(57)【要約】本発明は、細胞の混合集団から、リンパ管内皮細胞を単離する方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明者らは、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインを認識する特定の抗体を用いて、他の非リンパ管内皮細胞が実質的に混入していないリンパ管内皮細胞を特異的に単離することができることを発見した。前記細胞の作製および前記細胞の使用のための方法および組成物を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ管内皮細胞を含む生物学的サンプルからリンパ管内皮細胞を単離する方法であって、
ａ）前記サンプルと、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞を優先的に認識する抗体とを、該抗体がリンパ管内皮細胞と結合する条件下にて接触させ、さらに
ｂ）前記抗体と結合しているリンパ管内皮細胞を単離すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記抗体が、リンパ管内皮細胞に特異的なＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインのエピトープと免疫反応性のある抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルが、ヒト患者由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が固相支持体上に固定化され、かつ、前記生物学的サンプルが該支持体と接触して、前記リンパ管内皮細胞が前記抗体と結合することを可能とするものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体を蛍光ラベルにて標識し、かつ、前記リンパ管内皮細胞が蛍光活性化セルソーティングによって単離するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体を磁気ラベルにて標識し、かつ、前記リンパ管内皮細胞が磁気活性化セルソーティングによって単離するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リンパ管内皮細胞が、免疫組織化学によって単離するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リンパ管内皮細胞が免疫クロマトグラフィーによって単離するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がポリクローナル抗体であるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体であるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、２Ｅ１１Ｄ１１の抗原結合フラグメントを含んでなる結合試薬であるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、２Ｅ１１Ｄ１１によって認識されるＶＥＧＦＲ−３タンパク質の同じエピトープを認識するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、２Ｅ１１Ｄ１１であるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、抗ポドプラニンであるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
微小血管内皮細胞のサンプルから血管内皮細胞を単離する方法であって、
ａ）前記細胞と、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体とを、前記抗体がリンパ管内皮細胞と結合する条件下にて接触させ、さらに
ｂ）前記抗体と結合していない微小血管細胞から、前記抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を取り除くものであり、ここで、前記抗体と結合していない前記微小血管細胞が、リンパ管内皮細胞を実質的に含まない血管内皮細胞集団を含んでなること
を含んでなる、方法。
【請求項１６】
前記抗体が、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）リンパ管内皮細胞を含む生物学的サンプルと、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体とを、前記抗体がリンパ管内皮細胞と結合する条件下にて接触させ、さらに
ｂ）該抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を単離すること
を含んでなる方法によって単離されたものである、リンパ管内皮細胞集団。
【請求項１８】
前記抗体がＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体である、請求項１７に記載のリンパ管内皮細胞集団。
【請求項１９】
細胞の前記生物学的サンプルが、内皮細胞の異種集団を含んでなるものである、請求項１７に記載のリンパ管内皮細胞集団。
【請求項２０】
細胞の前記生物学的サンプルが、微小血管内皮細胞集団であるものである、請求項１７に記載のリンパ管内皮細胞集団。
【請求項２１】
血管内皮細胞が実質的に混入していない、請求項１７に記載のリンパ管内皮細胞集団。
【請求項２２】
前記リンパ管内皮細胞を増殖させることを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）微小血管内皮細胞集団と、血管内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体とを、該抗体がリンパ管内皮細胞と結合する条件下にて接触させ、さらに
ｂ）前記抗体と結合していない微小血管細胞から、前記抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を取り除き、ここで、前記抗体と結合していない微小血管細胞が、リンパ管内皮細胞を実質的に含まない血管内皮細胞集団を含んでなること
を含んでなる方法によって単離された、血管内皮細胞集団。
【請求項２４】
前記抗体が、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体である、請求項２３に記載の血管細胞集団。
【請求項２５】
前記血管内皮細胞集団を増殖させることをさらに含んでなる、請求項２３に記載の血管細胞集団。
【請求項２６】
他の内皮細胞が実質的に混入していない、リンパ管内皮細胞集団。
【請求項２７】
他の内皮細胞が実質的に混入していない、血管内皮細胞集団。
【請求項２８】
リンパ管内皮細胞の部分集団が実質的に富化されたものである組成物を得る方法であって、
（ａ）微小血管内皮細胞を含んでなる細胞源を用意し、
（ｂ）該細胞と、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合するモノクローナル抗体とを、該抗体がリンパ管内皮細胞と結合しうる条件下にて接触させ、
（ｃ）前記モノクローナル抗体が特異的に結合する細胞を分離して、リンパ管内皮細胞の部分集団が実質的に富化されたものである組成物を得ること
を含んでなる、方法。
【請求項２９】
前記抗体が、抗ポドプラニン抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、２Ｅ１１Ｄ１１である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８、２９または３０に記載の方法によって得られ、実質的に富化されたリンパ管内皮細胞部分集団を含んでなるものである、組成物。
【請求項３２】
リンパ管内皮細胞障害を改善する方法であって、治療剤を用いてリンパ管内皮細胞を標的化することを含んでなり、前記治療剤が、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体を用いてリンパ管内皮細胞を標的化し、前記抗体が、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体であるものである、方法。
【請求項３３】
前記障害が、リンパ腫、遺伝性リンパ水腫、リンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症、および頸部水嚢胞からなる群から選択されるものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ex vivo治療を含んでなるものである、リンパ系疾患を改善する方法であって、
前記ex vivo治療が、
ａ）該治療を必要とする患者の微小血管内皮細胞を用意し、
ｂ）微小血管内皮細胞と、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体とを、該抗体とリンパ管内皮細胞との結合を可能にする条件下にて接触させ、
ｃ）前記抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を単離し、
ｄ）該リンパ管内皮細胞を発現構築物にてトランスフェクトし、ここで、該発現構築物は、プロモーターに作動可能に連結された治療用タンパク質をコードする核酸を含んでなり、前記細胞内にて前記タンパク質を発現させるのに有効な量であり、さらに
ｅ）該トランスフェクト細胞を前記患者に再導入すること
を含んでなる、方法。
【請求項３５】
前記抗体が、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体であるものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
リンパ管内皮細胞培養系の増殖を促進する方法であって、
ａ）請求項１に記載のようにリンパ管内皮細胞を用意し、
ｂ）該細胞をＶＥＧＦＲ−３リガンドにより刺激すること
を含んでなり、
ここで、前記ＶＥＧＦＲ−３リガンドによる前記細胞の増殖刺激が、該刺激の不在下における増殖に比べて前記培養細胞の生存を促進するものである、方法。
【請求項３７】
前記ＶＥＧＦＲ−３リガンドが、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６ＳまたはＶＥＧＦ−Ｄである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞を、ＶＥＧＦＲ−２リガンドにより刺激することをさらに含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞の刺激が、該細胞をアポトーシスから防護するものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞の防護が、Ａｋｔまたはｐ４２／ＭＡＰＫシグナル伝達分子の活性化により媒介されるものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記刺激が前記細胞の分化内皮細胞の特性の維持を可能にするものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳類生物体のリンパ管内皮細胞を選択的に調節する方法であって、
ａ）請求項１に記載の方法によって哺乳類生物体からリンパ管内皮細胞を単離し、
ｂ）単離された前記リンパ管内皮細胞を、リンパ管内皮細胞を調節する薬剤と接触させ、さらに
ｃ）該リンパ管内皮細胞を、前記生物体に再導入すること
を含んでなる、方法。
【請求項４３】
前記接触工程が、外因性ポリヌクレオチドを前記細胞へ導入することを含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物体が、リンパ管内皮細胞内で発現される遺伝子内の遺伝子突然変異を特徴とする疾患を有し、かつ、前記接触が、外因性ポリヌクレオチドを前記細胞へ導入して前記遺伝子内の遺伝子突然変異の影響を克服することを含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患が、遺伝性リンパ水腫である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
脊椎動物生物体由来の組織のリンパ管内皮細胞をイメージングする方法であって、
（ａ）リンパ管内皮細胞含有の疑いのある脊椎動物組織と、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体を含んでなる組成物とを、該抗体とリンパ管内皮細胞との結合を可能にする条件下にて接触させ、
（ｂ）前記組織のリンパ管内皮細胞と結合した前記抗体を検出し、さらに
（ｃ）前記抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を同定することによって前記組織のリンパ管内皮細胞をイメージングすることを含んでなり、ここで、リンパ管内皮細胞と前記抗体との結合が前記組織内のリンパ管内皮細胞の存在および位置を示すものである、方法。
【請求項４７】
前記組織がヒト組織を含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
接触工程の後、イメージング工程の前に、前記組織のリンパ管内皮細胞と結合していない抗体を、前記組織から取り除く条件下にて、前記組織を洗浄する工程をさらに含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が抗ポドプラニン抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、共有結合した検出可能なラベルをさらに含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記組織を、血管内皮には実質的に存在しないリンパ管内皮マーカーと特異的に結合する第２の化合物と接触させ、さらに
前記組織の細胞と結合した前記第２の化合物を検出すること
をさらに含んでなり、ここで、前記イメージング工程が、前記抗体および第２の化合物の両方にて標識されたリンパ管を同定することを含んでなり、前記抗体および第２の化合物の両方にて標識されたリンパ管が、前記組織におけるリンパ管内皮細胞の存在および位置と相関するものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体がＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体であり、かつ、前記第２の化合物が抗ポドプラニン抗体であるものである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
リンパ管内皮細胞における変化を特徴とする疾病についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）リンパ管内皮細胞における変化を特徴とする病態の疑いのある脊椎動物生物体から組織サンプルを用意し、
（ｂ）該組織サンプルを、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体を含んでなる組成物に対し、前記抗体と前記生物体のリンパ管内皮細胞との結合を可能にする条件下にて曝し、
（ｃ）前記組織サンプルを洗浄し、さらに
（ｄ）前記組織サンプル中の前記結合抗体の存在、量、または分布を検出することにより、前記疾病についてスクリーニングすること
を含んでなる、方法。
【請求項５５】
哺乳類のリンパ管内皮細胞を特異的に検出する方法であって、
（ａ）前記哺乳類に、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体を含んでなる組成物を、該抗体とリンパ管内皮細胞との結合を可能にする条件下にて投与し、さらに
（ｂ）リンパ管内皮細胞と結合した前記抗体を検出して、前記生物体におけるリンパ管内皮細胞を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項５６】
前記哺乳類に、リンパ管内皮細胞マーカーと特異的に結合する第２の化合物を投与することをさらに含んでなり、ここで、前記検出工程が、リンパ管内皮細胞と結合した前記抗体および第２の化合物の検出を含んでなるものである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
リンパ管内皮細胞を改変する方法であって、
ａ）微小血管内皮細胞を用意し、
ｂ）該微小血管内皮細胞と、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体とを、該抗体とリンパ管内皮細胞との結合を可能にする条件下にて接触させ、
ｃ）前記抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を単離し、さらに
ｄ）該リンパ管内皮細胞を、発現構築物にてトランスフェクトし、該発現構築物はプロモーターに作動可能に連結された治療用タンパク質をコードする核酸を含んでなり、前記細胞内にて前記タンパク質を発現させるのに有効な量であり、ここで、前記トランスフェクションが、リンパ管内皮細胞を改変すること
を含んでなる、方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法によって作製されたものである、リンパ管内皮細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、一般に、内皮細胞の単離に関する材料および方法、ならびに本発明により単離される細胞に関する。さらに詳しくは、本発明は、単離されたリンパ管内皮細胞集団の獲得に関する。
【発明の背景】
【０００２】
リンパ系は、循環系に匹敵する組織化された複雑な構造である。血液を全身に送り込むのに心臓を用いる循環系とは対照的に、リンパ系はリンパ管本来の収縮性を利用してリンパ液を送り込む。リンパ管は血管と同じ様に相互に連結していないが、毛細リンパ管に流れ込む最初のリンパ洞[Jeltsch et al., Science, 276: 1423-1425 (1997); およびCastenholz, A., in Olszewski, W. L. (ed.), Lymph Stasis: Pathophysiology, Diagnosis, and Treatment. CRC Press: Boca Raton, Florida (1991), pp. 15-42]、さらにリンパ本幹に流れ込む集合リンパ管に続いて、最後に静脈循環に流れ込む胸管を含む一連の組織的構造を形成している。リンパ液が流れるチャンネルの構成は、最初のリンパ管の単一内皮層、内皮、筋層および外膜層を含む集合リンパ管の多層、ならびにリンパ節の複雑な組織をはじめとして様々である[Olszewski, W. L., in Olszewski, W. L. (ed), Lymph Stasis: Pathophysiology, Diagnosis, and Treatment. CRC Press: Boca Raton, Florida (1991), pp. 235-258; およびKinmonth, J. B., in Kinmonth, J. B. (ed), The Lymphatics: Diseases, Lymphography and Surgery. Edward Arnold Publishers: London, England (1972), pp. 82-86]。皮膚、肺、および胃腸管などの体の様々な器官のリンパ成分は様々な独特の特徴を有する[Ohkuma, M., in Olszewski (1991), 前記, at pp. 157-190; Uhley, H. and Leeds, S., in Olszewski (1991), 前記, at pp. 191-210; およびBarrowman, J. A., in Olszewski (1991), at pp. 221-234).を参照]。
【０００３】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は内皮細胞増殖、血管新生(angiogenesis)、脈管形成(vasculogenesis)および血管透過性の最も重要なレギュレーターである(Ferrara, J Mol Med 77: 527-543, 1999)。ＶＥＧＦの他、増殖因子のＶＥＧＦファミリーには現在、その他の５種の周知のメンバー、すなわち、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびオルフウイルスＶＥＧＦホモログが存在する(Eriksson and Ali talo, Curr Top Microbiol Immunol., 237: 41-57; 1999)。さらに新規なＶＥＧＦ様ヘパリン結合タンパク質が最近ヘビ毒から単離されている(Gasmi et al., Biochem Biophys Res Commun. 268(1): 69-72, 2000; Gasmi et al., Biochim Biophys Acta 1481(1): 209-12, 2000; Komori et al., 1999)。ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦファミリーの３種の受容体、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ１、ＶＥＧＦＲ−２／Ｆｌｔ１／ＫＤＲもしくはＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ４のいずれかをコードする遺伝子の破壊によって血管発生の不全による胚の致死が起こる(Dumont et al., Science, 282: 946-949, 1998; Fong et al., Nature, 376: 66-70, 1995; Shalaby et al., Nature, 376: 62-66, 1995)。これらの受容体およびそれらのリガンドについての詳細な説明は、米国特許第５，７７６，７５５号；同第５，６０７，９１８号；同第５，８４０，６９３号；同第５，９２８，９３９号；同第６，１３０，０７１号；同第６，２２１，８３９号；同第６，２３５，７１３号；同第６，２４５，５３０号；１９９９年１０月２６日出願の米国特許出願第０９／４２７，６５７号；２０００年３月２４日出願の同第０９／５３４，３７６号；２００１年１月１７日出願の同第６０／２６２，４７６号；ならびに１９９８年２月２日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号で示されている。これら各々の文献は、特に全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。血管内皮増殖因子およびそれらの受容体に関するさらなる開示は、例えば、米国特許第６，２４５，５１２号；同第６，１６８，７７８号；同第６，１００，０７１号；同第６，０５１，６９８号；同第６，０４０，１５７号；同第６，０２０，４７３号；および同第６，０１１，００３号において得られるものであり、これらは各々、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００４】
ＶＥＧＦＲ−２は血管新生および内皮細胞の有糸分裂についての主要なシグナル伝達ＶＥＧＦ受容体であると考えられる。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ−２の活性化、さらにその後の、ＭＡＰ（有糸分裂促進物質活性化タンパク質）キナーゼ／ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼ経路をはじめとするシグナル変換経路によって内皮細胞増殖、移動および生存を誘導する(総説については、Petrova et al., Exp. Cell. Res. 253: 117-130, 1999; Shibuya et al., In Claesson-Welsh, L (ed.) Vascular growth factors and angiogenesis. Springer Verlag, GmbH&Co., KG, Heidelberg, 237: 59-83, 1999を参照)。ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／ＥＲＫ２）カスケードの活性化は多数の細胞の増殖応答に関連している。さらに、この経路は生存促進遺伝子の転写の刺激、さらに細胞死機構の要素の翻訳後修飾および不活性化により細胞生存の高まりをもたらしうる(Bonni et al., Science, 286: 1358-1362, 1999; Gupta et al., Exp. Cell. Res., 247: 495-504, 1999)。また、当初、ＰＩ３−キナーゼ経路は有糸分裂にも関連しているとされていたが、後にいくつかの研究によってこの経路がセリン／トレオニンキナーゼ  Ａｋｔ（タンパク質キナーゼＢ）の活性化による細胞生存の調節において重要な機能を有することが示された(Datta et al., Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999)。さらに、最近の研究ではＭＡＰＫおよびＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路間のいくつかのクロストーク(crosstalk):ＡｋｔによるＲａｆのリン酸化反応によってＲａｆ−ＭＥＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）−ＥＲＫ経路の阻害がもたらされることも示された(Rommel et al., Science 286: 1738-1741, 1999; Zimmermann and Moelling, Science 286: 1741-1744, 1999)。
【０００５】
分子生物学ではリンパ系の増殖および／または胚発生を媒介する役割を有すると仮定される少なくともいくつかの遺伝子およびタンパク質を同定してきた。１つのこのような遺伝子／タンパク質がＦｌｔ４（ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ４；血管内皮細胞増殖因子受容体３またはＶＥＧＦＲ−３ともいう）と称するヒト赤白血病細胞および胎盤ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた受容体チロシンキナーゼである[米国特許第５，７７６，７５５号および同第６，１０７，０４６号; Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746-748 (1992); Galland et al., Genomics, 13: 475-478 (1992); Galland et al., Oncogene, 8: 1233-1240 (1993);およびPajusola et al., Cancer Res., 52: 5738-5743 (1992)を参照。ここで全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。]。研究ではマウス胚におけるＶＥＧＦＲ−３遺伝子の標的破壊によって一次血管網再構築が不全となり、さらに９．５日後の胚が死に至ることが示された[Dumont et al., Science, 282: 946-949 (1998)]。さらなる研究によってＶＥＧＦＲ−３における特定の変異には明らかに遺伝性リンパ水腫の原因となる役割があることがわかってきた（ＰＣＴ公報第ＷＯ００／５８５１１号）。しかしながら、ＶＥＧＦＲ−３はリンパ管だけに限定されていない。ＶＥＧＦＲ−３はリンパ管の発生前に胚血管構造の形成において重要な役割を有する。しかしながら、さらなる研究によって、さらに進んだ発達段階ではＶＥＧＦＲ−３の発現が主としてリンパ管に限定されるようになることがわかった[Kaipainen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3566-3570 (1995)]。しかし、ＶＥＧＦＲ−３発現は少なくともいくつかの腫瘍の新生血管(neovascular blood vessel)にも認められる（ＰＣＴ公報第ＷＯ００／２１５６０号)。
【０００６】
ＶＥＧＦＲ−３遺伝子の発現は、血管が発生するマウス８．５日胚時に始まるが、ＶＥＧＦＲ−３欠損胚は、一次血管網再構築の欠如により妊娠中期に死に至る(Dumont et al., Science, 282: 946-949, 1998)。しかしながら、成体組織ではＶＥＧＦＲ−３発現は、主としてリンパ管内皮で起こり(Kaipainen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3566-3570, 1995; Partanen et al., FASEB J., 14: 2087-2096, 2000)、ＶＥＧＦＲ−３リガンド、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄはリンパ管の増殖を誘導しうる(Jeltsch et al., Science, 276: 1423-1425, 1997; Veikkola et al., EMBO J. 20: 1223-1231, 2001)。その一方、可溶性ＶＥＧＦＲ−３タンパク質の使用によるＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達の遮断によって内皮細胞アポトーシスの誘導よるリンパ管の発生の退行がもたらされる(Makinen et al., Nature Med., 7: 199-205, 2001)。しかしながら、ＶＥＧＦＲ−３を介して活性化される生化学的シグナル伝達経路はＶＥＧＦＲ−２のものほど特徴付けられておらず、リンパ管内皮細胞機能のこれらの重要なレギュレーターの作用機構を解明するまでにはなかなか至らない。このような情報がないために、これらの相互作用の機能障害に関する治療的・診断的関連は依然として解明されていない。
【０００７】
例えば、米国特許第６，１０７，０４６号（引用することにより本明細書の一部とされる）に見られるように、これまでに多くのＶＥＧＦＲ−３抗体が記載されてきた。さらに、最近、ポドプラニン(podoplanin)がリンパ管内皮の特異的マーカーとして同定され(Breiteneder-Geleff et al., Am. J. Path., 154(2) 385-394, 1999)、さらに、ＬＹＶＥ−１、すなわち、ＣＤ４４糖タンパク質のホモログがヒアルロンのリンパ特異的受容体であるとされている(Banerji et al., J. Biol. Chem., 144(4) 789-801, 1999)。しかしながら、これらのマーカーが利用できるにもかかわらず、現在のところ単離されたリンパ管内皮細胞を得る適切な方法がない。このような単離内皮細胞が得られ、分子研究に提供しうるならば、種々のリンパ管細胞障害の診断および治療と関連する研究の大きな助けとなるであろう。さらに、このような細胞が利用できることによりリンパ管内皮細胞の特性についての有用な情報が提供され、それにより治療的介入のための特定の領域のさらなる特定が容易になる。
【０００８】
遺伝性リンパ水腫、癌転移および手術後浮腫など、リンパ管内皮細胞およびそれについての受容体の異常に関与する多くの病態がある。リンパ管内皮細胞を単離し、増殖させ、さらに置換する能力があれば、このような疾患に対して有効な緩和介入、治療またはその他の改善法となるだろう。このような介入は例えば、創傷誘導性リンパ水腫に対して特に有効であろう。さらに、このような細胞が利用できるならば、細胞特異的な治療法に特に用い易く、それによって、例えば、非細胞特異的な遺伝子療法または化学療法プロトコールに見られるような望ましくない副作用がかなり軽減されると思われる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、医薬および分子生物学において、多くの実用性がある内皮細胞ならびにリンパおよび血管系を操作する能力の向上を提供する。より詳しくは、本発明はリンパ管内皮細胞を含む生物学的サンプルからリンパ管内皮細胞を単離する方法であって、前記生物学的サンプルと、その他の内皮細胞と比較してリンパ管内皮細胞を優先的に認識するものである抗体とを、その抗体がリンパ管内皮細胞と結合する条件下にて接触させ、さらにその抗体と結合しているリンパ管内皮細胞を単離することを含んでなる方法を提供する。本明細書において使用する「抗体」とは、標的抗原（例えば、リンパ管内皮細胞）と特異的に結合する全ての抗体薬または 抗原を特異的に認識する抗原結合フラグメントを含んでなる全てのポリペプチドをいう。より詳しくは、上記抗体はリンパ管内皮細胞に特異的なＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインのエピトープと免疫反応性のあるものである。本発明において、「優先的な」または「特異的な」とは、抗体が標的抗原（例えば、リンパ管内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ−３) と、その他の細胞の類似抗原（例えば、血管内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ−３）と結合するよりも高い親和性またはアビディティにて結合することを意味する。この結合の違いによって、ある細胞種を別のものから単離することが可能になる。
【００１０】
生物学的サンプルはどんな哺乳類生物体由来のものであってもよく、さらにリンパ管内皮細胞を含むと考えられるあらゆる組織または体液サンプルであってもよいことは分かるであろう。特に好ましくは、生物学的サンプルはヒト患者由来のものである。好ましい態様によれば抗体を固相支持体上に固定化し、この支持体に前記生物学的サンプルを接触させ、リンパ管内皮細胞が前記抗体と結合し、それによって支持体と結合することが可能となる。他の好ましい態様によれば、抗体を蛍光ラベルで標識し、さらにリンパ管内皮細胞を蛍光活性化セルソーティング(cell sorting)によって単離する。別の好ましい態様によれば、抗体を磁気ラベルで標識し、さらにリンパ管内皮細胞を磁気活性化セルソーティングによって単離する。生物学的サンプル中のリンパ管内皮細胞は、免疫組織化学によって単離しうると考えられる。他の態様によれば、リンパ管内皮細胞を単離するための免疫クロマトグラフィーの使用が意図される。
【００１１】
抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、またはモノクローナル抗体であってもよいことは分かるであろう。好ましい態様によれば、抗体は２Ｅ１１Ｄ１１の抗原結合フラグメントを含んでなる結合剤である。他の態様によれば、抗体が２Ｅ１１Ｄ１１の誘導体である。さらなる態様によれば、抗体は、リンパ管内皮細胞に特異的なＶＥＧＦＲ−３エピトープに対して高い結合特異性を有するように変異または改変させた２Ｅ１１Ｄ１１の抗原結合フラグメントから誘導された抗原結合フラグメントを含んでなる結合剤である。他の態様によれば、抗体は、２Ｅ１１Ｄ１１によって認識されるＶＥＧＦＲ−３タンパク質の同じエピトープを認識する。特に好ましい態様によれば、抗体は２Ｅ１１Ｄ１１である(European Collection of Cell Cultures, Center for Applied Microbiology and Research, Porton Down Salisbury, U.K.において受託番号01083129として寄託)。この抗体の作製については米国特許第６，１０７，０４６号（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。他の好ましい態様によれば、抗体は抗ポドプラニンである。特定の態様によれば、抗体はリンパ管内皮細胞に対して結合特異性を有する抗ポドプラニン抗体変異体または誘導体である。
【００１２】
本発明の特定の態様によれば、微小血管内皮細胞を含む生物学的サンプルから血管内皮細胞を単離する方法であって、生物学的サンプルと、その他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞を優先的に認識する抗体とを接触させ、ここで、前記抗体はＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫性を有する抗体であり、さらに前記抗体と結合していない微小血管細胞から、前記抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を取り除くこと（ここで、前記抗体と結合していない微小血管細胞は、リンパ管内皮細胞を実質的に含まない血管内皮細胞集団を含む）を含んでなる方法が提供される。
【００１３】
本発明の他の態様によれば、リンパ管内皮細胞集団であって、リンパ管内皮細胞を含む生物学的サンプルと、ここで前記抗体は、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体とを接触させ、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体であり、さらに前記抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を単離することを含んでなる方法によって単離されるものである、リンパ管内皮細胞集団が提供される。好ましい態様によれば、生物学的サンプルは内皮細胞の異種集団を含んでなる。他の好ましい態様によれば、細胞のサンプルは微小血管内皮細胞集団である。特に好ましい態様によれば、リンパ管内皮細胞集団には血管内皮細胞が実質的に混入していない。好ましい態様によれば、細胞を単離する方法は、リンパ管内皮細胞を培養増殖させることを含んでなる。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、血管内皮細胞集団であって、微小血管内皮細胞集団と、血管内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体とを接触させ、ここで、前記抗体は、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体であり、さらに前記抗体と結合していない微小血管細胞から前記抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を取り除くこと（ここで、前記抗体と結合していない微小血管細胞はリンパ管内皮細胞を実質的に含まない血管内皮細胞集団を含む）を含んでなる方法によって単離されるものである、血管内皮細胞集団が提供される。特定の態様によれば、血管細胞集団は、血管内皮細胞集団を増殖させることをさらに含んでなる方法によって作製される。
【００１５】
本発明の好ましい態様によれば、特にその他の内皮細胞が実質的に混入していないリンパ管内皮細胞集団が意図される。本発明のもう１つの好ましい態様では、その他の内皮細胞が実質的に混入していない血管内皮細胞集団を記載している。
【００１６】
本発明の他の好ましい態様はリンパ管内皮細胞の部分集団が実質的に富化された組成物を得る方法であって、微小血管内皮細胞を含む細胞源を準備し、その細胞と、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合するモノクローナル抗体とを、その抗体とリンパ管内皮細胞との結合を可能にする条件下にて接触させ、モノクローナル抗体が特異的に結合するそれらの細胞を分離することによって、リンパ管内皮細胞の部分集団が実質的に富化された組成物を得ることを含んでなる、方法に関する。好ましい態様によれば、抗体は、リンパ管内皮細胞にて発現される抗原の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体である。さらに好ましい態様によれば、抗原はＶＥＧＦＲ−３である。また、本発明は、好ましい態様において、このような方法によって得られる実質的に富化されたリンパ管内皮細胞の部分集団を含んでなる組成物を含む。好ましい態様によれば、抗体は抗ポドプラニンである。他の好ましい態様によれば、抗体はリンパ管内皮細胞にて発現されるＶＥＧＦＲ−３を優先的に認識する２Ｅ１１Ｄ１１である。
【００１７】
他の態様によれば、リンパ管内皮細胞障害を改善（ameliorate)する方法であって、治療剤によってリンパ管内皮細胞を標的化することを含んでない、ここで、この治療剤は、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体を用いてリンパ管内皮細胞を標的とするものであり、前記抗体はＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体である、方法が提供される。特定の態様によれば、前記障害はリンパ腫、遺伝性リンパ水腫、リンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症、および頸部水嚢胞からなる群から選択される。
【００１８】
本発明によれば、さらに、リンパ系疾患を改善する方法であって、ex vivo治療を含んでなり、このex vivo治療は、その治療を必要とする患者から微小血管内皮細胞を含む生物学的サンプルを得て、この微小血管内皮細胞と、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体であって、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体と接触させ、その抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を単離し、そのリンパ管内皮細胞を、発現構築物であって、プロモーターに作動可能に連結してタンパク質をコードする核酸を含んでなる発現構築物を前記細胞内でそのタンパク質を発現させるのに有効な量で用いてトランスフェクトし、さらにそのトランスフェクト細胞を前記患者に再導入することを含んでなる、方法を提供する。このコードされるタンパク質は（例えば、疾病を治療する、疾病の症状を緩和する、または診断またはイメージング(imaging)を向上させるために）リンパ管内皮細胞内で発現させようとするタンパク質であってよい。
【００１９】
本発明はまた、リンパ管内皮細胞培養系の増殖を改善する方法であって、本発明の方法によってリンパ管内皮細胞を得て、さらにその細胞をＶＥＧＦＲ−３リガンドにより刺激することを含んでなり、ここで、ＶＥＧＦＲ−３リガンドによる前記細胞の増殖刺激が、その刺激の不在下における増殖に比べて前記培養細胞の生存を促進するものである、方法を提供する。特に好ましい態様によれば、ＶＥＧＦＲ−３リガンドは、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６ＳまたはＶＥＧＦ−Ｄである。この方法は、細胞をＶＥＧＦＲ−２リガンドにより刺激することをさらに含んでいてもよい。特定の態様によれば、細胞の刺激はその細胞をアポトーシスから防護するものとされる。好ましい態様によれば、細胞のアポトーシスからの防護は、Ａｋｔまたはｐ４２／ＭＡＰＫシグナル伝達分子の活性化により媒介される。好ましい態様によれば、細胞の刺激は、前記細胞の分化内皮細胞の特性の維持を可能にする。
【００２０】
また、哺乳類生物体のリンパ管内皮細胞を選択的に調節する方法であって、本発明に記載のように哺乳類生物体からリンパ管内皮細胞を単離し、単離されたリンパ管内皮細胞をリンパ管内皮細胞と、調節するための薬剤とを接触させ、さらにそのリンパ管内皮細胞を前記生物体に再導入することを含んでなる、方法も本発明に含まれる。好ましい態様によれば、接触工程が、外因性ポリヌクレオチドを前記細胞へ導入することを含んでなる。他の好ましい態様によれば、生物体がリンパ管内皮細胞内にて発現される遺伝子内の遺伝子突然変異を特徴とする疾患を有し、かつ前記は、接触外因性ポリヌクレオチドを前記細胞へ導入して前記遺伝子内における遺伝子突然変異の影響を克服することを含んでなる。特定の態様によれば、前記疾患は遺伝性リンパ水腫である。例えば、前記疾患はＶＥＧＦＲ−３変異を特徴とする遺伝性リンパ水腫であり、かつ治療は野生型ＶＥＧＦＲ−３対立遺伝子を導入することを含んでなる。
【００２１】
本発明の他の態様によれば、脊椎動物生物体由来の組織のリンパ管内皮細胞をイメージング(imaging)する方法であって、リンパ管内皮細胞含有の疑いのある脊椎動物組織と、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体を含んでなる組成物とを、その抗体とリンパ管内皮細胞との結合を可能にする条件下にて接触させ、その組織におけるリンパ管内皮細胞と結合した前記抗体を検出し、さらに前記抗体が結合しているリンパ管内皮細胞を同定することによってその組織のリンパ管内皮細胞をイメージングすることを含んでなり、ここで、リンパ管内皮細胞と前記抗体との結合が、その組織内におけるリンパ管内皮細胞の存在および位置を示すものである、方法が記載される。より詳しくは、前記組織は、ヒト組織を含んでなるものである。特定の態様によれば、この方法は、接触工程の後、イメージング工程の前に前記組織から前記組織のリンパ管内皮細胞と結合していない抗体を取り除く条件下にて前記組織を洗浄する工程をさらに含んでなる。抗体はＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体であってよい。その他の態様によれば、抗体は抗ポドプラニン抗体である。好ましい態様によれば、抗体は、それと共有結合した検出可能なラベルをさらに含んでなる。
【００２２】
この方法は、前記組織と、血管内皮には実質的に存在しないリンパ管内皮マーカーと特異的に結合する第２の化合物とを接触させ、さらに前記組織の細胞と結合したその第２の化合物を検出することを含んでなり、ここで、イメージング工程が抗体および第２の化合物の両方で標識されたリンパ管を同定することを含んでなり、抗体および第２の化合物の両方にて標識されたリンパ管がその組織におけるリンパ管内皮細胞の存在および位置と相関するものであってもよい。好ましい態様によれば、抗体がＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のある抗体であり、かつ第２の化合物が抗ポドプラニン抗体である。
【００２３】
さらに、リンパ管内皮細胞における変化を特徴とする疾病についてスクリーニングする方法であって、リンパ管内皮細胞における変化を特徴とする病態の疑いのある脊椎動物生物体から組織サンプルを得て、その組織サンプルを、その他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体を含んでなる組成物に、その抗体と前記生物体のリンパ管内皮細胞との結合を可能にする条件下にて曝し、その組織サンプルを洗浄し、さらにその組織サンプル中の前記結合抗体の存在、量、または分布を検出することにより前記疾病についてスクリーニングすることを含んでなる方法も本発明に含まれる。
【００２４】
他の態様によれば、哺乳類のリンパ管内皮細胞を特異的に検出する方法であって、哺乳類に、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞と優先的に結合する抗体を含んでなる組成物を、その抗体とリンパ管内皮細胞との結合を可能にする条件下にて投与し、さらにリンパ管内皮細胞と結合したその抗体を検出することによって前記生物体におけるリンパ管内皮細胞を検出することを含んでなる、方法が挙げられる。この方法は、哺乳類にリンパ管内皮細胞マーカーと特異的に結合する第２の化合物を投与することをさらに含んでなり、ここで、検出工程はリンパ管内皮細胞と結合した前記抗体および第２の化合物を検出することを含んでいてもよい。本発明の全てのイメージング方法において、イメージング方法がリンパ管の疾患において疾患の存在を決定するだけでなく、疾患の治療の効果をモニタリングするのにも用いられると考えられる。このような方法は特にリンパ水腫、例えば、遺伝性リンパ水腫または創傷誘導性水腫およびその他のリンパ管疾患の評価において有用であろう。
【００２５】
本願全体から当業者ならば本発明のさらなる特徴および変形が明らかであろう。このような全ての特徴が本発明の態様とされる。同様に、本明細書に記載の特徴を組み合わせてさらなる態様とすることができ、その組合せが本発明の態様または具体例として上文で明示されているかどうかによらず、本発明の態様とされる。さらに、本明細書において、本発明にとって重要であると記載した限定だけを、それとして見るべきであり、本明細書において重要であるとは記載していない、限定されない本発明の変形は本発明の態様とされる。
【００２６】
本発明の態様は分類ごとに要約されているが、その分類に属する個々のものが本発明の個々の態様とされることが分かるであろう。
【発明の具体的説明】
【００２７】
本発明において、本発明者らはＶＥＧＦ−ＣおよびそのＶＥＧＦＲ−３特異的変異体（ＶＥＧＦＣ１５６Ｓ）を用いてＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達の研究を行い、このシグナル伝達をさらに詳細に特徴付けた。ヒト皮膚内皮細胞の初代培養物が、異なる系統の血管およびリンパ管内皮細胞からなること、さらに後者がＶＥＧＦＲ−３に対する抗体を用いて単離できることが初めて示される。
【００２８】
特に、ＶＥＧＦＲ−３がリンパ管内皮細胞で特異的に発現され、その刺激がこれらの細胞を血清飢餓誘発性アポトーシスから防護し、さらに細胞移動を増進することが示されている。さらに、本明細書で示したデータでは、ＶＥＧＦＲ−３ＰＫＣは、依存的ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ活性化およびＡｋｔのワートマニン(wortmannin)感受性リン酸化反応を誘導しうることが示される。これらの２つの重要なシグナル伝達カスケードは細胞生存に関連するとされている(Bonni et al., Science, 286: 1358-1362, 1999; Datta et al., Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999)。
【００２９】
当業者ならば本明細書で提供される詳細に鑑みて、リンパ管内皮細胞の単離にＶＥＧＦＲ−３などの分子マーカーを使用することができるであろう。さらに、本発明では、特異的増殖因子の存在下でのこれらの細胞の培養は、これらの細胞の分化特性の喪失なく行うことができることを教示している。さらに、特異的ＶＥＧＦＲ−３リガンドは細胞移動を誘導し、さらに細胞生存に関連した２つの重要なシグナル伝達分子、Ａｋｔおよびｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫの活性化を介して血清飢餓状態のリンパ管内皮細胞をアポトーシスから防護しうることを示している。リンパ管内皮細胞を培養する能力によって、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達経路、ならびにリンパ管内皮細胞と対比した血管内皮細胞の分子の特徴および遺伝子発現プロフィールのさらなる特徴付けが可能となる。
【００３０】
Ａ．  内皮細胞培養物の作製および使用方法
本発明者らは微小血管内皮細胞が内皮細胞、すなわち、リンパ管内皮細胞および血管内皮細胞の２つの異なる集団からなることを見出した。本発明は、初めて、微小血管内皮細胞の混合集団からリンパ管内皮細胞を単離する方法を提供するものである。これに関連して、リンパ管内皮細胞を除去した単離血管内皮細胞を提供することができるということができる。本節では本発明の概要を示すが、本明細書を通じ他の場所においても本発明の種々の態様のさらなる詳細を示している。
【００３１】
本発明の教示により、両方の種類の内皮細胞を培養することが可能となる。このような培養物は、内皮細胞の細胞シグナル伝達および機能を理解する上での手掛かりとするのに有用なだけでなく、血管新生、リンパ管新生、遺伝性リンパ水腫などをはじめとする新生脈管形成(neovascularization)を伴う疾病の治療的介入も提供する。
【００３２】
当業者が利用可能な微小血管内皮細胞についての商業的に入手可能な供給元は数多くある。このような商業的に入手可能な供給元としては、例えば、Promocell(Heidelberg, Germany; ＨＤＭＥＣの供給業者、増殖させたまたは低温保存した微小血管内皮細胞)；Cell Applications Inc.,(San Diego, Ca, USA, ＣＡＤＭＥＣ（商標）の供給業者、正常ヒト新生児包皮（または成人皮膚）毛細血管から単離した微小血管内皮細胞)が挙げられる。また、さらなる商業的に入手可能な供給元については当業者ならば周知であろう。これらの供給元は、細胞の他、通常、細胞を増殖状態に維持するのに用いるべき、典型的な増殖培養条件を提供する。このように、市販にて供給される細胞系および培養物が本発明の方法の特に有用な出発材料である。微小血管内皮細胞を含んでなる全ての細胞培養物が本発明において用いることができると考えられる。このような細胞培養物は、好ましくは微小血管内皮細胞のみ含むものであるが、培養細胞の一部がリンパ管内皮細胞である限り、リンパ管および血管内皮細胞以外の細胞を含む細胞培養物もまた十分に本発明の出発宿主細胞培養物であることが分かるであろう。
【００３３】
商業的に入手可能な提供元の他、ヒトをはじめとする様々な種から微小血管内皮細胞を単離してもよい。また、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ウマ、および霊長類をはじめとするその他の種由来の細胞であってもよい。よって、本発明では特に、一次細胞培養物、とりわけ、一次ヒト微小血管細胞培養物の使用が意図される。出発一次細胞培養物は内皮細胞のみ含むものであるが、一次細胞培養物が被験体から最初に単離される場合、このような細胞培養物は、繊維芽細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、および内皮細胞が単離されている組織に特異的な他の細胞など、さらなる細胞も含む。このような混入細胞は、例えば、密度勾配遠心分離法、細胞の特異的マーカーを用いる免疫吸着クロマトグラフィー、蛍光活性化細胞スクリーニング、磁気活性化細胞スクリーニングおよびその他のセルソーティング技術を用いて容易に除去することができる。
【００３４】
一般に、微小血管内皮細胞の重大な器官特異性が存在する場合においては、一次微小血管内皮細胞培養物は、研究または調節することが望まれる疾病に関与する組織から誘導されるべきである。一般に、これらの細胞を単離する方法については当業者ならば周知であり、所定の組織のトリプシンおよびコラゲナーゼによる消化、例えば、ヒト血漿への暴露により誘導される微小血管内皮細胞の凝集、密度遠心分離、例えば、パーコール密度遠心分離、および光学顕微鏡使用下、トリプシン／ＥＤＴＡによる局部消化後の細胞の最終的な選抜および培養を伴うものであろう。
【００３５】
本発明の細胞は内皮細胞の増殖に好適な培地、例えば、ハムＦ１２培地−１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で増殖させる。ひとたび、このような培養物が生じると、当業者ならば、例えば、接触阻止（すなわち、単層に増殖する）、およびフォン・ヴィレブランド(von willebrand)因子（ｖＷＦ）、血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ３１）、およびアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の転写物をはじめとする従来の内皮マーカーの発現の存在、毛細血管様構造の形成などの微小血管内皮細胞に関係のある特徴を観察することによって微小血管内皮細胞の存在を確認することができる。微小血管内皮細胞の典型的な機能アッセイについての詳細は本明細書の他の場所に示している。
【００３６】
上記のように、当業者ならば、一般に微小血管内皮細胞を増殖させる条件が分かっている。本発明では、細胞の培地に種々の増殖因子および刺激因子を添加することができる。好ましい態様では、以下に限定されるものではないが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＯＲＦＶ２−ＶＥＧＦをはじめとするＶＥＧＦＲ−３の刺激因子および／またはＶＥＧＦＲ−２の刺激因子の存在下にて細胞を増殖させてもよい。これらおよび他の関連薬剤については、当業者ならば十分に周知であり、本明細書の他の場所にさらに詳細に記載している。
【００３７】
本発明の好ましい使用においては、単離された内皮細胞を長期間培養増殖させることが有利でありうる。一般に、このような細胞の培地での増殖は、細胞のアポトーシスによって妨げられることが多い。本発明では、ＶＥＧＦＲ−３および／またはＶＥＧＦＲ−２の刺激因子での細胞の刺激によって細胞のアポトーシスが阻害され、遅延され、あるいは回避されうることを示している。特に好ましい態様によれば、微小血管内皮細胞の混合集団におけるリンパ管内皮細胞または他の内皮細胞が実質的に混入していない実際に単離されたリンパ管内皮細胞の培養物の生存は、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓを培地に添加することにより促進または高められる。
【００３８】
内皮細胞培養物を増殖させたことから、本発明の方法は、他の内皮細胞に比べてリンパ管内皮細胞を優先的に認識する抗体を用いることによって、混合細胞集団の微小血管内皮細胞からリンパ管内皮細胞を単離する方法を提供する。さらに詳しくは、抗体はＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと免疫反応性のあるものである。本発明の特に好ましい態様によれば、抗ＶＥＧＦＲ−３抗体２Ｅ１１Ｄ１１はリンパ管内皮細胞に特異的であることが示されている。リンパ管内皮細胞に特異的な他の典型的な抗体は、抗ポドプラニン抗体である。本明細書における多くの例ではこれらの抗体を使用しているが、本発明の教示を考えれば、本発明における単離の目的に役立つ他の抗体を同定しうることが分かるであろう。例えば、以下に記載するように、このような他の抗体はモノクローナル抗体を作製するための従来の方法にて作製され、これらの典型的な抗体によって認識される同じエピトープを使用するものである。あるいは、そのような他の抗体を作製し、当業者に周知のファージディスプレイ技術により単離してもよい。さらに他の代替法は、２Ｅ１１Ｄ１１または抗ポドプラニン抗体に関連する抗体の作製であり、リンパ管内皮細胞に特異的な第二世代抗体を作製する抗体の特定部位での部位特異的突然変異誘発であろう。このような抗体を作製する方法については、以下においてさらに詳細に記載する。
【００３９】
「リンパ管内皮細胞に特異的な」とは、この抗体が内皮細胞の混合集団中のリンパ管内皮細胞を優先的に認識するが、血管内皮細胞系統の内皮細胞は認識しないか、または認識してもその程度は低いことを意味する。この結合の違いによって、ある細胞種を混合集団から単離することが可能になる。
【００４０】
本発明が微小血管内皮細胞が一般に血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞の混合集団からなることを示し、さらに本発明が初めて、リンパ管内皮細胞に他の内皮細胞、例えば、血管内皮細胞が実質的に混入しないように、微小血管内皮細胞培養物からリンパ管内皮細胞を単離する方法の詳細を提供していることを示していることから、本発明が他の内皮細胞、例えば、リンパ管内皮細胞が実質的に混入していない血管内皮細胞を単離する方法もまた包含することもわかるであろう。
【００４１】
ある細胞が「実質的に混入していない」細胞集団とは、本発明では、細胞培養物において、混入細胞が全く存在しないことが求められるという意味ではない。むしろ、培養細胞の大半が所定の細胞種のものであるという意味である。例えば、その他の内皮細胞が実質的に混入していないリンパ管内皮細胞培養物では、少なくとも５１％の細胞がリンパ管内皮細胞であると考えられる。さらに好ましくは、少なくとも６０％の細胞がリンパ管内皮細胞である。なおさらに好ましくは、少なくとも７０％のリンパ管内皮細胞 、いっそう好ましくは７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％のリンパ管内皮細胞を含んでなる細胞培養物であろう。本発明の特に好ましい方法は、培養物が９０％を超えるリンパ管内皮細胞を含んでなるようにリンパ管内皮細胞を単離するものである。言うまでもなく、培養物をより精製すれば培養物中のリンパ管内皮細胞の割合は高まり、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらに当然のことではあるが、１００％のリンパ管内皮細胞を含んでなる細胞培養物が最も好ましいであろう。当然のことではあるが、これらの数値はリンパ管内皮細胞に限定されるものではなく、血管内皮細胞のかなり精製された集団にも適用されることが分かるであろう。当業者は、細胞種を決定するために、所定の細胞に特異的なマーカーの存在を調べてもよい。例えば、リンパ管内皮細胞はＶＥＧＦＲ−３の存在、ポドプラニンの存在、およびＬＹＶＥ−１などの他のリンパ管細胞マーカーによって同定してもよい。上記のマーカーと組み合わせて有用であるその他のＶＥＧＦＲ−３特異的抗体としては、９Ｄ９Ｆ９および７Ｂ３Ｆ９、および米国特許第６，１０７，０４６号に記載の抗体が挙げられる。当然のことではあるが、マーカーの組合せが特に有用であることは分かるであろう。細胞機能を調べる他のアッセイについては本明細書に記載しているが、当業者ならば周知である。
【００４２】
別の態様によれば、本発明の方法によって作製した細胞培養物は、混入細胞が最少量であるという点から、極めて精製されたものであるリンパ管内皮細胞培養物または極めて精製されたものである内皮細胞培養物と定義される。混入細胞とは、培養物の大部分を構成する細胞種ではない全ての細胞を意味する。例えば、リンパ管内皮細胞培養物における混入細胞は、リンパ管内皮細胞でない全ての細胞である。同様に、血管内皮細胞培養物における混入細胞は、血管内皮細胞でない全ての細胞である。リンパ管内皮細胞培養物の混入細胞の例としては、血管内皮細胞であり、その逆もまた同様である。当然のことではあるが、例えば、繊維芽細胞などのその他の細胞種も混入細胞のカテゴリーに入る。例えば、特異的マーカーを調査することにより混入細胞を同定することは比較的容易である。よって、好ましい態様によれば、本発明による方法によって、４９％未満の混入細胞を含有する細胞培養物が生じ、さらに好ましくは、これらの培養物が４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満の混入細胞、１３％未満の混入細胞、１２％未満の混入細胞、１１％未満の混入細胞または１０％未満の混入細胞を含有む。言うまでもなく、培養物をより精製すれば培養細胞中に存在する混入細胞の割合は減少し、特に好ましくは、細胞培養物は、９％未満の混入細胞、８％未満の混入細胞、７％未満の混入細胞、６％未満 の混入細胞、５％未満の混入細胞、４％未満の混入細胞、３％未満の混入細胞、２％未満の混入細胞、さらに当然のことではあるが、１％未満の混入細胞しか含んでいないことができる。
【００４３】
本発明の特定の態様によれば、本発明は、本発明の単離細胞集団を用いた治療および診断方法を提供することができる。例えば、リンパ管内皮細胞に関するまたは実際には血管内皮細胞に関する疾患を有する疑いのある個体から細胞を単離するのに本発明の方法を用いてもよい。診断用途では、患者個体の細胞を解析して、特定の細胞の、または生化学的なマーカーまたは病態を示すと思われる細胞の特徴の存在、不在もしくは変化を調べる。予後用途では細胞に関連する疾患の治療に対して行われる特別な治療法の実施前後に細胞を単離し、同様の解析を行って治療的介入が望ましい効果を及ぼすかどうかの判定ができる。さらなる態様によれば、本発明の単離細胞は、細胞の物理的、生化学的または分子特性における異常に関連する疾患の有効な治療を促進するのに用いてもよい。典型的な態様によれば、可能性ある治療法の効果を、in vitroにて患者の細胞を用いて試験し、その患者の細胞がこのような介入に反応するかどうかを判定することにより治療を促進する。あるいは、患者から単離した細胞をin vitroにおいて遺伝子発現構築物で変換し、増殖させ、さらに個体に再送達して患者の疾患を分子レベルで矯正するものであるex vivo遺伝子療法に、前記細胞を用いてもよい。なおもう１つの代替法では、本発明の単離、増殖した細胞を、治療効果を特定部位に送達するのに用いてもよい。例えば、細胞の患者への再送達の前に、細胞を細胞傷害性薬剤と結合させることによって、例えば、個体のリンパ管内皮細胞だけを特異的にターゲッティングする。本発明のこれらおよびその他の態様については本明細書の下記でさらに詳細に記載する。
【００４４】
Ｂ．  ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達経路の役割の解明
本発明が初めて、混入細胞を実質的に含まないリンパ管内皮細胞集団の単離を可能にするということから考えれば、リンパ管内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達の分かりにくい役割、リンパ管新生などの現象およびリンパ系疾患におけるこれらの細胞の役割が解明できる。
【００４５】
ＶＥＧＦＲ−２による刺激は細胞生存能力を促進するが、ＶＥＧＦの中断により内皮細胞アポトーシスが起こり、血管新生が阻害され、さらにin vivoにて血管退行がもたらされる(Aiello et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., 92: 10457-10461, 1995; Ferrara et al., Nature Med., 4: 336-340, 1998; Gerber et al., Development, 126: 1149-1159, 1999)。同様に、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達の阻害によってリンパ管発生の退行が起こる(Makinen et al., Nature Med., 7: 199-205, 2001)。これまでに公開された研究に一致して、ＶＥＧＦＲ−２による刺激は、血清飢餓状態の一次内皮細胞をアポトーシスから強く防護した。この効果は、ＶＥＧＦＲ−２単独（ＯＲＦＶ２−ＶＥＧＦによる刺激）にて、およびＶＥＧＦＲ−１による刺激（ＶＥＧＦによる）またはＶＥＧＦＲ−３による刺激（ＶＥＧＦ−Ｃによる）との組み合わせによっても生じた。しかしながら、ＶＥＧＦＲ−１（ＰＩＧＦによる刺激)では細胞生存シグナルがあっても伝達は非常に弱かった。さらに、血清飢餓誘発性アポトーシスの阻害には、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達単独で十分であった。興味深いことに、ＶＥＧＦ−Ｃは血管内皮細胞に対してＶＥＧＦよりも弱い生存因子であったが、ＶＥＧＦＲ−３を発現するリンパ管内皮細胞の生存を強く促進した。
【００４６】
ＶＥＧＦＲ−３は２つの重要な生存シグナル伝達分子、ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫおよびＡｋｔのリン酸化反応を誘導した。ＰＫＣ阻害剤によってＶＥＧＦＲ−３が媒介するｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫリン酸化反応が大幅に減少したことから、この経路がＶＥＧＦＲ−２に関してこれまでに示されたものと同様に、ＲａｓではなくＰＫＣによって主として伝達されていることが示唆される(Doanes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 255: 545-548, 1999; Takahashi et al., Oncogene, 18: 2221-2230, 1999; Yoshiji et al., Cancer Res., 59: 4413-4418, 1999)。一般に、ＰＫＣ依存的ＭＡＰＫ活性化は主として特定の７回膜貫通型Ｇタンパク質結合受容体により必要とされていると考えられるため、このような経路は受容体チロシンキナーゼの中では特異である。ＰＫＣは、内皮細胞増殖および移動をはじめとする血管新生に関連する多くの内皮細胞プロセスを調節する(Harrington et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 271: 499-508, 2000; Harrington et al ., J. Biol. Chem., 272: 7390-7397, 1997;Ilan et al., J. Cell Sci., 111: 3621-3631, 1998)が、ＰＫＣの阻害により腫瘍新生脈管形成を遮断することができた(Yoshiji et al., Cancer Res., 59: 4413-4418, 1999)。
【００４７】
ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｃにより刺激されたＨＭＶＥ細胞においてｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ活性化は類似の動態によって起こったが、後者はより持続した応答を誘導した。活性化期間およびｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫの細胞内分布の違いによって、異なる細胞応答が誘導されることが報告された(Kaiser et al., Exp. Cell Res., 249: 349-358, 1999; Marshall, Cell 80: 179-185, 1995; Pang et al., J. Biol. Chem., 270: 13585-13588, 1995)。この違いはＶＥＧＦ−ＣだけがＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３を介して同時にシグナル伝達ができるという事実にあると考えられる。しかしながら、ＶＥＧＦにより誘導されたＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２とのホモまたはヘテロダイマー複合体が有糸分裂を異なった形で調節することが示されていたにもかかわらず(Rahimi et al., J. Biol. Chem., 275: 16986-16992, 2000)、ＶＥＧＦ−Ｃにより刺激された細胞でのＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３によるヘテロダイマー形成は我々には検出できなかった。
【００４８】
ＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦＲ−３特異的変異型、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６ＳがＶＥＧＦＲ−３が媒介するシグナル伝達の研究に向けた有益なツールであることが分かった(Joukov et al., EMBO J., 15: 290-298, 1998; Veikkola et al., EMBO J., 20: 1223-1231, 2001; 米国特許第６，１３０，０７１号)。バイオセンサー解析では、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６ＳのＶＥＧＦＲ−３に対する親和性が、野生型ＶＥＧＦ−Ｃに比べて低下していた。さらに、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓによって誘導される最大ＶＥＧＦＲ−３リン酸化反応またはｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ活性化は、ＶＥＧＦ−Ｃほど強くはなかった。この理由は分からないが、シスチンノット増殖因子ドメインを形成する８つの保存されたシステイン残基の１つがセリン残基に変化したことから、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓは野生型ＶＥＧＦ−Ｃよりも不安定であると考えられる。しかしながら、トランスジェニックモデルでは、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓは、リンパ管新生の促進において、野生型ＶＥＧＦ−Ｃと同じくらい有効であった(Veikkola et al., EMBO J., 20: 1223-1231, 2001)。さらに、本明細書に記載のアッセイに用いる濃度は、ＶＥＧＦＲ−３飽和状態にしておくとよい。その結果、最高濃度のＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓでさえも、細胞のアポトーシスからの防護においては、ＶＥＧＦ−Ｃほど有効ではなかったため、ＶＥＧＦ−Ｃにより誘導されるリンパ管内皮細胞の最大生存には、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３の同時活性化が必要であると思われる。
【００４９】
Ｃ．  リンパ管内皮細胞特異的抗体
本発明では、培養したヒト一次微小血管内皮細胞を、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインに対する特定の抗体を用いることにより、血管およびリンパ管内皮細胞の識別可能な安定した系統に分けることができ、さらに両系統が培養増殖できることを示している。本節では、これらの分離技術に用いた抗体を説明し、本発明に使用しうるさらなる抗体の作製方法をさらに説明する。
【００５０】
本発明の特に好ましい抗体としては、例えば、２Ｅ１１Ｄ１１(Jussila et al., Cancer Res. 58: 1599-1604, 1998; 米国特許６，１０７，０４６号)、および抗ヒトポドプラニン(Breiteneder-Geleff et al., et al., Am. J. Path., 154(2) 385-394, 1999)が挙げられる。これらの抗体は当業者ならば周知である。ＶＥＧＦＲ−３に特異的な抗体（Ｆｌｔ４としても知られる）の作製については、特に引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第６，１０７，０４６号で詳述されている。
【００５１】
２Ｅ１１Ｄ１１および抗ポドプラニンがリンパ管内皮細胞を特異的に認識するという本発明の教示を考えれば、当業者ならば、これらの抗体が認識する特異的エピトープを認識するさらなる抗体を作製できる。従って、当業者ならば、２Ｅ１１Ｄ１１が認識するＶＥＧＦＲ−３の部分を用いて、リンパ管内皮細胞を認識するさらなる抗体を作製できる。このように、前記抗体は、好ましくは２Ｅ１１Ｄ１１が認識するＶＥＧＦＲ−３分子の部分、または前記抗体に他の細胞種に比べて優先的にリンパ管内皮細胞を特異的に認識させることを可能とするＶＥＧＦＲ−３の他の部分、と免疫反応性のあるものである。「他の細胞種に対して優先的に」とは、前記抗体が、血管内皮細胞などの他の内皮細胞をはじめとするその他の細胞と比べて、リンパ管内皮細胞とより強い反応性があることを意味する。
【００５２】
さらに、２Ｅ１１Ｄ１１抗体が、血管内皮細胞で発現されるＶＥＧＦＲ−３に比べて、リンパ管内皮細胞で発現されるＶＥＧＦＲ−３を優先的に認識するという発見によって、従来の免疫法およびスクリーニング技術を用いて、前記抗体を単離することが実現可能性であることが示されている(例えば、Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988を参照)。ＶＥＧＦＲ−３抗体の集団は、本明細書に記載の異なる細胞集団に対する結合特異性または交差反応性についてスクリーニングすることができる。
【００５３】
本発明に用いられる抗体としては、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーにより作製されたフラグメント、二価性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体ならびにＶＥＧＦＲ−３に特異的であるＣＤＲ配列の部分を含む抗体が挙げられる。中和抗体、すなわち、ＶＥＧＦＲ−３活性を阻害するものも、また有用でありうる。好ましい態様によれば、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体を作製し、特性決定する手段については当技術分野では十分に公知である(例えば、Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988を参照)。
【００５４】
要するに、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを含んでなる免疫原にて動物を免疫化し、その免疫化した動物から抗血清を採取することにより準備する。抗血清の作製には様々な動物種が使用できる。一般には、抗血清の作製に使用する動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウマをはじめとする非ヒト動物である。ウサギは血液量が比較的多いため、ポリクローナル抗体の作製にとってウサギが好ましい選択である。
【００５５】
宿主種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫反応を高めてもよい。このようなアジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペット・ヘモシニアンおよびジニトロフェノールなどの界面活性物質が挙げられる。ＢＣＧ（弱毒ウシ結核菌株(Bacilli Calm ette-Guerin)）およびコリネバクテリウム・パルヴム(Corynebacterium parvum)が潜在的に有用性のあるヒトアジュバントである。
【００５６】
一般に当業者には周知であるが、イソ型の抗原に特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体のいずれも、従来の免疫化技術を用いて作製しうる。本明細書において使用する「特異的な」とは、抗体の可変領域が、前記抗体に特異的かつ優先的にリンパ管内皮細胞を認識させうるエピトープを認識して結合し、さらに、このようなエピトープを、その他の抗原、例えば、他のＶＥＧＦ受容体または非リンパ管細胞で発現される同じ受容体と識別しうることを意味する。２Ｅ１１Ｄ１１または抗ポドプラニンが認識するような抗原性エピトープを含む組成物を用いて、ウサギまたはマウスなどの１種以上の実験動物を免疫化することができるが、後にこれらによって、本発明の化合物に対する特異的抗体の作製を行う。ポリクローナル抗血清は、抗体産生の時間を考慮に入れ、単に動物から血を抜き、全血から血清サンプルを調製することによって作製する。
【００５７】
本発明で用いるモノクローナル抗体は、連続継代性培養細胞系によって、抗体分子の産生を提供するいずれかの技術を用いて作製しうる。これらとしては、限定されるものではないが、最初にKoehler and Milsteinが記載したハイブリドーマ技術(Nature 256: 495-497, 1975)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al., Immunol Today 4: 72, 1983; Cote et al., Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030, 1983)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, New York N.Y., pp 77-96, (1985)が挙げられる。
【００５８】
ハイブリドーマ技術を用いる場合には、骨髄腫細胞系を用いてもよい。このようなハイブリドーマを作製する融合法で用いるのに好適な細胞系は、好ましくは抗体産生をせず、高い融合効率を有し、かつ、目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）の増殖だけを助ける特定の選択培地において、増殖できない酵素の欠乏を有するものである。例えば、免疫化した動物がマウスである場合では、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌを用い、ラットの場合では、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を用いうるが、細胞融合に関してはＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６全てが有用である。モノクローナル抗体を作製するこれらの技術によって作製されるハイブリドーマおよび細胞系が、本発明の新規な組成物であると考えられることには注目すべきである。
【００５９】
選択されたＶＥＧＦＲ−３エピトープと免疫反応性のあるポリクローナル抗血清を作製する典型的な方法では、ウサギの免疫化のため、５０μｇのＶＥＧＦＲ−３抗原をフロイントの完全アジュバントに乳化させる。例えば、２１日おきに、追加免疫のため、５０μｇのエピトープを、フロイントの不完全アジュバントに乳化させる。
【００６０】
モノクローナル抗体を作製するために、抗体をする惹起するものである組換えＶＥＧＦＲ−３を、マウスに定期的に注射する（例えば、１０〜２０μｇをフロイントの完全アジュバントに乳化する）。ＰＢＳ中のリンパ管内皮細胞の特異的認識を可能にするエピトープを含むＶＥＧＦＲ−３ポリペプチドの融合前最終の追加免疫を、マウスに施し、４日後にマウスを犠牲にし、その脾臓を取り出す。脾臓を１０ｍＬ血清フリーＲＰＭＩ１６４０に入れ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）(Gibco, Canada)を添加した血清フリーＲＰＭＩ１６４０に浸漬した２枚の顕微鏡用ガラススライドのフロスト処理した端部間にて、脾臓を強くこすり付けて、単一細胞懸濁物を調製する。この細胞懸濁物を滅菌７０メッシュＮｉｔｅｘ細胞濾過器(Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey)で濾過し、さらに２００ｇにて５分間遠心分離し、ペレットを２０ｍＬ血清フリーＲＰＭＩに再懸濁させることにより２回洗浄する。３匹の実験未使用のＢａｌｂ／ｃマウスから採取した脾臓細胞を同様に準備し、対照として用いる。融合に先立ち、３日間、１１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）(Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah)を加えたＲＰＭＩにおいて対数期(log phase)に維持したＮＳ−１骨髄腫細胞を、上記のパラグラフで記載したように２００ｇにて５分間遠心分離し、ペレットを２回洗浄する。
【００６１】
１×１０８脾臓細胞を２．０×１０７ＮＳ−１細胞と合わせて遠心分離し、上清を吸引する。管を軽くたたいてこの細胞ペレットを取り出し、１ｍＬの３７℃  ＰＥＧ  １５００（７５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０中５０％）(Boehringer, Mannheim)を攪拌しながら１分間にわたって添加し、次に、７分間にわたって７ｍＬの血清フリーＲＰＭＩを添加する。さらに８ｍＬ  ＲＰＭＩを添加し、細胞を２００ｇで１０分間遠心分離する。上清を廃棄した後、ペレットを１５％ＦＢＳ、１００μＭヒポキサンチンナトリウム、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン（ＨＡＴ）(Gibco)、２５単位／ｍＬ  ＩＬ−６(Boehringer, Mannheim)および１．５×１０６脾臓細胞／ｍＬを含有する２００ｍＬ  ＲＰＭＩに再懸濁し、１０のCorning平底９６ウェル組織培養プレート(Corning, Corning New York)に播種する。
【００６２】
融合後２、４および６日目に融合プレートのウェルから１００μＬの培地を取り除き、新鮮培地と交換する。８日目に融合物をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、マウスＩｇＧのＶＥＧＦＲ−３との結合の存在については次のように試験する。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４プレート(Dynatech, Cambridge, MA)を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で希釈したＶＥＧＦＲ−３  １００ｎｇ／ウェルで３７℃にて２時間コーティングする。コーティング液を吸引し、ブロッキング溶液（ＣＭＦ−ＰＢＳにて希釈した０．５％ 魚皮ゼラチン(Signia)）２００μＬ／ウェルを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ 培養上清を添加する。３７℃で３０分間のインキュベーション後、上記のように洗浄し、ＰＢＳＴで１：３５００希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（ｆｃ）(Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania)５０μＬを添加する。プレートを上記のようにインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬ ｏ−フェニレンジアミン(Sigma)および０．１μＬ／ｍＬ １００ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４．５中３０％Ｈ２０２からなる１００μＬ 基質を添加する。５分間後に５０μＬの１５％Ｈ２Ｓ０４を添加して、呈色反応を停止させる。Ａ４９０をプレートリーダー(Dynatech)で読み取る。
【００６３】
選択された融合ウェルを、９６ウェルプレートへの希釈および５日後のコロニー数／ウェルの目視評価により、２回クローニングする。ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体は、Ｉｓｏｓｔｒｉｐシステム(Boehringer, Mannheim, Indianapolis, IN)を用いてイソ型決定する。
【００６４】
モノクローナル抗体の作製に加え、「キメラ抗体」の作製に向けて開発された技術である、好適な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを用いることができる(Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314: 452-454; 1985)。あるいは、単鎖抗体の作製に関して記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、ＶＥＧＦＲ−３特異的単鎖抗体の作製に適合させることもできる。
【００６５】
ＶＥＧＦＲ−３またはその他のリンパ管内皮細胞抗原と結合することが分かっている抗体集団から、血管内皮細胞を用いて、ＶＥＧＦＲ−３またはその細胞の他のエピトープと交差反応する抗体を「取り去る」ことができる。残る抗体集団は、リンパ管内皮細胞エピトープに特異的な抗体に富むことになる。
【００６６】
また、Orlandi et al(Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837; 1989)、およびWinter G and Milstein C(Nature 349: 293-299, 1991)で開示されたように、リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導するか、または組換え免疫グロブリンライブラリーまたは高特異性結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより、抗体を作製してもよい。
【００６７】
本発明による抗体は、本発明による単離方法における使用に加え、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法などの標準的な免疫化学法および組織染色などの免疫組織化学法、ならびにＶＥＧＦＲ−３関連抗原エピトープに特異的な抗体を使用すると思われるその他の手法において、有益な用途が見出せるものと考えられる。
【００６８】
一般に、本発明に向けて作製したポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、いずれも種々の他の態様において用いてよい。特定の態様では、抗体は、ＶＥＧＦＲ−３活性の阻害が望まれる治療用途に用いられる。抗体を用いてＶＥＧＦ−Ｃ作用およびＶＥＧＦＲ−３受容体機能を遮断し、それによってリンパ管新生に関連した過増殖性疾患を治療しうる。また、本発明の抗体は、診断用途、例えば、疑わしい病態部位のサンプルを含む組織サンプル内のＶＥＧＦＲ−３タンパク質の増加または減少を検出するのにも有用であることが示される。さらなる態様によれば、抗体クローニングプロトコールにおいて本発明の抗体を使用し、その他のＶＥＧＦＲ−３タンパク質をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子を得る。また、それらを阻害研究に用いて、細胞または動物におけるＶＥＧＦＲ−３関連ペプチドの効果を解析してもよい。さらに、本発明に向けて作製された抗体は、種々の細胞事象中のＶＥＧＦＲ−３の分布を解析するものであり、例えば、細胞周期の異なる時点におけるＶＥＧＦＲ−３ポリペプチドの細胞または組織特異的分布を解明する免疫学的局在性研究においても有用である。このような抗体の特に有用な用途は、未変性または組換えＶＥＧＦＲ−３を精製ずる場合、例えば、抗体アフィニティーカラムを用いて精製する場合にある。このような免疫学的技術全ての操作は本開示に照らしてみると、当業者ならば分かるであろう。
【００６９】
また、本発明で用いる抗体を作製する上記の「従来」法に加えて、本明細書において使用する抗体についてスクリーニングするファージディスプレイ法も提供されるものである。２Ｅ１１Ｄ１１および抗ポドプラニン抗体がリンパ管内皮細胞を特異的に認識することが、現在判っている。これら２種の抗体を使用して単離された細胞は、２Ｅ１１Ｄ１１または抗ポドプラニン関連分子のあらゆる可能性ある変異のファージディスプレイを利用して提示されるその他の関連抗体を、読み出す（read out）ために使用できる。また、提示された抗体は、２Ｅ１１Ｄ１１または抗ポドプラニンが認識する特定のエピトープに対する結合能によって選択することができる。新規抗体を単離するこの方法については、当業者には周知公知であり、さらに例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、結合タンパク質の定向進化を記載する米国特許第５，２２３，４０９号で詳述されている。また、関連法が米国特許第５，４０３，４８４号；同第５，５７１，６９８号；同第５，８３７，５００号；同第５，７０２，８９２号にも記載されている。さらに、米国特許第５，７８０，２７９号；同第５，８２１，０４７号；同第５，８２４，５２０号；同第５，８５５，８８５号；同第５，８５８，６５７号；同第５，８７１，９０７号；同第５，９６９，１０８号；同第６，０５７，０９８号；同第６，２２５，４４７号に記載の技術も本発明に向けた抗体の作製に有用である。
【００７０】
さらに、本発明で用いる抗体を作製するもう１つの有用な技術は、合理的設計様式のアプローチを用いるものであってよい。合理的設計の目的は、生物学的に活性なポリペプチドまたはそれらが相互作用する化合物（アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、ペプチドミメティクス、結合パートナーなど）の構造的類似体を作製することである。この場合の活性なポリペプチドは、本明細書を通じて記載される２Ｅ１１Ｄ１１および抗ポドプラニン抗体である。このような類似体を作製することにより、未変性または天然２Ｅ１１Ｄ１１または抗ポドプラニン分子よりも高い免疫反応性のある他の抗体を作出することができる。あるアプローチによれば、抗体またはそのエピトープ結合フラグメントの３次元構造を作成する。これはＸ線結晶写真、コンピューターモデリングまたは両アプローチの組合せにより行うことができる。別のアプローチ、「アラニンスキャン」では、分子中の残基のアラニンによるランダム置換、およびその結果として機能に及ぼされる影響の判定を伴う。
【００７１】
また、特異的抗体の結晶構造を解明することもできる。原則的には、このアプローチによれば、今後の医薬品設計の基本となりうるファーマコアが得られる。機能的、薬理的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作製することによって、タンパク質結晶写真は全て省くことができる。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は最初の抗原の類似体であると考えられる。そこで、抗イディオタイプを用いて同定し、化学的または生物学的に作製されたペプチドのバンクからさらなる抗体を単離することができる。
【００７２】
Ｄ．  細胞の単離方法
本発明は、混合細胞培養物からリンパ管内皮細胞を単離する方法を提供する。特に、この単離方法では、リンパ管内皮細胞を優先的に認識する抗体を使用する。このような抗体の作製およびその例については上記した。本節では、抗体と併せて用いて細胞を単離しうる特定の技術を記載した。これらは典型的な技術にすぎず、本明細書に記載の方法と組み合わせて使用可能な細胞を単離する他の方法について、当業者ならば周知のことであろう。
【００７３】
本発明による細胞の分離には、種々の技術が用いられる。抗体を固相支持体と結合させると粗分離が可能である。用いる分離技術は、回収すべき画分の生存能力の保持を最大にするものであるべきである。異なる効果の種々の技術を用いると、「比較的粗」な分離がもたらされる。このような分離では、マーカーを有していない現存全細胞の最大１０％、通常約５％以下、好ましくは約１％以下が細胞集団に保持される。用いる特定の技術は、分離効率、関連細胞傷害性、動作の容易さおよび速度、ならびに最新式の設備および技術的熟練の必要性に依存する。
【００７４】
分離の手法としては、限定されるものではないが、磁気分離、抗体被覆磁気ビーズの使用、アフィニティークロマトグラフィー、限定されるものではないが、補体および細胞毒素をはじめとするモノクローナル抗体と結び付けたまたはモノクローナル抗体と併せて用いる細胞傷害性薬剤、および固相マトリックス、例えば、プレートに結合させた抗体との「パンニング(panning)」、水簸またはその他の便宜な技術が挙げられる。
【００７５】
分離技術の使用においては、限定されるものではないが、物理性（密度勾配遠心分離法および向流遠心水簸法）、細胞表面（レクチンおよび抗体アフィニティー）、ならびに生体染色特性（ミトコンドリア結合色素ｒｈｏ１２３およびＤＮＡ結合色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）の違いに基づくものが挙げられる。
【００７６】
精密な分離を提供する技術としては、限定されるものではないが、種々の精度、例えば、複数の色成分、小角および鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなど、を有しうる蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）ＦＡＣＳが挙げられる。
【００７７】
ＦＡＣＳは浮遊状態の細胞を細胞表面マーカーの違いに基づいて分離できるセルソーティング法である。本発明においては、ＦＡＣＳを用いて細胞の混合集団からリンパ管内皮細胞を特異的に取り出す。ＦＡＣＳは異種集団から目的とする細胞または粒子を物理的に分離する。この技術を用いて、回収した細胞の培養を可能にする滅菌環境にて細胞を選別できる。リンパ管内皮細胞は本明細書に記載の抗体が認識する抗原の存在によって選別される。さらに、ＦＡＣＳを用いて、細胞培養物から、抗原発現の認識、ＧＦＰ発現、混入細胞のＤＮＡ含量または細胞機能（例えば、カルシウム流動またはアポトーシス）により混入細胞を除去してもよい。混入細胞はリンパ管内皮細胞が単離される前、後または前後のいずれもにおいて除去しうる。
【００７８】
ＦＡＣＳは、細胞または粒子が浮遊状態で検出点を過ぎて１個１個進むため、それらの特定の物理的および化学的特性を測定する手段であるフローサイトメトリーに基づいている。そのため、フローサイトメーターは特殊化した蛍光顕微鏡であると考えられる。現在あるフローサイトメーターは光源、集光系(collector)、電子機器およびコンピューターからなり、シグナルをデータに変換する。最新のサイトメーターにおいては、指定の波長で干渉性光を放つレーザーが光源として最適である。散乱放射された蛍光は２つのレンズ（１枚は光源の前に置き、１枚は直角に置く）、さらに一連の構成部分、ビームスプリッターおよびフィルターにより集められ、特定バンドの蛍光性が測定できる。フローサイトメトリー技術により測定できる物理的特性としては、細胞の大きさ、形態および内部複雑性などの特性が挙げられるが、さらに当然のことではあるが、蛍光化合物によって検出できる細胞成分または機能を調べることができる。
【００７９】
一般に、フローサイトメーターは帯電液滴の静電偏向に関する原則を用いる。細胞をサンプルから吸引し、通常ＰＢＳであるがイオン化液でもよいシース液の流れ中にあるノズルから１個１個出す。細胞がレーザー光線を遮るため、散乱光および蛍光シグナルが生じ、ソートロジックボードが細胞を選別すべきか否かを（ユーザー定義の基準により）判断する。この場合、リンパ管内皮細胞を選別するためのユーザー定義の基準は、細胞が２Ｅ１１Ｄ１１、抗ポドプラニンなどのようなリンパ管内皮細胞特異的抗体と結合するまたはそれらによって認識されるか否かである。
【００８０】
レーザーインターセプトとブレイクオフポイント(break-off point)間の距離がドロップデライ(drop delay)と呼ばれる。目的の細胞、すなわち選別しようとするもの、が検出されると、その細胞がインターセプトからブレイクオフポイントまで進むまでサイトメーターは待機し、その後その流れにチャージをかける。目的の細胞を含む液滴は、固体を液体流にするために正または負のいずれかの電荷を帯びる。帯電液滴は流れに沿ってさらに進み２枚の高電圧偏向板を通過し、異極性のプレートに引き付けられる。このように、同じサンプルから２つの別個の集団が選別できる。
【００８１】
第１の分離では、典型的には約１×１０８−９、好ましくは約５×１０８−９細胞で開始して、リンパ管細胞特異的抗体をある蛍光色素で標識し、様々なその他の細胞に対する抗体または抗ｇｐ８０抗体を少なくとも１つの異なる蛍光色素と結合させてもよい。各系統を分離工程で分離しすることができ、所望により、２Ｅ１１Ｄ１１および／またはその他のリンパ管内皮マーカーが認識するエピトープについて陽性選抜するのと同時に系統を分離する。細胞を死滅細胞に関連する色素（限定されるものではないが、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）など）を使用することによって、死滅細胞について選択してもよい。好ましくは、細胞の増殖または保存に好適な培地に細胞を回収する。細胞は光散乱特性、ならびに種々の細胞表面抗原のそれらの発現に基づいて選抜してもよい。当業者ならば、本発明に向けた細胞のＦＡＣＳ選抜に用いうる特定のプロトコールについては十分に周知である。
【００８２】
典型的なＦＡＣＳ手法では、微小血管内皮細胞を、リンパ管内皮細胞を認識する１種以上の抗体とともに４℃で４０分間インキュベートすることにより浮遊状態で標識する。選別前後の細胞を４℃で好適な培地で維持する。抗体標識完了後、最終濃度１０μｇ／ｍＬでヨウ化プロピジウム（死滅細胞の確認用）を各サンプル試験管に添加した。蛍光活性化セルソーティングは、出力６０ｍＷおよびノズル１００μｍで４Ｗアルゴンレーザーを用いるBecton Dickinson  ＦＡＣＳＴＡＲｐｌｕｓ(San Jose, Calif.)により実施する。また、ＦＡＣＳは、細胞のＦＳＣおよびＳＳＣ散乱を調べることにより物理的特性を測定するのにも使用できる。
【００８３】
ＦＡＣＳの他、ＭＡＣＳもまたセルソーティングには有用な技術である。細胞の単離方法として免疫蛍光検査を用いる代わりに、細胞を免疫磁気標識し、磁場を用いて分離する。また、抗体を付けた磁気ビーズに用いても混合集団培養物からリンパ管内皮細胞を分離することができる。抗体を提示する磁気ビーズは、磁場を帯びたカラム内で結合される。そこで、微小血管細胞集団がカラムを通り抜け、リンパ管内皮細胞は抗体と結合した状態となり、残りの細胞はカラムフロースルーで回収される。
【００８４】
また、従来の免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーも、リンパ管細胞の単離に用いることができる。このような技術では、抗体を不活性カラムクロマトグラフィービーズと結合させ、ビーズをカラムに充填する。微小血管細胞集団がカラムを通り抜けると、リンパ管内皮細胞は抗体と結合した状態にあり、非リンパ管内皮細胞は通り抜けてカラムフロースルーに入る。
【００８５】
また、パンニング技術を用いて、本発明のリンパ管内皮細胞を単離してもよい。細胞のパンニングは、抗体を用いて細胞をペトリ皿などの固相支持体と結合させるというよく知られた技術である。基本的には、例えば、リンパ管内皮細胞に特異的な２Ｅ１１Ｄ１１についてパンニングしようとする細胞特異的な抗体を付着細胞培養プレートにコーティングする。その後、細胞の混合集団をプレートに添加し、細胞がプレート表面に固定化した抗体と十分に接触するようプレートを回転させる。抗体によって認識されない細胞を含む残りの細胞培養培地をプレートから除去し、抗体と結合した、混入細胞を実質的に含まないリンパ管内皮細胞を残す。細胞は回収するか、または増殖用の新鮮培地に移すことが可能である。あるいは新鮮培地を抗体と付着した細胞に添加してもよい。微小血管細胞集団の場合、浮遊状態にあり、かつ付着したリンパ管細胞から除去された細胞が、リンパ管内皮細胞が実質的に混入していない血管内皮細胞集団であることは分かるであろう。
【００８６】
典型的なパンニングプロトコールでは、９ｍＬの好適なバッファーで希釈した抗体（０．５ｍｇ／皿）を１００ｍｍ２細菌用ポリスチレンペトリ皿(Falcon, Lincoln Park, N.J.)に注ぐ。表面を均一にコーティングするようその皿を回転させ、室温で４０分間インキュベートする。使用前にコーティングした皿をバッファーで洗浄し、ペトリ皿の表面には付着しなかった残留抗体を除去する。例えば、最大３×１０７細胞を含む１０ｍＬ量の微小血管細胞懸濁物を４℃で１０分間抗体にてコーティングした皿でインキュベートする。非付着細胞を吸引除去し、プレートをバッファーまたは細胞に好適な培地で洗浄する。非付着細胞を遠心分離沈降させて、再び培養することができる。
【００８７】
Ｅ．  ＶＥＧＦＲ−３活性の存在を調べるアッセイ
ＶＥＧＦ−Ｃ／ＤのＶＥＧＦＲ−３受容体ファミリーとの結合によって媒介される多くの生物学的活性（限定されるものではないが、血管内皮細胞および血管の増殖および移動に影響を与える；リンパ管内皮細胞およびリンパ管の増殖を促進する；血管透過性を高める；ならびに骨髄造血に影響を与えるなど）は本発明の単離細胞に関する多くのin vitroおよびin vivo 臨床的有用性を裏付ける。非リンパ管内皮細胞が原因と考えられてきた汚染の影響のないリンパ管内皮細胞培養物において初めてこのような活性が明確にモニタリングできる。これらの細胞ではＶＥＧＦＲ−３結合およびＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄの活性、ならびに結合を調節する化合物についてモニタリングできる。従って、本発明による細胞は、モジュレーター、好ましい具体例ではＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄが媒介する生物学的反応の阻害剤の同定に有効である。本節では、ＶＥＧＦＲ−３結合および／または活性の存在を調べるための種々のアッセイについて説明する。本発明によって単離された細胞におけるこのような活性の存在を用いて、このような細胞がリンパ管内皮細胞であることを示す。
【００８８】
リンパ管内皮細胞の存在は、ＶＥＧＦＲ−３結合活性を示す細胞の能力によってモニタリングしうる。典型的な結合アッセイについては全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Achen et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 548-53 (1998)に記載されている。一般に。これらのアッセイはＶＥＧＦＲ−３受容体を発現する本発明の細胞と受容体のリガンド（例えば、ＶＥＧＦ−Ｃ）とを混合し、さらに受容体結合を調べることを含んでなる。
【００８９】
細胞をＶＥＧＦＲ−３受容体の阻害における薬剤の治療効果が望まれる用途に用いて薬剤を個体に投与する前に調べることができる。活性の指標として、治療薬の細胞におけるＶＥＧＦＲ−３受容体の自己リン酸化反応を変化させる能力も調べることができる。候補治療薬を細胞に添加した後、細胞を溶解し、抗ＶＥＧＦ受容体抗血清により免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロット法により解析してＶＥＧＦ受容体のリン酸化反応を調べる。
【００９０】
これらのアッセイでは、細胞を当業者ならば十分に周知の技術を用いて増殖させる。例えば、細胞をハムＦ１２培地−１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で増殖させる。細胞を０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したＤＭＥＭ培地またはハムＦ１２で一晩飢餓状態にした後、ＶＥＧＦ−Ｃ単独またはＶＥＧＦ−Ｃとともに治療薬を加えて５分間インキュベートする。
【００９１】
ＶＥＧＦ−Ｃの添加後、細胞を１００ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷Ｔｒｉｓ緩衝溶液（ＴＢＳ）で２回洗浄し、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、０．１Ｕ／ｍＬアプロチニンおよび１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムを含有するＲＩＰＡバッファーに溶解する。溶解物を超音波処理し、１６，０００×ｇで２０分間の遠心分離により明澄化し、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦＲ−２に特異的な抗血清３〜５μＬとともに氷上にて３〜６時間インキュベートする。免疫沈降物をプロテインＡ−セファロースと結合させ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムを含有するＲＩＰＡバッファーにて３回洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にて２回洗浄し、７％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに付す。ポリペプチドをウエスタンブロット法によりニトロセルロースに移し、ＰＹ２０ホスホチロシン特異的モノクローナル抗体(Transduction Laboratories)または受容体特異的抗血清およびＥＣＬ検出法(Amersham Corp.)を用いて解析する。
【００９２】
候補治療用物質の自己リン酸化反応に影響を与える能力（抗ホスホチロシン抗体を用いて検出される）を受容体の調節として評価する。既知の濃度のＶＥＧＦ−Ｃに対して種々の濃度の治療薬で認められる変化のレベルが、受容体調節に関する有効性の判定の指標となる。受容体と結合することは分かっているが受容体リン酸化反応を刺激することができない治療用物質を阻害剤として評価する。組換えＶＥＧＦ−Ｃなどの既知の受容体アゴニストを培地単独または濃縮したならし培地のいずれかと混合することによって、阻害活性をさらにアッセイし、濃縮したならし培地によってＶＥＧＦ−Ｃが媒介する受容体リン酸化反応が阻害されるか否かを調べることができる。
【００９３】
また、リンパ管内皮細胞の存在は、ＶＥＧＦＲ−３の天然または組換えリガンドの結合アッセイを用いてモニタリングできる。選択されたリガンドの結合親和性を測定するためにＥＬＩＳＡタイプのアプローチを用いてもよい。例えば、ＶＥＧＦＲ−３の結合親和性を調べるため、競合するＶＥＧＦＲ−３−ＩｇＧ融合タンパク質の連続希釈物とｍｙｃエピトープでタグ付けした亜飽和濃度の候補リガンドをＶＥＧＦＲ−３でコーティングしたマイクロタイタープレートに添加し、平衡が成立するまでインキュベートする。次いで、このプレートを洗浄して結合していないタンパク質を除去する。ＶＥＧＦＲ−３コーティングしたプレートと結合した状態にあるリガンドは容易に検出可能な標識、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合した抗ｍｙｃ抗体を用いて検出される。結合親和性（ＥＣ５０）は競合するＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ融合タンパク質の半最大量の結合を生じる濃度として算出できる。
【００９４】
ＶＥＧＦ−Ｃはコラーゲンゲル中の内皮細胞移動を刺激する。本発明による細胞を調べて、ＶＥＧＦ−Ｃが媒介するコラーゲンゲル中の内皮細胞移動を解明することにより、単離された細胞が確かにリンパ管内皮細胞であるというもう１つの証が提供される。典型的な細胞移動アッセイについては引用することにより本明細書の一部とされる、国際特許公開番号第ＷＯ９８／３３９１７号に記載されている。要するに、本発明において単離されたリンパ管内皮細胞を、組織培養プレートのコラーゲン層の上に播種する。ＶＥＧＦ−Ｃを付けたリンパ管内皮細胞の位置から約４ｍｍ離してコラーゲンゲルで作製したウェルに入れる。その後、コラーゲンゲルに付けた最初の範囲からＶＥＧＦ−Ｃを含有するウェルに向かって移動した内皮細胞数を計数してＶＥＧＦ−Ｃにより誘導された細胞移動を評価する。
【００９５】
これらのアッセイでのコラーゲンゲルはＩ型コラーゲン原液（１ｍＭ  ＨＣｌ中５ｍｇ／ｍＬ）を等容量の２×ＭＥＭおよび２容量の１０％新生仔ウシ血清を含有するＭＥＭと混合することによって調製して最終コラーゲン濃度１．２５ｍｇ／ｍＬを得る。組織培養プレート（５ｃｍ径）を約１ｍｍ厚の溶液層で覆い、これを３７℃で重合させる。本発明のリンパ管内皮細胞をこの層の上に播種する。
【００９６】
移動アッセイでは、細胞を第１のコラーゲン層の上に置かれたプラスチックリング（１ｃｍ径）の内側に付着させる。３０分後、リングを取り除き、付着していない細胞を洗い流す。０．７５％低融点寒天（ＦＭＣ  BioProducts, Rockland, ME)によって凝固させたコラーゲンの第２の層および増殖培地の層（５％新生仔ウシ血清（ＮＣＳ））を添加する。細胞スポットの両側に４ｍｍ離して、全ての層を打ち抜くウェル（３ｍｍ径）を設け、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを含有する培地を毎日ピペットでウェルに取る。スポット端部から移動し始めた細胞の顕微鏡写真を、例えば、６日後にOlympus ＣＫ２倒立型位相差顕微鏡によって撮影する。蛍光色素ビスベンズイミド（１ｍｇ／ｍＬ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８, Sigma）での核染色後に移動細胞を計数する。
【００９７】
付着させた最初の範囲からＶＥＧＦ−Ｃを含有するウェルに向かって異なる距離を移動する細胞数を培地の添加６日後に判定する。付着させた最初のリングから移動し始めている細胞数を蛍光顕微鏡の顕微鏡接眼レンズのグリッドおよび倍率１０×を用い、隣接する５箇所の０．５ｍｍ×０．５ｍｍ四方において計数する。０．５ｍｍより先に移動している細胞はグリッドを０．５ｍｍ動かして同様に計数する。本発明の細胞のＶＥＧＦ−Ｃが媒介する移動を行う能力によって単離された細胞がＶＥＧＦＲ−３を発現するリンパ管内皮細胞であることが示される。
【００９８】
さらに、ＶＥＧＦ−Ｃの細胞分裂誘起活性を全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Breier et al., Dev 114: 521-532 (1992)に記載されたものなどの内皮細胞増殖アッセイを用いて調べることができる。ＶＥＧＦ−Ｃを細胞に添加することにより細胞のこの作用についてアッセイしうる。３日後、細胞をトリプシンにより解離し、サイトメーターを用いて計数してペプチドのリンパ管内皮細胞の増殖活性への影響を調べる。
【００９９】
Ｆ．  ＶＥＧＦＲ−３の刺激因子
本明細書に示すように、単離されたリンパ管内皮細胞は、培養中のそれらの生存が促進されるような様式で培養増殖しうると考えられる。特定の態様によれば、細胞を、限定されるものではないが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＯＲＦＶ２−ＶＥＧＦをはじめとするＶＥＧＦＲ−３の刺激因子および／またはＶＥＧＦＲ−２の刺激因子の存在下にて増殖させてもよい。これらの刺激因子およびＶＥＧＦ受容体へのそれらの影響は本節においてさらに詳細に記載する。これらの因子を、それらと本発明の細胞との併用を可能にする製剤に調製しうることは分かるであろう。さらに、これらの刺激因子は、単独またはリンパ管内皮細胞培養系のアポトーシスの阻害、抑制、減少、あるいは阻止の混用にて本発明の細胞に供給してもよい。
【０１００】
上記の刺激因子はＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子に属しており、これらのものとしては、少なくとも次のメンバー：ＰＤＧＦ−Ａ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０６３７４を参照）、ＰＤＧＦ-Ｂ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１２７８３を参照）、ＶＥＧＦ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ１６８８９を参照、本明細書においてはＶＥＧＦ−Ａとしてまたは特定のイソ型により明確に示される）、ＰＩＧＦ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５４９３６を参照、胎盤増殖因子）、ＶＥＧＦ−Ｂ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４８８０１を参照；ＶＥＧＦ関連因子（ＶＲＦ）としても知られる）、ＶＥＧＦ−Ｃ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９４２１６を参照；ＶＥＧＦ関連タンパク質（ＶＲＰ）としても知られる）、ＶＥＧＦ−Ｄ（ｃ−ｆｏｓ−誘導性増殖因子（ＦＩＧＦ）としても知られる；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０００１８５を参照）、ＶＥＧＦ−Ｅ（ＮＺ７  ＶＥＧＦまたはＯＶ  ＮＺ７としても知られる；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ６７５２２を参照）、ＮＺ２  ＶＥＧＦ（ＯＶ  ＮＺ２としても知られる；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ６７５２０を参照）、Ｄ１７０１  ＶＥＧＦ様タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１０６０２０を参照；Meyer et al., EMBO J 18: 363-374）、ならびにＮＺ１０  ＶＥＧＦ様タンパク質（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５８６９に記載）[Stacker and Achen, Growth Factors 17: 1-11(1999); Neufeld et al., FASEB J 13: 9-22(1999); Ferrara, J Mol Med 77: 527-543(1999)]が挙げられる。
【０１０１】
ＶＥＧＦ−Ｃはアミノ酸レベルにおいてＶＥＧＦ−Ａと約３０％同一であるＶＨＤを含んでなる。ＶＥＧＦ−Ｃは当初、広範なアミノおよびカルボキシ末端ペプチド配列がフランキングするＶＨＤとバルビアニ環３タンパク質に典型的なモチーフにおいて、タンデム反復システイン残基を含有するＣ末端ペプチドとを有する大型前駆体タンパク質、プレプロＶＥＧＦ−Ｃとして表されている。プレプロＶＥＧＦ−Ｃはシグナルペプチド、Ｃ末端プロペプチド、およびＮ末端プロペプチドの連続切断を伴う広範なタンパク質分解性成熟を受ける。分泌されたＶＥＧＦ−Ｃタンパク質は各モノマーがＶＨＤを含有する非共有結合ホモダイマーからなる。部分的タンパク質分解プロセシングによって生成された中間体ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３受容体に対する親和性を高め、さらに成熟タンパク質はＶＥＧＦＲ−２受容体と結合することもできる[Joikov et al., EMBO J., 16: (13): 3898-3911(1997).]。また、１５６位のただ１つのシステインが別のアミノ酸で置換されているか、または欠失している変異型ＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦＲ−２との結合能は喪失しているが、ＶＥＧＦＲ−３と結合し、活性化することは依然可能であることも示されてきた[国際特許公開番号第ＷＯ９８/３３９１７号]。マウス胚では、ＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡは、主として尿嚢、頸部領域、および後腎で発現される。[Joikov et al., J Cell Physiol 173: 211-215 (1997)].ＶＥＧＦ−Ｃはリンパ管新生の調節に関与している。ＶＥＧＦ−Ｃがトランスジェニックマウスの皮膚で過剰発現された場合には、過形成性リンパ管網が観察され、ＶＥＧＦ−Ｃによってリンパ管増殖が誘導されたことが示される[Jeltsch et al., Science, 276: 1423-1425 (1997)]。また、成体におけるＶＥＧＦ−Ｃの継続発現によっても、分化したリンパ管内皮の維持における役割が示される[Ferrara, J Mol Med 77: 527-543 (1999)]。さらに、ＶＥＧＦ−Ｃは血管形成特性も示す。これはコラーゲンにおけるウシ毛細管内皮（ＢＣＥ）細胞の移動を刺激して、ヒト内皮細胞の増殖を促進することができる[例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、国際特許公開番号第ＷＯ９８/３３９１７号を参照]。ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓは、ＶＥＧＦＲ−３と結合するＶＥＧＦ−Ｃシステイン欠失変異体であるが、（ＶＥＧＦ−Ｃと比べて）ＶＥＧＦＲ−２との結合が低下していることが示されている。本発明において用いうるＶＥＧＦＲ−３に特異的なＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓおよび関連リガンドについては、特に全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第６，１３０，０７１号に記載されている。ＶＥＧＦ−Ｃ材料および方法については、引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第６，２４５，５３０号および第６，２２１，８３９号に記載されている。
【０１０２】
ＶＥＧＦ−Ｄは、構造的にも機能的にもＶＥＧＦ−Ｃと最も密接な関係がある[引用することにより本明細書の一部とされる、国際特許公開番号第ＷＯ９８/０７８３２号および米国特許第６，２３５，７１３号を参照]。ＶＥＧＦ−Ｃのように、ＶＥＧＦ−Ｄは、Ｎ末端およびＣ末端タンパク質分解性プロセシングを受けるプレプロペプチドとして初期発現され、非共有結合ダイマーを形成する。ＶＥＧＦ−Ｄはin vitroにおいて内皮細胞における細胞分裂誘起反応を刺激する。胚形成時、ＶＥＧＦ−Ｄは時間的および空間的複合パターンにて発現され、その発現は成体の心臓、肺、および骨格筋において可能である。ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣと呼ばれるＶＥＧＦ−Ｄの生物学的に活性な断片の単離については、引用することにより本明細書の一部とされる、国際特許公開番号第ＷＯ９８/０７８３２号に記載されている。ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣは、アフィニティータグペプチドＦＬＡＧ（登録商標）と連結したＶＥＧＦ−Ｄのアミノ酸残基９３〜２０１番からなる。
【０１０３】
ＶＥＧＦ−Ａは当初、数種類の起源から内皮細胞に対するその細胞分裂誘起活性に基づいて、さらには微小血管透過性を誘導するその能力によっても精製されたことから、血管透過性因子（ＶＰＦ）とも呼ばれている。後に、ＶＥＧＦ−Ａは、細胞内カルシウムの移行、プラスミノゲンアクチベーターおよびプラスミノゲンアクチベーター阻害剤−１合成の誘導、in vitroにおける単球移動の促進、ヒト内皮細胞における抗アポトーシスタンパク質発現の誘導、内皮細胞における窓形成の誘導、内皮細胞における細胞接着分子発現の促進ならびに一酸化窒素を介した血管拡張および低血圧の誘導をはじめとする多くの生物学的過程を誘導することが分かってきた[Ferrara, J Mol Med 77: 527-543 (1999); Neufeld et al., FASEB J 13: 9-22(1999); Zachary, Intl J Biochem Cell Bio 30: 1169-1174(1998)]。
【０１０４】
ＶＥＧＦ−Ａは、２３ｋＤサブユニットからなる分泌性ジスルフィド結合ホモダイマー糖タンパク質である。異なるｍＲＮＡスプライス変異体によってコードされる１２１、１４５、１６５、１８９または２０６アミノ酸長のヒトＶＥＧＦ−Ａイソ型５種（ＶＥＧＦ１２１−２０６）については記載されており、その全てが内皮細胞において有糸分裂を刺激することができる。しかしながら、各々のイソ型は生物活性、受容体特異性、およびＶＥＧＦ−Ａの低親和性受容体として挙動する細胞表面および細胞外マトリックス関連ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する親和性の点で異なる。ＶＥＧＦ１２１は、ヘパリンおよびヘパラン硫酸のいずれともと結合しない。ＶＥＧＦ１４５およびＶＥＧＦ１６５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３２９７７）はいずれもヘパリンと結合できる。さらにＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６はヘパリンおよびヘパラン硫酸に対する最も強い親和性を示す。ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５およびＶＥＧＦ１６５は可溶形で分泌されるが、大部分のＶＥＧＦ１６５は細胞表面および細胞外マトリックスプロテオグリカンに限定される。一方、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６は細胞外マトリックスと結合してとどまっている。ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６はいずれもヘパリンまたはヘパリナーゼでの処理により放出させることができることから、これらのイソ型がプロテオグリカンを介して細胞外マトリックスと結合されることが示される。また、細胞結合ＶＥＧＦ１８９はプラスミンなどのプロテアーゼによって切断され、その結果として活性可溶性ＶＥＧＦ１１０の放出が起こる。ＶＥＧＦを発現する大部分の組織では数種類のＶＥＧＦイソ型の同時発現が観察されるが、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５がプレドミナント型であり、ＶＥＧＦ２０６はほとんど検出されない[Ferrara, J Mol Med 77: 527-543 (1999)]。ＶＥＧＦ１４５は主として生殖器官由来の細胞で発現されるという点で異なる[Neufeld et al., FASEB J 13: 9-22(1999)]。
【０１０５】
ＶＥＧＦ−Ａ発現のパターンは正常な脈管系の形成および維持、および腫瘍増殖および慢性関節リウマチなどのその他の病的状態に関係する血管新生へのその関与を示唆している。ＶＥＧＦ−Ａは脈管系の形成に関係する胎児組織で発現され、多くの腫瘍細胞系によって分泌される。標的遺伝子破壊によってＶＥＧＦ−Ａをノックアウトしたマウスの解析ではＶＥＧＦ−Ａが生存に重要であること、さらに心臓血管系の形成がＶＥＧＦ−Ａ濃度勾配に高感受性であることがわかる。単一コピーのＶＥＧＦ−Ａを欠いたマウスは、妊娠１１〜１２日間に死ぬ。これらの胚は増殖異常および心臓血管構造の形成不全をはじめとするいくつかの発達異常を示す。また、ＶＥＧＦ−Ａは生後の生育、器官形成、成長板形態形成の調節および軟骨内性骨形成にも必要とされる。ＶＥＧＦ−Ａの必要性は年齢とともに、特に生後４週後に減少する。成熟動物では、ＶＥＧＦ−Ａは主として創傷治癒および黄体の形成などのプロセスにおいて活性な血管新生に必要である[Neufeld et al., FASEB J 13: 9-22(1999); Ferrara, J Mol Med 77: 527-543 (1999)]。ＶＥＧＦ−Ａ発現は主として低酸素状態、ならびに多くのホルモン類および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−β、および種々のインターロイキン類をはじめとするサイトカイン類の影響を受ける。調節は転写により、さらにはｍＲＮＡ安定性の高まりによるなど転写後に生じる[Ferrara, J Mol Med 77: 527-543 (1999)]。
【０１０６】
ＶＥＧＦサブファミリーのさらなる４種のメンバーがヒト、ヒツジおよびヤギに感染するポックスウイルスで同定された。オルフウイルスによってコードされるＶＥＧＦ−ＥおよびＮＺ２  ＶＥＧＦは有力な有糸分裂促進物質であり、透過性増強因子である。いずれも哺乳類ＶＥＧＦ−Ａと約２５％アミノ酸同一性を示し、ジスルフィド結合ホモダイマーとして表される。これらのウイルスによる感染はこれらのウイルスＶＥＧＦタンパク質によって誘導される内皮細胞増殖および血管透過性に関連すると考えられる膿疱性皮膚炎を特徴とする[Ferrara, J Mol Med 77: 527-543 (1999); Stacker and Achen, 増殖 Factors 17: 1-11 (1999)]。
【０１０７】
また、ＶＥＧＦ様タンパク質も、オルフウイルスのさらなる２種類の株、Ｄ１７０１[ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１０６０２０；Meyer et al., EMBO J 18: 363-374 (1999)に記載されている]およびＮＺ１０[引用することにより本明細書の一部とされる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５８６９に記載されている]から同定された。これらのウイルスＶＥＧＦ様タンパク質は、宿主の内皮に存在するＶＥＧＦＲ−２と結合することが示されており、この結合は感染の進行および血管新生のウイルス誘導に重要なものである[Meyer et al., EMBO J 18: 363-374 (1999)；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５８６９]。
【０１０８】
Ｇ．  ＶＥＧＦ−Ｃ関連疾患の治療方法
また、本発明は、また、他の態様において、リガンドが媒介するＶＥＧＦＲ−３の活性を特徴とする病状の診断および治療を含んでなる。このように、介入によって恩恵を受けると考えられる、限定されるものではないが、癌、慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症などをはじめとする多くの疾患がある。特定の態様によれば、リンパ系疾患の治療に本発明の治療方法が用いられる。本発明の細胞は、ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦＲ−３との結合により媒介されるこのような疾患を有する疑いのある患者から単離される。
【０１０９】
「リンパ系疾患」とは、リンパ系に影響を与える、限定されるものではないが、 リンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症および頸部水嚢胞をはじめとする臨床症状を意味する。好ましい態様は、ヒト被験体をリンパ水腫疾患、すなわち、医師がリンパ水腫と診断する、リンパ液の貯留に関係する腫脹を特徴とする非遺伝的原因（例えば、寄生生物、外科処置）であることが分かっているリンパ水腫以外の疾患、を発症する高い危険性についてスクリーニングする方法である。例証として、リンパ水腫疾患は、一般に独立した存在として記載され、いずれもが優性遺伝を特徴とする、ミルロイ−ノンネ（ＯＭＩＭ  １５３１００）症候群−早期リンパ水腫[Milroy, N.Y. Med. J., 56: 505-508 (1892);およびDale, J. Med. Genet., 22: 274-278 (1985)]および早発性リンパ水腫（メージ症候群、ＯＭＩＭ  １５３２００）−遅発性リンパ水腫[Lewis et al., J. Ped., 104: 641-648 (1984); Holmes et al., Pediatrics 61: 575-579 (1978);およびWheeler et al., Plastic Reconstructive Surg., 67: 362-364 (1981)]が挙げられる。しかしながら、文献においてこれらの疾患の区別に関する混乱がある。ミルロイ症候群では、一般に下肢で比較的重症である水腫の存在が出生直後から認められる。早発性リンパ水腫は同様に現われるが、腫脹の徴候は通常思春期頃である。思春期後に発症したといういくつかの症例が報告されている。本明細書に記載の特定の分析では、５q３４−ｑ３５との関連を示すリンパ水腫系は罹患した個体の大部分において早期のものであったが、これらの系統の個体では思春期中または後に現れた。
【０１１０】
特に、本発明の治療では、遺伝子的原因が特定できる遺伝性リンパ水腫を意図している。例えば、国際特許公開番号第ＷＯ００５／５８５１１号では、ＶＥＧＦＲ−３変異に関連するリンパ水腫についてのスクリーニングおよび治療法が記載されている。このような患者からリンパ管内皮細胞を単離する能力は、ex vivoにおいて標的細胞を治療薬と接触させ、さらにその細胞を再導入することによるタンパク質または遺伝子に基づく治療法を向上させる。
【０１１１】
さらに、本発明により治療しうる他の種類の疾患はＶＥＧＦＣおよび／またはＶＥＧＦＲ−３が関与するということによってのみ限定される。従って、例えば、本発明の細胞を用いて脳（膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣細胞腫）、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、膵臓、小腸、血液細胞、大腸、胃、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、骨髄、血液またはその他の組織の癌をはじめとする様々な腫瘍を評価することを意図する。これらの疾病を有する患者から単離した細胞は個体に治療法を提供するために用いる。
多くの状況では、治療法を提供するにあたり腫瘍細胞を死滅させる、または正常な細胞死または「アポトーシス」を誘導する必要がない。むしろ、有意義な治療をなし遂げるのに必要なことは腫瘍増殖をある程度遅延させるか、または特定の場所に限局して本質的に異なる部位への拡大を阻害することだけである。これは腫瘍増殖を完全に阻止すること、または幾分かの腫瘍の退行(regression)をなし遂げることであろう。また、「緩解(remission)」および「全身腫瘍組織量の減少(reduction)」などの臨床医学用語が一般的に用いられる。本発明に関しては、治療効果は血管形成の阻害および／またはリンパ管新生の阻害によってもたらされる。
【０１１２】
Ｌ．  遺伝子に基づく治療法
本発明によって単離された細胞は核酸形態で提供される遺伝子に基づく治療法を用いて処置され、患者に再導入されてex vivo 遺伝子治療効果を達成する。ex vivoにおける態様によれば、患者由来の細胞を取り出し、少なくともしばらくの間体外で維持する。この期間中には治療効果が送達されるため、その後、細胞を患者に再導入する；うまくいけば、サンプル中のいずれの腫瘍細胞も死滅する。特に、細胞を治療用遺伝子をリンパ管または血管細胞の腫瘍に提供しうる発現構築物とその脈管構造におけるＶＥＧＦＲ−３の阻害が可能になる様式で接触させる。
【０１１３】
これらの態様では、典型的な発現構築物はウイルスまたはウイルスゲノムから誘導した操作構築物を含む。一般に、発現構築物は発現させようとする治療用遺伝子をコードする核酸と、さらにそれが投与される細胞において遺伝子の発現を達成させるさらなる調節領域を含んでなる。このような調節領域としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。
現在では種々のウイルスベクターを用いてＤＮＡを細胞に導入しうることは広く知られている。このような態様では、目的とする遺伝子を含むウイルスベクターを含んでなる発現構築物が、アデノウイルス（例えば、各々が引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第５，８２４，５４４号；同第５，７０７，６１８号；同第５，６９３，５０９号；同第５，６７０，４８８号；同第５，５８５，３６２号を参照）、レトロウイルス（例えば、各々が引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，８８８，５０２号；同第５，８３０，７２５号；同第５，７７０，４１４号；同第５，６８６，２７８号；同第４，８６１，７１９号を参照）、アデノ随伴ウイルス（例えば、各々が引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第５，４７４，９３５号；同第５，１３９，９４１号；同第５，６２２，８５６号；同第５，６５８，７７６号；同第５，７７３，２８９号；同第５，７８９，３９０号；同第５，８３４，４４１号；同第５，８６３，５４１号；同第５，８５１，５２１号；同第５，２５２，４７９号を参照）、アデノウイルス−アデノ随伴ウイルスハイブリッド（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，８５６，１５２号を参照）またはワクシニアウイルスもしくはヘルペスウイルス（例えば、各々が引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第５，８７９，９３４号；同第５，８４９，５７１号；同第５，８３０，７２７号；同第５，６６１，０３３号；同第５，３２８，６８８号を参照）ベクターであってよい。
【０１１４】
その他の態様によれば、非ウイルス性送達が提供される。これらとしては、リン酸カルシウム沈降(Graham and Van Der Be, Virology, 52: 456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7: 2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10: 689-695, 1990)、ＤＥＡＥ−デキストラン(Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190, 1985)、エレクトロポレーション(Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6: 716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7161-7165, 1984)、直接マイクロインジェクション(Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101: 1094-1099, 1985)、ＤＮＡ封入リポソーム(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348-3352, 1979; Felgner, Sci Am. 276 (6): 102-6, 1997; Felgner, Hum Gene Ther. 7(l5): 1791-3, 1996)、細胞超音波処理(Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8463-8467, 1987)、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃(gene bombardment)(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568-9572, 1990)、および受容体媒介性トランスフェクション(Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432, 1987; Wu and Wu, Biochemistry, 27: 887-892, 1988; Wu and Wu, Adv. Drug Deli very Rev., 12:159-167, 1993)が挙げられる。
【０１１５】
本発明の特定の態様によれば、発現構築物(すなわち、実際には上記のペプチド）をリポソームに封入する。リポソームはリン脂質二重層膜と内部水性媒質とを特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは水性媒質によって隔てられた多重脂質層である。これらはリン脂質が過剰の水性溶液に懸濁されると自然に形成される。脂質成分は閉構造形成前に自己再構成し、脂質二重層間の水および溶解した溶質を取り込む(Ghosh and Bachhawat, In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C ed., New York: Marcel Dekker, pp. 87-104, 1991)。ＤＮＡのカチオン性リポソームへの導入によりリポソームから光学的複屈折液晶凝縮球への位相遷移が起こる(Radler et al., Science, 275(5301): 810-4, 1997)。これらのＤＮＡ−脂質複合体が遺伝子療法および送達用に有望な非ウイルスベクターである。
【０１１６】
in vitroにおける異質ＤＮＡのリポソーム媒介性核酸送達および発現では、非常によい結果が得られた。さらに、本発明では「リポフェクション」テクノロジーを要する種々の商業的アプローチも意図する。本発明の特定の態様によれば、リポソームとセンダイウイルス（ＨＶＪ）とで複合体を形成する。これが細胞膜との融合を容易にし、リポソームカプセル封入したＤＮＡの細胞侵入を促進することは分かっている(Kaneda et al., Science, 243: 375-378, 1989)。その他の態様によれば、リポソームを核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化するか、またはそれと併用する(Kato et al., J. Biol. Chem., 266: 3361-3364, 1991)。なおさらなる態様によれば、リポソームをＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体化するか、またはそれらと併用する。このような発現構築物はin vitroおよびin vivoでの核酸移入および発現における使用に成功したことから、これらは本発明に適用できる。
【０１１７】
治療用遺伝子をコードする核酸の細胞への送達に使用できるその他のベクター送達系としては、受容体媒介性送達ビヒクルが挙げられる。これらはほぼ全ての真核生物細胞における受容体媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取込みをうまく利用する。種々の受容体は細胞種特異的な分布をしているため、送達は高度に特異的でありうる(Wu and Wu, 1993, 上記)。
【０１１８】
一般に、受容体媒介性遺伝子ターゲッティングビヒクルは、２成分：細胞受容体特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤からなる。いくつかのリガンドは受容体媒介性遺伝子移入に用いられてきた。最も広く知られているリガンドが、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）(Wu and Wu, 1987, 上記)およびトランスフェリン(Wagner et al., Proc. Nat'l. Acad Sci. USA, 87(9): 3410-3414, 1990)である。最近では、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が、遺伝子送達ビヒクルとして用いられ(Ferkol et al., FASEB J., 7: 1081-1091, 1993; Pexales et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 4086-4090, 1994)、さらに上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ)が遺伝子を扁平上皮癌細胞へ送達するのに用いられている(Myers, EPO 0273085)。
【０１１９】
その他の態様によれば、送達ビヒクルがリガンドとリポソームとを含んでなる。例えば、Nicolau et al.(Methods Enzymol., 149: 157-176, 1987)はラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドを使用し、リポソームに組み込んで肝細胞によるインスリン遺伝子の取込みの増大が観察された。このように、リポソームを用いてまたは用いなくとも多くの受容体−リガンド系によって治療用遺伝子をコードする核酸を特定の細胞種に特異的に送達することが可能である。
【０１２０】
本発明の他の態様によれば、発現構築物がｎａｋｅｄ  組換えＤＮＡまたはプラスミドだけからなる。構築物の導入は物理的または化学的に細胞膜を透過させることが可能な上記のいずれかの方法によってなし遂げられる。これはin vitroにおける導入に特に適しており、またin vivoにおける使用にも適合する。Dubensky et al.,(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7529-7533, 1984)は、ポリオーマウイルスＤＮＡのＣａＰ０４沈降物としての成体および新生マウスの肝臓および脾臓への注入に成功し、活性ウイルス複製および急性感染を証明した。また、Benvenisty and Neshif(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 9551-9555, 1986)はプラスミドＣａＰ０４沈降物の直接腹腔内注射によってトランスフェクトした遺伝子の発現が生じることも証明した。
【０１２１】
ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ発現構築物の細胞への導入についての本発明の他の態様は、粒子衝撃に関するものである。この方法は、ＤＮＡ被覆したマイクロプロジェクタイルを、それらが細胞膜を貫通し、それらを死滅させることなく細胞に侵入することが可能な高速に加速する能力によるものである(Klein et al., Nature, 327: 70-73, 1987)。小粒子を加速するためのいくつかの装置が開発された。あるこのような装置は高圧放電を利用するものであり、生じた電流がその推進力となる(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568-9572, 1990)。用いるマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金ビーズなどの生物学的に不活性な物質で構成される。
【０１２２】
遺伝子送達をin vivoおよびex vivo状況に適合させる方法については、当業者ならば十分に周知なことである。ウイルスベクターの場合には通常ウイルスベクター材料を調製する。ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１または１×１０１２感染粒子を患者に送達する。リポソームまたはその他の非ウイルス製剤の場合でも、相対的取り込み効率を比較することによって同様の数字が予想される。医薬上許容される組成物としての製剤は以下で説明する。
【０１２３】
種々の腫瘍型に対して様々な経路が考えられる。経路についての以下の節では有力な候補経路についての広範なリストを示している。実際にはいずれの腫瘍にも全身送達を意図する。これは特に、顕微鏡的または転移性の癌の攻撃に重要であることが分かる。離散性の腫瘍塊が確認される場合には様々な直接、局部的および限局性アプローチが採られる。例えば、腫瘍に直接発現ベクターまたはタンパク質を注射してもよい。切除前、切除中または切除後に腫瘍床を治療してもよい。一般的には、切除後、外科処置後にも配置されているカテーテルによってベクターを送達する。
【０１２４】
II.  免疫療法
一般に、免疫療法では癌細胞を標的化して破壊する免疫エフェクター細胞および分子の使用を利用する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞表面のいくつかのマーカーに対して特異的な抗体である。抗体単独で治療用のエフェクターとして作用しうるし、または実際に細胞致死をもたらすその他の細胞を補充もしうる。また、抗体を薬剤または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と結合して単に標的化剤として用いてもよい。別法では、エフェクターが直接または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０１２５】
本発明に関しては、抗体、抗体複合体または免疫エフェクター細胞によって治療に向けて選択された腫瘍を標的化し、さらに免疫療法と併用される本発明のペプチドによって腫瘍の脈管構造を標的化することにより複合的な治療効果を得ることが可能である。
【０１２６】
併用療法での一般的なアプローチについては、以下で説明する。本発明に関しては、２Ｅ１１Ｄ１１および抗ポドプラニン抗体がリンパ管内皮細胞を特異的に認識できることが判明したため、細胞傷害性薬剤によってこれらの細胞を標的化することができる。従って、種々の癌に関連するリンパ管新生を本明細書に記載の方法を用いて阻害してもよい。
【０１２７】
いくつかの態様では、抗体を用いて治療用タンパク質をリンパ管内皮細胞に向ける。これらの治療法は、抗リンパ管新生および／または抗血管形成治療として特に有用であるが、本発明はこれらの有益な効果に限定されるものではないと考えられる。組成物の投与は全身または局部的であってよく、治療上有効な量のタンパク質の単一箇所への注射も含まれる。本発明の治療用組成物の投与では、例えば、静脈内、筋肉内、皮下または長期投与用のカテーテルをはじめとする当業者ならば周知のいずれの経路も考えられる。また、治療用組成物を患者の複数箇所に送達させてもよいと考えられる。同時に複数箇所の投与を行ってもよいし、または数時間にわたって投与してもよい。特定の症例では、治療用組成物の連続流を提供することが効果的である。付加治療として定期的に、例えば、１日１回、週１回または月１回管理する。さらに、化学療法薬をリンパ管内皮細胞に向けてもよい。本発明の治療用途に有用なこのような薬剤については以下でさらに詳細に記載している。
【０１２８】
III．  免疫療法、従来の化学または放射線療法との併用療法
ＤＮＡ損傷剤耐性の腫瘍細胞は、臨床腫瘍学における大きな問題となっている。現在の癌研究の１つの目標は化学および放射線療法の効果を向上させる方法を見つけることである。１つには、このような従来の治療法と遺伝子療法とを併用した方法がある。例えば、単純ヘルペス−チミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔｋ）遺伝子をレトロウイルスベクター系により脳腫瘍に送達すると、抗ウイルス薬ガンシクロビル感受性がうまく誘導された(Culver et al., 1992)。本発明のある具体例では、本発明のペプチドを化学または放射線療法的介入、免疫療法と、またはその他の抗血管形成／抗リンパ管新生療法と併せて投与してもよいと考えられる。
【０１２９】
一般に、本発明の方法および組成物を用いて、細胞を死に至らしめる、Ｔ細胞増殖を阻害する、転移を阻害する、血管形成を阻害する、あるいはそうでなければ、悪性表現型の腫瘍細胞を改善するまたは減少させるためには「標的」細胞、腫瘍またはその脈管構造を少なくとも２つの異なる治療用組成物と接触させる。これらの組成物は、癌細胞および／または癌細胞を供給してそれを発する血管およびリンパ管の内皮の増殖を絶つおよび／または阻害することによって、癌の増殖を絶つおよび／または阻害するのに有効な混合量で提供されるであろう。この方法では、細胞をペプチドまたは発現構築物および薬剤または因子と同時に接触させる必要がある。これは細胞を両方の薬剤を含有する単一組成物または薬理学的製剤と接触させることにより、または細胞を２つの異なる組成物または製剤と同時に接触させることにより達成されうる。
【０１３０】
あるいは、２つの異なる処置を数分間〜数週間という間隔で分割してもよい。２種類の療法を別々に管理する態様では、一般に、第１および第２の療法がなお有利な併用効果を与えうるように、各送達の合間に有効期限が終了しないようにする。このような場合では、両方の治療を互いに約１２〜２４時間以内、さらに好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に行い、遅延時間が約１２時間のみであることが最も好ましいと考えられる。しかしながら、治療期間をかなり延長することが望ましいと思われる状況もあり、その場合には各投与の間に数日（２、３、４、５、６または７）〜数週（１、２、３、４、５、６、７または８）間が経過する。１種または両方の療法による反復治療が特に意図される。特定の態様によれば、癌細胞を死に至らせる、阻害する、または壊死させるように癌細胞を直接攻撃する抗癌治療を遂行し、併せて、抗血管形成および／または抗リンパ管新生効果に基づく治療用組成物も投与する。抗リンパ管新生組成物はその他の抗癌剤の後、その他の抗癌剤の前、または実際にはその他の抗癌剤と同時に投与してもよい。
【０１３１】
併用療法での使用に好適な薬剤または因子は、細胞に適用するとＤＮＡ損傷を誘導する全ての化合物または治療方法である。このような薬剤または因子としては、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などのようなＤＮＡ損傷を誘導する放射線および波動が挙げられる。「化学療法薬」としても記載される種々の化合物は、ＤＮＡ損傷を誘導する働きをするものであり、その全てが本明細書に記載の併用療法に有用であるとされる。有用と考えられる化学療法薬としては、例えば、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カンプトセシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）および過酸化水素までも挙げられる。また、本発明は、放射線に基づくものであっても、または実際の化合物であってもよい、Ｘ線とシスプラチンとの併用またはシスプラチンとエトポシドとの併用などの１種以上のＤＮＡ損傷作用因子の組合せの使用も包含する。
【０１３２】
本発明による癌の治療においては、腫瘍細胞および／または腫瘍血管の内皮を抗リンパ管新生治療薬と併せて作用因子と接触させる。これは限局した腫瘍部位にＸ線、ＵＶ光線、γ線あるいはマイクロ波などの放射線を照射することによって達成されうる。あるいは、被験体にアドリアマイシン、５−フルオロウラシル、エトポシド、カンプトセシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、またはシスプラチンなどの化合物を含んでなる治療上有効な量の医薬組成物を投与することによって腫瘍細胞を薬剤と接触させてもよい。また、キナーゼ阻害剤も本発明のペプチドとの併用療法に有用であると考えられる。この薬剤は、引用することにより本明細書の一部とされる、２００１年１月１７日出願の米国特許第６０／２６２、４７６号に記載のものなどのＶＥＧＦ−Ｃ／Ｄ阻害剤ペプチドと合わすことによって、併用療法用組成物、またはキットとして調製され、用いられる。
【０１３３】
核酸、特にＤＮＡを直接架橋する薬剤はＤＮＡ損傷を促進するため、抗リンパ管新生薬との相乗的抗新生物性の組合せを生み出すと考えられる。シスプラチンなどの薬剤、およびその他のＤＮＡアルキル化剤が用いられる。シスプラチンは臨床応用に用いる有効用量３週間おきに５日間２０ｍｇ／ｍ２、合計３クールにより癌の治療に広く用いられている。シスプラチンは経口摂取されないため、静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内注射によって送達する必要がある。
【０１３４】
また、ＤＮＡを損傷させる薬剤としては、ＤＮＡ複製、有糸分裂および染色体分離を妨げる化合物が挙げられる。このような化学療法化合物としては、ドキソルビシンとしても知られるアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどが挙げられる。新生物の治療で広く臨床応用されるこれらの化合物は、アドリアマイシンの場合の２１日おきに２５〜７５ｍｇ／ｍ２からエトポシドの場合の３５〜５０ｍｇ／ｍ２までの範囲の量での静脈内ボーラスによる、静脈内または静脈内用量を２倍にした経口投与が行われる。
【０１３５】
また、核酸前駆体およびサブユニットの合成および忠実性を混乱させる薬剤によってもＤＮＡ損傷が起こる。それによって、多くの核酸前駆体も開発された。広範な試験を受けた、容易に入手可能な薬剤が特に有用である。従って、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ)などの薬剤は、この薬剤が新生物細胞を標的化するのに特に有用なものとなる新生物組織付近で、優先的に用いられる。５−ＦＵは相当な毒性があるが、様々な担体により、一般的に用いられる３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量での局所、または静脈内投与などによって適用できる。
【０１３６】
例証として、以下に化学療法薬およびこのような薬剤の投与によって管理されることがわかってきた癌を挙げる。これらの化学療法薬と本発明のペプチドとの併用が種々の新生物性疾患の軽減に有用であることが分かるであろう。これらの化合物の例としては、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても知られる）、ＶＰ−１６（エトポシドとしても知られる）など、ダウノルビシン（ＤＮＡにインターカレートし、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを遮断し、ＤＮＡ合成を阻害する）が挙げられる。マイトマイシン（ミュータマイシンおよび／またはマイトマイシンＣとしても知られる）は抗腫瘍活性を有することが分かってきた放線菌(Streptomyces caespitosus)のブロスから単離された抗生物質である。全身療法に反応しない腫瘍が放射線療法を増強することでも知られるダクチノマイシンの局所潅流に反応することもあることから、アクチノマイシンＤもまた本発明のペプチドと組み合わせて使用するのに有用な薬剤であると考えられる。また、これは一次手術、放射線療法、およびその他の薬剤、特に、ビンクリスチンおよびシクロホスファミドとの組合わせでも用いられ、ユーイング腫瘍、カポジ肉腫および軟組織肉腫、絨毛癌、転移性睾丸癌、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫に対して有効であることが見出された。
【０１３７】
ブレオマイシンは放線菌(Streptomyces verticillus)株から単離された細胞傷害性糖ペプチド抗生物質の混合物であり、単一薬剤としてまたは頭頸部（口、舌、扁桃、鼻咽頭、中咽頭、洞、口蓋、唇、頬粘膜、歯肉、喉頭蓋、喉頭を含む）、皮膚、陰茎、子宮頸管、および外陰部などの扁平上皮細胞癌において立証されたその他の承認化学療法薬との組合わせで、以下の新生物の管理に有効である。また、これはリンパ腫および睾丸癌の治療においても用いられている。
【０１３８】
シスプラチンは転移性睾丸または卵巣癌、進行性膀胱癌、頭部または頸部癌、子宮頸癌、肺癌またはその他の腫瘍などの癌の治療に広く用いられてきたが、本発明のペプチドと組み合わせても有用であると考えられる。ＶＰ１６（エトポシド）は睾丸腫瘍の治療には主としてブレオマイシンおよびシスプラチンと組み合わせて用いられるが、肺の小細胞癌にはシスプラチンと組み合わせて用いられる。これは非ホジキンリンパ腫、急性非リンパ性白血病、乳癌、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に伴うカポジ肉腫に対しても活性である。ある種類の癌細胞を死に至らしめ、サイトカイン産生を活性化し、マクロファージおよび内皮細胞を活性化し、コラーゲンおよびコラゲナーゼの生成を促進する腫瘍壊死因子［ＴＮＦ；カケクチン］糖タンパク質は炎症メディエーター、さらに敗血性ショックのメディエーターでもあり、異化、発熱および睡眠を促す。ＴＮＦは単独で有効量で用いた場合にはかなりの毒性があるため、最善の計画では恐らくその他の薬剤と組み合わせて低用量で用いられるであろう。その免疫抑制作用がγ−インターフェロンによって増強されるため、その組合せは潜在的に危険である。また、ＴＮＦとインターフェロン−αとのハイブリッドも抗癌活性を有することが認められた。
【０１３９】
タクソール、トネリコ、セイヨウイチイ(Taxus brevifolia)の樹皮から最初に単離された細胞分裂抑制薬、およびその誘導体パクリタクソールは乳癌に対して有効であることが確認されており、本発明の併用療法においても用いられる。ビンクリスチンに対する有益な反応は、その他の様々な新生物、特に、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、脳腫瘍、横紋筋肉腫、および乳房、膀胱、および男性および女性生殖器官の癌を有する患者で報告されている。また、ビンブラスチンもビンクリスチンと同じ癌において有用な治療用物質として示されている。ビンブラスチンは転移性睾丸腫瘍の治癒的治療においてブレオマイシンおよびシスプラチンともに頻繁に臨床に用いられる。また、これはカポジ肉腫、神経芽細胞腫およびレッテレル・シヴェ病（ヒスチオサイトーシスＸ）、ならびに女性の乳癌および絨毛癌においても活性である。
【０１４０】
アルケラン、Ｌ−フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、Ｌ−ＰＡＭ、またはＬ−サルコリシンとしても知られるメルファランはナイトロジェンマスタードのフェニルアラニン誘導体である。メルファランは選択的ヒト新生物性疾患に対して活性である二官能性アルキル化剤である。メルファランは、メドファランとして知られるＤ−異性体の活性なＬ−異性体であり、これは特定の動物腫瘍に対する活性が低く、染色体に影響を与えるのに必要な量はＬ−異性体で必要な量よりも多い。メルファランは経口投与に好適な形態で入手可能であり、多発性骨髄腫の治療に用いられている。多発性骨髄腫を有する患者の約３分の１〜２分の１が、薬剤の経口投与に好反応を示すことを示唆する確証も得ることができる。メルファランは上皮性卵巣癌の治療においても用いられている。
【０１４１】
シクロホスファミドは、胃腸管内で安定し、耐容性に優れ、経口および非経口経路によって有効であり、局部的発疱疹、壊死、静脈炎または痛みすら生じない。クロラムブシルは、ナイトロジェンマスタード種の二官能性アルキル化剤であり、選択されたヒト新生物性疾患に対して活性であることが認められている。クロラムブシルは、慢性リンパ性（リンパ球性）白血病、リンパ肉腫、巨大濾胞性リンパ腫およびホジキン病をはじめとする悪性リンパ腫の治療において必要である。これは、これらの疾患のいずれにおいても治療効果はないが、臨床的に有用な苦痛緩和をもたらしうる。
【０１４２】
ＤＮＡ損傷を引き起こす、広範に用いられているその他の因子としては、γ線、Ｘ線および／または放射性同位元素の腫瘍細胞への直接送達として一般的に知られているものが挙げられる。また、その他の種類のＤＮＡ損傷因子としてマイクロ波およびＵＶ照射なども考えられる。これらの因子が全て、多様なＤＮＡ損傷をＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の構成および維持において行う可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は長期（３〜４週間）の場合の１日線量５０〜２００レントゲンから１回線量２０００〜６０００レントゲンまでの範囲である。放射性同位元素の線量範囲は、広く多様であり、同位元素の半減期、照射する放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存している。
【０１４３】
当業者は"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33、特にpages 624-652を教示とする。治療する被験体の症状に応じて線量の変更を行う必要がある。いずれにせよ、投与責任者が各被験体に好適な線量を決定する。さらに、ヒト投与では、調製物がFDA Office of Biologics standardsの定めるところによる無菌性、発熱性、総括的な安全性および純度基準を満たさなければならない。
【０１４４】
本発明者らは、治療効果のＶＥＧＦＲ−３関連癌を有する患者への局所送達が、疾患の影響を弱めるための治療上有効な遺伝子の送達には極めて有効な方法であることを提示している。同様に、化学または放射線療法も被験体の特定の罹患部位を対象としてよい。もう１つの方法として、発現構築物および／または薬剤の全身送達も特定の状況において、例えば、広範な転移が起こっている場合には好適でありうる。
【０１４５】
上記の抗癌治療用物質の他、本発明のペプチドをその他の血管形成阻害剤と組み合わせてもよいと考えられる。本発明のペプチドは、抗リンパ管新生および抗血管形成特性のいずれもを有すると思われる。また、多くの抗血管形成剤もリンパ管新生特性を有しうる。http:/cancertrials.nci.nih.gov/news/angioは米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)が維持する、抗血管形成剤を用いて現在行われている試験に関する最新情報を提供するウェブサイトである。これらの薬剤としては、例えば、マリマスタット（British Biotech, Annapolis MD；非小細胞肺、小細胞肺および乳癌に用いられる）；ＡＧ３３４０（Agouron, LaJolla, CA；多形性膠芽腫)；ＣＯＬ-３（Collagenex, Newtown PA；脳腫瘍）；ネオバスタット（Aeterna, Quebec, Canada；腎臓および非小細胞肺癌）；ＢＭＳ−２７５２９１（Bristol-Myers Squibb, Wallingford CT；転移性非小細胞肺癌)；サリドマイド（Celgen；黒色腫、頭頸部癌、卵巣、転移性前立腺、およびカポジ肉腫；再発性または転移性結腸直腸癌（補助薬を使用）；婦人科肉腫、肝臓癌；多発性骨髄腫；ＣＬＬ、再発性または進行性脳癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺、非転移性前立腺、難治性多発性骨髄腫、および腎癌）；スクアラミン（Magainin Pharmaceuticals Plymouth Meeting, PA；非小細胞癌および卵巣癌)；エンドスタチン（EntreMEd, Rockville, MD；固形腫瘍）；ＳＵ５４１６（Sugen, San Francisco, CA；再発性頭頸部、進行性固形腫瘍、IIIBまたはIV期乳癌；再発性または進行性脳（小児））；卵巣、ＡＭＬ；神経膠腫、進行性悪性腫瘍、進行性結腸直腸、フォンヒッペルリンダウ病、進行性軟組織；前立腺癌、結腸直腸癌、転移性黒色腫、多発性骨髄腫、悪性中皮腫；転移性腎臓、進行性または再発性頭頸部、転移性結腸直腸癌）；ＳＵ６６６８（Sugen San Francisco, CA；進行性腫瘍）；インターフェロン−α；抗ＶＥＧＦ抗体（National Cancer ln stitute, Bethesda MD; Genentech San Eranscisco, CA；難治性固形腫瘍；転移性腎細胞癌、未治療進行性結腸直腸）；ＥＭＤ１２１９７４（Merck KCgaA, Darmstadt, Germany；ＨＩＶ関連カポジ肉腫、進行性または再発性異型性神経膠腫）；インターロイキン１２（Genetics Institute, Cambridge, MA；カポジ肉腫）およびＩＭ８６２（Cytran, Kirkland, WA；卵巣癌、結腸および直腸起源の未治療転移性癌ならびにカポジ肉腫）が挙げられる。薬剤の後に続く説明的な情報はこれらの試験で薬剤を用いる対象となる癌を示している。これらの疾患は本発明のペプチド単独または列挙した薬剤と組み合わせて治療しうると考えられる。
【０１４６】
今後、これらの治療がリンパ管内皮細胞に与える効果は、本発明によって単離されたリンパ管内皮細胞を用いて試験することができることであるということができる。これらの細胞を単離する方法の適用性によって、リンパ管内皮細胞の疾患の管理についてのより有効な治療プロトコールの開発が可能になる。
【０１４７】
Ｆ．  さらなる治療薬を同定するためのアッセイ方法
また、本発明は、これらの細胞のＶＥＧＦＲ−３受容体活性、細胞増殖、リンパ管新生能力などのようなこれらの細胞の特徴を調節する（増強するまたは減弱する）化合物のスクリーニングにおける本発明のリンパ管内皮細胞の使用も提供する。これらのアッセイでは種々の異なる方法を利用するが、スクリーニングを行う対象となる「活性」の種類に応じたものとなる。考えられる機能的「読み出し」機構としては、ＶＥＧＦＲ−３と基質との結合；リガンドと受容体との結合が挙げられ、通常移動アッセイまたはその他の機能的アッセイは内皮細胞活性をモニタリングするのに使用される。内皮細胞のこのような機能的アッセイについては当業者ならば十分に周知であり、いくつかの典型的なアッセイについては本文書の他の場所に記載している。
【０１４８】
ａ．  アッセイ方法
本発明は、このような活性を候補物質の存在および不在下でモニタリングし、さらにこのような結果を比較することによって、ＶＥＧＦＲ−３活性の阻害剤についてスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング技術がＶＥＧＦＲ−３活性を阻害し、低下させ、抑制するために働く化合物の一般的な同定に有用であることは立証されると考えられる。このような化合物は、新生脈管形成を特徴とし、例えば、リンパ腫、リンパ水腫、固形癌、および特に引用することにより本明細書の一部とされる、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６１３３に記載されたものなどのその他の疾患、ＶＥＧＦＲ−３受容体関連疾患の例を挙げるならば、特に、限定されるものではないが、遺伝性リンパ水腫、リンパ水腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ管腫症、リンパ管拡張症および頸部水嚢胞をはじめとする疾患などの様々な疾患の治療に有用である。
【０１４９】
これらの態様では、本発明は候補物質の本発明のリンパ管内皮細胞のＶＥＧＦＲ−３活性を阻害する能力を調べる方法を対象とする。一般に、この方法は以下の：
（ｉ）本発明の単離リンパ管内皮細胞培養物を準備し、
（ii）前記培養物を候補物質と接触させ、さらに
（iii）工程（ii）の細胞培養物の活性または特徴を候補物質の不在下で観察された細胞培養物の活性または特徴と比較する
工程を含み、
なおここで、細胞培養物の活性または特徴における変化が、前記候補物質が前記細胞のモジュレーターであることを示す。
【０１５０】
活性を調節し、または本発明の細胞の特徴を改変することが可能な候補物質を上記のアッセイにおいて同定するため、添加される候補物質の不在下での活性または特徴を測定し、または調べる。次いで、候補物質を細胞培養物に添加し、候補物質の存在下での活性または特徴を調べる。その不在下で観察される活性に対して活性を改変する候補物質がモジュレーター能力を有する候補物質であることを示す。
【０１５１】
上記の方法では、本発明の培養細胞の活性または特徴を一般に記載しているが、候補物質がＶＥＧＦＲ−３の生成を改変し、それによってＶＥＧＦＲ−３の単位当たり活性と対比して存在するＶＥＧＦＲ−３量を増加させるまたは減少させる薬剤であることは分かるであろう。同様に、候補は細胞の増殖を数および／または大きさにおいて拡大または縮小するものであると思われる。さらに、上文での記載は単離リンパ管内皮細胞培養物の使用を対象にしたものであるが、血管内皮細胞に作用するまたは受容体およびその成分を調節する治療薬の同定にも同様のアッセイが提供しうることは分かるであろう。
【０１５２】
ｂ．  候補物質
本明細書において使用する「候補物質」とは、リンパ管内皮細胞の活性または特徴を調節することが可能な分子をいう。特定の態様によれば、この分子はＶＥＧＦＲ−３のそのリガンドとの結合活性を調節するものである。別の場合では、候補物質はＶＥＧＦＲ−３受容体／リガンド相互作用の下流での影響、例えば、受容体自己リン酸化反応を調節すると考えられる。候補物質はタンパク質またはその断片、小分子阻害剤、または核酸分子ですらありうる。これはスクリーニングアッセイを用いた同定に最も有用な薬理学的化合物が、ＶＥＧＦＲ−３活性のその他の公知のモジュレーターと構造に関係がある化合物である場合であることは分かるであろう。活性な化合物は天然化合物の断片または一部を含んでいるか、またはそうでなく不活性な公知の化合物の活性な組合せとしてしか見つけられないであろう。しかしながら、ヒトまたは動物モデルでのこのような化合物の試験に先立ち、種々の候補を試験してこれらが治療薬としての可能性があるか否かを調べる必要がある。
【０１５３】
従って、活性な化合物は天然化合物の断片または一部を含んでいるか、またはそうでなく不活性な公知の化合物の活性な組合せとして見つけられるであろう。よって、本発明は細胞ＶＥＧＦ受容体を調節する薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。動物、細菌、真菌、葉および樹皮をはじめとする植物起源、ならびに海洋サンプルなどの天然起源から単離された化合物を候補として潜在的に有用性のある医薬物質の存在についてアッセイすることを提示している。
【０１５４】
また、スクリーニングしようとする医薬物質が、化学合成品または合成化合物から誘導し、または合成することができることは分かるであろう。よって、本発明によって同定された候補物質がポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤または合理的医薬品設計によってＶＥＧＦ受容体の公知のモジュレーターから設計しうるその他の無機もしくは有機化合物でありうることも分かるであろう。
【０１５５】
候補スクリーニングアッセイは計画および実施が簡単である。上文で述べたように、候補物質についてのアッセイでは、本発明の単離リンパ管内皮細胞集団を準備した後、候補物質をリンパ管内皮細胞の特異な測定可能な活性が生じ、または特異な特徴が観察できる条件下で細胞集団と混合する。この方法で、候補物質の不在下での候補物質の細胞の活性または特徴を調節する能力も測定できる。
【０１５６】
「有効な量」とは、ある特定の状況では、特定の事象、すなわち、細胞の活性または表現型をそれら正規のレベルと比較して再生可能な方法で改変するのに有効な量である。活性において重大なる適切な変化を達成する化合物が用いられる。
【０１５７】
例えば、移動アッセイ、細胞増殖アッセイ、受容体結合、自己リン酸化反応などを用いて測定される活性または機能的特徴における重大な変化は、少なくとも約３０％〜４０％の活性の増強／減弱、最も好ましくは、少なくとも約５０％（当然のことではあるが、もっと高い値をとる可能性もある）の変化によって表される。また、本発明の活性化合物は、後にさらなるこのようなモジュレーターを検出し、定量する分析および調製技術において用いる抗体の作製にも用いられる。
【０１５８】
本発明の単離細胞培養は、当技術分野で公知の多くのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイに改めることができる。総説については、Jayawickreme and Kost, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 629-634 (1997)を参照。また、自動化および小型化ＨＴＳアッセイも、例えば、Houston and Banks Curr. Opin. Biotechnol. 8: 734-740 (1997)に記載されるように意図される。
【０１５９】
小分子モジュレーターの同定に用いられる、化学物質ライブラリー、天然物ライブラリーおよびランダムまたは設計ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子で構成されるコンビナトリアルライブラリーをはじめとする多くの異なるライブラリーがある。化学物質ライブラリーは、公知の化合物の構造的類似体または天然物スクリーニングまたは潜在的な治療標的に対するスクリーニングによるヒットまたはリードとして同定された化合物で構成される。天然物ライブラリーは微生物、動物、植物、昆虫、または海洋生物由来の生成物質のコレクションであり、これらは、例えば、土壌、植物または海洋生物のブロスの発酵および抽出による混合スクリーニングの開発に用いられる。天然物ライブラリーにはポリペプチド、非リボソーム性ペプチドおよびその非天然型変異体が含まれる。総説については、Science 282:63-68 (1998)を参照。コンビナトリアルライブラリーは多数のペプチドオリゴヌクレオチドまたは有機化合物の混合物で構成されている。従来の自動合成方法、ＰＣＲクローニングまたはその他の合成方法による作製は比較的簡単である。特に注目すべきは、ペプチド、タンパク質、ペプチドミメティック、マルチパラレル合成コレクション、組換えおよびポリペプチドライブラリーを含むライブラリーであることである。コンビナトリアルライブラリーおよびそれから作製されるライブラリーの総説については、Myers Curr. Opin. Biotechnol. 8: 701-707 (1997)を参照。記載した様々なライブラリーを使用して同定された候補モジュレーターは、その後、例えば、合理的医薬品設計によって細胞の活性を調節するよう最適化される。
【０１６０】
当然のことではあるが、本発明の全てのスクリーニング方法は、有効な候補が発見されないかもしれないという事実にもかかわらず、それ自体で有用であることは分かるであろう。本発明はこのような候補を発見する方法だけでなく、それらについてスクリーニングする方法を提供する。
【０１６１】
ｃ．In vitroアッセイ
ある特定の態様によれば、本発明は種々の結合アッセイを包含する。これらではリガンド−受容体複合体の阻害剤または受容体機能に代わる、ＶＥＧＦＲ−３と結合しうる分子についてスクリーニングし、さらにそれによって天然リガンドとこの受容体との結合を改変し、さらにその活性に作用することを含めることができる。このようなアッセイでは、細胞は溶液中に遊離しているか、または支持体と結合している。リガンドか、または細胞の受容体のいずれかを標識することによって、結合の判定が可能になる。
【０１６２】
このようなアッセイは、自動化およびハイスループットに大いに改めることができる。化合物のハイスループットスクリーニングについてはＷＯ８４／０３５６４に記載されている。多数の小ペプチド試験化合物がプラスチックピンまたはその他の表面などの固相マトリックス上で合成されている。ペプチド試験化合物を細胞と反応させ、洗浄する。結合したポリペプチドを種々の方法によって検出する。特に、好適なペプチド試験化合物を作出するコンビナトリアル法が意図される。
【０１６３】
この方法において特に注目すべきは、これらの細胞におけるＶＥＧＦＲ−３受容体の天然リガンドの種々の異なる変異体のスクリーニングである。欠失、末端切断、挿入および置換変異体をはじめとするこれらの変異体は、リガンド／受容体相互作用と関係しているドメインを同定する手助けする。ひとたび、この領域を解明すれば、これらの変異体のうち、改変構造を有するが、この相互作用の機能の一部または全てを保持しているものを同定することができる。
【０１６４】
精製したリガンドは、上記の薬剤スクリーニング技術で用いるプレートに直接コーティングすることができる。また、ポリペプチドに対する非中和抗体を用いて、ポリペプチドを固相に固定することもできる。さらに、反応領域（好ましくは末端領域）を含む融合タンパク質を用いて、リガンド活性領域を固相と連結してもよい。
【０１６５】
その他の種類のin vitroアッセイでは、機能の読み出しを含むものがある。このようなアッセイでは、物質を適宜調製し、その化学的性質を受けて、さらに細胞と接触させる。アッセイによっては培養が必要となる場合がある。その後、上記のような多くの異なる生理学的アッセイによって、細胞を調べる。あるいは、分子解析を行って細胞の特徴を調べてもよい。これにはアッセイ、例えば、タンパク質発現、酵素機能、基質の利用、ｍＲＮＡ発現（全細胞またはポリＡ  ＲＮＡのディファレンシャル・ディスプレイなど）などについてのものが必要であろう。
【０１６６】
Ｇ．  診断アッセイにおける細胞の使用
特定の態様によれば、本発明の方法が細胞の成分の機能または活性、例えば、ＶＥＧＦＲ−３／リガンド相互作用における異常を有する状態または疾病の診断に用いられる。例えば、本発明の方法を用いてリンパ管内皮細胞関連疾患を有する疑いのある患者の細胞を単離する。細胞のポリヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションまたはＰＣＲアッセイに用いて、発現に関連する疾病の存在を検出する。このような方法は本質的に定性的または定量的であり、サザンもしくはノーザン解析、ドットブロットまたはその他のメンブレンテクノロジー；ＰＣＲテクノロジー；ディップスティック、ピン、チップおよびＥＬＩＳＡテクノロジーが挙げられる。これらの技術の全てが当技術分野では十分に周知のものであり、商業的に入手可能な多くの診断キットの基礎である。
【０１６７】
さらに、このようなアッセイは、動物研究における特定の治療上の処置計画の効果の評価、臨床試験、または各患者の治療のモニタリングにおいて有用である。疾病診断の基礎を提供するためには、例えば、ＶＥＧＦＲ−３受容体発現についての正常または標準プロフィールを確立する必要がある。一般に、これには正常被験体からリンパ管内皮細胞を準備し、さらにそれ由来の疾病マーカーの好適なハイブリダイゼーションまたは増幅を実施する必要がある。標準ハイブリダイゼーションは、正常被験体で得られた値を希釈した一連のマーカーと比較することにより定量しうる。正常サンプルから得られた標準値と、特定の疾患について診断しようとする被験体の細胞サンプルから得られた値とを比較する。標準および被験体値間の偏差によって、疾病の存在を確立する。
【０１６８】
ひとたび、疾病が確立されたら、治療薬を投与し、さらに治療プロフィールを作成する。このようなアッセイを定期的に繰り返してプロフィールの値が正常または標準パターンに向かっているか、または戻っているかを評価する。一連の治療プロフィールを用いて数日または数ヶ月間にわたる治療の効果が示される。
【０１６９】
米国特許第４，６８３，１９５号および第４，９６５，１８８号に記載のＰＣＲ。このようなアッセイに用いるオリゴマーは一般に化学合成されるが、本明細書の上文に記載したように、これらを酵素的に作製してもよいしまたは組換え源から作製してもよい。一般に、オリゴマーは２つのヌクレオチド配列（一方はセンス方向、もう一方はアンチセンス方向）を含んでおり、特定遺伝子または病気の同定に最適な条件下で用いられる。密接な関係があるＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出および／または定量では、同じ２つのオリゴマー、入れ子構造のオリゴマー、または変性オリゴマープールが、あまりストリンジェントでない条件下で用いられる。
【０１７０】
さらに、特定分子の発現を定量する方法としては、ヌクレオチドの放射性同位体標識(Melby et al., J Immunol Methods 159: 235-44, 1993)またはビオチン化(Duplaa et al., Anal Biochem 229-36, 1993)、対照核酸の同時増幅、および試験結果が補間された標準曲線が挙げられる。複数サンプルの定量は、目的のオリゴマーが種々の希釈物として提供され、分光学的または比色反応によって迅速な定量が得られるＥＬＩＳＡ様式でアッセイを実施することにより迅速化するであろう。保健専門家は、この種の確定診断によって積極的治療を開始し、病状のさらなる悪化を防ぐことが可能になる。同様に、治療中の患者の経過をモニタリングするためにもさらなるアッセイを用いることができる。
【０１７１】
Ｈ．キット
本発明は、上記の方法を用いてリンパ管内皮細胞を単離するためのキットに関する。このようなキットには、キット、標準ＶＥＧＦ受容体リガンド、バッファーなどが含まれる。本発明では、リンパ管内皮細胞を特異的に検出するのに使用しうる特異的抗体を同定するため、このような成分のいずれかまたはその両方がキットにおいて提供される。従って、キットでは好適な容器手段内に、標準となるリンパ管または血管内皮細胞成分、リンパ管内皮細胞と優先的に結合する一次抗体、および免疫検出試薬が含められている。
【０１７２】
キット形式内に供給できる本発明のさらに別の組成物は、非リンパ管系統のその他の細胞が実質的に混入していないリンパ管内皮細胞および非血管系統のその他の細胞が実質的に混入していない血管内皮細胞である。細胞は培養フラスコでの増殖培養物として供給するか、または低温保存細胞として提供する。また、細胞系キットには好適な培地、増殖サプリメントおよび細胞の増殖に用いるべき増殖条件についての説明書も含まれる。
【０１７３】
特定の態様によれば、リンパ管内皮細胞と結合する一次抗体をカラムマトリックスまたはマイクロタイタープレートのウェルなどの固相支持体と結合させる。
【０１７４】
このキットの免疫検出試薬には、既定の抗体または抗原と結合するまたは連結する検出可能な標識、および二次結合リガンドと結合するまたは接着する検出可能な標識をはじめとする種々の形式のうちのいずれか１つが採用される。典型的な二次リガンドが、一次抗体または抗原に対する結合親和性を有する二次抗体、およびヒト抗体に対する結合親和性を有する二次抗体である。
【０１７５】
本キットに用いるさらなる好適な免疫検出試薬としては、一次抗体または抗原に対する結合親和性を有する二次抗体とともに、二次抗体に対する結合親和性を有する検出可能な標識と連結した三次抗体を含む二成分試薬が挙げられる。
【０１７６】
キットには、検出アッセイ用の標準曲線を作成するのに用いうる適宜等分した量の増殖または低温保存細胞（標識したものでも非標識のものでもよい）をさらに含めてもよい。
【０１７７】
キットには抗体−標識複合体を、完全結合形、中間体形、またはキットの使用者によって結合される独立した部分、のいずれかとして含めてもよい。キットの成分は水性媒質または凍結乾燥形態のいずれかにパッケージングされる。
【０１７８】
一般に、キットの容器手段としては、抗体または抗原を入れ、好ましくは、適宜等分ための、少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他の容器手段が挙げられる。二次もしくは三次結合リガンドまたはさらなる成分を提供する場合、一般にキットにはこのリガンドまたは成分を入れるための二次、三次またはその他のさらなる容器がさらに含められる。一般に、本発明のキットは市販用に厳重な管理下で抗体、抗原およびその他の試薬容器を収容するための手段も含む。このような容器としては、所望のバイアルを入れておく射出形成または吹込形成プラスチック容器が挙げられる。
【０１７９】
Ｉ．  リンパ管内皮細胞のイメージング
本発明による方法のさらなる使用は、特定組織のリンパ管内皮細胞の存在を調べるための組織イメージングである。このような診断イメージングの使用は、例えば、リンパ系疾患患者の組織像を捉えるのに特に好適である。さらに、腫瘍塊またはその近隣のリンパ管も本発明によりイメージングしうる。これまで、当業者はＶＥＧＦＲ−３抗体を、例えば、米国特許第６，１０７，０４６号（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載のようなイメージング用途で使用してきた。本発明に記載の２Ｅ１１Ｄ１１および関連抗体は、米国特許第６，１０７，０４６号で開示される抗体による方法と同様にイメージングに用いうると考えられる。
【０１８０】
本発明のイメージング剤（すなわち、本明細書を通じて記載する抗体または抗体誘導体）を、好適な超磁性、常磁性、高電子密度、音響発生または放射性物質と共有または非共有結合させて標的とされるイメージング剤とする。このような態様によれば、イメージング剤が上記の技術を用いてイメージングされるリンパ管内皮細胞および局在部位に集中する。
【０１８１】
当技術分野では多くの好適なイメージング剤が知られているが、標識剤と本発明のペプチドとを接着する方法も同様である（例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第４，９６５，３９２号、同第４，４７２，５０９号、同第５，０２１，２３６号および同第５，０３７，６３０号を参照）。イメージング剤は、医薬上許容される担体により被験体に投与され、リンパ管内皮細胞を有する標的部位に集積する。そして、このイメージング剤が標的部位のＸ線、磁気共鳴、超音波またはシンチグラムイメージングの造影剤として働く。本発明の抗体は便宜であり、癌、リンパ水腫およびその他のリンパ管内皮細胞障害の診断調査用の医用イメージングツールの有効な蓄積への重要な追加となる。当然のことではあるが、被験体の組織を生検によって準備し、リンパ管内皮細胞の存在を本明細書に記載のイメージング剤と、組織を調製し、固定するための組織化学的な技術とを組み合わせて用いて検出するイメージングがin vitroにおいて実施されることは分かるであろう。
【０１８２】
本発明のイメージング剤に有用な常磁性イオンとしては、例えば、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、およびエルビウム（III）が挙げられる。Ｘ線イメージングに有用なイオンとしては、限定されるものではないが、ランタナム（III）、金（III）、鉛（II）、および特にビスマス（III）が挙げられる。診断用の放射性同位元素としては、例えば、２１１アスタチン、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、６７銅、１５２Ｅｕ、６７ガリウム、３水素、１２３ヨウ素、１２５ヨウ素、１１１インジウム、５９鉄、３２リン、１８６レニウム、７５セレン、３５硫黄、９９ｍテクネチウム、および９０イットリウムが挙げられる。
【０１８３】
本発明による抗体は、当業者には十分に公知な技術により標識しうる。例えば、ペプチドをヨウ化ナトリウムまたはカリウムと次亜塩素酸ナトリウムなどの化学的酸化剤またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤と接触させることによってペプチドをヨウ素化することができる。抗体を、例えば、錫（II）溶液で過テクネチウム酸塩(pertechnate)を還元し、還元したテクネチウムをセファデックスカラムとキレート化させ、さらに抗体をカラムに注入することによるリガンド交換によってテクネチウム−９９ｍで標識してもよい。タンパク質およびペプチドを標識するためのこれらおよびその他の技術については、当業者ならば十分に周知である。
【０１８４】
Ｊ．  医薬組成物
多くの態様によれば、本発明において論ずる細胞またはその他の組成物は臨床用途に用いられる。従って、これらの製剤を医薬組成物として、すなわち、in vivo使用に好適な形態で製造しなければならない。一般に、これには発熱物質、ならびにヒトまたは動物にとって有害である可能性のあるその他の夾雑物を本質的に含まない組成物を製造することが必要とされる。
【０１８５】
一般的には、送達ベクターを安定させ、標的細胞による取込みを可能にさせる好適な塩およびバッファーの使用が望まれる。また、バッファーは、組換え細胞の患者への導入の際にも使用される。本発明の水性組成物は医薬上許容される担体または水性媒質に溶解したまたは分散した有効量のペプチドまたは細胞の発現ベクターを含む。また、このような組成物は接種材料としても見られる。「医薬上または薬理学上許容される」とは、動物またはヒトに投与した場合に副作用、アレルギー反応、またはその他の有害作用が生じない分子化合物および組成物をいう。本明細書において使用する「医薬上許容される担体」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌薬、等張化および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬上活性な物質におけるこのような媒質および薬剤の使用については、当技術分野では十分に知られている。従来の媒質または薬剤が本発明のベクターまたは細胞と不適合である場合を除き、治療用組成物におけるその使用も考えられる。また、補助的有効成分も組成物に配合することができる。
【０１８６】
本発明の活性組成物として、古典的医薬製剤を包含する。本発明のこれらの組成物の投与は、一般的な経路を介して標的組織に有効である限り、その一般的な経路を介したものとなる。医薬組成物は、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、くも膜下、球後、肺臓内（例えば、期間放出）を経由し、経口、舌下、経鼻、肛門、膣、または経皮送達により、または特定部位への外科的植込みによって、従来の方法にて、被験体に導入される。治療は、単回投与またはある期間にわたっての複数回投与で構成される。
【０１８７】
活性化合物は、投与に向けて、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適宜混合した遊離塩基または薬理学上許容される塩の水溶液として調製される。また、分散液はグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物、ならびにオイルにより調製できる。通常の条件での保存および使用において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【０１８８】
注射用に好適な製剤形態としては、滅菌水性溶液または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用滅菌散剤が挙げられる。あらゆる場合において、この形態は無菌でなければならず、かつ容易に注射針を通過する範囲内において流動性がなければならない。製造および保存条件下では安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を防がねばならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、好適なその混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、界面活性剤の使用により、好適な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによってもたらされる。
【０１８９】
滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、上記の種々の他の成分とともに好適な溶媒に配合し、必要により、この後に濾過滅菌を行うことによって調製する。一般に、分散液は、種々の滅菌有効成分を、基本分散媒と上記のものから必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに、配合することによって調製する。滅菌注射溶液調製用の滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は予め滅菌濾過したその溶液から、有効成分と所望の追加的成分との粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１９０】
本明細書において使用する「医薬上許容される担体」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌薬、等張化および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬上活性な物質におけるこのような媒質および薬剤の使用については、当技術分野では十分に知られている。従来の媒質または薬剤が有効成分と不適合である場合を除き、治療用組成物におけるその使用も考えられる。また、補助的有効成分も組成物に配合することができる。
【０１９１】
経口投与では、組成物に賦形剤を配合し、非内服口腔洗浄液および歯磨剤として用いてもよい。口腔洗浄液は、必要な量の有効成分を、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの好適な溶媒に配合することによって調製する。また、有効成分をホウ酸ナトリウム、グリセリン、および重炭酸カリウムを含有する殺菌洗浄剤に配合してもよい。さらに、有効成分をゲル剤、ペースト剤、散剤、およびスラリー剤といった歯磨剤に分散させてもよい。有効成分を治療上有効な量において水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤および湿潤剤を含有する歯磨ペースト剤に添加してもよい。
【０１９２】
本発明による組成物は、中性または塩形態で製造しうる。医薬上許容される塩としては、酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基とで形成）、および、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とにより形成したものが挙げられる。また、遊離カルボキシル基とで形成する塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第２鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導することができる。
【０１９３】
調剤において、溶液は投与形態に適合する様式で、かつ治療上有効な量にて投与される。製剤は注射溶液、薬剤放出カプセルなどの種々の剤形で容易に投与される。水性溶液での非経口投与では、例えば、必要であれば溶液を適宜緩衝剤で処理し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする必要がある。これらの特殊な水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に好適である。
【０１９４】
「単位投与量」とは、好適な担体に分散した治療用組成物を分割した量と定義される。例えば、ポリペプチドを非経口投与する場合、一般にポリペプチド組成物を１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲の用量、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲の用量にて注射する。非経口投与は、最初はボーラスにて、続いて製剤の治療的循環レベルを維持するために持続注入により実施する。当業者ならば、優良医療規範および各患者の臨床症状によって判断するため、有効な投与量および投与計画を容易に最適化するであろう。
【０１９５】
投与回数は、薬剤の薬物動態学的パラメーターおよび投与経路によって異なる。最適な医薬製剤は、投与経路および所望の投与量に応じて当業者により決定される。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publ. Co, Easton PA 18042) pp 1435-1712を参照。このような調剤は、投与される薬剤の物理的状態、安定性、in vivo放出速度およびin vivoクリアランス速度に影響を与える。好適な用量は、投与経路に応じて、体重、体表面積または器官の大きさにより算出される。通常、当業者は試験を行うことなく、特に、本明細書で開示する投薬情報およびアッセイ、ならびに動物またはヒト臨床試験で観察された薬物動態学的データを踏まえて、好適な治療用量の決定に必要な計算のさらなる調整を行う。
【０１９６】
好適な投与量は、関連する用量反応データと併せて血液凝固レベルを調べるための確立されたアッセイを使用することによって確定される。最終的な投与計画は、薬剤の作用を調節する因子、例えば、薬剤の特異的活性、患者の損傷および反応性の重篤度、患者の年齢、状態、体重、性別および食習慣、感染の重篤度、投与期間およびその他の臨床的因子を考慮して医師により決定される。特定の疾患および症状についての好適な投与量レベルおよび治療期間に関しては、調査を行うにつれて情報がさらに集まるであろう。
【０１９７】
ウイルス送達を用いる遺伝子療法の態様によれば、単位投与量が投与するウイルス粒子の量という形で算出される。ウイルス投与量には、指定数のウイルス粒子またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）がある。アデノウイルスに関する具体例では、指定単位投与量として、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４ｐｆｕが挙げられる。粒子投与量は感染不全粒子が存在するために少し高くなる（１０〜１００倍）場合がある。
【０１９８】
本発明による医薬組成物および治療方法が、ヒト医療および獣医療の分野で有用であることは分かるであろう。よって、治療する被験体は哺乳類、好ましくはヒトまたはその他の動物である。獣医学的用途では、被験体として、例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヤギをはじめとする家畜、イヌおよびネコなどの伴侶動物、外来および／または動物園動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターをはじめとする試験動物、ならびにニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウなどの家禽が挙げられる。
【実施例】
【０１９９】
以下の実施例は好ましい具体例を示すが、これに限定されるものではない。当業者ならば、本開示をかんがみて開示されている特定の材料および方法に様々な変更を行い、なお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることが分かるであろう。
【０２００】
実施例１
材料および方法
この例は本願を通じて、また本明細書の以下に示される実施例で用いられる材料および方法の詳細を示す。
【０２０１】
抗体および増殖因子  免疫蛍光法に用いた一次抗体は、ヒトＣＤ３１(Dako)、ｖＷＦ(Dako)およびＶＥＧＦＲ−３に対するマウスｍＡｂｓ(クローン９Ｄ９Ｆ９、２Ｅ１１Ｄ１１および７Ｂ３Ｆ９; Jussila et al., Gancer Res. 58:1599-1604, 1998)、ヒトＬＹＶＥ−１に対するウサギ校血清(Banerji et al., J. Biol.  Chem., 144(4)789-801, 1999)、アフィニティー精製ウサギ抗ヒトポドプラニン(Breiteneder-Geleff et al., Am. J. Path., 154(2) 385-394, 1999)またはウサギ抗ヒトＶＥＧＦ−Ｃ(882; Joukov et al., EMBO J., 15:290-298, 1996)であった。増殖細胞核抗原に対するモノクローナル抗体（クローンＰＣ１０）は、Santa Cruz Biotechnologyから入手した。ＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧおよびロバ抗マウスＩｇＧは、Jackson Immunoresearchから入手した。ヒトＶＥＧＦＲ−２に対するウサギ抗血清は、Lena Claesson-Welsh (Uppsala Sweden)から厚意により譲渡されたものであり、アフィニティー精製ヤギ抗ヒトＶＥＧＦＲ−１はR&D Systemsから入手した。Ａｋｔ、ＭＡＰＫまたはＣＲＥＢに対するウサギポリクローナル抗体は、New England Biolabsから入手した。ベーシックＦＧＦ、組換えヒトＶＥＧＦ１６５および組換え成熟ヒトＶＥＧＦ−Ｄ(残基Ｐｈｅ９３〜Ｓｅｒ２０１からなる）は、R&Dから入手した。組換えヒトＰＩＧＦ−１は、厚意によりGraziella Persico (Naples, Italy)から譲渡されたものであった。組換えヒトＶＥＧＦ−Ｃ（Ｔｈｒ１０３〜Ｌｅｕ２１５）、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ（Ｔｈｒ１０３〜Ｉｌｅ２２５）、ＯＲＦＶ２−ＶＥＧＦおよびヒトＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇは、これまでに記載されているようにして製造および精製した(Joukov et al., EMBO J., 16:3898-3911, 1997; Makinen et al., Nature Med.,7:199-205, 2001; Wise et al., Proc. Nat'l Acad Sci., 96:3071-3076, 1999)。ウォルトマンニン、ＬＹ２９４００２、ＰＤ９８０５９およびビスインドリルマレイミドＩ（ＧＦ１０９２０３Ｘ）は、Calbiochemから、Ｕ０１２６はPromega (Madison, WI)から入手した。
【０２０２】
細胞培養  ＨＭＶＥおよびＨＵＶＥ細胞は、PromoCell(Heidelberg, Germany)から入手し、この供給者から提供されている内皮細胞培地で培養し、継代培養3〜7代で用いた。ネズミＢａ／Ｆ３プレＢリンパ球は、１０％ウシ胎児血清、グルタミンおよび２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３(Calbiochem)を添加したＤＭＥＭで培養した。
【０２０３】
免疫蛍光染色  カバーグラス上の細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）またはメタノール：アセトン（１：１）にて１０分間固定した。必要であれば、ＰＢＳ中０．１％のトリトンＸ−１００中で５分間浸透処理した。５％ヤギ血清中でブロッキングした後、細胞を室温で３０分間一次抗体で染色し、次にＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣコンジュゲート二次抗体（１５μｇ／ｍＬ）にて３０分間インキュベートした。核染色にはHoechst 33258フルオロクロム(Sigma, ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ）を用いた。細胞が生きた状態で染色されたならば、氷上でこの手順を行った後、ＰＦＡで固定した。
【０２０４】
リンパ管および血管内皮細胞の単離  モノクローナルＶＥＧＦＲ−３抗体（クローン２Ｅ１１Ｄ１１）またはポリクローナルポドプラニン抗体、ＭＡＣＳコロイドスーパーパラマグネチックマイクロビーズコンジュゲート−ラット抗マウスＩｇＧ１または−ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)、ＭＡＣＳ  ＭＳセパレーションカラムおよびＭｉｎｉＭＡＣＳセパレーター(Miltenyl Biotech)を、製造業者の説明書に従ってセルソーティングに用いた。
【０２０５】
ＶＥＧＦＲ刺激のバイオアッセイ  ＶＥＧＦＲ−２／ＥｐｏＲ(Achen et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:548-53 1998; Stacker et al., J. Blol. Chem., 274:34884-34892, 1999)またはＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＡ(Achen et al., Eur. J. Biochem., 267: 2505-2515, 2000)を発現するＢａ／Ｆ３プレＢ細胞を用いた生存能アッセイを、これまでに記載されているように行った(Makinen et al., Nature Med.,7:199-2O5, 2001)。Ｂａ／Ｆ３  ＶＥＧＦＲ−１／ＥｐｏＲ細胞の作製のため、ヒトＶＥＧＦＲ−１ｃＤＮＡのトランスメンブランドメインをコードする配列の前にＢｇＩＩＩ部位３を導入した後に、マウスエリスロポイエチン受容体のトランスメンブランドメインと細胞内ドメインからなるＢｇＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を連結することでキメラ受容体を構築した(Achen et al., Eur J. Biochem, 267: 2505-2515, 2000))。ＶＥＧＦＲ−１／ＥｐｏＲ  ｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクターへサブクローニングし(Mizushima and Nagata, NucleicAcid Res., 18:5322, 1990)、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏベクター(Invitrogen)とともにＢａ／Ｆ３細胞へ同時トランスフェクトした。２５０ｍｇ／ｍＬゼオシンで選択することにより安定な細胞プールを作出した。
【０２０６】
バイオセンサー分析  総てのタンパク質調製物を使用直前にＳＭＡＲＴ（商標）システム(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)にインストールしたスクロース１２（３．２／３０）カラムを用いた微量分取サイズ排除ＨＰＬＣにより均一性に関して分析し、バッファー交換した(Nise and Catimel, Bioessays, 21:339-352, 1999)。Ｅ２８０  １％  １ｃｍの０−６５を用いて２８０ｎｍの吸光度により、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄの濃度を求めた。ＢＩＡコア２０００光バイオセンサー(BIAcore, Uppsala, Sweden)を用いるリガンド結合の分析に関しては、標準的なアミンカップリング化学(Nice and Catimel, Bioessays, 21:339-352, 1999)を用い、ＣＭ５センサーチップのカルボキシメチル化デキストラン層に受容体ドメインを連結した。固定化レベルは、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３それぞれ３，０００ＲＵおよび７，０００ＲＵであった。固定化した後、活性化されたエステル残基を１Ｍ塩酸エタノールアミンｐＨ８．５で処理することによりブロッキングした後、１０ｍＭジエチルアミンで洗浄して非共有結合材料を除去した。１０ｍＭジエチルアミンまたは１０ｍＭ  ＨＣｌを用い、それぞれＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｃ結合に関するアッセイ間でセンサー面を再生した。サンプルをランニングバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈した。ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓの受容体ドメインへの見かけの結合親和性は最初の解離相を分析してｋｄ値を得ることで求め、次にこれを用いて会合領域の曲線のグローバルな分析を行い、１：１ラングムリアンモデルを推定した。データはこれまでに記載されているようにBIAevaluation3.0(BIAcore, Uppsala, Sweden)を用いて解析した(Catimel et al., J. Chromatogr., 776:15-30, 1997)。
【０２０７】
内皮細胞のアポトーシス分析  アポトーシス分析については、２４ウェルプレートにウェル当たり７０，０００の細胞を播種した。処理は２回行い、死細胞検出ＥＬＩＳＡ  ＰＬＵＳキット(Roche, Indianapolis, IN)を用いて細胞質ヒストンと会合したＤＮＡ断片を測定することにより、アポトーシスを検出した。以下の範囲の増殖因子濃度を試験した：ｂＦＧＦ  １０〜２０ｎｇ／ｍＬ、ＰＩＧＦ−１  ５０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ  １０〜５０ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｃ  ５０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｄ  ５０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ  ５０〜１０００ｎｇ／ｍＬおよびＶＥＧＦ−Ｅ  ５０〜１０００ｎｇ／ｍＬ。アネキシン−Ｖ−ＦＬＵＯＳ(Roche, Indianapolis, IN)を用い、製造業者の説明書に従い蛍光顕微鏡によりアポトーシス細胞のホスファチジルセリンを検出した。壊死細胞を識別するにはヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍＬ）での同時染色を用いた。
【０２０８】
ウエスタンブロット解析  内皮細胞を３５ｍｍディッシュで密集付近まで培養し、血清フリー培地で２４時間飢餓状態にし、示されたように刺激した。示されたように刺激の１〜３時間前にウォルトマンニン（３０ｎＭ）、ＬＹ２９４００２（１０〜２０μＭ）、ＰＤ９８０５９（１０〜２５μＭ）またはＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５〜５μＭ）を加えた。阻害剤を溶かしたＤＭＳＯを対照として用いた。刺激後、細胞を溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＦ、１％トリトンＸ−１００、これに２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、１００Ｕ／ｍＬアプロチニンおよび１０μｇ／ｍＬロイペプチンを添加）中で溶解した。明澄化した溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移し、Ａｋｔ−Ｓｅｒ４７３、Ａｋｔ−Ｔｈｒ３０８、ｐ２／４４  ＭＡＰＫ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４またはＣＲＥＢ−Ｓｅｒ１３３に対するリン特異的抗体を用いてマイクロブロットした。結合した抗体はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体および増強化学発光検出系を用いて検出した。Multi-Analyst 2.0.1プログラム(Bio-Rad)を用いてシグナルの光学濃度を読みとることで定量するため、これらのブロットを掻き取り、Ａｋｔ、ＭＡＰＫまたはＣＲＥＢに対する抗体で再プロービングした。
【０２０９】
細胞移動アッセイ  移動アッセイは、４８ウェル走化性Ｂｏｙｄｅｎチャンバー(Neuroprobe Inc.)で行った。８ミクロンのヌクレオポア・ポリカーボネートフィルター(Corning)を＋４℃にて一晩１００μｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン(Upstate Biotechnology)でコーティングし、風乾した。このフィルターを、０．２％ＢＳＡを添加した血清フリー増殖培地中に増殖因子の入った下のチャンバーウェルに置いた。ブロッキング実験については、ＶＥＧおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓを１０倍モル過剰の可溶性ヒトＶＥＧＦＲ−３とともに３０分間プレインキュベートした。ＨＭＶＥ細胞を増殖培地に懸濁させ、上のチャンバーウェルの各ウェルに５０μＬ中１０，０００細胞を加えた。細胞を３７℃で６時間移動させた後、このフィルターを冷メタノールで固定し、ヘマトキシリン(Meyer)で染色した。フィルター上面の移動しなかった細胞を綿棒で掻き取って除去し、移動した細胞数を数えた。このアッセイを４回行い、３種類の異なるＨＭＶＥＣバッチを用いて繰り返した。
【０２１０】
実施例２
ヒト皮膚微小血管内皮細胞は、血管およびリンパ管内皮細胞の異なる集団からなる。
トランスフェクト細胞系にて種々のＶＥＧＦ受容体の機能が鋭意研究されてきたが、適当な細胞バックグラウンドがないために、このような研究から得られる結果は不十分なものである。従って、本発明者らは微小血管内皮細胞を、他種の内皮細胞を実質的に含まないある種の内皮細胞の特定の構成集団へと分離することにした。より詳しくは、発明者らは、血管内皮細胞を実質的に含まないリンパ管内皮細胞の集団およびその逆の集団を作製した。この作業を遂行し、内皮細胞の生存を増進するＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達経路を解明するため、発明者らは一次内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）およびヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた。ＨＭＶＥおよびＨＵＶＥ細胞の両培養物において、３種総てのＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体およびニューロピリン−１コレセプターが発現したことが判明した。これらの知見を本実施例にてさらに詳細に説明する。
ヒト一次皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞系でＶＥＧＦＲのｍＲＮＡの発現を調べるため、８μｇのｍＲＮＡを含有するノーザンブロットを、ヒトＶＥＧＦ受容体の放射標識ｃＤＮＡ断片と、対照として同じ添加量のｂ−アクチンにてプロービングした。右側の数字は転写物の大きさ（ｋｂ）を表す。ＶＥＧＦＲ−３ｍＲＮＡの発現は、微小血管内皮細胞において強いことから、これらの細胞を次の実験でＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達の研究に用いた。
【０２１１】
免疫蛍光を用い、発明者らは、ＨＭＶＥ細胞が血管およびリンパ管内皮細胞の２つの異なる集団からなることを示した。要するに、Hoechstフルオロクロムによる核の対比染色とともにＶＥＧＦＲ−３およびＬＹＶＥ−１に対する抗体を用いて免疫蛍光二重染色を行った。この免疫蛍光染色により、ＶＥＧＦＲ−３陽性細胞では、ＬＹＶＥ−１の発現は検出されないが、ＶＥＧＦＲ−３陰性細胞にはＬＹＶＥ−１抗体で弱く染色させるものもあることがわかった。また、ポドプラニン、ｖＷＦおよびＣＤ３１に対する抗体による免疫標識も行ったところ、ここでも核はHoechstフルオロクロムで染色された。この一連の二重染色実験により、ｖＷＦの発現が主としてポドプラニン陰性細胞で見られるが、ポドプラニン陽性細胞でも弱い発現が検出されることが明らかになった。ＶＥＧＦＲ−３、ＬＹＶＥ−１に対する染色、Hoechstフルオロクロムによる核の対比染色およびポドプラニンに対する染色は氷上の生細胞を用いて行い、一方、ｖＷＦおよびＣＤ３１に対する染色はＰＦＡ固定の後に行った。
【０２１２】
このように免疫蛍光顕微鏡法によって、ＨＭＶＥ細胞の一部のみがＶＥＧＦＲ−３陽性であることがわかった。抗原ブロッキング試験および３種の異なるモノクローナル抗体の使用から、ＶＥＧＦＲ−３染色が特異的なものであることがわかった。ＶＥＧＦＲ−３発現細胞は、ＶＥＧＦＲ−３陰性細胞に囲まれた明瞭な島（island）にて増殖した。ヒト組織からのこれまでの免疫染色結果に基づけば(Jussila et al., Cancer Res. 58:1599-1604, 1998; Lymboussaki et al., Am. J. Pathol., 153:395-403, 1998)、前者がリンパ管内皮細胞を、後者が血管内皮細胞を示すと推定される。これらの細胞の総てではないが、大部分とＶＥＧＦＲ−３陰性細胞のいくつかが、リンパ管内皮細胞マーカーＬＹＶＥ−１に関して染色された(Banerji et al., J. Biol. Chem., 144(4)789-801, 1999)。またＶＥＧＦＲ−３陽性細胞は、最近確認されたもう1つのリンパ管内皮マーカーであるポドプラニンでも特異的に染色された(Breiteneder-Geleff et al., Am. J. Path., 154(2)385-394, 1999)。同じ結果がＦＡＣＳ分析でも得られた。ｖＷＦ抗原は、ポドプラニン陰性である血管内皮細胞でより旺盛に発現した。全内皮細胞マーカーＣＤ３１は、総ての細胞で検出されたが、これにより非内皮細胞の混入がないことが確認される。またウエスタンブロット解析によれば、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２は両内皮細胞集団で検出された。新しく単離されたＨＭＶＥ細胞のうち、ＶＥＧＦＲ−３陽性細胞集団は通常５０％を超え、継代培養を繰り返すと低下する。
【０２１３】
実施例３
細胞生存実験に用いるＶＥＧＦＲ特異的リガンドの分析
ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ−２の活性を介して飢餓およびＴＮＦ−ａ誘導アポトーシスから内皮細胞を保護することがわかっている内皮細胞分裂促進物質である(Gerber et., J. Biol. Chem., 273:30336-30343, 1998; Spyridopoulos et al.,  J. Mol. Cell. Cardiol., 29:1321-1330, 1997)。種々のＶＥＧＦＲの内皮細胞の生存を増進する能力は、ＶＥＧＦＲ特異的ＮＥＧＦを用いることにより比較した。用いた増殖因子の特異性は、細胞生存バイオアッセイを用いて調べた。このバイオアッセイでは、Ｂａ／Ｆ３プレＢ細胞をマウスエリスロポイエチンのトランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインと融合させたヒトＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインを含むキメラ受容体で安定的にトランスフェクトした。
【０２１４】
予測されたように、ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦは、ＶＥＧＦＲ−１／ＥｐｏＲ細胞の生存を増進することができた（図１Ａ）。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびｏｒｆウイルスＮＺ２（ＯＲＦＶ２−ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦＲ−２／ＥｐｏＲ発現細胞の生存を助けることができたが、ＶＥＧＦ−３のみと結合してこれを活性化するものである突然変異変異体ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ(Joukov et al., EMBO J., 15:290-298, 1998)は、これらの細胞に影響を及ぼさなかった（図１Ｂ）。代わりに、ＶＥＧＦ−３／ＥｐｏＲ発現細胞は、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６ＳおよびＶＥＧＦ−Ｄの存在下で生存した（図１Ｃ）。これらの実験を基に、次のアポトーシスおよびシグナル伝達実験のために、ＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲ細胞生存アッセイにおいて最大活性を示すＶＥＧＦ−Ｃ濃度１００ｎｇ／ｍＬおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ濃度５００ｎｇ／ｍＬを選択した。
【０２１５】
バイオセンサー分析を用いて、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓと、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３との相互作用をさらに調べた。バイオセンサー結合曲線を解析したところ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓは、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインのみと結合し、野生型ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３受容体の双方と結合することが確認された（図１Ｄ〜図１Ｇ）。ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦの相互作用の動態解析（表１）から、受容体発現培養細胞における放射活性リガンド結合分析を用い、これまでに報告されているもの(Joukov et al., EMBO J., 16:3898-3911, 1997)より低いＫＤ値が示された。しかし、どちらのアッセイでも、ＶＥＧＦＲ−３に対するＶＥＧＦ−Ｃの親和性はＶＥＧＦＲ−２に対する親和性よりも高かった。ＶＥＧＦ−Ｃに比べ、ＶＥＧＦＲ−３に対するＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓの親和性は有意に低かったが、マウスＶＥＧＦ−ＤとマウスＶＥＧＦＲ−３との相互作用に関して報告されているものと同様の規模であった(Baldwin et al., J. Biol Chem., 276:19166-19171, 2001)。
【０２１６】
ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓと、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３との相互作用のバイオセンサー分析から得られた動態データ。これらのデータは大量変換の１：１ラングムリアンモデルを推定するBIAevaluation 3.0を用いてグローバルフィッティングにより導いた。
【表１】
2005500045.tif 000002
Baldwin et al.による研究に用いられたリガンドは、本研究で用いたＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓと同じ成熟型のＶＥＧＦ−Ｄである。一価であるｍＶＥＧＦＲ−２以外、用いた他の受容体は総て二価免疫グロブリン融合タンパク質であった。
【０２１７】
実施例４
ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達は血清飢餓誘導性アポトーシスから内皮細胞を保護する
ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＯＲＦＶ２−ＶＥＧＦをはじめ、ＶＥＧＦＲ−２もしくはＶＥＧＦＲ−３またはその双方を刺激しうる総てのＶＥＧＦは、微小血管内皮細胞を飢餓誘発性のＤＮＡ分解から保護することができ、これを細胞質ヒストン会合ＤＮＡ断片の量として測定した（図２Ａ）。これに対してＶＥＧＦＲ−１としか結合しないＰＩＧＦは、有意な保護を示さなかった。ＶＥＧＦＲ−２特異的リガンドであるＯＲＦＶ２−ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦで得られたものにほぼ匹敵する保護を示すことから、ＶＥＧＦＲ−１により媒介される生存シグナルが欠如していることも示唆された。ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓは、オリゴヌクレオソームおよびモノヌクレオソームの血清飢餓リンパ管内皮細胞への蓄積を用量依存的に阻害した。ＶＥＧＦ−Ｃの最大作用は、１００ｎｇ／ｍＬに、そしてＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓの最大作用は５００ｎｇ／ｍＬに達した。
【０２１８】
実施例５
ＶＥＧＦＲ−３発現リンパ管内皮細胞の単離
リンパ管内皮細胞と血管内皮細胞の生存に対するＶＥＧＦの作用を比較するため、特異的抗体と磁気マイクロビーズを用い、ＶＥＧＦＲ−３陽性および陰性細胞を単離および培養した。すなわち、このプロトコールでは、個別の３つのＶＥＧＦＲ−３発現リンパ管内皮細胞セットを培養し、第一のセットは５％血清を含有する完全培地で培養し、第二のセットは５％血清を含有し、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した完全培地で培養し、第三のセットは５％血清を含有し、ＶＥＧＦ−Ｃ（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加した完全培地で培養した。ＶＥＧＦＲ−３陽性細胞を血清またはＶＥＧＦ−Ｃを添加した血清にて選別して５日間増殖させた後、ポドプラニンおよび増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に関して染色した。核はHoechstフルオロクロムにて染色した。ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦを添加した場合、細胞はＰＣＮＡに関して染色された。ポドプラニンまたはＶＥＧＦＲ−３に対する抗体により、無選別細胞、またはＶＥＧＦＲ−３陰性およびＶＥＧＦＲ−３陽性細胞集団の免疫蛍光二重染色も行った。
【０２１９】
リンパ管内皮細胞培養物は、免疫蛍光染色に応じ９５を超える％純度であった。単離されたＶＥＧＦＲ−３陽性細胞は、培養でディッシュの壁面に接着せず、血清を含む完全培養培地中に、わずかな細胞が増殖したに過ぎなかった。しかし、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｃのいずれかを添加した場合、ほとんどのポドプラニン陽性細胞が容易に増殖した。これに対し、血管内皮細胞はこれらの因子を添加しなくても十分増殖した。
【０２２０】
単離されたリンパ管内皮細胞の形態は細長く、特にＶＥＧＦ−Ｃの存在下にて培養した場合には、細胞にはいくつかの突起が見られた。ポドプラニンおよびＶＥＧＦＲ−３に関する免疫蛍光は、無選別のＶＥＧＦＲ−３陰性細胞と陽性細胞集団では同じ細胞に同時に局在した。ＶＥＧＦ−Ｃを添加した培養系では、ＶＥＧＦＲ−３の細胞染色だけが見られ、これはリガンド−受容体複合体のインターナリゼーションと一致している。これに対し、血清またはＶＥＧＦの存在下では、ＶＥＧＦＲ−３は細胞表面に分布していた。
【０２２１】
実施例６
ＶＥＧＦ−Ｃは主としてＶＥＧＦＲ−３発現リンパ管内皮細胞の生存を増進する
細胞質モノクローナルヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの蓄積を、血清飢餓状態での２種の内皮細胞集団におけるアポトーシスの徴候として測定した。ＶＥＧＦＲ−３発現細胞では、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦの両者が細胞の生存を増進した（図２Ｂ）。しかし、ＶＥＧＦＲ−３陰性細胞では、ＶＥＧＦ−Ｃは効果の低い生存因子であり、ＶＥＧＦＲ−３陽性細胞で検出されたものと同等の作用に対して５〜１０倍高い濃度を要した。予測されたように、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６ＳはＶＥＧＦＲ−３陽性細胞の生存のみ促進した（図２Ｂ）。これらの結果から、ＶＥＧＦＲ−３単独で内皮細胞生存シグナルを伝達できること、また、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｃが血管およびリンパ管内皮細胞を示差的にターゲッティングすることが確認された。リンパ管内皮細胞集団の増殖を選択的に増進することができれば、これらの細胞種の細胞培養系をさらなる富化させることができる。
【０２２２】
血清飢餓誘発性アポトーシスはまた、蛍光コンジュゲートリン脂質結合タンパク質アネキシン−Ｖを用い、細胞表面のホスファチジルセリンの露出を分析することによってもモニタリングした。アネキシン−Ｖで染色された細胞は、血清飢餓状態の２４時間後から７２時間まで検出され、接着細胞の約４０％がアポトーシスと起こしていたが、継代初期および密集状態では細胞はアポトーシスに対する耐性が高かった。
【０２２３】
飢餓培地にＶＥＧＦを添加すると、アネキシン−Ｖ陽性を示す細胞数も細胞の解離も減少した。ＨＭＶＥ細胞のアネキシン−Ｖ染色は、血清フリー培地単独（ＢＳＡ）またはＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦ−Ｃの刺激を加えて、培養７２時間後に行った。ポドプラニンに対する抗体を用いた同時染色を用いて、リンパ管内皮細胞と血管内皮細胞を識別した。この染色プロトコールを用いると、アポトーシスアネキシン−Ｖ陽性リンパ管内皮細胞およびアポトーシス血管内皮細胞の検出が可能であった。ここで再び、核をHoechstフルオロクロムで対比染色した。アネキシン−Ｖ陽性細胞は、ヨウ化プロピジウムで染色されないことから、それらは壊死ではなくアポトーシス細胞を呈した。一方、Hoechstフルオロクロムによる核染色では、アポトーシスを受けている細胞に典型的な濃縮核が明らかとなった。これらの濃縮核はまたＴＵＮＥＬ染色に関して陽性であった。興味深いことにＶＥＧＦ−Ｃ特にＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓによる刺激で主としてリンパ管内皮細胞の生存が高まった（図３）。アネキシン−Ｖ陽性細胞の数はポドプラニン陰性細胞で、またＢＳＡおよびＶＥＧＦで処理された培養物においても高かった（図３）。これは血管内皮細胞がＶＥＧＦ−Ｃを産生するがリンパ管内皮細胞は産生せず、それらはリンパ管内皮細胞の生存をおそらく増進しうることから、ある程度の直接的作用を示すと考えられる。
【０２２４】
実施例７
ＶＥＧＦＲ−３のリン酸化はＰＩ−３−キナーゼ依存性のＡｋｔ活性化をもたらす
背景で論じたように、増殖因子が細胞の生存を増進しうる主要なシグナル伝達経路は、ＰＩ−３−キナーゼと、その下流にある標的セリン−トレオニンキナーゼＡｋｔを用いている。Ａｋｔに対する種々のＶＥＧＦの作用を、リン特異的抗体を用い、セリン４７３およびトレオニン３０８におけるＡｋｔリン酸化を評価することによって分析した。Ａｋｔは、ＶＥＧＦ、ＯＲＦＶ２−ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６ＳまたはＶＥＧＦ−Ｄにて刺激されたＨＭＶＥ細胞ではＳｅｒ４７３によりリン酸化されるが、ＰＩＧＦにて刺激されたＨＭＶＥ細胞ではリン酸化されないことがわかった。このことから、Ａｋｔは、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−２により伝達される増殖因子シグナルによって活性化されるが、ＶＥＧＦＲ−１によって伝達されるものでは活性化されないことが示された。Ａｋｔ  Ｔｈｒ３０８リン酸化においても同様の上昇が検出された。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ウォルトマンニン（３０ｎＭ）およびＬＹ２９４００２（２０μＭ）は、検討したＶＥＧＦの総てに応答してＡｋｔリン酸化を無効にしたが、このことはＶＥＧＦＲ−３により媒介されるＡｋｔ活性化はＶＥＧＦＲ−２に関してこれまでに示されているように(Gerber et al., J. Biol. Chem., 273:30336-30343, 1998; Thakker et al., J. Biol. Chem., 274:10002-10007, 1999)ＰＩ３−キナーゼによって伝達されることを示している。
【０２２５】
Ａｋｔは、ＨＭＶＥＣのＶＥＧＦへの暴露から２０〜３０分後に最大にリン酸化されるが、ＶＥＧＦ−Ｃにより誘導されるＡｋｔリン酸化は１０分にピークがあることがわかった（図４）。明らかに対照的に、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓで刺激するとＡｋｔリン酸化は遅くなり、３０〜４０分にピークがある。下流標的の活性化に違いがあることは、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３によるＡｋｔのリン酸化は、異なる経路によって伝達されるのではないかと示唆される。ＶＥＧＦＲ−２はＰＩ３−キナーゼの調節ｐ８５サブユニットと構成的に会合するので(Thakker et al., J. Biol. Chem., 274:10002-10007, 1999)、おそらく従来の経路によりＡｋｔリン酸化のシグナルを伝達する可能性がある。これに対し、本発明者らも他者も、ＶＥＧＦＲ−３の自己リン酸化後のｐ８５とＶＥＧＦＲ−３との会合、またはＰＩ３−キナーゼ活性の刺激を検出することができていない(Borg et al., Oncogene, 10:973-984, 1995; Pajusola et al., Oncogene, 9:3545-3555, 1994)。
【０２２６】
実施例８
ＶＥＧＦ−ＣによるＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３の同時刺激によって、ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ活性化の持続が起こる
本発明者らは、ＶＥＧＦ−Ｃ刺激時にＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３により同時にシグナル伝達されると、ＨＭＶＥ細胞においてｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ活性化の持続が起こることを証明した。ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫの活性化は、リン−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４−ＭＡＰＫ特異的抗体を用いたウエスタンブロット法およびリン−Ｓｅｒ１３３特異的抗体を用いたＣＲＥＢリン酸化により検出した。増殖因子の使用濃度は、ＶＥＧＦ１０ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｃ１００ｎｇ／ｍＬおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ５００ｎｇ／ｍＬとした。さらに本試験から、ＨＭＶＥ細胞においてＶＥＧＦＲ−３により誘導されるｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ活性化はタンパク質キナーゼＣによって媒介されることがわかった。ＨＭＶＥ細胞におけるｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ  Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４のリン酸化、ＣＲＥＢ  Ｓｅｒ１３３のリン酸化およびＡｋｔ  Ｓｅｒ４７３のリン酸化に対するＧＦ１０９２０３Ｘによるタンパク質キナーゼＣ、ＰＤ９８０５９によるＭＥＫ１、およびＬＹ２９４００２によるＰＩ−３キナーゼの阻害作用。増殖因子の使用濃度は、ＶＥＧＦ１ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｃ１０ｎｇ／ｍＬ、およびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ５００ｎｇ／ｍＬとした。
分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路は、増殖因子に依存する細胞生存に関連するもう１つの機構である。本発明者らは、ＨＭＶＥ細胞においてＶＥＧＦ−Ｃの刺激時に、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３による同時シグナル伝達がｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫの活性化の持続をもたらすことを証明した。ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫの活性化は、リン−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４−ＭＡＰＫ特異的抗体を用いたウエスタンブロット法およびリン−Ｓｅｒ１３３特異的抗体を用いたＣＲＥＢリン酸化により検出した。
【０２２７】
本発明者らは、ＨＭＶＥ細胞においてＶＥＧＦ−Ｃ１５６ＳによるＶＥＧＦＲ−３刺激の後にＭＡＰＫの活性化が検出されることを示した。しかし、これらの細胞ではＶＥＧＦＲ−２リガンドＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｃによって誘導されたＭＡＰＫのリン酸が有意に強かった。ＶＥＧＦ−Ｃ刺激後も、ＶＥＧＦ刺激後も、ＭＡＰＫの活性化は１０〜２０分にピークがあったが、ＶＥＧＦにより誘導される活性化は、少なくとも６時間持続するＶＥＧＦ−Ｃにより誘導されるものよりも一時的であった。
【０２２８】
ＭＡＰキナーゼの下流では、ＭＡＰＫにより活性化されるキナーゼＲｓｋは、Ｓｅｒ１３３において転写因子ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）をリン酸化し、プロ生存遺伝子の転写を増強することにより細胞の生存を増進することがわかっている(Bonni et al., Science, 286:1358-1362, 1999)。ｐ４２／ｐ４４活性化と相関するＣＲＥＢのリン酸化は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−ＣによるＨＭＶＥＣの刺激後には検出されたが、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓによる刺激後には検出されなかった。ＡｋｔもまたＣＲＥＢをリン酸化するが(Du and Montminy, J. Biol. Chem., 273:32377-32379, 1998)、ＬＹ２９４００２によるＡｋｔの阻害はＣＲＥＢのリン酸化には影響を及ぼさなかった。これに対して、ＰＤ９８０５９またはＵ０１２６によるＭＥＫ１（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）の阻害は、ＶＥＧＦ−Ｃを阻害したが、ＶＥＧＦにより誘導されるＣＲＥＢのリン酸化は阻害しなかった。
【０２２９】
さらに本発明者らは、ＶＥＧＦＲ−３により誘導されるＭＡＰＫの活性化がＰＫＣを媒介とすることを見出した。ＶＥＧＦにより誘導されるＭＡＰＫカスケードの活性化は従来のＲａｓ経路の代わりにタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を媒介とすることが示されている(Doanes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 255: 545-548, 1999; Takahashi et al., Oncogene, 18:2221-2230, 1999; Yoshiji et al., Cancer Res., 59:4413-4418, 1999)。ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓにより誘導されるＭＡＰＫ活性化に対するＰＫＣ阻害の作用を検討するため、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓの最小濃度を滴定したところ、リン特異的抗体を用いたウエスタンブロット法により測定すると最大のｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ活性化が得られた。これらの条件で、ＧＦ１０９２０３ＸによるＰＫＣの阻害は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓにより誘導されたｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫのリン酸化およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｃにより誘導されたＣＲＥＢのリン酸化を完全にブロックした。また、ＰＤ９８０５９によるＭＥＫ１の阻害の結果、ＶＥＧＦ−Ｃ刺激時のＣＲＥＢのリン酸化は低下した。驚くことに、この処理によってはＶＥＧＦにより誘導されるＣＲＥＢのリン酸化は阻害されなかった。このことと合致して、最近の研究では、ＶＥＧＦにより誘導されるＣＲＥＢのリン酸化は、ＰＫＣおよびｐ３８  ＭＡＰＫを媒介とするが、ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫは媒介としないことがわかっている。
【０２３０】
実施例９
ＶＥＧＦＲ−３は内皮細胞の移動を誘導する
内皮細胞の移動は血管新生に重要な役割を果たし、ＶＥＧＦにより誘導される移動シグナルの少なくともいくつかは、ＰＩ３−キナーゼによって伝達される(Gille et al., J. Biol. Chem., 276:3222-3230, 2001; Gille et al., EMBO J., 19:4064-4073, 2000; Qi and Claesson-Welsh, Exp. Cell Res., 263:173-182, 2001)。ＶＥＧＦＲ−３が欠損している胚は、血管が再構築できないために死に至るので(Dumont et al., Science, 282:946-949, 1998)、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達も内皮細胞の移動に関与するかどうかという問題は、さらに検討するに値するものであった。Boydenチャンバーアッセイにおいて、種々のＶＥＧＦの存在下、ＨＭＶＥ細胞をインキュベートした。ＶＥＧＦは、１０倍の細胞移動刺激を誘導し、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄの作用は、ＶＥＧＦの作用にほぼ匹敵するものであった（図５）。さらに、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓは、ＨＭＶＥ細胞の移動も誘導し、これは１０倍モル過剰の可溶性ＶＥＧＦＲ−３により特的にブロックされた（図５の右のグレーのバー）。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ−３によるシグナル伝達が内皮細胞の移動誘導に十分なものであることを示している。
本発明の組成物および方法を好ましい実施形態として記載してきたが、当業者ならば本発明の概念、精神および範囲を外れることなく本明細書に記載の方法にバリエーションを加えうることがわかるであろう。当業者に明らかなこのような同等の代替法および改変は総て本発明の精神、範囲および概念の中にあるものとする。発現ライブラリーの作製および組換えペプチドの作製および単離のための技術は当業者に周知のものであり、本発明とともに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
次の図面は本明細書の一部をなし、本発明の態様をさらに例示するために含めるものである。本明細書に示した特定の具体例の詳細な説明と組み合わせて１つ以上の図面を参照することにより、本発明はよりよく理解されるであろう。
【図１】Ａ−Ｃ  Ｂａ／Ｆ３バイオアッセイを用いた種々のＶＥＧＦの受容体特異性の解析。示された濃度における種々のＶＥＧＦの存在下でのキメラ受容体ＶＥＧＦＲ−１／ＥｐｏＲ（図１Ａ）、ＶＥＧＦＲ−２／ＥｐｏＲ（図１Ｂ）またはＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲ（図１Ｃ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞の生存能力の測定。細胞生存能力はＭＴＴアッセイを用いて決定した。データは３回のアッセイの平均値を示している（平均±ｓ．ｄ．）。  Ｄ−Ｇ  ＶＥＧＦ−Ｃ（図１Ｄ、図１Ｅ）およびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ（図１Ｆ、図１Ｇ）と、ＶＥＧＦＲ−３（図１Ｄ、図１Ｆ）およびＶＥＧＦＲ−２（図１Ｅ、図１Ｇ）との相互作用のバイオセンサー解析。キメラ受容体タンパク質を、カルボキシメチル化したデキストラン表面に固定化した。増殖因子は、指定濃度で流速２０μＬ／分にて表面上に注入した。示されたセンサーグラム(sensorgram)から、同じサンプルをブランク対照チャンネルに通した場合に得られる対応シグナルを減じた。バイオセンサー解析より得た動的データを表Ｉに示す。
【図２】Ａ−Ｂ  ＶＥＧＦＲ−１ではなく、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３活性化リガンドが血清飢餓状態のＨＭＶＢ細胞のアポトーシスを阻害する。血管およびリンパ管内皮細胞の２つの細胞集団からなる血清飢餓状態のＨＭＶＢ細胞（図２Ａ）またはＶＥＧＦＲ−３抗体を用いた磁気セルソーティング(magnetic cell sorting)後に単離された細胞集団（図２Ｂ）の細胞質ヒストン関連ＤＮＡ断片（モノおよびオリゴヌクレオソーム）の測定。血清フリー培地（ＢＳＡ）にて２４時間増殖させたアポトーシス細胞の細胞質オリゴヌクレオソームの強化因子を１００（％）とした。データは３回の独立した試験の平均値を示している（平均±ｓ．ｄ．）。次の濃度の増殖因子を用いた：ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍＬ、ＰｌＧＦ  ５００ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ  ５０ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｃ  １００ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ  ５００ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｄ  ５００ｎｇ／ｍＬ、ＯＲＦＶ２-ＶＥＧＦ  ５００ｎｇ／ｍＬおよび無関係の対照タンパク質としてのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）  ５００ｎｇ／ｍＬ。
【図３】７２時間の血清飢餓後のポドプラニン陽性および陰性細胞集団におけるアネキシン(Annexin)−Ｖ陽性細胞（付着細胞の割合％)の定量。データは５つの計数領域の平均値（×４００）を示している（平均±ｓ．ｄ．）。
【図４】ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３刺激によりＰＩ３−キナーゼ依存的Ａｋｔリン酸化反応が誘導される。ＶＥＧＦ (グレーの円)、ＶＥＧＦ−Ｃ（黒色のボックス）およびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ(白い三角形)は、異なる動態によってＡｋｔのリン酸化反応を誘導した。データは３回の独立した試験における全Ａｋｔタンパク質と対比したリン酸化Ａｋｔタンパク質のシグナルの光学濃度の評価を示している（平均±ｓ．ｄ．）。
【図５】ＶＥＧＦＲ−３が内皮細胞移動を媒介する。Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒアッセイにおける異なるＶＥＧＦの存在下でのＨＭＶＥ細胞の移動。ＶＥＧＦではなくＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓにより刺激された移動が、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓと１０モル過剰の可溶性ＶＥＧＦＲ−３（薄いグレーのバー）とをプレインキュベートすることによってブロックされた。データは３回の独立した試験の平均値を示している（平均±ｓ．ｄ．）。用いた増殖因子濃度は：ＶＥＧＦ  １０ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｃ  ５００ｎｇ／ｍＬ、ＶＥＧＦ−Ｄ  ５００ｎｇ／ｍＬおよびＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ  ３μｇ／ｍＬである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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