(57)【要約】本発明は、ウィングレス・シグナル伝達経路の新たな必須下流成分に関する。特に、本発明は、キイロショウジョウバエのｄａｕｇｈｔｅｒ  ｏｆ  ｌｅｇｌｅｓｓ（ｄｏｌｌ）遺伝子のヌクレオチド配列、そのコードされるタンパク質、並びにそれらの誘導体、断片、及び類似体に関する。本発明には、ショウジョウバエＤｏｌｌ遺伝子に類似したアミノ酸のストレッチを含有するタンパク質を含んでなる、脊椎動物及び無脊椎動物のＤｏｌｌタンパク質の相同体が含まれる。Ｄｏｌｌタンパク質、誘導体、及び類似体を例えば組換え法により産生する方法と、Ｄｏｌｌへの抗体も本発明により提供される。本発明はまた、Ｄｏｌｌ機能をＷｎｔ経路において変調させる化合物のハイスループットスクリーニングアッセイを実施する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫及び脊椎動物における少なくとも１つのシグナル伝達経路の一部であるポリペプチドをコードする核酸配列であって、「Ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｏｆ  Ｌｅｇｌｅｓｓ」（ＤＯＬＬ）遺伝子、並びにその相同体、断片、誘導体、そして機能及び構造類似体であることを特徴とする、核酸配列。
【請求項２】
前記シグナル伝達経路がＷｎｔシグナル伝達経路であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項３】
配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ｄｏｌｌ遺伝子（ｄｄｏｌｌ）であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸配列。
【請求項４】
配列番号６に示されるようなショウジョウバエＤｏｌｌポリペプチドの断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項３に記載の核酸配列。
【請求項５】
配列番号２に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなるヒトｄｏｌｌ−１遺伝子（ｈｄｏｌｌ−１）であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸配列。
【請求項６】
配列番号７に示されるようなヒトＤｏｌｌ（ｈＤｏｌｌ−１）ポリペプチドの断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項５に記載の核酸配列。
【請求項７】
配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列を有するヒトｄｏｌｌ−２遺伝子（ｈｄｏｌｌ−２）であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸配列。
【請求項８】
配列番号８に示されるようなヒトＤｏｌｌポリペプチド（ｈＤｏｌｌ−２）の断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項９】
配列番号４に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなるマウスｄｏｌｌ−１遺伝子（ｍｄｏｌｌ−１）であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸配列。
【請求項１０】
配列番号９に示されるようなマウスＤｏｌｌポリペプチド（ｍＤｏｌｌ−１）の断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項９に記載の核酸配列。
【請求項１１】
配列番号５に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなるマウスｄｏｌｌ−２遺伝子（ｍｄｏｌｌ−２）であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸配列。
【請求項１２】
配列番号１０に示されるようなマウスＤｏｌｌポリペプチド（ｍＤｏｌｌ−２）の断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項１１に記載の核酸配列。
【請求項１３】
昆虫及び脊椎動物における少なくとも１つのシグナル伝達経路の一部であるポリペプチドであって、「Ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｏｆ  Ｌｅｇｌｅｓｓ」（ＤＯＬＬ）タンパク質、並びにその相同体、断片、誘導体、そして機能及び構造類似体であることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項１４】
前記シグナル伝達経路がＷｎｔシグナル伝達経路であることを特徴とする、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号６に示されるようなアミノ酸配列を有するキイロショウジョウバエＤｏｌｌタンパク質であることを特徴とする、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号６に示されるようなＤｏｌｌポリペプチドの断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号７に示されるようなアミノ酸配列を有するヒトＤｏｌｌタンパク質（ｈＤＯＬＬ−１）であることを特徴とする、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号７に示されるようなＤｏｌｌポリペプチドの断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を有するヒトＤｏｌｌタンパク質（ｈＤＯＬＬ−２）であることを特徴とする、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号８に示されるようなＤｏｌｌポリペプチドの断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号９に示されるようなアミノ酸配列を有するマウスＤｏｌｌ−１タンパク質（ｍＤＯＬＬ−１）であることを特徴とする、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号９に示されるようなＤｏｌｌポリペプチドの断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列を有するマウスＤｏｌｌ−２タンパク質（ｍＤＯＬＬ−２）であることを特徴とする、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号１０に示されるようなＤｏｌｌポリペプチドの断片又は全配列に対して５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
低い全体アミノ酸配列同一性と、保存ドメインにおける５０％〜１００％、好ましくは１００％の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項２に記載の核酸配列。
【請求項２６】
前記保存ドメインがＤＨＤドメインであることを特徴とする、請求項２５に記載の核酸配列。
【請求項２７】
前記保存ドメインがＰＨＤフィンガーであることを特徴とする、請求項２６に記載の核酸配列。
【請求項２８】
配列番号１、２、３、４、又は５に由来する、長さ２０〜１００ヌクレオチド、好ましくは２０〜６０ヌクレオチド、及び最も好ましくは２０〜５０ヌクレオチドの断片を含むことを特徴とする、請求項２に記載の核酸配列。
【請求項２９】
ハイブリダイゼーションプローブとして使用される、請求項２８に記載の核酸配列。
【請求項３０】
配列番号１、２、３、４、又は５からなる群から選択される、ショウジョウバエ若しくは脊椎動物のｄｏｌｌ遺伝子又はその断片をコードする核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項３１】
真核及び原核発現ベクターからなる群から選択される、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は細菌細胞からなる群から選択される、請求項３１のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３３】
ａ）完全なｄｏｌｌ  ｃＤＮＡ配列又はその一部を含有する核酸配列を単離する工程；
ｂ）ｄｏｌｌ  ｃＤＮＡ又はその断片を細菌、哺乳動物、植物、酵母、又は昆虫の細胞において組換え的に発現させる工程；
ｃ）前記細胞においてタンパク質産生を誘導する工程；
ｄ）Ｄｏｌｌタンパク質を精製する工程を含んでなる、Ｄｏｌｌタンパク質、その断片、誘導体、及び類似体の調製方法。
【請求項３４】
工程ａ）が、脊椎動物若しくは無脊椎動物のｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーからのｄｏｌｌ  ｃＤＮＡを包含する核酸分子の単離を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程ｂ）が、完全長若しくは先端切断（truncated）ｄｏｌｌをコードするＤＮＡの、誘導可能な真核若しくは原核発現ベクター内に含有されるエピトープタグ及び切り離し部位への融合と、割り当てた宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換する工程を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
エピトープタグ付き配列、抗体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼからなる群から選択される異種アミノ酸配列へ融合したＤｏｌｌポリペプチドを含んでなるキメラタンパク質。
【請求項３７】
Ｄｏｌｌポリペプチドが、ｄＤｏｌｌ、ｈＤｏｌｌ−１、ｈＤｏｌｌ−２、ｍＤｏｌｌ−１、及びｍＤｏｌｌ−２からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載のキメラタンパク質。
【請求項３８】
抗Ｄｏｌｌ抗体への抗体結合部位を含んでなる、完全長Ｄｏｌｌポリペプチド又はその断片を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
Ｄｏｌｌポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、ポリクローナル及びモノクローナル抗体とその断片からなる群から選択される、前記抗体。
【請求項４０】
ショウジョウバエ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、カエル、ブタ、又はヒツジからなる群から選択される生物の使用を含んでなり、前記生物は、増加又は低下若しくは皆無のｄｏｌｌ発現を示すか、又は少なくとも１つの組織若しくは臓器において突然変異したＤｏｌｌポリペプチドを発現する、破壊されたＷｎｔ機能により誘導される疾患を研究するためか又は薬物スクリーニングのためのアッセイ。
【請求項４１】
前記生物がｄｏｌｌ遺伝子を異種トランス遺伝子として発現することを特徴とする、請求項４０に記載のアッセイ。
【請求項４１】
前記ｄｏｌｌ遺伝子が、欠失、点突然変異、異種ＤＮＡ挿入、及び逆位からなる群から選択される突然変異を含むことを特徴とする、請求項４０に記載のアッセイ。
【請求項４２】
細胞の運命、分化、又は増殖の障害からなる群から選択される状態の処置への治療及び診断の方法の開発への、Ｄｏｌｌタンパク質、その相同体、誘導体、及び断片の使用。
【請求項４３】
細胞の運命、分化、又は増殖の障害からなる群から選択される状態の診断への治療及び診断の化合物の開発への、Ｄｏｌｌタンパク質、その相同体、誘導体、及び断片の使用。
【請求項４４】
前記治療若しくは診断の化合物が、ショウジョウバエ及び脊椎動物のＤｏｌｌタンパク質相同体とその断片、そしてその抗体及び抗体断片からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４３に記載のＤｏｌｌタンパク質、その相同体、誘導体、及び断片の使用。
【請求項４５】
細胞の運命、分化、又は増殖の障害からなる群から選択される状態の処置への治療及び／又は診断の化合物の開発への、ｄｏｌｌ核酸、その相同体、誘導体、及び断片の使用と、個体へのその適用。
【請求項４６】
細胞の運命、分化、又は増殖の障害からなる群から選択される状態の処置への治療及び診断の方法の開発への、ｄｏｌｌ核酸、その相同体、誘導体、及び断片の使用と、個体へのその適用。
【請求項４７】
前記治療若しくは診断の化合物が、ｄｏｌｌアンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｄｏｌｌ二本鎖ＲＮＡ、及び、ｄｏｌｌ機能に干渉する化学的若しくは天然に存在する化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４５に記載のｄｏｌｌ核酸、その相同体、誘導体、及び断片の使用。
【請求項４８】
Ｄｏｌｌポリペプチドの断片を含んでなるペプチド。
【請求項４９】
ｈＤｏｌｌ−１、ｈＤｏｌｌ−２、ｍＤｏｌｌ−１、ｍＤｏｌｌ−２、及びショウジョウバエＤｏｌｌのＮ末端領域に４０〜６０のアミノ酸を含んでなる、請求項４８に記載のペプチド。
【請求項５０】
Ｄｏｌｌ相同性ドメイン（ＤＨＤ）を含んでなる、請求項４９に記載のペプチド。
【請求項５１】
Ｗｎｔ経路においてＤｏｌｌ機能に干渉する、化学的化合物、有機産物、ポリペプチド若しくはペプチドの同定へのスクリーニング方法における、ＤＨＤの使用。
【請求項５２】
タンパク質−タンパク質相互作用に基づいたスクリーニングアッセイにおける、請求項５１に記載のＤＨＤの使用。
【請求項５３】
前記スクリーニングアッセイが、in vitro タンパク質−タンパク質相互作用アッセイと宿主細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用アッセイを含んでなる群から選択される、請求項５２に記載のＤＨＤの使用。
【請求項５４】
Ｄｏｌｌともう１つのタンパク質との間の相互作用を特異的に阻害する化合物のスクリーニングアッセイにおける、請求項５１に記載のＤＨＤの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィングレス・シグナル伝達経路の新規な必須下流成分に関する。特に、本発明は、キイロショウジョウバエのｄａｕｇｈｔｅｒ  ｏｆ  ｌｅｇｌｅｓｓ（ｄｏｌｌ）遺伝子のヌクレオチド配列、そのコードされるタンパク質、並びにそれらの誘導体、断片、及び類似体に関する。本発明には、ショウジョウバエＤｏｌｌ遺伝子に類似したアミノ酸のストレッチを含有するタンパク質を含んでなる、脊椎動物及び無脊椎動物のＤｏｌｌタンパク質の相同体が含まれる。Ｄｏｌｌタンパク質、誘導体、及び類似体を例えば組換え法により産生する方法と、Ｄｏｌｌへの抗体も本発明により提供される。本発明はまた、Ｄｏｌｌ機能をＷｎｔ経路において変調させる化合物のハイスループットスクリーニングアッセイを実施する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔ遺伝子は、多種多様な生物学的プロセスにおける細胞間シグナル伝達分子として主要な役割を担う、大きなファミリーの分泌性システインリッチタンパク質をコードする（広範な概説については、WodarzとNusse  1998を参照のこと）。最初のＷｎｔ遺伝子、マウスｗｎｔ−１は、マウス乳房腫瘍ウイルスの乳房腫瘍における組込みにより活性化される癌原遺伝子として発見された（NusseとVarmus  1998）。必然的に、Ｗｎｔ経路の癌における関与が広く研究されてきた。ショウジョウバエのポラリティー遺伝子、ウィングレス（ｗｇ）のｗｎｔ−１相同体としての同定（Cabrera，Alonso  et  al．1987；PerrimonとMahowald  1987；Rijse-wijk，Schuermann  et  al．1987）により、ｗｎｔ遺伝子が重要な発生レギュレーターであることが明らかになった。このように、一見すると似ていないが、胚発生と発癌のような生物学的プロセスは、いずれも同一のシグナル伝達経路を介した細胞情報伝達に依存する。この経路の現行モデルにおいては、分泌されるＷｎｔタンパク質がＦｒｉｚｚｌｅ細胞表面受容体へ結合し、細胞質タンパク質のＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）を活性化する。するとＤｓｈは、プロテインキナーゼＳｈａｇｇｙ／ＧＳＫ３、骨格タンパク質のＡｘｉｎ及びβ−カテニン、Ａｒｍａｄｉｌｌｏの脊椎動物相同体を含む、いくつかのタンパク質の複合体へこのシグナルを伝達する。この複合体において、β−カテニンは、Ｓｇｇによりリン酸化された後で分解の標的になる。Ｗｎｔシグナル伝達と生じるＳｇｇ活性のダウンレギュレーションの後で、β−カテニン（又はそのショウジョウバエ相同体のＡｒｍａｄｉｌｌｏ）は分解から逃れ、細胞質中に蓄積する。フリーの細胞質β−カテニンは依然として不明瞭な機序により核へ転座し、Ｔｃｆ／Ｌｅｆファミリーの転写因子へ結合することにより遺伝子転写を変調させる（Grosschedl  R  1999）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
重要なトランスデューサーが絶えず抑制されているこの状況は、その阻害成分において突然変異をきわめて受けやすい。β−カテニン破壊複合体の３つの要素のいずれかの喪失は、β−カテニンレベルの増加、故にこの経路の構成的な活性化をもたらす。このことは、ＧＳＫ−３機能の喪失と同時に細胞の生存能力を抑制する場合があるが、それはまた、ＡＰＣ及びＡｘｉｎの場合のように、細胞運命の変化、非制御の増殖と腫瘍形成性の挙動をもたらすことも可能である（Barker  N  1999；Morin  1999；Potter  1999；RooseとClevers  1999；WalzerとBienz  1999）。これらの有害な状況に対抗する試みは、β−カテニン−ＴＣＦ複合体の形成を防止することか、又はその転写アクチベータ機能に干渉することのいずれかによってβ−カテニンの核活性を抑制することを目的としなければならない。
【０００４】
今のところ、β−カテニン転写活性化を有効に阻害する既知の治療薬剤は存在しない。これは、一部は、その完全な活性化と核転座に要求される必須成分の多くが依然として不明であるという事実のためである。必然的に、これらのきわめて悪性の疾患に抗する有効な薬物を開発することを可能にするために、この経路についてより多くのことを理解することが要請されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ウィングレス活性化に要求される新規成分を同定するために、発明者たちは、ショウジョウバエの遺伝アプローチを使用して、ウィングレス（ショウジョウバエのＷｎｔ相同体）の眼発生の間の異所性発現により引き起こされるラフ眼表現型の優性サプレッサーをスクリーニングした。３つの遺伝子を同定した：β−カテニン相同体のａｒｍａｄｉｌｌｏ（ａｒｍ）、ｔｃｆ／ｌｅｆ−１相同体のｐａｎｇｏｌｉｎ（ｐａｎ）、及び、完全に新しい遺伝子のレッグレス（ｌｇｓ）である（米国０９／９１５，５４３）。引き続き、このｌｇｓ遺伝子をクローニングして、それが胚と発生中の組織におけるウィングレスシグナル伝達にin  vivoで必須であることを確かめた。転写活性のＡｒｍ／Ｐａｎｇｏｌｉｎ複合体にはＬｇｓの存在が要求され、Ｌｇｓの過剰発現は、この二極（bipartite）転写因子の転写アウトプットを強く刺激する。ヒトゲノムは、少なくとも２つのヒトＬｇｓ相同体を含有する。そのうちの１つであるＢｃ１９は、以前からＢ細胞悪性腫瘍に関係があるとされてきた（Willis，Zalcberg  et  al，1998）。また、ヒト細胞においてｄＬｇｓとｈＬｇｓがＡｒｍａｄｉｌｌｏ及びβ−カテニンへ結合し、Ｗｎｔシグナル伝達に機能的に要求されることが遺伝学的に、そして生化学的に実証された。しかしながら、遺伝実験は、Ｌｇｓへ結合し、活性β−カテニン−Ｐａｎｇｏｌｉｎ−Ｌｇｓ複合体の機能に必須である第二のタンパク質の存在を強く示唆した。
【０００６】
本発明は、Ｌｇｓへ結合してＷｎｔシグナル伝達に要求される、Ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｏｆ  Ｌｅｇｌｅｓｓ（Ｄｏｌｌ）と名付けた新規のショウジョウバエタンパク質のクローニング及び機能特性決定を記載する。さらに、本発明は、機能及び構造上のヒト及びマウス相同体の配列、並びに、Ｗｎｔ経路においてＤｏｌｌ機能を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０００７】
諸定義
用語「Ｄｏｌｌポリペプチド」、「Ｄｏｌｌタンパク質」には、本明細書において使用される場合、ネーティブな無脊椎動物及び脊椎動物のＤｏｌｌ及びＤｏｌｌ変異体の配列（これは、本明細書においてさらに明確にされる）が含まれる。
【０００８】
「野生型配列Ｄｏｌｌ」は、天然に由来のＤｏｌｌタンパク質と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。Ｄｏｌｌのそのような野生型配列は、天然から単離することが可能であるか、又は組換え及び／又は合成の手段により産生することが可能である。用語「野生型配列Ｄｏｌｌ」には、特に、Ｄｏｌｌの天然に存在する先端切断型、天然に存在する変異型（例、選択的にスプライスされた形）、及び天然に存在する対立遺伝子変異型が含まれる。本発明の１つの態様において、野生型Ｄｏｌｌ配列は、ｄＤｏｌｌのアミノ酸１〜８１５（図１）、又はｈＤｏｌｌ−１の１〜４１９、又はｈＤｏｌｌ−２の１〜４０６（図２）、又はｍＤｏｌｌ−１の１〜４１７、又はｍＤｏｌｌ−２の１〜４０７（図３）を含んでなる成熟若しくは完全長のＤｏｌｌ配列である。
【０００９】
「Ｄｏｌｌ変異体」は、図１、２、及び３の野生型Ｄｏｌｌタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性を有する、活性Ｄｏｌｌを意味する。しかしながら、用語「Ｄｏｌｌ変異体」にはまた、Ｗｎｔ経路におけるＤｏｌｌの機能的相同体も含まれる。
【００１０】
本明細書において同定されるＤｏｌｌ配列に関する「アミノ酸配列同一性比率（％）」は、配列を並置して、必要ならば、最大の配列同一性比率を達成するためにギャップを導入し、そして保守的アミノ酸置換を配列同一性の一部とみなさない場合に、Ｄｏｌｌ配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義される。本明細書に使用される％同一性値は、（Tatusova  TA  1999）から入手したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により生成することが可能である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索変数を使用し、そのほとんどがデフォルト値を設定している。
【００１１】
上記のように実施される配列比較の文脈において、用語「陽性」には、同一ではないが、類似の特性（例えば、保守的置換の結果として）を有する、比較された配列中の残基が含まれる。陽性の％値は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおいて陽性値を記録する残基を、上記に定義されるようなより長い配列中の残基の全数により割った分数により決定される。
【００１２】
類似のやり方で、本明細書において同定されるＤｏｌｌポリペプチドのコーディング配列に関する「核酸配列同一性比率（％）」は、本発明のＤｏｌｌコーディング配列のいずれかにおけるヌクレオチド配列と同一である候補配列中のヌクレオチド残基の比率として定義される。本明細書に使用される同一性値は、デフォルト変数を設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴモジュールを使用して算出することが可能である。
【００１３】
用語「エピトープタグ」は、「タグポリペプチド」へ融合したＤｏｌｌポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドへ言及する。タグポリペプチドは、それに対して抗体を作製することが可能であるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが融合するＤｏｌｌポリペプチドの活性には干渉しないほど十分に短い。
【００１４】
核酸は、別の核酸配列と機能上の関連性があるように配置される場合、「機能可能的に連結」している。
【００１５】
用語「エピスタシス」は、遺伝子作用におけるヒエラルキーを意味する。エピスタシス実験は、シグナル伝達経路の諸成分を正しい順序に置くために実施する。
【００１６】
用語「レスキュー実験」は、どの遺伝子が特定の突然変異体の表現型の原因であるかを決定するために設計される。特に、突然変異体の胚にコーディング若しくはゲノムＤＮＡを注射し、導入したＤＮＡの効果を、突然変異体の表現型を復帰させる能力を基にして決定する。
【００１７】
「活性の」又は「活性」は、生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＤｏｌｌポリペプチドの諸形態へ言及する。好ましい活性には、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路を変調させる能力が含まれる。
【００１８】
用語「アンタゴニスト」は、広い意味で使用され、本明細書に記載されるＤｏｌｌポリペプチドの生物学的活性を一部又は全部阻害する、阻止する、又は中和する分子が含まれる。同じように、用語「アゴニスト」は、最も広い意味で使用され、活性Ｄｏｌｌポリペプチドの生物学的活性を模倣するか又は支援する分子が含まれる。
【００１９】
「処置」は、治療的処置と予防若しくは防止の手段の両方に言及し、ここでその目的は、標的となる病理学的状態若しくは障害を予防するか又は遅らせることである。処置の必要な人には、すでに障害のある人、並びに障害にかかりやすい人、又は障害を予防すべき人が含まれる。
【００２０】
本発明は、以後「Ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｏｆ  Ｌｅｇｌｅｓｓ（Ｄｏｌｌ）」タンパク質と呼ぶ、昆虫及び脊椎動物の生物に存在する新規なタンパク質のファミリーに関する。これらのタンパク質は、Ｗｎｔシグナル伝達経路において、従って、発生期の組織の空間配置及び増殖の形成及び維持において、そして多くのヒト腫瘍の形成及び増殖において、必須の役割を担っている。
【００２１】
特に、本発明は、キイロショウジョウバエｄｏｌｌ遺伝子のヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質、並びにその断片、誘導体、そして機能及び構造の類似体に関する。
【００２２】
好ましい態様において、本発明は、ヒト及びマウスのｄｏｌｌ相同体、それぞれｈｄｏｌｌ−１、ｈｄｏｌｌ−２及びｍｄｏｌｌ−１、ｍｄｏｌｌ−２のヌクレオチド及びタンパク質の配列に関する。
【００２３】
１つの態様において、単離核酸は、（ａ）図１に示すＤｏｌｌポリペプチドの断片又は全タンパク質配列、又は（ｂ）（ａ）をコードする核酸分子の相補体に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、なおさらにより好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、そして最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。
【００２４】
もう１つの態様において、単離核酸は、（ａ）図２ａ／ｂの部分若しくは全体のヒトＤｏｌｌポリペプチドであるポリペプチド、又は（ｂ）（ａ）をコードする核酸分子の相補体に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは約７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは約９５％の配列同一性、なおさらにより好ましくは約９８％の配列同一性、そして最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００２５】
もう１つの態様において、単離核酸は、（ａ）図３ａ／ｂの全マウスＤｏｌｌタンパク質の一部をコードするポリペプチド、又は（ｂ）（ａ）をコードする核酸分子の相補体に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは約７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは約９５％の配列同一性、なおさらにより好ましくは約９８％の配列同一性、そして最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードする。
【００２６】
さらなる態様において、単離核酸は、低い全体アミノ酸配列同一性をもったポリペプチドをコードする配列を含むが、保存ドメインのＤＨＤ及びＰＨＤにおいては、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは１００％の配列同一性を示す（図４）。
【００２７】
本発明のなおもう１つの態様において、単離核酸は、ｄｏｌｌ遺伝子の機能に類似する機能を有するポリペプチドをコードする。
【００２８】
もう１つの態様において、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブとして適用される、ショウジョウバエ若しくは脊椎動物のｄｏｌｌ核酸配列の断片に関する。そのような核酸断片は、約２０〜約１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０〜約６０ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは２０〜５０ヌクレオチドの長さであり、図１、２、及び３に示すヌクレオチド配列に由来する。
【００２９】
さらに本発明は、図１，２、及び３に示すようなショウジョウバエ若しくは脊椎動物のｄｏｌｌ又はその断片をコードする核酸分子を含んでなる、真核及び原核の発現ベクターを提供する。このベクターは、上記に記載される分子又はその断片のいずれも含むことが可能である。
【００３０】
本発明にはまた、そのようなベクターを含んでなる宿主細胞が含まれる。例を挙げると、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は細菌細胞であり得る。
【００３１】
例えば、組換え手段による、Ｄｏｌｌタンパク質、誘導体、類似体の産生、単離、及び精製の方法も提供される（以下の実施例ＶＩを参照のこと）。特定の側面において、本発明は、図１、２、及び３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なお最も好ましくは１００％の同一性のアミノ酸配列を含んでなる、単離Ｄｏｌｌペプチドに関する。
【００３２】
なおもう１つの態様において、本発明は、異種のポリペプチド若しくはアミノ酸配列へ融合したＤｏｌｌポリペプチドを含んでなるキメラタンパク質に関する。そのようなキメラ分子の例は、以下の実施例ＶＩに記載されるように、エピトープタグ付き配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質、又はβ−ガラクトシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼのような、酵素活性のあるタンパク質へ融合したＤｏｌｌポリペプチドを含む。
【００３３】
さらなる側面において、本発明は、図１、２、及び３のアミノ酸配列を含んでなる、（実施例ＶＩに記載のように調製した）単離された完全長Ｄｏｌｌポリペプチド、又は抗Ｄｏｌｌ抗体へ結合部位を提供するのに十分な、本発明に記載の任意のＤｏｌｌポリペプチド、又はその断片に関する。
【００３４】
もう１つの態様において、本発明は、Ｄｏｌｌポリペプチドを特異的に認識する抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル調製物、又はその断片であり得る。ポリクローナル抗体は、実施例ＶＩに記載されるように調製した精製Ｄｏｌｌポリペプチドを用いたウサギの免疫化により調製する。
【００３５】
本発明はまた、トランス遺伝子を有するトランスジェニック動物（例、ショウジョウバエ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ブタ、又はヒツジ）、例えば、本明細書に記載のＤｏｌｌ遺伝子の異種型を含み、好ましくは発現するか、又は内因性若しくはトランスジェニックｄｏｌｌ遺伝子を誤って発現する動物に関する。そのようなトランスジェニック動物は、Ｗｎｔシグナル伝達経路が破壊された疾患を研究するためのモデルとして、Ｄｏｌｌタンパク質の産生のため、又は薬物スクリーニングのために役立つことが可能である。
【００３６】
なおもう１つの態様において、本発明はまた、ｄｏｌｌ遺伝子における突然変異、例えば欠失、点突然変異、異種ＤＮＡ挿入、又は逆位を有する動物（例、ショウジョウバエ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ブタ、又はヒツジ）を特徴とする。そのような動物は、破壊されたＷｎｔ機能により特徴づけられる疾患を研究するために、又は薬物スクリーニングにおいて役立つことが可能である。
【００３７】
さらに、本発明は、Ｄｏｌｌタンパク質、その相同体、誘導体、及び断片、並びに核酸、その誘導体、及び断片の、治療及び診断の方法及び化合物における使用に関する。特に、本発明は、細胞の運命、分化、又は増殖の障害の、本発明の治療化合物の投与による処置のための方法及び化合物を提供する。そのような治療化合物には：ショウジョウバエ及び脊椎動物のＤｏｌｌタンパク質相同体又はその断片、それへの抗体又は抗体断片、ｄｏｌｌアンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｄｏｌｌ二本鎖ＲＮＡ、及びＤｏｌｌの機能、合成、又は分解に干渉する化学的若しくは天然に存在する化合物が含まれる。特に、本発明は、Ｗｎｔ経路においてＤｏｌｌ機能に干渉する化学的化合物、有機産物、又はペプチドをスクリーニングする方法を提供する。好ましい態様において、スクリーニング方法は、細胞レポーター遺伝子アッセイ又はタンパク質−タンパク質相互作用アッセイであろう。
【００３８】
もう１つの態様においては、タンパク質−タンパク質相互作用に基づいたスクリーニングアッセイを使用して、Ｄｏｌｌ−Ｌｇｓ又はＤｏｌｌ−相互作用パートナーＸを特異的に阻害する化合物をスクリーニングする。
【００３９】
本発明はまた、Ｗｎｔ経路においてＤｏｌｌ機能に干渉する化学的化合物、有機産物、又はペプチドをスクリーニングする方法を提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、in  vitroタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ、又は宿主細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用のようなスクリーニングアッセイにおけるＤＨＤドメインの使用を含む。前記アッセイは、Ｗｎｔ経路においてＤｏｌｌ機能に干渉する化学的化合物、有機産物、ポリペプチド、又はペプチドの同定に適用される。
【００４１】
好ましい態様において、本発明に記載の治療産物は、癌性状態を処置するか、又は前新生物若しくは非悪性状態から新生物若しくは悪性状態への進行を予防するために投与される。
【００４２】
他の特定の態様において、本発明の治療産物は、血液疾患を処置するか、又は組織の再生及び修復を促進するために投与される。最後に、細胞運命の障害、特に、Ｄｏｌｌタンパク質の異常であるか若しくは望まれない発現、又は局在化、又は活性が関与する、過剰増殖性若しくは低増殖性の障害は、そのようなレベルを検出することによって診断することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
Ｗｎｔシグナル伝達カスケードは、無脊椎動物と脊椎動物の両方の発生に必須であり、腫瘍形成に関係があるとされてきた。ショウジョウバエｗｇ遺伝子は、１００より多い遺伝子を含むＷｎｔタンパク質ファミリー内で最もよく特徴づけられた遺伝子の１つである。ショウジョウバエの胚において、ｗｇは、パラセグメント境界の形成と隣接細胞におけるエングレイルド（ｅｎ）発現の維持に要求される。ｗｇ機能の欠損した胚の表皮は、未発達の体節化しか示さず、これは異常な体表パターンに反映される。野生型幼虫の腹側の体表がむき出しの領域と交互に現れる歯状突起帯を示すのに対し、ｗｇ突然変異幼虫の体表は、歯状突起で完全に覆われる。成虫盤の発生の間、ｗｇは、背−腹の位置情報を制御する。ｌｅｇ盤において、ｗｇは、腹側の運命の誘導により将来の足をパターン化する（StruhlとBasler  1993）。ｗｇ活性が低下した動物では、足の腹側半分が背側の鏡像へ発達する（Baker  1988）。従って、低下したｗｇ活性は、翅の胸背板組織へのトランシフォーメーションをもたらすので、この遺伝子の名称がある（SharmaとChopra  1976）。眼の盤においては、ｗｇは頭部表皮の発達を優先して複眼分化を抑制し、眼の領域を通る背腹軸を確定させることに関与する（Heberlein，Borod  et  al．1998）。
【００４４】
追加の遺伝子がＷｇシグナル伝達の分泌、受容、又は解釈に関係があるとされてきた。例えば、ショウジョウバエにおける遺伝研究は、ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｄｆｚ）、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（ｄｓｈ）、ｓｈａｇｇｙ／ｚｅｓｔｅ−ｗｈｉｔｅ−３（ｓｇｇ／ｚｗ−３）、ａｒｍａｄｉｌｌｏ（ａｒｍ）、ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ（Ｅ−ａｐｃ）、ａｘｉｎ、及びｐａｎｇｏｌｉｎ（ｐａｎ）のＷｇシグナル伝達における関与を明らかにした。これらトランスデューサーの遺伝子序列が確定されているが、そこでは、ＷｇはＤｓｈを介してＳｇｇを阻害するように作用し、これによりＳｇｇによるＡｒｍの抑圧を解除し、Ａｒｍの細胞質蓄積とその核への転座をもたらす。核において、ＡｒｍはＰａｎと相互作用して標的遺伝子の転写を活性化する。これらの成分すべてについて、脊椎動物の相同体が同定されていて（更新された概説については、PeiferとPolakis  2000を参照のこと）、ショウジョウバエシグナル伝達経路の新規に同定されるメンバーに脊椎動物の対照物がある可能性があることを示唆する。
【００４５】
結腸癌、乳癌、メラノーマ、肝細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、髄芽腫、毛基質細胞腫、及び前立腺癌を含む多くのタイプの癌には、Ａｒｍ、β−カテニンの哺乳動物相同体の核蓄積、そして必然的に、Ｗｎｔ経路の構成的な活性をもたらす突然変異が観察されている（Morin  1999；Polakis，Hart  et  al．1999）。β−カテニンシグナル伝達の脱調節（deregulation）がこれら悪性腫瘍の発生において重要なイベントであることは今や明らかである。しかしながら、それでも、β−カテニン転写活性化を有効に阻害する既知の治療薬剤はまだ存在していない。これは、一部は、その完全な活性化と核転座に要求される必須成分の多くが依然として不明であるという事実のためである。
【００４６】
ウィングレス活性化に要求される新たな成分を同定するために、発明者たちは、ショウジョウバエの遺伝アプローチを使用して、ウィングレス（ショウジョウバエのＷｎｔ相同体）の眼発生の間の異所性発現により引き起こされるラフ眼表現型の優性サプレッサーをスクリーニングした。新たな遺伝子、レッグレス（ｌｇｓ，米国０９／９１５，５４３）を、ラフ眼表現型の強い優性サプレッサーとして同定した。引き続き、この遺伝子をクローニングして、それが胚と発生中の組織におけるＷｇシグナル伝達にin vivo で必須であることを確かめた。ヒトゲノムは、少なくとも２つのヒトＬｇｓ相同体、ｈＬｇｓ／Ｂｃ１９及びｈＬｇｓ−１を含有する。ｄＬｇｓとｈＬｇｓは、Ａｒｍａｄｉｌｌｏとβ−カテニンへ結合し、無脊椎動物及び脊椎動物の細胞におけるＷｎｔシグナル伝播に機能的に要求される（米国０９／９１５，５４３）。特に、転写活性のＡｒｍ／Ｐａｎｇｏｌｉｎ複合体にはＬｇｓの存在が要求され、Ｌｇｓの過剰発現は、この転写アウトプットを強く刺激する。
【００４７】
後に、発明者たちは、β−カテニン相互作用ドメインが欠失しているＬｇｓタンパク質の突然変異型が、野生型幼虫においてトランス遺伝子から発現されるときに、Ｗｇ依存性のパターン形成プロセスに対して強い優性ネガティブ効果を示すという興味深い観察をした（データ示さず）。このことは、Ｌｇｓが正常にはＡｒｍとだけでなく少なくとも１つの追加成分とも相互作用することを強く示唆した。そのような成分を同定しようとする努力において、相互作用するタンパク質について酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。Ｌｇｓの全タンパク質かＮ末端半分のいずれかを餌（bait）として使用する２つの独立したスクリーニングにおいて、Ｄａｕｇｈｔｅｒ−ｏｆ−Ｌｅｇｌｅｓｓ（Ｄｏｌｌ）と呼ぶ新規のＰＨＤフィンガータンパク質を、Ｌｇｓ結合タンパク質として同定した（図４）。８１５アミノ酸残基のＤｏｌｌタンパク質は６０アミノ酸のＣ末端ドメインを担い（図４ａ）、これはＬＡＰ（白血病関連タンパク質）ドメイン（Aasland，Gibson  et  al．1995）としても知られるＰＨＤ（植物相同性ドメイン）フィンガーに対して広範な相同性を示す。このドメインは、システインリッチのＺｎ結合モチーフを含み、これはクロマチン仲介性の転写調節に関与するタンパク質と関連づけられてきた。ＤｏｌｌのＰＨＤフィンガーは、Ｌｇｓへの相互作用を仲介するのに必要であり十分である（図４ｃ〜ｄ）。発明者たちはまた、本明細書において、この相互作用がＤｏｌｌ機能に必須であることを明示する。
【００４８】
Ｄｏｌｌ結合の原因となるＬｇｓの領域をＨＤ１配列にマップした（図４ｄ）。さらに、ショウジョウバエｄｏｌｌ遺伝子の２つのヒト相同体を同定して単離した（図４ａ）。両方のヒト遺伝子，ｈＤＯＬＬ−１及びｈＤＯＬＬ−２、並びにそれらのマウス相同体のタンパク産物は、ｈＬｇｓ／ＢＣＬ９のＨＤ１と相互作用する高度保存ＰＨＤフィンガーを保有する（図４ｄ）。ショウジョウバエＤｏｌｌ、ｈＤｏｌｌ−１／ｈＤｏｌｌ−２、及びｍＤｏｌｌ−１／ｍＤｏｌｌ−２において有意な配列相同性を示す他の唯一のドメインは、Ｎ末端領域にある５０アミノ酸ストレッチであり、本明細書ではこれを「Ｄｏｌｌ相同性ドメイン」（ＤＨＤ、図４ａ，ｂ）と呼ぶ。
【００４９】
ＨＤ１が欠失しているＬｇｓの突然変異型はｌｇｓ突然変異動物をレスキューすることができなかったので、Ｄｏｌｌとの相互作用はＬｇｓの in vivo 機能に関連しているようである。ＤｏｌｌとＬｇｓの物理的な関連性は、Ｄｏｌｌが、Ｌｇｓと同じように、in  vivoでのＷｇシグナル伝達に要求される可能性があることを示唆した。この仮説を探究するために、ｓｅｖ−ｗｇ表現型のサプレッサーの専用コレクションを、ｄｏｌｌ遺伝子の位置である、第３染色体の右アームの先端に対してマップする突然変異について検索した。１つのそのようなサプレッサー、Ｓｕｐ１３０をこの位置に対してマップしたが、大変興味深いことに、それは、ｌｇｓ対立遺伝子のｌｇｓ１７Ｅと組み合わせると優性の致死性を示した（米国０９／９１５，５４３）（Ｓｕｐ１３０／＋ｌｇｓ１７Ｅ／＋トランスヘテロ接合動物は生存しない）。ホモ接合Ｓｕｐ１３０突然変異幼虫由来のゲノムＤＮＡを使用してｄｏｌｌコーディング領域を配列決定し、アミノ酸７５１位から始まる１４ｂｐの欠失を同定した。故に、この対立遺伝子はｄｏｌｌ１３０と呼ばれ、Ｃ末端ＰＨＤフィンガーを欠落する末端切断Ｄｏｌｌタンパク質をコードする。
【００５０】
ホモ接合ｄｏｌｌ１３０遺伝子型により引き起こされる致死性は、ショウジョウバエｄｏｌｌ遺伝子のコーディング領域又はその２つのヒト相同体ｈＤｏｌｌ−１及びｈＤｏｌｌ−２のうち１つのそれのいずれかを含有するチューブリン１プロモーター推進トランス遺伝子により完全にレスキューすることが可能である（図７）。このように、ｄｏｌｌの脊椎動物相同体がＤｏｌｌの真の機能性相同体であることを遺伝学的に確かめたので、この脊椎動物相同体は本発明の一部となる。
【００５１】
発生期のＷｇシグナル伝達におけるＤｏｌｌの可能な役割をアッセイするために、ｄｏｌｌについて等しく突然変異体である雌性生殖細胞に由来する、ｄｏｌｌ１３０突然変異についてホモ接合の胚を産生した。Ｄｏｌｌ  ｍＲＮＡは母方からもたらされ、すべての発生段階の間、強く、普遍的に発現されている。必然的に、胚と母方のｄｏｌｌの両方を欠落している胚だけが重篤なセグメントポラリティー表現型により特徴づけられ（図５Ａ〜Ｃ）、一方、ｄｏｌｌ機能の欠失がより弱い突然変異体は、触角及び足が一部若しくは完全に損失した蛹の致死性を示す。接合機能のみを欠落する突然変異体の個体は初期蛹段階まで生存し、異常に小さい成虫盤を示す。これらの盤では、Ｈｈ標的遺伝子のｐｔｃが野生型レベルで発現されたが、Ｗｇ標的Ｄ１１の発現は検出し得なかった（図５Ｆ〜Ｉ）。これらの盤は、推定の翅根フィールドを欠落するようであり、胸背板への２つの原基を保有する（図５Ｇ及びＩ）。ｗｇ、ｄｓｈ、ａｒｍ、又はｌｇｓの機能の損失により同様の表現型が引き起こされるという事実により、Ｗｇシグナル伝達経路におけるｄｏｌｌの必須の役割が確かめられる。
【００５２】
β−カテニン仲介性の転写におけるＤｏｌｌの役割に取り組むために、不死化ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）においてＴＣＦレポーター遺伝子（ＴＯＰＦＬＡＳＨ，(Morin，Sparks  et  al．1997)）を使用した。安定した突然変異型の低レベルのβ−カテニン（ΔＮ−β−カテニン；（van  de  Wetering，Cavallo  et  al．1997））を上記の細胞に導入し、この経路を一部刺激した。ｈＤｏｌｌ−１（図８）又はｈＤｏｌｌ−２（示さず）の追加の発現は、ルシフェラーゼ活性の大きな増加（３０倍）をもたらす。これらのレベルは、一方の処置単独により産生されるレベルの合計より有意に高い（図８）。ｈＤｏｌｌ−１及び２によるβ−カテニン活性のこの効力増加は、内因性ＴＣＦタンパク質のそのＤＮＡ標的部位との相互作用により仲介されるようである。なぜなら、それは５つの最適ＴＣＦ結合部位を含有するＴＯＰＦＬＡＳＨでのみ観察され、５つの突然変異部位を含有する対照レポーターＦＯＰＦＬＡＳＨでは観察されないからである（Morin，Sparks  et  al．1997）。このように、この実験は、Ｄｏｌｌタンパク質がβ−カテニン依存的なやり方でＴＣＦ標的遺伝子を活性化させることによってＷｎｔシグナルを変換するという考え方への裏づけ証拠を加える。
【００５３】
まとめると、ショウジョウバエのＤｏｌｌ及びＬｇｓ間で明示されたタンパク質−タンパク質相互作用とそのヒト相同体、ヒトＤｏｌｌ及びｈＬｇｓ／Ｂｃ１９間での相互作用は、それぞれ、遺伝子や細胞生物学のデータとともに、Ｄｏｌｌタンパク質がそれぞれＷｇ及びＷｎｔシグナル伝達経路の正のレギュレーターであることを示す。
【実施例】
【００５４】
実施例Ｉ：ｄｏｌｌ  ｃＤＮＡの単離
ショウジョウバエｃＤＮＡライブラリーの、Ｌｇｓへ直接結合するタンパク質についての２つの独立した酵母遺伝子スクリーニングにおいて、Ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｏｆ  Ｌｅｇｌｅｓｓ（Ｄｏｌｌ）のｃＤＮＡを単離した。脊椎動物及び無脊椎動物の生物由来のゲノム及びｃＤＮＡライブラリーのような、他のＤＮＡライブラリーも同様に使用可能である。酵母ツーハイブリッドスクリーニング以外の方法も同様に使用可能である。そのような方法には、限定されないが、遺伝子特異的プライマーを使用する直接増幅法と当業者に知られた標準法が含まれる。Ｌｇｓへ結合するタンパク質についての酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実施するために、第一の７３２アミノ酸（「ＬｇｓＮ」）と１４６４アミノ酸の完全長タンパク質（「ＬｇｓＦＬ」）をコードするｃＤＮＡ配列を、酵母発現ベクター（ｐＬｅｘＡ，クローンテク）へサブクローニングし、それらをＬｅｘＡ
【００５５】
ＤＮＡ結合ドメインへ融合させた。引き続き、これらの構築体を、ｌａｃＺ−レポータープラスミドｐＳＨ１８−３４と、酸性転写活性化ドメインへ融合したキイロショウジョウバエ胚性ｃＤＮＡライブラリー（「ＲＦＬＹ−１」ライブラリー、PNAS93, 3011-3015）と一緒に、ＬＥＵ２−レポーター酵母株ＥＧＹ４８へ入れて形質転換した。第一の工程において、ＬｇｓＮ−若しくはＬｇｓＦＬ−ＬｅｘＡ−融合構築体をそれぞれ含有する三重形質転換体コロニー、ｐＳＨ１８−３４レポーター、及びＲＦＬＹ−１ライブラリープラスミドを、最少選択培地プレートで２日間増殖させ、採取し、徹底的に混合し、そして均一なアリコートして保存した。次いで、これらアリコートの１つからの細胞を許容ガラクトース／ラフィノース最少選択液体培地へ移し、振り混ぜながら３０℃で数時間インキュベートし、それによりライブラリーｃＤＮＡ―活性化ドメイン融合のＧＡＬ１−誘導プロモーターからの発現を誘導した。最後に、これらの「誘導された」細胞を、アミノ酸のｌ−ロイシンを欠くガラクトース／ラフィノース最少選択培地プレートにおいてプレート培養した。これらのプレートで細胞増殖が維持されるのは、それぞれのＬｅｘＡ−融合と活性化ドメイン−融合タンパク質との分子相互作用によりＬＥＵ２−セレクター遺伝子が活性化されるときだけである。ＬＥＵ２−遺伝子は、ロイシンの他のアミノ酸前駆体からの生合成に必要とされる必須代謝酵素をコードする。これらの制限条件下で増殖するクローンをすべて単離し、腸内細菌E．coli由来の代謝酵素β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ−レポーター遺伝子の活性について、標準的なＸ−Ｇａｌアッセイ（例、BartelとFields（編）、オックスフォードユニバーシティプレス、１９９７年）により分析した。上記２つの選択工程に合格したすべての候補クローンから、再び標準技術（例、「酵母遺伝学の方法」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、１９９７年）によりｃＤＮＡ−ライブラリープラスミドを単離し、無関係のＬｅｘＡ−融合タンパク質を陰性対照として使用して、Ｌｇｓとの特異的な相互作用をＸ−Ｇａｌアッセイにおいて再試験した。この方法により、Ｌｇｓとのみ強力かつ特異的に相互作用し、一部重複する配列を含有する、３つの独立したｃＤＮＡクローン：ＢＫ１２ｂ、ＢＫ１４ｂ、及びＴＫ５．３５ｈを同定した。ショウジョウバエゲノムのデータベースを、ｂｌａｓｔｎアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST/）を使用して検索することによって、我々は、この３つの単離ｃＤＮＡを長さ８１５アミノ酸のタンパク産物をコードするＣＧ１１５１８座へマップした。このｃＤＮＡクローンは、Ｄｏｌｌタンパク質の異なる部分をコードしたが、ＢＫ１２ｂは、コンピューター操作により予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド（ｎｔ）２２２３〜２４４８を、ＢＫ１４ｂはｎｔ２１９１〜２４４８を、そしてＴＫ４．３５ｈはｎｔ７４９〜２４４８を含有していた。さらなるバイオインフォマティクス分析（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）により、このＬｇｓ結合クローンの３つすべてにおいて存在する、タンパク質配列のまさにＣ末端部分（ほぼ、アミノ酸７４５〜８０５）が、異なるレベル��の転写調節に関与する他のタンパク質において同定されている、ＰＨＤフィンガーフォールドに適合することが予測された。
【００５６】
実施例ＩＩ：ショウジョウバエＤｏｌｌのヒト及びマウス相同体の同定
ショウジョウバエＤｏｌｌアミノ酸配列の同定の後で、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST/）を使用して、他の種にある類似のタンパク質配列について、公的に利用可能なデータベースを検索した。それぞれ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓとＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のＥＳＴにおいて２つの候補配列をそれぞれ見出した。そのＣ末端ドメインにおいてＤｏｌｌとの高い類似性を示す推定タンパク産物である。これらの高い類似性のストレッチも、同様にＰＨＤフィンガーフォールドに適合すると予測された（図４）。Ｄｏｌｌタンパク質は、そのＮ末端配列において他の既知の構造モチーフを示さないが、それらは第二の高い相同性ドメインを示し、従って、これをＤＯＬＬ相同性ドメイン（ＤＨＤ）と命名した（図４）。無脊椎動物と脊椎動物の両方の起源のＤｏｌｌタンパク質はこれまでに詳しく記載されていないし、実験的に研究されてもいないので、これまでにある特定の生物学的プロセスとの関連が示唆されたこともない。
【００５７】
実施例ＩＩＩ：ショウジョウバエｄｏｌｌ対立遺伝子の単離及びマッピング
ＥＭＳ処理オスを、２コピーのｓｅｖｅｎｌｅｓｓエンハンサー（Basler，Christen  et  al．1991）により推進されるｗｇトランス遺伝子（ｓｅｖ−ｗｇ）を担うメスへ交配した。２ｘ１０５の子孫についてラフ眼表現型のサプレッサーをスクリーニングした。第三染色体のサプレッサーを、Ｐ［ｙ＋］インサートのパネルを使用する減数分裂組換えにより粗くマップした。１つのそのようなサプレッサー、Ｓｕｐ１３０は、ｌｇｓ対立遺伝子のｌｇｓ１７Ｅ（米国０９／９１５．５４３）との組み合わせにおいて、大変興味深いほどに優性の致死性を示し（Ｓｕｐ１３０／＋ｌｇｓ１７Ｅ／＋トランスヘテロ接合動物は生存しない）、緊密な遺伝子相互作用を強く示唆した。変性ＨＰＬＣ（ＷＡＶＥシステム、トランスゲノミック社）を使用してこの突然変異を細かくマッピングすると、それがｄｏｌｌ遺伝子内に局在化することが実証された。故に、このｄｏｌｌコーディング領域を、ホモ接合Ｓｕｐ１３０突然変異幼虫からのゲノムＤＮＡに由来するｄｏｌｌコーディング領域をカバーするＰＣＲ断片を使用して、配列決定した。Ｓｕｐ１３０における欠損は、アミノ酸７５１へ後続するフレームシフトを誘導し、未成熟の停止コドンの形成をもたらす、ｄｏｌｌオープンリーディングフレーム内の１４ｂｐ欠失（ヌクレオチド２２５３〜２２６６：５’ＣＡＴＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧ３’）であることが判明した。故に、この対立遺伝子はｄｏｌｌ１３０と呼ばれ、Ｃ末端ＰＨＤフィンガーを欠落する末端切断Ｄｏｌｌタンパク質をコードする。
【００５８】
極細胞移植、染色体押しつぶし（squash）、及び染色体in  situハイブリダイゼーションの実験は、標準プロトコール（Ashburner  1989）に従って行った。
【００５９】
実施例ＩＶ：ｄｏｌｌのハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、ｄｏｌｌの非反復ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。この方法は、他の生物においてｄｏｌｌ相同体をスクリーニングすることにも同様に適用可能である。（図１、２、３に示すような）ｄｏｌｌの配列を含んでなるＤＮＡを（ｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーに含まれるような）相同体ＤＮＡをスクリーニングするためのプローブとして利用する。いずれかのライブラリーＤＮＡを含有するフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄を、標準的な高ストリンジェンシー条件（Sambrook，Fritsch  et  al．1989）の下で実施する。陽性クローンを使用して、より大きなｃＤＮＡライブラリー平板培養物（platings）をさらにスクリーニングすることが可能である。引き続き、代表的なｃＤＮＡクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）又は類似のクローニングベクターへクローニングして、配列決定をする。
【００６０】
実施例Ｖ：in  situハイブリダイゼーション用ハイブリダイゼーションプローブとしてのｄｏｌｌの使用
ショウジョウバエｄｏｌｌ  ｍＲＮＡのin  situハイブリダイゼーションは、（TautzとPfeifle  1989）に記載のように胚において実施することが可能である。しかしながら、わずかな変更を加えれば、それは、ショウジョウバエ幼虫の成虫盤や脊椎動物の組織切片において任意のｍＲＮＡ転写物を検出するためにも使用可能である。標識化ＲＮＡプローブは、（図１、２、３に示されるような）直線化ｄｏｌｌ  ｃＤＮＡ又はその断片から、ＤＩＧ  ＲＮＡ標識化キット（ＳＰ６／Ｔ７）（ベーリンガーマンハイム）を製造業者の推奨に従って使用して、調製することが可能である。
【００６１】
実施例ＶＩ：キイロショウジョウバエにおけるｄｏｌｌの発現
Ｄｏｌｌは、ショウジョウバエにおいて、その全生物体において、特定の臓器において、又は特定の細胞型において、全生活の間か、又はある特定の発生段階のみに、そして様々なレベルで発現させることが可能である。ショウジョウバエの遺伝学において使用される標準法の概説は、（BrandとPerrimon  1993；Perrimon  1998；Perrimon  1998）に見出すことが可能である。
【００６２】
ｄｏｌｌ突然変異胚の産生
ＦＬＰ組換え酵素を介した部位特異的組換えを利用して、モザイク生殖系列を産生する（XuとRubin  1993）。遺伝子型ｈｓｐ７０：ｆｌｐ，ＦＲＴ８２  ｄｏｌｌ１３０／ＦＲＴ８２  ｕｂｉ−ＧＦＰのメスを、第三齢幼虫期の間に、３７℃で１時間熱ショック処理し、ＦＬＰ指向性組換えを誘導してから、ｄｏｌｌ１３０／ＴＭ６ｂ［ｙ＋］のオスと交配する。生殖系列モザイクが誘導される。組換え酵素の供給源は、ｈｓｐ７０プロモーター（「ｈｓｐ７０」により示される）のＦＬＰコーディング配列への融合物の第一染色体インサートである。ＦＲＴ８２部位での体細胞組換えは成体メス生殖系列を生じさせるが、これは機能性ｄＤｏｌｌタンパク質の産生についての情報を接合からも母系貢献からも含有しない胚を受精時にもたらす卵細胞を産生する。これらの胚は、ＴＭ６ｂ［ｙ＋］父方バランサー（balancer）染色体により提供される黄色＋表現型の非存在によって同定することが可能である。分析のためには、標準技術により突然変異胚から体表を調製し、暗視野顕微鏡により検査する。
【００６３】
ｄＡＰＣ２  ｄｏｌｌ二重突然変異生殖系列クローンは、ＦＲＴ８２  ｄＡＰＣ２  ＤＳ  ｄｏｌｌ１３０染色体を用いて産生した。ＦＲＴ８２  ｏｖｏＤ１染色体（ChouとPerrimon  1996）を使用して、突然変異生殖細胞を選択した。また、ＦＲＴ８２  ｄｏｌｌ１３０染色体を使用して、ＦＲＴ８２  ａｒｍ−ｌａｃＺ染色体とともに、ｄｏｌｌ突然変異体クローンをディスク中に作製した。
【００６４】
構成的に活性なＡｒｍを発現するｄｏｌｌ突然変異胚の産生
構成的に活性なＡｒｍ（「ΔＡｒｍ」）を発現させるために、上記に記載の遺伝子型のメスを後期蛹段階の間に３７℃で１時間熱ショック処理し、遺伝子型ＵＡＳ：ΔＡｒｍ  ｈｓｐ７０−Ｇａｌ４／ＵＡＳ：ΔＡｒｍ  ｈｓｐ７０−Ｇａｌ４；ｄｏｌｌ／ＴＭ６ｂ［ｙ＋］のオスへ交配する。追加のトランス遺伝子のこれらのオスにおける存在により、ｄｏｌｌ突然変異卵細胞及びｄｏｌｌ突然変異精子から生まれた子孫は、熱処理のときに、構成的に活性なＡｒｍタンパク質を発現し、これはウィングレス標的遺伝子を一過的に誘導した。
【００６５】
実施例ＶＩＩ：ｈｄｏｌｌ−１及びｈｄｏｌｌ−２  ｃＤＮＡ発現を用いたｄｄｏｌｌ−／−ハエのレスキュー
ショウジョウバエ及びヒトのＤｏｌｌ−１とヒトＤｏｌｌ−２との機能相同性を確かめるために、２つの突然変異体ｄｏｌｌ対立遺伝子を担うショウジョウバエ（ｄｄｏｌｌ−／−ハエ）へ、このヒト遺伝子を導入した。特に、例えば、ｔｕｂ：ｈｄｏｌｌトランス遺伝子と、２つの突然変異体ｄｏｌｌ対立遺伝子、例えばｄｏｌｌ１３０及びＥＰ（３）１０７６（公的に利用可能）を担うハエを産生した。ｄｄｏｌｌ−／−突然変異体のハエは、幼虫若しくは蛹の致死性を示す。対照的に、少なくとも１つのコピーのｔｕｂ：ｈｄｏｌｌ−１若しくはｔｕｂ：ｈｄｏｌｌ−２トランス遺伝子を担うｄｄｏｌｌ−／−突然変異体のハエは、成虫まで生存する。このことは、ｈＤｏｌｌ−１とｈＤｏｌｌ−２の両方が、ハエにおける内因性ｄＤｏｌｌ機能に置き換わることが可能であることを明示するので、ショウジョウバエ及びヒトのＤｏｌｌの間の機能相同性を証明する（図７）。
【００６６】
実施例ＶＩＩＩ：E．coliにおけるタンパク質産生とＤｏｌｌの精製
以下の方法は、細菌細胞におけるＤｏｌｌタンパク質の組換え発現を記載する。完全長若しくは末端切断型ＤｏｌｌをコードするＤＮＡを、例えば、エピトープタグ若しくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｃＤＮＡと、誘導可能細菌発現ベクター内に含まれるトロンビン若しくはエンテロキナーゼ切り離し部位の下流で融合させる。そのようなエピトープタグには、ポリ−ｈｉｓ、Ｓ−タンパク質、チオレドキシン、及び免疫グロブリンのタグが含まれる。ｐＧＥＸ−４Ｔ（ファルマシア）若しくはｐＥＴ−３２ａ（ノヴァーゲン）のような市販のプラスミドを含む、多様なプラスミドを利用することが可能である。
【００６７】
簡潔には、例えばＧＳＴ配列へ融合したｄｏｌｌ配列を含有する細菌の発現プラスミドを、慣用法により、ＢＬ２１（ストラタジーン）のようなプロテアーゼ欠損  E．coliへ入れて形質転換させる。次いで、このプラスミドを含有する細菌コロニーを、選択培地において、飽和に達するまで一晩増殖させる。翌朝、この培養物を１００倍希釈し、０．６の光学密度（ＯＤ６００）まで細菌を増殖させる。ＧＳＴ−Ｄｏｌｌ融合タンパク質がその下で発現されるプロモーターの誘導物質の添加により、タンパク質産生を開始する。使用する発現ベクターに依存して、ＩＰＴＧを含む、多様な誘導物質が利用可能である。
【００６８】
次いで、発現されたＧＳＴタグ付きＤｏｌｌは、例えば、グルタチオンビーズ（ファルマシアから市販されている）のような、アフィニティービーズ又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製可能である。Ｄｏｌｌ発現細菌を音波処理緩衝液（１０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．５％  サルコシル、２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，１ｍＭ  ＤＴＴ，及びプロテアーゼ阻害剤）において溶菌させることによって抽出物を調製した後で、氷上での短い音波処理（例えば、中位のパワーで２０秒、３回）と遠心分離を行う。次いで、澄明な上清を、例えばグルタチオンビーズとともに、穏やかに回転させながら、４℃で１時間インキュベートする。次いで、洗浄緩衝液（２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ
【００６９】
ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５％  ＮＰ４０）においてビーズを数回洗浄し、最後に保存緩衝液（２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％  グリセロール、０．５％  ＮＰ４０，及びプロテイナーゼ阻害剤）に保存する。
【００７０】
他のやり方では、Ｈｉｓ−タグ付き、Ｓ−タンパク質、チオレドキシン、又はＩｇＧタグ付きのＤｏｌｌを、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することが可能である。
【００７１】
調製物の品質は、例えば、ＳＤＳ−ゲル電気泳動と銀染色若しくはウェスタンブロットにより、チェックすることが可能である。
【００７２】
エピトープタグを切り離さなければならない場合は、エピトープタグとＤｏｌｌタンパク質の間の切り離し部位の存在に依存して、いくつかの方法が利用可能である。例えば、第一のＤｏｌｌアミノ酸の直前にトロンビン切り離し部位を含有するＧＳＴ−Ｄｏｌｌ融合タンパク質を産生することが可能である。簡潔には、グルタチオン−アフィニティービーズ上のＧＳＴ−Ｄｏｌｌ調製物を、切り離し緩衝液（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ）において数回洗浄する。次いで、トロンビンを加え、このサンプルを室温で１６時間以上の間インキュベートする。次いで、上清を採取し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色若しくはウェスタンブロットにより、Ｄｏｌｌのビーズからの成功した切り離しについて分析する。
【００７３】
実施例ＩＸ：Ｄｏｌｌが関与するタンパク質−タンパク質相互作用
ＧＳＴ−融合タンパク質in  vitro結合アッセイを実施して、結合ドメインをマップし、追加の相互作用パートナーを見出すことが可能である。この目的のためには、［３５Ｓ］メチオニンを含有する網状赤血球溶解液（例えば、ＴＮＴ溶解液、プロメガ社）を製造業者により提供される指示書に従って使用して、タンパク質をin  vitroで翻訳する。他のやり方では、培養細胞の［３５Ｓ］メチオニンと一緒のインキュベーションにより、細胞タンパク質を標識化することが可能である。実施例ＶＩＩＩに例示されるように産生した、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質をグルタチオン−セファロースに固定化し、結合緩衝液（２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％  グリセロール、０．５％  ＮＰ４０，０．０５％  ＢＳＡ，及びプロテイナーゼ阻害剤）において４５分間阻止する。次いで、２μｇの固定化ＧＳＴタンパク質を、結合緩衝液中０．５〜６μｌのin  vitro翻訳タンパク質、又は［３５Ｓ］メチオニン標識化細胞抽出物とともに１．５時間インキュベートする。このビーズを洗浄緩衝液（２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５％  ＮＰ４０）において４回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳサンプル緩衝液において煮沸した。Ｄｏｌｌへのタンパク質結合を、オートラジオグラフィーにより検出する。細胞溶解液を使用して新規のＤｏｌｌ結合パートナーを同定した場合は、ゲル上のタンパク質バンドを当技術分野において知られた方法により単離することが可能であり、タンパク質配列は、例えば質量分光測光分析により、決定することが可能である。
【００７４】
酵母ツーハイブリッドアッセイを追加的に実施して、上記のin  vitro結合アッセイの結果を確認するか、又は新たな結合パートナーについてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが可能である（FieldsとSternglanz  1994）。この文脈においては、所望のｃＤＮＡを、Ｌｅｘ  ＤＮＡ結合ドメイン（例、ｐＬｅｘＡ，クローンテク）又は酸性活性化ドメイン（例、ｐＧＪ４−５，クローンテク）のいずれかへそれらを連結させる適正な酵母発現ベクター中へサブクローニングする。次いで、酢酸リチウム−ポリエチレングリコール法により、この適正なプラスミドの対をレポータープラスミド（例、ｐＳＨ１８−３４，クローンテク）と一緒に適正な酵母株（例、ＥＧＹ４８）へ入れて形質転換させ、選択培地で増殖させる（Sambrook，Fritsh  et  al．1989）。使用するベクター−レポータープラスミドの製造業者により記載されるように、形質転換体についてレポーター遺伝子活性を分析する。再現性を確立するために、この相互作用は両方向において試験する。他のやり方では、この方法を使用して新規Ｄｏｌｌ相互作用パートナーをスクリーニングする。この文脈においては、例えばｐＬｅｘＡ−Ｄｏｌｌを、上記のように、例えばｐＧＪ４−５へクローニングされたｃＤＮＡライブラリーと一緒に酵母へトランスフェクトする。陽性クローンを単離することが可能であり、それらが含有するｃＤＮＡについて、当業者に知られた方法により配列決定することが可能である。
【００７５】
実施例Ｘ：免疫組織化学
Ｄｏｌｌタンパク質の位置決定は、本発明により提供される抗Ｄｏｌｌ抗体を使用して、ショウジョウバエ胚、成虫盤、無脊椎動物及び脊椎動物の生体組織断片、又は腫瘍細胞系について実施する。例えば、腫瘍細胞系を使用する場合、細胞は、ポリリジンでコートした８穴チャンバ（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔ．）へ播き、３７℃で一晩増殖させることが可能である。陽性対照として、２９３ＭＥＫ細胞（ＡＴＣＣ）を、例えばリポフェクチン法（例、リポフェクタミン、ギブコテクノロジーズ）により、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン）のようなＤｏｌｌ発現プラスミドでトランスフェクトしてもよい。トランスフェクションから２日後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中３．７％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００においてさらに１０分間透過させ、２％  ＢＳＡ−ＰＢＳ中のプレ免疫血清の１０００倍希釈液で、室温で１時間阻止する。次いで、細胞を抗Ｄｏｌｌ免疫血清の１０００倍希釈液とともに室温で２時間インキュベートした後で、ＰＢＳにおいて洗浄し、抗ウサギ二次抗体で染色する。この洗浄工程を繰り返し、調製物を、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００中３％  ＢＳＡの溶液において１時間阻止する。次いで、このスライドをＰＢＳにおいて５分間、３回洗浄し、ＴＲＩＴＣ共役ブタ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ社）の２００倍（ｖ／ｖ）希釈液とともにインキュベートする。この洗浄工程を繰り返してから、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）マウント培地（ベクターラボラトリーズ社）を使用してカバースリップを付ける。β−カテニン、ｈＬｇｓ、又はＴｃｆのような他のタンパク質の検出は、それぞれ、抗β−カテニン（市販）、抗ｈＬｇｓ（米国０９／９１５．５４３）、又は抗Ｔｃｆ（市販）特異抗体を使用して、同じやり方で実施することが可能である。
【００７６】
実施例ＸＩ：ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
Ｔｃｆトランス活性化活性に対するＤｏｌｌの効果は、Ｔｃｆ応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用する細胞培養系において実施することが可能である。使用する発現ベクターに依存して、このプロトコールは、ショウジョウバエ細胞系だけでなく、哺乳動物にも適用可能である。例えば、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）は、十分に適した系である。これによって、Ｄｏｌｌ完全長ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）のような哺乳動物発現ベクターへクローニングし、ＴＯＰＦＬＡＳＨルシフェラーゼレポータープラスミド（アップステートバイオテクノロジー、ニューヨーク、アメリカ）と一緒に２９３細胞へトランスフェクトする。リポフェクタミントランスフェクション試薬（ライフテクノロジーズ社）のようなリポフェクション剤がこの目的に使用可能である。レニラルシフェラーゼレポータープラスミド、例えばｐＲＬ−ＳＶ４０（プロメガ・コーポレーション、マジソン、アメリカ）を同時トランスフェクトして、トランスフェクション効率を正規化する。トランスフェクションから４８時間後に細胞抽出物を調製し、製造業者により記載されるようにして（二元ルシフェラーゼレポーターアッセイ系、プロメガ・コーポレーション）、ホタル及びレニラのルシフェラーゼ活性をアッセイする。すべてのルシフェラーゼ値をレニラルシフェラーゼ活性に対して正規化する（図８を参照のこと）。
【００７７】
実施例ＸＩＩ：Ｄｏｌｌ機能に干渉する化学的化合物、有機産物、又はペプチドのスクリーニング
実施例ＸＩの記載に類似しているが、ハイスループットスクリーニングとして実施するためにスケールダウンしたプロトコールで、レポーター遺伝子アッセイを実施する。この目的のために、突然変異した、及び／又は構成的に活性なβ−カテニンを有する結腸癌細胞系を、実施例ＸＩに記載のＴｏｐｆｌａｓｈベクターとＤｏｌｌ  ｃＤＮＡで安定的にトランスフェクトする。最も信頼できる一定のレポーター遺伝子活性を与える安定したモノクローナル集団を、後のアッセイ用に選択する。プレート培養から１日後、化合物若しくはペプチドのライブラリーに由来する単一化合物で細胞を処理する。１〜２４時間後、レポーター遺伝子の活性を測定する。次いで、レポーター遺伝子活性を阻害することが見出された化合物を、Ｄｏｌｌ含有転写複合体への比活性についてさらに特性決定する。他のやり方では、Ｗｎｔ経路活性は、標的遺伝子、例えばｍｙｃのｍＲＮＡ若しくはタンパク質レベルを検出することによって測定することが可能である（He，Sparks  et  al．1998）。
【００７８】
実施例ＸＩＩＩ：タンパク質−タンパク質相互作用に基づいた、Ｄｏｌｌ−Ｌｇｓ若しくはＤｏｌｌ相互作用パートナーＸを阻害する化合物のスクリーニングアッセイ
Ｄｏｌｌとその相互作用パートナー又はその断片を、例えばE．coli培養物から（例えば、実施例ＶＩＩＩに記載のように）産生して精製する。タンパク質は、例えば、６−ヒスチジン、Ｓ−タンパク質、ＧＳＴ、又はチオレドキシンでタグを付ける。精製したタンパク質の小アリコートを適正な結合緩衝液においてインキュベートする。この時点で、この混合物へ化学的化合物を加え、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊するその能力を、例えば以下に記載の方法のいずれかによりモニターする。引き続き、この相互作用を阻害する化合物について、その特異性とin  vivo毒性を試験する。タンパク質−タンパク質相互作用をモニターするための十分確立した方法は、例えば以下である：
【００７９】
・ランタニドキレート標識を用いる、時間分割フルオロメトリー（Hemmila  IとWebb  S．DDT  2：373-381（1997））。
・シンチレーション近似アッセイ（ＳＰＡ）（アマーシャム・ライフサイエンス）。
・蛍光偏光法
【００８０】
参考文献
Aasland，R．，T．J．Gibson  et  al．(1995)．「ＰＨＤフィンガー：クロマチン仲介性転写調節への意義」Trends  Biochem  Sci  20(2)：56-9．
Ashburner，M．(1989)．「ショウジョウバエ：実験手引き」コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス．
Baker，N．E．(1988)．「セグメントポラリティー遺伝子、ウィングレスのショウジョウバエの成虫盤における転写と蛹−致死ｗｇ突然変異の表現型」Development  102(3)：489-97．
Barker  N，H．G．，Korinek  V，Clevers  H  (1999)．「Ｔｃｆ−４タンパク質の腸及び乳腺上皮における制限された高レベル発現」Am  J  Pathol  154：29-35．
Basler，K．，B．Christen，et  al．(1991)．「ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ受容体チロシンキナーゼのリガンド依存性活性化は、発生中のショウジョウバエ眼における細胞の運命を変化させる」Cell  64(6)：1069-81．
Brand，A．H．とN．Perrimon  (1993)．「細胞運命を改変して優性表現型を産生させる手段としての標的化遺伝子発現」Development  118(2)：401-15
Cabrera，C．V，．M．C．Alonso，et  al．(1987)．「アンチセンスＲＮＡで誘導した表現型模写はウィングレス遺伝子を同定する」Cell  50(4)：659-63．
Chou，T．B．とN．Perrimon  (1996)．「キイロショウジョウバエにおいて生殖系列モザイクを産生するための常染色体ＦＬＰ−ＤＦＳ技術」Genetics  144(4)：1673-9．
Fields，S．とR．Sternglanz  (1994)．「ツーハイブリッド系：タンパク質−タンパク質相互作用のアッセイ」Trends  Genet  10(8)：286-92．
Grosschedl  R，E．Q．(1999)．「Ｗｎｔと他のシグナルによるＬＥＦ−１ＴＣＦ転写因子の調節」Current  Opinion  in  Cell  Biology  11：233-240．
He，T．C．，A.  B．Sparks，et  al．(1998)．「ｃ−ＭＹＣをＡＰＣ経路の標的として同定すること［注釈参照］」Science  281(5382)：1509-12．
Heberlein，U．，E．R．Borod，et  al．(1998)．「ウィングレスによるショウジョウバエ網膜における背腹パターン形成」Development  125(4)：567-77．
Morin，P．J．(1999)．「β−カテニンシグナル伝達と癌」Bioessays  21(12)：1021-30．
Morin，P．J．，A．B．Sparks  et  al．(1997)．「結腸癌におけるβ−カテニン−Ｔｃｆシグナル伝達の、βカテニン又はＡＰＣにおける突然変異による活性化」Science  275(5307)：1787-90．
Nusse，R．とH．E．Varmus  (1982)．「マウス乳癌腫瘍ウイルスにより誘導される多くの腫瘍は、宿主ゲノムの同一領域に組込まれたプロウイルスを含有する」Cell  31(1)：99-109．
Peifer，M．とP．Polakis  (2000)．「腫瘍形成及び胚形成におけるＷｎｔシグナル伝達−核の外側の様子」Science  287(5458)：1606-9．
Perrimon，N．(1998)．「ショウジョウバエにおけるモザイクの作製」Int  J  Dev  Biol  42(3)：243-7．
Perrimon，N．(1998)．「ショウジョウバエにおける新たな前進は、遺伝子機能を研究する好機を提供する」Proc  Natl  Acad  Sci  USA  95(17)：9716-7．
Perrimon，N．とA．P．Mahowald  (1987)．「セグメントポラリティー遺伝子のショウジョウバエにおける多機能」Dev  Biol  119(2)：587-600．
Polakis，P．，M．Hart，et  al．(1999)．「結直腸癌におけるβ−カテニンの調節障害」Adv  Exp  Med  Biol  470：23-32．
Potter，J．D．(1999)．「結直腸癌：分子と集団」Journal  of  the  National  Cancer  Institute  91(11)：916-32．
Rijsewijk，F．，M．Schuermann，et  al．(1987)．「マウス乳癌遺伝子ｉｎｔ−１のショウジョウバエ相同体は、セグメントポラリティー遺伝子のウィングレスと同一である」Cell  50(4)：649-57．
Roose，J．とH．Clevers  (1999)．「ＴＣＦ転写因子：発癌における分子スイッチ」Biochimica  et  Biophysica  Acta  1424(2-3)：M23-37．
Sambrook，J．，E．F．Fritsch，et  al．(1989)．「分子クローニング：実験マニュアル」コールドスプリングハーバーラボラトリープレス．
Sharma，R．P．とV．L．Chopra  (1976)．「キイロショウジョウバエにおける翅及び平均棍の発生に対するウィングレス（ｗｇ１）突然変異の効果」Dev  Biol  48(2)：461-5．
Struhl，GとK．Basler  (1993)．「ウィングレスタンパク質のショウジョウバエにおける組織形成活性」Cell  72(4)：527-40．
Tatusova  TA，M．T．(1999)．「Ｂｌａｓｔ２配列−タンパク質及びヌクレオチドの配列を比較する新たなツール」FEMS  Microbiol  Lett．174：247-250．
Tautz  D．とC．Pfeifle  (1989)．「特定ＲＮＡのショウジョウバエ胚における位置決定のための非放射活性in  situハイブリダイゼーション法は、分節遺伝子ハンチバック（hunchback）の翻訳制御を明らかにする」Chromosoma  98(2)：81-5．
van  de  Wetering，M．，R．Cavallo，et  al．(1997)．「Ａｒｍａｄｉｌｌｏは、ショウジョウバエのセグメントポラリティー遺伝子ｄＴＣＦの産物により推進される転写を共活性化する」Cell  88(6)：789-99．
Waltzer，L．とM．Bienz  (1999)．「胚発生及び癌の間のβ−カテニン及びＴＣＦの制御」Cancer  &  Metastasis  Reviews  18(2)：231-46．
Willis，T．G．，I．R．Zalcberg，et  al．(1998)．「転座ｔ（１；１４）（ｑ２１；ｑ３２）の分子クローニングは、新規遺伝子（ＢＣＬ９）を染色体ｌｑ２１に明確化する」Blood  91(6)：1873-81．
Wodarz，A．とR．Nusse  (1998)．「発生におけるＷｎｔシグナル伝達の機序」Annual  Review  of  Cell  &  Developmental  Biology  14：59-88．
Xu，T．とG．M．Rubin  (1993)．「発生中及び成体のショウジョウバエ組織における遺伝子モザイクの解析」Development  117(4)：1223-37．
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ショウジョウバエｄｏｌｌのｃＤＮＡ及びタンパク質配列。
【図２】ヒトｄｏｌｌ−１及びｄｏｌｌ−２のｃＤＮＡ及びタンパク質配列。
【図３】マウスｄｏｌｌ−１及びｄｏｌｌ−２のｃＤＮＡ及びタンパク質配列。
【図４】ショウジョウバエ及びヒトのＤｏｌｌタンパク質は、ＰＨＤフィンガーモチーフを含有し、それによりそれらはＬｇｓ／ＢＣＬ９のＨＤ１へ結合する。  （Ａ）上：Ｄｏｌｌ、ヒトＤＯＬＬ−１、及びヒトＤＯＬＬ−２の概略図。高い配列類似性を示す２つのドメインを暗い灰色（ＤＨＤ：Ｄｏｌｌ相同性ドメイン）と赤色（ＰＨＤ：植物相同性ドメイン）で強調する。ＤＨＤは、発明者が他のショウジョウバエ若しくはヒトのタンパク質に類似の配列を見出すことができなかったので、ユニークであるらしい。Ｄｏｌｌ、ｈＤｏｌｌ−１、ｈＤｏｌｌ−２のＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号は、それぞれＡＦ４５７２０６、ＡＦ４５７２０７、ＡＦ４５７２０８である。下：ショウジョウバエ、ヒト、及びマウスＤｏｌｌタンパク質配列の多重並置。  （Ｂ）Ｄｏｌｌとそのヒト相同体におけるＤＨＤ及びＰＨＤのアミノ酸配列の並置。類似部分を箱で囲み、同一部分は灰色で陰影をつける。左の数字はＤＨＤ及びＰＨＤのそのそれぞれのタンパク質配列内での位置を示す。ＤＨＤの並置では、２２のアミノ酸のギャップをショウジョウバエＤＨＤに導入した（（Ｘ）５として表す）。  （Ｃ）Ｌｇｓ／ＢＣＬ９相互作用部位のＤｏｌｌにおけるマッピング。酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて、そのＬｇｓ及びＢＣＬ９との相互作用を試験したタンパク質の概略図。結果を右側に示す（「ｂｄｇ」）。  （Ｄ）ｄＬｇｓ及びｈＬｇｓ／ＢＣＬ９におけるＤｏｌｌ相互作用部位のマッピング。酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて、そのＬｇｓとの相互作用を試験したタンパク質の概略図。下に示した２つのタンパク質を、プルダウンアッセイにより、ｄＬｇｓ（括弧なしの数字）及びｈＬｇｓ／ＢＣＬ９（括弧中の数字）の両方について試験し、同じ結果を得た（「ｂｄｇ」）。ＨＤ１を除去する欠失部分は、Ｌｇｓではアミノ酸３１８〜３４５を、ｈＬｇｓ／ＢＣＬ９ではアミノ酸１７７〜２０４を含む。使用した融合タンパク質は、Ｓ−タグ−ｄＤｏｌｌ（アミノ酸５４２〜８１５）とＧＳＴ−ｈＤＯＬＬ−２（アミノ酸３０１〜４０６）であった。
【図５】ｄｏｌｌは、Ｗｇシグナル伝達に要求されるセグメントポラリティー遺伝子である。  （Ａ〜Ｃ）野生型（Ａ）、ｗｇ突然変異体（Ｂ）、及びｄｏｌｌ突然変異体（Ｃ）の胚に由来する幼虫の体表調製物。（Ｃ）のｄｏｌｌ１３０／ｄｏｌｌ１３０胚は、ホモ接合ｄｏｌｌ１３０突然変異生殖系列クローンに由来し（実験方法を参照のこと）、ｗｇ様の表現型を示す。  （Ｄ，Ｅ）ｄＡＰＣ２の下流のｄｏｌｌ機能。母系接合の野生型ｄＡＰＣ２機能の非存在下に発生した幼虫に由来する２つの体表調製物を示す（McCartney  et  al．，1999）。（Ｅ）の胚は、さらに、ｄｏｌｌの母系接合機能を欠いている（実施例を参照のこと）。強く抑制された歯状突起帯を有するｄＡＰＣ単一突然変異動物とは対照的に、二重突然変異体は、ｄｏｌｌ様の表現型を示す。  （Ｆ−１）Ｄｏｌｌ（Ｆ，Ｇ）とＰｔｃ（Ｈ，Ｉ）に対する抗体で染色した、第三齢の翅（ウィング）の成虫盤調製物の共焦イメージ。野生型動物は、これらの遺伝子の正常は発現を示す（Ｆ，Ｈ）。ｄｏｌｌ１３０突然変異幼虫由来の盤は小さく、それでもＰｔｃ（Ｉ）を発現するが、Ｄ１１（Ｈ）を発現し得ない。Ｄ１１発現の欠落は、ｄｏｌｌ１３０幼虫におけるより早期の翅から胸背板へのトランスフォーメーションの間接的な結果である可能性がある。しかしながら、我々はまた、モザイク動物由来のｄｏｌｌ１３０突然変異細胞においてはＤ１１発現の著しい低下を見ている（示さず）。
【図６】ＤｏｌｌのＬｇｓ及びＰＨＤフィンガーは、Ｄｏｌｌ及びＡｒｍを組立てることに役立つ。  ｌｇｓ若しくはｄｏｌｌ突然変異動物をレスキューする能力を評価するトランス遺伝子アッセイに使用したＬｇｓ（黄色）及びＤｏｌｌ（明緑色）構築体の概略図。１：完全長Ｌｇｓ（ｐＯＰ２１６，アミノ酸１〜１４６４）。２：Ｃ末端先端切断Ｌｇｓ（ｐＴＫ１３１，アミノ酸１〜５８３）。３：ＨＤ１−Ｇａｌ１１−ＨＤ２（ｐＴＫ１５３，アミノ酸２６８〜３９５（ＨＤ１）、アミノ酸３６９〜５００（Ｇａｌ１１）、アミノ酸４６５〜５９６（ＨＤ２））。４：ＨＤ１−（ＨＡ）３−ＨＤ２（ｐＴＫ１４３，アミノ酸２６８〜３９５（ＨＤ１）、アミノ酸４６５〜５９６（ＨＤ２））。５：完全長Ｄｏｌｌ（ｐＴＫ５６，アミノ酸１〜８１５）。６：Ｄｏｌｌ［ＤＰＨＤ］−ＨＤ２（ｐＴＫ１３５，アミノ酸１〜７４０（Ｄｏｌｌ［ＤＰＨＤ］、アミノ酸４８３〜５６１（ＨＤ２））。トランス遺伝子１〜４は、ｌｇｓ２０Ｆホモ接合体をレスキューすることができる。トランス遺伝子３によりレスキューされた成体動物の例を右側に示す。トランス遺伝子５は、ｄｏｌｌ１３０ホモ接合体をレスキューすることができる。トランス遺伝子６は、ｌｇｓ２０Ｆホモ接合体だけでなくｄｏｌｌ１３０もレスキューすることができる（右側の写真）。
【図７】ヒトｄｏｌｌトランス遺伝子の発現による、ｄｄｏｌｌ−／−ハエのレスキュー。ｄｏｌｌ１３０／ＥＰ（３）１０７６遺伝子型により引き起こされる致死性は、ショウジョウバエｄｏｌｌ遺伝子のコーディング領域（示さず）又はその２つのヒト相同体ｈｄｏｌｌ−１及びｈｄｏｌｌ−２のうち１つのそれのいずれかを含有するチューブリン１プロモーター推進トランス遺伝子により完全にレスキューすることが可能である。
【図８】ヒトＤｏｌｌ１及び２のＴｃｆ転写に及ぼす効果。２９３細胞を、指定のように、ｐＴＯＰＦＬＡＳＨ若しくはｐＦＯＰＦＬＡＳＨルシフェラーゼレポーターと様々なエフェクタープラスミドで一過的にトランスフェクトした。β−カテニンの構成活性型（ΔＮ−β−カテニン、５０ｎｇ）又はヒトＤｏｌｌ−１若しくはｈＤｏｌｌ−２（３５０ｎｇ）は、ｐＴＯＰＦＬＡＳＨレポーターを活性化する。ヒトＤｏｌｌのΔＮ−β−カテニンとの同時トランスフェクションは、この応答を強く亢進させる。
【図１−１】
2005500016.tif 000002
【図１−２】
2005500016.tif 000003
【図２−１】
2005500016.tif 000004
【図２−２】
2005500016.tif 000005
【図３−１】
2005500016.tif 000006
【図３−２】
2005500016.tif 000007
【図４−１】
2005500016.tif 000008
【図４−２】
2005500016.tif 000009
【図５】
2005500016.tif 000010
【図６】
2005500016.tif 000011
【図７】
2005500016.tif 000012
【図８】
2005500016.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2005500016.tif 000014
2005500016.tif 000015
2005500016.tif 000016
2005500016.tif 000017
2005500016.tif 000018
2005500016.tif 000019
2005500016.tif 000020
2005500016.tif 000021
2005500016.tif 000022
2005500016.tif 000023
2005500016.tif 000024
2005500016.tif 000025
2005500016.tif 000026
2005500016.tif 000027
2005500016.tif 000028
2005500016.tif 000029
2005500016.tif 000030
2005500016.tif 000031
2005500016.tif 000032
2005500016.tif 000033
2005500016.tif 000034
2005500016.tif 000035
2005500016.tif 000036
2005500016.tif 000037
2005500016.tif 000038
2005500016.tif 000039
2005500016.tif 000040
2005500016.tif 000041
2005500016.tif 000042
2005500016.tif 000043
2005500016.tif 000044
2005500016.tif 000045
2005500016.tif 000046
2005500016.tif 000047
2005500016.tif 000048
2005500016.tif 000049
2005500016.tif 000050
2005500016.tif 000051
2005500016.tif 000052
2005500016.tif 000053
2005500016.tif 000054
2005500016.tif 000055
2005500016.tif 000056
2005500016.tif 000057
2005500016.tif 000058
2005500016.tif 000059
2005500016.tif 000060
2005500016.tif 000061
2005500016.tif 000062
2005500016.tif 000063
2005500016.tif 000064
2005500016.tif 000065
2005500016.tif 000066
2005500016.tif 000067
2005500016.tif 000068
2005500016.tif 000069
2005500016.tif 000070
2005500016.tif 000071
2005500016.tif 000072
2005500016.tif 000073
2005500016.tif 000074
2005500016.tif 000075
2005500016.tif 000076
2005500016.tif 000077
2005500016.tif 000078
2005500016.tif 000079
2005500016.tif 000080
2005500016.tif 000081
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500016.tif 000082
【国際調査報告】
2005500016.tif 000083
2005500016.tif 000084
2005500016.tif 000085
2005500016.tif 000086
2005500016.tif 000087
2005500016.tif 000088