因子ＩＧＦ−Ｉを含む治療用製剤または組成物（本明細書では、本発明の治療用製剤と呼ぶ）であり、これにより、無傷の、機能的に活性なＩＧＦ−Ｉの持続放出が可能となり、この治療用製剤は、直径５μｍ未満、一般的には１〜２μｍ、好ましくは約１．３μｍの高粘度コポリマーの微小球により構成される。
【０００９】
本発明により提供される治療用製剤は治療上有効な量のＩＧＦ−Ｉと、薬学的に適した賦形剤とから構成される。この治療用製剤は、哺乳類種、好ましくはヒトにおいて投与および／または塗布するのに有益である。
【００１０】
送達させるべき、治療上有効な量の本発明の製剤、ならびに病的状態を治療するための該製剤の用量は、様々な因子、例えば、年齢、患者の状態、疾患の重篤度、投与経路および投与回数、その他に依存する。
【００１１】
本発明により提供するＩＧＦ−Ｉを含む治療用製剤は、皮下投与に適していると考えられる任意の投与形態により送達することができ、投与形態に従い製剤に必要な薬学的に許容される賦形剤を含む。医薬品の投与のための薬学的形態および必要な賦形剤のレビューは、Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ（ガレニック薬局の協定（Ｔｒｅａｔｙ  ｏｆ  Ｇａｌｅｎｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、Ｃ．ファウリィトリロ（Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ）、１９９３、Ｌｕｚａｎ  ５、ＳＡ出版、マドリードにおいて見出すことができる。
【００１２】
放出速度に対する可能な効果は、前の研究で記述したような５０２Ｈの代わりに、レソマー（Ｒｅｓｏｍｅｒ）５０６（ベーリンガーインゲルハイム）のようなより高粘度のコポリマーを使用することにより補償されている。このように、引用した研究において記述されているもの（粘度は０．２ｄｌ／ｇ）の代わりに、０．８ｄｌ／ｇの粘度を有するコポリマーの使用が提案されている。より小さな微小球を得るために、三成分エマルジョン技術を使用した。この技術では、ベースとしてＩＧＦ−Ｉ溶液を使用し、高ホモジネーション速度により、エマルジョン中で最も小さな可能な内相が達成される。さらに、本発明で提案した方法では、アルカリｐＨ（ＩＧＦ−Ｉが不溶性になりうる）および他の高分子量蛋白質（アルブミン、ゼラチン、など）は使用しない。これにより、一般に１〜２μｍの微小球が得られ、これは針注射による皮下投与により適している。
【００１３】
本発明の他の目的は、本発明において言及した治療用製剤の調製および製造のための手順であって、本明細書では本発明の手順と呼ばれるが、以下のように：
−使用するコポリマーは高粘度であり、０．５ｄｌ／ｇ〜１．５ｄｌ／ｇ、好ましくは０．８ｄｌ／ｇである、
−高ホモジナイゼーション速度、好ましくは１３５００ｒｐｍを使用する、
−使用する溶液は非アルカリ性ｐＨである、
−高分子量蛋白質、例えばアルブミンおよびゼラチンは使用しない、
三成分エマルジョン技術および溶媒抽出を基本とする手順である。
【００１４】
本発明の特別な目的は、コポリマーが特に、５０：５０の乳酸およびグリコール酸（ＰＬＧＡ５０：５０）である本発明の手順である。
【００１５】
本発明の他の目的は、本発明の手順により得られる治療用製剤である。
【００１６】
三成分エマルジョン技術の参考および非限定的例として、ラムら、シンらおよびメイネルらの公表された研究を引用する（ラムＸＭ、デュエナスＥＴ、ドーエルティＡＬ、レヴィＮ、およびクレランドＪＬ「糖尿病の治療のための組み換えヒトインスリン様成長因子−Ｉの持続放出」Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ６７：２８１−２９２［２０００］、シンＭ、シャーリーＢ、バジャＫ、サマラＥ、ホラＭ、およびオハガンＤ；「ポリラクチド−コ−グリコリド微粒子の新規製剤からの組み換えインスリン様成長因子の制御放出」Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：２１−２８［２００１］；メイネルＬ、イリＯＥ、ザフＪ、マルファンティＭ、マークルＨＰ、ガンダーＢ、「ポリ［Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド］微小球におけるインスリン様成長因子Ｉの安定化」Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ  ７０：１９２−２０２［２００１］）。
【００１７】
他方、序文で示したように、乳酸およびグリコール酸コポリマー類のこれらの微小球はまた、この問題に関する熟練者により、とりわけ、三成分エマルジョンおよび溶媒抽出手順により、および噴霧技術により調製することができる。これが、これらの技術を用いて調製され、得られる本発明の治療用製剤が本発明の一部である理由である。微小球の調製のための噴霧化手順は多くの研究において記述されており、例えば以下の通りである：Ｐ．ヨハンセン（Ｊｏｈａｎｓｅｎ）、Ｅ．エステベス（Ｅｓｔｅｖｅｚ）、Ｒ．ズルブリッゲン（Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ）、Ｈ．Ｐ．マークル（Ｍｅｒｋｌｅ）、Ｒ．グルック（Ｇｌｕｃｋ）、Ｇ．コラジン（Ｃｏｒｒａｄｉｎ）、Ｂ．ガンダー（Ｇａｎｄｅｒ）、ＰＬＡ／ＰＬＧＡ微小球に基づく１回投与破傷風ワクチンの臨床試験に対して（Ｔｏｗａｒｄｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＰＬＡ／ＰＬＧＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、Ｖａｃｃｉｎｅ２０００．１９（９−１０）：１０４７−５４；Ｐ．ヨハンセン、Ｙ．メン（Ｍｅｎ）、Ｒ．アウドラン（Ａｕｄｒａｎ）、Ｇ．コラジン、Ｈ．Ｐ．マークル、Ｂ．ガンダー、添加剤を共にカプセル化することによるマイクロカプセル化破傷風トキソイドの安定性の向上（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ  ｂｙ  ｃｏ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９８．１５（７）：１１０３−１０；Ｓ．タカダ（Ｔａｋａｄａ）、Ｙ．ウダ（Ｕｄａ）、Ｈ．トグチ（Ｔｏｇｕｃｈｉ）、Ｙ．オガワ（Ｏｇａｗａ）、生物分解性ポリマーの注射可能なＴＨＲ含有持続放出性マイクロカプセルの製造における噴霧乾燥技術の適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｒａｙ−ｄｒｙｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＨＲ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、ＰＤＡ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９５．４９（４）：１８０−４；Ｆ．パバネット（Ｐａｖａｎｅｔｔｏ）、Ｉ．ゲンタ（Ｇｅｎｔａ）、Ｐ．ギウンチェジ（Ｇｉｕｎｃｈｅｄｉ）、Ｂ．コンチ（Ｃｏｎｔｉ）、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコリド微小球調製のための方法としての噴霧乾燥の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｒａｙ  ｄｒｙｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  １９９３．１０（４）：４８７−９７；Ｂ．ビトナー（Ｂｉｔｔｎｅｒ）およびＴ．キッセル（Ｋｉｓｓｅｌ）、噴霧乾燥のための超音波噴霧化：蛋白質充填した生物分解性微小球の調製のための用途の広い技術（Ｕｌｔ��ａｓｏｎｉｃ  ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｐｒａｙ  ｄｒｙｉｎｇ：ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏａｄｅｄ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍｉｃｒｓｐｈｅｒｅｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  １９９９．１６（３）：３２５−３４１。
【００１８】
微小球および錠剤は、皮下注射または移植により定期的に投与される。神経変性疾患に対する予防効能は長くなる。遺伝的神経変性に苦しむＰｃｄマウスにこの製剤をほとんど５ヶ月間投与すると、その間には遺伝性神経変性疾患を発現しない。これは、薬物を投与している間は、疾患は発現しないが、投与を中断すると再び発現することを意味する。疾患の初期段階では、製品の再投与により疾患の症状が消える（図２Ａ）。他方、アルツハイマー様疾患のトランスジェニックマウスおよび老齢ラットに治療用微小球製剤を投与すると、この疾患に関連する症状、例えば特にβ−アミロイド沈着および反応性グリオーシスが軽減した（実施例３および４を参照のこと、図２）。
【００１９】
本発明は、神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病、小脳性運動失調症、運動失調−毛細血管拡張症、血管性痴呆、多発性硬化症、脳卒中、末梢神経障害、および脳外傷または脊髄外傷の治療および予防のための医薬品の調製におけるこれらの製剤のうちの任意の１つの使用を記述する。このように、本発明の目的は、神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病、小脳性運動失調症、運動失調−毛細血管拡張症、血管性痴呆、多発性硬化症、脳卒中、末梢神経障害、および脳外傷または脊髄外傷の治療および予防のための医薬品の調製または製造における本発明の治療用製剤の使用である。
【００２０】
これらの小さな微小球の他に、非常に長期にわたる効果を有する調製物を得るために、皮下移植用の錠剤またはカプセルが開発されており（実施例１ｃを参照のこと）、これらは本明細書では本発明の錠剤と呼ばれ、これらについては、他の著者による前の研究から、引用文献またはデータは見出されていない。このように、本発明の他の目的は長期ＩＧＦ−Ｉ放出用のこの錠剤またはカプセルである。
【００２１】
本発明の他の目的は、本発明の錠剤の調製および製造のための手順であり、この手順は以下の技術に基づく：
−ＩＧＦ−Ｉを０．０１ｍＭ酢酸に溶解する、
−この溶液にシクロスポリンを添加する、
−この混合物を乳酸およびグリコール酸コポリマー（べーリンガーインゲルハイムのレソマー５０３Ｈ）に添加し、穏やかに混練し、その後、生成物を２−ｍｍメッシュのふるいにかける、
−３時間室温で乾燥させ、再び２−ｍｍメッシュのふるいにかける、
−室温でさらに１５時間乾燥させ、直径６ｍｍの凹状パンチで圧縮する。
【００２２】
最後に、本発明の他の目的は、神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病、小脳性運動失調症、運動失調−毛細血管拡張症、血管性痴呆、多発性硬化症、脳卒中、末梢神経障害、および脳外傷または脊髄外傷の治療および予防のための医薬品の生産または調製において、本発明の錠剤を使用することである。
【実施例】
【００２３】
実施例１．ＩＧＦ−Ｉ調製物の生産および投与
実施例１ａ．ＩＧＦ−Ｉの皮下注射（図１Ａ）
凍結乾燥させたヒト組み換えＩＧＦ−Ｉ（ｒｈＩＧＦ−Ｉ）（グロペップ（ＧｒｏＰｅｐ）、オーストラリア）を生理食塩水（ＮａＣｌ  ０．９％）に溶解し、５００μｇ／１００μｌの濃度とする。３００ｇの体重の成人Ｗｉｓｔａｒラット（各収集時間に対しｎ＝６）は１００μｌの１回の皮下注射（肩甲骨内）を受ける。ラジオイムノアッセイ法により血清中のＩＧＦ−Ｉを評価するために（Ｉ．トーレス−アレマン（Ｔｏｒｒｅｓ−Ａｌｅｍａｎ）、Ｓ．ポンス（Ｐｏｎｓ）、Ｌ．Ｍ．ガルシア−セグラ（Ｇａｒｃｉａ−Ｓｅｇｕｒａ）、登上線維求心路遮断により小脳中のインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）量が減少する（Ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｆｉｂｅｒ  ｄｅａｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ５６４：３４８−３５１［１９９１］；Ｓ  ポンスおよびＩ  トーレス−アレマン  塩基性線維芽細胞増殖因子は視床下部細胞培養物中のインスリン様成長因子−Ｉ、その受容体およびその結合蛋白質を調節する（Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ、ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｎｄ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３１：２２７１−２２７８［１９９２］）、ＩＧＦ−Ｉ注射後異なる時間で動物を麻酔し、屠殺した後血液を収集する。
【００２４】
図１Ａで記述したように、成人ラットにおけるＩＧＦ−Ｉ（１．８ｍｇ／ｋｇ）の１回の皮下注射により、ＩＧＦ−Ｉレベルの急激な上昇が引き起こされるが、このレベルの持続は２４時間未満であった（図１Ａ）。
【００２５】
実施例１ｂ．ＩＧＦ−Ｉ微小球の生産
ＩＧＦ−Ｉ微小球の調製は、記述された三成分エマルジョンおよびＡ／Ｏ／Ａ溶媒抽出法の改良を用いて以前実施した（シンＭ、シャーリーＢ、バジャＫ、サマラＥ、ホラＭ、およびオハガンＤ（２００１）、「ポリラクチド−コ−グリコリド微粒子の新規製剤からの組み換えインスリン様成長因子の制御放出」Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７０：２１−２８）。これにより、無傷で、生物学的に活性なＩＧＦ−Ｉの効果的な放出が得られる（メイネルＬ、イリＯＥ、ザフＪ、マルファンティＭ、ピーターＭＨ、ガンダーＢ（２００１）、「ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）微小球におけるインスリン様成長因子Ｉの安定化」Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７０：１９２−２０２；シンＭ、シャーリーＢ、バジャＫ、サマラＥ、ホラＭ、およびオハガンＤ［２００１］）。方法は、０．０ｍＭ酢酸１００μｌに４０ｍｇのＩＧＦ−Ｉを溶解させることにより開始する。この溶液に、１０．５ｍｇのツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（サーバ（Ｓｅｒｖａ）、ドイツ）を含む１０ｍＭのリン酸１ナトリウム０．７ｍｌ（ｐＨ６．０）を添加する。同時に、固有粘度が０．８ｄｌ／ｇである乳酸：グリコール酸の５０：５０コポリマー（ＰＬＧＡ５０：５０、レソマー（登録商標）５０６、ドイツ）５００ｍｇを１０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、これをＩＧＦ−Ｉの水相と混合する。ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、登録商標）を用い、２分間、１３５００ｒｐｍでエマルジョンをホモジナイズし、小粒子サイズの第１二成分Ａ／Ｏエマルジョンを得る。その後、６．８ｇのリン酸１カリウムおよび０．２ＭのＮａＯＨ溶液１９５．５ｍｌを用いて１リットル調製した、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液４００ｍｌに、このエマルジョンを添加する。このＰＢＳ緩衝液は８ｇのポリビニルアルコール（ポリビニルアルコール１５０００、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、スイス）を含む。第１のエマルジョンをＰＢＳ溶液上に注ぎ、その後ホモジナイザを用い１３５００ｒｐｍで２分間激しく撹拌することにより（ウルトラツラックス（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ、登録商標））、三成分Ａ／Ｏ／Ａエマルジョンを得る。塩化メチレンを蒸発させながら、この三成分エマルジョンを穏やかに（７００ｒｐｍ）４時間撹拌すると、微小球が形成される。その後、６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより微小球を回収し、上清をデカントする。次に、微小球を脱イオン水で洗浄し、再び遠心分離し、デカントする。洗浄工程を３回繰り返す。最後に、微小球を凍結乾燥し、使用するまで冷蔵保存する（４℃）。
【００２６】
１０ｍｇの微小球を１Ｎ  ＮａＯＨ  １ｍｌに溶解し、室温で一晩中撹拌することにより、微小球中のｒｈＩＧＦ−Ｉの荷重を決定した。１Ｎ  ＮａＯＨ中のｒｈＩＧＦ−Ｉに対し、１０４３（ｍｇ／ｍｌ）−１ｃｍ−１の吸光係数を用い、２８４ｎｍでのＵＶ吸収により蛋白質濃度を評価した。レーザ回折（ガライ（Ｇａｌａｉ、登録商標）Ｃｉｓ−１）により微小球サイズを決定した。複数のバッチの希釈サンプルについて３度行い、各バッチに対する平均直径を考慮した。微小球の形態は電子顕微鏡（ＪＥＯＬ６４００）により分析した。得られた微小球の平均粒子サイズは１．３±１μｍであり、強度は５％である。カプセル化のパーセンテージは７０％であった。
【００２７】
これらのＩＧＦ−Ｉ微小球を成人ラットへ皮下投与すると（５ｍｇ／ｋｇ）、血液中のＩＧＦ−Ｉレベルが高くなり、少なくとも２週間高いままであった（図１Ｂ）。これらの微小球の比較的小さな直径により、２３Ｇ針を介してこの懸濁液を注射するのが容易になった。
【００２８】
実施例１ｃ．ＩＧＦ−Ｉ移植カプセルの生産
１バッチ１０錠剤を調製するために、１５ｍｇのＩＧＦ−Ｉ（グロプレプ、オーストラリア）を計り分け、その後、０．０１ｍＭ酢酸１．５ｍｌに溶解する。シクロスポリン３０ｍｇをこの溶液に添加し、懸濁液のままとする。この混合物を４５５ｍｇの乳酸およびグリコール酸のコポリマー（レソマー５０３Ｈ、べーリンガーインゲルハイム）に添加し穏やかに混練し、その後、生成物を２−ｍｍメッシュのふるいにかける。室温で３時間乾燥させ、再び２−ｍｍメッシュのふるいにかける。室温でさらに１５時間乾燥させ、直径６ｍｍの凹状パンチで圧縮し、カプセル質量５０ｍｇに調整する。これにより、直径６ｍｍ、厚さ３ｍｍ、質量５０ｍｇの、１カプセルあたり１．５ｍｇのＩＧＦ−Ｉを有する両凸カプセルまたは錠剤が得られる。これらの錠剤をｐｃｄマウスの皮膚の下に、麻酔せずに、小さく切開することにより移植する。生物分解性材料のため、除去する必要はない。
【００２９】
実施例２．ＩＧＦ−Ｉ微小球および移植用カプセルを用いた、遺伝性小脳変性法（プルキンエ細胞変性症）マウスの処置
１月齢で疾患の症状を示した（早死に至る協調運動不能）、遺伝性小脳性運動失調症の２月齢マウス（ｐｃｄ、または「プルキンエ細胞変性」マウス、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）研究所）に、最初の２回は５０μｇ／ｋｇおよび７５μｇ／ｋｇ、その後は２週毎に１回、１００μｇ／ｋｇの用量で、皮下注射によりＩＧＦ−Ｉ微小球を投与した（図２Ａ）。症状が処置により軽減したかどうかを決定するために、ロタロッド（ｒｏｔａ−ｒｏｄ）試験により週に１度、運動能力を評価した（Ａ．Ｍ．フェルナンデス、Ａ．ゴンザレスデラヴェーガ、Ｉ．トレス−アレマン、インスリン様成長因子は小脳性運動失調症のラットモデルにおいて運動協調性を回復させる、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９５：１２５３−１２５８［１９９８］）。各回、６匹のマウスからなる２つの別個のバッチにおいて実験を実施した。結果的に、健康なマウスにおける所見と比較し、マウスは、微小球（図２Ａ、▲を伴う線）またはカプセル（図２Ａ、■を伴う線）のいずれかによる処置（１００日）が続く間、正常な程度の運動協調性を示した（処置マウスはほとんど３００秒の最大運動協調性を有し、これは健康マウスにおける所見と類似した［データは示さず］）が、対照群では運動失調症の症状は消えなかった（２００〜２４０秒の最大運動協調性値）。
【００３０】
１回分のＩＧＦ−Ｉを投与している間は、微小球によるか、またはカプセルによるかに関係なく、ＩＧＦ−Ｉレベルの減少は運動協調性の損失と相関したことに注意すべきである。新たにＩＧＦ−Ｉを投与すると（微小球の第２回目［１４日］および第３回目［２８日］後、ならびに第２のカプセル移植後［７０日］）、疾患の症状は再び軽減した。微小球による処置の効能は投与した用量に依存し（図２Ａ）、５０μｇ／ｋｇおよび７５μｇ／ｋｇの最初の用量とは対照的に、１００μｇ／ｋｇの用量では運動協調性の損失は観察されない。
【００３１】
実施例３．ＩＧＦ−Ｉ微小球を用いた、アルツハイマー様疾患を患うトランスジェニックマウスの処置
１ヶ月間ＩＧＦ−Ｉ微小球を投与した、突然変異ヒトＡＰＰ遺伝子の遺伝子導入による過剰β−アミロイドを有する１０月齢トランスジェニックマウス（Ｔｇ２５７６マウス、シアオ（Ｈｓｉａｏ）ら、１９９６（シアオＫ、チャップマン（Ｃｈａｐｍａｎ）Ｐ、ニルセン（Ｎｉｌｓｅｎ）Ｓ．エクマン（Ｅｃｋｍａｎ）Ｃ、ハリガヤ（Ｈａｒｉｇａｙａ）Ｙ、ヨウンキン（Ｙｏｕｎｋｉｎ）Ｓ、ニャグ（Ｙｎａｇ）Ｆ、コール（Ｃｏｌｅ）Ｇ．、トランスジェニックマウスにおける相関的な記憶障害、無β上昇、およびアミロイド斑（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ、Ａｂｅｔａ  ｅｌｅｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９９−１０２、［１９９６］）を参照のこと、標準ケージ条件下：１２時間の明暗サイクル、ならびに水および食物は無制限で飼育）において、ウエスタン−ブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）により脳β−アミロイドレベルを評価した。（デンシトメトリーによるウエスタン−ブロットを用いて得られたバンドを評価することにより決定される）未処置トランスジェニックマウスの皮質および海馬中のβ−アミロイド（βＡ）レベルは、無病同腹子（ｈｍｕｔＡＰＰ−／−）において見られるものより７および２５倍高く、一方、ＩＧＦ−Ｉで処置したトランスジェニックマウスは無病動物と同じβ−アミロイドレベルを有した（未処置Ｔｇ２５７６に対しｐ＜０．０１）。
【００３２】
実施例４．ＩＧＦ−Ｉ微小球による、老齢ラットにおけるアルツハイマー病の予防
標準の光および食物条件下で飼育した、１８月齢の老齢Ｗｉｓｔａｒラットにおいて、ＩＧＦ−Ｉ微小球を１ヶ月投与し、脳実質（前頭葉）内のグリオーシス病変の出現をＧＦＡＰ免疫染色により決定した（リー（Ｌｅｅ）、ＣＫ．ウェインドルッチ（Ｗｅｉｎｄｒｕｃｈ）、Ｒ，プローラ（Ｐｒｏｌｌａ）、ＴＡ．、マウスにおける老齢脳の遺伝子発現プロファイル（Ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ａｇｅｉｎｇ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２５、２９４−２９７［２０００］）（図２Ｂ）。脳ＧＦＡＰ蛋白質レベル（図２Ｃ）および脳（皮質）および脳脊髄液（ＣＳＦ）内のβ−アミロイドレベル（バウシャー（Ｖａｕｃｈｅｒ）、Ｅ．ら、老齢の認識機能障害ラットおよび認識機能障害のないラットにおけるアミロイドβペプチドレベルおよび海馬アセチルコリン放出に対するその影響（Ａｍｙｌｏｉｄ  β  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｇｅｄ、ｃｏｎｇｎｉｔｉｖｅｌｙ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｉｍｐａｉｒｅｄ  ｒａｔｓ）、Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔ  ２１、３２３−３２９［２００１］）（図２Ｄ）は、ウエスタン−ブロットにより決定した。これらは全て、アルツハイマー神経変性に関連するアミロイドーシスの症状である。これらのパラメータは全て、ＩＧＦ−Ｉ処置老齢ラットと成人ラット間で類似しており、後者２つの場合、レベルは未処置老齢ラットにおいて観察されたレベルより低かった（図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄ）。ＣＳＦ中のβ−アミロイドレベルは、ＩＧＦ−Ｉ処置老齢ラットでは、β−アミロイドクリアランスにより上昇したことに注意すべきである（図２Ｄ、下のパネル）。
【００３３】
材料および方法
動物．近交系成人および老齢Ｗｉｓｔａｒラット（２５０〜４５０ｇ）、トランスジェニックＴｇ２５７６マウス、雄および雌ｐｃｄ（プルキンエ細胞変性）マウス、および対照群としての、Ｃ５７と年齢および性別が一致する運動失調症でないマウスの同腹子を、ＥＵ指令８６／６０９／ＥＥＣに従い使用した。動物は標準の実験室条件下で飼育した。
【００３４】
試薬．１２５ＩＮａ（アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、英国）を使用してｒｈＩＧＦ−Ｉのヨウ素処理を行った。特に記載がなければ、本発明で使用した試薬の残りはシグマ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）またはメルク（Ｍｅｒｃｋ、スペイン）からのものとした。
【００３５】
血液中のＩＧＦ−Ｉ分析の実験設計．各成人ラットから複数の血液サンプルをとり、ｒｈＩＧＦ−Ｉの皮下投与（ｓ．ｃ．）前後に血清中のＩＧＦ−Ｉレベルを決定した。ラットの体重により、微小球用量（５ｍｇ／ｋｇ）は、即時ボーラス注入のための滅菌生理食塩水に溶解した懸濁液として調製した。他の群のラットは、１．８ｍｇ／ｋｇのｒｈＩＧＦ−Ｉの溶液の従来の皮下ボーラス注入を受けた。全ての場合において、血液サンプルは注入後、異なる時間に鎖骨下部から採取した。かなり高い用量を使用すると注入後に血清中で検出された。マウスにおいては血液サンプルの複数の抽出物を作成することは困難であるので、サンプルは異なるマウスから異なる時間に入手した。ｐｃｄマウスは飼育が困難なので、ＩＧＦ−Ｉ微小球の治療効果を評価するためだけに使用した。
【００３６】
ＩＧＦＢＰとの干渉を減少させるために、血清サンプルはＣ１８カートリッジ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、合衆国）を用いて抽出し、一方、組織サンプルは、発明者らが以前に記述したように（ポンスＳおよびトーレス−アレマンＩ（１９９２）、塩基性線維芽細胞増殖因子は視床下部細胞培養物中のインスリン様成長因子−Ｉ、その受容体およびその結合蛋白質を調節する、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３１：２２７１−２２７８）１Ｎ酢酸中で、３０分間沸騰させた。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】ＩＧＦ−Ｉの１回の皮下注射後の血液中のＩＧＦ−Ｉレベルを示したものであり、高いレベルが一時されるのは２４時間未満であることを示す図である。
【図１Ｂ】ＩＧＦ−Ｉ微小球の皮下注射（ｓ．ｃ．）では、ＩＧＦ−Ｉレベルは少なくとも２週間高いままであることを示す図である。
【図２】Ａ）ＩＧＦ−Ｉ微小球（σ）、ＩＧＦ−Ｉカプセル（ν）で処置した遺伝性小脳性運動失調症マウス、および未処理対照群（空の微小球）（●）での、神経変性疾患におけるＩＧＦ−Ｉデポー剤による治療の予防効果を示した図であり、運動協調性の程度は、フェルナンデスら（１９９８）が記述しているロタロッド試験により評価し、Ｂ）ＩＧＦ−Ｉ微小球で処置した老齢ラットであり、動物の正常な老化中の神経変性に関連するアミロイドーシスをＧＦＡＰ蛋白質の免疫染色により評価したものを示す図であり、Ｃ）ＩＧＦ−Ｉ微小球で処置した老齢ラットであり、動物の正常な老化中の神経変性に関連するアミロイドーシスを脳（皮質）中のＧＦＡＰ蛋白質レベルの決定により評価したものを示す図であり、Ｄ）ＩＧＦ−Ｉ微小球で処置した老齢ラットであり、動物の正常な老化中の神経変性に関連するアミロイドーシスを脳（皮質）および脳脊髄液（ＣＳＦ）中のβ−アミロイドレベルを決定することにより評価したものを示す図である。
【図１Ａ】
2005529083.tif 000003
【図１Ｂ】
2005529083.tif 000004
【図２】
2005529083.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月2日(2004.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＩＧＦ−１を含む活性物質を投与するための新規製剤（微小球および錠剤）の調製および製造、ならびに、神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病または小脳性運動失調症の治療および予防におけるそれらの使用に関する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
簡単な説明
本発明はＩＧＦ−Ｉの緩やかな投与のための新規治療用製剤、これらの製剤の調製および製造手順、および、神経変性疾患、例えば特に、アルツハイマー病または小脳性運動失調症の治療および予防のための医療品の製造におけるそれらの使用に関する。これらの製剤は、数ある特徴のなかで特に、直径５μｍ未満の微小球、および皮下移植用の錠剤に対応する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
これらの小さな微小球の他に、非常に長期にわたる効果を有する調製物を得るために、皮下移植用の錠剤が開発されており（実施例１ｃを参照のこと）、これらは本明細書では本発明の錠剤と呼ばれ、これらについては、他の著者による前の研究から、引用文献またはデータは見出されていない。このように、本発明の他の目的は長期ＩＧＦ−Ｉ放出用のこの錠剤である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
実施例１ｃ．ＩＧＦ−Ｉ移植錠剤の生産
１バッチ１０錠剤を調製するために、１５ｍｇのＩＧＦ−Ｉ（グロプレプ、オーストラリア）を計り分け、その後、０．０１ｍＭ酢酸１．５ｍｌに溶解する。シクロスポリン３０ｍｇをこの溶液に添加し、懸濁液のままとする。この混合物を４５５ｍｇの乳酸およびグリコール酸のコポリマー（レソマー５０３Ｈ、べーリンガーインゲルハイム）に添加し穏やかに混練し、その後、生成物を２−ｍｍメッシュのふるいにかける。室温で３時間乾燥させ、再び２−ｍｍメッシュのふるいにかける。室温でさらに１５時間乾燥させ、直径６ｍｍの凹状パンチで圧縮し、錠剤質量５０ｍｇに調整する。これにより、直径６ｍｍ、厚さ３ｍｍ、質量５０ｍｇの、１錠剤あたり１．５ｍｇのＩＧＦ−Ｉを有する両凸錠剤が得られる。これらの錠剤をｐｃｄマウスの皮膚の下に、麻酔せずに、小さく切開することにより移植する。生物分解性材料のため、除去する必要はない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
実施例２．ＩＧＦ−Ｉ微小球および移植用錠剤を用いた、遺伝性小脳変性法（プルキンエ細胞変性症）マウスの処置
１月齢で疾患の症状を示した（早死に至る協調運動不能）、遺伝性小脳性運動失調症の２月齢マウス（ｐｃｄ、または「プルキンエ細胞変性」マウス、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）研究所）に、最初の２回は５０μｇ／ｋｇおよび７５μｇ／ｋｇ、その後は２週毎に１回、１００μｇ／ｋｇの用量で、皮下注射によりＩＧＦ−Ｉ微小球を投与した（図２Ａ）。症状が処置により軽減したかどうかを決定するために、ロタロッド（ｒｏｔａ−ｒｏｄ）試験により週に１度、運動能力を評価した（Ａ．Ｍ．フェルナンデス、Ａ．ゴンザレスデラヴェーガ、Ｉ．トレス−アレマン、インスリン様成長因子は小脳性運動失調症のラットモデルにおいて運動協調性を回復させる、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９５：１２５３−１２５８［１９９８］）。各回、６匹のマウスからなる２つの別個のバッチにおいて実験を実施した。結果的に、健康なマウスにおける所見と比較し、マウスは、微小球（図２Ａ、▲を伴う線）または錠剤（図２Ａ、■を伴う線）のいずれかによる処置（１００日）が続く間、正常な程度の運動協調性を示した（処置マウスはほとんど３００秒の最大運動協調性を有し、これは健康マウスにおける所見と類似した［データは示さず］）が、対照群では運動失調症の症状は消えなかった（２００〜２４０秒の最大運動協調性値）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
１回分のＩＧＦ−Ｉを投与している間は、微小球によるか、または錠剤によるかに関係なく、ＩＧＦ−Ｉレベルの減少は運動協調性の損失と相関したことに注意すべきである。新たにＩＧＦ−Ｉを投与すると（微小球の第２回目［１４日］および第３回目［２８日］後、ならびに第２の錠剤移植後［７０日］）、疾患の症状は再び軽減した。微小球による処置の効能は投与した用量に依存し（図２Ａ）、５０μｇ／ｋｇおよび７５μｇ／ｋｇの最初の用量とは対照的に、１００μｇ／ｋｇの用量では運動協調性の損失は観察されない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
実施例４．ＩＧＦ−Ｉ微小球による、老齢ラットにおけるアルツハイマー病の予防（脳アミロイドーシスの予防）
標準の光および食物条件下で飼育した、１８月齢の老齢Ｗｉｓｔａｒラットにおいて、ＩＧＦ−Ｉ微小球を１ヶ月投与し、脳実質（前頭葉）内のグリオーシス病変の出現をＧＦＡＰ免疫染色により決定した（リー（Ｌｅｅ）、ＣＫ．ウェインドルッチ（Ｗｅｉｎｄｒｕｃｈ）、Ｒ，プローラ（Ｐｒｏｌｌａ）、ＴＡ．、マウスにおける老齢脳の遺伝子発現プロファイル（Ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ａｇｅｉｎｇ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ２５、２９４−２９７［２０００］）（図２Ｂ）。脳ＧＦＡＰ蛋白質レベル（図２Ｃ）および脳（皮質）および脳脊髄液（ＣＳＦ）内のβ−アミロイドレベル（バウシャー（Ｖａｕｃｈｅｒ）、Ｅ．ら、老齢の認識機能障害ラットおよび認識機能障害のないラットにおけるアミロイドβペプチドレベルおよび海馬アセチルコリン放出に対するその影響（Ａｍｙｌｏｉｄ  β  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｇｅｄ、ｃｏｎｇｎｉｔｉｖｅｌｙ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｉｍｐａｉｒｅｄ  ｒａｔｓ）、Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔ  ２１、３２３−３２９［２００１］）（図２Ｄ）は、ウエスタン−ブロットにより決定した。脳内の高レベルのＧＦＡＰ蛋白質またはβ−アミロイドペプチドおよび／または脳脊髄液中の低レベルのβ−アミロイドペプチドは、アルツハイマー神経変性に関連するアミロイドーシスの症状である。これらのパラメータは全て、ＩＧＦ−Ｉ処置老齢ラットと成人ラット間で類似しており、後者２つの場合、レベルは未処置老齢ラットにおいて観察されたレベルより低かった（図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄ）。ＣＳＦ中のβ−アミロイドレベルは、ＩＧＦ−Ｉ処置老齢ラットでは、β−アミロイドクリアランスにより上昇したことに注意すべきである（図２Ｄ、下のパネル）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
血液中のＩＧＦ−Ｉ分析の実験設計．各成人ラットから複数の血液サンプルをとり、ｒｈＩＧＦ−Ｉの皮下投与（ｓ．ｃ．）前後に血清中のＩＧＦ−Ｉレベルを決定した。ラットの体重により、微小球用量（５μｇ／ｋｇ）は、即時ボーラス注入のための滅菌生理食塩水に溶解した懸濁液として調製した。他の群のラットは、１．８ｍｇ／ｋｇのｒｈＩＧＦ−Ｉの溶液の従来の皮下ボーラス注入を受けた。全ての場合において、血液サンプルは注入後、異なる時間に鎖骨下部から採取した。かなり高い用量を使用すると注入後に血清中で検出された。マウスにおいては血液サンプルの複数の抽出物を作成することは困難であるので、サンプルは異なるマウスから異なる時間に入手した。ｐｃｄマウスは飼育が困難なので、ＩＧＦ−Ｉ微小球の治療効果を評価するためだけに使用した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
【図１Ａ】ＩＧＦ−Ｉの１回の皮下注射後の血液中のＩＧＦ−Ｉレベルを示したものであり、高いレベルが一時されるのは２４時間未満であることを示す図である。
【図１Ｂ】ＩＧＦ−Ｉ微小球の皮下注射（ｓ．ｃ．）では、ＩＧＦ−Ｉレベルは少なくとも２週間高いままであることを示す図である。
【図２】Ａ）ＩＧＦ−Ｉ微小球（σ）、ＩＧＦ−Ｉ錠剤（ν）で処置した遺伝性小脳性運動失調症マウス、および未処理対照群（空の微小球）（●）での、神経変性疾患におけるＩＧＦ−Ｉデポー剤による治療の予防効果を示した図であり、運動協調性の程度は、フェルナンデスら（１９９８）が記述しているロタロッド試験により評価し、Ｂ）ＩＧＦ−Ｉ微小球で処置した老齢ラットであり、動物の正常な老化中の神経変性に関連するアミロイドーシスをＧＦＡＰ蛋白質の免疫染色により評価したものを示す図であり、Ｃ）ＩＧＦ−Ｉ微小球で処置した老齢ラットであり、動物の正常な老化中の神経変性に関連するアミロイドーシスを脳（皮質）中のＧＦＡＰ蛋白質レベルの決定により評価したものを示す図であり、Ｄ）ＩＧＦ−Ｉ微小球で処置した老齢ラットであり、動物の正常な老化中の神経変性に関連するアミロイドーシスを脳（皮質）および脳脊髄液（ＣＳＦ）中のβ−アミロイドレベルを決定することにより評価したものを示す図である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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