(57)【要約】  本発明は、好熱性生物であるＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ由来の核酸ポリメラーゼ酵素についての核酸およびポリペプチドを提供する。本発明はまた、これらの核酸およびポリペプチドを使用するための方法を提供する。本発明の単離された核酸は、好ましい実施形態では、５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を有する。本発明の単離された核酸は、好ましい実施形態では、ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項２】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項３】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して、低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項５】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して、ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する低下した識別能を有する、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に相補的な配列を含む、単離された核酸。
【請求項８】
配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項９】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１０】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする、単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１２】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸識別能を有する、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項１４】
配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項１５】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項１６】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項１８】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸識別能を有する、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項２０】
宿主細胞が、前記核酸によってコードされる耐熱性ポリペプチドを発現し得、かつ該ポリペプチドが、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２２】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２３】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２５】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸識別能を有する、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項２７】
配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む、単離された核酸ポリメラーゼ。
【請求項２８】
５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を有する配列番号５を含む、単離された誘導体核酸ポリメラーゼ。
【請求項２９】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項２８に記載の単離された誘導体核酸ポリメラーゼ。
【請求項３０】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸に対する識別能を低下させる変異を有する配列番号５を含む、単離された誘導体核酸ポリメラーゼ。
【請求項３１】
前記誘導体核酸ポリメラーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較して低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸識別能を有する、請求項３０に記載の単離された誘導体核酸ポリメラーゼ。
【請求項３２】
核酸ポリメラーゼを含む容器を備えるキットであって、該核酸ポリメラーゼは、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む、キット。
【請求項３３】
未標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ヌクレオチドのバランスのとれた混合物、鎖終結ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、緩衝溶液、マグネシウム含有溶液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマー、逆転写酵素含有溶液、またはＤＮＡ増幅プライマーもしくはＲＮＡ増幅プライマーを含む容器をさらに備える、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
ＤＮＡ配列決定反応、ＤＮＡ増幅反応、逆転写反応、ＲＮＡ増幅反応またはプライマー伸長反応を実施するために適合されている、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含む核酸ポリメラーゼを作製する方法であって、該方法は、ＲＮＡの転写および翻訳に十分な条件下で、プロモーターに作動可能に連結した、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項３６】
前記核酸が、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法によって作製された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３８】
ＤＮＡを合成する方法であって、該方法は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含むポリペプチドを、ＤＮＡの重合を可能にするのに十分な条件下で、ＤＮＡと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３９】
核酸の熱サイクルによる増幅のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）核酸を、該核酸の増幅に適切な条件下で、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を有する熱安定性ポリペプチドと接触させる工程、および
（ｂ）該核酸を増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記核酸の熱サイクルによる増幅が、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸の熱サイクルによる増幅が、鎖置換増幅によって実施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＤＮＡの熱サイクルによる増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
ＤＮＡをプライマー伸長する方法であって、該方法は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含むポリペプチドを、ＤＮＡの重合を可能にするのに十分な条件下で、核酸と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４４】
前記核酸がＤＮＡである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記プライマー伸長が、前記核酸を配列決定するために実施される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記プライマー伸長が、前記核酸を増幅するために実施される、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、好熱性細菌であるＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ由来の核酸ポリメラーゼ酵素に対する核酸およびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡポリメラーゼは、１つの核酸鎖を読み取り、その相補鎖を生成することによってＤＮＡを複製するために細胞により使用される天然に存在する細胞内酵素である。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、核酸プライマーの伸長末端の３’ヒドロキシル基と新たに付加されるヌクレオチド三リン酸の５’リン酸基との間の結合の形成を触媒する。ＤＮＡ合成に使用されるヌクレオチド三リン酸は、通常、デオキシアデノシン三リン酸（Ａ）、デオキシチミジン三リン酸（Ｔ）、デオキシシトシン三リン酸（Ｃ）、およびデオキシグアノシン三リン酸（Ｇ）であるが、これらのヌクレオチドの改変または変更されたものもまた使用され得る。ヌクレオチドが付加される順番は、Ａヌクレオチド塩基とＴヌクレオチド塩基との間の水素結合形成およびＧヌクレオチド塩基とＣヌクレオチド塩基との間の水素結合形成によって指示される。
【０００３】
細菌細胞は、３つの型のＤＮＡポリメラーゼ（ポリメラーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩと呼ばれる）を含有する。ＤＮＡポリメラーゼＩは、最も豊富なポリメラーゼであり、一般的に、特定の型のＤＮＡ修復（ＤＮＡ複製の間の岡崎フラグメントの連結を可能にする修復様反応を含む）を担う。ＤＮＡポリメラーゼＩは、ＵＶ照射および放射性模倣薬物（ｒａｄｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｒｕｇ）により誘導されるＤＮＡ損傷の修復に必須である。ＤＮＡポリメラーゼＩＩは、ＳＯＳ応答を誘導するＤＮＡ損傷を修復する上で役割を果たすと考えられている。ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩＩの両方を欠く変異体において、ＤＮＡポリメラーゼＩＩは、ＵＶにより誘導される損傷を修復する。ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩは、モノマーポリメラーゼであるが、一方、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩは、複数のサブユニットの複合体である。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、しばしば、ｃＤＮＡ合成およびＤＮＡ配列決定反応を含む種々の生化学的適用のためにインビトロで使用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照のこと（本明細書中で参考として援用する）。ＤＮＡポリメラーゼはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号（参考として援用する））およびＲＮＡ転写媒介増幅方法（例えば、Ｋａｃｉａｎら，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０１３８４（参考として援用する））のような方法による核酸の増幅のためにも使用される。
【０００５】
ＤＮＡ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の使用を通じたプライマー伸長、それに続いて、別の回のプライマーアニーリングおよび伸長のための新たなテンプレートを提供するための、得られた二本鎖核酸の熱変性のサイクルを利用する。鎖の変性のために必要な高い温度は、多くのＤＮＡポリメラーゼを不可逆的に不活性化するので、約３７℃より高い温度で活性を維持できるＤＮＡポリメラーゼの発見および使用は、費用効率および労働効率の面での利点を提供する。
【０００６】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、多くの好熱性生物（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ属内の種、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属内の種、Ｓｕｌｆｏｂｕｓ属内の種、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属内の種を含む）において発見されている。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の全長の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）は、Ｌａｗｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７−６４３７（１９８９）およびＧｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，４６６，５９１号によって記載されている。さらに、短縮型のＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現は、Ｌａｗｙｅｒら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２７５−２８７（１９９３）、およびＢａｒｎｅｓ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０６１８８（１９９２）に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎは、ＥＰＯ番号公開０４８２７１４Ａ１（１９９２）において、変異型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのクローニングを報告している。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼもまた、クローニングおよび発現されている。Ａｓａｋｕｒａら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．（Ｊａｐａｎ），７４：２６５−２６９（１９９３）。しかし、熱に安定なＤＮＡポリメラーゼが単離されている一方、熱に安定であるＲＮＡポリメラーゼは、入手不可能である。さらに、この入手可能なＤＮＡポリメラーゼの性質は、様々である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を合成し得、かつ改善された配列識別能、より良い耐塩性、種々の程度の耐熱性、標識ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドに対する改善された許容性および他の価値のある特性を有する、新規のポリメラーゼが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、好熱性生物である、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉから単離された核酸ポリメラーゼ酵素についての核酸およびポリペプチドを提供する。本発明の核酸をクローニングするために使用された株は、株ＣＢ１と名付けられた（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ａ．Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｅ．，Ｗｅｌｃｈ，Ｓ．Ｇ．およびＭｉｃａｌｌｅｆ、Ｊ．Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ  ｓｐ．ｎｏｖ．，Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｏｔ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｐｏｒｔｕｇａｌ，Ｉｃｅｌａｎｄ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｚｏｒｅｓ，ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  ａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｄｉｓｔｒｕｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，（１９９６）４６：４０３〜４０８）。
【０００９】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む単離された核酸および相補的な核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８との少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、これらの単離された核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを含む、これらの単離された核酸を含むベクターを提供する。このような単離された核酸およびベクターを含む宿主細胞、特に、ポリペプチドが、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有する、核酸配列によってコードされる耐熱性ポリペプチドを発現することが可能な宿主細胞もまた、本発明によって提供される。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、５−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を提供する。誘導体核酸ポリメラーゼの低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性とは、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較してである。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、ジデオキシヌクレオチド三リン酸識別能を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸を提供する。この低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸識別能とは、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較してである。
【００１２】
本発明はまた、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８のアミノ酸配列を含み得る、単離されたポリペプチドを提供する。本発明により提供される単離されたポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８との少なくとも９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得、それらは、例えば、タンパク質１ｍｇあたり５０，０００Ｕとタンパク質１ｍｇあたり５００，０００Ｕとの間のＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有し得る。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、５−３’エキソヌクレーゼ活性を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼを提供する。この誘導体核酸ポリメラーゼの低下した５−３’エキソヌクレアーゼ活性とは、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較してである。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ジデオキシヌクレオチド三リン酸識別能を低下させる変異を有する配列番号５のアミノ酸配列を含む誘導体核酸ポリメラーゼを提供する。この低下したジデオキシヌクレオチド三リン酸識別能とは、配列番号５のアミノ酸配列を含む核酸ポリメラーゼと比較してである。
【００１５】
本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８を含むポリペプチドと核酸とをこの核酸の重合を可能にするのに十分な条件下で接触させる工程を含む、核酸を合成する方法をさらに提供する。この核酸は、好ましくはＤＮＡである。
【００１６】
本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８を含むポリペプチドとＲＮＡとを、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡの重合を可能にするのに十分な条件下で接触させる工程を含む、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを合成する方法をさらに提供する。
【００１７】
本発明は、核酸と、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８を有する耐熱性ポリペプチドとを、この核酸の増幅に適切な条件下で接触させる工程およびこの核酸を増複する工程を含む、核酸の熱サイクル増幅のための方法をさらに提供する。このような増幅は、例えば、逆転写反応、鎖置換増幅反応またはポリメラーゼ連鎖反応を含み得る。
【００１８】
本発明はまた、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８を含むポリペプチドとＤＮＡとを、ＤＮＡの重合を可能にするのに十分な条件下で接触させる工程を含む、ＤＮＡをプライマー伸長する方法を提供する。このようなプライマー伸長は、例えば、ＤＮＡを配列決定するためか、またはＤＮＡを増幅するために実施され得る。
【００１９】
本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８を含む核酸ポリメラーゼを作製する方法をさらに提供する。この方法は、ＲＮＡの転写および翻訳に対して十分な条件下でプロモーターに作動可能に連結された、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程を包含する。１つの実施形態において、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む核酸を使用する。本発明はまた、この方法によって作製された核酸ポリメラーゼ酵素に関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の核酸ポリメラーゼ酵素を含む容器を備えるキットを提供する。このような核酸ポリメラーゼ酵素は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８を含むアミノ酸配列を有し得る。このキットはまた、未標識ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、ヌクレオチドのバランスのとれた混合物、鎖終結ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、緩衝溶液、マグネシウム含有溶液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマー、逆転写酵素含有溶液、またはＤＮＡ増幅プライマーもしくはＲＮＡ増幅プライマーを含む容器を備え得る。このようなキットは、例えば、ＤＮＡ配列決定反応、ＤＮＡ増幅反応、逆転写反応またはプライマー伸長反応を実施するために適合され得る。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、好熱性生物由来の核酸ポリメラーゼ酵素をコードする核酸配列およびアミノ酸配列に関する。特に、本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、株ＣＢ１）由来の核酸ポリメラーゼ酵素を提供する。本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼポリペプチドは、種々の手順（ＤＮＡ合成手順、ＤＮＡプライマー伸長手順、逆転写手順、ＤＮＡ配列決定手順およびＤＮＡ増幅手順を含む）において使用され得る。
【００２２】
（定義）
用語「アミノ酸配列」は、ペプチド分子、ポリペプチド分子、またはタンパク質分子における、アミノ酸の位置的配置および正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をいう。用語「アミノ酸配列」の使用は、そのアミノ酸配列を、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の完全なネイティブのアミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００２３】
「キメラ」は、ＤＮＡ配列（例えば、ベクターまたは遺伝子）が、異なる起源の１つより多いＤＮＡ配列で構成されており、このＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術によって別のＤＮＡ配列に融合されて、天然には存在しない、より長いＤＮＡ配列を生成していることを示すために使用される。
【００２４】
用語「コード領域」は、目的のタンパク質をコードする核酸セグメントをいう。タンパク質のコード領域は、５’側が開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」に、そして３’側が停止コドンを特定する３つのトリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）のうちの１つに結合されている。
【００２５】
「構成性発現」は、構成性プロモーターを用いる発現をいう。
【００２６】
「構成性プロモーター」は、細胞の生活環の全てまたはほぼ全ての相においてそれが制御する遺伝子を発現し得るプロモーターをいう。
【００２７】
「相補的」または「相補性」は、核酸間の塩基対合またはハイブリダイゼーションの程度を規定するために使用される。例えば、当業者に公知のように、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と水素結合または塩基対を形成し得、そしてグアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と水素結合または塩基対を形成し得る。従って、ＡはＴと相補的であり、一方、ＧはＣと相補的である。相補性は、二本鎖核酸における全ての塩基が塩基対合する場合、完全であり得る。あるいは、相補性は、核酸中の塩基のいくつかだけが塩基対合の法則に従って一致する場合、「部分的」であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対する影響を有する。
【００２８】
参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドの「誘導体」は、それぞれの参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドと関連するが異なる配列または化学構造を有する、それぞれ、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである。誘導体核酸、誘導体タンパク質、誘導体ポリペプチド、または誘導体ペプチドは、一般的に、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドに存在しないかまたはわずかにしか存在しないいくつかの化学的特性、物理的特性、または機能的特性を増強または組み込む目的で作製される。誘導体核酸は、一般的に、参照核酸とヌクレオチド配列が異なり得、一方、誘導体タンパク質、誘導体ポリペプチド、または誘導体ペプチドは、それぞれ、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドと、アミノ酸配列が異なり得る。このような配列の相違は、１つ以上の置換、挿入、付加、欠失、融合、および短縮であり得、これらは任意の組合せで存在し得る。相違は、わずか（例えば、１つのヌクレオチドまたはアミノ酸の相違）であり得るし、またはより実質的であり得る。しかし、誘導体の配列は、当業者が、その誘導体とその参照とが構造および／または機能において関連することを認識しないほどには参照と異ならない。一般的に、相違は、その参照およびその誘導体が、全体的に緊密に類似し、そして多くの領域において同一であるように制限される。「改変体」は、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドの化学的特性、物理的特性、または機能的特性を有意に変更しないサイレントな構造上の相違を有し得るという点で、「誘導体」核酸、「誘導体」タンパク質、「誘導体」ポリペプチド、または「誘導体」ペプチドと異なる。対称的に、参照と誘導体との間の核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの相違は、参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドの１つ以上の化学的特性、物理的特性、または機能的特性を改善するために行われた意図的な変化である。
【００２９】
用語「ＤＮＡポリメラーゼ活性」、「合成活性」、および「ポリメラーゼ活性」は、交換可能に使用され、そして酵素がデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込みにより新たなＤＮＡ鎖を合成する能力をいう。テンプレート依存様式でデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込みによる新たなＤＮＡ鎖の合成を指示し得るタンパク質は、「ＤＮＡ合成活性が可能」であるといわれる。
【００３０】
用語「５’エキソヌクレアーゼ活性」は、タンパク質における、核酸の５’末端からヌクレオチドを除去し得る活性の存在をいう。
【００３１】
用語「３’エキソヌクレアーゼ活性」は、タンパク質における、核酸の３’末端からヌクレオチドを除去し得る活性の存在をいう。
【００３２】
「発現」は、生物における内因性または外因性の遺伝子の転写および／または翻訳をいう。発現は、一般的に、ｍＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。発現はまた、タンパク質の生成をいい得る。
【００３３】
「発現カセット」は、特定のヌクレオチド配列の発現を指示し得る核酸配列を意味する。発現カセットは、一般的に、終止シグナルに作動可能に連結された、発現されるべきヌクレオチド配列（例えば、コード領域）に作動可能に連結されたプロモーターを含む。発現カセットはまた、代表的に、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要とされる配列を含む。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、これは、その構成要素の少なくとも１つがその他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーターの制御下、または宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあり得る。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発達段階に特異的であり得る。
【００３４】
用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連する核酸の任意のセグメントをいうために広い意味で使用される。用語「遺伝子」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または構造ＲＮＡのコード領域を包含する。用語「遺伝子」はまた、コード領域のいずれかの末端から約２ｋｂまでの距離の配列を含む。これらの配列は、「隣接」配列または「隣接」領域といわれる（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写産物に存在する非翻訳領域の５’側または３’側に位置する）。５’隣接領域は、調節配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）またはその遺伝子の転写を制御するかもしくはその転写に影響を及ぼすタンパク質に対する他の認識配列もしくは結合配列を含み得る。３’隣接領域は、転写の終結を指示する配列、転写後切断を指示する配列、およびポリアデニル化を指示する配列、ならびに他のタンパク質に対する認識配列を含み得る。遺伝子にコードされるタンパク質あるいはポリペプチドは、全長であるか、または全ての活性もしくは機能的特性が保持されるような、または全長タンパク質または全長ポリペプチドの選択された活性（例えば、酵素活性、リガンド結合、またはシグナル伝達）のみが保持されるような、その任意の部分であり得る。タンパク質またはポリペプチドは、プロタンパク質または前駆ポリペプチドの生成に必要な任意の配列を含み得る。用語「ネイティブ遺伝子」は、非形質転換細胞のゲノムに天然に存在する遺伝子をいう。
【００３５】
「ゲノム」は、生物中に天然に存在し、かつある世代から次の世代へと伝えられる、完全な遺伝物質のことをいう。
【００３６】
用語「異種核酸」または「外来性核酸」は、特定の宿主細胞に対して外来の供給源を起源とする核酸をいうか、または、同じ供給源由来である場合は、その元の形態から改変されている核酸をいう。従って、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内来性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用を介して改変されている遺伝子を含む。この用語はまた、天然に存在する核酸の天然に存在しない複数のコピーも含む。従って、この用語は、この細胞に対して外来性もしくは異種であるか、またはその細胞内で通常に見出されるが、この細胞もしくはゲノム内の通常では見出されない位置にある、核酸セグメントをいう。
【００３７】
用語「相同性」は、核酸と参照核酸との間、またはポリペプチドと参照ポリペプチドとの間の類似性の程度をいう。相同性は部分的であり得るかまたは完全であり得る。完全な相同性とは、核酸配列またはアミノ酸配列が同一であることを示す。部分的に相同な核酸配列またはアミノ酸配列は、参照核酸配列または参照アミノ酸配列に対して同一ではない配列である。従って、部分的に相同な核酸は、その配列中に、比較される核酸に対するヌクレオチドの相違を１つ以上有する。相同性の程度は、配列比較によって決定され得る。あるいは、当業者によって充分理解されるように、種々のハイブリダイゼージョン条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼージョンまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼージョンは、核酸間の相同性の程度の推定を提供し得る（例えば、ＨａｉｎｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．を参照のこと）。
【００３８】
「ハイブリダイゼージョン」とは、相補的な核酸鎖上のヌクレオチド塩基間に水素結合を形成することによって、相補的な核酸鎖をアニーリングするプロセスのことをいう。ハイブリダイゼージョン、および核酸間の会合の強度は、ハイブリダイズしている核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比のような因子によって影響される。
【００３９】
「誘導性プロモーター」とは、外部刺激（例えば、化学物質、光、ホルモン、ストレス、温度または病原体）によって、１種以上の細胞型において始動（ｔｕｒｎ  ｏｎ）され得る、調節されるプロモーターのことをいう。
【００４０】
「開始部位」は、転写配列の一部である第１ヌクレオチドの位置（これは、＋１位として定義される）を取り囲む領域である。遺伝子の全てのヌクレオチド位置は、転写配列の第１ヌクレオチド（これは、開始部位内に存在する）を参照することによって番号付けされる。下流配列（すなわち、３’方向の配列）は、ポジティブと呼ばれ、一方、上流配列（すなわち、５’方向の配列）は、ネガティブと呼ばれる。
【００４１】
「単離された」もしくは「精製された」核酸または「単離された」もしくは「精製された」ポリペプチドは、ヒトの手によって、そのネイティブな環境とは離されて存在し、よって天然の産物ではない、核酸またはポリペプチドである。単離された核酸またはポリペプチドは、精製された形態で存在し得るか、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞内のような、ネイティブではない環境中に存在し得る。
【００４２】
用語「インベーダーオリゴヌクレオチド」とは、プローブオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する配列と実質的に同一である配列をその３’末端に含むオリゴヌクレオチドをいう。これらの領域は、相補的な標的核酸に沿った同一のセグメントへのハイブリダイゼーションについて競合する。
【００４３】
用語「標識」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために使用され得、そして核酸またはタンパク質に結合し得る、任意の原子または分子をいう。標識は、蛍光、放射能、比色定量、重量測定、Ｘ線回折またはＸ線吸収、磁性、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供し得る。
【００４４】
用語「核酸」は、糖、リン酸塩および塩基（プリンまたはピリミジンのいずれか）を含むモノマー（ヌクレオチド）から構成される、一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたその改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列ならびに明白に示される参照配列も暗黙のうちに包含する。
【００４５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは、３つより多く、そして通常は、１０個または１５個より多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子として定義される。オリゴヌクレオチドのサイズには、正確な上限はない。しかし、一般的に、オリゴヌクレオチドは、約２５０ヌクレオチドよりも短く、好ましくは、約２００ヌクレオチドよりも短く、より好ましくは、約１００ヌクレオチドよりも短い。正確なサイズは、多くの因子に依存し、この因子は、続いて、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存する。このオリゴヌクレオチドは、任意の様式（化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写またはこれらの組み合わせを含む）で作製され得る。
【００４６】
用語「オープンリーディングフレーム」および「ＯＲＦ」は、コード配列の翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間でコードされたアミノ酸配列をいう。用語「開始コドン」および「終止コドン」は、それぞれ、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始および鎖の終止を特定するコード配列中の３つの隣接するヌクレオチドの単位（「コドン」）をいう。
【００４７】
「作動可能に連結される」とは、同じ核酸分子の一部として結合され、その結果その一方の機能が他方によって影響されることを意味する。一般的に、「作動可能に連結される」とはまた、２つ以上の核酸が適切に配置されて配向され、その結果それらが共に機能し得ることも意味する。核酸は、しばしば、作動可能に連結されて、コード領域の転写がプロモーターから始められることを可能にする。例えば、調節配列は、調節配列がコード領域の発現に影響を及ぼすような状況（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）に２つの配列がある場合に、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結される」または「関連する」といわれる。コード領域は、センスな配向またはアンチセンスな配向で、調節配列に作動可能に連結され得る。
【００４８】
用語「プローブオリゴヌクレオチド」は、標的核酸と相互作用して、インベーダーオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下において切断構造を形成する、オリゴヌクレオチドをいう。標的核酸にアニーリングする場合、このプローブオリゴヌクレオチドおよび標的は、切断構造を形成し、そしてプローブオリゴヌクレオチド内で切断が生じる。このプローブオリゴヌクレオチド上流のインベーダーオリゴヌクレオチドの存在は、（インベーダーの非存在下での切断部位に対して）プローブオリゴヌクレオチド内の切断部位をシフトし得る。
【００４９】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに対する認識部位および適切な転写に必要とされる他の因子を提供することによってコード領域の発現を制御する、（通常、コード領域に対して上流（５’側）の）ヌクレオチド配列をいう。「プロモーター」としては、最小のプロモーター（これは、ＴＡＴＡボックスから構成される短いＤＮＡセグメントである）が挙げられるが、これに限定されない。従って、プロモーターは、転写開始部位を特定して、そして発現を制御または調節するように作用する他の配列（例えば、エンハンサー）を含む。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡのセグメントであり、そしてプロモーターの先天的エレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る。エンハンサーは、両方向（順方向または逆方向）に作動し得、そしてプロモーターから上流または下流のいずれかに移動した場合にさえ、機能し得る。プロモーターは、ネイティブの遺伝子からその全体を誘導され得るか、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成され得るか、または合成ＤＮＡセグメントからも構成され得る。プロモーターはまた、生理学的状態または発達状態に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡセグメントも含み得る。
【００５０】
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００５１】
「調節配列」および「調節エレメント」は、核酸配列の発現のいくつかの局面を制御するヌクレオチド配列をいう。このような配列またはエレメントは、コード配列の上流（５’側非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’側非コード配列）に配置され得る。「調節配列」および「調節エレメント」は、転写、ＲＮＡプロセシングもしくはＲＮＡ安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、エンハンサー、イントロン、プロモーター、ポリアデニル化シグナル配列、スプライシングシグナル、終止シグナル、および翻訳リーダー配列が挙げられる。調節配列はまた、天然の配列および合成配列を含む。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー」は、その遺伝子を有する生物中で発現されそして検出され得る、観察可能な形質または選択可能な形質をコードする遺伝子をいう。選択マーカーは、しばしば、目的の核酸の存在を追跡または選択するために、観察可能な形質をコードしないかもしれない、目的の核酸に連結される。当業者に公知の任意の選択マーカーが本発明の核酸とともに使用され得る。いくつかの選択マーカーは、マーカーを有さなければ宿主が死ぬ状況下で、宿主が生存することを可能にする。選択マーカーの例としては、抗生物質耐性（例えば、テトラサイクリン耐性またはアンシピリン耐性）が挙げられる。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼージョンが行なわれる、温度、イオン強度および有機溶媒のような他の化合物の存在の条件を定義するために使用される。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸塩基対合は、高い頻度の相補塩基配列を有する核酸間のみで生じる。「弱い」または「低い」ストリンジェンシー条件では、核酸の相補配列の頻度は通常より低く、その結果、異なる配列を有する核酸が検出および／または単離され得る。
【００５４】
用語「実質的に類似」および「実質的に相同」は、本発明の配列の機能的等価物を示す、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をいう。例えば、遺伝暗号の縮重を単に反映するがそれにもかかわらず本発明のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする、変更されたヌクレオチド配列は、本発明の配列と実質的に類似である。さらに、本発明の配列と実質的に類似のアミノ酸配列は、アミノ酸全体の同一性が活性で熱的に安定な核酸ポリメラーゼを提供するのに十分であるアミノ酸配列である。例えば、本発明の配列と実質的に類似のアミノ酸配列は、アミノ酸全体の同一性が、本発明のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％または９４％）、およびより好ましくは９５％以上（例えば、９６％、９７％、９８％、または９９％）である配列である。
【００５５】
「終結剤」、「終結ヌクレオチド」または「ターミネーター」は、ＤＮＡ合成またはＤＮＡ配列決定と関連して、特定の塩基におけるＤＮＡ配列決定反応を特異的に終結し得る化合物のことをいい、このような化合物としては、２’，３’ジデオキシ構造を有するジデオキシヌクレオシド（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
「耐熱性の」とは、核酸ポリメラーゼが、約３７℃より高い温度で活性を維持することを意味する。好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約４２℃より高い温度で活性を維持する。より好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約５０℃より高い温度で活性を維持する。なおより好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約６０℃より高い温度に曝された後に活性を維持する。最も好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、約７０℃より高い温度への曝露にもかかわらず活性を維持する。
【００５７】
「導入遺伝子」は、形質転換によってゲノム中に導入されており、安定に維持される、遺伝子をいう。導入遺伝子としては、例えば、形質転換される特定の生物の遺伝子に対して非相同であるかまたは相同であるかのいずれかの遺伝子が挙げられ得る。さらに、導入遺伝子は、非ネイティブの生物中に挿入されるネイティブな遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。用語「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置にあるネイティブな遺伝子をいう。「外来性」遺伝子または「外因性」遺伝子とは、宿主生物中で正常に見出されないが、遺伝子移入によって導入される遺伝子をいう。
【００５８】
用語「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝を生じる、宿主細胞のゲノム中への核酸フラグメントの移入をいう。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主細胞は、「トランスジェニック」細胞と呼ばれ、そしてトランスジェニック細胞を含む生物は、「トランスジェニック生物」と呼ばれる。形質転換は、当該分野で公知の種々の手段によって達成され得、この手段としては、カルシウムＤＮＡ共沈、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが挙げられる。
【００５９】
参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照ペプチドの「改変体」は、それぞれの参照核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照ペプチドと関連するが異なる配列を有する、それぞれ、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。改変体と参照との間の核酸、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照ペプチドの相違は、サイレントな相違または保存的な相違である。改変体核酸は、参照核酸とはヌクレオチド配列が異なり、一方、改変体核酸、改変体タンパク質、改変体ポリペプチドまたは改変体ペプチドは、それぞれ、参照タンパク質、参照ポリペプチド、または参照ペプチドとアミノ酸配列が異なる。改変体および参照の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、１つ以上の置換、挿入、付加、欠失、融合および短縮（これらは、任意の組み合わせで存在し得る）によって配列が異なり得る。相違は、わずか（例えば、１つのヌクレオチドまたはアミノ酸の相違）であり得るかまたはより実質的であり得る。しかし、この改変体の構造および機能は当業者が、改変体および参照が構造および／または機能において関連していることを認識しないほどには参照と異ならない。一般的には、相違は参照および改変体が、全体的に緊密に類似しており、多くの領域で同一であるように制限される。
【００６０】
用語「ベクター」は、別の核酸セグメントを細胞中に移入し得る核酸をいうために使用される。「ベクター」としては、とりわけ、自己伝播性または動員性であってもそうでなくてもよい、二本鎖または一本鎖、線形または環状形態の、任意のプラスミド、コスミド、ファージまたは核酸が挙げられる。ベクターは、細胞ゲノム中に組みこむことによってかまたは染色体外に存在する（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）ことによって、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を形質転換し得る。細菌系に使用されるベクターは、しばしば、ベクターを細菌染色体とは独立して複製させることが可能な複製起点を含む。用語「発現ベクター」は、発現カセットを含むベクターをいう。
【００６１】
用語「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離される場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は、集団中で最も頻繁に観察される遺伝子形態であり、従って、任意に、遺伝子の「正常」形態または「野生型」形態と呼ばれる。対照的に、用語「改変体」または「誘導体」とは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に、配列および／または機能的特性における改変（すなわち、変更された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物のことをいう。天然に存在する誘導体は、単離され得る。これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合にそれらが変更された特徴を有するという事実によって同定される。
【００６２】
（本発明のポリメラーゼをコードする核酸）
本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ核酸ポリメラーゼをコードする単離された核酸、ならびに活性で熱的に安定な核酸ポリメラーゼをコードする、その誘導体、フラグメントおよび改変体の核酸を提供する。従って、本発明の１つの局面は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ  株ＣＢ１由来の核酸ポリメラーゼに関する。配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列（これらは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ野生型およびいくつかの誘導体ポリメラーゼについてのアミノ酸配列である）をコードする任意の核酸もまた、本発明によって企図される。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１の核酸（核酸ポリメラーゼ酵素をコードする野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ核酸）を提供する：
【００６４】
【化１】
2005511044.tif 000002
2005511044.tif 000003
別の実施形態において、本発明は、配列番号２の核酸（１２７位〜１２９位（コドン４３）にＧＧＣ（Ｇｌｙをコードする）のかわりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有するＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ誘導体核酸）を提供する。配列番号２は、以下に提供される：
【００６５】
【化２】
2005511044.tif 000004
2005511044.tif 000005
別の実施形態において、本発明は、配列番号３の核酸（１９９３位〜１９９５位（コドン６６５）にＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）のかわりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）（太字で示される）を有するＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ誘導体核酸）を提供する。配列番号３は、以下に提供される：
【００６６】
【化３】
2005511044.tif 000006
2005511044.tif 000007
なお別の実施形態において、本発明は、配列番号４の核酸（１２７位〜１２９位（コドン４３）にＧＧＣ（Ｇｌｙをコードする）のかわりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）を有し、かつ１９９３位〜１９９５位にＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）のかわりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）を有するＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ誘導体核酸）を提供する。配列番号４は、以下に提供される：
【００６７】
【化４】
2005511044.tif 000008
2005511044.tif 000009
示される位置での、ＴＴＣ（Ｐｈｅをコードする）の代わりにＴＡＣ（Ｔｙｒをコードする）への置換は、ＤＮＡポリメラーゼＩによるｄｄＮＴＰ取り込みに対する識別能を低下させ得る。例えば、米国特許第５，６１４，３６５号（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。示される位置での、ＧＧＧ（Ｇｌｙをコードする）の代わりにＧＡＣ（Ａｓｐをコードする）への置換は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる。
【００６８】
本発明の核酸は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸の部分に対して相同性を有する。しかし、本発明の核酸配列のかなりの部分は、異なっている。
【００６９】
本発明はまた、配列番号１〜４のフラグメント核酸および改変体核酸を包含する。本発明によって包含される核酸「フラグメント」は、２つの一般的な型のものである。第１の、全長ＤＮＡポリメラーゼをコードしないが、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する熱安定性ポリペプチドをコードするフラグメント核酸は、本発明に包含される。第２の、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であるが生物学的活性を維持するポリメラーゼを一般にコードしないフラグメント核酸もまた、本発明に包含される。従って、配列番号１〜４のようなヌクレオチド配列のフラグメントは、約９ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド以上の程度の小ささであり得る。一般に、本発明のフラグメント核酸は、本発明の核酸に配列が関連するが全長ではない限り、任意のサイズ上限を有し得る。
【００７０】
上に示されたように、「改変体」は、実質的に類似であるかまたは実質的に相同な配列である。ヌクレオチド配列について、改変体としては、遺伝暗号の縮重に起因して、ネイティブなＤＮＡポリメラーゼＩタンパク質の同一のアミノ酸配列をコードする配列が挙げられる。改変体核酸としてはまた、ネイティブなＤＮＡポリメラーゼＩタンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有さないが、アミノ酸配列中に保存的変化を有する、活性な、熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼＩをコードするポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【００７１】
当業者に公知であるように、遺伝暗号は「縮重」し、これは、いくつかのトリヌクレオチドコドンが同じアミノ酸をコードし得ることを意味する。この縮重性は、表１から明らかである。従って、改変体のヌクレオチド配列における多くの変化はサイレントであり得、そしてその核酸によってコードされるアミノ酸配列を変更させないかもしれない。核酸配列の変更がサイレントである場合、改変体核酸は、参照核酸と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。従って、本発明の特定の核酸配列はまた、縮重したコドン置換を有する改変体およびその相補配列、ならびに配列番号によって明白に特定される配列を包含する。具体的には、縮重コドン置換は、参照コドンがその参照コドンによって特定されるアミノ酸に対するコドンのいずれかによって置換されている配列を生成することによって、達成され得る。
【００７２】
【表１】
2005511044.tif 000010
一般に、１つ以上の選択されたコドンの第３位は、Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９，５０８１（１９９１）および／またはＯｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，２６０５（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８，９１（１９９４）によって開示されるように、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換され得る。
【００７３】
しかし、本発明は、本発明のヌクレオチド配列におけるサイレントな変化に限定されないが、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を保存的に変更する改変体核酸配列もまた含む。本発明に従って、本発明の改変体核酸および参照核酸は、コードされるアミノ酸配列が、１つ以上の置換、付加、挿入、欠失、融合および短縮によって異なり得、これらは、活性な、熱的に安定な核酸ポリメラーゼが改変体核酸によってコードされる限り、任意の組み合わせで存在し得る。このような改変体核酸は、参照核酸と正確に同じアミノ酸配列をコードするわけではないが、保存的配列変化を有する。
【００７４】
サイレントな保存的な変化を有する改変体核酸は、参照核酸に対する相同性の程度によって定義および特徴付けされ得る。好ましい改変体核酸は、本発明の参照核酸に対して「実質的に相同」である。当業者によって認識されるように、このような実質的に類似の核酸は、ストリンジェントな条件下で、本明細書中の配列番号によって同定される参照核酸とハイブリダイズし得る。これらの型の実質的に相同な核酸は、本発明によって包含される。
【００７５】
一般に、本発明の核酸の誘導体および改変体は、本明細書中で定義される参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％の配列同一性を有する。好ましくは、本発明の核酸は、本明細書中で定義される参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【００７６】
改変体核酸は、標準的なハイブリダイゼーション手順によって、検出および単離され得る。
【００７７】
このような配列を検出または単離するためのハイブリダイゼーションは、一般に、ストリンジェントな条件下で実施される。核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション）の文脈における、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメータの下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，１頁、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に見出される。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，９．３１−９．５８頁（１９８９）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（第３版、２００１）もまた参照のこと。
【００７８】
本発明はまた、核酸ポリメラーゼ活性をコードする誘導体核酸または改変体核酸の、検出および単離のための方法を提供する。この方法は、配列番号１、２、３または４を含む核酸の少なくとも一部を、サンプル核酸にハイブリダイズさせ、これによって、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程；およびハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含む。この複合体の存在は、核酸ポリメラーゼの少なくともセグメントをコードする誘導体核酸または改変体核酸の存在に相関する。一般に、ハイブリダイゼーションのために使用される、配列番号１、２、３または４を含む核酸の部分は、少なくとも１５ヌクレオチドであり、そしてハイブリダイゼーションは、実質的に相同な核酸の検出および単離を可能にするのに十分なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてである。代替の実施形態において、核酸サンプルは、配列番号１、２、３または４から選択されるプライマーオリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。
【００７９】
一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の二本鎖配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃より低いように選択される。例えば、「高度にストリンジェントな条件」下または「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下において、核酸は、他の配列より検出可能に大きい程度で（例えば、バックグラウンドを少なくとも２倍超えて）、その相補体とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件のストリンジェンシーを制御することによって、１００％相補的な核酸が同定され得る。
【００８０】
あるいは、ストリンジェンシー条件は、配列におけるいくらかのミスマッチを許容し、その結果、より低い程度の類似性が検出されるように調節され得る（異種プロービング）。代表的に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、代表的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン（または他の塩）の濃度であり、そして温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃で、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）については少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって、達成され得る。
【００８１】
例示的な低ストリンジェンシーの条件としては、３０〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中５０〜５５℃での洗浄が挙げられる。例示的な中程度にストリンジェンシーの条件としては、４０〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに０．５×〜１×ＳＳＣ中５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシーの条件としては、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに０．１×ＳＳＣ中６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。
【００８２】
ハイブリダイゼーションの間に得られるハイブリッドの相補性または相同性の程度は、代表的に、ハイブリダイゼーション後の洗浄と相関関係にあり、重要な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ハイブリダイズする核酸の型および長さもまた、ハイブリダイゼーションが起こるか否か、ならびに形成される任意のハイブリッドが所定のセットのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で安定であるか否かに、影響を与える。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４（１９８４）の方程式から近似され得る；Ｔｍ８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；ここで、Ｍは、一価陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡにおけるグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、そしてＬは、ハイブリッドの塩基対長一致である。Ｔｍは、（定義されたイオン強度およびｐＨで）完全に整合したプローブに５０％の相補的標的配列がハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍに等しいように選択される。
【００８３】
１００を超える相補的残基を有する相補的核酸の、サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルタ上での、ハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミドであり、このハイブリダイゼーションは、一晩行われる。高度にストリンジェントな条件の例は、７２℃で約１５分間０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間、０．２×ＳＳＣでの洗浄である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（後出）をまた参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシーの洗浄の前に、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェンシーの洗浄が行われる。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての中程度のストリンジェンシーの例は、４５℃で１５分間、１×ＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての例示的な低ストリンジェンシーの洗浄の例は、４０℃で１５分間、４〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については、ストリンジェントな条件としては、代表的に、ｐＨ７．０〜８．３において、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、代表的に、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）が挙げられ、その温度は、代表的に、少なくとも約３０℃である。
【００８４】
ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける無関係のプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比の２倍の（またはそれより高い）シグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下では互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を使用して作製される場合に起こる。
【００８５】
以下は、本発明の参照核酸と実質的に同一な相同核酸を検出および単離するために使用され得る、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である：参照ヌクレオチド配列は、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃で参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、より望ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、より望ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でなおもハイブリダイズし、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄され、より好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃でハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、６５℃で洗浄される。
【００８６】
一般に、Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃低下する。従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、および／または洗浄条件は、所望の配列同一性の配列にハイブリダイズするように調整され得る。例えば、９０％を超える同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは、１０℃低下され得る。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその相補体についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。しかし、非常にストリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）より１℃、２℃、３℃、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；中程度にストリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）より６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；低ストリンジェンシーの条件は、熱融解点（Ｔｍ）より１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。
【００８７】
所望の程度のミスマッチが、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍを生じる場合、より高い温度が使用され得るように、ＳＳＣ濃度を上昇させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  １，第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。Ｔｍ、ミスマッチ、ならびにハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の間の関係について、これらの参考文献および本明細書の教示を使用して、当業者は、本発明の核酸の改変体を作製し得る。
【００８８】
コンピュータ分析をまた配列の比較のために利用して、配列同一性を決定し得る。このような分析としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン８におけるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）およびＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから入手可能）。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトパラメータを使用して実施され得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓら．Ｇｅｎｅ  ７３：２３７  ２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇら．ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５（１９９２）；およびＰｅａｒｓｏｎら．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１（１９９４）によって、十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（前出）のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（前出）のアルゴリズムに基づく。比較の目的でギャップを含むアライメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０中）が、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）において記載されるように、利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０中）は、分子間の距離の関係を検出する反復検索を実施するために使用され得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮ、タンパク質についてＢＬＡＳＴＸ）が使用され得る。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０９１５（１９８９）を参照のこと）。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。アライメントはまた、調査によって手動で実施され得る。
【００８９】
本発明の目的で、配列同一性％の決定のためのヌクレオチド配列の、本明細書中に開示されるポリメラーゼ配列との比較は、好ましくは、ＢｌａｓｔＮプログラム（バージョン１．４．７以降）を使用してそのデフォルトパラメータを用いて、または任意の等価なプログラムを使用して、行われる。「等価なプログラム」とは、好ましいプログラムによって作製される対応するアライメントと比較した場合に、問題の任意の２つの配列について、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致、ならびに同一の配列同一性％を有するアライメントを生じる、任意の配列比較プログラムを意図する。
【００９０】
（ポリメラーゼをコードする核酸の発現）
本発明の核酸は、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドの組換え発現のために使用され得る。一般的に、本発明のポリメラーゼポリペプチドの組換え発現は、特定の型の宿主細胞における使用に適合させた発現ベクターへ、そのポリペプチドをコードする核酸を導入することによって実行される。本発明の核酸は、任意の宿主生物、例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞の両方において導入され得、そして発現され得る。宿主細胞の例としては、細菌細胞、酵母細胞、培養された昆虫細胞株、および培養された哺乳動物細胞株が挙げられる。好ましくは、核酸ポリメラーゼが由来する生物のものと類似の様式で、新生ポリペプチドをプロセシングし、そして翻訳後修飾する、組換え宿主細胞系が、選択される。本発明の核酸ポリメラーゼ酵素ポリペプチドを発現し、そして単離する目的のために、原核生物が好ましく、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが好ましい。従って、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００９１】
導入されるべき核酸は、目的の生物における発現のための発現カセット中に、簡便に配置され得る。このような発現カセットは、本発明の核酸に連結された転写開始領域を含む。発現カセットはまた、好ましくは、種々の制御エレメントの転写調節下にあるべき核酸の挿入のための、複数の制限部位を有する。この発現カセットはさらに、選択マーカー遺伝子を含み得る。適切な制御エレメント（例えば、エンハンサー／プロモーター、スプライス結合点、ポリアデニル化シグナルなど）は、適切な転写の開始および／または１次ＲＮＡ転写の正確なプロセシングを可能にする必要がある場合、遺伝子のコード領域に非常に近接して配置され得る。あるいは、本発明の発現ベクターにおいて利用されるコード領域は、内因性エンハンサー／プロモーター、スプライス結合点、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性制御エレメントおよび外因性制御エレメントの両方の組み合わせを含み得る。
【００９２】
好ましくは、ベクター中の核酸は、宿主細胞中における適切なプロモーターまたは他の転写調節エレメントの制御下にあり、そしてそれらと作動可能に連結される。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターであり得る。転写カセットは、一般的に、その転写の５’−３’方向で、その生物において機能的な、プロモーター、転写開始領域および翻訳開始領域、目的のＤＮＡ配列、ならびに転写終止領域および翻訳終止領域を含む。この終止領域は、転写開始領域にとってネイティブであり得るか、目的のＤＮＡ配列にとってネイティブであり得るか、または、別の供給源由来であり得る。
【００９３】
原核生物細胞および真核生物細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的発現は、一般的に、効率的な終止に指示する調節制御エレメントおよび生じる転写産物のポリアデニル化を必要とする。転写終止シグナルは、一般的に、ポリアデニル化シグナルの下流において見出され、そして数百ヌクレオチド長である。用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、本明細書で使用される場合、新生ＲＮＡ転写産物の終止およびポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を表す。組換え転写産物の効率的なポリアデニル化は、ポリＡテールを欠く転写産物が、不安定でかつ迅速に分解されるので、望ましい。
【００９４】
核酸ポリメラーゼをコードする核酸は、当業者に公知の方法によって、細菌宿主細胞に導入され得る。例えば、本発明の好熱性ポリメラーゼをコードする核酸は、一般的に使用されている形質転換手順によって（例えば、塩化カルシウムによる処理または電気穿孔によって）細菌細胞に導入され得る。好熱性ポリメラーゼが、真核生物宿主細胞において発現されるべき場合、好熱性ポリメラーゼをコードする核酸は、多数の手段（リン酸カルシウム共沈、スフェロプラスト融合、電気穿孔などが挙げられる）によって真核生物宿主細胞に導入され得る。真核生物宿主細胞が、酵母細胞の場合、形質転換は、酢酸リチウムによる宿主細胞の処理または電気穿孔によってもたらされ得る。
【００９５】
従って、本発明の１つの局面は、本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞を提供することである。広範な発現ベクターが、当該分野において周知である。種々の発現ベクターの説明およびそれらの使用方法については、とりわけ、米国特許第５，６０４，１１８号；同第５，５８３，０２３号；同第５，４３２，０８２号；同第５，２６６，４９０号；同第５，０６３，１５８号；同第４，９６６，８４１号；同第４，８０６，４７２号；同第４，８０１，５３７号およびＧｏｅｄｅｌら，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９８９）において見出され得る。組換え細胞系におけるポリメラーゼの発現は、十分に確立された技術である。ＤＮＡポリメラーゼの組換え発現の例は、米国特許第５，６０２，７５６号；同第５，５４５，５５２号；同第５，５４１，３１１号；同第５，５００，３６３号；同第５，４８９，５２３号；同第５，４５５，１７０号；同第５，３５２，７７８号；同第５，３２２，７８５号；および同第４，９３５，３６１号において見出され得る。
【００９６】
本発明の局面をなし、そしてそれを使用するのを助けるために使用され得る組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ならびにＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）によって記載されている。
【００９７】
（核酸ポリメラーゼ酵素）
本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ核酸ポリメラーゼ酵素ならびにそのフラグメントおよび活性でかつ熱に安定な改変体核酸ポリメラーゼ酵素を提供する。配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列（これらは、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉのポリメラーゼおよび誘導体ポリメラーゼについてのアミノ酸配列である）を含む任意のポリペプチドは、本発明によって意図される。本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチドか、または実質的に精製されたポリペプチドである。特に、本発明の単離されたポリペプチドは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ細菌中に通常存在するタンパク質を実質的に含まない。
【００９８】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号５のポリペプチド（これは、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ核酸ポリメラーゼポリペプチドである）を提供する。
【００９９】
【化５】
2005511044.tif 000011
本発明の核酸ポリメラーゼポリペプチドは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の一部分に相同性を有する（図１を参照のこと）。しかし、本発明のアミノ酸配列のかなりの部分は、異なる。これらとしては、例えば、５６位〜６１位のアミノ酸（ペプチドＧＥＶＡ、配列番号９）、１５２位〜１６３位のアミノ酸（ペプチドＬＬＨＰＥＧＥＶＬＴＰＧ、配列番号１０）、２１４〜２５６位のアミノ酸（ペプチドＩＬＫＮＬＤＱＶＫＰＥＲＶＲＥＡＩＲＮＮＬＤＫＬＱＭＳＬＥＬＳＲＬ、配列番号１１）、２６４位〜２６８位のアミノ酸（ペプチドＷＥＧＬＫ、配列番号１２）、２９０位〜２９３位のアミノ酸（ペプチドＫＥＡＥ、配列番号１３）、３０１位〜３０５位のアミノ酸（ペプチドＧＧＡＦＬ、配列番号１４）、３２４位〜３３８位のアミノ酸（ペプチドＧＡＫＥＧＲＶＨＲＡＥＤＰＶＧ、配列番号１５）、３６２位〜３６５位のアミノ酸（ペプチドＧＲＥＩ、配列番号１６）、３８１位〜３８４位のアミノ酸（ペプチドＧＮＴＮ、配列番号１７）、３９６位〜４０２位のアミノ酸（ペプチドＷＫＥＤＡＡＡ、配列番号１８）、４１１位〜４２０位のアミノ酸（ペプチドＷＱＡＬＹＰＲＶＡＥ、配列番号１９）、４３５位〜４３８位のアミノ酸（ペプチドＬＡＱＶ、配列番号２０）、４５９位〜４７３位のアミノ酸（ペプチドＱＥＶＡＦＥＬＥＲＬＥＡＥＶＨ、配列番号２１）、５１９位〜５３７位のアミノ酸（ペプチドＬＬＲＥＡＨＰＩＶＧＲＩＬＥＹＲＥＬＭ、配列番号２２）、６０１位〜６０４位のアミノ酸（ペプチドＧＨＬＬ、配列番号２３）、６５１位〜６５５位のアミノ酸（ペプチドＧＶＤＧＡ、配列番号２４）、６８１位〜６８９位のアミノ酸（ペプチドＳＩＰＹＥＥＡＡ、配列番号２５）、７０４位〜７０７位のアミノ酸（ペプチドＷＩＡＫ、配列番号２６）、７７４位〜７７７位のアミノ酸（ペプチドＧＶＲＩ、配列番号２７）および７９９位〜８３０位のアミノ酸（ペプチドＱＬＡＫＥＴＭＥＧＶＹＰＬＳＶＰＬＥＶＥＶＧＭＧＥＤＷＬＳＡＫＡ、配列番号２８）が挙げられる。
【０１００】
多くのポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性に加えて活性を有する。このような活性としては、例えば、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、組み込まれたかもしれない不正確な塩基を除去することによって、新規に合成された鎖の正確さを改善する。このような活性が低いかまたは存在しないＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチド残基のプライマー伸長鎖への組み込みにおいてエラーを起こしやすい。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、低い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有すると報告されている。Ｌａｗｙｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７−６４３７を参照のこと。ＤＮＡの複製が、しばしばプライマー伸長サイクルの数に関して幾何的である核酸増幅手順のような適用において、このようなエラーは、重大な人為的問題（例えば、核酸増幅産物（アンプリコン）の配列不均一性）をもたらし得る。従って、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、このような目的のために使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの望ましい特徴である。
【０１０１】
対照的に、ポリメラーゼ酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、しばしば、この活性が、５’末端が保護されていない核酸（プライマーを含む）を消化し得るので、望ましくない。従って、弱められた５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するか、またはこのような活性が存在しない耐熱性ポリメラーゼは、生化学的適用に対して望ましい。種々のＤＮＡポリメラーゼ酵素が、記載されており、ここで、改変が、この目的を達成するＤＮＡポリメラーゼに導入されている。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントは、このタンパク質のうちの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性制御ドメインが除去されているホロ酵素のタンパク質分解フラグメントとして産生され得る。このＫｌｅｎｏｗフラグメントは、依然として、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保持する。Ｂａｒｎｅｓ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０６１８８（１９９２）およびＧｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，４６６，５９１号は、５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損組換えＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを産生している。Ｉｓｈｉｎｏら、ＥＰＯ公開番号０５１７４１８Ａ２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来の５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼを産生している。
【０１０２】
別の実施形態において、本発明は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低減しているかまたは除去されているＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ誘導体ポリペプチドである、ポリペプチドを提供する。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性欠損ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲおよび鎖終結ポリヌクレオチド配列決定に関して優れた特性を有する。ＤＮＡポリメラーゼにおいて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異は、当業者に利用可能である。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減する変異の導入方法についての指針は、とりわけ米国特許第５，４６６，５９１号；米国特許第５，５４１，０９９号；米国特許第５，４８９，５２３号；Ｂｅｒｎａｄら、Ｃｅｌｌ  ５９：２１９−２８８（１９８９）；およびＸｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’−３’  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７年５月２日；２６８（２）：２８４−３０２に見出され得る。１つの実施形態において、Ａｓｐは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低下したポリペプチドを作製するために、４３位のＧｌｙのかわりに使用される。それは、以下の配列番号６を有する。
【０１０３】
【化６】
2005511044.tif 000012
別の実施形態において、本発明は、ｄｄＮＴＰの取りこみに対する偏りが低下したＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ誘導体ポリペプチドである、配列番号７のポリペプチドを提供する。配列番号７は、６６５位にてＰｈｅのかわりにＴｙｒを有する。配列番号７の配列は、以下である。
【０１０４】
【化７】
2005511044.tif 000013
別の実施形態において、本発明は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低下しており、かつｄｄＮＴＰの取りこみに対する偏りが低下したＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ誘導体ポリペプチドである、配列番号８のポリペプチドを提供する。配列番号８は、４３位にてＧｌｙのかわりにＡｓｐおよび６６５位にてＰｈｅのかわりにＴｙｒを有する。配列番号８の配列は、以下である。
【０１０５】
【化８】
2005511044.tif 000014
上記に示したように、本発明の誘導体ポリペプチドおよび改変体ポリペプチドは、野生型ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；野生型ポリペプチド内の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；あるいは野生型ポリペプチド内の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換によって野生型ポリメラーゼから誘導される。従って、本発明のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、短縮、および挿入を含む種々の方法で変更され得る。
【０１０６】
このような改変体ポリペプチドおよび誘導体ポリペプチドは、例えば、遺伝的多型またはヒト操作から生じ得る。このような操作のための方法は、一般的に、当該分野で公知である。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７）；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）ならびにそれらに引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換についての指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｄ．（１９７８）のモデルに見出され得、これは本明細書で参考として援用される。
【０１０７】
本発明の単離されたポリペプチドの誘導体および改変体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸位置の少なくとも約９２％と同一性を有し、かつ核酸ポリメラーゼ活性もしくはＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつ／または耐熱性である。好ましい実施形態において、ポリペプチド誘導体およびポリペプチド改変体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸位置の少なくとも約９３％と同一性を有し、かつ核酸ポリメラーゼ活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつ／または耐熱性である。より好ましい実施形態において、ポリペプチド誘導体およびポリペプチド改変体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸位置の少なくとも約９５％と同一性を有し、かつ核酸ポリメラーゼ活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつ／または耐熱性である。
【０１０８】
単離されたポリペプチドならびにポリペプチド誘導体およびポリペプチド改変体のアミノ酸残基は、遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸、天然に存在する、遺伝的にコードされないＬ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸または上記のいずれかのＤ−鏡像体であり得る。遺伝的にコードされる２０個のＬ−アミノ酸および一般的にコードされないアミノ酸について、本明細書で使用されるアミノ酸記号は、従来の通りであり、表２に示されるとおりである。
【０１０９】
【表２】
2005511044.tif 000015
2005511044.tif 000016
2005511044.tif 000017
本発明の範囲内に包含されるポリペプチド改変体は、これらの改変体ポリペプチドが核酸ポリメラーゼ活性もしくはＤＮＡポリメラーゼ活性を保持しかつ／または耐熱性のままである限り、類似の化学的特性および／または物理的特性のアミノ酸によって、１以上のアミノ酸が置換され得る。誘導体ポリペプチドは、これらの改変体ポリペプチドが核酸ポリメラーゼ活性もしくはＤＮＡポリメラーゼ活性を保持しかつ／または耐熱性のままである限り、異なる化学的特性および／または物理的特性を有するアミノ酸によって１以上のアミノ酸が置換され得る。
【０１１０】
本発明の改変体ポリペプチドにおいて相互に置換可能であるアミノ酸は、一般に、類似のクラスまたはサブクラス内に存在する。当業者に公知であるように、アミノ酸は、そのアミノ酸側鎖の特徴に主に依存して、以下の３つの主要なクラスに分けられ得る：親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸およびシステイン様アミノ酸。これらの主要なクラスは、サブクラスにさらに分けられ得る。親水性アミノ酸としては、酸性側鎖、塩基性側鎖または極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられ、そして疎水性アミノ酸としては、芳香族側鎖または無極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。無極性アミノ酸は、とりわけ、脂肪族アミノ酸を含むようにさらに細分され得る。本明細書中で使用される場合、これらのクラスのアミノ酸の定義は、以下のとおりである：
「疎水性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにて無電荷でありかつ水溶液によってはじかれる側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸の例としては、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌが挙げられる。遺伝的にコードされない疎水性アミノ酸の例としては、ｔ−ＢｕＡが挙げられる。
【０１１１】
「芳香族アミノ酸」とは、共役π電子系を有する少なくとも１個の環（芳香族）を含む側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。この芳香族基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル基、スルホニル基、ニトロ基およびアミノ基などのような置換基でさらに置換され得る。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられる。一般に遭遇する遺伝的にコードされない芳香族アミノ酸としては、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニンおよび４−フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
【０１１２】
「無極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにて一般に無電荷でありかつ極性ではない側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされる無極性アミノ酸の例としては、グリシン、プロリンおよびメチオニンが挙げられる。コードされない無極性アミノ酸の例としては、Ｃｈａが挙げられる。
【０１１３】
「脂肪族アミノ酸」とは、飽和または不飽和の直鎖、分枝鎖または環状の炭化水素側鎖を有する無極性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸の例としては、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅが挙げられる。コードされない脂肪族アミノ酸の例としては、Ｎｌｅが挙げられる。
【０１１４】
「親水性アミノ酸」とは、水溶液によって結合される側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸の例としては、ＳｅｒおよびＬｙｓが挙げられる。コードされない親水性アミノ酸の例としては、ＣｉｔおよびｈＣｙｓが挙げられる。
【０１１５】
「酸性アミノ酸」とは、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。酸性アミノ酸は、代表的には、水素イオンの損失に起因して、生理学的ｐＨにて負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸の例としては、アスパラギン酸（アスパルテート）およびグルタミン酸（グルタメート）が挙げられる。
【０１１６】
「塩基性アミノ酸」とは、７より高い側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。塩基性アミノ酸は、代表的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的ｐＨにて正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。遺伝的にコードされない塩基性アミノ酸の例としては、非環状アミノ酸であるオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸およびホモアルギニンが挙げられる。
【０１１７】
「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにて無荷電であるが、２つの原子によって共有される電子対がこれらの原子のうちの一方により接近して保持された結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされる極性アミノ酸の例としては、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。遺伝的にコードされない極性アミノ酸の例としては、シトルリン、Ｎ−アセチルリジンおよびメチオニンスルホキシドが挙げられる。
【０１１８】
「システイン様アミノ酸」とは、別のアミノ酸残基の側鎖と共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を形成することが可能な側鎖を有するアミノ酸をいう。代表的には、システイン様アミノ酸は、一般に、少なくとも１個のチオール（ＳＨ）基を含む側鎖を有する。遺伝的にコードされるシステイン様アミノ酸の例としては、システインが挙げられる。遺伝的にコードされないシステイン様アミノ酸の例としては、ホモシステインおよびペニシラミンが挙げられる。
【０１１９】
当業者によって理解されるように、上記の分類は、絶対的ではない。数種のアミノ酸は、１を超える特徴的な特性を示し、それゆえ、１を超えるカテゴリーに含まれ得る。例えば、チロシンは、芳香族環と極性ヒドロキシル基との両方を有し得る。従って、チロシンは、二重の特性を有し、そして芳香族カテゴリーと極性カテゴリーとの両方に含まれ得る。同様に、ジスルフィド結合を形成することができることに加えて、システインはまた、無極性特性を有する。従って、厳密には疎水性アミノ酸としても無極性アミノ酸としても分類されないが、多くの場合において、システインは、ポリペプチドに疎水性を与えるために使用され得る。
【０１２０】
遺伝的にコードされずかつ本発明の改変体ポリペプチド中に存在し得るか、またはアミノ酸で置換され得る、特定の一般に遭遇するアミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：β−アラニン（ｂ−Ａｌａ）および他のω−アミノ酸（例えば、３−アミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸など）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）およびホモセリン（ｈＳｅｒ）。これらのアミノ酸はまた、上で定義されるカテゴリーに分類される。
【０１２１】
上記の遺伝的にコードされるアミノ酸およびコードされないアミノ酸の分類は、以下の表３において要約される。表３は、例示目的のみのためであり、本明細書中に記載される改変体ポリペプチドおよび誘導体ポリペプチドを含み得るアミノ酸残基の完全な列挙であることを意味しないことが理解されるべきである。本明細書中に記載される改変体ポリペプチドおよび誘導体ポリペプチドを作製するために有用である他のアミノ酸残基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．およびその中で引用される参考文献において見出され得る。本明細書中で特に言及されていないアミノ酸は、既知の挙動ならびに／または特に特定されたアミノ酸と比較した場合のそれらの特徴的な化学的特性および／もしくは物理的特性に基づいて、上記のカテゴリーに簡便に分類され得る。
【０１２２】
【表３】
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本発明のポリペプチドは、ペプチド改変体が耐熱性でありかつ／または核酸ポリメラーゼ活性もしくはＤＮＡポリメラーゼ活性を保持する限り、改変体ポリペプチドを作製するために、同様に分類された任意のアミノ酸によって任意のアミノ酸が置換されていてもよい。
【０１２３】
「ドメインシャッフリング」または「耐熱性キメラ核酸ポリメラーゼ」の構築は、新規の特性を含む耐熱性ポリメラーゼを提供するために使用され得る。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのコドン１〜２８８の後ろへのＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ  ポリメラーゼコード領域由来のコドン２８９〜４２２の配置は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼドメイン（１〜２８８）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン（２８９〜４２２）、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼドメイン（４２３〜８３２）を含む新規の耐熱性核酸ポリメラーゼを生じる。あるいは、このＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼドメインおよび３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ（ｄＮＴＰ結合ドメインおよびプライマー／テンプレート結合ドメイン）部分（コドン約４２３〜８３２）に融合され得る。ドナーおよびレシピエントは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼに限定される必要性はない。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、５’−３’エキソヌクレアーゼドメインおよびＤＮＡポリメラーゼドメインによって同様に、本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼにおけるドメインを置換し得る。
【０１２４】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼドメインは、耐熱性の有意な損失もポリメラーゼ活性の有意な損失もなしに、このタンパク質のアミノ末端から除去され得ることが実証されている（Ｅｒｌｉｃｈら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３−１６５１，Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５．，Ｌａｗｙｅｒら（１９８９）ＪＢＣ  ２６４：６４２７−６４３７）。他のＮ末端欠失は、同様に、耐熱性および活性を維持することが示されている（Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１７８５−１７９２およびその中の参考文献）。従って、本発明はまた、本明細書中で提供される、同様に短縮型形態の任意の野生型ポリメラーゼまたは改変体ポリメラーゼを含む。例えば、本発明はまた、本発明によって提供されるポリメラーゼのうちのいずれかの活性な短縮型改変体に関し、ここで、最初の３３０アミノ酸が除去されている。
【０１２５】
さらに、本発明は、配列番号３９の短縮型形態のポリメラーゼを提供する。ここでは、野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼのＮ末端の２８９アミノ酸が除去されている。
【０１２６】
【化９】
2005511044.tif 000019
従って、本発明のポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ならびにそれらの改変体、短縮型および改変形態の両方を包含する。このような改変体は、所望の活性を保有し続ける。本明細書中に包含されるポリペプチド配列の欠失、挿入、および置換は、このポリペプチドの特徴において根本的な変化を生じるとは予測されない。当業者は、慣用的なスクリーニングアッセイによって、本発明のポリペプチドおよび改変体ポリペプチドの耐熱性およびポリメラーゼ活性を容易に評価し得る。
【０１２７】
本発明のポリペプチドを含むキットおよび組成物は、細胞性物質を実質的に含まない。このような調製物および組成物は、約３０（乾燥重量）％未満、約２０（乾燥重量）％未満、約１０（乾燥重量）％未満、約５（乾燥重量）％未満の夾雑細菌細胞性タンパク質を有する。
【０１２８】
ポリメラーゼポリペプチドおよび改変体ポリペプチドの活性は、当業者に公知の任意の手順によって評価され得る。例えば、本発明の改変体ポリメラーゼポリペプチドおよび非改変体ポリメラーゼポリペプチドのＤＮＡ合成活性は、標準的なＤＮＡ配列決定反応またはＤＮＡプライマー伸長反応において試験され得る。１つのこのようなアッセイは、１００μｌ（最終容積）の反応混合物で行われ得、この反応混合物は、例えば、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭの緩衝化合物（例えば、ＰＩＰＥＳ、Ｔｒｉｓまたはトリエチルアミンを含む緩衝液中、０．１ｍＭ  ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、α−３２Ｐ−ｄＡＴＰ、０．３ｍｇ／ｍｌの活性化子ウシ胸腺ＤＮＡおよび）０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む。各ポリメラーゼ酵素の０．１単位／μｌまでの希釈物を調製し、そして５μｌのこのような希釈物を、この反応混合物に加え、続いて、６０℃にて１０分間インキュベートする。反応産物を、ＤＮＡに組み込まれた３２Ｐの量を決定するかまたはポリアクリルアミドゲルでの分離後の産物を観察することによって、検出し得る。
【０１２９】
（核酸ポリメラーゼについての使用）
本発明の耐熱性酵素は、核酸ポリメラーゼ酵素活性が必要であるかまたは望ましい、任意の目的のために使用され得る。例えば、本発明の核酸ポリメラーゼ酵素は、以下の手順の１つ以上において使用され得る：ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、逆転写、ＲＮＡ増幅、ＤＮＡ合成および／またはプライマー伸長。本発明の核酸ポリメラーゼ酵素は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＮＡテンプレートまたはＲＮＡテンプレートを増幅するために使用され得る。本発明の核酸ポリメラーゼ酵素は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定手順によってＤＮＡを配列決定するために使用され得る。本発明の核酸ポリメラーゼ酵素はまた、プライマー伸長反応においても使用され得る。本発明の核酸ポリメラーゼ酵素は、ターミネーターヌクレオチドを使用する一ヌクレオチドプライマー伸長によって、一塩基多型（ＳＮＰ）について試験するために使用され得る。任意のこのような手順および関連手順（例えば、ポリヌクレオチド標識またはプライマー標識、ミニ配列決定（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）など）は、本発明の核酸ポリメラーゼ酵素について使用することが企図される。
【０１３０】
本発明の方法は、プライミングしたポリヌクレオチドテンプレートを、少なくとも１つの標識ヌクレオチドを用いて伸長させる工程を包含し、ここで、この伸長は、本発明のポリメラーゼによって触媒される。Ｓａｎｇｅｒ配列決定のために使用されるＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識される産物を生成し得、この産物は、自動化蛍光ベースの配列決定装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１０または３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））によって分析される。Ｓａｎｇｅｒ配列決定のための詳細なプロトコルは、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）において見出され得る。
【０１３１】
１つの実施形態において、本発明の核酸ポリメラーゼ酵素は、核酸増幅のために使用される。ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素を用いる任意の増幅手順は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、鎖置換増幅および他の増幅手順において使用され得る。鎖置換増幅は、Ｗａｌｋｅｒら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，１６９１−１６９６において記載されるように使用され得る。用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，９６５，１８８号（本明細書中で参考として援用される）の方法（これらは、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸の混合物中の標的配列のセグメント濃度を、クローニングも精製もすることなしに増加させるための方法を記載する）をいう。
【０１３２】
標的配列を増幅するためのＰＣＲプロセスは、大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含む核酸の混合物に導入し、続いてポリメラーゼの存在下での一連のサーマルサイクリングを含む核酸の混合物に導入する工程からなる。これら２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、この混合物を変性させ、そしてプライマーを、標的分子内の相補配列にアニーリングする。アニーリングの後、このプライマーを、相補鎖の新たな対を形成するように、ポリメラーゼを用いて伸長させる。変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼ伸長工程を、「サイクル」と呼ぶ。多数のサイクルが存在し得、生成された増幅核酸の量は、各サイクルの度に増加する。従って、高濃度の増幅された標的核酸を獲得するために、多くのサイクルが行われる。
【０１３３】
ＰＣＲ核酸増幅法に含まれる工程は、以下に、より詳細に記載される。議論を容易にするために、増幅される核酸を、二本鎖であるものとして記載する。しかし、最終的な産物は一般的に二本鎖ＤＮＡであるが、このプロセスは一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を増幅するためにも等しく有用である。一本鎖核酸の増幅において、第一の工程は、相補鎖の合成を含む（例えば、２つの増幅プライマーのうちの１つが、この目的のために用いられ得る）。引き続く工程は、一般的に以下のように進められる：
（ａ）各核酸鎖を、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および増幅されるべき各核酸鎖に対する１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる。ここで、各プライマーは、増幅されるべき核酸鎖の一部分に実質的に相補的であるように選択されており、その結果、一方のプライマーから合成された伸長産物は、その相補体と分離された際に、他方のプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレートとしての役割を果たし得る。プライマーと増幅されるべき核酸鎖との適切なアニーリングを促進するために、相補的核酸鎖への各プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする温度が使用される。
【０１３４】
（ｂ）プライマーアニーリングの後に、プライマーによってハイブリダイズされる鎖に相補的な伸長する核酸鎖へのヌクレオシド三リン酸を取りこむプライマー伸長のために、ポリメラーゼが使用される。一般に、このプライマー伸長反応は、酵素の活性を促進し、かつ完全な第２プライマー結合を介して伸長する「全長」相補的核酸鎖を合成するのに有効な温度および時間で実施される。しかし、その温度は、その核酸テンプレート鎖から各伸長産物を分離するほどには高くない。
【０１３５】
（ｃ）次いで、工程（ｂ）からの混合物は、それらの相補的なテンプレートからプライマー伸長産物を分離するのに十分な時間および温度で加熱される。この選択された温度は、その混合物中に存在するポリメラーゼを不可逆的に変性させるほどには高くない。
【０１３６】
（ｄ）（ｃ）からの混合物は、工程（ｂ）で生成された各々の一本鎖分子にプライマーのハイブリダイゼーションを促進するのに有効な時間および温度で冷却される。
【０１３７】
（ｅ）工程（ｄ）からの混合物は、ポリメラーゼによるプライマー伸長を促進して、「全長」伸長産物を生成するのに十分な時間および温度で維持される。使用される温度は、相補的鎖テンプレートから各伸長産物を分離するほどには高くない。工程（ｃ）〜（ｅ）は、所望のレベルの増幅が得られるまで反復される。
【０１３８】
増幅方法は、既知の配列の大量の特異的核酸配列を生成するためだけでなく、存在することは知られているが完全には特定されていない核酸配列を生成するためにも有用である。それらの位置における所望の配列との異なる鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーが調製され得るに十分に詳細な、配列両方の末端での十分な数の塩基の正体のみを知る必要がある。伸長産物は、１つのプライマーから合成される。その伸長産物が、テンプレートから分離される場合、その伸長産物は、他のプライマーの伸長に対するテンプレートとして働き得る。この配列の両方の末端の塩基についての知見が多くなればなるほど、標的核酸配列についてのプライマーの特異性が、高くなり得る。
【０１３９】
従って、耐熱性ポリメラーゼが、一般的に、ＰＣＲに使用される。なぜなら、これらのポリメラーゼが、二本鎖標的ＤＮＡを融解するため、およびＰＣＲ反応の各サイクルの間にプライマーをアニーリングするために使用される高温で機能し得るからである。高温は、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利であって、かつ標的ではない配列とのハイブリダイゼーションに有利で熱力学的条件を生じる（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（編）、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ［１９８９］）。
【０１４０】
本発明の耐熱性ポリメラーゼは、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）における有効な使用のための要件を満たす。本発明のポリメラーゼポリペプチドは、増幅プロセスの間に二本鎖核酸を融解するのに必要な時間で、必要とされる上昇した温度に供される際に、不可逆的に変性（不活化）されない。本明細書における目的のための不可逆的な変性は、酵素活性の永久的かつ完全な損失をいう。核酸の変性のために必要な加熱条件は、例えば、緩衝液の塩濃度ならびに変性される核酸の組成および長さに依存するが、代表的には、約９０℃〜約１０５℃で、主に、温度および核酸の長さに依存した時間（代表的に、数秒間から４分間まで）の範囲におよぶ。緩衝液の塩濃度および／または核酸のＧＣ組成が上昇するにつれて、より高い温度が必要とされ得る。本発明のポリメラーゼポリペプチドは、約９０℃〜１００℃の温度への比較的短い曝露に対しては、不可逆的に変性されない。
【０１４１】
本発明の耐熱性ポリメラーゼポリペプチドは、それらのポリメラーゼが機能をする至適温度を有し、その温度は、約４５℃より高い。４５℃未満の温度は、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションを促進するが、塩の組成および濃度ならびにプライマーの組成および長さに依存して、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションは、より高い温度（例えば、４５℃〜７０℃）で生じ得、これは、プライマーハイブリダイゼーション反応の特異性を促進し得る。本発明のポリメラーゼポリペプチドは、約３７℃〜約９０℃広範な温度範囲にわたって活性を示す。
【０１４２】
本発明のポリメラーゼポリペプチドは、ＰＣＲについての特定の有用性を有する。このことは、これらの耐熱性に起因するだけでなく、標的核酸の複製におけるそれらの忠実度にもまた起因する。ＰＣＲにおいて、１コピーの特定の標的核酸を、いくつかの異なる方法論によって検出可能なレベルに増幅することが可能である。しかし、標的核酸の配列が、忠実に複製されない場合、増幅産物は、多様な配列を有する核酸のプールを含み得る。従って、標的の配列を正確に複製し得るポリメラーゼが、非常に望ましい。
【０１４３】
任意の核酸が、本発明のＰＣＲ法のための「標的核酸」として作用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応を参照して使用される場合、用語「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応のために使用されるプライマーに結合される核酸の領域をいう。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のｃＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、適切なセットのプライマー分子を用いて増幅され得る。特に、ＰＣＲプロセス自体により作製された増幅されたセグメントは、それら自体が、次のＰＣＲ増幅のための効率的なテンプレートである。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対的な位置により決定され、従って、この長さは、制御可能なパラメータである。
【０１４４】
増幅された標的核酸は、当業者に公知の任意の方法によって検出され得る。例えば、標的核酸は、しばしば、これらの核酸がサイズ分離ゲルにて可視のバンドを形成するような程度に増幅される。標的核酸はまた、標識されたプローブとのハイブリダイゼーションによって；ＰＣＲの間のビオチン化プライマーの取り込みとそれに続くアビジン−酵素結合体検出によって；ＰＣＲの間の３２Ｐ−標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みによって、などにより、検出され得る。
【０１４５】
増幅の量がまた、例えば、米国特許第５，７２３，５９１号に記載されるようなレポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチド、および５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用によりモニタリングされ得る。このレポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドは、結合されたレポーター分子および結合されたクエンチャー分子を有し、このクエンチャー分子は、これら２つの分子が近位にある場合にレポーター分子の蛍光をクエンチし得る。クエンチングは、レポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドが相補的核酸にハイブリダイズしていない場合に生じる。なぜなら、レポーター分子とクエンチャー分子とは、近位にあるか、またはクエンチングに最適な距離にある傾向にあるためである。ハイブリダイズされる場合、レポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされていない場合よりも多くの蛍光を放出する。なぜなら、レポーター分子とクエンチャー分子とがさらに離れている傾向があるためである。増幅をモニタリングするために、レポーター−クエンチャーオリゴヌクレオチドは、増幅プライマーに対して３’側にハイブリダイズするように設計される。増幅の間、ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、レポーターオリゴヌクレオチドプローブを消化し、これによりレポーター分子をクエンチャー分子から分離する。増幅が実施される際、レポーター分子の蛍光は、増加する。従って、実施された増幅の量は、観察される蛍光の増加に基づき定量され得る。
【０１４６】
ＰＣＲプライマーについて使用されるオリゴヌクレオチドは、通常、約９ヌクレオチド長〜約７５ヌクレオチド長、好ましくは、約１７ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長である。好ましくは、ＰＣＲ反応における使用のためのオリゴヌクレオチドは、約４０以下（例えば、９、１２、１５、１８、２０、２１、２４、２７、３０、３５、４０または９と４０との間の任意の数）のヌクレオチド長である。一般的に特異的なプライマーは、少なくとも約１４ヌクレオチド長である。最適な特異性および費用効果のために、１６〜２４ヌクレオチド長のプライマーが、一般的に好ましい。
【０１４７】
当業者は、ＰＣＲのようなプロセスに使用するためのプライマーを容易に設計し得る。例えば、ＤＮＡ増幅のための潜在的なプライマーは、このプライマーが単一の標的について選択的であるか否か、およびどのような条件が、サンプルまたは核酸の複合的な混合物中の標的に対するプライマーのハイブリダイゼーションを可能にするかを決定するためのプローブとして使用され得る。
【０１４８】
本発明はまた、他の手順または酵素と組み合わせた、本発明のポリメラーゼポリペプチドの使用も企図する。例えば、これらのポリメラーゼポリペプチドが、特定のＲＮＡの逆転写について使用され得る。この方法において、そのＲＮＡは、本発明のポリメラーゼの逆転写酵素活性に起因してｃＤＮＡに変換され、次いで、同じポリメラーゼを使用して増幅される。別のＲＮＡポリメラーゼを追加する必要はない。ＲＮＡの逆転写および増幅についての手順は、本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，３２２，７７０号に提供される。
【０１４９】
別の実施形態において、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する本発明のポリメラーゼが、インベーダー指向切断アッセイ（ｉｎｖａｄｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｓｓａｙ）において標的核酸を検出するために使用される。この型のアッセイは、例えば、米国特許第５，９９４，０６９号に記載される。ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼは、核酸の５’末端からヌクレオチドを漸次切断する現実のエキソヌクレアーゼではなく、特定の型の核酸構造体を切断して、オリゴヌクレオチド切断産物を生成し得るヌクレアーゼであることに注意することが重要である。そのような切断は、ときどき、構造特異的切断と呼ばれる。
【０１５０】
一般的に、インベーダー指向切断アッセイは、標的核酸と相互作用して、そのポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性についての切断構造体を形成する少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを使用する。特徴的な切断産物は、その切断構造体がそのポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により切断される際に放出される。そのような標的依存性切断構造の形成および得られた切断産物は、試験サンプル中の特異的標的核酸配列の存在を示す。
【０１５１】
従って、インベーダー指向切断手順において、本発明のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、標的核酸と相互作用して５’−３’ヌクレアーゼについての切断構造体を形成する少なくとも一対のオリゴヌクレオチドもまた必要とされる。ときどき「プローブ」と呼ばれる第一のオリゴヌクレオチドは、標的部位内であるが、ときどき「インベーダー」オリゴヌクレオチドと呼ばれる第二のオリゴヌクレオチドの下流で、ハイブリダイズし得る。このインベーダーオリゴヌクレオチドは、このプローブオリゴヌクレオチドに隣接しかつ上流でハイブリダイズし得る。しかし、このプローブオリゴヌクレオチドおよびインベーダーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする標的部位は、インベーダーオリゴヌクレオチドの３’側セグメントがプローブオリゴヌクレオチドの５’側セグメントと重複するように、重複する。本発明のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼは、内側部位でプローブオリゴヌクレオチドを切断して、サンプル中の標的核酸の存在の診断に役立つ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）特徴的（ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ）フラグメントを生成し得る。特定の状況へのインベーダー指向切断アッセイの適合についてのさらなる詳細および方法は、米国特許第５，９９４，０６９号において見出され得る。
【０１５２】
１つ以上のヌクレオチドアナログもまた、本発明の方法、キットと共に、そしてポリメラーゼポリペプチドと共に使用され得る。そのようなヌクレオチドアナログは、改変されているか、または天然に存在しないヌクレオチド（例えば、７−デアザプリン（すなわち、７−デアザ−ｄＡＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰ））であり得る。ヌクレオチドアナログは塩基アナログを含み、そしてデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの改変形態を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチドアナログ」は、ＰＣＲ混合物中に存在する標的を参照して使用する際、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ以外のヌクレオチドの使用をいい；従って、ＰＣＲにおけるｄＵＴＰ（天然に存在するｄＮＴＰ）の使用は、ＰＣＲにおけるヌクレオチドアナログの使用を含む。反応混合物中のｄＵＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰまたは任意の他のヌクレオチドアナログを使用して作製されたＰＣＲ産物は、ヌクレオチドアナログを含むといわれる。
【０１５３】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明のポリメラーゼポリペプチドを備えるキットを提供する。個々のキットは、以下の手順のうち１つ以上の実施のために適合され得る：ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ増幅および／またはプライマー伸長。本発明のキットは、本発明のポリメラーゼポリペプチドおよび少なくとも１つのヌクレオチドを含む。本発明のキット中に提供されるヌクレオチドは、標識されてもよく、または標識されなくてもよい。好ましくは、キットはまた、キットが適合される手順を実施する方法に対する指示書も備え得る。
【０１５４】
必要に応じて、本発明のキットは、このキットが実施するために適合されている方法を実施するために必要とされる少なくとも１つの他の試薬をさらに備え得る。そのような追加の試薬の例としては、以下が挙げられる：別の未標識ヌクレオチド、別の標識ヌクレオチド、ヌクレオチドのバランスのとれた（ｂａｌａｎｃｅ）混合物、１つ以上の鎖終結ヌクレオチド、１つ以上のヌクレオチドアナログ、緩衝溶液、マグネシウム溶液、クローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、配列決定プライマー、逆転写酵素、およびＤＮＡ増幅プライマーまたはＲＮＡ増幅プライマー。本発明のキットに備えられる試薬は、より高い精度および正確度を提供するために予め測定された単位で供給され得る。代表的に、キットの試薬および他の成分は、別個の容器中に配置および保有される。反応容器、試験管、マイクロウェルトレイ、マイクロタイターディッシュ、または他の容器もまた、このキットに備えられ得る。異なるラベルが、異なる試薬に対して使用され得、その結果、各々の試薬が、互いに区別され得る。
【０１５５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示し、そして本発明の範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【０１５６】
（実施例１：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ核酸ポリメラーゼをコードする遺伝子のクローニング）
（細菌の増殖およびゲノムＤＮＡの単離）
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ核酸を、ＣＢ１と名付けられた株からクローニングした。その単離源は、Ａｚｏｒｅｓ（Ｒ．Ａ．Ｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士，Ｑｕｅｅｎ  Ｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄから）である。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ  ＣＢ１株の凍結乾燥したサンプルを得、ＡＴＣＣ培養培地４６１（Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ  ＴＹＥ培地）中で回復させ、そして定常期まで一晩増殖させた。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ調製プロトコルおよびキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて調製した。
【０１５７】
（クローニング方法）
第１の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）のＤＮＡ配列の５’末端および３’末端の相同性保存領域の分析によって設計した。部分的なＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子のフラグメントを、Ｎ末端プライマー５’  ｇｇｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃｔｇ  ｇｃｃ  ｔａｃ  ３’（配列番号２９）およびＣ末端プライマー５’  ｃｃｃ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａｇ  ３’（配列番号３０）を用いて増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、２５μｌの全反応容積中に、２．５μｌの１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ緩衝液（ＡＢｉ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ、１００ｎｇ  ＤＮＡテンプレート、（各）２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマー、および１．２５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。
【０１５８】
このＰＣＲ反応混合物について、（９７℃で３秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３分間）を３０サイクル行い、最後の工程は（７２℃で７分間）であった。これにより、約２．４ｋｂのＤＮＡフラグメントが生成され、このＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  クリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応混合物から精製した。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ  ＣＢ１株フラグメントをｐＣＲ（商標登録）Ｔ７−ＣＴ−ＴＯＰＯ（商標登録）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。このクローニングされたフラグメントの配列は、ヌクレオチド６４４と３０６０との間のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＰｏｌＩ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号４６６５７３）にいくらか相同性を示した。
【０１５９】
全長Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子の配列を得るために、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉゲノムＤＮＡのＳｍａＩ消化によってライブラリーを構築した。完全な消化の後、生じたフラグメントをＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭアダプター（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭキット、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）に連結した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子の５’末端部分を含むフラグメントを、遺伝子特異的プライマー（５’−ｃａｔｃｃｔｃｃｔｔｃａｇｇｇｃｃｔｔｇａ−３’、配列番号３１）およびＣｌｏｎｅｔｅｃｈアダプタープライマーＡＰ１（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒキット、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｍｏｕｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して増幅した。ＰＣＲ混合物を８０℃に加熱し、次いで遺伝子特異的プライマーを加えた。サイクル条件は、（９４℃を２５秒間、７２℃を３分間）を７サイクルに続いて、（９６℃を５秒間、６６℃を１分間）を３０サイクルであった。ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭライブラリーから増幅されたフラグメントを、Ｑｕｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応混合物から精製した。そのフラグメントを、増幅に使用したのと同じ遺伝子特異的プライマーを使用して配列決定した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子の３’末端の配列を得るために、遺伝子特異的プライマー  ５’−ｔｔｇ  ｃａｇ  ｇｔｇ  ｃａｃ  ｇａｃ  ｇａｇ  ｃｔｇ  ｇｔｃ−３’（配列番号３２）を使用して同じＳｍａＩライブラリーを用いて、上記のプロセスを反復した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子の３’末端を含むフラグメントを、同じ遺伝子特異的プライマーによって配列決定した。これらの配列を、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ核酸ポリメラーゼ遺伝子全体を得るために最初の遺伝子フラグメントの配列で組み立てた。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ遺伝子のＮ末端のＤＮＡ配列（開始コドンは太字）は、以下である：
【０１６０】
【化１０】
2005511044.tif 000020
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子のＣ末端（終止コドンは太字）は、以下の配列を有する：
【０１６１】
【化１１】
2005511044.tif 000021
野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子の全長（配列番号１）を含む産物をＰＣＲ増幅するために、２つのプライマーを使用した。その３’末端配列に相補的なプライマーは、５’−ｇｔｃ  ｇａｃ  ｔａｇ  ｇｃｃ  ｔｔｇ  ｇｃｇ  ａａａ  ｇｃｃ  ａ−３’（配列番号３５）であった。これは、終止コドンと重複するＳａｌＩ認識部位（ｇｔｃｇａｃ（配列番号３６））を有する。５’末端に相補的なプライマーは、５’−ｃａｔ  ａｔｇ  ｃｔｔ  ｃｃｃ  ｃｔｃ  ｔｔｔ  ｇａｇ  ｃｃｃ  ａ−３’（配列番号３７）であった。制限酵素ＮｄｅＩに対する認識部位（ｃａｔａｔｇ（配列番号３８））をこのプライマーを使用して導入した。ＮｄｅＩ制限部位およびＳａｌＩ制限部位を、他のプラスミドＤＮＡベクターにこの遺伝子のサブクローニングを促進するために使用した。ＣＢ１由株来のＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子を増幅するために使用したＰＣＲ反応混合物は、２５μｌの全反応容積中に、２．５μｌの１０×Ａｍｐｌｉｔａｑ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２０ｎｇのゲノムＤＮＡテンプレート、（各）０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマーおよび１．２５単位のＡｍｐｌｉｔａｑを含んだ。その反応を、酵素、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、緩衝液および水を含むプレミックスを、プライマーおよびテンプレートを含む８０℃に予め加熱した別のプレミックスに添加することによって開始した。次いで、反応混合物全体を変性（９６℃、３０秒）させ、次いでＰＣＲサイクル（９７℃を３秒間；６２℃を３０秒間；７２℃を３分間）を３０回行い、さらに最終工程（７２℃を７分間）を行った。
【０１６２】
このＰＣＲ反応は、約２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを生成した。この増幅したフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応混合物から精製した。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ  ＣＢ１株フラグメントを、誘導性発現ベクターｐＣＲ（商標登録）Ｔ７ＣＴ−ＴＯＰＯ（商標登録）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。異なる３つのクローニングしたＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子を、ＰＣＲエラーを除外するために独立に配列決定した。その結果生じたコンセンサス配列は、本発明の報告されるＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ核酸ポリメラーゼ配列である。
【０１６３】
（野生型Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ遺伝子の改変）
ダイターミネーターＤＮＡ配列決定に適切な形態のＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼを生成するために、２つのアミノ酸置換を行った。それらは、ＦＳ変異（米国特許第５，６１４，３６５号；ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５  ＰＮＡＳ  ９２：６３３９−６３４３）およびエキソマイナス変異（米国特許第５，４６６，５９１号；Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’−３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７年５月２日；２６８（２）：２８４−３０２）である。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ  Ｇ４３Ｄ改変体ポリペプチドは、エキソヌクレアーゼ活性が非常に低いレベルに低下しており、そしてＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ  Ｆ６６５Ｙ改変体ポリペプチドは、ｄｄＮＴＰとｄＮＴＰとの識別能が低下している。変異誘発を、ＳａｗａｎｏおよびＭｉｙａｗａｋｉ（２０００）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２８巻に記載される、改変したＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＰＣＲ変異誘発プロトコルを使用して実施した。この変異した遺伝子を再度完全に配列決定して、変異の導入を徹底的に確認し、かつＰＣＲエラーが導入されていないことを確実にし。
【０１６４】
（実施例２：タンパク質の発現および精製）
細胞を１．２ＯＤの光学密度まで１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｍａｎｉａｔｉｓ）中で培養し、１．０ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて４時間誘導して、タンパク質を過剰生成させた。その細胞を遠心分離により収集し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗浄して、増殖培地を除去し、そしてその細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
【０１６５】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼを単離するために、その細胞を解凍し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡの２．５容積（湿重量）中に再懸濁した。その細胞壁を超音波処理によって破壊し、生じたＥ．ｃｏｌｉ細胞破片を遠心分離によって除去した。その結果生じた溶解産物を水浴中で（７５℃で４５分間）低温殺菌し、非耐熱性Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の大部分を変性および沈殿させ、そして耐熱性Ｔｏｓｈ  Ｐｏｌ  Ｉを溶液中に残した。０．３％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いた共沈によって、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを除去した。次いで、清浄な溶解産物を一連の２つのカラムに適用した：（１）過剰ＰＥＩをキレートするＢｉｏｒｅｘ７０陽イオン交換樹脂および（２）このポリメラーゼを保持するヘパリンアガロースカラム（提供される寸法）。このカラムを、カラムの５倍の容積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、５％グリセロール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＫＴＡ）で洗浄する。次いで、このタンパク質を、０．１〜１．０Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配を用いて溶出させた。このポリメラーゼは、０．８Ｍ  ＮａＣｌに溶出した。溶出したＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼを濃縮し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮フィルター（３０ｋＤ  Ｍ．Ｗ．カットオフ）を使用して緩衝液を交換した。濃縮したタンパク質をＫＴＡ（塩なし）＋５０％グリセロール中で−２０℃に保存した。
【０１６６】
ポリメラーゼの活性を、標準サケ精子ＤＮＡ放射測定活性アッセイを使用して測定し、そして配列決定をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ３を使用して試験した。酵素は、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＵＴＰおよび０．３ｍＭ  ｄＩＴＰからなるｄＮＴＰ混合物において、ｐＨ８．０〜１０．０の４０〜８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．０〜２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ中で活性であり、最適活性は、ｐＨ９．０と９．５８との間にある。この酵素はまた、０〜１００ｍＭのＫＣｌ濃度においても活性であり、このことは、Ｔ．ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼが、Ｔｔｈほど塩耐性ではないが、ＴｆｉｌまたはＴａｑのいずれよりも塩耐性が高いことを示す。
【０１６７】
上の明細書において述べられたすべての刊行物および特許は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されているが、本願発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、当業者に明らかな本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ  株ＣＢ１（Ｔｏｓｈ）由来のＤＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸アラインメントを提供する。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ核酸ポリメラーゼ酵素の推定アミノ酸配列が、他のすべてのＤＮＡポリメラーゼＩ配列と異なる、６０アミノ酸位置が、存在する。これらの位置は、太字で示される。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ核酸ポリメラーゼ酵素はまた、Ｎ末端が３アミノ酸少ないという点で、他と異なる開始位置を有する（これも太字で示される）。
【図１】
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【国際調査報告】
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