(57)【要約】本発明は、ヒト細胞表面受容体タンパク質（ＨＣＳＲＰ）並びにＨＣＳＲＰを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明はＨＣＳＲＰの発現に関わる疾患の診断、治療又は予防の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３及びそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有する実質的に精製された変異体。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列。
【請求項５】
ストリンジェントな条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプルの少なくとも１つの核酸とハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が前記サンプルにおけるポリヌクレオチドの存在と相関性を有するような検出過程とを含むことを特徴とする検出方法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６及びそれらの断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９のポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
【請求項１１】
請求項９のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
ポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１３の宿主細胞を培養する過程と、
（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
適切な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む医薬品組成物。
【請求項１６】
請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
【請求項１８】
請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
【請求項１９】
ＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防の方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１５の医薬品組成物を投与する過程を含む方法。
【請求項２０】
ＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療又は予防の方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１８のアンタゴニストを投与する過程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヒト細胞表面受容体タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、並びに細胞増殖障害、免疫系異常、感染症及び神経細胞障害の診断、治療及び予防におけるこれらの配列の利用法に関するものである。
【０００２】
発明の背景
用語「受容体」は、他の分子を特異的に識別するタンパク質を説明するものである。そのカテゴリーは広く、多くの機能を備えたタンパク質を含む。受容体の大部分は、細胞外配位子と結合し、成長、分化、エンドサイトーシス、エキソサイト、及び免疫の各反応の領域に於ける細胞反応を産出する細胞表面タンパク質である。細胞表面受容体の機能の中心となるのは、特異的な機能的ドメインを介した、その他のタンパク質若しくは配位子との密着若しくは結合の能力である。
【０００３】
細胞表面の受容体は、典型的な必須原形質膜タンパク質である。これらの受容体は、カテコールアミン；ペプチドホルモン；成長因子及び分化因子；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン等の小ペプチド因子；ガラニン、ソマトスタチン及びタキキニン；並びに循環系−骨格シグナル伝達分子等のホルモンを識別する。免疫系細胞の細胞表面受容体は、抗原、抗体、及び主な組織適合複合体（ＭＨＣ）結合ペプチドを認識する。その他の細胞表面受容体は、細胞によって内面化されるために配位子と結合する。この受容体媒介エンドサイトーシスは、低濃度のリポプロテイン（ＬＤＬ）、トランスフェリン、グルコース若しくはマンノース末端糖タンパク質、ガラクトース末端糖タンパク質、免疫グロブリン、ホスホビテロゲニン、フィブリン、蛋白質分解酵素阻害剤複合体、プラスミノゲン活性化剤、及びトロンボスポンジンの取り込みに機能する。（Ｌｏｄｉｓｈ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐ． ７２３： ａｎｄ Ｍｉｋｈａｉｌｅｎｋｏ． Ｉ． ｅｔａｌ． （１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：６７８４−６７９１）．
成長修飾物質αトロンビンは勿論のこと、上皮成長因子、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子に対する受容体を含めた多くの成長因子受容体は、内因性プロテインキナーゼ活性を含む。成長因子が受容体と結合するとき、受容体上のセリン、トレオニン、若しくはチロシン残基の自己リン酸化を引き起こす。これらのリン酸化部位は、その他の原形質のシグナル伝達タンパク質の結合の為の認識部位である。これらのタンパク質は、最終的に細胞表面に於ける初期的受容体活性と特異的な細胞内標的分子の活性とを結びつけるシグナル伝達経路に関係する。チロシン残基自己リン酸化の場合、これらのシグナルタンパク質は、ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインとして引用されるような通常のドメインを有する。ＳＨ２ドメインは、多様なシグナル分子、及びホスホリパーゼＣ−ｙの様な発癌性のタンパク質中に於いて見られる。
【０００４】
Ｇ−タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）
Ｇ−タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）は、原形質膜に広がり非平衡のαへリックスの束を形成する７つの疎水性膜貫通ドメインの存在によって特徴付けられた不可欠な膜ドメインである。これらのタンパク質は４００よりも少ないアミノ酸から１０００を越えるアミノ酸までその大きさに幅を有する（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ． Ａ．Ｄ． （１９９１） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９６：１−１０： Ｃｏｕｇｈｌｉｎ． ＳＲ． （１９９４） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６：１９１−１９７）。ＧＰＣＲのアミノ末端は細胞外にあり、様々な鎖長を有し、多くの場合はグリコシル化されている。カルボキシ末端は細胞質内にあり、通常はリン酸化されている。ＧＰＣＲの細胞外ループは、細胞内ループと互い違いとなり、膜貫通ドメインに結合されている。ＧＰＣＲの最も保護された領域は、膜貫通ドメインであり、最初の２つの細胞質ループである。膜貫通ドメインは、受容体の構造的機能的特色を説明する。ほとんどの場合、αループの束は結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）の形態を取る。加えて、細胞外Ｎ末端セグメント、若しくは３つの細胞外ループのうち一つ若しくはそれ以上は、また配位子結合に関係し得る。配位子結合は、受容体の細胞内部分に於ける構造変化の誘発により受容体を活性化させる。活性化された受容体は、結果として、細胞内ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合（Ｇ）タンパク質複合体と相互に干渉する。前記複合体は、一般的にはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、ホスホリパーゼＣ、イノシトール三リン酸若しくはイオンチャンネルタンパク質のような第二のメッセンジャーの生産である細胞内シグナル活性を更に仲介する。（Ｂａｌｄｗｉｎ， ＪＭ． （１９９４） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６：１８０−１９０）
ＧＰＣＲの一つのグループは、ホルモン、神経伝達物質、及び光を含む種々の特性の細胞外シグナルを伝えるロドプシン様ＧＰＣＲである。ロドプシンは脊椎動物の目における感光性のＧＰＣＲである。動物の網膜に見られるＧＰＣＲの保存されたサブファミリーを定義するロドプシンは、約３５０のアミノ酸の鎖長を有する。脊椎動物では、ロドプシン分子は、光受容体（杆状）細胞に見られる膜の積み重ね中に埋め込まれる。各ロドプシン分子は、原形質膜のナトリウムチャンネルの閉鎖を導く、ｃＧＭＰのレベルの減少を誘引することで光の光子に応答する。この方式で、映像信号は神経インパルスへと転換される。その他のロドプシン様ＧＰＣＲは、神経伝達物質に応じて直接的に関係させられる。これらのＧＰＣＲはアドレナリン（アドレナリン受容体）、アセチルコリン（ムスカリン様受容体）、アデノシン、ガラニン、及びグルタミン酸塩（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルターゼ／ＮＭＤＡ 受容体）の受容体を含む。（Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｗａｔｓｏｎ． Ｓ． ａｎｄ Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ， Ｓ． （１９９４） Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ｐｐ． ７−９． １９−２２． ３２−３５． １３０−１３１． ２１４−２１６ ２２１−２２２． Ｈａｂｅｒｔ−Ｏｒｔｏｌｉ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：９７８０−９７８３．）
ソマトスタチン受容体４型はロドプシン様ＧＰＣＲのその他の例である。それは、下垂体前葉よりの成長ホルモンの分泌を抑制するテトラペプチドであるソマトスタチンの複数の高親和性受容体の一つである。特定のソマトスタチンの発現は、特異的な内分泌腫瘍に於ける薬物療法の効能との関係を持ってきた。
【０００５】
その他のロドプシン様ＧＰＣＲは、心血管及び免疫反応を含む種々の生理学的機能を仲介するための、プロスタグランジンの様なプロスタノイドを認識するプロスタノイドＥＰ１受容体である。ＥＰ１受容体は、平滑筋の収縮及び弛緩の役割を果たし、ホスホイノシチド経路を活性化させうる。（Ｗａｔｓｏｎ． 前出 ｐｐ． ２３９−２５１）プロスタノイドＤＰ受容体は、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）に特異的な別のロドプシン様ＧＰＣＲである。ＤＰ受容体の発現は、哺乳動物の脳及び目の組織部分に制限されてきた。また活性化に於いて細胞内ｃＡＭＰ及びＣａ２＋可動化の向上を促進するが、イノシトール１，４，５−３リン酸塩を生成することはない。（Ｂｏｉｅ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：ｌ８９ｌ０−１８９ｌ６； Ｇｅｒａｓｈｃｈｅｎｋｏ． Ｄ． ｅｔ．ａｌ． （１９９８）Ｊ， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ７１：９３７−９４５）
更に別のロドプシン様ＧＰＣＲは、エンドセリンを介した心血管系調整の役割を果たすエンドセリン受容体である。エンドセリンは、腎臓、肝臓、及び副腎の様な組織に於ける分泌を刺激するのは勿論のこと、心臓及び平滑筋の収縮も刺激しうるような効力のある血管収縮薬である。エンドセリン受容体は脳中に於いても役割を果たしうる。また脳中に於いて発見されもする。加えて、エンドセリンがストレスのような 異常病態生理学条件と関連しうる事は明白である。（Ｗａｔｓｏｎ， 前出 ｐｐ． １１１−１１６）．
セクレチン受容体は、膵臓及び小腸に於いて酵素及びイオンの分泌を刺激するペプチドホルモンであるセクレチンに反応する特異的なＧＰＣＲの一例である。（Ｗａｔｓｏｎ，前出ｐｐ． ２７８−２８３）セクレチン受容体は約４５０のアミノ酸からなる鎖長を有し、胃腸細胞の原形質膜に見られる。受容体に対するセクレチンの結合は、ｃＡＭＰの生成を刺激する。セクレチン受容体のファミリーの例外的なメンバーは、神経外胚葉のｃＤＮＡライブラリから同定されてきた。（Ｂａｕｄ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６：３３４−３４４）この受容体ＥＭＲ１（ＥＧＦ様、ムチン様ホルモン受容体）は、８８６のアミノ酸からなる鎖長を有し、セリン／スレオニンに富む領域が続くＮ−末端における６つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様分子を含む。後者の特色は、ムチン様必須膜粘着性タンパク質の特徴である。
【０００６】
免疫反応に於いて機能するその他のＧＰＣＲが同定されている。例えば、ＧＰＣＲの新規な亜科がヒト単核白血球（ＨＭ）ｃＤＮＡライブラリより同定された。（Ｎｏｍｕｒａ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：１２３９−１２４９）これらＧＰＣＲのほとんどは、サイトカインやその他の白血球シグナル分子と結合しがちである。その様なＧＰＣＲの一つであるＨＭ７４は、Ｎ−末端にＮ−グリコシレーション部位が含まれ無いという点でとりわけ異常である。
【０００７】
トロンビン受容体（ＴＲｓ）は、ＧＰＣＲ活性を有し、配位子αトロンビンによって活性化される。ＴＲ媒介シグナル伝達経路を介して、αトロンビンは培養単核細胞及び内皮細胞におけるＩＬ−８及びＩＬ−６の生成を誘導する。（Ｊｏｈｎｓｏｎ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０：５１３０−５１３５）逆に、αトロンビンはチャイニーズハムスター肺線維芽細胞中の白血病抑制因子及び神経栄養因子であるＩＬ−６の活動を阻害する。（Ｂｈａｔ． Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３５０：３０７−３１４）加えて、αトロンビンがＴＲと結合する時、それは受容体のＮ−末端より４０のアミノ酸をタンパク分解性に切り離す。切り離されたペプチドは、トロンビン受容体アゴニストペプチドと名付けられ、トロンビン誘導シグナルの潜在能を増加させる目的でＴＲの束縛配位子として働く。（Ｈｏｕ． Ｌ． Ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ． ３３：２０５−２１１： Ｊｏｈｎｓｏｎ． ｅｔ ａｌ． 前出）
機能若しくは構造的活性化の低下を引き起こしうるＧＰＣＲ変異は、多くのヒトの疾患と関わりを持ってきた。（Ｃｏｕｇｈｌｉｎ． 前出）例えば、色素性網膜炎はロドプシン遺伝子の変異より発生する。Ｐａｒｍａ．Ｊら（１９９３． Ｎａｔｕｒｅ ３６５：６４９−６５１）は、甲状腺刺激ホルモン受容体に於ける体性活性変異が機能亢進の甲状腺腺腫を引き起こすことを報告しており、また構成的活性化を受けやすいあるＧＰＣＲが癌原遺伝子として振る舞いうる事を示唆している。
サイトカイン受容体
サイトカインは、免疫系及び炎症性反応を調節するシグナル分子のファミリーである。サイトカインは、一般的に外傷若しくは感染症に応じて白血球によって分泌される。しかし、他の組織は疾患若しくはその他の生理学的混乱に応じてサイトカインを分泌することが可能である。サイトカインは、本来リンパ球、単核白血球、及び顆粒白血球の様な免疫系の細胞上で働く、成長及び分化の要素として機能する。その他のシグナル分子のように、サイトカインは、遺伝子の発現、細胞の増殖、及び細胞の分化を調節する、特徴的な原形質膜受容体及びトリガー細胞内シグナル伝達経路と結合する。
【０００８】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、白血球の代わりに腎臓や肝臓で生成される異常サイトカインである。ＥＰＯは、赤血球へと分化する目的で赤血球前駆物質を刺激する。ＥＰＯはまた、血小板の生成も刺激する。ＥＰＯ受容体は、約５００のアミノ酸からなる、シグナル伝達膜貫通タンパク質であり、その細胞内ドメインはＪＡＫ２キナーゼと関連する。活性化されたＥＰＯ受容体は、遺伝子転写及びマイトジェネシスを誘発するＪＡＫ２のリン酸化反応活性を刺激する。（Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｃａｌｌａｒｄ． Ｒ． ａｎｄ Ｇｅａｒｉｎｇ， Ａ． （１９９４） Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ． ＣＡ． ｐｐ．１１４−１１８．）
免疫グロブリンドメイン受容体
免疫系及び関連する細胞表面受容体タンパク質は、受容体の型の広い配列に類似する機能性を備えた、優良な機能性ドメイン（例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン）である。ヒト免疫系は、環境から来る感染因子と戦う役割を担う。免疫系に於けるある重要な構成要素は、免疫グロブリン（Ｉｇ）と呼ばれる高く分化された分子、若しくは外来の抗原を認識し結合することが可能でそれによりそれらの排除を促進する抗体である。免疫グロブリン固有の特性は、膜結合、抗原認識（可変（Ｖ）領域）、及び重合作用の為の領域を含む構造的モチーフを有する。腺分泌ＩｇＡ及びＩｇＭの様な重合された免疫グロブリンは、ポリ免疫グロブリン（ｐｏｌｙ−Ｉｇ）受容体によって仲介されるプロセス、経細胞輸送を経なければならない。ポリ免疫グロブリン受容体は、それ自身が免疫グロブリンの可変（Ｖ）領域と相同性を有する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。（Ｈｏｏｄ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｃｅｌｌ ４０：２２５−２２９）すべての免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーのように、ポリ免疫グロブリン受容体は、保存免疫グロブリン様ドメインを介した他のタンパク質との接合及び結合を伴う。この免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンループ（Ｉｇ ｆｏｌｄ）と呼ばれる配列に於いてジスルフィド結合を用いて結合された非パラレルβの一枚からなる。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、Ｔリンパ球受容体、ＭＨＣタンパク質、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８の各細胞表面タンパク質、及び抗体を含む。
【０００９】
免疫グロブリン若しくは抗体は、体液性免疫反応の中心構成要素である。循環における免疫グロブリンの最も一般的なクラスであるＩｇＧは、二つの主たる機能的ドメインによって説明される。作用因子機能はＦｃ（結晶断片）領域によって仲介されるのに対して、抗原認識はＦａｂ（抗原結合断片）領域によって仲介される。バクテリアのような抗原に対するＩｇＧの結合は、マクロファージや好中球の様な食細胞白血球による抗原の破壊のきっかけとなる。これらの細胞は、明確にＩｇＧ Ｆｃ領域に結合し、また食細胞がＩｇＧ結合抗原を吸い込み、摂取し、弱らせる事を許す細胞表面受容体を発現する。食細胞によって発現するＩｇＧ Ｆｃ受容体は、約４００のアミノ酸からなるシングルパス（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）の膜貫通糖タンパク質である。（Ｓｅａｒｓ． Ｄ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３７１−３７８）ＩｇＧ Ｆｃ受容体の細胞外タンパク質は二つ若しくは三つのＩｇドメインを含む。
【００１０】
Ｔリンパ球は免疫系に於いて、抗原の認識と、感染した細胞に於ける細胞の死をもたらしまたその他の細胞を刺激するシグナルの伝達とを結びつける作動因子及び調節因子といった二つの役割を果たす。Ｔリンパ球は、広範囲の異なる抗原をまとめて認識するが、Ｔリンパ球のクローンライン（ｃｌｏｎａｌ ｌｉｎｅ）は単一の抗原を認識するのみである。さらには抗原は、抗原提供細胞の表面に於ける主たる組織適合性分子（ＭＨＣ）によって合成されたペプチドとして、Ｔリンパ球受容体（ＴＣＲ）に対して提供されうる。ほとんどのＴリンパ球上のＴＣＲは、類似分子の免疫グロブリン様必須膜糖タンパク質である二つのポリペプチドサブユニット、α及びβからなる。ＴＣＲαサブユニット及びＴＣＲβサブユニットは、可変及び一定の領域を含む細胞外ドメイン、すなわち一度膜を通過する膜貫通ドメイン、及び短い細胞内ドメインを有する。（Ｓａｉｔｏ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９：７５７−７６２）ＴＣＲサブユニットのための遺伝子は、異なる遺伝子セグメントの体細胞再配列を介して構成される。ＴＣＲによる固有のＭＨＣの関係に於ける抗原の相互作用は、免疫系の細胞構成物の増殖、成熟、及び機能を誘発するシグナルカスケードを開始する。（Ｗｅｉｓｓ． Ａ． （１９９１） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２５： ４８７− ５１０）ＴＣＲ遺伝子に於ける再配列及び、ＴＣＲの発現に於ける変化は、リンパ腫、白血病、自己免疫疾患、及び免疫不全疾患に於いて記録されている。（Ａｉｓｅｎｂｅｒｇ． ＡＣ． ｅｔ ａ！． （１９８５） Ｎ． ＥｎｇＩ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３ １３：５２９−５３３： Ｗｅｉｓｓ． ｓｕｐｒａ： ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ， ｓｕｐｒａ）ＴＣＲを由来とするペプチドによる免疫法は、複数のヒトＴリンパ球媒介自己免疫疾患及び同様の疾患の動物モデル、特にリウマチ様大動脈炎に於いて効果的な治療法である。（Ｂｒｉｄｇｅｓ． Ｓ．Ｌ． ａｎｄ Ｍｏｒｅｌａｎｄ． ＬＷ． （１９９８） Ｒｈｅｕｍ． Ｄｉｓ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． ２４：６４１−６５０）
新規のヒト細胞表面受容体タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見により、細胞増殖障害、免疫系疾患、感染症及び神経細胞障害の診断、予防及び治療に於いて、有用な新規の組成物を提供することで当分野のニーズを満たすことが出来る。
【００１１】
発明の概要
本発明は、まとめて「ＨＣＳＲＰ」、個別には「ＨＣＳＲＰ−１」、「ＨＣＳＲＰ−２」、「ＨＣＳＲＰ−３」、「ＨＣＳＲＰ−４」、「ＨＣＳＲＰ−５」、「ＨＣＳＲＰ−６」、「ＨＣＳＲＰ−７」、「ＨＣＳＲＰ−８」、「ＨＣＳＲＰ−９」、「ＨＣＳＲＰ−１０」、「ＨＣＳＲＰ−１１」、「ＨＣＳＲＰ−１２」及び「ＨＣＳＲＰ−１３」と称される実質的に精製されたポリペプチドであるヒト細胞表面受容体を特徴とする。一実施態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３及びそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。また、本発明にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる一群より選択されたアミノ酸配列から１又はそれ以上の保存的アミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
【００１２】
また、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３及びそれらの断片からなる一群より選択された少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する。更に本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３及びそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。更に本発明にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３及びそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列が含まれる。
【００１３】
更に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １−１３及びそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １−１３及びそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
また、本発明は核酸を含むサンプルにおけるポリヌクレオチドの検出方法を提供し、その方法には（ａ）サンプルの少なくとも１つのポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの相補配列とをハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、該ハイブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有するような検出過程とが含まれる。本発明の一実施態様では、ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を更に含む。
【００１５】
更に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６及びそれらの断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４−２６及びそれらの断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列を提供する。更に本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４−２６及びそれらの断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
更に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、その発現ベクターは宿主細胞に包含される。
【００１７】
また、本発明はポリペプチドの製造方法を提供し、その方法には（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とが含まれる。
【００１８】
更に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３及びそれらの断片からなる一群より選択されたのアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを適切な製薬用担体と共に含む医薬品成分を提供する。
【００１９】
更に、本発明にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３及びそれらの断片からなる一群より選択されたポリペプチドに結合する精製された抗体が含まれる。また本発明は前記ポリペプチドの精製されたアゴニスト及び精製されたアンタゴニストを提供する。
【００２０】
更に、本発明はＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な患者に対してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを適切な製薬用担体と共に含む有効な量の医薬品組成物を投与する過程が含まれる。
【００２１】
更に、本発明はＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な患者に対してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの有効な量のアンタゴニストを投与する過程が含まれる。
【００２２】
発明を実施するための形態
本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、ここに開示した特定の装置、材料、及び方法に限定されるものではなく、その実施形態は変更可能であることを理解されたい。また、ここで使用した専門用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いたものであり、特許請求の範囲のみで限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも理解されたい。
【００２３】
請求の範囲を含む本明細書において、単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈からそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」の表記には、複数のそのような宿主細胞が含まれ、この「抗体」の表記は、１又はそれ以上の抗体及び当業者に周知のその等価物なども表している。
【００２４】
特別に定義されていない限り、本明細書における全ての専門用語及び特定の用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似あるいは等価な方法、装置、及び材料を本発明の実施や試験において使用可能であるが、本明細書においては好適な方法、装置、材料を説明する。本発明で言及した全ての文献は、文献で報告された本発明に関して用いられ得る株化細胞、プロトコル、試薬、及びベクターを説明・開示するために引用したものである。本明細書のあらゆる開示内容は、本発明が従来発明によるそのような開示に先行し得ないことを認めるものと解釈してはならない。
【００２５】
定義
用語「ＨＣＳＲＰ」は、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、及びヒトを含む哺乳類の種から得られたものであって、天然、合成、半合成か、或いは組換え体を起源として得られた実質的に精製されたＨＣＳＲＰのアミノ酸配列を指す。
【００２６】
用語「アゴニスト」は、ＨＣＳＲＰの生物学的活性を強化したり、模擬する分子を指す。このアゴニストには、タンパク質、核酸、糖質、小分子又は他の任意の化合物や組成物が含まれ、それらはＨＣＳＲＰと直接相互作用するか、或いはＨＣＳＲＰが関与する生物学的経路の成分に作用することによってＨＣＳＲＰの活性を調節する。
【００２７】
用語「アレル変異配列」は、ＨＣＳＲＰをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル変異配列は、核酸配列における少なくともひとつの突然変異に起因し、変異したｍＲＮＡ或いはポリペプチドが生ずるが、それらの構造又は機能は変化する場合と変化しない場合とがある。遺伝子には、自然発生型のアレル変異配列がないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列が生じる通常の変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加又は置換によるものである。これらの変化の形態の各々は、単独又は他の変化と組み合わされて、所定の配列において１又はそれ以上の回数で生じ得る。
【００２８】
ここで用いるＨＣＳＲＰをコードする「変異（ａｌｔｅｒｅｄ）」核酸配列には、結果として同一のＨＣＳＲＰ又はＨＣＳＲＰの機能的特徴の少なくとも１つを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換をともなうそれらの配列が含まれる。この定義には、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の位置とは異なる位置のアレル変異配列に対する不適切な或いは予期しないハイブリダイゼーションや、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、或いは検出困難な多型が含まれる。コードされたタンパク質もまた「変異」したものであり得て、サイレント変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）をもたらして結果的に機能的に等価のＨＣＳＲＰとなるアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、ＨＣＳＲＰの生物学的又は免疫学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質についての類似性に基づき行なわれ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれる。類似の親水性値を有する非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン及びバリン；グリシン及びアラニン；並びにフェニルアラニン及びチロシンが含まれる。
【００２９】
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の配列又はそれらの何れかの断片であり、自然発生や合成の分子を指す。「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すのに用いられる場合は、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、そのアミノ酸配列を、記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００３０】
用語「増幅」は、核酸配列の更なる複製物を生成することであり、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実施される。
【００３１】
用語「アンタゴニスト」は、ＨＣＳＲＰの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストには、抗体、核酸、糖質、小分子又は他の任意の化合物や組成物などのタンパク質が含まれ、それらはＨＣＳＲＰと直接相互作用するか、或いはＨＣＳＲＰが関与する生物学的経路の成分と作用することによってＨＣＳＲＰの活性を調節する。
【００３２】
用語「抗体」は、完全な分子や、抗原決定基と結合し得るＦａ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメントのようなそれらの断片を指す。ＨＣＳＲＰポリペプチドに結合する抗体は、未処置のポリペプチドを用いて、或いは免疫化する抗原として関与する小型のペプチドを含むその断片を用いて調製することができる。動物（例えば、マウス、ラット又はウサギ）を免疫化するのに用いるポリペプチド又はオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳又は化学的に合成されたものから得られ、必要ならば担体タンパク質と結合可能である。ペプチドと化学的に結合する通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が含まれる。次に、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００３３】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ち、エピトープ）を指す。タンパク質若しくはタンパク質の断片を用いて宿主の動物を免疫化する場合、このタンパク質の多くの領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域又は３次元構造）と特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体への結合に関して元の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００３４】
用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列の「センス」鎖と相補的な核酸配列を含む任意の成分を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で生成することができる。この相補的ヌクレオチドは、一度細胞内に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合して２重鎖を形成し、転写や翻訳を妨げる。「ネガティブ」若しくは「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖を指し、「ポジティブ」若しくは「プラス（＋）」なる表現がセンス鎖を指すことがある。
【００３５】
用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節機能又は生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、適切な動物や細胞において特定の免疫反応を誘発し、特定の抗体と結合するための、天然のＨＣＳＲＰ、組換え体のＨＣＳＲＰ若しくは合成のＨＣＳＲＰ又はその任意のオリゴペプチドの能力を指す。
【００３６】
用語「相補的」又は「相補性」は、塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然な結合を指す。例えば、配列「５’Ａ−Ｇ−Ｔ３’」は相補的配列「３’Ｔ−Ｃ−Ａ５’」に結合する。２つの１本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合しているような「部分的」なものや、或いは１本鎖分子間に完全な相補性が存在するような「完全」なものもある。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左右される増幅反応や、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計及び使用において特に重要である。
【００３７】
用語「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」及び「所定のアミノ酸配列を含む組成物」とは、概して所定のポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥した製剤又は水溶液が含まれ得る。ＨＣＳＲＰ若しくはＨＣＳＲＰの断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用できる。このプローブは凍結乾燥した状態で保存することができ、糖質のような安定化剤と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブを、塩（例えば、ＮａＣｌ）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））及び他の物質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散させることができる。
【００３８】
用語「コンセンサス配列」は、再度配列決定して不要な塩基を分離した核酸配列か、ＸＬ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）を用いて５‘方向及び／又は３’方向に伸長して再度配列決定した核酸配列か、或いは断片の組み立てためのコンピュータプログラム（例えば、ＧＥＬＶＩＥＷ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｓｙｓｔｅｍ， ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて、２種以上のインサイトクローンや、また場合によっては１又はそれ以上の公有のＥＳＴの重複した配列から組み立てられた核酸配列である。いくつかの配列が伸長され且つ組み合わされてコンセンサス配列が作られる。
【００３９】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど損なわない置換を指し、つまり、その置換によってそのタンパク質の構造や、ことに機能は大きくは変化せずに保存される。以下に、タンパク質の元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。
元の残基                保存的な置換
Ａｌａ                    Ｇｌｙ， Ｓｅｔ
Ａｒｇ                    Ｈｉｓ， Ｌｙｓ
Ａｓｎ                    Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ
Ａｓｐ                    Ａｓｎ， Ｇｌｕ
Ｃｙｓ                    Ａｌａ， Ｓｅｒ
Ｇｌｎ                    Ａｓｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ
Ｇｌｕ                    Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ
Ｇｌｙ                    Ａｌａ
Ｈｉｓ                    Ａｓｎ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ
Ｉｌｅ                     Ｌｅｕ， Ｖａｌ
Ｌｅｕ                    Ｉｌｅ， Ｖａｌ
Ｌｙｓ                    Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ
Ｍｅｔ                    Ｌｅｕ， Ｉｌｅ
Ｐｈｅ                    Ｈｉｓ， Ｍｅｔ， Ｌｅｕ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ
Ｓｅｒ                    Ｃｙｓ， Ｔｈｒ
Ｔｈｒ                    Ｓｅｒ， Ｖａｌ
Ｔｒｐ                    Ｐｈｅ， Ｔｙｒ
Ｔｙｒ                    Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ
Ｖａｌ                    Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｔｈｒ
一般に、保存的なアミノ酸置換では、（ａ）置換領域のポリペプチドの主鎖構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、（ｂ）置換部位の分子の電荷若しくは疎水性並びに／又は（ｃ）側鎖の大部分が維持される。
【００４０】
用語「欠失」は、結果的に１個又はそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠けるようなヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の変化を指す。
【００４１】
用語「誘導体」は、化学的に修飾されたポリペプチド配列若しくはポリヌクレオチド配列を指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、水素からアルキル基、アシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基への置換が含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、自然発生の分子の生物学的又は免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、又は元のポリペプチドの生物学的若しくは免疫学的機能を保持する別の任意のプロセスで修飾されたものである。
【００４２】
用語「断片」は、ＨＣＳＲＰ若しくはＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがより長さの短い配列を指す。「断片」には、所定の配列の長さから１つのヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さのものまでが含まれ得る。例えば、或る断片には、５〜１０００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基が含まれ得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子又はその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、分子の特定の領域から優先的に選択されることもある。例えば、ポリペプチド断片には、所定の配列に示すような最初の２５０若しくは５００個のアミノ酸（又は、ポリペプチドの最初の２５％又は５０％）から選択された連続する所定の長さのアミノ酸が含まれ得る。これらの長さは例示的なものであり、本発明の実施例には、配列表、表及び図面を含めた明細書に記載された任意の長さが含まれ得る。
【００４３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の或る断片には、例えば同一のゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域が含まれる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の或る断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術や、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法において有用である。或る断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の断片やＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の領域の正確な長さは、その断片の目的に基づいて周知技術によってルーチン的に決定可能である。
【００４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の或る断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の或る断片には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域が含まれる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３を特異的に認識する抗体の産生のための免疫原性ペプチドとして有用である。或る断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の断片やＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の領域の正確な長さは、その断片の目的に基づいて周知技術によってルーチン的に決定可能である。
【００４５】
用語「類似性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的な類似性と、完全な類似性の場合がある。用語「類似性」の代わりに「同一性」が用いられ得る。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列を「実質的に類似」と称する。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、緩やかな厳密性の条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット、ノーザンブロット又は溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検定可能である。実質的に類似な配列又はハイブリダイゼーションプローブは、緩やかなストリンジェントな条件下で、標的配列に対する完全に類似（同一）な配列の結合について競合してそれを阻害し得る。これは、緩やかなストリンジェントな条件では、非特異的な結合が許容されるということを意味するものではなく、緩やかなストリンジェントな条件では、２つの配列の相互の結合が特異的（即ち、選択的）な相互作用であることが必要である。非特異的な結合が存在しないことを、部分的な相補性さえも有していない（即ち、約３０％未満の類似性又は同一性）第２の標的配列を用いることにより検査することができる。非特異的結合が存在しない場合には、実質的に類似な配列又はプローブは第２の非相補的な標的配列とハイブリダイズしない。
【００４６】
ポリヌクレオチド配列についての用語「同一性のパーセント」又は「同一性の％」とは、標準的なアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間の残基の一致の百分率を意味する。このようなアルゴリズムでは、２つの配列間のアラインメントを最適化するために、標準的な再現性のある方法で、比較される配列にギャップを挿入して２つの配列間のより有意な比較を行うことができる。
【００４７】
ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定可能である。このプログラムはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖについては、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 及び Ｐ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３並びにＨｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． ら （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４及び「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重みづけされた」残基重みづけ表がデフォルトとして選択される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって、同一性のパーセントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列の対の間の「類似性のパーセント」として報告される。
【００４８】
或いは、一般的に用いられる無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式は、ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）などを含めた幾つかのソースから入手できるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）によって提供される。ＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と種々のデータベースからの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含めた様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と称されるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして対話形式で利用可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐ（後述）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、デフォルト設定に設定されたギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するとき、デフォルトのパラメータに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（Ｍａｙ−０７−１９９９）をｂｌａｓｔｎと共に使用できる。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようなものであり得る。
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で定められる配列の全長に対して測定するか、或いはより短い長さの配列、例えば、より大きな所定の配列から得られた断片（例えば、少なくとも、２０、３０、４０、５０、７０、１００又は２００個の連続するヌクレオチドの断片）の長さに対して測定してもよい。このような長さは単に例示的なものであり、配列表、表及び図面を含めた明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定され得る長さを示すことができることを理解されたい。
【００４９】
高い同一性を示さない核酸配列にも関わらず、遺伝子コードが縮重するために類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。縮重を利用して核酸配列を変化させて、それらが全て実質的に同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を作り出すことができる。
【００５０】
ポリペプチド配列についての用語「同一性のパーセント」又は「同一性の％」とは、標準的なアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリペプチド配列間の残基の一致の百分率を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ酸置換を考慮するものもある。先に詳述したこのような保存的な置換では、通常は置換部位の酸性度や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造が（従って機能も）保存される。
【００５１】
ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ バージョン３．１２ｅ配列アラインメントプログラム（前述）に組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定可能である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いるポリぺプチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトのパラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５及び「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。ＰＡＭ２５０マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の間の同一性のパーセントは、「類似性のパーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００５２】
或いは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式が用いられ得る。例えば、２つのポリペプチド配列の対の比較をする場合、デフォルトのパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）をｂｌａｓｔｐと共に使用できる。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようなものであり得る。
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： １１ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で定められるポリペプチド配列の全長に対して測定するか、或いはより短い長さの配列、例えば、より大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片（例えば、少なくとも、１５、２０、３０、４０、５０、７０又は１５０個の連続する残基の断片）の長さに対して測定してもよい。このような長さは単に例示的なものであり、配列表、表及び図面を含めた明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定され得る長さを示すことができることを理解されたい。
【００５３】
「ヒト人工染色体」（ＨＡＣ）は、６ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み、且つ安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体である。
【００５４】
用語「ヒト化抗体」は、抗体が本来の結合能力をそのまま保持しながらヒト抗体により近づくように、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列を変化させた抗体分子を指す。
【００５５】
用語「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件の下で或る１本鎖ポリヌクレオチドが相補的な鎖と塩基対を形成することによるアニーリングプロセスを指す。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配列が高度な同一性を有することを意味する。特異的なハイブリダイゼーション複合体はアニーリングが許容される条件の下で形成され、「洗浄過程」の後もハイブリダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーの決定において特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異的な結合（即ち、完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によってルーチン的に決定され、ハイブリダイゼーション実験の間は一定であるが、一方で、所望のストリンジェンシーのために実験中に洗浄条件を変更可能であり、従ってハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ及び約１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの存在下で成立する。
【００５６】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの一部は、洗浄過程を行う温度で表すことができる。通常、この洗浄温度は、所定のイオン強度とｐＨにおける特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５〜２０℃低く選択される。このＴｍは、（所定のイオン強度とｐＨの下で）標的の配列の５０％が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔｍを算出するための式及び核酸のハイブリダイゼーションの条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ らの文献（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版の１−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ； 特に２巻の９章を参照）に記載されている。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの高いストリンジェンシーの条件には、約０．２×ＳＳＣ及び約１％のＳＤＳの存在下の約６８℃での１時間の洗浄過程が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５℃又は４２℃の温度で行う。ＳＳＣの濃度は、約０．１％のＳＤＳの存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲を変化し得る。通常は、遮断剤を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡが含まれる。約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤を、例えば、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な変更については、当業者には容易に明白であろう。特に高度なストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリペプチドに対して類似の役割を強く示唆している。
【００５８】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基の間の水素結合形成の力によって、２つの核酸配列間で形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、Ｃ０ｔ又はＲ０ｔ解析）、或いは溶液中に存在する一方の核酸と固体支持体（例えば、紙、メンブラン、フィルタ、ピン若しくはガラススライド、又は細胞若しくはその核酸が固定される他の適切な基板）に固定されたもう一方の核酸との間で形成され得る。
【００５９】
用語「挿入」或いは「付加」は、１又は２個以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基をそれぞれ付加するようなヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の変化を指す。
【００６０】
用語「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症又は伝染性若しくは遺伝性の疾患に関連する症状を指す。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用する種々の因子（例えば、サイトカイン、ケモカイン及び他のシグナル伝達分子）の発現によって特徴づけられる。
【００６１】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の種々のポリヌクレオチドの配置を指す。
【００６２】
マイクロアレイの文脈における用語「エレメント」又は「アレイエレメント」は、基板の表面に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。
【００６３】
用語「調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、ＨＣＳＲＰの活性の変化を指す。例えば、調節によって、タンパク質活性、結合特性、又はＨＣＳＲＰの他の任意の生物学的特性、機能的特性若しくは免疫学的特性の増大や低下がもたらされる。
【００６４】
用語「核酸」又は「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又はそれらの任意の断片を指す。また、これらの用語は、１本鎖若しくは２本鎖の、センス鎖若しくはアンチセンス鎖のゲノム起源又は合成起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様若しくはＲＮＡ様物質も指す。
【００６５】
用語「機能的に結合（する）」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般に、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードする領域が結合する必要がある場合は、機能的に結合したＤＮＡ配列は非常に近接するか、或いは連続し得る。
【００６６】
用語「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した少なくともヌクレオチド５個以上の長さのオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤（ａｎｔｉ−ｇｅｎｅ ａｇｅｎｔ）を指す。末端のリジンがその組成に溶解性を賦与している。ＰＮＡは相補的な１本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、またＰＮＡをポリエチレングリコール化して細胞におけるＰＮＡの寿命を延ばすことが可能である。
【００６７】
「プローブ」とは、ＨＣＳＲＰ、それらの相補配列又はそれらの断片をコードする核酸配列のことであり、それらを同一の核酸配列、アレル核酸配列又は関連する核酸配列の検出に用いる。プローブは、検出可能な標識又はレポーター分子に結合した単離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素が含まれる。「プライマー」は、短い核酸（通常はＤＮＡオリゴヌクレオチド）であり、それらは、相補的な塩基対を形成することで標的のポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。次に、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的のＤＮＡ鎖に沿って延長され得る。プライマーの組は、例えば、ＰＣＲ法による核酸配列の増幅（及び同定）に用いること可能である。
【００６８】
本発明に用いるプローブ及びプライマーは、通常は既知の配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及びプライマーが用いることが可能であり、そのようなプローブ及びプライマーには、例えば、開示した核酸配列の連続する少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又は１５０のヌクレオチドが含まれる。プローブ及びプライマーは、これらの例よりも相当長い場合もあり、表、図面及び配列表を含めた本明細書に示された任意の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【００６９】
プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．らによる、１９８９年、名称「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版の１−３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）、又はＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． らによる、１９８７年、名称「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）、並びに Ｉｎｎｉｓらによる、１９９０年、名称「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を参照されたい。ＰＣＲ用のプライマーの組は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）ような目的のためのコンピュータプログラムを用いて既知の配列から得ることができる。
【００７０】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各々が最大１００個のヌクレオチドまでのＰＣＲ用のプライマーの対の選択や、３２キロベースまでの入力ポリヌクレオチド配列からの最大５，０００個のヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチド及びより大きなポリヌクレオチドの分析に有用である。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡張する更なる機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈ Ｗｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄａｌｌａｓ ＴＸより入手可能）は、メガベースの配列から特定のプライマーを選択可能であり、ゲノムワイドスコープ（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｏｐｅ）におけるプライマーの設計に有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ１より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列をユーザーが指定する「ミスプライミングライブラリー（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂａｒａｙ）」を入力できる。また、Ｐｒｉｍｅｒ３は、特にマイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーの特定のニーズを満たすように変更することもできる）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（ＵＫ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ より入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の最も保存された領域又は殆ど保存されない領域の何れかとハイブリダイズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有の保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。前述の任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、例えば、ＰＣＲ法や配列決定のプライマー、マイクロアレイ要素、或いは核酸のサンプルにおいて完全又は部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定する特定のプローブとしてハイブリダイゼーション技術において有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上述の方法に限定されるものではない。
【００７１】
用語「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の異なる離隔されたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工的組み合せは、化学合成によって実施する場合も多いが、より一般的には、例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ（前出） に記載されたような遺伝工学的手法によって核酸の離隔されたセグメントを人工的に操作する。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の付加、置換又は欠失によって変更された核酸も含まれる。組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に結合した核酸配列が含まれる場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある細胞を形質転換するために用いられるベクターの一部であり得る。
【００７２】
或いは、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワクチン接種に用いられ、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発するワクシニアウイルスに基づくウイルスベクターの一部であり得る。
【００７３】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。ＨＣＳＲＰをコードする核酸若しくはその断片、又はＨＣＳＲＰ自体を含む疑いのあるサンプルには、体液や、細胞から分離された染色体、細胞小器官又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、溶液中の、或いは固体支持体に結合したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡや、組織や、組織プリント等が含まれ得る。
【００７４】
用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子又は任意の天然若しくは合成の結合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば、結合する分子が認識する抗原決定基、つまりエピトープ）の存在に左右されることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識された遊離した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープ「Ａ」（つまり遊離し、標識されていない「Ａ」）を含むポリヌクレオチドが存在することにより、抗体に結合する標識された「Ａ」の量が低下する。
【００７５】
用語「実質的に精製され」は、天然の環境から取り除かれた核酸配列又はアミノ酸配列であって、天然にはそれが結合して存在する他の構成成分から単離又は分離されて、その構成要素が少なくとも約６０％以上、好ましくは約７５％以上、最も好ましくは約９０％以上除去された核酸配列又はアミノ酸配列である。
【００７６】
用語「置換」は、１個又は２個以上のヌクレオチド或いはアミノ酸を、別のヌクレオチド或いはアミノ酸にそれぞれ置換することを意味する。
【００７７】
用語「基板」は、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気或いは非磁気のビーズ、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管を含む適切な固体又は半固体の支持体を指す。基板は、ポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する壁、溝、ピン、チャンネル及び孔等の様々な表面形態をとることが可能である。
【００７８】
用語「形質転換」は、外来性のＤＮＡが入り込み宿主細胞を変化させるプロセスを意味する。形質転換は、当業者に周知の種々の方法によって自然又は人工の条件下で起こり、またそれは外来性の核酸配列を原核細胞又は真核細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づき得る。形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞の種類によって選択され、それらには、以下に限定しないが、ウイルス感染、熱ショック、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法が含まれる。このような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡを自律的に複製するプラスミドとして、或いは宿主の染色体の一部として複製可能な安定的に形質転換された細胞や、限られた時間で導入されたＤＮＡやＲＮＡを発現する一時的に形質転換された細胞が含まれる。
【００７９】
特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｎによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「アレル」変異配列（上述）又は「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多形性」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一性が極めて高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの択一的スプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多形性変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１つのヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば、或る集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、病態、病態の特徴を表し得る。
【００８０】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｐによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このようなポリペプチドの対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。
【００８１】
発明
本発明は、新規なヒト細胞表面受容体（ＨＣＳＲＰ）、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド、並びに細胞増殖障害、免疫系異常、感染症及び神経細胞障害の診断、治療又は予防のためのこれらの組成物の利用法の発見に基づくものである。
【００８２】
表１は、ＨＣＳＲＰをコードする完全長のヌクレオチド配列を組み立てるために用いたインサイト社クローンの表である。第１列及び第２列は、それぞれポリペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）を示す。第３列は、各ＨＣＳＲＰをコードする核酸が同定されたインサイトクローンのクローンＩＤを示し、第４列は、これらのクローンが単離されたｃＤＮＡライブラリを示す。第５列は、インサイトクローン及びそれらの対応するｃＤＮＡライブラリー示す。ｃＤＮＡライブラリーが示されていないクローンは、プールされたｃＤＮＡライブラリーから得られたものである。第５列のクローンは、各ＨＣＳＲＰのコンセンサスヌクレオチド配列を組み立てるために用いられ、ハイブリダイゼーション技術における断片として有用である。
【００８３】
表２の各列は、本発明の各ポリペプチドの種々の特性を示しており、列１にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ、第２列には各ポリペプチドのアミノ酸残基の数、第３列には潜在的なリン酸化部位、第４列には潜在的なグリコシル化部位、第５列にはサイン配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）及びモチーフを含むアミノ酸残基、第６列にはＢＬＡＳＴ解析によって識別されるＧｅｎＢａｎｋホモログ、更に、第７列には配列相同性及びタンパク質モチーフによる各ポリペプチドの特徴づけのために用いた解析方法を示している。詳細には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列の約３０番目から８０番目までのアミノ酸残基は、ヒトトロンビン受容体のＮ末端の繋がれたリガンドトロンビン受容体アゴニストペプチドとは異なり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列の約１１５番目から１４０番目までのアミノ酸残基は、ヒトＴＣＲαサブユニットの定常領域及びＣ末端結合領域とは異なる。
【００８４】
表３の各列は、組織特異性並びにＨＣＳＲＰをコードするヌクレオチド配列に関連する疾患、障害若しくは症状を示す。表３の第１列はヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯを示す。第２列は、第１列のヌクレオチド配列の断片を示す。これらの断片は、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６を同定するため、或いは関連するポリヌクレオチド配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６とを識別するためのハイブリダイゼーション若しくは増幅技術において有用である。これらの断片によってコードされるポリペプチドは、例えば免疫原性ペプチドとして有用である。第３列は、ＨＣＳＲＰを発現する全組織中の割合としての組織の分類区分を示す。第４列は、それらの組織と関連する疾患、障害若しくは症状のＨＣＳＲＰを発現する全組織における割合を示す。第５列は、ｃＤＮＡライブラリのサブクローニングに用いたベクターを示す。特に注目すべきは、癌、自己免疫及び炎症反応や、肺、胸腺、膀胱、精嚢及び陰茎組織や、リウマチ様関節炎におけるＨＣＳＲＰの発現である。更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４は、主に腫瘍関連上皮組織において発現され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５は、主に成長関連及び腫瘍関連上皮組織並びに免疫反応組織において発現される。
【００８５】
表４の各列は、ＨＣＳＲＰをコードするｃＤＮＡクローンが単離されるｃＤＮＡライブラリーを作製するのに用いる組織の説明を示す。第１列はヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ、第２列はこれらのクローンが単離されたｃＤＮＡライブラリー、更に、第３列は第２列のｃＤＮＡライブラリーに関連する組織源及び他の記載情報をそれぞれ示す。
【００８６】
また、本発明はＨＣＳＲＰの変異体を含む。好適なＨＣＳＲＰ変異体は、ＨＣＳＲＰアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上、或いは少なくとも９０％以上、更には少なくとも９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、またＨＣＳＲＰの機能的若しくは構造的特徴の少なくとも１つを含む。
【００８７】
更に、本発明はＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の実施例において、本発明はＨＣＳＲＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる一群より選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を包含する。
【００８８】
更に、本発明はＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドの変異配列を含む。特に、そのようなポリヌクレオチドの変異配列は、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％以上、或いは少なくとも９０％以上、更には少なくとも９５％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。本発明の特定の態様には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４−２６からなる一群より選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列が含まれ、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４−２６からなる一群より選択された核酸配列に対して少なくとも８０％以上、或いは少なくとも９０％以上、更には少なくとも９５％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。上記のポリヌクレオチドの変異配列は何れもＨＣＳＲＰの機能的又は構造的特徴の少なくとも１つを含むアミノ酸配列をコードすることが可能である。
【００８９】
遺伝暗号の縮重の結果、既知の遺伝子及び自然発生の遺伝子のポリヌクレオチド配列に対する最小の類似性を有する幾つかのものを含め、多数のＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド配列が作り出されることが、当業者には理解されるであろう。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択により作り出され得るポリヌクレオチド配列の可能な全ての変異を考慮している。これらの組合せは自然発生のＨＣＳＲＰのヌクレオチド配列に対し適用されるような標準のトリプレット遺伝暗号に従い作り出されるものであり、また全てのそのような変異はここに明確に開示されると考えられたい。
【００９０】
ＨＣＳＲＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適切に選択された厳密性の条件下に於いて、自然発生のＨＣＳＲＰのヌクレオチド配列に対してハイブリダイズ可能であることが好ましいが、それは非自然発生のコドンを含める等の実質的に異なるコドンの用法を有するＨＣＳＲＰ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すのに有利である。特定のコドンが宿主により利用される頻度に従い、真核生物又は原核生物の宿主に於いてペプチドの発現が起こる割合を高めるようにコドンを選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変化させることなしにＨＣＳＲＰ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列から作り出された転写物よりも長い半減期のようなより望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。
【００９１】
また本発明は、ＨＣＳＲＰ及びＨＣＳＲＰの誘導体をコードするＤＮＡ配列、又はその断片を専ら合成化学によって作り出すことを含む。作製の後に、合成配列を当業者によって周知の試薬を用いて任意の多数の利用可能な発現ベクター及び細胞系に挿入することが可能である。更に、合成化学を利用してＨＣＳＲＰをコードする配列又はそれらの任意のフラグメントに突然変異を導入し得る。
【００９２】
また本発明に包含されるものには、種々の厳密な条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、また特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６並びにそれらの断片に対してハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７；Ｋｉｍｍｅｌ， Ａ．Ｒ．（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１参照）。ハイブリダイゼーション条件には、「定義」に記載したアニーリング及び洗浄条件が含まれる。
【００９３】
ＤＮＡ塩基配列決定方法は周知のものであり、本発明の任意の実施例においても利用され得る。その方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）に於いて発見されたようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼの組合せのような酵素を使用する。配列の準備は、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）、ＰＴＣ２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のような装置によって自動化することが好ましい。次に、ＡＢＩ ３７３若しくは３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡ配列決定システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）又は他の周知の装置を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当業者に周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｉ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７； Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３を参照）。
【００９４】
ＨＣＳＲＰをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を用いて先行技術に於いて周知の種々のＰＣＲ法をベースとした方法で伸長し、プロモータ及び調節エレメントのような上流の配列を検出することができる。例えば、用いられる方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別の方法では、多岐に伸長して環状化鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵素断片に由来する。（Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．ら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６）。第３の方法として、キャプチャーＰＣＲ法（ｃａｐｔｕｒｅ ＰＣＲ）には、ヒト及び酵母菌の人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅が含まれる（例えば、Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．ら（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、多数の制限酵素の消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域に組換え２本鎖配列を挿入することができる。また、未知の配列を回収するのに用いられ得る他の方法が当業者に周知である（例えば、Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ． ら （１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６を参照）。更に、ＰＣＲ法、ネスト化プライマー、ＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン移行部の発見に有用である。全てのＰＣＲ法をベースとした方法については、プライマーは、ＯＬＩＧＯＴＭ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， ＭＮ）のような市販のソフトウェア又は別の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、また約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよう設計され得る。
【００９５】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするとき、大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリーを用いることが好ましい。また、遺伝子の５’領域を配列を含むことが多いランダムプライムド（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）ライブラリーは、ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）ライブラリーで完全な長さのｃＤＮＡを得られない場合に好適である。またゲノムライブラリーは、５’非転写領域における配列の伸長のために役立ち得る。
【００９６】
配列決定やＰＣＲの産物のヌクレオチド配列のサイズ分析又は確認のために、市販のキャピラリー電気泳動法システムを用いることができる。特に、キャピラリーシークエンシングでは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、４つの異なるヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、及び放射された波長の検出を行うＣＣＤカメラを使用し得る。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ及びＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御され得る。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプル内に限られた量だけしか存在しないこともあるＤＮＡの小片の配列決定に特に好適である。
【００９７】
本発明の別の実施例では、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、ＨＣＳＲＰ、その断片又はその機能的等価物の適切な宿主細胞内における発現を指向することができる。遺伝暗号の固有の縮重によって、実質的に同一、即ち機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が作り出され、ＨＣＳＲＰの発現のために用いることができる。
【００９８】
限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改変すること等の種々の理由により、ＨＣＳＲＰをコードする配列を改変するために、本発明のヌクレオチド配列を当業者に周知の方法を用いて操作可能である。ランダムな断片化によるＤＮＡ混合や、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再構成を用いて、ヌクレオチド配列を操作できる。例えば、オリゴヌクレオチド媒介の部位特異的変異誘発により、新しい制限部位を生成する突然変異の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライシングバリアントの生成等が可能である。
【００９９】
本発明の別の実施例では、当業者に周知の化学的手法を用いて、ＨＣＳＲＰをコードする配列の全体、或いはその一部を合成することができる（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ．Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３；Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２参照）。或いは、化学的手法を用いて、ＨＣＳＲＰそのもの又はその断片を合成することができる。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．ら（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４参照）。また、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて合成の自動化を行なうことができる。更に、ＨＣＳＲＰのアミノ酸配列若しくはその任意の部分を、直接の合成において改変することにより、並びに／又は他のタンパク質若しくはその任意の部分に由来する配列と結合させることにより、変異体ポリペプチドを生成可能である。
【０１００】
そのペプチドは、分離用の高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製することができる（例えば、Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．及びＲｅｇｎｉｅｒ． Ｆ．Ｚ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いは配列決定法により確認することができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｖｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。
【０１０１】
生物学的に活性なＨＣＳＲＰを発現させるために、ＨＣＳＲＰをコードするヌクレオチド配列又はその誘導体を、適切な発現ベクター（即ち、適切な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入する。これらのエレメントには、ベクター及びＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域等の調節配列が含まれる。このようなエレメントの長さ及び特異性は変化し得る。特定の開始シグナルを利用して、ＨＣＳＲＰをコードする配列のより効果的な翻訳を行なうことが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンや例えばコザック配列等の隣接する配列が含まれる。ＨＣＳＲＰをコードする配列、その開始コドン、及び上流の調節配列が、適切な発現ベクターに挿入された場合は、付加的な転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは不用となり得る。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、読み枠の中のＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターよって与えられなければならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の種々のものからなり得る。用いられる特定の宿主細胞株に適当なエンハンサーを含むことにより、発現の効率を高めることが可能である（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． ら （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２を参照）。
【０１０２】
ＨＣＳＲＰをコードする配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクターを作製するために、当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝的組換え技術が含まれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹ， ｃｈ．４，８，及び１６−１７；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｃｈ．９，１３，及び１６参照）。
【０１０３】
ＨＣＳＲＰをコードする配列を包含し、発現するために、種々の発現ベクター／宿主系が利用できる。これらには、以下に限定しないが、組換え型のバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）又はタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））或いは細菌の発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。本発明は、利用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１０４】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド配列の使用の目的に応じて選択できる。例えば、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、及び増殖は、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）又はｐＳｐｏｒｔｌ ｐｌａｓｍｉｄ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の多機能性Ｅ．ｃｏｌｉベクターを用いて実施することが可能である。ベクターの多数のクローニング部位へのＨＣＳＲＰをコードする配列のライゲーションによりｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターは、クローニングされた配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、ジデオキシークエンシング、ヘルパーファージによる１本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成に有用である（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ． Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９を参照）。例えば、抗体産生の目的等に多量のＨＣＳＲＰが必要な場合、ハイレベルなＨＣＳＲＰの発現をもたらすベクターが用いられ得る。例えば、強力な誘発性のＴ５又はＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが用いられ得る。
【０１０５】
ＨＣＳＲＰの生成に酵母の発現系を利用できる。酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成型又は誘導型のプロモーターを含む多種のベクターを使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌若しくは細胞内保持の何れかを導き、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来性の配列を組込みを可能とする（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ， 前出； 及び Ｇｒａｎｔら（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４；Ｓｃｏｒｅｒ， Ｃ．Ａ．ら（１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４を参照）。
【０１０６】
植物系もＨＣＳＲＰの発現に使用できる。ＨＣＳＲＰをコードする配列の転写は、ウイルス性のプロモータ（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモーター単独、又はＴＭＶ由来のオメガリーダー配列との組合わせ）で促進され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．ら（１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１）。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換又は病原体媒介の形質移入によって、植物細胞中に導入可能である。（例えば、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ｐｐ．１９１−１９６を参照）。
【０１０７】
哺乳動物の細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、ＨＣＳＲＰをコードする配列が、後発のプロモータ及び三連のリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体の中に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須Ｅ１又はＥ３領域における挿入により、宿主細胞においてＨＣＳＲＰを発現する感染性のウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを、哺乳類の宿主細胞内の発現を増大させるために用いることができる。また、タンパク質の高レベルの発現のために、ＳＶ４０又はＥＢＶをベースとしたベクターを用いることができる。
【０１０８】
また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いることにより、プラスミドに含まれ発現され得るものに比べてより大きなＤＮＡの断片を供給することもできる。治療を目的とし、６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣを構築して従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリカチオンのアミノポリマー、又は小胞）を介して供給することができる（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ． Ｊ．ら（１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５）。
【０１０９】
哺乳類系の組換え型タンパク質の産生を長期間にわたり確保するためには、細胞株におけるＨＣＳＲＰの安定した発現が好ましい。例えば、発現ベクターを用いてＨＣＳＲＰをコードする配列を細胞株に形質転換することが可能であり、その発現ベクターには、ウイルス起源の複製及び／若しくは内在性の発現エレメント並びに同一或いは個別のベクターの上の選択マーカー遺伝子が含まれる。ベクターの導入の後、選択培地に切り替える前に濃縮培地内で細胞を１〜２日間増殖させる。選択可能なマーカーの目的は、選択的な媒介物に対して耐性を与えることであり、またその存在によって導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能とすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞の型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。
【０１１０】
形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができる。これらには、以下に限定しないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれは、ｔｋ−及びａｐｒ−細胞において用いられる（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら（１９７７）Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２；Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３参照）。また代謝拮抗剤、抗生剤或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることが可能で、例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対する耐性を与える（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．ら（１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−７０；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． ら（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば、代謝産物に対する細胞の必要性を変更するｔｒｐＢ及びｈｉｓＤが文献に記載されている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−８０５１参照）。例えば、アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、β−グルクロニダーゼ及びその基質β−グルクロニド、又はルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等の可視マーカーを利用できる。これらのマーカーは形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するために広く用いられる（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ．ら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１参照）。
【０１１１】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在も示唆されるが、その遺伝子の存在及び発現の確認を必要とすることもある。例えばＨＣＳＲＰをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、ＨＣＳＲＰをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子の機能が存在しないことにより同定できる。或いは、単一のプロモータの制御下において、ＨＣＳＲＰをコードする配列とマーカー遺伝子を直列に配置することができる。選択又は誘導に応じた標識遺伝子の発現は、通常直列に配置された配列の発現も同様に示す。
【０１１２】
一般に、当業者に周知の様々な方法により、ＨＣＳＲＰをコードする核酸配列を含みＨＣＳＲＰを発現する宿主細胞を同定できる。このような方法には、以下に限定しないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、並びに核酸とタンパク質配列を検出及び／若しくは定量するための技術に基づく膜、溶液、若しくはチップを含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイが含まれる。
【０１１３】
特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体のいずれかを用いるＨＣＳＲＰの発現を検出・測定するための免疫学的手法は、当業者に周知のものである。そのような技術の例には、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）及び蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）が含まれる。ＨＣＳＲＰ上において２つの非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位のモノクローナルベースのイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合的結合実験も用いられうる。これらアッセイ及び他のアッセイは、当業者によって開示されている（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｒ．ら（１９９０）；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ Ｐａｕｌ，ＭＮ Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＶ；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ．ら（１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； 及びＰｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ．（１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪを参照）。
【０１１４】
多様なラベル及び結合技術が当業者には周知であり、そして種々の核酸及びアミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドに関係する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲプローブを作製するための手段には、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション法、末端標識（ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ）、或いは標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などが含まれる。或いは、ＨＣＳＲＰをコードする配列、又はその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローン化できる。そのようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、これを用いて、例えばＴ７、Ｔ３或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加えることによってｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成することができる。これらの方法は、種々の市販のキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、及びＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ提供）を用いて実施することができる。検出を容易にするために用いる適切なレポーター分子、即ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤や、基質、コファクター、インヒビター、磁性粒子等が含まれる。
【０１１５】
細胞培養からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下において、ＨＣＳＲＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を培養することができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられる配列及び／又はベクターに応じて分泌されるか、又は細胞内に保持され得る。当業者に理解されるように、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物か真核生物の細胞膜を通してＨＣＳＲＰ分泌を指向するシグナル配列を含むように設計することができる。
【０１１６】
更に、宿主細胞株は、挿入した配列の発現の調節能力又は発現したタンパク質を所望の形にプロセシングする能力によって選択される。このようなポリペプチドの修飾には、以下に限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びアシル化が含まれる。タンパク質の「ｐｒｅｐｒｏ」形を切断する翻訳後プロセシングを用いて、タンパク質の標的、折り畳み及び／又は活性を特定することができる。翻訳後の活性のための特定の特徴的な機構及び細胞装置を有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、及びＷＩ３８）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）より入手可能であり、外来性のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０１１７】
本発明の別の実施例では、ＨＣＳＲＰをコードする天然の核酸、改変された核酸、又は組換えの核酸配列を、前述の任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させ得る。例えば、市販の抗体によって識別できる異種部分を含むキメラＨＣＳＲＰタンパク質が、ＨＣＳＲＰの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、市販の親和性の基質を用いて、異種タンパク質及びペプチド部分が、融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分には、以下に限定されるものではないが、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれる。ＧＳＴ、ＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、及び６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物、カルモジュリン、及び金属キレート樹脂の各々で同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に識別する市販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性の精製が可能である。また、ＨＣＳＲＰをコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置するタンパク質切断部位を融合タンパク質が含むように、融合タンパク質が操作されて、精製の後にＨＣＳＲＰが異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法については、Ａｕｓｕｂｅｌの文献（１９９５， 前出， ｃｈ １０）に記載されている。また、融合タンパク質の発現及び精製の促進のために、種々の市販のキットを用いることができる。
【０１１８】
本発明の更に別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液又はコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＨＣＳＲＰの合成を行なうことができる。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳を結びつける。転写は放射能標識されたアミノ酸前駆体（好ましくは３５Ｓ−メチオニン）の存在の下で起こる。
【０１１９】
組換え体の生成だけでなく、固相技術を用いた直接のペプチド合成によって、ＨＣＳＲＰの断片を作り出すことができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， 前出 ｐｐ．５５−６０を参照）。タンパク質合成は手作業又は自動で行なうことができる。自動化された合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行うことができる。ＨＣＳＲＰの種々の断片を個別に合成して、次に結合させて完全長分子を作り出すことも可能である。
【０１２０】
治療
ヒト細胞表面受容体タンパク質とＨＣＳＲＰの領域との間には、（例えば、配列及びモチーフの前後関係において）化学的及び構造的類似性が存在する。更に、ＨＣＳＲＰの発現は、肺、胸腺、膀胱、精嚢及び陰茎組織や、リウマチ様関節炎や、炎症、癌及び神経系と密接な関係を有する。従って、ＨＣＳＲＰは、細胞増殖障害、免疫系異常、感染症及び神経細胞障害において一定の役割を果たしていると考えられる。ＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＨＣＳＲＰの発現若しくは活性を低下させることが望ましい。ＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＨＣＳＲＰの発現若しくは活性を増大させることが望ましい。
【０１２１】
従って、一実施例においては、ＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防のためにＨＣＳＲＰ又はその断片若しくは誘導体を患者に投与することができる。そのような疾患の例には、以下に限定しないが、日光性角化症及び動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌等の細胞増殖障害；並びに炎症、日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群や、癌、血液透析及び体外循環の合併症や、外傷や、リンパ腫、白血病及び骨髄腫を含めた造血性の癌等の免疫系異常；並びにアデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、パラミキソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス及びトガウイルスに分類されるウイルス病原体による感染や、肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、コリネバクテリウム、クロストリジウム属、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラクセラ属、キンゲラ、ヘモフィルス属、レジオネラ、ボルデテラ、グラム陰性腸内細菌（赤痢菌属及びサルモネラ、カンピロバクターを含む）、シュードモナス、ビブリオ属、ブルセラ、フランシセラ、エルシニア、バルトネラ、ｎｏｒｃａｒｄｉｕｍ、アクチノミセス、ミコバクテリア、スピロヘターレス、リケッチア、クラミジア及びマイコプラズマに分類される細菌病原体による感染や、コウジカビ、ブラストマイセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、ｍａｌａｓｅｚｚｉａ、ヒストプラスマ及び様々な真菌症を引き起こすその他の真菌病原体に分類される真菌病原体による感染や、プラスモディウム又はマラリアを引き起こす体内寄生性アメーバ、レーシュマニア、トリパノソーマ属、トキソプラズマ、ニューモシスチス‐カリニ、ジアルジア属などの腸内原生動物、トリコモナス、旋毛虫などの組織線形動物、回虫属などの腸内線形動物、リンパのフィラリア性線形動物並びに住血吸虫及び条虫（サナダムシ）などの線形動物に分類される寄生虫による感染等の感染症；並びに静座不能、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側策硬化、双極性障害、緊張病、脳腫瘍、痴呆、鬱病、糖尿病性ニューロパシー、ダウン症候群、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、てんかん、ハンチントン病、末梢神経疾患、多発性硬化症、神経線錐腫症、パーキソン病、妄想性精神病、帯状疱疹後神経痛、分裂症、及びトゥーレット病等の神経細胞障害が含まれる。
【０１２２】
別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防のために、ＨＣＳＲＰ又はその断片若しくは誘導体を発現可能なベクターを患者に投与してもよい。
【０１２３】
また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防のために、適切な医薬用担体と共に精製されたＨＣＳＲＰを含む医薬品組成物を患者に投与してもよい。
【０１２４】
また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防のために、ＨＣＳＲＰの活性を調節するアゴニストを患者に投与してもよい。
【０１２５】
更に別の実施例においては、ＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療又は予防のために、ＨＣＳＲＰのアンタゴニストを患者に投与してもよい。そのような疾患の例には、以下に限定はしないが、上述の細胞増殖障害、免疫系異常、感染症及び神経細胞障害が含まれる。一実施態様では、ＨＣＳＲＰと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いるか、或いはＨＣＳＲＰを発現する細胞や組織に薬剤をもたらす送達機構又はターゲティングとして間接的に用いることができる。
【０１２６】
別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むＨＣＳＲＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療又は予防のために、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現可能なベクターを患者に投与してもよい。
【０１２７】
他の実施例においては、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的配列又はベクターの何れかを、他の適切な治療薬と組合せて投与することもできる。当業者は従来の製薬の原理に基づいて併用療法で使用するための適切な薬剤を選択することができるであろう。治療薬を組み合わせることにより、上述の種々の反応の治療又は予防に効果を与えるように相乗剤的に機能し得る。この方法を用いることにより、より少ない各薬剤の投与量で治療効果を上げることができ、従って副作用の可能性を低下させることができる。
ＨＣＳＲＰのアンタゴニストは、当業者に周知の方法を用いて製造することができる。詳細には、精製されたＨＣＳＲＰを用いて抗体を作り出したり、或いはＨＣＳＲＰに特異的に結合するものを同定するために、薬剤のライブラリーをスクリーニングすることができる。ＨＣＳＲＰの抗体は、当業者によく知られた方法を用いて産生することができる。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーにより作られたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち、二量体形成を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。
【０１２８】
抗体を産生するために、ＨＣＳＲＰか、免疫学的特性を有するその任意の断片或いはそのオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿主を免疫化することができる。ラット及びマウスは、モノクロナール抗体生成を含むダウンストリーム適用のための宿主として好ましい。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増強するために種々のアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバントには、以下に限定しないが、フロイントのアジュバント、アルミニウムの水酸化物ようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ＫＬＨ及びジニトロフェノールが含まれる。ヒトで使用するアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【０１２９】
ＨＣＳＲＰの抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド又はその断片は、少なくとも５個のアミノ酸、また一般的には少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらのオリゴペプチド、ペプチド、又は断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一で、小形の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。ＨＣＳＲＰアミノ酸の短い伸展部が、ＫＬＨのような別のタンパク質の伸展部と融合し、キメラ分子の抗体が産生され得る。
【０１３０】
ＨＣＳＲＰのモノクローナル抗体は、培養における持続的な細胞株によって抗体分子を産生させる任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下に限定しないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．ら（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． ら（１９８５） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１ ：３１−４２；Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． ら（１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． ら（１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０参照）。
【０１３１】
更に、適切な抗原特異性及び生物活性を備えた分子を得るために、ヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングする技術のような「キメラ抗体」の産生のために開発された技術を用いることができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ． ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ， Ｓ． ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４参照）。或いは、当業者に周知の方法を用いて単鎖の抗体の生成のための技術を適用して、ＨＣＳＲＰに特異的な単鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を有するがイディオタイプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリーからの鎖混合（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって産生することができる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ．（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１０１３４−１０１３７参照）。
【０１３２】
抗体は、免疫グロブリンライブラリー又は高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより、或いはリンパ球集団でのｉｎ ｖｉｖｏの産生を誘導することにより産生することができる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら（１９８９）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６：３８３３−３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ．ら（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９参照）。
【０１３３】
またＨＣＳＲＰに対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも作り出すことができる。例えばこのような断片には、以下に限定はしないが、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントや、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるＦａｂフラグメントが含まれる。或いは、所望の特異性を備えたモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定可能なように、Ｆａｂ発現ライブラリーを構成し得る（例えば、Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．ら（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１参照）。
【０１３４】
種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングに用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射線測定法の多数のプロトコルが、当技術分野で周知である。このようなイムノアッセイには、一般にＨＣＳＲＰとその特異的な抗体との間の複合体の形成の測定が含まれる。２つの非干渉ＨＣＳＲＰエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる２部位のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイ（ｔｗｏ ｓｉｔｅｓ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が通常は用いられるが、競合的結合アッセイも用いられ得る（Ｐｏｕｎｄ， 前出）。
【０１３５】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析等の種々の方法を用いて、ＨＣＳＲＰ抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態におけるＯＰ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったものとして定義される。多数のＨＣＳＲＰエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナール抗体試薬に対して測定されたＫａは、ＨＣＳＲＰ抗体の平均親和性又は結合活性を表す。特定のＨＣＳＲＰエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬に対して測定されたＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａの値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高い親和性の抗体試薬は、ＨＣＳＲＰ抗体複合体が厳密な操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａの値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低い親和性の抗体試薬は、最終的にＨＣＳＲＰが活性化状態で抗体から解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ．及びＣｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０１３６】
ポリクロナール抗体試薬のタイター及び結合活性を更に評価して、ある一定のダウンストリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適合性を判定する。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクロナール抗体試薬が、ＨＣＳＲＰ抗体複合体の沈殿を必要とする方法に通常は使用される。種々の適用における抗体の特異性、タイター、及び結合活性に対する処理、並びに抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である （例えば、Ｃａｔｔｙ， 前出、及びＣｏｌｉｇａｎら， 前出を参照）。
【０１３７】
本発明の別の実施例では、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド、又はその任意の断片や相補配列を、治療を目的として用いることができる。一態様では、ｍＲＮＡの転写を阻害することが望ましい状況において、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列を用いることができる。詳細には、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。従って、ＨＣＳＲＰの活性を調節する、或いは遺伝子の機能を調節するために、相補的な分子又は断片を用いることができる。現在このような技術は周知であり、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きな断片を、ＨＣＳＲＰをコードする配列のコード領域や調節領域に従って様々な位置から設計可能である。
【０１３８】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニアウイルスに由来する、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、組織、即ち細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得る。当業者に周知の方法を用いて、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を発現するためのベクターを産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， 前出、及びＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５， 前出 参照）。
【０１３９】
ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド又はその断片を高レベルで発現する発現ベクターで細胞又は組織を形質転換させることによって、ＨＣＳＲＰをコードする遺伝子を作り出すことができる。このような作製物は、翻訳不能なセンス配列或いはアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることができる。ＤＮＡへ組み込みが存在しない場合でも、このようなベクターは、それらが内在性のヌクレアーゼにより無能となるまで、ＲＮＡ分子を転写し続け得る。一過性の発現は、非複製ベクターでも１ヶ月以上、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合にはさらに長い期間持続し得る。
【０１４０】
前述のように、ＨＣＳＲＰをコードする遺伝子の制御、５’、又は調節領域に対する相補配列、つまりアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡ）を設計することによって、遺伝子発現を変更することができる。転写開始点（例えば、開始部位から＋１０〜−１０の位置）に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、三重らせん体の塩基対形成方法論を用いて、阻害を達成することができる。ポリメラーゼ、転写制御因子、或いは調節分子の結合のために二重らせんが十分にほどける能力を阻害するので、三重らせん対合は有用である（例えば、Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ．ら（１９９４）Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．及びＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，ＮＹ，ｐｐ．１６３−１７７参照）。転写物のリボソームへの結合を阻止することによりｍＲＮＡの転写を阻害するために、相補的配列、即ちアンチセンス分子を設計し得る。
【０１４１】
リボザイム、つまり酵素ＲＮＡ分子を用いてＲＮＡの特異的切断を触媒することができる。リボザイム作用機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列の特異的ハイブリダイゼーションに関与し、その後のヌクレオチド鎖切断が行なわれる。例えば、操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、ＨＣＳＲＰをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効果的に触媒し得る。
【０１４２】
任意の潜在的なＲＮＡ標的物内の特異的なリボザイム切断部位は、最初、後続する配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、そのオリゴヌクレオチドを動作不能（ｉｎｏｐｅｒａｂｌｅ）とする２次の構造的特徴について評価することができる。また候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を用い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する接触性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の検査により評価することができる。
【０１４３】
本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するのための当技術分野で周知の方法により作り出すことができる。これらには、固相ホスホラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成のための技術が含まれる。或いは、ＲＮＡ分子は、ＨＣＳＲＰをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの転写により作り出すことができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを伴う多様なベクターに取り込むことができる。或いは、構成的又は誘導的に相補的なＲＮＡを合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、株化細胞、細胞又は組織内に導入することができる。
【０１４４】
細胞内の安定性を高め、また半減期を長くするために、ＲＮＡ分子は修飾することができる。可能な修飾としては、以下に限定しないが、その分子の５′末端及び／又は３’末端でのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート或いは２′Ｏ−メチルを使用を含む。この概念はＰＮＡ生成において固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンの、アセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態だけでなく、イノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、及びワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）のような従来よりあまり用いられない塩基を含めることにより、これら全ての分子に拡張可能である。
【０１４５】
細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能で、同様にｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏでの使用にも適している。ｅｘ ｖｉｖｏでの治療法のに対し、ベクターを患者から採取された幹細胞に導入し、自己移植して同じ患者に戻すためにクローンとして増殖させることができる。トランスフェクションによるデリバリー、或いはリポソーム注入又はポリカチオンアミノポリマーによるデリバリーは、当技術分野でよく知られた方法を用いて実施することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ．ら（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−４６６参照）。
【０１４６】
前述の治療法は何れも、例えばヒト、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ及びサル等の哺乳類を含む、治療が必要な任意の対象に適用することができる。
【０１４７】
本発明の更なる実施例では、前述の任意の治療効果のために、医薬成分を薬剤上受け入れられる担体とともに投与する。このような医薬成分は、ＨＣＳＲＰ、ＨＣＳＲＰの抗体、ＨＣＳＲＰの模倣体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものでありうる。この成分は、単体或いは例えば安定化する配合ような１以上の他の薬剤とともに、任意の無菌の生体適合性の医薬用担体に投与され、その担体には、以下に限定しないが、生理食塩水、バッファー食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。このような組成物は、単体或いは他の薬剤、ドラッグやホルモンと結合した形で患者に投与されうる。
【０１４８】
本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下に限定されないが、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所的投与、舌下投与、或いは直腸投与が含まれ得る。
【０１４９】
有効成分に加えて、これらの医薬成分は、有効成分を医薬上使用できる製剤にするための処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む、適切な医薬上認められる担体を含みうる。更に、製剤或いは投与に関する技術の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）の最新版に記載されている。
【０１５０】
経口投与のための医薬品組成物は、当技術分野でよく知られる医薬上認められる担体を用いて、経口投与に適当な投与量に配合される。このような担体により、医薬品組成物を患者に摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等に調剤できる。
【０１５１】
経口投与用の医薬製剤は、有効成分と固形の賦形剤とを配合して、（所望により、粉砕した後に）得られた顆粒の混合物を処理して錠剤或いは糖衣剤コア（ｄｒａｇｅｅ ｃｏｒｅ）を作ることによって得られる。必要ならば、適切な添加物が加えることができる。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質又はタンパク質賦形剤や、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプンや、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロースや、アラビアゴム或いはトラガカントゴムのようなゴムや、並びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。必要ならば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤又は可溶化剤を加えてもよい。
【０１５２】
糖衣丸コアは、濃縮糖液のような適切な剤皮と共に用いられるが、それらにはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤（ｃａｒｂｏｐｏｌ ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール及び／又はチタンの二酸化物、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤の混合物等が含まれる。錠剤の識別のため、或いは有効成分の量（即ち投与量）を特徴づけるために、染料或いは色素を錠剤或いは糖衣錠皮に加えることができる。
【０１５３】
経口投与できる製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ゼラチンからなる軟性のシールされたカプセル及びグリセロール或いはソルビトールのような錠皮が含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤又は結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、及び所望により安定剤と混合された有効成分を含みうる。軟性カプセルにおいて、有効成分は、安定剤とともに或いは安定剤なしに、脂肪性の油、液体又は液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸濁される。
【０１５４】
非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液中で、好適にはハンク溶液、リンゲル溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合するバッファーの中で配合することができる。水性の注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランのような懸濁液の粘性を高める物質を含みうる。更に、有効成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製してもよい。適切な親油性の溶媒或いは賦形剤には、胡麻油のような脂肪性の油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルが含まれる。また非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、送達のために用いられる。所望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて濃縮度の高い溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は薬剤を含んでもよい。
【０１５５】
局所又は経鼻投与用には、浸透する特定の障壁に対して適切な浸透剤が調合に用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において周知のものである。
【０１５６】
本発明の医薬組成物は周知の方法、例えば通常の混合処理、溶解処理、顆粒化処理、糖衣形成処理、湿式粉砕処理（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化処理、カプセル化処理、エントラップ処理（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）或いは凍結乾燥処理により製造される。
この医薬組成物は塩類として提供されることもあり、以下に限定しないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸とともに形成することができる。塩は水性或いはプロトニック溶剤において、対応する遊離塩基形態よりも溶解性が高くなる傾向がある。別のケースでは、好適な製剤としては、使用前に緩衝剤配合したｐＨ４．５〜５．５の範囲にある１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、２％〜７％のマンニトールの何れか、或いは全てを含む凍結乾燥粉末でもよい。
【０１５７】
医薬組成物は調製された後に適切な容器内に入れられて、指示された状態の治療のためにラベル付けできる。ＨＣＳＲＰの投与の場合では、このようなラベルには、投与量、投与頻度、投与方法が表示される。
【０１５８】
本発明において使用するのに適する医薬品組成物は、所望の目的を達成するために有効成分を効果的な量だけ含む成分を含んでいる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内で十分行うことができる。
【０１５９】
任意の化合物の場合、治療に有効な量は、最初は例えばマウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデル又は腫瘍性細胞の何れかの細胞培養のアッセイにおいて見積もることができる。また、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために動物モデルを用いることができる。次にこのような情報を利用して、ヒトにおける投与量や投与経路を決定することができる。
【０１６０】
治療的に有効な量とは、例えば、症状や状態を回復させるＨＣＳＲＰ又はその断片、ＨＣＳＲＰの抗体、ＨＣＳＲＰのアゴニスト、ＨＣＳＲＰのアンタゴニスト、又はＨＣＳＲＰのインヒビターの有効成分の量を指す。治療的な効力及び毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬方法により、例えばＥＤ５０（母集団の５０％における治療的な有効投与量）又はＬＤ５０（母集団の５０％の致死投与量）統計量を計算することによって決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０ ／ ＥＤ５０比として表すことができる。医薬品組成物は大きな治療指数を示すことが好ましい。細胞培養のアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの使用のための投与量の範囲をまとめるのに用いることができる。そのような成分の投与量は、毒性が少ないか或いは全く毒性がなく、ＥＤ５０を含む循環する濃度の範囲内にあることが好ましい。使用する剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じて、投与量はこの範囲内で変化する。
【０１６１】
正確な用量は、治療が必要な患者に関連する要因を考慮して医師が決定する。投与及び投薬量は、十分なレベルの有効成分を与える、即ち所定の効果を維持するために調節される。考慮すべき要因としては、疾病状態の重症度、全般的な患者の健康、年齢、体重、性別や、食餌、投与の時間及び頻度や、併用する薬剤、反応感受性、及び治療への反応が含まれる。長時間作用性の医薬品組成物は、半減期及び特定の製剤のクリアランス率に応じて３〜４日毎に、１週間毎に、或いは２週間に１度投与してもよい。
【０１６２】
通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲であり、最大約１ｇの総投与量まで、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは送達の方法のガイダンスは文献において提供され、通常当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やインヒビター用の製剤とは異なる製剤を採用することができる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に対して特異的でありうる。
【０１６３】
診断
別の実施例においては、ＨＣＳＲＰに特異的に結合する抗体を、ＨＣＳＲＰの発現によって特徴づけられる疾患の診断や、ＨＣＳＲＰ又はＨＣＳＲＰのアゴニスト、アンタゴニスト若しくはインヒビターで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイに用いることができる。診断目的に対して有用な抗体は、前述の治療のためのものと同様の方法で作製することができる。ＨＣＳＲＰの診断のアッセイには、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物においてＨＣＳＲＰを検出するために抗体及び標識を用いる方法が含まれる。抗体は修飾しても、修飾なしでも用いることができ、また共有結合或いは非共有結合かのいずれかによりリポーター分子と結合させて標識することができる。当業者に周知の多様なリポーター分子が用いられ、そのうちの幾つかについては前述の通りである。
【０１６４】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む、ＨＣＳＲＰを測定するための種々のプロトコルが当技術分野では周知であり、またこれによりＨＣＳＲＰ発現の変化や異常性のレベルを診断するための基礎が得られる。ＨＣＳＲＰの発現の正常値、即ち標準値は、複合体形成に適した条件下で、哺乳類（例えば、人間の被検者）の正常な患者から得られる体液或いは細胞抽出物とＨＣＳＲＰの抗体を結合させることによって確立できる。標準の複合体形成量は、測光手段等の種々の方法を用いて定量化できる。患者の生検組織からの対照サンプル及び患部サンプルにおいて発現されたＨＣＳＲＰの量を、標準値と比較する。標準値と患者の値との偏差によって疾病診断のためのパラメータを確立する。
【０１６５】
本発明の別の実施例において、ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドを、診断の目的で用いることができる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドは、ＨＣＳＲＰの発現が疾病と関連するであろう生検組織における遺伝子発現の検出や定量のために用いられる。診断アッセイは、ＨＣＳＲＰが存在、非存在、過剰発現の何れの状態かを識別したり、治療の処置の際にＨＣＳＲＰレベルの調節をモニタリングするために用いることができる。
【０１６６】
一態様では、ＨＣＳＲＰ又は密接に関連分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを用いて、ＨＣＳＲＰをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブの特異性、つまりそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば、５’調節領域）に由来するか、或いはより特異性の度合いの低い領域（例えば、保存されたモチーフ）の何れに由来するかによって、またハイブリダイゼーション或いは増幅の（最大の、高い、中程度の、或いは低い）厳密性によって、そのプローブがＨＣＳＲＰをコードする自然発生の配列のみを同定するか、或いはアレルや関連する配列も同定するかが決定される。
【０１６７】
プローブは関連する配列を検出するためにも用いることができ、また好ましくはＨＣＳＲＰをコードする任意の配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡか、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の配列に由来するものか、或いはＨＣＳＲＰ遺伝子のイントロン、エンハンサー、及びプロモータを含むゲノムの配列に由来するものでもよい。
【０１６８】
ＨＣＳＲＰをコードするＤＮＡのための特異的なハイブリダイゼーションプローブを作製するための手段には、ｍＲＮＡプローブを作り出すためにＨＣＳＲＰ又はＨＣＳＲＰ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローンニングする方法がある。このようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼや適切な標識されたヌクレオチドを付加することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータグループにより標識され、例えば、その標識は、３２Ｐや３５Ｓのような放射性核種によるものや、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素による標識等である。
【０１６９】
ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＨＣＳＲＰの発現に関連する疾患の診断のために用いることができる。そのような疾患の例としては、以下に限定はしないが、日光性角化症及び動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌等の細胞増殖障害；並びに炎症、日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群や、癌、血液透析及び体外循環の合併症や、外傷や、リンパ腫、白血病及び骨髄腫を含めた造血性の癌等の免疫系異常；並びにアデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、パラミキソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス及びトガウイルスに分類されるウイルス病原体による感染や、肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、コリネバクテリウム、クロストリジウム属、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラクセラ属、キンゲラ、ヘモフィルス属、レジオネラ、ボルデテラ、グラム陰性腸内細菌（赤痢菌属及びサルモネラ、カンピロバクターを含む）、シュードモナス、ビブリオ属、ブルセラ、フランシセラ、エルシニア、バルトネラ、ｎｏｒｃａｒｄｉｕｍ、アクチノミセス、ミコバクテリア、スピロヘターレス、リケッチア、クラミジア及びマイコプラズマに分類される細菌病原体による感染や、コウジカビ、ブラストマイセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、ｍａｌａｓｅｚｚｉａ、ヒストプラスマ及び様々な真菌症を引き起こすその他の真菌病原体に分類される真菌病原体による感染や、プラスモディウム又はマラリアを引き起こす体内寄生性アメーバ、レーシュマニア、トリパノソーマ属、トキソプラズマ、ニューモシスチス‐カリニ、ジアルジア属などの腸内原生動物、トリコモナス、旋毛虫などの組織線形動物、回虫属などの腸内線形動物、リンパのフィラリア性線形動物並びに住血吸虫及び条虫（サナダムシ）などの線形動物に分類される寄生虫による感染等の感染症；並びに静座不能、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側策硬化、双極性障害、緊張病、脳腫瘍、痴呆、鬱病、糖尿病性ニューロパシー、ダウン症候群、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、てんかん、ハンチントン病、末梢神経疾患、多発性硬化症、神経線錐腫症、パーキソン病、妄想性精神病、帯状疱疹後神経痛、分裂症、及びトゥーレット病等の神経細胞障害が含まれる。ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチド配列を、患者の生検組織や体液を利用するサザンブロット法又はノーザン解析、ドットブロット法或いは他の膜をベースとした技術や、ＰＣＲ技術や、ディップスティック試験法（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン及びマルチフォーマットＥＬＩＳＡ様アッセイや、マイクロアレイにおいて用いて、ＨＣＳＲＰ発現の変化を検出することができる。このような定性的又は定量的試験法は当業者に周知のものである。
【０１７０】
特定の態様では、特に上述のような関連疾患の存在を検出するアッセイにおいて、ＨＣＳＲＰをコードするヌクレオチド配列は有用であり得る。ＨＣＳＲＰをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、またハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で、患者からの体液や組織サンプルに加えることができる。適当なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、対照サンプルに比べて有意に変化している場合、サンプルのなかのＨＣＳＲＰをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化は、関連する疾患の存在を示している。また、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、又は個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療学的な処置法の有効性を評価することもできる。
【０１７１】
ＨＣＳＲＰの発現に関連する疾病の診断のための基礎を提供するために、正常な、即ち標準の発現のプロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適した条件下で、動物又はヒト何れかの正常な患者から採取された体液或いは細胞抽出物をＨＣＳＲＰをコードする配列又はその断片と結合させることにより達成される。標準のハイブリダイゼーションは、正常な患者から得られる値と、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを用いる実験から得られる値とを比較することにより定量することができる。このように正常なサンプルから得られた標準値は、疾病の徴候がある患者のサンプルから得られる値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾病の存在を証明する。
【０１７２】
一旦疾患の存在が確認されて治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイが定期的に繰り返され、患者の発現のレベルが正常な患者で観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価できる。連続的なアッセイから得られる結果を用いて、数日から数ヶ月にわたる治療の効果を示すことができる。
【０１７３】
癌に関しては、個体からの生検組織における異常な量の転写物（不十分若しくは過剰に発現されたもの）の存在が、疾病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出するための手段となり得る。このタイプのより決定的な診断により、健康の専門家が予防的処置を講じたり、より早期に積極的な治療を行なうことが可能となり、故に癌の発生や更なる進行を予防することができる。
【０１７４】
ＨＣＳＲＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの更なる診断のための使用法には、ＰＣＲ法の利用が含まれる。これらのオリゴマーは化学的に合成されるか、酵素を用いて作製されるか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで作製されてもよい。オリゴマーは、好ましくはＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドの断片、又はＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定の遺伝子或いは状態を同定するための最適化された条件の下で用いられる。また密接に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ配列の検出及び／又は定量のために、オリゴマーは緩やかな厳密性の条件で用いることができる。
【０１７５】
またＨＣＳＲＰ発現を定量するために用いられる方法には、放射標識或いはビオチン化したヌクレオチドの利用、対照核酸の同時増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の利用、及び標準の検量線で補間する実験結果の利用が含まれる（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．ら（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−２４４；Ｄｕｐｌａａ， Ｃ． ら（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６参照）。多数のサンプルの定量の速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈溶液中に存在し、分光光度法又は比色定量応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ形式のアッセイを実施することによって加速することができる。
【０１７６】
別の実施例においては、ここに開示した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチド又はより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に多くの遺伝子の発現レベルをモニタし、また遺伝子の変異配列、変異及び多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的基礎の理解、疾病の診断、並びに治療薬の開発及びその活性のモニタリングにおいて有用である。
【０１７７】
マイクロアレイが準備され、それを用いて当業者に周知の方法で分析してもよい（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ．ら（１９９５） Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ＮＯ． ５，４７４，７９６； Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．ら（１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら（１９９５） ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｍ Ｄ．ら （１９９５） ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９５／３５５０５： Ｈｅｌｌｅｒ． Ｒ．Ａ． ら（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； 並びにＨｅｌｌｅｒ． Ｍ．Ｊ．ら（１９９７） Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６０５，６６２を参照）。
【０１７８】
本発明の別の実施例においては、ＨＣＳＲＰをコードする核酸配列を用いて、自然発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作り出すことができる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の部分、又は人工染色体作製物にマッピングすることができ、その人工染色体作製物には、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣｓ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１作製物又は一本鎖染色体ｃＤＮＡライブラリーがある（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ．ら（１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：Ｉ２７−１３４； 並びにＴｒａｓｋ． Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４を参照）。
【０１７９】
蛍光性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的な染色体マッピング技術や遺伝地図データと関連し得る（例えば、Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈら（１９９５）ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， 前出， ｐｐ．９６５−９６８を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学誌、又はＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂサイトに見られる。物理的な染色体地図上のＨＣＳＲＰをコードする配列の位置及び特定の疾病、若しくは特定の疾病の素因との関連性が、疾患に関係するＤＮＡの領域の範囲を定めるのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリア、また発症した個体との間の遺伝子配列の違いを検出することができる。
【０１８０】
遺伝地図を拡大するために、染色体作製物のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術を用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知であっても、マウスのような別の哺乳類の染色体上の遺伝子配置によって関連するマーカーが明らかになる。物理的マッピングによって、新たな配列を染色体のアーム、或いはその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニング又は別の遺伝子発見技術を用いて、疾病遺伝子を検索する研究者に価値ある情報を提供できる。ひとたび疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域（例えば、１１ｑ２２−２３に対する毛細血管拡張性運動失調 ）への遺伝連鎖による不完全な位置ぎめがなされると、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子又は調節遺伝子を表し得る（例えば、Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．ら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０参照）。また、本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者の染色体の位置と、キャリア、又は発症した個体の、転座、逆位等によって生じた染色体の位置との違いを検出することもできる。
【０１８１】
本発明の別の実施例においては、ＨＣＳＲＰや、その触媒作用性又は免疫原性断片、又はそれらのオリゴペプチドを、種々の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリーのスクリーニングのために用いることができる。そのようなスクリーニングにおいて用いられる断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体へ付着しているか、細胞表面へ付着しているか、或いは細胞内に位置しているものであり得る。ＨＣＳＲＰと試験する薬剤との結合複合体の形成を測定することができる。
【０１８２】
別の薬物スクリーニング技術によって、目的のタンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングが提供される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４） ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０３５６４参照）。この方法においては、多くの異なる小形の試験化合物が固体基板において合成される。試験化合物をＨＣＳＲＰ又はその断片と反応させ、そして洗浄する。次に、当技術分野で周知の方法で結合ＨＣＳＲＰを検出する。また、前述の薬剤スクリーニング技術において使用するために、精製されたＨＣＳＲＰをプレート上に直接コーティングすることもできる。或いは、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉して固体支持体上に固定することができる。
【０１８３】
別の実施例においては、ＨＣＳＲＰの結合のためにＨＣＳＲＰと結合可能な中和抗体が試験化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法において、抗体を用いて、１以上の抗原決定基をＨＣＳＲＰと共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
【０１８４】
更に別の実施例においては、その新技術が、以下に限らないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のようなものを含め現在周知のヌクレオチド配列の特性に基づくものであれば、ＨＣＳＲＰをコードするヌクレオチド配列を、未だ開発されていない分子生物学的技術に用いることができる。
【０１８５】
当業者は、更なる説明がなくても前述の説明によって本発明を十分に利用できるであろう。従って、以下に記す特定の好適実施例は、単なる例示であって本発明を限定するものではない。
【０１８６】
本明細書に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、並びに米国特許出願［代理人明細書番号ＰＦ−０６３６Ｐ］（１９９８年１１月１２日出願）、米国特許出願［代理人明細書番号ＰＦ−０６５０Ｐ］（１９９８年１２月７日出願）及び米国特許出願第６０／１２３，４０４号については、ここで言及することにより本明細書の一部とする。
【０１８７】
【実施例】
１  ｃＤＮＡライブラリーの作製
ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入したものか、表４に示した組織から単離したもである。幾つかの組織を均質化してグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、一方では別の組織を均質化してフェノールに溶解するか、或いはＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液等の適切な変性剤の混合液に溶解した。結果として得られた溶解産物をＣｓＣｌクッションでの遠心分離又はクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムの何れかとエタノールで、或いは別の通常の方法でこの溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０１８８】
ＲＮＡのフェノール抽出及び沈殿を必要な回数繰り返してＲＮＡの純度を高めた。場合によっては、ＲＮＡをＤＮＡ分解酵素で処理した。殆どのライブラリーでは、ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）結合常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）、又はＯＬＩＧＯＴＥＸＴＭ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｐｏｌｙ（Ａ＋） ＲＮＡを単離した。或いは、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）等の別のＲＮＡ単離キットを用いてＲＮＡを組織溶解産物から直接単離した。
【０１８９】
場合によっては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社にＲＮＡを提供してそれに対応するｃＤＮＡライブラリーを作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰＴＭベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ プラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて当業者に周知の推奨された方法若しくは類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリーを作製した。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７，前出， ｕｎｉｔｓ ５．１−６．６を参照）。ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）又はランダムプライマーを用いて逆転写を開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを２本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、適切な（複数の）制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、 ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２Ｂ、若しくはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、又は分離用のアガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ（３００〜１０００ｂｐ）を選択した。適切なプラスミド（例えば、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又はｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ） 等）のポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを結合させた。組換えプラスミドを、例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ、若しくはＳＯＬＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、又はＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、若しくはＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。
【０１９０】
２  ｃＤＮＡクローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又は細胞溶解を利用して、ｉｎ ｖｉｖｏでの切除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。Ｍａｇｉｃ若しくはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、及びＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム又はＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキット（ＱＩＡＧＥＮ）のうちの少なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿の後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０１９１】
或いは、高スループットフォーマットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解産物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｌｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で実施した。サンプルを処理して３８４−ウエルプレートで保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光定量的に測定した。
【０１９２】
３  配列決定及び分析
ｃＤＮＡシークエンシング反応は、標準的な方法或いはＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ若しくはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）等の高スループットの機器とＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）若しくはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ｌｉｑｕｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍとを共に用いて処理した。ｃＤＮＡシークエンシング反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社によって提供された試薬か、又はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のようなＡＢＩシークエンシングキットに供給された試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡシークエンシング反応の電気泳動的な分別及び標識したポリヌクレオチドの検出は、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）；ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３若しくは３７７シークエンシングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）と標準的なＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアとの組合せ；又は当業者に周知の他の配列分析システムを用いて実施した。ｃＤＮＡ配列中の読み枠は、標準的な方法を用いて識別した（Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７， 前出， ｕｎｉｔ ７．７のレビュー）。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、本実施例の５に記載した方法で伸長した。
【０１９３】
周知のアルゴリズムを利用するソフトウェアプログラムを組合せて用いて、ｃＤＮＡシークエンシングから得られたポリヌクレオチド配列を構築及び分析した。表５は、利用したツール、プログラム、及びアルゴリズムの概要、並びに適切な説明、引用文献、及び閾値パラメータを示す。表５の第１列は用いたツール、プログラム、及びアルゴリズムであり、第２列はそれらの簡単な説明であり、第３列は引用文献（それらの全てはここで言及することにより本明細書の一部とする）であり、第４列は２つの配列間の一致の程度の評価に用いた適切なスコア、確率値、及び他のパラメータである（スコアが高いほど２つの配列間の相同性が高い）。配列は、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アライメントは、整列した配列間の同一性％を計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシーケンス・アライメント・プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組込まれたｃｌｕｓｔａｌアルゴリズムによって指定されたデフォルトのパラメータを用いて作成した。
【０１９４】
ポリヌクレオチド配列の確証は、ＢＬＡＳＴ、動的計画法及びジヌクレオチド最近接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター、リンカー及びポリＡ配列を取除き、多義性の塩基対をマスクすることによって実施した。次に、配列をＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＩＭＰＳに基づくプログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物及び真核生物のデータベースや、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰＦＡＭ等の公共のデータベースでから選択した配列に対して問合わせて注釈を得た。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ及びＣｏｎｓｅｄに基づくプログラムを用いて配列を完全長のポリヌクレオチドに構築し、ＧｅｎｅＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡに基づいたプログラムを用いて読み枠にスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、続いてその完全長のポリヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース（前述）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、Ｐｒｏｓｉｔｅ及び隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づくＰＦＡＭなどのタンパク質ファミリーデータベースに問い合わせることによって分析した。ＨＭＭは、遺伝子ファミリーの共通一次構造を解析する確率的アプローチである（例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照）。
【０１９５】
完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析のための上述のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも使用した。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約２０から約４０００までのヌクレオチドの断片については、前述の「発明」の部分で説明した。
【０１９６】
４  ノーザン解析
ノーザン解析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織に由来するＲＮＡが結合しているメンブレンと、標識されたヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションに関わる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出， ｃｈ．７；並びにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら前出， ｃｈ．４及び１６参照）。
【０１９７】
ＢＬＡＳＴを使用する類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）等のヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は、多くのメンブレンをベースとしたハイブリダイゼーションに比べてより高速である。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは類似の何れとして分類されるかを決定することができる。
検索の基準は、以下で定義される積スコア（ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｃｏｒｅ）である。
（配列一致％×最大ＢＬＡＳＴスコア％）／１００
積スコアは、２つの配列間の類似の程度及び配列一致の長さの両方を考慮に入れる。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２％誤差の範囲内の正確さであり、積スコア７０の場合は正確な一致となる。類似の分子は通常１５〜４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでは関連した分子として同定される。
【０１９８】
ノーザン解析の結果は、ＨＣＳＲＰをコードする転写物が発生したライブラリーの割合の分布として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるｃＤＮＡライブラリーの分類が含まれる。器官／組織の分類には、心血管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖及び泌尿器が含まれる。疾病／症状の分類には、癌、炎症／心的外傷、細胞増殖、神経及び貯留（ｐｏｏｌｅｄ）が含まれる。各カテゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリーを数えて、カテゴリー全体にわたるライブラリーの合計数で割った。各組織に特異的な発現ならびに疾病、疾患若しくは症状に特異的な発現の割合を表３に示した。
【０１９９】
５  ＨＣＳＲＰをコードするポリヌクレオチドの伸長
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片を伸長してこの断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５’の伸展を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の伸展を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２〜３０個のヌクレオチドからなる長さであって５０％以上のＧＣ含有物を有し、且つ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにｃＤＮＡから設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー２量体を生ずるようなヌクレオチドの如何なる伸長も回避した。
【０２００】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリーを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要であるか、又は望ましい場合には、プライマーの付加的な或いはネストした組を設計する。
【０２０１】
当業者に周知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度の増幅を実施した。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）用いて９６ウェルプレートにおいて行った。反応混合液には、ＤＮＡ鋳型、２００ｎｍｏｌの各プライマーと、Ｍｇ２＋、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びβ−メルカプトエタノールを含む反応緩衝液と、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とが含まれる。プライマーの組ＰＣＩ Ａ及びＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータを用いた。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管
或いは、プライマーの組Ｔ７及びＳＫ＋に対して以下のパラメータを用いた。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ５７℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管
各ウェルのＤＮＡ濃度は、０．５μｌの希釈していないＰＣＲ生成物及び１Ｘ ＴＥに溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配し、ＤＮＡが試薬と結合可能なようにして測定した。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を計測し、またＤＮＡ濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌの一定分量を１％のアガロースミニゲル上での電気泳動法によって解析し、何れの反応物が配列の伸長に成功したかを決定する。
【０２０２】
伸長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮し、３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理又はせん断を実施した。ショットガン配列決定のために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長したクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、更にコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質を含む培地において選択し、個々のコロニーを選択してＬＢ／２Ｘ ｃａｒｂ培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で終夜培養した。
【０２０３】
細胞を溶解し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下のパラメータでＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ７２℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６    ７２℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管
前述のようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡ回収率の低いサンプルは、上記の条件で再度増幅した。サンプルを２０％のジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプライマー並びにＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）若しくはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて配列決定した。
【０２０４】
同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６のヌクレオチド配列を使用し、上記手順、５’伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド、及び適切なゲノムライブラリーを用いて５’調節配列が得られる。
【０２０５】
６  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４−２６から得られたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡをスクリーニングする。約２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片にも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような当技術分野のソフトウエアを用いて設計し、５０ｐｍｏｌの各オリゴマー、２５０μＣｉの［γ−３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を結びつけることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超微細分子サイズ排除デキストランビーズカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、以下のエンドヌクレアーゼ、即ちＡｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１又はＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の中の１つで消化されたヒトゲノムＤＮＡの典型的なメンブレンに基づくハイブリダイゼーション解析に用いる。
【０２０６】
各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲルに上で分画して、ナイロンメンブレン（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて実施する。非特異的シグナルを除去するために、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で、ブロットを室温にて順次洗浄する。ハイブリダイゼーションパターンをオートラジオグラフィー若しくは代替イメージング手段を用いて視覚化して比較する。
【０２０７】
７  マイクロアレイ
化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることにより、基板の表面上でアレイエレメントを合成することができる。（例えば、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ， 前出 参照）。また、ドットブロット又はスロットブロット法に類似の所定のアレイを用いて、熱、ＵＶ、化学的若しくは機械的結合プロシージャを利用して、基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。標準的なアレイは、手製で或いは手近な方法及び機械を用いて製作でき、また任意の適切な数のエレメントを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていないプローブを取除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを判定する。マイクロアレイ上のエレメントとハイブリダイズする各プローブの相補性の度合及び相対的な存在量は、スキャナーで読取られた画像を解析することにより評価する。
【０２０８】
完全長ｃＤＮＡ、発現された配列タグ（ＥＳＴｓ）、又はそれらの断片は、マイクロアレイのエレメントを含み得る。ハイブリダイゼーションに適した断片は、当業者に周知のＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）のようなソフトウェアを用いて選択可能である。本発明のヌクレオチド配列の１つに対応する完全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、若しくはそれらの断片を、又は本発明に関連するｃＤＮＡライブラリーから無作為に選択されたものを、例えばスライドガラスのような適切な基板に配置する。そのｃＤＮＡを、例えばＵＶ架橋の後に熱的及び化学的に処置し、さらに乾燥することによって、スライドガラスに固定する（例えば、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０； 並びにＳｈａｌｏｎ， Ｄ．ら（１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５参照）。蛍光プローブを作製し、基板上のエレメントとのハイブリダイゼーションに用いる。基板は前述の方法によって解析する。
【０２０９】
８  相補的ポリヌクレオチド
ＨＣＳＲＰをコードする配列に相補的な配列、或いはその任意の一部を、自然発生ＨＣＳＲＰの発現を検出し、低下させる、即ち抑制するために用いる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより大きな配列フラグメントの場合でも本質的に同じ方法が用いられる。ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア及びＨＣＳＲＰのコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特な５’配列から設計してコーディング配列へのプロモーターの結合を防止するために用いる。翻訳を抑制するために、相補的なオリゴヌクレオチドを設計してＨＣＳＲＰをコードする転写物へのリボソームの結合を防ぐ。
【０２１０】
９  ＨＣＳＲＰの発現
ＨＣＳＲＰの発現及び精製は、細菌又はウイルスに基づく発現系を用いて実施される。細菌におけるＨＣＳＲＰの発現の場合、抗菌性の耐性遺伝子とｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターとを含む適切なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターの例としては、以下に限定しないが、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５又はＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが挙げられる。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの適切な細菌性の宿主に形質転換する。抗生物質耐性菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘発によりＨＣＳＲＰを発現する。真核生物の細胞におけるＨＣＳＲＰの発現は、昆虫又は哺乳動物の細胞株に、一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させることによって行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同的組換え又は転移プラスミド中間体を含む細菌媒介の遺伝子転移の何れかによって、ＨＣＳＲＰをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高レベルのｃＤＮＡの転写が行われる。多くの場合、組換え型バキュロウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞の感染に用いられるが、場合によっては、ヒト肝細胞の感染にも用いられる。後者の感染には、バキュロウイルスに対する更なる遺伝的変更が必要となる。（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．ら（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７； Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ．ら（１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５を参照）。
【０２１１】
殆どの発現系において、ＨＣＳＲＰは、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又はＦＬＡＧ若しくは６−Ｈｉｓ等のペプチドエピトープ標識で融合タンパク質として合成され、粗製の細胞溶解物からの組換え型融合タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に１段階で行うことができる。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６キロダルトンの酵素のＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した条件の下で固定化されたグルタチオにおける融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後に、特定の操作部位においてＨＣＳＲＰからＧＳＴ部分をタンパク分解的に切断可能である。８個のアミノ酸のペプチドであるＦＬＡＧにより、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫親和性の精製が可能となる（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）。６個の連続したヒスチジン残基のストレッチである６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）における精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法については、Ａｕｓｕｂｅｌが（１９９５年， 前出， ｃｈ １０ ａｎｄ １６）論じている。これらの方法によって得られた精製されたＨＣＳＲＰを、以下のアッセイで直接用いることができる。
【０２１２】
１０  ＨＣＳＲＰ活性の実証
ＨＣＳＲＰ活性のためのアッセイでは、細胞表面におけるＨＣＳＲＰの発現を測定する。ＨＣＳＲＰをコードするｃＤＮＡを適切な哺乳動物の細胞株に形質移入する。細胞表面タンパク質は、先行技術（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ． Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ９０：２３９８−２４０５）のようにビオチンで標識する。ＨＣＳＲＰ特異性の抗体を用いて免疫沈降を実施し、免疫沈降させたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法を用いて解析する。標識されていない免疫沈降物（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）に対する標識された免疫沈降物の割合は、細胞表面で発現されるＨＣＳＲＰの量に比例する。
【０２１３】
ＨＣＳＲＰ活性の別のアッセイは、細胞増殖のリガンド／受容体性調節についてのプロトタイプのアッセイに基づく。このアッセイでは、ＨＣＳＲＰを発現するスイスマウス３Ｔ３細胞において新たに合成されるＤＮＡの量を測定する。ＨＣＳＲＰをコードするｃＤＮＡを含む適切な哺乳動物の発現ベクターを、周知の形質移入法を用いて静止状態の３Ｔ３培養細胞に付加する。形質移入された細胞を、［３Ｈ］チミジンの存在下において様々なＨＣＳＲＰリガンドの量でインキュベートする。［３Ｈ］チミジンの酸不溶性のＤＮＡへの組込みは、トリチウム放射性同位体カウンタを用いて適切な時間間隔で測定し、また組込まれた量は、新たに合成されたＤＮＡの量に直接的に比例する。少なくとも１００倍のＨＣＳＲＰリガンド濃度範囲に渡る線形の用量反応曲線は、受容体活性を表す。ミリリットル当たりの活性の１単位は、５０％の応答レベルが生じるＨＣＳＲＰの濃度として定義され、ここで１００％の応答が、［３Ｈ］チミジンの酸不溶性のＤＮＡへの最大の組込みに相当する（ＭｃＫａｙ， Ｉ． ａｎｄ Ｌｅｉｇｈ， Ｉ．， ｅｄｓ． （１９９３） Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｐ．７３）。
【０２１４】
１１  機能的アッセイ
ＨＣＳＲＰの機能は、哺乳類細胞培養系における生理学的に高められたレベルでのＨＣＳＲＰをコードする配列の発現によってアッセイする。高レベルでｃＤＮＡを発現する強力なプロモーターを含む哺乳類の発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。選り抜きのベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）及びｐＣＲ３．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が含まれ、その各々にはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。５〜１０μｇの組換えベクターを、リポソーム製剤或いは電気穿孔法によって、例えば内皮若しくは造血細胞株に瞬間的に形質移入する。また、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇの付加的なプラスミドを同時形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別することができ、また組換えベクターからのｃＤＮＡの発現を確実に予測できる。選り抜きの標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４、又はＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質が含まれる。自動化されたレーザー光学に基づいた技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰ又はＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、また細胞の特性（例えば、アポトーシスの状態）を評価する。ＦＣＭによって、先行する或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取込みを検出及び定量化する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって測定される核ＤＮＡ内容物の変化、ブロモデオキシウリジンの取込み量の低下によって測定されるＤＮＡ合成の下方制御、特異的抗体との反応性によって測定される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化、並びにフルオレセイン結合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって測定される原形質膜組成の変化が含まれる。フローサイトメトリーの方法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．の （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹに記載されている。
【０２１５】
遺伝子発現におけるＨＣＳＲＰの影響は、ＨＣＳＲＰをコードする配列並びにＣＤ６４若しくはＣＤ６４−ＧＦＰの何れかが形質移入された高度に精製された細胞集合を用いて評価することができる。ＣＤ６４及びＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞を、ヒトＩｇＧ若しくはＣＤ６４の抗体の何れかで被覆された磁気ビーズを用いて、形質転換されていない細胞から分離することができる（ＤＹＮＡＬ， Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ， ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。ＨＣＳＲＰ及び目的とする他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン解析やマイクロアレイ技術で解析することが可能である。
【０２１６】
１２  ＨＣＳＲＰ特異的抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５参照）、或いは他の精製技術を使用して実質的に精製されたＨＣＳＲＰを用いて、標準的なプロトコルに従ってウサギを免疫化して抗体を生成する。
【０２１７】
或いは、ＨＣＳＲＰのアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を判定し、対応するオリゴポリペプチドを合成し、これを用いて当業者に知られた方法により抗体を産生させる。Ｃ−末端付近又は親水性領域内のエピトープのような適切なエピトープの選択方法の詳細については当業者の文献に記載されている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５， 前出， ｃｈ．１１参照）。
【０２１８】
通常、１５残基の長さのオリゴペプチドを、ｆｍｏｃ法の化学作用を利用するＡＢＩ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて合成し、ＭＢＳ（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）を用いた反応によりＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）に結合させて免疫抗原性を増強させる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ前出 参照）。ウサギをフロイント完全アジュバントにおけるオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫化する。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合させ、１％ＢＳＡでブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。
【０２１９】
１３  特異的抗体を用いる自然発生ＨＣＳＲＰの精製
ＨＣＳＲＰに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより、自然発生或いは組換えＨＣＳＲＰを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＨＣＳＲＰ抗体を、ＣＮＢｒ−活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作製する。結合の後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。
【０２２０】
ＨＣＳＲＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＨＣＳＲＰを優先的に吸着させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファー）でそのカラムを洗浄する。抗体／ＨＣＳＲＰ結合を分裂させる条件下（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、又は尿素若しくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度のカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ））でカラムを溶出させ、ＨＣＳＲＰを回収する。
【０２２１】
１４  ＨＣＳＲＰと相互作用する分子の同定
１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いて、ＨＣＳＲＰ或いはその生物学的に活性な断片を標識する（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ． 及びＷ． Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９）。マルチウエルプレートのウエル内に予め配置した候補分子を、標識したＨＣＳＲＰと共にインキュベートし、洗浄し、標識したＨＣＳＲＰ複合体を有する任意のウエルをアッセイする。種々のＨＣＳＲＰ濃度で得られたデータを用いて、ＨＣＳＲＰと候補分子との結合、親和性及び数についての値を計算する。
【０２２２】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を特定の好適実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実施例に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本発明の実施のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明らかであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。
【０２２３】
表の簡単な説明
表１には、ＨＣＳＲＰをコードする完全長配列を構築するために用いたポリペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）、クローンＩＤ番号（クローンＩＤ）、ｃＤＮＡライブラリー及びｃＤＮＡ断片を示す。
【０２２４】
表２には、潜在的モチーフ及び相同配列を含めた各ポリペプチド配列の特徴並びにＨＣＳＲＰの同定に用いた方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースを示す。
【０２２５】
表３には、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン解析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連する疾患、障害又は症状と、各ＤＮＡがクローニングされたベクターとを示す。
【０２２６】
表４には、ＨＣＳＲＰをコードするｃＤＮＡクローンを単離したｃＤＮＡライブラリーを作製するのに用いた組織を示す。
【０２２７】
表５には、ＨＣＳＲＰの解析に用いたツール、プログラム及びアルゴリズム並びに適切な説明、引用文献及びパラメーター閾値を示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500801.tif 000113
2005500801.tif 000114
【国際調査報告】
2005500801.tif 000115
2005500801.tif 000116
2005500801.tif 000117
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