(57)【要約】フィブロネクチンのＦＮＩＩＩ１３ドメインおよびそのより小さい断片は腫瘍細胞増殖阻害効果を有する。ＦＮＩＩＩ１３ドメインおよびその断片を有するフィブロネクチンの断片を含む組成物が提供される。フィブロネクチンに曝され、テネイシンの存在によって増殖するようにされた細胞を含む系は、抗腫瘍剤候補のスクリーニングのインビトロ方法として用いられる。フィブロネクチンリガンドおよびテネイシンを含む無細胞系はまた、抗腫瘍または抗癌剤候補のスクリーニングにも用いられる。被験化合物は、テネイシンに対するフィブロネクチンリガンドの結合を破壊する能力についてアッセイされる。さらなる無細胞系は、さらにシンデカン分子を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品として使用するための配列番号１に示すポリペプチドまたはその部分あるいはバリアントを含む組成物であって、該部分がフィブロネクチンに対するテネイシンの結合を干渉するものである組成物。
【請求項２】
腫瘍形成または癌の治療または予防処置のための請求項１の組成物。
【請求項３】
例えば、リウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患、および／または移植拒絶などの免疫関連疾患の治療または予防処置のための請求項１の組成物。
【請求項４】
血栓症の治療または予防処置のための請求項１の組成物。
【請求項５】
アテローム性動脈硬化症の治療または予防処置のための請求項１の組成物。
【請求項６】
創傷治癒において使用するための請求項１の組成物。
【請求項７】
テネイシンとフィブロネクチンの相互作用に依存するあらゆる疾患または症状の治療または予防処置のための請求項１の組成物。
【請求項８】
該部分を含む請求項１から７のいずれかの組成物であって、該部分が配列番号３に示すアミノ酸配列の最初の５アミノ酸を含み、Ｘａａはいずれかのアミノ酸である、請求項１から７のいずれかの組成物。
【請求項９】
該部分が配列番号３に示すアミノ酸配列またはその断片あるいはバリアントを含み、Ｘａａがいずれかのアミノ酸である、請求項８の組成物。
【請求項１０】
該部分が配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片あるいはバリアントである、請求項８の組成物。
【請求項１１】
該部分が配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片あるいはバリアントである、請求項８の組成物。
【請求項１２】
該部分が他のいかなるフィブロネクチンドメインもモジュールも含まない、請求項１から１１の組成物。
【請求項１３】
さらに医薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む、請求項１から１２のいずれかの組成物。
【請求項１４】
該部分がシンデカンシグナル伝達を修復することができる、請求項１から１３のいずれかの組成物。
【請求項１５】
シンデカンシグナル伝達がシンデカン−４によって媒介される、請求項１４の組成物。
【請求項１６】
該部分がテネイシンに結合する、請求項１から１５のいずれかの組成物。
【請求項１７】
該部分がテネイシンＣに結合する、請求項１から１６のいずれかの組成物。
【請求項１８】
該部分がさらにシンデカン、好ましくはシンデカン４に結合する、請求項１から１７のいずれかの組成物。
【請求項１９】
該部分がテネイシン結合についてネイティブなフィブロネクチンタンパク質の第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピートと競合する、請求項１から１８のいずれかの組成物。
【請求項２０】
該部分が組換えのものである、請求項１から１９のいずれかの組成物。
【請求項２１】
医薬品として使用するための配列番号１に示すポリペプチドまたはその部分あるいはバリアントであって、該部分がフィブロネクチンに対するテネイシンの結合に干渉する配列番号１に示すポリペプチドまたはその部分あるいはバリアント。
【請求項２２】
医薬品として使用するための配列番号１に示すポリペプチドの部分であって、該部分が請求項８から１２に記載の該部分の特徴の１または複数を有するものである配列番号１に示すポリペプチドの部分。
【請求項２３】
腫瘍形成または癌の治療または予防処置のための薬物の製造のための、請求項２１のポリペプチドまたはその部分あるいはバリアントの使用。
【請求項２４】
例えば、リウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患、または移植拒絶などの免疫関連疾患の治療または予防処置のための薬物の製造のための、請求項２１のポリペプチドまたはその部分あるいはバリアントの使用。
【請求項２５】
血栓症の治療または予防処置のための薬物の製造のための、請求項２１のポリペプチドまたはその部分あるいはバリアントの使用。
【請求項２６】
アテローム性動脈硬化症の治療または予防処置のための薬物の製造のための、請求項２１のポリペプチドまたはその部分あるいはバリアントの使用。
【請求項２７】
創傷治癒において使用するための薬物の製造のための、請求項２１のポリペプチドまたはその部分あるいはバリアントの使用。
【請求項２８】
テネイシンとフィブロネクチンの相互作用に依存するあらゆる疾患または症状の治療または予防処置のための薬物の製造のための、請求項２１のポリペプチドまたはその部分あるいはバリアントの使用。
【請求項２９】
腫瘍または腫瘍細胞がテネイシン、好ましくはテネイシンＣを発現する請求項２３の使用。
【請求項３０】
テネイシンの発現が、非腫瘍組織または細胞におけるものより少なくとも２倍多い、請求項２９の使用
【請求項３１】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項２３、２９および３０のいずれかの使用。
【請求項３２】
腫瘍が間葉または上皮癌である、請求項２３、２９および３０のいずれかの使用。
【請求項３３】
腫瘍がグリア芽細胞腫または乳癌である、請求項２３、２９から３１のいずれかの使用。
【請求項３４】
有効量の配列番号１に示すポリペプチドまたはその部分あるいはバリアントを投与することを含む、腫瘍形成または癌の治療または予防処置の方法であって、該部分がフィブロネクチンに対するテネイシンの結合を干渉するものである方法。
【請求項３５】
例えば、リウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患、または移植拒絶などの免疫関連疾患の治療または予防処置のための請求項３４の方法。
【請求項３６】
血栓症の治療または予防処置のための請求項３４の方法。
【請求項３７】
アテローム性動脈硬化症の治療または予防処置のための請求項３４の方法。
【請求項３８】
創傷治癒における使用のための請求項３４の方法。
【請求項３９】
テネイシンとフィブロネクチンの相互作用に依存するあらゆる疾患または症状の治療または予防処置のための請求項３４の方法。
【請求項４０】
該部分が配列番号２、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列を有する請求項３５から３９のいずれかの方法。
【請求項４１】
該癌がテネイシン、好ましくはテネイシンＣを発現する、請求項３４の方法。
【請求項４２】
テネイシンの発現が非腫瘍組織または細胞におけるものの少なくとも２倍多い、請求項４１の方法。
【請求項４３】
癌が固形腫瘍である、請求項４１または４２のいずれかの方法。
【請求項４４】
癌が間葉または上皮癌である、請求項４１から４３のいずれかの方法。
【請求項４５】
癌がグリア芽細胞腫または乳癌である、請求項４１から４４のいずれかの方法。
【請求項４６】
配列番号２または配列番号４に示すポリペプチドに対して特異的に反応する抗体。
【請求項４７】
医薬品として使用するための請求項４６の抗体。
【請求項４８】
以下を含む腫瘍形成または癌の治療または予防処置のための薬剤を同定する方法：
被験化合物と、配列番号１に示すポリペプチドまたはその部分あるいはバリアント（該部分はフィブロネクチンに対するテネイシンの結合を干渉するものである）およびテネイシンまたはその部分にさらした細胞とを接触させること、および、
以下の１または複数を測定すること：
ａ）細胞増殖；
ｂ）ＤＮＡ合成；
ｃ）細胞接着；
ｄ）細胞拡張；
ｅ）フィブロネクチン上での限局的接着およびアクチン張力繊維形成；
ｆ）細胞周期のＳ期に入っている細胞の比率；
ｇ）細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する結合、好ましくはここで、ＥＣＭはフィブロネクチンであるかフィブロネクチンを含む；または、
ｈ）シンデカンシグナル伝達経路からのその他のなんらかの結果。
【請求項４９】
細胞がシンデカン、好ましくはシンデカン−４を発現する、請求項４８の方法。
【請求項５０】
被験化合物の不在下で培養した細胞のコントロールにおける（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および／または（ｈ）を測定することをさらに含む、請求項４８または４９のいずれかの方法。
【請求項５１】
細胞が固体基体上で培養される、請求項４８または４９のいずれかの方法。
【請求項５２】
以下を含む、テネイシンとフィブロネクチンの相互作用に依存する疾患または症状に対して有効な薬剤を同定する方法：
被験化合物と以下を含む系を接触させること：
ｉ）配列番号１に示すポリペプチドまたはその部分あるいはバリアント、ここで該部分はフィブロネクチンに対するテネイシンの結合を干渉するものである、
ｉｉ）（ｉ）に結合することができるテネイシンまたはその部分、および／または、
ｉｉｉ）（ｉ）に結合することができるシンデカン分子；および、
次いで（ｉ）と（ｉｉ）の結合および／または（ｉ）と（ｉｉｉ）の結合を測定すること。
【請求項５３】
（ｉ）と（ｉｉ）の結合の減少を、抗増殖または抗腫瘍薬剤と相関させることを含む、請求項５２の薬剤を同定する方法。
【請求項５４】
（ｉ）と（ｉｉｉ）の結合の増加を、抗増殖または抗腫瘍薬剤と相関させることをさらに含む、請求項５２の薬剤を同定する方法。
【請求項５５】
系が、被験化合物の不在下で（ｉ）と（ｉｉ）の結合および／または（ｉ）と（ｉｉｉ）の結合を測定することをさらに含む、請求項５２から５４のいずれかの方法。
【請求項５６】
該系が該部分を含み、該部分が配列番号２、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、請求項５２から５５のいずれかの方法。
【請求項５７】
テネイシンがインタクトなテネイシン、好ましくはテネイシンＣである、請求項５２から５６のいずれかの方法。
【請求項５８】
シンデカン分子がシンデカンのエクトドメイン、好ましくはシンデカン４のエクトドメインである、請求項５４から５７のいずれかの方法。
【請求項５９】
該ポリペプチド、その部分またはバリアントが固相に接着している、請求項５４から５８のいずれかの方法。
【請求項６０】
該ポリペプチド、その部分またはバリアントに結合したテネイシンがテネイシンに対して反応性の抗体を用いて測定される、請求項５４から５９のいずれかの方法。
【請求項６１】
テネイシンが固相に接着している、請求項５４から５８のいずれかの方法。
【請求項６２】
シンデカンが固相に接着している、請求項５４から５８のいずれかの方法。
【請求項６３】
フィブロネクチン、テネイシン、シンデカン、またはそれらのバリアントあるいは断片のコンポーネントの１または複数が標識されている、請求項５４から６２のいずれかの方法。
【請求項６４】
該標識が、放射性標識、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素、ビオチン／アビジン、ジオキシゲニン、またはハプテンを含む、請求項６３の方法。
【請求項６５】
請求項４８から６４のいずれかの方法によって同定された薬剤。
【請求項６６】
以下を含む、癌を診断または予知する方法：
ａ）個体からサンプルを得ること；
ｂ）利用可能なＦＮＩＩＩ１３またはその部分あるいはバリアントの存在について該サンプルを分析すること；および、
ｃ）利用可能なＦＮＩＩＩ１３またはその部分あるいはバリアントの存在を、好ましい予知または診断と相関させること。
【請求項６７】
該利用可能なＦＮＩＩＩ１３またはその部分あるいはバリアントが、ＦＮＩＩＩ１３またはその部分あるいはバリアントに対して特異的な抗体を用いて検出され、所望によりコントロール反応において、ＦＮＩＩＩ１３以外のフィブロネクチンの部分に特異的なコントロール抗体を用いる、請求項６６の癌を診断または予知する方法。
【請求項６８】
該サンプルが培養中で増殖された細胞を含む、請求項６６または６７のいずれかの癌を診断または予知する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗腫瘍および／または抗発癌性活性を有する活性薬剤、かかる薬剤の医薬組成物およびかかる薬剤および組成物の医薬用途に関する。本発明はまた、抗腫瘍および／または抗発癌性活性について薬剤をスクリーニングするインビトロでの方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
テネイシン−Ｃは様々な細胞型のための接着調節細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子である（Vollmer、G. (1997) Crit Rev Oncol Hematol 25: 187-210において概説されている）。テネイシン−Ｃはほとんどの固形腫瘍の間質において顕著に発現しており（Chiquet-Ehrismann、R. et al (1986) Cell 47: 131-139）新規に形成された血管の周囲において観察される（Schnyder、B. et al (1997) Int J Cancer 72: 217-224）。テネイシン−Ｃ発現は、ストロメライシン／ＭＭＰ３トランスジェニックマウスにおいて乳腺新形成が現れる前に起こり、これによってテネイシン−Ｃが腫瘍形成の初期段階に関与している可能性があることが示唆される（Thomasset、N. et al (1998) Am J Pathol 153: 457-467）。興味深い発現パターンにもかかわらず、腫瘍形成および腫瘍進行におけるテネイシン−Ｃの役割は未知である。
【０００３】
ＥＣＭは組織恒常性において重要な調節機能を有しており、そして癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子とともに腫瘍形成に不可欠に関与している（Boudreau、N. & Bissell、M. J. (1998) Curr Opin Cell Biol 10: 640-646 および Ruoslahti、E. (1999) Adv Cancer Res 76: 1-20において概説されている）。強制的な腫瘍細胞とフィブロネクチンとの相互作用により、細胞培養において増殖を阻害することができ、またヌードマウスにおいて腫瘍増殖を抑えることができる（Akamatsu H. et al (1996) Cancer Res 56: 4541-4546 および Giancotti、F. G & Ruoslahti、E. (1990) Cell 60: 849-859）。テネイシン−Ｃは、細胞とフィブロネクチンとの相互作用を破壊することが示され、それによって腫瘍細胞増殖が促進され得る。Chiquet-Ehrismann、R. et al (1988) Cell 53: 383-390は、テネイシン−Ｃがフィブロネクチンに結合し、フィブロネクチンに対する細胞の接着を阻害し、ラット乳腺癌細胞の増殖を増加させることを初めて示した（Chiquet-Ehrismann、R. et al (1986) Cell 47: 131-139）。テネイシン−Ｃは、ＲＧＤ−依存的にフィブロネクチンに結合し、これはテネイシン−ＣがフィブロネクチンにおけるＲＧＤ細胞結合部位をブロックしないことを示す（Chiquet-Ehrismann、R. et al (1988) Cell 53: 383-390）。テネイシン−Ｃがどのようにフィブロネクチンに対する細胞の接着を阻害しているのかという機構は未知である。
【０００４】
細胞接着において、ＥＣＭからのシグナルは特異的細胞表面受容体を介して細胞骨格に共役する（Hynes、R. O. (1999) Trends Cell Biol 9: M33-37による概説を参照されたい）。特に、インテグリンとプロテオグリカンが関与するフィブロネクチンへの細胞接着は、接着複合体のアセンブリーとアクチン細胞骨格の再編成を組織化し、それによって細胞の挙動（例えば、生存および増殖）を決定する細胞質内シグナル伝達がトリガーされる（Giancotti、F. G. & Ruoslahti、E. (1990) Cell 60: 849-859による概説を参照されたい）。
【０００５】
線維芽細胞はフィブロネクチンの細胞結合部位（ＲＧＤおよび相乗作用(synergy)部位）に接着することができるが、限局的接触(focal contact)とアクチン張力繊維形成を含む完全な拡張(spreading)にはさらにシンデカン（syndecan）−４の活性化が要求される（Woods、A. & Couchman、J. R. (1994) Mol Biol Cell 5: 183-192）。シンデカン−４はフィブロネクチンにおけるＨｅｐＩＩ部位との相互作用によって完全な細胞拡張に必要とされると考えられている（Tumova、S. et al (2000) J Biol Chem 275: 9410-9417 および Saoncella、S. et al (1999) P.N.A.S. 95: 2805-2810）。シンデカン−４の細胞結合はフィブロネクチンにおけるヘパリン−結合部位ＩＩ（ＨｅｐＩＩ部位）によって媒介されており（Woods、A. et al (2000) Arch Biochem Biophys 374: 66-72）、クラスター形成の際に、シンデカン−４は、インテグリンを含む細胞質内シグナル伝達を開始させることが示された（Rapraeger、A. C. (2000) J Cell Biol 149: 995-998による概説を参照されたい）。
【０００６】
Zvibel、I. et al (2001) Int J Cancer 91: 316-321により、増殖促進性のｅｒｂ−Ｂ２とｅｒｂ−Ｂ３の発現が、可溶性シンデカン−４の大腸癌細胞に対する添加によって増加することが示された。
【０００７】
いくつかのインテグリンがテネイシン−Ｃに対する細胞表面受容体として特徴づけされている（Sriramarao、P. et al (1993) J Cell Sci 105: 1001-1012; Yokosaki、Y. et al (1994) J Biol Chem 269: 26691-26696; Schnapp、L. M. et al (1995) J Biol Chem 270: 23196-23202; および Yokoyama、K. et al (2000) J Biol Chem 275: 16891-16898）。テネイシン−Ｃはまた、シンデカン（Salmivirta、M. et al (1991) J Biol Chem 266: 7733-7739）およびその他の硫酸化グリコサミノグリカンに結合することも示された（Chiquet、M. & Fambrough、D. M. (1984) J Cell Biol 98: 1937-1946; Vaughan、L. et al (1987) EMBO J 6: 349-353; Barnea、G. et al (1994) J Biol Chem 269: 14349-14352; Grumet、M. et al (1994) J Biol Chem 269: 12142-12146; Milev、P. et al (1994) J Cell Biol 127: 1703-1715; Vaughan、L. et al (1994) Perspect Dev Neurobiol 2: 43-52; および Chung、C. Y. & Erikson、H. P. (1987) J Cell Sci 110: 1413-1419）。これらの受容体のいずれかに対するテネイシン−Ｃの結合が、腫瘍細胞増殖に影響を及ぼすフィブロネクチンにおけるテネイシン−Ｃ−誘導性接着の調節において役割を果たしているか否かは未知である。
【０００８】
インテグリン機能を競合機構によってブロックすることは、細胞接着の調節における最近のトピックである。例として、ビトロネクチンにおけるαｖβ３インテグリン結合部位をマスキングする高分子キニノーゲン（Asakura、S. et al (1998) J Biochem (Tokyo) 124: 473-484）およびそのＳＨ３様ドメインを介するフィブロネクチンにおける第１４フィブロネクチンタイプＩＩＩリピートへのα４β１インテグリン結合と競合するようであるメラノーマ阻害活性（ＭＩＡ）（Stoll、R. et al (2001) EMBO J 20: 340-349）が挙げられる。
【０００９】
フィブロネクチンは、結合組織、細胞表面、および血漿その他の体液においてみられる大きなマルチドメイン糖タンパク質である。フィブロネクチンは、細胞骨格および細胞外マトリックスの成分、血液凝固、線維素溶解、急性期および補体系の循環系成分を含む多様な巨大分子、そして線維芽細胞、神経細胞、貪食細胞および細菌を含む多様な細胞上の細胞表面受容体と相互作用する。フィブロネクチンはまたそれら同士で相互作用し、その構造があまりよくわかっていない原線維体（fibrillar entities）を形成する。
【００１０】
ＦＮのアミノ酸配列により、通常は短い連結配列によって分かたれている３つのタイプの内部相同的リピートまたはモジュールが明らかになった。１２のタイプＩ、２つのタイプＩＩおよび１５のタイプＩＩＩモジュールが存在し、ＦＮＩ、ＦＮＩＩおよびＦＮＩＩＩとも称される。各モジュールは独立にフォールディングされた単位を構成し、ドメインと呼ばれることも多いが、１より多いモジュールを含むことが多い「機能的ドメイン」と混同すべきではない。フィブロネクチンにおけるものと相同的なモジュールはその他のタンパク質においてもみられ、特にタイプＩＩＩにおけるものについてみられるが、これは全てのモジュールのなかの最も普遍的なものの一つであり、動物タンパク質の約２％においてみられる。フィブロネクチンモジュールのアミノ酸配列は高度に保存されている。３つのすべてのフィブロネクチンモジュールは、いくつかの保存されたコア残基を含む。
【００１１】
フィブロネクチンｍＲＮＡには選択的スプライシング部位が４つある。これらのなかで、最初の２つの結果としてモジュールＩＩＩ−１１およびＩＩＩ−７の後にそれぞれさらなる(extra)タイプＩＩＩドメイン（ＥＤＡおよびＥＤＢ）が挿入される。これらのモジュールは実質的に成人組織には存在しないが、胚発生の間に異なる様式で発現し、また血管新生の際に悪性または損傷組織において発現する。さらなるＥＤＡモジュールによってフィブロネクチンは細胞の拡張および遊走のためのよりよい基体になり、特定のタイプの癌のマーカーとしても使用されている。これらのドメインのいずれについても特異的リガンドは同定されていない。
【００１２】
フィブロネクチンに対する細胞接着は腫瘍形成と血管新生において重要な役割を果たしており、腫瘍形成と腫瘍細胞のフィブロネクチンへの接着は逆相関の関係にある（Akiyama、S. K. et al (1995) Cancer Metastasis Rev、14: 173-189; および Ruoslahti、E. (1997) Kidney Int. 51: 1413-1417）。特に、α５β１インテグリンをブロックすることによりＤＮＡ複製が促進され（Gong、J. et al (1998) J Biol Chem 273: 1662-1669）、インテグリンα５β１の過剰発現によりヌードマウスにおけるＣＨＯ細胞の増殖と腫瘍形成が低下する（Giancotti、F. G. & Ruoslahti、E. (1990) Cell 60: 849-859; Gong、J. et al (1997) Cell Growth Differ 8: 83-90）。１つの動物モデルを分析しただけではテネイシン−Ｃの腫瘍形成−促進効果は裏付けられないが（Talts、J. F. et al (1999) J Cell Sci 112: 1855-1864）、免疫組織化学研究（Tan、M. I. et al (1999) Cancer Lett 140: 145-152; and Jahkola、T. et al (1998) Eur J Cancer 34: 1687-1692）および細胞培養実験（Chiquet-Ehrismann、R. et al (1986) Cell 47: 131-139）により、特にインサイチュでの癌細胞の増殖を促進することによる、腫瘍形成におけるテネイシン−Ｃの役割が示唆された。
【００１３】
米国特許第５６４１４８３号(Beaulieu）には、皮膚創傷の治癒のためのヒト血漿フィブロネクチンを含有する局所用ゲルおよびクリーム製剤が開示されている。該製剤は創傷部位へのフィブロネクチンの徐放および接触時間の増加を提供し、これによって皮膚における創傷治癒に有効な量のフィブロネクチンの有効な吸収が可能となる。
【００１４】
米国特許第５９５８８７４号（Clark et al）は組換えフィブロネクチンタンパク質および骨格マトリックスを含む創傷治癒のための細胞外マトリックスを提供する。組換えフィブロネクチンタンパク質は、少なくとも３つのフィブロネクチンドメインからのペプチドを含む；該３つのフィブロネクチンドメインは、細胞結合ドメイン、ＩＩＩＣＳドメイン、およびヘパリンＩＩ結合ドメインである。
【００１５】
米国特許第５７５０３７８号（Goodheart et al）は、細胞培養において細胞フィブロネクチンを産生し、次いでフィブロネクチンを回収する方法を教示する。示唆される細胞フィブロネクチンの用途の１つはヒトにおける癌切除の処置または獣医薬である。
【００１６】
米国特許第６０６０３１７号（Malech）は、哺乳類細胞に形質導入する方法およびそれに関する産物を教示し、これには、細胞を多官能性化学物質の存在下でウイルスベクターと接触させることが含まれる。多官能性化学物質は、少なくとも１つの細胞表面結合ドメイン、例えば、少なくとも１つのウイルス結合ドメイン、例えば、フィブロネクチンのヘパリンＩＩ結合ドメインに連結したフィブロネクチンまたはテネイシンを有する。この方法の示唆される用途の一つは、新形成などの遺伝的欠陥の治療である。
【００１７】
米国特許第６１８０６１０号（Chen et al）は、マトリックス、骨誘導性因子（例えば石灰化した骨）および細胞外マトリックスタンパク質を含む造骨性組成物に関する。１つの態様において細胞外マトリックスタンパク質はフィブロネクチンである。
【００１８】
米国特許第６０２５１５０号（Livant）はアミノ酸配列ＰＨＳＲＮを含むフィブロネクチン−由来ペプチドを含む創傷治癒組成物を開示する。
【００１９】
米国特許第６１９４３７８号（Clark et al）は創傷治癒のためのフィブロネクチンペプチド・ベースの細胞外マトリックスを開示し、これは骨格マトリックスにおける２以上のフィブロネクチンドメインからのペプチドを含み、例えば細胞結合ドメインおよびヘパリンＩＩ結合ドメインを含む。
【００２０】
国際特許出願第ＷＯ９４１３６９２Ａ１号（Regents of the University of Minnesota et al）は、急性または慢性の炎症性または自己免疫障害の治療方法を教示し、該方法は、フィブロネクチンのヘパリン−結合領域内のアミノ酸配列またはＲＧＤ−含有アミノ酸配列に対応する少なくとも３アミノ酸を有するポリペプチドを投与する工程を含む。
【００２１】
国際特許出願第ＷＯ００５５１８１Ａ１号（The General Hospital Corp.）は、細胞接着および遊走の調節方法に関し、これにはシンデカン−４エクトドメイン(ectodomain)とカウンターリガンド、例えばＥＣＭのヘパリン−結合ドメインの相互作用（結合）を調節する薬剤を投与する工程が含まれる。かかる薬剤の例としては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲンのシンデカン結合または細胞結合ドメイン、またはＥＣＭ分子などのシンデカン−４結合部分またはシンデカン−４のエクトドメインに結合するその他のペプチドが挙げられる。
【００２２】
国際特許出願ＷＯ０１７２７７６Ａ２号（Wisconsin Alumni Research Foundation）は、細胞接触を低下させる方法に関し、ヒトまたは非ヒト眼の小柱網におけるマトリックス組織化が開示され、これにはフィブロネクチンのＨｅｐＩＩドメインにおいてみられる配列を有する好適なペプチドを投与する工程が含まれ、ここで該ペプチドは細胞接触およびマトリックス形成を破壊する能力を有する。特に、ＦＮＩＩＩ１４のペンタペプチド（ＰＲＡＲＩ）が開示され、これはシンデカンに結合する。ＦＮＩＩＩ１４はＨｅｐＩＩドメインの最も活性な領域であると開示されている。
【００２３】
欧州特許第０３９９８０６号（Takara Shuzo Co Ltd）には、ヒトフィブロネクチンのヘパリン−結合ドメインと直接またはリンカーアミノ酸またはペプチドによって結合したヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインを有する機能性ポリペプチドが開示されており、これはいまだに詳細には同定されていないが、それぞれ約９０アミノ酸からなる３つのタイプＩＩＩ反復配列からなると考えられている。その調製方法及びそのような機能性ポリペプチドの血管新生の阻害のための使用も開示されている。
【００２４】
欧州特許第０８３７０７４Ａ２号（Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc）は、３０アミノ酸以下のフィブロネクチンペプチドであって、アミノ酸配列ＹＴＩＹＶＩＡＬを含み、細胞接着阻害活性を有するものを開示している。かかるペプチドはフィブロネクチンのＦＮＩＩＩ−１４ドメインのなかにあり、様々な疾患又は症状の治療における使用が示唆されている。かかる疾患又は症状としてはとりわけ、癌、リウマチ、喘息、アレルギー疾患、血栓症、移植拒絶、創傷治癒、炎症、腸炎、腎石灰化症（例えば潰瘍性大腸炎）を含む免疫性炎症、および自己免疫疾患が挙げられる。
【００２５】
（発明の開示）
本発明者らは細胞接着および腫瘍細胞の増殖を研究した結果、テネイシン−ＣがＨｅｐＩＩ部位の第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）（配列番号１）に対する特異的結合によってフィブロネクチン上での細胞接着および拡張をブロックし、それによってフィブロネクチンに対するシンデカン−４の結合を干渉することを見出した。これは組換えＦＮＩＩＩ１３によって中和され得る腫瘍細胞の増殖の増強と相関していることが見出された。本発明者らはまた、テネイシン−ＣがフィブロネクチンにおけるＨｅｐＩＩ部位に対するシンデカン−４の結合と競合し、それによってシンデカン−４機能をブロックまたは変化させることを見出した。これによってフィブロネクチン接着シグナル伝達が妨げられる（損なわれた細胞の接着および拡張、フィブロネクチン特異的細胞接着構造の欠除、アクチン張力繊維の欠除およびフィブロネクチン上の腫瘍細胞の増殖の増加として観察される）。ＦＮＩＩＩ１３またはＦＮＩＩＩ１３のより小さいペプチドの添加と同様にシンデカン−４の過剰発現もテネイシン−Ｃにより損なわれた細胞の拡張を修復することが見出された。本発明者らはフィブロネクチンにおけるＦＮＩＩＩ１３がシンデカン−４に対するリガンドとして働くと結論付けた。
【００２６】
要約すると、本発明者らは、テネイシン−Ｃがフィブロネクチン特異的接着シグナル伝達をブロックすることを見出した。これはフィブロネクチンにおけるＦＮＩＩＩ１３との直接的相互作用によってフィブロネクチンにおけるシンデカン−４結合部位をマスクすることによる。その結果、シンデカン−４機能の干渉が、テネイシン−Ｃによる腫瘍細胞の増殖の増加を引き起こした。本発明者らはそれゆえ、インテグリンシグナル伝達におけるシンデカン−４の共−受容体機能をブロックすることによってフィブロネクチンの接着機能をテネイシン−Ｃが損ない、それによって腫瘍細胞増殖がトリガーされることを見出した。
【００２７】
したがって、本発明は腫瘍形成の予防または予防処置、あるいは腫瘍またはリウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患の一又は複数の治療又は予防処置、あるいは移植拒絶の予防、あるいはテネイシン／フィブロネクチン相互作用が関与する血栓症およびアテローム性動脈硬化症を含むあらゆる疾患または症状の治療又は予防処置のための、ヘパリン−結合部位ＩＩ（ＨｅｐＩＩ部位）を有するフィブロネクチンの断片を含む組成物を提供する。
【００２８】
本発明はまた、腫瘍形成の予防または予防処置、あるいは腫瘍または癌または１または複数のリウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患の治療または予防処置、あるいは移植拒絶、血栓症、アテローム性動脈硬化症の予防、またはテネイシンとフィブロネクチンの相互作用に依存する疾患または症状の治療または予防処置のための組成物であって、フィブロネクチンの第１３タイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）（配列番号１）の全部又は部分を有するフィブロネクチンの断片を含む組成物を提供し、ここで該部分はフィブロネクチンに対するテネイシンの結合に干渉するものである。好適な態様において、本発明はＦＮＩＩＩ１３フィブロネクチン断片の部分を含む組成物を提供し、ここで該部分は配列番号３に示すアミノ酸配列の最初の５アミノ酸を含み、この配列中、Ｘａａはいずれのアミノ酸であってもよい。好ましくは、Ｘａａは疎水性アミノ酸である。より好適な態様において、本発明はＦＮＩＩＩ１３フィブロネクチン断片の部分を含む組成物を提供し、ここで該部分は配列番号３に示すアミノ酸配列を含む。好ましくは、配列番号３のアミノ酸番号３、５、８、１３、１５、および１７のＸａａは疎水性アミノ酸であり、配列番号３のアミノ酸番号７および１０のＸａａは荷電アミノ酸であり、配列番号３のアミノ酸番号、６、９、１１、１２、１４、１６、および１９のＸａａは中性アミノ酸である（もっとも好ましくはヒドロキシル基を有する）。もっとも好適な態様において、本発明はＦＮＩＩＩ１３フィブロネクチン断片の部分を含む組成物を提供し、ここで該部分は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドかまたはそのバリアントである。好ましくは、本発明は配列番号４に示すアミノ酸配列の最初の１０アミノ酸を含む断片を提供する。別の態様において本発明は、ＦＮＩＩＩ１３フィブロネクチン断片の部分を含む組成物を提供し、ここで該部分は配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片あるいはバリアントである。好ましくは、本発明は上記のＦＮＩＩＩ１３フィブロネクチン断片の部分を含む組成物を提供し、ここで該部分はその他のいかなるフィブロネクチンドメインもモジュールも含まない。上記のすべての部分は、フィブロネクチンに対するテネイシンの結合に干渉することができ、そしてテネイシンによって強いられた細胞の拡張の欠陥を修復することができる部分である。
【００２９】
本発明の組成物は、創傷治癒における治療にも有用である。特に、本発明はその他のフィブロネクチンモジュールまたはドメインを含まない第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）の全部または部分を有するフィブロネクチンの断片を含む創傷治癒のための組成物を提供する。別の態様において、本発明はフィブロネクチン断片の部分を含む創傷治癒のための組成物を提供し、ここで該部分は配列番号３に示すアミノ酸配列の最初の５つのアミノ酸を含み、配列におけるＸａａはいずれのアミノ酸であってもよく、その他のフィブロネクチンモジュールもドメインも含まない。さらに別の態様において、本発明はフィブロネクチン断片の部分を含む創傷治癒のための組成物を提供し、ここで該部分は配列番号３に示すアミノ酸配列を有するかまたはその断片あるいはバリアントであり、配列中Ｘａａはいずれのアミノ酸でもよく、いかなるその他のフィブロネクチンモジュールもドメインも含まない。さらに別の態様において、本発明はフィブロネクチン断片の部分を含む創傷治癒のための組成物を提供し、ここで該部分は配列番号４または配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドであるかその断片あるいはバリアントであっていかなるその他のフィブロネクチンモジュールもドメインも含まない。
【００３０】
本発明の組成物のフィブロネクチン断片は同じあっても異なっていてもよく、すなわち組成物は１または複数種類の断片を含むものであってよい。フィブロネクチンのＨｅｐＩＩ部位はＦＮＩＩＩ１２、ＦＮＩＩＩ１３およびＦＮＩＩＩ１４を含むが、好ましい断片は第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）の全部または部分のみを含む。したがって、フィブロネクチン断片は、ネイティブな全長フィブロネクチンよりもアミノ酸数が少ないフィブロネクチンのあらゆるポリペプチド（即ちタンパク質）種を含む。言い替えると、フィブロネクチン断片は５からｎ−１アミノ酸残基の範囲であり、ここでｎは全長の、ネイティブなフィブロネクチンである。好適な態様において、フィブロネクチン断片はＦＮＩＩＩ１３（配列番号１）、またはその部分あるいはバリアントであり、好ましくはその他のいかなるフィブロネクチンドメインも含まない。
【００３１】
「断片」および５アミノ酸残基程度の小さい断片の「部分」は本発明の範囲に含まれる。好適な態様において、本発明の組成物のフィブロネクチン断片は、Sharma et al EMBO J 18: 1468-1479において用いられる番号付けによるアミノ酸配列Ａｒｇ９８からＡｒｇ１４６を含む。このアミノ酸９８から１４６を含む断片はテネイシン−Ｃによって損なわれたフィブロネクチン接着シグナル伝達を修復することができる。該ペプチドを配列番号２に示す。
【００３２】
特に好ましい断片は配列番号４の断片であるが、より大きいまたはより小さい断片を用いてもよい。断片および断片の部分は、５から１００アミノ酸残基の範囲、好ましくは８９、より好ましくは４９、さらに好ましくは少なくとも５または６、特に好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基を有する。ペプチドのその他の性質（例えば溶解性）は用いられるペプチドの実際の長さによって左右される。１つの態様において、本発明はＦＮＩＩＩ１３断片（配列番号１）の配列の８９アミノ酸の全部または部分を有するフィブロネクチンの断片を提供する。別の態様において、本発明は、配列番号２に示す配列の４９アミノ酸の全部または部分を有するフィブロネクチンの断片、あるいは配列番号３または配列番号４に示す配列の２０アミノ酸の全部または部分を有するフィブロネクチンの断片を提供する。あるいは別の態様において、本発明は配列番号３または配列番号４の最初の５アミノ酸を有する断片の部分を提供する。別の態様において、本発明は配列番号３または配列番号４の最初の６アミノ酸を有する断片の部分を提供する。好ましくは、本発明は配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列の最初の１０アミノ酸を有する断片の部分を提供する。配列番号３におけるＸａａはいずれのアミノ酸でもよいが、好ましくは前記のアミノ酸である。
【００３３】
本発明の組成物はＨｅｐＩＩ部位またはＦＮＩＩＩ１３ドメイン自体またはそれを含むものあるいはその部分に加えてその他の個々のフィブロネクチン断片を含んでいてもよい。これらのその他の断片は例えば、ＦＮＩＩＩ１からＦＮＩＩＩ１２、ＦＮＩＩＩ１４およびＦＮＩＩＩ１５、ＣＳまたはＨｅｐＩ部位あるいはその断片から選択すればよい。その他の好ましい断片にはＦＮＩＩＩ４、ＦＮＩＩＩ５およびＦＮＩＩＩ６も含まれ、これはこれらドメインの２以上を含む近接する断片あるいはその断片も含む。好適な態様において、本発明の組成物のフィブロネクチン断片はその他のフィブロネクチン配列またはドメインを含まない。かかる状況において、本発明の組成物はフィブロネクチン以外のタンパク質由来のその他のタンパク質、ペプチドまたは断片を含んでいてもよい。
【００３４】
本発明はそれゆえ１または複数の上記のフィブロネクチンの活性断片を含むヒト用の医薬組成物または動物用の獣医用組成物を提供する。該組成物はその他の活性または非活性薬剤を含んでいてもよい。非活性薬剤には、医薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体、そして食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水が含まれるがこれらに限定されない。
【００３５】
フィブロネクチン断片は好ましくはテネイシンによって強いられる細胞の拡張の欠陥を修復することができるものであり、例えばシンデカンシグナル伝達を修復することができるものが挙げられるが、その他にも標的候補はある。シンデカンシグナル伝達は、細胞をインビトロで培養した場合に拡張するように現れる。丸い形態ではなく、光学顕微鏡下で細胞は平坦で、伸びたようにみえる。修復される拡張の質は、観察によって決定でき、あるいは形態計測分析によって測定できる（基体に接着した細胞の表面積を測定する）。その他のシンデカンシグナル伝達の徴候には、インビトロでのフィブロネクチンへの細胞の修復された接着、特定の細胞接着構造およびアクチン張力繊維の存在が含まれる。
【００３６】
シンデカンシグナル伝達を測定する様々なアプローチおよび実践方法を以下に記載する。
【００３７】
シンデカン分子は数多く存在し、シンデカン１、シンデカン２、シンデカン３およびシンデカン４が含まれる。本発明の好ましい組成物はシンデカン４−媒介シグナル伝達を修復する。
【００３８】
好適な態様において、フィブロネクチン断片はテネイシンに結合する；好ましくはテネイシンはフィブロネクチン断片のＨｅｐＩＩ部位に結合し、より好ましくはテネイシンはフィブロネクチン断片のＦＮＩＩＩ１３部位またはその部分に結合し、あるいはより好ましくはテネイシンは、ＦＮＩＩＩ１３部位のペプチド（６−２５）（配列番号４）または上記のフィブロネクチン断片の任意の部分に結合し、好ましくは配列番号４に示すアミノ酸配列の最初の１０アミノ酸を有する断片の部分に結合する。特に好ましい態様においてテネイシンはテネイシンＣであるが、別の態様においてはテネイシンはテネイシンＸまたはテネイシンＹ、ＲあるいはＷであってもよい。
【００３９】
特に好適な態様において、ヘパリンは、フィブロネクチン断片のＨｅｐＩＩ部位に対する結合について、あるいはフィブロネクチン断片のＦＮＩＩＩ１３部位またはその部分に対する結合について、シンデカンと競合する。より好適な態様において、本発明のフィブロネクチン断片の部分は、テネイシンの結合について、ネイティブなフィブロネクチンタンパク質のＦＮＩＩＩ１３部位またはその部分と競合する。
【００４０】
特に好適な態様において、テネイシンは本発明のＦＮＩＩＩ１３またはＦＮＩＩＩ１３断片の１または複数のヘパリン−結合部位に結合する。
【００４１】
本発明はまた、１または複数のフィブロネクチン断片が組換え手段によって産生される組成物を提供する。それにより、該１または複数の断片が操作されてＨｅｐＩＩ部位またはＦＮＩＩＩ１３部位またはその部分が存在するが、フィブロネクチン断片の残りの隣接配列がその他の観点において有用であると当業者が考えるアミノ酸配列を含むようにすることができる。その他の観点には例えば安定性、溶解性、またはいくつかのさらなる生物機能の担持、例えば、インテグリン結合部位を介する細胞結合活性が含まれる。当業者に周知の組換え手段によって作成されたかかるバリアント断片は、第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）を有するフィブロネクチン断片、あるいは上記の本発明の部分またはバリアント、および１または複数のその他のフィブロネクチンドメインまたはその部分、あるいはフィブロネクチン以外のタンパク質由来のタンパク質、ペプチドまたは断片を含む。
【００４２】
フィブロネクチンの完全なヌクレオチド配列は米国特許第５６７９２３０号において提供されている。アミノ酸配列は、Kornblihtt et al EMBO J 4: 1755-1759において提供されている。
【００４３】
本発明には、組換え手段によって産生したか、合成手段によって作成したかあるいは天然源から単離したかを問わず、フィブロネクチン断片のバリアントおよび誘導体が含まれる。例えば、修飾アミノ酸／ペプチド結合を有するペプチド、および非天然アミノ酸を含むペプチドおよび／または環状ペプチドであって、よりよい特性、例えば安定性または活性を有するものも含まれる。さらに、本発明のペプチドはその他のタンパク質との融合形態であってもよい。例えば、標的化送達またはＨｅｐＩＩ部位またはＦＮＩＩＩ１３断片またはその部分あるいはバリアントの検出のためのタグと融合させてもよい。
【００４４】
アミノ酸配列に関して「バリアント」とは、通常は関連する別のアミノ酸配列と１または複数のアミノ酸が異なっているアミノ酸配列のことをいう。バリアントは「保存的」変化を有していてもよく、ここで置換されるアミノ酸は、類似の構造又は化学特性を有する（例えば、ロイシンとイソロイシンの置換）。頻度は少ないが、バリアントは「非保存的」変化、例えばグリシンとトリプトファンの置換を有していてもよい。類似のわずかな変動にはアミノ酸欠失または挿入（即ち付加）またはその両方が含まれる。活性を失うことなく、どのそしてどれだけのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失されてよいかの決定のガイダンスは当該技術分野で周知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。
【００４５】
それゆえ本発明は医薬として使用するためのヘパリンＩＩ結合部位（ＨｅｐＩＩ部位）を有する上記のフィブロネクチンの断片を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）を有する上記のフィブロネクチンの断片またはその部分あるいはバリアントを提供し、ここで該部分はフィブロネクチンに対するテネイシンの結合を干渉する。本発明はまた、医薬として使用するためのフィブロネクチンの断片の部分も提供し、ここで該部分は上記の１または複数の特徴を有する。
【００４６】
本発明はさらに腫瘍形成の予防または予防処置あるいは腫瘍あるいは癌の治療または予防処置のための薬物の製造のための、上記のフィブロネクチンの断片であって、ヘパリン−結合部位ＩＩ（ＨｅｐＩＩ部位）を有するか、第１３タイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）の全部または部分を有するか、または配列番号２から４の配列の１または複数において示されるアミノ酸配列を有するペプチドの全部または部分を有するものか、または上記のその断片またはバリアントの使用を提供する。本発明はまた、リウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植拒絶を含むがそれらに限定されない免疫関連疾患の１または複数の治療または予防処置のための薬物の製造のための本発明のフィブロネクチン断片の使用も含む。本発明はさらに血栓症、アテローム性動脈硬化症、創傷治癒およびその他のフィブロネクチンとテネイシンの相互作用に依存する疾患または症状の１または複数の治療または予防処置のための薬物の製造のための本発明のフィブロネクチン断片の使用も含む。
【００４７】
本発明の組成物および薬物はそれゆえ腫瘍の形成を妨げるために予防的に使用することができ、あるいはそれらは既存の腫瘍症状を治療又は阻止する(contain)ために治療的にまたは部分的に治療的に使用することもできる。腫瘍と同様に、癌または悪性の症状も本発明の組成物または薬物によって予防又は治療することができる。
【００４８】
腫瘍または腫瘍細胞は好ましくは間質においてテネイシンを、より好ましくはテネイシンＣを発現するものである。テネイシンの発現は好ましくは非腫瘍組織又は細胞の少なくとも２倍多い。特に好ましい態様において腫瘍は、固形腫瘍、例えば間葉腫瘍、例えばグリア芽細胞腫または上皮癌、例えばグリア芽細胞腫または乳癌である。
【００４９】
本発明はまた、腫瘍形成の予防または予防処置あるいは腫瘍または癌あるいは１または複数のリウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患の治療または予防処置、移植拒絶、血栓症、アテローム性動脈硬化症の予防または個体におけるフィブロネクチンとテネイシンの相互作用に依存する疾患または症状の治療または予防処置の方法であって、第１３タイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）の全部または部分を有するか、配列番号２から４に示す配列の１または複数に示すアミノ酸配列を有するペプチドの全部または部分を有する本発明のフィブロネクチン断片または部分あるいはバリアントを有効量投与することを含む方法を提供する。
【００５０】
本発明はさらに、有効量の本発明のフィブロネクチン断片を投与することを含む創傷治癒方法を提供する。
【００５１】
有効用量の決定は当業者の能力の範囲内である。いずれの化合物についても、治療的に有効な用量はまず細胞培養アッセイまたは適当な動物モデルにおいて見積もられる。動物モデルは所望の濃度範囲及び投与経路を達成するためにも用いられる。かかる情報を用いてヒトへの投与のための有用な用量及び経路を決定することができる。
【００５２】
治療的に有効な用量とは徴候又は症状を寛解させる活性薬剤の量のことをいう。かかる化合物の治療効力および毒性は細胞培養または実験動物において標準的な医薬手段（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％が致死する用量）によって決定することができる。治療効果と毒性効果の間の用量比は治療指標であり、それは比、ＬＤ５０／ＥＤ５０によって表される。大きな治療指標を示す医薬組成物が好ましい。ヒト用の用量範囲の製剤において細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータを用いればよい。かかる化合物の用量は、毒性が無いかわずかであるＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。用量は用いる剤形、患者の感受性および投与経路によってこの範囲内で変動する。
【００５３】
正確な用量は個々の医師によって治療される患者に鑑みて選択される。用量及び投与は活性部分の十分なレベルを提供し、あるいは所望の効果を維持するように調整され得る。考慮され得るさらなる因子には疾患状態の重篤度（例えば腫瘍の大きさおよび位置）；患者の年齢、体重および性別；食事；投与時期と頻度；併用する薬剤；反応感受性；および治療に対する耐性／応答が含まれる。長時間作用性の医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、１日１回、３から４日に１回、週１回または２週間に１回などで投与すればよい。
【００５４】
本発明はさらに第１３タイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）の全部または部分を有する上記のフィブロネクチン断片に対して特異的に反応する抗体も提供する。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生方法は当業者に公知であり、科学文献および特許文献に記載されている。例えば、Coligan、Current Protocols in Immunology、Wiley/Green、NY (1991); Stites (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.) Lange Medical Publications、Los Altos、CA、およびそこで引用されている文献 (Stites); Goding、Monoclonal Antibody: Principles and Practice (2nd ed.) Academic Press、New York、NY (1986); および Kohler (1975) Nature 256: 495を参照されたい。かかる技術は、ファージにディスプレーされたか同様に細胞上の組換え抗体のライブラリーからの抗体の選抜を含む。Huse (1989) Science 246: 1275 and Ward (1989) Nature 341: 544を参照されたい。組換え抗体は、Norderhaug (1997) J. Immunol. Methods 204: 77-87に記載のように一過性または安定な発現ベクターによって哺乳類細胞において発現され得る。
【００５５】
本発明はさらに以下のものを含むその他の有用な態様を提供する。腫瘍形成または癌の治療または予防処置のための薬剤の同定方法であって、以下を含む方法が提供される：
被験化合物を、ＥＣＭ、フィブロネクチン、ＦＮＩＩＩ１３断片またはその部分に曝され、テネイシンまたはその断片の存在により増殖させられた細胞と接触させること、そして、
以下の１または複数を測定すること：
ａ）細胞増殖；
ｂ）ＤＮＡ合成；
ｃ）細胞接着；
ｄ）細胞拡張；
ｅ）フィブロネクチン上の限局的接着およびアクチン張力繊維形成；
ｆ）細胞周期のＳ期に入った細胞の比率；および、
ｇ）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への細胞の結合、
好ましくはここでＥＣＭはフィブロネクチンであるかそれを含む；または、
ｈ）シンデカンシグナル伝達経路からのあらゆるその他の結果。
【００５６】
上記方法は、腫瘍形成または癌の治療または予防処置のための薬剤の同定方法を教示するが、該方法は、リウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、血栓症、アテローム性動脈硬化症、および／または創傷治癒を含むがそれらに限定されない、テネイシンとフィブロネクチンの相互作用に依存するあらゆる疾患または症状の治療または予防処置のための薬剤の同定も含む。
【００５７】
細胞培養にテネイシンを添加することにより増殖細胞の増殖が促進されるが、好ましくはテネイシンによって固体基体をコーティングすることによって促進する。細胞培養は好ましくは固体基体または液体培地で培養する。（ａ）から（ｈ）の１または複数の最初の測定は細胞と被験化合物の接触の前に行なうとよい。２回目の測定はその後に行なうとよい。さらなる多くの回数の測定は、細胞と被験化合物の接触の数時間後または数日後にわたって行なうとよい。このようにして細胞応答のタイムコースを得て分析するとよい。
【００５８】
好適な態様において細胞と被験化合物の接触後に起こる以下の１または複数は被験化合物が抗増殖または抗腫瘍薬剤であることを示す：
（ａ）細胞増殖の低下；
（ｂ）ＤＮＡ合成の低下；
（ｃ）細胞接着、好ましくはフィブロネクチンに対する細胞接着の増加；
（ｄ）細胞拡張の増加；
（ｅ）フィブロネクチン上の限局的接着およびアクチン張力繊維形成の増加；
（ｆ）細胞周期のＳ期に入る細胞の比率の減少；
（ｇ）細胞のＥＣＭ、好ましくはフィブロネクチン、ＦＮＩＩ１３またはその部分に対する結合の増加；および、
（ｈ）シンデカンシグナル伝達経路からのあらゆるその他の結果の増加。
【００５９】
正常細胞および形質転換細胞の両方を含むあらゆる接着細胞を本方法に用いることができる。かかる細胞としては、例えば、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および星状細胞が挙げられる。
【００６０】
アクチン張力繊維形成は、Bloom、L et al (1999) Mol Biol Cell 10: 1521-1536に記載のアクチンアセンブリーアッセイにしたがってアッセイすることができる。接着アッセイは、Bloom、L et al (1999)または以下の実施例の記載の方法にしたがって行なうことができる。
【００６１】
好適な方法において、細胞はシンデカン、特にシンデカン４を発現し、被験化合物との接触前、接触中あるいは接触後にフィブロネクチンとテネイシンの存在下で増殖される。
【００６２】
別の態様において、本発明の方法はさらに被験化合物の不在下で増殖されたコントロール細胞を含み、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および／または（ｈ）はコントロール培養物と被験培養物の両方において測定される。試験の測定はそれによって、コントロールに対して標準化される。
【００６３】
別の態様において、本発明は、本発明の抗腫瘍または抗発癌性の候補化合物あるいはリウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患の１または複数の治療または予防処置、移植拒絶の予防、またはテネイシンとフィブロネクチンの相互作用に依存する疾患または症状、例えば、血栓症、創傷治癒およびアテローム性動脈硬化症の治療または予防処置のための化合物の同定方法を提供し、該方法は、以下を含む：
被験化合物を
（ｉ）フィブロネクチン分子、ＦＮＩＩ１３、またはその部分あるいはバリアント、および、
（ｉｉ）（ｉ）と結合することができるテネイシンまたはその部分；
を含む系に接触させること、および、
（ｉ）と（ｉｉ）の結合を測定すること。
【００６４】
上記のこの方法は、抗腫瘍または腫瘍予防候補薬剤の同定のための実質的に無細胞系を提供する。フィブロネクチン分子、その部分、バリアントまたは断片は好ましくは、ＦＮＩＩ１３、またはその部分、バリアントあるいは断片であって、それらに対するテネイシンの結合の測定を可能にするのに十分なものである。この方法は、抗腫瘍候補薬剤のフィブロネクチンとテネイシンとの間の結合を阻止、阻害または破壊する能力に依存する。フィブロネクチンとテネイシンとの結合の破壊の性質は、当業者がフィブロネクチンとテネイシンの結合アッセイを行なうことによって決定することができる。試薬と被験化合物の相対量及び濃度を変動させることによって、阻害定数その他のパラメーター、例えば、結合アフィニティーの算出が可能となる。アッセイ条件の最適化は当業者の技能の範囲内である。
【００６５】
系はさらに被験化合物を含まないコントロールを含んでいてもよく、そのコントロールにおいて（ｉ）と（ｉｉ）の結合が測定され、それによって試験系における対応する測定がコントロールに対して標準化されることになる。
【００６６】
テネイシンとフィブロネクチンとの相互作用に依存する疾患または症状に対して有効な薬剤を同定する別のスクリーニング方法は以下を含む：
被験化合物と以下を含む系を接触させること、
（ｉ）フィブロネクチン分子、特にＦＮＩＩ１３、その部分またはバリアント、
（ｉｉ）テネイシン分子または（ｉ）に結合することができるその部分、および／または、
（ｉｉｉ）（ｉ）に結合することができるシンデカン分子；
そして次に、
（ｉ）と（ｉｉ）の結合および／または（ｉ）と（ｉｉｉ）の結合を測定すること。
【００６７】
このようにしてフィブロネクチンに対するテネイシンの結合を破壊、阻害または阻止できる被験化合物の能力を、フィブロネクチンに対するシンデカンの結合を修復するその能力と相関させることができる。（ｉ）と（ｉｉ）の結合の減少は、抗増殖または抗腫瘍薬剤と結びつけられ、（ｉ）と（ｉｉｉ）の結合の増加は抗増殖または抗腫瘍薬剤と結び付けられる。
【００６８】
本発明の先のスクリーニングの態様と同様に、この系はさらに被験化合物を含まないコントロールを含んでいてもよく、（ｉ）と（ｉｉ）との結合および／または（ｉ）と（ｉｉｉ）との結合が測定される。
【００６９】
テネイシンとフィブロネクチンとの相互作用に依存する疾患または症状には、腫瘍形成または癌、リウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、血栓症、アテローム性動脈硬化症、および／または創傷治癒が含まれるがこれらに限定されない。好適な態様において、本発明は腫瘍形成または癌に対して有効な薬剤、好ましくは抗腫瘍または抗増殖薬剤を提供する。
【００７０】
本発明の上記のすべてのスクリーニングの態様において、フィブロネクチン分子、その部分またはバリアントは以下から選択すればよい：
（ａ）インタクトなフィブロネクチン，
（ｂ）ＦＮＩＩＩ１３、
（ｃ）少なくとも５アミノ酸残基のＦＮＩＩＩ１３の断片、または、
（ｄ）配列番号２、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列を含むフィブロネクチンの断片またはその部分あるいはバリアント。
【００７１】
本発明の上記すべての方法において、テネイシンは好ましくはインタクトなテネイシンであり、より好ましくはテネイシンＣである。また、シンデカン分子は好ましくはシンデカンのエクトドメインを含み、より好ましくはシンデカン４のエクトドメインを含む（McFall and Rapraeger (1998) J. Biol. Chem. 273:28270-28276を参照されたい）。しかしこれらの分子の活性の断片または断片の部分を用いてもよい。
【００７２】
フィブロネクチン分子、その部分またはバリアント、テネイシンまたはシンデカンあるいはその活性の断片または部分の一つを固相に接着させてもよい。固相は粒子を含むものであっても表面であってもよい。例えば、ラテックスビーズやセルロースなどの粒子を用いることができる。固体基体の例には、メンブレンフィルター、例えば、ニトロセルロースまたはポリスチレンが含まれ、例えばマイクロタイタープレートの形態のものが挙げられる。
【００７３】
本発明のアッセイ（スクリーニング）系の１つのコンポーネントが固体粒子または基体に結合している場合、そのように結合させていない１または複数のその他のコンポーネントを標識してもよい。標識の例には、放射性標識、例えば１４Ｃまたは３Ｈ、色素、金属ゾル、酵素またはビオチン／アビジンが含まれる。系において「遊離」のコンポーネントにかかる標識を接着させることにより、あらゆる結合アッセイが当該技術分野で周知の方法によって溶液中で行なうことができる。コンポーネントを固相と反応させた後、粒子を溶液から例えばろ過又は遠心沈降（遠心分離を含む）によって分離することができる。免疫沈降を用いて結合したものと遊離の標識化コンポーネントを分離するような態様もある。通常は、（このコンポーネントがその他の標識化コンポーネントに結合していたか否かにかかわらず）抗体を用いて非標識化コンポーネントを溶液から取り出すことができる。分離後、溶液中に存在する標識（遊離）と固相中または固相上に存在する標識（結合）を測定すればよい。かかる結合および遊離データの標準的分析、例えば、スキャッチャードプロット、および結合についてのアフィニティーと阻害定数の決定は当業者に周知である。
【００７４】
固相が粒子でない場合、例えばマイクロタイタープレートウェルなどの表面の形態である場合でも、結合および遊離標識を測定する結合アッセイを行なうことができるが、これは通常、結合反応が起こった後のウェルからの液相の除去を伴う。好ましいことに、このアッセイ形式によると、特異的に標識化した反応コンポーネントを提供する必要がない。そのかわり、標識化抗体を用いて、以前に遊離であった反応コンポーネントの固相コンポーネントへの結合を測定すればよい。
【００７５】
フィブロネクチン分子、そのバリアントまたは断片を直接固相に接着させる態様もある。このタイプの好適なイムノアッセイの態様において、フィブロネクチンに結合したテネイシンはテネイシンに対して反応性の抗体を用いて測定される。このアッセイは、シンデカンの存在下で行なってもよい。
【００７６】
別の態様においてはテネイシンを固相に接着させてもよい。このタイプの好適なイムノアッセイの態様において、テネイシンに結合した、フィブロネクチン分子、そのバリアントまたは断片はフィブロネクチンに対して反応性の抗体を用いて測定される。このアッセイも、シンデカンの存在下で行なってもよい。
【００７７】
さらなる態様において、シンデカンを固相に接着させて、フィブロネクチン分子、そのバリアントまたは断片との結合アッセイをテネイシンの存在下で行なってもよい。このタイプの好適なイムノアッセイの態様において、シンデカンに結合した、フィブロネクチン分子、そのバリアントまたは断片は、フィブロネクチンに対して反応性の抗体を用いて測定される。
【００７８】
免疫学的結合アッセイは当該技術分野で公知である。概説として、Methods in Cell Biology Vol. 37: Antibodies in Cell Biology、Asai、(Ed.) Academic Press、Inc. New York (1993)を参照されたい。
【００７９】
標識はいかなる検出可能な組成物であってもよく、検出は、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、物理的または化学的のいずれであってもよい。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミンおよびランタニド蛍光体）、高電子密度試薬、酵素、例えばＥＬＩＳＡに通常使用される酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼ）、ビオチン、ジオキシゲニン、またはその抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質が含まれる。標識は検出すべき標的化合物に直接導入してもよいし、標的に結合するプローブまたは抗体に接着させてもよい。
【００８０】
本発明のアッセイを通して、試薬の添加の後または試薬の混合物のインキュベーションの後にインキュベーションおよび／または洗浄工程が要求されることがある。インキュベーション工程は約５分から数時間の間で変動し得、約３０分から約６時間であることが多い。しかし、インキュベーション時間は通常、アッセイ形式、分析物、溶液の体積、濃度などに依存する。通常、アッセイは周囲温度で行なうが、例えば１０℃から４０℃の温度で行なってもよい。
【００８１】
特に好ましいアッセイ形式は酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。
【００８２】
本発明の上記スクリーニング方法はすべて、創傷治癒またはアテローム性動脈硬化症の治療、テネイシンとフィブロネクチンの相互作用に依存する疾患または症状の治療または予防処置のための生物活性と候補薬剤について物質をスクリーニングするために同様に適用できる。
【００８３】
抗発癌性、抗腫瘍、抗転移、創傷治癒または抗アテローム性動脈硬化症の性質の物質または、リウマチ、喘息、アレルギー疾患、自己免疫疾患の１または複数の治療または予防処置のための物質、移植拒絶の予防、またはテネイシンとフィブロネクチンの相互作用に依存する疾患または症状、例えば血栓症の治療または予防処置のための本発明のスクリーニング方法によって同定される物質も本発明の範囲に含まれる。これらの物質はタンパク質であっても、ポリペプチドまたは小有機分子（薬物）であってもよい。それゆえ本発明は腫瘍、転移、創傷治癒またはアテローム性動脈硬化症の予防又は治療のための医薬組成物であって、本発明の方法によって同定される１または複数の物質を含むものを包含する。
【００８４】
本発明はまた以下を含む癌の診断または予知方法も提供する：
ａ）個体からサンプルを得ること；
ｂ）該サンプルを利用可能なＦＮＩＩＩ１３またはその部分あるいはバリアントの存在について分析すること；および、
ｃ）利用可能なＦＮＩＩＩ１３またはその部分あるいはバリアントの存在を好ましい予知または診断と相関させること。
【００８５】
利用可能なＦＮＩＩＩ１３またはその部分あるいはバリアントは、ＦＮＩＩＩ１３またはその断片に対して特異的な抗体を用いて検出でき、コントロールアッセイをフィブロネクチンの異なる領域に対して特異的な抗体を用いて行なえばよい。サンプルは好ましくは、組織化学的分析のための固体表面に載せられた組織サンプルである。検出可能な、利用可能なＦＮＩＩＩ１３またはその部分あるいはバリアントの存在は、ＦＮＩＩＩ１３が結合について細胞に対して利用可能なことを示す。特に、ＦＮＩＩＩ１３−特異的抗体が組織切片中のＦＮＩＩＩ１３と反応すると、そのサンプルにおいて細胞がＦＮＩＩＩ１３と相互作用できるということが予測される。これによって好ましい診断または予知が導かれる。一方、例えばテネイシンがＦＮＩＩＩ１３部位をマスクしているために抗体が組織切片におけるＦＮＩＩＩ１３と反応しなければ、細胞は相互作用できないと予測される。これによって好ましくない診断または予知が導かれる。
【００８６】
好適な態様において、本発明は、本発明の診断または予知方法での使用に好適なキットを提供する。かかるキットは、これらの方法を行なうために有用な試薬、例えば、ＦＮＩＩＩ１３に対して特異的な１又は複数種からの抗体を含む。さらに、キットは、コントロールとして使用するためのフィブロネクチン分子のその他の部分に特異的な１または複数種からの抗体を含んでいてもよい。かかる一次抗−フィブロネクチン抗体のいずれかまたは両方を認識する二次抗体も、サンプルに対する一次抗体の結合を認識および検出する目的で含めてもよい。かかる二次抗体は検出のために、例えばフルオロフォア、酵素、放射性標識その他で標識してもよい。その他の検出標識は当業者に公知である。あるいは、一次抗−フィブロネクチン抗体を直接検出のために標識してもよい。
【００８７】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生方法は当業者に公知である。簡単に説明すると、免疫原を好適なアジュバントと混合し、動物を免疫化する。免疫原調製物に対する免疫応答を、試験血を採取し、免疫原に対する反応性のタイターを測定することによってモニターする。免疫原に対する好適に高いタイターの抗体がえられると、動物から血液を回収し、抗血清を調製する。抗血清をさらに反応性の抗体を濃縮するために分画するとよい。
【００８８】
フィブロネクチン分子、そのバリアントまたは断片、テネイシンまたはシンデカンに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供するいかなる技術を用いて調製してもよい。これらにはKoehler and Milstein (Koehler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497)に最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al (1983) Immunol Today 4: 72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R Liss Inc、New York NY、pp 77-96）が含まれるがこれらに限定されない。イムノアッセイに使用される大量のモノクローナル抗体は当該技術分野でよく知られた様々な技術によって得ることができる。簡単に説明すると、所望のタンパク質によって免疫化された動物からの脾臓細胞を、通常は骨髄腫細胞との融合により不死化する。別の不死化方法には、エプスタイン・バーウイルス、癌遺伝子、またはレトロウイルスによる形質転換またはその他の当該技術分野で周知の方法が含まれる。単一の不死化細胞から生じたコロニーを、フィブロネクチン分子、そのバリアントまたは断片、テネイシンまたはシンデカンに対して所望の特異性およびアフィニティーを有する抗体の産生についてスクリーニングする。かかる細胞によって産生されたモノクローナル抗体の産生量は、様々な技術によって増加させることができ、かかる技術には脊椎動物宿主の腹腔への注射が含まれる。あるいは、適当なヒトＢ細胞、即ち常套方法によって免疫化されたＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってモノクローナル抗体またはその結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離してもよい。
【００８９】
抗体の産生について、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む様々な宿主を、フィブロネクチン分子、そのバリアントまたは断片、テネイシンまたはシンデカンあるいは免疫原性を保持しているあらゆる部分または断片を注射することによって免疫化することができる。宿主の種に応じて様々なアジュバントを免疫応答を増加させるために用いてもよい。かかるアジュバントは市販されており、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機物ゲル、およびリゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳液、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールが含まれるがこれらに限定されない。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルヴムが潜在的に有用なアジュバントである。
【００９０】
動物（例えばマウスまたはウサギの近交系株）はフロイントアジュバント等の標準的アジュバント、および標準的免疫化プロトコールを用いて免疫原によって免疫化することができる。あるいは、キャリアタンパク質に結合した合成ペプチドを免疫原として用いてもよい。ポリクローナル血清を回収し、例えば、固体支持体に固定化した免疫原を用いた固相イムノアッセイなどのイムノアッセイにおいて免疫原に対してタイターを測定する。例えばタイターが１０４以上のポリクローナル抗血清を選択し、その他の生物からの相同的タンパク質および／または非−免疫原タンパク質に対する交差反応性を、例えば競合結合イムノアッセイを用いて試験する。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は通常少なくとも約１μＭまたはそれ以下、好ましくは０．１μＭまたはそれ以下、最も好ましくは、０．０１μＭまたはそれ以下のＫＤで結合する。
【００９１】
抗体はまた、リンパ球集団におけるインビボの産生を誘導することにより、または組換え免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても産生することができる（Orlandi et al (1989) Proc Natl Acad Sci 86: 3833;および Winter and Milstein (1991) Nature 349: 293）。
【００９２】
免疫原に対する特異的結合部位を含む抗体断片を作成してもよい。例えば、かかる断片には抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２断片およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合の還元によって作成され得るＦａｂ断片が含まれるがこれらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して迅速且つ簡単に所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片が同定されるようにしてもよい（Huse et al (1989) Science 256: 1275）。
【００９３】
本発明の医薬組成物の投与は経口的であっても非経口的であってもよい。非経口送達方法には、局所、動脈内（例えば腫瘍に対して直接的に）、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、複腔内、または鼻腔内投与が含まれる。活性成分に加えて、これら医薬組成物は賦形剤および医薬に用いられ得る調製物へ活性な化合物を加工するのを促進するようなその他の化合物を含む好適な医薬上許容される担体を含んでいてもよい。製剤と投与のための技術は Remington’s Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co、Easton PA）の最新版に記載されている。
【００９４】
経口投与用の医薬組成物は当該技術分野で周知の医薬上許容される担体を用いて経口投与に好適な用量において製剤すればよい。かかる担体によって医薬組成物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤など、患者による摂取に好適なように製剤できる。
【００９５】
経口投与用の医薬調製物は、活性の化合物と固体賦形剤を組み合わせることによって得られる。所望によりその結果得られる混合物を粉砕してもよく、錠剤または糖衣錠コアを得るために望ましい場合はさらに好適な化合物を添加した後、顆粒混合物を加工処理してもよい。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質賦形剤であり、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたはその他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類；およびアラビアガムおよびトラガカント・ゴムなどのゴム類；そしてゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。所望であれば、崩壊剤または可溶化剤を添加してもよく、例えば架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩が挙げられる。
【００９６】
糖衣錠コアは好適なコーティングを付して提供してもよく、かかるコーティングには濃厚糖溶液が挙げられ、これにもアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール(carbopol)ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物が含まれる。製品の同定または活性化合物の量（すなわち用量）の決定のために染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【００９７】
経口用に使用されうる医薬調製物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセルおよびゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングからなる軟密封カプセルも含まれる。プッシュフィットカプセルは充填剤またはラクトースまたはデンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、そして所望により安定剤と混合した活性成分を含むものでもよい。軟カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体に溶解または懸濁してもよく安定剤を用いても用いなくてもよい。
【００９８】
非経口投与用の医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射用では、本発明の医薬組成物は水溶液中、好ましくはハンクス溶液、リンゲル液、または生理的食塩水などの医薬上許容される緩衝液中に製剤すればよい。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてもよく、かかる物質としてはカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランが挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液は適当な油性注射用懸濁液として調製してもよい。好適な脂溶性溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。所望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させる好適な安定剤または薬剤を含んでいてもよく、これにより高濃度の溶液の調製が可能となる。
【００９９】
局所または経鼻投与用には、浸透される特別の障壁に好適な浸透剤が製剤において用いられる。かかる浸透剤は当該技術分野で一般的に知られている。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、実質的に当該技術分野で公知の標準的製造方法に従って製造すればよい（例えば常套の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠−製造、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程の手段による）。
【０１０１】
本発明をさらに以下の実施例において詳細に説明するが、これは例示の目的にすぎない。
【実施例１】
【０１０２】
テネイシン−Ｃ、フィブロネクチンおよび組換えフィブロネクチンタンパク質、ならびにシンデカンの調製
全長ニワトリテネイシン−Ｃ  ＴＮ２６０を、テネイシン−Ｃのすべての既知のさらなるフィブロネクチンタイプＩＩＩリピートをコンストラクトｐＣＤＮＡ／ＴＮ１９０（Fischer、D. et al (1995) J Biol Chem 270: 3378-3384）に挿入することによりクローニングし、ｐＣＥＰ−Ｐｕベクター（Kohfeldt、E. et al (1997) FEBS Lett 414: 557-561）にサブクローニングし、ヒト胚性ＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。安定に発現する細胞をピューロマイシンで選抜した。組換えテネイシン−Ｃを、細胞を１０％ＦＣＳ−含有培地中２／３の集密まで増殖させることにより産生させた。培地を無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と交換し、培養上清を２日後に回収した。培養上清を６回回収し、各サイクルの間に血清含有培地において１８時間細胞を維持した。組換えテネイシン−Ｃを文献（Fischer、D et al (1995) J Biol Chem 270: 3378-3384）に記載のようにイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。培養上清をゼラチンアガロース、および抗−テネイシン−Ｃ（ｍＡｂＭ１）および（ｍＡｂ６０）を結合させたセファロース４Ｂ（Pharmacia、Uppsala、Sweden）のカラムに連続して通した（抗体については、Fischer、D. et al (1997) Mol Biol Cell 8: 2055-2075を参照されたい）。結合したテネイシン−Ｃを０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３で洗浄し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中の５０ｍＭジエチルアミンで溶出し、ＰＢＳ中の０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０に対して透析した。
【０１０３】
フィブロネクチンは文献（Fischer、D. et al (1997) J Cell Sci 110: 1513-1522）に記載のゼラチンアガロースクロマトグラフィーによって調製した。ウマ血清をゼラチンアガロースカラムに通し、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３で洗浄し、４Ｍ尿素で溶出し、ＰＢＳに対して透析した。組換えフィブロネクチンタンパク質を製造業者(Quiagen)の指示に従ってＮｉ−ＮＴＡ樹脂上で単離した。
【０１０４】
以下の組換えタンパク質を文献に記載のようにして得た：ＦＮＩＩＩ１３（Bloom、L. et al (1999) Mol Biol Cell 10: 1521-1536）、ＦＮＩＩＩ７−１０（Redick、S. D. et al (2000) J Cell Biol 149: 521-527）、ＦＮＩＩＩ４−６およびＦＮＩＩＩ１２−１５＋ＣＳおよびその他のフィブロネクチンコンストラクト（Bloom、L. et al (1999)の方法によって調製した）、以下のｃＤＮＡも文献に記載のようにして得た。マウスシンデカン−１（Liu、W. et al (1988) J Biol Chem 273: 22825-22832）、シンデカン−２（Klass、C. M. et al (2000) J Cell Sci 113: 493-506）およびシンデカン−４（Oh、E. S. et al (1997) J Biol Chem 272: 11805-11811）。
【０１０５】
配列番号４に示すアミノ酸配列またはその最初の１０アミノ酸を有するＦＮＩＩＩ１３の断片をｔ−ＢｏｃおよびＦｍｏｃ化学を用いる通常の固相ペプチド合成法にしたがって合成した（例えば、Chan、W.C. and White、P. D. (2000)、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach、Oxford University Press、368 pp.、または Rovero、P. et. al. (1991) Int. J. Peptide Protein Res.、37、140-4を参照されたい）。ペプチドをＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）によって精製し、質量分析法を用いて確認した。
【実施例２】
【０１０６】
細胞系、細胞培養および形質移入
すべての細胞系は特記しない限りＡＴＣＣから入手した；ヒトＫＲＩＢ骨肉腫、ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫およびチャイニーズハムスターＣＨＯ−Ｋ１および誘導体（Bauer、J. S et al (1992) J Cell Biol 116: 447-487 および Schreiner、C. L. et al (1989) J Cell Biol 109: 3157-3167）。細胞を１０％ＦＣＳおよび抗生物質（０．３６ｍｇ／ｍｌペニシリン、１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭまたはαＭＥＭで培養した。形質移入はFugene6を用いて製造業者のプロトコールに従って行った。安定にシンデカン−４を過剰発現するものを選抜するために、Ｔ９８Ｇ細胞をＧ４１８とともに培養し、発現を免疫蛍光によって分析した。クローン系を限界希釈法によって得た。
【実施例３】
【０１０７】
接着アッセイ
６０−ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）を１０μｇ／ｍｌのＥＣＭ分子で３７℃で１時間コーティングして、１μｇ／ｃｍ２（フィブロネクチンおよびテネイシン−Ｃ）および４μｇ／ｃｍ２（ＦＮＩＩＩ１３）とした。ＥＣＭタンパク質は別々にコーティングし、まずフィブロネクチン、その後テネイシン−Ｃ、ＦＮＩＩＩ１３およびＢＳＡでコーティングした。コーティングされていないプラスチック表面をＰＢＳ中の１％熱不活性化ＢＳＡでブロッキングし、タンパク質を１０μｇ／ｃｍ２とした。同様に、それぞれテネイシン−Ｃと混合したコラーゲンＩおよびラミニン１の混合基体を調製し、テネイシン−ＣをＥＬＩＳＡによって検出した。有効なフィブロネクチンおよびテネイシン−Ｃコーティングをそれぞれ抗−フィブロネクチンおよび抗−テネイシン−Ｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡによって判定し（Fischer、D. et al (1995) J Biol Chem 270: 3378-3384）、また、溶解した表面結合ＥＣＭ物質をクーマシーブリリアントブルー染色と組み合わせてＰＡＧＥ分析によって判定した。プレーティングの前に、１ｘＩＴＳ（インシュリン、トランスフェリン、セレン（selene））を追加したＤＭＥＭ中で１８時間、細胞から血清を欠乏させ、トリプシン処理し、トリプシンをＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌダイズトリプシン阻害剤で阻害し、細胞を無血清培地に再懸濁し、計数した。ウェルあたり２００−５００の細胞を示された時間にプレーティングし、グルタールアルデヒド（２％最終濃度）の１５分間の添加により固定し、２０％メタノール中の０．１％クリスタルバイオレットで３０分間染色した。細胞をNikon顕微鏡(Nikon diaphot)で観察し、Nikonカメラで写真撮影した。
【実施例４】
【０１０８】
ＤＮＡ複製および増殖アッセイ
９６−ウェルプレート（Falcon）を上記のようにしてコーティングした。細胞から血清を一晩欠乏させ、上記のようにトリプシン処理した。１０４の細胞を示された分裂促進因子の存在下でコーティングしたプレートに移した。１４時間後、細胞を放射性３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）で４時間３７℃で標識し、取り込まれた３Ｈ−チミジンを１０％ＴＣＡによって沈降させ、０．３Ｎ  ＮａＯＨ、２％ＳＤＳ中で細胞を溶解した後、ベックマン（Beckman）シンチレーションカウンターで測定した。長期細胞増殖アッセイのために、２ｘ１０３のＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞をＥＣＭ−コーティングした９６−ウェルプレートに１００ｎｇ／ｍｌインシュリン存在下でプレーティングし、示された期間、３７℃でＣＯ２−インキュベーター中の加湿チャンバ中でインキュベートした。増殖因子を含む５０％の新鮮な培地を２４時間ごとに添加した。様々な時点で細胞をトリプシン処理し、カウントした。
【実施例５】
【０１０９】
インビトロ結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートを、示されたＥＣＭタンパク質によって１時間３７℃でコーティングし、ＰＢＳ中の１％粉乳、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロッキングした。ＥＣＭタンパク質をブロッキング溶液中、示された濃度で１時間添加し、ブロッキング溶液で洗浄し、抗−フィブロネクチンまたは抗−テネイシン−Ｃ抗体を添加した。結合タンパク質を、それぞれ抗−フィブロネクチンおよび抗−テネイシン−Ｃ抗体を特異的に認識するペルオキシダーゼ−結合二次抗体との免疫反応によって検出し、２１ｍｇ／ｍｌクエン酸１−水和物、３４ｍｇ／ｍｌＮａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇ／ｍｌフェニレンジアミン、１μｌＨ２Ｏ２による染色反応を行い、これを４Ｍ硫酸で停止させた。吸光度を５９０ｎｍで読んだ。
【実施例６】
【０１１０】
免疫蛍光顕微鏡観察
１０４の細胞を上記のようにＥＣＭタンパク質でコーティングした４−ウェルセルスター（Cellstar）プラスチックプレート（Greiner）に移した。細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド、５０ｍＭリン酸バッファー、５ｍＭ  ＥＤＴＡで１５分間固定し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロッキングし、ブロッキング溶液中の一次抗体および二次抗体とともにインキュベートした。スライドを抗退色(antifade)薬剤として２．５％ＤＡＢＣＯを含有する１０．５％モウィオール（Mowiol）で包埋した。シンデカンの発現を免疫蛍光によって判定した。
【０１１１】
細胞をメタノールで固定し、それぞれ１：５０の希釈度の抗−シンデカン−１、抗−シンデカン−２および抗−シンデカン−４抗体とともにインキュベートした。細胞を顕微鏡観察によって分析した。
【実施例７】
【０１１２】
テネイシン−Ｃは細胞接着を阻害し、フィブロネクチン上での細胞拡張を阻止する
１０種類の腫瘍細胞系をフィブロネクチン、コラーゲンＩおよびラミニン１などの接着基体上か、あるいは大きな腫瘍によって発現される形態のテネイシン−Ｃ上にプレーティングした（Borsi、L. et al (1992) Int J Cancer 52: 688-692）（以下の表１を参照されたい）。
【０１１３】
【表１】
2005502646.tif 000002
【０１１４】
表１はテネイシン−Ｃによって細胞接着が損なわれたことを示す。１時間−接着と２０時間−接着アッセイの結果を示された腫瘍細胞系について要約する。細胞を無血清培地または４０ｎｇ／ｍｌ血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（ａ）、１００ｎｇ／ｍｌインシュリン（ｂ）およびＩＴＳ（ｃ）を追加した培地にプレーティングした。接着した細胞の数をフィブロネクチンに接着した細胞の％として表す。
【０１１５】
ほとんどの細胞がフィブロネクチン、コラーゲンＩおよびラミニン１に接着したが、１０％未満の細胞がテネイシン−Ｃに接着し、プレーティングの１時間後においても丸いままであった。これはテネイシン−Ｃが試験したすべての細胞系に対して接着するわけではないことを示す。テネイシン−Ｃは長時間抗−接着のままであった。というのはすべての細胞は無血清培地中にプレーティングした２０時間後においてもいまだ接着することができなかったためである（表１を参照されたい）。ＰＤＧＦ−ＢＢ、インシュリン、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびトランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）の分裂促進因子の添加によってはテネイシン−Ｃの抗−接着性は減少しなかった（表１を参照されたい）。
【０１１６】
組織においては、細胞はその他のＥＣＭ分子と組み合わせてテネイシン−Ｃに接触する。テネイシン−Ｃが、細胞がフィブロネクチン、ラミニン１またはコラーゲンＩなどの接着ＥＣＭと接着させられる状況においても抗−接着性であるかを確認する実験を行った。テネイシン−Ｃは、フィブロネクチンとともに与えられた場合は、等モル量のテネイシン−Ｃおよびフィブロネクチンを含有する基体に細胞をプレーティングして１時間後および２０時間後の両方において細胞接着を損なうことが見いだされた（表１を参照されたい）。テネイシン−Ｃのフィブロネクチンに対するモル比が１：８（これはテネイシン−Ｃの有効なコーティングに影響を与えない；実施例９を参照されたい）の場合であっても、テネイシン−Ｃは等モル比の場合と同程度にフィブロネクチンへの細胞接着を阻害した。混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体と対照的に、等モル量のテネイシン−Ｃを含有するその他のコラーゲンＩおよびラミニン１の基体はテネイシン−Ｃがない場合と同様に接着した。単一のＥＣＭ分子の場合と同程度の数のＴ９８Ｇ細胞およびＭＲＣ−５線維芽細胞がこれらの混合基体に接着し、拡張した。しかし混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体では４５％のＴ９８Ｇ細胞だけが２０時間後に部分的に拡張した。テネイシン−Ｃはフィブロネクチン上で細胞接着を阻害し、適切な細胞拡張を干渉するが、試験したすべての細胞系において、コラーゲンＩ上でもラミニン１上でもそうではなかった。テネイシン−Ｃはグリア芽細胞腫および乳癌細胞を含む様々な被験腫瘍細胞系の増殖を促進する。したがって組織においては、テネイシン−Ｃは腫瘍細胞数を増加させることによって、腫瘍マスを増加させるようである。アポトーシス速度が変化するという証拠はないが、フィブロネクチン上に接着させて培養した対応物と比べてより高い比率の細胞がフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ混合物上では、細胞周期のＤＮＡ合成期に入る。明らかに、フィブロネクチン上では、Ｓ期に入るという決定を経ていない細胞が、フィブロネクチンに対してテネイシン−Ｃの接着が損なわれることによって、ＤＮＡ合成の開始がトリガーされる。
【実施例８】
【０１１７】
インテグリン発現の増加はテネイシン−Ｃにより損なわれた細胞接着を克服しない
本発明者らは、フィブロネクチンに結合することができるインテグリンの発現がテネイシン−Ｃ−誘導性のフィブロネクチン上の損なわれた接着に影響を与えるか否かを試験した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（中程度のα５β１を発現する細胞（Bauer、J. S. et al (1992) J Cell Biol 116: 477-487））が、フィブロネクチンとその他のＥＣＭ基体上の接着レベルについて、実質的にフィブロネクチン結合インテグリンを発現しない細胞（ＣＨＯ−Ｂ２）、またはα５β１を過剰発現する細胞（ＣＨＯ−Ｂ２α２７）およびαｖβ１を過剰発現する細胞（ＣＨＯ−Ｂ２ｖ７）と比較された（Schreiner、C. et al (1991) Cancer Res 51: 1738-1740）。実験により、混合基体上の細胞接着がすべての細胞系において、インテグリン発現の性質にかかわらず同様に阻害されることが示された（表１を参照されたい）。また、ヒトＨＴ２９大腸癌細胞におけるα５β１インテグリンの過剰発現によっても混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上の細胞接着と拡張は支持されなかった。β１インテグリンはおそらくテネイシン−Ｃ作用の主な標的ではない。
【実施例９】
【０１１８】
混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上での腫瘍細胞増殖の増加
フィブロネクチン、テネイシン−Ｃおよび混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上で培養したＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫、およびチャイニーズハムスター卵巣癌細胞（ＣＨＯ）の細胞増殖とＤＮＡ合成を判定した。ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞をフィブロネクチン上またはフィブロネクチンとテネイシン−Ｃの等モル混合物上で１００ｎｇ／ｍｌインシュリンの存在下で培養した。２７時間後、５１時間後、および７５時間後に細胞を計数した。フィブロネクチン上よりも培養５１時間後および７５時間後にそれぞれ２４％および３３％多い細胞がフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ上で計数された。Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞を、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、ラミニン１およびこれらＥＣＭ分子の混合物上で４０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ−ＢＢの存在下でテネイシン−Ｃと培養した。接着した細胞あたりの３Ｈ−チミジン取り込みがフィブロネクチン上でのｃｐｍの何倍であるかを測定した。ＭＤＡ−ＭＢ４３５およびＴ９８Ｇ細胞のＤＮＡ複製指標（ｃｐｍ／細胞）はフィブロネクチンのみの場合と比べて混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体の場合は約２および３倍増加していた（以下の表２を参照されたい）。
【０１１９】
【表２】
2005502646.tif 000003
【０１２０】
表２はテネイシン−ＣによるＤＮＡ合成の上昇を示す。ＤＮＡ複製は３Ｈ−チミジン取り込みによって測定し、フィブロネクチン上にプレーティングした細胞と比較したｃｐｍの相対的増加として表した。血清を欠乏させた細胞は４０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ−ＢＢ（ａ）、１００ｎｇ／ｍｌインシュリン（ｂ）およびＩＴＳ（ｃ）によってＳ期へ入るようトリガーされた。
【０１２１】
Ｔ９８Ｇ細胞がＳ期に入らない４時間後に同程度の細胞の全ｃｐｍが異なる基体にプレーティングされた細胞からカウントされたため、丸い細胞が接着した細胞より多くの３Ｈ−チミジンを取り込むという可能性は排除できる。ＤＮＡ合成レベルの増加はその他の被験腫瘍細胞系についても観察された（表２を参照されたい）。これは、フィブロネクチン単独の場合よりも混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体の場合の方が多くの細胞が細胞周期のＳ期に入ることをトリガーされることを示す。すべての被験腫瘍細胞系が同様に混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上での細胞接着が損なわれたので、２つの代表的な細胞系である、ヒトＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞およびＴ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞をさらなる研究のために選んだ。
【０１２２】
テネイシン−Ｃ単独とＥＣＭ関係のフィブロネクチン以外のものにおけるテネイシン−Ｃが増殖も促進するかどうかを調べるため、細胞が丸く維持されている純粋なテネイシン−Ｃ基体上と、細胞が正常に拡張しているテネイシン−Ｃを含有するコラーゲンＩとラミニン１の混合基体上でのＤＮＡ合成についての調査を行った。これらの実験により、試験したすべての細胞系のＤＮＡ複製指標が純粋なテネイシン−Ｃ上では１１倍のレベルで増加したことが明らかとなった（表２を参照されたい）。しかし、テネイシン−Ｃを含有する接着基体（それぞれコラーゲンＩおよびラミニン１との混合物）上では、ＤＮＡ合成速度は単一ＥＣＭ分子のものと同程度であった。テネイシン−Ｃが腫瘍細胞における細胞周期のＳ期を短くしているという可能性を排除するために、Ｔ９８Ｇ細胞のＤＮＡ合成を、プレーティングの１１時間後から開始して２時間ごとのアッセイにより測定した。それゆえ、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞をフィブロネクチン上またはフィブロネクチンとテネイシン−Ｃの混合物上で４０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ−ＢＢの存在下で培養し、３Ｈ−チミジンで１時間標識し、収集してプレーティングの１１時間後から開始して２時間ごとにカウントした。この実験により混合基体上でのＤＮＡ複製はフィブロネクチン上と同様の動力学を示すことが明らかとなった。これらの観察は、テネイシン−Ｃがフィブロネクチン−特異的細胞接着シグナル伝達を干渉することによって、一連の細胞が細胞周期のＳ期に入ることを刺激することを示す。
【実施例１０】
【０１２３】
テネイシン−ＣはフィブロネクチンにおけるＨｅｐＩＩ部位の第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピートに結合する
テネイシン−Ｃの抗−接着および増殖−刺激効果は、混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上の細胞に特異的であることが判明した。ＥＬＩＳＡアッセイを行ったところ（実施例５を参照されたい）、フィブロネクチンが基体に固定化されたテネイシン−Ｃに用量依存的に結合することが示された。さらにＥＬＩＳＡアッセイにより、ヘパリンおよびフィブロネクチンにおける細胞結合部位ＨｅｐＩＩＩとＨｅｐＩＩの部分である組換え断片ＦＮＩＩＩ４−６、ＦＮ１２−１５＋ＣＳおよびＦＮＩＩＩ１３がそれぞれテネイシン−Ｃに用量依存的に結合し、飽和に達する（例えばＦＮＩＩＩ１３）ことが示された。結合断片をポリクローナル抗−フィブロネクチン抗体で検出し、結合テネイシン−Ｃをモノクローナル抗−テネイシン−Ｃ抗体で検出した。
【０１２４】
テネイシン−ＣとＦＮＩＩＩ１３は共免疫沈降実験において複合体を形成することも判明した。さらに、テネイシン−Ｃの表面に固定化されたインタクトなフィブロネクチンへの結合は、濃度依存的にＦＮＩＩＩ１３によって競合されうる。ＲＧＤおよび相乗作用部位を含む組換え断片ＦＮＩＩＩ７−１０のテネイシン−Ｃに対する結合はＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出されなかった。これは、フィブロネクチンのＨｅｐＩＩ部位におけるテネイシン−ＣのＦＮＩＩＩ１３に対する結合が特異的であることを示す。
【実施例１１】
【０１２５】
第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピートは、フィブロネクチン上でテネイシン−Ｃによって誘導される細胞の拡張の欠陥を修復する
接着アッセイにより、大多数のＴ９８Ｇ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞およびラット胚線維芽細胞ＲＥＦ５２がフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ／ＦＮＩＩＩ１３のトリプルマトリックス上で拡張することが示された。細胞を基体（ＦＮ、ＦＮ／ＴＮ、ＦＮ／ＴＮ／ＩＩＩ１３、ＦＮ／ＴＮ＋ＩＩＩ１３、ＩＩＩ１３、またはＢＳＡ）に１時間および２時間プレーティングし、固定してクリスタルバイオレットまたはビンキュリンおよびＴＲＩＴＣ−標識化ファロイジンで染色した。接着細胞を撮影し、拡張した細胞を計数した。６倍モル過剰のＦＮＩＩＩ１３（４μｇ／ｃｍ２）を、混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体に細胞の添加に先立って結合させるか（ＦＮ／ＴＮ／ＩＩＩ１３）、あるいは細胞とともに溶液に添加した（ＦＮ／ＴＮ＋ＦＮＩＩＩ１３）。ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞の増殖とＴ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞のＤＮＡ複製を実施例４および５に記載のようにして測定した。これによってすべての被験細胞系においてテネイシン−Ｃによって引き起こされる細胞の拡張の欠陥をＦＮＩＩＩ１３が修復することができることが明らかとなった。ＦＮＩＩＩ１３断片はそれ自体では拡張シグナルを提供しない。というのは細胞はＦＮＩＩＩ１３基体上ではあまり接着せず丸いままであるからである。細胞拡張は、細胞が可溶性ＦＮＩＩＩ１３とともにフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体に添加された場合も修復された。ＦＮＩＩＩ１３とは対照的に、ＦＮＩＩＩ４−６は、固定化された場合でも溶液中で与えられた場合もフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ上での細胞拡張を修復しなかった。これらの結果は、様々な基体にプレーティングされた細胞の細胞骨格および接着構造を分析することによって確認された。フィブロネクチン上または混合基体上に２時間プレーティングされたＴ９８Ｇ細胞をビンキュリンで染色した。限局的接触がフィブロネクチン上に形成されていることが判明したが、フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ上には形成されていなかった。さらに、アクチンの張力繊維への多量体化がテネイシン−Ｃによって阻害された。多量体化されたアクチンは見られなかった。
【０１２６】
ＦＮＩＩＩ１３断片がフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ上で細胞拡張を修復したので、アクチン張力繊維と限局的接触がＦＮＩＩＩ１３によって修復されるか否かを調べる実験を行った。免疫蛍光実験により、フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体にＦＮＩＩＩ１３断片を添加した場合にＴ９８ＧおよびＲＥＦ５２細胞におけるアクチン張力繊維と限局的接触をＦＮＩＩＩ１３が大幅に修復することが明らかになった。
【０１２７】
テネイシン−Ｃはフィブロネクチン上での細胞の接着と拡張に特異的に干渉する。テネイシン−Ｃは限局的接触とアクチン張力繊維形成を損なった。これらはともに、インテグリン媒介細胞接着の特徴である。さらに、β１インテグリンは限局的接触を局在化せず、ＭｎＣｌ２によるインテグリン活性化もα５β１インテグリンの過剰発現もテネイシン−Ｃ表現型の復帰を引き起こさなかった。テネイシン−Ｃは間接的機構によってインテグリン機能に影響を与える。
【０１２８】
テネイシン−Ｃはフィブロネクチンに、具体的にはフィブロネクチンにおけるＨｅｐＩＩおよびＨｅｐＩＩＩ細胞結合部位に結合する。フィブロネクチンのＨｅｐＩＩＩ（ＦＮＩＩＩ４−６）およびＨｅｐＩＩ（ＦＮＩＩＩ１２−１５＋ＣＳ、ＦＮＩＩＩ１３）部位を含む組換え断片は用量依存的かつ競合的に（ＦＮＩＩＩ１３）テネイシン−Ｃに結合する。対照的に、ＲＧＤおよび相乗作用細胞結合部位（ＦＮＩＩＩ７−１０）を含む断片はテネイシン−Ｃに結合しない。ＦＮＩＩＩ４−６はのＴ９８Ｇ細胞の細胞拡張に影響を与えないが、ＦＮＩＩＩ１３は拡張の欠損を中和し、フィブロネクチンとテネイシン−Ｃの混合基体上の限局的接触とアクチン張力繊維形成を修復する。テネイシン−Ｃは、ＦＮＩＩＩ１３に位置する細胞結合部位に直接結合することによって効率的にフィブロネクチンに対する細胞の接近を阻害し、それによって完全な細胞拡張を阻害する。
【０１２９】
要約すると、テネイシン−Ｃはフィブロネクチン上の細胞拡張、限局的接触およびアクチン張力繊維形成を干渉し、この効果はＦＮＩＩＩ１３の添加によって中和されうる。
【実施例１２】
【０１３０】
第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピートの断片はフィブロネクチン上のテネイシン−Ｃによって誘導される細胞の拡張の欠陥を修復する
実施例１１に記載のように、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＦＮＩＩＩ１３の組換え断片は、フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ上での細胞拡張を修復することが示された。免疫蛍光実験により、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＦＮＩＩＩ１３の組換え断片は、フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体に対する組換え断片の添加によってＴ９８ＧおよびＲＥＦ５２細胞におけるアクチン張力繊維と限局的接触を大幅に修復することが明らかになった。
【０１３１】
それゆえ、テネイシン−Ｃは、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＦＮＩＩＩ１３の組換え断片に位置する結合部位に直接結合することによって効率的にフィブロネクチンに対する細胞の接近を阻害し、それによって完全な細胞拡張を阻害する。テネイシン−Ｃはフィブロネクチン上の細胞拡張、限局的接触およびアクチン張力繊維形成を干渉し、この効果は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＦＮＩＩＩ１３の組換え断片の添加によって中和されうる。
【０１３２】
同じ実験を配列番号４に示すアミノ酸配列の最初の１０アミノ酸を有するＦＮＩＩＩ１３の組換え断片を用いて行ったところ、同様の結果が得られたが効果は小さかった。
【実施例１３】
【０１３３】
第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピートはテネイシン−Ｃの細胞増殖刺激効果を中和する
テネイシン−Ｃによる剥離は、腫瘍細胞増殖の上昇と相関しており、ＦＮＩＩＩ１３が細胞拡張を修復したため、ＦＮＩＩＩ１３が混合基体上でもフィブロネクチン上と同レベルに細胞増殖を減少させるかを調べる実験を行った。これは確認された。フィブロネクチン単独上と同程度の数のＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞がプレーティングの７５時間後にＦＮＩＩＩ１３を含むトリプルマトリックス上で計数され、Ｔ９８Ｇ細胞についてはフィブロネクチン上と同レベルのＤＮＡ合成がフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ／ＦＮＩＩＩ１３上で測定された。
【０１３４】
配列番号４に示す配列のペプチドがフィブロネクチン上と同レベルで混合基体上で細胞増殖を減少させるかを調べる同じ実験を行ったところ、これが確認された。フィブロネクチン単独上と同程度の数のＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞が配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＦＮＩＩＩ１３の組換え断片を含むトリプルマトリックス上でプレーティングの７５時間後に計数され、Ｔ９８Ｇ細胞についてはフィブロネクチン上と同程度のＤＮＡ合成レベルがフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ／ＦＮＩＩＩ１３断片上で測定された。
【０１３５】
配列番号４に示すアミノ酸配列の最初の１０アミノ酸を有するＦＮＩＩＩ１３の組換え断片について同じ実験を行った。
【実施例１４】
【０１３６】
シンデカン−４の過剰発現は混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上での細胞拡張を修復する
テネイシン−ＣがフィブロネクチンにおけるＨｅｐＩＩ部位に対する結合についてシンデカン−４と競合している可能性を確認するための実験を行った。この実験によって過剰発現によるシンデカン−４の活性化によってフィブロネクチン上のテネイシン−Ｃによって誘導される拡張の欠損がレスキューされるかを試験した。親Ｔ９８Ｇ細胞、グリア芽細胞腫細胞のプール（Ｔ９８Ｇ：Ｓ４）またはシンデカン−４を安定に過剰発現している細胞（Ｔ９８Ｇ：Ｓ４）の選抜クローン（Ｔ９８Ｇ：Ｓ４＊）を示された基体上に３０分間、２時間、１８時間プレーティングし、あるいは固定化し、クリスタルバイオレットで染色し、写真撮影し、計数するかまたはＴＲＩＴＣ−標識化ファロディンおよびビンキュリンで染色した。シンデカン−４を抗−シンデカン−４抗体を用いた免疫蛍光によって検出した。非特異的抗−Ｈｉｓモノクローナル抗体（コントロール）による染色はみられず、二次抗体のみによる染色も見られなかった。Ｙ３９７におけるＦＡＫ（限局的接着キナーゼ）自己リン酸化および全ＦＡＫ発現レベルを特異的抗体によるイムノブロッティングにより評価した。ＤＮＡ複製を実施例４および５に記載のようにして測定した。その結果、シンデカン−４を過剰発現し、それによってシンデカン−４を活性化するＴ９８Ｇ細胞のプール（Ｔ９８Ｇ：Ｓ４）は混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上で接着および拡張した。接着したＴ９８Ｇ：Ｓ４細胞の６４．７％の大多数はフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上でも拡張した。これは内因性シンデカン−４発現レベルが低いＴ９８Ｇ細胞と対照的であり、これは混合基体上でごくわずかな程度しか拡張しなかった（３．５％）。シンデカン−４−過剰発現クローンＴ９８Ｇ：Ｓ４＊の拡張は混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上でプレーティングの２時間後には完全に修復した。
【０１３７】
混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上での細胞の接着と拡張の刺激に加えて、クローンＴ９８Ｇ：Ｓ４＊におけるシンデカン−４の過剰発現は限局的接触形成とアクチンの張力繊維への多量体化も完全に修復した。この観察は最近Saoncella、S. et al (1999) P.N.A.S. 96: 2805-2810によって示されたようにシンデカン−４の細胞拡張における機能がＲｈｏ−媒介アクチン張力繊維形成と連動していることを支持する。限局的接着キナーゼ（ＦＡＫ）のＹ３９７における自己リン酸化による活性化は、細胞接着シグナル伝達における初期段階である。これはフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上でのＴ９８Ｇ親細胞およびＴ９８Ｇ：Ｓ４＊細胞では損なわれている。対照的に、ＦＮＩＩＩ１３を含むフィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上のプレーティングは大幅にＦＡＫ自己リン酸化を修復し、これはＦＮＩＩＩ１３によるシンデカン−４の活性化が、ＦＮＩＩＩ１３による細胞接着シグナル伝達の修復と連動していることを示す。混合フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ基体上での細胞拡張をレスキューすることに加えて、シンデカン−４の過剰発現によりフィブロネクチン上と同レベルにＤＮＡ複製レベルが低下する。
【０１３８】
Ｔ９８Ｇ細胞におけるシンデカン−４の過剰発現はフィブロネクチンとテネイシン−Ｃの混合物上での拡張の欠損およびアクチン張力繊維形成の欠損をレスキューする。これはシンデカン−４に特異的である。というのはシンデカン−１および−２の過剰発現はテネイシン−Ｃによって誘導される表現型を中和しなかったからである。ＦＮＩＩＩ１３の添加とシンデカン−４の過剰発現はともにフィブロネクチン上でのテネイシン−Ｃによって損なわれた細胞拡張を修復することを示した。それゆえ、テネイシン−Ｃ効果のＦＮＩＩＩ１３による中和はシンデカン−４に媒介されており、フィブロネクチンにおける特徴付けられたシンデカン−４認識配列（ＦＮＩＩＩ１２−１５）（Woods、A. et al (2000) Arch Biochem Biophys 374: 66-72）におけるシンデカン−４の結合はＦＮＩＩＩ１３を介して起こる。また、ＦＮＩＩＩ１３はシンデカン−４を過剰発現するＴ９８Ｇ細胞に用量依存的かつヘパリン−競合的に結合する。シンデカン−４はテネイシン−Ｃとフィブロネクチンにおける同じ部位（ＦＮＩＩＩ１３）に結合し、テネイシン−ＣとＦＮＩＩＩ１３の相互作用はシンデカン−４結合と競合する。ＦＮＩＩＩ１４はテネイシン−Ｃによって誘導される細胞の拡張の欠陥には関係がない。といのはＦＮＩＩＩ１３のみの添加が細胞の拡張の修復に十分であったからである。
【０１３９】
テネイシン−Ｃによるシンデカン−４機能の阻害は、腫瘍細胞増殖を促進する。本発明者らはグリア芽細胞腫および乳癌細胞におけるシンデカン−４のより高いレベルによって、フィブロネクチンとテネイシン−Ｃに関する腫瘍細胞増殖が弱められると結論した。
【実施例１５】
【０１４０】
フィブロネクチンの第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）がシンデカン−４に結合する
シンデカン−４のリガンド候補としてのＦＮＩＩＩ１３を調査するために、シンデカン−４とＦＮＩＩＩ１３の相互作用を試験した。ＦＮＩＩＩ１３をＴ９８Ｇ：Ｓ４＊細胞に添加すると、ＦＮＩＩＩ１３がシンデカン−４免疫沈降において検出され、その後ＧＳＴ特異的抗体によるウェスタンブロッティングを行った。この相互作用はヘパリンの添加によって阻害された。親細胞とシンデカン−４を過剰発現するＴ９８Ｇ：Ｓ４＊細胞を（１００μｇ／ｍｌ）ＦＮＩＩＩ１３とともに１時間、０．５ｍｇ／ｍｌヘパリンの存在下または不在下でインキュベートした。シンデカン−４に結合したＦＮＩＩＩ１３はシンデカン−４の免疫沈降およびＦＮＩＩＩ１３についてのイムノブロッティングで検出された。組換えＦＮＩＩＩ１３を（０．５ｍｇ／ｍｌ）ヘパリンの存在下または不在下で細胞に添加した。これによってＦＮＩＩＩ１３がシンデカン−４のリガンドであることが示された。さらにＦＮＩＩＩ１３がシンデカン−４に結合するかを試験するために、ＦＮＩＩＩ１３をＴ９８Ｇ細胞に添加し、細胞表面に結合したＦＮＩＩＩ１３をグルタチオンセファロースを用いたＧＳＴ−タグ付加ＦＮＩＩＩ１３の沈降により検出し、その後抗−Ｈｉｓ抗体によるウェスタンブロッティングを行うか、あるいは抗−ＧＳＴ抗体による免疫蛍光によって検出した。ＦＮＩＩＩ１３はＴ９８Ｇ：Ｓ４＊の細胞表面に親Ｔ９８Ｇの数倍のでベルで結合したが、Ｔ９８Ｇ：Ｓ１およびＴ９８Ｇ：Ｓ２細胞（それぞれシンデカン−１およびシンデカン−２を過剰発現する、以下を参照されたい）には結合しなかった。この相互作用はヘパリンによって阻害され得、これはシンデカン−４がＦＮＩＩＩ１３にグリコサミノグリカン−依存的に結合していたことを示す。さらに、細胞表面に結合したＦＮＩＩＩ１３を抗−Ｈｉｓおよび抗−ＧＳＴ抗体を用いた免疫蛍光によって検出した。シンデカン−１と−２の過剰発現がテネイシン−Ｃ−特異的な細胞の拡張の欠陥をレスキューすることができるかを試験するために、シンデカン−１および−２を安定に過剰発現するＴ９８Ｇ細胞（Ｔ９８Ｇ：Ｓ１およびＴ９８Ｇ：Ｓ２）を作成し、フィブロネクチン／テネイシン−Ｃ上に２時間プレーティングした。シンデカン−４と対照的に、シンデカン−１の過剰発現によってもシンデカン−２の過剰発現によっても細胞は混合基体上で拡張できなかった。Ｔ９８Ｇ：Ｓ４＊のように、シンデカン−１および−２を過剰発現する細胞はＦＮＩＩＩ１３にもテネイシン−Ｃにも結合しなかった。Ｔ９８Ｇ：Ｓ１とＴ９８Ｇ：Ｓ２におけるシンデカン過剰発現をシンデカン−１および−２特異的抗体を用いた免疫蛍光によって確認した。シンデカン−２発現はニワトリ抗−シンデカン−２とのインキュベーション、その後のウサギ抗−ニワトリおよびＦＩＴＣ結合ヤギ抗−ウサギ免疫染色によって判定した。
【０１４１】
細胞拡張のレスキューはシンデカン−４の活性化によってのみ達成され、シンデカン−１または−２によっては達成されない。ＦＮＩＩＩ１３はそれゆえシンデカン−４のリガンドであり、テネイシン−Ｃは特異的にシンデカン−４のＦＮＩＩＩ１３に対する結合に競合し、それによってフィブロネクチン上の細胞拡張を阻止する。
【実施例１６】
【０１４２】
フィブロネクチンの第１３フィブロネクチンタイプＩＩＩリピート（ＦＮＩＩＩ１３）の断片がシンデカン−４に結合する
実施例１５と同じ実験を行って、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＦＮＩＩＩ１３の組換え断片について調査し、シンデカン−４のリガンド候補としての配列番号４に示す配列の最初の１０アミノ酸を有する断片について調査した。
【国際公開パンフレット】
2005502646.tif 000004
2005502646.tif 000005
2005502646.tif 000006
2005502646.tif 000007
2005502646.tif 000008
2005502646.tif 000009
2005502646.tif 000010
2005502646.tif 000011
2005502646.tif 000012
2005502646.tif 000013
2005502646.tif 000014
2005502646.tif 000015
2005502646.tif 000016
2005502646.tif 000017
2005502646.tif 000018
2005502646.tif 000019
2005502646.tif 000020
2005502646.tif 000021
2005502646.tif 000022
2005502646.tif 000023
2005502646.tif 000024
2005502646.tif 000025
2005502646.tif 000026
2005502646.tif 000027
2005502646.tif 000028
2005502646.tif 000029
2005502646.tif 000030
2005502646.tif 000031
2005502646.tif 000032
2005502646.tif 000033
2005502646.tif 000034
2005502646.tif 000035
2005502646.tif 000036
2005502646.tif 000037
2005502646.tif 000038
2005502646.tif 000039
2005502646.tif 000040
2005502646.tif 000041
2005502646.tif 000042
2005502646.tif 000043
2005502646.tif 000044
2005502646.tif 000045
2005502646.tif 000046
2005502646.tif 000047
2005502646.tif 000048
2005502646.tif 000049
2005502646.tif 000050
2005502646.tif 000051
2005502646.tif 000052
2005502646.tif 000053
2005502646.tif 000054
2005502646.tif 000055
2005502646.tif 000056
2005502646.tif 000057
2005502646.tif 000058
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502646.tif 000059
【国際調査報告】
2005502646.tif 000060
2005502646.tif 000061
2005502646.tif 000062
2005502646.tif 000063
2005502646.tif 000064
2005502646.tif 000065