(57)【要約】本発明はアテローム性動脈硬化性疾患の重要な病原因子としての脂質酸化アブザイムの同定に関する。血管系においてアブザイムによって媒介される脂質酸化を低減させるための方法および手段が、アテローム性動脈硬化性疾患の治療のための治療的手法として提供される。
2005502665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるアテローム性動脈硬化性病状の治療方法において使用するための医薬の製造における、脂質酸化抗体の阻害剤の使用。
【請求項２】
前記治療方法が、個体の血管系における前記抗体の脂質酸化活性を低下させることを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記治療方法が、その処置前、処置中、および／または処置後の個体から得たサンプルに由来する抗体の脂質酸化活性を決定することをさらに含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
阻害剤が、抗イディオタイプ抗体、抗酸化剤、および金属キレート剤からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
阻害剤が、デスフェリオキサミンメシレート、ヘム誘導体、ペニシラミン、チオプロニン、トリエンチンジヒドロクロライド、ジエチルジチオカルバメート、エデト酸2ナトリウム／3ナトリウム、アセチルサリチル酸、エデト酸、ユニチオール(unithiol)、α-トコフェロール、マンニトール、アジスロマイシン、シリジアニン、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
個体におけるアテローム性動脈硬化性病状の治療方法において使用するための医薬の製造における、抗菌薬の使用。
【請求項７】
抗菌性化合物が、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、オフロキサシン、クリナフロキサシン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、およびテトラサイクリンからなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
アテローム性動脈硬化性病状の治療方法において使用するための医薬の製造における、クラミジア細胞またはクラミジア細胞抗原の使用。
【請求項９】
前記治療方法が、その処置前、処置中、および／または処置後の個体から得たサンプル中の抗体の脂質酸化活性を決定することを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
クラミジア細胞またはクラミジア細胞抗原が、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)の細胞または細胞抗原である、請求項８または請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
アテローム性動脈硬化性疾患を有する個体の血管系において抗体により媒介される脂質過酸化活性を低下させることを含む、アテローム性動脈硬化性疾患を有する個体の治療方法。
【請求項１２】
脂質酸化抗体の阻害剤を前記個体に投与することを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は個体におけるアテローム性動脈硬化症および関連病状の治療用の手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロール[Swartz G.M., Jr.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, 1902-1906, Alving C.R.およびSwartz G.M., Jr. Critical Reviews in Immunology (1991), 10, 441-453.]、リン脂質[Alving C.R. Biochem. Soc. Trans. (1984), 12, 342-344.]および低密度リポタンパク質(LDL)のような脂質に対する自己抗体がヒト血漿中に見られ[Kabakov A.E.ら, Clin. Immun. Immunopath. (1992), 63, 214-220, Mironova Mら,同書 (1997), 85, 73-82.]、それがアテローム性動脈硬化症の発症に関与している[Lopes-Virella M.F.およびVirella G. Clin. Immun. Immunopath. (1994), 73, 155-167, Kiener P.A.ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1995), 15, 990-999.]。
【０００３】
また一方で、抗体もLDLも病原因子ではないが、その2つからなる免疫複合体だけは病原因子である[Tertov V.Vら, Atherosclerosis (1990), 81, 183-189, Orekhov A.N.ら, Biochem. Biophys. Res. Comm. (1989), 162, 206-211.]。
【０００４】
未修飾の血漿リポタンパク質を含む免疫複合体はアテローム原性(atherogenicity)は低いことが知られている。しかし、リポタンパク質が修飾を受けると、特に酸化されると、これらの免疫複合体は高いアテローム原性を示すようになる[Orekhov A.N.ら, Biobhem. Biophys. Res. Comm. (1989), 162, 206-211, Orekhov A.N.ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1991), 11, 316-326.]。過酸化の形態をとる血漿脂質の酸化は、一般にアテローム性動脈硬化症の発症の原因と考えられ、それは、病院において一貫して見られ、かつ報告がなされているこの疾病の特徴である[Goto Y. In: Lipid Peroxides in Biology and Medicine, Yagi K.編, Academic Press, New York, London, Tokyo (1982), 295-303, Halliwell B.およびJ.M.C. Gutteridge, Free Radicals in Biology and Medicine, Clarendon Press, Oxford, 1989, Schultz Dら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2000), 20, 1412-1413.]。しかし、本発明の開示までは血漿におけるこの過酸化の原因は明らかではなかった。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、自己抗体の特定のサブグループが、脂質およびリポタンパク質と結合し、かつこれらを酸化することができるという発見に関連する。これらの触媒抗体（「アブザイム」）は低密度リポタンパク質と反応してこれを酸化し、アテローム原性因子を生成する。これらは最初に報告された抗脂質アブザイムの例である。
【０００６】
種々の態様において、本発明は、アテローム性動脈硬化性疾患の治療において、脂質酸化抗体を治療標的として使用することに関する。
【０００７】
治療は、個体の血管系において抗体により媒介される脂質酸化活性を低下させ、それによって、アテローム性動脈硬化性疾患の症状を改善または緩和する効果を示しうる。
【０００８】
抗体により媒介される脂質酸化活性は、さらに後述するように、個体に対して脂質酸化抗体の阻害剤を投与することによって、または個体の血管系における脂質酸化抗体の量もしくはレベルを低減させる薬剤を投与することによって、低下させることができる。
【０００９】
本発明の一態様は、個体におけるアテローム性動脈硬化性病状の治療方法において使用するための医薬品の製造における脂質酸化抗体の阻害剤の使用を提供する。
【００１０】
従って、アテローム性動脈硬化性疾患を有する個体の治療方法は、当該個体の血管系において抗体により媒介される脂質過酸化活性を低下させることを含みうる。
【００１１】
抗体により媒介される脂質酸化活性は、さらに後述するように、例えば阻害剤を用いて個体の血管系における脂質酸化抗体を阻害することによって、または個体の血管系における脂質酸化抗体の量もしくはレベルを低減させることによって、低下させることができる。
【００１２】
脂質酸化抗体は、結合活性および触媒活性の双方に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである分子である。例えばプロテインGを用いて精製した後、脂質酸化抗体は抗原との結合および触媒活性(すなわち、脂質の酸化)の双方を示す。
【００１３】
結合活性および触媒活性はいずれも脂質酸化抗体に本来的に備わったものでありうる。あるいは、脂質酸化活性は、該抗体と強固に結合してそれとともに複合体として(例えば、プロテインG／プロテインAまたはプロテインLカラムを用いて)同時精製される触媒分子によるものでありうる。この触媒分子は免疫グロブリン、または酵素もしくは金属イオンなどの非免疫グロブリンでありうる。精製後、この複合体は抗体に由来する結合活性と触媒分子に由来する触媒活性を示す。あるいは、脂質酸化抗体は別のメカニズムにより、例えば脂質抗原の環境を変化させる(例えば、単球の活性化による)ことにより、または脂質もしくはリポタンパク質を変化させて脂質の酸化を促進することにより、脂質の酸化を誘導しうる。
【００１４】
触媒抗体は、様々な抗原が保持する特定のエピトープに特異的であってそのために同じエピトープを有する異なる抗原と結合するものでもよい。この抗体は他のエピトープとは有意な結合を示さないと考えられる。従ってこの抗体はそのエピトープと、またはそのエピトープを含む抗原と、「特異的に結合する」と言える。この抗体によって認識されるエピトープは、宿主分子と、感染因子（例えば細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物）由来の抗原とが共有するものであってよい。すなわち、例えば病原体感染の際に、外来抗原に応答して宿主が産生する脂質酸化抗体は宿主の脂質もしくはリポタンパク質、または他の抗原と交差反応しうる。
【００１５】
このように、脂質酸化抗体は宿主分子とも外来抗原とも結合でき、これらの分子の一方または双方の酸化を触媒することができる。抗体分子は、血漿リポタンパク質（特に低密度リポタンパク質）の脂質部分を酸化、特に過酸化しうる。
【００１６】
脂質酸化抗体が結合する抗原は、ある範囲の感染性因子(例えば、2種以上のグラム陰性菌)で見られる高い配列同一性を共有する分子のファミリー(例えば、ホモログ)のメンバーであってもよいし、あるいは抗原は特定の感染性因子に特異的(すなわち、他種においてそのホモログが存在しない)なものであってもよい。また、同じエピトープが、高いレベルの配列同一性をそれ以外の部分では共有しない異なる感染性因子(すなわち、ホモログ)に由来する抗原に存在する場合もある。ある範囲の感染性因子に共通する抗原の例としては、アポリポタンパク質B、OmpA、リポ多糖、hsp60 MQMP、(P)OMP、p54およびリピドAが挙げられる。
【００１７】
脂質の酸化を触媒する抗体分子を、本明細書では触媒抗体分子、抗脂質アブザイム、アブザイムまたは脂質酸化抗体と呼ぶ。上記のように、このような触媒抗体は、内在的なもしくは本来的に備わっている脂質オキシダーゼ活性、または脂質酸化をもたらすその他の活性を有するか、あるいは脂質オキシダーゼ活性を有する分子と天然に会合している(すなわち、それらの天然状態でその本体内で非共有結合的に結合または付着している)ものであってよい。
【００１８】
本明細書に記載の方法による治療に好適なアテローム性動脈硬化性疾患としては、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患(冠状動脈性心疾患)、心筋虚血(狭心症)、心筋梗塞、動脈瘤疾患(aneurismal disease)、アテローム性末梢血管疾患、大動脈腸骨動脈疾患、慢性重症下肢虚血、内臓虚血、腎動脈疾患、脳血管疾患、卒中、アテローム性動脈硬化性網膜症、血栓症および異常血液凝固、ならびに高血圧症が挙げられうる。このような病状は医学的または獣医学的病状でありうる。
【００１９】
本発明の方法の被験体となりうる個体としては、ヒト、ならびにイヌ、ネコ、ウマおよびオウムなどの飼育動物、ヒツジおよびウシなどの家畜、およびゾウおよびトラなどの希少動物または外国産動物をはじめとする非ヒト動物が挙げられる。本明細書での「ヒト」についての言及は、特に他に断りのない限り、「非ヒト動物」も包含するものと理解すべきである。
【００２０】
本明細書に記載の阻害剤またはその他の薬剤は、アテローム性動脈硬化性疾患について個体を評価する工程を含む方法において使用することができる。このことは、下記に記載するように、個体から得たサンプルの抗体により媒介される脂質酸化活性を決定することによって達成することができる。
【００２１】
アテローム性動脈硬化性病状の指標となる脂質酸化抗体を有するとして同定された個体に、本方法に従った治療的処置を施し、病状またはその症状を緩和することができる。脂質酸化アブザイムのレベルまたは量は、病状の重篤度を示すものであり、本明細書に記載のように、特定の治療計画を決定するために用いることができる。
【００２２】
従って、阻害剤またはその他の薬剤は、個体から得たサンプルに由来する抗体の脂質を酸化する能力を試験し、そして、当該個体の血管系における抗体により媒介される脂質酸化活性を低下させるために阻害剤またはその他の薬剤を投与することを含む方法に使用することができる。
【００２３】
1つの方法は、さらに、抗体により媒介される脂質酸化活性の低下に続いて、個体から得たサンプルの抗体により媒介される脂質酸化活性を決定することを含んでもよい。
【００２４】
抗体により媒介される脂質酸化活性は、後述するようにして決定することができる。
【００２５】
本願における実験データは、クラミジア感染に応答して誘導される抗体のサブグループが、宿主抗原と交差反応し、かつ、血漿の脂質過酸化の原因となる自己抗体であることをさらに示す。触媒性抗クラミジア抗体は、ヒトアテローム性動脈硬化性病変部とアテローム性動脈硬化症の臨床合併症を示す患者の血清とから抽出された抗リポタンパク質IgG画分には存在するが、健康人の血清から抽出されたIgGには存在しないことが示されている。よって、本明細書に記載のような脂質と結合してこれを酸化する触媒抗体は、クラミジア細胞との反応性を有し、すなわちそれと結合しうるものである。
【００２６】
アテローム性動脈硬化症は、以前には、細菌クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)が動脈壁に存在することと関連付けられていた[Roivainen M.ら, Circulation (2000), 101, 252-257, Siscovick D.S.ら,. J. Infect. Dis. (2000), 181, Suppl. 3, S417-420]が、患者の血漿または血清中の特異的な抗クラミジア抗体を検出するための血清学的試験[Mendall M.ら, (1995) J. Infect. 30 121-128, Wang S-Pら, (1970) 70 367-374]を用いてアテローム性動脈硬化症患者を同定または識別することはできない。その集団のうちかなりの割合がクラミジア感染歴を持ち、その結果、アテローム性動脈硬化症の臨床徴候がなくても、血清中に特異的抗クラミジア抗体を有する[Davidson M.ら, Circulation (1998), 98, 628-633m, Song Y.G.ら, Yonsei Med. J.(2000), 41, 319-327.]。よって、血漿または血清中に抗クラミジア抗体が存在すること自体はアテローム性動脈硬化症の指標とはならない。
【００２７】
しかし、本明細書では、ヒト抗原と交差反応し、血漿リポタンパク質の酸化を触媒する触媒性抗クラミジア抗体が、アテローム性動脈硬化性疾患の治療標的として有用であることを示す。
【００２８】
このように、脂質酸化抗体はクラミジア細胞抗原と結合するかまたはそれとの反応性を有するものでありうる。すなわちその抗体分子は、抗クラミジアアブザイムであっても抗体分子であってもよい。
【００２９】
本明細書に記載のようなクラミジア抗原はクラミジア細胞の任意の免疫原または免疫原性成分であってよく、すなわち、哺乳類においてクラミジア細胞に対して免疫応答を惹起するか、または惹起できるクラミジア由来の分子、例えばHsp60であってもよい(Huittinenら, (2001) Eur Resp. J. 17(6) 1078-1082, Kinnunen A.ら, (2001) Scand. J. Immunol. 54(1-2) 76-81)。好ましくはこの抗原はタンパク質抗原または脂質抗原であり、すなわち、それは脂質基または脂質部分を含むか、またはそれから構成される。脂質抗原は、例えば抗クラミジア抗体と結合する、脂質、リポタンパク質または他の脂質結合細胞成分であってもよく、「脂質抗原」とはこれらの成分のいずれもを指す。このような抗原は精製および／または単離されていてもよいし、あるいはクラミジア細胞内に含まれていてもよい。このようなリポタンパク質を精製および／または単離する好適な方法は当技術分野で周知であり、例えばHPLCがある。
【００３０】
ヒトアポリポタンパク質Bに対する抗体はクラミジア細胞との反応性を有することが示されている(実施例７参照)。いくつかの実施形態では、このように、本明細書に記載のような脂質酸化抗体は例えばヒトアポリポタンパク質Bとの反応性を有しうる。クラミジア細胞はクラミジア・プシタッシ(Chlamydia psittaci)群に属する種に由来する細胞であってもよい。クラミジア・プシタッシ群には、クラミジア・プシタッシ(Chlamydia psittaci)およびクラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)が含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、クラミジア細胞はヒツジ・クラミジア・プシタッシ細胞である。ヒツジ・クラミジア・プシタッシ生菌の凍結乾燥形態である好適な調製物が市販されている(Intervet)。
【００３１】
脂質酸化抗体の阻害剤は、脂質抗原に対する脂質酸化抗体の結合を阻害する(すなわち、アブザイムの結合部位をブロックする)か、または抗体の脂質酸化活性を阻害する(すなわち、触媒活性中心をブロックする)ことができる。
【００３２】
アブザイムの触媒活性中心をブロックする阻害剤としては、例えば、表７に示す金属キレート剤が挙げられる。アブザイムの触媒中心における過渡的原子価の金属イオンは、アブザイムの触媒特性を中和するようなそのキレート剤によって特異的に標的とされる。アブザイムを阻害する金属キレート剤としては、アスピリンが挙げられる。
【００３３】
そのようなその他の阻害剤としては、宿主の生物においてアブザイムとその標的エピトープとの結合を阻止する基質アンタゴニストが挙げられる。結合性アンタゴニストは、ペプチド、脂質、多糖類、あるいは、アブザイムのエピトープを模倣するその他の任意の合成または天然産物であってよい。そのようなアンタゴニストは、例えば、宿主抗原、すなわち、ヒト抗原または病原体抗原であり得る脂質抗原について、モデル化してもよい。
【００３４】
アブザイムの活性中心は、その触媒特性を不活化するように他の方法で改変することができる。例えば、アブザイムの活性中心は、これらの分子の脂質過酸化特性を不活化するように、血漿/血清の身体外(UV)照射によって改変し得る光(UV)感受性基を含んでもよい。
【００３５】
アブザイムの結合部位をブロックする阻害剤の例としては、Fab/Fvまたはその他の抗体フラグメントおよび誘導体を含む抗イディオタイプ抗体分子、あるいはそれらの活性中心の相補性ループのフラグメントを表す(すなわち、抗イディオタイプ抗体分子を模倣する)ペプチド分子が挙げられ、これらによってアブザイムとそれらの標的抗原との結合を阻害することができるだろう。好適な抗体分子を、ポリクローナルまたはモノクローナルストラテジーを用いて、またはファージディスプレイによって作製することができる。
【００３６】
拮抗特性を有するその他の化合物を用いて、アブザイムの結合部位に対する抗原と拮抗させることができ、そのような抗原の例としては、アブザイムが結合するエピトープを模倣する、ペプチド、脂質、多糖、あるいは、その他の任意の合成または天然産物が挙げられる。また、本発明のアブザイムの結合部位を修飾することができるその他の化合物、または化学的および物理的方法を用いて、結合性を破壊することができる。そのような例としては、上記に記載した照射が挙げられる。
【００３７】
本明細書で提供するデータは、抗細菌薬アジスロマイシンがアブザイム活性の阻害剤であることを示す。このことから、候補阻害剤としては、アジスロマイシンと構造的に関連する分子、並びにエリスロマイシン、ロキシスロマイシン、オフロキサシン、クリナフロキサシン(clinafloxacin)、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびテトラサイクリンなどの抗菌薬の、両方が挙げられうる。
【００３８】
本発明の態様は、アテローム性動脈硬化症の治療に使用するための医薬の製造におけるアジスロマイシンの使用、およびアテローム性動脈硬化症の治療に使用するための医薬の製造における第2のアブザイム阻害剤、例えばアスピリンなどの金属キレート剤と組み合わせたアジスロマイシンの使用を提供する。例えば、アジスロマイシンとアスピリンなどのキレート剤とを、単一の組成物に混ぜ合わせてもよいし、または同時もしくは連続的に投与してもよい。
【００３９】
本発明の態様は、本明細書で記載するように、脂質酸化抗体の阻害方法におけるアジスロマイシンの使用、および当該抗体をアジスロマイシン分子に接触させることを含む脂質酸化抗体の阻害方法を提供する。
【００４０】
個体の血管系における抗体により媒介される脂質過酸化活性は、例えば、本明細書に記載の特異的治療剤を用いて、個体の血管系における脂質酸化抗体の量またはレベルを低減することによって低下させることができる。
【００４１】
アテローム性動脈硬化性疾患の治療方法は、治療を必要とする個体の血管系から脂質を酸化する抗体を排除または除去することを含んでもよい。そのような方法における使用に好適な薬剤は、さらに下記で記載する。
【００４２】
本発明の態様は、個体におけるアテローム性動脈硬化性病状の治療方法において使用するための医薬の製造における、個体の血管系におけるアブザイムのレベルを低減する薬剤の使用、および個体の血管系におけるアブザイムのレベルを低減することを含むアテローム性動脈硬化性病状の治療方法を提供する。
【００４３】
かかる方法は、排除もしくは除去工程の前および/または後に、個体から得たサンプルにおける本明細書に記載の脂質酸化抗体の存在または量を決定する工程を含みうる。
【００４４】
脂質を酸化する抗体(すなわち、アブザイム)を、血管系から、すなわち循環から、様々な方法のうちの任意の１つによって除去することができる。アブザイム産生を担う細胞を、例えば、このB細胞の亜集団に対する特異的抗体を用いて、阻害、中和または排除することができる。アブザイム産生の阻害は、抗体の結合を通じて、またはこれらの抗体上に装填され、かつB細胞に送達される細胞傷害剤の作用を通じて、達成することができる。
【００４５】
特異的抗アブザイム抗イディオタイプ抗体の産生を活性化することができる。このことは、例えば、ファージディスプレイ抗体技法を用いて好適な抗イディオタイプ抗体を同定し、これらの抗体またはそれらのコード核酸を個体に導入することによるか、あるいは抗イディオタイプ抗体を産生する組換え宿主細胞の移植によって、達成することができる。
【００４６】
アブザイムレベルを低減するための薬剤は、宿主に移植する化学的、物理的または生物学的実体であってよく、それは自律的に、または宿主の恒常性/代謝と協調して、循環中のアブザイムを直接的にまたは非直接的に不活化、中和または排除する。例えば、高親和性エピトープ模倣標的を担持するポリマーまたはその他の物質を用いることができ、そのためそれらは循環性アブザイムに結合することができるが、さらに食細胞によって吸収および消化されて、それにより循環から結合したアブザイムを除去することができる。
【００４７】
患者の血漿を、吸着剤またはメンブレンを通して透析し、循環からアブザイムを特異的に除去するか、あるいは、血漿を化学的または物理的手段によって身体外で処理し、アブザイムを不活化してもよい。吸着剤に、例えば特定のエピトープまたはキレート剤を積載して、身体外透析系を用いることによって循環からアブザイムを特異的に除去してもよい。その他の実施形態においては、血清または血漿を、上記に記載したように身体外で照射することにより、アブザイムを不活化してもよい。
【００４８】
特定の抗菌剤、例えば、抗クラミジア殺菌剤を用いて、宿主から細菌感染を取り除くことによって血管系から脂質酸化抗体を除去してもよい。また、かかる抗菌剤は、身体自身の恒常性機構を動員させて、脂質酸化抗体の産生を中止/ブロック/排除することができる。好適な抗菌剤の例は、表８において提供される。
【００４９】
1つの方法では、1以上の上記手法の組み合わせを含んでもよく、個体に対して同時にまたは連続的に適用してもよい。例えば、抗体の脂質酸化活性を、例えば抗酸化剤などの第1の阻害剤を用いて低下させまたは排除し、一方、それと同時にまたは連続して、金属キレート剤などの別の阻害剤を投与してもよい。阻害剤の好適な組み合わせとしては、本明細書に記載のアスピリンとアジスロマイシンとが挙げられる。
【００５０】
あるいは、抗酸化剤などの阻害剤を、抗菌剤とともに同時にまたは連続的に投与することで、循環中の脂質酸化抗体の量またはレベルを低減させてもよい。
【００５１】
従って、抗クラミジアアブザイムなどのアブザイムに対して特異的に指向される薬剤の組み合わせを、アテローム性動脈硬化性病状を治療するために同時にまたは連続的に使用することができる。薬剤の正確な選択、用量、期間およびその他のパラメーターは、個体の症例に応じて、医師によって決定されうる。この特定の治療の有効性は、各個体の症例ごとに、本明細書に記載の方法を用いて治療した患者の血清におけるアブザイム活性の変化をモニタリングすることによって決定することができる。
【００５２】
ある状況では、アブザイムの産生は病原体感染に応答して誘導され、そして病原体に対して誘導されたそのアブザイムは、宿主抗原と交差反応し、かつ脂質酸化を引き起こしうる。
【００５３】
本発明の態様は、抗酸化剤、キレート剤、および抗菌性化合物からなる群より選択される2以上の薬剤を個体に投与することを含む、アテローム性動脈硬化性病状を有する個体の治療方法を提供する。
【００５４】
本発明の態様は、個体におけるアテローム性動脈硬化性病状の治療方法において使用するための医薬の製造における抗菌剤の使用を提供する。
【００５５】
好適な抗菌性化合物は、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、オフロキサシン、クリナフロキサシン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびテトラサイクリンからなる群より選択してもよい。
【００５６】
アジスロマイシンを含む特定の抗菌性化合物はまた、本明細書において、脂質酸化抗体を阻害することが示される。
【００５７】
好ましくは、抗菌剤は、抗酸化剤または金属キレート剤などのアブザイム阻害剤と組み合わせて投与される。
【００５８】
本発明の別の態様は、抗酸化剤、キレート剤、および抗菌性化合物からなる群より選択される2以上の薬剤を個体に投与することを含む、アテローム性動脈硬化性病状を有する個体の治療方法を提供する。
【００５９】
好適な抗酸化剤、キレート剤および抗菌性化合物については、本明細書の他の箇所に記載されている。
【００６０】
1つの方法では、処置前、処置中および/または処置後の個体から得たサンプルに由来する抗体の脂質酸化活性を決定することを含んでいてもよい。
【００６１】
アブザイムのレベルを低減するのに有用な薬剤のさらなる部類は、クラミジア細胞抗原に基づくワクチンおよび免疫療法薬である。本明細書において、クラミジア細胞を含むワクチンの投与は、アブザイム活性を低減または排除することが示されている(表１０を参照-ワクチン接種後)。従って、クラミジアワクチンを用いて、アテローム性動脈硬化症を有するヒトおよび動物の血管系からアブザイムを低減または排除するか、あるいはアブザイムの産生を阻止することができる。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、アテローム性動脈硬化性疾患の治療に使用するためのクラミジアワクチン（特にクラミジア・ニューモニエワクチン）、治療を必要とする個体に対してクラミジアワクチンを投与することを含むアテローム性動脈硬化性疾患の治療方法、およびアテローム性動脈硬化性病状の治療において使用するための医薬の製造における記載したクラミジアワクチンの使用、を提供する。
【００６３】
ワクチンは、クラミジアなどの病原体、特にクラミジア・ニューモニエに由来する1以上の抗原を含む非毒性の物質であり、これは個体において活性のある免疫を刺激し、当該病原体またはその他の近縁病原体による感染に対して防御する。
【００６４】
クラミジアワクチンは、非毒性のクラミジア細胞、特にクラミジア・ニューモニエ細胞であってよく、例えば、加熱死滅されたまたはホルマリン処理したクラミジア細胞、あるいはかかる細胞の構成成分、抽出物または画分であってよい。獣医学用のクラミジアワクチンは、当技術分野で周知であり、凍結乾燥形態のヒツジ・クラミジア・プシタッシ(Chlamidia psittaci)生菌の製剤が市販されている(Intervet)。
【００６５】
好適なクラミジアワクチン、特にクラミジア・ニューモニエワクチンは、医学的な(すなわち、非獣医学的な)製剤とすることができる。かかる製剤は、ヒトへの投与に好適である。
【００６６】
上記で記載したように、本発明の方法は、個体から得たサンプルに由来する抗体の脂質酸化活性を決定することによって、処置前、処置中および/または処置後にアテローム性動脈硬化性疾患について個体を評価することを含んでもよい。脂質酸化活性は、アテローム性動脈硬化性病状を有する個体の指標となり、従って、本方法に従った治療における候補となる。
【００６７】
脂質酸化活性は、個体から得たサンプルに由来する抗体の、脂質を酸化する能力を試験することによって、決定することができる。例えば、血清サンプルに由来する抗体を、固定化抗イディオタイプ抗体を用いて捕捉し、捕捉された抗体の脂質酸化活性を決定してもよい。
【００６８】
脂質を酸化する抗体のサンプル中の存在は、アテローム性動脈硬化性疾患を有するかまたはそれに罹患している個体、あるいは将来的にその疾患に罹患する危険性のある個体を示す。かかる個体は、本明細書に記載の方法を用いる治療に好適でありうる。かかる抗体の量、レベルまたは活性は、疾患の重篤度を示すものであり、すなわち、抗体の量および/または活性の増大は、疾患の重篤度の増大を示す。このようにして、個体におけるアテローム性動脈硬化性疾患の存在および/または重篤度を判定することができる。
【００６９】
脂質酸化抗体は、クラミジア抗原に結合しうる。個体から得たサンプルに由来する、脂質酸化活性を有する(すなわち、脂質を酸化する)抗体分子のクラミジア抗原への結合、または、個体から得た、クラミジア抗原に結合する抗体の脂質酸化を、判定することができる。あるいは、個体から得たサンプルに由来する抗体分子のクラミジア抗原への結合および脂質酸化活性の双方を決定してもよい。
【００７０】
好適なサンプルは、血清、血漿、血液またはその他の生物学的サンプルであり、好ましくは血清または血漿サンプルである。本明細書に記載の抗体または抗体分子は、好ましくはIgG分子である。
【００７１】
結合の決定様式は本発明の特徴ではなく、当業者であれば、好みおよび一般的知識に応じて好適な様式を選択することができる。
【００７２】
脂質過酸化活性をはじめとする脂質酸化活性は、宿主脂質(例えば、サンプル由来の脂質)、クラミジア細胞などの外来抗原由来の脂質、または試験法の一部として添加されうる別の供給源由来の脂質の酸化を判定することにより、判定されうる。
【００７３】
脂質酸化は、生成物、または共酸化される共役リポーター分子などの副生成物の蓄積、あるいは非修飾脂質などの基質もしくは酸素などの補基質の消失または消費を測定することにより判定してもよい。
【００７４】
当技術分野では脂質の過酸化を判定する多くの方法が知られており、これらは本発明に従って用いるのに適している。脂質酸化を判定する様式そのものは本発明の特徴ではなく、当業者ならばその好みや一般知識に従って適切な様式を選択することができる。
【００７５】
好適な方法は例えば、CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, CRC Press, Boca Raton, Florida (1985), Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 186, Academic Press, London (1990); Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 234, Academic Press, San Diego, New York, Boston, London (1994); and Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996)に記載されている。
【００７６】
好ましい実施形態では、酸化は脂質酸化生成物の産生(すなわち、その存在または量)を判定することにより判定する。
【００７７】
酸化が引き起こされた脂質の酸化生成物および／または中間体を測定してもよいし、あるいは酸化が伝播される脂質の酸化生成物および／または中間体を測定してもよい。
【００７８】
好適な脂質酸化生成物としては、マロンジアルデヒド(MDA)などのアルデヒド、(脂質)過酸化物、ジエンコンジュゲートまたは炭化水素ガスが挙げられる。脂質酸化生成物は好適な任意の方法によって測定すればよい。例えば、脂質過酸化生成物はHPLC(Brown, R.K.,およびKelly, F.J In: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 119-131)、UV分光法(Kinter, M. Quantitative analysis of 4-hydroxy-2-nonenal.同書,133-145)、またはガスクロマトグラフィー-質量分析(Morrow, J.D.,およびRoberts, L.J. F2-Isoprostanes: prostaglandin-like products of lipid peroxidation.同書, 147-157)を用いて測定することができる。
【００７９】
脂質の過酸化はタンパク質、炭水化物、核酸およびその他の分子種の酸化をもたらしうる。このような酸化の生成物はまた、アブザイムの活性の間接的測定のために用いることができる。さらに、過酸化は、伝播する脂質酸化に伴ってリポーター分子の特性の変化を引き起こしうる。後述のように、リポーター分子がこれらの脂質中に、例えばリポソームとして封入されていて、リポソームからのリポーター分子の放出を酸化の指標としてもよい。
【００８０】
好適なリポーター物質および分子としては、発光細菌そのもの、ルミノール、ルシゲニン、フォラシンおよびルシフェリンが挙げられる。このような物質は、例えばペルオキシダーゼ、エステラーゼ、オキシダーゼ、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペリレン、NAD+およびアクリジニウムエステルビス(トリクロロフェニル)オキサレートなどの分子を利用してH2O2/O2・−/O2-と共役させてもよい(Campbell A.K. Chemiluminescence. VCH, Ellis Horwood Ltd., England, 1988)。
【００８１】
フリーラジカル連鎖反応を受けやすいその他の物質も、脂質酸化を判定するために用いることができる。例えば、連鎖プロセスとしての脂質の過酸化は、アクリルアミドの重合を誘導および促進する。従って、脂質酸化は14C-アクリルアミドの共重合を判定することにより判定されうる(Kozlov Yu P. (1968) Role of Free Radicals in normal and pathological processes. Doctorate thesis - MGU Moscow 1968)。
【００８２】
脂質およびリポタンパク質の過酸化はフリーラジカルによって媒介されるプロセスであることから、脂質酸化アブザイムはこれらのラジカルを検出することにより測定されうる。ラジカルは内因性低レベル化学発光(増感剤を用いるか、もしくは用いない)(Vladimirov, Y.A.,およびArchakov, A.I. Lipid Peroxidation in Biological Membranes. Nauka, Moscow (1972); Vladimirov, Y.A. Intrinsic low-level chemiluminescence. In: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 65-82)、電子スピン共鳴(スピントラッピングを用いる(Mason, R.P. In vitro and in vivo detection of free radical metabolites with electron spin resonance. In: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 11-24)か、もしくはスピントラッピングを用いない(Petyaev, M.M. Biophysical approaches in the diagnosis of cancer. Medicina, Moscow (1972))、または当技術分野で周知の他の技術を利用して、検出または測定すればよい。脂質酸化はまた、この反応の脂肪酸またはその他の物質の消費を判定することにより判定されうる。
【００８３】
いくつかの好ましい実施形態では、1mM 2-チオバルビツール酸と反応させた後に、525nmなどの適当な波長での吸光度を測定することにより、マロンジアルデヒド(MDA)の産生を判定する。
【００８４】
抗クラミジアアブザイムによって酸化される脂質としては、リポタンパク質、脂肪酸、リン脂質、コレステロール、コレステロールエステルまたはトリグリセリドの脂質部分が挙げられる。上記のように、アブザイムの脂質酸化活性もまた、タンパク質、炭水化物および／または核酸、例えばリポタンパク質のタンパク質部分および／または炭水化物部分の酸化をもたらしうる。
【００８５】
いくつかの好ましい実施形態では、例えば抗クラミジアアブザイムの有無を判定するために使用できる好都合な一段階アッセイを提供することから、クラミジア脂質の酸化が判定される。クラミジア脂質の酸化は、脂質を含むクラミジア抗原と結合してそれを酸化するクラミジア特異的抗体が存在する場合に起こる。
【００８６】
アテローム性動脈硬化性病状は、個体において、個体により提供されるサンプルをクラミジア細胞抗原と接触させること、および該サンプルにおける脂質の酸化を判定することによって、評価することができる。
【００８７】
脂質の酸化の判定は、クラミジア抗原との接触の結果としてもたらされる酸化の量、レベルまたは程度を決定することを含みうる。好ましくはこのクラミジア細胞抗原は脂質抗原であり、クラミジア細胞脂質抗原の酸化が判定される。
【００８８】
抗原は精製および／または単離されていてもよく、より好ましくはクラミジア細胞に含まれていてもよい。このため、個体におけるアテローム性動脈硬化性病状は、個体により提供されるサンプルをクラミジア細胞と接触させること、および該細胞の脂質の酸化を判定することによって、評価することができる。
【００８９】
例えばサンプルにおける、クラミジア細胞または抗原の存在下での脂質の酸化を、クラミジア細胞または抗原の不在下での脂質の酸化と比較してもよい。脂質酸化の増大が抗脂質アブザイムが存在することを示す。
【００９０】
脂質／リポタンパク質の過酸化はフリーラジカル連鎖反応であり、ある分子から別の分子へ、または脂質含有ミセルへ、または(受容体または非特異的吸収によってその膜へ付着した後)細胞全体へと、自己伝播することができる(Chemical and Biochemical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase. Elsevier/North-Holland, New York, Amsterdam (1980); Lipid Peroxides in Biology and Medicine. Academic Press, Orlando, San Diego, San Francisco, New York, London (1982); Halliwell, B.,およびGutteridge, J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press. Oxford (1996); Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals. Taylor and Francis, Washington (1997))。
【００９１】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、過酸化の伝播を利用して脂質酸化アブザイムの検出を容易にする。
【００９２】
例えば、フリーラジカル分解を受けやすい材料から構成される膜(例えば、リン脂質膜)を有するリポソーム、小胞またはマイクロカプセルなどの微小容器に色素、蛍光色素、またはその他のリポーター物質もしくは検出物質、例えば、エオシン、フルオレサミン、ローダミンBまたはマラカイトグリーンを充填し、脂質酸化アブザイムの検出に用いてもよい。こうして、本明細書に記載の方法における脂質酸化は封入されたリポーター物質の放出を判定することにより判定してもよい。
【００９３】
充填した微小容器を血漿または血清サンプルと混合すればよい。次に、便宜にはクラミジア細胞中に、またはその一部に含まれるクラミジア抗原を、その混合物に加える。次に、サンプル中に脂質酸化アブザイムがあればそれが抗原と結合し、過酸化が引き起こされる。
【００９４】
アテローム性動脈硬化性病状は、脂質酸化を受けやすく、かつ、リポーター物質を含有する微小容器の存在下で個体により提供されるサンプルをクラミジア細胞抗原と接触させること、および微小容器からの該リポーター物質の放出を判定することによって、評価することができる。
【００９５】
クラミジア抗原とアブザイムとの相互作用による脂質／リポタンパク質酸化が引き起こされると、自己伝播し、微小容器のコーティングへと広がる。これがコーティングに損傷を与え、リポーター物質が周囲の溶液中に放出される。次に、この放出を検出する。
【００９６】
リポーターの放出によって生じたシグナルの強度が、記録可能な、すなわち検出可能なシグナルを生じるには十分でない場合、反応混合物中に、フリーラジカル伝播促進剤(propagator)または増感剤、例えば遊離イオンおよびFe2+/Co2+錯体または過渡的原子価のその他の金属を含めることができる。これらの、およびその他の増感剤はある系におけるフリーラジカルの量を増加させるのに役立つ。
【００９７】
微小容器からの含有されている物質の放出は、視覚的に(または他の便宜な手段によって)示されうる、反応混合物の物理／化学特性の変化をもたらす。あるいは、損傷した／断片化した／溶解した微小容器は、能動的遠心分離または受動的沈降法のいずれかにより、改質されていないものから分離することができる。
【００９８】
リポソームまたはその他の微小容器(リポーター物質を充填したもの)の代わりに、血液サンプル自体からの赤血球を、抗脂質アブザイムによって生ずる伝播性の脂質／リポタンパク質の過酸化の標的として用いてもよい。クラミジア菌またはクラミジア抗原は、場合により過酸化反応の伝播を確保するための増感剤の存在下で、血液サンプルに導入するかまたは血液サンプルと接触させればよい。脂質酸化は血液サンプルにおいて赤血球の溶血を判定することにより判定すればよい。
【００９９】
そのサンプルにおいてクラミジア抗原とアブザイムとの相互作用により脂質／リポタンパク質の酸化がわずかでも開始されれば、自己伝播し、赤血球細胞膜へと広がり、それによって損傷が生じ、そしてついには細胞溶解が起こる。従って、クラミジア菌／抗原の添加に応答して全血サンプルにおいて溶血が現れることは、脂質酸化アブザイムの存在を示す。溶血は任意の好適な方法によって判定することができる。
【０１００】
アテローム性動脈硬化性病状は、個体により提供される、赤血球を含むサンプルを、クラミジア細胞抗原と接触させること、および該赤血球の溶血を判定すること、によって評価することができる。
【０１０１】
リポソームまたはその他の微小容器には例えばヘモグロビンの赤色とは異なる色を発色しうる材料を充填してもよい。あるいは、供試サンプルのスピン、または受動的沈降でも、損傷を受けた微小容器／赤血球は分離できる。リポーター色素の放出または溶血は、分析材料中に脂質酸化抗体が存在することを示す。シグナルの強度はそれらの活性／濃度と相関する。
【０１０２】
全血は上記の方法を用いて分析できるので、それらは遠心分離の工程を伴わず、実験室以外の条件または家庭条件でも使用できる。アテローム性動脈硬化症の存在または重篤度は、例えば観察されたリポーターシグナルまたは溶血を、アテローム性動脈硬化症患者および正常個体の既知の値と比較することにより判定しうる。このような比較はアテローム性動脈硬化症の特定のステージまたは重篤度におけるリポーターシグナルまたは溶血の量またはレベルを示すチャート、スケール、グラフまたはキャリブレーションを用いて行えばよい。
【０１０３】
脂質の過酸化はまた、共役した酸化還元系を用いて測定することができる酸化還元プロセスである。好適な酸化還元系には、物理系および化学系が含まれる。例えば、センサーチップを用いてそれと共役した脂質酸化反応の酸化還元能の変化を検出してもよい。酸化還元酵素または酸化還元メディエーターのいずれかに基づくある範囲のセンサーチップが当業者に公知である。これらの種のセンサーはいずれも、フリーラジカル分子またはそれと共役する酸化還元分子の検出のために適合させ／使用することができる(Hall E.A.H. Biosensors. Redwood Press Ltd., Great Britain, 1990)。
【０１０４】
脂質の過酸化によって生ずるH2O2の蓄積は、例えば、過酸化水素を用いてそれとは別の補基質を酸化し発色生成物を生じるであろう、共役したペルオキシダーゼに基づく反応を加えることにより、測定できる。脂質の過酸化によって生じたO2・−の蓄積は、チトクロームCまたはリボフラビンなどのO2・−感受性分子を用いることにより判定することができる。
【０１０５】
あるいは、脂質の過酸化は酸素分子を消費することから、何らかのO2依存性化学反応または物理的プロセスを、例えば酸素電極またはポーラログラフィーにおいて用いることができる(Polarography. Kolthoff I.M.編, Lingane J.J. Interscience Publishers, New York, London, 19520)。
【０１０６】
以下、上記の添付図面ならびに後述の実施例および表を参照して本発明の態様を説明するが、これらは例示であって限定するものではない。当業者にはさらなる態様や実施形態は明らかであろう。
【０１０７】
本明細書にて言及した文献は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
表１は、クラミジア菌の脂質過酸化に対するヒトアテローム性動脈硬化性病変部から抽出したIgG画分の影響を示すデータを含む。pH5.7。測定は全て3回行った。
【０１０９】
表２は、ヒト血清リポタンパク質とクラミジア・プシタッシのヒツジ株との間の病変部IgGに対する交差反応を示すデータを含む。
【０１１０】
表３は、ヒト血清における脂質過酸化に対するネコクラミジアの影響を示すデータを含む。測定は全て3回行った。
【０１１１】
表４は、ヒト血漿における、ヒツジクラミジアによる脂質過酸化の誘導におけるIgGの役割を示すデータを含む。測定は全て3回行った。
【０１１２】
表５は、対照血清およびアテローム性動脈硬化症の臨床合併症を有する患者の血清へのヒツジクラミジアの添加の影響を示すデータを含む。
【０１１３】
表６は、抗酸化阻害剤による、アテローム性動脈硬化性病変部のIgGの脂質酸化活性の阻害を示す。
【０１１４】
表７は、本発明に従って使用されうる金属キレート剤の例を示す。
【０１１５】
表８は、本発明に従って使用されうる抗菌薬の例を示す。
【０１１６】
表９は、本発明に従って使用されうる抗酸化剤の例を示す。
【０１１７】
表１０は、健康および感染ヒツジにおける脂質酸化性抗クラミジア抗体のレベルを示す(括弧の中の数字は、対照に対する増加率／低下率%を表す)。
【０１１８】
表１１は、金属キレート剤を用いたアブザイムの阻害を示す。
【０１１９】
表１２は、金属キレート剤を用いたin vitroアブザイム活性の阻害を示す。
【０１２０】
表１３は、冠状動脈性心臓病患者における抗クラミジアアブザイムの活性に対するアスピリンの影響を示す。
【０１２１】
表１４は、無症候性心筋虚血患者における抗クラミジアアブザイムの活性に対するアスピリンの影響を示す。
【０１２２】
表１５は、抗菌薬で処置した患者におけるアブザイム活性を示す。
【０１２３】
表１６は、抗菌薬＋アスピリンで毎日処置した患者におけるアブザイム活性を示す。
【０１２４】
表１７は、抗菌薬のみで処置した患者の臨床状態を示す。
【０１２５】
表１８は、アテローム性動脈硬化症関連病状に罹患している個体群の平均アブザイムレベルを示す。
【０１２６】
表１９は、アスピリンを投与された、または投与されなかった、狭心症に罹患している患者における個々のアブザイムレベルを示す。
【０１２７】
表２０は、クラミジアを接種したウサギにおけるアブザイムの誘導を示す。
【０１２８】
表２１は、アブザイムが誘導されたウサギにおけるホルマリンで処理したクラミジアの効果を示す。
【０１２９】
表２２は、毎日500mgのアジスロマイシンで処置した患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す(治療群A)。
【０１３０】
表２３は、毎日500mgのアジスロマイシン＋250mgのアスピリンで処置した患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す(治療群B)。
【０１３１】
表２４は、毎日500mgのアジスロマイシン＋抗酸化剤で処置した患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す(治療群C)。
【０１３２】
表２５は、毎日250mgのアスピリンで処置した治療群Dの患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す(治療群D)。
【０１３３】
表２６は、対照群の患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す。
【０１３４】
表２７は、抗アブザイム処置の結果のまとめを示す。
【０１３５】
表２８は、改変型Rose-Blackburn質問表による処置前後の狭心症の重篤度の評価を示す。
【０１３６】
表２９は、抗クラミジアIgGについて陰性と判定されたIHD患者に関する処置前後のアブザイムおよびRose-Blackburnテストスコアを示す。
【０１３７】
表３０は、アブザイムに対するアジスロマイシンの阻害特性を示す。
【０１３８】
表３１は、抗クラミジアアブザイム活性に対する種々の薬剤の影響を示す。
【０１３９】
表３２は、血栓症および血液凝固に対する抗アブザイム治療の効果を示す。
【実施例】
【０１４０】
材料および方法
サンプル
第一臨床病院の心血管外科センター(Rostov-na-Donu, Russia)に冠状動脈および腹部大動脈のバイパス手術のために入院した、アテローム性動脈硬化症の臨床合併症を患う22人の患者由来の血清3サンプルずつを使用した。
【０１４１】
これらの患者のうち20人は男性、2人は女性であり、年齢は47歳から66歳の間であった。これらの患者のうち1人(番号6/6a)が試験の際に急性心筋梗塞を起こしたため、いくつかの最終計算にはこの患者のデータは含まれなかった。対照群は臨床的に健康なボランティアからなり、5人は男性、5人は女性で年齢は40歳から55歳の間であった。
【０１４２】
これらの患者のうち7人の腹部大動脈から得たアテローム片を使用して、以下に記載するようにプロテインA吸着剤によりIgG画分を抽出した。
【０１４３】
アテローム性動脈硬化性病変部からのIgGの抽出
この大動脈片(湿重量で約200〜400mg)をおよそ10mgの切片になるよう切断し、1%非イオン性界面活性剤Igepal CA-630を含むPBS 5.0ml中に入れ、機械式ホモジナイザー(Ultra-Turrax)により、15mmプローブを用いて全出力でそれぞれ3秒間、冷却用の間隔20秒間をはさんで3回繰り返してホモジナイズした。ホモジナイズの後、5000g、10分間の遠心分離により不溶性成分を分離し、上清を分析に用いた。
【０１４４】
この上清を、架橋した4％ビーズ状アガロースに結合させたプロテインAで37℃にて30分間処理した。次に、ビーズに結合した免疫グロブリン画分を5000gで10分間の遠心分離により沈降させ、上清をデカントした。沈降させた免疫グロブリンに結合したリポタンパク質を除去するために、このサンプルを10% Igepal CA-630に再懸濁した。次に、それらを5000gで10分間遠心分離し、上清をデカントした。
【０１４５】
界面活性剤を除去するために、過剰量のリン酸バッファー中で同じ設定での遠心分離により、その後3回洗浄した。免疫グロブリン画分からのリポタンパク質の除去は、この画分にコレステロールが存在しないことによって確認した。
【０１４６】
抗クラミジア抗体の測定
一晩絶食した翌朝に肘前静脈から血液を採取し、血清を分離して試験を行うまで-20℃で凍結しておいた。
【０１４７】
抗クラミジア抗体の存在は、ヒツジクラミジア細胞との凝集反応およびELISA(組換え抗原に基づく)アッセイにより測定した。
【０１４８】
凝集反応では、供試血清の段階希釈液を、106個のヒツジクラミジア生菌とともに37℃で24時間インキュベートした。凝集塊の出現を700nmにて検出し、測定した。ELISAアッセイは製造業者の説明書(Medac)に従って行った。
【０１４９】
1：64以上の力価を血清反応陽性とみなした。
【０１５０】
脂質の過酸化の判定
脂質の過酸化は、分光光度法により測定されたMDA濃度のレベルとして評価した[Draper, H.H.ら,  Free Radic. Biol. Med. (1993) 15, 353]。この方法は、マロンジアルデヒドがチオバルビツール酸と反応する際の発色生成物の形成に基づく。
【０１５１】
血清リポタンパク質とクラミジアとの間の交差反応性
抗クラミジアアブザイムを含むIgG画分は、上記のようにヒトアテローム性動脈硬化性病変部から抽出した。この画分の100μl(1ml当たり1μg含有)を、健康なドナー由来の890μlの全血清または脱脂血清とともに37℃、pH5.7で1時間プレインキュベートした。
【０１５２】
リポタンパク質(および結合物質)を、既報の方法[Havel R.Jら, J. Clin. Invest. (1955) 34, 1345-1353.22]に従ってKBr溶液中での分取超遠心分離により血清から除去した。
【０１５３】
次に、10μl体積中の105個のクラミジア・プシタッシ細胞(Intervet)を血清に加えた。次いでクラミジア細胞との接触により誘発された酸化の量を上記の方法を用いて測定した。
【０１５４】
抗クラミジアアブザイムと血漿リポタンパク質との結合が存在する場合には、抗クラミジアアブザイムは超遠心分離により除去されるため、クラミジア細胞との接触時にさらなる酸化は認められない。
【０１５５】
抗クラミジアアブザイムと血漿リポタンパク質との結合が存在しない場合には、抗クラミジアアブザイムがサンプル中にまだ存在しているため、血漿とクラミジア細胞との接触時に酸化が認められる。
【０１５６】
抗クラミジアアブザイムのアッセイ
抗クラミジアアブザイムのアッセイに使用される試薬を以下に示す：
1. ヒツジクラミジア生菌(凍結乾燥形態)
2. PBS(細菌溶解用)
3. 0.05M 酢酸バッファー pH4.0
4. 40%トリクロロ酢酸
5. 1mM 2-チオバルビツール酸。
【０１５７】
サンプル中の触媒性抗クラミジア抗体の存在または量は以下のように検出した。
1. 被験血清のサンプルを0.05Mの酢酸バッファー(pH4.0)で1：1に希釈し、これらのサンプルの最終pHを5.6〜5.8の間にする。
2. 990μlの希釈血清を10μlの市販ヒツジクラミジア生ワクチンと混合する。
3. 次にサンプルを37℃で一晩(12〜16時間)インキュベートする。
4. 各サンプルに250μlの40%トリクロロ酢酸および250μlの1mM 2-チオバルビツール酸を加える。
5. 全てのサンプルを水浴中に入れて、30分間煮沸する。
6. サンプルを冷まし、3,000gで10分間遠心分離する。
7. 上清を回収してそれらの吸光度をλ525nmで測定して、脂質過酸化の生成物であるマロンジアルデヒド(MDA)の濃度を決定する。
【０１５８】
結果
実施例１
上記の方法を用いて患者のアテローム性動脈硬化性病変部からIgGを抽出した。このIgG画分には抗クラミジア抗体が存在することが認められた(図１)。
【０１５９】
抽出されたIgG画分の脂質酸化能を決定した。このIgG画分はヒツジおよびネコ両方のクラミジア・プシタッシ菌株において脂質の過酸化を引き起こすことが示された(表１)。この過酸化反応の反応速度分析から、この反応は酵素的特徴を持つことが示された(図２、３)。そのため、クラミジア細菌は、ヒトアテローム性動脈硬化性病変部から抽出されたそれらの抗体に対する基質と考えることができた。
【０１６０】
さらに非イオン性界面活性剤を用いて、抗クラミジアアブザイムに対するエピトープを検討した。クラミジアをTriton X-100またはIgepal CA-630で処理することにより、抽出されたアブザイムによる細菌中の脂質の酸化は失われた。ヒト血清低密度リポタンパク質を処理する場合についても同様の結果が得られた。
【０１６１】
このことは、触媒抗体に対するいずれのエピトープも高次構造性のものであり、かつ／またはその抗原の完全性がリポタンパク質およびクラミジア双方における脂質の酸化を誘導するために重要であることを示唆する。
【０１６２】
次に、抗クラミジアアブザイムの、血漿リポタンパク質と交差反応する能力を決定した。アテローム性動脈硬化性病変部から抽出したIgGを患者由来の血清とともにプレインキュベートし、抽出物中の抗リポタンパク質抗体を非修飾リポタンパク質と相互作用させた。次に、このリポタンパク質とそれに結合している抗体を超遠心分離により除去した。
【０１６３】
触媒性抗クラミジア抗体は、リポタンパク質とともに除去されたことが分かった(表２)。このことは、この触媒性抗クラミジア抗体が血清リポタンパク質およびヒツジクラミジア細菌株の両方と交差反応することを示す。
【０１６４】
次に、アテローム性動脈硬化症患者の血清中の抗クラミジア抗体の存在について検討した。ヒツジクラミジアを患者の血清に添加したところ、サンプル中で脂質過酸化の増大が起こった。同様の効果がネコクラミジア株を用いた場合にも観察された(表３)。
【０１６５】
観察されたこの効果は、患者血清中のIgG画分に脂質酸化性抗クラミジア抗体が存在することによるものである(表４)。従ってアテローム性動脈硬化症患者の血清由来の触媒抗体はリポタンパク質およびヒツジクラミジア双方と交差反応することが観察された。
【０１６６】
ヒト血清中の抗クラミジア抗体および抗リポタンパク質抗体の濃度の相関性分析から、これらのパラメーターは両方とも高い相関係数0.82を示す統計学的に有意な正の関連性を有することが分かった。このことはさらに、同じ抗体が両方の結合活性を有していることを示すものである。
【０１６７】
研究において、アテローム性動脈硬化症患者について上記のアッセイ法を用いたところ、アテローム性動脈硬化症の臨床合併症を患う患者の81%に触媒性抗クラミジア抗体が認められたのに対し、対照群では10%に認められただけであった(図４、表５)。このことは、これらの抗体がこの疾患の病因性マーカーであることを示す。
【０１６８】
この研究では、生体系における抗脂質／リポタンパク質アブザイムの存在が初めて示された。それらがアテローム性動脈硬化症においては出現するが、正常個体では出現しないことは、これらのアブザイムがこの疾患およびその合併症の病因において重要な役割を果たしていることを示す。そのことはまた、このような生化学的／免疫学的疾患の主たるものを、脂質過酸化、抗リポタンパク質抗体の出現およびクラミジア感染(これらは全てアテローム性動脈硬化症の発症に関与している)の活性化の点で、相互に関連付ける可能性がある。
【０１６９】
ある個体の血漿中の脂質酸化性抗クラミジア抗体の存在は、この疾患に特有の病理学的変化が既に始まっていることを示す。これらのアブザイムは脂質／リポタンパク質の酸化を担い、またこのプロセスは通常、アテローム性動脈硬化症の全身拡大の程度／強度と相関しており、抗脂質アブザイムのレベル／活性はこの疾病の重篤度を反映する。
【０１７０】
血漿／血清中のリポタンパク質プロフィールの変化および全コレステロールの増加はアテローム性動脈硬化症に関して確立された唯一の特有の危険因子である。しかし、これらの変化はこの疾患の臨床合併症を患う全ての患者のうちのわずか10〜15%についてしか検出できない。脂質酸化性抗クラミジア抗体の検出はアテローム性動脈硬化症の２番目の特異的マーカーであり、しかしながら上記の脂質パラメーターの測定よりもずっと高い診断的価値を有する。
【０１７１】
従って本明細書に記載の方法は、アテローム性動脈硬化症および関連病状の診断および予防に幅広く適用できる。
【０１７２】
実施例２
脂質過酸化の阻害
ヒト検体
第一臨床病院の心血管外科センター(Rostov-na-Donu, Russia)において腹部大動脈狭窄のバイパス手術の際に、年齢範囲53〜64歳の4人の男性患者から取り出したヒト大動脈の、進行したアテローム性動脈硬化性病変部から抗体を抽出した。これらのサンプルは回収後直ちに30% w/vのNaCl溶液中に入れて試験まで0〜4℃で1〜2週間保存した。
【０１７３】
対照実験では、この期間中、トリプシン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンパーオキシダーゼ、クレアチンキナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼなどの酵素の活性が、免疫グロブリン(IgG)の断片化レベルおよび脂質過酸化の程度(マロンジアルデヒドの濃度)とともに、有意に変化しなかったことを示した。
【０１７４】
大動脈片(湿重量で約200〜400mg)をおよそ10mgの切片になるよう切断し、1%非イオン性界面活性剤Igepal CA-630を含むPBS 5.0ml中に入れ、機械式ホモジナイザー(Ultra-Turrax)により、15mmプローブを用いて全出力でそれぞれ3秒間、冷却用の間隔20秒間をはさんで3回繰り返してホモジナイズした。ホモジナイズの後、5000g、10分間の遠心分離により不溶性成分を分離し、上清を分析に用いた。
【０１７５】
抗体の抽出
4人の異なる患者から得た4片の腹部大動脈の病変部から抗体を抽出し、別々に分析した。
【０１７６】
第1の工程では、この上清を、架橋した4%ビーズ状アガロースに結合させたプロテインAで37℃にて30分間処理した。次に、ビーズに結合した免疫グロブリン画分を5000gで10分間の遠心分離により沈降させ、上清をデカントした。沈降した免疫グロブリンに結合したリポタンパク質を除去するために、このサンプルを10% Igepal CA-630に再懸濁した。次に、それらを5000gで10分間遠心分離し、上清をデカントした。界面活性剤を除去するために過剰量のリン酸緩衝液中で同じ設定での遠心分離により、その後3回洗浄した。免疫グロブリン画分からのリポタンパク質の除去は、この画分にコレステロールが存在しないことによって確認した。
【０１７７】
リポタンパク質
従前に記載された方法[Havel R.J.ら, J. Clin. Invest. (1955) 34, 1345-1353]に従ってKBr溶液中の連続分取超遠心分離により、健康なドナーの血漿から低密度リポタンパク質(d=1.030〜1.050)を得た。この調製物中でLDLはすでに血漿免疫グロブリンと結合している可能性がある[Bauer B.J. et al Atherosclerosis (1982), 44, 153-160]。
【０１７８】
これらの免疫グロブリンは、LDLと、プロテインAに結合したそれら抗体との反応を妨げたり、または後者のタンパク質そのものに結合したりする可能性がある。これらの人工事象の可能性を避けるために、アフィニティー試験において病変部の抗体を用いるリポタンパク質の滴定の前に、飽和量のプロテインAアガロースビーズを用いて抗体が結合したLDLを除去することが重要であった。
【０１７９】
LDLレベルを(コレステロール濃度として)測定するために、リポタンパク質の新しいバッチごとに、また新しい実験ごとに、キャリブレーション曲線を作製した。
【０１８０】
病変部のIgGによるLDLの過酸化
供試抗酸化剤を加えた、または加えない(対照)、LDLサンプルを、病変部のIgGとともに37℃、pH5.6で16時間インキュベートした。マロンジアルデヒド(MDA)濃度としての脂質過酸化のレベルを、以下に示す方法で測定した。各サンプル1.0mlに250μlの40%トリクロロ酢酸および250μlの1mM 2-チオバルビツール酸を加えた。サンプルを水浴中で30分間煮沸した後、それらを冷まし、3,000gで10分間遠心分離した。上清を回収してその吸光度をλ525nmで測定した。
この実験の結果を表６に示す。
【０１８１】
抗酸化活性を有する各種阻害剤は、アテローム性動脈硬化性プラークから単離された抗体の脂質酸化活性を本アッセイの検出限界以下に減少させることが認められた。よってこれらの化合物は全て脂質酸化抗体の活性を阻害する。
【０１８２】
単離されたアブザイムを以下に示すクラスの種々の抗酸化阻害剤存在下で、本明細書に記載の触媒活性に関してin vitroでアッセイした。
鉄(Fe2+)キレート剤−テトラサイクリン
銅(Cu2+)キレート剤−DDC、アスピリンおよびペニシラミン
一般金属キレート剤−CN-、N3、DTPA(遊離イオンのみキレートする)、およびピコリン酸
結果は表１１に示す。
【０１８３】
これらの結果は、アブザイム阻害が鉄原子のキレート化ではなく銅原子のキレート化を介して起こることを示す。3種の別個の銅キレート剤が活性を阻害することが示され、これらの結果はアブザイムが触媒中心としての結合銅イオンと接触することを示唆する。
【０１８４】
実施例３
脂質酸化性抗クラミジア抗体活性の低下の臨床例
患者−A.M.P.。白人。男性。43歳。息切れとともに一過性の非刺激性胸痛を訴える狭心症の初期ステージに似た臨床症状。しかしながら、ECGでは心臓に病理学的変化は認められなかった。
【０１８５】
2000年12月27日の血液検査の結果では、全コレステロールおよびLDLコレステロールレベルは正常であった。抗クラミジアIgGおよびIgA抗体の力価は両方とも1:64であった(ELISA, Medac)。しかし、脂質酸化性抗クラミジアアブザイムが検出され、その活性は血清1mlあたり32μM MDAであった(3回測定の平均値)。
【０１８６】
以下に示すような3ヶ月間にわたる毎日の処置が推奨された：塩酸テトラサイクリン500mgと抗酸化剤カクテル(ビタミンE 20mg、ビタミンA 1.5mg、ビタミンB6 3.2mg、アスコルビン酸180mg、グルコン酸亜鉛 30mg、L-セレノメチオニン100μg)との併用。
【０１８７】
この治療法の開始後3ヶ月で、胸部痛および息切れの訴えはなくなった。処置終了時点であり処置開始からほぼちょうど3ヶ月に当たる3月末に、患者血清を分析したところ、抗クラミジアIgGおよびIgA抗体力価に変化は認められなかった(1:64 (ELISA, Medac))。一方で、抗クラミジアアブザイムの存在は検出されなかった。
2週間後に重ねて行った試験の結果も同様であった。
【０１８８】
実施例４
ヒツジ血清の脂質過酸化に対するヒツジクラミジアの影響
標準法を用いてヒツジにクラミジア細胞をワクチン接種し、アブザイム活性について試験した。結果を表１０に示す。
【０１８９】
ワクチン接種前のヒツジは無病で健康であり、クラミジアを投与する場合としない場合とでアッセイレベルに有意な変化は認められなかった。
【０１９０】
ワクチン接種後、ヒツジは非常に高い抗クラミジア抗体レベルを示したが、アブザイムのレベルは有意でないか全く示されなかった。
【０１９１】
流産後(野生型)とは、子宮の血管系の閉塞により流産してしまったクラミジア症のヒツジを意味する。これらのヒツジにおいてクラミジア投与により確認されるアブザイム活性レベルは、クラミジアを投与しない場合よりも有意に高かった。
【０１９２】
これらの結果は、クラミジアワクチンの投与が脂質酸化抗体の産生を減少させるか、または妨げる可能性を示す。
【０１９３】
実施例５
アブザイム活性と動脈狭窄との関連性
2つの異なる臨床群において、脂質酸化性抗クラミジア抗体の活性および動脈狭窄の程度を調べた。第1の群は虚血性心疾患(IHD)の患者からなり、第2の群は虚血性脳血管疾患(ICD)の患者からなる。
【０１９４】
冠状動脈狭窄
この試験の予備的な結果から、IHD患者の抗クラミジアアブザイムの活性と冠状動脈狭窄の重篤度との間には有意な正の相関関係がみられる(図５)。
【０１９５】
冠状動脈狭窄の程度と、トリグリセリド、全コレステロールおよび低密度リポタンパク質のコレステロール、LDL-コレステロールのような血清脂質との間に関連性は認められなかった(図６、７、８)。
【０１９６】
大脳動脈狭窄
ICD患者群において、アブザイムレベルと動脈狭窄との間に有意な正の相関関係が認められた(図９)。
【０１９７】
IHD患者群と同様に、この群においても動脈狭窄の程度と血清トリグリセリド、全コレステロールおよびLDLコレステロールとの間に関連性はなかった(図１０、１１、１２)。
【０１９８】
これらの実験は、抗クラミジアアブザイム活性と心臓および脳の両方の動脈の狭窄の程度との間の正の関連性を明らかにし、これらの抗体がアテローム性動脈硬化症の発症および進行の両方に関与していることを示す。
【０１９９】
実施例６
アセチルサリチル酸(アスピリン)を用いるアブザイムの阻害
表１３および１４に示したデータは、アセチルサリチル酸(アスピリン)をヒトに投与した場合、アセチルサリチル酸(アスピリン)が抗クラミジア脂質酸化アブザイムの活性を阻害することができることを示している。
血液中のこれらのアブザイムのアブザイム活性が著しく高い冠状動脈性心臓病(CHD)の患者を、250mgの日用量のアスピリンを用いて処置した。
【０２００】
1週間後、これらの患者の血液検査で、アブザイム活性の大幅な阻害が示された。1人の患者においては5分の1、他の2人においては検出できないほど低いレベルであった(表１３)。
【０２０１】
上記の実験でのアスピリンの投与が、患者の体からのアブザイムの自然な排泄に一致する可能性を排除するため、またin vivoにおけるアスピリンの抗クラミジア脂質酸化アブザイムに対する効果を検討するために、以下に示す実験を行った。
【０２０２】
アスピリンを毎日定期的に250mg服用していた、無症候性心筋虚血の患者Fを特定した。患者Fの血液中のアブザイムレベルを測定したところ、ほとんど検出できなかった。
【０２０３】
患者Fが1週間の間アスピリン服用を停止したところ、血液中のアブザイムレベルが同様に測定された。患者Fの血清中に有意なレベルの脂質酸化アブザイムが認められた。
【０２０４】
患者Fは従前のアスピリン250mg/日を投与する療法を再開し、7日後にアブザイムレベルを測定した。これらのアブザイムレベルは、患者がアスピリンを服用していなかった時のレベルに比べて有意に減少した(表１４)。
【０２０５】
これらの実験経過の間に、患者に呼吸器疾患またはその他の病的状態の徴候は見られなかった。このことは、報告されたアブザイム活性の変動がこの患者のアスピリン摂取に関連していたことを示す。
【０２０６】
結論として、本発明のデータは、アセチルサリチル酸がin vivoで、特にアテローム性動脈硬化症の臨床合併症を患う患者において、脂質酸化性抗クラミジア抗体を阻害することを示している。
【０２０７】
実施例７
クラミジア細胞と交差反応する抗体
ヒトApo-Bに特異的な抗体の市販品を、ヒツジクラミジア・プシタッシ(Intervet)と交差反応する能力について試験した。
【０２０８】
抗Apo-B抗体調製品は、ヒツジクラミジアにも結合する画分を含有することが認められた(図１３）。
【０２０９】
よってApo-Bは、クラミジア膜に存在するエピトープと同一のエピトープを有する。このエピトープに結合する抗体は、クラミジア細胞およびヒトApo-Bと交差反応する。
【０２１０】
実施例８
in vivoにおけるアブザイム活性に対する抗クラミジア薬の作用
年齢45〜62歳の安定狭心症の患者に、アジスロマイシン500mgを1日1回、15日間および30日間投与するか、またはアジスロマイシン500mgとアスピリン250mgを毎日15日間投与するかのいずれかによって処置した。
処置前および処置後のアブザイム活性を、第1群は表１５、第2群は表１６に示す。
【０２１１】
15日後、両群の患者のアブザイム活性は有意に減少し、アジスロマイシンとアスピリンを投与した群においてその減少は特に大きかった。LDLレベルの減少も認められた、いずれの患者においても副作用の報告はなかった。
【０２１２】
処置期間中、患者の臨床病状にも改善がみられた(表１７)。
抗クラミジア薬であるアジスロマイシンを、特にアスピリンと併用して2週間にわたり投与したところ、狭心症を患う患者のアブザイム活性が減少し、臨床病状が改善された。
【０２１３】
実施例９
in vivoにおけるアブザイム活性
本明細書に記載した方法を用いて、5組の被験者のアブザイムレベルを測定した。対照群は現行の手法により健康であると判定された。無症候性虚血群は、ECG運動負荷テストで虚血性であることが分かったが健康障害の自覚はない個体であった。安定または不安定狭心症を患う個体群、および心筋梗塞を患った個体群も試験した。
【０２１４】
各群のアブザイムレベルの平均を表１８に示した(表中、ｎは各群の個体数を表す)。本明細書に記載の方法を用い、クラミジア細胞を投与した際に脂質酸化の15%の増加が観察されれば、その個体はアブザイム陽性であるとみなした。各群のアブザイム陽性率も表１８に示した。この表の値はいずれもアスピリンを服用している個体についての調整は行っていない。
【０２１５】
アブザイム活性レベルおよびアブザイム陽性と判定された個体の割合が、その個体の病状の重篤度と相関することが示された。アブザイム活性は心臓発作後に激減することが認められた(不安定狭心症と急性期心筋梗塞の値を比較)。心臓発作後生き長らえた患者において、その後のアブザイム活性は徐々に増加する。
【０２１６】
このことはアブザイムが心筋梗塞の誘発に積極的な役割を果たすことを示唆している。アブザイムは、血管をふさいで梗塞を引き起こす血栓溶解性凝血塊の凝集メカニズムの一部を担っている可能性がある。この凝血塊中への凝集により、血管系中の検出可能なアブザイム活性は減少する。梗塞後、凝血塊が溶解するにつれて検出可能なアブザイム活性は増加する。
【０２１７】
実施例１０
in vivoにおけるアブザイム活性に対するアスピリンの影響
安定狭心症または不安定狭心症のクラスI、クラスIIおよびクラスIIIに当たる個体の群において、本明細書に記載の方法を用いてアブザイム活性を測定した。個体にはアスピリン服用の有無を問診した。アスピリン服用の報告の有無により個体をさらにサブグループに分けて、結果を表１９に示した。これらの結果は、アスピリンを服用しているが報告しなかった個体についての調整はされていない。
【０２１８】
表１９に示した数字は、各群の個体のアブザイム活性の値である(すなわち、クラスIアスピリン服用者およびアスピリン非服用者など)。
【０２１９】
これらの結果はアブザイムレベルが疾患の重篤度と一致することを示す。一般にアスピリン服用者は、同じ臨床病状のアスピリン非服用者よりもアブザイム活性が低い。
【０２２０】
実施例１１
アテローム性動脈硬化性疾患の動物モデル
ウサギに、1×107.5個のクラミジア細胞を含有するニワトリ胚の10%懸濁液1.5mlを気管内投与することにより、クラミジア・プシタッシ(Lori株)に感染させた。このウサギの血清を、標準的な血液採取経路により心臓から、0日目(感染前)に、そしてその後14日ごとに採取した。
【０２２１】
次にこの血清を標準ELISAアッセイに用いて、抗クラミジアIgG力価を測定した。同じ血清サンプルを用いて、クラミジアアブザイムレベルの量を上記の標準アッセイにより測定した。アブザイムの出現は、抗クラミジアIgG抗体の発現と相関していた。
4個体のウサギについての結果(感染3個体、対照1個体)を表２０に示す。
【０２２２】
これらの結果は、クラミジアに感染させることによりアブザイムレベルの高い動物モデルを作製できることを示す。このモデルはアブザイムにより引き起こされる疾患の進行の追跡、およびクリアランス速度のような種々のパラメーターの測定に有用である。また、このモデルはアブザイムレベルを減少させ、同時に症状を改善させるための薬物候補としての化合物を試験する上で有用である。
【０２２３】
実施例１２
ウサギにおける抗クラミジアアブザイム
クラミジア・プシタッシの気管内感染により、上記のように作製されたウサギモデルを用いて、脂質酸化性抗クラミジア抗体の産生を証明した。
【０２２４】
結果を表２１に示す。ウサギを、1×107.5細胞のクラミジア・プシタッシ(Lori株)を含有するニワトリ胚の10%懸濁液1.5mlを用いて気管内感染させた後、ウサギの心臓から血液を採取した。ワクチン、ホルマリン処理された1×107.5個のクラミジア・プシタッシ(Lori株) (表２１の§)を皮下注射した後7日目のアブザイムレベルを示す。
【０２２５】
アブザイムの出現は、ELISAにより検出された抗クラミジアIgGの蓄積と一致していた。感染14日目に同じ細菌ではあるがホルマリン処理した調製物を注射した場合(ウサギ3)、この接種後の7日目にELISAによる抗クラミジアIgG力価の増加がもたらされた。一方、このウサギの血清中のアブザイム活性は131から64μM MDA/mlへと2分の1に減少した。
【０２２６】
この接種を受けなかった他の2匹のウサギにおいてはこのようなアブザイム活性の減少はみられなかった。
【０２２７】
このように、クラミジア抗原のワクチン調製物の接種により抗クラミジアアブザイムの存在／活性の減少が認められた。
【０２２８】
実施例１３
虚血性心疾患における抗アブザイム治療
虚血性心疾患(IHD)患者30人の群を、血清中の抗クラミジアアブザイム活性を減少／排除する実験的治療のために選択し(治療群)、「同等の」患者20人の群は処置しなかった(非処置患者対照群)。この試験はサラトフ心臓病学センター(ロシア連邦)において2002年6月から8月まで行われた。
【０２２９】
この治療群は23人の男性患者および7人の女性患者からなり、平均年齢は55±1.1歳であった。アブザイムレベルをモニターするための患者対照群は20人のIHD患者からなり、そのうち15人は男性患者、5人は女性患者であり、平均年齢は53±1.2歳であった。各患者には試験への参加に関して書面による承諾をとった。
【０２３０】
全ての患者はカナダ心臓病学協会の分類によるクラスII〜IIIの狭心症であった。治療群の15人の患者および患者対照群の10人の患者は過去に心筋梗塞の病歴があった。第1群の他の15人および患者対照群の10人についてのIHD診断は冠状動脈造影法により確認し、70%以上の動脈狭窄が検出された。
【０２３１】
アテローム性動脈硬化症の全身拡大の程度または重篤度以外は、全ての群は年齢、性別および危険因子のみならず薬物療法、硝酸塩剤、β-遮断薬、アンギオテンシン変換酵素阻害剤などについても一致していた。
【０２３２】
患者の臨床病状の進行は、トレッドミル運動負荷／ストレスECGテストのための改変型Bruceプロトコール、Rose-Blackburn質問表(Cardiovascular Survey Methods. WHO, Geneva, 1968)を用いてモニターした。
【０２３３】
試験のための患者の選択に用いる主要なパラメーターは、15μMマロンジアルデヒド(MDA)/ml血清を超える抗クラミジアアブザイム活性レベルである。この治療群を4つの治療上のサブグループに分けた。
1.)  治療群A−抗クラミジアアブザイムの非特異的阻害剤であり、抗菌特性も有するアジスロマイシンが500mg/日の用量で処方された。
2.)  治療群B−同用量のアジスロマイシンとアセチルサリチル酸(アスピリン)の併用投与が処方された。後者はその活性中心の銅イオンをキレート化することにより特異的にアブザイムを阻害する明らかな能力を有する。アスピリンの用量は250mg/日であった。
3.)  治療群C−抗酸化特性を有するアブザイムの2種類の非特異的阻害剤である、前記の群と同用量の抗菌薬アジスロマイシン、およびビタミンE、A、C、の併用投与が処方された。ビタミンEは30mg/日、ビタミンAは1,500EU/日およびビタミンCは90mg/日の用量であった。
4.)  治療群D−この群の患者にはアスピリンのみを250mg/日の用量で投与した。
【０２３４】
3群全ての患者の血液を2週間ごとに試験した。抗クラミジアアブザイム活性の抑制／排除の効率に応じて治療を継続し、試験結果はプラシーボ／治療薬の投与後最大60日までを示す。
【０２３５】
治療群において、上記の方法を用いて抗クラミジア抗体の力価を測定した(表２８参照)。臨床症状の重篤度も判定した(表２８参照)。
【０２３６】
抗クラミジアアブザイム活性の抑制をモニターした結果を以下の表に示す(表２２〜２７)。
【０２３７】
最初に、治療を始めて2週間で、全ての群でアブザイム活性の著しい減少が認められた。最も顕著だったのは非特異的阻害剤であるアジスロマイシンと特異的阻害剤であるアスピリンを併用した治療群Bであった(表２３）。実際、この群の活性レベルは臨床的に健康な個体のレベルに達した(総括した表２８を参照)。重要な観察結果は、この群の患者TGB7のアブザイムレベルが45日目に(アスタリスク2個−表２３)大幅に増加したことであり(これは臨床症状の悪化と相関した)、次いでさらに15日投与した後、その患者は回復し始め、アブザイムは0にまで減少した。また、TGB7は、45日目のアブザイムレベルの増加と同時に、ApoBレベルの増加も示した(アスタリスク−表７参照)。
【０２３８】
最も効果の低かった治療法は、治療群A(アジスロマイシン単独−表２２)であり、患者の27%(11人中3人、アスタリスクで示す)においては15日後のアブザイム活性に変化は認められなかった。しかし、第1の群において継続的に減少していた大多数の患者のうち2人は試験30日目に結果が逆転した(TGA2およびTGA6、表１、2つのアスタリスクで示す)。この結果と、何人かの患者では減少してはいるが依然としてかなりのアブザイム活性レベルが残存している事実と併せて、投与をさらに30日延長した結果、全ての患者において有意な減少が認められた。治療群Aにおいて患者TGA2およびTGA6の臨床症状は15日間は改善し、アブザイムレベルの減少と相関していたが、試験の30日目ごろに臨床症状が悪化してアブザイムレベルも増加した(2つのアスタリスク−表２２)。
【０２３９】
治療群C(アジスロマイシンおよび抗酸化剤)においては、1人の患者(TGC1)はアブザイム活性が減少しなかった(アスタリスク−表２４)。
【０２４０】
アジスロマイシンは投与せず、処方された用量のアスピリン単独を使用した場合にもアブザイム活性の減少が引き起こされたが、併用投与でみられたものよりもその程度は低かった(治療群D−表２５)。
【０２４１】
適用した抗アブザイム治療法は、改変型Rose-Blackburn質問表により評価され、トレッドミル運動負荷／ストレスESGテストを使用して確認したところ、大多数の患者の臨床病状を有意に改善した(表２７)。一方、対照群においては積極的な臨床学的動態を示した患者は1人もいなかった。表２７において、PCGは患者対照群、§は免疫蛍光アッセイによって得られた結果、§§は免疫酵素的アッセイによって得られた結果、§§§は免疫比濁アッセイによって得られる結果を示す。*は統計学的有意差を示す。
【０２４２】
以下の凝集パラメーターについて統計学的に有意な変化は認められなかった：カオリン凝固時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間。血清クレアチニンおよび肝酵素アラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのレベルに変化は認められなかった。
【０２４３】
実験的治療群のどの患者も、この試験に選ばれる以前の数ヶ月／数年の間、臨床病状に好ましい変化がなかった。従って、好ましい動態が認められない状態を、著しい臨床学的改善が観察された患者についての「内在性」対照として用いることができる。
【０２４４】
抗菌特性を有するアブザイム阻害剤の本来の集中治療は、完全に抗クラミジアIgGの存在を排除した。
【０２４５】
抗クラミジアアブザイムを標的とすることにより、脂質濃度および血栓症における著しい改善がもたらされた(表２７)。従って、アテローム性動脈硬化症における脂質代謝および凝固系の異常の発生が、これらの脂質酸化性触媒抗体の出現に対して二次的なものであることが示唆されうる。
【０２４６】
試験のために選択された30人の患者中15人(50%)だけが、試験前にクラミジア感染について陽性と判定されていたため、観察されたアジスロマイシンの有益な効果を、その抗細菌特性により説明することはできなかった。他の8人の患者の血清中の抗クラミジアIgGレベルは有意ではなく免疫蛍光アッセイでは1:32を下回っていた。他の7人の患者は陰性と判定された。
【０２４７】
診断学的試験は、ある患者がアブザイムを保持しているかどうかは、その患者がクラミジアIgG抗体について陽性であることと必ずしも相関しないことを示している。よってこの治療法はクラミジアについて血清反応陽性であることに基づいて処方されるべきではない。このことは、この診断学的試験が、正しい治療とその後のこの治療を用いるアブザイムのクリアランスをモニターするための反復予後診断試験を行うことと関連付けられる場合には、本発明における有用性を示す。
【０２４８】
治療用診断(theranostic)試験では、特定のIHD患者の抗クラミジアIgG抗体は陰性であったがアブザイムは陽性と判定された。これらの患者の、投与前および投与後のアブザイムおよびRose-Blackburnテストスコアを表２９に示す。これらの患者は処置されて、アブザイム活性が減少し、その後臨床症状も改善された。
【０２４９】
これらの結果は、患者がアブザイムを保持しているかどうかはその患者がクラミジアIgG抗体について陽性であることとは必ずしも相関しないことを示している。アテローム性動脈硬化性病状は、クラミジアについて血清反応陽性であることに基づいて診断または治療処方することはできない。しかし、アブザイムはアテローム性動脈硬化性病状の診断マーカーとして有用であることが示されているので、それは適切な治療とその後のアブザイムのクリアランスをモニターするための反復予後診断試験を行うことと関連付けられる。
【０２５０】
実施例１４
アジスロマイシンの抗アブザイム／抗酸化特性
アテローム性動脈硬化性病変部から単離されたアブザイムに対するアジスロマイシンの阻害活性を上記のように測定した。その結果を表３０に示す。それぞれの数は、ヒツジクラミジアワクチン('Intervet')を0.5の免疫用量で投与する前および後の被験血清中のMDA蓄積レベル間の差として計算された2回測定／3回測定の平均値である。(**)で示された場合は、DMSOの影響を測定値から差し引いた。
【０２５１】
アジスロマイシンはアブザイム活性のin vitroでの強力な阻害剤であることが分かった。この活性は、アジスロマイシン投与後のアブザイム活性の急激な減少のような、アジスロマイシンにより認められるin vivoにおける生物学的作用を担っている可能性がある。
【０２５２】
実施例１５
クラミジアの膜の完全性とアブザイム活性
ホルマリン、硫酸アンモニウムまたはSDS処理されたクラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)またはクラミジア・プシタッシ(Chlamydia psittaci)のサンプルを用いて、上記のようにアブザイム活性を測定した。これらの反応において、試験系中で脂質酸化反応は認められなかった。
【０２５３】
非イオン性界面活性剤である1% Triton X-100およびIgepal CA-630、10%DMSO溶液を含むカオトロピック剤でクラミジア細菌を処理した場合、その系中の膜脂質の存在は維持されるが、細菌の膜の完全性は破壊されて、脂質酸化反応の発生は完全に失われた。
【０２５４】
これらの実験は、脂質がこの試験系中で生じている脂質過酸化反応の誘導および進行のために重要であることを示す。特に前記の処理で破壊されるリポ多糖の役割が示される。
【０２５５】
実施例１６
症例経過
症例番号1
64歳の男性患者は、狭心症の最初の症状がみられた3年前に虚血性心疾患であると診断された。この診断は冠状動脈造影法で確認され、2つの動脈の狭窄が明らかになった：右冠状動脈の75%、前心室内動脈の100%が閉塞。
【０２５６】
この患者は血清中にアブザイムが検出されたという理由で治療用診断(theranostic)試験のために選ばれた。2つのアブザイム阻害剤を、アジスロマイシンを500mg/日の用量で、そしてアスピリンを250mg/日の用量で、併用した。患者の抗クラミジアIgGレベルは高く、力価は1:256であった。
【０２５７】
改変型Rose-Blackburnプロトコールのスコアにより評価された投与前の臨床病状は、19であった。アブザイム活性は25μM MDA/ml、全コレステロールレベルは226 mg/dL、トリグリセリドは90 mg/dL、HDLコレステロールは56 mg/dL、LDLコレステロールは73 mg/dL、ApoAは139 mg/dL、ApoBは81 mg/dL、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)は25 U/L、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)は29 U/L、クレアチニンは0.71 mg/dLであった。
【０２５８】
投与期間中、顕著な副作用はみられなかった。治療開始後の最初の来院時に(15日目)、この患者はその疾患の徴候がある程度改善したことを報告した。この改善は治療30日目まで続いた。このことは、改変型Bruceプロトコールによるトレッドミル運動負荷ESGテストの耐容時間の増加により支持された。
【０２５９】
その時点ではアブザイム活性のみならず抗クラミジアIgGも患者血清中からは検出されなかった。脂質パラメーターのレベルも改善した。総コレステロールレベルは172 mg/dL、トリグリセリドは80 mg/dL、HDLコレステロールは52 mg/dL、LDLコレステロールは64 mg/dL、ApoAは110 mg/dL、ApoBは67 mg/dLに減少した。ALT、ASTおよびクレアチニンのレベルは、それぞれ25 U/ml、27 U/ml、および0.7 mg/dLと同程度に維持された。
【０２６０】
治療開始から45日目に至ったとき、患者は1週間前つまり開始から38日目に病状が悪化し始めたこと、つまり狭心症発作の頻度および強度が突然増加したことを報告した。このことは、80μM MDA/mlに達したアブザイム活性の上昇と一致していた。しかし、「従来の」抗クラミジアIgGが認められなかったことに注目することは重要である。
【０２６１】
それと同時に、脂質代謝のパラメーターも悪化した。総コレステロールは185 mg/dL、トリグリセリドは143 mg/dL、LDLコレステロールは74 mg/dL、ApoAは115 mg/dL、ApoBは87 mg/dLに増加した。HDLコレステロールレベルおよびApoAレベルは本質的には同程度に保持され、50 mg/dL および115 mg/dLであった。重要な観察結果は、肝酵素のレベルも変化したことであり、ALTが35 U/Lに、ASTが39 U/Lに増加し；クレアチニン濃度は0.8mg/dLであった。
【０２６２】
しかし、治療継続によりアブザイム活性は完全に抑制／排除されたように思われ、いくつかの脂質パラメーター濃度においても改善が認められた。総コレステロールは165mg/dLに、トリグリセリドは100mg/dLに減少した。HDLコレステロール濃度は47mg/dL、LDLコレステロールは72mg/dL、ApoAは112mg/dLであった。ALT、ASTおよびクレアチニンはそれぞれ24U/ml、25U/mlおよび0.7mg/dLとなった。
【０２６３】
一方、ApoBレベルは投与前のレベルである80mg/dLのままであった。最初に改善した臨床病状も治療開始前のレベルに戻り、Rose-Blackburnスコアは19であった。患者の臨床パラメーターを改善する試みとともに抑制されたアブザイムレベルで安定化するため、処方された抗アブザイム治療を続けることが推奨された。
【０２６４】
この患者においては、治療開始の15日目から抗クラミジアIgGは検出されず、アジスロマイシンの継続使用は、細菌感染それ自体ではなく、リポタンパク質に結合して酸化する交差反応性アブザイムを抑制されたレベルに制御することを目的とした。
【０２６５】
症例番号2
2002年2月21日に46歳の男性患者が急性心筋梗塞で入院し、IHDと診断された。その患者は、それ以前には心臓病の病歴はなかった。その後5月に冠状動脈造影を行い、冠状動脈に狭窄／狭小化は無いことが示された。
【０２６６】
この患者は血清中の抗クラミジアアブザイム活性がかなり高いという理由で治療用診断(theranostic)試験に選ばれた。その値は140μM MDA/mlであった。2つのアブザイム阻害剤の組み合わせである、アジスロマイシンを500mg/日の用量、およびビタミンE、A、Cの抗酸化剤カクテルが、処方された。ビタミンEは30mg/日、ビタミンAは1,500EU/日およびビタミンCは90mg/日の用量であった。
【０２６７】
投与前または投与期間中、この患者の血清中に検出可能なレベルの「従来の」抗クラミジアIgA、IgGまたはIgMは検出されなかった。改変型Rose-Blackburnプロトコールのスコアにより評価された投与前の臨床病状は17であった。総コレステロールレベルは205 mg/dL、トリグリセリドは129me/dL、HDLコレステロールは39mg/dL、LDLコレステロールは80mg/dL、ApoAは152mg/dL、ApoBは221mg/dLであった。
【０２６８】
投与中、顕著な副作用はみられなかった。患者は投与の最初の2週間経過後から疾患の徴候にある程度の改善を感じ始めた。この改善は60日間の治療期間全体を通して続いた。このことは、改変型Bruceプロトコールに従って行われたトレッドミル運動負荷ESGテストの耐容時間の有意な増加により支持された。
【０２６９】
60日後の観察期間終了時には、アブザイム活性のみならず抗クラミジアIgGの存在も患者血清中からは検出されなかった。
【０２７０】
アブザイム活性のこれらの変化は、患者の臨床病状における顕著な改善と一致していた。改変型Rose-Blackburnプロトコールのスコアは処置前の17から処置後は13に減少した。
【０２７１】
実施例１７
血栓症に対する抗アブザイム治療の効果
アテローム性動脈硬化性疾患の指標のうちの1つは、多くの場合、患者の血液が凝血塊を形成するのに要する時間に異常がみられることである(患者ではこれは通常増加している）。様々な経路により凝血塊形成が引き起こされ、そのため凝固時間に関しては国際的に認められた試験が4つある。1つは活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)と呼ばれており、トロンボプラスチンとカルシウムを添加し、内在性経路を測定することによって実施する。2つめはプロトロンビン時間(PT)と呼ばれ、外因性経路を単純に測定するものである。シリカ凝固時間(SCT)は、微細粒子(シリカ)により誘発された凝固を測定し、カオリン凝固時間(KCT)はより大きな粒子(カオリン)により誘発された凝固を測定する。これら全てについて、凝固時間が迅速であることは血栓症の危険度が高いことを示す。
【０２７２】
処置の前に、4つの全ての方法を用いて全治療群の全患者の凝固時間を測定し、平均と標準誤差を計算した。60日後に測定を繰り返した。対照は本研究での患者対照群(測定は1回行った。これらの患者についての値はその期間にわたって有意に変化しなかった)および臨床的に健康な対照群であった。処置の結果を表３２に示した。
【０２７３】
処置前の患者のAPTTテストについての平均値は22.4±0.89であり(患者対照群の対応する値は25.2±1.37)、臨床的に健康な群についての値49.1±7とは有意に異なっていた。処置後の患者は平均値46.9±6.45を示し、従ってこれは凝固時間の「正常範囲」内であり、すなわち、正常化された。
【０２７４】
処置前の患者のPTテストについての平均値は13.5±0.94であり(患者対照群の対応する値は17.3±4.05)、臨床的に健康な群についての値23.7±4.01よりも低かった。処置後の患者は平均値25.3±4.05を示し、従ってこれは凝固時間の「正常範囲」内であり、すなわち正常化された。
【０２７５】
処置前の患者のSCTテストについての平均値は151±15.0であり(患者対照群の対応する値は137±11.5)、臨床的に健康な群についての値248±10.0よりも有意に低かった。処置後の患者は平均値235±17.9を示し、従ってこれは凝固時間の[正常範囲」内であり、すなわち正常化された。
【０２７６】
処置前の患者のKCTテストの平均値は51.2±4.59であり(患者対照群の対応する値は50.3±2.16)、臨床的に健康な群についての平均値133±23.7とは有意に異なっていた。投与後の患者は平均値126±34.2を示し、従ってこれは凝固時間の「正常範囲」内であり、すなわち正常化された。
【０２７７】
これらの結果は、抗アブザイム治療法を凝固時間を正常化するために使用することができ(全て国際的に認められた凝固時間アッセイを用いて)、そして血栓症、およびそれによる心臓発作および卒中のリスクを低減し得ることを示している。
【０２７８】
図１４に示すin vitro実験の結果は、抗クラミジアアブザイムを含むアテロームIgG画分をタンパク質濃度0.5〜10mgで投与することにより、供試血漿のカオリン凝固に対して活性化された作用を示した。
【０２７９】
アブザイムと、活性中心のCu2+への結合を介してそれらの抗体を阻害するジエチルジチオカルバメートまたはアジ化ナトリウムのいずれかとのプレインキュベーションは、血漿凝固に対するアブザイムの作用を低下させた。
【０２８０】
これらのデータは、抗クラミジアアブザイムがヒト血漿の血栓症を直接的に阻害できること、およびそれが虚血性心疾患の発症において重要な要因であることを示している。
【表１】
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【０２８１】
【表２】
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【０２８２】
【表３】
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【０２８３】
【表４】
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【０２８４】
【表５】
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【０２８５】
【表６】
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【０２８６】
【表７】
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【０２８７】
【表８】
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【０２８８】
【表９】
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【０２８９】
【表１０】
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【０２９０】
【表１１】
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【０２９１】
【表１２】
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【０２９２】
【表１３】
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【０２９３】
【表１４】
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【０２９４】
【表１５】
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【０２９５】
【表１６】
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【０２９６】
【表１７】
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【０２９７】
【表１８】
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【０２９８】
【表１９】
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【０２９９】
【表２０】
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【０３００】
【表２１】
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【０３０１】
【表２２】
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【０３０２】
【表２３】
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【０３０３】
【表２４】
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【０３０４】
【表２５】
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【０３０５】
【表２６】
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【０３０６】
【表２７】
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【０３０７】
【表２８】
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【０３０８】
【表２９】
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【０３０９】
【表３０】
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【０３１０】
【表３１】
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【０３１１】
【表３２】
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【図面の簡単な説明】
【０３１２】
【図１】100μlのヒツジクラミジアと、ヒトアテローム性動脈硬化性病変部から抽出したIgGとの間の凝集反応の結果を示す。
【図２】ヒトアテローム性動脈硬化性病変部のIgGの濃度に対するヒツジクラミジアの過酸化の相関関係を示す。クラミジアの濃度は一定とし、pHは5.7とした。
【図３】1.8μgヒトアテローム性動脈硬化性病変部のIgGによるヒツジクラミジアにおける脂質過酸化のミカエリス-メンテン反応速度論を示す。クラミジア懸濁液の見かけのKM＝13.3−16.1μl。pH5.7。
【図４】ヒト血清における脂質過酸化に対するヒツジクラミジア懸濁液の添加の影響を示す。細菌懸濁液10μlを1:1希釈した血清990μlに加えた。pH5.7。混合したサンプルは全て37℃で18時間インキュベートした(血清番号は表５と同じ)。
【図５】IHD患者における冠状動脈狭窄の程度と脂質酸化性抗クラミジア抗体の活性との間の相関を示す。狭窄の重篤度は、血管造影法により見積もられた冠状動脈狭窄の積分パラメーターとして計算されたスコアで示す。
【図６】冠状動脈狭窄の程度とIHD患者血清中のトリグリセリド濃度との間の関係を示す。
【図７】冠状動脈狭窄の程度とIHD患者血清中の全コレステロール濃度との間の関係を示す。
【図８】冠状動脈狭窄の程度とIHD患者血清中のLDL-コレステロール濃度との間の関係を示す。
【図９】大脳動脈狭窄の程度とICD患者血清中の脂質酸化性抗クラミジア抗体の活性との間の相関を示す。狭窄の重篤度は、血管造影法により見積もられた大脳動脈狭窄の積分パラメーターとして計算されたスコアで示す。
【図１０】冠状動脈狭窄の程度とICD患者血清中のトリグリセリド濃度との間の関係を示す。
【図１１】冠状動脈狭窄の程度とICD患者血清中の全コレステロール濃度との間の関係を示す。
【図１２】冠状動脈狭窄の程度とICD患者血清中のLDL-コレステロール濃度との間の関係を示す。
【図１３】抗アポリポタンパク質B抗体とクラミジアとの交差反応を示す。
【図１４】図１４は、血液凝固に対するアブザイム不活化の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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