(57)【要約】真核細胞および生物において対象となる遺伝子の発現を効率的にダウンレギュレーションするための方法および手段を提供する。そのために、本発明は、改変されたアンチセンスおよびセンスRNA分子、前記改変されたアンチセンスまたはセンスRNA分子をコードするキメラ遺伝子、ならびに前記改変されたアンチセンスおよび／またはセンスRNA分子あるいはそれをコードするキメラ遺伝子を含む、植物、動物、真菌、酵母または糸状菌のような真核生物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするための方法であって、以下のステップ：
a)  真核生物の細胞にキメラRNA分子を供給すること、ここにおいて、前記キメラRNA分子は、
i)  標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む標的遺伝子特異的RNA領域と、これに機能的に連結された
ii) 大部分が二本鎖のRNA領域、
を含むものであること、
b)  標的遺伝子の発現がダウンレギュレーションされている真核生物を同定すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（PSTVd）型のウイロイド由来の核局在化シグナルを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
核局在化シグナルが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド、カンキツウイロイド種III、カンキツウイロイド種IV、ホップ潜在ウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、トマトプランタマチョウイロイド、ココヤシチナンガヤウイロイド、トマト頂端矮化ウイロイド、ココヤシカダング-カダングウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、およびカンキツベントリーフウイロイドからなる群より選択されるウイロイドに由来する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイロイドが配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択されるゲノムヌクレオチド配列を有する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルチューバーウイロイド由来である、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルウイロイドRG1株由来である、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
核局在化シグナルが、配列番号3のヌクレオチド配列から選択される核局在化シグナルとして機能するヌクレオチド配列を含む、請求項2〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
大部分が二本鎖のRNAが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IIIのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IVのゲノムヌクレオチド配列、ホップ潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、オーストラリアブドウウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマトプランタマチョウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシチナンガヤウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマト頂端矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシカダング-カダングウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツエクソコーティスウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、コルムネア潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ホップ矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、およびカンキツベントリーフウイロイドのゲノムヌクレオチド配列からなる群より選択されるウイロイドゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項2または3に記載の方法。
【請求項９】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列が配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項2〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列がジャガイモスピンドルチューバーウイロイドRG1株のゲノムヌクレオチド配列である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記ゲノムヌクレオチド配列が配列番号3のヌクレオチド配列を有する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの少なくとも35回の繰返しを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの44〜2000回の繰返しを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記RNA分子が複数の標的遺伝子特異的領域を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記RNA分子がイントロン配列を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記イントロン配列が、pdk2イントロン、トウゴマ由来のカタラーゼイントロン、ワタ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、シロイヌナズナ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、トウモロコシ由来のユビキチンイントロン、イネ由来のアクチンイントロン、アスペルギルス由来のトリオースリン酸イソメラーゼイントロン、およびSV40由来のイントロンからなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記真核生物が植物である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記植物が、シロイヌナズナ、アルファルファ、オオムギ、マメ、トウモロコシ、ワタ、アマ、エンドウ、セイヨウアブラナ、イネ、ライムギ、ベニバナ、モロコシ、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コムギ、アスパラガス、ビート、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッシュ、ホウレンソウ、カボチャ属、トマト、ズッキーニ、アーモンド、リンゴ、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カカオ、サクランボ、ココヤシ、クランベリー、ナツメヤシ、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、キーウィ、レモン、ライム、マンゴー、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、ラッカセイ、ナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、イチゴ、タンジェリン、クルミ、およびスイカからなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記真核生物が真菌、酵母または糸状菌である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記真核生物が動物である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記動物が、ヒト、哺乳動物、魚、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、げっ歯類、ハムスター、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、霊長類、線虫類、甲殻動物、エビ、カニ、ロブスター、昆虫、ミバエ、鞘翅目の昆虫、双翅目の昆虫、鱗翅目の昆虫、または同翅亜目の昆虫である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記キメラRNAがキメラDNA分子からの転写により生成される、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするためのキメラRNA分子であって、
a)  前記真核生物の前記細胞中の標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む標的遺伝子特異的RNA領域と、これに機能的に連結された
b)  大部分が二本鎖のRNA領域、
を含んでなり、前記真核生物の細胞に供給されると、前記標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションする、上記キメラRNA分子。
【請求項２５】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（PSTVd）型のウイロイド由来の核局在化シグナルを含む、請求項24に記載のキメラRNA分子。
【請求項２６】
核局在化シグナルが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド、カンキツウイロイド種III、カンキツウイロイド種IV、ホップ潜在ウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、トマトプランタマチョウイロイド、ココヤシチナンガヤウイロイド、トマト頂端矮化ウイロイド、ココヤシカダング-カダングウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、およびカンキツベントリーフウイロイドからなる群より選択されるウイロイドに由来する、請求項25に記載のキメラRNA分子。
【請求項２７】
前記ウイロイドが配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択されるゲノムヌクレオチド配列を有する、請求項25または26に記載のキメラRNA分子。
【請求項２８】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルチューバーウイロイド由来である、請求項25または26に記載のキメラRNA分子。
【請求項２９】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルウイロイドRG1株由来である、請求項25または26に記載のキメラRNA分子。
【請求項３０】
核局在化シグナルが、配列番号3のヌクレオチド配列から選択される核局在化シグナルとして機能するヌクレオチド配列を含む、請求項25〜29のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項３１】
大部分が二本鎖のRNAが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IIIのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IVのゲノムヌクレオチド配列、ホップ潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、オーストラリアブドウウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマトプランタマチョウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシチナンガヤウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマト頂端矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシカダング-カダングウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツエクソコーティスウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、コルムネア潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ホップ矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、およびカンキツベントリーフウイロイドのゲノムヌクレオチド配列からなる群より選択されるウイロイドゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項25または26に記載のキメラRNA分子。
【請求項３２】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列が配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択される、請求項31に記載のキメラRNA分子。
【請求項３３】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項25〜32のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項３４】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列がジャガイモスピンドルチューバーウイロイドRG1株のゲノムヌクレオチド配列である、請求項33に記載のキメラRNA分子。
【請求項３５】
前記ゲノムヌクレオチド配列が配列番号3のヌクレオチド配列を有する、請求項34に記載のキメラRNA分子。
【請求項３６】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの少なくとも35回の繰返しを含む、請求項24に記載のキメラRNA分子。
【請求項３７】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの44〜2000回の繰返しを含む、請求項36に記載のキメラRNA分子。
【請求項３８】
前記RNA分子が複数の標的遺伝子特異的領域を含む、請求項24〜37のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項３９】
前記RNA分子がイントロン配列を含む、請求項24〜38のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項４０】
前記イントロン配列が、pdk2イントロン、トウゴマ由来のカタラーゼイントロン、ワタ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、シロイヌナズナ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、トウモロコシ由来のユビキチンイントロン、イネ由来のアクチンイントロン、アスペルギルス由来のトリオースリン酸イソメラーゼイントロン、およびSV40由来のイントロンからなる群より選択される、請求項39に記載のキメラRNA分子。
【請求項４１】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現を低下させるためのキメラDNA分子であって、
a)  前記真核生物の細胞においてRNAポリメラーゼにより認識され得るプロモーターまたはプロモーター領域と、これに機能的に連結された
b)  転写されたときRNA分子をもたらすDNA領域、
を含んでなり、ここにおいて、前記RNA分子は、
i)  前記真核生物の前記細胞中の標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む標的遺伝子特異的RNA領域と、これに機能的に連結された
ii) 大部分が二本鎖のRNA領域、
を含むものであり、前記真核生物の細胞に供給されると、前記標的遺伝子の発現を低下させる、上記キメラDNA分子。
【請求項４２】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（PSTVd）型のウイロイド由来の核局在化シグナルを含む、請求項41に記載のキメラDNA分子。
【請求項４３】
核局在化シグナルが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド、カンキツウイロイド種III、カンキツウイロイド種IV、ホップ潜在ウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、トマトプランタマチョウイロイド、ココヤシチナンガヤウイロイド、トマト頂端矮化ウイロイド、ココヤシカダング-カダングウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、およびカンキツベントリーフウイロイドからなる群より選択されるウイロイドに由来する、請求項42に記載のキメラDNA分子。
【請求項４４】
前記ウイロイドが配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択されるゲノムヌクレオチド配列を有する、請求項42または43に記載のキメラDNA分子。
【請求項４５】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルチューバーウイロイド由来である、請求項42〜44のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項４６】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルウイロイドRG1株由来である、請求項45に記載のキメラDNA分子。
【請求項４７】
核局在化シグナルが、配列番号3のヌクレオチド配列から選択される核局在化シグナルとして機能するヌクレオチド配列を含む、請求項42〜46のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項４８】
大部分が二本鎖のRNAが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IIIのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IVのゲノムヌクレオチド配列、ホップ潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、オーストラリアブドウウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマトプランタマチョウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシチナンガヤウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマト頂端矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシカダング-カダングウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツエクソコーティスウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、コルムネア潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ホップ矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、およびカンキツベントリーフウイロイドのゲノムヌクレオチド配列からなる群より選択されるウイロイドゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項42または43に記載のキメラDNA分子。
【請求項４９】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列が配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択される、請求項48に記載のキメラDNA分子。
【請求項５０】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項42〜49のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項５１】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列がジャガイモスピンドルチューバーウイロイドRG1株のゲノムヌクレオチド配列である、請求項50に記載のキメラDNA分子。
【請求項５２】
前記ゲノムヌクレオチド配列が配列番号3のヌクレオチド配列を有する、請求項51に記載のキメラDNA分子。
【請求項５３】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの少なくとも35回の繰返しを含む、請求項41に記載のキメラDNA分子。
【請求項５４】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの44〜2000回の繰返しを含む、請求項53に記載のキメラDNA分子。
【請求項５５】
前記RNA分子が複数の標的遺伝子特異的領域を含む、請求項41〜54のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項５６】
前記RNA分子がイントロン配列を含む、請求項41〜55のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項５７】
前記イントロン配列が、pdk2イントロン、トウゴマ由来のカタラーゼイントロン、ワタ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、シロイヌナズナ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、トウモロコシ由来のユビキチンイントロン、イネ由来のアクチンイントロン、アスペルギルス由来のトリオースリン酸イソメラーゼイントロン、およびSV40由来のイントロンからなる群より選択される、請求項56に記載のキメラDNA分子。
【請求項５８】
前記RNA分子をコードする前記DNA領域に機能的に連結された転写終結およびポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項41〜56のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項５９】
前記プロモーターまたはプロモーター領域が植物で発現可能なプロモーターである、請求項41〜58のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項６０】
前記プロモーターまたはプロモーター領域が動物において機能するプロモーターである、請求項41〜58のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項６１】
前記プロモーターまたはプロモーター領域が酵母、真菌または糸状菌において機能するプロモーターである、請求項41〜58のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項６２】
前記プロモーターまたはプロモーター領域が単一サブユニットバクテリオファージRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターである、請求項41〜58のいずれか1項に記載のキメラDNA分子。
【請求項６３】
請求項41〜62のいずれか1項に記載のキメラDNA分子を含む真核生物由来の細胞。
【請求項６４】
請求項24〜40のいずれか1項に記載のキメラRNA分子を含む真核細胞。
【請求項６５】
前記真核生物が植物である、請求項63または64に記載の細胞。
【請求項６６】
前記植物が、シロイヌナズナ、アルファルファ、オオムギ、マメ、トウモロコシ、ワタ、アマ、エンドウ、セイヨウアブラナ、イネ、ライムギ、ベニバナ、モロコシ、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コムギ、アスパラガス、ビート、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッシュ、ホウレンソウ、カボチャ属、トマト、ズッキーニ、アーモンド、リンゴ、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カカオ、サクランボ、ココヤシ、クランベリー、ナツメヤシ、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、キーウィ、レモン、ライム、マンゴー、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、ラッカセイ、ナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、イチゴ、タンジェリン、クルミ、およびスイカからなる群より選択される、請求項65に記載の細胞。
【請求項６７】
前記真核生物が真菌、酵母または糸状菌である、請求項63または64に記載の細胞。
【請求項６８】
前記真核生物が動物である、請求項63または64に記載の細胞。
【請求項６９】
前記動物が、ヒト、哺乳動物、魚、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、げっ歯類、ハムスター、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、霊長類、線虫類、甲殻動物、エビ、カニ、ロブスター、昆虫、ミバエ、鞘翅目の昆虫、双翅目の昆虫、鱗翅目の昆虫、または同翅亜目の昆虫である、請求項68に記載の細胞。
【請求項７０】
細胞中に請求項41〜62のいずれか1項に記載のキメラDNA分子を含む非ヒト真核生物。
【請求項７１】
細胞中に請求項24〜40のいずれか1項に記載のキメラRNA分子を含む非ヒト真核生物。
【請求項７２】
前記真核生物が植物である、請求項70または71に記載の非ヒト真核生物。
【請求項７３】
前記植物が、シロイヌナズナ、アルファルファ、オオムギ、マメ、トウモロコシ、ワタ、アマ、エンドウ、セイヨウアブラナ、イネ、ライムギ、ベニバナ、モロコシ、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コムギ、アスパラガス、ビート、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッシュ、ホウレンソウ、カボチャ属、トマト、ズッキーニ、アーモンド、リンゴ、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カカオ、サクランボ、ココヤシ、クランベリー、ナツメヤシ、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、キーウィ、レモン、ライム、マンゴー、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、ラッカセイ、ナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、イチゴ、タンジェリン、クルミ、およびスイカからなる群より選択される、請求項72に記載の非ヒト真核生物。
【請求項７４】
前記真核生物が真菌、酵母または糸状菌である、請求項70または71に記載の非ヒト真核生物。
【請求項７５】
前記真核生物が動物である、請求項70または71に記載の非ヒト真核生物。
【請求項７６】
前記動物が、ヒト、哺乳動物、魚、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、げっ歯類、ハムスター、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、霊長類、線虫類、甲殻動物、エビ、カニ、ロブスター、昆虫、ミバエ、鞘翅目の昆虫、双翅目の昆虫、鱗翅目の昆虫、または同翅亜目の昆虫である、請求項75に記載の非ヒト真核生物。
【請求項７７】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現を低下させるための請求項24〜40のいずれか1項に記載のキメラRNA分子の使用。
【請求項７８】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現を低下させるための請求項41〜62のいずれか1項に記載のキメラDNA分子の使用。
【請求項７９】
細胞における標的遺伝子の発現が低下しているトランスジェニック真核生物の作製方法であって、以下のステップ：
a)  前記生物の1個以上の細胞に請求項41〜62のいずれか1項に記載のキメラDNA分子を供給して、1個以上のトランスジェニック細胞を作製すること、
b)  前記1個以上のトランスジェニック細胞からトランスジェニック真核生物を成長または再生させること、
を含んでなる上記方法。
【請求項８０】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするための方法であって、以下のステップ：
a)  真核生物の細胞に第1および第2のキメラRNA分子を供給すること、ただし、
i)   第1のキメラRNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
ii)  第2のキメラRNA分子は、第1のキメラRNA分子の相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
iii) 第1および第2のキメラRNAは、少なくとも、第1のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドと第2のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドの間で塩基対合することができること、
iv)  ここにおいて、第1または第2のキメラRNA分子のいずれかが、前記アンチセンス標的特異的RNA領域または前記センス標的特異的RNA領域に機能的に連結された、大部分が二本鎖のRNA領域を含むこと、
b)  標的遺伝子の発現がダウンレギュレーションされている真核生物を同定すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項８１】
第1および第2のキメラRNA分子が大部分が二本鎖のRNA領域を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
第1および第2のキメラRNA分子が、同一の、大部分が二本鎖のRNA領域を含む、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（PSTVd）型のウイロイド由来の核局在化シグナルを含む、請求項80〜82のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８４】
核局在化シグナルが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド、カンキツウイロイド種III、カンキツウイロイド種IV、ホップ潜在ウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、トマトプランタマチョウイロイド、ココヤシチナンガヤウイロイド、トマト頂端矮化ウイロイド、ココヤシカダング-カダングウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、およびカンキツベントリーフウイロイドからなる群より選択されるウイロイドに由来する、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
前記ウイロイドが配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択されるゲノムヌクレオチド配列を有する、請求項83に記載の方法。
【請求項８６】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルチューバーウイロイド由来である、請求項83〜85のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８７】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルウイロイドRG1株由来である、請求項83〜86のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８８】
核局在化シグナルが、配列番号3のヌクレオチド配列から選択される核局在化シグナルとして機能するヌクレオチド配列を含む、請求項83〜87のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８９】
大部分が二本鎖のRNAが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IIIのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IVのゲノムヌクレオチド配列、ホップ潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、オーストラリアブドウウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマトプランタマチョウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシチナンガヤウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマト頂端矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシカダング-カダングウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツエクソコーティスウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、コルムネア潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ホップ矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、およびカンキツベントリーフウイロイドのゲノムヌクレオチド配列からなる群より選択されるウイロイドゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項83または84に記載の方法。
【請求項９０】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列が配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択される、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項83〜90のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９２】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列がジャガイモスピンドルチューバーウイロイドRG1株のゲノムヌクレオチド配列である、請求項91に記載の方法。
【請求項９３】
前記ゲノムヌクレオチド配列が配列番号3のヌクレオチド配列を有する、請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの少なくとも35回の繰返しを含む、請求項80〜82のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９５】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの44〜2000回の繰返しを含む、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
前記RNA分子が複数の標的遺伝子特異的領域を含む、請求項80〜95のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９７】
前記RNA分子がイントロン配列を含む、請求項80〜96のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９８】
前記イントロン配列が、pdk2イントロン、トウゴマ由来のカタラーゼイントロン、ワタ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、シロイヌナズナ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、トウモロコシ由来のユビキチンイントロン、イネ由来のアクチンイントロン、アスペルギルス由来のトリオースリン酸イソメラーゼイントロン、およびSV40由来のイントロンからなる群より選択される、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
第1および第2のキメラRNAが第1および第2のキメラ遺伝子から転写される、請求項80〜98のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１００】
第1および第2のキメラRNA分子を含む真核生物由来の細胞であって、
i)   第1のキメラRNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
ii)  第2のキメラRNA分子は、第1のキメラRNA分子の相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
iii) 第1および第2のキメラRNAは、少なくとも、第1のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドと第2のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドの間で塩基対合することができること、
iv)  ここにおいて、第1または第2のキメラRNA分子のいずれかが、前記アンチセンス標的特異的RNA領域または前記センス標的特異的RNA領域に機能的に連結された、大部分が二本鎖のRNA領域を含むこと、
を特徴とする、上記細胞。
【請求項１０１】
第1および第2のキメラRNA分子が、大部分が二本鎖のRNA領域を含む、請求項100に記載の細胞。
【請求項１０２】
第1および第2のキメラRNA分子が、同一の、大部分が二本鎖のRNA領域を含む、請求項101に記載の細胞。
【請求項１０３】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（PSTVd）型のウイロイド由来の核局在化シグナルを含む、請求項100〜102のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１０４】
核局在化シグナルが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド、カンキツウイロイド種III、カンキツウイロイド種IV、ホップ潜在ウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、トマトプランタマチョウイロイド、ココヤシチナンガヤウイロイド、トマト頂端矮化ウイロイド、ココヤシカダング-カダングウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、およびカンキツベントリーフウイロイドからなる群より選択されるウイロイドに由来する、請求項103に記載の細胞。
【請求項１０５】
前記ウイロイドが配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択されるゲノムヌクレオチド配列を有する、請求項103に記載の細胞。
【請求項１０６】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルチューバーウイロイド由来である、請求項103〜105のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１０７】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルウイロイドRG1株由来である、請求項103〜106のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１０８】
核局在化シグナルが、配列番号3のヌクレオチド配列から選択される核局在化シグナルとして機能するヌクレオチド配列を含む、請求項103〜107のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１０９】
大部分が二本鎖のRNAが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IIIのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IVのゲノムヌクレオチド配列、ホップ潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、オーストラリアブドウウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマトプランタマチョウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシチナンガヤウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマト頂端矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシカダング-カダングウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツエクソコーティスウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、コルムネア潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ホップ矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、およびカンキツベントリーフウイロイドのゲノムヌクレオチド配列からなる群より選択されるウイロイドゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項103または104に記載の細胞。
【請求項１１０】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列が配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択される、請求項109に記載の細胞。
【請求項１１１】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項103〜109のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１１２】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列がジャガイモスピンドルチューバーウイロイドRG1株のゲノムヌクレオチド配列である、請求項111に記載の細胞。
【請求項１１３】
前記ゲノムヌクレオチド配列が配列番号3のヌクレオチド配列を有する、請求項112に記載の細胞。
【請求項１１４】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの少なくとも35回の繰返しを含む、請求項100〜102のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１１５】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの44〜2000回の繰返しを含む、請求項114に記載の細胞。
【請求項１１６】
前記RNA分子が複数の標的遺伝子特異的領域を含む、請求項100〜115のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１１７】
前記RNA分子がイントロン配列を含む、請求項100〜116のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１１８】
前記イントロン配列が、pdk2イントロン、トウゴマ由来のカタラーゼイントロン、ワタ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、シロイヌナズナ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、トウモロコシ由来のユビキチンイントロン、イネ由来のアクチンイントロン、アスペルギルス由来のトリオースリン酸イソメラーゼイントロン、およびSV40由来のイントロンからなる群より選択される、請求項117に記載の細胞。
【請求項１１９】
第1および第2のキメラRNAが第1および第2のキメラ遺伝子から転写される、請求項100〜118のいずれか1項に記載の細胞。
【請求項１２０】
請求項100〜119のいずれか1項に記載の細胞を含む非ヒト真核生物。
【請求項１２１】
キメラアンチセンスRNA分子と協同して、真核生物の細胞における標的遺伝子の発現を低下させるためのキメラセンスRNA分子であって、
a)  前記標的遺伝子のヌクレオチドに対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス標的遺伝子特異的RNA領域と、これに機能的に連結された
b)  大部分が二本鎖のRNA領域、
を含んでなる上記キメラセンスRNA分子。
【請求項１２２】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（PSTVd）型のウイロイド由来の核局在化シグナルを含む、請求項121に記載のキメラRNA分子。
【請求項１２３】
核局在化シグナルが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド、カンキツウイロイド種III、カンキツウイロイド種IV、ホップ潜在ウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、トマトプランタマチョウイロイド、ココヤシチナンガヤウイロイド、トマト頂端矮化ウイロイド、ココヤシカダング-カダングウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、およびカンキツベントリーフウイロイドからなる群より選択されるウイロイドに由来する、請求項122に記載のキメラRNA分子。
【請求項１２４】
前記ウイロイドが配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択されるゲノムヌクレオチド配列を有する、請求項123に記載のキメラRNA分子。
【請求項１２５】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルチューバーウイロイド由来である、請求項122〜124のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項１２６】
核局在化シグナルがジャガイモスピンドルウイロイドRG1株由来である、請求項122〜125のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項１２７】
核局在化シグナルが、配列番号3のヌクレオチド配列から選択される核局在化シグナルとして機能するヌクレオチド配列を含む、請求項122〜126のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項１２８】
大部分が二本鎖のRNAが、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IIIのゲノムヌクレオチド配列、カンキツウイロイド種IVのゲノムヌクレオチド配列、ホップ潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、オーストラリアブドウウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマトプランタマチョウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシチナンガヤウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、トマト頂端矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ココヤシカダング-カダングウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、カンキツエクソコーティスウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、コルムネア潜在ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、ホップ矮化ウイロイドのゲノムヌクレオチド配列、およびカンキツベントリーフウイロイドのゲノムヌクレオチド配列からなる群より選択されるウイロイドゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項122または123に記載のキメラRNA分子。
【請求項１２９】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列が配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択される、請求項128に記載のキメラRNA分子。
【請求項１３０】
大部分が二本鎖のRNA領域が、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムヌクレオチド配列を含む、請求項122〜129のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項１３１】
ウイロイドゲノムヌクレオチド配列がジャガイモスピンドルチューバーウイロイドRG1株のゲノムヌクレオチド配列である、請求項130に記載のキメラRNA分子。
【請求項１３２】
前記ゲノムヌクレオチド配列が配列番号3のヌクレオチド配列を有する、請求項131に記載のキメラRNA分子。
【請求項１３３】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの少なくとも35回の繰返しを含む、請求項121に記載のキメラRNA分子。
【請求項１３４】
大部分が二本鎖のRNA領域が、トリヌクレオチドCUGの44〜2000回の繰返しを含む、請求項133に記載のキメラRNA分子。
【請求項１３５】
前記RNA分子が複数の標的遺伝子特異的領域を含む、請求項121〜134のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項１３６】
前記RNA分子がイントロン配列を含む、請求項121〜135のいずれか1項に記載のキメラRNA分子。
【請求項１３７】
前記イントロン配列が、pdk2イントロン、トウゴマ由来のカタラーゼイントロン、ワタ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、シロイヌナズナ由来のデルタ12デサチュラーゼイントロン、トウモロコシ由来のユビキチンイントロン、イネ由来のアクチンイントロン、アスペルギルス由来のトリオースリン酸イソメラーゼイントロン、およびSV40由来のイントロンからなる群より選択される、請求項136に記載のキメラRNA分子。
【請求項１３８】
真核生物の細胞における標的遺伝子の発現を低下させるためのキメラDNA分子であって、
a)  前記真核生物の細胞においてRNAポリメラーゼにより認識され得るプロモーターまたはプロモーター領域と、これに機能的に連結された
b)  転写されたとき、請求項121〜137のいずれか1項に記載のキメラセンスRNA分子をもたらすDNA領域、
を含んでなる上記キメラDNA分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞および真核生物における関心のある遺伝子の発現を効率よくダウンレギュレーション（下方制御）するための方法に関する。そのために、本発明は、改変されたアンチセンスおよびセンスRNA分子、前記改変されたアンチセンスまたはセンスRNA分子をコードするキメラ遺伝子、ならびに改変されたアンチセンスおよび／またはセンスRNA分子またはそれをコードするキメラ遺伝子を含む植物、動物、または真菌、酵母もしくは糸状菌のような真核生物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、干渉RNA（RNAi）とも呼ばれる二本鎖RNA（dsRNA）またはヘアピンRNAの導入は、動物、真菌または植物を含む多数の真核生物において遺伝子サイレンシングを誘発するための有効なトリガーとなることが明らかにされている。
【０００３】
dsRNA介在遺伝子サイレンシングの定性レベル（ある生物内の遺伝子サイレンシングのレベル）および定量レベル（ある集団内で顕著なレベルの遺伝子サイレンシングを示す生物の数）はどちらも、以前のアンチセンスRNAまたはセンスRNA介在遺伝子サイレンシング法より優れていることが判明した。
【０００４】
実際上は、アンチセンスRNA分子およびこのようなアンチセンスRNAをコードするキメラ遺伝子の作製は、dsRNA分子またはそれをコードする遺伝子の作製よりも直接的である。事実、キメラ核酸dsRNA分子やそれをコードする遺伝子は、大きな、多かれ少なかれ完全な、逆方向反復構造を含み、かかる構造は、中間クローニング宿主の原核細胞内にこれらの核酸を完全な状態で維持することを妨げる傾向がある。アンチセンスRNA介在遺伝子サイレンシングの効率を高めるための、後述する方法および手段は、様々な実施形態および特許請求の範囲において説明するように、この問題に対する解決策を提供するものである。
【０００５】
US 5,190,131およびEP 0 467 349 A1は、非天然の核酸配列を細胞の遺伝物質に組み込んだり、または該遺伝物質と結合させたりすることにより、細胞における遺伝子の発現を調節または抑制するための方法および手段を開示している。前記配列が転写されるとmRNAが生成され、このmRNAは前記細胞の遺伝物質により生産されるmRNAに相補的で、該mRNAと結合することができる。
【０００６】
EP 0 223 399 A1は、標的RNA鎖に実質的に相補的なネガティブRNA鎖の植物細胞内での転写を引き起こすことにより、植物に有用な体細胞変化を生じさせる方法を開示している。標的RNA鎖は遺伝子発現において生じるmRNA転写産物、ウイルスRNA、または植物細胞中に存在する他のRNAでありうる。ネガティブRNA鎖は標的RNA鎖の少なくとも一部に相補的であって、その活性をin vivoで阻害する。
【０００７】
EP 0 240 208は、植物細胞ゲノムにコードされる遺伝子の発現を調節するための方法を開示しており、この方法は、宿主内で機能するプロモーターの転写制御下に遺伝子を組み込むことにより達成される。この方法においては、転写されるDNAの鎖が、調節しようとする内在性遺伝子から転写されるDNAの鎖に対して相補的である。
【０００８】
WO 95/15394およびUS 5908779は、核アンチセンスRNAによる阻害を介して（マウス）細胞における遺伝子発現を調節するための方法および構築物を開示している。この構築物は、プロモーター、アンチセンス配列、およびポリアデニル化機構とは無関係に3’末端を生成するシス-またはトランス-リボザイムを含んでおり、それによりRNA分子の細胞質への輸送を阻害する。
【０００９】
WO 98/05770は、(GC)n-パリンドローム-(GC)nまたは(AT)n-パリンドローム-(AT)nまたは(CG)n-パリンドローム-(CG)nのような特殊な二次構造を有するアンチセンスRNAを開示している。
【００１０】
WO 01/12824は、宿主細胞の核に、異常な（好ましくは、ポリアデニル化されていない）標的特異的RNAを供給することにより、真核細胞（特に、植物細胞）における関心のある核酸の表現型発現を低下させるための方法および手段を開示している。好ましくは、ポリアデニル化されていない標的特異的RNAは、プロモーター、標的特異的RNAをコードするDNA領域、自己スプライシングリボザイム、ならびに3’末端形成とポリアデニル化に関与するDNA領域を含むキメラ遺伝子の転写により供給される。
【００１１】
WO 02/10365は、真核生物における遺伝子抑制方法を提供し、この方法は、プロモーター、抑制しようとする遺伝子の少なくとも1つのアンチセンスおよび／またはセンスヌクレオチド配列を含む組換え構築物を用いて形質転換することにより達成され、その際、構築物の転写産物の核から細胞質への輸送が阻害される。1つの実施形態では、核から細胞質への輸送が正常な3’UTRの不在により阻害される。この構築物は場合により少なくとも1つの自己開裂性リボザイムを含んでいてもよい。また、この構築物は場合により、単一のプロモーターを用いて同時にダウンレギュレーションさせようとする複数の遺伝子に対するセンスおよび／またはアンチセンス配列を含むことができる。さらに、かかる組換え構築物を含むベクター、植物、動物、種子、配偶子、および胚も開示されている。 
Zhaoら, J. Gen. Virology, 82, 1491-1497 (2001)には、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（Potato spindle tuber viroid: PSTVd）の核ターゲッティングを実証するための全植物アッセイにおけるジャガイモウイルスXに基づいたベクターの使用が記載されている。
【００１２】
WO 02/00894は、遺伝子サイレンシング法に関し、この場合には、核酸構築物が転写される領域内にT塩基のストレッチからなるDNA配列を含んでいる。
【００１３】
WO 02/00904は、遺伝子サイレンシング法に関し、この場合には、核酸構築物が、宿主により発現される少なくとも1つの標的mRNAに対する相同領域と、これに接近して、該宿主内のいずれの内在性RNAとも関係のない2つの相補的RNA領域を含んでいる（またはコードしている）。
【発明の開示】
【００１４】
本発明の一実施形態では、真核生物の細胞における標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするための方法が提供され、この方法は、以下のステップ：
a)  真核生物の細胞にキメラRNA分子を供給すること、ここにおいて、前記キメラRNA分子は、
i)  標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む1つの標的遺伝子特異的領域または複数の標的遺伝子特異的領域と、これに機能的に連結された
ii) ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（PSTVd）型のウイロイド（例えば、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド、カンキツウイロイド種III、カンキツウイロイド種IV、ホップ潜在ウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、トマトプランタマチョウイロイド、ココヤシチナンガヤウイロイド、トマト頂端矮化ウイロイド、ココヤシカダング-カダングウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、およびカンキツベントリーフウイロイド）由来の核局在化シグナルを含む大部分が二本鎖のRNA領域、またはトリヌクレオチドCUG、CAG、GACもしくはGUCの少なくとも35回の繰返し（例えば、これらのトリヌクレオチドの44〜2000回の繰返し）を含む大部分が二本鎖のRNA領域、
を含むものであること、
b)  標的遺伝子の発現がダウンレギュレーションされている真核生物を同定すること、
を含んでなる。
【００１５】
キメラRNA分子はイントロン配列を含んでいてもよい。ウイロイドは配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8からなる群より選択されるゲノムヌクレオチド配列を含みうる。真核生物は植物であってよく、例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis)、アルファルファ、オオムギ、マメ、トウモロコシ、ワタ、アマ、エンドウ、セイヨウアブラナ、イネ、ライムギ、ベニバナ、モロコシ、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コムギ、アスパラガス、ビート、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッシュ、ホウレンソウ、カボチャ属、トマト、ズッキーニ、アーモンド、リンゴ、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カカオ、サクランボ、ココヤシ、クランベリー、ナツメヤシ、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、キーウィ、レモン、ライム、マンゴー、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、ラッカセイ、ナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、イチゴ、タンジェリン、クルミ、およびスイカから選択される植物が含まれる。真核生物はまた、真菌、酵母もしくは糸状菌であってもよく、また、ヒト、哺乳動物、魚、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、げっ歯類、ハムスター、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、霊長類、線虫類、甲殻動物、エビ、カニ、ロブスター、昆虫、ミバエ、鞘翅目（Coleapteran）の昆虫、双翅目（Dipteran）の昆虫、鱗翅目（Lepidopteran）の昆虫、または同翅亜目（Homeopteran）の昆虫のような動物であってもよい。
【００１６】
本発明の目的は、真核生物の細胞における標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするためのキメラRNA分子を提供することであり、このキメラRNA分子は、
前記標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む標的遺伝子特異的RNA領域と、これに機能的に連結された、
ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（PSTVd）型のウイロイド（例えば、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド、カンキツウイロイド種III、カンキツウイロイド種IV、ホップ潜在ウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、トマトプランタマチョウイロイド、ココヤシチナンガヤウイロイド、トマト頂端矮化ウイロイド、ココヤシカダング-カダングウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、およびカンキツベントリーフウイロイド）由来の核局在化シグナルを含む大部分が二本鎖のRNA領域、またはトリヌクレオチドCUG、CAG、GACもしくはGUCの少なくとも35回の繰返し（例えば、トリヌクレオチドCUG、CAG、GACもしくはGUCの44〜2000回の繰返し）を含む大部分が二本鎖のRNA領域と、
を含んでなり、これにより、前記キメラRNA分子は、真核生物の細胞に供給されると、前記標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションする。
【００１７】
本発明の別の目的は、真核生物の細胞における標的遺伝子の発現を低下させるためのキメラDNA分子を提供することであり、このキメラDNA分子は、
a)  前記真核生物の細胞においてRNAポリメラーゼにより認識され得るプロモーターまたはプロモーター領域と、これに機能的に連結された
b)  転写されたときRNA分子をもたらすDNA領域と、
を含んでなり、ここにおいて、前記RNA分子は、
i)  前記標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む1つの標的遺伝子特異的領域または複数の標的遺伝子特異的領域と、これに機能的に連結された
ii) ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド（PSTVd）型のウイロイド（例えば、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド、カンキツウイロイド種III、カンキツウイロイド種IV、ホップ潜在ウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、トマトプランタマチョウイロイド、ココヤシチナンガヤウイロイド、トマト頂端矮化ウイロイド、ココヤシカダング-カダングウイロイド、カンキツエクソコーティスウイロイド、コルムネア潜在ウイロイド、ホップ矮化ウイロイド、およびカンキツベントリーフウイロイド）由来の核局在化シグナルを含む大部分が二本鎖のRNA領域、またはトリヌクレオチドCUG、CAG、GACもしくはGUCの少なくとも35回の繰返し（例えば、トリヌクレオチドCUG、CAG、GACもしくはGUCの44〜2000回の繰返し）を含む大部分が二本鎖のRNA領域と、
を含むものであり、場合により、
iii) 前記RNA分子をコードする前記DNA領域に機能的に連結された転写終結およびポリアデニル化シグナルをさらに含み、
これにより、前記キメラDNA分子は、真核生物の細胞に供給されると、前記標的遺伝子の発現を低下させる。
【００１８】
真核生物宿主に応じて、プロモーターまたはプロモーター領域は、動物内で機能するプロモーター、酵母、真菌もしくは糸状菌内で機能するプロモーター、または植物で発現可能なプロモーターでありうる。また、プロモーターは単一サブユニットバクテリオファージRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターまたはプロモーター領域であってもよい。
【００１９】
本発明はさらに、本発明に従うキメラDNAまたはRNA分子を含む真核生物由来の細胞、ならびに細胞内に本発明に従うキメラDNAまたはRNA分子を含む非ヒト真核生物を提供する。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、真核生物の細胞における標的遺伝子の発現を低下させるための、本発明に従うキメラRNAまたはDNA分子の使用を提供することである。
【００２１】
本発明はさらに、細胞における標的遺伝子の発現が低下しているトランスジェニック真核生物の作製方法を提供し、この方法は、以下のステップ：
a)  前記生物の1個以上の細胞に本発明に従うキメラDNA分子を供給して、1個以上のトランスジェニック細胞を作製すること、
b)  前記1個以上のトランスジェニック細胞からトランスジェニック真核生物を成長または再生させること、
を含んでなる。
【００２２】
本発明はまた、真核生物の細胞における標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするための方法を提供し、この方法は、以下のステップ：
a)  真核生物の細胞に第1および第2のキメラRNA分子を供給すること、ただし、
i)   第1のキメラRNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
ii)  第2のキメラRNA分子は、第1のキメラRNA分子の相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
iii) 第1および第2のキメラRNAは、少なくとも、第1のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドと第2のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドの間で塩基対合することができること、
iv)  ここにおいて、第1または第2のキメラRNA分子のいずれかが、前記アンチセンス標的特異的RNA領域または前記センス標的特異的RNA領域に機能的に連結された、大部分が二本鎖のRNA領域を含むこと、
b)  標的遺伝子の発現がダウンレギュレーションされている真核生物を同定すること、
を含んでなる。第1および第2のキメラRNA分子は両方とも、大部分が二本鎖のRNA領域を含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の別の目的は、第1および第2のキメラRNA分子を含む真核生物由来の細胞、（ならびに、かかる細胞を含む非ヒト真核生物）を提供することであり、
i)   第1のキメラRNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
ii)  第2のキメラRNA分子は、第1のキメラRNA分子の相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
iii) 第1および第2のキメラRNAは、少なくとも、第1のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドと第2のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドの間で塩基対合することができること、
ここにおいて、第1または第2のキメラRNA分子のいずれかは、前記アンチセンス標的特異的RNA領域または前記センス標的特異的RNA領域に機能的に連結された、大部分が二本鎖のRNA領域を含むこと、を特徴とする。
【００２４】
本発明はさらに、キメラアンチセンスRNA分子と協同して、真核生物の細胞における標的遺伝子の発現を低下させるためのキメラセンスRNA分子、またはそのようなキメラセンスRNA分子をコードするキメラDNA分子を提供し、前記キメラセンスRNA分子は、前記標的遺伝子のヌクレオチドに対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス標的遺伝子特異的RNA領域と、これに機能的に連結された大部分が二本鎖のRNA領域と、を含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
遺伝子発現のアンチセンスRNA介在ダウンレギュレーションを高めるための、本明細書に記載の方法および手段は、予期せざる観察に基づくものであり、その観察とは、標的遺伝子特異的RNA配列を、ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドゲノムのヌクレオチド配列を含むRNA領域（そのRNAの核局在化シグナルを含む）のような、大部分が二本鎖のRNA領域に機能的に連結させると、植物細胞などの宿主生物の細胞に導入したとき、標的遺伝子の発現がダウンレギュレーションされた系統の数と、標的遺伝子の発現が顕著にダウンレギュレーションされ、阻止さえもされた系列の数の両方が増加した、というものである。
【００２６】
したがって、本発明の一実施形態では、真核生物の細胞における標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするための方法が提供され、この方法は、以下のステップ：
a)  真核生物の細胞にキメラRNA分子を供給すること、ここにおいて、前記キメラRNA分子は、
i)  標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む標的遺伝子特異的RNA領域（「アンチセンスRNA」）と、これに機能的に連結された
ii) 大部分が二本鎖のRNA領域、
を含むものであること、
b)  標的遺伝子の発現がダウンレギュレーションされている真核生物を同定すること、
を含んでなる。
【００２７】
本明細書中で用いる「キメラ遺伝子」または「キメラ核酸」とは、特定の真核生物種に通常は見出せない遺伝子または核酸をさし、あるいはまた、プロモーターが転写されるDNA領域の全部もしくは一部と、または遺伝子の少なくとも1つの他の調節領域と自然界で結合していない遺伝子をさす。
【００２８】
本明細書中で用いる「アンチセンスRNA」とは、標的遺伝子から転写される生物学的に活性なRNA（通常はmRNAであるが、これに限らない）のヌクレオチド配列の部分に対して大部分が相補的なヌクレオチド配列を含むRNA分子をさす。
【００２９】
本明細書中で用いる「標的遺伝子」という表現は、真核細胞中に存在し、かつ生物学的に活性なRNAに転写される核酸をさす。標的遺伝子は内在性の遺伝子であってもよいし、真核細胞の祖先にヒトの介入を経て導入されたトランスジーンであってもよいし、アグロバクテリウム菌株またはレトロウイルスのような感染性生物により細胞のゲノムに導入された遺伝子であってもよい。標的遺伝子はウイルス起源のものであってもよい。さらに、少なくとも19個のヌクレオチドのストレッチはプロモーター領域、5’UTR、コード領域、または3’UTRから選択することができる。
【００３０】
本明細書中で用いる「遺伝子発現」または「核酸の発現」とは、遺伝子または核酸が、適切な宿主細胞内に導入されたとき、RNAを生成するように転写（または複製）され、かつ／または、その宿主細胞においてポリペプチドもしくはタンパク質を生成するように翻訳されるプロセスをいう。
【００３１】
本明細書中で用いる「遺伝子発現のダウンレギュレーション」とは、本発明のRNAまたはキメラ遺伝子の存在下での真核細胞における対象の標的遺伝子または核酸の発現と、本発明のRNAまたはキメラ遺伝子の不在下での対象の標的遺伝子または核酸の発現との比較をさす。したがって、本発明のキメラRNAの存在下での標的遺伝子の発現は、その不在下での発現より低くなるべきであり、例えば、キメラRNAの不在下での表現型発現の約50％または約25％または約10％または約5％ほどでありうる。いくつかの用途の場合には、キメラRNAまたはキメラRNAをコードするキメラ遺伝子の存在によって発現が実際上完全に阻止されるべきである。
【００３２】
本明細書中で用いる「含む」および「含んでなる」とは、そこに挙げた特徴、整数、ステップまたは成分の存在を特定するものと解釈されるべきであるが、1以上の特徴、整数、ステップまたは成分、あるいはそのグループの存在または付加を排除するものではない。したがって、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に引き合いに出したものより多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができ、すなわち、より大きな核酸またはタンパク質の中に組み込まれていてもよい。機能的にまたは構造的に特定されるDNA領域を含むキメラ遺伝子は、追加のDNA領域などを含むことができる。
【００３３】
したがって、標的遺伝子特異的RNA領域の約19ntのアンチセンスRNAの最小ヌクレオチド配列は、サイズが19ntから標的遺伝子のサイズに等しい長さまでの間で変化し、全体的にさまざまな程度の配列同一性を有する、より大きなRNA分子内に含まれていてもよいことが明らかだろう。
【００３４】
本発明において、2つの関連したヌクレオチドまたはアミノ酸配列の、パーセントで表される「配列同一性」とは、2つの最適にアライメントさせた配列において、同一の残基を有する位置の数を、比較した位置の数で割った値（×100）をさす。ギャップ、すなわち、ある残基が一方の配列には存在するが、他方の配列には存在しないアライメント中の位置は、非同一残基を有する位置とみなされる。2つの配列同士のアライメントはNeedlemanおよびWunschのアルゴリズム (NeedlemanおよびWunsch 1970)を用いて行う。上記のコンピュータ支援配列アライメントは、Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, USA) の一部であるGAPのような標準ソフトウェアプログラムにより、ギャップ生成ペナルティ50およびギャップ延長ペナルティ3を有するデフォルトスコアリングマトリックスを用いて、都合よく行うことができる。配列が少なくとも約75％、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらに好ましくは約90％、特に好ましくは約95％、さらに特に好ましくは約100％の配列同一性を有する場合、それらの配列は「実質的に類似している」とされる。RNA配列がDNA配列と実質的に類似しているか、ある程度の配列同一性を有する場合、DNA配列中のチミン(T)がRNA配列中のウラシル(U)と同等であるとみなされることは明らかである。したがって、本出願において、19個連続したヌクレオチドの配列が19個のヌクレオチドの配列に対して94％の配列同一性を有すると記載される場合、これは、第1配列の19個のヌクレオチドのうち少なくとも18個が第2配列の19個のヌクレオチドのうち18個と同一であることを意味する。
【００３５】
したがって、記載されるアンチセンスヌクレオチド領域は、長さが約21nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt、さらには約5000ntまたはそれ以上であってもよく、それぞれが約40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％の全体的な配列同一性を有する。配列が長ければ長いほど、全体的な配列同一性の要件は厳格でなくなる。
【００３６】
さらに、1つの標的遺伝子のヌクレオチド配列の相補体に対して配列同一性を有する複数の配列（複数の標的遺伝子特異的RNA領域）は、1つのRNA分子内に存在することができる。また、数個の標的遺伝子のヌクレオチド配列の相補体に対して配列同一性を有する複数の配列が1つのRNA分子内に存在してもよい。
【００３７】
「標的遺伝子特異的」とは、本発明によるキメラ核酸が特定の標的遺伝子のダウンレギュレーションにのみ使用されるという意味に解釈されるべきでない。事実、標的遺伝子特異的RNA領域と別の遺伝子との間に十分な相同性が存在するか、または他の遺伝子が（いわゆる遺伝子ファミリーに属する遺伝子のように）19ヌクレオチドの同一のストレッチを共有する場合には、こうした他の遺伝子の発現もダウンレギュレーションされることがある。
【００３８】
本明細書中で用いる「大部分が二本鎖のRNA領域」とは、内部の塩基対合により棒(rod)状構造にフォールディング可能なRNA分子をさす。生じる棒状構造は、そのRNA分子内の他の19個連続したヌクレオチドの別のストレッチの相補体に対して94％の配列同一性を有して、RNA分子が棒状構造にフォールディングしたとき二本鎖領域を形成することができる、19個連続したヌクレオチドのいかなるストレッチも含まない。換言すれば、フォールディングしたとき、大部分が二本鎖のRNA領域は、19bp中にせいぜい1つのミスマッチを有する少なくとも19bpの二本鎖RNA領域を含まず、少なくともエネルギー的に最も有利な棒状のコンフォメーションにおいては含まない。限定するものではないが、このような構造の例を図1に示す。
【００３９】
本発明を特定の作用様式に限定するつもりはないが、そのような大部分が二本鎖のRNA領域は、それらが結合されるアンチセンスRNA分子の核局在化に関与すると考えられる。その結果、アンチセンスRNA分子の核内濃度が増加し、アンチセンスRNAに対応するセンスRNAとの塩基対合による配列特異的dsRNAがより効率的に形成される。
【００４０】
本明細書中でRNA分子に関して用いる「棒状構造にフォールディング可能」という用語は、RNA分子が内部の塩基対合によって好ましく適応し、長い棒のような全体的な外観を有する二次構造を形成することをさす。棒状構造は分岐部または突出部（マッチしないヌクレオチドが全体的な構造から突き出ている部分）を含んでいてもよく、また、より大きな二次構造（棒状でもよいし、そうでなくてもよい）の一部であってもよい。棒状構造にフォールディング可能なRNA分子の例を図1に示す。
【００４１】
適応する具体的な二次構造は、RNA分子の自由エネルギーにより決定され、FOLDRNA (ZukerおよびStiegler, 1981)またはGCGのMFOLD構造予測パッケージ (Genetics Computing Group; Zuker 1989, Science 244, 48-52)のような適当なソフトウェアを用いて様々な状況について予測することができる。
【００４２】
本発明の一実施形態において、アンチセンスRNA分子に機能的に連結される大部分が二本鎖のRNA領域は、宿主細胞または宿主植物細胞の核内で複製することができるPSTVd（ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド）のようなPSTVd型のウイロイドに由来する核局在化シグナルである。
【００４３】
本発明の一実施形態において、大部分が二本鎖のRNA領域は、配列番号3に示すヌクレオチド配列のようなPSTVd RG1株の全長配列を含み、この配列は、下記のヌクレオチド配列：
5’-cgcagatctcggaactaaactcgtggttc-3’[配列番号1] および
5’-gcgagatctaggaaccaactgcggttc-3’[配列番号2]
を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ウイロイドのRNAゲノムのcDNAコピーからの増幅により都合よく取得することができる。
【００４４】
RNA分子に組み込む場合は、DNA分子を対応するRNA分子に変換するための追加のステップが必要であることが理解される。そのような変換は、転写、例えば単一サブユニットバクテリオファージRNAポリメラーゼを用いるin vitro転写により達成することができる。
【００４５】
RNA配列が、配列表のエントリー中に表示されている、または配列表に示したDNA配列と本質的に類似している、または該DNA配列に対してある程度の配列同一性を有する、とされる場合には、エントリー中の該配列に対応するRNA配列に言及していることが明らかである。ただし、DNA配列中のチミン(T)はRNA配列ではウラシル(U)に置き換えられる。その言及がRNA配列に対してなのか、DNA配列に対してなのかは、前後関係によりすぐに明らかになろう。
【００４６】
同様の大部分が二本鎖のRNA構造は、PSTVd型（またはBussiereら, 1996による分類に従うグループB）の他の核複製性ウイロイドのゲノム内にも見出され、これらのRNA配列も同様に効果的に使用することができる。PSTVdグループの他の核複製性ウイロイドとしては、カンキツウイロイド種III(Citrus viroid species III)、カンキツウイロイド種IV(Citrus viroid species IV)、コレウスウイロイド(Coleus viroid)、ホップ潜在ウイロイド(Hop latent viroid) (配列番号7)、オーストラリアブドウウイロイド(Australian grapevine viroid) (配列番号4)、トマトプランタマチョウイロイド(Tomato planta macho viroid) (配列番号6)、ココヤシチナンガヤウイロイド(Coconut tinangaja viroid) (配列番号5)、トマト頂端矮化ウイロイド(Tomato apical stunt viroid) (配列番号8)、ココヤシカダング-カダングウイロイド(Coconut cadang-cadang viroid)、カンキツエクソコーティスウイロイド(Citrus exocortis viroid)、コルムネア潜在ウイロイド(Columnea latent viroid)、ホップ矮化ウイロイド(Hop stunt viroid)、およびカンキツベントリーフウイロイド(Citrus bent leaf viroid)を挙げることができる。これらのウイロイドは自己スプライシング活性の不在によっても特徴づけられ、これはハンマーヘッドモチーフのような触媒モチーフが存在しないことで明らかになる (Busiereら, Nuc. Acids Res. 24, 1793-1798, 1996)。PSTVd型の全ウイロイドの中で完全なdsRNA構造の最長ストレッチは11塩基対のサイズである。通常、ミスマッチはかなり均一に分布している。
【００４７】
これらのウイロイドのヌクレオチド配列は、世界的ウェブ(http://www.callisto.si.usherb.ca/~jpperraまたはhttp://nt.ars-grin.gov/subviral/ )によりアクセス可能なデータベースにコンプライされており、以下のものが含まれる：
ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド(PSTVd) [PSTVd.1 (登録番号: J02287(gb), M16826(gb), V01465(embl); 333351(gi), 333352(gi)および62283(gi)); PSTVd.2 (登録番号: M38345(gb), 333354(gi)); PSTVd.3 (登録番号: M36163(gb), 333356(gi)); PSTVd.4 (登録番号: M14814(gb), 333357(gi)); PSTVd.5 (株: S.commersonii) (登録番号: M25199(gb), 333355(gi)); PSTVd.6 (株: tomato cv. Rutgers, 分離株: KF440-2) (登録番号: X58388(embl), 61366(gi)); PSTVd.7 (KF6-M弱毒株) (登録番号: M88681(gb), 333358(gi)); PSTVd.8 (Burdock株) (登録番号: M88678(gb), 333360(gi)); PSTVd.9 (Wisconsin (WB) 株) (登録番号: M88677(gb), 333359(gi)); PSTVd.10 (PSTVd-N (Naaldwijk) 株) (登録番号: X17268(embl), 60649(gi)) ;PSTVd.11 (弱毒株変異体A, WA-M分離株) (登録番号: X52036(embl), 61365(gi)); PSTVd.12 (弱毒株, F-M分離株) (登録番号: X52037(embl), 61367(gi)); PSTVd.13 (中程度の毒性株, F-IS分離株) (登録番号: X52039(embl), 61369(gi)); PSTVd.14 (有毒致死株, F-SL分離株) (登録番号: X52038(embl), 61368(gi)); PSTVd.15 (中程度の毒性株, F88-IS分離株) Herold,Tら, Plant Mol. Biol. 19, 329-333 (1992)に発表; PSTVd.16 (F88またはS88変異株)(登録番号: X52040(embl), 61370(gi)); PSTVd.17 (個体分離株 kf 5) (登録番号: M93685(gb), 333353(gi)); PSTVd.18 (KF5分離株) (登録番号: S54933(gb), 265593(gi)); PSTVd.19 (S-XII株, s27変種) (登録番号: X76845(embl), 639994(gi)); PSTVd.20 (S-XIII株, s23変種) (登録番号: X76846(embl), 639993(gi)); PSTVd.21 (M株(弱毒)) (登録番号: X76844(embl), 639992(gi)); PSTVd.22 (I-818株, I4変種) (登録番号: X76848(embl), 639991(gi)); PSTVd.23 (I-818株, I3変種) (登録番号: X76847(embl), 639990(gi)); PSTVd.24 (PSTVd-341株) (登録番号: Z34272(embl), 499191(gi)); PSTVd.25 (QF B株) (登録番号: U23060(gb), 755586(gi)) PSTVd.26 (QF A株) (登録番号: U23059(gb), 755585(gi)); PSTVd.27 (RG 1株) (登録番号: U23058(gb), 755584(gi)); PSTVd.28 (登録番号: U51895(gb), 1272375(gi)); PSTVd.29(ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド) (登録番号: X97387(embl), 1769438(gi)); PSTVd.30 (S27-VI-24株) (登録番号: Y09382(emb), 2154945(gi)); PSTVd.31 (S27-VI-19株) (登録番号: Y09383(emb), 2154944(gi)); PSTVd.32 (SXIII株) (登録番号: Y08852(emb), 2154943(gi)); PSTVd.33 (S27-I-8株) (登録番号: Y09381(emb), 2154942(gi)); PSTVd.34 (PSTV M-VI-15株) (登録番号: Y09577(emb), 2154941(gi)); PSTVd.35 (PSTV M-I-40株) (登録番号: Y09576(emb), 2154940(gi)); PSTVd.36 (PSTV M-I-17株) (登録番号: Y09575(emb), 2154939(gi)); PSTVd.37 (PSTV M-I-10株) (登録番号: Y09574(emb), 2154938(gi)); PSTVd.38 (I4-I-42変異株) (登録番号: Y09889(emb), 2154937(gi)); PSTVd.39 (PSTVd I2-VI-27変異株) (登録番号: Y09888(emb), 2154936(gi)); PSTVd.40 (PSTVd I2-VI-25変異株) (登録番号: Y09887(emb), 2154935(gi)); PSTVd.41 (PSTVd I2-VI-16変異株) (登録番号: Y09886(emb), 2154934(gi)); PSTVd.42 (PSTVd I4-I-10変異株) (登録番号: Y09890(emb), 2154933(gi)); PSTVd.43 (PSTVd I2-I-14変異株) (登録番号: Y09891(emb), 2154932(gi)) ; PSTVd.44 (KF7分離株) (登録番号: AJ007489(emb), 3367737(gi)); PSTVd.45 (登録番号: AF369530, 14133876(gi)] ;
【００４８】
グループIIIカンキツウイロイド (CVd-III) [CVd-III.1 (登録番号: S76452(gb), 913161(gi)); CVd-III.2 (Australia New South Wales 分離株) (登録番号: S75465(gb)およびS76454(gb), 914078(gi)および913162(gi)); CVd-III.3 (登録番号: AF123879, GI:7105753);  CVd-III.4 (登録番号: AF123878, GI:7105752) CVd-III.5 (登録番号: AF123877, GI:7105751); CVd-III.6 (登録番号: AF123876, GI:7105750); CVd-III.7 (登録番号: AF123875, GI:7105749); CVd-III.8 (登録番号: AF123874, GI:7105748); CVd-III.9 (登録番号: AF123873, GI:7105747); CVd-III.10 (登録番号: AF123872, GI:7105746); CVd-III.11 (登録番号: AF123871, GI:7105745); CVd-III.12 (登録番号: AF123870, GI:7105744); CVd-III.13 (登録番号: AF123869, GI:7105743); CVd-III.14 (登録番号: AF123868, GI:7105742); CVd-III.15 (登録番号: AF123867, GI:7105741); CVd-III.16 (登録番号: AF123866, GI:7105740); CVd-III.17 (登録番号: AF123865, GI:7105739); CVd-III.18 (登録番号: AF123864, GI:7105738); CVd-III.19 (登録番号: AF123863, GI:7105737); CVd-III.20 (登録番号: AF123860, GI:7105736); CVd-III.21 (登録番号: AF123859, GI:7105735); CVd-III.22 (登録番号: AF123858, GI:7105734); CVd-III.23 (登録番号: AB054619, GI:13537479); CVd-III.24 (登録番号: AB054620, GI:13537480); CVd-III.25 (登録番号: AB054621, GI:13537481); CVd-III.26 (登録番号: AB054622, GI:13537482); CVd-III.27 (登録番号: AB054623, GI:13537483); CVd-III.28 (登録番号: AB054624, GI:13537484); CVd-III.29 (登録番号: AB054625, GI:13537485); CVd-III.30 (登録番号: AB054626, GI:13537486); CVd-III.31 (登録番号: AB054627, GI:13537487); CVd-III.32 (登録番号: AB054628, GI:13537488); CVd-III.33 (登録番号: AB054629, GI:13537489); CVd-III.34 (登録番号: AB054630, GI:13537490); CVd-III.35 (登録番号: AB054631, GI:13537491); CVd-III.36 (登録番号: AB054632, GI:13537492); CVd-III.37 (登録番号: AF416552, GI:15811643); CVd-III.38 (登録番号: AF416553, GI:15811644); CVd-III.39 (登録番号: AF416374, GI:15788948); CVd-III.40 (登録番号: AF434680)]; 
【００４９】
カンキツウイロイドIV (CVdIV) [CVdIV.1 (登録番号: X14638(embl), 59042(gi))]  
【００５０】
コリウス(Coleus blumei)-1ウイロイド (CbVd-1) [CbVd.1 (コリウスウイロイド1 (CbVd 1),栽培変種株Bienvenue, ドイツ分離株) (登録番号: X52960(embl), 58844(gi)); CbVd.2 (コレウスイエローウイロイド(CYVd), ブラジル分離株) (登録番号: X69293(embl), 59053(gi)); CbVd.3 (コリウスウイロイド1-RG ステム-ループRNA.) (登録番号: X95291(embl), 1770104(gi)); CbVd.4 (コリウスウイロイド1-RL RNA) (登録番号: X95366(embl), 1770106(gi))]
【００５１】
コリウス-2ウイロイド (CbVd-2) [CbVd.1 (コリウスウイロイド2-RL RNA) (登録番号: X95365(embl), 1770107(gi)); CbVd.2 (コリウスウイロイドCbVd 4-1 RNA) (登録番号: X97202(embl), 1770109(gi))] 
【００５２】
コリウス-3ウイロイド (CbVd-3) [CbVd.1 (コリウスウイロイド3-RL) (登録番号: X95364(embl), 1770108(gi)); CbVd.2 (コリウス栽培変種「Fairway Ruby」由来のコリウスウイロイド8) (登録番号: X57294(embl),780766(gi)); CbVd.3 (コリウスウイロイド3-FR ステム-ループRNA, コリウス栽培変種「Fairway Ruby」由来) (登録番号: X95290(embl), 1770105(gi))]
【００５３】
ホップ潜在ウイロイド (HLVd)
[HLVd.1 (登録番号: X07397(embl), 60259(gi)); HLVd.2 (「熱変異株(thermomutant)」T15) (登録番号: AJ290404(gb), 13872743(gi)); HLVd.3 (「熱変異株」T40)(登録番号: AJ290405.1(gb), 13872744(gi)); HLVd.4 (「熱変異株」T50)(登録番号: AJ290406(gb), 13872745(gi)); HLVd.5 (「熱変異株」T59)(登録番号: AJ290406(gb), 13872746(gi)); HLVd.6 (「熱変異株」T61)(登録番号: AJ290408(gb) 13872747(gi)); HLVd.7 (「熱変異株」T75)(登録番号: AJ290409(gb), 13872748(gi)); HLVd.8 (「熱変異株」T92) (登録番号: AJ290410(gb), 13872749(gi)); HLVd.9 (「熱変異株」T218) (登録番号: AJ290411(gb), 13872750(gi)); HLVd.10 (「熱変異株」T229)(登録番号: AJ290412(gb), 13872751(gi))]
【００５４】
オーストラリアブドウウイロイド (AGVd) [AGVd.1 (登録番号: X17101(embl), 58574(gi))] 
【００５５】
トマトプランタマチョウイロイド (TPMVd) [TPMVd.1 (登録番号: K00817(gb))]
【００５６】
ココヤシチナンガヤウイロイド (CTiVd) [CTiVd.1 (登録番号: M20731(gb), 323414(gi))]
【００５７】
トマト頂端矮化ウイロイド (TASVd) [TASVd.1 (登録番号 K00818(gb), 335155(gi)); TASVd.2 (株: インドネシア)(登録番号: X06390(embl), 60650(gi)); TASVd.3(トマト頂端矮化ウイロイド-S ステム-ループRNA.) (登録番号: X95293(embl), 1771788(gi))]
【００５８】
カダング-カダングココヤシウイロイド (CCCVd) [CCCVd.1 (分離株 baao 54, ccRNA 1 fast) (登録番号: J02049(gb), 323275(gi)); CCCVd.2 (分離株 baao 54, ccRNA 1 fast) (登録番号: J02050(gb), 323276(gi)); CCCVd.3 (分離株 baao 54, ccRNA 1 slow) (登録番号: J02051(gb), 323277(gi)); CCCVd.4 (分離株 Ligao 14B, 620C, 191DおよびT1, ccRNA 1 fast) (Haseloffら Nature 299, 316-321 (1982)) CCCVd.5 (分離株 Ligao T1, ccRNA 1 slow) (Haseloffら Nature 299, 316-321 (1982)); CCCVd.6 (分離株 Ligao 14B, ccRNA 1 slow) (Haseloffら Nature 299, 316-321 (1982)); CCCVd.7 (分離株 San Nasciso, ccRNA 1 slow) (Haseloffら Nature 299, 316-321 (1982))]
【００５９】
カンキツエクソコーティスウイロイド (CEVd) [CEVd.1 (gynura由来cev) (登録番号: J02053(gb), 323302(gi)); CEVd.2 (A株) (登録番号: M34917(gb), 323305(gi)); CEVd.3 (de25株)(登録番号: K00964(gb), 323303(gi)); CEVd.4 (de26株) (登録番号: K00965(gb), 323304(gi)); CEVd.5 (CEV-JB) (登録番号: M30870(gb), 484119(gi)); CEVd.6 (CEV-JA) (登録番号: M30869(gb), 484118(gi)); CEVd.7 (登録番号: M30871(gb), 484117(gi)); CEVd.8 (CEV-A)(登録番号: M30868(gb), 484116(gi)); CEVd.9 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.10 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.11 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.12 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.13 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.14 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.15 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.16 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.17 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.18 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.19 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.20 (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.21 (cev-j classe B) (Visvader,J.E.およびSymons,R.H. Nucleic Acids Res. 13, 2907-2920 (1985)); CEVd.22 (ブドウウイロイド(GV)) (登録番号: Y00328(embl), 60645(gi)); CEVd.23 (CEVd-t) (登録番号: X53716(embl), 433503(gi)); CEVd.24 (CEVcls, トマトハイブリッドカルス分離株) (登録番号: S67446(gb), 141247(gi)); CEVd.25 (CEV D-92) (登録番号: S67442(gb), 141248(gi)); CEVd.26 (CEVt, トマトハイブリッド分離株) (登録番号: S67441(gb), 141246(gi)); CEVd.27 (CEVt, トマト分離株)(登録番号: S67440(gb), 141245(gi)); CEVd.28 (CEVg, Gynura分離株) (登録番号: S67438(gb), 141244(gi)); CEVd.29 (CEVc, シトロン分離株) (登録番号: S67437(gb), 141243(gi)); CEVd.30 (CEVd-225株) (登録番号: U21126(gb), 710360(gi)); CEVd.31 (ソラマメ分離株, Vicia faba L.) (登録番号: S79831(gb), 1181910(gi)); CEVd.32 (トマトにcevd.31を接種した後に得られる変異株) (Fagoagaら J. Gen. Virol. 76, 2271-2277 (1995)); CEVd.33 (Fagoagaら J. Gen. Virol. 76, 2271-2277 (1995)); CEVd.34 (登録番号: AF298177, 15419885(gi)); CEVd.35 (登録番号: AF298178, 15419886(gi)); CEVd.36 (登録番号: AF428058 )(カンキツエクソコーティスウイロイド分離株 205-E-1 Uy, 完全なゲノム); CEVd.37 (登録番号: AF428059) (カンキツエクソコーティスウイロイド分離株 205-E-2 Uy, 完全なゲノム); CEVd.38 (登録番号: AF428060) (カンキツエクソコーティスウイロイド分離株 205-E-5 Uy, 完全なゲノム); CEVd.39 (登録番号: AF428061) (カンキツエクソコーティスウイロイド分離株 205-E-7 Uy, 完全なゲノム); CEVd.40 (登録番号: AF428062) (カンキツエクソコーティスウイロイド分離株 54-E-1 Uy, 完全なゲノム); CEVd.41 (登録番号: AF428063) (カンキツエクソコーティスウイロイド分離株 54-E-3 Uy, 完全なゲノム); CEVd.42 (登録番号: AF428064) (カンキツエクソコーティスウイロイド分離株 54-E-18 Uy, 完全なゲノム); CEVd.43 (登録番号: AF434678) (カンキツエクソコーティスウイロイド, 完全なゲノム)]
【００６０】
コルムネア潜在ウイロイド (CLVd) [CLVd.1 (登録番号: X15663(embl), 58886(gi)); CLVd.2 (CLVd-N, 個体分離株 Nematanthus) (登録番号: M93686(gb), 323335(gi)); CLVd.3(コルムネア潜在ウイロイド-B ステム-ループRNA) (登録番号: X95292(embl), 1770174(gi))]
【００６１】
カンキツベントリーフウイロイド (CBLVd) [CBLVd.1 (CVd-Ib) (登録番号: M74065(gb), 323413(gi)); CBLVd.2 (CBLVd-225株) (登録番号: U21125(gb), 710359(gi)); CBLVd.3 (ウイロイドIa ゲノムRNA, 分離株: Jp) (登録番号: AB006734(dbj), 2815403(gi)); CBLVd.4 (ウイロイドIb ゲノムRNA, 分離株: P2) (登録番号: AB006735(dbj), 2815401(gi)); CBLVd.5 (ウイロイドIa ゲノムRNA) (登録番号: AB006736(dbj), 2815402(gi)); CBLVd.6 (カンキツウイロイドIa クローン17) (登録番号: AF040721(gb), 3273626(gi)); CBLVd.7 (カンキツウイロイドIa クローン18) (登録番号: AF040722(gb), 3273627(gi)); CBLVd.8 (カンキツベントリーフウイロイド分離株 201-1-1 Uy, 完全なゲノム) (登録番号: AF428052); CBLVd.9 (カンキツベントリーフウイロイド分離株 201-1-2 Uy, 完全なゲノム) (登録番号: AF428053); CBLVd.10 (カンキツベントリーフウイロイド分離株 201-1-5 Uy, 完全なゲノム) (登録番号: AF428054); CBLVd.11 (カンキツベントリーフウイロイド分離株 205-1-1 Uy, 完全なゲノム) (登録番号: AF428055); CBLVd.12 (カンキツベントリーフウイロイド分離株 205-1-3 Uy, 完全なゲノム) (登録番号: AF428056); CBLVd.13 (カンキツベントリーフウイロイド分離株 205-1-4 Uy, 完全なゲノム) (登録番号: AF428057)] 
【００６２】
ホップ矮化ウイロイド (HSVd) [HSVd.h1 (日本型株) (登録番号: X00009(embl), 60684(gi)); HSVd.h2 (日本株, 変異体2) (Leeら Nucleic Acids Res. 16, 8708-8708 (1988)); HSVd.h3 (韓国株) (登録番号: X12537(embl), 60421(gi)); HSVd.g1 (ブドウウイロイド(GVVd), 分離株SHV-g(GV)) (登録番号: M35717(gb), 325405(gi)); HSVd.g2 (株: ドイツ栽培変種Riesling) (登録番号: X06873(embl), 60422(gi)); HSVd.g3 (株: Vitis vinifera Rootstock 5BBから分離) (登録番号: X15330(embl), 60648(gi)); HSVd.g4 (ブドウ分離株 (HSVdg), 変異体Ia) (登録番号: X87924(embl), 897764(gi)); HSVd.g5 (ブドウ分離株 (HSVdg), 変異体Ib) (登録番号: X87923(embl), 897765(gi)); HSVd.g6 (ブドウ分離株 (HSVdg), 変異体Ic) (登録番号: X87925(embl), 897766(gi)); HSVd.g7 (ブドウ分離株(HSVdg), 変異体Id)(登録番号: X87926(embl), 897767(gi)); HSVd.g8 (ブドウ分離株(HSVdg), 変異体Ie) (登録番号: X87927(embl), 897768(gi)); HSVd.g9 (ブドウ分離株(HSVdg), 変異体IIa) (登録番号:X87928(embl), 897769(gi)); HSVd.cit1 (変異体1, 分離株HSV-cit) (登録番号: X06718(embl), 60646(gi)); HSVd.cit2 (変異体2, 分離株HSV-cit) (登録番号: X06719(embl), 60647(gi)); HSVd.cit3 (HSV.カンキツ) (登録番号: X13838(embl), 60418(gi)); HSVd.cit4 (登録番号: U02527(gb), 409021(
gi)); HSVd.cit5 (Hsuら Virus Genes 9, 193-195 (1995)); HSVd.cit6 cit5 (Hsuら Virus Genes 9, 193-195 (1995)); HSVd.cit7 (分離株 CVd-IIaまたはE819) (登録番号: AF131248(gb)); HSVd.cit8 (分離株 CVd-IIbまたはCa902) (登録番号: AF131249(gb)); HSVd.cit9 (分離株 CVd-IIcまたはCa905) (登録番号: AF131250(gb)); HSVd.cit10 (分離株Ca903) (登録番号: AF131251(gb)); HSVd.cit11 (分離株 CA909) (登録番号: AF131252(gb)); HSVd.cit12 (悪液質(cachexia)分離株 X-701-M) (登録番号: AF213483(gb), 12082502(gi)); HSVd.cit13 (悪液質分離株 X-701-1) (登録番号: AF213484(gb), 12082503(gi)); HSVd.cit14 (悪液質分離株 X-701-2) (登録番号: AF213485(gb), 12082504(gi)); HSVd.cit15 (悪液質分離株 X-701-3) (登録番号: AF213486(gb), 12082505(gi)); HSVd.cit16 (悪液質分離株 X-704-M) (登録番号: AF213487(gb), 12082506(gi)); HSVd.cit17 (悪液質分離株 X-704-1) (登録番号: AF213488(gb), 12082507(gi)); HSVd.cit18 (悪液質分離株 X-704-2) (登録番号: AF213489(gb), 12082508(gi)); HSVd.cit19 (悪液質分離株 X-704-3) (登録番号: AF213490(gb), 12082509(gi)); HSVd.cit20 (悪液質分離株 X-707-M) (登録番号: AF213491(gb), 12082510(gi)); HSVd.cit21 (悪液質分離株 X-707-1) (登録番号: AF213492(gb), 12082511(gi)); HSVd.cit22 (悪液質分離株 X-707-2) (登録番号: AF213493(gb), 12082512(gi)); HSVd.cit23 (悪液質分離株 X-707-3) (登録番号: AF213494(gb), 12082513(gi)); HSVd.cit24 (悪液質分離株 X-707-4) (登録番号: AF213495(gb), 12082514(gi)); HSVd.cit25 (悪液質分離株 X-712-M) (登録番号: AF213496(gb), 12082515(gi)); HSVd.cit26 (悪液質分離株 X-712-1) (登録番号: AF213497(gb), 12082516(gi)); HSVd.cit27 (悪液質分離株 X-712-2) (登録番号: AF213498(gb), 12082517(gi)); HSVd.cit28 (悪液質分離株 X-712-3) (登録番号: AF213499(gb), 12082518(gi)); HSVd.cit29 (悪液質分離株 X-715-M) (登録番号: AF213500(gb), 12082519(gi)); HSVd.cit30 (悪液質分離株 X-715-1) (登録番号: AF213501(gb), 12082520(gi)); HSVd.cit31 (悪液質分離株 X-715-2) (登録番号: AF213502(gb), 12082521(gi)); HSVd.cit32 (CVd-Iia (117)) (登録番号: AF213503(gb), 12082522(gi));  HSVd.cit33 (分離株 CVd-IIa 17uy) (登録番号: AF359276(gb), 13991644(gi));  HSVd.cit34 (分離株 CVd-IIa 11uy) (登録番号: AF359275(gb), 13991643(gi)); HSVd.cit35 (分離株 CVd-IIa 10uy) (登録番号: AF359274(gb), 13991642(gi));  HSVd.cit36 (分離株 CVd-Ib 10uy) (登録番号: AF359273(gb), 13991641(gi));  HSVd.cit37 (分離株 CVd-Ib 5uy) (登録番号: AF359272(gb), 13991640(gi));  HSVd.cit38 (分離株 CVd-Ib 3uy) (登録番号: AF359271(gb), 13991639(gi));  HSVd.cit39 (分離株 CVd-Ib 2uy) (登録番号: AF359270(gb), 13991638(gi)); 
HSVd.cit40 (分離株 CVd-IIa) (登録番号: X69519(embl), 2369773(gi)); HSVd.cit41 (分離株 CVd-IIb) (登録番号: X69518(embl),2369774(gi));  HSVd.cit42 (分離株 CVd-IIa 54-2-1) (登録番号: AF416554, 15811645(gi));  HSVd.cit43 (分離株 CVd-IIa 54-2-2) (登録番号: AF416555, 15811646(gi)); HSVd.cit44 (分離株 CVd-IIa 205-2-4) (登録番号: AF416556, 15811647(gi)); HSVd.cit45 (分離株 CVd-IIa 205-2-1) (登録番号: AF416557, 15811648(gi)); HSVd.p1 (HSV-peach (A9)) (登録番号: D13765(dbj), 221254(gi)); HSVd.p2 (HSV-plumおよびHSV-peach (AF) 分離株) (登録番号: D13764(dbj), 221255(gi)); HSVd.p3 (スペインからのcv. Jeronimo J-16) (登録番号: Y09352(embl),1684696(gi)); HSVd.apr1 (フランスからのcv. Rouge de Roussillon) (登録番号: Y08438(embl), 2462494(gi)); HSVd.apr2 (スペインからの不明の栽培変種) (登録番号: Y08437 (embl), 2462495(gi)); HSVd.apr3 (スペインからのcv. Bulida) (登録番号: Y09345(embl),1684690(gi)); HSVd.apr4 (スペインからのcv. Bulida) (登録番号: Y09346(embl),1684691(gi)); HSVd.apr5 (スペインからのcv. Bulida d'Arques) (登録番号: Y09344(embl),1684692(gi)); HSVd.apr6 (スペインからのcv. Pepito del Rubio) (登録番号:Y09347(embl), 1684697(gi) ); HSVd.apr7 (スペインからのcv. Pepito del Rubio) (登録番号: 09348(embl), 1684699(gi)); HSVd.apr8 (スペインからのcv. Pepito del Rubio) (登録番号: Y09349(embl), 684698(gi)); HSVd.apr9 (モロッコからのcv. Canino) (登録番号: AJ297825(gb), 10944963(gi)); HSVd.apr10 (モロッコからのcv. Canino) (登録番号: AJ297826(gb), 10944964(gi)); HSVd.apr11 (モロッコからのcv. Canino) (登録番号: AJ297827(gb), 10944965(gi)); HSVd.apr12 (モロッコからのcv. Canino) (登録番号: AJ297828(gb), 10944966(gi)); HSVd.apr13 (モロッコからのcv. Canino) (登録番号: AJ297829(gb), 10944967(gi)); HSVd.apr14 (トルコからのcv. Septik) (登録番号: AJ297830(gb), 10944968(gi)); HSVd.apr15 (キプロスからのcv. Monaco bello) (登録番号: AJ297831(gb), 10944969(gi)); HSVd.apr16 (キプロスからのcv. Cafona) (登録番号: AJ297832(gb), 10944970(gi)); HSVd.apr17 (キプロスからのcv. Cafona) (登録番号: AJ297833(gb), 10944971(gi)); HSVd.apr18 (キプロスからのcv. Boccuccia spinosa) (登録番号: AJ297834(gb), 10944972(gi)); HSVd.apr19 (キプロスからのcv. Palumella) (登録番号: AJ297835(gb), 10944973(gi)); HSVd.apr20 (キプロスからのcv. Palumella) (登録番号: AJ297836(gb), 10944974(gi)); HSVd.apr21 (キプロスからのcv. Canino) (登
録番号: AJ297837(gb), 10944975(gi)); HSVd.apr22 (ギリシャからのcv. Kolioponlou) (登録番号: AJ297838(gb), 10944976(gi)); HSVd.apr23 (ギリシャからのcv. Bebecou Paros) (登録番号: AJ297839(gb), 10944977(gi)); HSVd.apr24 (ギリシャからのcv. Bebecou Paros) (登録番号: AJ297840(gb), 10944978(gi)); HSVd.c1 (キュウリペールフルーツウイロイド(Cucumber pale fruit viroid) (CPFVd), 分離株 HSV-cucumber) (登録番号: X00524(embl), 60644(gi)); HSVd.c2 ((キュウリペールフルーツウイロイド (CPFVd)) (登録番号: X07405(embl), 59015(gi)); HSVd.alm1 (登録番号: AJ011813(emb), 3738118(gi)); HSVd.alm2 (登録番号: AJ011814(emb), 3738119(gi)); HSVd. カンキツウイロイドII, 完全なゲノム (登録番号: AF434679)]。これらのヌクレオチド配列のすべてを参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【００６３】
上記リストからも直ちに明らかとなるように、ウイロイドは非常に配列変化を起こしやすいが、そのような天然の変異体も、それらが機能的に連結されたRNAと共に核に輸送される能力を保持するかぎり、本発明の方法および手段に使用することができる。
【００６４】
ウイロイドヌクレオチド配列の天然の改変に加えて、特定のヌクレオチドの置換、欠失または付加によっても変異体を得ることができ、かかる変異体も、それらが機能的に連結されたRNAと共に核に輸送される能力を保持するかぎり、本発明の方法および手段に使用することができる。
【００６５】
さらに、機能的に連結されたRNAと共に核に輸送され得るウイロイドヌクレオチド配列由来のより小さなRNA領域およびその変異体も、本発明において使用することができる。
【００６６】
植物細胞などの宿主細胞の核に輸送されるウイロイドヌクレオチド配列由来の小領域および変異体の能力は、Zhouら, 2001, J. Gen Virology, 82, 1491-1497に記載のアッセイを用いて調べることができる。簡単に説明すると、このアッセイは、宿主細胞の細胞質において複製するウイルスRNAベクターを用いて、マーカー遺伝子のコード領域中に介在配列を含むマーカーコード領域（例えば、GFP）を宿主細胞に導入することを含む。機能的な核局在化シグナルが導入される（有利には、介在配列中に挿入される）と、マーカー遺伝子を含むウイルスRNAベクターは核に移され、そこでイントロンが除去されて、スプライシングされたRNAが細胞質に戻される。スプライシングされたRNAは、GFPタンパク質への翻訳により、ならびにスプライシングされたRNA分子からのイントロンの不在を確かめるRNA分析法（例えば、RT-PCR）により検出することができる。
【００６７】
さらに、ヒト肝炎デルタRNAは、核に局在化されて棒状構造を形成するという点でPSTVd型のウイロイドに非常に似ている1700 ntの一本鎖環状RNAであり、これも本発明に従って使用することができる。
【００６８】
本発明の別の実施形態においては、大部分が二本鎖のRNA領域はCUG、CAG、GACまたはGUC繰返しを含む。本明細書中で用いる「トリヌクレオチド繰返し」あるいは「CUG、CAG、GACまたはGUC繰返し」とは、いくつかのCUG、CAG、GACまたはGUCトリヌクレオチドを含むRNA分子のことである。好ましくは、CUGトリヌクレオチドは介在配列なしで繰り返されるが、CUGトリヌクレオチドで構成されない1から20〜30ヌクレオチドの短い領域がCUGトリヌクレオチド繰返し間に存在してもよい。好ましくは、CUG繰返しは35コピーまたは44コピーを超えた数（例えば、50コピーと2000コピーの間の任意の数）のCUGトリヌクレオチドを含む。有利には、CUGトリプレットのコピー数は100または150を超えないほうがよい。CAG、GACまたはGUC繰返しも同様に使用できると予想される。
【００６９】
本発明を特定の作用様式に限定するつもりはないが、このようなトリヌクレオチド繰返しは不完全な塩基対合によって棒状構造を形成し、この棒状構造が（おそらくは核膜孔からのRNA輸送を立体的に阻止することによって）核保持シグナルとして機能すると同時に、二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼPKRを活性化すると考えられる [Davisら, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 7388-7393; Tianら, 2000 RNA 6, 79-87; KochおよびLefert 1998 J. Theor. Biol. 192, 505-514]。
【００７０】
CUG繰返しを含むRNA分子が、後述するように、例えば当該RNAをコードするキメラ遺伝子の転写により、宿主細胞の核に送達される場合、かかるCUG繰返しはアンチセンス介在遺伝子サイレンシングの効率を高めるのに特に適している。
【００７１】
PSTVd型ウイロイド由来の核局在化シグナルまたはトリヌクレオチド繰返しのような、大部分が二本鎖のRNA領域は、標的特異的アンチセンスRNAの3’末端に位置づけることが有利であるが、大部分が二本鎖のRNA領域の位置はあまり重要ではないと予想される。それゆえ、大部分が二本鎖のRNA領域はRNA分子の5’末端に存在してもよく（好ましくは、3’末端）、そのようなRNA分子の中央部にさえ存在してもよい。
【００７２】
また、予期せざることに、遺伝子発現のアンチセンス介在ダウンレギュレーションは、大部分が二本鎖のRNA領域にアンチセンスRNAが機能的に連結されている場合、宿主細胞に供給されるRNA分子中にイントロン配列を含めることによってさらに増強しうることがわかった。この場合も、RNA分子中の標的特異的ヌクレオチド配列および大部分が二本鎖のRNA領域の双方に対するイントロンの位置は、効率にほとんど影響を与えないと予想される。事実、大部分が二本鎖のRNA領域をイントロン配列内に位置づけることができると考えられる。
【００７３】
本明細書中で用いる「イントロン」または介在配列とは、より大きな転写DNA内のDNA領域をさすために用いられ、このDNA領域が核内で転写されると、より大きなRNAの一部であるRNA領域が生成されるが、イントロン配列に対応するこのRNA領域は、細胞質に移行するとき、より大きなRNAから取り除かれる。対応するRNAもイントロンまたは介在配列と称される。イントロン配列はスプライシング部位によって挟まれた配列であり、合成イントロンを作製するには、適切な分枝点を有する基本的に任意の配列に適切なスプライス部位を結合させる。5’UTR、コード領域または3’UTR内に位置するイントロンまたは介在配列を使用することが可能である。
【００７４】
介在配列またはイントロンは好ましくは宿主真核細胞内でスプライシングされるべきであるが、（例えば、それらのガイド配列が改変されているか、または突然変異を起こしているため）もはやスプライシングされない介在配列の存在が、標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするキメラRNA分子の効率をさらに高めることさえある。本発明の一実施形態では、イントロンは双子葉植物フラベリア・トリネルビア（Flaveria trinervia）のピルビン酸・リン酸ジキナーゼ2イントロン2（pdk2イントロン）と配列が実質的に同一であり、配列番号9の配列を含みうる。植物イントロンの他の例としては、トウゴマ(Castor bean)由来のカタラーゼイントロン (登録番号AF274974)、ワタ由来のデルタ12デサチュラーゼ(Fad2)イントロン (登録番号AF331163)、シロイヌナズナ(Arabidopsis)由来のデルタ12デサチュラーゼ(Fad2)イントロン (登録番号AC069473)、トウモロコシ由来のユビキチンイントロン (登録番号S94464)、イネ由来のアクチンイントロンが挙げられる。哺乳動物ウイルスイントロンのその他の例には、SV40由来のイントロンが含まれる。真菌イントロンの例には、アスペルギルス(Aspergillus)由来のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来のイントロンがある。
【００７５】
また、予期せざることに、真核生物の細胞中にすでに存在するアンチセンスRNA分子の標的遺伝子特異的領域に対応する標的遺伝子特異的領域を有するセンスRNA分子をさらに導入すると、標的遺伝子の発現のダウンレギュレーションの効率がさらに高まることが見出された。標的遺伝子の発現のダウンレギュレーションの同じ効率が、本明細書に記載するような大部分が二本鎖のRNA領域と共にセンスRNA分子を供給したときに観察された。センスRNA分子は、そのセンスRNA分子との塩基対合により二本鎖領域を形成することができるアンチセンスRNA分子と同時に、真核宿主生物の細胞に供給された。
【００７６】
したがって、本発明の別の実施形態では、真核生物の細胞における標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションするための方法が提供され、この方法は、以下のステップ：
a)  真核生物の細胞に第1および第2のキメラRNA分子を供給すること、ただし、
i)   第1のキメラRNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアンチセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
ii)  第2のキメラRNA分子は、第1のキメラRNA分子の相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むセンス標的遺伝子特異的RNA領域を含むこと、
iii) 第1および第2のキメラRNAは、少なくとも、第1のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドと第2のキメラRNAの前記19個連続したヌクレオチドの間で塩基対合することができること、
iv)  ここにおいて、第1または第2のキメラRNA分子のいずれかが、前記アンチセンス標的特異的RNA領域または前記センス標的特異的RNA領域に機能的に連結された、大部分が二本鎖のRNA領域を含むこと、
b)  標的遺伝子の発現がダウンレギュレーションされている真核生物を同定すること、
を含んでなる。
【００７７】
別の特定の実施形態においては、第1および第2の両キメラRNA分子は大部分が二本鎖の領域を含む。大部分が二本鎖のRNA領域および標的遺伝子特異的アンチセンスRNAの特定の実施形態は本明細書に記載したとおりである。センスRNA領域の特定の実施形態はアンチセンスRNA領域の特定の実施形態と同様である。
【００７８】
有利には、本明細書に記載するような大部分が二本鎖のRNA領域を含むアンチセンスまたはセンスRNA分子は、キメラ遺伝子（その転写により、そのようなアンチセンスまたはセンスRNAがもたらされる）の導入と起こりうる組込みにより、真核宿主細胞または生物に供給される。したがって、本発明は、そのようなキメラ遺伝子を提供することも目的にしており、かかるキメラ遺伝子は、
−  対象の真核生物の細胞において発現され得るプロモーターまたはプロモーター領域と、これに機能的に連結された、転写されたときアンチセンスRNA分子をもたらすDNA領域、ただし、前記アンチセンスRNA分子は、
−  標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドの相補体に対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドの標的遺伝子特異的アンチセンスヌクレオチド配列、または
−  標的遺伝子のヌクレオチド配列からの19個連続したヌクレオチドに対して少なくとも約94％の配列同一性を有する少なくとも約19個連続したヌクレオチドの標的遺伝子特異的センスヌクレオチド配列と、これに機能的に連結された、
−  本明細書に記載するような、大部分が二本鎖のRNA領域、
を含むものであること、および、場合により、
−  選択した真核細胞に適した転写終結およびポリアデニル化領域、
を含んでなる。
【００７９】
本明細書中で用いる「プロモーター」という用語は、転写開始時にDNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されて、それと直接または間接的に結合するDNAをさす。プロモーターは、転写開始部位と、転写開始因子およびRNAポリメラーゼのための結合部位を含み、また、遺伝子発現調節タンパク質が結合しうる他の部位（例えば、エンハンサー）を含んでいてもよい。
【００８０】
本明細書中で用いる「調節領域」という用語は、所定のDNA配列（例えば、タンパク質またはポリペプチドをコードするDNA）の転写を駆動し、かつその転写のタイミングおよびレベルを制御（すなわち、調節）することに関与しているDNAをさす。例えば、5’調節領域（または「プロモーター領域」）はコード配列の上流（すなわち、5’側）に位置するDNA配列であって、プロモーターと5’-非翻訳リーダー配列を含んでいる。3’調節領域はコード配列の下流（すなわち、3’側）に位置するDNA配列であって、1以上のポリアデニル化シグナルをはじめとする適当な転写終結（および／または調節）シグナルを含んでいる。
【００８１】
本発明の一実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。本発明の別の実施形態では、プロモーター活性が外部または内部刺激により増強され（誘導プロモーター）、かかる刺激として、例えばホルモン、化学物質、機械的衝撃、非生物的または生物的ストレス条件があるが、これらに限らない。また、プロモーターの活性は時間的または空間的にも調節することが可能である（組織特異的プロモーター；発生的に調節されるプロモーター）。
【００８２】
本発明の特定の実施形態において、プロモーターは植物発現可能プロモーターである。本明細書中で用いる「植物発現可能プロモーター」とは、植物細胞内で転写を制御（開始）することができるDNA配列を意味する。これには植物由来のあらゆるプロモーターが含まれるが、植物細胞内で転写を指令することができる非植物由来のプロモーターも含まれる。すなわち、ウイルスまたは細菌由来のいくつかのプロモーター、例えばCaMV35S (Hapsterら, 1988)、地下性クローバーウイルスプロモーターNo4もしくはNo7(WO9606932)、またはT-DNA遺伝子プロモーターも含まれ、さらに組織特異的または器官特異的プロモーター、例えば種子特異的プロモーター (例えば、WO89/03887)、器官原基特異的プロモーター(Anら, 1996)、茎特異的プロモーター(Kellerら, 1988)、葉特異的プロモーター(Hudspethら, 1989)、葉肉特異的プロモーター(例えば、光誘導性Rubiscoプロモーター)、根特異的プロモーター(Kellerら, 1989)、塊茎特異的プロモーター(Keilら, 1989)、維管束組織特異的プロモーター(Pelemanら, 1989 )、雄しべ選択的プロモーター(WO 89/10396, WO 92/13956)、裂開帯(dehiscence zone)特異的プロモーター(WO 97/13865)なども含まれる。
【００８３】
本発明の別の特定の実施形態において、プロモーターは真菌発現可能プロモーターである。本明細書中で用いる「真菌発現可能プロモーター」とは、真菌細胞内で転写を制御（開始）することができるDNA配列を意味し、例えば、A. nidulans trpC遺伝子プロモーターまたは誘導性S. cerevisiae GAL4プロモーターなどがあるが、これらに限らない。
【００８４】
本発明のさらに別の特定の実施形態において、プロモーターは動物発現可能プロモーターである。本明細書中で用いる「動物発現可能プロモーター」とは、動物細胞内で転写を制御（開始）することができるDNA配列を意味し、例えば、SV40後期および初期プロモーター、サイトメガロウイルスCMV-IEプロモーター、RSV-LTRプロモーター、SCSVプロモーターなどがあるが、これらに限らない。
【００８５】
本発明に有用なアンチセンスまたはセンスRNA分子はまた、in vitro転写によっても作製することができる。このために、本発明によるキメラ遺伝子のプロモーターは、バクテリオファージの単一サブユニットRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターであってよく、例えば、大腸菌ファージT7、T3、φI、φII、W31、H、Y、A1、122、cro、C21、C22、およびC2; シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)ファージgh-1; ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)ファージSP6; レイ菌(Serratia marcescens)ファージIV; シトロバクター(Citrobacter)ファージViIII; およびクレブシェラ(Klebsiella)ファージNo.11に由来するRNAポリメラーゼが含まれる [Hausmann, Current Topics in Microbiology and Immunology, 75: 77-109 (1976); Korstenら, J. Gen Virol. 43: 57-73 (1975); Dunnら, Nature New Biology, 230: 94-96 (1971); Towleら, J. Biol. Chem. 250: 1723-1733 (1975); Butler and Chamberlin, J. Biol. Chem., 257: 5772-5778 (1982)]。このようなプロモーターの例は、それぞれT3 RNAポリメラーゼ特異的プロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼ特異的プロモーターである。CIG中の第1プロモーターとして用いられるT3プロモーターは、McGrawら, Nucl. Acid Res. 13: 6753-6766 (1985)に記載されるT3遺伝子のいずれかのプロモーターでありうる。あるいはまた、T3プロモーターは、T3 RNAポリメラーゼにより認識されるようにヌクレオチド位置-10、-11および-12で改変されたT7プロモーターでありうる [Klementら, J. Mol. Biol. 215, 21-29(1990)]。好ましいT3プロモーターは、米国特許第5,037,745号に記載されるように、T3プロモーターの「コンセンサス」配列を有するプロモーターである。T7 RNAポリメラーゼと組み合わせて、本発明に従って使用しうるT7プロモーターは、DunnおよびStudier, J. Mol. Biol. 166: 477-535 (1983)に記載されるようなT7遺伝子のうちの1つの遺伝子のプロモーターを含む。好ましいT7プロモーターは、DunnおよびStudier(前掲)に記載されるように、T7プロモーターの「コンセンサス」配列を有するプロモーターである。
【００８６】
アンチセンスまたはセンスRNAは、アクセプターベクターDNAを適当なバクテリオファージ単一サブユニットRNAポリメラーゼと、当業者に公知の条件下で、接触させることにより大量に作製することができる。そのようにして作製したアンチセンスまたはセンスRNAは、その後、植物細胞、真菌細胞または動物細胞のような、遺伝子サイレンシングを起こしやすい細胞に送達するために使用される。アンチセンスRNAはリポソームや他のトランスフェクション試薬（例えば、ClonTechからのClonfectionトランスフェクション試薬またはCalPhos哺乳動物トランスフェクションキット）により動物細胞に導入することができ、適当な標的遺伝子をサイレンシングすることによって、ヒトをはじめとする動物の治療方法に使用できると考えられる。アンチセンスまたはセンスRNAはいくつかの異なる方法で細胞に導入することができる。例えば、マイクロインジェクション、アンチセンスまたはセンスRNAを被覆した粒子による衝撃、アンチセンスまたはセンスRNAの溶液中への細胞または生物の浸漬、アンチセンスまたはセンスRNAの存在下での細胞膜のエレクトロポレーション、アンチセンスまたはセンスRNAのリポソーム介在送達、リン酸カルシウムのような化学物質が介在するトランスフェクション、ウイルス感染、形質転換などによりアンチセンスまたはセンスRNAを導入しうる。細胞によるRNAの取込みを高めたり、アニーリングした鎖を安定化したり、あるいは他の方法で標的遺伝子の阻害を増大する成分と共に、アンチセンスまたはセンスRNAを導入してもよい。完全な動物の場合には、アンチセンスまたはセンスRNAを生物の内腔または間隙に注入または灌流することにより、あるいは全身的に経口、局所、非経口（皮下、筋肉内、または静脈内投与を含む）、膣内、直腸内、鼻腔内、眼内、または腹腔内投与により導入することが有利である。また、アンチセンスまたはセンスRNAを植込み式の持続放出装置により投与することもできる。
【００８７】
アンチセンスまたはセンスRNAを生産することができる本発明のキメラ遺伝子は、特定の原核生物宿主でのアンチセンスまたはセンスRNAの発現に適した、任意の原核生物プロモーターを備えていてもよい。原核生物宿主は、線虫や昆虫のような動物（標的遺伝子のサイレンシングを想定して、それをリポーター遺伝子の発現低下によりモニタリングする）に該原核生物を摂取させることにより、アンチセンスおよび／またはセンスRNAの供給源として使用することができる。この場合には、標的遺伝子とリポーター遺伝子は標的真核生物の細胞内に存在する遺伝子であって、原核生物宿主の細胞内には存在すべきでないことが明らかだろう。こうして、本発明のアンチセンスおよびセンスRNA、あるいはこの種のアンチセンスまたはセンスRNA分子をもたらし得るキメラ遺伝子は、1つの宿主生物において産生させて、別の標的生物に（例えば、摂取、経口投与により、裸のDNAもしくはRNA分子として、リポソームに封入して、ウイルス粒子もしくは弱毒ウイルス粒子に挿入して、または不活性粒子上に被覆して）投与し、その別の生物において1以上の標的遺伝子の発現低下を起こすことができる。
【００８８】
適切な転写終結およびポリアデニル化領域としては、限定するものではないが、SV40ポリアデニル化シグナル、HSV TKポリアデニル化シグナル、Agrobacterium tumefaciensのノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター、CaMV 35S転写産物のターミネーター、地下性矮化クローバーウイルス(subterranean stunt clover virus)のターミネーター、Aspergillus nidulans trpC遺伝子のターミネーターなどが挙げられる。
【００８９】
本発明はさらに、これらのキメラ遺伝子からの転写により得ることができ、本発明による方法に有用であるアンチセンスおよびセンスRNA分子を提供することを目的とする。
【００９０】
本発明の別の目的は、本発明のアンチセンスRNA分子を含有するか、または本発明のアンチセンスRNA分子をもたらすことができるキメラ遺伝子を含有する、真核細胞ならびに非ヒト真核生物を提供することである。好ましい実施形態では、キメラ遺伝子が真核生物の細胞のゲノムに安定して組み込まれる。
【００９１】
本発明の目的はまた、センスおよびアンチセンスRNA分子（そのうちの一方または両方のRNA分子は大部分が二本鎖のRNA領域を含む）を同時に含有するか、またはそのようなRNA分子をコードするキメラ遺伝子を含有する、真核細胞ならびに非ヒト真核生物を提供することである。
【００９２】
別の実施形態において、本発明のキメラ遺伝子は、真核生物の細胞内で自律複製が可能なDNA分子（例えば、ウイルスベクター）上に担持させることができる。また、キメラ遺伝子またはアンチセンスもしくはセンスRNAを真核生物の細胞に一過性に保持させてもよい。
【００９３】
キメラ遺伝子（またはRNA分子）の宿主細胞への導入は、さまざまな方法により行うことができ、こうした方法には、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイル法(microprojectile bombardment)、核へのマイクロインジェクションなどがある。
【００９４】
キメラ遺伝子の植物細胞への導入方法は当技術分野で周知であり、アグロバクテリウム介在形質転換、粒子銃送達、マイクロインジェクション、インタクトな細胞のエレクトロポレーション、ポリエチレングリコールによるプロトプラスト形質転換、プロトプラストのエレクトロポレーション、リポソームによる形質転換、シリコン-ウィスカー(silicon-whisker)介在形質転換などが含まれる。このようにして得られた形質転換細胞を、その後、繁殖可能な成熟植物へと再生することができる。
【００９５】
トランスジェニック動物は、キメラ遺伝子を受精した卵母細胞の前核に注入したり、細胞（好ましくは、未分化の細胞）を発生中の胚に移植してキメラ胚を作製したり、組換え細胞からの核を除核した胚または活性化卵母細胞に移植したりすることにより作製することができる。トランスジェニック動物の作製方法は当技術分野で十分に確立されており、米国特許第4,873,191号; Rudolphら 1999 (Trends Biotechnology 17:367-374); Dalrympleら (1998) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 15: 33-49; Colman (1998) Bioch. Soc. Symp. 63: 141-147; Wilmutら (1997) Nature 385: 810-813; Wilmuteら (1998) Reprod. Fertil. Dev. 10: 639-643; Perryら (1993) Transgenic Res. 2: 125-133; Hoganら Manipulating the Mouse Embryo, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory press, 1994、ならびにそこに引用された文献を参照されたい。
【００９６】
従来の育種法で生産される、本発明のキメラ遺伝子を含む植物または動物の配偶子、種子、胚、子孫、ハイブリッドも本発明の範囲内に含まれる。
【００９７】
本明細書に記載する方法および手段は、遺伝子サイレンシングが起こるどのような真核生物にも適用することができ、かかる生物としては、とりわけ、植物（トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、ヒマワリ、シバ、オオムギ、ライムギ、トマト、サトウキビ、ベニバナ、ワタ、シロイヌナズナ、イネ、アブラナ属植物、野菜、ダイズ、タバコ、樹木、アマ、ヤシ、落花生、マメ類など）、無脊椎動物（例えば、昆虫、甲殻動物、軟体動物、エビ、カニ、ロブスターなど）、脊椎動物（例えば、魚、鳥類、哺乳動物、ヒト）、酵母および菌類が含まれ、これらに限定されない。
【００９８】
以下の非限定的な実施例では、真核細胞内での標的遺伝子発現のアンチセンスRNA媒介サイレンシング、またはセンス／アンチセンスRNA組合せにより媒介される標的遺伝子サイレンシングを増強するための方法および手段について記載する。
【００９９】
実施例で特に断らないかぎり、全ての組換えDNA法は、Sambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、ならびにAusubelら (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの第1および2巻に記載されるような、標準的プロトコルに従って行われる。植物分子の研究のための標準的な材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd (UK)とBlackwell Scientific Publications, UKから共同で発行された、R.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に記載されている。標準的な分子生物学技法に関するその他の文献としては、SambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、ならびにBrown (1998) Molecular Biology LabFax, 第2版, Academic Press (UK)の第IおよびII巻が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応に関する標準的な材料および方法は、DieffenbachおよびDveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびMcPhersonら (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, 第1版, Springer Verlag, Germanyに見出すことができる。
【０１００】
説明および実施例全体を通して、以下の配列を参照されたい：
配列番号1: RG1 PSTVdの増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー 
配列番号2: RG1 PSTVdの増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー 
配列番号3: PSTVd RG1のゲノムのヌクレオチド配列 
配列番号4: オーストラリアブドウウイロイドのゲノムのヌクレオチド配列
配列番号5: ココヤシチナンガヤウイロイドのゲノムのヌクレオチド配列
配列番号6: トマトプランタマチョウイロイドのゲノムのヌクレオチド配列 
配列番号7: ホップ潜在ウイロイドのゲノムのヌクレオチド配列
配列番号8: トマト頂端矮化ウイロイドのゲノムのヌクレオチド配列 
配列番号9: pdk2イントロンのヌクレオチド配列
配列番号10: EIN2 cDNAのヌクレオチド配列
配列番号11: ゲノムEIN2クローンのヌクレオチド配列
配列番号12: 実施例に記載の構築物中で用いるEIN2部分の増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー1
配列番号13: 実施例に記載の構築物中で用いるEIN2部分の増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー2
配列番号14: pMBW491中のpTSVd配列
配列番号15: pMBW489中のpTSVd配列(10ヌクレオチドの欠失を有する)。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：  異なるキメラ遺伝子を含む異なる植物系統の作製
各種の構築物を用いて発現をダウンレギュレーションさせるための標的遺伝子の例として、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のEIN2遺伝子を選択した。EIN2遺伝子発現のダウンレギュレーションは、種子をMS-ACC培養基（アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(ACC)を含む)上で発芽させ、暗室または光線のもとで生育させることにより、簡単に肉眼で観察することができる。暗室で生育させたEIN2サイレンス化苗は、野生型の苗と比べて、長い胚軸と発達した根系を有する。一方、光線のもとで生育させたEIN2サイレンス化苗は、その比較的大きい子葉によって野生型の苗と区別することができる（図3参照）。
【０１０２】
さまざまな構築物中でセンスまたはアンチセンス配向で使用されるEIN2ヌクレオチド配列はPCRで増幅したが、その際、配列番号12および13に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、鋳型DNAとしてはゲノムDNA（ヌクレオチド配列については、配列番号11参照）またはcDNA（ヌクレオチド配列については、配列番号10参照）を使用した。ゲノムEIN2配列部分(gEIN2)の増幅により、配列番号11の538位のヌクレオチドから1123位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を有するPCR断片を取得したが、この断片はEIN2遺伝子の2つの天然のイントロンを含んでいた。
【０１０３】
gEIN2断片をKpnI/ClaI断片としてpART7 (Gleave, 1992 Plant. Mol. Biol. 20: 1203-1207)にクローニングしてpMBW313を取得し、35Sプロモーター-gEIN2sense-OCS3’カセットをpART27 (Gleave 1992 前掲)にNotI部位でクローニングしてpMBW353を取得した。
【０１０４】
同様の断片(cEIN2)をPCRで増幅したが、鋳型としてEIN2 cDNA (配列番号10)を使用し、gEIN2の場合と同じプライマー対を使用した。cEIN2断片をBamHI/ClaIで消化し、pSHUTTLE (Wangら, 1998 Acta Hort. 461: 401-407)に同一部位でクローニングしてpMBW310を得た。次に、XbaIを用いてpMBW310からcEIN2断片を切り出し、pART7のXbaI部位にクローニングしてpMBW351を形成させた。この中間体ベクターから35S-EIN2アンチセンス-OCS3’カセットを切り出し、pWBVec2A (Wangら 1998, 前掲)にNotI部位でクローニングしてpMBW360を得た。
【０１０５】
PSTVd RG1株の全長配列(配列番号3)は、配列番号1および配列番号2のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてcDNAから増幅した。得られたPCR断片をBglIIで消化し、pMBW313のBamHI部位にクローニングしてpMBW345を得、pMBW345から35S-gEIN2-PSTVd-OCS3’カセットを切り出して、pART27にNotI部位でクローニングするとpMBW355が得られた。
【０１０６】
pMBW359の場合は、PCR増幅したPSTVd配列をBglIIで消化し、pMBW310のBamHI部位にクローニングしてpMBW346を得、pMBW346からXbaIでcEIN2アンチセンス-PSTVd配列を切り出し、pHANNIBAL (Wesleyら 2001)のXbaI部位にクローニングしてpMBW349を形成した。次に、35S-pdk2-cEIN2アンチセンス-PSTVd-OCS3’カセットをpWBVec2aにNotI部位でクローニングしてpMBW359を形成した。cEIN2アンチセンスPSTVd断片もpWBVec2aにクローニングしてpMBW357を得た。
【０１０７】
EIN2 cDNA断片をpMBW310からEcoRV/BamHIで切り出し、Pfu処理して平滑末端とし、pKANNIBAL (Wesleyら 2001)のBamHI部位(同様にPfu処理した)に連結させた。35Sプロモーターに対して両方の配向でcEIN2を有するプラスミドを回収し、pMWB401 (アンチセンス)およびpMBW404 (センス配向)と命名した。
【０１０８】
pLMW37、pLMW38、pLMW39およびpLMW40の場合は、cEIN2断片をPSTVd配列の逆方向繰返し配列の上流または下流にセンスまたはアンチセンス配向で挿入した。そのために、部分的PSTVd配列（配列番号3の16位のヌクレオチドから355位のヌクレオチドまで）をPSTVdゲノムの完全コピーに対して逆方向でpdkイントロンの上流にクローニングした。 
いろいろな構築物の模式図を図2に示す。
【０１０９】
実施例２：  実施例1の異なるキメラ遺伝子を含むトランスジェニック・シロイヌナズナ系統におけるEIN2遺伝子発現の分析
図2に示すキメラ構築物を従来法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入し、得られたアグロバクテリウム株を用いて、キメラ遺伝子を浸漬法によりシロイヌナズナ生態型ランドバーグ・エレクタ(Landsberg erecta)に導入した。選択薬剤として15 mg/L ヒグロマイシンまたは50 mg/Lカナマイシンを用いてトランスジェニック系統を選択した。T1 opr F1種子を集めて、EIN2サイレンシングをアッセイした。
【０１１０】
そのために、50μMのACCを含むMS培養基に種子を播いた。プレートをパラフィルムでしっかりとシールし、光線のもとにまたは暗室に置いた。サイレンシングは、根と子葉の大きさを観察することにより（光線のもとで保温）、あるいは根または胚軸の大きさを観察することにより（暗室で保温）評価した。EIN2サイレンス化系統においては、根または胚軸が同一条件下で生育させた野生型系統よりも著しく長くなり、また、子葉が顕著に大きくなる。
【０１１１】
初代形質転換体からの種子をMS-ACC培養基に播き、パラフィルムでシールし、4℃で0〜2晩保持し、その後生育室に移して光線のもとにまたは暗室に置いた。EIN2遺伝子のサイレンシングは、（光線のもとで発芽するものについては）根と子葉の大きさを、（暗室で発芽するものについては）胚軸の大きさを調べることにより評価した。顕著なまたは強いサイレンシングでは根または胚軸が長くなり、弱いサイレンシングでは子葉が比較的大きくなるが、根または胚軸は短い。これらの結果を表1に要約する。
【表１】
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【０１１２】
実施例３：  実施例1の異なるキメラ遺伝子を含むトランスジェニック・シロイヌナズナ系統の交雑により得られたシロイヌナズナ系統におけるEIN2遺伝子発現の分析
シロイヌナズナ系統MBW353、MBW355、MBW359、MBW360を他家受粉させることにより、センスおよびアンチセンスEIN2構築物を同時に含む新系統を得た。これらの新系統を実施例2に記載したのと同様の方法で分析した。結果を表2に要約する。トランスジーンの少なくとも一方がPSTVd配列を含んでいた植物は非常に効率よくサイレンシングされた。
【表２】
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【０１１３】
実施例４：  哺乳動物細胞におけるGFP遺伝子の遺伝子サイレンシングを媒介するための様々なキメラ遺伝子の構築、ならびにCHO細胞における分析
哺乳動物細胞における発現をダウンレギュレーションさせるための標的遺伝子の例として、CMVプロモーター領域の制御下で発現されかつSV40ポリアデニル化シグナルが後に続くヒト化GFPコード領域を選択した(pCI-GFP)。
【０１１４】
GFPコード領域をCMVプロモーター領域に対してセンス方向（pMBW493、pMBW494およびpMBW497）またはアンチセンス方向（pMBW489、pMBW491またはpMBW496）のいずれかでクローニングした、様々な実験的サイレンシング構築物を作製した。
【０１１５】
プラスミドpMBW493およびpMBW489は、GFPコード領域の下流であってSV40ポリアデニル化シグナルの上流に、10ヌクレオチドの欠失を有するPSTVd配列に対応するヌクレオチド配列（配列番号15）を含んでいた。この欠失は予想された二次構造に影響を与える（図5参照）。
【０１１６】
プラスミドpMBW494およびpMBW491は、GFPコード領域の下流であってSV40ポリアデニル化シグナルの上流に、10ヌクレオチドの欠失を有しない配列番号14のPSTVd配列に対応するヌクレオチド配列を含んでいた。
【０１１７】
プラスミドpMBW497およびpMBW496は、GFPコード領域の下流であってSV40ポリアデニル化シグナルの上流に、60のCUGトリヌクレオチドの繰返しを含むヌクレオチド配列を含んでいた。
【０１１８】
異なる実験プラスミドを、GFP発現キメラ遺伝子を含むプラスミドと組み合わせてCHO細胞に（様々な濃度で）導入した（表3；エントリー1〜18）。GFP構築物はセンス構築物中では機能的な配列であるため、これらの構築物単独によるGFP発現を調べるために、センスGFPを含む実験構築物を、余分のGFP発現キメラ遺伝子を用いないで、導入した（表3；エントリー19〜30）。さらに、アンチセンスおよびセンス実験構築物の組合せを様々な濃度でCHO細胞に導入した（表3；エントリー31〜42）。対照として、キメラGFP発現構築物(pCi-GFP)をCHO細胞に単独で導入した。
【０１１９】
24時間または48時間後、細胞をGFP発現について評価した。平均カウント数と標準偏差を表3に示す。
【０１２０】
pTSVdまたはCUG繰返し配列を保持しているアンチセンスGFP構築物pMBW491、pMBW496およびpMBW489は、GFP遺伝子の発現を顕著に低下させた。
【０１２１】
興味深いことに、PSTVd配列が10ヌクレオチドの欠失を含んでいるpMWB489は、インタクトなPSTVd配列を含むpMWB491よりもGFPサイレンシングが遅く、その程度が低かった。
【表３】
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【０１２２】
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【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】Mfoldソフトウェアを用いて推定された、PSTVd型のさまざまなウイロイドの二次構造を模式的に示す。A.  ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド；B.  オーストラリアブドウウイロイド；C.  ココヤシチナンガヤウイロイド；D.  トマトプランタマチョーウイロイド；E.  熱突然変異体T229のホップ潜在ウイロイド；F.  トマト頂端矮化ウイロイド。
【図２】本明細書の実施例1〜3において使用した各種のキメラ遺伝子構築物を模式的に示す。35S-P：CaMV 35Sプロモーター；Pdkイントロン：双子葉植物Flaveria trinerviaのピルビン酸・リン酸ジキナーゼ2イントロン2；cEIN2：シロイヌナズナ由来のEIN2遺伝子のcDNAコピー（エチレンに対する感受性のために必要な遺伝子；Alonsoら 1999 Science 284, 2148-2152）、この領域のプロモーターに対する配向は矢印で示してある；gEIN2：シロイヌナズナ由来のEIN2遺伝子のゲノムコピー；PSTVd：ジャガイモスピンドルチューバーウイロイドのゲノムのcDNAコピー；PSTVd*：PSTVdのインタクトなコピーに対して逆方向でクローニングされた、ヌクレオチド16からヌクレオチド355までのPSTVd由来の部分配列；OCS3’：アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のオクトピンシンターゼ遺伝子の3’領域。
【図３】1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(ACC)の存在下で発芽させたときのEIN2サイレンス化植物の表現型。A.  暗室で；B.  光線条件下で。Wt：野生型植物。
【図４】実施例4において使用した各種のキメラ遺伝子構築物を模式的に示す。CMVプロモーター：サイトメガロウイルスプロモーター；SV40ポリ(A)：SV40由来の転写終結およびポリアデニル化領域；PSTVd：ジャガイモスピンドルチューバーウイロイド配列；CUGrep：CUG配列の60回の繰返しを含む配列；humGFP：ヒト化緑色蛍光タンパク質コード領域（ヒト遺伝子のコドン使用頻度に適合させた；この領域のプロモーターに対する配向は矢印で示してある）。
【図５】pMBW491（A；ほぼ野生型の立体構造をとる）およびpMBW489（10ヌクレオチドの欠失が野生型の立体構造とは異なる構造をもたらす）中のpSTVdの推定二次構造を模式的に示す。
【０１２４】
（配列表）
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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