(57)【要約】内皮細胞増殖を阻害するために有効なＤＮＡワクチンは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物を含有する。本発明は、ＶＥＧＦ受容体−２（ＫＤＲ、配列番号２）、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１、配列番号４）、又はＦｌｋ−１（ＫＤＲのマウス相同体、配列番号６）をコードするＤＮＡワクチン、それぞれ配列番号１、３及び５のＤＮＡ配列、ならびに腫瘍の微小環境において血管内皮細胞増殖を阻害するためにそのようなＤＮＡワクチンを使用する方法を提供する。血管新生を阻止し、その後の腫瘍の成長と転移を減少することを実現した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬適合性の担体中に、ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物を含有する、増殖内皮細胞に対する免疫応答を誘導するために有効なＤＮＡワクチン。
【請求項２】
上記ＶＥＧＦ受容体タンパク質がＶＥＧＦ−２受容体タンパク質である、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項３】
上記ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ；配列番号２）、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１；配列番号４）、Ｆｌｋ−１（配列番号６）、及びそれらと少なくとも約８０％の相同性を共有するその機能的等価物から成る群より選択される、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４】
上記ＤＮＡ構築物が裸のＤＮＡ構築物である、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５】
上記ＤＮＡ構築物がプラスミドベクターに作動可能に組み込まれている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項６】
上記ＤＮＡ構築物が弱毒化細菌ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項７】
上記弱毒化細菌ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ＢＣＧ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、及びカンピロバクター菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）から成る群より選択される、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項８】
上記弱毒化細菌ベクターが弱毒化ネズミチフス菌である、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項９】
上記ＤＮＡ構築物が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及びそれらと少なくとも約８０％の相同性を共有するその機能的相同体から成る群より選択されるポリヌクレオチド配列を有する、実質的に精製されたＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１０】
上記ＤＮＡ構築物が弱毒化ネズミチフス菌ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項９に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１１】
ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物及びそのための医薬適合性の担体を含有する、有効な免疫応答誘導量のＤＮＡワクチンを哺乳動物に投与する段階を含み、それによって上記哺乳動物が、ワクチンによって誘導される、増殖内皮細胞に特異的な免疫応答を示す、哺乳動物において内皮細胞増殖を阻害する方法。
【請求項１２】
上記哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ；配列番号２）、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１；配列番号４）、Ｆｌｋ−１（配列番号６）、及びそれらと少なくとも約８０％の相同性を共有するその機能的相同体から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
上記ＤＮＡ構築物が弱毒化細菌ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
上記弱毒化細菌ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌、チフス菌、赤痢菌属、バチルス属、乳酸杆菌属、ＢＣＧ、大腸菌、コレラ菌、及びカンピロバクター菌から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記弱毒化細菌ベクターが弱毒化ネズミチフス菌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記ワクチンを経口的に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物及びそのための医薬適合性の担体を含有する、免疫学的に有効な量のＤＮＡワクチンを哺乳動物に投与することを含み、それによって上記哺乳動物が、ワクチンによって誘導される、増殖内皮細胞に特異的な免疫応答を示し、血管形成の阻害を生じさせる、哺乳動物において血管新生を阻害する方法。
【請求項１９】
上記哺乳動物がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ；配列番号２）、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１；配列番号４）、Ｆｌｋ−１（配列番号６）、及びそれらと少なくとも約８０％の相同性を共有するその機能的相同体から成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
上記ＤＮＡ構築物が弱毒化細菌ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
上記弱毒化細菌ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌、チフス菌、赤痢菌属、バチルス属、乳酸杆菌属、ＢＣＧ、大腸菌、コレラ菌、及びカンピロバクター菌から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記弱毒化細菌ベクターが弱毒化ネズミチフス菌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
上記ワクチンを経口的に投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物及びそのための医薬適合性の担体を含有する、免疫学的に有効な量のＤＮＡワクチンを哺乳動物に投与することを含み、それによって上記哺乳動物が、ワクチンによって誘導される、増殖内皮細胞に特異的な免疫応答を示し、腫瘍増殖の停止、腫瘍の大きさの縮小、又は腫瘍播種性転移の阻害を生じさせる、哺乳動物において腫瘍増殖を阻害する方法。
【請求項２６】
上記哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ；配列番号２）、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１；配列番号４）、Ｆｌｋ−１（配列番号６）、及びそれらと少なくとも約８０％の相同性を共有するその機能的相同体から成る群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
上記ＤＮＡ構築物が弱毒化細菌ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
上記弱毒化細菌ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌、チフス菌、赤痢菌属、バチルス属、乳酸杆菌属、ＢＣＧ、大腸菌、コレラ菌、及びカンピロバクター菌から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記弱毒化細菌ベクターが弱毒化ネズミチフス菌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
上記ワクチンを経口的に投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
上記ワクチンを特定する印刷物を担い、上記ワクチンの患者への個々の投与に有用な情報を提供するラベルが貼付された密封滅菌容器内に包装されている、請求項１に記載のワクチンを含む工業製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
本発明は、契約第５−７０３７３−ＣＯＬＯＮ号の下に国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）による政府援助を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、増殖内皮細胞に対する免疫応答を誘導するために有効である適切な分子をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチンに関する。より特定すると、本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体をコードするＤＮＡワクチンに関する。本発明はまた、血管内皮細胞増殖、腫瘍増殖及び血管新生を阻害するために上記ＤＮＡワクチンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、疾患の病原体を、それらが増殖して病的作用を引き起こしうる前に破壊するように生物の免疫系を刺激する予防薬剤の極めて限られた投与により、多くの疾患状態に対して長期的な防御を与えるために使用されてきた。ワクチン及びワクチン接種への様々なアプローチが、Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｒ．ＧｌｉｃｋとＪａｃｋ  Ｊ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，第２版、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  ｐ．２５３−２７６（１９９８）に述べられている。
【０００４】
ワクチン接種は、自らの身体の免疫系を、感染因子が病的応答を引き起こす前にそれを捜し出して破壊するように誘導する手段である。典型的には、ワクチンは、生であるが弱毒化した感染因子（ウイルス又は細菌）又は死滅形態の感染因子のいずれかである。生細菌又はウイルスから成るワクチンは非病原性でなければならない。典型的には、細菌又はウイルス培養物を物理的又は化学的処理によって弱毒化する。該因子は非ビルレントであるが、そのワクチンで処置した被験対象においてまだ免疫応答を誘導することができる。
【０００５】
免疫応答は、抗原、すなわち特異高分子又は感染因子のいずれかによって誘導される。これらの抗原は一般に、Ｂ細胞及びＴ細胞として知られるリンパ球によって「外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）」と認識されるタンパク質、多糖類、脂質又は糖脂質である。どちらの型のリンパ球も、抗原に暴露されると速やかな細胞分裂と分化応答を誘導し、暴露リンパ球のクローンの形成を生じさせる。Ｂ細胞は形質細胞を産生し、それが今度は抗体（Ａｂ）と呼ばれるタンパク質を生成して、抗体が感染因子上に存在する抗原と選択的に結合し、それによって病原体を中和する又は不活性化する（体液性免疫）。一部の場合、Ｂ細胞応答はＣＤ４ヘルパーＴ細胞の助けを必要とする。
【０００６】
抗原暴露に応答して形成される特殊なＴ細胞クローンは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり、これは抗原を提示する病原体及び組織に結合してそれらを排除することができる（細胞媒介性又は細胞性免疫）。一部の場合、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、エンドサイトーシスによって病原体又は他の外来性細胞を被包する。次にＡＰＣは細胞から抗原をプロセシングして、これらの抗原を組織適合性分子：ペプチド複合体の形態でＣＴＬ上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示し、それによって免疫応答を刺激する。
【０００７】
特異抗体の形成を特徴とする体液性免疫は一般に急性細菌感染及びウイルスからの反復感染に対して最も有効であり、一方、細胞媒介性免疫はウイルス感染、慢性細胞内細菌感染及び真菌感染に対して最も有効である。細胞性免疫はまた、癌に対して防護し、臓器移植の拒絶反応の原因になることが知られている。
【０００８】
事前の感染からの抗原に対する抗体は、非常に長い期間にわたって血液中で検出可能なままであり、それ故病原体への事前暴露を判定する手段を提供する。同じ病原体に再び暴露したとき、免疫系は、病原体が増殖して病的応答を生じうる前に病原体を排除することによって再感染を有効に予防する。
【０００９】
病原体によって誘導される同じ免疫応答がまた、時として、同じ抗原を病原体として提示する非病原性因子によって生じることがある。このようにして、被験対象は、以前に感染を撃退していなかった病原体へのその後の暴露に対して防護されうる。
【００１０】
しかしながら、必ずしもすべての感染因子がワクチン生成の必要に応じて容易に培養でき、不活性化できるわけではない。現代の組換えＤＮＡ手法は、この限界を克服することを目指す新しいワクチンの構築を可能にした。病原性遺伝子を持たない、それ故生の非ビルレント形態の生物をワクチンとして使用することを可能にする感染因子を創製することができる。また、病原性担体の細胞表面抗原を提示する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような比較的病原性の低い生物を構築することも可能である。そのような形質転換担体で処置した被験対象の免疫系は、病原体に対する抗体を形成するように「だまされる（ｔｒｉｃｋｅｄ）」。病原因子の抗原タンパク質を構築し、非病原種において発現させることができ、その抗原タンパク質を単離し、精製して、「サブユニットワクチン」を生産することができる。サブユニットワクチンは、安定であり、安全であって、化学的に十分に定義されているという点で有利である：しかしながら、それらの生産は禁止も同然なほどコストがかかることがある。
【００１１】
近年、広く遺伝学的免疫（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）と称される、ワクチンへの新しいアプローチが出現した。このアプローチでは、病原因子の抗原をコードする遺伝子を、免疫する被験対象の体内の細胞に作動可能に挿入する。処置細胞は形質転換され、病原体の抗原タンパク質を生産する。これらのインビボで生産した抗原は、その後、宿主における所望免疫応答の引き金となる。そのような遺伝学的ワクチンにおいて使用される遺伝物質はＤＮＡ又はＲＮＡ構築物でありうる。しばしば該抗原をコードするポリヌクレオチドは、該遺伝子の挿入、複製又は発現を高めるために他のプロモーターポリヌクレオチド配列と組み合わせて導入される。
【００１２】
抗原遺伝子をコードするＤＮＡワクチンは、様々な発現系によって被験対象の宿主細胞に導入することができる。これらの発現系は、原核生物、哺乳動物及び酵母発現系を含む。例えば、１つのアプローチは、宿主細胞に接種するために、新たな遺伝物質を組み込んだワクシニアウイルスなどのウイルスベクターを利用することである。あるいは、遺伝物質を「裸の」ポリヌクレオチドとして、すなわち単に精製ＤＮＡとして、ベクターに組み込むか又は宿主細胞に直接送達することができる。さらに、ＤＮＡをネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの弱毒化細菌に安定にトランスフェクトすることができる。患者が形質転換したサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）で経口的にワクチン接種されるとき、細菌は腸のパイアー斑（すなわち二次リンパ系組織）へと輸送されて、その後免疫応答を刺激する。
【００１３】
ＤＮＡワクチンは、遺伝病及び癌のような、伝統的病原体によって引き起こされるのではない疾患状態に対して免疫する機会を提供する。典型的には、遺伝学的癌ワクチンにおいては、特定の型の腫瘍細胞に対する抗原を単離して、ワクチンに導入しなければならない。多くの癌に対する有効な一般的ワクチンは、それ故、それに対して免疫する各々の型の癌細胞について数多くの個別ワクチンの開発を必要とすると考えられる。
【００１４】
腫瘍の治療への１つの一般的なアプローチは、増殖腫瘍を有する患者に血管新生阻害性化合物を投与することを含む。血管新生は新しい毛細管及び血管が形成される過程である。血管新生は、胚発生、組織成長、組織修復及び組織再生において重要である。これらの正常で基本的な過程に加えて、血管新生はまた、腫瘍増殖、腫瘍転移、及び糖尿病性網膜症のような眼血管疾病などの多くの異常な病的過程にも関与する。
【００１５】
血管新生は、（ａ）血管内皮細胞の活性化、（ｂ）プロテアーゼ活性を示す内皮細胞による細胞基質タンパク質の分解、（ｃ）潜在的増殖部位への内皮細胞の移動、（ｄ）内皮細胞の増殖、及び（ｅ）内皮細胞の分化による管形成を含む、いくつもの相互依存的過程を包含する。これらの過程の各々が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などの様々なプロモーター物質によって影響される。血管内皮細胞増殖因子（集合的にＶＥＧＦ）は内皮細胞増殖及び分化において決定的な役割を果たす。ＶＥＧＦは、内皮細胞膜に存在する受容体タンパク質−チロシンキナーゼに結合することによって作用し、それが次に、細胞増殖を刺激するシグナル伝達反応のカスケードを開始させる。
【００１６】
病的血管新生の阻害は腫瘍のための治療として提案された。例えば、Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｃｎｅ，２２１，７１９（１９８３）参照。そのような治療の基本的概念は、腫瘍が増殖するためには新生血管形成を必要とするので、血管新生阻害性化合物の投与を通して血管形成を阻害することは、腫瘍の血液供給を枯渇させることによって腫瘍増殖を妨げるというものである。このアプローチの難点は、腫瘍増殖を防ぐために血管新生阻害因子を比較的持続的なベースで投与しなければならないことである。阻害因子の供給送達の停止は腫瘍増殖の再開を導きうる。血管新生を阻害する上で有効なワクチンは、腫瘍形成に対する魅力的な予防薬となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
特定腫瘍抗原を標的することを必要とせずに様々な腫瘍の増殖も阻害することができる、血管新生に対する免疫のための一般的に有効なワクチンが引き続き求められている。本発明は、この要求を満たしている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
内皮細胞増殖を阻害するために有効なＤＮＡワクチンは、ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物を含有する。該ＤＮＡワクチンは、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ；配列番号２）、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１；配列番号４）、及びＦｌｋ−１（配列番号６、ＫＤＲのマウス相同体）などの、ＶＥＧＦについての受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えばそれぞれ配列番号１、配列番号３及び配列番号５のＤＮＡ配列を含有する。該ワクチンは、精製ＤＮＡ構築物などの線状核酸、又はプラスミドベクターに組み込まれたＤＮＡ構築物を含有しうる。本発明のＤＮＡワクチンは、ＶＥＧＦＲ−２を過剰発現する増殖内皮細胞に対して活性なＣＴＬの形成を刺激する。
【００１９】
内皮細胞は哺乳動物血管組織の内層を形成する。内皮細胞の増殖は血管新生の鍵となる過程である。本発明のワクチンは、増殖内皮細胞に対する免疫応答を誘導することにより、ワクチンで処置した生物において血管新生の長期的な阻害を生じさせる方法を提供する。確立された血管の内層のような非増殖性内皮細胞は、有意の量のＶＥＧＦ受容体抗原を提示せず、それ故ワクチンに応答して産生されるＣＴＬによって実質的に影響を受けないままである。
【００２０】
本発明の１つの方法の局面では、ワクチン接種した患者において内皮細胞増殖の長期的阻害を提供するためにＤＮＡワクチンを使用する。１つの方法の実施態様では、ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするポリヌクレオチド構築物を含有するＤＮＡワクチンを、内皮細胞増殖の阻害を必要とする患者に、増殖内皮細胞に対する免疫応答を誘導するために十分な量で経口投与する。
【００２１】
本発明はまた、該ＤＮＡワクチンで予防接種した患者において血管新生を阻害する方法を提供する。そのような方法の実施態様では、免疫応答を誘導する量の、ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物を含有するワクチンを、血管新生関連疾患に罹患している患者に投与する。
【００２２】
本発明のさらにもう１つの方法の局面では、ＤＮＡワクチンを患者に接種することによって腫瘍増殖を阻害する。そのような方法の実施態様では、免疫応答を誘導する有効量の、ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物を含有するワクチンを、増殖性腫瘍を有する患者に投与する。ワクチン接種は腫瘍増殖の停止を生じさせる。患者の免疫系による増殖内皮細胞の破壊は腫瘍の新血管形成を妨げ、本質的に腫瘍を飢餓状態にして死滅へと至らせる。
【００２３】
本発明の方法の実施態様では、該ＤＮＡワクチンは、経口投与のように経腸的に、あるいは注射又は静脈内注入のように非経口的に投与することができる。
【００２４】
本発明のワクチンは、多くの疾患状態の治療及び予防のために有用である。例えば、癌、糖尿病性網膜症等に罹患している患者は、本発明のワクチンによる免疫から恩恵を受けることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
内皮細胞増殖を阻害するために有効なＤＮＡワクチンは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物を含有する。本文中及び特許請求の範囲の中で使用する「ＤＮＡ構築物」の語は、標的細胞において転写されうる合成ＤＮＡ構造を意味する。該構築物は、精製ＤＮＡなどの線状核酸、又は好ましくはプラスミドベクターに組み込まれたＤＮＡを含有しうる。該ＤＮＡはまた、ウイルス又は細菌ベクター、好ましくは非病原性である弱毒化ウイルス又は細菌ベクターに組み込むこともできる。適切なＤＮＡは、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ；配列番号２）、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１；配列番号４）、及びＦｌｋ−１（配列番号６、ＫＤＲのマウス相同体）などのＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードするもの、例えばそれぞれ配列番号１、配列番号３及び配列番号５のＤＮＡ配列である。
【００２６】
ＶＥＧＦ−１（ＶＥＧＦ−Ａとしても知られる）、ＶＥＧＦ−２（ＶＥＧＦ−Ｃとしても知られる）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｄ及びＶＥＧＦ−Ｅを含む５つのＶＥＧＦ亜型が特定されている。例えば、Ａｃｈｅｎらへの米国特許第６，２３５，７１３号及びその中で引用されている参考文献参照。ＶＥＧＦ受容体は、内皮細胞に特異的なタンパク質−チロシンキナーゼである。Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦ受容体１；ＶＥＧＦＲ−１）、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、Ｆｌｋ−１（ＫＤＲのマウス相同体）、Ｆｌｔ−４（ＶＥＧＦＲ−３）、Ｔｉｅ、Ｔｉｅ−２及びＴｅｋを含む、内皮細胞に特異的ないくつかの受容体タンパク質−チロシンキナーゼが特定されており、その内のいくつかはＶＥＧＦ受容体である。
【００２７】
本発明のＤＮＡワクチンは、ＶＥＧＦＲ−２を過剰発現する増殖内皮細胞に対して活性なＣＴＬの形成を刺激する。ＶＥＧＦ受容体は実質的に増殖内皮細胞上でのみ発現されるので、ワクチンに応答して形成されるＣＴＬは、実質的に、活発な血管新生（例えば新血管形成）が起こっている組織だけを標的する。確立された血管の内層のような非増殖性内皮細胞は実質的にＶＥＧＦ受容体抗原を欠如しており、それ故ワクチンが誘導するＣＴＬによって影響されない。
【００２８】
好ましい実施態様では、該ＤＮＡワクチンは、ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするポリヌクレオチドを配列を含有する。このワクチンは、樹状細胞の介入を通して、直接及び間接的に天然Ｔ細胞の活性化を促進することができる。
【００２９】
ここで使用するとき、「免疫（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」の語は、ビルレント形態の感染因子又は腫瘍抗原に対する長期的な免疫学的防御を指す。「免疫法（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」は、処置した被験対象において病原体に対する免疫を生じさせる、非ビルレントソースから誘導した病原因子の抗原に対する予防的暴露を指す。
【００３０】
本発明のＤＮＡ構築物は、好ましくは遺伝子発現に必要な調節エレメントに作動可能に連結されたＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
有用なＤＮＡ構築物は、好ましくはヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。そのようなエレメントは、例えば、プロモーター、開始コドン、終結コドン及びポリアデニル化シグナルを包含する。さらに、免疫原性標的タンパク質をコードする配列の発現のためにしばしばエンハンサーが必要とされる。当技術分野で既知であるように、これらのエレメントは、好ましくは所望タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される。調節エレメントは、好ましくはそれらが投与される種において作動可能であるように選択される。
【００３２】
開始コドン及び終結コドンは、好ましくは本発明の遺伝子ワクチン中に、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部として含まれる。開始及び終結コドンはコード配列を有するインフレームでなければならない。
【００３３】
本発明のワクチンに含まれるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、好ましくは免疫される被験対象の細胞内で機能性であるように選択される。
【００３４】
本発明のワクチンにおいて、特にヒト用の遺伝子ワクチンの生産において有用なプロモーターの例は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）からのプロモーター、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明のワクチンにおいて、特にヒト用の遺伝子ワクチンの生産において有用なポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントも該ＤＮＡ分子に含めることができる。そのような付加的なエレメントはエンハンサーを包含する。エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、及びＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶなどからのウイルスエンハンサーでありうる。
【００３７】
調節配列及びコドンは一般に種依存性であり、それゆえタンパク質産生を最大化するためには、調節配列及びコドンは、好ましくは免疫される種において有効であるように選択される。当業者は、所与の被験対象種において機能性であるＤＮＡ構築物を生産することができる。
【００３８】
本発明のワクチンのＤＮＡ構築物は、その関連する開示が参照してここに組み込まれる、Ｒｅｓｔｉｆｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，８９−９２（２０００）において定義されているような「裸の（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡでありうる。あるいは、該ＤＮＡはベクターに作動可能に組み込むことができる。有用な送達ベクターは、生分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）又はリポソーム、及びウイルス又は細菌などの遺伝子操作された弱毒化生ベクターを包含する。
【００３９】
適切な弱毒化生細菌ベクターの例は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、又は当技術分野で既知である他の何らかの適切な細菌ベクターを含む。生細菌ベクターを外因性ＤＮＡ構築物で形質転換する方法は当技術分野において広く記述されている。例えば、Ｊｏｓｅｐｈ  ＳａｍｂｒｏｏｋとＤａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）参照。
【００４０】
好ましいウイルスベクターは、バクテリオファージ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス、及びアビポックス（Ａｖｉｐｏｘ）を含む。ウイルスベクターを外因性ＤＮＡ構築物で形質転換する方法も当技術分野において広く記述されている。上記ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ参照。
【００４１】
リポソームベクターは、脂質親和性物質で形成される膜部分と内部水性部分を有する、単層又は多重層小胞である。水性部分は、標的細胞に送達するポリヌクレオチド物質を含有するために本発明において使用される。リポソーム形成物質は、第四アンモニウム基などのカチオン基、及び約６個から約３０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アルキル基などの１又はそれ以上の親油基を有することが一般に好ましい。適切な物質の１つの群は、その関連する開示が参照してここに組み込まれる、欧州特許公開第０１８７７０２号に述べられており、Ｗｏｌｆｆらへの米国特許第６，２２８，８４４号の中でさらに論じられている。多くの他の適切なリポソーム形成カチオン脂質化合物が文献において記述されている。例えば、Ｌ．Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：３９１７−３９２５（１９８８）；及びＨ．Ｅｉｂｌら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０：２６１−２７１（１９７９）参照。あるいは、ポリアクチド−コグリコリド生分解性ミクロスフェアなどのミクロスフェアが使用できる。核酸構築物は、当技術分野で既知のように、組織への核酸の送達のために被包されるか又はさもなければリポソーム又はミクロスフェアと複合される。
【００４２】
本発明のこの方法の局面は、ＤＮＡポリヌクレオチドをヒトなどの哺乳動物の組織に投与する段階を含む。一部の好ましい実施態様では、ＤＮＡポリヌクレオチドを経口的、筋肉内、鼻内、腹腔内、皮下、皮内又は局所的に投与する。
【００４３】
本発明の１つの方法の局面では、ＤＮＡワクチンを、該ワクチンで処置した患者において内皮細胞増殖の長期的阻害を提供するために使用することができる。１つの好ましい方法の実施態様では、ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするポリヌクレオチド構築物を含有するＤＮＡワクチンを、増殖内皮細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で、内皮細胞増殖の阻害を必要とする哺乳動物に投与する。
【００４４】
本発明はまた、該ＤＮＡワクチンで処置した哺乳動物において血管新生を阻害する方法を提供する。そのような方法の実施態様では、ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物を含有するワクチンを、増殖内皮細胞に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で、血管新生関連疾患に罹患している哺乳動物に投与する。
【００４５】
本発明のさらにもう１つの方法の局面では、ＤＮＡワクチンで哺乳動物を処置することによって腫瘍増殖を阻害する。そのような方法の実施態様では、免疫応答を誘導する有効量の、ＶＥＧＦ受容体タンパク質を作動可能にコードするＤＮＡ構築物を含有するワクチンを、増殖性腫瘍を有する哺乳動物に投与する。ワクチンによる処置は、増殖内皮細胞に対して哺乳動物を免疫することにより、腫瘍増殖の停止を生じさせる。哺乳動物の免疫系による増殖内皮細胞の破壊は、腫瘍の新血管形成を妨げるか又は少なくとも最小限に抑える。
【００４６】
本発明の方法の実施態様では、該ワクチンは、経口投与のように経腸的に、又は筋肉内注射によって投与することができる。好ましくは、本発明のワクチンで処置する哺乳動物はヒトである。肺癌又は結腸癌などの癌、又は前立腺腫瘍、糖尿病性網膜症等に罹患している患者は、本発明のワクチンによる免疫から恩恵を受けることができる。
【００４７】
本発明のワクチンは、好ましくは、水、食塩水、デキストロース、グリセロール等、及びそれらの組合せのような医薬適合性の担体又は賦形剤と共に製剤される。該ワクチンはまた、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等のような補助物質を含有しうる。
【００４８】
本発明のワクチンは、好ましくは、約１μｇから約１０μｇ／ｍｌの範囲内のＤＮＡ濃度で、医薬適合性の担体中の溶液又は懸濁液として、ヒトなどの哺乳動物に経口投与される。適切な用量は、ワクチン接種する被験対象、及び一部にはワクチンを投与する又は投与を要求する開業医の判断に依存する。
【００４９】
本発明のワクチンは、多回用量又は単位投与量形態で、アンプル、ビン又はバイアルなどの適切に滅菌された容器に包装されうる。容器はワクチン製剤で満たされた後、好ましくは密封される。好ましくは、該ワクチンは、該ワクチンを特定し、適用法令の下での該ワクチンの認可を反映する米国食品医薬品局などの政府当局によって規定された形態の告知書、投薬情報等を担うラベルが貼付された容器に包装される。そのラベルは、好ましくはワクチンを患者に投与する保健医療の専門家にとって有用な該ワクチンについての情報を含む。包装はまた、好ましくは、ワクチンの投与に関する印刷された情報資料、指示書、説明書、及び他の必要な警告も含む。
【００５０】
好ましくは、本発明のためのワクチンは、例えばＦｌｔ−１、ＫＤＲ、Ｆｌｋ−１及びその機能性相同体を含む、内皮細胞に特異的なチロシンキナーゼなどの１又はそれ以上のＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含有する。機能性相同体は、好ましくは上記ＶＥＧＦ受容体タンパク質と少なくとも約８０％の相同性を共有する。
【００５１】
ＶＥＧＦ受容体タンパク質のアミノ酸配列は、これらのタンパク質をコードする核酸配列と同様に、当技術分野において開示されている。ＫＤＲをコードする核酸配列（図１、配列番号１）及びその対応するタンパク質配列（図２、配列番号２）は、その開示が参照してここに組み込まれる、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ，ＵＫのＥＭＢＬデータベースにおいて、Ｙｕらによって公表された（ＥＭＢＬアクセッション番号はＥＭＢＬ：ＡＦ０６３６５８である）。Ｆｌｔ−１をコードする核酸配列（図３、配列番号３）及びその対応するタンパク質配列（図４、配列番号４）は、その開示が参照してここに組み込まれる、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ，ＵＫのＥＭＢＬデータベースにおいて、Ｙｕらによって公表された（ＥＭＢＬアクセッション番号はＥＭＢＬ：ＡＦ０６３６５７である）。Ｆｌｋ−１をコードする核酸配列及びその対応するタンパク質配列は、その関連する開示が参照してここに組み込まれる、Ｍａｔｈｅｗｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９１，８８：９０２６−９０３０によって公表され、その構造がＱｕｉｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９１，９０：７５３３−７５３７によって訂正された。Ｆｌｋ−１の訂正されたＤＮＡ配列を図５に配列番号５として提示し、Ｆｌｋ−１の訂正されたタンパク質配列を図６に配列番号６として示している。
【００５２】
遺伝子コードの固有の縮重により、ＫＤＲ、Ｆｌｋ−１及びＦｌｔ−１などのＶＥＧＦ受容体タンパク質と実質的に同じか又は機能的に等価のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が本発明の実施において使用できる。そのようなＤＮＡ配列は、ＶＥＧＦ受容体配列にハイブリダイズすることができるものも包含する。好ましくはＶＥＧＦ受容体タンパク質ＤＮＡの機能的に等価の相同体は、上記ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードするＤＮＡと少なくとも約８０％の相同性を共有する。
【００５３】
本発明に従って使用できる変化したＤＮＡ配列は、同じか又は機能的に等価の遺伝子産物をコードする配列を生じる、種々のヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含む。遺伝子産物自体がＶＥＧＦ受容体配列内にアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含んでもよく、それが沈黙変化をもたらし、その結果機能的に等価のＶＥＧＦ受容体タンパク質を生じる。そのようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいて行われうる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む；正に荷電したアミノ酸はリシン及びアルギニンを含む；類似親水性値を有する非荷電極性頭部基を持つアミノ酸は次のものを含む：ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシン。ここで使用するとき、機能的に等価のＶＥＧＦ受容体とは、ＶＥＧＦ受容体又はそのフラグメントに結合するが、必ずしもその対応物である天然ＫＤＲ、Ｆｌｋ−１又はＦｌｔ−１と同じ結合親和性ではない受容体を指す。
【００５４】
本発明のＤＮＡ配列は、遺伝子産物のプロセシング及び発現を修飾する変化を含むがそれに限定されない、様々な目的のためにＶＥＧＦ受容体コード配列を変化させるように構築しうる。例えば、新しい制限部位を挿入するため、グリコシル化パターン、リン酸化等を変化させるために、当技術分野において周知の手法、例えば位置指定突然変異誘発を用いて突然変異を導入しうる。
【００５５】
マウスＦｌｋ−１（配列番号６）はヒトＫＤＲ（配列番号２）と約８５％の相同性を共有し、マウスの生理においてヒトにおけるＫＤＲの役割と類似した役割を果たす。実際に、ＶＥＧＦＲ−２はしばしばＫＤＲ／Ｆｌｋ−１と称され、これら２つのＶＥＧＦ受容体相同体間の密接な相似性を反映する。この理由から、Ｆｌｋ−１をコードする本発明のＤＮＡワクチン（例えば配列番号５のＤＮＡ）によるマウスの処置を、ＫＤＲをコードするヒトＤＮＡワクチンについての適切なモデルとして選択した。
【００５６】
下記の実施例は、本発明の特徴及び実施態様をさらに説明するために提供するものであり、限定を意味しない。
【００５７】
試験材料、方法及び実施例
試験材料。Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊ及びＢａｌｂ／ＣマウスをＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ繁殖施設より入手した。評価のために使用したマウス腫瘍細胞系統は、黒色腫細胞系Ｂ１６及び結腸癌細胞系ＣＴ２６を含み、それらはすべてＤｒ．Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ，ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸより入手した。マウスルイス肺癌細胞系統Ｄ１２１はＤｒ．Ｌｅａ  Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ，Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌより入手した。Ｆｌｋ−１をコードするＤＮＡはＤｒ．Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）の好意により提供され、これを、制限部位ＫｐｎＩ及びＸｂａｌを用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａより提供されたｐｃＤＮＡ３．１真核生物発現ベクターにクローニングした。ネズミチフス菌の弱毒化菌株は、Ｂ．Ａ．Ｄ．Ｓｔｏｃｋｅｒ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）によって提供された。抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡより入手した。Ｔ−ＳＴＩＭ培養サプリメントはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡより入手した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲより入手した。ＦＩＴＣ標識及びＰＥ標識抗体を製造者の推奨プロトコールに従って作製した。
【実施例１】
【００５８】
Ｆｌｋ−１をコードするＤＮＡワクチンの調製
Ｆｌｋ−１  ＤＮＡ（配列番号５；約１０ｐｇから約０．１μｇのＤＮＡ）を含むｐｃＤＮＡ３．１ベクターを、製造者の推奨手順に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｕｌｓｅｒを２．５ｋＶ、２５μＦ及び２００オームで使用して、新鮮調製した弱毒化ネズミチフス菌に電気穿孔した。該ベクターを含むネズミチフス菌をアンピシリン含有平板上で選択した。その翌日コロニーを採取し、アンピシリンを添加したＬＢ肉汁（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中で一晩培養した。細菌を単離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗った。次に、洗浄した細菌をＰＢＳ１ミリリットル当り約１×１０９組換えネズミチフス菌の濃度でＰＢＳ媒質に懸濁した。該ワクチンを使用時まで密封アンプルで保存した。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターだけ（Ｆｌｋ−１  ＤＮＡなし）で形質転換したネズミチフス菌から成る「対照ワクチン」も同じ手順に従って調製した。ネズミチフス菌を形質転換するまでプラスミドＤＮＡを約−８０℃で保存した。
【実施例２】
【００５９】
Ｆｌｋ−１をコードするＤＮＡワクチンによるマウスのワクチン接種
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（各処置群当り約６匹のマウス）に、２週間の間隔をおいて３回、経口栄養により実施例１のＤＮＡワクチン（約１００μｌのＰＢＳ中約１×１０８組換えネズミチフス菌）を接種した。もう１つの群のマウスには、本発明のワクチンを接種したマウスと同じスケジュールに従って対照ワクチン（空のベクターを含む弱毒化ネズミチフス菌から成る）を接種した。
【実施例３】
【００６０】
ワクチン接種マウスの腫瘍抵抗性の評価
３回目のワクチン接種から約２週間後、実施例２からのＢａｌｂ／Ｃマウス（各処置群当り約６匹のマウス）を、約１×１０５Ｂ１６黒色腫細胞（皮下）、約１×１０５Ｄ１２１ルイス肺癌細胞（皮下）、又は約７．５×１０４ＣＴ２６結腸癌細胞（静脈内）のいずれかで攻撃誘発した。約２週間増殖させて肺に自然播種転移させた後、皮下ルイス肺癌を外科的に切除した。皮下腫瘍増殖を１日おきに二次元測定し、各々の腫瘍について腫瘍容積を次の式：
容積＝（幅２）（長さ÷２）
に従って算定した。肺へのＤ１２１の自然転移の量を、皮下原発腫瘍の切除から約３０日後に評価した。マウスを犠牲死させて剖検し、肺の腫瘍負荷（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎｓ）を、腫瘍によって覆われた肺表面のパーセンテージに従って評価し、腫瘍なしの場合は「０」、約２０％未満の腫瘍被覆度については「１」、約２０％から約３０％の腫瘍被覆度については「２」、及び約５０％以上の腫瘍被覆度については「３」と採点した。図７は、Ｄ１２１ルイス肺癌細胞で攻撃誘発した３匹のマウスからの肺の写真を示す。下の肺は１と採点され、一方上の２つの肺は３と採点され、大きな割合の肺表面が腫瘍によって覆われていた。３０日目の評価以前に死亡した動物は、「＋」の採点を与えた。
【００６１】
これらの評価の結果を表１から４及び図８から１０に示しており、下記で詳細に論じる。
【００６２】
【表１】
2005519092.tif 000002
ＣＴ−２６結腸癌細胞の静脈内注射によって攻撃誘発したＢａｌｂ／Ｃマウスを、約６３日間（７週間）にわたって死亡率に関して評価した。死亡率情報を下記の表２に示し、図８にグラフで表わしている。
【００６３】
図８において、実施例１の本発明のワクチンで処置したマウスの％生存率は、１００％生存率として太い実線で表示されている。Ｃ２６細胞で攻撃誘発した天然マウス（ワクチン接種なし）の％生存率は細い実線で示されており、対照ワクチン（Ｆｌｋ−１  ＤＮＡなし）で処置したマウスの％生存率は破線で表示されている。
【００６４】
【表２】
2005519092.tif 000003
Ｄ１２１で攻撃誘発したＢａｌｂ／Ｃマウスにおける原発（皮下）腫瘍の増殖の抑制を、攻撃誘発後１４日目の原発腫瘍容積の測定によって評価した。結果を下記の表３に示し、図９にグラフで表わしている。
【００６５】
図９において、「ＰＢＳ」と表示した最初のバーはワクチン接種しなかったマウス（天然マウス）を示し、「空ベクター」と表示した中央のバーは対照ワクチンで処置したマウスを示し、及び「ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＫ１」と表示した３番目のバーは実施例１の本発明のワクチンで免疫したマウスを示す。
【００６６】
【表３】
2005519092.tif 000004
皮下Ｂ１６黒色腫増殖の抑制を、腫瘍攻撃誘発後約１７日間にわたって皮下腫瘍容積をモニターすることによって評価した。結果を下記の表４に示し、図１０にグラフで表わしている。図１０において、（●）で表わした平均腫瘍容積データは実施例１の本発明のワクチンで免疫したマウスを示し、（○）で表わしたデータは対照ワクチンで処置したマウスを示す。
【００６７】
【表４】
2005519092.tif 000005
【実施例４】
【００６８】
ワクチン接種マウスからの脾細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）におけるＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ２活性化マーカーの上方調節
Ｃ５／７ＢＬ／６Ｊマウス（各処置群当り約４匹のマウス）に、実施例２で述べたように実施例１のＤＮＡワクチン及び対照ワクチン（Ｆｌｋ−１なし）を接種した。３回目のワクチン接種から約６週間後に免疫マウス及び対照マウス群から脾細胞を単離した。その脾細胞を、約４容量％のＴ−ＳＴＩＭ培養サプリメント（カタログ番号３５４１１５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を含むＴ細胞培地（約５ｍＬ／培養）中で、Ｆｌｋ−１を発現するように形質導入したＢ１６黒色腫細胞系からの細胞及び非形質転換Ｂ１６細胞と共に２４時間培養した。次に細胞をＦＩＴＣ複合ＣＤ８＋抗体及びＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ２のＰＥ複合抗体で染色した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣスキャンを使用して細胞懸濁液を評価し、各々の脾細胞／Ｂ１６黒色腫細胞の組合せについて、ＣＤ２５及びＣＤ６９に関して陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。その結果を表５に示し、図１１にグラフで表わしている。
【００６９】
【表５】
2005519092.tif 000006
表１から５及び図８から１１に示す結果は、Ｆｌｋ−１をコードするＤＮＡ、ＫＤＲのマウス類似体を含有する実施例１のＤＮＡワクチンが、様々な腫瘍形成癌細胞に対してマウスを有効に免疫しうることを明らかにしている。理論に縛られることを意図しないが、該ワクチンは腫瘍における血管新生を阻害することによって、すなわち新しい血管形成を妨げ、腫瘍を有効に飢餓させることによって作用すると考えられる。
【００７０】
表１のデータは、実施例１の本発明のワクチンが、Ｄ１２１ルイス肺癌で攻撃誘発したマウスの肺への腫瘍転移の抑制を導くことを明らかにしている。実施例１のワクチンで免疫したマウスで死亡したものはなく、すべてのマウスが約５０％未満の肺の腫瘍被覆度を有していた（２匹は＜２０％であった）。これに対し、各々の対照群から２匹のマウスが死亡し、残りのマウスすべてが約５０％以上の肺の腫瘍被覆度を有していた。
【００７１】
実施例１の本発明のワクチンはまた、表２及び図８のデータが明らかにするように、ＣＴ−２６結腸癌細胞によって静脈内経路で攻撃誘発したＢａｌｂ−Ｃマウスの死亡率も有意に低下させた。実施例１のワクチンで免疫したすべてのマウスが、攻撃誘発後６３日の全観察期間中生存した。対照群では、しかしながら、攻撃誘発後３６日目までにすべてのマウスが死亡した。
【００７２】
表３及び図９のデータが示すように、皮下Ｄ１２１ルイス肺癌腫瘍増殖は、ワクチンなし又は対照ワクチンで処置した対照マウス群と比較して、約４．３から約４．５の係数で実施例１の本発明のワクチンでの免疫によって抑制された。
【００７３】
同様に、表４及び図１０に示すように、皮下Ｂ１６黒色増殖は、対照群における腫瘍増殖と比較して、実施例１の本発明のワクチンで免疫したマウスにおいて約４の係数で抑制された。
【００７４】
表５及び図１１のデータは、実施例１のＤＮＡワクチンを接種したＣ５７／ＢＬ／６Ｊマウスから単離した脾細胞が、Ｆｌｋ−１抗原を提示するように形質転換したＢ１６黒色腫細胞と共に培養したとき、対照群のマウスと比較してＣＤ２、ＣＤ２５及びＣＤ６９活性化マーカーの上方調節を示すことを明らかにしている。
【００７５】
上述した実施態様の数多くの変法及び修正が本発明の新規特徴の精神及び範囲から逸脱することなく実施できる。ここで例示する特定実施態様に関していかなる限定も意図されていないこと又は推論されるべきでないことは了解されている。言うまでもなく、本発明の範囲内に含まれるそのような修正はすべて、付属の特許請求の範囲によってカバーされることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１−１】図１は、ヒトＫＤＲをコードするＤＮＡ配列、配列番号１を示す。
【図１−２】図１は、ヒトＫＤＲをコードするＤＮＡ配列、配列番号１を示す。
【図２】図２は、ヒトＫＤＲのタンパク質配列、配列番号２を示す。
【図３−１】図３は、ヒトＦｌｔ−１をコードするＤＮＡ配列、配列番号３を示す。
【図３−２】図３は、ヒトＦｌｔ−１をコードするＤＮＡ配列、配列番号３を示す。
【図４】図４は、ヒトＦｌｔ−１のタンパク質配列、配列番号４を示す。
【図５−１】図５は、マウスＦｌｋ−１をコードするＤＮＡ配列、配列番号５を示す。
【図５−２】図５は、マウスＦｌｋ−１をコードするＤＮＡ配列、配列番号５を示す。
【図５−３】図５は、マウスＦｌｋ−１をコードするＤＮＡ配列、配列番号５を示す。
【図６】図６は、ヒトＦｌｋ−１のタンパク質配列、配列番号６を示す。
【図７】図７は、＞５０％被覆度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）（３と表示）から＜１０％被覆度（１と表示）までの範囲の様々なレベルの腫瘍被覆度を有するマウス肺の写真である。
【図８】図８は、本発明のＤＮＡワクチンを接種し、ＣＴ−２６結腸癌細胞の静脈内注射によって攻撃誘発したマウス（太い黒色の実線）が、２つの対照群のマウス（実処置マウス：細い実線；対照ワクチン：破線）に比べて有意に低い死亡率を示すことを明らかにしたデータのグラフ表示である。
【図９】図９は、２つの対照群のマウスと比較して、本発明のＤＮＡワクチン（ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＫ−１）を接種したマウスにおけるＤ１２１ルイス肺癌腫増殖の抑制を示すデータのグラフ表示である。
【図１０】図１０は、対照群（○）と比較して、本発明のＤＮＡワクチン（●）を接種したマウスにおけるＢ１６黒色腫増殖の抑制を示すデータのグラフ表示である。及び
【図１１】図１１は、対照群のマウスと比較して、本発明のＤＮＡワクチンを接種したマウスにおけるＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ２陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の上方調節を示すデータのグラフ表示である。
【配列表】
2005519092.tif 000007
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【図１−１】
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【図１−２】
2005519092.tif 000022
【図２】
2005519092.tif 000023
【図３−１】
2005519092.tif 000024
【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
2005519092.tif 000028
【図５−３】
2005519092.tif 000029
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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