(57)【要約】本発明は、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のPTAPPモチーフまたはLドメインに結合する哺乳動物Tsg101タンパク質中のペプチドを同定するための方法を提供する。そのようなペプチドは、Tsg101-HIV Gag結合を抑制するために使用することが可能であり、したがって、HIV粒子の産生を減少させるのに有効である。本発明は、本発明の方法により同定されたペプチド、およびHIV感染を治療するための、そのようなペプチドの使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、
（a）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を哺乳動物細胞内に導入し、
（b）HIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現構築物を該哺乳動物細胞内に導入し、
（c）該トランスフェクト哺乳動物細胞を、適当な培地中、約37℃の温度で十分な時間にわたりインキュベートして、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物ならびにHIV gag、polおよびrev遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現する哺乳動物細胞を含む哺乳動物細胞培養物を取得し、
（d）該哺乳動物細胞培養物において、粒子に結合したp24のレベルを測定し、
（e）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む該発現構築物でトランスフェクトされていない対照の哺乳動物細胞培養物と比較した場合の、粒子に結合したp24のレベルの低下を、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なペプチドまたは断片の同定と相関づける、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、
（a）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を哺乳動物細胞内に導入し、
（b）HIVを該哺乳動物細胞内に導入し、
（c）トランスフェクトされかつ感染した該哺乳動物細胞を、適当な培地中、約37℃の温度で十分な時間にわたりインキュベートして、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物を発現しかつHIV粒子を産生する哺乳動物細胞を含む哺乳動物細胞培養物を取得し、
（d）該哺乳動物細胞培養物において、粒子に結合したp24のレベルを測定し、
（e）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む該発現構築物でトランスフェクトされていない対照の哺乳動物細胞培養物と比較した場合の、粒子に結合したp24のレベルの低下を、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なペプチドまたは断片の同定と相関づける、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項３】
HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、
（a）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を哺乳動物細胞内に導入し、
（b）HIVを該哺乳動物細胞内に導入し、
（c）該トランスフェクト哺乳動物細胞を、適当な培地中、約37℃の温度で十分な時間にわたりインキュベートして、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物を発現しかつHIV粒子を産生する哺乳動物細胞を含む哺乳動物細胞培養物を取得し、
（d）該細胞から放出されたHIV粒子を定量し、
（e）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む該発現構築物でトランスフェクトされていない対照の哺乳動物細胞培養物と比較した場合の、HIV粒子の産生の減少を、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なペプチドまたは断片の同定と相関づける、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項４】
HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、
（a）HIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現構築物を哺乳動物細胞内に導入し、
（b）哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を該哺乳動物細胞内に導入し、
（c）1以上の該発現構築物でトランスフェクトされかつ哺乳動物Tsg101ペプチド由来のペプチドまたは断片を浸透させた該哺乳動物細胞を、適当な培地中、約37℃の温度で十分な時間にわたりインキュベートして細胞培養物を取得し、
（d）該哺乳動物細胞培養物において、粒子に結合したp24のレベルを測定し、
（e）哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を浸透させていない対照の哺乳動物細胞培養物と比較した場合の、粒子に結合したp24のレベルの低下を、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なペプチドまたは断片の同定と相関づける、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項５】
HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、
（a）HIVを哺乳動物細胞内に導入し、
（b）哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を該哺乳動物細胞内に導入し、
（c）HIVでトランスフェクトされかつ哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を浸透させた該哺乳動物細胞を、適当な培地中、約37℃の温度で十分な時間にわたりインキュベートして細胞培養物を取得し、
（d）該細胞培養物において、粒子に結合したp24のレベルを測定し、
（e）哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を浸透させていない対照の哺乳動物細胞培養物と比較した場合の、粒子に結合したp24のレベルの低下を、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なペプチドまたは断片の同定と相関づける、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項６】
HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、
（a）HIVを哺乳動物細胞内に導入し、
（b）哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を該哺乳動物細胞内に導入し、
（c）HIVでトランスフェクトされかつ哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を浸透させた該哺乳動物細胞を、適当な培地中、約37℃の温度で十分な時間にわたりインキュベートし、
（d）該細胞から放出されたHIV粒子を定量し、
（e）哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を浸透させていない対照の哺乳動物細胞培養物と比較した場合の、HIV粒子の産生の減少を、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なペプチドまたは断片の同定と相関づける、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項７】
哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列がTsg101のUEV Aドメインに由来する、請求項1、2または3のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
HIV粒子の産生を減少させるのに有用なペプチドまたは断片であって、哺乳動物Tsg101タンパク質の少なくとも4個連続したアミノ酸を含んでなり、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法により同定されたものである、上記ペプチドまたは断片。
【請求項９】
哺乳動物Tsg101タンパク質がマウスTsg101タンパク質（配列番号1）、ヒトTsg101タンパク質（配列番号2）または他の哺乳動物Tsg101タンパク質である、請求項8記載のペプチドまたは断片。
【請求項１０】
4個連続したアミノ酸が哺乳動物Tsg101タンパク質のUEV Aドメインに由来する、請求項8記載のペプチドまたは断片。
【請求項１１】
前記ペプチドがHIV粒子の産生を少なくとも約3倍減少させる、請求項8記載のペプチド。
【請求項１２】
1種以上の製薬上許容される担体または希釈剤と哺乳動物Tsg101タンパク質またはその断片とを含んでなる、HIV粒子の産生を減少させるための医薬組成物。
【請求項１３】
1種以上の製薬上許容される担体または希釈剤と請求項8記載のペプチドとを含んでなる、HIV粒子の産生を減少させるための医薬組成物。
【請求項１４】
Tsg101タンパク質がマウスTsg101タンパク質（配列番号1）である、請求項13記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Tsg101タンパク質がヒトTsg101タンパク質（配列番号2）である、請求項13記載の医薬組成物。
【請求項１６】
4個連続したアミノ酸が哺乳動物Tsg101タンパク質のUEV Aドメインに由来する、請求項13記載の医薬組成物。
【請求項１７】
Tsg101タンパク質とHIV Gagとの相互作用を阻害する、HIV-1 Gagp6後期（L）ドメインPTAPP（配列番号3）を含むペプチドを同定するための方法であって、
（a）HIV-1 GagまたはHIV-1 Gagp6後期（L）ドメインを含むペプチドを、少なくとも第1および第2の固相支持体または表面上に固定化し、ここで、該固定化ペプチドは特異的抗GagもしくはLドメイン抗体または他のリンカーに連結されており、
（b）標識Tsg101タンパク質と、適当なバッファーと、HIV-1 Gagp6後期（L）ドメインの少なくとも4個連続したアミノ酸を含むペプチドと、を含む第1反応混合物を、約4℃で十分な時間にわたりインキュベートし、
（c）標識tsg101と適当なバッファーとを含む第2反応混合物を、約4℃で十分な時間にわたりインキュベートし、
（d）工程（b）の第1反応混合物を工程（a）の第1固相支持体または表面混合物に加え、液相中にて約4℃の温度で十分な時間にわたりインキュベートし、
（e）工程（c）の第2反応混合物を工程（a）の第2固相支持体または表面混合物に加え、液相中にて4℃の温度で十分な時間にわたりインキュベートし、
（f）該第1固相支持体または表面を工程（d）の液相から分離して、第1固相を取得し、
（g）該第2固相支持体または表面を工程（e）の液相から分離して、第2固相を取得し、
（h）工程（f）の第1固相中および工程（g）の第2固相中の標識tsg101の量を測定し、
（i）工程（g）の第2固相中の標識tsg101の量と比較した場合の工程（f）の第1固相中の標識tsg101の量の減少を、HIV-1 Gagp6後期（L）ドメインの少なくとも4個連続したアミノ酸を含みかつTsg101タンパク質とHIV Gagとの相互作用を阻害するペプチドの同定と相関づける、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項１８】
Tsg101タンパク質がマウス、ヒトまたは他の哺乳動物Tsg101タンパク質である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
HIV-1 Gagp6後期（L）ドメインPTAPP（配列番号3）の少なくとも4個連続したアミノ酸を含んでなり、請求項17記載の方法により同定された、Tsg101タンパク質とHIV Gagとの相互作用を阻害するためのペプチド。
【請求項２０】
ALQSRPEPTAPPEES（配列番号4）の少なくとも5個連続したアミノ酸を更に含む、請求項19記載のペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドがTSG101-HIV Gag相互作用を少なくとも約3倍減少させる、請求項19または20記載のペプチド。
【請求項２２】
1種以上の製薬上許容される担体または希釈剤と請求項19または20記載のペプチドとを含んでなる、TSG101とHIV Gagとの相互作用を阻害するための医薬組成物。
【請求項２３】
治療に有効な量の請求項8記載のペプチドを投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項２４】
治療に有効な量の請求項9記載のペプチドを投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項２５】
治療に有効な量の請求項10記載のペプチドを投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項２６】
治療に有効な量の請求項11記載のペプチドを投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項２７】
治療に有効な量を請求項19または20記載のペプチドを投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項２８】
治療に有効な量の請求項12記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項２９】
治療に有効な量の請求項13記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項３０】
治療に有効な量の請求項14記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項３１】
治療に有効な量の請求項15記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項３２】
治療に有効な量の請求項16記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項３３】
治療に有効な量の請求項22記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、HIVまたは他のレトロウイルスに感染した患者の治療方法。
【請求項３４】
HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、
（a）哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIV粒子のレベルを測定し、ただし、該哺乳動物細胞は、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を含んでいて、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物を発現し、かつHIVウイルスに感染しており、
（b）該HIV粒子のレベルと、類似した条件下で対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIV粒子のレベルと、を比較し、ただし、該対照の哺乳動物細胞は、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を含まないが、HIVウイルスに感染しており、
その際、工程（a）で測定したHIV粒子のレベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物のHIV粒子のレベルと比較して所定の閾値レベル未満であれば、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物を、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なものとして同定する、
ことを特徴とする上記方法。
【請求項３５】
HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、
（a）哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIV粒子のレベルを測定し、ただし、該哺乳動物細胞は、（i）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物、および（ii）HIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現構築物、を含んでいて、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物とHIV gag、polおよびrev遺伝子にコードされる遺伝子産物とを発現し、
（b）放出されたHIV粒子のレベルと、類似した条件下で対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIV粒子のレベルと、を比較し、ただし、該対照の哺乳動物細胞は、HIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現構築物を含んでいて、HIV gag、polおよびrev遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現するが、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む該発現構築物は含んでおらず、
その際、工程（a）で測定したHIV粒子のレベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIV粒子のレベルと比較して所定の閾値レベル未満であれば、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物を、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なものとして同定する、
ことを特徴とする上記方法。
【請求項３６】
HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、
（a）哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルを測定し、ただし、該哺乳動物細胞は、（i）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物、および（ii）HIV gagコード配列を含む発現構築物、を含んでいて、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物とHIV gag遺伝子にコードされる遺伝子産物とを発現し、
（b）放出されたHIVウイルス粒子のレベルと、類似した条件下で対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルと、を比較し、ただし、該対照の哺乳動物細胞は、HIV gagコード配列を含む1以上の発現構築物を含んでいて、HIV gag遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現するが、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を含んでおらず、
その際、工程（a）で測定したHIVウイルス粒子のレベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIV粒子のレベルと比較して所定の閾値レベル未満であれば、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物を、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なものとして同定する、
ことを特徴とする上記方法。
【請求項３７】
哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIV粒子のレベル、および対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIV粒子のレベルが、粒子に結合したp24の測定レベルにより表される、請求項34、35または36記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物tsg101のコード配列の前記部分がTsg101遺伝子のUEV Aドメイン中の配列である、請求項34、35または36記載の方法。
【請求項３９】
所定の閾値レベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物のHIV粒子のレベルと比較して、工程（a）で測定したHIV粒子のレベルの2倍の減少である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
所定の閾値レベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物のHIV粒子のレベルと比較して、工程（a）で測定したHIV粒子のレベルの4倍の減少である、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
所定の閾値レベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物のHIV粒子のレベルと比較して、工程（a）で測定したHIV粒子のレベルの90％減少である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
所定の閾値レベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物のHIV粒子のレベルと比較して、工程（a）で測定したHIV粒子のレベルの95％減少である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
所定の閾値レベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物のHIV粒子のレベルと比較して、工程（a）で測定したHIV粒子のレベルの99％減少である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
所定の閾値レベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物のHIV粒子のレベルと比較して、工程（a）で測定したHIV粒子のレベルの99.5％減少である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
レトロウイルスの産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法であって、レトロウイルスタンパク質のPTAPモチーフを含むペプチドと結合するペプチドを同定することを含んでなる方法。
【請求項４６】
前記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記レンチウイルスがHIV-1ウイルスである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記レンチウイルスがHIV-2ウイルスである、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
前記レンチウイルスがサル免疫不全ウイルスである、請求項46記載の方法。
【請求項５０】
PTAPモチーフを含むペプチドがHIV Gagタンパク質である、請求項45記載の方法。
【請求項５１】
PTAPモチーフを含むペプチドが配列番号4のペプチドである、請求項45記載の方法。
【請求項５２】
レトロウイルスの産生を減少させるのに有効である、PTAPモチーフを含むペプチドを同定するための方法であって、TSG101タンパク質またはその断片と結合する、PTAPモチーフを含むペプチドを同定することを含んでなる方法。
【請求項５３】
前記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
前記レンチウイルスがHIV-1ウイルスである、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
前記レンチウイルスがHIV-2ウイルスである、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
前記レンチウイルスがサル免疫不全ウイルスである、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドが配列番号4の配列を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５８】
前記tsg101遺伝子がヒトtsg101遺伝子である、請求項34〜36および45〜57のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1．発明の分野
本発明は、レトロウイルス粒子の産生（例えば、HIV粒子の産生）を阻害するのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質中のペプチドを同定するための方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により同定されたペプチド、およびレトロウイルス感染、HIV感染を治療するための前記ペプチドの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
2．発明の背景
ヒト免疫不全ウイルスI型（HIV-1）のPr55Gagタンパク質は、細胞膜上の集合(assembly)部位への輸送、ゲノムRNAとの結合および細胞外腔への放出に必要な情報のすべてを含有する（例えば、E. G., Swanstrom, R. & Wills, J. W., 1997, in Retroviruses, Coffin, J. M., Hughes, S. H. & Varmus, H. E.編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, pp. 263-334を参照されたい）。しかし、Gagはウイルス集合に十分なものではあるが、細胞性タンパク質がこの過程を促進している可能性がある。精製されたビリオンから幾つかの細胞性タンパク質が回収されうるが、このことは、集合粒子への接近性を示唆している（例えば、Arthur, L. O., Bess, J. W., Jr., Sowder, R. C. I., Benveniste, R. E., Mann, D. L., Chermann, J.-C. & Henderson, L. E., 1992, Science 258,1935-1938およびOtt, D. E., Coren, L. V., Kane, B. P., Busch, L. K., Johnson, D. J. Sowder, R. C. I., Chertova, E. N., Arthur, L. O. & Henderson, L. E., 1996, J. Virol. 70,7734-7743を参照されたい）。他のタンパク質はPr55Gagと直接的に相互作用する（例えば、Luban, B., Bossolt, K. L., Franke, E. K., Kalpana, G. V. & Goff, S. P., 1993, Cell 73,1067-1078を参照されたい）。Gagは翻訳後修飾を含有するため、その他のタンパク質との相互作用も示唆されている（例えば、Bryant, M. & Ratner, L., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,523-527; Camaur, D., Gallay, P., Swingler, S. & Trono, D., 1997, J. Virol. 71,6834-6841; Gottlinger, H. G., Sodroski, J. G. & Haseltine, W. A., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,5781-5785; Ott, D. E., Coren, L. V., Copeland, T. D., Kane, B. P., Johnson, D. G., Sowder, R. C., 2nd, Yoshinaka, Y., Oroszlan, S., Arthur, L. O. & Henderson, L. E., 1998, J Virol. 72,2962-2968）。成熟粒子の放出に必要なGag中の領域である後期（L）ドメイン（例えば、Wills, J. W., Cameron, C. E., Wilson, C. B., Xiang, Y., Bennett, R. P. & Leis, J., 1994, J Virol. 68, 6605-6618; Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G. & Haseltine, W. A., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88,3195-3199; Huang, M., Orenstein, J. M., Martin, M. A. & Freed, E. O., 1995, J : Virol. 69,6810-6818を参照されたい）が該タンパク質とユビキチン化機構との相互作用を指令することが新たに報告されている（例えば、Schubert, U., Ott, D. E., Chertova, E. N., Welker, R., Tessmer, U., Princiotta, M. F., Bennink, J. R., Krausslich, H. G. & Yewdell, J. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13057-13062; Strack, B., Calistri, A., Accola, M. A., Palu, G. & Gottlinger, H. G., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13063-13068; Vogt, V. M., 2000, Proc. Natl. Acad Sci. USA 97,12945-12947; Ott, D. E., Coren, L. V., Chertova, E. N., Gagliardi, T. D. & Schubert, U., 2000, Virology 278,111-121, Patnaik, A., Chau, V. & Wills, 3. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13069-13074を参照されたい）。Tsg101は、その配列および最近の研究に基づけば、細胞内輸送の調節、転写調節および細胞周期の制御に関与するユビキチン（Ub）結合性E2酵素変異体（variant）（UEV）タンパク質である（例えば、Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J. & Emr, S. D., 2000, Traffic 1,242-258; Lemmon, S. K. & Traub, L. M., 2000, Curr. Opin Cell Biol. 12,457-466, Xie, W., Li, L. & Cohen, S. N., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,1595-1600; Zhong, Q., Chen, Y., Jones, D. & Lee, W. H., 1998, Cancer Res. 58,2699-2702; Sun, Z., Pan, 3., Hope, W. X., Cohen, S. N. & Balk, S. P., 1999, Cancer 86,689-96を参照されたい）。UEVタンパク質は、タンパク質基質またはUb結合性（E3）酵素へのUbの結合および移行に不可欠なきわめて重要なCys残基を欠いている（Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Ponting, C. P., Cai, Y.-D. & Bork, P., 1997, J. Mol. Med. 75,467-469）。それらは進化において高度に保存されており、E2酵素と構造的に関連したタンパク質の新規ファミリーを構成するが、E2酵素とは明確に区別される。
【０００３】
すべてのレトロウイルスは、そのウイルスの構造的機能および酵素的機能を定める3つの遺伝子gag、polおよびenvを共有している（例えば、Swanstrom, R. & Wills, J. W., 1997, in Retroviruses, Coffin, J. M., Hughes, S. H. & Varmus, H. E.編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, pp. 263-334を参照されたい）。gag遺伝子は単独で、未熟ウイルス様粒子の集合、および感染細胞からのその放出に十分なものである。感染粒子を形成するように成熟するためには、pol中にコードされているウイルスコード化プロテアーゼ（PR）が必要である。gagがコードするタンパク質（Gag）は、集合および放出に関与している、明確に区別されるドメインを含有する。N末端マトリックス（MA）領域に位置する細胞膜結合性（M）ドメイン、ゲノムを封入するコア構造体を形成するキャプシド（CA）ドメイン、ヌクレオキャプシド（NC）領域内のタンパク質相互作用（I）ドメイン、および細胞膜からの出芽による放出に必要な後期（L）ドメインが存在する。Lドメインは、レトロウイルスにおいて高度に保存されたProリッチモチーフである。ラブドウイルス、フィブ（fib）ウイルス、エプスタインバーウイルスなどの他の包膜ウイルス、および細胞性タンパク質も、Proリッチモチーフをもっている（Harty, R. N., Brown, M. E., Wang, G., Huibregtse, I. & Hayes, F. P., 2000, Proc. Natl. Acad Sd. USA 97,13871-13876; Wills, J. W., Cameron, C. E., Wilson, C. B., Xiang, Y., Bennett, R. P. & Leis, J., 1994, J : Virol.68,6605-6618; Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G. & Haseltine, W. A., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88,3195-3199; Huang, M., Orenstein, J. M., Martin, M. A. & Freed, E. O., 1995, J. Virol. 69,6810-6818; Ikeda, M., Ikeda, A., Longan, L. C. & Longnecker, R., 2000, Virol. 268,178-191; Yasuda, J. & Hunter, E., 1998, J. Virol. 72, 4095-4103; Harty, R. N., Paragas, J., Sudol, M. & Palese, P., 1999, J. Virol. 73,2921-2929）。レトロウイルスにおけるLドメインは、アミノ酸配列とそれぞれのウイルス構造タンパク質内の位置が様々であるものの、機能的には互換性があり（Wills, J. W., Cameron, C. E., Wilson, C. B., Xiang, Y., Bennett, R. P. & Leis, J., 1994, J. Virol. 68, 6605-6618; Parent, L. J., Bennett, RP., Craven, R. C., Nelle, T. D., Krishna, N. K., Bowzard, J. B., Wilson, C. B., Puffer, B. A., Montelaro, R. C. & Wills, J. W., 1995, J. Virol. 69,5455- 5460）、このことは、機能が共通していることを示唆している。
【０００４】
TSG101遺伝子のタンパク質産物は元々は、マウス繊維芽細胞においてその機能的不活性化に関連した可逆的異常増殖により同定されたものである（Li, L. & Cohen, S. N., 1996, Cell 85, 319-329）。Tsg101は転写のモジュレーション（Sun, Z., Pan, J., Hope, W. X., Cohen, S. N. & Balk, S. P., 1999, Cancer 86,689-96; Watanabe, M., Yanagi, Y., Masahiro, Y., Yano, T., Yoshikawa, H., Yanagisawa, J., & Kato, S., 1998, Biochem, Biophys. Res. Commun. 245,900-905; Hittleman, A. B., Burakov, D., Iniguez-Lluhi, J. A., Freedman, L. P., & Garabedian, M. J., 1999, Embo 3,18,5380-5388）と、ユビキチン化およびタンパク質分解の抑制（Li, L., Liao, J., Ruland, J., Mak, T. W., & Cohen, S. N., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,1619-1624）との両方において機能しうることが、配列分析から示唆されており（Li, L. & Cohen, S. N., 1996, Cell 85, 319-329; Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Ponting, C. P., Cai, Y.-D. & Bork, P., 1997, J : Mol. Med. 75,467-469）、また、実験的証拠により示されている。後者の作用はN末端領域により媒介され、そのN末端領域は、ユビキチン（Ub）コンジュガーゼ（conjugase）（E2）様ドメインを含有するが、Ubの結合にきわめて重要な活性部位であるCys残基を欠いてる。Tsg101のUEVドメインの構造、ならびにUbおよびPTAPとのその相互作用様式も報告されている（Pornillosら, 2002, EMBO J. 21: 2397-2406）。
【０００５】
Tsg101を欠損した細胞は核、微小管および紡錘体の種々の異常を示し（Xie, W., Li, L. & Cohen, S. N., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,1595-1600; Zhong, Q., Chen, Y., Jones, D. & Lee, W. H., 1998, Cancer Res. 58,2699-2702）、tsg101ヌル突然変異マウスは、不完全な細胞増殖および早期胎児死を呈する（Ruland, J., Sirard, C., Elia, A., MacPherson, D., Wakeham, A., Li. L., de la Pompa, J. L., Cohen, S. N., & Mak, T. W., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,1859-1864）。Tsg101の定常状態レベルは、通常、培養されたマウスおよびヒト細胞系においては翻訳後に狭い範囲内で制御されており（Feng, G. H., Lih, C.-J., & Cohen, S. N., 2000, Cancer Research 60,1736-1741）、外来性プロモーターからの過剰発現およびtsg101の欠損は悪性形質転換を招くことがある（Li, L. & Cohen, S. N., 1996, Cell 85,319-329）。Tsg101タンパク質レベルの調節は、UbリガーゼであるMdm2による影響を受けることがあり（Li, L., Liao, J., Ruland, J., Mak, T. W., & Cohen, S. N., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,1619-1624）、ヒト、線虫C. elegans、分裂酵母S. pombeおよびキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）に及ぶ多様な生物において進化的に高度に保存されたC末端Tsg101配列を必要とする（Feng, G. H., Lih, C.-J., & Cohen, S. N., 2000, Cancer Research 60, 1736-1741; Bishop NおよびWoodman P., 2001, J Biol Chem. 276: 11735-42）。
【０００６】
S. cerevisiaeにおけるクラスE液胞タンパク質ソーティング（vps）タンパク質であるStp22p/Vps23はTsg101のオルソログとして同定されており、Tsg101自体は膜結合型タンパク質の輸送に関与している（Bishop NおよびWoodman P., 2001, J Biol Chem. 276: 11735-42; Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J. & Emr, S. D., 2000, Traffic 1, 242-258; Li, Y., Kane, T., Tipper, C., Spatrick, P. & Jenness, D. D., 1999, Mol. & Cell. Biol. 19,3588-3599）。また、SL6細胞は、複数の表面結合型タンパク質のソーティングに欠陥があることが示されている（Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J. & Emr, S. D., 2000, Traffic 1, 242-258）。
【０００７】
前記の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものと解釈されるものではない。
【発明の開示】
【０００８】
3．発明の概要
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のPTAPモチーフまたはLドメインに結合する、哺乳動物Tsg101タンパク質中のペプチドを同定するための方法を提供する。そのようなペプチドは、Tsg101-HIV Gag結合を阻害するために使用することが可能であり、したがって、HIV粒子の産生を減少させるのに有効である。本発明の好ましい実施形態においては、（a）哺乳動物細胞（該哺乳動物細胞は、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を含んでいて、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物を発現し、かつHIVウイルスに感染している）の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルを測定し、（b）該HIVウイルス粒子のレベルと、類似した条件下で対照の哺乳動物細胞（該対照の哺乳動物細胞は、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む上記発現構築物を含まない）の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルと、を比較することを含む方法により、哺乳動物tsg101タンパク質中のペプチドを同定する。前記方法においては、工程（a）で測定したHIVウイルス粒子のレベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物中のHIVウイルス粒子のレベルと比較して所定の閾値レベル未満であれば、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物は、HIV粒子の産生を減少させるのに有効であると同定される。好ましい実施形態においては、哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベル、および対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルは、粒子に結合したp24の測定レベルにより表される。本発明の好ましい実施形態においては、所定の閾値レベルは、対照の哺乳動物細胞の培養物のHIVウイルス粒子のレベルと比較して、工程（a）で測定したHIVウイルス粒子のレベルの2倍、4倍、90％、95％、99％または99.5％の減少である。
【０００９】
本発明のもう1つの好ましい実施形態においては、（a）哺乳動物細胞［該哺乳動物細胞は、（i）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物および（ii）HIV gagコード配列を含む発現構築物を含んでいて、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物とHIV gag遺伝子にコードされる遺伝子産物とを発現する］の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルを測定し、（b）該放出HIVウイルス粒子のレベルと、類似した条件下で対照の哺乳動物細胞（該対照の哺乳動物細胞は、HIV gagコード配列を含む1以上の発現構築物を含んでいて、HIV gag遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現するが、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を含まない）の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルと、を比較することを含む方法により、哺乳動物tsg101タンパク質中のペプチドを同定する。本発明の更にもう1つの好ましい実施形態においては、（a）哺乳動物細胞［該哺乳動物細胞は、（i）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物および（ii）HIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現構築物を含んでいて、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物とHIV gag、polおよびrev遺伝子にコードされる遺伝子産物とを発現する］の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルを測定し、（b）該放出HIVウイルス粒子のレベルと、類似した条件下で対照の哺乳動物細胞（該対照の哺乳動物細胞は、HIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現構築物を含んでいて、HIV gag、polおよびrev遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現するが、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を含まない）の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルと、を比較することを含む方法により、哺乳動物tsg101タンパク質中のペプチドを同定する。これらの実施形態においては、工程（a）で測定したHIVウイルス粒子のレベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルと比較して、所定の閾値レベル未満であれば、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物は、HIV粒子の産生を減少させるのに有効であると同定される。好ましい実施形態においては、哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベル、および対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルは、粒子に結合したp24の測定レベルにより表される。本発明の好ましい実施形態においては、所定の閾値レベルは、対照の哺乳動物細胞の培養物の粒子結合p24のレベルと比較した場合、工程（a）で測定した粒子結合p24のレベルの2倍、4倍、90％、95％、99％または99.5％の減少である。
【００１０】
本発明はまた、レトロウイルス粒子（例えば、HIV-1およびHIV-2、サル免疫不全ウイルス（SIV）を含むレンチウイルスの粒子が挙げられるが、これらに限定されるものではない）の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法を提供する。前記方法は、レトロウイルスタンパク質（例えば、HIV Gagタンパク質）のPTAPモチーフを含むペプチドに結合するペプチドを同定することを含む。好ましい実施形態においては、PTAPモチーフを含むペプチドは配列番号4のペプチドである。もう1つの好ましい実施形態においては、PTAPモチーフを含むペプチドはHIV Gagタンパク質である。
【００１１】
本発明はまた、レトロウイルス粒子（例えば、HIV-1およびHIV-2、サル免疫不全ウイルス（SIV）を含むレンチウイルスの粒子が挙げられるが、これらに限定されるものではない）の産生を減少させるのに有効である、PTAPモチーフを含むペプチドを同定するための方法を提供する。前記方法は、TSG101タンパク質に結合するPTAPモチーフを含むペプチドを同定することを含む。好ましい実施形態においては、該ペプチドは配列番号4の配列を含む。
【００１２】
本発明はまた、本発明の方法により同定されたペプチド、およびHIV感染を治療するための、そのようなペプチドの使用方法を提供する。
【００１３】
4．図面の説明
図1．  ツーハイブリッドアッセイを用いた、Tsg101結合に必要とされるPr55Gag中の領域の同定。βガラクトシダーゼ単位の測定により、レポーター遺伝子の活性化を定量した。図1A：Gagおよびpl-p6とTsg101との相互作用。Gagおよびpl-p6のβガラクトシダーゼ活性は、2つの独立した試験において同等であった。図1B：pl-p6とTsg101との相互作用（100％とみなす）は、20の独立した試験において約10〜30 βガラクトシダーゼ単位の範囲であった。陰性相互作用は、Tsg101を欠くベクターでpl-p6を同時形質転換した場合に得られたものと同等であった（<0.3単位）。この図は、野生型相互作用に対するパーセント+/- 1％として6つの独立した試験において突然変異体に関して得られた平均値を示している。
【００１４】
図2．  PR55GagとTsg101とのin vitro結合。図2A：免疫捕捉された放射能標識Tsg101を検出するオートラジオグラフィー。レーン1，RRLにおいて合成されたTsg101。レーン2〜9，プロテインAビーズ上に固定化された抗T7（レーン3）、抗CA（レーン7、8）または抗p6（レーン9）IgGに結合した未標識Pr55GSへの放射性Tsg101の結合の測定。抗体は「材料および方法」において定義されている。レーン2〜9において使用したRRLの量は、レーン1において使用した量より5倍多かった。図2B：ウェスタン分析による該ビーズ上のPR55Gagの存在の証明。Aにおいて使用した抗体で免疫沈降したGagタンパク質を可視化するために、CAドメイン中の抗原部位に対するモノクローナル抗体を使用した。該パネルの左側に分子量マーカー（kDa）が示されている。
【００１５】
図3．  細胞質抽出物由来のPR55GagとTsg101との共免疫沈降。図3A：全細胞質抽出物。rev（レーン1）、rev、gagおよびpol（レーン2）、またはrev、gagΔp6およびpol（レーン3）でトランスフェクトされた細胞から抽出物を調製した。図3B：rev（レーン1）；rev、野生型gagおよびpol（レーン2）；またはrev、gagΔp6およびpol（レーン3）でトランスフェクトされた細胞の抽出物を使用した、抗Tsg101モノクローナル抗体での免疫沈降（抗NCポリクローナル抗体により検出）。免疫沈降物中のTsg101の存在を確認するために、ブロットを抗Tsg101ポリクローナル抗体で再びプローブした（レーン4〜6）。図3C：rev（レーン1）またはrev、gagおよびpol（レーン2）でトランスフェクトされた細胞からの抽出物を使用した、抗CAポリクローナル抗体での免疫沈降（抗Tsg101モノクローナル抗体により検出）。免疫沈降物中のGagの存在を確認するために、ブロットを抗CAモノクローナル抗体で再びプローブした（レーン3、4）。パネルの左側に分子量マーカー（kDa）が示されている。
【００１６】
図4．Pr55Gag結合に必要とされるTsg101中の領域の同定。Tsg101のトランケート型（図4A）および置換型（図4Bおよび4C）突然変異体を、pl-p6融合タンパク質との相互作用に関してツーハイブリッドアッセイで試験した。この図は、野生型相互作用に対する割合（％）（+/- 2〜6％の誤差を伴う）としての平均値を示している。表示は図1の説明のとおりである。
【００１７】
図5．ウイルス産生および細胞局在に及ぼすTsg101欠損の影響。図5A：gagトランスフェクト細胞から調製したNIH 3T3およびSL6ライセートをSDS-PAGEにより分離し、全タンパク質に対してクーマシーブルーにより染色し（レーン1および2）、Na+K+ATPアーゼ、アクチンおよびTsg101に関してウェスタンブロット法により分析した（レーン3および4）。図5B〜5D：（5B）ウイルス粒子、（5C）NIH 3T3およびSL6細胞のS1抽出物［挿入図，pHIVトランスフェクトNIH 3T3細胞のS100（レーン1）およびP100（レーン2）画分］、（5D）SL6細胞のS1およびP1抽出物のウェスタンブロット。該ブロットは、抗CAウサギ血清（図5Bおよび5C）または抗NCヤギ抗血清（図5D）でプローブした。ウェスタン分析用の同等のサンプルをバイオラッド（Biorad）アッセイにより測定した。
【００１８】
図6．HIV-1粒子の放出に及ぼす野生型Tsg101の過剰発現の影響。図6A：野生型Tsg101FLAGの誘導発現。トランスフェクトCOS-1細胞から調製したS1画分を、抗Tsg101抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した。pa，誘導物質ポナステロン。図6B：抗CA抗体を使用するウェスタンブロット法に粒子を付すことにより分析した、COS-1細胞からのHIV-1の放出に及ぼすTsg101-FLAG過剰発現の影響。左側に分子サイズマーカーの移動位置が示されている。
【００１９】
図7．HIV-1粒子の放出に及ぼす突然変異Tsg101の過剰発現の影響。図7A：Tsg101FLAGΔ348-351Gの誘導発現。図7B：HIV-1粒子の産生に及ぼすTsg101-FLAG過剰発現の影響。図6の説明に記載のとおりに、S1画分およびウイルス粒子を分析した。
【００２０】
図8．抗Tsg101抗体による細胞質抽出物中のウイルスタンパク質の免疫沈降。図8A：FLAG標識野生型（レーン1および3）または突然変異型（レーン2および4）Tsg101を発現する模擬トランスフェクト（レーン1および2）およびgagトランスフェクト（レーン3および4）COS-1細胞から調製した細胞質抽出物を、抗p6抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した。tsg101をコードする2μgのDNAおよび5μM paを使用して、発現を誘導した。図8B〜8D：該抽出物を抗Tsg101ウサギポリクローナル抗体で免疫沈降させ、（8B）抗p6抗体、（8C）抗FLAG抗体および（8D）抗Tsg101マウスモノクローナル抗体でタンパク質に関してプローブした。
【００２１】
図9．ウイルスタンパク質の細胞内定常状態レベルに及ぼすTsg101過剰発現の影響。Rev（図9A、レーン1および3）、野生型Gag（図9Bおよび9C、レーン1および3）またはGagΔp6（図9Bおよび9C、レーン2および4）、およびFLAG標識野生型（図9B）または突然変異型（図9C）Tsg101を発現する細胞から、細胞質抽出物を調製した。S1（レーン1および2）およびP1（レーン3および4）画分を、抗CA抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した。
【００２２】
5．発明の詳細な記載
本発明によれば、Gag前駆体ポリタンパク質のC末端p6領域内に位置する、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のPTAPモチーフまたはLドメインが、in vitroでトランスフェクト細胞の細胞質中のtsg101遺伝子のタンパク質産物と結合することが見出された。本発明は、Tsg101-HIV Gag結合を阻害する分子、例えば、PTAPモチーフの少なくとも4個連続したアミノ酸を含むペプチド、を試験するためのアッセイを提供する。好ましくは、本発明のアッセイは、HIVウイルス放出の少なくとも2倍、4倍、90％、95％、99％または99.5％の減少を達成する分子（例えば、ペプチド）を同定するために使用する。前記アッセイにより同定された分子（例えば、ペプチド）は、HIV-1または他のレトロウイルスに感染した患者を治療するための治療用組成物として使用することができる。
【００２３】
また、驚くべきことに、Tsg101タンパク質の過少発現または過剰発現によるTsg101タンパク質の定常レベルの変動（perturbation）が、マウスおよび霊長類細胞からのHIV-1ウイルス様粒子の放出にマイナスの影響を及ぼすことを見出した。したがって、本発明は、1以上の製薬上許容される担体または希釈剤と哺乳動物Tsg101タンパク質とを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明のもう1つの態様においては、HIV粒子の産生を減少させるのに有効である哺乳動物Tsg101タンパク質の断片を同定するためのアッセイを提供する。本発明で用いる「HIV粒子」は、成熟ウイルス様粒子および未熟ウイルス様粒子の両方を含む。HIV粒子の産生を減少させるのに有効であると本アッセイにより同定された、本発明でTsg101の「ペプチド」と称されるTsg101の断片は、HIV-1または他のレトロウイルスに感染した患者を治療するための治療用組成物として有用である。したがって、1種以上の本発明のペプチドと1種以上の製薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物も提供する。
【００２４】
したがって、本発明の1つの実施形態においては、HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドを同定するための方法を提供する。前記方法は、（a）第1発現構築物（第1発現構築物は哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む）を哺乳動物細胞内に導入し、（b）HIVウイルス、またはHIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現ベクターを該哺乳動物細胞内に導入し、（c）該トランスフェクト哺乳動物細胞を、適当な培地中、十分な時間にわたり及び十分な条件下でインキュベートして、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物ならびにHIV gag、polおよびrev遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現する哺乳動物細胞の培養物を得る工程を含む。HIV gag、polおよびrev遺伝子を含む1以上の発現ベクターを使用して細胞をトランスフェクトした場合には、粒子に結合したp24（キャプシドタンパク質）のレベルを測定することができる。哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物でトランスフェクトされていない対照の哺乳動物細胞培養物と比較して、粒子結合p24のレベルが低いという知見は、HIV粒子形成を減少させるのに有効なTsg101ペプチドの同定と相関する。哺乳動物細胞にHIVウイルスを加えた場合には、前記のとおり、粒子結合p24を測定し、相関づけることが可能である。あるいは、哺乳動物細胞にHIVウイルスを加えた場合には、該細胞から放出されたHIV粒子を定量することができる。哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物でトランスフェクトされていない対照の哺乳動物細胞培養物と比較して、HIV粒子の産生が少ないという知見は、HIV粒子の産生を減少させるのに有効なペプチドの同定と相関する。
【００２５】
本発明のもう1つの実施形態においては、（a）哺乳動物細胞（該哺乳動物細胞は、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を含んでいて、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物を発現し、かつHIVウイルスに感染している）の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルを測定し、（b）該HIV粒子のレベルと、類似した条件下で対照の哺乳動物細胞（該対照の哺乳動物細胞は、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む該発現構築物を含まない）培養物中に放出されたHIV粒子のレベルとを、比較することを含む方法により、哺乳動物tsg101タンパク質中のペプチドを同定する。前記方法においては、工程（a）で測定したHIV粒子のレベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物のHIV粒子のレベルと比較して、所定の閾値レベル未満であれば、前記の哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物は、HIV粒子の産生を減少させるのに有効であると同定される。
【００２６】
本発明の更にもう1つの実施形態においては、（a）哺乳動物細胞［該哺乳動物細胞は、（i）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物および（ii）HIV gagコード配列を含む発現構築物を含んでいて、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物とHIV gag遺伝子にコードされる遺伝子産物とを発現する］の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルを測定し、（b）該放出HIVウイルス粒子のレベルと、類似した条件下で対照の哺乳動物細胞（該対照の哺乳動物細胞は、HIV gagコード配列を含む1以上の発現構築物を含んでいて、HIV gag遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現するが、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む該発現構築物を含まない）の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルとを、比較することを含む方法により、哺乳動物tsg101タンパク質中のペプチドを同定する。
【００２７】
本発明の更にもう1つの実施形態においては、（a）哺乳動物細胞［該哺乳動物細胞は、（i）哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物ならびに（ii）HIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現構築物を含んでいて、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物とHIV gag、polおよびrev遺伝子にコードされる遺伝子産物とを発現する］の培養物中に放出されたHIV粒子のレベルを測定し、（b）該放出HIV粒子のレベルと、類似した条件下で対照の哺乳動物細胞（該対照の哺乳動物細胞は、HIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現構築物を含んでいて、HIV gag、polおよびrev遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現するが、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む該発現構築物を含まない）の培養物中に放出されたHIV粒子のレベルとを、比較することを含む方法により、哺乳動物tsg101タンパク質中のペプチドを同定する。これらの実施形態においては、工程（a）で測定したHIVウイルス粒子のレベルが、対照の哺乳動物細胞の培養物中に放出されたHIVウイルス粒子のレベルと比較して、所定の閾値レベル未満であれば、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の該部分にコードされる遺伝子産物は、HIV粒子の産生を減少させるのに有効であると同定される。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態においては、同定されたペプチドは、放出されたHIV粒子のレベルまたは培養物中の粒子結合p24のレベルの少なくとも2倍、4倍、90％、95％、99％または99.5％の減少を引き起こす。
【００２９】
もう1つの実施形態においては、HIV粒子の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドを同定するための方法は、前記の方法において、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の一部分を含む発現構築物を使用する代わりに、哺乳動物Tsg101タンパク質のランダムな断片（ペプチド）を作製し、同様にHIVに感染した又はHIV gag、polおよびrevコード配列を含む1以上の発現構築物でトランスフェクトされた哺乳動物細胞に添加することにより行うことが可能である。Tsg101断片（ペプチド）は、周知の浸透（permeation）方法を用いて哺乳動物細胞内に導入することができる。この実施形態は、HIVまたは他のウイルス粒子の産生を減少させるのに有効である他の分子の同定にも適用可能であることが、当業者には明らかであろう。したがって、本発明のもう1つの態様においては、HIVまたは他のウイルス粒子の産生を減少させるのに有効である分子を同定するための方法を提供する。
【００３０】
もう1つの実施形態においては、本発明は、レトロウイルス粒子（例えば、HIV-1およびHIV-2、サル免疫不全ウイルス（SIV）を含むレンチウイルスの粒子が挙げられるが、これらに限定されるものではない）の産生を減少させるのに有効である、哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドまたは断片を同定するための方法を提供する。前記方法は、HIV Gagタンパク質のPTAPモチーフを含むペプチドに結合するペプチドを同定することを含む。好ましい実施形態においては、PTAPモチーフを含むペプチドは配列番号4のペプチドである。もう1つの好ましい実施形態においては、PTAPモチーフを含むペプチドはHIV Gagタンパク質である。ペプチドの結合を同定するための、当業者に公知の任意の標準的な方法を用いることができる。
【００３１】
好ましくは、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の前記部分は、Tsg101のUEV Aドメインの少なくとも一部を含む。UEV A領域は哺乳動物Tsg101のアミノ酸1〜140にまたがっている。
【００３２】
もう1つの好ましい実施形態においては、哺乳動物細胞が霊長類細胞である。本発明を実施するのに有用な哺乳動物細胞には、ミドリザル腎細胞、ヒトHeLa細胞およびヒト293細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの及び他の哺乳動物細胞系は、American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Va)のような種々の入手源から入手可能である。
【００３３】
哺乳動物tsg101遺伝子はどのような哺乳動物細胞から得てもよい。例えば、ヒトtsg101遺伝子はB細胞またはB細胞ライブラリーから単離することができる（Durfee T.ら, 1993, Genes Dev. 7: 555-569）。同様に、マウスまたは他の哺乳動物tsg101遺伝子をB細胞またはB細胞ライブラリーから単離することもできる。ヒトtsg101遺伝子およびマウスtsg101遺伝子のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列は公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れるLi, L.ら (1997) Cell 88: 143-154を参照されたい。関連するマウスおよびヒトtsg101遺伝子も、参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,807,995号、第5,892,016号、第5,679,523号および第5,891,668号に開示されている。前記の開示および本明細書に記載の他の任意の刊行物を、それらの内容が本明細書に完全に記載されているものとして、参照により本明細書に組み入れることとする。また、マウスTsg101タンパク質は、本明細書では配列番号1として記載されている。ヒトTsg101タンパク質は、本明細書では配列番号2として記載されている。
【００３４】
哺乳動物Tsg101タンパク質由来のペプチドは、tsg101コード配列の3'末端、5'末端、または3'末端および5'末端の両方を遺伝子操作によりトランケートすることにより得ることができる。in vitro突然変異誘発は、簡便な制限部位を導入するのに有用である。この用途に特に適した種々の商業的に入手可能なキットがあり、例えば、T7-Gene in vitro Mutagenesis Kit（USB, Cleveland, OH）およびQuikchange Site Directed Mutagenesis Kit（Stratagene, San Diego, CA）が挙げられる。あるいは、tsg101コード配列の特定の部分の直接的な増幅を可能にするようなPCRプライマーを画定することができる（例えば、実施例1を参照されたい）。好ましくは、tsg101コード配列の前記部分はUEVA領域の一部分に対応する。哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の前記部分は、多種多様なタイプの配列ベクター内に挿入することができる。例えば、哺乳動物tsg101遺伝子のコード配列の部分を含む発現構築物は、哺乳動物細胞内で機能する任意の発現構築物でありうる。より好ましい実施形態においては、ヘテロ二量体のエクジソン誘導性受容体［これは、ホルモンであるエクジソンまたはエクジソン類似体（例えば、プロナステロン）と一緒になって、転写アクチベーター複合体を形成し、該複合体はtsg101の発現を駆動するプロモーターに結合する］の両方の単量体をコードするベクター内に、tsg101遺伝子の一部のコード配列を配置する。
【００３５】
種々のHIV遺伝子をコードする発現ベクターが広く知られており、入手可能である。例えば、tgp-RRE-r（Smithら 1990 J. Virol. 64:2743-2750）は、gagコード領域およびpolコード領域の両方を含む発現ベクターである。pCMV-revは、HIV-1 rev遺伝子を含む発現ベクターである。Revは、gagおよびpolの発現に必要なHIV-1コード化タンパク質である。哺乳動物宿主細胞においては、tsg101コード配列の一部ならびにHIV gag、polおよびrevコード配列を発現させるために、ウイルスおよび細胞DNAからのエレメントを用いる多数の発現系を利用することができる。
【００３６】
細胞から放出されたHIV粒子を定量するためには、任意の公知方法を用いることができる。細胞から放出されたHIV粒子の定量は、種々の方法、例えば、p24 ELISAにより又はFlint, S. J.ら, 2000, Principles of Virology : Molecular Biology, Pathogenesis and Control, ASM Press, Washington, D. C.に記載の感染性アッセイにより行うことができる。まず、フィルター（例えば、0.22μmのフィルター）に通し、ついで20％ スクロースクッションによる超遠心に付すことにより、ウイルス粒子を培地または上清から単離する。適当な界面活性剤（例えば、1％ SDS）でHIV粒子を破壊した後、12.5％ SDSポリアクリルアミドゲルによる電気泳動およびそれに続く、p24に特異的な抗体［例えば、天然形態のCAタンパク質に対して産生させた抗CAウサギポリクローナル抗体（Ehrlich, L. S.ら, 1990 AIDS Res & Hum. Retro. 6:1169-1175）または抗CAマウスモノクローナル抗体（NEN-DuPont）］を使用するウェスタンブロット法により、p24タンパク質を分離することができる。
【００３７】
本発明においては、HIV粒子の産生を減少させるのに有効であり、かつ前記の本発明アッセイにより同定された、哺乳動物Tsg101タンパク質の少なくとも約4個連続したアミノ酸を含むTsg101ペプチドを提供する。好ましくは、本ペプチドは、HIV粒子の産生を減少させるのに有効であり、前記の本発明アッセイにより同定された、少なくとも約5個連続したアミノ酸を含む。より一層好ましいのは、少なくとも6個連続したアミノ酸を含み、HIV粒子の産生を減少させるのに有効であり、前記の本発明アッセイにより同定されたペプチドである。最も好ましい実施形態においては、本ペプチドは少なくとも約7個連続したアミノ酸を含む。したがって、例えば、本ペプチドは、配列番号1または配列番号2に記載のアミノ酸配列の少なくとも約4個、好ましくは少なくとも約5個、より好ましくは少なくとも約6個、最も好ましくは少なくとも約7個連続したアミノ酸を含みうる。好ましくは、本ペプチドは、哺乳動物Tsg101タンパク質のUEV Aドメインの部分に由来する又はそれを含む。本発明で用いる「ペプチド」は、少なくとも約4個のアミノ酸を含むTsg101タンパク質の断片を意味する。したがって、ペプチドは、哺乳動物Tsg101タンパク質のわずか約4個のアミノ酸しか含まないものであってもよい。本ペプチドはまた、哺乳動物Tsg101タンパク質由来の約4〜約140の任意の個数の連続的アミノ酸を含みうる。本発明では、約140アミノ酸より大きなアミノ酸配列はTsg101断片と称される。また、本ペプチドの類似体、ホモログ、断片、化学誘導体および製薬上許容される塩も、「ペプチド」なる語の範囲内に含まれる。本ペプチドはアミノ酸単位の反復も含みうる。
【００３８】
「類似体」は、本ペプチドのアミノ酸配列における置換体または改変体を意味し、ここで、アミノ酸残基の置換または改変、例えば付加および欠失は、HIV粒子の産生を減少させる又はTsg101-Gag結合を阻害するという特性を妨げない。したがって、類似体は、本ペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有し、かつ1個以上のアミノ酸残基が化学的に類似したアミノ酸で保存的に置換されているペプチドを含みうる。
【００３９】
本ペプチドを製造するための前記の組換えDNA技術に加えて、多数の公知技術により、本発明のペプチドを合成することができる。例えば、MerrifieldによりJ. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)に最初に記載された固相合成法を用いて、ペプチドを製造することができる。他のペプチド合成技術は、M. Bodanszkyら, Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed. (1976)、および当業者に容易に入手可能な他の参考文献に記載されている。ポリペプチド合成技術の概要は、J. StuartおよびJ. D. Young. Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984)に記載されている。また、The Proteins, Vol.II, 3d Ed., Neurath, H.ら編, p.105-236, Academin Press, New York, N. Y. (1976)に記載されている液相法によっても、ペプチドを合成することができる。種々のペプチド合成に使用する適当な保護基は、前記文献およびJ. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Pelenu Press, New York, N. Y. (1973)に記載されている。
【００４０】
また、哺乳動物Tsg101タンパク質のより大きな部分または全哺乳動物Tsg101タンパク質の化学的または酵素的切断によっても、本発明のペプチドを製造することが可能であろう。本発明のペプチドは、好ましくは、Merrifieldの固相法により化学合成する。一般には、この方法は、1個以上のアミノ酸残基の逐次的付加によりペプチド鎖を伸長させることを含む。通常、第1アミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基を、選択的に除去しうる適当な保護基で保護する。反応性側鎖基を含有するアミノ酸（例えば、リシン）には、選択的に除去しうる異なる保護基を使用する。
【００４１】
好ましい固相合成法は、保護された又は誘導体化されたアミノ酸をその未保護カルボキシルまたはアミノ基を介して不活性固相支持体に結合させることを含む。ついで該アミノまたはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適切に保護された相補（complementary）（アミノまたはカルボキシル）基を有する次の配列順序のアミノ酸を混合し、固相支持体に既に結合している残基とのアミド結合の形成に適した条件下で反応させる。ついでアミノまたはカルボキシル基の保護基を、この新たに付加されたアミノ酸残基から除去し、次のアミノ酸（適切に保護されたもの）を加えることを繰り返す。すべての所望のアミノ酸が適当な配列で連結された後、残存している末端保護基および側鎖保護基（固相支持体を含む）を逐次的または同時に除去して、最終的なペプチドを得る。
【００４２】
本発明の更にもう1つの態様においては、HIV-1後期（L）ドメインの少なくとも4個連続したアミノ酸を含みかつTsg101タンパク質とHIV Gagとの間の相互作用を阻害するペプチドを同定するための方法を提供する。HIV-1後期Lドメインは、アミノ酸配列PTAPP（配列番号3）（これはPTAPPモチーフとも称される）から構成される。したがって、前記方法により同定されたペプチドはPTAPPモチーフの少なくとも4個連続したアミノ酸を有し、また、アミノ末端およびカルボキシ末端の一方または両方に追加的なアミノ酸を含みうる。好ましくは、前記方法により同定されたペプチドは、PTAPPモチーフを含む少なくとも7個のアミノ酸を含む。より好ましくは、前記方法により同定されたペプチドは、PTAPPモチーフの少なくとも4個のアミノ酸と、天然においてPTAPPモチーフに隣接している1個以上のアミノ酸とを含む。PTAPPから誘導されるペプチドは、5アミノ酸PTAPPモチーフの反復を含むことができる。PTAPPモチーフに隣接したアミノ酸を以下に示す（Lドメインが下線で示されている）。
ALQSRPEPTAPPEES（配列番号4）。
【００４３】
HIV-1 Gagp6後期（L）ドメインを含みかつTsg101タンパク質とHIV Gagとの相互作用を阻害するペプチドを同定するための方法は、以下の工程を含む。第1に、HIV-1 GagまたはHIV-1 Gagp6後期（L）ドメインを含むペプチドを固相支持体または表面（例えば、ビーズ、プレート、スライドまたはマイクロタイターディッシュ）上に固定化する。固定化は、特異的抗GagもしくはHIV Gagp6後期ドメイン抗体または他の化学的リンカー（例えば、UVクロスリンカー）を使用して行なうことができる。実験用および対照用の両方の試験を行う。したがって、少なくとも2つの個別の固相支持体または表面（すなわち、第1および第2固相支持体または表面）は、その上に固定化されたHIV-1 GagまたはHIV-1 Gagp6後期（L）ドメインを有する（例えば、実験用試験のための1つのカラムおよび対照用試験のための1つのカラム）。標識Tsg101タンパク質、バッファーおよびHIV-1 Gagp6後期（L）ドメイン含有ペプチドを含む第1（実験用）反応混合物を、十分な時間にわたり約4℃でインキュベートする。また、標識TSG101とバッファーとを含む第2（対照用）反応混合物を、十分な時間にわたり約4℃でインキュベートする。好ましくは、十分な時間は約60分である。第1（実験用）反応混合物を第1固相支持体または表面に加え、液相中で十分な時間にわたり約4℃でインキュベートする。同様にして、第2（対照用）反応混合物を第2固相支持体または表面に加え、液相中で十分な時間にわたり約4℃でインキュベートする。好ましくは、十分な時間は約60分である。次に、第1固相支持体または表面を液相から分離して第1固相を得る。同様にして、第2固相支持体または表面を液相から分離して第2固相を得る。ついで第1固相および第2固相中の標識Tsg101の量を測定する。第2固相中の標識Tsg101の量と比較した場合の第1固相中の標識TSG101の量の減少は、HIV-1 Gagp6後期（L）ドメインを含みかつTsg101タンパク質とHIV Gagとの間の相互作用を阻害するペプチドの同定と相関する。HIV-1 GagまたはHIV-1 Gagp6後期（L）ドメインを含む固定化ペプチドに結合され得る適当な抗体には、抗p6ラットモノクローナル抗体（ABI）および抗Gag CA（NEN-Dupont）が含まれる。
【００４４】
本発明はまた、Tsg101が相互作用するウイルスタンパク質のPTAPまたは関連モチーフとTsg101との相互作用をモジュレートまたは阻害する、PTAPモチーフを含むペプチドを同定するための方法を提供する。前記ペプチドは、ウイルス粒子（例えば、HIV-1およびHIV-2、サル免疫不全ウイルス（SIV）を含むレンチウイルスの粒子が挙げられるが、これらに限定されるものではない）の産生を減少させるために使用することができる。前記方法は、TSG101タンパク質と結合するPTAPモチーフを含むペプチドを同定することを含む。好ましい実施形態においては、前記ペプチドは配列番号4の配列を含む。前記方法は、Tsg101が相互作用するウイルスタンパク質のPTAPまたは関連モチーフ（例えば、HIV GagのPTAPモチーフ）とTsg101との相互作用を、Tsg101またはウイルスタンパク質の活性部位への結合によりモジュレートまたは阻害する他の分子の同定にも適用可能である。したがって、本発明のもう1つの態様においては、ウイルスタンパク質のPTAPまたは関連モチーフとTsg101との相互作用をモジュレートまたは阻害する分子を同定するための方法を提供する。ペプチドの結合を同定するための当技術分野で公知の標準的な方法を用いることができる。
【００４５】
Tsg101は、商業的に入手可能な一般的なシグナル生成系のいずれかを利用する蛍光物質、酵素、化学発光物質、光増感剤、懸濁可能粒子または放射性同位体で標識されていてもよい。あるいは、Tsg101は、抗体、6Hisタグ、GSTタグまたはインフルエンザウイルスエピトープ（HAタグ）のようなタグ（標識）で標識されていてもよい。前記のアッセイで使用するTsg101タンパク質は、マウス、ヒトまたは他の哺乳動物タンパク質由来でありうる。
【００４６】
好ましくは、前記アッセイにより同定されたペプチドは、Tsg101-HIV Gag相互作用の少なくとも約3倍の減少をもたらす。本発明のペプチドはいずれも、HIV粒子の形成を減少させるための又はTsg101-HIV Gag相互作用を阻害するための治療用組成物として使用することができる。好ましくは、治療用組成物は医薬組成物である。したがって、本発明のペプチドは、好ましくは、治療に有効な量の少なくとも1つの本発明ペプチドと1種以上の製薬上許容される担体または希釈剤とを含有する医薬組成物としてヒト被験者に投与することができる。「治療に有効な量」なる語は、本ペプチドの作用様式に応じて、HIV粒子の形成または他のレトロウイルスの形成を減少させるのに又はTsg101-HIV Gag相互作用を阻害するのに必要な用量を意味する。そのような作用様式は、前記の適当なアッセイにより決定される。
【００４７】
ペプチド組成物は、静脈内に投与される場合には、担体および／または希釈剤および／または補助剤のような他の成分と組み合わされる。典型的な担体には、例えば、水緩衝化水溶液、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、それらの適当な混合物、界面活性剤または植物油を含む溶媒または分散媒が含まれる。本組成物には、糖または塩化ナトリウムのような等張化剤を含有させることが可能である。血液からのペプチドのクリアランスを最小限に抑えるために、ペプチドをアルブミンのようなタンパク質担体と共有結合させることができる。その他の成分の性質に対する制限はないが、それらは製薬上許容されるものであり、意図されるそれらの投与に有効でなければならず、該組成物の有効成分の活性を低下させないものでなければならない。本発明のペプチド組成物を、好ましくは、治療に有効な量の1種以上の本ペプチドが被験者に徐放されるように液体または半液体形態で、経皮パッチ中に含浸させたり、皮下インサート中に含有させることが可能である。
【００４８】
本発明のペプチドを経口投与する場合には、有効量のペプチドを含有するその医薬組成物はまた、同化可能な食用担体などのような不活性希釈剤を含有したり、硬質または軟質シェルゼラチンカプセル剤であったり、錠剤に圧縮されていたり、あるいはエリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることが可能である。したがって、本ペプチドは、薬学的に有効な量での簡便かつ効果的な投与のために、治療に有効な量の製薬上許容される適当な担体と配合される。
【００４９】
HIV感染者の治療方法に使用するペプチドの厳密な治療に有効な量は、対象者の年齢、体重および／または性別、病態の重症度、食事、投与の時間および頻度、薬物の組合せおよび／または反応感受性に基づいて、臨床医により決定される。好ましくは、ペプチドは、投与経路に応じて、投与量として約0.1〜100,000μgの量で、合計用量約1gまで投与すべきであると一般には述べられている。本発明のペプチド組成物は最終的には血流からクリアランスされるため、該組成物の再投与が指示され、そうすることが好ましい。
【実施例】
【００５０】
6．実施例
以下の実施例は本発明の例示として示されており、本発明を何ら限定するものではない。
【００５１】
6.1.  実施例1
本実施例においては、HIV-1 Pr55Gagを酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいてベイトとして使用し、哺乳動物の腫瘍感受性遺伝子Tsg101の産物であるTsg101（Li, L. & Cohen, S. N., 1996, Cell 85, 319-329）を、HIV-1 Gagと相互作用する細胞性タンパク質として同定した。本実施例は、in vitroおよびトランスフェクト細胞の細胞質の両方において、Tsg101がHIV-1 Gagのp6領域と特異的に相互作用したことを示している。p6中のLドメイン内の高度に保存された2つのPro残基は、Tsg101の結合にきわめて重要であった。さらに、Tsg101中のUEVドメイン内の改変されたUb結合部位、およびTsg101に特有の他の残基は、Gagとの相互作用の決定基であった。これらの結果は、細胞輸送機構の特定の成分がウイルスの出芽および成熟に関与していることを示している。
【００５２】
ユビキチン化は感染細胞からのウイルス粒子の放出に関与しているようである。遊離ユビキチン（Ub）と、p6 Gagの小断片に共有結合したUbとが、成熟ヒト免疫不全ウイルス粒子において検出される。Pr55Gag構造前駆体ポリタンパク質中のp6領域は、細胞膜結合タンパク質の輸送に関与する推定Ub調節因子であるTsg101と結合する。Tsg101は、（i）酵母ツーハイブリッドアッセイ、（ii）精製Pr55Gagとウサギ網状赤血球ライセートにより合成されたTsg101とを使用するin vitro共免疫沈降、および（iii）gagでトランスフェクトされたCOS細胞の細胞質でin vivoにおいて、Gagと相互作用することが判明した。p6中のPTAPPモチーフ（または後期（L）ドメイン）は、細胞膜からの成熟ウイルスの放出に必要とされ、Pr55Gagへの結合の決定因子である。Ub結合（E2）酵素のUbc4クラスに相同である、Tsg101中のN末端領域は、p6との相互作用の決定因子であった。E2酵素中のUbと結合する活性部位Cysの代わりに存在するTsg101中のTyr110の突然変異、およびTsg101に特有の他の残基の突然変異は、p6との相互作用を妨げたが、このことは、活性なE2酵素からTsg101を区別する特徴が該ウイルスタンパク質への結合に重要であったことを示している。これらの結果は、HIVにおけるLドメインの機能を、Ub機構と細胞輸送装置の特定成分とに関連づけるものである。
【００５３】
材料および方法
プラスミドの構築
酵母内での発現のためのPr55Gag pl-p6およびTsg101 GAL4ハイブリッド、in vitro発現のためのヒトTsg101、ならびに哺乳動物細胞内での発現のためのPr55Gag Δp6を構築するためのPCRおよび突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチドおよび方法を以下に記載し、表1に示す。
【００５４】
酵母で発現させるためのPr55Gagおよびpl-p6ハイブリッド：
酵母発現ベクターpGBT9またはpMA424およびpGAD424内に連結するためのインサートを合成するための鋳型としてプラスミドgpVIを使用するPCRにより、HIV-1配列を増幅した。pgpVIは、Pr55Gag、およびpolの一部、およびPol中のPR（D25A）の触媒部位内の不活性化突然変異をコードする。完全長gagのPCR断片を合成するために、5'末端プライマー（表1のオリゴ番号1）および3'末端プライマー（番号2）を使用した。それらのプライマーは、それぞれ、gagのnt 333とPRコード領域の末端とにアニールした。pGBT9およびpGAD424中に連結するために、インサート中のBamHIおよびBglII部位を操作した。MA-CAインサートの場合には、同じ5'末端プライマー（番号1）および3'末端プライマー（番号3）（これは、CAのC末端におけるgag遺伝子中の1421位にアニールする）を使用した。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、制限部位BglIIおよびBamHIを含有していた。CA-p2-NCインサートの場合には、CAのN末端におけるgag遺伝子の730位にアニールする5'プライマー（番号4）、およびp1のC末端におけるgag遺伝子の1673位に相補的な3'末端プライマー（番号5）を使用した。PCR産物をBglIIで切断し、該ベクター中のその部位に連結した。p1-p6インサートの場合には、gag遺伝子に1636位においてアニールする5'末端プライマー（番号6）、およびpci遺伝子中の2116位においてアニールする3'末端プライマー（番号7）を使用した。得られたインサートは、gagフレームにおけるGagのp1-p6領域、およびpciフレームの最初の99アミノ酸に及ぶものであった。gagフレームの発現のみが得られるように、それは、ヌクレオチド1636の上流のp1領域中に位置するフレームシフト部位を欠いていた。両方のオリゴヌクレオチドはBglII部位を含有していた。ユニークBglII部位における制限消化により、Pr55GagΔp6インサートを作製した。最終的には、BamHIおよびSalI部位を使用してpMA424由来のインサートをpGBT9に導入することにより、gag配列をpGBT9ベクターバックグラウンド中に配置した。Gene Editor（Promega）を使用する突然変異誘発により、pGBT9-p1-p6中の欠失および部位特異的突然変異を作製した。突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（番号8〜15）を、製造業者のプロトコルに従い使用した。アミノ酸の変化に至る点突然変異または欠失突然変異のために導入されたミスマッチ領域が、それぞれ下線または「/」で示されている。該ベクター中のSnaBI制限部位を除去する第2選択オリゴヌクレオチド（番号13）を使用して、二重突然変異を作製した。SnaBI消化に対する抵抗性により突然変異プラスミドを選択した。鋳型としての突然変異体K487Rと共に第2選択オリゴヌクレオチドおよびK487R突然変異誘発性オリゴ（番号11）を使用して、二重突然変異体K487,493Rを合成した。鋳型としてのΔPTAPP1と共に第2選択オリゴヌクレオチドおよびΔPTAPP2突然変異誘発性オリゴ（番号9）を使用して、二重突然変異体ΔPTAPP1,2を合成した。第2選択オリゴならびにオリゴ番号14および15（表1に示されているとおり）を使用して、突然変異体ΔPTAPP1から、第2ΔPTAPP1モチーフ中の点突然変異を合成した。
【００５５】
酵母内で発現させるためのTsg101ハイブリッド：
pACTベクターとしてB細胞ライブラリーから単離されたTsg101を、酵母ツーハイブリッド系用のインサートのPCRのための鋳型として使用した。該インサートを、pGAD424中に連結するためにEcoRIおよびSalI部位を有するように操作した。野生型tsg101インサートの場合には、フォワード（5'末端）プライマー（番号16）はTsg101のコード領域の開始部位に相補的であった。リバース（3'末端）プライマーは番号17であった。tsg101フォワードプライマー（番号16）およびリバースプライマー番号18〜20（すべて、該遺伝子の下流末端に導入されたSalI部位および翻訳終結コドンを有する）を使用して、3'末端におけるトランケーションを導入した。tsg101リバースプライマー（番号17）およびフォワードプライマー番号21〜23（それぞれ、該配列の5'末端の前に導入されたEcoRI部位を有する）を使用して、5'末端におけるトランケーションを導入した。Gene Editorおよびオリゴ番号24〜28を使用して、tsg101中に部位特異的突然変異を作製した。
【００５６】
in vitro発現：
T7プロモーターの制御下のpET3aベクター（Novagen）のBamHI部位に、ヒトtsg101をサブクローニングした。5'プライマー番号29（これは、該タンパク質中のアミノ酸10に対応する位置でアニールする）および3'プライマー番号30（これは、該コード領域のC末端にアニールする）と共に鋳型としてのpACT-tsg101を使用するPCRにより、該インサートを得た。
【００５７】
哺乳動物細胞で発現させるためのPr55GagΔp6：
p6の最初のコドン中に3つの点突然変異をPCRにより合成してそれを終止（オーカー）コドンに変換するための鋳型として、pgp-RRE-rを使用した。5'プライマー（番号31）はBH10 gagのヌクレオチド1637-1687にアニールし、ユニークBglII部位を含む。3'プライマー（番号32）は、ユニークEcoRV部位の下流のpol遺伝子中のヌクレオチド2655-2682にアニールする。pgp-RRE-rプラスミドおよびPCRから得られた断片をBglIIおよびEcoRVで切断し、所望の断片を連結した。
【００５８】
すべての構築物は、ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット（Perkin-Elmer, Foster City, CA）を製造業者の説明に従い使用する配列決定により確認した。
【００５９】
例えば、Ehrlich, L. S., Fong, S., Scarlata, S., Zybarth, G. & Carter, C., 1996, Biochemistry 35,3933-3943; Durfee, T., Becherer, K., Chen, P.-L., Yeh, S.-H., Yang, Y., Kilburn, A. E., Lee, W.-H. & Elledge, S. J., 1993, Genes Dev. 7,555-569; Smith, A. J., Cho, M. I., Hammarskjold, M. L. & Rekosh, D., 1990, J. Virol. 64,2743-2750; Ratner, L., Hasteline, W., Patarca, R., Livak, K. J., Starcich, B., Josephs, S. F., Doran, E. R., Rafalski, J. A., Whitehorn, E. A., Baumeister, K.ら, 1985, Nature (London) 313,277-284を参照されたい。
【表１】
2005500825.tif 000002
2005500825.tif 000003
【００６０】
ツーハイブリッドアッセイ
B細胞ライブラリーを使用する酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Durfee, T., Becherer, K., Chen, P.-L., Yeh, S.-H., Yang, Y., Kilburn, A. E., Lee, W.-H. & Elledge, S. J., 1993, Genes Dev. 7,555-569）により、PR55Gag-Tsg101相互作用を確認した。GAL4活性化および結合ドメイン融合タンパク質としてPR55GagまたはTsg101配列をコードするベクターpGBT9およびpGAD424を、既に記載されている方法（Bartel, P. L. & Fields, S., 1995, Methods Enzymol. 254,241-263）によりサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Y153中に形質転換した。簡潔に説明すると、TrpおよびLeu原栄養性に関する選択ならびにそれに続くLacZ活性化に関する定量的アッセイにより、相互作用を検出した。インサートを保持しないベクターまたは非特異的遺伝子（ラミン）を保持するベクターと相互作用しないことを示すことにより、真の陽性体を確認した。該DNAを自動配列決定に付し、それをデータベース中のタンパク質配列と一致させた後、タンパク質を同定した。該タンパク質のトランケート型、欠失型または点突然変異型と融合した酵母GAL4転写アクチベータータンパク質のDNA結合または活性化ドメインをコードするベクターを使用して、相互作用ドメインの位置決定を行った。相互作用は両方向で試験した。本明細書には、GAL4 DNA-結合ドメイン-Gagまたは-p1-p6融合タンパク質とGAL4活性化ドメイン-Tsg101融合タンパク質との相互作用が記載されている。SDS-ゲル電気泳動と、GAL4結合ドメイン（Upstate Biochemical）およびGAL4トランス活性化ドメイン（Santa Cruz）に対する抗体でのウェスタンブロット法と、による酵母細胞抽出物の分析により、すべてのGAL4融合体の発現を調べた。
【００６１】
細胞培養、トランスフェクションおよび細胞質抽出物の調製
COS-1細胞を、ウシ胎児血清を補充したDMEM中、60％コンフルエントになるまで37℃で培養した。FuGene 6試薬（Roche）を製造業者の説明に従い使用して、該細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、該細胞を培地中に回収し、遠心分離により集めた。ペレット化細胞を冷PBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含有する低張性バッファー（10mM Tris, pH 7.4, 1mM MgCl2; 4℃）で膨潤させ、Dounceホモジナイザー（B型乳棒）で破壊した。全ライセートを10,000×g、4℃で10分間遠心して、未破壊細胞、核およびミトコンドリアを除去した。
【００６２】
免疫捕捉アッセイ
Tsg101-Gag相互作用のin vitroアッセイのために、TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega)を使用して、[35S]-Met（DuPont NEN）存在下、pET3a-tsg101構築物からウサギ網状赤血球ライセート（RRL）中でTsg101を発現させた。T7 RNAポリメラーゼプロモーターを使用して産生された、T7遺伝子10のアミノ酸1-10をN末端に含有する組換えPr55Gagを、既に記載されているとおりに（Ehrlich, L. S., Fong, S., Scarlata, S., Zybarth, G. & Carter, C., 1996, Biochemistry 35,3933-3943）、大腸菌（E. coli）（BL21-DE3）発現株から精製した。プロテアーゼ阻害剤（Roche）を含有する非変性バッファー（25mM Tris, pH 7.4, 150mM NaCl, 0.5mM MgCl2, 1mM CaCl2, 1 % IGEPAL (Sigma)）で予め洗浄したプロテインAアガロースビーズ（Pierce）を適当な抗体と共にインキュベートし、再び洗浄し、ついでGagと共にプレインキュベートした。ついで放射能標識Tsg101を加え、さらに該混合物を回転装置中で4℃で60分間インキュベートした。ビーズを洗浄し、SDS-PAGEローディングバッファーに懸濁させ、95℃で5分間加熱した。また、前記のとおりに調製した細胞質抽出物をTsg101-Gag相互作用に関して調べた。これは、該抽出物および該抗体コーティングプロテインAビーズを10mM Tris, pH 7.4, 1mM MgCl2中に維持した以外は同じ方法を用いて行った。
【００６３】
タンパク質の検出
12.5％ SDSポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によりタンパク質を分離した。電気泳動後の放射能標識Tsg101の検出のために、ゲルを固定し、ゲルフルオログラフィーのためにEN3HANCE（DuPont NEN）オートラジオグラフィーエンハンサー中で30分間インキュベートし、乾燥させた。イメージングフィルム（BioMax, Kodak）を使用して、放射性バンドを可視化した。非放射性サンプルを含有するゲルをニトロセルロースに転写し、ウェスタンブロット法により分析した。本明細書中に特定されている以下の抗体を使用した：抗キャプシド(CA)1およびCA2抗体（CAタンパク質のそれぞれ天然および変性形態に対して産生させたウサギポリクローナル抗体；Ebbets-Reed, D., 1996, Molecular Microbiology, State University of New York (Stony Brook, Stony Brook, NY), pp.209; Ehrlich, L. S., Agresta, B. E. & Carter, C. A., 1992, J Virol. 66, 4874-4883）、抗CA3抗体（マウスモノクローナル抗体, NEN-Dupont）、抗p6抗体（C末端の16アミノ酸に対するウサギポリクローナル抗体, S. Campbell, NCI-FCRDC）、抗ヌクレオキャプシド抗体（NC、ヤギポリクローナル抗体, A. Rein, NCI-FCRDC）、抗T7抗体（Novagen）、抗Tsg1011抗体（モノクローナル抗体、Santa Cruz）、抗Tsg1012抗体（S. Cohen (Stanford U.)から得たウサギポリクローナル抗体）。Lumi-Light (Roche)を使用する化学発光により、タンパク質を可視化した。
【００６４】
結果
Pr55GagはツーハイブリッドアッセイにおいてTsg101と相互作用する
ヒトB細胞由来のcDNAライブラリー（Durfee, T., Becherer, K., Chen, P.-L., Yeh, S.-H., Yang, Y., Kilburn, A. E., Lee, W.-H. & Elledge, S. J., 1993, Genes Dev. 7,555-569）においてコードされている相互作用性タンパク質を同定するために、酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Bartel, P. L. & Fields, S., 1995, Methods Enzymol. 254,241-263）におけるベイトとしてHIV-1 Pr55Gagを使用した。約2百万個の形質転換体をスクリーニングし、2個の陽性体を単離した。配列決定およびGenBankデータベース中の登録配列との一致により、一方の相互作用相手はシクロフィリンBであることが確認された。これはPr55Gagと相互作用することが既に判明している（Luban, B., Bossolt, K. L., Franke, E. K., Kalpana, G. V. & Goff, S. P., 1993, Cell 73,1067-1078）。もう一方の相互作用タンパク質はヒト腫瘍感受性遺伝子Tsg101（Li, L. & Cohen, S. N., 1996, Cell 85, 3 19-329; Li, L., Li, X., Francke, U. & Cohen, S. N., 1997, Cell 88, 143-154）の産物であることが確認された。
【００６５】
Tsg101と相互作用するPr55Gat中の領域の同定
Tsg101との相互作用に必要とされるPr55Gagの領域を位置決定するために、酵母GAL4タンパク質のDNA結合ドメインに融合したNまたはC末端欠失Pr55Gagをコードするプラスミドを、ツーハイブリッドアッセイを用いてLacZレポーター遺伝子の活性化に関して試験した。該融合タンパク質中のGAL4 DNA結合ドメインに対する抗体を使用するウェスタン分析は、突然変異型および野生型タンパク質がすべて、比較しうるレベルで発現されることを示した。図1Aに示すとおり、シグナルは、Pr55Gagのp1-p6領域が欠失すると失われたが、p1-p6をコードするプラスミドにおいては保持された。このように、Tsg101との相互作用はPr55Gagのp1-p6内の要素による影響を受けた。
【００６６】
p6領域は、保存モチーフP7T/SAP10P11（p6ドメイン内の番号づけ）および反復Leu配列(LXX)4を含有する。(LXX)4モチーフは、直接的には相互作用しないかもしれないが、Vpr結合のための非常に重要な決定因子である（例えば、Frankel, A. D. & Young, J. A., 1998, Annu. Rev. Biochem. 67,1-25を参照されたい）。PTAPPモチーフまたは後期（L）ドメイン、および特にPro10,11は、集合の最終段階における成熟ウイルスの放出の決定因子である（Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G. & Haseltine, W. A., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88,3195-3199; Huang, M., Orenstein, J. M., Martin, M. A. & Freed, E. O., 1995, J. Virol. 69,6810-6818）。PTAPPモチーフは、集合したウイルス粒子内へのpol遺伝子産物の効率的なパッケージングにきわめて重要である領域(P5XP7)と重複している（Dettenhofer, M. & Yu, X. F., 1999, J. Virol. 73,4696-4704）。p6領域はまた、ユビキチン化のための基質であるLys残基を含有する（Ott, D. E., Coren, L. V., Copeland, T. D., Kane, B. P., Johnson, D. G., Sowder, R. C., 2nd, Yoshinaka, Y., Oroszlan, S., Arthur, L. O. & Henderson, L. E., 1998, J. Virol. 72,2962-2968）。前記の保存モチーフのいずれかがTsg101結合に重要であるかどうかを判定するために、Pr55Gagのp1-p6領域をコードするプラスミド中に欠失および点突然変異を導入し、ツーハイブリッドアッセイによりタンパク質-タンパク質相互作用を測定した。これらの研究に使用したpBH10クローン由来のp6領域は2コピーのPTAPPモチーフを含有し（Ratner, L., Haseltine, W., Patarca, R., Livak, K. 3., Starcich, B., Josephs, S. F., Doran, E. R., Rafalski, J. A., Whitehorn, E. A., Baumeister, K.ら, 1985, Nature 313,277-284）、これらのそれぞれを、独立して欠失させた。第1 PTAPPモチーフ（Gag中での番号づけでaa 455-459）の欠失は、野生型タンパク質結合の約50％のレベルにまでβガラクトシダーゼ活性を減少させた（図1B）。すべてのHIV株およびほとんどのレンチウイルス間で保存されている第2 PTAPPモチーフ（aa 467-471）（Myers, G., Korber, B., Wain-Hobson, S., Smith, R. F. & Pavlakis, G. N., 1995, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM）の欠失は、野生型タンパク質結合の約25％にまでβガラクトシダーゼ活性を減少させた。両方のモチーフ（aa 455-459および467-471）の欠失は、該ベクターがインサートを欠く場合に得られたレベル（<0.3％）にまでβガラクトシダーゼ活性を減少させた。第2モチーフ中のPro7からAlaへの置換と組み合わせた第1 PTAPPモチーフの欠失は、野生型の25％まで酵素活性を減少させた。同じ状況で、Pro10,11からAlaへの置換は該相互作用を完全に遮断した。Ub修飾のための基質として働くLys残基（Ott, D. E., Coren, L. V., Copeland, T. D., Kane, B. P., Johnson, D. G., Sowder, R. C., 2nd, Yoshinaka, Y., Oroszlan, S., Arthur, L. O. & Henderson, L. E., 1998, J. Virol. 72,2962-2968）の一方または両方からArgへの置換は野生型βガラクトシダーゼ活性を与えたが、このことは、p6中のUb基質がTsg101認識に必要とされないことを示している。(LXX)4反復モチーフの欠失は、野生型レベルの約55％にまでβガラクトシダーゼ活性を減少させた。第1 PTAPPモチーフの全体を除去した場合に、同じ減少が得られた。第2の高保存PTAPPモチーフ全体の欠失により又はこのモチーフ中のPro10,11の突然変異により引き起こされる、より有害な影響は、それがTsg101結合の主要な決定因子であることを示唆している。
【００６７】
Tsg101はin vitroでPr55Gagに結合する
ツーハイブリッドアッセイによる本発明者らの観察を証明し進展させるために、細菌中で発現された未標識のバクテリオファージT7タンパク質タグ付けした組換えPr55Gag（Ehrlich, L. S., Fong, S., Scarlata, S., Zybarth, G. & Carter, C., 1996, Biochemistry 35,3933-3943）およびRRLにおいて発現された[35S]-Met標識マウスまたはヒトTsg101を使用して、in vitro共免疫沈降実験を行った。マウス（Stanford U.のS. Cohenから入手）およびヒトTsg101（B細胞ライブラリー由来）は94％同一であり、これらのアッセイにおいて互換的に使用した。図2A（レーン1）に示す放射能標識タンパク質は、Tsg101の予想分子量（391アミノ酸、約43kDa）で移動した。該タンパク質は、一貫して二重線として検出されたが、これはおそらく、Met10における内部開始によるものであろう。細胞質抽出物においても、該タンパク質は時々、二重線として検出された。Tsg101は、T7タグ、CAまたはp6ドメインに対する抗体が固定化されており、かつPr55Gagと共にプレインキュベートされたプロテインAコーティングビーズにより捕捉された（レーン3、7、8および9）。Gagと共にプレインキュベートされなかった（レーン2、4、5、6）または抗体の非存在下でGagと共にプレインキュベートされたビーズは、Tsg101を捕捉しなかった。抗p6抗体は、該タンパク質のC末端の16残基（(Leu-X-X)4反復を含む）中の抗原部位を認識する。この抗p6抗体に結合したPr55Gagが尚もTsg101を捕捉し得たという事実は、p6中のTsg101結合領域が露出していたことを示している。これは、p6領域のC末端半分がTsg101の結合部位ではないこと示したツーハイブリッドアッセイの結果と合致している。競合アッセイにおいては、PTAPPモチーフを含有する、5倍モル過剰のペプチド（ALQSRPEPTAPPEES）の添加は、Pr55GagによるTsg101捕捉の2.2倍の減少を引き起こした。該ペプチドの溶解度が限られたものであったため、より高濃度での試験を行うことはできなかった。これとは対照的に、突然変異LIAPP配列を含有する、5倍モル過剰のペプチドでは、何の変化も検出されなかったが、このことは、PTAPPモチーフの作用が特異的であったことを示している。抗CAモノクローナル抗体でのウェスタン分析は、Tsg101を捕捉する、抗T7、CAおよびp6抗体でコーティングされたビーズ上の完全長Pr55Gagの存在を証明した（図2B、レーン1〜4）。免疫捕捉アッセイの結果は、Tsg101が、Lドメインとの相互作用を介して、Pr55Gagと特異的かつ安定にin vitroで相互作用することを示している。
【００６８】
Tsg101はin vivoでPr55Gagと結合する
ウイルス集合中にTsg101とGagとが結合するかどうかを確認するために、Gagを発現するCOS細胞を共免疫沈降アッセイによりTsg101-Gag複合体に関して調べた。プラスミドpgp-RRE-rは、HIV-1 GagおよびGag-Polポリタンパク質ならびにVifをSV40後期プロモーターの制御下で発現する（Smith, A. J., Cho, M. I., Hammarskjold, M. L. & Rekosh, D., 1990, J. Virol. 64,2743-2750）。発現には、pCMV-revの発現によりトランスで付与されるRevタンパク質が必要である（Smith, A. J., Cho, M. I., Hammarskjold, M. L. & Rekosh, D., 1990, J. Virol. 64,2743-2750）。細胞質内のTsg101-Gag相互作用の特異性が保証されるよう、p6ドメインを欠くGag突然変異体を加えた。revのみ、rev、gagおよびpol、またはrev、gagΔp6およびpolでトランスフェクトされた細胞から調製した細胞質抽出物を抗Tsg101マウスモノクローナル抗体と共にインキュベートし、NCドメインに対するヤギポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット法により免疫沈降体をGag関連タンパク質に関して調べた。まず、全細胞質抽出物を調べた（図3A）。抗NC抗体は、野生型Gagタンパク質を発現する細胞から調製した抽出物において、Pr55Gag、18kDaのNC関連タンパク質、およびNCp7を認識した（レーン7）。18kDaのバンドは、抗NC抗体および抗p6抗体の両方に対するその反応性に基づき、NC-p6であると確認された。抗NC抗体はまた、突然変異体を発現する細胞から調製した抽出物において、NCp7、および約49kDaで移動するタンパク質を認識した（レーン3）。後者は、Pr55GagΔp6前駆体タンパク質の予想分子量である。この結論と一致して、Revのみ（レーン1）または野生型Gagタンパク質（レーン2）を発現する細胞から調製した抽出物においては、その49kDaのタンパク質は検出されなかった。Tsg101に対するモノクローナル抗体を使用する免疫沈降は、野生型Gag前駆体およびNC-p6タンパク質を沈降させたが、NCp7（図3B、レーン2）や、p6ドメインを欠くGag（レーン3）は沈降させなかった。別の抗Tsg101抗体で同じブロットを再プローブすることにより、全3個の抽出物の免疫沈降体中の細胞タンパク質の存在が証明された（レーン4〜6）。反復実験において、抗CA抗体は、Gagを発現する細胞の抽出物からはTsg101を共免疫沈降させたが（図3C、レーン2）、Revのみを発現する抽出物からはTsg101を共免疫沈降させなかった（レーン1）。別の抗CA抗体で同じブロットを再プローブすることにより、Tsg101を捕捉するビーズ上のGagの存在が証明された（レーン4）。無関係な抗体（ウサギ抗マウスIgG）での免疫沈降はGagもTsg101も沈降させなかった。その結果は、Tsg101とGagとの相互作用が、ウイルスタンパク質を含有する細胞の細胞質において生じることを示しており、Gagタンパク質のp6領域が該相互作用を特異的に導くことを示している。
【００６９】
Pr55Gagと相互作用するTsg101中の領域の同定
Tsg101タンパク質は、E2酵素のUb結合（Ubc）4サブグループに対する相同性を有するN末端E2様（UEV）ドメインを含有する（Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Ponting, C. P., Cai, Y.-D. & Bork, P., 1997, J. Mol. Med. 75,467-469）。それはまた、中央のProリッチ領域およびコイルドコイル領域、ならびにその定常状態レベルを制御するC末端ステディネス（steadiness）ボックス（SB）を含有する（図4；Feng, G. H., Lih, C. J. & Cohen, S. N., 2000, Cancer Res. 60, 1736-1741）。Gagの集合にUbを関連づける最近の知見（Ott, D. E., Coren, L. V., Copeland, T. D., Kane, B. P., Johnson, D. G., Sowder, R. C., 2nd, Yoshinaka, Y., Oroszlan, S., Arthur, L. O. & Henderson, L. E., 1998, J. Virol. 72,2962-2968; Schubert, U., Ott, D. E., Chertova, E. N., Welker, R., Tessmer, U., Princiotta, M. F., Bennink, J. R., Krausslich, H. G. & Yewdell, J. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13057-13062; Strack, B., Calistri, A., Accola, M. A., Palu, G. & Gottlinger, H. G., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13063-13068; Vogt, V. M., 2000, Proc. Natl. Acad Sci. USA 97,12945-12947; Ott, D. E., Coren, L. V., Chertova, E. N., Gagliardi, T. D. & Schubert, U., 2000, Virology 278,111-121; Patnaik, A., Chau, V. & Wills, J. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13069-13074）に基づき、Tsg101のどの領域がウイルスタンパク質により認識されるのかを決定することに関心が持たれた。これを調べるために、酵母ツーハイブリッド系を用いて、Pr55Gagとの相互作用に必要とされるTsg101中の領域を位置決定した。GAL4タンパク質の活性化ドメインに融合したNまたはC末端トランケート型Tsg101をコードするプラスミドを、GAL4 DNA結合性ドメインに融合したp1-p6と結合する能力に関してアッセイした。図4Aに示すとおり、レポーター遺伝子の活性化の評価は、p6-Tsg101相互作用が、N末端の155アミノ酸を保有する断片においては維持されるが、この領域を欠く突然変異体においては失われることを示した。このことは、N末端領域が結合の最小決定因子であることを示唆している。ウェスタン分析は、相互作用性および非相互作用性断片の比較可能な発現を示し、したがってこの結論を支持している。興味深いことに、定性的アッセイにおいては、N末端の155、215および311残基断片が、比較できるほどにp6と結合したが、定量的アッセイにおいては、311残基断片が著しく大きな程度に相互作用した（図4A）。この相違は、aa155の下流の結合部位を反映するものではなかった。なぜなら、Tsg101のaa139からC末端に及ぶ断片は相互作用しなかったからである。さらに、Tsg101の残基167-374に融合したGSTから構成されるハイブリッドタンパク質を使用するin vitro捕捉アッセイにおいては、結合は検出されなかった。N末端の155残基断片中のp6結合領域の最適な提示には下流配列が必要かもしれない。これに関して、Tsg101は、約150残基の保存された触媒コアドメインと、基質認識において何らかの役割を果たすと推測されているこのコアドメインに結合した追加的なC末端延長部とを有するクラスII E2酵素に類似している（Jentsch, S., Seufert, W., Sommer, T. & Reins, H. A., 1990, Trends Biochem. Sd. 15,195-198; Li, L. Liao, J., Ruland, J., Mak, T. W. & Cohen, S. N., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,1619-1624）。
【００７０】
Ubc4を含めたE2酵素においては、Ubは活性部位Cysに結合する。Tsg101では、このCys残基がTyrにより置換されている。しかし、このTyrに隣接する14個中8個の残基はTsg101およびUbc4の両方において保存されている（Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Ponting, C. P., Cai, Y.-D. & Bork, P., 1997, J. Mol. Med. 75,467-469; 図4B）。p6ドメインによる認識が、Tsg101に特有のアミノ酸残基によるものであったのかどうかを確認するために、完全長タンパク質中の活性部位相同体に点突然変異を導入し、ツーハイブリッドアッセイでp6との相互作用を試験した。融合タンパク質中のGAD部分に対する抗体を使用するウェスタン分析は、突然変異タンパク質および野生型タンパク質がすべて、比較しうるレベルで発現されることを示した。E2およびUEVタンパク質のすべてのクラスにおいて保存されており、活性部位領域のC末端の境界を定めると考えられているTrp117（Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Hershko, A. & Ciechanover, A., 1998, Annu. Rev. Biochem. 67,425-479）の突然変異は結合を完全に妨げたが、このことは、この残基がTsg101およびUbc4の両方において重要であることを示している。Tsg101に特有の残基がLドメインとの相互作用を決定づけるという仮説と一致して、試験した4個中3個の非保存残基の置換がp6結合を妨げた（図4B）。Tyr110からTrpへの保存的置換は、p6相互作用を野生型の31％にまで減少させた。Tyr113から疎水性アミノ酸Valへの置換は、結合を野生型の33％にまで減少させた。Lys118からAlaへの置換は、より低い程度に結合を減少させた。
【００７１】
上記仮説を更に検証するために、本発明者らは、E2酵素において保存されていないTsg101中の残基のうち、Ubc4サブグループにおける基質認識を決定づけることが既に示されている領域（Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Ponting, C. P., Cai, Y.-D. & Bork, P., 1997, J. Mol. Med. 75,467-469; Oughtred, R., Bedard, N, Vrielink, A. & Wing, S. S., 1998, J. Biol. Chem. 273, 18435-18442）と整列する残基を調べた。Ubc4中の残基49および125は、構造的には相同であるが機能的には異なるUbc4アイソフォームの基質特異性を決定することが判明した（Oughtred, R., Bedard, N, Vrielink, A. & Wing, S. S., 1998, J. Biol. Chem. 273,18435-18442）。残基49はTsg101のThr67（Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Sancho, E. Vila, M. R., Sanchez-Pulido, L., Lozano, 3.3., Paciucci, R., Nadal, M., Fox, M., Harvey, C. Bercovich, B., Loukili, N., Ciechanover, A., Lin, S. L., Sanz, F. Estivill, X., Valencia, A. & Thomson, T. M., 1998, Mol. Cell Biol. 18,576-589）またはAsn69（Ponting, C. P., Cai, Y.-D. & Bork, P., 1997, J. Mol. Med. 75,467-469）と整列する。残基125はSer149(24)またはTyr150と整列する（Sancho, E. Vila, M. R., Sanchez-Pulido, L., Lozano, 3.3., Paciucci, R., Nadal, M., Fox, M., Harvey, C. Bercovich, B., Loukili, N., Ciechanover, A., Lin, S. L., Sanz, F. Estivill, X., Valencia, A. & Thomson, T. M., 1998, Mol. Cell Biol. 18, 576-589）。したがって、本発明者らは、67Thr-Tyr-Asn69および149Ser-Tyr150をAlaにより置換し、結合に及ぼす影響を調べた。図4Cに示すとおり、67Thr-Tyr-Asn69の突然変異は野生型レベルの5％にまで結合を減少させた。149Ser-Tyr150の突然変異は何ら影響を及ぼさなかった。ウェスタンブロット法は、該突然変異体が野生型レベルで発現されることを証明した。その結果は、GagとTsg101との相互作用が特定の認識に基づくという結論と一致しており、Tsg101のN末端E2様ドメインがp6結合の最小決定因子であるという示唆を裏付けている。
【００７２】
考察
本実施例には、in vitroおよびin vivoでのTsg101とHIV-1 Pr55Gagとの相互作用が記載されている。Tsg101のN末端半分は、Gag結合の決定因子を含有し、Ub結合E2酵素に相同である（Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Ponting, C. P., Cai, Y.-D. & Bork, P., 1997, J. Mol. Med. 75,467-469; Jentsch, S., Seufert, W., Sommer, T. & Reins, H. A., 1990, Trends Biochem. Sd. 15, 195-198）。Tsg101のC末端半分は、微小管ダイナミックス（動力学）に関与する細胞質リンタンパク質のスタシミン（stathmin）と相互作用しうるコイルドコイル・ドメインを有し（Li, L. & Cohen, S. N., 1996, Cell 85, 319-329）、かつ該タンパク質の定常状態レベルを調節する高度に保存された配列を含有する（Smith, A. J., Cho, M. I., Hammarskjold, M. L. & Rekosh, D., 1990, J Virol. 64,2743-2750）。Tsg101は、その構造的特徴に基づき、（i）ドミナントネガティブUb調節因子（Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Ponting, C. P., Cai, Y.-D. & Bork, P., 1997, J. : Mol. Med. 75,467-469）、（ii）転写調節因子（Sun, Z., Pan, 3., Hope, W. X., Cohen, S. N. & Balk, S. P., 1999, Cancer 86,689-96）、（iii）細胞周期の調節因子（Xie, W., Li, L. & Cohen, S. N., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,1595-1600; Zhong, Q., Chen, Y., Jones, D. & Lee, W. H., 1998, Cancer Res. 58,2699-2702）、および（iv）膜タンパク質輸送の調節因子（Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J. & Emr, S. D., 2000, Traffic 1,242-258; Lemmon, S. K. & Traub, L. M., 2000, Curr. Opin Cell Biol. 12,457-466）であると推測されている。多岐にわたるようにみえるこれらの役割が、該タンパク質の独立したまたは関連した機能を反映するものであるかどうかは明らかでない。さらに、これらの機能の関与がユビキチン化過程におけるTsg101の役割とどのように関連しうるのかも不明である。
【００７３】
哺乳動物細胞内でTsg101がHIV-1 Gagと相互作用するという観察は、該相互作用がウイルスの生活環に関連していることを示唆している。かかる相互作用は、細胞質抽出物においては、in vitroの場合より遥かに効率的であることが認められるが、これは恐らく、安定化細胞因子または特定のGag集合状態が必要とされることを示唆するものであろう。該タンパク質のLドメイン含有p6領域が結合に必要とされることから、該相互作用は後期出芽機能に関連づけられる。本実施例に記載されている結果は、LドメインPTAPPモチーフの欠失がGagとTsg101との相互作用を妨げることを示している。このProリッチ配列は、ウマ伝染性貧血ウイルス以外のすべてのレンチウイルスにおいて高度に保存されている（Myers, G., Korber, B., Wain-Hobson, S., Smith, R. F. & Pavlakis, G. N., 1995, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM）。HIV-1、HIV-2およびサル免疫不全ウイルス（SIV）のいくつかの分離株においては、それは重複している。ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）およびメイソンファイザーサルウイルス（MPMV）Gagタンパク質は、レンチウイルスモチーフ（PT(S)AP）および(P)PPPYモチーフ（機能的に互換性のあるトリレトロウイルス対応物）の両方を含有する（Wills, J. W., Cameron, C. E., Wilson, C. B., Xiang, Y., Bennett, R. P. & Leis, J., 1994, J. Virol. 68,6605-6618; Parent, L. J., Bennett, R. P., Craven, R. C., Nelle, T. D., Krishna, N. K., Bowzard, J. B., Wilson, C. B., Puffer, B. A., Montelaro, R. C. & Wills, J. W., 1995, J. Virol. 69,5455-5460）。PYおよびPTAPモチーフがUb装置を動員すること、ならびに或るプロテアソームインヒビターが、PTAPPおよびPYの突然変異から生じた欠陥に類似したウイルス粒子出芽における改変を引き起こすこと示す研究は、該細胞のユビキチン化装置がウイルス集合に関連している可能性を支持している（Schubert, U., Ott, D. E., Chertova, E. N., Welker, R., Tessmer, U., Princiotta, M. F., Bennink, J. R., Krausslich, H. G. & Yewdell, J. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13057-13062; Strack, B., Calistri, A., Accola, M. A., Palu, G. & Gottlinger, H. G., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13063-13068; Patnaik, A., Chau, V. & Wills, J. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13069-13074）。しかし、この関連性がUbの直接的または間接的な関与を反映するものであるかどうかは、現時点では明らかではない。一方で、Ub修飾のための基質であるp6ドメイン中のLys残基の突然変異は、ウイルス集合または放出に見かけ上の影響を及ぼさない（Ott, D. E., Coren, L. V., Chertova, E. N., Gagliardi, T. D. & Schubert, U., 2000, Virology 278,111-121）。他方で、GagへのUbの共有結合は、プロテアソームインヒビターにより生じた放出における欠陥をレスキューすることが示された（Patnaik, A., Chau, V. & Wills, J. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13069-13074）。p6中の好ましい部位が利用可能でない場合には、おそらく、他のLys残基がUb基質として働くのであろう。
【００７４】
Tsg101がドミナントネガティブUb調節因子として機能するという見解は、活性なE2酵素中のUbに結合する活性部位Cys残基をTsg101が欠くということに基づいている（Koonin, E. V. & Abagyan, R. A., 1997, Nat. Genet. 16,330-331; Ponting, C. P., Cai, Y.-D. & Bork, P., 1997, J. Mol. Med. 75,467-469）。ユビキチン化過程は2または3種の酵素の連続的作用を必要とする（例えば、Hershko, A. & Ciechanover, A., 1998, Annu. Rev. Biochem. 67,425-479を参照されたい）。Ub活性化酵素であるE1は、チオエステル結合を介してUbに結合し、ついでそれをE2に伝達する。E2酵素は、単独で又はE3 Ub-タンパク質リガーゼと共に機能して、Ubを基質タンパク質中のリシン残基に結合させうる。ポリユビキチン化により修飾された基質はプロテアソームにより分解される。モノユビキチン化は、エンドサイトーシスのためのシグナルとして働く（Shili, S. C., Sloper-Mould, K. E. & Hicke, L., 2000, Embo. J. 19,187-198）。活性部位CysはTsg101において保存されていないが、本発明者らの結果は、この領域がHIV-1 Lドメインの結合において直接的または間接的に機能することを示唆している。LドメインPTAPPの結合に寄与するTsg101中の改変されたUb結合部位中の残基は、正に荷電したLys残基に隣接するTyrおよびTrp残基であることに注目すべきである（図4B）。荷電残基に隣接した芳香族アミノ酸は、SH3およびWWドメインのようなタンパク質結合モチーフのための非常に重要な結合決定因子である。SH3ドメインは、PTAPPのようなコンセンサスPXXPを有するProリッチ配列と結合する。WWドメインはPPXYモチーフと相互作用する（Kay, B. K., Williamson, M. P. & Sudol, M., 2000, Fasebj. 14,231-241; Gamier, L., Wills, J. W., Verderame, M. F. & Sudol, M., 1996, Nature 381,744-745）。さらに、Tsg101中のこれらの芳香族残基を取り囲むアミノ酸は、活性なE2酵素において保存されているため、E2-Ub-E3相互作用性複合体に関して示唆されているとおり（Laney, J. D. & Hochstrasser, M., 1999, Cell 97, 427-430; Nuber, U. & Schefflier, M., 1999, J. Biol. Chem. 274,7576-7582）、Tsg101は、Gagp6を相互作用性E3酵素に提供するE2様能力を維持しているかもしれない。そうであれば、Tsg101-Gag複合体が活性なE3酵素と結合して、Lドメインの機能に関連した事象を促進するかもしれない。さらに、Tsg101は膜タンパク質輸送において機能することが示されている（Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J. & Emr, S. D., 2000, Traffic 1,242-258; Lemmon, S. K. & Traub, L. M., 2000, Curr. Opin Cell Biol. 12,457-466）。膜結合タンパク質の再循環に必要とされる小胞を調節する際のその関与（Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J. & Emr, S. D., 2000, Traffic 1,242-258; Bishop N And Woodman P., 2001, J Biol Chem. 276: 11735-42）が、粒子の成熟および放出の部位へのGagの輸送において何らかの役割を果たすことを可能にしているのかもしれない。
【００７５】
HIV-1 GagがTsg101中のE2様ドメインを介して結合するという知見は幾つかの仮説を示唆している。活性なE2酵素に対するTsg101の類似性に基づけば、GagとTsg101との相互作用は偶発的なものであるかもしれない。あるいは、示唆されているように（Schubert, U., Ott, D. E., Chertova, E. N., Welker, R., Tessmer, U., Princiotta, M. F., Bennink, J. R., Krausslich, H. G. & Yewdell, J. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13057-13062; Strack, B., Calistri, A., Accola, M. A., Palu, G. & Gottlinger, H. G., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13063-13068; Patnaik, A., Chau, V. & Wills, 3. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13069-13074）、Ubが集合に必要とされるのであれば、Tsg101は、活性なE2酵素とGagとの相互作用を妨げる細胞防御機構として機能するのかもしれない。また、Tsg101がシャペロンとしてウイルスにより動員されて、Gagのポリユビキチン化と、それに続くプロテアソームによる分解を阻止する可能性がある。この見解は、活性Cysの代わりにSerを含有するサイクリン特異的E2酵素が実際にサイクリン破壊のドミナントネガティブインヒビターであるということにより裏付けられている（Townsley, F. M., Aristarkhov, A., Beck, S., Hershko, A. & Ruderman, J. V., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci USA 94,2362-2367）。最後に、Tsg101は、相互作用性E3タンパク質の機能を改変する酵母UEV Mms2タンパク質のように機能するのかもしれない（Hofmann, R. M. & Pickart, C. M., 1999, Cell 96, 645-653）。興味深いことに、エボラウイルス基質タンパク質のLドメインは、E3 Ubタンパク質リガーゼであるNedd4と相互作用する（Harty, R. N., Brown, M. E., Wang, G., Huibregtse, J. & Hayes, F. P., 2000, Proc. Natl. Acad Sci. USA 97,13871-13876）。Ubの修飾に影響を及ぼす細胞性タンパク質とLドメインとの相互作用の明らかな保存は、Ub機構の関与が、レトロウイルスファミリー内およびレトロウイルスファミリー外の両方のウイルスの集合および粒子放出における高度に保存された事象であることを示唆している。
【００７６】
6.2.  実施例2
実施例1は、Gag前駆体ポリタンパク質のC末端のp6領域に位置するヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のPTAPPモチーフまたはLドメインがtsg101遺伝子のタンパク質産物に結合することが判明したことを示している。Tsg101は転写のモジュレーションとユビキチン化およびタンパク質分解の抑制との両方において機能しうることを、配列分析が示唆しており、また、実験的証拠も示している。後者の効果は、ユビキチン（Ub）コンジュガーゼ（E2）様ドメインを含有するがUb結合にきわめて重要な活性部位Cys残基を欠くN末端領域により媒介される。Tsg101のこのドメインは、HIV-1 Gagとのその相互作用に必要な最小結合領域である。エンドソーム輸送におけるTsg101の関与、ならびにそれがin vitroおよび哺乳動物細胞においてHIV-1 Gagと相互作用する能力（実施例1に示したとおり）、およびGagのp6領域内のLドメインが、結合に特に必要とされるという知見は、細胞表面からの成熟ウイルスの放出をもたらす後期出芽機能に及ぼすTsg101の効果を検討するための本実施例での研究につながった。
【００７７】
本実施例では、成熟HIV-1粒子の放出が、Tsg101を欠損しているマウスSL6細胞（Li, L. & Cohen, S. N., 1996, Cell 85, 319-329）、および野生型Tsg101タンパク質を過剰産生する霊長類COS-1細胞においては減少することが示されている。また、SL６細胞は複数の表面結合タンパク質のソーティング（選別）に欠陥があることが示されている（Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J. & Emr, S. D., 2000, Traffic 1,242-258）。Tsg101タンパク質の分解の調節には必要であるがGagの結合には必要でない領域内のTsg101の突然変異（実施例1を参照）は、ウイルスの放出に対するTsg101の過剰発現の抑制効果を部分的に逆転させた。Tsg101の過剰産生の効果は、Tsg101と相互作用する配列がGag中に存在することを必要とした。本実施例における結果は、Tsg101タンパク質が、GagのLドメインとの相互作用を介して、HIV-1粒子の輸送および成熟を特異的に調節しているという証拠を提供するものであり、増殖性ウイルス集合におけるTsg101の機能を示唆している。
【００７８】
ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）にコードされる構造前駆体ポリタンパク質であるPr55Gag中のp6領域は、gagトランスフェクト細胞の細胞膜からの成熟ウイルス様粒子の放出を導く。実施例1は、Gagp6が、膜結合タンパク質の輸送に影響を及ぼすタンパク質であるTsg101と結合することを示している。本実施例では、アンチセンス転写産物によるTsg101 mRNAの機能的不活性化により誘導されるTsg101の欠損は、細胞膜に富む細胞画分におけるGagタンパク質の成熟を妨げ、ウイルス粒子の放出を減少させることが示されており、このことは、正常なGagの輸送およびプロセシングにはTsg101が必要であることを示唆している。逆説的であるが、Tsg101の過剰発現もウイルス粒子の放出を阻害したが、Tsg101と結合しないGagΔp6の排出には影響を及ぼさなかった。阻害は、Tsg101分解の適当な自己調節に必要とされる、Tsg101のC末端ステディネス（steadiness）ボックス（SB）ドメインの突然変異により減少した。しかし、SBの突然変異は、過剰発現されたTsg101がウイルス粒子の放出を妨げる能力を低下させたが、粒子に結合したGag前駆体タンパク質の成熟は不完全であった。本実施例の結果は、Tsg101がHIV粒子の成熟および放出の両方において何らかの役割を果たしており、HIV-1の産生を妨げる新規標的となる可能性があることを示唆している。
【００７９】
材料および方法
プラスミド
野生型gag、polおよびvifをコードするpgp-RRE-r（Smith, A. J., Cho, M. I., Hammarskjold, M. L. & Rekosh, D., 1990, J. Virol. 64,2743-2750）を、PCRによりp6の最初のコドンに3つの点突然変異を導入して、それを終止（オーカー）コドンに変換すことによりPr55 GagΔp6を合成するための鋳型として使用した。5'プライマー（GGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGGAAGGCCAGGGAATT、配列番号37）はBH10 gagのnt 1637-1687にアニールし（Ratner, L., Haseltine, W., Patarca, R., Livak, K. J., Starcich, B., Josephs, S. F., Doran, E. R., Rafalski, J. A., Whitehorn, E. A., Baumeister, K.ら, 1985, Nature 313,277-284）、ユニークBglII部位を含む。3'プライマー（CCATGTATTGATAGATAACTATGTCTG、配列番号38）は、ユニークEcoRV部位の下流のpol遺伝子中のnt 2655-2682にアニールする。pgp-RRE-rプラスミドおよびPCRから得られた断片をBglIIおよびEcoRVで切断し、所望の断片を連結した。突然変異を、ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット（Perkin-Elmer, Foster City, CA）を使用する配列決定により確認した。pIND-hTsg101-FLAG（野生型ヒトTsg101）およびpIND-SD5-59-FLAG（アミノ酸348-351がGlyにより置換されている）は記載されている（Feng, G. H., Lih, C.-J., & Cohen, S. N., 2000, Cancer Research 60,1736-1741）。
【００８０】
細胞培養、トランスフェクションおよび細胞質抽出物の調製
COS-1細胞を、ウシ胎児血清および抗生物質を補充したDMEM中、60％コンフルエントになるまで37℃で培養した。FuGene 6試薬（Roche）を使用して、野生型または突然変異pIND-hTsg101-FLAG、pVgRXR、pCMV-rev、および野生型または突然変異pgp-RRE-rを種々の組合せで該細胞にトランスフェクトした。Revは、gagおよびpolの発現に必要なHIV-1コード化タンパク質である（Frankel, A. D. & Young, J. A., 1998, Annu. Rev. Biochem. 67,1-25）。PVgRXRは、ヘテロ二量体のエクジソン誘導性受容体［これは、該ホルモンと一緒になって、転写アクチベーター複合体を形成し、該複合体はtsg101の発現を駆動するプロモーターに結合する］の両方の単量体をコードしている。トランスフェクションの24時間後にトランスフェクト細胞をエクジソン類似体プロナステロンで24時間処理したところ、Tsg101の発現が誘導された。トランスフェクションの48時間後、該細胞をかき取ることにより該培地中に回収し、遠心分離により集めた。ペレット化細胞を冷PBSで3回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含有する1mlの冷低張性バッファー（10mM Tris, pH 7.4, 1mM MgCl2）で膨潤させ（15分間、4℃）、35ストロークのDounceホモジナイザー（B型乳棒）により破壊した。ライセートを10,000×g、4℃で10分間遠心して、未破壊細胞、核およびミトコンドリアを除去した。NIH 3T3およびSL6細胞を、抗生物質およびウシ胎児血清を補充したDMEM中、37℃で維持した。SL6細胞は、既に記載されているランダムホモ接合ノックアウト（RHKO）法（Li, L. & Cohen, S. N., 1996, Cell 85, 319-329）を用いてアンチセンスRNAによりtsg101遺伝子の機能的不活性化が施された3T3誘導体である。FuGene6試薬を使用して、これらの細胞をpHIV-APΔenv（Sutton, R. E., Wu, H. T., Rigg, R., Bohnlein, E. & Brown, P. O., 1998, J. Virol. 72,5781-5788）と、明細書中に示されている場合にはpME VSV G（Sutton, R. E., Wu, H. T., Rigg, R., Bohnlein, E. & Brown, P. O., 1998, J. Virol. 72,5781-5788）とでトランスフェクトした。全細胞質画分（S1）、核／ゴルジに富む画分（P1）、可溶性画分（S100）および細胞膜に富む画分（P100）への分画化を、記載されているとおり（L. Alland, S. M. Peseckis, R. E. Atherton, L. Berthiaume & Resh, M. D., 1994, J. Biol. Chem. 269,16701-16705）に行った。20％ スクロースのクッションによる30,000rpm、4℃で80分間の超遠心分離（Beckman SW41ローター）により、0.45μmフィルターを通した培養上清からウイルス粒子を単離した。ペレット化ウイルス粒子を、4℃で穏やかに振とうすることにより1mlのリン酸緩衝食塩水に再懸濁させた。VSV G偽型ウイルス調製物の感染力を、MAGIアッセイ（Vodicka, M. A., Goh, W. C., Wu, L. I., Rogel, M. E., Bartz, S. R., Schweickart, V. L., Raport, C., & Emerman, M., 1997, Virol. 233,193-198）を用いて評価した。
【００８１】
免疫沈降アッセイ
プロテアーゼ阻害剤（Roche）を含有する非変性低張性バッファー（10mM Tris, pH 7.4, 1mM MgCl2）で予め洗浄したプロテインAアガロースビーズ（Pierce）を適当な抗体と共にインキュベートし、サイトゾル抽出物に加え、4℃で60分間回転させた。免疫沈降物を低張性バッファー中で洗浄し、5％ メルカプトエタノールを含有するSDSサンプルバッファー中で煮沸し、SDS-PAGEにより分離し、本明細書中に示されている抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した。
【００８２】
タンパク質の検出
12.5％ SDSポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によりタンパク質を分離した。電気泳動後、該ゲルをニトロセルロースに転写し、ウェスタンブロット法により分析した。本明細書中に特定されている以下の抗体を使用した：抗Tsg101マウスモノクローナル抗体（Santa Cruz, Inc）、アミノ酸383-391に対して誘導された抗Tsg101ウサギポリクローナル抗ペプチド抗体、抗FLAGマウスモノクローナル抗体（Sigmaから入手）、天然形態のCAタンパク質に対して誘導された抗CAウサギポリクローナル抗体（Ehrlich, L. S., Krausslich, H.-G., Wimmer, E. & Carter, C. A., 1990, AIDS & Hum. Retro. 6,1169-1175）、抗CAマウスモノクローナル抗体（NEN-DuPont）、抗p6ラットモノクローナル（ABI）。Lumi-Light試薬（Roche）を使用する化学発光により、タンパク質を可視化した。
【００８３】
結果
ウイルス産生に及ぼすTsg101欠損の影響
実施例1は、Tsg101が、感染細胞からの成熟ウイルス粒子のエキソサイトーシスを導く領域であるHIV-1 Pr55 Gagp6中のLドメイン（Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G. & Haseltine, W. A., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88,3195-3199; Huang, M., Orenstein, J. M., Martin, M. A. & Freed, E. O., 1995, J. Virol. 69,6810-6818）と特異的に結合することを示している。ウイルス産生におけるこの相互作用の役割を調べるために、ウイルス粒子の放出に及ぼすtsg101発現のモジュレーションの影響を判定した。初期アプローチとして、Tsg101発現がアンチセンス法（Li, L. & Cohen, S. N., 1996, Cell 85, 319-329）により正常レベルの約30％にまで低下しているNIH 3T3由来細胞系（SL6）においてウイルスの産生を調べた。
【００８４】
これらの実験のために、Gagと、NefおよびEnv以外のその他のすべてのウイルスタンパク質とを、pHIV-APΔenv（Sutton, R. E., Wu, H. T., Rigg, R., Bohnlein, E. & Brown, P. O., 1998, J. Virol. 72,5781-5788）から発現させ、培地内に放出されたウイルス粒子をウェスタンブロット法により評価した。pHIV-APΔenvは、nef遺伝子の代わりにヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子を含有し、env遺伝子が欠失している。特定の細胞画分マーカーの全タンパク質染色およびウェスタンブロット分析により測定して、コンフルエンシーの程度に合致した細胞培養物が得られるよう、増殖条件を確認した。対照実験においては、Fugene6試薬を使用してSL6が3T3と同じ効率でトランスフェクトされたことを確認する。トランスフェクトされた親および突然変異細胞の合致した培養物から調製された、互いの+/- 0.01μg以内の全タンパク質値を示す細胞質（S1）抽出物は、同じクーマシーブルー染色タンパク質パターン（図5A、レーン1、2）、ならびにNa+K+ATPアーゼおよびアクチンの比較可能な発現（レーン3、4）を示した。これに対して、SL6細胞は、既に報告されているとおり、抗Tsg101モノクローナル抗体を使用する比較半定量的ウェスタン分析により測定したときに親細胞のレベルの約30％のTsg101を蓄積した。
【００８５】
3T3およびSL6細胞における細胞結合Gagタンパク質の分析
Gagの細胞内蓄積に及ぼすTsg101欠損の影響を判定するために、トランスフェクト細胞を分画遠心分離に付し、ウイルスタンパク質の量をS1ライセートおよび細胞画分において評価した。擬似処理細胞には含まれていなかったが、トランスフェクト3T3細胞から調製したS1ライセートは、細胞膜に富むP100画分中に蓄積した（図5Cの挿入図）成熟CAタンパク質を含有していた（図5C、レーン1、2）。この画分は、内在性膜タンパク質であるNa+K+ATPアーゼの局在化により同定された（例えば、L. Alland, S. M. Peseckis, R. E. Atherton, L. Berthiaume & Resh, M. D., 1994, J. Biol. Chem. 269,16701-16705を参照されたい）。これに対して、擬似処理SL6細胞またはトランスフェクトSL6細胞から調製したS1画分には、成熟CAがまったく検出されなかった（図5C、レーン3、4）。Gag前駆体を認識する抗体を使用する、SL6細胞からのS1およびP1画分の更なる分析は、これらの未処理SL6細胞またはトランスフェクトSL6細胞から調製したS1画分中にウイルス特異的タンパク質が存在しないことを証明した（図5D、レーン1、2）。これとは対照的に、該抗体は、繊維状アクチンタンパク質、ゴルジ複合体タンパク質および核タンパク質に富むP1画分中に完全長Gag前駆体を明らかにした（レーン4）（例えば、L. Alland, S. M. Peseckis, R. E. Atherton, L. Berthiaume & Resh, M. D., 1994, J. Biol. Chem. 269,16701-16705を参照されたい）。これらの結果は、SL6細胞におけるウイルス放出の阻止が、細胞膜へのGag前駆体の輸送の欠陥（通常は、細胞膜においてそれが集合する）から生じたことを示唆しており、したがって、このことから、Tsg101はこの輸送機能に関連づけられる。
【００８６】
HIV-1粒子の放出に及ぼすTsg101過剰産生の影響
Tsg101タンパク質の定常状態レベルは、タンパク質分解を含む翻訳後機構により、細胞増殖中は狭い範囲内に維持される（Feng, G. H., Lih, C.-J., & Cohen, S. N., 2000, Cancer Research 60,1736-1741）。FLAGタグ付きTsg101タンパク質の過剰発現は、内因性およびFLAGタグ付きの両タンパク質の代謝回転を促進させる（Feng, G. H., Lih, C.-J., & Cohen, S. N., 2000, Cancer Research 60,1736-1741）。pIND-h-Tsg101-FLAG構築物（Feng, G. H., Lih, C.-J., & Cohen, S. N., 2000, Cancer Research 60, 1736-1741）の使用は、ショウジョウバエ（Drosophilia）エクジソン応答性DNAエレメントを含有する修飾プロモーターの制御下でのFLAGタグ付きTsg101の誘導性発現を可能にする。エクジソン類似体である誘導物質プロナステロン（以下、「pa」という）を使用する予備的実験においては、内因性タンパク質の定常状態レベルの大きな変動を伴うことなくFLAGタグ付きTsg101を過剰産生させる条件を確認した。図6Aに示すとおり、抗Tsg101抗体を使用するウェスタン分析は、予想された約46kDaの位置に移動する内因性タンパク質のバンドと、より遅く移動する漸増量のタンパク質とを検出した。8残基のFLAG配列に対する抗体で該ブロットを再プローブすることにより、より遅く移動するタンパク質は、該タンパク質をコードする誘導プラスミドの発現に由来するFLAGタグ付きTsg101であることが確認された。
【００８７】
既に示されているとおり、プラスミドpgp-RRE-rは、COS細胞内でHIV-1調節タンパク質Revと共に発現されると、成熟HIV-1とは区別できないウイルス様粒子の集合および放出を可能にする（Smith, A. J., Cho, M. I., Hammarskjold, M. L. & Rekosh, D., 1990, J. Virol. 64,2743-2750, Ebbets-Reed, D., Scarlata, S. & Carter, C. A. Biochem. 35,14268-14275）。本発明者らが観察したTsg101関連効果の特異性を確実なものとするために、HIV-1 GagΔp6突然変異体を平行して調べた。突然変異Gagタンパク質は、（i）Tsg101に結合するp6ドメインを欠き、（ii）タンパク質分解性成熟を完結できない粒子を集合させ、（iii）非効率的に放出される（実施例1; Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G. & Haseltine, W. A., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88, 3195-3199; Huang, M., Orenstein, J. M., Martin, M. A. & Freed, E. O., 1995, J. Virol. 69, 6810-6818を参照されたい）。GagΔp6を含有する粒子は、細胞質中および培地中の蓄積を比較することにより測定した場合に、野生型の50％の効率で放出されることが判明した。一定量のpIND-h-Tsg101-FLAG DNA、rev、polおよびgagまたはgagΔ6でトランスフェクトされた細胞に誘導物質paを0、1および5μMで加え、ウイルス様粒子に関して培地を調べることにより、ウイルス粒子の放出に及ぼす漸増量のTsg101の影響を調べた。予想どおり、revだけを発現する細胞からはウイルス特異的タンパク質は放出されなかった（図6B、レーン1）。0μMのpaで処理した細胞から放出されたウイルス粒子は、予想されるバンドの成熟CAタンパク質を含有していた（レーン2）。1または5μMのpaで処理した細胞から放出されたウイルスは、同じ成熟CA組成物を示したが、その量は対照（0μMのpa）レベルのそれぞれ約60％および約30％に低下した（それぞれレーン3および4）。pIND-h-Tsg101-FLAGの非存在下での5μMのpaの添加は抑制効果を示さなかった。トランケート型GagΔp6前駆体タンパク質およびMA-CAと同定されたバンドを含有する未成熟粒子の放出は、Tsg101の過剰発現によっては有意には影響されず、実質的に不変のままであった（レーン5〜7）。これらの結果は、Tsg101の細胞内レベルの増加が野生型Pr55Gag粒子の放出を妨げたこと、およびこの抑制がGag中のインタクトのp6ドメインの存在を必要としたことを示している。
【００８８】
Tsg101 SBドメインの成熟の効果
総合すると、前記の結果は、Tsg101の欠損および過剰産生の両方が成熟ウイルス粒子の放出を妨げうることを示唆した。しかし、過剰発現されたFLAGタグ付きTsg101タンパク質が、正常な輸送を妨げるドミナントネガティブインヒビターとして作用している可能性があった。前記のとおり、C末端に位置するSBドメインは、Tsg101タンパク質の分解に影響を及ぼすことにより、翻訳後にTsg101の定常状態レベルを調節する（Feng, G. H., Lih, C.-J., & Cohen, S. N., 2000, Cancer Research 60,1736-1741）。最近得られた証拠は、26Sプロテアソームがこの過程に関与していることを示している（Li, L., Liao, J., Ruland, J., Mak, T. W., & Cohen, S. N., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,1619-1624）。Tsg101の過剰発現の際のウイルス粒子の放出における観察された低下は、自己調節に関連した事象によるTsg101結合Gagタンパク質の偶発的な分解から生じうると仮定される。この見解は、SB領域中で突然変異してTsg101自己調節に欠陥があるTsg101タンパク質の過剰発現がウイルスの放出の抑制を招くはずがないことを予想させるものである。Tsg101突然変異SD5-59タンパク質は、SBドメイン中の4個のアミノ酸（残基348-351）がグリシン残基により置換された高度に局在化した突然変異を含有し、その結果、Tag101タンパク質をダウンレギュレーションするその能力に一部欠陥がある（Feng, G. H., Lih, C.-J., & Cohen, S. N., 2000, Cancer Research 60,1736-1741）。ウェスタンブロット分析は、誘導物質paの添加後に又は漸増量の突然変異Tsg101-FLAG DNAのトランスフェクションに応答して、このタンパク質が蓄積することを証明した（図7A）。
【００８９】
前記突然変異体ならびにrev、polおよびgagまたはgagΔ6でトランスフェクトされたCOS細胞にpaを0、1および5μMで加え、ウイルス様粒子に関して培地を調べることにより、ウイルス粒子の放出に及ぼす漸増量のSD5-59の影響を検討した。予想どおり、revだけを発現する細胞からはウイルス特異的タンパク質は放出されなかった（図7B、レーン1）。前記の結果（図6B、レーン2）と一致して、0μMのpaで処理した細胞から放出された粒子は成熟ウイルス粒子のCA組成物を示した（レーン2）。Tsg101の自己調節に関連した事象がウイルスの産生を妨げるという仮説と一致して、漸増量のSD5-59突然変異タンパク質（これは調節において非効率的である）の発現はウイルス粒子の放出を可能にした（レーン3、4）。しかし、驚くべきことに、突然変異Tsg101タンパク質の発現は、粒子と結合した未切断Gag前駆体の蓄積をも引き起こした。一方、GagΔp6により集合した粒子は、野生型tsg101が過剰発現された場合に検出されたものと同一であった（レーン5〜7）。Tsg101突然変異体の過剰発現が、プロセシングされていないGagを含有する粒子の放出を引き起こしたという観察は、該突然変異が、正常なウイルス放出を可能にするものの、ウイルス放出とGagプロセシングとの通常の結びつきを切り離したことを示唆している。
【００９０】
aa348-351の欠失は、GagとTsg101との相互作用に影響を及ぼすとは予想されない。なぜなら、GagへのTsg101中の結合部位はN末端のUb E2変異体（UEV）ドメイン内に存在するからである。残基348-351を欠くC末端トランケート型タンパク質は、ツーハイブリッドアッセイにおいて、無傷のタンパク質と同等の効率でGagp6に結合する。図8に示すとおり、抗p6抗体を使用するウェスタン分析は、Gagp6前駆体およびNC-p6切断産物が、gagと2μgの野生型または突然変異型tsg101 DNAとでトランスフェクトされた誘導細胞から調製された細胞質抽出物中に蓄積することを示した（図8A、レーン3、4）。抗Tsg101抗体は、それらの2つの抽出物において、比較可能な程度に該ウイルスタンパク質を免疫沈降させたが（図8B、レーン3、4）、このことは、外因性タンパク質の発現が、Tsg101に結合したGagの量を変化させなかったことを示している。FLAGタグ（図8C）または完全長Tsg101タンパク質（図8D）に対する抗体で該ブロットを再プローブすることにより、免疫沈降物中に外因性（FLAGタグ付き）および天然Tsg101タンパク質が存在することが確認された（レーン1〜4）。これらの結果は、Gag放出に及ぼすSD5-59突然変異の影響の欠如がTsg101-Gag相互作用の廃止によるものではなかったことを示している。
【００９１】
野生型Tsg101タンパク質の過剰発現によるウイルス粒子の放出の抑制が、Tsg101の自己調節に関連した事象から生じるという仮説を更に検証するために、放出に対する最大効果が検出される条件下でのウイルスタンパク質の定常状態レベルを評価した。図9Aに示すとおり、gag、polおよびrevでトランスフェクトされているが外因性tsg101ではトランスフェクトされていない対照細胞は、抗CA抗体を使用するウェスタン分析により示されるように、S1およびP1の両方の画分において、高レベルのウイルスタンパク質を蓄積した（レーン2、4）。これに対して、最大抑制をもたらす条件下でgag、pol、revおよび野生型tsg101-FLAG DNAでトランスフェクトされた細胞（図6B、レーン4を参照されたい）は、S1またはP1画分中に、検出可能なウイルスタンパク質を含有していなかったが、このことは、ウイルスタンパク質の著しい分解が生じたことを示唆している（図9B、レーン1、3）。S1およびP1の両方の画分においてGag Δp6が検出されたため（レーン2、4）、この効果はGagのp6ドメインを必要としたことになる。同じ条件下、野生型Tsg101タンパク質の代わりにSD5-59突然変異体を発現する細胞は、S1画分においては検出可能なレベルのウイルスタンパク質を蓄積したが（パネルC、レーン1）、P1画分においてはタンパク質は見出されなかった（レーン3）。これに対して、GagΔp6は、両方の画分において、より高いレベルで蓄積した（レーン2、4）。これらの結果は、Tsg101自己調節機構が細胞内Gagの定常状態レベルに影響を及ぼすという仮説を支持している。
【００９２】
考察
本実施例においては、Tsg101の過少または過剰発現によるTsg101の定常状態レベルの変動が、マウス細胞および霊長類細胞からの成熟HIV-1ウイルス様粒子の放出にマイナスの影響を及ぼしたことが示されている。Tsg101の定常状態タンパク質レベルのTsg101媒介翻訳後自己調節に関与しているTsg101 SB領域の突然変異は、p6ドメインの突然変異と同様に、ウイルス粒子の放出を阻止する過剰発現Tsg101の能力を低下させた。これらの結果は、HIV-1ウイルス粒子の産生を、成熟ウイルスの排出を制御するGag Lドメインに結合する細胞性タンパク質（すなわち、Tsg101）に直接的に関連づけるものであり、Gag-Tsg101相互作用がHIV-1増殖において特異的かつ重大な役割を果たしているという有力な証拠を提供するものである。マウス（SL6）細胞および霊長類（COS）細胞の両方におけるTsg101の発現のモジュレーションがウイルスの放出に影響を及ぼしたということは、Tsg101が多様な細胞内環境中のHIV-1ウイルス集合における重要な補因子であることを示している。
【００９３】
SBドメインにおいて突然変異したTsg101タンパク質の過剰発現が、タンパク質分解によりプロセシングされていないGagを含有するウイルス粒子の放出をもたらしたという観察は、ウイルス粒子の放出に関連したGagタンパク質の成熟にTsg101が関与していることを示している。成熟ビリオンの放出に及ぼすTsg101の影響は、エンドサイトーシス経路の、提案されているTsg101の調節（Lemmon, S. K. & Traub, L. M., 2000, Curr. Opin. Cell Biol. 12,457-466）の結果であるかもしれない。興味深いことに、自己調節機構を部分的に不活性化するSD5-59の突然変異は、もう1つのエンドサイトーシスソーティングタンパク質であるVps28（Bishop NおよびWoodman P., 2001, J Biol Chem. 276: 11735-42）［これは、細胞膜とエンドサイトーシス小胞との間のタンパク質の輸送において機能する複合体中にTsg101と共に含まれる（Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J. & Emr, S. D., 2000, Traffic 1,242-258）］との相互作用に必要とされる領域内に存在する。
【００９４】
もしかすると、SD5-59突然変異は、エンドサイトーシスソーティング機構からTsg101を切り離して、Gagがプロセシング部位を迂回して未切断形態で放出されるようにしたのかもしれない。この可能性は、Tsg101には結合せず従って該機構には関与しないGagΔp6突然変異体も、プロセシングされない形態で放出されるという観察により支持される。
【００９５】
この点に関して、tsg101欠損SL6細胞が、リソソーム加水分解酵素カテプシンDのソーティングおよびタンパク質分解性成熟に欠陥［これは、該酵素がリソソーム中のプロセシング部位へ運搬されないことによると推定される（Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J. & Emr, S. D., 2000, Traffic 1,242-258）］を示したことは注目に値する。また、本実施例の結果は、Tsg101欠損を、Gag前駆体のそれらの正常な細胞膜成熟部位への欠陥のある輸送と関連づけるものである。本発明者らが観察したとおり、SL細胞におけるGag輸送の欠陥は、膜出芽部位で利用可能なGag前駆体のプールを制限して、放出される粒子の量を減少させうる。p6を欠くGagは、それがあまり効率よく放出されなくとも、該膜と効率的に結合するため（例えば、Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G. & Haseltine, W. A., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88,3195-3199を参照されたい）、特異的プロセシング部位または膜画分への輸送（膜局在化それ自体ではない）が、正常なレベルの天然Tsg101タンパク質を必要とするGag関連事象なのかもしれない。あるいは、タンパク質分解プロセシングはウイルスプロテアーゼ含有Gag-Pol前駆体を必要とするため（Swanstrom, R. & Wills, J. W., 1997, in Retroviruses, Coffin, J. M., Hughes, S. H. & Varmus, H. E.編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, pp. 263-334）、SD5-59突然変異体により媒介されるタンパク質分解プロセシングの効率の変化は、Gag-Pol（p6を欠く）ではなくGagp6に対するTsg101の示差的（differential）効果を反映しているのかもしれない。いずれにせよ、Tsg101をエンドサイトーシス機構から切り離したと考えられる突然変異が、COS-1細胞内に集合した粒子においてタンパク質分解プロセシングの効率を低下させたことは、HIV-1 Gagのタンパク質分解性成熟および放出を、エンドサイトーシス機構におけるタンパク質の適切な機能に関連づけるものである。おそらく、推定プロセシング画分または示差的（differential）輸送事象（その存在が本発明者らの結果により示唆される）には、プロテアソームが間接的に関与している。なぜなら、プロテアソームインヒビターはTsg101の細胞媒介分解（Li, L., Liao, J., Ruland, J., Mak, T. W., & Cohen, S. N., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,1619-1624）およびGagのウイルスプロテアーゼ媒介プロセシング（Schubert, U., Ott, D. E., Chertova, E. N., Welker, R., Tessmer, U., Princiotta, M. F., Bennink, J. R., Krausslich, H. G. & Yewdell, J. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13057-13062）を妨げることが判明したからである。
【００９６】
Tsg101によるウイルス放出の制御に関して、これらの結果は、Tsg101の定常状態レベルと成熟ウイルスの放出の効率とが密接に関連していることを示唆している。Tsg101の欠損および過剰産生は、類似した結果、すなわち、細胞膜に富むS1画分中のGag蓄積の減少を引き起こした。本実施例は、Tsg101の過剰発現がGagの見かけ上の分解と相関していること、およびSD5-59突然変異タンパク質の抑制効果の減少が、Tsg101の自己調節により課されるGagへの影響低下と関連していることを示している。興味深いことに、これらの実験条件下、Gagは、外因性tsg101遺伝子の過剰発現により、内因性Tsg101タンパク質より遥かに大きな影響を受けた。この観察は、Tsg101に結合するGagの形態が多量体であること、および該多量体中のサブセット分子とTsg101との相互作用が、Gagの蓄積および放出に対する観察された抑制効果を誘導するのに十分なものであることを示唆している。これは、効率的な粒子放出には、各Gag分子がLドメイン（実施例1に示すようにGag中のTsg101の結合部位）を有することを必要としないという従来の観察（Wills, J. W., Cameron, C. E., Wilson, C. B., Xiang, Y., Bennett, R. P. & Leis, J., 1994, J. Virol. 68, 6605-6618）と一致しているようである。こうした観察はまた、Tsg101分子の亜集団のみがGagと増殖性複合体を形成しうることを示唆しているのかもしれない。なぜなら、成熟ウイルスの産生の抑制は、野生型FLAGタグ付きTsg101タンパク質の、より著しい蓄積により増強されたからである。最近得られた証拠は、Tsg101が、UbリガーゼであるMdm2（Li, L., Liao, J., Ruland, J., Mak, T. W., & Cohen, S. N., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,1619-1624）およびNedd4と相互作用しうることを示している。これらの酵素は、エンドサイトーシス機構により輸送されることになる基質をモノユビキチン化し（Shih, S. C., Sloper-Mould, K. E. & Hicke, L., 2000, EMBO. J. 19,187-198）、また、プロテアソーム分解が意図される運搬物（cargo）（これはおそらく、過剰産生された場合のTsg101自体を含むであろう）をポリユビキチン化する（Hershko, A. & Ciechanover, A., 1998, Annu. Rev. Biochem. 67,425-479）。Tsg101がUbリガーゼと協同的に機能するという見解は、Ub機構をLドメインの機能およびウイルスのエキソサイトーシスに関連づける研究により裏付けられている（Schubert, U., Ott, D. E., Chertova, E. N., Welker, R., Tessmer, U., Princiotta, M. F., Bennink, J. R., Krausslich, H. G. & Yewdell, J. W., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13057-13062, Strack, B., Calistri, A., Accola, M. A., Palu, G. & Gottlinger, H. G., 2000, Proc. Natl. Acad Sci. USA 97,13063-13068; Patnaik, A., Chau, V. & Wills, J. W., 2000, Proc. Natl. A Cad. Sci. USA 97,13069-13074; Ott, D. E., Coren, L. V., Chertova, E. N., Gagliardi,. T. D. & Schubert, U., 2000, Virology 278, 111-121; Vogt, V. M., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,12945-12947）。Tsg101とUbリガーゼとの相互作用は、集合しつつあるGag粒子にこれらの酵素を接近させうる。Gagは、輸送と分解を促進する厳密なTsg101媒介制御を必要とするのかもしれない。
【００９７】
Tsg101がGagの輸送を厳密にどのように媒介しうるのかは明らかではない。おそらく、Tsg101は、エキソサイトーシスを調節する膜結合型の細胞性タンパク質の輸送を制御するのであろう。また、Tsg101が調節すると考えられているソーティング多重小胞体（multi vesicular body: MVB）の形成に関連した陥入事象(invagination event)（Lemmon, S. K. & Traub, L. M., 2000, Curr. Opin. Cell Biol. 12,457-466）が、ウイルス出芽（この場合は、小胞形成が細胞質から離れて方向づけられる）以外では、細胞における唯一の例であることは、注目に値する。したがって、Gagは、Tsg101との相互作用を介して、ソーティングMVBの形成を決定づける他のvpsホモログと結合する可能性があり、ウイルス粒子を含有する小胞の細胞外への陥入を該機構に導かせるのかもしれない。この方法が実際に該ウイルスに特有のものであれば、該相互作用の必要条件が、HIV増殖を妨げることができる標的となりうる。
【００９８】
7．引用参考文献
本明細書中に引用されている全ての参考文献は、各個の刊行物または特許または特許出願の全体が全ての目的において参照により本明細書に組み入れられると明示的かつ個々に示されているのと同等に、それらの全体が全ての目的において参照により本明細書に組み入れられる。
【００９９】
当業者には明らかなとおり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多数の修飾および変更を施すことが可能である。本明細書に記載の具体的な実施形態は例示として記載されているにすぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲の文言ならびにその特許請求の範囲に含まれる均等物の全範囲により限定されるにすぎない。
【０１００】
配列番号１：
2005500825.tif 000004
【０１０１】
配列番号２：
2005500825.tif 000005
【０１０２】
配列番号３：
PTAPP                                                                        5
配列番号４：
ALQSRPEPTA PPEES                                                            15
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ−１Ｂ】ツーハイブリッドアッセイを用いた、Tsg101結合に必要とされるPr55Gag中の領域の同定を示した図である。
【図２Ａ−２Ｂ】PR55GagとTsg101とのin vitro結合を示した図である。
【図３Ａ−３Ｃ】細胞質抽出物由来のPR55GagとTsg101との共免疫沈降を示した図である。
【図４Ａ−４Ｃ】Pr55Gag結合に必要とされるTsg101中の領域の同定を示した図である。
【図５Ａ−５Ｄ】ウイルスの産生および細胞局在に及ぼすTsg101欠損の影響を示した図である。
【図６Ａ−６Ｂ】HIV-1粒子の放出に及ぼす野生型Tsg101の過剰発現の影響を示した図である。
【図７Ａ−７Ｂ】HIV-1粒子の放出に及ぼす突然変異Tsg101の過剰発現の影響を示した図である。
【図８Ａ−８Ｄ】抗Tsg101抗体による細胞質抽出物中のウイルスタンパク質の免疫沈降を示した図である。
【図９Ａ−９Ｃ】ウイルスタンパク質の細胞内定常状態レベルに及ぼすTsg101過剰発現の影響を示した図である。
【図１Ａ−１Ｂ】
2005500825.tif 000006
【図２Ａ−２Ｂ】
2005500825.tif 000007
【図３Ａ−３Ｃ】
2005500825.tif 000008
【図４Ａ−４Ｃ】
2005500825.tif 000009
【図５Ａ−５Ｄ】
2005500825.tif 000010
【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｄ】
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【図９Ａ−９Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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2005500825.tif 000080
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【国際調査報告】
2005500825.tif 000082
2005500825.tif 000083