(57)【要約】本発明は、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼの生物活性を有する真菌ポリペプチドをコードする核酸、それにコードされるポリペプチド、殺真菌剤の標的としてのそれらの用途、および新規殺真菌性化合物を同定するためのそれらの用途に関する。本発明は更に、該ポリペプチドのモジュレーターを見出すための方法、およびアセトアセチルＣｏＡチオラーゼの機能を有する真菌ポリペプチドをコードする配列を含むトランスジェニック生物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病原性真菌のＡＣＡＴの活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２】
担子菌のＡＣＡＴをコードすることを特徴とする、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）のＡＣＡＴをコードすることを特徴とする、請求項１または２記載の核酸。
【請求項４】
一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの形態をとることを特徴とする、請求項１、２または３記載の核酸。
【請求項５】
ゲノムＤＮＡの断片の形態またはｃＤＮＡの形態をとることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸。
【請求項６】
ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３に示す配列、
ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列、
ｃ）ａ）および／またはｂ）で定められた配列に３５〜５２℃のハイブリダイゼーション温度でハイブリダイズする配列、
ｄ）ａ）および／またはｂ）で定められた配列に対して少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、非常に特に好ましくは９５％の同一性を有する配列、
ｅ）ａ）および／またはｂ）で定められた配列に相補的である配列、ならびに
ｆ）遺伝コードの縮重により、ａ）および／またはｂ）で定められた配列と同じアミノ酸配列をコードする配列
から選ばれる配列を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の核酸。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項記載の核酸と異種プロモーターとを含んでなるＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１項記載の核酸または請求項７記載のＤＮＡ構築物を含んでなるベクター。
【請求項９】
該核酸が、原核細胞または真核細胞内での該核酸の発現を保証する調節配列に機能しうる形で連結されていることを特徴とする、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれか１項記載の核酸、請求項７記載のＤＮＡ構築物または請求項８もしくは９記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
原核細胞の形態をとることを特徴とする、請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１２】
真核細胞の形態をとることを特徴とする、請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれか１項記載の核酸によりコードされる、ＡＣＡＴの生物活性を有するポリペプチド。
【請求項１４】
ａ）配列番号４に示す配列、
ｂ）ａ）で定められた配列に対して少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％の同一性を有する配列、および
ｃ）ａ）で定められた配列と同じ生物活性を有する配列
から選ばれる、ＡＣＡＴの生物活性を有するポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１６】
（ａ）自体公知の方法による完全な化学合成、
（ｂ）オリゴヌクレオチドの化学合成、該オリゴヌクレオチドの標識、真菌細胞由来のゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡから作製されたゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡへの該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、陽性クローンの選択、および陽性クローンからの該ハイブリダイズＤＮＡの単離、または
（ｃ）オリゴヌクレオチドの化学合成およびＰＣＲによる標的ＤＮＡの増幅
の工程を含んでなる、請求項１から６のいずれか１項記載の核酸の製造方法。
【請求項１７】
（ａ）請求項１から６のいずれか１項記載の核酸の発現を保証する条件下、請求項１０から１２のいずれか１項記載の宿主細胞を培養すること、または
（ｂ）請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸をインビトロ系で発現させること、
（ｃ）該細胞、該培地または該インビトロ系から該ポリペプチドを得ること
を含んでなる、請求項１３または１４記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１８】
（ａ）請求項１０から１２のいずれか１項記載の宿主細胞または請求項１３もしくは１４記載のポリペプチドを、該ポリペプチドと化合物との相互作用を許容する条件下、化合物または化合物の混合物と接触させる工程、および
（ｂ）該ポリペプチドに特異的に結合する及び／又はこのポリペプチドの活性をモジュレーションする化合物を同定する工程
を含んでなる、請求項１３または１４記載のポリペプチドに結合する及び／又はこのポリペプチドの活性をモジュレーションする化合物を見出すための方法。
【請求項１９】
（ａ）請求項１０〜１２のいずれか１項記載の宿主細胞を化合物または化合物の混合物と接触させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドの濃度を測定する工程、および
（ｃ）該ポリペプチドの発現に特異的に影響を及ぼす化合物を同定する工程
を含んでなる、請求項１３または１４記載のポリペプチドの発現を修飾する化合物を見出すための方法。
【請求項２０】
真菌ＡＣＡＴ、それをコードする核酸もしくはこれらの核酸を含有するＤＮＡ構築物または宿主細胞の、真菌活性化合物を見出すための使用。
【請求項２１】
ＡＣＡＴの生物活性を有するポリペプチドのモジュレーターの、殺真菌剤としての使用。
【請求項２２】
ＡＣＡＴの生物活性を有するポリペプチドのモジュレーターの、有害な真菌を防除するための組成物の製造のための使用。
【請求項２３】
請求項１８または１９記載の方法により同定されたモジュレーター。
【請求項２４】
請求項１８または１９記載の方法により見出された殺真菌活性物質。
【請求項２５】
請求項１から６のいずれか１項記載の核酸、請求項７記載のＤＮＡ構築物または請求項８もしくは９記載のベクターの、トランスジェニック植物および真菌を作製するための使用。
【請求項２６】
請求項１から６のいずれか１項記載の核酸、請求項７記載のＤＮＡ構築物または請求項８もしくは９記載のベクターの導入後、請求項１３または１４記載のポリペプチドの細胞内濃度が、対応する野生型細胞の場合と比較して増加または減少していることを特徴とするトランスジェニック植物、植物部分、プロトプラスト、植物組織または植物繁殖物質。
【請求項２７】
請求項１から６のいずれか１項記載の核酸、請求項７記載のＤＮＡ構築物または請求項８もしくは９記載のベクターの導入後、請求項１３または１４記載のポリペプチドの細胞内濃度が、対応する野生型細胞の場合と比較して増加または減少していることを特徴とするトランスジェニック真菌、真菌細胞、真菌組織、子実体、菌糸体および胞子。
【請求項２８】
対応する内因性ポリペプチドと比較して修飾された生物活性または発現パターンを有する請求項１３または１４記載のポリペプチドを含有することを特徴とする植物、植物部分、プロトプラスト、植物組織または植物繁殖物質。
【請求項２９】
請求項１から６のいずれか１項記載の核酸を内因性突然変異誘発により修飾することを特徴とする請求項２８記載の植物、植物部分、プロトプラスト、植物組織または植物繁殖物質の生産方法。
【請求項３０】
対応する内因性ポリペプチドと比較して修飾された生物活性または発現パターンを有する請求項１３または１４記載のポリペプチドを含有することを特徴とする真菌、真菌細胞、真菌組織、子実体、菌糸体および胞子。
【請求項３１】
請求項１から６のいずれか１項記載の核酸を内因性突然変異誘発により修飾することを特徴とする請求項３０記載の真菌、真菌細胞、真菌組織、菌糸体および胞子の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼの生物活性を有する真菌ポリペプチドをコードする核酸、それにコードされるポリペプチド、殺真菌剤の標的としてのそれらの用途、殺真菌的に活性な新規化合物を同定するためのそれらの用途、これらのポリペプチドのモジュレーターを見出すための方法、およびアセトアセチルＣｏＡチオラーゼの機能を有する真菌ポリペプチドをコードする配列を含有するトランスジェニック生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば農業において、著しい損害を毎年引き起こしている望ましくない真菌増殖は、殺真菌剤の使用により抑制することが可能である。殺真菌剤に対する要求は、その活性、そのコストおよびとりわけその生態学的妥当性に関して絶えず増大している。したがって、強力かつ生態学的に妥当な新規殺真菌剤に開発されうる新規物質または物質のクラスが要求されている。一般には、そのような新規リード構造体を温室試験において探索するのが通例である。しかし、そのような試験は、高い労働力の投入および高い資金の投入を要する。したがって、温室内で試験しうる物質の数は制限される。そのような試験の代替手段としては、（超）ハイスループットスクリーニング法（（Ｕ）ＨＴＳ）として公知のものの利用が挙げられる。これは、多数の個々の物質を個々の細胞、個々の遺伝子産物または遺伝子に対するそれらの効果に関して自動化法で試験することを含む。ある物質が効果を有することが判明したら、それを通常のスクリーニング法で研究し、適当な場合には更に開発することが可能である。
【０００３】
殺真菌剤の有利な標的は必須生合成経路において探索されることが多い。さらに、理想的な殺真菌剤は、真菌の病原性の発現に決定的に重要な遺伝子産物を抑制する物質である。そのような殺真菌剤の一例としては、例えば、真菌のメラニン生合成を抑制して無傷付着器（付着器官）の形成を妨げる活性物質カルプロパミド（ｃａｒｐｒｏｐａｍｉｄ）が挙げられる（Ｋｕｒａｈａｓｈｉら，１９９７）。しかし、真菌に対してそのような役割を果たす公知遺伝子産物は非常に少数しかない。さらに、対応生合成経路を抑制することにより標的細胞の栄養要求性を誘導して病原性の喪失を招く殺真菌剤が公知である。したがって、例えば、エシリモール（ｅｔｈｉｒｉｍｏｌ）の添加の際のアデノシンデアミナーゼの抑制はブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）の有意な抑制をもたらす。
【０００４】
メバロン酸経路（図１および図２を参照されたい）は必須の代謝経路である。なぜなら、その産物はステロール、キノン、ドリコールおよびｔＲＮＡ中のイソペンチル化アデノシンのようなイソプレン含有化合物を含むからである。さらに、いくつかのタンパク質は、イソプレノイド基であるファルネシルおよびゲラニルによる翻訳後修飾を受ける。メバロン酸はすべてのイソプレノイドの前駆体であり、３段階で生成する（図１を参照されたい）。
【０００５】
真核生物および原核生物においては、チオール反応の対応基質の鎖長に基づき区別されうる２つのクラスのチオラーゼが存在する。アセチルＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（以下、ＡＣＡＴと称される）としても公知のアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．９）はアセトアセチルＣｏＡに特異的である。これとは対照的に、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．１６）は種々のβ−ケトアシルＣｏＡ基質に対して広い鎖長スペクトルを示す。これらの２つのクラスは、それらの細胞下局在に関して更に分類することができる。アセトアセチルＣｏＡチオラーゼは一般には細胞質およびミトコンドリアに存在し、細胞質においては、それはメバロン酸代謝経路のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの第１反応工程を触媒し（これはアセトアセチルＣｏＡの可逆的チオール開裂の逆反応である）、ミトコンドリアにおいては、それはケトン体代謝における機能を担う。アルカン同化真菌においては、ペルオキシソームＡＣＡＴも同定されている（Ｋｕｒｉｈａｒａら，１９８８、Ｋｕｒｉｈａｒａら，１９９２、Ｙａｍａｇａｍｉら，２００１）。一方、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼは一般にはミトコンドリアおよびペルオキシソームに局在し、脂肪酸β酸化に関与している。
【０００６】
２つの異なるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ  イソ酵素（すなわち、細胞質のもの及びミトコンドリアのもの）がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に関して記載されている（ＫｏｒｎｂｌａｔｔおよびＲｕｄｎｅｙ，１９７１ｂ）。細胞質アセトアセチルＣｏＡチオラーゼは、おそらく、メバロン酸代謝において同化的に作用し、ミトコンドリア  アセトアセチルＣｏＡチオラーゼは、脂肪酸異化において形成されるアセトアセチルＣｏＡのプールサイズ、およびクエン酸回路に入るアセチルＣｏＡのプールサイズを調節する。それらの２つの酵素のサイズは、ゲル濾過による推定によると、細胞質イソ酵素では１４０，０００Ｄａ、ミトコンドリア  イソ酵素では６５，０００Ｄａである。それらの２つのイソ酵素は更に、ジチオトレイトールをチオール供与体としてインビトロで利用するそれらの能力において異なる（ＫｏｒｎｂｌａｔｔおよびＲｕｄｎｅｙ，１９７１ａ）。それらの２つのイソ酵素の関連性の度合に関する免疫学的データもタンパク質配列情報も存在しない。
【０００７】
アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ遺伝子は多数の原核生物および真核生物から単離されている。細菌においては、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼは、貯蔵分子であるポリ−β−ヒドロキシ酪酸の生合成において何らかの機能を果たしている。アセトアセチルＣｏＡチオラーゼをコードする細菌遺伝子は、例えば、ズーグレア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）（Ｐｅｏｐｌｅｓら，１９８７）およびチオシスティス・ビオラセア（Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ  ｖｉｏｌａｃｅａ）（ＬｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，１９９３）から単離されている。ミトコンドリアアセトアセチルＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子は、とりわけ、ヒト細胞（Ｆｕｋａｏら，１９９０）およびラット細胞（Ｆｕｋａｏら，１９８９）において単離されている。酵母カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）は、同じ２つの遺伝子（ＣＴ−Ｔ１ＡおよびＣＴ−ＴＩＢ；Ｋａｎａｙａｍａら，１９９７）にコードされる２つのＡＣＡＴイソ酵素（サイトゾルおよびペルオキシソーム）を有する。酵母サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）からのアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ遺伝子の産物（Ｄｅｑｕｉｎら，１９８８）は、おそらく、細胞質に局在しているであろう。
【０００８】
エルゴステロールは酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のメバロン酸代謝経路の主要産物である（図１および図２を参照されたい）。エルゴステロールは真菌細胞膜の構成成分であり、真菌の増殖に必要である。ＡＣＡＴをコードする遺伝子ＥＲＧ１０はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の必須遺伝子として記載されている（Ｈｉｓｅｒら，１９９４を参照されたい）。ＥＲＧ１０は、３９８アミノ酸および４１６８１Ｄａの計算分子量を有するポリペプチドをコードしている。組換え酵母ＡＣＡＴは、約１７９ｋＤａのタンパク質サイズを有するホモ四量体として存在することが、ゲル濾過により示されている。
【０００９】
ＡＣＡＴは生化学的に十分に特徴づけられている（Ｃｌｉｎｋｅｎｂｅａｒｄら，１９７５、Ｄｅｑｕｉｎら，１９８８、Ｈｉｓｅｒら，１９９４）。該酵素の結晶構造は細菌ズーグレア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）から同定されている（Ｍｏｄｉｓら，１９９９）。
【００１０】
ＡＣＡＴのこの十分な特徴づけにもかかわらず、該酵素が殺真菌活性化合物の標的として認識されたことはこれまでになかった。現在のところ、この興味深い酵素の利用は、ケトン体代謝の欠損の診断のためにＡＣＡＴを使用する臨床化学に限定されている（Ｗａｔａｎａｂｅら，１９９８）。しかし、種々の生物のＡＣＡＴ（例えば、ラット肝臓におけるもの；Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら，１９８９を参照されたい）が有機分子により抑制されうることが公知である。
【００１１】
ＡＣＡＴをコードするウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）の完全なｃＤＮＡ配列および対応遺伝子（ａｃｃ１）（配列番号１および配列番号２）が本発明の範囲において単離されている［例えば、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）株５２１、ＤＳＭ  Ｎｏ．１４６０３、第９染色体  ＢＡＣ  Ｕｍ３１のコード配列、開始１５２６６−１５２１０（エキソン１）、１５０７３−１４７０３（エキソン２）および１４１５０−１３３５６（エキソン３）、１５２０９−１５０７４（イントロン１）および１４７０２−１４１５１（イントロン２）（４０８アミノ酸長に対応する）］。
【００１２】
担子菌である黒穂病真菌ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）はトウモロコシ植物を冒す。該疾患は、トウモロコシが栽培されるすべての地域で生じるが、乾燥した年においてのみ重要となる。典型的な症状は、すべての地上植物部分に形成される瘤状の握りこぶしサイズの膨潤（膨れ）である。該瘤は最初は淡灰色の粗い膜に覆われている。該膜が破裂すると、最初は滑らかで後に粉末状になる黒い黒穂菌胞子（ｕｓｔｉｌｏｓｐｏｒｅ）塊が放出される。ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属の更なる植物病原性種としては、例えば、ウスチラゴ・ヌダ（Ｕ．ｎｕｄａ）（オオムギおよびコムギの裸黒穂病を引き起こす）、ウスチラゴ・ニグラ（Ｕ．ｎｉｇｒａ）（オオムギの黒穂病を引き起こす）、ウスチラゴ・ホルデイ（Ｕ．ｈｏｒｄｅｉ）（オオムギの堅黒穂病を引き起こす）およびウスチラゴ・アベネ（Ｕ．ａｖｅｎａｅ）（エンバクの堅黒穂病を引き起こす）が挙げられる。
【発明の開示】
【００１３】
担子菌ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）におけるノックアウト解析により、驚くべきことに、子嚢菌サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の場合（Ｈｉｓｅｒら，１９９４も参照されたい）と同様にこの植物病原性真菌においても酵素ＡＣＡＴが該生物の生存に必須であることが本発明の範囲内で見出された。これは、ＡＣＡＴが特定の真菌（この場合はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））においてだけでなく真菌全般においても重要な役割を果たしているという結論づけを可能にするものである。このように、ＡＣＡＴが新規特異的殺真菌剤（厳密には病原性真菌におけるもの）の探索のための最適な標的として初めて認識された。したがって、この標的を使用して、ＡＣＡＴを抑制し殺真菌剤として使用しうる全く新規でありうるリード構造体を同定することが可能となった。
【００１４】
さらに、該酵素の活性に影響を及ぼす物質を適切な試験方法において同定するためにＡＣＡＴを使用しうることが本発明の範囲内で見出された。アミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列により特徴づけられる病原性真菌のＡＣＡＴに加えて、該酵素のモジュレーターを同定するための適切な試験方法も提供する。
【００１５】
さらに、ＡＣＡＴが活性化合物により実際に抑制されること、およびこれらの活性化合物で処理された真菌生物がこれらの活性化合物での処理により損傷または殺菌されうること、すなわち、ＡＣＡＴインヒビターが殺真菌剤として使用されうることが本発明の範囲内で見出された。例えば、試験系において同定された物質でのＡＣＡＴの抑制が合成培地内および植物上の両方において処理真菌の破壊をもたらすことが、本発明において示されている。
【００１６】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＡＴをコードする遺伝子が必須遺伝子であることが既に知られていたとしても、真菌においてＡＣＡＴが殺真菌活性物質の標的タンパク質でありうることはこれまで知られていなかった。したがって、真菌、特に植物病原性真菌に必須であり、したがって更なる改良された殺真菌活性化合物の探索のための標的タンパク質としての使用に特に適した酵素にＡＣＡＴが相当することが、本発明において初めて示された。
【００１７】
ＡＣＡＴが植物病原性真菌などの真菌に必須の酵素に相当するという証拠は、好ましくは、欠失突然変異体の作製により得られる。この目的には、ＤＥ  １０１  ３３  ９２８．３に記載の方法を用いる（実施例も参照されたい）。
【００１８】
さらに、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴは本発明において初めて記載されるものである。記載されているＡＣＡＴは前記クラスのチオラーゼに属する。担子菌のＡＣＡＴをコードする配列は従来知られていなかった。種々の真菌（それらはすべて、子嚢菌である）、すなわち、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・バヤナス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（それらはすべて、植物病原性ではない）およびミコスファエレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）（これは植物病原性である）のＡＣＡＴの遺伝子はデータベースに寄託されている。該データベースは更に、植物病原性子嚢菌マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、非病原性子嚢菌ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）およびザイゴサッカロミセス・ロウキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）ならびに植物病原性卵菌フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）のＡＣＡＴコード化ＤＮＡの断片を含有する（表１を参照されたい）。
【００１９】
【表１】
2005519588.tif 000002
【００２０】
公知サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）配列および本発明のウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）配列を用いて、ＥＳＴとして公知の推定部分配列を、ＡＣＡＴをコードする配列として確認することが今や可能となった。
【００２１】
本発明の範囲内で行う比較に基づけば（表１も参照されたい）、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴと、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のような他の真菌のＡＣＡＴとは、互いに相当な度合の相同性を有するといえる。したがって、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴに相同である及び対応相同核酸にコードされるポリペプチドを、殺真菌活性化合物の分子相互作用の相手（標的）として使用することが可能である。植物病原性真菌からの相同核酸またはポリペプチドには特に関心が持たれる。この目的には、植物病原性担子菌が特に好ましく使用されうる。該ＡＣＡＴ間の高い相同性のため、ヒトに病原性である真菌からのＡＣＡＴ（表１を参照されたい）またはそれらをコードする核酸を、該酵素のインヒビターを同定するために使用することが可能である。同様に、ＡＣＡＴインヒビターは、ヒトに対して病原性である真菌に対しても活性を示すことがあり、抗真菌剤として使用されうる。
【００２２】
したがって、本発明は、真菌ＡＣＡＴ、特に子嚢菌、担子菌および卵菌、さらに詳しくは、植物病原性真菌または植物病原性担子菌、特にウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）のＡＣＡＴの、殺真菌活性物質の同定のための使用を完全に包含する。
【００２３】
前記相同ポリペプチドは、特に好ましくは、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、特に好ましくは少なくとも３０個、非常に特に好ましくは少なくとも１００個の連続したアミノ酸の長さ、最も好ましくは全長にわたり、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴに対して少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、非常に特に好ましくは９５％の類似性を有するポリペプチドの形態をとる。
【００２４】
ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴ（特に配列番号４のポリペプチド）に相同であり、真菌活性物質の同定に使用しうるそのようなポリペプチドは、完全な真菌ＡＣＡＴを構成している必要はなく、これらの断片が完全真菌ＡＣＡＴの生物活性を少なくとも尚も有する限り、該断片のみを構成していることも可能である。配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＡＣＡＴと同じタイプの生物活性を示すポリペプチドも、本発明の範囲内とみなされる。この点において、本発明のポリペプチドは、前記の理由により、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）のＡＣＡＴまたは植物病原性真菌から推定可能である必要はない。また、本発明の範囲内とみなされるポリペプチドは、とりわけ、例えば以下の真菌のＡＣＡＴまたはこれらの断片に対応しそれらの生物活性を尚も有するポリペプチドである。
【００２５】
例えば、ネコブカビ（Ｐｌａｍｏｄｉｏｐｈｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、卵菌（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子嚢（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）および不完全菌（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）。
【００２６】
ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）種、例えばピチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）種、例えばフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、シュードペロノスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）種、例えばシュードペルノスポラ・フムリ（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｕｍｕｌｉ）またはシュードペルノスポラ・キューベンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、プラスモパラ種、例えばプラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）、ブレミア（Ｂｒｅｍｉａ）種、例えばブレミア・ラクチュセ（Ｂｒｅｍｉａ  ｌａｃｔｕｃａｅ）、ペロノスポラ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）種、例えばペロノスポラ・ピシ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｉｓｉ）またはペロノスポラ・ブラッシセ（Ｐ．Ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、エリシフェ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）種、例えばエリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、スフェロテカ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ）種、例えばスフェロテカ・フリジネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、ポドスフェラ種（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）、例えばポドスフェラ・リューコトリチャ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、ベンチュリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）種、例えばベンチュリア・イネカリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）種、例えばピレノフォラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｅｒｅｓ）またはピレノフォラ・グラミネア（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｇｒａｍｉｎｅａ）（分生子形態：ドレクスレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、異名：ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））、コクリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）種、例えばコクリオボルス・サチブス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（分生子形態：ドレクスレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、異名：ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））、ウロミセス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ）種、例えばウロミセス・アペンジクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、プシニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）種、例えばプシニア・レコンジタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）、スクレロティニイア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）種、例えばスクレロティニイア・スクレロティロルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、ティレチア（Ｔｉｌｌｅｔｉａ）種、例えばティレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）種、例えばウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｎｕｄａ）またはウスチラゴ・アベネ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ａｖｅｎａｅ）、ペリキュラリア（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ）種、ペリキュラリア・ササキイ（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ  ｓａｓａｋｉｉ）、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）種、例えばピリキュラリア・オリゼ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、例えばフザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕ��）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）種、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）種、例えばセプトリア・ノドルム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）種、例えばレプトスフェリア・ノドルム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）種、例えばセルコスポラ・カネッセンス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）種、例えばアルテルナリア・ブラッシセ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）またはシュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）種、例えばシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）。
【００２７】
特に関心が持たれるその他のものとしては、例えば、マグナポルセ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、コクリオブルス・ヘテロストロフス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｕｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）およびフィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）種が挙げられる。
【００２８】
本発明のＡＣＡＴを使用して見出された殺真菌活性化合物は、ヒトに対して病原性である真菌種のＡＣＡＴとも相互作用しうるが、これらの真菌で見られる異なるＡＣＡＴとの相互作用は常に同等に顕著であるわけではない。
【００２９】
したがって、本発明はまた、ヒトに対して病原性である真菌により引き起こされる疾患を治療するための組成物の製造のための、ＡＣＡＴインヒビターの使用に関する。
【００３０】
この場合に特に関心が持たれるのは、ヒトに対して病原性であり後記の症状を引き起こしうる以下の真菌である。
【００３１】
皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅ）、例えば白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）種、小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）種、有毛表皮糸状菌（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）またはケラトミセス・アジェロイ（Ｋｅｒａｔｏｍｙｃｅｓ  ａｊｅｌｌｏｉ）（これらは、例えば乾疱状白癬（足部白癬）を引き起こす）。
【００３２】
酵母、例えばカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（これは、がこう瘡食道炎および皮膚炎を引き起こす）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）またはクリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）（これらは、例えば肺クリプトコックス症または他の部位のクリプトコックス症を引き起こしうる）。
【００３３】
カビ、例えばアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラーブス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（これらは、例えば気管支肺アスペルギルス症または真菌敗血症を引き起こす）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）種、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）種またはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種（これらは、例えば接合菌症（脈管内真菌症）を引き起こす）、リノスポリジウム・シーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｅｂｅｒｉ）（これは、例えば慢性肉芽腫咽頭炎および気管炎を引き起こす）、マズレラ・ミゼトマティス（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ  ｍｙｚｅｔｏｍａｔｉｓ）（これは、例えば皮下菌腫を引き起こす）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）（これは、例えば細網内皮サイトマイコーシスおよびダーリング病を引き起こす）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）（これは、例えば肺コクシジオイデス症および敗血症を引き起こす）、ブラジル・パラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）（これは、例えば南アメリカブラストミセス症を引き起こす）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）（これは、例えばギルクリスト病および北アメリカブラストミセス症を引き起こす）、ロボア・ロボイ（Ｌｏｂｏａ  ｌｏｂｏｉ）（これは、例えばケロイド性ブラストミセス症およびロボ病）およびスポロスリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）（これは、例えばスポロトリクム症（肉芽腫皮膚真菌症）を引き起こす）。
【００３４】
したがって、本発明のＡＣＡＴを使用して見出された殺真菌活性化合物は多数の他の植物病原性真菌種のＡＣＡＴとも相互作用しうる。これらの真菌で見られる異なるＡＣＡＴとの相互作用は常に同等に顕著であるわけではない。これは、とりわけ、この酵素上で活性である物質で観察される選択性を説明するものである。
【００３５】
したがって、本発明は、表１に記載されており記載のアクセッション番号で寄託された配列を有するブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）およびミコスフェレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）の配列断片以外の植物病原性真菌の完全なＡＣＡＴをコードする核酸に関する。
【００３６】
本発明は特に、担子菌、好ましくは植物病原性担子菌、非常に特に好ましくはウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属のＡＣＡＴをコードする核酸に関する。
【００３７】
本発明は、非常に特に好ましくは、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴをコードする核酸に関する。
【００３８】
本発明は、特に好ましくは、配列番号４に示すポリペプチドまたはその活性断片をコードする配列番号２および配列番号３に示すウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）核酸に関する。
【００３９】
特に、本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の形態をとる。好ましい実施形態は、イントロンを含有しうるゲノムＤＮＡの断片、およびｃＤＮＡである。
【００４０】
本発明の核酸は、好ましくは、本発明の核酸のｃＤＮＡに対応するＤＮＡ断片の形態をとる。
【００４１】
本発明の核酸は、特に好ましくは、
ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３に示す配列、
ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列、
ｃ）ａ）および／またはｂ）で定められた配列に３５〜５２℃のハイブリダイゼーション温度でハイブリダイズする配列、
ｄ）ａ）および／またはｂ）で定められた配列に対して少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、非常に特に好ましくは９５％の同一性を有する配列、
ｅ）ａ）および／またはｂ）で定められた配列に相補的である配列、ならびに
ｆ）遺伝コードの縮重により、ａ）および／またはｂ）で定められた配列と同じアミノ酸配列をコードする配列
から選ばれる真菌配列を含む。
【００４２】
配列番号４を有するウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴをコードする配列番号１、配列番号２または配列番号３に示す配列を有するｃＤＮＡ分子は、本発明の核酸の非常に特に好ましい実施形態を構成する。
【００４３】
本発明で用いる「完全」なＡＣＡＴなる語は、ＡＴＧ開始コドンから開始し、起源生物に存在するＡＣＡＴをコードする遺伝子および適切な転写終結に必要なシグナルの情報を保持するエキソン領域のすべてを含む転写単位の完全コード領域によりコードされるＡＣＡＴを意味する。
【００４４】
本発明で用いる「活性断片」なる語は、ＡＣＡＴをコードする核酸のうち、もはや完全ではないが、ＡＣＡＴの生物活性を有し前記のＡＣＡＴに特徴的な反応を触媒しうる酵素を尚もコードするものを意味する。そのような断片は、ＡＣＡＴをコードする前記の完全な核酸より短い。本発明においては、核酸は、該配列の３’および／または５’の末端の両方まで除去されていることが可能であり、あるいはＡＣＡＴの生物活性に決定的に有害な効果をもたらさない該配列のその他の部分が欠失している、すなわち除去されていることが可能である。生じたＡＣＡＴ断片の特徴づけ又は使用を尚も可能にする、より低い、あるいは適切であれば、増加した活性は、本発明で用いる用語の目的に十分であるとみなされる。同様に、「活性断片」なる語はＡＣＡＴのアミノ酸配列を意味しうる。この場合、それは、前記のものと同様に、前記の完全配列と比べて或る部分を含有していないが該酵素の生物活性に決定的な悪影響を及ぼさないポリペプチドに適用される。
【００４５】
本発明で用いる「遺伝子」なる語は、ポリペプチド鎖の合成を引き起こす、細胞のゲノムのセグメントの名称である。
【００４６】
本発明で用いる「ハイブリダイズ」なる語は、一本鎖核酸分子が相補鎖と塩基対を形成する過程を示す。例えば、これにより、本明細書に記載の又は推定されうる配列情報から出発して、本発明のＡＣＡＴの１つと同一または類似の特性を有するＡＣＡＴをコードするＤＮＡ断片をウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）以外の植物病原性真菌から単離することが可能である。
【００４７】
ハイブリダイゼーション条件は、大まかには以下の式により算出される。
融解温度Ｔｍ＝
８１．５℃＋１６．６ｌｏｇ［ｃ（Ｎａ＋）］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−５００／ｎ
（ＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈおよびＺｏｒｂａｓ，１９９８）。
【００４８】
この式において、ｃは濃度であり、ｎは塩基対中のハイブリダイズ配列セグメントの長さである。１００ｂｐを超える配列の場合、５００／ｎの項は省略される。最高のストリンジェンシーは、Ｔｍより５〜１５℃低い温度および１５ｍＭ  Ｎａ＋（０．１×ＳＳＣに対応する）のイオン強度での洗浄を含む。ＲＮＡサンプルをハイブリダイゼーションに使用する場合には、融解温度は１０〜１５℃高くなる。
【００４９】
好ましいハイブリダイゼーション条件を以下に示す。
ハイブリダイゼーション溶液：ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ，ＺＺ）、ハイブリダイゼーション温度：３７℃〜５０℃、好ましくは４２℃（ＤＮＡ−ＤＮＡ）、５０℃（ＤＮＡ−ＲＮＡ）。
洗浄工程１：２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ  ２×５分、室温。
洗浄工程２：１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ  ２×１５分、５０℃；好ましくは、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ  ２×１５分、６５℃；特に好ましくは、０．２×ＳＳＣ、２×１５分、６８℃。
【００５０】
核酸／ペプチドの同一性は、好ましくは、プログラムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．４（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）を使用して決定される。
【００５１】
本発明で用いる「異種プロモーター」なる語は、元の生物における対象遺伝子の発現を制御するプロモーター以外の特性を有するプロモーターを意味する。
【００５２】
異種プロモーターの選択は、発現に使用するのが原核細胞であるのか真核細胞であるのか無細胞系であるのかに左右される。異種プロモーターの具体例としては、植物細胞にはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、酵母細胞にはアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、原核細胞または無細胞系にはＴ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーター、および植物病原性真菌由来の組織特異的プロモーター、例えば本発明に従い使用するアルドラーゼの特異的プロモーターが挙げられる。
【００５３】
本発明は更に、本発明の核酸、本発明の調節領域または本発明のＤＮＡ構築物を含有するベクターに関する。
【００５４】
使用しうるベクターとしては、分子生物学の実験室において使用されるすべてのファージ、プラスミド、ファジミド、ファスミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、人工染色体、または粒子射撃に適した粒子が挙げられる。
【００５５】
好ましいベクターはｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。
【００５６】
本発明はまたは、本発明の核酸、本発明のＤＮＡ構築物または本発明のベクターを含有する宿主細胞に関する。
【００５７】
本発明で用いる「宿主細胞」なる語は、本発明の核酸を天然では含有していない細胞を意味する。
【００５８】
宿主細胞として適当なものとしては、原核細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に加えて、真核細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、植物病原性真菌、植物の細胞、カエル卵母細胞および哺乳類細胞系が挙げられる。
【００５９】
本発明は更に、本発明の核酸によりコードされるＡＣＡＴの生物活性を有するポリペプチドに関する。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、
ａ）配列番号４に示す配列、
ｂ）ａ）で定められた配列に対して少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％の同一性を有する配列、および
ｃ）ａ）で定められた配列と同じ生物活性を有する配列
から選ばれるアミノ酸を含む。
【００６１】
本発明で用いる「ポリペプチド」なる語は、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと一般に称される短いアミノ酸鎖だけでなく、タンパク質と通常称される、より長いアミノ酸鎖をも意味する。それは、翻訳後修飾プロセシングのような天然の過程又は化学的な先行技術方法により修飾されうるアミノ酸鎖を含む。そのような修飾は、例えばペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノおよび／またはカルボキシル末端のようなポリペプチド中の種々の部位で反復して生じることが可能である。例えば、それらは、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体、脂質もしくは脂質誘導体またはホスファチジルイノシトールへの共有結合、環化、ジスルフィド架橋形成、ジメチル化、シスチン形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、セレン化およびｔＲＮＡ媒介アミノ酸付加を含む。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態またはより大きなタンパク質、例えば融合タンパク質の一部として存在しうる。それらは更に、分泌またはリーダー配列、プロ配列、簡便な精製を可能にする配列、例えばポリヒスチジン残基または追加的な安定化アミノ酸を含有しうる。本発明のタンパク質は、例えば、それが直接入手されうる起源生物において天然で存在する形態で存在しうる。
【００６３】
本発明で用いる「完全（な）ＡＣＡＴ」なる語は、ＡＴＧ開始コドンから開始し、起源生物に存在するＡＣＡＴをコードする遺伝子および適切な転写終結に必要なシグナルの情報保持エキソン領域のすべてを含む転写単位の完全コード領域によりコードされるＡＣＡＴを意味する。
【００６４】
天然に存在するＡＣＡＴの対応領域と比較して、本発明のポリペプチドは、それが完全ＡＣＡＴの少なくとも１つの生物活性を尚も示す限り、アミノ酸の置換または欠失を有することが可能である。保存的置換が好ましい。そのような保存的置換は、以下のグループ内で１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換された変異を含む。
１．小さな脂肪族残基、無極性残基またはほとんど極性を有さない残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；
２．極性の負荷電残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；
３．極性の正荷電残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；
４．大きな脂肪族無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに
５．芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｒｙおよびＴｒｐ。
【００６５】
好ましい保存的置換を以下の一覧に示す。
【００６６】
【表２】
2005519588.tif 000003
【００６７】
したがって、本発明は、配列番号１または配列番号２に示すウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）の配列に対して少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含みＡＣＡＴの少なくとも１つの生物活性を示すポリペプチドの使用に関する。
【００６８】
本発明で用いる「ＡＣＡＴの生物活性」なる語は、アセチルＣｏＡのアセチル化を触媒する能力を意味する。
【００６９】
本発明の核酸は常法により製造することができる。例えば、該核酸分子のすべてを化学的に合成することができる。本発明の核酸の短い断片も化学的に合成することが可能であり、そのようなオリゴヌクレオチドは放射能または蛍光色素で標識することができる。標識オリゴヌクレオチドは、例えば植物病原性真菌由来のｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することが可能である。標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするクローンを選択して、関心のあるＤＮＡ断片を単離する。単離したＤＮＡの特徴づけの後、本発明の核酸が簡便に得られる。
【００７０】
あるいは、本発明の核酸は、化学合成オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ法により製造することも可能である。
【００７１】
この文脈で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドから構成されるＤＮＡ分子を意味する。それらを化学合成し、プローブとして使用することが可能である。
【００７２】
さらに、本発明のポリペプチド、特に、配列番号２に示す核酸配列によりコードされるポリペプチドを製造するために、本発明の核酸を含有する宿主細胞を適当な条件下で培養することができる。ついで所望のポリペプチドを該細胞または培地から常法により単離することができる。あるいは、該ポリペプチドはインビトロ系において製造することが可能である。
【００７３】
本発明のウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴを製造するためには、例えば、遺伝子ａｃｃｌを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内で組換え的に発現させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から酵素調製物を調製することが可能である。
【００７４】
１つの可能なＡＣＡＴ精製方法は、分取電気泳動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えば、ゲル濾過カラム、逆相カラムまたは弱疎水性カラムを使用するもの）、ゲル濾過、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーに基づくものである。
【００７５】
本発明において用いる、核酸を使用して宿主細胞により合成された本発明のポリペプチドの高速単離方法は、融合タンパク質（該融合部分はアフィニティー精製により簡便に精製されうる）を発現させることから開始される。例えば、該融合部分は６個のＨｉｓのタグであることが可能であり、この場合、該融合タンパク質はニッケル−ＮＴＡアフィニティーカラム上で精製することが可能である。該融合部分は、例えば、精製される本発明のポリペプチドと該融合部分との間のリンカーにおいて、部分タンパク質分解切断により除去されうる。該リンカーは、トリプシンによる切断部位となるアルギニンおよびリシン残基のような標的アミノ酸を含むように設計することができる。そのようなリンカーを作製するためには、オリゴヌクレオチドを使用する標準的なクローニング方法を用いることが可能である。
【００７６】
可能な他の精製方法は、同様に、分取電気泳動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えば、ゲル濾過カラム、逆相カラムまたは弱疎水性カラムを使用するもの）、ゲル濾過、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーに基づくものである。
【００７７】
本発明で用いる「単離または精製」なる語は、本発明のポリペプチドを細胞または組織の他の巨大分子または他のタンパク質から分離することを意味する。本発明のポリペプチドを含有する組成物のタンパク質含量は、宿主細胞調製物の場合より好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも１００倍高い。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドに結合する抗体を使用することにより、融合部分を使用することなくアフィニティー精製することが可能である。
【００７９】
本発明はまた、ＡＣＡＴに結合しその特性を修飾する化合物を見出すための方法に関する。ＡＣＡＴは重要な機能を有するため、該活性に影響を及ぼすモジュレーターは新規殺真菌活性化合物に相当する。モジュレーターはアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはインヒビターもしくはアクチベーターでありうる。
【００８０】
同様に、本発明は、ＡＣＡＴに結合しその特性を修飾する化合物を見出すための方法における、本発明のポリペプチドの使用に関する。
【００８１】
適当な方法により見出された、ＡＣＡＴを抑制する化合物は、真菌ＡＣＡＴ、特に、植物病原性真菌のＡＣＡＴのインヒビターとして作用する特性を有するため、この群の化合物には必ずしも属さない真菌ＡＣＡＴの更なるインヒビターを見出すための方法において、標識されていてもよい競合体として使用することも可能である。
【００８２】
本発明の方法における本発明の核酸またはポリペプチドの使用は、本発明のポリペプチドに結合する化合物を見出すことを可能にする。ついで後者を、例えば植物における殺真菌剤として、あるいはヒトおよび動物における抗真菌活性化合物として使用することができる。例えば、本発明の核酸を含有し対応ポリペプチドを発現する宿主細胞、または該遺伝子産物自体を、少なくとも１つの化合物と該宿主細胞、受容体または個々のポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下、化合物または化合物混合物と接触させる。
【００８３】
特に、本発明は、ＡＣＡＴ、好ましくは植物病原性真菌由来のＡＣＡＴ、特に好ましくはウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）由来のＡＣＡＴの生物活性を有する真菌ポリペプチドに結合する、ならびに該ポリペプチドに相同である及び前記のコンセンサス配列を有するポリペプチドに結合する殺真菌活性化合物を同定するのに適した方法に関する。しかし、該方法は、本明細書に記載されている以外の種に由来しＡＣＡＴに相同であるポリペプチドを使用して行うことも可能である。本発明のもの以外のＡＣＡＴを使用する方法も本発明の一部である。
【００８４】
化合物および天然抽出物をアッセイするための多数のアッセイ系は、一定時間内にアッセイされる物質の数が最大となるよう、ハイスループット用に設計される。無細胞法に基づくアッセイ系は精製または半精製タンパク質を必要とする。それは、標的タンパク質に対する物質のいずれかの考えられうる効果を検出することを主目的とした「初期アッセイ」に適している。
【００８５】
モジュレーターを見出すためには、本発明のポリペプチドを含有する合成反応混合物（例えば、インビトロ転写産物）または細胞成分、例えば膜、画分または他の任意の調製物を、アゴニストまたはアンタゴニストでありうる候補分子の存在下および非存在下、該ポリペプチドの標識基質またはリガンドと共にインキュベートする。該候補分子が本発明のポリペプチドの活性を増強または抑制する能力を、該標識リガンドの結合の増強もしくは減弱または該標識基質の変換の増強もしくは減弱に基づき確認する。よく結合し本発明のポリペプチドの活性の増強を招く分子はアゴニストである。よく結合し本発明のポリペプチドの生物活性を抑制する分子は良好なアンタゴニストである。それは前記クラスの殺真菌物質のインヒビターの形態をとることもあるが、全く新しいクラスの物質がこのモジュレーション活性を示すこともありうる。
【００８６】
本発明のポリペプチドの生物活性の検出は、レポーター系として公知のものにより改善することができる。この場合、レポーター系は、産物に変換される比色または蛍光基質、あるいは本発明のポリペプチドの活性または発現の変化に応答するレポーター遺伝子、あるいは他の公知結合アッセイを含むが、これらに限定されるものではない。逆に、比色または蛍光により検出可能な産物に変換される基質を使用することが可能である。この場合、レポーター系は、適当な方法で検出されうる産物を最終的に与えるいくつかの共役反応工程よりなりうる。
【００８７】
好ましい実施形態においては、ＡＣＡＴに加えて２つの他の酵素（すなわち、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）およびクエン酸シンターゼ（ＣＩＴ））の活性を利用するアッセイ系を用いて、測光的に測定されるＮＡＤＨ濃度の増加に関してＡＣＡＴ活性を測定することが可能である。該酵素アッセイ中に、図３に示す反応が生じる。示されている反応は可逆反応であり、その方向は、供給される基質により影響されうる。該酵素アッセイに要求される反応の方向が矢印で示されている。ＭＤＨ反応の経路は、通常は、オキサル酢酸からリンゴ酸を優先的に形成する。しかし、ＣＩＴ反応との共役がオキサル酢酸の消費、およびＭＤＨによるリンゴ酸からの変換をもたらし、したがって、測定可能なＮＡＤＨの形成をもたらす。ＮＡＤＨの増加は蛍光測定により簡便に測定することができる（３４０ｎｍでの励起／４６５ｎｍでの発光または３６０ｎｍでの励起／４６０ｎｍでの発光）。
【００８８】
この共役アッセイ系で見出されたモジュレーターを、酵素ＭＤＨおよびＣＩＴのみを含有する第２のアッセイ系で試験する。それがＡＣＡＴ、ＭＤＨおよびＣＩＴアッセイにおいては活性の増強または減弱を招くが、ＭＤＨおよびＣＩＴのみを含有するアッセイにおいては活性の増強または減弱を招かないことにより、特異的ＡＣＡＴモジュレーターが特定される。
【００８９】
本発明のポリペプチドのモジュレーターを見出すことを可能にする方法のもう１つの例として、置換アッセイが挙げられる。このアッセイにおいては、本発明のポリペプチドおよび潜在的モジュレーターを、本発明のポリペプチドに結合することが知られている分子（例えば、天然基質もしくはリガンドまたは基質もしくはリガンド模擬体）と適切な条件下で一緒にする。本発明のポリペプチド自体を例えば蛍光的または比色的に標識して、リガンドに結合した又は変換を受けたポリペプチドの数を正確に測定することが可能である。このようにして、アゴニストまたはアンタゴニストの効力を測定することができる。
【００９０】
一般には、これらのインビトロ系においては、細胞毒性のような効果は無視される。該アッセイ系は物質の阻害または抑制効果だけでなく、刺激効果をも試験する。物質の効力は一連の濃度依存的アッセイにより試験することができる。試験物質を含有しない対照混合物を、該効果の評価に使用することができる。
【００９１】
ＡＣＡＴをコードする核酸を含有する宿主細胞が本発明において入手可能であり、また、他の種に由来する対応相同ＡＣＡＴが本発明において同定可能であるため、本発明のポリペプチドの活性をモジュレーションする物質を特定するための、細胞に基づくアッセイ系の開発が可能となる。
【００９２】
本発明のポリペプチドの活性をモジュレーションする物質を特定するもう１つの可能性としては、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）として公知のものが挙げられる。ＥＰ  ０１５  ４７３を参照されたい。このアッセイ系は、ポリペプチド（例えば、ウスチラゴ・メイディス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴ）と放射能標識リガンド（例えば、小さな有機分子または第２の放射能標識タンパク質分子）との相互作用を利用するものである。この場合、ポリペプチドを、発光（シンチレーション）分子を伴うミクロスフェアまたはビーズに結合させる。放射能が減少するにつれて、ミクロスフェア中の発光物質が放射能標識の原子構成粒子により励起され、検出可能な光子が放出される。リガンドから放出された粒子が、本発明のポリペプチドに結合したリガンドにより放出されたシグナルを与えるよう、アッセイ条件を最適化する。
【００９３】
１つの可能な実施形態においては、ウスチラゴ・メイディス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴを、相互作用性または結合性試験物質と共に又はそれを伴わずに、ビーズに結合させる。使用しうる試験物質としては、とりわけ、本発明の断片が挙げられる。例えば、放射能標識リガンドは、アセチル化され得ない標識アセチルＣｏＡ類似体でありうる。結合性リガンドが固定化ＡＣＡＴに結合する際、このリガンドは、固定化ＡＣＡＴと標識リガンドとの間の既存の相互作用を抑制または無効にして、接触領域においてそれ自体に結合するはずである。固定化ＡＣＡＴへの結合が生じたら、それを発光により検出することができる。したがって、固定化標識リガンドと遊離標識リガンドとの既存の複合体が試験物質の結合により破壊され、それにより、検出される発光強度の減少が生じる。この場合、該アッセイ系は補足的抑制系の形態をとる。
【００９４】
そのようなアッセイ系のもう１つの例としては、ツーハイブリッド系として公知のものが挙げられる。具体例としては、相互作用捕捉（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｒａｐ）として公知のものが挙げられる。この系は、酵母における相互作用性タンパク質の遺伝的選択を伴う（例えば、Ｇｙｕｒｉｓら，１９９３を参照されたい）。該アッセイ系は、２つのタンパク質の相互作用を検出するよう、および相互作用が生じた場合の検出可能シグナルの生成によりそれを表示するように設計される。
【００９５】
そのようなアッセイ系は、多数の試験物質を一定時間内に試験するように適合化することも可能である。
【００９６】
該系は、２つのベクター（すなわち、ベイトベクターおよびプレイベクター）の構築に基づくものである。本発明のＡＣＡＴまたはその断片をコードする遺伝子をベイトベクター内にクローニングし、ついで、ＤＮＡ結合タンパク質であるＬｅｘＡタンパク質との融合タンパク質として発現させる。ＡＣＡＴの相互作用相手をコードする第２の遺伝子をプレイベクター内にクローニングし、該ベクターにおいて、それをＢ４２プレイタンパク質との融合タンパク質として発現させる。それらの２つのベクターは、ｌａｃＺまたはＨＩＳ３レポーター遺伝子の５’側にＬｅｘＡ結合ＤＮＡのコピーを含有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主内に存在する。それらの２つの融合タンパク質の間で相互作用が生じると、レポーター遺伝子の転写が活性化される。試験物質の存在が該相互作用の抑制または阻害を引き起こすと、それらの２つの融合タンパク質は、もはや相互作用することができず、レポーター遺伝子の産物は、もはや産生されない。
【００９７】
本発明のポリペプチドのモジュレーターを見出すことを可能にする方法のもう１つの例としては、置換試験が挙げられる。この試験においては、本発明のポリペプチドおよび潜在的モジュレーターを、本発明のポリペプチドに結合することが知られている分子（例えば、天然基質もしくはリガンド、または基質模擬体もしくはリガンド模擬体）と適当な条件下で一緒にする。
【００９８】
本発明で用いる「競合体」なる語は、ＡＣＡＴへの結合に関して他の化合物（おそらくは未だ同定されていないもの）と競合して該酵素から後者を追い出す又は後者により追い出される特性を有する化合物を意味する。
【００９９】
本発明で用いる「アゴニスト」なる語は、ＡＣＡＴの活性を促進または増強する分子を意味する。
【０１００】
本発明で用いる「アンタゴニスト」なる語は、ＡＣＡＴの活性を抑制または妨害する分子を意味する。
【０１０１】
本発明で用いる「モジュレーター」なる語は、アゴニストまたはアンタゴニストの総称である。モジュレーターは、本発明のポリペプチドに結合する小さい有機化学分子、ペプチドまたは抗体でありうる。さらに、モジュレーターは、本発明のポリペプチドに結合する分子に結合してその生物活性に影響を及ぼす小さな有機化学分子、ペプチドまたは抗体でありうる。モジュレーターは天然の基質およびリガンド、またはこれらの構造的もしくは機能的模擬体でありうる。
【０１０２】
本発明で用いる「殺殺菌剤」または「殺真菌（性）」は、植物病原性真菌を防除する物質およびヒトまたは動物に病原性である真菌を防除する物質についての総称である。したがって、この用語は、抗真菌剤として使用しうる物質をも意味する。好ましい意義においては、この用語は、植物病原性真菌を防除するための物質に関するものである。
【０１０３】
モジュレーターは、好ましくは、小さな有機化合物である。
【０１０４】
ＡＣＡＴへのモジュレーターの結合は、それで処理された細胞病原性真菌の破壊を引き起こすよう細胞過程を修飾しうる。
【０１０５】
したがって、本発明はまた、ＡＣＡＴモジュレーターを特定するための本出願に記載の方法により見出された、植物病原性真菌由来のＡＣＡＴのモジュレーターに関する。
【０１０６】
本発明は更に、本発明のポリペプチドの発現を修飾する化合物を見出すための方法を含む。そのような「発現モジュレーター」もまた、新規殺真菌活性化合物を構成しうる。発現モジュレーターは、本発明のポリペプチドをコードする核酸の調節領域に結合する小さな有機化学分子、ペプチドまたは抗体でありうる。さらに、発現モジュレーターは、本発明のポリペプチドをコードする核酸の調節領域に結合する分子に結合してその発現に影響を及ぼす小さな有機化学分子、ペプチドまたは抗体でありうる。また、発現モジュレーターはアンチセンス分子でありうる。
【０１０７】
同様に、本発明は、本発明のポリペプチドのモジュレーターまたは発現モジュレーターの、殺真菌剤としての使用に関する。
【０１０８】
同様に、本発明は、発現モジュレーターを見出すための前記方法により見出された、ＡＣＡＴの発現モジュレーターに関する。
【０１０９】
本発明の方法は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）および超ハイスループットスクリーニング（ＵＨＴＳ）を含む。本発明の核酸および／またはポリペプチドを含む宿主細胞および無細胞調製物の両方を使用することが可能である。
【０１１０】
本発明は更に、本発明のポリペプチドまたはこの断片に特異的に結合する抗体に関する。そのような抗体は、常法により産生させる。例えば、該抗体は、抗体産生に有効な量の本発明のポリペプチドまたはその断片を実質的に免疫適格性の宿主に注射し、ついでこの抗体を得ることにより製造することができる。さらに、モノクローナル抗体を産生する不死化細胞系を自体公知の方法により得ることが可能である。適切な場合には、該抗体を検出試薬で標識することができる。そのような検出試薬の好ましい具体例としては、酵素、放射能標識元素、蛍光化合物またはビオチンが挙げられる。完全な抗体の代わりに、所望の特異的結合特性を有する断片を使用することができる。
【０１１１】
同様に、本発明の核酸は、トランスジェニック生物、例えば細菌、植物または真菌を作製するために、好ましくは、トランスジェニック植物および真菌を作製するために、特に好ましくは、トランスジェニック真菌を作製するために使用することができる。これらは、例えば、野生型から逸脱した、本発明のポリペプチドまたはその変異体の発現に基づくアッセイ系において使用することができる。それらは更に、前記のもの以外の遺伝子の修飾または遺伝子制御配列（例えば、プロモーター）の修飾により本発明のポリペプチドまたはその変異体の発現が改変された任意のトランスジェニック植物または真菌を含む。本発明のポリペプチドを（過剰）産生させる場合にも、トランスジェニック生物に関心が持たれる。例えば、天然形態の場合より高い本発明ポリペプチドの発現の度合を示す真菌（例えば、酵母またはウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ））が、該ポリペプチドのモジュレーターを特定するための方法（実際にはＨＴＳ法にも）における使用に特に適している。
【０１１２】
トランスジェニック生物は、異種（外来）遺伝子（トランスジーン）が実験技術によりゲノム内に安定に挿入され適当な条件下で発現される生物を意味すると理解される。
【０１１３】
トランスジェニック植物を作製するための最も開発されているベクター系は、細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のプラスミドである。天然においては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は植物に感染し、クラウンゴールと称される腫瘍を形成する。これらの腫瘍は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミド（腫瘍誘発性）により引き起こされる。Ｔｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡと称されるそのＤＮＡの一部を宿主植物の染色体ＤＮＡ内に組込む。該植物内に遺伝物質を導入するその特性を保有させたまま該プラスミドのＤＮＡから腫瘍誘発性領域を除去するための手段は既に開発されている。ついで、通常の組換えＤＮＡ技術により外来遺伝子（例えば、本発明の核酸の１つ）をＴｉプラスミド内に導入することができる。ついで該組換えプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）内に再挿入し、ついでそれを植物細胞培養への感染に使用することが可能である。一方、該プラスミドを植物に直接挿入することが可能であり、この場合、それはそれ自身を染色体内に組込む。無傷生物へのそのような細胞の再生は、外来遺伝子を含有し更にそれを発現する（すなわち、所望の遺伝子産物を産生する）植物を与える。
【０１１４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は双子葉植物には容易に感染するが、それはトウモロコシ、コムギまたはコメのような単子葉植物の形質転換用のベクターとしては限られた用途しか有していない。なぜなら、それはこれらの植物には容易には感染しないからである。他の技術、例えば「ＤＮＡ銃」、パーティクルガン法として公知のものをそのような植物の形質転換に利用することが可能である。この方法においては、ガスの噴出または爆薬の爆発により微量のチタンまたは金ミクロスフェアを受容細胞または組織内に射入する。該ミクロスフェアは、関心のある遺伝子のＤＮＡで被覆されており、そのため、後者が細胞内に到達し、徐々に脱離し、宿主細胞のゲノム内に組込まれる。
【０１１５】
外来遺伝物質にさらされた細胞の少数のみが、その相同遺伝物質内に該外来遺伝物質を安定に組込みうる。遺伝子導入に使用した組織においては、非トランスジェニック細胞が優勢となる。したがって、無傷植物への再生中、トランスジェニック細胞に有利となる選択を行う必要がある。実際には、この目的には、植物細胞内に導入されるマーカー遺伝子を使用する。これらの遺伝子の産物はインヒビター、例えば抗生物質または除草剤を不活性化して、該インヒビターで補足された栄養培地上でトランスジェニック細胞が増殖するのを可能にする。一方、後に検出されうる酵素をコードする遺伝子はそれほど問題にはならない。これらは本発明のポリペプチドをも含み、その酵素活性は実施例２に記載のとおりに検出することが可能である。
【０１１６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）での形質転換の場合には、葉断片の代わりにプロトプラスト（細胞壁を伴わない単離された細胞は、エレクトロポレーションを用いた場合または或る化学物質の存在下の培養内で外来ＤＮＡを取り込む）を使用することが可能である。新たな細胞壁が形成されるまで（例えば、タバコの場合には約２日間）、それを組織培養内で維持する。ついでアグロバクテリアを加え、組織培養を継続する。ＤＮＡ構築物でのプロトプラストの一過性形質転換のための簡便な方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）の存在下でのインキュベーションである。
【０１１７】
ＤＮＡは、エレクトロポレーションによっても細胞内に導入することが可能である。これは、生きた細胞内へのＤＮＡの取込みを増強するための物理的方法である。電気パルスは、生体膜を破壊することなく生体膜の透過性を一時的に増加させる。
【０１１８】
また、ＤＮＡは、マイクロインジェクションによっても導入することが可能である。ガラス毛細管を使用して、ＤＮＡを細胞の核の近傍に注入する。しかし、これは、強固な細胞壁および大きな液胞を有する植物細胞の場合には困難である。
【０１１９】
もう１つの可能性は、超音波を利用することである。ヒトの可聴周波数範囲を超える音波（２０ｋＨｚ超）で細胞を超音波処理すると、膜の一時的な透過性が観察される。この方法を行う場合には、音波の振幅を非常に厳密に調節しなければならない。そうでなければ、超音波処理された細胞が破裂し破壊されるからである。
【０１２０】
トランスジェニック真菌は、当業者に自体公知の方法で作製することが可能である（実施例も参照されたい）。
【０１２１】
したがって、本発明はまた、本発明の核酸の少なくとも１つを含有するトランスジェニック植物または真菌、好ましくは、アラビドプシス（シロイヌナズナ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）種のようなトランスジェニック植物、または酵母種もしくはウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）種のようなトランスジェニック真菌、およびそれらのトランスジェニック後代に関する。それらはまた、該トランスジェニック植物の植物部分、プロトプラスト、植物組織または植物繁殖物質、あるいは本発明の核酸を含有するトランスジェニック真菌の個々の細胞、真菌組織、果実、菌糸および胞子を含む。好ましくは、該トランスジェニック植物または真菌は、野生型から逸脱した形態で本発明のポリペプチドを含有する。しかし、本発明のポリペプチドを非常に低度でしか発現しない又は全く発現しないことにより特徴づけられるトランスジェニック植物または真菌も本発明の範囲内とみなされる。
【０１２２】
したがって、同様に、本発明は、トランスジェニック植物および真菌であって、ＡＣＡＴの活性を有するポリペプチドをコードする配列内に修飾が施され、ついで、本発明のポリペプチドの産生に対する適合性、および／または該植物または真菌内に存在する、突然変異誘発により生じた、本発明のポリペプチドの生物活性の増強または減弱に関して選択されたトランスジェニック植物および真菌に関する。
【０１２３】
本発明で用いる「突然変異誘発」なる語は、自然突然変異率を増加させて突然変異体を単離するための方法を意味する。本発明においては、突然変異を誘発するのに適した化合物または物理的因子（例えば、塩基類似体、ＵＶ線など）のような突然変異原を使用して、突然変異体をインビボで作製することが可能である。所望の突然変異体は、特定の表現型に対して選択することにより入手することができる。染色体上の突然変異の位置は、相補性および組換え分析により、他の既知突然変異に対して決定することができる。あるいは、直接的な方法（インビトロ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、エラー頻発型ＰＣＲなど）により染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡに突然変異を導入することも可能である。
【０１２４】
本発明で用いる「突然変異体」なる語は、修飾（突然変異）遺伝子を含有する生物を意味する。突然変異体は、未修飾遺伝子を保持する野生型との比較により定められる。
【０１２５】
以下の実施例は、驚くべきことに、ＡＣＡＴが植物病原性真菌における必須酵素であること、さらには、該酵素が殺真菌剤の同定のための適当な標的タンパク質であること、殺真菌活性化合物の同定方法においてそれを使用しうること、および適当な方法で同定されたＡＣＡＴモジュレーターを殺真菌剤として使用しうることを示している。
【０１２６】
さらに、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのこの酵素の入手が例示として記載されており、最後に、殺真菌活性化合物の探索における本発明の適用が示されている。
【０１２７】
以下の実施例はウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）に限定されるものではない。他の植物病原性真菌に関しても、類似の方法および結果が得られる。
【０１２８】
実施例
【実施例１】
【０１２９】
大腸菌内でのサッカロミセス・セレビシエＡＣＡＴ遺伝子の機能的発現
ＰＣＲにより増幅されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＡＴ（ＥＲＧ１０）のコード配列を発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ切断部位にクローニングして、Ｃ末端Ｈｉｓタグを付着させる。細菌株ＮｏｖａＢｌｕｅ  ＢＬ２１（ＤＥ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）の細胞をこのＨｉｓ−タグＡＣＡＴ構築物（４０６アミノ酸）で形質転換し、グリセロール中で−８０℃で長期培養として保存する。
【０１３０】
サッカロミセス・セレビシエからのＡＣＡＴの単離および精製
グリセロール中の長期培養からの細胞を新鮮なＬＢプレートに移し、ストリークして個々のコロニーを得る。一晩培養（約２ｍｌ）を１つのコロニーで樹立し、２０μｌのこの培養を使用して、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で補足された２５０ｍｌのＬＢ培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ）に接種し、振とうしながら３７℃でインキュベートする。ＯＤ６００＝０．９に達した後（４〜６時間後）、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）を加えることにより該ポリペプチドの発現を誘導し、該培養のインキュベーションを、振とうしながら１８℃で１６時間継続する。該細胞を遠心分離［８０００ｒｐｍ≒１００００ｇ、４℃、ＪＡ１４ローター、Ｊ２−２１遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）］により集め、−２０℃で凍結する。
【０１３１】
該ペレット（１．５ｇ）を１５ｍｌの破壊バッファー（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１ｍＭ  グルタチオン）に取る。３０ｍｇのリゾチームおよび２．５ｍｌの１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（水中）を加え、該混合物を２８℃で３０分間インキュベートする。ついで該容器を水／エタノール／氷浴に移し、該細胞を超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０、大きな振動器頭部の使用、出力５０〜５５％、それぞれ３０秒間で６回、各回に１分間の冷却）により破壊する。０．８ｍｌの５Ｍ  塩化ナトリウム溶液（最終濃度０．２Ｍ）の添加後、細胞片を３０分間の遠心分離（Ｊ２−２１，ＪＡ２０（Ｂｅｃｋｍａｎｎ），４℃，１００００ｇ）により除去する。該上清はＡＣＡＴ（粗抽出物）を含有する。
【０１３２】
アフィニティークロマトグラフィー（２ｍｌ  Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム、ＦＰＬＣ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））により１０ｍｌずつの２回分割で上清からＡＣＡＴを単離する。この目的には、以下の２種類のバッファーを使用する。
バッファーＡ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  グルタチオン。
バッファーＢ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  グルタチオン、１Ｍ  イミダゾール。
【０１３３】
該クロマトグラフィーは、以下の勾配により行う。
１）１０カラム容積のバッファーＡ。
２）１０カラム容積のバッファーＡ：Ｂ  ９９５：５（最終濃度  ５ｍＭ  イミダゾール）。
３）１０カラム容積のバッファーＡ：Ｂ  ９０：１０（最終濃度１００ｍＭ  イミダゾール）。
４）５カラム容積のバッファーＢ（最終濃度１Ｍ  イミダゾール）。
【０１３４】
該タンパク質は１００ｍＭ  イミダゾールの濃度で完全に溶出する。これらの条件下、該カラムに過負荷（ｏｖｅｒｌｏａｄ）をかける（タンパク質はフロースルーにも出現する）。
【０１３５】
該タンパク質（１０ｍｌ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  グルタチオン、１０％  グリセロールを使用して、４つのＰＤ１０カラム上、８℃で脱塩した。
【０１３６】
これは、９９％を超える純度（クーマシー染色、図４を参照されたい）で約１５ｍｇのＡＣＡＴを与える。
【０１３７】
−８０℃または−２０℃でのＡＣＡＴの凍結は、それぞれ約１５％または２０％の活性の喪失をもたらす。しかし、氷上では、それは活性の実質的な喪失を伴うことなく数週間にわたり保存することが可能である。本実施例は、異なる温度で別々に保存された該酵素および基質溶液の安定性を示している。
【実施例２】
【０１３８】
大腸菌内でのウスチラゴ・メイディスａｃｃｌ遺伝子のｃＤＮＡクローンの機能発現
ＰＣＲにより増幅されたウスチラゴ・メイディス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）のコード配列を発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ切断部位にクローニングして、Ｃ末端Ｈｉｓタグを付着させる。細菌株ＮｏｖａＢｌｕｅ  ＢＬ２１（ＤＥ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）の細胞をこのＨｉｓ−タグＡＣＡＴ構築物（Ｃ末端＋６ヒスチジン＝４１６アミノ酸のクローニングにより４０８＋２アミノ酸）で形質転換し、グリセロール中で−８０℃で長期培養として保存する。
【０１３９】
ウスチラゴ・メイディスからのＡＣＡＴの単離および精製
グリセロール中の長期培養からの細胞を新鮮なＬＢプレートに移し、ストリークして個々のコロニーを得る。一晩培養（約２ｍｌ）を１つのコロニーで樹立し、２０μｌのこの培養を使用して、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で補足された２５０ｍｌのＬＢ培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ）に接種し、振とうしながら３７℃でインキュベートする。ＯＤ６００＝０．９に達した後（４〜６時間後）、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）を加えることにより該ポリペプチドの発現を誘導し、該培養のインキュベーションを、振とうしながら１８℃で１６時間継続する。該細胞を遠心分離［８０００ｒｐｍ≒１００００ｇ、４℃、ＪＡ１４ローター、Ｊ２−２１遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）］により集め、−２０℃で凍結する。
【０１４０】
該ペレット（１．５ｇ）を１５ｍｌの破壊バッファー（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１ｍＭ  グルタチオン）に取る。３０ｍｇのリゾチームおよび２．５ｍｌの１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（水中）を加え、該混合物を２８℃で３０分間インキュベートする。ついで該容器を水／エタノール／氷浴に移し、該細胞を超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０、大きな振動器頭部の使用、出力５０〜５５％、それぞれ３０秒間で６回、各回に１分間の冷却）により破壊する。０．８ｍｌの５Ｍ  塩化ナトリウム溶液（最終濃度０．２Ｍ）の添加後、細胞片を３０分間の遠心分離（Ｊ２−２１，ＪＡ２０（Ｂｅｃｋｍａｎｎ），４℃，１００００ｇ）により除去する。該上清はＡＣＡＴ（粗抽出物）を含有する。
【０１４１】
該酵母酵素の場合と同様にして、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）ＡＣＡＴをアフィニティークロマトグラフィーにより、数分割で上清から単離し、加工し、使用する。
【実施例３】
【０１４２】
ＡＣＡＴモジュレーターを見出すための酵素アッセイ
アッセイする物質の５μｌ部分を３８４ウェルマイクロタイタープレート内の５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド中に導入する。公知ＡＣＡＴインヒビターであるヨードアセトアミドの溶液を対照として使用する。該物質の濃度は、行うアッセイにおける該物質の最終濃度が２μＭ〜１０μＭに達するようにする。２０μｌの酵素溶液（１〜２℃に冷却；組成は後記を参照されたい）および２５μｌの基質溶液（１〜２℃に冷却；組成は後記を参照されたい）を試験物質の溶液中にピペッティングする。関係する酵素の比活性に応じて、約１００〜５００ｎｇの全タンパク質を使用する。該反応を該基質溶液の添加により開始する。インキュベーションを室温で２５分間行う。λＥｘ＝３４０ｎｍおよびλＥｍ＝４６５ｎｍまたはλＥｘ＝３６０ｎｍおよびλＥｍ＝４６０ｎｍで蛍光の減少を測定する。
【０１４３】
以下の表は、該アッセイで使用した全物質に関する情報（ストック溶液および最終濃度）を含む。
【０１４４】
【表３】
2005519588.tif 000004
２０μｌの酵素溶液、５μｌのインヒビター溶液または試験物質溶液および２５μｌの基質溶液を使用する。
【０１４５】
前記アッセイにおいて酵素活性の増強または減弱を引き起こした物質をＭＤＨまたはＣＩＴのモジュレーションに関する第２のアッセイで試験する。
【０１４６】
試験する物質の５μｌ部分を３８４ウェルマイクロタイタープレート内の５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド中に導入する。該物質の濃度は、行うアッセイにおける該物質の最終濃度が２μＭ〜１０μＭに達するようにする。２０μｌの酵素溶液（１〜２℃に冷却；組成は後記を参照されたい）および２５μｌの基質溶液（１〜２℃に冷却；組成は後記を参照されたい）を試験物質の溶液中にピペッティングする。関係する酵素の比活性に応じて、約１００〜５００ｎｇの全タンパク質を使用する。該反応を該基質溶液の添加により開始する。インキュベーションを室温で２５分間行う。λＥｘ＝３４０ｎｍおよびλＥｍ＝４６５ｎｍまたはλＥｘ＝３６０ｎｍおよびλＥｍ＝４６０ｎｍで蛍光の減少を測定する。
【０１４７】
以下の表は、該アッセイで使用した全物質に関する情報（ストック溶液および最終濃度）を含む。
【０１４８】
【表４】
2005519588.tif 000005
２０μｌの酵素溶液、５μｌの試験物質溶液および２５μｌの基質溶液を使用する。
【実施例４】
【０１４９】
時間の関数としてのＡＣＡＴの酵素活性（■）を図５に示す。非特異的インヒビターの存在下のプロットの形状（●）を、比較のために示す。
【実施例５】
【０１５０】
ヒグロマイシンノックアウトカセット（ｈｐｈカセット）の構築
工程１
プライマーｈｐｈ−Ｎｃｏ／Ｂａｍ（配列番号７）およびｈｐｈ−Ｓｔｏｐ（配列番号８）を使用するＰＣＲにより、細菌ヒグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）をプラスミドｐＣＭ５４（Ｔｓｕｋｕｄａら，１９８８を参照されたい）から増幅する（Ｉｎｎｉｓら，１９９０のＰＣＲプロトコール；サイクル：ａ）９４℃で１０分間の１サイクル、ｂ）各場合に９４℃で１分間、６０℃で1分間、７２℃で３分間の３０サイクル、ｃ）７２℃で１０分間の１サイクル）。これは、ｈｐｈ遺伝子の２つの隣接部に、異なる制限切断部位、すなわち、ｈｐｈ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに配列５’−Ｃ↓ＣＡＴＧＧ−３’を有するＮｃｏＩ切断部位、およびｈｐｈ遺伝子の終結コドンの１ヌクレオチド後方に配列５’−ＧＣ↓ＧＧＣＣＧＣ−３’を有するＮｏｔＩ切断部位を導入する。ついで該ＰＣＲ産物を酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；該製造業者により指定されたとおりの条件）で制限酵素処理する。
【０１５１】
工程２
次の工程では、ｈｐｈ遺伝子を含有するこのＰＣＲ産物をアグロバクテリアＮＯＳターミネーターに連結する。この目的には、第１にアグロバクテリアＮＯＳターミネーターと、第２にｓＧＦＰ遺伝子の交換可能な遺伝子配列とを含有するプラスミドｐｏｔｅｆＳＧ（Ｓｐｅｌｌｉｇら，１９９６を参照されたい）を、酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；該製造業者により指定されたとおりの条件）で制限酵素処理する。該制限酵素処理は、ｓＧＦＰ遺伝子を有する断片を遊離し、それを、ｈｐｈ遺伝子を有するＰＣＲ断片と交換する。このクローニング工程により、ｈｐｈ遺伝子は、３’末端において、アグロバクテリアＮＯＳターミネーターと隣接して配置され、ｈｐｈの転写の有効な終結が保証される。
【０１５２】
工程３
このプラスミドから出発して、ＮＯＳターミネーターを伴うｈｐｈ遺伝子を第２のＰＣＲで増幅する。この目的には、プライマーｈｐｈ−Ｎｃｏ／Ｂａｍ（配列番号７）および３−ｈｐｈ（配列番号９）を使用する（Ｉｎｎｉｓら，１９９０のＰＣＲプロトコール；サイクル：ａ）９４℃で１０分間の１サイクル、ｂ）各場合に９４℃で１分間、６０℃で1分間、７２℃で３分間の３０サイクル、ｃ）７２℃で１０分間の１サイクル）。このＰＣＲにより、制限切断ＢａｍＨＩの切断部位（配列５’−Ｇ↓ＧＡＴＣＣ−３’を有する）およびＮｃｏＩ切断部位が５’末端に生じ、切断部位Ｓｆｉ  Ｉ−ｂおよびそれに続く酵素ＳａｃＩの切断部位（配列５’−ＧＡＧＣＴ↓Ｃ−３’）が３’末端に生じる。ついで該ＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのキットを使用；該製造業者により指定されたとおりの条件）によりプラスミドｐＣＲ２．１内に直接的にクローニングする。これはプラスミドｐＢＳ−ｈｐｈ−Ｎｏｓを与える。
【０１５３】
工程４
プラスミドｐＣＭ５４（前記を参照されたい）から出発して、ウスチラゴ・メイディス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）ｈｓｐ７０プロモーターの５５０ｂｐの断片を、プライマー５−ｈｓｐ（配列番号１０）およびｈｓｐ−Ｎｃｏ（配列番号１１）を使用する第３のＰＣＲで増幅する（Ｉｎｎｉｓら，１９９０のＰＣＲプロトコール；サイクル：ａ）９４℃で１０分間の１サイクル、ｂ）各場合に９４℃で１分間、６０℃で1分間、７２℃で３分間の３０サイクル、ｃ）７２℃で１０分間の１サイクル）。このＰＣＲにより、切断部位Ｓｆｉ  Ｉ−ａの直前の制限酵素ＸｈｏＩの切断部位（配列５’−Ｃ↓ＴＣＧＡＧ−３’を有する）が、ｈｓｐ７０プロモーター配列の５’末端に導入される。酵素ＨｉｎＤＩＩＩの切断部位（配列５’−Ａ↓ＡＧＣＴＴ−３’を有する）の前の酵素ＮｃｏＩの切断部位が３’末端に生じる。この場合もまた、該ＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのキットを使用；該製造業者により指定されたとおりの条件）によりプラスミドｐＣＲ２．１内に直接的にクローニングする。これはプラスミドｐＢＳ−ｈｐｈを与える。クローニングの後、ＰＣＲにより生じた断片の配列が正しいことを配列決定（ＡＢＩ  ３７７  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；汎用およびリバースプライマー；標準的な汎用およびリバースプライマーを使用する該製造業者により指定されたとおりの条件）により確認する。
【０１５４】
工程５
最終工程においては、ｉ）プラスミドｐＢＳ−ｈｐｈ−Ｎｏｓを酵素ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；該製造業者により指定されたとおりの条件）で切断して、ｈｐｈ遺伝子、ＮＯＳターミネーター配列およびＳｆｉ  Ｉ−ｂ切断部位を有する断片を得、ｉｉ）プラスミドｐＢＳ−ｈｓｐを酵素ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；該製造業者により指定されたとおりの条件）で切断して、ｈｓｐ７０プロモーター配列およびＳｆｉ  Ｉ−ａ切断部位を有する断片を得、ｉｉｉ）商業的に入手可能なプラスミドｐＢＳＫＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＸｈｏＩおよびＳａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；該製造業者により指定されたとおりの条件）、ならびにｉｖ）得られた３つの断片を連結（Ｒｏｃｈｅのリガーゼ；該製造業者により指定されたとおりの条件）してプラスミドｐＢＳ−ｈｈｎを得る。このプラスミドから、Ｓｆｉ  Ｉでの制限酵素処理によりヒグロマイシンノックアウトカセットを得、それを本発明の方法において使用することができる。
【０１５５】
ＡＣＡＴをコードするウスチラゴａｃｃｌ遺伝子の欠失
（３’領域において）ＡＣＡＴ遺伝子に隣接する又は（５’領域において）第２エキソンに伸長する約７５０ｂｐ長の領域を各場合に得るために、配列ｌａｃｃｌ１（配列番号１２）、ｌａｃｃｌ２（配列番号１３）、ｒａｃｃｌ１（配列番号１４）およびｒａｃｃｌ２（配列番号１５）を有するプライマーを使用するＰＣＲを用いる。
【０１５６】
該ＰＣＲは以下の条件下で行う：９４℃で５分間の初期変性工程、ならびにそれに続く各場合に９４℃で１分間（変性）、６２℃で１分間（ハイブリダイゼーション）および７２℃で１分間（ポリメラーゼ反応）の３０  ＰＣＲサイクル、ならびにそれに続く７２℃で７分間の最終インキュベーション（Ｉｎｎｉｓら，１９９０のＰＣＲ）。
【０１５７】
該ＰＣＲ反応により、ｈｐｈカセットのＳｆｉ  Ｉ切断部位に適合性の２つの異なるＳｆｉ  Ｉ切断部位が、ａｃｃｌ遺伝子に隣接する又はそれにおいて終結する断片の末端に導入される。この目的において、プライマーｌａｃｃｌ２は、内部の左隣接領域の認識配列に加えて、Ｓｆｉ  Ｉ−ｂ切断部位の配列および更に３個のヌクレオチドを含有する。この目的において、プライマーｒａｃｃｌ２は、内部の右隣接領域の認識配列に加えて、Ｓｆｉ  Ｉ−ａ切断部位の配列および更に３個のヌクレオチドを含有する。
【０１５８】
ベクターｐＢＳ−ｈｈｎおよびＰＣＲ精製断片を適当な方法によりＳｆｉ  Ｉで制限酵素処理し、ついでフェノールで抽出し、ゲル電気泳動により精製し、ｈｐｈカセットに連結する。
【０１５９】
エタノールによる沈殿の後、該ＰＣＲ断片をＳｆｉ  Ｉで制限酵素処理する（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、２０単位、２時間、該製造業者により指定されたとおりの酵素反応の条件）。
【０１６０】
アガロースゲル電気泳動による分離の後、Ｇｅｎｏｍｅｄのゲル溶出キットＪｅｔｓｏｒｂを該製造業者の指示に従い使用して該断片を精製する。
【０１６１】
０．２μｇの各隣接部分および０．２μｇの２ｋｂ  ｈｐｈカセットを２．５単位のリガーゼと共にインキュベートして（Ｒｏｃｈｅ；該製造業者により指定された酵素反応条件）、該隣接部分をｈｐｈカセットに連結する。
【０１６２】
Ｓｆｉ切断部位は、非回文構造であり異なる突出部を有するため、同一隣接部分の連結および異なる隣接部分の連結が避けられる。該ＰＣＲ反応において使用するプライマーはリン酸化されないため、該断片の平滑末端を介した連結は生じない。３．５ｋｂの全産物を、対応外部プライマー（ｌａｃｃｌ１およびｒａｃｃｌ２）を使用する後続のＰＣＲにおいて増幅する。
【０１６３】
該ＰＣＲは以下の条件下で行う：９４℃で４分間の初期変性工程、ならびにそれに続く各場合に９４℃で１分間（変性）、６０℃で３０秒間（ハイブリダイゼーション）および７２℃で４．５分間（ポリメラーゼ反応）の３５  ＰＣＲサイクル、ならびに７２℃で７分間の最終インキュベーション。
【０１６４】
３．５ｋｂのＰＣＲ産物を沈殿させ、水中に取り、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）株ＦＢＤ１１（ａｌａ２／ｂ１ｂ２）の形質転換（形質転換の説明は後記を参照されたい）に直接使用する。１６個のコロニーを該形質転換反応から単離し、トウモロコシ植物への接種に使用する。生じた腫瘍の胞子を分離比分析に付した。ａｃｃｌ遺伝子がウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）における必須の機能を有する場合には、該分離比分析においては以下のパターンが予想される：ヒグロマイシンを含有しない培地上では半数体小生子が成長し、ヒグロマイシンＢの存在下では成長が観察されない。典型的な結果においては、以下のパターンが生じた：ヒグロマイシンＢの非存在下では１１個の小生子が成長したが、該抗生物質の存在下では成長しなかった。両方の条件下で１個のコロニーが成長した。このコロニーにおいて、ＰＣＲ分析によりａｃｃｌ遺伝子およびヒグロマイシン耐性遺伝子のコピーが検出された。その他の株においては、ａｃｃｌ遺伝子のみが検出された。ａｃｃｌ遺伝子を欠き同時にヒグロマイシンＢに耐性の候補体は見出されなかったため、ａｃｃｌ遺伝子はウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）の必須遺伝子として分類されている。
【０１６５】
ウスチラゴ・メイディスプロトプラストの作製および形質転換
ＹＥＰＳ培地内の５０ｍｌのウスチラゴ・メイディス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）培養を約５×１０７／ｍｌ（ＯＤ６００  ０．６〜１．０）の細胞密度まで２８℃で成長させる。この目的のために、静置前培養を３段階で１：１００、１：３００、１：１０００に希釈し、バッフルフラスコ内で２８℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートする。所望の細胞密度に達した後、該培養を２５００ｇで７分間遠心沈殿させる。該細胞ペレットを２５ｍｌのＳＣＳバッファーに再懸濁させ、再び２５００ｇで７分間遠心する。該ペレットを、２．５ｍｇ／ｍｌ  Ｎｏｖｏｚｙｍ  ２３４（例えば、Ｎｏｖｏ−Ｂｉｏｌａｂｓ）で補足された２ｍｌのＳＣＳバッファーに再懸濁させる。プロトプラストは室温で遊離する。これを顕微鏡下で５分ごとにモニターする。ついで該プロトプラストを１０ｍｌのＳＣＳバッファーと混合し、１１００ｇで１０分間遠心する。該上清を捨てる。該ペレットを１０ｍｌのＳＣＳバッファーに注意深く再懸濁させ、遠心し、ついで１０ｍｌのＳＴＣバッファーで洗浄し、ついで５００μｌの冷ＳＴＣバッファーに再懸濁させ、氷上に維持する。１５μｇのヘパリンおよび５０μｌのプロトプラスト（ＳＴバッファー中）を７μｌ以下の直鎖状ＤＮＡ（３μｇ〜５μｇ）に順次加え、該混合物を氷上で１０分間冷却する。ついで５００μｌのＰＥＧ４０００［ＳＴＣバッファー中、４０％（ｗ／ｗ）］を加え、該プロトプラスト懸濁液と注意深く混合し、氷上で１５分間インキュベートする。
【０１６６】
形質転換体を同定するために、該形質転換反応物を寒天プレート（１．５％  寒天、１Ｍ  ソルビトールおよび抗生物質で補足されたＹＥＰＳ培地；プレーティングの直前に、この寒天層を、抗生物質を含有しない寒天プレート用の等容量の尚も流体の培地で覆う）上にプレーティングする。２８℃で３〜４日間のインキュベーションの後、結果を判定する。
【０１６７】
ＹＥＰＳ培地（Ｔｓｕｋｕｄａら，１９８８を参照されたい）
１％  酵母エキス、２％  Ｂａｃｔｏペプトン（Ｄｉｆｃｏ）、２％  スクロース（水中）。
【０１６８】
ＳＣＳバッファー：  ２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１．０Ｍ  ソルビトール（水中、ｐＨ５．８）。
【０１６９】
ＳＴＣバッファー：  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．０Ｍ  ソルビトール、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２（水中）。
【０１７０】
形質転換を確認するための寒天プレート用の培地
１．５％  寒天、１．０Ｍ  ソルビトールおよび抗生物質で補足されたＹＥＰＳ培地。形質転換を確認するために寒天培地において使用した種々の抗生物質の濃度：
フレノマイシン  ８０μg／ｍｌ；カルボキシン  ４μｇ／ｍｌ；ヒグロマイシン  ４００μｇ／ｍｌ；ＣｌｏｎＮＡＴ  ３００μｇ／ｍｌ。
【０１７１】
配列表に関する情報
配列番号１：ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴ（ａｃｃｌ）（株５２１、ＤＳＭ番号１４６０３）のゲノムＤＮＡ配列。
配列番号２：ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴ（株５２１、ＤＳＭ番号１４６０３）をコードする配列番号１のゲノムＤＮＡ配列の対向鎖のＤＮＡ配列。該ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）配列は２つのイントロンを含有する。
配列番号３：ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴをコードするｃＤＮＡ配列。
配列番号４：ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）ＡＣＡＴをコードする配列番号３のｃＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列。
配列番号５：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＡＴをコードするＤＮＡ配列。該サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）配列はイントロンを含有しない。該コード領域が認められうる。
配列番号６：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＡＴをコードする配列番号５の配列のエキソンによりコードされるアミノ酸配列。
配列番号７：プライマーｈｐｈ−Ｎｃｏ／ＢａｍのＤＮＡ配列。
配列番号８：プライマーｈｐｈ−ＳＴＯＰのＤＮＡ配列。
配列番号９：プライマー３−ｈｐｈのＤＮＡ配列。
配列番号１０：プライマー５−ｈｓｐのＤＮＡ配列。
配列番号１１：プライマーｈｓｐ−ＮｃｏのＤＮＡ配列。
配列番号１２：プライマーｌａｃｃｌ１のＤＮＡ配列。
配列番号１３：プライマーｌａｃｃｌ２のＤＮＡ配列。
配列番号１４：プライマーｒａｃｃｌ１のＤＮＡ配列。
配列番号１５：プライマーｒａｃｃｌ２のＤＮＡ配列。
【０１７２】
【表５】
2005519588.tif 000006
2005519588.tif 000007
2005519588.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】エルゴステロールの生合成  その１：アセチルＣｏＡからスクアレンまで。
【図２】エルゴステロールの生合成  その２：スクアレンからエルゴステロールまで。図１および図２においては、アセチルＣｏＡからエルゴステロールまでの個々の中間工程が黒太字で示されている。反応矢印の隣の枠内には公知酵素が示されており、反応矢印の左側には関連遺伝子がイタリックで示されている。公知標的（枠に向いた白矢印）および関連クラスの活性物質（下線付きの太字）も示されている（Ｄａｕｍら，１９９８およびＷｉｌｌｓら，２０００を参照されたい）。
【図３】ＡＣＡＴ酵素アッセイにおける酵素反応。ＡＣＡＴ：アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ。ＭＤＨ：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ。ＣＩＴ：クエン酸シンターゼ。ＣｏＡ：補酵素Ａ。ＮＡＤ＋：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）。ＮＡＤＨ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）。
【図４】サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＡＴの単離からの個々の画分のＳＤＳゲル電気泳動。レーン１：サイズマーカー。レーン２：ペレット（集められた細胞）、約２μｇ。レーン３：粗抽出物（細胞破壊後）、１０μｇ。レーン４：全体（Ｒｕｎ−ｔｈｒｏｕｇｈ）、１０μｇ。レーン５：サイズマーカー。レーン６：ＰＤカラム後のＡＣＡＴ画分６〜８、５μｇ。レーン７：ＦＰＬＣ後のＡＣＡＴ画分６〜８、５μｇ。レーン８：ＦＰＬＣ後のＡＣＡＴ画分９、約１μｇ。レーン９：バッファーＢ（１Ｍ  イミダゾール）での溶出液。レーン１０：サイズマーカー。
【図５】ＡＣＡＴの酵素活性。
【０１７４】
【化１】
2005519588.tif 000009
【配列表】
2005519588.tif 000010
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005519588.tif 000027
【国際調査報告】
2005519588.tif 000028
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