(57)【要約】本発明は、非白血球血液構成成分の除去によって、血液構成成分の不均一な混合物の白血球を富化するための、平行流濾過デバイスおよび方法を提供する。１つの特定の実施形態において、このデバイスは、単球が富化された組成物を提供し得る。１つの例示的な実施形態は、除去器ユニット（１）を含み、この除去器ユニットは、細孔フィルタ（５）によって濾液チャンバ（４）から分離された、クロスフローチャンバ（３）を有し、この除去器ユニット（１）はまた、平行流入口（６）、白血球が富化された流体のための流体出口（７）、および濾液出口（８）を有する。
2005529746.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球を富化された細胞集団を調製するための、平行流濾過デバイスであって、以下：
クロスフローチャンバ、濾液チャンバおよびこれらの間に配置されたフィルタを有する除去器ユニットであって、該フィルタは、該クロスフローチャンバおよび該濾液チャンバと流体連絡している、除去器ユニット、
を備え；
該クロスフローチャンバは、入口および出口を有し、該入口は、白血球を含有する血液構成成分のサンプルを、該クロスフローチャンバに導入するように、かつ該フィルタの表面に対して平行に配置され；そして該出口は、該クロスフローチャンバの、該フィルタ表面に対向する部分で中心に配置され；
該フィルタは、約１〜約１０ミクロンの範囲の平均孔サイズを有し；その結果、該サンプルの、該フィルタを横切る流れが、該血液構成成分のサンプルの白血球を富化する、デバイス。
【請求項２】
さらに、以下：
予め決定された投入速度の前記サンプルを、前記クロスフローチャンバの前記入口に提供するための手段；
該フィルタを通って前記濾液チャンバ内への、濾液の濾過速度を制御するための手段、
を備え；そして
該濾過速度を制御する手段が、該濾過速度を、該フィルタについての対向しない濾過速度より低く制限する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記フィルタの孔サイズが、約３ミクロン〜約７ミクロンである、請求項１または請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記フィルタの孔サイズが、約３ミクロン〜約５．５ミクロンである、請求項１または請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
前記クロスフローチャンバの入口と流体連絡した、血液構成成分の源をさらに備える、請求項１または請求項２に記載のデバイス。
【請求項６】
前記血液構成要素の源が、白血球搬出デバイスである、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
さらに、以下：
入口および出口を備える回収ユニットであって、前記クロスフローチャンバおよび該回収ユニットが、ループの形態で相互接続されており、該クロスフローチャンバの入口は、該回収ユニットの出口と流体連絡しており、そして該クロスフローチャンバの出口は、該回収ユニットの入口と流体連絡している、請求項１または請求項２に記載のデバイス。
【請求項８】
前記回収ユニットが、サンプル入口および洗浄液入口をさらに備える、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記洗浄液入口と流体連絡した置換液体の源をさらに備える、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記置換液体が、等張性緩衝液または組織培養培地である、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記クロスフローチャンバが、円筒形であり、そして前記出口が、前記フィルタの中心に対向し、そして前記フィルタの表面に対して垂直に位置する、請求項１または請求項２に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記除去器ユニットと流体連絡した細胞処理装置をさらに備える、請求項１または請求項２に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記細胞処理装置が、ビーズを備える、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記細胞処理装置が、白血球を富化された前記細胞集団を培養するための手段を備える、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記培養するための手段が、以下：
第一のポートおよび第二のポートを有する容器；
単球樹状細胞前駆体接着基材であって、該基材は、該第一のポートおよび該第二のポートと流体連絡している、基材；
該基材を該容器内に保持するためのスクリーンであって、該スクリーンは、該スクリーンを通る単球樹状細胞前駆体および樹状細胞の通過を可能にする孔サイズを有する、スクリーン；
該第一のポートと流体連絡する排液ライン；ならびに
該第一のポートと流体連絡する収集ライン、
を備える、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記第一のポートまたは前記第二のポートと流体連絡する、複数の流体源をさらに備える、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記単球樹状細胞前駆体を無菌状態で受け取るように適合された、密封可能な組織培養容器をさらに備える、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記密封可能な組織培養容器が、組織培養バッグ、フラスコまたはバイオリアクターである、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記流体源が、結合媒体、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液を含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記複数の流体源および前記第一のポートと流体連絡するポンプをさらに備える、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記基材を予め決定された温度に維持するための温度制御手段をさらに備える、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記温度制御手段が、ヒータである、請求項２１に記載のデバイス。
【請求項２３】
血液構成成分のサンプルの白血球を富化するための、平行流デバイスであって、以下：
フィルタ（５）によって分離されたクロスフローチャンバ（３）および濾液チャンバ（４）を備える、除去器ユニットであって、該クロスフローチャンバ（３）は、入口（６）および出口（７）を有し、該出口は、該チャンバの上部に中心に配置され、そして該入口は、該フィルタの上方に配置され、そして流体を、該クロスフローチャンバに、該フィルタに対して実質的に平行に導入する、除去器ユニット；
該クロスフローチャンバの入口を通る、該サンプルの予め決定された投入速度（１４）を提供するための手段；ならびに
該フィルタを通る濾過速度（１５）を減少させるための手段、
を備え；
該フィルタが、約３ミクロン〜約７ミクロンの孔サイズを有し；そして
これによって、該サンプルが、該クロスフローチャンバ内の濃縮物中の白血球を富化される、デバイス。
【請求項２４】
血液構成成分を含有するサンプルの白血球を富化するための、平行流デバイスであって、以下：
フィルタ（５）によって分離されるクロスフローチャンバ（３）および濾液チャンバ（４）を有する、除去器ユニット（１）であって、該クロスフローチャンバは、入口（６）および出口（７）を有し、該出口は、該入口の上方でありかつ該チャンバの上部で中心に配置され、そして該フィルタは、該クロスフローチャンバの入口の下方に、該入口に対して実質的に平行に配置される、除去器ユニット；
該クロスフローチャンバの入口を通る該サンプルの、予め決定された投入速度（１４）を提供するための手段；
該フィルタを通る流体の予め決定された濾過速度（１５）を提供するための手段であって、該予め決定された濾過速度が、該予め決定された投入速度の約５分の１〜約１００分の１である、手段；ならびに
該サンプル中の血液細胞の予め決定された濃度を提供するための手段であって、該血液細胞の予め決定された濃度は、１ミリリットルあたり約１０７個〜約１０１０個の細胞である、手段、
を備え；
該フィルタが、約３ミクロン〜約７ミクロンの孔サイズを有し；そして
該サンプルが、該クロスフローチャンバ内の濃縮物中の白血球を富化される、デバイス。
【請求項２５】
被験体由来の血液構成成分のサンプルから白血球を分離するための方法であって、該サンプルは、白血球を含有し、該方法は、以下：
（１）該サンプルを、除去器ユニットの入口を介して該除去器ユニットに導入する工程；
（２）該サンプルを、フィルタに対して実質的に平行なクロスフローに供する工程であって、該フィルタが、約１〜約１０ミクロンの孔サイズを有する、工程；
（３）該流体を、該フィルタを通す濾過に供する工程；および
（４）非白血球血液構成成分を該サンプルから選択的に除去して、白血球を富化された細胞集団を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記除去器ユニットへの導入のために、前記サンプルを、前記被験体から、白血球搬出法、密度遠心分離、鑑別溶解、濾過、またはバフィコートの調製によって調製する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記非白血球血液構成成分が、血漿および血小板を含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記非白血球血液構成成分が、赤血球を含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記白血球が、単球を含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
工程（１）、（２）および（３）を少なくとも２回繰り返して、白血球を富化された細胞集団を形成する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記富化された細胞集団が、少なくとも約２０％の白血球を含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記富化された細胞集団が、少なくとも約６０％の白血球を含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記クロスフローチャンバ内で、前記サンプルの渦運動を誘導する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記白血球を富化された細胞集団を、洗浄溶液で洗浄する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記白血球を富化された細胞集団から、単球樹状細胞を調製する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記単球樹状細胞前駆体の単離が、以下：
単球樹状細胞前駆体接着基材を、前記白血球を富化された細胞集団と接触させる工程；
該細胞集団中の単球樹状細胞前駆体を、該基材への可逆的に接着させ、単球樹状細胞前駆体および基材を含む複合体を形成する工程；
該複合体を、接着していない白血球から分離して、単球樹状細胞前駆体を含む複合体を得る工程；ならびに
該単球樹状細胞前駆体を培養して、該前駆体を分化させ、未熟樹状細胞または成熟樹状細胞を形成する工程、
を包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記単球樹状細胞前駆体が、培養の前に、前記基材から溶出される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記単球樹状細胞前駆体が、前記基材上で培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記基材が、ガラス、ポリスチレン、プラスチック、またはガラスをコーティングされたポリスチレンマイクロビーズを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
血液構成成分のサンプルの白血球を富化するための方法であって、以下：
（１）該サンプルを、平行流濾過（ＴＦＦ）ユニットに導入する工程であって、該ＴＦＦユニットは、クロスフローチャンバ、濾液チャンバ、ならびに該クロスフローチャンバおよび該濾液チャンバと流体連絡するフィルタを備え、該フィルタは、約１〜約１０ミクロンの孔サイズを有する、工程；
（２）該サンプルを、予め決定された投入速度および予め決定された濾過速度で、該ＴＦＦユニットを通して再循環させる工程であって、該予め決定された投入速度が、該予め決定された濾過速度の少なくとも５倍であり、該予め決定された濾過速度が、該フィルタについての対向しない濾過速度より低い、工程；ならびに
（３）白血球を富化された細胞集団を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記富化された細胞集団が、非白血球血液構成成分を実質的に含まない、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
血液を被験体から収集し、そして前記サンプルを、該血液から、白血球搬出、密度遠心分離、鑑別溶解、濾過、またはバフィコートの調製によって調製する工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記非白血球血液構成成分が、血漿および血小板を含有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記非白血球血液構成成分が、赤血球を含有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記白血球が、単球を含有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記富化された細胞集団が、少なくとも約２０％の白血球を含有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記富化された細胞集団が、少なくとも約６０％の白血球を含有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記サンプルが、前記クロスフローチャンバ内で、渦運動で流れる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記富化された細胞集団を洗浄溶液で洗浄する工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記富化細胞集団から樹状細胞を調製する工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記樹状細胞が、以下：
単球樹状細胞前駆体接着基材を、前記富化された細胞集団と接触させる工程；
該富化された細胞集団中の単球樹状細胞集団を、該基材に可逆的に接着させて、単球樹状細胞前駆体および基材を含む複合体を形成する工程；
該複合体を、接着していない白血球から分離して、単球樹状細胞前駆体を含む複合体を得る工程；ならびに
該単球樹状細胞前駆体を培養して、該前駆体を分化させ、未熟樹状細胞または成熟樹状細胞を形成する工程、
によって調製される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記基材が、ガラス、ポリスチレン、プラスチック、またはガラスをコーティングされたポリスチレンマイクロビーズを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記未熟樹状細胞または成熟樹状細胞を単離する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記単球が、樹状細胞への単球の分化を促進するサイトカインと共に培養される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記サイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記樹状細胞が、成熟樹状細胞まで成熟される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記樹状細胞が、抗原と共に、該抗原のプロセシングを誘導する条件下で培養されて、抗原を取り込んだ樹状細胞を形成する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗原を取り込んだ樹状細胞を個体に投与する工程をさらに包含する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗原を取り込んだ樹状細胞が、成熟因子と共に培養されて、該細胞を、成熟抗原提示樹状細胞まで成熟させる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記フィルタが、約３〜約５．５ミクロンの孔サイズを有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項６１】
前記白血球が、ＣＤ３４＋細胞を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記血液構成成分のサンプルが、少なくとも１つの幹細胞動員剤で処理されたドナー由来である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記幹細胞動員剤が、Ｇ−ＣＳＦまたはシクロホスファミドである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記白血球のＣＤ３４＋細胞を富化する工程をさらに包含する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記白血球のＣＤ３４＋細胞の富化が、磁気ビーズに結合した抗ＣＤ３４抗体の使用を包含する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣＤ３４＋細胞をエキソビボで増殖させる工程をさらに包含する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
単球由来の多能性幹細胞を、前記白血球を富化された細胞集団から調製する工程をさらに包含する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
先祖細胞または幹細胞の分化を誘導する工程をさらに包含する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
分化された細胞の分化形質転換を誘導する工程をさらに包含する、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国仮特許出願番号６０／３９０，７３０（２００２年６月１９日出願、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に対して優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
白血球を富化された血液細胞集団は、しばしば、研究または治療における使用のために所望される。白血球の代表的な供給源としては、全末梢血、白血球搬出産物またはアフェレーシス産物、あるいは他のありふれていない供給源（例えば、臍帯血）が挙げられる。白血球の富化は、いくつかの様式でなされ得る。代表的な方法としては、密度段階勾配法（例えば、ＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥ（登録商標）、コロイドシリカなど）、溶出、遠心分離、低張ストックによる赤血球の溶解、およびこれらの方法の種々の組み合わせが挙げられる。これらの方法の各々に対する欠点が存在し、そのうちの１つは、富化工程が実施された後の、面倒な洗浄工程の必要性である。
【０００３】
富化に続いて、細胞は、代表的に、反復プロセスによって洗浄される。これらの工程は、一般に、富化された細胞懸濁物を遠心管に入れる工程、およびこれらの細胞を、遠心力の使用によって、この管の底部にペレット化させる工程を包含する。この管は、遠心器から取り外され、そしてこの上清が、ペレット化された細胞からデカンテーションされる。洗浄液がこの管に添加され、そして細胞ペレットが再懸濁される。これらの工程は、代表的に、２〜４回繰り返される。
【０００４】
この洗浄プロセスの１つの欠点は、連続した再懸濁および遠心分離が、細胞の生存性を減少させ得、そして細胞溶解を増加させ得ることである。遠心分離による洗浄の別の欠点は、細菌または他の感染性因子画細胞を汚染する機会である。全ての材料が滅菌を保たれる場合でさえも、遠心管を繰り返し開くこと、ならびにピペットおよび洗浄溶液の瓶の空気に対する曝露は、汚染を生じ得る。汚染の危険は、重大なものであって、いくつかの医療規制機関が、「閉じた」系のみが細胞の取り扱いのために使用されることを要求する。
【０００５】
濾過方法もまた、他の血液構成成分を後の使用のために取っておきながら、白血球を血液から取り出すために使用されている。このような方法は、一般に、白血球を、回収不可能な形態のフィルタ上に捕捉し、一方で、他の血液構成成分が、このフィルタを通過し、そして収集容器に入ることを可能にする。例えば、フィルタは、輸血後の同種免疫反応の発生数が最小にされるように、白血球を血液から取り出すために利用可能である。この取り出しは、代表的に、マット状プラスチック繊維メッシュから作製されるフィルタを使用してなされる。このメッシュは、通常、白血球を、細胞がフィルタの深さ全体にわたって捕捉されるように十分な深さを有する、網状のマトリックス中に捕捉し、これによって、白血球が平坦な表面上に捕捉される場合に起こるような、このフィルタが詰まることを防ぐように配置される。
【０００６】
細胞の物理的捕捉に加えて、このフィルタの材料および大きい表面積は、白血球が、表面に不可逆的に接着することを可能にする。これらの接着性細胞の多くは、いくつかの医療手順のためにまさに望ましいものである。フィルタへの捕捉および接着の得られる組み合わせは、輸血治療の前の処分のための、白血球の取り出しのための非常に効率的な手段を生じる。しかし、白血球が望ましい細胞である場合、この濾過方法は、有利ではない。
【０００７】
種々の粒子の濾過において有用な方法は、平行流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）濾過（ＴＦＦ）、すなわち「クロスフロー（ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ）」濾過である。ＴＦＦは、多孔性膜フィルタの表面に対して平行な流体の動きに依存する。この膜の孔は、流体、およびこの流体中の、この孔より小さい粒子の通過を可能にする。さらに、フィルタに対して平行な、流体のクロスフロー（すなわち、「平行」流）は、孔より大きい粒子がフィルタ表面に蓄積することを防止する。
【０００８】
ＴＦＦは、種々の材料の大まかな分離のために使用されている。平行流濾過の、薬学的分野での使用は、Ｇｅｎｏｖｅｓｉ（Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒ．Ａｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３７：８１，１９８３）によって概説されており、これには、無菌注射用水の濾過、溶媒系の清澄化、ならびにブロスおよび細菌培養物からの酵素の濾過が挙げられる。Ｍａｒｉｎａｃｃｉｏら（ＷＯ８５／０３０１１）は、血漿瀉血のための、血液からの特定の血液構成成分の取り出しにおいて使用するためのプロセスを報告し、そしてＲｏｂｉｎｓｏｎら（米国特許第５，４２３，７３８号）は、血液細胞および血小板の、患者への再注入を可能にする、血液からの血漿の取り出しのためのＴＦＦの使用を記載する。
【０００９】
別の使用において、ＴＦＦは、ビールの濾過（ＥＰ  ０  ２０８  ４５０）について、特に、酵母細胞および他の懸濁固形物などの粒子の除去について、報告されている。Ｋｏｔｈｅら（米国特許第４，６４４，０５６号）は、乳汁または初乳からの免疫グロブリンの精製における、ＴＦＦの使用を開示し、そしてＣａｓｔｉｎｏ（米国特許第４，４２０，３９８号）は、抗ウイルス物質（例えば、インターフェロン）の、これらの物質を含有するブロスならびにウイルス粒子および細胞からの分離におけるその使用を記載する。同様に、ＴＦＦは、細胞細片からの細菌酵素の分離において使用されている（Ｑｕｉｒｋら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６：２０１，１９８４）。さらに、平行流濾過ユニットは、培養培地中に懸濁された細胞の濃縮において使用されている（例えば、Ｒａｄｌｅｔｔ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：４９５，１９７２を参照のこと）。
【００１０】
ＴＦＦはまた、リポソームおよび脂質粒子を、サイズに従って分離することが、最近報告された（Ｌｅｎｋら、米国特許第５，９４８，４４１号）。ＴＦＦは、このような粒子の不均一な集団から、異なるサイズの範囲を有するリポソームおよび脂質粒子の形成および単離を可能にする（Ｌｅｎｋら、前出を参照のこと）。
【００１１】
しかし、ＴＦＦは、生物学的液体の大まかな分画、および例えば、リポソームの分離のために使用されているが、異なる特徴を有する異なる生存細胞集団の分離のためのＴＦＦの使用は、当該分野において認識されていない。特に、滅菌性、細胞生存性、分化に対する潜在的な造血、および免疫療法細胞活性を維持しながら、他の血液細胞からの白血球集団（例えば、単球、ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞、樹状前駆細胞など）の選択的分離に付随する特有の問題は、取り組まれていない。さらに、他の細胞集団（例えば、重なるサイズ範囲を有する集団）の除去は、現在のアプローチによって解決されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、滅菌性、細胞生存性、分化の可能性、および免疫療法細胞活性を維持しながら、白血球を他の血液構成成分（血漿、赤血球、および／または血小板が挙げられる）から選択的に富化するための、さらなるデバイスおよび方法に対する必要性が、当該分野において残っている。本発明は、これらおよび他の必要性を満足する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、血液および血液製剤からの、白血球の分離に関する。特に、白血球を富化された細胞集団が、平行流濾過デバイスの使用によって調製される。富化された白血球集団および単球、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞が富化された細胞集団の調製のためのデバイスの使用のための方法が、提供される。本発明のデバイスおよび方法の使用によって得られる、白血球および／または単球などが富化された細胞集団は、免疫応答の誘導のために個体に投与するための、抗原提示細胞（例えば、抗原提示樹状細胞）の組成物を構成するため、上皮細胞、ニューロン細胞、内皮細胞、または肝細胞の形成の誘導のための、多能性幹細胞（例えば、ｆ−マクロファージ（ｆ−ＭΦ））の組成物を調製するため、富化された数の造血幹細胞または前駆細胞を含有する組成物を調整するためなどに使用され得る。
【００１４】
本発明の平行流濾過デバイスは、クロスフローチャンバ、濾液チャンバ、およびこれらの間に配置されたフィルタを有する、除去器ユニットを備える。このフィルタは、片側の濃縮物表面において、クロスフローチャンバと流体連絡しており、そして他方の側の濾液表面において、濾液チャンバと流体連絡している。このクロスフローチャンバは、白血球を含有する血液構成成分のサンプルを、クロスフローチャンバ内に、そしてこのフィルタの濃縮物表面に対して平行に導入するように、適合される。出口がまた、このクロスフローチャンバに提供され、この出口は、フィルタの濃縮物表面の逆のチャンバの部分に配置される。平行流濾過デバイスにおける使用に適したフィルタは、代表的に、約１〜約１０ミクロンの範囲の平均孔サイズを有する。特定の実施形態において、このフィルタは、約３〜約７ミクロン、または約３〜約５．５ミクロンの平均孔サイズを有する。
【００１５】
さらに、このデバイスは、予め決定された投入速度のサンプルを、クロスフローチャンバの入口に提供するための手段、およびこのフィルタを通して濾液チャンバ内への濾液の濾過速度を制御するための手段を備え得る。濾過速度制御手段は、濾過の速度を、フィルタについての対向しない濾過速度より低く制限する。血液構成成分を含有するサンプルは、供給デバイス（例えば、白血球搬出デバイス、または例えば、白血球搬出デバイスから収集されるサンプルを含む容器など）によって提供され得る。
【００１６】
平行流濾過デバイスは、回収ユニットをさらに備え得る。入口および出口を備える回収ユニットは、ループの形態で、回収ユニットのクロスフローチャンバと相互接続され得る。デバイスのこの実施形態において、クロスフローチャンバの入口は、回収ユニットの出口と流体連絡しており、そしてクロスフローチャンバの出口は、回収ユニットの入口と流体連絡している。回収ユニットは、サンプル入口および洗浄液入口をさらに備え得る。平行流濾過デバイスの特定の実施形態において、サンプル入口および洗浄液入口は、単一の共有された入口である。代表的に、洗浄液入口は、置換流体または洗浄流体の源と流体連絡している。置換流体または洗浄流体は、例えば、等張緩衝液または組織培養培地であり得る。
【００１７】
回収ユニットのサンプル入口は、血液構成成分の源と流体連絡している。本発明の１つの実施形態において、血液構成成分の供給源は、細胞プロセシングデバイスである。この細胞プロセシングデバイスは、白血球搬出デバイス、または白血球を部分的に富化された細胞集団を生成し得るデバイスであり得る。１つの例において、この細胞プロセシングデバイスは、第一のポートおよび第二のポートを有する容器、第一のポートおよび第二のポートと流体連絡する単球樹状細胞前駆体接着基材、基材を容器内に保持し、そして単球樹状細胞前駆体および樹状細胞の通過を可能にするために十分な孔のサイズを有するスクリーンを備える。このデバイスは、第一のポートまたは第二のポートと流体連絡した廃液ライン、および第一のポートおよび／または第二のポートと流体連絡した収集ラインをさらに備え、この収集ラインはまた、平行流濾過デバイスの回収ユニットのサンプル入口と流体連絡している。
【００１８】
細胞プロセシングデバイスはまた、結合媒体、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液を提供するための、複数の流体源を備え得る。このデバイスは、種々の流体を細胞プロセシングデバイスの内外に移動させるための、ポンプをさらに備え得る。温度制御手段（例えば、ヒータまたは冷却デバイス）もまた、提供され得る。閉じた系を提供する本発明の１つの実施形態において、血液サンプルまたは血液産物調製物は、単球樹状細胞前駆体を接着し得るビーズ材料を含む、細胞プロセシングデバイスに提供される。血液サンプルは、単球樹状細胞前駆体に接着するために十分な時間にわたって、ビーズ材料と接触され、そしてこのデバイスは、廃液ラインを介して、他の細胞成分を洗浄除去される。溶出緩衝液が、細胞プロセシングデバイスに添加され、そして単球の血液サンプルのさらなる富化のために、単球樹状細胞前駆体は、収集ラインを通して、回収ユニットのサンプル入口内へと、無菌的に通過される。
【００１９】
本発明の１つの実施形態において、血液構成成分のサンプルの白血球を富化するための平行流濾過デバイスが提供され、このデバイスは、フィルタによって分離されたクロスフローチャンバおよび濾液チャンバを備える除去器ユニットであって、このクロスフローチャンバは、入口および出口を有し、この出口は、チャンバの上部で中心に位置し、そしてこの入口は、フィルタの上方に位置し、そして流体を、クロスフローチャンバに、フィルタに対して実質的に平行に導入する、除去器ユニット；クロスフローチャンバの入口を通るサンプルの予め決定された投入速度を提供するための手段；ならびにフィルタを通る濾過速度を減少させるための手段を備え；ここで、このフィルタは、約３ミクロン〜約７ミクロンの孔サイズを有し；そしてここで、サンプルは、クロスフローチャンバ内の濃縮物中で、白血球を富化される。さらに、別の特定の実施形態において、フィルタは、細胞集団のＣＤ３４＋を富化するために、約３〜約５．５ミクロンの孔サイズを有する。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、血液構成成分のサンプルの単球を富化するための平行流濾過デバイスが提供され、このデバイスは、フィルタによって分離された、濾液チャンバおよびその下方のクロスフローチャンバを備える除去器ユニットであって、このクロスフローチャンバは、入口および出口を有し、この出口は、チャンバの下部で中心に位置し、そしてこの入口は、フィルタの下方に位置し、そして流体を、クロスフローチャンバに、フィルタに対して実質的に平行に導入する、除去器ユニット；クロスフローチャンバの入口を通るサンプルの予め決定された投入速度を提供するための手段；ならびにフィルタを通る濾過速度を維持するための手段を備え；ここで、このフィルタは、約３ミクロン〜約７ミクロンの孔サイズを有し；そしてこれによって、サンプルは、クロスフローチャンバ内の濃縮物中で、白血球を富化される。さらに、別の特定の実施形態において、フィルタは、細胞集団のＣＤ３４＋を富化するために、約３〜約５．５ミクロンの孔サイズを有する。
【００２１】
本発明のなお別の実施形態において、血液構成成分を含有するサンプルの白血球を富化するための平行流デバイスが提供され、このデバイスは、フィルタ（５）によって分離されるクロスフローチャンバ（３）および濾液チャンバ（４）を有する、除去器ユニット（１）を備え、このクロスフローチャンバは、入口（６）および出口（７）を有し、この出口は、入口の上方でありかつチャンバの上部で中心に配置され、そしてフィルタは、クロスフローチャンバの入口の下方に、この入口に対して実質的に平行に配置される。このデバイスは、クロスフローチャンバの入口を通るサンプルの、予め決定された投入速度を提供するための手段；フィルタを通る流体の予め決定された濾過速度を提供するための手段であって、この予め決定された濾過速度が、予め決定された投入速度の約５分の１〜約１００分の１である、手段；ならびにサンプル中の血液細胞の予め決定された濃度を提供するための手段であって、血液細胞の予め決定された濃度は、１ミリリットルあたり約１０７個〜約１０１０個の細胞である、手段をさらに備える。代表的に、このフィルタは、約３ミクロン〜約７ミクロンの孔サイズを有する。さらに、別の特定の実施形態において、フィルタは、細胞集団のＣＤ３４＋を富化するために、約３〜約５．５ミクロンの孔サイズを有する。
【００２２】
本発明はまた、白血球を含有する血液構成成分のサンプルから白血球を分離するための方法を提供する。この方法において、以下を包含する工程が提供される：（１）サンプルを、除去器ユニットの入口を介して除去器に導入する工程；（２）サンプルを、フィルタに対して実質的に平行なクロスフローに供する工程であって、このフィルタが、約１〜約１０ミクロンの孔サイズを有する、工程；（３）流体を、フィルタを通す濾過に供する工程；および（４）非白血球血液構成成分をサンプルから選択的に除去して、白血球を富化された細胞集団を形成する工程。このサンプルは、除去器ユニットへの導入のために、白血球搬出、密度遠心分離、鑑別溶解、濾過、またはバフィコートの調製によって、部分的な精製または富化に供され得る。１つの実施形態において、サンプルは、クロスフローチャンバ内で、渦運動を有する流れを誘導される。さらに、白血球を富化された細胞集団は、洗浄溶液で洗浄され得る。
【００２３】
本発明の方法において、サンプルから除去される非白血球血液構成成分としては、血漿および血小板、赤血球などが挙げられる。本発明の方法からの生成物の白血球は、単球の実質的に富化された集団を含み得る。富化された細胞集団は、少なくとも約２０％の白血球を含有し得るが、代表的に、少なくとも約６０％以上の白血球を含有し得る。本発明の方法の１つの実施形態において、工程（１）、（２）および（３）は、少なくとも２回繰り返されて、白血球を富化された細胞集団を形成する。白血球を富化された細胞集団は、単球樹状細胞前駆体の調製のために使用され得る。１つの実施形態において、富化された細胞集団は、単球樹状細胞前駆体接着基材と、白血球を富化された細胞集団とを接触させる工程；細胞集団中の単球樹状細胞前駆体を、この基材に可逆的に接着させて、単球樹状細胞前駆体および基材を含む複合体を形成する工程；この複合体を、接着していない白血球から分離して、単球樹状細胞前駆体を含む複合体を得る工程；ならびに単球樹状細胞前駆体を培養して、この前駆体を分化させ、未熟樹状細胞または成熟樹状細胞を形成する工程を包含する方法によって生成される。１つの特定の実施形態において、単球樹状細胞前駆体は、培養の前に、基材から溶出される。単球樹状細胞前駆体を接着するための基材としては、ガラス、ポリスチレン、プラスチック、またはガラスをコーティングされたポリスチレンマイクロビーズが挙げられ得る。
【００２４】
本発明のなお別の実施形態において、血液構成成分のサンプルの白血球を富化するための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（１）サンプルを、平行流濾過（ＴＦＦ）ユニットに導入する工程であって、このＴＦＦユニットは、クロスフローチャンバ、濾液チャンバ、ならびにクロスフローチャンバおよび濾液チャンバと流体連絡するフィルタを備え、このフィルタは、約１〜約１０ミクロンの孔サイズを有する、工程；（２）このサンプルを、ＴＦＦユニットに通して、予め決定された投入速度および予め決定された濾過速度で再循環させる工程であって、この予め決定された投入速度は、予め決定された濾過速度の少なくとも５倍であり、ここで、予め決定された濾過速度は、フィルタについての対向しない濾過速度より低い、工程；ならびに（３）白血球を富化された細胞集団を単離する工程。この方法は、非白血球血液構成成分（血漿、血小板および赤血球）を実質的に含まない、富化された細胞集団を生じ得る。この方法によって生成される、富化された細胞集団は、少なくとも約２０％の白血球、そして代表的に、少なくとも約６０％以上の白血球を含有し得る。この方法は、血液を被験体から収集する工程、およびサンプルを、この血液から、白血球搬出、密度遠心分離、鑑別溶解、濾過、またはバフィコートの調製によって調製する工程を、さらに包含し得る。
【００２５】
一旦、細胞集団の白血球が富化されると、この方法は、白血球に由来し得る特定の細胞型（例えば、樹状細胞前駆体、ＣＤ３４＋造血幹細胞、または多能性幹細胞（例えば、ｆ−マクロファージ）など）を調製する工程をさらに包含し得る。１つの特定の実施形態において、樹状細胞は、富化された細胞集団から調製され得る。この方法において、樹状細胞は、単球樹状細胞前駆体接着基材と、富化された細胞集団とを接触させる工程；細胞集団中の単球樹状細胞前駆体を、この基材に可逆的に接着させて、単球樹状細胞前駆体および基材を含む複合体を形成する工程；この複合体を、接着していない白血球から分離して、単球樹状細胞前駆体を含む複合体を得る工程；ならびに単球樹状細胞前駆体を培養して、この前駆体を分化させ、未熟樹状細胞または成熟樹状細胞を形成する工程によって調製される。この基材としては、ガラス、ポリスチレン、プラスチック、またはガラスをコーティングされたポリスチレンマイクロビーズが挙げられ得る。さらに、単球樹状細胞前駆体は、単球の樹状細胞への分化を促進するサイトカインと共に培養され得る。特定の実施形態において、このサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４である。さらに、樹状細胞は、成熟樹状細胞まで成熟され得る。
【００２６】
一旦、樹状細胞前駆体が単離されると、これらの樹状細胞は、抗原と共に、この抗原のプロセシングを誘導する条件下で培養されて、抗原を取り込んだ樹状細胞を形成し得る。次いで、この抗原を取り込んだ樹状細胞は、個体に投与され得るか、またはこの抗原を取り込んだ樹状細胞は、インビトロもしくはエキソビボで、Ｔ細胞と共に培養されて、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の形成を誘導し得る。この細胞傷害性Ｔ細胞は、誘導された抗原特異的免疫応答を必要とする個体に、例えば、癌および細菌感染またはウイルス感染の処置において、投与され得る。
【００２７】
造血幹細胞を富化された細胞集団が、生成され得る。１つの実施形態において、個体は、幹細胞動員剤（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＭＤ３１００（またはＣＸＣＲ−４機能を阻害する他の薬剤）、または高用量もしくは低用量のシクロホスファミドなど）を与えられ得る。幹細胞動員剤は、ＣＤ３４＋幹細胞の増殖を誘導し、これは、末梢血幹に放出される。個体由来の白血球搬出サンプルは、平行流濾過（ＴＦＦ）ユニットに導入され、このＴＦＦユニットは、クロスフローチャンバ、濾液チャンバ、ならびにクロスフローチャンバおよび濾液チャンバと流体連絡するフィルタを備え、このフィルタは、約３〜約５．５ミクロンの孔サイズを有する；（２）このサンプルを、ＴＦＦユニットに通して、予め決定された投入速度および予め決定された濾過速度で再循環させる工程であって、この予め決定された投入速度は、予め決定された濾過速度の少なくとも５倍であり；この予め決定された濾過速度は、フィルタについての対向しない濾過速度より低い、工程；ならびに（３）ＣＤ３４＋白血球を富化された細胞集団を単離する工程。この方法は、非白血球血液構成成分（血漿、血小板および赤血球が挙げられる）を実質的に含まない、富化された細胞集団を生じ得る。この方法によって生成される、富化された細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞の百分率を、白血球材料の１％〜約５％から、富化された細胞集団中の細胞の約１０％〜約４０％まで、２〜５倍増加させ得る。
【００２８】
さらに、上記のように単離される単球は、Ｍ−ＣＳＦ含有培地中で、非接着性細胞培養容器（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）培養バッグ）中で、培養され得る。Ｍ−ＣＳＦ中での単球の培養は、かなりの数のＣＤ３４＋細胞の生成を生じる。上記のように白血球または単球を富化された細胞集団はまた、当該分野において公知の多数の他のサイトカインおよびロイコカイン（ｌｅｕｋｏｋｉｎｅ）の存在下で培養されて、多数の他の先祖細胞型の産生を生じ得る。例えば、白血球および／または単球を富化された細胞集団は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＥＧＦおよび胎仔血清の存在下で、フィブロネクチンでコーティングされた表面上で培養され得、そして非接着性細胞を処分することによって、内皮様循環脈管形成細胞が得られ得るか、またはｆ−ＭΦは、ＥＧＦ中で培養することによって、上皮細胞に分化され得るか、ＮＧＦもしくはＶＥＧＦ中でインキュベーションすることによって、それぞれニューロン細胞および内皮細胞に分化し得るか、またはＨＧＦの存在下でインキュベーションすることによって、肝細胞に分化し得る、などである。
【００２９】
（特定の実施形態の説明）
本発明は、血液構製成分の不均質な混合物を処理して、白血球の富化された集団を提供するためのデバイスおよび方法を提供する。本発明の１つの局面において、非白血球血液構成成分（例えば、血漿、血小板および／または赤血球など）の選択的な除去による、白血球の富化のためのデバイスおよび方法が提供される。別の局面において、混合物からの、非単球血液構成成分の選択的な除去（例えば、リンパ球、赤血球、血小板などの除去が挙げられる）による、単球の富化のためのデバイスおよび方法が提供される。
【００３０】
白血球の富化された集団は、代表的に、血液構成成分を含有するサンプルまたは流体混合物から調製される。用語「血液構成成分」とは、本明細書中において使用される場合、血液中に代表的に存在する任意の物質（望ましい状態および望ましくない状態で代表的に存在するような材料が挙げられる）をいう。血液構成成分としては、白血球が挙げられ、そして例えば、リンパ球、単球、赤血球、好中球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および／または血小板、可溶性または不溶性のタンパク質またはタンパク質複合体（例えば、酵素、免疫グロブリン、もしくは免疫グロブリン−抗原複合体）、他の高分子構成成分（例えば、脂質、またはその正確な分子もしくは細胞の構成にかかわらず物理的に分離され得る、全血の他の任意の部分（例えば、血漿もしくは血清が挙げられる））が挙げられ得る。
【００３１】
サンプルまたは流体混合物は、本発明の方法を実施する前に、白血球を部分的に富化され得る。用語「白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）」は、用語「白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）」（「ＷＢＣ」）と交換可能に使用される。これらの用語は、単核無顆粒白血球（これには、例えば、単球、樹状細胞前駆体、およびリンパ球が挙げられる）ならびに分節した核および細胞質顆粒を有する多形核顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球、およびマスト細胞が挙げられる）を包含する。「単球」とは、骨髄由来白血球のクラスをいい、一般に、リンパ球より大きく、卵形または腎臓形の核を有し、代表的に、リソソーム顆粒を含み、そして代表的に、ＣＤ１４を発現する。
【００３２】
本発明の特定の局面において、リンパ球は、白血球から分離される。「リンパ球」とは、リンパ前駆細胞由来の細胞をいい、そしてＢリンパ球、Ｔリンパ球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を包含する。用語「小リンパ球」とは、直径が約７〜８ミクロンのリンパ球をいう。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「白血球の集団」とは、白血球を含有する任意の細胞の群をいう。白血球の集団は、広範な白血球のサブタイプまたは特定のサブタイプ（例えば、単球および／または単球樹状前駆細胞）を包含し得る。用語「富化」、「富化する」および「富化された」とは、本発明のデバイスを使用するか、または本発明の方法に従う、血液構成成分の混合物の処理が、他の構成成分と比較して、最初の混合物（すなわち、富化の前）より高い百分率の生存可能な白血球を有する細胞集団を生じることを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「生存可能」とは、適切な培養条件下で分化可能である白血球をいう。
【００３４】
本発明に従うデバイスは、白血球の集団を富化するために、平行流濾過を利用する。用語「平行流濾過」および「クロスフロー濾過」は、交換可能に使用され、そして懸濁した粒子（例えば、細胞）の、流体混合物からの分離（規定された特徴（例えば、所望のサイズ範囲）の粒子の、流体混合物中の粒子の不均一な混合物からの分離を包含する）をいう。これらの粒子は、流体混合物（例えば、サンプル流体）を、フィルタに対して実質的に平行または接線方向（例えば、フィルタの表面がサンプル流体に面する）で、代表的にはいくらかの正圧下で、濃縮された粒子または白血球を含有する流体混合物が膜表面に対して接線方向に流れ続ける状態で、サンプルチャンバに通すか、またはサンプルチャンバ内で循環させることによって、分離される。
【００３５】
一般に、どの粒子が「濾液」、すなわち、フィルタを通過する流体の部分に除去されるか、および「濃縮物」中に残される粒子の決定は、種々の要因に依存する。このような要因としては、例えば、フィルタの孔サイズ、投入速度、濾過速度、流体混合物中の粒子の濃度、温度、および流体混合物の粘度が挙げられる。本明細書中において使用される場合、「孔サイズ」とは、フィルタ中の孔の平均サイズをいう。「投入速度」とは、サンプル（例えば、流体混合物）が、フィルタを収容するチャンバに導入される速度をいう。サンプルがフィルタを横切って複数回再循環される場合（例えば、本発明に従うデバイスにおいて）、投入速度はまた、「再循環速度」と称される。「クロスフロー」とは、フィルタを横切る流体混合物の実質的に平行な（すなわち、任意の方向で、フィルタの表面に対して平行な）流れをいう。「クロスフロー速度」とは、サンプルまたは流体混合物の、フィルタを越える、フィルタに対して実質的に平行な流れの速度をいう；流体混合物のクロスフロー速度は、一般に、種々のパラメータ（例えば、投入速度、ならびにフィルタを収容するチャンバの大きさおよび形状が挙げられる）に依存する。「濾過速度」とは、フィルタを通る流体混合物の流れの速度をいう。本発明に従うデバイスおよび方法についての濾過速度は、代表的に、対向しない（すなわち、開管）濾過速度より低い。「排出速度」とは、フィルタを通過する流体混合物（すなわち、濾液）以外の、クロスフローチャンバからの流体混合物の除去の速度をいう。排出速度は、一般に、投入速度から濾過速度を減算したものに等しい。
【００３６】
本明細書中において使用される場合、用語「フィルタ」とは、物品にわたるクロスフローに供されるサンプルまたは流体混合物の一種以上の構成成分（例えば、血液構成成分）がこの物品を通過し、これによって、これらの構成成分（例えば、非白血球）を他の血液成分（例えば、白血球）から分離することを可能にする、複数の孔を有する、任意の材料または材料の組み合わせから作製される任意の物品をいう。フィルタの表面は、任意の適切な面積を有し得、例えば、直径が約４２〜約１４５ｍｍであるが、より大きい面積またはより小さい面積のフィルタが使用され得る。特定の実施形態において、１つのフィルタのみが、ＴＦＦデバイスにおいて使用される。他の実施形態において、さらなるフィルタが、ＴＦＦデバイスにおいて使用され得る。
【００３７】
本発明のＴＦＦデバイスにおいて代表的に使用されるフィルタは、広範な有機ポリマーフィルタから選択され得る。このようなフィルタとしては、ナイロン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース／硝酸セルロース、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、およびポリアミドの細孔膜が挙げられるが、これらに限定されない。他のフィルタ（例えば、セラミックフィルタおよび金属フィルタ）もまた使用され得る。親水性フィルタと疎水性フィルタとの両方、荷電フィルタと非荷電フィルタとの両方が、使用され得る。特定の適用において、親水性フィルタが好ましくあり得る。
【００３８】
本発明のフィルタは、代表的に、このフィルタの面積にわたって分布する、多数の孔を備える。特定の実施形態において、このフィルタは、孔サイズの変動が小さい孔サイズを有する。例えば、孔サイズの変動性は、約±２０％、または約＋０〜約２０％の範囲内であり得る。代表的な実施形態において、「ニュークレポア（ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）」フィルタまたは「トラックエッチ（ｔｒａｃｋ  ｅｔｃｈｅｄ）」フィルタ（例えば、Ｐｏｒｅｔｉｃｓ（登録商標）ポリエチレンまたはポリカーボネートトラックエッチフィルタ膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ））が使用される。これらのフィルタは、代表的に、材料において孔サイズが厳密に制御された、平滑な表面を有する。このようなフィルタは、代表的に、非多孔性プラスチックの平坦なシートを、プラスチックシートを貫通するために十分なエネルギーを有する放射能粒子の源に曝露することによって、調製される。次いで、化学溶媒またはエッチング剤への曝露によって、「軌道」の直径が拡大される。孔のサイズは、トラックエッチング条件によって制御され得る。
【００３９】
本発明は、白血球（例えば、単球、樹状細胞前駆体など）を富化するために、血液中の種々の細胞型の間の差を利用する。このような差としては、例えば、サイズ、形状および／または変形能の差が挙げられ得る。ヒト血液中の細胞のサイズおよび変形能は、代表的に、細胞型によって異なる。赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ））は、代表的に、両凹ディスク形状であり、核がなく、大きい直径の測定値が約７ミクロンであり、そして比較的変形しやすい。多形核白血球は、代表的に、回転楕円対であり、これもまた、約７ミクロンであるが、赤血球ほど変形しやすくない。単核細胞のうちで、リンパ球は、代表的に、７〜１０ミクロンであり、そして単球は、通常、１０〜１５ミクロンの範囲である。
【００４０】
種々の実施形態において、フィルタの孔サイズは、白血球を富化し、そして／または血液構成成分を分画し、これによって白血球を富化するように、選択される。例えば、特定の実施形態において、１０〜１５ミクロンの見かけの直径を有する単球、および７ミクロンの見かけの直径を有する赤血球は、約５〜約５．５ミクロンの孔サイズを有するフィルタを使用するＴＦＦによって、分離され得る。特定の実施形態において、４．５ミクロンのフィルタが、白血球搬出サンプルの他の細胞性構成成分から単球を首尾よく分離するために、使用された。
【００４１】
他の実施形態において、フィルタの孔サイズは、約１〜約１０ミクロン、または約３〜約８ミクロン、または約３〜約５ミクロンの範囲内であり得る。約３ミクロンの範囲のフィルタの孔サイズは、大部分の白血球を保持し得、そして白血球からの赤血球の非効率的な除去をもたらす。対照的に、約８ミクロンの範囲のフィルタの孔サイズは、赤血球のより効率的な除去を生じ得るが、濾液中への白血球の損失を増加させる。約３〜約５．５ミクロンのフィルタサイズは、ＣＤ３４＋造血幹細胞を富化するために使用され得る。
【００４２】
他の細胞性血液構成成分からの白血球の富化はまた、投入速度、濾過速度、および／またはサンプルもしくは流体混合物中の細胞の濃度によって影響を受け得る。例えば、赤血球は、白血球より変形しやすく、従って、赤血球の大きい直径より小さい（例えば、約７ミクロン未満の）フィルタの孔サイズをより容易に通過し得る。特定の例において、赤血球は、約５ミクロンの孔サイズを有するフィルタを使用して、白血球から分離され得る。他の実施形態において、赤血球を白血球から効率的に分離するために、フィルタの孔サイズは、約３ミクロンまで減少し、そして細胞の濃度が増加（上昇）される。
【００４３】
白血球の、他の細胞性血液構成成分からの富化はまた、対向しない（すなわち、開管）濾過速度未満の濾過速度を、同じ投入速度または再循環速度より低く維持することによって、なされ得る。他の実施形態において、濾液への白血球の損失は、濾過速度より高い投入速度または再循環速度を維持することによって、減少され得る。例示的な実施形態において、投入速度または再循環速度は、濾過速度の少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍、大きくあり得る。
【００４４】
ＴＦＦによる細胞分画のための、種々の血液構成成分を含有するサンプルまたは流体混合物は、種々の源から得られ得、そして処理の種々の段階のいずれかにおける、血液産物の流体混合物が挙げられ得る。例えば、血液供給源は、ヒト供給源または非ヒト供給源のいずれかであり得る。さらに、流体混合物は、例えば、全血、全血の種々の希釈物、または例えば、血漿もしくは他の血液構成成分の除去による処理に供された全血もしくは血液希釈物であり得る。従って、流体混合物としては、例えば、すでに白血球を少なくとも部分的に富化された血液細胞集団が挙げられ得る。
【００４５】
血液構成成分、または白血球の集団は、当業者に周知の方法によって調製され得る。このような方法としては、代表的に、ヘパリン化血液の収集、アフェレーシスまたは白血球搬出術、バフィコートの調製、ロゼット形成（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）、遠心分離、密度勾配遠心分離（例えば、ＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥ（登録商標）、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）、スクロースなど）、非白血球細胞の鑑別溶出、濾過などが挙げられる。白血球集団はまた、被験体から血液を収集し、血小板の除去のために線維除去し、そして赤血球の大部分を溶解することによって、調製され得る。白血球の集団は、必要に応じて、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を通しての遠心分離によって、単球を富化され得る。
【００４６】
血液構成成分を含有する流体混合物は、必要に応じて、所望されるように、希釈または濃縮され得る。例えば、特定の実施形態において、血液構成成分は、１：２、１：５、１：１０、または他の任意の適切な希釈で希釈される。血液構成成分は、例えば、等張緩衝液（例えば、ＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水）、組織培養培地などで希釈され得る。代表的に、ＴＦＦに供される血液構成成分のサンプルは、１ｍｌあたり約１０６〜約１０８個の細胞の細胞濃度を有する。
【００４７】
血液細胞集団は、白血球の富化された集団の所望の使用に従って、種々の型の被験体から得られ得る。被験体は、健常な被験体であり得る。あるいは、血液細胞は、免疫刺激が必要な被験体（例えば、癌患者または免疫刺激が有利であり得る他の患者）から得られ得る。同様に、血液細胞は、免疫抑制が必要な被験体（例えば、自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症など）を有する患者）から得られ得る。血液細胞集団はまた、免疫刺激が必要なＨＬＡに適合する患者への投与のために、ＨＬＡに適合する健常な個体から得られ得る。血液細胞集団はまた、幹細胞動員剤（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＳＣＦ、ＡＭＤ３１００（または他のＣＸＣＲ−４機能を阻害する薬剤）、または低用量もしくは高用量のシクロホスファミド（Ｄｅｌｉｌｉｅｒｓら、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４３：１９５７、２００２）など）を投与された個体から収集され得る。個体は、富化された細胞集団を受ける患者、血族、またはＨＬＡに適合する個体であり得る。
【００４８】
特定の実施形態において、白血球の富化された集団は、濃縮物中に収集され得、一方で、他の血液構成成分は、濾液に入る。例えば、白血球（例えば、単球およびリンパ球が挙げられる）の集団の富化のために、他の血液構成成分（例えば、血漿、血小板、および／または赤血球）は、構成成分のうちでも、濾液中に選択的に除去され得る。さらなる実施形態において、リンパ球、または小リンパ球は、濾液中に選択的に除去され得、そして濾液中に選択的に入り得る。
【００４９】
図１Ａ〜１Ｃに示されるような、本発明に従うデバイスは、代表的に、クロスフローチャンバ（３）および濾液チャンバ（４）を備える。フィルタ（５）は、これらのクロスフローチャンバと濾液チャンバとの間に配置され、そして一方の表面（濃縮物表面）でクロスフローチャンバと流体連絡し、そして他方の表面（濾液表面）で濾液チャンバと流体連絡する。クロスフローチャンバ、濾液チャンバおよびフィルタは、除去器ユニット（１）を構成する。１つの実施形態において、クロスフローチャンバは、代表的に、約５５ｍｌの体積を有し、そして濾液チャンバは、約２５ｍｌの体積を有する。フィルタの直径は、代表的に、クロスフローチャンバの直径と実質的に同じである。本発明の利用を実証するために使用される特定の実施形態において、フィルタは、約１４０ｍｍ〜約１４３ｍｍの直径である。
【００５０】
流体混合物は、流体入口（６）を通ってクロスフローチャンバ（３）に入り、この流体入口は、代表的に、フィルタの濃縮物表面に隣接して配置され、そしてその結果、流体混合物（例えば、サンプル）は、フィルタの濃縮物表面に対して実質的に平行に、チャンバに入る。代表的に、流体は、流体出口（７）を通してクロスフローチャンバ（３）から除去され、この流体出口は、通常、フィルタの濃縮物表面に対して垂直な、クロスフローチャンバの部分に位置する。特定の例示的な実施形態において、クロスフローチャンバの入口（６）の直径は、約７ｍｍ〜約８ｍｍであり、そしてクロスフローチャンバの出口（７）の直径は、約８ｍｍ〜約１０ｍｍである。濾液は、濾液チャンバ（４）の出口（８）を通して除去される。
【００５１】
代表的に、流体混合物は、フィルタの表面（濃縮物表面）を横切る流体混合物のクロスフローが、流体および細胞をフィルタの接触表面（すなわち、境界層）で穏やかに破壊し、そして逆混合するために十分に高い速度であるような、十分な投入速度で、クロスフローチャンバに導入される。本明細書中において使用される場合、「境界層」とは、フィルタに隣接し、そしてフィルタの濃縮物側にあり、代表的に、フィルタを通過する流体によって残される流体の層をいう。境界層のこの破壊は、フィルタの接触表面の材料がフィルタに結合するか、または停滞すること（これらは、効率的な濾過を妨げ得る）を防止することによって、効率的な濾過を容易にする。しかし、流体混合物の投入速度は、通常、かなりの数の白血球の溶解を引き起こすために十分ではない。
【００５２】
特定の実施形態において、血液構成成分は、流体混合物をクロスフローチャンバ（３）内にポンピングすることによって、フィルタの濃縮物表面を横切って通る。フィルタを横切る流体のクロスフローを駆動するために使用されるポンプは、「クロスフローポンプ」または「再循環ポンプ」（１４）と称される。クロスフローポンプとしては、流体の流れを、特定された投入速度で、細胞に対する実質的な損傷（例えば、細胞溶解）を引き起こさずに、クロスフローチャンバ（３）に導入し、そしてフィルタを横切らせるために十分な、チャンバと流体連絡する任意のポンピングデバイスが挙げられ得る。本発明において使用するために適切なクロスフローチャンバとしては、例えば、蠕動ポンプ、ピストンポンプ、ダイアフラムポンプ、またはローラポンプが挙げられ得る。蠕動ポンプは、例えば、ＴＦＦデバイスを「閉じた」系の一部として維持することが望ましい場合に使用され得る。
【００５３】
流体混合物は、代表的に、クロスフローチャンバ（３）に、濾過速度を超える投入速度でポンピングされる。例示的な実施形態において、投入速度は、約１６８０ｍｌ／分であり、そして濾過速度は、約１５ｍｌ／分である。他の例示的な実施形態において、投入速度は、約１６００〜約１８００ｍｌ／分であり、そして濾過速度は、約１０〜約２０ｍｌ／分である。非白血球材料（例えば、赤血球、免疫複合体、タンパク質など）は、フィルタ（５）を通過して、濾液チャンバ（４）に入る。
【００５４】
上で議論されたように、濾過速度は、代表的に、対向しない（すなわち、開管）速度未満である。濾過速度は、例えば、濾液チャンバの出口の大きさを減少または制限すること、第二のポンプ手段（例えば、「濾過ポンプ」）を使用して流れを制限することなどによって、制御され得る。
【００５５】
別の例示的な実施形態において、流体混合物の、デバイスへの導入は、流体内での渦運動を引き起こす。これは、例えば、流体混合物を、例えば、円筒形のクロスフローチャンバ内の円形のフィルタに対して実質的に平行に、濾過速度の約５倍または約１０倍〜約１００倍の投入速度で導入することによって、なされ得る。フロースルーは、円筒形チャンバ内に、フィルタに対して垂直に位置し、そして代表的に、フィルタ表面の中心に隣接する、出口（７）によって除去される。この配置は、流れを、フィルタの中心に向けて螺旋状に内向きにする。この流れは、代表的に、白血球のかなりの溶解を引き起こすような乱流でも高速でもない。上で議論されたように、流れはまた、フィルタ表面を「洗浄」して、境界層の結合または滞留を防止し得る。投入速度を、濾過速度に対して大きく（例えば、少なくとも約５倍に）なるように較正することによって、得られる白血球の富化された集団は、少なくとも約２０％、または少なくとも約４０％、あるいはそれより多くの白血球であり得る。
【００５６】
別の例示的な実施形態において、濃縮物は、分離の効率を増加するように、再循環される。例えば、血液構成成分を含有する流体混合物は、クロスフローチャンバに導入され得、次いで、濃縮物が、クロスフローチャンバの流体出口（７）を通して別のチャンバ（例えば、流体が最初に提供されるチャンバ（「回収ユニット」；（２）））内に引き出され得る。次いで、回収ユニット内の流体混合物は、クロスフローユニット内に再導入され得る。回収ユニット（２）と除去器ユニット（１）とを「ループ形態」で接続することによって、流体混合物の連続的な再循環および濾過が達成され得る。あるいは、濃縮物は、クロスフローチャンバ（３）の流体出口（７）を通して引き出され得、そしてクロスフローチャンバの入口に直接再導入され得る（すなわち、回収ユニットまたは別のチャンバを通過しない）。流体混合物は、任意の適切な時間にわたって、クロスフローユニットを通過し得る。特定の実施形態において、流体混合物は、所望の白血球の純度または富化を達成するために、約５〜約６０分間、またはそれより長く再循環され得る。
【００５７】
なお別の実施形態において、流体混合物の体積は、緩衝液、洗浄溶液または他の溶液（包括的に、「置換液体」と称される）を添加することによって、調節され得る。洗浄溶液は、例えば、回収ユニット内で（例えば、溶液入口（１３）を介して）か、除去器ユニット内でか、ポンプ（１４）においてか、除去器ユニットへ、もしくは除去器ユニットから延びる管内でか、または他の任意の好都合な位置で、流体混合物と合わされ得る。従って、濃縮物中の細胞は、同じ操作で、富化および洗浄され得る。代表的に、洗浄溶液は、細胞と等張性である。適切な緩衝液および洗浄溶液としては、種々の緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水）、組織培養培地などが挙げられ得る。
【００５８】
特定の実施形態において、細胞集団は、白血球の集団を、閉じた無菌系において富化される。本明細書中において使用される場合、用語「閉じた無菌系」または「閉じた系」とは、非滅菌条件、周囲条件、または循環空気もしくは他の非滅菌状態への曝露が、最小化または排除された系いう。細胞集団を富化するための閉じた系は、一般に、頂部が開いた管内での遠心分離、野外での細胞の移動、組織培養プレートまたは密封されていないフラスコでの細胞の培養などを排除する。濾過システム全体（例えば、任意の細胞コンテナ、インキュベータ、組織培養容器、および細胞プロセシングのための他の装置（下記）を含む）が、「閉じた」系として維持され得る。代表的な実施形態において、閉じた系は、白血球の無菌富化、および必要に応じて、最初の収集容器から密封可能な組織培養容器への移動を、非滅菌空気への曝露なしで可能にする。代表的に、蠕動ポンプ（図１Ａおよび１Ｃ；（１５））手段は、閉じた系において使用される。
【００５９】
本発明の別の局面において、血液構成成分の不均一な混合物は、この混合物からの、非白血球血液構成成分（例えば、血漿、血小板、赤血球などが挙げられる）の選択的な除去によって、実質的に、白血球を富化される。本明細書中において使用される場合、用語「実質的に富化される」とは、濃縮物中に回収された細胞集団が、所望される程度に多くのサイクルの再循環に続いて、少なくとも約２０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約６０％の所望の細胞型（例えば、白血球）を含有することを意味する。他の実施形態において、血液構成成分の不均一な混合物は、白血球を富化されて、非白血球血液構成成分を実質的に含まない、白血球の富化された集団を形成する。本明細書中において使用される場合、用語「実質的に含まない」とは、白血球の富化された集団が、少なくとも５０％の白血球を含有することを意味する。
【００６０】
本発明のこの局面の例示的な実施形態において、ＴＦＦデバイスは、約５５ｍｌの体積を有するクロスフローチャンバ（３）、および約２５ｍｌの体積を有する濾液チャンバ（４）を備える。さらに、このデバイスは、以下から構成される：約１〜約１０ミクロン、または約２〜約８ミクロン、または約３〜約５ミクロンのフィルタ孔サイズ；約１６００〜約１８００ｍｌ／分の投入速度；約１２〜約１７ｍｌ／分の濾過速度、および約１４２ｍｍのフィルタ直径。最初の流体混合物は、代表的に、１ｍｌあたり少なくとも約１０７個の細胞（例えば、白血球または他の細胞）の細胞濃度を有する。
【００６１】
本発明の別の局面において、血液構成成分の不均一な混合物は、非単球血液構成成分の選択的な除去（例えば、混合物からのリンパ球の除去が挙げられる）によって、単球を実質的に富化される。本明細書中において使用される場合、用語「選択的除去」、「選択的に除去される」および「選択的に除去する」とは、１つの細胞型の優先的な除去、および別の細胞型の富化をいう。この局面の例示的な実施形態において、ＴＦＦデバイスは、約５５ｍｌの体積を有するクロスフローチャンバ（３）、および約２５ｍｌの体積を有する濾液チャンバ（４）を備える。さらに、このデバイスは、以下から構成される：約１〜約１０ミクロン、または約２〜約８ミクロン、または約３〜約５ミクロンのフィルタ孔サイズ；約１６００〜約１８００ｍｌ／分の投入速度；約１２〜約１７ｍｌ／分の濾過速度、および約１４２ｍｍのフィルタ直径。最初の流体混合物は、代表的に、１ｍｌあたり少なくとも約１０７個の細胞（例えば、白血球または他の細胞）の細胞濃度を有する。この実施形態において、このデバイスは、逆の様式で操作された。
【００６２】
（富化された細胞集団の培養、発現および分化）
上に記載されたように白血球集団を付加した後に、これらの白血球は、必要に応じて、それらの生存性を維持するため、細胞の数を増加させるため、および／またはこれらの細胞を別の細胞型に分化させるために、培養され得る。適切な組織培養容器としては、例えば、組織培養フラスコ、バッグ、プレート、バイオリアクター（醗酵槽が挙げられる）などが挙げられる。
【００６３】
例示的な実施形態において、白血球の富化された集団は、閉じた無菌系（例えば、バイオリアクター、組織培養バッグなど）において培養され得る。この閉じた系は、流体（例えば、組織培養培地、洗浄緩衝液）、気体、細胞などの、制御された無菌での導入または除去のための、入口及び／または出口を有し得る。
【００６４】
別の例示的な実施形態において、白血球の富化された集団は、バイオリアクターに移動され得る。このバイオリアクターは、細胞、滅菌気体（例えば、酸素、二酸化炭素、および／または空気）、組織培養培地などの導入のために適切な入口および／または出口を備え得る。このバイオリアクターはまた、温度を制御するための手段を有し得る。このバイオリアクターは、代表的に、約３７℃で操作される。このバイオリアクターはまた、バイオリアクター内の細胞および／または培養培地を撹拌するための手段を備え得る。この撹拌手段としては、例えば、パドルまたはスピンフィルタ（これらは、媒体の出口として機能し得る）が挙げられ得る。
【００６５】
なお別の例示的な実施形態において、白血球の富化された集団は、閉じた系（例えば、組織培養バッグ）に移動され得る。適切な組織培養バッグとしては、例えば、ＳＴＥＲＩＣＥＬＬ（登録商標）培養コンテナ（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）またはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）培養バッグ（Ａｍｅｒｉｍａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。閉じた系は、当業者によって理解されるような、任意の適切な大きさまたは体積を有し得る。適切な体積としては、例えば、約０．０１リットル〜約５リットル、または約０．０１リットル〜約０．０５リットルが挙げられるが、より大きい体積およびより少ない体積が可能であり、そして本発明の範囲内である。
【００６６】
本発明に従う種々の実施形態において、白血球（例えば、単球、単球樹状細胞前駆体、ＣＤ３４＋造血幹細胞、または他の前駆細胞が挙げられる）を富化された細胞集団は、必要に応じて、適切な誘導因子の添加によって、培養および分化され、特定の細胞型の細胞（例えば、未熟または成熟樹状細胞ｆ−マクロファージ、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞、あるいは他の前駆細胞が挙げられる）を得ることが可能である。適切な組織培養培地としては、例えば、ＡＩＭ−Ｖ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５ＴＭなどが挙げられる。組織培養培地は、所望であれば、細胞の、例えば、未熟樹状細胞への分化を促進するために、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および／またはインターロイキン（ＩＬ−４）、二価カチオンなどを補充され得る。代表的なサイトカインの組み合わせは、約５００単位／ｍｌずつのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４である。
【００６７】
白血球の富化された集団は、任意の適切な時間にわたって培養され得る。特定の実施形態において、未熟樹状細胞までの細胞の分化のために適切な培養時間は、約４〜約７日間であり得る。未熟樹状細胞の、前駆体からの分化は、当業者に公知の方法（例えば、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１４−、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ８３ｌｏ、ＨＬＡ−ＤＲ＋）の存在または非存在）によってモニタリングされ得る。未熟樹状細胞はまた、適切な組織培養培地中で培養されて、細胞集団を増殖させ得、そして／または未熟樹状細胞を、さらなる分化もしくは抗原の取り込み、プロセシングおよび提示のための状態に維持し得る。例えば、未熟樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で維持され得る。
【００６８】
特定の実施形態において、未熟樹状細胞は、最適な抗原提示のために好ましい。なぜなら、これらは、新たな抗原をプロセシングする能力を保持するからである（例えば、Ｋｏｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：９３−１００，１９９５を参照のこと）。対照的に、抗原に提示され、そして抗原を成熟抗原までプロセシングする成熟樹状細胞（例えば、ＣＤ１４−、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋）は、代表的に、新たな抗原を効率的に提示する能力を失っている。
【００６９】
培養の間、未熟樹状細胞は、必要に応じて、予め決定された抗原に曝露され得る。適切な予め決定された抗原としては、Ｔ細胞の提示のための任意の抗原（例えば、活性化、増殖の刺激、アネルギーの誘導など）が挙げられ得る。１つの実施形態において、未熟樹状細胞は、腫瘍関連抗原（例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ））の存在下で培養され得る（例えば、癌の免疫療法および／または腫瘍増殖の阻害のため）。他の抗原としては、例えば、細菌抗原およびウイルス抗原、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原（例えば、腫瘍細胞溶解酵素、腫瘍細胞膜調製物、腫瘍から単離された抗原、融合タンパク質、リポソームなど）、ならびに他の任意の抗原が挙げられ得る。抗原との接触に続いて、細胞は、任意の適切な時間にわたって、培養され、抗原の取り込みおよびプロセシングを可能にし得、抗原特異的な樹状細胞の集団を増殖させ得る、などである。未熟樹状細胞はまた、ＭＨＣ分子の観点で抗原を提示する成熟樹状細胞に成熟され得る。このような成熟は、例えば、成熟因子（例えば、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）、細菌産物（例えば、ＢＣＧ）など）の存在下で培養することによって、実施され得る。
【００７０】
本発明の別の局面において、血液構成成分の不均一な混合物は、単球樹状前駆細胞を実質的に富化され得る。細胞の集団の、上記のような白血球または単球の富化に続いて、単球樹状細胞前駆体（例えば、末梢血由来のもの）は、基材（例えば、単球樹状細胞前駆体結合基材）への選択的な接着を介して、富化された集団から単離され得る。このような基材は、例えば、組織培養ディッシュまたはフラスコによって提供され得る。あるいは、高い表面積対体積比を有する基材（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０２／２３８６５（２００２年７月２５日出願、その開示は、本明細書中に参考として援用される）に開示されるような、粒子性基材または繊維性基材）が、使用され得る。単球樹状細胞前駆体は、基材に選択的に接着して、単球樹状細胞前駆体および基材の複合体を形成する単球であり得、一方で、他の白血球は、結合しないままである（「非接着性」）。次いで、接着した白血球は、結合していない白血球から分離されて、基材上の単球樹状細胞前駆体が富化された細胞の集団を形成する。この単球樹状細胞前駆体は、基材上で培養および分化されるか、または基材から溶出され、次いで別個に培養および分化されて、未熟抗原提示樹状細胞および／または成熟抗原提示樹状細胞を与え得る。この局面に従って、単球樹状細胞前駆体は、必要に応じて、閉じた無菌系において単離および分化され得る。
【００７１】
別の局面に従って、予め決定された抗原に曝露される樹状細胞は、インビトロまたはインビボでこの抗原に対してＴ細胞を活性化するために使用され得る。樹状細胞は、必要に応じて、抗原への曝露の直後に、Ｔ細胞を刺激するために使用され得る。あるいは、樹状細胞は、抗原およびＴ細胞への曝露の前に、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）の組み合わせの存在下で維持され得る。特定の実施形態において、ヒト樹状細胞が、ヒトＴ細胞をインビトロまたはインビボで刺激するために使用される。
【００７２】
Ｔ細胞またはＴ細胞のサブセットは、種々のリンパ球組織から得られ得る。このような組織としては、秘蔵、リンパ節、および末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞の精製は、例えば、ポジティブ選択またはネガティブ選択（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、および／またはＣＤ８に対する抗体の使用が挙げられるが、これらに限定されない）を提供することによって、達成され得る。
【００７３】
Ｔ細胞は、混合されたＴ細胞集団としてか、または精製されたＴ細胞サブセットとして、予め決定された抗原に曝露された樹状細胞と共培養され得る。例えば、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原に曝露された樹状細胞と共培養されて、抗原特異的ＣＴＬを産生し得る。特定の実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞の初期の排除は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との両方の混合培養物中での、ＣＤ４＋細胞の過剰増殖を防止し得る。あるいは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合された集団は、樹状細胞と共培養されて、サイトカインとＴＨ免疫応答との両方を包含する抗原に特異的な応答を生じ得る。
【００７４】
このような刺激されたＴ細胞は、必要に応じて、被験体に再注入され得る（例えば、ＲｉｄｄｌｅおよびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４５：３５−４３，２０００；Ｃｏｒｒｅａｌｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０７：１３０−３９，２０００を参照のこと；これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）。例えば、未熟樹状細胞は、抗原（例えば、ＰＳＭＡ）と接触され得、そして成熟されて、成熟樹状細胞を形成し得る。Ｔ細胞は、被験体から単離され得、成熟樹状細胞とエキソビボで接触され得、次いで、この被験体に再投与され得る。例えば、約１×１０７〜約５×１０９個のＣＤ８＋Ｔ細胞の用量は、被験体に、毎週、または２週間おきに、１〜４ヶ月、またはより長い期間にわたって、投与され得る。あるいは、成熟樹状細胞は、直接、被験体に投与され得る。代表的に、約１×１０７個の樹状細胞が、患者への１回の投与あたりで使用される。
【００７５】
代表的に、幹細胞動員剤で処置されたドナー由来の白血球搬出生成物は、約１０〜約２５％の単球の周りで、十分な量の赤血球および血小板を含み、約１〜５％の細胞、約５〜約２０％の顆粒球、約４０〜約６０％の白血球を含有する。本発明のＴＦＦデバイスを、約３〜約５．５ミクロンの孔サイズを有するフィルタと共に使用すると、約６０〜約７０％の単球を含有し、顆粒球をほとんど含まず、約１０％のリンパ球および約１０〜約４０％のＣＤ３４＋細胞を含有する、富化された白血球集団が生じる。この富化された白血球手段は、以下に記載されるように使用され得る。
【００７６】
他の実施形態において、本発明の方法は、単球または単球樹状細胞前駆体以外の細胞サブセットを得るために使用される。例えば、富化された白血球の集団は、例えば、同種異型移植または自己由来移植のための、造血幹細胞の供給源として使用され得る。特定の実施形態において、富化された白血球の集団は、平行流分離手順に続いて、幹細胞をさらに富化される。造血幹細胞を、末梢血白血球の供給源から富化するための方法は、当該分野において公知であり、そして本明細書中に記載されるように単離された白血球の富化された集団と共に使用するために、適合され得る。例えば、白血球の富化された集団は、例えば、免疫磁気分離技術（例えば、Ｒｏｗｅｌｙら、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２１：１２５３，１９９８；Ｄｅｎｎｉｎｇ−Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０５：７８０，１９９９を参照のこと）を使用して、ＣＤ３４＋細胞をさらに富化され得る。さらに、幹細胞の収量をさらに増加させるために、本発明に記載されるようなＴＦＦに続いて単球を富化された細胞集団は、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦの存在下で、胎仔血清を含有する培地中で培養されて、ＣＤ３４＋細胞を誘導し得る。この培養は、非接着性の細胞培養コンテナ（例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）培養バッグ）中で実施されなければならない。さらに、末梢血ドナーは、末梢血の収集およびＴＦＦによる白血球の分離の前に、幹細胞動員レジメンに供され得る。幹細胞の収穫の効率を増加させるための種々の動員剤が、当該分野において公知である。例えば、ドナーは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＡＭＤ３１００（またはＣＸＣＲ−４機能を阻害する他の薬剤）、および／または動員化学療法剤（例えば、高用量もしくは低用量のシクロホスファミド）で処理され得る（例えば、Ｄｅｌｉｌｉｅｒｓら、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，４３：１９５７，２００２を参照のこと）。血液ドナーは、移植を受ける患者、血族、ＨＬＡに適合する個体などであり得る。
【００７７】
なお別の実施形態において、本発明の方法はまた、非幹細胞サブセット（例えば、前駆細胞（例えば、造血前駆細胞もしくは内皮前駆細胞）または目的の因子（例えば、造血増殖因子もしくは脈管形成増殖因子）を分泌する細胞の細胞集団）を得るために使用される。例えば、循環内皮前駆細胞（ＣＥＰ）は、例えば、ＶＥＧＦＲ−２およびＡＣ１３３（ならびに例えば、ＶＥ−カドヘリンおよびＥ−セレクチン）の同時発現）によって、循環ＣＤ３４＋のサブセットとして同定され得る（例えば、Ｐｅｉｃｈｅｖら、Ｂｌｏｏｄ  ９５：９５２、２０００を参照のこと）。白血球の富化された集団は、例えば、ＶＥＧＦＲ−２およびＡＣ１３３に対する抗体を用いる免疫磁気分離技術を使用して、ＣＥＰをさらに富化され得る。また、ＣＥＰは、サイトカイン（例えば、ＶＥＧＦ）での処理によるＴＦＦの前に、動員され得る（例えば、Ｇｉｌｌら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．，８８：１６７，２００１を参照のこと）。さらに、なお他の実施形態において、内皮様循環脈管形成細胞（ＣＡＣ）（これは、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦを分泌する）は、白血球の富化された集団を、例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、およびＦＢＳと共に、フィブロネクチンでコーティングされた表面で培養し、次いで、非接着性細胞を処分することによって、得られる（例えば、Ｒｅｈｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７：１１６４、２００３を参照のこと）。
【００７８】
さらに、白血球の富化された集団は、培養されて、多能性前駆細胞または幹細胞の増殖を誘導し得る。例えば、ＣＤ３４＋幹細胞は、造血増殖因子（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＧ−ＣＳＦの組み合わせなど）との培養によって、増殖され得る（例えば、Ｓｕｎら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８８：５６１、２００３を参照のこと）。あるいは、例えば、単球を富化された集団は、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、および／またはＩＬ−６で処理されて、多能性「ｆ−マクロファージ」（ｆ−ＭΦ）を与え得、これは、形態学的に、線維芽細胞に類似しており、そして標準的なマクロファージとは異なり、上昇したレベルのＣＤ３４を提示する（Ｚｈａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：２４２６、２００３を参照のこと）。前駆細胞または幹細胞は、実質的に、任意の種々のサイトカインおよび増殖因子で処理されて、造血株または非造血株への分化を誘導する。
【００７９】
他の実施形態において、白血球の富化された集団は、分化（例えば、前駆細胞の分化、またはより分化した細胞型（例えば、単球もしくは単球由来の樹状細胞）の分化転換）を誘導するために適切な条件下で培養され得る。（本明細書中において使用される場合、「分化転換」とは、いかなる細胞分割をも一般的に必要としない、分化した細胞の表現型の改変のプロセスであって、これによって、分化した細胞は、形態学的および／または機能的に異なる細胞型に分化するプロセスをいう。）例えば、樹状細胞への分化に加えて、単球は、培養条件に依存して、他の造血細胞型または非造血細胞型（例えば、マクロファージ、破骨細胞、および内皮様細胞が挙げられる）に形質転換され得る（例えば、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３７０３、１９８７；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ．９９：１３３、２０００；Ｈａｖｅｍａｎｎら、Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ４７−５７（Ｎｉｃａｎｏｒ  Ｉ．Ｍｏｌｄｏｖａｎ編、２００３）を参照のこと）。１つの実施形態において、単球または単球由来の樹状細胞の富化された集団は、例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ヒドロコルチゾン、およびＦＣＳとともに、フィブロネクチンでコーティングされた表面で培養することによって、内皮様細胞に分化転換される（Ｈａｖｅｍａｎｎら、前出を参照のこと）。また、白血球の富化された集団は、比較的分化していない細胞サブセット（例えば、多能性前駆細胞または幹細胞）の分化を誘導する条件下で、造血株または非造血株に、種々のサイトカインまたは増殖因子のいずれかを使用して、培養され得る。例えば、単球由来の多能性幹細胞（ｆ−ＭΦ）は、例えば、ＬＰＳ、ＩＬ−２、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、またはＨＧＦでの処理によって、それぞれ、標準的なマクロファージ、Ｔリンパ球、上皮細胞、ニューロン細胞、内皮細胞、または造血細胞への分化を誘導され得る（Ｚｈａｏら、前出を参照のこと）。このような分化は、例えば、上に記載されたような細胞増殖の前または後に誘導され得る。
【００８０】
以下の実施例は、本発明の種々の局面の例示として単に提供され、そしていずれの様式においても、本発明を限定するとは解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８１】
（実施例１：除去器ユニットおよび回収ユニットをループの構成で備えるＴＦＦデバイス）
本発明の１つの実施形態は、除去器ユニット（１）および回収ユニット（２）を、平行流濾過デバイスのループ構成で有する構成を備える（図１Ａ）。この除去器ユニットは、約１ミクロン〜約１０ミクロンの孔サイズを有する細孔フィルタ（５）（直径１４２ｍｍ）によって分離される、２つのチャンバ（クロスフローチャンバ（３）および濾液チャンバ（４））を有するハウジングを備えた。クロスフローチャンバは、流体入口（６）および流体出口（７）を備えた。濾液チャンバは、濾液出口（８）を備えた。回収ユニットは、戻り入口（１０）、戻り出口（１１）、サンプル入口（１２）、および溶液入口（１３）を収容する、ハウジング（９）を備えた。特定の実施形態において、サンプル入口および溶液入口は、同じであるが、別々であり得る。サンプル（例えば、血液、血液製剤、または調製された白血球の集団）を、再循環ポンプ（１４）の作動によって、サンプル入口（１２）によって回収ユニットに導入し、そして戻り出口（１１）を通して、除去器ユニットに引き抜いた。サンプルを、流体入口（６）を通して除去器ユニットに導入し、そして細孔膜（５）を横切って流し、その結果、流体の移動は、濾過の方向に対して接線方向に方向付けられた。流体入口（６）を、フィルタの半径に対してほぼ垂直に配置した。入口、濾過、および出口の相対的な速度は、渦を生じ、この渦の中心は、血液性剤中の構成成分を、フィルタを通過させずに、流体出口（７）に引き込み、そして回収ユニット（２）に戻した。回収ユニット除去器ユニットとの間の流体の流れを、再循環ポンプ（１４）によって制御した。除去器ユニットからの濾液の除去を、濾液ポンプ（１５）によって制御した。
【００８２】
（実施例２：ＴＦＦ後の白血球の保持−保持効率に対する再循環速度および濾液速度の影響）
この実施例において、実施例１に記載されるようなＴＦＦデバイス（これは、直径１４２ｍｍのポリエステル膜を収容した）を使用する、白血球の富化を実証した。白血球生成物のサンプルを、デバイス中でのＴＦＦに、種々の条件下で供し、そして白血球の選択的保持を評価した。１セットの研究において、ＴＦＦを、１０ｍｌの白血球生成物に対して、３ミクロンのフィルタを使用して、１５ｍｌ／分の濾液速度で（１７分間）、そして種々の再循環（投入）速度（例えば、１６８０ｍｌ／分、１３８０ｍｌ／分、１０８０ｍｌ／分、８７０ｍｌ／分、および５４０ｍｌ／分）で実施した。大部分の白血球は、再循環速度が１０８０ｍｌ／分未満でない限り、一般に、濃縮物中に保持された（すなわち、濃縮物中約１０％未満の白血球）（図２；注記：最大、１０、９、８、７、および６で示される、対応する実際の再循環速度は、それぞれ、１６８０ｍｌ／分、１３８０ｍｌ／分、１０８０ｍｌ／分、８７０ｍｌ／分、および５４０ｍｌ／分であった）。
【００８３】
別のセットの研究において、ＴＦＦを、１０ｍｌの白血球生成物について、実施例１のＴＦＦデバイスにおいて、３ミクロンのフィルタを使用して、１０８０ｍｌ／分の再循環（投入）速度で、３つの異なる濾過速度（１１ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、および１９．６ｍｌ／分、）で実施した。１つの研究に対して、約２５０ｍｌの濾液を収集した。１９．６ｍｌ／分の濾過速度も１１ｍｌ／分の濾過速度も、白血球の保持について、実質的に、１５ｍｌ／分の濾過速度ほど有利ではなかった（図３）。
【００８４】
（実施例３：白血球生成物からの赤血球の選択的除去）
この実施例において、赤血球の選択的除去、ならびに実施例１のＴＦＦデバイスを使用する分離効率に対する、再循環速度、濾過速度およびサンプル濃度の影響を、実証した。白血球生成物のサンプルを、実施例２で確立された条件下でＴＦＦに供し、そして赤血球の選択的除去を評価した。実施例２においてのように、ＴＦＦを、１０ｍｌのリンパ球搬出生成物について、３ミクロンのフィルタを使用して、１５ｍｌ／分の濾過速度で（１７分間）、そして種々の再循環（投入）速度（例えば、１６８０ｍｌ／分、１３８０ｍｌ／分、１０８０ｍｌ／分、８７０ｍｌ／分、および５４０ｍｌ／分、）で実施した。一般に、細循環速度を減少させることによって、より多くの赤血球が濾液に入ることを促進することが実証された（図４；注記：最大、１０、９、８、７、および６で示される、対応する実際の再循環速度は、それぞれ、１６８０ｍｌ／分、１３８０ｍｌ／分、１０８０ｍｌ／分、８７０ｍｌ／分、および５４０ｍｌ／分であった）。再循環速度を低下させることによって、濃縮物からの赤血球の除去は増加したが、１０８０ｍｌ／分未満の再循環速度においては、濃縮物中の白血球の流量が減少したことが見られ得る（図４）。
【００８５】
実施例２においてと同様に、ＴＦＦを、１０ｍｌの白血球生成物について、同じＴＦＦデバイスにおいて、３ミクロンのフィルタを使用して、１０８０ｍｌ／分の再循環（投入）速度で、３つの異なる濾過速度（１１ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、および１９．６ｍｌ／分）で実施した。１回の研究あたり約２５０ｍｌの濾液を収集した。１９．６ｍｌ／分の濾過速度も１１ｍｌ／分の濾過速度も、赤血球の選択的除去について、実質的に、１５ｍｌ／分の濾過速度ほど有利ではなかった（図５）。１９．６ｍｌ／分の濾過速度は、１５ｍｌ／分よりも、濃縮物中の赤血球を減少させたが、実施例２に見られるように、１５ｍｌ／分の濾過速度は、濃縮物中の白血球のより大きい収量を生じた（図３）。
【００８６】
図６を参照すると、サンプル中の白血球材料の濃度を増加させる効果もまた試験した。５０ｍｌの白血球搬出材料（ＰＢＳ＋ヘパリン＋ＤＮａｓｅ  Ｉ中１：５に希釈）を、３ミクロンの孔サイズを有するフィルタを備えるデバイスを使用するＴＦＦに供した。濾過速度が約１５ｍｌ／分または１９．６ｍｌ／分である場合、濃縮物中の赤血球の百分率（「ＲＢＣ」で示される）は、およそ同じであり、投入の約１００％であった。しかし、５０ｍｌの白血球搬出生成物を、同じ緩衝液中に１：２に希釈した場合、投入された赤血球のほんの４０％が、濃縮物中に保持された。このことは、より高いサンプル濃度の負荷はまた、白血球（「ＷＢＣ」で示される）からの赤血球の分離を促進し得ることを示す。
【００８７】
（実施例４：白血球搬出生成物からの赤血球の選択的除去−赤血球の除去に対する孔サイズの影響）
実施例１に記載されるＴＦＦデバイスの実施形態が、スケールアップの際にも同様に機能することを確認するために、１２０ｍｌの白血球搬出生成物（ユニット全体の１／２）のＴＦＦを、４．５ミクロンに対して、３ミクロンの孔サイズを有するフィルタを備えるデバイスにおいて比較した。再循環（投入）速度は、１６８０ｍｌ／分であり、そして濾過速度は、１５ｍｌ／分であった。図７を参照すると、４．５ミクロンのフィルタを使用して実施されるＴＦＦについては、赤血球（「ＲＢＣ」で示される；黒い影付きの棒）の約８０％が濃縮物から除去され、一方で、投入された白血球（「ＷＢＣ」で示される；明るい影付きの棒）の約６２％、または投入された単球の約７０％より多くが保持された。対照的に、３ミクロンのフィルタを使用すると、投入された白血球の約６５％が、濃縮物中に保持されたが、赤血球のほんの３％が、除去された。
【００８８】
図８を参照すると、４５ｍｌの白血球搬出生成物のＴＦＦを、８ミクロンに対して４．５ミクロンの穴サイズを有するフィルタを有するデバイスにおいて比較した。再循環（投入）速度は、１６８０ｍｌ／分であり、そして濾過速度は、１５ｍｌ／分であり、そして時間は６０分間であった。４．５ミクロンのフィルタを使用して実施されるＴＦＦについては、赤血球（「ＲＢＣ」で示される；黒い影付きの棒）の約９９％が濃縮物から除去され、一方で、投入された白血球（「ＷＢＣ」で示される；明るい影付きの棒）の約９０％が保持された。８ミクロンのフィルタについては、投入された赤血球の約９８％が除去されたが、白血球のほんの４％が、保持された。このことは、４．５ミクロンのフィルタを使用することにより、より大きい８ミクロンの孔サイズのフィルタと等しい赤血球の除去が促進されたが、白血球「ＷＢＣ」で示される）のより良好な保持が得られたことを示す。
【００８９】
（実施例５：血小板および血漿の除去を伴う白血球の選択的富化）
この実施例において、白血球搬出生成物のサンプルを、実施例１に記載されるデバイスでのＴＦＦに、種々の条件下で供し、そして血小板および結晶の選択的除去を評価した。表１の実験１〜６を参照すると、４５ｍｌの白血球搬出生成物を、４．５ミクロンまたは８ミクロンのいずれかの孔サイズを有するフィルタを備えるＴＦＦに供した。再循環速度（投入速度）は、１６９０ｍｌ／分または１８８０ｍｌ／分のいずれかであり、そして濾過速度は、１５ｍｌ／分であった。濾過を、示されるように、６０分間または９０分間行った。ＴＦＦに続いて、濃縮物を、白血球、血小板、および血漿について評価した。全ての実験において、孔サイズ（４．５ミクロンまたは８ミクロン）、再循環（投入）速度（１６９０ｍｌ／分または１８８０ｍｌ／分）、および時間（６０分または９０分）とは無関係に、９２％〜約１００％の間の投入された血小板および約９７％〜約９９％の投入された血漿が、濃縮物から除去された。実験７について、白血球搬出生成物全体（２５０ｍｌ）を、４．５ミクロンの孔サイズ、１６９０ｍｌ／分の再循環（投入）速度、１５ｍｌ／分の濾過速度、９０分間の持続時間を使用するＴＦＦに供した。ＴＦＦに続いて、濃縮物をアッセイし、そして投入された白血球の約８４％を有するが、投入された血小板のほんの２％および投入された血漿の３％のみを有することを見出した。
【００９０】
【表１−１】
2005529746.tif 000003
【００９１】
【表１−２】
2005529746.tif 000004
【００９２】
これらの実験は、ＴＦＦが、複数の孔サイズ（４．５ミクロンまたは８ミクロン）、再循環（投入）速度（１６９０ｍｌ／分または１８８０ｍｌ／分）、白血球搬出産物の体積（４５ｍｌまたは２５０ｍｌ）および時間（６０分〜９０分）について、血小板および血漿のほとんどを除去することを示す。
【００９３】
（実施例６：全白血球搬出生成物からの白血球の選択的富化）
ＴＦＦデバイスのこの実施形態が、より大きいサンプルサイズへのスケールアップの際に再現可能に機能することを確認するために、５倍のデバイスに設計されたＴＦＦデバイスを、２５０ｍｌの白血球搬出生成物（全ユニット）とともに、４．５ミクロンの孔サイズのフィルタ、１６８０ｍｌ／分の再循環速度、および１５ｍｌ／分の濾過速度を使用して用い、そしてより低い投入体積と比較した。図９を参照すると、ＴＦＦを、９０分間、３つの異なる白血球搬出生成物に対して、異なる比に実施した。８０％と９５％との間の赤血球が、濃縮物から除去され、一方で、投入された単球の約８０から約１００％が保持された。図９の実験１についてのＴＦＦに続いて、濃縮物をまた評価し、そして投入された血小板の約２％のみ、および投入された血漿の３％を有することが見出された（表１に実験７と示される）。これらのデータは、ＴＦＦが、白血球を再現可能に富化し得、そして赤血球、血小板、および血漿を、濃縮物から優先的に除去し得ることを実証した。
【００９４】
（実施例７：血液製剤の単球を選択的に富化するためのＴＦＦデバイス）
白血球の富化に加えて、血液製剤からの単球の選択的富化を、ＴＦＦ装置を使用して試験した。デバイスのこの特定の実施形態は、膜を横切る重力の方向を変化させることによって流動力学を変化させるように設計された、逆（「ＩＶ型」）構成を備えた（図１Ｃ）。２３５ｍｌの白血球搬出生成物を、９０分間、４．５ミクロンの孔サイズのフィルタ、１６８０ｍｌ／分の再循環（投入）速度、および１５ｍｌ／分の濾過速度を使用して、ＴＦＦに供した。ＴＦＦの６０分後、有効な濾液を増加させるために、急激の体積を、約１２０ｍｌまで減少させた。投入物、濃縮物、および濾液を、各々、細胞計数についてアッセイした。投入物は、３２％の単球および６５％のリンパ球を有したが、濃縮物は、２２％のリンパ球と比較して、約７１％の単球を有することが見出された。濾液は、８３％のリンパ球と比較して、１．５％の単球を含んだ（表２を参照のこと）。
【００９５】
【表２】
2005529746.tif 000005
【００９６】
（実施例８：ＴＦＦによって単離された細胞からの樹状細胞の産生）
この実施例において、ＴＦＦによって単離および精製された細胞集団を、単球樹状前駆細胞からの樹状細胞の成熟のための標準的な条件で培養した。ＴＦＦによって単離された細胞の集団は、約５８．６％の単球、２２％のリンパ球、および１２．５％の顆粒球を含有した。この細胞の混合物を、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地中で、それぞれ５００ＵのＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦと共に、組織培養バッグに導入した。５日後、これらの細胞の約５０％を採取し、ＤＣマーカーについて染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。他方の約５０％の細胞を、成熟因子（ＢＣＧ（２．８×１０５ｐｆｕ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ））に曝露した。２４時間後、これらの細胞もまた採取し、そして同じ様式で分析した。表３は、これらの分析の結果を示す。提供される値は、樹状細胞のうちの陽性の細胞（すなわち、大きい細胞に対するゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）後）の百分率を表す。
【００９７】
【表３】
2005529746.tif 000006
【００９８】
フローサイトメーター分析の前方光散乱パラメータおよび側方散乱パラメータに基づいて、未熟樹状細胞集団が、約７１％の生存ＤＣ、２１％のリンパ球および７％のその他の細胞（ほとんどが、未知の起源の死んだ細胞）を含有することが実証された。成熟樹状細胞集団は、６１％の生存ＤＣ、２１％のリンパ球、および１５％の他の細胞を含有した。これらの結果は、ＴＦＦによって白血球搬出材料から直接精製された単球が、樹状細胞を成熟させる標準的な培養条件を使用して、ＤＣに効率的に転換され得ることを実証した。
【００９９】
（実施例８：ガラスビーズ上での単球の単離）
白血球の富化された集団を、先の実施形態のいずれかに従うＴＦＦによって単離する。ＴＦＦの間、緩衝液を、１％の熱不活性化自己由来血漿（結合媒体）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で置き換える。ガラスビーズ（２０グラム）を、結合媒体中で２回洗浄することによって調製し、そして引き続いて、ビーズを保持するためのフリットを取り付けた６０ミリリットルのシリンジに入れ、カラムベッドを形成する。（あるいは、Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐｌｕｓマイクロキャリアビーズ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ製の処理されたスチレンコポリマービーズ）またはＨｉｌｌｅＸマイクロキャリアビーズ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ製のスチレンコポリマービーズ）が使用され得る。）次いで、結合媒体を、重力流によって、カラムベッドから排出する。ＴＦＦからの白血球の富化された集団を、このカラムに適用し、そして任意のフロースルーを収集する。結合媒体を添加して、カラムベッドの上に、小さい液体の層を提供する。細胞を含むカラムを、３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１００】
インキュベーション後、カラムポートを開き、そしてフロースルーを収集する。次いで、カラムベッドを、与えられた結合媒体（３５ｍｌ／洗浄）で６回洗浄し、そしてカラムポートを通して複数回除去して、ビーズを穏やかに再懸濁させる。これらの洗浄に続けて、リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）で２回洗浄する。細胞計数を、全ての洗浄液およびもとのフロースルーについて得、そしてこれらを、前方および側方散乱ＦＡＣＳ分析によって分析して、単球の存在を決定する。洗浄の完了後、結合した単球を、ＰＢＳ／０、４％  ＥＤＴＡ（ｗ／ｖ）を使用してビーズから溶出し、続いて、１回以上ＰＢＳで洗浄する。これらの画分中に得られる細胞を、洗浄液と同じ様式で分析する。単球に富む画分をプールする。
【０１０１】
（実施例９：ガラスビーズから溶出された単球からの樹状細胞の分化）
単球を、３０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、そして培養培地（１ｍｌあたり５００ＵのＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕのインターロイキン４を含むＸ−ＶＩＶＯ  １５（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｃｏｒｐ．））中に再懸濁させる。次いで、この細胞懸濁液の一部（２／３）を、ロータリーバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ）に移し、そして５％のＣＯ２を含む湿潤環境中３７℃で６日間培養する。培養後、この細胞集団は、細胞の大きさ、顆粒性および細胞表面マーカーに基づいて、約７０％の未熟樹状細胞を含む。
【０１０２】
（実施例１０：前立腺特異抗原での未熟樹状細胞の活性化）
単球を、先の実施例において記載されたように、前立腺癌患者から単離する。これらの単球を、組織培養バッグ中で、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン４（各々５００Ｕ／ｍｌ）を補充されたＸ−ＶＩＶＯ  １５組織培養培地中で、３７℃で６日間培養する。次いで、得られる未熟樹状細胞を、この培養培地に添加された前立腺特異抗原（ＰＳＭＡ）（米国特許第５，７８８，９６３号に記載されるように単離された）に曝露する。次いで、成熟因子を使用して、未熟樹状細胞を分化させて、成熟樹状細胞を形成する。成熟（活性化）樹状細胞を、Ｔ細胞増殖アッセイに添加する。Ｔ細胞培養物を、５％のＣＯ２を補充した加湿した３７℃のインキュベータ内で５日間インキュベートし、その後、マイクロタイタープレートの１つのウェルあたり１μＣｉの３Ｈ−チミジンを添加する。２４時間のインキュベーション後、細胞を半自動細胞採取器（Ｓｋａｔｒｏｎ，Ｓｔｅｖｉｎａ，Ｖａ．）で採取し、そして収集した細胞の放射能を決定する。Ｔ細胞増殖を、３Ｈ−ＴｄＲの平均取り込みの測定によって評価する。
【０１０３】
（実施例１１：培養された成熟樹状細胞が抗原を提示する能力）
培養された成熟樹状細胞が、抗原を提示し、そして同じ患者由来の自己由来Ｔ細胞を刺激する能力を評価するために、Ｔ細胞増殖アッセイを、上記（実施例１０）のように実施する。破傷風トキソイドを、これらの実験における代表的な抗原として選択して、患者の記憶Ｔ細胞がインビトロで活性化され得るか否かを決定する。患者の樹状細胞および破傷風トキソイドと共に培養される自己由来のＴ細胞は、バックグラウンドレベル（樹状細胞の非存在下）より有意に高いレベル、および破傷風トキソイドなしで成熟（活性化）樹状細胞）と培養される（すなわち、自己由来の混合リンパ球反応を示す）Ｔ細胞より有意に高いレベルで増殖する。従って、樹状細胞による破傷風トキソイドの提示は、Ｔ細胞増殖のために有用である。
【０１０４】
（実施例１２：自己由来のＴ細胞の刺激）
前立腺癌に特異的な成熟（活性化）樹状細胞は、前立腺癌患者の自己由来のＴ細胞を刺激するために使用される。ＬＮＣａＰ細胞の粗製細胞溶解物である、転移性前立腺癌細胞株を、米国特許第５，７８８，９６３号（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に一般的に記載されるようなＴ細胞増殖アッセイにおいて、代表的な前立腺癌抗原として使用する。成熟活性化樹状細胞とＬＮＣａＰ溶解物との両方が、Ｔ細胞培養物中に含まれる場合、３ＨＴｄＲ取り込みの有意な増加が観察される。
【０１０５】
（実施例１３：被験体への刺激された自己由来のＴ細胞の投与）
細胞を、被験体からの白血球搬出によって調製する。Ｔ細胞を、成熟活性化樹状細胞と接触させる。これらの樹状細胞を、ＬＮＣａＰ細胞（転移性前立腺癌細胞株）の粗製細胞溶解物との接触後に成熟させる。接触後、活性化Ｔ細胞を、１用量あたり約１０７〜約５×１０９細胞の容量で、被験体に投与する。
【０１０６】
（実施例１４：単球からＣＤ３４＋幹細胞の転換）
末梢血中のＣＤ３４＋細胞の百分率は、極端に低く、約０．０１％〜約０．１％の範囲である。ＣＤ３４＋細胞は、造血機能の首尾よい移植のために必要な細胞型であると認識されている。単球を、上記デバイスおよび方法を使用して、末梢血から単離し得、１×１０９〜２×１０９個の単球を得ることが可能である。次いで、これらの細胞を、ウシ胎仔血清を含有する５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ中で、培養して、ＣＤ３４＋細胞を駆動し得る。これらの培養は、非接着性環境（例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）培養バッグ）中で実施されなければならない。標準的なポリスチレン組織培養フラスコ中の培養物は、ＣＤ３４＋細胞に発育しない。培養物中の大きい細胞の分析は、ＣＤ３４＋細胞が、より大きいサイズ範囲で見出されることを明らかにした。
【０１０７】
【表４】
2005529746.tif 000007
【０１０８】
この方法によって調製されるＣＤ３４＋細胞は、レシピエントの骨髄の再構築のための移植に使用され得るか、または他のサイトカインの存在下でさらに培養されて、例えば、心筋梗塞などの処置において使用するための内皮細胞を作製し得る。
【０１０９】
本明細書中に提供される実施例は、例示的であることが意図されるが、特許請求される発明の範囲を限定するとは意図されない。本発明の他の改変物は、当業者に容易に明らかになり、そして添付の特許請求の範囲に包含される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の参考文献はまた、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、白血球およびまた単球の、血液製剤サンプルからの分離のための、平行流濾過デバイスの実施形態を示す。図１Ａは、クロスフローチャンバが濾過チャンバの上方にある、白血球の富化のためのデバイスの実施形態を提供する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、白血球およびまた単球の、血液製剤サンプルからの分離のための、平行流濾過デバイスの実施形態を示す。図１Ｂは、単球の富化のための、サンプルの投入がフィルタの下方であり、そして濾液が、このフィルタを通って上方に通るデバイスの正面図を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、白血球およびまた単球の、血液製剤サンプルからの分離のための、平行流濾過デバイスの実施形態を示す。図１Ｃは、図１Ｂに示されるデバイスの上面図である。
【図２】図２は、白血球搬出生成物の産物に対して種々の条件下で実施される、平行流濾過（ＴＦＦ）の例を示す。１０ｍｌの白血球搬出生成物のサンプル（ＰＢＳ＋ヘパリン＋ＤＮａｓｅ  Ｉの緩衝液中で１：５に希釈される）を、１５ｍｌ／分の濾過速度を有する３ミクロンのフィルタを使用して、ＴＦＦに注入した。ＴＦＦ後の、濃縮物（「濃縮物」と示される；斜線付きの棒）中の白血球（ＷＢＣ）の百分率および濾液（「濾液」と示される；黒い棒）中の白血球（ＷＢＣ）の百分率が示される。最大、１０、９、８、７、および６についての再循環（投入）速度は、それぞれ１６８０ｍｌ／分、１３８０ｍｌ／分、１０８０ｍｌ／分、８７０ｍｌ／分、および５４０ｍｌ／分に対応した。
【図３】図３は、１０８０ｍｌ／分の再循環（投入）速度を有する３ミクロンのフィルタを使用して、３つの異なる濾過速度（１１ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、および１９．６ｍｌ／分）で、ＴＦＦデバイスにおいて白血球搬出生成物に対して実施したＴＦＦの研究の結果を示す。濃縮物（斜線付きの棒）または濾液（「濾液」と示される；黒い棒）における白血球（「ＷＢＣ」と示される）の百分率が示される。
【図４】図４は、図１に示される研究についての白血球搬出生成物のサンプルに対して実施された、ＴＦＦのさらなる結果を示す。１０ｍｌの白血球搬出生成物のサンプル（１：５に希釈される）を、１５ｍｌ／分の濾過速度を有する３ミクロンのフィルタを使用して、ＴＦＦに注入した。ＴＦＦ後の、濃縮物（「濃縮物」と示される；斜線付きのボックス）中の赤血球（ＲＢＣ）の百分率または濾液（「濾液」と示される；黒いボックス）中の赤血球（ＲＢＣ）の百分率が示される。最大、１０、９、８、７、および６についての再循環（投入）速度は、それぞれ１６８０ｍｌ／分、１３８０ｍｌ／分、１０８０ｍｌ／分、８７０ｍｌ／分、および５４０ｍｌ／分に対応した。
【図５】図５は、図２に示される研究についての白血球搬出生成物のサンプルに対して実施された、ＴＦＦのさらなる結果を示す。１０ｍｌの白血球搬出生成物のサンプル（１：５に希釈される）を、１０８０ｍｌ／分の再循環（投入）速度を有する３ミクロンのフィルタを使用して、３つの異なる濾過速度（１１ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、および１９．６ｍｌ／分）で、ＴＦＦに供した。濃縮物（「濃縮物」と示される；斜線付きのボックス）中の赤血球（ＲＢＣ）の百分率または濾液（「濾液」と示される；黒いボックス）中の赤血球（ＲＢＣ）の百分率が示される。
【図６】図６は、サンプル中の白血球搬出材料の濃度を増加させることの効果の例を示す。５０ｍｌの白血球搬出材料（ＰＢＳ＋ヘパリン＋ＤＮａｓｅ  Ｉ中で１：５に希釈される）を、３ミクロンの孔サイズのフィルタを有するデバイスを使用するＴＦＦに供した。濃縮物（「濃縮物」と示される）中の赤血球（「ＲＢＣ」と示される）および白血球（「ＷＢＣ」と示される）の百分率が、濾過速度の関数として示される。
【図７】図７は、白血球搬出生成物のスケールアップ（１２０ｍｌ、すなわち全単位の１／２）の際の、３ミクロンのフィルタと５ミクロンのフィルタとの間の白血球搬出生成物の分離の例を示す。再循環（投入）速度は、１６８０ｍｌ／分であり、そして濾過速度は、１５ｍｌ／分であった。５ミクロンのフィルタを使用して実施されるＴＦＦについては、赤血球（「ＲＢＣ」と示される；黒い影付きの棒）の約８０％が、濃縮物から除去され、一方で、投入された白血球（「ＷＢＣ」と示される；明るい斜線付きの棒）の約６２％、または投入単球の約７０％より多くが、保持された。対照的に、３ミクロンのフィルタを使用すると、投入された白血球の約６５％が濃縮物中に保持されたが、赤血球の３％のみが除去された。
【図８】図８は、サンプルとして提供される白血球搬出生成物の量のスケールアップの際の、約４．５ミクロンのフィルタおよび８ミクロンのフィルタを通しての白血球搬出生成物の分離の比較を示す。再循環（投入）速度は、１６８０ｍｌ／分であり、そして濾過速度は、１５ｍｌ／分であった。４．５ミクロンのフィルタを使用して実施されるＴＦＦについては、赤血球（「ＲＢＣ」と示される；黒い影付きの棒）の約９９％が、濃縮物から除去され、一方で、投入された白血球（「ＷＢＣ」と示される；明るい斜線付きの棒）の約９０％が保持された。対照的に、８ミクロンのフィルタでは、投入された白血球の約９８％が除去されたが、赤血球の４％のみが保持された。
【図９】図９は、処理される白血球搬出生成物のスケールアップ（２５０ｍｌ、すなわち全単位）の際の、４．５ミクロンのフィルタでの分離の例を示す。再循環（投入）速度は、１６８０ｍｌ／分であり、そして濾過速度は、１５ｍｌ／分であった。３つの異なる白血球搬出生成物に対して９０分間実施された、４．５ミクロンのフィルタでのＴＦＦについては、赤血球の約８０〜９５％が、濃縮物から除去され、一方で、投入された白血球の約８０〜１００％が保持された。１つの白血球搬出サンプルのＴＦＦに続いて、濃縮物はまたアッセイされ、そして投入された白血球の約２％のみおよび投入された血漿の３％のみを有することが見出された（表１の実験７に示される）。
【図１Ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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