(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞、特に上皮腫細胞によって分泌される、単離された細胞外マトリックスの製造方法、このようなマトリックスを用いる腫瘍細胞の培養方法、腫瘍細胞株を製造するためのこのようなマトリックスの使用、並びに前記方法によって得られた新規腫瘍細胞株に関する。また、本発明は、腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害することができる化合物の選択方法、癌治療のための薬剤としての前記化合物の使用、並びに前記マトリックスを用いる染色体分析によるイン・ビトロでの診断または予測に関する。さらに、本発明は、このような細胞外マトリックスを含んでなる細胞培養のための反応装置またはキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む動物起源の腫瘍細胞によって分泌される単離された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を製造する方法であって、
a)  動物起源の前記腫瘍細胞を、支持体上において、動物起源の前記腫瘍細胞が増殖して前記ＥＣＭを分泌することができる条件下で培養する工程、および
b)  このようにして形成され、かつ前記腫瘍細胞が除去されたＥＣＭを回収する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記工程a)と前記工程b)の間に、前記腫瘍細胞を溶解させる工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の単離されたＥＣＭを製造する方法。
【請求項３】
動物起源の前記腫瘍細胞が上皮腫細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍細胞が、原発性腫瘍および／または転移増殖物から予め確立された腫瘍細胞株の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記腫瘍細胞株が、乳腺腫瘍または卵巣腫瘍に由来する腫瘍細胞および／または転移細胞から確立されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞がヒト起源の腫瘍に由来する細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍細胞が、２００２年６月２０日にＩ−２８９３の番号でＣＮＣＭに寄託された腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１に由来する細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られる、単離されたＥＣＭ。
【請求項９】
２００２年６月２０日にＩ−２８９３の番号でＣＮＣＭに寄託された腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１によって分泌されるものである、請求項８に記載の単離されたＥＣＭ。
【請求項１０】
流動性の形態、冷凍された形態、乾燥された形態もしくは凍結乾燥された形態、および適当な場合には滅菌された形態で包装されている、請求項８または９に記載の単離されたＥＣＭ。
【請求項１１】
腫瘍細胞を培養する方法であって、
前記腫瘍細胞を請求項８〜１０のいずれか一項に記載の単離されたＥＣＭと接触させる工程を含んでなり、培養することが望まれる前記腫瘍細胞が、前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである、方法。
【請求項１２】
ヒトを含む動物起源の原発性腫瘍および／または転移腫瘍の試料に由来する腫瘍細胞から確立される腫瘍細胞株を調製する方法であって、
前記腫瘍の試料に含まれ、かつ確立された株を得ることが望まれる腫瘍細胞を、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の単離されたＥＣＭと接触させる工程を含んでなり、確立された株を得ることが望まれる前記腫瘍細胞が、前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである、方法。
【請求項１３】
前記ＥＣＭを得た腫瘍細胞の供給源である第一の腫瘍組織と、培養することが望まれるか、または細胞株を確立することが望まれる腫瘍細胞を含む第二の腫瘍組織とが、ヒトを含む同じ動物種のものである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の腫瘍組織および前記第二の腫瘍組織が同じ胚起源のものである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の腫瘍組織および前記第二の腫瘍組織が異なる胚起源のものである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一の腫瘍組織および前記第二の腫瘍組織が、互いに独立して、乳腺型または卵巣型のものである、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一の腫瘍組織が卵巣型のものであり、前記第二の腫瘍組織が乳腺型または卵巣型のものである、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一の腫瘍組織および前記第二の腫瘍組織がヒト起源のものである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
原発性腫瘍由来の腫瘍細胞の細胞培養または腫瘍細胞の細胞株の確立のための培地の構成要素としての、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の単離されたＥＣＭの使用であって、前記腫瘍細胞が、前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである、使用。
【請求項２０】
請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法によって得られる、確立された腫瘍細胞株。
【請求項２１】
２００２年６月２０日にＩ−２８９４の番号でＣＮＣＭに寄託された、ＩＧＲ−ＯＶ−２２−ＡＳと呼ばれる、請求項２０に記載の腫瘍細胞株。
【請求項２２】
２００２年６月２０日にＩ−２８９５の番号でＣＮＣＭに寄託された、ＩＧＲ−ＢＲ−１１−ＮＳと呼ばれる、請求項２０に記載の腫瘍細胞株。
【請求項２３】
腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害することができる化合物の選択方法であって、
a)  前記腫瘍細胞を培養する工程であって、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の単離されたＥＣＭ上で培養する少なくとも１つの段階を含んでなり、前記腫瘍細胞が前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである、工程、
b)  前記化合物を、工程a)で得られた腫瘍細胞に、通常は該細胞の成長および/または増殖を可能とする条件下で接触させる工程、ならびに
c)  前記化合物が前記腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害することができる場合に、該化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２４】
前記工程a)における単離されたＥＣＭが、２００２年６月２０日にＩ−２８９３の番号でＣＮＣＭに寄託された腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１によって分泌されるＥＣＭである、請求項２３に記載の化合物の選択方法。
【請求項２５】
腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害することができる化合物の選択方法であって、
a)  前記化合物を、２００２年６月２０日にＩ−２８９４の番号でＣＮＣＭに寄託された腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ−２２−ＡＳまたは２００２年６月２０日にＩ−２８９５の番号でＣＮＣＭに寄託されたヒト起源の腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＢＲ−１１−ＮＳから誘導される細胞培養物に接触させる工程、ならびに
b)  前記化合物が前記腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害することができる場合に、該化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２６】
腫瘍に罹患している患者から予め採取した腫瘍細胞の試料を用いて、前記患者由来の腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害することができる化合物を選択する方法であって、
a)  請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の確立された腫瘍細胞株の調製方法によって、患者から採取した前記腫瘍細胞から腫瘍細胞株を確立する工程、
b)  前記化合物を、工程a)で得られた腫瘍細胞株の試料に、通常は該細胞の成長および／または増殖を可能とする条件下で接触させる工程、ならびに
c)  前記化合物が前記腫瘍細胞株の細胞の成長および/または増殖を阻害することができる場合に、該化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２７】
患者から予め採取した腫瘍細胞の、染色体分析、特に細胞遺伝学的分析および間期ＦＩＳＨ分析による、イン・ビトロでの診断および予測の方法であって、
試験を行うことが望まれる、予め採取した前記腫瘍細胞を、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の単離されたＥＣＭ上で培養する工程を含んでなり、前記腫瘍細胞が前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである、方法。
【請求項２８】
患者から予め採取した腫瘍細胞の、細胞遺伝学的分析によるイン・ビトロでの診断または予測の方法であって、
a)  請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の確立された腫瘍細胞株の調製方法によって、前記腫瘍細胞から腫瘍細胞株を確立する工程、ならびに
b)  工程a)で得られた前記細胞株の細胞の試料に対して、該細胞の成長および/または増殖を可能とする条件下で細胞遺伝学的分析を行う工程
を含んでなる、方法。
【請求項２９】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＥＣＭを含んでなる、腫瘍細胞、特に乳腺腫瘍または卵巣腫瘍に由来する腫瘍細胞を培養するための、または前記腫瘍細胞由来の細胞株を確立するための、キット。
【請求項３０】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の単離されたＥＣＭを含む、細胞培養のための反応装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、腫瘍細胞、特に上皮腫細胞によって分泌される単離された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の製造方法、このようなマトリックスを用いる腫瘍細胞の培養方法、腫瘍細胞株を確立するためのこのようなマトリックスの使用、およびこの方法によって得られる新規な腫瘍細胞株に関する。また、本発明は、腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害することができる化合物の選択方法、癌治療用医薬品としてのこのような化合物の使用、およびこのようなマトリックスを用いる染色体分析によるイン・ビトロでの診断または予測の方法に関する。また、本発明は、このようなＥＣＭを含んでなる細胞培養のための反応装置またはキットに関する。
【０００２】
背景技術
固形腫瘍、特に上皮腫は、培養することが困難であり、適当な場合に株の形態でイン・ビトロで増殖させることも困難である。固形癌腫は、悪性上皮コンティンジェント(contingent)(厳密な意味での癌細胞)の他に、悪性細胞がそれなしではイン・ビボでは発育することができない支質細胞のコンティンジェント(contingent)(繊維芽細胞、腫瘍血管内皮細胞)を示す。
【０００３】
上皮細胞の問題であるか、または支持細胞の問題であるかに関わりなく、総ての組織はインテグリン、プロテオグリカン、ラミニンタンパク質および増殖因子受容体の集合体である細胞外マトリックス（ＥＣＭ）からなる基底膜を組織化し、かつこれから分極している。このＥＣＭの組成および構造は、所定の組織に対して特異的である。
【０００４】
基底膜および上皮の場合には、支持を行う結合組織は、この支持組織を供給する血管からの繊維芽細胞、マクロファージ、肥満細胞および内皮細胞から構成されている。このような結合した組織は極めて多量のＥＣＭを合成し、これにより緊張、本質的に機械的緊張に応答することが可能となる。
【０００５】
上皮のＥＣＭは、その組織の状況において遺伝子を保持し、細胞付着後の形態形成を誘導し、アポトーシスおよび腫瘍侵襲を予防する（分解現象があると、侵襲が起きる）、という３つの役割を有する。
【０００６】
上皮細胞および結合組織細胞のＥＣＭの正確な組成は、現在のところ知られていない。
【０００７】
癌細胞の支持体への付着を改良するのに用いられる試薬としては、例えば、ラミニン、コラーゲンIVまたはゼラチンなど、多くの業者により販売されている、上皮の基底膜によって分泌される細胞外マトリックスのある種の構成タンパク質が挙げられる。これらの試薬は、単層として培養フラスコのプラスチックに塗布することができる。
【０００８】
また、Sigma社(米国)によって提案されているMatrigel（登録商標）(「基底膜様」）のようなマルチタンパク質複合体を挙げることもできる。これらの複合体は未知の組成を有し、一般に細胞溶解工程の後に実験的腫瘍から抽出される。
【０００９】
臍帯細胞に由来し、かつ幾つかの学術的大学研究室から販売されている細胞外マトリックスも挙げられる。
【００１０】
細胞培地に用いられる増殖因子および付着因子を含むウシ胎児血清であって、癌細胞の付着を促進するものを挙げることもできる。
【００１１】
一般に、これらの試薬は癌細胞の付着を促進するが、特に産生バッチやその品質の多様性によって、上記細胞の増殖を刺激し、または該増殖を定常的に刺激することはできない。
【００１２】
最後に、腫瘍細胞の培養に用いられるウシ角膜内皮細胞からGospodarowitcz et al.によって提案された細胞外マトリックスの産生手法が挙げられるが(Endocrine Reviews, 1(3): 201-227, 1980)、このマトリックスは安定性に乏しい。
【００１３】
従って、悪性腫瘍細胞を、特にプラスチック支持体上で付着させ、そしてこれを増殖させることができる悪性腫瘍細胞の培養のための一定の生物学的試薬を提供することができるようにすることが依然として必要である。
【００１４】
実際に、このような試薬は、腫瘍細胞の培養だけでなく、原発性腫瘍由来の腫瘍細胞株を確立するためにも有利に用いることができる。このような培養物または株は、それらの生物学的特性(核酸、タンパク質、酵素活性)を研究する目的で選択されるツールとすることができ、あるいは治療(化学療法および放射線療法)に対する腫瘍の感受性を予測する試験を行う目的で選択されるツールとすることもできる。
【００１５】
所定の種類の癌に対するこのような試薬を提供して、患者の腫瘍の試料由来の腫瘍細胞を増殖させることができるようにすることも望ましい。実際に、これらの腫瘍細胞の増殖またはこれらの細胞からの細胞株の確立によって、イン・ビトロで、かつ短期間に、この患者からの悪性細胞およびこれらの悪性細胞の想定された治療法に対する感受性を、患者の治療前に検討することができる。
【００１６】
本発明は、このような課題を解決しようとするものである。
【発明の開示】
【００１７】
本発明者らは、意外にも、哺乳類腫瘍細胞、特に上皮腫細胞によって分泌される単離された細胞外マトリックスが、腫瘍細胞を付着させ、および増殖させ、かつ、特に培養することが望まれるか、または細胞株の確立が望まれるこれらの腫瘍細胞が前記マトリックスを分泌する腫瘍細胞と同じ胚起源を有する組織から誘導される場合には、原発性腫瘍および/または転移腫瘍の試料から誘導される腫瘍細胞株を確立することができることを明らかにした。
【００１８】
従って、本発明の第一の態様によれば、ヒトを含む動物起源の腫瘍細胞によって分泌される単離された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を製造する方法が提供され、該方法は、
a)  動物起源の前記腫瘍細胞を、支持体上において、動物起源の前記腫瘍細胞が増殖して前記ＥＣＭを分泌することができる条件下で培養する工程、および
b)  このようにして形成され、かつ前記腫瘍細胞が除去されたＥＣＭを回収する工程
を含んでなる。
【００１９】
好ましい実施態様では、本発明による単離された細胞外マトリックスの製造方法は、前記工程a)と前記工程b)の間に、前記腫瘍細胞を溶解させる工程をさらに含んでなる。
【００２０】
特に好ましい実施態様では、本発明による単離された細胞外マトリックスの製造方法は、動物起源の前記腫瘍細胞が上皮腫細胞であることを特徴とする。
【００２１】
他の好ましい実施態様では、本発明による単離された細胞外マトリックスの製造方法は、前記腫瘍細胞が、原発性腫瘍および/または転移増殖物から予め確立された腫瘍細胞株の細胞であることを特徴とする。
【００２２】
好ましくは、本発明は、前記腫瘍細胞株が乳腺（mammary）腫瘍または卵巣腫瘍に由来する腫瘍細胞および/または転移細胞から確立されたものであることを特徴とする、本発明による単離された細胞外マトリックスの製造方法に関する。
【００２３】
さらに好ましくは、本発明は、前記腫瘍細胞がヒト起源の腫瘍に由来する細胞であることを特徴とする、本発明による単離された細胞外マトリックスの製造方法に関する。
【００２４】
本発明の特に好ましい態様によれば、本発明による単離された細胞外マトリックスの製造方法であって、前記腫瘍細胞が、ブダペスト条約に基づき、２００２年６月２０日にＩ−２８９３の番号でCollection Nationale de Culture de Microorganismes（ＣＮＣＭ）[ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズム・カルチャーズ], Pasteur Institute, パリ(フランス)に寄託された腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１に由来する細胞であることを特徴とする方法が提供される。
【００２５】
腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１は、ヒト卵巣腫瘍の原発性腫瘍から誘導される上皮様細胞の株である。これらの癌細胞は、単層として、および培地中に浮遊している「クラスター」として発育する。これらの細胞「クラスター」は、プラスチックに付着することができる。他方では、付着性細胞は浮遊する「クラスター」として増殖することができ、増殖する付着コンティンジェント(contingent)である(Benard, J. et al., Cancer Research, 45, 4970-4979, 1985)。
【００２６】
本発明の第二の態様によれば、本発明による単離された細胞外マトリックスの製造方法によって得ることができる、単離された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が提供される。
【００２７】
本発明による単離されたＥＣＭとしては、２００２年６月２０日に１−２８９３の番号でＣＮＣＭに寄託された腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１によって分泌される、単離されたＥＣＭが最も好ましい。
【００２８】
好ましくは、本発明による単離されたＥＣＭは、流動性の形態、冷凍された形態、乾燥された形態もしくは凍結乾燥された形態、および適当な場合には滅菌された形態で包装される。
【００２９】
本発明の第三の態様によれば、本発明による単離されたＥＣＭを含む、細胞培養のための反応装置が提供される。
【００３０】
本発明の第四の態様によれば、腫瘍細胞を培養する方法が提供され、該方法は、前記腫瘍細胞を本発明による単離されたＥＣＭと接触させる工程を含んでなる。培養することが望まれる前記腫瘍細胞は、前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである。
【００３１】
本発明の第五の態様によれば、ヒトを含む動物起源の原発性腫瘍および/または転移腫瘍の試料に由来する腫瘍細胞から確立される腫瘍細胞株を調製する方法が提供され、該方法は、前記腫瘍の試料に含まれ、かつ確立された株を得ることが望まれる腫瘍細胞を、本発明による単離されたＥＣＭと接触させる工程を含んでなる。確立された株を得ることが望まれる前記腫瘍細胞は、前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである。
【００３２】
好ましい実施態様では、本発明による腫瘍細胞の培養方法または本発明による腫瘍細胞株の調製方法は、前記ＥＣＭを得た腫瘍細胞の供給源である第一の腫瘍組織と、培養することが望まれるか、または細胞株を確立することが望まれる腫瘍細胞を含む第二の腫瘍組織とが、ヒトを含む同じ動物種のものであることを特徴とする。
【００３３】
他の好ましい実施態様では、本発明による腫瘍細胞の培養方法または本発明による腫瘍細胞株の調製方法は、前記第一の腫瘍組織および前記第二の腫瘍組織が、互いに独立して、悪性または良性腫瘍の群に由来し、特に卵巣腫瘍、乳腫瘍（breast tumors）、前立腺腫瘍または甲状腺腫瘍に由来することを特徴とする。
【００３４】
好ましくは、本発明による腫瘍細胞の培養方法または本発明による腫瘍細胞株の調製方法は、前記第一の腫瘍組織が乳腫瘍（a breast tumor）、特に腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１に由来する組織であり、前記第二の腫瘍組織が悪性または良性の卵巣腫瘍、乳腫瘍（breast tumors）、前立腺腫瘍または甲状腺腫瘍に由来することを特徴とする。
【００３５】
他の好ましい実施態様では、本発明による腫瘍細胞の培養方法または本発明による腫瘍細胞株の調製方法は、前記第一の腫瘍組織および前記第二の腫瘍組織が同じ胚起源のものであることを特徴とする。
【００３６】
腫瘍組織に対する「同じ胚起源」という用語は、本明細書において、同じ胚の一次組織(内胚葉、外胚葉または中胚葉)に由来する腫瘍組織を表すものである。例えば、卵巣および乳腺（mammary）上皮腫は、卵巣および乳腺（mammary）上皮組織が内胚葉に由来するため、同じ胚起源に由来しているものとされる。
【００３７】
他の好ましい実施態様では、本発明による腫瘍細胞の培養方法または本発明による腫瘍細胞株の調製方法は、前記第一の腫瘍組織および前記第二の腫瘍組織が異なる胚起源のものであり、好ましくは内胚葉および外胚葉に由来し、またはその逆であることを特徴とする。
【００３８】
他の好ましい実施態様では、本発明による腫瘍細胞の培養方法または本発明による腫瘍細胞株の調製方法は、前記第一の腫瘍組織および前記第二の腫瘍組織が、互いに独立して、乳腺型（mammary type）または卵巣型（ovarian type）のものであることを特徴とする。
【００３９】
さらに好ましい実施態様では、本発明による腫瘍細胞の培養方法または本発明による腫瘍細胞株の調製方法は、前記第一の腫瘍組織が卵巣型のものであり、前記第二の腫瘍組織が乳腺型または卵巣型のものであることを特徴とする。
【００４０】
本発明の特に好ましい態様によれば、本発明による腫瘍細胞の培養方法または本発明による腫瘍細胞株の調製方法であって、前記第一の腫瘍組織および前記第二の腫瘍組織がヒト起源のものであることを特徴とする方法が提供される。
【００４１】
本発明の第六の態様によれば、原発性腫瘍および／または転移増殖物に由来する腫瘍細胞の細胞培養または腫瘍細胞の細胞株の確立のための培地の構成要素としての、本発明による単離されたＥＣＭの使用が提供され、前記腫瘍細胞は、前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである。
【００４２】
本発明の第七の態様によれば、本発明による腫瘍細胞株の調製方法によって得られる、確立された腫瘍細胞株が提供される。
【００４３】
本発明による腫瘍細胞株の調製方法によって得ることができる確立された腫瘍細胞株としては、好ましくは、特にブダペスト条約の条件下で２００２年６月２０日にＩ−２８９４の番号でＣＮＣＭに寄託された、ＩＧＲ−ＯＶ−２２−ＡＳと呼ばれる腫瘍細胞株、またはブダペスト条約の条件下で２００２年６月２０日にＩ−２８９５の番号でＣＮＣＭに寄託された、ＩＧＲ−ＢＲ−１１−ＮＳと呼ばれる腫瘍細胞株が挙げられる。
【００４４】
ＩＧＲ−ＯＶ−２２−ＡＳと呼ばれる腫瘍細胞株は、ヒト卵巣上皮腺癌からの癌性腹水の試料に含まれる上皮腫細胞、ならびに乳癌および／または卵巣癌症候群の素因の遺伝学的情況において、ＢＲＣＡ２遺伝子について構造的にヘテロ接合体である（該遺伝子の１つの対立遺伝子が突然変異した）患者で発生した卵巣上皮癌から確立されたものである。これらの上皮腫性癌細胞は、単層として発育する。ヒト乳癌、上皮腫細胞は、小節に由来した。
【００４５】
ＩＧＲ−ＢＲ−１１−ＮＳと呼ばれる腫瘍細胞株は、乳癌／卵巣癌症候群の素因の遺伝学的情況において、ＢＲＣＡ１遺伝子についてヘテロ接合体である（該遺伝子の１つの対立遺伝子が突然変異した）患者で新たに確立されたものである。
【００４６】
これらの上皮腫癌細胞も、単層として発育する。
【００４７】
本発明の第八の態様によれば、腫瘍細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を阻害することができる化合物の選択方法が提供され、該方法は、
a)  前記腫瘍細胞を培養する工程であって、本発明による単離されたＥＣＭ上で培養する少なくとも１つの段階を含んでなり、前記腫瘍細胞が前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである、工程、
b)  前記化合物を、工程a)で得られた腫瘍細胞に、通常は該細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を可能とする条件下で接触させる工程、ならびに
c)  前記化合物が前記腫瘍細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を阻害することができる場合に、該化合物を選択する工程
を含んでなる。
【００４８】
好ましい実施態様では、本発明による化合物の選択方法は、前記工程a)における単離されたＥＣＭが、２００２年６月２０日にＩ−２８９３の番号でＣＮＣＭに寄託された腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１によって分泌されるＥＣＭであることを特徴とする。
【００４９】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、腫瘍細胞、特に卵巣腫瘍からの腫瘍細胞、好ましくはヒトのもの、または卵巣細胞と同じ胚起源の腫瘍細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を阻害することができる化合物の選択方法であって、
a)  前記化合物を、２００２年６月２０日にＩ−２８９４の番号でＣＮＣＭに寄託された腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ−２２−ＡＳから誘導される細胞培養物に接触させる工程、ならびに
b)  前記化合物が前記腫瘍細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を阻害することができる場合に、該化合物を選択する工程
を含んでなる方法が提供される。
【００５０】
本発明の他のさらに好ましい実施態様によれば、腫瘍細胞、特に乳腺（mammary）腫瘍からの腫瘍細胞、好ましくはヒトのもの、または乳腺（mammary）腫瘍と同じ胚起源の腫瘍細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を阻害することができる化合物の選択方法であって、
a)  前記化合物を、２００２年６月２０日にＩ−２８９５の番号でＣＮＣＭに寄託されたヒト起源の腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＢＲ−１１−ＮＳから誘導される細胞培養物に接触させる工程、ならびに
b)  前記化合物が前記腫瘍細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を阻害することができる場合に、該化合物を選択する工程
を含んでなる、方法が提供される。
【００５１】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、腫瘍に罹患している患者から予め採取した腫瘍細胞の試料を用いて、前記患者由来の腫瘍細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を阻害することができる化合物を選択する方法が提供され、該方法は、
a)  本発明による方法に従う確立された腫瘍細胞株の調製方法によって、患者から採取した前記腫瘍細胞から腫瘍細胞株を確立する工程、
b)  前記化合物を、工程a)で得られた腫瘍細胞株の試料に、通常は該細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を可能とする条件下で接触させる工程、ならびに
c)  前記化合物が前記腫瘍細胞株の細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を阻害することができる場合に、該化合物を選択する工程
を含んでなる。
【００５２】
本発明の第九の態様によれば、癌の治療を目的とする医薬品を製造するための化合物の使用が提供される。この化合物は、本発明による選択方法によって選択されるものである。
【００５３】
好ましくは、本発明は、乳癌または卵巣癌の治療を目的とする医薬品を製造するための、本発明による化合物の使用に関する。
【００５４】
本発明の第十の態様によれば、患者から予め採取した腫瘍細胞の、染色体分析、特に細胞遺伝学的分析および間期ＦＩＳＨ分析による、イン・ビトロでの診断および予測の方法が提供され、該方法は、試験を行うことが望まれる、予め採取した前記腫瘍細胞を、本発明による単離されたＥＣＭ上で培養する工程を含んでなる。前記腫瘍細胞は、前記ＥＣＭを分泌した腫瘍細胞とは異なるものである。
【００５５】
好ましい実施態様では、患者から予め採取した腫瘍細胞の染色体分析によるイン・ビトロでの診断および予測の方法は、
a)  本発明による方法に従う確立された腫瘍細胞株の調製方法によって、前記腫瘍細胞から腫瘍細胞株を確立する工程、
b)  工程a)で得られた前記細胞株の細胞の試料に対して、該細胞の成長（growth）および/または増殖（proliferation）を可能とする条件下で染色体分析を行う工程、ならびに
c)  １以上の染色体の遺伝子変化（genetic alteration）を、このような変化を検出するための手法、特に核型分析または「間期ＦＩＳＨ」法によって明らかにする工程
を含んでなる。
【００５６】
腫瘍細胞のゲノムは、一連の遺伝子変化、すなわち染色体領域の獲得および/または喪失によって特徴づけられる。細胞遺伝学者は、特に２つの手法、すなわち当業者に周知の核型分析およびＦＩＳＨ（蛍光イン・シテュー・ハイブリダイゼーション）法、によってこれらの変化を日常的に明らかにしており、増殖能を有する腫瘍細胞を得ることができることの重要性を示すために、本明細書では一定の工程のみを例示する。
【００５７】
腫瘍細胞のイン・ビトロ培養後の核型分析
腫瘍細胞の播種の２４時間後に、コルヒチンの溶液を培地に加える。プラスチックに付着して増殖を開始した細胞を有糸分裂でブロックして、それらの染色体を明らかにする。これらの条件下での有糸分裂の収率は、腫瘍の種類および腫瘍組織の増殖能によって大きく異なる。
【００５８】
細胞付着での間期ＦＩＳＨ分析
細胞学的観察のためのスライドの上に腫瘍断片を付着させることによって、悪性細胞を沈着させ、固定した後に、蛍光イン・シテュー・ハイブリダイゼーション法によって分析することができる。この分析は有糸分裂を行っている細胞を必要とせず、大部分は間期であり、従って、少数が有糸分裂を行うことによって染色体を可視化させることができる総ての細胞に適用される。
【００５９】
本発明による細胞外マトリックスの存在下での、特にＩＧＲ−ＯＶ１株由来の上皮腫の腫瘍細胞は、付着し、分化し、増殖する。従って、腫瘍細胞の遺伝子変化を明らかにするために細胞遺伝学者によって用いられる手法によって、本発明による細胞外マトリックスから下記の改良点が得られる。
【００６０】
核型分析について
核型分析は、有糸分裂を受ける細胞を補充するため、先行して細胞培養を行う必要がある。これらの培養は、通常は上皮腫癌細胞の付着および増殖を特に促進しないプラスチック支持体上で行われる。有糸分裂の数は限定されているため、分析の収率は極めて低い。本発明による細胞外マトリックスの存在下における培養は腫瘍細胞に特異的な付着とそれらの増殖を促進するので、マトリックスによって補充される腫瘍細胞の有糸分裂の数は遙かに大きくなる。
【００６１】
ＦＩＳＨ分析について
予め調製した細胞外マトリックスを塗布したスライド上において、スライド上に固定された本発明による細胞外マトリックスの存在により、癌細胞の付着を増加させることができる。マトリックス上に生じたフットプリントは細胞で増加し、分析時間を減少させる。
【００６２】
本発明の最後の態様によれば、本発明によるＥＣＭを含んでなる、腫瘍細胞、特に乳腺（mammary）腫瘍または卵巣腫瘍に由来する腫瘍細胞を培養するための、または前記腫瘍細胞由来の細胞株を確立するためのキットが提供される。
【００６３】
本発明は、固形支持体、特にガラススライドであって、この上に本発明による細胞外マトリックスを固定するもの、および腫瘍細胞の染色体分析のためのその使用にも関する。
【００６４】
下記の実施例は、本発明を製造し、かつ使用することができるようにするための完全な説明を当業者に提供するように選択した。これらの実施例は、本発明者らがその発明であると考えるものの範囲を制限しようとするものではなく、下記の実験だけを行ったことを示そうとするものでもない。
【実施例】
【００６５】
実施例１：ＩＧＲ−ＯＶ１株から得られる細胞外マトリックスの調製
１）ＩＧＲ−ＯＶ１細胞の培養
ＩＧＲ−ＯＶ１細胞（倍加時間、約２５時間）を約５００世代に相当する１７０−２１０の継代で培養し、世代数により株の安定性を保証する。コンフルエンシーに達したならば、細胞を２５ｃｍ２培養フラスコ中で１／３に分割し、ウシ胎児血清１０％を補足した５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中で培養する。５％ＣＯ２の存在下、３７℃のインキュベーター中で３日間培養した後、上皮腫細胞はコンフルエンシーに達する。
【００６６】
２）マトリックスの調製
コンフルエント細胞を被覆する培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水）に取り換え、３７℃で予備インキュベーションした。この操作を３回繰り返し、これにより、その存在によって細胞溶解の再現性が変化する培地中のタンパク質を除去することができる。３連続緩衝液の容積は、
２４穴プレートのウェル当たり１ｍｌ、
６穴プレートのウェル当たり２ｍｌ、
２５ｃｍ２培養フラスコに対して５ｍｌ、
７５ｃｍ２培養フラスコに対して１０ｍｌ
である。
【００６７】
３回目のＰＢＳの除去の後、３７℃に予熱した同容積の０．０２Ｍ ＮＨ４ＯＨをフラスコの壁に振りかけた後、コンフルエント細胞に適用させる。インキュベーションは、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６分間行う。このインキュベーション時間の終了時に溶解が完了していなければ、溶解を３０秒間ずつ継続する。総ての細胞本体が消失したならば、粘性の高い（細胞によって放出されるゲノムＤＮＡ）アンモニア含有溶液の除去によって工程を停止する。マトリックスを、溶解容積と同容積のＰＢＳを用いて、添加−除去のサイクルを３回繰り返すことによって洗浄する。最初の洗浄液は、粘性が高いままであることがある。洗浄液は、効果的であり、かつマトリックスを損傷しない程度に十分穏和でなければならない。
【００６８】
３）マトリックスの保存
マトリックスを含む培養フラスコおよびプレートを、抗生物質を含むＰＢＳ培地の培養容積の１／４でヒートシールしたバッグに保存し、全集合体を４℃に置く。このようにして調製したマトリックスは、その調製から３〜２１日間にわたって用いることができ、分解もしない。
【００６９】
４）必要な材料および培地
材料：
Ｃｏｓｔａｒ培養プレート（６穴、２４穴および９６穴皿）、
Ｎｕｎｃ  ２５および７５ｃｍ２培養フラスコ。
【００７０】
培養培地：
２ｍＭグルタミン、
抗生物質：バンコマイシン（１２μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）およびファンギゾン（２μｇ／ｍｌ）．
を補足したＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ＲＰＭＩ  １６４０。
【００７１】
このようにして再構成した培地を、最終濃度１０ｍＭのＨｅｐｅｓで緩衝化する。
【００７２】
カナダ産のウシ胎児血清、Biomedia社製、
ＰＢＳ（ＰＢＳはリン酸緩衝食塩水を表す）、カルシウムおよびマグネシウムを含まないもの、Gibco製、
マトリックス保存培地：抗生物質の存在下および上記最終濃度でのGibco製のカルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ。
【００７３】
実施例２：２種類の上皮腫株ＩＧＲ−ＯＶ−２２およびＩＧＲ−ＢＲ−１１の生産
Ａ）上皮腫株ＩＧＲ−ＯＶ−２２の確立
卵巣上皮の癌は、ロコリージョナル(locoregional)固形卵巣腫瘍の形態、および上皮腫細胞を含む腹水の形態で発育する。
【００７４】
乳癌および/または卵巣癌に対する罹病性の家族的関連性を有する患者であって、ＢＲＣＡ２遺伝子について構造的にヘテロ接合体であった患者から予め採取した原発性腫瘍（ＴＰ）および腹水（Ａｓｃ）は、解剖学−病理学研究室から入手した。
【００７５】
１）腫瘍の調製
針（２２ゲージ）および１ｍｌのヘパリンで予め処理した注射器（インスリン型）を用いて、腫瘍を穿刺した。注射器の内容物を大容積のＲＰＭＩ１６４０−１０％ウシ胎児血清に溶解した後、遠心分離した。細胞ペレットに混入している赤血球は、滅菌蒸留水を用いる低張ショックによって除去した。細胞懸濁液を再度遠心分離し、最後に４ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−１０％ウシ胎児血清に溶解することによって、７．５ｘ１０５個／ｍｌの上皮腫細胞の懸濁液を得ることができた。このようにして調製した細胞懸濁液を、予め調製しておいた、ＩＧＲ−ＯＶ１株によって分泌される細胞外マトリックスを塗布した培養プレートの１２個のウェルに播種した（マトリックスは１７日前に調製した）。播種密度は高く、約３ｘ１０５個／４．５ｃｍ２である。
【００７６】
２）腹水の調製
大容積の腹水試料を、ＲＰＭＩ１６４０−１０％ウシ胎児血清の存在下で遠心分離した。得られた細胞個体群ペレットを、次に、腫瘍について上記したのと同じ条件下で処理した。上皮腫細胞を、ＩＧＲ−ＯＶ１株によって分泌された細胞外マトリックスを塗布した２４穴プレートに、上記と同じ細胞濃度を用いて播種した。
【００７７】
３）腫瘍および腹水からの上皮腫細胞のイン・ビトロ培養
４日毎に培養物を観察することによって、基質に付着し、（それらの形態の観点で）分化し、増殖する上皮腫細胞を具体的に確認することができた。
【００７８】
コンフルエンスを観察するときには、細胞を０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し、ＲＰＭＩ１６４０培地−１０％ウシ胎児血清に溶解し、同じ初期播種密度でマトリックスに再播種した。
【００７９】
１２穴培養皿で２種類の細胞個体群ＴＰおよびＡｓｃを増幅した後、その後の５継代は大きめの培養表面積、すなわち、２５ｃｍ２を有し、細胞外マトリックスも塗布してある培養フラスコで行った。
【００８０】
細胞外マトリックス上におけるこれらの１０継代の終了時には、上皮腫細胞はプラスチック上で直接増殖することができる。ＴＰおよびＡｓｃ腫瘍細胞は２０継代を受けたので、亜株ＩＧＲ−ＯＶ２２−ＡｓｃおよびＩＧＲ−ＯＶ２２−ＴＰは、類似の典型的な上皮腫表現型を示すものとして確立されていると考えられる。
【００８１】
Ｂ）ＩＧＲ−ＢＲ−１１株の確立
乳癌および／または卵巣癌に対する罹病性の家族的関連性を有する患者であって、ＢＲＣＡ１遺伝子について構造的にヘテロ接合体であった患者から予め採取した乳腺（mammary）腫瘍の原発性腫瘍（ＴＰ）は、解剖学−病理学研究室から入手した。
【００８２】
ＩＧＲ−ＯＶ−２２（ＴＰ）株を確立するために示されたプロトコール、特に初期播種濃度は、このＩＧＲ−ＢＲ−１１株の確立についてのものと厳密に同一であった。細胞外マトリックスの存在下での１０継代の終了時に、上皮腫細胞を細胞外マトリックスの非存在下でプラスチック上にて３０継代培養した。このようにして、ＩＧＲ−ＢＲ−１１株を確立した。
【００８３】
実施例３：腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１由来のＥＣＭを用いる様々な組織学的種類の上皮腫細胞および様々な悪性腫瘍の培養
腫瘍細胞株ＩＧＲ−ＯＶ１由来のＥＣＭ上で開始した最初の培養（Ｐ０）に続く連続継代（Ｐ１、Ｐ２など）を、下記の腫瘍に由来する細胞を用いて行い、良好な結果を得た。
【００８４】
Ａ）悪性腫瘍
１）癌性乳腫瘍（ｎ＝８）
結果：
２個のＰ０、続いてそれぞれＰ１、および
１個の確立された株（Ｐ４０）。
すなわち、成功率３／８（３５％）。
【００８５】
２）癌性卵巣腫瘍（ｎ＝５）
結果：
３個のＰ０、および
１個のＰ０に続いて、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４。
すなわち、成功率４／５（８０％）。
【００８６】
３）癌性前立腺腫瘍（ｎ＝２）
１個のＰ０に続いて、Ｐ１およびＰ２。
すなわち、成功率１／２（５０％）。
【００８７】
４）乳頭状甲状腺癌（ｎ＝２）
２個のＰ０、続いてそれぞれＰ１。
すなわち、成功率２／２（１００％）。
【００８８】
Ｂ）境界上の悪性を有する腫瘍および良性腫瘍
１）「境界上」卵巣腫瘍（ｎ＝７）
３個のＰ０、続いてＰ１、および
２個のＰ０。
すなわち、成功率５／７（７０％）。
【００８９】
２）甲状腺腫（ｎ＝１）
１個のＰ０。
すなわち、成功率１／１（１００％）
【００９０】
このようにして、癌性上皮細胞の一次培養は、胸部３／８（３５％）、卵巣４／５（８０％）、前立腺１／２（５０％）、甲状腺２／２（１００％）の各種悪性腫瘍だけでなく、境界上の悪性卵巣腫瘍５／７（７０％）および良性甲状腺腫瘍１／１（１００％）についても、ＥＣＭ上で良好に実現した。
【００９１】
従って、これらの結果は、様々な組織学的種類および様々な悪性腫瘍（１６／２５、すなわち６５％）の上皮腫の培養のための、および新規な細胞株を確立するための、本発明によるＥＣＭ、すなわちＩＧＲ−ＸＣマトリックスの利点を示している。
【国際調査報告】
2005533512.tif 000002
2005533512.tif 000003
2005533512.tif 000004
2005533512.tif 000005
2005533512.tif 000006
2005533512.tif 000007