(57)【要約】      （修正有）【課題】オリゴヌクレオチドを用いた治療によって影響を受け得る医薬の副作用を軽減する医薬製剤の提供。【解決手段】ウイルス感染、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、アルツハイマー病、プリオン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ等を治療するための、オリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。該オリゴヌクレオチドキレート錯体は、二価の金属カチオン、特にカルシウム、マグネシウム、鉄（２＋）、マンガン、銅、亜鉛を用いて調製されるものであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染を治療するための、抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
【請求項２】
高コレステロール血症を治療するための、抗コレステロールオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
【請求項３】
高トリグリセリド血症を治療するための、抗トリグリセリドオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
【請求項４】
アルツハイマー病を治療するための、抗アルツハイマーオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
【請求項５】
プリオン病を治療するための、抗プリオンオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、二価の金属カチオンを用いて調製される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、カルシウムを用いて調製される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、マグネシウムを用いて調製される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、鉄（２＋）、マンガン、銅または亜鉛を用いて調製される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、２種類以上の異なる二価の金属カチオンを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、カルシウムおよびマグネシウムを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、１つの２’位が修飾されたリボースを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、それぞれのリボースの２’位がＯ−メチル化されている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの５’メチルシトシンを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、各シトシンが５’メチルシトシンである少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、完全にホスホロチオエート化され、すべてのリボースが２’位でＯメチル修飾され、すべてのシトシンが５’メチルシトシンとして存在する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１〜６または１０〜１８から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
高コレステロール血症を治療するための、配列番号２０を含むキレート錯体を含む医薬製剤。
【請求項２２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための、配列番号１９を含むキレート錯体を含む医薬製剤。
【請求項２３】
Ｃ型肝炎感染を治療するための、配列番号７を含むキレート錯体を含む医薬製剤。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、皮下投与のために製剤化される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、静脈点滴のために製剤化される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、眼内、経口摂取、腸内、吸入、筋肉注射、腹腔内注射、髄腔内注射、髄腔内注入、気管内、静脈注射および局所投与からなる群から選択される投与のために製剤化される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、エアロゾルによって投与するために製剤化される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
感染を引き起こすウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項２９】
感染を引き起こすウイルスが、ヘパドナウイルスである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３０】
感染を引き起こすウイルスが、デルタ型肝炎ウイルスである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３１】
感染を引き起こすウイルスが、インフルエンザである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３２】
感染を引き起こすウイルスが、レトロウイルス科のメンバー、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヘルペスウイルス科のメンバー、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、ポックスウイルス科のメンバー、パラミクソウイルス科のメンバー、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ブニヤウイルス科のメンバー、ハンタウイルス、フィロウイルス科のメンバー、エボラウイルス、マールブルグウイルス、フラビウイルス科のメンバー、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、オルトミクソウイルス科のメンバー、トガウイルス科のメンバー、コロナウイルス科のメンバー、ラブドウイルス科のメンバーおよびアレナウイルス科のメンバーからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号２を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号１８を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号１１を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３６】
ウイルス感染を治療するための、抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
【請求項３７】
高コレステロール血症を治療するための、抗コレステロールオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
【請求項３８】
高トリグリセリド血症を治療するための、抗トリグリセリドオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
【請求項３９】
アルツハイマーを治療するための、抗アルツハイマーオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
【請求項４０】
プリオン病を治療するための、抗プリオンオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、二価の金属カチオンを用いて調製される、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、カルシウムを用いて調製される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、マグネシウムを用いて調製される、請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４４】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、鉄（２＋）、マンガン、銅または亜鉛を用いて調製される、請求項３６〜４３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４５】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、２種類以上の異なる二価の金属カチオンを含む、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４６】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、カルシウムおよびマグネシウムを含む、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４７】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項３６〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６〜４７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、１つの２’位が修飾されたリボースを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６〜４９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、それぞれのリボースの２’位がＯ−メチル化されている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６〜５０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５２】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの５’メチルシトシンを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６〜５１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５３】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、すべてのシトシンが５’メチルシトシンである少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５４】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、完全にホスホロチオエート化され、すべてのリボースが２’位でＯメチル修飾され、すべてのシトシンが５’メチルシトシンとして存在する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６〜５３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１〜６または１０〜１８から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５６】
高コレステロール血症を治療するための、配列番号２０を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
【請求項５７】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための、配列番号１９を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
【請求項５８】
Ｃ型肝炎感染を治療するための、配列番号７を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
【請求項５９】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、皮下投与のために製剤化される、請求項３６〜５８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６０】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、静脈点滴のために製剤化される、請求項３６〜５８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６１】
前記ＯＮキレート錯体が、眼内、経口摂取、腸内、吸入、筋肉注射、腹腔内注射、髄腔内注射、髄腔内注入、気管内、静脈注射および局所投与からなる群から選択される投与のために製剤化される、請求項３６〜５８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６２】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、エアロゾルによって投与するために製剤化される、請求項３６〜５８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６３】
感染を引き起こすウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスである、請求項３６に記載の使用。
【請求項６４】
感染を引き起こすウイルスが、ヘパドナウイルスである、請求項３６に記載の使用。
【請求項６５】
感染を引き起こすウイルスが、デルタ型肝炎ウイルスである、請求項３６に記載の使用。
【請求項６６】
感染を引き起こすウイルスが、インフルエンザである、請求項３６に記載の使用。
【請求項６７】
感染を引き起こすウイルスが、レトロウイルス科のメンバー、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヘルペスウイルス科のメンバー、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、ポックスウイルス科のメンバー、パラミクソウイルス科のメンバー、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ブニヤウイルス科のメンバー、ハンタウイルス、フィロウイルス科のメンバー、エボラウイルス、マールブルグウイルス、フラビウイルス科のメンバー、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、オルトミクソウイルス科のメンバー、トガウイルス科のメンバー、コロナウイルス科のメンバー、ラブドウイルス科のメンバーおよびアレナウイルス科のメンバーからなる群から選択される、請求項３６に記載の使用。
【請求項６８】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号２からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項６９】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項７０】
前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年５月１８日に出願された米国仮出願番号第６１／６４８，６９４号からの優先権を主張し、その内容全体が、本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）キレート錯体の投与または使用を含む、疾患を治療する方法に関する。これらの疾患としては、ウイルス感染、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、アルツハイマー病、プリオン病またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーを挙げることができる。
【背景技術】
【０００３】
ＯＮキレート錯体は、二価または多価の金属カチオンによって分子間で接続した２つ以上のＯＮである。ＯＮキレート錯体は、これらの化合物の投与に関連する副作用の原因となり得るＯＮ固有のキレート化特性を無効化する。ＯＮキレート錯体の投与は、キレート化されていないＯＮ（当該技術分野で一般的に使用されるようなナトリウム塩として投与されるＯＮ）の投与に関連する副作用を軽減する、ＯＮを被検体に投与する新しい方法である。これらの副作用としては、静脈点滴に伴う振戦、発熱および悪寒、または皮下投与の注射部位での硬結、炎症および疼痛が挙げられる。さらに、ＯＮをキレート化した錯体として調製することによって、その薬物動態挙動が向上することがあり、その全体が本明細書に本明細書に参照により組み込まれる国際出願公開第ＷＯ  ２０１２／０２１９８５号および米国特許出願公開第２０１２／００４６３４８号に記載されるように、キレート化されていないＯＮと比較して、同様の投薬量で向上した治療性能を与える。
【０００４】
従って、ウイルス感染、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、アルツハイマー病またはプリオン病を含む多くの疾患状態に対し、治療効果を与え、ＯＮで一般的な投与に関連する副作用を低減するか、または減らす、配列依存性の機構または配列非依存性機構によって作用するＯＮキレート錯体を提供することが望ましい。
【０００５】
従って、当該技術分野において、ＯＮキレート錯体を含む医薬組成物を、治療を必要とする被検体に投与することを含む、上述の疾患状態を治療する方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本記載によれば、オリゴヌクレオチドをキレート錯体として投与することによって、オリゴヌクレオチドを用いた治療によって影響を受け得る任意の疾患状態を治療する方法が提供される。
【０００７】
本記載によれば、オリゴヌクレオチドを用いた治療によって影響を受け得る任意の疾患状態を治療するための、キレート錯体として製剤化されるオリゴヌクレオチドの使用が提供される。
【０００８】
本記載によれば、オリゴヌクレオチドを用いた治療によって影響を受け得る任意の疾患状態を治療するための医薬の製造における、キレート錯体として製剤化されるオリゴヌクレオチドの使用が提供される。
【０００９】
治療が必要な被検体に抗ウイルスＯＮキレート錯体を投与する工程を含む、ウイルス感染を治療する方法が提供される。
【００１０】
ウイルス感染を治療するための抗ウイルスＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００１１】
ウイルス感染を治療するための医薬の製造における抗ウイルスＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００１２】
一実施形態では、抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１〜６または１０〜１８から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００１３】
治療が必要な被検体に、抗コレステロールＯＮキレート錯体を投与する工程を含む、高コレステロール血症を治療する方法が提供される。
【００１４】
一実施形態では、抗コレステロールオリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１、２、３、５、６、１０、１１、１２、１５、１６または１７から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００１５】
治療が必要な被検体に、抗高トリグリセリドＯＮキレート錯体を投与する工程を含む、高トリグリセリド血症を治療する方法が提供される。
【００１６】
一実施形態では、抗コレステロールオリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１、２、３、５、６、１０、１１、１２、１５、１６または１７から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００１７】
治療が必要な被検体に、抗アルツハイマーＯＮキレート錯体を投与する工程を含む、アルツハイマー病を治療する方法が提供される。
【００１８】
治療が必要な被検体に、抗プリオンＯＮキレート錯体を投与する工程を含む、プリオン病を治療する方法が提供される。
【００１９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の正しくないスプライシングを正しくするように設計されたＯＮキレート錯体を投与する工程を含む、ＤＭＤを含め、ｍＲＮＡ成熟中の正しくないスプライシングから生じる疾患を治療する方法が提供される。
【００２０】
ウイルス感染を治療するための抗ウイルスＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００２１】
ウイルスを治療するための医薬の製造における抗ウイルスＯＮキレート錯体の使用が提供される。一実施形態では、抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１〜６または１０〜１８から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００２２】
高コレステロール血症を治療するための抗コレステロールＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００２３】
高コレステロール血症を治療するための医薬の製造における抗コレステロールＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００２４】
一実施形態では、抗コレステロールオリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１、２、３、５、６、１０、１１、１２、１５、１６または１７から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００２５】
高トリグリセリド血症を治療するための抗トリグリセリドＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００２６】
高トリグリセリド血症を治療するための医薬の製造における抗トリグリセリドＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００２７】
一実施形態では、抗トリグリセリドオリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１、２、３、５、６、１０、１１、１２、１５、１６または１７から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００２８】
アルツハイマー病を治療するための抗アルツハイマーＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００２９】
アルツハイマー病を治療するための医薬の製造における抗アルツハイマーＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００３０】
プリオン病を治療するための抗プリオンＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００３１】
プリオン病を治療するための医薬の製造における抗プリオンＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００３２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を含む、ｍＲＮＡ成熟中の正しくないスプライシングから生じる疾患を治療するために、ＤＭＤにおいて正しくないスプライシングを正しくするように設計されたＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００３３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を含む、ｍＲＮＡ成熟中の正しくないスプライシングから生じる疾患を治療するための医薬の製造における、ＤＭＤにおいて正しくないスプライシングを正しくするように設計されたＯＮキレート錯体の使用が提供される。
【００３４】
配列番号２０を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の投与を含む、高コレステロール血症を治療するための方法が提供される。
【００３５】
高コレステロール血症を治療するための配列番号２０を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用が提供される。
【００３６】
高コレステロール血症を治療するための医薬の製造における配列番号２０を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用が提供される。
【００３７】
配列番号１９を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の投与を含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための方法が提供される。
【００３８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための配列番号１９を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用が提供される。
【００３９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬の製造における配列番号１９を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用が提供される。
【００４０】
配列番号７を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の投与を含む、Ｃ型肝炎感染を治療するための方法を提供する。
【００４１】
Ｃ型肝炎感染を治療するための配列番号７を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用が提供される。
【００４２】
Ｃ型肝炎感染を治療するための医薬の製造における配列番号７を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用が提供される。
【００４３】
ウイルス感染を治療するための抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤が提供される。
【００４４】
高コレステロール血症を治療するための抗コレステロールオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤が提供される。
【００４５】
高トリグリセリド血症を治療するための抗トリグリセリドオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤が提供される。
【００４６】
アルツハイマー病を治療するための抗アルツハイマーオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤が提供される。
【００４７】
プリオン病を治療するための抗プリオンオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤が提供される。
【００４８】
高コレステロール血症を治療するための配列番号２０を含むキレート錯体を含む医薬製剤が提供される。
【００４９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための配列番号１９を含むキレート錯体を含む医薬製剤が提供される。
【００５０】
Ｃ型肝炎感染を治療するための配列番号７を含むキレート錯体を含む医薬製剤が提供される。
【００５１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、二価の金属カチオンを用いて調製される。
【００５２】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、カルシウムを用いて調製される。
【００５３】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、マグネシウムを用いて調製される。
【００５４】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、鉄（２＋）、マンガン、銅および／または亜鉛を用いて調製される。
【００５５】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、２種類以上の異なる二価の金属カチオンを含む。
【００５６】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、カルシウムおよびマグネシウムを含む。
【００５７】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチドを含む。
【００５８】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００５９】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００６０】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、１つの２’位が修飾されたリボースを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００６１】
別のさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、それぞれのリボースの２’位がＯ−メチル化されている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００６２】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの５’メチルシトシンを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００６３】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、各シトシンが５’メチルシトシンである少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００６４】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、完全にホスホロチオエート化され、すべてのリボースが２’位でＯメチル修飾され、すべてのシトシンが５’メチルシトシンとして存在する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００６５】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１〜６または１０〜１８から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００６６】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、皮下投与のために製剤化される。
【００６７】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、静脈点滴のために製剤化される。
【００６８】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、眼内、経口摂取、腸内、吸入、筋肉注射、腹腔内注射、髄腔内注射、髄腔内注入、気管内、静脈注射および局所投与からなる群から選択される投与のために製剤化される。
【００６９】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、エアロゾルによって投与するために製剤化される。
【００７０】
別の実施形態では、感染を引き起こすウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスである。
【００７１】
別の実施形態では、感染を引き起こすウイルスは、ヘパドナウイルスである。
【００７２】
さらなる実施形態では、感染を引き起こすウイルスは、デルタ型肝炎ウイルスである。
【００７３】
別の実施形態では、感染を引き起こすウイルスは、インフルエンザである。
【００７４】
別の実施形態では、感染を引き起こすウイルスは、レトロウイルス科のメンバー、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヘルペスウイルス科のメンバー、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、ポックスウイルス科のメンバー、パラミクソウイルス科のメンバー、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ブニヤウイルス科のメンバー、ハンタウイルス、フィロウイルス科のメンバー、エボラウイルス、マールブルグウイルス、フラビウイルス科のメンバー、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、オルトミクソウイルス科のメンバー、トガウイルス科のメンバー、コロナウイルス科のメンバー、ラブドウイルス科のメンバーおよびアレナウイルス科のメンバーからなる群から選択される。
【００７５】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号２（ＲＥＰ  ２０５５）を含む。
【００７６】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１８（ＲＥＰ  ２１３９）を含む。
【００７７】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１１（ＲＥＰ  ２１４８）を含む。
【００７８】
ここで、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】図１は、ＯＮの一般的な物理化学的特徴を示す。（Ａ）高速液体クロマトグラフィーによる、ＲＥＰ  ２００６および確定した配列を有する２１マーのホスホロチオエートＯＮの同時分離。
【図１Ｂ】（Ｂ）質量分析計による２１マーＯＮ中の種類の特定。
【図１Ｃ】（Ｃ）質量分析計によるＲＥＰ  ２００６のＯＮ中の種類の特定。
【図２Ａ】図２Ａは、ＯＮ配列に依存しないＯＮの一般的な化学的特徴を示す。その配列にかかわらず、任意のＯＮは、疎水性および親水性の活性を両方とも有するポリマーとして存在する。ホスホロチオエート化（この図の化学構造で示される）は、ＯＮポリマーの疎水性を高めるのに役立つが親水性には影響を与えない。
【図２Ｂ】図２Ｂは、二価金属カチオンおよび三価金属カチオンのＯＮキレート化の性質を概念化したものである。金属カチオン（黒丸であらわされる）は、ホスホジエステル結合中の２個または３個の架橋していない酸素原子または硫黄原子の間の金属イオン架橋（楕円であらわされる）を介し、ＯＮポリマーの親水性表面を分子間で接続する。
【図３】図３は、さまざまなＯＮ濃度および二価金属カチオン濃度で、二価金属カチオンまたは多価金属カチオンが存在する状態でＯＮの溶液挙動のモデルを示す。（Ａ）低濃度の二価／三価の金属カチオン、低濃度のＯＮでは、ダイマーが得られるか、または結合部位が少ないＯＮキレート錯体が得られる。（Ｂ）二価／三価の金属カチオン濃度を高めると、溶液中にもっと多くの完全なＯＮキレート錯体が得られる。（Ｃ）二価または三価の金属が存在する状態で、ＯＮ濃度をさらに上げると、金属濃度を上げていくにつれて、もっと結合部位が多いＯＮキレート錯体を得ることができる。（Ａ）〜（Ｃ）のすべてのキレート錯体は、親水性表面が水性環境に露出していることによって、水溶液に可溶性であり、そのため、溶解度が維持される。（Ｄ）十分なＯＮ濃度および金属濃度では、すべての親水性表面がＯＮキレート錯体内に封じ込められ、水性環境に疎水性表面のみが露出している。これにより、ＯＮキレート錯体が沈殿する。
【図４】図４は、蛍光性ＯＮキレート錯体の溶液挙動が蛍光偏光に及ぼす影響を示す。金属濃度を上げていくと、ＯＮキレート錯体形成の大きさ（および質量）も大きくなり（図３を参照）、従って、溶液中でさらにゆっくりと回転する。溶液中で錯体がこのようにゆっくりと回転すると、蛍光偏光が大きくなり、ｍＰ値が大きくなる。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
その内容が全体的に本明細書に参照により組み込まれる国際出願公開第ＷＯ  ２０１２／０２１９８５号および米国特許出願公開第２０１２／００４６３４８号に記載されるように、二価の任意の単純な金属カチオン（例えば、限定されないが、Ｃａ2+、Ｍｇ2+およびＦｅ2+）を含む水溶液中のＯＮは、塩として存在せず、ＯＮのキレート化した錯体として存在する。これらの錯体は、ＯＮダイマー、またはＯＮが二価金属イオン架橋を介し、そのホスホジエステル骨格で結合したもっと結合部位が多い分子組織で構成される（図２Ｂを参照）。特定のＯＮ濃度および金属カチオン濃度では、これらのキレート化された錯体は、水溶液中で安定であり、可溶性であり、ＯＮキレート錯体中の任意の二価カチオンが溶液と相互作用するのを効果的に抑える。このキレート錯体の形成は、３＋以上の電荷を有する単純な金属カチオンとの間でも起こりそうである（図２Ｂに示されるように）。従って、ＯＮは、多価金属カチオンキレート化剤として機能し、多価金属カチオンと塩を形成しない。
【００８１】
ＯＮキレート錯体は、カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄、マンガン、バリウム、ニッケル、銅、亜鉛、カドミウム、水銀および鉛を含む多様な多価金属カチオンを含んでいてもよい。さらに、これらの多価金属カチオンのキレート化によって、金属カチオンを介して接続する２つ以上のＯＮで構成されるＯＮキレート錯体が生成し、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のいずれかを有するＯＮ存在下、６ヌクレオチド長より長いヌクレオチドのＯＮが生じることが示される。ＯＮは、場合により、それぞれホスホロチオエート酸による結合を有していてもよい。キレート化によって、リボースの２’位に修飾（例えば、２’位のＯメチル）を含み、修飾された塩基（例えば、５’メチルシトシンまたは４−チオウラシル）を含むＯＮも生じる。これらの２’位での修飾は、１つ以上またはすべてのリボースに存在していてもよく、修飾された塩基は、１つ以上の塩基に存在していてもよく、またはそれぞれの塩基に広く存在していてもよい（すなわち、すべてのシトシンが５’メチルシトシンとして存在する）。さらに、ＯＮキレート錯体は、複数の修飾を含むＯＮを含んでいてもよく、例えば、それぞれの結合がホスホロチオエート化されており、それぞれのリボースが２’位で修飾されており、それぞれの塩基が修飾されている。ＯＮキレート錯体の作成と適合するＯＮの修飾を、以下にさらに定義する。さらに、金属カチオンのキレート化は、存在するヌクレオチドの配列に依存しないが、その代わりに、すべてのＯＮに共通する物理化学的特徴に依存する（図２Ａを参照）。
【００８２】
ＯＮキレート錯体の作成は、任意の二価の金属カチオンを用いて達成することができるが、医薬として使用することを意図したＯＮキレート錯体は、好ましくは、カルシウムおよび／またはマグネシウムのみを含むべきであり、鉄、マンガン、銅または亜鉛も痕跡量含んでいてもよいが、コバルト、バリウム、ニッケル、カドミウム、水銀、鉛またはここに列挙しない任意の他の二価の金属は含むべきではない。
【００８３】
重要なことに、ＯＮキレート錯体の作成は、一価カチオン、例えば、Ｎａ+、Ｋ+またはＮＨ4+を用いて行われず、従って、任意の一価カチオンを用いては行われないであろう。従って、「ＯＮ塩」という用語は、もっと正確には、一価カチオンとのＯＮ塩、またはＯＮとキレート錯体を形成しないカチオンとのＯＮ塩にのみ限定される。
【００８４】
血液中のタンパク質成分とＯＮの既知の一時的な相互作用の少なくとも一部は、ＯＮと、金属に結合するタンパク質、例えば、アルブミンおよびカルシウム依存性凝固カスケードのタンパク質との相互作用によって媒介されるであろう。従って、キレート化された錯体としてのＯＮの投与（二価の金属に結合したタンパク質と相互作用する傾向を顕著に減らすか、またはなくす）は、血液中のこれらのタンパク質の相互作用を軽減し、ＯＮ投与の副作用を少なくすることができ（例えば、一時的な抗凝固）、キレート化されていないＯＮと比較して、ＯＮ投薬量のうち、標的臓器（例えば、肝臓、肺または膵臓）に到達する部分を増やすこともできる。本開示以前には、このようなタンパク質相互作用の軽減が治療活性に及ぼす影響は知られておらず、記載されたこともなかった。
【００８５】
蛍光偏光は、分子間相互作用を調べるために一般的に用いられる方法である。この技術では、ベイト（すなわち、任意のＯＮ）を蛍光タグ（例えば、ＦＩＴＣ）で標識する。溶液中、ベイト分子は、ブラウン運動に起因して溶液中で自由に回転し、ベイトを正しい波長の光で励起させたとき、不十分な偏光した蛍光発光が生じる。十分な分子量（少なくともベイトと同じ大きさ）のリガンドを用いると、ベイトとリガンドとの相互作用によって、溶液中でのこの錯体の回転が実質的に阻害される。このように溶液中で回転が阻害された結果、励起したときの蛍光発光は顕著に偏光するようになる。従って、この技術を用い、結合相手に対する物理的な制約条件なく、溶液中の相互作用を測定することができる。蛍光偏光は、無次元のｍＰとして報告され、反応中で結合したベイト分子の割合に正比例する。例えば、非常に少量のベイト分子が特定のリガンドに結合している場合、蛍光偏光は非常にわずかであると思われ、その結果、ｍＰ値が小さい。そのスペクトルの他端で、多くの割合のベイト分子が特定のリガンドに結合している（または高濃度のリガンドを用いる）場合、かなりの蛍光偏光が存在すると思われ、その結果、ｍＰ値が大きい。この様式で、固定した量の蛍光タグ化ベイト存在下、リガンドの濃度を変えることによって、特定のベイト−リガンド相互作用の結合等温線を作成することができる。
【００８６】
ここで、多様な蛍光標識したＯＮを使用し、多価金属カチオン存在下、これらの錯体生成を調べる。蛍光偏光による錯体生成の監視は、これらのＯＮを蛍光標識する必要があるが、この標識は、当該ＯＮの窒素系塩基またはホスホジエステル骨格のいずれかと干渉しないように、３’末端でＯＮに接続する。さらに、蛍光タグは、硬い３炭素リンカーによってＯＮから離れた状態で保持され、さらに、溶液中の通常のＯＮの挙動の撹乱を排除する。従って、蛍光標識されたＯＮを用いた蛍光偏光を用いる本明細書で観察される任意のＯＮ錯体生成は、標識されていないＯＮ（錯体化しているか、していないかによらない）の溶液挙動の正確な代表例である。
【００８７】
当該技術分野の技術水準は、ＯＮナトリウム塩を用いた治療が必要な被検体にＯＮを投与する実務を明確に教示する。この教示は、ホミビルセン（ＩＳＩＳ  ２９２２）、ミポメルセン（ＩＳＩＳ  ３０１０１２）、トレコビルセン（Ｔｒｅｃｏｖｉｒｓｅｎ）（ＧＥＭ  ９１）、クスチルセン（ＯＧＸ−０１１／ＩＳＩＳ  １１２９８９）、ゲナセンス（Ｇ３１３９）、アプリノカルセム（Ａｐｒｉｎｏｃａｒｓｅｍ）（ＩＳＩＳ  ３５３１／ＬＹ  ９００００３）、ＰＲＯ−５１（ＧＳＫ  ２４０２９６８）およびＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む、ナトリウム塩として臨床試験で多くのＯＮを投与することによって例示される（Ｇｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、４１：２５５−２６０；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、４８：３９−５０；Ｓｅｒｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３９：４７−５４；Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．、９７：１２８７−１２９６；Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１５：１２７４−１２８３；Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ、６：３２−４０；Ｇｏｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  ＮＥＪＭ  ３６４：１５１３−１５２２）。カルシウムまたはマグネシウムまたは任意の他の二価の金属の使用を伴う親化合物の任意の投与経路についてのオリゴヌクレオチド製剤を教示する現時点で公開されたデータは存在しない。
【００８８】
ＯＮナトリウム塩の投与に関連する副作用の多くは、そのキレート化効果に起因するものであろう。ＯＮによる血液の抗凝固性は、少なくとも部分的には、ＯＮによる血清カルシウムのキレート化によって生じ、これにより、カルシウム依存性の凝固カスケードが損なわれる。血清カルシウムのキレート化およびこのキレート化が起こり得る背後にある血清低カルシウム血症は、ＩＶ投与によるＯＮ投与で観察される副作用とも一致しており、発熱、振戦、衰弱および動脈血圧の低下（後者は、迅速なＩＶ点滴または注射に伴う）が挙げられる。ＯＮの皮下注射で観察される注射部位での反応（硬結、炎症、圧痛および疼痛）は、少なくとも一部には、注射部位でのカルシウムおよび可能な他の二価のカチオン、例えば、マグネシウムまたは多価カチオンのＯＮによる局所的なキレート化に起因する。キレート化した錯体としてのＯＮの投与は、これらの副作用の多くを軽減することが示されている（ＷＯ  ２０１２／０２１９８５号を参照）。
【００８９】
オリゴヌクレオチド（ＯＮ）という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、修飾されたヌクレオ塩基（５’メチルシトシンおよび４’チオウラシルを含む）、糖類およびヌクレオチド間の共有（骨格）結合で構成されるＯＮ、および同様の機能を有する天然には存在しない部分を含むＯＮを含む。このような修飾または置換されたＯＮは、例えば、免疫反応性の低下、細胞取り込みの向上、核酸標的に対する親和性の向上、ヌクレアーゼ存在下での安定性の上昇といった望ましい特性のため、天然形態よりも好ましい場合がある。ＯＮは、二本鎖であってもよい。
【００９０】
ＯＮは、種々の修飾、例えば、安定化する修飾を含んでいてもよく、従って、ホスホジエステル結合および／または糖および／または塩基に少なくとも１つの修飾を含んでいてもよい。例えば、ＯＮは、限定されないが、１つ以上の修飾を含んでいてもよく、または示した修飾を有するすべての結合または糖類または塩基を含むように完全に修飾されていてもよい。修飾された結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、および／またはメチルホスホネート結合を挙げることができる。修飾された結合は有用であるが、ＯＮは、ホスホジエステル結合を含んでいてもよい。さらなる有用な修飾としては、限定されないが、２’−Ｏ−アルキル修飾を含め、糖の２’位での修飾、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾、２’Ｏ−メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’−アミノ修飾、２’−ハロ修飾、例えば、２’−フルオロ；および／または非環状ヌクレオチド類似体が挙げられる。他の２’位での修飾も当該技術分野で知られており、例えば、ロックド核酸を使用することができる。特に、ＯＮは、全体的に修飾された結合を有するか、またはそれぞれの結合が修飾されており、例えば、ホスホロチオエートを含み；３’−および／または５’−キャップを含み；末端３’−５’結合を含み；ＯＮは、リンカーによって接続した２つ以上のＯＮ配列からなるコンカテマーであるか、またはこれを含む。塩基修飾は、シトシン塩基の５’メチル化（５’メチルシトシンまたはヌクレオチドの観点で、５’メチルシチジン）および／またはウラシル塩基の４’チオ化（４’チオウラシルまたはヌクレオチドの観点で、４’チオウリジン）を含んでいてもよい。ホスホロチオエート結合、２’リボース修飾（例えば、２’Ｏ−メチル化）および修飾された塩基（例えば、５’メチルシトシン）を含むオリゴヌクレオチドのように、合成条件が化学的に適合性であるような異なる化学的に適合性の修飾された結合を組み合わせてもよい。ＯＮは、さらに、これらの異なるすべての修飾で完全に修飾されていてもよい（例えば、それぞれの結合がホスホロチオエート化され、それぞれのリボースが２’位で修飾されており、それぞれの塩基が修飾されている）。
【００９１】
本開示では、「抗ウイルスＯＮ」という用語は、その特定の生化学的活性（配列依存性または配列非依存性）によって、任意のＯＮが、ある態様のウイルス複製を直接的または間接的に阻害する能力、または免疫学的機構または他の機構による感染を排除する宿主の能力を直接的または間接的に高める能力を有することを指す。
【００９２】
本開示では、「抗ウイルスＯＮキレート錯体」という用語は、多価金属カチオンによって分子間で接続した、溶液中の２つ以上の抗ウイルスＯＮの錯体を指す。抗ウイルスＯＮキレート錯体は、異なる配列を有する２つ以上のＯＮを含んでいてもよい。
【００９３】
本開示では、「抗コレステロールＯＮ」という用語は、その特定の生化学的活性（配列依存性または配列非依存性）によって、任意のＯＮが、被検体における異常に高まった血清総コレステロールまたは低い／非常に低い密度のリポタンパク質血清レベルを直接的または間接的に下げる能力を有することを指す。
【００９４】
本開示では、「抗コレステロールＯＮキレート錯体」という用語は、多価金属カチオンによって分子間で接続した、２つ以上の抗コレステロールＯＮの錯体を指す。抗コレステロールＯＮキレート錯体は、異なる配列を有する２つ以上のＯＮを含んでいてもよい。
【００９５】
本開示では、「抗トリグリセリドＯＮ」という用語は、その特定の生化学的活性（配列依存性または配列非依存性）によって、任意のＯＮが、被検体の異常に高まった血清トリグリセリドレベルを直接的または間接的に下げる能力を有することを指す。
【００９６】
本開示では、「抗トリグリセリドＯＮキレート錯体」という用語は、多価金属カチオンによって分子間で接続した２つ以上の抗トリグリセリドＯＮの錯体を指す。抗トリグリセリドＯＮキレート錯体は、異なる配列を有する２つ以上のＯＮを含んでいてもよい。
【００９７】
本開示では、「抗アルツハイマーＯＮ」という用語は、その特定の生化学的活性（配列依存性または配列非依存性）によって、任意のＯＮが、
Ａ．脳でのアミロイド−βの蓄積または発現を直接的または間接的に止め、遅らせ、または逆行させる能力；
Ｂ．脳でのアルツハイマープラーク生成を直接的または間接的に止め、遅らせ、または逆行させる能力；および／または
Ｃ．アルツハイマー病の進行に関連する神経障害を直接的または間接的に止め、遅らせ、または逆行させる能力を有することを指す。
【００９８】
本記載では、「抗アルツハイマーＯＮキレート錯体」という用語は、多価金属カチオンによって分子間で接続した、溶液中の２つ以上の抗アルツハイマーＯＮの錯体を指す。
【００９９】
本記載では、「抗プリオンＯＮ」という用語は、その特定の生化学的活性（配列依存性または配列非依存性）によって、任意のＯＮが、
Ａ．脳の周囲または脳内のプリオンタンパク質生成を直接的または間接的に止め、遅らせ、または逆行させる能力；および／または
Ｂ．プリオン病に関連する神経障害を直接的または間接的に止め、遅らせ、または逆行させる能力を有することを指す。
【０１００】
本記載では、「抗プリオンＯＮキレート錯体」という用語は、多価金属カチオンによって分子間で接続した２つ以上の抗プリオンＯＮの錯体を指す。抗プリオンＯＮキレート錯体は、異なる配列を有する２つ以上のＯＮを含んでいてもよい。
【０１０１】
本出願では、「縮重ＯＮ」という用語は、すべての位置にゆらぎ（Ｎ）を有する一本鎖ＯＮ、例えば、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを意味することを意図している。それぞれの塩基は、このＯＮが、実際に、同じ長さおよび物理化学的特性を有する異なるランダムに生成した配列の集合として存在するとき、ゆらぎとして合成される。例えば、４０塩基長の縮重ＯＮについて、この集合の任意の特定の配列は、理論的には、フラクション全体の１／４40または８．３×１０-25のみにあらわれるだろう。１モル＝６．０２２×１０23分子であり、１モルの４０マーＯＮは、質量が約１２〜１４ｋｇ（存在する配列および修飾に依存する）であるという事実から、特定の配列が効果的に存在する任意のＯＮは、任意の調製において、１個より多く存在しない。従って、このような調製で観察される任意のキレート生成または生物学的活性は、その調製に固有である確定した配列を有する任意の特定のＯＮが、特定のヌクレオチド配列から誘導される任意の意味ある活性の原因となるとは予測することができないため、配列に依存しない（または配列とは独立した）ＯＮの物理化学特性に起因しなければならない。
【０１０２】
この概念をさらに説明すると、実施例Ｉは、高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析計によって、ＲＥＰ  ２００６（縮重し、完全にホスホロチオエート化された配列を有する４０マーＯＮ）の特徴を、確定した配列を有する２１マーＯＮ（これも完全にホスホロチオエート化されている）と比較し、同様の大きさおよび化学修飾（すなわち、ホスホロチオエート化）を有する任意のＯＮは、存在するヌクレオチド配列によって影響を受けない非常によく似た（同一ではないにしても）物理化学特徴を有することを明確に示す（図１Ａ〜Ｃを参照）。
【０１０３】
本出願では、「核酸ポリマー」またはＮＡＰという用語は、配列特異的な機能を含まない任意の一本鎖ＯＮを特定することを意図している。ＮＡＰの生化学的活性は、ＯＮのＴｏｌｌ様受容体認識、標的核酸のハイブリダイゼーション、または存在する特定の順序のヌクレオチドから誘導される特定の二次元三次元のＯＮ構造を必要とするアプタマー相互作用に依存しない。ＮＡＰは、上述のような塩基および／または結合および／または糖修飾を含んでいてもよい。
【０１０４】
ＯＮは、配列依存性または配列に依存しない多くの機構によって、その効果を発揮することができる。配列依存性の機構は、その活性に特定の核酸配列を必要とし、その活性が、存在するヌクレオチド配列の１つ以上の改変によって低下する機構である。この特定の配列は、ＯＮの全長またはその一部分（配列モチーフ）のみを包含していてもよい。配列依存性のＯＮの例としては、以下のものが挙げられる。
１．アンチセンスＯＮ（一本鎖または二本鎖（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））が、ある疾患状態（すなわち、ウイルス感染またはコレステロールの制御）に関与するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定の部分（すなわち、ウイルスｍＲＮＡまたはホストｍＲＮＡ）と相補性であり、細胞に導入されたとき、ＲＮＡｓｅ  ＨまたはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって、これらの標的ｍＲＮＡの分解を行わせる。
２．立体障壁のあるＯＮは、ｍＲＮＡの特定の部分に相補性であるが、ＲＮＡｓｅ  Ｈを活性化しないように設計された一本鎖アンチセンスＯＮである。標的ｍＲＮＡに対するこれらのＯＮのハイブリダイゼーションによって、ｍＲＮＡに対して通常は作用するタンパク質に対し立体的な障壁を与える二本鎖構造が得られる。このようなＯＮを使用し、特定のｍＲＮＡの翻訳をブロックするか、または特定のｍＲＮＡの後翻訳スプライシングおよび成熟を妨害することができる。このようなＯＮを、ＯＮに存在する全体またはそれぞれのリボースの２’位でのリボース修飾（例えば、２’位でのＯメチル化）によって（これらのＯＮの作用機序に不可欠ではないため）、ＲＮＡｓｅ  Ｈの活性化をブロックするように操作してもよい。
３．アプタマーは、特定のタンパク質（すなわち、ウイルスタンパク質または宿主タンパク質）との相互作用を可能にする特定の三次元構造に合うように変えられ、ホストＤＮＡまたはＲＮＡと簡単には相互作用しないＯＮである。アプタマーは、さらに、シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）を含んでいてもよく、ＯＮのヌクレアーゼ分解への抵抗性を与えるためにＬ−ヌクレオチドを使用する。
４．免疫刺激性ＯＮは、哺乳動物における免疫応答を刺激するために特定の６マー核酸モチーフ（ＸＸＣＧＸＸ）を利用する。最適モチーフは、種ごとにさまざまであるが、ＸＸＣＧＸＸモチーフに一致する特定の配列に厳格に依存する。
５．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ある疾患状態（すなわち、ウイルス複製またはコレステロールの制御）に関与する天然に存在するｍｉＲＮＡに結合し、その機能をブロックする。
【０１０５】
アンチセンスＯＮ、例えば、ウイルスｍＲＮＡの分解を触媒することによってウイルス活性を標的とするもの（例えば、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１；Ｚａｍｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１８３：５３１−５３８）またはＡｐｏＢ１００  ｍＲＮＡの分解を触媒することによってＬＤＬおよびＶＬＤＬの産生を標的とするもの（例えば、ミポメルセン［Ｋｙｎａｍｒｏ（商標）］；Ｒａａｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｌａｎｃｅｔ  ３７５：９９８−１００６）を種々の疾患状態に適用することができる。また、アンチセンスＯＮを使用し、異常なタンパク質を産生し得る遺伝子転写物のミススプライシングを正しくする、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーで発生するジストロフィン遺伝子転写物のミススプライシングを正しくすることもできる（例えば、ＰＲＯ−０５１、Ｇｏｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、ＮＥＪＭ  ３６４：１５１３−１５２２）。
【０１０６】
ＬＤＬおよびＶＬＤＬ産生の制御およびＣ型肝炎の発生の両方に関与する細胞内で天然に存在するｍｉＲ−１２２とハイブリダイズし、この分解を触媒することによって、ｍｉＲＮＡを種々の疾患状態に適用することができる（例えば、ミラビルセン：Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｒ  ２７  ２０１３  ＮＥＪＭ、印刷物に先駆けたｅｐｕｂ）。
【０１０７】
配列非依存性ＯＮについて、唯一報告されている例はホスホロチオエート化ＮＡＰであり、両親媒性ポリマーとしての物理化学特性によって、大きさ（長さ）に依存する様式で両親媒性タンパク質構造と選択的に相互作用する（例えば、米国特許第８，００８，２６９号を参照）。
【０１０８】
任意のＯＮは、生理学的観点でその生物学的効果をどのように発揮するかにかかわらず、オリゴヌクレオチドが血液循環中に入ると、二価のカチオンが介在する相互作用を生成すると予想され、血液循環は、遊離の二価カチオンまたは三価カチオンをいくらか含むが、血清二価金属の大部分は、タンパク質に結合している（例えば、カルシウム結合性タンパク質、例えば、アルブミン、トロンビンおよびフィブリノゲンに結合したカルシウム）。従って、顕著な量の二価金属が介在するオリゴ相互作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏ設定での別のオリゴヌクレオチド（キレート錯体中）の代わりにタンパク質との相互作用であると思われる。多くのＯＮは、その設計に従ってｉｎ  ｖｉｖｏで投与されるとき、（一本鎖アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして）予想可能な機能を有することが示されており、これらのカルシウムが介在するタンパク質相互作用は、ＯＮの忍容性の観点で影響を有するが（国際出願公開第ＷＯ２０１２／０２１９８５号および米国特許出願公開２０１２／００４６３４８号に記載されるように）、ＯＮの臓器での蓄積、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＯＮの細胞内輸送およびこれらのＯＮとその核酸標的との相互作用を妨害しないように可逆性であると思われる。これらの相互作用の可逆性は、これらの二価金属が介在するオリゴタンパク質の相互作用に依存すると合理的に予想することができた。オリゴヌクレオチドのキレート錯体の投与は、これらのタンパク質の相互作用を妨害すると思われ（米国特許出願公開第２０１２／００４６３４８号に記載されるように）、当業者は、ＯＮキレート錯体の投与が、ＯＮ、特に、腎臓、肝臓、肺、脾臓に蓄積することが知られており、ＯＮ−タンパク質相互作用に依存することが当該技術分野で受け入れられているホスホロチオエート化ＯＮ（ＰＳ−ＯＮ）の薬物動態の挙動（および臓器蓄積）を変えることが合理的に予測されるだろう。
【０１０９】
さらに、米国特許出願公開第２０１２／００４６３４８号に記載されるようなＯＮキレート錯体の調製は、任意のタンパク質非存在下、血液循環中に通常存在するよりも高い濃度の二価金属カチオン濃度が存在する状態で相互作用するＯＮを含み、米国特許出願公開第２０１２／００４６３４８号に記載されるように教示される当該技術分野から、これらのＯＮキレート錯体が、通常ならば血中のタンパク質と相互作用する能力を失っている（また、すべてのＯＮは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの最終的な運命にかかわらず、血液循環中で遷移しなければならない）ことが、合理的に予想されるであろう。従って、ＯＮキレート錯体の投与が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＯＮのキレート化挙動を防ぐか、または軽減し、そのため、オリゴのキレート効果から生じる副作用を軽減し、ＯＮキレート錯体製剤を調製するために用いられるＯＮ（ｅｘ  ｖｉｖｏおよび非生理学的環境で作られた）が、キレート錯体として投与されるとき、（ナトリウム塩として被検体に投与したときにＯＮの活性と比較して）その特定の臓器での蓄積と機能性を保持するということは、本出願の実施可能な開示の前には予想可能ではなく、または明らかではなかった。ＯＮキレート錯体がｉｎ  ｖｉｖｏで作成しなかった場合、解離することができない場合もあり、および／または細胞内輸送されるか、または正しいタンパク質および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの他の生化学的相互作用に合うように変えられ、その機能を発揮してもよい（例えば、相補性ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖に対するアニーリングまたはタンパク質中の両親媒性らせんとの相互作用、または特定のタンパク質との配列特異的なアプタマー相互作用の生成）。さらに、あらかじめ作成したＯＮキレート錯体の投与によって、単純なＯＮ塩として投与する場合の同じＯＮと比較して、宿主被検体内の必要な位置での蓄積を減らすことができた。従って、本開示の前には、任意の特定のＯＮキレート錯体が、生理化学的環境に入れるとき、または被検体に投与するとき、キレート化していないＯＮ塩前駆体の生化学的機能を保持することは明らかではなかった。
【０１１０】
さらに、キレート化特性および溶液中で二価金属とキレート錯体を生成する能力は、任意のＯＮに固有であり、キレート錯体として投与したとき、任意の特定のＯＮが生物学的活性の保持を示すことは、キレート錯体として投与したとき、その特定の作用態様または標的疾患にかかわらず、任意のＯＮの生物学的活性が保持されるという明らかな証拠を与え、教示を与える。
【０１１１】
いくつかの抗ウイルスＯＮに基づく薬物は、現時点では、ウイルス感染の治療のために開発途中であり、ＨＢＶの治療について、ＮＡＰ  ＲＥＰ  ９ＡＣ（ＲＥＰ  ２０５５または配列番号２、ＲＥＰ  ９ＡＣ’（ＲＥＰ  ２１３９または配列番号１８）およびＲＥＰ  ９ＡＣ−ｍ（ＲＥＰ  ２１４８または配列番号１１）、ＨＣＶの治療について、ミラビルセン、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の治療について、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１が挙げられる。これらのＯＮは、それぞれ、異なる作用機序を有し、核酸に基づくポリマーがＨＢＶウイルスの侵入をブロックし、さらに、ＨＢＶ表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）の血液中への放出を防ぎ（免疫機能を阻害するタンパク質）、ミラビルセン（ｍｉＲＮＡ）は、ＨＣＶ複製において役割を果たすことが知られているマイクロＲＮＡ  ｍｉｒ−１２２の作用をブロックし、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＳＶカプシドタンパク質の合成をブロックし、ＲＳＶビリオンの産生を防ぐ。これらのＯＮ薬物は、すべて、被検体で意図した効果の励起において非常に効果的であり、ＲＥＰ  ９ＡＣ／ＲＥＰ  ９ＡＣ’は、ＨＢｓＡｇを血中から除去するように十分に働き、ミラビルセンは、ｍｉｒ−１２２の機能を阻害するように十分に働き、ＡＬＮ−ＲＳＶ−０１は、カプシドタンパク質の産生をブロックするように十分に働く。しかし、これらのＯＮに由来する化合物を非経口で投与するあらゆる場合には、投与に関連する副作用、例えば、静脈点滴によって投与するときの発熱、悪寒、振戦、または皮下投与によって投与するときに注射部位での疼痛、炎症または硬結を伴う。
【０１１２】
いくつかのＯＮは、高コレステロール血症および高トリグリセリド血症を治療するとき、ヒト患者に効能を示す。これらは、ミポメルセン（ＫｙｎａｍｒｏTM）、Ａｐｏ  Ｂ１００の合成を標的とする第２世代のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＣＳ−ＧａｌＮＡｃ、ＰＣＳＫ９およびＮＡＰを標的とする糖がコンジュゲート化したｓｉＲＮＡである（実施例Ｖを参照）。
【０１１３】
ＮＡＰは、動物において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのプリオン病の発生を予防することができることも示されている（Ｋｏｃｉｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｒｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５０：１０３４−１０４４）。
【０１１４】
疾患状態で異常なＲＮＡスプライシングを正しくするためのオリゴヌクレオチドの使用は、種々の疾患状態で受け入れられている治療的介入でもある（Ｄｕ  ａｎｄ  Ｇａｔｔｉ、２００９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１１：１１６−１２３）。デュシェンヌ型筋ジストロフィーの場合、オリゴヌクレオチドＰＲＯ−０５１は、成熟中にジストロフィンＲＮＡに結合し、罹患した筋肉繊維で正常なジストロフィン産生を回復する成熟ｍＲＮＡにおいてエクソン５１のスキッピングを誘発するように設計される（Ｇｏｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、ＮＥＪＭ  ３６４：１５１３−１５２２）。しかし、ＰＲＯ−０５１の従来的な投与は、米国特許出願公開第２０１２／００４６３４８号に記載されるように、少なくとも部分的にはＯＮのキレート化によって媒介される特性に起因して生じる注射部位の反応を伴う。
【０１１５】
これらの投与に関連する副作用を最低限にするために、これらの生化学的機能を保持することができることを条件として、これらのＯＮに基づく任意の薬物をＯＮキレートとして調製することが望ましい。本開示は、ＯＮをキレート錯体として調製することができ、その生化学的機能を保持したままにすることができることを示す。製剤中のＯＮキレート錯体は、抗ウイルス活性を有する任意のＯＮから誘導されてもよく、その例を表１に与える。
【表１】
2018058853.tif 000002
2018058853.tif 000003
LNA＝ロックド核酸、PS＝ホスホロチオエート、2’OMe＝2’Oメチル、2’MOE＝2’メトキシエチル、5’MeC＝5’メチルシトシン
【０１１６】
さらに、上の組成物は、生理学的および／または医薬的に許容され得る担体、アジュバント、ビヒクルおよび／または賦形剤を含んでいてもよい。担体の特徴は、投与経路によって変わってもよい。「医薬的に許容され得る担体、アジュバント、ビヒクルおよび／または賦形剤」という用語は、被検体に投与してもよく、本明細書に記載する組成物に組み込まれてもよく、その薬理活性を破壊しない担体、アジュバント、ビヒクルまたは賦形剤を指す。本明細書に記載する医薬組成物で使用してもよい医薬的に許容され得る担体、アジュバント、ビヒクルおよび賦形剤としては、限定されないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化性薬物送達システム（「ＳＥＤＤＳ」）、医薬投薬形態に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ類または他の同様のポリマー系送達マトリックス、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、バッファー基剤、例えば、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系基剤、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、羊毛脂、カプリン酸ナトリウムまたはテトラデシルマルトシド（ＴＤＭ）、ＴＤＭ誘導体または他のアルキル化糖類が挙げられる。シクロデキストリン、例えば、α−、β−およびγ−シクロデキストリン、または化学修飾された誘導体、例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含め、ヒドロキシアルキルシクロデキストリン、または他の可溶化された誘導体を使用し、本明細書に記載する組成物の送達性を高めてもよい。
【０１１７】
本明細書で記載する組成物は、以下に記載するような他の治療薬剤を含んでいてもよく、例えば、従来の固体または液体のビヒクルまたは希釈剤や、例えば、医薬製剤の分野でよく知られた技術に従って、望ましい投与態様に適した種類の医薬添加剤（例えば、賦形剤、バインダー、防腐剤、安定化剤、香味剤など）を使用することによって製剤化されてもよい。
【０１１８】
本明細書に記載する組成物を、任意の適切な手段によって、例えば、経口で、例えば、液体懸濁物、錠剤、カプセル、顆粒または粉末の形態で；舌下；口腔；非経口で、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内注射または点滴技術によって（例えば、滅菌の注射可能な水溶液または非水溶液または懸濁物として）；経鼻で、例えば、吸入スプレーによって；局所的に、例えば、クリームまたは軟膏の形態で；または直腸から、例えば、坐剤または浣腸の形態で；非毒性の医薬的に許容され得るビヒクルまたは希釈剤を含む投薬単位の製剤で投与してもよい。本組成物を、例えば、即時放出または持続性放出に適切な形態で投与してもよい。即時放出または持続性放出を、適切な医薬組成物を用いることによって、特に、持続性放出の場合には、デバイス、例えば、皮下インプラントまたは等張性ポンプを用いることによって達成してもよい。従って、上の組成物を、眼内、経口摂取、腸内、吸入、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射、髄腔内注射または髄腔内注入、気管内、静脈注射または静脈点滴、または局所的のいずれか１つによって投与するのに合わせて変えてもよい。
【０１１９】
経口投与のための例示的な組成物としては、例えば、かさを付与するための微結晶性セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、粘度向上剤としてのメチルセルロース、および甘味剤または香味剤、例えば、当該技術分野で知られているものを含んでいてもよい懸濁物；および例えば、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはラクトースおよび／または他の賦形剤、バインダー、増量剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤、例えば、当該技術分野で知られているものを含んでいてもよい即時放出錠剤が挙げられる。また、本組成物を、舌下投与および／または口腔投与によって口腔を介して送達してもよい。成型した錠剤、圧縮した錠剤または凍結乾燥した錠剤は、使用可能な例示形態である。例示的な組成物としては、迅速に溶解する希釈剤、例えば、マンニトール、ラクトース、スクロースおよび／またはシクロデキストリンを用いて本組成物を製剤化するものが挙げられる。さらに、このような製剤に含まれるのは、高分子量賦形剤、例えば、セルロース（ａｖｉｃｅｌ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよい。このような製剤は、粘膜付着を補助する賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＳＣＭＣ）、無水マレイン酸コポリマー（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ）および放出を制御する薬剤、例えば、ポリアクリルコポリマー（例えば、カルボポール９３４）を含んでいてもよい。また、製造および使用を容易にするために、滑沢剤、滑剤、香味剤、着色剤および安定化剤を加えてもよい。
【０１２０】
本明細書に記載する化合物の有効量は、当該技術分野の一般的な技術によって決定されてもよく、成人について、１日あたり、体重１ｋｇあたり約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの活性化合物といった例示的な投薬量を含み、これを１回の投薬で投与してもよく、例えば、１日に１〜５回の個々に分けた投薬量の形態、または特定の投与週に複数回投与する投薬量で投与してもよい。任意の特定の被検体のための特定の投薬レベルおよび投薬頻度は、変わってもよく、使用する特定の化合物の活性、この化合物の代謝安定性および活性の長さ、被検体の種類、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与態様および投与時間、排泄速度およびクリアランス、薬物の組み合わせおよび特定の状態の重篤度といった種々の因子に依存して変わることが理解されるだろう。治療に好ましい被検体としては、動物、最も好ましくは、哺乳動物種、例えば、ヒトおよび家畜、例えば、イヌ、ネコなどが挙げられる。
【０１２１】
以下の実施例を参照することによって、本開示はさらに簡単に理解されるだろう。
【実施例】
【０１２２】
（実施例Ｉ）
（ＯＮキレート錯体の形成）
図１Ａは、同時にカラムに一緒に注入された２種類のＯＮ調製物のＨＰＬＣ（疎水性カラムを用いる）による分離の詳細である。これらの１つ目は、内部標準と呼ばれ、特定の確定した配列を有する２１マーのホスホロチオエートＯＮであり、２つ目はＲＥＰ  ２００６（４０マーの縮重ホスホロチオエートＯＮ）である。これら両方の種は、その物理化学特性（すなわち、大きさおよび疎水性）にのみ由来して別個の確定したピークに分離され、これらそれぞれのＯＮに存在するヌクレオチド配列は、その物理化学特性に意義のある影響はなく、従って、その分離に影響がない。そのように、内部標準は、ＲＥＰ  ２００６と比較して、これら２種類のＯＮポリマーの大きさの違いのみに起因して、もっと短い保持時間で厳密に確定したピークとしてカラムから溶出する。ＲＥＰ  ２００６のピークの片方の端にある肩部は、比較的長いＯＮの産生に典型的な配列の失敗に起因することを注記しておく。非常に多くの異なる配列が存在するが、ＲＥＰ  ２００６の不均一な配列の性質にかかわらず、ＲＥＰ  ２００６調製物中のすべての種類に共通の物理化学的特性を示す２１マーの特定の配列としてＨＰＬＣによって同様に十分に確定されたピークとして分離される。ＲＥＰ  ２００６および２１マーピークのＨＰＬＣ分離の後、これらに対し、質量分析法（ＭＳ）を行い、これらの確定したピークの中に存在する種類を特定することができる（図１Ｂおよび１Ｃ）。
【０１２３】
図１Ｂでは、この２１マーは、ＭＷが７４０２．６Ｄａの単一の種類に分離され、確定した配列を有するＰＳ−ＯＮと一致する。しかし、ＲＥＰ  ２００６のＭＳ分析（図１Ｃ）から、質量範囲がほとんど完全な正規分布を有し、完全な縮重の性質と一致する非常に多量の種類が存在することがわかる。この質量範囲は、Ｃ40（最小の種類）からＡ40（最大の種類）にわたり、これらの種の出現率は非常に小さく、その質量が質量範囲の中心に近づくにつれて種類の数（ピーク強度）が増加する。これは、ますます多くの異なる配列から同様の質量が生じるためである。ＲＥＰ  ２００６に存在する異なるＯＮ種類のすべてが、ＨＰＬＣ分離中に疎水性カラムで同じ保持時間を有するという事実は、同じ大きさの同じ化学修飾（すなわち、ホスホロチオエート化）を有するすべてのＯＮは、非常によく似た（同じではない場合）物理化学的特性を有し、それ自体が、特定のＯＮ分子に存在するヌクレオチドの配列に依存しない任意の用途または特性において機能的によく似ていると考え得ることを明確に示す。従って、任意の特定の縮重ＯＮで観察された任意のＯＮキレート錯体（例えば、ＲＥＰ  ２００３、ＲＥＰ  ２００４、表２を参照）は、存在するＯＮの配列に依存するはずはなく、任意のＯＮの保存された物理化学的特性に依存しなければならない。
【０１２４】
上述のような蛍光偏光（ＦＰ）によって、ＯＮアンモニウム塩と種々の二価の金属カチオンとの相互作用を調べた。ＯＮの合成中、各ＯＮを、十分に確立された試薬および合成プロトコルを用い、硬い３炭素リンカーによって３’末端でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲート化した。この合成によってこれらのＯＮを切断し、アンモニウム塩として残した。この実施例で使用するＯＮを表２に記載する。
【表２】
2018058853.tif 000004
N＝縮重配列（A、G、CまたはTのランダム組み込み）
PS＝それぞれの結合でのホスホロチオエート化
2’OMe＝それぞれのリボースで、2’でのOメチル化
【０１２５】
使用した３’位でＦＩＴＣ標識したＯＮは、ＲＥＰ  ２０３２−ＦＬ（６マーホスホロチオエート化縮重オリゴデオキシヌクレオチド）、ＲＥＰ  ２００３−ＦＬ（１０マーホスホロチオエート化縮重ＤＮＡ  ＯＮ）、ＲＥＰ  ２００４−ＦＬ（２０マーホスホロチオエート化縮重オリゴデオキシヌクレオチド）、ＲＥＰ  ２００６−ＦＬ（４０マーホスホロチオエート化縮重ＤＮＡ  ＯＮ）、ＲＥＰ  ２０３１−ＦＬ（４０マーポリシチジンホスホロチオエート化ＤＮＡ  ＯＮ；配列番号１）、ＲＥＰ  ２１０７−ＦＬ（それぞれのリボースが２’位でのＯメチル化によって修飾された４０マーホスホロチオエート化縮重ＲＮＡ  ＯＮ）、ＲＥＰ  ２０８６−ＦＬ（それぞれのリボースが２’位でのＯメチル化によって修飾された４０マー縮重ホスホジエステルＲＮＡ  ＯＮ）、ＲＥＰ  ２０５５−ＦＬ（配列［ＡＣ］20を含むホスホロチオエート化ＤＮＡ  ＯＮ；配列番号２）、ＲＥＰ  ２０５７（配列［ＡＧ］20を含むホスホロチオエート化ＤＮＡ  ＯＮ；配列番号３）およびＲＥＰ  ２１３９−ＦＬ（それぞれのリボースが２’位でメチル修飾され、それぞれのシトシンが５’位でメチル化された配列［２’ＯＭｅＡ−２’ＯＭｅ、５’ＭｅＣ］20を含むホスホロチオエート化ＲＮＡ  ＯＮ；配列番号１８）であった。これらのＯＮを、それぞれ１ｍＭトリス（ｐＨ７．２）中の０．５ｍＭストックとして調製した。これらのストックを使用し、ＦＰバッファー（１０ｍＭトリス、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）中の３ｎＭ蛍光ＯＮ溶液を調製した。ＦＰ測定の前に、溶液中に存在する二価の金属を除去するために、ＥＤＴＡが存在した。これらのバッファー溶液は、それぞれ、モル過剰の一価カチオン存在下、ＯＮ錯体形成を評価するために、８０ｍＭ  ＮａＣｌも含んでいた。溶液中のそれぞれの蛍光ＯＮに、種々の量のＡＣＳグレードの二価の（２＋）金属の塩化物塩を加えた（表３に記載されるように）。ＯＮキレート錯体の形成の増加により質量のより大きな変化が生じるように、蛍光偏光の増加によって、ダイマーまたはより高次のＯＮキレート錯体の形成を監視した（無次元の単位「ｍＰ」によって定量）（図３を参照）。溶液中のこれらのＯＮキレート錯体の回転がゆっくりになると、発光する蛍光の偏光が増加した（図４を参照）。これらの実験結果を表３にあらわす。
【表３】
2018058853.tif 000005
【０１２６】
それぞれの場合に、すべての二価のカチオン存在下、すべてのＯＮについて蛍光偏光の顕著な増加がみられ、これは、二価の金属カチオンとのＯＮキレート錯体形成を示す。これらの結果は、以下のことを示す。
・カルシウムおよびマグネシウム存在下、ＯＮは、ダイマーまたはより高次の錯体を形成する。これらの錯体は、すべての他の二価の金属カチオンでも形成されると予想される。これらのＯＮ錯体の形成は、ＯＮと、これらの二価の金属カチオンとの相互作用を含む。
・ＯＮ錯体の形成は、試験したＯＮの縮重性に起因して、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用を介する窒素系塩基の間のハイブリダイゼーションに起因するものとは考えられない。さらに、ＲＥＰ  ２０３１（配列番号１）、ＲＥＰ  ２０５５（配列番号２）、ＲＥＰ  ２０５７（配列番号３）またはＲＥＰ  ２１３９（配列番号１８）は、使用した実験条件では自己ハイブリダイズすることができない。
・ＯＮ錯体の形成は、水溶液中で安定であり、可溶性であり、かつ、これらの錯体が、形成される錯体の一部として、問題にしている二価の金属を組み込むと思われるため、これらのＯＮ錯体は、問題となる二価金属を、ＯＮ錯体が形成される溶液からキレート化する作用を有する。
・これらの金属のキレート化およびＯＮキレート錯体の形成は、縮重ＯＮで観察されるキレート化によって実証されるように、特定のヌクレオチド配列に依存せず、さらに、ホスホジエステル結合または２’位でのリボース部分の修飾または塩基の修飾（例えば、５’メチルシトシン）を含むヌクレオチド修飾とともに起こる。
・この実施例では、６〜４０ヌクレオチド長のＯＮとこれらの金属がキレート化し、このことは、任意の長さのＯＮまたは４０ヌクレオチド長より長いＯＮとのＯＮキレートが形成され得ることを示す。
【０１２７】
（実施例ＩＩ）
（二本鎖ＯＮを用いたＯＮキレート錯体の形成）
ＷＯ  ２０１２／０２１９８５号に記載したように、水溶液中でＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用によって互いにハイブリダイズする２個の一本鎖の相補的なＯＮを用いて二本鎖ＯＮを作成する。二本鎖ＯＮは、生成したＤＮＡらせんの外側に露出したホスホジエステル骨格を有しているため、二価のカチオン存在下、キレート錯体を生成することが可能であるはずである。この仮説を試験するために、ＲＥＰ  ２０５５−ＦＬ（４０マーポリＡＣ；配列番号２）を、ＲＥＰ  ２０３３−ＦＬ（４０マーポリＴＧ；配列番号６）でハイブリダイズし、ＲＥＰ  ２０５７−ＦＬ（４０マーポリＡＧ；配列番号３）をＲＥＰ  ２０５６−ＦＬ（４０マーポリＴＣ；配列番号５）でハイブリダイズすることによって、２つの異なる二本鎖ＤＮＡ  ＯＮを調製した。ＯＮのハイブリダイゼーションによって二重鎖を生じるため、得られる質量の増加を、錯体を調製するために使用する一本鎖ＯＮに対する蛍光偏光の増加によって検出することができる。一本鎖ＯＮ（ＲＥＰ  ２０５５−ＦＬ（配列番号２）、Ｒｅｐ  ２０３３−ＦＬ（配列番号６）、Ｒｅｐ  ２０５７−ＦＬ（配列番号３）およびＲＥＰ  ２０５６−ＦＬ（配列番号５））を、それぞれ１×ＦＰバッファーで２０ｎＭまで希釈した。上に特定したようなこの２つの相補性対のハイブリダイゼーションも、１×ＦＰバッファー（１０ｎＭの各ＯＮ）で行い、ハイブリダイゼーションを蛍光偏光の増加によって確認した。次いで、二本鎖構築物を１００ｍＭ  ＣａＣｌ2または１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2に曝露した。ＯＮキレート錯体の生成を、さらなる蛍光偏光の増加によって監視した（表４を参照）。この実験の結果は、蛍光偏光の増加によって実証されるように、ＯＮの両方の相補性対から二本鎖ＯＮへの首尾よいハイブリダイゼーションを確認した。さらに、これらの二本鎖ＯＮにＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2を添加すると、蛍光偏光がさらに増加し、このことは、これらの二本鎖ＯＮが、二価金属カチオン存在下、キレート錯体を生成することができることを示す。これらの結果は、二本鎖ＯＮが、任意の二価のカチオンとＯＮキレート錯体を形成可能であることを強く示唆し、溶液から二価カチオンを捕捉するという効果を有することも予想されるであろう。
【表４】
2018058853.tif 000006
【０１２８】
（実施例ＩＩＩ）
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多様なエンベロープウイルス中のＯＮキレート錯体の抗ウイルス活性）
単純ヘルペス−２（ＨＳＶ−２）ＭＳ株（ヘルペスウイルスファミリー）、インフルエンザＡ（ＩＮＦＡ）Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ株（オルトミクソウイルス科のファミリー）および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｌｏｎｇ株（パラミクソウイルス科のファミリー）といった異なるウイルスファミリー由来の３種類の異なるエンベロープウイルス中、ＯＮキレート錯体の抗ウイルス活性を確認するために、実験を行った。宿主細胞での各ウイルスのウイルス細胞変性効果の阻害を測定することによって、それぞれのウイルスについて、既知の抗ウイルス活性を有するＯＮの効能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでカルシウムキレートと比較した。ＨＳＶ−２およびＲＳＶについて、Ｖｅｒｏ細胞を使用し、ＩＮＦＡについて、ＭＤＣＫ細胞を使用した。ＨＳＶ−２抗ウイルスを評価する場合、プラーク低下アッセイを使用し、ＩＮＦＡおよびＲＳＶの場合、細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイを使用した。
【０１２９】
プラーク低下アッセイの場合、Ｖｅｒｏ成長培地を用い、Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェルプレートに７５，０００細胞／ウェルで接種した。プラークを３７℃、５％  ＣＯ2で一晩インキュベートした。次の日に、培地を吸引し、約１００プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＨＳＶを、容積が２００μＬのアッセイ培地（２％ＦＢＳを含有するＶｅｒｏ成長培地）に加えた。３７℃、５％  ＣＯ2で１時間かけてウイルスを細胞に吸着させた。これを、０．５％メチルセルロースを含有するアッセイ培地で希釈することによって、化合物を調製した。このインキュベーション時間の後、それぞれの薬物希釈液１ｍＬを加え、プレートのウェルを３つ作成した（ウイルス接種源を吸引することなく）。このプレートを２日間インキュベートし、プラークを生成させた。次いで、このウェルから培地を吸引し、細胞を固定し、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔを含有する２０％メタノールを用いて染色した。顕微鏡観察によってプラークを数え上げ、ウイルス対照に対するパーセントとしてデータをプロットした。
【０１３０】
ＣＰＥアッセイの場合、試験化合物存在下、ウイルスおよび細胞を混合し、必要なアッセイ時間（ＨＳＶ−２の場合５日間、ＩＮＦＡおよびＲＳＶの場合７日間）、インキュベートした。それぞれのウイルスを、対照ウェルが、ウイルス複製に起因して細胞生存性が８５〜９５％の消失を示すように、あらかじめ滴定した。従って、この化合物がウイルス複製を妨害するとき、抗ウイルス効果または細胞保護作用を観察した。サンプルについて、ＩＣ50値を決定するために、段階希釈によって調製した１２種類の濃度を用い、３ッ組の測定を用い、抗ウイルス効力を評価し、検出可能な場合、２ッ組の測定値を用い、細胞毒性を決定した。この試験の目的のために、それぞれのアッセイのＦＢＳ濃度は、０．５％であった。アッセイ終了時に、アッセイプレートを、可溶性テトラゾリウム系染料ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）で染色し、細胞生存性を決定した。ＭＴＳを、代謝によって活性な細胞のミトコンドリア酵素によって代謝し、可溶性ホルマザン産物を得て、細胞生存性および化合物の細胞毒性を迅速に定量分析することができる。この試薬は、使用前に調製の必要がない安定な１種類の溶液である。アッセイ終了時に、ウェルあたり、１０〜２５ｕＬのＭＴＳ試薬を加え（体積基準で最終濃度１０％）、次いで、マイクロタイタープレートを３７℃、５％  ＣＯ2で４〜６時間インキュベートし、細胞生存性を評価した。蓋の代わりに接着プレートシーラーを使用し、シールしたプレートを数回引っ繰り返し、可溶性ホルマザン産物を混合し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＶｍａｘまたはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダーを用い、４９０／６５０ｎｍで分光光度的にプレートを読み取った。抗ウイルス活性を評価する化合物は、ＲＥＰ  ２０５５カルシウムキレートおよびＲＥＰ  ２１３９カルシウムキレートを含んでいた（表５を参照）。ＲＥＰ  ２０５５（配列［ＡＣ］20を有する４０マーホスホロチオエートＤＮＡ  ＯＮ；配列番号２）およびＲＥＰ  ２１３９（配列［２’ＯＭｅＡ−２’ＯＭｅ，５’ＭｅＣ］20を含む４０マーホスホロチオエートＲＮＡ  ＯＮ；配列番号１８）は、エンベロープウイルスに対し、広いスペクトルの抗ウイルス活性を有するＮＡＰである（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００８  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５２：２７２７−２７３３；Ｃａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊ．６：２１４；Ｖａｉｌｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：１３９３−１４０１；Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１２：１１４７−１１５６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３７２：１０７−１１７；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１３７：６７３−６８１および米国特許第８，００８，２６９号、同第８，００８，２７０号および同第８，０６７，３８５号）。抗ウイルス活性のために必要な唯���のＮＡＰ修飾は、ＯＮ中の各結合のホスホロチオエート化である。２’位でのリボース修飾（例えば、２’  Ｏメチル化）および塩基修飾（例えば、５’メチルシトシンおよび／または４’チオウラシル）を含むさらなる修飾は、ＮＡＰの抗ウイルス活性への影響は無視できるが、これを使用し、ヒト患者での忍容性を最適化することができる。国際公開第ＷＯ  ２０１２／０２１９８５号および米国出願公開第２０１２／００４６３４８号に従って、ＯＮ１００ｍｇごとに３０ｍｇ  ＣａＣｌ2の比率で、ＲＥＰ  ２０５５およびＲＥＰ  ２１３９をカルシウムキレートとして調製した。
【表５】
2018058853.tif 000007
【０１３１】
試験した３種類すべてのウイルスにおいて、ＲＥＰ  ２０５５カルシウムキレートおよびＲＥＰ  ２１３９カルシウムキレートの抗ウイルス活性を確認した。このことは、ＨＳＶ−２、ＲＳＶおよびＩＮＦＡに対して広いスペクトルの抗ウイルス活性を有するＮＡＰ  ＯＮをキレート化錯体として調製することができ、これらのウイルスに抗ウイルス活性を示すことを示す。さらに、これらのＯＮの抗ウイルス活性が、ＯＮキレートとして投与すると長く続くため、他の種類のＯＮ（アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）をＯＮキレートとして投与しても、これらのＯＮの生物学的活性に顕著な影響を与えないと思われる。これは、特定のタンパク質の相互作用（ＮＡＰまたはアプタマーまたはＣｐＧ  ＯＮの場合）または核酸相互作用（アンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの場合）が、ＯＮキレート錯体中で生じるＯＮ／多価金属カチオン相互作用よりもかなり大きな親和性を有するという事実に起因するだろう。キレート化されていないＯＮ塩に対して、ＯＮキレートの優れた毒性と組み合わせ、これらの実験は、キレート化された抗ウイルスＯＮが、キレート化されていない対応物よりも望ましい抗ウイルス薬物であり得ることを示唆する。さらに、核酸系ポリマーから調製したＯＮキレートは、米国特許第８，００８，２６９号、同第８，００８，２７０号および同第８，０６７，３８５号に開示されるように、一般的に、エンベロープウイルスに対し、広いスペクトルの抗ウイルス活性を有すると予想されるであろう。
【０１３２】
（実施例ＩＶ）
ＯＮキレートは、ヒト患者における慢性ＨＢＶ感染に対し、有効な抗ウイルス剤である。
すでに慢性ＨＢＶに感染している患者に、上述のように当該技術分野の技術水準に従って、単純なナトリウム塩溶液として調製した匹敵するモル投薬量のＲＥＰ  ２０５５、カルシウムキレート錯体として調製した（国際出願公開第ＷＯ  ２０１２／０２１９８５号および米国出願公開第２０１２／００４６３４８号に従って、ＲＥＰ  ２１３９  １００ｍｇごとに３０ｍｇのＣａＣｌ2を用いて調製した）ＲＥＰ  ２１３９を週に１回投与した。ナトリウム塩ＮＡＰ（ＲＥＰ  ２０５５）と、カルシウムキレートＮＡＰ（ＲＥＰ  ２１３９−Ｃａ）の投与の抗ウイルス効果は、匹敵する投薬計画を用いて匹敵するモル投薬量で与えられるとき、血中のＨＢＶ表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）のレベルの低下によって評価された（Ａｂｂｏｔｔ  ＡｒｃｈｉｔｅｃｔTMプラットフォームによって測定した場合）。ＲＥＰ  ２０５５およびＲＥＰ  ２１３９−Ｃａの抗ウイルス効果を表６に示す。
【表６】
2018058853.tif 000008
＊HBsAgのためのAbbott ArchitectTM定量試験によって決定した場合
【０１３３】
ＲＥＰ  ２０５５およびＲＥＰ  ２１３９−Ｃａは、両方とも、匹敵するモル投薬量で、ＨＢＶに感染した細胞からのＳＶＰの放出のブロックに等しく有効であり、このことは、一般的に、ＨＢＶ感染に対し、すべてのＮＡＰの治療に関連する作用機序である。この活性は、具体的には、その機能を達成するために、肝細胞でＮＡＰを細胞内輸送することが必要である。ＲＥＰ  ２０５５およびＲＥＰ  ２１３９−Ｃａは、匹敵する単剤療法で与えられる場合、ＨＢＶに感染した患者において、匹敵するＨＢｓＡｇの低下またはクリアランスを達成し、このことは、これら２種類の異なるＮＡＰの匹敵する抗ウイルス活性を示し、カルシウムキレート錯体としてのＲＥＰ  ２１３９の製剤が、その臓器蓄積、細胞内輸送または生化学的活性に対し、認識し得る影響をもたないことを示す。
【０１３４】
これらの結果は、ＯＮキレート錯体が、おそらくタンパク質相互作用をある程度ブロックすることによってＯＮの忍容性を高める能力を有するが、特にＮＡＰ、および多くのＯＮ全般の生化学的活性に必須のＯＮの臓器蓄積（上の実施例では、肝臓において）または細胞内輸送（上の実施例では、肝細胞）に影響を与えないような様式で分解することもできることを示す。ＯＮキレート錯体が、変化しない臓器蓄積、細胞内輸送および生化学的活性を保持しつつ、ＯＮ忍容性のいくつかの側面で関与するタンパク質相互作用を防ぐ能力（米国出願公開第２０１２／００４６３４８号に開示されるように）は、米国出願公開第２０１２／００４６３４８号の教示から当業者が予測することはできなかった。
【０１３５】
これらの結果は、慢性ＨＢＶ感染を治療するためのＯＮキレートの有効性を明らかに示す。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはヒト被検体でＨＢＶに活性であるか、または他のウイルス感染に対して有効な他のＯＮは、カルシウムキレートとして調製することができ、本明細書に提示する本開示の利点を用い、化合物の投与中または全体としての治療計画全体の間に改善された忍容性を有しつつ、治療効力を保持することを信頼性高く予測することができる。本明細書に開示されるとき、ＯＮキレート錯体が、治療活性には特定の臓器蓄積、細胞内での区画分けおよび生化学的相互作用の保持が必要なＯＮのヒト患者での効果を変えないという発見は、作用機序にかかわらず、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ  ｓｈＲＮＡまたはＮＡＰのいずれであるかによらず、キレート錯体として製剤化可能な任意のＯＮを使用し、その設計された治療効果を達成し、米国出願公開第２０１２／００４６３４８号に教示されるような投与に関連する副作用を減らすというさらなる利点を有することができることも明らかに教示する。
【０１３６】
さらに、ＮＡＰが、ＨＢＶ表面の抗原の放出をブロックすることによって、ＨＢＶに対して作用することが示されているため、ＮＡＰは、Ｄ型肝炎ウイルス、その産生のためのＨＢＶ表面の抗原に依存する近縁でないウイルスに対しても活性であろう。そのために、ＮＡＰキレート錯体は、デルタ型肝炎ウイルス感染に対して活性であることも予想されるだろう。
【０１３７】
重要なことに、上の実施例で患者に投与したＯＮキレート錯体は、投与に関連する副作用について明確な改善を示した。ＲＥＰ  ２１３９カルシウムキレートのＩＶ点滴は、２時間で終了させることができ、非常にまれな場合にのみ中程度の振戦または悪寒を伴った。対照的に、ＲＥＰ  ２１３９−Ｃａに匹敵するモル投薬量で、単純なナトリウム塩としてヒト患者に投与されたＲＥＰ  ２０５５は、ＩＶ点滴を終了させるのに１０時間より長い時間が必要であり、ほとんど常に中程度の発熱、悪寒および振戦を伴っていた。さらに、血清ＨＢｓＡｇを低下させつつ、注射部位の反応を起こさず、ＲＥＰ  ２１３９カルシウムキレートをヒト患者に１日に１回、皮下注射によって５週間投与することが可能であった。注射部位の反応を発生させずにこの投与経路を用いることは、単純なＯＮナトリウム塩を皮下投与した場合には不可能であろう。
【０１３８】
これらの観察は、抗ウイルスＯＮキレート錯体が、投与に関連する副作用を大きく改善しつつ、抗ウイルス活性を失わず、被検体に抗ウイルスＯＮを投与する有用な方法であることを示す。
【０１３９】
これらの観察は、さらに、ＯＮを用いて意図した生物学的効果を妨害することなく、さらに、ＯＮの特定の生体分布または細胞内輸送を妨害することなく、任意のＮＡＰまたはアンチセンスＯＮ（伝統的なアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ  ＯＮを含む）をＯＮキレート錯体として製剤化できることを示す。
【０１４０】
（実施例Ｖ）
（ＮＡＰＳはｉｎ  ｖｉｖｏで血清トリグリセリドおよびコレステロールを低下させる）
ＮＡＰがハムスターにおいて、高フルクトース（ＨＦ）餌を供給したときに高コレステロール血症および高トリグリセリド血症の発生を予防することができるか否かを知るために、４０マーの完全にホスホロチオエート化したオリゴデオキシシチジン酸ＲＥＰ  ２０３１（配列番号１）を、ＨＦ餌を与えた動物に腹腔内注射によって週に３回、４週間投与した。高コレステロール血症および肥満に関連するいくつかのパラメータを監視した（表９を参照）。
【表７】
2018058853.tif 000009
【０１４１】
これらの結果は、ＲＥＰ  ２０３１投与によって、ＨＦ餌に関連するトリグリセリドおよびコレステロールの増加を阻害したことを示す。従って、ＯＮは、高コレステロール血症の予防に治療活性を有し得る。
【０１４２】
すでに存在する高コレステロール血症および／または高トリグリセリド血症を有するヒト患者に対し、カルシウムキレート錯体として調製したＲＥＰ  ２０５５を週に１回投与した。血清総コレステロール、ＬＤＬおよびトリグリセリドに対するＲＥＰ  ２０５５投与の効果を、許容された実験的手順および試験方法論を用いて監視した。血清コレステロールの動力学に対するＲＥＰ  ２０５５治療の効果を表１０に示す。
【表８】
2018058853.tif 000010
LDL＝低密度リポタンパク質、プレ＝治療前のベースライン、治療＝REP 2055治療で達成した最低レベル
【０１４３】
コレステロールおよびトリグリセリドが高い患者（患者１〜３）では、ＲＥＰ  ２０５５治療により、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールだけではなく、血清トリグリセリドも低下した。通常のコレステロール値であるが、トリグリセリドがわずかに高い状態から中程度に高い状態の患者（患者４および５）では、ＲＥＰ  ２０５５治療は、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールレベルには有意な影響を与えないが、血清トリグリセリドは低下された。これらのデータは、ＮＡＰ  ＲＥＰ  ２０５５が、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールだけではなく、血清トリグリセリドを低下または正常化させる能力を有することを示す。
【０１４４】
上の実施例では、２種類の異なるＮＡＰ（ＲＥＰ  ２０３１［配列番号１］およびＲＥＰ  ２０５５［配列番号２］）は、それぞれ異なる配列を有するが、物理化学的特性が同一であり、血清コレステロールおよびトリグリセリドの低下について、ｉｎ  ｖｉｖｏで同様の効果を達成することができた。これらの結果は、ＮＡＰの配列に依存しない活性が、血清コレステロールおよびトリグリセリドを減らすことを明らかに示し、本明細書に記載する任意のＮＡＰが、本明細書に示すＲＥＰ  ２０３１およびＲＥＰ  ２０５５と同様の効果を有することが予想されることを示す。
【０１４５】
ＮＡＰの抗ウイルス活性、抗トリグリセリド活性、抗コレステロール活性および抗プリオン活性が、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの同じ配列に依存しない特性から誘導され、ウイルス感染に対し、キレート錯体として製剤化した場合、ＮＡＰの抗ウイルス活性の保持に関する本開示は、ＮＡＰが、ＯＮキレート錯体として投与した場合に、その抗トリグリセリド、抗コレステロールおよび抗プリオン活性も保持するという決定的な証拠を与える。
【図１Ａ】
2018058853.tif 000011
【図１Ｂ】
2018058853.tif 000012
【図１Ｃ】
2018058853.tif 000013
【図２Ａ】
2018058853.tif 000014
【図２Ｂ】
2018058853.tif 000015
【図３】
2018058853.tif 000016
【図４】
2018058853.tif 000017
【配列表】
2018058853000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月30日(2017.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染を治療するための、抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
ＮＡＰの抗ウイルス活性、抗トリグリセリド活性、抗コレステロール活性および抗プリオン活性が、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの同じ配列に依存しない特性から誘導され、ウイルス感染に対し、キレート錯体として製剤化した場合、ＮＡＰの抗ウイルス活性の保持に関する本開示は、ＮＡＰが、ＯＮキレート錯体として投与した場合に、その抗トリグリセリド、抗コレステロールおよび抗プリオン活性も保持するという決定的な証拠を与える。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ウイルス感染を治療するための、抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
〔２〕高コレステロール血症を治療するための、抗コレステロールオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
〔３〕高トリグリセリド血症を治療するための、抗トリグリセリドオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
〔４〕アルツハイマー病を治療するための、抗アルツハイマーオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
〔５〕プリオン病を治療するための、抗プリオンオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む医薬製剤。
〔６〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、二価の金属カチオンを用いて調製される、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔７〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、カルシウムを用いて調製される、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔８〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、マグネシウムを用いて調製される、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔９〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、鉄（２＋）、マンガン、銅または亜鉛を用いて調製される、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１０〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、２種類以上の異なる二価の金属カチオンを含む、前記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１１〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、カルシウムおよびマグネシウムを含む、前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１２〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１３〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１４〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１５〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、１つの２’位が修飾されたリボースを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１６〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、それぞれのリボースの２’位がＯ−メチル化されている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１７〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの５’メチルシトシンを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１８〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、各シトシンが５’メチルシトシンである少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔１９〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、完全にホスホロチオエート化され、すべてのリボースが２’位でＯメチル修飾され、すべてのシトシンが５’メチルシトシンとして存在する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔２０〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１〜６または１０〜１８から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔２１〕高コレステロール血症を治療するための、配列番号２０を含むキレート錯体を含む医薬製剤。
〔２２〕デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための、配列番号１９を含むキレート錯体を含む医薬製剤。
〔２３〕Ｃ型肝炎感染を治療するための、配列番号７を含むキレート錯体を含む医薬製剤。
〔２４〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、皮下投与のために製剤化される、前記〔１〕〜〔２３〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔２５〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、静脈点滴のために製剤化される、前記〔１〕〜〔２３〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔２６〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、眼内、経口摂取、腸内、吸入、筋肉注射、腹腔内注射、髄腔内注射、髄腔内注入、気管内、静脈注射および局所投与からなる群から選択される投与のために製剤化される、前記〔１〕〜〔２３〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔２７〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、エアロゾルによって投与するために製剤化される、前記〔１〕〜〔２３〕のいずれか１項に記載の医薬製剤。
〔２８〕感染を引き起こすウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスである、前記〔１〕に記載の医薬製剤。
〔２９〕感染を引き起こすウイルスが、ヘパドナウイルスである、前記〔１〕に記載の医薬製剤。
〔３０〕感染を引き起こすウイルスが、デルタ型肝炎ウイルスである、前記〔１〕に記載の医薬製剤。
〔３１〕感染を引き起こすウイルスが、インフルエンザである、前記〔１〕に記載の医薬製剤。
〔３２〕感染を引き起こすウイルスが、レトロウイルス科のメンバー、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヘルペスウイルス科のメンバー、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、ポックスウイルス科のメンバー、パラミクソウイルス科のメンバー、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ブニヤウイルス科のメンバー、ハンタウイルス、フィロウイルス科のメンバー、エボラウイルス、マールブルグウイルス、フラビウイルス科のメンバー、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、オルトミクソウイルス科のメンバー、トガウイルス科のメンバー、コロナウイルス科のメンバー、ラブドウイルス科のメンバーおよびアレナウイルス科のメンバーからなる群から選択される、前記〔１〕に記載の医薬製剤。
〔３３〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号２を含む、前記〔１〕に記載の医薬製剤。
〔３４〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号１８を含む、前記〔１〕に記載の医薬製剤。
〔３５〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号１１を含む、前記〔１〕に記載の医薬製剤。
〔３６〕ウイルス感染を治療するための、抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
〔３７〕高コレステロール血症を治療するための、抗コレステロールオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
〔３８〕高トリグリセリド血症を治療するための、抗トリグリセリドオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
〔３９〕アルツハイマーを治療するための、抗アルツハイマーオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
〔４０〕プリオン病を治療するための、抗プリオンオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
〔４１〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、二価の金属カチオンを用いて調製される、前記〔３６〕〜〔４０〕のいずれか１項に記載の使用。
〔４２〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、カルシウムを用いて調製される、前記〔３６〕〜〔４１〕のいずれか１項に記載の使用。
〔４３〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、マグネシウムを用いて調製される、前記〔３６〕〜〔４２〕のいずれか１項に記載の使用。
〔４４〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、鉄（２＋）、マンガン、銅または亜鉛を用いて調製される、前記〔３６〕〜〔４３〕のいずれか１項に記載の使用。
〔４５〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、２種類以上の異なる二価の金属カチオンを含む、前記〔３６〕〜〔４４〕のいずれか１項に記載の使用。
〔４６〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、カルシウムおよびマグネシウムを含む、前記〔３６〕〜〔４５〕のいずれか１項に記載の使用。
〔４７〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕〜〔４６〕のいずれか１項に記載の使用。
〔４８〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕〜〔４７〕のいずれか１項に記載の使用。
〔４９〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕〜〔４８〕のいずれか１項に記載の使用。
〔５０〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、１つの２’位が修飾されたリボースを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕〜〔４９〕のいずれか１項に記載の使用。
〔５１〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、それぞれのリボースの２’位がＯ−メチル化されている少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕〜〔５０〕のいずれか１項に記載の使用。
〔５２〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、少なくとも１つの５’メチルシトシンを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕〜〔５１〕のいずれか１項に記載の使用。
〔５３〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、すべてのシトシンが５’メチルシトシンである少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕〜〔５２〕のいずれか１項に記載の使用。
〔５４〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、完全にホスホロチオエート化され、すべてのリボースが２’位でＯメチル修飾され、すべてのシトシンが５’メチルシトシンとして存在する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕〜〔５３〕のいずれか１項に記載の使用。
〔５５〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体は、配列番号１〜６または１０〜１８から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕〜〔４０〕のいずれか１項に記載の使用。
〔５６〕高コレステロール血症を治療するための、配列番号２０を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
〔５７〕デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための、配列番号１９を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
〔５８〕Ｃ型肝炎感染を治療するための、配列番号７を含むオリゴヌクレオチドキレート錯体の使用。
〔５９〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、皮下投与のために製剤化される、前記〔３６〕〜〔５８〕のいずれか１項に記載の使用。
〔６０〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、静脈点滴のために製剤化される、前記〔３６〕〜〔５８〕のいずれか１項に記載の使用。
〔６１〕前記ＯＮキレート錯体が、眼内、経口摂取、腸内、吸入、筋肉注射、腹腔内注射、髄腔内注射、髄腔内注入、気管内、静脈注射および局所投与からなる群から選択される投与のために製剤化される、前記〔３６〕〜〔５８〕のいずれか１項に記載の使用。
〔６２〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、エアロゾルによって投与するために製剤化される、前記〔３６〕〜〔５８〕のいずれか１項に記載の使用。
〔６３〕感染を引き起こすウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスである、前記〔３６〕に記載の使用。
〔６４〕感染を引き起こすウイルスが、ヘパドナウイルスである、前記〔３６〕に記載の使用。
〔６５〕感染を引き起こすウイルスが、デルタ型肝炎ウイルスである、前記〔３６〕に記載の使用。
〔６６〕感染を引き起こすウイルスが、インフルエンザである、前記〔３６〕に記載の使用。
〔６７〕感染を引き起こすウイルスが、レトロウイルス科のメンバー、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヘルペスウイルス科のメンバー、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス、ポックスウイルス科のメンバー、パラミクソウイルス科のメンバー、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ブニヤウイルス科のメンバー、ハンタウイルス、フィロウイルス科のメンバー、エボラウイルス、マールブルグウイルス、フラビウイルス科のメンバー、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、オルトミクソウイルス科のメンバー、トガウイルス科のメンバー、コロナウイルス科のメンバー、ラブドウイルス科のメンバーおよびアレナウイルス科のメンバーからなる群から選択される、前記〔３６〕に記載の使用。
〔６８〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号２からなるオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕に記載の使用。
〔６９〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕に記載の使用。
〔７０〕前記オリゴヌクレオチドキレート錯体が、配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含む、前記〔３６〕に記載の使用。
【外国語明細書】
2018058853000001.pdf