(57)【要約】本発明は、概略的には、in vitroの細胞及び多細胞生物における遺伝子機能又は遺伝子発現の低下又は不活性化に関する。本発明は、変異原の組合せ、特に、少なくとも１つの変異原が挿入変異原であるような変異原の組合せを用いて細胞を変異させて、同細胞中でノックアウト、ノックダウン、及び他の改変を生じるホモ接合型遺伝子変異、あるいは、表現型を累積的に達成するのに必要な複数の遺伝子の変異、を達成する方法を包含する。さらに本発明は、本挿入変異誘発により作製された遺伝子の少なくとも１つが、挿入配列により標識されているために、変異遺伝子の特定が可能であるようなものを含め、本発明の方法により作成された細胞（及びそのライブラリ）及び生物にも関する。さらに本発明は変異細胞のライブラリや、それらの使用にも関する。さらに本発明は、細胞（及びそのライブラリ）や生物中で、挿入標識により、本発明の方法を用いて変異を特定する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の遺伝子を変異させる方法であって、
前記遺伝子の一つのアレルが物理化学的に変異し、他方のアレルが挿入により変異するように、細胞に対し、同時に物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法を行うステップ
を含む、方法。
【請求項２】
細胞中の遺伝子を変異させる方法であって、
前記遺伝子の一つのアレルが物理化学的に変異し、他方のアレルが挿入により変異するように、細胞に対し、最初に挿入変異誘発法を行い、次に物理化学的変異誘発法を行うステップ
を含む、方法。
【請求項３】
細胞中の遺伝子を変異させる方法であって、
前記遺伝子の一つのアレルが物理化学的に変異し、他方のアレルが挿入により変異するように、細胞に対し、物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法を行うステップ
を含む、方法。
【請求項４】
細胞中の遺伝子を変異させ、変異遺伝子を特定する方法であって、
前記遺伝子の一つのアレルが物理化学的に変異し、他方のアレルが挿入により変異するように、細胞に対し、同時に物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法を行うステップと、挿入変異原により前記遺伝子を特定するステップと
を含む、方法。
【請求項５】
細胞中の遺伝子を変異させ、変異遺伝子を特定する方法であって、
前記遺伝子の一つのアレルが物理化学的に変異し、他方のアレルが挿入により変異するように、細胞に対し、最初に挿入変異誘発法を行い、次に物理化学的変異誘発法を行うステップと、挿入変異原により前記遺伝子を特定するステップと
を含む、方法。
【請求項６】
細胞中の遺伝子を変異させ、変異遺伝子を特定する方法であって、
前記遺伝子の一つのアレルが物理化学的に変異し、他方のアレルが挿入により変異するように、細胞に対し、物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法を行うステップと、挿入変異原により前記遺伝子を特定するステップと
を含む、方法。
【請求項７】
細胞中の２つ以上の遺伝子を変異させる方法であって、前記変異が、ある表現型を生じるのに累積的に必要であり、
前記２つ以上の遺伝子が物理化学的に変異又は挿入により変異するが、前記２つ以上の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子は挿入により変異するように、細胞に対し、物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法を行うステップ
を含む、方法。
【請求項８】
細胞中の２つ以上の遺伝子を変異させ、変異遺伝子のうちの少なくとも１つを特定する方法であって、前記変異が、ある表現型を生じるのに累積的に必要であり、
前記２つ以上の遺伝子が物理化学的に変異又は挿入により変異するが、前記２つ以上の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子は挿入により変異するように、細胞に対し、物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法を行うステップと、挿入変異原により、少なくとも１つの挿入変異した遺伝子を特定するステップと
を含む、方法。
【請求項９】
細胞を物理化学的及び挿入により同時に変異誘発するステップと、所望の表現型について前記細胞をスクリーニングするステップと、挿入変異原により、前記表現型と相関する変異遺伝子を特定するステップと
を含む、細胞の表現型を変異遺伝子と相関付ける方法。
【請求項１０】
細胞を物理化学的及び挿入により変異誘発するステップと、所望の表現型について前記細胞をスクリーニングするステップと、挿入変異原により、前記表現型と相関する変異遺伝子を特定するステップと
を含む、細胞の表現型を変異遺伝子と相関付ける方法であって、挿入変異誘発法が物理化学的変異誘発法の前に行われる、方法。
【請求項１１】
細胞を物理化学的及び挿入により変異誘発するステップと、所望の表現型について前記細胞をスクリーニングするステップと、挿入変異原により、前記表現型と相関する変異遺伝子を特定するステップと
を含む、細胞の表現型を変異遺伝子と相関付ける方法。
【請求項１２】
複数の細胞に対し、物理化学的及び挿入による変異誘発法を行うステップと、挿入変異細胞を、挿入変異原により選抜するステップと
を含む、複数の細胞から変異細胞を選抜する方法。
【請求項１３】
多細胞生物においてホモ接合型変異を作る方法であって、
第一生物に物理化学的変異誘発法を行うステップと、前記第一生物の反対の性の生物に挿入変異誘発を行うステップと、前記第一及び第二変異生物を交配するステップと、前記交配から後代を得るステップとを含み、但し前記後代がある遺伝子での変異についてホモ接合型であり、また前記遺伝子の一つのアレルが、物理化学的変異誘発法により変異させられ、また前記遺伝子の第二のアレルが挿入変異誘発法により変異させられる、
方法。
【請求項１４】
細胞中の遺伝子を変異させる方法であって、前記細胞が、前記遺伝子の一つのアレルに、物理化学的変異原により誘導された変異を含有し、前記方法が、前記遺伝子の第二アレルが挿入により変異するように、前記細胞を挿入変異原に曝すステップを含む、方法。
【請求項１５】
細胞中の遺伝子を変異させる方法であって、前記細胞が、前記遺伝子の一つのアレルに、挿入変異原により誘導された変異を含有し、前記方法が、前記遺伝子の第二アレルが物理化学的に変異するように、前記細胞を物理化学的変異原に曝すステップを含む、方法。
【請求項１６】
細胞中の２つ以上の遺伝子を変異させる方法であって、前記変異が、ある表現型を生じるのに累積的に必要であり、前記方法が、充分な数の遺伝子が物理化学的に変異して前記表現型を生じるように前記細胞に物理化学的変異誘発法を行うステップを含み、前記細胞が、挿入変異を前記表現型を生じるのに必要な前記遺伝子のうちの少なくとも１つに含有する、方法。
【請求項１７】
細胞中の２つ以上の遺伝子を変異させ、前記変異遺伝子のうちの少なくとも１つを特定する方法であって、前記変異が、ある表現型を生じるのに累積的に必要であり、前記方法が、充分な数の遺伝子が物理化学的に変異して前記表現型を生じるように前記細胞に物理化学的変異誘発法を行うステップであって、前記細胞が、前記表現型を生じるのに必要な挿入変異を前記遺伝子の少なくとも１つに含有する、ステップと、挿入変異原により、少なくとも１つの挿入変異遺伝子を特定するステップと、を含む、方法。
【請求項１８】
前記物理化学的変異原が、紫外線、ガンマ線、Ｘ線、制限酵素、変異原性もしくは催奇形性化学物質、DNA修復変異原、DNA修復阻害剤、エラープローンDNA複製たんぱく、N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）、エチルメタンスルホネート（EMS）及びICR191、から成る群より選択される、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記エラープローンDNA複製たんぱくがエラープローンDNAポリメラーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記物理化学的変異原が、ENU及びEMSから成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記挿入変異原が、一つ以上の多重クローニング部位、一つ以上の転写終了部位、一つ以上の転写調節配列、一つ以上の翻訳シグナル配列、一つ以上の読み取り枠（ORF）、ORFを変異させる一つ以上の配列、一つ以上の停止コドン、停止コドンを変異又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のmRNA不安定化因子、一つ以上のヘアピン配列、ヘアピンを変異又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のレポータ遺伝子、一つ以上のスプライス受容側配列、一つ以上のスプライス供与側配列、一つ以上の内部リボゾーム侵入部位（IRES）、一つ以上のトランスポゾン配列、一つ以上の部位特異的組換え部位配列、一つ以上の制限酵素配列、融合相手のタンパク質又はペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列、一つ以上の選択マーカ又は選択モジュール、前記ベクタをホスト細胞内で増殖させるために有用な一つ以上の細菌性配列、一つ以上の3'遺伝子トラップ、一つ以上の5'遺伝子トラップ、局在化シグナルをコードする一つ以上のヌクレオチド配列、一つ以上の複製開始点、一つ以上のプロテアーゼ開裂部位、ある遺伝子もしくはある遺伝子部分にコードされた一つ以上の所望のタンパク質又はペプチド、及び、一つ以上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイルをコードする一つ以上の配列、から成る群より選択される一つ以上の物理的もしくは機能的ヌクレオチド配列を含む、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記転写調節配列が、プロモータ、エンハンサ及びリプレッサから成る群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記一つ以上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイルが一つ以上のpoly(A)テイルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記挿入変異原が少なくとも１つの停止コドンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記挿入変異原が少なくとも１つのスプライス受容側部位を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクタが少なくとも１つのスプライス供与側部位を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記挿入変異原が前記細胞のゲノムに組み込まれると、前記スプライス受容側部位が、前記遺伝子のスプライス供与側部位に作動的に連結される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記挿入変異原が前記細胞のゲノムに組み込まれると、前記スプライス供与側部位が、前記内因性遺伝子のスプライス受容側部位に作動的に連結される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記挿入変異原が少なくとも１つの5'遺伝子トラップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記挿入変異原が少なくとも１つの選択マーカを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記挿入変異原が少なくとも１つのレポータ遺伝子を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記レポータ遺伝子が、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく及びその誘導体、黄色蛍光たんぱく及びその誘導体、青色蛍光たんぱく及びその誘導体、並びに赤色蛍光たんぱく及びその誘導体から成る群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞を前記物理化学的変異源及び前記挿入変異源に同時に接触させる、請求項３、６、７、８、１０、１１、１２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞を前記物理化学的変異源及び前記変異原性挿入変異源に順次接触させる、請求項３、６、７、８、１１、１２、１４−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞を前記物理化学的変異源に、前記挿入変異源に接触させる前に接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞を前記物理化学的変異源に、前記挿入変異源に接触させた後に接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞を前記物理化学的変異原に２回以上、及び／又は、前記挿入変異原に２回以上、接触させるステップをさらに含む、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記付加的な変異原処理が、前記細胞を一つ以上の物理化学的変異原に接触させるステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記付加的な変異原処理が、前記細胞を一つ以上の挿入変異原に接触させるステップを含む、請求項３７に記載の方法。 
【請求項４０】
前記挿入変異原がウィルス又はトランスポゾン内に含有されている、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記ウィルスがアデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アルファ-ヘルペスウィルス、レンチウィルス、偽狂犬病ウィルス及び単純疱疹ウィルスから成る群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ウィルスがレトロウィルスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記レトロウィルスがレンチウィルスである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
in vitro細胞であって、前記細胞中の遺伝子の一つのアレルが、挿入により変異しており、そして前記遺伝子の第二のアレルが物理化学的に変異している、in vitro細胞。
【請求項４５】
２つ以上の遺伝子に変異を含有する細胞であって、前記変異のうちの少なくとも１つが挿入変異であり、また前記変異は、前記細胞中である表現型を生じるのに累積的に必要である、細胞。
【請求項４６】
前記細胞が胚性幹細胞又は生殖細胞である、請求項４４又は４５に記載の細胞。
【請求項４７】
前記細胞が、紫外線、ガンマ線、Ｘ線、制限酵素、変異原性もしくは催奇形性化学物質、DNA修復変異原、DNA修復阻害剤、エラーププロ−ンDNA複製たんぱく、ENU、EMS及びICR191、から成る群より選択される少なくとも１つの物理化学的変異原で処理されている、請求項４４又は４５に記載の細胞。
【請求項４８】
前記エラープロ−ンDNA複製たんぱくがエラープロ−ンDNAポリメラーゼである、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記細胞が、ENU及びEMSから成る群より選択される少なくとも１つの物理化学的変異原で処理されている、請求項４７に記載の細胞。
【請求項５０】
前記挿入変異原が、一つ以上の多重クローニング部位、一つ以上の転写終了部位、一つ以上の転写調節配列、一つ以上の翻訳シグナル配列、一つ以上のORF、ORFを変異させる一つ以上の配列、一つ以上の停止コドン、停止コドンを変異又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のmRNA不安定化因子、一つ以上のヘアピン配列、ヘアピンを変異又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のレポータ遺伝子、一つ以上のスプライス受容側配列、一つ以上のスプライス供与側配列、一つ以上のIRES、一つ以上のトランスポゾン配列、一つ以上の部位特異的組換え部位配列、一つ以上の制限酵素配列、融合相手のタンパク質又はペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列、一つ以上の選択マーカ又は選択モジュール、前記ベクタをホスト細胞内で増殖させるために有用な一つ以上の細菌性配列、一つ以上の3'遺伝子トラップ、一つ以上の5'遺伝子トラップ、局在化シグナルをコードする一つ以上のヌクレオチド配列、一つ以上の複製開始点、一つ以上のプロテアーゼ開裂部位、ある遺伝子もしくはある遺伝子部分にコードされた一つ以上の所望のタンパク質又はペプチド、及び、一つ以上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイルをコードする一つ以上の配列、から成る群より選択される一つ以上の物理的もしくは機能的ヌクレオチド配列を含む、請求項４４又は４５に記載の細胞。
【請求項５１】
前記転写調節配列が、プロモータ、エンハンサ及びリプレッサから成る群より選択される、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５２】
前記一つ以上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイルが一つ以上のpoly(A)テイルである、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５３】
前記挿入変異原が少なくとも１つの停止コドンを含む、請求項４４に記載の細胞。
【請求項５４】
前記挿入変異原が少なくとも１つのスプライス受容側部位を含む、請求項４４に記載の細胞。
【請求項５５】
前記挿入変異原が少なくとも１つのスプライス供与側部位を含む、請求項４４に記載の細胞。
【請求項５６】
前記挿入変異原が前記細胞のゲノムに組み込まれると、前記スプライス受容側部位が、前記遺伝子のスプライス供与側部位に作動的に連結される、請求項５４に記載の細胞。
【請求項５７】
前記挿入変異原が前記細胞のゲノムに組み込まれると、前記スプライス供与側部位が、前記遺伝子のスプライス受容側部位に作動的に連結される、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５８】
前記挿入変異原が少なくとも１つの5'遺伝子トラップ・カセットを含む、請求項４４に記載の細胞。
【請求項５９】
前記挿入変異原が少なくとも１つの選択マーカを含む、請求項４４に記載の細胞。
【請求項６０】
前記挿入変異原が少なくとも１つのレポータ遺伝子を含む、請求項４４に記載の細胞。
【請求項６１】
前記レポータ遺伝子が、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく及びその誘導体、黄色蛍光たんぱく及びその誘導体、青色蛍光たんぱく及びその誘導体、並びに赤色蛍光たんぱく及びその誘導体から成る群より選択される、請求項６０に記載の細胞。
【請求項６２】
前記細胞に、２つ以上の物理化学的及び／又は挿入変異誘発処理が行われている、請求項４４に記載の細胞。
【請求項６３】
前記一つ以上の付加的な変異原処理が、前記細胞を一つ以上の物理化学的変異源に接触させるステップを含む、請求項６２に記載の細胞。
【請求項６４】
前記一つ以上の付加的な変異原処理が、前記細胞を一つ以上の挿入変異源に接触させるステップを含む、請求項６２に記載の細胞。
【請求項６５】
前記挿入変異原がウィルス内に含有されている、請求項４４に記載の細胞。
【請求項６６】
前記ウィルスがアデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アルファ-ヘルペスウィルス、レンチウィルス、偽狂犬病ウィルス及び単純疱疹ウィルスから成る群より選択される、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６７】
前記ウィルスがレトロウィルスである、請求項６６に記載の細胞。
【請求項６８】
前記レトロウィルスがレンチウィルスである、請求項６７に記載の細胞。
【請求項６９】
前記細胞が、ヒト細胞、ヒト以外の霊長類の細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、トリ類の細胞、ウシの細胞、ブタの細胞、ヒツジの細胞、イヌの細胞、ネコの細胞、植物細胞、魚類の細胞、昆虫細胞及び蠕虫細胞から成る群より選択される、請求項４４に記載の細胞。
【請求項７０】
細胞のうちの一つ以上が一つ以上の挿入変異原に接触させられている、２つ以上の物理化学的変異細胞のライブラリであって、但し一つ以上の挿入変異原が、前記ライブラリ内の少なくとも１つの細胞のゲノムに挿入されている、ライブラリ。
【請求項７１】
それぞれの細胞が一つ以上の挿入変異原をゲノムに挿入させて含む、一つ以上の挿入変異細胞のライブラリであって、前記ライブラリのうちの一つ以上の細胞が、一つ以上の物理化学的変異原で処理されている、ライブラリ。
【請求項７２】
前記一つ以上の挿入変異原が、それぞれ、一つ以上の多重クローニング部位、一つ以上の転写終了部位、一つ以上の転写調節配列、一つ以上の翻訳シグナル配列、一つ以上の読み取り枠（ORF）、ORFを変異させる一つ以上の配列、一つ以上の停止コドン、停止コドンを変異又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のmRNA不安定化因子、一つ以上のヘアピン配列、ヘアピンを変異又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のレポータ遺伝子、一つ以上のスプライス受容側配列、一つ以上のスプライス供与側配列、一つ以上の内部リボゾーム侵入部位（IRES）、一つ以上のトランスポゾン配列、一つ以上の部位特異的組換え部位配列、一つ以上の制限酵素配列、融合相手のタンパク質又はペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列、一つ以上の選択マーカ又は選択モジュール、前記ベクタをホスト細胞内で増殖させるために有用な一つ以上の細菌性配列、一つ以上の3'遺伝子トラップ、一つ以上の5'遺伝子トラップ、局在化シグナルをコードする一つ以上のヌクレオチド配列、一つ以上の複製開始点、一つ以上のプロテアーゼ開裂部位、ある遺伝子もしくはある遺伝子部分にコードされた一つ以上の所望のタンパク質又はペプチド、及び、一つ以上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイルをコードする一つ以上の配列、から成る群より選択される一つ以上の物理的もしくは機能的ヌクレオチド配列を含む、請求項７０又は請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項７３】
前記転写調節配列が、プロモータ、エンハンサ及びリプレッサから成る群より選択される、請求項７２に記載のライブラリ。
【請求項７４】
前記一つ以上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイルが一つ以上のpoly(A)テイルである、請求項７２に記載のライブラリ。
【請求項７５】
前記一つ以上の挿入変異原がそれぞれ少なくとも１つの停止コドンを含む、請求項７０又は請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項７６】
前記一つ以上の挿入変異原がそれぞれ少なくとも１つのスプライス受容側部位を含む、請求項７０又は請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項７７】
前記１つ以上の挿入変異原がそれぞれ少なくとも１つのスプライス供与側部位を含む、請求項７０又は請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項７８】
前記挿入変異原が前記細胞のゲノムに導入されると、前記スプライス受容側部位が、前記遺伝子のスプライス供与側部位に作動的に連結される、請求項７６に記載のライブラリ。
【請求項７９】
前記挿入変異原が前記細胞のゲノムに導入されると、前記スプライス供与側部位が、前記遺伝子のスプライス受容側部位に作動的に連結される、請求項７７に記載のライブラリ。
【請求項８０】
前記一つ以上の挿入変異原がそれぞれ少なくとも１つの5'遺伝子トラップを含む、請求項７０又は請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項８１】
前記一つ以上の挿入変異原がそれぞれ少なくとも１つの選択マーカを含む、請求項７０又は請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項８２】
前記一つ以上の挿入変異原がそれぞれ少なくとも１つのレポータ遺伝子を含む、請求項７０又は請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項８３】
前記レポータ遺伝子が、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく及びその誘導体、黄色蛍光たんぱく及びその誘導体、青色蛍光たんぱく及びその誘導体、並びに赤色蛍光たんぱく及びその誘導体から成る群より選択される、請求項８２に記載のライブラリ。
【請求項８４】
前記物理化学的変異原が、紫外線、ガンマ線、Ｘ線、制限酵素、変異原性もしくは催奇形性化学物質、DNA修復変異原、DNA修復阻害剤、エラープロ−ンDNA複製たんぱく、ENU、EMS及びICR191、から成る群より選択される、請求項７０又は請求項７１に記載のライブラリ。
【請求項８５】
前記エラープロ−ンDNA複製たんぱくがエラープロ−ンDNAポリメラーゼである、請求項８１に記載のライブラリ。
【請求項８６】
前記物理化学的変異原が、ENU及びEMSから成る群より選択される、請求項６７又は請求項６８に記載のライブラリ。
【請求項８７】
前記ライブラリが少なくとも50個の物理化学的変異クローンと、少なくとも1000個の挿入変異クローンとを含む、請求項６７又は請求項６８に記載のライブラリ。
【請求項８８】
前記細胞がin vitroである、請求項１乃至１２、１４乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞がin vivoである、請求項１乃至１２、１４乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
前記細胞が単離された細胞である、請求項１乃至１２、１４乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
前記挿入変異誘発が、トランスポゾンの挿入及びレトロウィルスの挿入から成る群より選択される方法により達成される、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項９２】
前記挿入変異誘発が、レトロウィルスの挿入により達成される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記レトロウィルスの挿入が、レンチウィルスを用いて達成される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、ウサギの細胞、ウシの細胞、ヒツジの細胞、ブタの細胞、イヌの細胞、及びネコの細胞から成る群より選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞が胚性幹細胞である、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
少なくとも１つの遺伝子の変異についてホモ接合型になった細胞を含有するトランスジェニック生物を作製する方法であって、
細胞に挿入変異誘発をin vitroで行って、前記細胞のゲノム中の遺伝子の第一アレルに変異を含む変異細胞を生じさせるステップと、
前記細胞に非挿入変異誘発を行って、前記細胞のゲノム中の対応する第二アレルに変異を誘導するステップと、
前記細胞からトランスジェニック生物を作製するステップであって、前記トランスジェニック生物が、前記遺伝子の変異についてホモ接合型である、ステップと
を含む、方法。
【請求項９８】
細胞中の２つ以上の遺伝子に変異を持つ細胞を含有するトランスジェニック生物を作製する方法であって、前記変異は、前記細胞中又は前記生物中の表現型を生じるのに累積的に必要であり、
細胞に挿入変異誘発をin vitroで行って、前記細胞のゲノム中の一つ以上の遺伝子に変異を含む変異細胞を生じさせるステップと、
前記細胞に非挿入変異誘発を行って、前記細胞のゲノム中の一つ以上の遺伝子に変異を誘導するステップと、
前記細胞からトランスジェニック生物を作製するステップであって、前記トランスジェニック生物が、細胞中の２つ以上の遺伝子で変異させられている、ステップと
を含む、方法。
【請求項９９】
前記挿入変異誘発法が、少なくとも１つの挿入変異原を用いて、前記挿入変異原が前記ドナー細胞のゲノム中に導入されることで一つのアレルを変異させるような条件下で、達成される、請求項９７又は請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記挿入変異原が、一つ以上の多重クローニング部位、一つ以上の転写終了部位、一つ以上の転写調節配列、一つ以上の翻訳シグナル配列、一つ以上の読み取り枠（ORF）、ORFを変異させる一つ以上の配列、一つ以上の停止コドン、停止コドンを変異又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のmRNA不安定化因子、一つ以上のヘアピン配列、ヘアピンを変異又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のレポータ遺伝子、一つ以上のスプライス受容側配列、一つ以上のスプライス供与側配列、一つ以上の内部リボゾーム侵入部位（IRES）、一つ以上のトランスポゾン配列、一つ以上の部位特異的組換え部位配列、一つ以上の制限酵素配列、融合相手のタンパク質又はペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列、一つ以上の選択マーカ又は選択モジュール、前記ベクタをホスト細胞内で増殖させるために有用な一つ以上の細菌性配列、一つ以上の3'遺伝子トラップ・カセット、局在化シグナルをコードする一つ以上のヌクレオチド配列、一つ以上の複製開始点、一つ以上のプロテアーゼ開裂部位、ある遺伝子もしくはある遺伝子部分にコードされた一つ以上の所望のタンパク質又はペプチド、及び、一つ以上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイルをコードする一つ以上の配列、から成る群より選択される一つ以上の物理的もしくは機能的ヌクレオチド配列を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記転写調節配列が、プロモータ、エンハンサ及びリプレッサから成る群より選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記一つ以上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイルが一つ以上のpoly(A)テイルである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記挿入変異原が少なくとも１つの停止コドンを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記挿入変異原が少なくとも１つのスプライス受容側部位を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記挿入変異原が少なくとも１つのスプライス供与側部位を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記挿入変異原が前記細胞のゲノムに導入されると、前記スプライス受容側部位が、前記遺伝子のスプライス供与側部位に作動的に連結される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記挿入変異原が前記細胞のゲノムに導入されると、前記スプライス供与側部位が、前記遺伝子のスプライス受容側部位に作動的に連結される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記挿入変異原が少なくとも１つの3'遺伝子トラップ・カセットを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０９】
前記挿入変異原が少なくとも１つの選択マーカを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１０】
前記挿入変異原が少なくとも１つのレポータ遺伝子を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記レポータ遺伝子が、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく及びその誘導体、黄色蛍光たんぱく及びその誘導体、青色蛍光たんぱく及びその誘導体、並びに、赤色蛍光たんぱく及びその誘導体から成る群より選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記非挿入変異誘発が、少なくとも１つの物理化学的変異原を用いて達成される、請求項９７又は請求項９８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記物理化学的変異原が、紫外線、ガンマ線、Ｘ線、制限酵素、変異原性もしくは催奇形性化学物質、DNA修復変異原、DNA修復阻害剤、エラープロ−ンDNA複製たんぱく、ENU、EMS及びICR191、から成る群より選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記エラープロ−ンDNA複製たんぱくがエラープロ−ンDNAポリメラーゼである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記物理化学的変異原が、ENU及びEMSから成る群より選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
前記挿入変異誘発が、レトロウィルスの挿入及びトランスポゾンの挿入から成る群より選択される方法により達成される、請求項９８又は請求項９９に記載の方法。
【請求項１１７】
前記挿入変異誘発が、レトロウィルスの挿入により達成される、請求項９８又は請求項９９に記載の方法。
【請求項１１８】
前記レトロウィルスの挿入が、レンチウィルスを用いて達成される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項９７又は請求項９８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記細胞が植物細胞である、請求項９７又は請求項９８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記細胞が酵母細胞である、請求項９７又は請求項９８に記載の方法。
【請求項１２２】
前記細胞が胚性幹細胞である、請求項９７又は請求項９８に記載の方法。
【請求項１２３】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞、ヒト以外の霊長類の細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、ウサギの細胞、ウシの細胞、ヒツジの細胞、ブタの細胞、イヌの細胞、及びネコの細胞から成る群より選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
前記トランスジェニック生物が、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、トランスジェニック鳥、トランスジェニック魚、トランスジェニック蠕虫、トランスジェニック昆虫、トランスジェニック植物及びトランスジェニック酵母から成る群より選択される、請求項９７又は請求項９８に記載の方法。
【請求項１２５】
前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヒツジ、トランスジェニックブタ、トランスジェニックイヌ及びトランスジェニックネコから成る群より選択される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記トランスジェニック魚がトランスジェニックゼブラフィッシュである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記トランスジェニック蠕虫が、トランスジェニックＣ．エレガンスである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２８】
前記トランスジェニック昆虫がトランスジェニックドゥロソフィラ、トランスジェニックスポドプテラ及びトランスジェニックトリコプルサから成る群より選択される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２９】
前記トランスジェニック植物がトランスジェニック双子葉植物である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３０】
前記トランスジェニック植物がトランスジェニック単子葉植物である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３１】
少なくとも１つの細胞を含む生物を作製する方法であって、但し前記細胞が、少なくとも１つの遺伝子での変異についてホモ接合型であり、前記方法が、請求項４９に記載の細胞を得るステップと、前記細胞を生物に導入するステップと、を含む、方法。
【請求項１３２】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記細胞が植物細胞である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
前記細胞が胚性幹細胞である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３６】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞、ヒト以外の霊長類の細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、ウサギの細胞、ウシの細胞、ヒツジの細胞、ブタの細胞、イヌの細胞、及びネコの細胞から成る群より選択される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３７】
前記生物が、哺乳動物、トリ、サカナ、蠕虫、昆虫、植物及び酵母から成る群より選択される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３８】
前記哺乳動物が、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ及びネコから成る群より選択される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
前記魚がゼブラフィッシュである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４１】
前記蠕虫がＣ．エレガンスである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４２】
前記昆虫が、ドゥロソフィラ、スポドプテラ及びトリコプルサから成る群より選択される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４３】
前記植物が双子葉植物である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４４】
前記植物が単子葉植物である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４５】
内因性遺伝子中の少なくとも１つの変異についてホモ接合型であるin vitroの細胞であって、前記細胞が、前記遺伝子の第一アレルの挿入変異と、前記遺伝子の第二アレルの非挿入変異とを含む、in vitroの細胞。
【請求項１４６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４５に記載の細胞。
【請求項１４７】
前記細胞が植物細胞である、請求項１４５に記載の細胞。
【請求項１４８】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１４５に記載の細胞。
【請求項１４９】
前記細胞が胚性幹細胞である、請求項１４５に記載の細胞。
【請求項１５０】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞、ヒト以外の霊長類の細胞、マウスの細胞、ラットの細胞、ウサギの細胞、ウシの細胞、ヒツジの細胞、ブタの細胞、イヌの細胞、及びネコの細胞から成る群より選択される、請求項１４６に記載の細胞。
【請求項１５１】
前記細胞が単離された細胞である、請求項１４５に記載の細胞。
【請求項１５２】
前記挿入変異が、組込み変異、染色体転座、欠失変異、DNA末端接合、二本鎖破損修復、架橋破損融合、トランスフェクトしたポリヌクレオチドのコンカテマー化、レトロウィルス挿入及びトランスポゾン挿入から成る群より選択される、請求項１４５に記載の細胞。
【請求項１５３】
前記非挿入変異が、少なくとも１つの物理化学的変異原を用いて達成される、請求項１４５に記載の細胞。
【請求項１５４】
前記物理化学的変異原が、紫外線、ガンマ線、Ｘ線、制限酵素、変異原性もしくは催奇形性化学物質、DNA修復変異原、DNA修復阻害剤、エラープロ−ンDNA複製たんぱく、ENU、EMS及びICR191、から成る群より選択される、請求項１５３に記載の細胞。
【請求項１５５】
前記エラープロ−ンDNA複製たんぱくがエラープロ−ンDNAポリメラーゼである、請求項１５４に記載の細胞。
【請求項１５６】
前記物理化学的変異原が、ENU及びEMSから成る群より選択される、請求項１５３に記載の細胞。
【請求項１５７】
請求項１４５に記載の細胞を含む非ヒト生物。
【請求項１５８】
前記生物がヒト以外の哺乳動物、トリ、サカナ、蠕虫、昆虫、植物及び酵母から成る群より選択される、請求項１５７に記載の非ヒト生物。
【請求項１５９】
前記非ヒト哺乳動物が、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ及びネコから成る群より選択される、請求項１５８に記載の非ヒト生物。
【請求項１６０】
前記サカナがゼブラフィッシュである、請求項１５８に記載の非ヒト生物。
【請求項１６１】
前記蠕虫がＣ．エレガンスである、請求項１５８に記載の非ヒト生物。
【請求項１６２】
前記昆虫が、ドゥロソフィラ、スポドプテラ及びトリコプルサから成る群より選択される、請求項１５８に記載の非ヒト生物。
【請求項１６３】
前記植物が双子葉植物である、請求項１５８に記載の非ヒト生物。
【請求項１６４】
前記植物が単子葉植物である、請求項１５８に記載の非ヒト生物。
【請求項１６５】
前記生物がトランスジェニック生物である、請求項１５７に記載の非ヒト生物。
【請求項１６６】
請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法により作製される細胞。
【請求項１６７】
請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法により作製される細胞のライブラリ。
【請求項１６８】
請求項１乃至１７、９７、９８のいずれかに記載の細胞により作製されるトランスジェニック生物。
【請求項１６９】
請求項１３乃至１６又は１３１に記載の方法により作製される生物。
【請求項１７０】
前記変異誘発事象のうちの１つ以上がin vitroで行われる、請求項１乃至１２又は１４乃至１７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体を引用をもってここに援用することとする２００１年１０月２２日出願の米国仮出願第60/336,497号及び２００２年７月１５日出願の米国出願10/196,721号の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は分子生物学、細胞生物学、及び遺伝学の分野に関する。本発明は、概略的には、in vitro及び多細胞生物の遺伝子を変異させることに関する。本発明は、変異原の組合せを用いて細胞中の遺伝子を変異させる方法を包含するものであり、この場合、少なくとも１つの変異原は、挿入変異原として働くポリヌクレオチドである。このような方法を用いて、所望の表現型を達成するための単一遺伝子の変異や、所望の表現型を達成するために累積的に必要な複数の遺伝子の変異を、一細胞又は多細胞生物内で達成する。さらに本発明は、本発明の方法により作成された１つ以上の変異遺伝子を、細胞及び多細胞生物内において、挿入変異原により提供される標識付け特性を利用して、特定する方法にも関する。このように、前記挿入変異原により、前記挿入変異原の挿入により変異させられた一つ以上の遺伝子の特定が可能である。
【０００３】
さらに本発明は、本発明の方法により作成された細胞及び多細胞生物や、前記細胞及び多細胞生物の使用にも関する。さらに本発明は、本発明の方法により作成された細胞のライブラリや、前記ライブラリの使用にも関する。
【０００４】
背景
大型の、そして増加を続ける遺伝子の機能を明らかにするために変異誘発法が用いられてきた。多細胞生物又は生物中の１つ以上の遺伝子における変異により、当業者は、この変異生物又は細胞を研究し、それを変異誘発されていない（野生型でもよい）親生物又は細胞と比較することができる。変異生物又は細胞に関連する表現型を特定することにより、変異の起きた遺伝子の機能を確認することができる。さらに、変異誘発法は、所望の結果を得るために、ある細胞又は多細胞生物の遺伝上の構成を変更する手段となる。例えば、１つ以上の遺伝子を変異させた後、その関連する遺伝子の１つ以上を特定することにより、真核生物での生理学的異常を作り出すことが好ましい場合がある。このように、所望の用途（例えばタンパク質、食物、又は薬品の商業用生産や、又は、特定の疾患モデルとしてのトランスジェニック動物の作製など）を有する変異を特定し、選抜することができる。in vitro、ex vivo、又はin vivoのいずれにかかわらず、この技術の用途の可能性は当業で公知である。
【０００５】
変異誘発法を用いた新規な遺伝子の同定やそれらの機能の特徴付けは、新規な薬物及び薬物ターゲットの同定においても生産的であることが示されている。臨床上関連する表現型を示すin vitro細胞モデルを作製することは、ターゲットを同定したり、当該表現型だけでなく、この表現型を制御するターゲットまでも調節する化合物をスクリーニングする上で貴重な基板となる。このようなターゲットの調節は、ターゲットのこのような調節が、臨床上関連する表現型を調節するのに役立つ場合に、臨床上の異常に治療的介入を行う上で重要なターゲットをバリデートする情報を提供することができる。
【０００６】
臨床上関連する表現型を示す動物モデルも、薬物発見及び開発や、薬物ターゲットの同定にとって、貴重である。例えば体細胞又は生殖細胞を変異させると、目的の表現型を有する、遺伝子改変された子孫又はクローン動物の作製に有効である。このような動物は、例えば、（ヒトの遺伝病などの）生理学的異常を治療又は防止するための候補治療化合物又は組成物の効験をスクリーニングする上で有用な、このような生理学的異常のモデルとしてなど、数多くの用途を有する。さらに、当該表現型を担う遺伝子を同定すると、表現型を調節するための潜在的薬物ターゲットや、また当該表現型が臨床上関連していれば、治療的介入などのための潜在的薬物ターゲットも提供できる。加えて、生物の遺伝子構成を操作したり、新規な遺伝子を同定することは、例えば野生型もしくは非変異型のものに比べて栄養価が高い、もしくは環境ストレス（例えば熱、干ばつ、又は病害虫）に対する耐性が高いといった動物及び植物の新規な株の開発など、農業上の重要な用途を有する。
【０００７】
大半の真核細胞は二倍体であるため、大半の遺伝子のコピーが２つ、各細胞中に存在する。その結果、所望の表現型を生じさせるにはホモ接合型の変異が通常、必要である。なぜなら、変異のある方の遺伝子コピー１つが、未変異の、即ち野生型細胞又は多細胞生物と比べて、遺伝子産物の遺伝子発現又は活性のレベルで充分な変化を生じない場合があり、また、残った方の野生型のコピーが、まだ尚機能的な遺伝子産物を産生するのに充分なレベルで発現することがあるからである。このように、ある細胞又は多細胞生物で遺伝子発現及び／又は機能のレベルにおいて所望の変化を生じさせるには、遺伝子のコピーのそれぞれに１つという、少なくとも２つの変異が同じ細胞中で必要である。
【０００８】
他の場合では、複数の遺伝子における変異が、所望の表現型を生じさせるのに必要なことがある。場合によっては、１つの遺伝子の１つのコピーの変異では、その遺伝子の発現レベルには影響があるが、当該遺伝子産物の活性は所望の程度までは影響されず、その結果、その細胞又は多細胞生物に対し、所望の生理学的効果が達成されないことがある。しかしながら、二番目の遺伝子に変異があると、たとえそれがその二番目の遺伝子のコピーの一方のみであったとしても、この二番目の遺伝子の遺伝子発現レベルが低下することで、両者の遺伝子の発現レベルが充分に低くなる場合、一番目の変異と組み合わせた累積的な表現型上の効果を生むことがある。この効果は、細胞又は多細胞生物の機能を変えることがある。この現象の一例は、血液凝固因子VIII及びIX間の相乗効果である。いずれかの遺伝子単独の変異により、レベルで重大な低下が起きても、凝固機能に何ら影響がないこともある。しかしながら、両方の遺伝子の発現レベルが著しく低下すると、大きな影響を与えることができる。この原理は、複数の（２つ、３つ、４つ、又はそれ以上など）遺伝子の変異が、ある細胞又は多細胞生物のある１つの遺伝子産物の活性又は別の表現型に影響をもたらすのに、累積的に必要であるような他の場合にも延長できる。この場合、このような遺伝子がすべて同じ細胞種で発現し、従って必要な変異のすべてが同じ細胞で起きることに留意されたい。しかしながら、当該遺伝子が通常は異なる細胞種で発現していることもある（例えば異なる細胞から異なる遺伝子産物を分泌しているなど）。この場合は、当該遺伝子産物は異なる細胞で発現するが、それでも尚、生化学的関係を有しているために、各遺伝子での１つ異常の変異が、所望の表現型を得るのに必要なことになる。
【０００９】
残念ながら、所望の表現型を累積的に生じるような複数の遺伝子変異を含有する培養細胞を作製する方法は数少ない。このような方法はしばしば時間がかかったり、誤りを生みがちである。加えて、このような方法を用いて変異させた遺伝子を特定するのは大変困難であるか、又は不可能である場合が多い。
【００１０】
変異の前では変異の起きる遺伝子が不明であるような培養細胞において、ホモ接合型変異を起こさせる方法は、現在のところ未知である。さらに、ホモ接合型変異を特定する方法なしでは、当業者は、表現型を任意の変異と関連づけることはできない。現在では、培養細胞において所望の表現型をホモ接合型変異に関連づけるために、遺伝子の位置、構造及び／又は機能を、当業者が前もって知っていなくてはならない。従って、当業で公知の変異法は、所望の表現型を得るために細胞をホモ接合型に変異させ、この表現型を担う遺伝子を特定するためには、適していない。また、所望の表現型を累積的に生じるような複数の変異を持つ細胞を作製し、この表現型を担う遺伝子を特定するために適した方法も、存在しない。
【００１１】
真核性遺伝子に変異を導入するいくつかのアプローチが現在、用いられている。それぞれには大きな制約がある。
【００１２】
アプローチの１つは、ある細胞中の遺伝子発現レベル又は遺伝子産物の活性を変異させる相同組換えである。1:  Montgomery et al., Cell. 1991 Feb 22;64(4):693-702; 2:  te Riele et al. Nature. 1990 Dec 13;348(6302):649-51; 3:  Mansour et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Oct;87(19):7688-92; 4:  Koller et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Nov;86(22):8927-31; 5: Capecchi MR. Science. 1989 Jun 16;244(4910):1288-92; 6: Zimmer A, Gruss P. Nature. 1989 Mar 9;338(6211):150-3; 7:  Joyner AL, Skarnes WC, Rossant J. Nature. 1989 Mar 9;338(6211):153-6; 8:  Thompson S, Clarke AR, Pow AM, Hooper ML, Melton DW. Cell. 1989 Jan 27;56(2):313-21; 9:  Doetschman T, Maeda N, Smithies O. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 Nov;85(22):8583-7;  10:  Doetschman T, Gregg RG, Maeda N, Hooper ML, Melton DW, Thompson S, Smithies O. Nature. 1987 Dec 10-16;330(6148):576-8; 11:  Thomas KR, Capecchi MR. Cell. 1987 Nov 6;51(3):503-12。
【００１３】
典型的には、このアプローチは、目的の変異を持つトランスジェニック動物を作製するために用いられる胚性幹細胞又は胚性生殖細胞で採られる。このアプローチの制約で重要なものの１つは、変異の起きる遺伝子を、変異の前に知っておき、クローニング及び配列決定して、相同組換えで用いる変異原性ベクタが適切なターゲティング配列を確実に含有しているようにしなければならない点である。さらに、当該プロセスは面倒であり、細胞中で目的の遺伝子の変異コピーが１つのみ、できるだけである。従って、表現型の発現がホモ接合型に依存する場合、相同組換えによりこの遺伝子の二番目のコピーをなくしておく付加的な作業を行わないままでは、目的の表現型の変化を探すスクリーニングに、そのヘテロ接合型の細胞を用いることはできない。この付加的な作業は時間がかかり、高価であり、またより重要なことに、当業者が前もって知っている遺伝子に対してのみ、可能な作業である。
【００１４】
このような変異したヘテロ接合型細胞を、トランスジェニック動物を作製するために用いることはできる。しかしながら、このような動物もヘテロ接合型であり、野生型又は非変異動物とは異なる表現型を発現しないかも知れない。従って、当該変異の表現型上の効果を分析したいのであれば、この動物をさらに交配してホモ接合型にすることが必要である。このような交配は時間がかかり、また高価である。
【００１５】
もう一つのアプローチは、細胞及び／又は生物の化学的変異誘発法を含むものである（例えば、細胞又は動物において検出可能な表現型を作る変異を生じさせる際のENUの使用を教示するために、その全ての開示を引用をもってここに援用することとするBrown et al., Hum. Mol. Genet. 7:1627-1633 (1998); Chen et al., Nature Gen. 24:314-317 (2000); Munroe et al., Nature Gen. 24:318-321 (2000); Nolan et al., Nature Gen. 25:440-443 (2000)を参照されたい）。このアプローチは、ゲノム中に１つ以上の変異を生むことのできる１つ以上の化学的変異原の使用に依拠している。しかしながら、相同組換えによる変異と同様に、化学的変異誘発法も、典型的には、ある遺伝子のコピー１つのみでの変異誘発に終わる。所望の表現型を達成するのにホモ接合型変異が必要な場合、所望の表現型が達成できるまでに、ある任意の遺伝子の両方のコピーを変異させねばならず、一回の化学変異誘発を行った細胞又は生物は、典型的には、表現型で所望の変化を示さない。従って、これらの細胞又は生物は、一般的に、所望の表現型を達成するには有用でない。
【００１６】
更なる問題は、化学的変異誘発法の結果、細胞中の一つ以上の遺伝子で変異は起きるが、当該表現型を担う変異遺伝子を決定する簡単な方法がないことである。このアプローチは、所望の表現型を累積的に提供するような複数の変異を起こさせると同時に、当該表現型を担う遺伝子の容易な特定も可能にするような方法を提供することもできない。
【００１７】
上に（相同組換え変異誘発法に関して）論じたように、化学的変異誘発法により調製された変異したヘテロ接合型細胞を用いてトランスジェニック動物を作製することはできる。しかしながら、当該動物もヘテロ接合型であり、従って、野生型からの所望の表現型変化を発現しないかも知れない。動物を交配してホモ接合型にするという、時間がかかり、高価な方法が必要である。所望の表現型変化がトランスジェニック動物で（例えばホモ接合型のトランスジェニック動物ででも）観察されたとしても、その表現型を担う変異遺伝子を特定することは、不可能でないにしても、大変難しい。従って、標準的なポジショナル・クローニング法により変異遺伝子をクローニングするには、膨大な回数の交配を行わなければならない。このように、このプロセスは多数の変異動物で実施するには遅く、高価で、困難であり、失敗率も高い。このように、化学的変異誘発法では、ホモ接合型変異を培養細胞で（よってこのような細胞から作製されたトランスジェニック動物でも）提供することはできず、培養細胞又は多細胞生物において表現型を担う変異遺伝子を特定する簡単な方法を提供することもできない。
【００１８】
遺伝子を変異させるために用いられてきたもう一つのアプローチは、遺伝子トラップ・ベクタなどの挿入変異原を用いて遺伝子を変異させる方法に関する（例えば、変異誘発技術としての遺伝子トラップの使用を教示するために、そのすべての開示を引用をもってここに援用することとするAmsterdam et al., Genes Dev. 13:2713-2724 (1999); von Melcher et al., Genes Dev. 6:919-927 (1992); Gogos et al., J. Virol. 71:1644-1650 (1997); Voss et al., Dev. Dyn. 212:171-180 (1998); Zambrowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3789-3794 (1997); Friedrich et al., Genes Dev. 5:1513-1523 (1991)を参照されたい。）これらのベクタは典型的には、非相同組換えにより、ある細胞のゲノムに挿入される。これらのベクタは、挿入されると、ある遺伝子の転写及び／又は翻訳を破壊するようにデザインされる。残念ながら、遺伝子トラップ・ベクタは非効率的な変異原であり、特定の遺伝子の１つのコピーのみを変異させるだけである。その結果、このような変異原では、ホモ接合型の変異は細胞培養では作り出せないことが多い。動物においては、表現型分析の前に、変異動物を変異遺伝子についてホモ接合型になるように交配しなければならない。膨大な数の動物をホモ接合型になるように交配するのは困難かつ高価であるため、このアプローチは今日までのところ、比較的に少数の遺伝子に用いられてきただけである。
【００１９】
このアプローチでも、所望の表現型を累積的に提供できる複数の変異を作ると共に、当該表現型を担う遺伝子を特定できるような方法を提供することはできない。一個の細胞で必要な遺伝子のすべてで挿入に成功できる可能性は低く、さらに、所望の表現型を得るのに変異させねばならない遺伝子数が増すとともにこの可能性は低下する。このように、遺伝子トラップでは複数の遺伝子を変異させられず、培養細胞においてホモ接合型の変異を作り出すことはできない。
【００２０】
Starkら (Human Molecular Genetics 8:1925-1938 (1999))は、遺伝子発見のための機能的アプローチを用いた哺乳動物細胞における前方向遺伝学に関するレビュー誌において、欠失遺伝子をクローニングするために、発現ライブラリを用いることで変異型の補完をするという代替法の可能性を示唆した。彼らは、この代替法が、化学的変異誘発法と組み合わされたレトロウィルス媒介型の挿入変異誘発法に関係するものだと示した。また彼らは、挿入変異誘発法をde novoで用いて標的遺伝子の２つのアレルを不活性化しようとするのは実際的でなかったことも示唆した。しかしながら、これがどのようにしたら達成できるかの示唆はなく、またこの文献は、実際に行われた方法の記載も開示していなかった。提案されていたのは、変異誘発を多量に行った一集団の細胞を得、次にこれらの細胞にレトロウィルスを導入して当該遺伝子を不活性化及び標識することであった。しかしながら、この提案が実施されたとの報告はなく、ホモ接合型の変異を成功させるために、前記変異誘発法のいずれかをどのように行うかに関する指針もなかった。
【００２１】
従って、当該遺伝子を前もって知ることなく、細胞培養及び多細胞生物においてゲノム・ワイドなホモ接合型遺伝子変異を起こす必要が、当業においてあるのである。また、当該遺伝子を特定する方法を提供する必要もある。また、所望の表現型を得たり、そして変異遺伝子の１つ以上を特定したりするのに累積的に必要な、細胞中の複数の遺伝子を変異させる方法が求められている。培養細胞又は多細胞生物において、複数の遺伝子を変異させたり、又は、同じ遺伝子の両方のコピーを変異させたりできる能力を、変異遺伝子を特定する能力と組み合わせると、新規な遺伝子を特定したり、遺伝子を機能と相関付けたり、そしてこれら変異遺伝子、それらの野生型の相対物、及び他のバリアントを、例えば薬物のスクリーニング及び開発、トランスジェニック動物及び植物の作製や、所望の遺伝子産物の作製を行ったりするために、有用性の高いアプローチとなるであろう。
【００２２】
発明の簡単な概要
本発明は、同じ細胞中の複数の遺伝子を効率的に変異させると共に、前記変異遺伝子の１つ以上を特定できるように前記変異した複数の遺伝子を含有する細胞中で変異遺伝子の少なくとも１つを標識する方法を提供することにより、上記の必要性に対する解決法を初めて紹介するものである。さらに本発明は、ホモ接合型遺伝子変異を作り、前記変異遺伝子を標識する方法も提供する。
【００２３】
広い意味では、本発明は、２つ以上の変異原を用いて変異した細胞及び多細胞生物を作製する方法に関し、但しこの場合、前記変異原の少なくとも１つは、挿入変異原として働くポリヌクレオチドである。本ポリヌクレオチドは、変異した遺伝子を含有する細胞を特定するための、及び／又は、変異した遺伝子自体を特定するための、標識として使用可能である。本発明の局面の１つは、同じ細胞中で、所望の表現型を累積的に生じるような複数の遺伝子を変異させると共に、前記変異遺伝子のうちの少なくとも１つを標識する方法に関する。本発明のもう一つの局面は、所望の表現型を生じるように前記変異遺伝子機能を充分に変化させると共に、前記変異遺伝子のうちの少なくとも１つを標識するような、細胞中に１つ以上のホモ接合型変異を作る方法に関する。
【００２４】
本発明に基づいて用いられる変異法の１つは、物理化学的変異原を用いて細胞を変異させる方法に関する。これらの方法は、細胞で変異を効率的に起こすことが示されてはいるが、変異遺伝子を標識するために用いることはできない。当該遺伝子を標識できないために、化学的に変異させた遺伝子の特定は困難又は不可能である。
【００２５】
本発明に基づいて用いられる他の変異法は、挿入変異原を用いて細胞を変異させる方法に関する。これらの方法は、ヘテロ接合型遺伝子変異を作り、そして場合によっては変異遺伝子を標識することが知られている。しかしこれらの方法は、個々の細胞内でホモ接合型遺伝子変異を起こしたり、又は、所望の表現型を累積的に生じるような、細胞中での複数の遺伝子変異を効率的に起こすとは、示されていない。このように、本発明は、複数の変異を含有する各細胞中で変異遺伝子のうちの少なくとも１つが標識されるように、細胞内で（所望の表現型を累積的に生じる）複数の変異を達成する際に、物理化学的変異誘発法を挿入変異誘発法と組み合わせて利用する。従って、変異遺伝子のうちの１つ以上を、この標識の検出により特定することができる。ホモ接合型変異の場合、所望の表現型を担う変異を特定できるように、遺伝子の変異したコピーのうちの少なくとも１つを標識する。
【００２６】
本発明によれば、物理化学的変異原を用いて、細胞中の１つ以上の遺伝子を変異させる。変異には、限定はしないが、点変異、挿入、欠失、反転、塩基修飾及び転位、がある。このような変異の結果、エキソン利用を変えるスプライシング不全、フレームシフト、転写産物及びタンパク質（アミノ末端及びカルボキシ末端）の切断（５’及び３’）、そして一次タンパク質配列中の個々の残基の種類を変更したり、２つ以上の遺伝子のコーディング配列を融合させて融合タンパク質を作製したり、また変異遺伝子からの転写産物の産生、安定性又は翻訳可能性に対し、変異誘発法で誘導される変更を行って他の点では正常なタンパク質の豊富度を変えたりすることにより、変異遺伝子のタンパク質産物の配列及び豊富度を変える。
【００２７】
大半の真核生物ゲノムは少なくとも二倍体（例えば各遺伝子が少なくとも２つのコピーから成るなど）であるため、ある遺伝子をこの態様で真核生物細胞で変異させると、典型的には一方のコピーのみが変異して、他方のコピーは未変異のままである。従って、ある遺伝子の両方のコピーからの遺伝子発現をなくすようなホモ接合型変異は、物理化学的変異誘発法のみでは典型的には達成されない。
【００２８】
よって、この欠陥を回避するために、挿入変異誘発法も、物理化学的変異誘発法に加えて行う。この手法では、物理化学的変異誘発法のレベルを、挿入変異誘発法を用いずに目的の表現型を生じさせるためでなく、変異原性に調節する。１種以上の挿入変異原を、一つ以上の細胞遺伝子の機能的遺伝子産物（例えばRNA又はタンパク質）の発現が変化するような態様で、ホスト細胞又は生物のゲノム中に挿入する。さらに、１つ以上の挿入される変異原は、挿入により変異させられた遺伝子の「標識付け」の特性を有するため、それの特定を可能にする。
【００２９】
同じ細胞に対して物理化学的変異誘発法及び挿入変異誘発法の両方を行うことにより、１つ以上の遺伝子がこの物理化学的変異原により変異させられ、１つ以上の遺伝子がこの挿入変異原により変異させられているような細胞が生じる。本発明のこのような実施態様の１つでは、ある遺伝子の一方のコピーがこの物理化学的変異原により変異させられ、同じ遺伝子の他方のコピーがこの挿入変異原により変異させられているような細胞が生じるため、その遺伝子においてホモ接合型の変異を持つ細胞が生じることになる。このような変異は所望の表現型を生じ得る。こうして変異細胞を、所望の表現型の産生についてスクリーニングし、当該標識を用いて、当該表現型を担う遺伝子を特定することができる。
【００３０】
これら２つの変異法を用いることにより、所望の表現型を生じるのに累積的に働く２つ以上の遺伝子に変異を含有するような細胞も提供される。現れる表現型に寄与する変異遺伝子のうちの少なくとも１つは、挿入変異原により標識付けされる。２つの遺伝子を変異させる必要がある簡単な場合を例に採ると、本発明には以下のシナリオが包含される（１）１つの細胞中、遺伝子＃１を物理化学的変異誘発法により変異させ、遺伝子＃２を挿入変異誘発法で変異させる。（２）第二の細胞中、遺伝子＃１を挿入変異誘発法で変異させ、遺伝子＃２を物理化学的に変異させる。両方の細胞が、２つの遺伝子の変異により累積的に生じる所望の表現型を示す。第一の細胞では、遺伝子＃２のみを標識により特定することができる。第２の細胞では、遺伝子＃１のみを標識により特定することができる。しかしながら、これら２つの細胞は、所望の表現型を得るのに変異させねばならない遺伝子の種類について完全な情報を提供するものとなる。
【００３１】
ここで解説する２つの種類の変異事象は、いずれの順番で行ってもよく、又は同時に行うこともできる。変異事象を繰り返して、任意の細胞、細胞集団又は生物に対し、物理化学的変異誘発法及び／又は挿入変異誘発法が一回以上（例えば二回、三回、四回、五回、六回、七回、八回、九回、十回、十五回、二十回等）、いずれかの順序又は同時に行われるようにすることもできる。この過程のいずれかの時点で、細胞又は生物を所望の表現型についてスクリーニングしたり、又は所望の表現型を両者が有する挿入変異原の挿入についてスクリーニングしたり、当該挿入を含有するものを単離及びクローニングすることもできる。ある好適な実施態様では、物理化学的変異誘発法は挿入変異誘発法の前に行われ、細胞は挿入変異誘発法に向けて選抜される。挿入変異原は、部位特異的組換え及び転位に関するシグナルを持つ５’遺伝子トラップである。
【００３２】
さらに本発明は、本発明の挿入変異誘発法で用いるための挿入変異原として働くポリヌクレオチドも提供する。このようなポリヌクレオチドは、いずれのヌクレオチド配列及びジオメトリ（例えば線形、円形、コイル型、超コイル型等）を有していてもよく、また二本鎖でも、もしくは一本鎖でもよい。好適な挿入変異原を本図面及び実施例の項で解説する。唯一の制約は、これらが変異原性で、標識機能を提供することである。
【００３３】
ある好適な実施態様では、当該挿入変異原は、プロモータ配列に作動的に連結していないスプライス受容側配列を含む。他の好適な実施態様では、本挿入変異原は、以下の因子：スプライス受容側配列に対して３’側に見られる３つのすべてのフレームでの停止コドン、内部リボソーム侵入部位、選択マーカ、及びpolyAトラップ、のうちの１つ以上を含む。PolyAトラップは、PolyAトラップの教示について、引用をもってここに援用することとする米国出願第09/276,820号に詳述されている。上記の実施態様では、選択マーカは好ましくは、ポリアデニレーション・シグナルに作動的に連結されているとよい。他の好適な実施態様では、当該挿入変異原は、レトロウィルスの複製及び感染サイクルを可能にするレトロウィルス配列を含有する。他の好適な実施態様では、当該挿入変異原は、転位に必要な配列を含有する。特に好ましい実施態様では、当該挿入変異原は、プロモータに作動的に連結されていないスプライス受容側配列であって、至適な分岐点を有する、スプライス受容側配列と、３つのフレームすべての停止コドンと、エキソン・スプライシング・エンハンサを含む内部リボゾーム侵入部位と、ポリアデニレーション・シグナルの付いた選択マーカと、poly Aトラップとを含有し、これらの因子はレトロウィルス・ベクタ内に含有されているか、又は、転位シグナル配列を含有する。更なる好適な実施態様では、当該挿入変異原は、プロモータに作動的に連結されていないスプライス受容側配列であって、至適な分岐点を含有する、スプライス受容側配列と、３つのフレームすべてでの停止コドンと、内部リボゾーム侵入部位と、ポリアデニレーション・シグナルを連結させた選択マーカと、を含有し、この場合の当該挿入変異原は、レトロウィルス・ベクタであるか、又は転位シグナルを含有する。さらに、ここでの実施態様のいずれでも、そして上記の好適な実施態様では特に、好適な挿入変異原は、ここで解説するように部位特異的組換えのための組換え部位を含有するものである。
【００３４】
さらに本発明は、好ましくは真核細胞（例えば植物細胞、真菌細胞（酵母細胞を含む）、動物細胞（昆虫細胞、鳥類の細胞、蠕虫細胞、哺乳動物細胞（ヒト細胞、ヒト以外の霊長類又はサルの細胞、げっ歯類（ラット、マウス等）の細胞、ウサギの細胞、ウシの細胞、ヒツジの細胞、ブタの細胞、イヌの細胞、ネコの細胞）、等）である、本発明の方法により作製された細胞も包含するものである。これらの細胞は、当業者に公知の方法を用いて単離及びクローニングすることができる。変異細胞を調製するために、初代又は樹立細胞を本発明の方法で用いることができる。
【００３５】
別の局面では、本発明は、本発明により作製される細胞のライブラリも提供するものである。両方の変異プロセスを２個以上の細胞、好ましくは106乃至108個の細胞（哺乳動物細胞などの大型のゲノムを持つ細胞の場合）に行ったり、又は、変異誘発法を組み合わせたときの変異上の飽和を確認するために必要な場合に、物理化学的／挿入変異ライブラリが作製される。細胞集団は（細胞株の場合のように）すべて同じであっても、又は、異なる下位集団（例えば組織から調製された細胞集団の場合など）を含むものでもよい。このようなライブラリの各クローンが、該ライブラリ内の他のクローンの変異遺伝子組とは異なる一組の変異遺伝子を含有していてもよい。代替的には、異なるクローン中の同じ遺伝子を変異させてもよいが、各遺伝子の変異の種類が異なっていてもよい。例えば、遺伝子＃１、＃２、及び＃３の３つの遺伝子すべてを、３つの別々のクローン中で変異させてよく、しかし変異の種類（挿入対物理化学的）は異なっていてもよい。（概略図を参照されたい）。従って、このような細胞ライブラリは、多種の単一変異又は多種の組合せ変異で生じた所望の表現型（例えば野生型もしくは変異のない表現型からの変化）について、迅速にスクリーニングするのに有用である。
【００３６】
ライブラリが一集団を包含していてもよい（挿入変異誘発法又は物理化学的変異誘発法の両方ではなく、いずれか一方を行った２個以上、好ましくは102乃至105個の細胞）。これらのライブラリは、本発明の二番目の変異原性プロセスによる更なる変異の基板を成す細胞集団として役立つ。物理化学的変異誘発法の効率により、効率の低い挿入変異誘発法を用いて得られるより、すべての遺伝子に変異を含有する、より小型のライブラリの作製が可能である。
【００３７】
従って、本発明は、２個以上の物理化学的変異誘発細胞のうちで、少なくとも１個の物理化学的変異誘発細胞を挿入的に変異誘発することにより、変異誘発細胞のライブラリを作製する方法を包含するものである。さらに本発明は、２個以上の挿入変異誘発細胞のうちで、少なくとも１つの挿入変異誘発細胞を物理化学的に変異誘発することにより、変異誘発細胞のライブラリを作製する方法にも関する。さらに本発明は、１種以上の物理化学的変異原と、１種以上の挿入変異原とで、２個以上の細胞を同時に変異誘発することにより、変異誘発細胞のライブラリを作製する方法も、包含するものである。また本発明は、物理化学的変異原を含有する２個以上の細胞に対し、挿入変異誘発を行うことにより、変異誘発細胞のライブラリを作製する方法も包含する。さらに本発明は、挿入変異原を含有する２個以上の細胞に、物理化学的変異原を投与することにより、変異誘発細胞のライブラリを作製する方法にも関する。例えば物理化学的変異誘発事象の後、挿入変異誘発事象の後、又は両方もしくはすべての変異誘発事象の後など、当該プロセスのいずれの段階で、特定の所望の遺伝子の変異について、又は他の所望の表現型について、１個以上の細胞をスクリーニングすることができる。所望の表現型を有する細胞を単離及びクローニングすることができる。さらに、例えば物理化学的変異誘発事象の後、挿入変異誘発事象の後、又は両方もしくはすべての変異誘発事象の後など、当該プロセスのいずれの段階で、挿入変異原の所持について、細胞をスクリーニングすることもできる。これらの細胞には、更なる挿入変異誘発又は物理化学的変異誘発を行うことができる。これらの細胞は、例えば挿入変異原の所持に関する選抜後など、当該プロセスのいずれの段階でも、単離及び／又はクローニングすることができる。従ってこのようなクローンは、更なる変異誘発事象のための基板を成すことができる。実施態様の一つでは、複数の細胞に対して物理化学的変異誘発を行う。次にこれら細胞を増殖させてクローン集団を形成させ、これらの集団に挿入変異誘発を行って、挿入変異誘発細胞の不均質な集団を形成する。これらの細胞を増殖させても、又は増殖させなくともよいが、特定の所望の遺伝子の変異について、又は、所望の表現型について、スクリーニングすることができる。別の例示的な実施態様では、複数の細胞を物理化学的に変異させ、細胞を増殖させた後、挿入的に変異誘発する。この一回目の挿入は、表現型を起こす挿入であっても、又はそうでなくともよい。表現型を起こす挿入は、最初の挿入変異原の更なる挿入から生じさせてもよい。例えば、最初の挿入変異誘発事象後に、細胞を増殖させ、増殖後に、トランスポゼースなど、更なる挿入変異誘発を起こすこととなる成分をこの細胞に導入するか、この細胞で誘導してもよい。ある関連する例示的な実施態様では、細胞に物理化学的変異誘発及び挿入変異誘発の両方を（同時に）行い、増殖させ、そして挿入変異原を起こす因子をこの細胞に導入するか、又は、この細胞内で誘導することができる。ある関連する例示的な実施態様では、第一の挿入変異原の導入で細胞を挿入的に変異誘発し、増殖させた後、内因性の挿入変異原からの更なる挿入を起こさせる因子を当該細胞で活性化させた後に、当該細胞を物理化学的に変異させることができる。上述したように、各処理後に細胞を増殖させても、又はさせなくてもよい。
【００３８】
ある表現型が変異により生じた後のいずれの段階でも、挿入変異原上の部位特異的組換え配列の存在を用いて、この挿入によりその表現型を引き起こしたかどうかを確認することができる。挿入変異原を切り取ると表現型が逆戻りするのであれば、これは、この表現型を起こす変異が当該挿入により起きたことを示している。
【００３９】
さらに本発明は、本発明の変異誘発法により作製された表現型についてスクリーニングするため、そして当該表現型を担う一箇所以上の変異を特定するために、当該細胞及びライブラリを使用する方法も提供するものである。
【００４０】
本発明の方法は、ある遺伝子の機能を確定する方法を提供する。本方法により、いずれの特定の所望の遺伝子の機能を決定することも可能である。細胞を変異させ、ある特定の所望の遺伝子の変異について、その遺伝子での変異を特異的に検出するために使用できるいずれの検定でも、スクリーニングすることができる。次に、この変異が細胞又は動物に及ぼす作用を確認することができる。この場合、標識された挿入変異原が、目的の遺伝子の変異を含有する細胞を特定するのに有効である。
【００４１】
あるいは、変異細胞を、所望の表現型について、又は、当該細胞から作製された多細胞生物での所望の表現型の産生について、無作為にスクリーニングすることができ、こうしてこの表現型を、一つ以上の遺伝子での変異と、標識を利用して相関付けることができる。あるいは、変異した細胞を、それが有する、又は、その細胞からなる生物にもたらされる、表現型に基づいて選抜し、こうしてその表現型を、一つ以上の遺伝子での変異と、標識を利用して相関付けることもできる。このように、細胞（又は当該細胞を由来とする多細胞生物）の表現型を、非変異細胞（又は細胞生物）のそれと比較したときの何らかの変化を、変異遺伝子に起因させることができる。所望の表現型を生じる変異遺伝子を選抜し、特定し、例えばクローニング、配列決定、マッピングなどにより、特徴付けることができる。本発明のこの局面によれば、いずれの遺伝子の機能も特定及び評価が可能である。このように、ある表現型を、当業で公知の遺伝子（既に同定されている、例えばマッピング、クローニング、配列決定、又は他の特徴付けがなされているなど）や、又は、当業で未知の遺伝子と相関付けることができる。
【００４２】
本発明の方法は、変異遺伝子を特定するが、本発明は、ある機能と前記遺伝子を相関付ける方法を提供し、従って、ある機能を野生型遺伝子に起因させ、この野生型遺伝子及び遺伝子産物を用いる方法を提供するものである。従って本発明は、上述のように特定された野生型遺伝子又は当該遺伝子の他の天然バリアントの使用法を提供するものである。これには、限定はしないが、アレル・バリアント、相同体、オーソログ、偽遺伝子等も含まれる。変異遺伝子を利用して特定された野生型遺伝子や他のバリアントは、例えば非変異細胞から、cDNAライブラリ・スクリーニング又はPCRなどの標準的な組換えDNA又は分子生物学的技術を用いて単離することができる。野生型遺伝子／タンパク質又は他のバリアントは、例えば治療用タンパク質、抗体ターゲットとして使用できる。天然で発生する変異体も、例えば抗体又は他の検出可能及び／又は阻害性結合試薬などと一緒に、治療ターゲット又は診断ターゲットとして有用である。
【００４３】
疾患組織又は細胞においては、天然の変異遺伝子が疾患を生じる。本発明の方法により更なる変異を起こさせると、細胞又は生物を正常な表現型に戻すことができ、変異のある疾患遺伝子を特定することもできる。
【００４４】
さらに本発明は、トランスジェニック動物を作製するための本変異細胞の使用も包含する。トランスジェニック動物は、変異させた体細胞又は生殖細胞から作製することも、あるいは本発明の方法により作成された変異幹細胞（例えば胚性又は成体幹細胞）から作製することもできる。（ドナー動物由来の体細胞でも、成体幹細胞でも、生殖細胞でも、又は胚性幹細胞でもよい）ドナー細胞に、挿入変異誘発及び物理化学的変異誘発法をin vitroで行って、当該細胞又は生物で所望の表現型を生じる単一のホモ接合型変異を持つ変異ドナー細胞、あるいは、複数の遺伝子に変異を持つ（当該細胞又は生物で所望の表現型を累積的に達成することとなる）変異ドナー細胞、を作製する。当該動物は、ドナー細胞由来の核を（例えば脱核してある受精卵母細胞でもよい）レシピエント細胞に移動させ、このレシピエント細胞からトランスジェニック生物を生じさせることにより、作製することができる。あるいは、変異幹細胞を胚盤胞に移植したり、変異幹細胞を用いてin vitro受精又は人工授精を通じて変異接合子を作製し、その結果得られる変異接合子を偽妊娠のメスに移植して、トランスジェニック生物を生じさせることもできよう。
【００４５】
遺伝子改変動物は、本発明の技術により変異誘発した細胞を由来とする核の移植により、作製することができる。次に、変異細胞から抽出した核を脱核した受精卵に移植し、その結果できた接合子を偽妊娠のメスに移植して、最初の変異誘発させた細胞で生じた変異を持つ動物を発生させる。
【００４６】
接合子はまた、変異胚性もしくは他の多能性幹細胞から、遺伝子改変マウスの作製について開発された胚盤胞融合プロトコルに従って形成することもできる。
【００４７】
簡単に説明すると、改変された幹細胞を二倍体の細胞又は四倍体の桑実胚に組み合わせるか、あるいは、改変された細胞を、発生中の胚盤胞の割腔に直接注射する。その結果できたキメラ接合子を偽妊娠のメスに移植して、該幹細胞で生じさせた変異を持つ動物を発生させる。遺伝子改変された生殖細胞は、成体及び未成熟動物の両方の精原幹細胞へのin vitroレトロウィルス媒介型送達もしくは他の遺伝子送達により作製することができ、幹細胞の2乃至20%で、挿入変異原の安定な組込みを起こさせることができる。形質導入した幹細胞を、無精レシピエント動物の精巣に移植した後では、これらのオスの子孫のほぼ4.5%が当該の挿入変異原を含有し、この変異原性ベクタは次の世代に伝播されて、機能する。1:  Chesne P, Adenot PG, Viglietta C, Baratte M, Boulanger L, Renard JP.Nat Biotechnol. 2002 Apr;20(4):366-9;  2:  Hosaka K, Ohi S, Ando A, Kobayashi M, Sato K. Hum Cell. 2000 Dec;13(4):237-42; 3:  Wolf E, Zakhartchenko V, Brem G. Biotechnol. 1998 Oct 27;65(2-3):99-110.; In Hogan B, Beddington R, Costantini F, Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo; a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994; 1:  Cecconi F, Gruss P.Methods Mol Biol. 2002;185:335-46. Review; 1:  Brinster RL. Science. 2002 Jun 21;296(5576):2174-6; 2:  Nagano M, Brinster CJ, Orwig KE, Ryu BY, Avarbock MR, Brinster RL. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Nov 6;98(23):13090-5; 1:  Cecconi F, Gruss P. Methods Mol Biol. 2002;185:335-46. 
【００４８】
別の実施態様では、本発明の方法に従って挿入的及び物理化学的変異誘発を行った後に、所望の表現型をin vitroで示すために選ばれた細胞から、トランスジェニック生物を生じさせることができる。この表現型を担う一つ又は複数の遺伝子の種類は、トランスジェニック動物の調製のためのこの段階で判明していても、又は未知でもよい。別の実施態様では、トランスジェニック生物を、特定の所望の遺伝子に変異を持つ細胞から作製することができる。別の実施態様では、変異細胞を無作為に選抜し、トランスジェニック生物を作製するために用い、そしてこのトランスジェニック生物を、所望の表現型についてスクリーニングすることもできる。
【００４９】
さらに本発明は、トランスジェニック動物を作製する方法と、本方法により作製されたトランスジェニック動物も、包含するものである。本発明の方法により作製できるトランスジェニック動物には、例えば、昆虫（ドゥロソフィラ（原語Drosophila）、スポドプテラ（原語：Spodoptera ）及びトリコプルサ（原語：Trichoplusa ）種を含む）、鳥類、蠕虫、（シー・エレガンス《原語C. elegans》を含む）、魚類（ゼブラフィッシュを含む）、哺乳動物（ヒト、並びに、サル及び他の非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳動物、マウス、ラット、ブタ、牛、ヒツジ、イヌ、ネコ等）、がある。当該トランスジェニック動物は、例えば、ヒト疾患モデルとしてや、遺伝子機能の研究、目的の表現型に関するスクリーニング、農業用用途、又は薬物検査などに、使用することができる。
【００５０】
本発明の局面の一つでは、トランスジェニック動物を、in vitroで物理化学的に変異させた細胞から作製する。次にレシピエント動物の細胞を挿入変異誘発法により変異させてもよい。この挿入変異原は動物に外因的に導入することもできるが、又は、内因的に組み込まれた挿入変異原から誘導又は活性化させることもできる。ある実施態様では、物理化学的に変異させた細胞から作製したトランスジェニック動物を、ここで解説するものなどのトランスポゾンなど、その生殖細胞系に挿入変異原を含有する別の動物と交雑することにより、挿入変異誘発を行う。物理化学的に変異させた細胞を用いて動物を形成した後、及び／又は、挿入変異誘発の後で、当該動物をスクリーニングして、特定の所望の遺伝子の変異を探したり、又は、別の所望の表現型の発現について探すことができる。
【００５１】
さらに本発明は、トランスジェニック植物を作製する方法と、このような方法により作成されたトランスジェニック植物も、提供するものである。このような方法により有利に作製できるトランスジェニック植物には、双子葉植物及び単子葉植物がある。
【００５２】
さらに本発明は、薬物スクリーニングのための変異細胞の使用も包含する。この実施態様では、変異細胞を、治療的可能性を有しているかも知れない検査化合物又は組成物に暴露して、変異遺伝子又はタンパク質の発現又は活性のレベルを含め、この化合物又は組成物が、変異細胞のうちの１つ以上の変異により誘導される所望の表現型に及ぼす作用を判定する。さらに、一つ又は複数の変異遺伝子に対応する野生型遺伝子又は他のバリアントを用いても、野生型もしくはバリアント遺伝子又は目的のタンパク質の発現又は活性のレベルを含め、一つ又は複数の当該遺伝子により引き起こされる表現型に影響する薬物を特定することができる。
【００５３】
本発明の他の好適な実施態様は、以下の図面及び本発明の解説、ならびに請求の範囲を参照しながら、当業で公知の知見をもとに、当業者には明白であろう。
【００５４】
発明の詳細な説明
定義
以下の解説では、組換えDNA技術で用いられる多数の用語を広汎に用いる。このような用語の範囲も含め、本明細書及び請求の範囲の明確及び一致した理解を提供するために、以下の定義を提供する。
【００５５】
ここで用いる用語「物理化学的変異誘発」とは、例えば生物において一つ以上の変異を誘導する電離放射及び／又は、細胞又は化学的アプローチなど、挿入変異誘発（即ち、以下に定義する挿入変異原による）でない、遺伝子を変異させるあらゆる方法を意味する。従って、物理化学的変異誘発法は、化学的変異原、放射線（例えば紫外線、α線、β線、γ線、Ｘ線）、エラープローン複製タンパク質（例えば、限定はしないが、変異DNAポリメラーゼ、例えばプルーフリーディング機能を欠くものなど）、（ホスト細胞に導入されたときにDNAに切り込み及び欠失を生じさせるために用いられる）制限酵素、及び（自発的及び誘導性変異による変異を促進するために用いられる）DNA修復変異体及び阻害剤、の使用を包含するものである。例には、限定はしないが、XP-G及びXP-Aとして知られる色素性乾皮症（XP）の遺伝子相補群に欠陥のある変異細胞株、DNA修復タンパク質Ku、及び、DNA依存的プロテインキナーゼDNA-PK、がある。DNA修復阻害剤の一例はO6-BGであり、O6-アルキルグアニン−アルキルトランスフェラーゼの阻害剤である。いずれの物理化学的変異原を単独で用いることも、又は、１種以上の他の物理化学的変異原と組み合わせて用いることもできる。
【００５６】
本発明に関する場合の「挿入変異誘発」とは、内因性の遺伝子を変異させるような態様で、あるポリヌクレオチドが細胞のゲノム中に挿入されるプロセスを意味する。ここで用いる、内因性遺伝子への「導入」又は「組込み」又は「挿入」という用語は同義的に用いられている。
【００５７】
挿入変異誘発とは、挿入変異原が細胞に外因的に導入され、この外因性の導入の結果、ゲノム中に導入されて、一つ以上の内因性遺伝子を変異させるとき起き得るものである。しかしながら本発明は、内因性挿入変異原が、元の位置とは異なる位置に挿入させられる場合に起きる変異誘発事象にも関する。これは、内因性の転位可能な因子が、トランスポゼースの作用により更に転位するように誘導される場合である。従って、本発明の実施例の一つでは、あるアレル又は遺伝子の挿入変異は、内因性挿入変異原の転位が原因で起きる。この内因性挿入変異原は、細胞中で天然で生じることもあり、又は、当該細胞のゲノム中、又は、例えばin vitroの前駆細胞又はin vivoの前駆細胞などの前駆細胞のゲノム中に既に導入されている場合もある。
【００５８】
様々な変異原の細胞への同時導入の局面の一つでは、変異原のうちの１種以上を内因的に産生させる。１種以上の変異原が細胞のゲノム中にあって、一箇所以上の新たな位置でゲノムにさらに挿入することができる。このように、同時変異誘発は、細胞内部からの１種以上の異なる変異原の新たな挿入を起こすことにより、起こさせることができ、またこの内因的導入が、外因性変異原の導入と同時である場合にも起こさせることができる。
【００５９】
ここで用いる用語「遺伝子破壊」とは、挿入変異原が内因性遺伝子に組み込まれることで、内因性エキソンと、挿入変異原中の配列との間の融合転写産物が発現されるような、遺伝子ノックアウト又はノックダウンを言う。
【００６０】
変異の結果、ある遺伝子の発現レベルや、又は、ある遺伝子産物の活性レベルを変化させることができる。「活性」は、例えば構造的、酵素的、触媒的、アロステリック的、及びシグナル伝達上など、ある遺伝子産物のすべての機能を包含する。ある実施態様では、変異の結果、遺伝子発現レベル（RNA及び／又はタンパク質）の低下又は消失か、あるいは、遺伝子産物活性（RNA及び／又はタンパク質）の低下又は消失が起きる。大半の変異は、変異遺伝子の活性を低下させるものであろう。しかしながら、挿入的及び物理化学的変異原の両者とも、変異遺伝子の産物の活性を上昇又は質的に変化（例えば結合特異性に対する基質の変化、又はタンパク質活性の調節など）させるよう、作用することができる。変異はしばしば検出の困難な表現型を生じることもあるが、表現型上検出可能な大半の変異は、細胞又は生物にとって有害な態様で、変異遺伝子のレベル又は活性を変化させるものである。
【００６１】
挿入変異原を用いると、変異遺伝子を少なくともDNAレベルで「標識」することもでき、ある実施態様では、RNA又はタンパク質レベルでも、当該挿入変異原によっては、標識することができる。変異原性の配列は、挿入的に変異させられた遺伝子又はその遺伝子の産物を「標識」するよう、それ自体が検出可能であってもよい。
【００６２】
このように、ここで用いる用語「標識」は、挿入変異原が、組換えにより標的核酸分子に（例えば標的細胞のゲノムに）挿入されるや、その位置を判定可能にするような、本発明の挿入変異原上に含有された構造上又は機能上（典型的にはヌクレオチド配列）の特徴を言う。従って、当該標識は、挿入変異原の位置特定を可能にするだけではない。それにより、ベクタが挿入された位置を特定することもできる。標識の例には、限定はしないが、レポータ遺伝子（例えばβ-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質及びその誘導体、黄色蛍光タンパク質及びその誘導体、青色蛍光タンパク質及びその誘導体、シアン蛍光タンパク質及びその誘導体、赤色蛍光タンパク質及びその誘導体等）をコードするヌクレオチド配列、（正の選択マーカでも、又は負の選択マーカでもよい）選択マーカをコードするヌクレオチド配列、がある。しかしながら、本発明の目的のためには、標識がタンパク質をコードしている必要はないことを認識されたい。それは単に、当該標識自体か、又は、標識された配列に隣接するヌクレオチド配列、又は、標識された配列に連結されたヌクレオチド配列の検出を可能にする配列を提供するものである。
【００６３】
「標識」はまた、挿入変異原を含有する細胞を検出できる（そして必要な場合に単離したり、あるいは特異的に操作できる）ように、挿入変異原を検出できるような性質を提供することもできる。
【００６４】
「５’遺伝子トラップ」は、当該変異原が遺伝子に挿入されると、ある内因性遺伝子の機能的発現を防止又は低下させるようにデザインされた挿入変異原である。５’遺伝子トラップは、変異遺伝子の一次転写産物の正常なスプライシング又はエキソン構造に割り込むことで、遺伝子発現を変化させる。スプライシングの割り込みは、変異遺伝子の上流エキソンを、本挿入変異原内のスプライス受容側配列上にスプライスすることにより、行われる。スプライシングのこのような変化により、しばしば、変異遺伝子の転写産物のタンパク質暗号が破壊される。あるいは、本挿入変異原を、変異遺伝子のエキソンに直接挿入させて、変異遺伝子のエキソンのコーディング能を破壊させることもできる。
【００６５】
「３’遺伝子トラップ」は、変異原性ベクタが挿入された遺伝子の内因性エキソンの、転写及び選択的には翻訳を、活性化又は促進するようにデザインされた挿入変異原である。３’遺伝子トラップは、この挿入変異原内に位置するプロモータ配列で変異遺伝子の転写を開始させることにより、機能する。該変異原性ベクタ内で開始された転写産物は、その挿入部位の３’側以降にも続き、変異遺伝子の下流エキソンまで含有することで、キメリックな一次転写産物ができる。ベクタ配列を含有するエキソンは、変異遺伝子のエキソン上にスプライスされることで、変異遺伝子の正常なタンパク質産物の全部又はＣ末端断片を含むタンパク質をコードするキメラ転写産物を生じることができる。
【００６６】
ここで用いる「減少する」は、ある遺伝子が変異し、その結果、細胞又は生物中の遺伝子発現レベル又は遺伝子産物の活性レベルが、野生型もしくは非変異型の細胞又は生物で観察されるものから減少することを意味する。これはしばしば、遺伝子の転写により生じるmRNA量を減少させたり、又は、当該遺伝子から産生されるmRNA又はタンパク質を変異させて、発現産物がより少量であるか、活性が低くなるようにすることで、なされる。
【００６７】
ここで用いる、そして他に明示しない限り、「一つ（原語：「a」）は一つ以上を意味する。
【００６８】
ここで用いる用語「変異クローン」とは、本発明の変異誘発法の一方又は両方で作製された変異親細胞から生じた一個以上の後代細胞を言う。
【００６９】
ここで用いる「ホモ接合型変異体」とは、（大半の真核細胞では典型的に２つであり、しかし特定の糸状酵母、及びいくつかの高等真核細胞系は３つ以上のコピーを有していることがあるが）ある遺伝子のすべてのコピーが変異させられているような細胞を言う。
【００７０】
ここで用いる、遺伝子の「コピー」は当業で「アレル」としても公知である。後者の用語は、ある細胞中のある遺伝子の天然で生じるコピーを意味する。通常は、二倍体細胞中の遺伝子には２つのコピーがある。場合によっては（例えばトリソミー２１）、３つのコピーがあり、しかし、一本以上の全染色体の４つ以上のコピーや、又は、遺伝子もしくは染色体断片の余分なコピーにも、自然界では遭遇する。また、細胞を実験的に変更して、特定の遺伝子の数又は発現を変更する場合もある。
【００７１】
本発明の方法及び組成物には、相同組換えのための標的ヌクレオチド配列を含有する挿入変異原が含まれるであろう。ここで用いる「標的配列」とは、挿入変異原性ヌクレオチドと細胞DNAとの、前記細胞DNA上の所定部位での相同組換えを可能とするものであり、この場合の前記所定部位は、前記挿入変異原の配列に対して相同性を有するため、前記所定部位での相同組換えの結果、該挿入変異原がゲノムに導入され、続いて変異を起こすことになる。変異させようとする遺伝子内の一つ又は複数の配列、又は、変異させようとする遺伝子の上流又は下流の一つ又は複数の配列で、標的が相同性を有していてもよい。標的配列の使用は、標的配列の教示について、すべて引用をもって援用することとする米国第5,641,670号、第6,270,989号、及び第5,733,761号を含め、数多くの米国特許出願に開示されてきた。
【００７２】
ここで用いる「非相同組換え」（また均等には「非正統的組換え」とも言及される場合もある）とは、相同組換え（例えば配列の相同性で導かれる組換えなど）が関与せず、また、部位特異的組換え（例えば部位特異的組換えシグナル及び対応する部位特異的リコンビナーゼにより導かれる組換えなど）も関与しないような機序を通じた、遺伝物質の接合（交換又は再配分）を意味する。非相同組換えの例には、非相同部位での外因性DNAの染色体への組み込み、染色体の転座及び欠失、DNA末端の接合、二本鎖の破損修復、架橋−分解−融合、トランスフェクトしたポリヌクレオチドのコンカテマー化、レトロウィルスの挿入、及び転位、がある。大半の場合、非相同組換えは、「自由DNA末端」の接合を通じて起きると考えられている。自由末端は、第二のDNA末端に直接か、又は修復もしくはプロセッシング後のいずれかに接合することができる末端を含有するDNA分子である。このDNA末端は、５’突出、３’突出、又は平滑末端から成る場合がある。
【００７３】
レトロウィルス・ベクタは、ウィルスにコードされたインテグラーゼ酵素の作用により触媒される非相同組換えという独特な機序により、真核生物ゲノムに組み込まれるが、このウィルス組込み、複製及び感染という機序は、よく解説されている（文献０）。レトロウィルス及びレトロウィルス・ベクタの変異原性や、変異誘発された遺伝子の転写産物内にレトロウィルス・タグ配列が連結されているために、変異遺伝子の迅速な特定を可能にするその能力は、当業でよく知られている（文献２−５）。
【００７４】
レトロウィルス感染、複製、及び組込みの機序に関する概略的文献： 0: In: Retroviruses. Coffin, JM.; Hughes, SH.; Varmus, HE. Plainview (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; c1997；変異原としての野生型レトロウィルスの使用： 1:  Varmus HE, Quintrell N, Ortiz S. Cell. 1981 Jul;25(1):23-36；変異原としての、そしてトラップされた遺伝子を単離するためのレトロウィルス・プロモータ・トラップの使用；2: Friedrich G, Soriano P. Methods Enzymol. 1993;225:681-701; 3: Gossler A, Joyner AL, Rossant J, Skarnes WC.  Science. 1989 Apr 28;244(4903):463-5;  4: Friedrich G, Soriano P. Genes Dev. 1991 Sep;5(9):1513-23; 5: von Melchner H, DeGregori JV, Rayburn H, Reddy S, Friedel C, Ruley HE. Genes Dev. 1992 Jun;6(6):919-27;レトロウィルス挿入のランダム性： 6: King W, Patel MD, Lobel LI, Goff SP, Nguyen-Huu MC. Science. 1985 May 3;228(4699):554-8; 7: Hubbard SC, Walls L, Ruley HE, Muchmore EA. J Biol Chem. 1994 Feb 4;269(5):3717-24。
【００７５】
レトロウィルスと同様、トランスポゾン及びトランスポゾン・ベクタも、挿入変異原として働かせることのできる配列を組み込むために用いることができる。やはりレトロウィルスと同様に、トランスポゾンは、トランソポゼース酵素がトランスポゾンDNAのゲノム組込み及び転位を触媒するという、酵素触媒性非相同組換えにより組み込まれる（文献１、２、１２、１３）。昆虫（文献１３−１５）、植物（文献１６−２０）及び脊椎動物（哺乳動物を含む、文献３−１２）で機能する数多くのトランスポゾンが特徴付けられてきた。特に、TC1/マリナー誘導体トランスポゾンであるスリーピング・ビューティが、哺乳動物で効率的に組み込まれることが実証されている。トランスポゾンは、数多くの系で効率的な挿入変異原として機能すること（文献５、１５、１７、２４−２６）、そして幅広い標的特異性を示すこと（文献２１−２３）が示されている。トランスポゼースはSB転位及び組込みを触媒する：1:  Cui Z, Geurts AM, Liu G, Kaufman CD, Hackett PB. J Mol Biol. 2002 May 17;318(5):1221-35; 2:  Izsvak Z, Khare D, Behlke J, Heinemann U, Plasterk RH, Ivics Z. J Biol Chem. 2002 Jun 24  SBトランスポゾンは哺乳動物において挿入変異原として転位し、作用する：3:  Dupuy AJ, Clark K, Carlson CM, Fritz S, Davidson AE, Markley KM, Finley K, Fletcher CF, Ekker SC, Hackett PB, Horn S, Largaespada DA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr 2;99(7):4495-9; 4:  Horie K, Kuroiwa A, Ikawa M, Okabe M, Kondoh G, Matsuda Y, Takeda J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 31;98(16):9191-6; 5:  Dupuy AJ, Fritz S, Largaespada DA. Genesis. 2001 Jun;30(2):82-8; 6:  Fischer SE, Wienholds E, Plasterk RH. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jun 5;98(12):6759-64; 7:  Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, Izsvak Z. Cell. 1997 Nov 14;91(4):501-10。他のトランスポゾンも哺乳動物で機能する：8:  Zagoraiou L, Drabek D, Alexaki S, Guy JA, Klinakis AG, Langeveld A, Skavdis G, Mamalaki C, Grosveld F, Savakis C. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Sep 25;98(20):11474-8; 9:  Sherman A, Dawson A, Mather C, Gilhooley H, Li Y, Mitchell R, Finnegan D, Sang H. Nat Biotechnol. 1998 Nov;16(11):1050-3; 10:  Kawakami K, Shima A, Kawakami N. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Oct 10;97(21):11403-8; 11:  Fadool JM, Hartl DL, Dowling JE. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Apr 28;95(9):5182-6; 12:  Plasterk RH. Cell. 1993 Sep 10;74(5):781-6. P エレメントは、無脊椎動物において挿入変異原として発生した：13:  Kaufman PD, Rio DC. Nucleic Acids Res. 1991 Nov 25;19(22):6336; 14:  Rubin GM, Spradling AC. Nucleic Acids Res. 1983 Sep 24;11(18):6341-51; 15:  Spradling AC, Rubin GM.  Science. 1982 Oct 22;218(4570):341-7。 Ac 及びDs 並びに他の植物トランスポゾンは植物において挿入変異原として転位し、組み込まれ、また用いられている： 16:  Grevelding C, Becker D, Kunze R, von Menges A, Fantes V, Schell J, Masterson R. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Jul 1;89(13):6085-9; 17:  Walbot V. Curr Opin Plant Biol. 2000 Apr;3(2):103-7; 18:  Pereira A, Aarts MG. Methods Mol Biol. 1998;82:329-38; 19:  Cooley MB, Goldsbrough AP, Still DW, Yoder JI. Mol Gen Genet. 1996 Aug 27;252(1-2):184-94; 20:  Bhatt AM, Page T, Lawson EJ, Lister C, Dean C. Plant J. 1996 Jun;9(6):935-45。P エレメント・トランスポゾンはゲノム全体に広く組み込ませることができる：21:  Kassis JA, Noll E, VanSickle EP, Odenwald WF, Perrimon N. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 1;89(5):1919-23; 22:  Berg CA, Spradling AC. Genetics. 1991 Mar;127(3):515-24; 23:  Tower J, Karpen GH, Craig N, Spradling AC. Genetics. 1993 Feb;133(2):347-59; 24:  Cooley L, Berg C, Kelley R, McKearin D, Spradling A. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1989;36:99-109; 25:  Cooley L, Kelley R, Spradling A. Science. 1988 Mar 4;239(4844):1121-8; 26:  Spradling AC, Stern DM, Kiss I, Roote J, Laverty T, Rubin GM. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 21;92(24):10824-30。
【００７６】
ここで用いられる用語「表現型」とは、細胞又は生物のあらゆる性質を意味する。表現型は、単にmRNA又はタンパク質の発現上の変化であってもよい。さらに表現型の例には、限定はしないが、細胞学的、生化学的、組織学的、挙動的、又は、当業者により検出可能な全生物的特性が含まれる。表現型には、限定はしないが、細胞の形質転換、細胞遊走、細胞の形態、細胞の活性化、薬物又は化学物質に対する耐性又は感受性、細胞内の病原性タンパク質局在（例えば細胞質から核へのタンパク質の転位など）に対する耐性又は感受性、分泌性もしくは細胞表面上のタンパク質のプロファイル（例えば細菌もしくはウィルス）感染、翻訳後修飾、細胞内のタンパク質局在（例えば細胞質から核へのタンパク質の転位など）、分泌性もしくは細胞表面上のタンパク質のプロファイル、細胞増殖、シグナル伝達、代謝不全又は亢進、転写活性、細胞又は器官の転写産物プロファイル（例えば遺伝子チップを用いて検出される場合）、アポトーシス耐性又は感受性、動物の挙動、臓器の組織構造、血液の化学的性質、生化学的活性、肉眼的形態上の特性、寿命、腫瘍への易罹患性、体重、身長／長さ、免疫機能、器官の機能、何らかの疾患状態、及び、当業で公知の他の特性、がある。いくつかの場合、従って本発明のいくつかの実施態様では、細胞又は生物中の一つ以上の遺伝子の変異の影響は、変異細胞又は生物の一つ以上の任意の表現型（例えば上述した表現型のうちの一つ以上などの一つ以上の任意の構造上又は機能上の特徴など）を、対応する野生型又は（非変異）細胞又は生物（例えば遺伝子が変異していない細胞又は生物など）での同じ構造上又は機能上の特徴に比較したときの、変化を観察することにより、決定することができる。
【００７７】
ここで用いる用語「多倍数体」とは、一倍体を越えるあらゆる多倍数性を意味する。多倍数体は、二倍体、三倍体、四倍体、及び異数体を包含する。
【００７８】
ここで用いる「ライブラリ」とは２個以上の細胞を意味する。ライブラリは、一方又は両方の変異誘発法を１回、又は２回以上で行った細胞でよい。このように、ライブラリには、限定はしないが、変異細胞の一つ以上のクローン、又は、各細胞が異なる組の変異を有するような変異細胞が含まれる。ライブラリは、変異誘発法を行うための細胞ソースや、変異誘発法後に所望の表現型を探すスクリーニングのための細胞ソースとなる。
【００７９】
「公知の」遺伝子とは、ある遺伝子の特徴付けのレベルに関する。本発明により、特徴付けの済んだ遺伝子の発現や、特徴付けの済んでいない遺伝子の発現が可能である。異なるレベルの特徴付けが可能である、これらには、例えばクローニング、DNA、RNA及び／又はタンパク質の配列決定、遺伝子の調節及び機能の、クローニングされた配列への関係付け（例えばプロモータ及びエンハンサ配列の認識、読み取り枠、イントロン等の機能等）、が含まれる。特徴付けは、例えば遺伝子及び関連する機能のマッピングや、部分的アミノ酸又はヌクレオチド配列の獲得、又は、タンパク質の精製及び機能の確認など、あまり詳細でなくともよい。また、ヌクレオチド又はアミノ酸配列が判明しているか、又は、タンパク質が単離されているがその機能は未知である場合など、特徴付けが最小でもよい。あるいは、機能は判明しているが、関連するタンパク質又はヌクレオチド配列が判明していないか、又は、判明はしているが機能には相関付けられていなくともよい。最終的には、ある遺伝子の存在と、その機能の両方が未知であるという点で特徴付けがなくともよい。本発明により、あらゆる遺伝子の発現が、これら等の特徴付けのいずれの程度においても、可能である。
【００８０】
また本発明を、物理化学的もしくは挿入変異と、例えばメチル化による修飾、RNAアンチセンスRNA、リボザイム、複数の転写調節配列を活性化又は不活性化するようデザインされた転写因子、複数の遺伝子の転写可能性を改変する、ヒストンなどの染色体タンパク質の調節物質など、ゲノム機能を改変するための後成的調整技術との組合せで、実施できるかも知れない。
【００８１】
概観
多数倍体細胞及び多細胞生物において複数の遺伝子で標識された変異を作ることができるという能力は、遺伝子同定や遺伝子発見により、ある表現型を担う遺伝子をその表現型に相関付けること、遺伝子機能を決定すること、表現型を作製すること、薬物ターゲットを発見すること、そして、ヒト疾患モデルを細胞及び多細胞生物で作製すること、を含め、数多くの分野で実用性を有するであろう。
【００８２】
標識されたホモ接合型変異を、細胞又は多細胞生物で起こさせられるという能力により、細胞の遺伝子構成を変更することができ、また、上述したものなどの数多くの用途や、遺伝子異常を修正するといった用途を有する。この技術のin vitro、ex vivo、及びin vivoでの潜在的用途は膨大であり、当業者には容易に明白であろう。
【００８３】
従って本発明は、真核細胞及び多細胞生物において単一の遺伝子又は複数の遺伝子（例えば２つ以上）を変異させる方法に関する。さらに本発明は、変異細胞及び生物を作製するための挿入変異原に関し、前記挿入変異原を用いると、当該細胞及び生物で起きた変異を分析することもできる。さらに本発明は、前記挿入変異原により提供される標識で一つ以上の変異遺伝子を標識することにより、当該挿入変異原で標識されたゲノムを持つ細胞の検出、選抜、単離、及び操作を可能にすると共に、変異遺伝子の特定及び単離を可能にする方法にも関する。
【００８４】
本発明は、細胞及び生物において複数の変異（即ち、ある表現型を累積的に生じる２つ以上の遺伝子での変異）を作り、前記変異遺伝子のうちの少なくとも１つを標識して、それを迅速に回収及び特定できるようにする方法を提供する。細胞で複数の変異を作り、その変異のうちの少なくとも１つが標識されているようにすると、遺伝子機能を研究する上で便利である。この理由の１つは、数多くの表現型が、発現のために複数の遺伝子変異を必要とするからである。現在の方法では、変異遺伝子を容易に特定できる態様では、細胞中に複数の変異を作ることはできない。本発明では、同じ細胞中で複数の変異を作り、その変異のうちの少なくとも１つを標識することができる。
【００８５】
挿入変異誘発法及び物理化学的変異誘発法の組合せにより変異誘発した細胞を含有するライブラリを、目的の表現型についてスクリーニングすることができる。目的の表現型を有する細胞においては、一つ以上の標識された遺伝子を特定でき、また、特定の対象表現型を担うかどうか、確認することができる。
【００８６】
さらに本発明は真核細胞及び生物においてホモ接合型変異を作る方法も提供する。このホモ接合型に変異させた遺伝子を、挿入変異原で標識することで、それを特定し、また必要に応じて回収できるようにする。ホモ接合型変異は、当該変異遺伝子に関連する機能を発見する上で有用である。
【００８７】
本発明の方法を用いると、限定はしないが、一倍体（複数の遺伝子変異の場合）、二倍体、三倍体、四倍体、又は異数体を含め、あらゆる真核細胞を変異させることができる。ある実施態様では、当該細胞は二倍体である。本発明の方法を有利に利用できる細胞には、限定はしないが、初代細胞（例えばドナー生物から直接外植された細胞）又は二次細胞、（例えばin vitroで成長させ、ある一定の期間、例えば10乃至100世代、分裂させた初代細胞）、がある。このような初代又は二次細胞は、多細胞生物由来でも、又は単細胞生物由来でもよい。本発明に基づいて用いる細胞には、正常細胞、最終分化細胞、又は不死化細胞（正常細胞でも、樹立細胞でも、又は形質転換細胞でもよい細胞株を含む）が含まれ、また、分化後でも（例えば体細胞又は生殖細胞）、又は未分化（例えば多能性、万能性又は全能性幹細胞） でもよい。
【００８８】
本発明で用いるために、細胞を分離できる組織の例には、限定はしないが、神経組織（（中枢及び末梢神経系由来の組織を含む）、造血系組織、リンパ系組織、免疫組織、骨組織、間質組織（骨髄組織などを含む）、間葉組織、中皮組織、結合組織（軟骨、皮膚組織、皮下組織、脂肪組織等を含む）、内皮組織、上皮組織、肺組織、皮膚組織、腎組織、胃腸管組織（食道、胃、小腸等を含む）、脳組織、心組織、膵組織、筋組織、肝組織、性腺組織、胚性幹細胞及び胚性生殖細胞を含む）胚性組織、接合子組織、胚、及び当業で公知の他の細胞及び組織、がある。
【００８９】
上記の組織から単離される、又は、他の源（例えば市販の供給源又は細胞バンクなど）から得られる、多種の細胞を、本発明で用いることができる。このような細胞の非限定的な例には、体細胞、例えば血球（赤血球及び白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢もしくは末梢神経系由来）、筋細胞（骨格、平滑もしくは心筋由来の筋細胞及び筋原細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞及び骨芽細胞を含む）及び他の間質細胞（例えばマクロファージ、樹状細胞、胸腺栄養細胞、シュワン細胞等）、がある。真核性生殖細胞（精母細胞及び卵母細胞）も、上記の体細胞及び生殖細胞を生じる始原細胞、前駆細胞及び幹細胞と同様に、本発明で使用することができる。これらの細胞、組織及び器官は正常であってもよいが、あるいはこれらが、例えば、限定はしないが、感染性疾患（細菌、真菌又は酵母、ウィルス（HIVを含む）又は寄生生物により引き起こされるもの）を含む疾患又は身体の異常に関与するもの、遺伝子又は生化学的病理（例えば嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、統合失調症、筋ジストロフィー、多発性硬化症等）に関与するもの、又は、発癌及び他の癌関連プロセスに関与するものなど、病原性であってもよい。
【００９０】
本発明の方法で用いる真核細胞は、動物細胞でも、植物細胞（単子葉又は双子葉植物）でも、又は酵母などの真菌細胞でもよい。動物細胞には、脊椎動物又は無脊椎動物起源のものが含まれる。脊椎動物細胞、特に哺乳動物細胞（限定はしないが、ヒト、サル又は他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、鳥類、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等から得られる又は由来とする細胞を含む）、鳥類細胞、魚類細胞（ゼブラフィッシュの細胞を含む）、昆虫細胞（限定はしないが、ドゥロソフィラ（原語：Drosophila）種、スポドプテラ（原語：Spodoptera ）種（例えばＳ．フルギペルダ（原語：S. frugiperidaspecies ）から得られる又は由来とする Sf9、あるいはHIGH FIVETM細胞）又はトリコプルーザ（原語：Trichoplusa ）種（例えばＴ．ニー（原語：T. ni）由来のMG1など）から得られる又は由来とする細胞など）、蠕虫細胞（例えばＣ．エレガンス （原語：C. elegans）から得られる又は由来のものなど）等、が特に有用である。しかしながら、当業者であれば、ここに具体的に開示したものの他に、いずれの種を由来とする細胞も、本発明の方法に従い、常法をここに開示したものと組み合わせて用いて、不要な実験を行う必要なく、有利に用いることができることは理解されよう。
【００９１】
細胞株も本発明において有用である。有用な細胞株の例には、限定はしないが、HT1080 細胞 (ATCC CCL 121)、HeLa細胞及びHeLa細胞の由来株(ATCC CCL 2、2.1 及び2.2)、MCF-7乳癌細胞 (ATCC BTH 22)、K-562 白血病細胞 (ATCC CCL 243)、KB 癌細胞(ATCC CCL 17)、2780AD 卵巣癌細胞 (Van der Blick, A. M. et al., Cancer Res. 48:5927-5932 (1988)を参照されたい、Raji 細胞 (ATCC CCL 86)、Jurkat細胞 (ATCC TIB 152)、Namalwa 細胞 (ATCC CRL 1432)、HL-60 細胞 (ATCC CCL 240)、Daudi 細胞 (ATCC CCL 213)、RPMI 8226 細胞 (ATCC CCL 155)、U-937 細胞 (ATCC CRL 1593)、Bowes黒色腫細胞 (ATCC CRL 9607)、WI-38VA13サブライン2R4 細胞(ATCC CLL 75.1)、及びMOLT-4 細胞(ATCC CRL 1582)や、ヒト細胞及び他の種の細胞の融合により作製されるヘテロハイブリドーマ細胞、がある。WI-38 (ATCC CCL 75) 及びMRC-5 (ATCC CCL 171)などの二次ヒト線維芽細胞株も用いることができる。限定はしないが、CHO 細胞、COS 細胞、VERO 細胞、293 細胞、PER-C6 細胞、M1 細胞、NS-1 細胞、COS-7 細胞、MDBK 細胞、MDCK 細胞、MRC-5 細胞、WI-38 細胞、WEHI 細胞、SP2/0 細胞、BHK細胞（BHK-21 細胞を含む)を含め、他の哺乳動物細胞及び細胞株も、本発明に従って使用することができる。これら及び他の細胞及び細胞株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(米国２０１０８、ヴァージニア州マナサス、私書箱1549号）など、市販のものを入手できる。数多くの他の細胞株が当業で公知であり、また当業者の知るところとなるであろう。従って、このような細胞株は、本発明の方法において同じように良好に使用することができる。
【００９２】
本発明は植物細胞を用いても実施できる。植物細胞を培養する方法、植物細胞を挿入的に変異させる方法、及びトランスジェニック植物を作製する方法は当業で公知である（例えば、培養法、トランスフェクション法、変異法、及びトランスジェニック植物及び植物細胞を作製する方法の教示のためにそれぞれを引用をもってここに援用することとするHall, Robert D., Plant Cell Culture Protocols, Humana Press, New Jersey (1999); Gartland and Davey, Agrobacterium Protocols, Humana Press, New Jersey (1995)を参照されたい)。
【００９３】
本発明のいくつかの実施態様では、細胞を生物内、又は天然環境内で、組織外植体と同じように（例えばin vivo又はin situで）変異させることができる。あるいは、当業で公知の方法及び遺伝子を用いて生物から単離された組織又は細胞を、本方法に従って変異させることもできる。当該組織又は細胞は、培養株内（例えばin vitro）に維持したり、又は、組織又は生物（例えばex vivo）に再移植される。
【００９４】
変異細胞を作製する方法
本発明は、物理化学的及び挿入的という、２つの種類の変異誘発事象に関係する。ある局面では、所望の表現型を累積的に生じる複数の遺伝子を変異させる。当該変異は、ホモ接合型でも、ヘテロ接合型でも、又はこれら２つの組合せでもよい。これらの遺伝子の一つ以上は、挿入変異原で標識される。一個の細胞は、標識された遺伝子のすべてを含有していても、又は、例えば標識された遺伝子のうちの一個など、標識された遺伝子のすべてより少ないものを含有していてもよい。従って、ある非限定的な例においては、所望の表現型を生じさせるのに、同じ細胞中で２つの変異遺伝子が必要である。細胞を、当該表現型を生じるように変異させ、所望の表現型についてスクリーニングし、各々の細胞中で両方の遺伝子が変異したために当該表現型を有するようになった２つの細胞を選抜する。一方の遺伝子を一方の細胞中で標識し、他方の遺伝子を二番目の細胞中で標識する。このプロセスにより、一方のみの遺伝子が各細胞中で標識された場合でも、所望の表現型を累積的に生じる両方の遺伝子の特定が可能となる。
【００９５】
さらに、本発明は、表現型を担う遺伝子の一個のみが特定された場合でも有用である。このような遺伝子は、当該表現型を調節するためのターゲットと成るかも知れない。これは、例えば薬物発見や、有用な遺伝子産物の生産において有用である。従って、所望の表現型を生じさせるのに必要な複数の遺伝子のうちの一つ以上を、本発明の変異誘発法を用いて特定することができる。
【００９６】
さらに本発明は、本変異誘発法を用いて、単一の遺伝子がホモ接合型変異したときに起きる所望の表現型を得る方法に関する。変異させられるアレルのうちの少なくとも一方を標識する。
【００９７】
本変異プロセスは、いかなる順序でも、又は同時でも行うことのできる、少なくとも１つの物理化学的変異誘発事象と、少なくとも１つの挿入変異誘発事象とに関係する。
【００９８】
物理化学的変異誘発法
本発明の変異法の段階の一つは、一つ以上の物理化学的変異原による、ある細胞又は生物の物理化学的変異誘発に関係する。ある実施態様では、物理化学的変異誘発法は、変異誘発プロセスの最初の事象である。別の実施態様では、それを、挿入変異誘発事象と同時に行うこともできる。別の実施態様では、それが最初の挿入変異誘発事象に続く。これらの実施態様のいずれの場合でも、１回以上の更なる物理化学的及び／又は挿入変異事象を、いかなる順序でも、そして同時でも、行うことができる。
【００９９】
物理化学的変異誘発法は、多種の変異誘発因子により行うことができる。当業で公知の変異誘発因子の例には、限定はしないが、化学的変異原（例えば、当該化学物質が結合した先のDNA分子が含有する遺伝子の活性、タンパク質コーディング能又は発現に影響を与える（例えば増加又は減少させる）DNA介在もしくはDNA結合性化学物質）、物理的変異原（例えば紫外線、電離放射線、（ガンマ、ベータ及びアルファ線、Ｘ線）、生化学的変異原（例えば制限酵素、DNA修復変異原、DNA修復阻害剤、及びエラープロ−ンDNAポリメラーゼ及び複製タンパク質）等、がある。DNA配列中の変異原性変化は、変異原／DNA間の相互作用の直接的な結果として起き得る。あるいは、変異原により被った損傷に応答して誘導されるDNA修復機序が、変異の発生に参与することもある。
【０１００】
いくつかの実施態様では、化学的変異誘発法を用いて、標的細胞又は生物中の一つ以上の遺伝子で変異を誘導する。細胞及び生物を変異させるのに通常用いられている化学的変異原の一例は、N-エチル-N-ニトロソウレア(ENU)である。本発明で有用な化学的変異原の他の例には、限定はしないが、エチルメタンスルホネート(EMS) 及びICR191がある。数多くの他の化学的変異原が当業で公知であり、本発明で有用である（例えば化学的変異原や、多種の細胞及び生物で遺伝子変異を誘導するためのそれらの使用に関する教示について引用をもってここに援用する E. C. Friedberg, G. C. Walker, W. Siede, DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington DC (1995); 1:  Justice MJ, Zheng B, Woychik RP, Bradley A. Methods. 1997 Dec;13(4):423-36; 2:  Gasparro FP, Felli A, Schmitt IM. Recent Results Cancer Res. 1997;143:101-27; 3:  Vogel EW, Natarajan AT. Mutat Res. 1995 Aug;330(1-2):183-208; 4:  Anderson P. Methods Cell Biol. 1995;48:31-58; 5:  Russell LB. Environ Mol Mutagen. 1994;23 Suppl 24:23-9; 6:  DeMarini DM, Brockman HE, de Serres FJ, Evans HH, Stankowski LF Jr, Hsie AW. Mutat Res. 1989 Jan;220(1):11-29; 7:  Wood RD, Sedgwick SG. Mutagenesis. 1986 Nov;1(6):399-405; 8:  Loprieno N, Barale R, Von Halle ES, von Borstel RC.  Mutat Res. 1983 Jun;115(2):215-23; 9:  Bradley MO, Bhuyan B, Francis MC, Langenbach R, Peterson A, Huberman E. Mutat Res. 1981 Sep;87(2):81-142; 10:  Hoffmann GR. Mutat Res. 1980 Jan;75(1):63-129; 1:  Flessel CP. Adv Exp Med Biol. 1977;91:117-28; 12:  McCann J, Ames BN. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976 Mar;73(3):950-4; 13:  Orias E, et. al. Methods Cell Biol. 1976;13:247-82; 14:  Kilbey BJ. Methods Cell Biol. 1975;12:209-31 を参照されたい）。
【０１０１】
細胞及び生物において変異を誘導する化学的変異原の好適な用量は、本明細書の他所で解説されているか、当業で公知であるか、若しくはここに解説するか又は当業で公知である、変異誘発法の検定を用いれば、当業者には容易に決定できるものである。in vitroでの細胞の化学的変異誘発は、多種の用量の変異誘発性因子で細胞を処理する、及び／又は、前記物質への暴露時間を制御する、ことにより、達成することができる。変異誘発性因子への暴露及び／又は用量を滴定することにより目的の用途にとって最適な程度の変異誘発を行うことができ、こうして各細胞内で所望の数の遺伝子を変異させることができる。ENUの有用な用量の例は１乃至２時間で0.1 - 0.4 mg/ml である。EMSの有用な用量の例は１０乃至３０時間で0.1 - 1 mg/ml である。ここで解説する処理条件は、本発明で有用なことが判明しているが、これより少ない及び多い用量及び暴露時間を用いても所望の変異頻度を達成することができる。加えて、最適な用量及び暴露時間は、細胞種に応じて様々であり、本発明の方法や、当業で容易に入手できる知見、及び慣例的な実験を用いて容易に決定することができる。他の化学的変異原及び変異誘発性因子は、当業で公知の用量、又は、慣例的な実験を通して決定可能な用量で、用いられる。
【０１０２】
物理化学的変異誘発法は単一の変異誘発性因子を用いても行うことができる。あるいは、物理化学的変異誘発法を、複数（２つ以上）の変異誘発性因子を用いて行うこともできる。複数の変異誘発性因子を用いる場合、変異誘発法は、細胞を当該因子に同時又は順次暴露することにより、行うことができる。ある細胞又は生物の物理化学的変異誘発は、一回の暴露でも、又は、いかなる順序の複数回の順次暴露によっても、行うことができる。
【０１０３】
ある細胞又は生物の物理化学的変異誘発を、同じ細胞又は生物に対して行われる別の変異誘発事象（例えば挿入変異誘発、又は、別の回の物理化学的変異誘発）の前に行う場合、物理化学的に変異させられる細胞又は生物の変異頻度は、選択に応じて、この付加的な変異誘発事象の前又は後（例えば挿入変異誘発、又は、次の回の物理化学的変異誘発、の前又は後）に、決定することができる。このアプローチにより、当業者は、所望の変異頻度を達成する変異誘発性因子や条件を選択することができる。
【０１０４】
ある特定の変異原で得られた変異頻度を、ここで解説した及び当業で公知の数多くの方法を用いて評価することができる。このような方法の一つが、細胞内の選択マーカ又はスクリーニング・マーカの遺伝子機能についての検査である。典型的には、このアプローチで用いられるマーカは、細胞内に一個のコピー遺伝子として存在するが、複数コピーの遺伝子も、特に高変異頻度を評価するためには、このような方法で有用かも知れない。マーカ遺伝子は例えばHPRTなどの細胞内遺伝子でもよく、あるいは、例えばHSV-チミジンキナーゼ、緑色蛍光たんぱく、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、FACSソーティングに適した細胞表面たんぱく等、外因的に導入される遺伝子でもよいであろう。変異誘発後、当業者は、マーカ遺伝子の発現又は活性の非存在又は減少について、検定することができる。例えば、HPRT (内因性HPRTはX染色体に連鎖しているため、通常はある一個の細胞に機能的コピーは一個のみ存在する）又は HSV-TK (HSV-TK遺伝子の単一のコピーをトランスフェクトした細胞において）について、それぞれ6-チオグアニン(6-TG)及び1,2'-デオキシ-2'-フルオロ-o-D-アラビノフラノシル-5-ヨードウラシル (FAIU)で淘汰をかけることで、変異頻度を変異誘発細胞で評価することができる。こうして、生存クローンの数を、プレートしたクローンの総数で除算したものが、単一コピーの遺伝子に関する変異頻度を定義する。このように、複数の条件下で細胞を変異誘発し、マーカ活性について検定し、そして変異頻度を判定することにより、あらゆる細胞又は生物で、所望の変異頻度を得ることができる。上述した、そして当業で公知の、他のマーカの例については、酵素検定、ELISA、及びFACSを含め、いずれの適した検定も、マーカ機能の消失（又は機能の獲得）を検査するために用いることができる。ある細胞集団で所望の変異レベルが得られたら、この集団から採った一つ以上の細胞を、下記の解説する二番目の段階のプロセスに用いることができる。
【０１０５】
変異頻度を評価するもう一つの方法は、一個の細胞（又は細胞集団）のあるゲノム遺伝子座又はcDNAを（例えばPCRにより）増幅し、この増幅産物をクローニングし、そしてこのクローンされたヌクレオチドを配列決定する方法である。変異誘発細胞の配列を、野生型（非変異誘発）細胞の配列に比較することにより、１単位長当たりの変異数（例えば1000塩基対当たり１つの変異など）を決定することができる。この方法及び同様の方法の多種の変更例が、当業者には明白であろう。このように、この検定を用いて、所望の変異頻度を生じる変異誘発条件を選択することができる。
【０１０６】
本発明は、各細胞において１種以上の遺伝子が変異誘発されるように、当業で公知であり、従って当業者にはなじみ深い変異原など、物理化学的変異原で細胞を変異誘発することに関する。
【０１０７】
各細胞中、いかなる数の遺伝子も変異誘発することができる。変異頻度及びライブラリ網羅率を選択するには、細胞のゲノムに含まれる遺伝子の総数と、各細胞中で生じる変異遺伝子の数と、生じる変異細胞の数と、ライブラリの複雑さとの間に相関関係があることを考慮すると便利である。一般的には、同じライブラリ網羅率を得るには、ある細胞中の遺伝子数が増すにつれ（例えば酵母対哺乳動物細胞など）、一個の細胞当たりの変異数、又は、変異細胞の数（又は両者）も増加していなければならない。
【０１０８】
一般的な指針として、一個の細胞当たりで生じさせる変異数が多くなるにつれ、ゲノム中のすべての遺伝子が平均して少なくとも一回、変異しているような細胞ライブラリを得るのに必要な細胞数は減少する。同様に、変異頻度が増すにつれ、ライブラリの大きさは、その網羅率に影響を与えることなく、減少させることができる。例えば、ある遺伝子の一個のコピーが、100個の生存変異誘発細胞のうちほぼ１個の細胞の頻度で変異するとすると、各遺伝子のコピー一つが平均で１回変異しているようなライブラリを作製するには、100個の変異細胞クローンが必要になるであろう。しかしながら、ある遺伝子の一個のコピーが30個の細胞当たり１個の細胞の頻度で変異する場合、同じIXライブラリを作製するには僅かに30個の変異クローンが必要なことになる。この大きさのライブラリを、各遺伝子の一つのコピーが平均で１回、変異していることを示すものとして、1Xライブラリと言及することができる。
【０１０９】
好適な実施態様では、少なくとも50乃至10,000個（二倍体ゲノム中のアレルの総数の0.05-10%に一個の変異コピー）の遺伝子を各細胞中で変異させる。大変好適な実施態様では、少なくとも250乃至5,000個（二倍体ゲノム中のアレルの総数の0.25-5%に一個の変異コピー）の遺伝子を各細胞中で変異させる。他の実施態様では、各細胞中10乃至100個の遺伝子を変異させると便利である。さらに他の実施態様では、10,000乃至50,000個の遺伝子又はそれ以上を変異させると有効である。一個の細胞当たりの変異数が増すにつれ、何らかの遺伝子の両方のアレルが変異する可能性が高くなり、また、特定の生物学的機能に必要な複数の遺伝子が一個の細胞中で変異する可能性も高くなる。このように、細胞を変異誘発すると、この細胞、又は同様に変異誘発した細胞から成るライブラリを、この感作の起きた遺伝子バックグラウンド上で更なる変異（例えば挿入変異誘発）を行ったときの表現型誘導に対して感作を行うことができる。
【０１１０】
1Xライブラリはライブラリの複雑さの推定に過ぎないことに留意されたい。統計学的には、無作為な変異頻度を想定した場合、1Xライブラリは、含有する遺伝子の約66%が一回の変異を持つことになる。遺伝子の中には二回、変異している（細胞中のゲノムが二倍体である場合）ものもあり、また変異していないものもあるであろう。ライブラリ中の大半又は全ての遺伝子が少なくとも一回、変異している可能性を上げるには、より複雑なライブラリを用いることができる（例えば5X又は10Xライブラリを用いることができる）。ゲノム中のすべての遺伝子に変異を必要とはしない他の実施態様では、複雑さの少ないライブラリを作製することができる（例えば 0.1X (又は未満)のライブラリなど）。
【０１１１】
ライブラリ中の個々の遺伝子の変異頻度を評価することにより、ライブラリの大きさ及び網羅率を推定することも可能である。例えばHPRT 及びHSV-TKが両者とも、特定の変異条件下では500個の細胞中1回の頻度で変異するのであれば、1Xライブラリは500個の細胞を含有すると推定できよう。このような、複雑さの高い又は低いライブラリは、細胞を暴露する物理化学的変異誘発の条件を操作することにより、作製することができ、例えば複雑さの高いライブラリを作るには物理化学的変異原の用量及び／又は暴露時間を増やし、あるいは、複雑さの低いライブラリを調製するには、物理化学的変異原の用量及び／又は暴露時間を減らす。
【０１１２】
物理化学的変異誘発を挿入変異誘発の前に行う場合、物理化学的に変異させられる細胞又は生物を、選択に応じ、所望の表現型についてこの時点でスクリーニングすることができる。このスクリーニングは、この物理化学的に変異させられる細胞の変異頻度が判明していても、判明していなくとも、行うことができる。こうして、挿入変異誘発を行う前に所望の表現型を示す変異細胞を廃棄することもできる。この段階で所望の表現型を示す細胞を取り除くことが好ましいが、それはなぜなら、これらは、挿入変異誘発とは独立に、所望の表現型を示すことにより、その後のスクリーニングに干渉すると思われるからである。ここで開示するように、挿入変異誘発法は、所望の表現型の誘導に関与する遺伝子を標識する方法となる。ある遺伝子を物理化学的に変異誘発したことで、当該の表現型が既に生じるのであれば、その表現型は挿入事象により誘導されるものではないため、挿入による標識は、標識された遺伝子と表現型とを相関付けるためには使用できないことになる。このように、本発明のある実施態様では、挿入変異の前に、所望の表現型について細胞を検定して、挿入変異誘発がなくとも当該表現型を獲得してしまった細胞を特定及び除去する。
【０１１３】
物理化学的変異誘発を挿入変異誘発の前に行う、本発明の別の実施態様では、所望の表現型が生じる可能性が低いために、挿入変異の前には表現型を評価しない。この実施態様では、所望の表現型が生じる可能性が低いために、一個当たりの細胞の変異箇所が少なくなるような条件下で、細胞を変異させることが好ましい。その理由は、例えば１個当たり10,000個の遺伝子が変異するなど、各細胞中で多数の変異を起こさせた場合、ある表現型を生じるような２つの遺伝子又はアレルが変異する可能性も相対的に高くなるからである。反対に、例えば１個の細胞当たり100個の遺伝子が変異するなど、各細胞中で起きる変異の数が少ないと、ある表現型を生じるのに同じ細胞中で２つ以上の必要な遺伝子又はアレルが変異する可能性も低くなる。さらに、挿入変異誘発に向けて選抜される物理化学的に変異させた細胞の数は、挿入変異誘発の前に当該表現型を有する細胞が選抜される可能性にも影響を与える。例えば、各細胞中の1,000個の変異が物理化学的変異誘発により起き、しかし挿入変異誘発には一個の細胞しか、選抜されないとすると、この一個の細胞が所望の表現型を有する可能性は相対的に低いであろう。他方、物理化学的変異誘発により10個の遺伝子変異が各細胞中で生じ、しかし106個の物理化学的に変異したクローンが挿入変異誘発法に向けて選抜されるとすると、一個以上の細胞が、挿入変異誘発法の前に所望の表現型を有する可能性は相対的に高いであろう。このように、一個の細胞当たりの物理化学的変異数と、 挿入変異誘発法に向けて選抜される物理化学的変異細胞の数と、挿入変異誘発の前に、ある表現型を示す一個以上の細胞を選抜する可能性との間には、相関関係がある。ある表現型について、この関係を経験的に評価する方法の一つは、複数の条件下で細胞を物理化学的に変異させた後、挿入変異誘発の前に表現型の頻度について検査するという方法である。例えばもし、ある特定の物理化学的変異に関する表現型頻度が、1000個の細胞当たり１種類の変異表現型が観察されることが見出されたら、50個の細胞を選抜することにより、目的の表現型を示す細胞を選抜する可能性は僅かに約5%であることになる。所望の表現型を示す物理化学的変異細胞を選抜する可能性を評価するもう一つのアプローチは、ある任意の変異細胞集団の変異頻度を、上述の検定（例えばHPRT又はHSV-TK選択検定を用いるなど）のうちの一つを用いて判定する方法である。例えば、もしある単一コピーの遺伝子の変異頻度が400個のクローンのうち１個の変異であれば、二倍体細胞での一遺伝子の両方のアレルが変異する可能性は、おおよそ160,000個（1/400×400）に一個である。従って、挿入変異誘発法に向けて4000個の細胞を選抜すると、細胞が、ホモ接合型遺伝子変異で起きる表現型を示す可能性はかなり低い。
【０１１４】
変異頻度を判定するための前述の検定法は、単に、挿入変異誘発法のための細胞を選抜する際に当業者にとっての指針を与えるために提供された非限定的な例として意図されている。当業者であれば気付かれるように、本発明と併用できる変異頻度の検定法は他にも数多くある。従って、ここで解説した例示的な検定法は、決して本発明の範囲を限定するものと、見なされてはならない。
【０１１５】
挿入変異誘発法
本発明の他の変異法は、（同じでも、又は異なっていてもよい）一つ以上の挿入変異原による細胞又は生物の挿入変異誘発法である。ある実施態様では、挿入変異誘発は最初の変異誘発事象であり、物理化学的変異誘発事象に先行する。別の実施態様では、挿入変異誘発法を物理化学的変異誘発法と同時に行う。別の実施態様では、挿入変異誘発事象が物理的変異誘発事象に続く。これらの実施態様のいずれにおいても、細胞に、その後一回以上の付加的な物理化学的変異誘発事象、一回以上の付加的な挿入変異誘発事象、又は、いかなる数のこれらの事象の組合せを、いかなる順序又は同時に行ってもよい。挿入変異誘発法を一回以上の付加的な変異事象と組み合わせると、これまで変異を起こすことが困難又は不可能であった、あるいはその検出が困難又は不可能であったような細胞又は生物において、変異を作ることができる。
【０１１６】
本発明では、挿入変異誘発は、細胞又は生物のゲノム中に一つ以上のポリヌクレオチド配列を組み込ませて、この細胞又は生物の一つ以上の内因性遺伝子を変異させることに関係する。このように、本発明の挿入変異原性ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに組み込まれたときに一つ以上の内因性遺伝子を変異させるよう、デザインされている。
【０１１７】
挿入変異原
従って、本発明で用いる挿入変異原には、遺伝子発現レベル、又は、ある遺伝子産物の活性を、当該遺伝子を含有するDNAに挿入されるや変更することのできる、あらゆるヌクレオチド配列を含めることができる。当該挿入変異原は、DNA及びRNA、又はDNA及びRNAのハイブリッドを含め、あらゆるポリヌクレオチドであってもよく、一本鎖又は二本鎖でも、天然型又は非天然型（例えばホスホロチオエート、ペプチド−核酸等）でもよい。当該挿入変異原は、限定はしないが、直線状、環状、コイル状、超コイル状、分枝状、ヘアピン等を含めいかなる幾何学形状でもよく、内因性遺伝子の変異及び標識付けを促すことができればいかなる長さでもよい。典型的には、当該挿入変異源は少なくとも5ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも15ヌクレオチド長、少なくとも20ヌクレオチド長、少なくとも25ヌクレオチド長、少なくとも50ヌクレオチド長、少なくとも100ヌクレオチド長、少なくとも200ヌクレオチド長、少なくとも250ヌクレオチド長、少なくとも500ヌクレオチド長、少なくとも1000ヌクレオチド（例えば少なくとも1kb）長等である。本発明のいくつかの実施態様では、当該の挿入変異原は、少なくとも1kb長、少なくとも2kb長、少なくとも2.5kb長、少なくとも5kb長、少なくとも7.5kb長、少なくとも10kb長、又はそれ以上であってもよい。好ましくは、当該の挿入変異原が少なくとも10乃至15ヌクレオチド長であるとよい。この長さであれば、当業者なら、当該遺伝子を検出又は特徴付け（例えば配列決定）する際に、挿入されるポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチドプライマを、挿入変異遺伝子のプライマ伸長産物の作製に用いることができる。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施態様では、本挿入変異原には、所望の機能を提供する一つ以上のヌクレオチド配列を含めることができる。このようなヌクレオチド配列には、限定はしないが、一つ以上の多重クローニング部位、一つ以上の転写終了部位、一つ以上の転写調節配列（例えば一つ以上のプロモータ、エンハンサ、又はリプレッサ）、翻訳シグナルをコードする一つ以上の配列、一つ以上の読み取り枠（ORF）、ORFを変異させる一つ以上の配列、一つ以上の停止コドン、停止コドンを変異又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のmRNA不安定化因子、一つ以上のRNA安定化因子、ヘアピン・ループを形成させる一つ以上の配列、ヘアピン・ループを破壊又は消失させる一つ以上の配列、一つ以上のレポータ遺伝子、一つ以上のスプライス受容側配列、一つ以上のスプライス供与側配列、一つ以上の内部リボゾーム侵入部位（IRES）、一つ以上のトランスポゾン配列、一つ以上の部位特異的組換え部位配列、一つ以上の制限酵素配列、融合相手のタンパク質又はペプチド（例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ヘキサヒスチジン（His6）又はチオレドキシン）をコードする一つ以上のヌクレオチド配列 、一つ以上の選択マーカ又は選択モジュール、ホスト細胞内で挿入変異原性ポリヌクレオチド分子を増殖させるために有用な一つ以上の細菌性配列、一つ以上の3'遺伝子トラップ・カセット、核内移行シグナル又は分泌シグナルなどの局在シグナルをコードする一つ以上のヌクレオチド配列、一つ以上の膜貫通領域をコードする一つ以上のヌクレオチド配列（例えば、ポリペプチドを細胞膜につなげることのできる一つ以上のアミノ酸、及び典型的には一つ以上の疎水性アミノ酸）、一つ以上の複製開始点、一つ以上のプロテアーゼ開裂部位、ある遺伝子又は遺伝子部分にコードされた一つ以上の所望のタンパク質又はペプチド、挿入変異原上の5'遺伝子トラップ、挿入変異原上の3'遺伝子トラップ、一つ以上の選択マーカ、一つ以上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイル（特にpoly(A)テイル）をコードする一つ以上の配列等、がある。当業者であれば容易に理解されるように、本発明の挿入変異原には、これら又は他のヌクレオチド配列のうちの一つ以上を、いかなる順序及び組み合わせで含めることもでき、また、２つ以上のヌクレオチド配列を含めることもできる。
【０１１９】
好ましくは、本挿入変異原が、選択マーカか、5'遺伝子トラップか、プロモータを作動的に連結させていないスプライス受容側配列か、３つの読み取り枠すべての停止コドンか、IRESか、トランスポゾン配列か、又は部位特異的組換え部位を含むとよい。
【０１２０】
ある具体的な実施態様では、本挿入変異原は、作動的に連結されたプロモータを5'側に含有しないスプライス受容側配列を含む。このポリヌクレオチドは、基本的な5'遺伝子トラップとして働くことができる。いくつかの他の具体的な実施態様では、本挿入変異原がレトロウィルス・ベクタ上に見られる。前記レトロウィルスは感染性でも、又は非感染性でもよいが、ある好適な実施態様では、前記レトロウィルス・ベクタは感染性のレトロウィルス粒子を形成することができる。別の具体的な実施態様では、本挿入変異原は、転位に必要な配列を含有し、従って転位可能な因子を形成する。更なる具体的な実施態様では、本挿入変異原は、プロモータを作動的に連結させていないスプライス受容側配列を有するポリヌクレオチドを含み、このスプライス受容側配列は最適な分岐点を有し、また前記変異原は、さらに、３つの全読み取り枠のための３つの停止コドンと、エキソン・スプライシング・エンハンサを含むIRESとを含有し、前記変異原はさらに、ポリアデニレーション部位を作動的に連結させた選択マーカと、polyAのトラップ成分とを含む。このpolyAトラップ成分は、選択に応じてここに解説したように、そして当業で広く公知のように構成することができる。polyAトラップは、polyAトラップの開示のために引用をもってここに援用することとする米国特許第 6,410,266号にも論じられている。別の実施態様では、本挿入変異原は、5'側にプロモータを作動的に連結させていないスプライス受容側配列を含有し、このスプライス受容側配列は、最適な分岐点を含有し、当該ベクタは、全ての３つの読み取り枠のための３つの停止コドンと、エンハンサを含有しないIRESと、作動的に連結されたポリアデニレーション部位を持つ選択マーカとをさらに含有し、この場合の当該ベクタはpolyAトラップを含有しない。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、本挿入変異原は、読み取り枠（ORF）を変異させることのできる一つ以上のヌクレオチド配列を含む。例えば、本挿入変異原は、3で除算できない、従って、ORFにポリヌクレオチドが挿入されるとフレームシフトが起きるような数のヌクレオチドを含有することができる。
【０１２２】
別の実施態様では、本挿入変異原は、一つ以上のプライマ認識部位を含み、従って、PCRなど、プライマをベースにした増幅法又は配列決定法を用いて変異遺伝子を検出するのに便利である。
【０１２３】
本発明のいくつかの他の実施態様では、本挿入変異原には、付加的又は選択的に、一つ以上の停止コドンを含めることができる。停止コドンは、遺伝子の翻訳を終了させることで、機能タンパク質の変異を促すのに有用である。停止コドンは二本鎖の挿入変異原の一方又は両方の鎖上にあってよくまた、３つの読み取り枠すべてで翻訳を終了させるように入れ子状になっていてもよい。
【０１２４】
本発明のいくつか他の実施態様では、本挿入変異原には付加的又は選択的に、一つ以上のmRNA不安定化因子を含めることができる。ある遺伝子に組み込まれ、この遺伝子の産生するmRNAに取り込まれると、該RNA不安定因子はこの遺伝子からのmRNA量を減少させるであろう。多数のmRNA不安定因子が当業で公知であり、本発明において有用である（例えば、RNA不安定因子及びこのような因子を用いる方法の教示について引用をもってここに各々援用することとするShaw et al., Cell 46:659-667 (1986); Ishida et al., Nucleic Acids Research 27:e35 (1999)を参照されたい）。
【０１２５】
本発明のいくつかの他の実施態様では、本挿入変異原には、付加的又は選択的に、一つ以上の選択マーカを含めることができる。選択マーカは、選抜又は淘汰の基準とすることができる発現産物をコードする遺伝子である。選択マーカの例には、限定はしないが、：（１）毒性の化合物（例えば抗生物質又は他の薬物）に対する耐性を提供する産物をコードするポリヌクレオチド部分；（２）レシピエント細胞中に欠ける産物をコードするポリヌクレオチド部分（例えばtRNA遺伝子、栄養要求マーカ）；（３）ある遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするポリヌクレオチド部分；（４）容易に同定可能な産物をコードするポリヌクレオチド部分 （例えばβ-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光たんぱく（GFP）、及び細胞表面たんぱくなどの表現型マーカ）；（５）細胞生存及び／又は機能にとって有害な産物に結合するポリヌクレオチド部分；（６）上記の（１）−（５）に解説されたポリヌクレオチド部分のいずれかの活性を阻害するポリヌクレオチド部分（例えばアンチセンス・オリゴヌクレオチド）；（７）基質（例えばメチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ）を修飾する産物に結合するポリヌクレオチド部分；（８）所望の分子（例えば特異的タンパク質結合部位）を単離又は同定するために使用できるポリヌクレオチド部分；（９）一つ以上のスクリーニング可能なマーカをコードするポリヌクレオチド部分；（１０）存在しない場合、細胞の、特定の化合物に対する耐性又は感受性を直接もしくは間接的にもたらすポリヌクレオチド部分；（１１）レシピエント細胞において毒性の産物をコードするポリヌクレオチド部分；（１２）自らを含有する核酸分子の複製、分配又は遺伝力を阻害するポリヌクレオチド部分；及び（１３）特定のホスト又はホスト細胞株あるいは特定の環境条件（例えば温度、栄養条件等）下での複製など、条件的複製機能をコードするポリヌクレオチド部分、がある。本発明においては、選択マーカにより、ホスト細胞ゲノムへの挿入変異原の組込みの検出が可能となる。加えて、選択マーカを、ゲノムの転写活性もしくはサイレント領域で起きる挿入事象を選抜できるように、挿入変異原上に配置することができる（非限定的な例については図２乃至６を参照されたい）。選択マーカは、挿入される本挿入変異原上のプロモータから発現させることも、又は、変異させようとするポリヌクレオチド中に位置するプロモータから発現させることもできる（非限定的な例については図７を参照されたい）。本発明のこの局面での使用に適した選択マーカには、正の選択マーカ及び負の選択マーカがある。
【０１２６】
正の選択マーカにより、選択マーカを発現している細胞は淘汰を免れることができ、他方、選択マーカを発現していない細胞は淘汰により死滅する。正の選択マーカの例には、限定はしないが、ネオマイシン耐性遺伝子（neo）、ピューロマイシン耐性遺伝子（puro）、ゼオマイシン耐性遺伝子（zeo）、ヒグロマイシン耐性遺伝子（hyg）、ヒスチジンD（his D）、ジヒドロ−オラターゼ、グルタミンシンターゼ（gs）、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、カルバミルホスフェートシンターゼ（cad）、多剤耐性1（mdr1）、チミジンキナーゼ（tk）、及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）、がある。他の適した正の選択マーカも当業で公知であり、当業者は熟知のことであろう。本発明では、選択マーカは、挿入される本挿入変異原上のプロモータから発現させることも、又は、変異させようとするDNA中に位置するプロモータから発現させることもできる。従って、本発明においては、正の選択マーカを用いると、例えば、本挿入変異原を組み込んだ（ゲノム中の位置に関係なく細胞や（図７、SMに関する選択）、又は、 挿入が転写上活性な遺伝子に起きた細胞（例えば図２乃至６を参照されたい）を、選抜することができる。
【０１２７】
負の選択マーカは、当該選択マーカを発現している細胞に、淘汰により死滅させるものであり、他方、当該選択マーカを発現していない細胞は淘汰を免れる。負の選択マーカの例には、限定はしないが、HPRT、チミジンキナーゼ、コレラ毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、及びジフテリア毒素、がある。他の負の選択マーカが当業で公知であり、当業者の熟知するところであろう。本発明で用いられる負の選択マーカは、有利なことに、本挿入変異原上のプロモータから発現させることも、又は、変異させようとするDNA中に位置するプロモータから発現させることもできる。本発明においては、負の選択マーカを用いると、例えば、挿入が転写上活性な遺伝子に起きた細胞を淘汰することができる。部位特異的組換えシグナルと組み合わせて負の選択マーカを存在させる方法を用いると、組換えシグナル間の配列を削除できなかった細胞を淘汰することができる（本発明のこの実施態様で有用な挿入変異原の非限定的な例については、例えば図８Ｃ、９Ａ−９Ｄ及び９Ｆを参照されたい）。
【０１２８】
いくつかのこのような実施態様では、本挿入変異原に、一つ以上の正の選択マーカ及び一つ以上の負の選択マーカを含めることができる。本挿入変異原が正及び負の両方の選択マーカを含有するこのような実施態様では、該マーカは、別々の読み取り枠として存在させても、又は、一個の融合読み取り枠として存在させてもよい（このようなポリヌクレオチドの非限定的な例については図９Ｆを参照されたい）。これら選択マーカがポリヌクレオチド中に別々の読み取り枠として存在する場合、正の選択マーカ及び負の選択マーカを一個の多シストロン転写産物として発現させることも（このような挿入変異原の非限定的な例については図９Ｇを参照されたい）又は、別々の転写産物として発現させることも（このような挿入変異原の非限定的な例については図８Ｃ及び９Ａ−９Ｃを参照されたい）できる。正の選択マーカ及び負の選択マーカの両方を同じ挿入変異原中に存在させる方法を用いると、例えば、活発に発現している遺伝子や、発生上調節を受ける遺伝子を淘汰したり、又はその逆を行うことができる。あるいは、正の選択マーカ及び負の選択マーカの両方が存在する方法を用いて、発生上もしくは環境上のきっかけに応答して下方調節される活発に発現している遺伝子を選抜することができる。発生上調節を受ける遺伝子をトラップし、選抜するためのベクタ及び方法は当業で公知である（例えば、そのすべての開示を、これらのベクタ及び方法に関するそれらの全文について引用をもってここに援用することとするGogos et al. , J. Virol. 71:1644-1650 (1997); Wempe et al., Genome Biol. 2:research 23.1-23.10 (2001); 及び Medico et al., Nature Biotech. 19:579-582 (2001)を参照されたい）。
【０１２９】
本発明のいくつか他の実施態様では、本挿入変異原には、付加的に又は選択的に、例えば一つ以上の部位特異的組換え部位又はシグナルなど、一つ以上の組換え部位を含めることができる（図８及び９を参照されたい）。これらの組換え部位は、核酸分子上で離散した部分であり、このような組換え部位を各々が含有する２つの核酸分子間で起きる組込み又は組換えの最初の段階で特定の組換えタンパク質が認識及び結合する先の部位となる。上に詳述したように、このような部位特異的組換え部位又はシグナルは、当該挿入変異原が挿入される先のDNAから、挿入された挿入変異原又はその一部分を削除（又は反転）させるために有用である。これは、例えば、挿入された挿入変異原が起こした細胞表現型を復帰させるのに有用であり、この復帰は、特定の細胞表現型変化が、本挿入変異源の挿入により誘導された変異が原因であることを確認するために有用と考えられる。さらにこのアプローチは、選択マーカなど、挿入された挿入変異原から特定の配列を除去しながらも、挿入変異原が挿入された先のDNA中の一つ以上の遺伝子を破壊する配列など、本挿入変異原中の他の配列を残すためにも、有用である。挿入された挿入変異原を除去又は反転させることができれば、いかなる部位特異的組換え系も使用することができる。有用な組換えシグナルの例には、それぞれCre、FLP (又はFLPe) 及びPhiC31リコンビナーゼと組み合わせたときに有用なloxP、FRT、及びatt、がある（例えば、哺乳動物細胞での部位特異的組換えのためのベクタ及び方法の教示について、引用をもってそれぞれここに援用することとする Hoess and Abremski, in: Nucleic Acids and Molecular Biology, vol. 4. Eds.: Eckstein and Lilley, Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag; pp. 90-109 (1990); Broach, et al., Cell 29:227-234 (1982); Ishida et al., Nucl. Acids Res. 27:e35 (1999); O'Gorman et al., Science 251:1351-1355 (1991); Bergemann et al., Nucl. Acids Res. 23:4451-4456 (1995); Sauer, B., Curr. Opin. Biotech. 5:521-527 (1994); Schwenk et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jun 1; 30(11):2299-306; Schaft et al.; Genesis.  2001 Sep;31(1):6-10; Farley et al.; Genesis, 2000 Nov-Dec;28(3-4):106-10; Rodriguez et al.; Nat Genet. 2000 Jun;25(2):139-40; Buchholz et al.; Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):657-62; Olivares et al.; Gene. 2001 Oct 31;278(1-2:167-76; Lee L, Sadowski PD, J Biol Chem. 2001 Aug 17;276(33):31092-8; Kolb AF, Anal Biochem. 2001 Mar15;290(2):260-71; Araki et al., Nucleic Acids Res. 1997 Feb 15;25(4):868-72; Albert et al., Plant J. 1995 Apr;7(4):649-59;  Santoro et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002 Apr 2;99(7):4185-90; Trinh et al., J Immunol Methods, 2000 Oct 20;244(1-2):185-93;  Soukharev et al., Nucleic Acids Res. 1999 Sep 15;27(18):e21 及び米国特許第4,959,317号、第5,434,066号、第5,888,732号、第6,080,576号及び第6,136,566号を参照されたい)。本発明の挿入変異原での使用に適した組換え部位の他の例には、組換えたんぱくβ Int、及び補助たんぱく組込みホスト因子(IHF)、FIS 及びエクシシオナーゼ(Xis)により認識されるattB、attP、attL、及びattR配列、がある。Landy, Curr. Opin. Biotech. 3:699-707 (1993)を参照されたい。さらにその全文を引用をもってここに援用することとする米国特許第5,888,732号、第6,143,557号、第6,171,969号及び第6,277,608号も参照されたい。組換え系の更なる例には、そのすべてが当業で公知であり、また当業者の熟知するところとなるであろうHin、Gin、Pin、Cin、及びVDJ 組換え、がある。当業で公知の他の部位特異的組換え系も、当業者によ��有用と認識され、従って本発明の方法及び組成物で使用できるものがあるであろう。部位特異的組換えシグナルは野生型でも、又は変異型でもよい。変異型シグナルは、例えば、組換え反応の可逆性を制御するために、使用することができる（全文を援用する文献 Araki et al., Nucleic Acids Res. 1997 Feb 15;25(4):868-72; Dale et al., Plant J. 1995 Apr;7(4):649-59;  Trinh et al., J Immunol Methods, 2000 Oct 20;244(1-2):185-93; Soukharev et al. Nucleic Acids Res. 1999 Sep 15;27(18):e21 )。本発明のこの局面で用いられる部位特異的リコンビナーゼは野生型でも、変異型でも、又は融合タンパク質でもよい。本発明のこの局面で有用な改変リコンビナーゼの例には、限定はしないが、細胞透過性CRE 及びCRE-ER (その全文を引用をもってそれぞれここに援用することとするJo et al., Nature Biotech. 19:929-933 (2001); Vallier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2467-2472 (2001))がある。本発明で用いるリコンビナーゼは、当該リコンビナーゼをコードする発現ベクタの感染又はトランスフェクション(その全文を引用をもってここに援用することとするWesterman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8971-8976 (1996))、タンパク質のトランスフェクション（例えば電気穿孔法により； それぞれ、その全文を引用をもってここに援用することとするAger et al., Radiat. Res. 128:150-156 (1991); Chung et al., Radiat. Res. 125:107-113 (1991))、又は細胞透過性リコンビナーゼの使用 (それぞれ、その全文を引用をもってここに援用することとするJo et al., Nature Biotech. 19:929-933 (2001); Vallier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2467-2472 (2001))を通じて、細胞に送達することができる。あるいは、リコンビナーゼ遺伝子自体が、当該の挿入変異原上に存在してもよい。これらの系のうちのいずれの部位特異的リコンビナーゼ遺伝子及び／又は組換え部位も、所望の組換え事象を達成するために、本発明の挿入変異原に含めたり、あるいは、ホスト細胞に別々に導入することができる。
【０１３０】
選択に応じ、一つ以上の組換え部位を含有する挿入変異原を用いることで、本発明の方法により作製された変異細胞又は生物（例えば一つ以上の変異遺伝子を含有する細胞又は生物）を分析して、この変異細胞又は生物で観察される何らかの表現型変化が、少なくとも１つの挿入変異遺伝子の結果であることを確認することもできる。このような方法の一つが、部位特異的組換えを利用して、典型的には、挿入された挿入変異原を削除又は反転させることにより、変異から野生型への復帰を誘導して、表現型変化を復帰させる方法を含むものである。このような実施態様の一つでは、特異的リコンビナーゼ酵素（例えばバクテリオファージ8由来の att/Int 系、バクテリオファージP1由来の lox/Cre 系、及びサッカロミセス−セレビジエ（Saccharomyces cerevisiaege ）2μ環状プラスミド由来の frt/FLP 系) により認識される部位特異的組換えシグナルを、挿入変異原上に含めることができる（部位特異的組換えシグナルを含有するこのような挿入変異原の非限定的例については図９Ａ−９Ｈを参照されたい）。一般的には、このような組換え部位を当該挿入変異原上に配置し、こうして、適切なリコンビナーゼ酵素を当該細胞内に導入することにより、当該挿入変異原が挿入された先のDNAから、当該遺伝子の変異を担う挿入変異原全体又は挿入変異源の一部分を削除したり、又は同DNA中で反転させることができるようにする。選択によっては、以下に論じるように、負の選択マーカ又はレポータ遺伝子を用いると、挿入変異原の変異原性部分が削除又は反転させられた細胞の特定又は単離に便利であり、またこのような削除又は反転の結果としての細胞表現型の何らかの変化を評価することができ、ひいては当該挿入変異誘発法の表現型上の効果を判定することができる（例えば、挿入変異誘発したときに観察された細胞表現型が復帰又は変化していれば、挿入変異原のうちの少なくとも１つは、野生型からの、観察された表現型変化を担っている可能性がある、など）。
【０１３１】
さらに本発明は、発生上調節を受ける遺伝子を特定するためにも、用いることができる。ある実施態様では、正の選択マーカ及び負の選択マーカの両方を同じ挿入変異原中に存在させる方法を用いて、例えば活発に発現している遺伝子を淘汰したり、発生上調節を受ける遺伝子を選抜することができる。反対に、正の選択マーカ及び負の選択マーカの両方を存在させる方法を用いて、発生上もしくは環境上のきっかけに応答して下方調節される活発に発現している遺伝子を選抜することもできる。発生上調節を受ける遺伝子をトラップ及び選抜するためのベクタ及び方法は当業で公知である(例えばこれらのベクタ及び方法に関するそれらの開示全体をすべて引用をもってここに援用することとする Gogos et al., J. Virol. 71:1644-1650 (1997); Wempe et al., Genome Biol. 2:research 23.1-23.10 (2001); and Medico et al., Nature Biotech. 19:579-582 (2001)を参照されたい）。本発明に基づいて、トラップされた発生上調節を受ける遺伝子を特定する他の方法は、図９Ｂ、９Ｃ及び９Ｈで示されたものなど、遺伝子トラップ・ベクタとして働く挿入変異原の使用を含むものである。これらは、例えば、正の選択マーカ（図９Ｂのように）及び負の選択マーカ（図９Ｃのように）又は、正及び負の両方の選択マーカ（図９Ｇ及び９Ｈのように）をフランクする、少なくとも２つの部位特異的組換えシグナル（例えば少なくとも２つの lox 部位 (例えば loxP)、少なくとも２つのatt 部位（例えばattP、attB、attL 及び／又は attR)、少なくとも２つのFRT部位等）を含むであろう。
【０１３２】
一番目のこのような実施態様では、図９Ｂ、９Ｈ、１１、及び１３に示した挿入変異原を、当業で公知であり、従って当業者の熟知するところとなるであろう、ホスト細胞へ核酸分子を導入するための標準的な方法を用いて、組み込むことができる。挿入変異原を組み込ませたら、この挿入変異原が持つ（従ってホスト細胞中のDNAに組み込まれた）正の選択マーカに基づいて細胞を選抜することができる。生存クローンは、このような細胞においてのみ、正の選択マーカの発現も可能であるため、転写上活性の遺伝子に組み込まれた挿入変異原を含有するであろう。その後細胞を処理して、正の選択マーカを削除する（図１１）か、又は、正のマーカを反転させ（図１３ 凡例 ）て、トラップされた遺伝子と負の選択マーカとの間に作動的な連結を作ることができる。本発明のこのような局面のいくつかでは、この結果は、部位特異的組換え反応を通じて得られる。細胞を部位特異的リコンビナーゼで処理するが、この部位特異的リコンビナーゼの種類は、当該挿入変異原の構築に用いた特異的組換え部位に応じるであろう（例えばlox組換え部位にはCreリコンビナーゼを用い、att組換え部位には Int リコンビナーゼを用い、frt組換え部位にはFLP リコンビナーゼを用いる、等）。このような処理の結果、対向する組換え部位（例えば図９Ｂを参照されたい）同士の間で組換えが起きて、当該細胞のゲノムから正の選択マーカが削除又は反転される（そして負の選択マーカ及びトラップされた遺伝子が作動的に連結される）。その後細胞を新しい条件下で培養する、及び／又は、選択因子で処理して、負の選択マーカの発現のない細胞を選抜することで、トラップされた遺伝子の転写が減少又は消滅した細胞（例えばこの負の選択を生き延びた細胞）を特定することができる。このプロセスを図１１に概略的に図示し、図１３の凡例で解説する。
【０１３３】
別のこのような実施態様では、図９Ｃ及び９Ｈに示す挿入変異原を、当業で公知であり、従って当業者の熟知するところとなるであろう、ホスト細胞へ核酸分子を導入するための標準的な方法を用いて、組み込むことができる。挿入変異原を組み込ませたら、この挿入変異原が持つ（従って組み込まれた）負の選択マーカに基づいて細胞を選抜することができる。該挿入変異原が、転写上活性な遺伝子に組み込まれた（例えばトラップされた）細胞は、このような細胞でのみ、該負の選択マーカも発現するために、淘汰の過程で死滅し、他方、該挿入変異原が、ゲノムのうちで転写上サイレントな領域に組み込まれた細胞は、生き残るであろう。その後細胞を処理して負の選択マーカを削除して、トラップされた遺伝子と正の選択マーカとの間の作動的な連結を、例えば上に概略した部位特異的組換えなどを用いて作ることができる。このような処理の結果、対向する組換え部位同士（例えば図９Ｃを参照されたい）の間で組換えが起きることで、負の選択マーカが削除（図１２）又は反転（図１３）させられるため、正の選択マーカが、トラップされた遺伝子に作動的に連結されることになる。その後細胞を新しい条件下で培養するか、又は、遺伝子発現を誘導することのできる作用因子で処理することができ、正の選択マーカを発現している細胞を選抜し、こうしてトラップされた遺伝子の転写が増加した細胞（例えば正の選択で生き残った細胞）を特定することができる。このプロセスを図１２及び１３に概略的に示す。
【０１３４】
本発明の他のいくつかの実施態様では、本挿入変異原に、付加的又は代替的に、スクリーン可能マーカとしても公知の一つ以上のレポータ遺伝子を含めることができる。レポータ遺伝子は、細胞内で検出可能な発現産物をコードする遺伝子である。本発明では、レポータ遺伝子を本挿入変異原上のプロモータから発現させても、又は、本挿入変異原が挿入された先のDNA中のプロモータから発現させてもよい。レポータ遺伝子を検出することにより、当業者は、このレポータ遺伝子を発現している、又は発現していない細胞をスクリーニングすることができる。本発明では、レポータ遺伝子により、挿入を検出することができる。加えて、ゲノムの転写上活性又はサイレントな領域で起きる挿入事象についてスクリーニングできるように、レポータ遺伝子を本挿入変異原上に配置することもできる（図２乃至６を参照されたい）。本発明での使用に適したレポータ遺伝子は、検定法が存在する発現産物をコードしていれば、いずれの遺伝子であってもよい。このような適したレポータ遺伝子の例には、限定はしないが、酵素、構造タンパク質、細胞表面タンパク質、及び蛍光タンパク質、がある。当業で公知の具体的なレポータ遺伝子には、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく及びその誘導体、黄色蛍光たんぱく及びその誘導体、青色蛍光たんぱく及びその誘導体、シアン蛍光たんぱく及びその誘導体、並びに赤色蛍光たんぱく及びその誘導体、がある。他にも数多くのレポータ遺伝子が当業で公知であり、本発明で有用であろうと、当業者が認識するところであろう。
【０１３５】
レポータ遺伝子を検出する検定法には、限定はしないが、酵素活性検定法、細胞微小蛍光測定法又は蛍光活性化細胞ソーティング法（FACS(R)）、磁気ビーズ細胞ソーティング法、ELISA、ELISA スポット、転写レポータ検定法、及び、増殖、形質転換、形態等の細胞の表現型検定、がある。
【０１３６】
選択に応じ、レポータ遺伝子を部位特異的組換え配列の代わりに、又は、部位特異的組換え配列に加えて、用いることで、発生上調節を受ける遺伝子を特定したり、表現型を復帰させることができる。
【０１３７】
本発明の他のいくつかの実施態様では、本挿入変異原に、付加的に又は代替的に、一つ以上の選択マーカ及び一つ以上のレポータ遺伝子を含めることができる。この一つ以上の選択マーカ及び一つ以上のレポータ遺伝子は、融合遺伝子として存在していても、あるいは２つの別個の読み取り枠として存在していてもよい。上に詳述したものを含め、あらゆる組合せの選択マーカ及びレポータ遺伝子を用いることができる。有用な選択可能なレポータ遺伝子融合の一例は、ネオマイシン耐性遺伝子とβ-ガラクトシダーゼ遺伝子との融合であるβ-geoである。当業で公知であり、従って当業者の熟知するところである他の融合遺伝子も、本発明で使用することができる。
【０１３８】
本発明の他のいくつかの実施態様では、本挿入変異原に、付加的又は代替的に、一つ以上のスプライス受容側配列を含めることができる。この一つ以上のスプライス受容側配列は、標的DNAに導入されるや、この標的DNA中の一つ以上のスプライス供与側配列と対を形成して、このDNA中の遺伝子から、挿入された挿入変異原に対するスプライシングを導くことができる。こうして、このスプライシングにより、標的DNA中の遺伝子の、融合mRNA分子の生成を介した変異が促される。スプライス受容側部位として機能できれば、いかなる配列も、本発明のこの局面で使用することができる。当該スプライス受容側部位は天然で生じるものでも、又は非天然で生じるものでもよい。スプライス受容側部位や、候補もしくは推定スプライス受容体のスプライシング活性を検査する方法は当業で公知であり、従って当業者の熟知するところであろう。ヒト細胞においては、スプライス受容側部位は、：YYYYYYYYYYNYAGで表される特徴的な配列を有し、式中Y はピリミジンを表し、そしてNはいずれかのヌクレオチドを表す（Nucleic Acids Research 19:3715-3799 (1991)を参照されたい)。
【０１３９】
本発明の他の実施態様では、本挿入変異原に、付加的又は代替的に、一つ以上のスプライス供与側配列を含めることができる。この一つ以上のスプライス供与側配列は、標的DNAに導入されるや、この標的DNA中の一つ以上のスプライス受容側配列と対を形成して、このポリヌクレオチドから標的DNAのある遺伝子に対するスプライシングを導くことができる。こうしてこのスプライシングにより、融合mRNA分子の生成を介した遺伝子変異が促される。該スプライス供与側部位は、選択に応じ、本挿入変異原上にあるスプライス受容側部位と対を形成してもよい。典型的には、このような構成では、これらの因子の順序は、スプライス受容体の次に、スプライス供与体が来ることになる（非限定的な例については図１Ｈ−１Ｊ、２Ｄ及び２Ｈを参照されたい）。このスプライス供与側部位を、選択に応じて、挿入変異原上のプロモータに作動的に連結して、プロモータ−スプライス供与体3'遺伝子トラップを提供してもよい（このようなベクタの非限定的な例については図５Ｂ−５Ｅを参照されたい）。スプライス供与側部位として機能できれば、いかなる配列を用いることもできる。該スプライス供与側部位は天然で生じるものでも、又は非天然で生じるものでもよい。スプライス供与側部位や、候補もしくは推定スプライス供与側部位のスプライシング活性を検査する方法は当業で公知であり、従って当業者の熟知するところであろう。ヒト細胞においては、スプライス受容側部位は： (A/C)AG GURAGUで表される特徴的な配列を有し、式中、R はプリンヌクレオチドを表す (Nucleic Acids Research 19:3715-3798 (1991)を参照されたい)。該挿入変異原は、一つ以上のエキソン配列を含有していてもよい。これらは天然で生じるものでも、又は非天然の、組換えDNA又は合成法により生じるものでもよい。 該エキソンは真核性遺伝子を由来としていてもよい。さらに一つ以上のエキソンがタンデムになっていてもよい。
【０１４０】
他の実施態様において、本挿入変異原には、付加的又は代替的に、本挿入変異原が組み込まれる先のDNAから転写されるmRNA上の5'もしくは3'ポリヌクレオチドテイルの付加を導く一つ以上の配列を含めることができる。このような配列はpoly(A)テイル、poly（G）テイル、poly(U)テイル、poly(C)テイル、poly(I)テイル等、いずれのポリヌクレオチドテイルをコードするものでもよい。ある実施態様では、本挿入変異原は、本挿入変異原が組み込まれる先のDNAから転写されるmRNA分子上のpoly(A)テイルの付加を導く一つ以上のポリアデニレーション・シグナルを含む。ポリアデニレーション・シグナルは、天然型配列由来でも、又は非天然型配列由来でもよい。有用なポリアデニレーション・シグナルの例には、限定はしないが、SV40遺伝子、成長ホルモン遺伝子（例えばウシ成長ホルモン）、β-グロビン遺伝子、アクチン遺伝子、血清アルブミン遺伝子、及びレトロウィルス遺伝子、を由来とするものがある。他のポリアデニレーション・シグナルが当業で公知であり、従って当業者の熟知するところであろう。
【０１４１】
本発明の他のいくつかの実施態様では、本挿入変異原には、付加的又は代替的に、一つ以上の内部リボソーム侵入部位（IRES）を含めることができる。該IRESは内部読み取り枠の翻訳を可能にするものであり、転写上活性な遺伝子に組み込まれるや、本挿入変異原上に位置する読み取り枠を発現させるのに有用である。いくつかの実施態様では、本挿入変異原上のORFは選択マーカ及び／又はレポータ遺伝子である。本挿入変異原上に位置するORFを発現させるために、いずれのIRESも使用できる。有用なIRES及びIRES活性を測定する方法の例は当業で公知である（例えば、IRES配列や、IRES活性の測定法の教示に関しては、引用をもってそれぞれここに援用することとするZhou et al., PNAS 98:1531-1536 (2001), Owens et al., PNAS 99:1471-1476 (2001); Venkatesan et al., Mol Cell Biol. 8: 2826-2837 (2001); Jackson et al., Trends Biochem. Sci. 15: 477-483 (1990); and Jang et al., J. Virol. 62:2636-2643 (1988)を参照されたい）。
【０１４２】
本発明の他のいくつかの実施態様では、本挿入変異原に、付加的又は代替的に、一つ以上のトランスポゾン・シグナルを含めることができる。1. Cui et al., J Mol Biol. 2002 May 17;318(5):1221-35; 2. Izsvak et al., J Biol Chem. 2002 Jun 24; 3. Dupuy et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr 2;99(7):4495-9; 4. Horie et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 31;98(16):9191-6; 5. Dupuy et al.,Genesis. 2001 Jun;30(2):82-8; 6. Fischer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jun 5;98(12):6759-64;  7. Ivics et al.,Cell. 1997 Nov 14;91(4):501-10。他のトランスポゾンも哺乳動物で機能する：8. Zagoraiou et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Sep 25;98(20):11474-8; 9. Sherman et al., Nat Biotechnol. 1998 Nov;16(11):1050-3; 10. Kawakami et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Oct 10;97(21):11403-8; 11. Fadool et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Apr 28;95(9):5182-6; 12. Plasterk RH, Cell. 1993 Sep 10;74(5):781-6; 13:  Kaufman et al.,Nucleic Acids Res. 1991 Nov 25;19(22):6336; 14. Rubin et al., Nucleic Acids Res. 1983 Sep 24;11(18):6341-51; 15. Spradling et al., Science. 1982 Oct 22;218(4570):341-7; Ac 及び Ds 並びに他の植物トランスポゾンは、植物中で転位し、組み込まれ、又は挿入変異原として用いられている： 16. Grevelding et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Jul 1;89(13):6085-9; 17. Walbot V., Curr Opin Plant Biol. 2000 Apr;3(2):103-7; 18. Pereira et al, Methods Mol Biol. 1998;82:329-38; 19. Cooley et al., Mol Gen Genet. 1996 Aug 27;252(1-2):184-94; 20. Bhatt et al, Plant J. 1996 Jun;9(6):935-45。 Pエレメント・トランスポゾンは、ゲノム全体に広く組み込ませることができる：21. Kassis et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 1;89(5):1919-23;  22. Berg et al., Genetics. 1991 Mar;127(3):515-24; 23. Tower et al., Genetics. 1993 Feb;133(2):347-59; 24. Cooley et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1989;36:99-109; 25. Cooley et al., Science. 1988 Mar 4;239(4844):1121-8; 26. Spradling et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 21;92(24):10824-30。
【０１４３】
本挿入変異原を用いて、細胞内でトランスポゼースを発現又は誘導すると、トランスポゾン・シグナルにより、本挿入変異源をDNAへ挿入することができる。ある好適な実施態様では、本挿入変異原をまず細胞内のDNAへ導入し、次に、一つ以上の遺伝子を挿入的に変異させるために、転位又は「ホップ」させる。これは in vitroでも、in vivoでも、そしてin situでも行わせることができる。 ベクタを in situ で転位させる方法は当業で公知である（例えば、ベクタ及びその転位法の教示に関しては、それぞれを引用をもってここに援用することとするLucklow et al., J. Virol. 67:4566-4579 (1993); Ivics et al., Cell 91:501-510 (1997); and Luo et al., PNAS 95:10769-10773 (1998)を参照されたい）。
【０１４４】
本発明で有用な、当業で公知のトランスポゾン系及びトランスポゾン・シグナルが数多くある。これらには、酵母由来のTY （例えばTY1；引用をもってその全文をここに援用することとするDevine and Boeke Nucl. Acids Res. 22:3765-3772 (1994)を参照されたい)、ドゥロソフィラ由来のPエレメント、Hobo、Minos、及び Manner、細菌由来のTn5、Tn7、T0、Tn10、及びMu、トウモロコシ由来の En/Spm、並びにマウス及びＣ．エレガンス（原語：C. elegans）由来のTCI/Mariner (及びその誘導体、例えばスリーピング・ビューティなど）及びMinos、がある。数多くの他のトランスポゾン系が当業で公知であり、本発明で有用として当業者が認識するところであろう。加えて、効率を高めた、改変されたトランスポゾン・シグナル及び変異トランスポゼースも解説されており、本発明で有用であろう。
【０１４５】
挿入についてここに解説した挿入変異原のいずれも、レトロウィルス・ベクタ（レンチウィルスを含む）、ヘルペスウィルス・ベクタ（例えばエプスタイン−バー・ウィルス、サイトメガロウィルス（CMV）、ヘルペス−ゾスター（Herpes zoster）、及び単純疱疹）、パピロマウィルス、ピコルナウィルス、パポバウィルス（例えばポリオーマ・ベクタ及びSV40）、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、及び肝炎ウィルスなど、ウィルスベクタとして作製することができる。特に好適なベクタはレトロウィルスである。ウィルスは、本挿入変異原を細胞に効率的に導入したり、またいくつかのウィルスの場合には、本挿入変異原の細胞への効率的な送達や、本挿入変異原の細胞内DNAへの組込みを促すという、利点を有する。
【０１４６】
本発明のレトロウィルス・ベクタ、及び本発明の方法で使用するレトロウィルス・ベクタには、感染性レトロウィルス・ベクタの作製を容易にするレトロウィルスLTR、パッケージング・シグナル、及び他のいずれかの配列を含めることができる。レトロウィルスLTR及びパッケージング・シグナルにより、本発明の挿入変異原を、感染性粒子にパッケージし、ウィルス感染により細胞へ送達することができる。組換えレトロウィルス・ベクタを作製する方法は当業で公知である（例えばBrenner et al., PNAS 86:5517-5512 (1989); Xiong et al., Developmental Dynamics 212:181-197 (1998) 及びその中の引用を参照されたい；それぞれ引用をもってここに援用することとする）。好適な実施態様では、本発明で用いられる、レトロウィルス・ベクタは、逆方向ベクタであり、つまり、本挿入変異原中の遺伝子変異因子は、ウィルス転写とは反対の方向になっていることを意味する。レトロウィルス・ベクタは自己不活性化ウィルス(SIN ウィルス)であってもよい。SINウィルスは挿入されても転写上活性とはならない。SINウィルスを作製する方法は当業で公知である（例えばHawley et al., PNAS 84:2406-2410 (1987); Brenner et al., PNAS 86:5517-5512 (1989); 及びLih et al., Gene 164:289-294 (1995)を参照されたい；それぞれ、ベクタの教示のために引用をもってここに援用することとする）。レトロウィルスLTR及びパッケージング・シグナルは、感染させようとするホスト細胞に応じて選択することができる。本発明で有用なレトロウィルス配列の例には、マウス・モロニー白血病ウィルス (MMLV)、トリ白血病ウィルス(ALV)、トリ肉腫白血病ウィルス (ASLV)、ネコ白血病ウィルス(FLV)、及びヒト免疫不全ウィルス(HIV)、由来のものがある。当業で公知の他のウィルスも、本発明で有用であり、従って当業者の熟知するところであろう。
【０１４７】
他のいくつかの実施態様では、本挿入変異原に、付加的又は代替的に、原核細胞又は真核細胞で本挿入変異原を増殖させるのに有用な一つ以上の細菌性配列を含めることができる。このように、本発明の挿入変異原には、例えば、一つ以上の抗生物質耐性マーカ及び／又は、本挿入変異原を増殖させて分析するのに有用な、一つ以上の他の当業で公知の配列を含めることができる。
【０１４８】
ここで解説する挿入変異原のいずれにも、更に又は代替的に、一つ以上の3'遺伝子トラップを含めることができる。数多くの3'遺伝子トラップが解説されており、本発明において有用である（例えば Harrington et al., WO 99/15650; Zambrowicz et al., 米国特許第6,080,576号；Sands et al., 米国特許第6,136,566号；Niwa et al., J. Biochem. 113:343-349 (1993); Yoshida et al., Transgenic Research 4:277-287 (1995)を参照されたい；3'遺伝子トラップの教示のために、すべての参考文献の全文を引用をもってここに援用することとする）。3'遺伝子トラップを用いると、本挿入変異原の挿入部位の下流にある標的DNA中のエキソンを回収することができる。選択的には、これを用いると、標的DNA中の遺伝子からのRNA又はタンパク質発現を活性化させることができる。3'遺伝子トラップ・カセットを本発明の挿入変異原内に含有させる場合、それは、本挿入変異原の変異原性部分の上流に位置していても、又は下流に位置していてもよい。好適な実施態様では、3'遺伝子トラップを、本挿入変異原の変異原性部分の3'側に配置する。
【０１４９】
さらに、ここで解説する挿入変異原のいずれにも、更に又は代替的に、一つ以上の5'遺伝子トラップ・カセットを含めることができる。数多くの5'遺伝子トラップが解説されており、本発明において有用である（例えば Zambrowicz et al., 米国特許第6,080,576号；Sands et al., 米国特許第6,136,566号；Niwa et al., J. Biochem. 113:343-349 (1993); Yoshida et al., Transgenic Research 4:277-287 (1995)を参照されたい；3'遺伝子トラップの教示のために、すべての参考文献の全文を引用をもってここに援用することとする）。5' 遺伝子トラップを用いて、本挿入変異原の挿入部位の下流にある標的DNA中のエキソンを回収することができる。選択的には、これを用いると、標的DNA中の遺伝子からのRNA又はタンパク質発現を活性化させることができる。5'遺伝子トラップ・カセットを本発明の挿入変異原内に含有させる場合、それは、本挿入変異原の変異原性部分の上流に位置していても、又は下流に位置していてもよい。好適な実施態様では、5'遺伝子トラップを、本挿入変異原の変異原性部分の5'側に配置する。
【０１５０】
挿入変異原の組込み
本発明の挿入変異原は、当業で公知のいずれの方法によっても、細胞内に導入し、DNAに組み込ませることができる。ある好適な実施態様では、これらをトランスフェクションにより導入する。トランスフェクションの方法には、限定はしないが、電気穿孔法、粒子照射、リン酸カルシウム沈殿法、脂質媒介トランスフェクション（例えば陽イオン脂質を用いるなど）、マイクロインジェクション、DEAE媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、裸のDNA取り込み、及びレセプタ媒介性エンドサイトーシス、がある。
【０１５１】
別の好適な実施態様では、本挿入変異原を、ウィルス形質導入又は感染により、導入する。本発明で有用な適したウィルスベクタには、限定はしないが、アデノ随伴ウィルス、アデノウィルスベクタ、アルファ-ヘルペスウィルスベクタ、偽狂犬病ウィルスベクタ、単純疱疹ウィルスベクタ及びレトロウィルスベクタ（レンチウィルス・ベクタを含む）、がある。ウィルスベクタを作製し、用いる方法は上及び本明細書の他所にも解説されており、当業で公知であり、従って当業者の熟知するところである（例えばViral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications E. Caplitt and Loewy, Academic Press, San Diego (1995)を参照されたい；ウィルスベクタや、目的のポリヌクレオチドを導入し発現させるためのこのようなベクタの使用法の教示のために、引用をもってここに援用することとする）。
【０１５２】
ある好適なこのような実施態様では、ベクタはレトロウィルスベクタ（レンチウィルスベクタを含む）であり、感染により細胞内に導入される。ウィルスLTR及びパッケージング・シグナルを含有するベクタは上に解説されている。レトロウィルスベクタをパッケージする方法は当業で公知であり、本発明で用いることができる（例えば、ベクタ、パッケージング細胞株、及びウィルスベクタを作製し、パッケージする方法の教示のために、その開示全文を引用をもっってここに援用することとする米国特許第5,449,614号を参照されたい）。
【０１５３】
内因性挿入変異原の導入や、又は、トランスフェクションもしくは感染による細胞内へのその導入に続き、本発明の挿入変異原は当該細胞のゲノムに組み込まれる。本挿入変異原は、限定はしないが、レトロウィルス感染及び転位を含む非相同組換え、部位特異的組換え、相同組換え等を含め、いかなる方法でも、標的DNAに組み込ませることができる。いくつかの好適な実施態様では、本挿入変異原は、非相同組換え（例えばDNA末端の接合、レトロウィルス挿入、又は転位などによる組込み）により組み込まれる。
【０１５４】
本発明のいくつかの好適な実施態様では、細胞を、本挿入変異原の細胞への誘導又は導入の前、最中、又は後に、１種以上のDNA破壊因子で処理することができる。DNA破壊因子は組込みの効率を高める。本発明のこの局面で使用するのに適したDNA破壊因子の例には、限定はしないが、γ線、Ｘ線照射、紫外線照射、ブレオマイシン、過酸化物、及び制限酵素、がある。生存細胞中のDNAを破壊することが公知の他の因子を用いることもできる。DNA破壊因子を用いて挿入変異原の挿入を高める方法は解説されている（例えば非相同組換えを高める方法の教示のために、引用をもってここに援用することとする Harrington et al., WO 99/15650を参照されたい）。
【０１５５】
ある実施態様では、最初の組込みは変異誘発事象ではない。本挿入変異原が転位シグナルを含有する場合、最初の組込み後に、内因性の挿入変異原を誘導して新しい位置に転位（「ホップ」）させ、そこで変異誘発事象が起き得るようにすることにより、本発明の方法を実施することができる。in situでベクタを転位させる方法が当業で公知であり、従って当業者の熟知するところであろう（例えば Ivics et al., Cell 91:501-510 (1997); and Luo et al., PNAS 95:10769-10773 (1998)を参照されたい；転位ベクタ及び方法の教示のために、それぞれ引用をもってここに援用することとする）。
【０１５６】
本発明の方法を用いて多種の遺伝子を変異させることができる。例えば、疾患原因遺伝子（例えば腫瘍遺伝子、組み込まれたウィルス遺伝子（HIVを含む）、癌、多発性硬化症、アルツハイマー病、糖尿病、筋ジストロフィー、ALS、ゴーシェ病、テイ−サックス病、血友病、β-サラセミア、嚢胞性線維症、鎌状赤血球形成傾向等などの遺伝的異常を起こす遺伝子など）や、正常遺伝子（何らかの表現型を細胞又は生物にもたらすもの）を含む公知の遺伝子も、本発明の方法を用いて変異させることができる。別の実施態様では、前もっては未知であるか、又は、特徴付けが不完全な遺伝子を、本発明の方法を用いて変異させることができる。別の実施態様では、公知であるか、又は特徴付けがされているが、本発明の変異誘発法で生じる所望の表現型に相関することが判明していない遺伝子を、変異させることができる。このように、本発明は、それまで未知であるか、又は特徴付けが不完全な、多種の真核細胞中の遺伝子を特定、単離及び特徴付けする方法や、当該遺伝子が変異した場合の細胞表現型に及ぼす影響を調べることにより、このような遺伝子の表現型状の重要性を調べるための方法を提供するものである。
【０１５７】
またさらに、少なくとも１つの遺伝子が細胞中で変異する可能性を高めるために、各標的細胞中に複数の（１個の細胞当たり２つ以上）挿入変異原を持たせることも、可能である。このように、本発明の方法で作製される細胞には、一つ以上の組み込まれた挿入変異原を含めることができる。いくつかの実施態様では、標的細胞の各々が、１乃至１０個の挿入変異原、又は１０個以上の挿入変異原を含有するであろう。ある一個の細胞中、２つ以上の挿入変異原があると、所望の遺伝子に変異を持つ細胞や、所望の表現型を起こす遺伝子に変異を持つ細胞を特定するのにスクリーニングしなければならない細胞の総数を減らせるという利点がある。
【０１５８】
有用な挿入変異の数は、ホスト細胞のゲノム・サイズ、その多倍数性、遺伝子構造、遺伝子変異に関係する平均挿入領域（例えば遺伝子の大きさ）、所望のゲノム網羅量（例えば挿入変異させる遺伝子のパーセンテージ）、遺伝子への挿入変異源組込みの性向、及び、変異した場合に所望の表現型を産生できる遺伝子の数、に左右される。高等真核生物では、ゲノムは典型的には大型である。例えばマウス及びヒト細胞においては、その一倍体ゲノムは3×109塩基対（二倍体ゲノムでは６０億塩基対）であると推定されている。従って、106の挿入を行うと、 3,000個の塩基対当たり1回の挿入の変異誘発頻度となるであろう。平均的なヒト遺伝子がほぼ25,000塩基対であることを想定し、そして無作為な挿入を想定すると、3,000個の塩基対に1回の頻度で106箇所の挿入を行うとすると、平均して各遺伝子のコピー一つに少なくとも１回の変異が起きることになるであろう。実際、組込みが無作為でないことが判明すれば、より多く又は少ない数の挿入を生じさせることが必要かも知れない。例えば、遺伝子の大半を少なくとも一回、挿入変異させるには、107箇所以上の無作為な挿入を生じさせる必要がある場合がある。さらに、特定の状況又は特定の用途では、挿入を作る箇所を少なくした方が有用である。好適な実施態様では、少なくとも10,000回の挿入を含有する挿入ライブラリを作製する。大変好適な実施態様では、少なくとも100,000回の挿入を含有する挿入ライブラリを作製する。研究対象の細胞中で転写上活性となることができるような遺伝子での変異誘発に焦点を当てたい場合には、活性遺伝子（例えばレトロウィルス又はトランスポゾン）への挿入に偏りを示す挿入変異原を用いると、活性遺伝子がすべてノックアウトされた104乃至105個のメンバーのライブラリを作製することができる。
【０１５９】
ゲノム・サイズは多様であるため、ある複雑さのライブラリを作製するのに必要な挿入数を決定するための一般的な指針に依拠することが可能である。一般的な指針として、ホスト細胞ゲノムの1000乃至10,000個の塩基対当たりで１回の挿入を生じさせると便利である。ある実施態様では、ホストゲノムの30,000塩基対当たり１回の挿入を生じさせる。大変好適な実施態様では、当該挿入頻度を、ライブラリ中の１遺伝子当たり少なくとも１回の変異が生じるように調節する。これらは一般的な指針であり、他の挿入頻度も可能であって、当業者の認識するところであることを理解されたい。
【０１６０】
本挿入変異原が選択マーカ又はレポータ遺伝子を含有する実施態様では、選択マーカの発現について選択をかけることで、組込みについて細胞を選抜することができる。選択マーカを本挿入変異原上のプロモータから発現させる場合（例えば図１４を参照されたい）、組み込まれた挿入変異原を含有する細胞はすべて、回収すべきである。選択マーカを本挿入変異原上のプロモータから発現させず、標的DNA上の上流プロモータから発現させる場合は（例えば図２−６を参照されたい）、転写上活性な遺伝子に組み込まれた挿入変異原を含有する細胞を、それぞれ正又は負の選択マーカのいずれを用いているかに応じて、選択又は淘汰することができる。転写上活性な遺伝子への組込みが好ましいが、それはなぜなら、細胞を表現型に関してスクリーニングすることになる状況下では、転写上活性な遺伝子の変異は、転写上不活性な遺伝子の変異よりも表現型を生じる可能性が高いからである。代替的には、転写上活性な遺伝子を淘汰する方法が、転写上活性な遺伝子を挿入変異させた細胞を取り除いて他の遺伝子を研究できるようにするためには、有用であろう。例えば、変異した転写上活性な遺伝子を含有する細胞を除去した後で、細胞内の遺伝子発現変化を起こすような因子で細胞を処理すると、当業者であれば、以前はサイレントであったが活性となった遺伝子の変異により生じた表現型について、今やスクリーニングすることができる。選択的に応じてレポータ遺伝子を用いても、転写上活性な又はサイレントな遺伝子への組込みについて、スクリーニングすることができる。
【０１６１】
ライブラリの構築
２種類の変異誘発法を一個の細胞に対して行うことができる。次に当該細胞をスクリーニングして、特定の所望の遺伝子の変異を探したり、又は、一つ以上の遺伝子の変異で生じる所望の表現型を探したりすることができる。
【０１６２】
ある実施態様では、細胞の、一個の物理化学的変異クローンに対して、挿入変異誘発法を行う。例えば一個の物理化学的に変異させた細胞を増殖させ、挿入変異誘発法に用いることができる。これにより、両方の方法で変異誘発した細胞のライブラリができる。典型的には、哺乳動物細胞の場合、１乃至107個又はそれ以上の遺伝子トラップ挿入を、物理化学的に変異させたクローンのそれぞれに作る。遺伝子トラップ挿入は、本挿入変異原のゲノム組込みが、構成的もしくは条件的活性内因性遺伝子に作動的に連結した結果、この挿入変異原中のエキソン配列が、内因性遺伝子の転写産物に取り入れられる場合である。これらの遺伝子トラップ挿入の多くにより、挿入変異誘発された遺伝子の正常な機能が破壊されるであろう。いくつかの実施態様では、この範囲は変異クローン一個当たり102乃至104個の挿入であろう。いくつかの好適な実施態様では、各物理化学的変異クローンで生じる挿入変異体数は、104乃至106個の範囲、そしてしばしば104乃至105個の範囲である。ある実施態様では、挿入変異誘発後、その結果得られるライブラリをスクリーニングして、一個以上の挿入変異原の組込みを探すことができる。別の実施態様では、得られるライブラリをスクリーニングして、特定の遺伝子の変異を探したり、又は、目的の遺伝子の変異の結果生じる表現型を探したり、あるいは、それまで未知であったか、又は、それまで当該表現型との相関が知られていなかった遺伝子の変異の結果生じる表現型を探す。本発明のこれらの方法により作製される変異細胞をクローニングすることもできる。組合せの変異誘発から得られる表現型を示す変異細胞は、例えば、その後の更なる操作又は使用に向けて精製集団を作製するなどのために、クローニングすることができる。
【０１６３】
別の実施態様では、細胞の、２個以上の物理化学的変異クローンに対して、挿入変異誘発を行う。例えば、２個以上の物理化学的変異細胞を挿入変異誘発用に増殖させることができる。物理化学的変異クローンの数は、1個乃至106個又はそれ以上の範囲であってもよい。好適な実施態様では、本挿入変異体を作るのに用いる物理化学的変異クローンの数は、1乃至100,000個の間、そしてより好ましくは1乃至10,000個の間である。大変好適な実施態様では、本挿入変異体を作るのに用いる物理化学的変異クローンの数は、1乃至1000個の間である。有用な範囲には、約2個、5個、10個、25個、50個、100個、200個、400個、600個、及び800個のクローンが含まれる。物理化学的変異頻度を評価し、変異細胞の適した数を選択するための指針は、物理化学的変異誘発を解説した上の項で論じた。選択された数の物理化学的変異細胞を増殖させて、２つの方法で変異誘発させた細胞のライブラリを作製するために用いることができる。典型的には、哺乳動物細胞の場合、1乃至108個又はそれ以上の挿入を、存在する物理化学的変異クローンのそれぞれに生じさせる。好適な実施態様では、各物理化学的変異クローンに生じさせる挿入変異体の数は、104乃至106の範囲であり、そしてしばしば104乃至105の範囲である。例えば、限定はしないが、100個の物理化学的変異クローンを用いて一つのライブラリを作製する場合、クローン1個当たり104個の挿入を持つライブラリが、106個のクローンのライブラリの作製にあたってできるであろう（100個の物理化学的変異クローン×104個の挿入変異クローン）。ある実施態様では、挿入変異誘発後に、得られたライブラリをスクリーニングして、一個以上の挿入変異原の組込みを探すことができる。別の実施態様では、得られるライブラリをスクリーニングして、目的の遺伝子の変異を探したり、又は、目的の遺伝子の変異の結果生じる表現型を探したり、あるいは、それまで未知であったか、又は、それまで当該表現型との相関が知られていなかった遺伝子の変異の結果生じる表現型を探すことができる。本発明のこれらの方法により作製された変異細胞をクローンすることもできる。
【０１６４】
挿入変異誘発によりライブラリを作製し、このライブラリを、物理化学的変異誘発に用いることもできる。ある実施態様では、一個以上の細胞を、一個以上の挿入変異原の組込みにより、変異させる。典型的には、哺乳動物細胞の場合、本挿入変異原は1乃至107個又はそれ以上の細胞に挿入される。好適な実施態様では、本挿入変異原は104乃至106個の細胞、そしてしばしば104乃至105個の細胞に挿入される。次に、組み込まれた挿入変異原を含有する細胞を、物理化学的に変異させる。ある実施態様では、いずれの手法でも、物理化学的変異誘発の前に細胞を増殖させておく。好ましくは、50個乃至10,000個の遺伝子を、各物理化学的変異細胞で変異させるとよい。いくつかの実施態様では、約1,000個の遺伝子を、各標的細胞で変異させる。細胞の物理化学的変異／挿入変異させられたライブラリを作製したら、スクリーニングを行って、目的の遺伝子の変異を探したり、又は、目的の遺伝子の変異の結果生じる表現型を探したり、あるいは、それまで未知であったか、又は、それまで当該表現型との相関が知られていなかった遺伝子の変異の結果生じる表現型を探すことができる。本発明のこれらの方法により作製された変異細胞をクローニングすることもできる。
【０１６５】
ライブラリのスクリーニング
変異細胞のライブラリには、所望の遺伝子の変異を探すスクリーニングを行うことができる。遺伝子発現レベル又は遺伝子産物活性を検定したり、所望の遺伝子に特異的に関係する別の表現型を検定してもよいだろう。該検定を用いると、遺伝子発現もしくは機能が低下又は消失したり、あるいは遺伝子発現もしくは機能が増加又は回復した細胞を特定することができる。この実施態様でも、標識はやはり有用である。それを用いると、変異が所望の遺伝子にあるかを確認したり、あるいは、所望の遺伝子が、別の遺伝子での変異でのために適切でない発現をしているかどうかを確認することができる。標識は、感受性の充分な検定法がない場合に、変異細胞や、又は、細胞のクローンを、多数の細胞から単離する方法としても、有用であろう。
【０１６６】
所望の遺伝子を検出するのに有用な検定法の例には、限定はしないが、ELISA、ELISA スポット検定法、PCR (例えばrtPCR)、転写レポータ検定法、ウェスタン・ブロット、ノーザン・ブロット、サザン・ブロット、電気泳動度検定法、転写プロファイリング（例えば遺伝子チップを用いるなど）、酵素検定法（例えばプロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、及び他の公知の検定法）、リガンド結合検定法、及び蛍光活性化細胞ソーティング(FACS(R))及び磁気ビーズ細胞ソーティング法、がある。
【０１６７】
本発明により作製される変異細胞のライブラリをスクリーニングして、所望の表現型を探すこともできる。次に、所望の表現型を示すこの細胞を用いて、本変異原性ポリヌクレオチドが変異遺伝子の標識である標識を含むような表現型を担う一つ以上の変異遺伝子を特徴することができる。このアプローチは、例えば、細胞内又は生化学的プロセスで役割を果たす変異遺伝子を特定するために用いることができる。本発明のこのような方法により、限定はしないが、細胞増殖、細胞形質転換、細胞泳動、細胞分化、シグナル伝達、細胞形態、細胞輸送、タンパク質分解、アポトーシス、化学的抵抗、化学的感受性、炎症性応答、タンパク質の核内移行、タンパク質分泌、細胞活性化、遺伝子活性化、タンパク質発現、受容体活性化、及び転移を含め、遺伝子変異と関係があると思われる多種の細胞表現型変化を分析できよう。上記のリストも参照されたい。当業者であれば本発明で有用と認識されるような、数多くの他の検定法が当業で公知である。
【０１６８】
さらに本発明の方法は、細胞又は生物において条件的変異の存在をスクリーニングする際にも用いることができる。条件的変異により、ある表現型のスクリーニングを行う（しばしば遺伝子発現に依存する）まで、ある遺伝子の変異をサイレントにしておくことができる。このアプローチは、例えばある変異がホスト細胞にとって有毒であったり、成長遅滞又は無成長という表現型を生じたり、細胞を致死させたり、最終分化を誘導したり、あるいは細胞にとって有害であるような場合に、特に有効である。本発明に基づいて使用できると思われる、又は、本発明の方法により検出できると思われる、このような条件的変異の例には、限定はしないが、温度感受性変異（熱又は低温感受性変異）、ジメチルスルホキシドなどの化学物質に対する感受性、in vitro又はin vivoでの部位特異的組換え、 翻訳読み過ごし等、がある。
【０１６９】
変異細胞の使用
所望の表現型を持つ細胞を特定したら、当該タンパク質又はmRNAの上に存在する標識や、以下に論じるように、本挿入変異原のゲノム組込み部位を分析することにより、変異した遺伝子を特定することができる。標識された遺伝子を単離する方法には、限定はしないが、5' RACE、逆PCR法、及びcDNAライブラリ構築及びハイブリダイゼーション、がある。変異した、又は活性化した遺伝子をクローニングする方法は当業で公知である (例えば Harrington et al.の１９９９年３月２６日提出の米国特許出願第 09/276,820号； Zambrowicz et al.の米国特許第6,080,576号；Sands et al.の米国特許第6,136,566号；Niwa et al., J. Biochem. 113:343-349 (1993); Yoshida et al., Transgenic Research 4:277-287 (1995); Baker et al., Dev.  Biol. 185:201-214 (1997)を参照されたい；本変異原性ポリヌクレオチドによって変異した遺伝子を特定する方法の教示のために、それぞれ引用をもってここに援用することとする)。
【０１７０】
さらに本発明は、多種の疾患及び身体的異常を診断、治療又は防止する際に使用する新規な薬物及び薬物ターゲットを発見するためにも、用いることができる。例えば、目的の変異遺伝子を含有するcDNA分子及びゲノム断片を用いると、in vitro又は細胞もしくは動物で遺伝子産物を産生させたり、薬物をスクリーニングしたり、目的の遺伝子型又は表現型に関係する新規な診断法又は検定法を開発したり、あるいは、治療用途用のタンパク質を発現させることができる（例えば、ある遺伝子が、ある状態を治療するために患者に投与することのできる、エリスロポエチンなどのタンパク質をコードしているかも知れない）。当該変異遺伝子又は遺伝子産物を用いても、対応する野生型遺伝子又は遺伝子産物を特定することができる。該野生型遺伝子を用いて、野生型遺伝子産物をin vitro又は細胞もしくは動物で産生させたり、薬物をスクリーニングしたり、目的の遺伝子型又は表現型に関係する新規な診断法もしくは検定法を開発したり、あるいは、治療用途用のタンパク質を発現させることができる（例えば、ある遺伝子が、ある状態を治療するために患者に投与することのできる、エリスロポエチンなどのタンパク質をコードしているかも知れない）。
【０１７１】
本発明を用いて作製された変異細胞を薬物スクリーニングに用いることができる。例えば、治療上関係する遺伝子型又は表現型を示す変異細胞を、変異細胞のライブラリから単離することができる。単離した変異細胞を検査化合物に暴露すると、目的の遺伝子型又は表現型を阻害、さらに刺激、又は調節する化合物を同定することができる。このプロセスを行うと、薬物及び／又は薬物リードを同定することができる。薬物スクリーニングに関係する表現型の例には、限定はしないが、アポトーシス、細胞増殖、化学的感受性、化学療法耐性、細胞移動、細胞活性化（例えばＴ細胞活性化）、細胞形質転換、転移、細胞分化、シグナル伝達、転写活性化、タンパク質発現、タンパク質分解、タンパク質分泌、及び、当業者には容易に明白であろう、当業で公知の他の表現型、がある。
【０１７２】
本発明に基づいて調製された変異細胞は、製造目的又は他の商業目的でも、用いることができる。例えば、高い成長率、高いタンパク質発現レベル、高レベルのタンパク質分泌、発現タンパク質の至適化された翻訳後修飾、無血清又は他の定義されたもしくは安価な培地での成長能等を示す、本発明の細胞は、例えばタンパク質、食品、飲料、治療薬等の製造などにおいて、商業上の用途で利便性を提供する。
【０１７３】
本発明の方法に基づいて調製された変異細胞は、in vivoで遺伝子機能を研究するためにも、用いることができる。ある実施態様では、本発明で変異させた細胞を、養子移入により動物に導入する。その後、この動物で所望の表現型を示す細胞を回収し、単離することができる。代替的には、培養において所望の表現型を示す変異細胞を、養子移入により動物に導入して、この細胞のin vivo表現型を研究することもできる。in vivo検定の例には、限定はしないが、腫瘍形成、転移、移植片対宿主疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、欠損又は非機能的細胞種の再構築（例えば骨髄移植）、細胞分化、及び、当業で公知の他の検定法、がある。養子移入により動物に細胞を導入する方法は当業で公知である（例えばRoth et al., J Exp Biol. 200:2057-2062 (1997); Mosier Adv Immunol. 50:303-325 (1991); Mule et al., J. Immunother. 12:196-198 (1992)を参照されたい；養子移入の方法及び用途の教示のために、それぞれ引用をもってここに援用することとする）。選択的には、変異遺伝子を変異細胞から特定することができる。
【０１７４】
別の実施態様では、変異細胞（例えば体細胞又は生殖細胞、胚性幹細胞又は成体多能幹細胞）を用いて、トランスジェニック動物を作製することができる。胚性幹細胞からトランスジェニック動物を作製する方法は当業で公知である（例えばJackson and Abbott (2000) Mouse Genetics and Transgenics, Oxford University Press, pgs. 266-284; and Hogan, Beddington, Costantim, and Lacy (1994) Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, all pages; Joyner, Bioessays 13:649-656 (1991)を参照されたい；幹細胞からトランスジェニック動物を作製する方法を教示するために、それぞれ引用をもってここに援用することとする)。同様に、体細胞又は生殖細胞からトランスジェニック動物を作成する方法も当業で公知である（例えば、すべて、変異した又は遺伝子操作された体細胞又は生殖細胞からのトランスジェニック動物の作製法を教示するために、引用をもって全文をここに援用することとする米国特許第5,322,775号、第5,366,894号、第5,476,995号、第5,650,503号及び第5,861,299号を参照されたい)。このような方法の一つが核移入クローニング法であり、この方法では、ドナーの体細胞の核を、遺伝子改変（例えば本発明の変異法を用いるなどして）した後、核をドナー細胞から取り出し、レシピエント細胞（好ましくは卵母細胞）内に入れて、ドナーの核由来の遺伝子改変を含有するトランスジェニック動物を作製する。このプロセスは当業で公知であり、当業者の熟知するところであろう（例えば Campbell et al., Nature 380:64-66 (1996); Cibelli et al., Nature Biotech. 16:620-621 (1998); McCreath et al., Nature 405:1066-1069 (2000); Hochedlinger et al., Nature 415:1035-1038 (2002); Schnieke et al., Science 278:2130-2133 (1997); Kasinathan et al., Nature Biotech. 19:1176-1178 (2001); Wolf et al., Arch. Med. Res. 32:609-613 (2001)を参照されたい；すべての開示を、その全文を引用をもってここに援用することとする）。
【０１７５】
ある実施態様では、特定の変異遺伝子に関係する挿入変異原を含有するトランスジェニック動物を、例えば精子細胞をin vivoで物理化学的もしくは挿入的に変異させたり、又は、卵母細胞をin vitro又はin vivo（例えば一個以上のレンチウィルス・ベクタ）で物理化学的又は挿入的に変異させ、この変異卵母細胞を変異精子細胞と受精させてホモ接合型の変異接合子を作るなどにより、調製することができる。その後、この接合子をレシピエントのメスに移植し、産期に至らせ、一つ以上の変異がホモ接合型になったトランスジェニック動物を作製することができる。トランスジェニック動物を作製する他の方法は当業で公知であり、当業者の熟知するところであろう（例えば、すべての開示を、その全文を引用をもってここに援用することとするWO 90/05188; Hammer, R.E., et al., J. Animal Sci. 63:269-278 (1986); Pursel, V.G., et al., J. Reprod.  Fert. Suppl. 40:235-245 (1995); Houdebine, L.-M., J. Biotechnol. 34:269-287 (1994); Hammer, R.E., et al., Nature 315:680-683 (1985); Mortensen, R.M., et al., Mol. Cell. Biol. 13:2391-2395 (1992); Deng, C., et al. , Cell 82:675-684 (1995); and Murakami, T., et al., Devel. Gen. 10:393-401 (1989)を参照されたい)。
【０１７６】
トランスジェニック動物はあらゆる真核生物で作製できる。好適な実施態様では、該トランスジェニック生物はハエ、蠕虫、魚、又は哺乳動物である。大変好適な実施態様では、該生物はヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、トリ、ゼブラフィッシュ、シー・エレガンス、又はドゥロソフィラである。本トランスジェニック動物を用いて、目的の表現型を探したり、又は、個々の遺伝子の機能を研究する遺伝子スクリーニングを行うために用いることができる。表現型の例には、限定はしないが、重さ、高さ／長さ、器官の組織構造、器官の機能、免疫適格性、血液の化学的性質（例えばコレステロール・レベル等）、骨密度及び構造、肉眼的形態、及び行動、がある。更なる表現型上のスクリーンが当業で公知であり、本発明で有用である（例えばNolan et al., Nature Genetics 25:440-443 (2000)を参照されたい；表現型上のスクリーンの教示のために、引用をもってここに援用することとする）。
【０１７７】
別の実施態様では、多細胞生物を、in vivo変異誘発法で直接変異させることができる。動物は、in vitroで変異させた細胞から生じさせることができる。変異誘発は物理化学的でも、又は挿入によるものでもよい。当該細胞は幹細胞（胚性又は成体）、体細胞、又は生殖細胞であってもよい。このようにして動物に導入する変異は、ある生物中、又は、ある生物の細胞中で表現型を生じさせるにはホモ接合型の変異が必要であるような遺伝子においても、ヘテロ接合型であってもよいであろう。ホモ接合型の変異を生じるように当該生物を直接変異誘発することができる。当該表現型を担う遺伝子は、当該動物を作製するのに用いた細胞中で、又は、インタクト動物で挿入変異誘発した細胞中で、標識により、特定することができる。導入される変異は、ある生物中、又は、ある生物の細胞中で、表現型を生じるにはすべて必要であるような一組の変異（即ち、２つ以上の異なる遺伝子の変異）の一部であってもよい。この生物を、その他の必要な変異を生じるように直接変異誘発することもできる。
【０１７８】
代替的には、本発明の方法に従って、トランスジェニック植物を作製することもできる。このような方法では、植物細胞中で、一つ以上、又は適宜２つ以上、の遺伝子又はアレルを、本発明の方法に従って変異させる。次に、トランスジェニック植物を、この変異させたゲノムDNAを用いて、例えば核移入、形質転換又はプロトプラスト融合など、当業で公知の植物遺伝子操作技術に従って調製できよう（Hall, Robert D., Plant Cell Culture Protocols, Humana Press, New Jersey (1999); Gartland and Davey, Agrobacterium Protocols, Humana Press, New Jersey (1995); Kosuge et al., Gen. Eng. of Plants 26:5-25 (1983); Rogers et al., in: Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, CA (1988)を参照されたい)。このような技術は広く用いられており（例えば Chaleff, R.S., Genetics of Higher Plants: Applications of Cell Culture, Cambridge: Cambridge University Press (1981)を参照されたい)、新たに挿入される外来遺伝子が、植物の再生において安定に維持されることが示されており、典型的なメンデルの形質として後代に伝播される (Horsch et al., Science 223:496 (1984), and DeBlock et al., EMBO 3:1681 (1984))。これらの外来の遺伝子はそれらの正常な組織特異的及び発生上の発現パターンを保持する。数多くの双子葉植物種(Barton et al., Cell 32:1033(1983); Chang et al., Planta 5:551-558 (1994)) 及び単子葉植物、例えばユリ科及びヒガンバナ科の植物など(Hooykaas-Van Slogteren et al., Nature 311:763-764 (1984))や、カシュウイモ（Dioscorea bulbifera (yam)） (Schafer et al., Nature 327:529-532 (1987))を含め、アグロバクテリウム−ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）媒介形質転換系も、遺伝物質の移入にとって効率的であることが立証されている。
【０１７９】
条件的変異の特定
特定の実験的に制御された条件を与えた後でのみ、表現型を生じるような条件的変異も、本出願で解説した手法を用いて作り出すことができる。これらの条件的変異は、遺伝子機能のより詳細な調査を可能にし、条件的変異遺伝子産物の機能のタイミング及び程度を精確に制御するという固有の能力の結果として可能となる幅広い表現型を入手可能にするという点で、有用であろう。条件的変異の例には、それぞれ低温又は高温条件下でのみ、変異遺伝子機能の喪失を示すと共に、その結果として変異表現型を発現させる低温又は高温感受性変異細胞又は生物の作製（参考文献１−６）や、あるいは、変異アレルの変化した機能を現すのに、DMSOへの暴露などに左右される化学的に不安定なアレルの作製（参考文献７）、がある。
【０１８０】
上で解説した例は、細胞又は生物の環境変化を条件とするアレルを特定するものである。変異細胞に固有の変化を条件とする他のアレルも、特定することができる。この実施態様では、細胞又は生物の成分の活性に、実験的に制御された変化があると、条件的変異遺伝子産物の機能が変化するようにしてもよく、このような変異遺伝子機能の調節に、変異表現型の出現も調節する役目をさせてもよいであろう。例えば、Hsp90及び他のシャペロニンタンパクが、変異の結果、不安定化配列変化を含有するようなタンパク質を含め、数多くの限界的に安定なタンパク質の活性コンホメーションを維持するのに必要であることが示されている（参考文献８−１１）。誘導性プロモータの調節下のみでHsp90を発現するように細胞を操作する（例えばテトラサイクリン、エクジソン、又はHsp90遺伝子発現を制御する他の誘導性プロモータ系を用いるなどして）か、又は、細胞をHsp90機能を妨げる化学物質で処理すると、多くの変異タンパク質が不安定化させられているような細胞が生じ、機能喪失というこれらの表現型は、Hsp90活性を実験的制御操作すれば明らかとなるであろう（参考文献８−１１）。このように、変異表現型の発現は、Hsp90又は他のシャペロニン活性の、実験的に誘導された低下に依存したものになるであろう。さらに、細胞の唯一のHsp90タンパク質が、ステロイドホルモン結合（又は他の調節）ドメインがHspタンパク質に融合されたものから成る融合タンパク質として発現されるような細胞を作製するなどによっても、Hsp90活性を操作できよう。このような調節ドメイン−シャペロニン融合タンパク質は、適したステロイドホルモン（又は他の調節性リガンド；参考文献１２−１５）に結合した場合にのみ、シャペロン活性を示し、条件的変異及び表現型は、これらの細胞中での調節性リガンドの濃度に依存するであろう。1:  Tasaka SE, Suzuki DT. Genetics. 1973 Jul;74(3):509-20; 2:  Suzuki DT. Science. 1970 Nov 13;170(959):695-706; 3:  Suzuki DT, Piternick LK, Hayashi S, Tarasoff M, Baillie D, Erasmus U. Proc Natl Acad Sci U S A. 1967 Apr;57(4):907-12; 4:  Pringle JR. Methods Cell Biol. 1975;12:233-72; 5:  Basilico C. Adv Cancer Res. 1977;24:223-66; 6:  Meiss HK, Talavera A, Nishimoto T. Somatic Cell Genet. 1978 Jan;4(1):125-30; 7:  Poloni D, Simanis V. FEBS Lett. 2002 Jan 30;511(1-3):85-9; 8:  Morimoto RI, Kline MP, Bimston DN, Cotto JJ. Biochem. 1997 32: 17-29; 9:  Jakob U, Lilie H, Meyer I, Buchner J.  J. Biol. Chem. 1995 270:7288-94; 10:  Rutherford SL, Lindquist S. Nature. 1998 Nov 26;396(6709):336-42; 11:  Queitsch C, Sangster TA, Lindquist S. Nature. 2002 Jun 6;417(6889):618-24; 12:  Angrand PO, Woodroofe CP, Buchholz F, Stewart AF. Nucleic Acids Res. 1998 Jul 1;26(13):3263-9; 13:  Tada M, O'Reilly MA, Smith JC. Development. 1997 Jun;124(11):2225-34; 14:  Takebayashi H, Oida H, Fujisawa K, Yamaguchi M, Hikida T, Fukumoto M, Narumiya S, Kakizuka A. Cancer Res. 1996 Sep 15;56(18):4164-70; 15:  Metzger D, Clifford J, Chiba H, Chambon P. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Jul 18;92(15):6991-5。
【０１８１】
当業者であれば、ここで解説する方法、組成物及び用途に対する他の適した変更及び適応法が、当業者に公知の情報を鑑みつつ、ここに含まれた本発明の解説から容易に明白であると共に、本発明の範囲又はそのいずれかの実施態様から逸脱することなく、実施可能であることは理解されよう。以上、本発明を詳細に説明したところで、同事項は、以下の実施例を参照されるとより明確に理解されるであろう。同実施例は描写のみを目的としてここに含められたのであり、本発明を限定することは意図していない。
【０１８２】
実施例
実施例１：    胚性幹細胞の組合せ変異誘発：
胚性幹細胞（RI） (Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8424-8428 (1990)) を、7.5%のCO2を含んだ加湿したインキュベータに入れたフィーダ細胞又はゼラチンで被覆したプレート上で37ECで培養する。この細胞を、D-MEM/15% FBS/0.1 mM β-メルカプトエタノール/白血病阻害因子 (1000 U/ml)／非必須アミノ酸中で培養する。この細胞を80%コンフルエントになるまで成長させる。それぞれ4×106個の細胞を含有する10枚のプレートに、O6-ベンジルグアニン（O6-BG）をDMSOで希釈してから培地に10μM最終濃度になるように加える。別の10枚のプレートにはO6-BGを加えない。１２乃至１６時間のインキュベーション後、各プレートの細胞をトリプシン処理し、5×106細胞/mlに希釈し、多様な濃度のENUと一緒に１又は２時間、インキュベートする。ENU濃度は0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.35 mg/ml、及び0.4 mg/mlである。ENU処理中、O6-BGで前処理される細胞をO6-BGと一緒にインキュベートした。処理後、各ENU処理した細胞を洗浄し、トリプシン処理して凝集体を解離させ、計数し、複式にしてゼラチンで被覆した組織培養プレートに、一枚のプレート当たり100、1000、10,000、及び100,000個の細胞をプレートし、上述の標準的な条件下で成長させる。O6-BG処理した細胞をO6-BG (10μM) の存在下で２４時間、成長させ、次に標準的な培地で成長させる。１０日後にコロニを計数する。複式のプレートに6-チオグアニン(6-TG)を、プレート後４８時間目に加えて、HPRT-ヌル変異のものを選抜することで、各処理条件で生じる変異頻度を判定する。6-TG耐性コロニの数を、複式（非-6TG選抜）プレート上に存在するコロニの数で除算すると、ある一個の遺伝子コピーに関する変異頻度を決定できる。
【０１８３】
本発明の方法の一実施例においては、約1000個のクローンを含有するプレートを、1000個中1個の変異頻度を生じるENU/O6-BG処理条件から選抜する。細胞を上述の標準的培養条件下で5×109個の細胞（50%コンフルエント）になるまで増殖させる。次に細胞を洗浄し、MOI=1のpKO-1レトロウィルスベクタと一緒に２４時間、インキュベートする。pKO-1の構造を図３Ｂに示す。２４時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地に10%コンフルエントになるように複式にして再プレートする。複式ライブラリの一方は、40-50%コンフルエントになるように成長させ、G418選抜 (250μg/ml)にかける。他方の複式ライブラリをコンフルエントになるまで成長させ、トリプシン処理し、90%FBS/10%DMSO中107個の細胞/mlで凍結させ、液体窒素中に保存する。G-418選抜下で成長させた細胞を、再プレートなしで、数回培地を取り替えながら１０乃至１２日間成長させる。G418耐性クローンを計数し、トリプシン処理し、増殖させる。その後、このライブラリを液体窒素中で保存するか、又は、表現型スクリーニングに用いることができる。
【０１８４】
実施例２：  Jurkat細胞の組合せ変異誘発：
Jurkat細胞においてFasL-誘導性アポトーシスに対する耐性を起こす遺伝子ノックアウトを特定するための細胞スクリーニング
別々の変異誘発技術を組み合わせて表現型を効率的に生じさせると同時に、これらの表現型を起こす遺伝子変異を簡単に特定できるようにすることにより、哺乳動物細胞株での遺伝子機能の発見を迅速に行うために、本出願で解説する組合せ変異誘発技術を開発した。組合せ変異誘発法では、多様な変異誘発アプローチの強みを組み合わせることで、個々の遺伝子誘発技術のそれぞれ個別の欠点を補償しようとする。ここで解説する組合せ変異誘発法の実施例では、細胞ベースの遺伝子機能を特定するために以下の順序のステップを用いる（図１に示す）：
＊  培養細胞中の高密度ENU変異誘発；ほぼすべての遺伝子に変異を含有する細胞の小型のライブラリを作製する。
＊  当該表現型をもはや示していないENU変異誘発クローンのみを、更なる遺伝子トラップ変異誘発に向けて選抜する。
＊  選抜されたENUクローンの遺伝子トラップ変異誘発
＊  今や当該表現型を示すようになった遺伝子トラップ変異誘発クローンを選抜する。
＊  当該遺伝子トラップをCre-媒介性除去すると、当該表現型が野生型に復帰することを確認する検査をする。
＊  Cre可逆性遺伝子トラップクローン中で挿入変異した遺伝子を配列決定する。
＊  特定の遺伝子ノックアウトがあれば表現型を付与するのに充分かどうかをsiRNA で確認する。
【０１８５】
表現型の効率的な獲得や、変異遺伝子の特定は、化学的変異誘発法の高い効率を、遺伝子トラップ挿入変異原が変異遺伝子の特定のための配列タグとなるという能力に組み合わせることで、可能となる（図１５）。化学的変異原は、哺乳動物細胞において高密度で変異を起こさせるために効率の高い手段であり、すべての遺伝子で変異を含有するライブラリのサイズは、50個細胞未満にすることができる。しかしながら、これらの化学的変異細胞株で特定の表現型を生じるアレルを特定することは、大変難しい。対照的に、遺伝子トラップ・ベクタによる変異誘発は効率はずっと低いが、これらの遺伝子トラップ変異原は、変異誘発させた遺伝子と、当該挿入変異原中の配列との間の物理的なつながりを利用して、ある表現型を担う遺伝子を簡単に特定できるという点で、補うものがある。組合せ変異誘発により生じた表現型を示す細胞は、少なくとも１つの化学的に誘導された変異と、少なくとも１つの遺伝子トラップ変異とを持つが、これらの相互間の相互作用が、当該細胞表現型を生じるのに必要なのである（図１５）。
【０１８６】
組合せ変異誘発技術を検査するために、１）高密度化学的変異誘発プロトコルを確立し、２）効果的かつ可逆的な遺伝子トラップレトロウィルスを構築し、３）これらの試薬で組合せ変異誘発変異誘発ライブラリを作製し、そして４）このライブラリの原理証明スクリーニングを行って、組合せ変異誘発の結果Fas誘導性アポトーシスに対する耐性を獲得した細胞を特定する、必要があった。組合せ変異誘発法の開発及び検査を以下に解説する。
【０１８７】
ある表現型を生じさせることのできるすべての遺伝子変異を特定するには、可能な限り少ない数の細胞で多数の変異を生じさせる必要があるが、この役目には効率の高いENU化学的変異誘発が向いている。我々は、すべての遺伝子が少なくとも１回（１×ノックアウトのライブラリと定義して）変異しているような50乃至100個の細胞のライブラリをJurkat細胞で作るのに必要なENU処理を決定しようと試みた。我々は、変異誘発を特徴付けるために、至適ENU処理を特徴付ける際に細胞生存率及び変異率の両方を測定した（表Ｉ）。生存率は限界希釈により判定され、変異率は、生存クローンの集団中で、単一コピーのHPRT遺伝子のノックアウトの頻度（6-チオグアニンの存在下で培養したこのようなHPRT細胞の生存率で検定）に基づいて算定された。下の表に示すように、ENU用量が0.2mg/mlのときには変異率は 0.02 HPRT- 遺伝子／細胞であり、従って1×libraryサイズは〜５０細胞である。これら密に変異誘発された細胞のライブラリを作製すると、変異誘発を小幅に増やしていくだけで、ENU変異遺伝子の残りの野生型アレルをノックアウトすることにより数々の表現型が生じるような、遺伝子的に感受性を持たせたバックグラウンドを提供できる。
【０１８８】
【表１】
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【０１８９】
*  「1×ライブラリ・サイズ」とは、変異を含有するのに必要なENU処理済みクローンの数を言う。化学的変異誘発プロトコル：
Jurkat細胞を、10μMの O-6-BG (シグマ社) で5×10＾5細胞/mlで１６時間、３７℃で、5%CO2を入れた加湿したインキュベータで処理した。次に、前処理されたこの細胞を所望の濃度のENU（シグマ社）と一緒に、O-6-BGの存在下で２時間、３７℃で一定に振とうしながらインキュベートした。このインキュベートの終了時に細胞を10容量の1×PBSで３回、洗浄し、10uM のO-6-BGを加えた完全培地中に再懸濁させた。 ２４時間後に O-6-BGを洗い落とし、細胞を完全培地中に再懸濁させ、96ウェル・プレートに１ウェル当たり20個の細胞又は１ウェル当たり400乃至2000個の細胞になるように接種した。その後細胞を１０日間培養した。生存率は、成長中のコロニを含有するウェル数に基づき、低い方の密度の接種により判定する。変異頻度を判定するために、高い密度で接種した細胞を用いて、Hprt機能消失変異体を、40uM の6-TG (シグマ社)の存在下で選抜した。6-TGの存在下で成長中のコロニを含有するウェルの数を７乃至１０日後に採点した。変異頻度は、6-TG耐性コロニの数を、接種した生存細胞の数で除算したものと計算されている。
【０１９０】
同様に、変異ライブラリを、上のプロトコルＡに従ってJurkat細胞を0.7mg/mlのEMS（シグマ社）で処理して作製した。1×ライブラリサイズは、この条件下では約100個の細胞を含有した。
【０１９１】
ENU変異誘発Jurkat細胞の核型：
いくつかの好適な実施態様では、変異を行わせる細胞はニ倍体である。従って我々は、ギームザ染色法でJurkat細胞及びENU変異誘発Jurkat細胞の染色体数を判定した。ENU変異誘発Jurkat細胞の最高75%がニ倍体又は低ニ倍体である。これは野生型Jurkat細胞に匹敵する。次に、遺伝子トラップ変異誘発用のENUライブラリを調製するために、生存するJurkatクローンを検査して、これらがFasL誘導性アポトーシスに、0.2mg/mlのENU変異誘発法後でも感受性のままでいるかを確認した。次に、これらのFas感受性クローンのうちの100個を、遺伝子トラップ変異誘発のターゲットとして選び出した。この練習では、我々が、各細胞中の遺伝子の1乃至3%のコピー一つにノックアウトを含有しても、目的の表現型を示さない細胞の、密に変異誘発したライブラリを作製できることを実証する。表現型を欠く密な変異誘発をこのように組み合わせると、単一の遺伝子トラップ・ノックアウトを行うだけで、表現型を決定する遺伝子の残りの野生型コピーも破壊されて一表現型を生じ得るような遺伝子バックグラウンドを持つ細胞の小型で追跡可能なライブラリができあがるために、重要である。
【０１９２】
効率的な遺伝子トラップ・ベクタの作製が、組合せ変異誘発機能発見の次の段階で、挿入ノックアウト変異原として、そして挿入変異した遺伝子の標識として役立てるために、必要だった。この目的のために作製された遺伝子トラップ・レトロウィルス・ベクタpDKO2のデザインを下に示す（図１６）。このベクタは、ベクタ中のスプライス受容側配列の機能を用いて転写活性遺伝子をトラップするようにデザインされる。ベクタをある遺伝子内に組み込む場合、トラップされた内因性遺伝子中のエキソン末端に存在するスプライス供与側配列から、ベクタにより提供されるスプライス受容側配列へと、スプライシングが起きる。このスプライシングが起きると、融合転写産物が作製され、その結果、ベクタにコードされた停止コドンが導入されて、トラップされた遺伝子のタンパク質産物の末端が早く来てしまうこととなる。該融合転写産物の下流IRES (内部リボゾーム侵入部位）活性により、該融合転写産物の翻訳の再開が可能であり、この翻訳により、選択可能な薬物耐性タンパク質が発現する。薬物耐性の発現により選抜が可能となって、転写上活性な遺伝子のトラッピングを特定することができる。LoxシグナルがpDKO2の遺伝子トラップ部分をフランクし、これらのlox部位のCre媒介性組換えの結果、pDKO2遺伝子トラップ及びノックアウト機能が欠失する。この欠失により、挿入変異誘発に依存する表現型が復帰し、生物学的に活性な遺伝子トラップの特定に役立つはずである。
【０１９３】
pDKO2の多様な成分の機能を別々に検査して、活性を以下のように確認した：
＊  IRES：  このIRESは翻訳を再開させる働きをすることを確認し、それがpDKO2ではプロモータ活性を持たないことを示した。
＊  TK: TKが発現すると、ガンシクロビル含有培地で細胞死が起きることが示された。
＊  Cre/lox: cre発現プラスミドを、pDKO2が組み込まれた細胞にトランスフェクトすると、細胞の最高80%で切り出し事象が起きた。
＊  S/A--x--IRES--DR--bGHpA：pDKO2の遺伝子トラップ部分をJurkat細胞に導入した後、薬物耐性（Jurkatの場合、ネオマイシン1.5mg/ml）で選抜し、薬物耐性クローンを採集し、薬物耐性の出現を、内因性転写産物のpDKO2スプライス受容側配列へのスプライシングに、すべての場合でRT-PCRで調べて、関連づけた。
【０１９４】
pDKO2をRetroPack PT67細胞（クロンテック社）に、Exgen500 (MBI ファーメンタス社)を介してトランスフェクトすることで生じるpDKO2レトロウィルス・ベクタの作製。個々の安定なコロニを摘みだし、高力価を産生しているものを選抜した。高力価のウィルス・スープを回収し、スピン−感染プロトコルに従ったJurkat細胞の感染に用いた。簡単に説明すると、3×106個のJurkat細胞を、2mlの完全培地に1mlのウィルス・スープ及びポリブレン8ug/ml加えたものの中に再懸濁させた。我々は1000gで１時間、スピン感染させた。その後細胞を３２℃のインキュベータ内に一晩置いた後、３７℃で２４時間、インキュベートして、レトロウィルスの組込み及び発現を行わせた。力価を限界希釈で判定すると、1ml当たり1乃至3×104であることが判明した。
【０１９５】
このベクタの遺伝子トラップ効率を評価するために、我々は遺伝子トラップ事象の頻度を、RT-PCRによりいくつかの公知の遺伝子について検定した。２対の入れ子状遺伝子特異的プライマ（DHFR、HPRT、FasR、及びCasp8に特異的）をこの分析に用い、その結果得られたRT-PCR産物を配列決定して、遺伝子トラップの種類を確認した。すべて、内因性遺伝子由来の上流のエキソンが適性にpDKO2のスプライス受容側配列にスプライスされた真の遺伝子トラップ事象であることが確認された。大半の場合で、pDKO2は、トラップされた遺伝子の5'末端近傍のイントロン内に組み込まれたことが判明した。下に示すデータは、一個のアレルをトラップするための1×ライブラリ・サイズは〜2×10∧4クローンであることを示す。この数のクローンを作製することは容易であり、この効率により、pDKO2を用いて、上述のFas感受性ENUクローンのそれぞれでゲノム・ワイドな遺伝子トラップノックアウト・ライブラリを作製することが可能となる。
【０１９６】
遺伝子トラップ頻度：
【０１９７】
【表２】
2005532782.tif 000003
【０１９８】
トラップされた遺伝子の特徴付け：
【０１９９】
【表３】
2005532782.tif 000004
【０２００】
75,000個のクローンの場合
(2+3+3+9)/(1+2+2+2)=1アレル当たり2.4 のヒット
２倍体遺伝子の場合：75,000個のクローン当たり4.8のヒット
検定する遺伝子の平均サイズ：(40+30+26+55)/4=38kb 
28kbの平均遺伝子サイズの場合、1×ライブラリ・サイズ：2×10∧4
【０２０１】
次のステップは、これらの要素を組み合わせて、遺伝子機能を特定するための組合せ遺伝子誘発スクリーニングを実施することである。ENU Jurkatライブラリから採ったクローンを、pDKO2遺伝子トラップ・レトロウィルスに感染させて、Jurkat細胞による組合せ変異誘発ノックアウト・ライブラリを作製した（図１７）。検査してFas誘導性アポトーシスへの感受性に変化がないことを確認してある100個のENU変異誘発Jurkatクローン（ENU変異原に関して2×ゲノム網羅率）をこのpDKO2レトロウィルス感染に選び、〜10∧4個の薬物耐性クローン (pDKO2変異原に関して0.5×ゲノム網羅率)を、各ENUクローンについて得た。従って、最終的な組合せ変異誘発ライブラリは、最高100万個のクローンから成り、この数はこれらの細胞での可能なヒト遺伝子破壊の範囲の〜1×網羅率を現す。この網羅率はJurkat細胞でFasL誘導性アポトーシスを減少させる変異の大半（しかし全てではない）を特定するためには充分である。上記の条件下では、自発的なFas耐性率は2乃至3×10∧6で最高1である。
【０２０２】
変異スクリーニング：
ENUクローンをまず、FasAb感受性について検査した。Fas感受性クローンのみをスクリーニング対象に進めた。100個の ENUクローン（0.2mg/ml ENU処理で得たもの、表A.1）を増殖させて（~2×ライブラリ網羅率）、１個のクローン当たり5乃至10×106個の細胞にした。各ENUクローンにpDKO2-neo レトロウィルスを感染させて、一個の遺伝子の一アレルが、pDKO2ベクタで変異させられている可能性のある細胞プールを作製した。約104個の薬物耐性クローンを各ENUクローンについて得たが、これは遺伝子トラップ事象については約0.5×のライブラリ網羅率である。感染直後に細胞を複式Ａ及びＢに分け、ネオマイシン含有培地で１０乃至１２日間成長させて、ネオマイシン耐性クローンを選抜すると共に、当該遺伝子の変異前に産生された内因性野生型タンパク質を枯渇させた。各プールＡ又はＢから0.5乃至1×106細胞（クローン1個当たり100乃至200個の細胞）を、C1のプロトコルに従ってFasスクリーニングに向けて取り出した。Fas処理後の最初の２乃至３週間、細胞を増殖させて、Fas耐性クローンを特定した。
【０２０３】
Fas耐性クローンにアネキシンＶ染色法（モラキュラー・プローブ社）及びカスパーゼ3活性検定（インタージェン社）による再検査を行った(Ref: Blood 84, 1415, 1994; J. Biol. Chem. 273, 32608-32613, 1998)。これら２つの検定に基づき、最高70%のクローンで、Fas耐性表現型が確認される。この耐性表現型がpDKO2ベクタのゲノムへの挿入を原因とするものかを判定するために、cre発現プラスミドを各クローンにトランスフェクトし、ガンシクロビル選択して、切り出し事象があったものを選抜した。次にクローンを表現型の復帰について分析して、トラップされた遺伝子がこの表現型を担っていることを実証した。
【０２０４】
FasL誘導性アポトーシスはJurkat細胞でよく研究されており、この経路のモジュレータは、癌、脳卒中、及び他の疾患プロセスで臨床上関連している可能性がある。これまでの遺伝学的及び生化学的分析により、数多くのシステム及び研究期間が、FasL誘導性アポトーシスの惹起に関与する基本的なシグナル伝達経路を立証している（図１８）。我々は、公知のFasシグナル伝達経路（図１８）のメンバーのうちのいくつかの組合せ変異誘発遺伝子トラップ・ノックアウトが、このスクリーニングの結果の一つとして特定されると予測している。さらに、新規な遺伝子のノックアウトは、アポトーシスを調節する上で重要なこれまで未知の因子を明らかにする可能性があり、これらの新規な調節遺伝子は、治療的介入にとって潜在的な新しいターゲットとして大きな関心事である。
【０２０５】
FasLに対する感受性に影響する遺伝子トラップを特定するために、二重変異誘発した、組合せ変異誘発ライブラリから、Fas誘導性アポトーシスに対する耐性を示したクローンを選抜した。このFasL選抜条件下では、耐性の自発的バックグラウンドは低く、2乃至3×106個の細胞当たり〜1であり、我々は、この百万のクローンライブラリから、35個のFas耐性クローンを回収した。さらに、FasL処理では、アポトーシスの分子マーカである正常なレベルのアネキシンV染色及びカスパーゼ3活性を活性化できなかったことを示すことで、各クローンの表現型を確認した。これらの結果は、組合せ変異誘発が、哺乳動物細胞において再現可能な表現型を効率的に生むことができることを示している。
【０２０６】
FasL耐性細胞のどれが、ゲノムへのpDKO2ベクタの挿入の直接的結果としてそれらの表現型を獲得したかを判定するために、我々はCre発現プラスミドのトランスフェクションを用いて、クローンの各々からのpDKO2遺伝子トラップ配列の切り出しを誘導した。Cre媒介性組換えを行った後、ガンシクロビル選抜を行って、pDKO2における遺伝子トラップ機能と共にチミジンキナーゼ因子が削除されたことを検出した。次にクローンを分析して表現型の復帰を調べると、３５個のクローンのうち１３個が遺伝子トラップのCre媒介性除去後に表現型が復帰していることが示された（表現型復帰データを図１９に示す）。遺伝子トラップの切り出し後に表現型復帰を示さなかった細胞は、自発的変異のためにFasLに対する耐性を獲得したと考えられるが、このような事象は特定が不可能に近いため、これらのクローンについてはそれ以上、分析しなかった。１３個のクローンは、遺伝子トラップ・ノックアウトに依存したFasL耐性を示し、これらの細胞をさらに研究して、トラップされた遺伝子を特定し、それらのアポトーシスにおける役割を特徴付けた。pDKO2遺伝子トラップにより生じたFasL耐性を示すこれら１３個のクローンをRT-PCR、5'-RACE及び逆方向PCRを用いて分析して、生物活性なトラップされた遺伝子を特定した。カスパーゼ-8遺伝子が変異するとFasL耐性が起きることが以前に実証されている (Curr. Biol. 8(18), 1001-1008, 1998)。カスパーゼ-8が我々のスクリーニングで出たいずれかのFasL耐性クローンで変異しているかどうかを検査するために、我々は２つの入れ子状カスパーゼ-8特異的正方向プライマと、２つの入れ子状ベクタ特異的逆方向プライマをこれらのクローンに用いて、RT-PCR検定を行った。我々は、クローンのうちで２つにカスパーゼ-8のトラップを特定した。5'-RACE 及び逆方向PCRでは、トラップされた遺伝子が、他のFas耐性クローンの大半で明らかになった。これらの遺伝子の多くがこれまで、FasL誘導性アポトーシスへの関与を有するとして特徴付けられたことはなく、これらの遺伝子は、アポトーシスにおいて意外な役割を果たす、潜在的な治療用ターゲットであると期待できる。
【０２０７】
要約すると、我々は、哺乳動物細胞でのin vivo遺伝子機能の発見を可能にする機能消失的な遺伝学的戦術を開発したと共に、この組合せ変異誘発戦術は、これらの機能を果たす公知及び新規な遺伝子の迅速な特定を可能にするものであることを示したのである。このような遺伝子学的アプローチは、遺伝子機能の特定や、治療的介入用の新しいターゲットの発見において、貴重であるに違いない。
【０２０８】
以上、本発明を、明確に理解されるよう図示及び実施例を挙げながらある程度詳細に完全に説明したところで、本発明の範囲又はその具体的な実施態様に影響を与えることなく、幅広い、そして均等な範囲の条件、調合及び他のパラメータ内で、本発明を改良又は変更することにより、同じ事項を実施できること、そしてこのような改良又は変更は付属の請求項の範囲に包含されるものと意図されていることは、当業者であれば明白であろう。
【０２０９】
本明細書で言及した全ての発行物、特許及び特許出願は、本発明が関係する当業者にとって通常の技術レベルを示すものであり、各発行物、特許及び特許出願を引用をもって援用することを具体的かつ個別に明示した場合と同じ程度に、引用をもってここに援用されている。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１Ａ−１Ｊ】図１Ａ−１Ｊは、本発明で有用な5'遺伝子トラップ挿入変異原ベクタの非限定的な例である。各挿入変異原を、その直線状型で概略的に示す。しかし、本発明の挿入変異原はいかなる幾何学形状（直線状、環状、コイル状、超コイル状等）も有することができる。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。停止コドンはいずれの読み取り枠にあってもよく、あるいは、全ての読み取り枠にあるように入れ子状になっていてもよい。S/Aはスプライス受容側部位を表す。S/Dは、スプライス供与側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。ETはエピトープ・タグを表す。
【図２Ａ−２Ｈ】図２Ａ−２Ｈは、本発明で有用な5'遺伝子トラップ挿入変異原の非限定的な例である。各挿入変異原を、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。SM及びRGはそれぞれ選択マーカ及びレポータ遺伝子を表す。S/Aはスプライス受容側部位を表す。S/Dは、スプライス供与側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ−３Ｂは、本発明で有用な5'遺伝子トラップ挿入変異原の非限定的な例である。各挿入変異原を、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。SM及びRGはそれぞれ選択マーカ及びレポータ遺伝子を表す。S/Aはスプライス受容側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ−４Ｃは、本発明で有用な5'遺伝子トラップ挿入変異原の非限定的な例である。各挿入変異原を、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。β-geoは、ネオマイシン耐性遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の融合体である。S/Aはスプライス受容側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。5'LTR及び3'LTRは、レトロウィルスの長い末端反復配列を表す。Ψはレトロウィルスのパッケージング・シグナルを表す。図４Ｂにおいては、レトロウィルス配列が、スプライス受容側部位及びβ-geo遺伝子に対して逆方向になるように、前記5'LTR、3'LTR、及びΨを上下逆さまに示す。図４Ｃでは、太字の四角はトランスポゾン・シグナルを表す。
【図５Ａ−５Ｅ】図５Ａ−５Ｅは、3'遺伝子トラップ成分を含有する5'遺伝子トラップ挿入変異原の非限定的な例である。各挿入変異原を、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。矢印はプロモータを表す。SM及びRGはそれぞれ選択マーカ及びレポータ遺伝子を表す。β-geoは、ネオマイシン耐性遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の融合体である。S/Aはスプライス受容側部位を表す。S/Dは、スプライス供与側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。5'LTR及び3'LTRは、レトロウィルスの長い末端反復配列を表す。Ψはレトロウィルスのパッケージング・シグナルを表す。図５Ｄにおいては、レトロウィルス配列が、スプライス受容側部位及びβ-geo遺伝子に対して逆方向になるように、前記5'LTR、3'LTR、及びΨを上下逆さまに示す。図５Ｅでは、太字の四角はトランスポゾン・シグナルを表す。
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ−６Ｃは、5'遺伝子トラップを用いた遺伝子変異の機構案である。ベクタを、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。矢印はプロモータを表す。β-geoは、ネオマイシン耐性遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の融合体である。S/Aはスプライス受容側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。図６Ａは、挿入変異原と、ベクタ挿入前の内因性遺伝子を示す。図６Ｂは、挿入変異原の挿入後の内因性遺伝子を示す。図６Ｃは、前記内因性遺伝子から産生した融合mRNAを示す。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ−７Ｂは、選択マーカ又はレポータ遺伝子に連結されたプロモータとその後に続くポリアデニレーションシグナルを含有する5'遺伝子トラップ挿入変異原の非限定的な例である。各挿入変異原を、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。矢印はプロモータを表す。SM及びRGはそれぞれ選択マーカ及びレポータ遺伝子を表す。β-geoは、ネオマイシン耐性遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の融合体である。S/Aはスプライス受容側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。5'LTR及び3'LTRは、レトロウィルスの長い末端反復配列を表す。Ψはレトロウィルスのパッケージング・シグナルを表す。図７Ｂにおいては、レトロウィルス配列が、スプライス受容側部位及びβ-geo遺伝子に対して逆方向になるように、前記5'LTR、3'LTR、及びΨを上下逆さまに示す。選択マーカ／レポータ遺伝子に作動的に連結されたプロモータとポリアデニレーション・シグナルとがあることにより、このゲノムの転写上活性な領域で組込みが起きたかどうかに関係なく、組み込まれた挿入変異原を選抜することができる。この図面は選択マーカを含有するいくつかの挿入変異原種を示しているが、プロモータ／選択マーカ／ポリアデニレーション・シグナルという単位は、ここで解説する挿入変異原のいずれにも、用いることができる。
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ−８Ｃは、部位特異的組換えシグナルを含有する5'遺伝子トラップ挿入挿入変異原の非限定的な例である。各挿入変異原を、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。矢印はプロモータを表す。塗りつぶした三角は部位特異的組換えシグナルを表す。この部位特異的組換えシグナルは、互いに対していずれの方向であってもよい。この図面では、ゲノムからの挿入変異原の切り出しを促進する方向を示す。シグナルを、互いに反対の方向になるように挿入変異原上に配置した場合、当該挿入変異原は、部位特異的組換え後ではゲノム中で反転するであろう。N-SMは負の選択マーカ遺伝子を表す。β-geoは、ネオマイシン耐性遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の融合体である。S/Aはスプライス受容側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。5'LTR及び3'LTRは、レトロウィルスの長い末端反復配列を表す。Ψはレトロウィルスのパッケージング・シグナルを表す。各例において、レトロウィルス配列が、スプライス受容側部位及びβ-geo遺伝子に対して逆方向になるように、前記5'LTR、3'LTR、及びΨを上下逆さまに示す。図８Ａ及び８Ｃでの部位特異的組換えシグナルの位置は、ウィルス挿入変異原の大半が切り出し可能であるように、ウィルスLTR中に示されている（例えば Ishida, Nucl. Acids Res. 27: e35 (1999)を参照されたい）。負の選択マーカに作動的に連結されたプロモータと、ポリアデニレーション・シグナルとがあることにより、組み込まれた挿入変異原が切り出された細胞を選抜することができる。この図面は部位特異的組換えシグナルを含有するいくつかの挿入変異原種を示しているが、この部位特異的組換えシグナルは、非ウィルス性挿入変異原も含め、ここで解説する挿入変異原のいずれにも、用いることができる。
【図９Ａ−９Ｈ】図９Ａ−９Ｈは、部位特異的組換えシグナル（ここでは組換え部位とも均等に言及する）を含有する5'遺伝子トラップ挿入変異原の非限定的な例である。各挿入変異原を、その直線状型で概略的に示す（しかし、挿入変異原は、直線状、環状、コイル状、超コイル状、分枝状等を含め、いかなるコンホメーションで存在してもよい）。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。矢印はプロモータを表す。塗りつぶした三角は部位特異的組換えシグナルを表す。この部位特異的組換えシグナルは、互いに対していずれの方向であってもよい。互いに反対方向で示された組換え部位（例えば図９Ｄ−９Ｆ及び９Ｈ）は、組換え後に反転を起こすが、互いに同じ方向で示された組換え部位（例えば図９Ａ−９Ｃ及び９Ｇ）は、組換え時に欠失を生じる。N-SMは負の選択マーカ遺伝子を表し、P-SMは正の選択マーカ遺伝子を表す。Neoはネオマイシン耐性遺伝子を表す。TKはヘルペスウィルス・チミジンキナーゼ（HSV-TK）遺伝子を表す。S/A はスプライス受容側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。負の選択マーカに作動的に連結されたプロモータと、ポリアデニレーション・シグナルとがあることにより、組み込まれた挿入変異原が切り出された細胞を選抜することができる。正の選択マーカ及び／又は負の選択マーカが挿入変異原上のプロモータを欠く場合、当該マーカを、当該挿入変異原がホスト細胞のゲノムに組み込まれたときに、内因性プロモータから発現させることができる。この図面は部位特異的組換えシグナルを含有するいくつかの挿入変異原種の図である。しかし、当該組換え部位は、非ウィルス性挿入変異原も含め、ここで解説した挿入変異源のいずれでも、用いることができる。加えて、この図面で示す挿入変異原のいずれにも、選択に応じて部位特異的組換えシグナルを含めないこともよい（又は一つのみ含めてもよい）。図９Ａ−９Ｆに示した挿入変異原は、選択的にはS/A、IRES及び／又はpAシグナルを欠くこともできる。図示した挿入変異原の各々を、選択的には、ウィルス挿入変異原として構成することができ、従って5'及び3'LTR並びにパッケージング・シグナルを含めることができる。当業者であれば容易に理解されるように、ここで解説した、及び／又は、当業で認識される他の挿入変異原要素を、図面に示した要素に加えて当該挿入変異原に含めることもできる。
【図１０Ａ−１０Ｇ】図１０Ａ−１０Ｇは、複数のエキソンを含有する5'遺伝子トラップ挿入変異源の非限定的例である。各挿入変異原を、その直線状型で概略的に示す（しかしベクタは、直線状、環状、コイル状、超コイル状、分枝状等を含め、いかなる幾何学形状で存在してもよい）。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。矢印はプロモータを表す。S/Aはスプライス受容側部位を表し、S/Dはスプライス供与側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。SMは正もしくは負の選択マーカを指す。この図面で示す挿入変異原のいずれでも、レポータ遺伝子をSMに置換することができる。図１０Ｆ及び１０Ｇにおいては、選択マーカの読み取り枠は、別々のエキソン上に分離されている。内因性遺伝子から転写されて、スプライシングが起きると、この読み取り枠は、機能的SMを生じるように再構築されるであろう。当業者であれば、この図面で示した挿入変異原のそれぞれに、選択に応じ、一つ以上の部位特異的組換えシグナルを含めることができることは認識されよう（図９を参照されたい）。選択的には、この図面に示した挿入変異原が、S/A、IRES、S/D 及び／又はpAシグナルを欠いていてもよい。図示の挿入変異原のそれぞれを、選択的には、ウィルス挿入変異原として構成することができ、従って5'及び3'LTR並びにパッケージング・シグナルを含めることができる。当業者であれば容易に理解されるように、ここで解説した、及び／又は、当業で認識される他の要素を、図面に示した要素に加えて当該挿入変異原に含めることもできる。
【図１１】図１１は、発生上調節される遺伝子で起きる遺伝子トラップ挿入を検出する方法である。この例では、転写上活性な遺伝子が、細胞に対する特定の処理又は環境刺激に応答して下方調節又はサイレントにさせられたような細胞を特定する。DNAを、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。矢印はプロモータを表す。塗りつぶした三角は部位特異的組換えシグナルを表す。この部位特異的組換えシグナルは、ゲノムからの正の選択マーカの切り出しを促進するような方向で示されている。P-SM及びN-SMはそれぞれ正の選択マーカ及び負の選択マーカを表す。S/Aはスプライス受容側部位を表す。S/Dはスプライス供与側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。
【図１２】図１２は、発生上調節される遺伝子で起きる遺伝子トラップ挿入を検出する方法である。この例では、転写上サイレントな遺伝子（又は発現が最小の遺伝子）が、細胞に対する特定の処理又は環境刺激に応答してスイッチが入れられた、又は促進されたような細胞を特定する。DNAを、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。矢印はプロモータを表す。塗りつぶした三角は部位特異的組換えシグナルを表す。この部位特異的組換えシグナルは、ゲノムからの負の選択マーカの切り出しを促進するような方向で示されている。P-SM及びN-SMはそれぞれ正の選択マーカ及び負の選択マーカを表す。S/Aはスプライス受容側部位を表す。S/Dはスプライス供与側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。
【図１３】図１３は、発生上調節される遺伝子で起きる遺伝子トラップ挿入を検出する方法である。この例では、転写上サイレントな遺伝子（又は発現が最小の遺伝子）が、細胞に対する特定の処理又は環境刺激に応答してスイッチが入れられた、又は促進されたような細胞を特定する。他の例では、転写上活性な遺伝子が、細胞に対する特定の処理又は環境刺激に応答して下方調節又はサイレントにさせられたような細胞を特定することができる。これは、この図面に示すベクタを、図１１に示した選抜スキーム（即ち、正の選択マーカによる選抜の後、その発現パターンを変えることのできる作用因子で細胞を処理し、負の選択マーカを発現している細胞を淘汰する）と組み合わせて用いることで、達成される。DNAを、その直線状型で概略的に示す。水平な線及び四角はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドを指す。矢印はプロモータを表す。塗りつぶした三角は部位特異的組換えシグナルを表す。この部位特異的組換えシグナルは、ゲノム中の正及び負の選択マーカの反転を促進するような方向で示されている。P-SM及びN-SMはそれぞれ正の選択マーカ及び負の選択マーカを表す。S/Aはスプライス受容側部位を表す。S/Dはスプライス供与側部位を表す。pAはポリアデニレーション・シグナルを表す。IRESは、内部リボゾーム侵入部位を表す。
【図１４】この図面は、本発明による変異誘発で生じる細胞の非限定的な例と、遺伝子を検出できるようにどのように標識できるかの例を概略的に示す。「X」は物理化学的事象を表す。「T」は、挿入変異誘発事象により導入された標識を表す。  （Ａ）  単一の遺伝子のホモ接合型変異で生じる表現型。遺伝子Ａの両方のコピーが変異を含有する。この遺伝子は一方のコピーの上の標識により、特定することができる。表現型（I）を担う遺伝子を特定するには、細胞一個が必要なだけである。細胞ＩＩは廃棄できる。  （Ｂ）２つの異なる遺伝子のヘテロ接合型変異で生じる表現型。当該表現型を担う２つの遺伝子を、同じ細胞Ｉで特定することができる。細胞ＩＩ及びＩＩＩを組み合わせて用いて当該表現型を担う両方の遺伝子を特定したり、又は別々に用いて、表現型を担う遺伝子の一方を特定する。細胞ＩＶは廃棄できる。  （Ｃ）遺伝子Ａのヘテロ接合型変異と、遺伝子Ｂのホモ接合型変異とにより生じる表現型。当該表現型を担う２つの遺伝子を、同じ細胞Ｉで特定することができる。細胞ＩＩ及びＩＩＩを組み合わせて用いて当該表現型を担う両方の遺伝子を特定したり、又は別々に用いて、表現型を担う遺伝子の一方を特定する。細胞ＩＶは廃棄できる。  （Ｄ）２つの異なる遺伝子のホモ接合型変異により生じる表現型。当該表現型を担う２つの遺伝子を、同じ細胞Ｉで特定することができる。細胞ＩＩ及びＩＩＩを組み合わせて用いて当該表現型を担う両方の遺伝子を特定したり、又は別々に用いて、表現型を担う遺伝子の一方を特定する。細胞ＩＶは廃棄できる。
【図１５】図１５は、所望の表現型の発生に関与する遺伝子の効率的な変異及び標識付けのための組合せ変異誘発法の具体的な例の概略図である。ステップ１では、ENUは細胞一個当たり数多くの変異を生じる。ステップ２では、遺伝子トラップ変異原が、ENUクローン中の付加的なアレルをノックアウト及び標識して表現型を生み、変異遺伝子の特定も可能とする。
【図１６】図１６は、pDKO2遺伝子トラップ・ノックアウト・ベクタのデザイン及び機能である。pDKO2レトロウィルスは組み込まれると、内因性遺伝子の上流エキソンをトラップする。以下の略語が本図面で用いられている。 S/A：pCIベクタ（プロメガ社）からPCRで得た免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンの分岐部位及びスプライス受容側配列； x: ３つの読み取り枠全ての停止コドン；IRES: EMCV由来の野生型内部リボゾーム侵入部位；pE5LVP0 (ATCC#67525)からPCRにより得られる；DR：ネオマイシン耐性遺伝子、(ピューロマイシン、ヒグロマイシン、又はゼオシンへの耐性を付与するものなど、他の選択マーカを含有するpDKOベクタを、pDKO2由来株で作製した)；bGHpA: ウシ成長ホルモン polyA 配列；pcDNA3.1 （インヴィトロジェン社）からPCR；lox: lox71/lox66 配列、cre リコンビナーゼ認識部位；TK: チミジンキナーゼ ORF; PGK: プロモータ；及びΨ：レトロウィルス・パッケージング・シグナル。
【図１７】図１７は、FasL誘導性アポトーシスに必要な遺伝子を特定するための組合せ変異誘発スクリーニングの概略図である。
【図１８】図１８は、Fas誘導性アポトーシス経路の概略図である。FasLへの感受性に影響する遺伝子トラップを特定するために、二重変異誘発組合せ変異誘発ライブラリから、Fas誘導性アポトーシスに対して耐性を示すクローンを選抜した。FasL選択条件下では、自発性のバックグラウンドは低い。
【図１９】Fas耐性表現型の組合せ変異誘発遺伝子トラップ復帰のCre媒介性切り出し。pDKO2遺伝子トラップにより生じたFasL耐性を示すクローンをRT-PCR、5'-RACE及び逆PCRを用いて分析して、生物学的に活性なトラップされた遺伝子を特定した。
【図１Ａ−１Ｊ】
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【図２Ａ−２Ｈ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｅ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｃ】
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【図９Ａ−９Ｈ】
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【図１０Ａ−１０Ｇ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１４（ＣＯＮＴ）】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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