(57)【要約】本出願において、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）ポリペプチドを含む組成物、およびそのＫＧＦポリペプチドを使用する方法が、記載されている。本発明のＫＧＦポリペプチドは、全長ＫＧＦ１６３に対して増強された生物活性を示す。従って、本発明のＫＧＦポリペプチドは、ＫＧＦ１６３を使用して必要な量よりも少ない量で、組成物において使用され得る。本出願はまた、上皮細胞増殖を刺激するための医薬の製造におけるＫＧＦポリペプチドの使用、および創傷を処置するための医薬の製造におけるＫＧＦポリペプチドの使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞増殖を刺激するための医薬の製造におけるＫＧＦポリペプチドの使用であって、該ＫＧＦポリペプチドは、
（ｉ）図１のアミノ酸残基１６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１５；
（ｉｉ）図１のアミノ酸残基１９〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１８；
（ｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２０〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１９；
（ｉｖ）図１のアミノ酸残基２１〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２０；
（ｖ）図１のアミノ酸残基２２〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２１；
（ｖｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２；
（ｖｉｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４；
（ｖｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２５；
（ｉｘ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）の生物学的に活性なアナログであって、該生物学的に活性なアナログは、それぞれ、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する、生物学的に活性なアナログ；
からなる群より選択され、
該ＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつ該ポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、該ＫＧＦポリペプチドは、治療上有効な量で存在し、該治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の７５％以下である、使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）に対して少なくとも９０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項４】
請求項１に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２またはその生物学的に活性なアナログであり、該生物学的に活性なアナログは、１４１アミノ酸からなり、かつ該生物学的に活性なアナログは、該ＫＧＦｄｅｓ１〜２２に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療的応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５０％以下である、使用。
【請求項５】
請求項４に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２である、使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４またはその生物学的に活性なアナログであり、該生物学的に活性なアナログは、１３９アミノ酸からなり、かつ該生物学的に活性なアナログは、該ＫＧＦｄｅｓ１〜２４に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療的応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５０％以下である、使用。
【請求項７】
請求項６に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４である、使用。
【請求項８】
上皮細胞増殖を刺激するための医薬の製造におけるＫＧＦポリペプチドの使用であって、該ＫＧＦポリペプチドは、（ｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２、または（ｉｉ）（ｉ）の生物学的に活性なアナログであり、該生物学的に活性なアナログは、（ｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ該（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、
該ＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつ該ポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、該ＫＧＦポリペプチドは、治療上有効な量で存在し、該治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の１０％〜７５％である、使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項１０】
請求項８に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも９０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項１１】
請求項８に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなり、Ｎ末端アルギニンがアラニン残基で置換されている、使用。
【請求項１２】
請求項８に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２である、使用。
【請求項１３】
請求項８に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜５０％である、使用。
【請求項１４】
請求項８に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２５％である、使用。
【請求項１５】
請求項１０に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２０％である、使用。
【請求項１６】
上皮細胞増殖を刺激するための医薬の製造におけるＫＧＦポリペプチドの使用であって、該ＫＧＦポリペプチドは、（ｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４、または（ｉｉ）（ｉ）の生物学的に活性なアナログであり、該生物学的に活性なアナログは、（ｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ該（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、
該ＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつ該ポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、該ＫＧＦポリペプチドは、治療上有効な量で存在し、該治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５％〜７５％である、使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項１８】
請求項１６に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも９０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項１９】
請求項１６に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４である、使用。
【請求項２０】
請求項１６に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜５０％である、使用。
【請求項２１】
請求項１６に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２５％である、使用。
【請求項２２】
請求項１６に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２０％である、使用。
【請求項２３】
請求項１６に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の５％〜１０％である、使用。
【請求項２４】
創傷を処置するための医薬の製造におけるＫＧＦポリペプチドの使用であって、該ＫＧＦポリペプチドは、
（ｉ）図１のアミノ酸残基１６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１５；
（ｉｉ）図１のアミノ酸残基１９〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１８；
（ｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２０〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１９；
（ｉｖ）図１のアミノ酸残基２１〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２０；
（ｖ）図１のアミノ酸残基２２〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２１；
（ｖｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２；
（ｖｉｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４；
（ｖｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２５；
（ｘｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）の生物学的に活性なアナログであって、該生物学的に活性なアナログは、それぞれ、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する、生物学的に活性なアナログ；
からなる群より選択され、
該ＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつ該ＫＧＦポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、該ＫＧＦポリペプチドは、治療上有効な量で存在し、該治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の７５％以下である、使用。
【請求項２５】
請求項２４に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項２６】
請求項２４に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）に対して少なくとも９０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項２７】
請求項２４に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２またはその生物学的に活性なアナログであり、該生物学的に活性なアナログは、１４１アミノ酸からなり、かつ該生物学的に活性なアナログは、該ＫＧＦｄｅｓ１〜２２に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療的応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５０％以下である、使用。
【請求項２８】
請求項２７に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２である、使用。
【請求項２９】
請求項２４に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４またはその生物学的に活性なアナログであり、該生物学的に活性なアナログは、１３９アミノ酸からなり、かつ該生物学的に活性なアナログは、該ＫＧＦｄｅｓ１〜２４に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療的応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５０％以下である、使用。
【請求項３０】
請求項２９に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４である、使用。
【請求項３１】
創傷を処置するための医薬の製造におけるＫＧＦポリペプチドの使用であって、該ＫＧＦポリペプチドは、（ｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２、または（ｉｉ）（ｉ）の生物学的に活性なアナログであり、該生物学的に活性なアナログは、（ｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ該（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、
該ＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつ該ポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、該ＫＧＦポリペプチドは、治療上有効な量で存在し、該治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の１０％〜７５％である、使用。
【請求項３２】
請求項３１に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項３３】
請求項３１に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも９０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項３４】
請求項３１に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなり、Ｎ末端アルギニンがアラニン残基で置換されている、使用。
【請求項３５】
請求項３１に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２である、使用。
【請求項３６】
請求項３１に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜５０％である、使用。
【請求項３７】
請求項３１に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２５％である、使用。
【請求項３８】
請求項３１に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２０％である、使用。
【請求項３９】
創傷を処置するための医薬の製造におけるＫＧＦポリペプチドの使用であって、該ＫＧＦポリペプチドは、（ｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４、または（ｉｉ）（ｉ）の生物学的に活性なアナログであり、該生物学的に活性なアナログは、（ｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ該（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、
該ＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつ該ポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、該ＫＧＦポリペプチドは、治療上有効な量で存在し、該治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５％〜７５％である、使用。
【請求項４０】
請求項３９に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項４１】
請求項３９に記載の使用であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも９０％の配列相同性を有する、使用。
【請求項４２】
請求項３９に記載の使用であって、前記ＫＧＦポリペプチドが、図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４である、使用。
【請求項４３】
請求項３９に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜５０％である、使用。
【請求項４４】
請求項３９に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２５％である、使用。
【請求項４５】
請求項３９に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２０％である、使用。
【請求項４６】
請求項３９に記載の使用であって、前記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の５％〜１０％である、使用。
【請求項４７】
組成物であって、
（ａ）治療上有効な量のＫＧＦポリペプチドと、
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤と、
を含み、該ＫＧＦポリペプチドは、
（ｉ）図１のアミノ酸残基１６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１５；
（ｉｉ）図１のアミノ酸残基１９〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１８；
（ｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２０〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１９；
（ｉｖ）図１のアミノ酸残基２１〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２０；
（ｖ）図１のアミノ酸残基２２〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２１；
（ｖｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２；
（ｖｉｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４；
（ｖｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２５；
（ｉｘ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）の生物学的に活性なアナログであって、該生物学的に活性なアナログは、それぞれ、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する、生物学的に活性なアナログ；および
（ｘ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）のアナログであって、それぞれ、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）のアミノ酸配列と、さらなるＮ末端メチオニンとからなる、アナログ；
からなる群より選択され、
該ＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつ該ＫＧＦポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の７５％以下である、
組成物。
【請求項４８】
請求項４７に記載の組成物であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する、組成物。
【請求項４９】
請求項４７に記載の組成物であって、前記生物学的に活性なアナログが、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）に対して少なくとも９０％の配列相同性を有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、ポリペプチド増殖因子に関する。詳細には、本発明は、ケラチノサイト増殖因子ポリペプチドを含む組成物およびそのケラチノサイト増殖因子ポリペプチドを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）は、繊維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）のファミリーに属し、ＦＧＦの原型は、塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦにより示される。ＫＧＦは、ＦＧＦ−７としても公知である。ＫＧＦは、ＦＧＦと同様に、ヘパリンに結合し、一般的には、胚外中胚葉または胚内中胚葉に由来する種々の細胞型および神経外胚葉に由来する種々の細胞型の、増殖および分化を刺激可能である。例えば、ＫＧＦは、ＦＧＦと同様に、初期胚胞において腹側中胚葉および背側中胚葉の分化および増殖を誘導する能力を有する。例えば、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９１）２５：３０７〜３１４；およびＢａｓｉｌｉｃｏら、Ａｄｖ．Ｃｎａｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９２）５９：１１５〜１６５を参照のこと。
【０００３】
他のＦＧＦと同様に、ＫＧＦは、ヘパリン結合たんぱく質であるが、他のＦＧＦとは異なり、ＫＧＦは、独特の標的細胞特異性を有する。特に、ＫＧＦは、上皮細胞増殖を刺激する能力において他のＦＧＦと類似するが、内皮細胞または繊維芽細胞の増殖を刺激する能力がないことにおいて、他のＦＧＦとは異なる。例えば、Ｆｉｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５：７５２〜７５５を参照のこと。成熟した全長ＫＧＦ（本明細書中でＫＧＦ１６３と呼ばれる）は、１６３アミノ酸残基を有するポリペプチドであり、Ｎ末端にアミノ酸残基１４〜１６に広がる潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有する。Ｆｉｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５：７５２〜７５５。
【０００４】
Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：２９８４〜２９８８は、ＫＧＦ１６３が原核生物細胞発現系において発現された場合に、マイトジェン活性を有する組換えＫＧＦ（「ｒＫＧＦ」）ポリペプチドが入手され得たことを見出した。このｒＫＧＦ分子が、成熟ＫＧＦ１６３ポリペプチドのＮ末端からの３アミノ酸残基、８アミノ酸残基、２７アミノ酸残基、３８アミノ酸残基、および４８アミノ酸残基の欠失によって短縮された場合、生じた分子の生物学的活性は変動した。３アミノ酸残基欠失および８アミノ酸残基欠失の場合、それぞれ、生じた分子のマイトジェン活性は、全長ｒＫＧＦと比較して影響されなかったようであった。しかし、２７アミノ酸残基の欠失によって、１０分の１〜２０分の１に減少したマイトジェン活性を示す分子が生じた。３８アミノ酸残基の欠失および４８アミノ酸残基の欠失は、それぞれ、マイトジェン活性の完全な喪失およびヘパリン結合能力の完全な喪失を生じた。しかし、Ｒｏｎらは、全長ｒＫＧＦ分子と比較して増加したマイトジェン活性を保有するいかなる短縮ｒＫＧＦフラグメントを生成することもできなかった。
【０００５】
Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚらに対する米国特許第５，６７７，２７８号、同第５，７７３，５８６号、同第５，８４３，８８３号、同第５，８６３，７６７号、および同第６，０７４，８４８号は、ＫＧＦ分子を記載する。２３アミノ酸残基のＮ末端欠失を有する１つの特定の分子（ＫＧＦｄｅｓ１〜２３と呼ばれる）は、成熟した全長組換えＫＧＦ１６３と比較して増大したマイトジェン活性を示す。
【０００６】
Ｏｓｓｌｕｎｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．（１９８８）７：１６８１〜１６９０は、種々のＮ末端短縮ＫＧＦ分子およびそのマイトジェン活性の特定の測定値を報告する。同様に、国際公開ＷＯ９６／１１９５１およびＷＯ９６／１１９４９は、種々のＮ末端短縮およびアミノ酸置換を有するＫＧＦ分子を記載する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、種々のＮ末端短縮ＫＧＦポリペプチドおよびそのアナログが、ネイティブの全長ＫＧＦ１６３と比較して１分子ベースで増大した生物学的活性を示すという発見に基づく。従って、これらの分子を含む組成物は、上皮形成が必要な状態の処置（例えば、創傷、火傷、眼の障害、胃腸疾患および上皮細胞増殖もしくは再生の刺激により規定される任意の障害の処置）について増加した能力を有する。これらの分子は、単独でかまたは他のマイトジェン因子（例えば、他の増殖因子（例えば、他のＦＧＦ（血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）など）のいずれかが挙げられる）と組み合わせて送達され得る。
【０００８】
さらに、これらのＫＧＦ分子は、過剰増殖疾患を処置するために毒素分子を上皮細胞に標的化するために、これらの毒素分子に結合体化され得る。従って、１つの実施形態において、本発明は、上皮細胞増殖を刺激する方法に関する。この方法は、上皮細胞を組成物と接触させる工程を包含し、その組成物は、
（ａ）治療上有効な量のＫＧＦポリペプチドと、
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤と、
を含み、このＫＧＦポリペプチドは、
（ｉ）図１のアミノ酸残基１６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１５；
（ｉｉ）図１のアミノ酸残基１９〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１８；
（ｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２０〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１９；
（ｉｖ）図１のアミノ酸残基２１〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２０；
（ｖ）図１のアミノ酸残基２２〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２１；
（ｖｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２；
（ｖｉｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４；
（ｖｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２５；
（ｉｘ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）の生物学的に活性なアナログであって、該生物学的に活性なアナログは、それぞれ、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する、生物学的に活性なアナログ；
からなる群より選択され、
このＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつこのＫＧＦポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、このＫＧＦポリペプチドは、治療上有効な量で存在し、この治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量のうちの７５％以下である。
【０００９】
特定の実施形態において、上記生物学的に活性なアナログは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）に対して少なくとも８０％もしくは９０％の配列相同性を有する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、上記のような方法に関し、この方法において、上記ＫＧＦポリペプチドは、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２またはその生物学的に活性なアナログであり、この生物学的に活性なアナログは、１４１アミノ酸からなり、かつこの生物学的に活性なアナログは、上記ＫＧＦｄｅｓ１〜２２に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、上記治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療的応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５０％以下である。
【００１１】
なおさらなる実施形態において、本発明は、上記のような方法に関し、この方法において、上記ＫＧＦポリペプチドは、図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４またはその生物学的に活性なアナログであり、上記生物学的に活性なアナログは、１３９アミノ酸からなり、かつこの生物学的に活性なアナログは、上記ＫＧＦｄｅｓ１〜２４に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、上記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療的応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５０％以下である。
【００１２】
さらなる実施形態において、本発明は、上皮細胞増殖を刺激する方法に関し、この方法は、上皮細胞を組成物と接触させる工程を包含し、この組成物は、
ａ）治療上有効な量のＫＧＦポリペプチドと、
ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤と、
を含み、このＫＧＦポリペプチドは、（ｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２、または（ｉｉ）（ｉ）の生物学的に活性なアナログであり、この生物学的に活性なアナログは、（ｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、
このＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつこのポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、この治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の１０％〜７５％である。
【００１３】
特定の実施形態において、上記生物学的に活性なアナログは、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％もしくは９０％の配列相同性を有する。
【００１４】
他の実施形態において、この生物学的に活性なアナログが、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなり、Ｎ末端アルギニンがアラニン残基で置換されている。
【００１５】
なおさらなる実施形態において、上記治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２０％、または１０％〜２５％、または１０％〜５０％、またはこれらの範囲内にある任意のパーセンテージである。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、上皮細胞増殖を刺激する方法に関し、この方法は、上皮細胞を組成物と接触させる工程を包含し、この組成物は、
ａ）治療上有効な量のＫＧＦポリペプチドと、
ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤と、
を含み、このＫＧＦポリペプチドは、（ｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４、または（ｉｉ）（ｉ）の生物学的に活性なアナログであり、この生物学的に活性なアナログは、（ｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、
このＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつこのポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、この治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５％〜７５％である。
【００１７】
上記の方法の特定の実施形態において、上記生物学的に活性なアナログは、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％もしくは９０％の配列相同性を有する。
【００１８】
さらなる実施形態において、上記治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の５％〜１０％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、または１０％〜５０％、またはこれらの範囲内にある任意のパーセンテージである。
【００１９】
上記の方法のすべてにおいて、上皮細胞が、インビトロまたはインビボで上記ＫＧＦポリペプチドと接触され得る。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、創傷を処置する方法に関し、この方法は、処置されるべき創傷領域にＫＧＦポリペプチド組成物を適用する工程、およびその創傷を治癒される工程を包含する。この組成物は、
（ａ）治療上有効な量のＫＧＦポリペプチドと、
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤と、
を含み、このＫＧＦポリペプチドは、
（ｉ）図１のアミノ酸残基１６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１５；
（ｉｉ）図１のアミノ酸残基１９〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１８；
（ｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２０〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１９；
（ｉｖ）図１のアミノ酸残基２１〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２０；
（ｖ）図１のアミノ酸残基２２〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２１；
（ｖｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２；
（ｖｉｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４；
（ｖｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２５；
（ｉｘ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）の生物学的に活性なアナログであって、該生物学的に活性なアナログは、それぞれ、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する、生物学的に活性なアナログ；
からなる群より選択され、
このＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつこのポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、この治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の７５％以下である。
【００２１】
上記の方法の特定の実施形態において、上記生物学的に活性なアナログは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）に対して少なくとも８０％もしくは９０％の配列相同性を有する。
【００２２】
上記の方法のさらなる実施形態において、上記ＫＧＦポリペプチドは、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２またはその生物学的に活性なアナログであり、この生物学的に活性なアナログは、１４１アミノ酸からなり、かつこの生物学的に活性なアナログは、上記ＫＧＦｄｅｓ１〜２２に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、上記治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療的応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５０％以下である。
【００２３】
上記の方法の他の実施形態において、上記ＫＧＦポリペプチドは、図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４またはその生物学的に活性なアナログであり、上記生物学的に活性なアナログは、１３９アミノ酸からなり、かつこの生物学的に活性なアナログは、上記ＫＧＦｄｅｓ１〜２４に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、上記治療上有効な量が、１分子ベースで、等価な治療的応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５０％以下である。
【００２４】
なおさらなる実施形態において、本発明は、創傷を処置する方法に関し、この方法は、処置されるべき創傷領域にＫＧＦポリペプチド組成物を適用する工程、およびその創傷を治癒される工程を包含する。この組成物は、
（ａ）治療上有効な量のＫＧＦポリペプチドと、
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤と、
を含み、このＫＧＦポリペプチドは、（ｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２、または（ｉｉ）（ｉ）の生物学的に活性なアナログであり、この生物学的に活性なアナログは、（ｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、
このＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつこのポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、この治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の１０％〜７５％である。
【００２５】
特定の実施形態において、上記生物学的に活性なアナログは、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％もしくは９０％の配列相同性を有する。
【００２６】
上記の方法のさらなる実施形態において、この生物学的に活性なアナログは、図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなり、Ｎ末端アルギニンがアラニン残基で置換されている。
【００２７】
さらなる実施形態において、上記治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の１０％〜２０％、または１０％〜２５％、または１０％〜５０％、またはこれらの範囲内にある任意のパーセンテージである。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明は、創傷を処置する方法に関し、この方法は、処置されるべき創傷領域にＫＧＦポリペプチド組成物を適用する工程、およびその創傷を治癒される工程を包含する。この組成物は、
（ａ）治療上有効な量のＫＧＦポリペプチドと、
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤と、
を含み、このＫＧＦポリペプチドは、（ｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４、または（ｉｉ）（ｉ）の生物学的に活性なアナログであり、この生物学的に活性なアナログは、（ｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、
このＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつこのポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、この治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の５％〜７５％である。
【００２９】
特定の実施形態において、上記生物学的に活性なアナログは、（ｉ）または（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列相同性もしくは９０％の配列相同性を有する。
【００３０】
なおさらなる実施形態において、上記治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要な全長ＫＧＦの量の５％〜１０％、または１０％〜２０％、または１０％〜２５％、または１０％〜５０％、またはこれらの範囲内にある任意のパーセンテージである。
【００３１】
上記の方法において、上記組成物は、インビトロまたはインビボにて上記創傷と接触され得る。
【００３２】
なおさらなる実施形態において、本発明は、組成物に関し、その組成物は、
（ａ）治療上有効な量のＫＧＦポリペプチドと、
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤と、
を含み、このＫＧＦポリペプチドは、
（ｉ）図１のアミノ酸残基１６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１５；
（ｉｉ）図１のアミノ酸残基１９〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１８；
（ｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２０〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜１９；
（ｉｖ）図１のアミノ酸残基２１〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２０；
（ｖ）図１のアミノ酸残基２２〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２１；
（ｖｉ）図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２２；
（ｖｉｉ）図１のアミノ酸残基２５〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２４；
（ｖｉｉｉ）図１のアミノ酸残基２６〜１６３に示される連続するアミノ酸配列からなるＫＧＦｄｅｓ１〜２５；
（ｉｘ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）の生物学的に活性なアナログであって、該生物学的に活性なアナログは、それぞれ、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）と同じ数のアミノ酸からなりかつ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）に対して少なくとも７０％の配列相同性を有する、生物学的に活性なアナログ；および
（ｘ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）のアナログであって、それぞれ、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）のアミノ酸配列と、さらなるＮ末端メチオニンとからなる、アナログ；
からなる群より選択され、
このＫＧＦポリペプチドは、Ｂａｌｂ／ＭＫ生物活性アッセイにより決定される場合に、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）に対して生物活性の増加を示し、かつこのポリペプチドは、上皮細胞増殖を特異的に刺激し、さらに、この治療上有効な量は、１分子ベースで、等価な治療応答を惹起するために必要なＫＧＦ１６３の量の７５％以下である。
【００３３】
特定の実施形態において、上記生物学的に活性なアナログは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）に対して少なくとも８０％もしくは９０％の配列相同性を有する。
【００３４】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかになる。さらに、特定の手順または組成物をより詳細に記載する種々の参考文献が、本明細書中に示される。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、別段示されなければ、当該分野の技術範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．  Ｋａｐｌａｎ編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を参照のこと。
【００３６】
以下のアミノ酸の略語は、本文全体を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ）            アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）        アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）          グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）        グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）          イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）            リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）          フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）            セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）          トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）            バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００３７】
（Ｉ．定義）
本発明を記載するにあたり、以下の用語が使用され、以下に示されるように規定されることが意図される。
【００３８】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、その生成物の最小の長さに限定されない。この用語はまた、別段示されなければ、アミノ酸配列を変化させないポリペプチドの改変（例えば、グリコシル化形態、アセチル化形態およびリン酸化形態）を含む。本発明の目的に関して、ポリペプチドまたはタンパク質は、合成されてもよいし、組換え精製されてもよく、ならびに天然の供給源から単離されてもよい。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「ケラチノサイト増殖因子」または「ＫＧＦ」とは、ＦＧＦＲ−２に結合し得、線維芽細胞に対する有意な活性を欠き、上皮細胞に独特に特異的な、特にケラチノサイトに対して活性なタンパク質のＦＧＦファミリーの群のメンバーをいう。ＫＧＦ、そのアナログおよびフラグメント（以下に詳述される）は、合成されてもよいし、組換え生成されてもよい。さらに、ＫＧＦは、天然の供給源（例えば、任意の哺乳動物供給源の任意のいくつかの組織（例えば、ヒト組織））から単離されてもよい。
【００４０】
「成熟の全長ＫＧＦ」、「ＫＧＦの長い形態」、「ＦＬ−ＫＧＦ」、「ネイティブＫＧＦ」または「ＫＧＦ１６３」は、本明細書中で使用される場合、全て図１に示される１６３アミノ酸残基を含む成熟ポリペプチドをいう。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「ＫＧＦフラグメント」とは、ＫＧＦ１６３の配列全体を含まない、ＫＧＦ１６３に由来するポリペプチドをいう。このようなフラグメントは、全長分子の短縮型バージョン、および内部欠失型バージョンであり得る。ＫＧＦフラグメントは、本明細書中の実施例４に記載されるＢａｌｂ／ＭＫ生体活性アッセイにより決定される場合、ＫＧＦ生体活性を有し得る。Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞株（Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｂ．Ｅ．およびＡａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．Ａ．Ｃｅｌｌ（１９８３）３２：５９９−６０６）は、クローン性Ｂａｌｂ／ｃマウスケラチノサイト細胞株である。これらの細胞は、それらの増殖が血清を含有する培地中ですら上皮細胞マイトジェンの外因性供給源に依存する。従って、ＫＧＦフラグメントおよびアナログの活性は、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞を用いてＥＤ５０値を決定することによって測定され、この値は、細胞増殖の半最大刺激を引き起こすＫＧＦフラグメントの濃度によって規定される。さらに、本発明のＫＧＦフラグメントは、上皮細胞増殖を特異的に刺激する。
【００４２】
標的細胞特異性を決定するために、ＤＮＡ合成刺激（添加された試験サンプルの非存在下でチミジンのバックグラウンド取り込みに対する刺激された合成の比として表される）は、同じアッセイ条件下でケラチノサイト以外の細胞において観察される類似の刺激と比較される。ＫＧＦフラグメントおよびアナログの活性はまた、内皮細胞（例えば、本明細書中の実施例５に記載される成体ウシ大動脈内皮細胞（ＡＢＡＥ）または副腎皮質由来毛細管内皮細胞（ＡＣＥ））に対して試験され得る。「上皮細胞増殖を特異的に刺激する」ＫＧＦポリペプチドまたはアナログは、飽和濃度にて以下のようである分子であり得る：（ｉ）本明細書中の実施例４に記載のＢａｌｂ／Ｍｋアッセイにおいて、ＫＧＦを受容しないウェルにおいて達成される細胞数の少なくとも４倍多いレベルまで、培養の７日間後、１ウェルあたりの最終的な細胞数を刺激し得る；および（ｉｉ）本明細書中の実施例５に記載のＡＢＡＥアッセイまたはＡＣＥアッセイにおいて、ＫＧＦを受容しないウェルにおいて達成される細胞数より高いレベルまで、培養の７日後、１ウェルあたりの最終的な細胞数を有意に刺激しない。
【００４３】
米国特許第５，７３１，１７０号（その全体が本明細書中に参考として援用される）は、特定の分子が、線維芽細胞とは対照的に、ケラチノサイトに対する顕著な特異性を有するＫＧＦマイトジェン活性を提示することを報告する。
【００４４】
本発明のフラグメントは、例えば、１０％以上の活性（例えば、１５％、２０％、２５％、５０％、１００％以上）から、１０倍以上程度の活性までのどこでも、または特定の範囲の間の任意の量にて、ＫＧＦ１６３に対して１分子あたりで増強した活性を示す。従って、本発明のＫＧＦフラグメントは、ＫＧＦ１６３を使用して、必要な量より少ない量にて、組成物中で使用され得る。本発明者らは、ＫＧＦより低い分子量の分子が生成され得ることを認識する。以下の実施例に示されるように、これらの種は、１分子あたりで比較される場合（すなわち、活性が分子量に対して調節される場合）、より活性である。特定のＫＧＦフラグメントは、以下に詳細に記載される。
【００４５】
用語「アナログ」とは、参照分子の誘導体をいう。このアナログは、上記のように、生物学的活性を維持し得る。概して、用語「アナログ」とは、改変が、活性を破壊しない限り、ネイティブのポリペプチドの配列および構造に対して、１以上のアミノ酸の付加、置換（概して、本質的には保存的）および／または欠失を有する配列および構造を有する化合物をいう。好ましくは、そのアナログは、親分子と少なくとも同じ生物学的活性を有し、親分子より増強した活性さえ提示し得る。ポリペプチドアナログを作製するための方法は、当該分野で公知であり、以下にさらに記載される。
【００４６】
特に好ましいアナログとしては、本質的に保存的な置換（すなわち、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換）を含む。具体的には、アミノ酸は、４つのファミリーに分けられる：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンに、アスパラギン酸をグルタミン酸に、スレオニンをセリンに単独で置換すること、または同様にあるアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸に保存的置換することは、生物学的活性に対して大きな影響がないことが合理的に推定可能である。例えば、目的のポリペプチドは、その分子の所望の機能がインタクトなままである限り、ほぼ１〜７０までの保存的または非保存的なアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５〜５０、１５〜２５、５〜１０、または１〜７０の間の任意の整数）を含み得る。当業者は、本明細書中に規定される生物学的活性を保持するという合理的な見込みの下に、改変され得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００４７】
例えば、シグナル伝達に関与する重要な決定因子は、ＫＧＦの最初の３０個のＮ末端アミノ酸内に位置しないようである（Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖら，Ｃｅｌｌ（２０００）１０１：４１３−４２４）。さらに、ＫＧＦのＮＨ２末端ドメインは、その細胞特異性に関与しないようである。アミノ酸残基９１〜１１０（図１に示されるアミノ酸配列に対して番号付けされる）は、ＫＧＦにレセプター結合特異性を付与するようである（Ｒｅｉｃｈ−Ｓｌｏｔｓｋｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：２９８１３−２９８１８）。従って、少なくともアミノ酸９１〜１１０にまたがる領域を保持するアナログおよびフラグメントが好ましい。さらに、アミノ酸置換が、この領域において行われる場合、これらの置換は、本質的に保存的であるべきである。Ｎ末端配列の一部を保持するフラグメント（例えば、例えば、アミノ酸３５（図１に対して番号付けられる）までは及ばない欠失を有するフラグメント）は、アミノ酸の付加、欠失および置換に対してより寛容性である。好ましい欠失としては、以下にさらに記載されるように、最初の２２アミノ酸、２３アミノ酸および２４アミノ酸の欠失が挙げられる。当業者は、ＫＧＦの公知の構造（例えば、Ｏｓｓｌｕｎｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．（１９９８）７：１６８１−１６９０を参照のこと）、およびＫＧＦと関連する分子（例えば、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦおよびカポジＦＧＦ（例えば、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９０）１４２：３２５−３３３を参照のこと）との間の公知の構造／機能の関係に基づいて、変化を寛容する他の領域を容易に決定し得る。
【００４８】
「精製される（た）」または「単離される（た）」によって、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう場合、示される分子が、同じ型の他の生物学的高分子が実質的にない状態で存在することを意味する。用語「精製（される）」は、本明細書中で使用される場合、同じ型の生物学的高分子が、好ましくは、少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも８５重量％、よりなお好ましくは、少なくとも９５重量％、および最もより好ましくは、少なくとも９８重量％、サンプル中に存在することを意味する。「特定のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド」とは、対象ポリペプチドをコードしない他の核酸分子が実質的にない核酸分子をいう；しかし、その分子は、組成物の基本的特徴に有害な影響を及ぼさないいくつかのさらなる塩基または部分を含み得る。
【００４９】
「組換えポリペプチド」によって、本明細書中に記載の組換えＤＮＡ技術によって調製されたポリペプチドを意図する。以下にさらに記載されるように、一般に、所望のポリペプチドをコードする遺伝子がクローニングされ、次いで、形質転換生物において発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、ポリペプチドを生成する。あるいは、内因性ポリペプチドの発現を制御するプロモーターが、組換えポリペプチドを与えるように改変され得る。概してより少ない開始物質からより高収量を可能にし、はるかに純粋な生成物を与える組換え生成物としてポリペプチドを組換え生成することは、特に有利である。従って、本発明のポリペプチドは、細胞中に通常存在する他の分子なしで生成され得る。例えば、微量のヒトタンパク質夾雑物も含まないヒトポリペプチド組成物は、組換え非ヒト宿主細胞により生成されるヒトタンパク質のみが、組換えヒトポリペプチドであるので、容易に得られ得る。天然の供給源に由来する潜在的ウイルス因子およびヒトに対して病原性のウイルス成分もまた回避される。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態をいう。この用語は、分子の一次構造をいうに過ぎず、従って、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。これらは、改変の既知の型（例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド内の改変（例えば、非荷電性連結（例えば、リン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、カルバメートなど）および荷電性連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどでの改変）、ペンダント部分を含む改変（例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む））、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）での改変、キレート剤を含む置換（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属など）、アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｏｒ）を含む改変、改変された連結での改変（例えば、αアノマー性核酸など））、ならびに非改変形態のポリヌクレオチドを含み得る。
【００５１】
用語「組換えＤＮＡ分子」または「組換えポリヌクレオチド」は、その起源または操作によって、以下の通りであるゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、半合成起源または合成起源のポリヌクレオチドをいうために本明細書中で使用される：（１）天然に関連するポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連しない、（２）天然に連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結される、または（３）天然に存在しない。従って、この用語は、「合成由来の」核酸分子を包含する。
【００５２】
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、通常は、ｍＲＮＡを介してポリペプチドへと翻訳される核酸分子である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳終止コドンによって決定され得る。コード配列は、ｃＤＮＡ、および組換えヌクレオチド配列を含み得るが、これらに限定されない。
【００５３】
「制御配列」とは、コード配列の発現に影響を及ぼすことが必要な、コード配列に連結される核酸配列をいう。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物においては、このような制御配列としては、概して、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられ；真核生物においては、概して、このような制御配列としては、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられる。用語「制御配列」は、少なくとも、コード配列の発現に必要な全ての成分を含むことが意図され、さらなる成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）もまた含み得る。
【００５４】
制御エレメント（例えば、プロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写する場合に、細胞においてコード配列の「転写を方向付け」、続いて、ｍＲＮＡが、コード配列によりコードされるポリペプチドに翻訳される。
【００５５】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載される成分が、それらが意図される様式にて機能することが可能になる関係にある位置をいう。コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、制御配列と適合する条件下で、コード配列の発現が達成されるように連結される。制御エレメントは、コード配列の発現を方向付けるように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、翻訳されていないが、なお転写される配列の介在は、プロモーターとコード配列との間に存在し得、そのプロモーターは、なお、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００５６】
本明細書中で使用される限り、用語「発現カセット」とは、適切な宿主細胞においてコード配列のクローンされたコピーの転写およびｍＲＮＡの翻訳を必要とする全てのヌクレオチド配列を含む、制御配列に作動可能に連結された少なくとも１つのコード配列を含む分子をいう。このような発現カセットは、細菌、藍藻類、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞および動物細胞のような種々の宿主において真核生物遺伝子を発現するために使用され得る。本発明のもとで、発現カセットは、クローニングベクター、特に、設計されたプラスミド、ウイルスまたはウイルス粒子が挙げられ得るが、これらに限定されない。カセットは、宿主細胞における自立的複製のために複製起点、選択マーカー、種々の制限部位、高コピー数および強いプロモーターのための能力をさらに含み得る。
【００５７】
「ベクター」によって、適切な制御エレメントと関連する場合に複製可能であり、細胞間で遺伝子配列を移入し得る任意の遺伝エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルスなど）を意味する。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
【００５８】
細胞は、外来ポリヌクレオチドが細胞膜内部に導入されている場合、このポリヌクレオチドにより形質転換されている。この発現ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合され）ていても、されていなくてもよい。原核生物および酵母において、例えば、外来ＤＮＡは、エピソームエレメント（例えば、プラスミド）上で維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、染色体複製を通じて娘細胞により遺伝されるように、外来ＤＮＡが、染色体に組み込まれている細胞である。この安定性は、真核生物細胞が、外来ＤＮＡを含む娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを樹立する能力によって実証される。
【００５９】
宿主細胞は、外来核酸分子によって、形質転換された細胞であるか、または形質転換し得る細胞である。
【００６０】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの部分の間の類似性％をいう。２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチドの配列は、それらの配列が、分子の規定された長さにわたり、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７０％〜７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは、少なくとも約９０％、最もより好ましくは、少なくとも約９５％〜９８％の配列相同性を示すか、またはこれらの特定の範囲の間の任意の相同性％を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチドの配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００６１】
一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列のそれぞれ正確なヌクレオチド−ヌクレオチド対応またはアミノ酸−アミノ酸対応をいう。同一性％は、配列を整列し、２つの整列した配列の間のマッチの正確な数を計数し、より短い方の配列の長さで除し、その結果に１００をかけることによって、２つの分子の間の配列情報の直接比較によって決定され得る。
【００６２】
好ましくは、天然に存在するタンパク質改変体または天然に存在しないタンパク質改変体は、図１の特定のＫＧＦフラグメントに対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％以上相同なアミノ酸配列を有する。より好ましくは、それらの分子は、９８％または９９％相同である。相同性％は、ギャップオープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２でのアフィンギャップ検索、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２を用いて、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９（１９８１）において教示される。
【００６３】
あるいは、相同性は、相同な領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化したフラグメントのサイズ決定により決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、その特定の系について規定されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出を参照のこと。
【００６４】
用語「有効量」または「薬学的有効量」とは、非毒性であるが、所望の生物学的結果を提供する薬剤の十分量をいう。その結果は、疾患の徴候、症状または原因の低減および／または緩和、あるいは生物学的系の任意の他の所望の変化であり得る。例えば、本発明の方法とともに使用するためのＫＧＦフラグメントの有効量は、上皮細胞の刺激または増殖に十分な量であり、好ましくは、上皮細胞増殖が所望される創傷および／または熱傷、ならびに他の障害の増大した治癒を引き起こすに十分な量である。このような量は、以下に記載される。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験を用いて、当業者によって決定され得る。
【００６５】
「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」によって、生物学的でないのでもなく、さもなければ所望されないのでもない材料を意味する（すなわち、この材料は、いずれの所望されない生物学的効果も、含まれる組成物の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することもなく、個体に投与され得る）。
【００６６】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」により、約７．０〜８．０までの範囲のｐＨを意味する。好ましい生理学的ｐＨは、約７．２〜７．６の範囲である。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」とは、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：哺乳類綱の任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ならびに他のサル（ａｐｅ）およびサル（ｍｏｎｋｅｙ）種）；家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；ウサギ、イヌ、およびネコのようなペット（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）；実験動物（例えば、ラット、マウスおよびモルモットが挙げられる）齧歯類など。非哺乳動物の例としては、鳥類、魚類などが挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢も性別も示さない。
【００６８】
（ＩＩ．発明を実施する態様）
本発明を詳細に記載する前に、本発明が、特定の処方にもプロセスパラメーターにも限定されず、よって当然のことながら、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語が、本発明の特定の実施形態のみを記載する目的であり、制限することを意味しないこともまた理解されるべきである。
【００６９】
本明細書中に記載される組成物および方法に類似したまたは等価な多くの組成物および方法が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。
【００７０】
本発明は、特定のＫＧＦポリペプチドフラグメントおよびこれらのフラグメントのアナログ（これは、全長配列の一部のみを保持する）は、全長配列に対して増強した生物学的活性を示すという発見に基づく。従って、全長分子とともに必要な量より少量のポリペプチドが、組成物中で使用され得る。特定の例においては、本明細書中に記載される分子を含む組成物が投与される場合、非特異的な副作用の発生がより少ない。
【００７１】
本発明は特に、本明細書中で具体的に示されるＢａｌｂ／ＭＫ生体活性アッセイによって決定されるＫＧＦ１６３に対して生体活性における増加を示し、上皮細胞増殖を特異的に刺激するＫＧＦフラグメントを含む組成物に関する。特に、ＫＧＦフラグメントおよびアナログの活性は、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞を使用して、ＥＤ５０値を決定することによって測定され、この値は、細胞増殖の半分最大刺激を引き起こすＫＧＦフラグメントの濃度によって規定される。細胞は、以下の実施例に記載されるように、７日間培養される。本明細書中に記載のＫＧＦフラグメントの生体活性は、好ましくは、全長ＫＧＦタンパク質の生体活性より、細胞増殖アッセイにおいて比較される場合、少なくとも約１．２〜１．５倍、好ましくは、約２倍、より好ましくは、約２〜１０倍以上高く、本明細書中で記載され、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９０／０８７７１で記載されるように、化学的に規定される培地中で維持されるＢａｌｂ／Ｍｋ細胞におけるＤＮＡ合成の刺激を用いて決定される場合、全長ＫＧＦより１０〜１００倍程度以上高くてもよい。増強された活性レベルに起因して、本発明のポリペプチドは、同じ生物学的結果を達成するために対応する組成物中に必要なＫＧＦ１６３の量（すなわち、分子量について調節される）の１分子ベースで、９０％以下、例えば、５％〜９０％、または１０％〜５０％、またはその間の任意の数値の使用を可能にする。
【００７２】
本明細書中で使用するための特定のポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ＫＧＦｄｅｓ１〜１５（図１のアミノ酸残基１６〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなる）；ＫＧＦｄｅｓ１〜１５のアナログ（図１のアミノ酸残基１６〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなり、さらなるＮ末端メチオニンを有する）；
ＫＧＦｄｅｓ１〜１８（図１のアミノ酸残基１９〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなる）；ＫＧＦｄｅｓ１〜１８のアナログ（図１のアミノ酸残基１９〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなり、さらなるＮ末端メチオニンを有する）；
ＫＧＦｄｅｓ１〜１９（図１のアミノ酸残基２０〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなる）；ＫＧＦｄｅｓ１〜１９のアナログ（図１のアミノ酸残基２０〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなり、さらなるＮ末端メチオニンを有する）；
ＫＧＦｄｅｓ１〜２０（図１のアミノ酸２１〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなる）；ＫＧＦｄｅｓ１〜２０のアナログ（図１のアミノ酸残基２１〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなり、さらなるＮ末端メチオニンを有する）；
ＫＧＦｄｅｓ１〜２１（図１のアミノ酸残基２２〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなる）；ＫＧＦｄｅｓ１〜２１のアナログ（図１のアミノ酸残基２２〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなり、さらなるＮ末端メチオニンを有する）；
ＫＧＦｄｅｓ１〜２２（図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなる）；ＫＧＦｄｅｓ１〜２２のアナログ（図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなり、さらなるＮ末端メチオニンを有する）；ＫＧＦｄｅｓ１〜２２のアナログ（図１のアミノ酸残基２３〜１６３に示された連続するアミノ酸配列からなり、アラニン残基で置換されたＮ末端アルギニン残基を有する）；
ＫＧＦｄｅｓ１−２４は、図１のアミノ酸残基２５〜１６３（両端を含む）にて示される連続アミノ酸配列からなる；そしてＫＧＦｄｅｓ１−２４のアナログは、さらなるＮ末端メチオニンを有して、図１のアミノ酸残基２５〜１６３（両端を含む）にて示される連続アミノ酸配列からなる；そして
ＫＧＦｄｅｓ１−２５は、図１のアミノ酸残基２６〜１６３（両端を含む）にて示される連続アミノ酸配列からなる；そしてＫＧＦｄｅｓ１−２５のアナログは、さらなるＮ末端メチオニンを有して、図１のアミノ酸残基２６〜１６３（両端を含む）にて示される連続アミノ酸配列からなる。
【００７３】
本発明の組成物において使用するために、上記で特定したフラグメントの生物学的に活性なアナログもまた企図され、ここで、この生物学的に活性なアナログは、上記フラグメントと同数のアミノ酸からなり、そしてそのフラグメントに対して、上記で決定されるように、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、そして好ましくは少なくとも約９８％の配列相同性を有する。例えば、生物学的に活性なアナログは、１４８アミノ酸からなり、そしてＫＧＦｄｅｓ−１５と少なくとも７０％の配列相同性を有する、ＫＧＦｄｅｓ−１５のアナログ；１４５アミノ酸からなり、そしてＫＧＦｄｅｓ−１８と少なくとも７０％の配列相同性を有する、ＫＧＦｄｅｓ−１８のアナログ；１４４アミノ酸からなり、そしてＫＧＦｄｅｓ−１９と少なくとも７０％の配列相同性を有する、ＫＧＦｄｅｓ−１９のアナログ；１４３アミノ酸からなり、そしてＫＧＦｄｅｓ−２０と少なくとも７０％の配列相同性を有する、ＫＧＦｄｅｓ−２０のアナログ；１４２アミノ酸からなり、そしてＫＧＦｄｅｓ−２１と少なくとも７０％の配列相同性を有する、ＫＧＦｄｅｓ−２１のアナログ；１４１アミノ酸からなり、そしてＫＧＦｄｅｓ−２２と少なくとも７０％の配列相同性を有する、ＫＧＦｄｅｓ−２２のアナログ；１３９アミノ酸からなり、そしてＫＧＦｄｅｓ−２４と少なくとも７０％の配列相同性を有する、ＫＧＦｄｅｓ−２４のアナログ；および１３８アミノ酸からなり、そしてＫＧＦｄｅｓ−２５と少なくとも７０％の配列相同性を有する、ＫＧＦｄｅｓ−２５のアナログ、であり得る。
【００７４】
ＫＧＦ１６３に関する本発明の組成物において使用するためのＫＧＦポリペプチドの量は、目的の特定のフラグメントに依存して変動する。一般に、組成物は、１分子ベースで（すなわち、分子量について調節して）、所望の結果を達成するために（例えば、上皮細胞の分裂および／または増殖を促進するために）必要な対応する組成物中のＫＧＦ１６３の量の、約９０％以下、またはさらに、７５％以下、５０％以下、３５％以下、２５％以下、１０％以下を含む。従って、例えば、本明細書中に記載される組成物は、所望の活性を達成するために必要な、対応する組成物中のＫＧＦ１６３の量の、１分子ベースで、５％〜９０％、または１０％〜９０％、または１０〜７５％、または１０％〜５０％、または１０％〜２５％、または１０％〜２０％を含み得る。これらの範囲の間の特定の割合もまた、本明細書中で企図されることが、理解されるべきである。
【００７５】
特に、ＫＧＦフラグメントが、ＫＧＦｄｅｓ１−１５、ＫＧＦｄｅｓ１−１８、ＫＧＦｄｅｓ１−１９、ＫＧＦｄｅｓ１−２０、ＫＧＦｄｅｓ１−２１、ＫＧＦｄｅｓ１−２２、ＫＧＦｄｅｓ１−２４、ＫＧＦｄｅｓ１−２５またはこれらの分子由来のポリペプチドである場合、その量は、７５％以下（例えば、１０％〜７５％）であり得る。ＫＧＦフラグメントがＫＧＦｄｅｓ１−２２もしくはＫＧＦｄｅｓ１−２４、またはこれらの分子由来のポリペプチドである場合、使用される量は、５０％以下、またはさらに、２５％以下もしくは２０％以下（例えば、５％〜５０％）であり得る。ＫＧＦｄｅｓ１−２４およびこれに由来するポリペプチドについて、例えば、その量は、等価な治療応答を達成するために必要なＫＧＦ１６３の量の、１０％以下（例えば、２％〜１０％）であり得る。適切な量は、以下に詳細に考察される。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のＫＧＦフラグメントは、特に大規模の商業的産生の場合に、組換え技術によって産生される。本発明のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子および発現ベクターが作製され得、そして遺伝子が、以下でより詳細に考察されるような、当該分野で周知の方法を使用する、従来の遺伝子発現技術によって発現され得る。特定のＫＧＦフラグメントのアナログはまた、例えば、部位特異的変異誘発によって、組換え的に作製され得る。従って、本発明の実施形態に対する全ての言及は、特定のＫＧＦフラグメントに関する場合、フラグメントのアナログに等価に適用される。
【００７７】
本発明の１実施形態において、ＫＧＦフラグメントは、例えば、米国特許第５，７３１，１７０号に記載される技術を使用して、ＫＧＦを産生する細胞（例えば、Ｍ４２６ヒト胚性繊維芽細胞（Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．Ａ．およびＴｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９６８）３６：２５４−２６１））から、ネイティブな成熟ＫＧＦを単離することによって、作製され得る。次いで、Ｎ末端アミノ酸残基は、回収された分子から欠失され得る。このような欠失は、当該分野で公知の任意の従来技術によって実施され得る。
【００７８】
あるいは、本発明の組成物中で使用するためのポリペプチドは、ペプチド分野の当業者に公知のいくつかの技術のいずれかによって、化学的に合成され得る。例えば、固相ペプチド合成技術については、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ  １９８４）ならびにＧ．ＢａｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、編，Ｖｏｌ．２，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０），ｐｐ．３−２５４；そして古典的な溶液合成については、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  １９８４）ならびにＥ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，編，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１を参照のこと。本発明のポリペプチドはまた、同時複数ペプチド合成の方法によって、化学的に調製され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：５１３１−５１３５；米国特許第４，６３１，２１１を参照のこと。
【００７９】
代替的実施形態において、ＫＧＦフラグメントは、ネイティブのＫＧＦ１６３のコード配列を単離し、欠失されるべきアミノ酸残基をコードするコドンを欠失させ、発現ベクター中に改変されたコード配列を挿入し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換して組換えＫＧＦフラグメントおよびアナログを産生し、そして従来の精製技術を使用して組換えＫＧＦフラグメントを単離することによって、作製され得る。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態において、ＫＧＦフラグメントのコード配列は、従来技術（このようなコード配列を含むことが既知のｃＤＮＡライブラリーからのＫＧＦ１６３のコード配列の単離、および欠失されるべきアミノ酸残基の部分をコードする配列をこのコード配列から欠失させることを含む）によって、獲得され得る。Ｎ末端アミノ酸のコード配列の欠失は、インビボまたはインビトロで達成され得る。前者は、例えば、適切な発現系でのＫＧＦ１６３コード配列の発現によって、達成され得る。後者は、Ｎ末端配列を排除するプライマーを使用する公知のＰＣＲ技術によって達成され得る。
【００８１】
好ましくは、本発明の組成物中で使用するためのポリペプチドは、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現によって、組換え的に産生される。ＫＧＦフラグメントの組換え産生のための方法は、周知である。例えば、米国特許第５，６７７，２７８号、同第５，７７３，５８６号、同第５，８４３，８８３号、同第５，８６３，７６７号および同第６，０７４，８４８号（全てＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚらに対する）；国際公開番号ＷＯ９６／１１９５１およびＷＯ９６／１１９４９；ならびにＯｓｓｌｕｎｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．（１９９８）７：１６８１−１６９０を参照のこと。
【００８２】
特に、本発明で使用するための分子は、分子生物学の標準的技術を使用して作製され得る。例えば、上記分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して（例えば、その遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってか、またはこのポリヌクレオチド配列を含むことが既知のベクターから遺伝子を誘導することによって）獲得され得る。さらに、所望の遺伝子は、標準技術（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの、フェノール抽出およびＰＣＲ）を使用して、この遺伝子を含む細胞または組織から直接的に単離され得る。例えば、ＤＮＡを獲得および単離するために使用される技術の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。目的の遺伝子はまた、クローニングされるのではなく、合成的に産生され得る。これらの分子は、特定の配列についての適切なコドンを用いて設計され得る。次いで、完全配列は、標準的方法によって調製される重複するオリゴヌクレオチドから構築され、そして完全なコード配列へと構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；およびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【００８３】
従って、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を有するベクターから得られ得るか、もしくは完全に合成され得るか、または一部、必要に応じて、当該分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）を使用して、獲得され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得る１つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成機で産生された重複する合成オリゴヌクレオチドの相補的セットをアニーリングし、次いで適切なＤＮＡリガーゼを用いて連結し、そして連結されたヌクレオチド配列をＰＣＲによって増幅することによる。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８４−４０８８を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド指向性の合成（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ５４：７５−８２）、オリゴヌクレオチド指向性の、既存のヌクレオチド領域の変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）、ならびにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用する、ギャップの入ったオリゴヌクレオチドの酵素的フィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３）が、本発明の下で使用されて、変更もしくは増強されたレセプター結合能力、および／または低減した免疫原性を有する分子を提供し得る。
【００８４】
一旦コード配列が調製または単離されると、このような配列は、任意の適切なベクターまたはレプリコン中にクローニングされ得る。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、そして適切なクローニングベクターの選択は、選択事項である。適切なベクターとしては、適切な制御エレメントと結合されると複製し得る、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体またはウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
次いで、コード配列は、発現のために使用される系に依存して、適切な制御エレメントの制御下に置かれる。従って、コード配列は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のため）および必要に応じてオペレーターの制御下に置かれ得、その結果、目的のＤＮＡ配列が、適切な形質転換体によって、ＲＮＡへと転写される。このコード配列は、シグナルペプチドをコードする配列、または翻訳後のプロセシングにおいて宿主によって後に除去され得るリーダー配列を、含んでも含まなくてもよい。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照のこと。シグナル配列が存在する場合、これは、ネイティブの配列であり得るか、または異種シグナル配列であり得るかのいずれかである。
【００８６】
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関して配列の発現の調節を可能にする調節配列を付加することが所望され得る。調節配列は当業者に公知であり、そして例としては、化学的刺激もしくは物理的刺激（調節化合物の存在を含む）に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものが挙げられる。他の型の調節エレメントもまた、ベクター中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、構築物の発現レベルを増大させるために、本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）のエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７）およびヒトＣＭＶ由来のエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列中に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８号））が挙げられる。発現カセットは、適切な宿主細胞中での自律的複製のための複製起点、１つ以上の選択マーカー、１つ以上の制限部位、高コピー数についての能力、および強力なプロモーターをさらに含み得る。
【００８７】
特定のコード配列が適切な調節配列を伴って、コード配列が制御配列の「制御」下で転写される（すなわち、この制御配列においてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼが、コード配列を転写する）ような、制御配列に対するコード配列の位置および方向でベクター中に配置されるように、発現ベクターが構築される。目的の分子をコードする配列の改変は、この目的を達成するために所望され得る。例えば、いくつかの場合、配列が適切な配向で（すなわち、リーディングフレームを維持するように）制御配列に結合され得るように配列を改変する必要があり得る。この制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前に、コード配列と連結され得る。あるいは、このコード配列は、制御配列および適切な制限部位をすでに含む発現ベクター中に、直接クローニングされ得る。
【００８８】
上記のように、参照ＫＧＦフラグメントの変異体またはアナログを生成することも所望であり得る。変異体またはアナログは、ＫＧＦフラグメントをコードする配列の一部の欠失、配列の挿入、および／またはこの配列内の１つ以上のヌクレオチドの置換によって、調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための技術（例えば、部位特異的変異誘発など）は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：６４０９を参照のこと。
【００８９】
分子は、広範な種々の系（昆虫、哺乳動物、細菌、ウイルスおよび酵母の発現系（全て当該分野で周知である））において発現され得る。例えば、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系についての材料および方法は、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から、キットにて市販される。同様に、細菌細胞発現系および哺乳動物細胞発現系は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載される。酵母発現系もまた、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら、編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎに記載される。
【００９０】
上記系での使用に適切な多数の宿主細胞もまた、公知である。例えば、哺乳動物細胞株が当該分野で公知であり、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株（例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞など）が挙げられる。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）は、本発明の発現構築物での用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主は、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用するための昆虫細胞としては、とりわけ、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【００９１】
短縮型ＫＧＦポリペプチドおよびそのアナログの酵母における細胞内発現が、特に所望される。このような系は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）からの精製によって生じ得る問題（多量のＤＮＡ、内毒素およびタンパク質混入物の存在を含む）を回避する。さらに、天然に存在する酵母の酵素は、分子が組換え的に産生される場合に存在し得るＮ末端メチオニンを効率的に切断し、そして酵母系が使用される場合にこの酵素を過剰発現する必要がない。さらに、ＫＧＦは、天然に分泌されるタンパク質であるが、ネイティブおよび短縮型のＫＧＦおよびそのアナログは、分泌されずに、酵母内で産生され、これらは、可溶性であり、適切に折り畳まれ、そして活性である。
【００９２】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、宿主ゲノム中に安定に組み込まれ得るか、または当該分野で周知の種々の遺伝子送達技術を使用して、適切な宿主細胞中の安定なエピソームエレメント上で維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【００９３】
選択される発現系および宿主に依存して、分子は、タンパク質が発現される条件下で、上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖することによって生成される。次いで、発現されたタンパク質は、宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系が、タンパク質を増殖培地中に分泌する場合、生成物は、培地から直接精製され得る。生成物が分泌されない場合、生成物は細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当該分野の技術範囲内である。
【００９４】
次いで、ＫＧＦフラグメントは、被験体への送達のために、以下にさらに記載される薬学的組成物へと処方される。あるいは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、被験体に直接送達され得、そしてインビボで発現され得る。多数のウイルスに基づく系が、哺乳動物細胞中への直接的遺伝子移入のために開発されている。これに関して、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利な土台を提供する。所望のポリペプチドをコードする、選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を使用して、ベクター中に挿入され得、そしてレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され、そして被験体に送達され得る。多数の適切なレトロウイルス系が記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０〜９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５〜１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９〜８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３〜８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２〜１０９）。
【００９５】
多数の適切なアデノウイルスベクターもまた、記載されている。宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外のままで存在し、それによって挿入性突然変異に関連する危険が最小になる（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７〜２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１〜５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７〜７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３〜９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１〜５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６〜６２９；およびＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１〜４７６）。近年、種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が、遺伝子送達のために開発されている。このような系は、転写の誘導を可能にする制御配列（例えば、プロモーターおよびポリアデニル化部位、ならびに選択マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列および他の制御エレメント）を含み得る。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）および同ＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，（１９８８）８：３９８８〜３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３〜５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７〜１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３〜８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５〜１６９；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７〜１８７５を参照のこと。
【００９６】
本発明の分子をコードする核酸分子を遺伝子移入により送達するための用途を見出すさらなるウイルスベクターとしては、ポックスファミリーのウイルス（例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルス（ａｖｉａｎ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ）を含む）由来のベクターが、挙げられる。例えば、国際公開番号ＷＯ９１／１２８８２；ＷＯ８９／０３４２９；およびＷＯ９２／０３５４５を参照のこと。
【００９７】
分子結合体化ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載される、アデノウイルスキメラベクター）もまた、本発明の下で遺伝子送達のために使用され得る。
【００９８】
アルファウイルス属のメンバー（例えば、これらに限定はされないが、シンドビスウイルス由来のベクターおよびセムリキ森林ウイルス由来のベクター）もまた、目的の遺伝子を送達するためのウイルスベクターとしての用途を見出す。本発明の方法の実施に有用なシンドビスウイルス（Ｓｉｎｂｕｓ−ｖｉｒｕｓ）由来ベクターの記載に関しては、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８〜５１９；および国際公開番号ＷＯ９５／０７９９５およびＷＯ９６／１７０７２を参照のこと。
【００９９】
目的の遺伝子はまた、ウイルスベクターを用いないで送達され得る。例えば、この遺伝子は、被験体またはその被験体に由来する細胞に送達する前に、付随する抗原を含んでかまたは含まずに、リポソーム中にパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般に、核酸を安定に結合または捕捉しそして保持し得る、リポソームを使用して達成される。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の概説に関しては、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１〜１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）、第１０１巻、５１２〜５２７頁を参照のこと。
【０１００】
本発明のＫＧＦフラグメントは、レセプター認識部位の同定のため、ならびにペプチドアゴニストまたはアンタゴニストの設計のために、使用され得る。さらに、ケラチノサイトに対するＫＧＦの独自の特異性、血管内皮細胞または繊維芽細胞の増殖を誘導する能力がないこと、およびその細胞傷害性の欠如の観点から、短縮型分子およびそのアナログは、創傷治癒適用のために、特に、皮膚の再上皮形成を促進することが望まれる場合に、選択される好ましい薬剤である。短縮型ＫＧＦ分子は、角膜上皮治癒において特に有用である。分子の他の使用としては、胃腸管において見出される上皮細胞に対する特異性を利用する適用が挙げられる。
【０１０１】
本発明のフラグメントは、その意図された使用に適切な他の分子に結合体化され得る。例えば、ＫＧＦポリペプチドは、その標的細胞（すなわち、上皮細胞、特にケラチノサイト）の破壊のために、毒性分子（例えば、リシンＡ、ジフテリア毒素、またはサポニン（ｓａｐｏｒｉｎ）と結合体化され得る。本明細書中での使用に適切なこのようなＫＧＦ毒素結合体は、当該分野で公知の方法（例えば、米国特許第４，７７１，１２８号、同第４，８０８，７０５号および同第４，８９４，４４３号、ならびに国際公開番号ＷＯ  ９２／０４９１８）によって生成され得る。
【０１０２】
本発明の組成物は、１種以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル、ならびに必要に応じて他の治療成分および／または予防的成分と共に、上記の分子を含む。このような賦形剤としては、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどのような液体が挙げられる。非液体処方物のために適切な賦形剤もまた、当業者に公知である。薬学的に受容可能な塩が、本発明の組成物中で使用され得、そしてこれには、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような無機酸の塩類；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩類が挙げられる。薬学的に受容可能な賦形剤および塩の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）において利用可能である。
【０１０３】
さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝化物質、界面活性剤など）は、このようなビヒクル中に存在し得る。生物学的緩衝液は、薬理学的に受容可能であり、そして所望のｐＨ（すなわち、生理学的に受容可能な範囲のｐＨ）を有する処方物を提供する、実質的に任意の溶液であり得る。緩衝化溶液の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、Ｈａｎｋ’ｓ緩衝化生理食塩水などが挙げられる。
【０１０４】
特に好ましい組成物は、局所的に適用される組成物である（例えば、軟膏、ペースト、粉剤、包帯、クリームおよび絆創膏）。このような局所的組成物としてはまた、局所麻酔（例えば、ベンゾカイン、リドカイン、ジブカイン、塩酸ジクロニン、塩酸プラモキシン、塩酸プロパラカイン、テトラカイン、塩酸ベノキシネート（ｂｅｎｏｘｉｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ピクリン酸アミノ安息香酸ブチル、チョウジ油およびオイゲノール、ならびに上記の組み合わせおよび誘導体が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられ得る。眼への直接送達のための眼科組成物はまた、本発明のＫＧＦフラグメントを用いて特に使用されるものである。例えば、種々の局所的組成物および眼科組成物の考察については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を参照のこと。
【０１０５】
上記のように、一旦処方されると、本発明の組成物は、一般に、局所的または眼に、投与される。しかし、他の投与様式としては、非経口投与（例えば、静脈内、動脈内、関節内（例えば、膝への）、皮下、皮内、筋内、経皮、鼻腔内、粘膜、およびエアロゾル投与による）が挙げられる。例えば、この組成物は、吸入（例えば、鼻または口のスプレーまたはエアロゾル）によって投与され得る。この組成物はまた、インサイチュで（例えば、移植によって）送達され得る。
【０１０６】
組成物の薬学的有効量または治療的有効量が、被験体に送達される。正確な有効量は、被験体によって異なり、そして種、年齢、被験体の大きさおよび健康状態、処置される状態の性質および程度、処置を行う医師の推奨、ならびに投与のために選択された治療剤または治療剤の組み合わせに依存する。従って、所定の状況についての有効量は、慣用的な実験によって決定され得る。本発明の目的のために、局所的に投与される場合、治療剤の量は、一般的に、約０．１μｇ／創傷ｃｍ２〜約５００μｇ／創傷ｃｍ２、好ましくは約１μｇ／創傷ｃｍ２〜約１００μｇ／創傷ｃｍ２、より好ましくは約１〜１０μｇ／創傷ｃｍ２〜約５０μｇ／創傷ｃｍ２、またはこれら値の間の任意の整数（例えば、２１、２２、２３、２４・・・３０、３１、３２、３３、３４・・・４０、４１、４３・・・５０・・・６０・・・など）の範囲である。非経口投与について、代表的な用量は、１以上の用量中に、約０．０１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約８０μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは１μｇ／ｋｇ／日〜約４０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。代表的に、ポリヌクレオチドが送達される場合、用量は、少なくとも１桁低い規模である。被験体は、問題の障害の兆候、症状または原因を低減および／または緩和するか、あるいは生物学的系の任意の他の所望の変更をもたらすのに必要なだけの数の用量を投与され得る。任意の事象において、目的の組成物中に存在するＫＧＦフラグメントの量は、等価な応答を得るために必要なＫＧＦ１６３の量よりも少ない量である。この量は、問題のフラグメントの生物学的活性を、上記のようなＫＧＦ１６３フラグメントの生物学的活性と比較することによって、容易に決定される。
【０１０７】
（ＩＩＩ．実験）
本発明を実施するための特定の実施形態の例を以下に示す。これらの実施例は、例示の目的のみのために提供され、いかなる手段によっても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１０８】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を確証するための努力が成されているが、ある程度の実験的誤差および偏差が、当然、許容されるべきである。
【０１０９】
酵素は、市販の供給源から購入し、そして製造業者の指示に従って使用した。放射性核種およびニトロセルロースフィルタもまた、市販の供給源から購入した。
【０１１０】
ＤＮＡフラグメントのクローニングにおいて、注記される以外は、全てのＤＮＡ操作を標準的な手順に従って行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。制限酵素、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメントおよび他の生物学的試薬は、業者から購入し、そして製造業者の指示に従って使用した。二重鎖ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲルで分離した。
【実施例】
【０１１１】
（実施例１）
（細胞内酵母発現のための短縮型ＫＧＦ酵母ベクターの構築）
この実施例は、本発明とともに使用するための種々の短縮型ＫＧＦ分子の細胞内発現のための酵母発現ベクターに関する手順を記載する。
【０１１２】
この発現ベクターは、特定の短縮型ＫＧＦコード配列を、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（ハイブリッド酵母プロモーター）の制御下に含んだ。特に、各異なる短縮のために、２つのオリゴ（下記を参照のこと）（上鎖および下鎖）を使用した。これらのオリゴをアニーリングさせ、その後、連結反応物中に配置した。この連結反応物は、プラスミドｐＳＩ３（Ｎｃｏ部位およびＳａｌ部位にて切断した）、短縮型ＫＧＦをコードするＫｐｎ／Ｓａｌフラグメント、およびアリールしたオリゴ対のうちの１つを含んだ。このオリゴ対は、望ましい特定の短縮型ＫＧＦタンパク質のアミノ末端をコードした。このオリゴ対は、ＫＧＦコードフラグメントのＫｐｎ部位にベクターのＮｃｏ部位を連結するように設計した。プラスミドｐＳＩ３は、ｐＹＡＳＩ１の誘導体である。このプラスミドを、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡに１９８５年２月２７日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号２０７４５を割り当てられた。ｐＹＡＳＩ１の構築は、米国特許第４，７５１，１８０号に記載される。
【０１１３】
完全な短縮型ＫＧＦのための種々のオリゴは、以下の通りであった。このオリゴ配列中の「Ｘ」は、５’リン酸基を示す。
【０１１４】
【化１】
2005500390.tif 000002
【０１１５】
【化２】
2005500390.tif 000003
【０１１６】
【化３】
2005500390.tif 000004
【０１１７】
【化４】
2005500390.tif 000005
さらに、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）をコードする発現ベクター、および最初の２３個のＮ末端アミノ酸が欠失された短縮型ＫＧＦ分子（ＫＧＦｄｅｓ１〜２３）をコードする発現ベクターを、作製した。例えば、米国特許第５，６７７，２７８号を参照のこと。天然に存在するアルギニンの代わりにＮ末端にアラニン残基を有するＫＧＦｄｅｓ１〜２２のアナログもまた、作製した。
【０１１８】
（実施例２）
（酵母細胞による短縮型ＫＧＦ分子の細胞内発現）
上記発現ベクターを使用して、標準的方法を使用する酢酸リチウムトランスフェクションによってＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換した。例えば、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）を参照のこと。形質転換体を、２％グルコースを含むウラシル欠損培地上で選択した。形質転換体を、５％グルコースを含むロイシン欠損培地５ｍｌ中で、振盪機器中で３０℃にて一晩インキュベートした。この組換え短縮分子の生成用培地は、２０ｍｌ培養であり、２％グルコースを含むＹＥＰ培地中の一晩培養物を約７２時間播種した。
【０１１９】
（実施例３）
（短縮型組換えＫＧＦ分子の精製）
上記からの培養物を遠心分離して、酵母細胞ペーストを形成した。細胞を、標準的技術を使用して、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）中に溶解した。その細胞溶解物は、Ｄｙｎｏｍｉｌｌ  ＤＫＬ−Ｐｉｌｏｔ中のガラスビースを使用して、バッチとして作製した。溶解物生成を、細胞破壊が≧９５％の時に完了した。そのホモジネートを、適切な熱交換器を使用することによって、４℃〜８℃に冷却した。その後、その溶解物を４℃にて１５，０００ｇで３０分間遠心分離することによって、破片を除去した。その上清のＮａＣｌ濃度を、０．５Ｍ  ＮａＣｌに調整し、そして組換え短縮型ＫＧＦを、以下のように上清から精製した。
【０１２０】
（Ａ．Ｈｅｐａｒｉｎ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ親和性クロマトグラフィー）
上記のようにして得た上清を、すぐにＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨＳ）樹脂カラムにすぐに適用した。その溶解生成物を、ＨＳ樹脂の３０ｍｌ床を通して４℃にて約３０分間流した。そのカラムを、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ、および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）を含む緩衝液中で平衡化した。一旦その細胞溶解物をローディングすると、２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに戻るまで、そのカラムを上記平衡化緩衝液で徹底的に洗浄した。増加する段階式ＮａＣｌ勾配を用いてＨＳカラムからタンパク質を溶出した。そのＮａＣｌ濃度は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１Ｍ  ＤＴＴ中で１Ｍ  ＮａＣｌおよび２Ｍ  ＮａＣｌであった。溶出の間のカラムの流速は、約９０ｍｌ／時間であり、４ｍｌサイズの画分を収集した。
【０１２１】
それらの画分を、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞を使用してＫＧＦ生物活性について試験した。このアッセイを下記に示す。最高の生物活性を有する画分を、１Ｍ  ＮａＣＬを用いて溶出し、そしてプールした。プールした画分を次のカラム上にローディングする前に、それらの画分を、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）に対して透析した。
【０１２２】
（Ｂ．Ｍｏｎｏ  Ｓカチオン交換クロマトグラフィー）
ＨＳカラムから溶出したプールした画分を、高圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）に接続したＭｏｎｏ  Ｓカラム上へとＳｕｐｅｒループを用いてローディングした。このＭｏｎｏ  Ｓカチオン交換カラムを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）を用いて平衡化した。プールした画分をローディングした時、吸光度がベースラインに戻るまで、このカラムを、上記平衡化緩衝液を用いて流速１ｍｌ／分にて徹底的に洗浄した。その後、直線ＮａＣｌ勾配（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．３）中０．２Ｍ  ＮａＣｌ〜１Ｍ  ＮａＣｌ）にて流速１ｍｌ／分でカラムから溶出し、１ｍｌ画分を収集した。
【０１２３】
主要なタンパク質ピークは、約０．６Ｍ  ＮａＣｌにて溶出した。このタンパク質ピークを通る画分を、生物活性についてアッセイし、そして活性画分をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。プールした画分のタンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）からのタンパク質アッセイキットに添付されている指示書に従うＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。
【０１２４】
（実施例４）
（Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞を使用するＫＧＦ生物活性アッセイ）
ＫＧＦ生物活性を、プールした０．６Ｍ  ＮａＣｌ画分がＢａｌｂ／Ｍｋ細胞の増殖を促進する能力によって評価した。詳細には、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞のストック培養物を、１０％ウシ胎仔血清と、０．２５μｇ／ｍｌフンジゾンと、１０ｎｇ／ｍｌ酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）とを補充した、低カルシウムダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ、そして維持した。その細胞を、９９％の湿度を有する１０％  ＣＯ２雰囲気中で３７℃にてインキュベートした。この生物活性アッセイのために、細胞を、ストック培養物について上記しＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９０）１４２：３２５〜３３３に記載されたような培地１ｍｌ中に１ウェルあたり５×１０３細胞の密度にて、１２ウェルプレート中に播種した（但し、播種培地は、ａＦＧＦを全く含まなかった）。
【０１２５】
望ましいカラム画分の１０μｌアリコートを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．２％（ｗ／ｖ）ゼラチン１ｍｌ中に希釈した。この希釈物１０μｌを、２２ｍｍウェルを含む１２ウェルクラスタープレート中に１ウェルあたり５×１０３細胞で播種したＢａｌｂ／Ｍｋ細胞に添加した。そして希釈したカラム画分かまたは１０ｎｇ  ａＦＧＦ含有培地のいずれかの１０μｌアリコートを、１日おきに細胞に添加した。
【０１２６】
培養７日間後に、細胞をトリプシン処理し、そしてＣｏｕｌｔｅｒＴＭカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌａ，ＵＳＡ）を使用して最終細胞密度を決定した。その培養培地を、０．９％  ＮａＣｌと、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）と、０．２５％トリプシンと、０．０２％  ＥＤＴＡ（ＳＴＶ）とを含む溶液で置換することによって、その細胞をプレートから遊離させた。その細胞を、３７℃にて５分〜１０分間この溶液中でインキュベートし、その後、ストック培養培地を、細胞に添加した。その後、その細胞を、ＣｏｕｌｔｅｒＴＭカウンターを使用して計数した。最終細胞密度を、カラム画分のタンパク質濃度の関数としてグラフにした。そのタンパク質濃度を、対数スケールにてグラフにした。
【０１２７】
そのＥＤ５０を、（ａ）曲線の最低細胞密度値と最高細胞密度値との間の差異を半分に除算し、（ｂ）そのグラフから、どのタンパク質濃度が、（ａ）において得られた細胞密度数に対応するかを決定することによって、計算した。
【０１２８】
ＫＧＦｄｅｓ１〜２２、ＫＧＦｄｅｓ１〜２３、ＫＧＦｄｅｓ１〜２４、ＫＧＦｄｅｓ１〜２６、およびＫＧＦｄｅｓ１〜３０についての代表的バイオアッセイの結果を、図２Ａに示す。同様の比較を、ＫＧＦｄｅｓ１〜２３、ＫＧＦｄｅｓ１〜２６、ＫＧＦｄｅｓ１〜３０、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）および全長ＫＧＦ（ＦＬ−ＫＧＦ）を用いて行った。結果を、図２Ｂに示す。異なる短縮形態のＥＤ５０を、１００％として採用したネイティブＫＧＦのＥＤ５０に対して正規化した（表１）。ＫＧＦｄｅｓ１〜２２、ＫＧＦｄｅｓ１〜２３、およびＫＧＦｄｅｓ１〜２４は、生物学的活性の有意な増加を有した。詳細には、ＫＧＦｄｅｓ１〜２２は、ネイティブＫＧＦ１６３より約６倍高い活性であり、一方、ＫＧＦｄｅｓ１〜２３およびＫＧＦｄｅｓ１〜２４は、ネイティブＫＧＦ１６３より１０倍高い活性であった。１分子ベースで比較して分子量について調整した場合でさえ、これらの種は、ＫＧＦ１６３と比較して大いに増大した活性を示した。ＫＧＦｄｅｓ１〜２４を越えてＫＧＦｄｅｓ１〜２４までの欠失は、ＫＧＦの短縮形態を、ネイティブ形態と匹敵する活性を有するようにし、ＫＧＦｄｅｓ１〜２６を越える欠失は、生物学的活性の減少をもたらした。
【０１２９】
ネイティブ形態の生物学的活性のうちのほんの２〜３％しか保持しないＫＧＦｄｅｓ１〜３５は、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞に対して試験した場合に、ａＦＧＦと同程度活性であったことに注目すべきである。この形態は、他の短縮物のいずれよりも高くａＦＧＦと相同性であるので、このＫＧＦ短縮形態は、ＫＧＦに特有の標的細胞特異性を失ったかもしれないかに関する疑問が生じた。上記に説明したように、ＫＧＦは、広範な標的細胞（特に、内皮細胞）を有する他のＦＧＦ形態とは対照的に、上皮起源の細胞のみを刺激する。しかし、このことは、見かけ上生じない。なぜなら、ヘパリンの存在下もしくは不在下で、副腎皮質由来毛細血管内皮細胞（ＡＣＥ）または成体ウシ大動脈内皮細胞（ＡＢＡＥ）のいずれかに対して試験した場合（下記を参照のこと）、ＫＧＦｄｅｓ１〜３５およびより短い他の短縮物は、不活性であったからである（図３）。
【０１３０】
【表１】
2005500390.tif 000006
＊（ＫＧＦｘｘｘのＥＤ５０÷ＫＧＦ１６３のＥＤ５０）×１００
＊＊分子量（ＭＷ）は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラム（１９９９年１２月２２日），Ｉｎｆｏｍａｘ，Ｉｎｃ．を使用して計算した。
【０１３１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された、天然に存在するＮ末端アルギニンの代わりにアラニンで置換されたＫＧＦｄｅｓ１〜２２アナログの活性を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたＫＧＦｄｅｓ１〜２３と比較した。このアナログを、複数回試験した。このアナログは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたＫＧＦｄｅｓ１〜２３のＥＤ５０と類似するＥＤ５０を示した。
【０１３２】
（実施例５）
（ＡＢＡＥ細胞またはＡＣＥ細胞に対するＫＧＦ生物活性）
ＫＧＦを、他の形態のＦＧＦ（塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）または酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ））と比較した場合の、大血管由来の血管内皮細胞（成体ウシ大動脈内皮細胞（ＡＢＡＥ））または毛細血管細胞に由来する血管内皮細胞（副腎皮質由来毛細血管内皮細胞（ＡＣＥ））に対する活性の欠如によって特徴付け得る。種々のＦＧＦ短縮形態がこの細胞特異性を保持しているか否かを分析するために、内皮細胞に対するその生物学的活性を試験した。
【０１３３】
ＡＢＡＥ細胞およびＡＣＥ細胞のストック培養物を、１０％ウシ血清と、０．２５μｇ／ｍｌフンジゾンと、２ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦとを補充した、ダルベッコ改変イーグル培地中で、増殖させそして維持した。その細胞を、１０％ＣＯ２濃度および９９％湿度とともに、３７℃にてインキュベートした。
【０１３４】
マイトジェンアッセイにおいて、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ（１９７６）７３：４１２０〜４１２４；Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９７６）１２７：１２１〜１３６；およびＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ（１９８９）８６：７３１１〜７３１５に記載されるように、ストック培養培地中にて、１２ウェルプレートの１ウェルあたり、５×１０３個のＡＢＡＥ細胞またはＡＣＥ細胞のいずれかをプレートした。
【０１３５】
飽和濃度のＫＧＦ１６３および種々の短縮型ＫＧＦ改変体および塩基性ＦＧＦを、１日おきに添加した。培養７日間後、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞培養について記載されるように細胞をトリプシン処理し、そして最終細胞密度をＣｏｕｌｔｅｒカウンターを使用して決定した。
【０１３６】
図３に示されるように、試験したＮ末端短縮ＫＧＦポリペプチドのすべてが、ｂＦＧＦと比較してＡＢＡＥおよびＡＣＥの両方に対する活性を欠いた。これらの短縮は、酸性ＦＧＦとの構造的アライメントに一部基づいた。これらの結果は、ネイティブＫＧＦの能力は、細胞特異性を変化させることなく酸性ＦＧＦの能力へと変化され得ることを、確認する。酸性ＦＧＦは、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞についての公知のマイトジェンであり、その能力は、ＫＧＦの能力の１０分の１である。このことは、ＫＧＦレセプターに対してのより低いＦＧＦの結合親和性を反映する。ネイティブＫＧＦの最初の３０アミノ酸〜３５アミノ酸の除去は、これらの短縮型アナログにより示される生物学的活性の強力な減少（ネイティブＫＧＦの２８．５％および３％）をもたらす。同時に、酸性ＦＧＦとＫＧＦとの間の相同性の程度は、ＦＧＦレセプターと相互作用するための細胞構造決定因子が維持される場合に、増加する。従って、より長く欠失しているＫＧＦアナログは、酸性ＦＧＦとより類似して挙動する。驚くべきことに、最長の欠失の場合でさえ、ＫＧＦに典型的な標的細胞特異性は維持され、そして、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦとは対照的に、そのアナログは、血管内皮細胞についてマイトジェンではない。
【０１３７】
（実施例６）
（熱安定性研究）
ネイティブのＫＧＦポリペプチドおよび種々のＮ末端短縮型ＫＧＦポリペプチドの、上昇した温度に耐える能力を試験した。０．１ｍｇ／ｍｌタンパク質を含むサンプルを、ＰＢＳを含まないＣａ＋＋Ｍｇ＋＋中に調製し、そして各サンプルの１００μｌを、１ｍｌプラスチックバイアルへとアリコートした。このバイアルを密封し、そして３７℃のインキュベーターに置いた。所定の時間間隔で、バイアルを取り出し、そして可溶性タンパク質の損失について分析した。
【０１３８】
３０μｌのアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｔｒｉｓ−グリシンプレキャストゲル（５％〜２０％のアクリルアミド、Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７：６８０−６８５に従う）を用いる電気泳動システム（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で行った。サンプルを、還元または非還元のＳＤＳサンプル緩衝液と、加熱しないでローディングの前に混合した。
【０１３９】
タンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色により検出した。この染色したゲルを、ＢｉｏＲａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ＧＳ  ７００  Ｉｍａｇｉｎｇデンシトメーター（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を用いてデンシトメトリーによりスキャンした。可溶性タンパク質の量を、染色されたバンドの面積を積分し、そして３７℃でのインキュベーション時間の関数として結果をプロットすることにより決定した。次いで、可溶性単量体タンパク質の損失についての半減期を、これらの動力学的曲線から評価した。
【０１４０】
種々の時間間隔でのサンプルの生物学的活性をまた、上記のＢａｌｂ／ＭＫ細胞増殖アッセイを用いて決定した。種々のサンプルの生物学的活性についての半減期を、３７℃でのインキュベーション時間の関数としてサンプルのＥＤ５０をプロットすることにより決定した。
【０１４１】
特に、ネイティブＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）対ＫＧＦｄｅｓ１−２３の熱安定性およびオリゴマー形成を、３７℃にて０〜８日間の範囲でＫＧＦポリペプチド（ＰＢＳ中に希釈した１８４μｇ／ｍｌネイティブＫＧＦおよび１３８μｇ／ｍｌ  ＫＧＦｄｅｓ１−２３）をインキュベートすることにより評価した。アリコートを、毎日取り、そしてそれら能力をＢａｌｂ／Ｍｋ細胞について評価し、一方で、オリゴマー形成をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、ネイティブのＫＧＦは、二量体を容易に形成した。二量体化は、ＫＧＦｄｅｓ１−２３についてはるかに明白ではなかった。ネイティブＫＧＦの単量体形態についての時間の関数として染色した際の低下もまた顕著であった。再度、これも、ＫＧＦｄｅｓ１−２３についてはるかに明白ではなかった。
【０１４２】
細胞増殖アッセイは、これらの条件下で、ネイティブＫＧＦの生物学的半減期は、２日であり、一方、ＫＧＦｄｅｓ１−２３の半減期は、７日であったことを示した。
【０１４３】
熱安定性研究はまた、ＫＧＦｄｅｓ１−１５、ＫＧＦｄｅｓ１−１８、ＫＧＦｄｅｓ１−１９、ＫＧＦｄｅｓ１−１２０、ＫＧＦｄｅｓ１−２１、ＫＧＦｄｅｓ１−２２、ＫＧＦｄｅｓ１−２４、ＫＧＦｄｅｓ１−２５、ＫＧＦｄｅｓ１−２６、ＫＧＦｄｅｓ１−３０、およびＫＧＦｄｅｓ１−３５を、全長ＫＧＦよりも、様々な程度ではあるが、より安定にしたことを示す。３日ごとにサンプルを採取して２４日間続く代表的な安定性研究を図４に示す。この研究において、ＫＧＦｄｅｓ１−２４およびＫＧＦｄｅｓ１−１５（１００μｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ中に希釈し、そして３７℃でインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサンプルを非還元条件下で分析した。次いで、ゲルを染色し、そしてデンシトメトリーによりスキャンした。
【０１４４】
９日〜２４日の熱安定性研究の延長は、ＫＧＦｄｅｓ１−２３対ネイティブＫＧＦのより正確に規定された半減期の溶液を可能にする。図５に示されるように、ネイティブのＫＧＦの半減期は、ＫＧＦｄｅｓ１−２３について７日対１７日であった。
【０１４５】
これらの結果は、合わせると、ネイティブのＫＧＦと短縮型分子との間の生物学的活性の差異は、一部、異なる熱安定性により引き起こされ得ることを示す。
【０１４６】
（実施例７）
（ｐＨ２．１での酸安定性）
時間の関数としてのオリゴマーの形成の後、３７℃にて種々の時間間隔の間維持された、ネイティブのＫＧＦサンプルおよびＫＧＦｄｅｓ１−２３サンプルを、逆相ＨＰＬＣにより分析した。１００μｌのサンプルを、水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｐＨ２．１）に希釈した。次いで、このサンプルを、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中で平衡化した、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラム（０．４６ｃｍ×２５ｃｍ、５μｍ粒子サイズ、３００Åポアサイズ）にアプライした。タンパク質を、線形の１１５分の多重線形アセトニトリル勾配（２０〜１００％）で溶出した。吸収ピークを、これらの表面積を積分することにより、それらのタンパク質含有量について分析した。単量体タンパク質の量を、時間の関数としてプロットした。次いで、この単量体タンパク質についての半減期を、上記のように推定した。オリゴマーの形成を決定するために、サンプルをまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより非還元条件下で分析した。種々のタンパク質ピークの生物学的活性を、上記のように、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞増殖アッセイを用いて決定した。
【０１４７】
特に、ネイティブのＫＧＦ（２８μｇ／ｍｌ）およびＫＧＦｄｅｓ１−２３（３６μｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ中に希釈し、３７℃にて０〜９日間の範囲の時間間隔の間でインキュベーションし、そしてアリコートを、酸条件（ｐＨ２．１）下で、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、毎日分析した。ネイティブおよびＫＧＦｄｅｓ１−２３の両方について６０分で溶離した、ＵＶ吸収の単一のピークを観察した。ピークの強度は、時間の関数として減少した。しかし、この減少は、ＫＧＦｄｅｓ１−２３よりもネイティブのＫＧＦについてより明白であり、その結果、９日までに、両方のピークの積分は、ネイティブＫＧＦの量がＫＧＦｄｅｓ１−２３の１／３であったことを示した。ネイティブＫＧＦの質量の減少は、生物学的活性の激しい低下に関係していた。７日までに、ネイティブのＫＧＦは、不活化した。対照的に、ＫＧＦｄｅｓ１−２３は、その本来の生物学的活性の５０％をまだ保持した（図６）。
【０１４８】
（実施例８）
（一度のみ対一日おきに加えた場合の、ネイティブＫＧＦ対ＫＧＦｄｅｓ１−２３の生理活性の比較）
上記の細胞増殖アッセイにおいて、漸増濃度のネイティブＫＧＦおよびＫＧＦｄｅｓ１−２３を、１日おきに加えた。安定性が増加した活性の機構である場合、たとえ、全ての細胞増殖が少ないとしても、ネイティブＫＧＦポリペプチドまたは短縮型ＫＧＦポリペプチドを、一日おきよりもむしろ、一度で、加えた場合、これらは、なおも、用量応答において同じ差異であるべきである。この仮説を試験するために、種々の濃度のＫＧＦｄｅｓ１−１８、ＫＧＦｄｅｓ１−２３およびＫＧＦｄｅｓ１−２５を、図７に示される濃度で一回のみ加えた。図７および表２に示されるように、生物学的活性の同じ差異が、ＫＧＦｄｅｓ１−２３で観察された。特にＫＧＦｄｅｓ１−２３は、１日おきに加えた場合、ネイティブＫＧＦよりも、１０倍より活性であったのに対して、一度で加えた場合、１３倍、より活性であった。さらに、ＫＧＦｄｅｓ１−１８ポリペプチドおよびＫＧＦｄｅｓ１−２５ポリペプチドの両方は、ネイティブのＫＧＦを超える活性の増加を示した。このことは、増加した安定性が、増加した能力に寄与する機構の１つであるを確かにする。
【０１４９】
【表２】
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（実施例９）
（ネイティブＫＧＦの迅速な消失の原因となるプロテアーゼ汚染）
ネイティブＫＧＦ調製物のプロテアーゼ汚染（ＫＧＦｄｅｓ１−２３調製物由来を除く）がネイティブＫＧＦの迅速な消失の原因であった可能性を除外するために、以下の実験を行った。ネイティブのＫＧＦおよびＫＧＦｄｅｓ１−２３（１００μｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ中に希釈し、そして単独かまたは等比率（ｖ／ｖ）のいずれかで、３７℃にてインキュベートした。サンプルを、３、６、９および１２日目に取り、そして上記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。染色の後、ゲルをデンシトメトリーでスキャンした。ネイティブのＫＧＦが消失し、ＫＧＦｄｅｓ１−２３が消失しない場合、プロテアーゼ汚染を除外した。
【０１５０】
ネイティブのＫＧＦは、６日までに消失した。しかし、ＫＧＦｄｅｓ１−２３は、１２日後になおも見られ得、このことは、ネイティブＫＧＦの消失についての理由としてのプロテアーゼ汚染の可能性を排除する。しかし、驚くべきことに、ＫＧＦｄｅｓ１−２３を単独でインキュベートした場合、対  ＫＧＦｄｅｓ１−２３をネイティブのＫＧＦと組合わせてインキュベートした場合には、バンド染色強度における差異があった。ＫＧＦｄｅｓ１−２３バンドの染色強度は、ネイティブのＫＧＦと混合した場合よりも、単独でインキュベートした場合、かなり増大した。ＫＧＦｄｅｓ１−２３がネイティブのＫＧＦと共にインキュベートした場合、複合体形態およびＫＧＦｄｅｓ１−２３を溶液から取り出すことが可能である。
【０１５１】
ネイティブＫＧＦ対ＫＧＦｄｅｓ１−２３の生物学的活性を分析した場合、能力の１０倍の増加が観察され、これは、短縮型形態対ネイティブ形態のより高い熱安定性と関係した。従って、増大した安定性は、増大した能力を一部説明する。しかし、このことは、増大した活性に寄与する機構のみであるようではない。特定の理論にとらわれることなく、ネイティブのＫＧＦの活性の欠如は、溶液からの沈殿に起因し得る。上記の種々の短縮を、安定性および生物学的活性について分析した場合、これらは、ネイティブ形態と比較して、増大した安定性および生物学的活性を示した。しかし、増大した安定性と増大した生物学的活性との間にわずかな関係が存在した。例えば、ＫＧＦｄｅｓ１−１５およびＫＧＦｄｅｓ１−２４は、匹敵する熱安定性を有したが、ＫＧＦｄｅｓ１−２４は、ネイティブＫＧＦよりも、１０倍より強力であった一方、ＫＧＦｄｅｓ１−１５は、１．５倍より活性であった。従って、他の機構が存在するようであり、これは、最も強力な分子、ＫＧＦｄｅｓ１−２２、ＫＧＦｄｅｓ１−２３およびＫＧＦｄｅｓ１−２４の増大した能力に寄与する。能力の最大増加を与えるドメインが、これらの残基からなるドメインに限定されることもまた著しかった。従って、これらの３つの残基は、レセプターと相互作用するＫＧＦの最適な立体配座を提供し得る。
【０１５２】
短縮化は、ネイティブのＫＧＦ能力が、細胞特異性の変化なしにａＦＧＦの能力に変化され得ることを確認する。酸性ＦＧＦは、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞についての公知のマイトジェンであり、そしてこれは、ＫＧＦよりも１０倍低い活性である。このことは、ＫＧＦレセプターについての低い結合アフィニティーに起因する。３０〜３５アミノ酸の除去は、短縮型ポリペプチドの生物学的活性の強力な低下（それぞれ、ネイティブのＫＧＦの２８．５％および３％）を導く。同時に、より長い欠失は、ａＦＧＦとＫＧＦとの間の相同性の度合を増加し、そしてＦＧＦレセプターと相互作用するための細胞構造決定因子を増加する。従って、欠失が長くなれば、よりａＦＧＦのように、短縮型ＫＧＦポリペプチドは振舞う。驚くべくことに、最も長い欠失でさえ、ＫＧＦの特色を示す標的細胞特異性（すなわち、上皮起源の細胞について）を保持し、そして最も短いポリペプチドは、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦとは対照的に、血管内皮細胞に対して分裂促進性ではなかった。ＫＧＦのＮＨ２末端ドメイン（少なくとも最初の３５残基と同じくらい遠いドメインが考慮される）は、その細胞特異性に関与するようにみえないというこれらの知見は、以前の報告と対照的である（例えば、国際公開ＷＯ  ９０／０８７７１を参照のこと）。
【０１５３】
（実施例１０）
（Ｎ末端短縮型ＫＧＦポリペプチドのインビボでの効力）
全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）およびＮ末端短縮型分子（ＫＧＦｄｅｓ１−２３）を、外科的結腸吻合（ａｎａｓｔａｍｏｓｉｓ）の治癒のラットモデルにおいて試験した。特に、５ｍｇ／ｍｌ  ＫＧＦ１６３または１ｍｇ／ｍｌ  ＫＧＦｄｅｓ１−２３を含む、ＫＧＦ処方物を、ラットに腹腔内投与する。結腸の陰窩の深さ（μｍ）、治癒に関係する細胞増殖の測定、およびｍｍＨｇの破裂圧、治癒した創傷の強度の測定を、ＫＧＦ１６３を与えたラットについて２、４および７日目に、そして短縮型分子を与えたラットについて２、４、６日目に測定した。結果を表３および４に示す。
【０１５４】
特に、１ｍｇ／ｍｌの短縮型分子は、創傷治癒を促進する５ｍｇ／ｍｌの全長ＫＧＦと同じくらいまたはそれよりも有効であった。より小用量の短縮型分子もまた有効であった。これらの結果に基づくと、他のＮ末端短縮型ＫＧＦ（特に、ＫＧＦｄｅｓ１−２２およびＫＧＦｄｅｓ１−２４）もまた、ＫＧＦ１６３を用いて必要とされるよりも、より少ない用量を用いる創傷治癒があまり有効でなければ、有効であるようである。
【０１５５】
【表３】
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【０１５６】
【表４】
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従って、新規のＫＧＦ組成物および新規のＫＧＦ組成物を用いる方法が開示される。本発明の好ましい実施形態を、いくらか詳細に記載してきたが、明白なバリエーションが、添付の特許請求の範囲に規定される発明の精神と範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１（配列番号２５および配列番号２６）は、成熟した全長ＫＧＦ（ＫＧＦ１６３）についてのＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、種々のＮ末端短縮ＫＧＦポリペプチドの生物学的活性の比較を示す。図２Ａは、ＫＧＦｄｅｓ１〜２２（黒菱形）、ＫＧＦｄｅｓ１〜２３（黒四角）、ＫＧＦｄｅｓ１〜２４（黒三角）、ＫＧＦｄｅｓ１〜２６（×）およびＫＧＦｄｅｓ１〜３０（二重×）の活性を比較する。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、種々のＮ末端短縮ＫＧＦポリペプチドの生物学的活性の比較を示す。図２Ｂは、ＫＧＦｄｅｓ１〜２３（黒四角）、ＫＧＦｄｅｓ１〜２６（×）およびＫＧＦｄｅｓ１〜３０（二重×）と、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ、黒菱形、中央の線）および全長ＫＧＦ（ＦＬ−ＫＧＦ（黒菱形、上から２番目の線）との比較を示す。
【図３】図３は、種々の短縮ＫＧＦ分子を、ウシ大動脈弓由来の血管内皮細胞（成体ウシ大動脈内皮細胞（ＡＢＡＥ）、図の左側）またはウシ副腎毛細血管（副腎皮質毛細血管内皮細胞（ＡＣＥ）、図の右側）のいずれかに対して試験した、実験の結果を示す。そのヒストグラムは、飽和濃度の種々のＫＧＦポリペプチドまたは塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）に、培養７日間後に曝露した培養物の最終細胞密度を示す。
【図４】図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した可溶性ＫＧＦｄｅｓ１〜２４（黒三角）およびＫＧＦｄｅｓ１〜１５（黒丸）の量を、３７℃にてインキュベートした時間の関数として示す。
【図５】図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した可溶性ＫＧＦｄｅｓ１〜２３（黒四角）およびネイティブＫＧＦ（ＦＬ、黒菱形）の量を、３７℃にてインキュベートした時間の関数として示す。
【図６】図６は、実施例に記載される熱安定性および酸安定性の試験の結果を示す。ＦＬ−ＫＧＦは、ＫＧＦ１６３を示す。Ｔ−ＫＧＦは、ＫＧＦｄｅｓ１〜２３を示す。このヒストグラムは、飽和濃度のＫＧＦｄｅｓ１〜２３またはＫＧＦ１６３のいずれかに曝露して７日間後の培養物の最終細胞密度を示す。
【図７】図７は、Ｂａｌｂ／Ｍｋ細胞の増殖に対する、１回だけ添加した場合の漸増濃度のネイティブＫＧＦ（ＦＬ、黒菱形）、およびＫＧＦｄｅｓ１〜１８（黒丸）、ＫＧＦｄｅｓ１〜２３（黒四角）およびＫＧＦｄｅｓ１〜２５（黒三角）の効果を示す。
【図８】図８（配列番号２７および２８）は、ＫＧＦｄｅｓ１〜２２についてのＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を示し、そのＮ末端アルギニン残基は、アラニン残基で置換されている。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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