(57)【要約】  周知のトール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーに類似の新規な可溶性タンパク質が開示されている。本発明は、これらの新しい可溶性ポリペプチド、該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、該ポリペプチドと選択的に結合する抗体、及び該ポリペプチドの産生に適した発現系に関する。前記ポリペプチドは、ＴＬＲの作用を含む哺乳動物における炎症反応を変調するのに有用である。
2005511020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２のいずれかによって同定される単離したポリペプチド、あるいは１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加又は置換によって得ることができる、配列番号１又は２のいずれかのポリペプチドと少なくとも９０％の相同性を有し、機能的かつ可溶性のポリペプチドであるその変異体及び断片。
【請求項２】
約２２、２５、３８、４０、６０、７０及び／又は８０ｋＤａの分子サイズを有しており、その有効型にあることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの断片。
【請求項３】
トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーの相同体であるか又はそれに関連しており、その有効型で可溶性であることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の単離したポリペプチド。
【請求項４】
母乳血清、血漿又は腸内容物など哺乳動物の体液の、抗ＴＬＲ抗体を用いて実施する免疫沈降によって得ることができる、請求項１から３までのいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４までに記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を有する、単離した核酸分子。
【請求項６】
医薬品、機能的食品成分又は化粧品として使用するための、請求項１から４までのいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
哺乳動物における免疫学的及び／又は炎症性プロセスを調節又は変調するための、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から４までのいずれかに記載のポリペプチドを含む消費可能な製品。
【請求項９】
請求項１から４までのいずれかに記載のポリペプチドを含むクリーム、ローション又は軟膏。
【請求項１０】
請求項１から４までのいずれかに記載のポリペプチドを有効量で投与することを含む、哺乳動物における炎症状態又はアレルギー反応を予防、阻止、処置又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊椎動物における免疫応答の変調及び調節の分野に関する。詳細には、本発明は、可溶性トール様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体調節分子（ｓＴＬＲＲ）と命名された乳から単離された新規のポリペプチドを報告する。本発明はまた、この新規ポリペプチドをコードしている核酸分子、並びにこのポリペプチドを含む消費可能な製品、ペットフード及びクリームやローションにも関する。
【背景技術】
【０００２】
無菌胎児腸は、出生直後に環境中の微生物によって急激にコロニー形成される。コロニー形成の初期における主な細菌成分は、内毒素（ＬＰＳ）産生細菌であるグラム陰性細菌である。これらはまた、新生児の胃腸管におけるいくつかの感染性及び炎症状態に寄与し得る。母乳で育てた新生児では腸の感染症及び腸の炎症症の発生率がより低く、呼吸器の感染症の発生率がより低く、また後の人生において発生するアレルギー疾患がより少ない。いくつかのヒト乳の成分がこの保護的な役割を説明しており、とりわけ、免疫担当細胞、受動免疫の保護を移行させる抗体、ヒト乳オリゴ糖、リゾチーム、ラクトフェリン、及び他の因子が誘起される。
【０００３】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）中で細胞のシグナル伝達を媒介しているトール受容体は、全く異なった脈絡で見なければならない。この膜貫通型分子の重要なファミリーは主に形態発生に関与しているが、ハエの成体の後の生涯では、その活性化により感染症における防御的な応答が誘発される。
【０００４】
トール受容体ファミリーの哺乳動物における相同体が最近発見された（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ、  Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ  Ｊｒ．、生得免疫：非クローナル認識系の効力（Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｔｈｅ  ｖｉｒｔｕｅｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎｃｌｏｎａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）、Ｃｅｌｌ、１９９７年、９１：２９５〜２９８）。明らかな関係性のため、哺乳動物の相同体はトール様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれている。ＴＬＲは、ハエ中のトールタンパク質及びトール関連タンパク質として、細胞内ドメイン内に伸びる膜貫通型の細胞表面タンパク質である。細胞外領域（Ｎ末端）は一般に複数のロイシンに富んだ反復（ＬＲＲ）を含み、周知のヒト及びショウジョウバエのファミリーメンバーの中には、膜近傍のスペーサーであると推定される上端部のシステインに富んだモジュールが含まれる。哺乳動物のＴＬＲ及びショウジョウバエのトールタンパク質の細胞内（Ｃ末端）ドメインは十分に記載されているインターロイキン１及び１８の受容体（ＩＬ−１Ｒ及びＩＬ−１８Ｒ）のそれと類似しており、これは、下流のシグナル伝達における機構及びこれに関与するものが類似していることを示している。現在までに、約１０種の哺乳動物ＴＬＲからなるファミリーが同定されている。
【０００５】
それ以降、細胞の外側からＴＬＲに媒介されるシグナル伝達を活性化できる潜在的なリガンドを探すために、また活性化された受容体の細胞内シグナル伝達経路を決定するために、数多くの研究が行われてきた。
【０００６】
ＴＬＲファミリーのメンバーが、細菌及び細菌細胞壁成分の認識及びこれらへの応答を担っている哺乳動物の生得免疫系の一部であることが明らかになった。
【０００７】
国際公開公報ＷＯ  ００７５３５８号は、新規のＴＯＬＬファミリーメンバー（ＴＯＬＬ核酸ファミリーメンバー）の発見に基づいている。この発明によるＴＯＬＬ分子が変調剤を開発するための標的として有用であると考えられている。したがって、ヌクレオチド及びアミノ酸配列が開示され、特許請求されている。国際公開公報ＷＯ  ００７５３５８号の図１には、ヒトＴＯＬＬタンパク質のヌクレオチド配列並びにそれにコードされているアミノ酸配列が示されている。このＴＯＬＬタンパク質は受容体として機能する膜タンパク質であるかもしれず、また免疫シグナル伝達機構に関与しているかもしれない。
【０００８】
国際公開公報ＷＯ  ００２４７７６号は、トールファミリーに属する新規の分子種ＴＬＲ６を開示している。したがって、ＴＬＲ６は免疫応答に関与しているさまざまな遺伝子の発現を調節する。また、受容体をコードしている遺伝子も示されている。
【０００９】
この科学的研究以外では、現在までに技術的に開発可能な効果及び上に記載した機能以外の機能は開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
その結果、本発明の課題は、ＴＬＲの成分、より詳細にはＴＬＲ−２に媒介される、細菌生成物によって誘発される活性化経路を調節する活性物質を個体に投与する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、第１態様では、本発明は配列番号１又は２のいずれかによって同定される請求項１に記載の単離したポリペプチド、あるいは１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加又は置換によって得ることができる、配列番号１又は２のいずれかのポリペプチドと少なくとも９０％の相同性を有し、機能的かつ可溶性のポリペプチドであるその変異体及び断片を提供する。
【００１２】
第２態様では、本発明は、本発明によるポリペプチドと選択的に結合する抗体を提供する。
【００１３】
第３態様では、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を有する単離した核酸分子を提供する。
【００１４】
第４態様では、本発明は、本発明によるポリペプチドを含む消費可能な製品を提供する。
【００１５】
第５態様では、本発明は、本発明によるポリペプチドを含むクリーム、ローション又は軟膏を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるポリペプチドを有効量で投与することを含む、哺乳動物における炎症状態又はアレルギー反応を予防、阻止、処置又は治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、ＴＬＲ分子の細胞外ドメイン、より詳細にはＴＬＲ−２と高い相同性を示す、ヒト母乳の分子成分における驚くべき発見に基づいている。したがって、この乳成分は、ヒトＴＬＲ２の天然に存在する可溶性の誘導体を構成する。特に驚くべきことは、膜貫通型タンパク質として知られているタンパク質の可溶性変異体がヒト乳中に見つかったことである。本発明はさらに、推定上のＴＬＲ−２リガンド、すなわちグラム陽性細菌のリポタンパク質、ＬＰＳ、ｓＣＤ１４とのその相互作用によって、乳中に可溶性トール様受容体調節分子（以降ｓＴＬＲＲ）が見つかる可能性に基づいている。これらは哺乳動物の免疫応答、特に哺乳動物の腸管内に存在する細菌に保存されている分子に対する免疫応答の調節において重要な役割を果たす。したがって、本発明者らはこの分子を可溶性トール様受容体調節分子又は可溶性トール様受容体と命名する。
【００１８】
本発明によるポリペプチドの利点は、これにより抗原に対する哺乳動物の炎症反応を調節する手段が提供されることである。
【００１９】
本発明の別の利点は、これにより哺乳動物における炎症反応の阻害、下方制御又は阻止に有効なポリペプチドが提供されることである。
【００２０】
本発明のさらに別の利点は、これにより医薬品又は化粧品として有用なポリペプチドが提供されることである。
【００２１】
本発明のさらに別の利点は、これが胃腸の炎症の予防、阻止又は治療に特に適していることである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書の文脈中では、「含む」という言葉は「数ある中でも含む」という意味である。これは、「それのみからなる」と解釈されることを意図しない。
【００２３】
本明細書の文脈中では、「ＴＬＲの相同体」又は「ＴＬＲに関連する」という言葉は、任意の知られているＴＬＲに特異的に結合する抗体に認識されるタンパク質を意味する。より詳細には、任意の知られているＴＬＲの外部ドメイン内の領域に結合する抗体である。ＴＬＲの新規のファミリーメンバーはヒト並びに他の生物中でも見つかると予測されているので、この定義はこれら新規のＴＬＲタンパク質に対する抗体に認識されるタンパク質も含むことを意図する。
【００２４】
本発明の文脈中では、用語「活性」とは酵素活性に限定されることを意図しない。しかし、これは、リガンド又はそれら自体で一緒になって結合し得るリガンド群の結合機能も言うことを意図する。したがって、ｓＴＬＲＲが果たし得るすべての機能が用語「活性」に包含される。
【００２５】
用語「有効」とは、分子、たとえばペプチドの状態であって、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で通常行われている機能が行われる状態をいう。
【００２６】
本発明の文脈中では、用語「可溶性」とは、その有効形及びその天然で機能する環境下で可溶性であるポリペプチドを言う。したがって、これらは、たとえばヒト母乳のｐＨに対応するｐＨで可溶性である。
【００２７】
本発明の文脈中では、「可溶性トール様受容体調節分子」の略記である用語「ｓＴＬＲＲ」は、本発明による任意のポリペプチドを包含することを意図する。経済的及び紙面的な理由により、また抗ＴＬＲ抗体とのその関係及び／又は抗ＴＬＲ抗体に認識されるその能力を反映しており、かつそれが可溶性であることが理由で、これが最も適切な命名であると考えられるので、用語ｓＴＬＲＲが時折使用される。
【００２８】
本発明の文脈中では、用語「可溶性トール様受容体調節分子」（ｓＴＬＲＲ）とは、新規ポリペプチドが、それだけには限定されないがヒト乳及び血漿を含めた任意の生体液の無細胞調製物中で検出可能であることを意味することを意図する。既に言及した源から得たこのポリペプチドの精製又は半精製した形すべてが、本発明に報告された活性を示す。たとえば、ｓＴＬＲＲは血液など乳以外の他の体液中、又はヤギ、ヒツジ、ウシなどヒト以外の他の哺乳動物の乳中で見つかるかもしれない。
【００２９】
本発明の文脈中では、用語「変異」とは、ヌクレオチド配列中の知られている改変すべてを含むことを意図する。これは点変異のみを含むことを意図せず、たとえば削除、挿入、フレームシフト、ナンセンス、ミスセンス変異も含まれる。
【００３０】
本発明の文脈中では、用語「相同性」又はアミノ酸配列の相同体を包含する「相同体」とは、「共通の進化起源を有する」ことを意味すると理解される。これはしばしば、ある配列と別の配列との比較をいい、相同性を決定するのに役立ち得る用語「類似性」と一緒に使用される。相同性を決定するモデルを以下に示す。
【００３１】
用語「機能的食品成分」とは、生物活性ではあるが医薬品ではない物質をいうことを意図する。医薬品とは一般的に、その消費により望ましくない副作用が示されるかもしれないので政府当局によって医薬品として使用が許可又は許容されなければならない活性成分を含む。一方、機能的食品成分は一般的に、それらが食品、たとえば乳などに天然に存在することが主に理由で消費者に有害でないことが知られている、厳密にいうと栄養上の目的を超える活性成分を反映している。
【００３２】
本発明によるポリペプチドは、たとえば配列番号１又は２のいずれかによって同定されるポリペプチドと少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の相同性を有し得る。
【００３３】
本発明によるポリペプチドは、配列番号１又は２によって同定される配列を有し得る。
【００３４】
本発明の一態様では、前記ポリペプチドは約２２、２５、３８、４０、６０、７０及び／又は８０ｋＤａの分子サイズを有しており、その有効型にある。
【００３５】
しかし、ポリペプチドのこれら分子量とは、分子量に影響を与えるグリコシル化されたペプチドについていう。本発明によるヒトＴＬＲ−２（ｓＴＬＲＲ）の８０ｋＤａの「完全長」細胞外の可溶性部分は、たとえば、グリコシル化なしでは６４．４ｋＤしかない。ヒトｓＴＬＲＲは４つの潜在的なＮグリコシル化部位（−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−）を有しており、ウシは３つ有していることが述べられている（ヒト：Ａｓｎ９６、Ａｓｎ１８１、Ａｓｎ３９６、Ａｓｎ４２４；ウシ：Ａｓｎ９４、Ａｓｎ１７８、Ａｓｎ４２２）。
【００３６】
さらなる実施形態では、本発明のポリペプチドはトール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーの相同体又はそれに関連しており、その有効型で可溶性である。
【００３７】
したがって、本発明によるポリペプチドは、同じリガンド又は同じリガンド群についてＴＬＲと競合するその能力によって特徴づけられ得る。
【００３８】
別の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、たとえば、母乳血清、血漿又は腸内容物など哺乳動物の体液の、抗ＴＬＲ抗体を用いて実施する免疫沈降によって得ることができる。
【００３９】
本発明のｓＴＬＲＲは、ヒト乳から、特に泌乳初期段階の間に得られる。明らかに、ｓＴＬＲＲは、乳中に存在する又は外部源由来の他のタンパク質あるいは分子と、相互作用又は結合する。ＳＤＳゲルで測定したポリペプチドの大きさは、それに結合しているコファクター／分子に応じて変動し得る。
【００４０】
このタンパク質を単離する可能かつ容易な技法は、免疫クロマトグラフィーとも呼ばれるアフィニティークロマトグラフィーである。当業者には周知であるこの方法では、特異的な抗体に対するタンパク質の特異的結合を利用する。抗ＴＬＲ抗体（たとえば抗ＴＬＲ２抗体）を固体基質上に保持する。抗体は、基質と共有結合していてもよく、その可変かつ特異的な部分を曝露している。基質は、化学的に不活性なビーズからなり得、これに抗体が結合している。抗体に結合したビーズをカラムに充填する。ｓＴＬＲＲ（たとえばヒト乳又は血清）を含む液体をカラムにすすぎ流すと、ポリペプチドが抗体に結合されてそこに保持される。ｓＴＬＲＲを含むカラムを洗浄した後、これを溶出させることができる。このようにして溶出されたタンパク質分画をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでさらに分離し、さらなる電気泳動によってニトロセルロースフィルター上に移してもよい。最後に、標準のウエスタンブロット手順に従って可溶性ＴＬＲＲを可視化させてもよい。あるいは、遠心分離又は減外濾過によって濃縮し、この形で消費可能な製品に有効量加えてもよい。
【００４１】
さらなる実施形態では、ＴＬＲの細胞外部分に対して産生させた抗体によって本発明によるポリペプチドを認識することができる。
【００４２】
したがって、本発明によるポリペプチドは、免疫沈降後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、適切な膜への電気ブロッティング、及びタンパク質溶出によって得ることができる。当業者はこれらの技法を十分知っている。
【００４３】
別の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、ＴＬＲポリペプチドと比較した場合、ＴＬＲポリペプチドの細胞外ドメインに対して最も高い配列類似性及び／又は相同性を示す。好ましくは、本発明によるポリペプチドはヒトＴＬＲ−２分子に対して最も高い配列類似性を示す。
【００４４】
さらに別の実施形態では、本発明によるポリペプチドはヒトＴＬＲ−２分子に関連している又はそれの相同体である。
【００４５】
なおさらなる実施形態では、本発明によるポリペプチドはヒト母乳由来である、又は乳由来の変異体と同一である。このポリペプチドをヒト乳から単離する方法は上述した。
【００４６】
本発明の一態様による抗体に関して、当業者が特定の抗原又はタンパク質に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体の調製方法を十分心得ていることが明らかである。タンパク質を単離した後は、標準の技術に従って抗体を産生し得る。ヒトＴＬＲ２のＮ末端にマッピング（Ｎ末端から５アミノ酸の所から開始）されている、人工的に合成した２０量体のペプチドで動物を免疫化することによって、有効なポリクローナル（ウサギ）抗体を産生し得る。このような抗体は、ＴＬＲ２の可溶型と非常に良好な反応性を示している。
【００４７】
本発明のｓＴＬＲＲを検出するのに有用な市販されている抗体は、Ｂｉｏｃａｒｔａ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨから販売されている抗ＴＬＲ２ポリクローナル（ウサギ）抗体のＩＭＧ４１０（ｗｗｗ．ｉｍｇｅｎｅｘ．ｃｏｍ）であり、これは、ヒトＴＬＲ−２のアミノ酸１８０〜１９６、３５３〜３７０、４７３〜４８９に対応する３つのペプチドの混合物を用いた免疫化によって産生されている。
【００４８】
さらなる抗体は、抗ＴＬＲ２ポリクローナル（ヤギ）抗体のＴＬＲ２（Ｎ−１７）Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ｗｗｗ．ｓｃｂｔ．ｃｏｍ）カタログ番号ｓｃ−８６８９であり、これは、ウエスタンブロット及び免疫沈降でうまく機能する。
【００４９】
本発明の核酸分子に含められることが意図される核酸分子の可能な変異体は、厳密な条件下で本発明の核酸とハイブリダイズする核酸分子である。
【００５０】
本発明の核酸分子は、本発明のポリペプチドと少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する能力のある発現系をさらに含んでいてもよい。
【００５１】
生物活性のあるｓＴＬＲＲを発現させるために、ｓＴＬＲＲ又はその機能的等価物をコードしているヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクター内に挿入する。
【００５２】
当業者に周知の方法を使用して、ｓＴＬＲＲコード配列並びに適切な転写及び翻訳制御配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏの組替え又は遺伝的組替えが含まれる。このような技術は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９年、「分子クローニング、実験室手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００５３】
ｓＴＬＲＲコード配列を含有して発現させるためにさまざまな発現ベクター／宿主系を利用することができる。これらには、それだけには限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌など微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクターを幹線させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクターを感染させた植物細胞系、あるいは動物細胞系が含まれる。原理的には、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞又は真菌細胞を含むすべての発現系を使用し得る。
【００５４】
驚くべきことに、ヒト乳腺上皮細胞にはｓＴＬＲＲの機能的なｍＲＮＡ転写物は見つからなかったが、理論的に有望である転写物は見つかった。さらに、驚くべきことに、ｓＴＬＲＲの機能的（可溶性）変異体は大きさが相当異なりうることが判明した（３７、４０、６０、７０、及び８０ｋＤａ）。これらの観察により、ｓＴＬＲＲが完全長ＴＬＲ２のプロセッシングにより作製されることが示唆される。また、ｓＴＬＲＲがＴＬＲ２の細胞外部分に対して産生した抗体と相互作用することにより、本発明によるｓＴＬＲＲがＴＬＲの細胞外部分又はより短いその断片に対応していることが明らかとなる。
【００５５】
したがって、本発明は、ヒト及びウシのＴＬＲ−２のプロセッシングされた可溶性細胞外部分に対応する配列番号１及び２を提供する。
【００５６】
本明細書の配列表部分における配列番号１は、ヒト乳中に生じる本発明によるポリペプチド及びより短いその断片を同定している。
【００５７】
本明細書の配列表部分における配列番号２は、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）における配列番号１の機能的相同体である本発明によるポリペプチドを同定している。配列番号２の機能的相同体はウシ乳から相当な量で容易に富化又は単離することができるので、工業的用途には配列番号２の機能的相同体の方がより適切であるかもしれない。
【００５８】
本発明の代替実施形態では、当分野で周知の化学方法を使用してｓＴＬＲＲのコード配列を全体として又は部分的に合成し得る。同様に、ｓＴＬＲＲアミノ酸配列を合成するために化学方法を使用して、このタンパク質自体を産生させることもできる。可能性のあるヌクレオチド配列は、遺伝コードから推論することができる。
【００５９】
医薬品、機能的食品成分又は化粧品として使用する本発明によるポリペプチドに関して、このポリペプチドを、哺乳動物における炎症状態を阻止又は下方制御するために使用し得る。
【００６０】
さらに、本発明によるポリペプチドを、哺乳動物における炎症状態の阻止、予防、処置又は治療に使用し得る。
【００６１】
たとえば、炎症状態とは哺乳動物の胃腸管又は皮膚の炎症状態である。
【００６２】
ポリペプチドの施用形態は重要ではない。たとえば、上記のように単離及び濃縮した後、ポリペプチドを単に直接、経口的に消費してもよい。これは、胃腸管の炎症状態を直接処置する場合に特に当てはまる。
【００６３】
ポリペプチドを皮膚の炎症状態の処置に使用する場合、ｓＴＬＲＲを、皮膚の刺激作用や炎症を処置又は阻止するために設計された任意の適切なローション、クリーム、バーム（ｂａｌｍ）などに加えてもよい。たとえば、ｓＴＬＲＲを水中油又は油中水の乳濁液に加えてもよい。好ましくは、油相と水相を乳化した後に高濃度に濃縮したｓＴＬＲＲを加える。また、最後のホモジナイズステップの後にｓＴＬＲＲを加えることも可能である。好ましくは、約３５℃で混合しながら濃縮したｓＴＬＲＲを加える。米国特許ＵＳ  ５７４４１４５号（Ｎｅｓｔｅｃ  Ｓ．Ａ．）では、ｓＴＬＲＲを容易に加えることができるいくつかの化粧品組成物が開示されている。
【００６４】
本発明のポリペプチドはさらに、皮膚科学的な薬剤として使用し得る。
【００６５】
別の例では、本発明のポリペプチドを、哺乳動物の粘膜における炎症状態の阻止、予防、処置又は治療に使用し得る。
【００６６】
さらに、本発明のポリペプチドを、哺乳動物におけるアレルギー反応の阻止、予防、処置又は治療に使用し得る。
【００６７】
本発明による消費可能な製品に関して、これはペットフードであり得る。好ましくは、この消費可能な製品はヒトを対象としており、より好ましくは幼児による消費を対象としている。これは、栄養フォーミュラ又は幼児用調乳、冷蔵の又は長期保存可能な乳製品あるいは菓子類であってもよい。
【００６８】
栄養フォーミュラは任意の適切な方法で調製し得る。たとえば、食物タンパク質源、炭化水素源及び脂肪源を適切な割合で混合することによって栄養フォーミュラを調製し得る。使用する場合は、乳化剤を混合物に含めてもよい。この時点でビタミン及びミネラルを加えてもよいが、熱分解を避けるために通常は後ほど加える。脂溶性のビタミン、乳化剤などはすべて、混合前に脂肪源に溶かしてもよい。その後、水、好ましくは逆浸透に供した水を混ぜ入れて液体混合物を形成する。水の温度は、成分の分散を補助するために約５０℃から約８０℃が好都合である。市販されている液化剤を使用して液体混合物を形成してもよい。その後、液体混合物をたとえば２段階でホモジナイズする。
【００６９】
精製したｓＴＬＲＲを有効量で直接液体フォーミュラに加えることができる。フォーミュラのｐＨは４．５から７．５の間でよく、これは、タンパク質が可溶性であることを意味している。もちろん、たとえばグリコシル化あるいはアミノ酸の付加、削除又は置換によってｓＴＬＲＲの化学特性が変えられた場合は許容できるｐＨ範囲は異なり得る。
【００７０】
一実施形態では、ｓＴＬＲＲの濃縮溶液を、任意の所望するエネルギー含量を有する液体の（再構成した）栄養フォーミュラに加える。好ましくは、ｓＴＬＲＲは最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ〜１０００ｎｇ／ｍｌで存在する。栄養フォーミュラ中では、濃度は食事の状況、特に栄養フォーミュラが食事のすべてを構成するかどうかにも依存し得る。また、たとえば消費されるフォーミュラの量、ｓＴＬＲＲの活性、患者の容態など他の状況もフォーミュラ中のｓＴＬＲＲの最終濃度に影響を与え得る。原則的には、さまざまな条件に応じて、１日用量は１０μｇ〜２０ｍｇ単位、好ましくは１００μｇ〜１ｍｇ単位のタンパク質を含むべきである。
【００７１】
ｓＴＬＲＲポリペプチドの機能がさまざまな異なるアミノ酸配列によって達成することができることは、当業者には明白である。したがって、本発明の別の態様は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含むポリペプチドに関する。このようなタンパク質は、本発明によって単離されたポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるが、それでも生物学的機能又は活性を保持している。たとえば、アミノ酸「非必須」アミノ酸残基で置換されていてもよい。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的機能や構造的折畳みを変化させることなくｓＴＬＲＲの野生型配列から変化されることが可能な残基であるのに対して、「必須」アミノ酸残基は生物学的機能に必要である。同様の機能は、多くの場合同様の構造特性又は化学特性を有するアミノ酸、たとえばロイシンをイソロイシンで置換することによって満たされている。より稀には、ある変異体は、たとえばグリシンがトリプトファンで置換される「非保存的」変化を有しているかもしれない。このことは、単一のアミノ酸残基にだけでなく、タンパク質の生物学的機能を変化させることなく付加又は省略し得るアミノ酸の全配列にも当てはまる。したがって、同様の軽微な変異には、アミノ酸の欠失、挿入、又はどちらもが含まれ得る。非常に多くの場合、はるかに大きなポリペプチド内の短いアミノ酸配列が主にタンパク質の生物活性又は機能を担っている。
【００７２】
したがって、本発明はまた、ｓＴＬＲＲの相同体も含む。
【００７３】
タンパク質配列の相同性あるいは配列類似性又は配列同一性は、当分野で周知の技術に従って、たとえば確立されたソフトウェアやコンピュータプログラム、たとえばＤ．Ｌｉｐｍａｎ他の研究に基づいたＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント配列ツール、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌ）プログラムを使用することによって、容易に決定し得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．、及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９９０年、「基本局所アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０、並びにＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．、及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９９７年、「ギャップＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新世代（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２）。
【００７４】
ＢＬＡＳＴ（登録商標）（基本局所アラインメント検索ツール）とは、クエリがタンパク質かＤＮＡかにかかわらず利用可能なすべての配列データベースを探索するよう設計された一連の類似性検索プログラムである。ＢＬＡＳＴプログラムは、遠い配列関係に対する感度の犠牲を最小限にしながら、迅速さのために設計されている。ＢＬＡＳＴ検索において割り当てられるスコアはよく定義された統計的な解釈を有しており、これにより、無作為のバックグラウンドの適合から真の一致を識別することが容易になる。ＢＬＡＳＴでは全域アラインメントではなく局所アラインメントを探す発見的アルゴリズムが使用されており、したがって、隔てられた類似領域しか共有しない配列間の関係性を検出することが可能となる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．、及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９９０年、「基本局所アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０）。
【００７５】
ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の同一性又は類似性が最も良好な区間を見つけるためのＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．、１９８１年、「共通分子部分配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４７：１９５〜１９７）並びにＳｅｌｌｅｒｓ（Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｐ．Ｈ．、１９８４年、「ミスマッチ密度による遺伝子配列のパターン認識（Ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ）」、Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏｌ．、４６：５０１〜５１４）の改良アルゴリズムに基づいている。配列相同性、類似性又は同一性の度合を決定するためにＢＬＡＳＴなどの配列アラインメントプログラムを使用する場合は、初期設定を使用してもよく、あるいは、同一性、類似性、又は相同性のスコアを最適化するためにＢＬＯＳＵＭやＰＡＭなどの適切なスコアマトリクスを選択してもよい。
【００７６】
さまざまな理由のために導入され得るアミノ酸配列の人工修飾を考慮するために、本発明はまた、相同体ではないが、少なくとも以下に定義する配列類似性あるいは本発明によるタンパク質の３次元構造又は機能を共有する配列も、包含している。
【００７７】
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、本発明によるタンパク質と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上類似しているアミノ酸配列を含む。
【００７８】
本発明はまた、これらのアミノ酸配列をコードしている、ＤＮＡ又はＲＮＡであるヌクレオチド配列も含む。
【００７９】
一実施形態では、本発明によるポリペプチドは、たとえばｓＴＬＲＲ活性の阻害剤についてペプチドライブラリをスクリーニングするため、又は市販されている抗体によって認識可能にさせるための融合タンパク質である。融合タンパク質はまた、ｓＴＬＲＲ配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように遺伝子操作してもよく、これはｓＴＬＲＲを切断し、異種性部分から離して精製し得るようにするためである。
【００８０】
本発明による有効な可溶性ポリペプチドは、二量体、三量体などであってもよい。また、ホモ−又はヘテロ二量体、三量体、重合体であってもよい。たとえば、有効なポリペプチドの異なるドメインを１つ又は複数のジスルフィド結合によって共有結合させる。特に細胞体タンパク質又は細胞外ドメインの場合では、異なるタンパク質内又は同じタンパク質内のジスルフィド結合が多くの場合見つかる。したがって、本発明は、２つの同一又は異なるポリペプチド鎖が互いに連結されてホモ−又はヘテロ二量体又は重合体が形成される可能性を含んでいる。２つの非常に類似した、限定数のアミノ酸残基だけが異なるドメイン、又はグリコシル化が異なるドメインがヘテロ−又はホモ二量体を形成することも可能である。これらの事例すべてにおいて、本発明は、本発明による特徴を有する少なくとも１つのドメインを含むタンパク質又はマルチドメインのタンパク質を含む。
【００８１】
遺伝コードの縮重によりｓＴＬＲＲをコードしている多数のヌクレオチド配列が生成され得、これらの一部は任意の周知の遺伝子及び天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の類似性した有さないことを、当業者は理解されよう。本発明は、可能なコドンの選択に基づいて組合せを選択することによって作ることができる、ヌクレオチド配列の可能なすべての変異を企図している。これらの組合せは、天然に存在するｓＴＬＲＲのヌクレオチド配列に適用される標準のトリプレット遺伝コードに従って作られ、このような変異すべてが、それらを具体的に開示していると同様にみなされるべきである。
【００８２】
さまざまな理由のために、それだけには限定されないが、遺伝子産物のクローニング、プロセッシング及び／又は発現を改変させる変化を含めたｓＴＬＲＲコード配列を変化させるための本発明によるヌクレオチド配列の遺伝子操作を行うことができる。たとえば、新しい制限部位を挿入すること、グリコシル化パターンを変化させること、スプライシングの変異を生成することなどのために、当分野で周知の技術、たとえば部位特異的突然変異誘発を使用して変異を導入し得る。したがって、本発明の一実施形態では、本発明によるタンパク質をコードしている配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれ以上の相同性を共有する核酸分子が関連している。
【００８３】
本発明によるタンパク質の配列はまた、本発明によるタンパク質をコードしている配列を一部だけ含んでいる配列も含む。
【００８４】
生理条件下におけるその溶解性及び同時に生得免疫応答におけるその関連性により、ｓＴＲＬＬが、多数の病原性又は非病原性状態における貴重な手段となる。たとえば、細菌エピトープや抗原に結合するその能力を開拓し、ｓＴＬＲＲを治療目的で使用してもよい。この点では、ｓＴＬＲＲの有意性は抗体と同様である。したがって、ｓＴＬＲＲは、免疫応答又は炎症応答を調節する新規の診断標的又は治療剤の開発に特に有用かもしれない。たとえば、自己免疫疾患、炎症性腸疾患又は喘息を含めたアレルギーなど免疫応答の調節不全に関連する状態が挙げられる。
【００８５】
以下の実施例は例示としてのみ示し、本出願の主題事項を限定すると解釈されるべきでない。パーセント及び部は、別段に指示しない限りは重量によるものである。
【実施例１】
【００８６】
ヒト母乳中の可溶性ＴＬＲ−２の検出
方法
出産後日数が異なる日（０、５、６、８日目）に採取したヒト乳試料を、以前に記載されているように（Ｄｕｒｉｅｘ，Ｊ．Ｊ．、Ｎ．Ｖｉｔａ、Ｏ．Ｐｏｐｅｓｃｕ、Ｆ．Ｇｕｅｔｔｅ、Ｊ．Ｃａｌｚａｄａ−Ｗａｃｋ、Ｒ．Ｍｕｎｋｅｒ、Ｒ．Ｅ，Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｊ．Ｌｕｐｋｅｒ、Ｐ．Ｆｅｒｒａｒａ、Ｈ．Ｗ．Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｂｒｏｃｋ、及びＭ．Ｏ．Ｌａｂｅｔａ、１９９４年、「リポ多糖受容体の２つの可溶型、ＣＤ１４：特徴づけ及び正常なヒト単球による放出（Ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＤ１４：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２００６〜２０１２）Ｌａｅｍｍｌｉ還元サンプルバッファーで希釈し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ  ＩＩ、ＢｉｏＲａｄ）上で電気泳動させ、ウエスタンブロットによって分析した。これはＴＬＲ−２特異的抗体（精製ヤギポリクローナル抗体、サンタクルーズ）又は２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を添加したｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：２０００（１００ｎｇ／ｍｌ）に希釈した正常ヤギＩｇＧ（サンタクルーズ）を使用することによって行った。抗ＴＬＲ−２抗体は、ＴＬＲ−２ポリペプチドのＮ末端付近にマッピングされている１７アミノ酸のペプチドを認識する。検出は、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＰＢＳで１：４０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヤギ抗体（サンタクルーズ）を用いて、増強化学発光法（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって、製造者の指示に従って実施した。抗ＴＬＲ−２のウエスタンブロットの特異性を確認するために、一部の実験では、ブロットの前に、抗ＴＬＲ−２抗体を抗ＴＬＲ−２抗体を産生させるのに使用したペプチド（サンタクルーズ）１０倍過剰濃度と共にプレインキュベート（２時間／室温）した。
【００８７】
さらに、可溶性ＣＤ１４（記載されているイオン）の濃度を各試料について決定した。（ヒト母乳は、書面による同意の後に健康なドナーから採取した）。乳は、採取後２時間以内に処理した。遠心分離の後、細胞ペレットは他の分析用に保存し、上清はＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によるｓＣＤ１４の試験まで−８０℃で凍結した。検査した試料により、２６〜８１μｇ／ｍｌの範囲のｓＣＤ１４濃度が示された。
【００８８】
結果及び結論
ウエスタンブロットの結果を図１及び２に示し、抗ＴＬＲ−２抗体を使用した場合に（図１のレーン１及び２）３８及び４０ｋＤａの２つのバンドが示された。
【００８９】
抗体を産生させるのに使用した特異的な１７アミノ酸のＴＬＲ２ペプチドと共にプレインキュベートした抗ＴＬＲ−２抗体を用いて膜をブロットした場合は、この新規ポリペプチドは検出されなかった（図１のレーン３及び４）。
【００９０】
ｓＴＬＲＲの発現は、出産後日数が短い場合に（０日目から５日目）より高かった。また、ｓＴＬＲＲと乳ｓＣＤ１４濃度との間の直接相関関係が顕著に見つかった（図２）。さらに、ｓＴＬＲＲと乳中のｓＣＤ１４との間の発現レベルを比較することにより、ｓＴＬＲＲはｓＣＤ１４より約６〜７倍低いレベルで発現されていることが示唆された。
【００９１】
結論として、ｓＴＬＲＲはヒト母乳中に存在する新規ポリペプチドであり、ヒトＴＬＲ２の可溶性相同体である。ｓＴＬＲＲの機能は恐らくｓＣＤ１４の機能に関連しており、これにより、ｓＴＬＲＲは炎症状態の調節における候補となる。加えて、これは、細菌及び細菌生成物の永続的な炎症誘発の挑戦に際して、腸粘膜の恒常性を保存するための分子を表し得る。
【実施例２】
【００９２】
ｓＴＬＲＲの精製
免疫沈降、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦ膜への電気ブロッティング、及びタンパク質溶出によって、さらなる研究のための、かなりの量の高純度に精製されたｓＴＬＲＲを得ることができる。
【００９３】
方法
一般的に、１ｍｌのヒト母乳（好ましくは初乳、出産後１〜５日目）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４のバッファーからなり、０．５％（ｗ／ｖ）のＮＰ−４０（ＢＤＨ）、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び５０ｍＭのＮａＦ（すべてＳｉｇｍａからのプロテアーゼ阻害剤）を添加した希釈バッファーで１：１０に希釈した。３０μｇの正常ヤギＩｇＧ（サンタクルーズ）と共にインキュベート（回転しながら１時間、４℃）すること、次いで２５０μｌのタンパク質Ｇ−セファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（１：１のスラリー；Ｓｉｇｍａ）と共に２回逐次インキュベートすること（最後のインキュベーションは終夜に及ぶ）によって、希釈した試料を事前に清澄にした。各回のタンパク質Ｇ−セファロースとのインキュベーションの後、穏やかな遠心分離（４℃で８００ｇ、２分間）によってビーズをペレット形成させ、ビーズを廃棄した。事前に清澄にした希釈乳試料を、３０μｇのポリクローナル（ヤギ）抗ＴＬＲ−２抗体（サンタクルーズ）、次いで１５０μｌのタンパク質Ｇ−セファロースと共にインキュベートした（回転しながら１時間、４℃）。セファロースビーズの穏やかな遠心分離の後、上清を廃棄し、希釈バッファーで上清を５回洗浄した。次いで、ビーズを１００μｌのＬａｅｍｍｌｉ還元サンプルバッファーに再懸濁させ、沸騰させ（５分間）、溶出された物質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに載せた。電気泳動の後、免疫沈降した分子をＰＶＤＦ膜上に移し、標準のプロトコルに従った酸性抽出によって溶出させた（タンパク質科学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｊ．Ｃｏｌｉｇａｎ他編；Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：第１０章、セクション１０．７）。あるいは、質量分析のために、記載のように（タンパク質科学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｊ．Ｃｏｌｉｇａｎ他編；Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：第１６章、付録１４、セクション４）分析に備えてトリプシン（シーケンシング級；Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてタンパク質をゲル内で消化した。
【００９４】
結論
新規ポリペプチドであるｓＴＬＲＲが、単離された形で得られた。溶出液中のポリペプチド濃度は、おおよそ０．５〜３μｇ、好ましくは１〜２μｇ／ｍｌの範囲である。
【実施例３】
【００９５】
ｓＴＬＲＲ及びｓＣＤ１４の免疫共沈降
方法及び結果
ｓＴＬＲＲがヒト乳中のｓＣＤ１４と相互作用するかどうかを試験した。ｓＣＤ１４特異的ポリクローナル抗体（ウサギ）では、抗ＴＬＲ２ヤギポリクローナル抗体との免疫沈降に次ぐ乳試料のウエスタンブロットによって強い４８ｋＤａのポリペプチドのバンドが検出されたが、対照のヤギＩｇＧとでは検出されなかった。
【００９６】
膜をストリップして抗ＴＬＲ２抗体で再プローブすることによって、４８ｋＤａのｓＣＤ１４バンドに加えて３８及び４０ｋＤａのポリペプチドの存在が確認された。この８０ｋＤａのバンドは、膜を抗ＴＬＲ２特異的抗体で再プローブした場合に検出可能であったが、対照のＩｇでは検出可能でなかった。
【００９７】
結論
新規ポリペプチド（ｓＴＬＲＲ）が既に記載したｓＣＤ１４と相互作用又は結合して８０ｋＤａの複合体を形成する証拠がある。この複合体の機能は、以前に記載されたｓＣＤ１４の機能と密接に関連しているはずである（Ｆｒｅｙ  ＥＡ、Ｍｉｌｌｅｒ  ＤＳ、Ｇｕｌｌｓｔｅｉｎ  Ｊａｈｒ  Ｔ、Ｓｕｎｄａｎ  Ａ、Ｂａｚｉｌ  Ｖ、Ｅｓｐｅｖｉｋ  Ｔ、Ｆｉｎｌａｙ  ＢＢ、Ｗｒｉｇｈｔ  ＳＤ、可溶性ＣＤ１４が細胞のリポ多糖への応答に関与している（Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ１４  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９２年、１７６：１６６５〜１６７１）。
【実施例４】
【００９８】
哺乳動物の乳腺上皮細胞によるｓＴＬＲＲの発現及び修飾
この実験の目的は、新規ｓＴＬＲＲポリペプチドの源を同定することである。
【００９９】
方法及び結果
抗ＴＬＲ２特異的抗体を用いて、免疫沈降、次いでウエスタンブロットを行うことにより、３８及び４０ｋＤａのＴＬＲＲポリペプチドの発現が示され、また、培養物の上清及び乳腺上皮細胞系ＭＣＦ−７の全溶解液中で８０ｋＤａのバンドが示された。
【０１００】
さらに、エストロゲン擬態性フェノールレッド（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｍｉｍｍｅｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ）、合成リポペプチド、ＩＮＦ−γ／ＴＮＦ−α、ＬＰＳ、ＰＭＡ／イオノマイシンを含めたさまざまな刺激を使用することによって、ｓＴＬＲＲの発現を変化させることを試験した。フェノールレッド及びＩＮＦ−γ／ＴＮＦ−αは、全溶解液並びに培養物の上清中の３８／４０ｋＤａ分子及び８０ｋＤａ分子のいずれについても有意な上方変調を誘発させた。
【０１０１】
結論
結論として、新規ポリペプチド（ｓＴＬＲＲ）は、免疫変調剤として作用する。具体的には、これは炎症誘発性サイトカインの誘発を阻害することによって免疫応答を下方制御する。したがって、新規ポリペプチドは、たとえば、アレルギー、腸の炎症性疾患、全身性慢性炎症及び自己免疫疾患など免疫系の過剰反応に関連するさまざまな疾患を調節する可能性を有している。
【実施例５】
【０１０２】
ｓＴＬＲＲを含む栄養フォーミュラ
子供の胃腸管における炎症性生得免疫応答を下方制御するために、ｓＴＬＲＲを有効量で含む栄養フォーミュラを調製した。
【０１０３】
上記のように濃縮された形で調製した可溶性ＴＬＲＲを、得られる調製物が乾物１ｇあたり約０．１〜１００、好ましくは０．５〜５０μｇの量のｓＴＬＲＲを含むような量で、約１５％の乾物を含む栄養的にバランスのとれた製品に加えた。乾物は、推奨値に従って２０％のタンパク質、４５％の炭水化物、３２．３％の脂肪並びに２．７％のミネラル及びビタミンからなる。この栄養フォーミュラは、約７５ｋｃａｌ／ｄｌ（３１５ｋＪ／ｄｌ）のエネルギー含量を有する。
【実施例６】
【０１０４】
ｓＴＬＲＲのさらなる効果
方法
ｓＴＬＬＲの調節効果を試験するために、ＬＰＳによる細胞刺激の前に抗ＴＬＲ２抗体を加え、既に記載されているように（Ｌａｂｅｔａ  ＭＯ、Ｖｉｄａｌ  Ｋ、Ｒｅｙｎｏｒｅｓ  ＪＡ、Ａｒｉａｓ  Ｍ、Ｖｉｔａ  Ｎ、Ｍｏｒｇａｎ  ＢＰ、Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ  ＪＣ、Ｌｏｙａｕｘ  Ｄ、Ｆｅｒｒａｒａ  Ｐ、Ｓｃｈｍｉｄ  Ｄ、Ａｆｆｏｌｔｅｒ  Ｍ、Ｂｏｒｙｓｉｅｗｉｃｚ  ＬＫ、Ｄｏｎｎｅｔ−Ｈｕｇｈｅｓ  Ａ、Ｓｃｈｉｆｆｒｉｎ  ＥＪ、ヒト乳中における細菌の生得認識は乳由来の高度に発現されるパターン認識受容体である可溶性ＣＤ１４に媒介される（Ｉｎｎａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍｉｌｋ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ１４）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００年、１９１：１８０７〜１８１２）、２％のヒト母乳（出産後１〜５日）を含む培地中でＵ３７３星細胞腫細胞（ＡＴＣＣ）を培養してＥ．ｃｏｌｉのＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で活性化させた。細胞刺激の前に、乳を含む培地を抗ＴＬＲ２抗体（１０マイクログラム／ｍｌ）又はアイソタイプが一致した対照と共にプレインキュベートした（３０分間／氷上）。２４時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡによって培養物上清のＩＬ−６の放出を試験した。刺激の４時間後に細胞アリコートを採取し、フローサイトメトリーによってＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）細胞表面発現について試験した。
【０１０５】
結果及び結論
細胞のプレインキュベーションで抗ＴＬＲ２を使用することにより、ＬＰＳに誘発される乳に媒介されたＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の発現及び細胞系によるＩＬ−６の分泌が有意に増強された。いくつかの実験における増強効果の程度は、平均してＩＬ−６の放出で１００％、ＣＤ−５４で１００％であった。また、乳の替わりに精製したｓＣＤ１４を使用した場合はこの増強効果が抹消された。これは、ｓＣＤ１４分子と複合体形成させた場合に、少なくとも一部の事例ではｓＴＬＲＲ分子の変調活性が起こることを示している。
【０１０６】
乳及び任意の他の体液中に存在する抗ＴＬＲ２は、生得免疫応答及び続く適応免疫応答における、細菌活性化の重要な調節分子であると考えられる。これは、新生時期に宿主が初めて過剰の新しい細菌高原及び炎症誘発性分子と遭遇した場合において、細菌生成物に対する過剰の炎症応答を制御するのに非常に重要であるかもしれない。
【実施例７】
【０１０７】
ヒト乳から単離したさまざまなｓＴＬＲＲ断片
Ｌａｅｍｎｌｉ還元サンプルバッファーで１：５０に希釈した乳試料のウエスタンブロットを行い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ヒトＴＬＲ２タンパク質のＮ末端にマッピングされている１７アミノ酸のペプチドに対して産生された抗ＴＬＲ２ポリクローナル（ヤギ）抗体（ｓｃ８６８９、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）を用いて免疫ブロットした。ロバ抗ヤギＩｇＧペルオキシダーゼ結合の抗体とのインキュベート、次いで増強化学発光法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってブロットを可視化した。詳細は実施例１参照。
【０１０８】
結果を図３に示し、配列番号１の断片に対応するさまざまなｓＴＬＲＲ分画が見られる。断片及びその大きさは：１（８０ｋＤａ）、２（７０ｋＤａ）、３（６０ｋＤａ）、４（４０ｋＤａ）、５（２５ｋＤａ）、６（２２ｋＤａ）である。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】還元条件下で、１０％ＳＤＳゲルを使用したヒト乳分画のウエスタンブロット分析を示す図である。抗ＴＬＲ−２ポリクローナル抗体を使用してｓＴＬＲＲのバンドが示された（ＴＬＲ２抗体、レーン１及び２）。また、ブロッティングの前に、抗ＴＬＲ−２抗体を、抗体を産生させるのに使用したペプチドと共にインキュベートした（ＴＬＲ２ペプチド、レーン３及び４参照）。また、アイソタイプの対照として別の抗体（ＩｇＧ）も試験した（レーン５）。
【図２】上記のように出産後異なる日に採取したヒト乳分画のウエスタンブロット分析を示す図である（図１のスキームに対応、レーン１及び２）。また、この図は、ｓＴＬＲＲ分析と平行して決定したｓＣＤ１４の濃度も示す。
【図３】出産後異なる日に採取したヒト乳分画のウエスタンブロット分析を示す図である。免疫ブロットには、ヒトＴＬＲ２タンパク質のＮ末端にマッピングされている１７アミノ酸のペプチドに対して産生された抗ＴＬＲ２ポリクローナル（ヤギ）抗体（ｓｃ８６８９、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）を使用した。ｓＴＬＲＲの断片及びその大きさは：１（８０ｋＤａ）、２（７０ｋＤａ）、３（６０ｋＤａ）、４（４０ｋＤａ）、５（２５ｋＤａ）、６（２２ｋＤａ）である。（実施例７）
【配列表】
2005511020.tif 000003
2005511020.tif 000004
2005511020.tif 000005
2005511020.tif 000006
2005511020.tif 000007
2005511020.tif 000008
【図１】
2005511020.tif 000009
【図２】
2005511020.tif 000010
【図３】
2005511020.tif 000011
【国際調査報告】
2005511020.tif 000012
2005511020.tif 000013
2005511020.tif 000014
2005511020.tif 000015
2005511020.tif 000016