(57)【要約】本明細書中において、ＮＯがヒト呼吸周期の重要な成分であり、Ｏ２送達を調節するように機能する血液ガスであり、すなわちこのＮＯレベルが組織酸素化の程度（血流によって決定される）を提供することによって血液ガスに有意に加え、赤血球および赤血球のＮＯによる充填が、低酸素性血管拡張および過酸素性血管収縮の古典的な生理学的応答に有意に寄与することを示すデータが、本発明者によって開発された。さらに、ヘモグロビンのヘムおよびチオールへのＮＯ結合が、ヘモグロビン飽和と酸素との関数として変動し、インビボにおいて肺動脈および全身性動脈を拡張または狭窄することを示すデータが、開発された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液から、患者の生理学的状態および病理学的状態からなる群から選択される状態に対応する血液ガス成分のレベルを決定する方法であって、
組織血流および酸素付加のマーカーとして該患者の血液中のＮＯレベルを測定する工程を包含する、方法。
【請求項２】
心臓、肺または血液中の酸素欠乏にともなう疾患を、このような疾患を有する患者において処置する方法であって、
該患者中に、治療有効量の酸化窒素の嫌気性溶液を、１〜５００ｎｍｏｌ酸化窒素／分の範囲の速度で注入する工程を包含する、方法。
【請求項３】
心臓、肺または血液中の酸素欠乏にともなう疾患を、このような疾患を有する患者において処置する方法であって、
該患者に、治療有効量の酸化窒素の嫌気性溶液を１〜５００ｎｍｏｌ酸化窒素／分の範囲の速度で、および治療有効量の亜硝酸塩を投与する工程を包含し、該亜硝酸塩が、該酸化窒素の活性を改善する酸素送達を促進する量で存在している、方法。
【請求項４】
心臓、肺または血液中の酸素欠乏にともなう疾患を、このような疾患、およびその患者に対する酸化窒素の血中生理学的レベルを有する患者において処置する方法であって、
該酸化窒素の酸素送達活性を促進するため、治療有効量の亜硝酸塩の嫌気性溶液を投与する工程を包含する、方法。
【請求項５】
全血または赤血球細胞の貯蔵時間を増加する方法であって、期限切れまたはＮＯ枯渇全血または赤血球細胞を、ＮＯおよび／または亜硝酸塩の溶液と混合する工程であって、該全血または赤血球細胞中の血管拡張性応答を充満または増加する工程を包含する、方法。
【請求項６】
輸液を必要とする患者に輸液する方法であって、
ＮＯおよび酸素が枯渇した全血または赤血球細胞を、ＮＯおよび／または亜硝酸塩の溶液で処理する工程であって、その中の血管拡張性応答を増加する工程、および該処理された全血または赤血球細胞を該患者中に輸液する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、２００２年５月２９日出願の米国仮特許出願第６０／３８３，５９５号の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、血液ガスの測定および血液処理およびそれに基づく治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｏ２およびＣＯ２測定は、代表的には、ヒト疾病の重篤度および治療に対する応答を評価するために使用されるが、ｐＯ２と組織酸素化とは無関係であることが周知である。
【０００４】
これまでに、血液中の一酸化窒素（ＮＯ）レベルが組織酸素化の程度（血流によって決定される）を提供することが着想されておらず、血液中のＮＯ測定は以前にヒト状態の評価および治療的応答と関連付けされていなかった。
【０００５】
さらに、これまでに、血液バンクの血液中のＮＯレベルが時間経過と共に枯渇し、赤血球のＮＯ含量の回復が、全血球および赤血球についての貯蔵時間を６週間より長く増加し得、貯蔵された血液および赤血球の血管作用性を増大し得、それによって輸血の危険性を緩和する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本明細書中において、ＮＯがヒト呼吸周期の重要な成分であり、Ｏ２送達を調節するように機能する血液ガスであり、すなわちこのＮＯレベルが組織酸素化の程度（血流によって決定される）を提供することによって血液ガスに有意に加え、赤血球および赤血球のＮＯによる充填が、低酸素性血管拡張および過酸素性血管収縮の古典的な生理学的応答に有意に寄与することを示すデータが、本発明者によって開発された。さらに、ヘモグロビンのヘムおよびチオールへのＮＯ結合が、ヘモグロビン飽和と酸素との関数として変動し、インビボにおいて肺動脈および全身性動脈を拡張または狭窄することを示すデータが、開発された。従って、長年のｐＯ２の失敗の謎についての力学的基礎を提供し、組織酸素化を決定するデータが開発された。さらに、本明細書中において、血液バンクの赤血球が時間経過と共にＮＯを消耗し、血管拡張剤応答の障害を生じるというデータが、本発明者によって開発された。
【０００７】
それゆえ、血中の（Ｏ２／ＣＯ２に関連した）ＮＯの測定値が、組織の血流および酸素付加のマーカーであること、赤血球中のＮＯのレベルをモニタリングして操作する能力が、血液気体の評価、健康状態の評価、酸素不足に関連した、心臓、肺および血液の疾患の診断および処置、ならびに治療（ＮＯドナー、エリスロポイエチン治療および代用血液を含む）の合理的開発に有用であることが本明細書中で見出された。さらに、赤血球の機能が、それらのＮＯ含量に依存すること；ならびにＮＯまたは亜硝酸塩をその中に導入することにより、赤血球および全血の保存時間が延びること；ならびに古すぎる赤血球をＮＯまたは亜硝酸塩で処理することにより、それらに対する血管拡張応答を正常化し、それにより、全血および赤血球の保存時間を延ばし、そして輸血の罹患率および死亡率の危険性を軽減する方法を提供することが見出された。
【０００８】
第１の実施形態を示す、本明細書中の本発明の１つの実施形態は、患者の生理学的状態および病理学的状態からなる群より選択される状態に対応する血中気体成分のレベルを血液から決定する方法に関し、この方法は、組織の血流および酸素付加のマーカーとして、患者の血液中のｐＯ２およびｐＣＯ２を測定することに関連した、ＮＯレベルを測定する工程を包含する。
【０００９】
第２の実施形態を示す、本明細書中の本発明の別の実施形態は、心臓、肺または血液中の酸素不足に関連した疾患を、このような疾患を有する患者において処置する方法に関し、この方法は、この患者に、一酸化窒素の無酸素溶液の治療有効量を、１〜５００ｎｍｏｌ  一酸化窒素／分の範囲の速度で注入する工程を包含する。
【００１０】
第３の実施形態を示す、本明細書中の本発明の別の実施形態は、心臓、肺または血液中の酸素不足に関連した疾患を、このような疾患を有する患者において処置する方法に関し、この方法は、この患者に、１〜５００ｎｍｏｌ  一酸化窒素／分の範囲の速度でＮＯの無酸素溶液の治療有効量を、およびＮＯの酸素送達改善活性を促進する量の亜硝酸塩を投与する工程を包含する。
【００１１】
第４の実施形態を示す、本明細書中の本発明の別の実施形態は、心臓、肺または血液中の酸素不足に関連した疾患を、このような疾患を有し、かつ、その患者にとって生理学的（正常）レベルの血中ＮＯを有する患者においてこのような疾患を処置する方法に関し、この方法は、ＮＯの酸素送達活性（血流増加活性）を促進する量の亜硝酸塩の無酸素溶液の治療有効量を投与する工程を包含する。
【００１２】
本明細書中の本発明のなお別の実施形態（第５の実施形態で示される）は、全血球または赤血球の保存時間を増大させることに関し、これは、全血球または赤血球における血管拡張を満たすかまたは増大させるために、期限切れまたはＮＯを枯渇した全血球または赤血球と、ＮＯまたは亜硝酸塩の溶液とを混合する工程を包含する。
【００１３】
本明細書中の本発明のなお別の実施形態（第６の実施形態で示される）は、輸血を必要とする患者に輸血する方法に関し、この方法は、全血球または赤血球における血管拡張を満たすかまたは増大させるために、ＮＯを枯渇した全血球または赤血球を、ＮＯまたは亜硝酸塩の溶液で処理する工程、および患者に、この処理した全血球または赤血球を輸血する工程を包含する。
【００１４】
患者における酸素欠乏に関連する疾患は、第１の実施形態において測定されるような患者の生理学的状態のベースラインより少なくとも１０％低いＮＯレベルの測定値または群の平均よりも少なくとも１０％低い患者のＮＯレベルの測定値が示すように、本明細書中で、酸素送達が欠損している疾患を意味するように使用される。
【００１５】
第４の実施形態において、患者の正常レベルのＮＯは、生理学的状態での患者のＮＯレベルを意味する。
【００１６】
用語「期限切れの全血球または赤血球」は、本明細書でこれ以降に記載される保存期間を越えたこと、あるいは新鮮な（正常な）血液でのＮＯレベルと比べて１０％より多くまでのＮＯの欠乏、または脱酸素化−酸素化サイクルにＳＮＯを補充できないことを意味するように使用される。後の説明において、赤血球が長時間にわたって脱酸素化された場合（例えば、１時間にわたって脱酸素化された場合）、赤血球のＮＯは、ＳＮＯを形成することはできない。なぜなら、ヘモグロビンのＮＯ位置は、システインとの接触は容易ではないように移動するからである。言い換えると、期限切れの赤血球は、ＳＮＯを作る能力はない。
【００１７】
用語「ＮＯの枯渇した全血球または赤血球」は、上記のように、新鮮な（正常な）血液でのＮＯレベルと比べて１０％より多くまでのＮＯの欠乏、または脱酸素化−酸素化サイクルにＳＮＯを補充できないことを意味するように使用される。
【００１８】
用語「全血球または赤血球置換における血管拡張を満たすかまたは増大させる」は、ＮＯレベルを少なくとも１０％増大させることを意味するように本明細書中で使用される。
【００１９】
用語「保存期間」は、静脈切開からの時間を意味するように本明細書中で使用される。
【００２０】
（詳細な説明）
発明者らは、現在、本明細書中の本発明の第１の実施形態（すなわち、血液、患者の生理学的状態および病理学的状態からなる群から選択される状態に対応する血液ガスレベルを血液から測定する方法）を始め、この方法は、組織の血流および酸素付加のマーカーとして患者の血液におけるｐＯ２およびｐＣＯ２の測定と組み合わせてＮＯレベルを測定することを包含する。
【００２１】
患者の血液中のＮＯレベルの測定は、患者の静脈血中または患者の動脈（混合された静脈）血中で行われ得る。ヒト静脈血は、例えば、肘前静脈を介して引き出され得る。
【００２２】
血液中のＮＯの測定は、例えば、ヘモグロビンに対するＳＮＯまたはＮＯの比を測定するために、例えば、ＤＡＦ−２アッセイにおける光分解化学発光によって、または電子常磁性共鳴分光法（ＥＰＲ）によって迅速に行われる。
【００２３】
光分解化学発光によるアッセイについて、赤血球からの溶血タンパク質（約９９％ヘモグロビン）を、Ｇ−２５  ｆｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーカラム（２５倍容積過剰）によって、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で平行化した溶出ゲル濾過（５０００ｇ、６０秒）によって部分的に精製した。気密なＨａｍｉｌｔｏｎガラスシリンジを使用して、ＭｃＭａｈｏｎ，Ｔ．Ｊ．およびＳｔａｍｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３０１，９９−１１４（１９９９）に記載されるような注射のために９０μｌのサンプル（最終［ヘモグロビン］、１００μＭ）を移した。
【００２４】
ＤＡＦ−２アッセイについて、２分の１の溶血血液を、ＨｇＣｌ２を含むかまたは含まないかのいずれかのＰＢＳ含有ジアミノフルオレセイン−２（ＤＡＦ−２）（最終ｐＨ７．４）を用いて１００μＭヘモグロビンに調節し、そして１０分間インキュベートした。次いで、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０ｋＤａのフィルター（１０、６００ｇ、２０分）を使用して、蛍光測定前にヘモグロビンを除去した。濾液を、マイクロプレートに移し、そして酸（０．４Ｎ  ＨＣｌ、最終濃度）を用いて処理し、ニトロソ化等価物を生成し、次いで最大の蛍光まで過剰のＮａＯＨを用いて処理した（励起および発光：それぞれ、４８５ｎｍおよび５２０ｎｍ）。標準曲線を、ＭｃＭａｈｏｎ，Ｔ．Ｊ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１６７３８−４５（２０００）に記載されるように、Ｓ−ニトロソヘモグロビンを使用して構築した。
【００２５】
ＥＰＲによるアッセイについて、分光法を、Ｇｏｗ，Ａ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ  ９６，９０２７〜９０３２（１９９９）に記載される通りに実行した。比較用のＳＮＯ−オキシヘモグロビンサンプル（０．５ｍＭタンパク質）を、Ｊｉａ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，２２１〜２２６（１９９６）に記載される通りに調製した。
【００２６】
ＮＯ／ヘモグロビン相互作用についての充分に確立されたプローブである光分解ベースの技術およびＥＰＲ技術が、好ましい。
【００２７】
試験は、個体間における生理学的（天然）ＮＯレベルの広範な変動を示し、通常は、ＳＮＯ／ヘモグロビンモル比は、０．０００１〜約０．００２９の範囲であり、より代表的には、０．０００５〜約０．００２の範囲である。ＮＯレベルの個体間変動が原因で、個体についてのＮＯレベルを、経時的にその個体と、および全体としてグループと比較することが、重要である。
【００２８】
ｐＯ２およびｐＣＯ２の測定を、従来通り実行し得る。
【００２９】
本発明者らは、ここで、本明細書中の第２の実施形態、第３の実施形態、および第４の実施形態にとりかかる。
【００３０】
第２の実施形態、第３の実施形態、および第４の実施形態の各々は、心臓、肺、または血液中の酸素欠乏に関連する疾患を有する患者において、そのような疾患を処置することに関する。上記のように、患者における酸素欠乏に関連する疾患は、酸素欠乏が、第１の実施形態において測定された場合に、生理状態（非病理）状態（その個体について、またはそのようなデータが入手不能である場合には、全体としてのグループの平均（例えば、１０００モルのヘモグロビン当たり１モル未満のＮＯ））についてよりも少なくとも１０％低いＮＯレベルの測定によって示されるような欠乏である、疾患である。
【００３１】
心臓における酸素欠乏に関連する疾患としては、アンギナが挙げられる。
【００３２】
肺における酸素欠乏に関連する疾患としては、肺高血圧が挙げられる。
【００３３】
血液における酸素欠乏に関連する疾患としては、鎌状赤血球症が挙げられる。
【００３４】
本発明者らは、ここで、本明細書中の第２の実施形態にとりかかる。この第２の実施形態は、心臓、肺、または血液中の酸素欠乏に関連する疾患を有する患者において、そのような疾患を処置する方法に関し、その方法は、その患者に、治療上有効な量の嫌気性酸化窒素溶液を、１〜５００ｎｍｏｌ  ＮＯ／分の範囲の速度で注入する工程を包含する。
【００３５】
この嫌気性酸化窒素溶液は、例えば、生理食塩水（０．９％  ＮａＣｌ）中の飽和ＮＯ（１．５ｍＭ  ＮＯ）溶液であり得、その溶液中にＮＯを導入する前に不活性ガスを溶媒に通して泡立てることによって、嫌気性にされ得る。
【００３６】
治療的有効量は、改善または利点が生じる限り、１〜５００ｎｍｏｌ  ＮＯ／分、好ましくは１〜１０ｎｍｏｌ  ＮＯ／分の範囲の速度において、血流を増加する（組織への酸素の送達を改善する）量である。この量は、赤血球についてのＮＯ置換量である。ＮＯの濃度は、全身血圧または全身血行力学に対する急性の影響を有さない濃度でなければならない。以前は、ＮＯの溶液が、０．７５〜３６マイクロモル／分の速度で注入され、高濃度が有効であると考えられていた；この範囲は、全身血圧または全身血行力学に対する急性の影響を有し得る。
【００３７】
本発明者らはここで、本明細書中の第３の実施形態を参照し、この第３の実施形態は心臓、肺または血液中の酸素不足に関連する疾患を有する患者において、このような疾患を処置する方法に関し、この方法は、この患者に、治療有効量のＮＯの無酸素溶液、およびＮＯの酸素送達改善活性を促進する量の亜硝酸塩（血流の増加により認められるように）を、１〜５００ｎｍｏｌ  ＮＯ／分（好ましくは、１〜１０ｎｍｏｌ  ＮＯ／分）の範囲の速度で、（例えば、このの患者に注入することによって）投与する工程を包含する。
【００３８】
ＮＯおよび治療的有効量のＮＯの投与は、第２の実施形態と同じである。
【００３９】
亜硝酸塩は、血液に可溶性であり、かつ血液と適合性の任意の亜硝酸であり、これは例えば、無機亜硝酸塩（例えば、亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸カリウムまたは亜硝酸カルシウム）であり得、好ましくは、注入されるＮＯの無酸素溶液中（例えば、生理食塩水中）に存在し、かつＳ−ニトロソヘマグロビンの形成を促進することによって、ＮＯ注入で同定される酸素送達活性を改善する量で存在する。亜硝酸塩の利点は、本発明者らにより開発されたデータによって示され、このデータは、亜硝酸塩の存在下において、ＮＯで同定される生物学的活性が促進されることを示す。亜硝酸塩は、１〜１０μＭ  亜硝酸塩／分の速度で投与され、この速度は、ＮＯの酸素送達改善効果を改善し、例えば、ＮＯ濃度の２０〜１５０倍の量である。
【００４０】
本発明者らはここで、本明細書中の第４の実施形態を参照し、この第４の実施形態は、心臓、肺または血液中の酸素不足に関連する疾患を有する患者において、このような疾患を処置し、この患者の血液中のＮＯの生理学的レべルを処置する方法に関し、この方法は、この患者に、治療有効量の亜硝酸塩の無酸素溶液を、（Ｓ−ニトロソヘモグロビンの形成を促進することによって）ＮＯの酸素送達活性（血流増加活性）を促進する量で投与する工程を包含する。
【００４１】
亜硝酸塩は、好ましくは、その無酸素溶液（例えば、亜硝酸塩との混合の前に、不活性ガスをこの溶液にバブリングすることにより無酸素性にした生理食塩水中）を患者に注入することによって投与される。
【００４２】
亜硝酸塩は、いずれも血液中で可溶であり、かつ血液と適合性であり、例えば、無機亜硝酸塩（例えば、亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸カリウムまたは亜硝酸カルシウム）であり得、そして、Ｓ−ニトロソヘモグロビンの形成を促進することによって、ＮＯの酸素送達向上活性を改善させる治療有効量で、例えば、１ｎｍｏｌ〜１０μＭ亜硝酸塩／分の範囲の速度で注入される。
【００４３】
第２および第３の実施形態について、ＮＯは、好ましくは、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中、１．５ｍＭ以下の濃度で、１．５ｍＭ  ＮＯのストック溶液（飽和溶液）から投与される。亜硝酸塩は、ｎＭ〜μＭの濃度を達成するのに必要とされる場合に、ストック溶液からもまた与えられ得る。
【００４４】
ここで、本発明者らは、本明細書中の本発明の第５の実施形態、すなわち、全血または赤血球の保存時間を増加させるための方法に返り、この方法は、古くなったか、またはＮＯが枯渇した全血または赤血球とＮＯおよび／または亜硝酸塩の溶液とを混合し、全血または赤血球における血管拡張薬応答を充満または増加させる工程を包含する。
【００４５】
現在、クエン酸−リン酸−デキストロース−アデニンと共に保存された全血または赤血球は、３５日間保存され得る。アデニン−生理食塩水保存料と共に保存された赤血球は、４２日間保存され得る。これらの期間にわたる保存後、全血および赤血球は、古くなったと考えられ、輸血目的には使用され得ない。なぜなら、罹患率および死亡率の危険性の懸念が増加しているからである。本発明の方法は、ＮＯ生体活性がもはや増大しなくなるような時間まで（例えば、顕微鏡下または血液溶解物中の遊離のヘモグロビンを測定することによって決定され得るように、赤血球がもはやインタクトでない場合）、古くなったか、またはＮＯが枯渇している全血または赤血球に対して使用され得る。言い換えると、連続的な処理は、インタクトな赤血球自体に対して有用であるか、または、血管拡張機能を含むＮＯ生体活性が増大している限り、全血中で有用である。ＮＯ生体活性としては、ＳＮＯ、ＮＯ、ＮＯｘ、ＮＯ＋およびＮＯ−からの活性が挙げられ得る。
【００４６】
ＮＯおよび／または亜硝酸塩は、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水中で、ＮＯまたは亜硝酸塩の溶液と、例えば、１ｎＭ〜１．５ｍＭのＮＯおよび／または亜硝酸塩のように混合することによって混合され、ヘモグロビンに対するＮＯおよび／または亜硝酸塩のモル比が１：１０〜１：１０００の範囲で、ＮＯまたは亜硝酸塩を血液製剤に充填する。適切な亜硝酸塩は、本明細書中の第４の実施形態と組み合わせて論じられる亜硝酸塩である。好ましくは、ＮＯまたは亜硝酸塩の溶液は、嫌気性である。なぜなら、これにより、投与がより効率的となるからである。嫌気性は、嫌気性条件下で、嫌気性溶媒とＮＯまたは亜硝酸塩とを混合することによってもたらされ得る。この溶媒は、その中にＮＯまたは亜硝酸塩を導入する前に、溶媒を通じて不活性ガス（例えば、アルゴン）をバブリングすることによって嫌気性にされ得る。雰囲気への曝露およびボルテックスにかける（混合する）ことによって脱酸素化された全血および赤血球は、すなわち、脱酸素状態で使用され得、その上で、酸素化は、身体内またはインビトロで生じる。
【００４７】
ＮＯおよび／または亜硝酸塩処理は、血流増加または臨床的結果によって測定され得るような、脈管拡張応答を回復または増加するために実施される。
【００４８】
ここで、本明細書中の本発明の第６の実施形態に戻り、これは、輸液の必要な患者に輸液する方法であり、これは、ＮＯおよび／または亜硝酸塩の溶液でＮＯの欠失した全血または赤血球を処理して、脈管拡張応答を増加する工程、および処理された全血または赤血球を患者に輸液する工程を包含する。
【００４９】
患者は、輸液が必要であり、血液を失ったかもしくは失っている患者、または腎臓機能の不全の場合、身体の老廃物の除去が必要な患者であるか、または毒作用の場合、血液からの毒性物質の除去が必要であるか、または酸化窒素もしくは酸素の障害と関連する任意の疾患（例えば、狭心症または発作）を処置するために赤血球またはヘモグロビンが必要である。
【００５０】
用語「ＮＯの欠失した全血または赤血球」は、本明細書中において、全血または赤血球が最初に提供される場合と比較して、ＭｃＭａｈｏｎ，Ｔ．Ｊ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，７１１−７１７（２００２）に記載される試験で少なくとも１０％少ない緩和を意味するために使用される。
【００５１】
ＮＯおよび／または亜硝酸塩の溶液は、ＮＯまたは亜硝酸塩を、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水（例えば、１ｎＭ〜１．５ｍＭのＮＯおよび／または亜硝酸塩）と混合して、ＮＯおよび／または亜硝酸塩を含む血液製剤を１：１０〜１：１０００の範囲のＮＯおよび／または亜硝酸塩対ヘモグロビンの比にロードすることによって形成され得る。適切な亜硝酸塩は、本明細書中の第４の実施形態に関連して考察されるものである。好ましくは、ＮＯおよび／または亜硝酸塩の溶液は、第５の実施形態の記載において考察されるように無酸素にされ、そしてＮＯおよび／または亜硝酸塩の無酸素溶液を血液製剤と混合することは、無酸素条件下で実行される。
【００５２】
脱酸素された全血および赤血球は、空気（大気）への曝露およびボルテックス（混合）によって酸素付加され得るか、または脱酸素化状態で使用され得、酸素付加が体内で生じる。
【００５３】
輸液は、従来の手段で実行され得る。
【００５４】
本明細書中の本発明の背景および本明細書中の本発明の要素は、ＭｃＭａｈｏｎ，Ｔ．Ｊ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，７１１−７１７（２００２）に記載され、これは、本明細書中において参考として援用される。
【００５５】
米国仮出願番号６０／３８３，５９５号（それらに対する付録Ａを含む）の全体は、本明細書中において参考として援用される。
【００５６】
本発明は、以下の作業実施例によって説明される。
【００５７】
（実施例Ｉ）
ＮＯの測定は、健常な（すなわち、病的な状態ではない）被験体の血液サンプルで行った。測定を、上記のように、ＤＡＦ−２および光分解化学発光により実行した。その結果は、ＮＯレベルにおける個体間の可変性を示し、これに従い、ＮＯレベルを群全体と個体との両方で経時的に比較することの重要性を示す。
【００５８】
ＥＰＲアッセイは、３００μＭ亜硝酸塩、１ｍＭのヘム濃度、５０μＭのＦｅ（ＩＩ）ＮＯ濃度のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中で調製した、Ｆｅ（ＩＩ）ＮＯスパイクヘモグロビンサンプルで実行した。Ｊｉａ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０、２２１〜２２６（１９９６）中に記述されているように調製した、ＳＮＯ−オキシヘモグロビンサンプル（０．５ｍＭタンパク質）との比較を行った。ＭｃＭａｈｏｎ、Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７１１〜７１７（２００２）の図１ｃおよび図１ｄに示されているように、結果は、亜硝酸塩の存在下で、ＮＯで同定される酸素送達の改善活性が促進されることを示す。
【００５９】
（実施例ＩＩ）
不安定狭心症の６５歳の男性を、病院に入院させる。その患者に、Ｉ．Ｖ．ニトログリセリン、ヘパリン、およびβブロッカーを与える。しかし、患者は、安静時に胸痛を経験し続ける。患者の通常のＮＯレベルは、過去の試験から既知である。患者のＮＯレベルの測定は、そのＮＯレベルが通常より下であることを示す。あるいは、患者の標準ＮＯレベルは過去の試験から既知ではないが、患者のＮＯレベルの測定は、そのＮＯレベルが平均より低いことを示す。０．９％ＮａＣｌ中でＮＯの５ｎｍｏｌ／分の速度での注入を実施する。胸痛が解決する。
【００６０】
さらに、亜硝酸塩を１００ｎｍｏｌ／分の速度で与えた場合、胸痛はより急速に解決する。
【００６１】
（実施例ＩＩＩ）
初期の肺高血圧症ＩＩ類である２７歳の女性は、息切れに不満を表す。その患者の通常のＮＯレベルは、事前の試験から既知である。患者のＮＯレベルの測定は、そのＮＯレベルが標準より下であることを示す。０．９％ＮａＣｌ中でＮＯの５ｎｍｏｌ／分の速度での注入を実施する。息切れの症状が解決する。治療の３日後、肺動脈の圧力は、５ｍｍＨｇに低下する。
【００６２】
（実施例ＩＶ）
鎌状細胞疾患を示す患者は、低酸素血症を示す。ＮＯレベルを測定し、そのＮＯレベルがこれまでの試験のレベルと同じであることを見出した。生理食塩水中での亜硝酸ナトリウムの嫌気性飽和溶液を、１００ｎｍｏｌ／分の速度で注入する。酸素送達の改善が起こる。
【００６３】
（実施例Ｖ）
９つの赤血球サンプルを、６週間保存した後の血液バンクから得た。その時点で、それらのサンプルが期限切れ（ｏｕｔｄａｔｅｄ）ことが観察された。光分解化学発光により測定される赤血球中のＮＯのレベルは、コントロール（新たに寄贈されたサンプル）と比較して非常に有意に枯渇している。その結果を、図１に示す。
【００６４】
枯渇したＮＯレベルを有するこれらの期限切れの赤血球サンプルは、ＭｃＭａｈｏｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，７１１〜７１７（２００２）に記載されるように、低ｐＯ２の標準的器官チャンババイオアッセイに赤血球を添加することによって実行されるアッセイにおいて、血管拡張応答の減損を示した。これらのアッセイにおいて、正常な血管拡張応答は、約２５％弛緩であった。これらのサンプルは、５％弛緩および１０％弛緩を提供することが、決定された。これらのサンプルを、低ｐＯ２のバイオアッセイバス中に配置することによって、脱酸素した。その後、対にしたサンプルにおいて、亜硝酸塩ナトリウム（リン酸緩衝化生理食塩水中で１：２００モル比の亜硝酸塩  対  ヘモグロビン）を、この脱酸素赤血球に１０分間添加した。その後、空気を再導入した後に振盪することによって、これらのサンプルを再酸素添加した。この処理は、血管拡張応答を正常化するが、ＮＯも亜硝酸塩も含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）での処理が、血管拡張応答に対して何の効果も有さないことが、見出された。これらの結果を、図２に示す。亜硝酸塩は、ネイティブの新鮮な赤血球の血管拡張応答に対して、何の効果も有さないことが、見出された。
【００６５】
各々３つの期限切れの赤血球の２つの組は、ＭｃＭａｈｏｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，７１１〜７１７（２００２）に記載されるような試験において、弛緩の減損を示した（新鮮な赤血球について約１５％弛緩であったのに対して、３％弛緩および８％弛緩）。各組からのサンプルに通してアルゴンガスで泡立てることによって、それらのサンプルを脱酸素し、その後、ＰＢＳ、ＮＯを溶解したＰＢＳ、または亜硝酸ナトリウムを溶解したＰＢＳと混合した。これらの処理は、赤血球に、ヘモグロビンに対して１：２５０モル比のＮＯ（または亜硝酸）を負荷した。その後、これらの赤血球を、空気に曝露することによって酸素添加した。このＮＯ充満赤血球および亜硝酸充満赤血球は、改善され有効に正常化された弛緩を示した。結果を、図３に示す。
【００６６】
（実施例ＶＩ）
赤血球を、ヘモグロビンに対してモル比１：２５０のＮＯとともに、毎週１回の間隔で１０分間インキュベートする。８週間目に、ＮＯレベルおよび血管拡張応答が、持続される。
【００６７】
（実施例ＶＩＩ）
重篤な冠状動脈疾患を有する５９歳の老人に、５週齢の血液を輸血する。血圧は、５ｍｍＨｇ上昇する。その患者は、胸部痛を経験する。ＮＯ（ＮＯ：ヘモグロビンのモル比１：２５０）で処理した第２ユニットを与える。胸部痛を経験しない。
【００６８】
（改変形）
上記の多くの改変形は、当業者にとって明らかである。従って、本発明は、特許請求の範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、コントロールと赤血球の期限切れサンプルにおけるＮＯを比較し、そして実施例Ｖの結果を示す。
【図２】図２は、ＰＢＳおよび亜硝酸塩で処理された期限切れ赤血球に対する血管拡張反応を比較し、そして実施例Ｖの結果を示す。
【図３】図３は、コントロールの期限切れ赤血球と亜硝酸塩およびＮＯで処理された期限切れ赤血球との％緩和を比較し、そして実施例Ｖの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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