(57)【要約】  本発明は、ポリヌクレオチド分子や、ペプチド、ポリペプチド及び／又は薬剤などのような生物活性分子を、哺乳類の体内へ配達するためのカチオン性デンドリマーを提供する。ここに記載するデンドリマーは、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓又は心臓を標的として生物活性分子を配達するのに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体体内の標的部位に生物活性分子を配達するための組成物であって、生物活性分子とこれに混合したカチオン性のデンドリマー及び／又はその誘導体から構成される組成物。
【請求項２】
カチオン性のデンドリマー又はその誘導体が、２〜１０個の炭素原子から成る中核分子から誘導されている請求項１記載の組成物。
【請求項３】
カチオン性のデンドリマー又はその誘導体が、１個又はそれ以上のアミン官能基を含んでいる請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
カチオン性のデンドリマー又はその誘導体が、ジアミノエタン、ジアミノプロパン及びジアミノブタンからなる群から選択された中核分子から誘導されている請求項３記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１個のプロピルアミン基が中核分子に結合している先行請求項の何れかに記載の組成物。
【請求項６】
デンドリマーが、ポリプロピレンイミン・デンドリマー又はその誘導体である先行請求項の何れかに記載の組成物。
【請求項７】
デンドリマーが中核にジアミノブタンを有する先行請求項の何れかに記載の組成物。
【請求項８】
カチオン性デンドリマーが、共有結合誘導基によって修飾されている請求項１記載の組成物。
【請求項９】
カチオン性デンドリマーが、疎水性基、親水性基及び両親媒性基からなる群から選択された基を用いて誘導されている請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
カチオン性デンドリマーが、１つの炭化水素鎖の両端に２つのデンドリマー分子を結合させることで誘導されている請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
炭化水素鎖が、炭素数８、１２、１４、１６及び１８の炭化水素鎖から選択される請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
誘導されたカチオン性デンドリマーが、ボランフィフリック・デンドリマーである請求項１０又は１１記載の組成物。
【請求項１３】
誘導基の数が、デンドリマー１分子当たり１から、デンドリマー分子表面に存する全ての末端基の数までである請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
両親媒性誘導体が、親水性セグメントと疎水性セグメントを兼備している請求項９記載の組成物。
【請求項１５】
親水性セグメントが、ホスホグリセリレート分子から誘導されている請求項９記載の組成物。
【請求項１６】
疎水性セグメントが、エステル結合によって親水性セグメントに共有結合している請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
疎水性セグメントが、炭素鎖長８〜２４のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基から選択される請求項１４又は１６記載の組成物。
【請求項１８】
両親媒性誘導体が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び糖分子から群から選択されたリンカー（連接）分子によってデンドリマーに結合している請求項１４記載の組成物。
【請求項１９】
リンカー分子ＰＥＧの長さが、エチレングリコール単位で１〜１２０である請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
リンカー分子が、ホスホグリセリドである請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
デンドリマー１分子あたりの両親媒性誘導体の数が、デンドリマー１分子当たり１つから、全ての基の数までである請求項１４記載の組成物。
【請求項２２】
受容体体内の標的部位が、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び心臓からなる群から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項２３】
組成物が受容体の肝臓へ生物活性分子を配達するための組成物であって、その組成物が、生物活性分子に混合させたポリプロピレンイミン・デンドリマーＤＡＢ１６である請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
組成物が受容体の脾臓へ生物活性分子を配達するための組成物であって、その組成物が、生物活性分子に混合させたポリプロピレンイミン・デンドリマーＤＳＡＭ１６である請求項２２記載の組成物。
【請求項２５】
受容体がヒトである請求項１又２２〜２４の何れかに記載の組成物。
【請求項２６】
生物活性分子が、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド及び薬理的活性剤からなる群から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項２７】
哺乳類の細胞をインビトロで生物活性分子にてトランフェクトするのに使用する請求項１記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２７の何れかに記載された組成物と、製薬上許容される担体とを含む調剤。
【請求項２９】
受容体体内の標的部位に生物活性分子を配達するための、生物活性分子と混合させたカチオン性デンドリマー及び／又はその誘導体を含有する組成物の使用。
【請求項３０】
標的部位が、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び心臓からなる群から選択される請求項２９記載の組成物の使用。
【請求項３１】
受容体体内の標的位置へ生物活性分子を配達する方法であって、生物活性分子に混合させたカチオン・デンドリマー又はその誘導体を含有する組成物を調製する工程と、その組成物を受容体に投与すること工程からなる生物活性分子の配達方法。
【請求項３２】
標的部位が、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び心臓からなる群から選択される請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
カチオン性デンドリマー及び／又はその誘導体と、少なくとも１つの生物活性分子とを混合する工程を含む請求項１〜２７の何れかに記載の組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ほ乳類体内に生物活性分子を標的デリバリ（目標部位を目標に分子を運搬すること）に関する。より詳しくは、ほ乳類の体内、特に、人体にポリヌクレオチド分子、ペプチド、ポリペプチド、及び／又は調合剤をデリバリするためのカチオン性デンドリマーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝的障害や癌を治療するための医薬として遺伝子を使用する可能性については、疾患部位へ遺伝物質を効率的にデリバリできないことが障害となっている（文献１）。様々なウイルスシステムや非ウイルスシステムが、それぞれ独特な長所および短所を伴って、実験的に使用されている。ウイルスシステム（文献２）は広範囲にわたって研究が行われ、その研究には、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、単純疱疹ウイルス、ＨＩＶベース・レンチウイルスなどの多様なウイルスタイプが含まれる。これら研究では例外無く、安全性の問題やスケールアップの困難性などが指摘されている。従って、カチオン性リポゾーム（文献４−６）、カチオン性重合体（文献７、８）、カチオン性重合体小胞（文献９、１０）やデンドリマー（文献１１−１４）などの非ウイルスシステムは、ウイルスに伴う安全性の課題や製造上の問題を回避する意図で、遺伝子デリバリ因子として研究されている。
適切な遺伝子伝達システムは、ヒトの健康に寄与するだけでなく、インビトロ分子生物学や実験用のインビトロ・トランスフェクション試薬として、商業的魅力も持っている。
【０００３】
デンドリマーは、単一の分岐単量体単位から段階的に合成された３次元巨大分子であり、その性質と機能性は、容易に制御でき、また変更できる。デンドリマーは、多機能コアに対して（合成への発散型アプローチ）、又は、多機能コアに向かって（合成への収束型アプローチ）、ビルディング・ブロック（基礎単位）を反復付加することで合成され、ビルディング・ブロックの３次元シェルが付加する度に、高位世代のデンドリマーが形成される。ポリプロピレンイミン・デンドリマーは、ジアミノブタン・コアから出発し、一級アミンにアクリロニトルを二重ミカエル（a double Michael）付加することで、当該ジアミノブタン・コアに２倍量のアミノ基を付加し、次に、ニトリルの水素化が行われる（文献５２）。これにより、アミノ基が２倍になる（文献５２）。
【０００４】
ポリプロピレンイミン・デンドリマーは、１００％プロトン化できる窒素（文献１７）と、６４以下の末端アミノ基（世代５、ＤＡＢ６４）とを含む（文献１５、１６）。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受容できるアミノ基である。デンドリマーの遺伝子デリバリ因子として利用は、接合単位としてアミン／アミドの混合物又はＮ−Ｐ(Ｏ２)Ｓと共に、ポリアミドアミン（文献１１−１３、１８−２５）および含リン化合物（文献１４）を使用することに多くは集中しているが、どちらも低位世代のポリプロピレンイミン・デンドリマーの遺伝子デリバリとしての使用は報告されていない。ポリプロピレンイミン・デンドリマーは、薬剤デリバリ（文献２６、２７）用のｐＨ感知放出システムとして研究されているほか、外縁アミノ酸基（文献２８）によって化学的に修飾されたゲスト分子のカプセル用のｐＨ感知放出システムとしても研究されている。細胞毒性（文献２９）やＤＮＡとポリプロピレンイミン・デンドリマーとの相互作用（文献３０）も、ＤＡＢ６４のトランスフェクション効力と同様に、研究されている（文献３１）。
【０００５】
カバノヴ（Ｋａｂａｎｏｖ）他は、内部アミン基を巻き込まずに、表面の一級アミンだけを媒介にしてポリプロピレンイミン・デンドリマーがＤＮＡと相互に作用し合うと報告し（文献３０）、一方、ゲハート（Ｇｅｂｈａｒｔ）とカバノヴは、極めて低位の遺伝子が第５世代のポリプロピレンイミン・デンドリマーであるＤＡＢ６４と共に活性を転移させ、コス細胞系に容易にトランスフェクションすると発表している（文献３１）。これらの研究者は、ＤＡＢ６４がデンドリマーよりかなり毒性が強く、ＤＮＡ重量比が０．６２：１（窒素対リン酸塩比４：１）であることも報告している。さらに、マリック（Ｍａｌｉｋ）他は、カチオン性デンドリマーが、アニオン性デンドリマーと違って、ポリエチレングリコール単位などの生体親和性基にて誘導体としない限り、非経口的に使用するには毒性が強すぎると結論付けている（文献２９）。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、上述した先行技術の開示と異なり、ポリプロピレンイミン・デンドリマーなどのカチオン性デンドリマーが、遺伝物質などの生物活性分子を標的にデリバリするうえで、標的を特定し易い、毒性が低いなどの好適な能力を発揮するとの知見に基づいている。
【０００７】
ポリプロピレンイミン・デンドリマーの化学修飾（誘導ないしは派生を意味する）についての報告は広範囲にわたり、その中には、当該デンドリマー表面の第一アミノ基に、アミノ酸（文献２８、３２）、カルボキシル酸塩（文献３３、３４）、アセチル（文献３５）、２−(ヒドロキシ)プロピルトリメチルアンモニウム（文献２７）、ジメチルドデシルアンモニウム（文献３６）、３，４，５−(オロゴエチレノキシ)ベンゾイル（文献３７）、アルカノイル・チオラクトジル（文献３９）などの各基が結合するとの報告や、疎水性の３，４−ビス(デシロキシ)ベンゾイル（文献４０）、パルミトイル（文献４１）、ペンタフルオフェニル  １１−[４−(４−ヘキシルオキシフェニルアゾ)フェニロキシ]ウンデカノイル（文献４１）、アダマンチンカルボキシル（文献４１）、デカノイル（文献４２）、ドデシル（文献４２）、ポリイソブチレン（文献４３）、ステアロイル（文献４４）、ω−(４’シアノビフェニルオキシ)アルキル（文献４５）、およびオリゴ（ｐ−フェニレン・ビニレン）（文献４６）のどの各基が、ポリプロピレンイミン・デンドリマー表面の第一アミノ基に結合するとの報告が含まれる。
【０００８】
遺伝物質の標的デリバリに加えて、ペプチド／ポリペプチドや薬剤などのようなその他の生物活性剤を選択的に標的に運搬することも、必要とされている。
【０００９】
本発明の目的の一つは、ほ乳類体内の特定の個所に生物活性分子の標的デリバリできるカチオン性デンドリマーを提供することにある。
【００１０】
本発明は、受容者の体内の標的箇所に生物活性分子を運搬する組成物を提供するものであって、その組成物は、生物活性分子と混合させたカチオン性デンドリマー及び／又はその誘導体を含有する。
【００１１】
"カチオン性デンドリマー"とは、生理的ｐＨにおいて正に帯電するデンドリマー分子を意味する。しかし、本発明のデンドリマー誘導体は、誘導の結果、必ずしもカチオン性であるとは限らない。
【００１２】
本発明に係る組成物のカチオン性デンドリマー又はその誘導体は、２〜１０個の、一般には３又は４個の、中でも４個の炭素原子を有するコア分子と、例えばアミノ基であって差し支えない１個又はそれ以上の官能基とから誘導することができる。本発明のカチオン性デンドリマー又はその誘導体は、例えば、ジアミノエタン、ジアミノプロパン又はジアミノブタンなどをコア分子として、特に、ジアミノブタンをコア分子として誘導することができる。
【００１３】
コア分子に結合する基には、例えば、プロピルアミンが含まれる。従って、デンドリマーは、ポリプロピレンイミン・デンドリマー又はその誘導体であっても良く、ジアミノブタン・コアを有することもある。
【００１４】
"ポリプロピレンイミン・デンドリマー"なる用語は、１個のジアミノブタン・コアに、１、２、３、４又は５世代のプロピレンイミン分子が結合したデンドリマーを意味する。この用語は、ＤＡＢ４、ＤＡＢ８、１６、３２、６４と、ＤＳＡＭ４、ＤＳＡＭ８、１６、３２、６４と、ＱＤＡＢ４、８、１６、３２、６４と、ＨＤＡＢ４、８、１６、３２、６４とを包含し、さらに、
、ボランフィフリック（bolamphiphilic）・ポリプロピレンイミン・デンドリマーであるＢＤＡＢ４、ＢＤＡＢ８、ＢＤＡＢ１６、ＢＤＡＢ３２、ＢＤＡＢ６４を包含する。化合物ＤＳＡＭ、ＱＤＡＢ、ＨＤＡＢ、及びＢＤＡＢの全世代は、１個のジアミノブタン・コアとこれに結合した複数のプロピレンイミン基を含有するが、特に記載が無い限り、"ＤＡＢ"なる用語は、誘導されていないＤＡＢ８、１６、３２、および６４の各化合物を指す。
【００１５】
"世代"なる用語は、化合物を生成するのに必要な反復反応段階の数を意味する。デンドリマーの名称あるいは略称に続く数字、例えば、８、１６、３２、又は６４などは、デンドリマー分子の表面基の数を意味するもので、アミノ基の誘導の有無とは関係ない。
【００１６】
本発明の組成物におけるカチオン性デンドリマーは、その表面に、疎水性基、親水性基又は両親媒性基などの誘導基を共有結合させて修飾することができ、また、２個のデンドリマー分子を炭素鎖長８、１２、１４、１６又は１８の炭化水素鎖の両端に結合させることで、ボランフィフリック・デンドリマーに修飾することができる（このような修飾デンドリマーを"誘導体"と称する）。修飾に移用する基の数は、デンドリマー１分子につき、一つ以上であって、デンドリマー分子の全ての利用可能な表面基又は末端基を修飾することも可能であって、例えば、ＤＡＢ１６分子の１６表面基全てを修飾することができる。
【００１７】
両親媒性の誘導体は、親水性セグメントと疎水性セグメントを含む。親水性セグメントは、ホスホグリセリン酸塩（エステル）から、例えば、グリセロース３−リン酸から誘導できる。疎水性セグメントは、例えば、エステル結合にて親水性セグメントと共有結合する。疎水性セグメントは、適当な疎水基から選択することができ、例えば、炭素鎖長８〜２４のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基から選択可能である。従って、疎水性セグメントとエステル結合との合体は、アシル基として定義することができる。両親媒性誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は親水性セグメントに結合したムラミン酸のような糖ユニットなどのリンカー分子によって、デンドリマーに結合することができる。リンカー分子となるＰＥＧの長さは、例えば、エチレングリコール単位で１〜１２０単位であってよく、従って、５０〜１００単位又は７０〜８０単位の範囲でよく、７７単位であって差し支えない。リンカー分子は、Ｍｗがほぼ３，５００のポリエチレングリコールでも良い。また、リンカー分子は、通常の疎水化修飾に用いるエステル、アミン又はエーテルであってもよく、また、ムラミン酸のような糖分子であっても構わない。特に、誘導体は、例えば、ホスファチダルエタノールアミンなどのホスホグリセリドであってよく、前記エタノールアミンの一例は、ジステアロイルホスファチダルエタノールアミン（distearoylphosphatidylethanolamin）である。デンドリマー１分子当たりの両親媒性誘導体の数は、１を超え、デンドリマーの全ての誘導可能な基の数（誘導に利用できる表面基の総数はデンドリマーの世代によって決まる）までの範囲であるが、デンドリマー１分子につき１基でも構わない。従って、本発明で言うデンドリマーには、両親媒性に修飾されたジアノブタン・デンドリマーの第１〜第５世代が含まれ、例えば、ここでは、１，２−ジアシル−ＳＮ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［（ポリエチレングリコール）−Ｎ−ジアミノブタンポリプロピレンイミン・デンドリマー(ＮＨ２)ｘ］と呼ばれるデンドリマーが含まれる。式中、ｘ＝４、８、１６、３２又は６４であって、それぞれを便宜上、ＤＳＡＭ４、８、１６、３２又は６４と呼ぶ。
【００１８】
疎水性誘導体は、炭素鎖長８〜２４のアルキル基、アシル基、アルケニル基、アルキニル基又はアリール基である。"疎水性"なる用語は、炭素鎖長が８以上であるアシル基を包含し、従って、例えば、ヘキサデカノイル基は疎水性の木である。デンドリマー１分子あたりの疎水基の数は、１を超え、デンドリマーの全ての誘導可能な基の数（誘導に利用できる表面基の総数はデンドリマーの世代によって決まる）までの範囲であるが、デンドリマー１分子につき１基でも構わない。従って、本発明のデンドリマーには、ＨＤＡＢ４、ＨＤＡＢ８、ＨＤＡＢ１６、ＨＤＡＢ３２、ＨＤＡＢ６４などで表示されるところの、疎水性に修飾されたジアミノブタンの第１世代〜５世代のデンドリマーが包含される。
【００１９】
ボランフィフル（bolamphiphiles）は、デンドリマーＤＡＢ４、ＤＡＢ８、ＤＡＢ１６、ＤＡＢ３２、ＤＡＢ６４の何れかの２つの分子が、炭素鎖長８〜２４のアルキル基、アシル基、アルケニル基、アルキニル基などの疎水性基の両端に結合することで構成されるか、あるいはアリール基によって結合することで構成される。このボランフィフルは、ＤＡＢ４又はＤＡＢ８のＣ１２ボランフィフルでも構わない。"ボランフィフル"なる用語は、親水性基が疎水性基によって分割されている両親媒性分子を意味すると理解される。従って、本発明のデンドリマーには、Ｂ８ＤＡＢ４、８、１６、３２又は６４と；Ｂ１０ＤＡＢ４、８、１６、３２又は６４と；Ｂ１２ＤＡＢ４、８、１６、３２又は６４と；Ｂ１４ＤＡＢ４、８、１６、３２又は６４と；Ｂ１６ＤＡＢ４、８、１６、３２又は６４として表示される第１世代〜５世代のデンドリマーのＣ８〜Ｃ１６アルキル・ボランフィフルが包含される。アミノ誘導体は、例えば、三級アミン誘導体でも、四級アンモニウム誘導体でもよく、その具体例を挙げれば、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基が、例えば３個のメチル基が、デンドリマー表面の窒素原子に共有結合した四級誘導体である。デンドリマー１分子当たりのアンモニウム誘導体の数は、１を超え、デンドリマーの全ての誘導可能な基の数（誘導に利用できる表面基の総数はデンドリマーの世代によって決まる）までの範囲である。従って、本発明で言うデンドリマーには、四級アンモニウムに誘導されたジアミノブタン・デンドリマーの第１〜第５世代が含まれ、例えば、ジアミノブタンポリプロピレンイミン・デンドリマー［ＮＨ２(ＣＨ３)３］ｘと称されるものが含まれる。ここで、ｘ＝４、８、１６、３２又は６４であり、これらのデンドリマーは便宜的にそれぞれＱＤＡＢ４、８、１６、３２、又は６４と呼ぶ。
【００２０】
本発明のデンドリマーは、親水基で誘導体とすることもでき、そうした親水基としては、糖、モノヒドロキシル及びオリゴヒドロキシルＣ１〜Ｃ６アルキル、モノヒドロキシル及びオリゴヒドロキシルＣ２〜Ｃ６アシル、アルコキシ基又はアルキレン基に置換した１個又はそれ以上のヒドロキシル基を持つことができるＣ１〜Ｃ２アルコキシアルキル、アミノ酸、１〜２００のアミノ酸からなるペプチド、１〜１２０のエチレンオキシド単位から成るポリオキシエチレンなどのオリゴ又はポリ−（オクサＣ１〜Ｃ３アルキレン）などが例示できる。
【００２１】
生物活性分子をデリバリする標的部位には、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓が含まれる。特に、本発明による２つのデンドリマーＤＡＢ１６及びＤＳＡＭ１６は、それぞれ、肝臓と脾臓を標的とする特定器官への標的デリバリ機能を有する。
【００２２】
従って、本発明は、受容体の肝臓へ生物活性分子をデリバリするための組成物も提供するものであって、その組成物は、生物活性分子と混合させたポリプロピレンイミン・デンドリマーＤＡＢ１６からなる。さらに、本発明は、受容体の脾臓へ生物活性分子をデリバリするための組成物を提供するものでもあって、その組成物は、生物活性分子と混合させたポリプロピレンイミン・デンドリマーＤＳＡＭ１６から成る。
【００２３】
受容体は、ヒトなどのほ乳類である。
【００２４】
"生物活性分子"および"生物学的に活性な分子"なる用語には、ポリヌクレオチド、ペプチド／ポリペプチド、及び／又は調合薬が包含される。"ポリヌクレオチド"なる用語は、特に断らない限り、一般にはＤＮＡを意味するが、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ，オリゴヌクレオチド、プラスミドなども意味することもある。さらに、"ポリヌクレオチド"なる用語は、"１個のポリヌクレオチド"、"遺伝子"、"遺伝物質"、"遺伝シーケンス"などと置き換えて使用することもある。発現を意図する遺伝子は、遺伝子療法の分野においてごくありふれたものであって、こうした遺伝子には、標的器官において生成物を発現させるセンスＤＮＡ又はＲＮＡや、あるいは、標的器官における固有遺伝子又は導入遺伝子の発現を減少又は阻止するアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡが含まれるが、これに限定されるものではない。"ペプチド"なる用語は、アミノ酸鎖長が４〜２００である場合を含む４〜６００のアミノ酸鎖長を意味し、従って、これにはポリペプチドとプロテインが包含されほか、酵素およびポリペプチドホルモンが包含される。さらに、例えば、糖鎖形成で修飾したペプチドも、インスリンや免疫グロブリンで例示される如く、各アミノ酸鎖長が４〜６００である２又はそれ以上のポリペプチド鎖が、例えばジスルフィド結合によって架橋した、タンパク質であるので、本発明で言うペプチドに含まれる。"調合薬"には、生理学的効果又は薬理学的効果を誘発する目的で受容体に投与される天然又は合成の化合物が含まれる。こうした調合剤の例は、抗腫瘍薬、抗生物質、ホルモン、抗炎症剤、駆虫薬、ＤＮＡワクチンなどである。
【００２５】
本発明のデリバリ用組成物を調製するに際しては、カチオン性デンドリマーが生物活性剤と混合される。ここで"混合"とは、生物活性剤が共有結合によらずにデンドリマーと結びついた結合を一般に意味するが、しかし、デンドリマーおよび生物活性剤の何か適当な反応基によって、デンドリマーと生物活性剤とが共有結合している場合も包含する。
【００２６】
生物活性剤がポリヌクレオチド分子の場合、この分子は共有結合によらずにデンドリマーと結合するために、ポリヌクレオチドが現される。しかし、共有結合で結合したポリヌクレオチド分子の発現も生起するので、共有結合したポリヌクレオチド分子も本発明は除外しない。
【００２７】
さらなる態様として、本発明は、本発明の組成物と製薬上許容される担体とからなる調剤を提供する。
【００２８】
製薬上許容される担体は当業者に周知であって、そうした担体を限定的な意味でなく例示すれば、０．１Ｍの、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液又は０．８％（ｗ／ｖ）のサリンがある。こうした製薬上許容される担体は、水性又は非水性の溶液、懸濁液およびエマルジョンであって差し支えない。非水性溶液の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体の例には、水、アルコール系水溶液、サリンや緩衝媒体を含むエマルジョン又は懸濁液などがある。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル又は不揮発性油などがある。静脈注射用賦形剤には、体液及び栄養素の補給液やリンゲルデキストロースなどを基体とする電解質補液などがある。また、本発明の調剤には、保存剤やその他の添加剤が含まれてもよく、そうした添加剤としては、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられる。
【００２９】
本発明の組成物又は調剤は、好ましくは、例えば５％デキストロース液のような、コロイド懸濁液の形成に寄与する助剤を含有する。含有可能なその他の助剤には、アルギナート及びポリエチレングリコールのような増粘剤、緩衝剤、水性溶液と非水性溶液を混合させたエマルジョンなどがある。
【００３０】
本発明はまた、受容体の体内の標的部位に生物活性分子をデリバリするために、本発明に係る組成物又は調剤を使用すること提案するものでもある。
【００３１】
さらなる実施態様によれば、本発明は、受容体の体内の標的部位に生物活性分子をデリバリする方法を提供するものであって、その方法は、生物活性分子と混合させたカチオン性デンドリマー又はその誘導体を含有する組成物を調製する工程と、続いて個の組成物を前記受容体に投与する工程からなる。
【００３２】
本発明によるデンドリマーは、インビボで生物活性分子をデリバリする上で好適な特性を発揮するが、インビトロで哺乳類細胞をトランスフェクションする場合にも有効である。従って、本発明は、インビトロで哺乳類細胞に生物活性分子をトランスフェクトするための組成物を提供するものでもある。哺乳類細胞は、例えば、ヒト細胞である。
【００３３】
本発明は、さらに、１，２−ジアシル−ＳＮ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［（ポリエチレングリコール）−Ｎ−ジアミノブタンポリプロピレンイミン・デンドリマー(ＮＨ２)ｘ］式中、ｘ＝４、８、１６、３２、又は６４（ＤＳＡＭ）と、四級アンモニウムジアミノブタンポリプロピレンイミン・デンドリマー［ＮＨ２(ＣＨ３) ３］ｘ式中、ｘ＝４、８、１６、３２、又は６４（ＱＤＡＢ）を提供する。デンドリマーＤＳＡＭ又はＱＤＡＢは、それぞれ第２世代、第３世代、第４世代及び第５世代のデンドリマーを包含し、これらをＤＳＡＭ４、８、１６、３２、６４及びＱＤＡＢ４、８、１６、３２、６４と表示する。
【００３４】
本発明は、さらに、上記した組成物の調製方法を提供するものであり、その方法は、カチオン性デンドリマー及び／又はその誘導体と、及び生物活性分子を混合することからなる。
【００３５】
本発明の様々な実施態様を添付の図面を参照しながら具体例の形で説明する。
【００３６】
実施例１
［方法］
［修飾されたデンドリマーの合成］
ＤＳＡＭ
無水エタノール（７０ｍｌ）に溶解させたＤＡＢ１６（イギリス、ドーセットのシグマ・アルドリッチ（Sigma Aldrich）社製、３．５２ｇ、１．３２ｍモル）に、トリエチルアミン（２７ｍｌ、６．６ｍモル）を加えた。クロロホルム（２５ｍＬ）に溶解させたＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン・ポリエチレン・グリコールＮ−ヒドロキシスクシンイミド(distearoylphosphatdylethanolamine polyethylene glycol N-hydroxysuccinimide)、５００ｍｇ、０．１１ｍモル、シャーウォータポリマ(Shearwater Polymers)）を、先に調製したＤＡＢ１６の溶液に６０分かけて滴下した。反応は、光から保護して攪拌しながら７２時間行った。反応後、反応混合物をロータリーエバポレーターにて減圧下、５０℃で蒸発乾固させた。残滓を無水エタノール（４０ｍｌ）に再溶解させて濾過し、濾液を蒸発乾固させた。この残滓を水（８０ｍｌ）に溶解し、これを５ｌの水で透析する操作を２時間で６回繰り返した。透析物を凍結乾燥させ、その構造を１Ｈ及び１３ＣＮＭＲで確認した。
【００３７】
ＱＤＡＢ
ＤＡＢ１６、３２又は６４（５００ｍｇ）をメチル−２−ピロリドン（５０ｍｌ）に、室温で１６時間攪拌しながら分散させた。ＤＡＢ分散液に水酸化ナトリウム（１２０ｍｇ）とヨウ化メチル（３ｇ）とヨウ化ナトリウム（１５０ｍｇ）を加えた。反応混合物を３６℃で３時間、窒素気流中で攪拌した。これをジエチルエーテルで沈殿させ、次いで濾過することで、四級アンモニウム生成物を回収した。固形分を多量の無水エタノール（１リットル）で、次いで多量のジエチルエーテル（５００ｍｌ）で洗浄した。洗浄した固体を次に水（１５０ｍｌ）に溶解させ、その溶液をイオン交換カラム（１ｘ６ｃｍ、アンバーライトＩＲＡ−９３Ｃｌ-３０ｍｌ充填）に通し、続いてＨＣＩ−９０ｍｌ、１Ｍ、で洗浄し、最後に溶出液のｐＨが中性になるまで蒸留水５００ｍｌで洗浄した。こうして得られた溶出液を凍結乾燥させ、その構造を１Ｈ及び１３ＣＮＭＲの両方で確認した。
【００３８】
［ＤＮＡ凝縮］
プラスミド（pCMVsport β-gal又はpCMV luciferase、ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、イギリス）を大腸菌で成長させ、プラスミドの精製を、ＱＩＡＧＥＮエンド−トキシン・フリー・ギガ・プラスミド・キット(QIAGEN Endo-toxin free Giga Plasmid Kit)（キアゲン(QIAGEN)、ヒルデン(Hilden)、ドイツ）にて、製造者の使用説明書に従って行った。アガロースゲル電気泳動法で純度を確認した（文献４７）。重合体によるＤＮＡの凝縮を調べるため、臭化エチジウム（EthBr）の低減蛍光を使用した。二本鎖ＤＮＡへの挿入は、ＥｔｈＢｒ蛍光を有意に増加する（未結合ＥｔｈＢｒと比較した係数４０）。ＤＮＡ−小胞の複合体が形成される際のアニオン性のＤＮＡと担体のカチオン性基との間の静電相互作用は、ＥｔｈＢｒ結合部位の数を減少させ、最終的にＥｔｈＢｒ溶液の蛍光度を減少させる。
【００３９】
ＤＡＢ１６とＤＳＡＭとのＤＮＡによる複合体は、様々な重合体、ＤＮＡ重量比およびＥｔｈＢｒ（４０μｇ  ｍｌ−１）の存在下で決定される複合体の蛍光度（λexcitation＝５２６ｎｍ、λemission＝５９２ｎｍ）の多様な時点で調製された。キュベットにおけるＤＮＡ濃度は一定に保たれ(１００μｇ ｍｌ−１)、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩水、ｐＨ＝７）中のポリマー溶液及びＰＢＳ中のＤＮＡ溶液を対照例とした。試料のそれぞれについて、減少蛍光（Ｆｔ／Ｆ０）を測定した。ここで、Ｆｔ＝ＤＮＡポリマー複合体の蛍光性であり、Ｆ０＝ＤＮＡ単独の蛍光性である。
【００４０】
［インビトロでの細胞障害検定］
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）と２ｍＭグルタミン（ギブコＢＲＬ(GibcoBRL)社製、イギリス）を補ったダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）において、ヒトの類表皮のガン腫細胞系（Ａ４３１、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５５５）を、ＣＯ２１０％、３７℃の条件で維持した。
【００４１】
ポリプロピレンイミン・デンドリマー又はその誘導体を含む調剤の細胞毒性を、標準的ＭＴＴ検定でＩＣ５０を測定することで評価した（文献４９）。ＭＴＴ検定で指示色素は、3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue)である。９６ウェルのマイクロタイタプレートに、１ウェル当たり５０００細胞を種付けして２４時間インキュベートした。組織培養培地(Opti-Mem)中で、デンドリマー／デンドリマーＤＮＡ配合物（１００μｌ）の希釈物と細胞を４時間インキュベートした。試料を、毎日新しいＤＭＥＭに交換して７２時間インキュベートした。この後、指示薬染料（５０μｌ、５０ｍｇ/ｍｌ）を各ウェルに添加し、暗所で４時間細胞をインキュベートした。次に、培地と指示薬を除去し、細胞をジメチルスルホキシド（２００μｌ）に溶解させた。セレンセングリシン緩衝液（２５μｌ）を添加した後、５７０ｎｍでの吸収を測定した。小胞を加えなかった場合と対照させた百分率で数値を示した。
【００４２】
［インビトロでのトランスフェクション］
ＤＮＡポリマー調剤
５％デキストロース溶液中でＤＮＡとデンドリマーを混合して、ＤＡＢ及びＱＤＡＢデンドリマーＤＮＡ（pCMVsport β-galactosidase）調剤を調製し、調製から１５分を経過しない内に試験に供した。得られたコロイド分散液を光量子相関分光器(Malvern Instruments、イギリス)で検査した。
【００４３】
細胞培養
ウシ胎児血清とＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補ったダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ、ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、イギリス）に保存されたＡ４３１細胞（ヒトの類表皮ガン腫細胞系、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５５５）を、密度１０４細胞/ｍｌ、細胞懸濁液２００μＬの条件で、９６ウェルの平底プレートに播種した。細胞を１０％のＣＯ２中３７℃で、２４時間インキュベートした。２００μｇ/ｍｌのＤＮＡを含むポリマー−ＤＮＡ複合体と、無血清培地（１００μｌ、ＯＰＴＩＭＥＭ、ライフテクノロジーズ、イギリス）とを、前記の細胞と共に１０％ＣＯ２中３７℃で、４時間、インキュベートした。
裸のＤＮＡを負の対照とする一方で、Ｎ−［１−(２，３−ジオレオイロキシ)プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム・メチル硫酸（ＤＯＴＡＰ）とＤＮＡとの比率が５：１である調剤を正の対照とした。正と負の両方の対照を１ウェルにつき２０μｇＤＮＡのレベルで投与する一方、デンドリマーに投与されたＤＮＡは記載した通り変化させた。この後、インキュベーション培地をペニシリン（１００Ｕ/ｍｌ）とストレプトマイシン（０．１ｍｇ/ｍｌ）から成るＤＭＥＭ培養培地と交換し、さらに、１０％ＣＯ２中４８時間３７℃でインキュベートした。次に細胞をＰＢＳ（２００μｌ）で洗浄し、１ｘ受動リーシス緩衝液(1x Passive Lysis Buffer)（８０μＬ、Promega、イギリス）で３０分間溶解させた。次いで、細胞ライゼート（溶菌液）を以下に記載するようにβ−ガラクトシダーゼ発現について分析した。
【００４４】
β−ガラクトシダーゼの発現
検定緩衝液［リン酸ナトリウム緩衝液２００ｍＭ、ｐＨ＝７．３；塩化マグネシウム２ｍＭ、メルカプトエタノール１００ｍＭ、o−ニトロフェノール−β−ガラクトピラノサイド(galactopyranoside)１．３３ｍｇ/ｍｌ］に、９６ウェルの平底プレート内の上記細胞ライゼートを等容量で添加した。各試料を１時間インキュベートし、自動読取り装置で４０５ｎｍの可視吸光度を読み取った。
【００４５】
［インビボでのトランスフェクション］
ＤＮＡ-ポリマー調剤
製造者の使用説明書に従って、エクスゲン５００（線状ポリエチレンイミン２２ｋＤ、Euromedex、フランス）と、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子（ｐＣＭＶルシフェラーゼ）とを配合した。ＤＡＢ１６とＤＳＡＭの両方を、プローブ音波処理（最大出力の１５％に設定した器具で１５分間）によって５％ｗ／ｖのデキストロースに溶解させ、静脈注射に先駆けて、重量比５：１でＤＮＡと１５分間混合した。
【００４６】
動物実験
Ｂａｌｂ／Ｃマウスのグループ（ｎ＝３）の尾部静脈に、それぞれ１００μｇのＤＮＡを含むＤＡＢ１６調剤、ＤＳＡＭ調剤、エクスゲン５００調剤又は裸のＤＮＡ調剤を、注射量２００〜４００μｌで注射した。エクスゲン５００と裸のＤＮＡを、それぞれ正の対照と負の対照とした。臓器を２４時間後に摘出し、液体窒素で急速冷凍し、分析が行われるまで−８０℃で保存した。
【００４７】
ルシフェラーゼの分析
肝臓組織１ｍｇ当たり５μｌの組織溶菌緩衝液を肝臓サンプルに添加した。この溶菌緩衝液は、緩衝液５０ｍｌ当たり２５ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）と、２ｍＭのＤＴＴと、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）と、１０％ｗ／ｖのグリセロールと、１％ｗ／ｖのトリトンＸ−１００と、１コンプリート・プロテイン抑制カクテルタブレットを含有する。その他の臓器には、組織１ｍｇ当たり４μｌの組織溶菌緩衝液を添加した。溶菌緩衝液中の臓器を氷上で均質化してスラリーとし、このスラリーを氷上で１５分間インキュベートした。得られたスラリーを１３，０００ｒｐｍの遠心分離に掛けて、破砕した沈殿物と上澄みとに分け、上澄みを新しい管に取り除いた。前記沈殿物に別の溶菌緩衝液５０μｌを添加した。この沈殿物を均質化により再度懸濁液とし、もう一度１３，０００ｒｐｍで遠心分離機に掛け、上澄みを取り除き、これを前の上澄みサンプルへ加えた。上澄みサンプルを組織溶菌緩衝液で１：１０に希釈し、この溶液８０μｌを採取してルシフェラーゼの分析に用いた。この分析は、プロメガ（Promega）、イギリスによって提供されたプロトコルに従って実行した。プロテイン評価は、シグマ（Sigma-Aldrich、イギリス）ビシンコニニック酸システム(bicinchoninic acid system)（ＢＣ−１）を使用して行った。
【００４８】
［結果および考察］
ＤＮＡは、窒素に富むデンドリマーＤＡＢ１６、ＤＡＢ３２およびＤＡＢ６４（表２）と、さらにおそらくはＤＡＢ８と静電気的に結合する。これらの化合物は、窒素対リン酸比１.４７、１.４９、及び１.４５でＤＮＡを凝縮させ始め（表１）、表面窒素対リン酸比０.７８、０.７７、０.７４でＤＮＡを凝縮させ始める。
【００４９】
【表１】
2005511533.tif 000002
【００５０】
ＤＮＡは、従来報告されているように（文献３０）、プロピレンイミン・デンドリマーの表面窒素だけに結合するだけでなく、デンドリマーの第２シェルにある窒素にもおそらく結合するように思われる。ポリアミドアミン・デンドリマーとＤＮＡの凝縮は、静電的手段で生じることも分かった（文献１９）。ポリアミドアミン重合体よりもポリプロピレンイミン・デンドリマーの方が遺伝子デリバリへの利用に有利なのは、単純に、ポリプロピレンイミン・デンドリマー上にはプロトン化できる窒素の含有量が多いという理由からだと考えられる。さらに、線状重合体に比較して重合体の形態に由来する利点もある。ちなみに、内部の三級アミンはエンドソーム／リソゾーム部内の酸ｐＨ（文献５０）の中和に残され、ＤＮＡは表面一級アミンのみと相互作用すると考えられる。エンドソームによるポリアミドアミン運搬遺伝子の放出は、エンドソームのプロトンによる内部三級窒素のプロトン化に由来すると考えられ、これがエンドソームの膨潤とＤＮＡの細胞質への放出をもたらす（文献１２）。さらに、水中又はエタノール中（文献１２、１３）のポリアミドアミン・デンドリマー・アミド結合の加水分解は、トランスフェクション効率を５０倍まで高め、著者はこれを熱分解で重合体の柔軟性が増強されたためと考えている。この増大した柔軟性は、エンドソームの膨潤に重要であると言われている（文献１２）。しかし、エンドソーム／リソゾームのｐＨ中和に利用できる重合体中の三級アミンのレベルを単純に増強することで、重合体の柔軟性とは無関係に、トランスフェクションが高められると我々は考える。
【００５１】
インビトロにおけるポリプロピレンイミン・デンドリマーのトランスフェクション効率は、ＤＯＴＡＰ調剤のＤＮＡ２０μｇを使用して得られるプロテインの発現は、ＤＡＢ１６調剤のＤＮＡ５μｇを使用するだけで得られ、ＱＤＡＢ１６調剤のＤＮＡ１５μｇの使用とＤＯＴＡＰ調剤のＤＮＡ２０μｇの使用とでは有意な差異がないことを示す（表２）。
【００５２】
【表２】
2005511533.tif 000003
【００５３】
表２に示すβ−ガラクトシダーゼ発現は、２０μｇのＤＮＡを投与した細胞における最適ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＡＰ、β−ガラクトシダーゼ・レポーターＤＮＡ比＝５：１）調剤で得られる発現と比較しての発現％である。２０μｇの裸のＤＮＡ単独で得られるＤＯＴＡＰ調剤に対比したタンパク質発現％＝２５．１５％
【００５４】
ＤＡＢ８のトランスフェクションも、ＤＯＴＡＰで得られるものより、若干、勝っている（表２）。これは、ＤＡＢ８とＤＡＢ１６デンドリマーの遺伝子伝達活動が優れていることを示すものである。ＤＡＢ４は、現在、我々の研究所で試験中である。ＤＡＢ１６調剤については、サイズが１５０ｎｍであるＤＡＢ１６複合体を、窒素対リン酸比が３０：１で、ＤＮＡと併用した時のトランスフェクションが最適と考えられる。ＤＡＢ８のトランスフェクションも、窒素対リン酸比が３０：１の場合が最適である。ポリアミドアミン・デンドリマーのトランスフェクションは、低密度可溶物質を２０：１の窒素対リン酸比で形成されたの場合に最適である（文献１９）。
【００５５】
今まで研究したポリプロピレンイミン・デンドリマーの中で最もトランスフェクション効率の高い分子であるＤＡＢ８は、毒性も最も低く、ＤＯＴＡＰよりほぼ６Ｘ倍高いＩＣ５０を示す（表３）。
【表３】
2005511533.tif 000004
【００５６】
表３のデータは、ＤＮＡと四級化した分子（ＱＤＡＢ３２及びＱＤＡＢ１６）とで形成された複合体が、ＤＮＡと非四級化分子とで形成されたものよりも毒性が低いことを示す。四級化分子ＱＤＡＢ１６は、２０μｇのＤＮＡ投与でＤＯＴＡＰと同様の活性を示し、ＱＤＡＢ３２は、１０μｇの投与レベルで、遺伝子伝達因子として若干の活性を示す（表２）が、ＤＡＢ３２は不活性である。ＱＤＡＢ８は、四級化されていない親重合体と比較して、生体親和性に優れ、かつ、活性低下を伴わない遺伝子伝達調剤を生成すると考えられる。
【００５７】
商業製品エクスゲン５００（Exgen 500）と比較して、ＤＡＢ１６及びＤＳＡＭは、インビボでＤＮＡを組織へ効率的に伝達し、特に、肝臓（ＤＡＢ１６）及び脾臓（ＤＳＡＭ１６）を標的とした場合、エクスゲン５００より効率的な伝達性能を示す（表４、図５）。
【表４】
2005511533.tif 000005
【００５８】
表４に示す発現（％）は、５０μｇのＤＮＡとＤＡＢ１６の調剤（ＤＡＢ１６とＤＮＡの重量比＝５：１）及びＤＳＡＭ１６の調剤（ＤＳＡＭ１６とＤＮＡの重量比＝５：１）を静脈注射し、線状ＰＥＩ（Ｍｗ＝２２ｋＤ、エクスゲン５００）で得られる発現と比較した場合のルシフェラーゼの発現（％）である。エクスゲン５００調剤は、線状ＰＥＩからなり、ＤＮＡ重量比は６：１である。
【００５９】
[結論]
要約すると、ポリプロピレンイミン・デンドリマーの低世代（ＤＡＢ８及びＤＡＢ１６）は、生体親和性においてＤＯＴＡＰより優れ、トランスフェクション活性に関しては、いくつかの投与レベルにおいてＤＯＴＡＰよりも勝っている。また、インビボにおいて、ＤＡＢ１６は肝臓を標的として、ＤＳＡＭ１６は脾臓を標的として使用することができる。
【００６０】
実施例２
[材料]
全てのポリプロピレンイミン・デンドリマー、グルコースは、シグマ(Sigma)社（Aldrich、イギリス）から入手した。フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、プロテアーゼ抑制カクテル、リン酸塩緩衝塩水用錠剤、イソプロパノ−ル及びマルトースも、全てシグマ社から得た。また、9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン-7-イル)-Ｄ-ガラクトピラノサイド(9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl)-D-galactopyranoside)（ＤＤＡＯ）は、モレキュラ・プローブス（Molecular Probes）社から購入した。エクスゲン５００（Exgen 500）（線状ポリエチレンイミン、Ｍｗ＝２２ｋＤ）は、フランスのユーロメデックス（Euromedex）社から入手した。受動溶菌緩衝液（passive lysis buffer）は、イギリスのプロメガ（Promega）社から供給を受けた。前述したように、ｐＣＭＶ−ベータ・ガルＤＮＡは、ライフサイエンス／インビトロゲン（Life Sciences/Invitrogen）社から入手し、大腸菌で増殖させた。
【００６１】
［方法］
健康な雌のバルブシーマウス群（ｎ＝３）に、ＤＡＢ８−ＤＮＡ、四級アンモニウムＤＡＢ８（Ｑ８）−ＤＮＡ、ＤＡＢ１６−ＤＮＡ、ＤＡＢ３２−ＤＮＡ、もしくは、エクスゲン５００（線状ポリエチレンイミン）−ＤＮＡの何れかを静脈注射した。１００μｇのＤＮＡを含む５％ｗ／ｖのグルコースに分散させたＤＮＡ複合体（２００μｌ）と、デンドリマー調剤又はエクスゲン５００を各マウスに注射した。デンドリマーとＤＮＡの重量比５：１で、ＤＡＢ８、Ｑ８およびＤＡＢ１６を投与し、ＤＡＢ３２はデンドリマーとＤＮＡの重量比３：１で投与した。エクスゲン５００は、製造者の指示書に従って投与された。
【００６２】
２４時間後にマウスを殺し、切除した肺と肝臓は、β−ガラクトシタ−ゼ検定を実施するまで液体窒素で冷凍した。検定に際し、１ｇの臓器をプロテアーゼ溶菌緩衝液と合わせて２ｍＬに調製した。プロテアーゼ溶菌緩衝液は、ａ）プロテアーゼ溶菌緩衝液５Ｘ（１ｍＬ）と、ｂ）フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）（メタノール中５０ｍＭ、２００μＬ）と、ｃ）プロテアーゼ抑制カクテル（１００μｌ）及び水（３．７ｍＬ）で構成させた。
【００６３】
０．１ｍｌのリン酸塩緩衝塩水（ｐＨ＝７．４、ＰＢＳ）に分散させた１×１０６のＡ４３１細胞を、ＣＤ−１メスヌードマウスそれぞれのわき腹に皮下注入した。注入から４日後、腫瘍が触診で確認された（２ｍｍ位）。注入から８日後、腫瘍の大きくなり（５ｍｍ位）、血管がより目立つようになった。腫瘍の移植から１１日後に投薬が行われた。複数のマウスに、全て５％ｗ／ｖのデキストロース２００μＬに分散させた裸のＤＮＡ，ＤＡＢ１６−ＤＮＡ、エクスゲン５００−ＤＮＡとして、５０のＤＮＡを静脈注射した。対照群のマウスには５％ｗ／ｖのデキストロースを注射した。２４時間後にマウスを殺し、腫瘍を摘出して液体窒素で急速冷凍した。検定のために、各腫瘍を３ｍＬのプロテアーゼ溶菌緩衝液に添加した。緩衝液中の臓器を均質化し、均質化した臓器の分散液１００μｌを、３００μｌの検定試薬に添加した。検定試薬は、ａ）ＤＭＳＯ（１５μＬ）中のＤＤＡＯ５ｍｇ/ｍＬと、ｂ）メタノール（２０μＬ）中のＰＭＳＦ５０ｍＭと、ｃ）ＰＢＳ（１００μＬ）中のマルト−ス２０％ｗ／ｖと、ｄ）プロテアーゼ抑制カクテル（１５μｌ）と、ｅ）ＰＢＳ（１５０μｌ）とで構成させた。試料を３７℃で適当な時間（４５〜９０分）インキュベートした。β−ガラクトシダーゼ反応を止め、検定の妨害に成り得るタンパク質を変性させるために、上で得た混合物２００μｌを９５℃で２分間暖めた。次に、８００μｌのイソプロパノ−ルを分散液に加えた。得られた混合物をボルテックス攪拌器で均質化し、暗所で２０分間振り混ぜた。この分散液を次に１３０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。５００μｌの上澄みを５００μｌの蒸留水に添加し、ベックマン(Beckman)ＬＳ−５０Ｂ蛍光計（λＥＸＣ：６３０ｎｍ、λＥｍ：６５８ｎｍ、スリット：２．５ｎｍ）で蛍光を読み取った。次に、β−ガラクトシダーゼ規格を用いて酵素量を定量した。
【００６４】
［結果及び考察］
商業製品エクスゲン５００と比較して、ＤＡＢ１６、Ｑ８及びＤＡＢ３２は、全て肝臓を標的とすることが判明した（図６）。ＤＡＢ１６は、エクスゲン５００と比べて、腫瘍における遺伝子発現に際立っていた（図７）。
【００６５】
こうしたデータは、市販の調剤、例えば肺を標的とする非ウイルス性の遺伝子デリバリシステムに比較して（文献８、５３）、ポリプロピレンイミン・デンドリマーが肝臓を標的とし、腫瘍組織でより高度な遺伝子発現を起こすことを裏付けている。肝臓を標的にできることは、肝臓の酵素異常や肝臓の腫瘍の治療に役立つことを示すものである。図７はポリプロピレンイミン・デンドリマーが、腫瘍で高度な遺伝子発現を起こすことを示している。
【００６６】
参照文献
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2005511533.tif 000007
2005511533.tif 000008
2005511533.tif 000009
2005511533.tif 000010
2005511533.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】第３世代ポリプロピレンイミン・デンドリマーであるＤＡＢ１６を示し、ＤＡＢ６４は、この分子にさえに２世代のプロピルアミンが結合したものである。
【図２】ＤＡＢ１６の両親媒性誘導体であるＤＳＡＭ１６（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ＋ＤＡＢ１６）を示す。
【図３】ＤＡＢ４のボランフィフリック誘導体であるＢｎＤＡＢ４を示し、ｎが８、１０又は１２である場合は、それぞれＢ８ＤＡＢ４、Ｂ１０ＤＡＢ４、Ｂ１２ＤＡＢ４を示す。
【図４】ＤＡＢ１６の四級アンモニウム誘導体であるＱＤＡＢ１６（ＣＨ３ｌ＋ＤＡＢ１６）を示す。
【図５】インビボにおけるルシフェラーゼの遺伝子発現を示す。
【図６】ポリプロピレンイミン・デンドリマーによる肝臓を標的とした遺伝子発現を示す。
【図７】ＤＮＡの静脈投与後の腫瘍遺伝子発現を示し、図中のＰＥＩ−ＤＮＡは、エクスゲン５００(Exgen 500)調剤に相当する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月5日(2003.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体体内の標的部位に生物活性分子を配達するための組成物であって、その組成物が生物活性分子とこれに混合されたカチオン性のポリプロピレンイミン・デンドリマー及び／又はその誘導体とを含有し、前記のデンドリマーがジアミノブタン分子を中核として、これに第１、第２又は第３世代のプロピレンイミン分子が結合したものである前記の組成物。
【請求項２】
カチオン性のデンドリマーが共有結合した誘導基で修飾されている請求項１記載の組成物。
【請求項３】
カチオン性デンドリマーが、疎水性基、親水性基及び両親媒性基からなる群から選ばれる基で修飾されている請求項２記載の組成物。
【請求項４】
カチオン性デンドリマーが一つの炭化水素鎖の両端に二つのデンドリマー分子が結合することで修飾されている請求項２記載の組成物。
【請求項５】
炭化水素鎖が、炭素数８、１２、１４、１６及び１８の炭化水素鎖からなる群から選ばれる請求項４記載の組成物。
【請求項６】
誘導されたカチオン性デンドリマーが、ボランフィフリック・デンドリマーである請求項４又は５記載の組成物。
【請求項７】
誘導基の数が、デンドリマー１分子当たり１から、デンドリマー分子表面に存する全ての末端基の数までである請求項６記載の組成物。
【請求項８】
両親媒性誘導体が、親水性セグメントと疎水性セグメントを兼備している請求項３記載の組成物。
【請求項９】
親水性セグメントが、ホスホグリセリレート分子から誘導されている請求項３記載の組成物。
【請求項１０】
疎水性セグメントが、エステル結合によって親水性セグメントに共有結合している請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
疎水性セグメントが、炭素鎖長８〜２４のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基から選択される請求項８又は１０記載の組成物。
【請求項１２】
両親媒性誘導体が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び糖分子から群から選択されたリンカー（連接）分子によってデンドリマーに結合している請求項８記載の組成物。
【請求項１３】
リンカー分子ＰＥＧの長さが、エチレングリコール単位で１〜１２０である請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
リンカー分子が、ホスホグリセリドである請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】
デンドリマー１分子あたりの両親媒性誘導体の数が、デンドリマー１分子当たり１つから、全ての基の数までである請求項８記載の組成物。
【請求項１６】
受容体体内の標的部位が、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び心臓からなる群から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
組成物が受容体の肝臓へ生物活性分子を配達するための組成物であって、その組成物が、生物活性分子に混合させたポリプロピレンイミン・デンドリマーＤＡＢ１６である請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
組成物が受容体の脾臓へ生物活性分子を配達するための組成物であって、その組成物が、生物活性分子に混合させたポリプロピレンイミン・デンドリマーＤＳＡＭ１６である請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
受容体がヒトである請求項１又１６〜１８の何れかに記載の組成物。
【請求項２０】
生物活性分子が、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド及び薬理的活性剤からなる群から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
哺乳類の細胞をインビトロで生物活性分子にてトランフェクトするのに使用する請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２５の何れかに記載された組成物と、製薬上許容される担体とを含む調剤。
【請求項２３】
受容体体内の標的部位に生物活性分子を配達するための、生物活性分子と混合させたカチオン性デンドリマー及び／又はその誘導体を含有する組成物の使用。
【請求項２４】
標的部位が、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び心臓からなる群から選択される請求項２３記載の組成物の使用。
【請求項２５】
受容体体内の標的部位へ生物活性分子を配達する方法であって、請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物を調製する工程を含む前記の配達方法。
【請求項２６】
標的部位が、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び心臓からなる群から選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ジアミノブタン分子を中核として、これに第１、第２又は第３世代のプロピレンイミン分子が結合したポリプロピレンイミン・デンドリマー及び／又はその誘導体と、
生物活性分子とを混合することをからなる請求項１〜２５の何れか記載の組成物の調製方法。
【国際調査報告】
2005511533.tif 000019
2005511533.tif 000020
2005511533.tif 000021
2005511533.tif 000022