(57)【要約】本発明は、ヒト疾患のための遺伝子治療に関する。より詳細には、本発明は、新脈管形成関連疾患を有する被験体を処置するための方法に関する。１実施形態において、ヒトＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸を、真核生物中で作動可能なプロモーターの制御下にて含むアデノウイルス発現構築物が、新脈管形成関連疾患を有する患者に投与される。従って、本発明は、ｍｄａ−７の発現および新脈管形成の阻害を介することによって新脈管形成関連疾患の処置を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新脈管形成を阻害するような治療を必要とする患者において、新脈管形成を阻害する方法であって、該方法は、ヒトＭＤＡ−７ポリペプチドまたはヒトＭＤＡ−７ポリペプチドを真核生物動物細胞で発現する核酸を該患者に投与し、それによって、ＭＤＡ−７ポリペプチドが該患者における新脈管形成を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記患者が新脈管形成関連疾患を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記新脈管関連疾患はさらに、新脈管形成依存性癌、良性腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、眼性新脈管形成疾患、Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群、心筋新脈管形成、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、創傷肉芽化、猫ひっかき病、潰瘍、腸管癒着、アテローム性動脈硬化症、強皮症、または過形成性瘢痕として定義される、方法。
【請求項４】
新脈管形成依存性癌が、固形癌、白血病または腫瘍転移としてさらに定義される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記良性腫瘍はさらに血管腫、神経腫、神経線維腫、トラコーマ、子宮類線維腫、過誤腫、奇形腫、または化膿性肉芽腫である、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であって、前記眼性新脈管形成がさらに、糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、盲腸後繊維増殖、または皮膚潮紅としてさらに定義される、方法。
【請求項７】
前記核酸が発現ベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス性ベクターが１０３ｐｆｕと１０１３ｐｆｕとの間で投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリーマウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記核酸がＣＭＶ  ＩＥ、ｄｅｃｔｉｎ−１、ｄｅｃｔｉｎ−２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２またはＭＨＣクラスＩＩ型プロモーターをさらに含む、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、ＭＤＡ−７ポリペプチドまたはＭＤＡ−７核酸が、新脈管形成の阻害が必要な領域に直接注入することによって、ヒトに投与される、方法。
【請求項１４】
前記患者が複数の注射を投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記注射が疾患部位に局所的に実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記注射が疾患部位に局部的に実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記注射が疾患部位に遠位で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＤＡポリペプチドまたは前記ＭＤＡ核酸が、連続的注入によって、前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＤＡポリペプチドまたは前記核酸が、静脈注射によって、前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＤＡポリペプチドまたは前記核酸が、外科手術前または外科手術後に、投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＤＡポリペプチドまたは前記核酸が化学療法、免疫療法、または放射線療法の前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＭＤＡポリペプチドまたは前記核酸が化学療法、免疫療法、または放射線療法の最中に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＭＤＡポリペプチドまたは前記核酸が化学療法、免疫療法、または放射線療法の後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＭＤＡポリペプチドが、配列番号２の１〜２０６のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＤＡポリペプチドが、配列番号２の４９〜２０６のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭＤＡポリペプチドが、配列番号１の７５〜２０６のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＭＤＡポリペプチドが、配列番号２の約１００〜約２０６のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＭＤＡポリペプチドが、配列番号２の１２５〜２０６のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＤＡポリペプチドが、配列番号２の１５０〜２０６のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＤＡポリペプチドが、配列番号２の１７５〜２０６のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭＤＡポリペプチドが、配列番号２の１８２〜２０６のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＭＤＡポリペプチドが、分泌シグナルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記分泌シグナルが疎水性コアと組み合わさった正に荷電したＮ末端領域としてさらに定義される、方法。
【請求項３５】
前記患者が癌患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
患者において内皮細胞分化を阻害する方法であって、該方法は、有効量のヒトＭＤＡ−７ポリペプチドまたは該ヒトＭＤＡ−７ポリペプチドを発現する核酸分子を、該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、化学療法剤が、前記ＭＤＡ−７ポリペプチドまたは前記核酸分子の投与前に、投与される、方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、化学療法剤が、前記ＭＤＡ−７ポリペプチドまたは前記核酸分子の投与後に投与される、方法。
【請求項３９】
前記化学療法剤がＤＮＡ損傷剤である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記ＤＮＡ損傷剤が、γ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カンプトセシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、または過酸化水素である、方法。
【請求項４１】
請求項３８に記載の方法であって、前記化学療法剤がシスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブチル、ビスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、タキソール、トランス白金、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、またはそれらのアナログもしくは誘導改変体である、方法。
【請求項４２】
前記核酸が、ウイルスベクターに含まれる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸が、脂質組成物中に含まれる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
患者において免疫応答を促進する方法であって、該方法は、該患者における免疫応答を誘導するのに有効な量のＭＤＡ−７ポリペプチドを被験体に提供する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、該方法は、前記患者に抗原を投与し、ここで、該抗原に対して免疫応答が促進される工程をさらに包含する、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、前記抗原が腫瘍抗原、細菌抗原、ウイスル抗原、または真菌抗原である、方法。
【請求項４７】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗原が細菌抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗原がウイルス抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗原が真菌抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４７に記載の方法であって、前記腫瘍抗原がＰＳＡ、ＣＥＡ、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ｇｐ１００、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、またはＰＭＳＡである、方法。
【請求項５２】
請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記ＭＤＡ−７が、前記被験体に発現構築物を投与することによって、該患者に提供され、ここで、該発現構築物は、配列番号２の少なくとも５０連続したアミノ酸をコードする核酸配列を含み、ここで、該核酸配列はプロモーターの転写調節下にある、方法。
【請求項５３】
前記発現構築物がウイスル性ベクターである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、ここで、前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはポリオーマウイルスベクターである、方法。
【請求項５５】
請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記抗原が前記患者に発現構築物を投与することによって提供され、該発現構築物は、該抗原をコードする核酸配列を含み、ここで、該核酸配列は、プロモーターの転写制御下にある、方法。
【請求項５６】
請求項４４に記載の方法であって、前記ＭＤＡ−７および抗原またはそれらの両方が前記被験体に１回より多く提供される、方法。
【請求項５７】
請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記ＭＤＡ−７、抗原、またはそれらの両方が、静脈内、直接的、腹腔内、局部的、全身的、または経口的に、前記患者に提供される、方法。
【請求項５８】
請求項４４に記載の方法であって、前記ＭＤＡ−７および抗原が同時に前記被験体に提供される、方法。
【請求項５９】
細胞中で、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、またはＴＮＦαの発現を誘導する方法であって、該方法は、有効量の、ＭＤＡ−７ポリペプチドまたは該ＭＤＡ−７ポリペプチドを発現する核酸を、該細胞に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６０】
ＩＬ−６の発現が誘導される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＴＮＦαの発現が誘導される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
ＩＦＮγの発現が誘導される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞が患者の中に存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
癌患者において、化学療法または放射性療法から細胞損傷を低減するための方法であって、該方法は、有効量の、ヒトＭＤＡ−７ポリペプチドまたは該ヒトＭＤＡ−７ポリペプチドを発現する核酸を、発該該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６５】
前記ＭＤＡポリペプチドまたは前記ＭＤＡ核酸が、化学療剤または免疫療剤が投与されるときに投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＭＤＡポリペプチドまたは前記ＭＤＡ核酸が化学療剤または免疫療剤が投与された後に投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＭＤＡポリペプチドまたは前記核酸が、前記患者に１以上投与される、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本願は、２０００年、１２月７日に出願された米国特許出願番号６０／２５４，２２６（その全体を、本明細書において参考として援用する）への優先権の利益を主張する。政府は、公衆衛生局助成金Ｐ０１ＣＡ７８７７８−０１Ａ１、国立衛生研究所からの助成金番号ＣＡ７３９５４、ならびに国立がん研究所からの助成金番号ＣＡ８６５８７およびＣＡ８９７７８により、肺癌（Ｐ５０−ＣＡ７０９０７）（Ｊ．Ａ．Ｒｏｔｈ）におけるｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ（ＳＰＯＲＥ）に従って、本発明において権利を所有し得る。
【０００２】
（Ａ．発明の分野）
本発明は一般的に、遺伝子治療の分野に関係する。より詳細には、本発明は、血管形成を阻害することによる、血管形成に関係する疾患の処置（抗血管形成治療）のための治療的核酸の投与の方法に関係する。１つの実施形態において、本発明は、血管形成を阻害することによる、血管形成に関係する疾患の処置のための、ヒトｍｄａ−７タンパク質をコードする核酸の発現に関係する。
【０００３】
（Ｂ．関連技術の説明）
（１．血管形成）
血管は、以下の２つのプロセスによって構成されている：脈管形成（これによって、初期の血管ネットワークが、多能性間葉前駆体から、胚形成の間に構築される）；および血管形成（ここでは、既存の血管が、毛細管新芽を送り出し、新しい血管を生じる）。内皮細胞は、各々のプロセスにおいて中心的に関与する。内皮細胞は、移動し、増殖し、次いで、血液を含むために緊密な細胞と細胞の結合を備える管を構築する（Ｈａｎａｈａｎ，１９９７）。血管形成は、内皮細胞によって放出される酵素、および白血球が内皮細胞を取り囲む基底膜を侵食し始め、内皮細胞が膜を通して突き出ることが可能となった場合に生じる。次いで、これらの内皮細胞は、血管の支流を形成する血管形成の刺激に応答して移動し始め、そしてこの支流が、新しい血管を形成するように結合するまで増殖し続ける。
【０００４】
通常、血管形成は、非常に限定された環境の設定（例えば、胚発達、創傷治癒、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成）において、ヒトおよび動物内で生じる。しかし、異常な血管形成は、腫瘍転移を含む多数の障害に関連している。実際に、腫瘍の増殖が血管形成プロセスに依存しているということは広く信じられている。したがって、血管形成を増加または減少する能力は、臨床的な状況（例えば、それぞれ、創傷治癒（例えば、移植片生存）または癌治療）に対して重要な意味を有する。
【０００５】
直接的な証拠のいくつかの傾向は、血管形成が固形腫瘍の増殖および残留ならびにそれらの転移に必須であるということを現在示唆している（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９８９；Ｈｏｎら、１９９１；Ｋｉｍら、１９９３；Ｍｉｌｌａｕｅｒら、１９９４）。血管形成を刺激するために、腫瘍は種々の血管形成因子のその産生をアップレギュレートし、この血管形成因子には線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦおよびＤＴＣＦ）（Ｋａｎｄｅｌら、１９９１）および血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＰ）が挙げられる。しかし、多数の悪性腫瘍はまた、血管形成のインヒビターを生成し、この血管形成のインヒビターにはアンギオスタチンおよびトロンボスポンジン（Ｃｈｅｎら、１９９５；Ｇｏｏｄら、１９９０：Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９４）が挙げられる。血管形成の表現型は、新生血管形成のこれらの正の制御因子と負の制御因子との間の正味の平衡の結果であるということが推論されている（Ｇｏｏｄら、１９９０；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９４；Ｐａｒａｎｇｉら、１９９６；Ｒａｓｔｉｎｅｉａｄら、１９８９）。血管形成のいくつかの他の内因性インヒビターが、同定されているが、すべてが腫瘍の存在に関連するというわけではない。これらには、血小板第４因子（Ｇｕｐｔａら、１９９５；Ｍａｉｏｎｅら、１９９０）、インターフェロンα、インターフェロン誘導タンパク質１０（Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏら、１９９５；Ｓｔｒｉｅｔｅｒら、１９９５）（これは、インターロイキン１２および／またはインターフェロンγ（Ｖｏｅｓｔら、１９９５）によって誘導される）、ｇｒｏ−β（Ｃａｏら、１９９５）、およびプロラクチンの１６ｋＤａのＮ末端フラグメント（Ｃｌａｐｐら、１９９３）が挙げられる。
【０００６】
（２．新脈管形成関連疾患）
本発明の方法は、内皮細胞関連の疾患および障害を処置するために有用である。特に重要な内皮細胞プロセスは、上記で記載されたような血管形成（血管の形成）である。新脈管形成関連疾患は、内皮細胞増殖を阻害するために、本発明で記載された方法を使用することにより処置され得る。新脈管形成関連疾患には以下のものが挙げられるが、これらには限定されない：血管形成依存性の癌、例えて挙げると、固形腫瘍、白血病のような血液から生じる腫瘍、および腫瘍転移；良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；慢性関節リウマチ；乾癬；眼の血管形成の疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス；オースラー−ウェーバー症候群；心筋の血管形成；プラーク新生血管形成（ｐｌａｑｕｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）；毛細血管拡張症；血友病性関節（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ  ｊｏｉｎｔ）；血管線維腫；および創傷肉芽形成。本発明の内皮細胞増殖の阻害方法は、内皮細胞の過剰または異常な刺激の疾患の処置に有用である。これらの疾患には、以下のものが挙げられるが、これらには限定されない：腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および過形成性瘢痕（すなわち、ケロイド）。それらはまた、病的な結果（例えば、ねこひっかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）および潰瘍（Ｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ））のような血管形成を有する疾患の処置に有用である。
【０００７】
（３．癌）
正常な組織の恒常性は、細胞増殖および細胞死の高度に調節されたプロセスである。細胞増殖または細胞死のどちらかの不均衡は、癌性の状態に発展し得る（Ｓｏｌｙａｎｉｋら、１９９５；Ｓｔｏｋｋｅら、１９９７；ＭｕｍｂｙおよびＷａｌｔｅｒ、１９９１；Ｎａｔｏｌｉら、１９９８；Ｍａｇｉ−Ｇａｌｌｕｚｚｉら、１９９８）。例えば、子宮頸癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌および脳癌は、生じ得る多数の癌のわずかな例にすぎない（Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎ、１９９８；Ｋｏｌｍｅｌ、１９９８；ＭａｒｇｒａｙおよびＫｉｎｇ，１９９８；ＧｅｒｔｉｇおよびＨｕｎｔｅｒ、１９９７；Ｍｏｕｇｉｎら、１９９８）。実際に、癌の発生は非常に高いので、米国だけで１年につき５００，０００人を超える死亡が、癌に起因している。
【０００８】
細胞増殖および細胞死の維持は、プロト癌遺伝子によって少なくとも部分的に調節される。プロト癌遺伝子は、細胞の増殖を誘導するタンパク質（例えば、ｓｉｓ、ｅｒｂＢ、ｓｒｃ、ｒａｓおよびｍｙｃ）、細胞の増殖を阻害するタンパク質（例えば、Ｒｂ、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１、ｐ５３、ＮＦ１およびＷＴ１）、またはプログラム細胞死を調節するタンパク質（例えば、ｂｃｌ−２）をコードし得る（Ｏｃｈｉら、１９９８；ＪｏｈｎｓｏｎおよびＨａｍｄｙ、１９９８；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎら、１９９８）。しかし、これらのプロト癌遺伝子に対する遺伝子再配列または変異は、強力な癌を引きおこす癌遺伝子へのプロト癌遺伝子の転換を生じる。しばしば、１点変異は、癌遺伝子へとプロト癌遺伝子をトランスフォーメーションするのに十分である。例えば、ｐ５３癌抑制遺伝子タンパク質における点変異は、野生型ｐ５３機能の完全な欠失（ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９２；Ｆｕｌｃｈｉら、１９９８）および「優性の」腫瘍促進機能の獲得を生じる。
【０００９】
現在、多数の共通の癌型の処置に効果のある選択肢はほとんど存在しない。個々に与えられた処置の経過は、診断、発展した疾患の病気、例えば、患者の年齢、性別および全身的な健康状態の要素に依存している。癌処置の最も通常の選択肢は、外科手術、放射線治療、および化学療法である。外科手術は、癌の診断および癌の処置の中心的な役割を果たす。代表的に、外科アプローチは、生検のために、そして癌増殖を除去するために必要とされる。しかし、癌が転移しそして広がった場合、外科手術は、治癒が生じる見こみは低く、代替アプローチがとられなければならない。放射線治療、化学療法および免疫療法は、癌の外科的な処置に代わる（Ｍａｙｅｒ、１９９８；Ｏｈａｒａ、１９９８；Ｈｏら、１９９８）。放射線治療は、癌細胞を破壊するための高エネルギー放射線の正確な照準に関係し、そして外科手術に類似して、主に非転移性の局在化した癌細胞の処置に効果がある。放射線治療の副作用は、皮膚の刺激、嚥下困難、口渇、吐き気、下痢、脱毛症およびエネルギーの消耗が挙げられる（Ｃｕｒｒａｎ、１９９８；Ｂｒｉｚｅｌ、１９９８）。
【００１０】
化学療法（抗癌剤を用いる癌の治療）は、癌治療の別の方法である。所定の抗癌剤治療の有効性はしばしば、固形腫瘍の全体に渡っての薬剤送達を達成することの困難性に制限される（ｅｌ−ＫａｒｅｈおよびＳｅｃｏｍｂ、１９９７）。化学療法のストラテジーは、腫瘍組織の増殖に基づいており、ここで抗癌剤は、急速に分裂する癌細胞を標的とする。ほとんどの化学療法アプローチは、ひとつより多い抗癌剤の組み合わせを含み、これは広範囲の癌の応答速度を増加することが証明されている（米国特許第５，８２４，３４８号；米国特許第５，６３３，０１６号および米国特許第５，７９８，３３９号は参考として本明細書中に援用される）。化学療法剤の主な副作用は、それらが正常な組織細胞にも影響することであり、影響される可能性が最も高い細胞は、急速に分裂する細胞（例えば、骨髄、胃腸管、生殖系および毛包）である。化学療法剤の他の毒性の副作用には、口内の潰瘍、嚥下困難、口渇、吐き気、下痢、嘔吐、疲労、出血、脱毛症および感染がある。
【００１１】
免疫療法（癌研究で急速に発展している分野）は、特定のタイプの癌の処置に対するさらに他の選択肢である。例えば、免疫系は外来物として腫瘍細胞を同定し、したがって免疫系による破壊の標的となる。残念ながら、この応答は代表的に、ほとんどの腫瘍増殖を妨げるには十分ではない。しかし、最近、免疫系の天然の防御機構を増強または補充する方法を開発するための免疫療法の分野に焦点があたっている。現在の研究中または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物）（米国特許第５，８０１，００５号；米国特許第５，７３９，１６９号；ＨｕｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓら、１９９８）、サイトカイン治療（例えば、インターフェロン）、および（ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ）（Ｂｕｋｏｗｓｋｉら、１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄら、１９９８））、遺伝子治療（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ｐ５３）（Ｑｉｎら、１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−ＥｄｗａｒｄおよびＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号および米国特許第５，８４６，９４５号）およびモノクローナル抗体（例えば、抗ガングリオシドＧＭ２、抗ＨＥＲ−２、抗ｐ１８５）（Ｐｉｅｔｒａｓら、１９９８；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉら、１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）がある。
【００１２】
（４．遺伝子治療）
遺伝子治療は、患者の体細胞への治療的な組換え核酸の導入による疾患の処置に焦点をあてる、生物医学研究において出現した分野である。遺伝子治療を使用する種々の臨床試験が開始され、そして種々の癌、ＡＩＤＳ、嚢胞性線維症、アデノシンデアミナーゼ欠損、心臓血管疾患、ゴーシェ病、慢性関節リウマチなどの処置を含む。現在、アデノウイルスは、遺伝子治療剤の送達のための好ましいビヒクルである。遺伝子治療剤としてアデノウイルスを使用する利点は、高い形質導入効率、非分裂細胞の感染、そのゲノムの容易な操作性、および宿主ゲノムとの非相同組換えの確率の低さである。
【００１３】
（５．サイトカイン）
ＩＬ−１０は、免疫系細胞、ならびにいくつかの腫瘍細胞によって産生される多面性のホモ二量体サイトカインである（Ｈｏｗａｒｄら、１９９２；Ｅｋｍｅｋｃｉｏｇｌｕら、１９９９）。その免疫抑制機能には、炎症誘発性のサイトカイン合成（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−６のものを含む）の強力な阻害が挙げられる（Ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔら、１９９１）。ＩＬ−１０様サイトカインのファミリーは、染色体１ｑ３２上の小さな１９５ｋｂの遺伝子クラスターをコードし、ＩＬ−１０と構造および配列の相同性を持つ多数の細胞内タンパク質（ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＭＤＡ−７）からなる（Ｍｏｏｒｅら、１９９０；Ｋｏｔｅｎｋｏら、２０００；Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００；Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、２００１；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒら、２０００；Ｋｎａｐｐら、２０００；Ｊｉａｎｇら、１９９５ａ；Ｊｉａｎｇら、１９９６）。ｍｄａ−７は、ＩＬ−１０ファミリーのメンバーとして特徴付けられている。
【００１４】
染色体の局在、転写制御、マウスおよびラットのホモログ発現、ならびに推定のタンパク質構造のすべてが、ＭＤＡ−７がサイトカインであることを暗示する（Ｋｎａｐｐら、２０００；Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０００；Ｓｏｏら、１９９９；Ｚｈａｎｇら、２０００）。急速分解のためのｍＲＮＡを標的とする３’ＵＴＲにおけるＡＵリッチエレメントを全て含むＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、およびＩＦＮγの転写物と類似して、ＭＤＡ−７は、その３’ＵＴＲにおいて３つのＡＲＥを有する１７。Ｍｄａ−７のｍＲＮＡは、ヒトのＰＢＭＣで同定され（Ｅｋｍｅｋｃｉｏｇｌｕら、２００１）、そしてヒトのＭＤＡ−７タンパク質のサイトカイン機能は、これまでに報告されていないが、ＭＤＡ−７は、遺伝子およびタンパク質配列の特性に基づいてＩＬ−２４として命名された（ＮＣＢＩデータベース登録ＸＭ＿００１４０５）。マウスのＭＤＡ−７タンパク質のホモログＦＩＳＰ（ＩＬ−４誘導分泌タンパク質）は、Ｔｈ２特異的サイトカインとして報告された（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２００１）。ＦＩＳＰの転写は、ノックアウト研究により実証されたように、ＴＣＲおよびＩＬ−４レセプター関与およびその後のＰＫＣおよびＳＴＡＴ６活性化によって誘導される。ＦＩＳＰの発現は、特徴付けられているが、機能はこの推定上のサイトカインにまだ属性付けられない１７。ラットのＭＤＡ−７ホモログＣ４９ａ（Ｍｏｂ−５）は、ｍｄａ−７遺伝子に７８％の相同性があり、そして創傷治癒に関連している（Ｓｏｏら、１９９９；Ｚｈａｎｇら、２０００）。Ｍｏｂ−５はまた、分泌タンパク質であることを示した、そして推定上の細胞表面レセプターは、ラットの形質転換細胞上に同定された（Ｚｈａｎｇら、２０００）。したがって、ｍｄａ−７遺伝子のホモログおよび分泌ＭＤＡ−７タンパク質は種々の種において発現され、そして分泌される。しかし、ＭＤＡ−７がサイトカイン活性を有することを示すデータはない。このような活性は、治療的な免疫応答を促進することまたは抗原の免疫原性を増強することにより、広範囲の疾患および感染の処置のための波及効果を有する。
【００１５】
（発明の要旨）
従って、本発明の目的は、新脈管形成関連疾患を示す患者を処置するための方法を提供することである。この方法は、真核生物細胞で作動可能なプロモーターの制御下でヒトＭＤＡ−７タンパク質をコードする治療核酸を投与する工程であって、ここでｍｄａ−７の発現が脈管形成を阻害する、工程を包含する。
【００１６】
特定の実施形態では、新脈管形成関連疾患は、脈管形成依存性癌、良性腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、眼脈管形成疾患、オスラー−ウェバー症候群、心筋脈管形成、プラーク新生血管形成、毛細管拡張症、血友病性関節（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ  ｊｏｉｎｔｓ）、血管線維腫、創傷肉芽形成、ネコ引っ掻き病、潰瘍、腸癒着、アテローム硬化、強皮症、および／または過形成性瘢痕（ケロイド）である。
【００１７】
さらなる実施形態では、脈管形成依存性癌は、充実性腫瘍、血液骨腫瘍（例えば、白血病）、および／または腫瘍転移としてさらに定義される。さらなる実施形態では、良性腫瘍は、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および／または化膿性肉芽腫としてさらに定義される。なおさらなる実施形態では、眼脈管形成疾患は、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、および／またはルベオーシスとしてさらに定義される。
【００１８】
本発明の患者を処置するための方法は、ヒトＭＤＡ−７タンパク質の全部または一部をコードする核酸の転移を包含する。この核酸を、真核生物細胞において活性なプロモーターの制御下で抗脈管形成治療を必要とする患者に投与した後、ＭＤＡ−７タンパク質は、内皮細胞によって発現され、または取り込まれ、それによって増殖停止を刺激する。
【００１９】
特定の好ましい実施形態では、新脈管形成関連疾患は、癌としてさらに定義される。より好ましい実施形態では、癌は、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、悪性肝癌、網膜芽腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、白血病、神経芽腫、頭部癌、頸部（ｎｅｃｋ）癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、頸部（ｃｅｒｖｉｃａｌ）癌、胃腸癌、リンパ腫、脳癌、結腸癌、または膀胱癌である。よりさらに好ましい実施形態では、新脈管形成関連疾患は、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム硬化、新形成前病巣、上皮内癌、口腔毛髪状白斑、または乾癬である。
【００２０】
特定の実施形態では、核酸は、ウイルスベクターであり、ここでこのウイルスベクター用量は、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３またはそれ以上のｐｆｕまたはウイルス粒子である。より好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、ポリオーマウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである。最も好ましくは、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。
【００２１】
特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、デクチン−１プロモーター、デクチン−２プロモーター、ヒトＣＤ１１ｃプロモーター、Ｆ４／８０プロモーター、ＳＭ２２プロモーター、またはＭＨＣクラスＩＩプロモーターであるが、しかし本発明のｍｄａ−７遺伝子の発現を駆動するために有用な任意の他のプロモーター（例えば、本明細書中に記載のプロモーター）が、本発明の実施に適用可能であると考えられる。
【００２２】
好ましくは、本発明の核酸は、注射によって投与される。他の実施形態は、複数の注射による核酸の投与を包含する。特定の実施形態では、注射は、疾患部位または腫瘍部位に局所的、領域的、または遠位で行われる。好ましい実施形態では、核酸の投与は、継続的な注入、腫瘍内注射、腹腔内注射、または静脈内注射による。特定の好ましい実施形態では、核酸は、腫瘍の切除前もしくは後；または腫瘍の前および後の両方に腫瘍床に投与される。好ましい実施形態では、核酸は、化学療法、生物療法、免疫療法、手術、または放射線療法の前、間、または後に患者に投与される。好ましくは、患者はヒトである。他の実施形態では、患者は、癌患者である。
【００２３】
好ましい実施形態では、核酸は、配列番号２の４９〜２０６、７５〜２０６、１００〜２０６、１２５〜２０６、１５０〜２０６、１７５〜２０６、または１８２〜２０６のアミノ酸をコードする。なおさらなる実施形態では、核酸は、配列番号２の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、または２０６の連続したアミノ酸をコードする。
【００２４】
特定の好ましい実施形態では、核酸は、分泌シグナル配列をコードするヌクレオチドをさらに含む。より好ましい実施形態では、核酸は、疎水性コアと組み合わせた正に荷電したＮ末端領域として定義される分泌シグナル配列をさらに含む。
【００２５】
さらなる実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ損傷剤を含む化学療法は、ＭＤＡ−７コード核酸分子の投与と組み合わせて実施される。ＤＮＡ損傷剤は、γ照射、Ｘ線、陽子線照射、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カンプトセシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、または過酸化水素であり得る。さらなる実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、アドリアマイシンである。他の実施形態では、化学療法は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソ尿素（ｎｉｔｏｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、タキソテール、タキソール、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、またはメトトレキサートあるいはそれらの任意のアナログまたは誘導改変体を包含する。本発明の１つの局面では、化学療法はタモキシフェンを含み、一方別の局面では、それはアドリアマイシンを含む。さらなる実施形態は、免疫療法（例えば、ハーセプチン）を含む。
【００２６】
癌性腫瘍を包含する場合、組み合わせ療法は、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする核酸分子の投与および腫瘍切除（これは、ｍｄａ−７遺伝子治療投与の前、後、または間に起こり得る）を包含し得る。ｍｄａ−７処置が腫瘍切除後に起こる場合、ＭＤＡ−７をコードする発現構築物またはベクターは、腫瘍床に投与され得る。
【００２７】
他の実施形態では、真核生物細胞で作動可能なプロモーターの制御下でヒトＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸分子を内皮細胞に投与する工程を包含する、内皮細胞分化を阻害する方法が記載される。あるいは、ｍｄａ−７発現ベクターは、腫瘍細胞に、または腫瘍近辺の部位もしくは腫瘍に対して局所的な部位に投与され得、それによりＭＤＡ−７タンパク質の放出を引き起こす。ＭＤＡ−７タンパク質は、内皮細胞に結合し、そして脈管形成を阻害する。
【００２８】
さらなる実施形態は、核酸分子の前、後、または前に化学療法剤の投与を包含する。なおさらなる実施形態では、化学療法剤は、ＤＮＡ損傷剤である。ＤＮＡ損傷剤は、γ照射、Ｘ線、陽子線照射、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、または過酸化水素としてさらに定義される。他の実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、タキソール、トランス白金、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキサート、またはそれらのアナログもしくは誘導改変体としてさらに定義される。
【００２９】
特定の実施形態では、核酸は、ウイルスベクター内または脂質組成物中に含まれる。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態は、脈管形成の阻害のための、細胞または被験体に投与されるＭＤＡ−７タンパク質、ＭＤＡ−７の短縮型、およびＭＤＡ−７アミノ酸配列に由来するペプチドを含む精製タンパク質組成物の使用を包含する。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、ＭＤＡ−７のサイトカインアッセイに関する。本発明は、被験体において免疫応答を促進するための方法であって、被験体に、免疫応答を促進するのに有効な量のＭＤＡ−７を提供する工程を包含する。免疫応答の促進は、サイトカイン発現もしくは活性、Ｔ細胞もしくはＴ細胞集団（例えば、ヘルパー細胞、細胞傷害性細胞、ＮＫ細胞）の増殖、Ｂ細胞もしくはＢ細胞集団の増殖、細胞傷害性Ｔ細胞活性、または抗体産生の増大によって示される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態では、抗原もまた被験体に提供され、この抗原に対する免疫応答を生じる。抗原は、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、または真菌抗原、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、抗原は腫瘍抗原（例えば、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ｇｐ１００、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、またはＰＭＳＡ）である。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態は、外傷処置（これは、正常細胞への損傷を引き起こす処置である）からの回復を増強もしくはまたは改善する方法、または損傷を減少させる方法を包含する。このような損傷は、例えば、好中球減少、貧血、血小板減少、およびリンパ球減少を引き起こす。いくつかの実施形態では、外傷処置は、化学療法および／または放射線療法である。ＭＤＡ−７は、外傷処置をこれから受ける患者、受けている患者、または受けた患者に投与され得ることが企図される。ＭＤＡ−７は、処置の前、後、または間に被験体に提供され得る。
【００３４】
本発明はまた、ＭＤＡ７ポリペプチドまたはこのＭＤＡ−７ポリペプチドを発現する核酸の有効量を細胞または患者に投与することにより、ＩＬ−６、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の発現を誘導し、それにより二次抗体（例えば、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、またはＴＮＦα）の誘導が生じる方法を包含する。
【００３５】
ＭＤＡ−７、抗原、または両方が、配列番号２の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または２０６の連続するアミノ酸をコードする核酸配列を含む発現構築物を被験体に投与することにより、被験体に提供され得ることが企図される。ここで、この核酸配列は、プロモーターの転写制御下にある。多数のプロモーターが後の節で議論され、そして本発明とともに使用されることが企図される。しかし、本発明は、いかなるようにもそれらのプロモーターに限定されない。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはポリオーマベクターを包含する。
【００３６】
被験体は、１回より多く、例えば、２、３、４回以上、ＭＤＡ−７または抗原を与えられ得る。ＭＤＡ−７および抗原は、同時または別々に与えられ得る。さらに、これらの化合物は、被験体に、静脈内に、直接に、腹腔内に、局部的に、全身に、または経口で提供され得ることが企図される。
【００３７】
本発明の一方法に関して本明細書中で議論された実施形態は、本発明の他の方法に関して実施され得ることが企図される。
【００３８】
本願において明細書中で使用される「ａ」または「ａｎ」は、他に明確に示されていない限り、１またはそれ以上を意味する。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」と共に使用される場合、本願において請求の範囲中で使用される用語「ａ」または「ａｎ」は、１または１より多くを意味し得る。本願において「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも二番目またはそれ以上を意味し得る。
【００３９】
（例示的実施形態の説明）
上述のように、腫瘍サプレッサーは、癌生物学において重要な役割を果たす。それらのうちの１つ、ｐ５３腫瘍サプレッサープロト癌遺伝子は、細胞の非腫瘍遺伝子表現型の維持に必要不可欠である（ＳｏｄｄｕおよびＳａｃｃｈｉ、１９９８に概説される）。全ての癌の約５０％は、ｐ５３遺伝子の変異に関連し、その変異がｐ５３の腫瘍サプレッサー特性の損失を生じることが見出された（Ｌｅｖｉｎｅら、１９９１；ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９２；Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９６ａ；Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９６ｂ）。ｐ５３遺伝子中の変異はまた、細胞中のｐ５３半減期の延長およびｐ５３タンパク質の過剰発現を生じる。正常な細胞において、ｐ５３は、その高いターンオーバー速度に起因して、検出不可能である。ｐ５３遺伝子の変異に関連する癌の高い発生数は、多くの研究グループに、遺伝子置換を介する癌の処置の経路としてｐ５３を調査させた。
【００４０】
ＭＤＡ−７（別の推定の腫瘍サプレッサー）が癌細胞（ｐ５３野生型、ｐ５３ヌル、およびｐ５３変異株）の増殖を抑制することが示された。ｐ５３ヌル細胞中のアポトーシス関連Ｂａｘ遺伝子のアップレギュレーションはまた、ＭＤＡ−７がｐ５３非依存機構を用いて、癌細胞の破壊を誘導し得ることを示す。これらの特徴は、ＭＤＡ−７が、アポトーシスのインデューサーとして、広い治療的潜在性を有することを示唆する。
【００４１】
本発明は、抗新脈管形成治療（癌を含む）を必要とする患者の処置を企図し、その処置は、そのような疾患を有する患者を同定し、そして核酸移入によってヒトｍｄａ−７ポリペプチドを発現させることによるものである。１つの実施形態におけるそのような新脈管形成関連疾患の処置は、その疾患に関連する血管床（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｅｄ）の内皮細胞への、各々のヒトｍｄａ−７発現構築物の腫瘍内投与を含む。次いで、内皮細胞は、ヒトＭＤＡ−７を発現し、新脈管形成の阻害を生じる。
【００４２】
（Ａ．ＭＤＡ−７）
ＭＤＡ−７タンパク質をコードするｃＤＮＡ（本明細書中にｍｄａ−７とも示される）はＪｉａｎｇら、１９９５（ＷＯ９５／１１９８６（本明細書中に参考として援用される））によって記載され、ここでｍｄａ−７  ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、黒色腫進行の潜在性の調節因子として認識された。Ｊｉａｎｇらは、差引きハイブリダイゼーション技術（Ｊｉａｎｇら、１９９５（本明細書中に参考として援用される））を用いて、ヒト黒色腫細胞における増殖および分化の調節に関る遺伝子を同定した。インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）分化およびメゼリン（ｍｅｚｅｒｉｎ）分化されたヒトＨＯ−１黒色腫細胞から調製されたｃＤＮＡに対して、活発に増殖するヒトＨＯ−１黒色腫細胞から調製されたｃＤＮＡの差引きハイブリダイゼーションによって調製されたｃＤＮＡライブラリーが、用いられて、複数の黒色腫分化関連（ｍｄａ）ｃＤＮＡ（ｍｄａ−７を含む）を同定した。ｍｄａ−７  ｍＲＮＡの発現は、黒色腫の進行に反対に関連し、それは、原発性黒色腫および転移性黒色腫と比較した場合の、正常なメラニン細胞におけるｍＲＮＡの増加されたレベル、ならびにヌードマウス中の増強された腫瘍形成について選択された、初期のバーチカル（ｖｅｒｔｉｃａｌ）増殖期の黒色腫細胞における減少されたｍｄａ−７  ｍＲＮＡ発現によって示される。
【００４３】
そのｍｄａ−７  ｃＤＮＡ（配列番号１）は、２３．８ｋＤａの予想されるサイズを有する２０６アミノ酸の、新規な、進化的に一定のタンパク質（配列番号２）をコードする。推定アミノ酸配列は、アミノ酸約２６〜４５の疎水性の伸長部を含み、この伸長部は、シグナル配列の特徴を有する。このタンパク質配列は、４２アミノ酸伸長部（これはインターロイキン１０（ＩＬ−１０）と５４％同一である）を除いて、公知のタンパク質に対する有意な相同性を示さない。構造分析は、ＭＤＡ−７（ＩＬ−ＢＫＷまたはＩＬ−２０）がサイトカインファミリーの構造的特徴を表すことを決定した（ＷＯ９８／２８４２５（本明細書中に参考として援用される））。アミノ酸の小さな伸長部に交差する構造的特徴および限定された同一性は、ＭＤＡ−７に関する細胞外での機能を示唆する。ＭＤＡ−７発現は、黒色腫の増殖に反対に関連し、それは、原発性黒色腫および転移性黒色腫との比較した場合、正常なメラニン細胞におけるｍＲＮＡの増加されたレベル、ならびにヌードマウス中の増強された腫瘍形成について選択された、初期のバーチカル（ｖｅｒｔｉｃａｌ）増殖期の黒色腫細胞における減少されたＭＤＡ−７発現によって示される。
【００４４】
さらなる研究は、ＭＤＡ−７の高められた発現が、インビトロで癌細胞の増殖を抑制し、そして選択的に、ヒト乳癌細胞におけるアポトーシスを誘導し、そしてヌードマウスにおける腫瘍の増殖を阻害することを示した。（Ｊｉａｎｇら、１９９６およびＳｕら、１９９８）。Ｊｉａｎｇら（１９９６）は、ｍｄａ−７が、胸部、中枢神経系、頚部、結腸、前立腺、および結合組織を含む、種々の起源の癌細胞において強力な増殖抑制遺伝子であるという知見を報告する。コロニー阻害アッセイは、ＭＤＡ−７の高められた発現が、ヒト頚部癌（ＨｅＬａ）、ヒト乳癌（ＭＣＦ−７およびＴ４７Ｄ）、結腸癌（ＬＳ１７４ＴおよびＳＷ４８０）、鼻咽頭癌（ＨＯＮＥ−１）、前立腺癌（ＤＵ−１４５）、黒色腫（ＨＯ−１およびＣ８１６１）、神経膠芽細胞（ＧＢＭ−１８およびＴ９８Ｇ）、および骨肉腫（Ｓａｏｓ−２）における増殖の阻害を増強することを示すために用いられた。正常な細胞（ＨＭＥＣ、ＨＢＬ−１００、およびＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６）におけるＭｄａ−７過剰発現は、限定された増殖阻害を示し、ｍｄａ−７導入遺伝子の効果は、正常な細胞においては明らかにならないことを示す。概して、ＭＤＡ−７の高められた発現による増殖阻害は、インビトロでは、正常な細胞よりも癌細胞においてより効果的である。
【００４５】
Ｓｕら（１９９８）は、ＭＤＡ−７が癌細胞の増殖を抑制する機構の調査を報告した。この研究は、乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＴ４７ＤにおけるＭＤＡ−７の異所性の発現が、正常なＨＢＬ−１００細胞への効果を除き、細胞周期分析およびＴＵＮＥＬアッセイによって検出されるようなアポトーシスを誘導することを報告した。アデノウイルスｍｄａ−７（「Ａｄ−ｍｄａ−７」）で感染された細胞由来の細胞溶解産物のウェスタンブロット分析は、アポトーシス刺激タンパク質ＢＡＸのアップレギュレーションを示した。Ａｄ−ｍｄａ−７感染は、ＭＣＦ−７細胞およびＴ４７Ｄ細胞のみにおいて、ＢＡＸタンパク質のレベルを高め、正常なＨＢＬ−１００細胞またはＨＭＥＣ細胞において、それを高めなかった。これらのデータは、調査者に、ＭＣＦ−７腫瘍細胞の異種移植片腫瘍形成に対する、エキソビボでのＡｄ−ｍｄａ−７の形質導入の効果の評価に導く。エキソビボ形質導入は、腫瘍異種移植片モデルにおいて腫瘍形成および腫瘍増殖の阻害を生じた。この新規腫瘍サプレッサー分子が作用する機構は、調査され始めている。
【００４６】
（Ｂ．新脈管形成関連疾患およびＭｄａ−７）
本発明の方法は、内皮細胞に関連する疾患および障害を処置するために有用である。特に重要な内皮細胞プロセスは、上記のような血管形成（血管の形成）である。新脈管形成関連疾患は、ＭＤＡ−７の増大した発現によって内皮細胞増殖を阻害する、本発明に記載の方法を用いて処置され得る。
【００４７】
遺伝子治療を用いる癌の処置のための主要な様式は、アポトーシスの誘導である。この誘導は、この癌細胞を、他の薬剤に対して感作することか、または細胞内経路を刺激することによって直接的にアポトーシスを誘導することのいずれかによって、達成され得る。他の癌治療は、この腫瘍が血管形成を誘導し、増殖している腫瘍に必要な栄養素を供給する必要性に対して利点を有する。エンドスタチンおよびアンギオスタチンは、このような２つの治療の例である（ＷＯ  ００／０５３５６およびＷＯ  ００／２６３６８）。
【００４８】
本出願人らは、血管形成を阻害する新しい方法を発見した。この新しい方法は、ヒトｍｄａ−７をコードする核酸の投与を含む。Ａｄ−ｍｄａ−７は、インビトロで増殖する内皮細胞に添加される場合、内皮分化を阻害する能力を有する。増大したｍｄａ−７発現の抗血管形成効果により、この分子は、新脈管形成関連疾患（特に、癌）の理想的な遺伝子治療処置である。ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介する、抗脈管形成標的細胞（これは、内皮細胞を含み得る）への、ｍｄａ−７をコードする核酸の投与、ならびに、腫瘍細胞への投与が、企図される。この併用処置は、医師が、腫瘍細胞の直接的な形質転換に依存するだけではなく、血管形成を阻害する効果にもまた依存することを可能にする。従って、異なる標的細胞集団に送達され得る２つの別個の様式を用いることにより、この腫瘍を餓死および攻撃する。
【００４９】
新脈管形成関連疾患としては、血管形成依存性癌（例えば、固形腫瘍、白血病のような血液由来腫瘍、および腫瘍転移）；良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；慢性関節リウマチ；乾癬；眼脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜炎、早熟の網膜炎、斑状変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症）、ルベオーシス；オースラー−ウェバー症候群；心筋血管形成；斑状新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；ならびに創傷顆粒化が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の、内皮細胞増殖阻害法は、内皮細胞の過剰な刺激および異常な刺激の疾患の処置において有用である。これらの疾患としては、腸管接着、アテローム硬化症、強皮症、および肥大性瘢痕（すなわち、ケロイド）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法はまた、病理的結果としての血管形成を有する疾患（例えば、ネコひっかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）および潰瘍（Ｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ））の処置において有用である。
【００５０】
癌は、西洋世界における主な死因の１つになっている（心臓病のみに続いて２番目）。現在の試算では、米国人の３人に１人が癌を発症し、そして５人に１人が癌によって死亡すると見積もられている。癌は、正常な増殖調節機構を失っている、変化した細胞であるとみなされ得る。
【００５１】
現在、癌遺伝子の異なる活性を反映する、癌遺伝子の３つの主要なカテゴリーがある。癌遺伝子の１つのカテゴリーは、細胞増殖を誘導するタンパク質をコードする。腫瘍抑制遺伝子または抗癌遺伝子と呼ばれる、癌遺伝子の第２のカテゴリーは、過剰な細胞増殖を阻害するよう機能する。癌遺伝子の第３のカテゴリーは、プログラムされた細胞の死を調節するタンパク質をコードすることによって、アポトーシスをブロックするかまたは誘導するかのいずれかである。
【００５２】
ｍｄａ−７タンパク質をコードするｃＤＮＡは、Ｊｉａｎｇら、１９９５（ＷＯ  ９５１１９８６）によって記載されており、そこで、ｍｄａ−７  ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、黒色腫進行の潜在的な調節因子として認識された。Ｊｉａｎｇらは、サブトラクティブハイブリダーゼ−ション技術（ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ、１９９３）を用いて、ヒト黒色腫細胞における増殖および分化の調節に関与する遺伝子を同定した。インターフェロン（ＩＦＮ−β）およびメゼリン（ｍｅｚｅｒｉｎ）により分化したヒト黒色腫細胞から調製されたｃＤＮＡに対する、活発に増殖するヒトＨＯ−１黒色腫細胞から調製されたｃＤＮＡのサブトラクションハイブリダイゼーションによって調製された、ｃＤＮＡライブラリーを用いて、いくつかの黒色腫分化関連（ｍｄａ）ｃＤＮＡを同定した。ｍｄａ−７に対するｃＤＮＡを、分化した黒色腫細胞において増大した発現レベルを有するｃＤＮＡとして同定した。
【００５３】
このｍｄａ−７  ｃＤＮＡは、２３．８ｋＤａの予測されたサイズを有する、２０６アミノ酸の、進化的に保存された新規のタンパク質をコードする。推論されるアミノ酸配列は、アミノ酸約２６〜４５の疎水性ストレッチを含む。このタンパク質配列は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）に対して５４％同一である４２アミノ酸ストレッチを除いて、公知のタンパク質またはタンパク質モチーフに対する有意な相同性を示さない。構造分析により、ｍｄａ−７（ＩＬ−ＢＫＷまたはＩＬ−２０）が、サイトカインファミリーの構造特性を示すことが決定された（ＷＯ  ９８２８４２５）。この構造特性、およびアミノ酸の小ストレッチを越える限定された同一性は、ｍｄａ−７についての潜在的な細胞外機能を意味する。
【００５４】
さらなる研究から、ｍｄａ−７の増大した発現が、ヒト乳癌細胞において、癌細胞の増殖を抑制し、そしてアポトーシスを選択的に誘導し、ならびに、ヌードマウスにおいて、腫瘍の増殖を阻害することが示された（Ｊｉａｎｇら、１９９６およびＳｕら、１９９８）。Ｊｉａｎｇら（１９９６）は、ｍｄａ−７が、乳房、中枢神経系、頚部、結腸、前立腺および結合組織を含む多様な起源の癌細胞における、潜在的な増殖抑制遺伝子であるという発見を報告する。コロニー阻害アッセイを用いて、ＭＤＡ−７の増大した発現が、ヒト頚部眼（ＨｅＬａ）、ヒト乳癌（ＭＣＦ−７およびＴ４７Ｄ）、結腸癌（ＬＳ１７４ＴおよびＳＷ４８０）、鼻咽頭癌（ＨＯＮＥ−１）、前立腺癌（ＤＵ−１４５）、黒色腫（ＨＯ−１およびＣ８１６１）、多型性グリオ芽細胞（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）（ＧＢＭ−１８およびＴ９８Ｇ）、ならびに骨肉腫（Ｓａｏｓ−２）における増殖阻害を増強することを実証した。正常な細胞（ＨＭＥＣ、ＨＢＬ−１００およびＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６）において過剰発現されたｍｄａ−７は、減少したコロニー阻害を示した。
【００５５】
ｍｄａ−７の増大した発現による増殖阻害は、通常の細胞よりも、癌細胞においてより有効である。Ｓｕら（１９９８）は、ｍｄａ−７が癌細胞増殖を抑制する機構を調査した。この研究により、乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＴ４７Ｄにおけるｍｄａ−７の異所的な発現が、細胞周期分析、および、正常なＨＢＬ−１００細胞への影響を有さないＴＵＮＥＬアッセイによって検出されるような、アポトーシスを誘導したことが報告された。アデノウイルスｍｄａ−７に感染した細胞に由来する溶解物のウエスタンブロットは、タンパク質Ｂａｘを刺激するアポトーシスの上方調節を示した。Ａｄ−ｍｄａ−７感染は、ＭＣＦ−７およびＴ４７ＤにおいてのみＢａｘタンパク質のレベルを増大させ、そして正常なＨＬＢ−１００細胞においても、正常なＨＭＥＣ細胞においても、増大させなかった。これらのデータにより、研究者らは、ＭＣＦ−７腫瘍細胞の異種移植片腫瘍形成に対する、エキソビボＡｄ−ｍｄａ−７形質転換の効果を評価した。エキソビボ形質転換は、腫瘍異種移植片モデルにおいて、腫瘍の形成および進行の阻害を生じた。ｍｄａ−７は、腫瘍細胞特異性アポトーシス誘導において有効であることが示されている。従って、本発明の１つの実施形態は、ｍｄａ−７アデノウイルスの構築による、種々の新脈管形成関連疾患の処置である。
【００５６】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／２８４２５は、ＩＬ−１０に関連するとされているサイトカイン分子を記載する。ＩＬ−ＢＫＷと名付けられたこの分子は、ｍｄａ−７と同一の遺伝子に由来するようである。ＩＬ−ＢＫＷの成熟形態は、ｍｄａ−７コード領域の残基４７または４９周辺から始まり、そして約１５８〜１６０残基（すなわち、ｍｄａ−７配列の残基２０６まで）続くと言われる。従って、好ましい分子は、好ましくは、全長ｍｄａ−７の、推定シグナル配列（残基１〜２５）および推定膜貫通疎水性ドメイン（残基２６〜４５）の両方の、全部または一部を欠く。
【００５７】
ｍｄａ−７の短縮された分子もまた企図される。例えば、ｍｄａ−７アミノ酸残基４６〜４９周辺で始まる分子は最大の分子であるが、さらなるＮ末端の短縮は、本発明の範囲内である。従って、残基４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、および１８２で始まり、そして残基２０６で終結する分子が、特に企図される。さらなる実施形態において、配列番号２に示されるように、ＭＤＡ−７の他の近接する残基とともに、残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、および４６が含まれる。
【００５８】
これらの構築物の操作性に関する特定の理論に固執するわけではないが、ＩＬ−１０に対する、およびＣ末端に位置するＤらせん領域における種を越える、ｍｄａ−７の注目すべきアミノ酸相同性があり、この領域は、レセプター結合に関与する。従って、好ましくはこの３０〜３５アミノ酸領域を含有する分子は、特に好ましい。
【００５９】
従って、本発明の１つの実施形態において、新脈管形成関連疾患の処置は、治療的なペプチドおよびポリペプチドの投与を包含する。別の実施形態において、この処置は、ｍｄａ−７をコードする核酸発現構築物の、標的への投与を包含し、この標的は、罹病した細胞または上皮細胞を含む。この標的細胞は、この構築物を取り上げ、そして核酸によってコードされる治療的ポリペプチドを発現し、それによって、標的細胞における分化を阻害することを企図される。次いで、ＭＤＡ−７を発現する細胞は、発現構築物による形質転換も感染もしていない近傍の細胞と相互作用し得るタンパク質を分泌する。この様式において、腫瘍に対する新しい脈管構造を確立するのに必要とされる複合体相互作用が阻害され、そしてこの腫瘍の処置は達成される。
【００６０】
本発明の別の実施形態において、新脈管形成関連疾患が、ＭＤＡ−７、またはＭＤＡ−７を発現する構築物で処置され得ることが企図される。本発明における処置のために企図される、新脈管形成関連疾患のうちのいくつかは、乾癬、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、変形性関節症（ＯＡ）および肺における前腫瘍性外傷である。
【００６１】
さらに別の実施形態において、多種多様な癌の状態の処置は、本発明の範囲内である。例えば、黒色腫、非小細胞肺（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ）、小細胞肺、肺、悪性肝癌、網膜芽腫、星状細胞腫、グリオ芽細胞腫、白血病、神経芽腫、頭、首、乳房、膵臓、前立腺、肝臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頚部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱。さらに好ましい実施形態において、この新脈管形成関連疾患は、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、腺腫（ａｄｅｍｏｎａｓ）、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム硬化症、前腫瘍性外傷、インサイチュでの癌、口内毛髪状白斑または乾癬であり、処置の対象であり得る。
【００６２】
（Ｃ．サイトカインおよび免疫刺激）
サイトカインは、化合物に対する免疫応答を促進し得る。ＭＤＡ−７はサイトカイン活性を有するので、この効果は、治療方法および予防方法のために用いられ得る。以下に記載される任意の抗原に対する免疫応答は、この抗原に関連する疾患または状態に対する治療効果に影響するか、またはその疾患または状態に対する予防的治療に影響する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７は、疾患または状態に関連する抗原に対する免疫応答を促進または増強するために用いられ得る。本発明のいくつかの実施形態において、抗原は、微生物薬剤、真菌薬剤、ウイルス薬剤または腫瘍薬剤と関連し得るか、またはそれらに由来し得る。本発明の抗原が由来する微生物の例としては、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉ、Ｓ．ｃａｎｉｓ、Ｓ．ｂｏｖｉｓ、Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、他のｖｉｒｉｄａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの他の関連種、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、特に鼻咽頭において、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、シュードモナス種（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｌｅｉ）、ブルセラ属（例えば、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｑｕｉなど、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｎｏｃｏｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バクテロイド種、放線菌種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、レプトスピラ種および関連する生物体の８３以上の異なる血清型が挙げられ得るが、これらに限定されない。本発明はまた、グラム陰性微生物（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ種、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、ＢａｃｔｅｒｉｏｄｅｓおよびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種など）に対して有用である。さらに、本発明は、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｂｅｌｌｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ種のような生物による、原虫または巨視的な感染の制御において、ならびに、例えばＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよび他のＣｈｌａｍｙｄｉａ感染体（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、またはＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のために有効であるとわかり得る。
【００６４】
本発明のウイルス抗原が形成され得るウイルスの例としては、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型およびインフルエンザＣ型、パラインフルエンザ、パラミキソウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、はしか、おたふく風邪、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎、コロナウイルス、ポリオウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス、乳頭腫ウイルス、ウイルスＢ、水痘‐帯状疱疹ウイルス、風疹、狂犬病、ピコルナウイルス、ロタウイルスおよびカポージ関連疱疹ウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｆ型肝炎、Ｇ型肝炎および他の任意の肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、インフルエンザウイルス、パポバウイルス（ｐａｏｐｖａｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス、デング熱ウイルス、ならびにエボラウイルスが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明の抗原が形成され得る真菌の例としては、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ、Ｐｉｅｄｒａｉａ  ｈｏｒｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｃａｒｒｉｏｎｉｉ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ、および２種のＦｏｎｓｅｃａｅａ、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｈｅｒｉａ  ｂｏｙｄｉｉ、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ  ｍｙｃｅｔｏｍａｔｉｓ、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ  ｇｒｉｓｅａ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ、およびＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｆａｌｃｉｆｏｒｍｅ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｊｅｎｓｅｌｍｅｉ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｒｉｃｈａｒｄｓｉａｅ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｓｐｉｃｉｆｅｒａ、およびＷａｎｇｉｅｌｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ａｂｓｉｄｉａ、およびＢａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
さらに、ＭＤＡ−７の全部または一部が、別のサイトカイン分子および／または抗原（この抗原に対して、免疫応答が所望される）との融合タンパク質の一部あり得ることが企図される。この融合タンパク質は、被験体に投与されて、この抗体に対する免疫応答を誘導または増強し得る。
【００６７】
ＭＤＡ−７はまた、殺腫瘍性化合物または腫瘍細胞分裂停止効果を有する化合物と組み合わせて患者に投与されて、その化合物が腫瘍細胞を阻害するかまたは殺す能力を増強する。このような化合物として、腫瘍抑制剤、および表題「組み合わせ療法（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」下の、以下で考察される化合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、この殺腫瘍性化合物は、ｐ５３、Ｒｂ、ＷＴ、ＦＨＩＴ、ｐ１６、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、またはＴＲＡＩＬである。
【００６８】
腫瘍抗原に対する免疫応答もまた、ＭＤＡ−７に関与し得る。腫瘍抗原としては、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ｇｐ１００、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、またはＰＭＳＡが挙げられる。腫瘍抗原に対する応答を誘導するための使用は特に企図され、そして、米国特許第５，５５２，２９３号および同第６，１３２，９８０号（これらは、参考として特に援用される）において見出され得る。
【００６９】
免疫応答の誘導、促進、または増強のためのアッセイに関する多くのアッセイは、当業者に周知であり、これらのいくつかは、以下の実施例、および本明細書中に参考として援用される参考文献において記載される。１つのアッセイは、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、または他のＩＬサイトカイン）の発現の増大を検出することを包含する。このようなサイトカインは、本明細書中に記載されるＭＤＡ−７組成物および本明細書中に記載される他の任意の組成物と組み合わせて、被験体に投与され得る。ＭＤＡ−７および血管形成の阻害または癌の処置に関して考察される任意の実施形態は、免疫応答を促進する方法に適用され得ることを企図される。
【００７０】
（Ｄ．核酸、ベクターおよび調節シグナル）
本発明は、核酸（ＭＤＡ−７コード核酸、ｍｄａ−７遺伝子配列の全てもしくは一部分と同一な核酸、またはその相補的な核酸を含む）、免疫応答が所望される抗原をコードする核酸、他の治療的核酸、ならびに核酸構築物および核酸プライマーに、関する。
【００７１】
本発明は、ｍｄａ−７遺伝子に関連するポリヌクレオチドまたは核酸分子、およびその遺伝子産物であるＭＤＡ−７に関する。これらのポリヌクレオチドまたは核酸分子は、哺乳動物細胞から単離可能および精製可能である。単離され精製されたＭＤＡ−７核酸分子（分泌バージョンまたは全長バージョンのいずれか）（これらは、ｍａｄ−７遺伝子産物に関連する核酸分子である）は、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態をとり得ることが、企図される。本明細書で使用する場合、用語「ＲＮＡ転写」は、ＤＮＡ核酸分子からの転写の生成物であるＲＮＡ分子のことをいう。このような転写産物は、１つ以上のポリペプチドをコードし得る。
【００７２】
本出願で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は、核酸分子、ＲＮＡまたはＤＮＡのことをいい、これらは、全ゲノム核酸を含まないで単離されている。ゆえに、「ＭＤＡ−７をコードするポリヌクレオチド」は、ＭＤＡ−７コード配列を含むが、全ゲノムＤＮＡおよびタンパク質から離れて単離または精製され、かつこれらを含まない、核酸セグメントをいう。本出願が、ＭＤＡ−７をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸の機能または活性をいう場合、このポリヌクレオチドは、血管形成を阻害し、腫瘍増殖を抑制し、癌細胞を死滅させ、そして／または免疫応答を誘導する能力を有する分子をコードすることが、意味される。
【００７３】
用語「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡをテンプレートとして使用することで調製されたＤＮＡを言及することが、意図される。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ転写産物とは対照的に、ｃＤＮＡを使用することの利点は、安定性および組換えＤＮＡ技術を使用して配列を操作する能力である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ、１９９６を参照のこと）。全ゲノム配列または部分的ゲノム配列が好まれる時もあり得る。あるいは、ｃＤＮＡはポリペプチドのコード領域を表し、かつイントロンおよび他の調節領域を排除しているので、ｃＤＮＡが有利であり得る。
【００７４】
所定の細胞由来の所定のＭＤＡ−７コード核酸またはｍｄａ−７遺伝子は、僅かに異なる核酸配列を有するがそれにもかかわらずＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする、天然改変体または天然株によって表さられ得ることもまた、企図される；ヒトＭＤＡ−７ポリペプチドは、好ましい実施形態である。続いて、本発明はまた、最小アミノ酸変化を含むが、結果的に同じ活性を有するＭＤＡ−７誘導体を含む。
【００７５】
用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする単位を言及するために、簡潔さのために使用される。当業者により理解されるように、この機能的用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および変異体を、発現するかまたは発現するように適合され得る、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびに、より小さい操作された遺伝子セグメントを、含む。ＭＤＡ−７または別の治療的ポリペプチドをコードする核酸分子は、以下の長さ、または少なくとも以下の長さの、連続した核酸配列を含み得る：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、１００００、１０１００、１０２００、１０３００、１０４００、１０５００、１０６００、１０７００、１０８００、１０９００、１１０００、１１１００、１１２００、１１３００、１１４００、１１５００、１１６００、１１７００、１１８００、１１９００、１２０００以上の、ヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基対。このような配列は、配列番号１（ＭＤＡ−７コード配列）と同一であり得るか、または相補的であり得る。
【００７６】
「実質的に他のコード配列から離れて単離される」は、目的の遺伝子が核酸セグメントのコード領域の一部を形成すること、そして、このセグメントが、天然に生じるコード核酸の巨大な部分（例えば、巨大な染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子もしくはｃＤＮＡコード領域）を含まないことを、意味する。もちろん、これは、本来単離されたような核酸セグメントをいい、人間の操作によって、後からセグメントに加えられた遺伝子、またはコード領域は除外しない。
【００７７】
特定の実施形態において、本発明は、単離されたＤＮＡセグメント、およびＵＧＴ２Ｂ７タンパク質、ＵＧＴ２Ｂ７ポリペプチドまたはＵＧＴ２Ｂ７ペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込む組換えベクターに関しており、このＵＧＴ２Ｂ７タンパク質、ＵＧＴ２Ｂ７ポリペプチドまたはＵＧＴ２Ｂ７ペプチドは、そのアミノ酸配列内に、「ヒトＭＤＡ−７」と名付けられたＭＤＡ−７に一致する、配列番号２に従った、または、本質的に配列番号２に記載されている連続するアミノ酸配列を、含む。
【００７８】
用語「本質的に配列番号２に記載の配列」は、この配列が、実質的に、配列番号２の一部と一致しており、そして、配列番号２に記載のアミノ酸と同一でないか、または生物学上の機能的等価物でないアミノ酸を、比較的にほとんど有していないことを、意味する。
【００７９】
用語「生物学上の機能的等価物」は、当該分野で周知であり、そして、さらに、本明細書中で詳細に定義される。従って、配列番号２のアミノ酸と、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％およびこの中で誘導できる任意の範囲（例えば、約７０〜約８０％、ならびに、より好ましくは〜約８１％、および〜約９０％；または、なおより好ましくは、約９１％と約９９％との間）で、同一であるか、または機能的に等価物であるアミノ酸を有する配列は、タンパク質の生物学的活性が維持される条件で、「本質的に配列番号２に記載」の配列である。特定の実施形態において、ＭＤＡ−７タンパク質、ＭＤＡ−７ポリペプチドもしくはＭＤＡ−７ペプチド、または生物学上の機能的等価物の生物学的活性は、血管形成の阻害、ガン細胞の阻害もしくは死滅、アポトーシスの誘導、および／または免疫応答の誘導を、含む。特定の他の実施形態において、本発明は、配列の中に、本質的に配列番号１に記載の核酸配列を含む、単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。用語「本質的に配列番号１に記載」は、上記と同様の意味において使用され、そして、核酸配列が、実質的に配列番号１の一部と一致し、そして、配列番号１と同一でないか、またはその機能的な等価物でないコドンを比較的にほとんど有していないことを、意味する。この場合も、ＭＤＡ−７活性を示すタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡセグメントが、最も好まれる。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明は、ＭＤＡ−７ポリペプチドまたはＭＤＡ−７ペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込む、単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関しており、このＭＤＡ−７ポリペプチドまたはＭＤＡ−７ペプチドは、そのアミノ酸配列中に、ＭＤＡ−７ポリペプチドに従うかまたは本質的に一致する、連続するアミノ酸配列を含む。
【００８１】
本発明のベクターは、主に、調節された真核生物のプロモーター（すなわち、誘導性プロモーター、抑制可能プロモーター、組織特異的プロモーター）の制御下にある、治療的ｍｄａ−７遺伝子で内皮細胞に形質転換するために、デザインされた。また、このベクターは、他に理由がない場合、インビトロでの操作を容易にするために、選択マーカーを含み得る。しかし、選択マーカーは、組換え細胞の生成において、重要な役割を果たし得る。
【００８２】
以下の表１および表２は、本発明による使用のための、種々の調節シグナルを記載する。
【００８３】
【表１】
2005500247.tif 000002
2005500247.tif 000003
【００８４】
【表２】
2005500247.tif 000004
2005500247.tif 000005
2005500247.tif 000006
真核細胞におけるタンパク質コード遺伝子の転写を制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝子エレメントから構成される。この細胞機構は、各エレメント（異なる遺伝子に、別個の（しばしば複合した）転写調節パターンを生み出させる）によって伝達される調節情報を集め、そして統合し得る。
【００８５】
用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための開始部位の周囲にクラスターが形成される、転写制御モジュールの一群を指すために、本明細書中で使用される。どのようにプロモーターが組織化されるかについての意見の多くは、いくつかのウイルスプロモーター（ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）のプロモーター、およびＳＶ４０初期転写ユニットのプロモーターを含む）の解析から、誘導される。より最近の研究によって増強されたこれらの研究は、プロモーターが、別個の機能的モジュールから構成されることを示し、この別個の機能的モジュールは、各々、約７ｂｐ〜約２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして、転写活性化タンパク質のための１つ以上の認識部位を有する。
【００８６】
各プロモーターにおける少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置付けるように機能する。この最も良く知られる例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスが欠如するいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター、およびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーター）において、開始部位上にかぶさる別個のエレメントは、それ自身が開始の場所を固定することを介助する。
【００８７】
さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。近年、多くのプロモーターが、開始部位の下流においても同様に、機能的エレメントを含むことが示されているが、典型的には、プロモーターエレメントは、開始部位の３０ｂｐ〜１１０ｂｐ上流の領域中に位置する。エレメント間の間隔は可動性があり、その結果、エレメントが互いに関して反転されるかまたは移動される場合、プロモーター機能は、保存される。ｔｋプロモーターにおいて、活性が減少し始める前に、エレメント間の間隔は、５０ｂｐ離れるところまで増加され得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために、協同してかまたは独立してかのいずれかで、機能し得る。
【００８８】
エンハンサーは、当初、同一ＤＮＡ分子上の遠隔位置に位置するプロモーターからの転写を増加する遺伝的エレメントとして、検出された。巨大な距離を越えて作用するこの能力は、原核生物の転写調節の古典的な研究において、ほとんど前例がなかった。続く研究は、エンハンサー活性を有するＤＮＡ領域が、プロモーターのように大いに組織化されることを、示した。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写タンパク質に結合する。
【００８９】
エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な区別は、作動的なものである。エンハンサー領域は、全体として、一定距離をおいて転写を刺激し得なければならない；このことは、プロモーター領域にもプロモーターの構成エレメントにも、当てはまる必要はない。一方、プロモーターは、特定の部位および特定の方向において、ＲＮＡ合成の開始を指向する、１つ以上のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠如する。この作動上の区別は別として、エンハンサーおよびプロモーターは、非常に類似した存在である。
【００９０】
プロモーターおよびエンハンサーは、細胞における転写の活性化という、同じ一般的な機能を有する。これらは、しばしば重複し連続しており、しばしば、非常に類似した単位構成を有すると思われる。まとめると、これらの考察は、エンハンサーおよびプロモーターが相同的な存在であること、そして、これらの配列に結合した転写アクチベータータンパク質は、本質的に同じ様式で、細胞の転写機構と相互作用し得ることを、示唆する。
【００９１】
本発明における使用にとって好ましいものは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。このプロモーターは、ベクターｐｃＤＮＡＩＩＩ中にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されており、これは、本発明における使用にとって、好ましい。また、デクチン（ｄｅｃｔｉｎ）−１プロモーターおよびデクチン−２プロモーターも、本発明において有用なものとして企図される。以下に、本発明と組合せて使用され得る、さらなるウイルスプロモーター、細胞のプロモーター／エンハンサー、および誘導性のプロモーター／エンハンサーを記載する。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢより）もまた、以下をコードする構造遺伝子の発現を助動するために、使用され得る：オリゴ糖プロセシング酵素、タンパク質フォールディング補助タンパク質、選択マーカータンパク質、または目的の異種タンパク質。
【００９２】
有用性を証明し得る別のシグナルは、ポリアデニル化シグナルである。このようなシグナルは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子、またはＳＶ４０から、取得され得る。
【００９３】
内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用か、多重遺伝子メッセージまたはポリシストロン性メッセージを生成するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５−メチル化キャップ依存性翻訳のリボソーム走査モデルを回避し得、内部部位にて翻訳を始め得る（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス）由来のＩＲＥＳエレメントは、記載されており（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）哺乳動物のメッセージ由来のＩＲＥＳ（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１）も同様である。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに、連結され得る。複数のオープンリーディングフレームが、ともに転写され得、ＩＲＥＳによって各々分割され得、ポリシストロン性メッセージを生成し得る。ＩＲＥＳエレメントによって、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するために、単一のプロモーター／エンハンサーを使用して、効率的に発現され得る。
【００９４】
いずれにしても、プロモーターは、遺伝子の上流に機能的に位置した場合に、その遺伝子の発現を導く、ＤＮＡエレメントであることが、理解される。本発明のほとんどの遺伝子導入構築物は、プロモーターエレメントの下流に、機能的に位置する。
【００９５】
（Ｅ．遺伝子移入）
（１．ウイルス形質転換）
（ａ．アデノウイルス感染）
組換えＤＮＡの送達のための１つの方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用に関する。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡへ組込む能力が低いことが既知であるが、この特徴は、これらのベクターによって提供される高い効率の遺伝子導入によって、埋め合わされる。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）最終的に、そのベクター中にクローニングされた組換え遺伝子構築物を発現するために十分な、アデノウイルス配列を含有する構築物を含むことを、意味する。
【００９６】
このベクターは、遺伝子操作された形態のアデノウイルスを、含む。アデノウイルスの遺伝子構造の知見（３６ｋｂ、線状、二本鎖ＤＮＡウイルス）により、７ｋｂまでの異種配列を用いて、アデノウイルスＤＮＡの巨大な断片を置換することが可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組込みを生じない。なぜならば、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性なしに、エピソーム様式にて、複製し得るからである。また、アデノウイルスは、構造的に安定で、そして、広範な増殖後もゲノム再配列が検出されていない。
【００９７】
アデノウイルスは、その中型サイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、標的細胞の範囲の広さ、および高い感染力が理由で、遺伝子移入ベクターとしての使用に特に適している。ウイルスゲノムの両端は、１００塩基対〜２００塩基対の反復配列（ＩＴＲ）を有し、この反復配列は、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージに必要なシスエレメントである。このゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡの複製の開始によって分裂される、異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび２〜３個の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質を、コードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡの複製のためのタンパク質合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフ（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）に関係する（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。後期遺伝子の生成物（ウイルスキャプシドタンパク質大多数を含む）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる単一の一次転写産物の顕著なプロセシング後にのみ、発現される。このＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期の間に特に効率的であり、そして、このプロモーターから生じたｍＲＮＡ全ては、そのｍＲＮＡを翻訳にとって好ましいｍＲＮＡとする、５−３つ組（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列（ＴＰＬ配列）を有する。
【００９８】
現在の系において、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから、生成される。２つのプロウイルスベクター間で起こりうる組換えが原因で、野生型アデノウイルスが、このプロセスから生成され得る。ゆえに、個々のプラークから単一のウイルスクローンを単離し、そしてそのゲノム構造を調査することが、重要である。
【００９９】
複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、ヒト胚性腎細胞からＡｄ５ＤＮＡフラグメントによって形質転換され、そして構成的にＥ１タンパク質を発現する、２９３と名付けられた独特のヘルパー細胞株に依存する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムに必ずしも必要とされないので（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、２９３細胞の助けを有する現行のアデノウイルスベクターは、Ｅｌ領域、Ｄ３領域または両領域のいずれかに外来ＤＮＡを保有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。事実上、アデノウイルスは約１０５％の野生型のゲノムをパッケージし得（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）、約２ｋｂ余分のＤＮＡ収容能力を提供する。Ｅｌ領域およびＥ３領域に入れ換え可能な約５．５ｋｂのＤＮＡと組み合わされる場合、現行のアデノウイルスベクターの最大の収容能力は、７．５ｋｂ以下、またはベクターの全長の約１５％である。８０％を超えるアデノウイルスのウイルスゲノムは、ベクターの骨格内に残る。
【０１００】
ヘルパー細胞株はヒト細胞（例えば、ヒト胚性腎細胞、筋細胞、造血細胞、あるいは他のヒト胚性の間葉細胞または上皮細胞）由来であり得る。あるいは、このヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容的な、他の哺乳動物種の細胞由来であり得る。このような細胞としては、例えば、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞、あるいは他のサル胚性の間葉細胞または上皮細胞が挙げられる。上記のように、好ましいヘルパー細胞株は２９３である。
【０１０１】
Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞を培養し、そしてアデノウイルスを増殖させるための改善された方法を開示している。１つの形式において、天然の細胞凝集体を、１００〜２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコーン処理されたスピナ（ｓｐｉｎｎｅｒ）フラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）中に個々の細胞に接種させることにより増殖させる。４０ｒｐｍでの攪拌に続いて、細胞の生存度をトリパンブルーを用いて評価する。別の形式において、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ，Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）は、以下のように使用される。５ｍｌの培地中に再懸濁された細胞接種物を、２５０ｍｌのエルレンマイアー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に加え、そして時々攪拌（４時間に１回）しながら静置する。次いで、この培地を５０ｍｌの新鮮な培地と交換し、そして振とうを開始する。ウイルス産生に関しては、培地を交換（最終容量の２５％まで）し、そしてアデノウイルスをＭＯＩ０．０５で加えた後、細胞を約８０％コンフルーエンスまで増殖させる。培養物を、一晩静置し、次いで、その容量を１００％まで増加し、そして攪拌をもう７２時間開始する。
【０１０２】
このアデノウイルスベクターは、複製欠損であり得るか、または、少なくとも条件付きで不完全であり得、アデノウイルスベクターの本質は、本発明の成功した実施にとって重要であるとは考えられない。このアデノウイルスは、４２の異なる公知の血清型または亜群Ａ〜Ｆのいずれかのアデノウイルスであり得る。アデノウイルス型５亜群Ｃは、本発明の使用のための、条件付きの複製欠損のアデノウイルスベクターを得るために、好ましい出発物質である。これは、アデノウイルス型５がヒトアデノウイルスであり、アデノウイルス型５についての大量の生化学的情報および遺伝的情報が公知であり、そしてベクターとしてアデノウイルスを用いる大部分の構築のために歴史的に使用されているからである。
【０１０３】
上記のように、本発明に関する典型的なベクターは複製欠損であり、そしてアデノウイルスＥ１領域を有さない。従って、Ｅ１をコードする配列が除去されている部位に形質転換構築物を導入することが、最も便利である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入部位は、本発明にさほど重要ではない。対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、除去されたＥ３領域の代わりに、Ｅ３置換ベクター（Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）によって述べられている）中またはＥ４領域（ヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補足する）中に挿入され得る。
【０１０４】
アデノウイルス増殖および操作は当業者に公知であり、そしてインビボおよびインビトロにおいて広範な宿主範囲を示す。このウイルス群は、高い力価（例えば、１０９〜１０１１プラーク形成単位／ｍｌ）で得られ、そしてそれらは高感染性である。このアデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノム内への組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターにより送達されたこの外来遺伝子は、エピソーム性（ｅｐｉｓｏｍａｌ）であり、そしてそれゆえに、宿主細胞に対し、低い遺伝子毒性を有する。野生型アデノウイルスによるワクチン接種の研究では、副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）、このワクチン接種の安全性、および、インビボでの遺伝子移入ベクターとしての治療の可能性を示している。
【０１０５】
アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）、およびワクチン開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９２）に使用されている。動物試験は、組換えアデノウイルスが遺伝子治療に使用され得ることを示唆している（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織への組換えアデノウイルスの投与における研究としては、気管点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、ならびに脳内への定位接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、１９９３）が挙げられる。
【０１０６】
（ｂ．レトロウイルス感染）
レトロウイルスは、感染した細胞内で、逆転写の工程によりそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力により特徴付けられる、一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、生じたＤＮＡは細胞の染色体中にプロウイルスとして安定に組み込まれ、そしてウイルスのタンパク質合成を誘導する。この組込みは、受容細胞内およびその子孫内でのウイルスの遺伝子配列の保持を生じる。このレトロウイルスのゲノムは、それぞれ、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、ならびにエンベロープ構成成分をコードする３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見出される配列は、ビリオン内へのゲノムのパッケージ化のためのシグナルを含む。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列と強力なエンハンサー配列とを含み、そしてまた、宿主細胞ゲノム中への組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【０１０７】
レトロウイルスベクターを構築するために、対象の遺伝子をコードする核酸が、複製欠損であるウイルスを産生するための特定のウイルス配列の代わりに、ウイルスゲノム中に挿入される。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲとパッケージング成分とを含まないパッケージング細胞株が、構築される（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスのＬＴＲおよびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが、この細胞株に導入される（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）場合、そのパッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写がウイルス粒子中にパッケージ化されることを可能にし、次いで、培養液中に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含むこの培養液は回収され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子移入に使用される。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染し得る。しかし、組込みおよび安定した発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１０８】
欠損レトロウイルスベクターの使用に対する懸念は、パッケージング細胞中で野生型の複製可能なウイルスの潜在的な出現である。これは、組換えウイルス由来のインタクトな配列が宿主細胞ゲノムに組み込まれたｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、ｅｎｖ配列から上流に挿入する組換え事象から生じる。しかし、パッケージング細胞株は、組換えの可能性を大きく減少させるので、有効である（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。
【０１０９】
（ｃ．ＡＡＶ感染）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、高頻度の組込みを有し、そして非分裂性の細胞に感染し得るので、本発明における使用のための魅力的な（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ）ベクター系である。従って、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、組織培養における哺乳動物細胞内への遺伝子の送達に有用である（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）。ＡＡＶは、感染性に関して広い宿主範囲を有し（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８）、このことは、ＡＡＶが本発明による使用に適用可能であることを意味する。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号（それぞれが本明細書中で参考として援用されている）に記載されている。
【０１１０】
遺伝子送達におけるＡＡＶの使用を実証する研究は、ＬａＦａｃｅら（１９８８）；Ｚｈｏｕら（１９９３）；Ｆｌｏｔｔｅら（１９９３）；およびＷａｌｓｈら（１９９４）を含む。組換えＡＡＶベクターは、標識遺伝子（Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、１９９４；Ｙｏｄｅｒら、１９９４；Ｚｈｏｕら、１９９４；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８５；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８）およびヒトの疾患に関係している遺伝子（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２；Ｌｕｏら、１９９４；Ｏｈｉら、１９９０；Ｗａｌｓｈら、１９９４；Ｗｅｉら、１９９４）のインビトロおよびインビボでの形質導入のために首尾良く使用されている。最近、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症の処置のための第Ｉ相ヒト試験として認められている。
【０１１１】
ＡＡＶは、培養細胞において生産的感染を起こすために、別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスファミリーの一員のいずれか）との同時感染を必要とする、依存性のパルボウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）。ヘルパーウイルスとの同時感染がない場合、野生型のＡＡＶゲノムは、そのＡＡＶゲノムの末端を通じてヒト第１９染色体に組み込み、プロウイルスと同様に、潜伏した状態で存在する（Ｋｏｔｉｎら、１９９０；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９９１）。しかし、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質も発現されない場合は、ｒＡＡＶは、組込みを第１９染色体に限定されない（ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、１９９４）。ＡＡＶプロウイルスを保有する細胞がヘルパーウイルスに重感染される場合、そのＡＡＶゲノムは、染色体から、または組換えプラスミドから「レスキューされ（ｒｅｓｃｕｅｄ）」、そして、正常な増殖性の感染が確立される（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８；Ｋｏｔｉｎら、１９９０；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）。
【０１１２】
代表的に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、２つＡＡＶ末端反復（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９；それぞれが本明細書中で参考として援用されている）に隣接する目的遺伝子を含むプラスミドと、末端反復を含まない配列をコードする野生型のＡＡＶを含む発現プラスミド（例えば、ｐＩＭ４５（ＭｃＣａｒｔｙら、１９９１；本明細書中で参考として援用されている））を同時トランスフェクトすることにより作製される。この細胞はまた、ＡＡＶのヘルパー機能に必要とされるアデノウイルス遺伝子を保有する、アデノウイルスまたはプラスミドにより感染またはトランスフェクトされる。このような方法で作製されたｒＡＡＶウイルスストックは、アデノウイルスに汚染され、物理的に（例えば、塩化セシウム濃度遠心分離法によって）ｒＡＡＶ粒子と分離されなければならない。あるいは、ＡＡＶをコードする領域を含むアデノウイルスベクター、または、ＡＡＶをコードする領域およびアデノウイルスヘルパー遺伝子の一部あるいは全てを含む細胞株が、使用され得る（Ｙａｎｇら、１９９４ａ；Ｃｌａｒｋら、１９９５）。組み込まれるプロウイルスとして、ｒＡＡＶ  ＤＮＡを保有する細胞株もまた使用され得る（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９５）。
【０１１３】
（ｄ．他のウイルス性のベクター）
他のウイルス性ベクターが、本発明における構築物として使用され得る。例えば、ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターが、使用され得る。それらは、種々の哺乳動物細胞のために、いくつかの魅力的な特性を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１１４】
ベネズエラのウマの脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの、分子的にクローン化された株は、異種性の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ウイルス性タンパク質の発現のために、複製能力のあるワクチンワクチンベクターとして、遺伝的に精製された（Ｄａｖｉｓら、１９９６）。研究は、ＶＥＥ感染が、強力なＣＴＬ応答を刺激することを示し、そしてＶＥＥが、免疫化に非常に有用なベクターであり得ることが示唆されている（Ｃａｌｅｙら、１９９７）。ＶＥＥウイルスが樹状細胞を標的とする場合に有用であり得ることが、本発明中で企図される。
【０１１５】
欠損Ｂ型肝炎ウイルスの最近の認識によると、異なるウイルス配列の構造機能の関連性において、新しい識見が得られた。インビトロでの研究は、このウイルスが、そのゲノムの８０％に及ぶ欠失にも関わらず、ヘルパー依存性のパッケージング能力および逆転写能力を保持し得ることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。このことは、ゲノムの大部分が、外来の遺伝物質と置換され得ることを示唆した。最近Ｃｈａｎｇら（１９９１）は、ポリメラーゼ、表面およびプレ表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）をコードする配列のかわりに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をアヒルのＢ型肝炎ウイルスゲノム中に導入した。野生型ウイルスにより、トリの肝癌細胞株内に同時トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含む培養液は、アヒルの子の初代肝細胞に感染させるために使用された。安定なＣＡＴ遺伝子の発現は、トランスフェクション後少なくとも２４日間検出された（Ｃｈａｎｇら、１９９１）。
【０１１６】
本発明のなおさらなる実施形態において、細胞外のヒトＭＤＡ−７をコードする送達されるべき核酸は、特異的結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルス内に収容される。従って、このウイルス粒子は、標的細胞の同属のレセプターに特異的に結合し、そして、その標的細胞に内容物を送達する。レトロウイルスベクターの特異的なターゲティングを許容するように設計された新規のアプローチが、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的な添加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質レセプターを介して肝細胞への特異的な感染を可能にし得る。
【０１１７】
例えば、組換えレトロウイルスのターゲティングが設計され、その中で、レトロウイルスのエンベロープタンパク質に対するビオチン化された抗体および特異的な細胞レセプターに対するビオチン化された抗体が使用された。これらの抗体は、ストレプトアビジンの使用によりビオチン成分を通して結合された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主要組織適合性複合体クラスＩ抗原およびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、エコトロピックなウイルスによりそれらの表面抗原を生じる（ｂｏｒｅ）種々のヒト細胞の感染をインビトロで実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０１１８】
（２．非ウイルス性の送達）
細胞外のｍｄａ−７タンパク質をコードする核酸の、ウイルス性の送達に加えて、下記は、所定の宿主細胞への組換え遺伝子送達のさらなる方法であり、従って、本発明中で検討されている。
【０１１９】
（ａ．エレクトロポレーション）
本発明の特定の好ましい実施形態において、遺伝子構築物を、エレクトロポレーションを介して、樹状突起細胞へと導入した。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液の高電圧放電への曝露を含む。
【０１２０】
エレクトロポレーションを用いる、真核細胞のトランスフェクションは、完全に成功した。マウス前Ｂリンパ球を、ヒトκ免疫グロブリン遺伝子（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）で形質転換し、そしてラット肝細胞を、クラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６）で、この様式で、形質転換した。
【０１２１】
異なった供給源由来の内皮細胞のためのエレクトロポレーションの条件は、最適化され得ることが意図される。電圧、静電容量、時間およびエレクトロポレーション媒体の組成物のようなパラメーターを特に最適化することが望まれ得る。他の慣用的調整の実行は、当業者に公知である。
【０１２２】
（ｂ．微粒子銃）
細胞中への裸のＤＮＡ構築物を形質移入するための本発明の別の実施形態は、微粒子銃を含む。この方法は、ＤＮＡ被覆微粒子を高速度に加速して、それらを殺すことなく細胞膜を通過させて、細胞内に入れることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら  １９８７）。使用される微粒子は、タングステン、白金または金のビーズのような生物学的に不活性な物質から構成される。
【０１２３】
いくつかの例では、金属粒子上のＤＮＡの沈殿は、微粒子銃を用いる、レシピエント細胞へのＤＮＡ送達のために必要でないことを意図する。粒子は、ＤＮＡでコートするよりも、ＤＮＡを含み得ることを意図する。従って、ＤＮＡコート粒子は、微粒子銃を介して、ＤＮＡ送達のレベルを増加させ得るが、しかしそれら自身の中またはそれら自身である必要はないことを提案する。
【０１２４】
小さい粒子を加速するための、いくつかのデバイスが、開発された。１つのそのようなデバイスは、電流を発生させるための高電圧放電に依存し、これは次いで推進力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。別の方法は、微粒子銃送達システム（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）の使用を含み、この微粒子銃送達システムは、懸濁液中で、細胞で覆われたフィルターの表面上の、スクリーン（例えば、ステンレス銅またはＮｙｔｅｘスクリーン）を通してＤＮＡでコートされる粒子を推進するために使用し得る。大きな集合体の中のレシピエント細胞へと送達しないようにこのスクリーンは、粒子を分散する。発射装置と衝突されるべき細胞との間に介在するスクリーンは、微粒子凝集体の大きさを減少し、そして大きすぎる微粒子によってレシピエント細胞に対して与えられる損傷を減少することによって、形質転換のより高い頻度に貢献すると考えられる。
【０１２５】
ボンバートメントのために、懸濁液中の細胞は、好ましくはフィルター上または固体培養培地で濃縮される。衝突させるべき細胞は、微粒子がとどまるプレートの下に、適切な距離で配置される。所望ならば、１つ以上のスクリーンはまた、加速デバイスと衝突させる細胞との間に配置される。
【０１２６】
ボンバートメント形質転換において、当業者は、プレボンバートメント培養条件、および最大数の安定な形質転換体を得るためにボンバートメントパラメーターを最適化し得る。ボンバートメントのための、物理的パラメーターおよび生物学的パラメーターが、この技術で重要である。物理学的因子は、ＤＮＡ／微粒子沈殿を操作することを伴うものであり、飛距離および速度、または巨大粒子または微粒子のどちらかに影響するものである。生物学的因子は、ボンバートメントの前及び直後の細胞の操作に関与する全ての段階、ボンバートメントに関係する損傷の緩和を助けるための標的細胞の浸透圧の調整、および形質転換するＤＮＡの性質（例えば、直線化ＤＮＡまたはインタクトなスーパーコイルプラスミド）を含む。プレボンバートメントの操作は、始原生殖細胞の首尾よい形質転換のために特に重要であると考えられている。
【０１２７】
従って、条件を完全に最適化するために小さいスケールの研究において、様々なボンバートメントパラメーターを調整することを所望し得る。物理学的パラメーター（例えば、ギャップ距離、飛距離、組織距離およびヘリウム圧力）を調整することを特に所望し得る。条件を変更することによって、損傷減少因子を最適化し得る。これは、レシピエント細胞の生理学的状態に影響し、従って、形質転換効果および組込み効果に影響し得る。例えば、レシピエント細胞の浸透圧状態、組織水和および継代培養段階または細胞同期は、最適な形質転換のために調節され得る。他の慣用的調整の実行は、当業者に公知である。
【０１２８】
（ｃ．リン酸カルシウム共沈またはＤＥＡＥ−デキストラン処理）
本発明の他の実施形態において、トランスジェニック構築物は、リン酸カルシウム共沈を用いて、細胞へと導入される。マウスの始原生殖細胞は、すばらしい結果で、ＳＶ４０大Ｔ抗原でトランスフェクトされた（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９７）。ヒトＫＢ細胞は、この技術を用いて、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクトされた（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３）。この様式でまた、マウスＬ（Ａ９）細胞、マウスＣ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７）、そしてラットの肝細胞が、様々なマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、１９９０）。
【０１２９】
別の実施形態において、発現構築物は、ＤＥＡＥデキシトラン、次いでポリエチレングリコールを用いて、細胞へ導入される。この様式で、レポータープラスミドは、マウスの骨髄腫細胞および赤白血病細胞へと導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５）。
【０１３０】
（ｄ．直接的マイクロインジェクションまたは超音波負荷）
本発明のさらなる実施形態は、直接的マイクロインジェクションまたは超音波負荷による核酸構築物の導入を含む。直接的マイクロインジェクションは、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞へ核酸を導入するために使用された（ＨａｒｌａｎｄよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、そしてＬＴＫ−線維芽細胞は、超音波負荷によって、チミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）。
【０１３１】
（ｅ．脂質媒介形質転換）
本発明のさらなる実施形態において、遺伝子構築物は、リポソームの処方物または脂質処方物に取り込まれ得る。リポソームは、リン脂質二重膜および内側の水溶性媒体によって特徴付けられる小嚢構造である。多重膜リポソームは、水溶性媒体によって分割される複数の脂質層を有する。リン脂質が過剰の水溶性溶液に懸濁される場合に、それらは、自然に形成する。脂質成分は、閉められた構造の形成の前に、自身での再構成を行い、そして脂質二重層の間の水および溶解された溶質を取り込む（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。リポフェクタミンと複合体化した遺伝子構築物（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）はまた、意図される。
【０１３２】
脂質媒介核酸送達およびインビトロでの外来ＤＮＡの発現は、十分に成功されていた（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７）。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養したニワトリ胚、ＨｅＬａ細胞および肝細胞腫細胞における、脂質媒介送達および外来ＤＮＡの発現の可能性を示した。
【０１３３】
脂質ベースの非ウイルス処方物は、アデノウイルス遺伝子療法の代替を提供する。多くの細胞培養の研究は、脂質ベースの非ウイルス性遺伝子の移入を実証したが、脂質ベースの処方物を介する全身の遺伝子送達には、制限があった。非ウイルス性脂質ベースの遺伝子送達の主要な制限は、非ウイルス性送達ビヒクルを含むカチオン性脂質の毒性である。リポソームのインビボにおける毒性は、遺伝子移入のインビトロとインビボとの間の不一致を一部説明する。この矛盾したデータの一因となる別の因子は、血清タンパク質の存在および不在での脂質ビヒクルの安定性における差異である。脂質ビヒクルと血清タンパク質との間の相互作用は、脂質ビヒクルの安定性の特性に対する劇的な影響を有する（ＹａｎｇおよびＨｕａｎｇ、１９９７）。カチオン性脂質は、負に電荷した血清タンパク質を引き寄せ、そして結合する。血清タンパク質に関連する脂質ビヒクルは、循環からそれらを除去可能にするマクロファージによって溶解されるか、吸収されるかのいずれかである。最近のインビボ脂質送達方法は、循環におけるカチオン脂質に関連する毒性および安定性の問題を回避するために皮下注射、皮内注射、腫瘍内注射、または、頭蓋内注射を使用する。脂質ビヒクルと血漿タンパク質との相互作用は、インビトロ遺伝子移入（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７）とインビボ遺伝子移入（Ｚｈｕら、１９９３；Ｐｈｉｌｉｐら、１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５；Ｌｉｕら、１９９５；Ｔｈｉｅｒｒｙら、１９９５；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、１９９５；Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈら、１９９６）との間の効率における不均衡の原因である。
【０１３４】
脂質処方物における、最近の進歩は、インビボでの遺伝子移入の効率を改善した（Ｓｍｙｔｈ−Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、１９９７；ＷＯ９８／０７４０８）。等モル比の１，２−ビス（オレオイルロキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロールから構成される新規の脂質処方物は、全身のインビボでの遺伝子移入を、約１５０倍に有意に増大する。ＤＯＴＡＰ：コレステロールの脂質処方物は、「サンドイッチリポソーム」と呼ばれる独特な構造を形成すると言われる。この処方物は、陥入した二層の間または「瓶（ｖａｓｅ）」構造の「サンドイッチ」ＤＮＡと報告されている。それらの脂質構造の有益な特徴は、コレステロール、二次ＤＮＡパッキングおよび増加した血清安定性による、正のコロイド安定化を含む。
【０１３５】
脂質処方物の生成は、しばしば、（Ｉ）逆相蒸発（ＩＩ）脱水−再水和（ＩＩＩ）界面活性剤透析および（ＩＶ）薄膜水和の後の、リポソーム混合物の超音波処理または連続の押し出しによって達成される。一旦、製造されると、脂質構造は、循環における場合、有毒（化学療法）または不安定（核酸）である化合物をカプセル化するために使用され得る。脂質のカプセル化は、このような化合物の対するより低い毒性および、より長い血清の半減期を生じた（Ｇａｂｉｚｏｎら、１９９０）。多数の疾患の処置は、脂質ベースの遺伝子移入ストラテジーを使用して、従来または確立した新規の療法（特に新脈管形成に関する疾患を処置するための療法）を増強する。
【０１３６】
本発明の特定の実施形態において、脂質ビヒクルは、血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合体化し得る。これは、細胞膜を容易に融合し、そして脂質カプセル化ＤＮＡの細胞侵入を促進することを示した（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施形態において、脂質ビヒクルは、複合体化し得るか、または核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とと組み合わせて用いられ得る（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる実施形態において、脂質ビヒクルは、複合体化し得るか、またはＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と組み合わせて用いられ得る。
【０１３７】
（Ｆ．薬学的処方物および送達）
本発明の好ましい実施形態において、ヒトｍｄａ−７タンパク質をコードする発現構築物の送達によって新脈管形成に関する疾患に対する処置の方法が、意図される。本発明において最も可能性が高い処置すべき新脈管形成に関する疾患は、癌遺伝子における変異および内皮細胞における野性型タンパク質の減少した発現から生じるものである。処置するために意図される新脈管形成に関する疾患の例としては、以下が挙げられる：肺癌、頭および首の癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、子宮頚癌、胃腸癌、リンパ腫、肺中の前腫瘍性病巣、結腸癌、乳癌、膀胱癌、およびヒトｍｄａ−７タンパク質をコードする核酸を投与することによって処置され得る他の新脈管形成に関する疾患。
【０１３８】
効果的な量の薬学的組成物は、一般に、疾患またはその症状の程度を改善、減少、最小化または限定するために、検出およびくり返し可能な十分な量として定義される。より厳密な定義が適用され得る（疾患の排除、根絶または治癒を含む）。
【０１３９】
好ましくは、患者は、適切な骨髄機能（＞２，０００／ｍｍ３の末梢顆粒球絶対数および１００，０００ｍｍ３の血小板数として定義される）、適切な肝臓機能（ビリルビン＜１．５ｍｇ／ｄｌ）および適切な腎臓機能（クレアチニン＜１．５ｍｇ／ｄｌ）を有する。
【０１４０】
（１．投薬）
細胞を殺すため、細胞増殖を阻害するため、転移を阻害するため、腫瘍または組織サイズを減少させるため、およびその他では腫瘍細胞の悪性表現型を反転または減少するために、方法および本発明の化合物を用いて、一般的に内皮細胞を治療的発現構築物と接触させる。投薬の経路は、病変の配置および性質で自然に変化し、そして例えば、皮内、非経口的、静脈内、筋肉内、鼻腔内および経口投与および処方を含む。
【０１４１】
腫瘍中への注射、または腫瘍血管系への注射は、別々の、硬い、アクセス可能な腫瘍に対して特異的に意図される。局所的、局部的または全身的な投与はまた、適切であり得る。＞４ｃｍ腫瘍について、投与される容積は、約４ｍｌ〜１０ｍｌ（好ましくは１０ｍｌ）であるが、＜４ｃｍ腫瘍については、約１ｍｌ〜３ｍｌの容積が使用される（好ましくは３ｍｌ）。複数回の注射は、約０．１ｍｌ〜約０．５ｍｌの容積を含む単一用量として送達された。ウイルス粒子は、複数回の注射を約１ｃｍの間隔を空けて腫瘍に投与することによって、有利に接触し得る。
【０１４２】
外科手術的介入の場合、本発明を手術に先立って使用して、手術不可能な腫瘍実体を切除させる。あるいは、本発明を外科手術の時および／または外科手術の後に使用して、後遺疾患または転移疾患を治療し得る。例えば、切除された腫瘍ベッドを、ｍｄａ−７またはｍｄａ−７をコードする構築物を含む処方物を用いて、注射または灌流し得る。例えば、この灌流は、外科手術の部位に移植されたカテーテルを残すことによって、切除後も続けられ得る。外科手術後の周期的な処置も想定される。
【０１４３】
連続的投与もまた、適切な場合、例えば、腫瘍を摘出し、そしてその腫瘍ベッドを処置し、後遺の顕微鏡的疾患を除去する場合、にも適用し得る。シリンジを通した送達またはカテーテル法が好ましい。このような連続的な灌流は、処置の開始に続いて約１〜２時間から、約２〜６時間まで、約６〜１２時間まで、約１２〜２４時間まで、約１〜２日まで、約１〜２週間まで、またはそれ以上の期間にわたって、起こり得る。一般的に、連続的灌流による治療組成物の用量は、灌流が生じる期間にわたって調整された単回または複数回の注射によって得られる用量と等しい。
【０１４４】
処置レジメンは、なお変化し得、しばしば腫瘍の型、腫瘍の位置、疾患の進行、ならびに患者の健康状態および年齢に依存する。明らかに、特定の型の腫瘍は、より攻撃的な治療を必要とするが、同時に、特定の患者は、よりやっかいなプロトコールを許容し得ない。臨床医が、治療的処方物の公知の効力または（もしあれば）毒性に基づいてそのような決定をなすことに最も適している。
【０１４５】
特定の実施形態において、処置された腫瘍は、少なくとも最初は、切除可能でないかもしれない。治療的ウイルス構築物を用いた治療は、辺縁での収縮に起因してか、またはある特定の侵略的な部位の除去によって、腫瘍の切除可能性を増加し得る。処置に続いて、切除は可能であり得る。切除の後のさらなる処置は、腫瘍部位の顕微鏡的な後遺的疾患を除去するように働く。
【０１４６】
原発性腫瘍または切除後腫瘍ベッドについての代表的な処置クールは、複数の用量を含む。代表的な原発性腫瘍の処置は、２週間にわたる６用量の適用を含む。２週間のレジメンは、１回、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の回反復され得る。処置クールの間、計画された投薬を完了する必要性は、再評価され得る。
【０１４７】
処置は、種々の「単位用量」を含み得る。単位用量を、所定量の治療的組成物を含むものとして定義する。投与されるべき量、ならびに特定の経路および処方は、臨床医の技術分野の範囲内にある。単位用量は、単回の注射として投与される必要はないが、１期間のセットにわたる連続した注射を含み得る。本発明の単位用量を、ウイルス構築物についてのプラーク形成単位（ｐｆｕ）またはウイルス粒子の観点において便宜上記載し得る。単位用量は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３およびそれ以上のｐｆｕまたはウイルス粒子数（ｖｐ）の範囲にわたる。
【０１４８】
タンパク質を、０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．０５ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０．４ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．６ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、０．９ｎｇ／ｍｌ、１．０ｎｇ／ｍｌ、２．０ｎｇ／ｍｌ、３．０ｎｇ／ｍｌ、４．０ｎｇ／ｍｌ、５．０ｎｇ／ｍｌ、６．０ｎｇ／ｍｌ、７．０ｎｇ／ｍｌ、８．０ｎｇ／ｍｌ、９．０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、６５ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、８５ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、９５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、５５０ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、６５０ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、８５０ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、９５０ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、３０００ｎｇ／ｍｌ、４０００ｎｇ／ｍｌ、５０００ｎｇ／ｍｌ、６０００ｎｇ／ｍｌ、７０００ｎｇ／ｍｌ、８０００ｎｇ／ｍｌ、９０００ｎｇ／ｍｌ、または１００００ｎｇ／ｍｌ以上の用量もしくは少なくともこれらの用量で患者へ投与し得る。
【０１４９】
（２．注射可能な組成物および処方物）
本発明における、ヒトｍｄａ−７タンパク質をコードする発現構築物を内皮細胞へ送達する好ましい方法は、腫瘍内注射による方法である。しかし、本明細書で開示される薬学的化合物を、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号（その全体が参考として本明細書中に各々特に援用される）に記載されるように、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、または腹腔内に代替的に投与し得る。
【０１５０】
核酸構築物の注射は、シリンジまたは、発現構築物が注射に必要な針の特定のゲージを通過し得る限り、溶液の注射に使用される任意の他の方法によってなされ得る。溶液を保持するためのアンプルチャンバーを規定するノズルおよび
溶液をノズルから送達部位へ押すエネルギーデバイスを有する、新規の、針を使用しない（ｎｅｅｄｅｌｅｓｓ）注射システムが、最近記載された（米国特許第５，８４６，２３３号）。正確に任意の深さにて所定量の溶液の複数回の注射を可能にするシリンジシステムも、遺伝子治療における使用のために記載された（米国特許第５，８４６，２２５号）。
【０１５１】
遊離塩基としての活性な化合物または薬学的に受容可能な塩の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で、調製し得る。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物ならびに油中で、調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を阻止するために、保存薬を含む。注射可能な使用に適した薬学的形態は、滅菌水溶液または分散剤および滅菌された注射可能な溶液または分散剤の即時処方物のための滅菌粉末を含む（米国特許第５，４６６，４６８号、その全体が参考として本明細書中に特に援用される）。全ての場合において、形態は滅菌状態でなければならず、そして、容易な注射可能性が存在するような程度の流体でなければならない。形態は、製造または貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して、保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、（例えばレシチンのような）コーティングの使用によって、分散剤の場合は要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌性因子および抗真菌性因子、例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、砂糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長した吸収は、吸収を延長させる因子（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中での使用によってもたらされ得る。
【０１５２】
例えば、水溶液での非経口投与について、溶液は、必要ならば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤はまず十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与および腹腔内投与に、特に適切である。この点について、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一回の投薬量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶かし得、そして、１０００ｍｌの皮下注入流体に加えるかまたは注入指定部位での注入をすることができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁）。投薬量のいくつかのバリエーションは、処置される被験体の状態に依存して、必然的に生じる。いずれにせよ、投与の責任を負う人は、個々の被験体について適切な用量を決定する。さらに、ヒトの投与について、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ標準によって要求されるような滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度標準を満たすべきである。
【０１５３】
滅菌された注射可能な溶液を、適切な溶媒中の必要量の活性な化合物を、上記で列挙した他の種々の成分と混合することによって調製し、必要な場合、続いて濾過滅菌を行う。一般的に、分散剤は、種々の滅菌された活性成分を、基本分散媒体および上記に列挙されたものから求められる他の成分を含む滅菌ビヒクルへ、混合することによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらの技術によって、予め濾過滅菌されたその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０１５４】
本明細書で開示される組成物は、中性形態または塩形態にて処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）酸付加塩ならびに、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、蓚酸、酒石酸、およびマンデリン酸などのような有機酸と形成されるものを含む。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液を投薬量処方物と互換可能な様式で、そして治療的に有効な量で投与する。処方物は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどのような種々の投薬量形態で容易に投与される。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「キャリア」としては、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈液、抗菌剤および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するそのような溶媒および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の簡便な溶媒または薬剤が活性な成分と互換可能ではない場合を除いて、治療組成物中でのその使用は、企図される。補充される活性成分もまた、組成物へ組み込み得る。
【０１５６】
用語「薬学的に受容可能」は、ヒトに投与された場合、アレルギーまたは類似した都合の悪い反応を引き起こさない分子実体および組成物をいう。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野で十分に理解されている。典型的には、そのような組成物は、注射可能物質（液状溶液か液状懸濁物のいずれか）として調製される；注入前に、液体中の溶液または懸濁物に適切な固体型もまた調製し得る。
【０１５７】
（Ｇ．組合せ処置）
ＭＤＡ−７ポリペプチドまたはそれをコードする発現構築物の効力を増加させるために、これら組成物を新脈管形成関連疾患の処置において有効な他の薬剤と組合わせることは、望ましいことであり得る。これらの組成物を、殺傷または細胞増殖の阻害に有効な結合量で提供する。このプロセスは、細胞を発現構築物および薬剤または複数の因子と同時に接触させる過程を含み得る。これは、細胞を単一の組成物もしくは両方の薬剤を含む薬学的処方物と接触させるかまたは細胞を２つの異なる組成物または処方物と同時に接触させることによって達成され得る。ここで、一方の組成物は発現構築物を含み、そして他方は、第二の薬剤を含む。
【０１５８】
化学療法剤および放射線療法因子に耐性な腫瘍細胞は、臨床腫瘍学での主要な問題を示す。現在の癌研究の一つの目標は、遺伝子治療と組合わせることによる化学療法および放射線療法の効力を改善させる方法を見出すことである。例えば、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達される場合、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、抗ウイルス剤ガンシクロビルへの感受性を首尾よく誘導した（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９２）。本発明の内容において、ｍｄａ−７遺伝子治療は、他のプロアポトーシス制御因子または細胞周期制御因子に加えて、化学療法的介入または放射線療法的介入と共に、同様に使用され得ることが企図される。
【０１５９】
あるいは、遺伝子治療は、数分から数週間にわたる間隔による他の薬剤処置に先立ち得るかまたはそれに続き得る。他の薬剤および発現構築物が細胞に別々に適用される実施形態において、薬剤および発現構築物がまだ細胞へ有利に複合した効果を働かせ得るように、各々の送達の時間の間、有意な期間が終了したことが、一般に保証される。そのような例において、細胞が、相互に約１２時間から２４時間以内、およびより好ましくは相互に約６時間から１２時間以内に両方の様相と接触させ得ることが、企図される。いくつかの状況において、処置の期間を有意に延長することが望ましくあり得る。しかし、ここで、数日（２日、３日、４日、５日、６日、または７日）から数週（１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、または８週）は、個々の投与の間に経過する。
【０１６０】
種々の組合せを使用し、遺伝子治療は「Ａ」であり、そして、放射線療法または化学療法のような第二の因子は「Ｂ」である：
【０１６１】
【化１】
2005500247.tif 000007
本発明の治療的発現構築物を患者へ投与することは、もしあるのならば、ベクターの毒性を考慮して、化学療法剤の投与についての一般的なプロトコールに従う。必要な場合には、処置サイクルは繰り返されることが期待される。種々の標準の治療法および外科的介入は、記載された内皮細胞療法と共に適用され得ることもまた企図される。
【０１６２】
（１．化学療法）
癌療法はまた、化学的基本処置および放射線治療的基本処置の両方とともに種々の組合せ療法を含む。組合せ化学療法として、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎ）、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、またはこれらの任意のアナログもしくは誘導体改変体が挙げられる。
【０１６３】
（２．放射線療法）
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範囲で使用されてきた他の因子は、腫瘍細胞へのγ腺、Ｘ線、および／または放射性同位元素の指向的送達として一般に公知のものを含む。ＤＮＡ損傷因子の他の形態はまた、例えば、マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）およびＵＶ照射が企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持に対する広範な損傷をもたらすようである。Ｘ腺についての線量の範囲は、延長した期間（３週間から４週間）について一日線量５０レントゲン〜２００レントゲンにわたり、単回線量２０００レントゲン〜６０００レントゲンにわたる。放射性同位元素についての線量範囲は、広い範囲で変化し、そして同位体の半減期、放射された放射線の強度および型、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１６４】
１９４５年において、Ｒ．Ｒ．Ｗｉｌｓｏｎは、癌の処置における陽子線の使用を提案した。そのような処置における陽子の利点は、以下の物理的特徴にある：（１）組織を貫通する陽子によって送達される放射線量は、陽子が減速すると上昇し、その停止点（「ブラッグピーク」）近傍の最大値に到達し、そして停止点を越えるとゼロである、（２）単一エネルギービーム中のプロトンは、ほとんど同じ範囲を有し、従って、同じ深さで最大線量を送達する、および（３）比較的重いプロトンは、それらが静止した場合、直線から大きく偏位しない。
【０１６５】
放射線処置に応答する癌および他の疾患の処置における陽子線の全潜在能力を実現するために、処置される部位の正確な位置および処置位置にわたる組織の特徴を知ることは、医師にとって必要である。このような情報が、現在、要求される精度で利用可能であるのは、コンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のような新しい画像化技術の出現のみである。癌患者の処置のための陽子線治療は、現在実現可能である。
【０１６６】
細胞に対して適用される場合、用語「接触させた」および「曝露させた」は、治療的構築物および化学療法剤または放射線療法剤が、標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接近位に配置されるプロセスを記載するために、本明細書中で使用される。細胞の死滅または静止（ｓｔａｓｉｓ）を達成するために、両方の薬剤は、細胞を死滅させるかまたは細胞を分裂から妨げるために有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
【０１６７】
（３．遺伝子）
なお別の実施形態において、二次処置は、二次遺伝子治療である。以下の遺伝子産物の１つをコードする第２のベクターと共にＭＤＡ−７をコードするベクターを送達することは、標的組織に対する組み合わせた抗過剰増殖効果を有する。あるいは、両方の遺伝子をコードする単一のベクターが使用され得る。
【０１６８】
（ａ．細胞増殖のインデューサー）
細胞増殖を誘導するタンパク質は、さらに、機能に依存して種々のカテゴリーに分類される。これらのタンパク質の全ての共通性は、細胞増殖を調節するそれらの能力である。例えば、ＰＤＧＦの１つの形態（ｓｉｓ癌遺伝子）は、分泌増殖因子である。癌遺伝子は、増殖因子をコードする遺伝子から稀にしか生じず、そして現時点で、ｓｉｓは、唯一知られた天然に存在する発癌性増殖因子である。本発明の１つの実施形態において、細胞増殖の特定のインデューサーに対するアンチセンスｍＲＮＡが、細胞増殖のインデューサーの発現を妨げるために使用されることが企図される。
【０１６９】
タンパク質ｆｍｓ、ｅｒｂＡ、ｅｒｂＢおよびｎｅｕは、増殖因子レセプターである。これらのレセプターに対する変異は、調節可能な機能の喪失を生じる。例えば、ｎｅｕレセプタータンパク質の膜貫通ドメインに影響する点変異は、ｎｅｕ癌遺伝子を生じる。ｅｒｂＡ癌遺伝子は、甲状腺ホルモンに対する細胞内レセプターから誘導される。改変された発癌性ｅｒｂＡレセプターは、内因性の甲状腺ホルモンレセプターと競合し、制御不能な増殖を引き起こすと考えられる。
【０１７０】
癌遺伝子の最大のクラスは、シグナル伝達物質であるシグナル伝達タンパク質（例えば、ｓｒｃ、ａｂｌおよびｒａｓ）である。タンパク質ｓｒｃは、細胞質タンパク質−チロシンキナーゼであり、そしていくつかの場合におけるプロト癌遺伝子から癌遺伝子へのその形質転換は、チロシン残基５２７での変異により生じる。対照的に、１つの例において、プロト癌遺伝子から癌遺伝子へのＧＴＰａｓｅタンパク質ｒａｓの形質転換は、配列中のアミノ酸１２でのバリンからグリシンへの変異から生じ、ｒａｓのＧＴＰａｓｅ活性を減少させる。
【０１７１】
タンパク質ｊｕｎ、ｆｏｓおよびｍｙｃは、転写因子として核の機能にそれらの効果を直接的に発揮するタンパク質である。
【０１７２】
（ｂ．細胞増殖のインヒビター）
腫瘍サプレッサー癌遺伝子は、過剰な細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子の不活性化は、それらの阻害性活性を破壊し、調節されない増殖を生じる。腫瘍サプレッサーｐ５３、ｐ１６およびＣ−ＣＡＭを、以下に記載する。
【０１７３】
高レベルの変異体ｐ５３は、化学的な発癌、紫外線照射、およびいくつかのウイルスによって形質転換された多くの細胞において見出されている。ｐ５３遺伝子は、多種多様なヒトの腫瘍における変異性不活性化の頻繁な標的であり、そしてｐ５３遺伝子は、すでに、一般的なヒトの癌において最も頻繁に変異された遺伝子であることが証明されている。ｐ５３遺伝子は、５０％を超えるヒトＮＳＣＬＣ（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、１９９１）および広範囲の他の腫瘍において変異される。
【０１７４】
ｐ５３遺伝子は、宿主タンパク質（例えば、ラージＴ抗原およびＥ１Ｂ）と複合体を形成し得る３９３アミノ酸のリンタンパク質をコードする。このタンパク質は、形質転換された細胞または腫瘍組織と比較してわずかな濃度ではあるが、正常組織および正常細胞中に見出される。
【０１７５】
野生型ｐ５３は、多くの細胞型における重要な増殖調節因子として認識されている。ミスセンス変異は、ｐ５３遺伝子について一般的であり、そしてミスセンス変異は、癌遺伝子の形質転換能力に対して不可欠である。点変異によって刺激された単一の遺伝子変化は、発癌性のｐ５３を引き起こし得る。しかし、他の癌遺伝子とは異なり、ｐ５３の点変異は、少なくとも３０個の異なるコドンにおいて生じることが知られ、しばしば、ホモ接合性への減数なしに細胞表現型にシフトを生じる優性対立遺伝子を引き起こす。さらに、これらのドミナントネガティブ対立遺伝子の多くが、生物において耐性であり、そして生殖細胞系において伝播されるようである。種々の変異対立遺伝子は、最小限に機能不全のドミナントネガティブ対立遺伝子から強力な浸透性のドミナントネガティブ対立遺伝子まで及ぶようである（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９９１）。
【０１７６】
細胞増殖の別のインヒビターは、ｐ１６である。真核生物細胞周期の主要な遷移は、サイクリン依存性キナーゼ（またはＣＤＫ）によって誘発される。１つのＣＤＫ、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）は、Ｇ１中の進行を調節する。この酵素の活性は、後期Ｇ１でＲｂをリン酸化することであり得る。ＣＤＫ４の活性は、活性化サブユニット（Ｄ型サイクリン）および阻害性サブユニット（ｐ１６ＩＮＫ４）によって制御される。このｐ１６ＩＮＫ４は、ＣＤＫ４に特異的に結合しかつ阻害するタンパク質として、生化学的に特性付けられ、従って、Ｒｂのリン酸化を調節し得る（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９３；Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９５）。ｐ１６ＩＮＫ４タンパク質が、ＣＤＫ４インヒビターであるので（Ｓｅｒｒａｎｏ、１９９３）、この遺伝子の欠失は、ＣＤＫ４の活性を増加し、Ｒｂタンパク質の過剰リン酸化を生じ得る。ｐ１６はまた、ＣＤＫ６の機能を調節することが知られる。
【０１７７】
ｐ１６ＩＮＫ４は、ｐ１６Ｂ、ｐ１９、ｐ２１ＷＡＦ１、およびｐ２７ＫＩＰ１をも含む、新規に記載されたＣＤＫ阻害性タンパク質のクラスに属する。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子は、多数の腫瘍のタイプにおいて頻繁に欠失される染色体領域９ｐ２１に位置する。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子のホモ接合性の欠失および変異は、ヒト腫瘍細胞株においてしばしば起こる。この証拠は、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子であることを示唆する。しかし、この解釈は、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子の変更の頻度が、培養された細胞株中よりも初期の培養されていない腫瘍中ではるかに低いという観察によって、検証されてきた（Ｃａｌｄａｓら、１９９４；Ｃｈｅｎｇら、１９９４；Ｈｕｓｓｕｓｓｉａｎら、１９９４；Ｋａｍｂら、１９９４；Ｋａｍｂら、１９９４；Ｍｏｒｉら、１９９４；Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９４；Ｎｏｂｏｒｉら、１９９５；Ｏｒｌｏｗら、１９９４；Ａｒａｐら、１９９５）。プラスミド発現ベクターでのトランスフェクションによる野生型ｐ１６ＩＮＫ４の機能の回復は、いくつかのヒト癌細胞株によるコロニーの形成を減少させた（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９４；Ａｒａｐ、１９９５）。
【０１７８】
本発明に従って使用され得る他の遺伝子としては、以下が挙げられる：ＲＢ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐ１６融合体、ｐ２１／ｐ２７融合体、抗血栓性遺伝子（例えば、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ）、ＰＧＳ、新脈管形成に関わる遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ）およびＭＣＣ。
【０１７９】
（ｃ．プログラム細胞死の調節因子）
アポトーシス（またはプログラム細胞死）は、正常な胚の発生、成人組織における恒常性の維持、および発癌の抑制に対して不可欠な過程である（Ｋｅｒｒら、１９７２）。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーおよびＩＣＥ様プロテアーゼは、他の系において、アポトーシスの重要な調節因子およびエフェクターであることが示されている。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたＢｃｌ−２タンパク質は、多様なアポトーシスの刺激に応答して、アポトーシスの制御および細胞の生存の向上に顕著な役割を果たす（Ｂａｋｈｓｈｉら、１９８５；ＣｌｅａｒｙおよびＳｋｌａｒ、１９８５；Ｃｌｅａｒｙら、１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら、１９８５；ＴｓｕｊｉｍｏｔｏおよびＣｒｏｃｅ、１９８６）。進化的に保存されたＢｃｌ−２タンパク質は、現在、死の（ｄｅａｔｈ）アゴニストまたは死のアンタゴニストとして分類され得る、関連タンパク質のファミリーのメンバーであると認識される。
【０１８０】
その発見に続いて、Ｂｃｌ−２が種々の刺激によって誘発される細胞死を抑制するように作用することが示された。また、現在、共通の構造的相同性および配列相同性を共有する、Ｂｃｌ−２細胞死調節性タンパク質のファミリーが存在することが明らかである。これらの異なるファミリーのメンバーは、Ｂｃｌ−２に類似の機能を有する（例えば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）か、またはＢｃｌ−２の機能を妨げて細胞死を促進する（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）かのいずれかであることが示されている。
【０１８１】
（４．他の薬剤）
他の薬剤が、処置の治療的効力を改善するために、本発明と組み合わせて使用され得ることが企図される。これらの付加的な薬剤としては、免疫調節性薬剤、細胞表面レセプターおよびＧＡＰ結合の上方制御に影響する薬剤、細胞増殖抑制性薬剤および分化薬剤、細胞接着のインヒビター、またはアポトーシスのインデューサーへの内皮細胞の感受性を増加させる薬剤が挙げられる。免疫調節性薬剤は、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカインアナログ；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインを含む。さらに、細胞表面レセプターまたはそれらのリガンド（例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ）の上方制御が、内皮細胞に対するオートクライン効果またはパラクリン効果の確立によって本発明のアポトーシスの誘導能力を増強することが企図される。ＧＡＰ結合の数が増加することによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する内皮細胞集団に対する抗過剰増殖の効果を増大させる。他の実施形態において、細胞増殖抑制性薬剤および分化薬剤は、処置の抗過剰増殖の効力を改善するために、本発明と組み合わせて使用され得る。細胞接着のインヒビターは、本発明の効力を改善するために企図される。細胞接着インヒビターの例は、局所性（ｆｏｃａｌ）接着キナーゼ（ＦＡＫ）インヒビターおよびロバスタチンである。さらに、抗体ｃ２２５のように、アポトーシスに対する内皮細胞の感受性を増大させる他の薬剤が、処置の効力を改善するために本発明と組み合わせて使用され得ることが企図される。
【０１８２】
（Ｈ．実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することを本発明者によって見出された技術を代表し、従って、その実施について好ましい形態を構成するとみなされ得ることは、当業者によって理解される。しかし、本開示の観点から、当業者は、開示された特定の実施形態において多くの変更を実施し得、さらに、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果を入手し得ることを理解する。
【０１８３】
（１．物質および方法）
（ａ．動物）
３〜６週齢のメス／オスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。動物を、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙの特定の無菌設備内で飼育した。
【０１８４】
（ｂ．ウイルス）
コントロールアデノウイルス（Ａｄ−ｃ）を、アデノウイルス血清型５由来のＥ１領域の欠失によって調製した。ヒト細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｌｒ）ｍｄａ−７（Ａｄ−ｍｄａ７ＥＣ）を含有するアデノウイルスを、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸによって構築した。
【０１８５】
（ｃ．細胞の調製およびアデノウイルスでの感染）
全ての細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手する。細胞を、ＡＴＣＣの推奨に従って、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で増殖させた。この細胞を、試験して、マイコプラズマが存在しないことを確認し、そして対数増殖期において使用した。細胞を、慣用的に、０．１２５％  トリプシン−１．３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）で収集した。
【０１８６】
（ｄ．インビトロでのトランスフェクション）
細胞を、ＲＰＭＩ／１０％  ＦＢＳ培地中、６０ｍｍ２あたり５×１０５個の細胞の密度でプレートし、そして３７℃で５％のＣＯ２中で増殖させた。
【０１８７】
（ｅ．組換えアデノウイルスの作製）
内部ＣＭＶＩＥプロモーターに連結し、続いてＳＶ４０ポリアデニル化（ｐＡ）シグナルを連結した、細胞外ヒトｍｄａ−７（またはルシフェラーゼ遺伝子）をコードする核酸を保有する複製欠損ヒト５型アデノウイルス（Ａｄ５）を構築した。ＣＭＶ−ｐＡ構築物のみを含む第３のコントロールベクターを構築した。遺伝子カセットを保有するＡｄ−５ベクターを、２９３細胞中にプラスミドｐＪＭ１７（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９２）と同時にトランスフェクトし、組換えウイルスのＡｄ−ｍｄａ７、ＡｄＬｕｃおよびＡｄＣＭＶｐＡをレスキューした。プラークを採取し、ウイルスのストックを増殖させ、そしてそれらのゲノムを、ＰＣＲ／制限分析および配列決定によって正確なものとして確認した。ウイルスを、２９３細胞中で増殖させ、そしてＨＰＬＣによって精製した。
【０１８８】
（ｆ．形質導入および細胞増殖の研究）
この研究において使用した癌細胞株または正常細胞株を、漸増ＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞；０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１００００ｖｐ／細胞の漸増濃度）中で、Ａｄ−ｍｄａ７（コントロールとしてＡｄＣＭＶｐＡまたはＡｄＬｕｃのいずれか共に）で感染させた。細胞を、トリチウム化チミジンの取り込み−細胞増殖アッセイのために９６ウェル形式で５００〜２０００細胞／ウェルでプレートするか、またはタンパク質発現アッセイもしくはアポトーシスアッセイのために６ウェルプレートに１０５〜１０６細胞／ウェルでプレートするか、あるいはＡｌａｍａｒ−ｂｌｕｅアッセイのために１０４細胞／ウェルでプレートするかのいずれかでプレートした。
【０１８９】
感染のために、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄＬｕｃ（またはＡｄＣＭＶｐＡ）を、漸増ＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞に基づいて；０〜１０，０００ウイルス粒子／細胞の範囲のＭＯＩ）で使用した。トリチウム化チミジン／アポトーシスアッセイおよびタンパク質発現アッセイおよびａｌｏｍａｒアッセイについて、細胞を、感染後３日および５日に分析した。
【０１９０】
（ｇ．トリチウム化チミジンアッセイ）
処置後の細胞の増殖阻害を、ＤＮＡ合成の分析によって測定する。簡単には、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイのために、細胞を、９６ウェル形式で１ウェルあたり２００〜５０００個の細胞をプレートし、そして５％のＣＯ２インキュベーター内でＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中、３７℃で一晩増殖させた。次の日、この培地を吸引し、そして適切なＭＯＩで適切なアデノウイルスを含有する５０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳで置換する。細胞を、感染培地で１〜４時間インキュベートし、次いで、２００ｍｌの全容量まで希釈し、そして一晩増殖させる。培地を、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ／ｍＣｉ  ３Ｈ−チミジンで置換し、そして１６〜１８時間増殖させる。Ｈ３−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の１００μＣｉ／ｍＬのストック溶液を、高グルコースＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中への希釈によって調製する。３Ｈ−チミジンを、１μＣｉ／ｍＬの最終濃度で各ウェルに加えた。この反応を、レシピエント細胞由来の上清の除去によって１５時間後に停止する。この細胞を、３７℃で１５分の各ウェルへの１００×  トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）の添加によって収集した。細胞を、製造業者のプロトコルに従ってＰａｃｋａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを使用して、９６ウェル形式のフィルター上に収集し、そして脱イオン水およびメタノールで洗浄した。このフィルターを乾燥して、Ｍａｔｒｉｘ  ９６００（Ｐａｃｋａｒｄ）で分析し、そしてトリチウム化チミジンの取り込み数に対するウイルス粒子／細胞を使用して細胞増殖をプロットした。
【０１９１】
（ｈ．Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイ）
細胞の増殖阻害をまた、Ａｌｏｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイによって測定した。簡単には、細胞を、９６ウェルプレート形式中に１０４細胞／ウェルの密度でプレートした。異なるＭＯＩでのＡｄ−ｍｄａ７ベクターまたはコントロールベクター（先に記載されるような）の感染後４日で、２０μＬのａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ色素を、各ウェルに加え、そしてプレートを、３７℃で６〜８時間インキュベートした。次いで、プレートを、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲＸプレートリーダーによって５９５ｎｍの波長での光学密度について読み取る。Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ３．２ソフトウェアプログラムを使用して、５９５ｎｍでの光学密度の値に対してＭＯＩをプロットした。
【０１９２】
（ｉ．ＴＵＮＥＬアッセイ）
癌細胞を、Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）中に１０４細胞／チャンバーの密度で接種した。細胞を、所望される濃度のアドベクター（Ａｄｖｅｃｔｏｒ）で形質導入した。異なる日時で（感染後）、細胞を、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＴＵＮＥＬ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙ（「Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＰＯＤ」，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用するアポトーシスのための製造業者の使用説明書に従って分析した。
【０１９３】
（ｊ．アネキシンＶアッセイ）
癌細胞をまた、ＡｐｏＡｌｅｒｔ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）によって、Ａｄ−ｍｄａ７処置後に、アポトーシスについて分析した。細胞内のアポトーシスの誘導後、形質膜の内側のリーフレットに優先的に位置するホスファチジルセリン（ＰＳ）が、フリッパーゼ（ｆｌｉｐｐａｓｅ）機構により外側のリーフレットに迅速に転位する。Ｃａ２＋の存在下で、アネキシンＶは、高い親和性でＰＳに結合し、そしてアネキシンに結合体化したＦＩＴＣは、蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳ分析による両方でアポトーシス細胞を正確に特定することに役立つ。
【０１９４】
（ｋ．ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いたＤＮＡ染色）
細胞周期の異なる段階での細胞を決定するために、Ａｄ−ｍｄａ７感染ガン細胞を、１〜２×１０６細胞／ｍＬのＰＢＳの単一細胞懸濁物として調製した。細胞を７０％の冷エタノールを用いて２時間固定した後、細胞を遠心分離し、そして固定液をデカントし、そしてＰＢＳを用いて２回洗浄し、次いでＰＢＳ中に５０μｇ／ｍＬのＰＩおよび２０μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅを含むヨウ化プロピジウム作業溶液を用いて染色した。次いで、処理された細胞をＦＡＣＳによって分析した。
【０１９５】
（ｌ．腫瘍異種移植モデル）
腫瘍細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびファンギゾンを補填したＲＰＭＩ／１０％  ＦＢＳ培地の１５０ｍｍ２シャーレ中に約２０〜４０％集密度の密度で蒔き、そして５％ＣＯ２において約８０％集密になるまで３７℃で増殖させる。細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、トリプシン処理し、そして計測する。細胞を、ＰＢＳにおいて５×１０６細胞／１００ｍｌの濃度まで希釈する。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、１００ｍｌのＰＢＳにおける５×１０６腫瘍細胞を皮下注射する。
【０１９６】
（ｍ．管形成アッセイ）
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を１％ゼラチンコートプレート上に播種し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、血清フリーの培地において１０，０００ｖｐ／細胞で、Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７と１時間感染させた。培地のみに曝露された細胞を、陰性コントロールとして供給し、その一方でスラミン（５０μＭ）に曝露された細胞を、陽性コントロールとして供給した。４８時間のインキュベーション期間後（血清含有培地において３７℃）、感染細胞を収集し、計測し、そして３通りのＭａｔｒｉｇｅｌコート２４ウェルプレートに添加した（ウェルごとに１．２×１０５細胞）。２４時間後、細胞を１０％の緩衝化ホルマリンを用いて固定し、そして４×および１０×の倍率でＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０倒立明視野顕微鏡を使用することによって、文化（管形成）について試験した。
【０１９７】
（実施例１：Ａｄ−ＭＤＡ７は、ガン細胞を殺生し、そしてアポトーシスを誘導する）
（１．乳ガン細胞）
一連の乳ガン細胞株（Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫＢｒ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を、Ａｄ−ｍｄａ７（またはＡｄ−ＣＭＶｐ（Ａ）またはコントロールベクターとしてＡｄ−ｌｕｃ）を用いて形質導入した。細胞株は、Ａｄ−ｍｄａ７形質導入によって強く増殖阻害された。Ａｄｍｄａ７に対して最も高い感受性が実証された２つの細胞株は、Ｔ４７Ｄ（ｐ５３変異株）およびＭＣＦ−７（ｐ５３野生型）（図２Ａおよび図２Ｂ）であり、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによって決定された。ガン細胞を、Ａｄ−ｍｄａ７形質導入の３〜６日後に分析した。以下の表３を参照のこと。
【０１９８】
【表３】
2005500247.tif 000008
図７は、Ａｄ−ｍｄａ−７によって乳ガン細胞株に誘導される高レベルのアポトーシス（アネキシンＶ染色によって測定されるように）を例示する。アネキシンＶ染色は、アポトーシスの初期段階および中間段階における細胞を同定し、その一方でＴＵＮＥＬアッセイは、アポトーシスの最終段階の１つであるＤＮＡ開裂産物を検出する。Ａｄ−ｍｄａ７を用いて感染されたＭＣＦ−７細胞において実行されるＴＵＮＥＬアッセイは、これらの細胞がアポトーシスの経路を介して殺生されることを確認した。Ａｄ−ＣＭＶｐ（Ａ）またはＡｄ−ｌｕｃコントロールベクターは、アポトーシスの誘導で効果がなかった。
【０１９９】
Ａｄ−ｍｄａ７に対して最も高い感受性を実証された２つの細胞株はＴ４７Ｄ（ｐ５３変異株）およびＭＣＦ−７（ｐ５３野生型）であった（図２Ａおよび図２Ｂ）。Ｔ４７Ｄ細胞またはＭＣＦ−７細胞の５０％（ＩＣ５０）まで、増殖を阻害するために必要とされるＡｄ−ｍｄａ７の濃度は、それぞれ平均５００および１５００ｖｐ／細胞であった（表４）。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞およびＢＴ−２０細胞を用いる代表的な実験がまた、図３（パネルＡおよびパネルＢ）に含まれる。これらの２つの細胞株はまた、Ａｄ−ｍｄａ７感染に対する著しい感受性を示した。表４は、Ａｄ−ｍｄａ７感染（Ａｄ−ｍｄａ７およびコントロールＡｄベクターについてのＩＣ５０値の比較によって決定されるように）に対する乳ガン細胞の応答性を要約する。正常な細胞株におけるＩＣ５０値もまた、表４に含まれる。
【０２００】
【表４】
2005500247.tif 000009
（２．Ａｄ−ｍｄａ７は肺ガン細胞を殺生し、そしてアポトーシスを誘導する）
６つの肺ガン細胞株（Ｈ１２９９、Ｈ４６０、Ａ５４９、Ｈ３２２、Ｈ３５８およびＳａｏｓＬＭ２）を、Ａｄ−ｍｄａ７と感染させた。これら全ては、Ａｄ−ｍｄａ７形質導入による効果的な死滅を実証した。Ｈ１２９９細胞株およびＨ３２２細胞株は、Ａｄ−ｍｄａ７死滅に対して最も感受性であった（図４Ａおよび図４Ｂを参照のこと）。これらの株におけるＩＣ５０は、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによって決定されたように、６００ｖｐ／細胞〜２０００ｖｐ／細胞の範囲であった。
【０２０１】
（３．Ａｄ−ｍｄａ７は、結腸直腸ガン細胞を殺生し、そしてアポトーシスを誘導する）
６つの結腸直腸ガン株（ＤＬＤ−１、ＳＷ−６２０、ＳＷ−４８０、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ）を、Ａｄ−ｍｄａ７と感染させた。これらの細胞株全ては、最も感受性であるＳＷ６２０、ＤＬＤ−１およびＳＷ−４８０で、Ａｄ−ｍｄａ７形質導入によって効果的に増殖阻害された。様々なＭＯＩでＡｄ−ｍｄａ７を用いて処理されるＳＷ６２０細胞は、図５Ａに示され、その一方で、ＤＬＤ−１細胞は、図５Ｂに示される。３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによって決定されたように、細胞増殖は、平均、より感受性の細胞株における１０００ｖｐ／細胞〜他のより感受性の低い細胞株における２０００ｖｐ／細胞であるＩＣ５０を実証した。ＤＬＤ−１細胞株を、１０００および５０００ｖｐ／細胞でＡｄ−ｍｄａ７と感染させ、感染していない細胞およびＡｄ−Ｌｕｃをコントロールとして用いた。４８時間後、形質導入細胞を、ＦＡＣＳ分析とともにアネキシンＶ染色を用いて、アポトーシスについて分析した。感染されていない細胞またはＡｄＬｕｃ−感染（５０００ｖｐ／細胞）細胞のいずれもアポトーシスの徴候を示さず、その一方で、Ａｄ−ｍｄａ７感染細胞は、１０００ｖｐ／細胞で約２６％のアポトーシス細胞および５０００ｖｐ／細胞で５８％のアポトーシス細胞を示した（図８）。
【０２０２】
（４．正常細胞におけるＡｄ−ｍｄａ７感染）
３つの正常なヒト細胞株（ＭＪ９０線維芽細胞、ＨＵＶＥＣ内皮細胞およびヒト乳腺上皮細胞）は、Ａｄ−ｍｄａ７と感染させた場合に増殖阻害を示さなかった。Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃコントロールベクターを用いて処理した場合、主要な線維芽細胞株ＭＪ９０は、重複増殖曲線を示した（図６Ａ）。ＨＵＶＥＣおよびヒト乳腺上皮細胞は、類似の結果を示した（図６Ｂ）。
【０２０３】
（５．タンパク質分析）
Ａｄ−ｍｄａ７形質導入ガン細胞株から得られた細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサイズ画分化し、続いて、ウサギ抗ＭＤＡ７抗体を用いてウェスタンブロット分析した。ＭＤＡ−７タンパク質の移動は、２３ｋＤの近似のサイズと一致していたが、１７ｋＤでさらなるバンドがまた観察された。Ｈ１２９９（肺ガン）細胞株およびＤＬＤ−１（結腸直腸ガン）細胞株のウェスタンブロット分析が、Ａｄ−ｍｄａ７およびＡｄ−ｌｕｃ感染後に実行された。約２３ｋＤおよび１７ｋＤで２つのバンドが観察された。類似の分子量サイズのバンドがまた、Ａｄ−ｍｄａ７で感染させられた乳ガン株において見られた。感染後の最初の４８時間の間、１７ｋＤのバンドが、ＤＬＤ−１細胞において観察される主要な種類であった。感染から７２および９６時間後、２３ｋＤのバンドの強度は、時間とともに減少し、そして他のより小さい分解産物が見られた。Ｈ１２９９細胞において、両方のバンドは、類似の強度を有していた。このブロットをまた、β−アクチンについて探索し、そして感染から７２および９６時間後、アクチンは、細胞の迅速なアポトーシス死と一致して実質的に分解された（データは示されていない）。
【０２０４】
これらのタンパク質発現の研究において見られるように、Ａｄ−ｍｄａ７感染細胞由来の溶解物は、２３ｋＤ／１７ｋＤ対を示し、ＭＤＡ−７が細胞内で処理されることを示唆する。Ｓｕら（１９９８）によるこれまでの研究は、インターフェロンβおよびメゼリン（ｍｅｚｅｒｉｎ）を用いて誘導されるヒト黒色腫細胞において、２３ｋＤ  ＭＤＡ−７タンパク質が、細胞質ゾルから核へ転位したことを示した。第１次のタンパク質配列分析に基づいて、ＭＤＡ−７は、いかなる共通の核の局在化部分も有さない。このことは、ＭＤＡ−７タンパク質が細胞質シャペロン（例えば、ＨＭＣ）と結合することを示唆し得る（Ｊｉａｎｇら、１９９５；１９９６）。この結合が、核へのｍｄａ７の転位を容易にし得ることが提案された。
【０２０５】
（６．アポトーシスの研究）
アネキシンＶ染色は、アポトーシスの初期段階および中間段階における細胞を同定し、その一方で、ＴＵＮＥＬアッセイは、アポトーシスの最終段階の１つのＤＮＡ開裂産物を検出する。図７は、Ａｄ−ｍｄａ７によって、乳ガン細胞株に誘導される高レベルのアポトーシス（アネキシンＶ染色によって測定されるように）を例示する。ＴＵＮＥＬアッセイは、Ａｄ−ｍｄａ７と感染させられたＭＣＦ−７細胞において実行され、このようにして、これらの細胞がアポトーシス経路を介して殺生されることを確認する。Ａｄ−ＣＭＶｐ（Ａ）またはＡｄ−ｌｕｃコントロールベクターは、誘導アポトーシスで効果がなかった。
【０２０６】
Ａｄ−ｍｄａ７誘導アポトーシスのさらなる例が、図９に示される。ＤＬＤ−１細胞株を、１０００および５０００ｖｐ／細胞でＡｄ−ｍｄａ７と感染させ、非感染細胞およびＡｄ−ｌｕｃをコントロールとして用いた。４８時間後、形質導入細胞を、ＦＡＣＳ分析とともにアネキシンＶ染色を用いてアポトーシスについて分析した（図８）。非感染細胞もＡｄ−ｌｕｃ感染（５０００ｖｐ／細胞）細胞も、アポトーシスの徴候を示さず、その一方で、Ａｄ−ｍｄａ７感染細胞は、１０００ｖｐ／細胞で約２６％のアポトーシス細胞、および５０００ｖｐ／細胞で約５８％のアポトーシス細胞を示した。Ａｄ−ｍｄａ７は、アポトーシスの迅速な誘導を生じた（図９）。ＮＳＣＬＣおよび結腸直腸ガンを表す２つの細胞株が示される。アポトーシスの実質的なレベルは、Ａｄ−ｍｄａ７との感染から１２時間後直ぐに明白となり、そして、次の数日間の間増加した。感染から１２時間後直ぐのアポトーシスの実証は、１２時間で丁度検出可能な免疫反応性ＭＤＡ−７タンパク質として顕著であり、そして一般的に感染から２４〜４８時間後までピークにならない。Ａｄ−ｐ５３はまた、アポトーシスの迅速な誘導を生じ得るが、ｐ１６またはＰＴＥＮのような他の腫瘍サプレッサーは、Ａｄ発現ベクターとの感染から２〜３日後でのみアポトーシスを生じる傾向がある。
【０２０７】
（７．Ａｄ−ｍｄａ７は、肺ガン株、乳ガン株および結腸直腸ガン株におけるＢａｘタンパク質レベルを増加する）
プログラムされた細胞死の調節は、アポトーシスを促進するか、または阻害するかのいずれかのシグナル伝達経路の間の相互作用に依存する（Ｒｅｅｄ、１９９７；Ｗｈｉｔｅ、１９９６）。ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｗ、ｂａｘ、ｂａｄ、ｂａｋ、ｂｃｌ−ｘｓ）は、アポトーシスのシグナル伝達において重要な役割を果たす（Ｓｅｄｌａｋら、１９９５；Ｒｅｅｄら、１９９６）。抗ｂａｘ抗体とともにウェスタンブロット分析を用いて、Ａｄ−ｍｄａ７感染が、Ｔ４７Ｄ細胞、ＤＬＤ−１細胞、Ａ５４９細胞およびＨ４６０細胞におけるＢＡＸタンパク質を上方制御することを決定した。３０〜１５０ｐｆｕ／細胞のＡｄ−ｍｄａ７との感染の２４時間後に調製した溶解物のウェスタンブロット分析は、試験した細胞株全てにおけるＢＡＸの増加した発現を実証した。例えば、Ａｄ−ｍｄａ７感染Ｔ４７Ｄガン細胞株におけるＢＡＸの上方制御を、ウェスタンブロット分析によって観察した。細胞を、Ａｄ−ｍｄａ７と感染させ、そしてＭＤＡ−７およびＢＡＸタンパク質発現について分析した。Ａｄ−ｍｄａ７は、他の細胞株で観察されたように、Ｔ４７ＤにおけるＢＡＸ発現を増加した。
【０２０８】
（８．ガン細胞および正常細胞におけるＭｄａ−７の内因性発現）
内因性のＭｄａ−７タンパク質発現について評価された５０以上の腫瘍細胞株のＤＬＤ−１（結腸直腸の）およびＬｎＣａｐ（前立腺の）の２つのみが、弱い陽性であった。研究は、種々のガン細胞株におけるｍｄａ−７  ｍＲＮＡの観察について進行中である。表５は、Ａｄ−ｍｄａ７研究において用いられるいくつかのガン株およびこれらの内因性のＭＤＡ−７状態の一覧である。Ａｄ−ｍｄａ７の抗腫瘍活性とウェスタンブロット分析に基づくＭＤＡ−７内因性発現との間には、なんの相互関係もなかった（表５）。
【０２０９】
【表５】
2005500247.tif 000010
（９．Ａｄ−ｍｄａ７は、独立して内因性のｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｓ、およびｐ１６の状態に機能する）
表６は、本研究において用いられる異なる細胞株における遺伝子およびＡｄ−ｍｄａ７感染に対するこれらの応答を調節する、異なる腫瘍のサプレッサー／癌遺伝子／細胞周期の状態を示す。ＭＤＡ−７の増殖阻害活性が、広範な種々のガン細胞株において、これらのｐ５３、ＲＢ、ｐ１６およびＲａｓ状態とは無関係に観察された。Ｂａｘ発現は、野生型ｐ５３によって確実に調節されている（Ｈａｎら、１９９６）が、ＢＡＸ上方制御が、ｐ５３変異体（ＤＬＤ−１、Ｔ４７Ｄ）およびｐ５３野生型（Ｈ４６０）において観察されるため、ＢＡＸを誘導するＭＤＡ−７の能力は、ｐ５３に無関係であると思われる。ＭＤＡ−７が、下流のアポトーシス事象に含まれる様々なカスパーゼの１つである、カスパーゼ３が欠けているＭＣＦ−７乳ガン細胞においてアポトーシスを効果的に誘導し得る。
【０２１０】
【表６】
2005500247.tif 000011
（実施例２：ＭＤＡ−７細胞性局在化研究）
（１．表面発現研究）
Ｈ４６０  ＮＳＣＬＣ細胞株を、Ａｄ−ｍｄａ７の増殖するＭＯＩまたはコントロールとしてのＡｄ−ｌｕｃで処理し、そして４８時間後、この細胞をポリクローナル抗ＭＤＡ−７抗体で染色し、そしてＦＡＣＳ分析により分析した（図１０）。高レベルの染色を、Ａｄ−ｍｄａ７で処理した細胞においてのみした。この染色は、用量依存的であり、そして細胞の約５０％は、１０００ｖｐ／細胞においてＭＤＡ−７陽性であった。この結果は、Ｈ４６０細胞のＡｄ−ｍｄａ７処理が、高レベルのタンパク質産生を生じ（ウエスタンブロット分析により実証された）そして、このタンパク質は細胞表面上で出現することを示した。
【０２１１】
（２．共焦点顕微鏡研究）
図１０に示されたこの結果を確認し、そして拡張するために、共焦点顕微鏡解析を、種々の細胞株（Ｈ４６０、Ｈ１２９９、Ｔ４７Ｄ、およびＤＬＤ−１細胞）上について行い、Ａｄ−ｍｄａ７処理後のＭＤＡ−７タンパク質の細胞成分分布を決定した。未処理またはＡｄ−ｌｕｃ処理した細胞におけるバックグラウンド染色は低く、そして拡散した。このバックグラウンドは、抗ＭＤＡ−７試薬がポリクローナル抗血清であることに起因すると考えられる。しかし、細胞をＡｄ−ｍｄａ７で処理した場合、非常に特異的な染色を観察した。低ＭＯＩにおいて、明確な膜染色は、細胞質内の点状の染色で観察された。高ＭＯＩにおいて、点状の染色および膜染色が再び生じ、そして非常に濃い色であった。この染色のパターンは、分泌タンパク質を示唆し、点状の染色は原形質膜におけるタンパク質の輸送および放出を表す。類似した観察が、他の細胞株で観察された。
【０２１２】
共焦点顕微鏡試験に加えて、癌細胞株をＡｄ−ｍｄａ７で処理し、そしてアポトーシス（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色）、ＤＮＡ含有量（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、Ｃａ２＋流入／流出（Ｆｌｕｏ  ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）およびミトコンドリアの完全性（ＭｉｔｏＴｒａｃｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）について分析した。この使用されたプロトコルは、Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ＵＴＨＳＣ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸで確立されたプロトコルであった。
【０２１３】
Ｈ４６０細胞およびＭＣＦ−７細胞の共焦点顕微鏡研究をおこなった。これらは、以下の各々の顕微鏡領域の複合を示す：（１）ＭＤＡ−７の表面発現（赤い表面および点状の染色）、（２）アポトーシス細胞（偏光された緑染色）、（３）核を同定するためのＨｏｅｃｈｓｔ染色（青色）および（４）（１）（２）および（３）の複合。
【０２１４】
カルシウムおよびミトコンドリア染色を、Ａｄ−ｍｄａ７制御形質導入細胞またはＡｄ−ｌｕｃ制御形質導入細胞でおこなった。細胞を、ラミニン被覆カバーガラス上にプレ−ティングし、そしてＦＬＵＯ−３（Ｃａ２＋について）またはＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（ミトコンドリアについて）で処理した。コントロールのＡｄ−ｌｕｃで処理した細胞は、十分に分配された細胞内カルシウム内容物（緑色蛍光）を示し、良好なミトコンドリアの完全性を示した（赤染色）。しかし、Ａｄ−ｍｄａ７処理において、細胞内Ｃａ２＋レベルは破壊され、ならびにミトコンドリアの完全性が破壊される。
【０２１５】
（実施例３：分泌ＭＤＡ−７タンパク質）
（１．ＭＤＡ−７の分泌）
Ｈ１２９９細胞を、Ａｄ−ｍｄａ７（１０００ｖｐ／細胞のＭＯＩ）で６時間感染させ、新鮮な培地で洗浄し、そして新鮮なＤＭＥＭ培地中にて３７℃でインキュベートした。２４時間後、細胞溶解物および増殖培地をウエスタンブロットを用いてＭＤＡ−７タンパク質発現について分析した。Ａｄ−ｍｄａ７形質導入された細胞は、増殖培地中で産生された特異的な４０ｋＤタンパク質を示し、このタンパク質は、形質導入されていない細胞にも１９ｋＤバンドおよび２３ｋＤバンドのみ示すＡｄ−ｌｕｃ形質導入された細胞にも存在しなかった。細胞内ＭＤＡ−７タンパク質および細胞外ＭＤＡ−７タンパク質における用量依存的な増加が観察された。コントロールとして、パネルＢのブロットを、抗アクチン抗体でプローブした。予測されたように、この細胞溶解物は、約４０ｋＤにおいてアクチンシグナルを示し、一方、細胞上清は、いかなるアクチンシグナルも示さなかった。これは、上清中で観察されたＭＤＡ−７タンパク質シグナルが、ＭＤＡ−７の活性的な放出分泌に起因し、そして死細胞からの放出に起因しないことを示唆する。
（２．分泌ＭＤＡ−７タンパク質のグリコシル化）
Ａｄ−ｍｄａ７を形質導入したＨ１２９９細胞由来の上清は、分泌ＭＤＡ−７タンパク質の獲得のために好ましい供給源であった。この上清を、タンパク質のグリコシル化についてさらに評価した。上清を、以下の３つの酵素で、別々にかまたは異なる組み合わせのいずれかで処理した。この用いた酵素は、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）、エンドグリコジダーゼＨおよびエンドグリコジダーゼＦ（すべてＳｉｇｍａから入手した）であった。このサンプルを、特異的抗ＭＤＡ−７ウサギポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットにより分析した。
【０２１６】
エンドグリコジダーゼ処理は、可溶性ＭＤＡ−７タンパク質がグリコシル化されることを示唆する。種々のグリコジダーゼ（特に、Ｅｎｄｏ  Ｆ）を用いて、低分子量バンドはまた観察される（これは、細胞溶解物中で観察されたＭＤＡ−７タンパク質バンドとほぼ同じ大きさである）。
【０２１７】
（３．ＭＤＡ−７タンパク質のグリコシル化および分泌の阻害）
２つの抗生物質（ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｓｉｎ）およびブレフェルディン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ）を用いて、可溶性ＭＤＡ−７の分泌のより詳細な特徴付けを提供する。Ｎ−結合型グリコシル化は、これが、リソソーム経路に分別されようと、細胞表面に転位されようと、分泌されようと、タンパク質の最終的なプロセシングにおいて重要な役割を果たす。ツニカマイシンを用いて、ゴルジ装置中のＮ−結合型グリコシル化プロセスを抑制し得、従って、タンパク質分泌または糖独立分別プロセスを阻害し得る。ブレフェルディンＡは、真菌代謝産物（大環状ラクトン）であり、これは、広範な抗菌活性を示す。ブレフェルディンＡは、可逆的にタンパク質の細胞内転位を阻害する（分泌または発現のための細胞表面へのタンパク質の輸送の間）。ツニカマイシンおよびブレフェルディンＡの両方は、可溶性ＭＤＡ−７タンパク質の分泌を効果的に阻害する。それゆえ、細胞内プロセシングおよびグリコシル化は、ＭＤＡ−７分泌に必要なようである。
【０２１８】
（４．分泌ＭＤＡ−７タンパク質は癌細胞の殺傷を誘導する）
分泌形態のＭＤＡ−７（ｓＭＤＡ−７）を、種々の細胞株を用いて産生し、そして抗癌活性について評価した。代表的な実験を、図１１Ａおよび１１Ｂに示す。可溶性ＭＤＡ−７を、Ｈ１２９９細胞に対するＭＤＡ−７の抗増殖効果について分析した。簡単には、Ｈ１２９９細胞を、Ｎｕｎｃチャンバースライド中に、１０３細胞／チャンバーの細胞密度でプレーティングした。２４時間後、この細胞を、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ（１０００ｖｐ／細胞の感染において）のいずれかで形質導入されたＨ１２９９より得た上清でチャレンジした。Ａｄ−ｍｄａ７ウィルスおよびＡｄ−ｌｕｃウィルスをまた、さらなるコントロールとして用いた。この可溶性タンパク質上清（全量５００μＬ、異なる希釈物）を未処理のＨ１２９９細胞に適用し、２４時間後、さらなるＤＭＥＭ中１０％ＦＢＳ０．５ｍＬを添加した。２４時間および４８時間後、この細胞を、トリパンブルー排除染色を用いて、生存度について顕微鏡で試験した。この可溶性ＭＤＡ−７タンパク質は、４８時間後、Ｈ１２９９の死滅を示した；しかし、Ａｄ−ｌｕｃ上清は僅かな効果しか有さなかった（図１１Ａ）。
可溶性ＭＤＡ−７上清の種々の希釈物をまた、トリパンブルー排除アッセイを用いて、Ｈ１２９９の死滅について分析した。可溶性ＭＤＡ−７の濃度依存的なバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）死滅効果を観察した（図１１Ｂ）。
【０２１９】
（実施例４：乳癌株におけるＡｄ−ｍｄａ７の組み合わせ研究）
（１．タモキシフェンとの組み合わせ）
Ａｄ−ｍｄａ７を、タモキシフェンと組み合わせ、乳癌株における抗癌効果について評価した（図１２ＡおよびＢ）。このグラフは、これら２つの薬剤の組み合わせが、いずれかの薬剤単独と比較して優れた抗癌活性を提供することを示す。Ｔ４７Ｄ細胞に対するタモキシフェンの効果（図１２Ａ）、およびＭＣＦ−７細胞対するタモキシフェンの効果（図１２Ｂ）を示す。細胞をプレーティングし、そして処理の４日後、トリチウム化チミジンアッセイを行なって、ＤＮＡ複製を測定した。細胞を、０／０（薬物なしかつベクターなし）あるいは種々の用量のタモキシフェンまたはベクター（Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７）で処理した。Ｔ４７Ｄ細胞において、タモキシフェンまたはＡｄ−ｍｄａ７は、ＤＮＡ複製に対する最小の効果を有した。しかし、タモキシフェンおよびＡｄ−ｍｄａ７を組み合わせた場合、相乗効果が観察された。ＭＣＦ−７細胞において、タモキシフェンは、１ｎｇ／ｍｌ用量でほとんど効果を有さなかった。Ａｄ−ｍｄａ７は、Ａｄ−ｌｕｃと比較してシグナルを減少させた。しかし、タモキシフェンをＡｄ−ｍｄａ７と組み合わせた場合、相乗効果が観察され、これは、Ａｄ−ｍｄａ７と化学治療薬との組み合わせの増強効果を再び実証した。
（２．アドリアマイシンとの組み合わせ）
Ａｄ−ｍｄａ７をアドリアマイシンと組み合わせ、乳癌細胞株の抗癌効果について評価した（図１３ＡおよびＢ）。このグラフは、これら２つの薬剤の組み合わせが、いずれかの薬剤単独と比較して優れた抗癌活性を提供することを示す。
【０２２０】
（実施例５：Ａｄ−ｍｄａ７によるカスパーゼカスケードの活性化）
（１．材料および方法）
（ａ．細胞培養物）
ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、ヒト前立腺癌細胞ＤＵ１４５、およびヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から入手した。すべての細胞を、１０％ウシ胎児血清、抗生物質、およびＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ培地中で維持した。正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ細胞）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、そして製造業者の指示書に従って維持した。
【０２２１】
この細胞が、マイコプラズマを含まないことを確認し、そして増殖の対数期に用いた。細胞を、０．１２５％トリプシン−１．３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いて慣用的に収集した。
（ｂ．組換えアデノウィルスベクターの構築）
上記の記述と同様。
【０２２２】
（ｃ．細胞増殖速度の決定）
本研究で使用した癌細胞株および正常細胞株を、１２ウェル皿に、各ウェルに２×１０４細胞でプレーティングした。この細胞を、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃコントロール（５０００ウィルス粒子／細胞）、またはさらなるコントロールとしてＰＢＳで感染させた。この細胞を、トリプシン処理により収集し、トリパンブルー（ＧＩＢＣＯ）で希釈し、そしてウィルス細胞の数を血球計で計数した。さらに、細胞増殖の阻害を、製造業者のガイドライン（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ、Ｒｏｃｈｅ）によるＸＴＴアッセイにより、またはＨ３−チミジンアッセイによりアッセイした。
【０２２３】
（ｄ．細胞周期分析）
蛍光活性化細胞分類分析を、以下のように行なった：細胞（５×１０５／プレート）を１０ｃｍプレートに播種し、そして細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ（５０００ｖｐ／細胞で）で感染させた。細胞を指定された時間（感染の２４時間後、４８時間後、７２時間後）にトリプシン処理により収集し、そしてＰＢＳで２度洗浄した。細胞を７０％エタノールで固定し、ＰＢＳで２度洗浄し、そしてＰＩ溶液（５μｇ／ｍｌ  ＰＩおよび１０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ）５００μｌに再懸濁した。細胞を、ＦＡＳＣスキャン分析計を用いて分析した。
【０２２４】
（ｅ．アポトーシスの検出）
腫瘍細胞を、１×１０５セル／チャンバーの密度で、チャンバースライド（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。この細胞を、Ａｄ−ｍｄａ７ベクターおよびＡｄ−ｌｕｃベクターで形質導入した。感染後異なる日数で、この細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、およびＴｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ビオチン化ＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色により分析した。
【０２２５】
（ｆ．免疫組織化学的染色）
免疫組織化学的染色を、ウィルスに感染した細胞について実行し、ＭＤＡ−７タンパク質発現を決定した。簡単には、細胞（Ｈ１２９９、Ａ５４９、Ｈ４６０、およびＮＨＢＥ）を、１×１０５の密度で、チャンバースライド（Ｆａｌｃｏｎ）にプレートし、そして、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ（５０００ウィルス粒子／細胞）で感染させた。４８時間後、この細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ホルマリン溶液で２分間固定した。メタノール中０．３％のＨ２Ｏ２で３０分、内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断した後、この細胞を、３０分間、室温で、正常ヤギ血清と共にインキュベートした。インキュベーション後、スライドをウサギポリクローナル抗ＭＤＡ−７抗体（１：５０００希釈）で６０分処理した。抗ウサギ２次抗体（ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒにより提供）で３０分のインキュベーションの後、細胞内におけるＭＤＡ−７の発現を、アビジン−ビオチン反応ＡＢＣキットでの増強による、ＤＡＢで検出した。このスライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、次いでＡｑｕａ−ｍｏｕｎｔ（Ｌｅｒｎｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で取りつけた。ネガティブコントロールは、未感染であるが、前述の染色すべてに供された細胞を含んだ。
【０２２６】
（ｇ．ウエスタンブロッティング分析）
細胞をトリプシン処理により収集し、ＰＢＳで洗浄し、そして溶解緩衝液１００μｌ（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、４Ｍ尿素）に再懸濁した。細胞抽出物を、超音波処理器で３０秒間ホモジナイズし、そして氷上での１時間インキュベーション後、この細胞抽出物を４℃にて１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この細胞抽出物を回収し、−７０℃で貯蔵した。すべての抽出物のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質決定キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて決定した。タンパク質サンプル各５０μｇを、溶解緩衝液２０μｌおよび５％の２−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で希釈し、そして９５℃で５分間、湯浴中で加熱した。次いで、タンパク質抽出物を、垂直のスラブゲル電気泳動セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中の１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。このタンパク質を、ゲルからニトロセルロースメンブレンへ移動させた（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ膜、Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ）。このタンパク質を、ブロック溶液（ＰＢＳ中、５％乾燥ミルクおよび０．３％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で１時間、室温でブロックした。膜を１次抗体とインキュベートし、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した２次抗体とインキュベートし、次いで増強化学発光ウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を３０秒間適用した。このタンパク質を、３０秒〜３０分に変化する曝露時間を利用して、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ増強化学発光フィルム上で可視化した。
【０２２７】
（２．ＭＤＡ−７の過剰発現による細胞増殖の阻害）
細胞内でのＭＤＡ−７の発現を検出するために、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞、およびＮＨＢＥ細胞を、５０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｍｄａ７を用いて感染させた。４８時間後、細胞を固定化し、そして抗ＭＤＡ−７抗体を用いて染色した。非感染細胞をコントロールとして同じ抗体を用いて染色した。高レベルのＭＤＡ−７の発現を、細胞の細胞質内において観察したが、一方で非感染コントロールにおいては、染色された細胞を見い出せなかった（図１４）。
【０２２８】
Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞、およびＮＨＢＥ細胞を１２ウェルプレートに準備し、そしてＡｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ＬｕｃまたはＰＢＳを用いて処置した。生細胞数を処置後１日〜５日まで計測した。Ａｄ−ｍｄａ７を用いた感染は、ＰＢＳまたはＡｄ−Ｌｕｃのコントロールと比較した場合、あらゆる腫瘍細胞株において細胞増殖を有意に抑制した。
【０２２９】
ＰＩ染色を用いた細胞周期の解析は、Ａｄ−ｍｄａ７が感染したＡ５４９細胞およびＨ１２９９細胞において、Ｇ２／Ｍ細胞周期の停止を示した。対照的に、ＰＢＳおよびＡｄ−Ｌｕｃの感染は、細胞周期に影響しなかった（図１４）。
【０２３０】
Ａｄ−ｍｄａ７の感染に引き続いて、腫瘍細胞において、形態学的な変化を観察した。平板化および肥大化のようなこれらの変化を、感染された全ての細胞株において観察した。アポトーシスの形態学的な変化を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を使用して可視化した。Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−Ｌｕｃ感染後７２時間では、核の濃縮および断片化を、Ａｄ−ｍｄａ７を感染させたＡ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、およびＨ４６０細胞において観察したが、一方でＮＨＢＥ細胞においてはアポトーシスの変化を見い出せなかった。ＴＵＮＥＬ染色は、Ａｄ−ｍｄａ７が感染したＡ５４９細胞において、多くの陽性細胞を実証したが、一方でＮＨＢＥ細胞においては、陽性細胞をほとんど見い出せなかった。Ａｄ−ｌｕｃ処置したサンプルにおいてもまた、ＴＵＮＥＬ陽性の細胞は非常にまばらであった。
【０２３１】
これらの結果は、肺癌細胞株において、Ｇ２／Ｍ細胞周期の停止およびアポトーシス誘導を伴う、細胞増殖の有意な抑制を示す。対照的に、ＮＨＢＥ細胞においては、ＭＤＡ−７の過剰発現は細胞増殖の極僅かの抑制を生じるが、アポトーシスを誘導しなかった。
【０２３２】
（３．野生型ｐ５３を有する細胞における、ｐ５３およびＢａｘのアップレギュレーション）
Ａｄ−ｍｄａ７およびＡｄ−Ｌｕｃを用いて細胞を感染させ、そしてウエスタンブロット分析のために細胞抽出物を感染後２４時間、４８時間および７２時間に収集した。非処置細胞からの細胞抽出物をコントロールとして収集した。ＭＤＡ−７タンパク質発現を、全てのＡｄ−ｍｄａ７感染癌細胞株において検出した。非処置のコントロール、およびＡｄ−Ｌｕｃ感染細胞は、ＭＤＡ−７タンパク質の発現を全く示さなかった。Ａｄ−ｍｄａ７感染後に、ｐ５３野生型のＡ５４９細胞およびＨ４６０細胞において、ｐ５３タンパク質のアップレギュレーションを見い出した。予想されるように、ｐ５３を欠失したＨ１２９９細胞においては、ｐ５３の発現または変調を全く見い出さなかった。ＢＡＸタンパク質レベルの増加をＡ５４９細胞およびＨ４６０細胞（ｐ５３野生型）において実証したが、一方でＨ１２９９（ｐ５３欠失）細胞においては、変化を全く観察しなかった。Ｂｃｌ−２の発現レベルは、分析した３つの細胞株の全てにおいて変化しなかった。Ｂａｘ欠損した、ヒト精巣癌細胞株ＤＵ１４５において、ｐ５３の発現レベルを変化せず、そしてＢＡＸを検出しなかった。しかし、ＤＵ−１４５細胞はＡｄ−ｍｄａ７感染に感受性であり、そして増殖の停止およびアポトーシスを示した。ｐ５３野生型の腫瘍細胞において、Ａｄ−ｍｄａ７によりｐ５３およびｂａｘをアップレギュレートした。さらに、Ａｄ−ｍｄａ７により、カスパーゼ３およびカスパーゼ９ならびにＰＡＲＰを活性化した。正常な細胞は、アポトーシスのメディエーターに関して変化を示さなかった。
【０２３３】
（４．カスパーゼカスケードの活性化およびＰＡＲＰ切断）
ウエスタンブロットは、Ａｄ−ｍｄａ７の感染によるカスパーゼカスケードの活性化を実証した。Ａ５４９細胞およびＨ４６０細胞においてはＡｄ−ｍｄａ７感染後４８時間、そしてＨ１２９９細胞については７２時間後、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−３の前駆体（ｐｒｏｆｏｒｍ）を切断して、そして活性化形態／切断化形態へと転換した。Ａ５４９細胞およびＨ４６０細胞においてＡｄ−ｍｄａ７感染の４８時間後に、カスパーゼ−８の切断を実証した。Ａ５４９細胞およびＨ４６０細胞におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）を、４８時間後Ｈ１２９９細胞において切断した。Ｂａｘを欠損したＤＵ１４５細胞において、Ａｄ−ｍｄａ７感染の７２時間後、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−３を切断した。
【０２３４】
（実施例６：ＡＤ−ＭＤＡ７のインビボでの効果）
（１．材料および方法）
（ａ．細胞培養）
ヒト非小胞肺癌細胞のＡ５４９およびＨ１２９９を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）より入手した。全ての細胞を、１０％ウシ胎仔血清、抗生物質およびＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて維持した。実験の開始に先立ち、細胞をマイコプラズマの存在しないことを確認し、そして対数増殖期中に使用した。細胞を０．１２５％トリプシン−１．３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いて慣用的に収集した。
【０２３５】
（ｂ．組換えアデノウイルスベクターの構築）
内部のＣＭＶ−ＩＥプロモーターに連結され、続いてＳＶ４０ポリアデニル化（ｐＡ）シグナルにより連結される、ｍｄａ−７遺伝子またはＬｕｃ遺伝子を保持する、複製欠損したヒト５型アデノウイルスベクター（Ａｄ５）を構築し、そしてそれぞれＡｄ−ｍｄａ７およびＡｄ−ｌｕｃと称する。ウイルスを２９３細胞において繁殖させ、そしてクロマトグラフィーで精製した。
【０２３６】
（ｃ．アポトーシス細胞の染色）
末端デオキシリボヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）キットを使用して、アポトーシス細胞死のために切片を染色し、そして（Ｆｕｊｉｗａｒａら、１９９４）記載されるようにメチレンブルーまたはメチレングリーンを用いて、対比染色した。
【０２３７】
（ｄ．ウエスタンブロッティング分析）
ウエスタンブロッティングを上記のように実施した。細胞をトリプシン処理により収集し、ＰＢＳを用いて洗浄し、そして１００μｌの溶解緩衝液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％  ＳＤＳ、１０％グリセロール、４Ｍ尿素）に再懸濁した。細胞抽出物をソニケーターを用いて３０秒間ホモジナイズし、そして氷上で１時間インキュベーション後、細胞抽出液を５分間１４０００ｒｐｍにて４℃で遠心分離した。細胞抽出物を回収し、そして−７０℃で保存した。全ての抽出物のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質測定キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。各々の５０μｇタンパク質サンプルを、溶解緩衝液および５％の２−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて２０μｌ中に希釈し、そして水浴中で９５℃で５分間加熱した。次いで、タンパク質抽出物を、二次元スラブ・ゲル電気泳動セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。
【０２３８】
ゲルからニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ膜）にタンパク質を移動させた。タンパク質をブロッキング溶液（ＰＢＳ中の、５％粉ミルクおよび０．３％  Ｔｗｅｅｎ２０）中で１時間室温でブロックした。次いで、膜を１次抗体と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された２次抗体を適用し、そして増強された化学発光ウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を３０秒間適用し、次いで、化学発光フィルムを増強したＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ上に、３０秒〜３０分まで変化させた露光時間を用いてタンパク質を可視化した。
【０２３９】
（ｅ．インビボにおける腫瘍増殖および処置の評価）
皮下腫瘍の増殖および処置に関連するあらゆる実験の開始に先立ち、腫瘍の取り込みを増強させるよう、ｎｕ／ｎｕマウスをセシウムソースを用いて照射した（３．５Ｇｙ）。全ての実験において、１００μｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した５×１０６個の腫瘍細胞（Ｈ１２９９、Ａ５４９）を、右背側面に注入した。腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の大きさに達した場合に、動物を３つの群（ｎ＝８動物／群）に無作為選出し、そして以下のように処置を開始した。群１は全く処置を受けず、一日おきに総計３用量で、群２はＡｄ−Ｌｕｃ（５×１０９ｖｐ／用量）を受け、そして群３はＡｄ−ｍｄａ−７（５×１０９ｖｐ／用量）を受けた。メトキシフルラン（ｍｅｔｈｏｘｙｆｌｕｒａｎｅ）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）を使用した麻酔状態で、業者の手引書に従って腫瘍内注入を実施した。腫瘍測定を、処置群について無作為に毎１日おきに記録し、そして体積を式Ｖ（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２を用いて計算し、ここで「ａ」は最も大きい寸法を有し、そして「ｂ」は垂直直径である。腫瘍の大きさおよび数の両方を説明するために、各々の群の動物全ての蓄積腫瘍体積として、抗腫瘍有効性データを提示する。
【０２４０】
（ｆ．免疫組織化学）
ヌードマウスにおいて、皮下に構築された腫瘍を取得し、そして１０％緩衝性ホルマリンで固定化し、パラフィン包埋し、そして４μｍ薄切片として切り取った。ｍｄａ−７遺伝子発現のために切片を染色した。簡潔に述べると、内在性のペルオキシダーゼ活性をブロックするため、組織切片を、０．３％  Ｈ２Ｏ２を含むメタノールを用いて３０分間処置し、続いて正常ヤギ血清を用いて、３０分間室温でインキュベートした。インキュベーションに引き続き、スライドを、ウサギポリクローナル抗ＭＤＡ−７抗体（１：５０００希釈）を用いて６０分間処置した。抗ウサギ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、ＡＢＣキットで提供される）を用いて３０分のインキュベーションの後、組織におけるＭＤＡ−７のタンパク質発現を、アビジン−ビオチン反応ＡＢＣキットを用いた増強により、ＤＡＢを用いて検出した。そのスライドを、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）を用いて対比染色し、次いでＡｑｕａ−マウント（Ｌｅｒｎｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｐｉｔｔｕｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に取りつけた。ＭＤＡ−７陽性に染色された腫瘍細胞の数を、明視野の顕微鏡観察の下で分析し、そしてイメージ分析およびｓｔａｔｐｒｏソフトウェアを使用する無作為様式にて定量した。標本当たり少なくとも５つの視野の合計を分析した。
【０２４１】
（ｇ．ＴＵＮＥＬ染色）
末端デオキシリボヌクレオチドトランスフェラーゼキット（Ｔｄｔ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、皮下腫瘍より得られた組織切片を、アポトーシス細胞死に対して染色した。全ての染色手順において、適切なネガティブコントロールを含めた。ＴＵＮＥＬ陽性に染まった腫瘍細胞数を、明視野の顕微鏡観察下で分析し、そしてイメージ分析およびｓｔａｔｐｒｏソフトウェアを使用して無作為様式にて定量した。標本当たり少なくとも５つの視野の合計を分析した。
【０２４２】
（ｈ．統計的分析）
腫瘍の測定のために、スチューデントのｔ−検定を使用して、実験結果の統計的な有意性を計算した。
【０２４３】
（２．Ａｄ−ｍｄａ７による部位的腫瘍増殖のインビボにおける抑制）
Ｈ１２９９およびＡ５４９の皮下腫瘍におけるｍｄａ−７遺伝子の治療効果を、ヌードマウスにおいて評価した。各々の腫瘍細胞型（Ｈ１２９９およびＡ５４９）を有するマウスを３つの群に分割し、１つは全く処置を受けず、１つはＡｄ−Ｌｕｃを用いた処置を、そして１つはＡｄ−ｍｄａ−７を用いた処置を、１日に総計３容量（５×１０９ウイルス粒子／用量）で受けた。各々の腫瘍型に対する二つのコントロール群における腫瘍増殖と比較して、Ａｄ−ｍｄａ−７を用いて処置されたマウスにおいて、Ｈ１２９９腫瘍およびＡ５４９腫瘍の有意な増殖抑制を、観察した。
【０２４４】
観察された治療効果がｍｄａ−７遺伝子発現に起因するというさらなる証拠を、注入後４８時間に皮下腫瘍を除去し、そしてそれらを免疫組織化学により分析することにより得た。処置されないかまたはＡｄ−Ｌｕｃを用いて処置されるかのどちらかであるコントロール腫瘍において全く陽性染色のないものと比較した場合、ｍｄａ−７遺伝子発現が、Ａｄ−ｍｄａ７を受ける動物中の腫瘍細胞において観察された。
【０２４５】
ＭＤＡ−７遺伝子発現は、インサイチュでカスパーゼ−３およびＡｐｏ２／ＴＲＡＩＬの活性化を介したアポトーシス細胞死を生じる。ｍｄａ−７により媒介される腫瘍阻害機構を理解するために、最終処置後４８時間で収集した皮下腫瘍を、ＴＵＮＥＬ染色によりアポトーシスの腫瘍細胞死について分析した。処置されないかまたはＡｄ−Ｌｕｃを用いて処置されるかのいずれかであるコントロールマウス由来の腫瘍は、極僅かなアポトーシス細胞死を示したが、一方でＡｄ−ｍｄａ−７を用いて処置された動物由来の腫瘍は、多数のアポトーシスを実証した。
【０２４６】
アポトーシスはカスパーゼの活性化によって媒介されるので、腫瘍組織は下流のカスパーゼであるカスパーゼ−３に対して試験される。カスパーゼ−３の活性化形態は、Ａｄ−ｍｄａ−７を用いて処置した組織において観察されるが、一方でコントロールマウス由来の組織においては、カスパーゼ−３の活性化は全く観察されなかった。同様に、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬの活性化は、ｍｄａ−７を発現する腫瘍において観察された。対照的に、処置されないかまたはＡｄ−Ｌｕｃを用いて処置されるかのいずれかである腫瘍において、ＴＲＡＩＬの発現は観察されなかった。
【０２４７】
（３．ＭＤＡ−７の発現は、同時刺激分子のアップレギュレーションとなる）  インサイチュの瀕死の腫瘍細胞が、同時刺激分子Ｂ７およびＩＣＡＭを活性化する能力を調査した。Ａｄ−ＭＤＡ７またはＡｄ−Ｌｕｃを用いて注入された皮下腫瘍を、最後の用量の後の４８時間に収集し、そして免疫組織化学により分析した。Ｂ７（７．１および７．２）およびＩＣＡＭの発現を、ＭＤＡ−７を発現する腫瘍において観察したが、一方でＡｄ−Ｌｕｃを用いて処置された腫瘍においては、全く発現が観察されなかった。
【０２４８】
（４．インサイチュでの腫瘍におけるＭＤＡ−７の発現は、脈管新生を阻害する）
ｍｄａ−７の腫瘍抑制能をさらに測定するために、皮下腫瘍を、腫瘍における脈管新生を同定するために頻繁に使用されるマーカーであるＣＤ３１の発現について分析した。Ａｄ−ｍｄａ−７を用いて処置された皮下腫瘍は、Ａｄ−Ｌｕｃを用いて処置された腫瘍または処置されない群と比較した場合、極僅かの血管を実証した。
【０２４９】
（実施例７：腫瘍の転位性拡散を妨げるためのＡＤ−ＭＤＡ７の有効性）
Ａｄ−ｍｄａ７が肺癌腫瘍の転位性拡散をインビトロで阻害し得ることを、実験は実証した。黒色腫腫瘍の転位性拡散を妨げるＭＤＡ−７の能力を評価するために、黒色腫細胞株を使用して、さらなる実験を実施する。これまでに論じられた技術およびプロトコルを使用する。
【０２５０】
ヒト黒色腫の異種移植片は、ヌードマウスの側面へ、ヒト黒色腫細胞（１×１０６細胞）を皮内注入することにより構築する。ＴＸＭ−１細胞またはＴＸＭ−１８細胞を使用し得る。一旦腫瘍が平均直径５ｍｍに到達すると、Ａｄ−ｍｄａ７またはコントロールＡｄ−ｌｕｃの増加した用量が腫瘍内に注入される。３×１０７〜３×１０９ｐｆｕの用量を試験する。アデノウイルスのベクターは約３３ｍｌの注入３回の合計１００ｍｌで、病変局所内注入で送達される。各々の注入は、効果的な腫瘍の適用範囲を確実にするため、この先の注入に対して直交に方向付ける。適切な容量の構築後は、記載された投与レジメンの効果を評価するために、３日間にわたる期間中、腫瘍異種移植片を、単回の１００ｍｌ用量または１００ｍｌに匹敵する複数の分割用量を用いて処置する。これらの研究に続いて、これまでに最適化されたｐｆｕ濃度の１００ｍｌ注入として定められた一用量を用いて、単回用量の投与対複数用量の投与の間の比較が実施される。有効性の研究は、構築されたアデノウイルス濃度、および３日〜５日間の処置レジメンに続く、腫瘍異種移植体の処置からなる。有効性は、腫瘍サイズの低下により評価される。腫瘍サイズは腫瘍の直径の直接的な測定により決定される。
【０２５１】
Ａｄ−ｍｄａ７処置された腫瘍は、ＭＤＡ−７タンパク質発現およびアポトーシス誘導について評価される。ＭＤＡ−７の免疫組織化学的な検出およびアポトーシスのＴＵＮＥＬアッセイ検出は、細胞レベルでＡｄ−ｍｄａ７処置の有効性を評価するために使用される。ＭＤＡ−７タンパク質を特異的に認識するＭＤＡ−７抗体は、免疫組織化学の手順に使用される。黒色腫の異種移植片における内皮細胞は、抗マウスＣＤ３１に特異的な抗体を用いて検出される。非常に多くの毛管および小さい細静脈を有する腫瘍切片の領域が、低倍率（４０倍および１００倍）で切片を取り込むことにより、見出され得る。これらの領域では、個々の血管が２００倍の拡大率の領域において計数され、そして処置および未処置の腫瘍サンプルについて平均スコアが記録される。本方法は、ヌードマウスにおける、ヒトの異種移植片の血液分散および濃度を比較するために使用されている（Ｙｏｎｅｄａら、１９９８）。
【０２５２】
（実施例８：Ｍｄａ−７の異所性発現中の、増殖因子の調整）
ＭＤＡ−７はオートクライン／パラクライン活性を有することが仮定されているので、黒色腫細胞についてのＡｄ−ｍｄａ７の効果は、黒色腫の進行に関連する因子の分泌について評価される。ＥＬＩＳＡアッセイは、これら水溶性メディエーター（例えば、異なる型の、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびｂＦＧＦ）の放出を調査するために使用される。黒色腫細胞株および正常細胞を、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃまたは希釈コントロールを用いて処置し、次いで２４〜４８時間後、培養物上清中の増殖因子レベルの変調についてモニターする。溶解物についての免疫ブロッティングは、また、処置後の様々な時間に実施され得る。
【０２５３】
（実施例９：Ａｄ−ｍｄａ７は、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の活性を増強する）
乳癌ＳｋＢｒ３（Ｈｅｒ２＋）細胞株およびＭＣＦ−７（Ｈｅｒ２−）細胞株を、共にＡＴＣＣから得た。細胞を、１０００細胞／ウェルの密度でＮｕｎｃ２チャンバ型スライド（２−ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ）に配置し、そして１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ培地において増殖させた。次の日、最終濃度１μｇ／ｍＬのハーセプチンを含まない（Ｍ系列）かまたはハーセプチンを含んで（Ｍ＋Ｈ系列）、細胞を、Ａｄ−ｍｄａ７（漸増するＭＯＩ：０、５００、１０００および２０００ｖｐ／細胞）で未処理のままにしたかまたは処理した。細胞を、３時間後に洗浄し、そして増殖培地（示したように、ハーセプチンを含むか、または含まない）を取り換えた。３日後、トリパンブルー除外アッセイ（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を使用して生存能力のある細胞数を数え（平均３〜４視野）、図１５に示されるようにプロットした。ハーセプチンのみのものは、およそ１２％の死細胞を、両方の細胞株において生じた。しかしながら、Ａｄ−ｍｄａ７は、乳癌細胞株におけるハーセプチンの殺傷効果を増強するようであった。
【０２５４】
（実施例１０：Ａｄ−ｍｄａ７は、ヒト肺癌増殖および新脈管形成を阻害する）
（１．材料および方法）
（細胞培養）
ヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９（腺癌）を、Ａｍｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ヒト肺大細胞癌腫細胞株（Ｈ１２９９）は、Ａ．Ｇａｚｄａｒ博士およびＪ．Ｄ．Ｍｉｎｎａ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ）からの贈与であった。正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）、およびヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。腫瘍細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、抗生物質（ＧＩＢＣＯ）、およびＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で維持し、そして正常細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓにより推奨される条件下で増殖させた。実験を始める前、細胞に、マイコプラズマが含まれないことを確認し；細胞を、増殖の対数期において使用した。組み換えアデノウイルスベクターの構築。ウイルスを、ヒト胚性腎臓２９３細胞において増殖させ、そしてクロマトグラフィーにより精製した。
【０２５５】
（細胞増殖アッセイ）
腫瘍細胞（Ｈ１２９９およびＡ５４９）ならびに正常細胞（ＮＨＢＥ）を、９６ウェル組織培養プレートに５ｘ１０３細胞／ウェルで植え付けた。次の日、５０００ウイルス粒子（ｖｐ）／細胞のＭＯＩで、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃを用いて、細胞を感染させた。トランスフェクションの後、細胞に、完全培地を補充した。感染の７２時間後に、細胞の生存可能度を、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により推奨されるＭＴＴアッセイにより決定した。
【０２５６】
（アポトーシス細胞染色（ヘキスト染色））
細胞を、１ｘ１０５細胞／ウェルの密度で２ウェルチャンバ型スライドに植え付け、そしてＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ（５０００ｖｐ／細胞）を用いて感染させた。感染の７２時間後、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｎｏ．３３３４２（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に１５分間インキュベートし、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２度洗浄し、そして蛍光顕微鏡の下で観察した。
【０２５７】
（管形成アッセイ）
ヒト臍静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を、１％ゼラチンコートしたプレートに植え付け、そして３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を、無血清培地中の１０，０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７を用いて１時間感染させた。培地のみに曝した細胞を、ネガティブコントロールとして用い、一方スラミン（５０μＭ）に曝した細胞を、ポジティブコントロールとして用いた。４８時間のインキュベーション期間（血清含有培地中３７℃）の後、感染させた細胞を、回収し、計数し、そしてＭａｔｒｉｇｅｌコートした２４ウェルプレート（１ウェルあたり１．２ｘ１０５細胞）に３連で加えた。２４時間後、細胞を、１０％緩衝化ホルマリンで固定し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０倒立型明視野顕微鏡を４Ｘおよび１０Ｘの拡大率を用いて分化（管形成）を調査した。
【０２５８】
（インビボにおける腫瘍増殖の評価）
皮下腫瘍増殖および処置に関与するすべての実験の開始前に、ｎｕ／ｎｕマウスを、腫瘍取り込みを増強するためにセシウム光源から照射した（３．５Ｇｙ）。全ての実験において、１００μｌの滅菌ＰＢＳに懸濁した５ｘ１０６の腫瘍細胞（Ａ５４９、Ｈ１２９９）を、右背部側腹（ｄｏｒｓａｌ  ｆｌａｎｋ）に皮下注射した。腫瘍が、５０〜１００ｍｍ３の大きさに達した場合、動物を、無作為に３つの群に分け（ｎ＝８匹／群）、処置を、以下のように開始した。群１は、処置を受けなかった；群２は、Ａｄ−ｌｕｃ（５ｘ１０９ｖｐ／用量）を受けた；そして群３は、Ａｄ−ｍｄａ７（５ｘ１０９ｖｐ／用量）を受けた。すべての処置を、１日おきに計３用量与えた。腫瘍内注射を、制度上のガイドラインに沿って、メトキシフルラン麻酔（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）の下で行った。腫瘍の測定値を、処置群についての知識なしに一日おきに記録し、そして腫瘍の容積を、式Ｖ（ｍｍ３）＝ａ  ｘ  ｂ２／２を用いて計算し、ここで「ａ」は、最大の寸法、「ｂ」は、それと垂直の直径である（Ｇｅｏｒｇｅｓら、１９９３）。抗腫瘍効力データを、腫瘍の大きさと数の両方を明らかにするために、各群のすべての動物についての平均的な腫瘍容積として示す。
【０２５９】
（免疫組織化学分析）
ヌードマウスにおいて確立した異種移植腫瘍を採取し、１０％の緩衝化ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして４μｍの切片に切り分けた。内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、一時的に、組織切片を、メタノール中０．３％のＨ２Ｏ２を用いて３０分間処理し、次いで、標準ヤギ血清と共に３０分間室温でインキュベートした。インキュベーションの後、スライドを、ウサギポリクローナル抗ＭＤＡ７抗体（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を用いて６０分間処理した。抗ウサギ２次抗体（ＡＢＣキットにおいて提供される、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍｅ、ＣＡ）でのインキュベーションの３０分後、組織におけるＭＤＡ−７タンパク質の発現を、アビジン−ビオチン反応ＡＢＣキットを使用した増強によりＤＡＢを用いて検出した。次いで、このスライドを、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、そしてＡｑｕａ−ｍｏｕｎｔ（Ｌｅｒｎｅｒ  Ｌａｂｓ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いて標本作製した。同様の染色手順を、抗マウスＣＤ３１抗体（１：５００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および抗ヒトＴＲＡＩＬ抗体（１：１０００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて続けて行った。ネガティブコントロールは、一次抗体なしに染色された組織切片を含んだ。組織切片を、分析し、定量し、そして結果を、目隠し様式（ｂｌｉｎｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）で解釈した。
【０２６０】
（ＴＵＮＥＬ染色）
皮下腫瘍から得られた組織切片を、アポトーシス細胞死を検出するために、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して前述（Ｆｕｊｉｗａｒａら、１９９３および１９９４）のように染色した。全ての染色手順において、適切なネガティブコントロールを含んだ。
【０２６１】
（統計的分析）
スチューデントｔ検定を、実験的腫瘍測定値の統計的な有意性を計算するために使用した。
【０２６２】
（２．結果）
（ＭＤＡ−７のインビトロ発現は、アポトーシスを通して腫瘍細胞増殖を阻害した）
ＭＤＡ−７の過剰発現がアポトーシスを導くかどうかを決定するために、肺腫瘍細胞（Ｈ１２９９およびＡ５４９）およびＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ（５０００ｖｐ／細胞）に感染した肺気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２での感染の７２時間後に染色し、そして蛍光顕微鏡下で観察した。Ａｄ−ｍｄａ７に感染した腫瘍細胞は、アポトーシスと一致する形態の変化を示した。Ａｄ−ｌｕｃに感染した腫瘍細胞は、アポトーシス性の変化をほとんど実証しなかった。Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃに感染したＮＨＢＥ細胞においては、アポトーシス性の変化は観察されなかった。さらに、細胞増殖に対するＭＤＡ−７過剰発現効果の分析は、感染の７２時間後、Ｈ１２９９細胞の２７％阻害し、そしてＡ５４９細胞の４０％阻害で、腫瘍細胞の有意な阻害を実証した（図１６Ｂ）。対照的に、ＮＨＢＥ細胞は、増殖効果を示さなかった。
【０２６３】
（ＭＤＡ−７過剰発現は、インビトロにおいて内皮細胞の分化を阻害した）
内皮細胞の分化を阻害するＡｄ−ｍｄａ７の能力を、ＨＵＶＥＣ細胞において評価した。Ａｄ−ｍｄａ７は、毛細管様構造への内皮細胞の分化（管形成）を阻害する。ヒト臍静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）を、スラミン、Ａｄ−ｌｕｃ（１０，０００ｖｐ／細胞）またはＡｄ−ｍｄａ７（１０，０００ｖｐ／細胞）で処理し、あるいは処理しなかった。４８時間後、細胞を回収し、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合し、そして管形成を観察した。ＭＤＡ−７の過剰発現は、管形成の既知のインヒビターである、スラミンと類似の効果で、内皮の管形成を阻害した。その一方で、コントロールベクター（Ａｄ−ｌｕｃ）に感染した細胞は、管形成の阻害がないことを実証した。内皮細胞による管形成の観察された阻害効果は、ＭＤＡ−７過剰発現に起因し、細胞傷害性に起因するものではないことが、細胞生存度についてのトリパンブルー除外アッセイによって決定された。ＭＤＡ−７を発現する８０％より多くの細胞は、生存可能であった。管形成の阻害は、Ａｄ−ｍｄａ７が、インビボにおいて抗脈管形成活性を有し得ることを示唆する（以下を参照のこと）。
【０２６４】
（ｍｄａ−７による局所的腫瘍増殖抑制のインビボにおける評価）
本発明者らは、ヌードマウスにおける皮下腫瘍Ａ５４９およびＨ１２９９に対するＡｄｍｄａ−７の腫瘍内注射の治療効果を評価した。実験的に誘導された異種移植腫瘍（Ａ５４９またはＨ１２９９）を有するマウスを、３つの群に分け、１つは処置を受けず、１つはＡｄ−ｌｕｃによる処置を、そして１つはＡｄ−ｍｄａ７による処置を毎日計３容量（５ｘ１０９ｖｐ／容量）受けた。Ｈ１２９９腫瘍（ｐ＝０．０１）およびＡ５４９腫瘍（ｐ＝０．００１）の両方の増殖の有意な阻害が、Ａｄ−ｍｄａ７を用いて処理されたマウスにおいて観察されたが、コントロール群においてはいずれの腫瘍型についても観察されなかった（図１７）。
【０２６５】
この治療効果が、ＭＤＡ−７の過剰発現に起因するというさらなる証拠を、処置の４８時間後に皮下腫瘍を取り出し、そしてこれらを免疫組織化学分析に供することによって得た。Ａｄ−ｍｄａ７を与えられた動物由来の腫瘍細胞において、強力なＭＤＡ−７の発現（１５％）を観察した。ＭＤＡ−７の発現は、Ａｄ−ｌｕｃで処置されないかまたは処理されたかのいずれかである腫瘍細胞において検知されなかった（図１７）。ＭＤＡ−７発現は、細胞質において主に観察され、核における発現は非常にわずかだった。さらに、細胞外液染色を、いくつかの領域において観察した。
【０２６６】
ｍｄａ−７によって媒介される腫瘍阻害の機構を理解するために、最後の処置の４８時間後に回収した皮下腫瘍について、ＴＵＮＥＬ染色によってアポトーシスによる腫瘍細胞死を分析した。Ａｄ−ｌｕｃを用いて処理したマウス由来の腫瘍は、最小のアポトーシス細胞死（３％）を示したが、一方、Ａｄ−ｍｄａ７で処置された動物由来の腫瘍は、大規模なアポトーシス（１７％）を示した（図１８）。
【０２６７】
（ＭＤＡ−７の過剰発現は、実験的腫瘍においてＣＤ３１のダウンレギュレーションおよびＴＲＡＩＬのアップレギュレーションを誘導した）
ｍｄａ−７の腫瘍抑制効果のさらなる明確化のために、Ｈ１２９９由来の皮下腫瘍を、腫瘍における新血管形成を同定するために慣用的に使用されるマーカーであるＣＤ３１、およびＴＲＡＩＬの発現について分析した。Ａｄ−ｍｄａ７で処理した腫瘍は、有意に低いレベル（９％）のＣＤ３１を有し、Ａｄ−Ｌｕｃ（２８％）で処理された腫瘍または処理されなかった腫瘍（３９％）においてよりも血管が少ないことを示す。同様に、アポトーシスのプロモーターである、ＴＲＡＩＬの発現についての分析は、Ａｄ−ｍｄａ７で処理された腫瘍（２０％）において、Ａｄ−ｌｕｃで処置された腫瘍（４％）または処置されていない腫瘍（１％）より高レベルのＴＲＡＩＬの発現を実証した（図１９）。
【０２６８】
（実施例１１：ＭＤＡ−７は、ヒト患者においても効果的である）
種々の腫瘍（頭部および頸部、胸、黒色腫、結腸、腎、非ホジキンリンパ腫、ヘパトームを含む）を有する１０人の患者を、Ａｄ−ｍｄａ７（上記に記載されるような構築物）の単回注射により処置した。２４〜９６時間後に腫瘍を切除し、そして免疫組織化学によりＭＤＡ−７の発現について分析し、ＴＵＮＥＬアッセイによってアポトーシスについて分析した。腫瘍を切片化し、そして病巣の中央部および周辺部を、評価し得た。前処理腫瘍または非注射腫瘍は、ＭＤＡ−７免疫組織化学に対してネガティブであった。Ａｄ−ｍｄａ−７の注射の後、高レベルのトランスジェニックＭＤＡ−７タンパク質を検出し、そして高レベルのアポトーシスを観察した（図２０）。いくつかの患者において、ＭＤＡ−７タンパク質およびＴＵＮＥＬ陽性を、腫瘍の周辺で（注射から＞１ｃｍ）検出した。さらに、ｍｄａ−７配列についてのＰＣＲ増幅は、注射した病変の中央部において高レベルのＡｄ−ｍｄａ７ＤＮＡを示した（図２１）。
【０２６９】
（実施例１２：ＭＤＡ−７タンパク質は、処置として投与され得る）
ＨＵＶＥＣ細胞に、２９３−ｍｄａ７細胞から精製された漸増量のＭＤＡ−７タンパク質を投与した。評価された用量は、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲であった。ＭＤＡ−７のＥＤ５０は、５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲であった。管形成に基づいて、細胞における内皮の分化は、ＭＤＡ−７タンパク質により阻害されたが、コントロール細胞においては、阻害されなかった。
【０２７０】
ＨＵＶＥＣ細胞に、２９３−ｍｄａ７細胞（ロット１〜６）またはｍｄａ−７発現（ｅｘｏｒｅｓｓｉｎｇ）バキュロウイルスから精製された異なる用量のＭＤＡ−７タンパク質を与えた。Ａｄ−ｍｄａ７のポジティブコントロールおよびＡｄ−ｌｕｃのネガティブコントロールは、ほとんどのアッセイにおいて含まれた。Ａｄ−ｍｄａ７は、管形成を阻害し、そしてＭＤＡ−７タンパク質もまた、０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ程度の低い用量で管形成を阻害した（図．２２）。
【０２７１】
（実施例１３：ＭＤＡ−７は、サイトカイン活性を有する）
（１．材料および方法）
（ＰＢＭＣの活性）
ＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）での遠心分離によって正常な健常ドナーの末梢血から単離した。細胞を、Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％ヒトＡＢ血清（Ｐｅｌｆｒｅｅｚ、Ｂｒｏｗｎ  Ｄｅｅｒ、ＷＩ）を補充しＲＰＭＩ−１６４０に基づく培地において、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐまたは１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（ともにＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから）の存在下で、１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で７２時間培養した。回収の４時間前に、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＢＦＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、最終濃度１０μｇ／ｍｌで加えた。次いで、上清ならびに細胞を、回収した。
【０２７２】
ＰＢＭＣサブクラスの研究のため、ＰＨＡ刺激された細胞を、ＭｉｎｉＭａｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いる磁気細胞分離（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）による１回のポジティブ選択によって、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ５６＋富化集団に分離した。末梢血単球を、チャンバ型スライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に対する接着によって単離した。全てのＰＢＭＣを、これらのチャンバにおいて、１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度でＬＰＳを含有するかまたは含有せずに、７２時間インキュベートした。これらの集団の純度を、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６またはＣＤ１４に対するＦＩＴＣ−結合体化モノクローナル抗体またはＰＥ−結合体化モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いた染色により決定した。細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いるＦＡＣｓａｎ（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を使用して細胞蛍光測定的に分析した。ＣＤ３富化亜集団は、９７％のＣＤ３＋を含み、ＣＤ１９亜集団は、７１％のＣＤ１９＋細胞を含みそしてＣＤ５６富化集団は、９１％のＣＤ５６＋細胞を含んだ（混入物は、ＣＤ３＋である）。ヒト組み換え型ＩＬ−１０を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入し、そしてＩＬ−２は、Ｃｅｔｕｓ／Ｃｈｉｒｏｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）からの寛大な寄贈品である。
【０２７３】
（ＭＤＡ−７についての免疫組織化学染色）
以前本発明者らによってメラノサイトおよび黒色腫細胞について最適化された方法によるアビジン−ビオチン化−ペルオキシダーゼ複合体法（Ｅｋｍｅｋｃｉｏｇｌｕ、２００１）を使用する、ヒトＰＢＭＣまたはヒトＰＢＭＣサブクラスの免疫染色を、ヒトＭＤＡ７に対するマウスモノクローナル抗体（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を用いて行った。
【０２７４】
（ＥＬＩＳＡアッセイ）
ヒトＭＤＡ−７を検知するためのＥＬＩＳＡ反応を、標準的技術および感度によって選択された抗体ペアを使用して、９６ウェルプレート中で実行した。サイトカインについてのＥｌｉｓａアッセイを、市販のキットを使用して、図の説明の中で示したのと同一の様式で行った。
【０２７５】
（ウエスタンブロッティング）
活性化されたＰＢＭＣを、ＰＢＳ中で１回洗浄し、改変ＲＩＰＡ緩衝液（ＴＢＳ、ｐＨ７．６、１％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭフッ化ナトリウム、０．２ｍＭアプロチニン、１ｍＭロイペプチン）中に再懸濁し、そして２０分間４℃で振とうした。溶解物を、１６，０００ｘｇで、４℃にて、３０分間の遠心分離により清浄化した。タンパク質濃度を、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて決定し、サンプルを、等量のサンプル緩衝液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール）中で５分間沸騰させた。サンプルを、１２％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに移した。膜を、遮断緩衝液を用いて３０分間ブロッキングし、ブロッキング緩衝液中のウサギポリクローナルＭＤＡ−７Ａｂ（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）の中でインキュベートした。その後、膜を、ＰＢＳＴ中で２度洗浄し、１：２０００でＨＲＰ結合体ヤギ抗ウサギ２次Ａｂとともにインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて現像した。膜を、除去緩衝液（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ６．７、２％ＳＤＳおよび１００ｍＭβ−メルカプトエタノール）中で３０分間６０℃でインキュベートし、ＰＢＳＴを用いて各１０分間の洗浄を３回行い、そして抗アクチン抗体（１：１０００）を用いて再プローブした。
【０２７６】
（ヒトＭＤＡ−７の精製）ｍｄａ−７の全長ｃＤＮＡを、ｐＣＥＰ４  ＦＬＡＧベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｍｄａ−７遺伝子発現を駆動するためにＣＭＶプロモーターを使用した。プラスミドを、ＨＥＫ  ２９３細胞にトランスフェクトし、抗生物質耐性の安定なサブクローンを、ハイグロマイシン（０．４ｕｇ／ｍＬ）を使用して単離した。ＭＤＡ−７タンパク質の精製を、対数増殖にあって、生存能力のあるＨＥＫ２９３細胞から収集した細胞上清を使用して実行した。粗の上清が約３０ｎｇ／ｍｌ  ＭＤＡ−７を含むことを、ＥＬＩＳＡによって決定した。上清中にはいずれのアクチンも見出されず（データは示さず）、このことは、誘導されたＭＤＡ−７物質が、死細胞ではなく、完全に生存能力があり健康な細胞からの分泌であるという前提を強く示唆する。分泌されたＭＤＡ−７を含む上清を、プロテアーゼインヒビター（１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチン、および０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ）および０．０５％アジドナトリウムで補充し、ＹＭ１０メンブレン上でＡｍｉｃｏｎ  ｓｔｉｒｒｅｄ  ｃｅｌｌによって１０倍に濃縮した。濃縮上清の１０ｍｌアリコートを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中Ｓ２００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｒｅｐグレードカラムによって分離し、ウエスタンおよびＥＬＩＳＡによってＭＤＡ−７を含むと同定された画分をプールした。Ａｍｉｃｏｎ  ｓｔｉｒｒｅｄ  ｃｅｌｌによる５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６への緩衝液交換の後、第二の精製工程を、ＢｉｏＲａｄ  Ｓカラムを使用して実行した。カラム条件は、０ｍＭ〜９０ｍＭのＮａＣｌ勾配、９０ｍＭ  ＮａＣｌで５分保持、１ｍｌ／分の流速で３０分勾配の９０ｍＭ〜２５０ｍＭ勾配および２５０ｍＭ  ＮａＣＩで５分保持から成る。精製全体を、４℃で実行し、そしてＭＤＡ−７をＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティング手順を使用して同定した。最終サンプルは、少なくとも３００ｎｇ／ｍｌのＭＤＡ−７（ＥＬＩＳＡによって決定した）であり、そして特異的な活性を、外来のタンパク質の排除に基づいて、開始上清物質よりも少なくとも２８倍に富化した。
【０２７７】
（２．結果）
（ヒトＰＢＭＣは、ＭＤＡ−７タンパク質の発現を誘導し得る）新しい正常ドナーヒトＰＢＭＣを、活性化しないか、またはＰＨＡもしくはＬＰＳのポリクローナル刺激物質によって処理するかのいずれかで、イムノブロッティングによっておよび免疫組織化学によって、細胞内ＭＤＡ−７タンパク質発現を調査した。未処理のＰＢＭＣは、一般に、検出可能なレベルのＭＤＡ−７タンパク質を発現しない。しかし、ＰＨＡおよびＬＰＳで７２時間処理の後、様々であるが検出可能な量のＭＤＡ−７タンパク質が、複数のドナー（５分の３）から明らかであった。これらの実験の１つにおいて、ＭＤＡ−７のより弱いバンドが、培養した活性化していないＰＢＭＣにおいて検出可能であり、このことは、特定の条件下でのいくつかの個体において、ＭＤＡ−７が新規に発現されること、または本発明者のブロッティング手順が、イムノブロッティング方法論における感受性の閾値であるかろうじて検出可能なベースラインを反映し得、そして発現が、刺激によってアップレギュレートされていることを示唆している。抗ＭＤＡ−７抗体の特異性を、以前に公開された（Ｅｋｍｅｋｃｉｏｇｌｕら、２００１）ように、組み換えＭＤＡ−７タンパク質によるトータルブロッキングによって確認した。
【０２７８】
（ＭＤＡタンパク質は、非ＣＤ３サブセットによって発現される）ＭＤＡ−７が、低いレベルで刺激されたＰＢＭＣすべてによって発現されるか否か、または特定サブクラスが、強く陽性であるか否かを決定するために、サブクラス分析を、ＰＨＡ刺激されたＰＢＭＣから選択されたサブセットを使用して実行した。陽性として選択された単球細胞（３実験のうちの３）およびＣＤ３＋Ｔ細胞（６実験のうちの６）は、決まりきって、陰性であったが、同じ開始ＰＢＭＣおよび分離手順から生じるＣＤ５６＋およびＣＤ１９＋部分母集団は、明らかに陽性であった。メンブレン染色は、ＣＤ５６＋細胞において最も明らかであり、そして両方の細胞型において顆粒局在が観察された。
【０２７９】
（ＭＤＡ−７は、分泌タンパク質であり得る）サイトカインの特徴の１つは、その分泌される能力である。通常、タンパク質のアミノ末端における疎水性アミノ酸の短いストレッチは、そのタンパク質を分泌経路へシグナル化し、そして標的化する。図２２Ａに示されるように、ｍｄａ−７  ｃＤＮＡ配列は、４９アミノ酸からなるリーダー配列を含み；このことは、疎水性プロット（図２３Ｂ）において、より詳細に示される。予想される切断部位を、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ＳｉｇｎａｌＰ  予想プログラム（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９７）によって決定した。しかし、本発明者らの利用可能な最大限の情報によっても、ＭＤＡ−７におけるこの切断部位は、実験的に確認されていない。哺乳動物細胞からＭＤＡ−７の分泌を実証するために、ヒトＭＤＡ−７全長ｃＤＮＡを含む２９３細胞の安定なトランスフェクト体が作製された（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら、２００１）。上清を、ウエスタンブロットによってＭＤＡ−７発現を分析し、ＭＤＡ−７タンパク質の４つのバンドを、ＭＤＡ−７をトランスフェクトした２９３細胞の培養物上清において検出した（ＭＤＡ−７をトランスフェクトしていない２９３細胞の培養物上清においては検出されなかった）。この時点で、分泌後のＭＤＡ−７の複数のサイズのバンドの分子的性質は、明らかではない。アミノ酸配列に基づいて、ＭＤＡ−７は、分子量１８，４１９ｋＤａを有することが予測され、そしてリーダー配列を含む場合は、分子量が２３，８２４ｋＤａであると予測された（ＰｒｏｔＰａｒａｍ  ｔｏｏｌ）。ＩＬ−１０に関して、ＭＤＡ−７のホモ二量体化が生じる可能性があり；また、ＭＤＡ−７に対する様々なグリコシル化の可能性も考慮すべき事項であり、そしてこれらの翻訳後修飾の両方を調査した。多くのサイトカインは、様々な程度でグリコシル化されることが実証されている（Ｍａｙら、１９９１；Ｇｒｏｓｓら、１９８９）。
【０２８０】
（ＭＤＡ−７タンパク質は、ＩＬ−１０によって阻害される第二のサイトカインを誘導する）サイトカインファミリーの別の証明は、細胞活性化または阻害に関与するさらなる分子のカスケードに属することである。サイトカインとしてのＭＤＡ−７の生物学的機能に取り組むために、ＰＢＭＣによる第二のサイトカイン分泌の誘導を調査した。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させた組み換えＭＤＡ−７を使用した予備実験は、ＭＤＡ−７が、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの強い産生を誘導し得、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０の非常に弱いレベルの産生を誘導し得、そしてＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−５の産生は誘導し得ないことを示した。しかし、おそらく組み換えタンパク質の不適切な折り畳みまたはグリコシル化に起因して、応答を刺激するために非常に高い用量（μｇ／ｍｌ  量）の細菌ＭＤＡ−７を必要とした。従って、安定にトランスフェクトされたヒト胚性腎臓細胞（２９３細胞）を調製し、分泌され、精製されたＭＤＡ−７を、これらの報告される活性化実験において使用した。
【０２８１】
図２４は、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＦＮγのＭＤＡ−７誘導を示し、２００ｐｇ／ｍｌのＭＤＡ−７のみによって最大のＩＬ−６分泌が刺激される。２ｎｇ／ｍｌのＭＤＡ−７では、ＩＬ−６分泌はすでに８００ｐｇ／ｍｌを超えている（ＥＬＩＳＡキットの標準曲線よりも上）。図２５Ｃ、Ｅに示されるように、より高い用量である２ｎｇ／ｍｌのＭＤＡ−７が、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ分泌の最適レベルを達成するために必要である。ＬＰＳ（炎症性サイトカインの公知のインデューサー）を、ポジティブコントロールとして使用し、そしてＴＮＦαの誘導に際して、ＭＤＡ−７は、陽性刺激コントロールＬＰＳより強力なインデューサーであった。図２５に示されるように、サイトカイン産生に関するＭＤＡ−７刺激の類似したパターンは、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦに関しても観察された。図２５に示されるドナーからのサイトカインの量の類似した範囲での値は、３つのさらなるドナーからの上清においても検出された。ポリクローナル抗血清またはＭＤＡ−７に特異的なモノクローナル抗体のいずれかを使用すると、ＥＬＩＳＡによって決定されたような９０％を上回るＭＤＡ−７タンパク質の吸着は、ＩＬ−６、およびＩＦＮγ（２実験のうちの２）の二次誘導の全損失に著しい減少をもたらし、これらの二次サイトカインの誘導がＭＤＡ−７に起因し、可能性のある夾雑によるものではないことが示された。
【０２８２】
ＭＤＡ−７は、ＩＬ−１０ファミリーの一員であり、ＩＬ−１０は、最も古い免疫抑制性サイトカインとして知られているので、ＭＤＡ−７が炎症誘発性サイトカインの産生を刺激することは、本発明者らにとって興味深いことであった。従って、本発明者らは、ＩＬ−１０およびＭＤＡ−７が、アンタゴニストであり得ると仮説を立てた。この仮説を試験するために、ヒト組換えＩＬ−１０を、ＭＤＡ−７によって刺激されたＰＢＭＣ培養物に加えた。使用された条件下では、ＩＬ−１０は、完全にＭＤＡ−７によるＴＮＦαおよびＩＦＮγの誘導を排除し、そして部分的にＭＤＡ−７によるＩＬ−６誘導をブロックすることが見出された（図２４）。ポジティブコントロールとして、ＩＬ−１０もまた、ＬＰＳに応答したこれらの３つのサイトカインのうちの２つの産生を提示した。ＬＰＳ誘導性ＩＬ−６分泌のＩＬ−１０阻害の欠如は、おそらく、このアッセイの標準曲線を大きく超えたＩＬ−６の値に起因する。ＩＬ−１０もまた、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦ産生を部分的に阻害し、そしてＩＬ−１２産生を完全に阻害した（図２５）。新しく単離したヒトＰＢＭＣを用いた任意の研究のように、ドナー間のいくからの変動性が存在するが、ＭＤＡ−７誘導性二次サイトカインおよびＩＬ−１０による阻害の結果は、試験した全てのドナーおよび全ての実験において一致した。
【０２８３】
（ＭＤＡ−７は、ヒトＰＢＭＣに対する増殖因子として機能しないようである）
いくつかのサイトカインはまた、増殖因子として機能し得る。従って、ＭＤＡ−７の増殖刺激機能を、ＰＢＭＣを用いて取り組んだ。ＩＬ−１０を、ネガティブサイトカインコントロールとして含めた。ＰＨＡをポジティブコントロールとして使用し、そして全３人のドナーにおいて、チミジンの強い取り込みを誘導した。予想したように、ＩＬ−１０は、４日間の期間にわたって、ＰＢＭＣのチミジン取り込みの増大を誘導しなかった。本発明者らの結果は、ＭＤＡ−７が、試験したいずれの３人のドナーにおいても、４日間のＰＢＭＣ集団の共培養の間に、有意な増殖を誘導しなかったことを示す。Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現された組換えＭＤＡ−７（５μｇ／ｍｌまで）を用いた初期の研究では、３人のドナーからのヒトＰＢＭＣにおいて、増殖応答は示されなかった。
【０２８４】
本明細書中に開示され、そして特許請求される全ての組成物および／または方法は、本開示を鑑みて過度の実験なく、作製および実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載してきたが、バリエーションが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に開示される、組成物および方法および工程または一連の工程に適用され得ることは、当業者に明らかである。より詳細には、化学的に関連する特定の因子および生理学的に関連する特定の因子の両方ともが、同じまたは類似の結果を達成しながら本明細書中に開示される因子に対して置換され得ることは、明らかである。当業者に明らかであるこのような類似の置換および改変の全てが、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【０２８５】
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中に記載される例示的な手順または他の詳細の補充してそれらを提供する程度まで、本明細書中に参考として援用される。
【０２８６】
【数１】
2005500247.tif 000012
2005500247.tif 000013
2005500247.tif 000014
2005500247.tif 000015
2005500247.tif 000016
2005500247.tif 000017
2005500247.tif 000018
2005500247.tif 000019
2005500247.tif 000020
2005500247.tif 000021
2005500247.tif 000022
2005500247.tif 000023
2005500247.tif 000024
2005500247.tif 000025
続く図面は、本明細書の一部をなし、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書中に示した具体的な実施形態の詳細な説明と合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ａｄベクターの模式図。ＣＭＶＩＥプロモーターに連結され、そして後にＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）が続くｍｄａ−７（またはルシフェラーゼ遺伝子）を有する複製能欠損ヒト５型アデノウイルス（Ａｄ５）を使用した。さらに、Ａｄ−ＣＭＶｐ（Ａ）（空ベクター）をコントロールとして使用した。
【図２Ａ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＴ４７Ｄ細胞。
【図２Ｂ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＭＣＦ−７細胞。
【図３Ａ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞。
【図３Ｂ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＢＴ−２０細胞。
【図４Ａ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＨ１２９９細胞。
【図４Ｂ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＨ３２２細胞。
【図５Ａ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＳＷ６２０細胞。
【図５Ｂ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＤＬＤ−１細胞。
【図６Ａ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＭＪ９０細胞。
【図６Ｂ】
種々のＭＯＩ（ウイルス粒子／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で処理したＨＵＶＥＣ細胞。
【図７】
乳癌細胞株におけるＡｄ−ｍｄａ７形質導入後のアポトーシス誘導を決定するためのアネキシンＶアッセイ。３つの乳癌細胞株（Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７）にＡｄ−ｍｄａ７またはコントロールＡｄ−ＣＭＶｐ（Ａ）空ベクターを感染させ、そしてアネキシンＶを用いてアポトーシスについて評価した。
【図８】
ＤＬＤ−１細胞にＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃを感染させ、４８時間後にＦＡＣＳ分析によってアネキシンＶ染色について調べた。
【図９】
パネルＡは、  Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃに感染したＨ１２９９細胞におけるアポトーシス誘導を示す。アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析を用いて、感染後の種々の時点で、細胞を評価した。パネルＢは、感染後種々の時点でＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃに感染したＤＬＤ−１細胞におけるアポトーシスを例示する（アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析により調べられる）。
【図１０】
図１０は、Ｈ４６０細胞が、増加するＭＯＩのＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃで感染され、そして４８時間後に、ＭＤＡ７表面発現のためにプロセシングされ、そしてＦＡＣＳによって分析されたことを示す。
【図１１】
図１１Ａは、可溶性ＭＤＡ−７（ｓＭＤＡ７）が、腫瘍細胞を殺傷することを示す。Ｈ１２９９細胞は、以下のサンプルでチャレンジされ、そして４８時間後に死細胞％を評価された：１）Ａｄ−ｍｄａ７ウイルス（１０００Ｖｐ／細胞で感染された、陽性コントロール）；２）Ａｄ−ｍｄａ−７（１０００ｖｐ／細胞）で感染されたＨ１２９９細胞由来の可溶性ＭＤＡ７上清；３）Ａｄ−ｌｕｃウイルス（１０００Ｖｐ／細胞で感染されたコントロール）；４）Ａｄ−ｌｕｃ（１０００ｖｐ／細胞）で感染されたＨ１２９９細胞からの上清；５）Ａｄ−ｐ５３ウイルス（２０Ｖｐ／細胞で感染された陽性コントロール）；６）Ａｄ−ｍｄａ−７（ｓｕｐ  Ｍ、５００Ｖｐ／細胞）で感染された２９３細胞から得られた可溶性ＭＤＡ−７上清の別のストック；および７）Ａｄ−ｍｄａ−７（ｓｕｐ  Ｐ、５００Ｖｐ／細胞）で感染された、改変された、血清を含まない２９３細胞から得られた可溶性ＭＤＡ−７上清の別のストック。この実験に用いられた全ての上清は、Ｈ１２９９細胞でチャレンジされる前に０．１ミクロンのフィルターを通してろ過された。図１１Ｂは、Ｈ１２９９細胞が、４種類の異なるストック由来の可溶性ＭＤＡ−７上清でチャレンジされ、そして４８時間後に、死細胞％について評価されたことを示す：１）２９３＊ＮＦ：改変された２９３細胞（細胞を、血清を含まない条件で増殖した）から得られた未ろ過上清；２）２９３＊Ｆ：改変された２９３細胞から得られ、０．１ミクロンのろ過をした上清；３）２９３Ｆ：正規の２９３細胞（ＦＢＳ＋）から得られ、０．１ミクロンのろ過をした上清；および４）Ｈ１２９９Ｆ：Ｈ１２９９細胞から得られ、０．１ミクロンのろ過をされた上清。Ｄ０は、希釈されていない物質であり、一方で、Ｄ１：１、Ｄ１：５、Ｄ１：１０は、用いられた希釈物を示す。Ａｄ−ｌｕｃ処理されたＨ１２９９細胞由来の、希釈されていないコントロール上清は、２０％の死細胞を示した。
【図１２】
図１２は、タモキシフェンとの組み合わせを示す。Ａｄ−ｍｄａ７は、タモキシフェンと組み合わせられ、乳癌細胞株における抗腫瘍効果について評価された。グラフは、これらの２種類の薬剤の組み合わせが、各々の薬剤単独と比較して優れた抗腫瘍活性を提供することを示す。
【図１３】
図１３は、アドリアマイシンとの組み合わせを示す。Ａｄ−ｍｄａ７は、アドリアマイシンと組み合わせられ、そして乳癌細胞株において抗腫瘍効果について評価された。グラフは、これらの２種類の薬剤の組み合わせが、各々の薬剤単独と比較して優れた抗腫瘍活性を提供することを示す。
【図１４】
図１４の左パネルは、Ａｄ−ｍｄａ７を用いた形質導入後の、ＮＳＣＬＣ細胞および正常な肺細胞におけるＭＤＡ−７タンパク質発現を示す。ＮＨＦＢ−正常ヒト気管支細胞。右上のパネルは、ＮＳＣＬＣ細胞および正常な肺細胞の増殖に対するＡｄ−ｍｄａ７の効果を示す。Ａｄ−ｍｄａ７（丸）、ＰＢＳ（ひし形）、Ａｄ−ｌｕｃ（四角）。下のパネルは、Ａｄ−ｍｄａ７を用いた形質導入後の、ＮＳＣＬＣ細胞および正常な肺細胞の細胞周期分析を示す。Ｇ１期における有意な減少およびＧ２／Ｍ期における有意な増加に注意すること。
【図１５】
図１５は、乳癌細胞株上のＡｄ−ｍｄａ７およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎの組み合わせを示す。Ａｄ−ｍｄａ７を用いて処理された細胞株は、発現しない細胞株と比較して、Ｈｅｒ２を発現する細胞株中で増強され、そのことは、Ａｄ−ｍｄａ７との接触後に、細胞の殺傷におけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎの増加された効果を示す。
【図１６】
図１６は、ＭＤＡ−７過剰発現が、アポトーシス性腫瘍細胞死を誘導し、そしてインビトロでの細胞増殖を阻害することを示す。腫瘍細胞（Ｈ１２９９、Ａ５４９）および正常なヒト気管支の上皮細胞（ＮＨＢＥ）は、Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７（５０００ｖｐ／細胞）で感染された。感染の７２時間後に、細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色され、そして蛍光顕微鏡下で観察された。感染７２時間後でのＭＴＴアッセイによる細胞生存力の分析は、腫瘍細胞増殖の阻害を示した（Ｈ１２９９については２７％、およびＡ５４９については４０％）が、ＮＨＢＥにおいては腫瘍細胞の増殖の阻害を示さなかった。
【図１７】
図１７は、皮下のヒト肺癌の異種移植片でのＡｄ−ｍｄａ７処置の治療効果を示す。皮下のＨ１２９９（ａ）腫瘍保有マウスおよびＡ５４９（ｂ）腫瘍保有マウスは、３つの群（８匹の動物／群）に分けられ、そして１日おきで、総量で３回の用量（５×１０９ｖｐ／用量）の、以下の処理がされた：処理なし（白四角）、Ａｄ−ｌｕｃ（黒四角）またはＡｄ−ｍｄａ７（黒丸）。腫瘍は、カリパスを用いて測定され、そして、腫瘍容積変化の統計学的有意性は、スチューデントのｔ−検定を用いて算出された。各々の時点は、各々の群についての平均の腫瘍容積を示す。バーは、標準誤差を示す。
【図１８】
図１８は、インビボでのＡｄ−ｍｄａ７処理の後の、ｍｄａ−７遺伝子発現およびアポトーシス細胞死を示す。Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７を受けた動物由来の皮下のＨ１２９９腫瘍は、処理の４８時間後に収集された。腫瘍組織の定量分析は、Ａｄ−ｍｄａ７で処理した腫瘍細胞の１５％がＭＤＡ−７を発現し（ａ）そして腫瘍細胞の１７％がアポトーシスを受ける（ｂ）ことを示した。
【図１９】
図１９は、ｍｄａ−７によるＣＤ３１発現のダウンレギュレーションおよびＴＲＡＩＬ発現のアップレギュレーションを示す。Ａｄ−ｍｄａ７で処理された腫瘍におけるＣＤ３１の発現（９％）が、処理を受けていない腫瘍におけるＣＤ３１発現（４０％）またはＡｄ−ｌｕｃで処理された腫瘍におけるＣＤ３１発現（２８％）よりも、より低いことが観察された（ａ）。Ａｄ−ｍｄａ７で処理された腫瘍（２０％）におけるＴＲＡＩＬの発現は、処理を受けていない腫瘍（１％）またはＡｄ−ｌｕｃで処理された腫瘍（４％）よりも、より高かった（ｂ）。
【図２０】
図２０は、Ａｄ−ｍｄａ７で腫瘍内を（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）処理された患者の免疫組織化学分析の要約を示す。「Ｐｔ」は、患者を示す。時間は、注射後、腫瘍が免疫組織化学のために切除された時間数を示す。ＭＤＡ−７に対する参照は、腫瘍の中央（注射部位）または末梢（注射部位から１ｃｍを超える）でのＭＤＡ−７タンパク質についての陽性の発現を示す。ＴＵＮＥＬのデータもまた、示される。ヒトにおける腫瘍へのＡｄ−ｍｄａ７注射は、ｍｄａ−７導入遺伝子の高レベルの発現および高レベルのアポトーシス誘導を生じる。
【図２１】
図２１は、ＤＮＡ  ＰＣＲデータの要約を示し、このデータは、患者において注射された病変の中央における高レベルのＡｄ−ｍｄａ７ＤＮＡを示す。腫瘍は、Ａｄ−ｍｄａ７を注射され、そして示された時間で切除された。約２ｍｍの切片は、各々の腫瘍の中央（注射部位に対応する）から得られ、そして定量的ＤＮＡ−ＰＣＲ分析に供された。データは、総腫瘍ＤＮＡ１μｇに対するＡｄ−ｍｄａ７  ＤＮＡコピー数としてプロットされ、そして切除の時間と比較された（例えば、「１．００Ｅ＋０３」は、１．００×１０３を示す）。アッセイのバックグラウンドは、約１００コピー／μｇＤＮＡであった。
【図２２】
図２２は、ＭＤＡ−７タンパク質が、用量に依存する様式で、内皮性の分化を阻害することを示す。
【図２３】
図２３Ａ、図２３Ｂは、ＭＤＡ−７が分泌されたタンパク質であることを示す。Ａは、ＭＤＡ−７タンパク質の特徴を示す。Ｂは、リーダー配列を有するＭＤＡ−７タンパク質の疎水性プロットを示す。
【図２４】
図２４は、ＰＢＭＣからの炎症性サイトカイン分泌に対するＭＤＡ−７およびＩＬ−１０の効果を示す。２ｍｌ／ウェル（２×１０６細胞／ｍｌ）のＰＢＭＣは、２４ウェルプレート中でプレートされ、そして処理されずに培養されるか、または示された量のＭＤＡ−７（Ｂ  ２ｎｇ／ｍｌ；  Ｄ、Ｆ  ２０ｎｇ／ｍｌ）、５μｇ／ｍｌのＬＰＳ、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１０（約１７ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）もしくはＩＬ−１０およびＭＤＡ−７の組み合わせと共に培養された。上清は、４８時間で収集され、そして製造者の指示に従い、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ）によって、サイトカイン含有量について分析した。１つの代表的なドナーからのデータが、報告される。＊は、標準曲線を超える値を示す。
【図２５】
図２５は、ＭＤＡ−７が、ＰＢＭＣからのＩＬ−１β、ＩＬ−１２、およびＧＭ−ＣＳＦ分泌を誘導し、その分泌がＩＬ−１０によって阻害されることを示す。ヒトＰＢＭＣは、５μｇ／ｍｌのＬＰＳ、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１０、５ｎｇ／ｍｌのＭＤＡ−７またはその組み合わせを用いて、４８時間、処理された。ＭＤＡ−７を含まないことがウェスタンによって決定された等容量のＳカラム画分（ＭＤＡ−７陰性画分（Ｎｅｇ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ））は、緩衝液／塩含有量についてのコントロールとして用いられた。上清は、４８時間で収集され、そして製造者の指示に従い、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ）によって、サイトカイン含有量について分析した。１つの代表的なドナーからのデータが、報告される。＊は、５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１βを超える値を示す。＊＊実際の値は、５３９ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２および８９３ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦである。１つの代表的なドナーからのデータが、報告される。
【図１】
2005500247.tif 000026
【図２Ａ】
2005500247.tif 000027
【図２Ｂ】
2005500247.tif 000028
【図３Ａ】
2005500247.tif 000029
【図３Ｂ】
2005500247.tif 000030
【図４Ａ】
2005500247.tif 000031
【図４Ｂ】
2005500247.tif 000032
【図５Ａ】
2005500247.tif 000033
【図５Ｂ】
2005500247.tif 000034
【図６Ａ】
2005500247.tif 000035
【図６Ｂ】
2005500247.tif 000036
【図７】
2005500247.tif 000037
【図８】
2005500247.tif 000038
【図９】
2005500247.tif 000039
【図１０】
2005500247.tif 000040
【図１１】
2005500247.tif 000041
【図１２】
2005500247.tif 000042
【図１３】
2005500247.tif 000043
【図１４】
2005500247.tif 000044
【図１５】
2005500247.tif 000045
【図１６】
2005500247.tif 000046
【図１７】
2005500247.tif 000047
【図１８】
2005500247.tif 000048
【図１９】
2005500247.tif 000049
【図２０】
2005500247.tif 000050
【図２１】
2005500247.tif 000051
【図２２】
2005500247.tif 000052
【図２４】
2005500247.tif 000053
【図２５】
2005500247.tif 000054
【国際公開パンフレット】
2005500247.tif 000055
2005500247.tif 000056
2005500247.tif 000057
2005500247.tif 000058
2005500247.tif 000059
2005500247.tif 000060
2005500247.tif 000061
2005500247.tif 000062
2005500247.tif 000063
2005500247.tif 000064
2005500247.tif 000065
2005500247.tif 000066
2005500247.tif 000067
2005500247.tif 000068
2005500247.tif 000069
2005500247.tif 000070
2005500247.tif 000071
2005500247.tif 000072
2005500247.tif 000073
2005500247.tif 000074
2005500247.tif 000075
2005500247.tif 000076
2005500247.tif 000077
2005500247.tif 000078
2005500247.tif 000079
2005500247.tif 000080
2005500247.tif 000081
2005500247.tif 000082
2005500247.tif 000083
2005500247.tif 000084
2005500247.tif 000085
2005500247.tif 000086
2005500247.tif 000087
2005500247.tif 000088
2005500247.tif 000089
2005500247.tif 000090
2005500247.tif 000091
2005500247.tif 000092
2005500247.tif 000093
2005500247.tif 000094
2005500247.tif 000095
2005500247.tif 000096
2005500247.tif 000097
2005500247.tif 000098
2005500247.tif 000099
2005500247.tif 000100
2005500247.tif 000101
2005500247.tif 000102
2005500247.tif 000103
2005500247.tif 000104
2005500247.tif 000105
2005500247.tif 000106
2005500247.tif 000107
2005500247.tif 000108
2005500247.tif 000109
2005500247.tif 000110
2005500247.tif 000111
2005500247.tif 000112
2005500247.tif 000113
2005500247.tif 000114
2005500247.tif 000115
2005500247.tif 000116
2005500247.tif 000117
2005500247.tif 000118
2005500247.tif 000119
2005500247.tif 000120
2005500247.tif 000121
2005500247.tif 000122
2005500247.tif 000123
2005500247.tif 000124
2005500247.tif 000125
2005500247.tif 000126
2005500247.tif 000127
2005500247.tif 000128
2005500247.tif 000129
2005500247.tif 000130
2005500247.tif 000131
2005500247.tif 000132
2005500247.tif 000133
2005500247.tif 000134
2005500247.tif 000135
2005500247.tif 000136
2005500247.tif 000137
2005500247.tif 000138
2005500247.tif 000139
2005500247.tif 000140
2005500247.tif 000141
2005500247.tif 000142
2005500247.tif 000143
2005500247.tif 000144
2005500247.tif 000145
2005500247.tif 000146
2005500247.tif 000147
2005500247.tif 000148
2005500247.tif 000149
2005500247.tif 000150
2005500247.tif 000151
2005500247.tif 000152
2005500247.tif 000153
2005500247.tif 000154
2005500247.tif 000155
2005500247.tif 000156
2005500247.tif 000157
2005500247.tif 000158
2005500247.tif 000159
2005500247.tif 000160
2005500247.tif 000161
2005500247.tif 000162
2005500247.tif 000163
2005500247.tif 000164
2005500247.tif 000165
2005500247.tif 000166
2005500247.tif 000167
2005500247.tif 000168
2005500247.tif 000169
2005500247.tif 000170
2005500247.tif 000171
2005500247.tif 000172
2005500247.tif 000173
2005500247.tif 000174
2005500247.tif 000175
2005500247.tif 000176
2005500247.tif 000177
2005500247.tif 000178
2005500247.tif 000179
2005500247.tif 000180
2005500247.tif 000181
2005500247.tif 000182
2005500247.tif 000183
2005500247.tif 000184
2005500247.tif 000185
2005500247.tif 000186
2005500247.tif 000187
2005500247.tif 000188
2005500247.tif 000189
2005500247.tif 000190
2005500247.tif 000191
2005500247.tif 000192
2005500247.tif 000193
2005500247.tif 000194
2005500247.tif 000195
2005500247.tif 000196
2005500247.tif 000197
2005500247.tif 000198
2005500247.tif 000199
2005500247.tif 000200
2005500247.tif 000201
2005500247.tif 000202
2005500247.tif 000203
2005500247.tif 000204
2005500247.tif 000205
2005500247.tif 000206
2005500247.tif 000207
2005500247.tif 000208
2005500247.tif 000209
2005500247.tif 000210
2005500247.tif 000211
2005500247.tif 000212
2005500247.tif 000213
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500247.tif 000214
【国際調査報告】
2005500247.tif 000215
2005500247.tif 000216
2005500247.tif 000217
2005500247.tif 000218
2005500247.tif 000219
2005500247.tif 000220