(57)【要約】本発明は細胞混合物を選別する方法に関する。求める生物を特異的に標識化し、個体群から分離することを可能にするヌクレオチド依存性ゾンデを使用する。
2005502328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の求めるヌクレオチドシークエンスを有する少なくとも１個の目的細胞を、前記ヌクレオチドシークエンスを有する細胞混合物中で選別または検出する方法において、
（１）細胞混合物を、ハイブリダイゼーション条件下で、ゾンデとして目的細胞のヌクレオチドシークエンスに相補的であるシークエンスを有する少なくとも１個の部分を有する少なくとも１個のポリヌクレオチドを用いて処理し、
（２）こうして処理した細胞混合物を、ゾンデポリヌクレオチド内の少なくとも１個の部分に相補的である、固体の担体に固定されたポリヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、かつ
（３）固体の担体に固定された目的細胞を固定されていない細胞から分離することを特徴とする、少なくとも１個の目的細胞を選別または検出する方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドゾンデがＲＮＡゾンデおよび／またはＤＮＡゾンデである請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞混合物中の細胞のｒＲＮＡ、プラスミドまたはＤＮＡ部分と相補的であるゾンデを使用する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも５０個のヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチドゾンデを使用する請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
固体の担体として細胞混合物から固定されない細胞を得るために、相補的ヌクレオチドシークエンスで被覆されたマイクロタイタープレートを使用する請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
担体に固定できる細胞を得るために、相補的ヌクレオチドシークエンスで被覆された固体の担体として、粒子状材料を使用する請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
標識されたポリヌクレオチドゾンデを使用する請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）目的細胞の高い変動性ヌクレオチドシークエンスに相補的である少なくとも１個の第１ポリヌクレオチドシークエンス、および
（ｉｉ）固体の担体に固定されたポリヌクレオチドシークエンスに相補的である少なくとも１個の第２ポリヌクレオチドシークエンス
を有するシークエンス部分からなるポリヌクレオチドゾンデを使用する請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、求める生物を特異的に標識化し、個体群から分離することにより細胞混合物を選別する方法に関する。
【０００２】
バクテリアの同定および特性化は微生物の生態学で特に重要な役割を果たす。例えば地中に存在するバクテリアのような生態系のうち全部で約１％のみが試験管内で培養できるので、種々の生態系の微生物を検査する、得られた培養に依存しない方法が重要である。しかし従来知られていない培養できない生物の単離はしばしば種々の個体群に起因する要因により困難になる。従って例えば個体群がすでに知られた生物から制圧されることがあり、これにより求める従来知られていない生物の発見が困難になり、場合によっては妨げられる。
【０００３】
細胞を選別する第１の方法の１つは赤外線レーザーを使用するバクテリア細胞およびウィルスの処理にもとづく（Ａｓｈｋｉｎ、Ａ.ｕｎｄ  Ｄｚｉｅｄｚｉｃ、Ｊ.Ｍ.（１９８７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５、１５１７−１５２０）。この方法を使用して個々の細胞を系統的分析に関して集めることが可能である。しかしこの方法は技術的にきわめて煩雑な方法である。従って培養できない生物を増加するための赤外線レーザーを使用する細胞の処理法はきわめてわずかの場合にのみ使用される。
【０００４】
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）は細胞混合物からバクテリア細胞を増加するもう１つの方法である。この方法は急速な細胞分析（１秒当たり１０３セルより多い）および細胞個体群からの個々の細胞の選別を可能にする。その際細胞の大きさ、細胞の形態、ＤＮＡ含量および蛍光標識化した抗体での比色（Ｐｏｒｔｅｒ、Ｊ.Ｅｄｗａｒｄｓ、Ｃ.Ｍｏｒｇａｎ、Ｊ.Ａ.Ｗ.ｕｎｄＰｉｃｋｕｐ、Ｒ.（１９９３）.Ａｐｐｌ.Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.５９、３３２７−３３３３）または蛍光標識化したｒＲＮＡ配向したオリヌクレオチドゾンデでの比色（Ｗａｌｌｎｅｒ.Ｇ.Ｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ.ｕｎｄ  Ａｍａｎｎ、Ｒ.（１９９５）、Ａｐｐｌ.Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.６１：１８５９−１８６６）のような種々のＦＣＭ基準がフローサイトメトリーでの細胞の分離を可能にし、同時に種々の系からの細胞個体群の選別を可能にする。しかしフローサイトメトリーは技術的にきわめて煩雑な方法であり、高価な実験装置を必要とし、それぞれ検査したＦＣＭ基準に依存して少ない特異性を有する。
【０００５】
細胞混合物からバクテリア細胞を減成するための培養に独立の、急速で柔軟な方法はビオチン標識化ｒＲＮＡゾンデを使用する（Ｓｔｏｆｆｅｌｓ、Ｍ.等（１９９９）Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１（３）２５９−２７１）。その際求める細胞をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりビオチン化ポリリボヌクレオチドゾンデを使用して標識化し、引き続き常磁性ストレプタビジン被覆粒子と一緒に培養する。こうして標識化した目的細胞を引き続き永久磁石の磁場にあるスチールウールを充填したカラムを介して細胞混合物の残りの細胞から分離する。この方法はビオチン標識化ｒＲＮＡゾンデにより細胞混合物の求める細胞の繊細で特異的な標識化を可能にする。しかしこの方法の欠点は、結合プロテインを介した標識化した細胞の増加が行われ（この場合にビオチン−ストレプタビジン結合）、これがしばしば非特異的結合を引き起こし、これにより求める細胞の高い固有の減成が困難になることである。
【０００６】
要約すると、個々の目的細胞の種に特異的な標識化および求める細胞の高い感度および高い特異的な分離を可能にする、細胞混合物から求める細胞を選別するための文献に従来なかった適当な培養に独立の方法は技術的に簡単であり、自動制御可能であり、廉価である。
【０００７】
従って本発明の課題は、技術水準に相当する前記の欠点を有しない、少なくとも１個の目的細胞を有する細胞混合物を選別する方法を提供することである。
【０００８】
前記課題は、本発明により、少なくとも１個の求めるヌクレオチドシークエンスを、これを有する細胞混合物に有する、少なくとも１個の目的細胞を選別または検出する方法により解決され、その際
（１）細胞混合物を、ハイブリダイゼーション条件下で、ゾンデとして目的細胞の求めるヌクレオチドシークエンスに相補的である少なくとも１個のポリヌクレオチドシークエンスで処理し、
（２）こうして処理した細胞混合物を、ゾンデポリヌクレオチドシークエンスに相補的である、固体の担体に固定されたポリヌクレオチドシークエンスと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、かつ
（３）固体の担体に固定された目的細胞を固定されない細胞から分離する。
【０００９】
ゾンデヌクレオチドシークエンスが目的細胞の求めるヌクレオチドシークエンスに相補的であり、かつ固体の担体に固定されたポリヌクレオチドシークエンスに相補的であるように選択される、ゾンデとして本発明によるポリヌクレオチドシークエンスの使用により、細胞混合物の求める目的細胞の高い特異的な、感度のよい減成を可能にする、細胞混合物を選別する方法が提供される。その際本発明の方法はポリヌクレオチドゾンデの２回のハイブリダイゼーションの原理にもとづく。
【００１０】
相補的の表現は、ここで使用されるように、ヌクレオチドシークエンスが完全に相補的であり、すなわち完全な塩基対が生じる可能性を含む。しかし相補的シークエンスは、本発明により、塩基の１００％未満、例えば８０％以上、有利に９０％以上、より有利に９５％以上が相補的であり、すなわち１つの塩基対を生じることができるシークエンスであると理解される。更に本発明により、求めるヌクレオチドシークエンスに全部のゾンデヌクレオチドシークエンスが相補的であることが必要でなく、むしろ本発明の意味で、シークエンスの部分領域、特に少なくとも１５個、より有利に少なくとも１８個、特に少なくとも２０個の塩基の長さを有する部分領域の相補性ですでに十分である。ゾンデヌクレオチドシークエンスが目的細胞の求めるヌクレオチドシークエンスおよび固体の担体に固定されたポリヌクレオチドシークエンスと共にハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションすることが重要である。
【００１１】
本発明の方法の少ない技術的経費により、真核細胞および原核細胞のようなすべての種類の従来知られていない生物、特に培養できないバクテリア細胞、酵母細胞および動物細胞を分子分析またはゲノム研究のような微生物の特性化のために単離するために、前記方法はすべての通常の標準実験に使用することができる。その際本発明の方法は２つの可能な単離法を提供する。１つは従来知られていない生物、有利に真核細胞または原核細胞を種に特異的なポリヌクレオチドゾンデにより標識化し、固体の担体により分離もしくは増加することができる。他方は頻繁に存在する細胞個体群の生物を相当する種に特異的なまたは特異性の少ないポリヌクレオチドゾンデにより標識化し、固体の担体により分離することができる。これにより細胞個体群の優勢である細胞を減成し、従来知られていない生物を増加する。
【００１２】
本発明の方法の工程（１）は、求める目的細胞の少なくとも１個の求めるヌクレオチドシークエンスに相補的であり、ポリヌクレオチドゾンデの相補的領域と細胞混合物の目的細胞の求めるヌクレオチドシークエンスとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにもとづく、少なくとも１個のポリヌクレオチドゾンデで検査すべき細胞混合物を処理することからなる。適当なハイブリダイゼーション条件は当業者に知られており、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ.Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ.Ｆ.  ｕｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ.１９８２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.  ｕｎｄ  Ａｍａｎｎ、Ｒ.Ｌｕｄｗｉｇ、Ｗ.  ｕｎｄ  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ、Ｋ.Ｈ.１９９５、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｒｅｖ.５９、１４３−１６９頁に記載されている。有利にはｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを本発明に相当してハイブリダイゼーション緩衝液中で５０〜６０℃、有利に５０〜５５℃、特に有利に５３℃で５〜３０時間の間行う。場合によりハイブリダイゼーション混合物をｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションの前に７０〜８５℃、有利に８０℃で１５〜３０分間、有利に２０分間培養することができる。
【００１３】
本発明の方法の基礎となるポリヌクレオチドゾンデはハイブリダイゼーションの際にすべてが完全に目的細胞に浸入しないという決定的な特性を有する。ポリヌクレオチドゾンデの一部は細胞に浸入せず、目的細胞の細胞壁の外部に残る。ゾンデから、分子内にｒＲＮＡまたはＤＮＡのような目的分子でハイブリダイゼーションされた若干のゾンデ分子を介して細胞に固定されているネットワークが形成されると思われる。この目的細胞の外部に存在するポリヌクレオチドゾンデネットワークの部分は本発明により、固体の担体に固定されたヌクレオチドシークエンスに相補的である領域を有する。この現象を使用して、本発明の方法の工程（１）で、求める目的細胞を種に特異的にポリヌクレオチドゾンデを用いて標識化し、ポリヌクレオチドゾンデの細胞の外部に存在する部分によりポリヌクレオチドゾンデで標識化されていない細胞から分離することが可能である（本発明の方法の工程（２））。
【００１４】
本発明の方法の工程（２）は、工程（１）でポリヌクレオチドゾンデで標識化された細胞混合物の目的細胞を固体の担体に定着もしくは固定することからなる。本発明に相当してポリヌクレオチドゾンデの細胞の外部に存在するシークエンス領域とこれに相補的な、固体の担体に定着もしくは固定されたヌクレオチドシークエンスとのハイブリダイゼーションによりポリヌクレオチドゾンデで標識化した目的細胞を定着もしくは固定する。ハイブリダイゼーションは有利に公知のハイブリダイゼーション法によりおよび公知のハイブリダイゼーション条件下で行う（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ.Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ.Ｆ.  ｕｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ.１９８２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.参照）。有利にハイブリダイゼーションを、本発明に相当して５０〜６０℃、有利に５０〜５５℃、特に有利に５３℃で１〜２時間行う。これによりポリヌクレオチドゾンデで標識化された目的細胞を、ゾンデヌクレオチドシークエンスに相補的なヌクレオチドシークエンスで被覆された固体の担体に固定し、増加することができる。
【００１５】
ポリヌクレオチドゾンデで標識化された目的細胞は従来知られていない生物であり、未知の生物の単離を、固体の担体に固定もしくは増加することにより行う。これに対して細胞個体群の優勢である生物をポリヌクレオチドゾンデで標識化する場合に、この生物を固体の担体に固定することにより除去するかもしくは細胞個体群から減成し、これが細胞個体群の培養液中の従来知られていない生物の増加を生じる。
【００１６】
固体の担体として、本発明の方法に、マイクロタイタープレート、例えば固有の表面被覆を有し、ポリヌクレオチドの非共有、疎水性または親水性結合を可能にするマイクロタイタープレート、および共有結合、アミノリンカーまたはホスホリル化によりポリヌクレオチド結合を行う従来のマイクロタイタープレート、膜、直接ポリヌクレオチドで被覆できるかまたは結合プロテインにより結合する（ストレプタビジン−ビオチン結合）粒子状担体材料およびバイオチップのような公知の担体材料を使用することができる。有利には多くの試料の処理に適しており、方法の自動制御が可能であるので、本発明の方法にマイクロタイタープレートを使用する。
【００１７】
本発明の有利な実施態様において、優勢である目的生物の減成の際に、マイクロタイタープレートがきわめて高い結合能力を有するので、固体の担体としてマイクロタイタープレート、有利にマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロウェル（ＮａｌｇｅｎＮｕｎｃＩｎｔ.Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ、米国）を使用する。しかし優勢である目的生物が真核細胞である場合は、粒子状担体材料が有利であり、それというのも原核細胞に比べてかなり大きい真核細胞が、例えばマイクロタイタープレートのような平坦な表面に固定する際に容易に洗い落とせるからである。
【００１８】
これに対して本発明の方法を、他の実施態様で、求める細胞種類を大きい細胞混合物から取り出し、固定により取得するために使用する場合に、有利に、例えばＤＮＡで被覆された粒子状担体材料を使用する。粒子状担体に結合した目的生物は、増加後直ちに再使用することができ、固定された状態で、例えば顕微鏡分析、ＰＣＲまたはシークエンスの検査に使用することができる。
【００１９】
ポリヌクレオチドゾンデに相補的である、固定すべきポリヌクレオチドシークエンスでの担体材料の被覆は、本発明により、公知のポリヌクレオチド被覆法により行う（マイクロタイタープレートに関しては、例えばエザキ、Ｔ.  ハシモト、Ｙ.およびヤブウチ、Ｅ.１９８９、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＤＮＡ−ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｗｅｌｌｓ  ａｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ  ａｒｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ  ａｍｏｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ、Ｉｎｔ.Ｊ.Ｓｙｓｔ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.３９、２２４−２２９頁参照、膜または他の担体材料に関しては、例えばＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ.Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ.Ｆ.  ｕｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ.１９８２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.または製造者の記載を参照）。その際固体の担体へのポリヌクレオチドゾンデの結合は有利に共有で、吸着によりまたは特異的結合パートナーにより行う。担体に固定されたポリヌクレオチドシークエンスは任意の核酸シークエンスであってもよく、有利にＤＮＡシークエンスまたはＲＮＡシークエンスである。
【００２０】
本発明の方法の工程（３）において、固体の担体に固定された、ポリヌクレオチドゾンデで標識化された目的細胞を細胞混合物の固定されない細胞から分離し、目的細胞の単離および増加もしくは減成を行い、その際本発明の方法により目的細胞は従来知られていない生物または少なくとも１個の優勢である生物であってもよい。
【００２１】
本発明の方法において、以下のシークエンス部分：
（ｉ）目的細胞のヌクレオチドシークエンスに相補的である少なくとも１個の第１ポリヌクレオチドシークエンス、この場合にポリヌクレオチドシークエンスは有利に目的細胞の高い変動性のヌクレオチドシークエンスに相補的であり、および
（ｉｉ）固体の担体に固定されたポリヌクレオチドシークエンスに相補的である少なくとも１個の第２ポリヌクレオチドシークエンス
を有する新規のポリヌクレオチドゾンデを使用する。
【００２２】
本発明の方法の新規のポリヌクレオチドゾンデは種に特異的であり、高い選択性の細胞選別を可能にする。ポリヌクレオチドゾンデのシークエンス部分（ｉ）および（ｉｉ）は、前記の基準を満たす限りで自由に選択できる。有利にはポリヌクレオチドゾンデは少なくとも５０個のヌクレオチド、有利に少なくとも１００個のヌクレオチド、より有利に少なくとも１５０個のヌクレオチドの全部の長さを有する。全部の長さの上限は制限されないが、しかし有利にポリヌクレオチドゾンデは最大１０００個の、より有利に最大８００個のヌクレオチドの長さを有する。
【００２３】
本発明によりポリヌクレオチドゾンデは１つの部分で、例えば人工的に試験管内転写またはＰＣＲにより製造することができ、その際２つのシークエンス部分（ｉ）および（ｉｉ）を有するかまたは２つのシークエンス部分（ｉ）および（ｉｉ）からなるポリヌクレオチドゾンデパターンをこれらの製造後に合成する。
【００２４】
少なくともポリヌクレオチドゾンデのシークエンス部分（ｉ）は、有利に求める目的細胞内部の高い変動性のシークエンスに相補的である。この高い変動性のシークエンスは、例えば２３ＳｒＲＮＡもしくは１６ＳｒＲＮＡまたは２８ＳｒＲＮＡもしくは１８ＳｒＲＮＡの高い変動性の領域のような細胞状ｒＲＮＡのわずかに保存された領域または高度、中程度および低度コピープラスミドであってもよい。これらのシークエンスは目的細胞に浸入するポリヌクレオチドゾンデによる確実なハイブリダイゼーションを可能にする。しかしこの方法は染色体ＤＮＡに配向したゾンデを使用しても首尾よく実施することができる。
【００２５】
有利な構成において、本発明のポリヌクレオチドゾンデのシークエンス部分（ｉ）は２３ＳｒＲＮＡ（ドメインＩＩＩ）および／または１６ＳｒＲＮＡの高い変動性の領域に相補的であるシークエンスを有する。この場合にゾンデシークエンスを選択する際に現在約２０００もしくは２２０００個のシークエンスのデーターを使用できる。特別な場合には目的細胞のために、その都度予め記載されていない、しばしば存在するシークエンスおよび最初に同定したシークエンスおよび構造の出発点として適したポリヌクレオチドゾンデを使用することができる。未知の種類のために、例えば介在するシークエンスが知られていなくてもよい、強く保存される位置で結合するプライマーを使用して処理することができる。
【００２６】
有利にはポリヌクレオチドゾンデのシークエンス部分（ｉ）は、ポリヌクレオチドゾンデと目的細胞の核酸の間に特異的結合を保証するために、少なくとも１５個、有利に少なくとも１８個、特に少なくとも２０個、より有利に少なくとも２５個のヌクレオチドの長さを有するべきである。しかしシークエンス部分（ｉ）が有利に１００以下のヌクレオチド、より有利に５０以下のヌクレオチドおよびきわめて有利に４０以下のヌクレオチドの長さを有する場合に、試験管内ハイブリダイゼーションにしばしば十分である。
【００２７】
ポリヌクレオチドゾンデのシークエンス部分（ｉｉ）は固体の担体に固定されたヌクレオチドシークエンスに相補的である。合成したポリヌクレオチドゾンデの場合にこのシークエンス部分は、固体の担体に固定されたヌクレオチドシークエンスでの簡単な、急速な、定量的なハイブリダイゼーションが行われるように、有利に選択する。
【００２８】
本発明の方法の有利な実施態様において、ポリヌクレオチドゾンデはリボ核酸ゾンデ（ＲＮＡゾンデ）である。これは公知のやり方で、例えば人工的に製造することができる。有利には本発明の方法のＲＮＡゾンデを伝統的な試験管内転写により製造する（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ.Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ.Ｆ.  ｕｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ.１９８２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.参照）。ＲＮＡゾンデは有利なやり方で、ゾンデシークエンスと目的ｒＲＮＡの間に強い、定量的なハイブリダイゼーションを可能にし、きわめて安定なＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。
【００２９】
本発明の方法の他の実施態様において、ポリヌクレオチドゾンデはデオキシリボ核酸ゾンデ（ＤＮＡゾンデ）である。ＤＮＡゾンデは伝統的な方法により人工的にオリゴヌクレオチド合成によりまたはＰＣＲを用いる増幅（Ｊ.Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ等、Ｓｙｓｔ.Ａｐｐｌ.Ｍｏｃｒｏｂｉｏｌ.２４（２）２３８−２４４（２００１））により製造することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ.Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ.Ｆ.  ｕｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ.１９８２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.参照）。
【００３０】
本発明の方法の他の実施態様において、ポリヌクレオチドゾンデを付加的に、ポリヌクレオチドゾンデ標識化目的細胞の後での検出を可能にするために、例えばビオチンおよびジゴキシゲニンのような適当な標識物質またはフルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ロダミンおよびテキサスレッドのような、エピ蛍光顕微鏡に使用される蛍光着色料を用いて標識することができる。本発明において、標識試薬として、有利にはビオチンおよびジゴキシゲニンを使用する。これは、ポリヌクレオチドゾンデで標識された目的細胞をストレプタビジン−フルオレセインもしくはアンチジゴキシゲニン−フルオレセインにより検出することにより、本発明の方法を使用して実施される細胞選別の顕微鏡での監視を可能にする。更に顕微鏡での目的細胞の算出またはストレプタビジン−ペルオキシダーゼもしくはアンチデゴキシゲニン−ペルオキシダーゼを用いる測光による検出により、固体の担体、有利にマイクロタイタープレートに固定された目的細胞の定量化が可能になる。しかし本発明は、半定量的ＰＣＲを用いて固体の担体に固定された目的細胞の定量化を行うことを用意する。その際検査すべき細胞混合物の細胞懸濁液の希釈液の列を有するＰＣＲを増加／減成の前および後に行う。どの希釈段階までなおＰＣＲ生成物が形成されるかの比較は固体の担体に固定された目的細胞の定量化を可能にする。
【００３１】
環境試料を用いる作業に関しては、成果の多い減成を定量化するための顕微鏡での細胞の算出はもはや実施できず、半定量的ＰＣＲはきわめて正確な値を生じない。この場合に、例えば適当なソフトウェアーと一緒の共焦点のレーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）を使用することが有利である。
【００３２】
このために試料の一部を減成後にスライドガラスにのせ、少なくとも２個の異なる蛍光標識化オリゴヌクレオチドゾンデを用いてハイブリダイゼーションする。試料に存在するすべての細胞を形成するゾンデ１（Ｅｕｂ３３８、Ｄａｉｍｓ  Ｈ.等、Ｓｙｓｔｅｍ.Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.２２：４３４−４４４（１９９９））、減成の目的細胞に特異的なゾンデ２。ＬＳＭを使用して少なくとも１０個の任意の選択した顕微鏡視野を記録する。例えば、目的細胞の面とバクテリアのすべての面の比較にもとづく、Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ５７０（Ｌｅｉｃａ  ＣａｍｂｒｉｄｇｅＬｔｄ、ケンブリッジ、英国）、ＮＩＨ画像分析器（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）、Ａｒｔｅｋ８１０画像分析器（Ａｒｔｅｋ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ、米国）のような市販のソフトウェアーを使用して評価する。これにより細胞選別の前および後の記録により減成の定量化が可能である。
【００３３】
本発明の方法の他の実施態様において、検査すべき細胞混合物を、有利にパラホルムアルデヒド、特に４％パラホルムアルデヒドを用いてまず固定する。固定は、例えば４℃で１０〜１６時間、有利に１２時間行う。酵母および他の真核生物の場合は、固定は必ずしも必要でないが、好ましい。細胞をゾンデに良好に到達するために、バクテリア細胞を有利に固定する。
【００３４】
本発明の方法は、広い適用可能性、高い特異性、高い選択性および微生物学の広い範囲で助導制御の可能性により使用できる。従って任意の細胞個体群のほとんどすべての従来知られていない培養可能なおよび／または培養できない細胞を検出し、単離し、引き続く分子分析および／またはゲノム研究に使用することができる。例えばこの方法を、伝染病予防法により危険群２に該当する若干の生物に首尾よく使用することができる。アシネトバクター  カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１７９７８、エンテロバクターエーロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エシェリシア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１１７７５Ｔ、クレブシエラ  ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｍｉａｅ）ＤＳＭ３０１０４、シュードモナス  エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＳＭ６２７９。人工的混合物において、生物を首尾よく減成することができた。付加的に生物を混合した環境試料での検査を実施した（動物活用装置の浄化槽からの汚泥）。この場合にエシェリシア  コリおよびシュードモナス  エルギノーサの首尾よい減成を検出できた。細胞混合物の選別への本発明によるポリヌクレオチドゾンデの使用により、結合プロテインによる目的細胞のかなりの非特異的増加を回避する。本発明の方法は更に固定された固体の担体からの目的細胞の遊離を容易にする。
【００３５】
本発明を以下の図面および実施例により説明する。
【００３６】
図１は本発明の細胞混合物を選別する方法の図である。本発明のビオチン標識化ポリヌクレオチドゾンデと求める目的細胞のヌクレオチドシークエンスのハイブリダイゼーションにより目的細胞を標識する。目的細胞の固定および減成を、ポリヌクレオチドゾンデの細胞の外部に存在する領域と固体の担体（有利にマイクロタイタープレート）に固定されたポリヌクレオチドシークエンスとの以下のハイブリダイゼーションにより行う。固定された目的細胞の検出は、顕微鏡でのビオチンで標識されたゾンデのストレプタビジン−フルオレセイン検出によりまたは固体の担体でのビオチンで標識されたゾンデのストレプタビジン−ペルオキシダーゼ検出により測光により行う。
【００３７】
図２ａ、ｂおよびｃはポリヌクレオチドゾンデのアンカー分子としてプラスミドを使用する実施例３に記載された方法の結果を示す顕微鏡写真である。その際、左側にゾンデを使用しない相コントラスト写真、右側に目的細胞の周囲にハレーションを示す蛍光ゾンデを使用する同じ写真を示す。この目的細胞の標識の特異性が明らかに認識できる。
【００３８】
図３は実施例４に関して図２と同様の顕微鏡写真（ポリヌクレオチドゾンデのアンカーとしてゲノムＤＮＡを使用する減成）である。
【００３９】
図４は図２に記載されると同様に、上にＥ.ｃｏｌｉ特異的ゾンデ３６７−Ｅで標識され、典型的なハレーションを有する相コントラスト写真を示す。下にＥ  ｃｏｌｉ棹菌のほかに主に存在するネイセリア  カニス（Ｎｅｉｓｅｒｉａ  ｃａｎｉｓ）球菌を示す、ゾンデを使用しない同じ写真を示す。
【００４０】
図５は図４と同様の顕微鏡写真を示す。上の図ではトルラスポラ  デルブルキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）に特異的なゾンデを使用し、中央の図では２つのゾンデを使用した。トルラスポラ  デルブルキイに特異的なゾンデおよびトルラスポラ  デルブルキイのほかにカンジダ  トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）も認識される、すべての細胞に結合する赤い蛍光ゾンデ。下の写真は上の２つの写真に相当するが、ゾンデを添加しない。
【００４１】
図６は図４と同様の写真を示す。上の図では真核細胞をｒＲＮＡゾンデで標識し、典型的なハレーションを形成する。下の図はゾンデを使用しない同じ写真を示す。
【００４２】
図７はｒＲＮＡ依存性ゾンデを使用する減成の前と後の目的細胞の％を表すグラフを示す。
【００４３】
図８は図７と同様の、ただしプラスミド依存性ゾンデのグラフを示す。
【００４４】
図９は図７と同様の、ただしＤＮＡ依存性ゾンデのグラフを示す。
【００４５】
例１
本発明の方法を使用する細胞混合物の選別
例１ａ
細胞の固定
細胞懸濁液を遠心分離し（１５分、５０００ｒｐｍ）、引き続き細胞ペレットをＰＢＳ（１３７ミリモルＮａＣｌ、１０ミリモルＮａ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２.７ミリモルＫＣｌ、ｐＨ７.２）中で再懸濁させる。細胞懸濁液に３容積％固定溶液（ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド［ｗ／ｖ］、ｐＨ７.０）を添加する。固定を４℃で１２時間行う。引き続き細胞を遠心分離し（２分、１２０００ｒｐｍ）、１ｍｌＰＢＳで洗浄し、最後に０.５ｍｌＰＢＳに取る。貯蔵のために、細胞に１容積％ＥｔＯＨ無水を混合する。こうして固定した細胞は−２０℃で数ヶ月保存できる。
【００４６】
例１ｂ
試験管内転写によるｒＲＮＡ依存性ＲＮＡ−ポリヌクレオチドゾンデの製造
浄化したゲノムＤＮＡからＰＣＲにより２３ＳｒＲＮＡの高い変動性領域（ドメインＩＩＩ）を増幅する。このために以下のヌクレオチドシークエンスを有する変性されたプライマー対１９００ＶＮおよび３１７ＲＴ３を使用する。１９００ＶＮ：５′−ＭＡＤＧＣＧＴＡＧＢＣＧＡＷＧＧ−３′、３１７ＲＴ３：５′−ＡＴＡＧＧＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ  ＧＧＡＣＣＷＧＴＧＴＣＳＧＴＴＴＨＢＧＴＡＣ−３′。プライマー３１７ＲＴ３は、試験管内転写に必要なＴ３−ＲＮＡポリメラーゼ（ＡＴＡＧＧＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ）のプロモーターシークエンスを有する。ＰＣＲ増幅は以下の処方により実施する。ゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、１９００ＶＮおよび３１７ＲＴ３それぞれ５０ｐモル、ｄＮＴＰ８０ｎモル、１０×ＰＣＲ緩衝液（タカラシュゾウ、大津、日本）および３ＵＴａｑポリメラーゼ（タカラｒＴａｑ）をＨ２Ｏと共に１００μｌの容積にする。９４℃、３分の最初の変性の後に９４℃、１分の変性、５０℃、１分のプライマーアニーリングおよび７２℃、１分のプライマー延伸の３０サイクルを行い、７２℃で５分の最終延伸を行う。ＰＣＲ生成物をＱ１Ａｑｕｉｃｋ−マトリックス（Ｑ１ＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて浄化する。試験管内転写のためにＰＣＲ増幅剤１〜２μｇを使用する。
【００４７】
転写に沿ってゾンデを選択的にビオチンもしくはジゴキシゲニンで標識する。転写配合物は以下のような組成である。ＮＴＰ２００ｎモル（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびビオチン−１６−ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）もしくはＤＩＧ−１１−ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）の１：１：１：０.３５：０.６５の比からなる）、１０×転写緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）３μｌ、Ｔ３−ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）３μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）１.５μｌ、ＰＣＲ生成物１〜２μｇ、最終容積３０μｌ。配合物を３７℃で３〜４時間培養する。引き続きＤＮａｓｅｌ（Ｒｏｃｈｅ、ＲＮａｓｅ不含）３μｌを添加し、３７℃で更に１５分間培養する。０.２モルＥＤＴＡ３μｌの添加により反応を中断し、ＲＮＡを酢酸アンモニウム１６μｌおよび無水ＥｔＯＨ１５６μｌとともに−２０℃で２時間沈殿する。ＲＮＡを遠心分離し（１５分、１４０００ｒｐｍ、４℃）、７０％ＥｔＯＨで洗浄し、引き続きＨ２Ｏ５０μｌ＋ＲＮａｓｅ阻害剤１μｌに取り、測光により測定する。ゾンデは−２０℃で２〜３ヶ月保存できる。
【００４８】
例１ｃ
ビオチンもしくはＤＩＧ標識したポリヌクレオチドゾンデでのハイブリダイゼーション
ＰＦＡ固定細胞５〜１０μｌを０.５ｍｌ反応容器中で２容積％無水ＥｔＯＨと混合し、室温で３分培養する。引き続き細胞を遠心分離し（３分、１２０００ｒｐｎ）、ＰＢＳで洗浄し、最後にハイブリダイゼーション緩衝液（ＮａＣｌ７５ミリモル、トリス２０ミリモル、ｐＨ８.０、ＳＤＳ０.０１％、８０％ホルムアミド）３０μｌに取る。ゾンデ０.５〜４μｇを添加し、ＲＮＡ二次構造を変性するために、配合物をまず８０℃で２０分培養する。引き続きハイブリダイゼーション炉内で５３℃で、５〜１６時間の間ハイブリダイゼーションを行う。
【００４９】
例１ｄ
マイクロタイタープレートの被覆
ＲＮＡゾンデに相補的なＤＮＡで被覆されたマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロウェル（ＮａｌｇｅｎＮｕｎｃＩｎｔ.Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ、米国）を使用する。この目的のために、ゾンデとして使用される２３ＳｒＤＮＡのドメインＩＩＩのシークエンスを、１ｂに記載された処方によりＰＣＲを用いて増幅する。ＰＣＲ生成物を０.１容積％ＮａＡＣ５モル、ｐＨ５.５、および２容積％無水ＥｔＯＨで沈殿することにより浄化する。マイクロタイターキャビティ当たりＰＢＳ／ＭｇＣｌ２５０μｌ（ＮａＣｌ１３７ミリモル、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４１０ミリモル、ＫＣｌ２.７ミリモル、ＭｇＣｌ２１００ミリモル、ｐＨ７.２）＋Ｈ２Ｏ５０μｌ中のＰＣＲ生成物１μｇを添加する。プレートを接着フィルムで閉鎖し（Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ、米国）、熱ブロック上で９４℃で１０分間変性し、引き続き３７℃で１時間培養する。プレートを紙の上でたたき出し、炉内で６０℃で１〜２時間乾燥する。被覆されたプレートは接着フィルムで閉鎖して室温で６ヶ月保存できる。使用する前に、場合により結合していないＤＮＡを洗い落とすために、プレートをそれぞれＰＢＳ１００μｌで２回洗浄する。
【００５０】
例１ｅ
マイクロタイタープレートでの細胞の減成−ＨＹＣＯＭＰ
ポリヌクレオチドゾンデでハイブリダイゼーションした細胞（１ｃ参照）を、過剰のゾンデを除去するためにＰＢＳで２回洗浄し、引き続きマイクロタイタープレート緩衝液（ＭＰ緩衝液：５×ＳＳＣ、０.０２％ＳＤＳ、２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）、０.１％Ｎ−ラウリルサルコシン、３３％ホルムアミド）に取り、ＲＮＡゾンデに相補的なＤＮＡで被覆された複数のマイクロタイターキャビティ（１ｄ参照）に分配する。５０μｌの容積で減成を行う。キャビティ当たり１μｌまで細胞懸濁液（ゾンデを使用するハイブリダイゼーション［１ｃ参照］の際に使用する細胞の量に対して）を使用する。その後１０μｌ細胞懸濁液の開始量で細胞をＭＰ緩衝液３５０μｌに取り、マイナスの対照群として使用されるキャビティを含めて１０個のマイクロタイターキャビティに分配する。マイナスの対照群はゾンデに相補的なＤＮＡと異なるもので被覆されるマイクロタイターキャビティからなる。
【００５１】
マイクロタイタープレートを５３℃で１〜２時間培養する。減成効率を更に高めるために、これに続いて上澄み液を新しいキャビティに移し、５３℃で更に１時間培養する。
【００５２】
この減成工程の後に上澄み液をキャビティから慎重に取り出し、他の顕微鏡分析または分子生物学分析に使用することができる。キャビティから上澄み液を取り出す際に、キャビティの底部が接触せず、間違えて結合した細胞を取り出さないことに注意すべきである。
【００５３】
例１ｆ
マイクロタイタープレートでの検出
プレートへの細胞の成果の多い結合はストレプタビジン−ペルオキシダーゼ結合物（ビオチン標識ゾンデを使用する場合）もしくはアンチ−ＤＩＧ−ペルオキシダーゼ結合物（ＤＩＧ標識ゾンデの場合）を使用して検出することができる。
【００５４】
まずキャビティを１００μｌＰＢＳで１回洗浄する。その後ブロッキング緩衝液１００μｌ（ＰＢＳ／１％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ））を添加し、室温で１５分間培養する。上澄み液を取り出し、ストレプタビジン−ペルオキシダーゼ溶液（ブロッキング緩衝液中で希釈したＳＡ−ＰＯＤ１００ｍＵ／ｍｌ）もしくはアンチ−ＤＩＧ−ペルオキシダーゼ溶液（ブロッキング緩衝液中アンチ−ＤＩＧ−ＰＯＤ１５０ｎＵ／ｍｌ）５０μｌを添加し、室温で３０分間培養する。引き続きキャビティをＰＢＳ１００μｌで３回洗浄する。基質ＢＭブルー（Ｒｏｃｈｅ）の添加後、着色反応が行われ（ブルーに変化）、１０〜１５分後１モルＨ２ＳＯ４１００μｌの添加により（黄色に変化）反応を中断する。色強度を光度計により干渉波長６５０ｎｍに対して４５０ｎｍの波長で測定できる。
【００５５】
例１ｇ
顕微鏡での検出
減成後にキャビティの上澄み液に含まれる細胞を、ゾンデ特異性および減成の結果を調節するために、蛍光着色料（ビオチンゾンデを使用する場合にストレプタビジン−フルオレセインもしくはＤＩＧゾンデの場合にアンチ−ＤＩＧ−フルオレセイン）を使用して検出し、顕微鏡で分析できる。この目的のために、細胞を遠心分離し、Ｈ２Ｏ１０μｌに取り、スライドガラスにのせ、炉内で６０℃で乾燥する。引き続きスライドガラスを蛍光着色料溶液（ストレプタビジン−フルオレセイン（Ｒｏｃｈｅ５μｌ／ｍｌ）ＤＰＢＳ中希釈した、もしくはアンチ−ＤＩＧ−フルオレセイン（Ｒｏｃｈｅ４０μｇ／ｍｌ）ＤＰＢＳ中：１３７ミリモルＮａＣｌ、２.７ミリモルＫＣｌ、８ミリモルＮａ２ＨＰＯ４））４０μｌで覆い、暗所で４５分間培養する。溶液をＨ２Ｏで洗浄し、スライドガラスを暗所でＤＰＢＳに１５分漬けることにより洗浄し、引き続き乾燥し、蓋で覆う。相当するフィルターを有するエピ蛍光顕微鏡で分析する。
【００５６】
例２
真核生物
例１に記載されるように、一方でマウスセルライン（ＮＩＨ−３Ｔ３  フィブロブラステン（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｅｎ））および他方でヒトセルライン（ジュルケートセル（Ｊｕｒｋａｔｚｅｌｌｅ）、ヒトＴ細胞）を使用した。哺乳動物セルラインはバクテリアおよび酵母と異なり、細胞壁を有せず、細胞膜にのみ包囲されているので、ゾンデを容易に細胞に浸入することができる。実際に２つの検査したセルラインにおいて強いハイブリダイゼーション信号を認めることができ、これはすでにハイブリダイゼーションの２〜３時間後に発生した（バクテリアおよび酵母の場合は速くても約５時間後）。異なる細胞固定法（４％ＰＦＡ、１００％ＥｔＯＨ、４％ＰＦＡ／７０％ＥｔＯＨ）はハイブリダイゼーションの結果に影響しなかった。顕微鏡での明らかな信号はマイクロタイタープレートでの細胞の固定が可能であることを示す。しかし２つの検査されるセルラインの混合物からの特異的増加／減成はこの場合に使用されるｒＲＮＡ依存性ゾンデでは不可能であり、それというのもヒトとマウスはｒＲＮＡ平面上でほぼ同じであり、従ってゾンデが特異的でないからである。
【００５７】
例３
プラスミド（ハイコピー／ミディアムコピー／ローコピー）ゾンデβ−Ｌａｃｔ
例１に記載された方法により、ポリヌクレオチドゾンデにアンカー分子としてｒＲＮＡの代わりにプラスミドを使用した。３個のプラスミドｐＣＲ２.１ＴＯＰＯ、コピー数約２００，ｐＢＢＲ１ＭＣＳ４、コピー数約５０−１００、およびｐＵＮ１２１、コピー数約２０−５０は選択マーカーとしてβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。このシークエンスから約８５０ｂｐの長い部分をポリヌクレオチドゾンデの目的領域として使用した。３個のすべてのプラスミドを使用して顕微鏡で明らかなハレーションを観察することができ、減成を首尾よく実施することができた。その際ハイコピー／ミディアムコピーおよびローコピープラスミドで信号強度の著しい変動が確認されなかった。しかし信号は全体としてｒＲＮＡ依存性ゾンデの場合より弱い。減成効率は実験から実験で５〜５０％の間で変動した。プラスミド依存性ゾンデの場合にアンチｒＲＮＡ依存性ゾンデに比較して長いハイブリダイゼーション時間（１８〜２４時間）および少ない厳格性（ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量により調節した、この場合に５〜２０％）が必要であることが示された（ｒＲＮＡ依存性ゾンデの比較する値はハイブリダイゼーション５〜１６時間、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミド８０〜９５％）。結果は図２ａ、２ｂおよび２ｃの顕微鏡写真に示される。
【００５８】
例４
ゲノムＤＮＡゾンデＧＡＰＤＨ
目的領域としてグリセリンアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）からの部分を使用した。例１に記載される方法および若干の反応パラメーターの調節により、この場合にも顕微鏡でハレーションが認められ、減成を首尾よく実施できた。信号はプラスミド依存性ゾンデと比較して弱い。減成効率は５〜３５％の範囲内にある。厳格性はプラスミド依存性ゾンデに比較して更に減少し（５〜１０％ホルムアミド）、ハイブリダイゼーション時間は更に延長する（２４〜３０時間）はずである。多くの互いに独立の試験においてプラスのハイブリダイゼーション信号が認められ、マイナスの対照群による信号の特異性が検出された。図３は得られた顕微鏡写真の形の結果を示す。
【００５９】
ＧＡＰＤＨゾンデをＥ.ｃｏｌｉおよび真核生物（ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔｚｅｌｌｅ）で試験した。真核細胞では期待どおり細胞核領域で信号の濃度を観察できた。この場合にｒＲＮＡ依存性ゾンデの場合と同様に真核生物においてハイブリダイゼーション信号がすでにバクテリアの場合よりかなり速く観察できた（４〜５時間後）。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の細胞混合物を選別する方法の図である。
【００６１】
【図２】ポリヌクレオチドゾンデのアンカー分子としてプラスミドを使用する実施例３に記載された方法の結果を示す顕微鏡写真である。
【００６２】
【図３】実施例４に関する図２と同様の顕微鏡写真（ポリヌクレオチドゾンデのアンカーとしてゲノムＤＮＡを使用する減成）である。
【００６３】
【図４】図２に記載されると同様に、上にＥ.ｃｏｌｉ特異的ゾンデ３６７−Ｅで標識され、典型的なハレーションを有する相コントラスト写真を示す。下にＥ  ｃｏｌｉ棹菌のほかに主に存在するネイセリア  カニス（Ｎｅｉｓｅｒｉａ  ｃａｎｉｓ）球菌を示す、ゾンデを使用しない同じ写真を示す。
【００６４】
【図５】上の図ではトルラスポラ  デルブルキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）に特異的なゾンデを使用し、中央の図では２つのゾンデを使用し、下の図は上の２つの写真に相当するが、ゾンデを添加しない図４と同様の顕微鏡写真を示す。
【００６５】
【図６】図４と同様の顕微鏡写真を示す。上の図では真核細胞をｒＲＮＡゾンデで標識し、典型的なハレーションを形成する。下の図はゾンデを使用しない同じ写真を示す。
【００６６】
【図７】ｒＲＮＡ依存性ゾンデを使用する減成の前と後の目的細胞の％を表すグラフを示す。
【００６７】
【図８】図７と同様の、ただしプラスミド依存性ゾンデのグラフを示す。
【００６８】
【図９】図７と同様の、ただしＤＮＡ依存性ゾンデのグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
2005502328.tif 000012
2005502328.tif 000013
2005502328.tif 000014
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005502328.tif 000047
【国際調査報告】
2005502328.tif 000048
2005502328.tif 000049
2005502328.tif 000050
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