(57)【要約】癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を提示する細胞に対して免疫応答を誘発するために有効なＤＮＡワクチンは、ＣＥＡを作動可能にコードするＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするＤＮＡ、それぞれ配列番号１及び配列番号２、又はそのホモ三量体ＣＤ４０ＬＴを含有する。該ＤＮＡワクチンは、弱毒化された生きた細菌又はウイルス、又はリポソーム担体などの送達ベクターに組み込むことができる。１つの方法の実施形態では、該ＤＮＡワクチンを、結腸癌細胞などのＣＥＡ提示細胞に対して免疫応答を誘発するために、ヒトなどの哺乳動物に経口投与する。１つの好ましい方法の実施形態は、該ワクチンの免疫応答有効性を増強するために、組換え抗体融合タンパク質ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２で該哺乳動物を処置する付加段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬適合性の担体と共に、
（ａ）癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を作動可能にコードするプラスミドＤＮＡ；及び
（ｂ）ＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするプラスミドＤＮＡ
を含有する、ＣＥＡを提示する細胞に対して免疫応答を誘発するのに有効なＤＮＡワクチン。
【請求項２】
ＣＥＡを作動可能にコードするＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするＤＮＡが両方とも同じプラスミドに組み込まれている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項３】
ＣＥＡを作動可能にコードするＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするＤＮＡが各々別のプラスミドに組み込まれている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４】
両方のプラスミドＤＮＡが弱毒化細菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５】
上記細菌送達ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及び弱毒化リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）から成る群より選択される細菌である、請求項４に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項６】
両方のプラスミドＤＮＡが弱毒化ウイルス送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項７】
上記ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスウイルスから成る群より選択されるウイルスの弱毒化形態である、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項８】
両方のプラスミドＤＮＡが弱毒化ネズミチフス菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項９】
上記ＣＤ４０リガンドがＣＤ４０ＬＴである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１０】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を作動可能にコードするプラスミドＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするプラスミドＤＮＡを含有する、有効な免疫応答誘発化量のＤＮＡワクチンを、ＣＥＡを提示する細胞に対して免疫応答を誘発するのに十分な量で哺乳動物に投与する段階を含む、ＣＥＡを提示する癌細胞に対して哺乳動物を免疫する方法。  
【請求項１１】
上記哺乳動物がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
両方のプラスミドＤＮＡが弱毒化細菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
上記細菌送達ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌及び弱毒化リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）から成る群より選択される細菌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
両方のプラスミドＤＮＡが弱毒化ウイルス送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
上記ウイルス送達ベクターが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスウイルスから成る群より選択されるウイルスの弱毒化形態である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記ＣＤ４０リガンドがＣＤ４０ＬＴである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
癌胎児性抗原を提示する上記細胞が結腸癌細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
上記ワクチンを経口的に投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＥＡを作動可能にコードするＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするＤＮＡが両方とも同じプラスミドに組み込まれている、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＥＡを作動可能にコードするＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするＤＮＡが各々別のプラスミドに組み込まれている、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を提示する癌細胞に対して哺乳動物を免疫する方法であって、  （ａ）ＣＥＡを作動可能にコードするプラスミドＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするプラスミドＤＮＡを含有する、免疫応答誘発化量のＤＮＡワクチンを該哺乳動物に投与すること；及び
（ｂ）医薬適合性の担体中の、免疫応答誘発化量の組換え抗体融合タンパク質ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２を該哺乳動物に投与すること
を含む、方法。
【請求項２２】
上記哺乳動物がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
両方のプラスミドＤＮＡが弱毒化細菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
上記細菌送達ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌及び弱毒化リステリア・モノシトゲネスから成る群より選択される細菌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
両方のプラスミドＤＮＡが弱毒化ウイルス送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
上記ウイルス送達ベクターが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスウイルスから成る群より選択されるウイルスの弱毒化形態である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記ＣＤ４０リガンドがＣＤ４０ＬＴである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
癌胎児性抗原を提示する上記細胞が結腸癌細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
上記ワクチンを経口的に投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
上記組換え抗体融合タンパク質ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２を静脈内投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＥＡを作動可能にコードするＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするＤＮＡが両方とも同じプラスミドに組み込まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＥＡを作動可能にコードするＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドを作動可能にコードするＤＮＡが各々別のプラスミドに組み込まれている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
上記ワクチンを特定する印刷が為され、上記ワクチンの患者への個々の投与に有用な情報を提供するラベルが貼付された密封滅菌容器内に包装されている、請求項１に記載のワクチンを含むキット。
【請求項３４】
ＣＤ４０リガンドがＣＤ４０ＬＴであり、両方のプラスミドＤＮＡが弱毒化ネズミチフス菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
融合タンパク質を特定する印刷が為され、前記融合タンパク質の患者への個々の投与に有用な情報を提供するラベルが貼付された密封滅菌容器内に包装されている、医薬適合性の担体と共に組換え抗体融合タンパク質ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
本発明は、契約第ＣＡ８３８５６−０１号の下に国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）による政府援助を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチンに関する。より特定すると、本発明は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＣＤ４０リガンドをコードするポリヌクレオチド構築物を含有するＤＮＡワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、生物の免疫系を刺激する予防薬剤の極めて限られた投与で疾患の病原体を、それらが増殖して病的作用を引き起こしうる前に破壊するように、多くの疾患状態に対して長期的な防御を与えるために使用されてきた。ワクチン及びワクチン接種への様々なアプローチが、Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｒ．ＧｌｉｃｋとＪａｃｋ  Ｊ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，第２版、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  ｐ．２５３−２７６（１９９８）に述べられている。
【０００４】
ワクチン接種は、自らの身体の免疫系を、感染因子が病的応答を引き起こす前にそれを捜し出して破壊するように誘導する手段である。典型的には、ワクチンは、生きているが弱毒化された感染性因子（ウイルス又は細菌）又は死滅形態の因子のいずれかである。生きた細菌又はウイルスから成るワクチンは非病原性でなければならない。典型的には、細菌又はウイルス培養物を物理的又は化学的処理によって弱毒化（弱体化）する。該因子は非ビルレントであるが、そのワクチンで処置した被験対象においてまだ免疫応答を誘発することができる。
【０００５】
免疫応答は、抗原、すなわち特異的高分子又は感染性因子のいずれかによって誘発される。これらの抗原は一般に、Ｂ細胞及びＴ細胞として知られるリンパ球によって「外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）」と認識されるタンパク質、多糖類、脂質又は糖脂質のいずれかである。どちらの型のリンパ球も、抗原に暴露されると速やかな細胞分裂と分化応答を誘発し、暴露リンパ球のクローンの形成を生じさせる。Ｂ細胞は形質細胞を産生し、それは次に抗体（Ａｂ）と呼ばれるタンパク質を生成して、抗体が感染性因子上に存在する抗原と選択的に結合し、それによって病原体を中和する又は不活性化する（体液性免疫）。一部の場合、Ｂ細胞応答はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の助けを必要とする。
【０００６】
抗原暴露に応答して形成される特殊なＴ細胞クローンは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり、これは抗原を提示する病原体及び組織に結合してそれらを排除することができる（細胞媒介性又は細胞性免疫）。一部の場合、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、エンドサイトーシスによって病原体又は他の外来性細胞を被包する。次にＡＰＣは細胞から抗原をプロセシングして、これらの抗原を組織適合性分子：ペプチド複合体の形態でＣＴＬ上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示し、それによって免疫応答を刺激する。
【０００７】
特異的抗体の形成を特徴とする体液性免疫は一般に急性細菌感染及びウイルスからの反復感染に対して最も有効であり、一方、細胞媒介性免疫はウイルス感染、慢性細胞内細菌感染及び真菌感染に対して最も有効である。細胞性免疫はまた、癌に対して防護し、臓器移植の拒絶反応の原因になることが知られている。
【０００８】
以前の感染からの抗原に対する抗体は、非常に長い期間にわたって血液中で検出可能なままであり、それ故病原体への事前暴露を決定する手段を提供する。同じ病原体に再び暴露されたとき、免疫系は、病原性因子が増殖して病的応答を生じうる前に病原性因子を排除することによって再感染を有効に予防する。
【０００９】
病原体によって誘導される同じ免疫応答がまた、時として、同じ抗原を病原体として提示する非病原性因子によって生じることがある。このようにして、被験対象は、以前は感染を撃退していなかった病原体にその後で暴露されると防護されうる。
【００１０】
しかしながら、必ずしもすべての感染性因子がワクチン生成の必要に応じて容易に培養でき、不活性化できるわけではない。現代の組換えＤＮＡ技術は、この限界を克服することを目指す新しいワクチンの工作を可能にした。病原性遺伝子を持たない、それ故生きた非ビルレント形態の生物をワクチンとして使用することを可能にする感染性因子を創製することができる。また、病原性担体の細胞表面抗原を提示する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような比較的病原性の低い生物を工作することも可能である。そのような形質転換担体で処置した被験対象の免疫系は、病原体に対する抗体を形成するように「だまされる（ｔｒｉｃｋｅｄ）」。病原性因子の抗原タンパク質を工作し、非病原種において発現させることができ、その抗原タンパク質を単離し、精製して、「サブユニットワクチン」を生産することができる。サブユニットワクチンは、安定であり、安全であって、化学的に十分に定義されているという点で有利である：しかしながら、それらの生産は手が出せないほど高額となり得る。
【００１１】
近年、広く遺伝子的免疫（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）と称される、ワクチンへの新しいアプローチが出現した。このアプローチでは、病原性因子の抗原をコードする遺伝子を、免疫する被験対象の細胞内に作動可能に挿入する。処置される細胞は形質転換され、病原体の抗原タンパク質を生産する。これらのインビボで生産した抗原は、その後、宿主における所望免疫応答の引き金となる。そのような遺伝子的ワクチンにおいて使用される遺伝物質はＤＮＡ又はＲＮＡ構築物でありうる。しばしば該抗原をコードするポリヌクレオチドは、該遺伝子の挿入、複製又は発現を高めるために他のプロモーターポリヌクレオチド配列と組み合わせて導入される。
【００１２】
抗原遺伝子をコードするＤＮＡワクチンは、様々な発現系によって被験対象の宿主細胞に導入することができる。これらの発現系は、原核生物、哺乳動物及び酵母発現系を含む。例えば、１つのアプローチは、宿主細胞に接種するために、新たな遺伝物質を組み込んだワクシニアウイルスなどのウイルスベクターを利用することである。あるいは、遺伝物質を「裸の」ポリヌクレオチドとして、すなわち単に精製ＤＮＡとして、ベクターに組み込むか又は宿主細胞に直接送達することができる。さらに、ＤＮＡをネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの弱毒化細菌に安定にトランスフェクトすることができる。患者が形質転換したサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）で経口的にワクチン接種されるとき、細菌は腸のパイアー斑（すなわち二次リンパ組織）へと輸送されて、その後免疫応答を刺激する。
【００１３】
ＤＮＡワクチンは、遺伝病及び癌のような、伝統的病原体によって引き起こされるのではない疾患状態に対して免疫する機会を提供する。典型的には、遺伝子性癌ワクチンにおいては、特定の型の腫瘍細胞に対する抗原を単離して、ワクチンに導入しなければならない。
【００１４】
腫瘍特異的免疫応答を達成する上での主要な障害の一つは、腫瘍自己抗原に対する末梢Ｔ細胞の免疫寛容を克服して、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導することであり、それは播種性腫瘍転移を有効に根絶し、その後腫瘍の再発を防ぐ長期持続性の免疫記憶を維持する。ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は腫瘍胎児性膜糖タンパク質であり、免疫療法のためのＤＮＡワクチン開発のために適切な腫瘍自己抗原標的を提供する。ＣＥＡに基づくワクチンのための有用な動物モデルがＣｌａｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８，５８：１４６９によって報告されている。このモデルは、ヒトＣＥＡについてのゲノムＤＮＡ導入遺伝子を担い、ＣＥＡをヒトに対すると同様に組織特異的に発現するマウス系統の樹立を含む。ＣＥＡでトランスフェクトした線維芽細胞でインビボで初回免疫した後、Ｍｉｚｏｂａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｏｔｈｅｒ．２０００、４９：２８５によって記述されている、ＣＤ４＋  Ｔ細胞画分中のＣＥＡに免疫寛容であるこれらのトランスジェニックマウスにおいて抗ＣＥＡ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘導した。Ｔｓａｎｇら、Ｊ  Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５，８７：９８２によるヒトでの試験は、トランスジェニックマウスで得られた所見と同様に、ＣＥＡに特異的なＣＤ８＋  ＣＴＬが負の選択を受けないことを示した。
【００１５】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の生物学的役割、特にＴ細胞活性化の同時刺激の際に抗原提示細胞上で発現されるＣＤ４０とのその相互作用は当技術分野において周知である。ＣＤ４０は、すべての成熟Ｂ細胞の表面、大部分の成熟Ｂ細胞悪性疾患及び一部の初期Ｂ細胞急性リンパ性白血病で発現される４８ｋＤａ糖タンパク質であるが、形質細胞上では発現されない。Ｃｌａｒｋ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  １９９０，３５：３３−３６。３５ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質であり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子ファミリーの一員であるＣＤ４０Ｌは、抗原認識時にＴ細胞表面で発現される。ＴＮＦファミリーの成員はホモ三量体として発現されるとき生物学的に最も活性である。ＣＤ４０Ｌもこの点に関して例外ではなく、このリガンドの細胞外ドメイン全体のＮ末端に融合した３３アミノ酸のロイシンジッパーモチーフの修飾により、ホモ三量体（ＣＤ４０ＬＴ）として発現されうる。ＣＤ４０ＬＴ  ＤＮＡは、Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６１：４５６３により、高度免疫原性モデル抗原β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡでマウスをワクチン接種したとき、ＩＦＮ−γ及び細胞溶解性Ｔ細胞活性の誘導などの細胞性免疫応答を増強することが報告された。
【００１６】
ＣＤ４０Ｌは、腫瘍自己抗原に対して有効な防御免疫を誘導するために必要なＴ細胞の活性化に重要な関わりを有する。ひとたびＭＨＣクラスＩ抗原：ペプチド複合体が樹状細胞（ＤＣ）によって取り込まれ、ナイーブＴ細胞に提示されれば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して最初の抗原シグナルが送達され、続いてＣＤ４０Ｌの上方調節が起こる。Ｔ細胞表面では、次にＣＤ４０Ｌが、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用によってＤＣへの同時刺激作用を誘導する。このように感作されて、これらのＡＰＣは今や同時刺激分子、Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）を発現し、それらが、プロ炎症性サイトカインＩＮＦ−γ及びＩＬ１２を同時に生産しエフェクター機能を実行するという、Ｔ細胞の完全な活性化のために必要な事象であるＣＤ２８との相互作用を通して、Ｔ細胞に第二の同時刺激シグナルを送る。
【００１７】
ＤＮＡワクチンの効果を増強する有効な手段は、その後経口ワクチンとして適用することができる、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の非複製株においてＤＮＡをコードするプラスミドを増殖させることである。生きた弱毒化細菌は、胃腸管を通して、及び次に腸のパイアー斑を覆うＭ細胞を通してＤＮＡを輸送する。そこから弱毒化細菌は樹状細胞及びマクロファージなどのＡＰＣに入り、そこで突然変異のために死滅して、食細胞の内部でＤＮＡの多数のコピーを遊離する。
【００１８】
弱毒化細菌は「危険信号」を与え、先天性免疫系を刺激して、ＩＬ１２のようなプロ炎症性サイトカイン、及び抗原提示を増強し、腫瘍の根絶に結びつくＴＨ１型細胞性免疫応答を促進する酸化窒素などのメディエイタを産生すると考えられる。実際に、弱毒化ネズミチフス菌はマウス黒色腫に対して防御する自家経口ＤＮＡワクチンのための有効な担体であると報告されている（Ｘｉａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）２０００、９７：５４９２）。組換えリステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ワクチンは、原発性マウス黒色腫及びそれらの確立された肺転移の後退を仲介する上で極めて有効であると報告された（Ｐａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９，５９：５２５４）。リステリア・モノシトゲネスは、大部分の他の細胞内細菌と異なり、食胞膜を破壊することによって細胞質に逃げ込み、その結果それが分泌する任意のタンパク質が抗原提示のために感染細胞のＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの両方の経路を標的化することを可能にするので、強力な細胞性免疫応答を生じさせる。
【００１９】
Ｘｉａｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１、３：８５６５は、ＣＥＡ及びヒト汎上皮細胞接着分子（ｐａｎ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＫＳＡで安定に形質導入した、ＭＣ３８マウス結腸癌細胞の致死的攻撃誘発に対する部分的腫瘍防御を報告している。経口強制栄養によってマウスに弱毒化ネズミチフス菌が担うＣＥＡベースのＤＮＡワクチンを接種し、それがＭＨＣクラスＩ抗原拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導して、皮下腫瘍の拒絶を生じさせた。しかしこれは、ＩＬ２を腫瘍微小環境に標的化する組換え抗体−ＩＬ２融合タンパク質でブーストしたときでも、ＣＥＡに関してトランスジェニックである実験マウスの一部においてのみ起こった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
結腸癌に対して改善された効果を有する、ＣＥＡ自己抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞を介した腫瘍防御性免疫応答を誘発するワクチンが求められている。本発明は、特にｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質でのブーストによって補助されるとき、ＤＣ及びナイーブＴリンパ球の両方を活性化する、ＣＥＡ及びＣＤ４０ＬＴをコードする独自の二元機能ＤＮＡワクチンによってこの目標を達成する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
結腸癌細胞などのＣＥＡ提示細胞に対して有効なワクチンが提供される。該ワクチンは、ＣＥＡ（例えば配列番号１のＤＮＡ配列）をコードするプラスミドＤＮＡ、及びヒトＣＤ４０Ｌ、配列番号２のＤＮＡ配列などのＣＤ４０リガンド又はそのホモ三量体ＣＤ４０ＬＴをコードするプラスミドＤＮＡを含有する。ＣＥＡとＣＤ４０Ｌ  ＤＮＡ、それぞれ配列番号１と配列番号２は、同じプラスミドか又は異なるプラスミドに組み込むことができる。単一ワクチン中のＣＥＡとＣＤ４０リガンドの両方をコードするプラスミドＤＮＡの組合せは、ナイーブＴ細胞と樹状細胞などの抗原提示細胞の両方の活性化を促進し、それによって２つの異なる免疫応答系を刺激する。
【００２２】
本発明のワクチンのプラスミドＤＮＡは、弱毒化細菌、非複製ウイルス又はリポソーム粒子などの効率的な担体に作動可能に組み込むことができる。
【００２３】
本発明の１つの方法の局面では、ＣＥＡ（配列番号１）をコードするプラスミドＤＮＡ及びＣＤ４０Ｌ（配列番号２）又はそのホモ三量体ＣＤ４０ＬＴをコードするプラスミドＤＮＡを含有するＤＮＡワクチンを、結腸癌細胞などのＣＥＡ提示細胞に対する免疫応答を誘発するために有効な量で、ヒトなどの哺乳動物に投与する。
【００２４】
本発明のもう１つの方法の局面では、ヒトなどの哺乳動物に、（ａ）ＣＥＡ（配列番号１）及びＣＤ４０リガンド（配列番号２１）又はそのホモ三量体ＣＤ４０ＬＴをコードするプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡワクチンを、結腸癌細胞などのＣＥＡ提示細胞に対する免疫応答を誘発するために有効な量で、及び（ｂ）組換え抗体−ＩＬ２融合タンパク質（ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２）の有効な免疫応答増強化量を、連続的に投与する。ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質は、該ＤＮＡワクチンで処置した哺乳動物の免疫応答性を、その免疫系が結腸癌細胞などのＣＥＡ提示細胞をより有効に攻撃するように増強する。該ワクチン及び融合タンパク質は、経口的及び非経口的に投与することができる。好ましくは、該ワクチンを経口投与し、該融合タンパク質を静脈内に投与する。
【００２５】
本発明のワクチンは、結腸癌細胞を含む、ＣＥＡを提示する細胞に対して免疫応答を誘発することにより、例えば結腸癌などの癌のための予防的治療を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ある種の癌細胞などのＣＥＡ提示細胞に対して有効なＤＮＡワクチンは、ＣＥＡ（配列番号１）をコードするプラスミドＤＮＡ構築物及びＣＤ４０Ｌリガンド（配列番号２）又はそのホモ三量体、ＣＤ４０ＬＴをコードするプラスミドＤＮＡを含有する。ＣＥＡとＣＤ４０Ｌ  ＤＮＡ、それぞれ配列番号１と配列番号２は、同じプラスミドか又は異なるプラスミドに組み込むことができる。該ＤＮＡプラスミドは、弱毒化細菌、非複製ウイルス又はリポソーム粒子などの担体に作動可能に組み込むことができる。該ＤＮＡワクチンはまた、「裸の（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡも含有しうる。
【００２７】
本発明のＤＮＡワクチンは、結腸癌細胞などのＣＥＡ提示細胞に対して活性なＣＴＬの形成を刺激する。ＣＥＡは結腸癌細胞についての特異的マーカーであるので、ワクチンに応答して形成されるＣＴＬは実質的にそのような癌組織だけを標的化する。ＣＤ４０リガンドは、細胞性免疫応答を生じさせるのを助ける最も有効な型のＡＰＣである、樹状細胞を刺激する。ＣＥＡとＣＤ４０リガンドをコードするＤＮＡ、それぞれ配列番号１と配列番号２の組合せを含むワクチンは、樹状細胞の介入を通して直接及び間接的にナイーブＴ細胞の活性化を促進することができる。そのような組み合わせワクチンは２つの異なる免疫応答機構を同時に刺激し、それによって治療の効率を高める。
【００２８】
ここで使用するとき、「ＤＮＡ」という用語は、文法上の単数及び複数の両形態のデオキシリボ核酸を指す。ここで使用するとき、「免疫（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」という用語は、ビルレント形態の感染性因子に対する長期的な免疫学的防御を指す。ここで使用するとき、「免疫化（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」という用語は、処置した被験対象において病原体に対する免疫を生じさせる、非ビルレントソースから誘導した病原性因子の抗原に対する予防的暴露を指す。
【００２９】
本発明のワクチンにおいて有用なＤＮＡは、好ましくは、遺伝子発現に必要な調節エレメントに作動可能に連結された、ＣＥＡ（配列番号１）及び／又はＣＤ４０リガンド（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、該ＣＤ４０リガンドはＣＤ４０ＬＴである。ＣＥＡとＣＤ４０リガンドのＤＮＡ、それぞれ配列番号１と配列番号２は、ここではｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ（すなわちプラスミドＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ）と称する単一プラスミドとしてワクチンに組み込まれる。あるいは、該ワクチンは、ＣＥＡ（配列番号１）をコードするプラスミドＤＮＡとＣＤ４０Ｌ（配列番号２）をコードする別個のプラスミドＤＮＡを含有しうる。
【００３０】
細胞によって取り込まれたとき、ＤＮＡ分子は、機能性染色体外分子として細胞中にそのまま存在しうる、及び／又は細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれうる。ＤＮＡは、別個の遺伝物質として存続しうるプラスミドの形態で細胞に導入することができる。あるいは、染色体に組み込まれうる線状ＤＮＡを細胞に導入することもできる。ＤＮＡを細胞に導入するとき、当技術分野で既知であるように、染色体へのＤＮＡ組込みを促進する試薬を添加することができる。組込みを促進するＤＮＡ配列も該ワクチンに含めることができる。ＣＥＡとＣＤ４０リガンドをコードするＤＮＡ、それぞれ配列番号１と配列番号２は、弱毒化された生きた微生物又は組換え微生物ベクターの形態であるワクチン中で遺伝物質の一部のままでありえ、患者の細胞において生存することができる。
【００３１】
有用なＤＮＡワクチンは、好ましくは核酸分子の発現に必要な調節エレメントを含む。そのようなエレメントは、例えば、プロモーター、開始コドン、終結コドン及びポリアデニル化シグナルを包含する。さらに、免疫原性標的タンパク質をコードする配列の発現のためにしばしばエンハンサーが必要とされる。当技術分野で既知であるように、これらのエレメントは、好ましくは所望タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される。調節エレメントは、好ましくはそれらが投与される種において作動可能であるように選択される。
【００３２】
開始コドン及び終結コドンは、好ましくは本発明の遺伝子ワクチン中に、ＣＥＡ及びＣＤ４０リガンドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部として含まれる。開始及び終結コドンはコード配列とインフレームでなければならない。
【００３３】
本発明のワクチンに含まれるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、好ましくは免疫される被験対象の細胞内で機能性であるように選択される。
【００３４】
本発明のワクチンにおいて、特にヒト用の遺伝子ワクチンの生産において有用なプロモーターの例は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からのプロモーター、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターを含むが、これらに限定されない。他の有用なプロモーターは、腫瘍内皮指定プロモーターなどの組織特異的プロモーター、ならびにＣＥＡプロモーターなどの腫瘍選択的プロモーター、及び初期増殖応答プロモーターなどの処置応答性プロモーターを含む。
【００３５】
本発明のワクチンにおいて、特にヒト用の遺伝子ワクチンの生産において有用なポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントも該ＤＮＡ分子に含めることができる。そのような付加的なエレメントはエンハンサーを包含する。エンハンサーは、ここで上述したプロモーターを包含する。好ましいエンハンサー／プロモーターは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、及びＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶなどからのウイルスエンハンサーを含む。
【００３７】
何らかの理由で遺伝的構築物を受け取る細胞を排除できることが望ましい場合は、細胞破壊の標的として役立つ付加的なエレメントを該ワクチンに加えることができる。例えば、発現可能形態のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を該ワクチンに含めることができる。ｔｋを産生する任意の細胞の選択的死滅を引き起こす薬剤、ガンシクロビールを免疫された被験対象に投与することができる。細胞の選択的破壊のための遺伝子標的を導入するためのそのような手段は公知であり、Ｗｅｉｎｅｒらへの米国特許第５，８１７，６３７号に述べられている。
【００３８】
調節配列及びコドンは一般に種依存性である。タンパク質産生を最大化するために、調節配列及びコドンは、好ましくは免疫される種において有効であるように選択される。当業者は、所与の被験対象種において機能性であるＤＮＡ構築物を生産することができる。
【００３９】
本発明のワクチンにおいて有用なＤＮＡは、その関連する開示が参照してここに組み込まれる、Ｒｅｓｔｉｆｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００，７：８９−９２において定義されているような「裸の（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡも包含する。あるいは、該ＤＮＡは担体又は送達ベクターに作動可能に組み込むことができる。有用な送達ベクターは、生分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）又はリポソーム、及びウイルス又は細菌などの遺伝子操作された弱毒化された生きた担体を包含する。
【００４０】
適切な弱毒化生細菌担体／送達ベクターの例は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、又は当技術分野で既知である他の何らかの適切な細菌ベクターを含む。好ましい細菌送達ベクターは、弱毒化ネズミチフス菌及び弱毒化リステリア・モノシトゲネスを包含する；弱毒化ネズミチフス菌が特に好ましい。生細菌ベクターを外因性ＤＮＡ構築物で形質転換する方法は当技術分野において広く記述されている。例えば、Ｊｏｓｅｐｈ  ＳａｍｂｒｏｏｋとＤａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）参照。
【００４１】
好ましい弱毒化ウイルス担体は、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、及びアビポックス（Ａｖｉｐｏｘ）ウイルスを含む。ウイルスベクターを外因性ＤＮＡ構築物で形質転換する方法も当技術分野において広く記述されている。上記ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ参照。
【００４２】
リポソーム担体は、脂質親和性物質で形成される膜部分と内部水性部分を有する、単層又は多重層小胞である。水性部分は、標的細胞に送達すべきポリヌクレオチド物質を含有するために本発明において使用される。リポソーム形成物質は、第四アンモニウム基などのカチオン基、及び約６個から約３０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アルキル基などの１以上の親油基を有することが一般に好ましい。適切な物質の１つの群は、その関連する開示が参照してここに組み込まれる、欧州特許公開第０１８７７０２号に述べられており、Ｗｏｌｆｆらへの米国特許第６，２２８，８４４号の中でさらに論じられている。多くの他の適切なリポソーム形成カチオン脂質化合物が文献において記述されている。例えば、Ｌ．Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：３９１７−３９２５（１９８８）；及びＨ．Ｅｉｂｌら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０：２６１−２７１（１９７９）参照。あるいは、ポリラクチド−コグリコリド生分解性ミクロスフェアなどのミクロスフェアが使用できる。ＤＮＡは、当技術分野で既知のように、組織へのＤＮＡの送達のために被包されるか又はさもなければリポソーム又はミクロスフェアと複合される。
【００４３】
本発明のワクチンはまた、処置した細胞によるワクチンの遺伝物質の取込みを改善する促進剤と共に投与することもできる。一部の好ましい実施形態では、該ＤＮＡを、その関連する開示が参照してここに組み込まれる、Ｗｉｌｌｉａｍｓらへの米国特許第６，２４８，５６５号に開示されているような、局所麻酔薬のファミリーなどの安息香酸エステル、アニリド、アミジン、ウレタン及びそれらの塩酸塩から成る群より選択される促進剤と共に製剤する又はそれらと同時に投与することができる。
【００４４】
本発明の１つの方法の局面では、ＤＮＡワクチンを、ワクチン接種した患者において結腸癌細胞などのＣＥＡ提示細胞に対する長期的防御を提供するために使用することができる。１つの好ましい方法の実施形態では、ＣＥＡ及びＣＤ４０リガンド、それぞれ配列番号１及び配列番号２の両方を作動可能にコードするプラスミドＤＮＡ（例えばｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ）を含有するＤＮＡワクチンを、ＣＥＡ提示細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分な量で、ＣＥＡ提示細胞に対する防御を必要とする哺乳動物に投与する。
【００４５】
本発明のもう１つの好ましい方法の実施形態では、本発明のｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴワクチンを哺乳動物に接種することによって腫瘍増殖を阻害する。そのような方法の実施形態では、ＣＥＡ及びＣＤ４０Ｌ、それぞれ配列番号１及び配列番号２の両方を作動可能にコードするプラスミドＤＮＡ構築物を含有するワクチンの、免疫応答を誘導する有効量を、ＣＥＡ提示細胞を含む増殖性腫瘍を有する哺乳動物に投与する。かかるワクチン接種は、腫瘍細胞に対して該哺乳動物を免疫することにより、腫瘍増殖の停止を生じさせ、新たな腫瘍の形成を最小限に抑える。
【００４６】
本発明のさらにもう１つの方法の局面では、哺乳動物に、（ａ）ＣＥＡをコードするプラスミドＤＮＡ及びＣＤ４０リガンドをコードするプラスミドＤＮＡ、それぞれ配列番号１及び配列番号２を含むＤＮＡワクチンを、結腸癌細胞などのＣＥＡ提示細胞に対する免疫応答を誘発するために有効な量で、及び（ｂ）組換えヒト化ＫＳ−１／４抗体−ＩＬ２融合タンパク質（ｈｕＫＳ−１／４−ＩＬ２）の免疫応答増強化有効量を、連続的に投与する。ｈｕＫＳ−１／４−ＩＬ２は、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８、１６０：６１９５−６２０３によって詳細に記述されている。
【００４７】
ＩＬ２は活性化Ｔ細胞によって産生される複雑なサイトカインであり、Ｂ細胞とＴ細胞の両方の増殖を刺激する。Ｔ細胞のＩＬ２活性化はまた、Ｔ細胞表面のＣＤ４０リガンドの産生も刺激する（一般に、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．とＰａｕｌ  Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，第２版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６の第７章参照）。ｈｕＫＳ−１／４−ＩＬ２融合タンパク質によって腫瘍微小環境に標的化されるＩＬ２の役割は、ＣＴＬの活性化における第二同時刺激シグナルとして働くことによって又はＩＬ２受容体を発現するプレ活性化ＤＣをさらに活性化することによって、抗腫瘍Ｔ細胞応答を増強することである。ｈｕＫＳ−１／４−ＩＬ２融合タンパク質は、このようにして、該ＤＮＡワクチンで処置した哺乳動物の免疫応答性を、その免疫系がＣＥＡ提示細胞をより有効に攻撃するように増強し、それによってワクチン接種の有効性を高める。
【００４８】
本発明のこの方法の実施形態では、該ワクチンを、好ましくは経口投与のように経腸的に、又は静脈内注入のように非経口的に投与する。一部の好ましい実施形態では、該ワクチンを筋肉内、鼻内、腹腔内、皮下、皮内、局所的、又は経口的に投与する。最も好ましくは該ワクチンを、弱毒化細菌送達ベクターに組み込んで、経口的に投与する。好ましくは、該ワクチンは、当技術分野において周知のように、生理食塩水、デキストロース溶液等のような医薬適合性の担体中で提供される。
【００４９】
結腸癌、膵癌、肺癌及び乳癌などの上皮癌に罹患している患者は、本発明のワクチンによる免疫から恩恵を受けることができる。
【００５０】
本発明のワクチンは、好ましくは、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組合せのような医薬適合性の担体及び賦形剤と共に製剤化される。該ワクチンはまた、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等のような補助物質も含有しうる。
【００５１】
本発明のワクチンは、好ましくは、約１０μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲内のＤＮＡ濃度で、医薬適合性の担体中の溶液又は懸濁液として、ヒトなどの哺乳動物に経口投与される。適切な用量は、ワクチン接種する被験対象に依存し、及び被験対象の免疫系がワクチンに含まれる核酸を発現する能力に依存しうる。選択される正確な用量は、一部には、ワクチンを投与する又は投与を要求する医療従事者の判断にも依存しうる。
【００５２】
本発明のもう１つの実施形態は、多回用量又は単位投与量形態で、アンプル、ボトル、バイアル等のような適切に滅菌された容器に包装された本発明のワクチンを含むキットである。該容器は、好ましくはワクチン製剤を充填した後密封される。好ましくは、該ワクチンは、該ワクチンを特定し、適用法令の下での該ワクチンの認可を反映する米国食品医薬品局などの政府規制当局によって規定された形態の告知書、投薬情報等を担うラベルが貼付された容器に包装される。そのラベルは、好ましくはワクチンを患者に投与する保健医療の専門家にとって有用な該ワクチンについての情報を含む。該キットはまた、好ましくは、ワクチンの投与に関する印刷された情報資料、指示書、説明書、及び他の必要な警告も含む。
【００５３】
本発明のキットはまた、多回用量又は単位投与量形態で、アンプル、ボトル、バイアル等のような適切に滅菌された容器に包装された組換え抗体融合タンパク質ｈｕＫＳ−１／４−ＩＬ２も含みうる。好ましくは、該融合タンパク質は、該ワクチンを特定し、適用法令の下での該融合タンパク質の認可を反映する米国食品医薬品局などの政府規制当局によって規定された形態の告知書、投薬情報等を担うラベルが貼付された容器に包装される。そのラベルは、好ましくは該融合タンパク質を患者に投与する保健医療の専門家にとって有用な該融合タンパク質についての情報を含む。キット中に存在する印刷情報資料はまた、好ましくは、該融合タンパク質の投与に関する情報、指示書、説明書、及び他の必要な警告も含む。
【００５４】
該ワクチンの特に好ましい実施形態では、ＣＤ４０リガンドをコードするプラスミドＤＮＡはＣＤ４０リガンド三量体（ＣＤ４０ＬＴ）をコードする。ＣＥＡ及びＣＤ４０ＬＴの両方をコードするプラスミドＤＮＡが弱毒化細菌送達ベクターに作動可能に組み込まれていることが特に好ましい。好ましい細菌送達ベクターは、弱毒化ネズミチフス菌及び弱毒化リステリア・モノシトゲネスであり、最も好ましくは弱毒化ネズミチフス菌である。ＣＥＡをコードするＤＮＡと組み合わせてＣＤ４０ＬＴをコードする核酸を含有する本発明のワクチンは、２つの異なる免疫応答系（すなわち細胞性及び体液性免疫）を同時に刺激することができる。
【００５５】
癌胎児性抗原ファミリーの一部の成員のヌクレオチド配列は当技術分野において既知である。ヒトＣＥＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、その開示が参照してここに組み込まれる、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ，ＵＫのＥＭＢＬデータベースにおいて、Ｓｃｈｒｅｗｅらによって開示された（ＥＭＢＬアクセッション番号はＥＭＢＬ：ＨＳＣＥＡ０１である）（図７、配列番号１）。
【００５６】
ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、体液性免疫の調節において中心的役割を果たす１５４アミノ酸のタンパク質である。ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４としても知られる）をコードするＤＮＡ配列は、その開示が参照してここに組み込まれる、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ，ＵＫのＥＭＢＬデータベースにおいて、Ｇｒａｍｍａｒらによって公表された（ＥＭＢＬアクセッション番号はＥＭＢＬ：ＨＡＣＤ４０Ｌである）（図８、配列番号２）。マウスＣＤ４０ＬをコードするＤＮＡ配列は、その開示が参照してここに組み込まれる、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ，ＵＫのＥＭＢＬデータベースにおいて、Ｍａｒｒａらによって公表された（ＥＭＢＬアクセッション番号はＥＭＢＬ：ＡＩ３８５４８２である）（図９、配列番号３）。
【００５７】
遺伝子コードの固有の縮重により、ＣＥＡ及び／又はＣＤ４０リガンドと実質的に同じか又は機能的に等価のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が本発明の実施において使用できる。そのようなＤＮＡ配列はまた、ＣＥＡ及び／又はＣＤ４０リガンド配列にハイブリダイズできるものも包含する。
【００５８】
本発明に従って使用できる変化したＤＮＡ配列は、同じか又は機能的に等価の遺伝子産物をコードする配列を生じる、種々のヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含む。遺伝子産物自体がＣＥＡ及び／又はＣＤ４０リガンド配列内にアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含んでもよく、それがサイレントな変化をもたらし、その結果機能的に等価のＣＥＡ及び／又はＣＤ４０リガンドタンパク質を生成する。そのようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行われうる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む；正に荷電したアミノ酸はリシン及びアルギニンを含む；類似する親水性値を有する非荷電極性頭部基を持つアミノ酸は次のものを含む：ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシン。
【００５９】
ここで使用するとき、ＣＤ４０リガンドの「機能的等価物」とは、ＣＤ４０又はそのフラグメントに結合するが、必ずしも天然ＣＤ４０リガンドと同じ結合親和性ではないリガンドを指す。同様に、ＣＥＡの機能的等価物は、ヒトＣＥＡに対して惹起される抗血清に結合するが、必ずしも天然ヒトＣＥＡと同じ結合親和性ではないタンパク質を指す。
【００６０】
ここで及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）という用語は、ヒトにおいて認められる天然の抗原及びその機能的等価物を包含する；「ＣＤ４０リガンド」という用語は、哺乳動物において認められる天然リガンドの単量体、二量体及び三量体、及びそれらの機能的等価物を包含する。好ましくは、ＣＥＡ及び／又はＣＤ４０リガンドＤＮＡの機能的等価物は、上記ＣＥＡ及び／又はＣＤ４０リガンドタンパク質をコードするＤＮＡと少なくとも約８０％の相同性を共有する。
【００６１】
本発明のＤＮＡ配列は、遺伝子産物のプロセシング及び発現を修飾する変化を含むがそれに限定されない、様々な目的のためにＣＥＡ及び／又はＣＤ４０リガンドのコード配列を変化させるように工作できる。例えば、新しい制限部位を挿入する等のために、当技術分野において周知の手法、例えば位置指定突然変異誘発を用いて突然変異を導入することができる。
【００６２】
下記の実施例は、本発明の特徴及び実施形態をさらに説明するために提供するものであり、限定を意味しない。
【００６３】
（試験材料及び方法）
試薬：Ｔ−ＳＴＩＭ培養サプリメントは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡより入手した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡより入手した。ＦＩＴＣ標識及びＰＥ標識抗体は、製造者の推奨プロトコールに従って作製した。すべての抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡより入手した。ｈｕＫＳ−１／４−ＩＬ２は、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８、１６０：６１９５−６２０３が述べたように作製した。
【００６４】
ＣＥＡトランスジェニックマウス：ヒトＣＥＡゲノム領域全体（配列番号１）及びゲノムコスミドクローンから単離したフランキング配列を含む３２．６Ｋｂ  ＡａｔＩＩ制限フラグメントを使用することにより、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ  ＣＥＡ−トランスジェニック種畜（ｂｒｅｅｄｅｒ）マウスを作製した。その関連開示が参照してここに組み込まれる、Ｃｌａｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８、５８：１４６９の方法によってマウス細胞系［Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ−ＴｇＮ（ＣＥＡＧｅ）１８；ＦＪＰ］を樹立した。ＣＥＡトランスジェニックマウスをＴｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物飼育施設において飼育した。６週から８週齢のマウスを使用した。すべての動物実験は、国立衛生研究所のＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って実施した。
【００６５】
腫瘍細胞系及び細菌株：化学的に誘発したマウス結腸腺癌細胞系、ＭＣ３８を、Ｇｉｌｌｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８、１６０：６１９５が述べたようにＣＥＡ（Ｃ１５−４．３クローン）及び上皮細胞接着分子ＥＰＣＡＭ／ＫＳＡの両方で安定にトランスフェクトした。弱毒化ネズミチフス菌ＡｒｏＡ−Ｓｔｒａｉｎ  ＳＬ  ７２０７は、Ｄｒ．Ｂ．Ａ．Ｄ．Ｓｔｏｃｋｅｒ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）の好意により提供された。化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より購入し、３７℃で、当技術分野で知られているように必要に応じて７５μｇ／ｍｌアンピシリンを補足した、ＬＢ肉汁中又は寒天平板上（ＶＷＲ）でルーチンに増殖させた。
【００６６】
発現プラスミドの構築：ＣＤ４０ＬＴ及びＣＥＡ分子をそれぞれＤＣ又はＴ細胞に標的化するためにいくつかの異なる形態の発現プラスミドを作製した。免疫に使用したプラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から構築した。小胞体（ＥＲ）に標的化してそこに保持されるｐＥＲ−ＣＥＡ対照プラスミド、及び細胞表面に標的化するｐＷ−ＣＥＡプラスミドは、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Ｘｉａｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１，３：８５６５によってこれまでに記述されている。ＣＤ４０ＬＴ遺伝子をコードするプラスミド（ｐＣＤ４０ＬＴ）は、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Ｆａｎｓｌｏｗら、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，６：２６７によって述べられているように、細胞表面へのタンパク質発現を指令する又は細胞外へのその分泌を誘導するＩＬ７リーダー配列のＣ末端に融合した三量体ＣＤ４０Ｌの形成を促進するために、改変３３アミノ酸ロイシンジッパーモチーフを含んだ。特異的モノクローナル抗体によって検出可能な短い抗原性配列、Ｆｌａｇを組み込むことにより、ウエスタンブロット法によるＣＤ４０ＬＴの検出を促進した。プラスミドｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴは、マウスＣＤ４０ＬのＣ末端に融合したＣＥＡ細胞外ドメイン全体を含み、それ故二元機能キメラ構築物を生成した。
【００６７】
経口免疫、腫瘍細胞攻撃誘発及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質ブースト：ＣＥＡ−トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを７つの実験群（ｎ＝８）に分けた。空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）、個々の発現ベクターｐＥＲ−ＣＥＡ（対照ワクチン）、ｐＷ−ＣＥＡ（対照ワクチン）、ｐＣＤ４０ＬＴ（対照ワクチン）、ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ（本発明のワクチン）を担持する１×１０８形質転換され弱毒化されたネズミチフス菌を含むＰＢＳ  １００μｌ、又は本発明のワクチンとそれに続くｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２でのブーストで、経口強制栄養することによって２週間隔で３回、マウスを免疫した。他の対照実験は、ＰＢＳ、及びＤＮＡワクチンによる免疫なしでの組換え抗体融合タンパク質ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２ブーストを含む経口強制栄養、及び照射ＭＣ３８細胞でのみワクチン接種したマウスの群を含んだ。すべてのマウスを、最後の免疫から２週間後に２．５×１０５ＭＣ３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ細胞の致死用量で、右側腹部に皮下経路で攻撃誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した。腫瘍が触知可能になるまでマウスを毎日検査し、その後は１日おきに直径を測微カリパス（ｍｉｃｒｏｃａｌｉｐｅｒ）で二次元測定した。
【００６８】
ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質の構築は、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８、１６０：６１９５−６２０３によってこれまでに記述されている。上述したように形質転換弱毒化ネズミチフス菌ワクチンで経口強制栄養によって免疫した、ＣＥＡに関してトランスジェニックなＣ５７ＢＬ．６Ｊマウスに、腫瘍細胞攻撃誘発後１日目から連続５日間、ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質のブースト５μｇを与えた。
【００６９】
細胞傷害性アッセイ：その関連開示が参照してここに組み込まれる、Ｘｉａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９７、５７：４９４８の方法に従い、標準５１Ｃｒ−放出アッセイによって細胞傷害性を測定した。腫瘍細胞攻撃誘発の１週間後に、ＣＥＡトランスジェニックマウスから単離した脾細胞を、その後完全Ｔ−ＳＴＩＭ培養培地（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中３７℃で３日間培養した。５１Ｃｒ  ０．５ｍＣｉで標識したＭＣ３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ標的細胞（３×１０６）を３７℃で４時間、様々なエフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比率でエフェクター細胞と共にインキュベートした。
【００７０】
トランスフェクション及びタンパク質発現の免疫ブロット評価：ＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクションのためにリポフェクタミンを製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って使用して、６穴平板に２．５×１０５細胞／穴でＣＯＳ−７細胞を接種し、２４時間後に、無血清培地中リポフェクタミン５μｌとＤＮＡ１μｇを加えた。先に述べられているように（Ｘｉａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９７、５７：４９４８）、対照溶解産物と共に還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に電気ブロットした、等量のタンパク質（１５μｌ／レーン）に関して免疫ブロット法を実施した。マウス抗ヒトＣＥＡ  ｍＡｂ（ＩＣＮ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）又は抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、次いで抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰで染色した後、ブロットをＥＣＬウエスタンブロット法検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びＸＯＭＡＴ−５フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）で展開した。
【００７１】
フローサイトメトリー分析：Ｔ細胞及びＣＤ１１ｃとＭＨＣクラスＩＩ抗原−陽性ＤＣ上の同時刺激分子の発現の活性化マーカーを、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎでの２色フローサイトメトリー分析によって測定した。Ｔ細胞の活性化は、ＰＥ複合化抗ＣＤ２５（Ｈ１２９．１９）、ＬＦＡ−１（２Ｄ７）、ＣＤ２８（３７．５１）及びＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）抗体と組み合わせて、抗ＣＤ８  ＦＩＴＣ（５３−６．７）で成功裏にワクチン接種したマウスから新鮮単離した脾細胞を染色することによって測定した。ＡＰＣ上の同時刺激分子の活性化は、ＰＥ複合化抗Ｂ７．１（１６−１０Ａ１）、Ｂ７．２（ＧＬ１）又はＩＣＡＭ−１と組み合わせた、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ−３）、及びビオチニル化抗ＩＡｂ（ＫＨ７４）抗体とそれに続くストレプトアビジンアロフィコシアニンによって測定した。すべてのフローサイトメトリー実験は、死細胞を除外するために０．１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムの存在下で実施した。すべての試薬はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）より入手した。
【００７２】
サイトカイン誘導アッセイ：２．５×１０５ＭＣ３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ細胞による皮下経路での致死的腫瘍細胞攻撃誘発の１週間後に、すべての実験群のマウスから脾細胞を採取した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｅ，ＭＤ）でリンパ球を単離し、１×１０５の照射（１５，０００ラド）ＭＣ３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ細胞と共に完全Ｔ細胞培地中で２４時間培養した。上清を収集し、使用時まで−７０℃で保存した。固相サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた市販のサイトカイン検出キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により、ＩＦＮ−γ又はＩＬ１２に関してサイトカインを分析した。
【実施例１】
【００７３】
ＣＥＡ及びＣＤ４０ＬＴのタンパク質発現
プラスミドｐＣＤ４０ＬＴ、ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ及びｐＷ−ＣＥＡのタンパク質発現を、ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクションによって分析した。ウエスタンブロット法は、還元条件下で分析したトランスフェクト細胞からの溶解産物のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって示されるように、すべての構築物が予想された分子量（それぞれ３５ｋＤａ、２１５ｋＤａ及び１８０ｋＤａ）のタンパク質を生産したことを示した（図１Ａ及び１Ｂ）。ｐＣＤ４０ＬＴをコードするプラスミドは、非還元条件下で、単量体、二量体及び三量体ＣＤ４０Ｌを示す細胞溶解産物中のタンパク質を発現した（図１Ｂ）。ＣＤ４０Ｌタンパク質はまた、還元条件下でトランスフェクト細胞の上清中でも検出された（図１Ａ）。
【実施例２】
【００７４】
ＣＤ４０ＬＴ及びＣＥＡ分子の両方をコードする二元機能ワクチンによる腫瘍防御免疫の誘導
二元機能ＤＮＡワクチン（ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ）は、ＣＤ４０ＬＴ及びＣＥＡがそれぞれＤＣ及びＴ細胞を標的化することを示す、いくつかの対照を含む多数の実験を実施した。それらの結果を図２にグラフで示す。図２では、各個体別マウスの腫瘍増殖を実線で表わしている。ＣＥＡに関してトランスジェニックなＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスを、０日目と７日目に各々２．５×１０５の照射（１５，０００ラド）ＭＣ３８マウス結腸癌細胞の皮下注射によって免疫した。２週間後、致死皮下用量のＭＣ３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ細胞によるこれらの対照の攻撃誘発は、すべてのマウスにおいて速やかに腫瘍の発現を生じさせ、ＭＣ３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ細胞がそれ自体は免疫原性でないことを示した（図２Ａ）。これはまた、他の３つの鍵となる対照実験にも当てはまることが認められた：空ベクター、専らＥＲを標的化してＥＲ内に保持されるｐＥＲ−ＣＥＡプラスミド、又はｐＣＤ４０ＬＴ構築物単独のいずれかを担う１×１０８弱毒化ネズミチフス菌を、経口強制栄養によって２週間隔で３回ワクチン接種したマウス（ｎ＝６）は、すべて一様に、致死的皮下腫瘍細胞攻撃誘発に対する防御免疫応答を誘導することができず、迅速で均一な腫瘍増殖を明らかにした（図２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄ）。これに対し、同じワクチン接種プロトコールによって処置したが、ｐＷ−ＣＥＡベクターを含有するＤＮＡワクチンを与えられたマウスの群は、腫瘍容積の実質的な減少を明らかにし、８匹の動物のうち３匹は腫瘍細胞攻撃誘発を完全に拒絶した（図２Ｆ）。本発明のｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴワクチンを接種したマウスでは、８匹の動物のうち４匹が腫瘍細胞攻撃誘発を完全に拒絶した。この場合、残りのマウスは、対照と比較したとき腫瘍増殖の劇的な抑制を示した（Ｐ＜０．００１）（図２Ｇ）。
【実施例３】
【００７５】
ブースト及び抗体−ＩＬ１２融合タンパク質によってワクチン接種の効果が増幅される
腫瘍微小環境に標的化した小量の非治療用量のｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質によるブーストは、本発明のＤＮＡワクチンの効果を著明に上昇させた。実際に、ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴワクチン群について述べたのと同じプロトコールによるＣＥＡトランスジェニックマウスのワクチン接種と、それに続く、腫瘍細胞攻撃誘発後１日目から連続５日間にわたるｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２  ５μｇの静脈注射は、８匹中８匹の実験動物において腫瘍細胞攻撃誘発の完全な拒絶をもたらした（図２Ｈ）。重要な対照実験は、５×５μｇのｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質の注射自体は、本発明のＤＮＡワクチンによる事前免疫なしで腫瘍攻撃誘発だけを受けたナイーブマウスに投与したとき、本質的に腫瘍増殖に作用を及ぼさなかった（図２Ｅ）。Ｍ３８結腸癌細胞によって発現されないガングリオシドＧＤ２に対する非特異的融合タンパク質ｈｕ１４．１８−ＩＬ２での追加抗原投与は全く無効であったので、ＩＬ２融合タンパク質ブーストは特異的であった。
【実施例４】
【００７６】
抗原特異的ＣＴＬ応答は、本発明のｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ二元機能ワクチンによって上昇する
ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質ブーストを伴う又は伴わない、本発明のｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴワクチンの適用は、個々のプラスミドの各々で免疫したＣＥＡトランスジェニックマウスにおいて明らかにされたように、強い細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングを誘導した（図３）。図３において、未処置担癌マウスについてのデータを（□）で示し、融合タンパク質だけで処置したマウスを
【化１】
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で示し、プラスミドｐＥＲ−ＣＥＡで免疫したマウスを（○）で示し、ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴで免疫したマウスを（△）で示し、ｐＷ−ＣＥＡで免疫したマウスを
【化２】
2005526750.tif 000003
で示し、ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴで免疫したマウスを
【化３】
2005526750.tif 000004
で示し、ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴとｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２で免疫したマウスを
【化４】
2005526750.tif 000005
で示す。ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴワクチンに加えて抗体−ＩＬ２融合タンパク質によるブーストでワクチン接種を受けたマウスのＣＴＬは最も有効であることを示し、同じワクチンで免疫されたが融合タンパク質ブーストを伴わなかったマウスから得た細胞による４５％溶解と比較して、７０％までの溶解を誘導した（図３Ａ）。これに対し、対照動物から得た脾細胞ではバックグラウンド溶解だけ観察された。ＣＥＡ発現を欠く非特異的Ｂ１６黒色腫細胞を標的として使用すると細胞溶解の完全な欠如を生じたため、腫瘍細胞溶解は特異的であった。重要な点として、図３Ｂに提示するデータは、Ｈ２−Ｋｂ／Ｈ２−Ｄｂ  ＭＨＣクラスＩ抗原に対する５０μｇ／ｍｌの抗体の存在が細胞傷害作用を完全に阻害したので、ＭＣ３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ腫瘍標的細胞に対して免疫したマウスからの脾細胞によって誘発される細胞溶解性応答は、ＭＨＣクラスＩ抗原拘束性であったことを明らかに示している。非特異的抗Ｈ−２Ｋｄ及びＨ−２Ｄｄ抗体の存在は細胞溶解を阻害しなかったので、この阻害作用は特異的であった。
【実施例５】
【００７７】
抗体−ＩＬ２融合タンパク質でのブーストによって本発明の二元機能ＤＮＡワクチンによるＣＴＬ活性マーカーの上方調節が増強される
活性化Ｔヘルパー細胞上のＣＤ４０ＬＴとＤＣ上のそのＣＤ４０標的との間の相互作用は、最適の抗原特異的Ｔ細胞応答を達成するために重要である。二元機能ＤＮＡワクチンがＴ細胞依存性免疫応答を増強する能力と、Ｔ細胞活性化マーカーの発現上昇との間に相関関係が認められた。これは、高親和性ＩＬ２受容体α鎖、ＣＤ２５、初期Ｔ細胞活性化抗原、ＣＤ６９、及び細胞間細胞接着分子ＩＣＡＭ−１を通してのＴ細胞とＤＣの初期相互作用のために重要な、リンパ球機能関連抗原、ＬＦＡ−１の発現上昇から明らかであった（図４）。重要な点として、これらの上方調節されるＴ細胞活性化マーカーは、ＤＣの同時刺激性Ｂ７．１及びＢ７．２分子についての受容体として働き、ＣＤ２８とのその連結が、次に、ナイーブＴ細胞の増殖を同時刺激する、Ｔ細胞上で発現されるＩｇスーパーファミリーの一員であるＣＤ２８も包含した（図４）。意外にも、腫瘍細胞攻撃誘発から２４時間後のｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質によるブーストは、これらの同じマーカーの発現をさらに２０％から３５％上昇させた。
【実施例６】
【００７８】
ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴワクチンでの免疫及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質でのブーストによる同時刺激分子の発現上昇
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２８との最適連結を達成するためにＤＣ上の同時刺激分子Ｂ７．１及びＢ７．２の発現の上方調節に依存する。同じく重要であるのは、Ｔ細胞インテグリンＬＦＡ−１に結合するＩＣＡＭ−１の上方調節である。本発明のＤＮＡワクチンで成功裏に免疫し、抗体−ＩＬ２融合タンパク質でブーストしたＣＥＡトランスジェニックマウスから得た脾細胞のフローサイトメトリー分析は、Ｂ７．１、Ｂ７．２及びＩＣＡＭ−１の発現が対照に比べて１−２倍以上に上方調節されたので、この上方調節が非常に効率的に達成されることを明らかに示した（図５）。抗体−ＩＬ２融合タンパク質でのブーストは、同時刺激分子及び接着分子の両方の発現をさらに２０％から４０％上昇させた（図５）。これらのデータは、ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ分子でのワクチン接種がＣＤ１１ｃ＋及びＭＨＣクラスＩＩ抗原陽性ＤＣ上の同時刺激分子の発現を誘導し、増強させることの証拠を提供し、腫瘍特異的抗原のプロセシング及び提示についてのこれらのＡＰＣの能力が有意に高められることを明らかにした。
【実施例７】
【００７９】
ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴワクチン接種は、抗体−ＩＬ２融合タンパク質でさらにブースとされるサイトカインの産生を増強する
照射（１５，０００ラド）ＭＣ３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ腫瘍細胞の存在下で平板培養した後２４時間目に様々な脾細胞試料の上清中でそれらの産生を測定した固相サンドイッチＥＬＩＳＡによって示されたように、ｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴワクチンはプロ炎症性サイトカイン、ＩＦＮ−γ及びＩＬ１２のＴ細胞からの放出を増強した。ＭＣ３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ細胞での攻撃誘発後にＰＢＳ処置したＣＥＡトランスジェニック対照マウスから得た脾細胞の上清を分析したときは、バックグラウンドレベルのＩＦＮ−γ及びＩＬ１２だけが検出された。しかし、マウスがｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ  ＤＮＡワクチンの接種を受けた場合は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ１２の産生が、ｐＣＤ４０ＬＴ又はｐＷ−ＣＥＡ単独でワクチン接種されたマウスで観察されたレベルに比べて、それぞれ７５％及び５０％上昇した（図６）。ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質によるブースト後、ＩＦＮ−γの産生はさらに２５％上昇し、ＩＬ１２の産生は、対照値の３倍及びワクチン接種後に、但しｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２ブーストなしで観察されたものに比べて１００％上昇した（図６）。これらのデータは、抗体−ＩＬ２融合タンパク質のブーストと組み合わせた本発明のワクチンによるＤＮＡ免疫が二次リンパ系組織におけるＴ細胞活性化を決定的に上昇させることを明らかにしている。
【００８０】
（考察）
ヒト腫瘍自己抗原ＣＥＡを産生する、ＣＥＡトランスジェニックマウスは、ヒト抗腫瘍治療の開発と評価のための有用なモデル生物を提供する。本発明の二元機能経口ＤＮＡワクチンは、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおいて、意外にもＣＥＡに対する末梢性Ｔ細胞の免疫寛容を破壊した。重要な点として、ＣＤ８＋Ｔ細胞を介したマウス結腸癌細胞の致死的攻撃誘発の拒絶が、予防的状況において実験マウスの１００％において完全に有効であるように起こった。これまでに報告されている、ＣＥＡトランスジェニックマウスにおいてＣＥＡベースのＤＮＡワクチンによって達成された腫瘍防御免疫は、必ずしもすべての実験動物において完全に有効ではなかった。意外にも、本発明のワクチンで処置したＣＥＡトランスジェニックマウスにおいて、特に組換え抗体融合タンパク質ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２のブースター注射と組み合わせて使用したとき、腫瘍防御免疫が成功裏に達成された。
【００８１】
本発明のワクチンは、ＭＨＣ：ペプチド複合体と共にそれらを提示するＤＣとの相互作用後に、Ｔ細胞の有効な活性化に決定的な影響を及ぼすことが知られているいくつかの受容体／リガンド対の発現を上方調節した。本発明のワクチンは、ＣＤ４０／ＣＤ４０ＬＴ、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２８／Ｂ７．１及びＢ７．２、及びＣＤ２５／ＩＬ２を上方調節し、プロ炎症性サイトカインＩＦＮ−γ及びＩＬ１２の分泌を上昇させた。Ｔ細胞及びＣＤ１１ｃ＋樹状様細胞の著明な活性化が、リンパ球のＡＰＣへの結合に相乗作用することが知られる、Ｔ細胞インテグリンＬＦＡ−１及びＩＣＡＭ−１の発現の決定的上方調節によって示された。
【００８２】
ＡＰＣへのナイーブＴ細胞の一過性結合は、これらの細胞が特異的ペプチドの存在に関して各々のＡＰＣの表面上の数多くのＭＨＣ分子をサンプリングする時間を提供する上で重要である。この機構を通して、ナイーブＴ細胞がその特異的ＭＨＣ：ペプチドリガンドを認識する機会が上昇し、その後ＴＣＲを通してのシグナル伝達及びＬＦＡ−１の立体配座変化の誘導が続く。これは、次に、ＩＣＡＭ−１に対するＬＦＡ−１の親和性を大きく上昇させ、抗原特異的Ｔ細胞とＡＰＣの間の会合を安定化する。
【００８３】
本発明のワクチンによる予防接種及び腫瘍細胞攻撃誘発後の、Ｔ細胞上のＣＤ２８の発現ならびにＤＣ上の同時刺激分子Ｂ７．１及びＢ７．２の発現の著明な上昇は、ナイーブＴ細胞の活性化に必要な２つのシグナルを提供するので、特に重要である。１つのシグナルは、ＴＣＲへのＭＨＣ：ペプチド複合体の結合後にＴ細胞に伝達される抗原認識を示し、他方のシグナルは、ＣＤ２８とＢ７．１及びＢ７．２の連結を示し、Ｔ細胞応答及び武装化（ａｒｍｅｄ）エフェクターＴ細胞の産生を開始させる。二次リンパ系組織におけるＴ細胞活性化の明瞭な指標が、ＣＤ２５、高親和性ＩＬ２受容体α鎖及びＣＤ６９の発現、初期Ｔ細胞活性化抗原の著明な上昇によって与えられた。
【００８４】
本発明の二元機能ＤＮＡワクチンによって誘導された、Ｔ細胞によるプロ炎症性サイトカインＩＦＮ−γ及びＩＬ１２の産生の有意の上昇は、第三のシグナルがＴ細胞に直接作用しうることを示唆する。この「危険シグナル」は、Ｔ細胞のクローン増殖を導くＴＨ１分化に必要であることが報告された。実際に、ＣＥＡのような腫瘍自己抗原に対する有効なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じさせるためにＴ細胞の助けが必要であるときにはいつでも、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に遭遇する前にＤＣの引き金を引くことが必要である。この作用は、ＡＰＣの表面上のＣＤ４０と活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞で発現されるＣＤ４０Ｌとの連結によって仲介される。
【００８５】
本発明のＤＮＡワクチンによって発現されるＣＤ４０ＬＴは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の代用物として働くことができ、Ｂ７．１及びＢ７．２同時刺激分子の決定的上方調節によって示されるようにＤＣの成熟を導く。ＣＥＡ及びＣＤ４０リガンドの両方をコードする遺伝子を含有する本発明の経口投与二元機能ＤＮＡワクチンは、ヒトＣＥＡ腫瘍自己抗原に対する極めて効率的な腫瘍防御免疫を誘導する。
【００８６】
上述した実施態様の数多くの変法及び修正が本発明の新規特徴の精神及び範囲から逸脱することなく実施できる。ここで例示する特定実施態様に関していかなる限定も意図されていないこと又は推論されるべきでないことは了解されている。言うまでもなく、本発明の範囲内に含まれるそのような修正はすべて、付属の特許請求の範囲によってカバーされることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
図面の中で、
【図１】プラスミドＣＥＡ及びプラスミドＣＤ４０ＬＴを含む、溶解した形質転換Ｃｏｓ−７細胞のウエスタンブロット分析を示し、細胞中にＣＥＡ及びＣＤ４０ＬＴ  ＤＮＡの両方が存在することを確認する。
【図２】本発明のｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ  ＤＮＡワクチンを接種したマウスにおける腫瘍増殖の阻害をグラフで示す。
【図３】本発明のＤＮＡワクチンを接種したマウスからの脾細胞がＭＣ−３８−ＣＥＡ−ＫＳＡ腫瘍細胞を死滅させる能力をグラフで示す。
【図４】本発明のｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ  ＤＮＡワクチンを接種したマウスにおけるＴ細胞活性化分子の上方調節発現、及び該ワクチン接種マウスをｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質ブーストでさらに処置したときの上方調節の増強をグラフで示す。
【図５】本発明のｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ  ＤＮＡワクチンを接種したマウスにおいて、それらのワクチン接種マウスをｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質ブーストでさらに処置したときの同時刺激分子の発現増強をグラフで示す。
【図６】本発明のｐＣＥＡ−ＣＤ４０ＬＴ  ＤＮＡワクチンを接種したマウスにおけるプロ炎症性サイトカインの誘導、及び該ワクチン接種マウスをｈｕＫＳ１／４−ＩＬ２融合タンパク質ブーストで処置したときのその誘導の増強をグラフで示す。
【図７】ヒトＣＥＡをコードする遺伝子のＤＮＡ配列、配列番号１を示す。
【図８】ヒトＣＤ４０リガンドをコードするＤＮＡ配列、配列番号２を示す。及び
【図９】マウスＣＤ４０リガンドをコードするＤＮＡ配列、配列番号３を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2005526750.tif 000019
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