(57)【要約】本発明は、融合タンパク質をコードする核酸を動物に投与することによる、融合タンパク質の生成方法に関する。核酸を動物に投与した後、タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで産生され、動物から生物学的サンプルを採取することにより単離される。これらの方法により、あらゆる目的の核酸配列によってコードされるタンパク質の迅速かつ効率的な生成および単離が可能になる。これらの方法に従って精製された融合タンパク質は、抗体などの、目的のタンパク質配列に結合する標的結合分子のスクリーニングに使用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的結合分子の単離方法であって、
融合タンパク質をコードする核酸を哺乳動物に投与し、該哺乳動物内で該融合タンパク質を発現させる工程であって、該融合タンパク質が第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を含み、該第２のアミノ酸配列が特異的結合対の第１のメンバーを含むことを特徴とする工程と、
該哺乳動物から、該融合タンパク質を含む生物学的サンプルを採取する工程と、
該特異的結合対の第２のメンバーを、該特異的結合対の第１のメンバーを介して該融合タンパク質に結合させる工程と、
該融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に結合する標的結合分子を含む溶液を提供する工程と、
該標的結合分子を、該融合タンパク質へのその結合により単離する工程と、
からなる方法。
【請求項２】
前記特異的結合対の第１のメンバーが免疫グロブリンのＦｃドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルが血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的サンプルが組織溶解物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記特異的結合対の第２のメンバーが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的結合分子がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的結合分子が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、前記融合タンパク質をコードする核酸構築物で動物を免疫することにより該動物内で調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物から前記生物学的サンプルを採取する前に前記哺乳動物にプロテアーゼ阻害剤を投与する工程からさらになる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的結合分子が抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、前記融合タンパク質をコードする核酸構築物で動物を免疫することにより該動物内で調製される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的結合分子が核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的結合分子が核酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的結合分子が小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的結合分子が小分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記融合タンパク質を固定する工程からさらになる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記融合タンパク質を固定する工程からさらになる、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記特異的結合対の第１のメンバーが、少なくとも５アミノ酸長のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
精製融合タンパク質の調製方法であって、
融合タンパク質をコードする核酸を哺乳動物に投与し、該哺乳動物内で該融合タンパク質を発現させる工程であって、該融合タンパク質が第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を含み、該第２のアミノ酸配列が特異的結合対の第１のメンバーを含むことを特徴とする工程と、
該哺乳動物から、該融合タンパク質を含む生物学的サンプルを採取する工程と、
該特異的結合対の第２のメンバーを、該特異的結合対の第１のメンバーを介して該融合タンパク質に結合させる工程と、
該特異的結合対の第２のメンバーに結合していない該生物学的サンプルの成分を除去して、精製融合タンパク質を得る工程と、
からなる方法。
【請求項２１】
前記第１のアミノ酸配列を前記第２のアミノ酸配列から切り離す工程からさらになる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記特異的結合対の第１のメンバーが免疫グロブリンのＦｃドメインである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的サンプルが血清である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物学的サンプルが組織溶解物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記特異的結合対の第２のメンバーが抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記特異的結合対の第２のメンバーが抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記融合タンパク質を固定する工程からさらになる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質を固定する工程からさらになる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質を固定する工程からさらになる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記特異的結合対の第１のメンバーが、少なくとも５アミノ酸長のペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の生産および結合分子の同定のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００１年９月１０日付けで出願された米国仮特許出願第６０／３１８，４７４号に基づく優先権を主張するものであり、前記仮特許出願の内容は本願明細書に援用される。
【０００３】
抗体および他のタンパク質特異的結合リガンドは、様々な疾患の基礎研究ならびに診断および治療のいずれにおいても有用なツールである。タンパク質特異的結合リガンドにより、生物学的サンプル中の特定の種類のタンパク質を正確に同定および定量することが可能になる。さらに、タンパク質とその結合リガンドとの相互作用により、タンパク質の活性または機能を調節することが可能である。タンパク質の活性または機能を調節することは、あるタンパク質の過剰な活性または不十分な活性を特徴とする疾患症状の治療において特に有効である。
【０００４】
抗体および他の結合リガンドの同定では、一般に、精製された形態のタンパク質を用いるスクリーニング方法が必要である。精製タンパク質は、多種多様なハイスループットスクリーニング法において使用可能である。これらのスクリーニング系としては、次のものが挙げられる：ファージディスプレイライブラリー、１本鎖抗体ライブラリー、核酸ベースの結合リガンド（オリゴリボヌクレオチドなど）、およびフィブロネクチンベースの結合リガンド。これらの系の多くの効率において速度を制限する要因は、スクリーニングしようとするタンパク質分子の入手し易さである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、タンパク質の生産および結合分子の同定のための方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、融合タンパク質をコードする核酸を動物に投与することにより、該融合タンパク質を生産する方法に関する。これらの方法によれば、目的のあらゆる核酸配列を、ハイブリッド核酸構築物に挿入し動物に投与することが可能である。その核酸を動物に投与した後、融合タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで生産され、その動物から生物学的サンプルを採取した後で単離される。これらの方法により、あらゆる対象の核酸配列によってコードされる融合タンパク質を迅速かつ効率的に生産および単離することが可能になる。
【０００７】
これらの方法に従って精製された融合タンパク質は、抗体などの、目的のタンパク質配列に結合する標的結合分子のスクリーニングに使用可能である。一般に、本方法は、最初に融合タンパク質を固体表面に固定することを含む。次に、この捕捉された融合タンパク質を用いて標的結合分子をスクリーニングする。したがって、本発明によれば、タンパク質配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成する必要なしに、任意のタンパク質配列に対する抗体または他のリガンドのハイスループットスクリーニングが可能になる。さらに、アミノ酸配列に対する抗体は、特定のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸を動物に投与してその特定のアミノ酸配列に対する免疫応答を惹起することによって、容易に生産可能である。
【０００８】
１態様において、本発明は、次の工程を実施することによって標的結合分子を単離する方法を包含する：（１）融合タンパク質をコードする核酸を哺乳動物に投与し、該哺乳動物内で該融合タンパク質を発現させる工程であって、該融合タンパク質が第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を含み、該第２のアミノ酸配列が特異的結合対の第１のメンバーを含むことを特徴とする工程；（２）該哺乳動物から、該融合タンパク質を含む生物学的サンプルを採取する工程；（３）該特異的結合対の第２のメンバーを、該特異的結合対の第１のメンバーを介して該融合タンパク質に結合させる工程；（４）該融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に結合する標的結合分子を含む溶液を提供する工程；ならびに（５）該標的結合分子を、該融合タンパク質へのその結合により単離する工程。
【０００９】
１実施形態において、特異的結合対の第１のメンバーは、少なくとも５アミノ酸長のペプチドである。例えば、特異的結合対の第１のメンバーは、免疫グロブリンのＦｃドメインとし得る。
【００１０】
この方法において用いられる生物学的サンプルとしては、例えば、血清または組織溶解物（ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｓａｔｅ）が含まれ得る。
１実施形態において、特異的結合対の第２のメンバーは抗体であり、例えばモノクローナル抗体が挙げられる。
【００１１】
標的結合分子は、例えば、タンパク質、核酸、または小分子とし得る。１実施形態において、標的結合分子は抗体である。抗体は、様々な方法でｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで調製可能である。例えば、融合タンパク質をコードする核酸構築物で哺乳動物を免疫することによりその哺乳動物内で抗体を調製することが可能である。
【００１２】
この方法は、哺乳動物から生物学的サンプルを採取する前に、その哺乳動物にプロテアーゼ阻害剤を投与する、という追加の工程も含み得る。
また、この方法は、融合タンパク質を固定する、という追加の工程を含み得る。
【００１３】
別の態様において、本発明は、以下の工程を実施することによる、精製融合タンパク質の調製方法を特徴とする：（１）融合タンパク質をコードする核酸を哺乳動物に投与し、該哺乳動物内で該融合タンパク質を発現させる工程であって、該融合タンパク質が第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を含み、該第２のアミノ酸配列が特異的結合対の第１のメンバーを含むことを特徴とする工程；（２）該哺乳動物から、該融合タンパク質を含む生物学的サンプルを採取する工程；（３）該特異的結合対の第２のメンバーを、該特異的結合対の第１のメンバーを介して該融合タンパク質に結合させる工程；ならびに（４）該特異的結合対の第２のメンバーに結合していない該生物学的サンプルの成分を除去して、精製融合タンパク質を提供する工程。
【００１４】
この方法は、第１のアミノ酸配列を第２のアミノ酸配列から切り離す、という追加の工程を含み得る。
１実施形態において、特異的結合対の第１のメンバーは、少なくとも５アミノ酸長のペプチドである。例えば、特異的結合対の第１のメンバーは、免疫グロブリンのＦｃドメインとし得る。
【００１５】
この方法において用いられる生物学的サンプルとしては、例えば、血清または組織溶解物が含まれ得る。
１実施形態において、特異的結合対の第２のメンバーは抗体であり、例えばモノクローナル抗体が挙げられる。
【００１６】
この方法は、融合タンパク質を固定するという追加の工程を含み得る。
本発明の有利な点は、大量のタンパク質またはその部分を、その生来の立体構造を有する状態で迅速かつ効率的に生産する方法を提供することである。次いで、精製されたタンパク質を標的結合分子のスクリーニングなどの方法において使用可能である。これらの生産方法では、タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生産および精製に付随する、時間や費用がかかる煩雑な作業を行わなくても済む。
【００１７】
本発明のもう１つの有利な点は、細菌内での組換えタンパク質生産に付随する難点の幾つかが回避されることである。細菌内で発現された哺乳動物のタンパク質は翻訳後修飾を受けず、本来の立体構造を持たない場合も多い。さらに、核酸構築物の中には細菌内では殆ど使用されないコドンを含むものがあるため、ある種の細菌内では翻訳さえ不可能なタンパク質もある。
【００１８】
目的のタンパク質と相互作用する分子を探索するために、多数のスクリーニング系が開発されている。これらの系の多くにおいて速度を制限する要因は、スクリーニングしようとするタンパク質分子の入手し易さである。多くの場合、スクリーニング機構が使われないままである一方で、目的のタンパク質は旧来の方法によって生産されている。したがって、本発明は、目的のタンパク質を迅速かつ効率的に得ることによって、これらのスクリーニング系を補うことが可能である。
【００１９】
別途定義されていない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を持つものとする。本発明の実施または試験では、本明細書で記載されているものと同様または等価な方法および物質が使用可能であるが、好適な方法および物質については後で説明する。本明細書中で言及する全ての刊行物、特許出願、特許および他の引用文献は、その全体を本明細書に援用する。用語に矛盾が生じた場合は、本明細書が優先する。さらに、記載されている物質および方法は単に説明のために過ぎず、限定しようとするものではない。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための最良の形態および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、目的のタンパク質をコードする核酸を動物に投与することにより該タンパク質を調製する方法に関する。このタンパク質は、動物内で生産され、次に、そのタンパク質に特異的に結合する（例えば、親和性タグを含むように人為操作された該タンパク質の部分に結合する）親和性試薬の使用により固定される。固定した後、該タンパク質に結合する分子、例えば抗体または任意の他の結合分子を同定するためにスクリーニングを実施することが可能である。さらに、体液、培養培地または任意の緩衝液中の抗体またはリガンドの結合力価を定量することが可能である。
【００２２】
（核酸構築物）
本発明は、融合タンパク質をコードする種々の核酸構築物の使用を包含する。本明細書に記載の核酸によりコードされる融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列と呼ばれる、少なくとも２つの異種アミノ酸配列を含む。これらの２つのアミノ酸配列は異種であるので、その融合タンパク質の配列は天然に存在するタンパク質の配列とは異なる。
【００２３】
第１のアミノ酸配列はそれ自体、基本的に何であってもよい。第１のアミノ酸配列は、同配列に結合する抗体などの標的結合分子を同定するためのスクリーニング法を含むがそれに限定されない様々な適用がこの配列について実施可能であるので、通常はこのアミノ
酸配列が本発明の方法の対象である。１例において、第１のアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質の全体または部分と同一である。好ましくは、第１のアミノ酸配列の長さは、少なくとも６、１０、２５、５０、１００または２００アミノ酸である。別の例では、第１のアミノ酸配列は、抗体などの標的結合分子により認識され得るエピトープを含む。
【００２４】
融合タンパク質の第２のアミノ酸配列は、該融合タンパク質の固定および／または精製を可能にする配列を含む。したがって、第２のアミノ酸配列は、特異的結合対の第２のメンバーに結合可能な該特異的結合対の第１のメンバーを含む。特異的結合対の１例において、この対の第１のメンバーは、その対の第２のメンバー（例えばモノクローナル抗体などの抗体）が結合する一続きのアミノ酸である。そのような結合対の１実施形態は、免疫グロブリンＦｃ定常領域（特異的結合対の第１のメンバー）と抗免疫グロブリンＦｃ定常領域抗体（特異的結合対の第２のメンバー）である。特異的結合対のもう１つの例において、結合対の第１のメンバーは、タンパク質以外の親和性物質が結合する一続きのアミノ酸である。そのような特異的結合対の１つの例は、ポリヒスチジンタグ（特異的結合対の第１のメンバー）とニッケル親和性試薬（特異的結合対の第２のメンバー）である。例えば、６〜１０個のヒスチジン残基からなるタグは、融合タンパク質に含めた場合、その融合タンパク質をニッケルアフィニティクロマトグラフィー（例えば、コペランドら（Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ｅｔ．ａｌ．），（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  第３７９巻、第１６２〜１６５頁を参照）により精製するのに使用可能である。
【００２５】
本明細書で記載される第１および第２のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を融合タンパク質に含めることが可能である。例えば、融合タンパク質の輸送を誘導するターゲティング配列を使用し得る（例えば、このターゲティング配列は融合タンパク質を特定の細胞内コンパートメントや原形質膜へと誘導可能であるか、または該タンパク質の分泌を誘導することが可能である）。１例において、融合タンパク質はシグナルペプチド配列を含む。シグナルペプチド配列とは、生成したばかりの分泌型および膜結合型ポリペプチドのアミノ末端に位置し、各種部位へのそれらの送達を誘導する短い（通常は約１５〜６０アミノ酸の）連続アミノ酸をいう。シグナル配列は、通常、約４〜１５アミノ酸からなる疎水性コア部を含み、このコア部のすぐ前には塩基性アミノ酸が存在することが多い。シグナルペプチドのカルボキシル末端には、シグナルペプチドの切断部位を規定する１個の介在アミノ酸を挟んだ１対の小さな非荷電アミノ酸が存在する（例えば、フォン・ヘイジュン（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ）  （１９９０）Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．第１９５〜２０１頁を参照のこと）。
【００２６】
融合タンパク質は、任意選択で、第１および第２のアミノ酸配列に加えて、その第１および／または第２のアミノ酸配列と実質的に同じ機能を果たす他のアミノ酸配列を含み得る。例えば、融合タンパク質は、特異的結合対のさらに別のメンバーおよび／または標的結合分子が結合可能なさらに別の配列を含み得る。したがって、１つの融合タンパク質は、第２のアミノ酸配列に加えて複数の異なるタンパク質由来の配列を含むことが可能であり、したがって、複数の異なる配列に対する抗体の作製および／またはこれら複数の異なる配列に対する標的結合分子のスクリーニングに使用可能である。
【００２７】
融合タンパク質は、任意選択で、その融合タンパク質の切断を可能にするアミノ酸配列を含み得る。例えば、タンパク質の切断部位を第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間に配置することが可能である。そのような切断部位は、融合タンパク質を精製した後で第１のアミノ酸配列を第２のアミノ酸配列から切り離すことを可能にする。例えば、融合タンパク質は、その分子内の他の場所には存在しない酵素切断用の特定の認識部位を含むアミノ酸の配列を含み得る。有用な部位の例は、血液凝固第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼにより認識され切断される配列である。したがって、切断酵素はその認識配列に
基づいて選択し得る。
【００２８】
融合タンパク質は、任意選択で１種以上のリンカー配列を含み得る。リンカー配列は、第１および／または第２のアミノ酸配列の間隔および／または配向を付与し、各配列の生物学的機能を促進するために使用し得る。一般にリンカー配列は、２つの配列が各々フォールディングして二次構造をとるのを確実にするのに十分な距離だけ、それらの配列を隔てる。機能性タンパク質ドメイン同士を適切に隔てるためには、約２０アミノ酸長のリンカー配列が使用可能であるが、それより長いかまたは短い（例えば３〜１００アミノ酸長の）リンカー配列も使用可能である。リンカーとして有用なアミノ酸配列としては、それだけに限定しないが、（ＳｅｒＧｌｙ４）ｙ（配列番号１）（配列中、ｙは少なくとも２である）またはＧｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ５Ｓｅｒ（配列番号２）が挙げられる。好ましいリンカー配列は、式（ＳｅｒＧｌｙ４）４（配列番号３）で表わされるものである。もう１つの好ましいリンカーは、配列（（Ｓｅｒ４Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）（配列番号４）で表わされるものである。あるいはまた、融合タンパク質はリンカー配列を含まなくてもよい。
【００２９】
核酸構築物は、従来の分子生物学技法を用いて調製可能である。核酸は、コード配列の発現を指令する制御エレメントと作動可能なように連結し得る。これらの制御エレメントとしては、それだけに限定しないが、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、および当業者に周知であって遺伝子発現を駆動もしくは制御する他のエレメントが挙げられる。そのような制御エレメントとしては、それだけに限定しないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、およびＳＶ４０の初期もしくは後期プロモーターが挙げられる。好ましい１実施形態では、核酸の発現はヒトＣＭＶ前初期プロモーターの制御下にある。
【００３０】
核酸構築物は、例えばプラスミドまたはウイルスベクターのような発現ベクターなどのベクターに組み込まれることが好ましい。核酸分子の効率的な翻訳に特定の開始シグナルが必要な場合もある。これらの翻訳制御シグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に合致する配列）が挙げられる。さらに、インサート全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは目的とするコード配列の読み枠と同じ読み枠でなければならない。翻訳制御シグナルおよび開始コドンは種々の起源のものとすることが可能であり、天然であっても合成であってもよい。適切な転写エンハンサーエレメント、転写終結因子またはイントロンを含めることにより、発現の効率を増大させることが可能である（ビトナーら（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ．ａｌ．），（１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  第１５３巻、５１６頁を参照）。
【００３１】
（融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ生産）
融合タンパク質は、本明細書に記載されている核酸を、例えばマウス、ラット、ヤギ、ウサギまたはヒトのような哺乳動物などの動物に投与することにより生産される。核酸を投与した後、翻訳（核酸がＤＮＡ配列である場合は、ならびに転写）はｉｎ  ｖｉｖｏで起こり、したがって融合タンパク質は動物内で生産される。核酸は、例えば静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、鼻腔内または皮下などの種々の経路で動物に投与し得る。
【００３２】
核酸は、「剥き出し（ｎａｋｅｄ）」でもよいし、送達用ビヒクルと複合させてもよい。有用な送達用ビヒクルの例としては、それだけに限定しないが、微粒子、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、または任意の他の適切な送達用ビヒクルが挙げられる。有用な遺伝子導入方法の説明については、例えば、テンプレトンら（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ｅｔ．ａｌ．），（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第１５巻、第６４７〜６５２頁および米国特許第６，２１４，８０４号を参照されたい。
【００３３】
動物内で核酸の高レベル発現を達成するための１つの特に有用な手段は、流体力学に基づくトランスフェクション法の使用によるものである（例えば、リウら（Ｌｉｕ  ｅｔ．ａｌ．），（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  第６巻、第１２５８〜１２６６頁；ザンら（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．），（１９９９）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  第１０巻、第１７３５〜１７３７頁；ザンら（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．），（２０００）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  第７巻、第１３４４〜１３４９頁；へーら（Ｈｅ
ｅｔ．ａｌ．），（２０００）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  第１１巻、第５４７〜５５４頁を参照）。これらの方法によれば、目的の核酸を含む大量の液体を動物に迅速に注入する。この方法は、８〜２４時間以内の遺伝子発現と数日または数週間にわたる長期の遺伝子発現とを可能にする。例えば、約５〜２５μｇのプラスミドＤＮＡを含有する溶液約１．５〜２．５ｍｌを約０．３ｍｌ／秒の速度でマウスの尾静脈に注射して、その核酸によりコードされる融合タンパク質を発現させることが可能である。核酸構築物がシグナルペプチド配列などの融合タンパク質の分泌を誘導する配列をコードする場合は、著しい量の融合タンパク質がその動物の血液中に分泌される。
【００３４】
本明細書中で記載されているように、動物内での融合タンパク質の生産には、１つのプロテアーゼ阻害剤または複数の異なるプロテアーゼ阻害剤を該動物に投与することを含め得る。例としては、セリン、システインまたはアスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤、ならびにアミノペプチダーゼの阻害剤が挙げられる。動物にプロテアーゼ阻害剤を投与することにより、その動物から単離される機能性融合タンパク質の収率を増大させることが可能になる。プロテアーゼ阻害剤は、核酸を動物に投与する前、投与している間、または投与した後で投与することが可能である。
【００３５】
融合タンパク質が動物内で生産された後、その融合タンパク質を含む生物学的サンプルをその動物から採取することが可能である。流体力学に基づくトランスフェクション法について上記で記載したように（例えば、プロテアーゼ阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏ投与と共に実施されるものとして記載されている）、核酸の投与後約８〜２４時間以内に、著しい量の融合タンパク質が生産される。採取しようとするサンプルの性質によっては、動物を殺処分しなければならない場合もある。例えば、融合タンパク質は、血液、またはそれだけに限定しないが肝臓、腎臓、脾臓、心臓および／もしくは肺などの固形臓器の中に見出され得る。固形臓器を摘出した後、任意選択で、融合タンパク質の単離および処理を容易にするために組織溶解物を調製してもよい。
【００３６】
（融合タンパク質の固定）
動物から融合タンパク質を含む生物学的サンプルを採取した後、融合タンパク質を固定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を実施する。本明細書に記載されているように、融合タンパク質は、特異的結合対の第１のメンバーを含んでいる。生物学的サンプルをその特異的結合対の第２のメンバーと接触させると、その結果サンプル中に含まれる融合タンパク質はその第２のメンバーと結合する。生物学的サンプル中に含まれる未結合の物質は、洗浄により除去可能である。特異的結合対のメンバー間の相互作用を用いてタンパク質を固定する方法は、当業者には周知である。本明細書に記載されているように、特異的結合対の第２のメンバーとしては、抗体などのタンパク質、ならびにニッケルなどのタンパク質以外の親和性試薬（ポリヒスチジンタグを含むタンパク質の精製に使用するためのもの）が含まれ得る。
【００３７】
１例において、融合タンパク質は、固相表面にコーティングされた抗体（融合タンパク質の第２のアミノ酸配列に特異的なもの）を用いて捕捉される。第２のアミノ酸配列に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、当業者に公知の様々な方法により、適当な固相表面に固定することが可能である。本発明の好ましい１実施形態では、ヒト免疫グロブリンＦｃ定常γ−１（Ｃｒ１）特異的抗体が使用される。固相表面はいかなる特
定の形態にも限定されず、プラスチック製チューブ、マイクロタイタープレート、セルロースビーズおよびアガロースビーズなどのビーズ、ラテックス製粒子、磁性粒子、紙、ならびにディップスティックが挙げられる。抗体の固定方法としては、受動的吸着、共有結合、および物理的捕捉が挙げられる。融合タンパク質は、その融合タンパク質を含有する生物学的サンプル（例えば、血清または組織溶解物）を、固相表面に予め固定されている第２のアミノ酸配列特異的抗体と共にインキュベートすることにより、その固相表面上に捕捉される。未結合の物質は洗浄により除去可能である。
【００３８】
固定された融合タンパク質は、種々の目的に使用可能である。例えば、融合タンパク質を用いて該タンパク質の第１のアミノ酸配列部分に結合する分子をスクリーニングすることが可能である。さらに、この融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列とその第１のアミノ酸配列の天然に存在するリガンドとの相互作用を阻害する分子のスクリーニングに使用可能である。これらのスクリーニング方法を、次のセクションでさらに詳細に述べる。もう１つの例では、融合タンパク質を（生物学的サンプルに含まれる未結合の物質の除去により）精製し、そのタンパク質の活性および／または構造の分析などの種々の目的で使用することが可能である。融合タンパク質またはその部分を、任意選択で、固定工程および洗浄工程の後で均質になるまで精製することが可能である。本明細書に記載されているように、融合タンパク質は、任意選択で、例えば、第１と第２のアミノ酸配列の間に配置される配列のような、融合タンパク質の切断および第１のアミノ酸配列の単離を可能にする配列を含み得る。
【００３９】
（抗体の作製）
免疫化工程において、本明細書に記載されているような核酸構築物は、例えばマウス、ラット、ヤギ、ウサギまたはヒトのような哺乳動物などの動物に投与される。この投与により、融合タンパク質が動物内で生産され、その融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に対して誘導される免疫応答が起こる。この免疫応答は、第１のアミノ酸配列を認識するポリクローナルまたはモノクローナルの抗体の調製に利用することが可能である。核酸は、液性免疫応答を誘導するのに十分な経路および投与量で送達される。例えば、核酸は、腹腔内、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、鼻腔内または皮下に投与することが可能である。
【００４０】
以下は、本明細書に記載されている核酸を用いたモノクローナル抗体の調製方法の例示的な１実施形態である。核酸構築物を、脂質の混合物と１：１０の割合で組み合わせ、１匹当たり５０μｇ／ｍｌのＤＮＡの投与量でマウスに腹腔内注射する。１０日目に同じ投与量で同じ経路での追加免疫注射を行い、２１日目に試験血清を採取する。ポリクローナル血清の力価を、本明細書に記載されているアッセイを用いて測定する。２１日目のポリクローナル血清の力価が十分である場合には、２２日目に３回目の追加免疫を実施し、２９日目にハイブリドーマを作製するための細胞融合実験を行うことが可能である。モノクローナル抗体は、例えば、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（（１９７６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
第６巻、第５１１〜５１９頁）の周知の細胞融合法を適用して、培養上清中に目的とする抗体を分泌するハイブリドーマを作製することにより作製可能である。均一な細胞集団を得た後（これは通常、限界希釈クローニングにより行われる）、抗体産生ハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させ、次にモノクローナル抗体の特異性を本発明のスクリーニング法により特性解析ことが可能である。
【００４１】
（標的結合分子のスクリーニング）
本明細書に記載されているように、融合タンパク質を動物内で生産し、続いて特異的結合対のメンバー間の相互作用を介して固定することが可能である。目的とする任意の配列（第１のアミノ酸配列）を含むタンパク質の生産および固定に関するこれらの迅速で効率的な方法は、第１のアミノ酸配列に結合し、かつ／またはリガンドがその第１のアミノ酸
配列に結合する能力を阻害する、本明細書中で標的結合分子と呼ぶ分子のスクリーニングに使用可能である。これらの方法は、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列部分に特異的に結合する抗体および他のリガンドのハイスループットスクリーニングに特にうまく適合する。スクリーニング系に加えて、またはその一部として、本発明の方法は、標的結合分子の同定、定量および／または精製を含む。例えば、候補標的結合分子の一群（例えばライブラリー）を、第１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と接触させ、次に結合している１つまたは複数の分子の化学的または物理的特性を（例えば、結合しているペプチドのアミノ酸配列または合成化学ライブラリーの結合しているメンバーの化学的構造を決定することにより）測定することによって標的結合分子を同定することが可能である。
【００４２】
融合タンパク質を表面に固定した後、その融合タンパク質を、少なくとも１つの候補標的結合分子を含むサンプルと接触させる。候補標的結合分子は、タンパク質配列に結合可能なものであればいずれの種類の分子であってもよい。標的結合分子の例としては、それだけに限定しないが、タンパク質（ポリペプチドまたはペプチドという用語と互換的に用いられる）、抗体およびそれらの断片、リボ核酸、小分子、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸、ならびに他の有機化合物が挙げられる。標的結合分子としては、Ｄ−および／またはＬ−立体配置のアミノ酸から構成されるランダムペプチドライブラリーおよびコンビナトリアル化学による分子ライブラリーのメンバー（これらに限定はしない）を含む可溶性ペプチド、リン酸化ペプチド（それだけに限定しないがランダムもしくは部分的に縮重した定方向リン酸化ペプチドライブラリーのメンバーを含む：例えばソンヤンら（Ｓｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．），（１９９３）Ｃｅｌｌ  第７２巻、７６７頁を参照）などのペプチド、抗体（それだけに限定しないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、もしくは１本鎖の抗体、ならびにそれらのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ発現ライブラリー断片、ファージディスプレイライブラリー、ならびにエピトープ結合断片を含む）、アプタマー（タンパク質リガンドへの特異的結合を可能にする三次構造を有する核酸分子（例えば、オズボーンら（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ．ａｌ．），（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．第１巻、第５〜９頁を参照））、フィブロネクチンベースの結合リガンド、ならびに小さな有機もしくは無機分子が挙げられる。
【００４３】
また、標的結合分子を、第１のアミノ酸配列の天然に存在するリガンドとすることも可能である。例えば、融合タンパク質を固定した後で、その融合タンパク質を、第１のアミノ酸配列の天然に存在するリガンドを含む生物学的サンプルと接触させることが可能である。結合工程および洗浄工程の後、当業者に周知の方法により、結合したリガンドを同定することが可能である。
【００４４】
本発明の１つの方法において、標的タンパク質特異的抗体を含む試験血清は、本明細書に記載されている核酸構築物で動物を免疫することにより作製される。その動物内で抗体を産生させた後、試験血清を採取し、本明細書に記載されているようにしてスクリーニングを行うことが可能である。
【００４５】
スクリーニングアッセイは、様々な方法で実施可能である。例えば、そうしたアッセイを実施するための１方法では、融合タンパク質を（特異的結合対のメンバー同士の結合により）固相に固定し、反応が完了した時点で固相に固定されている融合タンパク質／標的結合分子複合体を検出することを要する。そうした方法の１実施形態では、融合タンパク質を固相表面に固定し、試験化合物は固定せずに、直接的または間接的に標識する。
【００４６】
融合タンパク質の固定について本明細書に記載したように、固定およびスクリーニングの方法では多種多様な固相が使用可能である。例えば、マイクロタイタープレートが固相として好都合に使用可能である。特異的結合対の第２のメンバー（例えば、モノクローナ
ル抗体）を、非共有結合または共有結合により固相に固定することが可能である。非共有結合は、特異的結合対の第２のメンバーを含む溶液で固相表面を単にコーティングすることにより達成し得る。その表面は、前もって調製し保存することが可能である。
【００４７】
アッセイを行うために、標的結合分子を、融合タンパク質を含む表面に添加する。反応が完了した後、未結合の成分を、形成されたすべての複合体が固相表面に固定され続けるような条件下で（例えば洗浄により）除去する。固相表面に固定された複合体の検出は、多くの方法により達成可能である。固定される前の状態の標的結合分子が予め標識されている場合、表面に固定されている標識が検出されれば、複合体が形成されたことになる。固定される前の状態の標的結合分子が予め標識されていない場合は、間接的な標識を用いて表面に固定されている複合体を検出することが可能であり、これは、例えば、固定される前の状態の標的結合分子に特異的な標識抗体を用いて行われる（この抗体もやはり標識抗Ｉｇ抗体で直接的または間接的に標識することが可能である）。
【００４８】
代替例として、反応を液相中で行うことが可能であり、結合した生成物を未結合の成分から分離し、複合体を、例えば溶液中で形成された複合体を固定するための融合タンパク質に特異的な固定抗体と、固定された複合体を検出するための、生じうる複合体を構成する標的結合分子に特異的な標識抗体とを用いて検出される。
【００４９】
これらの手法のためのインキュベーションの時間および温度は、それほど厳密ではない。例えば、インキュベーション時間は１０分〜４８時間の範囲とすることが可能であり、好ましくは、インキュベーションは１〜２時間行われる。インキュベーション温度は、４℃〜３７℃の範囲とすることが可能である。好ましいインキュベーション時間は２０℃〜３７℃である。
【００５０】
融合タンパク質は、融合タンパク質を含有する血清または組織溶解物を、表面に予め固定させてある特異的抗体と共にインキュベートすることにより捕捉される。未結合の非特異的な物質を除去した後、試験抗体を固相と共にインキュベートし、シグナル発生マーカーで標識またはタグ付けした結合パートナーを用いて標的タンパク質特異的抗体を定量的に検出する。例えば試験血清がマウスに由来する場合、結合パートナーは、シグナル発生マーカーで標識したマウスＩｇＧ抗体に特異的な抗体とすることが可能である。
【００５１】
本発明のこの１実施形態では、結合パートナーは、種々のシグナル発生マーカーで標識またはタグ付けすることが可能である。これらとしては（それだけに限定しないが）、酵素、化学発光成分、蛍光標識、色素、放射性同位元素標識、酵素補因子、およびビオチンが挙げられる。この結合パートナーとシグナル発生マーカーとの化学的結合は、当業者に公知の種々の方法により達成可能である。
【００５２】
以下は、本発明の実施例である。それらは、本発明の範囲をいかようにも限定しようとするものではない。
【実施例１】
【００５３】
（ヒトＩＬ‐５−免疫グロブリンＦｃ定常領域融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ生産およびＩＬ‐５特異的抗体を用いた検出）
ヒトＩＬ‐５をコードする核酸配列を、ヒト免疫グロブリンＦｃ定常領域γ１（Ｃｒ１）と融合させた。ＩＬ‐５−Ｃｒ１融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物１０μｇを２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、１０秒以内にマウスに静脈内注射した。
【００５４】
そのＤＮＡを注射した２０時間後に、マウスから肝臓を摘出した。肝臓を摘出する１時
間前に、１００μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｐ８３４０）をそのマウスに静脈内注射した。肝臓をホモジナイズし、その溶解物中に含まれるＩＬ‐５−Ｃｒ１融合タンパク質を、Ｃｒ１特異的抗体で予めコーティングしておいたマイクロタイタープレートに捕捉した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ−１抗体（層１；捕捉抗体）は、それを２μｇ／ｍｌの濃度で一晩インキュベートすることにより、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標）プレート、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）Ｓｕｒｆａｃｅ）に固定した。
【００５５】
ＩＬ‐５−Ｃｒ１融合タンパク質（層２）を、肝臓溶解物（１％ＢＳＡおよび１０％正常ヤギ血清を含むブロッキング緩衝液で希釈したもの）をマイクロタイタープレートのウェル内で室温で２時間インキュベートすることにより、層１に結合させた。バックグラウウンド減算のための対照として、別の融合タンパク質（ＥＧＦＰ‐ＭＥＭ−Ｃｒ１）を含む肝臓溶解物を別のウェル内で並行して用いた。４回洗浄して未結合の物質を除去した後、プレートを、正常マウス血清で希釈したＩＬ‐５特異的マウス・モノクローナル抗体（米国ミネソタ州ミネアポリス所在のＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．））と共にインキュベートした。プレートに結合したＩＬ‐５特異的抗体（層３）の量は、次のものを添加した後４℃で１５時間インキュベートすることにより測定した：ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／５０００）（層４）；ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ酵素コンジュゲート（１／１００００）（層５）；および１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（酵素基質）。酵素基質を添加した後、ＯＤ４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼの存在を検出した。
【００５６】
図１において、Ｘ軸は陽性の試験血清（層３）の希釈率を示し、Ｙ軸はΔＯＤ（融合タンパク質含有肝臓溶解物由来のＯＤから正常肝臓溶解物由来のＯＤを差し引いたものとして算出）を示す。図１から、このアッセイにより、マイクロタイタープレート上で標的タンパク質特異的抗体の存在が検出されること、および陽性の血清の各希釈物のΔＯＤが、希釈率と直線的な相関を示すことが判る。図中の各点は三連のウェルの平均値を示し、この図は少なくとも２回の独立した実験の典型的な結果である。
【実施例２】
【００５７】
（ＥＧＦＰ‐ＭＥＮ１−免疫グロブリンＦｃ定常領域融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ生産およびＥＧＦＰ特異的抗体を用いた検出）
ＥＧＦＰ‐ＭＥＮ１をコードする核酸配列を、ヒト免疫グロブリンＦｃ定常領域γ１（Ｃｒ１）と融合させた。ＥＧＦＰ‐ＭＥＮ１−Ｃｒ１融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物１０μｇを２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、１０秒以内にマウスに静脈内注射した。
【００５８】
そのＤＮＡを注射した２０時間後に、マウスから肝臓を摘出した。肝臓を摘出する１時間前に、１００μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｐ８３４０）をそのマウスに静脈内注射した。肝臓をホモジナイズし、その溶解物中に含まれるＥＧＦＰ‐ＭＥＮ１−Ｃｒ１融合タンパク質を、Ｃｒ１特異的抗体で予めコーティングしておいたマイクロタイタープレートに捕捉した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ−１抗体（層１；捕捉抗体）を、その抗体を２μｇ／ｍｌの濃度で一晩インキュベートすることにより、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標）プレート、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）Ｓｕｒｆａｃｅ）に固定した。
【００５９】
ＥＧＦＰ‐ＭＥＮ１−Ｃｒ１融合タンパク質（層２）を、肝臓溶解物（１％ＢＳＡおよび１０％正常ヤギ血清を含むブロッキング緩衝液で希釈したもの）をマイクロタイタープレートのウェル内で室温で２時間インキュベートすることにより、層１に結合させた。バ
ックグラウウンド減算のための対照として、別の融合タンパク質（ＩＬ‐５−Ｃｒ１）を含む肝臓溶解物を、別のウェル内で並行して用いた。４回洗浄して未結合の物質を除去した後、プレートを、正常マウス血清で希釈したＥＧＦＰ特異的マウス・モノクローナル抗体（米国カリフォルニア州パロアルト所在のクロンテックラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．））と共にインキュベートした。プレートに結合しているＥＧＦＰ特異的抗体（層３）の量を、次のものを添加した後４℃で１５時間インキュベートすることにより測定した：ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／５０００）（層４）；ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ酵素コンジュゲート（１／１００００）（層５）；および１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（酵素基質）。酵素基質を添加した後、ＯＤ４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼの存在を検出した。
【００６０】
図２において、Ｘ軸は陽性の試験血清（層３）の希釈率を示し、Ｙ軸はΔＯＤ（融合タンパク質含有肝臓溶解物由来のＯＤから正常肝臓溶解物由来のＯＤを差し引いたものとして算出）を示す。図２から、このアッセイにより、マイクロタイタープレート上の標的タンパク質特異的抗体の存在が検出されること、および陽性の血清の各希釈物のΔＯＤが、希釈率と直線的な相関を示すことが判る。図中の各点は三連のウェルの平均値を示し、この図は少なくとも２回の独立した実験の典型的な結果である。
【００６１】
（他の実施形態）
本発明をその詳細な説明と共に記載してきたが、上記の記載は例示のためであり、本発明の範囲を限定しようとするものではないことを理解されたい。本発明の他の態様、利点および変更形態は、特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】Ｃｒｌをタグとして結合させたＩＬ‐５融合タンパク質をコードする核酸を動物に投与することにより産生させた同融合タンパク質の検出を示す図。検出は、ＩＬ‐５特異的抗体を用いて行った。
【図２】Ｃｒｌをタグとして結合させたＥＧＦＰ‐ＭＥＮ１融合タンパク質をコードする核酸を動物に投与することにより産生させた同融合タンパク質の検出を示す図。検出は、ＥＧＦＰ特異的抗体を用いて行った。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005533479.tif 000005
2005533479.tif 000006