(57)【要約】免疫コンジュゲートを調製するための改良方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体にメイタンシノイドをコンジュゲートさせるための方法であって、以下の工程：
ａ．  約ｐＨ５．０ないし約ｐH８．０にて、抗体とジスルフィド含有リンカーを反応させ、修飾抗体を形成する工程；
ｂ．  クロスフロー濾過によって、修飾抗体から未反応のリンカーを除去する工程；
ｃ．  ジメチルアセトアミドを含む溶媒中、約ｐＨ６．０ないし約ｐH６．５にて、メイタンシノイドと修飾抗体をコンジュゲートさせる工程；および
ｄ．  イオン交換クロマトグラフィーによって、修飾抗体−メイタンシノイドのコンジュゲートを精製する工程
を含む方法。
【請求項２】
抗体にメイタンシノイドをコンジュゲートさせるための方法であって、以下の工程：
ａ．  約ｐＨ５．０ないし約ｐH８．０にて、抗体とジスルフィド含有リンカーを反応させ、修飾抗体を得る工程；
ｂ．  クロスフローによって、修飾抗体から未反応のリンカーを除去する工程；
ｃ．  アセトニトリルを含む溶媒中、約ｐＨ６．０ないし約ｐH６．５にて、メイタンシノイドと修飾抗体をコンジュゲートさせる工程；および
ｄ．  イオン交換クロマトグラフィーによって、修飾抗体−メイタンシノイドのコンジュゲートを精製する工程
を含む方法。
【請求項３】
メイタンシノイドがＤＭ１である、請求項１もしくは２の方法。
【請求項４】
リンカーがＳＰＰである、請求項１もしくは２の方法。
【請求項５】
メイタンシノイドがＤＭ１であり、リンカーがＳＰＰである、請求項１もしくは２の方法。
【請求項６】
以下の工程：
ｅ．  修飾抗体−メイタンシノイドのコンジュゲートを処方する工程
をさらに含む、請求項１もしくは２の方法。
【請求項７】
イオン交換クロマトグラフィーをセラミックヒドロキシアパタイトカラムで実施する、請求項１もしくは２の方法。
【請求項８】
イオン交換クロマトグラフィーをＳＰ−セファロースで実施する、請求項１もしくは２の方法。
【請求項９】
請求項１もしくは２の方法によって調製される、抗体−メイタンシノイドのコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫コンジュゲート、特にモノクローナル抗体にコンジュゲートしたメイタンシノイドの製法に関する。
【０００２】
モノクローナル抗体のごとき細胞結合剤にコンジュゲートした高細胞毒性メイタンシノイドを有する腫瘍活性化プロドラッグについては、米国特許第5,208,020号に記載されている。該抗体は、腫瘍特異的抗原に対するものであり、直接腫瘍部位にメイタンシノイドをデリバーする。コンジュゲート形態では、メイタンシノイドは不活性であり、患者に全身性毒性を引き起こすことなく投与することができる。腫瘍細胞の表面に結合した後、そのコンジュゲートは内部移行し、メイタンシノイドは抗体から離れて、腫瘍細胞に細胞毒性効果を及ぼすことができる。
【０００３】
メイタンシノイドは、抗有糸分裂薬剤であり、従来の癌の化学療法薬剤、例えば、メトトレキセート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンよりも１００ないし１０００倍の細胞毒性を有する。非コンジュゲート形態で投与された場合、メイタンシノイドは中枢神経系および消化管に副作用を引き起こしうる。コンジュゲート形態では、メイタンシノイドが腫瘍標的部位において非修飾形態で離されうる場合にのみ、メイタンシノイドの可能性のある全細胞毒性ポテンシャルが観察されうることが認められている。
【０００４】
開裂可能でありながら高安定の、メイタンシノイドをモノクローナル抗体にコンジュゲートするためのリンカーを有するメイタンシノイド誘導体、例えば、メイタンシノールおよびＮ−メチル−Ｌ−アラニンメイタンシノイド誘導体であるＤＭ１の調製は、米国特許第5,208,020号に開示されている。ジスルフィドまたは他のあらゆる含硫黄結合、例えば、チオエーテルもしくはチオエステル結合を介して細胞結合剤に結合することのできるジスルフィド−およびチオール含有メイタンシノイドの合成は、米国特許第5,416,064号に開示されている。
【０００５】
一般的に、抗体−細胞毒コンジュゲートは、多段階の処理によって調製される。まず、修飾化反応において抗体をリンカーに共有結合し、脱塩によって未反応の成分および反応生成物を抗体−リンカーコンジュゲートから分離させる。次に、精製された抗体−リンカーコンジュゲートを、修飾された細胞毒と反応させ、抗体−細胞毒コンジュゲートを形成させる。サイズ排除クロマトグラフィーによって、コンジュゲートを未反応の成分、溶媒および反応生成物から精製する。例えば、Chari et al. in Cancer Research 52, 127-131 (1992) and Liu et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93, 8618-8623 (1996)参照。
【０００６】
これらの処理の修飾およびコンジュゲート反応を小規模で用いることはできるが、精製技術は、特にそれらの低い効率、収量および生産性のために、大規模の生産作業を制限する。従って、拡張可能であり、効率、収量および生産性において改善をもたらし、製剤製造原価を低下させる生産利用可能な代替方法への要求が存在する。
【０００７】
（発明の要約）
本発明の一態様は、以下の工程：
ａ．  約ｐＨ５．０ないし約ｐH８．０にて、抗体とジスルフィド含有リンカーを反応させ、修飾抗体を形成する工程；
ｂ．  クロスフローによって、修飾抗体から未反応のリンカーを除去する工程；
ｃ．  ジメチルアセトアミドおよび／またはアセトニトリルを含む溶媒中、約ｐＨ６．０ないし約ｐH６．５にて、メイタンシノイドと修飾抗体をコンジュゲートさせる工程；および
ｄ．  イオン交換クロマトグラフィーによって、もしくはＳＰ−セファロースを用いて、修飾抗体−メイタンシノイドのコンジュゲートを精製する工程
を含む、抗体にメイタンシノイドをコンジュゲートさせる方法である。
【０００８】
（図面の簡単な記載）
（図１）図１は、実施例２において３０分間隔で実施された各実験についてのＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）：モノクローナル抗体（Ｍａｂ）比を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
限定されるものではないが、本明細書において引用された特許および特許出願を含む、全ての出版物は、十分に記載されたものとして、出典を明示することにより本明細書の一部とする。
【００１０】
本明細書および請求の範囲において使用される「抗体」という語は、すべてのイムノグロブリン型、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥの抗体、またはそれらの断片を含み、あらゆる起源の抗体および抗体断片、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体およびトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック動物細胞培養にて生産されたヒト抗体を含む。
【００１１】
本明細書および請求の範囲において使用される「抗体断片」という語は、無傷な抗体の抗原結合部位もしくは可変領域を含む、無傷な完全な抗体の部分を定義する。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖ断片、二重特異性抗体（diabodies）、１本鎖Ｆｖ分子、ならびに軽鎖もしくは重鎖の可変ドメインまたは軽鎖もしくは重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含む１本鎖分子を含む。
【００１２】
抗体とジスルフィド含有リンカーを反応させ、修飾抗体を得る工程；クロスフロー（ＴＦＦ）によって、修飾抗体から未反応のリンカーを除去する工程；メイタンシノイドと修飾抗体をコンジュゲートさせる工程；および抗体−メイタンシノイドのコンジュゲートを精製する工程を含む、抗体−メイタンシノイドのコンジュゲートを調製するための方法が提供される。好ましくは、メイタンシノイドは、式Ｉ： 
【化１】
2005532258.tif 000002
で示されるＤＭ１である。その後、本発明の方法によって調製される抗体−メイタンシノイドのコンジュゲートを処方し、バルク製剤を提供することができる。
【００１３】
修飾抗体は、約ｐＨ５．０ないし約ｐＨ８．０のバッファー中、約２５ｇ／Ｌの濃度にて、所望のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を供給することによって得られる。好ましいバッファーの種類は、クエン酸、コハク酸、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−Ｎ−Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン）酸（ＰＩＰＥＳ）、イミダゾール、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）およびリン酸である。次いで、抗体はジスルフィド含有リンカーと反応し、リンカー修飾抗体が得られる。好ましくは、反応物は、少なくとも１２０分間、外界温度にて、連続的に混合されながらインキュベートされる。好ましいリンカーの種類は、式II： 
【化２】
2005532258.tif 000003
で示されるＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）である。
【００１４】
クロスフロー（ＴＦＦ）工程は、リンカー修飾抗体から未反応のリンカーおよびエタノールを除去するために使用される。次のダイアフィルトレーション（diafiltration）は、リンカー修飾抗体をコンジュゲーション反応バッファーへ濾過し、濃度を調節するために使用される。好ましくは、限外濾過膜は、Millipore Biomax 50（登録商標）ポリエーテルスルホンカートリッジである。コンジュゲーション反応バッファーは、約ｐＨ６．０ないし約ｐＨ６．５であり、キレート剤、好ましくはＥＤＴＡを含む。好ましいダイアフィルトレーションのパラメーターは、約２．５ｍ２の全膜面積、約１６ｐｓｉないし約３５ｐｓｉの操作膜間圧力差（ＴＭＰ）、および約２℃ないし約２５℃の実施温度である。
【００１５】
ＴＦＦおよびダイアフィルトレーション工程は、処理あらゆる時点で生成物の量を制御しながら、未反応のリンカーおよびエタノールの量を効率よく減少させる。この結果は、サイズ排除クロマトグラフィー液体クロマトグラフィー工程と比較して、より拡張可能な、制御された、生産性のある方法である。
【００１６】
ＤＭ１のごときメイタンシノイドは、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中で調製され、好ましくは１０ｍＭ  ＤＭ１であり、コンジュゲーション反応のためにリンカー修飾抗体と混合される。好ましくは、該薬剤を、約２０時間、室温にて、連続的に撹拌されながら反応させる。さらに、メイタンシノイドは、アセトニトリル含有溶媒中で調製されてもよい。
【００１７】
抗体−ＤＭ１のコンジュゲートは、イオン交換カラム上の液体クロマトグラフィーによって、未反応のＤＭ１、ＤＭＡおよび凝集物から精製される。好ましくは、カラムはセラミックヒドロキシアパタイトである。好ましくは、カラムを、ｐＨ６．５のバッファーであらかじめ平行にし、平衡化し、10-15 g/Lのローディング比でローディングし、平衡化バッファーで洗浄し、ＮａＣｌを含むｐＨ６．５のバッファーで溶出する。好ましい実施形態において、あらかじめ平衡化するバッファーは400 mMリン酸ナトリウム（pH 6.5）であり、平衡化バッファーは、 30 mM リン酸ナトリウム、70 mM NaCl（pH 6.5）であり、洗浄バッファーは、30 mM リン酸ナトリウム、70 mM NaCl（pH 6.5）であり、溶出バッファーは、30 mM リン酸ナトリウム、300 mM NaCl（pH 6.5）であり、カラムの流速は300 cm/hrである。
【００１８】
セラミックヒドロキシアパタイトカラム（Bio-Rad Laboratories製のMacro-Prep Ceramic Hyroxyapatite, Type I）は、コンジュゲートされた抗体生成物から、生成物の凝集体、ＤＭＡおよび未反応のＤＭ１を効率よく減少させる。同じ目的を達成するために、イオン交換液体クロマトグラフィー手段を使用することも可能である。イオン交換クロマトグラフィー手段は、陽イオン交換体（例えば、SP-Sepharose Fast FlowおよびCM-Sepharose Fast Flow、いずれもAmersham Pharmacia Biotech社）、または陰イオン交換体（例えば、Amersham Pharmacia Biotech製のQ-Sepharose Fast Flow, Bio-Rad LaboratoriesのMacro-Prep DEAE Support）である。
【００１９】
この工程によって、処理中のあらゆる時点で生成物の濃度を制御しながら、処方バッファーへ効率よくバッファー交換することができる。この結果は、サイズ排除クロマトグラフィー液体クロマトグラフィー工程と比較して、より拡張可能な、制御された、生産性の高い処理である。
【００２０】
さらに、本発明を、以下の具体的な、限定されない実施例を用いて説明する。実施例中で示される全ての比において、本文中に示される数字は、比における第１の数字であり、第２の数字は１であることから本文中で示されていない。例えば、３：１の比は、３として示される。
【実施例】
【００２１】
実施例１：抗ヒトCanAgモノクローナル抗体とＤＭ１のコンジュゲーション
式IIのジスルフィド含有リンカーを、以下の方法によって、Ｃ２４２のＣＤＲ（米国特許第5,552,293号を参照）を含む抗ヒトCanAgモノクローナル抗体に結合した。26.6 g/L 抗体溶液をpH 6.0バッファーに加え、 モノクローナル抗体溶液を0.5 M NaOHでpH 6.5に調節した。10 mM リンカーストックをエタノール中で作製し、実際のリンカー濃度は測定したところ9.7 mMであった。薬剤を以下の順：75.2 mL モノクローナル抗体、174.8 mL pH 6.5 バッファー、4.3 mL エタノール、および8.8 mL リンカー溶液にて、反応漕中で連続混合して混ぜた。リンカー溶液を加える前に、溶液を５分間混合した。最終反応物は、7.6 mg/mL モノクローナル抗体、5% エタノールおよび0.33 mM リンカーを含んでいた。反応物を、150分間、25℃（室温）にて、反応物のインキュベーションの間中連続混合しながらインキュベートした。
【００２２】
クロスフロー限外濾過およびダイアフィルトレーション工程を用いて、生成物溶液中の未反応のリンカーおよびエタノールを減少させた後、コンジュゲーション反応バッファーへ修飾抗体をダイアフィルターに付して、生成物の濃度を調整した。限外濾過メンブレンは、Millipore Biomax 50（登録商標）ポリエーテルスルホンカートリッジであった。コンジュゲーション反応バッファーは、EDTAを含むpH 6.5バッファーであった。生成物溶液を注入する前に、クロスフロー限外濾過システムを、注射用蒸留水(WFI)ですすぎ、コンジュゲーション反応バッファーで平衡化した。生成物を、５倍のダイアボリュームのpH 6.5反応バッファーでダイアフィルターに付した。生成物を過濃縮し、濾過装置をリンスし、リンス物を最終生成物に加えることにより収量を最大とさせた。最終生成物濃度を測定したところ、7.4 mg/mLであった。この操作のパラメーターは、総膜表面積 0.1 m2、操作TMP 10 psi、操作温度 25℃であった。
【００２３】
次いで、DM1薬剤をリンカー修飾モノクローナル抗体に結合させた。10 mM DM1ストックをジメチルアセトアミド(DMA)中で作製した。DM1濃度は、分光光度アッセイによって測定したところ、0.011 Mであった。薬剤を以下の順：210 mL モノクローナル抗体、435 mL pH 6.5 バッファー、11.6 mL DMA、および8.4 mL DM1溶液にて、反応漕中で連続混合して混ぜた。DM1溶液を加える前に、溶液を５分間混合した。最終反応物は、2.35 mg/mL モノクローナル抗体、3% DMAおよび0.14 mM DM1を含んでいた。反応は、２３時間、２２℃（室温）にて、反応物のインキュベーションの間中連続混合しながら行った。
【００２４】
セラミックヒドロキシアパタイト液体クロマトグラフィーカラムを用いて、未反応のＤＭ１、ＤＭＡおよび凝集物から抗体−ＤＭ１コンジュゲートを精製した。コンジュゲーション反応混合物全体を、１回のカラム注入で処理した。コンジュゲーション反応混合物を、ローディングの前に、0.22ミクロンフィルターを用いて濾過した。106 mLのカラムを636 mL pH 6.5バッファーで平衡化し、ローディング量 14.8 g/Lでローディングし、318 mL pH 6.5 バッファーで洗浄した。生成物を溶出した後、カラムを0.5 M NaOHで洗った後、0.01 M NaOH中で保存した。カラムの流速は300 cm/hrであった。抗体−ＤＭ１コンジュゲートを、ＵＶ吸光度によって測定される単一のピークとしてカラムから集めた。さらなる処理のために集められた全溶出物の容積は379 mL であり、コンジュゲート濃度は3.6 g/Lであった。ＤＭ１：抗体比を分光光度アッセイによって測定したところ、3.2であった。
【００２５】
クロスフロー限外濾過およびダイアフィルトレーション工程を用いて、抗体−ＤＭ１コンジュゲートをバルク処方バッファーにダイアフィルターに付して、生成物の濃度を調整した。限外濾過メンブレンは、Millipore Biomax 50（登録商標）ポリエーテルスルホンカートリッジであった。最終処方バッファーは、ｐＨ６．０であった。生成物溶液を注入する前に、そのクロスフロー限外濾過システムを、ＷＦＩですすぎ、処方バッファーで平衡化した。生成物を目標の10 mg/mLに濃縮し、８倍のダイアボリュームとバッファー交換した。ダイアフィルトレーションが完了することにより生成物は過濃縮され、濾過装置をすすぎ、すすぎ液を最終生成物に加えることにより収量を最大とした。この操作のパラメーターは、総膜表面積 0.1m２、操作膜間圧力差（ＴＭＰ）10psi、および操作温度 22℃であった。
【００２６】
本発明は、その精神もしくは本質的な特性から逸脱することなく他の特定の形態にて実施されてもよく、よって、本発明の範囲を示すものとして、前記の明細書よりも、添付の請求の範囲を参照とすべきである。
【００２７】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を例示するものであって、限定するものではない。
【００２８】
実施例２：SPPリンカーへの抗体の結合：様々なSPP：Mab比を導く条件
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）へのリンカーの結合比の制御に必要な条件を検討するために、統計学的組み合わせにてｐH、Ｍａｂ濃度およびリンカー濃度を変化させた要因実験を計画した。
【００２９】
多変数完全要因実験において、反応混合物を、表１に示されるＭａｂ濃度、ＳＰＰモル過剰、およびｐＨについて様々な統計学的組み合わせを調べるために調製した。
【表１】
2005532258.tif 000004
表２に従って、１０反応混合物（実験）をそれぞれ調製した。
【表２】
2005532258.tif 000005
【００３０】
リンカーについては、20 mMリンカーストックをエタノール中で調製して（実際の濃度は分光光度アッセイによって17.9 mMと測定された）、全ての反応に使用した。リンカー反応は、50 mM 酢酸ナトリウム pH 5.0; 50 mM; コハク酸 pH 6.5; and 50 mM トリス塩基 pH 8.0中で行われた。各反応物は、前記の量のMabおよび5% v/v エタノールを含んでいた。各反応は、３０分間隔でサンプルを採取しながら、１８０分間継続された。遠心メンブレンフィルターを用いて、サンプルを50 mM コハク酸, 2 mM EDTA, pH 6.5にバッファー交換して、未反応のリンカーを除去した。次いで、分光光度アッセイによって、サンプルをリンカーおよび抗体濃度について分析した。最終SPP:Mab比は１から１１と様々であった。図１は、各反応物の時間依存性および生じたSPP:Mab比を示す。
【００３１】
これらの結果は、リンカーのモル過剰、ｐH、時間の変化によって反応が進行することから、適当な組み合わせ中のMab濃度、SPP:Mab比は所望のレベルに操作されうることを示す。
【００３２】
この処理を、１反応につき２００ｍｇのモノクローナル抗体を用いてより大きな規模で再現し、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてバッファー交換した。生じたSPP:Mab比は、再び１から１１にわたった。
【００３３】
SPP:Mab比で見られた変化は、必要または要求に応じて比を変化させることができることを示す。SPP:Mab比はＤＭ１コンジュゲーション量に直接影響する。
【００３４】
さらに、３つのバッファー（酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびコハク酸）に透析された抗体を、３つの異なる濃度（20 mM、50 mM、および100 mM）および３つの異なるｐＨ(5.5、6.0、および6.5)にて用いて、別個のリンカー反応を行った。抗体に対するリンカーの最終的な比は、3.4から4.9に及んだ。ｐＨ６．５の実験で結合した抗体を、ＤＭ１コンジュゲーション工程に用いたところ、≧3.3の抗体に対するＤＭ１比が得られた。これらの結果は、リンカー反応におけるｐＨおよびバッファーの種類は、生じるSPP:Mab比にほとんど影響を与えないことを示す。
【００３５】
実施例３：反応混合物中の溶媒としてエタノールまたはアセトニトリルを用いた、リンカーに対する抗体の結合
濃度27 mg/mLの抗体ストックを、0.5 M NaOHを用いてｐＨ６．５に調整した。様々な量のエタノールを加え、最終エタノール量が3.5%から12.5% v/vまでの濃度となるようにした。10 mM SPPストックをエタノール中で調製し、分光光度アッセイによって実際の濃度を測定したところ、9.6 mMであった。反応バッファーは、50 mM コハク酸, pH 6.5であった。全ての場合において、最終タンパク質濃度は、7.6 mg/mLであった。１２０分後に、反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによってバッファー交換し、分光光度的に分析し、SPP:Mab比を確認した。SPP:Mab比は4.2から4.8にわたり、有意差は見られなかった。この例は、ＳＰＰ反応物中の最終エタノール濃度が3.5から12.5% v/vの間で変動できることを示す。
【００３６】
濃度14.4 mg/mLの抗体ストック溶液を、0.5 M NaOHを用いてｐＨ６．５に調整した。様々な量のアセトニトリルを加え、最終アセトニトリル量が3.8%から15% v/vまでの濃度となるようにした。10 mM SPPストックをアセトニトリル中で調製し、分光光度アッセイによって実際の濃度を測定したところ、8.6 mMであった。反応バッファーは、50 mM コハク酸, pH 6.5であった。全ての場合において、最終タンパク質濃度は、7.6 mg/mLであった。１２０分後に、反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによってバッファー交換し、分光光度的に分析し、SPP:Mab比を確認した。SPP:Mab比は5.0から6.5にわたった。この例は、ｐＨ６．５において、エタノールの代わりにアセトニトリルを使用してもよく、エタノールと比較して同等かもしくはそれ以上レベルのＳＰＰ結合が達成されることを示す。
【００３７】
実施例４：リンカーに対する抗体の結合に関する、さらなる反応時間の調査
濃度27 mg/mLの抗体ストック溶液を、0.5 M NaOHを用いてｐＨ６．５に調整した。エタノールを最終濃度が5% v/vとなるように加えた。10 mM SPPストックをエタノール中で調製し、分光光度アッセイによって実際の濃度を測定したところ、9.6 mMであった。反応バッファーは、50 mM コハク酸, pH 6.5であった。全ての場合において、最終タンパク質濃度は、7.6 mg/mLであった。はじめの３０分間は１０分おきに、その後１８０分までは３０分おきにサンプルを採取することによって、リンカー結合反応速度論を調査した。次いで、採取したサンプルをサイズ排除クロマトグラフィー(Sephadex G-25)によってバッファー交換し、分光光度的に分析し、SPP:Mab比を確認した。SPP:Mab比は1.0から5.9にわたった。この例は、反応時間を利用して、Ｍａｂに対するＳＰＰの結合を変化させることができることを示す。Ｍａｂに対するＳＰＰの結合量は、ＤＭ１コンジュゲーションの最終量に直接影響することから、ＳＰＰ結合におけるこの変化によって、次の反応における様々なレベルのＤＭ１コンジュゲーションが可能になる。
【００３８】
実施例５：様々な抗体の開始濃度を用いた、リンカーに対する抗体の結合
濃度27 mg/mLの抗体ストックを、0.5 M NaOHを用いてｐＨ６．５に調整した。様々な量の抗体ストック溶液を別々の反応混合物に加え、終濃度3.8 mg/mLから25.1 mg/mLとなるようにした。10 mM SPPストックをエタノール中で調製し、分光光度アッセイによって実際の濃度を測定したところ、9.6 mMであった。反応バッファーは、50 mM コハク酸, pH 6.5であった。全ての場合において、最終タンパク質濃度は、7.6 mg/mLであった。１２０分後に、反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによってバッファー交換し、分光光度的に分析し、SPP:Mab比を確認した。SPP:Mab比は4.1から6.3にわたった。この例は、ｐＨ６．５でのＳＰＰ反応は、3.8〜25.1 mg/mLの範囲におけるタンパク質濃度によってほとんど影響を受けず、タンパク質濃度に関して操作柔軟性を許容するものであることが示される。
【００３９】
実施例６：アセトニトリル存在下でのＤＭ１と修飾抗体のコンジュゲーション
コンジュゲーション反応を、溶媒としてアセトニトリル（ＡＣＮ）がＤＭＡを置換した反応混合物中で行った。10 mM ＤＭ１ストックをエタノール中で調製し、分光光度アッセイによって濃度を測定した。反応に用いた修飾抗体のSPP:Mab比は５．１である。１．５のＤＭ１モル過剰（ＳＰＰ修飾Ｍａｂに対する相対値）を反応に使用した。反応バッファーは、50 mM コハク酸, 2 mM EDTA, pH 6.5であり；最終反応混合物は5% v/v ACNを含んでいた。反応は２２時間行われ、その時点で反応混合物はG-25を通して精製された。生じたDM1:Mab比を分光光度アッセイによって測定したところ、２．４であった。この例は、溶媒成分としてエタノールの代わりにＡＣＮを使用できることを示す。
【００４０】
ＡＣＮおよびＤＭＡをベースにしたコンジュゲーション反応を一対一で比較した、さらなる調査が行われた。各反応を５時間行い、ＳＰＰ修飾Ｍａｂに対して１．７モル過剰のＤＭ１を使用した。各反応物を、G-25カラムを通して精製した。DM1:Mab比は、ＡＣＮおよびＤＭＡについて、それぞれ１．２および１．５であった。これらの調査は、使用された溶媒が、生じるコンジュゲーションの効率にほとんどまたは全く影響を及ぼさないことを示す。
【００４１】
実施例７：SP-Sepharose FFを使用したＤＭ１−抗体コンジュゲートの精製
SP-Sepharose fast flow column (Amersham Pharmacia Biotech)を、30 mM リン酸バッファー, pH 6.5で平衡化した。未精製のコンジュゲーション反応混合物を、15 mg/mL樹脂のロード量にて、カラムにローディング。ローディング後、カラムを平衡化バッファーで洗浄し、70 mM 塩化ナトリウム（NaCl）を含む30 mM リン酸ナトリウムバッファー, pH 6.5で溶出した。非結合物、溶出物、溶出物の終わりの画分を集めた。ローディング物質を含む全ての画分をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC-HPLC）法を用いて分析し、凝集物含有率を測定した。未精製のロード物質は2.3%の凝集物含有率を有していた。溶出画分は生成物のピークを含み、凝集物含有率1.77%を有した。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
（原文に記載なし）
【図１】
2005532258.tif 000006
【国際調査報告】
2005532258.tif 000007
2005532258.tif 000008