(57)【要約】  本発明は、癌以外の免疫学的疾患の治療方法であって、ＣＤ３０に結合し活性化リンパ球に対し細胞静止作用もしくは細胞傷害作用を及ぼす能力で特徴付けられたタンパク質を投与することを含む方法に関する。こうしたタンパク質には、モノクローナル抗体ＡＣ１０およびＨｅＦｉ１、ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１の誘導体、およびＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１とＣＤ３０への結合を競合する抗体が含まれる。他のこうしたタンパク質には、多価の抗ＣＤ３０抗体および細胞傷害性薬剤とコンジュゲートした抗ＣＤ３０抗体が含まれる。本発明の抗体による治療方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）活性化リンパ球に対し細胞静止作用もしくは細胞傷害作用を及ぼす第１の抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を、治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項２】
第１の抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の抗体が、多価である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の抗体が、ＣＤ３０への結合についてモノクローナル抗体ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１と競合する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第１の抗体が、細胞傷害性薬剤と結合せずに細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼすことができる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１の抗体が、活性化リンパ球以外の細胞の不在下で細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼすことができる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第１の抗体が、単一特異性抗体として細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼすことができる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第１の抗体の細胞静止作用または細胞傷害作用を増強する薬剤の投与をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第２の抗体の投与をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第２の抗体が、活性化リンパ球上で発現した第２の受容体または受容体複合体を認識する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第２の抗体が、第１の抗体の細胞静止作用または細胞傷害作用を増強する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第２の抗体が、活性化リンパ球にシグナルを送達することにより第１の抗体の細胞静止作用または細胞傷害作用を増強する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
受容体または受容体複合体が、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質を含む請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＩＣＯＳである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、またはＡＰＯ−３である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
インテグリンが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３またはＣＤ１０４である請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
レクチンが、Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプのレクチンである請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
第１の抗体が、二重特異性抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
二重特異性抗体が、ＣＤ３０、および活性化リンパ球上で発現した第２の受容体または受容体複合体、に結合する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第２の受容体または受容体複合体に結合する二重特異性抗体の部分が、ＣＤ３０に結合する二重特異性抗体の部分の細胞静止作用または細胞傷害作用を増強する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
二重特異性抗体の第２の受容体または受容体複合体への結合が、活性化リンパ球にシグナルを送達することにより、ＣＤ３０に結合する二重特異性抗体の部分の細胞静止作用または細胞傷害作用を増強する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
受容体または受容体複合体が、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質を含む請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＩＣＯＳである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４またはＡＰＯ−３である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
インテグリンが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３、またはＣＤ１０４である請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
レクチンが、Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプのレクチンである請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
活性化リンパ球上で発現した受容体または受容体複合体に結合するリガンドを投与することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
リガンドが、第１の抗体の細胞静止作用または細胞傷害作用を増強する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
リガンドが、活性化リンパ球にシグナルを送達することにより、第１の抗体の細胞静止作用または細胞傷害作用を増強する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
受容体または受容体複合体が、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質を含む請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＩＣＯＳである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４またはＡＰＯ−３である請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
インテグリンが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３、またはＣＤ１０４である請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
レクチンが、Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプのレクチンである請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
第１の抗体が、抗体ではない第２のタンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
第２のタンパク質が、第１の抗体に多価結合性を付与する請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
さらに免疫抑制剤の投与を含む請求項１、９、１０、１８または２７に記載の方法。
【請求項３８】
免疫抑制剤が、ガンシクロビル、エタナセプト、シクロスポリン、タクロリムスまたはラパマイシンである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
免疫抑制剤が、アルキル化剤である請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
アルキル化剤が、シクロホスファミドである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
免疫抑制剤が、代謝拮抗剤である請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
代謝拮抗剤が、プリンアンタゴニストである請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
プリンアンタゴニストが、アザチオプリンまたはミコフェノレートモフェチルである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
代謝拮抗剤が、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤である請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤が、メトトレキサートである請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
免疫抑制剤が、グルココルチコイドである請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
グルココルチコイドが、コルチゾールまたはアルドステロンである請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
免疫抑制剤が、グルココルチコイド類似体である請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
グルココルチコイド類似体が、プレドニゾンまたはデキサメタゾンである請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
免疫抑制剤が、抗炎症剤である請求項３７に記載の方法。
【請求項５１】
抗炎症剤が、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤またはロイコトリエン受容体アンタゴニストである請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
第１の抗体が、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
細胞傷害性薬剤が、エネジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤およびビンカアルカロイドからなる群から選択される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
細胞傷害性薬剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、ＤＭ−１、オーリスタチンＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥまたはネトロプシンである請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
細胞傷害性薬剤が、抗チューブリン剤である請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
細胞傷害性薬剤が、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチンまたはドラスタチンである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
細胞傷害性薬剤が、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンオレルビン、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロンＡ、エピチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルチミド、エストラムスチン、セマドチン、ディスコデルモリド、メイタンシン、ＤＭ−１、オーリスタチンＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥまたはエロイテロビンである請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
細胞傷害性薬剤が、ＭＭＡＥである請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
細胞傷害性薬剤が、ＡＥＦＰである請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
第１の抗体が、ペプチドリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
第１の抗体が、ｖａｌ−ｃｉｔリンカーまたはｐｈｅ−ｌｙｓリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
第１の抗体が、ヒドラゾンリンカーまたはジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
コンジュゲートがｃＡＣ１０−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥである請求項５２に記載の方法。
【請求項６４】
コンジュゲートがｃＡＣ１０−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＥＦＰである請求項５２に記載の方法。
【請求項６５】
第１の抗体が、５．５未満のｐＨで加水分解可能なリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項５２に記載の方法。
【請求項６６】
リンカーが５．０未満のｐＨで加水分解可能である請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
リンカーが、ヒドラゾンリンカーまたはジスルフィドリンカーである請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
第１の抗体が、プロテアーゼによって切断可能なリンカーによって細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項５２に記載の方法。
【請求項６９】
第１の抗体が、プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーによって細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項５２に記載の方法。
【請求項７０】
プロテアーゼが、膜結合プロテアーゼである請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
プロテアーゼが、細胞内プロテアーゼである請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
プロテアーゼが、エンドソームのプロテアーゼである請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
プロテアーゼが、リソソームのプロテアーゼである請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
第１の抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、グリコシル化抗体、多重特異性抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ＶＬドメインを含む断片、ＣＤ３０に特異的に結合するポリペプチド、またはＶＨドメインを含む断片である請求項５２に記載の方法。
【請求項７５】
第１の抗体が、免疫抑制剤にコンジュゲートされる請求項１に記載の方法。
【請求項７６】
免疫抑制剤が、ガンシクロビル、エタナセプト、シクロスポリン、タクロリムスまたはラパマイシンである請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
免疫抑制剤が、アルキル化剤である請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
アルキル化剤が、シクロホスファミドである請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
免疫抑制剤が、代謝拮抗剤である請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
代謝拮抗剤が、プリンアンタゴニストである請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
プリンアンタゴニストが、アザチオプリンまたはミコフェノレートモフェチルである請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
代謝拮抗剤が、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤である請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤が、メトトレキサートである請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
免疫抑制剤が、グルココルチコイドである請求項７５に記載の方法。
【請求項８５】
グルココルチコイドが、コルチゾールまたはアルドステロンである請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
免疫抑制剤が、グルココルチコイド類似体である請求項７５に記載の方法。
【請求項８７】
グルココルチコイド類似体が、プレドニゾンまたはデキサメタゾンである請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
免疫抑制剤が、抗炎症剤である請求項７５に記載の方法。
【請求項８９】
抗炎症剤が、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤またはロイコトリエン受容体アンタゴニストである請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
免疫学的疾患が、Ｔｈ２−リンパ球関連疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項９１】
免疫学的疾患が、アトピー性皮膚炎、全身紅斑性狼瘡、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症または慢性の移植片対宿主病である請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
免疫学的疾患が、Ｔｈ１−リンパ球関連疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項９３】
免疫学的疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、ショーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレイブ病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナーの肉芽腫症、結核または急性移植片対宿主病である請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
免疫学的疾患が、ウイルス感染に起因するものである請求項１に記載の方法。
【請求項９５】
ウイルス感染が、エプスタイン-バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ白血病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスまたは麻疹ウイルスを含む請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
免疫学的疾患が、活性化Ｂリンパ球に関連する疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項９７】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）リンパ球においてＣＤ３０シグナル伝達を誘導する第１の抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項９８】
第１の抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
第１の抗体が、多価である請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
第１の抗体が、ＣＤ３０への結合についてモノクローナル抗体ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１と競合する請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
第１の抗体は、リンパ球以外の細胞の不在下でＣＤ３０シグナル伝達を誘導することができる請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
第１の抗体が、単一特異性抗体としてＣＤ３０シグナル伝達を誘導することができる請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
第２の抗体の投与をさらに含む請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
第２の抗体が、活性化リンパ球上で発現した第２の受容体または受容体複合体を認識する請求項９７に記載の方法。
【請求項１０５】
受容体または受容体複合体が、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質を含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＩＣＯＳである請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、またはＡＰＯ−３である請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
インテグリンが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３またはＣＤ１０４である請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
レクチンが、Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプのレクチンである請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
第１の抗体が、二重特異性抗体である請求項９７に記載の方法。
【請求項１１１】
二重特異性抗体が、ＣＤ３０および活性化リンパ球上で発現した第２の受容体または受容体複合体に結合する請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
受容体または受容体複合体が、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質を含む請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＩＣＯＳである請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４またはＡＰＯ−３である請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
インテグリンが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３、またはＣＤ１０４である請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
レクチンが、Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプのレクチンである請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１７】
活性化リンパ球上で発現した受容体または受容体複合体に結合するリガンドを投与することをさらに含む請求項９７に記載の方法。
【請求項１１８】
受容体または受容体複合体が、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質を含む請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＩＣＯＳである請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４またはＡＰＯ−３である請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
インテグリンが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３、またはＣＤ１０４である請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
レクチンが、Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプのレクチンである請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２３】
第１の抗体が、抗体ではない第２のタンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質である請求項９７に記載の方法。
【請求項１２４】
第２のタンパク質が、第１の抗体に多価結合性を付与する請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
さらに免疫抑制剤の投与を含む請求項９７、１０３、１０４、１１０または１１１に記載の方法。
【請求項１２６】
免疫抑制剤が、ガンシクロビル、エタナセプト、シクロスポリン、タクロリムスまたはラパマイシンである請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
免疫抑制剤が、アルキル化剤である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
アルキル化剤が、シクロホスファミドである請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
免疫抑制剤が、代謝拮抗剤である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３０】
代謝拮抗剤が、プリンアンタゴニストである請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
プリンアンタゴニストが、アザチオプリンまたはミコフェノレートモフェチルである請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
代謝拮抗剤が、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤である請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３３】
ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤が、メトトレキサートである請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
免疫抑制剤が、グルココルチコイドである請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３５】
グルココルチコイドが、コルチゾールまたはアルドステロンである請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
免疫抑制剤が、グルココルチコイド類似体である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３７】
グルココルチコイド類似体が、プレドニゾンまたはデキサメタゾンである請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
免疫抑制剤が、抗炎症剤である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３９】
抗炎症剤が、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤またはロイコトリエン受容体アンタゴニストである請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
第１の抗体が、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項９７に記載の方法。
【請求項１４１】
細胞傷害性薬剤が、エネジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤およびビンカアルカロイドからなる群から選択される請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
細胞傷害性薬剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、ＤＭ−１、オーリスタチンＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥまたはネトロプシンである請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４３】
細胞傷害性薬剤が、抗チューブリン剤である請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４４】
細胞傷害性薬剤が、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチンまたはドラスタチンである請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
細胞傷害性薬剤が、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンオレルビン、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロンＡ、エピチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルチミド、エストラムスチン、セマドチン、ディスコデルモリド、メイタンシン、ＤＭ−１、オーリスタチンＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥまたはエロイテロビンである請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
細胞傷害性薬剤が、ＭＭＡＥである請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４７】
細胞傷害性薬剤が、ＡＥＦＰである請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４８】
第１の抗体が、ペプチドリンカーによって細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４９】
第１の抗体が、ｖａｌ−ｃｉｔリンカーまたはｐｈｅ−ｌｙｓリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１４０に記載の方法。
【請求項１５０】
第１の抗体が、ヒドラゾンリンカーまたはジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１４０に記載の方法。
【請求項１５１】
第１の抗体が、５．５未満のｐＨで加水分解可能なリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１４０に記載の方法。
【請求項１５２】
リンカーが５．０未満のｐＨで加水分解可能である請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
リンカーが、ヒドラゾンリンカーまたはジスルフィドリンカーである請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
第１の抗体が、プロテアーゼによって切断可能なリンカーによって細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１４０に記載の方法。
【請求項１５５】
第１の抗体が、プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーによって細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１４０に記載の方法。
【請求項１５６】
プロテアーゼが、膜結合プロテアーゼである請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
プロテアーゼが、細胞内プロテアーゼである請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５８】
プロテアーゼが、エンドソームのプロテアーゼである請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５９】
プロテアーゼが、リソソームのプロテアーゼである請求項１５４に記載の方法。
【請求項１６０】
第１の抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、グリコシル化抗体、多重特異性抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ＶＬドメインを含む断片、ＣＤ３０に特異的に結合するポリペプチド、またはＶＨドメインを含む断片である請求項１４０に記載の方法。
【請求項１６１】
第１の抗体が、免疫抑制剤にコンジュゲートされる請求項９７に記載の方法。
【請求項１６２】
免疫抑制剤が、ガンシクロビル、エタナセプト、シクロスポリン、タクロリムスまたはラパマイシンである請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
免疫抑制剤が、アルキル化剤である請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６４】
アルキル化剤が、シクロホスファミドである請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
免疫抑制剤が、代謝拮抗剤である請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６６】
代謝拮抗剤が、プリンアンタゴニストである請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
プリンアンタゴニストが、アザチオプリンまたはミコフェノレートモフェチルである請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
代謝拮抗剤が、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤である請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６９】
ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤が、メトトレキサートである請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
免疫抑制剤が、グルココルチコイドである請求項１６１に記載の方法。
【請求項１７１】
グルココルチコイドが、コルチゾールまたはアルドステロンである請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
免疫抑制剤が、グルココルチコイド類似体である請求項１６１に記載の方法。
【請求項１７３】
グルココルチコイド類似体が、プレドニゾンまたはデキサメタゾンである請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
免疫抑制剤が、抗炎症剤である請求項１６１に記載の方法。
【請求項１７５】
抗炎症剤が、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤またはロイコトリエン受容体アンタゴニストである請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
免疫学的疾患が、Ｔｈ２−リンパ球関連疾患である請求項９７に記載の方法。
【請求項１７７】
免疫学的疾患が、アトピー性皮膚炎、全身紅斑性狼瘡、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症または慢性の移植片対宿主病である請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
免疫学的疾患が、Ｔｈ１−リンパ球関連疾患である請求項９７に記載の方法。
【請求項１７９】
免疫学的疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、ショーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレイブ病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナーの肉芽腫症、結核または急性移植片対宿主病である請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
免疫学的疾患が、ウイルス感染に起因するものである請求項９７に記載の方法。
【請求項１８１】
ウイルス感染が、エプスタイン-バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ白血病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスまたは麻疹ウイルスを含む請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
免疫学的疾患が、活性化Ｂリンパ球に関連する疾患である請求項９７に記載の方法。
【請求項１８３】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）ＣＤ３０への結合についてモノクローナル抗体ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１と競合する第１の抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項１８４】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）配列番号２を含む抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項１８５】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）配列番号４、配列番号６および配列番号８の１つ、２つまたは全部を含む抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項１８６】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）配列番号１８を含む抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項１８７】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４の１つ、２つまたは全部を含む抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項１８８】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）モノクローナル抗体ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１とＣＤ３０との結合に関して競合し、細胞傷害性薬剤とコンジュゲートしている抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項１８９】
細胞傷害性薬剤が、エネジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤およびビンカアルカロイドからなる群から選択される請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
細胞傷害性薬剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、ＤＭ−１、オーリスタチンＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥまたはネトロプシンである請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９１】
細胞傷害性薬剤が、抗チューブリン剤である請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９２】
細胞傷害性薬剤が、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチンまたはドラスタチンである請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
細胞傷害性薬剤が、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンオレルビン、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロンＡ、エピチロンＢ、ノコダゾール、コルヒチン、コルチミド、エストラムスチン、セマドチン、ディスコデルモリド、メイタンシン、ＤＭ−１、オーリスタチンＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥまたはエロイテロビンである請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９４】
細胞傷害性薬剤が、ＭＭＡＥである請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９５】
細胞傷害性薬剤が、ＡＥＦＰである請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９６】
第１の抗体が、ペプチドリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９７】
第１の抗体が、ｖａｌ−ｃｉｔリンカーまたはｐｈｅ−ｌｙｓリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９８】
第１の抗体が、ヒドラゾンリンカーまたはジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９９】
第１の抗体が、５．５未満のｐＨで加水分解可能なリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１８８に記載の方法。
【請求項２００】
リンカーが５．０未満のｐＨで加水分解可能である請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
リンカーが、ヒドラゾンリンカーまたはジスルフィドリンカーである請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０２】
第１の抗体が、プロテアーゼによって切断可能なリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０３】
第１の抗体が、プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされる請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０４】
プロテアーゼが、膜結合プロテアーゼである請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０５】
プロテアーゼが、細胞内プロテアーゼである請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０６】
プロテアーゼが、エンドソームのプロテアーゼである請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０７】
プロテアーゼが、リソソームのプロテアーゼである請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０８】
第１の抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、グリコシル化抗体、多重特異性抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ＶＬドメインを含む断片、ＣＤ３０に特異的に結合するポリペプチド、またはＶＨドメインを含む断片である請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０９】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）ｃＡＣ１０−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥと、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項２１０】
被験体における癌ではない免疫学的疾患の治療方法であって、（ａ）ｃＡＣ１０−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＥＦＰと、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で該被験体に投与することを含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入まれる２００１年１１月２０日出願の米国仮出願第６０／３３１，７５０号の米国特許法第ｌ１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、ＣＤ３０結合タンパク質を使用する、活性化リンパ球における細胞死または静止状態を誘導する方法および組成物、ならびにこれらの方法および組成物の自己免疫、アレルギー、慢性炎症反応および移植対宿主片病（ＧＶＨＤ）などの免疫学的疾患の治療への適用に関する。さらに、本発明は、ＣＤ３０結合タンパク質と細胞傷害性薬剤のコンジュゲートを使用してＣＤ３０発現リンパ球を除去することによる免疫学的疾患の治療方法および組成物に関する。本発明の方法および組成物における有用な典型的なＣＤ３０結合タンパク質の例としては、抗ＣＤ３０抗体であるＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１、ならびにＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１と細胞傷害性薬剤とのコンジュゲートが含まれる。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
２．１  リンパ球
抗原刺激および細胞増殖（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の後、ナイーブＴ細胞は表現型が異なるエフェクター細胞へと発達可能である。ＩＦＮγやリンホトキシンなどの前炎症性サイトカインを分泌するエフェクターＴ細胞（ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）は、総称してＴｈ１またはＴｃ１細胞と呼ばれ、また、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を分泌するエフェクターＴ細胞は、Ｔｈ２またはＴｃ２として知られている。Ｔｈ１／Ｔｃ１サイトカインは、ＣＴＬおよび単球／マクロファージの活性化を含む細胞媒介性応答を誘導し、Ｔｈ２／Ｔｃ２サイトカインはＢ細胞によって抗体産生を増強することにより体液性免疫反応を誘導する。結果として、無制御のＴｈ１／Ｔｃ１応答は、通常、関節リウマチや糖尿病などの器官特異的自己免疫応答として顕れる。一方、無制御のＴｈ２／Ｔｃ２応答は、通常、全身性紅斑性狼瘡などの、アレルギー反応および全身性の自己免疫疾患と関連する。これらの２極化されたＴ細胞サブセットは、互いに相手の各活性を相反的に調節することが可能であり、Ｔｈ２／Ｔｃ２サイトカインが存在すると、細胞媒介性の自己免疫に起因する症状をある程度緩和することが可能であり、その逆も同様である（ＳｅｄｅｒとＭｏｓｍａｎｎ、１９９９、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ」、４版、８７９〜９０８頁；Ｏ’ＧａｒａとＡｒａｉ、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：５４２〜５５０頁）。
【０００４】
２．２  ＣＤ３０
白血球活性化マーカーＣＤ３０は、１０５〜１２０ｋＤａの膜内在性糖タンパク質であり、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリーのメンバーである。この重要な免疫調節分子ファミリーは、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５、ＯＸ４０、ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２を含む。もともとＣＤ３０は、Ｋｉ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｂｌｏｏｄ、６６、８４８〜８５８頁；Ｌａｕｄｅｗｉｔｚら、１９８６、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８６：３５０〜３５４頁）を使用して、ホジキン病（ＨＤ）のリード−シュテルンベルク（Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）細胞上で同定されたものであるが、その後、非ホジキン性リンパ腫（ＮＨＬ）のサブセットである未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ：ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）上ならびに胚性癌腫および精巣悪性腫瘍などの希少な固形癌中でも見出されている（Ｃｈｉａｒｌｅら、１９９９、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０：１５７〜１６４頁）。正常な条件下では、ＣＤ３０の発現は活性化ＴおよびＢ細胞に限定され、休止期のリンパ球、休止期の単球、および免疫系外の正常な細胞には見られない。ＣＤ３０は自己免疫疾患において活性化細胞によって高レベルで発現し、これらの細胞から流出したＣＤ３０は、関節リウマチ（Ｇｅｒｌｉら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４、４３９９〜４４０７頁）、多発性硬化症（ＭｃＭｉｌｌａｎら、２０００、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１０１：２３９〜２４３頁）および全身性硬化症（Ｉｈｎら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２７：６９８〜７０２頁）を含む疾患に罹患している患者の循環系において検出できる。ＣＤ３０発現についての組織学的検査によって、リンパ節、扁桃腺、胸腺、および胎盤境界面で脱落した子宮内膜細胞、の切片中に見られる希少な大リンパ系細胞が同定される（Ｄｕｒｋｏｐら、２０００、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９０：６１３〜６１８頁）。ＣＤ３０は、有系分裂促進物質活性化または抗原受容体架橋（ＨｏｒｉｅとＷａｔａｎａｂｅ、１９９８、Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４５７〜４７０頁）後の培養物中のＴ細胞上で一過的に発現され、ある種のウイルス感染（例えば、ＨＩＶ）（Ｒｏｍａｇｎａｎｉら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．５１：８３〜８８頁）後では構成的に発現される。
【０００５】
ＣＤ３０に対するリガンド（ＣＤ３０Ｌ）が同定されている。ＣＤ３０ＬはＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、これはＴＮＦスーパーファミリーのメンバーと配列および構造の相同性がある（Ｓｍｉｔｈら．、１９９３、Ｃｅｌｌ、７３、１３４９〜１３６０頁）。ＣＤ３０Ｌは、ＴＮＦαのように３量体としても存在すると考えられており、ＣＤ３０Ｌ−ＣＤ３０相互作用は、ＣＤ３０の３量体化を誘導してＣＤ３０＋細胞へのシグナル伝達を開始させる。ＣＤ３０Ｌの発現は、活性化Ｔ細胞、好中球、好酸球、休止Ｂ細胞、上皮細胞および胸腺髄質のハッサル（Ｈａｓｓａｌ）小体、ならびにある種の白血病細胞中で確認されている（Ｙｏｕｎｅｓら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、９３：５６９〜５７１頁；Ｐｉｎｔｏら、１９９６、Ｂｌｏｏｄ、８８：３２９９〜３３０５頁；Ｇｒｕｓｓら、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９、４６９〜４８１頁；Ｇａｔｔｅｉら．、１９９７、Ｂｌｏｏｄ、８９、２０４８〜２０５９頁；Ｒｏｍａｇｎａｎｉら、１９９８、Ｂｌｏｏｄ  ９１：３３２３〜３３３２頁；Ｗｉｌｅｙら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：３６３５〜３６３９頁）。
【０００６】
リンパ球表面抗原ＣＤ３０は、活性化Ｂ細胞およびＴ細胞に一過的に提示される活性化マーカーであり、また、ある種の悪性な血液細胞および、いくつかの自己免疫疾患で慢性的に活性化された細胞上で構成的に発現される。リンパ球調節におけるその役割は、減衰的なものの一種であると考えられている。ノックアウト動物におけるＣＤ３０の欠損は免疫刺激への過剰応答をもたらし、胸腺中のトランスジーンの過剰発現は胸腺細胞消耗の増大をもたらすからである。したがって、ＣＤ３０を標的とする療法によって活性化リンパ球を除去または減衰させることにより、自己免疫および慢性炎症性疾患の制御に効果を有し得る。
【０００７】
ＣＤ３０のリンパ球生存の調節は複雑なため、モデルシステムにおけるその作用についてはまったく異なる説明がなされている。ＤｕｃｋｅｔｔとＴｈｏｍｐｓｏｎ（１９９７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１：２８１０〜２１頁）は、ＣＤ３０シグナル伝達の初期の作用はＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２の補給（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）によって生存を促進することであることを示した。このシグナル伝達複合体はＮＦ−κＢを介して成長および生存遺伝子の発現を促進する。この活性化に続いて、ＣＤ３０と複合体を形成したＴＲＡＦは、その後分解し、細胞がさらにＮＦ−κＢを活性化する能力を弱める。この結果、細胞は、ＴＮＦ−Ｒ１の結合によって誘導されたアポトーシスに感受性を持つようになる（ＤｕｃｋｅｔｔとＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９９７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１：２８１０〜２１頁；Ａｒｃｈら、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７２：９３６〜９４５頁）。感作は、ＣＤ３０の細胞質ドメイン内のＴＲＡＦ２結合部位に依存し、ＴＲＡＦ２の細胞分解はアポトーシスの開始と一致する。
【０００８】
２．３  免疫系中のＣＤ３０の役割
２．３．１  正常免疫系
ＣＤ３０のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能は明らかにはわかっていない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ３０の結合は細胞の増殖または増殖抑制のいずれかを引き起こすことが示されている（Ｇｒｕｓｓら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ、８３、２０４５〜２０５６頁）。Ｔ細胞上のＣＤ３０の結合は様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞機能を調節することが実証されている。抗ＣＤ３０  ｍＡｂは、Ｔ細胞抗原受容体結合を共同刺激して、抗原（Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２：１６５５〜１６６１頁）または抗ＣＤ３抗体（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２１８０〜２１８７頁）のいずれかによって開始されたＴ細胞の細胞増殖を増大させる。ＣＤ３０シグナル伝達はまた、Ｔ細胞中のサイトカイン産生を促進する。インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの発現は、ＰＨＡ活性化末梢Ｔ細胞（ＧｒｕｓｓとＨｅｒｍａｎｎ、１９９６、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、２０：３９７〜４０９頁）、Ｔヘルパー（Ｔｈ）クローン（Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅと、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２：１６５５〜１６６１頁；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、２０００、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５２、５９５〜６０１頁）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ／ＣＴＬ）系（Ｂｏｗｅｎら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４４２〜４４９頁）およびγδＴ細胞（Ｂｉｓｗａｓら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２１７２〜２１８０頁）におけるＣＤ３０シグナルによって増強される。ＣＤ３０は、さらにＨＩＶ複製を刺激する上で重要な役割を果たしている可能性がある。ｍＡｂによるＣＤ３０の架橋は、ＨＩＶに慢性的に感染したＴ細胞系統によるＮＦ−κＢ活性化およびＨＩＶ産生を誘導する（Ｂｉｓｗａｓら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２、５８７〜５９６頁）。患者由来のＣＤ４＋、ＨＩＶ−感染Ｔ細胞も、抗ＣＤ３０  ｍＡｂまたはＣＤ３０Ｌ刺激に応答してＨＩＶを産生する（Ｍａｇｇｉら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：２５１〜２５５頁）。
【０００９】
ＣＤ３０は、Ｔ細胞の活性化誘導細胞死に関与している。Ｔ細胞ハイブリドーマ中で発現されたＣＤ８−ＣＤ３０キメラの結合は、Ｔ細胞抗原受容体によって媒介されるアポトーシスを増強した（Ｌｅｅら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：６６９〜６７４頁）。マウスのＣＤ８  Ｔ細胞におけるアゴニスト撤退誘導アポトーシスの第２モデルでは、ＣＤ３０−Ｉｇ融合タンパク質を用いてＣＤ３０シグナル伝達を阻止することにより、ＣＤ８  Ｔ細胞のアポトーシスが部分的ながら防止されている（Ｔｅｌｆｏｒｄら、１９９７、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：１２５〜１３６頁）。動物モデルから得られた結果からも、胸腺細胞におけるアポトーシス誘導、自動反応性Ｔ細胞の除去のネガティブ選別過程におけるＣＤ３０の役割が示唆される（Ａｍａｋａｗａら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８４：５５１〜５６２頁）。ＣＤ３０-/-ヌルマウスでは、ネガティブ選別が大幅に低減し胸腺細胞数の増加をもたらしており（Ａｍａｋａｗａら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８４：５５１〜５６２頁）、証明された１つの結果は、ＣＤ３０欠損ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、自己免疫性糖尿病を惹起するその能力において桁違いに高い自己反応性であるという点である（Ｋｕｒｔｓら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：３４１〜３４４頁）。反対に、ＣＤ３０の過剰発現が胸腺細胞におけるプログラム化された細胞死を促進することが示されており、従って、胸腺における自動反応性Ｔ細胞のネガティブ選別を増強し（Ｃｈｉａｒｌｅら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１９４〜２０５頁）、末梢において非リンパ組織に対するＴ細胞自動応答を妨げる（Ｈｅａｔｈら、１９９９、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６９：２３〜２９頁）。
【００１０】
２．３．２  疾患状態
ＣＤ３０がＴｈ２サイトカインを分泌するヒトＴ細胞クローン上で好ましく発現され（Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅら、１９９５、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９、８１〜８６頁）、Ｔ細胞上のＣＤ３０の架橋がＴｈ２様Ｔ細胞の発達を促す（Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２、１６５５〜１６６１頁）ことが実証されたため、Ｔｈ２サイトカインがかかわる免疫学的疾患がＣＤ３０＋Ｔ細胞の調節障害に起因するかもしれないという仮説が立てられた。
【００１１】
ＣＤ３０の発現は、アトピー性アレルギー（アトピー性皮膚炎、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎）、全身性紅班性狼痕、全身性硬化症（強皮症）、宿主対移植片病（ＧＶＨＤ）、ＨＩＶおよびＥＢＶ伝染、麻疹、オーメン（Ｏｍｅｎｎ）症候群、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、橋本甲状腺炎、原発性胆汁性肝硬変、ショーグレン（Ｓｊｏｇｒｅｎ）症候群、ウェゲナー（Ｗｅｇｅｎｅｒ）肉芽腫症および結核を含む多様な自己免疫学的疾患および炎症性疾患において増大または変化することが示されている（Ｇｒｕｓｓら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：１５６〜１６３頁；ＨｏｒｉｅとＷａｔａｂａｂｅ、１９９８、Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４５７〜４７０頁；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ、２００１、Ａｌｌｅｒｇｙ  ５６：５９３〜６０３頁；Ｇｅｒｌｉら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：７２〜７７頁）。
【００１２】
ＣＤ３０＋の浸潤Ｔ細胞は、アトピー性皮膚炎（Ｃａｐｒｏｎｉら、１９９７、Ａｌｌｅｒｇｙ  ５２：１０６３〜１０７０頁；Ｃａｖａｇｎｉら、２０００、Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１：２２４〜２２８頁）、アトピー性喘息（Ｂｌａｎｃｏ  Ｑｕｉｒｏｓら、１９９９、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２３５〜２４０頁）、ＧＶＨＤ（Ｄ’Ｅｌｉｏｓら、１９９７、Ｊ．Ｌｅｗｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６１：５３９〜５４４頁）、結核（Ｍｕｎｋら、１９９７、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７１３〜７２０頁）、原発性胆汁性肝硬変（Ｈａｒａｄａら、１９９９、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１４：１１９７〜１２０２頁）、麻疹（Ｖｉｎａｎｔｅら、１９９９、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８４：６８３〜６８９頁）、関節リウマチ（Ｇｅｒｌｉら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４３９９〜４４０７頁；Ｇｅｒｌｉら、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２：５４７〜５５０頁）および乾癬（Ｆｅｒｅｎｃｚｉら、２０００、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１４：６３〜７８頁）の病巣および炎症部位で見つかっている。ＣＤ３０発現は、正常な状況では活性化リンパ球のわずかな割合に厳密に限られているが、アトピー性喘息およびアレルギー性鼻炎でＣＤ３０  ｍＲＮＡ発現の増加が報告されている（Ｅｓｎａｕｌｔら、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：６７〜７２頁）。ＣＤ３０の変化した発現と免疫疾患の間の相関性は、前述の疾患のうちの多くで見られる可溶性ＣＤ３０（ｓＣＤ３０：ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ３０）の血漿中レベルが高いという点によりさらに強調される（Ｇｒｕｓｓら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：１５６〜１６３頁；ＨｏｒｉｅとＷａｔａｂａｂｅ、１９９８、Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４５７〜４７０頁；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ、２００１、Ａｌｌｅｒｇｙ  ５６：５９３〜６０３頁；Ｇｅｒｌｉら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：７２〜７７頁）。これらの疾患のうちのいくつかでは、ｓＣＤ３０の高血漿中レベルは循環系中のＣＤ３０＋Ｔ細胞を伴わないが、罹患組織中のＣＤ３０＋Ｔ細胞の増殖はｓＣＤ３０の潜在的な源であると考えられている（Ｍａｖｉｌｉａ、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１７５１〜１７５８頁）。
【００１３】
いくつかの疾患には、Ｔｈ２サイトカインおよびＣＤ３０＋Ｔ細胞の両者が関与していることが実証されている（Ｄ’Ｅｌｉｏｓら、１９９７、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６１：５３９〜５４４頁）。アトピー性皮膚炎患者のほとんどはＴｈ２サイトカインの産生増加と並行して血清ＩｇＥレベルの増大および循環系中の好酸球数の増加を示す（Ｌｅｕｎｇ、１９９５、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：３０２〜３１９頁）。ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を産生するアレルゲン特異的Ｔｈ２細胞の出現率の増加も、アトピー性皮膚炎患者の末梢血中で検出できる（Ｋｉｍｕｒａら、１９９８、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０１、８４〜８９頁）。ＣＤ３０発現とＴｈ２サイトカイン産生との間の相関性は、アトピー性皮膚炎患者で認められており、これは循環系中のＴ細胞におけるＣＤ３０の発現が、Ｔｈ２が支配する症状に対するｉｎ  ｖｉｖｏマーカーとして役立つかもしれないという示唆をもたらした（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０００、Ａｌｌｅｒｇｙ、５５、１０１１〜１０１８頁）。アトピー性喘息におけるアレルゲン誘導性のＩＬ−４産生は、アトピー性喘息被験体から単離されたＰＢＭＣ中のＣＤ３０発現と関連する（Ｌｅｏｎａｒｄら、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１７、３６８〜３７５頁）。これは、喘息患者由来の気管支肺胞の損傷γδＴ細胞中でも示されている（Ｓｐｉｎｏｚｚｉら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：８２１〜８２６頁）。同様に、全身性硬化症（これはｓＣＤ３０の高い血清レベルおよび皮膚損傷中のＣＤ３０発現によって特徴づけられた疾患である）では、ＩＬ−４  ｍＲＮＡが皮膚損傷部に浸潤したリンパ球中のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出可能である一方、皮膚浸潤部から生成したほとんどのＣＤ４＋Ｔ細胞クローンがＴｈ２サイトカインのプロファイルを示す（Ｍａｖａｌｉａら、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５、１７５１〜１７５８頁）。ＨＩＶに感染した患者では、健康なドナーと比較した時、末梢血中でＴｈ２サイトカイン産生ＣＤ８＋／ＣＤ３０＋細胞の不釣り合いに高い出現率が検出されることがある（Ｍａｎｅｔｔｉら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２４０７〜２４１１頁）。ＨＩＶに感染した患者では、Ｔｈ２型免疫の緊急出現も、疾患の進行に伴う免疫病理と関連しているように思われる（Ｒｉｚｚａｒｄｉら、１９９８、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４：６１〜６５頁）。
【００１４】
Ｔｈ２に関連する疾患とは対照的に、Ｔｈ１に関連する疾患におけるＣＤ３０＋の役割もわかっていない。多発性硬化症患者のＣＳＦおよび関節リウマチ患者の循環系中には高レベルのｓＣＤ３０が見出されている（ＭｃＭｉｌｌａｎら、２０００、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１０１：２３９〜２４３頁；Ｇｅｒｌｉら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４３９９〜４４０７頁）。これらの疾患では、Ｔｈ１サイトカインで駆動される応答および循環系中の高レベルのＣＤ３０は、両者とも、疾患寛解を伴っており、ＣＤ３０＋Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカインが、Ｔｈ１サイトカイン病原性活性に対抗し得ることを示唆する（ＭｃＭｉｌｌａｎら、２０００、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１０１：２３９〜２４３頁；Ｇｅｒｌｉら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４３９９〜４４０７頁）。Ｔ細胞サブセット上でのＣＤ３０発現を調べたより最近の実験では、細胞の活性化に際して、Ｔｈ１細胞もＣＤ３０を発現することが確認されている（Ｈａｍｍａｎら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：１３８７〜１３９１頁；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５８：６８３〜６８９頁）。アゴニスト性抗ＣＤ３０  ｍＡｂは、ＣＤ３０＋Ｔｈ１細胞中でＴｈ１サイトカインＩＦＮγの産生を刺激することができる（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、２０００、Ｓｃａｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５２：５９５〜６０１頁）。アトピー性皮膚炎では、疾患の進行に伴って、Ｔ細胞浸潤皮膚損傷部によるＴｈ２サイトカイン産生が優勢な状態からＴｈ２とＴｈ１サイトカインの同時発現への移行を決定付ける証拠が得られる（Ｇｒｅｗｅら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １９：３５９）。したがって、ＣＤ３０  Ｔ細胞もまた、Ｔｈ１関連疾患においてＴｈ１サイトカインの産生に役割を果たし得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
２．４  免疫療法
自己抗原またはアレルゲンに対しリンパ球が活性化状態を持続したり、進行中の免疫応答が抗原の除去後に終了しないことが、自己免疫疾患、アレルギー反応および慢性炎症反応で見られた病理の根本原因である。自己免疫性の疾患、アレルギー性疾患および炎症性疾患の治療には、代謝拮抗剤、ステロイドおよび抗炎症剤を含む様々な治療レジメが利用可能である。これらの薬剤は症状の緩和に効果があるが、それらのいずれもそれらの病原性細胞を特異的になくすようには働かないし、その大半は患者に対し重い副作用をもたらす。
【００１６】
ＣＤ３０を有する活性化リンパ球の除去または減衰は、自己免疫性の疾患および慢性の炎症性疾患の調節に効果があり得る。しかし、免疫疾患におけるＣＤ３０の役割についての上記の証拠にもかかわらず、ｍＡｂによりＣＤ３０を標的とすることは、そのような疾患を治療するのに有効であるとは実証されていない。ＣＤ３０を有する活性化したリンパ球を除去または減退できる薬剤は、免疫学的疾患の治療において非常に望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
３．発明の概要
本発明は、驚くべきことに抗ＣＤ３０抗体のあるクラスに関わる新規な活性を見い出したことに基づく。この新規な活性は、ある例では、ＣＤ３０受容体経路を介してシグナル伝達することにより、活性化リンパ球を死滅させるかその生育を阻害する抗ＣＤ３０抗体の能力である。ある好ましい実施形態では、本発明の抗体は、細胞傷害性試薬への結合がない状態で、および／またはＣＤ３０−発現リンパ球以外の細胞がない状態（例えば、エフェクター細胞がない状態）で、単一特異性抗体として活性化リンパ球のアポトーシスまたは生育停止を誘導することができる。
【００１８】
したがって、本発明は、被験体における免疫学的疾患（好ましくは免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）リンパ球においてＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または、活性化リンパ球に対し細胞静止作用もしくは細胞傷害作用を及ぼす第１の抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。抗体はヒトのものでもよいし、ヒト化されたものでもよいし、キメラでもよい。１つの実施形態では、抗体は多価である。好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１とＣＤ３０との結合に関して競合する。
【００１９】
本発明はさらに、被験体における免疫学的疾患（好ましくは免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）リンパ球においてＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または、活性化リンパ球に対し細胞静止作用もしくは細胞傷害作用を及ぼす第１の抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法であって、第１の抗体の細胞静止作用または細胞傷害作用を強めあるいは増す薬剤の投与をさらに含む方法を提供する。ある実施形態では、第１の抗体の細胞静止作用または細胞傷害作用を強める薬剤は、第２の抗体、活性化リンパ球上で発現される受容体または受容体複合体に結合するリガンドまたは免疫抑制剤である。そのような試薬およびそれらの使用方法の例についてはさらに以下に記載する。
【００２０】
したがって、本発明は、被験体における免疫学的疾患（好ましくは免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）リンパ球においてＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または、活性化リンパ球に対し細胞静止作用もしくは細胞傷害作用を及ぼす第１の抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法であって、前記被験体への第２の抗体の投与をさらに含む方法を提供する。好ましい実施形態では、第２の抗体は、活性化リンパ球上で発現された非ＣＤ３０受容体または受容体複合体を認識する。
【００２１】
ある特定の実施形態では、本発明は、被験体における免疫学的疾患（ここで、免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）モノクローナル抗体ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１とＣＤ３０との結合に関して競合する抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
別の特定の実施形態では、本発明は、被験体における免疫学的疾患（ここで、免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）配列番号２（抗ＣＤ３０抗体ＡＣ１０の重鎖可変領域）を含む抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
別の特定の実施形態では、本発明は、被験体における免疫学的疾患（ここで、免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）配列番号４、配列番号６および配列番号８（抗ＣＤ３０抗体ＡＣ１０の重鎖ＣＤＲ）または配列番号４、配列番号６および配列番号８と１個、２個または３個のアミノ酸が異なる配列番号４、配列番号６および配列番号８の改変体の１つ、２つまたは全部を含む抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
別の特定の実施形態では、本発明は、被験体における免疫学的疾患（ここで、免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）配列番号１８（抗ＣＤ３０抗体ＨｅＦｉ−１の重鎖可変領域）を含む抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
別の特定の実施形態では、本発明は、被験体における免疫学的疾患（ここで、免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４（抗ＣＤ３０抗体ＨｅＦｉ−１の重鎖ＣＤＲ）または配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４と１個、２個または３個のアミノ酸が異なる配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４の改変体の１つ、２つまたは全部を含む抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
さらに別の特定の実施形態では、本発明は、被験体における免疫学的疾患（ここで、免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）（ｉ）免疫特異的にＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）モノクローナル抗体ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１とＣＤ３０との結合に関して競合し、細胞傷害性薬剤とコンジュゲートしている抗体と、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明のある特定の実施形態では、抗ＣＤ３０抗体はアゴニスト抗体である。本発明の別の特定の実施形態では、抗ＣＤ３０抗体は非アゴニスト抗体である。さらに別の特定の実施形態では、抗ＣＤ３０抗体は、ＣＤ３０へのＣＤ３０リガンドの結合を妨げない。
【００２８】
好ましい実施形態では、非ＣＤ３０受容体または受容体複合体を認識する第２の抗体を被験体に投与する場合、そのような抗体は、ＣＤ３０抗体の細胞傷害作用または細胞静止作用を増強することができる。何らかの理論に拘束されるものではないが、そのような第２の抗体は、活性化リンパ球に細胞静止性または細胞傷害シグナルを送達することにより、ＣＤ３０抗体の細胞傷害作用または細胞静止作用を増強する。例示的な受容体または受容体複合体には、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質が含まれる。適当な免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの例（ただし、これらに限定されない）は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＩＣＯＳである。適当なＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの例（ただし、これらに限定されない）は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４およびＡＰＯ−３である。適当なインテグリン類の例（ただし、これらに限定されない）は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ  １０３およびＣＤ  １０４である。適当なレクチンの例（ただし、これらに限定されない）は、Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプおよびＩ−タイプのレクチンである。
【００２９】
ある好ましい実施形態では、本発明の方法において有用な抗体、つまり、ＣＤ３０に結合し、活性化リンパ球に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼす抗体は、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体である。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３０、および活性化リンパ球上で発現された非ＣＤ３０受容体または受容体複合体の両方に結合する。好ましくは、非ＣＤ３０受容体または受容体複合体に結合する、二重特異性抗体部分は、ＣＤ３０抗体の細胞傷害作用または細胞静止作用を増強することができる。二重特異性抗体の非ＣＤ３０結合部分は、好ましくは、活性化リンパ球に細胞静止性または細胞傷害シグナルを送達することによりＣＤ３０抗体の細胞傷害作用または細胞静止作用を増強する。受容体または受容体複合体は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質を含むことができる。適当な免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの例（ただし、これらに限定されない）は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＩＣＯＳである。適当なＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの例（ただし、これらに限定されない）は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４およびＡＰＯ−３である。適当なインテグリン類の例（ただし、これらに限定されない）は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３およびＣＤ１０４である。適当なレクチンの例（ただし、これらに限定されない）は、Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプおよびＩ−タイプのレクチンである。
【００３０】
他の実施形態では、本発明の治療方法は、非ＣＤ３０抗体と同時にまたは連続的に、活性化リンパ球上で発現する受容体または受容体の複合体に結合するリガンドを被験体に投与することをさらに含む。好ましくは、リガンドは、例えば、活性化リンパ球に細胞静止または細胞傷害シグナルを送達することにより、ＣＤ３０抗体の細胞傷害作用または細胞静止作用を増強することができる。受容体または受容体複合体は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質を含むことができる。適当な免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの例（ただし、これらに限定されない）は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＩＣＯＳである。適当なＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの例（ただし、これらに限定されない）は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４およびＡＰＯ−３である。適当なインテグリン類の例（ただし、これらに限定されない）は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３およびＣＤ１０４である。適当なレクチンの例（ただし、これらに限定されない）は、Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプおよびＩ−タイプのレクチンである。前述の受容体に結合するリガンドは当業者に知られている。
【００３１】
本発明の治療方法のある特定の実施形態では、抗ＣＤ３０抗体は抗体でない第２のタンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。好ましい実施形態では、第２のタンパク質が、ＣＤ３０抗体に多価結合特性を付与する。
【００３２】
他の実施形態では、本発明の治療方法はさらに、被験体への細胞静止剤、細胞傷害性薬剤および／または免疫抑制剤の投与を含む。１つの実施形態では、免疫抑制剤は、ガンシクロビル、アシクロビル、エタナセプト、ラパマイシン、シクロスポリンまたはタクロリムスである。別の実施形態では、免疫抑制剤は、代謝拮抗剤、プリンアンタゴニスト（例えば、アザチオプリンまたはミコフェノレートモフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  ｍｏｆｅｔｉｌ））、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤（例えば、メトトレキサート）、グルココルチコイド（例えば、コルチゾールまたはアルドステロン）、またはグルココルチコイド類似体（例えば、プレドニゾンまたはデキサメタゾン）である。さらに他の実施形態で、免疫抑制剤はアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）である。さらに他の実施形態で、免疫抑制剤は抗炎症剤であり、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤およびロイコトリエン受容体アンタゴニストを含むが、これらに限定されない。
【００３３】
ある好ましい実施形態では、本発明の方法において有用な抗体、つまり、ＣＤ３０に結合し、リンパ球においてＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対する細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼす抗体は、細胞静止剤、細胞傷害性薬剤または免疫抑制剤にコンジュゲートする。このようなコンジュゲートした抗体は、本明細書においては、抗ＣＤ３０抗体−薬剤コンジュゲート（「ＡＤＣ」または「ＡＤＣ類」）、抗ＣＤ３０抗体細胞傷害性薬剤／免疫抑制剤コンジュゲートと呼ぶこともある。
【００３４】
ある好ましい実施形態では、細胞傷害性薬剤は、エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）、レキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、タキサン（ｔａｘａｎｅ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）およびビンカアルカロイドからなる群から選択される。あるより具体的な実施形態では、細胞傷害性薬剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン（ｅｃｈｉｎｏｍｙｃｉｎ）、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＤＭ−１、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）Ｅ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥまたはネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）である。ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰおよびＭＭＡＥの構造は下記の３．１節で示す。
【００３５】
他の好ましい実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの細胞傷害性薬剤は、抗チューブリン剤である。より特定の実施形態では、細胞傷害性薬剤は、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、タキサン、バッカチン（ｂａｃｃａｔｉｎ）誘導体、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、メイタンシノイド、コンブレタスタチンおよびドラスタチンからなる群から選択される。より具体的な実施形態では、細胞傷害性薬剤は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンオレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ＶＰ−１６、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（ｅｐｉｔｈｉｌｏｎｅ）Ａ、エピチロンＢ、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）、コルヒチン、コルチミド（ｃｏｌｃｉｍｉｄ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、セマドチン（ｃｅｍａｄｏｔｉｎ）、ディスコデルモリド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ）、メイタンシン、ＤＭ−１、ＡＥＦＰ、オーリスタチンＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥまたはエロイテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）からなる群から選択される。
【００３６】
より具体的な実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの細胞傷害性薬剤は、ＭＭＡＥである。別の具体的な実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの細胞傷害性薬剤は、ＡＥＦＰである。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの抗ＣＤ３０抗体は、リンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートし、ここでリンカーはペプチド・リンカーである。特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの抗ＣＤ３０抗体は、リンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートし、ここでリンカーはｖａｌ−ｃｉｔリンカー、ｐｈｅ−ｌｙｓリンカー、ヒドラゾンリンカーまたはジスルフィドリンカーである。ある実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの抗ＣＤ３０抗体は、ペプチド・リンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートする。
【００３８】
ある実施形態では、本発明のコンジュゲートは、抗ＣＤ３０−バリン−シトルリン−ＭＭＡＥ（抗ＣＤ３０−ｖａｌ−ｃｉｔＭＭＡＥまたは抗ＣＤ３０−ｖｃＭＭＡＥ）または抗ＣＤ３０−バリン−シトルリン−ＡＥＦＰ（抗ＣＤ３０−ｖａｌ−ｃｉｔＡＥＦＰまたは抗ＣＤ３０−ｖｃＡＥＦＰ）である。特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートはＡＣ１０−バリン−シトルリン−ＭＭＡＥ（ＡＣ１０−ｖａｌ−ｃｉｔＭＭＡＥまたはＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ）またはＡＣ１０−バリン−シトルリン−ＡＥＦＰ（ＡＣ１０−ｖａｌ−ｃｉｔＡＥＦＰまたはＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰ）である。
【００３９】
別の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、抗ＣＤ３０−フェニルアラニン−リジン−ＭＭＡＥ（抗ＣＤ３０−ｐｈｅ−ｌｙｓＭＭＡＥまたは抗ＣＤ３０−ｆｋＭＭＡＥ）または抗ＣＤ３０−フェニルアラニン−リジン−ＡＥＦＰ（抗ＣＤ３０−ｐｈｅ−ｌｙｓＡＥＦＰまたは抗ＣＤ３０−ｆｋＡＥＦＰ）である。特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、ＡＣ１０−フェニルアラニン−リジンＭＭＡＥ（ＡＣ１０−ｐｈｅ−ｌｙｓＭＭＡＥまたはＡＣ１０−ｆｋＭＭＡＥ）またはＡＣ１０−フェニルアラニン−リジン−ＡＥＦＰ（ＡＣ１０−ｐｈｅ−ｌｙｓＡＥＦＰまたはＡＣ１０−ｆｋＡＥＦＰ）である。
【００４０】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、被験体における免疫学的疾患（ここで、免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）ｃＡＣ１０−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥと、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００４１】
別の特定の実施形態では、本発明は、被験体における免疫学的疾患（ここで、免疫学的疾患は癌ではない）の治療方法であって、（ａ）ｃＡＣ１０−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＡＥＦＰと、（ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を治療上有効な量で前記被験体に投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
ある実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの抗ＣＤ３０抗体は、リンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートし、ここでリンカーは５．５未満のｐＨで加水分解され得る。特定の実施形態では、リンカーは５．０未満のｐＨで加水分解され得る。
【００４３】
ある実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの抗ＣＤ３０抗体は、リンカーを介して細胞傷害性薬剤にコンジュゲートし、ここでリンカーはプロテアーゼによって切断され得る。特定の実施形態では、プロテアーゼはリソソームのプロテアーゼである。他の特定の実施形態では、プロテアーゼは、とりわけ、膜結合プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼまたはエンドソームの（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ）プロテアーゼである。
【００４４】
ある実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化されたキメラ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、グリコシル化抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ＶＬドメインを含む断片、またはＶＨドメインを含む断片である。ある実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの抗ＣＤ３０抗体は、特にＣＤ３０に特異的に結合するポリペプチドである。ある実施形態では、抗体が二重特異性抗体である。他の実施形態では、抗体は二重特異性抗体ではない。
【００４５】
ある実施形態では、抗ＣＤ３０抗体は放射標識される。ある実施形態では、抗ＣＤ３０抗体−細胞傷害性薬剤コンジュゲートの抗ＣＤ３０抗体は放射標識される。特定の実施形態では、放射性標識は、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１０９Ｐｄ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、１０５Ｒｈ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕまたは２１２Ｐｂである。
【００４６】
本発明の方法によって包含される免疫学的疾患は、Ｔｈ２リンパ球関連疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、全身紅斑性狼瘡（「ＳＬＥ」）、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症および慢性の移植片対宿主病）；Ｔｈ１リンパ球関連疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、ショーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレイブ病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結核および急性移植片対宿主病）；ウイルス感染に関連する疾患（例えば、エプスタイン−バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ白血病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび麻疹ウイルス感染症）；および活性化Ｂリンパ球に関連する疾患（例えば、全身紅斑性狼瘡、グッドパスチャー（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ）症候群、関節リウマチ、およびＩ型糖尿病）である。
【００４７】
３．１  略語
「ＡＥＦＰ」という略語は、ジメチルバリン−バリン−ドライソロイン−ドラプロイン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミン、すなわち、以下に示すオーリスタチンＥ誘導体を指す：
【化１】
2005511627.tif 000002
【００４８】
「ＭＭＡＥ」という略語は、モノメチル・オーリスタチンＥ、すなわち、以下に示すオーリスタチンＥ誘導体を指す：
【化２】
2005511627.tif 000003
【００４９】
「ＡＥＢ」という略語は、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸と反応させることにより生産されるエステルを指し、その構造は以下に示す通りである：
【化３】
2005511627.tif 000004
【００５０】
「ＡＥＶＢ」という略語は、オーリスタチンＥをベンゾイル吉草酸と反応させることにより生産されるエステルを指し、その構造は以下に示す通りである：
【化４】
2005511627.tif 000005
【００５１】
「ｆｋ」および「ｐｈｅ−ｌｙｓ」という略語は、リンカーであるフェニルアラニン−リジンを指す。
【００５２】
「ｖｃ」および「ｖａｌ−ｃｉｔ」という略語は、リンカーであるバリン−シトルリンを指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
４．図面の簡単な説明
（後記の図面の簡単な説明の欄参照のこと）
５．発明の詳細な説明
本発明は、ＣＤ３０に結合し、リンパ球においてＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または、活性化リンパ球に対し細胞静止作用もしくは細胞傷害作用を及ぼすタンパク質の免疫学的疾患の治療または予防のための使用に関する。本発明はさらに、ＣＤ３０との結合についてＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１と競合し、リンパ球においてＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または、活性化リンパ球に対し細胞静止作用もしくは細胞傷害作用を及ぼすタンパク質に関する。１つの実施形態では、タンパク質は抗体である。実施形態の好ましい態様において、抗体はＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１であり、最も好ましくはＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１のヒト化形態またはキメラ形態である。
【００５４】
ある実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０抗体は、細胞傷害性薬（例えば、小さな分子、毒素、放射性同位体）とコンジュゲートしていない状態で、および／またはＣＤ３０−発現リンパ球以外の細胞がない状態（例えば、ナチュラル・キラー細胞のようなエフェクター細胞が欠如した状態）で、単一特異性抗体として活性化リンパ球のアポトーシスまたは成長停止を誘導することができる。何らかの理論に拘束されるものではないが、本発明者は、ＣＤ３０経路を介してシグナル伝達することにより、そのような抗体がアポトーシスまたは生育停止を誘導すると考える。
【００５５】
本発明はさらに、ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の免疫学的疾患の治療または予防のための使用に関する。本発明はさらに、そのようなＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１タンパク質の断片、および他の誘導体および類似体に関する。そのような断片または誘導体をコードする核酸も本発明の範囲内である。前述のタンパク質の産生は、例えば、遺伝子組み換え法によって提供される。
【００５６】
本発明はまた、ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１タンパク質、および機能的に活性な、すなわち、ＣＤ３０への結合を示し、かつ、活性化リンパ球に対する細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼし得る、融合／キメラなタンパク質を含む誘導体の免疫学的疾患の治療または予防のための使用に関する。
【００５７】
その使用が本発明によって包含されるＣＤ３０の抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体、ならびに、化学療法剤などの細胞傷害性薬剤にコンジュゲートしたそのような抗体を含む。
【００５８】
本発明はさらに、本発明のタンパク質または核酸を単独でまたは細胞傷害性薬剤（化学療法剤を含むがこれに限定されない）と組み合わせて含む組成物を投与することを含む免疫学的疾患の治療または予防方法に関する。
【００５９】
開示を明瞭にするために、本発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分けるが、これらは本発明を限定するものではない。
【００６０】
５．１  本発明のタンパク質
本発明は、ＣＤ３０に結合し、活性化リンパ球に対し細胞静止作用および／または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質（抗体を含むが、これに限定されない）の免疫学的疾患の治療のための使用を包含する。本発明はさらに、ＣＤ３０への結合に関しＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１と競合し、活性化リンパ球に対し細胞静止作用および／または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質の免疫学的疾患の治療のための使用に関する。
【００６１】
本発明はさらにＨｅＦｉ−１のＣＤＲ（配列番号２０、配列番号２２；配列番号２４；配列番号２８、配列番号３０または配列番号３２）またはＡＣ１０のＣＤＲ（配列番号４；配列番号６；配列番号８；配列番号１２；配列番号１４；または配列番号１６）を含むタンパク質の免疫学的疾患の治療のための使用を包含する。
【００６２】
本発明はさらに、ＨｅＦｉ−１の可変領域（配列番号１８または配列番号２６）またはＡＣ１０の可変領域（配列番号２または配列番号１０）を含むタンパク質の免疫学的疾患の治療のための使用を包含する。各配列番号が対応するＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１の領域を次表に示す。
【表１】
2005511627.tif 000006
【００６３】
本発明はさらに、ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１の機能的な誘導体または類似体の免疫学的疾患の治療のための使用を含む。本明細書で使用する場合、本発明のペプチドまたはタンパク質に関連して「機能的な」という用語は、ペプチドまたはタンパク質が１）ＣＤ３０に結合することができ、２）リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導しかつ／または、活性化リンパ球に対し細胞静止作用および／または細胞傷害作用を及ぼし得ることを示す。
【００６４】
一般に、本発明の方法を実施するのに適する抗体は、免疫特異的にＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞静止作用と細胞傷害作用を及ぼす。本発明の方法を実施するのに適する抗体は、好ましくは、モノクローナルであり、多重特異的でもよく、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、および上記のいずれかのＣＤ３０結合断片である。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的にＣＤ３０に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。本発明の免疫グロブリン分子は、いずれのタイプの免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスでもよい。
【００６５】
本発明のある実施形態では、抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片を含む（ただし、これらに限定されない）。１本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変領域（単数または複数）を単独でまたは次のもの、すなわちヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬドメイン、の全体または一部と組み合わせて含み得る。また、可変領域（単数または複数）とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬドメインとの組合せを含む抗原結合断片も本発明に含まれる。好ましくは、抗体は、ヒト、ネズミ科動物（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ科の動物、ウマまたはニワトリである。本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー、ヒトＢ細胞、または１種または複数のヒト免疫グロブリンに組み換えられたトランスジェニック動物から単離された抗体を含む（下記または例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているものなど）。
【００６６】
本発明の方法を実施するのに適する抗体は単一特異的でもよいし、二重特異的、三重特異的、またはより多重特異的でもよい。多重特異性抗体はＣＤ３０の異なるエピトープに対して特異的でもよいしまたはＣＤ３０と異種起源のタンパク質の両方に対して特異的でもよい。例えば国際公開ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９頁；米国特許第４，４７４，８９３号；米国特許第４，７１４，６８１号；米国特許第４，９２５，６４８号；米国特許第５，５７３，９２０号；米国特許第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３頁参照のこと。本発明を実施するのに有用な二重特異的および三重特異的な抗体を含む多重特異性抗体は、ＣＤ３０（モノクローナル抗体Ｋｉ−２、Ｋｉ−４、Ｋｉ−５、Ｋｉ−７、Ｂｅｒ−Ｈ２、ＨＲＳ−１、ＨＲＳ−４、Ｋｉ−１、Ｋｉ−６、Ｍ６７、Ｋｉ−３、Ｍ４４、ＨｅＦｉ−１およびＡＣ１０のＣＤＲおよび／または重鎖を有する抗体を含むが、これらに限定されない）とリンパ球表面受容体または受容体複合体（例えば、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチン（Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプ）、または補体制御タンパク質など）の両者に免疫特異的に結合する抗体である。こうした分子の例および二重特異性抗体を誘導できるこのような分子に対する抗体の例は、下記の５．１２．２節で示す。好ましい実施形態では、リンパ球の細胞表面分子または分子複合体に対する多重特異性抗体部分の結合は、活性化リンパ球に細胞静止シグナルまたは細胞傷害シグナルを送達することにより、抗ＣＤ３０抗体の細胞傷害作用または細胞静止作用を増強する。
【００６７】
本発明のある特定の実施形態では、抗ＣＤ３０抗体はアゴニスト抗体である。本発明の別の特定の実施形態では、抗ＣＤ３０抗体は非アゴニスト抗体ではない。別の特定の実施形態では、抗ＣＤ３０抗体は、ＣＤ３０リガンドがＣＤ３０に結合することを妨げない。
【００６８】
本発明の方法において有用な抗体は、それらが含む特定のＣＤＲで記載または特定され得る。ある実施形態では、本発明の抗体は、ＡＣ１０および／またはＨｅＦｉ−１の１つまたは２以上のＣＤＲを含む。本発明は、重鎖または軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその誘導体の使用を包含する。ここで、前記可変ドメインは、（ａ）モノクローナル抗体ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１に由来する３個のＣＤＲのセット、および（ｂ）モノクローナル抗体ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１のフレームワーク領域とはそれぞれ異なる４つのフレームワーク領域のセットを含み、前記抗体またはその誘導体は免疫特異的にＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼすものである。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変ドメインを含む抗体またはその誘導体の免疫学的疾患を治療するための使用を包含する。ここで、前記可変ドメインは、（ａ）配列番号４、６または８を含む３個のＣＤＲのセット、および（ｂ）モノクローナル抗体ＡＣ１０のフレームワーク領域とはそれぞれ異なる４つのフレームワーク領域のセットを含み、前記抗体またはその誘導体は免疫特異的にＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼす。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変ドメインを含む抗体またはその誘導体の免疫学的疾患を治療するための使用を包含する。ここで、前記可変ドメインは、（ａ）配列番号２０、２２または２４を含む３個のＣＤＲのセット、および（ｂ）モノクローナル抗体ＨｅＦｉ−１のフレームワーク領域とはそれぞれ異なる４つのフレームワーク領域のセットを含み、前記抗体またはその誘導体は免疫特異的にＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼす。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその誘導体の免疫学的疾患を治療するための使用を包含する。ここで、前記可変ドメインは、（ａ）配列番号１２、１４または１６を含む３個のＣＤＲのセット、および（ｂ）モノクローナル抗体ＡＣ１０のフレームワーク領域とはそれぞれ異なる４つのフレームワーク領域のセットを含み、前記抗体またはその誘導体は免疫特異的にＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼす。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその誘導体の免疫学的疾患を治療するための使用を包含する。ここで、前記可変ドメインは、（ａ）配列番号２８、３０または３２を含む３個のＣＤＲのセット、および（ｂ）モノクローナル抗体ＨｅＦｉ−１のフレームワーク領域とはそれぞれ異なる４つのフレームワーク領域のセットを含み、前記抗体またはその誘導体は免疫特異的にＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼす。
【００７３】
さらに、本発明の方法の中で使用され得る抗体は、それらの１次構造によって記載または特定され得る。可変領域およびＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性（当技術分野で知られており本明細書に記載する方法を使用して計算される）を有する抗体も、免疫学的疾患を治療するための本発明の方法に含まれ得る。本発明の方法において有用な抗体は、ＣＤ３０へのそれらの結合親和性によって記載または特定され得る。好ましい結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄをもつものを含む。
【００７４】
本発明の抗体、すなわち、免疫学的疾患の治療に有用な抗体は、改変された誘導体、すなわち、任意のタイプの分子が抗体に共有結合により結合したもの（ただし、共有結合による結合は、抗体のＣＤ３０への結合を妨げず、または活性化リンパ球に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼすことを妨げない）を含む。例えば、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、公知の保護基またはブロッキング基、タンパク質分解性切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合などによる誘導体化などによって修飾された抗体を含む（ただし、これらに限定されない）。多数の化学的修飾のうちのいずれも、知られている技術によって行うことができ、そうしたものとしては、化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）などの代謝合成が含まれるが、これらに限定されない。さらに、誘導体は１種または２種以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【００７５】
免疫学的疾患の治療に使用可能な抗体は、当技術分野で知られている任意の適当な方法によって作製できる。当技術分野でよく知られた様々な手順によって、ＣＤ３０に対するポリクローナル抗体を生産することができる。例えば、ＣＤ３０をウサギ、マウス、ラットなど（ただし、これらに限定されない）を含む様々な宿主動物に投与し、タンパク質に特異的のポリクローナル抗体を含む血清の生産を誘導する。宿主種に応じて様々なアジュバントを用いて免疫応答を増大させてもよく、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの鉱物性ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）多価アルコール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネ細菌パルブムなどの潜在的に有用なヒト・アジュバントが含まれる（ただし、これらに限定されない）。このようなアジュバントも、当技術分野でよく知られている。
【００７６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換体およびファージディスプレイ技術の使用を含む、知られている種々様々の技術、またはその組合せを使用して作製できる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）（これらは参照によってその全体が本願明細書に組み入れられる）によって教示されているものを含むハイブリドーマ技術を使用し生産することができる。本願明細書で用いる場合、「モノクローナル抗体」という用語はハイブリドーマ技術によって生産された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む、単一クローンに由来する抗体を指し、それが生産される方法ではない。
【００７７】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を生産およびスクリーニングする方法は、当技術分野においてルーチンになされるものでよく知られている。限定的な例ではないが、マウスはＣＤ３０またはＣＤ３０を発現する細胞またはその断片もしくは誘導体によって免疫感作することができる。免疫応答が検出された後、例えば、ＣＤ３０に特異的な抗体がマウス血清中に検出された後、マウスの脾臓を採取して脾臓細胞を分離する。次いで、よく知られた技術によって、脾臓細胞を任意の適当なミエローマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞系統ＳＰ２０由来の細胞）に融合する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローン化する。次いで、ハイブリドーマクローンを、ＣＤ３０に結合可能な活性化リンパ球に対し細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼし得る抗体を分泌する細胞について当技術分野で知られている方法によってアッセイする。腹水（これは一般に高レベルの抗体を含む）は陽性ハイブリドーマクローンをマウスに注入することにより生成できる。
【００７８】
特定のエピトープを認識する抗体断片は知られた技術によって作製し得る。例えば、本発明のＦａｂと、Ｆ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生じる）などの酵素を使用した、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって生成され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【００７９】
例えば、本発明の方法において有用な抗体は、当技術分野で知られている様々なファージディスプレイ法を使用して作製することができる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体領域が、それらをコードする核酸配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態では、そのようなファージは、レパートリーすなわちコンビナトリアルな抗体ライブラリー（例えばヒトまたはネズミ科）から発現する抗原結合ドメインを提示するために利用することができる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインは、それらをコードする核酸配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＨまたはＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列が、動物のｃＤＮＡライブラリー（例えば、ヒトまたはネズミ科のリンパ系組織のｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨまたはＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと共に組み換えによって得られ、ファージミド・ベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）中にクローン化される。ベクターは大腸菌中にエレクトロポレートされ、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には線状ファージであり、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメイン（遺伝子組み換えによりファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに融合される）と共に、ファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む。ＣＤ３０またはそのＡＣ１０もしくはＨｅＦｉ−１結合部分に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、例えば、標識された抗原または固体の表面もしくはビーズに固定された抗原を使用して選択または識別できる。本発明の抗体の製造に使用することができるファージディスプレイ法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１〜５０頁；Ａｍｅｓら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７〜１８６頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２〜９５８頁；Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７、Ｇｅｎｅ  １８７：９〜１８頁；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９１〜２８０頁；国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；国際公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，７５０，７５３号；米国特許第５，８２１，０４７号；米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，５１６，６３７号；米国特許第５，７８０，２２５号；米国特許第５，６５８，７２７号；米国特許第５，７３３，７４３号および米国特許第５，９６９，１０８号に開示されているものなどである。これらはいずれも参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる。
【００８０】
上記の参照文献に記載されているように、ファージ由来の抗体コード領域は、ファージ選択後に分離し、ヒト抗体を含む全抗体または他の任意の所望の抗原結合断片を作製するのに使用することができ、例えば、下記に詳細に記載するように任意の所望の宿主（哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む）中で発現させることができる。例えば、国際公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９２、１２（６）：８６４〜８６９頁；およびＳａｗａｉら、１９９５、ＡＪＲＩ  ３４：２６〜３４頁；およびＢｅｔｔｅｒら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１〜１０４３頁に開示されるような当技術分野で知られた方法を用い、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片を組み換えにより作製する技術を使用することができる。（これらは参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００８１】
１本鎖Ｆｖｓおよび抗体を生産するために使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６〜８８頁；Ｓｈｕら、１９９３、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５〜７９９９頁；およびＳｋｅｒｒａら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８〜１０４０頁が挙げられる。ヒトでのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の使用およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖または細胞傷害性アッセイを含むいくつかの用途については、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体は、例えば、ネズミ科のモノクローナル抗体およびヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を生産する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、２２９：１２０２；Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１〜２０２頁；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第４，８１６，５６７号；および米国特許第４，８１６，３９７号参照のこと（これらは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体は、非ヒト種抗体由来の抗体分子であり、非ヒト種由来の１つまたは複数のＣＤＲおよびヒト免疫グロブリン分子のフレームワークおよび定常領域を有する所望の抗原を結合するものである。しばしば、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、変更するべきＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換され、好ましくは抗原結合性を改善する。これらのフレームワーク置換は当技術分野においてよく知られた方法によって同定され、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデル化することによって、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基が同定され、配列比較によって特定位置での非一般的なフレームワーク残基が同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３参照のこと。これらは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；米国特許第５，５３０，１０１号；および米国特許第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１、２８（４／５）：４８９〜４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５〜８１４頁；Ｒｏｇｕｓｋａ．ら、１９９４、ＰＮＡＳ  ９１：９６９〜９７３頁）およびチェイン・シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む当技術分野で知られた様々な技術を用いてヒト化することができる。
【００８２】
ヒト患者の治療には完全なヒト抗体が特に望ましい。ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて上記のファージディスプレイ法を含む、知られた様々な方法によってヒト抗体を作製できる。さらに米国特許第４，４４４，８８７号および米国特許第４，７１６，１１１号；また国際公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１参照のこと。これらのいずれもが参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる。
【００８３】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを使用して産生することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子複合体を、マウスの胚性幹細胞中にランダムにまたは相同的組み換えによって導入することができる。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組み換えによってヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別にまたは同時に非機能化することができる。特に、ＪＨ領域の同型接合体欠失は内生的な抗体産生を妨げる。キメラなマウスを生産するためには、改変した胚性幹細胞を増殖させて胚盤胞中に顕微注入する。次いで、キメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現する同型接合体の子孫を生じさせる。選択された抗原（例えば、ＣＤ３０のすべてまたは一部）によってトランスジェニックマウスを通常の方法で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、慣用のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化の間に再構成され、続いてクラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような技術を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生産することが可能である。ヒト抗体を生産するためのこの技術の概説については、ＬｏｎｂｅｒｇとＨｕｓｚａｒ、１９９５、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３頁参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのこの技術の詳細な議論およびそのような抗体を生産するためのプロトコルについては、例えば、国際公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０，５９８，８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；米国特許第５，５４５，８０６号；米国特許第５，８１４，３１８号；米国特許第５，８８５，７９３号；米国特許第５，９１６，７７１号；および米国特許第５，９３９，５９８号（これらは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）を参照のこと。さらに、アブジェニックス（Ａｂｇｅｎｉｘ）社（カリフォルニア州フリーモント所在（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）およびメダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ）（ニュージャージー州プリンストン所在（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）などの会社は、上に記載したのと同様の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体の提供を行っている。
【００８４】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は「ガイドされた選択」と呼ばれる技術を使用して作製することができる。このアプローチでは、選択された非ヒト・モノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を用いて、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓら、１９９４、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９〜９０３頁）。
【００８５】
さらに、ＣＤ３０に対する抗体はその後、当業者によく知られた技術（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎとＢｏｎａ、１９８９、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７〜４４４頁；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９〜２４３８頁参照）を使用して、本発明のタンパク質を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製するのに利用できる。このような抗イディオタイプのＦａｂ断片は、活性化リンパ球上に存在するＣＤ３０に対する個体自身の免疫反応を誘発する治療レジメに使用することができる。
【００８６】
上に示唆されるように、活性化リンパ球に対して治療または予防に有用なタンパク質は抗体である必要はない。したがって、本発明のタンパク質は、ＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対して細胞傷害作用および／または細胞静止作用を及ぼす抗体に由来する１つまたは２つ以上のＣＤＲを含むことができる。好ましくは、本発明のタンパク質は多量体であり、最も好ましくは二量体である。本明細書で使用する場合、「本発明のタンパク質」は、ＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対して細胞傷害作用および／または細胞静止作用を及ぼす抗体を含むが、これに限定されない。
【００８７】
本発明はまた、タンパク質を使用して免疫学的疾患を治療する方法であって、このタンパク質としては抗体を含み（ただし、これに限定されない）、当技術分野で知られている競合的結合の決定のための任意の方法（例えば、本明細書に記載された免疫測定法）によって決定されるＣＤ３０に対するＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１の結合を競合的に阻害するものである。好ましい実施形態では、タンパク質は、ＣＤ３０へのＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１の結合を少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７５％、競合的に阻害する。他の実施形態では、タンパク質は、ＣＤ３０へのＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１の結合を少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、競合的に阻害する。
【００８８】
以下により詳細に論じるように、本発明は、活性化リンパ球に結合しリンパ球に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼす抗体を含むタンパク質を使用して、免疫学的疾患を治療する方法を提供する。タンパク質は、免疫学的疾患の予防または治療において、単独でまたは他の組成物と組み合わせて投与することができる。タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端で異種起源のタンパク質に組み換えにより融合してもよいし、細胞傷害性薬剤、タンパク質または他の組成物に化学的に（共有結合的および非共有結合的コンジュゲーションを含む）コンジュゲートする。例えば、本発明の抗体は、化学療法または毒素として有用な分子に組み換えにより融合してもよいし、またはコンジュゲートしてもよいし、放射線療法として使用するための放射性核種を含む。例えば国際公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許ＥＰ３９６，３８７号を参照のこと。
【００８９】
本発明の方法において有用なタンパク質は、異種のタンパク質をコードする配列と共に本発明の抗体のＣＤＲの１つまたは複数のコード領域を同一枠内で組み換えにより融合させることにより生産できる。異種のタンパク質は、次の１つまたは複数の特徴、すなわち治療上の利点の追加；安定した発現の促進；高収率での組み換え体発現を促進する手段の提供；または、多量体化ドメインの提供を提供し得る。
【００９０】
ＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／またはリンパ球に対し細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼす抗体の１つまたは複数のＣＤＲを含むタンパク質に加えて、本発明の治療方法において有用なタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用についてスクリーニングするのに適する任意の方法を用いて同定することができる。まず、ＣＤ３０に結合するタンパク質が同定され、次いで、活性化リンパ球に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼすそれらの能力を決定することができる。使用することができる慣用法の中には、上記λｇｔ１１ライブラリーの抗体プロービング技術と同様のやり方で標識されたＣＤ３０を用いて発現ライブラリーのプロービングを行う「相互作用クローニング」技術がある。例としては、これは以下のように達成することができる（ただし、これに限定されない）。すなわち、ＣＤ３０（またはそのＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１結合ドメイン）をコードするｃＤＮＡクローンを、心筋キナーゼ（ＨＭＫ）（Ｂｌａｎａｒ  ＆  Ｒｕｔｔｅｒ、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１０１４〜１０１８頁）用のリン酸化部位の挿入により末端で改変することである。組み換えタンパク質を大腸菌中で発現させ、ＧＤＰ親和性カラムで均質になるまで精製し（Ｅｄｅｒｙら、１９８８、Ｇｅｎｅ  ７４：５１７〜５２５頁）、γ３２Ｐ−ＡＴＰおよびウシ心筋キナーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を比活性１×１０８ｃｐｍ／μｇまで用いて標識し、「ファー−ウエスタンアッセイ」（ＢｌａｎａｒとＲｕｔｔｅｒ、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１０１４〜１０１８頁）においてヒト胎盤λｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いる。ＣＤ３０プローブと相互作用するプラークを単離する。陽性λプラークのｃＤＮＡインサートを放出させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））などの配列決定に適するベクター中にサブクローニングする。
【００９１】
タンパク質相互作用をｉｎ  ｖｉｖｏで検出する１つの方法、２−ハイブリッドシステムについて、詳細に説明するが、これは単に例示のためにすぎず、本発明を限定するものではない。このシステムの１つのバージョンは文献に記載されており（Ｃｈｉｅｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８〜９５８２頁）、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（（カリフォルニア州パロアルト所在）（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から市販されている。
【００９２】
ＣＤ３０−結合タンパク質が同定した後、活性化リンパ球に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を誘発するその能力（単独で、または二量化または多量化ドメインに多量化されるか融合されたとき）を、下記５．７節に記載された方法によって決定する。
【００９３】
作用メカニズムに関して限定するものではないが、ＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質は、好ましくは２以上のＣＤ３０−結合部位を有し、したがって活性化リンパ球表面上のＣＤ３０分子と架橋する能力を有する。ＣＤ３０と結合するか、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１とＣＤ３０との結合に対して競合するタンパク質は、二量体化または多量体化すれば、活性化リンパ球に対する細胞静止作用または細胞傷害作用を誘導する能力を獲得し得る。ＣＤ３０−結合タンパク質がモノマーのタンパク質である場合、それは連なって（ｉｎ  ｔａｎｄｅｍ）発現することができ、それにより、多重のＣＤ３０結合部位を有するタンパク質が得られる。ＣＤ３０結合部位は柔軟なリンカー領域により分離することができる。別の実施形態では、ＣＤ３０結合タンパク質は、投与する前に、例えば、グルタルアルデヒドを使用して化学的に架橋することもできる。好ましい実施形態では、ＣＤ３０結合領域を異種起源のタンパク質（ここで、異種起源のタンパク質は二量体化ドメインと多量体化ドメインを含む）と融合される。免疫学的疾患を治療または予防するために被験体に本発明のタンパク質を投与する前に、そのようなタンパク質をホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する条件に曝露する。本明細書で使用する場合、ヘテロ二量体は、同一の二量化領域だが異なるＣＤ３０結合領域、同一のＣＤ３０結合領域だが異なる二量体化領域、または異なるＣＤ３０結合領域と異なる二量体化領域、を含み得る。
【００９４】
特に好ましい二量体化領域は転写因子に由来するものである。
【００９５】
１つの実施形態では、二量体化領域は塩基性領域ロイシンジッパー（「ｂＺＩＰ」）のそれである。ｂＺＩＰタンパク質は特徴的には２つのドメインを有する。ロイシンジッパーの構造ドメインおよび塩基性アミノ酸に富んだ塩基性ドメインであり、これらは「フォーク」ドメインによって隔てられている（Ｃ．Ｖｉｎｓｏｎら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：９１１〜９１６頁）。２つのｂＺＩＰタンパク質は、コイルド・コイル領域（そこではロイシンジッパードメインが二量体化している）の形成により二量体化する。したがって、これらのコイルド・コイル領域は、本明細書に記載する治療方法において有用なタンパク質に対する融合パートナーとして使用してもよい。
【００９６】
特に有用なロイシンジッパードメインは、酵母転写因子ＧＣＮ４、哺乳類の転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質Ｃ／ＥＢＰ、および、癌遺伝子における核形質転換、ＦｏｓおよびＪｕｎ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９〜１７６４頁；ＢａｘｅｖａｎｉｓとＶｉｎｓｏｎ、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖｅｌ．、３：２７８〜２８５頁；およびＯ’Ｓｈｅａら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：５３８〜５４２頁参照）のものである。
【００９７】
別の実施形態では、二量体化ドメインは、塩基性−領域ヘリックス−ループ−ヘリックス（「ｂＨＬＨ」）タンパク質（Ｍｕｒｒｅら、１９８９、Ｃｅｌｌ、５６：７７７〜７８３頁）である。ｂＨＬＨタンパク質も個別のドメインからなり、それらはこの構造を採ることにより、特定のＤＮＡの配列を認識し相互作用することが可能になる。ヘリックス−ループ−ヘリックス領域はｂＺＩＰタンパク質のロイシンジッパー領域の場合と同様にして、その両親媒性の螺旋を通して二量化を促進する（Ｄａｖｉｓら、１９９０  Ｃｅｌｌ、６０：７３３〜７４６頁；ＶｏｒｏｎｏｖａとＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：４７２２〜４７２６頁）。特に有用なｈＨＬＨタンパク質はｍｙｃ、ｍａｘおよびｍａｃである。
【００９８】
ヘテロ二量体は、ＦｏｓとＪｕｎの間で（Ｂｏｈｍａｎｎら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１３８６〜１３９２頁）、ＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリーのメンバー間で（Ｈａｌら、１９８９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、３：２０８３〜２０９０頁）、Ｃ／ＥＢＰファミリーのメンバー間で（Ｃａｏら、１９９１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、５：１５３８〜１５５２頁；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、５：１５５３〜１５６７頁；およびＲｏｍａｎら、ｌ９９０、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、４：１４０４〜１４１５頁）およびＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリーとＦｏｓ／Ｊｕｎファミリーのメンバー間で（ＨａｉとＣｕｒｒａｎ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：３７２０〜３７２４頁）で形成されることが知られている。したがって、本発明のタンパク質を異なる二量体化ドメインを含むヘテロ二量体として被験体に投与する場合、上記の任意の組合せが使用できる。
【００９９】
好ましい態様では、本発明のタンパク質は、本発明の抗体−薬剤コンジュゲートを含み（ただし、これに限定されない）、実質的に純粋である（例えば、その効果を制限するか、望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。ある特定の実施形態では、本発明のタンパク質は純度４０％、より好ましくは、純度約５０％、最も好ましくは純度約６０％である。ある特定の実施形態では、本発明のタンパク質はおよそ６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％または９５〜９８％の純度である。別の特定の実施形態では、本発明のタンパク質はおよそ９９％の純度である。
【０１００】
５．１．１  ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１遺伝子の単離
本発明はＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１核酸の、例えば、免疫学的疾患の遺伝子治療のための、または抗体分子の組み換え発現（これは免疫学的疾患の治療のための使用となり得る）のための使用に関する。したがって、本発明は、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１遺伝子配列の少なくとも８個のヌクレオチド（すなわち、ハイブリダイズさせることができる部分）からなる、精製された核酸を提供する。他の実施形態では、核酸は、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１配列の少なくとも２５個の（連続する）ヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、１００個または２００個のヌクレオチドまたはＡＣ１０もしくはＨｅＦｉ−１可変領域をコードする配列の全長からなる。同一または他の実施形態では、核酸は５０個、７５個、１００個、または２００個、または５０００個未満の長さのヌクレオチドである。核酸は１本鎖でもよいし２本鎖でもよい。本発明はまた、前述の配列またはそれらの逆相補鎖にハイブリダイズさせることができるか相補的な核酸、特に、ＣＤ３０に結合するか、ＣＤ３０への結合についてＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１と競合し、かつ／または、ＣＤ３０へのＣＤ３０リガンドの結合を少なくとも４５％、５０％、６０％または６５％増加させるタンパク質をコードするそうした核酸に関する。具体的態様では、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１可変領域遺伝子の少なくとも１０、２５、５０、１００または２００個ヌクレオチドまたはコード領域全体に相補的な配列を含む核酸が提供される。
【０１０１】
ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１タンパク質の誘導体および類似体をコードする核酸も、さらに提供される。
【０１０２】
５．１．２  クローニング操作
ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１核酸のクローニングのための特定の実施形態は以下の通りである。特定の実施形態では、全ＲＮＡを、ｍＡｂ  ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１産生ハイブリドーマから単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を用い、本明細書に示す配列に基づいたプライマーを使用して、所望の可変領域配列を増幅する。別の例としては、ｍＲＮＡをｍＡｂ  ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１産生ハイブリドーマから単離し、ｃＤＮＡを調製し、それを導入した宿主細胞によって発現され得るように、発現ベクター（例えば、バクテリオファージ誘導体）にライゲートする。次いで、発現産物について選択するために様々なスクリーニング・アッセイを使用することができる。１つの実施形態では、選択は、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１遺伝子の一部、またはそのＲＮＡまたはそれらの断片を表わす標識されたプローブへのハイブリダイゼーションに基づく（ＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓ、１９７７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎとＨｏｇｎｅｓｓ、１９７５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３９６１）。プローブと実質的な相同性をもつそのようなＤＮＡ断片はハイブリダイズするであろう。制限酵素消化および（公知の制限地図が利用できる場合は）断片サイズをそうした制限地図によって予想したものと比較することによって、適当な断片を同定することも可能である。遺伝子の特性に基づいてさらに選択を行うこともできる。
【０１０３】
あるいは、所望の遺伝子の存在は、その発現産物の物理的特性、化学的特性、または免疫学的特性に基づくアッセイによって検出し得る。例えば、ｃＤＮＡクローン、すなわち適当なｍＲＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンは、例えば、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１タンパク質について知られているのと同様もしくは同一の電気泳動移動度、等電点電気泳動での挙動、タンパク質分解消化地図、および機能的な活性を有するタンパク質を生産するように選択し発現させることができる。例えば、ＣＤ３０結合能力はＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定吸着法）タイプの操作において検出することができる。
【０１０４】
核酸のハイブリダイゼーション後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳を用いてｍＲＮＡ選択により、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１遺伝子を同定することもできる。この操作では、断片を用いてハイブリダイゼーションによって相補的ｍＲＮＡを単離する。単離したｍＲＮＡの分離産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳産物の機能的な分析（例えば、ＣＤ３０への結合など）により、ｍＲＮＡ、したがって所望の配列を含む相補的なＤＮＡ断片が同定される。
【０１０５】
別の実施形態では、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１核酸、最も好ましくは重鎖もしくは軽鎖の可変領域または重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲをコードするＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１核酸を本明細書に開示する配列から化学的に合成することができる。例えば、当技術分野で知られている標準的方法、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザー（それらはバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などから市販されている）を使用することによってＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１配列を合成することができる。あるいは、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１核酸は、例えば、ブルー・ヘロン・バイオテクノロジー（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ワシントン州ボッセル所在（Ｂｏｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ））またはキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社（カリフォルニア州バレンシア所在（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））による商業的に利用可能なサービスによって合成することもできる。当業者に知られている、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１遺伝子を単離する他の方法を使用することもできる。
【０１０６】
単離されたＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１核酸（例えば、ＡＣ１０もしくはＨｅＦｉ−１または１種または複数のそれらのＣＤＲもしくは可変領域をコードする核酸）は、次いで、適当なクローニングベクター中に挿入することができる。当技術分野で知られている多数のベクター−宿主システムを使用することができる。可能なベクターは、プラスミドや改変ウイルスを含むが、これらに限定されない。ただし、ベクター・システムは使用されている宿主細胞と適合性を有しなければならない。そのようなベクターは、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、ＰＢＲ３２２またはｐＵＣのプラスミド誘導体またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））などのプラスミドを含む（ただし、これらに限定されない）。クローニングベクター中への挿入は、例えば、相補的な付着末端を有するクローニングベクター中へＤＮＡ断片を結合することにより実施できる。しかし、ＤＮＡを断片とするために用いられる相補的な制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素で修飾してもよい。あるいは、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を結合することにより、所望の任意の部位を作製することもできる。これらの結合されるリンカーには、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする、特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含めてもよい。別の方法では、切断されたベクターおよびＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１遺伝子を、ホモポリマー尾付加または適当な配列を含むプライマーによるＰＣＲによって改変してもよい。組み換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞へ導入できる。その結果、遺伝子配列の多くのコピーを生成する。ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１に由来する１個または複数のＣＤＲならびに異なる免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を含む抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；米国特許第５，５３０，１０１号；および米国特許第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１、２８（４／５）：４８９〜４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５〜８１４頁；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４、ＰＮＡＳ  ９１：９６９〜９７３頁）およびチェイン・シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む当技術分野で知られた様々な技術を用いて製造することができる。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態では、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１核酸、例えばＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１の重鎖または軽鎖の可変領域をコードする核酸を、免疫グロブリン発現ベクター中にクローン化することができる。簡単に言えば、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１核酸は、本願明細書に記載する方法のうちの任意の方法によって合成あるいは取得され、好ましくは、側部に適当な制限部位を有し、次いで、免疫グロブリン分子の発現に適するベクター中にクローン化される。例えば、同一枠内に、プロモーターに作動可能に連結される抗体可変領域をクローニングするのに適した免疫グロブリン定常領域および制限部位をコードする配列、および場合によっては所望の宿主細胞中での発現に有用なシグナル配列を含む多数のベクターが文献に記載されている。この目的のために設計されるベクターの例（ただし、限定的なものではない）は、ＭｃＬｅａｎら、２０００、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（１４）：８３７〜４５頁；Ｌｉａｎｇら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４７（１−２）：１１９〜３０頁；Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７、Ｇｅｎｅ  １８７（１）：９〜１８頁；Ｓｋｅｒｒａ、１９９４、Ｇｅｎｅ  １４１（１）：７９〜８４頁；Ｗａｌｌｓら、１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１（１２）：２９２１〜２９頁；Ｃｏｌｏｍａら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５２（１）：８９〜１０４頁に記載されている。これらのベクターまたは同様に設計されるベクターは、発現目的用のＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１配列のクローン化に使用することができる。
【０１０８】
別の方法では、所望の遺伝子を、「ショットガン」法において適当なクローニングベクター中に挿入した後に同定し単離してもよい。例えば、クローニングベクターへ挿入前にサイズ分画によって所望の遺伝子の富化を行うことができる。
【０１０９】
特定の実施形態では、単離されたＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１遺伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を有する宿主細胞の形質転換体が、遺伝子の複数のコピーの生成を可能にする。したがって、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組み換えＤＮＡ分子を分離し、また必要な場合には、単離された組み換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより遺伝子が多量に得られ得る。
【０１１０】
本発明によって提供されるＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１配列は、天然のＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１可変領域に見出されるのと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、機能的に等価なアミノ酸をもつアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ならびに、以下に、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１誘導体または類似体について記載するような他のＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１誘導体または類似体をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
５．２  結合アッセイ
上に記載するように、本発明の方法による免疫学的疾患の治療に有用な抗体を含むタンパク質は、ＣＤ３０に結合し、活性化リンパ球に対し細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼす。タンパク質のＣＤ３０への結合能力を実証する方法は本願明細書に記載する。
【０１１２】
抗体は、当技術分野で知られている任意の方法によってＣＤ３０への免疫特異的な結合についてアッセイを行うことができる。使用することができる免疫アッセイをいくつか挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法などを含む競合的および非競合的アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのアッセイは、当技術分野では日常的に行われるものでよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙとＳｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照のこと。これは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）。典型的な免疫測定法を以下に簡単に説明するが、これらは発明を限定しようとするものではない。
【０１１３】
免疫沈殿プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、バナジン酸ナトリウム）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはトライトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％トラシロール（Ｔｒａｓｙｌｏｌ））などの溶解緩衝液で細胞集団を溶解させ、細胞溶解物に抗体を加えて、一定時間（例えば、約１〜４時間）４℃でインキュベートし、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に加え、約１時間以上４℃でインキュベートし、ビーズを溶解緩衝液で洗浄し、ビーズをＳＤＳ／試料緩衝液中に再懸濁することを含む。抗体がＣＤ３０を免疫沈殿させる能力は、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、ＣＤ３０への抗体の結合を増加させ、バックグラウンド（例えば、セファロースビーズを用いる細胞溶解物の予備清浄化）を低減させるために変更できるパラメーターに関してよく知っているであろう。免疫沈殿プロトコルに関するさらなる議論については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の１０．１６．１を参照のこと。
【０１１４】
ウェスタンブロット分析は、タンパク質試料を調製し、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動し、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどの薄膜に移し、薄膜をブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは無脂肪乳を含むＰＢＳ）中でインキュベートし、薄膜を洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳトゥイーン−２０）で洗浄し、薄膜をブロッキング緩衝液で希釈した第１の抗体（つまり、推定される抗ＣＤ３０抗体）でブロットし、薄膜を洗浄緩衝液で洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）とコンジュゲートした第２の抗体（これは第１の抗体を認識する。例えば、抗ヒト抗体）と共に薄膜をインキュベートし、薄膜を洗浄緩衝液で洗浄し、第２の抗体の存在を検出することを一般に含む。当業者であれば、検出されるシグナルを増大させ、かつバックグラウンド・ノイズを低減させるために変更できるパラメーターに関してよく知っているであろう。ウェスタンブロットに関するさらなる議論については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の１０．８．１を参照のこと。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡは、抗原（すなわち、ＣＤ３０）を調製し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルをＣＤ３０でコーティングし、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートした抗体をウェルに加えて一定期間インキュベートし、抗体の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、検出可能な化合物に抗体をコンジュゲートさせなくてもよく、代わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートした第２の抗体（それは目的の抗体を認識する）をウェルに加えてもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、検出可能な化合物にコンジュゲートした第２の抗体を、コーティングを施したウェルへのＣＤ３０タンパク質の添加に続いて加えてもよい。当業者は、検出されるシグナルを増大させるために変更できるパラメーターや当技術分野中で知られているＥＬＩＳＡの他の変法に関してよく知っているであろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる議論については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の１１．２．１を参照のこと。
【０１１６】
ＣＤ３０への抗体の結合親和性および抗体ＣＤ３０相互作用のオフ率(off-rate)は、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの１つの例は、標識されていないＣＤ３０の量を増加させて存在させつつ、標識されたＣＤ３０（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）を目的の抗体と共にインキュベートし、標識されたＣＤ３０に結合した抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイである。次いで、ＣＤ３０に対する抗体の親和性および結合オフ率を、スキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）プロット分析によるデータから求めることができる。第２の抗体（ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１など）との競合もラジオイムノアッセイを使用して決定することができる。この場合、標識されていない第２の抗体の量を増加させて存在させつつ、ＣＤ３０を、標識された化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ））にコンジュゲートした目的の抗体と共にインキュベートする。あるいはまた、その抗体のＣＤ３０に対する結合親和性ならびに抗体−ＣＤ３０相互作用のオン率(on-rate)およびオフ率は、表面プラズモン共鳴により測定できる。
【０１１７】
本発明の方法において有用なタンパク質は、当技術分野で知られた標準的アッセイによってＣＤ３０へのその結合能力についてアッセイしてもよい。そのようなアッセイには、ファーウェスタンおよび酵母の２ハイブリッドシステムが含まれる。これらのアッセイは、上記５．２節に記載されている。上に記載したファーウェスタン法の別の変法は、ウェスタンブロットにおいて標識された候補タンパク質のＣＤ３０への結合能力の測定を伴う。ファーウェスタンブロットの１つの例（ただし、これに限定されない）では、ＣＤ３０または目的のその断片を、さらにグルタチオン−Ｓ転移酵素（ＧＳＴ）およびプロテインセリン／トレオニンキナーゼ認識部位（ｃＡＭＰ依存性キナーゼ認識部位など）を含む融合タンパク質として発現させる。融合タンパク質はグルタチオン−セファロースビ−ズ（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））で精製し、ウシ心臓キナーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）））および１００μＣｉの３２Ｐ−ＡＴＰ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で標識する。試験対象のタンパク質（複数可）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース薄膜にブロットし、次いで、標識されたＣＤ３０と共にインキュベートする。しかる後、薄膜を洗浄し、放射能量を定量する。反対に、同じ方法で目的タンパク質を標識し、ＣＤ３０をブロットしたニトロセルロース薄膜をプローブするのにこのタンパク質を使用することもできる。
【０１１８】
５．３  ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１に関連する配列
本発明はさらに、ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１のＣＤＲに相同な領域、またはそのコード領域をそれぞれ含むタンパク質および核酸の、免疫学的疾患の治療または予防のための使用を包含する。様々な実施形態において、相同性領域は、対応するＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１の領域と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性によって特徴づけられる。
【０１１９】
１つの実施形態では、本発明は、免疫学的疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、ＨｅＦｉ−１のＣＤＲに相同な領域（配列番号２０、配列番号２２；配列番号２４；配列番号２８、配列番号３０または配列番号３２）を有し、但しリンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、免疫学的疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、ＡＣ１０のＣＤＲに相同な領域（配列番号４；配列番号６；配列番号８；配列番号１２；配列番号１４；または配列番号１６）を有し、但しリンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼすタンパク質を投与することを含む方法を提供する。
【０１２０】
別の実施形態では、本発明は、免疫学的疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、ＨｅＦｉ−１のＣＤＲコード領域に相同な領域（配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９または配列番号３１）を有する核酸(但し、この核酸によりコードされるタンパク質がリンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼす。)を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、免疫学的疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、ＡＣ１０のＣＤＲコード領域に相同な領域（配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５）を有する核酸(但し、この核酸によりコードされるタンパク質がリンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼす。)を投与することを含む方法を提供する。
【０１２１】
本発明はさらに、ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１の可変領域に相同な領域、またはそのコード領域をそれぞれ含むタンパク質または核酸を、それを必要とする患者に投与することを含む免疫学的疾患の治療または予防方法を包含する。様々な実施形態において、相同性領域は、対応するＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１の領域と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の同一性によって特徴づけられる。
【０１２２】
１つの実施形態では、本発明は、免疫学的疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、ＨｅＦｉ−１の可変領域に相同な領域（配列番号１８または配列番号２６）を有するタンパク質を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、免疫学的疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、ＡＣ１０の可変領域に相同な領域（配列番号２または配列番号１０）を有するタンパク質を投与することを含む方法を提供する。
【０１２３】
１つの実施形態では、本発明は、免疫学的疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、ＨｅＦｉ−１の可変領域コード領域に相同な領域（配列番号１７または配列番号２５）を有する核酸を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、免疫学的疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、ＡＣ１０の可変領域コード領域に相同な領域（配列番号１または配列番号９）を有する核酸を投与することを含む方法を提供する。
【０１２４】
例えば、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１可変領域の配列と、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１可変領域と相同な領域をもつ他のタンパク質由来の配列との間で、２つのアミノ酸配列または２つの核酸の％同一性を決定するために、配列を最適比較のためにアライメントをとる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適アライメントのためにギャップを第１のアミノ酸または核酸配列の配列中に導入することができる）。次いで、アミノ酸残基またはヌクレオチドを対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置で比較する。第１の配列中での位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で同一であるとする。２つの配列間の％同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の合計数（例えば、オーバーラップする位置）×１００）。１つの実施形態では、２つの配列は同じ長さである。
【０１２５】
２つの配列間の％同一性の決定は数学的なアルゴリズムを使用して行うことができる。２つの配列の比較のために利用される数学的なアルゴリズムの好ましい例（ただし、これに限定されない）は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８頁のアルゴリズム、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７頁において修正されたものである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴとＸＢＬＡＳＴプログラムに組み入れられている。ＳＣＡ−１改変タンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得るためには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施できる。ＳＣＡ−１改変タンパク質に相同なアミノ酸配列を得るためには、ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、ワード長＝３で実施できる。比較目的のためギャップ付きアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁に記載されるようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠位関係を検出する繰り返し検索を実施することもできる（前掲）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい例（ただし、これに限定されない）は、マイヤーズとミラー（Ｍｙｅｒｓ  ＆  Ｍｉｌｌｅｒ）（ＣＡＢＩＯＳ（１９８９））のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメント用ソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。アミノ酸配列の比較をするためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティとして１２およびギャップペナルティとして４を使用できる。配列分析のための追加的アルゴリズムは当技術分野で知られており、ＴｏｒｅｌｌｉｓとＲｏｂｏｔｔｉ、１９９４、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１０：３〜５頁に記載されているＡＤＶＡＮＣＥとＡＤＡＭ、およびＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４〜８頁に記載されているＦＡＳＴＡが含まれる。ＦＡＳＴＡの内では、ｋｔｕｐは、検索の感度および速度を設定するコントロールオプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較されている２つの配列の同様の領域は、アライメントをとった残基の対を見ることにより見つかる。また、ｋｔｕｐ＝１の場合は、単一のアライメントをとったアミノ酸を調べる。ｋｔｕｐはタンパク質配列に対しては２または１に、ＤＮＡ配列に対しては１〜６までセットできる。ｋｔｕｐが指定されない場合のデフォルトは、タンパク質に対しては２、ＤＮＡに対しては６である。ＦＡＳＴＡパラメーターのさらなる記載については、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｄｏｃｓ／ｍａｎ／ｍａｎ／ｆａｓｔａ．１．ｈｔｍｌ＃ｓｅｃｔ２を参照のこと（その内容は参照によって本願明細書に組み込まれる）。
【０１２６】
あるいは、タンパク質配列アライメントは、Ｈｉｇｇｉｎｓら．、１９９６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３〜４０２頁に記載されるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用して行ってもよい。
【０１２７】
２つの配列間の％同一性は、ギャップを許容するかまたは許容しないで、上に記載したのと同様な技術を使用して決定することができる。％同一性の計算では、正確な一致だけをカウントする。
【０１２８】
５．４  本発明のタンパク質生産方法
本発明の方法において有用な抗体を含むタンパク質は、タンパク質合成の技術分野で知られている任意の方法によって、特に化学合成法、または好ましくは組み換え発現技術によって生産することができる。
【０１２９】
ＣＤ３０に結合し、リンパ球中のＣＤ３０シグナル伝達を誘導し、かつ／または活性化リンパ球に対し細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼすタンパク質の組み換え発現には、そうしたタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターの構築が必要である。そのようなタンパク質をコードする核酸を得た後、タンパク質分子の産生のためのベクターは、当技術分野においてよく知られている組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る。したがって、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現させることによりタンパク質を製造する方法が本願明細書に記載される。当業者によく知られている方法を用いて、コード配列ならびに適当な転写および翻訳の制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子組換えが含まれる。
【０１３０】
したがって、本発明は、作動可能にプロモーターに連結された本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。ここで、タンパク質は抗体であり、そのヌクレオチド配列は、その重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、を作動可能にプロモーターに連結しコードすることができる。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み（例えば、国際公開ＷＯ８６／０５８０７；国際公開ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号参照）、重鎖または軽鎖全体の発現のため、抗体の可変領域をそのようなベクター中にクローン化してもよい。
【０１３１】
発現ベクターは慣用の技術によって宿主細胞に移入され、次いで、形質導入細胞は慣用の技術によって培養されて、本発明のタンパク質を生産する。したがって、本発明は、異種のプロモーターに作動可能に連結された、本発明のタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を包含する。２本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態では、下に詳述するように、重・軽鎖の両方をコードするベクターを免疫グロブリン分子全体の発現のための宿主細胞中で同時発現させてもよい。
【０１３２】
本発明のタンパク質分子を発現するためには様々な宿主-発現ベクター系が利用できる。そのような宿主-発現系は、目的のコード配列を生産し、続いて精製し得るようなベヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）を表わすが、また、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた時、ｉｎ  ｓｉｔｕで本発明のタンパク質を発現することができる細胞を表わす。これらは、抗体をコードする配列を含む、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；抗体をコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセス、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））などの微生物；抗体をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染された昆虫細胞系；抗体をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染されたか、または組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳類細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルスの後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組み換え発現構築物を有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）を含む（ただし、これらに限定されない）。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞、また特に全組み換え抗体分子の発現のためにより好ましくは、真核細胞を本発明の組み換えタンパク質の発現のために使用する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳類細胞を、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間期初期遺伝子プロモーター要素のようなベクターと共に用いるのがタンパク質についての有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。
【０１３３】
細菌の系では、目的とする用途に応じて、タンパク質が発現するために必要なフォールディングおよび翻訳後修飾の必要条件に応じて多数の発現ベクターを有利に選択できる。可能であれば、そのようなタンパク質を本発明のタンパク質を含む医薬組成物の製造のために大量に生産しようとする場合は、容易に精製し得る融合タンパク質産物を高レベルで発現させるベクターが望ましいであろう。そのようなベクターには、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｓｈｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ  １．２：１７９１）（この場合、融合タンパク質が生産されるように、同一枠内にｌａｃ  Ｚコード領域をもつベクター中に抗体コード配列を個別に結合してもよい）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ、１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１〜３１０９頁；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３〜５５０９頁）などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質を発現するのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から吸着およびマトリックスグルタチオンアガロースビーズへの結合後、遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、ＧＳＴ部分からクローン化標的遺伝子産物が放出され得るようにトロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１３４】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するベクターとして使用する。ウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。抗体をコードする配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個別にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリン・プロモーター）の制御下に置くことができる。
【０１３５】
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス系発現系が利用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、本発明のタンパク質のコード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび三分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列）に結合することができる。次いで、このキメラ遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの組み換えによってアデノウイルスゲノムに挿入すればよい。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）中への挿入により、生存可能で、感染した宿主中で本発明のタンパク質の発現を可能にする組み換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８  １：３５５〜３５９頁参照）。挿入されたコード配列の有効な翻訳のためには特異的な開始シグナルも必要になる場合がある。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接した配列を含む。さらに、インサート全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列のリーディングフレームと読み枠が合っていなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然物および合成物を含む様々な起源のものでよい。発現効率は、適当な転写エンハンサー・エレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強できる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１〜５４４頁参照）。
【０１３６】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調整するか、または、望ましい具体的態様で遺伝子産物を修飾し処理するものを選択することができる。そのような修飾（例えば、グリコシル化）およびタンパク質産物のプロセシング（例えば、切断）は、本発明のタンパク質の機能にとって重要な場合もある。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾といった特性および特定のメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために適当な細胞系統または宿主系を選ぶことができる。この目的のために、遺伝子産物の１次転写体の適切なプロセシング、グリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用できる。そのような哺乳類の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷ１３８が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３７】
ＣＤ３０に結合し、また活性化リンパ球に対する細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼす組み換えタンパク質の長期的な高収率生産のためには、安定した発現が好ましい。例えば、安定してタンパク質を発現する細胞系統を遺伝子操作で作製し得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化サイトなど）によって調節されるＤＮＡおよび選択可能なマーカーで形質転換できる。組み換え操作された細胞は、外来ＤＮＡの導入に続いて、富栄養培地中で１〜２日間増殖させ、次いで、選択培地に切り替える。組み換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体にプラスミドを安定的に組み込み、増殖巣を形成する。次いで、これをクローニングし、細胞系統に増殖することができる。この方法は、本発明のタンパク質を発現する細胞系統を作製するのに有利に用いることができる。
【０１３８】
以下のものを含む（ただし、これに限定されない）多くの選択系が使用できるが、単純疱疹ウイルス・チミジン・キナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ハイポキサンチングアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２）およびアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：８〜１７頁）遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞中でそれぞれ使用できる。また、以下の遺伝子の選択の基準として代謝拮抗剤耐性を使用することができる。遺伝子は、次のものである。ｄｈｆｒ、これはメトトレキサート耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与する（Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８〜５０５頁；ＷｕとＷｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７〜９５頁；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３〜５９６頁；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６〜９３２頁；およびＭｏｒｇａｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１〜２１７頁；Ｍａｙ、１９９３、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ１１（５）：１５５〜２１５頁）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシン耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）。組み換えＤＮＡ技術の技術分野において一般に知られている方法を、所望の組み換えクローンを選択するために慣用されているように適用してもよい。そのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；およびＣｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されており、これらの全体は参照によって本願明細書に組み込まれる。
【０１３９】
本発明のタンパク質の発現レベルはベクター増幅（総説として、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎとＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）参照）により増大させることができる。抗体を発現するベクター系中でマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤レベルの増大は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加させるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子を結合いているので、本発明のタンパク質の生産はさらに増加するであろう（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
【０１４０】
本発明のタンパク質が抗体である場合、宿主細胞は本発明の２つの発現ベクター、すなわち、重鎖由来のタンパク質をコードする第１のベクター、および軽鎖由来のタンパク質をコードする第２のベクターで同時にトランスフェクトしてもよい。２つのベクターは同一の選択可能なマーカーを含むことができ、これにより、重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質の等しい発現が可能になる。あるいは、重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質の両方をコードし、発現することができる単一のベクターを使用してもよい。こうした場合、有害な遊離重鎖が過剰にならないように、軽鎖は、重鎖の前に配置すべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２、Ｋｏｈｌｅｒ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７）。重・軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡを含んでもよい。
【０１４１】
本発明のタンパク質分子は、動物によって産生されるか、化学的に合成され、または組み換えにより発現される場合は、それは、タンパク質の精製用の当技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に特定の抗原への親和性、プロテインＡ（抗体分子に対し、またはタンパク質が融合タンパク質である異種の融合パートナーへの親和性および分子ふるいカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための他の標準的技術によって精製することができる。
【０１４２】
本発明は、融合タンパク質（すなわち、（好ましくは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または少なくとも１００個のアミノ酸の）異種タンパク質に組み換えにより融合させたか化学的にコンジュゲート（共有結合によるコンジュゲーションも共有結合でない結合によるコンジュゲーションも含む）したタンパク質）である本発明のタンパク質の使用を包含する。その融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して起こるものでもよい。
【０１４３】
本発明は、可変領域以外の抗体ドメインを融合またはコンジュゲートさせた本発明のタンパク質を含む組成物をさらに含む。例えば、本発明のタンパク質は、抗体Ｆｃ領域またはその部分に融合またはコンジュゲートすることができる。本発明のタンパク質に融合する抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＲ２ドメインおよびＣＨ３ドメインまたはこれらの全ドメインもしくはその部分の任意の組合せとすることができる。前記抗体部分にタンパク質をさらに融合またはコンジュゲートして多量体としてもよい。例えば、本発明のタンパク質に融合したＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。より多量化した形態は、ＩｇＡとＩｇＭの部分にタンパク質を融合させることにより作ることができる。本発明のタンパク質を抗体部分に融合させるかコンジュゲートさせる方法は、当技術分野で知られている。例えば米国特許第５，３３６，６０３号；米国特許第５，６２２，９２９号；米国特許第５，３５９，０４６号；米国特許第５，３４９，０５３号；米国特許第５，４４７，８５１号；米国特許第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；国際公開ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５〜１０５３９頁；Ｚｈｅｎｇら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０〜５６００頁；およびＶｉｌら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７〜１１３４１頁参照（参照によって本明細書にこれらの全体が組み込まれる）。
【０１４４】
５．５  コンジュゲートおよび融合タンパク質
上記で述べたように、本発明の免疫学的疾患の治療および予防方法は、ＣＤ３０に結合し活性化リンパ球に対し細胞静止作用および／または細胞傷害作用を及ぼし、さらに異種起源のタンパク質または細胞傷害性薬剤に融合またはコンジュゲートしたタンパク質の使用を包含する。
【０１４５】
したがって、本発明は、本発明のタンパク質または核酸の投与による免疫学的疾患の治療または予防方法を提供する。発明のある実施形態では、本発明のタンパク質または核酸は、その細胞傷害性および／または細胞静止性を改善するために化学的に改変されていてもよい。例えば、本発明のタンパク質はコンジュゲートとして投与することができる。本発明のタンパク質への結合のために特に適するものは、化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体もしくは化合物または毒素である。
【０１４６】
１つの実施形態では、精製を容易にするために、本発明のタンパク質をペプチドなどのマーカー配列に融合させる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）中で提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１〜８２４頁に記載されているように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の精製に都合がよい。精製に有用な他のペプチドタグは、「ＨＡ」タグ（それはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する）（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）および「フラグ」タグを含むがこれに限定されない。このような融合タンパク質は当業者に知られた標準的組み換え方法によって作製することができる。
【０１４７】
別の実施形態では、本発明のタンパク質が治療剤に融合またはコンジュゲートされる。例えば、本発明のタンパク質は化学療法剤（５．６節を参照）、毒素（例えば、細胞静止剤または殺細胞剤）または放射性核種（例えば、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔなどのαエミッター、１３１Ｉ、９０Ｙまたは６７Ｃｕなどのβエミッター）などの細胞傷害性薬剤にコンジュゲートしてもよい。本発明の抗ＣＤ３０分子をコンジュゲートするのに有用な追加剤の例を５．１２．１節に示す。
【０１４８】
本発明の方法において有用な、抗ＣＤ３０抗体の治療効果の増強のために使用される本発明のコンジュゲートは、毒素などの非古典治療剤を含む。そのような毒素には、アブリン（ａｂｒｉｎ）、リシンＡ、シュードモナス菌体外毒素またはジフテリア毒素が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
あるいは、本発明の抗体は、シーガル（Ｓｅｇａｌ）によって米国特許第４，６７６，９８０号（それは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体ヘテロコンジュゲートを形成する第２の抗体にコンジュゲートすることができる。本発明を実施するのに有用なヘテロコンジュゲート類は、ＣＤ３０に結合する抗体または抗体の一部（モノクローナル抗体Ｋｉ−２、Ｋｉ−４、Ｋｉ−５、Ｋｉ−７、Ｂｅｒ−Ｈ２、ＨＲＳ−１、ＨＲＳ−４、Ｋｉ−１、Ｋｉ−６、Ｍ６７、Ｋｉ−３、Ｍ４４、ＨｅＦｉ−１およびＡＣ１０のＣＤＲおよび／または重鎖を有する抗体を含むが、これらに限定されない）および、リンパ球表面受容体または受容体複合体（免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチン（Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプ）または補体制御タンパク質など）に結合する抗体または抗体の一部である。こうした分子の例およびヘテロコンジュゲートを作るのに使用できるこのような分子に対する抗体は、下記の５．１２．２節で示す。
【０１５０】
上記で述べたように、本発明のある実施形態では、本発明のタンパク質をプロドラッグ変換酵素と同時投与することができる。プロドラッグ変換酵素は、本発明のタンパク質に融合またはコンジュゲートした融合タンパク質として発現することができる。プロドラッグ変換酵素の例はカルボキシペプチダーゼＧ２、ベータグルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼＡである。
【０１５１】
５．６  抗体−薬剤コンジュゲート
本発明は、免疫学的疾患の治療または予防のための抗ＣＤ３０抗体−薬剤コンジュゲート（抗ＣＤ３０ＡＤＣ）の使用を包含する。本発明のＡＤＣは、ＣＤ３０発現細胞がかかわる免疫疾患に罹患した患者に投与したとき（好ましくは単独投与であるが他の治療剤との組合せてもよい）、ＣＤ３０発現細胞に対する臨床的に有益な細胞傷害作用または細胞静止作用を生じるように製造される。
【０１５２】
タンパク質、特に抗体に、そのような薬剤をコンジュゲートするための技術はよく知られている。例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３〜５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３〜１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）およびＴｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８頁を参照のこと。
【０１５３】
本発明の治療方法が対象として包含する疾患状態の多くでは、相当量の可溶性ＣＤ３０が活性化リンパ球から流出しているので、薬剤（例えば、細胞傷害性薬剤または免疫抑制剤）またはプロドラッグ変換酵素にコンジュゲートする抗ＣＤ３０抗体を使用する際には、薬剤またはプロドラッグ変換酵素は、可溶性ＣＤ３０が見出される身体中の任意の場所ではなく、活性化リンパ球の近傍において活性であることが好ましい。
【０１５４】
本発明の抗ＣＤ３０抗体によって標的とされる、活性化リンパ球の外部での薬剤活性を最小限にするために、２つのアプローチを取ることができる。第１は、細胞膜に結合するが可溶性ＣＤ３０には結合しない抗体を使用し、その結果、薬剤（プロドラッグ変換酵素の作用によって生産された薬剤を含む）は、活性化リンパ球の細胞表面に集中する。本発明の抗体に結合する薬剤の活性を最小限にするためのより好ましいアプローチは、それらが抗体から加水分解されたり切断されたりしない限り、それらの活性が低減されるように薬剤をコンジュゲートさせることである。そのような方法は、活性化リンパ球の細胞表面の環境（例えば、活性化リンパ球の細胞表面に存在するプロテアーゼの活性）またはそれが活性化リンパ球に取り込まれた場合、コンジュゲートが遭遇する活性化リンパ球の内部の環境（例えば、エンドソーム内または、例えば、リソソーム環境内のｐＨ感度もしくはプロテアーゼ感度によって）に敏感なリンカーを用いて抗体に薬剤を結合する方法を用いることであろう。
【０１５５】
１つの実施形態では、リンカーは、酸に不安定でリソソーム内で加水分解されるヒドラゾンまたはヒドラジド基である（例えば米国特許第５，６２２，９２９号参照）。別の実施形態では、薬剤はシス−アコニチン酸アミド類、オルトエーテル類、アセタール類およびケタール類などの、酸に不安定な他のリンカーを介して抗ＣＤ３０抗体に結合される（ＤｕｂｏｗｃｈｉｋとＷａｌｋｅｒ、１９９９、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７〜１２３頁；Ｎｅｖｉｌｌｅら、１９８９、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３〜１４６６１頁）。そのようなリンカーは、血液中のもののような中性ｐＨ条件下で比較的安定しているが、ｐＨ５（リソソームのｐＨ近く）以下で不安定である。
【０１５６】
他の実施形態では、薬剤は細胞内のプロテアーゼによって切断されるペプチドスペーサーを使用して、本発明の抗ＣＤ３０抗体に結合させる。標的酵素には、カテプシンＢおよびＤおよびプラスミンが含まれ、それらのすべてはジペプチド薬剤誘導体を加水分解することが知られており、標的細胞の内部の活性な薬剤の放出をもたらす（ＤｕｂｏｗｃｈｉｋとＷａｌｋｅｒ、１９９９、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７〜１２３頁）。細胞内でのタンパク質分解的薬剤放出を使用する利点は、コンジュゲートした時、薬剤が大幅に弱減され、コンジュゲートの血清安定性が非常に高くなり得るという点である。
【０１５７】
さらに他の実施形態では、リンカーはマロン酸リンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７〜９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９〜１３０４頁）または３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５〜１２頁）である。
【０１５８】
本発明の抗ＣＤ３０抗体へのコンジュゲーションに使用される薬剤は、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、エトポシドなどの慣用の化学療法剤を含むことができる。さらに、ＣＣ−１０６５類似体、カリチアミシン（ｃａｌｉｃｈｉａｍｉｃｉｎ）、メイタンシン、ドラスタチン１０の類似体、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）およびパリトキシンなどの有効な薬剤を、条件によっては安定したリンカーを使用して、抗ＣＤ３０抗体に連結させて有効なイムノコンジュゲートを形成することができる。本発明の抗ＣＤ３０抗体へのコンジュゲーション用の他の適当な薬剤の例は、下記５．１２．１節に示す。
【０１５９】
５．６．１  リンカー
上記５．６節で述べたように、一般に、ＡＤＣは、リンカーを介して抗体に薬剤をコンジュゲートさせることにより作られる。したがって、本発明のＡＤＣの大多数（それは抗ＣＤ３０抗体および高効力薬剤および／またはインターナリゼーション促進薬を含む）は、さらにリンカーを含む。当技術分野で知られているどのようなリンカーも本発明のＡＤＣで用いることができる（例えば、二官能性剤（ジアルデヒド類またはイミドエステル類など）または分岐ヒドラゾンリンカー（例えば、米国特許第５，８２４，８０５号参照。これは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる））。
【０１６０】
本発明のある実施形態（ただし、これに限定されない）では、薬剤部分と抗ＣＤ３０  ＡＤＣの抗体部分との間のリンカー領域はある条件下で切断可能かまたは加水分解可能であり、リンカーの切断または加水分解によって抗体部分から薬剤部分が放出される。好ましくは、リンカーは細胞内条件下で切断または加水分解を受けやすい。
【０１６１】
好ましい実施形態では、抗ＣＤ３０  ＡＤＣの薬剤部分と抗体部分の間のリンカー領域は、ｐＨがある値だけ変化するか、またはある値を超えると加水分解し得る。本発明の特に好ましい実施形態では、リンカーはリソソーム環境、例えば、酸性条件（すなわち、約５〜５．５以下のｐＨ）の下において加水分解され得る。他の実施形態では、リンカーは、ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素（リソソームのプロテアーゼ酵素、膜結合プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼまたはエンドソームのプロテアーゼを含むが、これらに限定されない）によって切断されるペプチジルリンカーである。好ましくは、リンカーは少なくとも２アミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも３アミノ酸長である。ＣＤ３０発現癌中に存在する酵素によって切断され得るペプチジルリンカーが好ましい。例えば、カテプシン−Ｂ（例えばＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー）（癌の組織で高度に発現されるチオール依存性プロテアーゼ）によって切断され得るペプチジルリンカーを使用することができる。他のそのようなリンカーは、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号（それは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）中に記載されている。
【０１６２】
他の相互に非排他的な本発明の実施形態において、本発明のＡＤＣの抗ＣＤ３０抗体および薬剤をコンジュゲートするリンカーは、細胞インターナリゼーションを促進する。ある実施形態では、ＡＤＣのリンカー−薬剤部分が細胞インターナリゼーションを促進する。ある実施形態では、リンカーは、全ＡＤＣの構造が細胞インターナリゼーションを促進するように選択される。
【０１６３】
本発明の特定の実施形態では、バリン−シトルリンの誘導体をリンカー（ｖａｌ−ｃｉｔリンカー）として使用する。ｖａｌ−ｃｉｔリンカーを有するドキソルビシンの合成は、以前に記載されている（ＤｕｂｏｗｃｈｉｋとＦｉｒｅｓｔｏｎｅの米国特許第６，２１４，３４５号（それは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる））。
【０１６４】
別の特定の実施形態では、リンカーはｐｈｅ−ｌｙｓリンカーである。
【０１６５】
別の特定の実施形態では、リンカーはチオエーテル・リンカーである（例えば、Ｗｉｌｌｎｅｒらに対する米国特許第５，６２２，９２９号参照（それは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）。
【０１６６】
さらに別の特定の実施形態では、リンカーはヒドラゾンリンカー（例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄらに対する米国特許第５，１２２，３６８号、およびＫｉｎｇらに対する米国特許第５，８２４，８０５号参照（それらは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）。
【０１６７】
さらに他の特定の実施形態では、リンカーはジスルフィドリンカーである。多様なジスルフィドリンカーが当技術分野で知られており、その中には、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレートおよびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジルジチオ）トルエン）を使用して形成することができるものが含まれる（ただし、これらに限定されない）。ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴ（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４７：５９２４〜５９３１頁；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら、１９８７、Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｐｒｅｓｓ、２８〜５５頁を参照のこと。また、Ｔｈｏｒｐｅらに対する米国特許第４，８８０，９３５号を参照のこと。それらは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる。）
本発明の組成物および方法と共に使用することができる様々なリンカーは、「Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，ａｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｒ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ」と題する米国仮出願第６０／４００，４０３号（発明者：Ｐｅｔｅｒ  Ｄ．Ｓｅｎｔｅｒ，Ｓｖｅｔｌａｎａ  ＤｏｒｏｎｉｎａおよびＢｒｉａｎ  Ｅ．Ｔｏｋｉ、出願日：２００２年７月３１日）に記載されており、これは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる。
【０１６８】
さらに別の本発明の実施形態においては、抗ＣＤ３０抗体−リンカー薬剤コンジュゲート（抗ＣＤ３０ＡＤＣ）のリンカーユニットが、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤（薬剤ユニット；−Ｄ）と抗ＣＤ３０抗体ユニット（−Ａ）を連結する。本明細書で使用する場合、抗ＣＤ３０  ＡＤＣという用語は、リンカーユニットの有無を問わず抗ＣＤ３０抗体薬剤コンジュゲートを包含する。リンカーユニットは以下の一般式を有する：
−Ｔａ−Ｗｗ−Ｙｙ−
（ここで、
−Ｔ−はストレッチャーユニットであり；
ａは０または１であり；
各−Ｗ−は独立してアミノ酸ユニットであり；
ｗは独立して２〜１２の範囲の整数であり；
−Ｙ−はスペーサーユニットであり；
ｙは０、１または２である。）
【０１６９】
５．６．１．１  ストレッチャーユニット
ストレッチャーユニット（−Ｔ−）は、存在する場合、アミノ酸ユニット（−Ｗ−）に対して抗ＣＤ３０抗体ユニットを連結する。抗ＣＤ３０抗体上に存在することができる有用な官能基は、天然または化学的操作によるものを含み、スルフヒドリル、アミノ、水酸基、炭水化物のアノマー性水酸基およびカルボキシルを含む（ただし、これらに限定されない）。好ましい官能基はスルフヒドリルおよびアミノである。抗ＣＤ３０抗体の分子内ジスルフィド結合の還元により、スルフヒドリル基を生成することができる。あるいは、スルフヒドリル基は、抗ＣＤ３０抗体のリジン部分のアミノ基と２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）または他のスルフヒドリル生成試薬との反応によって生成することができる。特定の実施形態では、抗ＣＤ３０抗体は組み換え型の抗体であり、１つまたは複数のリジンを有するように組み換え操作される。他の実施形態では、抗ＣＤ３０抗体はさらにスルフヒドリル基、例えば追加のシステインを有するように組み換え操作される。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、ストレッチャーユニットは、抗ＣＤ３０抗体ユニットの硫黄原子との結合を形成する。硫黄原子は、還元された抗ＣＤ３０抗体（Ａ）のスルフヒドリル（ＳＨ）基に由来し得る。これらの実施形態の代表的なストレッチャーユニットは、式（Ｉａ）および（Ｉｂ；下記）の角括弧内に示され、ここで、Ａ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上に定義した通りであり、Ｒ１は−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ−、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）−、−アリーレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−から選択され；また、ｒは１〜１０の範囲の整数である。
【化５】
2005511627.tif 000007
【０１７１】
例示的なストレッチャーユニットは式（Ｉａ）においてＲ１が−（ＣＨ２）５−の次式である。
【化６】
2005511627.tif 000008
【０１７２】
別の例示的なストレッチャーユニットは式（Ｉａ）においてＲ１が−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり、ｒが２の次式である。
【化７】
2005511627.tif 000009
【０１７３】
さらに別の例示的なストレッチャーユニットは式（Ｉｂ）においてＲ１が−（ＣＨ２）５−の次式である。
【化８】
2005511627.tif 000010
【０１７４】
ある他の特定の実施形態では、ストレッチャーユニットは、抗ＣＤ３０の抗体ユニットの硫黄原子とストレッチャーユニットの硫黄原子との間のジスルフィド結合によって抗ＣＤ３０抗体ユニット（Ａ）に連結される。この実施形態の代表的なストレッチャーユニットは式（ＩＩ）の角括弧内に示され、ここで、Ｒ１、Ａ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上に定義した通りである。
【化９】
2005511627.tif 000011
【０１７５】
さらに別の特定の実施形態では、ストレッチャーの反応性基は、抗ＣＤ３０抗体のアミノ基に反応し得る反応性部位を含む。アミノ基はアルギニンまたはリジンのそれであり得る。反応性部位が含む適当なアミンには、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、スルフォニルクロリド、イソシアネートおよびイソチオシアネートのような活性化エステルが含まれる（ただし、これらに限定されない）。これらの実施形態の代表的なストレッチャーユニットは式（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）の角括弧内に示され、ここで、Ｒ１、Ａ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上に定義した通りである。
【化１０】
2005511627.tif 000012
【０１７６】
さらに別の本発明の態様では、ストレッチャーの反応性官能基は、抗ＣＤ３０抗体上に存在し得る改変された炭水化物基に反応的な反応性部位を含む。特定の実施形態において、抗ＣＤ３０抗体は酵素によってグリコシル化されて炭水化物部分を生じる。炭水化物は過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬で穏やかに酸化され、酸化された炭水化物に生じたカルボニルユニットは、ヒドラジド、オキシム、反応性アミン、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびＫａｎｅｋｏ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １９９１、２、１３３−４１に記載されるようなアリールヒドラジドなどの官能性を含むストレッチャーと縮合され得る。この実施形態の代表的なストレッチャーユニットは式（ＩＶａ）〜（ＩＶｃ）の角括弧内に示され、ここで、Ｒ１、Ａ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上に定義した通りである。
【化１１】
2005511627.tif 000013
【０１７７】
５．６．１．２  アミノ酸ユニット
スペーサーユニットが存在する場合、アミノ酸ユニット（−Ｗ−）はストレッチャーユニット（−Ｔ−）をスペーサーユニット（−Ｙ−）に結合し、スペーサーユニットが存在しない場合は、ストレッチャーユニットを細胞毒素素または細胞静止剤（薬剤ユニット；Ｄ）に連結する。
【０１７８】
−Ｗｗ−ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチドユニットである。各−Ｗ−ユニットは、独立して角括弧中の下記式を有する。また、ｗは２〜１２の範囲の整数である。
【化１２】
2005511627.tif 000014
【０１７９】
ここで、Ｒ２は、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル−、−３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、
【化１３】
2005511627.tif 000015
【０１８０】
リンカーユニットのアミノ酸ユニットは酵素（腫瘍関連プロテアーゼが含まれるが、これに限定されない）によって酵素的に切断され、薬剤ユニット（−Ｄ）が解放され、これはｉｎ  ｖｉｖｏでは解放時にプロトン化され細胞傷害性薬剤（Ｄ）を与える。
【０１８１】
Ｗｗユニットの例は式（Ｖ）〜（ＶＩＩ）によって表わされる。
【化１４】
2005511627.tif 000016
【０１８２】
ここで、Ｒ３とＲ４は以下の通りである。
【０１８３】
Ｒ３ Ｒ４
ベンジル          （ＣＨ２）４ＮＨ２；
メチル            （ＣＨ２）４ＮＨ２；
イソプロピル      （ＣＨ２）４ＮＨ２；
イソプロピル      （ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２；
ベンジル          （ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２；
イソブチル        （ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２；
ｓｅｃ−ブチル    （ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２；
【化１５】
2005511627.tif 000017
【０１８４】
（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２；
ベンジル            メチル；および
ベンジル          （ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２；
【化１６】
2005511627.tif 000018
【０１８５】
ここでＲ３、Ｒ４およびＲ５は以下の通りである
Ｒ３ Ｒ４ Ｒ５
ベンジル          ベンジル      （ＣＨ２）４ＮＨ２；
イソプロピル      ベンジル      （ＣＨ２）４ＮＨ２；および
Ｈ            ベンジル      （ＣＨ２）４ＮＨ２；
【化１７】
2005511627.tif 000019
【０１８６】
ここでＲ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は以下の通りである
Ｒ３ Ｒ４ Ｒ５ Ｒ６
Ｈ            ベンジル      イソブチル          Ｈ；および
メチル          イソブチル      メチル        イソブチル
好ましいアミノ酸ユニットとしては、式（Ｖ）のユニットにおいて、Ｒ３がベンジルであり、Ｒ４が−（ＣＨ２）４ＮＨ２であるもの；Ｒ３がイソプロピルであり、Ｒ４が−（ＣＨ２）４ＮＨ２であるもの；Ｒ３がイソプロピルであり、Ｒ４が−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２であるものが含まれる（ただし、これらに限定されない）。別の好ましいアミノ酸ユニットは、式（ＶＩ）のユニットにおいて、Ｒ３がベンジルであり、Ｒ４がベンジルであり、Ｒ５が−（ＣＨ２）４ＮＨ２である。
【０１８７】
本発明において有用な−Ｗｗ−ユニットは、特定の腫瘍関連プロテアーゼによる酵素切断についてその選択性を基準として設計し最適化することができる。好ましい−Ｗｗ−ユニットはその切断がプロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤおよびプラスミンによって触媒されるものである。
【０１８８】
１つの実施形態では、−Ｗｗ−はジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドユニットである。
【０１８９】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６が水素以外である場合、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６が結合する炭素原子はキラルである。
【０１９０】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６が結合する各炭素原子は、独立して（Ｓ）配置か（Ｒ）配置である。
【０１９１】
好ましい実施形態では、アミノ酸ユニットはフェニルアラニン−リジンジペプチド（ｐｈｅ−ｌｙｓまたはＦＫリンカー）である。別の好ましい実施形態では、アミノ酸ユニットは、バリン−シトルリン・ジペプチド（ｖａｌ−ｃｉｔまたはＶＣリンカー）である。
【０１９２】
５．６．１．３  スペーサーユニット
スペーサーユニット（Ｙ）は、存在する場合、アミノ酸ユニットを薬剤ユニットに連結する。スペーサーユニットには２つの一般的なタイプ、すなわち、自己犠牲的タイプと非自己犠牲的タイプがある。非自己犠牲的スペーサーユニットは、抗ＣＤ３０抗体−リンカー−薬剤コンジュゲートまたは薬剤−リンカー化合物からアミノ酸ユニットが酵素により切断した後もスペーサーユニットの一部またはすべてが薬剤ユニットに結合したままであるものである。非自己犠牲的スペーサーユニットの例は、（グリシン−グリシン）スペーサーユニットおよびグリシンスペーサーユニット（両者ともスキーム１に示す）である（ただし、これらに限定されない）。本発明のグリシン−グリシンスペーサーユニットまたはグリシンスペーサーユニットを含む抗ＣＤ３０抗体リンカー−薬剤コンジュゲートが、腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼまたはリンパ球関連プロテアーゼにより酵素的に切断する場合、グリシン−グリシン薬剤部分またはグリシン−薬剤部分はＡ−Ｔ−ＷＷ−から切断される。薬剤を解放するためには、グリシン−薬剤ユニット結合を切断させる独立した加水分解反応が標的細胞内に起こらなければならない。
【０１９３】
好ましい実施形態では、−Ｙｙ−はｐ−アミノベンジルエーテルであり、これはＱｍ（ここで、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数である）で置換されていてもよい。
【化１８】
2005511627.tif 000020
【０１９４】
１つの実施形態では、非自己犠牲的スペーサーユニット（−Ｙ−）は、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−である。
【０１９５】
別の実施形態では、非自己犠牲的スペーサーユニット（−Ｙ−）は、−Ｇｌｙ−である。
【０１９６】
１つの実施形態では、薬剤−リンカー化合物または抗ＣＤ３０抗体−リンカー−薬剤コンジュゲートはスペーサーユニットを欠いている（ｙ＝０）。
【０１９７】
あるいは、自己犠牲的なスペーサーユニットを含む本発明の抗ＣＤ３０抗体−リンカー−薬剤コンジュゲートは、個別の加水分解ステップの必要なしで薬剤（Ｄ）を放出することができる。これらの実施形態では、−Ｙ−はｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）ユニットであり、ＰＡＢ基の窒素原子を介して−Ｗｗ−に連結され、カーボネート、カルバメートまたはエーテル基によって−Ｄに直接接続される（スキーム２およびスキーム３）。
【化１９】
2005511627.tif 000021
【０１９８】
ここで、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルコキシル、−ハロゲン、−ニトロ、−シアノであり；ｍは０〜４の範囲の整数であり；また、ｐは１〜２０の範囲の整数である。
【化２０】
2005511627.tif 000022
【０１９９】
ここで、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、−ハロゲン、−ニトロ、−シアノであり；ｍは０〜４の範囲の整数であり；また、ｐは１〜２０の範囲の整数である。
【０２００】
自己犠牲的スペーサーの他の例には、ＰＡＢ基と電子的に等価な芳香族化合物、例えば２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（例えば、Ｈａｙら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９９、９、２２３７参照）およびオルト−またはパラ−アミノベンジルアセタールが含まれる（ただし、これらに限定されない）。置換または未置換の４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、２、２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍら、Ｊ：Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７２、９４、５８１５）および２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、１９９０、５５、５８６７）などのような、アミド結合の加水分解により容易に環化するスペーサーを使用することができる。また、グリシンのα位が置換されたアミン含有薬剤の脱離（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙら、Ｊ；Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８４、２７、１４４７）も本発明の抗ＣＤ３０抗体−リンカー−薬剤コンジュゲートに適用することができる自己犠牲的なスペーサー戦略の例である。
【０２０１】
別の実施形態では、スペーサーユニットは、分岐したビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）ユニット（スキーム４）であり、これは追加の薬剤を組込むために使用することができる。
【化２１】
2005511627.tif 000023
【０２０２】
ここで、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルコキシル、−ハロゲン、−ニトロ、−シアノであり；ｍは０〜４の範囲の整数であり；ｎは０または１であり；また、ｐは１〜２０の範囲の整数である。
【０２０３】
１つの実施形態では、２つの−Ｄ部分は同一である。
【０２０４】
別の実施形態では、２つの−Ｄ部分は異なる。
【０２０５】
好ましいスペーサーユニット（−Ｙｙ−）は式（ＶＩＩＩ）〜（Ｘ）によって表わされる。
【化２２】
2005511627.tif 000024
【０２０６】
ここで、ＱはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシル、ハロゲン、ニトロ、シアノであり；ｍは０〜４の範囲の整数である。
【化２３】
2005511627.tif 000025
2005511627.tif 000026
【０２０７】
５．６．２  薬剤
本発明は、免疫学的疾患の治療または予防のための抗ＣＤ３０  ＡＤＣの使用を包含する。本明細書で使用する場合、「薬剤」または「細胞傷害性薬剤」という用語は、本発明の抗ＣＤ３０  ＡＤＣとの関連で使用された場合、放射性同位体を含まない。これ以外の点では、当業者に知られているどのような薬剤も、本発明のＡＤＣに関して使用することができる。
【０２０８】
本発明の抗ＣＤ３０抗体へのコンジュゲーションのために使用される薬剤は、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、エトポシドなどの従来の化学療法剤を含むことができる。さらに、ＣＣ−１０６５類似体、カリチアミシン、メイタンシン、ドラスタチン１０の類似体、リゾキシンおよびパリトキシンなどの有効な薬剤を、条件によっては安定したリンカーを使用して、抗ＣＤ３０抗体に結合して有効なイムノコンジュゲートを形成することができる。本発明の抗ＣＤ３０抗体へのコンジュゲーションのための他の適当な薬剤の例は、下記５．１２．１節に示す。
【０２０９】
ある実施形態では、本発明のＡＤＣは、ＣＤ３０発現細胞上でドキソルビシンより少なくとも４０倍より強力である薬剤を含む。そのような薬剤には、ＤＮＡ副溝結合剤、例えば、エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルを含む）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エピチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド類、ドラスタチン類、例えば、オーリスタチンＥ、ドラスタチン−１０、ＭＭＡＥ、ディスコデルモリド、エロイテロビンおよびミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）が含まれる（ただし、これらに限定されない）。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ３０  ＡＤＣはエネジイン部分を含む。特定の実施形態では、エネジイン部分は、カリケアマイシンである。エネジイン化合物はベルグマン環化を介してジラジカルを生成することにより２本鎖ＤＮＡを切断する。
【０２１１】
本発明の組成物および方法と共に使用することができる、様々な細胞傷害性薬剤と細胞静止剤は、「Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，ａｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｒ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ」と題する米国仮出願第６０／４００，４０３号（発明者：Ｐｅｔｅｒ  Ｄ．Ｓｅｎｔｅｒ、Ｓｖｅｔｌａｎａ  ＤｏｒｏｎｉｎａおよびＢｒｉａｎ  Ｅ．Ｔｏｋｉ、提出日：２００２年７月３１日）に記載されており、これは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる。
【０２１２】
他の特定の実施形態では、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤はオーリスタチンＥまたはそれの誘導体である。
【０２１３】
好ましい実施形態では、オーリスタチンＥ誘導体はオーリスタチンＥとケト酸の間で形成されたエステルである。例えば、オーリスタチンＥはＡＥＢとＡＥＶＢを生産するためにパラアセチル安息香酸かベンゾイル吉草酸とそれぞれ反応させることができる。他の好ましいオーリスタチン誘導体はＭＭＡＥとＡＥＦＰを含む。
【０２１４】
当技術分野でドラスタチン−１０としても知られているオーリスタチンＥおよびその誘導体の合成および構造は、米国特許出願第０９／８４５，７８６号および米国特許出願第１０／００１，１９１号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１３４３５；米国特許第６，３２３，３１５号；米国特許第６，２３９，１０４号；米国特許第６，０３４，０６５号；米国特許第５，７８０，５８８号；米国特許第５，６６５，８６０号；米国特許第５，６６３，１４９号；米国特許第５，６３５，４８３号；米国特許第５，５９９，９０２号；米国特許第５，５５４，７２５号；米国特許第５，５３０，０９７号；米国特許第５，５２１，２８４号；米国特許第５，５０４，１９１号；米国特許第５，４１０，０２４号；米国特許第５，１３８，０３６号；米国特許第５，０７６，９７３号；米国特許第４，９８６，９８８号；米国特許第４，９７８，７４４号；米国特許第４，８７９，２７８号；米国特許第４，８１６，４４４号；および米国特許第４，４８６，４１４号（それらのすべては参照によってそれらの全体に本願明細書に組み込まれる）。
【０２１５】
特定の実施形態では、薬剤はＤＮＡ副溝結合剤である。そのような化合物およびそれらの合成例は、米国特許第６，１３０，２３７号（それは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）に開示されている。ある実施形態では、薬剤はＣＢＩ化合物である。
【０２１６】
本発明のある実施形態では、本発明のＡＤＣは抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤は癌治療用化合物として十分に確立している種類である。抗チューブリン剤の例には、タキサン類（例えばＴａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、ドセタキセル）、Ｔ６７（Ｔｕｌａｒｉｋ）、ビンカ類およびオーリスタチン類（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＭＭＡＥ、ＡＥＦＰ）（ただし、これらに限定されない）。このクラスに含まれる抗チューブリン剤はさらに次のとおりである：ビンクリスチンとビンブラスチンを含むビンカアルカロイド、ビンデシンおよびビンオレルビン；パクリタキセルおよびドセタキセルとバッカチン誘導体などのようなタキサン類、エピチロンＡおよびＢ、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルチミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド類、コンブレタスタチン類、ドラスタチン類、ディスコデルモリドおよびエロイテロビン。
【０２１７】
特定の実施形態では、薬剤はメイタンシノイド（抗チューブリン剤のグループ）である。より具体的な実施形態では、薬剤はメイタンシンである。さらに、特定の実施形態では、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤はＤＭ−１（イムノジェン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）社；また、Ｃｈａｒｉら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：１２７〜１３１頁参照）である。メイタンシン（天然物）は、チューブリン重合を阻害し有系分裂の阻止および細胞死をもたらす。したがって、メイタンシンの作用メカニズムはビンクリスチンとビンブラスチンのそれに似ているように思われる。しかし、メイタンシンは、これらのビンカアルカロイドよりｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性が約２００〜１，０００倍大きい。
【０２１８】
別の特定の実施形態では、薬剤はＡＥＦＰである。
【０２１９】
本発明のある特定の実施形態では、薬剤は５０、１００または２００個以上のアミノ酸のポリペプチド（例えば、毒素）ではない。本発明の特定の実施形態では、薬剤はリシンではない。
【０２２０】
本発明の他の特定の実施形態では、本発明のＡＤＣは、１種または複数の細胞傷害性薬剤または細胞静止剤（相互に排他的でない以下の薬剤種）を含まない：アルキル化剤、アントラサイクリン類、抗生物質、抗葉酸類、代謝拮抗剤、抗チューブリン剤、オーリスタチン類、化学療法増感剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、デュオカルマイシン類、エトポシド類、フッ素化ピリミジン類、レキシトロプシン類、ニトロソ尿素類、プラチノール類、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド類、タキサン類、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、プリンアンタゴニストおよびジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤。より具体的な実施形態では、高効力薬剤は、男性ホルモン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニン（ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ）、スルホキシミン（ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ）、カンプトテシン、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５、クロラムブチル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンＢ、デカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサトロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テポノシド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンオレルビン、ＶＰ−１６、ＶＭ−２６、アゾチオプリン、ミコフェノレートモフェチル、メトトレキサート、アシクロビル、ガングシクロビル、ジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、リババリン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、アジドチミジン、シチジン・アラビノシッド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネット（ｐｏｓｃａｒｎｅｔ）およびトリフルウリジン（ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）の１種または複数ではない。
【０２２１】
５．６．２．１  ドラスタチン薬剤
ある実施形態では、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤はドラスタチンである。より具体的な実施形態では、ドラスタチンはオーリスタチンのクラスである。本発明の特定の実施形態では、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤はＭＭＡＥ（ＭＭＡＥ：式ＸＩ）である。本発明の別の特定の実施形態では、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤はＡＥＦＰ（式ＸＶＩ）である。
【化２４】
2005511627.tif 000027
【０２２２】
本発明のある実施形態では、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤は式ＸＩＩ〜ＸＶＩＩＩのドラスタチンである。
【化２５】
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【０２２３】
５．６．３  抗ＣＤ３０抗体−薬剤コンジュゲートの形成
抗ＣＤ３０抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の作製は当業者に知られている任意の技術によって遂行することができる。簡単に言えば、抗ＣＤ３０ＡＤＣは抗ＣＤ３０抗体、薬剤、および薬剤と抗体を連結するリンカーを含む。多数の様々な反応が薬剤の抗体への共有結合的結合に利用可能である。これはしばしば、リジンのアミン基、グルタミン酸やアスパラギン酸の遊離カルボキシル基、システインのスルフヒドリル基および様々な芳香族アミノ酸基を含む抗体分子のアミノ酸残基の反応によって遂行される。共有結合的結合で最も一般に用いられている非特異的方法のうちの１つは、化合物のカルボキシル基（またはアミノ）基を、抗体のアミノ（またはカルボキシル）基に連結するカルボジイミド反応である。さらに、ジアルデヒド類またはイミドエステル類などの二官能性剤は、化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に連結するために使用されてきた。また、シッフ塩基反応も薬剤の抗体への結合に利用可能である。この方法は、グリコールまたは水酸基を含む薬剤の過ヨウ素酸塩酸化を含んでおり、それによりアルデヒドを形成する（これは、次いで、抗体分子と反応する）。結合は、抗体分子のアミノ基とのシッフ塩基形成を通して生じる。イソチオシアネートも、抗体に共有結合的に薬剤を結合するためにカップリング剤として使用することができる。他の技術も当業者に知られており、本発明の範囲内である。そのような技術の例は、例えば、米国特許第５，６６５，３５８号、米国特許第５，６４３，５７３号および米国特許第５，５５６，６２３号（これらは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる）に記載されている（ただし、これらに限定されない）。
【０２２４】
ある実施形態では、リンカーの前駆体である中間体を、適当な条件下に薬剤と反応させる。ある実施形態では、薬剤および／または中間体上で反応性基が用いられる。薬剤と中間体の間の反応の生成物（すなわち誘導された薬剤）を、続いて、適当な条件下に抗ＣＤ３０抗体と反応させる。誘導体化された薬剤と抗体との間の反応のために選択された条件下での抗体の安定性を維持するように注意するべきである。
【０２２５】
５．７  細胞傷害性および細胞静止活性の分析
定義によって、本発明のタンパク質は、活性化リンパ球に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼすものでなければならない。ＣＤ３０結合タンパク質の細胞静止作用または細胞傷害作用についてのアッセイを行い得る活性化リンパ球は、培養された細胞系統（例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）およびＣＥＳＳ（これらの両方ともＡＴＣＣから入手可能である）；またはＫａｒｐａｓ  ２９９およびＬ５４０（これらの両方ともドイツのＳａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨから入手可能である）でもよいし、または新鮮な血液試料から調製したリンパ球由来でもよい。当業者には認識されるように、抗体とサイトカインの適当な混合物でリンパ球を活性化できる。例えば、下記１１節に記載するようにＴリンパ球は抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２の組合せを使用して活性化できる。
【０２２６】
タンパク質が細胞に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼすかどうか決める多くの方法が、当業者に知られており、特定のタンパク質が本発明のタンパク質であるか否かを明らかにするのに用いることができる。そのような方法を説明する例を下に記載する。
【０２２７】
ＣＤ３０に結合するタンパク質が、活性化リンパ球に対し細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼさない場合、そのタンパク質を上記５．１節に記載した方法によって多量化し、この多量体が活性化リンパ球に対する細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼす能力を分析することができる。
【０２２８】
好ましい実施形態では、活性化リンパ球に対する細胞静止作用または細胞傷害作用を評価する前に、本発明のタンパク質を架橋する。例示的な実施形態（この場合、本発明のタンパク質は抗ＣＤ３０抗体である）では、抗体は溶液中で架橋され得るし、１種または複数の抗ＣＤ３０抗体の希釈液は、第２の抗体の存在下または不在下に９６穴平底組織培養プレートに滴下することができる。次いで、活性化リンパ球をおよそ５，０００個の細胞／ウェルでプレートに加える。次いで、本願明細書に記載するようにして、例えば、活性化リンパ球への放射性標識チミジンの取り込みの阻害として、細胞静止作用または細胞傷害作用を評価することができる。
【０２２９】
タンパク質が（ｉ）ＣＤ３０に結合し、（ｉｉ）活性化リンパ球に対し細胞静止作用または細胞傷害作用を及ぼすことが確認されたならば、その動物モデルでの治療可能性が確認される。免疫学的疾患の典型的な動物モデルは下記５．７．１節に記載する。
【０２３０】
抗ＣＤ３０抗体が活性化リンパ球に対する細胞静止作用を及ぼすか否かを判定する好ましい実施形態では、チミジン取り込みアッセイを用いることができる。例えば、９６穴プレートに約５，０００細胞／ウェルの密度で載せた活性化リンパ球を７２時間の間培養し、７２時間の期間の最後の８時間、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンにさらし、抗体の存在下または不在下に培養細胞への３Ｈ−チミジンの取り込みを測定する。
【０２３１】
当業者に知られている多数の細胞傷害性アッセイが存在する。これらのアッセイには壊死を測定するものもあるし、アポトーシス（プログラムされた細胞死）を測定するものもある。壊死には形質膜の浸透性増加が伴い細胞は膨張して、形質膜は数分内に破裂する。他方、アポトーシスは、細胞膜の泡状突起の増加、細胞質の凝縮および内生的なエンドヌクレアーゼの活性化により特徴づけられる。上に記載した細胞静止作用または細胞傷害作用を測定するアッセイの代わりとして、ＣＤ３０−結合タンパク質が活性化リンパ球の処理または予防において有用なことを示すのには、活性化リンパ球に対するこれらの効果のうちの１つだけで十分である。
【０２３２】
１つの実施形態では、壊死はまたはニュートラルレッド、トリパンブルーまたはＡＬＡＭＡＲ（商標）ブルーなどの染料を取り込む細胞の能力の有無によって測定される（Ｐａｇｅら、１９９３、Ｉｎｔｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３：４７３〜４７６頁）。このようなアッセイでは、細胞を、染料を含む培地中でインキュベートし、細胞を洗浄し、染料を取り込む細胞の能力を反映する残留染料を分光分析によって測定する。
【０２３３】
別の実施形態では、染料がスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）であり、そのタンパク質への結合が細胞傷害性の尺度として使用できる（Ｓｋｅｈａｎら、１９９０、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１０７〜１２頁）。
【０２３４】
さらに別の実施形態では、ＭＴＴなどのテトラゾリウム塩を定量的熱量分析に使用し、生細胞（死細胞ではない）の検出により哺乳類細胞の生存および増殖を調べる（例えば、Ｍｏｓｍａｎｎ、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５〜６３頁参照）。
【０２３５】
さらに別の実施形態では、培養物中の結合部分と「浮遊」部分の両方によってアポトーシス細胞を測定する。上清を取り、結合細胞をトリプシン分解し、遠心分離洗浄ステップ（１０分、２０００ｒｐｍ）後に両方の調製物を組み合わせることによって両方のコンパートメントを回収する。スリンダック（ｓｕｌｉｎｄａｃ）および関連化合物で腫瘍細胞培養を処理して顕著な量のアポトーシスを得るプロトコルが、文献（例えば、Ｐｉａｚｚａら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：３１  １０〜１６頁参照）に記載されている。この方法の特徴は、浮遊細胞および結合細胞の両者を回収し、ＤＮＡの断片化によって検出されるアポトーシスの観察のために最適な処理時間および投与量範囲を同定し、さらにまた最適な細胞培養条件を同定することを含む。
【０２３６】
さらに別の実施形態では、ＤＮＡ断片化の測定によりアポトーシスを定量する。ＤＮＡ断片化はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの光定量法が利用可能である。ＴＵＮＥＬ（これは断片化されたＤＮＡ中に組み込まれた標識されたヌクレオチドを検出する）を含む、そのようなアッセイおよびＥＬＩＳＡに基づくアッセイの例が、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、１９９９、ｎｏ．２、３４〜３７頁（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に開示されている。
【０２３７】
別の実施形態では、アポトーシスを形態学的に観察することができる。
【０２３８】
試験タンパク質または核酸で処理した後、アクリジンオレンジおよび臭化エチジウムで標識してから蛍光顕微鏡を使用して培養物についてアポトーシスと壊死をアッセイする。アポトーシス細胞数を測定する方法は、Ｄｕｋｅ  ＆  Ｃｏｈｅｎ、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．、３．１７．１−３．１７．１６によって以前に記載された。別の実施形態では、細胞をＤＮＡ染料であるヨウ化プロピジウムで標識し、クロマチンの凝縮、核内膜に沿った呈色、細胞質の凝縮、細胞膜の泡状突起の増加および細胞の収縮などの形態変化について細胞を観察する。
【０２３９】
５．７．１  免疫学的疾患の動物モデル
臨床試験を行う前に、本発明の分子は免疫学的疾患の動物モデルにおいて試験または効果確認できる。免疫学的疾患について確立した多くの動物モデルが、当業者に知られており、本発明の分子の有効性を分析するためには、そのいずれを使用することもできる。そのようなモデルの例を以下に記載する（ただし、これらに限定されない）。
【０２４０】
糖尿病、狼痕、全身性硬化症、ショーグレン症候群、実験的な自己免疫脳脊髄炎（多発性硬化症）、甲状腺炎、重症筋無力症、関節炎、葡萄膜炎、炎症性腸疾患を含む全身的および器官特異的自己免疫疾患の動物モデル用のいくつかの例が、Ｂｉｇａｚｚｉ，Ｐ．、「Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ」、ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＲｏｓｅとＭａｃｋａｙ（編）、２１１〜２４４頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８）および「Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら（編．）、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５（Ｗｉｌｅｙ、１９９７）に記載されている。
【０２４１】
アレルギー症状（例えば喘息、皮膚炎）もげっ歯動物でモデル化することができる。航空機過敏症（ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は、オブアルブミン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５７９２〜５８００頁）またはシストソーマ・マンソーニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）卵抗原（Ｔｅｓｃｉｕｂａら、２００１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。  １６７：１９９６〜２００３頁）で誘導できる。マウスのＮｃ／Ｎｇａ株は、血清ＩｇＥの顕著な増加を示し、アトピー性皮膚炎状の損傷を自然に示す（Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄら、２０００、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ６：２０９〜２１０頁；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９７、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４６１〜４６６頁；Ｓａｓｋａｗａら、２００１、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：２３９〜２４７頁）。
【０２４２】
致死量の照射を行った組織不適合性宿主への免疫力のあるドナーからリンパ球の注入は、マウスにおいて急性ＧＶＨＤを誘導する古典的アプローチである。あるいは、親Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスモデルは、急性、慢性両方のＧＶＨＤを誘導する系を提供する。このモデルでは、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６およびＤＢＡ／２マウスの親株の交配により得られるＦ１子孫である。ＤＢＡ／２リンパ球を非照射Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス中に導入すると、慢性ＧＶＨＤを引き起こすが、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／１０またはＢ１０．Ｄ２リンパ球を導入すると、急性ＧＶＨＤが引き起こされる（Ｓｌａｙｂａｃｋら、２０００、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌ．２６：９３１〜９３８頁；Ｋａｔａｏｋａら、２００１、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０３：３１０〜３１８頁）。
【０２４３】
さらに、ヒト造血幹細胞および成熟末梢血リンパ球は両者とも、ＳＣＩＤマウスに移植可能であり、これらのヒト・リンパ−造血幹細胞はＳＣＩＤマウス中において機能を保つ（ＭｃＣｕｎｅら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６３２〜１６３９頁；Ｋａｍｅｌ−ＲｅｉｄとＤｉｃｋ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１７０６〜１７０９頁、Ｍｏｓｉｅｒら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：２５６〜２５９頁）。これは、可能性のある治療剤をヒトリンパ球上に直接に試験する小動物モデル系をもたらした。例えば、ヒト−マウスキメラモデルは抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−１３、抗ＩＬ−５および二重ムテイン（ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔｅｉｎ）ＩＬ−４の治療可能性を検討するために用いられた（Ｔｏｕｒｎｏｙら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６９８２−６９９１）。
【０２４４】
５．８  シグナル伝達活性のアッセイ
ある好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ３０を発現するリンパ球に結合することで、ＣＤ３０を介した１つまたは複数のシグナル伝達特性を誘導することができる。ＣＤ３０結合タンパク質のシグナル伝達作用についてアッセイすることができるＣＤ３０−発現リンパ球は、培養された細胞系統（例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）およびＣＥＳＳ（これらの両方ともＡＴＣＣから入手可能である）；またはＫａｒｐａｓ  ２９９およびＬ５４０（これらの両方ともドイツのＳａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨから入手可能である）でもよいし、または新鮮な血液試料から調製したリンパ球由来でもよい。
【０２４５】
好ましい実施形態では活性化リンパ球に対するその活性を評価するのに先立って、本発明のタンパク質を架橋する。例示的な実施形態（この場合、本発明のタンパク質は抗ＣＤ３０抗体である）では、抗ＣＤ３０抗体は溶液中で架橋され得る。簡単に言えば、１種または複数の抗ＣＤ３０抗体の希釈液は、第２の抗体の存在下または不在下に９６穴平底組織培養プレートに滴下することができる。次いで、活性化リンパ球をおよそ５，０００個の細胞／ウェルでプレートに加える。次いで、本願明細書に記載するようにして、抗体のシグナル伝達活性を評価することができる。
【０２４６】
タンパク質がＣＤ３０を介した１つまたは複数のシグナル伝達特性を誘導することができるかどうかを決める多数の方法が、当業者に知られている。そのような方法を説明する例を下に記載する。
【０２４７】
５．８．１  カルシウム放出
１つの実施形態では、本発明のタンパク質は、例えば、第２の抗体と架橋した際に、ジャーカット細胞において細胞内の遊離Ｃａ２＋の放出を誘導できる。細胞内の遊離Ｃａ２＋の放出はＥｌｌｉｓら（１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１、２３８０〜２３８９頁）またはＭｏｎｄとＢｒｕｎｓｗｉｃｋ（１９９８、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ  ３．９、Ｗｉｌｅｙ）が記載したようにして測定することができる。
【０２４８】
５．８．２  ＴＲＡＦ局在
ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３およびＴＲＡＦ５を含む４つのＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）がＣＤ３０の細胞質側尾部（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ）と相互作用することが実証されている（Ｇｅｄｒｉｃｈら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、１２８５２〜１２８５８頁；Ｌｅｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９３、９６９９〜９７０３頁；Ａｎｓｉｅａｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９３、１４０５３〜１４０５８頁；Ａｉｚａｗａら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、２０４２〜２０４５頁；Ｔｓｉｔｓｉｋｏｖら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９４、１３９０〜１３９５頁；Ｌｅｅら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８５、１２７５〜１２８５頁；Ｄｕｃｋｅｔｔ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１１、２８１０〜２８２１頁）。同時トランスフェクション研究、酵母２ハイブリッドスクリーニングおよびＧＳＴ融合タンパク質を使用し、ＴＲＡＦ相互作用サイトをＣＤ３０の細胞質側尾部のカルボキシル末端にマッピングし、細胞質ゾル相中でのＣＤ３０とのＴＲＡＦの間の会合がＣＤ３０を媒介としたシグナル・カスケードのキー・イベントであるとの仮説が立てられた。ＣＤ３０とＴＲＡＦの間の相互作用は、ＣＤ３０結合は必要としないようである（Ａｎｓｉｅａｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９３、１４０５３〜１４０５８頁；Ａｉｚａｗａら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、２０４２〜２０４５頁）。しかし、ＣＤ３０の架橋があると、細胞溶解物の界面活性剤可溶画分からＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２が消失する（ＤｕｃｋｅｔｔとＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９９７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１１、２８１０〜２８２１頁；Ａｒｃｈら、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７２、９３６〜９４５頁）。ＴＲＡＦ２が消失すると、それに対応して核を含む界面活性剤不溶な画分における検出可能なＴＲＡＦ２の量が増大する（Ａｒｃｈら、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７２、９３６〜９４５頁）。さらに、細胞下の局在研究によって、ＣＤ３０の架橋は、ＴＲＡＦ２の細胞質ゾルから細胞中の核周辺領域への転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を誘導することが確認された（Ａｒｃｈら、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７２、９３６〜９４５頁）。このようなＴＲＡＦ２のＣＤ３０媒介転移は、細胞感度を調節することにより、細胞生存をモジュレートし、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの他のＴＲＡＦ結合メンバーによって誘導されたアポトーシスを進行させるとの仮説が立てられている（ＤｕｃｋｅｔｔとＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９９７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１１、２８１０〜２８２１頁；Ａｒｃｈら、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７２、９３６〜９４５頁）。
【０２４９】
本発明の抗体がＴＲＡＦ２の核転位を誘導するかどうか判定するために、本発明の抗体をＣＤ３０＋細胞および第２の抗体のような架橋剤と接触させる。次いで、共焦点顕微鏡を使用して、ＴＲＡＦ２の局在を、本発明の抗体（プラス架橋試薬）と共にインキュベートした細胞と本発明の抗体と共にインキュベートしなかった細胞とで比較することができる。
【０２５０】
別の実施形態では、本発明の抗体がＴＲＡＦ２の核局在を誘導するかどうかを、例えば、ウェスタンブロットで様々な細胞画分中でＴＲＡＦ２の量を測定してアッセイすることができる。例えば、本発明の抗体２μｇ／ｍｌを０．５×１０６／ｍｌのＣＤ３０＋細胞と共にインキュベートすることができる。抗体を３７℃、５％ＣＯ２で、第２の抗体（例えば、本発明の抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ特異抗体（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）、ペンシルヴェニア州ウェスト・グローブ所在（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ））を第２の抗体として使用することができる）２０μｇ／ｍｌで架橋する。指定された時点（例えば、２〜２４時間）で、５×１０６個の細胞を取り出し遠沈させる。氷冷したＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・ダイアグノスティックＧｍＢＨ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｃ  ＧｍＢＨ）、ドイツ、マンハイム所在（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を添加した溶解緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．００５Ｍ  ＥＤＴＡおよび０．５％ＮＰ−４０またはトライトンＸ−１００）中、１００×１０６／ｍｌで溶解させる。溶解は４℃で２時間一定の混合を行いつつ行う。溶解後に、界面活性剤可溶画分および界面活性剤不溶な画分を１４，０００×ｇで２０分間遠心分離によって分離する。次いで、界面活性剤可溶画分を個別の試験管に移し、等量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料還元緩衝液をそれに加える。界面活性剤不溶画分（すなわち、遠心分離の後の沈殿）にも等量の１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料還元緩衝液を加える。両方の画分を１００℃で２分間加熱する。次いで、各時点で約１０μずつの画分を１２％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバード所在（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））に溶解する。溶解したタンパク質は、ＰＶＤＦ薄膜（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にウェスタン転写（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）し、０．０５％トゥイーン２０と５％ＢＳＡを添加したトリス緩衝塩水（０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１３８ＭＮａＣｌ、０．００２７ＭＫＣｌ）でブロックする。ブロットは、抗ＴＲＡＦ２抗体（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、カリフォルニア州サンディエゴ所在（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））でイムノブロットする。様々な画分中のＴＲＡＦ２タンパク質の存在は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびペルオキシダーゼ基質キットＤＡＢ（ベクター研究所（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州バーリンゲーム所在（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ））によって検出する。あるいは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州ロックフォード所在（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））を検出のた��に使用することもできる。
【０２５１】
５．８．３  ＮＦ−κＢの活性化
本発明のある抗体によって誘導され得ることがはっきりわかっている別のシグナル伝達事象は、ＮＦ−κＢの活性化である。Ｍ４４、Ｍ６７およびＢｅｒ−Ｈ２を含む抗ＣＤ３０  ｍＡｂは、ＮＦ−κＢの活性化が可能であり、これは標準的な移動度シフトＤＮＡ結合アッセイによって検出される（ＭｃＤｏｎａｌｄら、１９９５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５、２８７０〜２８７６頁；Ａｎｓｉｅａｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９３、１４０５３〜１４０５８頁；Ｈｏｒｉｅら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０、２０３〜２１０頁）。このような作用は、ホジキン細胞、Ｔ細胞およびＣＤ３０発現トランスフェクタント中で観察することができる（ＭｃＤｏｎａｌｄら、１９９５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５、２８７０〜２８７６頁；Ｂｉｓｗａｓら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２、５８７〜５９６頁；Ａｎｓｉｅａｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９３、１４０５３〜１４０５８頁；Ｈｏｒｉｅら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０、２０３〜２１０頁）。初期のマッピング研究は、ＣＤ３０を媒介としたＮＦ−κＢの活性化のためには、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、およびＴＲＡＦ５とＣＤ３０の細胞質側尾部との間の相互作用が必要になることを明らかにした（Ｌｅｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９３、９６９９〜９７０３頁；Ａｎｓｉｅａｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９３、１４０５３〜１４０５８頁；Ａｉｚａｗａら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、２０４２〜２０４５頁；Ｄｕｃｋｅｔｔら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１７、１５３５〜１５４２頁）。最近になって、アゴニスト性ｍＡｂによるＣＤ３０の結合も、ＴＲＡＦ２／５に依存しない経路でＮＦ−κＢを活性化し得るという証拠が得られている（Ｈｏｒｉｅら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０、２０３〜２１０頁）。ＣＤ３０媒介ＮＦ−κＢ活性化の生物学的作用のうちのいくつかは、遺伝子転写（Ｂｉｓｗａｓら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２、５８７〜５９６頁；Ｍａｇｇｉら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３、２５１〜２５５頁）および細胞生存の調節（Ｍｉｒら、２０００、Ｂｌｏｏｄ、９６、４３０７〜４３１２頁；Ｈｏｒｉｅら、２００２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１、２４３９〜２５０３頁）を含む。ＮＦ−κＢ活性化の特徴のいずれかをアッセイすることにより、本発明の抗体がＣＤ３０シグナル伝達の１つまたは複数の特性を誘導するかどうか判定することができる。
【０２５２】
本発明の抗体によってＣＤ３０＋細胞にＮＦ−κＢ活性化が誘導されるかどうかは、例えば、２μｇ／ｍｌの抗体と共に３×１０６／ｍｌのＣＤ３０＋細胞をインキュベートし、次いで、抗体を架橋し（例えば、本発明の抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、ヤギ抗ＩｇＧ  Ｆｃ特異抗体（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）、ペンシルヴェニア州ウェスト・グローブ所在（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ））２０μｇ／ｍｌによって架橋することができる）、次いで、培養物を３７℃、５％ＣＯ２下で１時間、一定の振盪を行いながらインキュベートすることにより測定できる。細胞密度を１．２×１０６／ｍｌに調節し、振盪を行いながらさらに１時間インキュベーションする。次いで細胞密度をさらに０．６×１０６／ｍｌに低減し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下でさらに４６時間、振盪は行わずにインキュベートした。インキュベーション終了時に、刺激した細胞から核抽出物を調製しＮＦ−κＢ活性化について分析した。
【０２５３】
ＮＦ−κＢ活性化は、１８５０×ｇで２０分間遠心分離を行うことによって細胞を回収し、次いで、細胞沈層容積の５倍のＰＢＳで１度洗浄することにより分析する。細胞ペレットを、細胞沈層容積の５倍の低張性緩衝液（０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、０．００１５Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍ  ＫＣ１、０．０００２Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド、０．０００５Ｍジチオスレイトール）で再懸濁する。１８５０×ｇ、５分間の遠心分離によって細胞を回収する。次いで、ペレットを細胞沈層容積の３倍の低張性緩衝液に再懸濁し、氷上で１０分間膨潤させる。次いで、膨潤した細胞を、ダウンス式のホモジナイザー中、隙間の狭いＢ内筒を使用して、ゆっくりした上下動で均質化する。細胞溶解はトリパンブルー排除法によってモニターするが、８０％を超える細胞溶解を達成するためには十分なストロークを用いるべきである。核は１５分間、３３００×ｇの遠心分離によってペレット化する。上清（細胞質抽出液）を除去する。次いで、核ペレットを、１／２核沈層容積の低塩緩衝液（０．０２Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５％容積／容積グリセリン、０．００１５Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．０２Ｍ  ＫＣｌ、０．０００２Ｍ  ＥＤＴＡ、０．０００２Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド、０．０００５Ｍジチオスレイトール）中に再懸濁する。次いで、等容積の高塩緩衝液（０．０２Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５％容積／容積グリセリン、０．００１５Ｍ  ＭｇＣｌ２、１．２Ｍ  ＫＣｌ、０．０００２Ｍ  ＥＤＴＡ、０．０００２Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド、０．０００５Ｍジチオスレイトール）を穏やかに撹拌させた核懸濁液にゆっくり加え、ＫＣｌの最終濃度をおよそ０．３Ｍとする。抽出液を、３０分間穏やかに撹拌し続ける。抽出後、２５，０００×ｇで３０分間核を遠心分離によって取り除く。次いで、核抽出液の伝導性が透析緩衝液と同じになるまで、核抽出液を、透析緩衝液（０．０２Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２０％容積／容積グリセリン、０．１Ｍ  ＫＣ１、０．０００２Ｍ  ＥＤＴＡ、０．０００２Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド、０．０００５Ｍジチオスレイトール）５０容積に対して透析する。残存する破砕物を除去するため、核抽出液を、２５，０００×ｇで２０分間もう一度遠心分離する。また、上清のタンパク質濃度はマイクロＢＣＡアッセイ（ピアス）（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定する。
【０２５４】
抗ＣＤ３０刺激細胞の核抽出液中のＮＦ−κＢの存在は、ゲルシフトアッセイシステム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン所在（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））を使用する標準的な移動度シフトＤＮＡ結合アッセイによって検出することができる。配列５’−ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  Ｃ−３’（配列番号３３）を有するコンセンサスＮＦ−κＢ結合モチーフ（ＬｅｎａｒｄｏとＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、２２７〜２２９頁）を含む２本鎖オリゴヌクレオチドプローブを核抽出液中のＮＦ−κＢを検出プローブとして使用する。このプローブは、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼおよび［α−３２Ｐ］ＡＴＰによってリン酸化される。リン酸化されたプローブは、ＴＥ緩衝液（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）で平衡に保たれたセファロースＧ２５スピン・カラムによって精製する。次いで、精製されたプローブを酢酸アンモニアおよびエタノールで沈殿させ、次いで、ＴＥ緩衝液１００μｌ中に再懸濁させる。抗ＣＤ３０処理した細胞および対照処理した細胞からの核抽出液を含む反応混合物を、Ｇｅｌ  Ｓｈｉｆｔ結合緩衝液、水およびメーカー指示による標識されていない競合プローブと別々に組み合わせる。ＮＦ−κＢコンセンサスを含む標識されていないオリゴヌクレオチドおよび標識されていない無関係のオリゴヌクレオチドを、配列特異的および配列非特異的競合物質として反応混合物に含有させる。室温で１０分間インキュベーションした後、３２Ｐ−標識したＮＦ−κＢコンセンサスオリゴヌクレオチド１μｌを各反応液に加える。この反応を室温でさらに２０分間継続する。インキュベーション終了時に、１μｌの１０×ローディング緩衝液（０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４０％容積／容積グリセリン、０．２％のブロモフェノールブルー）を反応液に加える。次いで、この反応液を、６％のＤＮＡ遅延ゲル（イントロビジェン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の個のウェルにロードし、０．５×ＴＢＥ（０．０４５Ｍトリス−ＨＣｌ、０．０４５Ｍホウ酸、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）に、１００ボルトで９０分間分離させる。電気泳動後に、ゲルをプラスチックラップで覆い、これを−７０℃でＸ線フィルムに露光し、ＮＦ−κＢとＮＦ−κＢ結合配列を含むオリゴヌクレオチドの間の特異的相互作用を検出する。
【０２５５】
５．９  免疫疾患
本発明の方法は免疫学的疾患（ここで、免疫学的疾患はリンパ球の不適切な活性化によって特徴づけられる）の治療または予防に有用である。本明細書で使用する場合、「免疫学的疾患」という用語は、ホジキン病および未分化大細胞リンパ腫のような免疫性の癌は包含しない。免疫学的疾患の治療または予防は本発明の方法によれば、そのような治療または予防を必要とする患者に、疾患状態に関係している活性化リンパ球に結合し、リンパ球に対し細胞傷害作用または細胞静止作用を及ぼすタンパク質、好ましくは抗体を投与することにより達成される。
【０２５６】
本発明の方法によって治療または予防することができる疾患の例としては、関節リウマチ、多発性硬化症、内分泌腺性眼障害、ブドウ膜炎（ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、全身紅斑性狼瘡、重症筋無力症、グレイブ病、糸球体腎炎、自己免疫性肝疾患、自己免疫性炎症性腸疾患、アナフィラキシー、アレルギー反応、シェーグレン症候群、若年性（タイプＩ）糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結合組織炎、炎症性腸疾患、多発性筋炎、皮膚筋炎、複合的内分泌腺不全、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、副腎炎、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃の萎縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期痴呆、脱髄疾患、亜急性皮膚紅斑性狼瘡、上皮小体機能減退症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、進行性全身性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化および毛細管拡張症）、成人糖尿病（タイプＩＩ糖尿病）、男性および女性の自己免疫性不妊、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合性結合組織疾患、結節性多発性動脈炎、全身性壊死脈管炎、若年性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サーコイドーシス、リウマチ熱および喘息、反復流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開術後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活性肝炎、鳥飼育者肺、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死症、アルポート症候群、歯槽骨炎、アレルギー性肺胞炎、線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸液反応、ハンセン病、マラリア、皮膚リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨大細胞動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サンプター（Ｓａｍｐｔｅｒ）症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、キャプラン症候群、川崎病、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン（Ｓｈｕｌｍａｎ）症候群、フェルティ（Ｆｅｌｔｙ）症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、不整脈毛様体炎、フック（Ｆｕｃｈ）毛様体炎、ＩｇＡネフロパシー、ヘノッホ−ショーンライン（Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ）紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶、ヒト免疫不全ウイルス感染、エコーウイルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス病感染、風疹ウイルス感染、予防接種後症候群、先天性風疹感染、イートン−ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、クリオグロブリン血（症）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ  ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｅｍｉａ）、エプスタイン・バー・ウイルス感染、耳下腺炎、エバン症候群および自己免疫性生殖腺不全が含まれる（ただし、これらに限定されない）。
【０２５７】
したがって、本発明の方法は、Ｂリンパ球疾患（例えば、全身紅斑性狼瘡、グッドパスチャー症候群、関節リウマチおよびＩ型糖尿病）、Ｔｈ１−リンパ球疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、ショーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレイブ病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結核または急性移植片対宿主病）およびＴｈ２−リンパ球疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症または慢性移植片対宿主病）の治療を包含する。
【０２５８】
免疫学的疾患状態を分類する別の方法は、基本となる生物学的機構による。本発明は、次のメカニズム（それらは４つのタイプに分類される）のうちのいずれかによって発症する免疫学的疾患についての治療および予防を対象とする。
【０２５９】
アナフィラキシー反応。これらの反応は、マスト細胞上の受容体に結合するＩｇＥ抗体によって媒介される。抗原との架橋が生じる場合、ＩｇＥ抗体は、マスト細胞を刺激してアナフィラキシーの徴候特性を引き起こし得る多くの薬理学的に活性な物質を放出させる。抗原のチャレンジに対するこれらの反応は即時的で、生命に危険を及ぼす場合もある。アナフィラキシー反応の例には、アレルギー性鼻炎、胃腸アレルギー、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、および馬の気道狭窄症（ｅｑｕｉｎｅ  ｈｅａｖｅｓ）および蹄葉炎が含まれる（ただし、これらに限定されない）。
【０２６０】
細胞傷害（細胞溶解）反応。これらの細胞表面反応はＩｇＭおよび／またはＩｇＧ（補体カスケードを活性化する）と抗原との相互作用に起因し、細胞の破壊をもたらす。細胞溶解反応の例には、白血球減少症、新生児溶血性疾患およびグッドパスチャー病の溶血性疾患が含まれる（ただし、これらに限定されない）。細胞傷害／細胞溶解の反応を含む自己免疫疾患は、溶血性貧血、血小板減少症および甲状腺炎である。
【０２６１】
免疫複合反応。抗原とＩｇＧまたはＩｇＭが、大きな複合体を循環系中で、または組織中で蓄積し、補体を固定する場合、免疫複合反応が生じる。補体結合サイトへは顆粒細胞が引きつけられ、それらの小粒から損傷性の細胞溶解性酵素を放出する。この種の反応の例は血清病である。免疫複合体反応を含む自己免疫疾患は全身性紅斑性狼瘡、慢性糸球体腎炎および関節リウマチを含む。
【０２６２】
細胞媒介免疫（ＣＭＩ）反応または遅延型過敏（ＤＴＨ）。最初の３タイプの免疫反応とは対照的に、この過敏反応は、Ｂリンパ球によって産生された抗体ではなくＴリンパ球によって媒介される。活性化Ｔリンパ球は、マクロファージ、Ｋ細胞およびＮＫ細胞（それらは局所の組織損傷を引き起こす）の蓄積および活性化をもたらすサイトカインを放出する。この反応は抗原チャレンジの１〜２日後に生じ得る。
【０２６３】
５．１０  遺伝子治療
特定の実施形態では、本発明のタンパク質をコードする核酸は、免疫学的疾患を治療するか、抑制するか、予防するために投与される。遺伝子治療とは、発現したかまたは発現し得る核酸を被験体に投与することによって行われる治療を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、それらがコードする治療効果をもたらすタンパク質を生産する。
【０２６４】
当技術分野において利用可能な遺伝子治療用の方法のうちのいずれも本発明によって使用することができる。典型的な方法を下に記載する。
【０２６５】
遺伝子治療方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８〜５０５頁；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７〜９５頁；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３〜５９６頁；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６〜９３２頁；ＭｏｒｇａｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１〜２１７頁；Ｍａｙ、１９９３、ＴＩＢＴＥＣＨ１、１（５）：１５５〜２１５頁参照。使用することができる組み換えＤＮＡ技術の技術中で一般によく知られた方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に記載されている。
【０２６６】
好ましい態様では、治療剤は抗体をコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、適当な宿主中で、抗体またはその断片、またはキメラタンパク質、重鎖または軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。そのような核酸配列は、特に、抗体コード領域に動作可能に連結したプロモーターを有し、このプロモーターは誘導的または構成的であり、場合によっては組織特異的である。別の特定の実施形態では、核酸分子は、抗体コード配列および他の所望の配列の側部が、ゲノム中の所望の部位で相同組み換えを促進する領域が備わっているようにして使用され、これによって抗体をコードする核酸は染色体内で発現する（（ＫｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２〜８９３５頁；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５〜４３８頁）。特定の実施形態では、発現された抗体分子は１本鎖抗体であるか、あるいは、核酸配列は、抗体の重・軽鎖の両方をコードする配列、またはその断片を含む。
【０２６７】
患者の体中への核酸の送達は、直接的（この場合は、被験体を直接に核酸または核酸保有ベクターにさらす）、間接的（この場合には、細胞は、核酸で最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質転換され、次に、患者へ移植される）のいずれでもよい。これらの２つのアプローチは、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療またはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療として、それぞれ知られている。
【０２６８】
特定の実施形態では、核酸配列はｉｎ  ｖｉｖｏで直接投与され、ｉｎ  ｖｉｖｏでそれは発現し、コードされた産物を産生する。これは、当技術分野で知られた多数の方法のうちのいずれによってでも、例えば、適当な核酸発現ベクターの一部としてそれらを構築し、核酸配列が細胞内に入るようにベクターを処理することにより行うことができる。遺伝子治療ベクターは、不完全なまたは減弱されたレトロウイルスその他のウイルスベクター（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号参照）を使用するか、むき出しのＤＮＡの直接注入；微粒子打ち込み（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ））の使用；脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクト剤によるコーティング；リポソーム、微粒子またはマイクロカプセル中のカプセル化；核内に入ることが知られているペプチドに連結しての投与；受容体を媒介としたエンドサイトーシスを受けるリガンドに連結しての投与（例えば、ＷｕとＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２頁参照）（これは特に受容体を発現する細胞タイプを標的とするのに使用できる）、などを使用して感染させ投与することができる。別の実施形態では、リガンドがエンドソームを破壊する融合誘導性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスペプチドを含む核酸−リガンド複合体を形成することができ、これにより、核酸がリソソーム分解を受けるのを回避することができる。さらに別の実施形態では、特定の受容体を標的とすることにより、核酸はｉｎ  ｖｉｖｏで細胞特異的取り込みおよび発現の標的とすることができる（例えば、国際公開ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；Ｗ０９２／２０３１６；Ｗ０９３／１４１８８およびＷＯ９３／２０２２１参照）。あるいは、核酸は細胞内で導入し、相同組み換えによって発現のため宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる（ＫｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２〜８９３５頁；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５〜４３８頁）。
【０２６９】
特定の実施形態では、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１〜５９９頁参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含む。遺伝子治療で使用される抗体をコードする核酸配列は、１つまたは複数のベクターへクローニングし、これにより、患者への遺伝子の送達を促進する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら、１９９４、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９  １〜３０２頁に見ることができ、これは、幹細胞に大きな化学療法耐性を与えるために造血幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用について記載したものである。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例証する他の参考文献は以下のとおりである：Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４〜６５１頁；Ｋｌｅｉｎら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７〜１４７３頁；ＳａｌｍｏｎｓとＧｕｎｚｂｅｒｇ、１９９３、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９〜１４１頁；およびＧｒｏｓｓｍａｎとＷｉｌｓｏｎ、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０〜１１４頁。
【０２７０】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを媒介としたトランスフェクションまたはウイルス感染などの方法によって組織培養中の細胞に遺伝子（例えば、ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１遺伝子）を輸送することを含む。通常、輸送の方法は、細胞への選択可能なマーカーの輸送を含む。次いで、輸送された遺伝子を発現している細胞を単離するために、細胞を選択下に置く。次いで、それらの細胞を被験体に送達する。
【０２７１】
この実施形態では、核酸は、生じた組み換え細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで投与する前に細胞に導入する。このような導入は、当技術分野で知られた任意の方法によって行うことができ、トランスフェクション、エレクトロポレーション、顕微注入（マイクロインジェクション）、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体を媒介とした遺伝子導入、ミクロセル媒介遺伝子トランスファー、スフェロプラスト融合などを含む（ただし、これらに限定されない）。細胞中への外来遺伝子の導入には、多数の技術が当技術分野で知られており（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒとＢｅｈｒ、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９〜６１８頁；Ｃｏｈｅｎら、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８〜６４４頁；Ｃｌｉｎｅ、１９８５、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９〜９２頁参照）、レシピエント細胞の発達や生理学上の機能を妨げない限り、本発明において使用することができる。こうした技術は、核酸を細胞に安定的に輸送させなければならない（その結果、核酸は細胞によって発現できて、好ましくはその細胞の子孫によって遺伝および発現可能なものとなる）。
【０２７２】
得られた組み換え細胞は、当技術分野で知られた様々な方法によって患者に送達することができる。好ましくは組み換え血球（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）を静脈内に投与する。使用のために考えられる細胞の量は、目的とする効果や患者の状態などによる。また、当業者はその細胞を決定することができる。
【０２７３】
核酸を遺伝子治療の目的のために導入することが可能な細胞は、利用可能ないずれの所望の細胞タイプも包含し、繊維芽細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血球；様々な幹細胞や前駆細胞、特に造血幹細胞や前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるもの等を含む（ただし、これらに限定されない）。
【０２７４】
好ましい実施形態では、遺伝子治療のために使用される細胞は患者自身に由来するものである。
【０２７５】
組み換え細胞が遺伝子治療で使用される実施形態では、抗体をコードする核酸配列は、細胞またはそれらの子孫によって発現できるように細胞に導入され、次いで、組み換え細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで治療効果を示すように投与される。特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞が使用される。単離することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持することができるものであれば、どのような幹細胞および／または前駆細胞も本発明の実施形態に従って使用することができる可能性がある（例えば、国際公開ＷＯ９４／０８５９８；ＳｔｅｍｐｌｅとＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２、Ｃｅｌｌ  ７１：９７３〜９８５頁；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ、１９８０、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９；およびＰｉｔｔｅｌｋｏｗとＳｃｏｔｔ、１９８６、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．６１：７７１参照）。
【０２７６】
特定の実施形態では、遺伝子治療の目的で導入する核酸は、コード領域に動作可能に連結された誘導可能なプロモーターを含んでおり、それにより、核酸の発現が、適当な転写誘導剤の有無を調節することにより制御可能であるようになっている。
【０２７７】
本発明の化合物または医薬組成物は好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験し、次いで、ヒトで使用する前に所望の治療または予防する活性についてｉｎ  ｖｉｖｏで試験する。例えば、タンパク質または医薬組成物の治療または予防剤としての有用性を実証するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、活性化リンパ球に対するそのタンパク質または医薬組成物の判定を決定することを含む。活性化リンパ球に対するタンパク質または組成物の細胞傷害作用および／または細胞静止作用は当業者に知られた技術を利用して判定することができる。あるいは、具体的なタンパク質または医薬組成物についてその投与効果が示されるかどうか決めるために使用できるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養を含み、ここでは、被験体から得た活性化リンパ球を含むリンパ球を培地で培養し、タンパク質または医薬組成物にさらし（また、さらさずに）、活性化リンパ球に対するそのような化合物の影響を観察する。
【０２７８】
５．１１  組成物の治療／予防のための投与
本発明は、活性化リンパ球に細胞傷害作用または細胞静止作用がある有効量のＣＤ３０−結合タンパク質（すなわち、本発明のタンパク質）、前記ＣＤ３０−結合タンパク質をコードする核酸（すなわち、本発明の核酸）または本発明のタンパク質もしくは核酸を含む医薬組成物（以下、本発明の医薬剤）を被験体に投与することによる、治療および予防方法を提供する。
【０２７９】
本発明の治療および予防方法の結果は、患者において少なくとも健康上の利益（以下を含むが、これらに限定されない：患者の延命、免疫障害症状の発症を遅らせること、および／または発症後に免疫障害の症状を緩和すること）を生じることである。そのような健康上の利益は、疾患の進行を抑制しかつ／または疾患の徴候を軽減することができる。
【０２８０】
本明細書で使用する場合、「予防」という用語は、問題とする免疫疾患の徴候または分子レベルでの前兆が出る前に、患者に（例えば、問題とする免疫疾患の素因をもった、または免疫疾患に罹患するリスクの高い個人に）本発明のタンパク質または核酸の投与することを指す。対照的に、「治療」という用語は、免疫疾患の症状または分子レベルでの前兆が出た後のどのような臨床段階であっても、本発明のタンパク質または核酸を患者に投与することを指す。
【０２８１】
好ましい実施形態では、本発明のタンパク質はモノクローナル抗体ＡＣ１０もしくはＨｅＦｉ−１、またはそれらの断片か誘導体である。好ましい態様では、本発明の医薬剤は実質的に精製された（例えば、その結果を制限するか、望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）本発明のタンパク質または核酸を含む。
【０２８２】
被験体は好ましくは動物であり、好ましくは哺乳動物であって、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含む（ただし、これらに限定されない）。最も好ましくは、被験体はヒトである。
【０２８３】
使用することができる処方(製剤)および投与方法は上に記載されている。これ以外の適当な処方および投与ルートは本明細書において下に記載するものの中から選択できる。
【０２８４】
様々な送達システムが知られており、本発明の核酸またはタンパク質を投与するために使用することができる（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組み換え細胞、受容体を媒介としたエンドサイトーシス（例えば、ＷｕとＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２頁参照）、レトロウイルスまたは他のベクターなどの一部としての核酸の構築など）。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口での経路が含まれるが、これらに限定されない。本発明の核酸およびタンパク質は、任意の便利なルートによって、例えば、点滴やボーラス注射によって、上皮または粘膜裏面（例えば、口内粘膜、直腸や腸の粘膜など）による吸収によって投与してもよいし、化学療法剤などの他の生物学に活性な薬剤と共に投与してもよい（５．２．１節参照）。投与は全身的でもよいしまたは局所的でもよい。
【０２８５】
特定の実施形態では、注入により、カテーテルにより、坐薬により、またはインプラントにより核酸またはタンパク質を投与することが望ましいかもしれない。前記インプラントは、多孔性、非多孔性、ゼラチン状材料でもよいし、あるいは、弾性膜などの膜や繊維を含む。本発明のタンパク質（抗体を含む）を投与する場合、好ましくは、タンパク質を吸収しない材料を用いるように注意すべきである。
【０２８６】
別の実施形態では、化合物または組成物は小胞、特にリポソーム中に入れて送達することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３頁；Ｔｒｅａｔら、１９８９、ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３５３〜３６５頁；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、前掲、３１７〜３２７頁参照；一般的には前掲書参照）。
【０２８７】
さらに別の実施形態では、化合物または組成物は徐放性システムで送達することができる。１つの実施形態では、ポンプを使用してもよい（前掲のＳｅｆｔｏｎ、１９８９、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４参照）。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９７４、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、１９８４、ＳｍｏｌｅｎとＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ、１９８３、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；およびＬｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５参照）。
【０２８８】
他の徐放性システムは、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３頁による総説で議論される。
【０２８９】
本発明の核酸を投与する特定の実施形態では、核酸は適当な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築しそれが細胞内に入るようにｉｎ  ｖｉｖｏで投与すること、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号参照）の使用によって、または直接の注入によって、または微粒子打ち込み（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ））の使用によって、または脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクト剤によるコーティング、またはホメオボックス様ペプチド（これは、核内に入ることが知られている（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４〜１８６８頁）に連結してそれを投与することによって、それがコードするタンパク質の発現を促進することができる。あるいは、細胞内に核酸を導入し、相同組み換えによって発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０２９０】
上に示唆したように、本発明はさらに医薬組成物（本発明の医薬剤）を提供する。そのような組成物は、治療上有効な量の本発明の核酸またはタンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む。特定の実施形態では、「薬学的に許容できる」という用語は、連邦政府の管轄機関または州政府によって承認されているか、米国薬局方その他一般に、動物での使用、特にヒトにおける使用のための調剤書と認識されているものにリストされていることを意味する。「担体」という用語は、それによって治療剤が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような製薬上の担体は、無菌の液体、例えば、水および油であり、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油その他を含む。医薬組成物を静脈内で投与する場合、水は好ましい担体である。食塩溶液およびデキストロース水溶液およびグリセリン溶液も特に注射可能な溶液のために液体の担体として使用することができる。適当な製薬上の賦形剤は、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物はまた、必要であれば、小量の湿潤剤、または乳化剤、ｐＨ緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、パウダー、徐放性製剤その他の形態をとることができる。組成物は、慣用の結合剤、およびトリグリセリドなどの担体と共に坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、製薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。適当な製薬の担体の例はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、被験体に投与するのに適当な形態とするために、適当量の担体と一緒に、治療上有効な量の本発明の核酸またはタンパク質（好ましくは精製した形で）を含むであろう。製剤は、投与形態に適したものとするべきである。
【０２９１】
好ましい実施形態では、本発明の医薬剤は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として慣用の手順に従って製剤化する。典型的には、静脈内投与用の組成物は無菌の等張性水性緩衝液である。必要であれば、本発明の医薬剤は、可溶化剤および注入部位での痛みを緩和するためにリグノカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、成分は、別々に提供されるか、単位剤形で、例えば、無水の凍結乾燥パウダーまたは活性物質の量を表示したアンプルや小袋などの気密封止容器内に無水高濃度液としてまたは単位剤形で互いに混合状態で提供する。本発明の医薬剤を点滴によって投与する場合、それは無菌の製薬等級の水または食塩水を含む点滴瓶で小分けすることができる。本発明の医薬剤を注射で投与する場合、注射用の無菌水または生理食塩水アンプルを提供し、投与の前に成分を混合できるようにしてもよい。
【０２９２】
標準的な臨床技術によって、免疫学的疾患の治療または予防に有効な本発明の核酸またはタンパク質の量を決定できる。さらに、場合によっては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて最適の投薬量範囲を同定する助けとしてもよい。製剤化で使用する正確な用量は、投与経路および免疫学的疾患の段階にも依存し、医師の判断および各被験体の状況に応じて決定すべきである。有効用量はｉｎ  ｖｉｔｒｏの動物モデル試験システムから得た投与応答曲線から外挿することができる。
【０２９３】
５．１２  免疫学的疾患の治療のための併用療法
本発明の核酸およびタンパク質は、免疫学的疾患の治療および予防のため、１種または複数の細胞静止剤、細胞傷害性薬剤および／または免疫抑制剤と一緒に投与することができる。さらに、併用治療は、活性化リンパ球表面上のＣＤ３０以外の受容体または受容体複合体を標的とする薬剤の投与を含んでもよい。そのような薬剤の例は、活性化リンパ球の表面で分子に結合する、第２の、つまり、非ＣＤ３０抗体である。別の例はそのような受容体または受容体複合体を標的とするリガンドである。好ましくは、このような抗体またはリガンドは、活性化リンパ球上の細胞表面受容体に結合し、活性化リンパ球に細胞静止性または細胞傷害シグナルを送達することにより、抗ＣＤ３０抗体の細胞傷害作用または細胞静止作用を増強する。
【０２９４】
このような併用投与は疾患パラメーターに対して付加的または相乗的な効果を有し得る。
【０２９５】
治療レジメに関して、特定の実施形態では、本発明の核酸またはタンパク質は、リンパ球の細胞表面受容体または受容体複合体を標的とする免疫抑制剤または分子と同時に投与する。別の特定の実施形態では、免疫抑制剤またはリンパ球の細胞表面受容体を標的とする薬剤を、本発明の核酸またはタンパク質の投与前または投与後、少なくとも１時間から数カ月（例えば、少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週、１カ月、３カ月）に投与する。
【０２９６】
５．１２．１  免疫抑制剤、細胞傷害性薬剤および細胞静止剤
本発明の併用治療法を実施するための免疫抑制剤、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤の有用な種類は、以下の互いに排他的ではない薬剤種を含む：アルキル化剤、アントラサイクリン類、抗生物質、抗葉酸類、代謝拮抗剤、抗チューブリン剤、オーリスタチン類、化学療法増感剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、デュオカルマイシン類、エトポシド類、フッ素化ピリミジン類、レキシトロプシン類、ニトロソ尿素類、プラチノール類、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド類、タキサン類、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド（ただし、これらに限定されない）。
【０２９７】
本発明によって包含される個々の免疫抑制剤、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤は、男性ホルモン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニン、スルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５、クロラムブチル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンＢ、デカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサトロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テポノシド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンオレルビン、ＶＰ−１６、ＶＭ−２６を含む（ただし、これらに限定されない）。
【０２９８】
好ましい実施形態では、免疫抑制剤、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤は代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、プリンアンタゴニスト（例えばアゾチオプリン、ミコフェノレートモフェチル）、ジヒドロ葉酸還元酵素抑制剤（例えば、メトトレキサート）、アシクロビル、ガングシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジン・アラビノシッド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネットおよびトリフルウリジンであり得る。
【０２９９】
別の好ましい実施形態では、免疫抑制剤、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤は、タクロリムス、シクロスポリンまたはラパマイシンである。
【０３００】
別の好ましい実施形態では、免疫抑制剤は、グルココルチコイドまたはグルココルチコイドの類似体である。本発明の方法において有用なグルココルチコイドの例は、コルチゾールとアルドステロンを含む。本発明の方法において有用なグルココルチコイド類似体の例はプレドニゾンとデキサメタゾンを含む。
【０３０１】
さらに別の好ましい実施形態では、免疫抑制剤は、アリールカルボン酸誘導体からなるもの、ピラゾール含有誘導体、オキシカム含有誘導体およびニコチン酸誘導体などの抗炎症剤である。本発明の方法において有用な抗炎症剤のクラスには、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤およびロイコトリエン受容体アンタゴニストを含む。
【０３０２】
適当なシクロオキシゲナーゼ阻害剤はメクロフェナム酸、メフェナム酸、カルプロフェン、ジクロフェナク（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）、ジフルニサル（ｄｉｆｌｕｎｉｓａｌ）、フェンブフェン（ｆｅｎｂｕｆｅｎ）、フェノプロフェン（ｆｅｎｏｐｒｏｆｅｎ）、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、ナブメトン（ｎａｂｕｍｅｔｏｎｅ）、ナプロキセン、スリンダック、テノキシカム（ｔｅｎｏｘｉｃａｍ）、トルメチン（ｔｏｌｍｅｔｉｎ）およびアセチルサリチル酸が含まれる。
【０３０３】
適当なリポキシゲナーゼ阻害剤は、酸化還元反応阻害剤（例えばカテコール・ブタン誘導体、ノルジヒドログアヤレト（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ）酸（ＮＤＧＡ）、マソプロコール（ｍａｓｏｐｒｏｃｏｌ）、フェニドン（ｐｈｅｎｉｄｏｎｅ）、イアノパレン（Ｉａｎｏｐａｌｅｎ）、インダゾリノン類、ナファザトロム（ｎａｐｈａｚａｔｒｏｍ）、ベンゾフラノール、アルキルヒドロキシルアミン）、および非酸化還元反応阻害剤（例えば、ヒドロキシチアゾール類、メトキシアルキルチアゾール類、ベンゾピラン類およびその誘導体、メトキシテトラヒドロピラン、ボスウェル（ｂｏｓｗｅｌｌｉｃ）酸、およびボスウェル酸のアセチル化誘導体、シクロアルキル残基で置換されたキノリンメトキシフェニル酢酸）ならびに酸化還元反応阻害剤の前駆体を含む。
【０３０４】
他の適当なリポキシゲナーゼ阻害剤は、酸化防止剤（例えば、フェノール、没食子酸プロピル、フラボノイド、および／またはフラボノイドを含む天然基質、フラボン類のヒドロキシル化された誘導体、フラボノール、ジヒドロケルセチン、ルテオリン、ガランギン、オロボール（ｏｒｏｂｏｌ）、チャルコーン（ｃｈａｌｃｏｎｅ）の誘導体、４，２’，４’−トリヒドロキシチャルコーン、オルト−アミノフェノール類、Ｎ−ヒドロキシ尿素、ベンゾフラノール類、エブセレン（ｅｂｓｅｌｅｎ）および還元性セレノ酵素の活性を増大させる種）、鉄キレート剤（例えば、ヒドロキサム酸およびその誘導体、Ｎ−ヒドロキシ尿素、２−ベンジル−１−ナフトール、カテコール類、ヒドロキシルアミン類、ｃａｒｎｏｓｏｌ  ｔｒｏｌｏｘ  Ｃ、カテコール、ナフトール、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）、ザイリュートン（ｚｙｌｅｕｔｏｎ）、５−ヒドロキシアントラニル酸および４−（オメガ−アリールアルキル）フェニルアルカン酸）、イミダゾール含有化合物（例えば、ケトコナゾールおよびイトラコナゾール）、フェノチアジンおよびベンゾピラン誘導体を含む。
【０３０５】
さらに他の適当なリポキシゲナーゼ阻害剤は、エイコサノイド類（例えば、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサヘキサエン酸、およびドコサヘキサエン酸およびそれらのエステル、ＰＧＥ１（プロスタグランジンＥ１）、ＰＧＡ２（プロスタグランジンＡ２）、ビプロストール（ｖｉｐｒｏｓｔｏｌ）、１５−モノヒドロキシエイコサテトラエン酸、１５−モノヒドロキシエイコサトリエン酸および１５−モノヒドロキシエイコサペンタエン酸、およびロイコトリエンＢ５、Ｃ５およびＤ５）の阻害剤、およびカルシウム流動の妨害剤、フェノチアジン、ジフェニルブチルアミン類、ベラパミル、フスコシド（ｆｕｓｃｏｓｉｄｅ）、クルクミン、クロロゲン酸、カフェー酸、５，８，１１，１４−エイコサテトライエン（ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｙｅｎｏｉｃ）酸（ＥＴＹＡ）、ヒドロキシフェニルレチナミド（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｒｅｔｉｎａｍｉｄｅ）、イオナパレン（Ｉｏｎａｐａｌｅｎ）、エスクリン、ジエチルカルバマジン、フェナントロリン、バイカレイン（ｂａｉｃａｌｅｉｎ）、プロキシクロミル（ｐｒｏｘｉｃｒｏｍｉｌ）、チオエーテル類、ジアリル・スルフィドおよびジ（１−プロペニル）スルフィドを含む。
【０３０６】
ロイコトリエン受容体アンタゴニストは、カルシトリオールおよびオンタゾラスト（ｏｎｔａｚｏｌａｓｔ）、Ｂａｙｅｒ  Ｂａｙ−ｘ−１００５、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  ＣＧＳ−２５０１９Ｃ、エブセレン、Ｌｅｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  ＥＴＨ−６１５、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ−２９３１１１、Ｏｎｏ  ＯＮＯ−４０５７、Ｔｅｒｕｍｏ  ＴＭＫ−６８８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ  ＢＩ−ＲＭ−２７０、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２１３０２４、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２６４０８６、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２９２７２８、Ｏｎｏ  ＯＮＯ  ＬＢ４５７、Ｐｆｉｚｅｒ  １０５６９６、Ｐｅｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＰＦ  １００４２、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＰ  ６６１５３、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＢ−２０１１４６、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＢ−２０１９９３、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＢ−２０９２４７、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５３２２８、Ｓｕｍｉｔａｍｏ  ＳＭ  １５１７８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＷＡＹ  １２１００６、Ｂａｙｅｒ  Ｂａｙ−ｏ−８２７６、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  ＣＩ−９８７、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  ＣＩ−９８７ＢＰＣ−１５ＬＹ  ２２３９８２、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ  ２３３５６９、Ｌｉｌｌｙ  ＬＹ−２５５２８３、ＭａｃｒｏＮｅｘ  ＭＮＸ−１６０、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．ＭＫ−５９１、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  ＣＯ．ＭＫ−８８６、Ｏｎｏ  ＯＮＯ−ＬＢ−４４８、Ｐｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＰＦ−５９０１、  Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＧ  １４８９３、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＰ  ６６３６４、  Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ  ＲＰ  ６９６９８、Ｓｈｉｏｎｏｏｇｉ  Ｓ−２４７４、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−４１９３０、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５０５０５、Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５１１４６、  Ｓｅａｒｌｅ  ＳＣ−５２７９８、  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  ＳＫ＆Ｆ−１０４４９３、Ｌｅｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  ＳＲ−２５６６、Ｔａｎａｂｅ  Ｔ−７５７  およびＴｅｉｊｉｎ  ＴＥＩ−１３３８を含む。
【０３０７】
本発明のある好ましい実施形態では、免疫抑制性剤、細胞傷害性薬剤または細胞静止剤は、別々に投与されるのではなく本発明の抗体にコンジュゲートする。本発明の方法において有用な抗体−薬剤コンジュゲートは、上記５．６節に記載されている。
【０３０８】
５．１２．２  リンパ球受容体ターゲティング剤
本発明の併用方法において特に有用な薬剤は、リンパ球細胞表面へ結合する分子、好ましくはＣＤ３０とは異なる受容体または受容体複合体に対して結合する分子である。ＣＤ３０に加えて、リンパ球表面上で発現された種々様々の受容体または受容体複合体が、様々なリンパ球サブセットの増殖、分化および機能の調節に関与している。そのような分子は、例えば、活性化リンパ球に追加的な細胞増殖抑止シグナルまたは細胞傷害シグナルを与えるべく標的とすることができる。
【０３０９】
１つの実施形態では、ＣＤ３０を並んで標的とするための適当な受容体は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである、これは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＩＣＯＳを含むが、これらに限定されない（Ｂａｒｃｌａｙら、１９９７、Ｔｈｅ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ、２ｎｄ  ｅｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ＣｏｙｌｅとＧｕｒｔｉｅｒｒｅｚ−Ｒａｍｏｓ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２０３〜２０９頁）。別の実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーを標的とすることができる。これは、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦＲ−２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、またＡＰＯ−３を含むが、これらに限定されない（Ｌｏｃｋｓｌｅｙら、２００１、Ｃｅｌｌ、１０４、４８７〜５０１頁）。さらに別の実施形態では、インテグリンを標的とすることができる。これは、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３およびＣＤ１０４を含むが、これらに限定されない（Ｂａｒｃｌａｙら、１９９７、Ｔｈｅ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ、２ｎｄ  ｅｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。さらに別の実施形態では、ＣＤ３０に加えて標的とするための適当な受容体はサイトカイン受容体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、２００１、Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ、２ｎｄ  ｅｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ケモカイン受容体（ＬｕｔｈｅｒとＣｙｓｔｅｒ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１０２〜１０７頁、ＧｅｒａｒｄとＲｏｌｌｉｎｓ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１０８〜１１５頁）、主要組織適合性タンパク質、レクチン（Ｃ−タイプ、Ｓ−タイプまたはＩ−タイプ）または補体制御タンパク質である。
【０３１０】
１つの実施形態では、これらの非ＣＤ３０受容体または受容体複合体に結合する薬剤は、活性化リンパ球に細胞静止シグナルまたは細胞傷害シグナルを送達することによりＣＤ３０結合剤（例えば抗ＣＤ３０抗体）の細胞傷害作用または細胞静止作用を増強する。本発明の抗ＣＤ３０分子との組合せによれば、標的とされたリンパ球中では増殖阻害またはアポトーシスに対する追加的または相乗的な効果を達成することができる。
【０３１１】
別の実施形態では、これらの受容体または受容体の複合体に対する薬剤は、それ自体が増殖阻害剤またはアポトーシス剤である必要はなく、ＣＤ３０結合剤と組み合わさって、ＣＤ３０結合剤単独で引き起こされる以上の増殖阻害またはアポトーシスに対する増強効果を達成できる。ある特定の実施形態では、所与の量または濃度のＣＤ３０結合剤の細胞静止作用または細胞傷害活性に対して、増強効果はほぼ５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、または１００％以上の増強である。１つの実施形態では、増強効果は、ＣＤ３０結合剤のＥＤ５０のおよそ５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％の減少として示され、すなわち、同じ細胞傷害作用または細胞静止作用を達成できるＣＤ３０結合剤の量は、ＣＤ３０以外の受容体または受容体の複合体に結合するそのような薬剤の投与がない状態で、同じ細胞傷害作用または細胞静止作用を達成するのに必要な量より少なくなる。
【０３１２】
１つの実施形態では、本発明の方法による非ＣＤ３０受容体または受容体複合体のターゲティングは、リガンドの投与により達成され得る。
【０３１３】
別の実施形態では、ターゲティングは、受容体または受容体複合体に対する抗体の投与により達成され得る。抗体は、上記５．１節および５．４節で記載したポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、エピトープ結合抗体断片または抗ＣＤ３０誘導体と等価な別のタイプの抗体誘導体であり得る。ある特定の実施形態では、５．１節および５．４節で記載したように、抗体は多価抗体またはＣＤ３０結合部分を含むヘテロコンジュゲートである。
【０３１４】
当業者には認識されるように、抗ＣＤ３０との同時投与に適した多数の抗体が、当技術分野で知られている。下にそのような抗体の典型的な例を挙げる（ただし、これらに限定されない）：抗ＣＤ２抗体はＢＴＩ−３２２（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）およびＵＭＣＤ２を含む；抗ＣＤ３抗体はＯＫＴ３、「ＳＭＡＲＴ」抗ＣＤ３（Ｎｕｖｉｏｎ（商標）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＦＮ１８、ＵＣＨＴ１、１４５−２Ｃ１１およびＨＩＴ３ａを含む；抗ＣＤ５抗体はＨＩ２１１（６Ｔ−００３）、ＨＩＳＭ２（６Ｔ−００４）、ＭＥＭ−１２８（６Ｔ−０１４）、７．８（６Ｔ−０８０、ＯＫＴ１、ＵＣＨＴ２およびＢＬ１ａを含む；抗ＣＴＬＡ−４抗体は１１Ｄ４、１０Ａ８、７Ｆ８、４Ｆ１０、ＡＮＣ１５２．２／８Ｈ５およびＢＮＩ３．１を含む；また抗ＰＤ−１は抗体Ｊ４３を含む。
【０３１５】
多数の受容体または受容体の複合体に対して天然リガンドもわかってきている（Ｂａｒｃｌａｙら、１９９７、Ｔｈｅ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ、２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｇｕｒｔｉｅｒｒｅｚ−Ｒａｍｏｓ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２０３〜２０頁；Ｌｏｃｋｓｌｅｙら、２００１、Ｃｅｌｌ  １０４：４８７〜５０１頁）。下記にそのようなリガンドの例を挙げる（ただし、これらに限定されない）：ＬＦＡ−３（ＣＤ２に対するリガンド）；ＣＤ８０およびＣＤ８６（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対するリガンド）；ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２（ＰＤ−１に対するリガンド）；Ｂ７ＲＰ−１（ＩＣＯＳに対するリガンド）；ＣＤ７０（ＣＤ２７に対するリガンド）；ＣＤ１５４（ＣＤ４０に対するリガンド）；ＦａｓＬ（ＣＤ９５／Ｆａｓに対するリガンド）；ＴＮＦα（ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２に対するリガンド）；ＴＲＡＮＣＥ（ＲＡＮＫに対するリガンド）、ＡＰＲＩＬ（ＴＡＣＩに対するリガンド）；ＢＬＹＳ（ＢＣＭＡに対するリガンド）、ＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、−Ｒ２、−Ｒ３およびＲ４に対するリガンド）；およびＴＷＥＡＫ（ＡＰＯ−３に対するリガンド）。
【０３１６】
５．１３  有効投与量
本発明のタンパク質および組成物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験の動物での標準的な薬学的手順、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な効果がある用量）により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０としてそれを表現することができる。より大きな治療指数を示すタンパク質が好ましい。有毒な副作用を示すタンパク質を使用してもよい場合は、感染の影響を受けた組織部位を標的としてそのようなタンパク質を送達するシステムを設計して感染していない細胞への潜在的な損害を最小限にし、副作用を低減するべきである。
【０３１７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを使用して、ヒトで使用する投薬量範囲を配合することができる。そのようなタンパク質の投与量は、好ましくはＥＤ５０以下を含む血中濃度となる範囲である。投与量は、この範囲内で、使用した投薬形式および利用する投与経路に依存して変わり得る。本発明の方法で使用する任意の化合物について、治療上有効な投与量はまず、細胞培養アッセイから評価することができる。細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、最大で症状の半数の阻害を達成する試験化合物濃度）を含む循環血中の血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルに投薬量を処方してもよい。そのような情報は、より正確にヒト中の有用な用量を決定するために使用することができる。血漿中濃度は例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定できる。
【０３１８】
一般に、免疫学的疾患患者に投与された本発明の医薬剤中の本発明のタンパク質の投与量は、典型的には患者の体重に対し０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される投与量は、患者の体重に対し０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまでである。一般に、外来タンパク質には免疫反応があるため、ヒト抗体は、他の種からの抗体より人体内で長い半減期を有する。したがって、多くの場合、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体の投与量は低くてもよいし投与回数も少なくてよい。
【０３１９】
５．１４  製剤
本発明に従って使用する医薬組成物は、１種または複数の生理学的に許容できる担体または賦形剤を使用して、慣用の方法で製剤化できる。本発明の抗ＣＤ３０抗体を含む医薬組成物はさらに、上記５．１２．２節に記載した抗体などの第２の抗体または上記５．１２．１節で挙げた免疫抑制剤などの免疫抑制剤を含む。
【０３２０】
したがって、タンパク質および生理学的に許容されるそれらの塩類および溶媒和物は、吸入すなわち通気（口または鼻のいずれかを通って）による投与または経口、バッカル、非経口、直腸の投与に対して処方してもよい。
【０３２１】
経口投与については、医薬組成物は、慣用の手段によって、結合剤（例えば、予めゲル化させてあるコーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピル・メチルセルロース）などの薬学的に許容できる賦形剤；充填剤（例えば、乳糖、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石または珪酸）；崩壊剤（例えば、ポテト・スターチまたはナトリウムスターチグリコレート）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）と共に、例えば、錠剤またはカプセルの形を取ることができる。錠剤は、当技術分野においてよく知られている方法によってコーティングしてもよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形式をとることができ、または、その使用前に水または他の適当なビヒクルで構成する乾燥した製品として提供することもできる。そのような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性のビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留によって得られた植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容できる添加剤と共に慣用の手段によって調製することができる。適当であれば、製剤はさらに緩衝塩類、香味剤、着色料、および甘味剤を含んでもよい。
【０３２２】
経口投与製剤は活性な化合物に徐放性を与えるように製剤化するのが適している。
【０３２３】
バッカル投与のためには、組成物が、従来の方法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形を取ることができる。
【０３２４】
吸入による投与のためには、本発明により使用するタンパク質は、従来通り、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素その他の適当なガスを使用した加圧充填物またはネビュライザーからのエアロゾル・スプレーの形で提供するのが便利である。加圧エアロゾルの場合、一定量を送達するためにバルブを設けることにより投与ユニットを決定してもよい。吸入器や通気器で使用する例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物のパウダーミックス、および乳糖またはデンプンなどの適当なパウダーベースを含んで処方してもよい。
【０３２５】
タンパク質は、非経口投与のために、注入によって、例えば、ボーラス注入か連続点滴によって投与してもよい。注入のための製剤は、例えば、アンプルや多数回投与用容器に入れて単位剤形の形で提供してもよいし、保存剤を添加してもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中における懸濁液、溶液または乳剤などの形をとることができるし、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。あるいは、活性成分は、使用前に、適当なビヒクル（例えば、発熱素を含まない滅菌水）で構成するためのパウダー形式でもよい。
【０３２６】
タンパク質は、例えば、カカオ脂または他のグリセリドのような慣用の坐薬基剤を含む坐薬または保持浣腸剤のような直腸組成物として製剤化することもできる。
【０３２７】
これまでに記載した製剤に加え、タンパク質は、デポー製剤として製剤化することもできる。そのような長期処方は、埋込み（例えば、皮下にまたは筋肉内に）によって、または筋肉注射によって投与できる。したがって、例えば、タンパク質は、適当な重合体または疎水性材料（例えば、許容される油中乳剤としての）またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として処方してもよい。
【０３２８】
組成物は、必要であれば、活性成分を含む１または複数のユニット剤形を含むパックまたはディスペンサー装置に入れて提供してもよい。パックは、例えばブリスターパックのような、金属またはプラスチック箔を含む。パックまたはディスペンサー装置には、好ましくはヒトへの投与のために説明書きを付けてもよい。
【０３２９】
本発明は、本願明細書に記載した特定の実施形態によってその範囲が制限されるものではない。実際に、当業者には、本願明細書で記載したものに加えて、上記記載および添付図面から本発明の様々な改変は明らかであろう。そのような改変は、添付する特許請求の範囲以内にあるものと意図される。
【０３３０】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、これらは、本発明の範囲を限定するように意図するものではない。
【実施例１】
【０３３１】
６．ジャーカット・ヒトＴリンパ球系統上でのＣＤ３０の発現
ジャーカット細胞系統は、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体およびＴ細胞機能にかかわる他の重要な付属分子を発現する急性Ｔ白血病細胞系統である。本来のジャーカット細胞系統に由来するサブラインは、多数の受容体系（例えばＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））によって媒介されるシグナル経路を解明するためのモデル系として広範囲に用いられてきた。表面受容体への結合で開始されるジャーカットＴ細胞における多数のシグナル経路は、抗原チャレンジにさらされた正常なＴリンパ球で起こることが証明されている。ジャーカットＴ細胞は、ＣＤ３０を検出可能なレベルに構成的に発現すること（図１）が見出されており、したがって、それらは活性化リンパ球の中でのＣＤ３０の機能を検討するモデルシステムとなり得る。
【実施例２】
【０３３２】
７．抗ＣＤ３０  ｍＡＢで阻害されたＤＮＡ合成によるジャーカットＴ細胞でのＣＤ３０の架橋
ジャーカットＴ細胞の増殖に対する抗ＣＤ３０によるＣＤ３０を介したシグナル伝達作用を、トリチウムを含むチミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）組み込みアッセイによって評価した。ジャーカット細胞を、可溶性の抗ＣＤ３０の投与量を段階的に変えながら処理するか、または第２架橋抗体（Ａｂ）により抗ＣＤ３０架橋した。ｃＡＣ１０の第２架橋のために、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をヤギ抗ヒト（ＧＡＭ）ＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｏｖｅ、ＰＡ）のＦ（ａｂ’）２断片と培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭ非必須アミノ酸）中で混合した。ネズミ科の抗ＣＤ３０  ｍＡｂ（ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１）の第２架橋のためには、ｍＡｂを培地中でヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のＦ（ａｂ’）２断片と混合した。１次ｍＡｂと第２架橋抗体との間で１：２．５、１：５および１：１０の最終比を用いた。抗体カクテルは、室温で１５分間インキュベートした。次いで、培地中のこれらの抗体カクテルを連続的に希釈した希釈液を調製し、所望の最終濃度を達成した。次いで、抗体カクテル１００μｌを５０００個の細胞を含む１００μｌジャーカット細胞懸濁液と９６穴組織培養（ＴＣ）プレート中で混合した。細胞を抗体カクテルと４４時間インキュベートした後、１μＣｉの３Ｈ−ＴｄＲで４時間パルス処理した。次いで、細胞をフィルタ上に回収し、取り込まれたトリチウム化チミジンを、シンチレーション計数により測定した。処理した細胞からチミジン取り込み値を得て、次いで、これを未処理の対照培養物と比較した。
【０３３３】
第２架橋のないキメラなＡＣ１０（ｃＡＣ１０）は１μｇ／ｍｌ未満の濃度ではジャーカット細胞増殖を阻害しなかった。ｃＡＣ１０の第２のＡｂとの架橋は、ジャーカット細胞増殖を阻害するために必要とされるｃＡＣ１０の濃度を有意に低下させた。最大の阻害は、ｃＡＣ１０の濃度が０．１μｇ／ｍｌという低レベルで達成された（図２）。ＡＣ１０とＨｅＦｉ−１の両者とも、第２架橋抗体を使用した場合にはジャーカット細胞投与量に応じてチミジン取り込みを阻害した（図３）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの架橋抗体の使用は、単球、マクロファージ、Ｂリンパ球およびＮＫ細胞上でｉｎ  ｖｉｖｏで発現されるＦｃ受容体の抗体のＦｃ部分の結合を介して架橋をシミュレートするようである。第１と第２の架橋抗体間の１：１０の比率が増殖阻害に最も効果的なようであった。検出可能な阻害は、ＡＣ１０とＨｅＦｉ−１の両者について、０．００１μｇ／ｍｌより大きな１次抗体濃度で観察された。阻害の最大レベルは、０．１μｇ／ｍｌより大きな濃度で観察された。ＴＣウェル上に固定化したＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１も、ジャーカットＴ細胞増殖を阻害する点において活性であった（データは示していない）。
【実施例３】
【０３３４】
８．ジャーカット細胞における抗ＣＤ３０ｍＡｂにより誘導されるＤＮＡ断片化（アポトーシス）によるＣＤ３０の架橋
架橋抗ＣＤ３０  ｍＡｂによって処理したジャーカット細胞の細胞周期状態およびＤＮＡ応答の関係をさらに調べた。４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３０  ｍＡｂ  ＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１を（ＧＡＭ）ＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のＦ（ａｂ’）２断片と培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭ非必須アミノ酸）中、最終比（重量：重量）１：４で混合した。抗体カクテルを室温で１５分間インキュベートした。次いで、培地中、これらの抗体カクテルの１：１０連続希釈液を調製した。次いで、抗体カクテル１ｍｌを、０．２５×１０６細胞を含むジャーカット細胞懸濁液１ｍｌと１２穴ＴＣプレート中で混合した。
【０３３５】
２４時間または４８時間のインキュベーション後に、細胞を遠心分離によって回収し、３７℃で平衡に保った新鮮な培地２ｍｌに再懸濁した。活発にＤＮＡを合成している細胞をターゲティングするためにブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス所在（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））を用いた。１ｍＭのＢｒｄＵ水溶液２０μｌを、細胞懸濁液に添加し、３７℃で１５分間インキュベーションを継続した。次いで、細胞を遠沈し、ＰＢＳで１回洗浄し、氷冷ＰＢＳ０．５ｍｌ中に再懸濁した。細胞固定のため−２０℃の１００％エタノール１ｍｌを細胞懸濁液に滴下した。４℃３０分間の定着後、固定された細胞を遠沈した。細胞ペレットを０．５％のトライトンＸ−１００（シグマ）と２Ｍ  ＨＣｌ  １ｍｌに再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした後、細胞を遠沈した。ｐＨ８．５の０．１ＭＮａ２Ｂ４Ｏ７１ｍｌを用いて細胞ペレットを再懸濁し、室温で１０分間酸を中和した。次いで、細胞を遠心分離によってペレット化し、０．５％トゥイーン２０（シグマ）および１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳ５０μｌ、０．５％トゥイーン２０、１％ＢＳＡを用いて各細胞ペレットを再懸濁させ、これに、２５μｌのＦＩＴＣ標識した抗ＢｒｄＵ（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を添加し、細胞懸濁液を室温で、３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ、０．５％トゥイーン２０、１％ＢＳＡで２回洗浄し、次いで、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（シグマ）５μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ０．５ｍｌ中に再懸濁させ、細胞中のＤＮＡ含有量を定量した。次いで、ＤＮＡ合成および細胞周期状態をフローサイトメトリーによって検討した。
【０３３６】
図４は、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体で架橋したＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１のいずれかで処理した培養物中のＤＮＡ断片化を有するジャーカット細胞の外観を示す。ＤＮＡ断片化を伴う細胞は、Ｇ０／Ｇ１期のＤＮＡ含有量よりも少なく（図４の中の第１枠）、ＢｒｄＵを組み込まなかったＧ２／Ｍ期のＤＮＡ（つまり、活発にＤＮＡを合成していない細胞）含有量よりも少ないという事実によって表される（図４の中の第４枠）。ＤＮＡ断片化は２４および４８時間のインキュベーション後に検出できた。ジャーカット細胞のこのようなＤＮＡ断片化はアポトーシスの特性である。これらのデータは、図５中で示されるジャーカット細胞の増殖阻害には、ＣＤ３０シグナル伝達に応答してアポトーシスを行う細胞が伴っていたことを示唆する。ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１を段階的な投与量で投与した培養物からの細胞周期の異なる部分中の細胞のパーセンテージを集計すると、＞０．００２μｇ／ｍｌの濃度のＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１は、ジャーカット細胞において実質的にアポトーシスを誘導することができたこと（特に処理後４８時間（図５））が明らかであった。アポトーシス細胞の出現は、細胞周期のＧ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期における細胞のパーセンテージに対応してまったく同様に減少した（図５）。
【実施例４】
【０３３７】
９．ＣＤ３のＣＤ３０との同時架橋が、ジャーカットＴ細胞に誘導されるアポトーシスを増強した
活性化誘導細胞死（ＡＣＩＤ）は、自動反応的なリンパ球およびエフェクターリンパ球を除去し、それによってそれぞれ自己抗原への寛容性の付与、自己免疫反応の終結を行うために免疫系が使用する重要なメカニズムである。Ｔリンパ球上のＣＤ３／ＴＣＲ複合体またはＢリンパ球上のｓＩｇ／Ｂ細胞抗原受容体複合体の結合は、Ｔリンパ球とＢリンパ球を活性化する。抗原受容体結合および付属受容体を介したシグナル伝達の情況によって、リンパ球は増殖しエフェクター細胞に分化することができる。または、それらはアポトーシスを経ることになる。多くの付属受容体、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４−１ＢＢおよびＩＣＯＳはＢまたはＴリンパ球上の抗原受容体と共同刺激して、細胞の増殖および／または分化を促進する。したがって、それらは免疫反応の促進にとって重要である。一方、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１を含む付属受容体によるシグナル伝達は、リンパ球増殖および様々なリンパ球機能を阻害する。したがって、これらの受容体は自動反応的なリンパ球の除去に重要な役割を果たすかもしれない。それらはまた、エフェクターリンパ球の活性を抑えることにより免疫反応の終了に関係する。付属受容体によって媒介されるシグナル伝達経路の調節の欠陥が、自己免疫、アレルギー性および炎症性疾患に寄与しているのかもしれない。
【０３３８】
本発明者らは、リンパ球中のアポトーシスを調節する上で、ＣＤ３０シグナル伝達経路がＣＤ３／ＴＣＲ複合体のそれと協働するかという疑問を抱いた。ジャーカットＴ細胞を抗ＣＤ３０  ｍＡｂ単独で、抗ＣＤ３  ｍＡｂで、または抗ＣＤ３０および抗ＣＤ３  ｍＡｂの組合せで処理した。図４および図５について述べたようにして、抗体をヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃによって架橋した。細胞周期の分布は、図４におけるようにＢｒｄＵおよびＰＩ染色によって決定した。抗ＣＤ３０（ＡＣ１０）は、単独でジャーカットＴ細胞にアポトーシスを引き起こした。しかし、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス所在（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ））は培地（対照）と比較してどのような効果ももたらさなかった。しかし、抗ＣＤ３は、２４および４８時間のインキュベーション後に、抗ＣＤ３０によって誘導されるアポトーシスを大きく増強した。両方のｍＡｂを０．２μｇ／ｍｌで使用した時に、ＡＣ１０とＯＫＴ３の間における最良の相乗効果が観察された（図６）。
【０３３９】
形質膜の細胞外側の面に対するアネクシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖの結合とＰＩに対する膜透過性との結びつきを使用して、ジャーカット細胞における抗ＣＤ３０−誘導アポトーシスを別の面から検討した。ＧＡＭ抗体と架橋させた、ＡＣ１０、ＨｅＦｉ−１、ＯＫＴ３、ＡＣ１０＋ＯＫＴ３またはＨｅＦｉ−１＋ＯＫＴ３を含む抗体カクテルを、実施例２および３に記載したように調製した。１次ｍＡｂは、２μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。１０倍過剰のＧＡＭ抗体を使用して１次抗体を架橋した。室温で１５分間のインキュベーション後、抗体カクテルをジャーカット細胞に加えた。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キットＩ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をメーカーの指示によって使用してＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖの結合とＰＩへの浸透性によって、図７の中で指定した回数で、培養物中のアポトーシス性死細胞のパーセンテージを求めた。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−／ＰＩ−細胞は、生細胞であり（図７中の下左四分域）、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ＋／ＰＩ−細胞はアポトーシス細胞（図７中の下右四分域）、また、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ＋／ＰＩ＋細胞は死細胞（図７中の上右四分域）であった。図６に示すＰＩ／ＢｒｄＵ染色から得られたデータと一致して、ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１はインキュベーション後早くも４時間でジャーカット細胞に検出可能なアポトーシスを誘導した。抗ＣＤ３  ｍＡｂの存在は、ＡＣ１０およびＨｅＦｉ−１の影響を著しく増強した。アポトーシス細胞および死細胞のパーセンテージはインキュベーションを４８時間続ける間中、増加し続けた。これらのデータは、抗ＣＤ３ｍＡｂと抗ＣＤ３０  ｍＡｂの特定の組合せは、自己免疫、アレルギー反応および慢性炎症性疾患における免疫反応の抑制を制御するＣＤ３０陽性Ｔリンパ球を除去する顕著な能力をもちうる、ということを示す。
【実施例５】
【０３４０】
１０．ｃＡＣ１０−抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）
１０．１  ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥの合成
【化２６】
2005511627.tif 000031
【０３４１】
ＡＤＣ  ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ（その一般構造を上に示す）の合成を以下に記載する。
【０３４２】
１０．１．１  薬剤−リンカー化合物の合成
【化２７】
2005511627.tif 000032
【０３４３】
オーリスタチンＥの合成は以前に文献に記載されている（Ｐｅｔｔｉｔ  ＧＲとＢａｒｋｏｃｚｙ，Ｊ．、１９９７、米国特許第５，６３５，４８３号、Ｐｅｔｔｉｔ，ＧＲ、Ｔｈｅ  Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎｓ、Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．、７０、１−７９、１９９）。オーリスタチンＥのモノメチル誘導体（ＭＭＡＥ）を、オーリスタチンＥの合成においてＮ，Ｎ−ジメチルバリンをモノメチルバリン保護形に置き換えることにより調製した（Ｓｅｎｔｅｒら、米国仮出願第６０／４００，４０３号、２００２年７月３１日出願（それは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる））。
【０３４４】
薬剤−リンカー化合物、ＭＭＡＥ（１．６９ｇ、２．３５ｍｍｏｌ）を調製するために、マレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコールｐ−ニトロフェニルカーボネート（２．６ｇ、３．５２ｍｍｏｌ、１．５当量。Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００２、１３、８５５〜８６９頁に記載されるようにして調製した）およびＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、０．２当量）をＤＭＦ（２５ｍＬ）で希釈した。２分後、ピリジン（５ｍＬ）を加え、反応を逆相ＨＰＬＣを使用してモニターした。反応は、２４時間で完了したことが示された。反応混合物を濃縮すると暗色の油となり、これをＤＭＦ３ｍＬで希釈した。ＤＭＦ溶液を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離剤勾配：１００％ジクロロメタンから４：１  ジクロロメタン−ＭｅＯＨ）を使用して精製した。関連する画分を合わせて濃縮すると油状物が得られ、これは高真空下で固化し、所望の薬剤−リンカー化合物および未反応ＭＭＡＥの混合物が汚い黄色の固体（９：１  ジクロロメタン−ＭｅＯＨ中のＲｆ  ０．４０）として得られた。この汚い黄色の固体をＤＭＦで希釈し、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  ＤｙｎａｍａｘＣ１８カラム４１．４ｍｍ×２５ｃｍ、８μ、１００Å、ＭｅＣＮと０．１％  ＴＦＡ水溶液を４５ｍＬ／分で４０分かけて１０％から１００％まで勾配をかけて流し、その後、１００％ＭｅＣＮで２０分間）を用いて精製したところ、所望の薬剤−リンカー化合物が非晶質の白いパウダー（９：１  ジクロロメタン−ＭｅＯＨ中のＲｆ  ０．４０）として得られた。これはＨＰＬＣで９５％以上の純度であり、１％未満のＭＭＡＥを含んでいた。収量：１．７８ｇ（５７％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １３１６．７［Ｍ＋Ｈ］＋；ＵＶλｍａｘ  ２１５、２４８ｎｍ。
【０３４５】
１０．１．２  コンジュゲートの調製
抗体還元。４．８ｍＬ  ｃＡＣ１０（１０ｍｇ／ｍＬ）に５００ｍＭホウ酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）６００μＬを加え、次いで、１００ｍＭ  ＤＴＴ水溶液６００μＬを添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍＭ  ＤＴＰＡ（アルドリッチ）を含むＰＢＳで平衡に保たれ溶出されたＧ２５樹脂上での溶出により緩衝液を交換した。溶液の２８０ｎｍの吸光度から還元された抗体濃度を決定し、チオール濃度はＤＴＮＢ（アルドリッチ）との反応および４１２ｎｍでの吸光度を決定することによりチオール／Ａｂ値をチェックした。
【０３４６】
還元抗体のコンジュゲーション。還元したｍＡｂを氷上で冷やした。薬剤−リンカー化合物は既知濃度のＤＭＳＯ溶液として使用し、反応混合物に加えた薬剤−リンカーの量は以下のように計算した。Ｌストック溶液＝Ｖ×［Ａｂ］×超過倍数／［薬剤−リンカー］。ここで、Ｖおよび［Ａｂ］はそれぞれ還元した抗体溶液の体積およびモル濃度である。２．３ｍＬの冷ＰＢＳ／ＤＴＰＡを還元抗体溶液に加えた。７．５ｍＭ薬剤−リンカー化合物ストック溶液１３３．６μＬを１．４７ｍＬアセトニトリル中に希釈した。アセトニトリル薬剤−リンカー溶液を氷上で冷やし、次に、還元した抗体溶液に加えた。その反応は、マレイミドに対して２０倍モル過剰のシステイン添加後１時間で終了した。反応混合物を遠心限外ろ過によって濃縮し、ＰＢＳ中脱塩Ｇ２５を通した溶出によって精製した。次いで、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥを無菌条件下に０．２ミクロンのフィルタで濾過し、−８０℃で直ちに冷凍した。ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥは、１）濃度（ＵＶ吸光度による）；２）凝集（サイズ排除クロマトグラフィーによる）；３）薬剤／Ａｂ（ＤＴＮＢによって未反応チオールを測定する）および４）残留する遊離薬剤（逆相ＨＰＬＣによる）について分析した。
【０３４７】
１０．２  ｃＡＣ１０−ｆｋＡＥＦＰの合成
【化２８】
2005511627.tif 000033
【０３４８】
ＡＤＣ  ｃＡＣ１０−ｆｋＡＥＦＰ（その一般的な構造を上に示す）の合成を下に記載する。
【０３４９】
１０．２．１  ＡＥＦＰ合成
【化２９】
2005511627.tif 000034
【０３５０】
Ｂｏｃ−フェニルアラニン（１．０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を１，４−ジアミノベンゼンＨＣｌ（３．５ｇ、１９．０ｍｍｏｌ、５．０当量）のトリエチルアミン（１０．７ｍＬ、７６．０ｍｍｏｌ、２０当量）およびジクロロメタン（５０ｍＬ）中懸濁液に添加した。生じた溶液に、追加のＤＥＰＣ（３．２ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ、５．０当量）を注射器で添加した。ＨＰＬＣは２４時間後に残留Ｂｏｃ−ｐｈｅを示さなかった。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮したところ、暗色の固体が得られた。この暗色の固体残渣を１：１  ＥｔＯＡｃ水中で分配し、ＥｔＯＡｃ層を水と塩水で連続して洗浄した。ＥｔＯＡｃ層を、ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘカラム４１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮと水溶液を４５ｍＬ／分で４０分かけて１０％から１００％まで勾配をかけて流し、その後、１００％ＭｅＣＮで２０分間）を用いて精製した。関連する画分を合わせて濃縮すると、赤褐色の固体中間体が得られた。収量：１．４ｇ（１００％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５５．９［Ｍ＋Ｈ］＋；ＵＶλｍａｘ２１５、２６５ｎｍ；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．４８（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）、７．２２〜７．３７（５Ｈ，ｍ）、７．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、７．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、５．１９（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）、４．３９〜４．４８（１Ｈ，ｍ）、３．４９（２Ｈ，ｓ）、３．１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）、１．４３（９Ｈ，ｓ）。
【０３５１】
赤褐色固体（０．５ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．３７ｍＬ、２．１１ｍｍｏｌ、１．５当量）をジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈し、生じる溶液にＦｍｏｃ−Ｃｌ（０．３８ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を撹拌したところ、数分後に白い固体沈殿を生じた。反応はＨＰＬＣによれば１時間で完了した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮すると油が得られた。油をＥｔＯＡｃで沈殿させると、赤みがかった白色の中間体製品が得られた。これを濾過によって回収し、真空下で乾燥した。収量：０．７５ｇ（９３％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ５７８．１［Ｍ＋Ｈ］＋、５９５．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋）。
【０３５２】
この赤みがかった白色の中間体（０．４９ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍＬで希釈し、次に、トリフルオロ酢酸５ｍＬで処理した。反応は逆相ＨＰＬＣによれば３０分で完了した。反応混合物を濃縮し、生じた残渣にエーテルを加えたところ白っぽい固体が沈殿した。この白っぽい固体を濾過し乾燥させると非晶質の粉末が得られた。これをＢｏｃ−ドラプロイン（Ｄｏｌａｐｒｏｉｎｅ）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９３、４９（９）：１９１３−１９２４頁に記載されるようにして調製）（０．２４ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に添加した。この溶液に、さらにトリエチルアミン（０．３６ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ、３．０当量）およびＰｙＢｒｏｐ（０．５９ｇ、１．３ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。反応混合物は逆相ＨＰＬＣを使用してモニターした。反応終了後すぐに反応混合物を濃縮し、得られた残渣をＥｔＯＡｃで希釈し、１０％のクエン酸水溶液、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、水および塩水で連続して洗浄した。ＥｔＯＡｃ層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。生じた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）を使用して精製したところ、白っぽい粉末状中間体が得られた。収量：０．５７ｇ（８８％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ７６４．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋；ＵＶλｍａｘ２１５、２６５ｎｍ；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ３）δ１０．０〜１０．１５（１Ｈ，ｍ）、９．６３（１Ｈ，ｂｒ  ｓ）、８．４２（１／２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、８．２２（１／２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．７３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．１１〜７．５５（１３Ｈ，ｍ）、４．６９〜４．７５（１Ｈ，ｍ）、４．４６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、４．２９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、３．２９（３Ｈ，ｓ）、２．７７〜３．４７（７Ｈ，ｍ）、２．４８〜２．５０（３Ｈ，ｍ）、２．２５（２／３Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，７．２Ｈｚ）、１．４１〜１．９６（４Ｈ，ｍ）、１．３６（９Ｈ，ｓ）、１．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、回転異性体）、１．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、回転異性体）。
【０３５３】
白色固体中間体（８５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）およびＭｅ−ｖａｌ−ｖａｌ−ｄｉｌ−Ｏ−ｔ−ブチル（５５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＰｅｔｔｉｔら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋ．Ｉ、１９９６、８５９に記載されるように調製し、ジクロロメタン（５ｍＬ）で希釈し、次に、室温で２時間窒素大気下のトリフルオロ酢酸２．５ｍＬで処理した。反応完了はＲＰ−ＨＰＬＣによって確認した。減圧して溶媒を除去し、生じた残渣を、トルエンと２度共沸蒸留により乾燥し、次いで、真空下で１２時間乾燥した。
【０３５４】
残基をジクロロメタン（２ｍＬ）で希釈し、ジイソプロピルエチルアミン（３当量）を添加し、ＤＥＰＣ（１．２当量）を続けて加えた。反応が終わった後、反応混合物を減圧下で濃縮し、生じた残渣をＥｔＯＡｃで希釈し、１０％クエン酸水溶液、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液および塩水で連続して洗浄した。ＥｔＯＡｃ層を乾燥させて濾過し濃縮したところ、黄色の油が得られた。
【０３５５】
この黄色の油をジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈し、生じた溶液にジエチルアミン（５ｍＬ）を加えた。ＨＰＬＣによれば、反応は２時間後に終った。反応混合物を濃縮すると油が得られた。この油をＤＭＳＯで希釈し、ＤＭＳＯ溶液は、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘカラム２１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮと０．１％ＴＦＡ水溶液を２０ｍＬ／分で４０分かけて１０％から１００％まで勾配をかけて流し、その後、１００％ＭｅＣＮで２０分間）を用いて精製した。関連する画分を合わせて濃縮すると、所望の薬剤が白っぽい固体として得られた。全収量：４２ｍｇ；（全体で４４％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ８３７．８［Ｍ＋Ｈ］＋、８５８．５［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＵＶλｍａｘ２１５、２４８ｎｍ。
【０３５６】
１０．２．２  リンカー合成
【化３０】
2005511627.tif 000035
【０３５７】
リンカー化合物、マレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リジン（ＭＭＴ）をＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、２００２、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８９６頁に記載されるようにして調製した。
【０３５８】
１０．２．３  薬剤−リンカー化合物の調製
【化３１】
2005511627.tif 000036
【０３５９】
１０．２．１節の薬剤（９ｍｇ、１０．８μｍｏｌ）および１０．２．２節で得たリンカー（５．２ｍｇ、１０．８μｍｏｌ）をジクロロメタン（１ｍＬ）で希釈し、得られた溶液にＨＡＴＵ（６．３ｍｇ、１６．１μｍｏｌ、１．５当量）、次いでピリジン（１．３μＬ、１６．１μｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応混合物は、ＨＰＬＣを使用してモニターしながらアルゴン雰囲気下に撹拌した。反応は６時間後に完了した。反応混合物を濃縮し、生じた残渣をＤＭＳＯで希釈した。ＤＭＳＯ溶液を分取逆相ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘカラム２１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５ｍ、１００Å、ＭｅＣＮとＥｔ３Ｎ−ＣＯ２（ｐＨ７）２０ｍＬ／分で４０分かけて１０％から１００％まで勾配をかけて流し、その後、１００％ＭｅＣＮで２０分間）を用いて精製し、関連する画分を合わせて濃縮すると、白っぽい固体中間体が得られ、これはＨＰＬＣで９５％以上の純度であった。
【０３６０】
この白っぽい中間体をジクロロメタン（２ｍＬ）に希釈し、得られた溶液をＴＦＡ（０．５ｍＬ）で処理した。反応はＨＰＬＣを使用してモニターし２時間で完了した。反応混合物を濃縮し、生じた残渣をＤＭＳＯで希釈し、実施例１３に記載するのと同じ条件下で精製した。関連する画分を合わせて濃縮すると、所望の薬剤−リンカー化合物が白っぽい粉末として得られた。収量：１４．９ｍｇ（９０％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １３０４．６［Ｍ＋Ｈ］＋；ＵＶλｍａｘ２１５、２７５ｎｍ。
【０３６１】
１０．２．４  コンジュゲートの調製
抗体還元。３．０ｍＬ  ｃＡＣ１０（１０ｍｇ／ｍＬ）に５００ｍＭホウ酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）３７５μＬを加え、次いで、１００ｍＭ  ＤＴＴ水溶液３７５μＬを添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍＭ  ＤＴＰＡ（アルドリッチ）を含むＰＢＳで平衡に保たれ溶出されたＧ２５樹脂上での溶出により緩衝液を交換した。溶液の２８０ｎｍの吸光度から還元された抗体濃度を求め、チオール濃度はＤＴＮＢ（アルドリッチ）との反応および４１２ｎｍでの吸光度を測定することによりチオール／Ａｂ値をチェックした。
【０３６２】
還元抗体のコンジュゲーション。還元したｍＡｂを氷上で冷やした。薬剤−リンカー化合物は既知濃度のＤＭＳＯ溶液として使用し、反応混合物に加えた薬剤−リンカーの量は以下のように計算した。Ｌストック溶液＝Ｖ×［Ａｂ］×超過倍数／［薬剤−リンカー］。ここで、Ｖおよび［Ａｂ］はそれぞれ還元した抗体溶液の体積およびモル濃度である。２．２ｍＬの冷ＰＢＳ／ＤＴＰＡを還元抗体溶液に加え、次いで、１．４７ｍＬ  ＤＭＳＯを加え、混合物を氷上で冷やした。次いで、１４０．０μＬ  ７．６ｍＭ薬剤−リンカー化合物ストック溶液を還元抗体／ＤＭＳＯ溶液に加えた。反応は、マレイミドに対して２０倍モル過剰のシステイン添加後１時間で終了した。反応混合物を遠心限外ろ過によって濃縮し、ＰＢＳ中脱塩Ｇ２５を通した溶出によって精製した。次いで、ｃＡＣ１０−ｆｋＡＥＦＰを無菌条件下に０．２ミクロンのフィルタを通して濾過し、−８０℃で直ちに冷凍した。ｃＡＣ１０−ｆｋＡＥＦＰは、１）濃度（ＵＶ吸光度による）；２）凝集（サイズ排除クロマトグラフィーによる）；３）薬剤／Ａｂ（ＤＴＴ、次いでＤＴＮＢによって未反応チオールを測定する）および４）残留する遊離薬剤（逆相ＨＰＬＣによる）について分析した。
【０３６３】
１０．３  ｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰの合成
【化３２】
2005511627.tif 000037
【０３６４】
ＡＤＣ  ｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰ（その一般的な構造を上に示す）の合成を下に記載する。
【０３６５】
１０．３．１  薬剤合成
薬剤は、上記セクション１０．２．１に例示したようにして合成した。
【０３６６】
１０．３．２  薬剤−リンカー化合物の調製
【化３３】
2005511627.tif 000038
【０３６７】
１０．２．１節の薬剤のトリフルオロ酢酸塩（０．３７ｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＦｍｏｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ（０．３０ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１．５当量。Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００２、１３、８５５〜８９６頁に従って調製）をＤＭＦ（５ｍＬ、０．１Ｍ）で希釈し、得られた溶液にピリジン（９５μＬ、１．２ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。次いで、ＨＡＴＵ（０．２３ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１．５当量）を固体として加え、反応混合物は、ＨＰＬＣを使用してモニターしながらアルゴン雰囲気下に撹拌した。反応は緩慢であり、４時間後にジイソプロピルエチルアミン１．０当量を加えた。反応は１時間後に完了した。反応混合物を真空化に濃縮し、生じた残渣を分取逆相ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  ＤｙｎａｍａｘＣ１８カラム４１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮと０．１％ＴＦＡ水溶液４５ｍＬ／分で４０分かけて１０％から１００％まで勾配をかけて流し、その後、１００％ＭｅＣＮで２０分間）を用いて精製すると、淡いピンク色の固体中間体が得られた。
【０３６８】
ピンク色の固体中間体をＤＭＦ（３０ｍＬ）で希釈し、生じた溶液にジエチルアミン（１５ｍＬ）を添加した。ＨＰＬＣによれば反応は２時間で完了していた。反応混合物を濃縮し、生じた残渣をエーテルで２度洗浄した。固体中間体を高真空下で乾燥し、次いで、そのまま次のステップで使用した。
【０３６９】
固体中間体をＤＭＦ（２０ｍＬ）で希釈し、生じた溶液に６−（２，５−ジオキシ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−ヘキサン酸２，５−ジオキシ−ピロリジン−１−１−イルエステル（０．１２ｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）（ＥＭＣＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を添加した。４日後に、反応混合物を濃縮すると油状物が得られ、これを分取逆相ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  ＤｙｎａｍａｘＣ１８カラム４１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮと０．１％ＴＦＡ水溶液４５ｍＬ／分で４０分かけて１０％から１００％まで勾配をかけて流し、その後、１００％ＭｅＣＮで２０分間）を用いて精製すると、所望の薬剤−リンカー化合物が白色鱗片状の固体として得られた。収量：０．２１ｇ（全体で３８％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １２８５．９［Ｍ＋Ｈ］＋、１３．０７．８［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＵＶλｍａｘ２１５、２６６ｎｍ。
【０３７０】
１０．３．３  コンジュゲートの調製
抗体還元。３．０ｍＬ  ｃＡＣ１０（１０ｍｇ／ｍＬ）に５００ｍＭホウ酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）３７５μＬを加え、次いで、１００ｍＭ  ＤＴＴ水溶液３７５μＬを添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍＭ  ＤＴＰＡ（アルドリッチ）を含むＰＢＳで平衡に保たれ溶出されたＧ２５樹脂上での溶出により緩衝液を交換した。溶液の２８０ｎｍの吸光度から還元された抗体濃度を求め、チオール濃度はＤＴＮＢ（アルドリッチ）との反応および４１２ｎｍでの吸光度を測定することによりチオール／Ａｂ値をチェックした。
【０３７１】
還元抗体のコンジュゲーション。還元したｍＡｂを氷上で冷やした。薬剤−リンカー化合物は既知濃度のＤＭＳＯ溶液として使用し、反応混合物に加えた薬剤−リンカーの量は以下のように計算した：Ｌストック溶液＝Ｖ×［Ａｂ］×超過倍数／［薬剤−リンカー］。ここで、Ｖおよび［Ａｂ］はそれぞれ還元した抗体溶液の体積およびモル濃度である。２．２ｍＬの冷ＰＢＳ／ＤＴＰＡを還元抗体溶液に加え、次いで、１．４７ｍＬ  ＤＭＳＯを加え、混合物を氷上で冷やした。次いで、１４０．０μＬ  ７．６ｍＭ薬剤−リンカー化合物ストック溶液を還元抗体／ＤＭＳＯ溶液に加えた。反応は、マレイミドに対して２０倍モル過剰のシステインを添加した後１時間で終了した。反応混合物を遠心限外ろ過によって濃縮し、ＰＢＳ中脱塩Ｇ２５を通した溶出によって精製した。次いで、ｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰを無菌条件下で０．２ミクロンのフィルタで濾過し、−８０℃で直ちに冷凍した。ｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰは、１）濃度（ＵＶ吸光度による）；２）凝集（サイズ排除クロマトグラフィーによる）；３）薬剤／Ａｂ（ＤＴＴ、次いでＤＴＮＢによって未反応チオールを測定する）および４）残留する遊離薬剤（逆相ＨＰＬＣによる）について分析した。
【０３７２】
１０．４  ｃＡＣ１０−ｆｋＭＭＡＥの合成
【化３４】
2005511627.tif 000039
【０３７３】
ＡＤＣ  ｃＡＣ１０−ｆｋＭＭＡＥ（その一般的な構造を上に示す）の合成を下に記載する。
【０３７４】
１０．４．１  薬剤−リンカー化合物の調製
【化３５】
2005511627.tif 000040
【０３７５】
オーリスタチンＥの合成は以前に文献に記載されている（Ｐｅｔｔｉｔ  ＧＲとＢａｒｋｏｃｚｙ，Ｊ．、１９９７、米国特許第５，６３５，４８３号、Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．、Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．、７０、１−７９、１９９）。オーリスタチンＥのモノメチル誘導体（ＭＭＡＥ）を、オーリスタチンＥの合成においてＮ，Ｎ−ジメチルバリンをモノメチルバリン保護形に置き換えることにより調製した（Ｓｅｎｔｅｒら、米国仮出願第６０／４００，４０３号、２００２年７月３１日出願（それは参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる））。
【０３７６】
ＭＭＡＥ（１００ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、リンカーであるマレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リジン（ＭＭＴ）−ｐ−アミノベンジルアルコールｐ−ニトロフェニルカーボネート（１６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．１当量。Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００２、１３、８５５〜８６９頁に記載されるようにして調製した）、およびＨＯＢｔ（１９ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（２ｍＬ）で希釈した。２分後、ピリジン（０．５ｍＬ）を加え、反応混合物を逆相ＨＰＬＣを使用してモニターした。２４時間後にはＭＭＡＥもリンカーも検出されなくなった。反応混合物を濃縮し、得られた残渣を分取逆相ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘカラム２１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮとＥｔ３Ｎ−ＣＯ２（ｐＨ７）２０ｍＬ／分で４０分かけて１０％から１００％まで勾配をかけて流し、その後、１００％ＭｅＣＮで２０分間）を用いて精製した。関連する画分をプールし、濃縮すると、白っぽい固体中間体が得られた。ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １６０８．７［Ｍ＋Ｈ］＋
この白っぽい中間体をＭｅＣＮ／水／ＴＦＡ（それぞれの比は８５：５：１０）に希釈した。得られた反応溶液をＨＰＬＣを使用してモニターし３時間で完了した。反応混合物を直接濃縮し、得られた残渣を分取逆相ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘカラム２１．４ｍｍ×２５ｃｍ、５μ、１００Å、ＭｅＣＮと０．１％ＴＦＡ水溶液２０ｍＬ／分で４０分かけて１０％から１００％まで勾配をかけて流し、その後、１００％ＭｅＣＮで２０分間）を用いて精製した。関連する画分を合わせて濃縮すると、所望の薬剤−リンカー化合物が白っぽい粉末として得られた。収量：４６ｍｇ（全体で３２％）；ＥＳ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １３３４．８［Ｍ＋Ｈ］＋；ＵＶλｍａｘ２１５、２５６ｎｍ。
【０３７７】
１０．４．２  コンジュゲートの調製
抗体還元。４．８ｍＬ  ｃＡＣ１０（１０ｍｇ／ｍＬ）に５００ｍＭホウ酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）６００μＬを加え、次いで、１００ｍＭ  ＤＴＴ水溶液６００μＬを添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍＭ  ＤＴＰＡ（アルドリッチ）を含むＰＢＳで平衡化し溶出させるＧ２５樹脂上での溶出により緩衝液を交換した。溶液の２８０ｎｍの吸光度から還元された抗体濃度を求め、チオール濃度はＤＴＮＢ（アルドリッチ）との反応および４１２ｎｍでの吸光度を測定することによりチオール／Ａｂ値をチェックした。
【０３７８】
還元抗体のコンジュゲーション。還元したｍＡｂを氷上で冷やした。薬剤−リンカー化合物は既知濃度のＤＭＳＯ溶液として使用し、反応混合物に加えた薬剤−リンカーの量は以下のように計算した：Ｌストック溶液＝Ｖ×［Ａｂ］×超過倍数／［薬剤−リンカー］。ここで、Ｖおよび［Ａｂ］はそれぞれ還元した抗体溶液の体積およびモル濃度である。２．３ｍＬの冷ＰＢＳ／ＤＴＰＡを還元抗体溶液に加えた。７．５薬剤−リンカー化合物ストック溶液１３３．６μＬを１．４７ｍＬアセトニトリル中に希釈した。アセトニトリル薬剤−リンカー溶液を氷上で冷やし、次に、還元した抗体溶液に加えた。その反応は、マレイミドに対して２０倍モル過剰のシステインを添加した後１時間で終了した。反応混合物を遠心限外ろ過によって濃縮し、ＰＢＳ中脱塩Ｇ２５を通す溶出によって精製した。次いで、ｃＡＣ１０−ｆｋＭＭＡＥを無菌条件下に０．２ミクロンのフィルタで濾過し、−８０℃で直ちに冷凍した。ｃＡＣ１０−ｆｋＭＭＡＥは１）濃度（ＵＶ吸光度による）；２）凝集（サイズ排除クロマトグラフィーによる）；３）薬剤／Ａｂ（ＤＴＮＢによって未反応チオールを測定する）および４）残留する遊離薬剤（逆相ＨＰＬＣによる）について分析した。
【０３７９】
１０．５  結果
ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥがジャーカットＴ細胞増殖を抑制する能力を検討した。９６穴ＴＣプレートに、培地１００μｌ中に５０００個含まれるジャーカットＴ細胞を播種した。培地１００μｌ中ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ濃度を段階的としたもの、または対照の非結合ＩｇＧ（ｃＩｇＧ）−ｖｃＭＭＡＥを図９に示す最終濃度を達成するようにジャーカット細胞へ加えた。８０時間のインキュベーションの後に、細胞のＤＮＡ合成を１６時間の３Ｈ−ＴｄＲパルスによって評価した。０．００１μｇ／ｍｌを超える濃度のキメラＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥは、ＤＮＡ合成を有意に阻害した。ＩＣ５０はおよそ０．１μｇ／ｍｌであった。対照ｃＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＥは、０．１μｇ／ｍｌ未満の濃度で有意な増殖抑制作用を示さなかった。図２は、可溶性のコンジュゲートされていないｃＡＣ１０が、１μｇ／ｍｌを超える濃度でジャーカット細胞に対する増殖抑制効果を有したことを示す。まとめると、これらのデータは、ｃＡＣ１０がＣＤ３０＋標的細胞に細胞傷害性薬剤を送達することにおいて有効であり、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ  ＡＤＣは標的とする細胞に結合すると効率的にインターナリゼーションすることを示唆している。
【実施例６】
【０３８０】
１１．正常なヒト末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）の活性化によってＴリンパ球上のＣＤ３０発現が誘導された
正常なドナーから成分採血によって得たヒトＰＢＭＣを、ヒトＴリンパ球の供給源とした。固定化した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂを、Ｔリンパ球を活性化し、その増殖を誘導するために使用した。ｍＡｂを固定化するために、ＰＢＳ中、抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８  ｍＡｂ（Ｂ−Ｔ３、ＤｉａＣｌｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ、または９．３、Ｈａｒａ  ら．、１９８５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６１、１５１３〜１５２４頁）のそれぞれを１μｇ／ｍｌで、ＴＣまたはフラスコ中、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄することによって非結合ｍＡｂを除去した。培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭ非必須アミノ酸）中０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で、ｍＡｂコーティングを施したＴＣウェルまたはフラスコへにＰＢＭＣを播種することによりＴ細胞活性化を開始した。いくつかの実験では、１００ＩＵ／ｍｌの最終濃度の組み換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）も含有させた。
【０３８１】
Ｔ細胞活性化およびＣＤ３０発現は多色フローサイトメトリー分析によってモニターした。ＣＤ３０発現の検出のために、精製した抗ＣＤ３０（ＡＣ１０）をメーカーの指示によって蛍光プローブＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ＡＦ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で標識した。抗体を染色する前に、活性化したＰＢＭＣを、染色用培地（ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０２％アジ化ナトリウム）で１回洗浄し、ペレット化した。ＡＦ標識した抗ＣＤ３＋５フィコエリトリン（ＰＥ）標識した抗ＣＤ４（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）＋Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ（Ｃｙ）標識した抗ＣＤ８（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ＣＤ２５（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）＋ＰＥ標識した抗ＣＤ４（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）＋Ｃｙ標識した抗ＣＤ８（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）のいずれかの染色培地中カクテル２５μｌを使用して０．２×１０６細胞ペレットを再懸濁した。細胞を氷上で２０分間インキュベートし、染色培地で２度洗浄し、ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣｓｃａｎ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カリフォルニア州サンホセ所在（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ））上で分析した。
【０３８２】
図１０に示したように、刺激されていないＰＢＭＣではＴリンパ球はほとんどＣＤ３０を発現しなかった。抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８または抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８＋ＩＬ−２のいずれかによるＰＢＭＣの活性化は、Ｔリンパ球上で時間依存的なＣＤ３０の発現を誘導した。対照的に、培地だけで維持したＰＢＭＣはＣＤ３０発現の誘導を示さなかった。ＣＤ３０の発現増加は、ＣＤ４＋およびＣＤ４−（ＣＤ８＋細胞を含むが、データは示していない）細胞の両方で検出された。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の両者についての発現ピークは、刺激後４日目頃であった。その後は、レベルは低減していき培養約８日後には基線レベルまで落ちた。
【実施例７】
【０３８３】
１２．ｃＡＣ１０  ＡＤＣが活性化正常Ｔリンパ球の増殖を抑制した
ｃＡＣ１０  ＡＤＣが、活性化正常Ｔリンパ球の増殖を抑制する能力を調べた。実施例６に記載するように、正常なＰＢＭＣは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂによって活性化された。培養３日目（それはＣＤ３０誘導のピークに接近していた（図１０））に、活性化したＰＢＭＣを回収した。細胞の一部は、ＣＤ４およびＣＤ８細胞の両者におけるＣＤ３０発現を確認するため、フローサイトメトリー分析に用いた。細胞の残りはペレット化し、５０，０００細胞／ｍｌで２００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を含む新鮮な培地に再懸濁させた。この細胞懸濁液１００μｌ（５，０００個の細胞）を９６穴ＴＣプレートの各ウェルに移した。２００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を添加した培地中、ｃＡＣ１０−ｆｋＭＭＡＥ、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ濃度を段階的にしたものまたは対応する非結合ｃＩｇＧ  ＡＤＣを１００μｌ、図１１中に示した濃度を達成するように培養ウェルに加えた。細胞をさらに４８または７２時間培養し、最後の１６時間は、３Ｈ−ＴｄＲのパルス処理をして細胞のＤＮＡ合成を評価した。ジャーカットＴ細胞上のその活性と同様に、ｃＡＣ１０  ＡＤＣは、活性化したＰＢＭＣの増殖を抑制した（図１１）。ｃＡＣ１０  ＡＤＣが、０．０１μｇ／ｍｌを超える濃度で存在した時に抑制効果が検出できた。一方のＡＤＣと共に７２時間インキュベーションした場合は、４８時間のインキュベーションより大きい増殖抑制をもたらした。キメラＡＣ１０−ｆｋＭＭＡＥはｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥより活性であるようにみえた。
【実施例８】
【０３８４】
１３．記憶Ｔリンパ球はナイーブＴリンパ球よりｃＡｃ１０ＡＤＣに対して感受性が高かった
ＰＢＭＣは、リンパ球の様々なサブセットから構成されるため、ｃＡＣ１０  ＡＤＣに対する１つの細胞サブセットの応答は、他のサブセットによって簡単にマスクされてしまうおそれがある。この可能性を検討するために、Ｔリンパ球の全体、ナイーブＴリンパ球と記憶Ｔリンパ球をネガティブ免疫選択によってＰＢＭＣから富化した。簡単に言えば、ＰＢＭＣを、２０×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で、飽和量の抗体を含む以下の抗体カクテルのうちの１つと共に氷上において２０分間、インキュベートした。全Ｔリンパ球を富化するために、抗体カクテルは、抗ＣＤ１４（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、抗ＣＤ１６（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）および抗ＣＤ２０（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含有した。ナイーブＴリンパ球（ＣＤ４５ＲＯ−）を富化するために、抗体カクテルは、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ２０、および抗ＣＤ４５ＲＯ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含有した。記憶Ｔリンパ球（ＣＤ４５ＲＡ−）を富化するために、抗体カクテルは、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含有した。抗体カクテルはすべて１０％ＦＢＳを添加した培地中で調製した。抗体結合後、細胞を氷冷した培地で２度洗浄し、培地中２０×１０６細胞／ｍｌの濃度になるように再懸濁した。抗体結合した細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ４５０ヤギ抗マウスＩｇＧ常磁性ビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）、ノルウェー、オスロ所在（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ））によって細胞懸濁液から取り除いた。細胞懸濁液に添加する前に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ４５０ヤギ抗マウスＩｇＧは、培地によって２度洗洗浄し、培地中６０×１０６細胞／ｍｌの濃度になるように再懸濁した。同容量の細胞および常磁性ビーズを４℃で混合し、２時間遠心した。細胞／常磁性ビーズ懸濁液を培地で２倍希釈した。非結合常磁性ビーズおよび常磁性ビーズ−細胞コンジュゲートは、磁石の印加によって培養物の側に引きつけた。非結合細胞は、上に記載したサブセットが富化しており、これを取り出した。フローサイトメトリー分析を行って、図１２の左欄に示すような富化を確認した。
【０３８５】
次いで、様々なＴ細胞サブセット上での活性化誘導によるＣＤ３０発現を検討した。簡単に言えば、免疫選択から得られた全Ｔリンパ球、ナイーブＴリンパ球、および記憶Ｔリンパ球は、実施例６に記載するように２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、固定化した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によって刺激した。７２時間のインキュベーションの後、（これも実施例６で概説したように）、様々な培養物中でのＣＤ４およびＣＤ８細胞の両方におけるＣＤ３０の発現を、フローサイトメトリーによって判定した。開始集団が全Ｔリンパ球、ナイーブＴリンパ球または記憶Ｔリンパ球であるか否かにかかわらず、ＣＤ４およびＣＤ８細胞の両方でＣＤ３０の発現が検出された（図１２）。記憶ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞上でのＣＤ３０のレベルは、一貫して他のサブセットよりもわずかに高かった。
【０３８６】
次いで、活性化したナイーブ（ＣＤ４５ＲＯ−）Ｔリンパ球および記憶Ｔリンパ球（ＣＤ４５ＲＡ−）のｃＡＣ１０  ＡＤＣに対する応答を調べた。３日活性化したナイーブＴリンパ球および記憶Ｔリンパ球を、９６穴ＴＣプレート上に培地（２００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２およびｃＡＣ１０  ＡＤＣまたはｃＩｇＧ  ＡＤＣを図１３に示した最終濃度で含む）の最終容量２００μｌで、５，０００細胞／ウェルとなるように播種した。細胞をさらに７２時間インキュベートし、細胞のＤＮＡ合成を評価するために最後の１６時間は３Ｈ−ＴｄＲでパルス処理した。ｃＩｇＧ  ＡＤＣは２μｇ／ｍｌ未満の濃度では、Ｔ細胞増殖に有意な効果がなかったが、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥまたはｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰのいずれも、０．００７μｇ／ｍｌ以上の濃度で活性化した記憶Ｔリンパ球の増殖を有意に抑制した。対照的に、活性化したナイーブＴリンパ球は、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥに対し比較的耐性であった。ｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰコンジュゲートは両方のＴ細胞サブセット上でｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートより有効であることが判明した。それにもかかわらず、ナイーブＴリンパ球は、記憶Ｔリンパ球よりもｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰに対する感受性がさらに低い（図１３）。ｃＡＣ１０  ＡＤＣ  に対するナイーブＴリンパ球と記憶Ｔリンパ球との間の感受性の差は、恐らく抗原密度によるものではないであろう。活性化ナイーブＴリンパ球と記憶Ｔリンパ球は、両方とも、ＣＤ３０を相当なレベルで発現することが見出されたからである（図１２）。図１１で報告した、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥの増殖抑制活性は、恐らくナイーブＴリンパ球と記憶Ｔリンパ球の応答の組合せを反映している。より重要なことに、これらの結果は、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥは、ＣＤ３０＋ナイーブＴリンパ球への影響を最小限にとどめつつ、ＣＤ３０＋記憶Ｔリンパ球の増殖を選択的に抑制し得ることを示唆している。自己免疫疾患、炎症性疾患およびアレルギー性疾患の病因にかかわるエフェクターＴリンパ球は通常、抗原によって刺激され、これらは記憶Ｔリンパ球サブセットに属する。したがって、治療的な介在過程にｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥを適用することには、抗原によって刺激されたＴリンパ球のみを標的とするという利点がある。他方、ｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰの適用は、活性化したナイーブＴリンパ球と記憶Ｔリンパ球両方の増殖を抑えることが望まれる状況（例えば、移植拒絶における）で好ましいであろう。
【実施例９】
【０３８７】
１４．正常なヒトＴリンパ球の同系異種的刺激がＣＤ３０発現を誘導した
自己免疫、アレルギー性疾患および炎症性応答の病因にかかわるエフェクターＴリンパ球は、通常、多数回の抗原刺激と増殖を経ている。この慢性の活性化プロセスで、それらは、サイトカイン分泌および細胞溶解応答を含むエフェクター機能を実行し続けて組織の損傷を誘導する。したがって、活性化と増殖の繰り返しを複数回経験したＴリンパ球が依然としてＣＤ３０を発現し得るか、また、抗ＣＤ３０  ｍＡｂおよびそれらのＡＤＣが、慢性的に活性化した、そうしたＣＤ３０＋Ｔリンパ球の増殖を抑制するためにはどのように適用し得るかを調べることが重要である。そのようなＴ細胞系統のうちの１つを同系異種の刺激細胞に対して生成した。実施例９において詳述するＣＤ８＋細胞の枯渇によってＰＢＭＣからＣＤ４＋リンパ球を富化した。簡単に言えば、ＰＢＭＣを、氷上で２０分間、飽和濃度の抗ＣＤ８  ｍＡｂ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含む培地中でインキュベートした。次いで、細胞を、氷冷培地で２度洗浄した。抗ＣＤ８結合細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ４５０ヤギ抗マウスＩｇＧ常磁性ビーズによって細胞懸濁液から取り除いた。非結合細胞は、ＣＤ４＋細胞が富化しており、そのＣＤ４発現をフローサイトメトリーによって分析した。
【０３８８】
ＰＢＭＣ（５×１０６）は、ＣＤ４＋細胞が富化しているが、これを、等しい数のガンマ線照射（２７００〜５０００ｒａｄｓ）同系異種Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ）と共培養した。４日目にＩＬ−２を４００ＩＵ／ｍｌの最終濃度で加え、培養を１４日目まで継続した。次いで、生存細胞を２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２存在下、Ｔ細胞：Ｄａｕｄｉ比を１：３として照射Ｄａｕｄｉ細胞で再刺激し増殖させた。これが第２周期の初めである（図１４）。７〜９日の培養後に、Ｔリンパ球を照射Ｄａｕｄｉ細胞で再刺激し、続く増殖ラウンドを開始させた。同系異種刺激細胞添加後３〜４日目および７〜９日目にＣＤ３０の発現を調べた。図７に示すように、ＣＤ３０は、ＣＤ４＋およびＣＤ４−細胞の両者について各ラウンドで同系異種刺激で誘導された。ＣＤ３０の発現レベルは各刺激サイクルの終わりに向けて漸減する。これらの結果は、抗原刺激Ｔリンパ球が、それらが抗原刺激でチャレンジされたときにＣＤ３０を発現する能力を保持していることを確認するものである。
【実施例１０】
【０３８９】
１５．Ｔリンパ球クローンの生成
エフェクターリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートする別の方法は、Ｔリンパ球クローンを作製することである。図１６は、抗原非特異性のヘルパー（Ｔｈ）および細胞傷害性（Ｔｃ）Ｔリンパ球クローンを作製するためのプロトコルを示す。ＰＢＭＣを出発原料として用いた。実施例８および９に記載した免疫選択方法を使用してＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を富化した。Ｔリンパ球を刺激し増殖するために２つのアプローチを適用した。第１のアプローチでは、９６穴ＴＣプレート中の限界希釈において、固定した抗ＣＤ３プラス可溶性抗ＣＤ２８およびｒｈＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ）とで細胞を刺激した。実施例６に記載するようにして抗ＣＤ３を１μｇ／ｍｌでＴＣウェルに固定した。あるいは、細胞は、フィトヘムアグルチニン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、（１〜２μｇ／ｍｌ））、１０，０００個の照射されたＣＥＳＳ細胞（ＡＴＣＣ、照射量：２７００ｒａｄ））およびｒｈＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ）で刺激した（９６穴プレート中の限界希釈）。サイトカインおよび／またはサイトカインに対する抗体を異なる組合せで含むものを添加してＴリンパ球クローンのＴｈ１エフェクター細胞またはＴｈ２エフェクター細胞への発達をそらすこともできる。
【０３９０】
限界希釈アッセイで同定されたクローンを多数回の再刺激によってさらに増殖した。各ラウンドは１０〜１２日間続けた。第２ラウンドの増殖では、ＰＨＡ（１〜２μｇ／ｍｌ）、１×１０６被照射フィーダー細胞（ＣＥＳＳ）およびｒｈＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ）でクローンを刺激した。いくつかの実験では、抗ＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、５μｇ／ｍｌ））およびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０ｎｇ／ｍｌ）を添加して、Ｔリンパ球クローンのＴｈ２またはＴｃ２サブセットへの発達を促した。続く再刺激ラウンドでは、Ｔリンパ球：フィーダー細胞比を１：２として使用し、ＩＬ−２を２００ＩＵ／ｍｌで添加した。Ｔ細胞クローンのいくつかのパネルはこれらの刺激プロトコルを使用して作製したもので、それらについてはさらに表現型と機能分析を行った。
【実施例１１】
【０３９１】
１６．Ｔリンパ球クローンの表現型
フローサイトメトリーによって決定した１０個のＴリンパ球クローンの表面表現型を、図１６に示す。１０のクローンはすべて、ＣＤ３を高レベルで、ＣＤ２８を検出できるレベルで発現した。１０のクローンのうちの６つはＣＤ４を発現したが、それらはＴヘルパークローン（Ｔｈ）と考えることができる。残りの４つのうちの３つはＣＤ８を発現したため、細胞傷害性Ｔリンパ球クローン（Ｔｃ）と考えることができる。最後のクローンはＣＤ４＋／ＣＤ８＋であった。ＣＤ３０の発現は１０のクローンすべてで検出できた。分析は休止クローンについて行ったので、シグナル強度は比較的低かった。
【０３９２】
Ｔリンパ球クローンについてはサイトカイン発現も分析した（図１７）。休止クローンを白血球活性化カクテル（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用い３７℃で４時間刺激した。タンパク質分泌のブロッキングにより細胞内のサイトカインの蓄積を可能にするために、ゴルジプラグ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を添加した。次いで、細胞を洗浄し、メーカーの指示によってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で固定した。細胞内サイトカインは、様々な抗サイトカイン抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用して検出し、染色した細胞をフローサイトメトリー分析によって分析した。Ｔｈクローンのうちの２つはＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＦＮγを発現したが、これはＴｈ０のプロフィールと一致している。４つのＴｈクローンはＴｈ２プロフィールを示した。すなわち、それらはＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＬ−１３を発現したが、ＩＦＮγは発現しなかった。２つのＴｃクローンはＴｃ０サイトカイン・プロフィールを、また、１つのＴｃクローンはＴｃ２プロフィールを示した。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋クローンはＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を発現したが、ＩＦＮγは発現しなかった。
【実施例１２】
【０３９３】
１７．Ｔリンパ球クローンの再刺激がＣＤ３０の発現を誘導した
Ｔリンパ球クローン再活性化の間のＣＤ３０発現について調べた。休止Ｔリンパ球クローンを、１または２μｇ／ｍｌのＰＨＡ、被照射ＣＥＳＳフィーダー細胞（Ｔ：ＣＥＳＳ細胞比１：２〜１：１０、２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２）で再刺激した。２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４もＴｈ２およびＴｃ２クローンに添加した。フローサイトメトリー分析によってＣＤ２５およびＣＤ３０の発現をモニターした。図１８は、代表的なＴｈクローンと代表的なＴｃクローンから得られた結果を示す。すべてのクローンの中でＣＤ２５の広範囲なアップレギュレーションが観察され、これは、２日目にピークに達した。これはＴリンパ球の活性化を示す。ＣＤ２５の発現はその日以後は漸減した。ＣＤ３０発現の誘導は、ＣＤ２５のそれと平行していた。ピーク誘導も刺激の後２日目に観察された。発現は、４日目にもまだ検出できたが、それは漸減して７日目にはほとんど基線レベルに落ちた。検討した他の８つのクローンも、ＣＤ２５およびＣＤ３０発現について同様の動力学および大きさを示した（データは示していない）。ＣＤ２５およびＣＤ３０の両者についての活性化−誘導発現はこれらのＴリンパ球クローンの一貫した特徴であった。
【実施例１３】
【０３９４】
１８．ｃＡＣ１０  ＡＤＣが活性化Ｔリンパ球クローンの増殖を阻害した
次に、ｃＡＣ１０  ＡＤＣに対するＴリンパ球クローンの応答を調べた。実施例１２に記載するようにして休止Ｔリンパ球クローンを活性化してＣＤ３０を発現させた。活性化後２日目に、細胞の一部についてフローサイトメトリーによってＣＤ３０発現を分析し、細胞の活性化とＣＤ３０誘導を確認した。残りの細胞はペレット化し、２００ＩＵ／ｍｌのｒＩＬ−２または２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、およびＴｈ２とＴｃ２クローンについては１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含む新しい培地中に再懸濁した。次いで、細胞を、図１９および図２０に示すようにして、ｃＡＣ１０  ＡＤＣまたは非結合ＩｇＧ  ＡＤＣを段階的濃度で含む培地（最終容積２００μｌ）中に、１０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞をさらに４８時間または７２時間インキュベートし、細胞のＤＮＡ合成を評価するために最後の１６時間は３Ｈ−ＴｄＲでパルス処理した。ＡＤＣ処理に対する２つのＴｈ２クローンの応答結果を図１９および図２０に示した。０．０１μｇ／ｍｌを超える濃度のキメラＡＣ１０  ＡＤＣは、いずれのクローンについても有意に増殖を阻害した。対照ＡＤＣ  ｃＩｇＧ−ｆｋＭＭＡＥは０．１μｇ／ｍｌ未満の濃度では、有意に増殖を抑制しなかったが、ｃＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＥでは、２μｇ／ｍｌの高濃度でも増殖抑制活性をまったく示さず、ｃＡＣ１０  ＡＤＣの抗原特異性が確認された。また、合計７２時間のインキュベーションでは、４８時間のインキュベーションより顕著な増殖阻害をもたらした。
【０３９５】
次いで、実施例４に記載したアネクシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖの結合およびＰＩへの細胞膜透過性を用いて、ｃＡＣ１０  ＡＤＣによって達成された増殖阻害が細胞死によるものかどうかを評価した（図２１）。１μｇ／ｍｌのＡＤＣと共に４８時間のインキュベーションの後、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥで処理した細胞の２７％はアポトーシスであったかまたは死滅していた。これに対してｃＩｇＧ−ｖｃＭＭＡＥで処理した細胞は７〜１４％であった。ｃＡＣ１０−ｆｋＭＭＡＥ処理した細胞では、ｃＩｇＧ−ｆｋＭＭＡＥで処理した細胞の１３％および３１％と比較して、４４〜４８％がアポトーシスであるかまたは死滅していた。これらのデータから、試験したｃＡＣ１０  ＡＤＣがＣＤ３０＋Ｔ細胞クローンに対して細胞傷害性を有することが確認された。
【０３９６】
活性化したＴリンパ球クローンの増殖に対するｃＡＣ１０  ＡＤＣの影響を分析する過程で、いくつかのクローンはｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ処理に比較的強いことがわかった（例えば、図２２のうちのクローン３．２７．２および４．０１．１）。記憶およびナイーブＴ細胞（図１３）の中で観察されたものと同様に、ｃＡＣ１０のＡＥＦＰコンジュゲートは、Ｔリンパ球クローンに対して強い阻害活性を示した。この結果、ｃＡＣ１０−ｆｋＡＥＦＰコンジュゲートおよびｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰコンジュゲートは両方とも、０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのＩＣ５０を与えた（これに対し、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥでは＞１μｇ／ｍｌ）。これらのデータは、Ｔリンパ球増殖の標的阻害において様々なｃＡＣ１０  ＡＤＣが有用性を有することをさらに確認するものである。
【実施例１４】
【０３９７】
１９．抗原刺激されたＴリンパ球はｃＡＣ１０  ＡＤＣに対してより感受性が高い
図２３は、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥおよびｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰが様々なタイプのＴリンパ球の増殖を阻害する効果をまとめて示したものである。以下の傾向が観察された。第１に、ナイーブＴ細胞は、記憶Ｔリンパ球またはＴリンパ球クローンと比較した場合、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥおよびｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰの両方に対し最も強いようである。第２に、Ｔリンパ球クローンと記憶Ｔ細胞の間では、１０のＴリンパ球クローンのうち８は記憶Ｔリンパ球と比較して、ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥより感受性が高いことがわかった。これらのクローンは、炎症性および自己免疫性応答にかかわる慢性的に刺激されたエフェクターＴ細胞と同様に、Ｔ細胞受容体およびサイトカインによる多数回の刺激によって増殖していた。第３に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球クローンのいずれの増殖も、ｃＡＣ１０  ＡＤＣに影響を受けやすかった。第４に、ｃＡＣ１０  ＡＤＣへの感受性は、それらのサイトカイン分泌プロフィールによって定義されるような何らかの特定のＴリンパ球サブセットに相互に関連するようにも見えなかった。したがって、Ｔｈ０、Ｔｈ２、およびＴｃ０クローンおよびＴｃ２の各１個とＣＤ４＋／ＣＤ８＋クローンは、ｃＡＣ１０  ＡＤＣに感受性を有することがわかった。これらの結果は、ｃＡＣ１０  ＡＤＣは、複合的なＴリンパ球サブセット（ナイーブＴリンパ球または記憶Ｔリンパ球、ヘルパー（ＣＤ４＋）または細胞傷害性（ＣＤ８＋）リンパ球を含む）および様々な組合せでサイトカインを分泌するエフェクターリンパ球を標的とするために使用され得ることを示唆する。さらに、免疫疾患の病因に参加するエフェクターＴリンパ球は、ナイーブＴ細胞より慢性的に活性化したＴリンパ球クローンに生物学上より似ているので、ｃＡＣ１０  ＡＤＣは、自己免疫応答、炎症性応答およびアレルギー性応答の病因に含まれるＣＤ３０＋エフェクターＴリンパ球の目的とする枯渇に特に適しているかもしれない。
【０３９８】
２０．特定の実施形態および参考文献の引用
本発明は本願明細書に記載した特定の実施形態によってその範囲が限定されるものではない。実際、本願明細書に記載したものに加えての本発明の様々な改変は、これまでの記載および添付図面から当業者には明らかであろう。そのような改変は、添付する特許請求の範囲内に含まれる。
【０３９９】
本願明細書に引用した、特許出願、特許および学術的な刊行物を含む様々な参考文献の各開示は、参照によってその全体が本願明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０４００】
【図１】ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞の上でのＣＤ３０の発現を示す図である。ジャーカットＴ細胞系統について、フローサイトメトリー分析により、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ３０の発現を調べた。
【図２】ジャーカットＴ細胞の増殖に対する抗ＣＤ３０の影響を示す図である。ジャーカットＴ細胞を、２次架橋性ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）Ｆｃγ特異的Ａｂの存在と共に（ＸＬ  ｃＡＣ１０）または存在させずに（ｃＡＣ１０）、段階的投与量のキメラＡＣ１０（ｃＡＣ１０）抗ＣＤ３０  ｍＡｂと共にインキュベートした。７２時間のインキュベーションの最後の４時間において、トリチウムを含むチミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）のパルスによって増殖を評価した。
【図３】抗ＣＤ３０  ｍＡｂの２次架橋によるジャーカットＴ細胞の増殖阻害を示す図である。ジャーカットＴ細胞を、２次架橋性ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）Ｆｃγ特異的Ａｂの存在下、段階的投与量のＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１  ｍＡｂと共にインキュベートした。１次Ａｂと２次Ａｂの比は図中に示すように変えた。４８時間のインキュベーションの最後の４時間において、３Ｈ−ＴｄＲのパルスにより増殖を評価した。
【図４】抗ＣＤ３０  ｍＡｂの２次架橋によるジャーカットＴ細胞のアポトーシス誘導を示す図である。ジャーカットＴ細胞を、０．８μｇ／ｍｌのＧＡＭ２次Ａｂで架橋したＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１  ０．２μｇ／ｍｌで処理した。処理後２４時間および４８時間の時点で、細胞周期の状態およびＤＮＡ合成を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および抗ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）染色によって検出した。
【図５】抗ＣＤ３０  ｍＡｂの２次架橋によるジャーカットＴ細胞のアポトーシス誘導を示す図である。ジャーカットＴ細胞を、ＧＡＭ２次Ａｂで架橋したＡＣ１０またはＨｅＦｉ−１の段階的投与量で処理した。１次Ａｂと２次Ａｂの濃度比は１：４とした。処理後２４時間および４８時間の時点で細胞周期の状態およびＤＮＡ合成をＰＩおよび抗ＢｒｄＵ染色によって検出した。
【図６】抗ＣＤ３  ｍＡｂによるジャーカットＴ細胞の抗ＣＤ３０誘導アポトーシスの増強効果を示す図である。図中に示す段階的投与量のＡＣ１０、抗ＣＤ３  ｍＡｂ  ＯＫＴ３または両方のｍＡｂの組合せでジャーカットＴ細胞を処理した。４倍過剰のＧＡＭ２次Ａｂを用いて１次ｍＡｂを架橋した。処理後２４時間および４８時間の時点で細胞周期の状態およびＤＮＡ合成をＰＩおよび抗ＢｒｄＵ染色によって検出した。
【図７】アネクシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ結合によるジャーカットＴ細胞の中の抗ＣＤ３０誘導アポトーシスの検出。ジャーカットＴ細胞は、ＡＣ１０、ＨｅＦｉ−１、抗ＣＤ３  ｍＡｂ  ＯＫＴ３、またはＡＣ１０もしくはＨｅＦｉ−１およびＯＫＴ３の組合せで処理した。抗ＣＤ３０および抗ＣＤ３  ｍＡｂは２μｇ／ｍｌで使用した。ＧＡＭ２次Ａｂは１次ｍＡｂを架橋するために１０倍過剰で使用した。ＦＩＴＣをコンジュゲートしたアネクシンＶの結合は、アポトーシス進行中の細胞の検出を可能にした。ＰＩへの細胞膜透過性を用いて細胞膜の完全性を失った死細胞を検出した。図中で、アネクシンＶ−／ＰＩ−事象は生存細胞（左下四分域）を、アネクシンＶ＋／ＰＩ−事象はアポトーシス細胞（右下四分域）を、アネクシンＶ＋／ＰＩ＋事象は死細胞（右上四分域）を表す。密度プロットの外の数は、各四分域中に存在する細胞のパーセンテージを表す。
【図８】抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）であるｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥ、ｃＡＣ１０−ｆｋＭＭＡＥ、ｃＡＣ１０−ｖｃＡＥＦＰおよびｃＡＣ１０−ｆｋＡＥＦＰの化学構造を示す図である。
【図９】ジャーカットＴ細胞の増殖に対するｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートの増殖抑制効果を示す図である。ｃＡＣ１０−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートまたは非結合対照ＩｇＧ（ｃＩｇＧ）−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートを段階的投与量で培養開始時にジャーカットＴ細胞に加えた。細胞は、合計９６時間、ＡＤＣに連続的に暴露した。インキュベーションの最後の１６時間に３Ｈ−ＴｄＲのパルスによって増殖を評価した。
【図１０】活性化された正常な末梢血上単核細胞（ＰＢＭＣ）でのＣＤ３０誘導を示す図である。正常なドナーから得たＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８、または培地のみ（ネガティブ・コントロール）で刺激した。０、２、４、６および８日目において細胞を回収した。また、ＣＤ３０の発現はＣＤ４細胞（図示）とＣＤ８細胞（図示していない）の両方について多色フローサイトメトリー分析によって決定した。
【図１１】活性化された正常なヒトＰＢＭＣに対するｃＡＣ１０  ＡＤＣの成長抑制効果を示す図である。正常なドナーから得たＰＢＭＣを、図１０に記載するように抗ＣＤ３＋抗ＣＤ８  ｍＡｂで活性化した。図中に示す様々なＡＤＣの段階的投与量を、培養開始時に細胞に加えた。細胞は、合計４８時間または７２時間、ＡＤＣに連続的に暴露した。インキュベーションの最後の１６時間に３Ｈ−ＴｄＲの取り込みによって増殖を評価した。
【図１２】記憶およびナイーブＴ細胞におけるＣＤ３０の誘導を示す図である。末梢血Ｔリンパ球、記憶Ｔリンパ球およびナイーブＴリンパ球を、免疫選択を使用してＰＢＭＣから富化した。次いで、Ｔ細胞を、組み換えヒトインターロイキン（ｒｈＩＬ）−２およびｒｈＩＬ−４の両者の存在下、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  ｍＡｂによって７２時間活性化した。次いで、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞上のＣＤ３０発現をフローサイトメトリー分析によって決定した。
【図１３】活性化した記憶およびナイーブＴリンパ球に対するｃＡＣ１０  ＡＤＣの成長抑制効果を示す図である。ＰＢＭＣから富化した記憶およびナイーブＴ細胞を誘導して、図１２に記載するようにＣＤ３０を発現させた。誘導の７２時間後にＴ細胞を回収し、ｒｈＩＬ−２存在下、図中に示す様々なＡＤＣの段階的投与量で処理した。細胞は、さらに４８時間または７２時間、ＡＤＣに連続的に暴露した。インキュベーションの最後の１６時間に３Ｈ−ＴｄＲの取り込みによって増殖を評価した。
【図１４】同種異系細胞によって刺激されたＴ細胞におけるＣＤ３０誘導を示す図である。ＣＤ４富化したＰＢＭＣを、照射された同種異系バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞の連続サイクルで刺激した。ＣＤ４細胞上のＣＤ３０の発現は、同種異系刺激細胞の添加後３〜５日目および７〜９日目に、フローサイトメトリー分析によって決定した。
【図１５】Ｔリンパ球クローンの作製を示す図である。ＰＢＭＣからのＴ細胞クローンの生成を模式的に要約した。
【図１６】Ｔリンパ球クローンの表現型を示す図である。図１５の中のスキームによる３人の異なる正常なドナーから単離した１０種の独立したＴリンパ球クローンについて、フローサイトメトリー分析によって、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８およびＣＤ３０の表面発現を調べた。２つの代表的なクローンから得たヒストグラムを示す。また、フローサイトメトリー分析から得られた平均蛍光強度によって示される１０クローンすべてにおける受容体発現レベルを表にして示す。
【図１７】Ｔリンパ球クローンによるサイトカイン発現を示す図である。図１６に示したＴリンパ球クローンを、フローサイトメトリー分析によって、ＩＬ−２、４、５、１３、ＩＦＮγおよびＴＮＦα発現能力について調べた。２つの代表的なクローンから得たヒストグラムを示す。また、フローサイトメトリー分析から得られた平均蛍光強度によって示される１０クローンすべてにおけるサイトカイン発現のレベルを表にして示す。表の最下列では、サイトカイン発現に基づいてＴリンパ球クローンを様々なサブセットに割り当てた。
【図１８】Ｔリンパ球クローンの刺激によるＣＤ３０のアップレギュレーションを示す図である。図１６および１７に示したパネル中の休止Ｔｈ２クローンおよび休止Ｔｃ２クローンを、フィトヘムアグチニン（ＰＨＡ）、照射されたフィーダー細胞、ＩＬ−２およびＩＬ−４で刺激した。０、２、４および７日目におけるＣＤ２５およびＣＤ３０発現を、フローサイトメトリー分析によって決定した。
【図１９】Ｔリンパ球クローン４０Ｅ１０に対するｃＡＣ１０  ＡＤＣの成長抑制効果を示す図である。４０Ｅ１０細胞は、図１８に記載するようにしてＣＤ３０発現を誘導した。活性化２日目のＣＤ３０発現のピーク時に細胞を回収し、ｒｈＩＬ−２およびｒｈＩＬ−４存在下、図中に示す様々な段階的濃度のＡＤＣで処理した。細胞は、さらに４８時間または７２時間、ＡＤＣに連続的に暴露した。インキュベーションの最後の１６時間に３Ｈ−ＴｄＲの取り込みによって増殖を評価した。
【図２０】Ｔリンパ球クローン４０Ｈ７に対するｃＡＣ１０  ＡＤＣの成長抑制効果を示す図である。４０Ｈ７細胞は、図１８に記載するようにしてＣＤ３０発現を誘導した。活性化２日目のＣＤ３０発現のピーク時に細胞を回収し、ｒｈＩＬ−２およびｒｈＩＬ−４存在下、図中に示す様々な段階的濃度のＡＤＣで処理した。細胞は、さらに４８時間または７２時間、ＡＤＣに連続的に暴露した。インキュベーションの最後の１６時間に３Ｈ−ＴｄＲのパルスによって増殖を評価した。
【図２１】ｃＡＣ１０  ＡＤＣによって誘導されたＴ細胞クローン中の増殖抑制には、アポトーシス誘導が伴うことを示す図である。クローン４０Ｅ１０および４０Ｈ７を、図中に示す様々なＡＤＣ  １μｇ／ｍｌと共にインキュベートした。インキュベーション４８時間後に、アネクシンＶ結合およびＰＩの透過性を用いてアポトーシス誘導の程度を評価した。
【図２２】Ｔリンパ球クローン３．２７．２と４．０１．１に対するｃＡＣ１０  ＡＤＣの成長抑制効果を示す図である。３．２７．２および４．０１．１細胞では、図１８に記載するようにしてＣＤ３０発現が誘導された。活性化２日目のＣＤ３０発現のピーク時に細胞を回収し、ｒｈＩＬ−２存在下、図中に示す様々な段階的濃度のＡＤＣで処理した。細胞は、さらに７２時間、ＡＤＣに連続的に暴露した。インキュベーションの最後の４時間に３Ｈ−ＴｄＲのパルスによって増殖を評価した。
【図２３】ＣＤ３０＋Ｔリンパ球クローンおよび活性化された正常なＴリンパ球の増殖を抑制するｃＡＣ１０  ＡＤＣの効果を要約して示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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