(57)【要約】  本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株のＧＫ２４およびＲＱ−１由来の新規核酸ポリメラーゼ、およびこれらのポリメラーゼをコードする核酸、ならびにポリメラーゼおよび核酸を使用する方法を提供する。本発明の核酸としては、例えば、誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、単離された核酸が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１（ＤＳＭカタログ番号９２４７）の核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項２】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１３〜２４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項４】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下する変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の単離された核酸であって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、単離された核酸。
【請求項６】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の単離された核酸であって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、単離された核酸。
【請求項８】
配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸。
【請求項９】
配列番号１〜１２のいずれか１つに対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項１０】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１（ＤＳＭカタログ番号９２４７）の核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１１】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
配列番号１３〜２４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１３】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下する変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、ベクター。
【請求項１５】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、ベクター。
【請求項１７】
配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１８】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１（ＤＳＭカタログ番号９２４７）の核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項１９】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
配列番号１３〜２４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項２１】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下する変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現ベクターであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、発現ベクター。
【請求項２３】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、発現ベクター。
【請求項２５】
配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項２６】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１（ＤＳＭカタログ番号９２４７）の核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２７】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
配列番号１３〜２４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２９】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下する変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２９に記載の宿主細胞であって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、宿主細胞。
【請求項３１】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３２】
請求項３１に記載の宿主細胞であって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、宿主細胞。
【請求項３３】
配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３４】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１（ＤＳＭカタログ番号９２４７）由来の、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３５】
前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３４に記載の単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３６】
配列番号１３〜２４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３７】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下する変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３８】
請求項３７に記載の単離された核酸ポリメラーゼであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３９】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項４０】
請求項３１に記載の単離された核酸ポリメラーゼであって、前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を有する、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項４１】
核酸ポリメラーゼを含む容器を含むキットであって、該核酸ポリメラーゼは、配列番号１３〜２４のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、キット。
【請求項４２】
請求項４１に記載のキットであって、非標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ヌクレオチドの均等混合物、鎖終結ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、緩衝溶液、マグネシウム含有溶液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマー、逆転写酵素含有溶液、またはＤＮＡ増幅プライマーもしくはＲＮＡ増幅プライマーを含む容器をさらに含む、キット。
【請求項４３】
請求項４１に記載のキットであって、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、逆転写、ＲＮＡ増幅またはプライマー伸長を実施するために適合されている、キット。
【請求項４４】
配列番号１３〜２４のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼを作製する方法であって、該方法は、ＲＮＡの転写および翻訳に十分な条件下で、プロモーターに作動可能に連結した、配列番号１３〜２４のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項４５】
前記核酸が、配列番号１〜１２のいずれか１つを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法によって作製された核酸ポリメラーゼ。
【請求項４７】
ＤＮＡを合成する方法であって、該方法は、配列番号１３〜２４のいずれか１つを含むポリペプチドを、ＤＮＡの重合を可能にするのに十分な条件下で、ＤＮＡと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４８】
核酸の熱サイクルによる増幅のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）核酸を、該核酸の増幅に適切な条件下で、配列番号１３〜２４のいずれか１つを有する熱安定性ポリペプチドと接触させる工程、および
（ｂ）該核酸を増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、前記核酸の熱サイクルによる増幅が、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含む、方法。
【請求項５０】
請求項４８に記載の方法であって、前記核酸の熱サイクルによる増幅が、鎖置換増幅によって実施される、方法。
【請求項５１】
請求項４８に記載の方法であって、前記核酸の熱サイクルによる増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、方法。
【請求項５２】
プライマー伸長の方法であって、該方法は、配列番号１３〜２４のいずれか１つを含むポリペプチドを、ＤＮＡの重合を可能にするのに十分な条件下で、プライマーおよび該プライマーに相補的な核酸と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５３】
前記核酸がＤＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記プライマー伸長が、前記核酸を配列決定するために実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記プライマー伸長が、前記核酸を増幅するために実施される、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、好熱性生物であるＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の核酸ポリメラーゼに対する核酸およびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡポリメラーゼは、１つの核酸鎖を読み取り、その相補鎖を生成することによってＤＮＡを複製するために細胞により使用される天然に存在する細胞内酵素である。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、核酸プライマーの伸長末端の３’ヒドロキシル基と新たに付加されるヌクレオチド三リン酸の５’リン酸基との間の結合の形成を触媒する。ＤＮＡ合成に使用されるヌクレオチド三リン酸は、通常、デオキシアデノシン三リン酸（Ａ）、デオキシチミジン三リン酸（Ｔ）、デオキシシトシン三リン酸（Ｃ）、およびデオキシグアノシン三リン酸（Ｇ）であるが、これらのヌクレオチドの改変または変更されたバリエーションもまた使用され得る。ヌクレオチドが付加される順番は、Ａヌクレオチド塩基とＴヌクレオチド塩基との間の水素結合形成およびＧヌクレオチド塩基とＣヌクレオチド塩基との間の水素結合形成によって指示される。
【０００３】
細菌細胞は、３つの型のＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩと呼ばれる）を含有する。ＤＮＡポリメラーゼＩは、最も豊富なポリメラーゼであり、一般的に、特定の型のＤＮＡ修復（ＤＮＡ複製の間の岡崎フラグメントの連結を可能にする修復様反応を含む）を担う。ポリメラーゼＩは、ＵＶ照射および放射性模倣薬物（ｒａｄｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｒｕｇ）により誘導されるＤＮＡ損傷の修復に必須である。ＤＮＡポリメラーゼＩＩは、ＳＯＳ応答を誘導するＤＮＡ損傷を修復する上で役割を果たすと考えられている。ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩＩの両方を欠く変異体において、ポリメラーゼＩＩは、ＵＶにより誘導される損傷を修復する。ポリメラーゼＩおよびＩＩは、モノマーポリメラーゼであるが、一方、ポリメラーゼＩＩＩは、複数のサブユニットの複合体である。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、しばしば、ｃＤＮＡ合成およびＤＮＡ配列決定反応を含む種々の生化学的適用のためにインビトロで使用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照のこと（本明細書中で参考として援用する）。ＤＮＡポリメラーゼはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号（参考として援用する））およびＲＮＡ転写媒介増幅方法（例えば、Ｋａｃｉａｎら，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０１３８４（参考として援用する））のような方法による核酸の増幅のためにも使用される。
【０００５】
ＤＮＡ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の使用を通じたプライマー伸長、それに続いて、別の回のプライマーアニーリングおよび伸長のための新たなテンプレートを提供するための、得られた二本鎖核酸の熱変性のサイクルを利用する。鎖の変性のために必要な高い温度は、多くのＤＮＡポリメラーゼを不可逆的に不活性化するので、約３７℃より高い温度で活性を維持できるＤＮＡポリメラーゼの発見および使用は、費用効率および労働効率の面での利点を提供する。
【０００６】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、多くの好熱性生物（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１つの株、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ属内の種、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属内の種、Ｓｕｌｆｏｂｕｓ属内の種、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属内の種を含む）において発見されている。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の全長の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）は、Ｌａｗｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７−６４３７（１９８９）およびＧｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，０７９，３５２号によって記載されている。さらに、短縮型のＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現は、Ｌａｗｙｅｒら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２７５−２８７（１９９３）、およびＢａｒｎｅｓ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０６１８８（１９９２）に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎは、ＥＰＯ番号公開０４８２７１４Ａ１（１９９２）において、変異型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのクローニングを報告している。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼもまた、クローニングおよび発現されている。Ａｓａｋｕｒａら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．（Ｊａｐａｎ），７４：２６５−２６９（１９９３）。しかし、種々のＤＮＡポリメラーゼの特性は、変化する。従って、改善された配列識別、より良好な塩許容性、様々な程度の熱安定性、標識ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドに対する改善された許容性および他の価値ある特性を有する、新たなＤＮＡポリメラーゼが必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、好熱性生物であるＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された、核酸ポリメラーゼを提供する。本発明は、いくつかのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株（株ＲＱ−１、株ＧＫ２４、および株１ｂ２１が挙げられる）から単離された核酸ポリメラーゼを提供する。従って、１つの実施形態において、本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１（ＤＳＭカタログ番号９２４７）核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸を提供する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号１３〜２４のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸を提供する。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号１３〜１５のいずれか１つが５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を有する、誘導体核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸を提供する。このような誘導体核酸ポリメラーゼは、アミノ酸配列の配列番号１３〜１５のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下した５−３’エンドヌクレアーゼ活性を有し有る。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別を低下させる変異を有する、アミノ酸配列１３〜１５のいずれか１つを含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸を提供する。このような誘導体核酸ポリメラーゼは、アミノ酸配列の配列番号１３〜１５のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して低下した、ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別を有し有る。
【００１１】
本発明はまた、配列番号１〜１２のいずれか１つを含む核ポリメラーゼをコードする、単離された核酸、および配列番号１〜１２のいずれか１つと相補的な、単離された核酸を提供する。
【００１２】
本発明はまた、これらの単離された核酸を含むベクターを提供し、このベクターとしては、これらの単離された核酸に作動可能に結合したプロモーターを含む、発現ベクターが挙げられる。このような単離された核酸およびベクターを含む宿主細胞もまた、本発明によって提供され、特に、核酸によってコードされる熱安定性ポリペプチドを発現し得る宿主細胞が提供され、ここで、このポリペプチドは、核酸活性および／またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【００１３】
本発明はまた、アミノ酸配列の配列番号１３〜２４のいずれか１つを含み得る、単離されたポリペプチドを提供する。本発明によって提供される単離されたポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号１３〜２４のいずれか１つを有し得、これは、例えば、５０，０００Ｕ／ｍｇタンパク質と５００，０００Ｕ／ｍｇタンパク質との間のＤＮＡポリメラーゼ活性を有し得る。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を有する、アミノ酸配列の配列番号１３〜１５のいずれか１つを含む、単離された誘導体核酸ポリメラーゼを提供する。このような誘導体核酸ポリメラーゼは、アミノ酸配列の配列番号１３〜１５のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有し得る。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別を低下させる変異を有する、アミノ酸配列の配列番号１３〜１５のいずれか１つを含む、単離された誘導体核酸ポリメラーゼを提供する。このような誘導体核酸ポリメラーゼは、アミノ酸配列の配列番号１３〜１５のいずれか１つを含む核酸ポリメラーゼと比較して、ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する低下した識別を有し得る。
【００１６】
本発明はまた、本発明の核酸ポリメラーゼの少なくとも１つを含む容器を備える、キットを提供する。このような核酸ポリメラーゼは、アミノ酸配列の配列番号１３〜２４のいずれか１つを含む、アミノ酸配列を有し得る。このキットはまた、非標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ヌクレオチドのバランス混合物、鎖終結ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、緩衝溶液、マグネシウム含有溶液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマー、逆転写酵素含有溶液、またはＤＮＡ増幅プライマーもしくはＲＮＡ増幅プライマーを含み得る。このようなキットは、例えば、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ増幅またはプライマー伸長反応を実施するために、適合され得る。
【００１７】
本発明は、核酸を合成する方法を提供し、この方法は、アミノ酸配列の配列番号１３〜２４のいずれか１つを含むポリペプチドを、核酸と、この核酸の重合を可能にするために十分な条件下で接触させる工程を包含する。このような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００１８】
本発明は、さらに、核酸の熱サイクル増幅のための方法を提供し、この方法は、核酸を、アミノ酸配列の配列番号１３〜２４のいずれか１つを有する熱安定性ポリペプチドと、核酸の増幅のために適切な条件下で接触させる工程、およびこの核酸を増幅する工程を包含する。このような増幅は、例えば、鎖置換増幅またはポリメラーゼ連鎖反応により得る。
【００１９】
本発明はまた、ＤＮＡをプライマー伸長させる方法を提供し、この方法は、アミノ酸配列の配列番号１３〜２４のいずれか１つを含むポリペプチドを、ＤＮＡと、ＤＮＡの重合を可能にするために十分な条件下で接触させる工程を包含する。このようなプライマー伸長は、例えば、ＤＮＡを配列決定するため、またはＤＮＡを増幅するために実施され得る。
【００２０】
本発明は、さらに、アミノ酸配列の配列番号１３〜２４のいずれか１つを含む、核酸ポリメラーゼを作製する方法を提供し、この方法は、プロモーターに作動可能に連結した、アミノ酸配列の配列番号１３〜２４のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、ＲＮＡの転写および翻訳のために十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。１つの実施形態において、この方法は、配列番号１〜１２のいずれか１つを含む核酸を使用する。本発明はまた、この方法によって作製された核酸ポリメラーゼに関する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、好熱性生物由来の核酸ポリメラーゼをコードする核酸配列およびアミノ酸配列に関する。特に、本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの特定の株（株ＧＫ２４、株ＲＱ−１、および株１ｂ２１が挙げられる）由来の核酸ポリメラーゼを提供する。本発明の核酸ポリメラーゼは、種々の手順（ＤＮＡ合成手順、逆転写手順、ＤＮＡプライマー伸長手順、ＤＮＡ配列決定手順およびＤＮＡ増幅手順を含む）において使用され得る。
【００２２】
（定義）
用語「アミノ酸配列」は、ペプチド分子、ポリペプチド分子、またはタンパク質分子における、アミノ酸の位置的配置および正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をいう。用語「アミノ酸配列」の使用は、そのアミノ酸配列を、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の完全なネイティブのアミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００２３】
「キメラ」は、核酸（例えば、ベクターまたは遺伝子）が、１つより多い核酸セグメントで構成されていること、および少なくとも２つの核酸セグメントが、異なる起源のものであることを示すために使用される。このような核酸セグメントは、組換え技術によって一緒に融合し、天然には存在しない核酸配列を生じる。
【００２４】
用語「コード領域」は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。タンパク質のコード領域は、５’側が開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」に、そして３’側が停止コドンを特定する３つのトリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）のうちの１つに結合されている。
【００２５】
「構成性発現」は、構成性プロモーターを用いる発現をいう。
【００２６】
「構成性プロモーター」は、細胞の生活環の全てまたはほぼ全ての段階においてそれが制御する遺伝子を発現し得るプロモーターをいう。
【００２７】
「相補的」または「相補性」は、核酸間の塩基対合またはハイブリダイゼーションの程度を規定するために使用される。例えば、当業者に公知のように、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と水素結合または塩基対を形成し得、そしてグアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と水素結合または塩基対を形成し得る。従って、ＡはＴと相補的であり、一方、ＧはＣと相補的である。相補性は、二本鎖核酸における全ての塩基が塩基対合する場合、完全であり得る。あるいは、相補性は、核酸中の塩基のいくつかだけが塩基対合の法則に従って一致する場合、「部分的」であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対する影響を有する。
【００２８】
参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドの「誘導体」は、それぞれの参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドと関連するが異なる配列または化学構造を有する、それぞれ、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである。誘導体核酸、誘導体タンパク質、誘導体ポリペプチド、または誘導体ペプチドは、一般的に、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドに存在しないかまたはわずかにしか存在しないいくつかの化学的特性、物理的特性、または機能的特性を増強または組み込む目的で作製される。誘導体核酸は、一般的に、参照核酸とヌクレオチド配列が異なり得、一方、誘導体タンパク質、誘導体ポリペプチド、または誘導体ペプチドは、それぞれ、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドと、アミノ酸配列が異なり得る。このような配列の相違は、１つ以上の置換、挿入、付加、欠失、融合、および短縮であり得、これらは任意の組合せで存在し得る。相違は、わずか（例えば、１つのヌクレオチドまたはアミノ酸の相違）であり得るし、またはより実質的であり得る。しかし、誘導体の配列は、当業者が、その誘導体とその参照とが構造および／または機能において関連することを認識しないほどには参照と異ならない。一般的に、相違は、その参照およびその誘導体が、全体的に緊密に類似し、そして多くの領域において同一であるように制限される。「改変体」は、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドの化学的特性、物理的特性、または機能的特性を有意に変更しないサイレントな構造上の相違を有し得るという点で、「誘導体」核酸、「誘導体」タンパク質、「誘導体」ポリペプチド、または「誘導体」ペプチドと異なる。対照的に、参照と誘導体との間の核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの相違は、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドの１つ以上の化学的特性、物理的特性、または機能的特性を改善するために行われた意図的な変化である。
【００２９】
用語「ＤＮＡポリメラーゼ活性」、「合成活性」、および「ポリメラーゼ活性」は、交換可能に使用され、そして酵素がデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込みにより新たなＤＮＡ鎖を合成する能力をいう。テンプレート依存様式でデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込みによる新たなＤＮＡ鎖の合成を指示し得るタンパク質は、「ＤＮＡ合成活性が可能」であるといわれる。
【００３０】
用語「５’エキソヌクレアーゼ活性」は、タンパク質における、核酸の５’末端からヌクレオチドを除去し得る活性の存在をいう。
【００３１】
用語「３’エキソヌクレアーゼ活性」は、タンパク質における、核酸の３’末端からヌクレオチドを除去し得る活性の存在をいう。
【００３２】
「発現」は、生物における内因性または外因性の遺伝子の転写および／または翻訳をいう。発現は、一般的に、ｍＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。発現はまた、タンパク質の生成をいい得る。
【００３３】
「発現カセット」は、特定のヌクレオチド配列の発現を指示し得る核酸配列を意味する。発現カセットは、一般的に、終止シグナルに作動可能に連結された、発現されるべきヌクレオチド配列（例えば、コード領域）に作動可能に連結されたプロモーターを含む。発現カセットはまた、代表的に、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要とされる配列を含む。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、これは、その構成要素の少なくとも１つがその他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーターの制御下、または宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあり得る。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発達段階に特異的であり得る。
【００３４】
用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連する核酸の任意のセグメントをいうために広い意味で使用される。用語「遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または構造ＲＮＡのコード領域を包含する。用語「遺伝子」はまた、コード領域のいずれかの末端から約２ｋｂまでの距離の配列を含む。これらの配列は、「隣接」配列または「隣接」領域といわれる（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写産物に存在する非翻訳領域の５’側または３’側に位置する）。５’隣接領域は、調節配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）またはその遺伝子の転写を制御するかもしくはその転写に影響を及ぼすタンパク質に対する他の認識配列もしくは結合配列を含み得る。３’隣接領域は、転写の終結を指示する配列、転写後切断を指示する配列、およびポリアデニル化を指示する配列、ならびに他のタンパク質に対する認識配列を含み得る。遺伝子にコードされるタンパク質あるいはポリペプチドは、全長であるか、または全ての活性もしくは機能的特性が保持されるような、または全長タンパク質または全長ポリペプチドの選択された活性（例えば、酵素活性、リガンド結合、またはシグナル伝達）のみが保持されるような、その任意の部分であり得る。タンパク質またはポリペプチドは、プロタンパク質または前駆ポリペプチドの生成に必要な任意の配列を含み得る。用語「ネイティブ遺伝子」は、非形質転換細胞のゲノムに天然に存在する遺伝子をいう。
【００３５】
「ゲノム」は、生物中に天然に存在し、かつある世代から次の世代へと伝えられる、完全な遺伝物質のことをいう。
【００３６】
用語「異種核酸」または「外来性核酸」は、特定の宿主細胞に対して外来の供給源を起源とする核酸をいうか、または、同じ供給源由来である場合は、その元の形態から改変されている核酸をいう。従って、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内来性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用を介して改変されている遺伝子を含む。この用語はまた、天然に存在する核酸の天然に存在しない複数のコピーも含む。従って、この用語は、この細胞に対して外来性もしくは異種であるか、またはその細胞内で通常に見出されるが、この細胞もしくはゲノム内の通常では見出されない位置にある、核酸セグメントをいう。
【００３７】
用語「相同性」は、核酸と参照核酸との間、またはポリペプチドと参照ポリペプチドとの間の類似性の程度をいう。相同性は部分的であり得るかまたは完全であり得る。完全な相同性とは、核酸配列またはアミノ酸配列が同一であることを示す。部分的に相同な核酸配列またはアミノ酸配列は、参照核酸配列または参照アミノ酸配列に対して同一ではない配列である。従って、部分的に相同な核酸は、その配列中に、比較される核酸に対するヌクレオチドの相違を１つ以上有する。相同性の程度は、配列比較によって決定され得る。あるいは、当業者によって充分理解されるように、種々のハイブリダイゼージョン条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼージョンまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼージョンは、核酸間の相同性の程度の推定を提供し得る（例えば、ＨａｉｎｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．を参照のこと）。
【００３８】
「ハイブリダイゼージョン」とは、相補的な核酸鎖上のヌクレオチド塩基間に水素結合を形成することによって、相補的な核酸鎖をアニーリングするプロセスのことをいう。ハイブリダイゼージョン、および核酸間の会合の強度は、ハイブリダイズしている核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比のような因子によって影響される。
【００３９】
「誘導性プロモーター」とは、外部刺激（例えば、化学物質、光、ホルモン、ストレス、温度または病原体）によって、１種以上の細胞型において始動（ｔｕｒｎ  ｏｎ）され得る、調節されるプロモーターのことをいう。
【００４０】
「開始部位」は、転写配列の一部である第１ヌクレオチドの位置（これは、＋１位として定義される）を取り囲む領域である。遺伝子の全てのヌクレオチド位置は、転写配列の第１ヌクレオチド（これは、開始部位内に存在する）を参照することによって番号付けされる。下流配列（すなわち、３’方向の配列）は、ポジティブと呼ばれ、一方、上流配列（すなわち、５’方向の配列）は、ネガティブと呼ばれる。
【００４１】
「単離された」もしくは「精製された」核酸または「単離された」もしくは「精製された」ポリペプチドは、ヒトの手によって、そのネイティブな環境とは離されて存在し、よって天然の産物ではない、核酸またはポリペプチドである。単離された核酸またはポリペプチドは、精製された形態で存在し得るか、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞内のような、ネイティブではない環境中に存在し得る。
【００４２】
用語「インベーダーオリゴヌクレオチド」とは、プローブオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する配列と実質的に同一である配列をその３’末端に含むオリゴヌクレオチドをいう。これらの領域は、相補的な標的核酸に沿った同一のセグメントへのハイブリダイゼーションについて競合する。
【００４３】
用語「標識」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために使用され得、そして核酸またはタンパク質に結合し得る、任意の原子または分子をいう。標識は、蛍光、放射能、比色定量、重量測定、Ｘ線回折またはＸ線吸収、磁性、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供し得る。
【００４４】
用語「核酸」は、糖、リン酸塩および塩基（プリンまたはピリミジンのいずれか）を含むモノマー（ヌクレオチド）から構成される、一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたその改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列ならびに明白に示される参照配列も暗黙のうちに包含する。
【００４５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは、３つより多く、そして通常は、１０個より多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子として定義される。オリゴヌクレオチドのサイズには、正確な上限はない。しかし、一般的に、オリゴヌクレオチドは、約２５０ヌクレオチドよりも短く、好ましくは、約２００ヌクレオチドよりも短く、より好ましくは、約１００ヌクレオチドよりも短い。正確なサイズは、多くの因子に依存し、この因子は、続いて、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存する。このオリゴヌクレオチドは、任意の様式（化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写またはこれらの組み合わせを含む）で作製され得る。
【００４６】
用語「オープンリーディングフレーム」および「ＯＲＦ」は、コード配列の翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間でコードされたアミノ酸配列をいう。用語「開始コドン」および「終止コドン」は、それぞれ、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始および鎖の終止を特定するコード配列中の３つの隣接するヌクレオチドの単位（「コドン」）をいう。
【００４７】
「作動可能に連結される」とは、同じ核酸分子の一部として結合され、その結果その一方の機能が他方によって影響されることを意味する。一般的に、「作動可能に連結される」とはまた、２つ以上の核酸が適切に配置されて配向され、その結果それらが共に機能し得ることも意味する。核酸は、しばしば、作動可能に連結されて、コード領域の転写がプロモーターから始められることを可能にする。例えば、調節配列は、調節配列がコード領域の発現に影響を及ぼすような状況（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）に２つの配列がある場合に、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸配列に「作動可能に連結される」または「関連する」といわれる。コード領域は、センスな配向またはアンチセンスな配向で、調節配列に作動可能に連結され得る。
【００４８】
用語「プローブオリゴヌクレオチド」は、標的核酸と相互作用して、インベーダーオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下において切断構造を形成する、オリゴヌクレオチドをいう。標的核酸にアニーリングする場合、このプローブオリゴヌクレオチドおよび標的は、切断構造を形成し、そしてプローブオリゴヌクレオチド内で切断が生じる。このプローブオリゴヌクレオチド上流のインベーダーオリゴヌクレオチドの存在は、（インベーダーの非存在下での切断部位に対して）プローブオリゴヌクレオチド内の切断部位をシフトし得る。
【００４９】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに対する認識部位および適切な転写に必要とされる他の因子を提供することによってコード領域の発現を制御する、（通常、コード領域に対して上流（５’側）の）ヌクレオチド配列をいう。「プロモーター」としては、最小のプロモーター（これは、ＴＡＴＡボックスから構成される短いＤＮＡセグメントである）が挙げられるが、これに限定されない。従って、プロモーターは、転写開始部位を特定して、そして発現を制御または調節するように作用する他の配列（例えば、エンハンサー）を含む。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡのセグメントであり、そしてプロモーターの先天的エレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る。エンハンサーは、両方向（順方向または逆方向）に作動し得、そしてプロモーターから上流または下流のいずれかに移動した場合にさえ、機能し得る。プロモーターは、ネイティブの遺伝子からその全体が由来し得るか、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成され得るか、または合成ＤＮＡセグメントからも構成され得る。プロモーターはまた、生理学的状態または発達状態に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡセグメントも含み得る。
【００５０】
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００５１】
「調節配列」および「調節エレメント」は、核酸配列の発現のいくつかの局面を制御するヌクレオチド配列をいう。このような配列またはエレメントは、コード配列の上流（５’側非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’側非コード配列）に配置され得る。「調節配列」および「調節エレメント」は、転写、ＲＮＡプロセシングもしくはＲＮＡ安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、エンハンサー、イントロン、プロモーター、ポリアデニル化シグナル配列、スプライシングシグナル、終止シグナル、および翻訳リーダー配列が挙げられる。調節配列はまた、天然の配列および合成配列を含む。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー」は、その遺伝子を有する生物中で発現されそして検出され得る、観察可能な形質または選択可能な形質をコードする遺伝子をいう。選択マーカーは、しばしば、目的の核酸の存在を追跡または選択するために、観察可能な形質をコードしないかもしれない、目的の核酸に連結される。当業者に公知の任意の選択マーカーが本発明の核酸とともに使用され得る。いくつかの選択マーカーは、マーカーを有さなければ宿主が死ぬ状況下で、宿主が生存することを可能にする。選択マーカーの例としては、抗生物質耐性（例えば、テトラサイクリン耐性またはアンシピリン耐性）が挙げられる。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼージョンが行なわれる、温度、イオン強度および有機溶媒のような他の化合物の存在の条件を定義するために使用される。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸塩基対合は、高い頻度の相補塩基配列を有する核酸間のみで生じる。「弱い」または「低い」ストリンジェンシー条件では、核酸の相補配列の頻度は通常より低く、その結果、異なる配列を有する核酸が検出および／または単離され得る。
【００５４】
用語「実質的に類似」および「実質的に相同」は、本発明の配列の機能的等価物を示す、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をいう。例えば、遺伝暗号の縮重を単に反映するがそれにもかかわらず本発明のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする、変更されたヌクレオチド配列は、本発明の配列と実質的に類似である。さらに、本発明の配列と実質的に類似のアミノ酸配列は、アミノ酸全体の同一性が活性で熱的に安定な核酸ポリメラーゼを提供するのに十分であるアミノ酸配列である。例えば、本発明の配列と実質的に類似のアミノ酸配列は、アミノ酸全体の同一性が、本発明のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％または９４％）、およびより好ましくは９５％以上（例えば、９６％、９７％、９８％、または９９％）である配列である。
【００５５】
「終結剤」、「終結ヌクレオチド」または「ターミネーター」は、ＤＮＡ合成またはＤＮＡ配列決定と関連して、特定の塩基におけるＤＮＡ配列決定反応を特異的に終結し得る化合物のことをいい、このような化合物としては、２’，３’ジデオキシ構造を有するジデオキシヌクレオシド（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
「耐熱性の」とは、核酸ポリメラーゼが、約３７℃より高い温度で活性を維持することを意味する。好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約４２℃より高い温度で活性を維持する。より好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約５０℃より高い温度で活性を維持する。なおより好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約６０℃より高い温度に曝された後に活性を維持する。最も好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約７０℃より高い温度への曝露にもかかわらず活性を維持する。
【００５７】
「導入遺伝子」は、形質転換によってゲノム中に導入されており、安定に維持される、遺伝子をいう。導入遺伝子としては、例えば、形質転換される特定の生物の遺伝子に対して非相同であるかまたは相同であるかのいずれかの遺伝子が挙げられ得る。さらに、導入遺伝子は、非ネイティブの生物中に挿入されるネイティブな遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。用語「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置にあるネイティブな遺伝子をいう。「外来性」遺伝子または「外因性」遺伝子とは、宿主生物中で正常に見出されないが、遺伝子移入によって導入される遺伝子をいう。
【００５８】
用語「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝を生じる、宿主細胞のゲノム中への核酸フラグメントの移入をいう。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主細胞は、「トランスジェニック」細胞と呼ばれ、そしてトランスジェニック細胞を含む生物は、「トランスジェニック生物」と呼ばれる。形質転換は、当該分野で公知の種々の手段によって達成され得、この手段としては、カルシウムＤＮＡ共沈、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが挙げられる。
【００５９】
参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照ペプチドの「改変体」は、それぞれの参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照ペプチドと関連するが異なる配列を有する、それぞれ、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。改変体と参照との間の核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照ペプチドの相違は、サイレントな相違または保存的な相違である。改変体核酸は、参照核酸とはヌクレオチド配列が異なり、一方、改変体核酸、改変体タンパク質、改変体ポリペプチドまたは改変体ペプチドは、それぞれ、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドとアミノ酸配列が異なる。改変体および参照の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、１つ以上の置換、挿入、付加、欠失、融合および短縮（これらは、任意の組み合わせで存在し得る）によって配列が異なり得る。相違は、わずか（例えば、１つのヌクレオチドまたはアミノ酸の相違）であり得るかまたはより実質的であり得る。しかし、この改変体の構造および機能は当業者が、改変体および参照が構造および／または機能において関連していることを認識しないほどには参照と異ならない。一般的には、相違は参照および改変体が、全体的に緊密に類似しており、多くの領域で同一であるように制限される。
【００６０】
用語「ベクター」は、別の核酸セグメントを細胞中に移入し得る核酸をいうために使用される。「ベクター」としては、とりわけ、自己伝播性または動員性であってもそうでなくてもよい、二本鎖または一本鎖、線形または環状形態の、任意のプラスミド、コスミド、ファージまたは核酸が挙げられる。ベクターは、細胞ゲノム中に組みこむことによってかまたは染色体外に存在する（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）ことによって、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を形質転換し得る。細菌系に使用されるベクターは、しばしば、ベクターを細菌染色体とは独立して複製させることが可能な複製起点を含む。用語「発現ベクター」は、発現カセットを含むベクターをいう。
【００６１】
用語「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離される場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は、集団中で最も頻繁に観察される遺伝子形態であり、従って、任意に、遺伝子の「正常」形態または「野生型」形態と呼ばれる。対照的に、用語「改変体」または「誘導体」とは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に、配列および／または機能的特性における改変（すなわち、変更された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物のことをいう。天然に存在する誘導体は、単離され得る。これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合にそれらが変更された特徴を有するという事実によって同定される。
【００６２】
（ポリメラーゼ核酸）
本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸、ならびに活性で熱的に安定な核酸ポリメラーゼをコードする、その誘導体、フラグメントおよび改変体の核酸を提供する。従って、本発明の１つの局面は、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＤＳＭカタログ番号９２４７）由来のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされる核酸ポリメラーゼを包含する。本発明の別の局面は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＧＫ２４由来の核酸ポリメラーゼを提供する。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＧＫ２４由来のＤＮＡポリメラーゼは、クローン化されており（Ｋｗｏｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ．１９９７  Ａｐｒ  ３０；７（２）：２６４−７１）、本発明によって提供されるＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株の核酸ポリメラーゼは、異なる。本発明の別の局面は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株１ｂ２１由来の核酸ポリメラーゼを提供する。従って、アミノ酸配列の配列番号１３−２４（これは、野生型のおよびいくつかの誘導体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ核酸ポリメラーゼのアミノ酸配列である）のいずれか１つをコードする核酸は、本発明によって企図される。
【００６３】
一実施形態において、本発明は、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＧＫ２４由来の核酸ポリメラーゼをコードする、配列番号１の核酸を提供する。配列番号１を以下に示す：
【００６４】
【数１】
2005511043.tif 000002
【００６５】
【数２】
2005511043.tif 000003
別の実施形態において、本発明は、例えば、配列番号２を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１由来の野生型核酸ポリメラーゼをコードする核酸を提供する。
【００６６】
【数３】
2005511043.tif 000004
【００６７】
【数４】
2005511043.tif 000005
別の実施形態において、本発明は、例えば、配列番号３を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株１ｂ２１由来の野生型核酸ポリメラーゼをコードする核酸を提供する。
【００６８】
【数５】
2005511043.tif 000006
【００６９】
【数６】
2005511043.tif 000007
【００７０】
【数７】
2005511043.tif 000008
別の実施形態において、本発明は、１３６〜１３８位において、ＧＧＣ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＧＫ２４に関連する誘導体核酸である、配列番号４の核酸を提供する。配列番号４を以下に示す。
【００７１】
【数８】
2005511043.tif 000009
【００７２】
【数９】
2005511043.tif 000010
別の実施形態において、本発明は、１３６〜１３８位において、ＧＧＣ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１に関連する誘導体核酸である、配列番号５の核酸を提供する。配列番号５を以下に示す。
【００７３】
【数１０−１】
2005511043.tif 000011
【００７４】
【数１０−２】
2005511043.tif 000012
【００７５】
【数１１】
2005511043.tif 000013
別の実施形態において、１３６〜１３８位において、ＧＧＣ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株１ｂ２１に関連する誘導体核酸である、配列番号６の核酸を提供する。配列番号６を以下に示す。
【００７６】
【数１２】
2005511043.tif 000014
【００７７】
【数１３】
2005511043.tif 000015
【００７８】
【数１４】
2005511043.tif 000016
別の実施形態において、本発明は、２００５〜０７位において、ＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＧＫ２４に関連する誘導体核酸である、配列番号７の核酸を提供する。配列番号７を以下に示す。
【００７９】
【数１５】
2005511043.tif 000017
【００８０】
【数１６】
2005511043.tif 000018
別の実施形態において、本発明は、２００５〜０７位において、ＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１に関連する誘導体核酸である、配列番号８の核酸を提供する。配列番号８を以下に示す。
【００８１】
【数１７】
2005511043.tif 000019
【００８２】
【数１８】
2005511043.tif 000020
【００８３】
【数１９】
2005511043.tif 000021
別の実施形態において、本発明は、２００５〜０７位において、ＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株１ｂ２１に関連する誘導体核酸である、配列番号９の核酸を提供する。配列番号９を以下に示す。
【００８４】
【数２０】
2005511043.tif 000022
【００８５】
【数２１−１】
2005511043.tif 000023
【００８６】
【数２１−２】
2005511043.tif 000024
別の実施形態において、本発明は、１３６〜１３８位において、ＧＧＣ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を、２００５〜０７位において、ＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＧＫ２４に関連する誘導体核酸である、配列番号１０の核酸を提供する。配列番号１０を以下に示す。
【００８７】
【数２２】
2005511043.tif 000025
【００８８】
【数２３】
2005511043.tif 000026
別の実施形態において、本発明は、１３６〜１３８位において、ＧＧＣ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を、２００５〜０７位において、ＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１に関連する誘導体核酸である、配列番号１１の核酸を提供する。配列番号１１を以下に示す。
【００８９】
【数２４】
2005511043.tif 000027
【００９０】
【数２５】
2005511043.tif 000028
【００９１】
【数２６】
2005511043.tif 000029
別の実施形態において、本発明は、１３６〜１３８位において、ＧＧＣ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を、２００５〜０７位において、ＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株１ｂ２１に関連する誘導体核酸である、配列番号１２の核酸を提供する。配列番号１２を以下に示す。
【００９２】
【数２７】
2005511043.tif 000030
【００９３】
【数２８−１】
2005511043.tif 000031
【００９４】
【数２８−２】
2005511043.tif 000032
示される位置での、ＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を用いる置換は、ＤＮＡポリメラーゼＩによるｄｄＮＴＰ取り込みに対する識別能を低下させ得る。例えば、米国特許第５，６１４，３６５号（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。示される位置での、ＧＧＧ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を用いる置換は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を取り除く。
【００９５】
本発明の核酸は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（図１および図２を参照のこと）をコードする核酸の部分に対して相同性を有する。しかし、本発明の核酸配列のかなりの部分は、異なっている。
【００９６】
本発明はまた、配列番号１〜１２のフラグメント核酸および改変体核酸を包含する。本発明によって包含される核酸「フラグメント」は、２つの一般的な型のものである。第１の、全長核酸ポリメラーゼをコードしないが、核酸ポリメラーゼ活性を有する熱安定性ポリペプチドをコードするフラグメント核酸は、本発明中に包含される。第２の、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であるが生物学的活性を維持するポリメラーゼを一般にコードしないフラグメント核酸もまた、本発明に包含される。従って、配列番号１〜１２のようなヌクレオチド配列のフラグメントは、約９ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドまたはそれ以上の程度の小ささであり得る。一般に、本発明のフラグメント核酸は、本発明の核酸に配列が関連するが全長ではない限り、任意のサイズ上限を有し得る。
【００９７】
上に示されたように、「改変体」は、実質的に類似の配列または実質的に相同な配列である。ヌクレオチド配列について、改変体としては、遺伝暗号の縮重に起因して、ネイティブな核酸ポリメラーゼタンパク質の同一のアミノ酸配列をコードする配列が挙げられる。改変体核酸としてはまた、ネイティブな核酸ポリメラーゼタンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有さないポリペプチドをコードするが、アミノ酸配列中に保存的変化を有する、活性な、熱的に安定な核酸ポリメラーゼをコードするポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【００９８】
当業者に公知であるように、遺伝暗号は「縮重」し、これは、いくつかのトリヌクレオチドコドンが同じアミノ酸をコードし得ることを意味する。この縮重性は、表１から明らかである。
【００９９】
【表１】
2005511043.tif 000033
従って、改変体のヌクレオチド配列における多くの変化はサイレントであり得、そしてその核酸によってコードされるアミノ酸配列を変更させないかもしれない。核酸配列の変更がサイレントである場合、改変体核酸は、参照核酸と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。従って、本発明の特定の核酸配列はまた、縮重したコドン置換を有する改変体およびその相補配列、ならびに配列番号によって明白に特定される配列を包含する。具体的には、縮重コドン置換は、参照コドンがその参照コドンによって特定されるアミノ酸に対するコドンのいずれかによって置換されている配列を生成することによって、達成され得る。一般に、１つ以上の選択されたコドンの第３位は、Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９，５０８１（１９９１）および／またはＯｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，２６０５（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８，９１（１９９４）によって開示されるように、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換され得る。
【０１００】
しかし、本発明は、本発明のヌクレオチド配列におけるサイレントな変化に限定されないが、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を保存的に変更する改変体核酸配列もまた含む。本発明に従って、本発明の改変体核酸および参照核酸は、コードされるアミノ酸配列が、１つ以上の置換、付加、挿入、欠失、融合および短縮によって異なり得、これらは、活性な、熱的に安定な核酸ポリメラーゼが改変体核酸によってコードされる限り、任意の組み合わせで存在し得る。このような改変体核酸は、参照核酸と正確に同じアミノ酸配列をコードするわけではないが、保存的配列変化を有する。
【０１０１】
サイレントな保存的な変化を有する改変体核酸は、参照核酸に対する相同性の程度によって定義および特徴付けされ得る。好ましい改変体核酸は、本発明の参照核酸に対して「実質的に相同」である。当業者によって認識されるように、このような実質的に類似の核酸は、ストリンジェントな条件下で、本明細書中の配列番号によって同定される参照核酸とハイブリダイズし得る。これらの型の実質的に相同な核酸は、本発明によって包含される。
【０１０２】
一般に、本発明の核酸の誘導体および改変体は、本明細書中で定義される参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％の配列同一性を有する。好ましくは、本発明の核酸は、本明細書中で定義される参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【０１０３】
改変体核酸は、標準的なハイブリダイゼーション手順によって、検出および単離され得る。
【０１０４】
このような配列を検出または単離するためのハイブリダイゼーションは、一般に、ストリンジェントな条件下で実施される。核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション）の文脈における、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメータの下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，１頁、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に見出される。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，９．３１−９．５８頁（１９８９）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（第３版、２００１）もまた参照のこと。
【０１０５】
本発明はまた、核酸ポリメラーゼ活性をコードする誘導体核酸または改変体核酸の、検出および単離のための方法を提供する。この方法は、配列番号１〜１２のいずれか１つを含む核酸の少なくとも一部を、サンプル核酸にハイブリダイズさせ、これによって、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程；およびハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を包含する。この複合体の存在は、核酸ポリメラーゼの少なくともセグメントをコードする誘導体核酸または改変体核酸の存在に相関する。一般に、ハイブリダイゼーションのために使用される、配列番号１〜１２のいずれか１つを含む核酸の部分は、少なくとも１５ヌクレオチドであり、そしてハイブリダイゼーションは、実質的に相同な核酸の検出および単離を可能にするのに十分なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてである。代替の実施形態において、核酸サンプルは、配列番号１〜１２の任意の１つから選択されるプライマーオリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。
【０１０６】
一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の二本鎖配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃より低いように選択される。例えば、「高度にストリンジェントな条件」下または「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下において、核酸は、他の配列より検出可能に大きい程度で（例えば、バックグラウンドを少なくとも２倍超えて）、その相補体とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件のストリンジェンシーを制御することによって、１００％相補的な核酸が同定され得る。
【０１０７】
あるいは、ストリンジェンシー条件は、配列におけるいくらかのミスマッチを許容し、その結果、より低い程度の類似性が検出されるように調節され得る（異種プロービング）。代表的に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、代表的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン（または他の塩）の濃度であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃で、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で、達成され得る。
【０１０８】
例示的な低ストリンジェンシーの条件としては、３０〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中、５０〜５５℃での洗浄が挙げられる。例示的な中程度にストリンジェンシーな条件としては、４０〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに０．５×〜１×ＳＳＣ中、５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシーの条件としては、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに０．１×ＳＳＣ中、６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。
【０１０９】
ハイブリダイゼーションの間に得られるハイブリッドの相補性または相同性の程度は、代表的に、ハイブリダイゼーション後の洗浄と相関関係にあり、重要な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ハイブリダイズする核酸の型および長さもまた、ハイブリダイゼーションが起こるか否か、ならびに形成される任意のハイブリッドが所定のセットのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で安定であるか否かに、影響を与える。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４（１９８４）の方程式から近似され得る；Ｔｍ  ８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；ここで、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡにおけるグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、そしてＬは、ハイブリッドの塩基対長である。Ｔｍは、（定義されたイオン強度およびｐＨで）完全に整合したプローブに５０％の相補的標的配列がハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍに等しいように選択される。
【０１１０】
１００を超える相補的残基を有する相補的核酸の、サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルタ上での、ハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミドであり、このハイブリダイゼーションは、一晩行われる。高度にストリンジェントな条件の例は、７２℃で約１５分間の、０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の、０．２×ＳＳＣでの洗浄である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（下記）をまた参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシーの洗浄の前に、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェンシーの洗浄が行われる。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての中程度のストリンジェンシーの例は、４５℃で１５分間の、１×ＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての例示的な低ストリンジェンシーの洗浄の例は、４０℃で１５分間の、４×〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については、ストリンジェントな条件としては、代表的に、ｐＨ７．０〜８．３において、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、代表的に、約０．０１Ｍ〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）が挙げられ、その温度は、代表的に、少なくとも約３０℃である。
【０１１１】
ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける無関係のプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比の２倍の（またはそれより高い）シグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下では互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を使用して作製される場合に起こる。
【０１１２】
以下は、本発明の参照核酸と実質的に同一な相同核酸を検出および単離するために使用され得る、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である：参照ヌクレオチド配列は、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃で参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、より望ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、より望ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でなおもハイブリダイズし、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、より好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、６５℃で洗浄される。
【０１１３】
一般に、Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃低下する。従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、および／または洗浄条件は、所望の配列同一性の配列にハイブリダイズするように調整され得る。例えば、９０％を超える同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは、１０℃低下され得る。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその相補体についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。しかし、非常にストリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）より１℃、２℃、３℃、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；中程度にストリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）より６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；低ストリンジェンシーの条件は、熱融解点（Ｔｍ）より１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。
【０１１４】
所望される程度のミスマッチが、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍを生じる場合、より高い温度が使用され得るように、ＳＳＣ濃度を上昇させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  １，第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。Ｔｍ、ミスマッチ、ならびにハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の間の関係について、これらの参考文献および本明細書の教示を使用して、当業者は、本発明の核酸ポリメラーゼ核酸の改変体を作製し得る。
【０１１５】
コンピュータ分析をまた配列の比較のために利用して、配列同一性を決定し得る。このような分析としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン８におけるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）およびＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから入手可能）。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトパラメータを使用して実施され得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓら．Ｇｅｎｅ  ７３：２３７  ２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇら．ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５（１９９２）；およびＰｅａｒｓｏｎら．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１（１９９４）によって、十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（前記）のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（前記）のアルゴリズムに基づく。比較の目的のためにギャップを含むアライメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０中）が、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）において記載されるように、利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０中）は、分子間の距離の関係を検出する反復検索を実施するために使用され得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前記を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮ、タンパク質についてＢＬＡＳＴＸ）が使用され得る。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０９１５（１９８９）を参照のこと）。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。アライメントはまた、調査によって手動で実施され得る。
【０１１６】
本発明の目的のために、配列同一性％の決定のためのヌクレオチド配列の、本明細書中に開示される核酸ポリメラーゼ配列との比較は、好ましくは、ＢｌａｓｔＮプログラム（バージョン１．４．７以降）を使用してそのデフォルトパラメータを用いて、または任意の等価なプログラムを使用して、行われる。「等価なプログラム」とは、好ましいプログラムによって作製される対応するアライメントと比較した場合に、問題の任意の２つの配列について、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致、ならびに同一の配列同一性％を有するアライメントを生じる、任意の配列比較プログラムを意図する。
【０１１７】
（ポリメラーゼをコードする核酸の発現）
本発明の核酸は、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドの組換え発現のために使用され得る。一般的に、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドの組換え発現は、特定の型の宿主細胞における使用に適合させた発現ベクターへ、そのポリペプチドをコードする核酸を導入することによって引き起こされる。本発明の核酸は、任意の宿主生物、例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞の両方において導入され得、そして発現され得る。宿主細胞の例としては、細菌細胞株、酵母細胞株、培養された昆虫細胞株、および培養された哺乳動物細胞株が挙げられる。好ましくは、核酸ポリメラーゼが由来する生物のものと類似の様式で、新生ポリペプチドをプロセシングし、そして翻訳後修飾する、組換え宿主細胞系が、選択される。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドを発現し、そして単離する目的のために、原核生物が好ましく、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが好ましい。従って、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１１８】
導入されるべき核酸は、目的の生物における発現のための発現カセット中に、簡便に配置され得る。このような発現カセットは、本発明の核酸に連結された転写開始領域を含む。発現カセットはまた、好ましくは、種々の制御エレメントの転写調節下にあるべき核酸の挿入のための、複数の制限部位を有する。この発現カセットはさらに、選択マーカー遺伝子を含み得る。適切な制御エレメント（例えば、エンハンサー／プロモーター、スプライス結合点、ポリアデニル化シグナルなど）は、適切な転写の開始および／または１次ＲＮＡ転写の正確なプロセシングを可能にする必要がある場合、遺伝子のコード領域に非常に近接して配置され得る。あるいは、本発明の発現ベクターにおいて利用されるコード領域は、内因性エンハンサー／プロモーター、スプライス結合点、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性制御エレメントおよび外因性制御エレメントの両方の組み合わせを含み得る。
【０１１９】
好ましくは、ベクター中の核酸は、宿主細胞中における適切なプロモーターまたは他の転写調節エレメントの制御下にあり、そしてそれらと作動可能に連結される。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターであり得る。転写カセットは、一般的に、その転写の５’−３’方向で、その生物において機能的な、プロモーター、転写開始領域および翻訳開始領域、目的のＤＮＡ配列、ならびに転写終止領域および翻訳終止領域を含む。この終止領域は、転写開始領域にとってネイティブであり得るか、目的のＤＮＡ配列にとってネイティブであり得るか、または、別の供給源由来であり得る。
【０１２０】
原核生物細胞および真核生物細胞における組換え核酸の効率的発現は、一般的に、効率的な終止に指向する調節制御エレメントおよび生じる転写産物のポリアデニル化を必要とする。転写終止シグナルは、一般的に、ポリアデニル化シグナルの下流において見出され、そして数百ヌクレオチド長である。用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、本明細書で使用される場合、新生ＲＮＡ転写産物の終止およびポリアデニル化の両方を指向する核酸配列を表す。組換え転写産物の効率的なポリアデニル化は、ポリＡテールを欠く転写産物が、不安定でかつ迅速に分解されるので、望ましい。
【０１２１】
核酸ポリメラーゼをコードする核酸は、当業者に公知の方法によって、細菌宿主細胞に導入され得る。例えば、好熱性核酸ポリメラーゼをコードする核酸は、一般的に使用されている形質転換手順によって（例えば、塩化カルシウムによる処理またはエレクトロポレーションによって）細菌細胞に導入され得る。好熱性核酸ポリメラーゼが、真核生物宿主細胞において発現されるべき場合、好熱性核酸ポリメラーゼをコードする核酸は、多数の手段（リン酸カルシウム共沈、スフェロプラスト融合、エレクトロポレーションなどが挙げられる）によって真核生物宿主細胞に導入され得る。真核生物宿主細胞が、酵母細胞の場合、形質転換は、酢酸リチウムでの宿主細胞の処理またはエレクトロポレーションによってもたらされ得る。
【０１２２】
従って、本発明の１つの局面は、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞を提供することである。広範な発現ベクターが、当該分野において利用可能である。種々の発現ベクターの説明およびそれらの使用方法については、とりわけ、米国特許第５，６０４，１１８号；同第５，５８３，０２３号；同第５，４３２，０８２号；同第５，２６６，４９０号；同第５，０６３，１５８号；同第４，９６６，８４１号；同第４，８０６，４７２号；同第４，８０１，５３７号およびＧｏｅｄｅｌら，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９８９）において見出され得る。組換え細胞系における核酸ポリメラーゼの発現は、十分に確立された技術である。核酸ポリメラーゼの組換え発現の例は、米国特許第５，６０２，７５６号；同第５，５４５，５５２号；同第５，５４１，３１１号；同第５，５００，３６３号；同第５，４８９，５２３号；同第５，４５５，１７０号；同第５，３５２，７７８号；同第５，３２２，７８５号；および同第４，９３５，３６１号において見出され得る。
【０１２３】
本発明の局面をなし、そしてそれを使用するのを補助するために使用され得る組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ならびにＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）によって記載されている。
【０１２４】
（核酸ポリメラーゼ酵素）
本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドならびにそのフラグメントおよび活性でかつ熱に安定な改変体核酸ポリメラーゼポリペプチドを提供する。配列番号１３〜２４のいずれか１つを有するアミノ酸配列（これらは、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの核酸ポリメラーゼおよび誘導体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの核酸ポリメラーゼについてのアミノ酸配列である）を含む任意のポリペプチドは、本発明によって企図される。本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチドか、または実質的に精製されたポリペプチドである。特に、本発明の単離されたポリペプチドは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌中に通常存在するタンパク質を実質的に含まない。
【０１２５】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３のポリペプチド（これは、株ＧＫ２４からの野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの核酸ポリメラーゼポリペプチドである）を提供する。配列番号１３は、以下に提供される。
【０１２６】
【数２９】
2005511043.tif 000034
別の実施形態において、本発明は、株ＧＫ２４からの配列番号１４野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの核酸ポリメラーゼ酵素を提供する。配列番号１４は、以下に提供される。
【０１２７】
【数３０】
2005511043.tif 000035
【０１２８】
【数３１】
2005511043.tif 000036
別の実施形態において、本発明は、株１ｂ２１からの配列番号１５野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの核酸ポリメラーゼ酵素を提供する。配列番号１５は、以下に提供される。
【０１２９】
【数３２】
2005511043.tif 000037
本発明の野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの核酸ポリメラーゼの配列は、公知のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と異なる。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、株ＧＫ２４アミノ酸配列（配列番号１３）と公開されたＧＫ２４ＤＮＡポリメラーゼＩ配列（Ｋｗｏｎら、（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ．１９９７  Ａｐｒ  ３０；７（２）：２６４−２７１）による）との比較は、配列番号１３が、Ｋｗｏｎ配列に対して以下の４つの変化を明らかにする：Ａｓｎ１２９→Ｌｙｓ、Ｐｒｏ１３０→Ａｌａ、Ａｓｐ１４７→Ｔｙｒ、およびＧｌｙ７９７→Ａｒｇ。これらの４つの位置は図１において同定される。これらの４つの位置の各々において、Ｋｗｏｎ  ＧＫ４  ＤＮＡポリメラーゼＩおよび配列番号１３を持つポリペプチドは、劇的に異なる化学的特性を有するアミノ酸を有する。１２９位のアスパラギン（Ｋｗｏｎ）は、極性の荷電してないアミノ酸側鎖である一方、リジン（配列番号１３）は荷電していて塩基性である。１３０位のプロリン（Ｋｗｏｎ）およびアラニン（配列番号１３）は、共に脂肪族であるが、アラニンは、ヘリックス形成またはβシート形成を促進し、一方プロリン残基は、一般的にヘリックスおよびシートを妨害する。１４７位のアスパラギン酸（Ｋｗｏｎ）は、酸性アミノ酸であり、一方チロシン（配列番号１３）は、芳香族である。７９７位のグリシン（Ｋｗｏｎ）は、最も小さなアミノ酸側鎖であり、一方アルギニン（配列番号１３）は、最も長く、最も塩基性に荷電された側鎖を有する。
【０１３０】
同様に、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、株ＲＱ−１アミノ酸配列（配列番号１４）と入手可能なＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株について公開されたアミノ酸配列との比較は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、株ＲＱ−１アミノ酸配列が、少なくとも２つの位置で異なっていることを示す。４０６位において、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、株ＲＱ−１アミノ酸配列は、グルタミンを有し、一方入手可能なＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株は、ヒスチジンを有する。６８５位において、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＲＱ−１アミノ酸配列は、セリンを有し、一方入手可能なＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株は、アラニンを有する。
【０１３１】
さらに、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、株１ｂ２１アミノ酸配列（配列番号１５）と入手可能なＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの株について公開されたアミノ酸配列との比較は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、株１ｂ２１アミノ酸配列が、少なくとも１つの位置で異なっていることを示す。１２９位において、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、株１ｂ２１アミノ酸配列は、リジンを有し、一方、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＨＢ８（ＡＴＣＣ受託番号４６６５７３）について公開されたアミノ酸配列は、アルギニンを有する。
【０１３２】
従って、本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼのいくつかの領域は、前もって入手可能なＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼと異なる。
【０１３３】
多くのＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性の他に活性を有する。このような活性としては、例えば、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、組み込まれたかもしれない不正確な塩基を除去することによって、新規に合成された鎖の正確さを改善する。このような活性が低いかまたは存在しないＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチド残基のプライマー伸長鎖への組み込みにおいて誤りを起こしやすい。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、低い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有すると報告されている。Ｌａｗｙｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７−６４３７を参照のこと。ＤＮＡの複製が、しばしばプライマー伸長サイクルの数に関して相乗的である核酸増幅手順のような適用において、このような誤りは、重大な人為的問題（例えば、核酸増幅産物（アンプリコン）の配列不均一性）をもたらし得る。従って、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、このような目的のために使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの望ましい特徴である。
【０１３４】
対照的に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、しばしば、この活性が、保護されていない５’末端を有する核酸（プライマーを含む）を消化し得るので、望ましくない。従って、弱められた５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するか、またはこのような活性が存在しない耐熱性核酸ポリメラーゼは、生化学的適用に対して酵素の所望される特性である。種々のＤＮＡポリメラーゼ酵素が、記載されており、ここで、改変が、この目的を達成するＤＮＡポリメラーゼに導入されている。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントは、このタンパク質（５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を制御する）のドメインが除去されているホロ酵素のタンパク質分解フラグメントとして産生され得る。このＫｌｅｎｏｗフラグメントは、依然として、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保持する。Ｂａｒｎｅｓ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０６１８８（１９９２）およびＧｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，０７９，３５２号は、５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損組換えＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを産生している。Ｉｓｈｉｎｏら、ＥＰＯ公開番号０５１７４１８Ａ２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来の５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼを産生している。
【０１３５】
別の実施形態において、本発明は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低下しているかまたは除去されているＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ誘導体ポリペプチドである、ポリペプチドを提供する。いくつかの方法が、この活性を減らすために存在し、そして本発明は、このような低下されるかまたは除去される５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリペプチドに由来する任意のポリペプチドを企図する。米国特許第５，４６６，５９１号；Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’−３’  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７年５月２日；２６８（２）：２８４−３０２を参照のこと。
【０１３６】
１つの実施形態において、本発明は、株ＧＫ２４（ここで、Ａｓｐが、４６位のＧｌｙの代わりに使用される）からのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号１６および低下した５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。配列番号１６は、以下に提供される。
【０１３７】
【数３３】
2005511043.tif 000038
１つの実施形態において、本発明は、株ＲＱ−１（ここで、Ａｓｐが、４６位のＧｌｙの代わりに使用される）からのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号１７および低下した５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。配列番号１７は、以下に提供される。
【０１３８】
【数３４】
2005511043.tif 000039
【０１３９】
【数３５】
2005511043.tif 000040
別の実施形態において、本発明は、株１ｂ２１（ここで、Ａｓｐが、４６位のＧｌｙの代わりに使用される）からのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ核酸ポリメラーゼポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号１８および低下した５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。配列番号１８は、以下に提供される。
【０１４０】
【数３６】
2005511043.tif 000041
別の実施形態において、本発明は、ｄｄＮＴＰの取りこみに対する偏りが低下した株ＧＫ２４からのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ誘導体ポリペプチドである、配列番号１９のポリペプチドを提供する。配列番号１９は、６６９位にてＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号１９の配列は、以下である。
【０１４１】
【数３７】
2005511043.tif 000042
別の実施形態において、本発明は、ｄｄＮＴＰの取りこみに対する偏りが低下した株ＲＱ−１からのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ誘導体ポリペプチドである、配列番号２０のポリペプチドを提供する。配列番号２０は、６６９位にてＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２０の配列は、以下である。
【０１４２】
【数３８】
2005511043.tif 000043
【０１４３】
【数３９】
2005511043.tif 000044
別の実施形態において、本発明は、ｄｄＮＴＰの取りこみに対する偏りが低下した株１ｂ２１からのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ誘導体ポリペプチドである、配列番号２１のポリペプチドを提供する。配列番号２１は、６６９位にてＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２１の配列は、以下である。
【０１４４】
【数４０】
2005511043.tif 000045
別の実施形態において、本発明は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低下しており、かつｄｄＮＴＰの取りこみに対する偏りが低下した株ＧＫ２４からのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ誘導体ポリペプチドである、配列番号２２のポリペプチドを提供する。配列番号２２は、４６位にてＧｌｙの代わりにＡｓｐを有し、そして６６９位にてＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２２の配列は、以下である。
【０１４５】
【数４１】
2005511043.tif 000046
別の実施形態において、本発明は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低下しており、かつｄｄＮＴＰの取りこみに対する偏りが低下した株ＲＱ−１からのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ誘導体ポリペプチドである、配列番号２３のポリペプチドを提供する。配列番号２３は、４６位にてＧｌｙの代わりにＡｓｐを有し、そしておよび６６９位にてＰｈｅのかわりにＴｙｒを有する。配列番号２３の配列は、以下である。
【０１４６】
【数４２】
2005511043.tif 000047
【０１４７】
【数４３】
2005511043.tif 000048
別の実施形態において、本発明は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低下しており、かつｄｄＮＴＰの取りこみに対する偏りが低下した株１ｂ２１からのＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ誘導体ポリペプチドである、配列番号２４のポリペプチドを提供する。配列番号２４は、４６位にてＧｌｙの代わりにＡｓｐを有し、そして６６９位にてＰｈｅの代わりにＴｙｒを有する。配列番号２４の配列は、以下である。
【０１４８】
【数４４】
2005511043.tif 000049
本発明の核酸ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの他の株由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の部分に相同性を有する。しかし、本発明のアミノ酸配列のいくつかの部分は、異なる（図１および２を参照のこと）。
【０１４９】
上記に示したように、本発明の誘導体ポリペプチドおよび改変体ポリペプチドは、野生型ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；野生型ポリペプチド内の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；あるいは野生型ポリペプチド内の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換による野生型核酸ポリメラーゼ由来である。従って、本発明のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、および挿入を含む種々の方法で改変され得る。
【０１５０】
このような改変体ポリペプチドおよび誘導体ポリペプチドは、例えば、遺伝的多型またはヒト操作から生じ得る。このような操作のための方法は、一般的に、当該分野で公知である。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７）；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｏｉｌｏｇｙ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）ならびにそれらに引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換についての指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｌｔａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｄ．（１９７８）のモデルに見出され得、これは本明細書で参考として援用される。
【０１５１】
本発明の単離されたポリペプチドの誘導体および改変体は、配列番号１３〜２４のいずれか１つのアミノ酸部分の少なくとも約９８％と同一性を有し、かつ核酸ポリメラーゼ活性を有し、そして／または熱的に安定である。好ましい実施形態において、ポリペプチド誘導体およびポリペプチド改変体は、配列番号１３〜２４のいずれか１つのアミノ酸部分の少なくとも約９９％と同一性を有し、かつ核酸ポリメラーゼ活性を有し、そして／または熱的に安定である。
【０１５２】
単離されたポリペプチドならびにポリペプチド誘導体およびポリペプチド改変体のアミノ酸残基は、遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸、天然に存在する、遺伝的にコードされないＬ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸または上記のいずれかのＤ−鏡像体であり得る。遺伝的にコードされる２０個のＬ−アミノ酸および一般的にコードされないアミノ酸について、本明細書で使用されるアミノ酸記号は、従来の通りであり、表２に示されるとおりである。
【０１５３】
【表２−１】
2005511043.tif 000050
【０１５４】
【表２−２】
2005511043.tif 000051
本発明の範囲内に包含されるポリペプチド改変体は、これらの改変体ポリペプチドがポリメラーゼ活性を保持しかつ／または耐熱性のままである限り、類似の化学的特性および／または物理的特性のアミノ酸によって、１以上のアミノ酸が置換され得る。誘導体ポリペプチドは、これらの改変体ポリペプチドがポリメラーゼ活性を保持しかつ／または耐熱性のままである限り、異なる化学的特性および／または物理的特性を有するアミノ酸によって１以上のアミノ酸が置換され得る。
【０１５５】
本発明の改変体ポリペプチドにおいて相互に置換可能であるアミノ酸は、一般に、類似のクラスまたはサブクラス内に存在する。当業者に公知であるように、アミノ酸は、そのアミノ酸側鎖の特徴に主に依存して、以下の３つの主要なクラスに分けられ得る：親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸およびシステイン様アミノ酸。これらの主要なクラスは、サブクラスにさらに分けられ得る。親水性アミノ酸としては、酸性側鎖、塩基性側鎖または極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられ、そして疎水性アミノ酸としては、芳香族側鎖または無極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。無極性アミノ酸は、とりわけ、脂肪族アミノ酸を含むようにさらに細分され得る。本明細書中で使用される場合、これらのクラスのアミノ酸の定義は、以下のとおりである：
「疎水性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにて無電荷でありかつ水溶液によってはじかれる側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸の例としては、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌが挙げられる。遺伝的にコードされない疎水性アミノ酸の例としては、ｔ−ＢｕＡが挙げられる。
【０１５６】
「芳香族アミノ酸」とは、共役π電子系を有する少なくとも１個の環（芳香族）を含む側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。この芳香族基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル基、スルホニル基、ニトロ基およびアミノ基などのような置換基でさらに置換され得る。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。一般に遭遇する遺伝的にコードされない芳香族アミノ酸としては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニンおよび４−フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
【０１５７】
「無極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにて一般に無電荷でありかつ極性ではない側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされる無極性アミノ酸の例としては、グリシン、プロリンおよびメチオニンが挙げられる。コードされない無極性アミノ酸の例としては、Ｃｈａが挙げられる。
【０１５８】
「脂肪族アミノ酸」とは、飽和または不飽和の直鎖、分枝鎖または環状の炭化水素側鎖を有する無極性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸の例としては、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅが挙げられる。コードされない脂肪族アミノ酸の例としては、Ｎｌｅが挙げられる。
【０１５９】
「親水性アミノ酸」とは、水溶液によって結合される側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸の例としては、ＳｅｒおよびＬｙｓが挙げられる。コードされない親水性アミノ酸の例としては、ＣｉｔおよびｈＣｙｓが挙げられる。
【０１６０】
「酸性アミノ酸」とは、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。酸性アミノ酸は、代表的には、水素イオンの損失に起因して、生理学的ｐＨにて負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸の例としては、アスパラギン酸（アスパルテート）およびグルタミン酸（グルタメート）が挙げられる。
【０１６１】
「塩基性アミノ酸」とは、７より高い側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。塩基性アミノ酸は、代表的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的ｐＨにて正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。遺伝的にコードされない塩基性アミノ酸の例としては、非環状アミノ酸であるオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンが挙げられる。
【０１６２】
「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにて無荷電であるが、２つの原子によって共有される電子対がこれらの原子のうちの一方により接近して保持された結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされる極性アミノ酸の例としては、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。遺伝的にコードされない極性アミノ酸の例としては、シトルリン、Ｎ−アセチルリジンおよびメチオニンスルホキシドが挙げられる。
【０１６３】
「システイン様アミノ酸」とは、別のアミノ酸残基の側鎖と共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を形成することが可能な側鎖を有するアミノ酸をいう。代表的には、システイン様アミノ酸は、一般に、少なくとも１個のチオール（ＳＨ）基を含む側鎖を有する。遺伝的にコードされるシステイン様アミノ酸の例としては、システインが挙げられる。遺伝的にコードされないシステイン様アミノ酸の例としては、ホモシステインおよびペニシラミンが挙げられる。
【０１６４】
当業者によって理解されるように、上記の分類は、絶対的ではない。数種のアミノ酸は、１を超える特徴的な特性を示し、それゆえ、１を超えるカテゴリーに含まれ得る。例えば、チロシンは、芳香族環と極性ヒドロキシル基との両方を有し得る。従って、チロシンは、二重の特性を有し、そして芳香族カテゴリーと極性カテゴリーとの両方に含まれ得る。同様に、ジスルフィド結合を形成することができることに加えて、システインはまた、無極性特性を有する。従って、厳密には疎水性アミノ酸としても無極性アミノ酸としても分類されないが、多くの場合において、システインは、ポリペプチドに疎水性を与えるために使用され得る。
【０１６５】
遺伝的にコードされずかつ本発明の改変体ポリペプチド中に存在し得るか、またはアミノ酸で置換され得る、特定の一般に遭遇するアミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：β−アラニン（ｂ−Ａｌａ）および他のω−アミノ酸（例えば、３−アミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸など）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）およびホモセリン（ｈＳｅｒ）。これらのアミノ酸はまた、上で定義されるカテゴリーに分類される。
【０１６６】
上記の遺伝的にコードされるアミノ酸およびコードされないアミノ酸の分類は、以下の表３において要約される。表３は、例示目的のみのためであり、本明細書中に記載される改変体ポリペプチドおよび誘導体ポリペプチドを含み得るアミノ酸残基の完全な列挙であることを意味しないことが理解されるべきである。本明細書中に記載される改変体ポリペプチドおよび誘導体ポリペプチドを作製するために有用である他のアミノ酸残基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．およびその中で引用される参考文献において見出され得る。本明細書中で特に言及されていないアミノ酸は、既知の挙動ならびに／または特に特定されたアミノ酸と比較した場合のそれらの特徴的な化学的特性および／もしくは物理的特性に基づいて、上記のカテゴリーに簡便に分類され得る。
【０１６７】
【表３−１】
2005511043.tif 000052
【０１６８】
【表３−２】
2005511043.tif 000053
本発明のポリペプチドは、ペプチド改変体が耐熱性でありかつ／またはＤＮＡポリメラーゼ活性を保持する限り、改変体ポリペプチドを作製するために、同様に分類された任意のアミノ酸によって任意のアミノ酸が置換されていてもよい。
【０１６９】
「ドメインシャッフリング」または「耐熱性キメラ核酸ポリメラーゼ」の構築は、新規の特性を含む耐熱性ポリメラーゼを提供するために使用され得る。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのコドン１〜２８８の後ろへの本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼコード配列の１つに由来のコドン２８９〜４２２の配置は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼドメイン（１〜２８９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ核酸ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン（２８９〜４２２）、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼドメイン（４２３〜８３２）を含む新規の耐熱性核酸ポリメラーゼを生じる。あるいは、本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ核酸ポリメラーゼの１つの５’−３’エキソヌクレアーゼドメインおよび３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ（ｄＮＴＰ結合ドメインおよびプライマー／テンプレート結合ドメイン）部分（コドン約４２３〜８３２）に融合され得る。ドナーおよびレシピエントは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼに限定される必要性はない。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、５’−３’エキソヌクレアーゼドメインおよび／または他のドメインは同様に、Ｔｈｅｒｍｕｓの種由来のものについて交換され得る。
【０１７０】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼドメインは、耐熱性の有意な損失もポリメラーゼ活性の有意な損失もなしに、このタンパク質のアミノ末端から除去され得ることが実証されている（Ｅｒｌｉｃｈら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３−１６５１，Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５．，Ｌａｗｙｅｒら（１９８９）ＪＢＣ  ２６４：６４２７−６４３７）。他のＮ末端欠失は、同様に、耐熱性および活性を維持することが示されている（Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１７８５−１７９２およびその中の参考文献）。従って、本発明はまた、本明細書中で提供される、同様に短縮型形態の任意の野生型ポリメラーゼまたは改変体ポリメラーゼを含む。例えば、本発明はまた、本発明によって提供されるポリメラーゼのうちのいずれかの活性な短縮型改変体に関し、ここで、最初の３３０アミノ酸が除去されている。
【０１７１】
さらに、本発明は、配列番号２９の短縮型形態のポリメラーゼを提供する。ここでは、株ＧＫ２４由来の野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼのＮ末端の２８９アミノ酸が除去されている。
【０１７２】
【数４５】
2005511043.tif 000054
別の実施形態では、本発明は、配列番号３０の短縮型形態のポリメラーゼを提供する。ここでは、株ＲＱ−１由来の野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼのＮ末端の２８９アミノ酸が除去されている。配列番号３０を以下に提供する。
【０１７３】
【数４６】
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別の実施形態では、本発明は、配列番号３０の短縮型形態のポリメラーゼを提供する。ここでは、株１ｂ２１由来の野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼのＮ末端の２８９アミノ酸が除去されている。配列番号３０を以下に提供する。
【０１７４】
【数４７】
2005511043.tif 000056
従って、本発明のポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ならびにそれらの改変体、短縮型および改変形態の両方を包含する。このような改変体は、所望の活性を保有し続ける。本明細書中に包含されるポリペプチド配列の欠失、挿入、および置換は、このポリペプチドの特徴において根本的な変化を生じるとは予測されない。当業者は、慣用的なスクリーニングアッセイによって、本発明のポリペプチドおよび改変体ポリペプチドの耐熱性およびポリメラーゼ活性を容易に評価し得る。
【０１７５】
本発明のポリペプチドを含むキットおよび組成物は、細胞性物質を実質的に含まない。このような調製物および組成物は、約３０（乾燥重量）％未満、約２０（乾燥重量）％未満、約１０（乾燥重量）％未満、約５（乾燥重量）％未満の夾雑細菌細胞性タンパク質を有する。
【０１７６】
核酸ポリメラーゼポリペプチドおよび改変体ポリペプチドの活性は、当業者に公知の任意の手順によって評価され得る。例えば、本発明の改変体ポリメラーゼポリペプチドおよび非改変体ポリメラーゼポリペプチドのＤＮＡ合成活性は、標準的なＤＮＡ配列決定反応またはＤＮＡプライマー伸長反応において試験され得る。１つのこのようなアッセイは、１００μｌ（最終容積）の反応混合物で行われ得、この反応混合物は、例えば、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭの緩衝化合物（例えば、ＰＩＰＥＳ、Ｔｒｉｓまたはトリエチルアミンを含む緩衝液中、０．１ｍＭ  ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、α−３２Ｐ−ｄＡＴＰ、０．３ｍｇ／ｍｌの活性化子ウシ胸腺ＤＮＡおよび）０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む。各ポリメラーゼ酵素の０．１単位／μｌまでの希釈物を調製し、そして５μｌのこのような希釈物を、この反応混合物に加え、続いて、６０℃にて１０分間インキュベートする。反応産物を、ＤＮＡに組み込まれた３２Ｐの量を決定するかまたはポリアクリルアミドゲルでの分離後の産物を観察することによって、検出し得る。
【０１７７】
（核酸ポリメラーゼポリペプチドについての使用）
本発明の耐熱性酵素は、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性が必要であるかまたは望ましい、任意の目的のために使用され得る。例えば、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドは、以下の手順の１つ以上において使用され得る：ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ増幅、逆転写、ＤＮＡ合成および／またはプライマー伸長。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＮＡを増幅するために使用され得る。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドはまた、プライマー伸長反応においても使用され得る。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドは、逆転写のために使用され得る。本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドは、ターミネーターヌクレオチドを使用する一ヌクレオチドプライマー伸長によって、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）について試験するために使用され得る。任意のこのような手順および関連手順（例えば、ポリヌクレオチド標識またはプライマー標識、ミニ配列決定（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）など）は、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドについて使用することが企図される。
【０１７８】
本発明の方法は、プライミングしたポリヌクレオチドテンプレートを、少なくとも１つの標識ヌクレオチドを用いて伸長させる工程を包含し、ここで、この伸長は、本発明の核酸ポリメラーゼによって触媒される。Ｓａｎｇｅｒ配列決定のために使用される核酸ポリメラーゼは、蛍光標識される産物を生成し得、この産物は、自動化蛍光ベースの配列決定装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１０または３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））によって分析される。Ｓａｎｇｅｒ配列決定のための詳細なプロトコルは、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）において見出され得る。
【０１７９】
１つの実施形態において、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドは、ＤＮＡ増幅のために使用される。ＤＮＡポリメラーゼを用いる任意の手順は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、鎖置換増幅および他の増幅手順において使用され得る。鎖置換増幅は、Ｗａｌｋｅｒら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，１６９１−１６９６において記載されるように使用され得る。用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，９６５，１８８号（本明細書中で参考として援用される）の方法（これらは、ゲノムＤＮＡもしくは他のＤＮＡ、またはＲＮＡの混合物中の標的配列のセグメント濃度を、クローニングも精製もすることなしに増加させるための方法を記載する）をいう。
【０１８０】
標的配列を増幅するためのＰＣＲプロセスは、大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に導入し、続いて核酸ポリメラーゼの存在下でのサーマルサイクリングの正確な順序に供する工程からなる。これら２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、この混合物を変性させ、そしてプライマーを、標的分子内の相補配列にアニーリングする。アニーリングの後、このプライマーを、相補鎖の新たな対を形成するように、ポリメラーゼを用いて伸長させる。変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼ伸長工程は、多数回反復され得る。変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼ伸長工程は、「サイクル」を構成する。多数のサイクルが存在し得、生成された増幅ＤＮＡの量は、サイクル数と共に増加する。従って、高濃度の増幅された標的核酸を獲得するために、多くのサイクルが行われる。
【０１８１】
ＰＣＲ核酸増幅法に含まれる工程は、以下に、より詳細に記載される。議論を容易にするために、増幅される核酸を、二本鎖であるものとして記載する。しかし、最終的な産物は一般的に二本鎖ＤＮＡであるが、このプロセスは一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を増幅するためにも等しく有用である。一本鎖核酸の増幅において、第一の工程は、相補鎖の合成を含む（例えば、２つの増幅プライマーのうちの１つが、この目的のために用いられ得る）。引き続く工程は、一般的に以下のように進められる：
（ａ）各核酸鎖を、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および増幅されるべき各核酸鎖に対する１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる。ここで、各プライマーは、増幅されるべき核酸鎖の一部分に実質的に相補的であるように選択されており、その結果、一方のプライマーから合成された伸長産物は、その相補体と分離された際に、他方のプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレートとしての役割を果たし得る。プライマーと増幅されるべき核酸鎖との適切なアニーリングを促進するために、相補的核酸鎖への各プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする温度が使用される。
【０１８２】
（ｂ）プライマーアニーリングの後に、プライマーによってハイブリダイズされる鎖に相補的な伸長する核酸鎖へヌクレオシド三リン酸を取りこむプライマー伸長のために、核酸ポリメラーゼが使用される。一般に、このプライマー伸長反応は、酵素の活性を促進し、かつ完全な第２プライマー結合を介して伸長する「全長」相補的核酸鎖を合成するのに有効な温度および時間で実施される。しかし、その温度は、その核酸テンプレート鎖から各伸長産物を分離するほどには高くない。
【０１８３】
（ｃ）次いで、工程（ｂ）からの混合物は、それらの相補的なテンプレートからプライマー伸長産物を分離するのに十分な時間および温度で加熱される。この選択された温度は、その混合物中に存在する核酸ポリメラーゼを不可逆的に変性させるほどには高くない。
【０１８４】
（ｄ）（ｃ）からの混合物は、工程（ｂ）で生成された各々の一本鎖分子にプライマーのハイブリダイゼーションを促進するのに有効な時間および温度で冷却される。
【０１８５】
（ｅ）工程（ｄ）からの混合物は、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を促進して、「全長」伸長産物を生成するのに十分な時間および温度で維持される。使用される温度は、相補的鎖テンプレートから各伸長産物を分離するほどには高くない。工程（ｃ）〜（ｅ）は、所望のレベルの増幅が得られるまで反復される。
【０１８６】
増幅方法は、既知の配列の大量の特異的核酸配列を生成するためだけでなく、存在することは知られているが完全には特定されていない核酸配列を生成するためにも有用である。テンプレート（相補体）から分離される場合、１つのプライマーから合成された伸長産物が、他のプライマーの伸長に対するテンプレートとして働き得るように、配列に沿った相対的な位置で所望の配列の異なる鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーが調製され得るに十分に詳細に、配列の両方の末端での十分な数の塩基のみを知る必要がある。この配列の両方の末端の塩基についての知見が多くなればなるほど、標的核酸配列についてのプライマーの特異性が、高くなり得る。
【０１８７】
従って、耐熱性核酸ポリメラーゼが、一般的に、ＰＣＲに使用される。なぜなら、これらのポリメラーゼが、二本鎖標的ＤＮＡを融解するため、およびＰＣＲ反応の各サイクルの間にプライマーをアニーリングするために使用される高温で機能し得るからである。高温は、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利であって、かつ標的ではない配列とのハイブリダイゼーションに有利で熱力学的条件を生じる（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（編）、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ［１９８９］）。
【０１８８】
本発明の耐熱性核酸ポリメラーゼは、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）における有効な使用のための要件を満たす。本発明のポリメラーゼは、増幅プロセスの間に二本鎖核酸を融解するのに必要な時間で、必要とされる上昇した温度に供される際に、不可逆的に変性（不活化）されない。本明細書における目的のための不可逆的な変性は、酵素活性の永久的かつ完全な喪失をいう。核酸の変性のために必要な加熱条件は、例えば、緩衝液の塩濃度ならびに変性される核酸の組成および長さに依存するが、代表的には、変性は、約９０℃〜約１０５℃の範囲の温度でなされ得る。変性に必要な時間は、主に、温度および二重鎖核酸の長さに依存する。編成に必要な時間は、代表的に、数秒間から４分間までの範囲におよぶ。緩衝液の塩濃度または核酸の長さおよび／もしくはＧＣ組成が上昇するにつれて、より高い温度が必要とされ得る。本発明の核酸ポリメラーゼは、約９０℃〜１００℃の温度への比較的短い曝露に対しては、不可逆的に変性されない。
【０１８９】
本発明の耐熱性ポリメラーゼは、それらのポリメラーゼが機能をする至適温度を有し、その温度は、約４５℃より高い。４５℃未満の温度は、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションを促進するが、塩の組成および濃度ならびにプライマーの組成および長さに依存して、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションは、より高い温度（例えば、４５℃〜７０℃）で生じ得、これは、プライマーハイブリダイゼーション反応の特異性を促進し得る。本発明のポリメラーゼは、約３７℃〜約９０℃の広範な温度範囲にわたって活性を示す。
【０１９０】
本発明のポリメラーゼは、ＰＣＲについての特定の有用性を有する。このことは、これらの耐熱性に起因するだけでなく、ＲＮＡテンプレートを使用してＤＮＡを合成するそれらの能力、ならびにテンプレート核酸の複製におけるそれらの忠実度にもまた起因する。ＲＮＡテンプレートを用いて開始するほとんどのＰＣＲ反応において、逆転写酵素が添加されなければならない。しかし、逆転写酵素の使用は、特定の欠点を有する。第一に、より高い温度では安定ではない。従って、いったん開始相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が逆転写酵素によって作製されたが、ＰＣＲの熱サイクルが開始されると、元のＲＮＡテンプレートは、増幅反応においてテンプレートとして使用されない。第二に、逆転写酵素は、特に良好な配列忠実度でｃＤＮＡコピーを生じない。ＰＣＲでもって、１コピーの特定の標的核酸またはテンプレート核酸を、いくつかの異なる方法論によって検出可能なレベルに増幅することが可能である。しかし、標的核酸の配列が、忠実に複製されない場合、増幅産物は、多様な配列を有する核酸のプールを含み得る。従って、ＲＮＡを正確に逆転写し得、テンプレートＲＮＡまたはＤＮＡの配列を高い忠実度で複製し得る、本発明の核酸ポリメラーゼが、非常に望ましい。
【０１９１】
任意の核酸が、本発明のＰＣＲ法のための「標的核酸」として作用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応を参照して使用される場合、用語「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応のために使用されるプライマーに結合される核酸の領域をいう。ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡに加えて、任意のｃＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、適切なセットのプライマー分子を用いて増幅され得る。特に、ＰＣＲプロセス自体により作製された増幅されたセグメントは、それら自体が、次のＰＣＲ増幅のための効率的なテンプレートである。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対的な位置により決定され、従って、この長さは、容易に制御される。
【０１９２】
増幅された標的核酸は、当業者に公知の任意の方法によって検出され得る。例えば、標的核酸は、しばしば、これらの核酸がサイズ分離ゲルにて可視のバンドを形成するような程度に増幅される。標的核酸はまた、標識されたプローブとのハイブリダイゼーションによって；ＰＣＲの間のビオチン化プライマーの取り込みとそれに続くアビジン−酵素結合体検出によって；ＰＣＲの間の３２Ｐ標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みによって、などにより、検出され得る。
【０１９３】
増幅の量がまた、例えば、米国特許第５，７２３，５９１号に記載されるようなレポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチド、および５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する本発明の核酸ポリメラーゼの使用によりモニタリングされ得る。このレポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドは、結合されたレポーター分子および結合されたクエンチャー分子を有し、このクエンチャー分子は、これら２つの分子が近位にある場合にレポーター分子の蛍光をクエンチし得る。クエンチングは、レポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドが相補的核酸にハイブリダイズしていない場合に生じる。なぜなら、レポーター分子とクエンチャー分子とは、近位にあるか、またはクエンチングに最適な距離にある傾向にあるためである。ハイブリダイズされる場合、レポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされていない場合よりも多くの蛍光を放出する。なぜなら、レポーター分子とクエンチャー分子とがさらに離れている傾向があるためである。増幅をモニタリングするために、レポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドは、増幅プライマーに対して３’側にハイブリダイズするように設計される。増幅の間、ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、レポーターオリゴヌクレオチドプローブを消化し、これによりレポーター分子をクエンチャー分子から分離する。増幅が実施される際、レポーター分子の蛍光は、増加する。従って、実施された増幅の量は、観察される蛍光の増加に基づき定量され得る。
【０１９４】
ＰＣＲプライマーのために使用されるオリゴヌクレオチドは、通常、約９ヌクレオチド長〜約７５ヌクレオチド長、好ましくは、約１７ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長である。好ましくは、ＰＣＲ反応における使用のためのオリゴヌクレオチドは、約４０以下（例えば、９、１２、１５、１８、２０、２１、２４、２７、３０、３５、４０または９と４０との間の任意の数）のヌクレオチド長である。一般的に特異的なプライマーは、少なくとも約１４ヌクレオチド長である。最適な特異性および費用効果のために、１６〜２４ヌクレオチド長のプライマーが、一般的に好ましい。
【０１９５】
当業者は、ＰＣＲのようなプロセスに使用するためのプライマーを容易に設計し得る。例えば、核酸増幅のための潜在的なプライマーは、このプライマーが単一の標的について選択的であるか否か、およびどのような条件が、サンプルまたは核酸の複合的な混合物中の標的に対するプライマーのハイブリダイゼーションを可能にするかを決定するためのプローブとして使用され得る。
【０１９６】
本発明はまた、他の手順または酵素と組み合わせた、本発明の核酸ポリメラーゼの使用も企図する。例えば、ポリメラーゼは、さらなる逆転写酵素または別のＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用され得る。本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，３２２，７７０号を参照のこと。
【０１９７】
別の実施形態において、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する本発明の核酸ポリメラーゼが、インベーダー指向切断アッセイ（ｉｎｖａｄｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｓｓａｙ）において標的核酸を検出するために使用される。この型のアッセイは、例えば、米国特許第５，９９４，０６９号に記載される。ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼは、核酸の５’末端からヌクレオチドを漸次切断する現実のエキソヌクレアーゼではなく、特定の型の核酸構造体を切断して、オリゴヌクレオチド切断産物を生成し得るヌクレアーゼであることに注意することが重要である。そのような切断は、ときどき、構造特異的切断と呼ばれる。
【０１９８】
一般的に、インベーダー指向切断アッセイは、標的核酸と相互作用して、その核酸ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性についての切断構造体を形成する少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを使用する。特徴的な切断産物は、その切断構造体がそのポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により切断される際に放出される。そのような標的依存性切断構造体の形成および得られた切断産物は、試験サンプル中の特異的標的核酸配列の存在を示す。
【０１９９】
従って、インベーダー指向切断手順において、本発明のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、標的核酸と相互作用して５’−３’ヌクレアーゼについての切断構造体を形成する少なくとも一対のオリゴヌクレオチドもまた必要とされる。ときどき「プローブ」と呼ばれる第一のオリゴヌクレオチドは、標的部位内であるが、ときどき「インベーダー」オリゴヌクレオチドと呼ばれる第二のオリゴヌクレオチドの下流で、ハイブリダイズし得る。このインベーダーオリゴヌクレオチドは、このプローブオリゴヌクレオチドに隣接しかつ上流でハイブリダイズし得る。しかし、このプローブオリゴヌクレオチドおよびインベーダーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的部位は、インベーダーオリゴヌクレオチドの３’側セグメントがプローブオリゴヌクレオチドの５’側セグメントと重複するように、重複する。本発明のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼは、内側部位でプローブオリゴヌクレオチドを切断して、サンプル中の標的核酸の存在の診断に役立つ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）特徴的（ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ）フラグメントを生成し得る。特定の状況へのインベーダー指向切断アッセイの適合についてのさらなる詳細および方法は、米国特許第５，９９４，０６９号において見出され得る。
【０２００】
１つ以上のヌクレオチドアナログもまた、本発明の方法、キットと共に、そして核酸ポリメラーゼと共に使用され得る。そのようなヌクレオチドアナログは、改変されているか、または天然に存在しないヌクレオチド（例えば、７−デアザプリン（すなわち、７−デアザ−ｄＡＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰ））であり得る。ヌクレオチドアナログは塩基アナログを含み、そしてデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの改変形態を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチドアナログ」は、ＰＣＲ混合物中に存在する標的を参照して使用する際、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ以外のヌクレオチドの使用をいい；従って、ＰＣＲにおけるｄＵＴＰ（天然に存在するｄＮＴＰ）の使用は、ＰＣＲにおけるヌクレオチドアナログの使用を含む。反応混合物中のｄＵＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰまたは任意の他のヌクレオチドアナログを使用して作製されたＰＣＲ産物は、ヌクレオチドアナログを含むといわれる。
【０２０１】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明の核酸ポリメラーゼを備えるキットを提供する。個々のキットは、以下の手順のうち１つ以上の実施のために適合され得る：ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ増幅および／またはプライマー伸長。本発明のキットは、本発明のＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つのヌクレオチドを含む。本発明のキット中に提供されるヌクレオチドは、標識されてもよく、または標識されなくてもよい。好ましくは、キットはまた、キットが適合される手順を実施する方法に対する指示書も備え得る。
【０２０２】
必要に応じて、本発明のキットは、このキットが実施するために適合されている方法を実施するために必要とされる少なくとも１つの他の試薬をさらに備え得る。そのような追加の試薬の例としては、以下が挙げられる：別の未標識ヌクレオチド、別の標識ヌクレオチド、ヌクレオチドのバランスのとれた（ｂａｌａｎｃｅ）混合物、１つ以上の鎖終結ヌクレオチド、１つ以上のヌクレオチドアナログ、緩衝溶液、マグネシウム溶液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマー、逆転写酵素、およびＤＮＡ増幅プライマーまたはＲＮＡ増幅プライマー。本発明のキットに備えられる試薬は、より高い精度および正確度を提供するために予め測定された単位で供給され得る。代表的に、キットの試薬および他の成分は、別個の容器中に配置および保有される。反応容器、試験管、マイクロウェルトレイ、マイクロタイターディッシュ、または他の容器もまた、このキットに備えられ得る。異なるラベルが、異なる試薬に対して使用され得、その結果、各々の試薬が、互いに区別され得る。
【０２０３】
以下の実施例は、本発明をさらに例示し、そして本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０２０４】
（実施例１：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｌｌｉｌｕｓのＲＱ−１株およびＧＫ２４株由来の核酸ポリメラーゼのクローニング）
（細菌増殖およびゲノムＤＮＡ単離）
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＲＱ−１株（Ｔｔｈ  ＲＱ−１）の細菌サンプルを、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＤＳＭカタログ番号９２４７）から得た。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＧＫ２４株を、Ｒ．Ａ．Ｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士（Ｑｕｅｅｎ  Ｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から得た。凍結乾燥した細菌を、４ｍｌのＡＴＣＣ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ増殖培地４６１（Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  ＴＹＥ培地）中で生き返らせた。その４ｍｌを、水浴回転式振盪機中で、６５℃にて一晩増殖させた。その４ｍｌ培養物を、２００ｍｌのＴＹＥに移し、水浴回転式振盪機中で６５℃にて一晩定常期になるまで増殖させた。ゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、これらの細菌株から調製した。
【０２０５】
（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｌｓのＲＱ−１株およびＧＫ２４株に由来する核酸ポリメラーゼ遺伝子のクローニング）
順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓに由来するＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ遺伝子のＧｅｎｅｂａｎｋ  ＤＮＡ配列の５’末端および３’末端の相同的保存領域の分析により設計した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＲＱ−１株およびＧＫ２４株に由来する核酸ポリメラーゼの遺伝子フラグメントを、Ｎ末端プライマー５’−ａｔｇ  ｇａｇ  ｇｃｇ  ａｔｇ  ｃｔｔ  ｃｃｇ  ｃｔｃ  ｔｔｔ  ｇａａ  ｃ−３’（配列番号２５）およびＣ末端プライマー５’−ｇｔｃ  ｇａｃ  ｔａａ  ａｃｇ  ｇｃａ  ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｃｃｃ  ｔａａ  ｃｃ−３’（配列番号２６）を使用して増幅した。以下のＰＣＲ反応混合物は、２５μｌの総反応容積中に、２．５μｌの１０×ｃＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート、０．２ｍＭ（各）ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマー、および１０ユニットのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含んだ。酵素、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、緩衝液および水を含むプレミックスを、８０℃に予め温めたプライマーおよびテンプレートを含む別のプレミックスに添加することによって、反応を開始した。次いで、反応混合物全体を変性し（９６℃で３０秒）、続いて、３０サイクル（９８℃で１５秒、５６℃で３０秒、および７２℃で３分）のＰＣＲサイクリング、最終工程（７２℃で６分）を行った。これにより、２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを生成した。これらの増幅フラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＰＣＲ反応混合物から精製した。次いで、このフラグメントを、誘導性発現ベクターｐＣＲ（登録商標）Ｔ７  ＣＴ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。３つの異なるポリメラーゼクローンを、ＰＣＲ誤差を排除するために、独立して配列決定し、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＲＱ−１株およびＧＫ２４株の全長コンセンサス配列を得た。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＧＫ２４株の核酸配列を、配列番号１として提供する。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＲＱ−１株の核酸配列を、配列番号２として提供する。ＧＫ２４ポリメラーゼのアミノ酸配列を、配列番号１３として提供する。ＲＱ−１ポリメラーゼのアミノ酸配列を、配列番号１４として提供する。
【０２０６】
（関連Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼとのアミノ酸配列比較）
ＧＫ２４アミノ酸配列（配列番号１３）と、Ｋｗｏｎら（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ．１９９７  Ａｐｒ  ３０；７（２）：２６４−７１）に由来する公開されているＧＫ２４  ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ配列との比較により、配列番号１３が、Ｋｗｏｎ配列に対して４つの変化：Ａｓｎ１２９→Ｌｙｓ、Ｐｒｏ１３０→Ａｌａ、Ａｓｐ１４７→Ｔｙｒ、およびＧｌｙ７９７→Ａｒｇを有することが明らかになった。これらの４つの位置は、図１において同定される。これらの４つの位置の各々において、Ｋｗｏｎ  ＧＫ２４  ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉおよび配列番号１３を有するポリペプチドは、劇的に異なる化学的特性を有するアミノ酸を有する。アスパラギン（Ｋｗｏｎ）は極性、非荷電性のアミノ酸側鎖であるのに対して、リジン（配列番号１３）は、荷電性の塩基性である（Ｎ１２９Ｋ）。プロリン（Ｋｗｏｎ）およびアラニン（配列番号１３）は、ともに脂肪族であるが、アラニンは、ヘリックス形成またはβシート形成を促進するのに対して、プロリンは、一般に、ヘリックスおよびシートを妨害する（Ｐｒｏ１３０→Ａｌａ、すなわちＰ１３０Ａ）。アスパラギン酸（Ｋｗｏｎ）は、酸性アミノ酸であり、チロシン（配列番号１３）は、芳香族（Ａｓｐ１４７→Ｔｙｒ、すなわちＤ１４７Ｙ）である。グリシン（Ｋｗｏｎ）は、最も小さなアミノ酸側鎖であるのに対して、アルギニン（配列番号１３）は、最も長く、最も塩基性の荷電した側鎖を有する（Ｇｌｙ７９７→Ａｒｇ、すなわちＧ７９７Ｒ）。
【０２０７】
配列番号１３は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８株の公開された配列から３つのアミノ酸変化を有し、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＺＯ５株（米国特許第５，６７４，７３８号）の公開された配列から２２のアミノ酸変化を有する。これらの変化は、図１に示されるアミノ酸整列に見いだされ得る。
【０２０８】
（野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＲＱ１株およびＧＫ２４株のポリメラーゼの改変）
色素−ターミネーターＤＮＡ配列決定に適切な形態においてポリメラーゼを生成するために、配列番号１および配列番号２において２つの置換を行って、部位特異的変異誘発によりポリペプチドを生成する。生成された変異は、ＦＳ（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５  ＰＮＡＳ  ９２：６３３９−６３４３；米国特許第５，６１４，３６５号）およびエキソ−マイナス変異（米国特許第５，４６６，５９１号；Ｘｕ  Ｙ．，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  Ｖ．，Ｎｇ  Ｋ．，Ｓｕｎ  Ｘ−Ｃ．，Ｇｒｉｎｄｌｅｙ  Ｎ．Ｄ．，Ｊｏｙｃｅ  Ｃ．Ｍ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８，２８４−３０２を参照のこと）である。非常に低いレベルにまでエキソヌクレアーゼ活性を低下させるために、変異Ｇｌｙ４６→Ａｓｐ、すなわちＧ４６Ｄを導入した。ｄｄＮＴＰとｄＮＴＰとの間の区別を減少させるために、変異Ｐｈｅ６６９→Ｔｙｒ、すなわちＦ６６９Ｙを導入した。Ｇ４６ＤおよびＦ６６９Ｙ変異は、ＤＮＡ配列決定のためにＴａｑ  Ｐｏｌ  Ｉとともに広く使用されている。
【０２０９】
配列番号１および配列番号２の変異誘発を、Ｓａｗａｎｏ＆Ｍｉｙａｗａｋｉ（２０００）に記載される改変Ｑｕｉｃｋ  ＣｈａｎｇｅＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＰＣＲ変異誘発プロトコルを使用して行った。変異誘発した核酸を、再び完全に配列決定して、その変異の導入を確認し、ＰＣＲ誤差が導入されなかったことを保証した。本発明のＦＳ，ＧＫ２４ポリメラーゼのエキソ−バージョンをコードする核酸を、（配列番号２２のアミノ酸配列を有する）配列番号１０として提供する。本発明のＲＱ−１ポリメラーゼのＦＳ，エキソ−バージョンをコードする核酸を、（配列番号２３のアミノ酸配列を有する）配列番号１１として提供する。
【０２１０】
（タンパク質発現および精製）
配列番号１０および配列番号１１を有する核酸を、別個に、クローニングベクターｐＣＲ（登録商標）Ｔ７  ＣＴ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入し、これらのベクターを使用して、そのタンパク質を発現した。ＢＬ２１  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、配列番号７または配列番号８を含むベクターで形質転換した。それらの細胞を、１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｍａｎｉａｔｉｓ）中で１．２  ＯＤの最適密度まで増殖させ、そのタンパク質を、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧで４時間誘導することによって過剰生成した。それらの細胞を、遠心分離によって採取し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  グリセロール、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗浄して、増殖培地を除去し、細胞ペレットを、−８０℃で保存した。
【０２１１】
ＧＫ２４ポリメラーゼおよびＲＱ−１ポリメラーゼを単離するために、細胞を融解し、２．５容積（湿重量）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した。細胞壁を、超音波処理によって破壊した。生じたＥ．ｃｏｌｉ細胞砕片を、遠心分離によって除去した。清透にした溶解物を、水浴中で低温殺菌し（７５℃、４５分）、変性し、非熱安定性Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の大部分を沈澱させ、熱安定性ＧＫ２４ポリメラーゼ（配列番号２２）およびＲＱ−１ポリメラーゼ（配列番号２３）を溶液中に残した。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを、０．３％  ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）との共沈殿により除去した。次いで、清透にした溶解物を、連続して２つのカラムにアプライした：（１）過剰のＰＥＩをキレート化するＢｉｏｒｅｘ  ７０陽イオン交換樹脂、および（２）ポリメラーゼを保持するヘパリン−アガロースカラム（提供される寸法）。このカラムを、５カラム容積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５)、５％  グリセロール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＫＴＡ緩衝液）で洗浄した。次いで、タンパク質を０．１〜１．０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。このポリメラーゼは、０．８Ｍ  ＮａＣｌで溶出された。溶出されたポリメラーゼを濃縮し、その緩衝液を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮フィルター（３０ｋＤ  Ｍｗｔカットオフ）を使用して交換した。その濃縮したタンパク質を、ＫＴＡ緩衝液（塩なし）＋５０％  グリセロール中で、−２０℃にて保存した。このポリメラーゼの活性を、サケ精子ＤＮＡ放射測定活性アッセイを使用して測定した。
【０２１２】
（実施例２：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１ｂ２１株に由来する核酸ポリメラーゼのクローニング）
（細菌増殖およびゲノムＤＮＡ単離）
本発明において使用されるＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１ｂ２１株は、Ｒ．Ａ．Ｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士（Ｑｕｅｅｎ  Ｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から得た。この凍結乾燥した細菌を、４ｍｌのＡＴＣＣ  Ｔｈｅｒｍｕｓ細菌増殖培地４６１（Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  ＴＹＥ培地）中で生き返らせた。その４ｍｌを、水浴回転式振盪機中で、６５℃にて一晩増殖させた。その４ｍｌ培養物を、２００ｍｌのＴＹＥに移し、水浴回転式振盪機中で６５℃にて一晩定常期になるまで増殖させた。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １ｂ２１  ゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して調製した。
【０２１３】
（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｌｓ  １ｂ２１ポリメラーゼをコードする核酸のクローニング）
順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓに由来するＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ遺伝子のＧｅｎｅｂａｎｋ  ＤＮＡ配列の５’末端および３’末端の相同的保存領域の分析により設計した。核酸ポリメラーゼコード領域の一部をコードする、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １ｂ２１  ゲノムＤＮＡフラグメントを、Ｎ末端プライマー５’−ａｔｇ  ｇａｇ  ｇｃｇ  ａｔｇ  ｃｔｔ  ｃｃｇ  ｃｔｃ  ｔｔｔ  ｇａａ  ｃ−３’（配列番号２７）およびＣ末端プライマー５’−ｇｔｃ  ｇａｃ  ｔａａ  ａｃｇ  ｇｃａ  ｇｇｇ  ｃｃｃ  ｃｃｃ  ｔａａ  ｃｃ−３’（配列番号２８）を使用して増幅した。以下のＰＣＲ反応混合物は、２５μｌの総反応容積中に、２．５μｌの１０×ｃＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート、０．２ｍＭ（各）ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマー、および１０ユニットのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含んだ。酵素、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、緩衝液および水を含むプレミックスを、８０℃に予め温めたプライマーおよびテンプレートを含む別のプレミックスに添加することによって、反応を開始した。次いで、反応混合物全体を変性し（９６℃で３０秒）、続いて、３０サイクル（９８℃で１５秒、５６℃で３０秒、および７２℃で３分）のＰＣＲサイクリング、最終工程（７２℃で６分）を行った。これにより、２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを生成した。これらの増幅フラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＰＣＲ反応混合物から精製した。次いで、このフラグメントを、誘導性発現ベクターｐＣＲ（登録商標）Ｔ７  ＣＴ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。ゲノム全長遺伝子をコードする３つの異なるＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １ｂ２１のゲノムＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ誤差を排除するために、独立して配列決定した。得られたコンセンサス配列は、配列番号３であり、そのポリメラーゼのヌクレオチド配列を、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１ｂ２１株から単離した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１ｂ２１株から単離されたポリメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１５である。
【０２１４】
（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １ｂ２１ポリメラーゼの発現および精製）
配列番号１２を有する核酸（ＦＳおよびエキソ−変異を含む）を、クローニングベクターｐＣＲ（登録商標）Ｔ７  ＣＴ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入して、そのタンパク質を発現した。ＢＬ２１  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、配列番号１２を含むこのベクターで形質転換した。この細胞を、１．２ＯＤの最適密度まで１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｍａｎｉａｔｉｓ）中で増殖させ、そのタンパク質を、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧで４時間誘導することにより、過剰発現させた。それらの細胞を、遠心分離によって採取し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  グリセロール、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗浄して、増殖培地を除去し、細胞ペレットを、−８０℃で保存した。
【０２１５】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１ｂ２１株のポリメラーゼを単離するために、細胞を融解し、２．５容積（湿重量）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した。細胞壁を、超音波処理によって破壊した。生じたＥ．ｃｏｌｉ細胞砕片を、遠心分離によって除去した。清透にした溶解物を、水浴中で低温殺菌し（７５℃、４５分）、変性し、非熱安定性Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の大部分を沈澱させ、熱安定性Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１ｂ２１株のポリメラーゼを溶液中に残した。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを、０．３％  ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）との共沈殿により除去した。次いで、清透にした溶解物を、連続して２つのカラムにアプライした：（１）過剰のＰＥＩをキレート化するＢｉｏｒｅｘ  ７０陽イオン交換樹脂、および（２）ポリメラーゼを保持するヘパリン−アガロースカラム（提供される寸法）。このカラムを、５カラム容積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５)、５％  グリセロール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＫＴＡ緩衝液）で洗浄した。次いで、タンパク質を０．１〜１．０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。このポリメラーゼは、０．８Ｍ  ＮａＣｌで溶出された。溶出されたＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１ｂ２１株のポリメラーゼを濃縮し、その緩衝液を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮フィルター（３０ｋＤ  Ｍｗｔカットオフ）を使用して交換した。その濃縮したタンパク質を、ＫＴＡ緩衝液（塩なし）＋５０％  グリセロール中で、−２０℃にて保存した。このポリメラーゼの活性を、サケ精子ＤＮＡ放射測定活性アッセイを使用して測定した。
【０２１６】
（参考文献）
【０２１７】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】図１は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの４つの株（ＨＢ８、ＺＯ５、ＧＫ２４（Ｋｗｏｎら、１９９７；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ６２５８４）および本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＧＫ２４ポリメラーゼ（配列番号９））由来のポリメラーゼのアミノ酸配列の比較を提供する。Ｋｗｏｎ  ＧＫ２４アミノ酸配列と配列番号９との間の４つの非保存的差異が、青色で示される。これら４つの株の間の単一のアミノ酸変化が、赤色で示される。
【図２】図２は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの４つの異なる株（ＨＢ８、ＺＯ５、ＧＫ２４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ６２５８４）およびＲＱ−１（配列番号１０））由来のアミノ酸配列の比較を提供する。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＲＱ−１由来の野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＨＢ８の配列から８個の変化、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＺＯ５（米国特許第５，６７４，７３８号）の配列から２５個の変化を有する。
【図３】図３は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの２つの株（ＨＢ８および１ｂ２１）由来のポリメラーゼのアミノ酸配列の比較を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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