(57)【要約】この発明は、培養面上で成長する細胞のインビトロ培養のための方法に関する。この発明に従うと、細胞は培養面（１）上に撒かれ、培地の中で培養され、培養面は培地から外されずに連続的または周期的に拡張する。培養面を拡張するため、細胞は培養面から分離されずに細胞間の培養面が拡張される。しかしながら、細胞の少なくとも一部を分離することができ、培養面は、さらなる培養面区域を溢れさせることによって拡張され得る。細胞培養のための例示的な装置の培養面は拡張膜（６）の一方側からなり、この膜は他方側の圧力を変更することによって拡張する。細胞培養は、手作業での継代培養なしに実行され得る。細胞が受ける応力は、公知の細胞培養方法よりも小さく、この方法はより容易に自動化可能である。
2005500860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞（４）のインビトロ増殖のための方法であって、細胞（４）は培養面（１）上に植え付けられ、培養面に接着して培地の中で培養され、
細胞増殖の間に、培養面（１）は連続的または段階的に拡大され、細胞（４）は培養面拡大の前およびその間は培地の中に留まり、培養面拡大は、継代培養とちょうど同じように、細胞増殖によって増加する細胞数に適合されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
培養面拡大の間に、細胞（４）は培養面に接着したままにされ、培養面（１）は拡張によって拡大されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養面拡大の間に、細胞（４）は培養面に接着したままにされ、培養面は、細胞が接着する培養面（１）の領域間にさらなる培養面領域を挿入することによって拡大されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培養面（１）は、細胞が接着する多数の粒子からなり、その面は、細胞が接着する粒子間にさらなる粒子を挿入することによって拡大されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
培養面（１）は、圧縮できる開孔体（２２）の内側面であり、培養面は、さらなる孔が開きかつ新たな表面部分が利用可能になるように、体（２２）の圧縮を減じることによって拡大されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
培養面拡大の前またはその間に、細胞（４）の少なくとも一部は培養面から分離されて懸濁され、培養面は、少なくとも１つのさらなる培養面領域（１″）を加えることによって拡大されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞（４）は剪断力によって分離され、剪断力は、分裂期の細胞のみが分離されるような大きさにされることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
剪断力は培地の流れによって発生されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞（４）は培養面（１，１″）から機械的に分離されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
培地の中での細胞（４）のインビトロ増殖のための装置であって、細胞は培養面に接着し、前記装置は、培地によってその上または付近が溢れさせられる培養面（１）と、培養面の上またはその付近を溢れさせる培地を新しくするための手段とを含み、
装置は、培地によってその上またはその付近が溢れさせられる培養面（１）の連続的または段階的な拡大のための手段をさらに含み、前記手段は、継代培養とちょうど同じように、細胞増殖によって増加する細胞数に適合される培養面拡大のために制御可能であることを特徴とする、装置。
【請求項１１】
培養面（１）は拡張可能膜（６）の一方側であり、装置は、膜（６）を拡張させるための手段を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
膜（６）を拡張させるための手段は、培養面（１）の反対の膜側に隣接し、かつ流体または気体で充填される空間（５）を含み、その空間（５）には、圧力を変更するための手段（７）が設けられることを特徴とする、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
培養面（１）は多数の粒子によって形成され、装置は、培養面（１）の粒子間にさらなる粒子を挿入するための手段をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
挿入のための手段は、上向きに増大する断面を有するコンテナ（１２）と、このコンテナ（１２）中の粒子を上向きに変位させるための手段（１５）とを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
装置は、培地によって選択的に溢れさせられる培養面領域（１″）を含み、培養面拡大のために培養面領域（１″）のさらなる領域が溢れさせられ、装置は、細胞の少なくとも一部を培養面（１，１″）から分離し、かつ分離された細胞を培地中に懸濁するための手段をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１６】
分離するための手段は剪断力を発生させるための手段であることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
分離するための手段は、培養面（１，１″）として備えられる外側面および透過性壁を含む導管（４０）であり、装置は、導管を通して酵素溶液を流し、透過性壁を通して、導管の外側面に接着する細胞と接触させるための手段をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
分離するための手段は、培養面（１，１″）に沿って動かすことができるブレード（５０）、ブラシ、またはスクレーパーであることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、インビトロ細胞培養の分野に存在し、対応の独立特許請求項のプリアンブルに従う方法および装置に関する。この発明に従う方法および装置は、培養面に接着する細胞のインビトロ増殖のために働く。
【背景技術】
【０００２】
たとえば、ファス他（Fuss et al.）の「異なる培養条件下でＩ／III型コラーゲンスポンジに植え付けられるヒトの軟骨細胞、骨芽細胞および繊維芽細胞の特徴」（“Characteristics of human chondrocytes, osteoblasts and fibroblasts seeded onto a Type I/III collagen sponge under different culture conditions”）、Anat. Anz. 182:303-310 (2000)；チャン他（Chan et al.）の「複合生体適合表皮植皮術および人工皮膚を用いて傷表面を新しくする新たな技術」（“A new technique to resurface wounds with composite biocompatible epidermal graft and artificial skin”）、J. Trauma 50:358-362 (2001)；ロス他（Roth et al.）の「重症血友病Ａを患う患者における遺伝子エンコード凝固因子VIIIの非ウイルス性の伝達」（“Nonviral transfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severe haemophilia A”）、N. Engl. J. Med. 344:1735-1742 (2001)などの複数の刊行物から、患者の組織（自己細胞）から細胞を取り出し、培養で増殖させた後、その細胞を患者の体内に戻すこと（細胞自己移植）が公知である。臓器移植と比較した細胞自己移植の主な利点は以下のとおりである。すなわち、自分の細胞を用いるので病気の感染の危険性がないこと、ならびに臓器ドナーの数が限られていることによる、およびドナーと受入側との間の組織適合性に関する条件による限定がないことである。さらに、手術のスケジュールを組むのがより容易である。
【０００３】
細胞の自己移植については、１回目の小さな手術で患者の体から小さな組織サンプルを取る。次に組織サンプルから生体の細胞を単離し、これをインビトロで増殖させる。２回目の手術で、増殖された細胞の懸濁液を患者に移植して戻す。インビボで、移植された細胞は、元の組織の機能を果たす組織等価を形成する。増殖された細胞からインビトロで組織等価を成長させる公知の方法も存在する（組織エンジニアリング）（tissue engineering）。次に、多かれ少なかれ機能組織の成熟前駆体を構成する、遺伝子工学で作られた組織を患者に移植する。
【０００４】
現行技術に従うと、組織細胞のインビトロ増殖は、細胞を懸濁液中では培養できないがこれを培養面に接着させる必要がある場合に、必ず高い技能を持つ担当者によって本質的に手作業で行なわれる。細胞が一旦そのような培養で増殖されると、それらはトリプシンまたは他の酵素の補助により培養面から分離される。次にそれらを酵素から分離し、酵素を含まない媒質中で再懸濁し、培養面単位当りの細胞数をより少なくして再び植え付ける。細胞を再び植え付ける細胞密度がより低いことにより、さらなる細胞増殖が可能になる。この作業ステップの連続が「細胞継代培養」（cell passaging）として公知である。必要な周期的培地交換も手作業で行なわれることがしばしばである。上記公知の細胞培養方法に固有の複数の欠点が存在する。特に不利であるのは、トリプシンまたは一般的に酵素を用いた細胞の処理である。なぜなら、この処理は通常は不可逆にかつ未知の程度にまで細胞を損傷するからである。さらに、手作業で行なわれるすべての方法ステップは人件費が非常に高く、広範な品質管理を必要とする。さらに、手作業で行なわれるすべての方法ステップは、細胞培養について、および臨床適用例の場合は患者にも、増大する感染危険性をもたらしてしまう。さらに、ヒトの細胞に関するすべての手作業については、実験室の担当者への感染の危険性が存在する。
【０００５】
培養面に接着する細胞を培養するのに好適な公知のバイオリアクタが存在する。そのようなバイオリアクタは、細胞が接着する、（たとえばＷＯ９６／４０８６０に記載の）二次元培養面または（たとえばＦＲ２７６８７８３Ａ１もしくはＷＯ０１／１４５１７Ａ１に記載の）三次元基質を含む。細胞は二次元培養面上に植え付けられ、増殖のために培養され、次に自己移植のために採取される。同様に細胞が植え付けられかつ培養される三次元基質は、通常はいわゆるエクスビボ臓器部分として直接に用いられる。バイオリアクタは、培地、気体交換および他の培養パラメータを予め定められた限界内に維持するための制御システムを備える。
【０００６】
品質管理費用および人件費は、完全に手作業での手順の代わりに上述のバイオリアクタを用いれば節約可能である。臨床適用例でのこれらのバイオリアクタの決定的な欠点は、利用可能な培養面によって細胞の増殖が限定されてしまうことである。可撓性の壁および培養面を含む、ＥＰ０７２５１３４およびＷＯ００６６７０６に従うバイオリアクタ、ならびに弾性壁を含むＷＯ００／１２６７６に従うバイオリアクタについても同じことが当てはまる。上記バイオリアクタにおける細胞増殖から得られる細胞数が限定されて十分でなく、したがって細胞をさらに増殖させる必要がある場合、細胞継代培養が再び必要となる。したがって、バイオリアクタは細胞の生態についての主な欠点を軽減することができない。なぜなら、継代培養の際、細胞はトリプシンおよび／または他の酵素と接し、それにより、不可逆かつ制御不可能な損傷を受けるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
培養面に接着する細胞の継代培養のためには、通常は細胞培養物から培地を分離し、これを酵素溶液で置換える。酵素の効果により、細胞が培養面から分離され、適用可能な場合は細胞は近隣の細胞からも分離され、これにより、酵素処理の結果、個別の細胞が懸濁される。次に、懸濁された細胞は洗浄され、通常はその前の培養面より大きくなるように選択される新しい培養面上に細胞密度をより低くして再び植え付けられ、細胞は培地でさらに増殖される。
【０００８】
培養面に接着する殆どの細胞タイプは、表面単位当りに、特に細胞タイプによって決まる細胞密度範囲内で異なる数で培養面上に存在する場合に最適に増殖することが公知である。相互の好ましい影響のためには細胞同士を互いから離し過ぎてはならず、増殖が妨げられないためには細胞同士を互いに近づけ過ぎてはならない。言及された細胞密度範囲外の細胞密度での培養では細胞は失われ、細胞増殖は減じられ、および／または加速された態様で細胞分化が変化してしまう。これらの理由により、培養中の細胞、特に細胞密度許容範囲が小さい細胞は比較的しばしば継代培養が必要である。
【０００９】
さらに上述されたように、酵素処理のために、継代培養は細胞にとっては大きな生物学的負担である。特に、継代培養の際に起こる細胞表面の成分の不可逆的変化は、培養される細胞の機能および分化に影響を及ぼし得る。
【００１０】
培養での細胞増殖の上述の知識から、細胞培養の改良は継代培養ステップを重視しなければならない、すなわち、細胞をよりしばしば継代培養し得るように、継代培養が細胞に与える負担を低減しなければならない、または、従来の意味での継代培養がもはや必要なくなるように公知の培養方法を変更しなければならないことがわかる。したがって、この発明の目的は、細胞が培養面に接着する培養で細胞を増殖させるための方法および装置を作り出すことである。この方法および装置は高い細胞増殖を可能にし、これにより、手作業での継代培養を含む公知の細胞培養方法と比較して、継代培養による細胞に対する全体的な負担がより低くなりながら、それにも拘らず、培養面上の細胞密度をより狭い範囲内に保てるようになる。さらに、この発明に従う方法および装置は、公知の方法および装置と比較して、汚染の危険性がより低く、かつ上皮細胞および結合組織細胞タイプを培養するのに特に好適である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的は、特許請求項に規定される方法および装置によって達成される。
【００１２】
この発明に従うと、増殖されるべき細胞が利用可能な培養面は、連続した細胞培養の間に拡大される。培養面のサイズの増大は、継代培養の場合とちょうど同じように、細胞増殖によって増大する細胞数に適合される。培養面の拡大のため、培養面に接着する細胞は培地から除去されない。培養面は、すべてのその領域で培養面に接着する細胞の間を最も少ない工程で拡大されるので、細胞増殖による細胞距離の減少はいわば連続的に補償され、細胞密度は本質的に一定のままであるか、または非常に狭い範囲内に維持される。これに代えて、細胞の一部を培養面から分離し、連続的にまたは小さな時間間隔で懸濁し、懸濁された細胞はまだコロニーを作っていない（colonized）さらなる培養面領域を利用できるようになる。培地を酵素溶液で置換える必要なく（たとえば機械的手段で）すべての細胞を培養面から分離し、同時に、まだコロニーを作っていない培養面領域をさらに細胞が利用できるようにすることによっても、同じことを達成することができる。
【００１３】
この発明に従うと、細胞は、それらが接着する培養面から分離されないか、または、これは、比較的頻繁な分離の場合ですら細胞に対する負担が許容可能な限界内に留まるようにより穏やかな手法で実行される。これにより、細胞が接着する培養面を公知の方法よりも少ない工程で拡大できるようになるか、または、本質的に連続的な態様で培養面を拡大できるようになる。これにより、公知の継代培養方法を用いて可能であるよりも変化の少ない細胞密度での細胞増殖が可能になる。この発明に従って行なわれる細胞培養では、公知の培養方法よりも多数の細胞が生き残るだけでなく、高い細胞増殖の場合ですら、公知の培養方法よりも細胞分化が変化しないことが認められる。細胞の機能および分化ならびにさらなる細胞特性が細胞培養の間の細胞密度に依存するという周知の事実は、この発明に従う方法および装置を用いることにより、選択された細胞密度に依存する予め規定された特徴を有する細胞を産生できるようになることを説明している。この発明に従う方法および装置により、公知の細胞培養方法よりも時間とともに変化しにくい細胞密度での細胞増殖が可能になるので、１つの細胞培養内での細胞特徴のばらつきがより少なくなる。細胞特徴のばらつきが少ないことは、多くの適用例にとって重要な実験的利点であるか、または、意義を達成するもしくは実験的なバックグラウンドのばらつきに反して解釈され得る何らかの結果を達成するための、実験結果の実験前提条件ですらある。
【００１４】
この発明に従う装置は、培地の中に位置決めされかつ細胞の接着に好適な培養面を含む。装置は、培養面が培地の中に位置決めされている間に培養面を拡大するための手段をさらに含む。この拡大手段は、培養面の拡大が、継代培養の場合とちょうど同じように、増殖による細胞数の増大に適合されるように制御される。装置は、公知のバイオリアクタと同様に、培地の周期的または連続的更新のための手段をさらに含む。適用可能な場合は、装置は、細胞の少なくとも一部を培養面から分離するための手段をさらに含む。
【００１５】
この発明に従って培養される細胞は、細胞生物学または分子生物学の適用例、自己移植、およびその他の適用例に好適である。
【００１６】
この発明に従う装置は、細胞増殖を予め規定された限界内に維持するように制御するため、または、予め規定された態様で培地を交換するために、たとえば散乱光の測定を介しておよび／または培養パラメータ（たとえば培地のｐＨ値）の測定を介して間接的に、細胞増殖をオンラインでモニタするための技術的手段と組合されてもよい。これにより、この発明に従う装置を、最も変化の激しい適用分野の要求に非常に柔軟に適合させることができる。
【００１７】
この発明に従う装置は、完全にもしくは部分的に使い捨てであるように、または再利用可能な装置となるように実現され得る。したがって、それらは、細胞培養研究、産業、診断、および臨床的になど、非常に異なる適用分野において用いられ得る。これにより、さまざまな適用分野における細胞および組織培養の、予測できないほどに単純、安全かつ安価な解決策がもたらされる。
【００１８】
この発明に従う装置は、細胞増殖の間に培養面を連続的または段階的に拡大するだけでなく、それを縮小させる可能性も切り開く。これは、全く新しい培養条件への道筋を開く。たとえば、細胞密度が変化する、複数細胞生物の臓器または組織の成長のインビトロ相（phase）をシミュレーションすることも可能になる。細胞密度または細胞間の距離をそれぞれ制御することにより、細胞培養および組織エンジニアリングについて、オートクリン因子による細胞同士の相互の影響および細胞間の接触を十分に活用することができる。
【００１９】
この発明に従う装置の培養面は、最適な細胞付着および／または所望の細胞もしくは組織の分化のため、それ自体公知の態様で前処理されてもよい。前処理は、たとえば、グロー放電もしくはプラズマ、特定の細胞外基質の分子もしくは細胞外基質の成分の混合物での被覆、フィーダ細胞による細胞外基質の層の生物学的構築、電荷密度の化学的変更、または、細胞受容体に適合されるシグナル分子および／もしくは官能基の結合などによって行なわれ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
この発明は、以下、この発明に従う装置の例示的な実施例を用いて説明されるが、示される実施例に限定されるものではない。
【００２１】
図１は、この発明に従う装置の例示的な実施例を示し、装置は、拡張可能な膜６の表面が構成する培養面１を含む。培養空間２は膜６の一方側に設けられ、培地の更新用の好適な供給および除去導管３を備える。後続の空間５が他方の膜側に位置し、気体または流体で充填され、たとえば、気体または流体圧を減じるためのプランジャ７を備える。
【００２２】
膜６は、培養空間２と後続の空間５との間に本質的に未拡張の状態で固定される。細胞５は、培養空間２に面する膜表面（培養面１）上に植え付けられ、培地で覆われる。媒質はそれ自体公知の態様で細胞培養の間に連続的または周期的に新しくされる。細胞培養の間に、膜６は、後続の空間５の中の圧力を連続的または周期的に減じることにより、連続的または周期的に（段階的に）拡張される。減圧により、膜６は変形してますます凹状になり、培養面１はそれとともに拡大する。
【００２３】
培養面１の凸状の変形および拡大は、後続の空間５の圧力を上昇させることにより同じ態様で実現され得る。
【００２４】
図１に従う装置の膜６、培養面１およびプランジャ７は、各々の場合、上述の参照番号で示される初期位置に示され、細胞培養の後の段階では、アポストロフィを含む同じ参照番号で示される（１′，６′，７′）。
【００２５】
図１に従う装置の膜６は、たとえば、細胞が培養されかつ増殖され得る、好ましくは４倍を超えて１０倍まで拡張可能な、歯科用の膜（たとえば、Ｄ−８９１２２ランゲナウ、ドイツ（D-89122 Langenau, Germany）のＲＯＥＫＯの「ノンラテックスデンタルダム（non-latex Dental Dam）」もしくは「フレキシダムノンラテックス（Flexi Dam non latex）」の商標名で入手可能な歯科用膜）またはいずれかの他の膜である。培養面の材料および構造は、細胞がこの表面に接着しかつその上で増殖するのを許すようなものである。この理由により、場合によっては、膜は、たとえばフィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチンなどによる被覆など、それ自体公知の方法を用いて被覆されるまたは変更される必要がある。
【００２６】
後続の空間５中で液体および気体透過膜６を用いることによって、後続の空間５を介して培養空間のガス供給（gassing）を行なってもよい。
【００２７】
図１に従う装置の培養空間２は、それ自体公知のシステムによって閉じられ、動作され得る。たとえば、培地は、供給および排出導管３を用いることにより、培養空間２を開くことなく交換される。さらに、培養パラメータを記録し制御するための測定システムを装置と一体化してもよい。図１に示されるような装置の例示的な実施例は、技術に合せてより好適な形態を有するように設計され得る。
【００２８】
図２Ａおよび図２Ｂは、細胞培養の開始（図２Ａ）および細胞培養の間（図２Ｂ）の段階の、この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例を示す。この実施例の培養面１は、その断面が上向きに増大し、多数の小さな粒子を含みかつコンテナ１２中に配置される容積体（volume）１３の上面によって形成される。コンテナ１２の中に、粒子容積体１３を上向きに押すのに好適な手段（たとえば押し器１５）が設けられ、これにより、この上面を構成する粒子間のさらなる粒子を押すことにより、その上面（培養面１）を拡大させる。培地を新しくするため、供給および除去導管３、ポンプ１６、供給コンテナ１７、および廃棄物コンテナ１８が設けられる。
【００２９】
初期状態（図２Ａ）に対して、図２Ｂには、培養面１′が拡大された状態の装置を示す。押し器１５′は上昇した位置にある。
【００３０】
図２Ａおよび図２Ｂに従う装置で用いられる粒子は、たとえば、ガラス、セラミック、プラスチック（たとえばポリウレタン）などからなる。粒子は、たとえば、球状、ロッド形状などであってもよく、典型的にはどの方向にも５ｍｍを超えないサイズを有する。
【００３１】
図３は、この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例を示し、装置は、その内側表面が培養面を構成する、たとえばスポンジなどの圧縮できる開孔体２２を含む。この内側表面は、体２２が押し器１５によって圧縮されている初期状態では小さい（開孔のうちごく少数しか開いていない）。細胞培養の間に、内側表面は開孔体の弛緩によって拡大し、これにより開孔の数が増加し、それらの内腔が拡大する。
【００３２】
圧縮および弛緩のため、圧縮できる開孔体２２（および２２′）は、たとえば、篩状の相互に変位可能な２つの担体プレート２３（および２３′）の間に配置され、それを通って妨げられない態様で培地が流れる。培地の交換は、培養空間２（および２′）を介して供給容器１７から廃棄物コンテナ１８の中へと行なわれる。
【００３３】
図４はこの発明に従う装置のさらなる例示的な実施例を示す。この実施例は、細胞が細胞分割の準備を整える際に、培養面から部分的に分離され、球体形状をとることに基づいている。この細胞状態では、培養面への接着は弱まり、細胞表面は、分割期にある細胞が比較的小さな剪断力、特に、細胞分割期にない細胞を分離するには弱過ぎる剪断力を用いて培養面から剥がされ得るように増大した剪断力により、係合される。次に、分離された細胞は、細胞培養のために新たに利用可能になった培養面上に植え付けられる。
【００３４】
細胞の一部のみを培養面から分離するために上記現象を活用することにより、さらなる増殖のためのより多くの付着空間を残余の細胞に与えるとともに、分離された細胞には、新たな培養面領域への付着の機会を与える。ここで、分離されたまたは残余の細胞のいずれも酵素処理による負担を被らない。なぜなら、細胞を分離するために酵素溶液を用いないからである。細胞を分離するのに必要な剪断力は、新たに利用可能になる培養面領域でコロニーを作ることができるように、分離された細胞を懸濁しかつ分散させる働きを同時に行なう培地の流れによって発生される。
【００３５】
図４に示されるこの発明に従う装置は、たとえば円筒状の培養空間２を含む。この中にも、両者ともが培地を透過する担体プレート２３とプランジャ３０との間で圧縮および弛緩される、圧縮できる開孔体２２が配置される。培養空間２の中でプランジャ３０がより高いところに位置決めされるにつれ、圧縮体２２はより弛緩される。すなわち、その内側培養面がより大きくなることを意味する。
【００３６】
細胞培養の間に上向きに変位されるプランジャ３０のアイドル位置は、圧縮体２２の細胞密度が常に予め規定された範囲内にあるように選択される。
【００３７】
部分的な細胞分離に必要な培地流れまたは波打ちは、圧縮体２２の瞬間的圧縮が短期間の間僅かに増大されるプランジャ３０のショック状の動きによって発生される。そのようなショック動は周期的に繰返され、ショックとショックとの間の時間は、完全な細胞分割サイクルのために培養細胞が必要とする時間、すなわち前期から終期の完了までの時間と少なくとも同じくらいのものである。
【００３８】
圧縮体２２の中で細胞分離に必要な培地波打ちを達成するため、その内部構造は、たとえば、主方向を培地の流れの方向に有する毛細管フィルタとして形成され得る。プランジャ３０の効率は、たとえば、その中に配置されるバルブメカニズムによってさらに高め得る。バルブメカニズムは、流れが強い場合（細胞分離のための波打ち）には閉じ、これに対し、通常の流れの場合（培地の交換）には開いたままである。
【００３９】
図４に示されるようなこの発明に従う装置を以下のように設計してもよい。培地を透過する２つの担体プレート２３と２４との間の円筒状培養空間２の中に圧縮できない開孔体２２を配置する。分裂中の細胞の分離に必要な剪断力は、たとえば、内腔の大きな供給および排出導管３を介してポンプ１６によって、またはプランジャ３０によって発生する。
【００４０】
図５は、この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例を示す。装置は、さまざまなレベルで培養空間２を通りかつその壁は酵素水溶液を透過する複数の導管４０が構成する培養面１を含む。導管４０は、入口側４１から出口側４２に流れる、酵素を含むまたは含まない媒質を個別におよび選択的に供給される。特定の導管４０から細胞を分離するため、酵素を含む媒質が導管を通って流され、導管壁を通って細胞の底側および細胞間接続部に達する。ここで、培養空間２に面する、すなわち導管壁と直接に接触しない細胞側の酵素溶液との接触は最小限に留まる。上記効果を高めるため、たとえば、用いる１つの酵素を抑制するために特化された抑制剤および／または血清などの酵素抑制剤を空間２の中の培地に加えてもよい。導管４０から分離されることにより、細胞４は本質的に酵素を含まない媒質の中に放出され、その中で細胞は増大した流れによって懸濁され、利用可能になったいくつかの導管４０上に分散されて再び植え付けられる。次に、培地の流れは、細胞が培養面１上に沈降し接着するまで停止される。
【００４１】
細胞培養を開始するため、最も下のレベルの導管４０上に細胞が植え付けられ、この導管レベルのみを培地で溢れさせる。これらの導管上の細胞が所望の細胞密度に達すると、酵素溶液が一時的に導管を通して流されて導管壁を通過し細胞に遭遇する。これにより、酵素の効果によって細胞を少なくとも部分的に分離する。酵素溶液の流れは、たとえば酵素溶液の代わりに培地を導管を通して流すことにより、細胞分離のすぐ後に停止される。空間２の中の培地はより迅速に循環されて、分離された細胞を懸濁し、かつ場合によっては培地の中に入り込んだ酵素を非活性化／中和および除去するために、より大きな流れを達成する。培養面（１および１″）は、第２のまたはさらなる導管レベル（さらなる培養面領域１″）を溢れさせるように空間２の培地レベルを上昇させることにより、分離された細胞を収容するように拡大される。培地の循環は、溢れさせた導管４０上にすべての細胞が再び接着するまで停止される。
【００４２】
図５に従う装置を用いると、細胞を分離するのに酵素溶液（たとえばトリプシン溶液）を用いる。しかしながら、この溶液は細胞の底側（培養面に接着する細胞の側）としか本質的に接触しないが、他の細胞側は依然として培地の中に位置決めされているので、酵素による細胞に対する負担は手作業での継代培養においてよりも遥かに低い。
【００４３】
図６は、この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例を示し、装置は、培養面から細胞を機械的に分離するための手段と、培養面を拡大するための手段とを含む。
【００４４】
培養面１は中空のシリンダの形状を有し、細胞は、プランジャ５１の端側に固定される好適に形作られたブレード５０を用いて分離される。プランジャは中空のシリンダの中で軸方向に変位可能である。細胞を分離するため、ブレード５０の代わりに、ブラシまたはゴムのスクレーパ（ゴムのポリスマン）を設けてもよい。
【００４５】
細胞を分離するため、プランジャ５１は培養空間２の中へ動かされる。培養面１を拡大するために（さらなる培養面領域１″の追加）、プランジャは中空のシリンダからさらに引っ込められる（位置５０′および５１′）。
【００４６】
この発明は、軟骨細胞培養の例を用いて以下に説明されるが、この細胞タイプに限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１
実施例１は、図１に図示されるような装置における細胞培養に関する。
【００４８】
歯科分野からの拡張可能膜を用いた（Hygienic（Ｒ）、NON-LATEX DENTAL DAM、Coltene/Whaledant Inc., USA）。さらに用いられた要素は、細胞培養実験室からの標準的材料であった。用いる装置は使い捨てプラスチックシリンジを用いて準備された。膜は滅菌リン酸緩衝食塩水で１０分間３回洗浄された。次に、膜は、各回１０分間、７０％エタノール中に３回位置決めされ、次に滅菌作業台上で乾燥された。装置は、滅菌手袋を用いて滅菌作業台に組立てられた。膜は、シリコンチューブ片の補助により、プラスチックシリンジの切断されたシリンダ上に固定された。
【００４９】
組立てられた装置は７０％エタノールで１５分間２回処理され、次にリン酸緩衝食塩水を用いて１０分間２回処理され、膜上に細胞を植え付ける前に、培地で１０分間２回処理された。細胞を植え付ける前に、シリンジプランジャと拡張可能膜との間の空間は、注射針を備えたシリンジを用いて培地で充填された。空間が気体を含まないように、かつ膜が平面を形成するように注意が払われた。
【００５０】
Ｌ−グルタミン酸塩および１０％の仔牛胎児血清（ハイクローン、ユタ州、ＵＳＡ）（HyClone, Utah, USA）を加えたＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１（ライフテクノロジイズ、バーゼル、スイス）（Life Technologies, Basel, Switzerland）を培地として用いた。ＣＯ2ガス供給をせずに細胞培養を実行できるようにするため、ＨＥＰＥＳ（ライフテクノロジイズ、バーゼル、スイス）を加えることによって緩衝液濃度を３５ｍＭに上昇させた。細胞は、トリプシン（ライフテクノロジイズ、バーゼル、スイス）を用いて培養面から分離された。
【００５１】
６ヶ月の仔牛の膝関節からの軟骨細胞をテスト細胞として用いた。軟骨細胞は、プロナーゼ（２．５ｍｇ／ｍｌ；ロッシュ、スイス（Roche, Switzerland））およびその後にコラゲナーゼ（２．５ｍｇ／ｍｌ；ロッシュ、スイス）を用いて関節軟骨から単離され、次に５％ＣＯ2のガス供給によりプラスチック培養瓶の中で１５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１０％仔牛胎児の血清を加えた培地Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２中で培養された。各々の場合、細胞は、合流に達すると、トリプシンを用いて培養面から分離され、新たな培養瓶の中に再び植え付けられた。細胞を以下の実験に用いる前に、細胞をこのようにして３回継代培養した。
【００５２】
軟骨細胞は、未拡張培養面１．８ｃｍ2上に１０，０００セル／ｃｍ2の密度で植え付けられた。培地として、３５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１０％の仔牛胎児血清を加えたＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２を用いた。装置は、小さなペトリ皿の蓋によって感染から保護された。プランジャの所望されない変位を防止するため、動脈クランプでプランジャロッドをしっかり固定した。培養のため、装置は３７℃に加熱された棚の中に置かれた。
【００５３】
細胞は手作業で植え付けられ、培地は手作業で新しくされた。軟骨細胞の培養の間、１０ｍｌシリンジのプランジャが毎日０．５ｍｌだけ下向きに引っ張られて、膜表面が段階的に拡大された。各々の場合、容積を補充するため０．５ｍｌの培地が培養空間に加えられた。対照装置には、同じように培地０．５ｍｌが加えられたが、プランジャはその初期位置に放置された。すなわち膜は拡張しなかった。
【００５４】
１０日後、リン酸緩衝食塩水で培養物を洗浄した。細胞はその後トリプシンで採取された。採取された細胞のうち、一部が実験前と同じ条件下でさらに培養され、倒立顕微鏡を用いて、次の４日間の形態に関して定性的に評価された。採取された細胞の別の部分はトリパンブルーで染色され、生きているおよび死んだ細胞の数を血球計で計数した。４％ホルムアルデヒド溶液を用いた洗浄の後、さらなる培養をインサイチューで固定し、次にマイヤーズ社（Mayers）のヘマルムで染色した。次に、拡張した膜を装置から注意深く除去した。装置から除去する際、膜はその元のサイズには戻らず、部分的に拡張したままであり、したがって平らではなかった。このため、膜を対物キャリア上に固定するためには膜を部分的に切開しかつカバーガラスで覆う必要があった。次に、膜に接着している細胞を検査し、落射型顕微鏡（epimicroscope）で写真撮影した。
【００５５】
実験の前後、ならびに（図７の未拡張膜上の）対照培養および（拡張した膜；図８）実験培養の完了後の培養物の細胞形態の定性的比較の結果、細胞の形態について明らかな相違はなかった。細胞数を判定する際に、死んだ細胞は観察されなかった。１０日後に生きている細胞の合計数を表１に示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
この結果は、細胞が拡張膜上で増殖したことを示す。拡張した膜（実験）上の細胞の形態は、未拡張膜（対照）上の細胞の形態と同等であった。拡張した膜から採取された細胞の数は、未拡張膜から採取された細胞の数のほぼ５倍であった。細胞をさらに培養しても、２つの細胞個体群間に細胞形態および細胞密度に関する相違は観察されなかった。これらの結果は、等しいが拡大していない培養面上で細胞を培養した場合と比較して、培養の間に培養面が拡大されれば軟骨細胞は同じ時間に遥かに多く増殖することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】この発明に従う装置の第１の例示的な実施例の断面図であり、装置は、拡張可能膜上に培養面を含む、図である。
【図２Ａ】この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例の断面図であり、装置は、多数の小さな粒子によって形成された培養面を含む、図である。
【図２Ｂ】この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例の断面図であり、装置は、多数の小さな粒子によって形成された培養面を含む、図である。
【図３】この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例の断面図であり、装置は、圧縮できる開孔体の内側表面によって形成される培養面を含む、図である。
【図４】この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例の断面図であり、装置は、培地の中に流れを発生させるための手段を含み、その流れによって細胞の一部が培養面から分離され、さらに装置は、分離された細胞によってコロニーが作られるさらなる培養面領域を培地で溢れさせるための手段を含む、図である。
【図５】この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例の断面図であり、装置は、酵素の助けによる細胞分離のための半透性壁を含む導管上の培養面と、分離された細胞によってコロニーが作られるようにさらなるそのような導管を培地で溢れさせるための手段とを含む、図である。
【図６】この発明に従う装置のさらなる例示的な実施例の断面図であり、装置は、培養面から細胞を機械的に分離するための手段と、分離された細胞によってコロニーが作られるさらなる培養面を培地で溢れさせるための手段とを含む、図である。
【図７】非拡張膜上に実施例１に従って増殖した細胞の顕微鏡写真の図である（着色：マイヤーズ社のヘマラム）。
【図８】細胞増殖の間に拡張する膜上に実施例１に従って増殖した細胞の顕微鏡写真の図である（着色：マイヤーズ社のヘマラム）。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月14日(2003.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
培地の中での細胞（４）のインビトロ増殖のための装置であって、細胞は培養面に接着し、前記装置は、培地によってその上または付近が溢れさせられる培養面（１）と、培養面の上またはその付近を溢れさせる培地を新しくするための手段とを含み、
装置は、培地によってその上またはその付近が溢れさせられる培養面（１）の連続的または段階的な拡大のための手段をさらに含み、前記手段は、継代培養とちょうど同じように、細胞増殖によって増加する細胞数に適合される培養面拡大のために制御されることを特徴とする、装置。
【国際調査報告】
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