(57)【要約】バイオポリマー結合のホモジニアスアッセイ法は、被験サンプルに対する刺激の適用前、適用中および／または適用後に被験サンプルからのシグナルを得ること、および該シグナルの関連付けを含む。そのシグナル強度が結合親和性と関連しているシグナルは、例えば、電気コンダクタンスおよび／または蛍光強度であり得る。前記刺激は、例えば、電圧および／またはレーザー照射であり得る。アッセイの信頼性を高めるために種々のタイプのシグナルが測定され、比較されることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列特異的ハイブリダイゼーションをアッセイするための方法であって、その方法は、
少なくとも１つの標的バイオポリマー配列を含んだ標的を準備すること；
少なくとも１つのプロ−ブ・バイオポリマー配列を含んだプローブを準備すること；
前記プローブおよび前記標的を結合媒体に加えて試験サンプルを準備すること；
第１の刺激を前記試験サンプルに与えて第１の被刺激試験サンプルを準備すること；
前記プローブと前記標的との間の結合親和性に相関している第１のシグナルを前記第１の被刺激試験サンプルから検出すること；
第２の刺激を前記第１の被刺激試験サンプルに与えて第２の被刺激試験サンプルを準備すること；
前記プローブと前記標的との間の前記結合親和性に相関している第２のシグナルを前記第２の被刺激試験サンプルから検出すること；および
前記第１のシグナルおよび前記第２のシグナルを比較して前記アッセイを達成することを備え；
前記第１の刺激および前記第２の刺激が光子照射である場合には前記第１の刺激の後かつ前記第２の刺激の前の試験サンプルに中間電子刺激が与えられることと、前記第１の刺激および前記第２の刺激が電子照射である場合には前記第１のシグナルおよび前記第２のシグナルは電流であることとを条件として、少なくとも１つの標識が前記試験サンプルに提供され、前記第１の刺激、前記第２の刺激、前記第１のシグナルおよび前記第２のシグナルは電磁照射である方法。
【請求項２】
前記第１の刺激は光子であり、かつ前記第２の刺激は電子である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の刺激は光子であり、かつ前記第２の刺激は光子である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の刺激は電子であり、かつ前記第２の刺激は光子である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の刺激は電子であり、かつ前記第２の刺激は電子である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の刺激の適用は、前記第１の刺激の適用と少なくとも部分的に共存する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のシグナルは光子であり、前記第２のシグナルは電子である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のシグナルは光子であり、前記第２のシグナルは光子である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のシグナルは電子であり、前記第２のシグナルは光子である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のシグナルは電子であり、前記第２のシグナルは電子である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記電磁照射は、光子照射および電子照射よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記光子照射はレーザー・ビームである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電子照射は電圧である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のシグナルおよび前記第２のシグナルのうちの少なくとも１つを発生させるために、前記少なくとも１つの標識は、少なくとも１つの他の標識にエネルギーを移動させる請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの標識は化学発光もしくは電気化学発光である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの標識は電子スピン標識である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブ・バイオポリマー配列および前記標的バイオポリマー配列は核酸塩基を含有し、前記プローブは、前記標的と特異的にハイブリッド形成して二本鎖を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブ・バイオポリマー配列および前記標的バイオポリマー配列は核酸塩基を含有し、前記プローブは、前記標的と特異的にハイブリッド形成して三本鎖を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記プローブ・バイオポリマー配列および前記標的バイオポリマー配列は核酸塩基を含有し、前記プローブは、前記標的と特異的にハイブリッド形成して四本鎖を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記プローブは、非荷電バックボーン、部分荷電バックボーン、カチオン性部分、架橋剤、架橋側鎖および核酸塩基類似体のうちの少なくとも１つを含有した核酸類似体である請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブ・バイオポリマー配列および前記標的バイオポリマー配列のうちの少なくとも１つはアミノ酸配列を含有する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの追加刺激を前記第２の被刺激試験サンプルに与えて追加被刺激試験サンプルを準備すること；
前記プローブと前記標的との間の前記結合親和性と相関している少なくとも１つの追加シグナルを前記追加被刺激試験サンプルから検出すること；および
前記第１のシグナル、前記第２のシグナルおよび前記少なくとも１つの追加シグナルを比較して前記アッセイを達成することをさらに備える請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の刺激、前記第２の刺激、および前記少なくとも１つの追加刺激は互いに異なる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のシグナル、前記第２のシグナル、および前記少なくとも１つの追加シグナルのうちの少なくとも１つは非連続的に与えられる請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のシグナルおよび前記第２のシグナルのうちの少なくとも１つは非連続的に与えられる請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記プローブおよび前記標的のうちの少なくとも１つは、基質、表面、隔膜、膜または電極に結合されている請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
配列特異的ハイブリダイゼーションをアッセイするための方法であって、その方法は、
標的を準備すること；
プローブを準備することであって、前記プローブおよび前記標的のうちの少なくとも１つは少なくとも１つのバイオポリマー配列を含むこと；
前記プローブおよび前記標的を結合媒体に加えて試験サンプルを準備すること；
第１の刺激を前記試験サンプルに与えて第１の被刺激試験サンプルを準備すること；
前記プローブと前記標的との間の結合親和性に相関している第１のシグナルを前記第１の被刺激試験サンプルから検出すること；
第２の刺激を前記第１の被刺激試験サンプルに与えて第２の被刺激試験サンプルを準備すること；
前記プローブと前記標的との間の前記結合親和性に相関している第２のシグナルを前記第２の被刺激試験サンプルから検出すること；および
前記第１のシグナルおよび前記第２のシグナルを比較して前記アッセイを達成することを備え；
前記第１の刺激および前記第２の刺激が光子照射である場合には前記第１の刺激の後かつ前記第２の刺激の前の試験サンプルに中間電子刺激が与えられることと、前記第１の刺激および前記第２の刺激が電子照射である場合には前記第１のシグナルおよび前記第２のシグナルは電流であることとを条件として、少なくとも１つの標識が前記試験サンプルに提供され、前記第１の刺激、前記第２の刺激、前記第１のシグナルおよび前記第２のシグナルは電磁照射である方法。
【請求項２８】
前記プローブまたは前記標的のうちの少なくとも１つは、蛋白質、ペプチドまたは脂質膜である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブまたは前記標的のうちの１つはバイオポリマーでない請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオポリマー結合をアッセイする方法、より詳細には、核酸塩基および／またはアミノ酸を含有するプローブと標的との結合をアッセイする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サンプルに電場をかけることによって生体分子を単離し、特性化できることは、長年にわたって知られていた。
電気泳動は、生体分子に対する電場の影響に基づく単離および特性化方法の中で恐らく最もよく知られた例である。ゲル電気泳動においては、均一なマトリックスまたはゲルが、例えば、ポリアクリルアミドから形成され、それに電場がかけられる。ゲルの一端に載せた混合物は、それらのサイズおよび電場との相互作用に従ってゲルを通って移動する。移動性は、高次構造、サイズ、電荷など、その物質独自の特徴に依存する。移動性は、濃度勾配またはｐＨ勾配の形成または緩衝液組成（ｐＨ、ＳＤＳ、ＤＯＣ、グリシン、塩）の変更によるなど、ゲルのポア・サイズを変えることにより影響を受ける。一次元および二次元のゲル電気泳動は、多くの研究室においてかなり日常的な方法である。標的物質は、ゲルの通過および／または物理的抽出により精製することが可能である。
【０００３】
生体サンプルに電場をかける、ごく最近開発された方法は、スタンレイ（Ｓｔａｎｌｅｙ）に対する特許（特許文献１）に開示されている。スタンレイの特許は、サンプル中の予め決定された核酸配列の有無を検出する方法を開示している。この方法は、（ａ）電極により溶液中のサンプルにかけられた電圧によってサンプルの二本鎖核酸を変性させること；（ｂ）前記変性核酸とその配列のためのオリゴヌクレオチド・プローブとのハイブリッドを形成すること；および（ｃ）ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを測定すること、からなる。スタンレイの特許は、標的配列を変性する限定目的のためにアッセイすべきサンプルへの電場の適用を開示している。
【０００４】
ハイブリダイゼーション・アッセイのよりよく知られたタイプは、蛍光標識剤の使用に基づいている。それらの最も基本的な形態において、蛍光強度に基づくアッセイは、典型的には、標的を発蛍光団含有プローブと接触させること、結合プローブから未結合プローブを除去すること、洗浄されたサンプル中の蛍光を検出することからなっていた。ホモジニアスアッセイは、このような基本アッセイを改良し、洗浄工程または非液相支持体の供給を必要としない。
【０００５】
アッセイの幾つかは、ハイブリダイゼーション複合体中の核酸の鎖間を結合する、このような発蛍光団の能力に基づいて、核酸ハイブリダイゼーションを検出するためにインターカレーション発蛍光団を使用している。
【０００６】
例えば、バーク（Ｂｕｒｋｅ）らに対する特許（特許文献２）は、核酸分子を検出し、定量する方法とキットを開示している。好ましい実施形態は、二本鎖核酸ヘリックスまたは１本鎖核酸への染料のインターカレーションによる。染料は、インターカレーション後蛍光を発し、その強度は、サンプル中に存在する核酸量の直接的測定値である。バークらの方法は、サンプル中の核酸量測定に有用であると主張しているが、この方法がインターカレーターと核酸との間の非特異的結合に基づいているため、特に非標的核酸の二本鎖が存在する条件下では、特異的結合を検出するためにはこの方法は非実用的となる。
【０００７】
イシグロ（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ）らに対する特許（特許文献３）は、バークら、および特許文献４においてイシグロらにより記載された初期のアッセイなどのように、インターカレーターと核酸二本鎖との間の非特異的相互作用によるアッセイを改善していると主張するアッセイを開示してしている。初期の開発は、標的核酸の特異的領域がＰＣＲにより増幅される前にサンプル溶液にインターカレーションされる場合、蛍光強度の増強を示す傾向を有するインターカレーション用蛍光色素を添加すること、増幅前に標的核酸を検出し、定量する所与時間間隔で反応液から蛍光強度を測定することからなっていた。前記特許文献３は、特異性が改善されたアッセイを提供することによって初期の開発を改良するように試みられており、プローブが標的核酸と１本鎖オリゴヌクレオチド・プローブとの間の相補的結合部位にインターカレーションされるインターカレーション用蛍光色素で標識された１本鎖オリゴヌクレオチドであるということにより特徴づけられる。
【０００８】
より高感度で、正確かつ迅速なアッセイ法に関する進行中の探索において、１つの研究グループは、核酸ハイブリダイゼーション二本鎖の蛍光強度に及ぼす電場の作用を分析することからなるアッセイを開発した。特許文献５および特許文献６を参照されたい。研究者らは、１塩基対不整合二本鎖の蛍光強度が、完全整合二本鎖の蛍光強度とは異なっていることを示した。このように、前記出願は、ヌクレオチド配列の検出法を開示していることを主張しているが、この方法では、検出工程前または検出工程と同時に電場を液体媒体にかけ、電場の相関関数としての蛍光発光の強度変化をプローブが、完全相補なヌクレオチド配列にハイブリッド形成しているのか、もしくは不完全な相補的ヌクレオチド配列にハイブリッド形成しているかを示すものとして検出している。
【０００９】
前述の開発にもかかわらず、核酸および／または核酸類縁体との間の相互作用を分析するための、簡便で、高感度、効果的かつ迅速な方法の必要性が当業界に存在し続けている。
【特許文献１】米国特許第５，８２４，４７７号
【特許文献２】米国特許第５，８２４，５５７号
【特許文献３】米国特許第５，８１４，４４７号
【特許文献４】特公１９９３−２３７０００
【特許文献５】米国特許出願第０８／８０７，９０１号（１９９７年２月２７日出願）
【特許文献６】米国特許第６，０６０，２４２号
【特許文献７】米国特許出願第０９／４６８，６７９号（１９９９年１２月２１日出願）
【特許文献８】米国特許出願第０９／２２４，５０５号（１９９８年１２月３１日出願）
【特許文献９】米国特許出願第０９／３４４，５２５号（１９９９年６月２５日出願）
【特許文献１０】米国特許出願第０９／８８５，７３１号（２００１年６月２０日出願）
【特許文献１１】弁理士整理番号Ｅ１０４７／２００５７を有する米国特許出願、発明の名称「ＰＡＲＡＬＬＥＬ  ＯＲ  ＡＮＴＩＰＡＲＡＬＬＥＬ、ＨＯＭＯＬＯＧＯＵＳ  ＯＲ  ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＯＲ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ  ＴＯ  ＦＯＲＭ  ＤＵＰＬＥＸ、ＴＲＩＰＬＥＸ  ＯＲ  ＱＵＡＤＲＵＰＬＥＸ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ」（２００１年７月２０日出願）
【非特許文献１】サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ」、２巻（１９８９）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  ３８０、２０７ページ（１９９６）
【非特許文献３】ククレッチら（Ｋｕｋｒｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｔｒｉｐｌｅｘｅｓ  ｂｙ  ａｃｒｉｄｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、２５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４２６４〜４２７０ページ（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、標的とプローブとの間の結合をアッセイするための、迅速で、高感度、環境に優しくかつ安全な方法を提供し、該方法において標的は、核酸配列または核酸類似配列からなり、プローブは、核酸配列または核酸類似配列からなる。本発明のアッセイはまた、標的とプローブとの間の結合をアッセイするために好適であり、該標的および／または該プローブは、アミノ酸配列からなる。したがって、本発明はバイオポリマー類の結合をアッセイするために好適であり、本明細書中で用いられるバイオポリマーとは、少なくとも２個のアミノ酸、アミノ酸類似体、核酸、核酸類似体および／またはそれらの組合せを含有する配列を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、配列特異的ハイブリダイゼーションをアッセイするための方法を提供するものであって、その方法は、少なくとも１つの標的バイオポリマー配列を含んだ標的を準備すること；少なくとも１つのプロ−ブ・バイオポリマー配列を含んだプローブを準備すること；プローブおよび標的を結合媒体に加えて試験サンプルを準備すること；第１の刺激を試験サンプルに与えて第１の被刺激試験サンプルを準備すること；プローブと標的との間の結合親和性に相関している第１のシグナルを第１の被刺激試験サンプルから検出すること；第２の刺激を第１の被刺激試験サンプルに与えて第２の被刺激試験サンプルを準備すること；プローブと標的との間の結合親和性に相関している第２のシグナルを第２の被刺激試験サンプルから検出すること；ならびに第１のシグナルおよび第２のシグナルを比較してアッセイを達成することを備え；第１の刺激および該第２の刺激が光子照射である場合には第１の刺激の後かつ第２の刺激の前の試験サンプルに中間電子刺激が与えられることと、第１の刺激および第２の刺激が電子照射である場合には第１のシグナルおよび第２のシグナルは電流であることとを条件として、少なくとも１つの標識が試験サンプルに提供され、第１の刺激、第２の刺激、第１のシグナルおよび第２のシグナルは、電磁照射である。
【００１２】
また、配列特異的ハイブリダイゼーションをアッセイするための方法を提供するものであって、その方法は、標的を準備すること；プローブを準備することであって、プローブおよび標的の少なくとも１つは少なくとも１つのバイオポリマー配列を含むこと；プローブおよび標的を結合媒体に加えて試験サンプルを準備すること；第１の刺激を試験サンプルに与えて第１の被刺激試験サンプルを準備すること；プローブと標的との間の結合親和性に相関している第１のシグナルを第１の被刺激試験サンプルから検出すること；第２の刺激を第１の被刺激試験サンプルに与えて第２の被刺激試験サンプルを準備すること；プローブと標的との間の結合親和性に相関している第２のシグナルを第２の被刺激試験サンプルから検出すること；ならびに第１のシグナルおよび第２のシグナルを比較してアッセイを達成することを備え；第１の刺激および第２の刺激が光子照射である場合には第１の刺激の後かつ第２の刺激の前の試験サンプルに中間電子刺激が与えられることと、第１の刺激および第２の刺激が電子照射である場合には第１のシグナルおよび第２のシグナルは電流であることとを条件として、少なくとも１つの標識が試験サンプルに提供され、第１の刺激、第２の刺激、第１のシグナルおよび第２のシグナルは電磁照射である。
【発明の効果】
【００１３】
ある先行技術とは異なり、本発明は、特定の結合の存在を検出するのみならず、標的とプローブとの間の結合の性質に関する定性的かつ定量的な情報を提供する。したがって、核酸塩基対核酸塩基結合アッセイからなる実施形態において、本発明により、当該専門家は、完全整合、１塩基対の不整合、２塩基対の不整合、３塩基対の不整合、１塩基対の欠失、２塩基対の欠失および３塩基対の欠失を区別できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の実施形態は、第１のプローブ−標的混合物に関する測定シグナル（例えば、電流および／または蛍光強度）を同一の標的と組み合わされた他のプローブ類によって示される同一タイプのシグナルに対して検定することからなり、ここで他のプローブの各々は、第１のプローブとは少なくとも１塩基異なっている。
【００１５】
ある一定の実施形態において、前記シグナルの測定前または測定と同時に、低電圧をかける。一般に、電圧は、不完全整合のハイブリダイゼーション・パートナーを不安定化させるほど十分な高さであって、しかも完全整合のハイブリダイゼーション・パートナーを不安定化させないような高さになるように選択される。ある一定の好ましい実施形態において、電圧は約ＩＶから約２０Ｖまでである。
【００１６】
測定シグナルの大きさ（例えば、電流および／または蛍光強度）が標的とプローブとの間の結合親和性の相関関数である検量線を作成することができる。標的と複数の異なるプローブとの間の結合親和性が、核酸塩基−核酸塩基アッセイにおける不整合の塩基数、不整合の性質（Ａ−Ｇ対Ａ−Ｃ対Ｔ−Ｇ対Ｔ−Ｃなど）、ハイブリダイゼーション複合体内の不整合の位置などにより変化するので、本発明のアッセイは、標的の配列決定のために使用可能である。
【００１７】
測定シグナルは、例えば、電気コンダクタンスであり得る。このような実施形態において、プローブと標的との間の結合親和性は、シグナルの大きさと直接的に関連する。すなわち、電気コンダクタンスは、好ましくは０〜２の不整合および／または欠失を含む範囲にわたり、より好ましくは０〜３の不整合および／または欠失を含む範囲にわたりプローブと標的との間の整合性の程度に伴って増加する。
【００１８】
他の実施形態において、測定シグナルは、試験サンプルに含まれる発蛍光団の蛍光強度であり得る。このような実施形態において、プローブと標的との間の結合親和性は、発蛍光団が、シグナル消去またはシグナル増幅によってハイブリダイゼーションをシグナル化するかどうかによって、その強度と直接的または間接的に関連し得る。したがって、インターカレーターによって発生する蛍光強度は、プローブ−標的の結合親和性と直接的に関連し、一方、プローブに共有結合している非インターカレーション発蛍光団を使用する実施形態の強度は、プローブ−標的の結合親和性と逆相関する。蛍光強度は、好ましくは０〜２の不整合および／または欠失を含む範囲にわたり、より好ましくは０〜３の不整合および／または欠失を含む範囲にわたり、プローブと標的との間の整合性の程度に伴って増加する（または非インターカレーターでは減少する）。
【００１９】
本発明者らは、核酸塩基含有配列のハイブリダイゼーションを解析するための蛍光強度アッセイの利点（特許文献７参照）、およびペプチド：核酸結合（特許文献８参照）、およびペプチド：ペプチド結合（特許文献９参照）を分析するための蛍光強度アッセイの利点を以前に開示しているが、サンプルに電場を適用することにより、下記の実施例６に示されるように、アッセイの分解能が増大すると思われる。
【００２０】
さらに、本発明の特に好ましい実施形態において、アッセイは、サンプルの少なくとも２種のシグナルの測定からなる。第１のシグナルは、蛍光強度であることが好ましく、第２のシグナルは、幾つかの電気コンダクタンス測定から選択される（または逆）ことが好ましい。
【００２１】
好ましい複数測定の実施形態において、第１のシグナルは、第２のシグナルと同一か、または異なっていてもよい。測定された第１のシグナルおよび第２のシグナルが同じである場合、第２のシグナルは、第１のシグナルに対しておよび／または第１のシグナルを検定するために用いられる同じ参照シグナルに対して検定し得る。さらに、少なくとも１つの条件変更刺激を、第１シグナルの測定後、かつ第２シグナルの測定前の試験サンプルに与えることが好ましい。前記刺激は、少なくとも１つのシグナルによって示される結合を測定可能なほどに変化させるために十分であることが好ましい。本発明の核酸塩基−核酸塩基の結合アッセイにおいて、前記刺激は、プローブと標的との間の不完全に相補的なハイブリダイゼーションに有意に影響を与えるには十分で、かつプローブと標的との間の完全に相補的なハイブリダイゼーションに有意に影響を与えるには不十分であることが好ましい。
【００２２】
本発明のある一定の実施形態において、少なくとも１種の刺激を１回または複数回与える。前記刺激は、連続的に与えるか、または非連続的に与えることが可能である。前記刺激は、シグナル検出の検出前、検出中および／または検出後に与えることが可能である。
【００２３】
好適な刺激は、例えば、光照射（レーザー光など）および／または電子照射であり得る。検出されたシグナルは、例えば、光および／または同様に電子であり得る。
例えば、本発明の特に好ましい実施形態において、第１の測定シグナルは、帯電前蛍光強度（すなわち、条件変更電圧を試験サンプルにかける前に測定された強度）であり、また、第２の測定シグナルは、帯電後の蛍光強度（すなわち、条件変更電圧を試験サンプルにかけている時とかけた後に測定された強度）である。
【００２４】
前述の実施形態において追加の測定により、アッセイの信頼性を増大させ、疑わしい結果を直ちに再試験できる。少なくとも２つの測定により得られた不一致な結果は、典型的には再試験の根拠となる。
【００２５】
本発明は、プローブと標的との間の結合親和性を定量できる。このような情報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬剤のデザインなど、種々の使用に役立ち得る。
従来技術の方法と違って、本発明のアッセイは均一性であることが好ましい。前記アッセイは測定シグナルの大きさを検出する前に、遊離プローブおよび標的からプローブ−標的複合体を分離することなく、実施可能である。前記アッセイは、ゲル分離工程を必要とせず、これにより、試験情報量を大いに増大できる。定量分析は簡便かつ正確である。その結果、該結合アッセイは、多くの時間と経費を節約し、容易に自動化が可能である。さらに該結合アッセイにより、緩衝液、ｐＨ、イオン濃度、温度、温置時間、プローブおよび標的配列の相対濃度、インターカレーター濃度、標的配列の長さ、プローブ配列の長さ、および可能な補因子要件などの結合変数の迅速な測定が可能になる。
【００２６】
前記アッセイは、例えば、不浸透性表面上またはバイオチップ上のウェル内の溶液中で実施可能である。
さらに、本発明のアッセイは、標的またはプローブ上にシグナル消去剤を準備することなく実施することが好ましい。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態は、具体的には、プローブと二本鎖標的との間の三本鎖および／または四本鎖ハイブリダイゼーションを検出し、したがって標的を変性する必要性はなくなる。三本鎖および四本鎖の形成および／または安定化は、被験サンプル中のインターカレーターの存在により増大する。例えば、特許文献１０、および特許文献１１を参照されたい。
【００２８】
本発明のアッセイの使用に好適な核酸塩基含有プローブとしては、例えば、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよび非電荷または部分電荷の骨格を有する他の核酸類似体が挙げられる。逆平行プローブ類は、ある一定の実施形態において好ましいが、プローブ類はまた、平行であってもよい。８個から２０個までの任意の塩基長を有するプローブ配列は、これが原核生物および真核生物の最も小さな独特のＤＮＡ配列が見出される範囲内にあることから好ましい。１２個から１８個の塩基のプローブ類は、これがヒト・ゲノム中の最も小さな独特の配列の長さであることから、特に好ましい。実施形態において、６個から３０個までの塩基のプローブ類が最も好ましい。しかしながら、複数のより短いプローブ類は中に複数の非独特の標的配列を有するヌクレオチド配列を検出するために使用が可能であり、これらを組み合わせてヌクレオチド配列を独自に同定する。プローブの長さは、標的の長さに整合するように選択することが可能である。
【００２９】
好適なアミノ酸含有プローブ類は、単一アミノ酸、単一アミノ酸類似体、ペプチド様類似体、ペプチドイド、ペプチド擬態、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、蛋白質または複数蛋白質複合体からなり得る。
【００３０】
本発明は、使用上危険で、冗長で、時間がかかる放射活性プローブの使用を必要とせず、絶えず再生する必要がない。本発明のプローブは、好ましいことに使用上安全で、数年にわたって安定である。したがって、プローブ類を大量に製造、または注文し、保存し得る。
【００３１】
標的がアミノ酸からなる本発明の実施形態において、該標的は、例えば、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、蛋白質または複数蛋白質複合体などのペプチド配列またはペプチド様類似体配列からなることが好ましい。前記標的は、プローブに対して少なくとも１つの受容体部位を有する蛋白質であることがより好ましい。
【００３２】
前記標的が核酸塩基からなる本発明の実施形態において、該標的は、８から３．３×１０９個の塩基対長であることが好ましく、核酸および／またはそれらの類似体の１本鎖または二本鎖配列であり得る。
【００３３】
プローブおよび標的は、無標識であることが好ましいが、他の実施形態において、前記プローブに共有結合するインターカレーターがある。このような実施形態において、前記インターカレーターは、いずれかの端でプローブに結合することが好ましい。
【００３４】
他の実施形態において、前記インターカレーターは、プローブに共有結合しないが、アッセイ中ある程度、非共有様式でプローブに結合して、プローブと標的との間にそれ自体をインターカレーションし得る。
【００３５】
本発明の使用に好ましいインターカレーターとしては、例えば、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２およびアクリジンが挙げられる。一般に、前記インターカレーターは、二本鎖、三本鎖および／または四本鎖核酸複合体の鎖間にインターカレーションできる部分分子である。好ましい実施形態において、前記インターカレーター（またはその成分）は、核酸の不在下で本質的に非蛍光性であり、インターカレーションされ、適切な波長の照射によって励起された場合に蛍光を発し、二本鎖または三本鎖核酸複合体内にインターカレーションされた場合は蛍光が１００倍から１０，０００倍の増強を示す。
【００３６】
他の実施形態において、前記インターカレーターは、インターカレーションして適切な波長の照射により励起すると蛍光波長のシフトを示し得る。正確な蛍光波長は、ＤＮＡ対ＲＮＡ、二本鎖対三本鎖など、インターカレーションされる核酸構造に依存し得る。
【００３７】
励起波長については、使用される発蛍光団に対し、この励起が最大になるように（慣例的実験および／または従来の知識により）選択され、２００ｎｍから１０００ｎｍが好ましい。インターカレーターは、発光波長２００ｎｍから１０００ｎｍとなるよう選択するのが好ましい。好ましい実施形態において、アルゴン・イオン・レーザーが、４００ｎｍから５４０ｎｍの範囲の波長を有する光で発蛍光団を照射するために使用され、蛍光発光は５００ｎｍから７５０ｎｍの範囲で検出される。
【００３８】
本発明のアッセイは、例えば、５℃から８５℃などの広範な温度にわたって実施し得る。先行技術のある一定のアッセイでは、昇温が必要であるため、経費がかさみ、またアッセイが遅れる。一方、本発明は、室温またはそれ以下（例えば、２５℃以下の温度）で実施し得る。
【００３９】
本発明のアッセイは極めて高感度であり、これによって標的のＰＣＲ増幅を実施する必要性がなくなる。例えば、少なくとも蛍光強度実施形態において、約１０フェムトモルの標的および約１０フェムトモルのプローブを含有する約２０マイクロリットルの体積を有する試験サンプルをアッセイすることが可能である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは５×１０−１０Ｍ以下の濃度で標的をアッセイするのに十分高感度である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは５×１０−１０Ｍ以下の濃度でプローブを使用するのに十分高感度である。
【００４０】
伝導率測定は、４０マイクロリットル中、約１ピコモルのプローブおよび約１ピコモルの標的という少量のサンプルを識別し得る。サンプル量を減少させることにより、プローブと標的がさらに少ない量で使用可能となる。
【００４１】
前述の値は、この方法が、より高い濃度を検出できないことを示唆することを意図していないことは言うまでもない。
広範囲のインターカレーター濃度が、プローブおよび被験標的の各濃度において許容される。例えば、５×１０−１０Ｍプローブと５×１０−１０Ｍ標的とがハイブリッド形成される場合、インターカレーターＹＯＹＯ−１の最適濃度は、２５ｎＭから２．５ｎＭの範囲である。プローブと標的の両方の濃度が５×１０−８Ｍにおいて、好ましいＹＯＹＯ−１の濃度範囲は１０００ｎＭから１００ｎＭである。
【００４２】
前記アッセイは、１塩基対不整合のプローブ−標的複合体を、２塩基対不整合のプローブ−標的複合体と区別し、また好ましくは２塩基対不整合のプローブ−標的複合体を、３塩基対不整合のプローブ−標的複合体と区別するほど十分に高感度である。もちろん、前記アッセイは、完全整合のプローブ−標的複合体を、上記の不整合された複合体のいずれとも区別するほど十分に高感度である。
【００４３】
結合媒体は、ヌクレオチドおよび／または蛋白質を保存するのに好適であることが知られている任意の従来媒体であり得る。非特許文献１を参照されたい。例えば、液体媒体は、ヌクレオチド、水、緩衝液および標準的塩濃度からなり得る。
【００４４】
相補的塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電強度、および緩衝液組成における変化を有する多種多様の条件下で生じる。これらの条件の例およびそれらを適用する方法は当業界に知られている。
【００４５】
ハイブリダイゼーション複合体は、約１５℃から約２５℃までの温度で約１分から約５分間で形成されることが好ましい。より長い反応時間は必要ではないが、数時間の温置は、ハイブリダイゼーション複合体に悪影響を与えない。
【００４６】
ある一定の試薬を用いることにより溶液中のハイブリダイゼーションを促進することが可能である（特にインターカレーターを含有する実施形態には不必要であるが）。これらの試薬の好ましい例としては、Ｒｅｃ  Ａ蛋白質などの１本鎖結合蛋白質、Ｔ４遺伝子３２蛋白質、大腸菌１本鎖結合蛋白質、主または副核酸溝結合蛋白質、二価イオン類、多価イオン類、ビオローゲン（ｖｉｏｌｏｇｅｎ）および臭化エチジウムなどのインターカレーション物質、アクチノマイシンＤ、ソラレンおよびアンゲリシン（ａｎｇｅｌｉｃｉｎ）が挙げられる。このような促進剤は、極端な操作条件、例えば、異常ｐＨレベルまたは極高温下で有用であることが立証し得る。
【００４７】
本発明のアッセイは、例えば、折り重ねられたヌクレオチド配列中の利用できる領域の同定、ハイブリダイゼーション複合体中の不整合の塩基対数の決定、ゲノムの地図化のために使用し得る。
【００４８】
インターカレーターを用いて蛍光強度を検出する実施形態において、プローブと標的との間の結合親和性が増すとともに強度が増加する。非インターカレーション発蛍光団を用いて蛍光強度を検出する実施形態において、プローブと標的との間の結合親和性が増すとともに強度が減少する。発蛍光団をインターカレーションする、しないにかかわらず、本法は、蛍光異方性法とは違って蛍光の偏光測定を必要としない。
【００４９】
本発明を以下の実施例を参照にしてより詳細に説明するが、本発明をそれに限定する意図のないことを理解すべきである。
【実施例１】
【００５０】
ヒト嚢胞性線維症遺伝子のエクソン１０から誘導された（非特許文献２）、センスおよびアンチセンス５０量体ｓｓＤＮＡ標的配列を、ＤＮＡシンセサイザ（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９、パーセプティブ・バイオシステムス（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。等モル量の相補的オリゴヌクレオチド類を、９５℃、１０分間で変性し、温度を１．５時間かけて２１℃に冷却させて徐々にアニールさせた。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチド類を１ピコモル／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００５１】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の配列：５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’。
【００５２】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のアンチセンス鎖の配列：５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’。
【００５３】
ｄｓＤＮＡ（配列番号１）の予測融解温度（Ｔｍ）は、６５．２℃である。
配列番号２は、野生型配列ＣＡＴがＣＧＴに変化した５０７位のアミノ酸での１塩基対の変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）に一致する５０量体変異体ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００５４】
配列番号２のセンス鎖に関する配列：５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’。
【００５５】
配列番号２のアンチセンス鎖に関する配列：５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’。
【００５６】
ｄｓＤＮＡ（配列番号２）の予測融解温度（Ｔｍ）は、６６．０℃である。
配列番号３は、野生型配列ＣＡＴがＡＣＴに変化した５０６位および５０７位のアミノ酸での連続２塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）に一致する５０量体変異体ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【００５７】
配列番号３のセンス鎖に関する配列：５’−ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ−３’。
【００５８】
配列番号３のアンチセンス鎖に関する配列：５’−ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＧＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ−３’。
【００５９】
ｄｓＤＮＡ（配列番号３）の予測融解温度（Ｔｍ）は、６５．２℃である。
本実施例に使用するＰＮＡプローブ類を合成し、ＨＰＬＣ精製およびコモンウェルス・バイオテクノロジーズ社（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）（米国、バージニア州リッチモンド所在）による質量分析により確認した。ＰＮＡプローブ類は最初、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中、１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、次いでｄｄＨ２Ｏの添加により１ｍｇ／ｍｌに希釈した。最終ＰＮＡストック溶液は、ｄｄＨ２Ｏ中、１ピコモル／μｌの濃度で調製した。
【００６０】
プローブ番号１は、５０量体野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の１５のヌクレオチド・セグメントに完全に相補的であるようにデザインされる１５量体逆平行ＰＮＡプローブであり、５０５位から５１０位のアミノ酸が重なっている（非特許文献２）。前記プローブは、以下の構造（配列番号８）を有した：５’−Ｈ−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’。
【００６１】
ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は、以下のものを含んだ：２ピコモルの標的ｄｓＤＮＡ、２ピコモルのＰＮＡプローブ、０．５Ｘ  ＴＢＥおよび２５０  ｎＭのＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ−１（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、米国オレゴン州ユージーン所在）。サンプルを３ｍｍ石英キュベットに入れ、１５秒間１ボルトまたは５ボルトＤＣ（Ｖ）帯電に供した。電流測定アッセイは、電圧を溶液に加えながら電流のモニタリングすることからなる。電流測定評価時点で温度を測定するために温度プローブを各溶液内に入れた。１ボルトでの電流ピークは、最初の２秒間の帯電中に観察された。電流は、次の１３秒にわたって急激に減少した。５ボルトの適用実験では、全帯電時間（１５秒）にわたり比較的安定を保持する電流が生じた。
【００６２】
ＤＮＡまたはＰＮＡが存在しない場合（対照）、または野生型配列番号１、変異体配列番号２または変異体配列番号３が、逆平行ＰＮＡプローブ番号１と反応する場合にコンダクタンス値が観察される一連の実験が実施された。図１Ａと１Ｂは、個々の実験におけるコンダクタンスについて得られたデータをプロットしている。図１Ａは１Ｖ帯電の適用結果であり、図１Ｂは５Ｖの適用結果を示している。完全な相補的配列（配列番号１＋プローブ番号１）からなる二本鎖ＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド三本鎖は、ＹＯＹＯ−１の最大インターカレーションを可能にし、１Ｖ適用の１５秒間全体にわたって最高コンダクタンス値（負電流値として図に描写）を生じた。逆平行ＰＮＡプローブと、１ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ（配列番号２＋プローブ番号１）との、および２ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ（配列番号３＋プローブ番号１）との三本鎖ハイブリダイゼーションに関する標準化ピークコンダクタンスは、電圧適用の第１秒時の完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖ハイブリッド（配列番号１＋プローブ番号１）で観察されたものよりも、それぞれ、７９％と９６％低かった（図１Ａ）。完全相補的三本鎖と塩基対不整合を含有する三本鎖との間のコンダクタンスの同様の減少率が、電圧適用の１５秒間全体にわたるコンダクタンス値を平均化した場合に得られた。図１Ａにおいて、１ｂｐおよび２ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドの平均コンダクタンス値は、完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドのものよりも、それぞれ、６５％と９１％低かった。図１Ａに示された全ての実験は、室温（２３℃）で実施された。プローブと二本鎖標的との間の不整合度が増すと、ＹＯＹＯ−１によるインターカレーション・レベルが減り、また、コンダクタンスレベルが減少した。これらの関係はまた、上記の実験を反復し、より高い電圧（５Ｖ）をかけた場合にも観察された。５Ｖ適用中、１ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋プローブ番号１）および２ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号３＋プローブ番号１）に関する標準化平均コンダクタンス値は、完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号３＋プローブ番号１）で観察されたものよりも、それぞれ、５２％と６７％低かった（図１Ｂ）。図１Ｂに示された実験は、室温（２３℃）で実施された。
【００６３】
実験が、５０℃および６５℃に上昇した温度で反復された場合、同様の電流測定値が観察された。５０℃において、完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号１＋プローブ番号１）に対する１Ｖ、１５秒間の適用により、１ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋プローブ番号１）および２ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号３＋プローブ番号１）に関して、それぞれの、−０．１５μＡｍｐ（４０％減少）および−０．０６μＡｍｐ（７６％減少）の値と比較して−０．２５μＡｍｐの平均電流を発生した（図１Ｃ）。６５℃で、１Ｖの電気を１５秒間適用した場合に、同様の観察が認められた。完全整合核酸ハイブリッドは、１ｂｐおよび２ｂｐ不整合ハイブリッドに関しての、それぞれ、−０．１６μＡｍｐ（５７％減少）および−０．０１μＡｍｐ（９７％減少）と比較して−０．３７μＡｍｐの平均電流を生じた（図１Ｃ）。高温での５ボルトの適用は類似の結果を生じた。５０℃で実施された実験は、完全整合ハイブリッド、１ｂｐ不整合ハイブリッドおよび２ｂｐ不整合ハイブリッドに関して、それぞれ、−０．２７ｍＡｍｐ、−０．１３ｍＡｍｐ（５２％減少）、および−０．０８ｍＡｍｐ（７０％減少）の平均電流を発生したが、６５℃で実施された実験は、それぞれ同じ３群に関して、−０．３１ｍＡｍｐ、−０．１４ｍＡｍｐ（５５％減少）、および−０．１０ｍＡｍｐ（６８％減少）の平均電流値を生じた（図１Ｄ）。前述の実験全てに関して、ｄｓＤＮＡは、逆平行ＰＮＡプローブ番号１との三本鎖ハイブリダイゼーション前には変性しなかった。
【００６４】
同様の実験を、ハイブリダイゼーション混合物を６５℃に加熱後直ちに冷却し、温度を変えて行った。室温（２３℃）に冷却後、完全整合サンプル（配列番号１＋プローブ番号１）に対する１Ｖ、１５秒間の適用により、−０．１８μＡｍｐの平均電流を生じた。比較により、１ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖ハイブリッド（配列番号２＋プローブ番号１）および２ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖ハイブリッド（配列番号３＋プローブ番号１）に関して、それぞれ、−０．０６μＡｍｐ（６７％減少）および−０．０５μＡｍｐ（７２％減少）の値が観察された（データは示していない）。サンプルを６５℃から５０℃に冷却して、１Ｖを１５秒間連続適用した場合、同様の観察が認められた。完全整合サンプル（配列番号１＋プローブ番号１）は、１ｂｐおよび２ｂｐ不整合サンプルに関して、それぞれ観察された−０．１１μＡｍｐ（５２％減少）および−０．０１μＡｍｐ（９６％減少）と比較して−０．２３μＡｍｐの平均電流を生じた（データは示していない）。２３℃または５０℃に冷却後に５Ｖを適用した場合、完全整合三本鎖ハイブリッド（配列番号１＋プローブ番号１）、１ｂｐ不整合三本鎖ハイブリッド（配列番号２＋プローブ番号１）および２ｂｐ不整合三本鎖ハイブリッド（配列番号３＋プローブ番号１）で発生した平均電流は：２３℃でそれぞれ、−０．１５ｍＡｍｐ、−０．０９ｍＡｍｐ（４０％減少）、および−０．０７ｍＡｍｐ（５３％減少）、５０℃でそれぞれ、−０．２３ｍＡｍｐ、−０．０９ｍＡｍｐ（６１％減少）、および−０．０９ｍＡｍｐ（６１％減少）であった（データは示していない）。
【００６５】
ハイブリダイゼーション混合物を６５℃（５０量体ｄｓＤＮＡ配列のＴｍ）での前処理に次いでの冷却では、逆平行ＰＮＡプローブが用いられた場合、２３℃または５０℃（６５℃での予備加熱なし）で直接測定した際、完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖と、１ｂｐまたは２ｂｐ不整合を含有するものとの間で観察されたコンダクタンスの差に有意な影響を与えなかった。明らかに、ＤＮＡインターカレーター、ＹＯＹＯ−１の存在下で逆平行ＰＮＡプローブは、ｄｓＤＮＡ標的との三本鎖構造を形成することができた。電気の低レベル適用（１Ｖまたは５Ｖ）により、完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖配列を、予め配列変性することなく１ｂｐおよび２ｂｐ変異体を含有するものと区別することができた。
【実施例２】
【００６６】
図２は、本発明の電流測定アッセイが、使用するＰＮＡプローブが標的ＤＮＡ配列に関して平行配向にある場合も、完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖ハイブリッドと、１ｂｐまたは２ｂｐ不整合を含有するものとの間の区別が可能であることを立証している。プローブ番号２は、配列がプローブ番号１と一致する１５量体ＰＮＡプローブであったが、従来の逆平行配向の替わりに、標的ＤＮＡの平行配向に整合するように合成された。プローブ番号２は、以下の構造（配列番号９）を有した：５’−Ｈ−ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＣＡＣ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’。
【００６７】
プローブ番号２をプローブ番号１の替わりに用いた唯一の違いだけで、実施例１に記載されたものと同一のアッセイ条件による実験が実施された。１ボルトを適用した場合、１ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋プローブ番号２）および連続２ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号３＋プローブ番号２）に関する平均電流は、整合温度で完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号１＋プローブ番号２）で観察されたものより、２３℃で、それぞれ２５％と３２％低く、５０℃で、それぞれ３０％と２３％低く、６５℃で、それぞれ２８％と５３％低かった（図２Ａ）。
【００６８】
５Ｖ（１Ｖの替わりに）を１５秒間適用すると、同様の結果が得られた。２３℃、５０℃および６５℃で完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、それぞれ−０．１５ｍＡｍｐ、−０．２４ｍＡｍｐおよび−０．１７ｍＡｍｐの平均電流を発生した（図２Ｂ）。１ｂｐ不整合および２ｂｐ不整合を有する不完全相補的三本鎖は、完全整合ハイブリッド・サンプルにより達成されたものよりも、２３℃でそれぞれ、２７％（−０．１１ｍＡｍｐ）および５３％少なく（−０．０７ｍＡｍｐ）、５０℃でそれぞれ、２１％（−０．１９ｍＡｍｐ）および４６％少なく（−０．１３ｍＡｍｐ）、６５℃でそれぞれ、未変化（−０．１７ｍＡｍｐ）および１８％少ない（−０．１４ｍＡｍｐ）、平均電流を生じた（図２Ｂ）。
【００６９】
図２Ａおよび２Ｂに説明した結果は、平行ＰＮＡプローブ番号２を使用した場合、完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖と１ｂｐ不整合または２ｂｐ不整合を含有するものとの間に得られた伝導率の鎖は、逆平行ＰＮＡプローブ番号１により達成されたものよりも劇的に少ないことを示した（図１）。
【００７０】
しかしながら、平行プローブ番号２およびサンプルを６５℃に加熱し、直ちに冷却させた後の５Ｖの適用を含む実験は、完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖と、１ｂｐまたは２ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖との間のシグナル化の差が増大したことを例証した電流測定法を開示した（図２Ｃ）。完全整合ハイブリッド（配列番号１＋プローブ番号２）、１ｂｐ不整合ハイブリッド（配列番号２＋プローブ番号２）および２ｂｐ不整合ハイブリッド（配列番号３＋プローブ番号２）は、２３℃でそれぞれ、−０．１９ｍＡｍｐ、−０．０８ｍＡｍｐおよび−０．０６ｍＡｍｐ、５０℃でそれぞれ、−０．１７ｍＡｍｐ、−０．０９ｍＡｍｐおよび−０．０７ｍＡｍｐ、６５℃でそれぞれ、−０．２３ｍＡｍｐ、−０．１３ｍＡｍｐおよび−０．０８ｍＡｍｐの平均コンダクタンス値を生じた。これは、完全相補的サンプルにより達成された値と比較した場合、１ｂｐおよび２ｂｐ不整合サンプルでは、２３℃でそれぞれ、５８％と６８％、５０℃で４７％と５９％、および６５℃で４３％と６５％の伝導率の減少に換算された（図２Ｃ）。
【００７１】
したがって、電流測定アッセイにおいて逆平行と平行の双方のＰＮＡプローブが、完全相補的ｄｓＤＮＡ標的と、１ｂｐまたは２ｂｐ変異体を含有する不完全相補的ｄｓＤＮＡ標的とを区別できる。
【実施例３】
【００７２】
プローブ番号３は、配列と配向が１５量体逆平行ＰＮＡプローブ番号１（配列番号８）と一致する１５量体ｓｓＤＮＡプローブであった。プローブ番号３は、以下の構造を有した：５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’。
【００７３】
電流測定アッセイの特異性を、前変性がない状態で、ｓｓＤＮＡプローブ番号３を、５０量体野生型配列と変異体ｓｓＤＮＡ標的配列とで反応させることによりさらに調べた。アッセイ条件は、実施例１に記載されたものと同一であった。
【００７４】
ＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ−１によって増大されたｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖は、３０℃と６５℃との間で形成された。１ボルト処理時、配列番号１＋プローブ番号３からなる完全整合ＤＮＡ三本鎖は、最高の伝導率値を生じた（図３Ａ）。対照的に、１ｂｐ不整合（配列番号２＋プローブ番号３）および連続する２ｂｐ不整合（配列番号３＋プローブ番号３）を生じる、不完全相補的プローブと標的の組合せは、整合温度において完全相補的配列で観察されたものよりも、それぞれ、２３℃で１４％および６４％低く、５０℃で３０％および７０％低く、６５℃で２５％および７２％低い平均コンダクタンス値となった（図３Ａ）。これらのサンプルに対するより高い電圧（５Ｖ）の適用は、１Ｖで特により低い温度で得られたものよりも、完全整合サンプルと不整合サンプルとの間で、より大きな電流測定差が観察される結果となった。１５秒間の５Ｖ処理後、１ｂｐ不整合ＤＮＡ三本鎖と２ｂｐ不整合ＤＮＡ三本鎖に関する平均電流は、整合温度において完全整合ＤＮＡ三本鎖で観察されたものよりも、２３℃でそれぞれ、５４％および７８％低く、５０℃でそれぞれ、６８％および７０％低く、６５℃でそれぞれ、３３％および６１％低かった（図３Ｂ）。
【００７５】
同様の電気実験において、ハイブリダイゼーション混合物を６５℃に加熱し、１Ｖまたは５Ｖの適用前に、この温度で維持するか、あるいは直ちに５０℃または２３℃に冷却した。完全整合ＤＮＡ三本鎖配列（配列番号１＋プローブ番号３）に対する１５秒間の１Ｖ処理により、２３℃、５０℃および６５℃で最高コンダクタンス値を生じた（図３Ａ）。１ｂｐ不整合（配列番号２＋プローブ番号３）および２ｂｐ不整合（配列番号３＋プローブ番号３）を含有するＤＮＡ三本鎖は、２３℃でそれぞれ、２１％および６３％低く、５０℃でそれぞれ、１８％および７４％低く、６５℃でそれぞれ、１２％および１０６％伝導性が低かった（図３Ａ）。同様に、５Ｖを加熱前サンプルに１５秒間適用した場合、１ｂｐ不整合ＤＮＡ三本鎖と２ｂｐ不整合ＤＮＡ三本鎖に関する平均コンダクタンス値は、完全整合ＤＮＡ三本鎖により発生した平均コンダクタンス値と比較した場合、２３℃でそれぞれ、２４％および１０４％、５０℃でそれぞれ、４２％および４４％、６５℃でそれぞれ、３８％および１０２％減少した（図３Ｂ）。
【００７６】
逆平行ＰＮＡプローブ（図１）およびｓｓＤＮＡプローブ（図３）が電流測定アッセイにおいて同様の様式で挙動した観察により、プローブとして用いられた核酸本体のバックボーンは特に重要ではないことが示唆された。ＹＯＹＯ−１の存在は、ｄｓＤＮＡ標的とｓｓＤＮＡプローブとが、溶液中、標的とプローブとの間の配列相補性のレベルによって異なる電荷を発生することのできる三重ヘリックス立体配座を形成することを可能にした。天然のＤＮＡプローブが前変性のない状態で用いられた場合、プローブと標的との間の不整合度が増すにつれて、コンダクタンスのレベルが減少し、電流測定アッセイの信頼性を証明した。
【実施例４】
【００７７】
実施例１から３に説明された電流測定アッセイにおいて、ＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ−１を、ハイブリダイゼーション混合物を含有する溶液に加えた。ＹＯＹＯ−１によるインターカレーションにより、ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖およびｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖の形成が促進された。電流測定アッセイにおいてｓｓＤＮＡプローブに共有的に結合したインターカレーター部分を利用する可能性を実施例４で評価した。
【００７８】
アクリジンもまた、三本鎖核酸構造にインターカレーションする能力を有する他のｄｓＤＮＡインターカレーターであり、これにより三本鎖ヘリックス形成を安定化する。例えば、非特許文献３を参照されたい。３’末端に共有結合したアクリジン分子（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国バージニア州スターリング所在）を含有するｓｓＤＮＡプローブは、ＤＮＡシンセサイザ（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９、パーセプティブ・バイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））上で合成され、ＨＰＬＣにより精製された。
【００７９】
プローブ番号４は、配列と配向が１５量体プローブ番号３と一致する（したがって、配列と配向が１５量体逆平行ＰＮＡプローブ番号１（配列番号８）とも一致する）が、３’位にアクリジン部分が付加していた。前記プローブは、以下の構造を有した：５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−アクリジン−３’。
【００８０】
ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は、以下のものを含んだ：２ピコモルの標的ｄｓＤＮＡ、２ピコモルのｓｓＤＮＡプローブ番号４および０．５Ｘ  ＴＢＥ。サンプルを３ｍｍ石英キュベットに入れ、２３℃で１１秒間５Ｖ  ＤＣ帯電に供した。電流および温度は、実施例１に記載したとおりモニターした。
【００８１】
図４に示されたように、ｓｓＤＮＡプローブ番号４は、共役的に繋がれたアクリジン部の安定なインターカレーションの結果、５０量体完全整合ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）とハイブリッドが形成でき、−０．５３ｍＡｍｐの平均電流を発生した。比較によって、１ｂｐ不整合（配列番号２＋プローブ番号４）または２ｂｐ不整合（配列番号３＋プローブ番号４）を含有する安定性のより低いＤＮＡ三本鎖は、対照（標的ＤＮＡなしのプローブ番号４）に対して標準化された場合、完全整合ＤＮＡ三本鎖により得られたものよりも、それぞれ、５２％および６６％低い平均電流を生じた（図４）。
【００８２】
したがって、ｓｓＤＮＡプローブに付加したアクリジンは、電流測定アッセイにおいて標的とプローブとの間の配列相補性のレベルによって、異なる電流を生じた三重ＤＮＡヘリックスを形成する上で未連結ＹＯＹＯ−１と同じく効率的であった。
【実施例５】
【００８３】
ヒト嚢胞性線維症遺伝子のエクソン１０から誘導されたセンスおよびアンチセンス１５量体ｓｓＤＮＡ標的配列を合成し、精製し、実施例１に記載されたとおりアニールさせた。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド類を１ピコモル／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００８４】
配列番号４は、プローブ番号１に完全相補的であるようにデザインされた配列番号１から誘導された１５量体ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）のセンス鎖に関する配列：５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ−３’。
【００８５】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）のアンチセンス鎖に関する配列：５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’。
ｄｓＤＮＡ（配列番号４）の予測融解温度（Ｔｍ）は４０．０℃である。
【００８６】
配列番号５は、配列ＴＴＴがＴＡＴに変化した１塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）に一致する１５量体変異体ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異体標的ＤＮＡ（配列番号５）のセンス鎖に関する配列：５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＧＴＧ−３’。
【００８７】
変異体標的ＤＮＡ（配列番号５）のアンチセンス鎖に関する配列：５’−ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’。
ｄｓＤＮＡ（配列番号５）の予測融解温度（Ｔｍ）は４０．０℃である。
【００８８】
配列番号６は、配列ＡＴＣがＧＧＣに変化した連続２塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）に一致する１５量体変異体ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異体標的ＤＮＡ（配列番号６）のセンス鎖に関する配列：５’−ＡＴＡ  ＴＣＧ ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ−３’。
【００８９】
変異体標的ＤＮＡ（配列番号６）のアンチセンス鎖に関する配列：５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＣ ＣＧＡ  ＴＡＴ−３’。
ｄｓＤＮＡ（配列番号６）の予測融解温度（Ｔｍ）は４４．０℃である。
【００９０】
配列番号７は、３種の１ｂｐ変異が各々３塩基対によって分離されている、分離３塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）に一致する１５量体変異体ｄｓＤＮＡ標的配列であった。配列ＡＴＣ、ＴＣＴおよびＴＧＧが、それぞれ、ＡＣＣ、ＴＡＴおよびＴＡＧに変化した。
【００９１】
変異体標的ＤＮＡ（配列番号７）のセンス鎖に関する配列：５’−ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＧＴＧ−３’。
変異体標的ＤＮＡ（配列番号７）のアンチセンス鎖に関する配列：５’−ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＴＡＴ−３’。
【００９２】
ｄｓＤＮＡ（配列番号７）の予測融解温度（Ｔｍ）は３８．０℃である。
ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は、以下のものを含んだ：２ピコモルの標的ｄｓＤＮＡ、２ピコモルの平行ＰＮＡプローブ番号２、０．５Ｘ  ＴＢＥおよび２５０ｎＭのＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ−１。反応混合物を、変性させるために９５℃で５〜１０分間温置し、次いでアッセイするまで６５℃に維持した。サンプルを石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴン・イオン・レーザー・ビームにより照射し、６５℃で蛍光発光をモニタした。各サンプル内に直接入れたソフトウェア制御温度プローブにより同時温度測定値が得られた。最大蛍光強度は５３６ｎｍの波長で起こり、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中にＹＯＹＯ−１がインターカレーションされたことを暗示している。第２のアッセイとして、各サンプルの最初のレーザー照射に続いて、同一サンプルを４秒間１Ｖ  ＤＣ帯電に供した。最終秒の帯電中、サンプルに、アルゴン・イオン・レーザーにより第２回目の照射をし、６５℃で蛍光発光をモニタした。蛍光強度を、各分析サンプルに対する波長関数としてプロットした。
【００９３】
完全相補的配列（配列番号４＋プローブ番号２）からなるｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、ＹＯＹＯ−１の最大インターカレーションを可能にし、最大蛍光強度を生じた（図５Ａ）。１ｂｐ不整合ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号５＋プローブ番号２）、連続２ｂｐ不整合ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号６＋プローブ番号２）、および分離３ｂｐ不整合ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号７＋プローブ番号２）に関する蛍光強度は、６５℃で完全整合ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドで観察されたものよりも全て低かった（図５、データは示していない）。プローブと標的の間の不整合度が増すにつれてＹＯＹＯ−１のインターカレーション・レベルが減じ、そのために蛍光強度のレベルが減少した。ＤＮＡまたはＰＮＡが存在しない場合（ＹＯＹＯ−１単独）は、蛍光のバックグラウンド・レベルのみが観察された（図５Ａ）。
【００９４】
完全整合ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドが、６５℃で４秒間１ボルトの電気に供された場合、蛍光強度は、２％だけ減少して比較的一定に留まった（図５Ａ）。対照として、１ｂｐ不整合（図５Ｂ）、２ｂｐ不整合（図５Ｃ）および３ｂｐ不整合（データは示していない）を含有する不完全相補的二本鎖に対する１Ｖの適用により、電気不在下で照射された同一のサンプルで得られたものよりも、それぞれ、１８％、３９％および７１％低い蛍光強度を生じた。電気の低レベル（１Ｖなど）処理により、ｂｐ不整合を含有するｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドの安定性をさらに低下させた。プローブと標的との間の配列相補性の程度が減少するにつれて、蛍光強度レベルは、電気存在下で劇的に減少し、完全整合配列と１ｂｐ、２ｂｐまたは３ｂｐ変異を含有する配列とを区別するための信頼性が高く、正確な第２のアッセイを提供した。
【実施例６】
【００９５】
実施例５におけるハイブリダイゼーション・アッセイを、ｄｓＤＮＡ標的配列の変性後に実施され、ｄｓＤＮＡ標的の融点（Ｔｍ）よりも高い温度でｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド形成を測定した。実施例６は、前変性の要件なしで完全整合と塩基対不整合とを区別するために、電気適用の有無で蛍光強度の信頼性を立証する。
【００９６】
ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は、以下のものを含んだ：４ピコモルの標的ｄｓＤＮＡ、４ピコモルの逆平行ＰＮＡプローブ番号１、０．５Ｘ  ＴＢＥおよび２５０ｎＭのＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ−１。サンプルを石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴン・イオン・レーザー・ビームにより８０ミリ秒間照射し、２３℃で蛍光発光をモニタした。各サンプル内に直接入れたソフトウェア制御温度プローブにより同時温度測定値が得られた。最大蛍光強度は５３６ｎｍの波長で起こり、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中にＹＯＹＯ−１がインターカレーションされたことを暗示した。第２のアッセイとして、各サンプルの最初のレーザー照射に続いて、同一サンプルを４秒間２０Ｖ  ＤＣ帯電に供した。３秒の帯電直後、サンプルを、アルゴン・イオン・レーザーにより８０ミリ秒間、第２回目の照射をし、２３℃で蛍光発光をモニタした。蛍光強度を、各分析サンプルに対する波長関数としてプロットした。
【００９７】
インターカレーターＹＯＹＯ−１により増強されたｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖は、２３℃で形成された。最大蛍光強度は、野生型５０量体ｄｓＤＮＡ標的配列（配列番号１）が、１５量体逆平行ＰＮＡプローブ番号１とハイブリッド形成した場合に得られた（図６）。比較により、１ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋プローブ番号１）および連続２ｂｐ不整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号３＋プローブ番号１）に関する蛍光強度は、２３℃で完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖により観察されたものよりも、それぞれ、６０％および９１％低かった（図６）。ＹＯＹＯ−１を含有する反応混合物中にＤＮＡまたはＰＮＡが存在しない場合は、蛍光のバックグラウンド・レベルのみが観察された。
【００９８】
完全相補的三本鎖と、１ｂｐまたは２ｂｐ不整合を含有するものとで得られた蛍光強度の差は、完全整合二本鎖と不完全相補的二本鎖間で得られたものよりも有意に大きかった（図５と６を比較）。明らかに、三本鎖形成の蛍光強度アッセイは、塩基対不整合を検出するために増強された識別能を有した。
【００９９】
さらに野生型配列と変異配列間の、さらなる識別が、第２の電気適用により可能であった。完全整合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖に対する２０Ｖ３秒間の処理により、電気に供されない同一のサンプルによって得られたものと実質的に同一の蛍光強度スペクトルが生じた（図６）。しかしながら、１ｂｐ不整合および２ｂｐ不整合を含有する不完全相補的三本鎖に対する２０Ｖ３秒間の適用は、電気不在下で照射された同一サンプルで得られたものよりも、それぞれ、２３％および７１％低い蛍光強度を生じた（図６）。電気の２０Ｖ処理は、完全相補的三本鎖の安定性に影響を与えなかったが、プローブと標的間の配列相補性の程度によるレベルで、塩基対不整合を含有するｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖の安定性を低下させた。したがって、蛍光強度アッセイに対する電気の適用は、配列の前変性なしに、野生型配列と、１ｂｐまたは２ｂｐ変異を含有する配列とを区別するために、さらに信頼性の高いアッセイを提供した。
【０１００】
本発明は、詳細にかつその具体例を参照して説明されたが、種々の変更および修飾が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく成され得ることは当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１Ａ】時間と相補性の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図１Ｂ】時間と相補性の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図１Ｃ】温度と相補性の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図１Ｄ】温度と相補性の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図２Ａ】温度、相補性および追加因子の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図２Ｂ】温度、相補性および追加因子の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図２Ｃ】温度、相補性および追加因子の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図３Ａ】温度、相補性および追加因子の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図３Ｂ】温度、相補性および追加因子の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図４】時間と相補性の相関関係としての電流を示すグラフ。
【図５Ａ】蛍光強度のスペクトルを示す図。
【図５Ｂ】蛍光強度のスペクトルを示す図。
【図５Ｃ】蛍光強度のスペクトルを示す図。
【図６】蛍光強度のスペクトルを示す図。
【配列表】
2005527779.tif 000002
2005527779.tif 000003
2005527779.tif 000004
2005527779.tif 000005
【図１Ａ】
2005527779.tif 000006
【図１Ｂ】
2005527779.tif 000007
【図１Ｃ】
2005527779.tif 000008
【図１Ｄ】
2005527779.tif 000009
【図２Ａ】
2005527779.tif 000010
【図２Ｂ】
2005527779.tif 000011
【図２Ｃ】
2005527779.tif 000012
【図３Ａ】
2005527779.tif 000013
【図３Ｂ】
2005527779.tif 000014
【図４】
2005527779.tif 000015
【図５Ａ】
2005527779.tif 000016
【図５Ｂ】
2005527779.tif 000017
【図５Ｃ】
2005527779.tif 000018
【図６】
2005527779.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月12日(2004.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２４】
前記第１の刺激、前記第２の刺激、および前記少なくとも１つの追加刺激のうちの少なくとも１つは非連続的に与えられる請求項２２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２５】
前記第１の刺激および前記第２の刺激のうちの少なくとも１つは非連続的に与えられる請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2005527779.tif 000020