(57)【要約】ＲＮＡ機能を阻害するために哺乳類の発現可能な核酸シーケンスに対して導かれる阻害剤を伝達するための処理過程が記載された。哺乳類の発現可能な核酸シーケンスに特異的なＲＮＡ機能を阻害するシーケンスが生成され、哺乳類の血管に注入される。阻害剤は細胞に伝達されて、核酸シーケンスの発現が阻害される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ機能を阻害するために哺乳類の発現可能な核酸シーケンスに対して導かれた阻害剤を伝達するための処理過程であって、
ａ）前記哺乳類の発現可能な核酸シーケンスに特異的なＲＮＡ機能を阻害するシーケンスから構成される前記阻害剤を生成することと、
ｂ）前記哺乳類の血管に前記阻害剤を注入することと、
ｃ）前記発現可能な核酸シーケンスの発現が阻害されるように細胞に前記機能を阻害するシーケンスを伝達することとからなる処理過程。
【請求項２】
前記阻害剤はウィルス反応を阻害することであることを特徴とする請求項１に記載の処理過程。
【請求項３】
前記ウィルス反応は天然痘であることを特徴とする請求項２に記載の処理過程。
【請求項４】
前記阻害剤は細菌反応を阻害することであることを特徴とする請求項１に記載の処理過程。
【請求項５】
前記細菌反応は炭そであることを特徴とする請求項４に記載の処理過程。
【請求項６】
前記血管の浸透性が上昇することを特徴とする請求項１に記載の処理過程。
【請求項７】
前記圧力の上昇は、前記血管内の流量が増大することからなることを特徴とする請求項６に記載の処理過程。
【請求項８】
前記ＲＮＡ機能を阻害することは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳を阻害することからなることを特徴とする請求項１に記載の処理過程。
【請求項９】
ＲＮＡ機能の阻害剤とコンプレックスを形成する少なくとも一つの化合物との混合からなる処理過程によって形成される哺乳類の核酸の発現を阻害するためのコンプレックスであって、前記コンプレックスのゼータ電位は前記阻害剤自体のゼータ電位よりも負であることを特徴とするコンプレックス。
【請求項１０】
哺乳類の核酸の発現を阻害するためのコンプレックスであって、該コンプレックスは、
ａ）前記コンプレックスが正のゼータ電位を有することを特徴とし、ＲＮＡ機能阻害剤と、ポリカチオン、タンパク質、両親媒性化合物、ポリ両性電解質と非ウィルスベクターからなる群から選択されるカチオンの第一層とを混合することと、
ｂ）前記ゼータ電位が前記第一層のみを備えるコンプレックスよりもさらに負であることを特徴とし、前記コンプレックスをアニオンの第二層で再電荷することからなる処理過程によって形成されるコンプレックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、二本鎖核酸を使用する遺伝子発現の阻害に関する。詳細には、遺伝子発現は、炭そなどの細菌感染又は天然痘などのウィルス感染に関して阻害される。
【背景技術】
【０００２】
病原菌がバイオテロ攻撃あるいは細菌戦で使用されるかもしれないので、病原菌は、人間の健康および国家安全に対する重大な脅威を表わす。これらの菌は、新しい未知の菌と同様に、天然痘などの既知のウィルスおよび炭そなどの細菌を含む。細菌戦のいくつかの様相は、新しく高度に適応可能で容易に合成される対抗策を開発する必要を強調する。例えば、天然痘、いわゆる天然痘ウィルスが世界的に根絶されていた一方、それは、旧ソ連および同様な他の国家およびテロリスト組織の細菌戦の病原菌として開発されている。ソビエトには、コルトソボ（Ｋｏｌｔｓｏｖｏ）、シベリア（「ベクター」として知られている）１の中の分子生物学の全国家の科学研究所でウィルスの細菌戦の病原菌を開発する大規模な秘密プログラムが存在していた。プロジェクトの目的はウィルスの毒性、病原性、およびウィルスの大量生産を増大させることを含んでいた。天然痘ウィルスの特に伝染力の強い菌株は、単一のスーパーウィルスへこれらの遺伝子を組み合わせることを目的として毒性を担う遺伝子を識別するためにシーケンス解析がされた。別のプロジェクトは、耐天然痘ウィルスの一般に用いられるワクチンを開発することだった。ソビエトのベクタープロジェクトは、天然痘ウィルスとエボラウィルスの組み合わせを含む、新規な遺伝子工学的にハイブリッドさせたウィルスを開発した１。より多くの致死ウィルスを工学的に開発する能力は、ハイブリッドのＨＩＶ／ＳＩＶが単一の突然変異によって免疫になった猿において耐性となったことを報道する最近のネイチャー記事によって例証された２。
【０００３】
現在のワクチンおよび薬が、これらの新しい病原体の発生を処理するのに有効ではありそうもない。さらに、抗菌性ワクチンあるいは小さな分子薬剤の開発に対する従来のアプローチは遅すぎるので、そのような病原菌の目的のある放出への対抗策を提供するのに有効になりえない。したがって、この新しく勃発する脅威に対抗するための新技術が必要とされる。そのような一つの技術は、病原体の遺伝子発現を阻害するｓｉＲＮＡの生体内伝達です。ＳｉＲＮＡ技術は、従来の薬剤に対して、新たに突然変異したか又は工学的に改変された病原菌に対して、より容易に適応する利点を有する。新たな病原菌は迅速にシーケンス解析ができ、また、ｓｉＲＮＡ分子は新しい生物兵器の脅威と戦うために合成される。ｓｉＲＮＡの伝達は、特定のシーケンスに関わらず同一のままであるだろう。転写、複製あるいは毒性の病原体遺伝子は、伝染性を減少させて、かつ感染した個人の生存を高めることを目標とするかもしれない。ポックスウィルスまたは他の感染のＳｉＲＮＡ治療は、更に免疫保護が得られるまで主な疾病の攻撃を遅らせる可能性を有する。
【０００４】
さらに、ある伝染病と格闘する従来のワクチン・アプローチは、マラリア、ＡＩＤＳ、疱疹、デング熱およびウィルス性肝炎のいくつかの形態を含む多くの自然な疾病を遅らせるか防ぐのに不適当であることが証明されている。それらの疾病はまた、ｓｉＲＮＡ治療の候補である。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、それによって目的遺伝子と同一か、高度に類似したシーケンスの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の存在が、その目的遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の劣化に帰着する現象を記述する３。しかしながら、研究者は、任意のシーケンスのｄｓＲＮＡに哺乳類の細胞を暴露することがタンパク質合成のグローバルシャット・ダウンを引き起こすので、哺乳類の細胞にＲＮＡｉを適用することは悲観的である。
【０００６】
哺乳類の細胞への長いｄｓＲＮＡの導入は、タンパク質合成の一般的なブロックおよびノンアポトティック（ｎｏｎ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）およびアポトティックな系によって細胞を導くインターフェロン反応を引き起こすと知られている４。実際、培養した哺乳類の細胞を使用して実行された研究は、長いｄｓＲＮＡの導入が目的とする遺伝子の発現の特異的な阻害を引き起こさないことを示す５，６。ｄｓＲＮＡに対するインターフェロン反応の主要な要素は、延長因子ｅｌＦ２ａをリン酸化し不活性化するｄｓＲＮＡ依存型タンパク質キナーゼＰＫＲである。加えて、ｄｓＲＮＡは、非シーケンスの特異的なＲＮａｓｅである、ＲＮａｓｅＬの活性を導く２´−５´ポリアデニル酸の合成を引き起こす７。一方、マウス卵母細胞および胎児中の目的遺伝子の発現を阻害するために長いｄｓＲＮＡを使用することができ８、９、インターフェロン反応の系がこれら細胞のこの早期の発育期に現れないは見込みがあることは、既に実証されている。
【０００７】
より最近、入り込んだｄｓＲＮＡｓから生成される長さのおよそ２１−２５のヌクレオチドの短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）によってＲＮＡｉがおそらく仲介されることが知られた１０、１１、１２、１３、１４。さらに、短いｄｓＲＮＡが培養中の哺乳類細胞のインターフェロン反応を引き起こすようには見えないことが分かった。この１つの理由はこれらのｓｉＲＮＡｓは小さすぎるので、ＰＫＲを活性化することができないことかもしれない１５、１６。最後に、３０ｂｐ未満のｓｉＲＮＡが、培養中の哺乳類細胞のＲＮＡｉを引き起こすことが知られている１７、１８。
【０００８】
特にＲＮＡｉによる目的遺伝子の発現を阻害する能力は、明白な利点を有する。例えば、遺伝子機能を研究するために真の遺伝的な「ノックアウト」動物に似せる動物を生成するためにＲＮＡｉを使用することができるかもしれない。さらに、多くの疾病が、特別の遺伝子の異常な発現あるいはグループの遺伝子から発生する。ＲＮＡｉは、遺伝子の発現を阻害するために使用され得、したがって疾病の兆候を緩和するか、または疾病を治療する。例えば、癌の状態に寄与する遺伝子を阻害することができるかもしれない。さらに、筋緊張症の栄養失調症のような支配的な遺伝疾病を引き起こす突然変異体遺伝子と同様にウィルスの遺伝子を阻害することができるかもしれない。シクロオキシナーゼ（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）またはサイトカインのような遺伝子を阻害することは、さらに関節炎のような扇動的な疾病を治療することができ得る。神経系の疾病もまた、治療することができるかもしれない。目的とする器官の例は、肝臓、膵臓、脾臓、皮膚、脳、前立腺、心臓などである。生体内で哺乳類細胞にｓｉＲＮＡを安全に伝達する能力は、ドラッグディスカバリーおよび目的の確認と同様に伝染病および疾病の治療の深遠な潜在性を有する。
【０００９】
現在の薬学研究および治療処置のいくつかの様相は、ｓｉＲＮＡ技術に対する候補である。目標確認のために、遺伝子不活性化は、調査者が特定の遺伝子産物を阻害する潜在的な治療の効果を評価することを可能にする。発現のアレイは目標遺伝子か系以外の遺伝子の発現に対する阻害の反応する効果を決定するために使用することができる。突然変異体の細胞株あるいはノックアウトしたハツカネズミの遺伝子不活性化、発生の他の方法は、胚の致死率、費用および柔軟性のなさを含む重大な欠乏に苦しむ。さらに、これらの方法は、十分により大きな動物を頻繁にモデル化しない。生体外と生体内のモデル中で利用することができるより多くの強健で、容易に適用可能な遺伝子不活性化技術の開発は、ドラッグディスカバリープロセスを非常に促進するであろう。
【００１０】
発明の概要
好ましい実施態様において、動物細胞にＲＮＡ機能阻害剤（以下、「阻害剤」と呼ぶ）を伝達する過程について記述する。さらに、動物細胞への阻害剤の伝達を促進する構成について記述する。阻害剤の伝達は、ＲＮＡ機能の阻害の低下を引き起こすことにより目的とする遺伝子発現の阻害に帰着する。阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスの核酸、リボザイム、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩで転写されたＤＮＡおよび同種のものを含むグループから選択される。好ましい阻害剤はｓｉＲＮＡである。
【００１１】
好ましい実施態様において、阻害剤の生成、血管への阻害剤の注入、組織内の細胞への阻害剤の伝達を有し、それによって細胞内の目的となる遺伝子の発現を阻害する、遺伝子発現（ＲＮＡ機能）の阻害のための哺乳動物の細胞へ阻害剤の伝達における生体内の過程について記述する。阻害剤に対する血管の浸透性は、血管に急速に多くの流体を注入することにより血管内の圧力を増加させて、そして目的とする組織内への流体の流れおよび／または目的とする組織からの流体の流れを閉鎖することを含む。この上昇した圧力は、注入量を変化すること、挿入量率を変化すること、および処理の間に組織の中へ、あるいはその組織からの血液の流れを収縮させることにより制御される。量は、溶液が阻害剤および伝達の支援で複雑であってもなくてもよい化合物（複数可）を含むかもしれない、かかる溶液における阻害剤から成る。
【００１２】
好ましい実施態様において、過程が、血管からの、および周囲の組織の細胞への阻害剤の通過を増加させるために記述され、かかる過程は、目的となる組織を供給する血管に急速に大量を注入して含むことを含み、これによって脈管外のスペースへ血管からの流体を強要することを含む。この過程は、血管へ阻害剤の含有量を強要し、流体のフローをエリア内および／またはエリア外に収縮させ、血管の浸透性を増加させる分子を添加することのいずれかによりまたは両方によって達成される。目的とする組織は、注入のポイントに血管の末端によって供給される細胞を有する。動脈への注入については、目的となる組織は、動脈が血液を供給する細胞である。静脈への注入については、目的となる組織は、静脈が血液を送り出す細胞である。
【００１３】
好ましい実施態様において、哺乳類の細胞に阻害剤を伝達する生体内の過程が、血管に阻害剤を挿入し、注入のポイントおよび目的となる組織に中心に近い方の血管に圧力を加えることからなる。過程は、哺乳類の皮膚の圧縮によるように、内部血管に外部的に圧力を加えることにより、導入性と輸出性の血管を通過する目的とする組織への流体の流れおよび目的とする組織からの流体の流れを妨害することを含む。哺乳類皮膚の圧縮は、血圧計あるいは止血器のような皮膚上のカフスを適用することを含んでいます。血管による流体の流れも、クランプあるいは気球カテーテルなどによって、血管を直接的に留めることにより収縮するかもしれない。血管は、組織に損傷を与えずに阻害剤の伝達に必要な期間で吸収される。
【００１４】
好ましい実施態様において、哺乳動物の細胞に阻害剤を伝達するためのコンプレックスが、コンプレックスを形成するために溶液の合成物と阻害剤とを混合することを含んで提供され、コンプレックスのゼータ電位が阻害剤単独のゼータ電位ほどネガティブでない。別の好ましい実施態様において、阻害剤は、コンプレックスのゼータ電位がネガティブでない化合物で複合される。化合物は、ポリマー、ポリカチオン（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｓ）、ポリ両性電解質（ｐｏｌｙａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）、両親媒性化合物、非ウィルスベクター、シグナル分子およびペプチドからなるグループから選択される。コンプレックスは、哺乳類の血管に挿入され、血管の浸透性が増加するかもしれない。それによって、細胞への阻害剤の伝達は、細胞の目的とする遺伝子の発現を阻害する。
【００１５】
好ましい実施態様において、生体内または生体外である動物細胞への阻害剤の伝達用粒子を再電荷する過程について記述する。阻害剤／カチオンの脂質（ＣＬ）または阻害剤／ポリカチオン（ＰＣ）のコンプレックスの再電荷でのポリアニオン（ｐｏｌｙａｎｉｏｎ）またはポリ両性電解質の使用について記述する。ポリアニオンまたはポリ両性電解質は、コンプレックスに加えられた場合、増加した阻害剤の伝達に帰着する。２つの層（最初がカチオンの層、第二は陰イオンの層）に阻害剤を入れることによって、安定した粒子が形成される。ポリアニオン層は、ｓｉＲＮＡが血清タンパク質によってオプソニン作用からのコアを含むことを防御する１９、２０、２１。ポリアニオンの外層は、さらに、内皮細胞を内層する肺および／または肝臓へ損傷を縮小し、毒性を減少する。ポリアニオンを備えたｓｉＲＮＡ／ポリカチオンのコンプレックスの正確な滴定は、狭い範囲のポリアニオン濃度において生体外および生体内の両方での遺伝子転移活性の相当の増加に帰着する。コンプレックスの再電荷は、増加した遺伝子転移活性および減少した毒性に帰着する。さらに、再電荷された粒子は、生理食塩水および血清中より安定である。好ましい実施態様において、コンプレックスの組成物が、その細胞外または細胞内の特質を強めるために修正されてよい。例えば、エンドソモリティック（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）な機能は、エンドソモリティック（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）な化合物の結合によって強めることができる。細胞結合もしくは吸収を増加させるか、または特定の細胞型の結合を増強する分子は、阻害剤を有するコンプレックスに対してさらに付加されてよい。再電荷されたコンプレックスは、肺の細胞に阻害剤を伝達するために使用されてもよい。粒子は鼻腔内で気管内であるいは静脈内で伝達することができる。
【００１６】
好ましい実施態様において、阻害剤を有するコンプレックスは、架橋試薬の使用により安定化する。例えば、阻害剤、ポリカチオン、およびポリアニオンを含む三次元のコンプレックスにおいて、ポリカチオンは、ポリカチオンそれ自体に、ポリアニオンに、あるいは阻害剤に架橋されてよい。ポリアニオンも、それ自体に、ポリカチオンに、あるいは阻害剤に架橋されてよい。架橋は、コンプレックスの安定性を増強する。
【００１７】
好ましい実施態様において、阻害剤、両親媒性化合物およびポリカチオンを含む三次元のコンプレックスと、細胞の目的となる遺伝子の発現を阻害する目的における生体内または生体外で動物細胞に阻害剤を伝達するかかるコンプレックスを使用する過程が記述される。ポリカチオンの使用および両親媒性化合物はともに著しく阻害剤の転移効率を増加させる。
【００１８】
ポリカチオンは、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリシラザン、ポリジヒドロイミダゾーレニウム（ｐｏｌｙｄｉｈｙｄｒｏｉｍｉｄａｚｏｌｅｎｉｕｍ）、ポリアリルアミンおよびタンパク質を含むグループから選択される。好ましいカチオンのポリマーは、エトキシレート（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）されたポリエチレンイミン（ｅＰＥＩ）である。別の好ましいポリカチオンは、ＤＮＡ結合タンパク質である。好ましいＤＮＡ結合タンパク質は、Ｈ１、Ｈ２ＡあるいはＨ２Ｂのようなヒストンである。ヒストンは、子牛胸腺のような自然源からなりえるか、あるいはバクテリアで生成された組換えタンパク質であり得る。好ましい実施態様において、ＤＮＡ結合タンパク質が、ＳＶ４０の大型Ｔ抗原の核局在化信号（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）および人間のヒストンＨ１（ＮＬＳ−Ｈ１）のＣ−ターミナル領域の両方を含んでいる組換えヒストンのような核局在化信号にリンクされる。
【００１９】
様々な両親媒性化合物は、細胞へｓｉＲＮＡの転送を仲介するためにポリカチオンと共に使用することができる。好ましい実施態様において、両親媒性化合物はカチオンである。カチオンの両親媒性化合物は、非天然のポリアミンであり、一つ以上のかかるアミンは、Ｃ６−Ｃ２４アルカン、Ｃ６−Ｃ２４アルケン、シクロアルキル、ステロール、ステロイド、適切に置換された脂質、脂肪酸のアシル・セグメント、疎水性ホルモンあるいは他の同様の疎水性のグループからなる群から選択される少なくとも１つの疎水性部位に結合される。両親媒性化合物は、リポソームを形成するかもしれないし、形成しなくてもよい。好ましい両親媒性のカチオンの化合物は、下記の一般構造
【００２０】
【化１】
2005519976.tif 000002
からなり、式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ６−Ｃ２４アルカン、Ｃ６−Ｃ２４アルケン、シクロアルキル、ステロール、ステロイド、適切に置換された脂質、脂肪酸のアシル・セグメント、疎水性ホルモンあるいは他の同様の疎水性のグループからなる群から選択される疎水性部位であり、Ｒ１は、Ｒ２と同一であるか、あるいは、Ｒ１はＲ２とは異なってよい。ポリカチオンおよび両親媒性化合物の組み合わせは、最小の細胞の毒性を備えた様々な動物細胞への阻害剤の転移効率を高める。
【００２１】
好ましい実施態様において、ポリエチレンイミンあるいは同様のポリマーは、ポリカチオンとして使用され、また、構造＃１の化合物は、両親媒性化合物として使用される。別の好ましい実施態様において、ヒストンＨ１タンパク質は、ポリカチオンとして使用され、また、構造＃１の化合物は両親媒性化合物として使用される。別の好ましい実施態様において、これらの両親媒性化合物は、後に阻害剤を動物細胞に伝達するように使用されるリポソームを形成する脂質など他の両親媒性化合物と結合してよい。
【００２２】
好ましい実施態様において、動物細胞への阻害剤を伝達するための化合物，組成物および過程が使用でき、細胞は、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、半ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）あるいは生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で位置する。細胞は、不滅または転換される細胞株などの組織培養中で維持される動物細胞であり得る。細胞は、細胞が動物から得られた後に比較的短時間において培養中で維持されることを意味する一次または二次の細胞であり得る。細胞はまた、組織あるいは動物から細胞が取り除かれていないことを意味して、インサイチュまたは生体内の組織内の哺乳類の細胞であり得る。
【００２３】
好ましい実施態様において、本発明は、溶液でポリカチオンの有効量を備え阻害剤と両親媒性化合物の混合を有する三次のコンプレックスの調製と、動物細胞にコンプレックスを関連させ、細胞内部に阻害剤を伝達することからなる動物細胞に阻害剤を伝達するための過程を提供する。その後、阻害剤は、細胞の遺伝子発現を阻害する。両親媒性化合物は、阻害剤と同時に、あるいは阻害剤の後に、阻害剤の添加に先立ってポリカチオンと混合されてよい。用語としての伝達は、ｓｉＲＮＡが細胞と関連し、それによって、遺伝子発現を阻害することにより細胞の内部成長的な特性を変化することを意味する。その他、感染、転移、転換を含む伝達としての互換性を有して使用される。
【００２４】
好ましい実施態様において、ポリカチオン、ｓｉＲＮＡ、ポリアニオンあるいは両親媒性化合物は、官能基の付加によって修飾されてよい。官能基は、下記に制限しないが、目的とするシグナルまたはラベルあるいは阻害剤の伝達を促進する他のグループであり得る。かかるグループは、コンプレックスの形成に先立って一つ以上の化合物に添加されてよい。代替として、かかるグループ（複数可）は、コンプレックスの形成後にコンプレックスに付加されてよい。
【００２５】
好ましい実施態様において、２つ以上の阻害剤の組み合わせは、目的とする遺伝子の発現の阻害の増強するためにともにあるいは連続して伝達される。阻害剤は、目的とする遺伝子のシーケンスと同一であるか、ほとんど同一であるか、補足的に同じであるか、異なるか、あるいはオーバーラップするセグメントのシーケンスを含む。例えば、好ましい組み合わせは、ｓｉＲＮＡである一つの阻害剤と、およびアンチセンスのポリヌクレオチドである別の阻害剤を含む。好ましいアンチセンスのポリヌクレオチドは、モルホリノあるいは２’−Ｏメチルオリゴヌクレオチドである。阻害剤は、生体内、半ビボ、インサイチュ、試験管内で細胞に伝達されてよい。
【００２６】
好ましい実施態様において、阻害剤は、治療の効果を提供するために目的とする遺伝子を阻害する目的のための哺乳動物の細胞に伝達されてよい。目的とする遺伝子は、機能障害の内部成長的な遺伝子およびウィルスあるいは他の病原菌の遺伝子を含むグループから選択される。機能障害の内部成長的な遺伝子は、疾病と癌の遺伝子を引き起こす支配的な遺伝子を含む。プリオンに変換することができるタンパク質を発現する遺伝子は、阻害剤の別の潜在的な目的である。阻害剤は、プリオン遺伝子の発現を減少するために伝達され、それによって変更された遺伝子産物によって引き起こされた異常なプラークの形成を減少する。
【００２７】
好ましい実施態様において、阻害剤は、疾病か伝染の治療のために生体内の哺乳類の細胞に伝達される。阻害剤は、ウィルスあるいはバクテリアの遺伝子の発現を減少する。阻害剤は、微生物生産、毒性あるいは両方を減少するかもしれないし阻止するかもしれない。内部成長的な免疫保護を得ることができるまで、阻害剤の伝達は、疾病の進行を遅らせるかもしれない。転写、複製、ビリオンアセンブリ、未熟なウィルスの薄膜構成、細胞外の包まれたウィルス構成、初期の遺伝子、中間の遺伝子、後期の遺伝子および毒性遺伝子に関与するウィルスの遺伝子が目的とされるかもしれない。転写、複製、毒性、細胞成長に関与するバクテリアの遺伝子は、病原性などが目標とされるかもしれません。好ましい実施態様において、同じか異なるウィルスの遺伝子または遺伝子のクラス（例えば転写、応答、毒性など）に対する目標とされた有効な阻害剤の組み合わせは、感染した哺乳類の細胞に生体内で伝達される。この方法で処理されてよい病原菌の例は、天然痘ウィルスおよび炭そのような細菌兵器を含む。
【００２８】
代替として、病原菌の遺伝子を阻害する代わりに、阻害剤は、病原体の毒性を縮小するために内部成長的な宿主遺伝子の発現を減少させてよい。細胞のレセプターの発現を縮小するために、阻害剤は哺乳動物の細胞に伝達されてよい。例えば、炭その致死率は、細胞のエントリーのために哺乳類の炭その熱毒素レセプター（ＡＴＲ）を要求する、分泌された三者間の毒素によって主に解決される２２。ＡＴＲの発現の縮小は、炭その毒性を減少させるかもしれない。病原体が結合するレセプターも目標とされてよい。
【００２９】
好ましい実施態様において、阻害剤は、免疫反応を調整するのに生体内の哺乳類の細胞に伝達される。宿主免疫反応が数多の病原菌の毒性の原因であるので、この反応の縮小は、感染した哺乳動物の存続を増加させるかもしれない。さらに、免疫反応の阻害は、免疫反応がトランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の発現、臓器移植および自己免疫疾患を頻繁で多大に制限する際の遺伝子治療を含む、多くの他の治療目的には有益です。
【００３０】
好ましい実施態様において、阻害剤は、創薬のドラッグディスカバリーあるいは目標の確認を促進する目的のための哺乳類の細胞に伝達される。哺乳類の細胞は、生体外または生体内であってよい。目標遺伝子の特異的な阻害は、タンパク質または遺伝子の阻害が重要な表現型の効果があるかどうかを決定することを支援することができる。目標遺伝子の特異的な阻害もまた、目標遺伝子の細胞に対する影響を研究するために使用することができる。
【００３１】
本発明のさらなる目的、特徴および利点は添付の図面と共に、下記の詳細な記載から明白となる。
【００３２】
発明の詳細な記載
図面の詳細な記載
図１．ｓｉＲＮＡは、生体内でハツカネズミの複数の組織の種類に効率的に伝達されて、伝達されたｓｉＲＮＡは、すべての器官で試験された目標とする遺伝子の発現を阻害するために相当に有効である。
【００３３】
図２．ｓｉＲＮＡの血管内の伝達は、遺伝子組み換えのハツカネズミの肝臓のＥＧＦＰ発現を阻害する。ＥＧＦＰは緑、ファロイジンは赤。ＥＧＦＰを発現する１０週目のハツカネズミ（Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）１０ｓｂ種）は、５０μｇ  ｓｉＲＮＡ（ハツカネズミ＃１および２）、（５０μｇコントロールｓｉＲＮＡ（ハツカネズミ＃３および４）を注入されたか、あるいは注入されなかった（マウス＃５）。肝臓は注入後３０時間で収穫されて、セクション化し、固定し、細胞の輪郭を視覚化するためにアレクサ（Ａｌｅｘａ）  ５６８  ファロイジンで染色した。画像は、ツァイスアクシオカム（ＡｘｉｏＣａｍ）デジタルカメラを備えるツァイスアクシオプラン（Ａｘｉｏｐｌａｎ）蛍光顕微鏡を使用して得られた。
【００３４】
図３．Ａ）  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋の伝達。最大の阻害は、１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋で達成される。Ｂ）モルホリノ−Ｌｕｃ＋の伝達。最大の特異的な阻害は、１００ｎＭモルホリノ−Ｌｕｃ＋で達成される。Ｃ）  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋（１．０  ｎＭ）単独と、モルホリノ−Ｌｕｃ＋（１００ｎＭ）単独と、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋（１．０ｎＭ）＋モルホリノ（１００ｎＭ）との阻害力の比較。ｓｉＲＮＡとモルホリノがこれらの濃度で共に添加される場合、阻害の程度は、ｓｉＲＮＡあるいはモルホリノ単独のいずれかより大きい。Ｄ）  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋（１０  ｎＭ）単独と、モルホリノ−Ｌｕｃ＋（１００ｎＭ）単独と、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋（１０ｎＭ）＋モルホリノ（１００ｎＭ）との阻害力の比較。ｓｉＲＮＡとモルホリノがこれらの濃度で共に添加される場合、阻害の程度はｓｉＲＮＡあるいはモルホリノ単独のいずれかより大きい。
【００３５】
図４．ＤＮＡ／ｂｒＰＥＩ／ポリアニオンのコンプレックスのピークの遺伝子転移活性は、１００％の牛の血清でのＨＵＨ７細胞に適用された。ピーク活性は、滴定実験で得られた。ｐＡＡ、ポリアクリル酸；  ｐＡｓｐ（ポリアスパラギン酸）；  ｐＧｌｕ（ポリグルタミン酸）；  ＳＰＬＬ、スクシニル化ｐｏｌｙ−Ｌ−リジン。
【００３６】
図５．異なる量のｐＡＡで肺におけるＤＮＡ／ｌＰＥＩ／ｐＡＡのコンプレックスの遺伝子転移活性で、ＤＮＡ／ｌＰＥＩ（５０μｇ／２００μｇ）に添加し、ハツカネズミの静脈内に注入した。コンプレックスは、等張のグルコースで形成された。個々の実験のポイントは、２匹の動物からの平均である。
【００３７】
図６．Ａ）  ＤＮＡ／ｌＰＥＩ／ｐＡＡのコンプレックス単独（５０μｇ／４００μｇ／５０μｇ）でまたはｐＡＡ「追撃者」の尾部静脈注入が３０分後に後続するコンプレックスで系統的に注入された動物におけるＡＬＴ血液レベル。Ｂ）  ＤＮＡ／ｌＰＥＩ／ｐＡＡのコンプレックス単独とコンプレックス／「追撃者」の組み合わせの系統的な注入を後続する肺のルシフェラーゼ発現レベル。
【００３８】
直接の柔組織的な注入より均衡のとれた分配の哺乳類の細胞にＲＮＡ機能阻害剤（阻害剤）が伝達されることを投与の血管内ルートが可能にすることが判明した。阻害剤の伝達効率は、組織の血管の浸透性を増加させることにより増加させられるかもしれない。浸透性は、大量の注入を使用し、および／または、血管壁の浸透性を増加させて、注入流体を急速に（注入流体を急速に注入して）運んで、血管内の静水圧（例えば血管中の留まる心拡張期の血圧上の）を増加させることにより増加させられる。
【００３９】
ＲＮＡ機能阻害剤
ＲＮＡ機能阻害剤（「阻害剤」）は、シーケンスに特異的な手法で、通常はｍＲＮＡである特異的な細胞のＲＮＡの劣化を引き起こすか、または機能もしくは翻訳を阻害して、細胞に存在するかもしくは発現するシーケンス（「阻害シーケンス」）を含んでいる核酸または核酸のアナログを含む。ＲＮＡの阻害は、ＲＮＡが転写される遺伝子の発現をこのように有効に阻害することができる。阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、干渉ＲＮＡあるいはＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写型ＤＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡ、ＤＮＡあるいは人工核酸であってよいアンチセンスからなるグループから選択される。ＳｉＲＮＡは、典型的には１５−５０の塩基対を含んでいる二本鎖構造を含み、また、好ましくは、２１−２５の塩基対であり、発現された目標遺伝子あるいは細胞内のＲＮＡと同一であるか、ほとんど同一であるヌクレオチド・シーケンスを有する。アンチセンスのポリヌクレオチドは、下記に制限しないが、モルホリノ、２’−Ｏメチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその他同種のものを含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写型ＤＮＡは、Ｕ６プロモーターのようなプロモーターを含む。これらのＤＮＡは、ｓｉＲＮＡとして機能することができる細胞の小さなＵ字型のＲＮＡ、あるいはアンチセンスＲＮＡとして機能することができる線形のＲＮＡを生成するために転写することができる２３。阻害剤は、生体外で組換えＲＮＡを重合し、キメラシーケンス、あるいはこれらのグループの派生物を含む。阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチドあるいは目標ＲＮＡおよび／もしくは遺伝子が阻害される、任意の適切な組み合わせを含んでよい。さらに、核酸のこれらの形態は、一本、二本、三重、四重鎖であってよい。
【００４０】
伝達された阻害剤は、細胞質か核内にとどまることができる。阻害剤は、内部成長的あるいは外生のヌクレオチド・シーケンスの発現を阻害するか、または細胞と当然関連しなかった特定の生理的な特性に影響するために細胞に伝達することができる。
【００４１】
阻害剤は、治療の細胞の変化を生成するために細胞に伝達できる。治療目的（疾病の治療あるいは予防を含む動物の健康を改善する技術）のための  阻害剤あるいは他の遺伝物質の伝達は、遺伝子治療と呼ばれる。阻害剤は、直接的にインサイチュで器官にまたは、後に器官に移植される転移によって間接的に半ビボで細胞にいずれかで伝達できる。細胞への導入は、阻害剤がタンパク質の生成を阻止するかあるいは目標ＲＮＡの量を減少させるために必要とされる。常染色体の支配的な筋ジストロフィー症のような疾病（それらは支配的な突然変異体遺伝子によって引き起こされる）は、ｓｉＲＮＡのような治療の阻害剤での処置に対する候補の例である。阻害剤の伝達は、正常なタンパク質に影響せずに、支配的なタンパク質生成を阻止し、それによって疾病を減少させる。
【００４２】
それらの細胞の特定の遺伝子発現にポスト胚のハツカネズミおよびネズミの細胞へのｓｉＲＮＡおよびアンチセンスの阻害剤の伝達が干渉することを実証する。阻害は、遺伝子に特異的であり、一般的な翻訳の阻止を引き起こさない。したがって、ＲＮＡｉは、ポスト胚の哺乳類の細胞に生体内で有効になり得る。
【００４３】
核酸／ポリヌクレオチド
用語の核酸またはポリヌクレオチドは、一連の少なくとも２つのヌクレオチドを意味する技術的用語である。ヌクレオチドは、核酸ポリマーのモノマーのユニットである。１２０未満のモノマーのユニットのポリヌクレオチドは、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる。自然の核酸は、デオキシリボースまたはリボースとのリン酸の骨格を有し、一方で、人工ポリヌクレオチドは生体外で重合され、同一あるいは同様の塩基を含んでいるが、他のタイプの骨格を含んでよい。これらの骨格は、下記ものを含み、それらは、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホルチオエイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ）、ホスホルジアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅｓ）、モリホリノ、および在来の核酸のリン酸の骨格の変形である。塩基は、プリンおよびピリミジン（それらは自然な化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび自然なアナログをさらに含んでいる）を含んでいる。プリンとピリミジンの合成派生物は、下記に制限しないが、アミン、アルコール、チオール、カルボン酸塩およびハロゲン化アルキルなどの塩基に基づいた新規の反応基を配置する修正を含む。用語の塩基は、制限しないが、下記のものを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡの周知の塩基アナログを包含し、それらは、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジニジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシ−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイド−ウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルリノシン、２、２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケノシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキシン、プソイドウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、２，６−ジアミノプリンである。用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、試験管内の重合ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの一部、ウィルスに由来した遺伝物質、線形ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡまたはこれらグループの派生物であってよい。ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小さな核のＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボゾームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（小型の干渉ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、リボザイム、試験管内で重合したＲＮＡ、あるいはこれらのグループの派生物の形態であってよい。
【００４４】
伝達
用語としての伝達は、ＲＮＡの機能を阻害することによって細胞の特性を変更するように、阻害剤が細胞と関連することを意味する。阻害剤は、細胞の細胞膜上、細胞質、核あるいは細胞の他の細胞器官の内部であり得る。頻繁に、伝達の別の用語は、感染、転移、または転換を含む伝達と互換して使用される。阻害剤の生体内の伝達は、阻害剤を哺乳類の外側の容器から哺乳類の細胞の外部の細胞膜の近くまたはかかる細胞膜内に転移することを意味する。阻害剤は、核あるいは細胞質のいずれかでＲＮＡ機能と干渉できる。
【００４５】
細胞
記載の発明を使用して、阻害剤は、培養中、つまり、生体外の細胞に効率的に伝達される。これらは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ベテスダ）から得ることができる多くの細胞株を含み、下記に限定しないが、例えば、３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）細胞、Ｒａｔ１（ネズミ繊維芽細胞）細胞、ＣＨＯ（中国のハムスター卵巣）細胞、ＣＶ−１（猿腎臓）細胞、ＣＯＳ（猿腎臓）細胞、２９３個の（人間の胚の腎臓）細胞、ＨｅＬａ（人間の頚部の癌）細胞、ＨｅｐＧ２（人間の肝細胞）細胞、Ｓｆ９（昆虫、卵巣、上皮）細胞およびその他同種のものである。
【００４６】
本発明は、さらに、生体内、インサイチュ、半ビボあるいは主要な細胞である細胞に対する阻害剤の伝達を記載する。主要な細胞は、下記に限定しないが、主要な肝臓細胞および主要な筋細胞および同種のものを含む。主要な細胞については、組織内の細胞が、細胞外のマトリックスを破壊するトリプシンまたはコラゲナーゼのような酵素での切断および消化により分離される。組織はいくつかの異なる細胞種からなる。勾配遠心分離あるいは抗体ソートなどの精製方法は、好ましい細胞種の精製された量を得るために使用することができる。例えば、主要な筋芽細胞は、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）（シグマ社）の勾配遠心分離を使用して、繊維芽細胞を汚染から分離される。
【００４７】
柔組織的な細胞
柔組織的な細胞は、結合組織フレームワークに含まれて支援された腺または器官の卓越した細胞である。柔組織的な細胞は、典型的には特別の器官に特有の機能を実行する。「柔組織的な」用語は、頻繁に、血管内の繊維芽細胞および内皮のセルのような組織に共通の多数の器官および組織である細胞を除外する。
【００４８】
例えば、肝臓器官では、柔組織的な細胞は、肝細胞、クッパー細胞、ならびに胆汁領域および胆汁小導管を並べる、上皮細胞を含む。肝臓柔組織の主な要素は、多面の肝細胞（さらに肝臓細胞として知られている）であり、それは肝臓のシヌソイドへの少なくとも１つの側および胆汁小管への反対された側に存在する。柔組織的な細胞でない肝臓細胞は、内皮細胞か繊維芽細胞のような血管内の細胞を含む。１つの好ましい実施態様では、肝細胞は、哺乳動物の門脈か胆管に阻害剤または阻害剤のコンプレックスを注入することにより目標とされる。
【００４９】
横紋筋では、柔組織的な細胞は、筋芽細胞、衛星細胞、ミオチューブル（ｍｙｏｔｕｂｕｌｅｓ）およびミオファイバー（ｍｙｏｆｉｂｅｒｓ）を含む。心筋では、柔組織的な細胞が、心筋繊維もしくは心筋細胞、洞房結節、房室ノードおよび房室の束を構成するような衝動を接続するシステムの細胞として知られている心筋を含む。
【００５０】
管
管は、身体内の組織か器官に接続された内部が中空の管状構造を含む。人体の流体は、管状の構造の孔内の身体部分に、あるいはその部分から流れる。人体の流体の例は、血液、リンパ液の流体あるいは胆汁を含む。管の例は、動脈、細動脈、毛細管、小静脈、シヌソイド、静脈、リンパ管および胆管を含む。器官の導入性の血管は、器官か組織の方へ、および、正常な生理条件下の器官か組織の方へ血液が流れるか導かれる管として定義される。反対に、器官の輸出性の血管は、器官か組織から遠ざかる血液が、正常な生理条件下の器官か組織から遠ざかって流れ導かれる管として定義される。肝臓では、下の大静脈へ肝臓から通常血液を運び去るので、肝臓の静脈は輸出性の血管である。さらに、肝臓では、それらが通常肝臓への血液を有するので、門脈および肝臓の動脈は肝臓に関する導入性の血管である。直接の柔組織的な注入と比較して、管への阻害剤または阻害剤のコンプレックスの挿入は、阻害剤を柔組織的な細胞に、より効率的により均衡のとれた分配で伝達できる。
【００５１】
血管の浸透性の増加
好ましい実施態様において、管の浸透性が増加する。阻害剤の伝達効率は、目標とする組織内の管の浸透性を増加させることにより増加させられる。浸透性は管を出て、かつ脈管外のスペースに入る阻害剤のような巨大分子の特性としてここに定義される。浸透性の１つの基準は、巨大分子が管から移動する率である。浸透性の別の手段は、血管内のスペースを残すために伝達されている阻害剤の移動に抵抗する力の不足である。
【００５２】
迅速な注入は、浸透性を増加させるために流出の妨害と結合してよい。妨害することは、この記載において、管を通って流体の流入あるいは流出を阻止するか、または阻害する。例えば、器官に供給する導入性の管は急速に注入され、また、組織から出て行く輸出性の管は一時的に結紮される。組織から出て行く輸出性の管（さらに静脈の流出かトラクトと呼ぶ）も、ポリヌクレオチドの伝達を可能にするのに十分な期間において、部分的にあるいは完全に留められる。逆では、輸出管が注入され、また、導入性の管が吸収される。
【００５３】
別の好ましい実施態様において、血管の圧力が、管内の浸透圧を増加させることにより増加させられる。典型的には、塩化ナトリウムのような塩類、砂糖あるいはマンニトールのような多価アルコールを含んでいる高張液が使用される。高緊張は、注入溶液の浸透性が生理学的な浸透性より大きいことを意味する。等張は生理学の浸透性（溶液の緊張力か浸透圧は血液の緊張力か浸透圧と同様である）と同じである。高張液は血液の浸透圧に関連のある緊張力および浸透圧を増加させており、細胞を縮ませる。
【００５４】
別の好ましい実施態様において、生物学上有効な分子によって、管の浸透性が増加させることができる。生物学上有効な分子は、パパベリン、あるいは内皮細胞あるいは平滑筋細胞のような管壁の内の細胞の機能、活性あるいは形状の変化を引き起こすことにより、容器の浸透性を増加させるヒスタミンのような、タンパク質あるいは単純な化学物質である。典型的には、生物学上有効な分子は、管の浸透性を変更するために特定のレセプターか酵素、あるいは管のセル内のタンパク質と相互作用する。生物学上有効な分子は、管の内皮の成長因子（ＶＥＧＦ）として知られている管の浸透性要因（ＶＰＦ）を含んでいる。別のタイプの生物学上有効な分子は、細胞外の接続物質の変更により浸透性を増加させることができる。例えば、酵素は細胞外の物質を消化し、接続物質の穴の数およびサイズを増加させるかもしれない。
【００５５】
好ましい実施態様において、阻害剤あるいは阻害剤を含有するコンプレックスが、大量の注入量で管に注入される。注入量は、注入される動物のサイズに依存し、小さな動物（つまりハツカネズミへの後部静脈注入）では１．０〜３．０ｍｌ以上であり得る。ネズミの注入量は、６〜３５ｍｌ以上である。霊長類における注入量は、７０〜２００ｍｌ以上です。ｍｌ／体重における注入量は、０．０３ｍｌ／ｇから０．１ｍｌ／ｇ以上であり得る。
【００５６】
注入量も目標組織と関係があり得る。例えば、手足への阻害剤を備えた非ウィルスベクターの伝達は、霊長類におけるネズミの手足当たり５ｍｌあるいは７０ｍｌ以上を越える量を注入することにより支援することができる。ｍｌ／手足筋肉での注入量は、通常筋肉の０．６〜１．８ｍｌ／ｇの範囲内にあるがより大きくなり得る。別の実施例において、ハツカネズミの肝臓への阻害剤または阻害剤のコンプレックスの伝達は、肝臓の０．６から１．８ｍｌ／ｇ以上の注入量における阻害剤の注入により援助することができる。霊長類（アカゲザル）の手足に阻害剤を伝達する別の実施例において、阻害剤またはコンプレックスは、手足筋肉の０．６から１．８ｍｌ／ｇまでの、あるいはいかなる場合でもこの範囲内の注入量になり得る。
【００５７】
別の実施態様において、注入流体は、管に急速に注入される。注入速度は、注入量、量が注入される管のサイズおよび動物のサイズに対して、部分的に依存する。１つの実施態様において、注入量（１−３ｍｌ）の総量は、１５〜５秒でハツカネズミの脈管系に注入することができる。別の実施態様において、注入量（６−３５ｍｌ）の総量は、２０〜７秒でネズミの脈管系に注入することができる。別の実施態様では、注入量（８０−２００ｍｌ）の総量は、１２０秒未満で猿の脈管系に注入することができる。
【００５８】
別の実施態様において、注入大量が使用されます。また、注入率が変更される。毎秒１グラム（動物重量）当たり０．０１２ｍｌ未満の注入率は、この実施態様において使用される。別の実施態様では、毎秒１グラム（目標組織重量）当たり０．２ｍｌ未満の注入率で、遺伝子の目標器官への伝達において使用される。
別の実施態様において、毎秒１グラム（目標組織重量）当たり０．０６ｍｌ未満の注入率で、手足筋肉および霊長類の他の筋肉への遺伝子伝達において使用される。
【００５９】
ポリマー
ポリマーはモノマーと呼ばれる、より小さなユニットに反復結合によってともに構築された分子である。２から薬８０のモノマーを有する小さなポリマーは、オリゴマーと呼ばれる。ポリマーは線形、枝分かれのネットワーク、星、櫛あるいは梯子タイプであり得る。ポリマーは、単一のモノマーが使用されるか、２つ以上のモノマーが使用される共重合体のホモポリマーであり得る。共重合体のタイプは交互、ランダム、ブロックおよびグラフトを含む。
【００６０】
ポリマーの主鎖は、その結合がポリマー長の伝播において必要になる原子から構成される。ポリマーの側鎖は、その結合がポリマー長の伝播において必要とはならない原子から構成される。
【００６１】
当業者にとっては、記述された過程で利用することができるいくつかのカテゴリーの重合過程がある。重合は連鎖または段階であり得る。この分類の記述は、追加と縮合重合の以前の用語から、より頻繁に使用される。「ほとんどのステップ反応重合は凝縮過程であり、ほとんどの連鎖反応重合は追加過程である。」（Ｍ。Ｐ．スティーヴンズ、ポリマー化学：イントロダクション、ニューヨーク・オックスフォード大学出版社１９９０）。テンプレート重合は、子ポリマーからポリマーを形成するために使用することができる。
【００６２】
重合段階
重合段階では、重合が徐々に発生する。ポリマー成長は、モノマーとオリゴマーおよびポリマー間の反応によって生じる。同じ反応が完全に生じて、終了ステップはないので、イニシエーターは必要ではなく、その結果、末端グループは未だ反応的である。官能基が消費されるにつれて、重合率は減少する。
【００６３】
典型的には、ステップ重合は、２つの異なる方法のいずれかをもたらす。一方では、Ａ−Ｂが［Ａ−Ｂ］を産出するように、モノマーは同じ分子に両方の反応的な官能基（ＡおよびＢ）を有し、
別のアプローチは、２つの非機能的（ｄｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）モノマーを有する。
【００６４】
Ａ−Ａ＋Ｂ−Ｂは［ＡＡ−Ｂ−Ｂ］を産出する。
【００６５】
一般に、これらの反応は、アシル化またはアルキル化を含むことができる。アシル化は、分子上にアシル基（ＣＯＲ）の導入として定義される。アルキル化は分子上にアルキル基の導入として定義される。
【００６６】
官能基Ａがアミンである場合、下記に限定しないが、Ｂはイソチオシアナート、イソシアン酸塩、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホニルクロリド、アルデヒド（ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを含む）、ケトン、エポキシド、炭酸塩、イミドエステル、カルボン酸塩もしくはリン酸アルキル、ハロゲン化アリール（ジフルオロ−ジニトロベンゼン）、無水物もしくは酸ハロゲン化物、ｐ−ニトロフェニルエステル、ｏ−ニトロフェニルペンタクロロフェニルエステルもしくはペンタフルオロフェニルエステルであり得る。他に、官能基Ａがアミンである場合、官能基Ｂは、アシル化あるいはアルキル化剤か、アミノ化であり得る。
【００６７】
官能基Ａがチオール（メルカプト基）である場合、下記に限定しないが、官能基Ｂは、ヨードアセチル派生物、マレイミド、アジリジン派生物、アクリロイル派生物、フルオロベンゼン派生物あるいは二硫化物の派生物（ピリジルジスルフィドもしくは５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）派生物のような）であり得る。
【００６８】
官能基Ａがカルボン酸塩である場合、下記に限定しないが、官能基Ｂはカルボジイミドが使用されるジアゾ酢酸あるいはアミンであり得る。他の添加物は、カルボニルジイミダゾール、ジメチルアミノピリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドあるいはアルコール使用するカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジンのように利用されるかもしれない。
【００６９】
官能基Ａが水酸基である場合、下記に限定しないが、官能基Ｂはエポキシド、オキシランまたは、カルボニルジイミダゾールかＮ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナートあるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロギ酸エステル、あるいは、他のクロロギ酸エステルが使用されるアミンであり得る。
【００７０】
官能基Ａがアルデヒドかケトンである場合、下記に限定しないが、官能基Ｂは生ずるヒドラジン、ヒドラジド派生物、アミン（ＮａＣＮＢＨ３のような還元剤によって縮小されるかもしれないし、縮小されないかもしれないイミンかイミニウムの形成）あるいはケタール、あるいはアセタールを形成するための水酸基化合物であり得る。
【００７１】
しかし、別のアプローチは、Ａ−Ａに別の薬剤の添加が−［ＡＡ］−を産出するように１つの非機能的なモノマーを有することである。
【００７２】
官能基Ａがチオール基である場合、ヨウ素（Ｉ２）あるいはＮａＩＯ４（過ヨウ素酸ナトリウム）または  酸素（Ｏ２）のような酸化剤によってジスルフィド結合に変換できる。官能基Ａはさらに、２−イミのチオラート（トラウト（Ｔｒａｕｔ）の試薬）（その後、それは酸化および二硫化物構成を受ける）での反応によってチオール基に変換されるアミンであり得る。二硫化物の派生物（ピリジルジスルフィドまたはＴＮＢ派生物のような）もジスルフィド結合構成に触媒作用を及ぼすために使用することができる。
【００７３】
上記の実施例のうちのいずれかの官能基ＡあるいはＢは、さらにアリルアジ化物、ハロゲン化されたアリール基を含むアジ化物、ジアゾ、ベンゾフェノン、アルキンまたはジアジリンの派生物のような光反応基であり得る。
【００７４】
アミン、水酸基、メルカプト基を含むカルボン酸塩の基の反応は、アミド、アミジン、二硫化物、エーテル、エステル、エナミン、尿素、イソチオ尿素、イソ尿素、スルホンアミド、カーバメート剤、炭素窒素二重結合（イミン）、アルキルアミン結合（二次アミン）、炭素が水酸基を有する炭素窒素単結合、チオール−エーテル、ジオール、ヒドラゾン、ジアゾ基あるいはスルホンとして記載される化学結合を産出する。
【００７５】
連鎖重合
連鎖反応において、ポリマーの重合は、成長する鎖の制限数までモノマー・ユニットの連続的な追加によって生じる。開始と伝播のメカニズムは、異なり、連鎖を終了する段階が通常ある。モノマーがなくなるまで、重合率は一定のままである。
【００７６】
アクリル酸ビニル、メタクリル酸塩、アクリルアミド、メタクリルアミド基を含んでいるモノマーは、連鎖反応（それはラディカルか、陰イオンか、カチオンになり得る）を受けることができる。連鎖重合は、サイクルまたはオープン重合によって達成でき得る。数多の異なるタイプのフリーラジカルのイニシエーターは、過酸化物、ヒドロキシパーオキサイド、および２、２’−アゾビス（アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰ）のようなアゾ化合物を含んで、使用することができる
モノマー
種々様々のモノマーは重合過程で使用することができる。これらは、アミン、イミジン、グアニジン、イミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、複素環式化合物（イミダゾール、ピリジン、モルホリン、ピリミジンあるいは種のような）のような正電荷の有機モノマーを含む。アミンは、４〜８の生理学的範囲内であるアミンのｐＫａでｐＨに感受性である。特定のアミンは、スペルミン、スペルミジン、Ｎ、Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１、３−プロパンジアミン（ＡＥＰＤ）および３、３’−ジアミノ−Ｎ、Ｎ−ジメチルジプロピル臭化アンモニウムを含む。
【００７７】
モノマーはさらに疎水性、親水性あるいは、両親媒性になり得る。モノマーは、さらにアクリジン、チアゾールオレンジあるいは臭化エチジウムのようなインターカレート剤になり得る。
【００７８】
ポリマーは、さらに、主鎖あるいは側鎖のいずれかに切断グループを含むことができる。切断グループは、下記に限定しないが、二硫化物結合、ジオール、ジアゾ基を含んだ結合、エステル結合、スルホン結合、アセタール、ケタール、エノール・エーテル、エノール・エステル、エナミンおよびイミンを含む。好ましい切断グループは、適応力のあるｐＨのグループを含む。
【００７９】
ポリマーは、それらのユーティリィティを増加する他の官能基あるいは修飾を有してよい。これらの基は、ポリマー構成に先立ったモノマーに組み入れるか、あるいはその構成の後にポリマーに付加できる。
【００８０】
高分子電解質／ポリカチオン／ポリアニオン
高分子電解質、またはポリイオン（ｐｏｌｙｉｏｎ）は、１つの電荷より高いポリマーを所有することであり、つまり、ポリマーは、１個以上の電子を獲得するか失うかいずれかを有する基を含む。ポリカチオンは、  例えばポリ−Ｌ−リジンヒドロブロミドであって、  正味の正電荷を有する高分子電解質である。ポリカチオンは、正、中性または負に帯電したモノマー・ユニットを含むことができるが、しかしながら、ポリマーの正味の電荷は正である。ポリカチオンは、さらに２つ以上の正電荷を含んでいる重合体でない分子を意味することができる。ポリアニオンは、正味の負電荷を含む高分子電解質である。ポリアニオンは、正、中性または負に帯電したモノマー・ユニットを含むことができるが、しかしながら、ポリマーにおける正味の電荷は負であるべきである。ポリアニオンは、さらに２つ以上の負の電荷を含んでいる重合体でない分子を意味することができる。用語としての高分子電解質は、ポリカチオン、ポリアニオン、両性イオンのポリマーおよび中立のポリマーを含む。両性イオンは、同じ分子の一部である酸性基と基礎的な基との間の反応の産物（塩）を意味する。
【００８１】
ポリマーは、細胞への核酸の伝達の探求において使用される。細胞への核酸伝達のいくつかの方法のうちの１つは、核酸／ポリカチオンのコンプレックスの使用です。スペルミンのような小さいポリカチオンではないが、ヒストンおよびプロタミンのようなカチオンのタンパク質またはポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）およびポリエチレンイミンのような合成ポリマーが、有効な細胞内のＤＮＡ伝達剤であるかもしれない。３以上の電荷を有する多価染色体の陽イオンは、９０％以上の電荷が糖−リン酸の骨格に沿って中和される場合に、核酸を圧縮することが示された。１つのポリヌクレオチド分子がポリカチオンのコンプレックスで占める量は、自由なポリヌクレオチド分子の量より少ない。ポリカチオンは、さらにセル表面にポリヌクレオチドの付加を供給する。ポリマーは、ポリカチオンな核酸と細胞のポリアニオンな表面との間のクロス・ブリッジを形成する。その結果、細胞内のスペースへの核酸転置のメカニズムは非特異性の吸着性のエンドシトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）かもしれない。さらに、ポリカチオンは、コンプレックスに特定のリガンドを付加するために便利なリンカーを提供する。その後、特定の細胞のタイプに核酸／ポリカチオンのコンプレックスを目標とすることができるかもしれない。コンプレックスの構成は、さらに、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）およびリゾソームと同様に血清の中にもあるヌクレアーゼによる核酸の劣化に対して保護する。エンドソーム／リゾソームでの劣化からの保護は、細胞器官の酸性化を防ぐことにより増強される。エンドソーム／リソソームの機能の混乱も、エンドソームあるいは膜の破壊剤をポリカチオンもしくはコンプレックスにリンクすることにより遂行されてよい。
【００８２】
ＤＮＡ結合タンパク質は、このアプリケーションに記述された条件下の核酸と関連し、一定の高結合で核酸とコンプレックスを形成する。ＤＮＡ結合タンパク質は、この過程のためのその自然な形態あるいは修飾された形態の有効量で使用でき得る。ポリカチオンの有効量は、阻害剤の伝達が生じることを可能にする量である。
【００８３】
非ウィルスベクターは、非ウィルスの阻害剤／ポリマーのコンプレックス、化合物を増強するトランスフェクションを備えた阻害剤および阻害剤＋両親媒性化合物を含む真核細胞内でアセンブルされないベクターとして定義される。
【００８４】
表面の電荷／再電荷
正の表面電荷が核酸／ポリカチオンのコンプレックスと細胞との間の相互作用を促進しているかもしれない一方、負の表面電荷は、特に生体内伝達において、多くの実際的な応用により望ましいでしょう。表面を再電荷する現象は、コロイド化学において周知であり、疎液性／親液システム（つまりハロゲン化銀ヒドロゾル）で詳述される。反対に電荷された表面を備えるラテックス粒子の懸濁へのポリカチオンの追加は、表面上にポリイオンの永久の吸収に結びつく。適切な化学量論に達する際、表面は反対の電荷に変化される。
【００８５】
ゼータ電位は、粒子表面上のイオンのしっかりと結合された層の間の電気的な電位の差、および粒子が懸濁される液体である。
【００８６】
両親媒性化合物
両親媒性化合物は、一方の端が疎水性で、もう一方が親水性の端を含んでいる分子です。疎水性の用語は、化学的部分が水を回避している特質を示す。炭化水素は疎水性基です。親水性の用語は、化学的部分が水を好む特質を示す。典型的には、そのような化学基は、可溶であり、水を有する水素結合のドナーまたはアクセプターである。親水基の例は、次の化学部分を備えた合成物を含んでおり、それらは炭水化物、ポリオキシエチレン、オリゴヌクレオチド、およびアミン、アミド、アルコキシル基のアミド、カルボン酸、硫黄あるいは水酸基を含む基である。
【００８７】
脂質
脂質は水において溶解不可能であるが、クロロホルムとベンゼンのような有機的な溶剤において可溶の有機化合物の種々のグループのいずれかである。脂質は疎水性および親水性部分を含む。脂質はコンプレックスの脂質、単純な脂質および合成脂質を含むことを意味する。コンプレックスな脂質は、脂肪酸のエステルで、グリセリド（油脂）、糖脂質、リン脂質およびロウを含む。単純脂質はステロイドとテルペンを含む。合成脂質は、脂肪酸から調製されるアミドを含み、カルボン酸がアミノ酸に変換され、１つ以上の酸素原子が別のヘテロ原子（窒素または硫黄）によって置換されている合成の様々なコンプレックスな脂質に変換され、追加的な親水基が化学的に付加されている単純な脂質の派生物に変換される。合成脂質は１つ以上の適応力のある基を含んでよい。
【００８８】
コンプレックス
２つの分子は、静電気の相互作用、水素結合の相互作用および疎水性の相互作用のような共有結合でない相互作用によって互いに接触する場合、コンプレキシレーション（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）あるいはコンプレックス形成と呼ばれる過程によりコンプレックスを形成するために組み合わせられる。相互高分子電解質のコンプレックスは、反対の電荷の高分子電解質間の共有結合でない相互作用である。
【００８９】
修正
分子は、２つの分子が共有結合によって接合されるようになる場合、第二の分子によって、修正と呼ばれる過程を通じて修正を形成するために修正される。すなわち、２つの分子は、１つの分子からの原子と、新しい単一の分子の構成に帰着する第２の分子からの原子の間の共有結合を形成する。化学的な共有結合は、電子密度の共有がある２つの原子間の相互作用の結合です。修正は、さらに共有結合でない結合を通じて２つの分子間の相互作用を意味する。例えば、クラウンエーテルは、あるアミン基と共有結合でない結合を形成することができる。
【００９０】
官能基
官能基は、細胞を目標とするシグナル、核の局地化のシグナル、エンドソームあるいは他の細胞内の小胞（信号を放出する）から内容の放出を増強する合成物および官能基が付加されるコンプレックスである化合物の挙動または相互作用を変更する他の化合物を含む。
【００９１】
細胞を目標とする信号は、細胞を備えた生物学上有効な化合物の関係を強めるすべての信号である。
これらの信号は、薬または核酸のような生物学上有効な化合物を修正することができ、培養あるいは全体の有機体のいずれかの細胞（核のような）で細胞の位置（組織のような）か位置に導くことができる。信号は、細胞表面および／または細胞内のコンパートメントとの関連への化合物の結合を増加してよい。外来遺伝子の細胞または組織位置を修正することによって、生物学上有効な化合物の機能は強めることができる。信号を目標とする細胞は、下記に限定しないが、タンパク質、ペプチド、脂質、ステロイド、砂糖、炭水化物、（非発現の）ポリ核酸または合成化合物であり得る。リガンドのような細胞を目標とする信号は、レセプターへの細胞の結合を強める。様々なリガンドは、細胞への、および特定の細胞のレセプターへの薬および遺伝子を目標とするために使用される。リガンドは、細胞膜内の、細胞膜上の、あるいは細胞の近くの目標を求めるかもしれない。レセプターにリガンドを典型的に結合することはエンドシトーシスを始める。リガンドは、アシオロ糖タンパク質（ａｓｉｏｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）またはガラクトースの残留物の使用によってアシアロ糖タンパク質（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）レセプターへ目標とする薬剤を含む。インシュリン、ＥＧＦあるいはトランスフェリンのような他のタンパク質は、目標とするために使用することができる。ＲＧＤシーケンスを含んでいるペプチドは多くの細胞を目標とするために使用することができる。細胞上のチオール、メルカプト基あるいはジスルフィド基で反応する、化学基も多くのタイプの細胞を目標とするために使用することができる。フォラシンと他のビタミンも目標とするために使用することができる。他の目標とする基は、脂質、脂肪酸、コレステロール、ダンシル合成物およびアンホテリシン派生物のような薄膜と相互作用する分子を含む。さらに、細胞に結合するためにウィルスのタンパク質を使用することができるかもしれない。
【００９２】
細胞を備えた超分子のコンプレックスの相互作用の後に、他の目標とする基は薬か核酸の伝達を細胞のある部分に増加させるために使用することができる。例えば、薬剤は、エンドソームを分裂させるために使用することができ、核を目標とするために核の局在化信号（ＮＬＳ）を使用することができる。
【００９３】
核の局在化信号は、核の接近へおよび／または核に入り込む薬学的な目標とすることを増強する。そのような核輸送信号はシミアンウイルス４０の大きなＴ抗原ＮＬＳあるいはネクロプラズミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）  ＮＬＳのようなタンパク質あるいはペプチドであり得る。核の局在化信号は、その後、カリオフェリン（ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎ）ベータと作用するＮＬＳレセプター（カリオフェリンアルファ）のような様々な核輸送因子と作用する。核気孔および核に目標とされるので、ＮＬＳのように、核輸送タンパク質はそれら自身をさらに機能することができる。例えば、カリオフェリンベータはそれ自身、核気孔のコンプレックスへのＤＮＡを目標とすることができる。いくつかのペプチドは、シミアンウイルス４０  Ｔ抗原に由来する。他のＮＬＳペプチドは、Ｍ９タンパク質、ネクロプラズミンおよびｃ−ｍｙｃに由来する。
【００９４】
多くの生物学上有効な化合物が、特別の大きな合成物および／または電荷された化合物において、生物的な薄膜と交差することができない。順番に、細胞に入るこれらの化合物については、細胞はエンドシトーシスによってそれらを取り上げるに違いなく、つまり、エンドソームへ、あるいは、化合物が交差することを可能にする細胞の細胞膜の混乱があるに違いない。エンドソーマルな導入の場合、エンドソーマルな薄膜がエンドソームからの、および細胞質の中への移動を考慮に入れるために分裂しなければならない。細胞への一方の導入系は、細胞の細胞膜の混乱を要求する。薄膜を分裂させるか、薄膜融合を促進する合成物は薄膜の有効な合成物と呼ばれる。これら膜の有効な合成物または信号の放出は、エンドソーム（初期および後期）のような細胞内のコンパートメント、リゾソーム、ファゴソーム、小胞、小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジ（ｔｒａｎｓ  ｇｏｌｇｉ）ネットワーク（ＴＧＮ）および筋小胞体からエンドシトーシスされた物質の放出を強める。放出は、細胞質へ、あるいは核のような細胞器官へ細胞内のコンパートメントからの移動を含む。放出する信号は、クロロキン、第１級のバフィロマイシン（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）か、ブレフェルディン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）、およびＥＲを保持する信号（ＫＤＥＬシーケンス）のような化学薬品、インフルエンザウィルスの赤血球凝集素サブユニットＨＡ−２ペプチドのようなウィルスの構成部分および他のタイプの両親媒性のペプチドを含む。膜の有効な化合物が活性される場合の制御は、有効な輸送に重大である。膜の活性剤がある時間および場所に機能的である場合、膜の活性剤は、生物学的な膜を横切る生物学上有効な化合物の移動を容易にする。膜の有効な化合物が間違った時間であまりにも活性である場合、輸送は発生しないか、または、輸送はセル破裂およびセル死に関係する。自然は、薄膜融合および使用薄膜を含む生物学上有効な合成物の薄膜輸送のために許可するべき様々な戦略を発展させ、その活動が調整される有効な合成物は、毒性なしで活性を支援するようなものを輸送する。多くの脂質ベースの輸送形態は、薄膜融合に依存し、ある膜の有効なペプチドの活動は、ｐＨによって調整される。特に、ウィルスでコートされたタンパク質は、頻繁にｐＨに感受性であり、中性または塩基のｐＨでは不活性であり、エンドソームでみられる酸性状態下では活性である。
【００９５】
別の官能基は、分子とそれら分子間の相互作用を減少し、別の分子を備えるポリエチレングリコールのような化合物を含む。そのような基は、血清因子と分子、または伝達されるコンプレックスとの間でのような制限のある相互作用において有用である。
【００９６】
適応力のある結合
適応力のある結合は、選択的に壊れることができる共有結合である。すなわち、適応力のある結合は、他の共有結合の破損のない他の共有結合に存在で破られるかもしれない。例えば、ジスルフィド結合は、分子に存在してもよい、炭素と炭素、炭素と酸素、炭素と硫黄、炭素と窒素結合のような他の結合の分裂のないチオールの存在で壊れることができる。さらに、適応力のあるという意味は、切断可能を意味する。
【００９７】
適応力のあるリンク
適応力のあるリンクは、適応力のある結合を含んでおり、２つの他のグループの間のリンクかスペーサーを提供する化合物である。リンクされる基は、生物学上有効な化合物、細胞膜の有効な化合物、その膜の活動を抑制し、機能的な反応的なグループ、モノマー、また信号を目標とする細胞などの化合物から選択されるかもしれない。スペーサー基は、アルカン、アルケン、エステル、エーテル、グリセリン、アミド、蔗糖エステル、多糖、および酸素、硫黄あるいは窒素のようなヘテロ原子を含んでいるグループから選択される化学部位を含んでよい。スペーサーは電子的に中立かもしれないし、あるいは全体の電荷が中性、正または負である正および負の両電荷を有してよい。
【００９８】
ｐＨ適応力のあるリンクおよび結合
ｐＨ適応力のあるという意味は、酸性条件（ｐＨ＜７）の下の共有結合の選択的な破壊に言及する。すなわち、ｐＨ適応力のある結合は、それらの破壊のない他の共有結合がある状態で酸性条件の下で破られるかもしれない。
【００９９】
切断ポリマー
阻害剤のコンプレックスにおいて、阻害剤は、阻害剤が有効なために細胞のコンプレックスの構成部分から分離される。この分離が、細胞外で、細胞質の小胞あるいは細胞器官（つまりエンドソーム）内に、細胞質中で、あるいは核中で生じるかもしれない。我々は、より良好にかかる過程を促進するために共同モノマーおよびカチオンの共同モノマーを含んでいるジスルフィド結合から調製されたバルクポリマーを開発した。これらのポリマーはポリヌクレオチドを圧縮し、かつジスルフィド結合の縮小の後にヌクレオチドを放出することが示された。これらのポリマーは、核酸と有効なコンプレックスするために使用することができ、さらに肝臓および他の器官までの伝達の間にヌクレアーゼから核酸を保護することができる。細胞への伝達後に、ポリマーは有効に核酸を放出して、モノマーになる。例えば、ジスルフィド結合は、細胞の内部のより高い濃度にあるグルタチオンによって縮小されるかもしれない。負に帯電したポリマーは、ジスルフィド結合の減少が核酸を放出した後に、濃縮した核酸粒子を正味が負電荷の粒子となる切断できる陰イオンポリマーで再電荷できる、同様の手法で作ることができる。減少可能な共同モノマー中のジスルフィド結合の縮小電位は、化学的にジスルフィド結合の環境を変更することにより調節することができる。したがって、核酸が、伝達過程での適切なポイントで放出されるように、その放出特性が調整することができる粒子を構築することができる。
【０１００】
細胞内のコンパートメント放出におけるｐＨ切断可能なポリマー
細胞の輸送ステップは、エンドソーム（初期および後期）、リゾソーム、ファゴソーム、小胞、小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）および筋小胞体のような細胞内のコンパートメントから放出するエンドシトーシスされた阻害剤の伝達において重要である。放出は、細胞質へ、あるいは核のような細胞器官へ細胞内のコンパートメントからの移動を含む。この放出を支援する化合物は、第１級のクロロキン、バフィロマイシンあるいはブレフェルディンのような化学薬品を含む。クロロキンは、エンドソーマルでリソソームのコンパートメントの酸性化を減少させるが、さらに他の細胞の機能に影響する。ブレフェルディンＡ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）（イソプレン構造の菌による代謝物質）は、細管を形成するために越ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）へ、小胞体および初期のエンドソーマルなコンパートメントへゴルジ体を可逆的に崩壊させる。第１級のバフィロマイシン、マクロライド系抗生物質は、エンドソーマルな酸性化および空胞タイプＨ＋ＡＴＰアーゼのより特定の阻害剤である。ＥＲ保持信号（ＫＤＥＬシーケンス）は、小胞体への伝達を強めて、かつリゾソームへの伝達を防ぐために提案された。
【０１０１】
血清中の阻害剤粒子の安定性を増加させるために、我々は、阻害剤のコンプレックスにおける第三層を形成し、粒子を負に帯電するポリアニオンで帯電した阻害剤／ポリカチオンのコンプレックスを正に再度帯電した。阻害剤のコンプレックスの混乱を支援するために、我々は、ｐＨ  ５−７のエンドソームで見られる酸性状態で切断されるポリマーを合成した。コンプレックスでのポリマーの細胞内の小胞内の切断は、小胞混乱を支援し、細胞質への阻害剤の放出を助けるかもしれない。
【０１０２】
ポリイオンは、より小さなポリイオンに帰着するポリマーの骨格の分裂あるいはポリマーの骨格間のリンクの分裂のいずれかによって裂かれるかもしれない。また、側鎖を含んでいるイオンは、小さなイオン化された分子およびポリマーに帰着してグループ化する。いずれの場合も、ポリイオンおよび核酸の間の相互作用は破壊しており、また、小胞中の分子の数は増加する。この増加は、小胞を分裂させる浸透圧衝撃を引き起こす。ポリマーの骨格が疎水性の場合、小胞の薄膜と相互作用するかもしれない。
【０１０３】
切断可能なポリマーを構築するために、ジスルフィド結合、ジオール、ジアゾ基を含んだ結合、エステル結合、スルホン結合、アセタール、ケタール、エノール・エーテル、エノール・エステル、イミン、イミニウムおよびエナミンのように本質的に適応力のある結合と共にイオンかポリイオンを付加するかもしれない。別のアプローチ、官能基間の反応が迅速なように隣接に反応的なグループ（つまり親電子物質、求核分子）を入れるような方法でポリマーを構築する。例は、カルボン酸派生物（酸、エステル、アミド）およびアルコール、チオール、カルボン酸あるいはエステル、チオールエステル、酸の無水物またはアミドを形成するように同一分子と共に反応するアミンを有して含む。
【０１０４】
本発明は、さらに加水分解に弱いシリコン窒素（ｓｉｌａｚａｎｅｓ）リンケージ（ポリマーの主鎖、あるいはポリマーの側鎖のいずれか）を含んでいるポリマーの使用において提供する。シリコン窒素の加水分解は、シアノール（ｓｉｌａｎｏｌ）およびアミンの構成に結びつく。シリコン窒素は、シリコン酸素の炭素リンケージであるよりも加水分解に対して本質的により弱い。加水分解率は、酸性条件で増加する。シリコン原子およびアミンの両方における代用は、立体と電子効果により加水分解率に影響することができる。これは、一方のシリコンにおける代用の変更によるシリコン窒素の加水分解率あるいは所望のものを促進するアミンが影響する調整の可能性を考慮に入れる。
【０１０５】
１つの実施態様において、エステル酸、およびアルコールおよびアミン、および無水物を形成する酸性環境（４を越える７未満のｐＨ）において適応力のあるアミド酸は、ペプチド、脂質、およびリポソームのような多重分子の協会を含んでいる様々な分子およびポリマーにおける使用である。
【０１０６】
１つの実施態様では、ジオールおよびケトンを形成する酸性環境（４を越える７未満のｐＨ）において適応力のあるケタールが、ペプチド、脂質およびリポソームを含んでいる様々な分子およびポリマーでの使用である。
【０１０７】
１つの実施態様では、ジオールおよびアルデヒドを形成する酸性環境（４を越える７未満のｐＨ）において適応力のあるアセタールが、ペプチド、脂質およびリポソームを含んでいる様々な分子およびポリマーでの使用である。
【０１０８】
１つの実施態様では、ケトンおよびアルコールを形成する酸性環境（４を越える７未満のｐＨ）において適応力のあるエノールが、ペプチド、脂質およびリポソームを含んでいる様々な分子およびポリマーでの使用である。
【０１０９】
１つの実施態様では、アミンおよびアルデヒドを形成する酸性環境（４を越える７未満のｐＨ）あるいはケトンにおいて適応力のあるイミニウムが、ペプチド、脂質およびリポソームを含んでいる様々な分子およびポリマーでの使用である。
【０１１０】
ペプチドおよびポリペプチドのｐＨに感受性な分裂
１つの実施態様において、ペプチドおよびポリペプチド（両方ともペプチドと呼ばれた）が無水物によって修正される。ペプチドのアミン（リジン）、アルコール（セリン、トレオニン、チロシン）およびチオール（システイン）基は、アミド、エステルあるいはチオエステル酸を生産する無水物によって修正される。内部小胞（４．５を越える６．５未満のｐＨ）（初期のエンドソーム、後期のエンドソームあるいはリゾソーム）の酸性環境では、アミド、エステルあるいはチオエステルは、オリジナルのアミン、アルコールあるいはチオ基または無水物を表して、裂かれる。
【０１１１】
様々なエンドソモリティック（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）で両親媒性のペプチドは、この実施態様で使用することができる。正に帯電された両親媒性／エンドソモリティックなペプチドは、アミド酸を形成するために無水物を備えた反応によって負に帯電したペプチドに変換され、この化合物はポリアニオンを濃縮した核酸で次にコンプレックスされる。エンドソームへ入り込んだ後に、アミド酸は裂かれ、また、ペプチドは、正に帯電されるようになり、ポリアニオンで濃縮した核酸はもはやコンプレックスされず、また両親媒性でエンドソモリティックになる。１つの実施態様では、ペプチド、チロシンとリジンを含む。また別の実施態様において、ペプチド（エステル酸の分裂の後の）の疎水性部分は、ペプチドの一端にあり、親水性の部分（例えば、分裂の後に負に帯電された）は、別の端にある。ジメチルマレイン酸無水物で疎水性部分を修正することができるかもしれないし、シトラコン酸無水物で親水性の部分を修正することができるかもしれない。ジメチルマレイ基がシトラコニル基よりも急速に裂かれるので、疎水性の部分は最初に形成する。別の実施態様では、親水性部分は、アルファへリックスかコイル−コイル構造を形成する。
【０１１２】
脂質とリポソームのｐＨに感受性な分裂
別の実施態様において、酸性環境では、脂質が修正され、リポソームが、分裂し、フソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）またはエンドソモリティックになるように、エステル、アミドあるいはチオエステル酸は脂質とリポソームでコンプレックスされた。脂質のジアクリルグリセロールは、エステル酸を形成するために無水物で反応される。細胞内の小胞の酸性化の後に、ジアクリルグリセロールは再形成し、破壊性でフソジェニックであるまさに脂質の二層である。
【０１１３】
リポーター分子
リポーター遺伝子から発現する３つのタイプのリポーター（マーカー）遺伝子生成物がある。
リポーター遺伝子／タンパク質システムは次のものを含む：
ａ）  ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、あるいはクロラムフェニコール・アセチル転移酵素のような細胞内の遺伝子産物。典型的には、それらはその酵素活性が容易に測定することができる酵素である。
【０１１４】
ｂ）  リポーター遺伝子を発現する細胞を識別するβガラクトシダーゼあるいは緑の蛍光性のタンパク質のような細胞内の遺伝子生成物。細胞の染色強度に基づいて、これらのリポーター遺伝子生成物は、さらに１個の細胞当たり生産された外来タンパク質量に関する質の情報を産出する。
【０１１５】
ｃ）  分泌されたアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、成長ホルモン、因子ＩＸあるいはａｌｐｈａ１−抗トリプシンのような分泌された遺伝子生成物は、遺伝子の転移過程が生産することができる分泌されたタンパク質量を決定するために役立つ。リポーター遺伝子の生成物は、少量の血液中で分析することができる。
【０１１６】
実施例
１．  生体内の肝臓セルのｓｉＲＮＡによるルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害。
【０１１７】
３’突出末端のデオキシヌクレオチドを備えた、一本鎖の遺伝子に特異的なセンスおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマーは、ＰＡＧＥによって調製され精製された。各４０μＭ  である２つのオリゴマーは、５０ｍＭトリスＨＣｌ  、ｐＨ  ８．０および１００  ｍＭ  ＮａＣｌを含んでいる２５０のμｌバッファー中で２分間９４°Ｃによって加熱し、１分間９０°Ｃで冷却し、その後、毎分１°Ｃの割合で２０°Ｃで冷却することによってアニールした。生じたｓｉＲＮＡは、使用に先立ち−２０°Ｃで保存された。
【０１１８】
ｌｕｃ＋遺伝子に対して同一なセンス・オリゴマーは、下記のシーケンスを有し：
ＳＥＱ  ＩＤ番号：４  ５’―ｒＣｒＵｒＵｒＡｒＣｒＧｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＧｒＡＴＴ−３’（ｌｕｃ＋リーディングフレームの１５５−１７３位置に相当する）。ヌクレオチドに先行する文字「ｒ」は、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す。ｌｕｃ＋遺伝子に対して同一のアンチセンスのオリゴマーは、下記のシーケンスを有し：
ＳＥＱ  ＩＤ番号：５  ５’―ｒＵｒＣｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＣｒＧｒＵｒＡｒＡｒＧＴＴ−３’（アンチセンスの方向ｎでｌｕｃ＋リーディングフレームの１５５−１７３の位置に相当する）。ヌクレオチドに先行する文字「ｒ」は、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す。ｌｕｃ＋をコード化するシーケンスを含むアニールされたオリゴマーは、ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋と呼ばれる。
【０１１９】
細菌のプラスミドのＣｏｌＥ１複製起点と同一のセンス・オリゴマーは、下記のシーケンスを有し：
ＳＥＱ  ＩＤ番号：６  ５’―ｒＧｒＣｒＧｒＡｒＵｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＧｒＵｒＧｒＵｒＣｒＵｒＵｒＡｒＣＴＴ−３’。ヌクレオチドに先行する文字「ｒ」は、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す。バクテリアのプラスミドのＣｏｌＥ１起点と同一のアンチセンスのオリゴマーは、下記のシーケンスを有し：
ＳＥＱ  ＩＤ番号：７  ５’―ｒＧｒＵｒＡｒＡｒＧｒＡｒＣｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＵｒＵｒＡｒＵｒＣｒＧｒＣＴＴ−３’。ヌクレオチドに先行する文字「ｒ」は、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す。ＣｏｌＥ１シーケンスを含んでいる、アニールされたオリゴマーはｓｉＲＮＡ−ｏｒｉと呼ばれる。
【０１２０】
ｌｕｃ＋のコード領域（プロメガ社）およびサイトメガロウイルスの主要な即時の初期のエンハンサー／プロモーターのキメラのイントロンの下流を含むプラスミドｐＭＩＲ４８（１０μｇ）は、０．５あるいは５μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋と混合されて、１−３ｍｌのリンゲル液（１４７のｍＭ  ＮａＣｌ、４つのｍＭ  ＫＣｌ（１．１３のｍＭ  ＣａＣｌ２））で希釈され、７−１２０秒以上でＩＣＲハツカネズミの後部静脈に注入された。注入の１日後に、肝臓は溶解バッファー（０．１％のトリトンＸ−１００、０．１ＭのＫ−リン酸塩、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ  ７．８）で収穫され均質化された。不溶解の物質は、遠心分離によって透明にされた。１０μｌの細胞の抽出液または１０倍に希釈された抽出液は、増強型ルシフェラーゼ分析キット（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）（ミラス（Ｍｉｒｕｓ）社）を使用して、ルシフェラーゼ活性を分析した。
【０１２１】
１０μｇ  ｐＭＩＲ４８単独の注入と比較して、１０μｇ  ｐＭＩＲ４８および０．５μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の共同注入は、Ｌｕｃ＋活性の６９％の阻害に帰着する。１０μｇ  ｐＭＩＲ４８と５μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の共同注入は、Ｌｕｃ＋活性の９３％の阻害に帰着する。
【０１２２】
２．  ｓｉＲＮＡによるルシフェラーゼ発現の阻害は生体内で肝臓に特異的な遺伝子である。
【０１２３】
２つのプラスミドが、実施例１に記述されるようにｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の有無に関係なく同時に注入された。第１のプラスミド（ｐＧＬ３コントロール（プロメガ社（マディソン）、ＷＩ））は、ｌｕｃ＋のコード化領域およびサルのウィルス４０のエンハンサーと初期プロモーター領域の転写制御下でキメラのイントロンを含む。第２のｐＲＬ−シミアンウイルス４０は、サルのウィルス４０  エンハンサーの転写制御下のレニラ・レニホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のルシフェラーゼのコード領域および初期のプロモーター領域を含む。
【０１２４】
０、０．５あるいは５．０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の実施例１に記述されるように、１０μｇ  ｐＧＬ３コントロールおよび１μｇ  ｐＲＬ−シミアンウイルス４０が注入された。注入の１日後に、実施例１に記述されるように、肝臓は収穫され均質化された。Ｌｕｃ＋およびレニラのＬｕｃ活性（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）は、デュアル・ルシフェラーゼ・リポーター分析システム（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社）を使用して分析された。Ｌｕｃ＋とレニラのＬｕｃ比率は標準化され、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋コントロールはない。ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋は、特に０．５μｇで共同注入されたｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋の目標Ｌｕｃ＋の７３％の発現を阻害し、５．０μｇの共同注入されたｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋ではその８２％を阻害した。
【０１２５】
３．  ｓｉＲＮＡによるルシフェラーゼ発現の阻害は遺伝子特異的であり、生体内の肝臓でｓｉＲＮＡに特異的である。
【０１２６】
５．０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋あるいは５．０μｇのコントロールｓｉＲＮＡ−ｏｒｉのいずれかの実施例１に記述されるように、１０μｇ  ｐＧＬ３コントロールおよび１μｇ  ｐＲＬ−シミアンウイルス４０が注入された。注入の１日後に、実施例１に記述されるように、肝臓は収穫され均質化された。Ｌｕｃ＋およびレニラの  Ｌｕｃ活性は、デュアル・ルシフェラーゼ・リポーター分析システム（プロメガ社）を使用して分析された。Ｌｕｃ＋とレニラの  Ｌｕｃ比率はｓｉＲＮＡ−ｏｒｉコントロールに標準化された。ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋は、ｓｉＲＮＡｓによってｓｉＲＮＡ−ｏｒｉ示す阻害と比較して、９３％で肝臓中のＬｕｃ＋発現を阻害したことは、この器官においてシーケンスに特異的である。
【０１２７】
４．  増加した圧力の血管内の注入によるｓｉＲＮＡの生体内伝達は、様々な器官の目標遺伝子発現の強い阻害に帰着する。
【０１２８】
１０μｇ  ｐＧＬ３コントロールおよび１μｇ  ｐＲＬ−シミアンウイルス４０が、実施例１でのようなプラスミドの骨格でシーケンスするために目標とされた、５μｇ  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋あるいは５μｇコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−ｏｒｉ）を共同注入された。注入の１日後に、器官は、収穫され均質化され、また、目標のホタル・ルシフェラーゼ＋活性およびコントロールのレニラのルシフェラーゼ活性のために抽出物が分析された。ホタル・ルシフェラーゼ＋活性は、動物間のトランスフェクション効率の差を補うためにそのレニラのルシフェラーゼ活性に標準化された。結果は、図１で示される。ホタル・ルシフェラーゼ＋活性の発現は、コントロールｓｉＲＮＡ−ｏｒｉを注入された動物と比較された肝臓（９５％の阻害）、脾臓（７７％）、肺（８１％）、心臓（７４％）、腎臓（８７％）および膵臓（９２％）で強く阻害された。コントロールｓｉＲＮＡ−ｏｒｉで単独で注入された同様のルシフェラーゼ活動を含まれていたプラスミドだけを注入された動物は、ｓｉＲＮＡだけの存在が生体内のプラスミドＤＮＡトランスフェクション効率（示されないデータ）に著しく影響しないことを示した。
【０１２９】
これらの結果（図１）は、生体内で多くの異なる組織へのｓｉＲＮＡの有効な伝達を示す。更に、コントロールのレニラのルシフェラーゼの発現がｓｉＲＮＡの存在によって影響されなかったという事実は、ｓｉＲＮＡがインターフェロン反応を引き起こしていないことを提示する。これは胚の後の哺乳類組織中の遺伝子発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの有効性の最初の実証で、遺伝子発現を阻害するためにこれらの器官にｓｉＲＮＡを伝達することができるかもしれないことを実証する。
【０１３０】
５．  ｓｉＲＮＡによるルシフェラーゼ発現の阻害は遺伝子特異的であり、胆管伝達の後に生体内で肝臓のｓｉＲＮＡに特異的である。
【０１３１】
５．０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋あるいは５．０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｏｒｉでの１０μｇ  ｐＧＬ３コントロールおよび１μｇ  ｐＲＬ−シミアンウイルス４０が、ハツカネズミの胆管に注入された。総量が１ｍｌのリンガーバッファーに６ｍｌ／分で伝達された。下位の大静脈は、注入前に肝臓の上下でクランプされ、クランプは注入後２分間そのままにされた。注入の１日後に、実施例１に記述されるように、肝臓は収穫され均質化された。Ｌｕｃ＋およびレニラの  Ｌｕｃ活性は、デュアル・ルシフェラーゼ・リポーター分析システム（プロメガ社）を使用して分析された。Ｌｕｃ＋とレニラの  Ｌｕｃ比率はｓｉＲＮＡ−ｏｒｉコントロールに標準化された。ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋は、コントロールｓｉＲＮＡ−ｏｒｉと比較して、８８％で肝臓中のＬｕｃ＋発現を阻害した。
【０１３２】
６．  ｓｉＲＮＡによるルシフェラーゼ発現の阻害は遺伝子特異的であり、動脈への伝達後に生体内の筋肉でｓｉＲＮＡに特異的である。
【０１３３】
５．０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋あるいは５．０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｏｒｉで１０μｇ  ｐＧＬ３コントロールおよび１μｇ  ｐＲＬ−シミアンウイルス４０が、増加した圧力下のネズミの回腸の動脈に注入された。特に、動物は麻酔をかけられ、外科手術の部分は剃られ、防腐薬で準備された。外科的処置の間に体温の低下を防ぐために、動物は電気座布団に置かれた。皮膚フラップが遠方に折り重ねられ、目標エリアを露出するためにクランプで保持された中線の腹部が切り開かれる。湿ったガーゼは内臓が過度に乾くことを防ぐために適用された。腸は回腸の静脈および動脈を視覚化するために移動された。微細管（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ）クリップは、足への血液の流出および流入を防ぐために、外部の回腸、尾部の上腹部、内部回腸、精管、臀部の動脈および静脈に配置された。流出エンハンサー溶液（例えば３ｍｌの食塩水中の０．５ｍｇのパパベリン）は、１−１０分後に溶液（１０ｍｌの食塩水中の）を含んでいるプラスミドＤＮＡおよびｓｉＲＮＡが後続して、外部の回腸の動脈に２５ｇの針により注入された。その溶液はおよそ１０秒で注入された。注入および出血が圧力およびゲル泡で制御された２分後、微細管クリップは取り外された。腹筋および皮膚は４−０のデクソン縫合で閉じられた。
【０１３４】
注入の４日後に、ネズミは犠牲にされ、実施例１に記述されるように、大腿四頭筋と腓腹筋の筋肉は収穫され、均質化された。Ｌｕｃ＋およびレニラのＬｕｃ活性は、デュアル・ルシフェラーゼ・リポーター分析システム（プロメガ社）を使用して分析された。Ｌｕｃ＋とレニラのＬｕｃ比率はｓｉＲＮＡ−ｏｒｉコントロールに標準化された。ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋は、コントロールｓｉＲＮＡ−ｏｒｉと比較して、８５％および９２％で大腿四頭筋と腓腹筋中のＬｕｃ＋発現をそれぞれ阻害した。
【０１３５】
７．  ｓｉＲＮＡを生体内で使用するＳＥＡＰリポーター遺伝子発現のＲＮＡｉ。
【０１３６】
３’突出末端のデオキシヌクレオチドを備えた一本鎖で、ＳＥＡＰに特異的のセンスおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマーは、ＰＡＧＥによって調製されて精製された。各４０μＭ  である２つのオリゴマーは、５０ｍＭトリスＨＣｌ  、ｐＨ  ８．０および１００  ｍＭ  ＮａＣｌを含んでいる２５０のμｌバッファー中で２分間９４°Ｃによって加熱し、１分間９０°Ｃで冷却し、その後、毎分１°Ｃの割合で２０°Ｃで冷却することによってアニールした。生じたｓｉＲＮＡは、使用に先立ち−２０°Ｃで保存された。
【０１３７】
ＳＥＡＰリポーター遺伝子と同一のセンス・オリゴマーは下記のシーケンスを有し：
ＳＥＱ  ＩＤ番号：８  ５’―ｒＡｒＧｒＧｒＧｒＣｒＡｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＣｒＡｒＧｒＡｒＣｒＣｒＡｒＵＴＴ−３’（センス方向のＳＥＡＰリーディングフレームの位置３６２−３８０に相当する）。ヌクレオチドに先行する文字「ｒ」は、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す。ＳＥＡＰリポーター遺伝子に同一のアンチセンスのオリゴマーはシーケンスを持し：ＳＥＱ  ＩＤ番号：９  ５’―ｒＡｒＵｒＧｒＧｒＵｒＣｒＵｒＧｒＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＵＴＴ−３’（アンチセンスの方向のＳＥＡＰリーディングフレームの位置３６２−３８０に相当する）。ヌクレオチドに先行する文字「ｒ」は、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す。ＳＥＡＰをコード化するシーケンスを含むアニールされたオリゴマーはｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰと呼ばれる。
【０１３８】
人間のユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）  Ｃプロモーターおよびアポリポタンパク質Ｅ遺伝子クラスタの人間の肝臓の制御領域の転写制御下でＳＥＡＰコード領域を含んでいるプラスミドｐＭＩＲ１４１（１０μｇ）は、１−３ｍｌのリンゲル液（１４７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１．１３ｍＭ  ＣａＣｌ２）で希釈されて、０．５あるいは５μｇ  ｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰあるいは５μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｏｒｉと混合して、後部静脈に７−１２０秒以上で注入した。コントロールのハツカネズミは、さらにｐＭＩＲ１４１を単独で注入されたものを含んでいた。各マウスは注入の１日後に鼻腔の後道から出血した。細胞および凝固因子は血清を得るために血液からペレット（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）された。その後、血清はトロピックスフォスファライトキット（Ｔｒｏｐｉｘ  Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ  ｋｉｔ）を使用して、化学発光分析によってＳＥＡＰの存在が評価された。結果は、０．５μｇ  ｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰが伝達された場合、ＳＥＡＰ発現が５９％で阻害されたことを示し、５．０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰが伝達された場合、８３％で阻害された。ｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰによるＳＥＡＰ発現の減少が遺伝子特異的であることを示して、５．０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ｏｒｉが伝達された場合、ＳＥＡＰ発現の減少は観察されなかった。
【０１３９】
表１．ＳＥＡＰ発現プラスミドおよびｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰの尾の静脈注入による生体内で続く伝達のＳＥＡＰ発現の阻害
【０１４０】
【表１】
2005519976.tif 000003
８．  ｓｉＲＮＡを使用する遺伝子組換えのハツカネズミ中の緑の蛍光性タンパク質の阻害。
市販されて利用可能なマウス種Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）１０ｓｂ（ジャクソン研究所）は、赤血球と毛髪以外のすべての細胞の種類で増強された緑の蛍光性タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するために報告された２４。これらのハツカネズミは、ＥＧＦＰ（ｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰ）に対して目標とされたｓｉＲＮＡあるいは血管内の注入方法が以前に記述した増加した圧力後部静脈を使用するコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−コントロール）を注入された。注入の３０時間後、動物は犠牲にされ、肝臓のセクションは蛍光顕微鏡使用のために調製された。５０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰを注入された動物からの肝臓セクションは、注入されたｓｉＲＮＡ−コントロールか模擬物を注入された動物と比較して、ＥＧＦＰを発現する細胞数の本質的な減少を表示した（図２）。ここに示されたデータは、肝臓へのｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰの有効な伝達を実証する。その後、伝達されたｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰは、ハツカネズミのＥＧＦＰ遺伝子発現を阻害した。したがって、我々は、ｓｉＲＮＡの能力が哺乳動物誕生後の内部成長的な遺伝子産物の発現を阻害することを示した。
【０１４１】
９．  ｓｉＲＮＡの生体内伝達後の内部成長的なマウスの細胞質ゾルのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）発現の阻害。
【０１４２】
３’突出末端のデオキシヌクレオチドを備えた一本鎖の胞質ゾルのアラニンアミノトランスフェラーゼに特異的なセンスおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマーは、ＰＡＧＥによって調製され精製された。各４０μＭ  である２つのオリゴマーは、５０ｍＭトリスＨＣｌ  、ｐＨ  ８．０および１００  ｍＭ  ＮａＣｌを含んでいる２５０のμｌバッファー中で２分間９４°Ｃによって加熱し、１分間９０°Ｃで冷却し、その後、毎分１°Ｃの割合で２０°Ｃで冷却することによってアニールした。生じたｓｉＲＮＡは、使用に先立ち−２０°Ｃで保存された。
細胞質ゾルのアラニンアミノトランスフェラーゼをコード化する内部成長的なマウスおよびネズミ遺伝子と同一のセンス・オリゴマーは、下記のシーケンスを有し：ＳＥＱ  ＩＤ番号：１０  ５’―ｒＣｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＣｒＵｒＣｒＵｒＡｒＡｒＧｒＧｒＧｒＣｒＵＴＴ−３’（センス方向で細胞質ゾルのアラニンアミノトランスフェラーゼのリーディングフレームの位置９２８−９４６に相当する）。ヌクレオチドに先行する文字「ｒ」は、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す。細胞質ゾルのアラニンアミノトランスフェラーゼをコード化する内部成長的なマウスおよびネズミ遺伝子と同一なセンス・オリゴマーは、下記のシーケンスを有し：ＳＥＱ  ＩＤ番号：１１  ５’―ｒＡｒＧｒＣｒＣｒＣｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＡｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＧＴＴ−３’（アンチセンスの方向で細胞質ゾルのアラニンアミノトランスフェラーゼのリーディングフレームの位置９２８−９４６に相当する）。ヌクレオチドに先行する文字「ｒ」は、ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す。細胞質ゾルのアラニンアミノトランスフェラーゼをコード化するシーケンスを含んでいるアニールされたオリゴマーは、ｓｉＲＮＡ−ＡＬＴ  と呼ばれる。
【０１４３】
ハツカネズミは、１−３ｍｌのリンゲル液（１４７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１．１３ｍＭ  ＣａＣｌ２）で希釈された、４０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ＡＬＴで７−１２０秒以上において後部静脈に注入された。コントロール・ハツカネズミはｓｉＲＮＡのないリンゲル液を注入された。注入の２日後に、肝臓は０．２５Ｍのスクロースで収穫され均質化された。ＡＬＴ活性は、試薬メーカーのインストラクションにより、シグマ・ダイアグノスティック社のインフィニティエーエルティー（ＩＮＦＩＮＩＴＹ  ＡＬＴ）試薬を使用して分析された。総タンパク質は、バイオラッドプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）を使用して決定された。４０μｇ  ｓｉＲＮＡ−ＡＬＴを注入されたハツカネズミは、リンゲル液を単独で注入されたハツカネズミと比較して、３２％のＡＬＴの特異的な活性で平均の減少を示した。
【０１４４】
１０．  ｓｉＲＮＡによる培養中の哺乳類細胞においてウィルスで発現されたルシフェラーゼの発現の阻害。
【０１４５】
培養中のヒーラ細胞は、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）のエンハンサー／プロモーター（Ａｄ２ＰＧＫルシフェラーゼ）の制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含んでいるアデノウイルスで最初に感染された。Ａｄ２ＰＧＫルシフェラーゼを備えたヒーラ細胞の感染は、この細胞株でルシフェラーゼの発現に帰着した。感染後、ルシフェラーゼをコード化する領域に目標とするｓｉＲＮＡあるいはコントロールｓｉＲＮＡｓは、細胞に伝達され、ルシフェラーゼ活性量は２４時間後に決定された。
【０１４６】
ヒーラ細胞は、Ｔ２５フラスコで１０％の胎児の牛の血清（ＦＢＳ）で補われたダルベコの修正済のイーグルの媒体（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）  （ＤＭＥＭ）で５０％の集合で植え付けされ、また５％のＣＯ２の加湿インキュベータで３７℃においてインキュベートされた。１６時間後、細胞はＰＢＳで洗浄され、１３ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳでトリプシンにし、収穫し、再懸濁された。５００μｌの細胞の懸濁は、２４枚のウェルプレートに各々に分配された。１６時間のインキュベーションの後に、各ウェルの媒体は、５μｌ  Ａｄ２ＰＧＫルシフェラーゼ（２．５ｘ１０１０粒子／ｍｌストック）を含んでいる、１００μｌ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳと置き換えられた。２時間のインキュベーション後に、４００μｌ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳが、トランスアイティー・ティーケイオー（ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ）（ミラス社）でコンプレックスされたｓｉＲＮＡの添加を後に続けて、各ウェルに加えられた。ｓｉＲＮＡコンプレックスの調製において、７．５μｇ  ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯが５０μｌの血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈され、５分間室温でインキュベートされた。ｓｉＲＮＡは、ウェルごとに０、１、１０あるいは１００ｎＭ  のｓｉＲＮＡの最終濃度を与えるために加えられ、室温で５分間インキュベートされた。その後、コンプレックスは、ウェルに直接加えられた。ルシフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ＋遺伝子あるいは無関係な遺伝子産物のいずれかに目標とするＳｉＲＮＡｓが使用された（ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋、ｓｉＲＮＡ−ｃのそれぞれ）。ｓｉＲＮＡ−ＬｕｃだけがＡｄ２ＰＧＫルシファラーゼと同一のシーケンスを含んでいた。すべての分析ポイントは、複製ウェルで実行された。
【０１４７】
ｓｉＲＮＡ伝達の２４時間後に、細胞は溶解され、ルシフェラーゼ活性が分析された。結果は、ルシフェラーゼ活性が（１ｎＭ  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃで３５％阻害され、１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃで５３％阻害されたことを示す（表２）。阻害は、ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃに関する３つの塩基対の誤った組合せを含むｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋またはｓｉＲＮＡ−ｃのいずれかの使用では観察されなかった。これらの結果は、ウィルスでコード化された遺伝子の発現を阻害するようにｓｉＲＮＡを使用することができることを実証する。さらに、ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋がルシフェラーゼ発現を阻害することができなかったという事実は、ｓｉＲＮＡを媒介としたＲＮＡｉがシーケンスに対する高い特異性を示すことを実証する。この実施例は、シーケンスに特異的な手法でウィルスの遺伝子産物の発現を阻害するようにｓｉＲＮＡを使用することができるという原理の証拠を提供する。
【０１４８】
表２．ヒーラ細胞中のウィルスでコード化されたルシフェラーゼのＳｉＲＮＡを媒介としたＲＮＡ干渉。
【０１４９】
【表２】
2005519976.tif 000004
１１．  哺乳類のヒーラ細胞へのｓｉＲＮＡおよびモルホリノのアンチセンスのオリゴヌクレオチドの同時伝達。
【０１５０】
ヒーラ細胞は１０％胎児の牛の血清で補われたダルベコの修正済のイーグル媒体で維持された。すべての培養は、３７°Ｃで５％のＣＯ２を含んでいる、加湿大気で維持された。トランスフェクションのおよそ２４時間前に、細胞は、Ｔ７５フラスコ中で適切な密度でプレートされ、オーバーナイトでインキュベートされた。５０％の集合では、細胞は、メーカーの推薦（ミラス社、マディソン、ウィスコンシン）によるトランスアイティー・エルティーワン（ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１）トランスフェクション試薬を使用して、ｐＧＬ３コントロール（ホタル・ルシフェラーゼ、プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン）およびｐＲＬ−シミアンウイルス４０（シーパンジー・ルシフェラーゼ、プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン）で最初に感染された。１５μｇ  ｐＧＬ３コントロールおよび５０ナノグラムのｐＲＬ−シミアンウイルス４０が、５００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および４５μｌ  ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１に加えられ、室温で５分間インキュベートされた。その後、ＤＮＡコンプレックスは、Ｔ７５フラスコに加えられ、３７°Ｃで、２時間インキュベートされた。細胞はＰＢＳで洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡで収穫され、媒体で懸濁され、２５０μｌ  ＤＭＥＭ＋１０％の血清を２４ウェルプレートへプレートし、３７°Ｃで２時間インキュベートされた。２時間のインキュベート後、４００μｌ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳが、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（ミラス社）でコンプレックスされたｓｉＲＮＡの添加を後に続けて、各ウェルに添加された。ｓｉＲＮＡおよびモルホリノを含むコンプレックスの調製において、２μｌ  ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯが５０μｌの血清なしのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈され、また５分間室温でインキュベートされた。ｓｉＲＮＡは、ウェルごとに０、０．１、あるいは１０ｎＭ  のｓｉＲＮＡの終濃度を与えるため、およびウェルごとに０、１０、１００あるいは１０００ｎＭ  のモルホリノの終濃度を与えるために加えられ、室温で５分間インキュベートされた。その後、コンプレックスは、ウェルに直接加えられた。すべての分析ポイントは、複製ウェルで実行された。
【０１５１】
ｐＧＬ３コントロール・プラスミドは、サルのウィルス４０  エンハンサーの転写制御下でホタルｌｕｃ＋のコード領域および初期のプロモーター領域を含む。ｐＲＬ−シミアンウイルス４０プラスミドは、サルのウィルス４０エンハンサーの転写制御下のレニラ・レニホルミス、シーパンジー、ルシフェラーゼのコード領域および初期のプロモーター領域を含む。
【０１５２】
この実施例で使用されるモルホリノのアンチセンスの分子およびｓｉＲＮＡｓは下記のようであり：
モルホリノ−Ｌｕｃ（ジーンツール（ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ）フィロマス、ＯＲ）、ＳＥＱ  ＩＤ番号：１  ５’ＴＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴ−３’（ｐＧＬ３コントロール・ベクターのＬｕｃ＋の−３〜＋２２）は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためにＬｕｃ＋スタート・コドンを囲む領域に塩基対が設計された。アンチセンスの方向のスタート・コドンのシーケンスに下線を引く。
【０１５３】
標準のコントロールのモルホリノ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０  ５’（ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ）  ３’は、Ｌｕｃ＋シーケンスあるいはｐＧＬ３コントロール・ベクター他のシーケンスと同一の著しいシーケンスを含まない。
【０１５４】
ＧＬ３  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋（  Ｌｕｃ＋をコード化するシーケンスのヌクレオチド１５５−１７３）：ＳＥＱ  ＩＤ番号：４  ５’ｒＣｒＵｒＵｒＡｒＣｒＧｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＧｒＡｄＴｄＴ’３、
ＳＥＱ  ＩＤ  番号：５  ３’ｄＴｄＴｒＧｒＡｒＡｒＵｒＧｒＣｒＧｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＣｒＵ’５。
【０１５５】
３’突出末端のデオキシヌクレオチドの一本鎖の遺伝子に特異的なセンスおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマーは、ＰＡＧＥ（ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ラファイエットＬａＦａｙｅｔｔｅ）、ＣＯ）によって調製され精製された。各４０μＭ  である２本の相補的なオリゴヌクレオチドは、５０ｍＭトリスＨＣｌ  、ｐＨ  ８．０および１００  ｍＭ  ＮａＣｌを含んでいる２５０のμｌバッファー中で２分間９４°Ｃによって加熱し、１分間９０°Ｃで冷却し、その後、毎分１°Ｃの割合で２０°Ｃで冷却することによってアニールした。生じたｓｉＲＮＡは、使用に先立ち−２０°Ｃで保存された。
【０１５６】
カチオンのトランスフェクション試薬、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（ミラス社）を使用して、培養細胞にモルホリノを伝達するために、モルホリノは相補シーケンスのＤＮＡオリゴヌクレオチドに最初にアニールされた。ＤＮＡストランドのシーケンスは下記のようであり：ＳＥＱ  ＩＤ番号：２  ５’−ＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＴ−３’である。各０．５ｍＭ  であるモルホリノおよび相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドは、５ｍＭＨｅｐｅｓ  、ｐＨ  ８バッファーで２分間９４°Ｃによって加熱し、１分間９０°Ｃで冷却し、その後、毎分１°Ｃの割合で２０°Ｃで冷却することによってアニールした。生じたモルホリノ／ＤＮＡコンプレックスは、使用に先立って−２０°Ｃで保存された。
【０１５７】
細胞は２４時間後に収穫され、プロメガ・デュアル・ルシフェラーゼ・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｋｉｔ）（プロメガ社）を使用して、ルシフェラーゼ活性を分析した。ルマトエルビー（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ）  ９５０７（ＥＧ＆Ｇ  ベルトホルド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）、バッド・ワイルドバッド（Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ）、ドイツ）照度計が使用された。ルシフェラーゼの発現量は、相対的な光の単位で記録された。その後、数値はコントロールのシーパンジー・ルシフェラーゼ発現のために調節され、ｓｉＲＮＡが存在しない状態でのホタル・ルシフェラーゼ表現のパーセンテージとして発現された（図３）。数値は、細胞の少なくとも２つの別個のウェルの平均である。
【０１５８】
これらのデータは、ｓｉＲＮＡとモルホリノが同時伝達される場合に、阻害の程度がｓｉＲＮＡあるいはモルホリノのいずれかの伝達におけるよりも単独で大きいことを実証する。
【０１５９】
１２．  生体内でアンチセンスのモルホリノおよびｓｉＲＮＡの肝臓への同時伝達によるルシフェラーゼ発現の阻害。
【０１６０】
この実施例で使用されるモルホリノのアンチセンスの分子およびｓｉＲＮＡｓは、ＤＬ９４  モルホリノ（ジーンツール、フィロマス、ＯＲ）、ＳＥＱ  ＩＤ  番号：１  ５’−ＴＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴ−３’（ｐＧＬ３コントロール・ベクターのＬｕｃ＋−３〜＋２２）であり、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためにＬｕｃ＋スタート・コドンを囲む領域に塩基対が設計された。アンチセンス方向のスタート・コドンのシーケンスに下線を引く。
【０１６１】
標準のコントロールのモルホリノ（ＳＥＱ  ＩＤ  番号）：３  ５’（ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ）  ３’は、Ｌｕｃ＋シーケンスあるいはｐＧＬ３コントロール・ベクターの他のシーケンスと同一性が著しいシーケンスを含んでいない。
【０１６２】
ＧＬ３  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋（  Ｌｕｃ＋をコード化するシーケンスのヌクレオチド１５５−１７３）：ＳＥＱ  ＩＤ番号：４  ５’ｒＣｒＵｒＵｒＡｒＣｒＧｒＣｒＵｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＧｒＡｄＴｄＴ’３、
ＳＥＱ  ＩＤ番号：５  ３’ｄＴｄＴｒＧｒＡｒＡｒＵｒＧｒＣｒＧｒＡｒＣｒＵｒＣｒＡｒＵｒＧｒＡｒＡｒＧｒＣｒＵ’５、
ＤＬ８８：ＤＬ８８Ｃ  ｓｉＲＮＡ（目標ＥＧＦＰ  ４７７−４９５（ｎｔ７６５−７８３））：
ＳＥＱ  ＩＤ番号：１２  ５’ｒＧｒＡｒＡｒＣｒＧｒＧｒＣｒＡｒＵｒＣｒＡｒＡｒＧｒＧｒＵｒＧｒＡｒＡｒＣｄＴｄＴ’３、
ＳＥＱ  ＩＤ番号：１３  ３’ｄＴｄＴｒＣｒＵｒＵｒＧｒＣｒＣｒＣｒＵｒＡｒＧｒＵｒＵｒＣｒＣｒＡｒＣｒＵｒＵｒＧ’５。
【０１６３】
１−３ｍｌのリンゲル液（１４７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１．１３ｍＭ  ＣａＣｌ２）中の２つのプラスミドＤＮＡ±ｓｉＲＮＡおよび±のアンチセンスのモルホリノが、７−１２０秒でハツカネズミの尾部静脈に注入された。プラスミドは、サルのウィルス４０エンハンサーの転写制御下のｌｕｃ＋をコード化する領域および初期のプロモーター領域をコード化する領域を含んでいるｐＧＬ３コントロールで、またサルのウィルス４０エンハンサーの転写制御下のレニラ・レニホルミスのルシフェラーゼのコード領域および初期のプロモーター領域を含むｐＲＬ−シミアンウイルス４０であった。２μｇ  ｐＧＬ３コントロールおよび０．２μｇ  ｐＲＬ−シミアンウイルス４０が、５．０μｇ  ｓｉＲＮＡの有無に関わらず、５０μｇ  ＤＬ９４モルホリノの有無に関わらずに注入された。注入の１日後に、肝臓は溶解バッファー（０．１％のトリトンＸ−１００、０．１Ｍ  Ｋ−リン酸塩、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ  ７．８）中で収穫され均質化された。不溶解な物質は、遠心分離によって溶解された。ホモジェネートは溶解バッファーで１０倍に希釈され、５μｌがデュアル・ルシフェラーゼ・リポーター分析システム（プロメガ社）を使用して、Ｌｕｃ＋およびレニラのルシフェラーゼ活性が分析された。Ｌｕｃ＋とレニラのＬｕｃ比率は、０μｇ  ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋コントロールに標準化された。
【０１６４】
表３．５０μｇのアンチセンスのモルホリノもしくは５μｇ  ｓｉＲＮＡまたは両方の伝達後のマウス肝臓中のｐＧＬ３コントロール・プラスミドからのルシフェラーゼ発現の阻害
【０１６５】
【表３】
2005519976.tif 000005
アンチセンスのモルホリノがｓｉＲＮＡと共に伝達される場合、これらの実験は、生体内で遺伝子発現のほぼ完全な阻害を実証する。このレベルは、阻害がｓｉＲＮＡのいずれかのモルホリノにおける阻害より個々に大きかった場合である。
【０１６６】
１３．  「再電荷された」コンプレックスを使用する遺伝子発現は、ポリアニオンのタイプに依存する。
【０１６７】
ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物に強いポリアニオンを加えることによるトランスフェクションの増強は、血清の有無の両方の状態で観察された。ＤＮＡ／ＰＥＩのコンプレックスは、生体外と生体内の研究のそれぞれで０．０２ｍｇ／ｍｌおよび０．２ｍｇ／ｍｌのＤＮＡの終濃度で形成された。すべてのコンプレックスは、バッファーを用いた等張のグルコース溶液（ＢＩＧＳ；  ５％のグルコース、ｌ０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．５）で形成された。コンプレックスは、５−５０μｌのＤＮＡアリコート、ＰＥＩおよびそれらの対応するストック溶液の連続する添加によって１．５ｍｌのマイクロフュージチューブ中で形成された。すべてのポリイオンのストック溶液は、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．５に溶解されたｐＤＮＡを除いてＢＩＧＳで調製された。チューブは、各構成成分の追加において３０秒間遠心分離された。人間の肝細胞性の癌ＨｕＨ７細胞は、１０％の胎児の子牛血清で補われたＤＭＥＭ媒体で維持された。培養は、３７°Ｃで５％のＣＯ２を含んでいる、加湿大気で成長した。細胞は、トランスフェクションの２４時間前に４０〜６０％の集合で６ウェルプレートに植え付けられた。コンプレックスの適用前に、細胞は、２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ媒体（ライフ・テクノロジーズインク）において、すでに洗浄された。ＢＩＧＳで形成されたＤＮＡコンプレックス（２μｇ／ウェル）は、２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭの媒体あるいは１００％の牛の血清のいずれかに細胞が加えられ、３７°Ｃにおいて４時間でインキュベートされた。その後、ＤＮＡを含んでいる媒体は、１０％のＦＢＳで補われた新鮮なＤＭＥＭと置き換えられた。リポーター遺伝子発現の分析のために処理される前に、細胞はさらに４８時間成長させた。
【０１６８】
これらのデータ（図４）は、三次元のコンプレックスに存在する場合、ポリアニオンが細胞内部のポリカチオンからのＤＮＡ放出を増強できることを示す２１。さらに、ポリアニオンは、血清タンパク質を備えたＤＮＡ／ポリカチオンのコンプレックスのオプソニン作用を防ぐことができる。正に帯電したＤＮＡ／ポリカチオンコンプレックスが、血清タンパク質（主要な血清アルブミン）との相互作用で強烈にオプソニン作用することが知られている。そのようなオプソニン作用の性質は、主に静電気であると考えられる２５。そのようなオプソニン作用がＤＮＡ／ｂｒＰＥＩのコンプレックスのトランスジーン活性を著しく阻害することが同時に分かった１９、２６。より重要な効果は、血清が存在する状態で観察された。
【０１６９】
１４．  再電荷されたＤＮＡコンプレックスを使用する系統遺伝子の転移
ＤＮＡ／ポリカチオンのコンプレックスへの高電荷密度のポリアニオンの添加は、生体外と生体内でそれらの遺伝子転移活性を強めることができる。ポリアクリル酸で再電荷されたＤＮＡ／ＰＥＩのコンプレックスは、ルシフェラーゼをコード化するベクターを使用して、ハツカネズミの尾部静脈注入で試験された。これらのコンプレックスを注入する場合のトランスジーン発現の主な解剖学的な部位は肺であると分かった。線形および枝分かれＰＥＩ（ｌＰＥＩおよびｂｒＰＥＩのそれぞれ）の両方は、プラスミドＤＮＡを圧縮するためにポリカチオンとして使用された。しかしながら、ＰＥＩは動物に注入された時有毒であると知られている。したがって、ＤＮＡ／ＰＥＩのコンプレックスは、ポリアクリル酸（ｐＡＡ）で再電荷された。毒性実験では、５０μｇ  ｐＣＩＬｕｃが、５％のグルコース溶液において１００μｇ  ｂｒＰＥＩで圧縮された。その後、ＤＮＡ／ＰＥＩのコンプレックスは、総量が２５０μｌである、ｐＡＡの変化する量の追加によって再電荷された。ＤＮＡ／ｂｒＰＥＩ／ｐＡＡのコンプレックスの毒性は、システム（／＋比率（表４））に加えられたｐＡＡの量に依存することが判明した。
【０１７０】
表４．ポリカチオン／ポリアニオンの総比率に依存するＤＮＡ／ｂｒＰＥＩ／ｐＡＡ調製の毒性。ＤＮＡ（ｐＣＩＬｕｃ、５０μｇ／動物（１つのグループ当たり３−７匹の動物））は、ｂｒＰＥＩの１００μｇでコンプレックスされ、５％のグルコース溶液でｐＡＡ量を増加する。生存は、ＤＮＡ注入の２４時間後での犠牲の時間前に登録された。
【０１７１】
【表４】
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肺への遺伝子の転移効率は、１：１  ｗ／ｗ  ＤＮＡ／ｐＡＡ比率で最適であることが分かった。発現の決定のために、ＤＮＡ／ｌＰＥＩ／ｐＡＡのコンプレックスが遺伝子転移においてより効率的で、ＤＮＡ／ｂｒＰＥＩ／ｐＡＡのコンプレックス（図５）と比較して、著しいほど有毒ではなかったので、ＩＰＥＩはプラスミドＤＮＡを圧縮するために使用された。コンプレックスは、５０μｇ  ｐＣＩＬｕｃおよび２００μｇ  ｌＰＥＩで、上に記載のように調製され、また５％（等張）のグルコースでｐＡＡのレベルを変化する。
【０１７２】
すべての実験動物（再電荷されたコンプレックスを備えた）は、より低い毒性がｂｒＰＥＩベースのコンプレックスと比較されることを示して、２４時間の実験において生き残った。遺伝子転移データは、ｐＡＡ量に依存する特有の鐘（最適）の形状を実証し、生体外で見られたパターンに同様に添加された（データは示されない）。さらに、肺で抽出されたタンパク質の１ｍｇ当たり、６ナノグラムのルシフェラーゼあるいは１．２のｘ  １０８  ＲＬＵを生成して、ピーク遺伝子転移活性はより高かった。再電荷されないＤＮＡ／ｌＰＥＩのコンプレックスの同様の注入においての利用可能な公表されたデータは、それぞれ２ナノグラム／ｍｇ（ｐＣＭＶｌｕｃ）の［１３］および３ｘ  １０７  ＲＬＵ／ｍｇ（ｐＣＩＬｕｃ）［１１］であった。ｐＡＡで再電荷することは、再電荷せずに、公表された結果に関する遺伝子転移を強めた。この実験に、再電荷されたコンプレックスと再電荷されなかったコンプレックスとの間のトランスジーン発現の差異の度合いを越えるものがさらにあった。この実験は、２００／５０（ｗ／ｗ）のｌＰＥＩ／ＤＮＡ比率あるいは３０の窒素とリン酸塩（Ｎ／Ｐ）の比率で実行された。再電荷されないＤＮＡ／ｌＰＥＩのコンプレックスでの事前の働きは、単に１０以上のＮ／Ｐ比率で毒性を増加させたことを注意する。したがった、ｐＡＡを備えたコンプレックスに再電荷することは、毒性を増加させずに、より高いＮ／Ｐ比率の使用を可能にした。ポリアニオンで再電荷することも、肺遺伝子転移および系統の毒性（示されないデータ）に対する同様の影響を備えたＤＮＡ／カチオンの脂質のコンプレックスのために行われるかもしれない。
【０１７３】
１５．  ｐＡＡの第２の注入は、再電荷されたＤＮＡのコンプレックスの毒性をさらに減少することを支援する。
【０１７４】
ＤＮＡ／ｌＰＥＩ／ｐＡＡの再電荷されたコンプレックスを体系的に注入された動物中の肺および肝臓組織の病理学的な予備データは、そのようなコンプレックスが、いくつかの内部毒性を未だに示すことを明らかにした（図６）。この毒性を減少する試みにおいて、さらに我々は、内部毒性（実験の設計および方法を参照）の指標として肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血液レベルをモニターする間にポリアクリル酸（１．５ｍｇ／動物；  ＤＮＡコンプレックスの注入後３０分）の第二の「追撃者」の注入を実行した。さらに、ルシフェラーゼ発現も測定された。図６で明白に示されたデータは、相当なほどに肺でのトランスジーン発現のレベルを減少させない間に再電荷されたＤＮＡ調製の系統的な毒性を減少するために第二の「追撃者」のポリアニオンの注入が支援することが実証する。
【０１７５】
１６．  再電荷された粒子を使用するｓｉＲＮＡの生体内伝達後の肺でのルシフェラーゼ発現の阻害。
【０１７６】
再電荷された粒子は、ルシフェラーゼ＋ｍＲＮＡに対して目標とされたｓｉＲＮＡあるいは肺へのコントロールｓｉＲＮＡと同様にリポーター遺伝子ルシフェラーゼ＋およびレニラのｌｕｃも伝達するために形成された。この実験では、リポーター遺伝子を含んでいる粒子がｓｉＲＮＡｓを含んでいる粒子の伝達を後に続けて、最初に伝達された。すべての場合に、粒子は、ポリカチオンの線形のポリエチレンイミン（ｌＰＥＩ）およびポリアニオンポリアクリル酸（ｐＡＡ）で調製された。リポーター遺伝子の伝達については、ｌｕｃ＋およびレニラｌｕｃ発現プラスミドの混合物を含む粒子が調製された。２つのルシフェラーゼ遺伝子の発現の正常化は動物間のプラスミド伝達効率を変化するために修正する。ルシフェラーゼ＋遺伝子およびレニラのルシフェラーゼ遺伝子を含んでいる発現プラスミドの混合物を含んでいる粒子は、血管内で注入された。ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋あるいはコントロールｓｉＲＮＡを含んでいる粒子はプラスミドを含んでいる粒子の注入された血管内で、直ちに続いて注入された。２４時間後に、肺は収穫され、Ｌｕｃ＋およびレニラのＬｕｃ活性の両方においてホモジェネートが分析された。
【０１７７】
特定の実験の詳細は以下のとおりである：プラスミドを含んでいる粒子は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．５／５％グルコースの中の３００μｇ  ｌＰＥＩと４５μｇ  ｐＧＬ３コントロール（Ｌｕｃ＋）および５μｇ  ｐＲＬ−シミアンウイルス４０（レニラのＬｕｃ）を混合することにより調製された。３０秒間遠心分離した後、５０μｇ  ｐＡＡが加えられ、また、溶液は３０秒間遠心分離された。２００μｇ  ｌＰＥＩおよび２５μｇ  ｐＡＡと共に２５μｇ  ｓｉＲＮＡが使用されたこと以外のｓｉＲＮＡを含んでいる粒子は、同様に調製された。プラスミドＤＮＡ（総量２５０μｌ）を含んでいる粒子は、ＩＣＲハツカネズミの尾部静脈に注入された。ｓｉＲＮＡを受け取った動物では、ｓｉＲＮＡ（総量１００μｌ）を含んでいる粒子が、プラスミドＤＮＡを含んでいる粒子の注入直後に尾部静脈に注入された。その後、１００μｌ中の１．５ｍｇのｐＡＡは、３０分後に数多の動物の尾部静脈に注入された。２４時間後に、動物は犠牲にされ、肺は収穫され、均質化された。ホモジェネートは、デュアル・ルシフェラーゼ分析キット（プロメガ社）を使用して、Ｌｕｃ＋およびレニラのＬｕｃ活性のために分析された。
【０１７８】
プラスミドｐＧＬ３コントロールおよびｐＲＬ−シミアンウイルス４０を含む粒子の血管内の注入は、肺組織中のＬｕｃ＋およびレニラのＬｕｃ発現に帰着することを結果は示す（表２）。プラスミドを含んでいる粒子の注入の後にｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋を含んでいる粒子の注入は、Ｌｕｃ＋発現の特定の阻害に帰着した。レニラのＬｕｃ発現は阻害されなかった。無関係な遺伝子産物に対して目標とされて、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−ｃ）を含んでいる粒子の注入は、Ｌｕｃ＋発現に対するｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋の影響が特定のシーケンスで、ｓｉＲＮＡ粒子それ自身の注入が、一般に伝達されたプラスミド遺伝子の伝達あるいは発現を阻害しないことを実証して、Ｌｕｃ＋あるいはレニラのＬｕｃ活性のいずれかの阻害に帰着しなかった。これらの結果は、ｓｉＲＮＡを含んでいるｌＰＥＩおよびｐＡＡが形成された粒子が肺にｓｉＲＮＡを伝達することができ、ｓｉＲＮＡカーゴは、一旦肺細胞の内部では生物学的に有効であることを実証する。
【０１７９】
表５．再電荷された粒子を使用する肺へのｓｉＲＮＡの伝達は目標遺伝子発現の阻害に帰着する
【０１８０】
【表５】
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１７．  生体内のＴｒａｎｓＩＴ  （登録商標）Ｉｎ  Ｖｉｖｏを使用するマウス肝臓細胞へのｓｉＲＮＡの生体内の伝達。
【０１８１】
１０μｇ  ｐＧＬ３コントロールおよび１μｇ  ｐＲＬ−シミアンウイルス４０が、メーカー推薦（ミラス社、マディソン、ウィスコンシン）による総量２．５ｍｌにおいて１１μｌ  ＴｒａｎｓＩＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏでコンプレックスされた。ｓｉＲＮＡ伝達において、１０μｇ  ｐＧＬ３コントロール、１μｇ  ｐＲＬ−シミアンウイルス４０および５μｇｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ＋あるいは５μｇコントロールｓｉＲＮＡのいずれかが総量２．５ｍｌにおいて１１μｌ  ＴｒａｎｓＩＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏでコンプレックスされた。粒子は、実施例１に記述されるように２５−３０ｇのＩＣＲハツカネズミの後部静脈に７秒より長く注入された。注入後１日で、実施例１に記述されるように、肝臓は収穫され均質化された。Ｌｕｃ＋およびレニラのＬｕｃ活性は、デュアル・ルシフェラーゼ・リポーター分析システム（プロメガ社）を使用して分析された。Ｌｕｃ＋とレニラのＬｕｃ比率は、ｓｉＲＮＡコントロールがない状態に対して標準化された。ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋は、特に９６％の目標のＬｕｃ＋発現を阻害した（表６）。
【０１８２】
表６．ＴｒａｎｓＩＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏを使用するマウス肝臓へのｓｉＲＮＡの伝達は、目標遺伝子発現の阻害に帰着する
【０１８３】
【表６】
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これらのデータは、ＴｒａｎｓＩＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏの適応力のあるポリマー・トランスフェクション試薬は有効に生体内でｓｉＲＮＡを伝達することを示す。
【０１８４】
１８．  ハツカネズミでの牛痘ウィルスの阻害
天然痘感染におけるモデルとして、ｓｉＲＮＡ伝達によるハツカネズミでの弱毒化した牛痘ウィルス感染に対する能力が決定された。５匹のハツカネズミ（４−６週経過のＣ５７Ｂｌ種）のグループは、イソフラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）麻酔の下で、牛痘ウィルス（アンカラ種（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９４８４８））の１０４−１０６  ｐｆｕを含んでいる４０μｌの総量において、マイクロピペットで各鼻孔へ、ＰＢＳ中の２０μｌウィルスのインストレーションによって接種を受けた。５μｇ  Ｅ９Ｌ  ＤＮＡポリメラーゼｓｉＲＮＡシーケンス３５１：ＳＥＱ  ＩＤ番号：１４  ５’ｒＣｒＧｒＧｒＧｒＡｒＵｒＡｒＵｒＣｒＵｒＣｒＣｒＡｒＧｒＡｒＣｒＧｒＧｒＡｄＴｄＴ’３、および
ＳＥＱ  ＩＤ  番号：１５  ３’ｄＴｄＴｒＧｒＣｒＣｒＣｒＵｒＡｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＧｒＵｒＣｒＵｒＧｒＣｒＣｒＵ’５は上に記述されるようなハツカネズミの尾部静脈への注入によってウィルス感染に関する数多のタイムポイント（４時間前、同時、４時間後、２４時間後、４８時間後）の１ポイントで伝達された。感染後の１、２、４および７日で、ハツカネズミが犠牲にされて、組織セクションが収集され、また、ウィルスのロード（ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ）は肺、肝臓、脾臓、脳および骨髄で決定された。ウィルスの病原性は、感染した組織の組織学、感染した組織中のウィルスの滴定濃度の測定およびマウス生存率によって評価された。ＯＣＴ組織−Ｔｅｋに埋め込まれていた組織サンプルは、液体窒素において冷凍にした。また、１０μｍ凍結セクションが２％のホルムアルデヒドに固定された。０．１％のトリトンＸ１００での透過に続いて、セクションはブロックされて、細胞表面マーカーあるいはウィルスの抗原に対して導かれた抗体で染色された。ＣＤ４３に対する抗体は、浸透するリンパ細胞を検知するために、炎症およびウィルスの病原性のためのマーカーとして使用された。牛痘ウィルスタンパク質（例えばＡ２７Ｌ）に対して導かれた抗体は、ウィルス反応部位を検知するために使用された。抗体はすべて、ペルオキシダーゼ（ベクター）あるいは蛍光性の（シグマ）第２の試薬で検出された。目標遺伝子およびコントロール遺伝子のｍＲＮＡ量は、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲシステムを使用して決定された。
【０１８５】
本発明の原理のみを例証するものとして、先の記載が考慮される。さらに、多数の修正および変更が当業者にとって容易であるので、示されて記述された正確な構築および操作に対して本発明を制限することは望ましくない。したがって、適切な修正および等価なものはすべて本発明の範囲以内となる。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】生体内で多くの異なる組織へのｓｉＲＮＡの有効な伝達を示す図である。
【図２】肝臓へのｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰの有効な伝達を実証する図である。
【図３】ｓｉＲＮＡとモルホリノが同時伝達される場合に、阻害の程度がｓｉＲＮＡあるいはモルホリノのいずれかの伝達におけるよりも単独で大きいことを実証する図である。
【図４】三次元のコンプレックスに存在する場合、ポリアニオンが細胞内部のポリカチオンからのＤＮＡ放出を増強できることを示す図である。
【図５】異なる量のｐＡＡで肺におけるＤＮＡ／ｌＰＥＩ／ｐＡＡのコンプレックスの遺伝子転移活性で、ＤＮＡ／ｌＰＥＩ（５０μｇ／２００μｇ）に添加し、ハツカネズミの静脈内に注入したことを示す図である。
【図６】相当なほどに肺でのトランスジーン発現のレベルを減少させない間に再電荷されたＤＮＡ調製の系統的な毒性を減少するために第二の「追撃者」のポリアニオンの注入が支援することが実証する図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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