(57)【要約】本発明は、患者の眼における緑内障および眼圧の上昇に関連した他の状態の治療における、強力なカリウムチャンネルブロッカーまたはその製剤の使用に関する。本発明はまた、哺乳類種、特にヒトの眼に神経保護作用を付与するための、そのような化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式Ｉ：
【化１】
2005533055.tif 000025
［式中、
Ｒ１およびＲ１ａは、独立して、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）Ｃ１−６アルキル、
【化２】
2005533055.tif 000026
または
【化３】
2005533055.tif 000027
である；
Ｒ２は、ｂの位置に二重結合が存在しない場合には、
（ａ）ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、
（ｂ）Ｈ、
（ｃ）ＯＨまたは
（ｄ）Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ３は、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）（Ｃ＝Ｏ）ＯＣ１−６アルキルまたは
（ｃ）所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｒ４は、
（ａ）Ｈ（ただし、この場合、Ｒ３はＨ以外である）、
（ｂ）所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキル；
【化４】
2005533055.tif 000028
または
【化５】
2005533055.tif 000029
である；
Ｒ５は、
（ａ）Ｈ、
（ｃ）ＯＨまたは
（ｄ）ＯＣ１−６アルキルである；
Ｒ６は、
（ａ）Ｈまたは
（ｂ）Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ７はＨ、または所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｒ８はＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＨ２−フェニル、ＣＨ２−ヒドロキシフェニル、ＣＨ２−インドリル、ＣＨ２−イミダゾリル、ＣＨ２ＯＲ６、ＣＨ（ＯＲ６）ＣＨ３、（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ６、（ＣＨ２）ｎＣＯ２ＮＲ６、（ＣＨ２）ｎＳＲ６、（ＣＨ２）ｎ（Ｎ＋Ｒ６）３である；
ｎは０〜４である；
- - - は、所望により及び独立してａまたはｂに存在しうる二重結合である］
の化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ１ａおよびＲ３が水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ４が
【化６】
2005533055.tif 000030
である、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２およびＲ７が水素であり、Ｒ４が
【化７】
2005533055.tif 000031
である、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
【化８】
2005533055.tif 000032
である化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物。
【請求項６】
式ＩまたはＩＩ：
【化９】
2005533055.tif 000033
［式中、
Ｒ１およびＲ１ａは、独立して、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）Ｃ１−６アルキル、
【化１０】
2005533055.tif 000034
または
【化１１】
2005533055.tif 000035
である；
Ｒ２は、ｂの位置に二重結合が存在しない場合には、
（ａ）ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、
（ｂ）Ｈ、
（ｃ）ＯＨまたは
（ｄ）Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ３は、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）（Ｃ＝Ｏ）ＯＣ１−６アルキルまたは
（ｃ）所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｒ４は、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキル；
【化１２】
2005533055.tif 000036
または
【化１３】
2005533055.tif 000037
である；
Ｒ５は、
（ａ）Ｈ、
（ｃ）ＯＨまたは
（ｄ）ＯＣ１−６アルキルである；
Ｒ６は、
（ａ）Ｈまたは
（ｂ）Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ７はＨ、または所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｒ８はＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＨ２−フェニル、ＣＨ２−ヒドロキシフェニル、ＣＨ２−インドリル、ＣＨ２−イミダゾリル、ＣＨ２ＯＲ６、ＣＨ（ＯＲ６）ＣＨ３、（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ６、（ＣＨ２）ｎＣＯ２ＮＲ６、（ＣＨ２）ｎＳＲ６、（ＣＨ２）ｎ（Ｎ＋Ｒ６）３である；
ｎは０〜４である；
- - - は、所望により及び独立してａまたはｂに存在しうる二重結合である］
の化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物の治療的有効量を、高眼圧または緑内障の治療を要する患者に投与することを含んでなる、高眼圧または緑内障の治療方法。
【請求項７】
式Ｉの化合物を溶液または懸濁液の形態の局所用製剤として投与する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
βアドレナリン性遮断剤、アドレナリン性アゴニスト、副交感神経作動剤、炭酸脱水酵素阻害剤、ＥＰ４アゴニストおよびプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選ばれる眼圧降下剤である第２の有効成分を同時または連続的に投与することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
βアドレナリン性遮断剤がチモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプチプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールである；副交感神経作動剤がピロカルピン、カルバコールまたはヨウ化ホスホリンである；アドレナリン性アゴニストがアイオピディン、ブリモニジン、エピネフリンまたはジピベフリンである；炭酸脱水酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドである；プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラである；およびプロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジン由来の低圧性脂質である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
局所用製剤がキサンタンガムまたはジェランガムを含有する、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
式Ｉの化合物が
【化１４】
2005533055.tif 000038
またはそれらの医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
請求項６記載の化合物の医薬上有効な量を、黄斑浮腫、黄斑変性を治療すること又は神経保護作用を付与することを要する患者に投与することを含んでなる、黄斑浮腫、黄斑変性を治療するための又は神経保護作用を付与するための方法。
【請求項１３】
式Ｉの化合物を溶液または懸濁液の形態の局所用製剤として投与する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
βアドレナリン性遮断剤、アドレナリン性アゴニスト、副交感神経作動剤、炭酸脱水酵素阻害剤、ＥＰ４アゴニストおよびプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選ばれる眼圧降下剤である第２の有効成分を同時または連続的に投与することを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
βアドレナリン性遮断剤がチモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプチプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールである；副交感神経作動剤がピロカルピン、カルバコールまたはヨウ化ホスホリンである；アドレナリン性アゴニストがアイオピディン、ブリモニジン、エピネフリンまたはジピベフリンである；炭酸脱水酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドである；プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラである；およびプロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジン由来の低圧性脂質である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
局所用製剤がキサンタンガムまたはジェランガムを含有する、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
式Ｉの化合物が
【化１５】
2005533055.tif 000039
またはそれらの医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物である、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
請求項１記載の式Ｉの化合物と医薬上許容される担体とを含んでなる組成物。
【請求項１９】
微生物株アスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１６８９１またはＰＴＡ−４２１０）、アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１５５４６またはＰＴＡ−４２１１）またはアスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４２１２）を使用する、式Ｉａ：
【化１６】
2005533055.tif 000040
の化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物の製造方法。
【請求項２０】
微生物株アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１５５４６（ＰＴＡ−４２１１）を使用する、式ＩａまたはＩｂ：
【化１７】
2005533055.tif 000041
の化合物またはそれらの医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物の製造方法。
【請求項２１】
微生物株アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４２１２を使用する、式Ｉｂ：
【化１８】
2005533055.tif 000042
の化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
緑内障は、正常な眼機能を維持できないほどに眼圧が高くなる、眼の変性疾患である。最終的には視神経乳頭に損傷が生じ、視機能の不可逆的喪失を引き起こす。緑内障は、治療されなければ、最終的には失明を招くことがある。現在では、眼圧上昇または高眼圧は緑内障の発症の初期段階を表すものであると大多数の眼科医により考えられている。
【０００２】
緑内障を治療するために以前使われていた薬物の多くは不満足なものであることが判明している。古くからの緑内障治療法はピロカルピンを使用するものであり、望ましくない局所作用を伴い、このため、この薬物は、貴重ではあるものの最重要薬物としては不満足なものとなった。その後、臨床医は、多数のβアドレナリン性アンタゴニストが眼圧降下に有効であることに注目した。これらの物質の多くはこの目的に有効であるが、患者によっては、この治療法が有効でないか又は十分には有効でない。これらの物質の多くは他の特徴、例えば膜安定化活性をも有し、これは、高い用量でより明らかとなり、それらを眼への慢性的な使用には許容し得ないものにし、また、心臓血管作用も引き起こしうる。
【０００３】
ピロカルピンおよびβアドレナリン性アンタゴニストは眼圧を低下させるが、これらの薬物はいずれも、炭酸脱水酵素を阻害することによってその作用を発現するものではなく、したがって、炭酸脱水酵素の経路による房水生成への関与を軽減することを利用するものではない。
【０００４】
炭酸脱水酵素阻害剤と称される物質は、炭酸脱水酵素を阻害することにより房水の生成を減少させる。そのような炭酸脱水酵素阻害剤は、全身および局所経路により眼圧異常を治療するために現在使用されているが、これらの物質を使用する現在の療法、特に、全身経路を用いるものには、依然として、望ましくない作用が付きまとう。炭酸脱水酵素阻害剤は基本的な生理的過程の改変における重要な作用を有するため、全身投与経路の回避は、代謝性アシドーシス、嘔吐、麻痺、刺痛、全身倦怠感などのような炭酸脱水酵素の阻害により引き起こされる副作用を、完全に消失させるわけではないものの、軽減するように働く。局所的に有効な炭酸脱水酵素阻害剤は米国特許第４，３８６，０９８号、第４，４１６，８９０号、第４，４２６，３８８号、第４，６６８，６９７号、第４，８６３，９２２号、第４，７９７，４１３号、第５，３７８，７０３号、第５，２４０，９２３号および第５，１５３，１９２号に開示されている。
【０００５】
プロスタグランジンおよびプロスタグランジン誘導体も眼圧を低下させることが公知である。Ｂｉｔｏの米国特許第４，８８３，８１９号は、眼圧降下におけるＰＧＡ、ＰＧＢおよびＰＧＣの使用および合成を記載している。Ｇｏｈらの米国特許第４，８２４，８５７号は、眼圧降下におけるＰＧＤ２およびその誘導体（例えば、Ｃ−１０が窒素で置換された誘導体）の使用および合成を記載している。Ｕｅｎｏらの米国特許第５，００１，１５３号は、眼圧降下のための１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンおよびプロスタグランジン誘導体の使用および合成を記載している。米国特許第４，５９９，３５３号は、眼圧降下におけるプロスタグランジンおよびプロスタグランジンインヒビターを含むエイコサノイドおよびエイコサノイド誘導体の使用を記載している。
【０００６】
プロスタグランジンおよびプロスタグランジン誘導体は、ぶどう膜強膜流出を増加させることにより眼圧を低下させる。これはＦ型およびＡ型のＰｇに当てはまり、したがって、おそらく、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＪ型のプロスタグランジンならびにそれらの誘導体にも当てはまるであろう。眼圧を低下させるためのプロスタグランジン誘導体の使用に伴う問題は、これらの化合物がしばしば、眼圧の初期増加を誘発し、眼色素沈着の色を変化させる可能性があり、眼の周囲のいくつかの組織の増殖を引き起こすことである。
【０００７】
現在、緑内障および眼圧上昇を治療するためのいくつかの療法があるが、これらの物質の効力および副作用プロフィールは理想的なものではないと理解されうる。最近、カリウムチャンネルブロッカーが眼における眼圧を減少させることが見出され、したがってこれは、高眼圧およびそれに関連した変性眼状態の治療に対する更にもう１つのアプローチを提供する。カリウムチャンネルの遮断は流体分泌を減少させ、ある状況下では、平滑筋収縮を増強することが可能であり、また、それはＩＯＰを低下させ、眼内の神経保護作用を有すると予想されるであろう（米国特許第５，５７３，７５８号および第５，９２５，３４２号；Ｍｏｏｒｅら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ  ３８，１９９７；ＷＯ  ８９／１０７５７，Ｗ０９４／２８９００およびＷＯ  ９６／３３７１９を参照されたい）。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、式Ｉ：
【０００９】
【化１９】
2005533055.tif 000002
［式中、
Ｒ１およびＲ１ａは、独立して、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）Ｃ１−６アルキル、
【００１０】
【化２０】
2005533055.tif 000003
または
【００１１】
【化２１】
2005533055.tif 000004
である；
Ｒ２は、ｂの位置に二重結合が存在しない場合には、
（ａ）ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、
（ｂ）Ｈ、
（ｃ）ＯＨまたは
（ｄ）Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ３は、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）（Ｃ＝Ｏ）ＯＣ１−６アルキルまたは
（ｃ）所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｒ４は、
（ａ）Ｈ（ただし、この場合、Ｒ３はＨ以外である）、
（ｂ）所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキル；
【００１２】
【化２２】
2005533055.tif 000005
または
【００１３】
【化２３】
2005533055.tif 000006
である；
Ｒ５は、
（ａ）Ｈ、
（ｃ）ＯＨまたは
（ｄ）ＯＣ１−６アルキルである；
Ｒ６は、
（ａ）Ｈまたは
（ｂ）Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ７はＨ、または所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｒ８はＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＨ２−フェニル、ＣＨ２−ヒドロキシフェニル、ＣＨ２−インドイル、ＣＨ２−イミダゾール、ＣＨ２ＯＲ６、ＣＨ（ＯＲ６）ＣＨ３、（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ６、（ＣＨ２）ｎＣＯ２ＮＲ６、（ＣＨ２）ｎＳＲ６または（ＣＨ２）ｎ（Ｎ＋Ｒ６）３である；
ｎは０〜４である；
- - - は、所望により及び独立してａまたはｂに存在しうる二重結合である］
の新規インドールジテルペン天然物および合成化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物、ならびに患者の眼における緑内障および眼圧の上昇に関連した他の状態の治療における、強力なカリウムチャンネルブロッカーとしてのそれらの使用に関する。本発明は更に、本発明の新規インドールジテルペンを含有する組成物に関する。本発明はまた、本発明の化合物のいくつかを製造するために使用する微生物に関する。本発明はまた、哺乳類種、特にヒトの眼に神経保護作用を付与するための、そのような化合物の使用を含む。より詳しくは、本発明は、式ＩまたはＩＩ：
【００１４】
【化２４】
2005533055.tif 000007
［式中、
Ｒ１およびＲ１ａは、独立して、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）Ｃ１−６アルキル、
【００１５】
【化２５】
2005533055.tif 000008
または
【００１６】
【化２６】
2005533055.tif 000009
である；
Ｒ２は、ｂの位置に二重結合が存在しない場合には、
（ａ）ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、
（ｂ）Ｈ、
（ｃ）ＯＨまたは
（ｄ）Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ３は、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）（Ｃ＝Ｏ）ＯＣ１−６アルキルまたは
（ｃ）所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｒ４は、
（ａ）Ｈ、
（ｂ）所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキル；
【００１７】
【化２７】
2005533055.tif 000010
または
【００１８】
【化２８】
2005533055.tif 000011
である；
Ｒ５は、
（ａ）Ｈ、
（ｃ）ＯＨまたは
（ｄ）ＯＣ１−６アルキルである；
Ｒ６は、
（ａ）Ｈまたは
（ｂ）Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ７はＨ、または所望によりＯＨ、Ｎ（Ｒ６）２もしくはＣＯ２Ｒ６で置換されていてもよいＣ１−６アルキルである；
Ｒ８はＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＨ２−フェニル、ＣＨ２−ヒドロキシフェニル、ＣＨ２−インドイル、ＣＨ２ＯＲ６、ＣＨ（ＯＲ６）ＣＨ３、（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＮＲ６、（ＣＨ２）ｎＣＯ２ＮＲ６、（ＣＨ２）ｎＳＲ６、（ＣＨ２）ｎ（Ｎ＋Ｒ６）３である；
ｎは０〜４である；
- - - は、所望により及び独立してａまたはｂに存在しうる二重結合である］
のインドールジテルペン化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物を使用する緑内障および高眼圧（眼圧の上昇）の治療に関する。
【００１９】
本発明のこの及び他の態様は、本明細書全体を精査すれば理解されるであろう。
【００２０】
発明の詳細な説明
いずれかの可変基（例えば、アリール、複素環、Ｒ１ａ、Ｒ６など）がいずれかの構成物中に２以上存在する場合には、各存在に関するその定義は各々の他の存在から独立したものである。また、置換基／可変基の組合せは、そのような組合せが安定な化合物を与える場合にのみ許容される。
【００２１】
また、本明細書に開示する化合物は互変異性体として存在する可能性があり、一方の互変異性構造のみが示されている場合であっても両方の互変異性体が本発明の範囲内に含まれると意図される。例えば、以下の化合物Ａに対する任意の特許請求は互変異性構造Ｂを含み、その逆も成り立ち、それらの混合物も含むと理解される。
【００２２】
【化２９】
2005533055.tif 000012
また、式Ｉの化合物中（例えば、置換アルキル部分）に塩基性または酸性基が存在する場合には、医薬上許容される塩またはエステルも本発明の範囲内に含まれる。酸性置換基（すなわち、−ＣＯＯＨ）が存在する場合には、投与形態として使用するアンモニウム、ナトリウムまたはカルシウム塩などが形成されうる。また、−ＣＯＯＨ基が存在する場合には、医薬上許容されるエステル、例えば酢酸エステル、マレイン酸エステル、ピバロイルオキシメチルなど、および徐放またはプロドラッグ製剤として使用する、溶解度または加水分解特性を改変することが当技術分野で知られているエステルを使用することが可能である。
【００２３】
塩基性基、例えばアミノ基が存在する場合には、酸性塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、パモ酸塩などを投与形態として使用することが可能である。
【００２４】
本明細書中で用いる「アルキル」は、特定されている炭素原子数を有する分枝状および直鎖状の両方の飽和脂肪族炭化水素基を包含する意であり、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒ）、ブチル（Ｂｕ）、ペンチル、ヘキシルなどを含む。「アルキル」はまた、飽和炭素環基である「シクロアルキル」、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル（Ｃｙｈ）を含む。「アルコキシ」は、酸素架橋を介して結合する、示されている炭素原子数のアルキル基を表す。「アルケニル」は、鎖に沿った任意の安定な位置に存在しうる１以上の炭素−炭素二重結合を有する、直鎖上または分枝状の立体配置の炭化水素基、例えばエテニル、プロペニル、ブテニルなどを包含する意である。「アルキニル」は、鎖に沿った任意の安定な位置に存在しうる１以上の炭素−炭素三重結合を有する、直鎖上または分枝状の立体配置の炭化水素基、例えばエチニル、プロピニル、ブチニルなどを包含する意である。本明細書中で用いる「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。「Ｂｏｃ」なる語はｔ−ブチルオキシ−カルボニルを意味する。
【００２５】
本発明の１つの実施形態は、Ｒ１、Ｒ１ａおよびＲ３が水素であり、すべての他の可変基が最初に記載されているものである場合と認識される。
【００２６】
本発明の更にもう１つの実施形態は、Ｒ４が
【００２７】
【化３０】
2005533055.tif 000013
であり、すべての他の可変基が最初に記載されているものである場合と認識される。
【００２８】
本発明の更にもう１つの実施形態は、Ｒ２およびＲ７が水素であり、Ｒ４が
【００２９】
【化３１】
2005533055.tif 000014
であり、すべての他の可変基が最初に記載されているものである場合と認識される。
【００３０】
本発明の１つの実施形態は、式Ｉのインドールジテルペンと医薬上許容される担体とを含んでなる組成物である。
【００３１】
本発明のもう１つの実施形態は、式Ｉの化合物を局所用製剤として投与する前記方法である。
【００３２】
さらにもう１つの実施形態は、式ＩまたはＩＩ：
【００３３】
【化３２】
2005533055.tif 000015
［式中、可変基は前記と同意義である］の化合物ならびにその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体および混合物の治療的有効量を、高眼圧および／または緑内障の治療を要する患者に投与することを含んでなる、高眼圧および／または緑内障の治療方法である。
【００３４】
さらにもう１つの実施形態は、局所用製剤が溶液または懸濁液である前記方法を意図する。
【００３５】
さらにもう１つの実施形態は、βアドレナリン性遮断剤、アドレナリン性アゴニスト、副交感神経作動剤、炭酸脱水酵素阻害剤およびプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選ばれる眼圧降下剤である第２の有効成分を同時または連続的に投与することを含む前記方法である。
【００３６】
もう１つの実施形態は、βアドレナリン性遮断剤がチモロール、レボブノロール（ｌｅｖｏｂｕｎｏｌｏｌ）、カルテオロール、オプチプラノロール（ｏｐｔｉｐｒａｎｏｌｏｌ）、メタプラノロール（ｍｅｔａｐｒａｎｏｌｏｌ）またはベタキソロールである；副交感神経作動剤がピロカルピン、カルバコールまたはヨウ化ホスホリンである；アドレナリン性アゴニストがアイオピディン、ブリモニジン（ｂｒｉｍｏｎｉｄｉｎｅ）、エピネフリンまたはジピベフリンである；炭酸脱水酵素阻害剤がドルゾラミド（ｄｏｒｚｏｌａｍｉｄｅ）、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミド（ｂｒｉｎｚｏｌａｍｉｄｅ）である；プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラである；およびプロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジン由来の低圧性（眼圧降下性）脂質である前記方法である。
【００３７】
もう１つの実施形態は、構造式ＩまたはＩＩ：
【００３８】
【化３３】
2005533055.tif 000016
［式中、可変基は前記と同意義である］の化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物の医薬上有効な量を、黄斑浮腫または黄斑変性の治療を要する患者に投与することを含んでなる、黄斑浮腫または黄斑変性の治療方法である。
【００３９】
もう１つの実施形態は、式ＩまたはＩＩの化合物を局所用製剤として投与する前記方法である。
【００４０】
本発明の更にもう１つの実施形態は、βアドレナリン性遮断剤、アドレナリン性アゴニスト、副交感神経作動剤、炭酸脱水酵素阻害剤およびプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選ばれる眼圧降下剤である第２の有効成分を同時または連続的に投与することを含む。
【００４１】
もう１つの実施形態は、βアドレナリン性遮断剤がチモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプチプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールである；副交感神経作動剤がピロカルピン、カルバコールまたはヨウ化ホスホリンである；アドレナリン性アゴニストがアイオピディン、ブリモニジン、エピネフリンまたはジピベフリンである；炭酸脱水酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドである；プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラである；およびプロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジン由来の低圧性脂質である前記方法である。
【００４２】
もう１つの実施形態は、式ＩまたはＩＩ：
【００４３】
【化３４】
2005533055.tif 000017
［式中、可変基は前記と同意義である］の化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物の治療的有効量を、網膜および視神経乳頭血流速度を増加させる又は網膜および視神経酸素圧を増加させることを要する患者に投与することを含んでなる、網膜および視神経乳頭血流速度を増加させる又は網膜および視神経酸素圧を増加させるための方法である。
【００４４】
もう１つの実施形態は、式ＩまたはＩＩの化合物を局所用製剤として投与する前記方法である。
【００４５】
さらにもう１つの実施形態は、βアドレナリン性遮断剤、アドレナリン性アゴニスト、副交感神経作動剤、炭酸脱水酵素阻害剤、２００２年６月６日付け出願の米国特許出願第６０／３８６，６４１号（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  ＭＣ０５９ＰＶ）、２００２年１０月２５日付け出願の第６０／４２１，４０２号（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  ＭＣ０６７ＰＶ）、２００３年３月２６日付け出願の第６０／４５７，７００号（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  ＭＣ０８０ＰＶ）、２００２年８月２８日付け出願の第６０／４０６，５３０号（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  ＭＣ０６０ＰＶ）、および２００２年１１月２７日付け出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ  ０２／３８０３９および２００２年１１月２７日付け出願のＰＣＴ  ０２／３８０４０（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）、ならびにプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選ばれる眼圧降下剤である第２の有効成分を同時または連続的に投与することを含む。
【００４６】
もう１つの実施形態は、βアドレナリン性遮断剤がチモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプチプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールである；副交感神経作動剤がピロカルピン、カルバコールまたはヨウ化ホスホリンである；アドレナリン性アゴニストがアイオピディン、ブリモニジン、エピネフリンまたはジピベフリンである；炭酸脱水酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドである；プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラである；およびプロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジン由来の低圧性脂質である前記方法である。
【００４７】
本発明のもう１つの実施形態は、式ＩまたはＩＩ：
【００４８】
【化３５】
2005533055.tif 000018
［式中、可変基は前記と同意義である］の化合物またはその医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物の治療的有効量を、神経保護作用を要する患者に投与することを含んでなる、哺乳類の眼に神経保護作用を付与するための方法である。
【００４９】
また、本発明の範囲内には、式ＩまたはＩＩの化合物を局所用製剤として投与する前記方法も含まれる。
【００５０】
さらにもう１つの実施形態は、βアドレナリン性遮断剤、アドレナリン性アゴニスト、副交感神経作動剤、炭酸脱水酵素阻害剤およびプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選ばれる眼圧降下剤である第２の有効成分を同時または連続的に投与することを含む。
【００５１】
もう１つの実施形態は、βアドレナリン性遮断剤がチモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプチプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールである；副交感神経作動剤がピロカルピン、カルバコールまたはヨウ化ホスホリンである；アドレナリン性アゴニストがアイオピディン、ブリモニジン、エピネフリンまたはジピベフリンである；炭酸脱水酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドである；プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラである；およびプロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジン由来の低圧性脂質である前記方法である。
【００５２】
また、本発明の範囲内には、キサンタンガムまたはジェランガムを含有する、前記化合物ＩまたはＩＩの局所用製剤も含まれると意図される。
【００５３】
本発明の化合物の具体例としては、
【００５４】
【化３６】
2005533055.tif 000019
またはそれらの医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物が挙げられる。
【００５５】
本発明はまた、式Ｉａの化合物の場合には微生物株アスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１６８９１またはＰＴＡ−４２１０）、アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１５５４６またはＰＴＡ−４２１１）またはアスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４２１２）を、式Ｉｂの化合物の場合にはアスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１５５４６またはＰＴＡ−４２１１）またはアスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−４２１２）を使用する、式ＩａまたはＩｂ：
【００５６】
【化３７】
2005533055.tif 000020
またはそれらの医薬上許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体もしくは混合物の製造方法に関する。本発明の範囲内には、微生物株アスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１６８９１（ＰＴＡ−４２１０）も含まれる。
【００５７】
本明細書においては、特に示さない限り、後記で定義する用語を用いて本発明を説明する。
【００５８】
式Ｉの化合物中に塩基性または酸性基が存在する場合には、医薬上許容される塩またはエステルも本発明の範囲内に含まれる。
【００５９】
本発明はまた、βアドレナリン性遮断剤、例えばチモロール、オプチプラノロール、レボブノロール、メタプラノロール、カルテオロール、ベタキソロールなど、副交感神経作動剤、例えばピロカルピン、カルバコール、ヨウ化ホスホリンなど、アドレナリン性アゴニスト、例えばアイオピディン、ブリモニジン、エピネフリン、ジピベフリンなど、炭酸脱水酵素阻害剤、例えばドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミド、プロスタグランジン、例えばラタノプロスト、レスキュラ、Ｓ１０３３またはプロスタグランジン誘導体、例えばＰＧＦ２αプロスタグランジン由来の低圧性脂質から選ばれる眼圧降下剤と共に式ＩまたはＩＩの化合物の１つを、高眼圧または緑内障の治療を要する患者に投与することによる、高眼圧または緑内障の治療方法に関する。低圧性脂質（基本プロスタグランジン構造のα鎖連結上のカルボン酸基が、電気化学的に中性の基で置換されている）の一例としては、該カルボン酸基がＣ１−６アルコキシ基、例えばＯＣＨ３またはヒドロキシ基で置換されたもの（それぞれ、ＰＧＦ２ａ  １−ＯＣＨ３またはＰＧＦ２ａ  １−ＯＨ）が挙げられる。
【００６０】
好ましいカリウムチャンネルブロッカーは、カルシウム活性化カリウムチャンネルブロッカーである。より好ましいカリウムチャンネルブロッカーは、高コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（マキシＫ）チャンネルブロッカーである。マキシＫチャンネルは、ニューロン、平滑筋および上皮組織に広く存在し膜電位および細胞内Ｃａ２＋によりゲーティングされるイオンチャンネルのファミリーである。
【００６１】
眼圧（ＩＯＰ）は房水の動力学により制御される。房水は無色素毛様体上皮の段階で産生され、主として経線維柱帯房水流出により除去される。房水流入はイオン輸送過程により制御される。無色素毛様体上皮細胞内のマキシＫチャンネルは２つのメカニズムにより間接的に塩素イオンの分泌を制御すると考えられている。すなわち、このチャンネルは、該細胞からの塩素イオン流出の原動力を付与する過分極膜電位（内側負）を維持し、それは塩素イオンの移動のための対イオン（Ｋ＋）を付与する。水はＫＣｌと共に受動的に移動して房水の産生をもたらす。この組織内のマキシＫチャンネルは流入を減少させるであろう。マキシＫチャンエルは或る平滑筋組織の収縮性をも制御することが示されており、場合によっては、チャンネルブロッカーは静止筋肉を収縮させたり、自発的活性組織の筋原性活性を増強しうる。ピロカルピンによって生じるのと同様に、毛様体筋の収縮は線維柱帯を開き、房水流出を促進するであろう。したがって、マキシＫチャンネルはいくつかの様態で房水の動力学に著しい影響を及ぼしうるであろう。すなわち、このチャンネルの遮断は、流入または流出過程に影響を及ぼすことにより、あるいは流入／流出過程の両方への影響の組合せにより、ＩＯＰを減少させるであろう。
【００６２】
本発明は、マキシＫチャンネルが、遮断されると、純溶質（ｎｅｔ  ｓｏｌｕｔｅ）およびＨ２Ｏの流出を抑制することにより房水産生を抑制して、ＩＯＰを低下させるという知見に基づくものである。この知見は、マキシＫチャンネルブロッカーが黄斑浮腫および黄斑変性のような他の眼科学的機能不全の治療に有用であることを示唆している。ＩＯＰの低下は網膜および視神経への血流の増加を促すことが公知である。したがって、本発明は、黄斑浮腫、黄斑変性またはそれらの組合せの治療方法に関する。
【００６３】
また、黄斑浮腫は、眼の眼底後極部における極めて重要な中心視域内の網膜内の腫脹である。網膜内の流体の蓄積は神経要素をお互いから及びそれらの局所血液供給から解離させて、この領域における視機能の停止を引き起こす。
【００６４】
緑内障は視神経の進行性萎縮により特徴づけられ、しばしば、眼圧（ＩＯＰ）の上昇を伴う。しかし、神経保護作用を付与する薬物を使用することにより、必ずしもＩＯＰに影響を及ぼすことなく緑内障を治療することが可能である。Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｏｌ．１１２，１９９４年１月，ｐ．３７−４４；Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２，５，１９９１年４月，ｐ．１５９３−９９を参照されたい。ＩＯＰを低下させるマキシＫチャンネルブロッカーは神経保護作用の付与に有用であると考えられる。それは、ＩＯＰを低下させることにより、網膜および視神経乳頭の血流速度を増加させるのに並びに網膜および視神経の酸素を増加させるのに有用であり、それらが組合されると、視神経の健康に有益であると考えられる。したがって、本発明は更に、網膜および視神経乳頭の血流速度の増加、網膜および視神経の酸素圧の増加ならびに神経保護作用の付与またはそれらの組合せのための方法に関する。
【００６５】
使用するマキシＫチャンネルブロッカーは、好ましくは、眼への局所投与に適した眼用医薬組成物、例えば溶液、軟膏剤、クリーム剤の形態で又は固体挿入物として投与する。この化合物の製剤は０．０１〜５％、特に０．５〜２％の医薬を含有しうる。用量が眼圧の低下、緑内障の治療、血流速度もしくは酸素圧の増加または神経保護作用の付与に有効である限り、より高い用量、例えば約１０％、またはより低い用量を使用することも可能である。化合物０．００１〜５．０ｍｇ、好ましくは０．００５〜２．０ｍｇ、特に０．００５〜１．０ｍｇの１回量をヒトの眼に投与することが可能である。
【００６６】
該化合物を含有する医薬製剤は無毒性の医薬用有機担体または無毒性の医薬用無機担体と簡便に混合されうる。医薬上許容される担体の典型例としては、例えば水、水と水混和性溶媒（例えば、低級アルカノールまたはアルアルカノール）との混合物、植物油、ポリアルキレングリコール、石油に基づくゼリー、エチルセルロース、エチルオレアート、カルボキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドン、イソプロピルミリスタートおよび他の通常使用され許容される担体が挙げられる。該医薬製剤は、無毒性の補助物質、例えば乳化剤、保存剤、湿潤剤、増量剤など、例えばポリエチレングリコール２００、３００、４００および６００、カーボワックス１，０００、１，５００、４，０００、６，０００および１０，０００、抗細菌成分、例えば四級アンモニウム化合物、冷殺菌作用を有することが知られており使用上無害であるフェニル水銀塩、チメロサール、メチルおよびプロピルパラベン、ベンジルアルコール、フェニルエタノール、緩衝化成分、例えばホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコナートバッファーおよび他の通常の成分、例えばソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミン、オレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチラート、ジオクチルナトリウムスルホスクシナート、モノチオグリセロール、チオソルビトール、エチレンジアミン四酢酸などをも含有しうる。また、本目的の担体媒体として、適当な眼用ビヒクルを使用することが可能であり、それらには、通常のリン酸バッファービヒクル系、等張性ホウ酸ビヒクル、等張性塩化ナトリウムビヒクル、等張性ホウ酸ナトリウムビヒクルなどが含まれる。また、該医薬製剤は微粒子製剤の形態でありうる。また、該医薬製剤は固体挿入物の形態でありうる。例えば、医薬用担体として固体水溶性高分子を使用することが可能である。該挿入物を形成させるために使用する高分子は、任意の水溶性無毒性高分子、例えばセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、（ヒドロキシ低級アルキルセルロース）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース；アクリラート、例えばポリアクリル酸塩、エチルアクリラート、ポリアクチルアミド；天然物、例えばゼラチン、アルギナート、ペクチン、トラガカント、カラヤ、コンドルス、寒天、アカシア；デンプン誘導体、例えば酢酸デンプン、ヒドロキシメチルデンプンエーテル、ヒドロキシプロピルデンプンおよび他の合成誘導体、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレンオキシド、中和カルボポールおよびキサンタンガム、ジェランガムおよび該高分子の混合物でありうる。
【００６７】
本発明の製剤の適当な投与対象には、霊長類、ヒトおよび他の動物、特にヒトおよび家畜、例えばネコおよびイヌが含まれる。
【００６８】
該医薬製剤は無毒性補助物質、例えば使用上無害である抗菌成分、例えばチメロサール塩化ベンザルコニウム、メチルおよびプロピルパラベン、ベンジルドデシニウムブロミド、ベンジルアルコールまたはフェニルエタノール；緩衝化成分、例えば塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたはグルコナートバッファー；および他の通常の成分、例えばソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチラート、エチレンジアミン四酢酸などを含有しうる。
【００６９】
該眼用溶液または懸濁剤は、眼内の許容ＩＯＰレベルを維持するのに必要な回数、投与することができる。哺乳類の眼への投与は１日約１回または２回であると予想される。
【００７０】
局所眼投与の場合には、本発明の新規製剤は、単位投与形が有効成分の治療的有効量を含むよう又は併用療法の場合にはそれらの幾つかの複数回分を含むよう製剤化された溶液、ゲル剤、軟膏剤、懸濁剤または固体挿入物の形態をとりうる。
【００７１】
式ＩａのマキシＫチャンネルブロッカーは、アスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ）（ＭＦ４９４６）を使用する微生物法により製造される。この株ＡＴＣＣ  １６８９１（ＰＴＡ−４２１０）は、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ  ｉｎ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに位置するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
【００７２】
式ＩａおよびＩｂのマキシＫチャンネルブロッカーは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ  １５５４６（ＰＴＡ−４２１１）として寄託されている株アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）（ＭＦ６２９６）を使用する微生物法により製造されうる。式ＩａおよびＩｂの化合物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ  １５５４６（ＰＴＡ−４２１２）として寄託されている株アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）（ＭＦ６８７５）を使用する微生物法によっても製造されうる。
【００７３】
本発明において使用する化合物ＩａおよびＩｂは、
（ａ）所望の化合物に応じてアスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ）ＭＦ４９４６＝ＡＴＣＣ  １６８９１（ＰＴＡ−４２１０）、アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）ＭＦ６２９６＝ＡＴＣＣ  １５５４６（ＰＴＡ−４２１１）またはアスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）ＭＦ６８７５＝ＡＴＣＣ  １５５４６（ＰＴＡ−４２１２）の菌糸および分生子を種培地（表１）に接種し、
（ｂ）該接種真菌発酵物を、室温（２０〜３０℃）で、一定の蛍光を伴う湿潤条件下、好ましくは振とうしながら又は攪拌しないで、最も好ましくは、回転振とう機上、アスペルギルス・アリアセウス（Ａ．ａｌｌｉａｃｅｕｓ）による液体培地内での発酵の場合には行程５ｃｍで２２０ｒｐｍで、アスペルギルス・アリアセウス（Ａ．ａｌｌｉａｃｅｕｓ）による固形培地の場合にはより遅い回転ｒｐｍで、またはいずれかのアスペルギルス・ノミウス（Ａ．ｎｏｍｉｕｓ）株による固形基質上での発酵の場合には静置的にインキュベートし、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を使用して液体生産培地または固形基質培地に接種し、工程（ｂ）に記載の条件下で更にインキュベートして化合物ＩａまたはＩｂを得ることを含む、カリウムチャンネルアンタゴニストを製造するための発酵法により製造することが可能である。
【００７４】
該発酵ブロス内の化合物の最大蓄積は第７〜３０日に生じる。本発明は更に、適当な一定の制御された条件下で該発酵ブロス内で産生された化合物を該ブロスから精製し単離する工程（ｄ）を含む。適当な単離方法には、例えば、溶媒、好ましくは、アスペルギルス・アリアセウス（Ａ．ａｌｌｉａｃｅｕｓ）発酵の場合にはメチルエチルケトンおよびアスペルギルス・ノミウス（Ａ．ｎｏｍｉｕｓ）発酵の場合にはヘキサンでの培地の抽出が含まれる。株ＡＴＣＣ−１６８９１（ＰＴＡ−４２１０）、ＡＴＣＣ  １５５４６（ＰＴＡ−４２１１）およびＡＴＣＣ  １５５４６（ＰＴＡ−４２１２）を以下に説明する。
【００７５】
以下に挙げるすべての株は１００ｍｍペトリ皿上に三点接種し、湿度制御を伴わない暗室内で２５℃で１４日間増殖させた。ＣＹＡはツァペック酵母自己分解物寒天であり、ＢＭＥＡはブレイクスリー（Ｂｌａｋｅｓｌｅｅ）麦芽エキス寒天である。これらの培地の製造方法はＲａｐｅｒ，Ｋ．およびＦｅｎｎｅｌｌ，Ｄ．１９６５．Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｃｏ．６８６ｐｐ．に記載されている。括弧内の色標準はＫｏｒｎｅｒｕｐ，Ａ．およびＷａｎｓｃｈｅｒ，Ｊ．１９７８．Ｍｅｔｈｕｅｎ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｕｒ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｅｙｒｅ  Ｍｅｔｈｕｅｎ．２５２ｐｐ．による。
【００７６】
アスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｌｉａｃｅｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６８９１＝ＰＴＡ−４２１０＝ＭＦ４９４６＝Ｅ−００３４７８）
肉眼的特徴
ＣＹＡ上では、直径６５〜７０ｍｍに達する。培養マットは綿状ないし羊毛状であり、密集した白色菌糸体の小さな房状分枝を伴い、白色。分生子形成は疎らであり、培養物の外縁に限局し、淡黄色。中等度の黒色菌核。裏面は無色で有溝。滲出物は透明で、少数の大きな液滴。可溶性色素は存在しない。
【００７７】
ＢＭＥＡ上では、直径６５〜７０ｍｍに達する。培養マットは綿状で疎らであり、気中菌糸体は縁近傍では無色ないしコロニー中心では白色。分生子形成はコロニー縁に限局し、淡黄色。少数の大きな黒色菌核。裏面、滲出物および可溶性色素は存在しない。
【００７８】
顕微鏡的特徴
分生子頭は小さく淡黄色、放射状であり、成長と共に（第１４〜２１日に）大きな分岐断片に分裂する。分生子柄は長さ約１．０ｍｍ、より一般的には５００〜７５０μであり、壁は、細かい棘を有し、厚さ１μ以下である。小胞は球状で２５〜４０μである。小柄は二列であり、第１列は長さ６〜９μ、第２列は５〜８μであり、どちらの列も幅２〜３μである。分生子は球状で滑らかであり直径２〜３μである。菌核は大きく、卵形ないし楕円形であり、１〜３ｍｍであり、最初は白色であるが、やがて黒色となり、成長につれて白色の先端を形成する。
【００７９】
アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｏｍｉｕｓ）（＝ＡＴＣＣ  １５５４６＝ＰＴＡ−４２１１＝ＮＲＲＬ  １３１３７＝ＭＦ６２９６）および（＝ＡＴＣＣ１５５４６−ＰＴＡ−１４１２＝ＭＦ６８７５）
肉眼的特徴
ＣＹＡ上では、直径６５〜７７ｍｍに達する。培養マットは白色で綿状ないし羊毛状であり、それを覆って、豊富な分生子柄が存在し、培養皿のほとんどを満たしており、色は、プレートの縁における褐色がかった緑色（４Ｃ８、４Ｃ７）から、コロニーの中心に向かって濃いオリーブ色（４Ｅ８、４Ｅ７）となる。裏面は淡いオレンジ褐色（５Ｂ６、５Ｂ４）であり、有溝。少数の黒色菌核が存在する。可溶性色素および滲出物は存在しない。
【００８０】
ＢＭＥＡ上では、直径６５〜７０ｍｍに達する。培養マットは疎らで綿状であり、白色の気中菌糸体。分生子形成は疎らであり、淡緑色（３０Ｂ８、３０Ｃ８）。裏面は無色。可溶性色素および滲出物は存在しない。
【００８１】
顕微鏡的特徴
分生子頭は放射状であり、輪郭が不明瞭な典型的には直径５００〜６００μの柱状物に分裂する。分生子柄は粗く、それは厚い壁で囲まれており、無色透明であり、通常は長さ１〜２ｍｍであり、通常は幅１０μ以下である。小胞は、若い時に伸長し、成長と共に亜球状ないし球状になり、ほとんどの場合に直径３０〜５０μである。小柄は通常は二列であり、フィアライドは長さ６〜１０μ、幅４〜５μである。分生子は粗い棘を有し、球状ないし亜球状であり、直径３〜５μである。菌核は球状ないし亜球状であり、濃褐色ないし黒色であり、直径４００〜７００μである。
【００８２】
該培養の菌糸体成長物から、適当な溶媒、例えばアルコール性または酸素化溶媒、例えばエステルまたはケトンで該活性化合物を抽出する。抽出のための好ましい溶媒は、液体発酵にはメチルエチルケトン、固形基質発酵にはヘキサンである。所望の化合物を含有する溶液を濃縮し、ついでクロマトグラフィー分離に付して、培地から化合物Ｉを単離する。
【００８３】
栄養培地内の好ましい炭素源には、グリセロール、グルコース、スクロース、マンニトール、ラクトース、ソルビトール、デンプン、デキストリン、他の糖および糖アルコール、デンプンおよび他の炭水化物または炭水化物誘導体などが含まれる。含められうる他の炭素源としては、複合栄養素、例えばコーンミール、エンバク粉、アワ、コメ、ひき割りトウモロコシなどが挙げられる。培地内で使用する炭素源の厳密な量は、１つには、培地内の他の成分に左右されるが、通常、培地に対して０．５〜４０重量％の炭水化物量で十分である。これらの炭素源は個別に使用することが可能であり、あるいは幾つかのそのような炭素源を同一培地内で組合わせることが可能である。
【００８４】
好ましい窒素源としては、酵母エキス、黄色コーンミール、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実ミール、大豆粕および他の植物ミール（部分的または完全に脱脂されたもの）、カゼイン加水分解物、大豆加水分解物および酵母加水分解物、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、フェザーミール、ピーナッツ粉、蒸留可溶物など、ならびに無機および有機窒素化合物、例えばアンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなど）、尿素、アミノ酸、例えばメチオニン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、プロリン、グリシン、アルギニンまたはトレオニンなどが挙げられる。種々の窒素源を単独で又は組合わせて、培地に対して０．２〜１０重量％の量で使用することが可能である。
【００８５】
炭素源および窒素源は有利に併用されるが、それらの純粋な形態で使用される必要はない。なぜなら、微量の増殖因子および相当な量の無機栄養素を含有する、より低純度の物質も、使用に適しているからである。所望により、無機塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ホスファート、スルファート、クロリド、カルボナート、および炭酸ナトリウムまたはカルシウム、リン酸ナトリウムまたはカリウム、塩化ナトリウムまたはカリウム、ヨウ化ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩などとして培地内に加えられうる同様のイオンを培地に加えることが可能である。また、微量金属、例えばコバルト、マンガン、鉄、モリブデン、亜鉛、カドミウム、銅などが加えられる。種々の無機塩源は単独で又は組合わせて、培地に対して０．１〜１．０重量％の量で、微量元素は培地に対して０．００１〜０．１重量％で使用されうる。
【００８６】
必要に応じて、特に培地が著しく発泡する場合には、消泡剤、例えばポリプロピレングリコール２０００（ＰＰＧ−２０００）、液体パラフィン、脂肪油、植物油、鉱油またはシリコーンを加えることが可能である。
【００８７】
化合物ＩａまたはＩｂの大量生産には、発酵槽内の液内好気的発酵条件が好ましい。少量生産には、フラスコまたはボトル内の振とう又は表面培養を用いる。さらに、大きなタンク内で培養を行う場合には、化合物ＩａまたはＩｂの生産過程における増殖の遅れを避けるために、生産タンク内の接種に該生物の栄養形を使用することが好ましい。したがって、まず、予め調製された凍結菌糸体からの又は「斜面」内で産生された該生物の胞子または菌糸体を比較的少量の培地に接種し、該接種培地（「種培地」とも称される）を培養し、ついで該培養栄養形接種物を大きなタンクに無菌的に移すことにより、該生物の栄養形接種物を製造することが望ましい。該接種物を産生させるための種培地は表１に記載されており、一般には、接種前に培地を滅菌するために高圧滅菌される。一般には、高圧滅菌工程の前に、酸または塩基、好ましくは、塩酸または水酸化ナトリウムの希薄溶液の適当な添加により、該種培地を５〜８、好ましくは約６．８のｐＨに調節する。この種培地内の培養物の培養は２２℃〜３７℃、好ましくは２５℃に維持する。種培地（好ましくは、表１に記載のもの）内の培養物ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１６８９１またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．１５５４６のインキュベーションは、通常、振とうしながら、好ましくは行程５ｃｍで２２０ｒｐｍで作動する回転振とう機上、約２〜６日間、好ましくは３〜４日間行う。インキュベーション時間の長さは発酵条件および規模に応じて様々となりうる。適当な場合には、新鮮な種培地を培地の一部に接種し、ついで同様の条件下であるが時間を短縮してインキュベートすることにより、菌糸体をより大量生産するために、種培地（表１）内で第２段階の種発酵を行うことができる。ついで、得られた培養物を使用して生産培地、好ましくは液体生産培地（表２）に接種することが可能である。該種培養物が接種された発酵液体生産培地を、攪拌しながら３〜２８日間、通常は７〜１１日間インキュベートする。該培養混合物の攪拌および通気は種々の方法で達成されうる。攪拌は、プロペラまたは同様の機械的攪拌装置により、あるいは発酵混合物を発酵槽内で回転または振とうすることにより、あるいは種々のポンピング装置により、あるいは培地に無菌空気を通すことより行うことができる。通気は、無菌空気を発酵混合物に通すことにより行うことができる。
【００８８】
発酵を行うための好ましい種および生産培地には、以下の培地が含まれる。
【００８９】
【表１】
2005533055.tif 000021
該種培地は蒸留水で調製し、綿栓付きの２５０ｍｌの無じゃま板エーレンマイヤーフラスコ当たり５０ｍｌで分注した。１２１℃で２０分間滅菌した。
【００９０】
表２
生産培地の組成
Ａ．固形基質生産培地
１．固体部分：
６７５ｃｃの大粒子状バーミキュル石を２リットルのローラーボトルに加えた。これをラテックス栓で塞ぎ、６０分間高圧滅菌し、３０分間乾燥させた。
【００９１】
２．液体部分：
【００９２】
【表２】
2005533055.tif 000022
該生産培地は蒸留水で調製し、５００ｍｌ  ボトル当たり２２０ｍｌで分注し、１２１℃で１５分間滅菌した。ＮＺ  Ａｍｉｎｅ  Ｔｙｐｅ  Ａがタンパク質加水分解物（カゼインの酵素消化物）である場合には、製造業者はＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＮＹ）である。
【００９３】
Ｂ．液体生産培地
【００９４】
【表３】
2005533055.tif 000023
該液体生産培地は蒸留水で調製し、綿栓付きの２５０ｍｌの無じゃま板エーレンマイヤーフラスコ当たり５０ｍｌで分注した。１２１℃で１５分間滅菌した。
【００９５】
発酵槽プロセス
種培地（表１に記載のものと同じ）：
成分 （ｇ／Ｌ）
コーンスティープリカー            ２．５
トマトペースト                    ４０
エンバク粉                      １０
グルコース                        １０
微量元素＃２                      １０（ｍｌ）
生産培地：
成分 （ｇ／Ｌ）
グリセロール                    １００．０
グルコース                        ７０．０
Ｌ−トリプトファン                  ０．７
ＮＨ４Ｃｌ                           ３．０
ＭＳＧ                            １０．０
アミカーゼ                          ８．０
ＭＥＳ                            ２０．０
Ｋ２ＨＰＯ４                          １．０
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ０．５
８５％  乳酸                        ５．０（ｍｌ）
微量元素１Ｂ                      ２０．０（ｍｌ）
ｐＨ６．０に調節し、ついで以下を加える：
ＣａＣＯ３                           １．０
Ｐ２０００                          １ｍｌ／Ｌ
微量元素１Ｂ：
成分 （ｇ／Ｌ）
０．６Ｎ  ＨＣｌ中で調製：
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ０．５
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                  ０．０５
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ０．５
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ                    ０．１
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                  ０．０４
方法：
大規模法においては２工程の種プロセスを用いる。第１工程では、２５０ｍＬ  フラスコ内の種培地を２２〜２５℃、２２０ｒｐｍで４８時間培養する。第２工程では、２Ｌ  フラスコ内の種培地に０．５〜１ｍＬの第１工程の種を接種し、それを同じ条件で４８〜７２時間培養する。発酵槽を、生産培地の稼動容積が２０〜５０Ｌとなるように設定し、１２３℃で２５分間滅菌する。ついで該発酵槽に第２工程の種（２．５〜３％  接種物）を接種し、以下の条件に設定した。
温度                      ２２〜２６℃
圧力                      ５．０ｐｓｉｇ
気流                      ５．０〜１５．０  ｌｐｍ
攪拌                      ３００〜７００ｒｐｍ
ｐＨ                      無制御
該攪拌はＲｕｓｈｔｏｎインペラにより行い、それを用いて溶存酸素レベルを３０％またはそれ以上に制御する。接種後第７日から、およびその後は生産力価レベルが低下するまで２〜３日ごとに、無菌サンプルを採取し、ＨＰＬＣによりアッセイする。最適な発酵サイクルは１４〜１７日である。
【００９６】
以下の実施例は本発明を例示するために記載されており、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００９７】
発酵による化合物Ｉａの製造
種：培養ＡＴＣＣ  １６８９１を凍結調製物として４℃で維持した。１本の凍結チューブの内容物を５０ｍｌの種培地に懸濁させた（種培地の組成については表１を参照されたい）。十分な量のバイオマスが得られるまで、該培養を旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃、相対湿度８５％で３〜４時間成長させた。
【００９８】
生産：
固形基質発酵培地の組成を表２に示す。各培養種の１ｍｌ  アリコートを２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ内の生産培地の５０ｍｌの液体部分中に配置した。代謝産物の産生のために該フラスコを１４〜２１日間インキュベートした。該バイオマスを分散させるために、これを激しく回転させた。該内容物を、６７５立方センチの蒸気滅菌大粒子バーミキュル石を含有する２リットルのローラー培養容器内に注ぐことにより分注した。該ローラーボトルの内容物を振とう／混合して、それが均一に接種され行き渡るようにした。ついで該ローラーボトルを、Ｗｈｅａｔｏｎローラー装置上、約４ｒｐｍで回転させて２２℃で１９日間、水平にインキュベートして、該発酵培地内で二次代謝産物を産生させた。
【００９９】
該液体発酵培地の組成を前記表２に示す。該培養種の１ｍｌ  アリコートを２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ内の５０ｍｌの液体産生培地中に配置した。代謝産物の産生のために該フラスコを２２℃、２２０ｒｐｍで１４〜２１日間インキュベートした。
【実施例２】
【０１００】
化合物ＩａまたはＩｂの精製および同定
本化合物は、クロマトグラフィー法の組合わせにより、発酵の粗抽出物から精製することができる。
【０１０１】
実施例１に記載のとおりに製造した発酵ブロス（体積２．０リットル）を、激しく振とうしながら、メチルエチルケトンで抽出した。濾過し、減圧下で溶媒を蒸発させた後、水性懸濁液をメチルエチルケトンで再抽出した。乾燥後、残渣を６０ｍｌの塩化メチレンに再溶解した。
【０１０２】
塩化メチレン中の酢酸エチルの勾配で溶出する８０ｃｃのシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより、第１分画を行った。該５０：５０（ｖ／ｖ）溶出液は、関心のある化合物を含有しており、それを主な不純物および他のインドールジテルペンから取り出した。
【０１０３】
豊富な留分を完全に蒸発させた。精製の第２工程をメタノール中のセファデックスＬＨ−２０上のゲル濾過により行って、溶出の０．７５〜０．９カラム容積において該化合物を得た。
【０１０４】
得られた調製物は、Ｚｏｒｂａｘ  ＲｘＣ８カラム［２．５×２５ｃｍカラム；８ｍｌ／分でアセトニトリル−水５０：５０（ｖ／ｖ）で、ついで１００％  アセトニトリルへの１００分間の勾配での溶出］上で行うＨＰＬＣに適していた。これは、溶媒の蒸発および凍結乾燥の後、純粋な化合物Ｉａを与えた。
【０１０５】
クロマトグラフィー特性：４０℃に維持し０．１％  トリフルオロ酢酸中の３０％〜１００％  アセトニトリルの勾配で１ｍｌ／分で３０分間にわたり溶出させた０．４６×２５ｃｍ  Ｚｏｒｂａｘ  ＲｘＣ８カラム上、ｋ’＝７．０。
【０１０６】
同様にして、実施例２に記載の発酵物から化合物Ｉａを精製した。
【０１０７】
６．５リットルに達するヘキサン抽出物を完全に蒸発させた。前記の塩化メチレンへの溶解およびカラムクロマトグラフィー工程の実施は、大量の他のインドールジテルペンおよび他の不純物の化合物Ｉの部分精製をもたらした。更なる精製を、再び前記のとおりのゲル濾過およびＺｏｒｂａｘ  ＲｘＣ８上での最終ＨＰＬＣ工程により行って、化合物ＩａおよびＩｂの両方を得た。
【０１０８】
該精製化合物をＮＭＲおよび質量分析により同定した。
【０１０９】
【化３８】
2005533055.tif 000024
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ５００  ＮＭＲ分光計上、ＣＤ２Ｃｌ２中、２５℃、５００ＭＨｚで記録した。ケミカルシフトは、内部標準として溶媒ピークを用いるゼロｐｐｍのＴＭＳに対するｐｐｍ単位で示されている。特徴的なピークのみが示されている。
略語：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｑ＝四重線、ｂｒ＝幅広、ｍ＝多重線、ｔ＝三重線。
１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ５００  ＮＭＲ分光計上、ＣＤ２Ｃｌ２中、２５℃、１２５ＭＨｚで記録した。
【実施例３】
【０１１０】
実施例３Ａ〜Ｆ
実施例３Ａ
実施例Ｅ−０５０２６１−００７Ｍ＋Ｅ−０５０２６１−００８Ｐ（株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１２による１ｂの製造）
種：培養ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１２を凍結調製物として４℃で維持した。１本の凍結チューブの内容物を５０ｍｌの種培地ＮＡＳに懸濁させた（種培地の組成については表１を参照されたい）。十分な量のバイオマスが得られるまで、該培養を旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃、相対湿度８５％で３日間成長させた。ＮＡＳの新たなフラスコに該３日培養物のアリコート（２ｍｌ）を接種することにより、第２の生産種を調製した。該第２生産種を、旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃で１日間インキュベートした。
【０１１１】
生産：固形基質発酵培地Ｆ１＋およびＲＭ＋の組成を表Ｘに示す。各培養種のアリコート（２．０ｍｌ）を、培地Ｆ＋またはＲＭ＋を含有する２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ内に配置した。接種されたフラスコを２５℃で２２日間インキュベートした。回収時に、完了した発酵物をフラスコ当たり７５ｍｌのヘキサンで抽出した。
【０１１２】
実施例３Ｂ
実施例Ｅ−０５０２６３−００１Ｓ（株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１１によるＩｂの製造）
種：培養ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１１を凍結調製物として４℃で維持した。１本の凍結チューブの内容物を５０ｍｌの種培地ＮＡＳに懸濁させた（種培地の組成については表Ｘを参照されたい）。十分な量のバイオマスが得られるまで、該培養を旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃、相対湿度８５％で３日間成長させた。ＮＡＳの新たなフラスコに該３日培養物のアリコート（２ｍｌ）を接種することにより、第２の生産種を調製した。該第２生産種を、旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃で１日間インキュベートした。
【０１１３】
生産：固形基質発酵培地３Ｑ１８の組成を表Ｘに示す。各培養種のアリコート（２．０ｍｌ）を、培地３Ｑ１８を含有する２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ内に配置した。接種されたフラスコを２５℃で２２日間インキュベートした。回収時に、完了した発酵物をフラスコ当たり１２５ｍｌのヘキサンで抽出した。
【０１１４】
実施例３Ｃ
実施例Ｅ−０５０２６３−００１Ｓ（株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１１によるＩｂの製造）
種：培養ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１１を凍結バイアル調製物として−８０℃で維持した。１本のバイアルの内容物を５０ｍｌの種培地ＮＡＳＭＯＤに懸濁させた（種培地の組成については表Ｘを参照されたい）。十分な量のバイオマスが得られるまで、該培養を旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃、相対湿度８５％で５日間成長させた。ＮＡＳＭＯＤの新たなフラスコに該５日培養物のアリコート（２ｍｌ）を接種することにより、第２の生産種を調製した。該第２生産種を、旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃で２日間インキュベートした。
【０１１５】
生産：固形基質発酵培地３Ｑ１８の組成を表Ｘに示す。各培養種のアリコート（２．０ｍｌ）を、培地３Ｑ１８を含有する２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ内に配置した。接種されたフラスコを２５℃で１４日間インキュベートした。回収時に、完了した発酵物をフラスコ当たり１２５ｍｌのヘキサンで抽出した。
【０１１６】
実施例３Ｄ
実施例Ｅ−０５０２６３−００１Ｓ（株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１１によるＩｂの製造）
種：培養ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１１を凍結バイアル調製物として４℃で維持した。１本の凍結チューブの内容物を５０ｍｌの種培地ＮＡＳに懸濁させた（種培地の組成については表Ｘを参照されたい）。十分な量のバイオマスが得られるまで、該培養を旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃、相対湿度８５％で３日間成長させた。ＮＡＳの新たなフラスコに該３日培養物のアリコート（２ｍｌ）を接種することにより、第２の生産種を調製した。該第２生産種を、旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃で１日間インキュベートした。
【０１１７】
生産：固形基質発酵培地Ｆ１＋の組成を表Ｘに示す。各培養種のアリコート（２．０ｍｌ）を、培地Ｆ１＋を含有する２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ内に配置した。接種されたフラスコを２５℃で２２日間インキュベートした。回収時に、完了した発酵物をフラスコ当たり７５ｍｌのヘキサンで抽出した。
【０１１８】
実施例３Ｅ
実施例（化合物Ｉａ）Ｅ−０５０２６３−０１４Ｃ−（株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１１によるＩｂの製造）
種：培養ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１１を凍結バイアル調製物として−８０℃で維持した。１本のバイアルの内容物を培地３Ｑ１８の１本のフラスコ内に懸濁させた（種培地の組成については表Ｘを参照されたい）。十分な量のバイオマスが得られるまで、該フラスコを旋回振とう機（２２０ｒｐｍ）上、２５℃、相対湿度８５％で３日間成長させた。該フラスコに４０ｍｌの新鮮なＮＡＳ培地を加え、攪拌して胞子を該液体全体に分散させることにより、胞子を回収した。
【０１１９】
生産：固形基質発酵培地３Ｑ１８の組成を表Ｘに示す。回収胞子のアリコート（１．０ｍｌ）を、培地３Ｑ１８を含有する２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ内に配置した。接種されたフラスコを３０℃で９日間インキュベートした。回収時に、完了した発酵物をフラスコ当たり１２５ｍｌのヘキサンで抽出した。
【０１２０】
実施例３Ｆ
種：培養ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４２１１を凍結バイアル調製物として−８０℃で維持した。１本のバイアルの内容物を５０ｍｌの種培地ＫＦＡに懸濁させた（種培地の組成については表Ｘを参照されたい）。十分な量のバイオマスが得られるまで、該培養を、攪拌することなく、２５℃、相対湿度８５％で１９日間成長させた。この培養物を１００ｍｌの無菌蒸留水で希釈し、激しく攪拌した後、生産フラスコへの接種に使用した。
【０１２１】
生産：固形基質発酵培地ＲｉｃｅＭａｎの組成を表Ｘに示す。各培養希釈ＫＦＡ種のアリコート（２．０ｍｌ）を、培地ＲｉｃｅＭａｎを含有する２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ内に配置した。接種されたフラスコを３０℃で２３日間インキュベートした。回収時に、完了した発酵物をフラスコ当たり１２５ｍｌのヘキサンで抽出した。
【０１２２】
培地組成
ＫＦ／ＮＡＳ−乾燥コーンスティープ  ２．５グラム、トマトペースト  ４０．０グラム、エンバク粉  １０．０グラム、グルコース  １０．０グラム、微量元素混合物＃２  １０．０ｍｌ、脱イオン水  １０００ｍｌ。６Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを６．８に調節。
微量元素混合物＃２は１０００ｍｌの０．６Ｎ  ＨＣｌ中に以下のものを含有する：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．０グラム、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  １．０グラム、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０２５グラム、ＣａＣｌ２  ０．１グラム、Ｈ３ＢＯ３  ０．０５６グラム、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ０．０１９グラム、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２グラム。
【０１２３】
ＫＦＡ−ＫＦ培地＋寒天  ４．０グラム／リットル。
【０１２４】
ＮＡＳＭＯＤ−グルコース  １０．０グラム、エンバク粉  １０．０グラム、乾燥トマトペースト  １８．０グラム、コーンスティープ粉末  ２．５グラム、微量元素混合物＃２  １０．０ｍｌ  脱イオン水  １０００ｍｌ（ＮａＯＨでｐＨ６．８）。微量元素混合物＃２は１０００ｍｌの０．６Ｎ  ＨＣｌ中に以下のものを含有する：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．０グラム、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  １．０グラム、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０２５グラム、ＣａＣｌ２  ０．１グラム、Ｈ３ＢＯ３  ０．０５６グラム、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ０．０１９グラム、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２グラム。
【０１２５】
Ｆ１＋−ひき割りトウモロコシ  １０．０グラム／２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ、基礎液体Ｃ  １０．０ｍｌ／２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ、脱イオン水  １０．０ｍｌ／２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ。基礎液体Ｃは以下のものを含有する：酵母エキス  ０．２グラム、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１グラム、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１グラム、酒石酸Ｎａ  ０．１グラム、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１グラム、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１グラム、脱イオン水  １０００ｍｌ。
【０１２６】
ＲＭ＋−  玄米  １０．０グラム／２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ、基礎液体Ｂ  ２０ｍｌ／２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ。基礎液体Ｂは以下のものを含有する：酵母エキス  １．０グラム、酒石酸Ｎａ  ０．５グラム、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５グラム、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５グラム、微量元素混合物１Ｂ  １０ｍｌ。微量元素混合物１Ｂは１０００ｍｌの０．６Ｎ  ＨＣｌ中に以下のものを含有する：ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５グラム、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０５グラム、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５グラム、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．１グラム、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０４グラム。
【０１２７】
３Ｑ１８−玄米  ２４．５グラム／２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ、基礎液体Ａ  ５０ｍｌ／２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ。基礎液体Ａは以下のものを含有する：マンニトール  １２５グラム、グルコース  １２．５グラム、Ｌ−トリプトファン  １０．０グラム、酵母エキス  ５．０グラム、ＫＨ２ＰＯ４  ５．０グラム、脱イオン水  １０００ｍｌ。
【０１２８】
ＲｉｃｅＭａｎ−玄米  ２２．０グラム、基礎液体１８Ｌ  ３５ｍｌ／２５０ｍｌ  エーレンマイヤーフラスコ。基礎液体１８Ｌは以下のものを含有する：マンニトール  １２５グラム、グルコース  １２．５グラム、Ｌ−トリプトファン  ４．０グラム、酵母エキス  ５．０グラム、ＫＨ２ＰＯ４  ５．０グラム、脱イオン水  １０００ｍｌ。
【実施例４】
【０１２９】
高コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャンネルに対する化合物の効果の電気生理学的アッセイ
方法：
高コンダクタンスカルシウム活性化カリウム（マキシＫ）チャンネルを流れる電流のパッチクランプ記録を、マキシＫチャンネルのαサブユニットを構成的に発現するＣＨＯ細胞またはαおよびβ１サブユニットの両方を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞から切り出された膜パッチから、通常の技術（Ｈａｍｉｌｌら，１９８１，Ｐｆｌｕｇｅｓ  Ａｒｃｈｉｖ．３９１，８５−１００）により室温で行った。ガラス毛細管（Ｇａｒｎｅｒ  ＃７０５２）を２段階で引いて、約１〜２ミクロンの先端径を有するミクロピペットを得た。ピペットには、典型的には、１５０  ＫＣｌ、１０  ヘペス（４−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−ピペラジンメタンスルホン酸）、１  Ｍｇ、０．０１  Ｃａを含有する溶液を充填し、それを３．７ｍＭ  ＫＯＨでｐＨ  ７．２０に調節した。該細胞膜と該ピペットとの間に高い抵抗（＞１０９オーム）のシールを形成させた後、該ピペットを該細胞から引いて、インサイドアウト（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）膜パッチを形成させる。該パッチを、１５０  ＫＣｌ、１０  ヘペス、５  ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸）、１〜５μＭの遊離Ｃａ濃度を与えるのに十分なＣａを含有するバス溶液中に切り入れ、ｐＨをＫＯＨで７．２に調節した。例えば、４．１９３ｍＭ  Ｃａを加えて２２℃で１μＭの遊離濃度を得た。ＥＰＣ９増幅器（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃ，Ｌａｍｂｒｅｃｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して電圧を制御し、該膜パッチを流れる電流を測定した。ヘッドステージ（ｈｅａｄｓｔａｇｅ）への入力をＡｇ／ＡｇＣｌ線でピペット溶液に接続し、増幅器のアースを、０．２Ｍ  ＫＣｌに溶解された寒天で満たされた管で覆われたＡｇ／ＡｇＣｌ線でバス溶液に接続した。マキシＫ電流であることは、膜電位および細胞内カルシウム濃度に対するチャンネル開口確率の感受性により確認した。
【０１３０】
データ収集は、ＰＵＬＳＥソフトウェア（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃ）により制御し、ＰＵＬＳＥＦＩＴ（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃ）およびＩｇｏｒ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ，Ｏｓｗｅｇｏ，ＯＲ）ソフトウェアを使用する後の解析のためにＭａｃＩｎｔｏｓｈコンピューター（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ）のハードドライブ上で保存した。
【０１３１】
結果：
マキシＫチャンネルに対する本発明の化合物の効果を、切り出したインサイドアウト膜パッチにおいて調べた。膜電位を−８０ｍＶに維持し、正の膜電位（典型的には＋５０ｍＶ）への短い電圧段階を１５秒ごとに１回適用してマキシＫチャンネルを一時的に開口させた。特定された化合物を該膜パッチの内側に適用することにより生じたピーク電流の減少から、各実験において遮断されたチャンネルの割合を計算した。各実験における陽性対照として、カルシウムを加えることなく標準バス溶液に１ｍＭ  ＥＧＴＡを加えることにより得た低濃度のカルシウム（＜１０ｎＭ）に該パッチを一時的にさらした後、マキシＫ電流がパルス電位において排除された。１ｎＭ濃度の化合物ＩａはマキシＫチャンネル電流における８８％の減少を引き起こした。該バスから化合物を除去した後、ピーク電流増幅の回復は１５分以内にほとんど又は全く観察されなかった。
【実施例５】
【０１３２】
化合物の活性は以下のアッセイにより定量することが可能である。
【０１３３】
マキシＫチャンネルのインヒビターの同定は、ＨＥＫ−２９３細胞における該チャンネルのαおよびβサブユニットのトランスフェクションの後、ならびにＨＥＫ−２９３細胞の内因性カリウムコンダクタンスを選択的に排除するカリウムチャンネルブロッカーと共にインキュベートした後、発現マキシＫチャンネルが細胞静止電位をもたらす能力に基づく。マキシＫチャンネルインヒビターの非存在下では、該トランスフェクト化ＨＥＫ−２９３細胞は、マキシＫチャンネルの活性による、Ｅｋ（−８０ｍＶ）に近い、内側が負の過分極膜電位を示す。マキシＫチャンネルブロッカーの存在下のインキュベーションによるマキシＫチャンネルの遮断は細胞脱分極を引き起こす。膜電位の変化は、ドナーであるクマリン（ＣＣ２ＤＭＰＥ）とアクセプターであるオキサノール（ＤｉＳＢＡＣ２（３））２つの成分を使用する電圧感受性蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）色素ペアを使用して測定することができる。
【０１３４】
オキサノールは親油性アニオンであり、膜電位に従い膜を横切って分布する。正常な条件下、細胞の内側が外側に対して負である場合には、膜の外側小葉状部分（ｏｕｔｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）にオキサノールが蓄積し、クマリンの励起がＦＲＥＴを生じさせる。膜脱分極を引き起こす条件は細胞の内側へのオキサノールを再分布を引き起こし、その結果、ＦＲＥＴの減少を引き起こす。したがって、変化率（ドナー／アクセプター）は膜の脱分極後に増加し、これが、試験化合物がマキシＫチャンネルを活性に遮断するかどうかを決める。
【０１３５】
ＨＥＫ−２９３細胞は受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ２０８５２から入手した。該細胞系の公的な入手に関するいずれの制限も、特許発行後に、取り消し無く（ｉｒｒｅｖｏｃａｂｌｙ）除去される。
【０１３６】
ＨＥＫ−２９３細胞におけるマキシＫチャンネルのαおよびβ１サブユニットのトランスフェクションは以下のとおりに行った。ＨＥＫ−２９３細胞を１００ｍｍ組織培養処理ディッシュ内で３×１０６細胞／ディッシュの密度でプレーティングし、合計５個のディッシュを調製した。１０％  ウシ胎児血清、１×Ｌ−グルタミンおよび１×ペニシリン／ストレプトマイシンで補足されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）よりなる培地内で３７℃、１０％  ＣＯ２で細胞を増殖させた。マキシＫ  ｈα（ｐＣＩｎｅｏ）およびマキシＫ  ｈβ１（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ）ＤＮＡでのトランスフェクションのために、１０ｍｌの無血清／無フェノールレッドＤＭＥＭに１５０μｌのＦｕＧＥＮＥ６（商標）を滴下し、室温で５分間インキュベートした。ついで該ＦｕＧＥＮＥ６（商標）溶液を、２５μｇの各プラスミドＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液に滴下し、室温で３０分間インキュベートした。該インキュベーション時間の後、２ｍｌの該ＦｕＧＥＮＥ６（商標）／ＤＮＡ溶液を細胞の各プレートに滴下し、該細胞を前記と同じ条件下で２日間増殖させた。第２日の終わりに、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および０．７５μｇ／ｍｌ  ピューロマイシンの両方で補足されたＤＭＥＭよりなる選択培地下に細胞を配置した。別々のコロニーが形成されるまで、細胞を増殖させた。５個のコロニーを集め、６ウェル組織培養処理ディッシュに移した。合計７５個のコロニーを集めた。コンフルエントな単層が得られるまで、細胞を増殖させた。ついで、該チャンネルへの１２５Ｉ−イベリオトキシン（ｉｂｅｒｉｏｔｏｘｉｎ）−Ｄ１９Ｙ／Ｙ３６Ｆの結合をモニターするアッセイを用いて、マキシＫチャンネルαおよびβ１サブユニットの存在に関して細胞を試験した。ついで、ＶＩＰＲ装置と共に蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ技術を使用して、トランスフェクト化ＨＥＫ−２９３細胞の膜電位をマキシＫチャンネルが制御する能力をモニターする機能アッセイにおいて、１２５Ｉ−イベリオトキシン−Ｄ１９Ｙ／Ｙ３６Ｆ結合活性を発現する細胞を評価した。最大Ｓ／Ｎ比を与えるコロニーを限界希釈に付した。このためには、細胞を約５細胞／ｍｌで再懸濁させ、２００μｌを９６ウェル組織培養処理プレート内の個々のウェルにプレーティングして約１細胞／ウェルを加えた。合計２個の９６ウェルプレートを調製した。コンフルエントな単層が形成したら、該細胞を６ウェル組織培養処理プレートに移した。合計６２ウェルを移した。コンフルエントな単層が得られたら、該ＦＲＥＴ機能アッセイを用いて細胞を試験した。最良のＳ／Ｎ比を与えるトランスフェクト化細胞を同定し、後続の機能アッセイにおいて使用した。
【０１３７】
機能アッセイ：
ついで該トランスフェクト化細胞（２Ｅ＋０６細胞／ｍｌ）を９６ウェルのポリ−Ｄ−リシンプレート上に約１００，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、約１６〜約２４時間インキュベートする。該培地を該細胞から吸引し、該細胞を１００μｌのダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で１回洗浄する。ウェルごとに、Ｄ−ＰＢＳ中の１００μｌの約９μＭ  クマリン（ＣＣ２ＤＭＰＥ）−０．０２％  プルロニック−１２７を加え、該ウェルを暗室で約３０分間インキュベートする。該細胞を１００μｌのダルベッコリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、１４０（ｍＭ）  ＮａＣｌ、０．１  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、２０  ヘペスーＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１０  グルコース中の１００μｌの約４．５μＭのオキサノール（ＤｉＳＢＡＣ２（３））を加える。ＨＥＫ−２９３細胞の内因性カリウムコンダクタンスの３μＭ  インヒビターを加える。マキシＫチャンネルブロッカー（約０．０１μＭ〜約１０μＭ）を加え、該細胞を暗室中、室温で約３０分間インキュベートする。
【０１３８】
該プレートを電圧／イオンプローブリーダー（ＶＩＰＲ）装置内にローディングし、ＣＣ２ＤＭＰＥおよびＤｉＳＢＡＣ２（３）の両方の蛍光発光を１０秒間記録する。この時点で、１００μｌの高カリウム溶液［１４０（ｍＭ）  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、２０  ヘペスーＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１０  グルコース］を加え、両方の色素の蛍光発光を更に１０秒間記録する。高カリウム溶液の添加前のＣＣ２ＤＭＰＥ／ＤｉＳＢＡＣ２（３）の比は１である。マキシＫチャンネルインヒビターの非存在下では、高カリウム溶液の添加後の比率は１．６５〜２．０の様々な値となる。マキシＫチャンネルが既知標準または試験化合物により完全に抑制された場合には、この比率は１のままである。したがって、該蛍光比における濃度依存的変化をモニターすることにより、マキシＫチャンネルインヒビターの活性を力価測定することが可能である。化合物ＩａおよびＩｂによるマキシＫチャンネルの遮断活性は１００ｎＭまたはそれ未満である。
【実施例６】
【０１３９】
ウサギにおける眼圧（ＩＯＰ）測定
いずれかの性別の正常圧Ｄｕｔｃｈ  Ｂｅｌｔｅｄウサギ（２．３ｋｇ）を、これらの実験中、１２時間の明／暗周期で維持した。眼圧（ＩＯＰ）は、較正空気眼圧計（Ａｌｃｏｎ  Ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ  Ｐｎｅｕｍａｔｏｎｏｇｒａｐｈ）を使用して測定し、結果は、ミリメートル水銀（ｍｍＨｇ）単位で表した。動物の不快感を最小限にするために、眼圧測定の前に１滴の０．０５％  プロパラカインを角膜に投与した。２つのベースライン（対照）値を−０．５および０時間の時点で得、ついで化合物Ｉ、ＩａまたはＩＩを２５μｌの容量で局所投与（片眼の結膜嚢に投与）し、反対側の眼（他眼）には等容量のビヒクルを投与した。薬物の投与およびＩＯＰの測定に関わった者には溶液の内容を知らせない盲検法を用いた。ついでＩＯＰの測定を薬物の局所投与の０．５、１、２、３、４、５および６時間後に行った。各日の測定の終了時に、較正器／検孔器（ｖｅｒｉｆｉｅｒ）を使用して眼圧計の安定性を測定した。
【０１４０】
結果
正常なＤｕｔｃｈ  Ｂｅｌｔｅｄウサギへの化合物ＩａまたはＩｂ（０．５、０．１および０．０１％）の片眼局所投与はそれぞれ３．７、３．３および３ｍｍＨｇのＩＯＰの減少を誘発した。該眼圧低下応答はすべての用量において有意であり、０．５および０．１％の用量では少なくとも６時間継続した。また、試験したすべての用量において、有意な対側性効果も観察された。
【国際調査報告】
2005533055.tif 000043