(57)【要約】組換え宿主細胞によってｐＨＳを産生するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの方法を開示する。この宿主細胞は、チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子のいずれかとの組み合わせで、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）
ａ）チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
ｂ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子と
を含んでなる組換え宿主細胞と発酵性炭素基質とを接触させ、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシスチレンを産生するのに十分な時間、該組換え細胞を成長させ、
（ｉｉｉ）場合により該パラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなる、パラ−ヒドロキシスチレンの産生方法。
【請求項２】
（ｉ）
ｃ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
ｄ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子と
を含んでなる組換え宿主細胞と発酵性炭素基質とを接触させ、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシスチレンを産生するのに十分な時間、該組換え細胞を成長させ、
（ｉｉｉ）場合により該パラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなる、パラ−ヒドロキシスチレンの産生方法。
【請求項３】
該発酵性炭素基質が、単糖類と、オリゴ糖類と、多糖類と、二酸化炭素と、メタノールと、ホルムアルデヒドと、ギ酸塩と、炭素含有アミンと、よりなる群から選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該発酵性炭素基質が、グルコースとラクトースと、よりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該組換え宿主細胞が、細菌と、酵母と、糸状菌類と、シアノバクテリア藻類と、植物細胞と、よりなる群から選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
該組換え宿主細胞が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）と、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）と、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）と、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）と、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）と、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）と、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）と、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）と、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ）と、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）と、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）と、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）と、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）と、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）と、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）と、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）と、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）と、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）と、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）と、アルトロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）と、ブレビバクテリア（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）と、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）と、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）と、よりなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該組換え宿主細胞がフェニルアラニン過剰産生株である請求項４に記載の方法。
【請求項８】
該フェニルアラニン過剰産生株が、ミクロバクテリウムアンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ  １０１５５と、コリネバクテリウムリリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ  ｌｉｌｌｉｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２２４３と、ブレビバクテリウムディバリカツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２３１１と、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４と、アルトロバクターシトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  １１６２４と、よりなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該組換え宿主細胞がチロシン過剰産生株である請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
該チロシン過剰産生株が、ミクロバクテリウムアンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ  １０１５５と、コリネバクテリウムリリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ  ｌｉｌｌｉｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２２４３と、ブレビバクテリウムディバリカツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＮＲＲＬ−Ｂ−２３１１と、アルトロバクターシトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  １１６２４と、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ＳＤ−２０と、よりなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該宿主細胞が、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子をさらに含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有する該ポリペプチドが、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＡＢ０５５５０８、ジェンバンクＡＢ０５５５０８、ジェンバンクＡＦ２８６６４８、ジェンバンクＡＦ２１２３１８、スイスプロット（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）Ｐ４８５２２、ジェンバンクＡＦ３０２４９５、スイスプロットＱ４３０５４、スイスプロットＱ０４４６８、スイスプロットＱ４３２４０、ジェンバンクＡＦ２５５０１４に記載の遺伝子によってコードされる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該組換え宿主細胞が、ダイズと、ナタネと、ヒマワリと、ワタと、トウモロコシと、タバコと、アルファルファと、コムギと、オオムギと、オートムギと、モロコシと、コメと、ブロッコリーと、カリフラワーと、キャベツと、パースニップと、メロンと、ニンジンと、セロリと、パセリと、トマトと、ジャガイモと、イチゴと、ラッカセイと、ブドウと、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐ）と、サトウダイコンと、サトウキビと、マメ類と、エンドウマメと、ライムギと、アマと、広葉樹と、針葉樹と、まぐさと、よりなる群から選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
該チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、チロシンに対する触媒効率が約４．１４×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１から約１×１０９Ｍ−１ｓｅｃ−１のポリペプチドをコードする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
該チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号２と、配列番号１３と、配列番号１４と、配列番号１５と、配列番号１６と、配列番号１７と、配列番号１８と、よりなる群から選択されるポリペプチドをコードする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
該パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、（ＡＡＣ４５２８２．１  ＧＩ：１７６２６１６）と、（ＡＡＦ８２７６１．１  ＧＩ：９０８２１６８）と、（ＡＡＦ８２７６２．１  ＧＩ：９０８２１７０）と、（ＡＡＦ８２７６３．１  ＧＩ：９０８２１７２）と、（ＡＡＦ８２７６６．１  ＧＩ：９０８２１７８）と、（ＡＡＫ８５４３３．１  ＧＩ：１５１５０３９１）と、（ＣＡＣ１６７９４．１  ＧＩ：１１３２２４５８）と、（ＣＡＣ１８７１９．１  ＧＩ：１１６９１８１０）と、（ＮＰ＿２６８０８７．１  ＧＩ：１５６７３９１２）と、に記載されているポリペプチドをコードする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
該パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号４または配列番号６に記載のポリペプチドをコードする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、ロドトルラグルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来のものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と、
ｂ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と
を含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項２２】
ａ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と、
ｂ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と
を含んでなる、組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本件出願は２００２年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／３８３４５０号の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は分子生物学および微生物学の分野に関する。特に、本発明はグルコースなどの単純な炭素源からパラ−ヒドロキシスチレンを産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
樹脂、コーティング、インキの製造をはじめとする多種多様な工業用途での利用が見込める周知の化合物のひとつに、パラ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）がある。
【０００４】
ｐＨＳの化学的な合成方法は多数知られている。たとえば、５ステップからなるプロセスではエチルベンゼンから（特許文献１）、あるいは２ステップからなるプロセスであればパラ−ヒドロキシアセトフェノールから（特許文献２）ｐＨＳを生成することができる。こうした方法を用いればｐＨＳを生成できることに違いはないが、これには強酸性または強塩基性の反応条件下で反応温度を高くしなければならない上、必要のない副生物が大量に生成されるのが普通である。また、化学的な方法では高価な開始材料を用いる必要があり、これがｐＨＳの産生コストを増すことになる。ｐＨＳにはさまざまな用途があるにもかかわらず、この素材を得るための安価な原料はいまのところ開発されていない。
【０００５】
菌・カビ（非特許文献１）および（非特許文献２）、酵母（非特許文献３）、グラム陰性菌ならびにグラム陽性菌（非特許文献４）および（非特許文献５）をはじめとする多数の微生物で４−ヒドロキシスチレンが生成されることが知られている。上記の事例のいずれにおいても、フェニルプロパノイドクラスのカルボン酸が脱炭酸化され、対応する４−ヒドロキシスチレンが生成される。
【０００６】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性によってパラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）がｐＨＳに変換される（非特許文献６）。クレブシエラオキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）由来の４−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ断片をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にて構成的に発現させると４−ヒドロキシスチレンが放出されるとの報告がなされた。この組換え宿主細胞には、想定されるｐＨＳ前駆体であるパラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）を産生する他の遺伝子はまったく含まれていなかった。
【０００７】
さらに、ハシドコ（Ｈａｓｈｉｄｏｋｏ）らは、クレブシエラオキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）由来のヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼによって４−ヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化することでヒドロキシスチレンが生成されることも示した（非特許文献７）。このハシドコ（Ｈａｓｈｉｄｏｋｏ）らによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物学的なｐＨＳ産生方法には、高価な開始材料であるｐＨＣＡから極めて低い力価しか得られないという制約がある。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，５０３，２７１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５２３，３７８号明細書
【非特許文献１】ベイン（Ｂａｙｎｅ）ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９５、１８８〜１９０（１９７６）
【非特許文献２】ハラダ（Ｈａｒａｄａ）ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１、１２５８〜１２６２（１９７６）
【非特許文献３】グッディ（Ｇｏｏｄｅｙ）ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２８、２６１５〜６２０（１９８２）
【非特許文献４】フィンクル（Ｆｉｎｋｌｅ）ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３７、２９２６〜２９３１（１９６２）
【非特許文献５】リンゼイ（Ｌｉｎｄｓａｙ）ら、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ３９、１８１〜１８７（１９７５）
【非特許文献６】ハシドコ（Ｈａｓｈｉｄｏｋｏ）ら、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８（１）、２１７〜２１８（１９９４）
【非特許文献７】Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９８）、３５９（２）、２２５〜２３０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記に鑑みると、炭水化物または糖類などの安価な材料を用いるｐＨＳの産生方法を提供し、かつ、ｐＨＣＡ中間体を用いてｐＨＳ産生プロセスの効率を高めることは、当該技術分野におけるひとつの進展となろう。この方法が副生物の発生を抑えつつ所望の生成物を高い濃度で産生できるものであると特に好都合であろう。このような方法を開発するには、グルコースなどの炭水化物からｐＨＣＡへの変換ならびにｐＨＣＡからｐＨＳへの変換を担う遺伝子装置（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を操作できなければならない。
【００１０】
上述した生物学的・化学的な系ではｐＨＳの産生に役立つ場合のある多数の経路が得られるが、未だこのモノマーの効率的な産生には至っていない。したがって、解決すべき課題は、安価な基質または発酵性炭素源を用いて生物源からｐＨＳを効率的に産生するための方法を設計し、これを実施することである。本願出願人らは、微生物宿主を画策してフェニルアラニンアンモニアリアーゼ／チロシンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）およびパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性をコードする外来遺伝子を発現させることでｐＨＳを生成し、上記の課題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を、チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子のうちのいずれか一方との組み合わせで発現する組換え宿主細胞によってｐＨＳを産生するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの方法を含んでなる。
【００１２】
したがって、本発明は、
（ｉ）
ａ）チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
ｂ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子と
を含んでなる組換え宿主細胞と発酵性炭素基質とを接触させ、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシスチレンを産生するのに十分な時間、該組換え細胞を成長させ、
（ｉｉｉ）場合により該パラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなる、パラ−ヒドロキシスチレンの産生方法を提供するものである。
【００１３】
あるいは、本発明は、
（ｉ）
ａ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子と、
ｂ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子と
を含んでなる組換え宿主細胞と発酵性炭素基質とを接触させ、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシスチレンを産生するのに十分な時間、該組換え細胞を成長させ、
（ｉｉｉ）場合により該パラ−ヒドロキシスチレンを回収する
ことを含んでなる、パラ−ヒドロキシスチレンの産生方法を提供するものである。
【００１４】
さらに、本発明は、
ａ）チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と、
ｂ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と
を含んでなる、組換え宿主細胞を提供するものである。
【００１５】
同様に、本発明は、
ａ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と、
ｂ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と
を含んでなる、組換え宿主細胞を提供するものである。
【００１６】
配列表の簡単な説明
以下の配列は米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（施行規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に従ったものである。
【００１７】
配列番号１は赤色酵母（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来のフェニルアラニン−チロシンアンモニアリアーゼ（ｐａｌ／ｔａｌ）酵素のヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号２は配列番号１の推定アミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号３は乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ１）のヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号４は配列番号３の推定アミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号５は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ２）のヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号６は配列番号５の推定アミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号７は赤色酵母（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来のｐａｌの増幅に用いられるプライマーである。
【００２４】
配列番号８は赤色酵母（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来のｐａｌの増幅に用いられるプライマーである。
【００２５】
配列番号９は乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐｄｃ１の増幅に用いられるプライマーである。
【００２６】
配列番号１０は乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐｄｃ１の増幅に用いられるプライマーである。
【００２７】
配列番号１１は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐｄｃ２の増幅に用いられるプライマーである。
【００２８】
配列番号１２は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐｄｃ２の増幅に用いられるプライマーである。
【００２９】
配列番号１３は変異体ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１４はＲＭ１２０−１という変異体ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１５はＲＭ１２０−２という変異体ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１６はＲＭ１２０−４という変異体ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１７はＲＭ１２０−７という変異体ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号１８はＲＭ４９２−１という変異体ＴＡＬ酵素のアミノ酸配列である。
【００３５】
発明の詳細な記述
本願明細書および特許請求の範囲を解釈するにあたっては、以下の略号および定義を用いる。
【００３６】
「フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ」をＰＡＬと略記する。
【００３７】
「チロシンアンモニア−リアーゼ」をＴＡＬと略記する。
【００３８】
「パラ−ヒドロキシケイ皮酸」をｐＨＣＡと略記する。
【００３９】
「ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ」をＣ４Ｈと略記する。
【００４０】
「パラ−ヒドロキシスチレン」をｐＨＳと略記する。
【００４１】
「パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼをＰＤＣと略記する。
【００４２】
本願明細書では「ケイ皮酸」および「ケイ皮酸塩」という用語を同義のものとして使用し、ＣＡと略記する。
【００４３】
「ＴＡＬ活性」という用語は、チロシンからｐＨＣＡへの直接的な変換を触媒するタンパク質の機能を示す。
【００４４】
「ＰＡＬ活性」という用語は、フェニルアラニンからケイ皮酸への変換を触媒するタンパク質の機能を示す。
【００４５】
「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」という用語は、ケイ皮酸からｐＨＣＡへの触媒変換を担うタンパク質の系を示す。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼの機能を果たす当該技術分野において周知のいくつかの酵素または酵素系のうちのひとつである。本願明細書において使用する「ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ」という用語がケイ皮酸からｐＨＣＡへの変換を引き起こす一般的な酵素活性を示すのに対し、「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」という用語は、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性を持つ特定の二成分タンパク質系を示す。
【００４６】
「Ｃ４Ｈ」という表現はケイ皮酸塩の水酸化に必要なｐ４５０／ｐ４５０レダクターゼ系のＰ−４５０酵素と等価であるケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼを示す。
【００４７】
「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」という用語は、ＰＡＬ活性とＴＡＬ活性の両方を含むタンパク質を示す。このようなタンパク質は、酵素基質としてのチロシンとフェニルアラニンの両方に対して少なくともいくらかの特異性を持つ。
【００４８】
「変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ」という用語は、ＰＡＬ活性よりもＴＡＬ活性の方が大きい野生型ＰＡＬ酵素に由来するタンパク質を示す。変異体ＰＡＬ／ＴＡＬタンパク質は、もともとフェニルアラニンよりもチロシンに対して高い基質特異性を持つものである。
【００４９】
「フェニルアラニン過剰産生株」という用語は、その株の野生型で見られるよりもかなり高い内在レベルでフェニルアラニンを産生する微生物株を示す。Ｅ．ｃｏｌｉフェニルアラニン過剰産生体の具体例のひとつにＥ．ｃｏｌｉ株ＮＳＴ７４（米国特許第４，６８１，８５２号明細書）がある。また、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（イケダ（Ｉｋｅｄａ），Ｍ．およびカツマタ（Ｋａｔｓｕｍａｔａ），Ｒ．  トリプトファン産生コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株でチロシンまたはフェニルアラニンを産生するための代謝工学、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）、５８（３）、第７８１〜７８５ページ）もあげられる。
【００５０】
「チロシン過剰産生株」という用語は、その株の野生型で見られるよりもかなり高い内在レベルでチロシンを産生する微生物株を示す。チロシン過剰産生体の具体例のひとつにオムニジーンバイオプロダクツインコーポレイテッド（Ｏｍｎｉｇｅｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）（マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）から得られるＴＹＩ株がある。また、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（マサト（Ｍａｓａｔｏ），Ｉ．およびリョウイチ（Ｒｙｏｉｃｈｉ），Ｋ．  トリプトファン産生コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株でチロシンまたはフェニルアラニンを産生するための代謝工学、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）、５８（３）、第７８１〜７８５ページ、ハギノ（Ｈａｇｉｎｏ），Ｈ．およびナカヤマ（Ｎａｋａｙａｍａ），Ｋ．  微生物による芳香族アミノ酸の産生、Ａｇｒ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９７３）、３７（９）、第２００１〜２００５ページおよび２０１３〜２０２３ページ）ならびにブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（イトウ（Ｉｔｏ），Ｈ．サクライ（Ｓａｋｕｒａｉ），Ｓ．タナカ（Ｔａｎａｋａ），Ｔ．サトウ（Ｓａｔｏ），Ｋ．エネイ（Ｅｎｅｉ），Ｈ．  ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）からのＬ−チロシン産生体の遺伝子育種、Ａｇｒ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９９０）、５４（３）、第６９９〜７０５ページ）もあげられる。
【００５１】
「触媒効率」という用語は、酵素のｋｃａｔ／ＫＭであると定義される。「触媒効率」は、基質に対する酵素の特異性を表す目的で用いられる。
【００５２】
「ｋｃａｔ」という表記は「代謝回転数」に用いられることが多い。「ｋｃａｔ」という表記は、単位時間に生成物に変換された基質分子の活性部位あたりの最大数または単位時間に酵素が代謝回転した回数として定義される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］であり、式中、［Ｅ］は酵素濃度（フェルスト（Ｆｅｒｓｔ）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、第２版；Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）：ニューヨーク、１９８５；第９８〜１２０頁）。
【００５３】
「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝される炭素源、特に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、一炭素基質またはこれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を示す。
【００５４】
「相補的である」という表現については、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を示す際に使用する。たとえば、ＤＮＡに関していえば、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明には、添付の配列表に記載の完全配列に対して相補的である単離された核酸断片のみならず、実質的に類似の核酸配列も含まれる。
【００５５】
「遺伝子」とは、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する制御配列をはじめとする特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「天然遺伝子」または「野生型遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ自然界に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含んでなるあらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含んでなるものであってもよいし、同一起源由来であるが自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含んでなるものであってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノムにおいて正常な位置にある天然遺伝子を示す。「外来遺伝子」とは、宿主生物には通常は見られないが、遺伝子移行によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子は、自然界には存在しない生物に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなる場合がある。
【００５６】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。
【００５７】
「好適な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列があげられる。
【００５８】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含んでなるものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほぼ常に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。
【００５９】
「作動的に結合された」という表現は、一方の機能が他方に影響するような形で１つの核酸断片上に核酸配列が会合した状態を示す。たとえばプロモーターであれば、コード配列の発現に影響をおよぼすことができる（すなわちそのコード配列がプロモーターの転写制御下にある）ときに、そのコード配列と作動的に結合されていると言う。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで制御配列への作動的な結合が可能なものである。
【００６０】
本願明細書で使用する「発現」という用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を示す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示すこともある。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することのできるアンチセンスＲＮＡ転写物が生成されることを示す。「過発現」とは、健常な生物または非形質転換生物において生成されるレベルを超えて遺伝子産物がトランスジェニック生物で生成されることを示す。「コサプレッション」とは、同一または実質的に類似の外来遺伝子または内在性遺伝子の発現を抑制することのできるセンスＲＮＡ転写物が生成されることを示す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００６１】
「ＲＮＡ転写物」とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写によって生じる産物を示す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これを一次転写物と呼び、一次転写物の転写後プロセシングで得られるＲＮＡ配列であれば成熟ＲＮＡと呼ぶ。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを持たず、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補であり、ｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡを示す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡ転写物を示す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的遺伝子の発現をブロックする標的の一次転写物またはｍＲＮＡの全体または一部に対して相補であるＲＮＡ転写物を示す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列など特定の遺伝子転写物のどの部分に対するものであってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳はされないが、それでもなお細胞プロセスに対する影響力を持つ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは他のＲＮＡを示す。
【００６２】
「形質転換」とは、核酸断片が宿主生物のゲノムに移行し、遺伝的に安定した遺伝継承がなされることを示す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ぶ。
【００６３】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」の各用語は、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形で、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持っていることの多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状で一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する特定のベクターを示す。
【００６４】
本願明細書で利用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は当該技術分野において周知のものであり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９（以下、「マニアティス」とする）およびシルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．およびエンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、１９８４ならびにオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーンパブリッシングアンドウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版、１９８７によって説明されている。
【００６５】
本発明はパラ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）を産生するための生物学的な方法を説明するものである。これらの方法では、タンパク質のフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）活性またはチロシンアンモニア−リアーゼ（ＴＡＬ）活性ならびにパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性をコードする遺伝子を利用する。ＰＡＬ活性はＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ［ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）およびＰ−４５０レダクターゼ］系の存在下でフェニルアラニンをｐＨＣＡに変換するものである。ＴＡＬ活性の高い酵素はチロシンを中間工程なしで直接ｐＨＣＡに変換する。パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼはｐＨＣＡをｐＨＳに脱炭酸化することが知られている。
【００６６】
したがって、微生物宿主を工学設計し、ＰＡＬおよびＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子と併用して、ＰＤＣをコードする遺伝子を少なくとも１つ導入するか、あるいはＴＡＬ活性をコードする遺伝子を用いるかのいずれかで、ｐＨＳを産生することができる。
【００６７】
本発明は、イオン交換樹脂、インキ用バインダー樹脂、ポリマーブレンド相溶化剤、選択透過膜、ポリマー担体をはじめとするさまざまな商業材料において役立つｐＨＳへの安価な生物学的経路を提供するものである。また、ＵＶ硬化型コーティング、金属表面処理剤、高温ホットメルト接着剤の用途といったさまざまなコーティング用途にｐＨＳを利用することもできる。
【００６８】
遺伝子
本発明において用いる鍵になる酵素活性は、当該技術分野において周知の多数の遺伝子によってコードされる。主な酵素活性として、フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）があげられる。組換え宿主にＰＡＬ酵素を用いるのが望ましい場合は、ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）またはＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系のいずれかをコードする遺伝子を得て発現させなければならないこともある。
【００６９】
フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）活性、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性。
ＰＡＬをコードする遺伝子は当該技術分野において周知であり、このうちいくつかは植物と微生物の両方のソースですでに配列が決定されている（たとえば、ＥＰ  ３２１４８８号明細書［赤色酵母（Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）］、国際公開第９８１１２０５号パンフレット［ユーカリグランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）およびラジアタ松（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）］、国際公開第９７３２０２３号パンフレット［ペチュニア］、特開平０５−１５３９７８号公報［エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）］、国際公開第９３０７２７９号パンフレット［ジャガイモ、コメ］を参照のこと）。ＰＡＬ遺伝子の配列については入手可能である（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ０１０１４３およびＸ７５９６７を参照のこと）。組換え宿主で野生型ＰＡＬ遺伝子を発現させると望ましい場合、野生型遺伝子を、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）、赤色酵母属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）およびスポロボロミセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）などの酵母、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの細菌生物、エンドウマメ、ジャガイモ、コメ、ユーカリ、マツ、トウモロコシ、ペチュニア、シロイヌナズナ、タバコ、パセリなどの植物を含むがこれに限定されるものではない、どのようなソースから得るようにしてもよい。
【００７０】
ＴＡＬ活性のみを持つ、すなわち、ｐＨＣＡを産生するための基質としてチロシンのみを利用する酵素をコードする遺伝子は知られていない。しかしながら、上述したＰＡＬ酵素の中にはチロシンに対する基質親和性をいくらか有する酵素もあり、最近になってロドバクターカプスレイタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）から明らかになった酵素ではチロシンに対する触媒効率がフェニルアラニンに対する触媒効率よりも約１５０倍高い（キント（Ｋｙｎｄｔ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５１２：  ２４０（２００２）。したがって、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子を、上述したｐａｌ遺伝子と同時に同定および単離できる可能性がある。たとえば、パセリから単離したＰＡＬ酵素（アパート（Ａｐｐｅｒｔ）ら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２５：４９１（１９９４）およびトウモロコシから単離したＰＡＬ酵素（ハヴィール（Ｈａｖｉｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４８：１３０（１９７１）にはどちらも基質としてチロシンを利用する機能があることが分かっている。同様に、赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）から単離したＰＡＬ酵素（ホッジンス（Ｈｏｄｇｉｎｓ）  Ｄ．Ｓ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４６：２９７７（１９７１）も基質としてチロシンを利用できる。このような酵素を本願明細書ではＰＡＬ／ＴＡＬ酵素または活性と呼ぶ。ＰＡＬ／ＴＡＬ活性をコードする野生型遺伝子を発現する組換え生物を作出するのが望ましい場合、ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）およびハヴィール（Ｈａｖｉｒ）、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ；アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）：ニューヨーク、１９８１；第７巻、第５７７〜６２５頁に記載されているように、トウモロコシ、コムギ、パセリ、リゾクトニアソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポロボロミセスパラロセウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）、赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）から単離した遺伝子を用いることができ、このうち赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）から単離した遺伝子が好ましい。
【００７１】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）をコードする遺伝子は周知であり、いずれも本発明においては適するものとなり得る。たとえば、ＰＤＣをコードする遺伝子が、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＡＡＣ４５２８２．１  ＧＩ：１７６２６１６  ）、ラクトバチルスクリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＡＡＦ８２７６１．１  ＧＩ：９０８２１６８）、ラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）（ＡＡＦ８２７６２．１  ＧＩ：９０８２１７０）、ラクトバチルスペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）（ＡＡＦ８２７６３．１  ＧＩ：９０８２１７２）、ラクトバチルスブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（ＡＡＦ８２７６６．１  ＧＩ：９０８２１７８）、ラクトバチルスサケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）（ＡＡＫ８５４３３．１  ＧＩ：１５１５０３９１）、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）（ＣＡＣ１６７９４．１  ＧＩ：１１３２２４５８）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）（ＣＡＣ１８７１９．１  ＧＩ：１１６９１８１０）、ラクトコッカスラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＮＰ＿２６８０８７．１  ＧＩ：１５６７３９１２  ）から単離されており、このうちラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離され、それぞれ配列番号４および配列番号６に示すポリペプチドをコードするＰＤＣ遺伝子が好ましい。
【００７２】
フェニルアラニンからｐＨＣＡへの変換用の主な酵素としてＰＡＬを選択する場合、ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ活性およびＰ−４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のクローニングが必要になることがある。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系を発現させるのが望ましい場合、この系の遺伝因子は周知であり、当該技術分野において入手可能である。たとえば、レダクターゼはすでに、キクイモ（ヘリアンサスツベロスス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、［ｅｍｂｌ位置  ＨＴＵ２ＮＦＲ、登録番号２６２５０．１］、パセリ（ペトロセリナムクリスパム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）［コープマン（Ｋｏｏｐｍａｎｎ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４（２６）、１４９５４〜１４９５９（１９９７）、［位置ＡＦ０２４６３４登録番号ＡＦ０２４６３４．１］、カリフォルニアポピー（エスコルチアカリフォルニカ（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、ロスコ（Ｒｏｓｃｏ）ら、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３４８（２）、３６９〜３７７（１９９７）、［位置ＥＣＵ６７１８６登録番号Ｕ６７１８６．１］、アラビドプシスサリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）［ｐｉｒ：位置Ｓ２１５３１］、カラスノエンドウ（フィシアサティバ（Ｖｉｃｉａ  ｓａｔｉｖａ）、［ｐｉｒ：位置Ｓ３７１５９］、リョクトウ（ビグナラジアタ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）、シェット（Ｓｈｅｔ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０（７）、２８９０〜２８９４（１９９３）、［ｐｉｒ：位置Ａ４７２９８］、ケシ（パパヴェルソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、［位置ＰＳＵ６７１８５登録番号Ｕ６７１８５．１］から単離されている。
【００７３】
シトクロムＰ−４５０はすでに、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、［ｅｍｂｌ位置ＨＴＴＣ４ＭＭＲ、登録番号Ｚ１７３６９．１］、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、［スイスプロット（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）：位置ＴＣＭＯ ＺＩＮＥＬ、登録番号Ｑ４３２４０］  ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）［スイスプロット：位置ＴＣＭＯ ＣＡＴＲＯ、登録番号Ｐ４８５２２］、アメリカヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）［スイスプロット：位置ＴＣＭＯ ＰＯＰＴＭ、登録番号Ｏ２４３１２］、ヤマナラシキタカミハクヨウ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｋｉｔａｋａｍｉｅｎｓｉｓ）［スイスプロット：位置ＴＣＭＯ ＰＯＰＫＩ、登録番号Ｑ４３０５４］、シナカンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ）［スイスプロット：位置ＴＣＭＯ ＧＬＹＥＣ、登録番号Ｑ９６４２３］、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）［スイスプロット：位置ＴＣＭＯ ＳＯＹＢＮ、登録番号Ｑ４２７９７］ならびに他のソースから単離されている。
【００７４】
ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）をコードする遺伝子も周知であり、ムラサキ属（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ）（ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＡＢ０５５５０８、ジェンバンクＡＢ０５５５０８）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）（ジェンバンクＡＦ２８６６４８）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）（ジェンバンクＡＦ２１２３１８）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）（スイスプロットＰ４８５２２）、ハコヤナギ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）（ジェンバンクＡＦ３０２４９５、スイスプロットＱ４３０５４）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）（スイスプロットＱ０４４６８）ジニア属（Ｚｉｎｎｉａ）、（スイスプロットＱ４３２４０）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）（ジェンバンクＡＦ２５５０１４）をはじめとするさまざまな植物源から単離されている。
【００７５】
本発明は上述した特定の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に限定されるものではなく、標準的な方法で得られるこのような遺伝子の好適な相同体も包含することは理解できよう。配列依存性プロトコールを利用してこれらの遺伝子に対する相同体を得る方法は当該技術分野において周知である。配列依存性プロトコールの例としては、核酸ハイブリダイゼーション法ならびに、核酸増幅技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）など）のさまざまな用途に見られるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法があげられるが、これに限定されるものではない。
【００７６】
たとえば、既知の配列の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして利用して、上述した活性を有するポリペプチドのいずれかの相同体をコードする遺伝子を直接単離し、当業者間で周知の方法で所望の植物、菌・カビ、酵母または細菌からライブラリをスクリーニングすることが可能であった。当該技術分野において周知の方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲）で、文献に記載の（ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ）核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを設計し、合成することができる。さらに、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識法などの当業者間で周知の方法で、完全配列を使ってＤＮＡプローブを直接合成したり、あるいは利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使ってＲＮＡプローブを直接合成したりすることも可能である。さらに、特定のプライマーを設計し、これを利用して本配列の一部または全長を増幅することが可能である。得られる増幅産物については、増幅反応時に直接標識してもよいし、増幅反応後に標識し、適切なストリンジェンシーの条件下で全長ｃＤＮＡ断片またはゲノム断片を単離するためのプローブとして利用してもよい。
【００７７】
また、文献に記載の配列の短いセグメント２つをポリメラーゼ連鎖反応のプロトコールに利用し、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードする長めの核酸断片を増幅することができる。一方のプライマーの配列を文献に記載の配列由来のものとし、他方のプライマーの配列で細菌遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸領域の存在を利用して、クローニングされた核酸断片のライブラリでポリメラーゼ連鎖反応を行うようにしてもよい。あるいは、第２のプライマーの配列をクローニングベクター由来の配列に基づくものとしても構わない。たとえば、当業者であれば、ＲＡＣＥプロトコール（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従ってＰＣＲでｃＤＮＡを生成し、転写物中の一点と３’末端または５’末端との間の領域のコピーを増幅することができる。文献に記載の配列から、３’方向のプライマーと５’方向のプライマーとを設計することが可能である。市販の３’ＲＡＣＥ系または５’ＲＡＣＥ系（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）  ＢＲＬ、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））を利用すれば、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離することができる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）；ロウ（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【００７８】
変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ活性：
チロシンからＰＨＣＡへの直接的な変換が望ましい場合、フェニルアラニンに対する基質特異性よりもチロシンに対する基質特異性の高い変異体ＰＡＬ／ＴＡＬ活性を発現する変異体を誘導すると都合がよい。このような変異体の産生にはさまざまな方法を利用できる。一般に、この方法ではフェニルアラニンに対する基質特異性よりもチロシンに対する基質特異性の高いＰＡＬ／ＴＡＬ活性を持つ生物を選択することになる。通常、基質特異性はｋｃａｔ／ＫＭ（触媒効率）で表されるが、これは酵素において同定された活性部位の数を基準にして算出されるものである。
【００７９】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼは分子量が約３３０，０００であり、約８０ｋＤａの同一のサブユニット４つで構成されている（ハヴィール（Ｈａｖｉｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４：１６２０〜１６２６（１９７５））。また、ＰＡＬには触媒的に重要なデヒドロアラニン残基が含まれるのではないかという意見がある（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）ら、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４１：１〜１７（１９７０））。パセリのＰＡＬのＳｅｒ−２０２がデヒドロアラニンの前駆体であることが明らかになっている（ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：１０８６７〜１０８７１（１９９７））。相同的な酵素であるヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）の結晶構造に関する最近の研究から得られる情報を用いてＰＡＬのｋｃａｔを算出した。これらの研究では、酵素の活性部位における求電子的な反応性残基が４−メチリデン−イミダゾール−５−オンであり、これがＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列を含む残基１４２〜１４４の環化および脱水によって自己触媒的に形成されるものであることが明らかになった（シュウェーデ（Ｓｃｈｗｅｄｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：５３５５〜５３６１（１９９９））。現在までに研究がなされている四量体のＰＡＬ酵素はいずれも活性部位それぞれにＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列を含むため、ＰＡＬの各活性部位にこの配列から形成される４−メチリデン−イミダゾール−５−オンも含まれている可能性が高い。
【００８０】
本発明に関してみれば、突然変異誘発の目的で選択する好適な野生型酵素の触媒効率はチロシンの場合で約４．１４×１０３から１×１０９Ｍ−１ｓｅｃ−１であり、この触媒効率が約１×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１から約５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１の範囲にあると好ましい。
【００８１】
好適なＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を選択するプロセスでは、弱い発現ベクターを作製し、突然変異を誘発し、ｐａｌコード配列を発展させ、最後にＴＡＬ活性が亢進した変種を選択する必要がある。
【００８２】
ｐａｌの突然変異誘発：
ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素の突然変異誘発にはさまざまな手法を用いることができる。本願明細書で使用する好適な手法として、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ（レオン（Ｌｅｕｎｇ）ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１：１１〜１５（１９８９）およびツォウ（Ｚｈｏｕ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６０５２〜６０５２（１９９１）およびスピー（Ｓｐｅｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：７７７〜７７８（１９９３））とｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発の２つがあげられる。
【００８３】
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの主な利点として、この方法で導入する突然変異はすべてｐａｌ遺伝子内にあり、ＰＣＲ条件を変えるだけでどのような変化でも容易に制御できるという点がある。あるいは、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）のストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、グリーナー（Ｇｒｅｅｎｅｒ）およびカラハン（Ｃａｌｌａｈａｎ）、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ７：３２〜３４（１９９４）から入手可能なＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ株およびＥｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ変異誘発遺伝子株などの市販の材料を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発を利用してもよい。この株では主要なＤＮＡ修復経路のうち３つ（ｍｕｔＳ、ｍｕｔＤ、ｍｕｔＴ）が不足しているため、野生型の場合と比して変異率が５０００倍になる。ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発はライゲーション効率に左右されない（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの場合同様）が、ベクターのどの領域でも変異が起こる可能性があり、一般に変異率はかなり低い。
【００８４】
突然変異誘発方法の如何を問わず、触媒効率が約４．１４×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１から約１×１０９Ｍ−１ｓｅｃ−１の酵素を得ることを想定しており、一般的な触媒効率は約１２．６×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１である。
【００８５】
ＴＡＬ活性が亢進した変種の選択：
ｐＨＣＡ反応に対するチロシンの可逆性による選択
ＴＡＬ活性が亢進したタンパク質をコードする遺伝子を持つ変異体を選択するために、ｐＨＣＡ反応に対するチロシンの可逆性を利用した選択系を開発した。チロシンのｐＨＣＡへの変換を担うＴＡＬ活性が逆の反応で平衡状態になることは明らかであろう。チロシンがないと成長できないＥ．ｃｏｌｉチロシン栄養要求株に変異体遺伝子を標準的な方法でクローニングした。形質転換体を適切な濃度のｐＨＣＡの存在下でチロシンマイナス培地に移した。このような条件下で成長したコロニーを採取し、変異体遺伝子の有無を分析した。このようにして、触媒効率が約１２．６×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１であり、野生型では０．５のＰＡＬ触媒活性に対するＴＡＬ触媒活性の比が１．７である酵素を発現する遺伝子を単離した。
【００８６】
当業者であれば、亢進したＴＡＬ活性をコードする遺伝子を選択する別のスクリーンを想定することができよう。たとえば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ５８６（ＡＴＣＣ  ３３３０４）はｐ−クマル酸（ｐＨＣＡ）を効率的に分解でき、これを単一の炭素源として利用することが周知である（デルネリ（Ｄｅｌｎｅｒｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １２４４：３６３〜３６７（１９９５））。
【００８７】
ＴＡＬ／ＰＡＬ比を比較することによる選択
ＰＡＬまたはＴＡＬ活性が変化した遺伝子を同定するための高スループットのアッセイを開発することで微生物の形質転換体のスクリーニングが大幅にやりやすくなることは当業者であれば理解できよう。細胞全体のＴＡＬ活性とＰＡＬ活性とを別々に測定する簡単な方法のひとつを開示する。この方法では、ＰＡＬ活性に対するＴＡＬの比を算出し、すみやかに野生型での活性と比較してバイオ触媒の活性の変化をモニタリングすることができる。
【００８８】
必須のアミノ酸をＴＡＬ活性で同定
上記の手法を利用して、本願出願人らは、野生型遺伝子と比してＴＡＬ活性が亢進したさまざまな変異型ＰＡＬ酵素を同定した。これらの変異体については、上述した突然変異誘発およびスクリーニングの方法を用いて同定した。変異体、変化したアミノ酸残基およびＴＡＬ／ＰＡＬ活性を以下にまとめておく。
【００８９】
【表１】
2005533489.tif 000002
【００９０】
【表２】
2005533489.tif 000003
【００９１】
上述した特定の突然変異だけでなく、化学的に等価なアミノ酸による置換が可能な突然変異も本発明に包含されることは理解できよう。したがって、あるアミノ酸を非極性の脂肪族アミノ酸であるアラニンで置換する場合、これと化学的に等価なアミノ酸であるセリンで同じ部位を置換できると考えられる。このように、本発明は、野生型ＴＡＬアミノ酸配列（配列番号８）に以下のアミノ酸置換を含む変異型ＴＡＬタンパク質を提供するものである。
【００９２】
【表３】
2005533489.tif 000004
【００９３】
生成生物−微生物宿主：
本発明の生成生物には、ｐＨＣＡの生成に必要な遺伝子を発現できる一切の生物を含む。一般に、生成生物は微生物と植物とに限定される。
【００９４】
本発明においてｐＨＳを生成するのに有用な微生物としては、腸内細菌（エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）など）ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）などのメタノトローフ（Ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ）などの細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）およびシネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）などのシアノバクテリア、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などの酵母、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアルトロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）などの糸状菌類、藻類などがあげられるが、これに限定されるものではない。本発明のｐａｌ、ｐａｌ／ｔａｌ、Ｃ４Ｈおよびｐｄｃ遺伝子を上記微生物の宿主ならびに他の微生物宿主にて産生させれば、商業的に有用な大量のｐＨＳを生成することができる。
【００９５】
上述した微生物はいずれもｐＨＳの産生において有用なものと思われるが、好ましいのはフェニルアラニンまたはチロシンを過剰産生する細菌の変異体株である。本発明は遺伝因子の少なくとも２通りの異なる組み合わせを用いてｐＨＳを産生する方法を提供するものである。一例では、チロシンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子とパラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子とを発現するように組換え宿主を構成することができる。この状況では、組換え宿主がチロシンを過発現すると好ましい。チロシン過剰産生株は周知であり、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、ブレビバクテリア（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）を含むがこれに限定されるものではない。特に有用なチロシン過剰産生株は、ミクロバクテリウムアンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）  ＡＴＣＣ  １０１５５、コリネバクテリウムリリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ  ｌｉｌｌｉｕｍ）  ＮＲＲＬ−Ｂ−２２４３、ブレビバクテリウムディバリカツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）  ＮＲＲＬ−Ｂ−２３１１、アルトロバクターシトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ）  ＡＴＣＣ  １１６２４およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  ＳＤ−２０を含むがこれに限定されるものではない。他にも好適なチロシン過剰産生体が当該技術分野において周知であり、たとえば、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ、Ｔ．Ｋ．マイティ（Ｍａｉｔｉ）ら、ヒンドスタン抗生物質誌（Ｈｉｎｄｕｓｔａｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）第３７巻、５１〜６５、１９９５を参照のこと。
【００９６】
あるいは、組換え宿主が、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を、パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子との組み合わせで含むものであってもよい。この状況ではさらに、細胞は上述したようなケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼである（Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ）系を有する遺伝子を何組か発現するものでなければならない。これらの補足的な遺伝子は宿主細胞に元々あるものであってもよいし、導入されたものであってもよい。いずれにしても、主な酵素がチロシンとの対比でフェニルアラニンに対する基質優位性を有する場合、宿主細胞がフェニルアラニン過剰産生体であると好ましい。フェニルアラニン過剰産生株は周知であり、Ｅ．ｃｏｌｉ、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ブレビバクテリア（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）を含むがこれに限定されるものではない。特に有用なフェニルアラニン過剰産生株としては、ミクロバクテリウムアンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）  ＡＴＣＣ  １０１５５、コリネバクテリウムリリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ  ｌｉｌｌｉｕｍ）  ＮＲＲＬ−Ｂ−２２４３、ブレビバクテリウムディバリカツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）  ＮＲＲＬ−Ｂ−２３１１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４、アルトロバクターシトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ）  ＡＴＣＣ  １１６２４を含むがこれに限定されるものではない。他にも好適なフェニルアラニン過剰産生株が周知であり、その概要が上掲のマイティ（Ｍａｉｔｉ）ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｊ．ボンゲラテス（Ｂｏｎｇａｅｒｔｅｓ）ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ第３巻、２８９〜３００、２００１に説明されている。
【００９７】
外来タンパク質の発現を高いレベルで指示する制御配列を含む微生物の発現系および発現ベクターが当業者間で周知である。このうちどれを使ってｐＨＳ生成用のキメラ遺伝子を構築しても構わない。これらのキメラ遺伝子を形質転換して適当な微生物に導入すれば、酵素を高いレベルで発現できるようになる。
【００９８】
好適な微生物宿主細胞の形質転換に役立つベクターまたはカセットは当該技術分野において周知である。一般に、このベクターまたはカセットには、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、自己複製または染色体組み込みを可能にする配列が含まれる。好適なベクターは、転写開始制御部を含む遺伝子の５’の領域と転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’の領域とを含んでなる。これは両方の制御領域が形質転換宿主細胞と相同遺伝子に由来するものである場合に最も好ましいが、このような制御領域が産生宿主として選択した特定の種に固有の遺伝子に由来するものでなくてもよいことは理解できよう。
【００９９】
所望の宿主細胞での関連遺伝子の発現を起こさせるのに役立つ開始制御領域またはプロモーターには多くのものがあり、当業者には馴染みのあるものである。これらの遺伝子を駆動できるほとんどすべてのプロモーターが本発明に適しており、その一例として、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現に有用）、ＡＯＸ１（ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）での発現に有用）、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ，およびｔｒｃ（エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現に有用）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１００】
終結制御領域も好ましい宿主に固有のさまざまな遺伝子から誘導することができる。場合により、終結部位が必要ないこともあるが、終結部位を含む形が最も好ましい。
【０１０１】
ｐＨＳの量産が望まれる場合、さまざまな発酵法を適用することができる。たとえば、バッチ発酵法または連続発酵法のどちらでも大量産生することができる。
【０１０２】
従来からのバッチ発酵は、培地の組成物を発酵開始時に仕込み、発酵の途中で人工的に変化させることのない閉じた系のひとつである。このため、発酵開始時に所望の微生物または複数の微生物を培地に播種し、系に何も加えずに発酵を引き起こさせる。しかしながら、一般に「バッチ」発酵での炭素源の濃度には限度があるため、ｐＨおよび酸素濃度などの要因の制御が試みられることが多い。バッチ系では、発酵が停止するまで系の代謝物とバイオマス組成が絶えず変化する。バッチ培養では、細胞は動きのない誘導期から大きく成長する対数期へと移り、最後に静止期において成長率が低下または停止する。未処理の状態では、静止期の細胞は最終的には死んでしまう。最終生成物または中間体の大半が対数期の細胞によって作られるのが普通である。
【０１０３】
標準的なバッチ系のバリエーションのひとつにＦｅｄ−バッチ系がある。Ｆｅｄ−バッチ発酵プロセスも本発明において好適であり、発酵が進むにつれて基質を増やしながら加えること以外は一般的なバッチ系を含んでなる。Ｆｅｄ−バッチ系は、カタボライト抑制によって細胞の代謝が阻害されやすい場合や、培地に含まれる基質の量を制限するのが望ましい場合に有用なものである。Ｆｅｄ−バッチ系で実際の基質濃度を測定するのは困難であるため、ｐＨ、溶存酸素、ＣＯ２などの廃ガスの分圧といった測定可能な要因の変化に基づいて濃度を推測する。バッチ発酵およびＦｅｄ−バッチ発酵は、一般的かつ当該技術分野において周知であり、その一例が、本願明細書に援用するブラック（Ｂｒｏｃｋ），Ｔ．Ｄ．；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、１９８９；またはデシュパンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ），Ｍ．Ｖ．，Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７（１９９２）に記載されている。
【０１０４】
連続発酵を用いてｐＨＳを商業的に産生することもできる。連続発酵は、処理時に一定の発酵培地を連続してバイオリアクターに加えると同時に、これと同じ量の条件培地を除去する開いた系のひとつである。連続発酵では細胞が主に成長の対数期にある培養を一定の高い密度に維持するのが普通である。
【０１０５】
連続発酵では、細胞の成長または最終生成物の濃度に影響する要因をいくつでも調整することができる。たとえば、ひとつの方法では、炭素源などの限られた栄養素または窒素濃度を一定率に維持し、他のすべてのパラメータを加減できるようにする。他の系では、培地の混濁度で測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響する多数の要因を連続して変化させることができる。連続系は、定常状態の成長条件を維持することを目指すものであるため、発酵時における細胞の成長率と培地除去による細胞喪失とのバランスを保つようにしなければならない。連続発酵プロセスで栄養素と成長因子とを調節する方法ならびに、生成物の形成速度を最大限にするための手法は工業用微生物学の当該技術分野において周知であり、上掲のブラック（Ｂｒｏｃｋ）の著書においてさまざまな方法が詳細に説明されている。
【０１０６】
組換え産生−植物：
植物および藻類には本発明によるｐＨＳの産生に必要とされる酵素の多くが関与する完全かつ複雑なフェニルプロぺノイド経路があることが分かっている。本発明の核酸断片を利用して、ｐＨＳの産生に必要な遺伝子を発現する機能を持つトランスジェニック植物を作出することができる。好ましい植物宿主は、本件酵素の高い産生レベルの土台となるあらゆる種類の植物である。好適な緑色植物としては、ダイズ、ナタネ（ブラッシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラッシカカンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒマワリ（ヘリアンサスアヌース（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、ワタ（ゴシッピウムヒルスーツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（ニコチアナタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（メディカゴサティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コムギ（トリチカムｓｐ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ）、オオムギ（ホルデウムウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、オートムギ（アベナサティバエル（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｌ）、モロコシ（ソルガムバイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、コメ（オリザサティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ナタネ科の野菜類（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、パースニップなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、マメ類、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹、針葉樹、まぐさがあげられるが、これに限定されるものではない。藻類の種としては、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）およびドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）などの商業上重要な宿主があげられるが、これに限定されるものではない。所望の組織において所望の発育段階で遺伝子の発現を指示できるプロモーターにコード領域が作動的に結合された本発明のキメラ遺伝子をまず作製することで、ｐＨＳを過産生させることができる。便宜上の理由で、キメラ遺伝子が同一の遺伝子に由来するプロモーター配列と翻訳リーダー配列を含んでなることがある。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列もなければならない。さらに、本件キメラ遺伝子は、遺伝子発現を容易にするためにイントロンを１つまたはそれ以上含んでなるものであってもよい。
【０１０７】
このキメラ遺伝子配列では、コード領域の発現を誘導できるどのようなプロモーターとターミネーターとをどのように組み合わせて用いてもよい。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの好適な例として、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子から得られるものがあげられる。使用できる効率的な植物プロモーターのタイプのひとつに高等植物のプロモーターがある。このようなプロモーターは、本発明の遺伝子配列と作動的に結合された際に、本願遺伝子産物の発現を促進できるものでなければならない。本発明において使用できる高等植物のプロモーターとしては、ダイズからの例から得られるリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．  Ｇｅｎ．１：４８３〜４９８、（１９８２））ならびにクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターがあげられる。これらの２種類のプロモーターは植物細胞において光誘導されることが知られている（たとえば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．キャッシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク（１９８３）、第２９〜３８ページ、コルッチ（Ｃｏｒｕｚｚｉ），Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８：１３９９（１９８３）、ダンスミア（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ），Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５（１９８３）を参照のこと）。
【０１０８】
このようにして、本件キメラ遺伝子を含むプラスミドベクターを作製することができる。どのプラスミドベクターを選択するかは、宿主植物の形質転換に使用する方法によって決まる。当業者であれば、キメラ遺伝子を含む宿主細胞を形質転換し、選択し、増殖させる過程を成功させるにはプラスミドベクターにどのような遺伝因子を存在させておく必要があるか分かるであろう。また、当業者であれば、互いに独立した異なる形質転換イベントでは得られる発現のレベルやパターンが異なる（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８（１９８５）、デ・アルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６（１９８９））ため、所望の発現レベルとパターンとを呈する株を得るには複数のイベントをスクリーニングしなければならないことも理解できよう。このようなスクリーニングについては、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロックツェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ａｐｐｌ．，６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型の分析によって行うことができる。
【０１０９】
細胞内または細胞外でのｐＨＳ蓄積濃度を高めることにつながるｐＨＳ産生用の酵素経路のさまざまな要素の変異体を作製できるだろうと考えられる。天然遺伝子の配列を突然変異させ、活性を変化または亢進させた遺伝子産物を生成する方法にはさまざまなものが周知であり、その一例として、ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（１９９９年２月１５日）第２７巻、Ｎｏ．４、第１０５６〜１０６２ページ）、部位特異的突然変異誘発（クームス（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８）、２５９〜３１１、１プレート、編集者（ら）：アンゲレッチ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ）、ルースオーグ（Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ）。出版社：カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ））、「遺伝子シャッフリング」（本願明細書に援用する、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３７，４５８号明細書）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１１０】
好ましい実施形態の記述：
本発明において定義する産生方法は、単一の宿主生物にｐａｌ／ｔａｌ遺伝子およびｐｄｃ遺伝子を導入し、グルコースなどの再生可能な資源をｐＨＳに変換する。
【０１１１】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）をコードする有効な遺伝子を同定するために、さまざまな微生物由来の細胞抽出液をスクリーニングした。ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ＃１４９１７）でＰＤＣの濃度が高いことが観察されたため、この株を以後の研究用として選択した。さらに、さまざまな微生物について、これらの生物が高めのレベルでＰＤＣ酵素を発現しているであろうという前提で、ｐＨＣＡをｐＨＳに変換する機能を調べた。バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ＃６６３３）でｐＨＣＡからｐＨＳへの変換率が高いことが観察されたため、この株を以後の研究用として選択した。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）パラ−クマル酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク登録番号Ｕ６３８２７）の既知の配列から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、２つのｐｄｃ遺伝子を単離し、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のｐｄｃ１およびバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐｄｃ２とした。これらの遺伝子ｐｄｃ１およびｐｄｃ２を単離し、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）フェニルアラニンアンモニウムリアーゼをコードする非相同遺伝子を有するフェニルアラニン過剰産生株にクローニングした。さまざまな発酵性炭素基質で細胞を成長させると、良好な収率でｐＨＳの産生が観察された。
【実施例】
【０１１２】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
【０１１３】
ＰＣＲ増幅、ＤＮＡをクローニングするのに望ましい末端を生成するためのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるＤＮＡの修飾、ライゲーションおよびバクテリア形質転換に必要な手順が当該技術分野において周知である。本願明細書で使用する標準的な分子クローニング手法は当該技術分野において周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．，フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールドスプリング（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ）、１９８９（以下「マニアティス」）ならびにシルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．，ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．およびエンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．によるＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールドスプリング（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ）、１９８４、さらにはオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らによるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；グリーンパブリッシングアソシエーツアンドウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）；１９８７に記載されている。
【０１１４】
細菌培養の管理と成長に適した材料および方法が当該技術分野において周知である。以下の実施例において使用するのに適した手法が、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ；フィリップゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ（Ｒａｌｐｈ）  Ｎ．コスティロー（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）  Ｗ．ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）  Ａ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、ノエル（Ｎｏｅｌ）  Ｒ．クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグズフィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ），ＤＣ．，１９９４）またはＴ．Ｄ．ブラック（Ｂｒｏｃｋ）著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウアーアソシエーツインコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）（１９８９）に記載されている。特に明記しない限り、細菌細胞の成長および管理に用いる試薬、制限酵素、材料はいずれも、アルドリッチケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ＤＩＦＣＯ  ラボラトリーズ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ギブコ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）またはシグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から入手したものである。
【０１１５】
ＰＣＲ反応については、ＧｅｎｅＡＭＰ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００においてＡｍｐｌｉｔａｑまたはＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ酵素（カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）のＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。サイクリング条件および反応については製造業者の指示に従って標準化した。
【０１１６】
略号の意味は以下のとおりである。「ｓｅｃ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｄ」は日数（単数または複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（単数または複数）を意味し、「μモル」はマイクロモルを意味し」、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」はユニットを意味し、「ｍＵ」はミリユニットを意味し、「ｒｐｍ」は１分あたりの回転数を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「Ｘ−ｇａｌ」は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを意味し、「ｇ」は引力定数を意味する。
【０１１７】
基本方法：
ＨＰＬＣ分析用試料の調製：
細胞全体によって形成されたケイ皮酸、ｐＨＣＡ、ｐＨＳ、フェニルアラニンおよびチロシンの濃度を測定するためのＨＰＬＣアッセイを開発した。一般的なアッセイでは、選択した培地で成長した培養を遠心処理した後、上清２００〜１０００μＬをリン酸で酸性化し、０．２または０．４５ミクロンのフィルタを通して濾過し、ＨＰＬＣで分析して成長培地中のｐＨＳ、ｐＨＣＡ、ケイ皮酸、フェニルアラニンおよびチロシンの濃度を求めた。
【０１１８】
ＨＰＬＣ法：
オートサンプラーとダイオードアレイＵＶ／Ｖｉｓ検出器とを備えたヒューレットパッカード製の１０９０Ｌ  ＨＰＬＣ系を、ＭＡＣ−ＭＯＤ  アナリティカルインコーポレイテッド（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）（ペンシルバニア州チャッドフォード（Ｃｈａｄｄｓ  Ｆｏｒｄ）から提供された逆相Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）で用いた。アッセイではカラム温度４０℃で１分あたりの流量を１．０ｍＬとした。２５０、２３０、２７０、２９０および３１０ｎｍの波長で溶出液をモニタリングできるようにＵＶ検出器を設定した。ＨＰＬＣ分析で用いた条件を表１にまとめておく。また、表１に示す条件での分析の対象とする代謝物の保持時間を表２にあげておく。
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
【表５】
2005533489.tif 000006
【０１２１】
実施例１
無細胞抽出物中でのＰＤＣ活性のスクリーニング
この実施例の目的は、多数の細菌株ならびに酵母株のＰＤＣ酵素活性、細胞成長、ｐＨＣＡ誘導をスクリーニングすることにある。
【０１２２】
バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ＃６６３３）、シュードモナスフルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＡＴＣＣ＃１１１５６）、シュードモナスフルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＡＴＣＣ＃１７５５９）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ａ型（ＡＴＣＣ＃１７４５３）の株をグリセロールストックからＬＢプレートに画線した。ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ＃１４９１７）とロドトルラルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ）（ＡＴＣＣ＃８８９）とを栄養寒天プレートに画線した。これらの株をすべて３７℃または３０℃のいずれかで成長させた。続いてシングルコロニーを選択し、２５０ｍＬ容の滅菌フラスコに入れたＬＢ、ＭＲＳ（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）または２ｘＹＴのいずれかの液体培地５０ｍＬ中に移した。これらの細胞を振盪機にて２５０ｒｐｍで３７℃または３０℃で一晩成長させた。各株のアリコート５．０ｍＬを新鮮な培地４５ｍＬの入った２５０ｍＬ容のフラスコ２つに移した。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＡＴＣＣ＃２０３４）またはロドトルラルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ）（ＡＴＣＣ＃８８９）を含む一方のフラスコに、ｐＨＣＡを最終濃度が１．２ｍＭになるようにして加えた。これらの細胞を飽和するまで成長させた後、遠心処理によって収集した。乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株を含む一方のフラスコに、培養が対数増殖期中期に達した後にｐＨＣＡを最終濃度が１．２ｍＭになるように加え、１．０時間後に細胞を収集した。
【０１２３】
無細胞抽出物の調製：
これらの細胞を洗浄した後、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（プロテアーゼインヒビタ、ロシェモレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）１．０μｇ／ｍＬと、ベスタチン４０μｇ／ｍＬと、ＥＤＴＡ１．０ｍＭと、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手したＡＥＢＳＦ）０．１ｍｇ／ｍＬとを含有するｐＨ６．０の２５ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁させた。次に１８，０００ｐｓｉに設定したフレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ）に細胞を２回通した。遠心処理によって細胞片を除去し、得られた上清を酵素アッセイ用の無細胞抽出物として利用した。
【０１２４】
ＰＤＣ酵素アッセイ：
プラスチック製のＵＶ透過性キュベットにてｐＨ６．０の２５ｍＭリン酸緩衝液と０．２ｍＭ  ｐＨＣＡとを含む溶液１．０ｍＬに酵素１．０μＬを加えることで反応を開始させた。この反応を、ｐＨＣＡ消失のモル吸光係数を６０００ｃｍ−１に設定して室温で３１５ｎｍにて分光光度的に５分間続けた。比活性をタンパク質１ミリグラムにつき１分あたりに分解されたｐＨＣＡのマイクロモル量で表す。
【０１２５】
タンパク質アッセイ：
タンパク質アッセイキット（バイオ−ラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ヘクレス（Ｈｅｃｕｌｅｓ）を用いてウシ血清アルブミンを標準とし、製造業者のプロトコールに従って総タンパク質濃度を求めた。
【０１２６】
結果：
表３のデータから明らかなように、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、蛍光菌（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のＰＤＣ比活性がｐＨＣＡでの誘導時に増加した。乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）では、ＰＤＣ活性はｐＨＣＡの添加によってタンパク質０から１．７Ｕ／ｍｇまで増大した。
【０１２７】
【表６】
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【０１２８】
細菌および酵母によるｐＨＣＡからｐＨＳへの生物変換：
細菌である乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ならびに、酵母であるサッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびロドトルラルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ）（ＡＴＣＣ＃８８９）を、１．０ｍＭ  ｐＨＣＡを含有するＬＢ培地または２ｘＹＴ培地のいずれかにて、３０℃で一晩成長させた。１８時間後、培地の試料を上述したようにしてＨＰＬＣ分析用に採取した。表４に示した結果から明らかなように、被験細菌株では酵母株よりもＰＤＣ活性が１０から２０倍高かった。したがって、乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｐｄｃ遺伝子を以後の代謝工学に向けた宿主株からのクローニング用に選択した。
【０１２９】
【表７】
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【０１３０】
実施例２
ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＰＤＣ酵素（Ｅｎｚｍｅ）の特性
この実施例の目的は、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＰＤＣ酵素をＥ．ｃｏｌｉで過発現させ、これらの酵素を精製してさらにキャラクタリゼーションできるようにすることにある。
【０１３１】
ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐｄｃ遺伝子のクローニング：
乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とをテンプレートとして利用し、ゲノムＤＮＡを用いて配列番号３および配列番号５のｐｄｃ遺伝子をＰＣＲで増幅した。このゲノムＤＮＡについては、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）を使用して、ＭＲＳ培地で成長させた乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と、ＬＢ培地で成長させた枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とから単離した。乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のパラ−クマル酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク登録番号Ｕ６３８２７）すなわち配列番号３のｐｄｃ１遺伝子用としたオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号９で示す５’−ＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡ−３’ならびに配列番号１０で示す５’−ＴＣＡＣＧＴＧＡＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＡＴＴ−３’であり、これにはＮｄｅＩ部位（下線で示したヌクレオチド）が含まれていた。フェノール酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク登録番号ＡＦ−１７１１７）すなわち配列番号５の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）  ｐｄｃ２用としたオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１１で示す５’−ＧＴＧＴＧＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴ−３’ならびに配列番号１２で示す５’−ＴＣＧＣＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴ−３’であり、これにもＮｄｅＩ部位（下線で示したヌクレオチド）が含まれていた。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲクリーンアップキット（Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ  Ｋｉｔ）を利用してｐｄｃ１遺伝子とｐｄｃ２遺伝子の両方について推定５５０ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＴＡクローニング（ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（登録商標）キットを用いてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターにライゲートした。ワンショット（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ）（登録商標）ケミカリーコンポーネント（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＳＯＣに代えて２ｘＹＴ培地を用いたこと以外は製造業者の指示どおりに利用して形質転換を行った。Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含む５０μｇ／ｍＬアンピシリンプレートに上記の形質転換細胞を延展した。これらのプレート各々から、白色のコロニー１０個を選択し、アンピシリンプレートに再画線した。ｐｄｃ１で形質転換した細胞とｐｄｃ２遺伝子で形質転換した細胞とを用いて以下の手順を実施した。
【０１３２】
これらのコロニーを各々、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地で一晩成長させた。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプレップキット（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）を用いてプラスミドを細胞から精製した。インサートの有無を調べるために、このプラスミドを３７℃で１時間かけてＥｃｏＲＩで消化した。消化産物をキロベースマーカーと共に１％アガロースゲルに仕込み、電気泳動を実施した。得られたゲルでは、一方はインサートに対応する約５５０ｂｐ、もう一方はベクターに対応する３．９ｋｂｐの２つのバンドが観察された。
【０１３３】
上記のミニプレップのうち１つで得られたベクターを含む細胞を、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する培養液５０ｍＬ中で一晩成長させた。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミディプレップキアフィルタ（Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ）を用いて製造業者の指示に従い、ベクターをこれらの細胞から精製した。ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ｐｄｃ遺伝子から得られたプラスミドをｐＤＣ１、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｄｃ遺伝子から得られたプラスミドをｐＤＣ２とした。ベクターにＭ１３フォワードプライマーとリバースプライマーとを利用して、デュポンのシーケンシング機関（ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）において上記のインサートをシーケンシングし、配列を確認した。ベクターＮＴＩ（インフォーマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．、メリーランド州フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）））ソフトウェアを利用して、これらの配列のコンピュータ分析を行った。
【０１３４】
プラスミドｐＤＣ１を３７℃にて４時間かけてＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。プラスミドｐＤＣ２を３７℃にて４時間かけてＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化した。消化産物をキロベースマーカーと共に１％アガロースゲルに仕込み、電気泳動を実施した。ｐＤＣ１の消化産物ではインサートに対応する５５５ｂｐのバンドとベクターに対応する３．９ｋｂｐのバンドが観察された。ｐＤＣ２の消化産物ではインサートに対応する５８３ｂｐのバンドとベクターに対応する３．９ｋｂｐのバンドが観察された。インサートのバンドをゲルから切り出し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キット（Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて製造業者のプロトコールに沿って精製した。ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）から得られるｐＥＴ−１７ｂベクターを上述したようにして消化し、１％アガロースゲルで泳動させた。切断ベクターに対応する３．３ｋｂｐのベクターバンドをゲルから切り出し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）  ゲル抽出キット（Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて製造業者のプロトコールに沿って精製した。
【０１３５】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＤＣ１インサートと切断ベクターとをライゲートした。同様に、ｐＤＣ２と切断ベクターとをライゲートした。この反応物を室温にて１時間インキュベートした。各反応で得られたアリコートを用いて、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）から入手したＢ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  コンピテント細胞を、製造業者の指示に従って形質転換した。この形質転換細胞にＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間成長させた。これらの培養物のアリコートを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩成長させた。これらのプレートで得られるコロニーを新鮮なプレートに再画線した後、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地で一晩成長させた。ｐＤＣ１含有細胞の場合、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプレップキット（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）を用いてプラスミドを単離した後、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで２時間かけて消化した。消化産物をキロベースマーカーと共に１％アガロースゲルで泳動させた。１つを除くすべてのクローンにインサートが含まれることが分かった。インサートを含むクローンのうちの１つを発現研究用に選択した。ｐＤＣ２含有細胞の場合、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地で成長させた培養物の試料をおよそ１０分間ボイルした後、５分間遠心処理した。これらの試料のアリコートをＰＣＲチューブに移し、上述したようにしてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応混合物のアリコートをキロベースマーカーと共に１％アガロースゲルで泳動させた。クローンのうちの１つにインサートが含まれることが明らかになった。このクローンを発現研究用に利用した。
【０１３６】
選択したクローンを、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地で成長させた。ｐＤＣ２含有クローンの場合、培地にはクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬも含有させた。これらの培養をスターター培養とした。これらのスターター培養を新鮮な培地への播種に利用し、６００ｎｍで測定したＯＤが０．５から１．０になるまで細胞を３７℃で成長させた。続いてｐＤＣ１含有細胞培養の一方とｐＤＣ２含有細胞培養の一方に最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えた。これらの培養を３７℃で４時間かけて成長させた。続いて、細胞を遠心処理によって収集し、−８０℃で凍結させた。以後の研究では、細胞を解凍した上で、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４を各々１μｇ／ｍＬと、ベスタチン４０μｇ／ｍＬ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＡＥＢＳＦ  ０．１ｍｇ／ｍＬ、少量のＤＮａｓｅを含有する２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬに再懸濁させた。ｐＬｙｓが存在することから細胞は自然に溶解し、得られる懸濁液を１０分間遠心処理した。細胞抽出液のタンパク質濃度とＰＤＣ活性とを実施例１で説明したようにして測定した。ｐＤＣ１とｐＤＣ２で形質転換した細胞ではどちらも、誘導細胞の方が予測した分子量のタンパク質を多く産生し、酵素の比活性も誘導なしで産生した場合よりも高かった。これらの結果から、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐｄｃ遺伝子をうまくクローニングしＥ．ｃｏｌｉで発現させられたことが分かる。
【０１３７】
Ｅ．ｃｏｌｉからの組換えタンパク質精製：
上述したｐＤＣ１およびｐＤＣ２形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞各々のシングルコロニーを採取し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地１０ｍＬへの播種に利用した。この細胞を２５０ｒｐｍの振盪機にて３７℃で一晩成長させた。翌日、この培養をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地への播種に利用した。この培養を２５０ｒｐｍの振盪機にて３７℃で４時間かけてインキュベートした。培養のＯＤが６００ｎｍで０．６に達したら、１ｍＭ  ＩＰＴＧを加えた。この培養を２５０ｒｐｍの振盪機にて３７℃で４時間インキュベートした後、１６，０００×ｇでの遠心処理によって２０分かけて細胞を収集した。これらの細胞をＬＢ培地に再懸濁させ、再度９，０００×ｇで遠心処理した。細胞を２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に再懸濁させ、フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ）に最高圧力で２回通した。１４，０００ｒｐｍで３０分間の遠心処理によって細胞片を除去した。得られた上清を無細胞抽出物として利用した。
【０１３８】
後述するように硫酸アンモニウムを加えて無細胞抽出物を分画した。後述するように、比活性の最も高い５０％画分を、ＨＱカラムを用いるアニオン交換クロマトグラフでの精製に利用し、続いてＰＥカラムを用いる疎水性相互作用クロマトグラフィに利用した。
【０１３９】
硫酸アンモニウム沈殿：
１５分間の過程で最終濃度が３０％、４０％、５０％になるように、無細胞抽出物約２．０ｍＬに飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えた。試料を氷上でさらに１５分間攪拌した後、ベンチトップ遠心処理装置において最大速度（１４，０００ｒｐｍ）で４℃にて１５分間遠心処理した。上清を次の抽出ステップ用に保管した。ペレットをｐＨ６．０の２５ｍＭリン酸緩衝液２００μＬに再懸濁させた。すべての画分のＰＤＣ活性を試験した。比活性の最も高い画分（５０％上清）を２５ｍＭリン酸緩衝液１．０Ｌに対して２時間かけて透析した。
【０１４０】
ＨＱカラムでのアニオン交換クロマトグラフィ：
１．６ｍＬポロス（Ｐｏｒｏｓ）（登録商標）灌流カラム（ロシェアプライドサイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を５×カラム容量に合わせてｐＨ６．０の２５ｍＭリン酸緩衝液中で平衡化した後、透析後の５０％上清１．０ｍＬを適用した。リン酸緩衝液での洗浄後、２０×カラム容量で０．０から５００ｍＭ  ＫＣｌまで、ＫＣｌ塩勾配でカラムを溶出させた。画分（０．８ｍＬ）を回収し、ＰＤＣ活性を持つ画分をプールし、次のステップに利用した。
【０１４１】
ＰＥカラムでの疎水性相互作用クロマトグラフィ：
１００％飽和硫酸アンモニウム２．０ｍＬを加えることで、アニオン交換クロマトグラフィステップでプールした画分２ミリリットルを５０％（ＮＨ４）２ＳＯ４飽和させた。１．０Ｍ  ＮａＯＨを２０μＬ加え、ｐＨが６．８になるように調節した。得られた混合物を、ｐＨ６．８の２５ｍＭリン酸塩中で５０％硫酸アンモニウムで平衡化した１．６ｍＬポロス（Ｐｏｒｏｓ）（登録商標）ＰＥカラムに適用した。ＰＤＣをステップ勾配（５０％−３０％−２０％）で溶出させたところ、主な活性は５０％と３０％との間で溶出された。活性の高い画分をプールし、試験した。各精製ステップではＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用した。
【０１４２】
ＰＡＧＥ分析：
低分子量マーカー（１４．４から９．４ｋＤａ、アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いる変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（１２．５％分解ゲル）によって、ＰＤＣ活性のあるタンパク質抽出物を分離した。
【０１４３】
乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＰＤＣ酵素のキャラクタリゼーション：
乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離したＰＤＣ酵素の特性を標準的な分光測定・電気泳動手法で求めた。これを表５にあげておく。
【０１４４】
【表８】
2005533489.tif 000009
【０１４５】
実施例３
Ｅ．ｃｏｌｉでのｐｄｃ遺伝子の機能的発現
バージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）の米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ）から株ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１８８４として入手可能なフェニルアラニン過剰産生株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４を、乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ｐｄｃ１）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ｐｄｃ２）由来のｐｄｃ遺伝子で形質転換した場合のパラ−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）産生能について試験した。ｐＨＳは、パラ−ヒドキシ（ｈｙｄｏｘｙ）ケイ皮酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）によって触媒される一ステップ酵素反応によってパラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）から産生可能である。これら２つのｐｄｃ遺伝子すなわち、配列番号５で示すＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のｐｄｃ１と配列番号７で示すＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｐｄｃ２とをＥ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４で機能的に発現させた。後述するようにエレクトロポレーションによって形質転換を行った。
【０１４６】
ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｐｄｃ遺伝子のクローニング：
乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とをテンプレートとして利用し、ゲノムＤＮＡを用いて配列番号３および配列番号５のｐｄｃ遺伝子をＰＣＲで増幅した。このゲノムＤＮＡについては、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）を使用して、ＭＲＳ培地で成長させた乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と、ＬＢ培地で成長させた枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とから単離した。乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のパラ−クマル酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク登録番号Ｕ６３８２７）すなわち配列番号３のｐｄｃ１遺伝子用としたオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号９で示す５’−ＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡ−３’ならびに配列番号１０で示す５’−ＴＣＡＣＧＴＧＡＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＡＴＴ−３’であり、これにはＮｄｅＩ部位（下線で示したヌクレオチド）が含まれていた。フェノール酸デカルボキシラーゼ（ジェンバンク登録番号ＡＦ−１７１１７）すなわち配列番号５の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）  ｐｄｃ２用としたオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１１で示す５’−ＧＴＧＴＧＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴ−３’ならびに配列番号１２で示す５’−ＴＣＧＣＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴ−３’であり、これにもＮｄｅＩ部位（下線で示したヌクレオチド）が含まれていた。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲクリーンアップキット（Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ  Ｋｉｔ）を利用してｐｄｃ１遺伝子とｐｄｃ２遺伝子の両方について推定５５０ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＴＡクローニング（ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（登録商標）キットを用いてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターにライゲートした。続いて、これらのプラスミドをＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化し、ｐｄｃ遺伝子を含む断片を、あらかじめＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化しておいたｐＫＳＭ７１５（ＡＴＣＣから入手）にライゲートし、それぞれｐＫＳＭ−ｐｄｃ１およびｐＫＳＭ−ｐｄｃ２を形成した。
【０１４７】
エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞の調製：
フェニルアラニン過剰産生Ｅ．ｃｏｌｉ株ＮＳＴ７４のグリセロールストックの試料を抗生物質なしでアガロースプレートに延展し、３７℃で一晩インキュベートした。シングルコロニーを採取し、ＬＢ培地４．０ｍＬに播種し、３７℃で一晩成長させた。ＬＢ培地１リットルに１／１００容量の新鮮な一晩培養を播種した。強く振盪しながらＯＤが６００ｎｍで約０．５から０．７になるまで細胞を３７℃で成長させた。これらの細胞を、冷却ローターにて冷却遠心分離ボトルで４０００×ｇで１５分間遠心処理した。上清を破棄し、全部で１．０Ｌの氷冷１０％グリセロールに細胞ペレットを静かに再懸濁させた。細胞を上述したようにして遠心処理した後、氷冷１０％グリセロール０．５Ｌに再懸濁させた。上記の手順を繰り返して細胞を得て、これを氷冷１０％グリセロール２５０ｍＬに再懸濁させ、再度洗浄した。最終洗浄で得られた細胞ペレットを最終容量が３．０〜４．０ｍＬになるように氷冷１０％グリセロールに再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコートをドライアイスで凍結させ、−８０℃で保管した。
【０１４８】
形質転換および選択の手順：
上述したエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を氷上で解凍し、この細胞を入れたチューブにプラスミドＤＮＡ（上述したプラスミドｐＫＳＭ−ｐｄｃ１またはｐＫＳＭ−ｐｄｃ２のものを５０ｎｇ以内）を加えた。次に、このＤＮＡ／細胞懸濁液をあらかじめ冷却したエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）キュベット（０．１ｃｍ、バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）に移し、キュベットを氷上に保持した。ジーンパルサー（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（２５μＦ、２００オーム）で１８ｋＶ／ｃｍで各試料に電気パルスを加えた。パルス印加後すみやかに各キュベットにＳＯＣ培地（１．０ｍＬ）を加えた。この細胞混合物をチューブに移し、振盪機に放置した（３７℃で１．０時間、２２０ｒｐｍで振盪）。各形質転換反応の試料（１００μＬ）をピペットで別のＬＢプレートに移し、３７℃で一晩インキュベートした。ＬＢプレートにはアンピシリン１００μｇ／ｍＬまたはカナマイシン５０μｇ／ｍＬのいずれかを入れておいた。
【０１４９】
組換えＥ．ｃｏｌｉによるパラ−ヒドロキシスチレン生合成：
ｐＨＣＡからｐＨＳへの生物変換のために、まず最初にｐｄｃ１遺伝子またはｐｄｃ２遺伝子を含む組換えＥ．ｃｏｌｉ株の細胞を、グリセロールストックから適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレートに画線した。シングルコロニーを選択し、抗生物質を含むＬＢ培地で種培養として一晩成長させた。この種培養をＬＢ培地に播種した（６００ｎｍでのＯＤ約０．５）。この培養を、１．０ｍＭ  ｐＨＣＡの存在下、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。誘導細胞を１．０ｍＭ  ｐＨＣＡと共に６０時間放置すると、形成されるｐＨＳが上述したＨＰＬＣ法で検出できるようになった。表６のデータから明らかなように、ｐｄｃ１形質転換体では０．６０ｍＭのｐＨＳが生成されたが、これはｐｄｃ２形質転換体で生成されたｐＨＳの量（０．５２ｍＭ）よりもわずかに多かった。表６のデータは、代表的な１つの実験を３回実施して平均で表したものである。これらのｉｎ  ｖｉｖｏでの結果から、ｐＨＣＡを基質としたときにバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の酵素（ｐｄｃ２）よりも乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のＰＤＣ酵素（ｐｄｃ１）の方がわずかに活性が高いことが分かる。
【０１５０】
【表９】
2005533489.tif 000010
【０１５１】
実施例４
フェニルアラニン過剰産生Ｅ．ｃｏｌｉ株でのｐｄｃ１およびｐａｌの同時発現
赤色酵母（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来のｐａｌ遺伝子（配列番号１）でｐｄｃ１遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４に同時形質転換した。
【０１５２】
ロドトルラグルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）からのｐａｌ遺伝子のクローニング：
ロドトルラグルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１０７８８）ｐａｌ遺伝子すなわち配列番号１（ジェンバンク登録番号Ｍ１８２６１）を、フェニルアラニン含有複合培地で成長させた対数期細胞から精製した逆転写ＲＮＡから増幅した。ロドトルラグルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）としても知られるロドスポリジウムトルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）を含むさまざまなソースから得たｐａｌの遺伝子配列がすでに得られており、刊行物に記載されている（エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８２：６７３１〜６７３５（１９８５）、クレーマー（Ｃｒａｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２：３６７〜３８３（１９８９）、ロイス（Ｌｏｉｓら）、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８：１６４１〜１６４８（１９８９）、ミナミ（Ｍｉｎａｍｉ）ら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８５：１９〜２５（１９８９）、アンソン（Ａｎｓｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ  ５８：１８９〜１９９（１９８７）、ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）＆エルム（Ｏｅｒｕｍ）、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、１：２０７〜２１１（１９９１））。
【０１５３】
ロドトルラグルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）のｍＲＮＡを、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（コネチカット州ノーウィッチ（Ｎｏｒｗｉｃｈ）ジーンアンプキット（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｋｉｔ）の指示に従って、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水を使用せずに逆転写した。プライマーにはキットに付属のランダムヘキサマーを用いた。ｐａｌ遺伝子の増幅に使用したプライマーには、ＥｃｏＲＩ制限部位を含む上流側プライマー５’−ＡＴＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＣＴＣＧＡＣＴＣＧＡ−３’（配列番号７）と、ロドスポリジウムトルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）のｐａｌ遺伝子に基づいて合成したＰｓｔＩ制限部位を含む下流側ＰＣＲプライマー５’−ＧＡＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＧ−３’（配列番号８）とが含まれていた。ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断しておいたｐＫＫ２２３−３にライゲートしてｐＣＡ１６を形成した。
【０１５４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４でのｐｄｃ１およびｐａｌの同時発現：
ｐａｌの発現にｐＣＡ１６、ｐｄｃ１の発現でｐＫＳＭ−ｐｄｃ１またはｐｄｃ２の発現ではｐＫＳＭ−ｐｄｃ２を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４細胞を実施例３にて説明した手順で形質転換した。
【０１５５】
ｐａｌ遺伝子とｐｄｃ遺伝子の両方を含むこれらの形質転換細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびカナマイシン５０μｇ／ｍＬの両方を用いて選択し、最小培地にてｐＨＣＡを添加せずに上述したように培養した。ＩＰＴＧ誘導の２、４、６、８、２４、４８、６０時間後に培養の試料を採取し、上述したようにＨＰＬＣで分析した。表７の結果から明らかなように、これらのｐａｌ／ｐｄｃ形質転換体は、グルコースを用いてＬＢ培地またはＭ９培地のいずれかにおいて６０時間成長させると、ｐＨＣＡ、ケイ皮酸塩、ｐＨＳを産生した。
【０１５６】
【表１０】
2005533489.tif 000011
【０１５７】
ｐＨＳを産生するために、適切な抗生物質を用いてＬＢ寒天プレートで形質転換体を選択し、ＬＢ培地またはＭ９培地のいずれかで６０時間成長させた。これらの培養でのフェニルアラニンおよびチロシンの濃度を上述したＨＰＬＣ法で測定した。結果を表８に示す。培養中のフェニルアラニン濃度はｐａｌ／ｐｄｃ１形質転換体およびｐａｌ／ｐｄｃ２形質転換体のどちらでも対照の場合に近かったが、ｐａｌ／ｐｄｃ１培養中のチロシン濃度はｐａｌ／ｐｄｃ２培養中の場合よりもかなり低かった。ｐａｌ／ｐｄｃ１形質転換体培養の方がチロシンが少ないことから、ＰＤＣ１酵素の比活性が高いことが分かる。
【０１５８】
【表１１】
2005533489.tif 000012
【０１５９】
実施例５
ｐａｌ／ｐｄｃ１形質転換体によるｐＨＳ産生の最適化
ｐＨＳ産生に対してｐａｌ／ｐｄｃ１形質転換体が高めの活性を示したため、これを以後の研究用に選択した。これらの形質転換体をグルコースを用いてＭ９培地で成長させ、ＩＰＴＧでの誘導の６時間後と６０時間後に、上述したＨＰＬＣ法を用いてｐＨＣＡ、ｐＨＳ、ＣＡのレベルを求めた。表９に示す結果から明らかなように、６時間の時点では少量のｐＨＣＡしか観察されなかったのに対し、６０時間でｐＨＣＡは全く観察されなかった。ケイ皮酸塩（ＣＡ）の濃度が６０時間後に約０．１ｍＭから約０．２５ｍＭまで上昇したことから、形成されるケイ皮酸塩の大半が培養中に残っているという事実が立証されることとなった。６０時間の培養にはｐＨＣＡは観察されなかったが、ｐＨＳの濃度は６時間の試料での約０．０５ｍＭから６０時間後の約０．３０ｍＭまで上昇した。
【０１６０】
【表１２】
2005533489.tif 000013
【０１６１】
６時間後と６０時間後にＨＰＬＣを利用して上記の培養中のフェニルアラニンとチロシンの濃度を測定し、６時間後に測定した濃度を表１０にあげておく。対照培養には成長６．０時間後に約０．３ｍＭのフェニルアラニンと０．０３ｍＭのチロシンとが含まれていた。ｐａｌ／ｐｄｃ１形質転換体培養の分析ではフェニルアラニンの存在は示されなかったが、極めて少量のチロシンが観察された。６０時間の試料を分析したところ、ｐａｌ／ｐｄｃ１形質転換体培養に約０．３ｍＭのフェニルアラニンが存在することが明らかになったが、チロシンは検出できなかった（表１１）。
【０１６２】
【表１３】
2005533489.tif 000014
【０１６３】
【表１４】
2005533489.tif 000015
【０１６４】
上記にて概説した実験は、酵母由来のｐａｌとグルコースからｐＨＳへの変換用のフェニルアラニン過剰産生Ｅ．ｃｏｌｉ株におけるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のｐｄｃ遺伝子との同時発現が成功する最初の例を構成するものである。また、本願発明者らの結果から、成長速度と開発された生物の遺伝子発現とに関するなお一層詳細な研究が必要であることも分かる。特に重要なのは培養で形成されるｐＨＳが宿主生物のさまざまな酵素活性に対しておよぼす毒性である。
【０１６５】
実施例６
グルコースからｐＨＳへの変換用のｐａｌ遺伝子とｐｄｃ遺伝子の両方を含む組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４株での成長速度の研究
実施例４で説明したように、ｐＣＡ１６およびｐＫＳＭ−ｐｄｃ１での形質転換ならびにアンピシリンおよびカナマイシン耐性に基づく選択によって、Ｅ．ｃｏｌｉフェニルアラニン過剰産生株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４から２つの株（ＷＷＱ５１．１およびＷＳＱ１で示す）を作出した。予備実験ではどちらの構築物でも同様のパターンが示されていたことから、本願発明者らは株ＷＷＱ５１．１を以後の研究用に選択した。
【０１６６】
野生型ｐａｌ／ｔａｌ遺伝子（ＰＡＬ／ＴＡＬ比２．０）を含むＥ．ｃｏｌｉ株は、ＰＡＬ経路とＴＡＬ経路の両方を使ってグルコースをＣＡおよびｐＨＣＡの両方に変換する。また、本願発明者らがＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を用いて過去に行った速度論的研究では、この酵素では、ＴＡＬ（０．７６）に比してＰＡＬ（５．５）のＶｍａｘが高いことが明らかになった。速度論的情報に立脚すると、フェニルアラニンの存在が酵素のＴＡＬ活性にとっての障害となっているのであろうと考えられる。また、ＴＡＬ活性に対するｐＨＣＡのＫｉが低い（１６μＭ）ことは、ｐＨＣＡがわずかに蓄積されるだけでもＴＡＬ活性が阻害される可能性があることを強調するものである。
【０１６７】
自らの過去の所見に立脚し、本願発明者らは、ｐａｌ／ｔａｌ遺伝子とｐｄｃ遺伝子の両方を含むＥ．ｃｏｌｉ株に関して自らが持つ現在の観察結果について、以下のとおり説明する。これらの二重形質転換体では、形成されるｐＨＣＡがｐＨＳに変換される。この過程でのｐＨＳの形成量は、ｐａｌ／ｔａｌ遺伝子のみを含む株で形成されるｐＨＣＡの量よりも多い。この観察についてのひとつの説明として、ｐＨＣＡのプールならびにそのｐＨＳへの変換をなくすと、（高いｐＨＣＡ濃度によって）ＴＡＬ活性の潜在的な阻害が排除され、ｐＨＳの形成につながるｐＨＣＡの産生がさらに容易になるということがあろう。また、ＴＡＬ活性によってチロシンを除去するとチロシンによるコリスミ酸／ｐ−プレフェン酸デヒドラターゼのフィードバック阻害がなくなり、系をさらに最適な状態で機能させられる可能性もある。ｐａｌ／ｔａｌ遺伝子とｐｄｃ遺伝子の両方を含む株の培養でｐＨＣＡの残留濃度が若干認められたことは、ｐＨＣＡからｐＨＳへの完全な形質転換にはＰＤＣ活性のｉｎ  ｖｉｖｏ発現レベルを高める必要性を強調するものである。
【０１６８】
実施例７
ｐａｌ／ｐｄｃ１遺伝子発現がフェニルアラニン過剰産生Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体の成長に対しておよぼす影響
乳酸菌（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の野生型ｐａｌ遺伝子およびｐｄｃ１遺伝子を含む、ｐＣＡ１６およびｐＫＳＭ−ｐｄｃ１の両方で形質転換したフェニルアラニン過剰産生株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４（実施例４参照）を、ＩＰＴＧ誘導ありまたはなしの状態でＬＢ培地に播種した。この研究の成長速度の結果を吸光度６００ｎｍで測定した細胞密度で表１２に示す。株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＳＴ７４のｐａｌ／ｐｄｃ形質転換体の成長は、ＩＰＴＧを約３．０時間加えたところで減速しはじめ、７．０時間まで低めの率に維持された。対照として使用したのは、ＩＰＴＧなしで成長させた同じ株である。この結果から、細胞に対して有毒であることがすでに分かっているｐＨＣＡおよびｐＨＳが形成されることがおそらくの原因で、ＩＰＴＧの存在下では成長速度が遅くなることが分かった。過去の研究では、ｐＨＣＡおよびｐＨＳはいずれも細胞に対して有毒であるということが分かっており、ｐＨＳでは０．５ｇ／Ｌという低い濃度で毒性が認められた。
【０１６９】
【表１５】
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【０１７０】
ＩＰＴＧで誘導した培養中でフェニルアラニンは短時間で消費され、誘導６時間後には消失したが、未誘導の培養ではほぼ変化せずに残った（表１３）。
【０１７１】
【表１６】
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【０１７２】
ＩＰＴＧによる誘導６．０時間以内でのフェニルアラニンの完全な消費はｐａｌ／ｐｄｃ１形質転換体によって達成された（表１３）。しかしながら、ＩＰＴＧ誘導なしの組換え株ではフェニルアラニンの消費がわずかに認められただけである。この観察結果については、野生型ｐａｌ／ｔａｌ遺伝子を持つｐＫＫ２２３由来のｐＣＡ１６プラスミドプロモーターからの発現が低レベルであることと、同じ細胞中のｐＫＳＭ７１５（ＩＰＴＧによって厳密に制御される）の存在とによって説明できよう。誘導後、ケイ皮酸（ＣＡ）も産生され（表１４）培地に蓄積された。
【０１７３】
【表１７】
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【０１７４】
ｐａｌ／ｐｄｃ１形質転換体によるチロシンの消費はＩＰＴＧでの誘導２．０時間後に開始され、７．０時間まで継続された（表１５）。ＩＰＴＧでの誘導を行っていない対照では、実験中を通して培地中のチロシンが一定濃度に維持された（表１５）。チロシンの消失に伴って培地中にｐＨＣＡ（表１６）およびｐＨＳ（表１７）の出現した。ＩＰＴＧ誘導なしでは、ｐＨＳは観察されず、ｐＨＣＡについてはいくらか観察できた。しかしながら、ＩＰＴＧで誘導すると、培地のｐＨＳ濃度が上昇しはじめた（表１７）。ｐＨＳが形成されている間、ｐＨＣＡの濃度が一定のままである（表１６）ことは興味深かった。この観察結果についてのひとつの説明として、ｐＨＳへの変換に用いられるｐＨＣＡがなくなることで、これがＴＡＬ酵素を阻害しなくなってｐＨＣＡの産生が促進されるのであろうといえる。誘導６．０時間後、培地中のｐＨＳが減少しはじめた。実験終了時の培養液中のｐＨＣＡの存在は、ｐＨＳへの変換のための十分なＰＤＣ活性が不足していることを示している。
【０１７５】
【表１８】
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【０１７６】
【表１９】
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【０１７７】
【表２０】
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【０１７８】
実施例８
フラスコ内でのグルコースからｐＨＳへの発酵
実施例６で説明したＥ．ｃｏｌｉ株ＷＷＱ５１．１を、２５０ｍＬ容のバッフルフラスコで培地５０ｍＬ中にて成長させ、グルコースからのｐＨＳの産生を試験した。培地には、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、４ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ＭのＭＯＰＳ、Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４から１ｇ／ＬのＰ０４、１ｍｇ／Ｌのチアミン、１５ｇ／Ｌのグルコース、クエン酸（１００ｍｇ／Ｌ）を含む微量金属、ＣａＣｌ２（１５ｍｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ（２５ｍｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ（２ｍｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ（２ｍｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ（１２ｍｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ（１．５ｍｇ／Ｌ）を含有させた。抗生物質すなわちカナマイシン（５０ｐｐｍ）およびアンピシリン（１００ｐｐｍ）を加えた。ＩＰＴＧを誘導物質として０．５ｍＭで加えた。濃ＫＯＨまたはＨＣｌを用いてｐＨが６．８〜７．０になるように調節した。種培養を１６時間かけて成長させた後、重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）フラスコにて５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）で測定したＯＤが０．１から０．２になるように新鮮な培地中で希釈した。これらの培養を３００ｒｐｍ、３５℃で５０時間インキュベートし、０、９、２５、５０時間の時点でＨＰＬＣでの分析用に試料を得た。結果を表１８に示す。発酵５０時間で、利用したグルコース１グラムあたりｐＨＳの収率０．００５１〜０．００５２ｇで６４〜６８ｍｇ／ＬのｐＨＳが産生された。
【０１７９】
【表２１】
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【０１８０】
実施例９
ｐＨＳへのラクトースの発酵
別の炭素源として、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＷＷＱ５１．１によるｐＨＳ産生用の発酵基質としてのラクトースを試験した。シードフラスコを１２時間インキュベートし、これらのフラスコから得た細胞を被験フラスコ内で新鮮な培地に播種した。この発酵の種培地は、グルコースの代わりにラクトースを用いたこと以外は実施例８で使用したものと同一とした。被験フラスコには、２５０ｍＬ容のバッフルフラスコに培養液５０ｍＬを入れたものを利用し、播種時にはラクトース１５．５ｇ／Ｌを用いた。これらを３００ｒｐｍで３５℃にて４日間インキュベートした。これらのフラスコに、０ｍＭ、０．５ｍＭまたは５ｍＭのいずれかの濃度でＩＰＴＧを加え、プラスミドからの遺伝子発現を誘導した。表１９に示すようなラクトースからｐＨＳへの発酵はグルコースからｐＨＳへの発酵よりも有意に良好であった。５ｍＭ  ＩＰＴＧのときに力価０．２４９ｇ／Ｌに達し、利用したラクトース１ｇあたりのｐＨＳの収率０．０２１〜０．０２４ｇという最良の結果が得られた。
【０１８１】
【表２２】
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【０１８２】
実施例１０
１０Ｌ規模でのグルコースからｐＨＳへの発酵
１４Ｌのブラウンボイスタット（Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｃ発酵槽（ビーブラウンバイオスタットインターナショナルゲーエムベーハー（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｍｂｈ）、ドイツのメルスンゲン（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）におけるグルコースからのｐＨＳの産生をホスフェート（ＰＯ４）制限条件下で試験した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＷＷＱ５１．１を発酵槽の播種前に種培養で１２時間かけて成長させた。６．７２時間の時点でＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を発酵槽に加えた。
【０１８３】
発酵プロトコール：
ＫＨ２ＰＯ４を１．６ｇ、ＭｇＳＯ４を１５．０ｇ、マズ（Ｍａｚｕ）ＤＦ２０４泡防止剤（ＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニュージャージー州マウントオリーブ（Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ）８．０ｍＬ、チアミン８ｍｇを含有する初期バッチ７Ｌで容器培地（ｖｅｓｓｅｌ  ｍｅｄｉｕｍ）を調製した。滅菌後、グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ）２４０ｇ、微量元素溶液（表２０）１６０ｍＬ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを最終容量が８Ｌになるようにして加えた。水酸化アンモニウム（４０％ｗ／ｖ）とＨ２ＳＯ４を２０％ｗ／ｖとをｐＨ調節用に利用した。攪拌、曝気、ｐＨ、圧力、溶存酸素（ＤＯ）のセットポイントを以下の表２１にあげておく。溶存酸素濃度（ＤＯ）を、酸素要求量の増加に伴って最初は攪拌によって上昇させ、続いて曝気を行って空気飽和の２５％に調節した。種培養５００ｍＬを２Ｌ容のフラスコに入れてＯＤ５５０が約２．０。になるように３００ｒｐｍで１２時間かけて３５℃で成長させた。発酵槽でＯＤ５５０が４に達した後にＩＰＴＧを０．５ｍＭまで加えた。１〜５ｇ／Ｌでグルコースの供給を開始し、以下の式を利用して細胞成長のためのグルコース供給量を調節した。
【０１８４】
供給速度（ｇ／分）＝ＯＤ５５０×発酵容量（Ｌ）×０．００２２。
【０１８５】
グルコースが２ｇ／Ｌを超えて蓄積された場合はグルコース供給速度を落とした。
【０１８６】
【表２３】
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【０１８７】
【表２４】
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【０１８８】
ｐＨＳへのグルコース発酵の反応速度を表２２に示す。ｐＨＳの産生量は発酵約５６時間後に０．４０ｇ／Ｌに達した。
【０１８９】
【表２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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