(57)【要約】複合体は、（１）核酸または核酸類似体のヘテロポリマー・プローブ配列を含有するプローブと、（２）核酸または核酸類似体のヘテロポリマー標的配列を含有する標的とを備えており、複合体が２重鎖であって尚かつヘテロポリマー・プローブ配列がヘテロポリマー標的配列に逆平行である場合にはヘテロポリマー・プローブ配列が相同的塩基相互作用によってヘテロポリマー標的配列に結合することと、複合体が３重鎖である場合には複合体には組換えタンパク質が含まれないこととを条件として、（ａ）プローブおよび標的の少なくとも１つは精製されたものか合成物であり、（ｂ）ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって、または相同的塩基相互作用によってヘテロポリマー・プローブ配列はヘテロポリマー標的配列に結合する。標的をアッセイするための方法は、複合体の形成を検出することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸または核酸類似体のヘテロポリマー・プローブ配列を含有するプローブと、核酸または核酸類似体のヘテロポリマー標的配列を含有する標的とを備える複合体において、
前記複合体が２重鎖であって尚かつ前記ヘテロポリマー・プローブ配列が前記ヘテロポリマー標的配列に逆平行である場合には前記ヘテロポリマー・プローブ配列が相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合することと、前記複合体が３重鎖である場合には前記複合体には組換えタンパク質が含まれないこととを条件として、（ａ）前記プローブおよび前記標的の少なくとも１つは精製されたものか合成物であり、（ｂ）ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって、または相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー・プローブ配列は前記ヘテロポリマー標的配列に結合する複合体。
【請求項２】
前記複合体は２重鎖であり、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によってまたはワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、前記ヘテロポリマー標的配列に平行または逆平行である請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記プローブおよび前記標的のうちの一方は１本鎖であり、前記プローブおよび前記標的のうちの他方は２本鎖であり、前記複合体は３重鎖である請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記複合体にはＰＮＡが含まれない請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項３に記載の複合体。
【請求項６】
前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項３に記載の複合体。
【請求項７】
（ａ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、（ｂ）前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第１の鎖と、前記第１のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー標的配列を含有する第２の鎖とを含み、（ｃ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記第２のヘテロポリマー標的配列に結合する請求項３に記載の複合体。
【請求項８】
前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項３に記載の複合体。
【請求項９】
前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項３に記載の複合体。
【請求項１０】
（ａ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、（ｂ）前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第１の鎖と、前記第１のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー標的配列を含有する第２の鎖とを含み、（ｃ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記第２のヘテロポリマー標的配列に結合する請求項３に記載の複合体。
【請求項１１】
前記プローブおよび前記標的は２本鎖であり、前記複合体は４重鎖である請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
前記複合体にはＰＮＡが含まれない請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項１１に記載の複合体。
【請求項１４】
前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項１１に記載の複合体。
【請求項１５】
（ａ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、（ｂ）前記プローブは、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第１のプローブ鎖と、前記第１のヘテロポリマー・プローブ配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第２のプローブ鎖とを含み、（ｃ）前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第１の標的鎖と、前記第１のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー標的配列を含有する第２の標的鎖とを含み、（ｄ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記第２のヘテロポリマー標的配列に任意に結合する請求項１１に記載の複合体。
【請求項１６】
（ａ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、（ｂ）前記プローブは、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第１のプローブ鎖と、前記第１のヘテロポリマー・プローブ配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第２のプローブ鎖とを含み、（ｃ）前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第１の標的鎖と、前記第１のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー標的配列を含有する第２の標的鎖とを含み、（ｄ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記第２のヘテロポリマー標的配列に任意に結合する請求項１１に記載の複合体。
【請求項１７】
（ａ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、（ｂ）前記プローブは、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第１のプローブ鎖と、前記第１のヘテロポリマー・プローブ配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第２のプローブ鎖とを含み、（ｃ）前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第１の標的鎖と、前記第１のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー標的配列を含有する第２の標的鎖とを含み、（ｄ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記第２のヘテロポリマー標的配列に任意に結合する請求項１１に記載の複合体。
【請求項１８】
（ａ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、（ｂ）前記プローブは、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第１のプローブ鎖と、前記第１のヘテロポリマー・プローブ配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第２のプローブ鎖とを含み、（ｃ）前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第１の標的鎖と、前記第１のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第２のヘテロポリマー標的配列を含有する第２の標的鎖とを含み、（ｄ）前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記第２のヘテロポリマー標的配列に任意に結合する請求項１１に記載の複合体。
【請求項１９】
前記プローブは前記標的の副溝を占有する請求項１に記載の複合体。
【請求項２０】
前記プローブは前記標的の主溝を占有する請求項１に記載の複合体。
【請求項２１】
前記プローブの塩基は、前記標的の両方の鎖の塩基に対して同時に相互作用する請求項３に記載の複合体。
【請求項２２】
前記プローブの塩基は、前記標的の両方の鎖の塩基に対して同時に相互作用する請求項１１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記プローブの主鎖はデオキシリボースホスフェートからなる請求項１に記載の複合体。
【請求項２４】
前記プローブの主鎖は、帯電していないか、部分的に負又は正に帯電している請求項１に記載の複合体。
【請求項２５】
前記プローブの少なくとも１つの塩基は、ワトソン・クリック相補的結合または相同的結合に基づく特異的な結合親和性を有した天然産出塩基の合成類似体である請求項１に記載の複合体。
【請求項２６】
標的をアッセイするための方法であって、その方法は、
核酸または核酸類似体のヘテロポリマー標的配列を含有する前記標的を含んだサンプルを準備する工程と、
核酸または核酸類似体のヘテロポリマー・プローブ配列を含有するプローブを準備する工程と、
前記標的、前記プローブ、水、および緩衝剤を含んだハイブリダイゼーション混合物を準備する工程と、
複合体を得るべく、前記ヘテロポリマー標的配列を前記ヘテロポリマー・プローブ配列に結合させるのに有効なインキュベーション時間で前記ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートする工程と、
標的をアッセイするべく、前記プローブと前記標的との間の結合親和性と相関するシグナルを検出する工程とを備え、
前記複合体が２重鎖であって尚かつ前記ヘテロポリマー・プローブ配列が前記ヘテロポリマー標的配列に逆平行である場合には前記ヘテロポリマー・プローブ配列が相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合することと、前記複合体が３重鎖である場合には前記複合体には組換えタンパク質が含まれないこととを条件として、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって、または相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー・プローブ配列は前記ヘテロポリマー標的配列に結合する方法。
【請求項２７】
前記ヘテロポリマー・プローブ配列の塩基と前記ヘテロポリマー標的配列の塩基との間の整合または不整合が検出される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブおよび前記標的は１本鎖であり、前記複合体は２重鎖であり、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって、またはワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、前記ヘテロポリマー標的配列に平行または逆平行である請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブおよび前記標的のうちの一方は１本鎖であり、前記プローブおよび前記標的のうちの他方は２本鎖であり、前記複合体は３重鎖である請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記プローブおよび前記標的は２本鎖であり、前記複合体は４重鎖である請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的は、支持体、表面、または半透膜に共有結合する請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記プローブは、支持体、表面、または半透膜に共有結合する請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記シグナルを生成または変化させるべく、電流または電磁力が前記複合体に印加される請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記プローブまたは前記標的は、支持体、表面、または半透膜に共有結合し、前記シグナルを生成または変化させるべく、電流または電磁力が前記複合体に印加される請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法はさらに、前記シグナルを変化させるべく、前記ハイブリダイゼーション混合物の条件を繰り返し変化させる工程を備え、前記標的は、前記変化に応答したシグナル分散の関数としてアッセイされる請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記変化させる工程によって、前記プローブを前記複合体の前記標的から解離させる請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記変化させる工程は、前記ハイブリダイゼーション混合物に第１の刺激および第２の刺激を与えることを含み、前記第１の刺激は、前記第２の刺激と同一の大きさであって尚かつ反対の極性を有する請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記変化させる工程は、一連の刺激を与えることを含み、前記刺激のそれぞれは同一である請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記シグナルは、前記プローブと共有結合した少なくとも１つの標識によって発せられる請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記シグナルは、前記標的と共有結合した少なくとも１つの標識によって発せられる請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
前記シグナルは、前記複合体と非共有的に結合した少なくとも１つの標識によって発せられる請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記プローブは前記標的に侵入し、ワトソン・クリック塩基認識または相同的塩基認識に基づいて前記ヘテロポリマー・プローブ配列の塩基が前記ヘテロポリマー標的配列の塩基と結合するように、前記ヘテロポリマー標的配列に結合した塩基の配列を置換する請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
前記プローブおよび前記標的のうちの少なくとも１つは、無水状態にて前記ハイブリダイゼーション混合物に導入される請求項２６に記載方法。
【請求項４４】
前記方法は、前記プローブまたは前記標的を変性させることなく実施される請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
前記ハイブリダイゼーション混合物はさらに、少なくとも１つの結合プロモーターを含有する請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのプロモーターは、縮合剤または非縮合剤である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記プロモーターは、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＬＯＬＯ−１、ＪＯＪＯ−１、シアニンダイマー、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、シアニンモノマー、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー１、エチジウムホモダイマー２、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジン誘導体、エチジウムアクリジンヘテロダイマー、エチジウムモノアジド、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯ色素、ＳＹＢＲグリーン１、ＳＹＢＲ色素、Ｐｉｃｏグリーン、ＳＹＴＯＸ色素、および７−アミノアクチノマイシンＤからなる群より選ばれる１つである請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記複合体の他の可能な結合構造よりも前記複合体の１つの結合構造に有利に働くように、前記少なくとも１つのプロモーターの濃度が提供される請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記標的を任意にマッピングするか、あるいは任意に前記標的の配列を決定する工程をさらに備える請求項２６に記載の方法。
【請求項５０】
前記シグナルは、連続的に変化する条件下で検出された一連のシグナルを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項５１】
前記解離の特性は、前記プローブと前記標的との間の結合親和性と相関する請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）相同的結合条件が提供されて、不完全相同的プローブは、前記標的に結合しないか、効率の低下した状態で前記標的に結合しており、若しくは（ｂ）ワトソン・クリック相補的結合条件が提供されて、不完全相補的プローブは、前記標的に結合しないか、効率の低下した状態で前記標的に結合している請求項２６に記載の方法。
【請求項５３】
前記プローブおよび前記標的のうちの少なくとも１つに結合した少なくとも１つの遊離塩基、ヌクレオチド、またはヌクレオシドをさらに備える請求項１に記載の複合体。
【請求項５４】
前記プローブおよび前記標的のうちの少なくとも１つに結合した少なくとも１つのタンパク質または酵素をさらに備える請求項１に記載の複合体。
【請求項５５】
前記複合体は、溶液中、固体の支持体上、インビトロ、インビボ、またはインシリコにある請求項１に記載の複合体。
【請求項５６】
前記プローブは、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合したヘテロポリマーＰＮＡであり、前記標的は２重鎖である請求項１に記載の複合体。
【請求項５７】
前記プローブは、前記２重鎖標的に侵入して前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項５６に記載の複合体。
【請求項５８】
前記プローブは２重鎖であり、前記プローブの少なくとも１つの鎖は、帯電していないか、部分的に負又は正に帯電しており、前記標的が１本鎖または２本鎖である請求項１に記載の複合体。
【請求項５９】
分析、診断、治療、または設計製作の用途に適合された請求項１に記載の複合体。
【請求項６０】
複合体形成混合物からの少なくとも１つの結合プロモーターをさらに備える請求項１に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２重鎖や３重鎖、４重鎖などの複合体中の核酸塩基結合に関し、より詳細には、そのような複合体を、１本鎖または２本鎖核酸塩基を含有するプローブと１本鎖または２本鎖核酸塩基を含有する標的配列との特異的な結合によって形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸のワトソン・クリック・モデルは、５０年近くにわたり分子生物学において認められてきた標準モデルである。非特許文献１に詳述されているように、ワトソンおよびクリックがノーベル賞を受賞したワトソン・クリック・モデルは、塩基が反対側の同様の塩基に結合するという彼らが諦めた理論の断片から生まれたものである。ワトソンは、同書のＡ：ＴおよびＧ：Ｃの結合に基づいたモデルの利点に気付いたときに、彼の「容易に思いつく似たもの同士の対合」モデルをどのように諦めたかについて、記述している。
【０００３】
ワトソンおよびクリックによって最初に提示された逆平行核酸２重鎖は、最も広く研究されたタイプの多重鎖核酸構造であるが、核酸は、ある特定の条件下で３重鎖構造および４重鎖構造を形成することも発見された。
【０００４】
最近まで、３重鎖を形成するための３本の核酸鎖同士の結合は、非常に限られた種の核酸（例えばポリプリンやポリピリミジンなどの配列）に限定されると広く考えられてきた（例えば、非特許文献２参照）。さらに、カノニカル３重鎖結合またはハイブリダイゼーションは、ワトソン・クリック型塩基対ではなく、限られた種類の隣接する核酸塩基同士のフーグスティーン結合に基づくことが教示されている（例えば、非特許文献２および特許文献１参照）。しかし発明者等は、最近いくつかの特許出願において、ワトソン・クリック塩基対に基づいて特異的に結合した混合塩基配列３重鎖核酸を生成し、特異的結合に関する高精度・高感度アッセイの基準として使用可能であることを開示した（例えば、特許文献２および３参照）。
【０００５】
非特許文献３は、平行ＤＮＡ３重鎖の可能性について開示しているが、これらの３重鎖は、ＲｅｃＡタンパク質などの組換えタンパク質の存在下、２重鎖の主溝における第３の鎖結合によって生成されると言われている。
【０００６】
３重鎖核酸の場合と同様に、４重鎖核酸に関する従来の知見とは、そのような特異な構造だけが、数少ない種類の核酸に関する比較的極端な条件下で存在するというものであった。特に非特許文献４は、グアニンに富むオリゴヌクレオチドを自然発生的に自己組織化して、生体外で４本鎖らせん体にすることが可能であることを開示している。非特許文献５は、これらの４本鎖複合体をさらに、８、１２、または１６オリゴマーからなる超構造に関連付けることが可能であることを開示している。
【０００７】
非特許文献６および７は、いくつかのグアニンに富むオリゴヌクレオチドを、長い「Ｇワイヤ」を形成するオフセット平行アライメントにアセンブルすることが可能であることを開示している。これらの高次構造は、フーグスティーン塩基対によって平面内に配置されかつ一緒に保持された４つのグアノシン残基からなるＧカルテットによって安定化する。非特許文献５によれば、オリゴマー内の少なくとも３つの隣接するグアニンが、これら高次構造の形成に極めて重要である。
【０００８】
４本鎖ＤＮＡは、様々な生物学的方法において、ＨＩＶ−１インテグラーゼの阻害（非特許文献８参照）や減数分裂中の対合形成（非特許文献４参照）、テロメア維持（非特許文献９および１０参照）などの役割を果たすことが示されている。さらに、グアニンに富む４重鎖の生成を制御することは、そのような生物学的方法を制御する鍵であることが示されている。例えば特許文献４は、グアニン・カルテットの形成を阻害する薬物でテロメラーゼ活性を制御できることを示している。
【０００９】
特許文献５は、核酸を検出するアッセイで、Ｇカルテット・ベースの４重鎖を使用することが可能であることを開示している。相補的なオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、Ｇカルテット構造は広がりまたは線状になり、それによってＧカルテット構造の異なる部分でのドナー部分とアクセプター部分との距離が増し、それらの相互作用が少なくなって、この構造から発せられるシグナル（例えば蛍光）の検出可能な変化が小さくなる。
【００１０】
特許文献６は、合成オリゴヌクレオチドを精製するための方法を開示しており、この方法では、合成オリゴヌクレオチドが所望の完全長オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、それに付随して４重鎖ＤＮＡなどの多量体凝集体を形成する。次いで精製するオリゴヌクレオチドを含有した多量体凝集体を、サイズ排除技法を使用して単離する。
【特許文献１】米国特許第５，８７４，５５５号（ダーバン（Ｄｅｒｖａｎ）他）
【特許文献２】米国特許出願番号０９／６１３，２６３（２０００年７月１０日出願）
【特許文献３】米国特許出願番号０９／４６８，６７９（１９９９年１２月２１日出願）
【特許文献４】米国特許第６，０１７，７０９号（ハーディン（Ｈａｒｄｉｎ）他）
【特許文献５】米国特許第５，８８８，７３９号（ピットナー（Ｐｉｔｎｅｒ）他）
【特許文献６】米国特許第５，９１２，３３２号（アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）他）
【特許文献７】米国特許第６，１４７，１９８号（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ））
【特許文献８】米国特許第５，７２０，９２８号（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ））
【特許文献９】米国特許出願番号０９／８８５，７３１（２００１年６月２０日出願、本発明者等による）
【特許文献１０】米国特許出願番号０９／４９０，２７３（２０００年１月２４日出願）
【非特許文献１】ジェームズ・ワトソン（Ｊａｍｅｓ  Ｗａｔｓｏｎ），“Ａ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ａｃｃｏｕｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＤＮＡ”（１９６８），ｐ．１２５
【非特許文献２】フローリス（Ｆｌｏｒｉｓ）他，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐｕｒｉｎｅ−ｐｕｒｉｎｅ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｘｅｄ−ｖａｌｅｎｃｅ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，２６０  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８０１−８０９（１９９９）
【非特許文献３】ザーキン（Ｚｈｕｒｋｉｎ）他，２３９Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１（１９９４）
【非特許文献４】セン（Ｓｅｎ）他，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：３６４−３６６（１９８８）
【非特許文献５】セン（Ｓｅｎ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：６５−７０（１９９２）
【非特許文献６】マーシュ（Ｍａｒｓｈ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１０７１８−１０７２４（１９９４）
【非特許文献７】マーシュ（Ｍａｒｓｈ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：６９６−７００（１９９５）
【非特許文献８】マツムダー（Ｍａｚｕｍｄｅｒ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１３７６２−１３７７１（１９９６）
【非特許文献９】ウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）他，Ｃｅｌｌ  ５９：８７１−８８０（１９８９）
【非特許文献１０】バラン（Ｂａｒａｎ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：２９７−３０３（１９９７）
【非特許文献１１】サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｖｏｌ．２（１９８９）
【非特許文献１２】Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，２０７（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前述の成果にもかかわらず、混合塩基配列核酸同士のすべての特異的な相互作用について体系的に調査し分類整理し、核酸および／または核酸類似体との特異的な相互作用を生成し分析するための新しく効果的で迅速な方法を作り出すことが、依然として引き続き求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、（１）核酸または核酸類似体のヘテロポリマー・プローブ配列を含有するプローブと、（２）核酸または核酸類似体のヘテロポリマー標的配列を含有する標的とを備える複合体において、複合体が２重鎖であって尚かつヘテロポリマー・プローブ配列がヘテロポリマー標的配列に逆平行である場合にはヘテロポリマー・プローブ配列が相同的塩基相互作用によってヘテロポリマー標的配列に結合することと、複合体が３重鎖である場合には複合体には組換えタンパク質が含まれないこととを条件として、（ａ）プローブおよび標的の少なくとも１つは精製されたものか合成物であり、（ｂ）ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって、または相同的塩基相互作用によってヘテロポリマー・プローブ配列はヘテロポリマー標的配列に結合する複合体を提供する。
【００１３】
また、標的をアッセイするための方法であって、その方法は、（１）核酸または核酸類似体のヘテロポリマー標的配列を含有する標的を含んだサンプルを準備する工程と、（２）核酸または核酸類似体のヘテロポリマー・プローブ配列を含有するプローブを準備する工程と、（３）標的、プローブ、水、および緩衝剤を含んだハイブリダイゼーション混合物を準備する工程と、（４）複合体を得るべく、ヘテロポリマー標的配列をヘテロポリマー・プローブ配列に結合させるのに有効なインキュベーション時間でハイブリダイゼーション混合物をインキュベートする工程と、（５）標的をアッセイするべく、プローブと標的との間の結合親和性と相関するシグナルを検出する工程とを備え、複合体が２重鎖であって尚かつヘテロポリマー・プローブ配列がヘテロポリマー標的配列に逆平行である場合にはヘテロポリマー・プローブ配列が相同的塩基相互作用によってヘテロポリマー標的配列に結合することと、複合体が３重鎖である場合には複合体には組換えタンパク質が含まれないこととを条件として、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって、または相同的塩基相互作用によってヘテロポリマー・プローブ配列はヘテロポリマー標的配列に結合する方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、ヘテロポリマー核酸鎖の特異的結合特性に関して本発明者等が解明した事項から生じたものである。本発明者等は、ヘテロポリマー鎖と２重鎖核酸との特異的結合、２重鎖核酸とその他の２重鎖核酸との特異的結合について既に開示している。そこで本発明者等は、相同的塩基結合ならびにワトソン・クリック塩基相互作用によってヘテロポリマー核酸（および／またはその類似体）を互いに特異的に結合することが可能であること、さらに塩基結合が、互いに対して逆平行の方向性を有する鎖に限られないことについて開示する。したがってヘテロポリマー核酸（および／またはその類似体）は、平行または逆平行の方向性を持ちながら互いに特異的に結合することが可能であり、相同的塩基結合および／またはワトソン・クリック塩基結合による塩基結合が支配する。
【００１５】
本発明は、従来から認められている核酸の結合特性の単なる開示を超えるものである。本発明は、新規な化合物、ならびに核酸を分析するための方法、診断方法、治療方法、予防方法、遺伝子治療、および遺伝子工学を包含する。
【００１６】
本発明は、核酸（および／またはその類似体）の新規な２重鎖、３重鎖、および４重鎖複合体を包含する。
核酸鎖は、固有の方向性を持つ。従来の知見によれば、反対の方向性を持つ鎖、すなわち互いにその向きが逆平行である鎖が、それぞれの塩基のワトソン・クリック相補的結合によって２重鎖を形成することが可能であることを教示している。
【００１７】
一方、本発明によるある特定の２重鎖は、互いに対して平行にハイブリダイズした核酸（および／または核酸類似体）の２本鎖からなり、この場合、特異的結合は、相同的塩基対合またはワトソン・クリック塩基対合によってなされる。従来の知見によれば、そのような２重鎖は存在せず、またはそのような２重鎖は、例えば平行な塩基結合の構造上の要件により必要とされる主鎖の不規則さによって、少なくとも極めて不安定になることが示されている。さらに意外なことは、適切なハイブリダイゼーション条件下、相同的結合がワトソン・クリック相補的逆平行２重鎖に匹敵する特異性および安定性を示すという、本発明者等の発見にある。
【００１８】
また本発明は、互いに対して逆平行にハイブリダイズした核酸（および／または核酸類似体）の２本の鎖を含有する２重鎖も包含し、この場合、特異的結合は相同的塩基対合によってなされる。
【００１９】
本明細書で使用する「ワトソン・クリック塩基対合」、「相補的塩基対合」、およびこれらと同様の用語は、一致した塩基（例えばＡ：Ｔ、Ｇ：Ｃ：、および／またはＡ：Ｕ）を介した核酸および／または核酸類似体の鎖の対向しまたは隣接する対の間の特異的な関連付けを示すものとする。平行２重鎖、平行および逆平行３重鎖、平行および逆平行４重鎖を含めた本明細書で述べる非カノニカル複合体の場合、「ワトソン・クリック塩基結合」や「相補的塩基結合」などの用語は、ＡとＴ、ＡとＵ、および／またはＧとＣとの結合を示すものとするが、必ずしもワトソンおよびクリックによって最初に記述されたような沿層的平面構造である必要はない。ワトソンおよびクリックによって最初に提案された従来の結合モチーフ（「Ｗ−Ｃモチーフ」）と、ワトソン・クリック塩基結合の前述の定義に包含されるその構造上の変形例の他、本発明は、相同的塩基結合によって形成された複合体を包含する。相同的塩基結合では、塩基が、相補的な塩基ではなく同一の塩基と特異的に結合する。したがって「相同的モチーフ」では、相同的塩基対がＡ：Ａ、Ｇ：Ｇ、Ｃ：Ｃ、Ｔ：Ｔ、およびＵ：Ｕを含む。
【００２０】
核酸鎖の塩基による結合は、いくつかのファクター、特にＷ−Ｃモチーフまたは相同的モチーフに従う鎖の結合可能性、およびイオン条件（例えば塩濃度および／またはタイプ）の影響を受け、または調整される。塩濃度の高い状態では、相同的結合よりもワトソン・クリック結合を形成し易い。同一の緩衝条件下では、Ｗ−Ｃモチーフ４重鎖よりも相同的モチーフ４重鎖になり易いが、その理由は、２つの２本鎖核酸の帯電主鎖の存在に基づいて、おそらくは局所環境が比較的低い塩濃度になる可能性があるからである。
【００２１】
核酸塩基は、それらがＷ−Ｃモチーフまたは相同的モチーフによって特異的に結合する核酸塩基に関係するものであるとすれば、本発明の複合体の各鎖は、核酸塩基および／または核酸塩基類似体の任意の配列からなる可能性がある。従来技術のある特定の教示とは対照的に、標的およびプローブは、３重鎖または４重鎖を形成する場合であっても、結合を実現するためにホモポリマーである必要はない。したがって、ある特定の実施形態では、分散しているプリンおよびピリミジンのヘテロポリマー・プローブ配列内にプローブ核酸塩基を配置し、標的核酸塩基については、プローブ配列に少なくとも一部が相補的でありまたは少なくとも一部が相同的な標的配列内に配置する。例えばプローブ配列は、２５％〜７５％のプリン塩基と７５％〜２５％のピリミジン塩基とを任意の順序で含有する可能性がある。本発明の複合体は、本明細書で定義したように、少なくとも１つのプリン核酸塩基またはプリン類似体と少なくとも１つのピリミジン核酸塩基またはピリミジン類似体を少なくともそれらがハイブリダイズするセグメントに含有する配列を意味するヘテロポリマー配列から形成することが可能である。ヘテロポリマー配列は、５塩基長を超えるホモポリマー断片に乏しいことが好ましい。例えば、その他の塩基に対して特異的なワトソン・クリックおよび／または相同的結合親和性を有する天然産出塩基の合成類似体など、その他の核酸塩基も、本発明での使用に適している。
【００２２】
２重鎖の他、本発明の複合体は３重鎖および４重鎖も含み、この場合、対向するヘテロポリマー鎖は、ワトソン・クリック相補的塩基によってまたは相同的塩基によって結合し、結合した配列の相対的な方向性は、互いに平行でありまたは逆平行である。
【００２３】
プローブ鎖は、２本鎖標的の主溝または副溝内で特異的に結合することが可能である。さらに、１本鎖プローブの塩基は、２本鎖標的の一方または両方の鎖の塩基に特異的に相互に作用することが可能である。同様に、２本鎖プローブの各鎖の塩基は、本発明の４重鎖複合体における２本鎖標的の一方または両方の鎖の塩基に特異的に相互に作用することが可能である。
【００２４】
ある特定の３重鎖および４重鎖の実施形態では、各核酸塩基が１つまたは複数のその他の核酸塩基と結合する。したがって、上記従来からの２重鎖ワトソン・クリック塩基対および２重鎖相同的塩基対の他、そのような実施形態は、以下のワトソン・クリック塩基結合トリプレット、すなわちＡ：Ｔ：Ａ、Ｔ：Ａ：Ｔ、Ｕ：Ａ：Ｔ、Ｔ：Ａ：Ｕ、Ａ：Ｕ：Ａ、Ｕ：Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ：Ｇ、および／またはＣ：Ｇ：Ｃ（Ｃ＋：Ｇ：Ｃ、および／または任意のその他の塩基のイオン化種を含む）、および／または以下の相同的塩基トリプレット、すなわちＡ：Ａ：Ｔ、Ｔ：Ｔ：Ａ、Ｕ：Ｕ：Ａ、Ｔ：Ｕ：Ａ、Ａ：Ａ：Ｕ、Ｕ：Ｔ：Ａ、Ｇ：Ｇ：Ｃ、および／またはＣ：Ｃ：Ｇ（Ｃ：Ｃ＋：Ｇ、および／または任意のその他の塩基のイオン化種を含む）を含む。
【００２５】
したがって、プローブが第１および第２の鎖の２重鎖と定義され、標的が第３および第４の鎖の２重鎖と定義されるある特定の４重鎖の実施形態では、（ａ）第１および第２の鎖の対向する塩基同士の結合と、（ｂ）第３および第４の鎖の対向する塩基同士の結合と、（ｃ）第２および第４の鎖の対向する塩基同士の結合の他に、第１および第３の鎖の塩基も互いに結合すると考えられる。
【００２６】
本発明の３重鎖および４重鎖構造の、ある特定の実施形態では、どの塩基の結合配列も別の塩基の結合配列に隣接していない。すなわち、少なくとも３本の個別の鎖がある。折畳み構造およびそれと同様のもの（例えばヘアピン・カーブなど）が本発明の範囲内に含まれるが、１本鎖の折畳み部分は、最小限必要な３本の個別の鎖に対し、２本以上の鎖であるとは数えない。
【００２７】
本発明の複合体は、複合体構造を維持するために、フーグスティーン結合またはＧ−Ｇカルテットを利用しないことが好ましいが、フーグスティーン結合および／またはＧ−Ｇカルテットが存在してもよい。すなわち、本発明の複合体は、フーグスティーン結合を実質的に含まず、かつＧ−Ｇカルテットを実質的に含まないことが好ましい。
【００２８】
複合体の各鎖は、独立に、デオキシリボースホスフェートまたはリボースホスフェートの主鎖を有する核酸（例えばＤＮＡやＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｃＤＮＡ）あるいは核酸類似体からなる。好ましい核酸類似体は、帯電していないかまたは一部が帯電している主鎖（例えば天然のＤＮＡ主鎖ほど負ではない電荷を有する主鎖）を含有し、例えばＰＮＡやＬＮＡを含む。ある特定の実施形態は、ＰＮＡを含まない。
【００２９】
複合体の少なくとも一部は、単離されたもの、精製されたもの、人工物、または合成物である。
実施形態において、複合体の一部はＰＣＲ増幅産物である。
【００３０】
本発明の複合体は、溶液中、固体の支持体上、インビトロ（in vitro）、インビボ（in vivo）、またはインシリコ（in silico）に存在させることが可能である。固体の支持体は、導電性（例えば電極）または非導電性でよい。さらに複合体は、特許文献７および８に教示されるように、伸長後、光学的にマッピングしまたは配列決定することが可能である。
【００３１】
本発明の複合体は、（ａ）核酸または核酸類似体のヘテロポリマー標的配列を含有する標的と、核酸または核酸類似体のヘテリポリマー・プローブ配列を含有するプローブと、緩衝剤とを含んだハイブリダイゼーション混合物を準備する工程と、（ｂ）複合体を得るべく、前記ヘテロポリマー標的配列が前記ヘテロポリマー・プローブ配列にハイブリダイスするのに有効なインキュベーション時間で前記ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートする工程とを備えた方法によって、提供することが可能である。
【００３２】
ハイブリダイゼーション混合物は、ヌクレオチドの保存に適した任意の従来の媒体を含んでよい（例えば、非特許文献１１参照）。例えば媒体は、ヌクレオチド、水、緩衝剤、および標準塩濃度からなるものでよい。３重鎖または４重鎖形成を促進させるためだけに２価の陽イオンを使用する場合は、ＥＤＴＡやＥＧＴＡなどのキレート剤を反応混合物中に含めるべきではない。
【００３３】
相補的な塩基同士の特異的結合は、温度、塩濃度、静電強度、および緩衝剤の組成に変化を示す広く様々な条件下で生じる。これらの条件の例と、その条件を適用するための方法は、当技術分野で周知である。特許文献９は、本発明での使用に特に適した条件を開示している。
【００３４】
約７．６よりも高いｐＨレベルで不安定または存在しない多くのフーグスティーン型（Hoogsteen-type）複合体とは異なり、本発明の複合体は、広範囲にわたるｐＨレベルで、好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９で安定である。
【００３５】
本発明の複合体は、分析、診断、治療、および／または設計製作の目的で提供することが可能である。この複合体を使用して、生物体またはウイルスによる感染に関連した状態を分析し、診断し、かつ／または治療することが可能である。生物体またはウイルスは、望むなら定量することが可能である。
【００３６】
本発明の複合体は、従来のハイブリダイゼーション条件下、３重鎖ハイブリダイゼーション条件下、４重鎖ハイブリダイゼーション条件下、またはin situハイブリダイゼーション条件下で形成することが可能である。複合体は、約２℃〜約５５℃の温度で、２時間またはそれ以下の時間で形成することが好ましい。ある特定の実施形態では、室温であっても、インキュベーション時間が５分未満であることが好ましい。より長い反応時間を必要とせず、ほとんどの場合、最長２４時間というインキュベーションは複合体に悪影響を与えない。本発明の複合体の結合時間が速いことは、フーグスティーン結合複合体の場合に必要な結合時間が非常に長いこととは対照的である。
【００３７】
ハイブリダイゼーション媒体におけるプロモーターは、特許文献２に開示されているように、挿入剤または陽イオンであることが好ましい。インターカレーターは蛍光性であってもよい。挿入剤は、例えばＹＯＹＯ−１やＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＬＯＬＯ−１、ＪＯＪＯ−１、シアニンダイマー、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、シアニンモノマー、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジン誘導体、エチジウムアクリジンヘテロマイマー、エチジウムモノアジド、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯ色素、ＳＹＢＲグリーン１、ＳＹＢＲ色素、Ｐｉｃｏグリーン、ＳＹＴＯＸ色素、および７−アミノアクチノマイシンＤからなる群より選ばれる１つなどの蛍光体でよい。
【００３８】
適切な陽イオンには、例えばＮａ＋（濃度４０ｍＭ〜２００ｍＭが好ましい）やＫ＋（濃度４０ｍＭ〜２００ｍＭが好ましい）、その他のアルカリ金属イオンなどの１価の陽イオン；アルカリ土類金属イオン（例えばＭｇ＋２やＣａ＋２）や２価値の遷移金属イオン（例えばＭｎ＋２やＮｉ＋２、Ｃｄ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２）などの２価のイオン；Ｃｏ（ＮＨ３）６＋３や３価のスペルミジン、４価のスペルミジンなどの少なくとも３価の正電荷を有する陽イオンが含まれる。Ｍｎ＋２は１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供することが好ましい。Ｍｇ＋２は１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供することが好ましい。Ｎｉ＋２は約２０ｍＭの濃度で提供することが好ましい。実施形態では、Ｍｇ＋２およびＭｎ＋２を、それぞれ１ｍＭ、それぞれ２ｍＭ、それぞれ３ｍＭ、．．．、それぞれ４０ｍＭ（すなわちそれぞれ１〜４０ｍＭ）の濃度で組み合わせて提供する。
【００３９】
複合体が形成される媒体に添加した陽イオンの量は、陽イオンの性質、プローブの濃度、標的の濃度、追加の陽イオンの存在、プローブおよび標的の塩基含量を含めたいくつかのファクターに応じて異なる。好ましい陽イオンの濃度および混合物は、実験によってごく普通に発見することが可能である。３重鎖では、陽イオンを以下の量で媒体に添加することが好ましく、すなわち（ａ）Ｍｎ＋２が１０ｍＭ〜３０ｍＭ、（ｂ）Ｍｇ＋２が１０ｍＭ〜２０ｍＭ、（ｃ）Ｎｉ＋２が２０ｍＭ、または（ｄ）Ｍｎ＋２およびＭｇ＋２のそれぞれが１ｍＭ〜３０ｍＭである。４重鎖では、陽イオンを以下の量で媒体に添加することが好ましく、すなわち（ａ）Ｍｎ＋２が１０ｍＭ〜４５ｍＭ、（ｂ）Ｍｇ＋２が１０ｍＭ〜４５ｍＭ、（ｃ）Ｍｎ＋２およびＭｇ＋２のそれぞれが１０ｍＭ〜４０ｍＭである。
【００４０】
必須ではないが、その他のプロモーターには、例えばＲｅｃＡタンパク質などの１本鎖結合タンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ１本鎖タンパク質、核酸の主溝または副溝に結合するタンパク質、ビオロゲン、およびアクチノマイシンＤやソラレン、アンゲリシンなどの追加のインターカレート型物質が含まれる。そのような促進試薬は、極端な動作条件下で、すなわち例えば異常なｐＨレベルまたは極めて高い温度で有用であることが明らかである。本発明の複合体を提供するためのある特定の方法は、ＲｅｃＡおよび／またはその他の組換えタンパク質など、タンパク質プロモーターが存在しない状態で実施する。
【００４１】
本発明は、迅速で高感度であり環境に優しく安全な、結合を評価するための方法を提供する。本発明のアッセイを使用して、例えば折畳みヌクレオチド配列内の到達可能な領域を特定し、ハイブリダイゼーション複合体の不適正塩基対の数を決定し、ゲノムをマッピングすることが可能である。
【００４２】
本発明のアッセイは、特異的なプローブ・標的結合を検出するだけではなく、プローブと標的との相互作用の性質に関する定性的・定量的情報も提供する。したがって本発明によれば、２本鎖プローブまたは１本鎖プローブの配列と２本鎖標的または１本酸標的の配列との間で生じた完全整合、１塩基対不整合、２塩基対不整合、３塩基対不整合、１塩基対欠失、２塩基対欠失、および３塩基対欠失を、実行者が見分けることが可能である。
【００４３】
本発明の実施形態は、第１のプローブ・標的混合物に関して測定されたシグナル（例えば光、蛍光、化学発光、電気化学発光、電気的または電気機械的性質）を、同じ標的と組み合わせたその他のプローブによって示される同じタイプのシグナルに対して校正することからなり、この場合その他のプローブのそれぞれは、少なくとも１塩基だけ第１のプローブと異なっている。
【００４４】
測定されたシグナル（例えば蛍光強度）の大きさが標的とプローブとの間の結合親和性の関数である校正曲線を作成することが可能である。標的と複数の種々のプローブとの間の結合親和性は、複合体における不整合塩基の数や、不整合の性質（例えばＷ−ＣモチーフのＡ：Ｇ対Ａ：Ｃ対Ｔ：Ｇ対Ｔ：Ｃなど）、不整合の位置などによって変化するので、本発明のアッセイを使用して標的の配列決定をすることが可能である。
【００４５】
実施形態で、測定されたシグナルは、試験サンプル中に含まれる蛍光体の蛍光強度でよい。そのような実施形態で、プローブと標的との間の結合親和性は、蛍光体がシグナル消光またはシグナル増幅によってハイブリダイゼーションを知らせるかどうかに応じて、蛍光強度に直接的にまたは間接的に相関し得る。選択された条件下、挿入剤によって生じた蛍光強度は、プローブと標的との間の結合親和性に直接相関し得るが、一方、プローブに共有結合した非インターカレート型蛍光体を用いる好ましい実施形態の強度は、プローブと標的との間の結合親和性に対して逆相関を示す。蛍光強度は、非インターカレート型蛍光体の場合、プローブと標的との間の整合の程度（例えば整合対不整合の量、および／または不整合のタイプ）が大きくなるにつれて低下し、好ましくは０〜２個の不整合および／または欠失を含む範囲にわたり、より好ましくは０〜３個の不整合および／または欠失を含む範囲にわたり低下する。
【００４６】
本発明は、プローブと標的との間の結合親和性を定量することが可能である。そのような情報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬物の設計も含めた様々な用途で価値あるものになる。
【００４７】
本発明のアッセイは、均一であることが好ましい。アッセイは、測定されたシグナルの大きさを検出する前に遊離プローブおよび遊離標的をハイブリダイゼーション複合体から分離することなく、実施することが可能である。アッセイは、ゲル分離工程を必要とせず、それによって試験の処理量を大幅に増大させることができる。定量分析は簡単で正確である。その結果アッセイは、非常に多くの時間と費用を節約し、容易に自動化することが可能である。さらに、緩衝剤やｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベーションの時間、プローブおよび標的配列の相対濃度、インターカレーター濃度、標的配列の長さ、プローブ配列の長さ、可能性ある補助因子（すなわちプロモーター）要件などの結合変数を、迅速に決定することができる。
【００４８】
アッセイは、例えばウェルまたはマイクロチャネル内にある溶液中で、不透過性の表面で、またはバイオチップ上で実施することが可能である。ある特定の実施形態では、標的がプローブの前にハイブリダイゼーション媒体中に加えられ、プローブは、ハイブリダイゼーション媒体に接触させることによる再水和の前に無水状態で加えられる。
【００４９】
ある特定の実施形態で、本発明のアッセイは、標的またはプローブ上にシグナル消光剤を加えることなく実施される。
本発明は、アッセイを行う前に標的を変性させる必要がない。プローブと標的との間の相互作用が、前掲の特許文献５の複合体ハイブリダイゼーションの非常に制約あるフーグスティーン・モデルではなくワトソン・クリックまたは相同的塩基相互作用に基づく場合（少なくともＡがＴ（またはＲＮＡの場合はＵ）に結合しＧがＣに結合するという意味で）、本発明者等がヘテロポリマー３重鎖および４重鎖を特異的にアッセイすることができたことは、驚くべきことである。
【００５０】
適切な標的は、８〜３．３×１０９塩基対の長さであることが好ましく、１本鎖または２本鎖でよい。本発明のプローブは、２〜７５塩基長であることが好ましく（より好ましくは５〜３０塩基長）、１本鎖または２本鎖でよい。したがって本発明のアッセイで使用するのに適したプローブには、例えばｓｓＤＮＡやＲＮＡ、ｓｓＰＮＡ、ＬＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ｄｓＰＮＡ、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと、帯電しておらずまたは一部帯電している糖リン酸および／またはペプチド主鎖を有するその他の１本鎖および２本鎖核酸と核酸類似体が含まれる。プローブの長さは、標的の長さに一致するよう選択することが可能である。
【００５１】
本発明は、使用するのに有害、冗長で時間がかかりかつ常に再生しなければならない放射性プローブを使用する必要がない。本発明のプローブは、使用するのに安全でかつ何年も安定であることが好ましい。したがってプローブは、大量に作製しまたは発注して貯蔵することが可能である。
【００５２】
複合体は、少なくとも１つの標識の変化によって検出されることが好ましい。この少なくとも１つの標識は、プローブおよび／または標識に取着することが可能であり、かつ／または試験媒体中で遊離させることが可能である。この少なくとも１つの標識は、少なくとも２つの部分からなるものでよい。
【００５３】
標識は、スピン標識、蛍光体、発色団、化学発光剤、電気化学発光剤、放射性同位元素、酵素、ハプテン、抗体、および標識抗体からなる群より選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。複合体は、標識からの少なくとも１回の放出によって、または複合体の電子特性をモニタすることによって、検出されることが好ましい。
【００５４】
標識抗体は、例えば、蛍光体、発色団、スピン標識、放射性同位元素、酵素、ハプテン、化学発光剤、および電気化学発光剤からなる群より選ばれる検出可能な部分で標識することができる標識抗核酸／核酸抗体でよい。
【００５５】
複合体は、特許文献１０に開示されるように、少なくとも１つの変化した条件下で検出することが可能である。適切な変化した条件には、例えば（ａ）試験媒体の非水性成分の変化、（ｂ）試験媒体のｐＨの変化、（ｃ）試験媒体の塩濃度の変化、（ｄ）試験媒体の有機溶媒含量の変化、（ｅ）試験媒体のホルムアミド含量の変化、（ｆ）試験媒体の温度の変化、（ｇ）試験媒体中のカオトロピック塩濃度の変化が含まれる。さらに、変化した条件は、例えば電流（ＤＣおよび／またはＡＣ）や光子放射（例えばレーザ光）、電磁力などの刺激を与えることでよい。刺激は、絶えずまたは間欠的に与えることが可能である。検出は、条件の１つを変化させ、または複数組み合わせた条件を順次変化させることによって行うことができる。
【００５６】
変化した条件または刺激に対する試験媒体中の複合体の特性の応答をモニタして、複合体を検出することが可能である。特性は、例えば導電率やＱ（伝送線の共鳴構造、あるいは試験媒体中の伝送線を伝搬するシグナルの相または振幅の変化）でよい。
【００５７】
実施形態で、検出方法は、（ａ）前記プローブと前記標識との間の結合親和性に相関するシグナルを標識から検出する工程と、（ｂ）試験媒体の条件を変化させる工程と、（ｃ）後続のシグナルを検出する工程と、（ｄ）シグナルと後続のシグナルを比較する工程とからなる。変化させる工程および検出する工程は、少なくとも１回繰り返すことが可能であり、または１回だけ実行することが可能である。
【００５８】
標識は、蛍光体であることが好ましい。インターカレート型蛍光体と非インターカレート型蛍光体の両方が、本発明での使用に適している。蛍光体は、溶液中で遊離してよく、プローブに共有結合してよく、かつ／または標的に結合してよい。蛍光体がプローブに共有結合する場合、プローブの両端に結合することが好ましい。好ましい蛍光マーカーには、ビオチン、ローダミン、アクリジン、およびフルオレセインと、励起エネルギーを照射したときに蛍光を発するその他のマーカーが含まれる。適切な非インターカレート型蛍光体には、例えばＡｌｅｘａ色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、ビオチン・コンジュゲート、チオール反応性プローブ、フルオレセインおよびその誘導体（「ケージド・プローブ」を含む）、オレゴン・グリーン、ローダミン・グリーン、およびＱＳＹ色素（可視光で励起された蛍光体の蛍光を消光する）が含まれる。
【００５９】
励起波長は、使用される蛍光体のこの最大励起に対応するように選択され（ごく普通の実験および／または従来の知識によって）、好ましくは２００〜１０００ｎｍである。蛍光体は、放出波長が２００〜１０００ｎｍになるよう選択することが好ましい。好ましい実施形態ではアルゴンイオン・レーザを使用して、波長が４００〜５４０ｎｍの範囲内の波長の光で蛍光体を照射し、５００〜７５０ｎｍの範囲内の蛍光放出を検出する。
【００６０】
本発明のアッセイは、例えば約２〜約６０℃などの、広く様々な温度にわたって実施することが可能である。ある従来技術のアッセイは、高温であることが必要であり、アッセイのコストがかかって手間取る。一方、本発明は、室温またはそれ以下（例えば２５℃よりも低い温度）で実施することが可能である。
【００６１】
本発明の信頼性は、プローブまたは標的中のグアニンおよびシトシンの含量とは無関係である。従来のＷ−Ｃモチーフでは、Ａ：Ｔ塩基対が２つの水素結合しか形成しないのに対しＧ：Ｃ塩基対が３つの水素結合を形成するので、ＧまたはＣの含量が高い標的およびプローブの配列はより安定で、より高い融点を有する。その結果、ハイブリダイズしたプローブおよび標的領域のＧＣ含量を、完全に整合したハイブリッドのＧＣ含量よりも増大させる塩基対不整合は、不整合プローブに関連した結合の弱さを相殺することができる。
【００６２】
本発明のアッセイは極めて感度が高く、それによって、標的のＰＣＲ増幅を実施する必要がなくなる。例えば、約１０フェムトモルの標的と約１０フェムトモルのプローブを含有する体積約２０マイクロリットルの試験サンプルをアッセイすることが可能である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは５×１０−１０Ｍ以下の濃度で標的のアッセイを行うのに十分感度が高い。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは５×１０−１０Ｍ以下の濃度でプローブを使用するのに十分感度が高い。前述の値は、この方法がより高い濃度を検出できないことを示すものではないことは言うまでもない。
【００６３】
プローブと標的の比は、約１：１〜約１０００：１であることが好ましい。
ある従来技術のアッセイとは異なり、本発明は、ハイブリダーゼーション（すなわち結合）の存在を検出するだけではなく、プローブと標的との結合の性質に関する定性的・定量的な情報も提供する。したがって本発明によれば、実行者は、（ａ）試験媒体中の標的の存在を検出し、（ｂ）標的中の対立遺伝子またはヘテロ接合の不一致を検出し、（ｃ）標的を定量し、（ｄ）プローブと標的との相補性（Ｗ−Ｃモチーフでの結合の場合）または相同的性（相同的モチーフでの結合の場合）の程度を検出し、（ｅ）ハプロタイプを検出することが可能になる。
【００６４】
本発明者等は、相補的塩基配列を含有する核酸の平行な鎖を複合する２重鎖が、反対の方向性を持つ核酸鎖によって形成された２重らせんの塩基とは異なる速度で３重鎖を形成するよう結合し、かつ上記２重らせんの塩基とは非常に異なる方法の究極点として結合することに注目してきた。反対の方向性を持つ２本の鎖（すなわち逆平行の鎖）は、主鎖の歪みが最小限に抑えられた状態で、反対側の塩基に対し、平面内で配向した規則正しく間隔を空けて配置された塩基を容易に示す。
【００６５】
本発明の様々な複合体は、核酸塩基および／または核酸塩基類似体のヘテロポリマー・プローブ配列を含有するプローブと、核酸塩基および／または核酸塩基類似体のヘテロポリマー標的配列を含有する標的とからなる。複合体は、プローブまたは標的の少なくとも一方が合成または精製されたものであるという意味で、合成または精製されたものである。プローブの主鎖は、ＤＮＡなどのデオキシリボースホスフェート主鎖、またはＰＮＡなどのペプチド様主鎖であり、あるいは、帯電していないかまたは一部が帯電している（負または正に）別の部分である。
【００６６】
ある実施形態では、プローブおよび標的が１本鎖であり、複合体が２重鎖である。前記プローブおよび標的は、これらが２重鎖である場合、Ｗ−Ｃ相補的結合または相同的結合に平行な方向性を持ち、あるいは相同的結合に対して逆平行の方向性を持つ。
【００６７】
その他の実施形態では、プローブまたは標的のどちらかが１本鎖であり、前記プローブまたは標的の他方が２本鎖であり、得られた複合体は３重鎖である。この複合体は、ＰＮＡを含まないものでよい。
【００６８】
ある実施形態では、３重鎖が、ヘテロポリマー標的配列に平行なヘテロポリマー・プローブ配列を含有し、このヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基結合またはワトソン・クリック相補的塩基結合によってヘテロポリマー標的配列に結合するものである。ある特定のその他の実施形態では、ヘテロポリマー・プローブ配列がヘテロポリマー標的配列に逆平行であり、このヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基結合またはワトソン・クリック相補的塩基結合によってヘテロポリマー標的配列に結合する。
【００６９】
３重鎖複合体のある特定の実施形態では、標的が、ヘテロポリマー標的配列を含有する第１の鎖と、第１のヘテロポリマー標的配列に対してワトソン・クリック相補的でありかつ逆平行である第２のヘテロポリマー標的配列を含有する第２の鎖とを含む。ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基結合によって第１のヘテロポリマー標的配列に結合し、またワトソン・クリック相補的塩基結合によって第２のヘテロポリマー標的配列にも結合する。
【００７０】
３重鎖複合体の、ある特定のその他の実施形態では、標的が、ヘテロポリマー標的配列を含有する第１の鎖と、第１のヘテロポリマー標的配列に対してワトソン・クリック的でありかつ逆平行である第２のヘテロポリマー標的配列を含有する第２の鎖とを含む。ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基結合によって第１のヘテロポリマー標的配列に結合し、また相同的塩基結合によって第２のヘテロポリマー標的配列にも結合する。
【００７１】
ある特定の実施形態では、プローブおよび標的が２本鎖であり、得られる複合体が４重鎖である。この複合体は、ＰＮＡを含まないものでよい。
ある特定の実施形態では、４重鎖が、ヘテロポリマー標的配列に平行または逆平行なヘテロポリマー・プローブ配列を含有し、このヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基結合またはワトソン・クリック相補的塩基結合によってヘテロポリマー標的配列に結合するものである。そのような実施形態では、４重鎖複合体が、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第１のプローブ鎖と、第１のプローブ配列に相補的であり逆平行な第２のプローブ配列を含有する第２のプローブ鎖とを含有する。標的は、ヘテロポリマー標的配列を含有する第１の標的鎖と、第１の標的鎖に相補的であり逆平行な第２のヘテロポリマー標的配列を含有する第２の標的鎖とを含む。
【００７２】
そのような４重鎖の実施形態では、ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基結合または相同的塩基結合によってヘテロポリマー標的配列に結合することが可能であり、ヘテロポリマー・プローブ配列は、任意選択でまた追加として、相同的塩基結合またはワトソン・クリック相補的塩基結合によって第２のヘテロポリマー標的配列に結合することがそれぞれ可能である。したがって、ヘテロポリマー・プローブ配列が相同的塩基結合によってヘテロポリマー標的配列に結合する場合、ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基結合によって任意選択で第２のヘテロポリマー標的配列に結合し、ヘテロポリマー・プローブ配列がワトソン・クリック相補的塩基結合によってヘテロポリマー標的配列に結合する場合は、ヘテロポリマー・プローブ配列が相同的塩基結合によって任意に第２のヘテロポリマー標的配列に結合する。
【００７３】
本発明について、以下の実施例を参照しながらより詳細に示すが、本発明は、これらに限定するものではないことを理解すべきである。
【実施例１】
【００７４】
ヒト嚢胞性線維症遺伝子のエキソン１０由来の相補的なセンスおよびアンチセンス５０量体ｓｓＤＮＡ標的配列（非特許文献１２）をＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９、パーセプティブ・バイオシステム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））で合成し、ＨＰＬＥで精製した。ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｄｄＨ２Ｏに溶解し、濃度１ｐｍｏｌ／μｌに希釈した。等モル量の相補オリゴヌクレオチドを９５℃で１０分間加熱し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下、１．５時間かけて温度を２１℃に冷却しながら徐々にアニールした。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｄｄＨ２Ｏに入れて濃度１ｐｍｏｌ／μｌに希釈した。
【００７５】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の配列は、５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’であった。
【００７６】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’であった。
【００７７】
配列番号２は、野生型センス鎖配列ＣＡＴがＣＧＴに変化したアミノ酸位置５０７での１塩基対変異（下線箇所）以外は野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一の、５０量体の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００７８】
配列番号２のセンス鎖の配列は、５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’であった。
【００７９】
配列番号２のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’であった。
【００８０】
配列番号３は、野生型センス鎖配列ＣＡＴがＡＣＴに変化したアミノ酸位置５０６および５０７での連続した２塩基対変異（下線箇所）以外は野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一の、５０量体の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００８１】
配列番号３のセンス鎖の配列は、５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’であった。
【００８２】
配列番号３のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＧＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’であった。
【００８３】
配列番号４は、野生型センス鎖配列ＣＡＴがＡＣＧに変化したアミノ酸位置５０６および５０７での連続した３塩基対変異（下線箇所）以外は野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一の、５０量体の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００８４】
配列番号４のセンス鎖の配列は、５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’であった。
【００８５】
配列番号４のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＣ ＧＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’であった。
【００８６】
配列番号５は、配列番号１に変更を加えた５０量体のｄｓＤＮＡ標的配列であり、ＧＣ含量％が３０％から５２％に変化したものである。
野生型標的ＤＮＡ（配列番号５）のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’であった。
【００８７】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号５）のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’であった。
【００８８】
配列番号６は、センス鎖配列ＣＡＴがＣＧＴに変化した１塩基対変異（下線箇所）以外は配列番号５と同一の、５０量体の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号６のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’であった。
【００８９】
変異配列番号６のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’であった。
【００９０】
配列番号７は、センス鎖配列ＣＴＣがＣＴＴに変化した１塩基対変異（下線箇所）以外は配列番号５と同一の、５０量体の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号７のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’であった。
【００９１】
変異配列番号７のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’であった。
【００９２】
配列番号８は、センス鎖配列ＣＡＴがＡＣＴに変化した連続する２塩基対変異（下線箇所）以外は配列番号５と同一の、５０量体の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号８のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’であった。
【００９３】
変異配列番号８のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’であった。
【００９４】
配列番号９は、野生型センス鎖配列ＣＴＴが欠失したアミノ酸位置５０７および５０８での連続する３塩基対欠失（３個のドットで示す）以外は野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一の、４７量体の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００９５】
配列番号９のセンス鎖の配列は、５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ．  ．  ．  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＧ−３’であった。
【００９６】
配列番号９のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡ  ．  ．  ．  Ａ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’であった。
【００９７】
配列番号１０は、センス鎖配列ＣＡＴがＣＴＴに変化した１塩基対変異（下線箇所）以外は配列番号５と同一の、５０量体の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号１０のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’であった。
【００９８】
変異配列番号１０のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’であった。
【００９９】
配列番号１１は、センス鎖配列ＣＴＣがＣＣＣに変化した１塩基対変異（下線箇所）以外は配列番号５と同一の、５０量体の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号１１のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’であった。
【０１００】
変異配列番号１１のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’であった。
【０１０１】
ＰＮＡプローブを合成し、ＨＰＬＣで精製して、コモンウェルス・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）［米国バージニア州リッチモンド］による質量分析によって確認した。ＰＮＡプローブをまず０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）に溶解して濃度１０ｍｇ／ｍｌにし、次いでｄｄＨ２Ｏを添加することによって１ｍｇ／ｍｌに希釈した。最終的なＰＮＡ原液をｄｄＨ２Ｏで調製して、濃度ｐｍｏｌ／μｌにした。
【０１０２】
プローブＮｏ．１は、アミノ酸位置５０５〜５１０に重なる状態で５０量体の野生型ＤＮＡ（配列番号１）センス鎖の１５ヌクレオチドに完全に相補的になるように設計された、１５量体のＰＮＡプローブであった（非特許文献１２）。プローブの方向性は、標的のセンス鎖の方向性に対して反対かまたは逆平行であった。
【０１０３】
プローブＮｏ．１の配列（配列番号１２）は、５’−Ｈ−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’であった。
プローブＮｏ．２は、プローブＮｏ．１の配列と同一な１５量体のＰＮＡプローブであるが、ｄｓＤＮＡ標的のセンス鎖と同じ方向性または平行なものであった。
【０１０４】
プローブＮｏ．２の配列（配列番号１３）は、５’−Ｈ−ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＣＡＣ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’であった。
１５量体のｓｓＤＮＡプローブを上述のように合成してＨＰＬＣにより精製した。ｓｓＤＮＡプローブをｄｄＨ２Ｏに溶解して、濃度１ｐｍｏｌ／μｌにした。
【０１０５】
プローブＮｏ．３は、５０量体の野生型標的ＤＮＡ（配列番号５）のセンス鎖の１５ヌクレオチド・セグメントと完全に相補的になるよう設計された、１５量体のｓｓＤＮＡプローブであった。プローブの方向性は、標的のセンス鎖の方向性に対して反対または逆平行であった。
【０１０６】
プローブＮｏ．３の配列（配列番号１４）は、５’−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ−３’であった。
プローブＮｏ．４は、その配列がプローブＮｏ．３と同一な１５量体のｓｓＤＮＡプローブであるが、ｄｓＤＮＡ標的のセンス鎖と同じ方向性または平行な方向性のものであった。
【０１０７】
プローブＮｏ．４の配列（配列番号１５）は、５’−ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＧ−３’であった。
プローブＮｏ．５は、５’位置に取着したフルオレセイン部分を有すること以外はプローブＮｏ．３と同一な、１５量体の逆平行ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１０８】
プローブＮｏ．５の配列（配列番号１６）は、５’−Ｆｌｕ−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ−３’であった。
プローブＮｏ．６は、５’位置に取着したフルオレセイン部分を有すること以外はプローブＮｏ．４と同一な、１５量体の平行ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１０９】
プローブＮｏ．６の配列（配列番号１７）は、５’−Ｆｌｕ−ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ−３’であった。
プローブＮｏ．７は、５０量体の野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の１５ヌクレオチド・セグメントに完全に相補的になるよう設計された、５’位置にフルオロセイン部分が取着している１５量体のｓｓＤＮＡプローブであった。このプローブの方向性は、標的のセンス鎖の方向性に対して反対または逆平行であった。
【０１１０】
プローブＮｏ．７の配列（配列番号１８）は、５’−Ｆｌｕ−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
プローブＮｏ．８は、５０量体の野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の１５ヌクレオチド・セグメントと完全に相補的になるよう設計された、１５量体のｓｓＤＮＡプローブであった。このプローブの方向性は、標的のセンス鎖の方向性に逆平行であった。
【０１１１】
プローブＮｏ．８の配列（配列番号１９）は、５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
プローブＮｏ．９およびプローブＮｏ．１０は、１塩基変異（下線箇所）以外、配列が野生型プローブＮｏ．８と同一な、１５量体の変異ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１１２】
プローブＮｏ．９の配列（配列番号２０）は、５’−ＣＡＣ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
プローブＮｏ．１０の配列（配列番号２１）は、５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【０１１３】
混合塩基配列のｓｓＤＮＡ鎖は、室温で逆平行なまたは平行な合成ｓｓＰＮＡ鎖と反応した場合、ワトソン・クリック対合に基づいて容易にｓｓＰＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖を形成することが周知である。本発明者等は、ＤＮＡインターカレーター、ＹＯＹＯ−１（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））［米国オレゴン州ユージーン所在］の存在下でアッセイを行った場合、完全整合の配列を含有するそのようなｓｓＰＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体と１ｂｐ不整合を含むｓｓＰＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体とを容易に区別することができ、またＰＮＡ鎖のアセンブリの順序は、ｓｓＤＮＡ標的に特異的に結合する能力に大きく関係することを、以前から示してきた。実施例１は、野生型または変異のｓｓＤＮＡ標的配列が、ワトソン・クリック相補的逆平行ｓｓＤＮＡプローブとまたは相同的のｓｓＤＮＡプローブ、すなわち同一で平行なｓｓＤＮＡプローブと反応した場合の、ｄｓＤＮＡ２重鎖の形成効率を比較する。
【０１１４】
図１Ａに示すデータをもたらすハイブリダイゼーション反応混合物は、それぞれが以下の混合物を含有し、すなわちｓｓＤＮＡ標的２ｐｍｏｌと、ｓｓＤＮＡプローブ２ｐｍｏｌと、０．５×ＴＢＥと、ＹＯＹＯ−１  ５００ｎＭとを含有して、最終体積を４０μｌにした。反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームを照射して、蛍光放出をモニタした。この蛍光強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１１５】
図１Ｂおよび１Ｃでは、ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）がそれぞれ下記のものを含有し、すなわちｓｓＤＮＡ標的２ｐｍｏｌ、５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ２ｐｍｏｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有した。反応混合物を、室温（２１℃）で３０分間〜９０分間インキュベートした。インキュベーション後、各サンプルを石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームを照射し、蛍光放出をモニタした。最大の蛍光強度は、フルオレセインの放出波長である波長５２５ｎｍで生じた。蛍光放出の強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１１６】
ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３が、ＹＯＹＯ−１の存在下、配列番号５の５０量体野生型センス鎖または配列番号７の５０量体変異センス鎖と反応した場合、逆平行の相補的ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖を形成した（図１Ａ）。１ｂｐＴ−Ｇ不整合の逆平行相補２重鎖（配列番号７のセンス鎖＋プローブＮｏ．３）が放出した蛍光の強度は、完全整合の逆平行相補２重鎖（配列番号５のセンス鎖＋プローブＮｏ．３）で得られた蛍光強度よりも５６％低かった。
【０１１７】
ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３が、ＹＯＹＯ−１の存在下、配列番号５の５０量体野生型アンチセンス鎖と反応した場合、平行相同的ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖の形成効率は、逆平行の相補的ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖の形成効率よりもわずかに３％低かった（図１Ａ）。この結果はまったく予期せぬことであった。配列番号７の５０量体の変異アンチセンス鎖がＹＯＹＯ−１の存在下でｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３と反応したときに形成される１ｂｐＡ−Ｇ不整合の平行相同的２重鎖は、その蛍光放出強度が、完全に平行な相同的２重鎖によって放出された場合よりも５６％低かった（図１Ａ）。それぞれ５０量体ｓｓＤＮＡ標的と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１とからなる対照サンプルは、完全整合の２重鎖で観察された場合よりも９１％から９２％低い蛍光レベルを示した（図１Ａ）。１５量体のｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３および５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１から放出された蛍光のレベルは、ＹＯＹＯ−１単独で生成された場合よりもわずかに大きかった。ｓｓＤＮＡ標的とプローブで観察された蛍光放出波長のシフトは、ｓｓＤＮＡ存在下でのＹＯＹＯ−１の放出プロフィルに典型的なものである。
【０１１８】
ＹＯＹＯ−１によって、ｓｓＤＮＡプローブと逆平行ｓｓＤＮＡ標的内の相補的塩基配列との間、またはｓｓＤＮＡプローブと平行ｓｓＤＮＡ標的内の同一塩基配列との間でのＤＮＡ複合体の形成が同じ効力で容易になり、その結果、完全整合の複合体と１ｂｐ不整合を含む複合体との区別が可能になった。平行相同的複合体では、１ｂｐ不整合が非相同的塩基対であった。
【０１１９】
逆平行の相補的な、また平行で相同的のｄｓＤＮＡ２重鎖の比較効率ついて、ＹＯＹＯ−１や陽イオンなどの複合体促進剤が存在しない状態で、ｓｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡ−Ｆプローブを使用してさらに検討した。ｓｓＤＮＡ−ＦプローブＮｏ．５を、配列番号５の５０量体野生型センス鎖と共に室温でＴｒｉｓ緩衝液中３０分間インキュベートした場合、ワトソン・クリック相補的な逆平行ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ２重鎖が非常に効率的に形成され、プローブＮｏ．５のみにより放出された場合に比べて蛍光放出が５３％減少した（図１Ｂ）。これとは対照的に、１ｂｐ  Ｔ−Ｇ不整合を含む逆平行の相補的なｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体（配列番号７のセンス鎖＋プローブＮｏ．５）は不安定であり、その蛍光放出は、３０分間インキュベーションした後にプローブＮｏ．５のみによって放出された場合に比べて４０％しか低下しなかった（図１Ｂ）。
【０１２０】
ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．５を、配列番号５の５０量体野生型アンチセンス鎖または配列番号７の５０量体変異アンチセンス鎖と反応させると、平行な相同的ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体が形成され、その蛍光放出強度は、３０分間インキュベーションした後にｓｓＤＮＡプローブＮｏ．５のみにより放出された場合よりもそれぞれ４４％および３７％低くなった（図１Ｂ）。促進剤が存在しない状態で平行相同的のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体が積極的に形成されることは、まったく予期しないことであった。複合体促進剤が存在しない状態での、完全整合の２重鎖と１ｂｐ不整合の２重鎖とから放出されたシグナルの区別は、ＹＯＹＯ−１が存在してプロモーターおよびシグナル伝達剤としての役割を果たしたときに観察された場合ほど劇的なものではなかった（図１Ａと１Ｂ比較されたい）。これは、逆平行２重鎖と平行２重鎖の両方の場合であった。ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体を生成するために逆平行の相補的なｓｓＤＮＡ標的を使用した場合よりも平行相同的のｓｓＤＮＡ標的を使用した場合、完全整合のＤＮＡ複合体と１ｂｐ不整合のＤＮＡ複合体との区別がわずかに劣ることが観察された（図１Ｂ）。
【０１２１】
９０分間インキュベーションした後、完全に相補的な配列（配列番号５のセンス鎖＋プローブＮｏ．５）または１ｂｐ  Ｔ−Ｇ不整合配列（配列番号７のセンス鎖＋プローブＮｏ．５）からなるワトソン・クリック逆平行ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体では、その蛍光放出強度が、プローブＮｏ．５のみにより放出された場合に比べてそれぞれ３９％および３０％減少した（図１Ｃ）。注目すべきことであるが、平行相同的のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体は、９０分間インキュベーションした後で、ワトソン・クリック逆平行ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体の場合と同レベルの安定性を示した。完全に平行な相同的２重鎖（配列番号５のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．５）と１ｂｐ  Ａ−Ｇ不整合の平行相同的２重鎖（配列番号７のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．５）に関する蛍光強度は、９０分間のインキュベーション後、ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．５のみにより放出された場合よりもそれぞれ４０％および２５％低かった（図１Ｃ）。
【０１２２】
平行ｄｓＤＮＡ２重鎖における相同的塩基の認識および結合のメカニズムは、今のところ知られていない。それにもかかわらず、平行相同的のｓｓＤＮＡ配列の認識および結合は、完全整合のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体と、１ｂｐまたは２ｂｐの不整合を含むものとの区別を可能にする構成で生じた。これらの平行相同的複合体では、１ｂｐ不整合が非相同的塩基対であった。
【実施例２】
【０１２３】
実施例１では、平行相同的のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖の形成効率が、ＹＯＹＯ−１などの複合体促進剤の存在下と、任意の複合体促進剤が存在しない状態との両方で、著しいものであることが実証された。平行ｄｓＤＮＡ２重鎖における相同的塩基の認識および結合は、完全に相同的の塩基配列と、１ｂｐ不整合を含む平行相同的配列との区別が容易になるようなものである。これらの平行相同的な１ｂｐ不整合は同様に、ワトソン・クリック相補的認識および結合規則に基づいて、不整合であると明らかに認識可能であった。実施例２は、これらワトソン・クリック相補的対合が平行相同的結合反応において不整合として現れるかどうかを決定するために、Ａ−ＴまたはＧ−Ｃ塩基対合を含有する平行相同的なｄｓＤＮＡ２重鎖の認識および結合効率について検討する。
【０１２４】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下のもの、すなわちｓｓＤＮＡ標的２ｐｍｏｌ、ｓｓＤＮＡプローブ２ｐｍｏｌ、０．５×ＴＢＥ、および５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有した。反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。蛍光強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１２５】
ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３（ＧＣ含量５３％）を、ＹＯＹＯ−１の存在下、配列番号５の５０量体野生型アンチセンス鎖または配列番号１０の５０量体変異アンチセンス鎖と反応させ、平行相同的のｓｓＤＮＡ：ｓｓＮＤＡ２重鎖を形成した（図２Ａ）。１ｂｐ  Ａ−Ｔ不整合の平行相同的２重鎖（配列番号１０のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．３）が放出した蛍光の強度は、完全に平行相同的な２重鎖（配列番号５のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．３）により得られた場合よりも７２％低かった（図２Ａ）。１ｂｐ  Ａ−Ｔを含有する平行相同的２重鎖によるこの蛍光放出の劇的な減少は、平行相同的な鎖の一部が安定な２重鎖を実現しようとするときに、ＡおよびＴの塩基に与えられた空間および／または電荷配置によってワトソン・クリックのＡ−Ｔ結合が妨げられることを、強く示していた。それぞれ５０量体ｓｓＤＮＡ標的と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１からなる対照サンプルの蛍光レベルは、完全整合の２重鎖で観察された場合よりも９６％から９７％にわたり低下していることを示した（図２Ａ）。１５量体のｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１により放出された蛍光のレベルは、ＹＯＹＯ−１単独で生成されたものよりもわずかに高かった。ｓｓＤＮＡ標的およびプローブで観察された蛍光放出波長のシフトは、ｓｓＤＮＡの存在下でのＹＯＹＯ−１の放出プロフィルの典型的なものである。
【０１２６】
平行相同的なｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖は、ＹＯＹＯ−１の存在下、配列番号１の５０量体野生型アンチセンス鎖（ＧＣ含量３３％）が野生型ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．８または変異ｓｓＮＤＡプローブＮｏ．９および１０と反応したときにも形成された（図２Ｂ）。１ｂｐ  Ｇ−Ｃ不整合の平行相同的２重鎖（配列番号１のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．９）と１ｂｐ  Ｃ−Ｇ不整合の平行相同的２重鎖（配列番号１のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．１０）が放出した蛍光の強度は、完全平行相同的２重鎖（配列番号１のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．８）によって得られた蛍光強度よりも、それぞれ６７％および６６％低かった（図２Ｂ）。平行相同的２重鎖で相互に作用する塩基の配置は、ワトソン・クリック相補的なＧ−Ｃ結合に好ましいものではなく、１ｂｐ不整合を示す蛍光放出の低下が生じた。５０量体のｓｓＤＮＡ標的と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１からなる対照サンプル、または１５量体のｓｓＤＮＡプローブと５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１からなるそれぞれのサンプルは、その蛍光レベルが、ＹＯＹＯ−１単独で生成された場合よりもわずかに高くなった（図２Ｂ）。
【０１２７】
したがって、ＹＯＹＯ−１の存在下で形成される、平行相同的ｄｓＤＮＡ２重鎖の相互に作用する塩基対は、ワトソン・クリック相補的塩基対間の結合に好ましくない配置をとり、そのような２重鎖は１ｂｐ不整合を含むと考えられる。
【０１２８】
本発明者等は、結合配列中の不整合が、ヘアピン複合体の一部として生じようとまたは多鎖複合体の一部として生じようといずれの結合モチーフにおいても塩基配列が理想的な結合配置の安定性を実現しようとするときに、どのように活発かつ繰り返される動きを引き起こし得るかについて考察するに至った。核形成部位の上流または下流の塩基対の結合強度、金属イオン、およびその他のファクターは、結合を実現しようとする試みに関係するものになることが予想される。
【実施例３】
【０１２９】
この実施例は、ＹＯＹＯ−１または１価の陽イオンによって促進される、逆平行相同的ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖の形成効率について検討する。
図３Ａに例示するデータを生成するハイブリダイゼーション反応は、それぞれ以下の物質、すなわちｓｓＤＮＡ標的２ｐｍｏｌ、ｓｓＤＮＡプローブ２ｐｍｏｌ、０．５×ＴＢＥ、および５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有し、その最終体積は４０μｌであった。反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに５分間入れて、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射し、蛍光放出をモニタした。蛍光放出強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１３０】
図３Ｂでは、ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）が、それぞれ以下の物質、すなわちｓｓＤＮＡ標的２ｐｍｏｌ、５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ２ｐｍｏｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有した。反応混合物を、室温（２１℃）で、１分から６０分に及ぶ様々な時間でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを石英キュベットに入れ、波長が４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。蛍光放出の強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１３１】
ＹＯＹＯ−１の存在下、配列番号５の５０量体野生型アンチセンス鎖と共にｓｓＤＮＡプローブＮｏ．４をインキュベートした結果、逆平行相同的のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体が形成された（図３Ａ）。逆平行相同的複合体の形成効率は、従来の逆平行相補ｄｓＤＮＡの形成効率のわずか６５％であったが（図１Ａと図３Ａを比較されたい）、ＹＯＹＯ−１によって促進された逆平行相同的のｓｓＤＮＡ配列の認識および結合が生じた。この結果は、まったく予期しないことであった。さらに、野生型配列からなる逆平行相同的のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体は、１ｂｐまたは２ｂｐ不整合からなるものとは明らかに区別された。１ｂｐ  Ａ−Ｇ不整合ＤＮＡ複合体（配列番号７のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．４）、１ｂｐ  Ｃ−Ｔ不整合ＤＮＡ複合体（配列番号６のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．４）、および連続２ｂｐ不整合ＤＮＡ複合体（配列願号８のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．４）が放出した蛍光の強度は、完全逆平行相同的複合体（配列番号５のアンチセンス＋プローブＮｏ．４）で得られた場合よりもそれぞれ２５％、６５％、および７１％低かった（図３Ａ）。プローブと標的との相同性の程度が低下するにつれ、蛍光放出のレベルが低下した。５０量体のｓｓＤＮＡ標的と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１からなる対照サンプルは、その蛍光ベレルが、完全整合複合体で観察された場合よりも８８％から９０％にわたり低いことを示した（図３Ａ）。１５量体のｓｓＤＮＡプローブＮｏ．４と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１によって放出された蛍光のレベルは、ＹＯＹＯ−１単独で生成された場合よりもわずかに高かった。
【０１３２】
逆平行相同的のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体形成について、５０ｍＭ  ＮａＣｌを存在させまたは存在させない状態で、ｓｓＤＮＡ標的とｓｓＤＮＡ−Ｆプローブの両方を使用してさらに検討した。５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下、配列番号５の５０量体野生型アンチセンス鎖と共にｓｓＤＮＡ−ＦプローブＮｏ．６を１５分間インキュベートした後、逆平行相同的ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体を形成したが、これはプローブＮｏ．６のみにより放出された場合と比較すると、観察された蛍光に３４％の低下が見られた（図３Ｂ）。逆平行相同的複合体の形成効率は、１５分間インキュベートした後の逆平行相補複合体の形成効率の６２％であった（データは図示せず）。これとは対照的に、１ｂｐ  Ａ−Ｇ不整合（配列番号７のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．６）、１ｂｐ  Ｃ−Ｔ不整合（配列番号６のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．６）、１ｂｐ  Ａ−Ｔ不整合（配列番号１０のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．６）、および連続２ｂｐ不整合（配列番号８のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．６）を含む逆平行相同的のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体では、その蛍光が、１５分間インキュベートした後のプローブＮｏ．６のみにより放出された場合と比較して、それぞれ２４％、２６％、２３％、および１３％低下した（図３Ｂ）。逆平行相同的２本鎖で相互に作用する塩基の配置は、ワトソン・クリック相補的Ａ−Ｔ結合に好ましいものではなく、１ｂｐ不整合を示す蛍光放出の変化が生じた。５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で３０分間インキュベートした後の逆平行相同的複合体の形成は、少なかった（データは図示せず）。４５分間インキュベートした後は、複合体が形成されないことが明らかであった。同様の速度での逆平行相同的複合体の形成および安定性が、ＮａＣｌを含まないＴｒｉｓ緩衝液で観察された（データは図示せず）。
【０１３３】
ＹＯＹＯ−１またはＮａＣｌで促進させることにより、逆平行相同的ｓｓＤＮＡ配列の認識および結合は、完全整合のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体と１ｂｐまたは１ｂｐ不整合を含む複合体との区別が可能な構成で生じた。逆平行相同的２重鎖の塩基対の相互作用により、従来のワトソン・クリックのＡ−Ｔ塩基対が不整合として不安定になった。
【実施例４】
【０１３４】
この実施例は、１価の陽イオンによって促進された平行相補ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成効率について実証する。ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、それぞれ以下の物質、すなわちｓｓＤＮＡ標的２ｐｍｏｌ、５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ２ｐｍｏｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有した。反応混合物を、室温（２１℃）で、１分から６０分にわたる様々な時間でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。蛍光放出の強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１３５】
５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で１５分間インキュベートした後、完全相補配列（配列番号５のセンス鎖＋プローブＮｏ．６）からなるｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ２重鎖が容易に形成され、その結果、蛍光放出強度は、プローブＮｏ．６のみにより放出された場合と比較して４１％低下した（図４）。このように平行相補２重鎖の形成効率が高いことは、まったく予期しないことであった。これとは対照的に、１ｂｐ  Ｔ−Ｇ不整合（配列番号７のセンス鎖＋プローブＮｏ．６）、１ｂｐ  Ｇ−Ｔ不整合（配列番号６のセンス鎖＋プローブＮｏ．６）、１ｂｐ  Ｔ−Ｔ不整合（配列番号１０のセンス鎖＋プローブＮｏ．６）、および連続２ｂｐ不整合（配列番号８のセンス鎖＋プローブＮｏ．６）を含む不完全相補ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体では、その蛍光放出強度が、プローブＮｏ．６単独で示される場合と比較してそれぞれ１８％、２０％、１０％、および１６％低下した（図４）。
【０１３６】
５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で形成されると、完全整合の平行相補２重鎖は非常に安定であり、その蛍光放出は、３０分間のインキュベーションおよび４５分間のインキュベーションの後でそれぞれ、プローブＮｏ．６のみにより放出された場合に比べて４０％と４７％低下した（データは図示せず）。１ｂｐおよび２ｂｐ不整合の平行相補複合体は、５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下でインキュベーションを３０分間および４５分間行った後では安定性が非常に低下した（データは図示せず）。平行相補ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆの形成速度および形成効率は、５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下での最初の４５分間のインキュベーション中は、逆平行相補ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆの形成速度および形成効率に非常に類似していた（データは図示せず）。５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で６０分間インキュベートした後は逆平行相補複合体の形成が容易に継続されたが、この時点での平行相補複合体の形成は明らかではなかった（データは図示せず）。
【０１３７】
ＮａＣｌによって、ｓｓＤＮＡ−Ｆプローブと逆平行相補ｓｓＤＮＡ標的、またはｓｓＤＮＡ−Ｆプローブと平行相補ｓｓＤＮＡ標的とのＤＮＡ複合体の形成が、同じ効果を示す状態で容易になり、その結果、完全整合の複合体と、１ｂｐまたは２ｂｐ不整合を含む複合体との区別が可能になった。
【実施例５】
【０１３８】
実施例１〜４は、従来の逆平行ワトソン・クリック相補ｄｓＤＮＡ複合体以外のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖を生成するために、逆平行または平行ｓｓＤＮＡプローブと相補的または相同的ｓｓＤＮＡ標的との間で生じる代替の塩基認識および結合モチーフについて実証した。この実施例では、塩基が、相補的塩基と相同的塩基の両方を同時に認識しかつこれらと相互に作用することが可能であることを示す。
【０１３９】
２ｐｍｏｌのｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３サンプルを、様々な濃度の遊離塩基の存在下、９５℃で１０分間加熱して３０分間室温に冷却させ、その結果、結合型塩基を含有するｓｓＤＮＡプローブが得られた。ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３の２つのサンプルを同様に変性させ、添加した遊離塩基が存在しない状態で冷却して、非結合型ｓｓＤＮＡプローブを生成した。次いでこれら結合型または非結合型のｓｓＤＮＡプローブ２ｐｍｏｌを、５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１および０．５×ＴＢＥの存在下、ｓｓＤＮＡ標的２ｐｍｏｌと混合して、最終的な反応体積を４０μｌにした。この反応混合物を、室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れて、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射し、蛍光放出をモニタした。蛍光強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１４０】
非結合型ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３を、ＹＯＹＯ−１の存在下で配列番号５の５０量体野生型センス鎖または配列番号７の５０量体変異センス鎖と反応させると、逆平行相補ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体が形成された（図５Ａ）。１ｂｐ  Ｔ−Ｇ不整合の逆平行相補２重鎖（配列番号７のセンス鎖＋プローブＮｏ．３）が放出した蛍光の強度は、完全整合の逆平行相補２重鎖（配列番号５のセンス鎖＋プローブＮｏ．３）によって得られた場合よりも４５％低かった。それぞれ５０量体ｓｓＤＮＡ標的と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１からなる対照サンプルの蛍光レベルは、完全整合２重鎖で観察された場合よりも９２％から９３％にわたって低下した状態を示した（図５Ａ）。１５量体のｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１によって放出された蛍光のレベルは、ＹＯＹＯ−１単独で生成された場合よりもわずかに高かかった。
【０１４１】
ＹＯＹＯ−１の存在下、ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３を配列番号５の５０量体野生型アンチセンス鎖と反応させた場合、平行相同的のｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖の形成効率は、逆平行の相補的ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ２重鎖の形成効率よりも１４％低下した（図５Ａおよび図５Ｂを参照されたい）。ＹＯＹＯ−１の存在下、配列番号７の５０量体変異アンチセンス鎖をｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３と反応させたときに形成された、１ｂｐ  Ａ−Ｇ不整合の平行相同的２重鎖は、その蛍光放出強度が、完全平行相同的２重鎖により放出された場合よりも４７％低かった（図５Ｂ）。
【０１４２】
１５量体のｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３は、６個のアデニン塩基を含有する。ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３  ２ｐｍｏｌと遊離チミン３ｐｍｏｌとを結合させると、添加したチミンに結合したプローブＮｏ．３内で、相補的なＡが２５％または相同的のＴが１００％になる可能性がある。相補的なＡ−Ｔ結合はエネルギー的に好ましい。ＹＯＹＯ−１の存在下、ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３（チミン３ｐｍｏｌと結合した）２ｐｍｏｌと配列番号５の野生型アンチセンス鎖２ｐｍｏｌとを反応させることによって、平行相同的ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成が劇的に高まった（図５Ｂ）。チミン３ｐｍｏｌとｓｓＤＮＡプローブとの２５％の結合により、完全相同的配列間での平行相同的複合体の形成が７８％増大した。この平行相同的複合体の形成の増大は、プローブＮｏ．３中のアデニンが、結合型相補チミン塩基ならびにｓｓＤＮＡ標的中の相同的アデニンと、同時に相互作用することができることに関連する可能性がある。さらに、利用可能な相補的塩基との相互作用は、相同的塩基およびそれらに隣接する塩基がとる相同的結合配置に有害ではなかった。
【０１４３】
これとは対照的に、１ｂｐ  Ａ−Ｇ不整合（配列番号７のアンチセンス鎖＋プローブＮｏ．３）を含む平行相同的複合体の形成効率は、プローブＮｏ．３をチミンに２５％結合させた場合のほうが、非結合型プローブＮｏ．３を使用した場合よりも１６％高まった（図５Ｂ）。これは、１ｂｐ  Ａ−Ｇ不整合の平行相同的複合体の蛍光放出強度が、Ｔ結合型プローブＮｏ．３を使用したときに完全整合の平行相同的複合体で観察された場合に比べて６５％低下したことに相当した。ｓｓＤＮＡプローブの結合は、完全整合の平行相同的複合体と１ｂｐ不整合の平行相同的複合体との区別における特異性を増大させた。
【０１４４】
注目すべきことであるが、完全整合の逆平行相補ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成は、ＹＯＹＯ−１の存在下、チミンに対して２５％が結合しているプローブＮｏ．３を配列番号５のセンス鎖と反応させた場合に、４８％高まった（図５Ａ）。プローブＮｏ．３のアデニンと、結合した相補的なチミンおよびｓｓＤＮＡ標的中の相補的なＴとの同時相互作用によって、完全整合の逆平行相補複合体の形成が増大した。注目すべきことであるが、１ｂｐ  Ｔ−Ｇ不整合の逆平行相補複合体の形成は、Ｔ結合型プローブＮｏ．３を使用した場合、非常に非効率的であり、その結果、蛍光放出強度は、結合型Ｔを含有する完全整合の逆平行相補複合体によって得られた値よりも、８８％低下した（図５Ａ）。完全整合と１ｂｐ不整合の逆平行相補ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の区別は、ＹＯＹＯ−１の存在下、結合型ｓｓＤＮＡプローブを使用することによって大幅に高められたことも、注目すべきことである。
【０１４５】
プローブＮｏ．３とシトシンまたはグアノシンとの２５％の結合によって、ＹＯＹＯ−１の存在下での逆平行相補ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体と平行相同的ｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の両方の形成効率も高まり、それと共に、完全整合の複合体と１ｂｐ不整合の複合体との差別化における特異性も改善された（データは図示せず）。
【０１４６】
結合型塩基からなるｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成は、別の鎖に特異的に結合している鎖の塩基に対して上記結合型塩基が相補的であるワトソン・クリック型であるならば、配列内の塩基が、相補的塩基および相同的塩基を特異的かつ同時に認識し相互作用し得ることを証明している。ｓｓＤＮＡプローブの塩基、結合型塩基、ｓｓＤＮＡ標的の塩基間での認識および結合配置は、本明細書で述べた逆平行ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体および平行ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体で形成された塩基配列と同様でよい。
【実施例６】
【０１４７】
実施例６は、混合塩基配列を含有するｄｓＤＮＡ標的とフルオレセインで標識した相同的ｄｓＤＮＡプローブとの４重鎖ＤＮＡの形成について実証する。４重鎖ＤＮＡの形成は、反応で添加した１価の陽イオンの存在によって高められる。
【０１４８】
相補的なセンスおよびアンチセンス１５量体ｓｓＤＮＡ配列を合成し、ＨＰＬＣで精製し、上述のようにアニールして、１５量体のｄｓＤＮＡプローブを生成した。ｄｓＤＮＡプローブをｄｄＨ２Ｏ中で希釈して、濃度１ｐｍｏｌ／μｌにした。
【０１４９】
プローブＮｏ．１１は、各５’位置にフルオレセイン部分が取着している１５量体のｄｓＤＮＡプローブであり、５０量体野生型標的ＤＮＡ（配列番号５）の中心にある１５ｂｐセグメントに完全相同的になるよう設計した。
【０１５０】
プローブＮｏ．１１のセンス鎖の配列（配列番号２２）は、５’−Ｆｌｕ−ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
プローブＮｏ．１１のアンチセンス鎖の配列（配列番号２２）は、５’−Ｆｌｕ−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ−３’であった。
【０１５１】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下の物質、すなわち標的ｄｓＤＮＡ  ０．４ｐｍｏｌ、５’−フルオレセインで標識したｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１１  ４ｐｍｏｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、および１００ｍＭ  ＫＣｌを含有していた。反応混合物を、事前に変性させることなく室温（２１℃）で１時間インキュベートした。サンプルを石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射した。最大蛍光強度は、フルオレセインの放出波長である５２５ｎｍという波長で生じた。図６は、分析した各サンプルの波長の関数として蛍光強度をプロットしたものを示す。
【０１５２】
ＫＣｌがない場合、ｄｓＤＮＡ標的とプローブＮｏ．１１との結合は検出されず、野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）または変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号７）をｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１１と混合したときに、あるいはｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１１を単独で存在させたときに、同様の蛍光強度が観察された（データは図示せず）。
【０１５３】
１００ｍＭ  ＫＣｌの存在下、２１℃で１時間インキュベートした後、ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）とｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１１の完全相同的配列からなるｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ−Ｆ  ４重鎖が容易に形成され、その蛍光放出強度は、ｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１１のみにより放出された場合に比べて６２％低下した（図６）。これとは対照的に、１塩基対不整合を含む不完全相同的のｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ−Ｆ  ４重鎖（配列番号７＋プローブＮｏ．１１）は、これらの反応条件下で安定性に乏しく、その蛍光強度は、ｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１１のみによって示された場合に比べて１８％の低下しかもたらさなかった。
【０１５４】
Ｋ＋などの１価の陽イオンを特定の濃度で存在させることは、事前に変性させることなくｄｓＤＮＡ標的とフルオレセインで標識したｄｓＤＮＡプローブとの間で４重鎖形成を行うのに十分であった。４重鎖形成は、相同的塩基対の親和性に基づいて生じ、完全相同的の２重鎖間で測定可能かつ著しく大量の４重鎖が形成された。さらにこの反応は、室温で、天然ｄｓＤＮＡを使用し、プローブと標的の比を１０対１としてインキュベートするちょうど１時間以内に生じた。この実施例で使用したｄｓＤＮＡ標的およびｄｓＤＮＡプローブは相同的であり、ＧＣ含量が５３％であり、どのＤＮＡ鎖にもホモプリンまたはホモピリミジン・ストレッチを含んでいなかった。本発明のアッセイは、ｄｓＤＮＡプローブを使用して、完全相同的ｄｓＤＮＡ配列と１対の不整合塩基を含有するそのような配列を識別することができた。
【実施例７】
【０１５５】
実施例６で行った４重鎖ＤＮＡアッセイを、反応混合物中に１価の陽イオンを添加することによって促進させた。ＧＣ含量が５３％であるｄｓＤＮＡ−ＦプローブおよびｄｓＤＮＡ標的を用いた４重鎖ＤＮＡの形成を促進させるため、２価の陽イオンを利用して、アッセイの特異性についてさらに検討した。
【０１５６】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下の物質、すなわち標的ｄｓＤＮＡ  ０．４ｐｍｏｌ、５’−フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１１、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、および２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有していた。反応混合物を、事前に変性する前に室温（２１℃）で１時間インキュベートした。サンプルを石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射し、蛍光放出をモニタした。図７は、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした蛍光強度を示す。
【０１５７】
ｄｓＤＮＡ−ＦプローブＮｏ．１１（ＧＣ含量５３％）を、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２および２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下、５０量体の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）または変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号７）と共にインキュベートし、４重鎖を非変性条件下で室温で形成した。完全相同的のＤＮＡ４重鎖では、その蛍光強度に最大限の低下、すなわち３４％の低下が生じたが、１ｂｐ不整合（配列番号７＋プローブＮｏ．１１）を含むそれほど好ましくないｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ−Ｆ  ４重鎖では、その蛍光強度が、ｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１１のみの場合に観察される蛍光強度とほぼ同じであった（図７）。
【０１５８】
Ｍｎ＋２やＭｇ＋２などの２価の陽イオンを存在させることによって、非変性条件下での４重鎖形成が促進し、その結果、完全相同的のｄｓＤＮＡ標的と、不整合の１対の塩基を含有する配列を持つｄｓＤＮＡプローブ４重鎖との正確な区別が可能になった。
【実施例８】
【０１５９】
実施例６および７で実施した４重鎖ＤＮＡアッセイは、反応混合物中に１価の陽イオンまたは２価の陽イオンを添加することによって促進させた。次の実施例は、ＤＮＡインターカレーター、ＹＯＹＯ−１を用いた場合の相同的４重鎖ＤＮＡアッセイの特異性について実証する。
【０１６０】
相補センスおよびアンチセンス１５量体ｓｓＤＮＡ配列を、上述のように合成し、ＨＰＬＣで精製して、１５量体のｄｓＤＮＡプローブを生成した。ｄｓＤＮＡプローブをｄｄＨ２Ｏ中で希釈して、濃度１ｐｍｏｌ／μｌにした。
【０１６１】
プローブＮｏ．１２は、配列がプローブＮｏ．１１と同一の１５量体ｄｓＤＮＡプローブであるが、５’−フルオレセイン部分は取着されていなかった。
プローブＮｏ．１２（配列番号２３）のセンス鎖の配列は、５’−ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
【０１６２】
プローブＮｏ．１２（配列番号２３）のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ−３’であった。
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下の物質、すなわちｄｓＤＮＡ標的０．４ｐｍｏｌ、ｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１２  ４ｐｍｏｌ、０．５×ＴＢＥ、および１００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有していた。反応混合物を２１℃で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。蛍光放出の強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１６３】
標的またはプローブが存在しない場合（ＹＯＹＯ−１のみ）に観察された蛍光強度を図８に示す。また図８は、反応混合物によって、ｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１２が、相同的配列を含有する野生型５０量体ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）と結合し、またはｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１２が、１対の不整合塩基を別にすれはｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１２の塩基配列と相同的の配列を含有する４種のその他のｄｓＤＮＡ標的と結合した場合に観察された、蛍光強度も示す。相同的野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）は、ｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１２との反応混合物中に存在する場合、最大限の蛍光強度をもたらした。反応混合物中でｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１２と共にインキュベートしたときの不整合ｄｓＤＮＡ標的の蛍光強度の値は、完全整合の４重鎖によって実現された蛍光強度に比べ、ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１０）の場合に示される２０％低い値からｄｓＤＮＡ標的（配列番号１１）の場合に示される８０％低い値にまで及んだ（図８）。
【０１６４】
ＹＯＹＯ−１のインターカレーションによって安定化した相同的４重鎖は、プローブが、ｄｓＤＮＡ標的の塩基対に対して非相同的の１対の塩基対を持つ場合よりも完全相同的の配列を含有する場合のほうが、すなわち同一である場合のほうが、ｄｓＤＮＡ標的とｄｓＤＮＡプローブとの間でより容易に形成されることが観察された。前述の３つの実施例で述べた４重鎖複合体を、本発明者等は、ミラー相同性（ｍｉｒｒｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）と呼ぶ。
【実施例９】
【０１６５】
この実施例では、５０量体のｄｓＤＮＡ標的を、ＧＣが５３％の１５量体ｄｓＤＮＡプローブ（プローブＮｏ．１３）に曝したが、ワトソン・クリック相補性は、一方の２重鎖の主溝が他方の副溝内に配置された場合に、プローブの鎖の塩基と標的の鎖の近接塩基との間に存在する。２重鎖プローブの塩基の配列は相同的ではなく、２重鎖標的の塩基配列に対して逆になっている。主溝が副溝内に配置されている場合、２重鎖は互いに平行であり、これを本発明者等はネスト相補性（ｎｅｓｔｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）と呼ぶ。
【０１６６】
相補センスおよびアンチセンス１５量体ｓｓＤＮＡ配列を、上述のように合成しＨＰＬＣで精製し、アニールして、１５量体のｄｓＤＮＡプローブを生成した。ｄｓＤＮＡプローブをｄｄＨ２Ｏ中で希釈して、濃度１ｐｍｏｌ／μｌにした。
【０１６７】
プローブＮｏ．１３（配列番号２４）のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ−３’であった。
プローブＮｏ．１３（配列番号２４）のアンチセンス鎖の配列は、５’−ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＡＣＴ  ＧＴＣ−３’であった。
【０１６８】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下の物質、すなわち標的ｄｓＤＮＡ  ０．４ｐｍｏｌ、ｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１３  ４ｐｍｏｌ、０．５×ＴＢＥ、および１００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有していた。反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。蛍光放出強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１６９】
図９は、事前に変性のない場合、野生型５０量体ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）とこのｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）に対してネスト相補に基づき完全整合である１５量体ｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１３とを反応させたときに、最高蛍光強度が得られたことを示す。蛍光強度は、生じたＤＮＡ結合を示し、この場合、ｄｓＤＮＡ標的とネスト相補ｄｓＤＮＡプローブとの間での４重鎖形成を示す。
【０１７０】
ネスト相補性の逆相同的性に基づいて整合性を評価したときに、１対の塩基対だけ２重鎖プローブに整合していない変異ｄｓＤＮＡ標的は、完全相補の野生型ｄｓＤＮＡ標的の場合に比べ、測定できるほどに少ない４重鎖複合体をｄｓＤＮＡプローブと共に形成した。実施例８でミラー相同的に基づき評価した様々な不整合について、この実施例ではネスト相補に基づいて評価した。
【０１７１】
図９に示すように、１ｂｐ不整合のｄｓＤＮＡ標的とｄｓＤＮＡプローブＮｏ．１３とによって形成された４重鎖がもたらす蛍光強度は、完全整合の４重鎖（配列番号５＋プローブＮｏ．１３）によって実現された蛍光強度よりも８％から１６％にわたって低かった。
【０１７２】
実施例８では、完全相同的の４重鎖と一部相同的の４重鎖との蛍光の区別がより大きく観察された。これは、完全相補または１塩基対不整合のネスト相補ｄｓＤＮＡプローブが、特異性がより高い状態で結合するミラー相同的のｄｓＤＮＡプローブの場合に比べて、区別できるほどはっきりとはｄｓＤＮＡに結合しないことを示している。
【０１７３】
この実施例は、ネスト相補ＤＮＡ２重鎖間のワトソン・クリック４重鎖結合が、ＹＯＹＯ−１の存在下で容易に生ずることを示す。
【実施例１０】
【０１７４】
実施例１０は、ＤＮＡインターカレーター、ＹＯＹＯ−１などの陽イオン縮合剤が存在する場合、本発明のアッセイが、完全整合のワトソン・クリック相補ｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体と、１ｂｐ、２ｂｐ、および３ｂｐ不整合を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体とを区別し得ることを実証する。
【０１７５】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下の物質、すなわち標的ｄｓＤＮＡ  ２ｐｍｏｌ、ｓｓＰＮＡプローブ２ｐｍｏｌ、０．５×ＴＢＥ、および５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有した。反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。蛍光強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１７６】
ＤＮＡまたはＰＮＡが存在しない場合（ＹＯＹＯ−１のみ）、あるいは野生型配列番号１、変異配列番号２、または変異配列番号３を逆平行ＰＮＡプローブＮｏ．１または平行ＰＮＡプローブＮｏ．２と反応させた場合に観察された蛍光強度を、図１０Ａおよび１０Ｂにそれぞれ示す。完全相補配列（配列番号１＋プローブＮｏ．１）からなるｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体では、ＹＯＹＯ−１と複合体との最大限の相互作用か可能になり、最高の蛍光強度が得られた（図１０Ａ）。１塩基対が不整合であるｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体（配列番号２＋プローブＮｏ．１）、および２塩基対が不整合であるｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体（配列番号３＋プローブＮｏ．１）に関する蛍光強度は、完全整合のｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体よりも、それぞれ９７％および９９％低かった（図１０Ａ）。同様に、平行ＰＮＡプローブＮｏ．２が標的ｄｓＤＮＡ配列に結合した場合、１塩基対および２塩基対が不整合であるｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体の蛍光強度は、完全相補ｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体（配列番号１＋プローブＮｏ．２）よりも、それぞれ９２％および９７％低かった（図１０Ｂ）。配列番号４およびプローブＮｏ．１、または配列番号４およびプローブＮｏ．２からなる、３塩基対が不整合のｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体の蛍光強度は、完全整合のｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体よりも、それぞれ９９％および９７％低かった（データは図示せず）。５０量体のｄｓＤＮＡ標的と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１からなる対照サンプルは、３ｂｐ不整合複合体で観察された蛍光レベルと同じかそれ以下の蛍光レベルを示した（データは図示せず）。ｓｓＰＮＡと５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１が一緒になって放出する蛍光のレベルは、ＹＯＹＯ−１のみの場合に放出される蛍光のレベルと同一であった（データは図示せず）。プローブと標的との不整合の程度が増すにつれ、ＹＯＹＯ−１と不整合複合体との相互作用のレベルが低下した。したがって、蛍光放出強度が低下した。この関係は、逆平行または平行ＰＮＡプローブを使用しても使用しなくても保たれた。各複合体から放出される特徴的な蛍光のレベルを経時的にモニタしたが、５分から２４時間の間、安定であった。
【０１７７】
興味深いことに、１５量体の標的ｄｓＤＮＡ配列を１５量体のＰＮＡプローブ配列と反応させた場合、逆平行ＰＮＡプローブを使用したときよりも平行ＰＮＡプローブを使用したときのほうが、完全整合複合体と１ｂｐまたは２ｂｐ不整合複合体との間で蛍光放出に大きい差があることが観察された（データは図示せず）。
【０１７８】
したがって、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＰＮＡ複合体形成を測定する蛍光強度アッセイは、２重鎖ＤＮＡ標的の事前変性なしで、野生型配列と、１ｂｐ、２ｂｐ、または３ｂｐの変異を含む配列とを区別することが可能である。
【実施例１１】
【０１７９】
ＹＯＹＯ−１によって促進される３重鎖形成を測定するアッセイの特異性について、ｄｓＤＮＡ標的の事前変性なしで、混合塩基配列の野生型および変異ｄｓＤＮＡ標的を逆平行および平行ｓｓＤＮＡプローブと反応させることにより、さらに調査した。
【０１８０】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下の物質、すなわち標的ｄｓＤＮＡ  ２ｐｍｏｌ、ｓｓＤＮＡプローブ２ｐｍｏｌ、０．５×ＴＢＥ、および５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有した。反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。分析した各サンプルの波長の関数として、蛍光強度をプロットした。
【０１８１】
逆平行ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．３（ＧＣ含量５３％）を、５０量体の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）および変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６および配列番号８）と反応させた場合、非変性条件下、室温で、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体が形成された（図１１Ａ）。完全整合のＤＮＡ複合体は最高蛍光強度を放出したが、１ｂｐ不整合（配列番号６＋プローブＮｏ．３）と連続２ｂｐ不整合（配列番号８＋プローブＮｏ．３）による不完全相補複合体は、完全整合配列で観察された蛍光強度よりも、それぞれ６３％および９５％低い蛍光強度をもたらした（図１１Ａ）。蛍光レベルは、プローブと標的との不整合の程度が増すにつれて低下した。各複合体によって示された特徴的な蛍光強度を経時的にモニタしたが、５分から２４時間の間、安定であった。５０量体ｄｓＤＮＡ標的と５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１からなる対照サンプルは、２ｂｐ不整合のＤＮＡ複合体で観察された蛍光レベルよりも低い蛍光レベルを示した（データは図示せず）。ｓｓＤＮＡプローブと５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１によって生成された蛍光のレベルは、ＹＯＹＯ−１のみによって実現された蛍光レベルと同一であった（データは図示せず）。１５量体の逆平行ｓｓＤＮＡプローブを、同じ反応条件下で、ＧＣ含量が３３％および７３％である野生型または変異５０量体ｓｓＤＮＡプローブと反応させた場合、非常に類似した結果が得られたが、これは、ｓｓＤＮＡプローブおよびｄｓＤＮＡ標的のＧＣ含量％に関係なく、逆平行ｓｓＤＮＡプローブを利用したｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体形成のアッセイが信頼性あることを実証している（データは図示せず）。
【０１８２】
同様にＹＯＹＯ−１の存在下、平行ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．４を、５０量体の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）と変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６および配列番号８）と反応させて、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体を形成した。１ｂｐ不整合のＤＮＡ複合体（配列番号６＋プローブＮｏ．４）と連続２ｂｐ不整合のＤＮＡ複合体（配列番号８＋プローブＮｏ．４）に関する蛍光強度は、完全整合の配列によって得られた蛍光強度よりもそれぞれ４８％および６８％低かった（図１１Ｂ）。プローブと標的との不整合の程度が増大するにつれ、蛍光放出のレベルは低下した。ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体を生成するために逆平行ｓｓＤＮＡプローブを使用したときよりも平行ｓｓＤＮＡプローブを使用したときのほうが、完全整合と不整合のＤＮＡ複合体の区別がわずかに不十分であることが観察された。
【０１８３】
ＹＯＹＯ−１により、逆平行ｓｓＤＮＡプローブとｄｓＤＮＡ標的との間、平行ｓｓＤＮＡプローブとｄｓＤＮＡ標的との間でのＤＮＡ複合体の形成が促進され、その結果、ｄｓＤＮＡ標的の事前変性に関する要件なしで、完全整合の複合体と１ｂｐまたは２ｂｐの不整合を含む複合体とを差別化することが可能になった。
【実施例１２】
【０１８４】
実施例１０および１１で形成した複合体を、反応混合物中に存在するＤＮＡインターカレーター、ＹＯＹＯ−１により安定化させた。ｄｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡ−Ｆプローブによる複合体の形成を促進させて安定化するため、２価の陽イオンを利用して、アッセイの特異性をさらに検討した。
【０１８５】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下の物質、すなわち標的ｄｓＤＮＡ  ０．４ｐｍｏｌ、５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、それぞれ１ｍＭ〜２０ｍＭのＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２を含有していた。反応混合物を、ｄｓＤＮＡ標的の事前変性なしで、室温（２１℃）で１分〜２時間にわたる様々な時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。最大蛍光強度は、フルオレセインの放出波長である５２５ｎｍという波長で生じた。蛍光放出強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１８６】
逆平行ｓｓＤＮＡ−ＦプローブＮｏ．５を、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１５ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下、５０量体の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）と共に１時間インキュベートした場合、完全相補のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体が非常に効率的に形成され、その蛍光は、プローブＮｏ．５のみによって実現された蛍光に比べて７４％の低下をもたらした（図１２Ａ）。これとは対照的に、１ｂｐ  Ｔ−Ｇ不整合を含んだｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体（配列番号７＋プローブＮｏ．５）は、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１５ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下でその安定性が非常に低く、蛍光は、１時間のインキュベーション後、プローブＮｏ．５のみによって放出された蛍光に比べて１５％の低下が生じた（図１２Ａ）。プローブＮｏ．５（含量５３％のＧＣを含有）を、ｄｓＤＮＡ標的配列番号９（含量３３％のＧＣを含有）と反応させた場合、その蛍光は、プローブＮｏ．５のみによって得られた蛍光に比べて３％の増加が観察されたが（図１２Ａ）、これはＤＮＡ複合体の形成がないことを示す。この結果は、このプローブと標的の組合せが５ｂｐ不整合をもたらす可能性があることを考慮すると、予期されるものであった。
【０１８７】
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下、ＧＣ含量が５３％であり完全相補配列（配列番号５＋プローブＮｏ．５）または１ｂｐ  Ｔ−Ｇ不整合（配列番号７＋プローブＮｏ．５）を含んだｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体は、プローブＮｏ．５のみによって放出された蛍光強度よりも、１時間のインキュベーション後ではそれぞれ６８％および２０％低い蛍光強度、また３０分のインキュベーション後ではそれぞれ７６％および１６％低い蛍光強度をもたらした（データは図示せず）。５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＭｎＣｌ２の添加（またはこれよりも低い濃度での添加）は、１時間のインキュベーション後、逆平行ｓｓＤＮＡ−ＦプローブＮｏ．５と試験をしたすべてのｄｓＤＮＡ標的との間で複合形成を行うのに不十分であった（データは図示せず）。
【０１８８】
ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体は、平行ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．６を５０量体野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）および変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号７）と反応させた場合にも形成された。この場合ＤＮＡ複合体の形成は、インキュベーション時間が短くてすむ、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２の濃度が非常に低い（すなわちそれぞれ１〜５ｍＭ）状態で促進された。１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、または２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下での１５分間のインキュベーションは、ＤＮＡ複合体を生成するのに十分であった（データは図示せず）。完全整合のＤＮＡ複合体（配列番号５＋プローブＮｏ．６）と１ｂｐ不整合のＤＮＡ複合体（配列番号７＋プローブＮｏ．６）に関する蛍光強度は、４５分間のインキュベーション後、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２および３ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で、平行ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．６のみによって得られる蛍光強度よりもそれぞれ２９％と６％低かった（図１２Ｂ）。
【０１８９】
ＤＮＡ複合体は、１時間インキュベーションした後に、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で容易に形成されたが、平行ｓｓＤＮＡｐローブを使用した場合、完全整合の複合体と不整合の複合体との区別は観察されなかった。１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を超える濃度では、平行ｓｓＤＮＡプローブとのＤＮＡ複合体形成が抑制され易かった（データは図示せず）。
【０１９０】
２価の陽イオンなどの塩橋、縮合剤の添加により、非変性ｄｓＤＮＡ標的と蛍光標識した逆平行または平行ｓｓＤＮＡプローブとのＤＮＡ複合体形成が促進し、完全相補配列と１ｂｐ変異を含む配列との区別を正確にかつ確実に行うことが可能になった。反応は、プローブと標的の比が１０対１のときに、室温で、インキュベーションの１５〜６０分以内に生じた。ｄｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡプローブは、ＤＮＡのホモプリンまたはホモピリミジン・ストレッチを含有していなかった。１５ヌクレオチドｓｓＤＮＡプローブ内に散在している５ピリミジン塩基の存在にもかかわらず、ＤＮＡ複合体は、配列に特異的な手法で容易に形成された。
【実施例１３】
【０１９１】
ｄｓＤＮＡ標的との複合体形成を促進させかつ安定化するために１価の陽イオンを使用した場合の、方向性が様々なプローブの有用性についても評価した。
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下の物質、すなわち標的ｄｓＤＮＡ  ０．４ｐｍｏｌ、５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ４ｐｍｏｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および１０ｍＭ〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有していた。反応混合物を、ｄｓＤＮＡ標的の事前の変性なく、室温（２１℃）で、１分から２時間にわたる様々な時間でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。最大蛍光強度は、フルオレセインの放出波長である５２３ｎｍという波長で生じた。蛍光放出の強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
【０１９２】
ＮａＣｌが存在しない状態、あるいは１０ｍＭまたは２５ｍＭ  ＮａＣｌの存在下では、インキュベーション時間がすべて経過した後に、ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１または配列番号２）と逆平行ｓｓＤＮＡ−ＦプローブＮｏ．７との結合が検出されなかった（データは図示せず）。
【０１９３】
５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で１時間インキュベートした後、完全相補配列（配列番号１＋プローブＮｏ．７）からなるｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体が容易に形成され、その蛍光放出強度は、反応混合物中で同様にインキュベートした対照プローブＮｏ．７によって放出された蛍光放出強度に比べ、４９％低下した（図１３Ａ）。これとは対照的に、１ｂｐ  Ｇ−Ｔ不整合（配列番号２＋プローブＮｏ．７）を含む不完全相補ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体では、その蛍光放出強度が、プローブＮｏ．７対照サンプルによって示される蛍光放出強度に比べて１１％低下した。
【０１９４】
また、反応混合物中に７５ｍＭ、１００ｍＭ、および１２５ｍＭ  ＮａＣｌを存在させることにより、完全整合の配列番号１の標的と逆平行プローブＮｏ．７との間での有意な量の複合体形成に一致した蛍光放出の消光も生じ、１ｂｐ  Ｇ−Ｔ不整合の配列番号２の標的とプローブＮｏ．７が存在する場合には消光が著しく低減し、５０ｍＭ  ＮａＣｌが存在する場合に観察された蛍光強度と同様の蛍光強度になった（データは図示せず）。
【０１９５】
ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体は、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、または１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下、平行ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．６を５０量体の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）および変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号７）と反応させたときにも形成された。最適な結果は、１００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で得られた。１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する反応混合物中、室温で７５分間インキュベートした後、完全整合のＤＮＡ複合体（配列番号５＋プローブＮｏ．６）と１ｂｐ不整合のＤＮＡ複合体（配列番号７＋プローブＮｏ．６）に関する蛍光放出強度は、同じ条件下で反応させた対照の平行ｓｓＤＮＡプローブＮｏ．６によって得られた蛍光放出強度よりも、それぞれ５３％と９％低下した（図１３Ｂ）。５０ｍＭ  ＮａＣｌにより、完全整合複合体と不整合複合体とを４５分間のインキュベーション時間で最大限区別することが促進された。一般に、逆平行または平行ｓｓＤＮＡプローブを含有する複合体は、同様のＮａＣｌ濃度およびインキュベーション時間で、同様の効率で形成されるようであった。
【０１９６】
既知のＤＮＡ縮合剤である１価の陽イオンを使用することにより、非変性ｄｓＤＮＡ標的と蛍光標識した逆平行または平行ｓｓＤＮＡプローブとのＤＮＡ複合体形成が促進され、完全相補配列と、１ｂｐ不整合を含む配列を含有する複合体を、確実に差別化することが可能になった。
【実施例１４】
【０１９７】
ＹＯＹＯ−１によって促進されたｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体は、室温で、インキュベーションの５分以内に容易に形成され、何時間にもわたって同じレベルの強度の蛍光放出を生成する。塩基対不整合を含む複合体は同様に持続する蛍光シグナルを放出するが、これは複合体の形成が経時的に同じレベルにあることを示している。陽イオンなどの縮合剤の存在下で形成されたｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成速度、安定性、および分解速度について検討するため、時間的経過の実験を行った。
【０１９８】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、以下の物質、すなわち非変性標的ｄｓＤＮＡ  ０．４ｐｍｏｌ、５’−フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ４ｐｍｏｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含有していた。反応混合物を、室温（２１℃）で、１分から２時間にわたる様々な時間でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴンイオン・レーザビームで１回照射して、蛍光放出をモニタした。同じサンプルに関し、その後指示された時間で複数回レーザ照射した後に、さらに蛍光測定を行った（図１４）。分析した各サンプルの時間の関数として、蛍光強度をプロットした。
【０１９９】
標的ｄｓＤＮＡが存在しない状態で、プローブＮｏ．５  ４ｐｍｏｌと１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２からなる対照サンプルによって放出された蛍光は、インキュベーションのわずか５分以内で３分の１に劇的に低下し（データは図示せず）、次いで次の数時間以内に、非常に遅い速度で徐々に低下した（図１４Ａ）。この作用を、本発明者等は「陽イオン消光」と呼ぶ。特定の陽イオンとのｓｓＤＮＡ−Ｆプローブのインキュベーション時間が長くなることに伴うこの蛍光の抑制は、２価の陽イオンの存在下でごく普通に生じたが、１価の陽イオンの存在下では生じなかった（データは図示せず）。この観察によれば、ある実験の試験サンプルを反応させる場合とまったく同じ条件下で、ある実験で対照サンプルをインキュベートすることの重要性が明らかになる。様々な時間でインキュベートした後に各ｓｓＮＤＡ−Ｆ対照サンプルを複数回レーザ照射することにより、蛍光体のさらなる消光が抑制され、その後の蛍光レベルが安定した（図１４Ａ）。この結果はまったく予期しないものであった。
【０２００】
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で逆平行ｓｓＤＮＡ−ＦプローブＮｏ．５を５０量体の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号５）と共にインキュベートした場合、インキュベーションの１５分後にｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体が形成されたことが明らかであり、蛍光が低減したが、これは対照プローブＮｏ．５の漸進的な陽イオン消光よりも６％高いものであった（図１４Ａと図１４Ｂを比較されたい）。複合体の形成は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下でプローブＮｏ．５と共に配列番号５をインキュベートしてから３０分後と６０分後に大きく示され、陽イオン消光したプローブＮｏ．５のみで得られた蛍光と比べて、それぞれ７６％と６１％の低減が蛍光に生じた（図１４Ｂ）。１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下でインキュベーションを９０分行った後と１２０分行った後は、複合体の形成を示すシグナルが得られなかった（図１４Ｂ）。９０分および１２０分で見られる蛍光放出のレベルは、完全に陽イオン消光作用によるものであった（図１４Ａおよび図１４Ｂを比較されたい）。
【０２０１】
これとは対照的に、１ｂｐ  Ｔ−Ｇ不整合（配列番号７＋プローブＮｏ．５）を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ−Ｆ複合体は非常に遅い速度で形成され、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で形成された後はその安定性が非常に不十分になった。１ｂｐ不整合複合体は、３０分間インキュベートした後に最初に観察されたが、６０分間インキュベートした後はなくなったようであった（図１４Ｃ）。この場合も、プローブは、２重鎖の相補鎖に逆平行であった（図１４Ｃ）。
【０２０２】
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下、インキュベーションを３０分行った後または６０分行った後に形成された完全相補ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体（配列番号５＋プローブＮｏ．５）に複数回レーザ照射すると、その蛍光放出は、逆平行ｓｓＤＮＡプローブを含有するＤＮＡ複合体に特徴的な速度でのこれら複合体の破壊に一致したものになった（図１４Ｂ）。３０分で完全相補複合体をレーザ照射した４５分後に次の測定を行った場合、その放出強度レベルは１８６９であり、複合体が素早く破壊されたことが証明された（データは図示せず）。複数回レーザ照射した後の蛍光放出のレベルは、非複合プローブＮｏ．５のみの対照によって観察された陽イオン消光の値に戻った（図１４Ａおよび図１４Ｂを比較されたい）。唯一の例外は、完全整合の複合体が、１５分間のインキュベーション後に形成されてその後繰り返し照射された完全整合の複合体であった（図１４Ｂ）。この場合、インキュベーションを１５分間行った後に複数回照射したときに、プローブＮｏ．５の別のさらなる陽イオン消光が完全に抑制されたにもかかわらず（図１４Ａ）、蛍光放出は複合体の破壊と一致していなかった（図１４Ｂ）。１ｂｐ  Ｔ−Ｇ不整合を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体（配列番号７＋プローブＮｏ．５）は、複数回のレーザ照射によって同様に明らかに破壊された（図１４Ｃ）。
【０２０３】
複数回のレーザ照射が複合体に及ぼす効果の根拠を決定するために、実験を行った。２回レーザ照射した反応混合物に新たな陽イオンを添加した場合、ｓｓＤＮＡ−Ｆプローブによって放出された蛍光の陽イオン消光の抑制を逆にすることができず、さらにインキュベーションを行ってもさらなる陽イオン消光が生じないことがわかったが、これは、まだわかっていないメカニズムにより、ｓｓＤＮＡ−Ｆプローブが複数回の照射によって不活性化したことを強く示唆している（データは図示せず）。同様に、２回レーザ照射した反応混合物に新たなｓｓＤＮＡ−Ｆプローブを添加した場合、新たなプローブの蛍光放出の増加を正規化した後、その反応混合物をさらにインキュベートしても漸進的な陽イオン消光を引き続き観察することはできなかったが、これは、レーザ照射した陽イオンが何らかの理由で使用不可能になったことを強く示唆している（データは図示せず）。
【０２０４】
前述の実施例および記述において、本発明者等は、ヘテロポリマー核酸鎖が相同的塩基対に基づいて特異的に結合することを明らかにした。そのような結合は、平行鎖または逆平行鎖の間で引き起こすことが可能である。
【０２０５】
また本発明者等は、近接する核酸鎖の塩基についてはワトソン・クリック相補２重鎖に結合した核酸鎖が静止状態にはなく、そのような塩基は、可能な結合モチーフのいずれかによって決定された近接する塩基配列の結合能力に応じて、ワトソン・クリック相補的塩基対合または相同的塩基対合に基づき相互に作用することが可能であることも明らかにした。このことは、２重鎖の塩基が第３の鎖の塩基と相互に作用して、特異的に結合した３重鎖構造を形成しようとも、または２重鎖の塩基が、それ自体はワトソン・クリック相補２重鎖に結合されている近接した塩基に特異的に相互に作用しようとも、確実に言えることである。したがって本発明は、ワトソン・クリック結合塩基が、他の鎖の近接塩基と相互に作用しかつ結合するような特異的な塩基として反応性を持ったままであり、またその特異性および迅速性が大きい状態で依然として反応性を持ったままであるという発見からなる。このすべては注目すべきことであるが、相同的結合モチーフが大半を占めている場合で、鎖全体にわたり、不可避的にすべての塩基対上で起こる結合反応では、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃ対合が不整合として検出されることは、特に注目すべきと考えられる。相同的４重鎖結合が、ワトソン・クリック相補４重鎖結合より特異的であることも、同様に注目すべきことである。当然ながら４重鎖結合は、２重鎖結合塩基または塩基対の主溝側と、２重鎖結合塩基または塩基対の副溝側との間で生じる。以前は、２重鎖で既に複合している塩基によってさらに結合する可能性は知られていなかったが、２重鎖の塩基の第３の鎖の認識は、２重鎖の主溝でのみ行われると仮定されてきた。本発明者等は、このことは事実ではないことを示している。本発明者等は、推定される主鎖の反発が２重鎖：２重鎖の相互作用に対する障害ではないことも実証した。
【０２０６】
本発明は、典型的には短いインキュベーション時間で室温で実現され、かつ反応を推進させるモル過剰量の試薬に左右されることのない、容易に実現される結合反応に関する。したがって本発明は、容易に実現されるだけではなく明らかに生物学的に適切であることも示す。
【０２０７】
最後に、本発明者等は、遊離塩基との部分的なワトソン・クリック相補結合が、２重鎖結合の増加および特異性の増大に寄与し得ることを示した。
本発明は、塩基結合の知識に対する実質的な追加を構成し、したがって本発明は、遺伝子抑制など、そのメカニズムが現在のところ謎につつまれている多くの生物学的機能の解明の中心をなす。
【０２０８】
ワトソン・クリック相補２重鎖に事前にかつ安定して結合された塩基によって、特異的な相同的認識および結合を検出することは、最も注目すべきことである。
本発明者等は、本発明者等が解明した事実により、多くの「カノニカル」な着想を放棄することが必要になり、核酸の結合能力に再び疑問が生ずることになると考えられる。
【０２０９】
本発明を、詳細にかつその特定の実施例に関して述べてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正を加えることが可能であることが、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１Ａ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１Ｂ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１Ｃ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図２Ａ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図２Ｂ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図３Ａ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図３Ｂ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図４】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図５Ａ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図５Ｂ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図６】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図７】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図８】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図９】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１０Ａ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１０Ｂ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１１Ａ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１１Ｂ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１２Ａ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１２Ｂ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１３Ａ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１３Ｂ】分析した各サンプルに関し、波長の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１４Ａ】分析した各サンプルに関し、時間の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１４Ｂ】分析した各サンプルに関し、時間の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【図１４Ｃ】分析した各サンプルに関し、時間の関数として蛍光強度をプロットした複合グラフを示す図。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【国際調査報告】
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