(57)【要約】患者から細胞のサンプルを得ること；特異的なサイトカインおよび／またはメディエータでの細胞のインビトロ調節の非存在下および存在下におけるサンプル遺伝子発現プロフィールを得ること；およびサンプルの遺伝子発現プロフィールと参照遺伝子発現プロフィールとを比較することを含む、ヒト患者において炎症性疾患を処置するための薬物の効力を予測するための方法が開示され、ここでサンプル発現プロフィールと参照プロフィールとの間の類似性が患者における炎症性疾患を処置するための薬物の効力を予測する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）患者から細胞のサンプルを入手すること；
ｂ）特異的なモジュレータでの該細胞のインビトロ調節の非存在下および存在下でサンプルから遺伝子発現プロフィールを得ること；および
ｃ）サンプルの遺伝子発現プロフィールと参照遺伝子発現プロフィールとを比較すること、
を含み、サンプル発現プロフィールと参照発現プロフィールとの間の類似性が患者の免疫性疾患を処置するための薬物の効力を予測する、ヒト患者において炎症性疾患を処置するための薬物の効力を予測する方法。
【請求項２】
発現プロフィールが、表１、2A、2B、4A、4Bおよび5A〜5Eに挙げられる１つ以上の遺伝子に対する発現値を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
発現プロフィールが、表１、2Aおよび2Bに挙げられる１つ以上の遺伝子に対する発現値を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
発現プロフィールが、表4Aおよび4Bに挙げられる１つ以上の遺伝子に対する発現値を含む請求項２記載の方法。
【請求項５】
発現プロフィールが表5A〜5Eに挙げられる１つ以上の遺伝子に対する発現値を含む請求項２記載の方法。
【請求項６】
サンプルの遺伝子発現プロフィールを得る前に炎症性疾患を処置するための薬物にサンプルを曝すことをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
炎症性疾患が、喘息、アトピー、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患および敗血症からなる群より選ばれるものである請求項１記載の方法。
【請求項８】
アトピーが、鼻炎、結膜炎、皮膚炎および湿疹からなる群より選ばれるアトピー性炎症性疾患である請求項７記載の方法。
【請求項９】
薬物が、喘息のための副腎皮質ステロイド、β2-アゴニストおよびロイコトリエンアンタゴニスト薬物からなる群より選ばれる薬物のクラスから選ばれるものである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
薬物が、炎症性疾患状態に対する症状軽減剤および抗炎症性薬物からなる群より選ばれるものである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
細胞のサンプルが末梢血単核細胞または好中球に由来するものである請求項１記載の方法。
【請求項１２】
サンプルが、滑膜または気道平滑筋からのバイオプシーにより得られる請求項１記載の方法。
【請求項１３】
サンプルの遺伝子発現プロフィールが、マイクロアレイに含まれるオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションアッセイを用いて得られる請求項１記載の方法。
【請求項１４】
有益な遺伝子に対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なハイブリダイゼーションプローブおよびハイブリダイゼーションを検出するための試薬を含む、
請求項１３記載の方法によりヒト患者の炎症性疾患を処置するための薬物の効力を予測する方法。
【請求項１５】
サンプルの遺伝子発現プロフィールが、有益な遺伝子のタンパク質産物を検出することにより得られる請求項１記載の方法。
【請求項１６】
有益な遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合可能な抗体および抗体結合を検出するための試薬を含む、請求項１５記載の方法によりヒト患者の炎症性疾患を処置するための薬物の効力を予測する方法。
【請求項１７】
参照発現プロフィールが喘息を有さない患者に由来する細胞のものである請求項１記載の方法。
【請求項１８】
参照発現プロフィールが炎症性疾患を有さない患者に由来する細胞のものである請求項１記載の方法。
【請求項１９】
細胞が、発現プロフィールが得られる前に薬物候補で処理される請求項１記載の方法。
【請求項２０】
ａ）患者から細胞のサンプルを得ること；
ｂ）特異的なメディエータでの細胞のインビトロ活性化の非存在下および存在下でサンプルから遺伝子発現プロフィールを得ること；および
ｃ）サンプルの遺伝子発現プロフィールと参照遺伝子発現プロフィールとを比較すること、
を含み、サンプルと参照プロフィールとの間の発現プロフィールにおける類似性がサンプルが得られた患者における糖コルチコイド感受性を示す、喘息患者において糖コルチコイド感受性をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
ａ）患者から細胞のサンプルを得ること；
ｂ）特異的なメディエータでの細胞のインビトロ調節の非存在下および存在下でサンプルに由来する遺伝子発現プロフィールを得ること；および
ｃ）サンプルの遺伝子発現プロフィールと参照遺伝子発現プロフィールとを比較すること、
を含み、サンプルと参照プロフィールとの間の発現プロフィールにおける類似性がロイコトリエンアンタゴニストのヒト喘息患者における効力を予測する、ロイコトリエンアンタゴニストのヒト喘息患者における効力を予測する方法。
【請求項２２】
表１、2A、2B、4A、4Bおよび5A〜5Eに記載される１つ以上の遺伝子からの遺伝子産物の発現レベルを含む発現プロフィール。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、2001年９月６日に出願された米国出願第09/947,991号の一部継続出願である。上記出願の全ての開示が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の背景
薬理遺伝学の分野は、遺伝的変異により引き起こされる投薬の効果における差異を測定する。かかる差異は、薬物の治療効果または有害事象における差異により明らかになる。ほとんどの薬物について、非応答者から薬物応答性患者を潜在的に特徴づける遺伝的変異は不明なままである。
【０００３】
発明の要旨
本発明は、喘息および関連する炎症状態の処置に対する患者の応答性を測定する方法に関する。
【０００４】
ある態様では、本発明は、患者から細胞のサンプルを得る工程；特異的なメディエータでの細胞のインビトロ調節の非存在下および存在下でのサンプルの遺伝子発現プロフィールを得る工程；およびサンプル発現プロフィールと参照発現プロフィールとの間の類似性が患者における炎症性疾患を処置するための薬物の効力を予測するように、サンプルの遺伝子発現プロフィールと参照遺伝子発現プロフィールとを比較する工程を含む、ヒト患者における炎症性疾患の処置のための薬物の効力を予測する方法に関する。参照遺伝子発現プロフィールは、表１、2A、2B、4A、4Bおよび5A〜5Eに列挙される１つ以上の有益な遺伝子（informative gene）の発現レベルを含みうる。サンプル発現プロフィールと参照発現プロフィールとの間の類似性は、患者における炎症性疾患を処置するための薬物の効力を予測する。特定の態様では、サンプルは、サンプルの遺伝子発現プロフィールを得る前に炎症性疾患を処置するために薬物に曝される。特定の態様では、サンプルは、サンプルの遺伝子発現プロフィールを得る前に炎症性疾患を処置するために薬物に曝される。炎症性疾患は、喘息、アトピー、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患（IBD）および敗血症でありうる。アトピー性炎症性疾患は、鼻炎、結膜炎、皮膚炎および湿疹でありうる。薬物は、喘息については、副腎皮質ステロイド、β2-アゴニストおよびロイコトリエンアンタゴニストでありうる。さらに、炎症性疾患について、薬物は、炎症性疾患状態のための症状軽減剤または抗炎症性薬物でありうる。ある態様では、細胞のサンプルは、末梢血単核細胞または好中球に由来しうる。特定の態様では、サンプルの遺伝子発現プロフィールは、例えば、マイクロアレイに含まれるオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションアッセイを用いて得られ得る。別の態様では、サンプルの発現プロフィールは、有益な遺伝子のタンパク質産物を検出することにより得られ得る。タンパク質産物の検出は、例えば、上記有益な遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合しうる抗体の使用を含みうる。参照発現プロフィールは、例えば、健康な非アトピー性、非喘息性個体に由来する細胞のものでありうる。別の態様では、参照発現プロフィールは、炎症性疾患を有さない患者に由来する細胞のものでありうる。ある態様では、細胞は、発現プロフィールが得られる前に薬物候補で処理される。
【０００５】
さらに別の態様では、本発明は、喘息性患者における糖コルチコイド感受性に関するスクリーニング方法に関し、患者から細胞のサンプルを得る工程；特異的サイトカイン（メディエータ）での細胞のインビトロ活性化の非存在および存在下でサンプルから遺伝子発現プロフィールを得る工程；およびサンプルの遺伝子発現プロフィールと参照遺伝子発現プロフィールとを比較する工程を含み、ここで、サンプルと参照プロフィールとの間の発現プロフィールにおける類似性は、サンプルが得られた患者において糖コルチコイド感受性を示す。
【０００６】
さらに別の態様では、本発明は、ロイコトリエンアンタゴニストのヒト喘息患者における効力を予測する方法に関し、患者から細胞のサンプルを得る工程；特異的メディエータでの細胞のインビトロ調節の非存在下および存在下でサンプルから遺伝子発現プロフィールを得る工程；およびサンプルの遺伝子発現プロフィールと参照遺伝子発現プロフィールとを比較する工程を含み、ここで、サンプルと参照プロフィールとの間の発現プロフィールにおける類似性はロイコトリエンアンタゴニストのヒト喘息患者における効力を予測する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、表１、2A、2B、4A、4Bおよび5A〜5Eに記載される１つ以上の遺伝子から遺伝子産物の発現レベルを含む発現プロフィールに関する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、モンテルカスト（a.k.a.,SINGULAIRTM; Merck, Whitehouse Station, NJ）、ザフィルルカスト（a.k.a.,ACCOLATETM, AstraZeneca, Wilmington, DE）、およびジレウトン（a.k.a., ZYFLOTM;Abbott Laboratories, Chicago, IL）を含むロイコトリエンアンタゴニストのヒト喘息患者における効率を予測する方法に関し、患者から細胞のサンプルを得る工程；特異的なメディエータでの細胞のインビトロ調節の非存在下および存在下でサンプルから遺伝子発現プロフィールを得る工程；およびサンプルの遺伝子発現プロフィールと参照遺伝子発現プロフィールとを比較する工程を含み、ここで、サンプルと参照プロフィールとの間の発現プロフィールにおける類似性は、ロイコトリエンアンタゴニストのヒト喘息患者における効力を予測する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載される方法に従ってヒト患者における炎症性疾患の処置のための薬物の効力を予測するためのキットに関し、予め決定された有益な遺伝子に対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズしうるハイブリダイゼーションプローブおよびハイブリダイゼーションを検出するための試薬を含有する。別の態様では、本発明は、本明細書中に記載される方法に従ってヒト患者における炎症性疾患を処置するための薬物の効力を予測するためのキットに関し、予め選択された有益な遺伝子のタンパク質産物に特異的に結合しうる抗体および抗体結合を検出するための試薬を含有する。
【００１０】
特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラーの図面を含む。カラー図面を有する本特許または特許出願の公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いにより特許庁により提供される。
【００１１】
本発明の前述および他の目的、特徴および利点は、付随する図面に示されるように、以下の本発明の好ましい態様のより詳細な記載から明らかである。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様の記載が続く。
【００１３】
本発明は、喘息患者における薬物処置の効力を予測する方法および炎症性疾患の処置において有用な薬物候補のスクリーニング方法に関する。喘息を処置するための現在の方法は、副腎皮質ステロイド、β2-アゴニストまたはロイコトリエンアンタゴニストの使用を含む。喘息は数年間これらの方法により処置され、喘息患者の有意な画分は処置に対して耐性である。喘息の処置方法に関連する危険性があるので、処置に応答する患者の同定は重要である。本明細書中に記載される方法は、非応答患者と比べて応答患者において差次的に発現される遺伝子を同定するために使用され、それにより、処置に応答する患者の好都合な決定が可能になる。患者サンプルから得られる培養細胞において活性化する方法、および上記培養細胞を薬物スクリーニングおよび発現プロフィールの入手に利用する方法が本明細書中に記載される。
【００１４】
喘息、または可逆性閉塞性気道疾患（ROAD）は、肺の気道が狭くなるか、または完全に遮断される状態であり、正常な呼吸が妨害され、より重篤な健康問題に至る可能性がある。正常な気道は、アレルゲンまたは刺激物に応答して狭窄する可能性を有するが、喘息の気道は、過敏または過反応性である。刺激に応答して、気道は、以下：気道の周囲の筋肉の収縮；気道の炎症および膨潤；または気道をふさぐ粘液産生の増大のいずれか１つによりふさがれる。気道が一旦ふさがれると、そこに空気を無理矢理通そうとする試みがより多くなされ、その結果、呼吸が困難になる。ふさがれた気道から吐き出すことが困難であるので、過剰な古い空気が各々の呼吸後に肺に残る。この古い空気の蓄積は、各々の新たな呼吸で得られ得る新鮮な空気の量を減らし、全身に利用可能な酸素が減るだけでなく、肺内の高濃度の二酸化炭素が血流を酸性にする。喘息が未処置のままである場合、血液中のこの酸性度は、毒性レベルに上昇しうる。
【００１５】
喘息は、呼吸における困難さを引き起こし、より重篤な問題に至り得、喘息に関連する肺閉塞は、自発的または投薬により可逆的である。喘息患者は、炎症および喘息症状を減らすために副腎皮質ステロイド、気管支拡張剤およびロイコトリエンアンタゴニスト等の抗炎症性薬剤を服用ししうる。
【００１６】
副腎皮質ステロイドは、「ステロイド」とも呼ばれる。このタイプの薬剤は、能力を増大させるためにいくらかの運動選手により誤用されるアナボリックステロイドとは関係がない。むしろ、副腎皮質ステロイドは、1948年以来、喘息およびアレルギーのための処置として使用されている。それらは、気道炎症および気管支の膨潤を減少させる；気管支の管壁細胞による粘液産生を減少させる；気道における過剰反応（過敏症）の連鎖を減少させる；他の薬物への気道平滑筋の応答を補助する。副腎皮質ステロイドは、吸入器の使用による、局所、経口、または注射による等の種々の経路で投与されうる。局所調製物（または皮膚または気管支の管壁等の特定の表面領域への）は、クリームまたはスプレー（吸入器）として適用されうる。副腎皮質ステロイド吸入器は、日周で中程度または重篤な喘息症状を有する患者に勧められる。経口用副腎皮質ステロイドおよび注射用副腎皮質ステロイドは、一般に重篤な喘息症状を有する患者にのみ処方される。
【００１７】
副腎皮質ステロイドの使用は、数年間で一般的になっているが、それらは常に効果的であるわけではなく、重大な副作用が起こる。いくらかの人々は、副腎皮質ステロイド吸入器の使用から嗄声および鵞口瘡（口および喉の真菌感染）の小さな副作用を経験する。また、吸入用副腎皮質ステロイドの長期間の使用は、子供の成長速度の減少に関係づけられている。経口用副腎皮質ステロイドは、吸入用副腎皮質ステロイドよりも大きな副作用を有しうる。経口用副腎皮質ステロイドは、他の処置が正常な肺機能の回復に失敗し、非管理の喘息の危険性がステロイドの副作用よりも大きい場合にのみ長期間処方されている。例えば、プレドニゾン、最も一般的に処方される副腎皮質ステロイドの１つは、体重増加、食欲増加、月経不順および痙攣、胸やけ、および消化不良の副作用の可能性を導きうる。いくらかの患者は、コルチゾンタブレットの用量が減少した場合に活動力の減少、食欲減少、重篤な筋肉痛または関節痛を経験する。長期間の経口副腎皮質ステロイドの使用は、潰瘍、体重増加、白内障、脆い骨および皮膚、高血圧、血糖値の上昇、容易な挫傷および子供の成長の減少等の副作用を引き起こしうる。かかる副作用は、喘息患者における副腎皮質ステロイド治療の効力を正確に評価する必要を指摘する。
【００１８】
気管支拡張剤（「β2-アゴニスト」とも呼ばれる）は、喘息症状を直ちに軽減するための短期間の「救助」薬剤としてしばしば使用される非ステロイド性抗炎症薬剤である。気管支拡張剤としては、アルブテロール、ビトルテロール、プルブテロールおよびテルブタリンが挙げられる。さらに、サルメテロールは、喘息を管理するために抗炎症剤ともに長期間基礎での使用が意図される長期間作用するβ2-アゴニストである。サルメテロールを使用する患者は、気分が良くても症状を予防するために日周基礎で薬剤を服用すべきである。散発的に効果的ではあるが、気管支拡張剤は重篤な喘息の症例では典型的には有用ではない。
【００１９】
気道炎症の原因に関連する細胞の多くは、「ロイコトリエン」と呼ばれる体内のシグナル伝達分子を産生することが知られている。ロイコトリエンは、気道平滑筋の収縮を担い、肺の血管から液体の漏出を増大させ、さらに気道に他の炎症細胞を攻撃させることにより炎症を促進させる。経口用抗ロイコトリエン薬剤は、アレルギー疾患を代表する炎症応答と戦闘するように導入されている。これらの薬物は、慢性喘息の処置に使用される。最近のデータは、処方される抗ロイコトリエン薬剤が喘息を有する多くの患者にとって有益でありうるが、有意な数の患者が抗ロイコトリエン薬物に応答しないことを示している。
【００２０】
本発明は、喘息等の炎症性状態を処置するために使用される薬物の処置結果を決定する方法に関する。この方法は、患者から得られたサンプル中において差次的に発現される遺伝子の同定により、研究下での薬物の臨床応答性に関連する。本明細書中で「有益な遺伝子」と呼ばれる特定の遺伝子は、疾患状態（例えば、喘息）を模倣するように誘導された細胞、または喘息または他の炎症性疾患を有すると診断された患者由来の組織サンプルにおいて同定される。有益な遺伝子は、例えば、誘導された遺伝子発現に対する非誘導細胞との比を決定し、不定の薬物感受性を有する患者間で結果を比較することにより同定されうる。あるいは、有益な遺伝子は、疾患における遺伝子発現対正常組織サンプルの比に基づいて同定され得、または薬物応答性を同定するために使用される有益な遺伝子の場合には、有益な遺伝子は、薬物に曝された細胞対薬剤に曝されていない細胞における遺伝子発現の比により同定され、認定される被験体において、薬物に対して応答する者対薬物に応答しない者として同定されうる。1.0の比は、上記遺伝子が両方のサンプルにおいて同じレベルで発現されることを示す。１より大きい比は、正常細胞または非誘導細胞を越える発現の増大を示し、一方、１より小さい比は、正常または非誘導細胞と比べて発現の減少を示す。
【００２１】
サブセットまたは全ての有益な遺伝子は、応答患者対非応答患者に関する「発現プロフィール」を作成するために遺伝子発現についてアッセイされうる。本明細書中で使用される「発現プロフィール」は、１つ以上の時間点の細胞の所定のサンプルにおける１つ以上の有益な遺伝子の、遺伝子発現のレベルまたは量をいう。「参照」発現プロフィールは、発現プロフィールが特定の条件の特徴を示すように特定の条件下で有益な遺伝子の特定のセットのプロフィールである。例えば、表１、2A、2B、4A、4Bおよび5A〜5Eに示される有益な遺伝子の発現を定量的に記載する参照発現プロフィールは、薬物処置応答性に関する参照発現プロフィールとして使用されうる。ある態様では、発現プロフィールは、差次的発現を示す50個の有益な遺伝子からなり、高い正確性をもって薬物に対する応答性を予測するのに十分な能力を提供する。他の態様は、例えば、約５個の有益な遺伝子、約25個の有益な遺伝子、約100個の有益な遺伝子、または約５〜約400個の有益な遺伝子の範囲のいずれかの数の遺伝子を含む発現プロフィールを含みうる。発現プロフィールにおいて使用される有益な遺伝子は、正常細胞よりも増大した発現または正常細胞に対して減少した発現を示す遺伝子でありうる。発現プロフィールを作成するために使用される有益な遺伝子の特定のセットは、例えば、最も大きな程度の差次的発現を示す遺伝子でありうるか、またはそれらは、ある程度の差次的発現を示す遺伝子のいずれかのセットであり得、薬物に対する応答性を正確に予測するのに十分な能力を提供する。選択される遺伝子は、正常細胞と比べて疾患、薬物応答性、または薬物感受性である細胞において差次的に発現されることが決定され、薬物に対する応答を予測する能力を付与するものである。患者由来の組織サンプルとこれらの参照発現プロフィールとを比較することにより、特定の疾患に対する患者の感受性、薬物-応答性、または薬物耐性が決定されうる。
【００２２】
発現プロフィールの作成は、有益な遺伝子からの発現を定量する方法およびスクリーニング対象の有益な遺伝子の決定の両方を必要とする。本発明は、細胞における遺伝子産物の発現レベルに影響する個体における特異的な変化のスクリーニングを記載する。本明細書中で使用される「遺伝子産物」は、特定の遺伝子座位に由来する転写または翻訳産物である。「遺伝子座位」は、コード配列および調節、隣接およびイントロン配列を含む。発現プロフィールは、細胞に存在する有益な遺伝子から生じる遺伝子産物のレベルの記述である。細胞のサンプルに由来するいくつかの遺伝子産物の発現レベルを迅速に決定する方法が当業者に現在利用可能である。例えば、数千の遺伝子のmRNA産物に相補的な短いオリゴヌクレオチドが、固相に化学的付着され（例えば、「遺伝子チップ」）、「マイクロアレイ」が作製される。遺伝子チップの具体例としては、Hu95GeneFL(Affymetrix,Santa Clara, CA)および6800ヒトDNA遺伝子チップ（Affymetrix, Stanta Clara, CA）が挙げられる。かかるマイクロアレイは、マイクロアレイ（Affymetrix,Stanta Clara, CA）にハイブリダイズしうるmRNA分子の相対量を決定するために使用されうる。このハイブリダイゼーションアッセイは、細胞サンプルにおける遺伝子発現の迅速な決定を可能にする。あるいは、タンパク質遺伝子発現産物を検出するための種々のイムノアッセイの方法が当業者に知られている。かかる方法は、例えば、特定の有益な遺伝子の遺伝子産物に特異的な抱合型抗体によるものでありうる。
【００２３】
有益な遺伝子は、例えば、データベーススクリーニングにより特定の特徴、例えば、糖コルチコイド感受性（GC-S）または糖コルチコイド耐性（GC-R）を有すると同定された個体から得られたサンプル中で同定されうる。さらに、培養細胞において同定された有益な遺伝子は、特定の薬物処置に対して応答性であるかまたは非応答性である既知の喘息患者のサンプルから発現プロフィールを得ることにより確認されうる。患者からサンプルを得ることおよびサンプルが得られた個体の家系および病歴について特定のデータベースを検索することの組み合わせの例は、本明細書中ではアイスランドの遺伝的に単離された集団について記載される。
【００２４】
アイスランドの集団は、特定の障害に関連する遺伝子エレメントを同定するための独自の機会を提供する。独自の機会は、少なくとも３つの状態：１）アイスランドの集団は遺伝的に単離されている；２）詳細な家系の記録が入手可能である；および３）詳細な医療記録が1915年の日付まで遡って保存されているために利用可能である。応答対非応答性患者における差次的に発現された遺伝子の同定は、患者の過去の家系および個体に由来するサンプルから得られたデータに加えて近親者の医療記録の調査後に起こる。
【００２５】
家系および医療記録の調査は、特定の特徴を示す家族歴を有する現代の個体を同定する。例えば、個体は、喘息であり、特定の喘息薬物処置に対して応答することが見出され得、家系のデータベースの調査は、本当に個体の近親者が、集団の残りよりも平均して、同じ特徴を示すことが確認されうる。従って、問題の個体が同様に応答性および非応答性患者を同定するために使用されうる遺伝的決定因子を有するようであるという不確かな結論が引き出されうる。この個体から得られたサンプルは、他のかかる個体から得られたサンプルと合わせて、続いて参照発現プロフィールを作成するために使用される有益な遺伝子を同定するために上記方法のいずれかにより遺伝子型が決定される。
【００２６】
有益な遺伝子はまた、患者サンプルに由来する細胞においてエキソビボで同定されうる。例えば、組織サンプルは患者から得られ得、このサンプルに由来する細胞はインビトロで培養されうる。細胞は、サイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子α（本明細書中以降、「TNFα」）およびインターロイキン１-β（本明細書中以降、「IL-1β」）、または他のメディエータ、例えば、ロイコトリエンレセプターアゴニスト、例えば、LTD4等の存在下または非存在下で培養されうる。本明細書中で使用される「メディエータ」は、特定の事象の分子シグナルをいう。サイトカインは、その細胞自身の機能（自己分泌効果）または隣接細胞の機能（パラ分泌効果）を変化させる目的で細胞により分泌される低分子量の薬理学的に活性なタンパク質であるメディエータのクラスの例である。ある場合には、サイトカインは循環に入り、全身的に１つ以上の効果を有する。有益な遺伝子の発現プロフィールは、サイトカインまたは他のメディエータの存在および／または非存在下でのサンプル由来細胞から得られ得、そのプロフィールは、薬物処置に対する感受性または耐性を決定するための参照発現プロフィールと比較されうる。さらに、発現プロフィールを得る前に、細胞は薬物自身の存在下または非存在下で培養されうる。
【００２７】
有益な遺伝子が一旦同定されると、有益な遺伝子の多型バリアントが決定され、多型バリアントがサンプル中に存在する（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイまたは特定の多型バリアントの遺伝子産物に特異的な抗体を用いるイムノ検出アッセイにより）ことに基づいて患者サンプルにおける障害を検出する方法に使用されうる。
【００２８】
あるいは、上記のアプローチは、培養細胞中で同定される有益な遺伝子の有用性を確認するために使用されうる。一旦同定されると、有益な遺伝子は、より遺伝的に多様な集団におけるその予測される能力に関して確認され得、アイスランドなどの遺伝的に単離された集団に加えて、集団におけるこれらの有益な遺伝子の予測能力の有用性が確実になる。
【００２９】
アイスランドの集団の「遺伝的単離」は、個体間の低い程度の対立遺伝子変化を意味する。この環境は、集団における差異をスクリーニングすることにおいてバックグラウンドを減少させる。「遺伝的に多様な」集団において、同じ特徴に寄与しうる多くの差異が個体間に現れる。例えば、喘息薬物処置に応答する個体の調査は、非応答性抗体に関して有限ではあるが数多くの遺伝的差異を生じうる。しかし、遺伝的に多様な集団において、これらの遺伝的差異の大多数は、集団の多様性のために検出された「アーチファクト」またはバックグラウンド「ノイズシグナル」である。遺伝的に単離された集団については、より少ない差異が２つのグループ間で見出されることが予測され得、発見される差異が問題の特徴（この場合、喘息薬物処置に対する応答性）に直接関係するようである高い可能性を提供する。一旦、遺伝的に単離された環境において決定されると、有益な遺伝子の有用性および有益な遺伝子に基づく発現プロフィールは、遺伝的に多様な集団におけるより一般的な使用のために確認されうる。
【００３０】
TNFαおよびIL-1βのレベルの上昇は、喘息および他の炎症性疾患（アトピー（例えば、鼻炎、結膜炎、皮膚炎、湿疹）、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節炎、乾癬、IBDおよび敗血症を含むがこれらに限定されない）の特徴であるので、これらのサイトカインの細胞レベルの上昇を示す細胞は、関連する炎症性疾患に対する薬物効力を決定するために使用されうる。本明細書中で使用される「効力」は、効果的でない（非応答）から完全に効果的であるまでの有効性の範囲、および２つの極端間の程度を記述する。本発明は、一部では、喘息または関連する炎症性状態を有する患者から単離された活性化された末梢血単核（PBM）細胞または好中球の遺伝子発現プロフィールと活性化された対照（非喘息）PBM細胞または好中球の遺伝子発現プロフィールとを比較することに関する。本明細書中で使用される「活性化」は、サイトカインまたは喘息もしくは関連する炎症性疾患疾患の他のメディエータで細胞を処理することをいう。かかる活性化は、TNFαおよびIL-1β等のサイトカインの上昇したレベルにより達成されうる。患者サンプルに由来する活性化された細胞は、薬物候補をスクリーニングするため、ならびに喘息および他の炎症性疾患を診断するのに有用なサンプルおよび参照発現プロフィールを提供するために使用されうる。
【００３１】
TNFαおよびIL-βの細胞レベルは、当該分野で公知の種々の方法により増大されうる。例えば、PBM細胞、好中球、滑膜細胞または気道平滑筋（ASM）細胞等の培養中で増殖した哺乳動物細胞は、これらのサイトカインが細胞に取り込まれるように単離され、精製されたTNFαおよびIL-1βに曝されうる（典型的には、培養物中５ng/mLの濃度のTNFαおよび１ng/mLの濃度のIL-1βの約４時間の曝露は、培養細胞において喘息誘発（pro-asthma）様症状を生じる）。培養物中で増殖した細胞のサイトカインの発現のための他の方法（例えば、発現ベクターにクローン化された遺伝子のトランスフェクション）は、当該分野で公知である。
【００３２】
本明細書中に記載される細胞において誘導される炎症誘発様症状により模倣されるように、TNF関連症状または疾患としては、炎症性疾患または障害、感染、神経変性疾患、悪性症状、悪液質症候群および所定の型の肝炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
炎症性疾患または障害としては、限定されないが、慢性関節リウマチ（RA）、若年性慢性関節炎（JCA）、乾癬、対宿主性移植片病（GVHD）、強皮症、糖尿病、アレルギー等の急性および慢性免疫性および自己免疫性症状；限定されないが、腎移植、心臓移植、骨髄移植、肝移植、膵臓移植、小腸移植、肺移植および皮膚移植等の同種間移植に関連する喘息、急性または慢性免疫疾患；限定されないが、サルコイドーシス、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、およびクローン症状または病等の慢性炎症性症状；限定されないが、汎発性血管内凝固、アテローム動脈硬化症、川崎病および限定されないが、結節性多発性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、巨細胞性動脈炎および腎臓の顕微的脈管炎等の脈管炎症候群等の脈管炎症性症状；慢性活性肝炎；シェーグレン病；乾癬性関節炎；腸疾患に基づく関節炎；反応性関節炎および炎症性腸疾患に関連する関節炎；およびブドウ膜炎が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
感染としては、敗血症症候群、悪液質（例えば、TNFα媒介性影響）、循環虚脱ならびに急性および慢性細菌感染、急性および慢性寄生生物性および／または感染性疾患、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）等の細菌、ウイルスまたは真菌に由来するショック、後天性免疫不全症候群（AIDS）（悪液質、自己免疫障害、エイズ痴呆複合症および感染を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３５】
神経変性疾患としては、多発性硬化症および急性横断脊髄炎等の脱髄性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
悪性症状は、TNFα分泌腫瘍または例えば、白血病（急性、慢性骨髄性、慢性リンパ性および／または脊髄形成異常症候群）およびリンパ腫（悪性リンパ腫（バーキットリンパ腫または菌状息肉腫）等のホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）等のTNFαに関連する他の悪性疾患に関する。
【００３７】
悪液質症候群および他の症状および過剰のTNFαに関連する疾患としては、癌の悪液質、寄生生物性疾患および心不全が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
上昇したレベルTNFαはまた、アルコール誘導性肝炎および他の型の慢性肝炎を含むがこれらに限定されない所定の型の肝炎に関連する。
【００３９】
当業者は、本明細書中に記載される方法を利用するのに必要な試薬はキットに含まれうることを認識する。記載されるような試薬は、市販されているか（例えば、緩衝溶液、化学試薬）、または当該分野で公知の方法により作製される（例えば、オリゴヌクレオチド、抗体、検出のためのリガンド）。従って、当業者は、キットが適切な区画に、例えば、本明細書中に記載される方法の実施を可能にするために必要な全ての試薬、プローブ、および材料を含んで作製されうることを認識する。
【００４０】
本発明を、以下の非限定的な実施例に関してさらに記載する。本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および全ての他の刊行物およびウエブサイトの教示は、参照により全体として取り込まれる。
【実施例】
【００４１】
実施例１．ヒト患者における発現プロフィールの予測値
喘息は、変動する表現型を有する一般的な複合疾患である。喘息の基礎となる細胞および分子機構はほとんどわからないままであるが、多面発現性サイトカイン、IL-1βおよびTNFαの増加したレベルが、喘息の病態生理学および様々な他の炎症性障害に関係している(Broide, D.ら、1992,J. Allergy Clin. Immunol. 89:958-967;Arend, W.,2001,Arthritis Rheum 45:101-106)。
【００４２】
一般母集団において一般的であり、薬物に対して変動する反応と共に、強いが複雑である遺伝子の成分を有することが示されている喘息などの疾患が、薬理遺伝子研究のための理想の候補疾患標的を有することが広く受けいれられている。後者は、個々の特定の治療の最適化ならびに薬物開発のための新規標的の提供において非常に有望である。現在使用されている薬物は全ての患者に有効ではなく、患者の高い割合において症状の再発が生じ、時々激しい有害な副作用を有するので、喘息患者の改良された、好ましくは予防的治療が所望される。DNAマイクロアレイを用いる単一アッセイにおける数千の遺伝子の発現レベルを解析する能力は、複数の分子遺伝子経路の強力な同時スクリーニングを可能にし、薬物に応じて個体の変動を決定する酵素、キナーゼ、イオンチャンネル、および他のシグナル伝達因子をコードする遺伝子における種々の発現を解析しうる。
【００４３】
したがって、高密度DNAマイクロアレイ解析を用いて、GC-SおよびGC-R喘息患者から新しく単離したPBM細胞のmRNA発現における差異を同定した。mRNAをベースライン(T0)でならびにIL-1βおよびTNFαの組み合わされた効果に対して試験した。さらに、GCの応答に寄与しうるこれらの遺伝子をさらに解明するための試みにおいて、本発明者らは、IL-1βおよびTNFαにより活性化される細胞における変化した遺伝子発現に対するGC処置の効果を試験した。この戦略を使用するための原理は、２つのよく確立された概念に基づいた。第１に、喘息の症状は、IL-1βおよびTNFαの作用を介して機械的に導かれる。第２に、糖コルチコイドは、プロ炎症性サイトカインにより調節される遺伝子の発現を変更することにより喘息患者において作用する。この結果は、1)調査した12,600個の遺伝子のうち、ナイーブベイジアン分類(naive Bayesian classifier)に基づくアルゴリズムにより選択された50個の遺伝子は、トレインされた(trained)14GC-Rおよび14GC-S患者の正しいGC-R表現型を82％の精度で予測した；2)26GC-R喘息患者の第２コホートが試験された場合、分類の予測精度は86％であった、ならびに；3)選択された遺伝子間に、GC応答の調節に潜在的に関連する数個の細胞シグナル伝達分子、転写因子およびプロ炎症性分子があったことを説明する新しい証拠を提供する。これは、高い精度で喘息患者における糖コルチコイドに対する応答を予測するのに十分な能力を提供するGC-RとGC-S患者とを識別する新しく単離されたPBM細胞における遺伝子発現プロフィールを用いる第１の証明である。
【００４４】
方法および材料
患者。研究した患者母集団は、アイスランドの国立大学病院のアレルギー／免疫学部門の開業アレルギー専門医の私立診療所および外来患者診療所から選択した。全1185人の患者記録を表現型情報について選抜し、患者の家族関係を決定するためにアイスランド家系データベースに関して分析した。吸入糖コルチコイド医薬を使用している喘息の診断を保有する患者を、さらに評価した。18〜70歳の54人の患者を、最初にランダムに補充して参加させ、２つのコホートに分けた。第１コホートは、喘息またはアトピーの徴候を持たず、吸入GCまたはいずれの他の医薬も使用していない14人の対照被験体と共に14人のGC-Sおよび14人のGC-R患者からなった。26人のさらなる患者をまた集め、予測分類のための第２コホートとして使用した。続いてこの研究を96人の患者(60人のGC-Sおよび36人のGC-R)を含むように拡張し、そのうち88人は、３個のインビトロ治療条件（ベースライン、GCの不在または存在下におけるIL-1β/TNFα）を全て完了した。続いて各コホートを等しい大きさの２個のサブコホートにランダムに分けた。ランダムな分割を10回行って、トレーニングセットにおいてGC-S患者からGC-R患者を検出する最も有益な(informative)遺伝子を、等しい大きさの独立した患者セットに対する予測変数(predictor)として用いた。患者に、β2-アドレナリン作動性薬物およびロイコトリエンアンタゴニストを短い作用および長い作用の両方で使用した。全薬物の医薬投与を、２週間変化せずに保ち、患者はPBM細胞発現研究のための血液の提供の前に最小４週間経口GCを絶たなければならなかった。発現アレイ研究を知らない1人の医者が、全患者を表現型分類した。身体検査の完了、薬物応答表現型の確認、および研究における彼／彼女の参加を認可するインフォームドコンセントの際に、患者に研究のための血液試料の提供を頼んだ。対照被験体においては試験を行わなかった。40nlのEDTA血液を集め、以下に記載した実験研究のために、残りの血液から末梢血液単核(PBM)細胞を単離した。
【００４５】
研究包含基準。患者が研究に入るために満たさなければならない基準は、以下を含む：
喘息は、アレルギー専門医／肺専門医により診断された。アイスランドにおいて喘息を診断するために使用したアプローチは、NHLBおよび米国胸部学会により概略を述べられた診断喘息基準のもの（国立衛生研究所。1997。喘息の診断および治療技術のためのガイドライン：ExpertPanel Report 2, 1997年7月, U.S. Government Printing Office, Washington, DC. NIHPublication No.97-4051; American Thoracic Society. Standardization ofSpirometry, 1994(改訂), Am J. Resp. Crit. Care. Med. 1995, 152:1107-1136）と一致し、ならびに任意の以下の測定を含む：
２年より多く咳および喘鳴音の再発症状を有し、気管支拡張療法に対する臨床応答（気管支拡張後、１秒当たりの努力呼気肺活量(FEV1)において＞15％増加が測定される）を示す患者
気管支拡張療法前にベースラインで減少したFEV1(FEV1＜80)を有し、気管支拡張療法後にFEV1において＞15％改善を示す患者
咳および喘鳴音の再発症状を有し、ATSガイドラインに従って行なったメタコリンチャレンジ試験に対し、メタコリン濃度＜8mgでFEV1において＞20％低下を生じる患者
メタコリンチャレンジ試験をFEV1＞70を有する患者において得た。さらに、アイスランドにおいて12個の最も一般的な空気アレルゲンに対する皮膚試験および総IgEレベルを得、鼻炎の病歴および臨床徴候を記録した。GCに対する臨床応答を決定した同じアレルギー専門医により全患者を再調査した。
【００４６】
吸入糖コルチコイドに対する応答。糖コルチコイド感受性(GC-S)または糖コルチコイド耐性(GC-R)のいずれかとして患者を分類した。以下の基準の任意の２つ以上の組み合わせは、GC-S患者における糖コルチコイド応答を規定した(Barnes,P.ら、Am. J. Resp. Crit. Care. Med., 1998. 157:S1-S53)：
推奨される治療用量（1000mgまでのFluticasone；800mgまでのBudesonide；または1000mgまでのBeclomethasone、これらが患者によって使用された３個の吸入GC薬物であった）で吸入GCを摂取した場合の喘息症状（咳および喘鳴音）の良好な管理。
８週間以上の治療用量の吸入GC後、改善された運動耐性および／またはより少ない憎悪。
８週間以上の吸入GC後、改善された最大流量および／または肺活量測定値。
８週間以上の吸入GC療法後、標準の質問事項に対する患者の返答により判断した生活／満足のいく状態の改善された質。
【００４７】
GC-R患者は、治療用量で吸入GCを用いた場合、上記測定における改善を経験しなかった。GC-R患者に１日当たり＞2,000mgの吸入Fluticasone（または等価の用量のBudesonideもしくはBeclomethasone）を試みた。研究した全GC-R患者は、GC療法に対して穏やかであるかまたは激しい耐性を有した。GC-RおよびGC-S患者をランダムに10回各々２つのコホートに分け、ここで１つのセットをトレーニングのために使用し、他の患者セットを、独立したセットのための予測変数を作製するために使用した。
【００４８】
研究排除基準。研究排除基準を、以下に概略を述べる：
効力の評価または有害な効果の発生を妨げうる療法は、以下を含む：
他の調査薬物
同時医薬（β2-アドレナリン作動性アゴニストまたは抗ロイコトリエン薬物以外）。
効力の評価または有害な効果の発生を妨げうる疾患または状態は、以下を含む：
妊娠または乳汁分泌期
過去における喘息薬物に対する過敏症または激しい有害な経験
アスピリン感受性喘息
職業喘息
研究薬物またはその成分に対する感受性
医薬に対するコンプライアンスが疑問である。
【００４９】
患者保護測定／インフォームドコンセント手順。登録した96人の喘息患者は、研究基準を満たす1185人の喘息患者のリストからランダムに選択した。患者の返答-および参加率は、95％を超えた。全患者は、インフォームドコンセントにサインし、血液試料を提供し、質問事項および適切な表現型に必要な全試験を完了した。この研究は、アイスランドデータ保護委員会および国立生命倫理委員会により承認された。続いて、アイスランドのデータ保護委員会は、患者およびその家族のメンバーについて個人の情報を暗号化した(Gulcher,J.およびStefansson, K. Clin. Chem. Lab. Med. 1998, 36:523-527)。全血液およびDNA試料もまた患者のプライバシーの保護のためにコード化した。
【００５０】
遺伝子マイクロアレイ発現の評価。96人の喘息患者を研究包含基準にしたがって補充した。上記臨床および実験パラメーターの両方を計算に取り入れる関数をスコアすることにより、GC応答を測定した。PBM細胞(PBMC)を、標準化Ficoll法により単離した。PBMCをカウントし、FITC-コンジュゲート抗CD3モノクローナル抗体(mAb)、PE-コンジュゲート抗CD19mAb、およびFITC-コンジュゲート抗CD14mAbで染色し、フローサイトメトリーにより調査して、各細胞型の相対寄与を決定した。次いで、細胞を、１条件当たり約6×106細胞を有する３つの処置条件に分けた（ベースライン、IL-1β／TNFα処置およびGCの存在下でのIL-1β／TNFα処置）。その後、12,600個のDNAオリゴヌクレオチドを含むヒトHu95-A遺伝子チップ(Affymetrix,Santa Clara, CA)を使用する遺伝子マイクロアレイ技術を用いて、単離したPBMC中で複数の遺伝子mRNA発現を試験した。簡単には、あわされたIL-1β(1ng/mL)およびTNFα(5ng/mL)に、またはDEX(10-6M)を用いた1時間の前処理の不在下および存在下で培地のみに4時間細胞を曝露し、RMPI-1640培地中で5％CO2／95％空気の加湿雰囲気にて37℃で維持した。細胞のインキュベーション後、マイクロアレイ発現解析のために使用した全RNAを抽出し、製造者により推奨される市販の試薬を用いて精製した。全RNAをTrizolを用いて抽出し、QiagenRNAEASYスピンカラム(Qiagen GmbH2, Germany)を用いて精製した。約5μgのRNAを第１および第２鎖cDNA合成に使用した。沈殿後、当該分野で公知の方法によりcDNAをcRNAに転写した。続いて、ビオチン標識cRNAを、製造業者にしたがってAffymetrix遺伝子チップ(Affymetrix,Santa Clara, CA)に一晩ハイブリダイズした。高ストリンジェンシー洗浄により、非結合プローブを除去した。ハイブリダイズしたチップをストレプトアビジン-PE複合体を用いて発達させ、スキャンした。次いで、スキャンした画像をAffymetrixソフトウエアを用いて解析し、市販のソフトウエアプログラムを用いてデータを調査した(AsherB. J. Mol. Graph Model. 2000, 18:79-82)。AvDiff値をAffymetrixソフトウエア出力により規定した。未処理PBMCのものを超えるサイトカインで処理したPBMCに由来するRNAのAvDiff値の比率としてフォールド変化(Fold change)を規定した。Affymetrix遺伝子チップに由来するmRNA発現値を数個の遺伝子に関連づけるために速度論PCRを使用した。
【００５１】
発現データセットの正規化。全遺伝子に対する未処理の発現データを、チップの整えた(trimmed)平均(98 ％) 発現値に正規化し、全チップに対する正規化した発現値を500にセットした(Hu, J. ら、2000. Ann. N.Y. Acad. Sci.，919:9-15)。遺伝子を、試料の様々な処理の間に安定であることを見出した20個の対照（ハウスキーピング）遺伝子のセットに対してまた正規化した。この分析は、PBM細胞において発現した全遺伝子、より具体的にはインビトロサイトカイン刺激により有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされ、続いて糖コルチコイド処置により逆転した全遺伝子に焦点を当てた。次いで、予測分類をこれらの遺伝子に適用した。３つの別々のアプローチを予測遺伝子シグナルを探すために用いた：1)ベースライン発現値のみ；2)サイトカインへのインビトロ曝露に応答する発現値；ならびに3)GC前処理の存在下でサイトカインに応答する発現値。選択バイアス(selectionbias)に対する可能性を最小にするために、独立セットに対しておよび交差検証法(cross validation)法を用いて両方で予測を行なった(Ambroise,C. およびMcLachlan, G., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:6652-6566)。
【００５２】
ナイーブベイジアン分類による薬物応答表現型の分類。ナイーブベイジアン分類(前に情報を与えたものとは異なる)(Duda, R.およびHart, P., Pattern Classification andScene Analysis. 1973, New York: John Wiley)を適用し、薬物応答表現型の分類が少数の有益な遺伝子についての発現値により達成されうるかどうかを試験した。表現型間の識別に関連性があると思われる遺伝子を選択することにより分類がトレインされる(Kellner,A.ら、DNAアレイ発現データのベイジアン分類。Technical report, Department of Computer Science and Engineering,University of Washington, August, 2000)。新しいケースが分類に存在する場合、遺伝子ｇについて観察された帰属(attribute)値xgは、与えられたケースが糖コルチコイド感受性である見込み：
【数１】
2005502345.tif 000002
を生じる。分類(「ナイーブ」仮定の独立下)における全遺伝子の確率の結合は、全見込み：
【数２】
2005502345.tif 000003
を与える。帰属、すなわちAvDiff値またはフォールド変化は、各遺伝子に対するトレーニングセットにおいて表現型を最適に分ける閾値を選択することにより２つのカテゴリー（低、高）に分けられる。確率P(x｜C)を、帰属値xを用いてトレーニングケースの表現型Cの分数として計算した。確率ゼロによる特異性を避けるために、ラプラス推定を使用した。すなわちさらなるケースの各表現型を、各帰属カテゴリーに加えた。
【００５３】
表現型予測のために使用される遺伝子を、遺伝子スコアとしてそれぞれ表現型GC-SおよびGC-Rを有するトレーニングケースに関して
【数３】
2005502345.tif 000004
の平均を使用して表現型間を分離する能力により選択した。最も高い全スコアを有するｎ遺伝子（すなわち、表現型GC-SおよびGC-Rに対するスコアの和）を、分類において用いた。帰属として、ベースラインおよびサイトカイン導入間のフォールド変化値を使用した。擬似フォールド変化値を避けるために、全個体についてベースラインおよびサイトカイン導入に対してAvgDiff値＞70を有する遺伝子のみを考慮に入れた。
【００５４】
Golubらにより記載された加重投票(weighted voting)法を用いる独立した患者セットの予測。GCSおよびGC-R患者コホートを、それぞれランダムに２つのコホートに分けた。ランダム分割手順を各回別の解析を用いて10回行なった。遺伝子を選択することによる以前記載したもの(Golub,T.ら、1999., Science, 286:531-537)と同様の加重投票アルゴリズムを使用する第１のコホートに対する予測器は、GC応答者の非応答者からの識別に最も関連すると思われる。加重投票アルゴリズムは、トレーニングセットにおいて得られる「有益な」遺伝子の加重一次結合を作製し、新規試料のための分類スキームを提供する。アルゴリズムの簡単な説明を以下にする。トレーニングセットにおける２つのクラス（耐性および感受性）のそれぞれに対して平均（μ）および標準偏差（ε）を最初に計算する。次いで、２つのクラス間のユークリッド距離を各遺伝子(x)について
【数４】
2005502345.tif 000005
のように計算する。各クラスの分散は、クラス平方内の標準偏差に等しく、VRS＝ε2である。次に、ほとんどの有益な遺伝子を選択するためおよび各遺伝子に対する加重の計算のために使用した測定基準は、以下ように計算される：MX＝(ED2X)/(VS＋VR)。試験試料Ｙのクラスを予測するために、各遺伝子Ｘは、各クラスに対して票を投じる：
【数５】
2005502345.tif 000006
試験Ｙの最終クラスは、(ΣWXR)および(ΣWXS)の小さい方により見出される。したがって、各遺伝子は、その測定基準に基づく票およびそのシグナルが最も近いクラスを有する。最後に最も小さい票を有するクラスが予測クラスであり、例えば、試験試料が測定時に使用しているユークリッド距離に最も近いクラスが予測クラスである。次いで、薬物応答の正確な予測が、以前記載されたような市販のソフトウエア(Shipp,M.ら、2002. Nat. Med. 8:68-74;Golub, T.ら,1999., Science, 286:531-537)を使用して、予め情報のない独立したコホートに対する遺伝子のこの限定的なセットの発現値により達成されうるかどうかを決定した。
【００５５】
k-至近隣接(Nearest Neighbor)アルゴリズムを使用する独立した患者セットの予測。k-至近隣接(k-NN)アルゴリズム(Cover,T.ら、1967.IT, 13:21-27)をまた行って、トレーニングセット中の「発現」スペースにおけるk「至近隣接」標準化試料に対する試料のユークリッド距離を計算することにより、試料のクラスを予測した。近隣のクラス帰属関係を調査し、トレーニングセットにおける各クラスの集団について調整した後、新しい試料を隣接間の最も大きな相対母集団を示すクラスに割り当てる。マーカー遺伝子選択プロセスを、標的クラスにより高度に相関する特徴にのみk-NNアルゴリズムを提供することにより行った。予測変数における使用のための遺伝子を選択するために、全遺伝子を個々に試験し、遺伝子単独における情報を用いて１つのクラスを他のクラスから識別する能力をランク付けした。各遺伝子および各クラスに対して、遺伝子に対する遺伝子発現レベルにおける全ての可能なカットオフ点は、カットオフより上または下のいずれかのクラス帰属関係を予測するとみなされる。遺伝子を、クラスの最良の予測点を基礎としてスコアした。スコア関数は、このクラス対全ての他のものに関する予測対実際のクラス帰属関係の超幾何試験(Fisher正確試験)に対するp-値の負の対数である。
【００５６】
一点除外交差検証法(Leave One Out Cross Validation)(LOOCV)を使用する予測。患者の独立セットにおけるボンフィルメーション(vonfirmation)に加えて、GC応答者を非応答者から最良に分離した遺伝子を選択し、交差検証法により試験し、ここで一人の患者をデータセットから除外し、次いで残りの患者に基づく全遺伝子から新しい予測変数を作製した。次いで、新しい予測変数を使用して、排除した試料を予測した。遺伝子選択基準を前記のように決定し、ベースラインまたはサイトカインおよびGCへのインビトロ曝露への応答における発現値に適用した。
【００５７】
試薬。cDNA Hu95遺伝子マイクロアレイチップおよびスキャナーおよびコンピューター解析ソフトウエアを含む解析システムを、Affymetrix,CAから購入した。RPM-1640培地をGibco BRL (Gaithersburg, MD) から得た。R&Dシステム(Minneapolis,MN)からIL-1βおよびTNFαを得た。DEXをSigma(St Louis, MO)から購入した。
【００５８】
結果
患者の特徴。1185人の患者を含み、その500人より多くが吸入糖コルチコイドを用いている利用できる家族クラスターから、登録患者をランダムに選択した。この研究のために補充された96人の患者のうち60人を糖コルチコイド感受性であると決定し、36人を糖コルチコイド耐性であると決定した。各群を２つのコホートに分けた。第１のコホートは、46人の患者を含み（トレーニングセット）、その30人はGC-Sであり、18人はGC-Rであった。さらなる46人の患者を独立セットと命名し、また30人のGC-S患者および18人のGC-R患者を含んだ。GC-R群における吸入糖コルチコイドの平均持続用量は、約1,600mg/日(1,000〜2,000の範囲)であった。対照的に、GC-S患者は、吸入GCの断続するかまたは低用量の療法(≦800mg/日のFluticasoneまたは同等薬物)のみを必要とした。アトピー状態と共に人口統計情報、肺機能およびメタコリンチャレンジ値を表３に示す。GC-S患者と比較した場合、喘息重篤度レベルがGC-R群においてより高いことが議論されうる一方、肺機能試験結果は、GC-R患者においてわずかにのみ低いことが注目される。表３に示されるように、雄／雌の比率およびアトピー状態はGC-R群においてより低く、一方平均年齢はより高かった。さらに、54％のGC-S患者および31％のGC-R患者は、１つ以上の空気アレルゲンに対して皮膚試験陽性であった。２つの群の間のT細胞、B細胞および単球の比において差異は観察されなかった。
【００５９】
遺伝子スコア選択遺伝子を用いるベイジアン分類の性能。この研究は、GC-R喘息患者が、ナイーブベイジアン分類を用いて、GC応答性である患者において得られるものとは異なる白血球における特異的遺伝子発現プロフィールにより同定されうるかどうかを調査した。分類をトレインして、存在すると定義され、AvgDiff発現値＞70を有したAffymetrix12,600 Hu95遺伝子チップに由来する全遺伝子を用いてGC-RおよびGC-S患者群間を最良に予測した遺伝子を選択した。後者の必要条件は、遺伝子の総数を5,011に減少した。したがって、分類は、ベースライン(BL)でまたはサイトカインもしくはGC処理に対する応答のいずれかでのAvgDiffまたはフォールド変化発現値において２群間の差異を説明する遺伝子を同定する目的で5,011個の遺伝子をトレインした。50個の遺伝子のサイトカイン処置に対する応答におけるフォールド変化mRNA発現値は、14GC-Rおよび14GC-S患者のランダムに選択されたサブグループを82％の精度で識別した。ベースライン発現値もGCに応答するフォールド変化発現も、２つの患者群間を識別する分類の能力を改善しなかった。薬物応答表現型の予測を、「交差検証法から１つを除外する」(LOOCV)方法により行い、ここで各トレーニングケースが順番に除外され、残っているトレーニングケースのみトレインした分類により予測される。次いで、正しく予測された除外されたトレーニングケースの百分率を、以前見られなかったケースの分類精度の推定値として得た。図１に見られるように、14人のGC-S患者のうち12人、14人のGC-R患者のうち11人を正しく予測した。さらに、分類を患者の全てについてトレインした場合、LOOCV法を用いる正しいGC応答表現型を決定する予測精度は、本質的に変更しないかまたは81％であった（図２）。
【００６０】
これらの50個の遺伝子が薬物応答表現型間で高精度にて識別されたので、それらはそれ自身の群内の個体に対する薬物応答表現型を予測するより強い能力を潜在的に有するであろう。したがって、これらの遺伝子が、分類をトレインるために使用しなかった患者の別のコホートの薬物応答表現型を予測する能力を調査した。図３に示されるように、分類が40GC-S対GC-R患者上でトレインされ、次いで独立した患者セットを予測するために使用された場合、得られた予測精度は86％に上がった。
【００６１】
50個の遺伝子は、GC応答者および非応答者間を識別する予測能力に寄与した。これらの遺伝子を、表１、2Aおよび2Bに分類別に示す。未知のGC応答プロフィールを有する14人の対照被験体のデータもまた含まれる。示されるように、対照群におけるmRNA発現のパターンは、GC-S患者のものに匹敵した。一般の喘息患者の90％までがGC応答者であるので、これは驚くことではない。各カテゴリーにおける遺伝子（特にCAM／ECM、細胞シグナル伝達／代謝分子、転写因子およびEST）は、GenBank寄託番号、およびサイトカインに応答して変化するmRNA発現の平均フォールド変化のそれぞれの大きさにより同定される。
【００６２】
GC応答者および非応答者の間を最も正確に識別する遺伝子シグナルが捕捉されたことを確実にするために、群を96人の患者(60GC-Sおよび36GC-R)に拡大し、交差検証法有りおよび無しでGC-SおよびGC-R患者の両方のランダムに分けたコホートに加重投票およびｋ-NNアルゴリズムを適用した。
【００６３】
表1、2Aおよび2Bにおける遺伝子は別として、表４に示す15個のさらなる遺伝子は、独立したセットに対する予測精度を86％に増加し、GC応答者を非応答者から識別する精度は、全患者において交差検証法を用いて89％に達した。
【００６４】
考察
薬物治療が医学の主要部のままである一方、多くの場合、所定の薬物は、患者の大多数においてほとんどもしくは全く効果を有さないか、または予測できなかったひどい副作用が生じる。患者に対してこれは危険でかつ潜在的に生活の脅威となる状態を示し、社会レベルで、有害な薬物反応は、疾患および死亡を導く原因を示す。遺伝子変動は、しばしば不十分な応答および副作用の基礎となる。実際、限定されないが、Dicumarol、WarfarinまたはIsoniazidに応答してこれらの薬物の迅速な加速対遅い加速を与えるCytP450遺伝子における多形により患者変動性を含むかかる相関のいくつかの例がすでに存在する。これらの遺伝子変動が、これらの遺伝子の制御機能における差異において反映されうると過程すれば、これらの遺伝子のmRNAおよび／またはタンパク質発現における変動性が予測されるであろう。薬理ゲノム学(Pharmacogenomics)は、効力および安全性の両問題を扱う薬物に対する応答を正確に予測する個体の遺伝子の組立(makeup)間における変動の輪郭をすぐに描きうる見込みを有する。この関係において、DNAマイクロアレイ技術により単一アッセイにおいて数千の遺伝子の発現レベルを解析する能力は、複数の分子遺伝子経路の強力なスクリーニングを同時に提供する。したがって、高スループット遺伝子アレイアッセイは、薬物に応答する個体の変動を決定する種々の酵素、キナーゼ、イオンチャンネル、および他の細胞シグナル伝達分子をコードする遺伝子における差示的発現を同定する可能性を有する。
【００６５】
これらの問題に取り組むために、本研究は、高密度DNAマイクロアレイ解析を用いてGC-RおよびGC-S喘息患者から単離された新しく単離されたPBMCにおける遺伝子発現における差異を調査した。結果は、糖コルチコイド感受性が86％の精度で予測されうることを示す。
【００６６】
糖コルチコイド(GC)は喘息療法に利用可能な最も有効な薬物であることが広く認められている。感受性である個体において、吸入GCは、血漿中に見出される濃度にてPBMC内で転写を活性化する比較的低い能力を有することが示されており、その作用は肺内で主に生じると考えられている。この知見は低いかまたは断続した投与での限られた全身性副作用に一致し、一方、気道におけるAP-1およびNF-kBなどのトランス-抑制転写因子活性に対するGCの相対能力はその相対臨床効力に一致する。対照的に、GC耐性は、プレゾニドンなどの延長した過程の高用量（＞1mg/kg/日）経口糖コルチコイドに対する応答の欠如により規定された。喘息を有するほとんどの患者が吸入GCを用いて治療されているので、GC-依存／耐性喘息に言及する新しい定義は、薬物の使用における吸入経路を考慮して明らかになる(Leung,D.およびChrousos, G., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2000. 162:1-3)。これらの論点の観点から、吸入GCの高い用量（すなわち、＞2000mg/日）に不完全に応答する条件としてGC耐性喘息を規定するための推薦に従った(Gagliardo,R.ら、Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2000. 162:7-13)。高レベルのGC-依存を有する患者対GC耐性喘息を有する患者の間の明確な分離が臨床的にいつも可能であるというわけではないが、これらの群の両方が、健康管理システムに対して非常に高価であるという難しい臨床問題を示すことは疑いない。ステロイドに対する最適状態に及ばない応答は、持続性の気道障害と共に深刻な有害な影響を伴う高用量GC療法の延長された過程をしばしば導く。GC耐性喘息を罹患している患者は、高用量のGCでの持続性治療にもかかわらず、気道の進行性の炎症を示す。これは、表３における低いメタコリン濃度の値により反映されるように、本発明者らのGC-R患者において検出された高度の気道過応答性に一致する。
【００６７】
最初の近似として病理生物学プロセスが喘息に関与すると過程すると、GC無感受性およびGC依存喘息を同じ病原性プロセスの一部としてみなすことは妥当である。したがって、GC-耐性／依存性喘息に寄与する機構の潜在的不均一性および複雑さならびに慢性喘息の自然病歴におけるその潜在的影響の観点から、GC耐性特性に関して、穏やか〜厳しいGC-耐性を有する本発明者らのGC依存研究患者の遺伝子発現プロフィールにおいて差異が見られなかったことは注目すべきである。
【００６８】
この研究において、予測能力を提供する遺伝子を同定するための遺伝子スコアアプローチを使用した。表１に示されるように、選択した40個の遺伝子は、２つの群の間のmRNA発現のシグナル強度において異なり、吸入糖コルチコイドに対する患者応答表現型に強く相関した。さらに、図１に示されるように、14人のGC-S患者および14人のGC-R患者のサブセットについてベイジアン分類をトレインする場合、これら２つの患者群の間を識別する分類の予測精度は82％であった。分類を40でトレインした場合、残りの独立した患者を予測する分類の精度は、高く86％であった（図２）。したがって、分類をトレインするために使用した患者の数をほぼ２倍にすることにより、研究の予測能力はさらに増加した。後者の観察は、２つの重要な関係を有する：1)分類の予測精度は、さらなる患者が含まれる場合さらに改善されうることを示唆する；ならびに2)14人のGC-S患者および14人のGC-R患者の開始データセットに適用する場合、ナイーブベイジアン分類を用いるアプローチは、80％を超える精度でGC-RおよびGC-S喘息患者の遺伝子発現プロフィールを予測する十分な能力を提供する。これらの遺伝子間は、多数のサイトカイン／ケモカイン−関連遺伝子、転写因子および細胞シグナル伝達分子遺伝子であることに注目すべきである（表１、2Aおよび2B）。疑いなくこれらの遺伝子の多くが、それ自体が喘息から独立したGC応答性の決定的な調節遺伝子であることがわかりうる。
【００６９】
糖コルチコイド感受性および糖コルチコイド応答性喘息の間の識別における予測能力を有する遺伝子を、表１に挙げる。サイトカインを用いる刺激後のフォールド変化mRNA発現値を用いて糖コルチコイド応答性(GC-R)喘息および糖コルチコイド感受性(GC-S)喘息の間を最も正確に識別する40個の遺伝子を示す。値を群に対して平均±SEMとして表した。GC応答状態がわからない14人の非喘息（対照）被験体における匹敵する値もまた示す。これらの遺伝子を含む発現プロフィールは、GC-RおよびGC-S患者を80％を超える精度で予測する。
【００７０】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【００７１】
表2Aおよび2Bは、IL-1β／TNF α療法によりアップレギュレートまたはダウンレギュレートし、GCを用いる前処理により少なくとも部分的に逆転し、サイトカインを用いた処置後に生じた発現値を用いて糖コルチコイド感受性を最も正確に予測した45個の遺伝子を含む。表2Aは、DEXの存在下にIL-1β／TNF αを用いて処理した細胞における発現レベルを示し、表2Bは、IL-1β／TNF αのみを用いて処理した細胞の発現レベルを示す。
【００７２】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【００７３】
表３に示されるように、雄／雌の比率およびアトピー状態は、GC-R群においてより低く、一方平均年齢はより高かった。いくつかの研究は、X染色体と喘息表現型との間の関連を報告しているが(Kauppi P.ら、Eur. J. Hum. Genet. 2000.10:788-92;Heinzmann A.ら、Hum. Mol. Gennt. 2000.9.549-59; Ahmed S.ら、Exp. Clin. Immunogenet.2000.17:18-22)、広範な疫学研究は、かかる関連がGC-R表現型と喘息との間に存在するのかどうかを確認するために必要である。同様に、この研究においてGC-R患者の31％と比較してGC-S患者の54％が１つ以上の空気アレルゲンに対して皮膚試験陽性であった。さらに、平均総IgEレベルは、GC-S群においてより高かった。陽性皮膚試験または増加したIgE レベルにより決定した場合、アイスランドにおける喘息患者の約50％がアトピーであるのと比較して(TheEuropean Community Respiratory Health Survey Group. Am. J. Resp. Crit. CareMed.1997.156:1773-1780)、いくつかのヨーロッパの国および米国の地域のいくつかにおいて患者の約70％がアトピーである(EgglestonP. およびBush R., J. Allergy Clin. Immunol. 2001 107:S403-5)。アトピー喘息患者が、非アトピー患者と比較してGC-R喘息をより有しにくいかどうかを決定することが残っている。この結果におけるこれらの変動性に由来する障害が除外され得ないが、患者の年齢、性別またはアトピー状態の予測能力は、研究下における遺伝子から発達した能力と比較してより低かった（および統計的に有意でない）。
【００７４】
これらの結果は、GC- 耐性の発達に寄与するメカニズムを解明するための基礎を提供し、新規治療アプローチの開発を可能にしうる。例えば、当業者は、アイスランド家系データベースを用いてGC-RおよびGC-Sクラスターに関する患者における連鎖研究を行いうる。GC-応答性の臨床測定に基づいて大きな家系図にGC-RおよびGC-S喘息を有する患者を関連づけることにより、ゲノム全体の連鎖解析が行なわれうる。第２に、DNAアレイ技術を用いて患者の大きなコホートにおけるGC-R対GC-S喘息を予測するmRNA発現プロフィールを探すことにより、当業者は、患者が糖コルチコイドを摂取しているかどうかまたは臨床応答が発現プロフィールのみに基づいて決定されたかどうかに無関係に、未知のGCプロフィールを有する患者を高い精度でGC-SおよびGC-R患者に分類しうる（例えば、応答者対非応答者の発現プロファイリングにそれぞれ類似するかどうか）。
【００７５】
表３．糖コルチコイド感受性(GC-S)およびGC-耐性(R)患者における人口統計、肺機能、メタコリンチャレンジおよび総IgE値。示された値は、群に対する平均+/-SEである。
【００７６】
【表３】
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【００７７】
GC応答者を非応答者から最も正確に識別する遺伝子シグナルが捕捉されることを確認するために、研究を96人の患者(60人のGC-Sおよび36人のGC-R)を含むように拡張し、GC-SおよびGC-R患者のランダムに分けたコホートを交差検証法有りおよび無しで解析した。
【００７８】
結果は、表1、2Aおよび2Bに列挙された遺伝子は別として、分割コホートを用いて同定した表4Aに列挙された15個のさらなる遺伝子、および交差検証法による表4Bに列挙された4個の遺伝子は、独立セットおよび交差検証法に対して予測精度をそれぞれ86％および89％に増加したことを結果は示す。これらの遺伝子は、免疫機能、シグナル変換プロセスおよびアポトーシスにおいて重要な役割をはたし、その全ては、喘息における糖コルチコイド応答の機構に高度に関連する機能である。
【００７９】
【表４】
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【００８０】
実施例２.
約80％の予測精度を示す遺伝子は別として、多数の遺伝子が２つの患者群間で差次的に発現されることを見出した。その内、表5A〜Eに列挙される遺伝子は、見出された予測シグナルに寄与した。これらの遺伝子を、実験セットアップの生物学的アプローチを適用することにより同定した（すなわち、IL-1β／TNFαによりアップレギュレートまたはダウンレギュレートされ、かつ少なくともGCにより部分的に逆転した遺伝子）。糖コルチコイド予測に関する表5A〜5Eにおける遺伝子の最大値は、これらの遺伝子が患者のより大きなコホートにおいて確認された場合にわかるであろう。
【００８１】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【００８２】
本発明をその好ましい態様を参照して詳細に示し、記載したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細において種々の変更がなされうることが当業者により理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、14の糖コルチコイド耐性（GC-R）および14の糖コルチコイド感受性患者の薬物応答表現型の予測におけるナイーブベイジアン分類の予測の正確性を示す代表的なベイジアンマトリックスプロットである。
【図２】図２は、54名の全ての患者が分類のトレーニングに含まれた場合のGC-RおよびGC-S患者の薬物応答表現型の予測におけるナイーブベイジアン分類の予測の正確性を示す代表的なベイジアンマトリックスプロットである。
【図３】図３は、遺伝子選択のプロセスまたは分類のトレーニングにおいて使用されない14名のGC-R患者の独立したコホートの薬物応答表現型の予測におけるナイーブベイジアン分類の予測の正確性を示す代表的なベイジアンマトリックスプロットである。
【図４】図４は、88名の患者において調査した15遺伝子（表５参照）の差次的発現を示す代表的なマトリックスプロットである。上記に挙げられた遺伝子に加えて、その全てが予測されるウェイトを保有する、これらの15の遺伝子は、トレーニングセットに関する誘導時間点を用いて非応答者からGC応答者のコホートを最も正確に区別した。合わせて、これらの遺伝子は、86％の正確性で等しいサイズの独立した患者コホートの正確なGC応答表現型を予測した。
【図５】図５は、「一点除外交差検証法」（LOOCV）法を用いた12名のロイコトリエン感受性（LT-S）および12名のロイコトリエン耐性（LT-R）患者のコホートの薬物応答表現型の予測におけるナイーブベイジアン分類の予測の正確性を示すプロットである。選択された12遺伝子は、90％より高い正確性で正確な薬物応答表現型を予測した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005502345.tif 000099
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