(57)【要約】本発明はヒト受容体および膜結合タンパク質(REMAP)、およびREMAPを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、REMAPの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（e）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-15（配列番号１乃至15）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO：1-14からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:15のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％が同一であるような天然アミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO：1-15を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｅ）SEQ ID NO:1-15を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1−１５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:１６−３０（配列番号16乃至３０）を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含む請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなる方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1−1５からなる群から選択したアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（e）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO：16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:16-30を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-15からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１７の組成物。
【請求項１９】
機能性REMAPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項１７に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能性REMAPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２１に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２５】
機能性REMAPの過剰発現に関連する疾患又は病状の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２４に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
（ｂ）請求項１のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示するような方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のREMAP の発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルと請求項１１の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記抗体が、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F（ab'）2 断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかである抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項３３】
被検者のREMAP の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者のREMAP の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO：1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO：1-１５からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-15 からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロフィールを作成する方法であって、
（ａ）サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
（ｃ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程とを含む方法。
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を含むアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイで、リンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板を連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイで、基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、基板上の固有の物理的位置の各々は、基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列とは異なる配列を有するヌクレオチド分子を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
EQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体および膜結合タンパク質の核酸配列とアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、神経疾患、代謝異常、発達障害および内分泌疾患の診断・治療・予防に関する。本発明は、さらに受容体および膜結合タンパク質の核酸配列とアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
シグナル伝達は、細胞が細胞外シグナルに応答する全般的プロセスである。原形質膜でのシグナル伝達は、ホルモン、神経伝達物質または成長因子などのシグナル分子が細胞膜受容体に結合することから開始される。このように活性化された受容体によって細胞内の生化学的カスケードが誘発され、このカスケードは転写因子などの細胞内標的分子の活性化で終る。シグナル伝達のこのプロセスは、細胞増殖、分化及び遺伝子転写を含む全てのタイプの細胞機能を制御する。
【０００３】
生体膜はオルガネラと、小胞および細胞自体とを囲む。生体膜は、脂質の２重層シートから成る高度に選択的な透過性障壁であって、シートの構成素材は、ホスホグリセリド、脂肪酸、コレステロール、リン脂質、糖脂質、プロテオグリカン、およびタンパク質である。膜にはイオンポンプや、イオンチャネル、および特異的受容体類があり、受容体は外部刺激を受け、生化学的シグナルを膜の内側に伝達する。これらの膜にはまた、セカンドメッセンジャータンパク質類があって、これらのポンプやチャネルや受容体と相互作用し、これらのシグナルの伝達を増幅し調節する。
【０００４】
形質膜タンパク質
形質膜タンパク質（MP）は２群に分けられ、その分類基準は膜からのタンパク質の抽出方法である。膜の外にあるタンパク質すなわち膜表在性タンパク質の放出させるには、極端なイオン強度またはpHを用いるか、尿素などの、タンパク質相互作用の撹乱物質を用いる。膜の内側にあるタンパク質すなわち膜内在性タンパク質を放出させる唯一の方法は、膜の脂質２重層を界面活性剤で溶解することである。
【０００５】
既知の膜内在性タンパク質の大部分は膜貫通タンパク質(TM)であり、細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを特徴とする。ＴＭドメイン群は通常、１５〜２５の疎水性アミノ酸からなり、これらのアミノ酸は１つのα螺旋構造をとると予測される。ＴＭタンパク質はバイトピック（bitopic）(タイプIおよびタイプII)と、ポリトピック（polytopic）(タイプIIIおよびタイプIV)(Singer, S.J. (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6:247-96) に分類され、バイトピックタンパク質は膜を1回貫通するが、ポリトピックタンパク質には、複数の膜貫通セグメントがある。TM タンパク質は種々の重要な細胞機能を果たしており、これには、シグナル伝達に関与する細胞表面受容体タンパク質としての作用が含まれる。これらの機能は、成長因子受容体および分化因子受容体、またショウジョウバエのpecanexやfrizzledタンパク質のような受容体相互作用タンパク質、LIV-1 タンパク質、NF2 タンパク質、およびGNS1/SUR4真核生物膜内在性タンパク質によって示される。ＴＭタンパク質はまた、イオンまたは代謝産物のトランスポータ（例えばギャップ結合チャネル（コネキシン類）とイオンチャネル類）として作用し、また、細胞接着タンパク質（例えばレクチン類とインテグリン類とフィブロネクチン類）として作用する。ＴＭタンパク質は、小胞オルガネラを形成する分子（例えばカベオリン（caveolin）類）、または、細胞認識分子（例えば分化クラスター（CD）抗原、糖タンパク質、およびムチン類）に存在する。
【０００６】
多くの膜タンパク質（MP）には、タンパク質を特定の亜細胞内部位に局在させるよう働く、アミノ酸配列モチーフがある。これらのモチーフの例に、PDZドメイン群や、KDEL、RGD、NGR、およびGSL配列モチーフ群や、フォンウィルブランド因子A（vWFA）ドメイン群や、EGF様ドメイン群がある。RGD、NGR、およびGSLモチーフ含有ペプチド類は、腫瘍血管系の標的癌を治療するための薬物送達剤として用いられている (Arap, W. 他 (1998) Science, 279:377-380)。さらに、膜タンパク質にはまた、糖質認識ドメイン群(CRD)のような細胞外分子や細胞内分子と相互作用するように働くアミノ酸配列モチーフ群がある。
【０００７】
アミノ酸残基側鎖の化学修飾により、MP類が他の分子（例えば膜リン脂質）と相互作用する方法が変わる。このような化学修飾の例に、グリコサミノグリカン類や、少糖類、リン脂質類、アセチル部分およびパルミトイル部分、ADPリボース、リン酸、および硫酸基との、共有結合の形成がある。
【０００８】
膜タンパク質をコードするRNAは選択的スプライス部位を持つことがあり、これらの部位により、同一遺伝子がコードするタンパク質群が、異なるメッセンジャーRNAとアミノ酸配列とを持ち得る。スプライス変異膜タンパク質は、他のリガンドやタンパク質のアイソフォームと相互作用し得る。
【０００９】
受容体
受容体の用語は他の分子を特異的に認識するタンパク質を意味する。そのカテゴリーは広く、様々の機能を持つタンパク質が含まれる。大部分の受容体は、細胞外リガンドと結合して、成長、分化、飲食細胞運動および免疫応答の領域において細胞内応答を生じる細胞表面タンパク質である。他の受容体は、小胞体からのタンパク質の選択的な輸送を促進し、細胞内の特定の部位に酵素を局在化させる。この用語はまた、リガンドの受容体として既知の、あるいは未知の化学的組成物と作用するタンパク質や、他の細胞構成成分と相互作用するタンパク質にも適用され得る。例えば、ステロイドホルモン受容体はDNAの転写物に結合し、調節する。
【００１０】
細胞表面受容体は一般に原形質膜内在性タンパク質である。これらの受容体はカテコールアミンのようなホルモン、ペプチドホルモン、成長因子、分化因子、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ガラニン、ソマトスタチン、およびタキキニンおよび循環系で運ばれるシグナル伝達分子を認識する。
免疫系細胞上の細胞表面受容体は、抗原、抗体、および主要組織適合性複合体（MHC）結合ペプチドを認識する。他の細胞表面受容体はリガンド類に結合し、リガンドはその細胞によって取り込まれる。この受容体介在性エンドサイトーシスは、低密度リポタンパク質（LDL）、トランスフェリン、グルコース末端糖タンパク質、マンノース末端糖タンパク質、ガラクトース末端糖タンパク質、免疫グロブリン、ホスホビテロゲニン（phosphovitellogenin）類、フィブリン、プロテイナーゼ-阻害剤複合体、プラスミノーゲン活性化因子、およびトロンボスポンジンの取り込み時に機能する(Lodish, H. 他 (1995) Molecular Cell Biology, Scientific American Books, New York NY, p. 723; Mikhailenko, I. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:6784-6791)。
【００１１】
受容体プロテインキナーゼ
多くの成長因子受容体(例えば、上皮性成長因子、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子、および成長調節因子αトロンビン等)には固有のプロテインキナーゼ活性がある。成長因子が受容体に結合すると、受容体のセリン、トレオニン、またはチロシン残基の自己リン酸化が誘発される。これらのリン酸化部位は他の細胞質シグナル伝達タンパク質結合の認識部位となる。これらのタンパク質は、細胞表面での最初の受容体の活性化を最終的に特異的細胞内標的分子の活性化に結びつけるシグナル伝達経路に関与する。チロシン残基自己リン酸化の場合、これらのシグナル伝達タンパク質にはSrc 相同性(SH)ドメインと呼ばれる共通ドメインが含まれている。SH2ドメインおよびSH３ドメインはホスホリパーゼC-γ、PI-3-K p85 調節サブユニット、Ras-GTPアーゼ活性化タンパク質およびpp60c-src に存在する。(Lowenstein, E.J. 他 (1992) Cell 70:431-442).サイトカインファミリの受容体は異なった共通結合ドメインを共有しており、成長ホルモン(GH)、インターロイキン、エリスロポエチンおよびプロラクチンが含まれる。
【００１２】
他の受容体およびセカンドメッセンジャー結合タンパク質は内在性セリン/トレオニンプロテインキナーゼ活性を有する。これらにはアクチビン/TGF-β/BMP-スーパファミリ受容体、カルシウムおよびジアシルグリセロール活性化/リン脂質依存性プロテインキナーゼ(PK-C)およびRNA依存性プロテインキナーゼ(PK-P)が含まれる。さらに、線虫Twitchinを含む他のセリン/トレオニンプロテインキナーゼはフィブロネクチン様、免疫グロブリンC２様ドメインを有する。
【００１３】
Ｇタンパク質共役受容体 
今までに同定されている遺伝子の最も大きいファミリーの１つによってコードされるＧタンパク質共役受容体（GPCR）は、原形質膜での細胞外シグナルの伝達において中心的役割を果たす。GPCRが治療の標的として成功していることは歴史的に証明されている。
【００１４】
GPCRは、７つの疎水性膜貫通ドメインを有することを特徴とする膜内在性タンパク質であり、それらのドメインがまとまって逆平行アルファ（α）螺旋の束を形成するようになる。GPCRのサイズは、４００以下から１０００以上のアミノ酸に及ぶ（Strosberg, A.D. (1991) Eur. J. Biochem. 196:1-10、Coughlin, S.R. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:191-197）。GPCRのアミノ末端は、細胞外にあり、長さが可変で、多くの場合グリコシル化される。カルボキシル末端は、細胞質内にあり、通常はリン酸化される。細胞外ループは、細胞内ループと交互に現れ、膜貫通ドメインに連結している。第２及び第３細胞外ループを結びつけるシステインジスルフィド架橋は、アゴニスト及びアンタゴニストと相互作用し得る。GPCRの最も保存されたドメインは、膜貫通ドメイン及び最初の２つの細胞質ループである。膜貫通ドメインによって、受容体の構造的及び機能的特徴がある程度決まる。大抵の場合、αへリックスの束がリガンド結合ポケットを形成する。細胞外Ｎ末端セグメント、または３つの細胞外ループの内の１つまたは複数のループが、リガンド結合にも関与し得る。リガンド結合によって、受容体の細胞内部分に構造的変化が誘発されて受容体が活性化される。次に、この活性化された受容体の大きな第３の細胞内ループがヘテロ３量体であるグアニンヌクレオチド結合Ｇタンパク質複合体と相互作用し、このGタンパク質複合体が更に細胞内のシグナル伝達作用を媒介する。この細胞内のシグナル伝達作用には、サイクリックAMP（cAMP）、ホスホリパーゼC、およびイノシトール三リン酸などのセカンドメッセンジャーの活性化、並びに活性化されたGPCRとイオンチャネルタンパク質との相互作用が含まれる(Watson, S.およびS. Arkinstall (1994) The G-protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, 2-6ページ、Bolander, F.F. (1994) Molecular Endocrinology, Academic Press, San Diego CA,162-176ページ、Baldwin, J.M. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:180190等参照)。
【００１５】
GPCRには、感覚性シグナルメディエータ（例えば光及び嗅覚刺激性分子）の受容体、アデノシン、γアミノ酪酸（GABA）、肝細胞成長因子、メラノコルチン、ニューロペプチドY、オピオイドペプチド、オプシン、ソマトスタチン、タキキニン、血管作用性腸管ポリペプチドファミリー及びバソプレシン、生体アミン（例えばドーパミン、エピネフリン及びノルエピネフリン、ヒスタミン、グルタミン酸（代謝調節作用）、アセチルコリン（ムスカリン様作用）及びセロトニン）、ケモカイン、炎症の脂質メディエータ（例えばプロスタグランジン及びプロスタノイド、血小板活性化因子及びロイコトリエン）及びペプチドホルモン（例えばボンベシン、ブラジキニン、カルシトニン、C5aアナフィラトキシン、エンドセリン、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）、ニューロキニン及び甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）及びオキシトシン）がある。まだ同定されていない刺激の受容体として作用するGPCRは、オーファン受容体として知られている。
【００１６】
GPCRの最も大きいファミリーはロドプシン様GPCRからなり、ロドプシン様GPCRはホルモン、神経伝達物質及び光を含む多様な細胞外シグナルを伝達する。ロドプシンは、動物の網膜に見られる感光性GPCRである。脊椎動物では、ロドプシン分子は光受容体（杆体）細胞に見られる膜性スタックに包埋されている。各ロドプシン分子は、cGMPレベルの低下を誘発し、これにより原形質膜ナトリウムチャネルが閉鎖することにより１光子の光に反応する。この方法で、可視シグナルが神経インパルスに変換される。その他のロドプシン様GPCRは、神経伝達物質への応答に直接関与する。このようなGPCRには、アドレナリンに対する受容体（アドレナリン受容体）、アセチルコリンに対する受容体（ムスカリン様受容体）、アデノシンに対する受容体、ガラニンに対する受容体及びグルタミン酸に対する受容体（N-メチル-D-アスパラギン酸／NMDA受容体）がある（Watson, S.およびS. Arkinstall (1994) The G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, .7-9, 19-22, 32-35, 130-131, 214-216, 221-222ページ、Habert-Ortoli, E. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9780-9783に概説されている）。
【００１７】
GPCRの最大のサブファミリーである嗅覚受容体もまた、ロドプシン様GPCRファミリーのメンバーである。この受容体は、臭覚シグナルの伝達により機能する。異なる臭気を区別するためには、複数の異なる嗅覚受容体が必要である。各嗅覚知覚ニューロンは１種類の嗅覚受容体しか発現せず、異なった受容体を発現するニューロンが、鼻の経路中の異なる位置を占める。例えば、ラット脳ライブラリから単離したRA1c受容体は、脳のまさに特有の領域及び画定された嗅覚上皮の特定の区域だけに発現が限定されていることを示した（Raining, K. 他 (1998) 受容体s Channels 6:141-151）。
【００１８】
嗅粘膜もまた、さらに臭気物質結合タンパク質群を所有すると考えられている。臭気物質結合タンパク質群は別の種類の臭気物質を認識し、結合する。例えば、嗅粘膜に高度に発現されるが、他の組織では検出されないｍRNAに相当するラットのcDNA クローンが単離されている。これらのクローンによってコードされるタンパク質はリポ多糖類またはポリ塩化ビフェニル類に結合するタンパク質に相同性であり、異なったタンパク質が粘膜組織の特定の部位に発現されると考えられる。これらのタンパク質は、臭気物質受容体による特異的認識の前後で臭気物質と相互作用する、おそらく、選択的シグナルフィルタとして作用すると考えられる(Dear, T.N. 他(1991) EMBO J. 10:2813-2819; Vogt, R.G. et al. (1991) J. Neurobiol. 22:74-84)。
【００１９】
セクレチン様GPCRサブファミリーのメンバーは、セクレチン、カルシトニン、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、及び血管作用性小腸ペプチドなどのペプチドホルモンをリガンドとして有する。例えば、セクレチン受容体は、膵臓及び小腸で酵素及びイオンの分泌を刺激するペプチドホルモンであるセクレチンに対応する（前出のWatson, 278-283ページ）。セクレチン受容体は、長さが約４５０アミノ酸であり、胃腸細胞の原形質膜に存在する。セクレチンがその受容体に結合することにより、cAMPの産出が誘発される。
【００２０】
炎症及び免疫応答に結びつけられるセクレチン様GPCRの例には、EGFのモジュールを含んだムチン様ホルモン受容体（Emrl）及びCD97受容体タンパク質がある。CD97は、主に白血球で発現し、活性化されたB及びT細胞上で顕著に上方制御される（McKnight, A.J.及びS. Gordon (1998) J. Leukoc. Biol. 63:271-280）。これらのGPCRは、最近特徴付けられたEGF-TM7受容体サブファミリーのメンバーである。これら膜７回貫通ホルモン受容体は、in vivoでヘテロ二量体として存在し、３から７の潜在的カルシウム結合EGF様モチーフを含む。このEGF モチーフは長さが約４０アミノ酸残基で、６つの保存されたシステイン残基を持ち、シグネチャ配列のN末端の近くにはカルシウム結合部位がある。アスパラギン酸またはアスパラギン残基の翻訳後のヒドロキシル化はいくつかのタンパク質のEGF様ドメインと関連している (Prosite PDOC00010 アスパラギン酸およびヒドロキシル化部位)。
【００２１】
カルシウム結合EGF様ドメインシグネチャ配列を有する多数のタンパク質が成長と分化に関与している。例としては、軟骨と骨の形成を誘導する骨形態形成タンパク質１； ショウジョウバエの上皮発生タンパク質であるｃｒｕｍｂｓ；  神経の成長と分化に関与するNotchおよび多数の相同体、およびトランスフォーミング成長因子ベータ１結合タンパク質等が挙げられる(Expasy PROSITE document PDOC00913; Soler, C. および Carpenter, G.,  Nicola, N.A. (1994) The Cytokine Facts Book, Oxford University Press, Oxford, UK,  193-197ページ)。EGF様ドメインはさまざまなタンパク質のタンパク質間相互作用を媒介する。たとえば、ECM糖タンパク質フィブリン１のEGF様ドメインは自己会合とフィブロネクチンへの結合の両方を媒介することが示されている(Tran, H. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:22600-22606)。ECMタンパク質のEGF様ドメインにおける点突然変異はマルファン症候群および偽軟骨芽形成（pseudochondroplasia）等のヒトの疾患の原因として同定されている(Maurer, P. 他 (1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8:609-617)。
【００２２】
GPCR突然変異は、機能または恒常的活性化の喪失を招き得るものであり、多数のヒト疾患に関与してきた（前出のCoughlin）。例えば、色素性網膜炎はロドプシン遺伝子の突然変異から発生し得る。更に、甲状腺刺激ホルモン受容体の体細胞活性化突然変異は、機能亢進甲状腺アデノーマの原因となることが報告されており、恒常的活性化に感受性が高い或るGPCRが癌原遺伝子のように振舞い得ることを示唆している（Parma, J. 他 (1993) Nature 365:649-651）。以下のリガンド即ち黄体形成ホルモン（思春期早発症）、バソプレシンV2（X連鎖の腎原発性糖尿病）、グルカゴン（糖尿病及び高血圧）、カルシウム（副甲状腺機能亢進症、低カルシウム尿症(hypocalcuria)、高カルシウム血症）、副甲状腺ホルモン（短肢小人症）、β3-アドレナリン受容体（肥満症、非インスリン依存型糖尿病）、成長ホルモン放出ホルモン（小人症）及び副腎皮質刺激ホルモン（糖質コルチコイド欠乏症）に対するGPCR受容体には、ヒトの疾患に関連する突然変異も含まれる（Wilson, S. 他 (1998) Br. J. Pharmocol. 125:1387-.1392、Stadel, J.M. ら (1997) Trends Pharmacol. Sci. 18:430-437）。GPCRは、抑うつ症、分裂病、不眠症、高血圧、不安、ストレス、腎不全その他幾つかの心血管障害にも関与している（Horn, F. および G. Vriend (1998) J. Mol. Med. 76:464-468）。
【００２３】
更に、GPCRの活性化及び阻害に直接作用する数百の新薬が過去２０年のうちに認知されてきた。これらの薬剤の治療標的は、癌、骨粗鬆症、子宮内膜症のみならず心血管障害、胃腸障害、中枢神経系疾患を含めた広範囲の疾病及び疾患に及ぶ（前出のWilson、同Stadel）。例えば、ドーパミンアゴニストのＬドーパはパーキンソン病の治療に用いられ、ドーパミンアンタゴニストは精神分裂病及びハンチントン病の初期段階の治療に用いられる。アドレナリン受容体のアゴニスト及びアンタゴニストは、喘息、高血圧その他の心血管障害及び不安の治療に用いられてきた。 ムスカリン様アゴニストは、緑内障及び頻脈の治療に用いられ、セロトニン5HT1Dアンタゴニストは片頭痛に対して用いられ、ヒスタミンH1アンタゴニストはアレルギー性及びアナフィラキシー性反応、枯草熱、痒み及び動揺病に対して用いられる（前出のHorn）。
【００２４】
核ホルモン受容体
核受容体又は細胞内受容体とも呼ばれる核ホルモン受容体群は、１つのタンパク質スーパーファミリーを構成する。 このスーパーファミリーのメンバーは、受容体及び転写調節因子の両方である。核ホルモン受容体は、その受容体機能及び転写調節機能の両方によって、発生、恒常性、細胞増殖、及び細胞分化を含む広範な生体プロセスに影響を与える（Mangelsdorf, D. J.他 (1995) Cell 83 : 835-840 ; Wen, D. X. 及び D. P. McDonnell (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6 : 582-589 ; Perlmann, T. 及び R. M. Evans (1997) Cell 90 : 391-397 ; Tenbaum, S. 及び A. Baniahmad (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol. 29 : 1325-1341 ; Moras, D. 及び H. Gronemeyer (1998) Curr. Opin. Cell Biol. 10 : 384-391 ; Willy, P. J. 及び D. J. Mangelsdorf (1998)  Hormones and Signaling (編集： B. W. O'Malley) vol. 1, Academic Press, San Diego CA, 307-358ページ ; Weatherman, R. V.他 (1999) Annu. Rev. Biochem. 68 : 559-581.）。
【００２５】
受容体としての核ホルモン受容体
一般に、受容体とは、他の分子を特異的に認識するタンパク質を指す。核ホルモン受容体は受容体として、それらの同種リガンドを特異的に認識してそれらに結合する。核ホルモン受容体は細胞内に局在するが、多くの受容体は、細胞外リガンドと結合する細胞外の細胞表面タンパク質である。このような細胞外受容体は、成長、分化、エンドサイトーシス、及び免疫反応に影響を与える細胞応答を引き起こす。他の受容体は、小胞体からのタンパク質の選択的な輸送を促進し、細胞の特定の領域に酵素を局在化させる。核ホルモン受容体による転写調節、細胞外受容体による細胞内へのシグナル伝達、及び他の受容体によるタンパク質の輸送及び局在化は全て、受容体と様々な細胞成分との間の特異的な相互作用に依存する。多くの場合、受容体が結合する同種リガンドが同定されていない。このような受容体はオーファン受容体と呼ばれる。リガンドと結合せずに転写調節機能を果たす核ホルモン受容体もオーファン受容体である。
【００２６】
転写調節因子としての核ホルモン受容体
多細胞生物は、構造及び機能が著しく異なる多様な細胞型から構成されている。細胞型は遺伝子発現パターンの特徴によって決定され、また 異なった細胞型は発生中、重複するが固有の一組の遺伝子群を発現する。遺伝子発現の空間的及び時間的な調節は細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、及び生物の発達に必要なその他のプロセスにとって極めて重要である。核ホルモン受容体は転写調節因子として、これらの基本的な生体プロセスの調節において重要な役割を果たしている。他の転写調節因子は、細胞間伝達の仲介および様々な細胞型の作用の調整を行なう細胞外シグナルに応答して遺伝子発現に影響を与える。
【００２７】
一般に、核ホルモン受容体等の転写調節因子は、配列特異的な要領でプロモーター、エンハンサー、及び遺伝子の上流の調節領域と結合して、遺伝子転写の開始、活性化、抑制、または停止を行う。しかしながら、或る種の転写調節因子は、遺伝子コード領域内或いはその下流の調節エレメントと結合する。転写調節タンパク質が、単体で或いは他のアクセサリーファクターと複合体を形成してDNAの特定の領域に結合し得る（Lewin, B. (1990)  Genes IV, Oxford University Press, New York NY, and Cell Press, Cambridge MA, 554-570ページ）。
【００２８】
核ホルモン受容体機能のメカニズム
核ホルモン受容体は、リガンドと結合していない状態では、hsp90等の熱ショックタンパク質及びhsp56等のイムノフィリンを含むシャペロンの多タンパク質複合体と結合して存在する。これらのシャペロンは、遊離リガンドの結合が受け入れられるような不活性な状態にリガンドのない受容体を維持し、リガンドのない受容体が核に転位するのを防止する。同種リガンドによって活性化されると、核ホルモン受容体はホモ二量体又はヘテロ二量体を形成することができ、そのホモ二量体又はヘテロ二量体は核に転位して、特定のDNA配列に結合し、転写調節機能を発揮する。核ホルモン受容体の調節の役割を効果的に果たすために、活性化した核ホルモン受容体はヒストンデアセチラーゼ含有コリプレッサー複合体から解離し、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ含有コアクティベーター複合体と結合する（Xu, L.他 (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9 : 140- 147）。活性化した受容体がコアクティベータタンパク質と結合してクロマチンが再構築されることにより、転写的に開いた活性な状態になり、活性化した核受容体の転写調節エレメントに到達できるようになる（Lemon, B. D. 及び L. P. Freedman (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9 : 499-504）。
【００２９】
核ホルモン受容体の構造
核ホルモン受容体は、ホルモンシグナルを転写反応に変換してシグナルトランスデューサとして作用する。一般に、核ホルモン受容体は、可変アミノ末端ドメイン、高度に保存されたDNA結合ドメイン、及び保存されたＣ末端リガンド結合ドメインからなる。ステロイド結合核ホルモン受容体では、アミノ末端ドメインがAF-1と呼ばれるトランス活性化エレメントを匿っている。 或る種の核ホルモン受容体はまた、AF-2と呼ばれるリガンド結合ドメインにトランス活性化エレメントを含む。 核ホルモン受容体のDNA結合ドメイン及びリガンド結合ドメインは二量体化エレメントを含み得る。 また、DNA結合ドメインは核局在化シグナルを含み得る（Weatherman, R. V.他 (1999) Annu. Rev. Biochem. 68 : 559-581）。
【００３０】
核ホルモン受容体のDNA結合ドメインは、特定のDNA配列の認識を媒介する２つのZnフィンガーモチーフからなる。Znフィンガーモチーフは、Zn+2を配位結合する周期的に離間したヒスチジン残基及びシステイン残基を含む。 この配列パターンの例には、C2H2型、C4型、及びC3HC4型（「RING」フィンガー）のZnフィンガー、及びPHDドメインが含まれる（Lewin, 前出 ; Aasland, R. 他 (1995) Trends Biochem. Sci. 20 : 56-59）。Znフィンガーモチーフは、構造及び隣接状態が亜鉛イオンによって維持されている１つの逆平行βシート及び１つのαヘリックスを含む。DNAとの接触は、ヘリックスの前のアルギニン残基によって、並びにαヘリックスの第２の残基、第３の残基、及び第６の残基によってなされる。Znフィンガーモチーフは、タンパク質の各ZnフィンガーのαへリックスがDNAの二重螺旋の主な溝に接触するように、タンパク質内でタンデムに反復している。この蛋白質とDNAの間における接触が反復されることにより、強力かつ特異的なDNAタンパク質相互作用が生じる。相互作用の強さと特異性はタンパク質内におけるZnフィンガーモチーフの数によって調節される。Znフィンガーは、初めはDNAと直接相互作用する領域としてDNA結合タンパク質において見出されたが、その後DNAと結合しないタンパク質からも見出された（例えばLodish, H.他 (1995) Molecular Cell Biology, Scientific American Books, New York NY,  447-451ページ参照）。
【００３１】
核ホルモン受容体のリガンド結合ドメインは、リガンド、コアクティベータタンパク質、及びコリプレッサータンパク質との結合に関与する。このドメインは三層のαヘリックスからなり、中間の層は多数の疎水性測鎖を含む２つのヘリックスからなる（Moras, D. 及び H. Gronemeyer (1998) Curr. Opin. Cell Biol. 10 : 384-391）。従って、これらの２つの中間層のαヘリックスが、リガンド結合部位である疎水性ポケットを形成している。 この疎水性リガンド結合部位のリガンド結合は、受容体タンパク質の内部に完全に埋もれ、溶液に露出していない。このことから、リガンドの結合にはリガンド結合ドメインにおける大きな構造の変化を伴うことが示唆される。リガンド結合ドメインのαヘリックスの一つは、核受容体の二量体にサブユニット間の接触の多くを提供する。このαヘリックスはリガンド結合ポケットにおいて結合している時はそのリガンドに接触することから、リガンド結合が受容体の二量体の形成に影響を与え得ることが示唆される（Weatherman, R. V.他 (1999) Annu. Rev. Biochem. 68 : 559-581）。
【００３２】
核ホルモン受容体のクラス
核ホルモン受容体は、ステロイド受容体、RXR−ヘテロ二量体受容体、及びオーファン核ホルモン受容体の３つのクラスに大きく分類することができる。ステロイド受容体はステロイドホルモンに結合し、このクラスにはアンドロゲン受容体、ミネラルコルチコイド受容体、エストロゲン受容体、糖質コルチコイド受容体、及びプロゲステロン受容体が含まれる。RXR−ヘテロ二量体受容体は非ステロイドリガンドと結合し、このクラスには、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、ビタミンD受容体、エクジソン受容体、及びペルオキシソーム増殖因子活性化受容体が含まれる。オーファン核ホルモン受容体には、ステロイド産生因子１、神経成長因子誘導性受容体、及びＸ染色体連鎖オーファン受容体DAX-1が含まれる。
【００３３】
ステロイドホルモン受容体は、特定のステロイドホルモンと結合すると活性化する。 リガンドの結合によって起こる構造の変化により、熱ショックタンパク質から受容体が解離し、ホルモン応答エレメント（HRE）と呼ばれる特定のパリンドロームDNA配列を認識する受容体ホモ二量体が形成される。ステロイドホルモン受容体ホモ二量体はHREに結合すると標的遺伝子の転写を調節し得る。
例えばプロゲステロン受容体（PR）は、女性の生殖周期を変化させる重要な要素であるコレステロール由来のプロゲステロン即ち4-プレグネン-3,20-ジオンによって活性化されるステロイドホルモン受容体である。これらの変動は、月経及び妊娠を含む解剖学的及び形態学的変化と相関する。プロゲステロンの作用はPRによって仲介される。細胞質では、PRは、幾つかの他のタンパク質及びPRヘテロ複合体として知られる因子と結合している。このヘテロ複合体には、hsp70、hsp90、hsp27、p59 (hsp56)、p48、及びp23等のイムノフィリン及び熱ショックタンパク質が含まれる（Johnson, J. L.他 (1994) Mol. Cell. Biol. 14 : 1956-1963）。プロゲステロンの結合で活性化されたPRが核に転移し、正準DNA転写エレメントに結合して分化及び細胞周期に関係するプロゲステロン調節性遺伝子を調節する（Moutsatsou, P 及び C. E. Sekeris (1997) Ann. N. Y. Acad. Sci. 816 : 99-115）。妊娠を終了させるのに用いられ得るPRアンタゴニストRU486は、ステロイドホルモン受容体を標的とした市販の治療薬の一例である。
【００３４】
RXRヘテロ二量体核受容体は、そのグループのメンバーがレチノイドＸ受容体（RXR）とヘテロ二量体を形成するとその標的DNA配列と結合することから、ステロイドホルモン受容体と区別される（Mangelsdorf, D. J. 及び R. M. Evans (1995) Cell 83 : 841-850）。RXRの３種類のアイソフォームが同定された（Minucci, S. 及び K. Ozato (1996) Curr. Opin. Genet. Dev. 6 : 567-574）。レチノイン酸受容体（RAP）はRXRヘテロ二量体核受容体の例である。レチノイン酸（RA）は、主に魚の肝油、肝臓、卵黄、バター、及びクリームに存在する脂溶性ビタミンであるビタミンA（レチノール）の生物学的に活性な代謝産物である。9-シス-RAはRAR/RXRに結合するが、オール-トランス-RAはRXRのみと結合する。RAR/RXRヘテロ二量体は、レチノイン酸応答エレメント（RARE）として知られる特定のDNA配列と高親和的に結合するため、RA依存性転写の制御因子として作用する。
【００３５】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）は、脂肪酸及びエイコサノイドによって誘導される治療的に重要なRXR−ヘテロ二量体核受容体である。それぞれが特定の発現パターンを有するPPARの３種類の既知のイソ型が存在し、これらはグルコース及び脂質の全身の恒常性に関与する遺伝子の調節に関与する（Kliewer, S. A. 及び T. M. Willson (1998) Curr. Opin. Genet. Dev. 8 : 576-581 ; Michalik, L. 及び W. Wahli (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10 : 564-570）。従って、PPARは糖尿病、異脂肪血症、及び肥満症等の疾患の治療標的である（Smith, S. A. (1996) Pharmacol. Rev. Commun. 8 : 57-64 ; Willson, T. M. 及び W. Wahli (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1 : 235-241 ; Barroso, I.他 (1999) Nature 402 : 880-883）。
【００３６】
オーファン核受容体は、活性化するリガンドを有していない核受容体、或いはリガンド結合してもその影響がなく転写調節活性を発揮し得る核受容体である。例えば、線虫において、X染色体によってコードされる核受容体相同体SEX-1は、性決定遺伝子xol-1の転写を調節する（Carmi, I.他 (1998) Nature 396 : 168-173）。SEX-1はリガンド結合に依存するのではなく、X染色体カウント機構による性分化調節において、用量応答的に転写調節因子として影響を与える。
【００３７】
或る種の核ホルモン受容体は、通常は核ホルモン受容体ファミリーと結合する通常のDNA結合ドメインを含まない。DAX-1は、通常のDNA結合ドメインを含まない核ホルモン受容体の一つであって、DAX-1における突然変異は先天性X染色体連鎖副腎形成不全を引き起こすことが分かっている（Zanaria, E. F.他 (1994) Nature 372 : 635-641）。DAX-1はオーファン核受容体であって、ステロイド産生因子１（SF-1）と直接相互作用する（Ito, M.他 (1997) Mol. Cell. Biol. 17 : 1476-1483）。 DAX-1はまた、性特異的遺伝子発現におけるSF-1の作用を調節する能力がある（Nachtigal, M. W.他 (1998) Cell 445-454）。SF-1は、副腎及び生殖腺の幾つかのステロイド産生酵素遺伝子の転写調節因子として作用するオルファン核受容体であり、（Lala, D. S.他 (1992) Mol. Endocrinol. 6 : 1249-1258 ; Lynch, J. P. 他 (1993) Mol. Endocrinol. 7 : 776-786 ; Clemens, J. W. 他 (1994) Endocrinology 134 : 1499-1508）、下垂体性腺刺激細胞で発現される幾つかの遺伝子も調節し得る（Barnhart, K. M. 及び P. L. Mellon (1994) Mol. Endocrinol. 8 : 878-885 ; Ingraham, H. A. 他 (1994) Genes Dev. 8 : 2302-2312 ; Halvorson, L. M. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271 : 6645-6650 ; Keri, R. A. 及び J. H. Nilson (1996) J. Biol. Chem. 271 : 10782-10785）。
【００３８】
SF-1はまた小ヘテロ二量体（SHP ; short heterodimer partner）パートナーの強力なトランス活性化因子として作用する（Lee, Y. K. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274 : 20869-20873）。SHPもまた、通常のDNA結合ドメインを含まない核ホルモン受容体である（Seol, W. 他 (1996) Science 272 : 1336-1339 ; Lee, H.-K. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273 : 14398-14402）。SHPは核ホルモン受容体ファミリーの多くのメンバーと相互作用する。 その中には、レチノイド受容体、エストロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体、及びオーファン受容体CARが含まれる。SHPは、エストロゲン受容体への結合においてコアクティベーターと競合することで、エストロゲン受容体仲介性転写活性化のインヒビターとして作用する（Johansson, L. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274 : 345-353）。SHPはまた、オーファン受容体肝細胞核因子４及びレチノイドX受容体によってトランス活性化を阻害する（Lee, Y. K. 他 (2000) Mol. Cell. Biol. 20 : 187-195）。
【００３９】
不完全な転写調節による結果
ヒトにおける腫瘍疾患の多くは不適切な遺伝子発現によって起こり得る。悪性の細胞成長は、腫瘍促進遺伝子の過剰な発現又は腫瘍抑制遺伝子の不十分な発現によって起こり得る（Cleary, M. L. (1992) Cancer Surv. 15 : 89-104）。染色体転座によって、或る遺伝子のコード配列を別の関連のない遺伝子の調節領域と結合させるキメラ座（chimeric loci）が生成され得る。このような配列は不適切な遺伝子転写を引き起こし、悪性腫瘍を引き起こす可能性もある。
【００４０】
更に、免疫系は、細胞防御機構の漸進的な選択、増幅、及び動員を調整するイベントのカスケードを活性化することにより感染や外傷に応答する。遺伝子の活性化及び抑制の複雑かつバランスの取れたプログラムが、このプロセスに関与している。しかしながら、遺伝子発現の不適切或いは不十分な調節によって起こる免疫系の過度の活性化は、組織や器官に相当な損傷を与え得る。この損傷は、関節炎、アレルゲン、心臓発症、発作、及び感染に関連する免疫応答についての文献に詳しく記載されている（例えばIsselbacher 他 (1996) Harrison's Principles of Internal Medicine, 13/e, McGraw Hill, Inc. and Teton Data Systems Software参照）。
【００４１】
更に、多細胞生物の成長は発生の適切な段階における細胞分化の誘導及び調整に基づいている。このプロセスの中心は、体中の細胞及び組織に固有性を与える示差的な遺伝子発現である。発生中に遺伝子発現の調節に失敗すると発生障害が起こり得る。
【００４２】
リガンド依存性受容体イオンチャネル
リガンド依存性受容体イオンチャネルは2つのカテゴリーに分かれる。第1のカテゴリーである細胞外リガンド依存性受容体イオンチャネル(ELG)は、神経伝達物質結合を迅速なシナプス神経伝達のような電気シグナルに急速に変換する。ELG機能は翻訳後修飾によって調節される。第二のカテゴリーである細胞内リガンド依存性受容体イオンチャネル(ILG)は多くの細胞内セカンドメッセンジャーによって活性化され、チャネル開放応答に作用する際、翻訳後修飾を必要としない。
【００４３】
ELGは、活動電位の発生の閾値にまで興奮性細胞を脱分極する。非興奮性細胞においては、ELGはアゴニストの存在時に限られたカルシウムイオン流入を可能にする。ELGにはアセチルコリン、L-グルタミン酸、グリシン、ATP、セロトニン、GABAおよびヒスタミンのような神経伝達物質によって直接制御されるチャネルが含まれる。ELG遺伝子は構造的かつ機能的に強い類似性を有するタンパク質をコードする。ILGは異なった、関連しない遺伝子ファミリによってコードされ、また、cAMP、 cGMP、カルシウムイオン、 ATPおよびアラキドン酸の代謝産物に対する受容体群を含む。
【００４４】
マクロファージスカベンジャー受容体
マクロファージスカベンジャー受容体類は広いリガンド特異性を持っており、低密度リポタンパク質（LDL）や外来抗原との結合に関与し得る。スカベンジャー受容体タイプIおよびIIは三量体膜タンパク質であり、各サブユニットには小さいN末端細胞内ドメインと、１つの膜貫通ドメインと、１つの大きな細胞外ドメインと、C末端システインリッチドメインとがある。細胞外ドメインには１つの短いスペーサードメインと、１つのα螺旋コイルドコイルドメインと、１つの３重螺旋コラーゲン性ドメインとがある。これらの受容体は或る範囲のリガンド群と結合することが示され、リガンドの例には、化学修飾されたリポタンパク質およびアルブミンと、ポリリボヌクレオチドと、ポリサッカライドと、リン脂質と、アスベストとがある（Matsumoto, A. 他 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9133-9137; および Elomaa, O. 他 (1995) Cell 80:603-609）。スカベンジャー受容体が主要な役割を果たすと思われるのはアテローム発生においてであり、これは、動脈壁内の、修飾されたLDLの取り込みを媒介して働き、また宿主防御においては、細菌性エンドトキシンと、細菌と、原虫とに結合して働く。
【００４５】
T細胞受容体
T細胞は免疫系において作動体および調節因子としての二つの役割を果たしており、感染細胞で細胞死を誘発し、他の免疫細胞の増殖を刺激するシグナルの伝達と抗原認識を連関する。T細胞の集団は広範囲の異なった抗原を認識できるが、個々のT細胞は一つの抗原のみを、抗原提示細胞表面上の主要組織適合分子(MHC)との複合型ペプチドとしてT細胞受容体(TCR)に提示された場合のみに認識できる。大部分のT細胞上のTCRは免疫グロブリン様膜内在性糖タンパク質からなる。この免疫グロブリン様膜内在性糖タンパク質は、似た分子量のαとβの二つのポリペプチドサブユニットを含む。両方のTCRサブユニットは、可変領域と定常領域の両方を有する細胞外ドメイン、膜を1回貫通する膜貫通ドメイン、および短い細胞内ドメインを有する(Saito, H. 他 (1984) Nature 309:757-762)。TCRサブユニットの遺伝子は、異なった遺伝子区分の体細胞性再構成によって作成される。適切なMHC状況における抗原とTCRとの相互作用によって、免疫系の細胞要素の増殖、成熟および機能を誘発するシグナルカスケードが開始される(Weiss, A. (1991) Annu. Rev. Genet. 25: 487-510)。リンパ腫、白血病、自己免疫疾患および免疫不全疾患においてTCR遺伝子の再編成とTCR発現の変化が注目されている(Aisenberg, A.C. 他 (1985) N. Engl. J. Med. 313:529-533; Weiss, 前出).
セレクチン
セレクチン（またはLEC-CAM）は主に炎症および白血球接着に関与する特殊なレクチンサブファミリである（Lasky, L.A. (1991) J. Cell. Biochem. 45:139-146に概説されている）。セレクチンは循環系から急性の炎症部位に白血球を補充する過程を仲介し、サイトカインシグナル伝達に応答して血管内皮細胞の表面で発現する。セレクチンは白血球上の特定のリガンドに結合し、白血球が内皮表面に接着して表面に沿って移動することを可能にする。セレクチンがそのリガンドに結合すると、アクチン細胞骨格の分極性再構成をもたらし、白血球内のシグナル伝達を刺激する(Brenner, B. 他 (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 231:802-807; Hidari, K. I. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:28750-28756)。セレクチンファミリのメンバーは３つの特徴的なモチーフを持っている：  すなわち、レクチンまたは糖質認識ドメイン、上皮成長因子様ドメイン、および異なった数の短いコンセンサスリピート（ｓｃｒまたは「スシ」リピート）の３つである。補体調節タンパク質(CCP)モジュールあるいは、短いコンセンサスリピート(SCR)とも呼ばれるスシドメインは、多様な補体および接着タンパク質において見られる(Norman, D.G. 他 (1991) J. Mol. Biol. 219:717-725)。
【００４６】
ネトリン受容体
ネトリンは拡散性誘引物質および忌避物質として働いて発達中の神経系内で遊走している細胞や軸索をその標的に誘導する分子のファミリである。このネトリンの受容体には線虫タンパク質UNC-5および最近脊椎動物中に同定された相同体が含まれる(Leonardo, E.D. 他 (1997) Nature 386:833-838)。これらの受容体は免疫グロブリンスーパファミリのメンバーであり、またZU5 ドメインと呼ばれる特徴的ドメインも含んでいる。ネトリン受容体ファミリのマウスメンバーにおける突然変異であるRcm(吻側小脳形成異常)では、明らかな神経細胞異常遊走の結果である小脳および中脳欠損を生じている。
【００４７】
VPS10 ドメイン含有受容体
VPS10含有受容体ファミリのメンバーはすべて、酵母の液胞ソーティングのタンパク質10 (VPS10) 受容体に相同性を持つドメインを含んでいる。このファミリには、マウス胚性および出生後早期の神経系発達時に発現するSorCS、モザイク受容体SorLA、およびニューロテンシン受容体sortilinが含まれる(Hermey, G. 他 (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:347-351; Hermey, G. 他 (2001) Neuroreport 12:29-32).このファミリの最近同定されたメンバーであるSorCS2は発達中および成熟したマウスの中枢神経系に高度に発現される。その発現の主要部位は底板であり、ドーパミン性脳核および視床背側核を含む脳領域においても一過性に高度に検出される(Rezgaoui, M. (2001) Mech. Dev. 100:335-338)。
【００４８】
膜結合タンパク質
テトラスパンファミリータンパク質
膜４回貫通型スーパーファミリー(TM4SF)、別名テトラスパンファミリーは多重遺伝子族であり、タイプIII膜内在性タンパク質をコードする（Wright, M.D. および Tomlinson, M.G. (1994) Immunol. Today 15:588）。このTM4SFは、細胞膜を４回貫通する膜タンパク質からなる。TM4SFのメンバーの例には、血小板および内皮細胞の膜タンパク質と、黒色腫関連抗原、白血球表面糖タンパク質、結腸癌腫抗原、腫瘍関連抗原、および住血吸虫表面タンパク質がある（Jankowski, S.A. (1994) Oncogene 9:1205-1211）。TM4SFの各メンバーは、約２５〜３０％のアミノ酸配列同一性を互いに共有する。
多数のTM4SFメンバーが関与すると示唆されている作用は、シグナル伝達、細胞接着の制御、細胞の成長と増殖との調節（例えば発生および発癌）、並びに細胞運動性（例えば腫瘍細胞転移）である。TM4SFタンパク質の発現は多様な腫瘍に関連し、発現のレベルは、細胞が成長する際や活性化する際に改変され得る。
【００４９】
腫瘍抗原
腫瘍抗原は表面分子であり、腫瘍細胞では正常細胞と異なる発現をする。腫瘍抗原は、腫瘍細胞を免疫的に正常細胞と区別し、ヒトの癌に関する診断と治療の標的を提供する（Takagi, S. 他 (1995) Int. J. Cancer 61: 706-715; Liu, E. 他 (1992) Oncogene 7: 1027-1032）。
【００５０】
イオンチャネル
イオンチャネルは、事実上、身体のあらゆる細胞の原形質膜内に見られる。例えば、塩素イオンチャネルは多様な細胞機能を媒介し、その機能の例には、膜電位の調節と、上皮膜を通ってのイオンの吸収と分泌とがある。塩素イオンチャネルが、ゴルジ体とエンドサイトーシス小胞の細胞内の膜にある場合、オルガネラのpHをも調節する（例えばGreger, R. (1988) Annu. Rev. Physiol. 50:111-122を参照）。塩素イオンチャネル類の電気生理的および薬理学的特性、例えばイオンコンダクタンス、電流-膜電位関係、およびモジュレーター(修飾因子）類への感受性は、筋肉、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、および白血球に、別々の塩素イオンチャネルがあることを示唆する。多くのチャネルは、１個若しくは数個のプロテインキナーゼによるリン酸化部位を有する。 プロテインキナーゼには、プロテインキナーゼA、プロテインキナーゼC、チロシンキナーゼ及びカゼインキナーゼIIがあり、これらはすべて細胞のイオンチャネル活性を調節する。細胞内におけるタンパク質の不適切なリン酸化は、細胞周期の進行および細胞分化における変化に関連する。細胞周期における変化は、アポトーシスの誘発や癌の誘発に関連することが示されている。細胞分化における変化は、生殖系、免疫系、および骨格筋の、疾患や障害に関連することが示されている。
【００５１】
小脳顆粒神経細胞は非不活化カリウム電流を持ち、これは神経伝達物質からの受容体刺激による発火頻度を調節し、また、静止膜電位を制御する。非不活化電流を示すカリウムチャネル類の例に、ether a go-go (EAG) チャネルがある。KCR1と名付けられた膜タンパク質は、ラットEAGと特異的にそのC末端領域で結合し、小脳非不活化カリウム電流を調節する。KCR1は、１２の膜貫通ドメイン群と、細胞内にアミノ酸末端およびカルボキシル末端を含むと予測される。これらの膜貫通領域の構造的特徴はトランスポータスーパーファミリーの領域に類似しているように見えるが、KCR1と既知のトランスポータとの間に相同性は見られないことから、KCR1は新規クラスのトランスポータに属すことが示唆される。KCR1は、非不活化カリウムチャネルの調節成分と考えられる (Hoshi, N. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:23080-23085)。
【００５２】
ＡＢＣ輸送体
ATP結合カセット（ABC）輸送体、別名「輸送ATPアーゼ」は膜タンパク質のスーパーファミリーであり、原核生物と真核生物とにおける輸送機能とチャネル機能とを媒介する（Higgins, C.F. (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8:67-113）。ABCタンパク質類は、類似した全体構造と、顕著な配列相同性とを共有する。すべてのABCタンパク質には約２００アミノ酸残基の或る保存されたドメインがあり、これには１つ以上のヌクレオチド結合ドメインが含まれている。ABC輸送体遺伝子群における突然変異は、高ビリルビン血症II／Dubin-Johnson症候群、劣性スタルガルト病、X染色体連鎖副腎白質ジストロフィー、多剤耐性、小児脂肪便症、および嚢胞性線維症など、様々な疾患に関与する。
【００５３】
セマホリンとニューロピリン
セマフォリン（semaphorin）類は軸索誘導分子の１大グループで少なくとも３０種のメンバーがあり、脊椎動物、非脊椎動物、更には数種のウィルスでも発見されている。すべてのセマフォリンは長さが約５００アミノ酸のセマ（sema）ドメインを有する。セマフォリン受容体であるニューロピリン（neuropilin）は、in vitroで神経突起の生成を促進することが示されている。ニューロピリンの細胞外領域はCUB、ジスコイジン（discoidin）、およびMAMドメインの３種のドメインからなる。ニューロピリンのCUBモチーフおよびMAMモチーフはタンパク質間相互作用において幾つかの役割を果たすことが示唆されており、更にセマドメインおよびＣ末端ドメインを介してセマフォリン類の結合に関与していると考えられる（Raper, J.A.（2000）Curr. Opin. Neurobiol. 10:88-94の概説を参照）。
【００５４】
細胞間伝達に関連する膜タンパク質
細胞間伝達は、多細胞生物の発生と生存とに必須である。細胞は、タンパク質シグナル伝達分子の分泌と取り込みとによって互いに通信する。細胞内へのタンパク質の取り込みを達成する手段がエンドサイトーシスであり、ここでは、シグナル伝達分子と原形質膜表面との相互作用が、しばしば特異的受容体への結合を通じて行われる結果、形質膜由来小胞を形成し、これらの小胞が分子を取り囲み、細胞質内に運ぶ。細胞からのタンパク質の分泌を達成する手段がエキソサイトーシスであり、ここでは、細胞内の分子が、トランスゴルジ網に由来する、膜に囲まれた輸送小胞内に詰められる。これらの小胞は原形質膜と融合し、小胞の内容物を周囲の細胞外空間に放出する。エンドサイトーシスとエキソサイトーシスとの結果、原形質膜成分の除去と追加とが起こり、また、これらの成分のリサイクルは、原形質膜と、膜に囲まれた内部区画との双方の、完全性、同一性、および機能性の維持に必須である。
【００５５】
Nogo は中枢神経系ミエリンの成分として同定され、成熟した脊椎動物における軸索再生を防ぐ。Nogo-66 受容体の切断および軸索表面からのグリコホスファチジルイノシトール結合タンパク質は神経細胞をNogo-66に対して非感受性にして中枢神経系障害からの回復を促進する(Fournier, A.E. 他 (2001) Nature 409:341-346)。
【００５６】
スリットタンパク質は神経系の腹側正中線の細胞によって発現される細胞外基質タンパク質である。スリットタンパク質は反発的ガイダンス受容体のRoundabout (Robo)のためのリガンドであり、したがって、反発的軸索誘導の役割を果たす(Brose, K. 他 (1999) Cell 96:795-806)。
【００５７】
リソソームは、自己貪食時の細胞内物質分解の部位であり、また、エンドサイトーシス後の細胞外分子の分解の場でもある。リソソーム酵素は、トランスゴルジ網から出芽する小胞内に詰められる。これらの小胞はエンドソームと融合して成熟リソソームを形成し、成熟リソソーム内では、エンドサイトーシスによって取り込まれた物質の加水分解性消化が起こる。リソソームはオートファゴソームと融合し、独特な区画を形成し得る。この区画の中では、オルガネラや他の細胞内成分の分解が起こる。
【００５８】
輸送小胞、例えばエンドソームによるタンパク質選別は、多様な生理的過程にとって重要な結果をもたらす。このような過程の例に、細胞表面成長、異なる細胞内オルガネラ群の生合成、エンドサイトーシス、および、ホルモンと神経伝達物質との制御された分泌がある（Rothman, J.E. および Wieland, F.T. (1996) Science 272:227-234）。特に、神経変性障害その他の神経病理には、エンドソームのタンパク質選別時、または、エンドソーム生合成の際の生化学的欠陥が関連する（Mayer R.J. 他 (1996) Adv. Exp. Med. Biol. 389:261-269）。
【００５９】
ペルオキシソーム類は、分泌経路とは独立したオルガネラである。これらは、細胞内の、過酸化物を生成する多くの酸化反応の場である。ペルオキシソームは、真核細胞のオルガネラの中でもサイズや数が独特であり、また、酵素内容は、生物と細胞タイプと代謝の需要によって異なる（Waterham, H.R. および Cregg, J.M. (1997) BioEssays 19:57-66）。ペルオキシソームタンパク質に遺伝子欠損があるとペルオキシソーム欠損症を生じ、この欠損が関連付けられる多数のヒト病理の例に、ツェルヴェーガー症候群、近位肢型点状軟骨異形成（rhizomelic chondrodysplasia punctata）、X染色体連鎖副腎白質ジストロフィー、アシルCoAオキシダーゼ欠損症、二頭酵素欠損症、古典的Refsum病、DHAPアルキルトランスフェラーゼ欠損症、および無カタラーゼ血症がある（Moser, H.W. および Moser, A.B. (1996) Ann. NY Acad. Sci. 804:427-441）。また、Gartner, J. 他 (1991; Pediatr. Res. 29:141-146) は、ツェルヴェーガー症候群の患者における低密度ペルオキシソーム様細胞内分画に関連する或る22 kDaの膜内在性タンパク質を発見した。
【００６０】
正常な胚発生と、生殖細胞成熟の制御とを変調する多数の分泌タンパク質は、それぞれの膜結合受容体と相互作用する。胚発生時の細胞運命は、アクチビン（activin）／TGF-βスーパーファミリーのメンバー、カドヘリン、IGF-2、および他のモルフォゲンによって決定される。また、生殖細胞と生殖組織との増殖、成熟、および再分化は、例えばIGF-2、インヒビン、アクチビン、およびフォリスタチン（follistatins）によって調節される（Petraglia, F. (1997) Placenta 18:3-8; Mather, J.P. 他 (1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 215:209-222）。トランスフォーミング成長因子β(TGFベータ) シグナル伝達は、II型TGFベータ受容体(TbetaR-II) とリン酸化I型TGFベータ受容体(TbetaR-I)の連続して作用する二つの受容体セリン/トレオニンキナーゼによって媒介される。TbetaR-I-結合タンパク質-1 (TRECAP-1)はI型トランスフォーミング成長因子β受容体の静止形態と活性形態を識別し、TGFベータシグナル伝達に関連している(Charng, M.J 他(1998) J. Biol. Chem. 273:93659368)。
【００６１】
レチノイン酸受容体α(RAR α) はレチノイン酸によって誘発される成熟を媒介し、骨髄の発達に関与する。顆粒球分化中にレチノイン酸によって誘発される遺伝子には、造血特異的遺伝子のE3が含まれているが、E3は骨髄造血時の活性RARαの直接の標的となる。
【００６２】
μ-オピオイド受容体(MOR)は、モルフィン、コデイン、メサドンおよびフェンタニル並びにヘロインなどの鎮痛薬の作用を媒介する。MORはGタンパク質活性化カリウムチャネルに機能的に結合する(Mestek A. 他 (1995) J. Neurosci. 15:2396-2406)。多様なMORサブタイプが存在する。ソマトスタチン2、ドパミンD2、プロスタグランディンEP3、およびセロトニン受容体サブタイプ 5-ヒドロキシトリプタミン4 および5ヒドロキシトリプタミン7 を含む多数のGタンパク質共役受容体と同様にMOR-1で選択的スプライシングが見られる(Pan, Y.X. 他 (1999) Mol. Pharm. 56:396403)
膜表在性タンパク質および固着膜タンパク質
いくつかの膜タンパク質は膜貫通しておらず、膜アンカー(固着)または膜内在性タンパク質との相互作用を介して原形質膜に固着している。膜アンカーは翻訳後のあるタンパク質に共役的に結合しており、プレニル、ミリスチルおよびグリコシルホスファチジルイノシトール基のような部分が含まれる。膜表在性タンパク質および固着タンパク質の膜局在化は受容体媒介シグナル伝達などのプロセスにおける機能にとって重要である。例えば、Rasのプレニル化は原形質膜への局在化に必要であり、またシグナル伝達における正常作用および発ガン性作用に必要とされる。
【００６３】
細胞外メッセンジャー
細胞間伝達は多細胞生物の成長と生存に必須である。特に内分泌系、神経系、免疫系の機能に必須である。更に細胞間伝達は組織作製と器官形成などの発生プロセスにとって極めて大切である。その場合細胞増殖、細胞分化および形態形成が空間的また時間的に正確な協働作用で調整されなければならない。細胞は、ホルモン、成長因子、神経ペプチド、およびサイトカインなどの多様なタイプのシグナル伝達分子の分泌および取り込みによって互いに伝達する。
【００６４】
ホルモン
ホルモンはシグナル伝達分子であり、胚形成から成人まで基本的な生理的プロセスを協働して調整する。これらのプロセスには代謝、呼吸、生殖、排出、胎児組織分化、器官形成、成長、発達、恒常性およびストレス反応が含まれる。ホルモン分泌と神経系は密接に組み込まれており、互いに依存している。ホルモンは内分泌腺により、主に視床下部と脳下垂体、甲状腺と副甲状腺、膵臓、副腎、卵巣、精巣で分泌される。
【００６５】
循環へのホルモンの分泌はきちんと制御されている。ホルモンはしばしば日中に、拍動性及び周期性パタ−ンで分泌される。ホルモン分泌は血液生化学の摂動、他の上流で作用するホルモン、神経インパルス、負のフィードバックループにより調整される。血中ホルモン濃度は常に監視され、最適の安定したレベルを維持するよう調整される。いったん分泌されると、ホルモンは特異的受容体を発現する標的細胞だけに作用する。
【００６６】
多くの内分泌系の疾患は、ホルモンの分泌不全あるいは分泌過多により引き起こされる。分泌不全はオリジンのホルモンの腺が損傷したりあるいは正常に機能しない場合に多くの場合発生する。分泌過多は、ホルモン分泌細胞に由来する腫瘍の増殖に多くの場合起因する。不適切なホルモンレベルは、調節フィードバックループあるいはホルモン前駆体のプロセッシングにおける障害により引き起こされる場合がある。内分泌系機能障害は、標的細胞がホルモンに応答できない場合にも発生し得る。
【００６７】
ホルモンは生化学的に、ポリペプチド、ステロイド、エイコサノイドまたアミンとして分類される。インスリンや成長ホルモンなど多様なホルモンを含むポリペプチドホルモンは、大きさや機能が様々である。多くの場合細胞内で成熟、活性化状態へ処理される不活性の前駆体として合成される。アミンホルモンにはエピネフリン、ドーパミンがあり、神経内分泌シグナリングで機能するアミノ酸誘導体である。ステロイドホルモンにはコレステロールに由来するホルモンエストロゲン、テストステロンがあり、性的成長と生殖において機能する。エイコサノイドホルモンにはプロスタグランジン、プロスタシクリンがあり、多様なプロセスで機能する脂肪酸誘導体である。多くのポリペプチドホルモンとある種のアミンホルモンは、循環で可溶性であるが、循環では分泌後数秒以内にタンパク質分解に対して感受性が高い。ステロイドホルモンとエイコサノイドホルモンは不溶性であり、循環ではキャリアタンパク質で輸送する必要がある。今からの記述では、主にポリペプチドホルモンに焦点を合わせる。
【００６８】
視床下部と脳下垂体腺によって分泌されたホルモンは、神経信号に応答して他の内分泌腺からのホルモン分泌と協調的に調節することにより内分泌機能において重要な役割を演じる。視床下部ホルモンには、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出因子、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、サブスタンスＰ、ドーパミン、プロラクチン放出ホルモンがある。これらのホルモンは、脳下垂体の前葉からのホルモン分泌を直接調節する。下垂体の前葉ホルモンによって分泌されたホルモンには、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、メラニン細胞刺激ホルモン、成長ホルモンおよびプロラクチンなどのソマトトロピンホルモン、甲状腺刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモン(LH)また卵胞刺激ホルモン(FSH)などの糖蛋白質ホルモン、β-リポトロピン、β-エンドルフィンがある。これらのホルモンは、甲状腺、膵臓、副腎からホルモン分泌を調節する。また排卵と精子形成を刺激して生殖器官に直接作用する。下垂体後葉は、抗利尿ホルモン(ADH, バソプレシン) とオキシトシンを合成、分泌する。
【００６９】
視床下部と下垂体の疾患は多くの場合、原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる。このような疾患は他の内分泌腺の機能に重大な影響を及ぼす。下垂体低下に関連した疾患には、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、カルマン症候群、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症が含まれる。下垂体機能亢進症に関連した疾患には、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ADH）分泌症候群（SIADH）及び先端巨大症、巨人症が含まれる。
【００７０】
甲状腺、副甲状腺によって分泌されるホルモンは、それぞれ主に代謝速度と血清カルシウムレベルの調製を制御する。甲状腺ホルモンには、カルシトニン、ソマトスタチン、甲状腺ホルモンが含まれる。副甲状腺は、副甲状腺ホルモンを分泌する。甲状腺機能低下症に関連した疾患には、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む。甲状腺機能亢進症に関連した疾患には、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む。副甲状腺機能亢進症に関連する疾患には、骨再吸収と副甲状腺肥大を招くConn病（chronic hypercalemia）がある。
【００７１】
膵臓によって分泌されるホルモンは、糖質、脂肪、タンパク質代謝の割合を調節して血糖値を調節する。膵臓ホルモンにはインスリン、グルカゴン、アミリン、γアミノ酪酸、ガストリン、ソマトスタチンおよび膵臓性ポリペプチドが含まれる。膵臓機能不全に関連する主な疾患は、インスリン活性の不足によって生じる真性糖尿病である。真性糖尿病は一般にI型(インスリン依存型、若年性糖尿病)、またはII型(非インスリン依存型成人性糖尿病)に分類される。インシュリン代償療法による両者の治療は公知である。真性糖尿は通常、低血糖症（インシュリン  ショック）、昏睡、糖尿病性ケトアシドーシス、乳酸アシドーシスなどの急性合併症を引き起こす。また目、腎臓、皮膚、骨、関節、循環系、神経系の疾患や感染への抵抗低下を招く慢性合併症も引き起こす。
【００７２】
ホルモン機能に関連する解剖、生理機能、疾患については、 McCance, K.L. 及び Huether, S.E. (1994) Pathophysiology:The Biological Basis for Disease in Adults and Children, Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO;  Greenspan, F.S. 及びBaxter, J.D. (1994) Basic and Clinical Endocrinology, Appleton and Lange, East Norwalk, CT.を参照されたい。
【００７３】
成長因子
成長因子は、細胞間伝達を仲介する分泌性蛋白質である。循環系を通って長距離を移動するホルモンとは異なり、ほとんどの成長因子は主に局所的なメディエータであり、隣接する細胞に作用する。ほとんどの成長因子は、成長因子を分泌経路に導く疎水性N末端シグナルペプチド配列を含む。またほとんどの成長因子は分泌経路内で翻訳後修飾される。このような修飾には、蛋白質分解、糖鎖形成、リン酸化反応、分子内ジスルフィド結合形成が含まれることもある。一旦分泌されると、成長因子は隣接する標的細胞の表面上で特定の受容体に結合する。そして結合された受容体は細胞内シグナル伝達経路を誘発する。これらのシグナル伝達経路は、標的細胞で特異的細胞応答を引き起こす。これらの応答には遺伝子発現の調節と細胞分裂、細胞分化、細胞運動の刺激または阻害が含まれることもある。
【００７４】
成長因子は、少なくとも２つのクラスに大きく、重複して分類される。一番大きなクラスには、作用が広範囲にわたる大きなポリペプチド成長因子が含まれる。これらの因子には上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子-β(TGF−β)、インスリン様成長因子(IGF)、神経成長因子(NGF)、および血小板由来成長因子(PDGF)が含まれ、各々多数の関連因子のファミリを示す。大きいポリペプチド成長因子はNGFを除いて、多様な細胞タイプ上で分裂促進因子として作用して創傷治癒、骨形成および再造形、細胞外基質合成並びに、上皮、表皮、結合組織の増殖を刺激する。TGF-β、EGFおよび FGF ファミリのメンバーもまた、胚組織の分化において誘導的シグナルとして作用する。NGFは特に、神経細胞の成長および分化を促進する神経栄養性因子として機能する。
【００７５】
別の成長因子のクラスには造血性成長因子が含めれており、標的特異性において狭い。造血性成長因子は、Bリンパ球、Tリンパ球、赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージ、及びそれらの幹細胞前駆体のような血液細胞の増殖及び分化を刺激する。造血性成長因子にはコロニー形成活性化因子 (G-CSF、 M-CSF、 GM-CSF、CSF1-3)、赤血球生成促進因子、サイトカインが含まれる。サイトカインは免疫システムの細胞によって分泌される特殊な造血性因子であり、以下に詳述する。
【００７６】
成長因子は、in vitroでの細胞の腫瘍性転化、及びin vivoでの腫瘍進行において重大な役割を果たす。大きなポリペプチド成長因子の過剰な発現は、培地において細胞の増殖と形質転換を促進する。in vivo の腫瘍細胞による成長因子の不適性な発現は、腫瘍の血管新生及び転移に貢献しうる。造血性成長因子の不適切な活性によって、貧血、白血病、及びリンパ腫が結果として起こる。更に成長因子は潜在的にプロトオンコジーンの発癌生成物である腫瘍性タンパク質に構造的、機能的に関連する。特定のFGF とPDGF ファミリーメンバ−自体が腫瘍性タンパク質に相同であるが、EGF、NGF及び FGF ファミリーの特定のメンバ−の受容体はプロトオンコジーンによってコードされる。成長因子もプロトオンコジーン及び腫瘍抑制因子遺伝子の双方の転写調節に影響を与える。(Pimentel, E. (1994) Handbook of Growth Factors, CRC Press, Ann Arbor, MI;  McKay, I.及び Leigh, I., 編集 (1993) Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY;  Habenicht, A.,編集 (1990) Growth Factors, Differentiation Factors, and Cytokines, Springer-Verlag, New York, NY.)。
【００７７】
更に、一部の大きなポリペプチド成長因子は、発達中の胚の始原胚葉の誘導において重要な役割を果たす。この誘導により究極的には胎児の中胚葉、外胚葉、内胚葉の形成がなされる。そして完全な成人の体のためのフレームワークを提供する。この誘導プロセスの崩壊は、胚発育にとって破局的となるであろう。
【００７８】
小さなペプチド因子 - 神経ペプチド及び血管介在物質
神経ペプチド及び血管介在物質(NP/VM) は、通常20以下のアミノ酸である小さなペプチド因子のファミリーを構成する。これらの因子は通常はニューロンの興奮と血管収縮/血管拡張、筋肉収縮、脳や他の内分泌組織からのホルモン分泌の阻害において機能する。このファミリーに含まれるのは、神経ペプチド及び神経ペプチドホルモンとして、ボンベシン、神経ペプチドY、ニューロテンシン、ニューロメディンN、メラノコルチン、オピオイド、ガラニン、ソマトスタチン、タキキニン、ウロテンシンII、及び平滑筋刺激ペプチド、バソプレッシンペプチド、血管作用性小腸ペプチドに含まれる関連ペプチド、また循環系−borneシグナル伝達分子として、アンジオテンシン、補体、カルシトニン、エンドセリン、ホルミルメチオニルペプチド、グルカゴン、コレシストキニン、ガストリン及び上記で取り上げた多くのペプチドホルモンである。NP/VMは直接信号を伝達することが可能であり、別の神経伝達物質及びホルモンの活性若しくは遊離を調節し、またシグナル伝達カスケードにおいて触媒酵素として働く。NP/VMの効果は、ごく短時間のものから長期間持続するものまで幅広い（Martin, C.R. 他（1985）Endocrine Physiology, Oxford University Press, New York, NY,  57-62ページの概説を参照）。
【００７９】
サイトカイン
サイトカインは、免疫システム及び炎症反応を調節するシグナル分子のファミリーを構成する。サイトカインは、損傷あるいは感染に反応して通常白血球あるいは白血球細胞によって分泌される。サイトカインは、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、マクロファージ、顆粒球などの免疫システムの細胞に主に作用する成長及び分化因子として働く。他のシグナル伝達分子のようにサイトカインは特異的原形質膜受容体に結合する。そして遺伝子発現パターンを変異する細胞内シグナル伝達経路を誘発する。炎症および免疫系疾患の治療におけるサイトカインの使用に関しては、かなりの可能性がある。
【００８０】
サイトカインの構造と機能は、in vitroで広範囲にわたって特徴付けられてきた。多くのサイトカインは30Kダルトン以下の小さなポリペプチドである。50を越えるサイトカインがヒト及びげっし類から同定されている。サイトカインのサブファミリの例としては、インターフェロン(IFN-α、-βおよび -γ)、インターロイキン(IL1-IL13)、腫瘍壊死因子(TNF-α と -β)およびケモカインがある。多くのサイトカイは組換えDNA技術を用いて産生されており、また個々のサイトカインの活性はin vitroで測定されている。これらの活性には白血球増殖、分化および運動の調節である。
【００８１】
in vitro の個々のサイトカインの活性は、in vivoのサイトカインの活性の完全な範囲を反映していないかもしれない。サイトカインはin vivo では個々に発現しないが、その代わり、生物体が刺激を受けると種々の他のサイトカインと結合して発現する。ともにこれらのサイトカインは、その特異な刺激に適切な方法で集団的に免疫応答を調節する。よってサイトカインの生理学的活性は、刺激自体によって決定される。また相乗作用と拮抗関係の双方によって示されることもあると同時に、発現するサイトカイン中の複合体双方向ネットワークによっても決定される。
【００８２】
ケモカインは、30を越えるメンバーでサイトカインサブファミリ−を構成する。(Wells, T. N. C. 及び Peitsch, M. C. (1997) J. Leukoc. Biol. 61:545-550 を参照)。ケモカインは、炎症の部位に単球とマクロファージを動員する走化タンパク質として始めに同定された。最近の証拠によると、造血及びHIV-1 感染においてケモカインは重要な役割を演じる。ケモカインは、分子量約6-15Kダルトンの範囲の小さなタンパク質である。更にケモカインは、重要なシステイン残基の数と位置に基づいて C、CC、CXC、あるいはCX3C に分類される。例えばCC ケモカインは２つの連続したシステインから成る保存されたモチーフをそれぞれ含む。それに続いてそれぞれ24- 及び 16-残基間隔の下流で起こる2つの付加的なシステインを含む。(ExPASy PROSITE database, documents PS00472 及び PDOC00434).これら4つのシステイン残基の存在と間隔は高度に保存される。しかし介在している残基は著しく異なる。しかしシステインダブレットのおよそ15残基下流に位置するチロシンは保存されており、走化活性にとって重要であるように思われる。CC ケモカインをコ−ドする多くのヒト遺伝子は、染色体１７上に集まっている。しかし他の所にマッピングされるCCケモカイン遺伝子の例が、少数ある。ケモカインには、他にも リンフォタクチン（lymphotactin） (C ケモカイン)、マクロファージ走化性及び活性因子 (MCAF/MCP-1、CC ケモカイン)、 血小板因子 4 及び IL-8 (CXC ケモカイン) そしてフラクタルカイン（fractalkine） またneurotractin (CX3C ケモカイン).がある(Luster, A. D. (1998) N. Engl. J. Med. 338:436-445の概説を参照)。
【００８３】
クロモグラニンおよびセクレトグラニンは、内分泌および神経内分泌細胞の分泌顆粒に存在する酸性タンパク質である(Huttner, W.B. 他 (1991) Trends Biochem. Sci. 16:2730) (Simon, J.-P. 他 (1989) Biochem. J. 262:1-13)。グラニンは生物活性ペプチドの前駆体か、またはペプチドホルモンやニューロペプチドの詰め込み時のヘルパータンパク質かも知れないが、これらの正確な役割は不明である。
【００８４】
新規の受容体および膜結合タンパク質、またそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。 この新規の組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、神経疾患、代謝異常、発達障害および内分泌疾患の診断・治療・予防において有用であり、また、受容体および膜結合タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響についての評価にも有用である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００８５】
本発明は、総称して「REMAP」、個別にはそれぞれ「CSAP-1」、「REMAP-2」、「REMAP-3」、「REMAP-4」、「REMAP-5」、「REMAP-6」、「REMAP-7」、「REMAP-8」、「REMAP-9」、「REMAP-10」、「REMAP-11」、「REMAP-12」、「REMAP-13」、「REMAP-14」および「REMAP-15」と呼ぶ受容体および膜結合タンパク質である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-15を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-15を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一性のある天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-15を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-15を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、SEQ ID NO:1-15のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００８６】
また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-15からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:16-30からなる群から選択される。
【００８７】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択したポリペプチドをコードするようなポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【００８８】
更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する天然のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-15とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００８９】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００９０】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。
【００９１】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）SEQ ID NO:16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。
【００９２】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO：16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００９３】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる群から選択される。一実施例では、SEQ ID NO:1−15からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。 更に、本発明は、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的REMAPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００９４】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的REMAPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００９５】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの免疫抗原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法で本発明は、機能的REMAPの過剰発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００９６】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００９７】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-15からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【００９８】
更に本発明は、SEQ ID NO:16-30からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップと、c)化合物の存在下での異なる量の標的ポリヌクレオチドの発現を化合物の不存在下での発現と比較するステップを含む、該スクリーニング方法を提供する。
【００９９】
本発明は更に、（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、（ｂ）（i）SEQ ID NO:16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物からなる群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程を含む、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:16-30からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（v）（i）〜（iv）のRNA等価物からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【０１００】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明する前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【０１０１】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【０１０２】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１０３】
(定義)
用語「REMAP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたREMAPのアミノ酸配列を指す。
【０１０４】
用語「アゴニスト」は、REMAPの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、REMAP に直接相互作用するか、或いはREMAP が関与する生物学的経路の成分と作用して、REMAP の活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【０１０５】
用語「対立遺伝子変異配列」は、REMAPをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。 また、変異mRNAまたはポリペプチドを作製し得る。その構造または機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を全く有しないか、１個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。
【０１０６】
REMAP をコードする「変異(altered)」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠失、挿入または置換する核酸配列を有し、REMAP と同一またはREMAP の機能的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドを産出する。この定義には、REMAPをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当あるいは予期しないハイブリダイゼーション、並びにREMAPをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能なあるいは検出困難な多型性を含む。コードされたタンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に機能的に等価なREMAPとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得る。生物学的或いは免疫学的にREMAPの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換が成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【０１０７】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分子を指す。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【０１０８】
「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。
【０１０９】
用語「アンタゴニスト」は、REMAPの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、REMAP に直接相互作用するか、或いはREMAP が関与する生物学的経路の成分と作用してREMAPの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【０１１０】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、そのままの免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab,、F(ab')2 及びFv断片を指す。REMAPポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じてキャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【０１１１】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体への結合において無損傷抗原（即ち免疫応答を誘発するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１１２】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーはin vitroの進化過程（例えば米国特許番号第5,270,163号に記載されたSELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法））から由来するもので、そのような過程は大きな組み合わせライブラリから標的特異的なアプタマー配列を選択する。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド構成要素は修飾された糖基(例えば、リボヌクレオチドの2'-OH 基が2'-F または 2'-NH2で置換されている)を有することが可能で、これらの糖基は、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性あるいは血中でのより長い生存期間などの望ましい性質を改善する。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリアー等の分子に抱合させることができる。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（Brody, E.N. および L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13等を参照。）
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味するたとえば、ワクシニアウィルスに基づくＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質で特定のＲＮＡ アプタマーが高レベルで発現するために使用されている（Blind, M. 他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【０１１３】
「spiegelmer」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【０１１４】
「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖と塩基対を形成することが可能な任意の組成物を指す。アンチセンス組成物の例には、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾されたバックボーン連鎖たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を阻止する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は、或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【０１１５】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のREMAP、合成のREMAPまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１１６】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配列「3'T-C-A5'」に結合する。
【０１１７】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」及び「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む広範囲の任意の成分を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。REMAP若しくはREMAP の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成要素（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【０１１８】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）か、あるいはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【０１１９】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2005500008.tif 000002
【０１２０】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分が保持される。
【０１２１】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１２２】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【０１２３】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【０１２４】
「示差発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損遺伝子またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【０１２５】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンがコードされたタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャーを再分類することによって、新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１２６】
用語「断片」は、REMAP またはREMAP をコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、画定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【０１２７】
SEQ ID NO:16-30 の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:16-30 を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SEQ ID NO:16-30のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはSEQ ID NO:16-30を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO：16-30の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO：16-30の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１２８】
SEQ ID NO:1-15 のある断片は、SEQ ID NO:16-30のある断片によってコードされる。 SEQ ID NO:1-15 の断片には、SEQ ID NO:1-15を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、SEQ ID NO:1-15 の断片は、SEQ ID NO:1-15を特異認識する抗体を産出するための免疫抗原性ペプチドとして有用である。 SEQ ID NO:1-15 の断片及び断片に対応するSEQ ID NO:1-15 の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１２９】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１３０】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【０１３１】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１３２】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウエアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１３３】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. 他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１３４】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１３５】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１３６】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【０１３７】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１３８】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr-21-2000)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１３９】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプチド配列の長さと比較して測定し得る。 一致率は、配列或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１４０】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１４１】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１４２】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１４３】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１４４】
本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対する高ストリンジェンシー条件には、約０.２×SSC及び約１％のSDS存在下で約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【０１４５】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１４６】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１４７】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１４８】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすREMAP のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なREMAP のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１４９】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１５０】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１５１】
用語「調節」は、REMAPの活性の変化を指す。調節することによって例えば、REMAPのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的特性が増大または低下し得る。
【０１５２】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１５３】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、一般に、機能的に連結したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【０１５４】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、この組成物に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１５５】
REMAP の「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾が含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、REMAPの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１５６】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、REMAPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【０１５７】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１５８】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１５９】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１６０】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１６１】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物ないで防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１６２】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節因子は、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１６３】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１６４】
本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１６５】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。REMAP、REMAPをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１６６】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
【０１６７】
「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合する他の構成要素の少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは少なくとも約９０％が無いものを指す。
【０１６８】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１６９】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１７０】
「転写イメージ」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１７１】
「形質転換」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１７２】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いは試験管内受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合（transconjugation）によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他 (1989) 等の参考文献に与えられている。
【０１７３】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１７４】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１７５】
（発明）
本発明は新規の受容体および膜結合タンパク質（REMAP）の発見、REMAPをコードするポリヌクレオチド、および細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患神経疾患、代謝疾患、発達障害および内分泌疾患の診断、治療、ならびに予防に対するこれらの組成の使用に基づいている。
【０１７６】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０１７７】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBankの識別番号（GenBank ID NO :）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにGenBank相同体１つ以上の注釈（annotation）を示し、これらはすべて本明細書では参考文献に含まれる。
【０１７８】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１７９】
表２及び表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それらの特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが受容体および膜結合タンパク質であることを確立している。例えば、SEQ ID NO:1は、ラットレチノイン酸受容体α 2イソ型 (GenBank ID g3213188) と９７％の同一性があり、これはBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)で確認された（表2参照）。BLAST確率スコアは8.5e-245であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:1はまた、核ホルモン受容体リガンド結合ドメインとＣ４タイプ亜鉛フィンガーを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。(表3参照)BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:1 がレチノイン酸受容体である、さらに実証的な証拠を提供する。別の実施例において、SEQ ID NO:2 はヒト多数回膜貫通受容体TRC８(GenBank ID g3395787) に残基A3から残基H575まで３１％の同一性を有することが9.7e-61の確率スコアでBLAST によって確認された(表２参照)。BLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:2が多数回膜貫通受容体である、さらに実証的な証拠を提供する。別の実施例において、SEQ ID NO:5 はラットの潜在的リガンド結合タンパク質(GenBank ID g57734) に残基V4から残基A４７９までに、７６％の同一性を有することが、6.3e-187の確率スコアでBLAST によって確認された(表２参照)。さらに、BLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:5が嗅覚リガンド結合タンパク質である、さらに実証的な証拠を提供する。別の実施例において、SEQ ID NO:11 はイヌの嗅覚受容体CfOLF2 (GenBank ID g1314663) に残基M1からF310までに、77％の同一性を有することが、9.7e-129の確率スコアでBLAST によって確認された（表２参照）。SEQ ID NO:11はまた、膜７回貫通受容体ドメイン（ロドプシンファミリ）を含むが、これはHMMに基づくPFAMデータベースの統計的に有意な一致を検して決定された。 （表3参照）BLIMPS、MOTIFS及びPROFILESCAN分析から得たデータは、SEQ ID NO:11がＧタンパク質共役受容体であることを裏づける証拠を更に提供する。別の実施例においてSEQ ID NO:15 は潜在的なリガンド結合タンパク質RYA3 (GenBank ID g11877275) のオルソログであるヒトタンパク質に対して残基M5から残基M328までに99%の同一性を有し、また残基V313 から 残基 E410までに89%に同一性を有することが3.3e-207の確率スコアでBLAST によって確認された(表２参照)。BLIMPS及び追加のBLAST 解析よりのデータは、SEQ ID NO:15 がリガンド結合タンパク質である、さらに実証的な証拠を提供する。SEQ ID NO:3−4、 SEQ ID NO:6−10、および SEQ ID NO:12−14は同じような方法で解析し、注釈を付けた。 SEQ ID NO:1-15の解析のためのアルゴリズム及びパラメータを表７に記述する。
【０１８０】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列、またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列、或いはこれらの２種類の配列のあらゆる組み合わせを用いて組み立てた。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列の構築、並びに、例えば、SEQ ID NO:16-30 を同定する、あるいはSEQ ID NO:16-30 と関連するポリヌクレオチド配列を区別するハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片のcDNA配列および/またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０１８１】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、具体的にはたとえば組織特異的なｃDNAライブラリまたはプールされたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合がある。或いは列2の識別番号は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与するGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列で記述されたポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方からなる群を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4  として同定されるポリヌクレオチド配列はアルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された」配列である( 実施例５参照 )。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_N として同定されるポリヌクレオチド配列は「ストレッチ」配列である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号である。（実施例５を参照。）RefSeq 配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのタンパク質相同体として使われた場合は、RefSeq 識別子(「NM 」、「NP」または「 NT」と表示された)はGenBank 識別子(すなわち、gBBBBB)の代わりに使われる場合もある。
【０１８２】
あるいは、接頭コードは手で編集されたか、ゲノムDNA配列から予測されたか、または配列解析方法の組み合わせから由来している構成配列を識別する。次の表は構成配列の接頭コードと、接頭コードと関連する同じ配列の分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
2005500008.tif 000003
【０１８３】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表4に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得られたが、それに関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１８４】
表５はIncyte cDNA配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列によって最も頻繁に代表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１８５】
本発明はまた、REMAP の変異体も含む。好適なREMAP 変異体は、REMAP の機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有し、かつ、REMAP アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。
【０１８６】
本発明はまた、REMAPをコードするポリヌクレオチド群をも含む。特定の実施例において、本発明は、REMAPをコードするSEQ ID NO:16−30からなる群から選択した配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。SEQ ID NO:16-30のポリヌクレオチド配列には、配列表に示したように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースで構成される。
【０１８７】
本発明はまた、REMAPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、REMAPをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:16−30からなる群から選択された核酸配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:16−30からなる群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。 上記のポリヌクレオチド変異配列は何れも、REMAPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１８８】
更に別の例では、本発明の或るポリヌクレオチド変異配列は、REMAPをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異配列である。スプライス変異体はREMAPをコードするポリヌクレオチド配列と有意な相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによる配列ブロックの追加または削除により、通常、ポリヌクレオチドがより多くまたはより少数の塩基を有することになる。或るスプライス変異配列には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、REMAPをコードするポリヌクレオチド配列との間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異配列の部分は、REMAPをコードするポリヌクレオチド配列の部分と、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えば、SEQ ID:30の配列を含むポリヌクレオチドはSEQ ID:20の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体である。前記のスプライス変異体のいずれもが、REMAPの少なくとも一つの機能的特徴か、または構造的特徴を含むアミノ酸配列をコードできる。
【０１８９】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るREMAPをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、自然発生する任意の既知の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明は、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のREMAPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【０１９０】
REMAPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、適切に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のREMAPのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、例えば、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するREMAP或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、REMAP 及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【０１９１】
本発明はまた、REMAP及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後、当分野で周知の試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてREMAPまたはその任意の断片をコードする或る配列に突然変異を誘導し得る。
【０１９２】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:16-30 及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511等を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１９３】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。 結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。 （Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。
【０１９４】
当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法を用いて部分的なヌクレオチド配列を利用して、REMAP をコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である(例えば、 Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照。)別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵素断片から得る(例えば、Triglia, T. 他 (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186。)第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Parker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１９５】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１９６】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１９７】
本発明の別の実施態様では、REMAP をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、REMAP 、その断片または機能的等価物を適切な宿主細胞内に発現させる組換えDNA分子にクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ得り、これらの配列をREMAPの発現に利用可能である。
【０１９８】
種々の目的でREMAPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１９９】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING（Maxygen Inc., Santa Clara CA。 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797、Christians, F.C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319に記載）等のDNAシャッフリング技術の対象となり、REMAPの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指示された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０２００】
別の実施例によれば、REMAPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.ら（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いて、REMAP 自体またはその断片を合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60ページ、Roberge, J.Y.他 (1995) Science 269:202204等を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にREMAPのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の改変により、および／または他のタンパク質群または任意のその一部からの配列群との組み合わせにより、変異配列ポリペプチドを作製、または、天然ポリペプチドの配列を有するポリペプチドを作製することが可能である。
【０２０１】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Chiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421などを参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。
【０２０２】
生物学的に活性なREMAPを発現させるために、REMAPをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。これらのエレメントの例には、エンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域など、ベクター及びREMAPをコードするポリヌクレオチド配列群における調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、REMAPをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ATG開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。REMAP をコードする配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(例えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)。
【０２０３】
当業者に周知の方法を用いて、REMAP をコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, および１6-17章; およびAusubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章、13章および16章を参照)。
【０２０４】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、REMAPをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌などの微生物等や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある。（前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. 及び S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509、; Engelhard、E.K. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY、191-196ページ、Logan, J. 及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照）レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他 (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. 他 (1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２０５】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、REMAPをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、REMAP をコードするポリヌクレオチド配列の慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Life Technologies）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターのマルチクローニング部位にREMAPをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(例えば、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:55035509を参照)。例えば抗体類の産生などに多量のREMAP が必要な場合は、高度レベルのREMAP の発現を誘導するベクター類が使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０２０６】
酵母の発現系を使用してREMAPを産出することもできる。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol.153:516-544、及びScorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-184.を参照)。
【０２０７】
植物系もREMAPの発現に使用可能である。REMAP をコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独であるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進し得る（Takamatsu, N.（1987）EMBO J 6:307-311）。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Coruzzi, G. 他 (1984) EMBO J. 3 : 1671-1680 ; Broglie, R. 他 (1984) Science 224 : 838-843 ; および Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17 : 85-105を参照）これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページ等を参照）。
【０２０８】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にREMAP をコードする配列を結合し得る。アデノウイルスゲノムの非必須のE1またはE3領域への挿入を用いれば、宿主細胞内でREMAP を発現する感染ウイルスを得ることができる(例えば、Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:36553659を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２０９】
ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療のために約６kb〜１０MbのHACを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:345-355.を参照)。
【０２１０】
長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内のREMAP の安定発現が望ましい。例えば、REMAP をコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じ或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、複製のウイルス起源、及び／または内在性の発現エレメントを持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２１１】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える( Wigler, M. 他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:114 等を参照。)この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている(例えば、 Hartman, S.C. 及びR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051参照。)可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照)。
【０２１２】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、REMAPをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、REMAPをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または単一プロモーター制御下で、REMAPをコードする配列とタンデムにマーカー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２１３】
一般に、REMAP をコードする核酸配列を持ち、REMAP を発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて同定し得る。これらの方法には、DNA−DNAあるいはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸配列あるいはタンパク質配列の検出および／または数量化のための膜系、溶液ベース、あるいはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２１４】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてREMAP の発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。 このような技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられる。REMAP 上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベース イムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. 他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照）。
【０２１５】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。REMAPをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、REMAPをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemical等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０２１６】
REMAPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。REMAP をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＰＰの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２１７】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０２１８】
本発明の別の実施例では、REMAP をコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列にライゲーションさせる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラREMAPタンパク質が、REMAP活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを容易にする。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質が、REMAP をコードする配列と異種タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を持つように遺伝子操作すると、精製後にREMAP が異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０２１９】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したREMAPの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２２０】
本発明のREMAPまたはその断片を用いて、REMAPに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、REMAPへの特異的結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０２２１】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのREMAPの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様に、化合物は、REMAPが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。或る実施例では、これら化合物のためのスクリーニングには、分泌タンパク質として、あるいは細胞膜上でREMAPを発現する、好適な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。PKINを発現する細胞またはREMAP を含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、REMAP または化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０２２２】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたREMAP と結合させるステップと、REMAP とこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０２２３】
本発明のREMAP またはその断片を用いて、REMAP の活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、REMAP の活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物とREMAPを混合し、試験化合物の存在下でのREMAP の活性が試験化合物不在下でのREMAP の活性と比較する。試験化合物の存在下でのREMAP の活性の変化は、REMAP の活性を調整する化合物の存在を示唆する。別の実施態様において、試験化合物をREMAP の活性に適した条件下でREMAP を含むin vitroまたは無細胞再構成系と混合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、REMAPの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要はない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２２４】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組み換えを用いて動物モデル系内で、REMAP またはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの産生に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマーカー遺伝子で破壊された目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330）。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０２２５】
REMAPをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1 147）。
【０２２６】
REMAP をコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組み換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、REMAP をコードするポリヌクレオチドのある領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばREMAP を乳汁内に分泌するなどREMAP を過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２２７】
（治療）
REMAP 領域と受容体および膜結合タンパク質領域との間に、例えば配列及びモチーフの内容における化学的及び構造的類似性が存在する。REMAP を発現する組織はまた、表６にも見られる。したがって、REMAPは細胞増殖異常、自己免疫/炎症、神経疾患、代謝疾患、発生障害および内分泌疾患に関与していると考えられる。REMAP の発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、REMAP の発現または活性を低下させることが望ましい。REMAP の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、REMAP の発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２２８】
従って、或る実施例において、REMAP の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にREMAP またはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定されるものではないが、そのような疾患として、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患筋ジストロフィー、および他の神経筋障害、末梢神経系疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と、季節性障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群(遅発性ジスキネジア)、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性���上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び家族性前頭側頭性健忘症が含まれ、限定するものではないが、代謝系の疾患の中には、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性（coumarin resistance）、嚢胞性繊維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、フルクトース-１、６−ジホスファターゼ欠乏症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、副腎皮質機能亢進症（Hyperadrenalism）、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、高コレステロール血症、甲状腺機能亢進症、低血糖症、甲状腺機能低下症、脂肪過剰血症、脂質ミオパシー、脂肪ジストロフィー症、リソソーム蓄積症、マノシドーシス、ノイラミニナーゼ欠損症、肥満、骨粗しょう症、フェニルケトン尿症、プソイドビタミンD欠損くる病、炭水化物代謝障害(例えば、先天性II型異常赤血球産生症性貧血、糖尿病、インスリン依存型真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病、ガラクトースエピメラーゼ欠乏症、糖原病、リソソーム蓄積症、果糖尿、五炭糖尿症)、およびピルビン酸代謝の先天性異常、脂肪肝のような脂質代謝異常、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、GM２にガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、最小変化症、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、およびMenke病のような銅代謝疾患、ウイルソン病、およびエーレルス‐ダンロー症候群IX型糖尿病が含まれ、
また発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、内分泌疾患の中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラークリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ADH）分泌症候群（SIADH）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Conn病（chronic hypercalemia）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Arnold-Healy-Gordon症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病、副腎機能不全などの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれる。
【０２２９】
別の実施例では、REMAP またはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むREMAP の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２３０】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上記した疾患を含む、REMAP の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたREMAP を含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に患者に投与することも可能である。
【０２３１】
更に別の実施例では、REMAP の活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むREMAP の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２３２】
更なる実施例では、REMAP の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にREMAP のアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記の細胞増殖異常、自己免疫／炎症性疾患、神経疾患、代謝疾患、発達障害および、内分泌疾患が含まれる。一実施態様では、REMAP と特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはREMAP を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２３３】
別の実施例では、REMAP をコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むREMAP の発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２３４】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２３５】
REMAP のアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。具体的には、精製されたREMAP を用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、ＴＭＰと特異結合するものを同定することが可能である。REMAP の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０２３６】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトその他など種々の宿主が、REMAP または、免疫原性の特性を備えるその任意の断片またはオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２３７】
REMAP に対する抗体類を誘導するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。REMAP アミノ酸の短いストレッチは、KLHなど別のタンパク質の配列と融合されることができ、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０２３８】
REMAP に対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他. (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D. 他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. 他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。
【０２３９】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発した技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:68516855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他. (1985) Nature 314:452-454を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、REMAP特異的一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０２４０】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る。（Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. 他 (1991) Nature 349:293-299等を参照）。
【０２４１】
REMAP のための特異結合部位を有する抗体断片を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（Huse, W.D. 他 (1989) Science 246:1275-1281等を参照）。
【０２４２】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセイには、REMAPとその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性REMAP エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２４３】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、REMAPに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でREMAP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多数のREMAP エピトープに対して親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体試薬に関して判定したKaは、REMAP に対する抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。特定のREMAP エピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、REMAP抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７liter／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、REMAPが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. 及び Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２４４】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、REMAP抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のCattyの文献、同Coligan 他の文献等を参照）。
【０２４５】
本発明の別の実施例では、REMAPをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用できる。ある実施態様では、REMAPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA及びRNA、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片を、REMAPをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(Agrawal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照。)
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. 他 (1995)9(13):1288-1296.等を参照）アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217-225; Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照）。
【０２４６】
本発明の別の実施例では、REMAP をコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. ら (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Blaese, R.M. ら (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C. ら (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J. ら (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G. ら (1995) Hum. Gene  Therapy 6:643-666、Crystal, R.G. ら. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35  R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosomacruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。REMAP の発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からREMAP を発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２４７】
本発明の更なる実施例では、REMAPの欠損による疾患や障害は、REMAPをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってREMAP欠損細胞に導入することによって治療される。in vivo或いはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、及び（v）DNAトランスポソンの使用（Morgan, R.A. および W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501-510; Boulay, J-L. および H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）がある。
【０２４８】
REMAP の発現に有効であり得る発現ベクターの例として、限定するものではないがpcDNA 3.1、EpiTag、pRcCMV2、pREP、pVAX、pCRII-TOPOTAベクター（Invitrogen, Carlsbad CA）、pCMV-Script、pCMV-Tag、PEGSH/PERV（Stratagene, La Jolla CA）およびPTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG（Clontech, Palo Alto CA）が挙げられる。REMAP を発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販のT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. and H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するREMAP をコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２４９】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. 及び A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２５０】
本発明の別の実施態様では、REMAP の発現に関連する種々の遺伝子欠損によって起こる疾患や障害を、（i）レトロウイルス長末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは或る独立プロモーターのコントロール下でREMAP をコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナル群と、（iii）効率的なベクター増殖に必要なコーディング配列群と追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列群とを伴うRev応答性エレメント（RRE）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療し得る。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。 上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２５１】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、REMAP の発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞にREMAP をコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために融通のきくことが証明された（Csete, M.E. 他 (1995) Transplantation 27:263-268）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２５２】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、REMAP の発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を持つ標的細胞群に、REMAP をコードするポリヌクレオチド群を送達する。単純ヘルペスウイルス（HSV）系ベクター類は、HSVが親和性を持つ中枢神経系の細胞にREMAP を導入する際に、特に有用であろう。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２５３】
別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてREMAPをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分かった（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、REMAP をコードする配列をキャプシッドをコードする領域の代わりにαウイルスゲノムに導入することによって、ベクター導入細胞において多数のREMAP をコードするRNAが産生され、高いレベルでREMAP が合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（SIN）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Dryga, S.A. 他 (1997) Virology 228 :74-83）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にREMAP を導入することができる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２５４】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E. 他 (1994) in: Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ページ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２５５】
リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子は、REMAPをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する可能性がある。
【０２５６】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２５７】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、REMAPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０２５８】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' O-メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）等を加えることでできる。
【０２５９】
本発明の更なる実施例は、REMAPをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、REMAP の発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、REMAP をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、REMAP の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、REMAP をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２６０】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。REMAP をコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。REMAP をコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、REMAP をコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性を調べるためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組合せライブラリをスクリーニングすることに関与している（Bruice, T.W. 他 (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２６１】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K. 他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466.等を参照）。
【０２６２】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２６３】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、REMAP、REMAPの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはREMAPのインヒビターなどからなる。
【０２６４】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２６５】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば従来の低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２６６】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２６７】
特殊形状の成分は、REMAP またはその断片を含む高分子を直接細胞内輸送するために調製される。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、REMAP またはその断片をHIV Tat-1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569-1572）。
【０２６８】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２６９】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばREMAPまたはその断片、REMAPの抗体、REMAPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。治療有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２７０】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２７１】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合計で約１gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２７２】
（診断）
別の実施例では、REMAP の発現によって特徴付けられる疾患の診断のために、或いはREMAP やREMAP のアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者をモニターするためのアッセイにおいて、REMAP を特異的に結合する抗体が用いられることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。REMAP の診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体および標識を用いてREMAP を検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものも、されていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２７３】
REMAPを測定するための、ELISA，RIA，及びFACSなど種々のプロトコルは、当分野では既知であり、変容した或いは異常なレベルのREMAP発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的なREMAP の発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とREMAP に対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのREMAP の発現の量が基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２７４】
本発明の別の実施例によれば、REMAP をコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るREMAPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、REMAPの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のREMAP値の調節を監視する。
【０２７５】
一実施形態では、REMAPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、REMAP をコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブが高度に特異的な領域(例えば５'調節領域)から作成されていようと、あるいは、やや特異性の低い領域(例えば保存されたモチーフ)から作成されていようと、プローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがREMAPをコードする天然の配列のみを同定するか、或いは対立形質変異体や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２７６】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、REMAPをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:16-30 の配列、或いはREMAP 遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２７７】
REMAP をコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、REMAP およびREMAP 誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２７８】
REMAP をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、REMAP の発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定されるものではないが、そのような疾患の例として、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患筋ジストロフィー、および他の神経筋障害、末梢神経系疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と、季節性障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群(遅発性ジスキネジア)、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び家族性前頭側頭性健���症が含まれ、代謝系の疾患の中には、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性（coumarin resistance）、嚢胞性繊維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、フルクトース-１、６−ジホスファターゼ欠乏症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、副腎皮質機能亢進症（Hyperadrenalism）、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、高コレステロール血症、甲状腺機能亢進症、低血糖症、甲状腺機能低下症、脂肪過剰血症、脂質ミオパシー、脂肪ジストロフィー症、リソソーム蓄積症、マノシドーシス、ノイラミニナーゼ欠損症、肥満、骨粗しょう症、フェニルケトン尿症、プソイドビタミンD欠損くる病、炭水化物代謝障害(例えば、先天性II型異常赤血球産生症性貧血、糖尿病、インスリン依存型真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病、ガラクトースエピメラーゼ欠乏症、糖原病、リソソーム蓄積症、果糖尿、五炭糖尿症)、およびピルビン酸代謝の先天性異常、脂肪肝のような脂質代謝異常、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、GM２にガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、最小変化症、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、およびMenke病のような銅代謝疾患、ウイルソン病、およびエーレルス‐ダンロー症候群IX型糖尿病が含まれ、また発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、内分泌疾患の中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラークリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ADH）分泌症候群（SIADH）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Conn病（chronic hypercalemia）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Arnold-Healy-Gordon症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病、副腎機能不全などの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれる。REMAP をコードするポリヌクレオチド配列は、変容したREMAP 発現を検出するために患者から採取した体液あるいは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、あるいはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、およびマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２７９】
ある実施態様では、REMAP をコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。REMAP をコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液あるいは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく変化している場合は、そのサンプル内のREMAP をコードするヌクレオチド配列群のレベル変化の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２８０】
REMAPの発現に関連する疾患の診断の基礎を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロフィールが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、REMAPをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２８１】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２８２】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２８３】
REMAP をコードする配列群から設計したオリゴヌクレオチド群の更なる診断的利用には、PCRの利用を含み得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはREMAPをコードするポリヌクレオチドの断片、あるいはREMAPをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２８４】
或る実施態様においては、REMAP をコードするポリヌクレオチド配列群に由来するオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。REMAP では、REMAPをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２８５】
SNPはヒト疾患の遺伝的根拠の研究に用いられ得る。例えば、少なくとも、１６のありふれたSNPは非インスリン型真性糖尿病に関連している。SNPは、例えば、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、または慢性肉芽腫症のような単一遺伝子病の疾患の現れ方の差異を調べる場合にも有用である。SNPにはまた生命を脅かす毒性のような薬剤に対する患者の反応に影響を与える遺伝的変異体の同定、薬物ゲノムにおける有用性がある。例えば、N-アセチルトランスフェラーゼにおける変異は抗結核剤、イソニアジドに応答した末梢神経障害の高発生率と関連しているが、ALOX5 遺伝子のコアプロモータの変異は５-リポキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息薬での治療に対する臨床的反応を減少する。異なった集団でのSNPの分布についての分析は遺伝的浮動、突然変異、組み換え体や選択および集団の起源の追跡および集団の移動について調べるために有用である。(Taylor, J.G. 他 (2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y. および Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P. 他 (2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641.)
REMAP の発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び、標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、 Melby, P.C. 他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235244; Duplaa, C. 他 (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照。)目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２８６】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２８７】
別の実施例では、REMAP、REMAPの断片、REMAPに特異的な抗体を、マイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質間相互作用、薬剤と標的間の相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２８８】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Seilhamer 他、米国特許第5,840,484号の「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。これらを引用することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写の全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２８９】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２９０】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価と併せて使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを示す、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称される特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. 及び N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの遺伝子の発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャのエレメントへの遺伝子機能を割り当てることは毒性機構の解明に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的な一致には遺伝子機能の知識は必要ではない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２９１】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプル間の転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２９２】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析される。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理された、または未処理の生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０２９３】
プロテオームのプロファイルは、REMAP に特異的な抗体を用いて作成してREMAP 発現レベルを定量する。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２９４】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行して分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２９５】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２９６】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【０２９７】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他の (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他の (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他の (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２９８】
本発明の別の実施例では、天然のゲノム配列をマッピングする際に有効なハイブリダイゼーションプローブを産出するため、REMAP をコードする核酸配列を用いることが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(例えば、 Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127134; and Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149154を参照。)一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（RFLP）と相関するような遺伝子連鎖地図を作製できる。(例えば、 Lander, E.S. 及び D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照。)
蛍光in situハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のHeinz-Ulrich, 他 (1995) in Meyers, 965-968ページ等を参照）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のREMAP をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２９９】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなる配列マッピングも、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Gatti, R.A.他 (1988) Nature 336:577-580等を参照）転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０３００】
本発明の別の実施例では、REMAP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。REMAPと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０３０１】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen, 他 (1984) PCT application WO84/03564等を参照)。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、REMAP、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたREMAP が当分野で周知の方法で検出される。 精製されたREMAPはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０３０２】
別の実施例では、REMAP と特異結合可能な中和抗体がREMAP との結合について試験用化合物競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、REMAPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３０３】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にREMAP をコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０３０４】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３０５】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/262.838号、第60/265.927号、第60/271.196号、第60/274.549号及び第60/334.179号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【実施例】
【０３０６】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNAは、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）に記載されたcDNAライブラリに由来するものである。ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるTRIZOL（Life Technologies）等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０３０７】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮA分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３０８】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズの選択（３００〜１０００bp）は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位に結合させた。 好適なプラスミドは例えば、PBLUESCRIPT プラスミド (Stratagene)、PSPORT1 プラスミド(Life Technologies)、PCDNA2.1 プラスミド(Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMV プラスミド(Stratagene)、 PCR2-TOPOTA (Invitrogen)、 PCMV-ICISプラスミド (Stratagene)、pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)または pINCY (Incyte Genomics)、あるいはその誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【０３０９】
２  cDNAクローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３１０】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKANII蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３１１】
３  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics）か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０３１２】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群より選択した１つに対して行った。すなわち、公共のデータベース群（例えばGenBankの霊長類およびげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）、PROTEOMEの、ヒト、ラット、マウス、線虫（Caenorhabditis elegans）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）およびCandida albicans（Incyte Genomics, Palo Alto CA）からの配列群を持つデータベース群、および、PFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群である（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照のこと）。Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）の選択に対するIncyte cDNA配列またはその翻訳を問い合わせた。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築した。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてIncyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを用いてcDNAの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、GenBankタンパク質データベース（genpept）、SwissProt、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）に基づいた、タンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０３１３】
Incyte cDNA及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０３１４】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:16-30のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表2の列４に示した。
【０３１５】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上の受容体および膜結合タンパク質は、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C. および S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94 及びBurge, C. 及び S. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が受容体および膜結合タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて受容体および膜結合タンパク質について問合せて分析した。潜在的な受容体および膜結合タンパク質は、また受容体および膜結合タンパク質として注釈が付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定した。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのGenscanにより予測された配列のエラーを修正する。BLAST分析はまた、任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列及び／または公共のcDNA配列でGenscan予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０３１６】
5  cDNA配列データを使ったゲノム配列データの構築
ステッチ配列（Stiched Sequence）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのcDNA及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【０３１７】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０３１８】
６  REMAP をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:16-30を構築するために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:16-30 と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrap（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前にマッピングされていたかを確認した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３１９】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関して測定する。（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。 尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットによって広範囲に変化する。）cM距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。NCBI「GeneMap99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３２０】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambrook, 7章、同Ausubel. F.M. 他, 4章及び16章等を参照。）
BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の一致を厳密な一致、或いは類似的な一致として分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３２１】
【数１】
2005500008.tif 000004
【０３２２】
積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（HSP）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、他端が７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３２３】
或いは、REMAPをコードするポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列が派生した組織源に関連して分析した。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列（実施例３を参照）と少なくとも一部はオーバーラップするように構築される。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の生物／組織カテゴリー即ち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、REMAP をコードするcDNAの疾患特異的な発現を反映する。 cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３２４】
８  REMAPをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０３２５】
配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３２６】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。 PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg２+と(NH4)2SO4と2−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。 プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。} ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。ステップ6: 68℃, 5 分、ステップ7:  4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。ステップ6: 68℃、5 分、ステップ7:  4℃で保存する。
【０３２７】
1X TEに溶解したPICOGREEN定量試薬（０.２５％(v/v) PICOGREEN、Molecular Probes, Eugene OR）１００μlと、希釈していないPCR産物０.５μlとを不透明な蛍光光度計プレート（Coming Costar, Acton MA）の各穴に分配し、DNAを試薬と結合可能なようにさせることによって各穴内のDNA濃度の測定を行った。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するためにプレートをFluoroskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μlを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０３２８】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。T4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いて伸長させたクローンをpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハング部分を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０３２９】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 72℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。ステップ6: 72℃, 5 分、ステップ7:  4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０３３０】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５'調節配列を得る。
【０３３１】
９  REMAP がコードするポリヌクレオチドのSNP(一塩基多型)の同定
SNPとして知られるありふれたDNA配列変異体がLIFESEQ データベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:16-30 同定された。実施例３に記述されているように、同じ遺伝子からの配列を共にクラスターにして構築し、これによって遺伝子のすべての配列変異体の同定ができた。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。予備フィルターは、最小限のPhredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラおよびスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍に最初のクロマトグラムファイルが解析された。クローンのエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて近接の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。最後のフィルターによって複製と、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在するSNPが除去された。
【０３３２】
高速処理MASSARRAY システム(Sequenom, Inc.) を用いて質量分析によってさらに特徴付けるために特定のSNPを選択して、四つの異なったヒト母集団中のSNP部位における対立遺伝子発生頻度を分析した。白人母集団は、ユタ州の83人、フランス人が4人、ベネズエラ、３人およびアーミッシュ派人の２人を含む92人で構成された。アフリカ人母集団はすべてアメリカ黒人である194人( 男性97人、 女性97人)からなる。ラテンアメリカ人母集団はすべてメキシコ系ラテンアメリカ人の324人( 男性162人、 女性162人)からなる。アジア人母集団は126人(男性64人、女性62人)からなり、その内訳は中国人43%、日本人31%、韓国人13%、ベトナム人5%およびその他のアジア人8%と報告されている。対立形質の発生頻度は最初に白人母集団において分析し、いくつかの例において、この母集団で対立形質変化を示さなかったSNPは他の三つの部集団においてさらに検査しなかった。
【０３３３】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
SEQ ID NO:16−30由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Pharmacia Biotech）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて十分に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化したヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３３４】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３３５】
１1  マイクロアレイ
マイクロアレイ上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、当業者に周知の利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Schena, M. 他 (1995) Science 270:467-470、Shalon. D. 他 (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照）。
【０３３６】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０３３７】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルは、MMLV逆転写酵素、０.０５pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1X 第１鎖バッファ、０.０３unit/μlのRNアーゼ阻害剤、５００μMのdATP、５００μMのdGTP、５００μMのdTTP、４０μMのdCTP、４０μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用いてポリ(A)+RNA含有の25体積ml内で行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて乾燥して仕上げ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３３８】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製される。
【０３３９】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理中及び処理後に０.１％のSDS及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオブンで硬化させる。
【０３４０】
米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３４１】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３４２】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC、０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０３４３】
検出
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには４８８nm、Cy５の励起のためには６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザ（Coherent, Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた１.８cm×１.８cmのアレイは、２０μmの解像度でスキャンした。
【０３４４】
２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３４５】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比1：100,000でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３４６】
光電子増倍管の出力は、IBM互換性PCコンピュータにインストールされた１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲への直線的２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３４７】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０３４８】
１2  相補的ポリヌクレオチド
REMAPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のREMAPの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びREMAPのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがREMAPをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３４９】
１3 REMAPの発現
REMAP の発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でREMAP が発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節因子に関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとREMAPを発現する。真核細胞でのREMAPの発現は、一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、REMAP をコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。
【０３５０】
殆どの発現系では、REMAP が、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Pharmacia Biotech）。精製の後、GST部分を特定の操作部位でREMAP からタンパク分解的に切断できる。FLAGは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したREMAP を直接用いて以下の実施例１７、１８、および１９のアッセイを行うことができる。
【０３５１】
１４  機能的アッセイ
REMAP機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのREMAPをコードする配列の発現によって評価する。 cDNAを、cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選択ベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3.1プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、前方光散乱と90°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【０３５２】
遺伝子発現におけるREMAPの影響は、REMAPをコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。REMAPおよび目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３５３】
１５  REMAPに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたREMAPを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０３５４】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてREMAPアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。 そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。 適切なエピトープ、例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel, 1995, 11章等を参照）。
【０３５５】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。例えば、ペプチドまたはREMAPを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させて、得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗REMAP活性を検査する。
【０３５６】
１６  特異的抗体を用いる天然REMAP の精製
天然REMAP或いは組換えREMAPを、REMAPに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗REMAP抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０３５７】
REMAPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、REMAPを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とREMAPとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、REMAPを回収する。
【０３５８】
１７  REMAP と相互作用する分子の同定
REMAP または生物学的に活性であるREMAP 断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する。(例えば Bolton A.E. および W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照。)マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したREMAP と共にインキュベートし、洗浄して、標識したREMAP 複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なREMAP 濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したREMAP の数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３５９】
別法では、REMAPと相互作用する分子を、Fields, S.およびO. Song（1989, Nature 340:245-246）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）やMATCHMAKERシステム（Clontech）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３６０】
REMAPはまた、ハイスループットな方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. ら (2000) 米国特許第6,057,101号）。(2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３６１】
１８  REMAP 活性の実証
REMAP 活性に対する或るアッセイは、細胞表面におけるREMAP の発現を測定する。REMAP をコードするcDNAを、好適な哺乳動物細胞株に形質移入する。細胞表面タンパク質は、記載されているようにビオチンで標識する（de la Fuente, M.A. 他 (1997) Blood 90:2398-2405）。REMAP特異抗体を用いて免疫沈降を実行し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）及び免疫ブロット技術を用いて免疫沈降サンプルを分析する。標識された免疫沈降と未標識免疫沈降の比は、細胞表面に発現したREMAP の量に比例する。
【０３６２】
或いは、REMAP 活性のためのアッセイは、リガンド／受容体が仲介する細胞増殖の調節のための原型アッセイに基づく。このアッセイでは、スイスマウス3T3細胞におけるDNA合成の速度を測定する。当分野で公知の形質移入方法を用いて、REMAP をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを静止状態の3T3培養細胞に加える。 一過性に形質移入された細胞は次に、放射性DNA前駆分子である[3H]チミジンの存在下でインキュベートする。次に、培養した細胞にREMAP リガンドの変化する量を加える。[3H]チミジンの酸沈殿可能DNAへの取り込みは、ラジオアイソトープカウンターを用いて適切な時間間隔で測定する。 取り込み量は、新たに合成されたDNAの量に正比例する。少なくとも１００倍のREMAP リガンド濃度範囲に対する用量反応曲線がリニアであることは、受容体活性を示唆するものである。ミリリットル当りの活性の１単位は、５０％の反応レベルを産出するREMAP の密度として画定され、１００％であれば[3H]チミジンを酸沈殿可能DNAに最大限取り込むことを表す（McKay, I. and I. Leigh, eds. (1993) Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Press, New York NY, 73ページ）。
【０３６３】
或いは、REMAP 活性のためのアッセイは、REMAP ファミリータンパク質がＧタンパク質活性化セカンドメッセンジャーシグナル伝達経路を調整する能力に基づく（例えばcAMP; Gauclin, P. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:4990-4996）。当分野で既知の方法を用いて、完全長REMAP をコードするプラスミドを哺乳動物細胞系（例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)またはヒト胎児腎臓(HEK-293)細胞系）に形質移入する。 培地中の１２穴トレーで形質移入された細胞を成長させ、培養液を廃棄して、接着した細胞をPBSで軽く洗浄する。培地においてリガンド有りまたはリガンドなしで細胞を３０分間インキュベートし、次に培地を除去し、細胞を１Mの過塩素酸で処理して溶解する。溶解産物中のcAMPレベルは、当分野で既知の方法を用いて放射免疫アッセイにより測定する。 リガンドに曝された細胞から得た溶解産物中のcAMPレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するREMAP の量に比例する。
【０３６４】
イノシトールリン酸レベルの変化を測定するためには、１×１０5 細胞／穴を含む２４穴プレートで細胞を成長させ、イノシトールを含まない培地及び [3H]ミオイノシトールを用いて２μCi／穴で４８時間インキュベートする。培養液を除去し、１０mMのLiClを含む緩衝液で細胞を洗浄し、その後リガンドを添加する。反応は、過塩素酸の添加により停止する。イノシトールリン酸は、Dowex AG1-X8（Bio-Rad）陰イオン交換樹脂及び液体シンチレーションにより計数された全ての標識されたイノシトールリン酸で抽出及び分離される。リガンドに曝された細胞から得た標識されたイノシトールリン酸のレベルをリガンドなしのものと比較したときの変化は、形質移入された細胞に存在するREMAP の量に比例する。
【０３６５】
更なる実施例において、REMAPのイオン伝導性機能は電気生理学的試験を用いて実証される。REMAPは、COS7、 HeLa または CHOのような哺乳類細胞系をREMAPをコードする 真核生物発現ベクターで形質転換することによって発現される。真核生物発現ベクターは市販されており、それらを細胞内に導入する技術は当業者には周知である。 β−ガラクトシダーゼのような多数の標識遺伝子のいずれか一つを発現させる第二プラスミドの少量は、細胞へと同時形質転換され、異質なDNAを吸収し発現させるそれら細胞の迅速な同定を可能とする。細胞は形質転換の後、株化細胞がREMAP 及び１３−ガラクトシダーゼを発現し蓄積するのに適した条件下で、４８−７２時間に渡ってインキュベートされる。β−ガラクトシダーゼを発現する形質転換細胞は、本技術分野で既知の条件下で適切な比色基質を培地へ添加すると青く染色される。 染色された細胞は、本技術分野で既知の電気生理学技術を用いて膜電気伝導度の違いを試験する。形質転換されていない細胞、及び/又はベクター配列だけ、若しくはβ−ガラクトシダーゼ配列だけのいずれかで形質転換された細胞は、対照として用いられ、並行して試験する。どちらかのREMAPに特異的な抗体を用いて細胞をインキュベートすることによってREMAP のカチオンまたはアニオン伝導性に寄与することが示される。それぞれの抗体は、REMAPの細胞外側に結合することにより、イオンチャネル内のポアと、それに伴う伝導性とをブロックする。
更なる実施例において、REMAP の輸送活性は、アフリカツメガエル卵母細胞への標識された基質の取り込みを測定することによって検査される。
ステージ５及び６の卵母細胞は、REMAP mRNA (卵母細胞あたり10 ng)で注入され、OR2培地(82,5. 5mMのNaCl、2. 5 mMのKC1、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、1mM Na2HPO4、5 mMのHepes、3. 8 mMのNaOH、 50μg/ml ゲンタマイシン、pH 7. 8) 内で１８℃で３日間インキュベートして、REMAP の発現を可能とする。卵母細胞は、次に標準取り込み培地(100mMのNaCl、2 mMのKC1、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、10 mMのHepes/Tris、pH 7. 5)へと移される。種々の基質(例えば、アミノ酸、糖、薬物および神経伝達物質)の取り込みは、卵母細胞にH3 基質を添加することによって開始される。30分間インキュベートした後、卵母細胞を Na+遊離培養液中で卵母細胞を3回洗浄して取り込みを中止させ、取り込まれた 3Hを測定し、対照と比較する。REMAP活性は吸収された3H基質の濃度に比例する。
【０３６６】
さらなる実施例において、REMAP プロテインキナーゼ(PK)活性は、γ標識の[32P]ATP を用いたタンパク質基質のリン酸化と組み込まれた放射活性を定量する。REMAPはタンパク質基質、32P-ATP、及び適切なキナーゼバッファと共にインキュベートする。生成産物に組み込まれた32Pは、電気泳動法で遊離32P-ATPより分離され、組み込まれた32Pをラジオアイソトープカウンターでカウントする。回収した32P の量はアッセイ中のREMAP のPK 活性に比例する。リン酸化した特異的アミノ酸残基の判定を、加水分解したタンパク質のホスホアミノ酸解析で行う。
【０３６７】
１９  REMAP リガンドの同定
REMAP は、CHO（チャイニーズハムスター卵巣）またはHEK（ヒト胎児腎臓）293などの真核細胞株において発現する。 これらの細胞株は、GPCR発現過程が良好であり、発現したREMAP が下流エフェクターに機能的に共役できるような広範囲のＧタンパク質を含む。候補リガンドの存在下で発現した受容体の活性化に対し、形質転換した細胞をアッセイする。活性は、cAMPまたはCa2+ などの細胞内セカンドメッセンジャーの変化により測定する。当分野で公知の標準的な方法を用いるか、活性化受容体によるタンパク質キナーゼCの刺激に反応して発光タンパク質（例えばホタルルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）がプロモーターの転写調節下にあるようなレポーター遺伝子アッセイを用いて直接測定する（Milligan, C. ら (1996) Trends Pharmacol. Sci. 17:235-237）。アッセイ技術は、これらセカンドメッセンジャーシステムの両方に利用可能であり、アデニリルシクラーゼ活性化FlashPlate Assay（NEN Life Sciences Products）などのマルチウェルプレートフォーマットまたはFluo-4 AM（Molecular Probes）などの蛍光Ca2+ 指示薬でFLIPR蛍光定量的プレート読出しシステム（Molecular Devices）を併用して高処理読出しを可能にする。生理的関連性のあるセカンドメッセンジャー経路が知られていない場合、REMAP は、ホスホリパーゼC及びCa2+ 可動化に関与する経路を介してREMAP のシグナル伝達を通すために、広範囲のＧタンパク質と共役することが実証されているようなＧタンパク質Ｇα15/16と同時発現し得る（Offerrnanns, S. and M.I. Simon (1995) J. Biol. Chem. 270:15175-15180）。或いは、REMAP は内因性GPCRが不足しているような操作された酵母系に発現し、それによってREMAP 活性化スクリーニングに対してバックグラウンドが存在しない利点を提供し得る。これらの酵母系は、ヒトGPCR及びＧαタンパク質を内因性酵母フェロモン受容体経路の対応する構成要素に対して置換する。シグナルに対する正常な酵母反応を、選択的培地の正の成長またはレポーター遺伝子発現に変換するように、下流シグナル伝達経路も変更する（Broach, J.R. and J. Thorner (1996) Nature 384 (supp.):14-16）。既知のGPCRリガンド及びその他の天然の生理活性分子を含む推定上のリガンドに対して受容体をスクリーニングする。組織、生物学的液体及び細胞上澄みから抽出した生物学的抽出物もスクリーニングする。
【０３６８】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明に記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３６９】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３７０】
表２は、GenBank識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３７１】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３７２】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３７３】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０３７４】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３７５】
表７は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０３７６】
【表１】
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【０３７７】
【表２−１】
2005500008.tif 000006
【０３７８】
【表２−２】
2005500008.tif 000007
【０３７９】
【表３−１】
2005500008.tif 000008
【０３８０】
【表３−２】
2005500008.tif 000009
【０３８１】
【表３−３】
2005500008.tif 000010
【０３８２】
【表３−４】
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【０３８３】
【表３−５】
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【０３８４】
【表３−６】
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【０３８５】
【表３−７】
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【０３８６】
【表３−８】
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【０３８７】
【表３−９】
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【０３８８】
【表３−１０】
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【０３８９】
【表３−１１】
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【０３９０】
【表４−１】
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【０３９１】
【表４−２】
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【０３９２】
【表４−３】
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【０３９３】
【表４−４】
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【０３９４】
【表５】
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【０３９５】
【表６−１】
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【０３９６】
【表６−２】
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【０３９７】
【表６−３】
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【０３９８】
【表６−４】
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【０３９９】
【表６−５】
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【０４００】
【表７−１】
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【０４０１】
【表７−２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500008.tif 000202
【国際調査報告】
2005500008.tif 000203
2005500008.tif 000204
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