(57)【要約】【課題】【解決手段】  卵をガンマ線に曝露することにより、卵を除核する方法。使用されるガンマ線照射の線量は、照射を受ける卵の核によって規定される卵またはそれに由来する胚の発育を停止するべく十分高いが、除核された卵に移入された核によって規定される卵または胚の発育を可能ならしめるべく十分低い量である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵を除核する方法であって、前記卵をガンマ線に曝露することを特徴とする除核方法。
【請求項２】
ガンマ線照射の線量が、前記卵を核移入法において使用可能とするべく十分高いことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガンマ線照射の線量が、照射を受ける卵の核によって規定される卵またはそれに由来する胚の発育を停止するべく十分高く、除核された卵に移入された核によって規定される卵または胚の発育を可能ならしめるべく十分低いことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記卵を１分〜３分の時間ガンマ線に曝露することを特徴とする先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記卵を２Ｇｙ／ｍｉｎ〜１２Ｇｙ／ｍｉｎの範囲の照射線量に曝露することを特徴とする先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ガンマ線照射の総線量が７Ｇｙを超えることを特徴とする先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ガンマ線照射の総線量が１０Ｇｙを超えることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ガンマ線照射の総線量が１２Ｇｙを超えることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ガンマ線照射の総線量が１２Ｇｙ〜１４Ｇｙの範囲にあることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ガンマ線照射の総線量が３７Ｇｙ〜６２．５Ｇｙの範囲にあることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ガンマ線照射の総線量が４４．５Ｇｙ〜４７．５Ｇｙの範囲にあることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記卵が鳥類のものであることを特徴とする先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて細胞を除核する段階を含むことを特徴とする動物の胚を発生せしめる方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて卵を除核することと、ドナー細胞から除核された卵へ二倍体核を移送することと、得られる胚を発育せしめることとを含むことを特徴とする動物の胚を発生せしめる方法。
【請求項１５】
前記ドナー細胞が遺伝子的に改変されていることを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法によって胚を発生せしめる段階（ａ）と、前記胚を動物に発育せしめる段階（ｂ）とを含むことを特徴とする動物を調製する方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、該方法が請求項１２に従属する場合に、前記方法がレシピエントである雌鳥に胚を移送する段階と、硬い殻の卵の形態で胚を生ませる段階と、胚を発育せしめて雛鳥として孵化せしめる段階とを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法において、該方法が請求項１１に従属する場合に、前記胚を卵外で発育せしめることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法において、該方法が請求項１１に従属する場合に、前記方法が請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって卵を除核する段階と、ドナー核を卵へ移送する段階と、胚を発育せしめてホスト殻の中で孵化せしめる段階とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
段階（ｂ）において形成された動物を繁殖せしめる段階（ｃ）を更に含むことを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって除核されたことを特徴とする卵。
【請求項２２】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法によって生産されたことを特徴とする胚。
【請求項２３】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法によって調製されたことを特徴とする動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は卵を除核する方法、詳細には、例えば核移入技法用のレシピエント細胞として使用する卵を除核する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核移入による胚クローニングが最初に実施されたのは１９５２年のことである（ブリッグスおよびキング、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．， Ｓｃｉ． ＵＳＡ ３８ ４５５〜４６１（１９５２））。以来、多くの種に関して核移入技術が実施され、羊の「ドリー」の生産において核移入技術は頂点を迎えることとなった（キャンベルら、ネイチャー ３８０、６４〜６６（１９９６））。
【０００３】
除核された卵母細胞や一個の細胞接合体へドナーの核を移入して胚を再構築することによって、遺伝子的に同一の個体を製造することが可能である。このことは、研究（即ち生物学的対照として）においても商業的応用（即ち、遺伝子的に価値のある家畜の繁殖、肉製品の均質性）においても明らかに有益な点である。核移入はまた、家畜種の遺伝子的改変の効率的な方法を開発する基礎となる。仮に、ドナー細胞が遺伝子改変されていれば、核移入後に発育する動物がその改変を有することになる（ＫＪマックリース、Ｊハウクロフト、ＫＨキャンベル、Ａコールマン、ＡＥシュニーケおよびＡＪカインド、ネイチャー ４０５、１００４〜１００５（２０００））。
【０００４】
核移入または核移植技術は、ある細胞から、核ＤＮＡが除去または破壊された他の細胞へ未処理の核を移入することを含む。特に、このプロセスは、レシピエントである卵や卵母細胞の細胞質にドナーの核を導入することを含み、レシピエントはドナー核の遺伝子材料を受容して、胚へと発育する可能性を有し、この胚は生育可能な成体動物へと発育するであろう。
【０００５】
核移入技術によって動物を生産可能とするためには、ドナー細胞の核を除核されたレシピエントである卵に移入する必要がある。両生類や、哺乳類、魚類において成功している核移入の方法はいずれも、ドナー核の導入の前にレシピエントである卵の除核を必要とし、ドナー核の導入によって卵の核が置換され生育の方向を定める。除核はレシピエントである卵の核の除去または不活化を含む。
【０００６】
レシピエントである卵は未受精卵であっても、受精したばかりの接合体段階の卵であってもよい。もし、卵が受精卵であれば、除去または不活化する必要がある雌性の前核を含んでいる。卵が受精してるならば、雌性の前核と雄性の前核、または受精後の精子に由来する多重雄性前核を含んでいる。ドナー核との置換に先立ち、これらはそれぞれ除去または不活化する必要がある。
【０００７】
従って、レシピエントである卵の除核は核移入技術の成否を左右する工程である。これまで数多くの方法が用いられてきた。
【０００８】
アフリカツメガエル等の両生類の場合、除核は通常紫外線照射によって行われ、ＤＮＡを損傷させることにより核を不活化する（ガードン、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．Ｓｕｐｐｌ．、４、２８７〜３１８（１９８６））。他の除核の方法としては、ヒョウガエルの卵等の両生類の卵に用いられる方法であるが、針を用いる用手操作が挙げられる。
【０００９】
哺乳類においては、通常ミクロピペットを用いて卵の核を物理的に除去することによって除核を行う（例えば、キャンベルら、ネイチャー ３８０ ６４〜６６（１９９６）、ワカヤマら、３６９〜３７４（１９９８）等参照）。
【００１０】
魚類においては、物理的な除核によってミノカサゴの核移入のためのレシピエント卵の調製を行っている（リーら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ａｕｇ；２０（８）：７９５〜９（２００２））。Ｘ線による未受精のメダカの卵母細胞の除核が報告されている（ワカマツら、ＰＮＡＳ ９８、１０７１〜１０７６ページ（２００１））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、多くの種において除核が成功してきたが、これまでの方法には問題が残っている。例えば、物理的な除核は技術的には非常に難しく、その成功率は低い。ＵＶ照射には発熱が伴い、これによって細胞が許容を越える損傷を受ける可能性がある。Ｘ線による除核は高線量のＸ線を必要とするため、同様に細胞が許容を越える損傷を受ける可能性がある。
【００１２】
従って、除核は核移入の実験の成否を左右する工程であり、達成困難な段階である。この問題は、鳥類の卵がその特有の構造故に除核を成功させることが非常に困難であることから、鳥類の細胞に関しては特に重要である。雌性の前核は芽盤に位置する、即ち直径約２ｍｍの白色スポットが卵黄の表面に存在する。
【００１３】
鳥類の卵の大部分は卵黄から構成され、他の動物の卵に比べ非常に大きく且つ割れやすい。従って、両生類や、哺乳類、魚類の卵を取扱うような容易さで操作することはできない。鳥類の卵の前核を容易に視覚化することはできず、従って手作業で除去することが困難であるため、鳥類の卵に物理的な除核を適用しようとする際に問題が生じる。鳥類の卵にＵＶ照射することも同様に成功を収めていない。雌鶏の卵へのＵＶ照射の適用を評価した結果、受精卵の発育を停止するのに必要な線量のＵＶを照射すると大量の熱が発生して卵を損傷する。Ｘ線照射は、高線量を要することにより、また必要な曝露時間が細胞に許容できない損傷をもたらす可能性が高いことにより適切な方法ではない。
【００１４】
従って、これらに代わる効率的な除核の方法、特に鳥類の卵を効率よく除核するために使用できる方法が提供されれば有益であることがわかる。
【００１５】
本発明の更なる目的は、核移入方法にもはや使用できないような損傷を卵に与えることなく卵を除核する方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の更なる目的は、簡便且つ迅速な除核の方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは驚くべきことに、ガンマ線照射を使用して効率よく卵、特に鳥類の卵を除核できることを見出し、照射を受ける卵の核によって方向付けられる発育は停止するが、照射を受ける卵に移入されたドナーの核によって方向付けられる発育は進行可能なように除核できることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明はその第一の様相において、卵をガンマ線に曝露することによる卵の除核方法を提供する。
【００１９】
使用されるガンマ線照射の線量は、照射を受ける卵の核によって規定される卵またはそれに由来する胚の発育を停止するように十分高く、且つ、除核された卵に移入された核によって規定される卵または胚の発育を可能ならしめるよう十分低いことが好ましい。
【００２０】
従って線量は、照射を受ける核がいかなる発育をも導くことができないような量である。このように、照射以前の核によって導かれるいかなる発育も停止され、照射を受ける卵の核によって導かれるいかなる発育も防止される。後続するいかなる発育も、除核された卵へ移入された核により規定される。
【００２１】
本発明の方法はいかなる動物の卵、例えば哺乳類や、両生類、鳥類、爬虫類、昆虫等の卵に適用できる。好ましい実施形態においては、鳥類の卵である。
【００２２】
本発明の方法に使用する卵は未受精卵であっても、受精したばかりの接合体段階の卵であってもよい。
【００２３】
卵のガンマ線照射は、照射を受ける卵の核によって導かれる発育を停止させるのに十分な照射をもたらすために十分長い時間で、しかも卵が核移入技術用のレシピエント卵として使用可能ならしめるための十分短い時間であれば任意の時間とすることができる。仮に卵が未受精ならば、線量は同様の受精卵の発育を停止させる量で十分である。例えば、卵またはそれに由来する胚を、卵に移入されたドナー核によって方向付けられた通りに発育せしめるに足る小線量で十分である。
【００２４】
照射への曝露時間、時間（分）当りの線量および卵への総線量は、卵の大きさや種類等種々の因子に依存する。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様においては、卵を１分間〜１０分間、例えば２分間〜５分間、好ましくは２分間〜４分間のガンマ線照射する。また、本発明の他の好ましい実施態様においては、卵を１分間〜３分間ガンマ線照射する。
【００２６】
一分間あたりの照射線量は、好ましくは２〜２５Ｇｙ／ｍｉｎ、例えば２〜２０、２〜１５、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、５〜２５、１０〜２５、１５〜２５、５〜１０、５〜１５、または１０〜１５Ｇｙ／ｍｉｎである。
【００２７】
好ましい一実施態様においては、１５Ｇｙ／ｍｉｎ〜２５Ｇｙ／ｍｉｎの照射線量、例えば１８  ６Ｇｙ／ｍｉｎ（１８．６Ｇｙ／ｍｉｎ）の照射線量に卵を曝露する。本実施態様において、放射線量の測定はＲＸ２０／５３Ｍイラジエータ（グラブアトムインダストリー社（ゴスポート、ハンプシャー））を用い、エジンバラ大学の細胞、動物、集団生物学研究所にて実施することが好ましい。
【００２８】
他の好ましい実施態様においては、卵を２Ｇｙ／ｍｉｎ〜１２Ｇｙ／ｍｉｎの照射線量に曝露する。
【００２９】
用いるガンマ線の総線量は７Ｇｙより大きいことが好ましく、例えば、８Ｇｙより大、好ましくは９Ｇｙより大、より好ましくは１０Ｇｙより大、更に好ましくは１１Ｇｙより大、最も好ましくは１２Ｇｙより大である。
【００３０】
特に好ましい一実施態様においては、総照射線量は１２〜１４Ｇｙ、例えば１２．８Ｇｙである。
【００３１】
卵の総照射量は好ましくは１０〜６２．５Ｇｙの間、例えば１０〜５０や、１０〜４０、１０〜３０、２０〜６２．５、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、３０〜６２．５、３０〜５０、３０〜４０、４０〜６２．５、４０〜５０、５０〜６２．５Ｇｙの間である。
【００３２】
好ましい一実施態様においては、卵を３７Ｇｙ〜６２．５Ｇｙの間、より好ましくは４２．５Ｇｙ〜４７．５Ｇｙの間、更に好ましくは４４〜４５Ｇｙの範囲の総照射線量に曝露する。本実施態様において、放射線量の測定はＲＸ２０／５３Ｍイラジエータ（グラブアトムインダストリー社（ゴスポート、ハンプシャー））を用い、エジンバラ大学の細胞、動物、集団生物学研究所にて実施することが好ましい。
【００３３】
他の好ましい一実施態様においては、卵を総線量６〜１８Ｇｙに曝露する。特に、好ましい一実施態様においては、総線量は約１２Ｇｙ、例えば１２．８Ｇｙである。
【００３４】
核移入手順において、ドナー核の注入以前に照射を行うことが好ましく、注入直前が最も好ましい。
【００３５】
本発明は本発明の第一の様相に従って除核された卵、および核移入技法（例えば動物の胚の再構築）におけるその使用も提供する。
【００３６】
本発明はその第二の様相において、動物の胚を発生せしめる方法を提供し、該方法は本発明第一の様相の方法に従って卵を除核することと、ドナー細胞からの二倍体核を除核された卵に移入することと、得られる胚を発育せしめることとを含む。
【００３７】
ドナー核は適切な細胞であればいずれのものから得ても良く、その細胞は完全或いは部分分化細胞でも未分化細胞でもよい。細胞はインビトロまたは抽出してエクスビボで培養することができる。ドナー細胞に関する唯一の限定は、正常なＤＮＡ含量を有することと、核型が正常であることである。有用な細胞源はＷＯ９６／０７７３２号公報に記載されている。
【００３８】
本発明の方法を用いてトランスジェニック胚および動物を発生せしめるには、マイクロインジェクション、マストランスフォーメーションまたはトランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション、ウイルス性トランスフェクション、リポフェクション等）等、当業界で知られている方法のいずれかを用いてドナー核を遺伝子的に改変することができる。
【００３９】
核移入には、当業界における適切な方法のいずれかを用いることができる。例えば、細胞融合やマイクロインジェクション（リッチーおよびキャンベル、Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．１５、 ｐ６０）を用いることができる。
【００４０】
核移入技術を用いる胚の発生に有用な方法の更なる詳細については、ＷＯ９６／０７７３２号公報およびＷＯ９７／０７６６８号公報に記載されている。これらの記載内容を本発明の一部を構成するものとしてここに援用する。
【００４１】
本発明はその第三の様相において、本発明の第二の様相の方法によって調製される生存可能な再構築された動物の胚を提供する。
【００４２】
本発明はその第四の様相において、動物を調製する方法を提供し、該方法は本発明の第二の様相の方法によって胚を発生せしめる段階（ａ）と、再構築された胚から動物を発育せしめる段階（ｂ）とを含む。
【００４３】
この方法は、段階（ｂ）において生じた動物を繁殖せしめる段階（ｃ）を更に含んでいてもよい。
【００４４】
本発明の方法によって生産された動物は、本発明の更なる様相を構成するものである。
【００４５】
胚はインビボまたはインビトロで予定日まで発育せしめることができる。胚が哺乳類のもである場合、レシピエントである雌に移入して予定日まで発育せしめなければならない。しかしながら、レシピエントである代理母体に移入して予定日まではらませておく以前の、胚盤胞の段階までの発育はインビトロで行うことができる。また、魚類または両性類（カエル等）の胚であれば、卵が正常に発育するような単純な溶液中インビトロで卵を維持することができる。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様においては、卵は鳥類の卵である。上述のように、鳥類と他の脊椎動物との卵における差異は、胚の発育が硬い殻の卵で行われる点にある。
【００４７】
本発明の本様相の好ましい実施態様においては、卵は鳥類の卵であり、雌鳥のレシピエントである卵管に胚を移入して、硬い殻に包囲された状態で産み落とさせることができる。
【００４８】
好ましい一実施態様においては、ＷＯ９０／１３６２６号公報に記載の技法の変法によって、鳥類の胚をインビトロまたはホスト殻中で予定日まで発育させることができる。本発明の本様相に従えば、本発明の第一の様相に従って除核した、雌鳥から除去した卵をドナー核と融合して胚を発生せしめ、ホスト殻の中で孵化するまで発育させる。
【００４９】
本発明の本様相に係る基本的な方法は次のものを含む。
＊未受精卵または受精したばかりの卵を雌鶏から取り出す。
＊用意したホスト殻にその卵を移入する。
＊本発明の第一の様相に従って除核を行う。
＊ドナー細胞または核を芽盤に導入する。
＊例えば、新鮮な卵から回収した卵白等の媒体を殻内部に注入された卵に添加する。
＊プラスチック製の蓋等で卵をカバーし、例えば５％二酸化炭素中４１℃で２４時間インキュベーターでインキュベートする。
＊更に媒体を添加し、卵を例えば粘着フィルムで密閉し、例えば３日間３７．５℃でインキュベートする。
＊場合によっては、この卵の内容物をより大きな卵に移入して、発育中の胚の上にスペースを確保する。
＊孵化するまでインキュベートする。
【００５０】
本発明は更に、本発明の方法を用いて発生せしめた動物を提供する。
【００５１】
本発明を、例示的な実施例を用い、添付の図面を参照して更に説明する。
【実施例１】
【００５２】
核移入の方法（図１に示す）は、通常次の段階を含む。
【００５３】
まず、細胞１をドナー動物２から抽出して培養する。他の動物７のレシピエントである卵細胞４ａから核３を取り出す。続いて、第一の動物から抽出した細胞を、除核した卵細胞４ｂと融合させて、培養可能であり続いて代理母体６へ移植可能な融合細胞５を提供する。移植された卵はクローン化動物８を生み出す。
【００５４】
核移入段階を成功させる上で、レシピエント卵細胞の除核は非常に重要であり、現在利用可能な核移入法の成否を左右する段階である。
【００５５】
本実施例においては、ガンマ線照射を用いて鳥類の卵を除核する。ガンマ線照射源としては、ＲＸ２０／５３Ｍイラジエータ（グラブアトムインダストリー社（ゴスポート、ハンプシャー））を使用して、英国エジンバラ大学の細胞、動物、集団生物学研究所にて実施した。
【００５６】
新たに生まれた雌鶏の卵の胚の発育を停止させる目的で、卵にガンマ線を２．５分照射した。受精接合体の発育を阻害するために必要な線量の概略値を決定するために、産卵雌鶏から接合体段階の卵を取り出し、続いてガンマ線照射源を用いて約４５Ｇｙの線量を２．５分に亘って照射した。
【００５７】
予備実験の結果によれば、１５〜２５Ｇｙ／ｍｉｎ（好ましくは１８Ｇｙ／ｍｉｎ）の率の線量を１〜３分照射することが、生まれたての卵の胚の発育を停止させるのに十分であることが判明した。総線量３７Ｇｙ（１〜３分に亘る）が有用であり、４４Ｇｙまたは４５Ｇｙも有用であることが判明した。本実施例において言及された全ての線量は、ＲＸ２０／５３Ｍイラジエータ（グラブアトムインダストリー社（ゴスポート、ハンプシャー））を使用して、エジンバラ大学の細胞、動物、集団生物学研究所において概算した。
【００５８】
受精接合体の発育を阻害するために必要な線量の概略値を決定するために、受精した産卵雌鶏から接合体段階の卵を取り出し、加温したインキュベーターのガンマ線照射源に移した。続いて卵を異なる時間範囲で照射し、続いて培養することにより、胚の更なる発育可能性を見積もることができた。対照の卵も同様な手続きに付したが、照射はしなかった。実験の結果を表１に示す。
【００５９】
表１は、通常は卵の６０％が正常に発育すると期待されるが、卵に行った操作と移動により対照の胚の発育が害されたことを示す。この場合、正常な発育は３０％のみであった。しかしながら、更に研究した結果、照射線源に卵を移動する必要性を無くすと、対照卵の問題が避けられるであろうことが示唆された。
【００６０】
【表１】
2005511067.tif 000002
【００６１】
表１のデータは、ガンマ線照射された胚の発育が完全阻害または著しく害されることを示唆するものである。
【実施例２】
【００６２】
ガンマ線照射線量の正確な決定
【００６３】
方法
実施例１で用いた照射線源ＲＸ２０／５３Ｍイラジエータの校正結果から、この機器が低線量においてターゲットにもたらされるガンマ線照射量を過剰に見積もっていたことが判明した。照射を受ける核によって規定される胚の発育を阻害するため、且つ照射卵へ移入されたドナー核によって規定される発育を可能ならしめるのに必要な最小照射線量をより正確に決定するために、ノルディオン・インターナショナル社のガンマセル３０００エランマシン（Elan machine）を用い、エジンバラの輸血サービス（the Blood Transfusion Service）において照射実験を繰り返した。
【００６４】
照射に先立つ卵の調製、および照射後の処理は実施例１に記載の実験に用いた卵の処理と同様に行った。
【００６５】
即ち、受精した雌鶏のマグナムより回収した卵を「フェーズＩ」培養ホスト殻（受精から胚盤葉生成、ＷＯ９０／１３６２６号公報参照）に配置し、卵黄を一重のガーゼで覆うことにより芽盤の乾燥を防止した。このホスト殻を５％ＣＯ２／４２℃の高湿度インキュベーターに配置した。
【００６６】
照射を受ける卵を加湿・加温（３７℃）移送用ボックスに移し、照射装置に入れた。移送用ボックス（３７℃）には水を入れて高湿度を維持し、エジンバラの線源へ移送する前に３０ｓｅｃｓの中程度のＣＯ２流を移送するインキュベーターに導入し、且つ卵の上には泡を載置した。
【００６７】
卵は一度に２個採取し、イラジエータのキャニスタへ入れた。
【００６８】
複数の卵を対照群と処理群とに分け、処理群には照射処理をした。実施例２の卵は次の４群：処理群１（総照射線量６．４Ｇｙ）、対照群１（総照射線量０Ｇｙ）、処理群２（総照射線量１２．８Ｇｙ）および対照群２（総照射線量０Ｇｙ）に分割した。
【００６９】
照射後（処理群の卵）、卵をボックスに戻した。全ての卵の処理を処理する際には、ボックスをラボに移送し、５％ＣＯ２／４２℃のインキュベータへと戻した。
【００７０】
結果
前述のように、実施例２の卵は次の４群：処理群１（総照射線量６．４Ｇｙ）、対照群１（総照射線量０Ｇｙ）、処理群２（総照射線量１２．８Ｇｙ）および対照群２（総照射線量０Ｇｙ）に分けた。
【００７１】
接合体の発育は、照射後３日目にハンバーガーおよびハミルトンの分類（Ｊ． Ｍｏｒｐｈｏｌ． ８８、４９〜９２（１９５１））を用いて評価した。
【００７２】
結果を表２および３に示す。
【００７３】
【表２】
2005511067.tif 000003
【００７４】
照射された３接合体は胚まで発育したが、段階１５までに遅延が生じ、小さいか不規則な形状を呈した。
【００７５】
【表３】
2005511067.tif 000004
【００７６】
２分間の照射により、盤（約３ｍｍの産卵胚盤葉）の更なる発育は起こらず、液胞状を呈したものもあった。
【実施例３】
【００７７】
核移入による胚の発生
【００７８】
実施例２に記載の方法を用いてレシピエントである卵を除核する。
【００７９】
即ち、受精した雌鶏のマグナムより回収した卵を「フェーズＩ」培養ホスト殻の中に置き、卵黄を一重のガーゼで覆うことにより芽盤の乾燥を防止する。このホスト殻を５％ＣＯ２／４２℃の高湿度インキュベーターに配置する。
【００８０】
照射を受ける卵を加湿・加温（３７℃）移送用ボックスに移し、照射装置に入れる。移送用ボックス（３７℃）には水を入れて高湿度を維持し、線源へ移送する前に３０ｓｅｃｓの中程度のＣＯ２流を移送するインキュベーターに導入し、且つ卵の上には泡を載置した。
【００８１】
卵を取出し、イラジエータのキャニスタへ入れ、総線量１２．８Ｇｙのガンマ線を２分間に亘って照射する。照射後、後述のように卵に細胞をマイクロインジェクトする。
【００８２】
細胞懸濁液２μＬをピペットで顕微鏡用スライド上に取り液滴を形成する。ガラス製ミクロキャピラリー（先端が３０°の斜角を有し、直径２５〜３０μｍ）をリサーチインストロメンツ社のミクロキャピラリーホルダーで保持して、浅い角度で液滴に進入させ、先端がスライドの表面に接触するだけとなるようにする。手動シリンジによってコントロールされた陰圧によって細胞をミクロキャピラリーに装填する。細胞懸濁液を採取し、細胞がメニスカスに向かって上昇するように過剰の溶液を排出することにより、最小体積（＜０．５ｎＬ）中に１〜１０個の細胞が装填される。
【００８３】
スライドを取り除き、卵に細胞を接種するのに適した対物レンズ下の作業距離を提供するように顕微鏡の焦点を合せる。卵黄からガーゼ層を除去した卵を顕微鏡下に配置し、芽盤を位置させる。芽盤全体（約３ｍｍ）が視野を占めるように倍率を調整する。芽盤の中心の上部にミクロキャピラリーを約４５°の角度で降ろし、ミクロマニピュレーターでコントロールすることにより、卵黄膜を穿刺し、芽盤の細胞質に約５０μｍ進入するようにする。続いて、倍率を上げて接種サイトを観察し、進入深さを評価する。この深さ評価のために、ミクロキャピラリーの先端から５０μｍの位置をインクでマークする。細胞懸濁液は、手動エアシリンジを用いてできる限りゆっくりと取出す。接種後に針を引き上げ、新たなガーゼ層を適用する。ペトリ皿の蓋を閉じ、卵を５％ＣＯ２／４２℃のインキュベータへ戻し、一夜インキュベートする。
【００８４】
ドナーの雌鶏から採卵した２４時間後に、接種された卵を「フェーズＩＩ」培養（胚の形態形成、ＷＯ９０／１３６２６号公報参照）に移行させ、その卵をモニターする。
【００８５】
本方法は、現行の除核の方法より多くの利点を有することがわかる。例えば、核移入の実験への使用を妨げるような卵の損傷を起こすことなく鳥類の卵を除核することができる。必要な場合には、他の動物への使用にも適切な方法である。
【００８６】
本明細書において参照した全ての文書を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。記載した本発明の実施態様の種々の改変や変更は、本発明の範囲と趣旨を逸脱しない限り当業者にとって明白であろう。実際、当業者にとって明白な、ここに記載した本発明の実施形態の種々の改変も、本発明の範囲に含まれることを意図している。例えば、線量の割合、各種の量および照射時間は、各種の要求に応じて変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】典型的な核移入手順の概観ダイアグラム
【図１】
2005511067.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月17日(2003.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵を除核する方法であって、前記卵をガンマ線に曝露し、ガンマ線照射の線量が前記卵を核移入法において使用可能とするべく十分高いことを特徴とする除核方法。
【請求項２】
ガンマ線照射の線量が、照射を受ける卵の核によって規定される卵またはそれに由来する胚の発育を停止するべく十分高く、除核された卵に移入された核によって規定される卵または胚の発育を可能ならしめるべく十分低いことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記卵を１分〜３分の時間ガンマ線に曝露することを特徴とする先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記卵を２Ｇｙ／ｍｉｎ〜１２Ｇｙ／ｍｉｎの範囲の照射線量に曝露することを特徴とする先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ガンマ線照射の総線量が７Ｇｙを超えることを特徴とする先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ガンマ線照射の総線量が１０Ｇｙを超えることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ガンマ線照射の総線量が１２Ｇｙを超えることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ガンマ線照射の総線量が１２Ｇｙ〜１４Ｇｙの範囲にあることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ガンマ線照射の総線量が３７Ｇｙ〜６２．５Ｇｙの範囲にあることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ガンマ線照射の総線量が４４．５Ｇｙ〜４７．５Ｇｙの範囲にあることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記卵が鳥類のものであることを特徴とする先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を用いて細胞を除核する段階を含むことを特徴とする動物の胚を発生せしめる方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を用いて卵を除核することと、ドナー細胞から除核された卵へ二倍体核を移送することと、得られる胚を発育せしめることとを含むことを特徴とする動物の胚を発生せしめる方法。
【請求項１４】
前記ドナー細胞が遺伝子的に改変されていることを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法によって胚を発生せしめる段階（ａ）と、前記胚を動物に発育せしめる段階（ｂ）とを含むことを特徴とする動物を調製する方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、該方法が請求項１１に従属する場合に、前記方法がレシピエントである雌鳥に胚を移送する段階と、硬い殻の卵の形態で胚を生ませる段階と、胚を発育せしめて雛鳥として孵化せしめる段階とを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法において、該方法が請求項１０に従属する場合に、前記胚を卵外で発育せしめることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法において、該方法が請求項１０に従属する場合に、前記方法が請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって卵を除核する段階と、ドナー核を卵へ移送する段階と、胚を発育せしめてホスト殻の中で孵化せしめる段階とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
段階（ｂ）において形成された動物を繁殖せしめる段階（ｃ）を更に含むことを特徴とする請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって除核されたことを特徴とする卵。
【請求項２１】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法によって生産されたことを特徴とする胚。
【請求項２２】
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法によって調製されたことを特徴とする動物。
【国際調査報告】
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