(57)【要約】哺乳動物細胞源の種連続増殖のための装置及び方法並びに生産バイオリアクターに移す前に細胞を増やすための専用接種バイオリアクターの使用を含んでなる細胞によって発現されるタンパク質の生産におけるそれらの使用を開示する。新規な接種バイオリアクターは、哺乳動物細胞種連続増殖の改善された方法を容易にするために設計され、そしてバイオリアクターの内部に通じそして商業用種連続増殖のための哺乳動物細胞の増殖を容易にする「接種ウェル」の存在によって区別される。該方法は、接種バイオリアクターの接種ウェル内の培地に凍結保存細胞を加えること、培地及び環境の条件をモニターしそして調整することによって接種ウェル内で細胞が既定の濃度まで増殖するのを可能にすること、並びにその後、最適な細胞増殖が維持されるようにリアクター内の培地の容量を増加的に増やすことを含んでなる。
2005502306.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）接種ウェルを有するバイオリアクターを準備すること、
ｂ）接種ウェル内の培地に哺乳動物細胞の懸濁液を送達すること、
ｃ）接種ウェル内の細胞増殖を最適化するように該培地の環境条件及び組成を制御すること、
ｄ）該ウェル内で既定の細胞密度に達するまで哺乳動物細胞を増殖させること、並びに
ｅ）バイオリアクターが既定の容量及び細胞密度に満たされるまで最適な環境条件及び環境増殖条件を保ちながら培地容量を増加的に増やすこと、
を含んでなる哺乳動物細胞種連続増殖の方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞が凍結保存細胞である請求項１の方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞及びベビーハムスター腎臓細胞よりなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項４】
細胞が凍結バッグ（ｃｒｙｏｂａｇ）から得られる請求項１の方法。
【請求項５】
細胞が凍結バイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）から得られる請求項１の方法。
【請求項６】
ａ）バイオリアクター、該バイオリアクターは室を特定する、
ｂ）外部及び内部側面、上面部材、壁部材、並びに底面部材を有する該室、該底面部材は開口部を有する、
ｃ）接種ウェル、該ウェルは、外部及び内部側面、上面及び底面部材、壁部材を有する室を特定する、並びに
ｄ）該バイオリアクター開口部に連結する該上面部材における開口部をさらに含む該ウェル、その結果、ウェル室及びバイオリアクター室間にそこで両者間に制限のない動きを可能にするように流路が形成される、
を含んでなる改善された発酵バイオリアクター。
【請求項７】
接種ウェル室にｐＨセンサー、酸素センサー、温度センサー及び光学センサーよりなる群から選択されるセンサーをつける請求項６において説明するとおりの改善されたバイオリアクター。
【請求項８】
ウェル室への培地及び作用因子の導入を可能にするために接種ウェルに該ウェルの壁を通した連絡開口部をつける請求項６において説明するとおりの改善されたバイオリアクター。
【請求項９】
接種ウェルの中身の攪拌を可能にするために該ウェルに機械アームをつける請求項６において説明するとおりの改善されたバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、引用することにより本明細書に組み込まれる２００１年１２月１４日に３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５３（ｃ）（２）のもとに仮出願に転換された２０００年１２月２０日に出願された出願０９／７４６，９７２の優先権を請求する。
【０００２】
発明の背景
分野：本発明は、製造規模の哺乳動物細胞培養技術に、そして特に哺乳動物細胞の新規な種連続増殖法に関する。生産規模の種源となる新規に考案したバイオリアクターに直接接種するために凍結保存細胞を使用する。
【０００３】
背景：哺乳動物細胞培養系の発現用の生産作戦（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｍｐａｉｇｎ）のための新しい細胞種連続増殖の開始は、重要なプロセス工程である。操作上の不一致及び誤りは、しばしば、このプロセスを危うくし、著しい遅れ及び接種材料の変動につながる。典型的な生産プロトコルにおいて、新しい種連続増殖は１−２ｍＬの凍結バイアル（マスター・ワーキング・セル・バンク、ＭＷＣＢ）から始まる。この容器の細胞濃度は、通常、５００万−１０００万細胞／ｍＬの範囲である。細胞を融解し、凍結防止剤を除くために洗浄し、そして次にまず小型組織培養フラスコにおいて培養する（接種する）。０．５〜１ ｘ １０６細胞／ｍＬの接種密度を用いることは哺乳動物細胞培養での標準的技法である。凍結保存後にさらに低い細胞濃度で細胞を接種することは、増殖期に入る前の延長された誘導期、乏しい細胞性能もしくは細胞死さえもたらし得る。これは、現在の細胞培養製造のやり方になっている無血清もしくはさらに無タンパク質細胞培養培地において特に際立っている。
【０００４】
細胞は、それらの特定の増殖速度（細胞密度）に従って継代培養され、そして通常２−３日ごとに複数の細胞培養フラスコに分けられる。いったん十分なバイオマスが生産されると、細胞はローラーボトル、振盪もしくはスピナーフラスコのようなさらに大型の培養ボトルに拡張される。十分な細胞量が蓄積された後に、生産規模容器の種培養になるバイオリアクターに接種する。この記述する種連続増殖は、いくつかの哺乳動物細胞系の一般的技法であり、そして商業生産及び学求的世界において幅広く用いられる。Ｔフラスコ及びスピナーフラスコを用いる商業用種連続増殖の概要はまた、Ｗｈｉｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２８−４３頁、１９９８によっても示される。
【０００５】
最適条件下で完了するのに約４〜６週かかる典型的なスケールアッププロトコルは大きな労働力を要し、そして汚染及び変動を受けやすい。小規模条件は明確に特定されず、通常、Ｔフラスコ、ローラーボトルもしくは振盪機フラスコ期間中のｐＨ及びＤＯの設定値はなく、これはプロセスの全体にわたってさらに多くの変動をもたらす可能性があり、そして接種材料及び生成物の品質を危うくするかもしれない。
【０００６】
発明の要約
我々は、哺乳動物細胞の種連続増殖のための新規なバイオリアクター及び方法を開発した。この技術は、組織培養フラスコ、ローラーボトルもしくは振盪フラスコの使用を省く。
【０００７】
我々の新規な接種バイオリアクターは、哺乳動物細胞種連続増殖の改善された方法を容易にするために設計され、そしてバイオリアクターの内部に通じそして商業用種連続増殖のための哺乳動物細胞の増殖を容易にする「接種ウェル」の存在によって区別される。
【０００８】
凍結保存細胞の種連続増殖のための我々の方法は、生産バイオリアクターに移す前に細胞を増やすための接種ウェルを有する専用の接種バイオリアクターの使用を含んでなる。さらに特に、我々の方法は、接種バイオリアクターの接種ウェル内の培地に凍結保存細胞を加えること、培地及び環境の条件をモニターしそして調整することによって細胞が接種ウェル内で既定の濃度まで増殖するのを可能にすること、並びにその後、最適な細胞増殖が維持されるようにリアクター内の培地の容量を増加的に増やすことを含んでなる。いったん所望の細胞密度及び容量が得られると、細胞を生産バイオリアクターに移す。
【０００９】
好ましい態様として、接種バイオリアクターは、リアクター室の底面に位置する「接種ウェル」を含む。この接種ウェルには、最適な培養条件を保証する助けとなるように発酵センサー（ｐＨ、溶存酸素、温度、光学密度など）をつける。最も好ましくは、連続攪拌式タンクリアクター（ＣＳＴＲ）液体攪拌装置によって羽根車駆動装置を含むようにこの接種ウェルを改造する。
【００１０】
特定の態様
材料及び方法
この種連続増殖法は、ヒトタンパク質を発現する組換えベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系のために最初に開発された。本発明に使用する細胞は、２０ ｘ １０６細胞／ｍＬを含有する１２Ｌ灌流バイオリアクターから取った。細胞を培養し、そしてＪＲＨ（Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）もしくはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）によって製造される市販のＤＭＥＭ／ハムＦ１２配合物（１：１）に基づきそして鉄、プルロニックＦ６８（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｄｉｐａｎｎｙ，ＮＪ）、組換えヒトインシュリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｄｉａｎｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を補足しそして他のタンパク質を本質的に含まない哺乳動物細胞培養培地において凍結させた。凍結培地は、凍結防止剤として７．５％のジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有した。
【００１１】
保存に使用する凍結保存バッグ（ＣｒｙｏｃｙｔｅＴＭ ２５０ｍＬもしくは５００ｍＬ，Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）は、５０−１００ｍＬの細胞懸濁液を含有し、そして液体Ｎ２フリーザー（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＯＨ）に移す前に−４０℃のフリーザー（Ｒｅｖｃｏ，Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ＮＣ）において凍結させた。２Ｌ容量における１００万細胞／ｍＬの初期バイオリアクター細胞密度を保証するために細胞を５０ｍＬでは約４０ ｘ １０６細胞／ｍＬに、もしくは１００ｍＬでは２０ ｘ １０６細胞／ｍＬに濃縮した。０．５−１ １０６細胞／ｍＬの細胞密度は、新しい種連続増殖プロセスを開始するために一般に用いられる。
【００１２】
凍結保存バッグ中のＢＨＫ細胞は、３７℃の水浴を用いて融解した。細胞懸濁液を遠心管に移し、新しい培地で希釈し（１：１）、そして１０００−１２００ｒｐｍで穏やかに遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを新しい培地に再懸濁し、そして「接種ウェル」バイオリアクターに接種するために滅菌ボトルに移した。この洗浄工程は、ＤＭＳＯの大部分を取り除くために用い、そして哺乳動物細胞培養における一般的技法である。後に、このＤＭＳＯ洗浄工程を省き、そして細胞をバッグからバイオリアクターに直接移した。（ＤＭＳＯ洗浄工程の削除は、閉鎖系の操作及び維持を可能にし、それにより系の汚染の機会を減らす。実施例２を参照。）
同じ技術を組換えＣＨＯ細胞にも使用した。
【００１３】
２つの異なるバイオリアクターを用いた。しかしながら、これらは両方とも、２Ｌ容量の「接種ウェル」に接種することができるという共通の特徴を有した。
【００１４】
１．５Ｌ培養は、通気のための焼結ステンレス鋼フリット（ＭｏｔｔＭｅｔａｌｌｕｒｇｉｃａｌ，Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）を備えたＡｐｐｌｉｋｏｎ ７Ｌバイオリアクター（Ｓｃｈｉｅｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において実施した。容器内で細胞を保持するためそして連続灌流形態での操作を可能にするために細胞分離装置を用いた。リアクター系は、５Ｌの容量において少なくとも２０００万細胞／ｍＬを維持することができる。ｐＨ、溶存酸素、温度及び光学密度は、少なくとも２Ｌの容量を用いる場合に培養物中に浸した探針によって測定した。リアクターは、２Ｌ容量のステンレス鋼接種ウェルで設計される。
【００１５】
２．１２Ｌ培養は、特注設計の１５Ｌバイオリアクターにおいて実施した。リアクターのステンレス鋼接種ウェルは、７Ｌ容器におけるものと同じ（２Ｌ容量）であった。しかしながら、上部の直径及び容量を広げるために円錐フランジを用いた（図３）。通気は、焼結ステンレス鋼フリット（Ｍｏｔｔ  Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｃａｌ，Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）を通して供給した。細胞分離装置を連続灌流技術に用いた。このリアクター系は、１２Ｌの作業容量において少なくとも２０００万細胞／ｍＬを維持することができる。
【００１６】
両方のバイオリアクター系は、他で報告されるような操作条件下でＢ．Ｂｒａｕｎ  ＤＣＵ（デジタル制御ユニット（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｕｎｉｔ），Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて制御した。
【００１７】
使用する凍結容器のサイズ及び細胞密度と接種リアクターの接種ウェル（ＶＩＲｍｉｎ）間の関係は、以下の式：
2005502306.tif 000003
によって決定することができ、ここで、Ｘｂａｇは凍結容器における細胞密度であり、そしてＶｂａｇは容量である。ＸＩＲｓｔａｒｔは、接種リアクターの接種ウェルにおける所望の開始細胞密度、通常は１ ｘ １０６細胞／ｍＬである。
【００１８】
接種リアクターの最終容量（ＶＩＲｍａｘ）は、使用する生産リアクターの容量により決まり、そして式：
2005502306.tif 000004
によって決定することができ、ここで、ＸＰＲは生産バイオリアクターにおける目標とする初期細胞密度（通常は１ １０６細胞／ｍＬ）であり、ＶＰＲは生産リアクターの容量であり、そしてＸＩＲは接種リアクターにおける最終細胞密度である。バイオリアクターの接種ウェルは通常小さく（本発明の実施例では２Ｌの接種ウェルを使用した）、そして容量は、バイオリアクターの直径及び高さを増すことによって増やすことができる。ＶＩＲｍａｘは限定されないので、同じ「接種ウェル」概念をさらに大きいバイオリアクターの設計に適用することができる（図３を参照）。
【００１９】
７及び１２Ｌの系において実施する培養は、２Ｌの初期容量を有した。これは、バイオリアクターのｐＨ、溶存酸素電極、並びに温度センサーを浸すために必要な最小容量である。通気は、接種直後にヘッドスペース通気を用いて実施する。容量は、０．８〜１．２ ｘ １０６細胞／ｍＬの細胞密度を維持するように段階的に増やす。いったん容量が４リットルに達するとガススパージング（ｇａｓ  ｓｐａｒｇｉｎｇ）による酸素化を用いる。細胞特異的灌流速度は、常に０．５−０．７ｎＬ／細胞／日で維持した。
【００２０】
細胞及び代謝産物濃度を決定するためにオフラインサンプリングを毎日実施した。細胞計数及び生存度は、血球計及びトリパンブルー排除法を用いて決定した。サンプルのグルコース、乳酸塩、グルタミン酸塩及びグルタミン濃度を測定するためにＹＳＩ分析器（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用した。ＬＤＨ及びアンモニアは、Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏｌｙｚｅｒ（Ｋｏｄａｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＮＹ）を用いて測定した。溶存ＣＯ２レベルを測定するためそしてｐＨ及び溶存酸素値を調べるためにＮＯＶＡ血液ガス分析器（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用した。サンプルは、１段階凝固法（ｏｎｅ  ｓｔａｇｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によりｒＦＶＩＩＩ活性に関して分析した。生成物の品質は、社内で開発したウェスタンブロットアッセイによって決定した。
【００２１】
実施例１
図４は、１２Ｌ灌流培養を示す。ＥＶＡバッグにおいて凍結保存した５０ｍＬの細胞懸濁液を接種に用いた。細胞は、接種前にＤＭＳＯを取り除くために新しい培地で洗浄した。培養は、ヘッドスペース通気で２Ｌの初期容量であった。細胞生存度は、プロセスの全体にわたって９５％を上回り、そして細胞密度に基づいて容量を段階的に増やした。いったん容量が４Ｌになるとガススパージングを用いた。容量が１２Ｌに達した１日後に連続培地灌流を開始した。灌流速度は、０．５−０．７ｎＬ／細胞／日で維持した。２０ １０６細胞／ｍＬの目標細胞密度に１１日後に達した。種連続増殖実験は、この新規な増殖技術の正確さを明確に実証する。中間の細胞培養フラスコを使用せず、起こりうる汚染の危険を劇的に減らし、培地及び環境を外部から制御し、そして結果として生産バイオリアクターを開始する時間を少なくとも７０％減らした。
【００２２】
実施例２
接種前のＤＭＳＯ除去工程（洗浄／希釈）の必要性を評価した。この評価では、２つのリアクターを同じ５０ｍＬバッグ凍結ロットから同時に開始した。
【００２３】
・ＤＭＳＯ洗浄工程を実施した１２Ｌリアクター。
【００２４】
・ＤＭＳＯ洗浄を省略した５Ｌリアクター。
【００２５】
両方の培養を同じ条件下（容量増加段階、ヘッドスペース通気及びスパージング速度など）で行った。２０ １０６細胞／ｍＬの目標細胞密度に５Ｌ培養は１１日以内に、１２Ｌ培養はそれから一日後に達した。図５は、これら２つの培養の比較を示す。細胞増殖もしくは生存度におけるいかなる違いも認められなかった。ＤＭＳＯ洗浄工程の削除は、種連続増殖プロセス（細胞融解から先）をさらに簡素化し、そして完全に系密閉を可能にする。
【００２６】
実施例３
図６は、１２Ｌ「接種ウェル」リアクターにおいて実施する培養の時間プロフィールを示す。バッグにおいて凍結保存した５０ｍＬの細胞懸濁液をＤＭＳＯ洗浄なしに接種に用いた。２０ ｘ １０６細胞／ｍＬの目標細胞密度に１６日後に達した。
【００２７】
実施例４
図７は、５Ｌバイオリアクターにおいて実施するＣＨＯ培養の時間プロフィールを示す。バッグ中の５０ｍＬの凍結保存細胞を接種に使用した。ＤＭＳＯ洗浄工程を行わなかった。目標細胞密度、ここでは１０ ｘ １０６細胞／ｍＬに６日以内に達した。
【００２８】
実施例５
図８ａ及び８ｂは、接種バイオリアクターにおいて実施する２つのＢＨＫ及び２つのＣＨＯ培養の時間プロフィールを示す。５０及び１００ｍＬの凍結バッグを接種に使用し、４つ全ての培養においてＤＭＳＯ洗浄工程を行わなかった。５０ｍＬもしくは１００ｍＬの凍結バッグのいずれを用いても負の効果は認められなかった。
【００２９】
要約
一般に、哺乳動物細胞培養の現在の種連続増殖法は、大きな労働力を要し、そしてＴフラスコ、ローラーボトル及びスピナーフラスコのような複数の培養容器の使用のために微生物汚染を受けやすい。新規な種連続増殖法は、バイオリアクターにおける特注の「接種ウェル」に直接接種するために用いる５０ｍＬもしくは１００ｍＬ ＥＶＡ凍結保存バッグを利用して開発された。このリアクターは、生産規模系の接種源となる。この方法論は、スケールアップ中のあらゆるＴフラスコ、ローラーボトルもしくはスピナーフラスコの使用を完全に除く。「接種ウェル」リアクターのサイジング及び設計の手順を提示する。この手順に従って、該方法を任意の規模の生産リアクターの直接接種に適用することができる。これらの実施例では凍結保存細胞を使用したが、凍結保存はこの技術の必要条件ではない。標準温度の哺乳動物細胞を凍結保存細胞の代わりに用いることができ、そして系の有効性及び実用性は同じままである。同様に、接種ウェルの概念及び使用の方法が維持される限り、バイオリアクターのサイズを調整することができる。
【００３０】
上記に提示する実施例は、本発明の一つの構成設計を例示するために提供する。従って、本発明の範囲は、以下の請求項によってのみ限定されるべきであるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
種連続増殖法の先行技術を例示する。
【図２】
本発明の好ましい方法を示す。
【図３】
接種ウェル接種バイオリアクターの概念を示す。
【図４】
５０ｍＬのバッグにおいて凍結保存したＢＨＫ細胞から開始する、５Ｌの「接種ウェル」を含有するバイオリアクターにおいて実施する連続灌流培養を示す。生存細胞密度（ＶＣＤ［●］）及び生存度プロフィール［］を示す。細胞生存度は、培養の全体にわたって高いままであった。５Ｌ規模で２０００万細胞／ｍＬの目標細胞密度に１２日以内に達した。
【図５】
ＢＨＫ細胞の種連続増殖中のＤＭＳＯ洗浄工程の影響を例示する。１２Ｌ培養（開いた記号）ではＤＭＳＯ洗浄工程を実施し、一方、もう一つの５Ｌ培養（詰まった記号）には細胞を洗浄せずに直接接種した。示すように、いかなる負の効果も認められず、細胞生存度並びに細胞増殖はいかなる違いも示さなかった。
【図６】
５０ｍＬのバッグにおいて凍結保存したＢＨＫ細胞から開始する、連続１２Ｌバイオリアクター培養を示し、接種前にＤＭＳＯ洗浄を行わなかった。生存細胞密度（ＶＣＤ［●］）及び生存度プロフィール［］を示す。１２Ｌ規模で２０００万細胞／ｍＬの目標細胞密度に１４日以内に達した。
【図７】
５０ｍＬのバッグにおいて凍結保存したＣＨＯ細胞から開始する、組換えＣＨＯ細胞の５Ｌ培養を例示し、接種前にＤＭＳＯ洗浄を行わなかった。生存細胞密度（ＶＣＤ［●］）及び生存度プロフィール［］を示す。目標細胞密度に６日以内に達した。
【図８ａ】
５０ｍＬのバッグにおいて凍結保存したｒＢＨＫ細胞、１００ｍＬのバッグにおけるもう一つの培養物から開始する２つの５Ｌ培養を例示し、接種前にＤＭＳＯ洗浄を行わなかった。生存細胞密度（ＶＣＤ［●］）及び生存度プロフィール［］を示す。両方の培養において５Ｌ規模で２０００万細胞／ｍＬの目標細胞密度に１０日以内に達した。
【図８ｂ】
５０ｍＬ及び１００ｍＬのバッグにおいて凍結保存した組換えＣＨＯ細胞から開始する２つの１２Ｌ培養を例示し、接種前にＤＭＳＯ洗浄を行わなかった。生存細胞密度（ＶＣＤ［●］）及び生存度プロフィール［］を示す。両方の培養においていかなる負の効果も認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005502306.tif 000068
2005502306.tif 000069
2005502306.tif 000070