(57)【要約】本出願において、生物学的サンプルのタンパク質発現プロファイルを確立するための方法が、提供される。この方法は、生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させることによって、特定の非ユビキチン化タンパク質（ＩＰＳ）がユビキチン結合タンパク質に結合する工程；そのＩＰＳタンパク質を単離する工程；およびその単離されたＩＳＰタンパク質を分析する工程であって、発現プロファイルが生成される、工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルのタンパク質発現プロファイルを確立するための方法であって、
（ａ）生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させることにより、ＩＰＳタンパク質（指標タンパク質セット）が該ユビキチン結合タンパク質と結合する、工程；
（ｂ）該ＩＰＳタンパク質を単離する工程；および
（ｃ）該単離されたＩＰＳタンパク質を分析する工程であって、組織または細胞についてのユビキチン化タンパク質の発現プロファイルが確立される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが、末梢血、体液、組織生検、培養細胞、タンパク質抽出物、または糞便サンプルである、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記ユビキチン結合タンパク質が、ユビキチンおよびユビキチン化タンパク質に高親和性結合を示す任意の天然もしくは人工のタンパク質または分子である、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記ユビキチン結合タンパク質が、直列に結合されたユビキチン結合（ＵＢＡ）ドメインを含む天然または人工のペプチド産物である、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記ユビキチン結合タンパク質が、Ｒａｄ２３、Ｄｄｉｌ１、Ｄｓｋ２、アタキシン−３、ｐ６２、Ｒｐｎ１０、ＵＢＡ含有タンパク質、およびその対応物からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、前記ユビキチン結合タンパク質が、抗ユビキチン抗体、またはＵＢＡ含有タンパク質に対する抗体である、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記単離する工程（ｂ）が、前記ユビキチン結合タンパク質（ＩＰＳ）を親和性マトリックスに付着することによって実施される、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、脱ユビキチン化反応による前記結合したタンパク質（指標タンパク質セット）の放出をさらに包含する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記分析する工程（ｃ）が、前記単離された脱ユビキチン化タンパク質（指標タンパク質セット）を高解像度二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動に供することによって実施される、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記２Ｄゲル電気泳動の後に、前記タンパク質の可視化が行われる、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記可視化が、硝酸銀染色を用いて達成される、方法。
【請求項１２】
請求項５に記載の方法であって、前記Ｒａｄ２３が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに融合された組換えヒト融合タンパク質であり、親和性マトリックスが、グルタチオン−セファロースから構成される、方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法であって、前記指標タンパク質セットの放出が、高塩条件、界面活性剤、または酵素反応への曝露による、方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、前記指標タンパク質セットの酵素的放出が、ユビキチン−イソペプチダーゼへの曝露による、方法。
【請求項１５】
生物学的サンプル中の疾患または病理の存在を決定するための診断方法であって、
（ａ）試験生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させることにより、ＩＰＳタンパク質（指標タンパク質セット）が該ユビキチン結合タンパク質と結合する、工程；
（ｂ）該ＩＰＳタンパク質を単離する工程；
（ｃ）該単離されたＩＰＳタンパク質を分析する工程であって、発現プロファイルが生成される、工程；および
（ｄ）該試験発現プロファイルをコントロール発現プロファイルと比較して、該試験プロファイルが該コントロールプロファイルと異なるか否かを決定する工程であって、該コントロールプロファイルとの差異は、疾患または病理の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
（ｅ）前記単離されたＩＰＳタンパク質（指標タンパク質セット）をタンデム型質量分析法に供する工程、
（ｆ）該ＩＰＳまたはそのサブセットに対する抗体を生成する工程；および
（ｇ）工程（ｆ）において生成された抗体の選択されたセットを使用して、タンパク質チップを構築する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１７】
目的のサンプルについてのタンパク質プロファイルを生成するためのキットであって、
（ａ）診断、予後判定、治療的モニタリングまたはこれらの適用の任意の組み合わせのためにユビキチン結合タンパク質を使用する指示、
（ｂ）該結合タンパク質に対する標識結合パートナー；
（ｃ）該結合タンパク質が固定される固相（例えば、試薬片）；および
（ｄ）診断用途、予後判定用途、もしくは治療用途、またはこれらの任意の組み合わせについての規制機関の認可を示す、標識または挿入物、
を備える、キット。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法により生成された２つ以上のタンパク質プロファイルのデータベース。
【請求項１９】
目的の指標タンパク質セットのタンパク質プロファイルを調節可能である化合物を同定するための方法であって、
（ａ）試験化合物に曝露された生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質に接触させることによって、ＩＰＳタンパク質（指標タンパク質セット）が該ユビキチン結合タンパク質に結合する、工程；
（ｂ）該ＩＰＳタンパク質（指標タンパク質セット）を単離する工程；および
（ｃ）該単離された指標タンパク質セットを分析する工程であって、該指標タンパク質セットの発現プロファイルに対する該試験化合物の影響が決定される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記化合物が、前記タンパク質プロファイルを異常から正常へと調節する、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法により同定される指標タンパク質セット（ＩＰＳ）。
【請求項２２】
請求項２１に記載のＩＰＳであって、生物学的サンプル由来のユビキチン化タンパク質または非ユビキチン化タンパク質を含み、該タンパク質は、疾患状態または病的状態において、対応する非病的生物学的サンプルと比較して変化した発現を示す、ＩＰＳ。
【請求項２３】
疾患または状態に特異的であり、かつ請求項１に記載の方法により単離された１つ以上のＩＰＳを含む細胞または組織に特異的であるタンパク質発現フィンガープリントであって、該ＩＰＳタンパク質は、疾患状態において、対応する非病的コントロール細胞または非病的コントロール組織と比較して変化した発現を示す、タンパク質発現フィンガープリント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の支援）
本発明に至る研究は、国立がん研究所からの公衆衛生局助成金ＣＡ−８３８７５によって一部支援された。米国政府は、本発明において一部の権利を有し得る。
（発明の分野）
本発明は、重要な細胞タンパク質（指標タンパク質セットまたはサブセット）の重要なセットについての発現プロファイルを得るための方法および異常な状態または病的状態の存在を診断するために生成されたタンパク質プロファイルの使用に関する。本発明は、指標タンパク質セットの発現プロファイルを変化することが可能な治療的化合物をスクリーニングするための方法をさらに提供する。本発明はまた、目的のタンパクがユビキチン／プロテアソーム経路の標的であるか否かを特異的に決定するための手段も提供する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
生物のタンパク質相補体の研究は、プロテオミクスと呼ばれ、薬物標的および新規薬物を同定するための重要なアプローチとして出現している。プロテオミクスの分野は、以下の２つのアプローチを含む：タンパク質発現における全体的な変化を研究する、発現プロテオミクス、およびタンパク質−タンパク質相互作用の系統的研究である、細胞マッププロテオミクス（Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１２１−１２７）。固定ゲノムと異なり、プロテオームは、遺伝子発現、安定性および翻訳後改変を反映する動的な実態である。プロテオームは、細胞特異的または組織特異的であり得、かつ生物の代謝状態、健康、および環境によって影響され得る。
【０００３】
全体的な遺伝子発現のモニタリングのための最近の方法は、遺伝子−チップ／ＤＮＡマイクロアレイ技術に主に依存する。細胞内におけるタンパク質の発現を研究するための別のアプローチは、高分解能２次元（２Ｄ）ゲル電気泳動の使用を必要とする。
【０００４】
ユビキチン（Ｕｂ）は、真核生物において高度に保存される７６アミノ酸タンパク質であり、他のタンパク質に共有結合的に連結され、プロテアソームと呼ばれるプロテアーゼによって分解されるタンパク質をマークする。タンパク質ユビキチン化の非タンパク質分解性の効果もまた、記載される。Ｒａｄ２３は、核酸除去修復に関与する高度に保存されたタンパク質である。ヒトＲａｄ２３は、プロテアソームに結合し得るアミノ末端ユビキチン様（ＵｂＬ）ドメインを含む（Ｓｃｈａｕｂｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７１５−７１８）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、細胞における異常な状態または病的状態（例えば、発症した疾患の存在下で生じるかまたは正常な状態から形質転換された状態もしくは異常な状態への移行において生じる）の存在を決定するための新規の診断方法を提供する。本発明は、異なる生理学的状態または条件下で最も変化する可能性が高い、細胞タンパク質の重要なサブセットについての発現プロファイルを確立する方法を提供する。本発明の方法において、代表的に情報価値のない（ｕｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）細胞タンパク質のバルクは削除され、そしてその分析は、細胞異常性の診断における高い予測値を有するタンパク質の小セットに限定される。本発明の方法は、「タンパク質プロファイリング」と呼ばれ、そして正常な発現からの変異について検査される重要な細胞タンパク質のサブセットは、「指標タンパク質セット」（「ＩＰＳ」）と呼ばれる。このＩＰＳは、ユビキチン化調節タンパク質および非ユビキチン化調節タンパク質の両方を含む。
【０００６】
本発明の方法は、ユビキチン結合タンパク質（例えば、Ｒａｄ２３）が重要な細胞タンパク質に結合する能力が、診断的に使用され得ることの認識に、一部基づく。本発明の重要な特徴は、細胞増殖および細胞発達の重要な制御因子を表す細胞タンパク質の特定のコホートを単離する能力である。このクラスのタンパク質レベルは、異常な細胞において代表的に変化するので、これらは、高い診断値を有するタンパク質のセットを表す。
【０００７】
以下に記載される方法論は、ＩＰＳプロファイルにおける改変が、異常条件または病的条件の存在を示すように、ユビキチン化細胞タンパク質および非ユビキチン化細胞タンパク質（ＩＰＳ）を能率的に回復し、このＩＰＳの発現プロファイルを決定し、そして正常発現プロファイルを比較する方法を提供する。
【０００８】
従って、第１の局面において、本発明は、組織または細胞についての発現プロファイルまたはフィンガープリントを確立するための方法を特徴とし、この方法は、（ａ）生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させることにより、ＩＰＳがこのユビキチン結合タンパク質と結合する、工程；（ｂ）ＩＰＳタンパク質を単離する工程；および（ｃ）この単離されたＩＰＳタンパク質を分析する工程であって、その組織または細胞についてのＩＰＳタンパク質の発現プロファイルが確立される、工程、を包含する。
【０００９】
本発明のタンパク質プロファイリング方法は、コントロールサンプル、および疾患サンプルまたは病的サンプルについてのフィンガープリントを確立するために使用される。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルは、コントロール生物学的サンプル、腫瘍生物学的サンプル、または病的な生物学的サンプルであり、任意の供給源由来の末梢血、体液、組織生検、糞便サンプル、培養細胞、およびタンパク質抽出物を含む、細胞もしくはタンパク質を含む任意の生物学的サンプルである。非常に少量の細胞物質しか必要とされない。例えば、代表的には、約０．１ｇ以下の生検組織が、本発明のタンパク質プロファイリング方法のために十分である。この技術をさらに洗練させると、１〜２ｍｇ程度の少量の組織が、本願のタンパク質プロファイリングのために十分であることが、想定される。
【００１０】
１つの実施形態において、このユビキチン結合タンパク質は、ユビキチンに高親和性結合を示す任意の天然もしくは人工のタンパク質である。より特定の実施形態において、このユビキチン結合タンパク質は、直列に結合されたユビキチン結合（ＵＢＡ）ドメインを含む天然または人工のペプチド構築物である。別の特定の実施形態において、このユビキチン結合タンパク質は、Ｒａｄ２３、Ｄｄｉｌ１、Ｄｓｋ２、Ｒｐｎ１０、またはアタキシン−３である。別の特定の実施形態において、このユビキチン結合タンパク質は、抗ユビキチン抗体である。より特定の実施形態において、この抗ユビキチン抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。これらの抗体は、インタクトなタンパク質に対して生成され得るか、または目的のタンパク質内に存在するアミノ酸配列を示す合成ペプチドに対して生成され得る。
【００１１】
より特定の実施形態において、単離する工程（ｂ）は、このユビキチン結合タンパク質を親和性マトリックスに付着し、生物学的サンプルからＩＰＳタンパク質を捕捉し、その後、そのＩＰＳタンパク質を脱ユビキチン化反応に供することにより結合タンパク質を放出させ、そして高塩処理または他の処理を用いる処理により非ユビキチン化タンパク質を放出させることによって、実施される。
【００１２】
より特定の実施形態において、分析する工程（ｃ）は、この単離された脱ユビキチン化タンパク質を高解像度二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動に供することによって実施され、その生物学的サンプルに特異的なタンパク質プロファイルが、得られる。
【００１３】
１つの特定の実施形態において、この方法は、ユビキチン化タンパク質および非ユビキチン化タンパク質についてのタンパク質プロファイルを生成するために使用され、この方法は、細胞抽出物または組織抽出物を親和性カラムに適用することにより、ここで、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対する融合物として発現された組換えＲａｄ２３が、グルタチオン−セファロースに付着される。結合したタンパク質が、このカラムから解離され、そしてゲル電気泳動により分解に供される。より特定の実施形態において、親和性カラムからの結合したタンパク質の解離は、高塩条件、界面活性剤（ＳＤＳなど）への曝露によるか、または結合したタンパク質をカラムから解離可能な酵素（例えば、ユビキチンイソペプチダーゼ）の使用による。非常に濃縮された単離された脱ユビキチン化タンパク質および他の細胞性非ユビキチン化タンパク質（ＩＰＳと呼ばれる）が、さらに処理される（例えば、２Ｄゲル電気泳動による分離、その後の例えば、硝化銀による染色）。個々の調節タンパク質を示す染色スポットの強度が、コントロール組織における対応する発現と比較される。
【００１４】
種々の細胞が、種々の条件下でユビキチン化調節タンパク質および非ユビキチン化調節タンパク質の独特なプロファイルを示すので、特定の疾患状態により示されるＩＰＳの明確なプロファイルが、決定され得、そして改良された診断目的のために使用され得る。
【００１５】
従って、第２の局面において、本発明は、生物学的サンプル中の疾患または病理の存在を決定するための診断方法を特徴とし、この方法は、（ａ）試験生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させることにより、ＩＰＳタンパク質がそのユビキチン結合タンパク質と結合する、工程；（ｂ）このＩＰＳタンパク質を単離する工程；（ｃ）この単離されたＩＰＳタンパク質を分析する工程であって、発現プロファイルが生成される、工程；および（ｄ）試験発現プロファイルをコントロール発現プロファイルと比較して、その試験プロファイルがコントロールプロファイルと異なるか否かを決定する工程であって、このコントロールプロファイルとの差異は、疾患または病理の存在を示す、工程、
を包含する。
【００１６】
第３の局面において、本発明は、生物学的サンプルにおける病理または疾患の存在を診断するためのキットを特徴とし、この診断は、その生物学的サンプルについてのタンパク質プロファイルを生成し、生成されたタンパク質プロファイルを、試験する生物学的サンプルに対応する正常な健常組織または健常細胞のフィンガープリントと比較することによる。この局面において、本発明は、適切なＩＰＳまたはサブセットに結合可能なユビキチン結合タンパク質を含むキットを特徴とする。さらに、このようなキットは、必要に応じて、以下のうちの１つ以上を備え得る：（１）診断、予後判定、治療的モニタリングまたはこれらの適用の任意の組み合わせのためにユビキチン結合タンパク質を使用する指示；（２）この結合タンパク質に対する標識結合パートナー；（３）この結合タンパク質が固定される固相（例えば、試薬片）；および（４）診断用途、予後判定用途、もしくは治療用途、またはこれらの任意の組み合わせについての規制機関の認可を示す、標識または挿入物。この結合タンパク質に対する標識結合パートナーが備えられていない場合、このタンパク質自体が、検出可能なマーカー（例えば、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、または放射性部分）で標識され得る。
【００１７】
さらに一般的には、本発明の方法は、タンパク質発現プロファイルまたはフィンガープリント（通常および通常でない）種々の細胞および組織から本発明のタンパク質プロファイリング方法によって生成される）のデータベースを提供する。腫瘍の各クラスは、例えば、タンパク質の特有の「フィンガープリント」を発現し、診断ツールとしてのために有用な、各疾患状態について別個の分子サインを提供する。
【００１８】
さらに、本発明のタンパク質プロファイリング方法は、ＩＰＳのサブセットをさらに与え、ＩＰＳのサブセットは、コントロールサンプル（通常、罹患していない）由来の対応セットと比較した疾患または病理の存在における増加した発現または減少した発現を有するタンパク質を反映する。
【００１９】
第４の局面において、本発明は、タンパク質発現フィンガープリント（各々は疾患状態について特有である）のデータベースを特徴とし、以下の工程によって生成される２つ以上のタンパク質プロファイル：（ａ）生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させ、その結果、指示タンパク質セット（ＩＰＳ）タンパク質が、ユビキチン結合タンパク質に結合する工程；（ｂ）ＩＰＳタンパク質を単離する工程；および（ｃ）単離されたＩＰＳを分析する工程（ここで、各々の組織または細胞についてのＩＰＳの発現プロファイルは、確立されている）、を包含する。
【００２０】
疾患の特定のフィンガープリントの確立は、その疾患の診断についての迅速な方法を提供し、この方法は、対応するコントロールサンプルと比較するために、関連のある生物学的サンプルにおいてＩＰＳのタンパク質プロファイルを検出し、疾患が存在するかどうかを決定する。これらの方法はまた、臨床的スクリーニング、予後判定、治療の結果をモニタリングすること、特定の治療的処置薬物スクリーニングおよび開発に最も応答しそうな患者を同定すること、ならびに薬物処置のための新たな標的の同定に適する。
【００２１】
第５の局面において、本発明は、ＩＰＳの重要なサブセットを特徴づけ、この重要なサブセットは、異常な状態（例えば、疾患の開始、病理、形質転換など）の存在において、発現の変化したレベルを示すタンパク質を提示する。変化は、増加した発現および減少した発現ならびに翻訳後改変（例えば、リン酸化）を誘導する。これらの重要な指示タンパク質の存在は、通常の健康状態から異常な状態または病理状態に、細胞または組織が変化することを示すことについて、診断的に有用である。具体的には、抗体が、ＩＰＳのサブセットに対して生成され得、これらの抗体が、利用可能な技術を使用してプロテインチップ上に配置され得る。次いで、生物学的サンプルが、直接的にプロテインチップに適用され得、各々のタンパク質のレベルは、チップ上に固定化された抗体の特定のセットによって認識され、通常状態と異常状態との間を識別するために定量化される。
【００２２】
第６の局面において、本発明は試験化合物または薬物の、ＩＰＳの発現に対する効果をモニタリングすることによる薬物の発見方法および確認方法を特徴とする。一実施形態において、本発明は、目的の指標タンパク質セット（ＩＰＳ）のタンパク質プロファイルを調節し得る化合物を同定する方法を特徴とし、この方法は、以下：（ａ）試験化合物に曝露された生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させる工程であって、その結果、ＩＰＳタンパク質がこのユビキチン結合タンパク質に結合する、工程；（ｂ）このＩＰＳタンパク質を単離する工程；および（ｃ）この単離された指標タンパク質セットを分析する工程であって、ここでこの試験化合物の、指標タンパク質セットの発現プロファイルに対する効果が決定される、工程、を包含する。
【００２３】
ＩＰＳの発現を異常から正常に調節する化合物の同定が、特に興味が持たれる。このような化合物は、疾患状態を回復させる能力または疾患の発症を阻害する能力について、さらに試験され得る。
【００２４】
第７の局面において、本発明は、以下の方法によって同定された指標タンパク質セット（ＩＰＳ）を特徴とする：（ａ）生物学的サンプルと、ユビキチン結合タンパク質とを接触させ、その結果、ＩＰＳタンパク質がユビキチン結合タンパク質に結合する、工程；および（ｂ）このＩＰＳタンパク質を単離する工程であって、ここでこの単離されたユビキチン化タンパク質および非ユビキチン化タンパク質がＩＰＳを生成する、工程。
【００２５】
ユビキチン化タンパク質は、ユビキチン部分の除去の後に、ＩＰＳの成分になる。ＩＰＳの同一性（これは、ユビキチン化タンパク質および非ユビキチン化タンパク質の両方を含む）は、本発明の重要な局面であり、以下に記載されるように、タンデム質量分析法（ＭＳ）によって決定され得る。
【００２６】
タンパク質プロファイリング法は、細胞ユビキチン化タンパク質および細胞非ユビキチン化タンパク質の発現パターン、ならびにそれらの存在の両方の決定を必要とする。利用可能なスキャニングソフトウェアは、２Ｄゲル分析によって検出されるタンパク質スポットの正確な定量のために使用され得る。
【００２７】
関連の局面において、本発明は、細胞または組織サンプルから単離されたＩＰＳを特徴とし、これは、（例えば、トリプシンを用いる）制限タンパク質分解性消化に供され、次いでタンデム質量分光（ＭＳ）分析に供される。このアプローチは、正常で健康なサンプルにおける発現に対して、疾患または病理の存在下において変化した発現を示す重要な指標タンパク質のＩＰＳおよび／またはサブセットの各メンバーの同定を可能にする。このアプローチの重要な利点は、非常に少ない量のタンパク質しか必要でないことである。ＭＳ分析におけるシグナルのほとんどの部分は、ユビキチンによって生成されるが、ユビキチンから誘導されるタンパク質分解性フラグメントを表すピークは、既知であり、そして無視できる。ＭＳ分析の第２の利点は、これが非常に迅速であり、かつ自動化適用およびハイスループット適用に容易に適合可能であることである。
【００２８】
第８の局面において、本発明は、疾患または状態、および細胞または組織に特異的なタンパク質発現フィンガープリントを特徴とし、これは上記の方法によって単離されたＩＰＳ中の１つ以上のタンパク質を含み、ここでこのタンパク質は、対応する非疾患コントロール細胞または組織に対して、疾患状態における変化した発現を示す。
【００２９】
第９の局面において、本発明は、目的のタンパク質がインビボでユビキチン化の標的であるか否かを決定するための方法を提供する。詳細には、この方法は、（ａ）目的のタンパク質を含む生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させる工程であって、その結果、ユビキチン化タンパク質がユビキチン結合タンパク質に結合する、工程；および（ｂ）この目的のタンパク質が存在するか否かを決定する工程、を包含する。
【００３０】
さらに特定の実施形態において、工程（ｂ）は、当該分野で公知の免疫学的検出方法または他の検出方法を使用して実施され得る。
【００３１】
第１０の局面において、本発明は、ユビキチン結合タンパク質と関連したユビキチン化タンパク質のプール全体の試験を可能にし、以前に疾患に関連した十分に特徴付けされた標的のレベルを検査する。詳細には、この方法は、（ａ）生物学的サンプルとユビキチン結合タンパク質とを接触させる工程であって、その結果、ユビキチン化タンパク質がユビキチン結合タンパク質に結合する、工程；および（ｂ）目的のタンパク質が存在するか否かを決定する工程、を包含する。
【００３２】
別個の局面において、本発明は、ＩＰＳの発現プロファイルに対する薬物スクリーンの効果のハイスループット分析のためのタンパク質チップを使用する方法、および末梢血、体液、組織生検または糞便サンプル由来の生物学的サンプルのハイスループット診断分析のためのタンパク質チップ技術を使用する方法を企図する。この生物学的サンプルはまた、培養された細胞および任意の供給源由来のタンパク質抽出物を含み、正常状態と異常状態とを区別する。他の目的および利点は、以下の例示的な図面と共に解釈される続く詳細な説明の参照から明らかとなる。
【００３３】
本発明の別の別個の局面において、多重ＧＳＴ−ＵＢＡドメインマトリックスが、単離されたユビキチン化タンパク質および非ユビキチン化タンパク質の数を同時に増加させるために使用され得る。各ＵＢＡドメインは、制限された基質特異性を有するので、これらは、多数のユビキチン化タンパク質および特定の非ユビキチン化タンパク質を単離するために、組み合わせて使用され得る。
【００３４】
本発明のなおさらなる局面において、ＵＢＡ相互作用タンパク質を同定するための代替のストラテジーは、ＵＢＡ含有マトリックスに結合したタンパク質の集団全体を、トリプシンで消化し、そのペプチドを、高速液体クロマトグラフィーで分離し、そして質量分析機による最終分析を実施することによる。ユビキチン由来の配列に対応するペプチドのピークは無視され、そして他の細胞タンパク質から生じるピークのみが特徴付けされる。この代替のストラテジーは、脱ユビキチン化工程およびその後の２Ｄゲル電気泳動の必要性を排除し、ハイスループットスクリーニングのためのロボットおよび自動化へのこの技術の適合を可能にする。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本方法が記載される前に、本発明が、記載される特定のアッセイ法、試験化合物および実験条件に限定されないので、このような方法および化合物が変化し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される技術が、特定の実施形態の記載のみの目的のみのためであり、限定することを意図されないこともまた、理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるからである。
【００３６】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照を包含する。従って、例えば、「ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ」を参照することは、このような複合体の混合物を包含し、「ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ」または「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ」に対する参照は、本明細書中に記載される型の、１つ以上の処方物、方法、および／または工程を包含し、これらは、本開示などを読む際に当業者に明らかになる。
【００３７】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるのと類似または等価の任意の方法および材料が、本発明の実施および試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書中において言及される全ての刊行物は、参考によって本明細書中に援用され、引用された刊行物に関連する方法および／材料を記載する。
【００３８】
（定義）
用語「タンパク質プロファイリング」は、細胞制御および細胞増殖に関連する重要なタンパク質の特定のセットの発現を定量化する方法を意味し、このタンパク質は、ユビキチン結合タンパク質（例えば、Ｒａｄ２３）に結合することによって本発明の方法において単離されたユビキチン化タンパク質および非ユビキチン化タンパク質を含む。
【００３９】
用語「指示タンパク質セット」または「ＩＰＳ」は、ユビキチン結合タンパク質に結合することによって同定された細胞性のサブセットを意味し、このタンパク質のサブセットは、細胞または疾患の、特定の異なるタンパク質発現パターンを示す。特定の例において、マルチサブユニット複合体の１つの構成要素のみが、ユビキチン化される場合、そのＵＢＡマトリックスとの相互作用は、単一のユビキチン化タンパク質およびさらなる非ユビキチン化因子を生じ、この非ユビキチン化因子は、この複合体に存在する特定の非ユビキチン化タンパク質を含み得る。しかし、全てのタンパク質は、潜在的な診断値を有し得、従って、「指示タンパク質セット」に含まれる。用語ＩＰＳの「サブセット」または「重要なサブセット」は、１つ以上の非ユビキチン化タンパク質を意味し、これは、正常な健常サンプルにおいて見出される対応する発現に比べて、異常な条件（すなわち疾患条件）または生理学的条件において変更された発現を示すように確立されたＩＰＳを含む。重要なサブセットタンパク質は、適切なコントロールに比べて疾患の存在下で発現の増加または減少を示すタンパク質、あるいはコントロールタンパク質に比べて構造変化または機能変化（リン酸化またはグリコシル化の変化を含む）を示すタンパク質を含み得る。
【００４０】
「タンパク質発現フィンガープリント」は、単離された指示タンパク質セットの発現パターンであり、本発明の方法によって分析される。
【００４１】
用語「タンパク質発現フィンガープリントのデータベース」または「タンパク質プロファイルのデータベース」は、正常状態および異常状態の両方において、特定の細胞または組織を特徴付ける２つ以上のタンパク質発現フィンガープリントの集団を意味する。
【００４２】
用語「調節する」は、１つの文脈において、細胞または組織のタンパク質発現フィンガープリントを変化させる化合物の能力を意味する。好ましくは、薬物候補は、対応する正常で非病的細胞のプロファイルに対して細胞のフィンガープリントを変化させる能力により同定される。本開示に基づいて、このような調節は、当業者に公知かまたは本明細書中に記載されるアッセイにより決定され得る。
【００４３】
用語「変化する」は、「増加する」および「減少する」を含み、かつ第２のサンプル（またはサンプルセット）と比較して、第１のサンプルまたはサンプルセットにおける、指標タンパク質の豊富さの相対的な増加もしくは減少、または指標タンパク質の発現または活性の相対的な増加および減少をいう。その観察された増加または減少は、使用される技術に依存して変化するが、変化は、当業者に公知の任意の技術により測定され得る。好ましくは、変化は、下記の実施例において記載されるように本明細書中で決定され、そして例えば、硝酸銀染色強度における差異を含む。
【００４４】
用語「異常」状態とは、正常で、健常で、疾患でない状態の条件とはことなる状態を意味する。異常は、疾患開始、疾患発生、形質転換などの状態を含む。この用語はまた別に、正常細胞におけるタンパク質発現パターンにおける差異を顕示にし得る、環境ストレス（機械的ストレスおよび温度ならびに薬物および他の医薬品の影響が挙げられるが、これらに限定されない）を包含する。
【００４５】
（本発明の一般的な局面）
ユビキチン（Ｕｂ）は、真核生物において非常に保存された７６アミノ酸タンパク質であり、プロテアソームとよばれるプロテアーゼによる分解に対する他のタンパク質を特徴付けるためにそれらに共有結合される。ヒトＲａｄ２３タンパク質は、インビボでユビキチン化タンパク質に結合する。この結合相互作用は、高塩条件および変性条件に耐えるのに十分強い。ユビキチン化タンパク質を選択的に精製する方法を開発するために、この特徴を研究した。この特徴は、細胞増殖および細胞発生の最も重要な公知の調節因子を示す。これらの生理学的役割のために、ユビキチン化タンパク質の発現は、病的細胞に対して、健常細胞において、ユビキチン化タンパク質のタンパク質プロファイルフィンガープリントを比較することにより悪性疾患の存在または疾患状態の発生を決定するために診断的に使用され得る。実質的には、細胞増殖および発生のすべての重要な調節因子は、ユビキチン経路による分解に対して標的化される。ウイルスによる細胞の形質転換または癌におけるそれらの変更された増殖特性は、増殖制御のパターンが変更されることを必要とする。ユビキチン経路により分解されるタンパク質の例としては、腫瘍サプレッサー（ｐ５３およびＲｂ）、炎症性応答のインヒビター（Ｉ  Ｂα）、シグナル伝達分子（ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ＭｙｃおよびＧ−α）、細胞周期調節因子（サイクリン、ＣＤＫインヒビター、コヒージョンおよびＰｄｓ１）、トポイソメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
全体的な遺伝子発現をモニタリングするための現在の方法は、遺伝子チップ／ＤＮＡマイクロアレイ技術に依存する。このアプローチは、いくつかの不利益を有し、それらとしては、高い費用、アッセイを実施するための長い所要時間および予測的な機能性を有することが期待される遺伝子のみを選択的に試験することが不可能であることが挙げられる。さらに、特定の環境条件下でｍＲＮＡ発現とタンパク質産物の必要量との間の相互関係は、非常に乏しいものであると示されている。その結果、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ技術により検出された膨大な遺伝子の大部分は、細胞状態における相異を同定し、特徴付けるには有利ではない。
【００４７】
タンパク質プロファイリングは、これまでは、異常細胞のタンパク質発現を試験し、それを正常細胞と比較することによりアプローチされてきた。このアプローチにおいて、少量の総タンパク質は、目的の組織から単離され、そして２次元ゲル電気泳動により分析される。コンピュータープログラムは、複雑な細胞発現プロファイルを特徴付けるために開発されてきた。しかし、このアプローチの深刻な限界は、細胞中のほとんどのタンパク質の発現が形質転換または発癌により影響されないことである。これは、細胞中のほとんどのタンパク質が、安定かつ豊富であり、正常細胞および異常細胞の両方について必要とされる構造的役割を実行するからである。さらにこのアプローチは、重要なタンパク質（例えば、細胞増殖を調節するタンパク質）を選択的に試験しないので、データの優勢は、情報価値のないタンパク質の発現を反映する。高レベルの安定なタンパク質は、存続時間が短く、低レベルで発現される、重要な細胞調節因子の検出を妨害する。このタンパク質の安定性は、ユビキチン媒介性分解により制御される。このタンパク質のサブセットは、多様な生理学的現象（細胞周期進行、ストレス応答およびシグナル伝達を含む）を制御する際に関与する重要な調節因子を示す。しかし、本発明のタンパク質プロファイリング方法は、ユビキチン化タンパク質および非ユビキチン化タンパク質の選択的精製を可能にする。このことは、重要な細胞タンパク質のセットを示す。総タンパク質抽出物における差異のモニタリングが困難であることを示すために、３０分にわたる持続時間タンパク質の安定性を試験した。３０分のインキュベーション後にレベルが減少したタンパク質は、ほとんど検出されなかった（結果示さず）。このことは、非常に大量でかつ安定なタンパク質が、存続時間が短い調節因子の検出を不明瞭にしたことを示唆する。従って、総細胞タンパク質の使用が、細胞のタンパク質プロファイルを試験するには非感受的な方法であることは明らかである。
【００４８】
本発明の方法は、正常な細胞から異常な細胞を区別するための新規なアプローチを示し、例えば、本発明の方法は、癌および他の細胞異常の同定のための診断ツールを提供する。この方法は、正常（病理学または疾患の非存在）の細胞における特定のタンパク質のタンパク質発現に対する疾患または病理学の存在下で生じる特定の鍵タンパク質のタンパク質発現の際の変化を利用する。
【００４９】
本発明は、現在のアプローチに対する前進を示す、なぜなら、それは、細胞の成長および発達において重要な役割を果たすこれらのタンパク質の選択的同定および選択的単離という結果を生じるからである。重要な情報を有さない細胞タンパク質のバルクを除去することによって、鍵指示タンパク質（ＩＰＳ）の小さいサブセットの発現プロファイルは、決定され得る。ＩＰＳの発現プロファイルは、細胞異常の存在を決定するために診断的に使用され得る。さらに、鍵指示タンパク質を含む、ＩＰＳのサブセットは、ＩＰＳからさらに選択され得、対応する正常なコントロールサンプルに関連する疾患または病理学の存在下で変化した発現を示すタンパク質を示す。
【００５０】
さらに、タンパク質プロファイリング法の感度は、複数のＧＳＴ−ＵＢＡドメインマトリックスの使用を通じて高められ得る。この手段において、複数のＧＳＴ−ＵＢＡドメインの刺激的使用は、単離されるユビキチンタンパク質および非ユビキチンタンパク質の数を増加し得る。このことは、各ＵＢＡドメインが、制限された基質特異性を有するので、可能である。従って、組み合せにおいて使用される場合、ユビキチン（および特定の非ユビキチン）タンパク質のより大きな群および別種の群は、同定され得る。
【００５１】
本発明のタンパク質プロファイリング法は、ＩＰＳまたはサブセットのプロファイルを調節（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレート）するための能力について化合物をスクリーニングするため、ならびに薬物の治療的有効性を検査するために有用である。例えば、薬物は、特定の疾患の有害な効果を逆転するかまたは軽減することを期待される。薬物が、この効果を達成する場合、タンパク質プロファイリングは、処置された細胞のタンパク質プロファイリングが、正常な細胞において発現パターンを回復するかまたは取り戻すことを確実にする。
【００５２】
本発明の別の局面において、各細胞サンプルまたは各組織サンプルについて単離された精製ユビキチンタンパク質または精製ＩＰＳは、制限されたタンパク分解消化（例えば、トリプシン）に供され、次いで縦列質量分光計（ＭＳ）分析に供される。このことは、確立されるべき各ＩＰＳの各要素の同定を可能にする。タンパク質スポットの同定に関する情報なしで、「フィンガープリント」を提供するのみである２Ｄゲル分析と対照的に、ＭＳは、成長および発達の情報調節因子の直接的同定についての能力を提供し、そのレベルは、疾患状態に影響される。このアプローチの重要な有利な点は、より低い量のタンパク質が必要とされることである。ＭＳ分析におけるシグナルの大きな断片は、ユビキチンによって発生されるが、ユビキチン由来のタンパク分解断片を示すピークは、公知であり、そして無視され得る。ＭＳ分析の第二の有利な点は、非常に迅速であり、そしてオートメーションおよび高い処理能力適用に容易に適合可能である。
【００５３】
本発明のもう一つの局面において、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄの合理化は、脱ユビキチン工程の除去によって達成され得る。この方法において、ＵＢＡ含有マトリックスに結合したタンパク質の集団全体が、トリプシンで消化され、ペプチドは、高い実施液体クロマトグラフィーによって分解され、そしてピークは、質量分光法によって分析される。他の細胞タンパク質から起始するピークは、特徴付けられるが、ユビキチン由来の配列に相当するこれらのペプチドピークは、無視される。従って、２次元ゲル電気泳動についての必要性は、除去され、従って、高い処理能力スクリーニングのための自動装置およびオートメーションについての技術の適合を可能にする。
【００５４】
以下の実験の節において示されるように、ユビキチン結合タンパク質（例えば、Ｒａｄ２３）によるユビキチンタンパク質および特定の非ユビキチンタンパク質の精製は、単一工程に関し、そして迅速であり、定量的に有効である。結合の親和性は、非常に高い。Ｒａｄ２３は、多量に精製され得、そして親和性マトリックスに容易に結合され得る。これらの物質（例えば、Ｒａｄ２３タンパク質および親和性マトリックス）のコストは、最小である。いくつかの結合薬剤は、市販されており、そしてＲａｄ２３を固定するためおよび安定化するために使用され得る。
【００５５】
さらに、目的のＩＰＳタンパク質を単離するために所望される時間は、最小である。細胞は、２０秒で溶解され得、そしてタンパク質抽出物は、１５分間、親和性マトリックスと共にインキュベートした。次いで、親和性マトリックスは、緩衝液で洗浄され、そして結合タンパク質は、目的の調節因子の集団を含む。全体の工程は、１時間未満で達成され得る。単離されたタンパク質を分析する工程は、当業者に公知な多くの方法を使用して実施され得、直接的なタンパク質消化および質量分光法による分析、または２Ｄゲル電気泳動による分析を含む。一般的に、２Ｄゲル電気泳動は、約２４時間かかることが予期され、そしてさらに硝酸銀による染色法は、約２時間必要であり得る。従って、定量的な結果は、４８時間以内に得られ得る。
【００５６】
図１は、プロテアソームに結合するＲａｄ２３についてのモデルを示す。Ｒａｄ２３は、多重Ｕｂ鎖（黒塗りの丸）に連結される基質と相互作用し得る。ユビキチン基質と相互作用は、さらに多重Ｕｂ鎖アセンブリを過度的に阻害する。Ｒａｄ２３は、プロテアソーム中で特定の多重Ｕｂ鎖結合因子（例えば、Ｒｐｎ１０（図におけるＲＰＮ）にユビキチン基質を送達する。各タンパク質は、鎖中で異なる特性を認識するため、基質連結多重Ｕｂ鎖は、Ｒａｄ２３とＲｐｎ１０との間の相互作用を媒介するようである。Ｒｐｎ１０と多重Ｕｂ鎖の間の相互作用は、疎水性相互作用によって媒介され、そして多重Ｕｂ鎖およびＲｐｎ１０と同時に陰影線によって示される。対照的に、Ｒａｄ２３は、多重Ｕｂ鎖中で遠位のＵｂ部分と相互作用し得る。プロテアソーム関連Ｅ２およびＥ３因子は、有効な分解を促進するため基質をさらにユビキチン化することは、示唆される。このスキームはまた、Ｄｄｉ１およびＤｓｋ２を含む、他のＵＢＡおよびＵｂＬが、プロテアソームのタンパク分解基質および調節因子の送達において同様の役割を実施することを予期する。
【００５７】
（分析的方法論）
本明細書で使用される場合、「２次元電気泳動」（２Ｄ−電気泳動）は、等電点電気泳動、その後の変性電気泳動を含む技術を意味し；これは、複数の分離したタンパク質を含む２次元ゲル（２Ｄ−ゲル）を生成する。好ましくは、変性電気泳動の工程は、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用する。２Ｄ−ゲル電気泳動を実施するための高い精度および自動可能な方法および装置が、当該分野において公知であり、刊行物（例えば、ＷＯ９８／２３９５０および米国特許第６，０６４，７５４号）中に記載され、それらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。簡単には、２Ｄ−ゲル電気泳動は、生物学的サンプル中のタンパク質を同定し、選択し、そして特徴付けるための、効率的でコンピューター補助された、方法および装置を提供する。２次元アレイを、これらの電気泳動的移動度および等電点に従う２次元ゲル上で、生体分子を分離することによって生成する。アレイのコンピューター生成デジタルプロファイルを生成し、同一性、見かけの分子量、等電点および、２次元アレイにおいて検出される複数の生体分子の相対量を表し、それによって、複数の生物学的サンプルからのプロファイルのコンピュ−ターの媒介比較ならびに目的の分離されたタンパク質の切除を可能にする。
【００５８】
本発明のタンパク質発現プロファイルフィンガープリントが、当業者に公知のあらゆる方法（本明細書に記載される方法論、キナーゼアッセイ、酵素アッセイ、結合アッセイおよび他の機能的アッセイ、免疫測定ならびにウエスタンブロティングが挙げられる（が、これらに限定されない））によって、定性的にまたは定量的に確立される。１つの実施形態において、フィンガープリントを、それらのＭＷおよびｐＩによって、２Ｄゲルに対する分析による定量的検出によって確立し、ゲルを染色することによって視覚化する。１つの実施形態において、ゲル電気泳動によって分離されるタンパク質を、そして硝酸銀染色またはヨウ化銅染色によって可視化し、そして定量化する。可視化した分離タンパク質についての方法は、当該分野に公知であり、そして、記載される。例えば、Ｒｏｏｔら、（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：３５４−３５９；Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：３３−３７；Ｓｙｒｏｖｙら、（１９９１）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．５６９：１７５−１９６；Ｄｒａｂｅｒ（１９９１）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １２：４５３−４５６；Ｐａｔｔｏｎら、（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０：３２４−３３５；Ｒｏｏｔら、（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８６：６９−７３を参照のこと。別の実施形態において、ＩＰＳまたは重要な指示タンパク質のサブセットを、蛍光染料で染色し、蛍光スキャナーを用いては画像化する。Ｓｙｐｒｏ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）は、この目的のために適した染料である。別の蛍光染料は、ピリジニウム４−［２−［４−（ジペンチルアミノ）−２−トリフルオロメチルフェニル］エテニル］−１−（スルホブチル）−内部塩である。
【００５９】
あるいは、関連する指示タンパク質セットまたはサブセットの発現プロファイルは、免疫測定における検出によって確立され得る。１つの実施形態において、免疫測定を、免疫特異的結合が、ＩＰＳまたはサブセット由来のタンパク質が存在する場合に起こり得るような条件下で、試験される被験体からの生物学的サンプルを、関連する抗体と接触させることによって実施し、そして抗体によって、あらゆる免疫特異的結合の量を検出および測定する。抗体を、当該分野に公知の方法および技術ならびに以下に記載される方法および技術によって産生し得る。
【００６０】
発現プロファイルを確立するためのＩＰＳまたはサブセットの定量的検出のための抗体の使用に加えて、あらゆる適切な免疫測定を使用し得る（この免疫測定としては、技術（例えば、ウエスタンブロット、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント測定法）、「サンドイッチ」免疫測定、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降素反応（ｇｅｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体−固定アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫測定およびプロテインＡ免疫測定を使用する競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられる（限定されない））。
【００６１】
（抗体方法）
本発明によれば、ＩＰＳまたはサブセットタンパク質は、免疫原として使用されて、このような免疫原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。このような免疫原は、上記の方法を含む任意の従来手段によって単離され得る。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）、または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
【００６２】
１実施形態において、ＩＰＳまたはサブセットタンパク質を認識する抗体は、市販され得る。別の実施形態において、ＩＰＳまたはサブセットタンパク質に対する抗体は、公知の抗体産生方法によって生成され得る。特定の実施形態において、ＩＰＳまたはサブセットタンパク質の親水性フラグメントは、抗体産生のための免疫原として使用される。抗体産生において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ））によって達成され得る。本発明の方法において使用され得るポリクローナル抗体は、免疫された動物の血清に由来する抗体分子の不均一集団である。分画されていない免疫血清もまた、使用され得る。種々のアジュバントは、宿主種に依存して、免疫学的応答を増強するために使用され得、アジュバントには、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、界面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール）、およびＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）またはｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのようなアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。さらなるアジュバントもまた、当該分野で周知である。
【００６３】
ＩＰＳまたはサブセットタンパク質に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の調製について、培養物中での継続する細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術が、使用され得る。例えば、元々、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）によって開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスの抗体であり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。本発明のさらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、公知の技術（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５、本明細書中で参考として援用される）を利用して、胚（ｇｅｒｍ）を含まない動物において産生され得る。
【００６４】
モノクローナル抗体としては、ヒトモノクローナル抗体およびキメラモノクローナル抗体（例えば、ヒト−マウスキメラ）が挙げられるが、これらに限定されない。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域およびマウスｍＡｂ由来の可変領域を有する分子である（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、Ｑｕｅｅｎ、米国特許第５，５８５，０８９号（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００６５】
キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ８７／０２６７１；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；欧州特許出願１７３，４９４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３に記載される方法を使用する、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。
【００６６】
（ユビキチン結合タンパク質）
本発明の方法は、ユビキチン結合タンパク質（例えば、Ｒａｄ２３、Ｄｄｉｌ、Ｄｓｋ２およびＲｐｎ１０）を提供する。しかし、類似の特性を持つ他のタンパク質の使用は、本発明の一部と考えられる。ユビキチン結合タンパク質は、遺伝子が入手可能である任意の種から得られ得る。これらのタンパク質は、グルタチオン−セファロース、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、Ｈｉｓ−６エピトープ、Ｆｌａｇ−エピトープ、または、親和試薬または抗体が入手可能である、多くの他のよく特徴付けられたエピトープのいずれかの１つとの融合体として発現され得る。ユビキチン結合タンパク質はまた、マトリックスと結合される特定の抗体に結合され得る。上述のユビキチン結合タンパク質の種々の誘導体と結合される、マトリックスの調製は、本発明の一部であると考えられる。加えて、（前述のエピトープおよびタグを欠失している）任意の上述のユビキチン結合タンパク質は、シアン活性化セファロースに直接結合し得、親和性マトリックスとして用いられ得る。さらに、タンパク質ユビキチン化の酵素学に関係するタンパク質は、ユビキチンとの一時的な相互作用を形成し、そしてまた、ユビキチン化タンパク質に結合するのに有用であることが分かり得る。
【００６７】
さらに、任意の種からのＵＢＡドメインは、ペプチド合成によって新たに構築され得、固体支持媒体に架橋され得る。さらに、合成ＵＢＡペプチド（約３０アミノ酸残基）は、標的タンパク質との相互作用によって検出され得る特異的に高められた特徴を有するドメインを生成するために変えられ得る。この同じ技術を用いて、ＵＢＡ親和性マトリックスの多量体およびハイブリッド形態を組み立て得る。
【００６８】
インタクトユビキチン結合タンパク質に加えて、Ｒａｄ２３、Ｄｄｉｌ、Ｄｓｋ２、アタキシン−３およびｐ６２からのＵＢＡ配列のみを含む親和試薬が、本発明の方法における使用のために作製され得る。同様に、タンパク質中のユビキチン結合モチーフ（例えば、Ｒｐｎ１０／Ｓ５ａ）はまた、本発明の方法において有用な親和性マトリックスの作製のために使用され得る。ＵＢＡドメインは、Ｕｂとの特異的な相互作用を形成し、ユビキチン化細胞性タンパク質との高親和性相互作用のために十分である。これらのドメインのいくらかはまた、特定のユビキチン化されていないタンパク質と相互作用する。複数の、直列に結合されたＵＢＡドメインを含む親和試薬がまた、これらが、ユビキチン化タンパク質およびユビキチン化されていないタンパク質に対してより高い結合効率を与え得るので、試験された。これらのタンパク質は、ユビキチン／プロテアソームシステムを欠失するＥ．ｃｏｌｉから発現および精製される。これらのキメラの構築、精製の方法、および親和試薬の調製が、この技術の構成要素と考えられる。（抗体／抗原相互作用のハプテンおよびアロステリックエフェクターを含む）ユビキチン結合分子の認識のための、合成ペプチドおよび他の合成分子の作製が、この技術の一部であると考えられることが、特筆される。
【００６９】
種々のＵＢＡ含有タンパク質（Ｒａｄ２３、Ｄｓｋ２、Ｄｄｉｌ、アタキシン−３、ｐ６２）が、重複しているが、余剰でない機能を発揮する。従って、これらが、重複しているが完全に余剰である訳ではない範囲のタンパク質と相互作用することが推定される。例えば、Ｒａｄ２３は、活発に増殖している細胞において全ての細胞性のユビキチン化タンパク質の約２５％の間で結合する。しかし、ＵＢＡを含むタンパク質のファミリーは、細胞性のユビキチン化されていないタンパク質の非常に大きな部分に選択的に結合し得る。この結果は、ＵＢＡを含むタンパク質が用いられるところに基づく細胞増殖および発生の重要な調節因子の異なるコホートを選択的に精製するための方法を提供するので、この技術の実行における異なる利点を提供する。
【００７０】
異なるタンパク質由来の配列が、各々Ｕｂに結合し得るので、ＵＢＡドメインが、普遍的なユビキチン（Ｕｂ）結合ドメインであることが、確立された。酵母Ｒａｄ２３に由来する２つのＵＢＡドメインならびにヒトｈＲ２３ＡおよびヒトｈＲ２３Ｂ両方に存在する２つのＵＢＡドメインが、各々高い親和性でユビキチン化細胞性タンパク質に結合し得る。すべての６つのＧＳＴ−ＵＢＡ配列は、図２に示されるように均質になるまで精製された。酵母Ｒａｄ２３タンパク質から調製されたＧＳＴ−ＵＢＡ１が、酵母、マウス、イヌおよびヒト細胞から調製されるタンパク質抽出に適用される場合、ユビキチン化タンパク質との高親和性相互作用が、全ての細胞中で観察された（図３）。
【００７１】
Ｒａｄ２３タンパク質は、構造的に区別できない２つのＵＢＡドメイン（ＵＢＡ１およびＵＢＡ２）を含む。両方のＵＢＡドメインが、Ｕｂと結合し得るが、これらのドメインは、特定のユビキチン化されていない調節タンパク質に対する特異性を有する（図４）。これらの特徴が、個々のＵＢＡドメインの結合特性からわずかに異なり得るので、インタクトＲａｄ２３タンパク質中の２つのＵＢＡドメインの三次元配置は、さらなる特異性に貢献する可能性がある。
【００７２】
特異的なＵＢＡ親和性試薬の使用について、調節タンパク質およびユビキチン化タンパク質の異なるセットが、単離され得る。これは、図５に示されたように、ストレス誘導条件の存在しない場合、インタクトなＲａｄ２３タンパク質が１００より多い細胞タンパク質に結合するので、重要な制約であり、これは、異なるＵＢＡドメインを使用することによって、相互作用因子のセットを細分（ｒｅｆｉｎｅ）するために有用である。
【００７３】
特定のＵＢＡドメインが、図４に示したように、ユビキチン化調節タンパク質および非ユビキチン化調節タンパク質の両方と結合し得る。タンパク質の両方のクラスの同定を許容する特異的試薬が、作製された。
【００７４】
（診断方法）
本発明に従って、疾患あるいは病理を有すると疑われる、またはこれらを有することが知られる非験体より得られた脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、血漿または尿の試験生物学的サンプルが、診断またはモニタリングに使用され得る。一つの実施形態において、コントロールサンプル（既知の健常なコントロールサンプル／被験体由来）または対応するＩＰＳまたはサブセットの以前に決定されたコントロール参照範囲タンパク質プロファイルに対して、試験生物学的サンプル中の異常状態の存在に典型的なＩＰＳまたはサブセットのタンパク質発現プロファイルは、異常状態の存在を示す。別の実施形態において、１つ以上の主要な指標タンパク質が異常状態を示すと同定された場合、対応するコントロールに対して、１つ以上の主要な指標タンパク質の発現の増加あるいは減少は、異常状態の存在を示す。加えて、ＩＰＳ中の１つ以上の主要指標タンパク質の改変（リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボシル化、ニトロシル化、脂肪酸付加および糖付加、タンパク分解性プロセシングまたはユビキチン様修飾因子との結合が挙げられるが、これらに限定されない）は、正常範囲と異なることを示し、そして異常状態を予想する。
【００７５】
現在までに、タンパク質プロファイリング技術が、酵母、マウス、イヌおよびヒト細胞において首尾良く試験され、そして特異的因子が十分量で単離され、それらは質量分析法で同定されている。特に、ヒト細胞におけるタンパク質発現パターンにおける組織特異的相違およびストレス誘導性の相違が、ＵＢＡアフィニティー試薬で検出された。さらに、イヌ心臓モデル系において、コントロール動物、ならびに持続性左心室肥大（ＬＶＨ）を被る動物および心不全（ＨＦ）を被る動物からの心臓組織に由来するタンパク質抽出物において異なるタンパク質が検出された。本研究は、異なる量のユビキチン化タンパク質が、これらの異なる細胞状態の間、ＧＳＴ−ＵＢＡと結合して単離され得ることを明白に確立し（図６）、タンパク質プロファイリング仮説を証明した。同様の結果は、紫外線により誘導されるＤＮＡ損傷に曝露させたヒト乳癌細胞において認められ（図７）、ストレス後のタンパク質発現における相違が検出され得ることを確認した。
【００７６】
本願で同定されるＵＢＡ試薬が、細胞増殖の相違をモニタリングするための強力な新しいツールを示すことが想定される。この点を説明するため、ヒト細胞タンパク質をＵＢＡアフィニティー試薬で単離し、そして質量分析法で同定するために十分量で精製した。ヒトＲａｄ２３タンパク質に由来するＧＳＴ−ＵＢＡアフィニティー試薬は、非常に高いアフィニティーで、ヒト乳癌細胞中の細胞骨格タンパク質の大きいセットに結合する（図８）。対照的に、豊富なハウスキーピングタンパク質（アルコールデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる）は、検出されず、このことは、細胞骨格とタンパク質ＧＳＴ−ＵＢＡの間の相互作用が特異的であることを示した。すべての単離された因子は、よく特徴付けられた細胞骨格の成分であり、細胞構造および細胞接着の両方に必要である。悪性細胞の急速な増殖およびそれらの付随する細胞接着性の損失は、直接細胞骨格に関連していることがよく確立されている。従って、ＧＳＴ−ＵＢＡ試薬は、細胞骨格成分の発現プロファイルのモニタリングにより細胞増殖における変化をモニタリングするためのツールを提供する。従って、この系は、予定外の細胞増殖に向けられた細胞傾向の初期指示薬として有効であることを証明し得る。
【００７７】
さらに、低い結合アフィニティーを有するユビキチン結合タンパク質が容易に同定され得るような方法を微調整することが本発明の目的である。これは、細胞のタンパク質抽出物を様々なＧＳＴ−ＵＢＡマトリックスで予備洗浄することで達成され得る。従って、ＧＳＴ−ＵＢＡと結合するより大量の因子、または高い結合アフィニティーを有する因子が最初にＧＳＴ−ＵＢＡ１に結合され得、そして除去され得る。次いで、吸着後の上清（おそらく、短いユビキチン鎖と結合したタンパク質（より弱いアフィニティー）、ならびにＵＢＡと結合し得る非ユビキチン化制御タンパク質を含む）が単離され得る。これは、図９に示され、ここで大量の因子が除去される場合、豊富ではないタンパク質の検出が可能となる。従って、本発明に従い、予備洗浄工程は、豊富ではないタンパク質またはより低いアフィニティーのタンパク質の単離を可能にするために必要であり、この工程はまたこれらの診断価値の点において重要であり得る。
【００７８】
（スクリーニング法）
本発明は、異常な発現パターンを改善するように（例えば、正常なフィンガープリントにより類似する）、ＩＰＳまたはサブセットのタンパク質の発現パターンを変化させ得るような薬剤（例えば、候補組成物または試験組成物）を同定するための方法を提供する。薬剤、候補組成物または試験組成物の例としては、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、小分子ならびに他の薬物が挙げられるが、これらに限定されない。薬剤は、以下を含む当該分野で公知であるコンビナトリアルライブラリー法において、多くのアプローチのうちいくつかを用いて得られ得る；生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ−１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；ならびにアフィニティークロマトグラフィー抽出を用いる合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定され、一方他の４つのアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５；米国特許第５，７３８，９９６号；および同５，８０７，６８３号、このそれぞれが、その全体が参考として本明細書中に援用される）。
【００７９】
本発明の別の異なる局面において、複数のＧＳＴ−ＵＢＡドメインが、単離されるユビキチン化タンパク質の数を増加させるために同時に使用され得る。各々のＵＢＡドメインは、限定された基質特異性を有するので、それらは、多数のユビキチン化タンパク質および特定の非ユビキチン化タンパク質を単離するために組み合わせて使用され得る。
【００８０】
本発明のなおさらなる局面において、ＵＢＡ相互作用タンパク質を同定するための代替のストラテジーは、ＵＢＡ含有マトリックスに結合したタンパク質の全集団をトリプシンで消化し、高速液体クロマトグラフィーによりペプチドを分解し、そして質量分析法により最終の分析を実施することによる。ユビキチン由来の配列に対応するペプチドピークは無視され、そして他の細胞タンパク質に由来するもののみが特徴付けられる。この代替のストラテジーは、脱ユビキチン化工程およびその後の２Ｄゲル電気泳動の必要性を排除し、そして高スループットスクリーニングのためにロボットを利用しそして自動化するための技術の適合を可能にする。
【００８１】
１つの実施形態において、ＩＰＳ直接相互作用を通じてＩＰＳタンパク質の発現を変更する因子は、細胞ベースのアッセイ系において同定される。別の実施形態において、直接相互作用を通じてＩＰＳタンパク質の発現を変更する因子は、無細胞アッセイ系において同定される。この実施形態に従って、ネイティブまたは組換えＩＰＳが、候補化合物またはコントロール化合物と接触され、そしてＩＰＳタンパク質に直接結合する候補化合物の能力が決定される。所望の場合、このアッセイは、複数の候補化合物（例えば、ライブラリー）をスクリーニングするために使用され得る。好ましくは、ＩＰＳタンパク質は、例えば、ＩＰＳタンパク質と、それを特異的に認識および結合する固定化抗体とを接触させるか、またはＩＰＳの精製された調製物と、タンパク質を結合するよう設計された表面とを接触させることにより、最初に固定化される。ＩＰＳタンパク質は、部分的にかもしくは完全に精製され得る（例えば、部分的にかもしくは完全に他のポリペプチドを含まない）かまたは細胞溶解物の一部であり得る。さらに、ＩＰＳタンパク質のサブセットは、ＩＰＳもしくはサブセット、またはその生物学的に活性な部分、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのようなドメインを含む融合タンパク質であり得る。あるいは、ＩＰＳタンパク質は、当業者に周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）を用いてビオチニル化され得る。ＩＰＳタンパク質に直接相互作用する候補化合物の能力は、当業者に公知の方法によって決定され得る。
【００８２】
別の実施形態において、細胞ベースのアッセイ系は、ＩＰＳタンパク質の産生もしくは分解を担うかまたはＩＰＳタンパク質の翻訳後修飾を担うタンパク質（例えば、酵素）またはその生物学的に活性な部分の発現を調節する因子を同定するために使用され得る。一次スクリーニングにおいて、複数の化合物（例えば、ライブラリー）は、ＩＰＳタンパク質の産生、分解、または翻訳後修飾を担う化合物を同定するために、（ｉ）ＩＰＳタンパク質、その融合構築物、またはそれらのいずれかの生物学的に活性なフラグメント、および（ｉｉ）ＩＰＳタンパク質のプロセシングを担うタンパク質を天然に発現するかまたは組換え発現する細胞と接触される。所望の場合、一次スクリーニングにおいて同定される化合物は、次いで、目的の特定のＩＰＳタンパク質を天然にかまたは組換え発現する二次スクリーニングにおいてアッセイされ得る。ＩＰＳタンパク質の産生、分解、または翻訳後修飾を調節する候補化合物の能力は、当業者に公知の方法（フローサイトメトリ、シンチレーションアッセイ、免疫沈降、およびウェスタンブロットアッセイが挙げられるがこれらに限定されない）によって決定され得る。
【００８３】
別の実施形態において、ＩＰＳタンパク質の発現を調節する（すなわち、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）因子は、ＩＰＳタンパク質を発現する細胞（例えば、原核生物起源または真核生物起源の細胞）を、候補化合物またはコントロール化合物（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））と接触させ、そしてＩＰＳタンパク質、ＩＰＳタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を決定することにより同定される。候補化合物の存在下での選択されたＩＰＳタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルは、候補化合物の非存在下（例えば、コントロール化合物の存在下）でのＩＰＳまたはｍＲＮＡの発現レベルと比較される。候補化合物は、次いで、この比較に基づき、ＩＰＳの発現の調節因子として同定され得る。例えば、ＩＰＳまたはｍＲＮＡの発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下で有意に大きい場合、候補化合物は、ＩＰＳまたはｍＲＮＡの発現の刺激因子として同定される。あるいは、ＩＰＳまたはｍＲＮＡの発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下で有意に小さい場合、候補化合物は、ＩＰＳまたはｍＲＮＡの発現のインヒビターとして同定される。ＩＰＳタンパク質またはそれをコードするｍＲＮＡの発現レベルは当業者に公知の方法により決定され得る。例えば、ｍＲＮＡの発現は、ノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによってアッセイされ得、そしてタンパク質レベルは、ウェスタンブロットアッセイによってアッセイされ得る。
【００８４】
別の実施形態において、ＩＰＳタンパク質の活性を調節する因子は、ＩＰＳタンパク質を含む調製物またはＩＰＳタンパク質を発現する細胞（例えば、原核生物または真核生物）を、試験化合物またはコントロール化合物と接触させ、そしてＩＰＳタンパク質の活性を調節する（例えば、刺激または阻害する）試験化合物の能力を決定することにより同定される。ＩＰＳタンパク質の活性は、ＩＰＳの細胞性シグナル伝達経路（例えば、細胞内Ｃａ２＋、ジアリルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒活性または酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（例えば、ＩＰＳに応答性であり、検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されている調節エレメント）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞の分化、または細胞の増殖）を検出することにより同定される。本明細書に基づいて、当業者に公知の技術は、これらの活性を測定するために使用され得る（例えば、米国特許第５，４０１，６３９号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。次いで、候補化合物は、コントロール化合物に対する候補化合物の効果を比較することにより、ＩＰＳタンパク質の活性の調節因子として同定され得る。適切なコントロール化合物としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および通常の生理食塩水（ＮＳ）が挙げられる。
【００８５】
別の実施形態において、ＩＰＳタンパク質の発現、活性、または発現と活性の両方を調節する（すなわち、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤は、動物モデルにおいて同定される。適切な動物の例としては、マウス、ラット、ウサギ、サル、モルモット、イヌ、およびネコが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、使用される動物は、目的の疾患のモデルを表す。この実施形態に従って、試験化合物またはコントロール化合物は、適切な動物に投与（例えば、経口的、直腸的、非経口的（例えば、腹腔内または静脈内））され、そしてＩＰＳタンパク質の発現、活性、または発現と活性の両方に対する効果が、決定される。この実施形態に従って、試験化合物またはコントロール化合物は、適切な動物に投与（例えば、経口的、直腸的、非経口的（例えば、腹腔内または静脈内））され、そしてＩＰＳタンパク質の発現、活性、または発現と活性の両方または発現と活性の両方に対する効果が、決定される。ＩＰＳタンパク質の発現の変化は、上記に概説した方法によって評価され得る。
【００８６】
なお別の実施形態において、ＩＰＳタンパク質を２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおいて「バイトタンパク質」として使用して、他のタンパク質、および／またはＲＮＡ（ＩＰＳタンパク質に結合するか、または相互作用する）を同定する（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９４／１０３００）。当業者が理解するように、このような結合タンパク質は、おそらく、本発明のＩＰＳタンパク質によるシグナルの伝播に、例えば、本発明のＩＰＳタンパク質が関与するシグナル伝達系路の上流エレメントまたは下流エレメントとしても関与する。
【００８７】
（実験結果）
酵母からヒトまでＲａｄ２３タンパク質は、プロテアソームサブユニットＲｐｎ１０／Ｓ５ａに結合するＵｂＬＲ２３ドメイン、およびユビキチンおよびユビキチン化細胞タンパク質に結合するＵＢＡドメインを含む。以下の実施例１は、Ｒａｄ２３が、ユビキチン化細胞タンパク質に結合し得ることを示す。かなり、この相互作用は、ＵＢＡドメインを必要とした。なぜなら、特定の変異体は、ユビキチン化細胞タンパク質に結合しないか、またはインビボで基質を試験しないからである。ＵｂＬＲ２３ドメインまたは機能的ＵＢＡドメインのいずれかを欠くＲａｄ２３変異体は、ｒａｄ２３Δｒｐｎ１０Δの欠点を抑圧しないので、ユビキチン化タンパク質とプロテアソームとの相互作用はともに、Ｒａｄ２３機能を必要とする。Ｒａｄ２３の高レベルの発現は、プロテアソームにおけるユビキチン化タンパク質のレベルの劇的な増加を生じたこともまた、決定された。この興味深い知見は、ユビキチン化タンパク質とプロテアソームとのインビボでの相互作用を明らかにすることの第１の証拠である。さらに、これらの知見は、Ｒａｄ２３が、ユビキチン化タンパク質の、プロテアソームに存在するＲｐｎ１０へのトランスロケーションを媒介することを示唆する。まとめると、これらの結果は、「シャトル因子仮説」についての反論し得ない支持を提供し、ここで、ＵｂＬドメインおよびＵＢＡドメインを含むＲａｄ２３および他のタンパク質（例えば、Ｄｓｋ２（Ｂｉｇｇｉｎｓら（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３３：１３３１−１３４６）およびＤｄｉｌ（Ｃｌａｒｋｅら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：１９９７−２００７））は、プロテアソームに対してタンパク質分解基質を転座させる新規な調節因子である。
【００８８】
Ｒａｄ２３は、ＤＡＮ修復タンパク質として初期に特徴付けられ、このタンパク質の修復因子Ｒａｄ４（ヒトにおけるＸＰＣ）（Ｇｕｚｄｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２９７３−１２９７６；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｐｅｋら（１９９６）前出）との相互作用は、ＤＮＡ損傷の部位における修復タンパク質のアセンブリを促進した（Ｇｕｚｄｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３１５４１−３１５４６；Ｊａｎｓｅｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３３１１１−３３１１４）。Ｒａｄ２３のアミノ末端におけるユビキチン様（ＵｂＬ）ドメインの発見は、潜在的なタンパク質分解機能を示唆した。これは特に、完全な機能性が、ＵｂＬＲ２３が、ユビキチン（Ｕｂ）（Ｗａｔｋｉｎｓら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７７５７−７７６５）によって置換された場合に達成されたからである。本発明者らは、Ｒａｄ２３は、そのＵｂＬＲ２３ドメインを介して触媒的に活性なプロテアソームと相互作用したことを以前に報告した（Ｓｃｈａｕｂｅｒら（１９９８）前出）。酵母Ｒａｄ２３におけるＵｂＬＲ２３の喪失は、ＤＮＡ損傷に対する感受性を生じ、このことは、プロテアソーム相互作用が、ＤＮＡ修復の間に重要であることを示す。しかし、Ｒａｄ２３／プロテアソーム相互作用が、ＮＥＲの間のタンパク質分解事象を媒介するか否かは不明である（Ｇｉｌｌｅｔｔｅら（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１５２８−１５３９；Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３：６８７−６９５）。Ｒａｄ２３／プロテアソーム相互作用は、ＤＮＡ修復の間に非タンパク質分解機能に関与することが考えられるが、幾つかの一連の証拠は、タンパク質分解においての役割を予想する。本発明者らの研究、ならびに他の報告は、Ｒａｄ２３は、Ｕｂに結合し得（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔら（２００１）前出；  Ｃｈｅｎら（２００１）前出）、基質連結多重Ｕｂ鎖のアセンブリを調節し得（Ｏｒｔｏｌａｎら（２０００）前出）、そしてインビボでタンパク質の安定性を制御し得る（Ｃｌａｒｋｅら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：１９９７−２００７）。さらに、Ｒａｄ２３は、インビトロで多重Ｕｂ鎖に結合することが最近報告された（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら（２００１）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：９３９−９４３）。別の研究は、Ｒａｄ２３は、Ｒａｄ４の安定性を制御し得ることを提唱した（Ａｒａｋｉら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：１８６６５−１８６７２）。このことは、本発明者らが、Ｒａｄ４−ＨＡが、幾つかのクロマトグラフィー工程の後に、Ｒａｄ２３および２６Ｓプロテアソームとともに同時精製され得ることを以前に示したことから、興味深い（Ｓｃｈａｕｂｅｒら（１９９９８）前出）。
【００８９】
高レベルのＲａｄ２３の発現は、酵母細胞において、ユビキチン化タンパク質の集積を生じた。Ｒａｄ２３におけるＵＢＡドメインは、インビボでのユビキチン化細胞タンパク質との相互作用を媒介し、そしてユビキチン化タンパク質に結合し得ない変異体は、生化学的欠陥および生理学的欠陥を呈した。Ｒａｄ２３とユビキチン化タンパク質との間の相互作用は、ＤＮＡ損傷後に一時的に増加し、そしてこれらのユビキチン化タンパク質は、時間経過ともに、より高分子量の誘導体に変換した。対照的に、プロテアソーム（ΔＵｂＬｒａｄ２３）に結合し得ないＲａｄ２３変異体は、ユビキチン化タンパク質との持続的な相互作用を形成し、より高分子量の結合体の形成の増加は見られなかった。この結果の１つの解釈としては、幾つかの基質について、多重Ｕｂ鎖の完全アセンブリは、プロテアソームとの相互作用を必要とし得るということである。
【００９０】
Ｒａｄ２３は、多重Ｕｂ鎖と結合するプロテアソームにおけるサブユニットである（ｖａｎ  Ｎｏｃｋｅｒら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：６０２０−６０２８）、Ｒｐｎ１０（Ｌａｍｂｅｒｔｓｏｎら（１９９９）前述）と重複する役割を行う。ユビキチン化タンパク質と結合できないＲａｄ２３変異体は、インビボで試験基質を安定化することも、ｒａｄ２３  ｒｐｎ１０のタンパク質分解および増殖欠損を抑制することもできない。以前のインビトロ解析と一致して、本発明者らは、Ｒｐｎ１０が、インビボでユビキチン化タンパク質と相互作用すること、およびさらには、Ｒａｄ２３と特異的相互作用を形成することを見つけた。Ｒａｄ２３およびＲｐｎ１０は、異なったＵｂ結合ドメインを包含し、多重Ｕｂ鎖における構造的に独特の特徴と相互作用する傾向にある。本発明者らは以前に、Ｒａｄ２３が、短い、基質に結合する多重Ｕｂ鎖と結合し得ることを示し、およびここで示される結果が、Ｒａｄ２３はまた、より長い多重Ｕｂ鎖を包含する基質とも結合することを示す。長い多重Ｕｂ鎖における遠位のＵｂ成分は、厳密に充填されておらず、短い基質に結合する多重Ｕｂ鎖と類似し得る（Ｃｏｏｋら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６４６７−１６４７１）。これに対して、Ｒｐｎ１０は、長い多重Ｕｂ鎖における、Ｕｂ成分の充填の後に産生される疎水性斑を認識する（Ｂｅａｌら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：２９２５−２９３４；Ｔｈｒｏｗｅｒら（２０００）前述）。Ｒａｄ２３と多重Ｕｂ鎖の間の相互作用は、インビトロおよびインビボデータに一貫して（Ｏｒｔｏｌａｎら（２０００）前述）、Ｕｂ特異的プロテアーゼによる分解を防ぎ得、その結果その基質の一過性の安定化を生じさせ得る。プロテアソ−ム中のＲｐｎ１０へのユビキチン化基質の引き続く送達は、分解を開始し得る。これらの結果は、多重Ｕｂ鎖にある異なった領域を認識することによって、Ｒａｄ２３およびＲｐｎ１０がタンパク質分解基質と同時に結合するという考えと一致する。
【００９１】
Ｒａｄ２３とＲｐｎ１０の間の重複する遺伝的相互作用は、それらの両方がプロテオソームへのタンパク質分解基質の送達に影響し得ることを示唆した。生物学的研究が、Ｒｐｎ１０およびＲａｄ２３が共に、インビトロで多重Ｕｂ鎖と結合し得、インビボでユビキチン化タンパク質と結合し得、そしてプロテアソ−ムと相互作用し得る（Ｄｅｖｅｒａｕｘら（１９９４）前述；Ｇｌｉｃｋｍａｎら；（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３１４９−３１６２；Ｓｃｈａｕｂｅｒら（１９９８）前述）。これらの結果および他の結果（Ｈｉｙａｍａら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８０１９−２８０２５）と一致して、本発明者らは、Ｒａｄ２３およびＲｐｎ１０が相互作用すると決定した。しかしながら、Ｈｉｙａｍａら（１９９９）の研究（前述）と比べて、本発明者らは、ＵｂＬドメインが、Ｒａｄ２３／Ｒｐｎ１０の相互作用に不可欠ではなく、基質に結合する多重Ｕｂ鎖がこれら２つのタンパク質の間の相互作用を架橋し得ることを示唆する。
【００９２】
プロテアソ−ムへの基質の送達におけるＲａｄ２３およびＲｐｎ１０の役割を調べるために、本発明者らは、２０Ｓコア粒子（Ｐｒｅ１−Ｆｌａｇ）中に存在するサブユニットを用いて、ｒｐｎ１０からおよび野生型細胞からプロテアソ−ムを免疫沈降させた。低レベルのユビキチン化タンパク質が、野生型株からプロテアソ−ムと共に共沈された。対照的に、多重Ｕｂ鎖との相互作用に一致して、かなり低レベルのユビキチン化タンパク質が、ｒｐｎ１０から分離されるプロテアソ−ムにおいて検出された。プロテアソ−ム関連ユビキチン化タンパク質のレベルは、Ｒａｄ２３が過剰発現するとき劇的に増加し、Ｒａｄ２３がプロテアソ−ムへ基質を送達するという考えを支持する。重要なことには、これらのユビキチン化タンパク質が、プロテアソ−ムと共に精製され得ないが、ｒｐｎ１０におけるＲａｄ２３の過剰発現の結果、非常に高レベルの細胞内ユビキチン化タンパク質の蓄積が生じた。これらの結果の適切な解釈は、過剰の遊離Ｒａｄ２３がプロテオソームと相互作用し得、基質結合型Ｒａｄ２３への接近を防ぎ得ることである。その結果、ユビキチン化細胞内タンパク質は、残りがＲａｄ２３と相関して分離し、プロテアソ−ムへ送達され得ない。この結論と一致して、本発明者らは、Ｒａｄ２３がｒｐｎ１０において過剰発現されるとき、ずっと高レベルのユビキチン化タンパク質が蓄積することを見つけた。正常な条件下で、Ｒａｄ２３／プロテアソ−ム相互作用は、プロテアソ−ム結合Ｅ３（Ｘｉｅら（２０００）前述）およびＥ２因子（Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒら（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４６９１−４６９８）によって、さらにユビキチン化を開始するために、基質をＲｐｎ１０に移行させ得る。ユビキチン化した基質をプロテオソームに効率的に移行させることができないことは、ｒａｄ２３  ｒｐｎ１０の多面発現増殖およびタンパク質分解欠損の根底にあり得る。
【００９３】
要するに、これらの発見は、プロテオソームがマルチユビキチン基質を認識するという、インビボでの初めの証拠を提供する。本発明者らの発見は、タンパク質分解基質のプロテアソームへのトランスロケーションにおけるＵｂＬＲ２３およびＵＢＡドメインの両方にとって重要な役割を支持する。Ｒａｄ２３は、ＵｂＬドメインおよびＵＢＡドメインの両方を含む他のタンパク質と重複する役割を行う（Ｄｄｉ１（Ｃｌａｒｋｅら（２００１）前述）およびＤｓｋ２（Ｂｉｇｇｉｎｓら（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３３：１３３１−１３４６）ので、このクラスのタンパク質は基質をプロテアソ−ムへ送達する新規のレギュレーターをコードすると考えられている。本発明者のＲａｄ２３機能に対する今までの理解は、Ｒａｄ２３（ならびにＵｂＬドメインおよびＵＢＡドメインの両方を含む他のタンパク質）が、タンパク質分解基質をプロテアソ−ムにトランスロケ−トする「シャトルファクター」であるという単純モデルによって表され得る（図１）。「シャトルファクター」モデルと一致して、本発明者らは、Ｒａｄ４がＲａｄ２３および２６ｓプロテアソ−ムを共沈さることを以前に示した。Ｐｎｇ１のプロテアソ−ムへのトランスロケーションは、このタンパク質が分解のための基質であるかどうか明らかではないが、Ｒａｄ２３（Ｓｕｚｕｋｉら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１６０１−２１６０７）を必要とすることが報告された。最近の研究は、Ｒａｄ２３が細胞周期レギュレーターＰｄｓ１（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔら（２００１）前述；（Ｃｌａｒｋｅら（２００１）前述）の量を制御しうることを示した。Ｐｄｓ１レベルを制御できないことは、ある意味でｒａｄ２３  ｒｐｎ１０のＧ２−＞Ｍ−期遷移欠損を説明し得る。
【００９４】
実施例２は、単一アフィニティー工程に続いてユビキチン化タンパク質を単離して回復するために、特異的ユビキチン結合タンパク質、組み換えヒトＲａｄ２３の使用を確認するさらなる実施例を示す。
【実施例】
【００９５】
次の実施例は、本発明をどのように作製し、使用するかについて完全な公示および記載を当業者に提供するために行われ、この実施例は、本発明者がそれらの発明とみなす範囲を制限する意図はない。使用される数（例えば、量や温度など）に関して正確性を保証するための努力が行われたが、幾らかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均的分子量であり、温度は（℃（摂氏度））であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【００９６】
（実施例１．材料および方法）
（酵母株およびプラスミド）ｂａｒ１Δ変異体は、一倍体の酵母株ＪＤ４７−１３Ｃ（Ｄｒ．Ｊ．Ｄｏｈｍｅｎにより提供）（ＪＤ４７−１３Ｃ：ＭＡＴａ  ｈｉｓ３−Δ２００ｔｒｐ１−Δ６３  ｌｙｓ２−８０１  ｕｒａ３−５２  ｌｅｕ２−１１２）中で、プラスミドｐＪＧＳＳＴ１を用いて構築された。酵母ＲＡＤ２３遺伝子は、プラスミドｐＤＧ２８（Ｄｒ．Ｒ．Ｄ．Ｇｉｅｔｚにより享受）を用いて、ＪＤ４７−１３Ｃ中で欠失された。ＫＭＹ１１８８はこのｒａｄ２３Δ株のＦＯＡ抵抗性誘導体である。Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３をコードするプラスミド、およびＧＳＴセットのＲａｄ２３融合タンパク質は以前に前述している（例えば、Ａｒａｋｉら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１８６６５−１８６７２を参照のこと）。
【００９７】
（タンパク質および免疫学的方法）  パルス追跡（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ）およびイムノブロット実験が、基本的に本明細書中に前述されるようにおこなわれた（Ｏｒｔｏｌａｎら（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：６０１−６０８およびＣｌａｒｋｅら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．２１：１９９７−２００７，共に本明細書中で参考として援用する）。
【００９８】
簡潔に言えば、対数増殖期の酵母細胞（Ａ６００＝１で約３０ｍｌ容量）が洗浄され、２５０μＣｉ３５Ｓ−Ｍｅｔ＋３５Ｓ−Ｃｙｓを有する標識緩衝液中で懸濁され、３０℃で５分間インキュベートされた。ラジオアイソトープの取り込みは、その細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのシクロへキシミドおよび過剰な非標識メチオニンおよびシステインを有する培養液中で懸濁させることで停止された。間隔をおいて一部を取り出し、液体窒素中で凍結させた。全ての時点で収集された後、０．５ｍｍの酸性洗浄ガラスビーズが添加され、細胞はボルテックスによって溶解された。ＴＣＡ不溶性物質中への３５Ｓ標識の組み込みは、シンチレーションカウンティングによって決定され、等量のタンパク質が等容量に調整され、特異的抗体と共にインキュベートされた。免疫沈降は、代表的には、一定に回転させながら、４℃、３時間行われた。結合タンパク質は洗浄され、ＳＤＳサンプルバッファー中で再懸濁され、煮沸されそして１０％ＳＤＳ包含ポリアクリルアミドゲル中で分解された。分離したタンパク質は、Ｈｏｅｆｅｒセミドライ式転写装置を用いてニトロセルロース膜に転写され、５％ミルク粉末でブロッキングされた。βーガラクドシダーゼに対する抗体は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ，（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から購入した。抗Ｆｌａｇ抗体、抗Ｕｂ抗体および抗ＧＳＴ抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。ＧＳＴ−Ｒａｄ２３に対する抗体は、Ｐｏｃｏｎｏ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏ．によって調製された。イムノブロット検出のために、増大した化学発光キットがＤｕｐｏｎｔ／ＮＥＮから購入された。プロテイン−Ａ  セファロースは、Ｋｅｎｄｒｉｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から、およびＧＳＴ−セファロースはＡｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入された。結果はＫｏｄａｋ１Ｄ−３．５ソフトエアを用いて定量された。
【００９９】
（細胞周期分析）  酵母ｂａｒ１−１変異細胞が１０ｎｇ／ｍｌα−因子（Ｓｉｇｍａ）の添加によって停止された。停止効率は顕微鏡下で決定され、９５％より多い細胞がＧ１で停止した後、その細胞は有糸分裂増殖を再回するためにαー因子を欠く新鮮培地中で再懸濁された。再懸濁後直ぐに、培養液の一部が取り出され、２００μＣｉ３５Ｓ−メチオニン＋３５Ｓ−システインを有する標識緩衝液中に５分間懸濁された。さらに、３５Ｓ標識のさらなる取り込みは、シクロへキシミドの添加によって決定され、その細胞はさらに６０分間（追跡（ｃｈａｓｅ））、インキュベートされた。等容量のアリコートが、追跡中に、各々０分、１０分および６０分後に取り出されて、液体窒素中で凍結された。同様のパルス追跡実験が３０分間隔で行われ、細胞周期の間さらに５回行われた。等量のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）不溶性物質が元のＲａｄ２３およびＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離された沈殿タンパク質に対する抗体と反応され、ニトロセルロースに転写され、Ｘ線フィルムに感光された。同じフィルターが次に、ユビキチンに対する抗体とインキュベートされ、増強化学発光によって検出された。
【０１００】
（ＲＡＤ２３変異体の構築）  ＵＢＡ１を欠失するために、または酵母のＲＡＤ２３のＵＢＡ１ドメインおよびＵＢＡ２ドメインにおける変異体を産生するために、ＤＮＡオリゴヌクレオチドが合成された。ＲＡＤ２３の５’末端および３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドは、酵母発現用のＦｌａｇエピトープを含むベクターへクローニングするためのＥｃｏＲ１およびＫｐｎ１  ＤＮＡ制限酵素切断部位を包含した。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉ中における同じＲＡＤ２３対立遺伝子の発現用に、本発明者らは、５’末端および３’末端にＮｃｏ１およびＢａｍＨ１  ＤＮＡ制限酵素切断部位を包含するオリゴヌクレオチドでＤＮＡを増幅し、ｐＥＴ１１ｄ（Ｎｏｖｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）中でＤＮＡをクローニングした。ＵＢＡ変異体を産生するために使用されるオリゴヌクレオチドは下記に示されており、変異遺伝子は、確認のためにＤＮＡ配列決定された。ＵＢＡ１の欠失を産生するために使用されるプライマーは、以前に記載されている（Ｏｒｔｏｌａｎら（２０００）前述）：＃４６１：５’−ＧＡＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１）＃４６２：５’−ＧＡＡＴＡＣＣＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＧＣ−３’（配列番号２）；＃４７０：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＧＧＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＣＧＡＴＡＴＴＴＧＣＴＧＣＡ−．ＧＣ−３’（配列番号３）。
【０１０１】
（結果）
（Ｒａｄ２３は、ユビキチン化タンパク質に結合する）  Ｒａｄ２３の高レベル発現は、酵母細胞におけるユビキチン化されたタンパク質の蓄積を導く。類似の条件において増殖したコントロール株、または過剰発現したＲｐｎ１０は、この効果を示さなかった。以前の研究は、Ｒａｄ２３が、フリーのユビキチン（Ｕｂ）に結合し得たことを示した（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔら（２００１）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：４１７〜４２２；Ｃｈｅｎら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ２）が、その天然の標的がユビキチン化タンパク質を示すことが予想された。高分子量のユビキチン化タンパク質の蓄積により、本発明者は、それらがＲａｄ２３に結合されたか否かを決定した。
【０１０２】
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｒａｄ２３融合タンパク質のセットを、ユビキチン化タンパク質との相互作用を特徴付けるために、酵母細胞（Ｓｃｈａｕｂｅｒら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７１５〜７１８）から精製した。等量の抽出物を、グルタチオンセファロースとともにインキュベートし、そしてＧＳＴ融合タンパク質と結合したタンパク質を、Ｕｂに対する抗体を用いた免疫ブロットで試験した。全長Ｒａｄ２３およびＮ末端のユビキチン様ドメイン（ΔＵｂＬｒａｄ２３）を欠損する変異体の両方とも、ユビキチン化タンパク質との強い相互作用を形成した。対照的に、ＧＳＴドメイン単独もＵｂＬＲ２３ドメイン単独のいずれも、ユビキチン化タンパク質との検出可能な相互作用を形成しなかった。ＵｂＬＲ２３は、プロテアソーム（ユビキチン化タンパク質と結合する）と相互作用し得るが、これらの結果は、ユビキチン化基質は、迅速に分解されることに起因して、プロテアソームとの結合において通常検出されないことを示唆する（結果は示されない）。
【０１０３】
（Ｒａｄ２３中のＵＢＡドメインは、ユビキチン化タンパク質との相互作用を媒介する）  Ｒａｄ２３（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｐｅｋら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３１：２０〜２７）中のユビキチン結合ドメイン（ＵＢＡ）（Ｈｏｆｍａｎら（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏ．Ｓｃｉ．２１：１７２〜１７３）および他のタンパク質は、Ｕｂに結合する（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔら（２００１）前出；Ｃｈｅｎら（２００１）前出）が、それらがユビキチン化タンパク質にインビボで結合するか否かは、未知であった。この可能性を考察するために、本発明者らは、以前に記載された研究（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔら（２００１））に基づいたＲａｄ２３変異体のセットを生成した。本発明者らは、Ｕｂとの相互作用を防ぐためにＵＢＡ１を欠損するか、または各ＵＢＡドメインにおける単一のアミノ酸置換を含むＲａｄ２３変異体を構築した。各誘導体は、酵母細胞からの迅速な精製を促進するためにアミノ末端Ｆｌａｇエピトープとともに発現された。Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３は、ネイティブタンパク質と機能上置換し得る。上記の結果に一致して、ユビキチン化タンパク質は、Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３とともに効率的に共精製された。しかし、ＵＢＡ１（Ｌ１８３Ａ；ｒａｄ２３ｕｂａ１）における単一のアミノ酸置換は、回収されたユビキチン化タンパク質の量において８０％の減少を引き起こした。対照的に、ＵＢＡ２（Ｌ３９２Ａ；ｒａｄ２３ｕｂａ２）における類似の変異体は、結合を２０％のみ減少させた。これは、以前に記載された（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔら（２００１）前出；Ｃｈｅｎら（２００１）前出）Ｕｂとのより弱い相互作用と一致する両方のＵＢＡドメイン（ｒａｄ２３ｕｂａ１，ｕｂａ２）における変異を含むＲａｄ２３変異体は、完全な欠損であり、そしてユビキチン化タンパク質との相互作用は、野生型タンパク質と比較して約１％に縮小した。ＵＢＡ１（ｒａｄ２３ｕｂａ１）における単一のアミノ酸置換とは対照的に、全ドメインの欠損（ｒａｄ２３Δｕｂａ１；残基１４１〜１９０の除去）は、非常に重症な欠損症を引き起こし、そしてインタクトなＵＢＡ２の存在にもかかわらず、ユビキチン化タンパク質との相互作用は、約１％に縮小された。Ｒａｄ２３中のＵＢＡドメインは、ホモダイマーの形成に関与することが報告されている（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔら（２００１ａ）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９５５〜９６３；Ｂｅｒｔｏｌｅａｔら（２００１）前出）ので、それらは、タンパク質の立体配座完全性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に寄与する可能性があり、そして欠損は、有意な構造的摂動（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を引き起こし得る。独立して折り畳まれたドメインを形成すると考えられる（Ｓｃｈａｕｂｅｒら（１９９８）前出、および本発明者らの未公開研究）ＵｂＬＲ２３（ΔＵｂＬｒａｄ２３）の除去は、ユビキチン化タンパク質との相互作用に影響を及ぼさなかった。同じフィルターをまた、Ｃｉｍ５／Ｒｐｔ１（プロテアソームの１９Ｓ調節粒子中に存在する６つのＡＴＰａｓｅのうちの１つ）に対する抗体とともにインキュベートした（Ｇｌｉｃｋｍａｎら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３１４９〜３１６２）。ΔＵｂＬｒａｄ２３を除いて、全ての他のＲａｄ２３誘導体は、ＵｂＬＲ２３を含み、そしてプロテアソームと結合し得た。Ｒａｄ２３のヒト相対物（ｈＨＲ２３−ＡおよびｈＨＲ２３−Ｂ）もまた、プロテアソームと結合し得、そして基質と結合された多重Ｕｂ鎖の集合をブロックし得る（Ｏｒｔｏｌａｎら（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：６０１〜６０８）。酵母タンパク質との類似性をさらに評価するために、本発明者らは、酵母中でＧＳＴ−ｈＨＲ２３−Ｂを発現させ、そしてこれが、インビボでユビキチン化タンパク質と結合し得ることを見出した。Ｕｂの配列および構造は、酵母およびヒトにおいて実質上同一であるので、これらの結果は、Ｒａｄ２３タンパク質中のＵＢＡドメインが、ユビキチン化タンパク質との結合において進化的に保存された役割を果たすことを示唆した。このタンパク質およびそのヒト相対物Ｓ５ａが、未結合の多重Ｕｂ鎖とインビトロで結合することが示された（Ｄｅｖｅｒａｕｘら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７０５９〜７０６１；ｖａｎ  Ｎｏｃｋｅｒら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：６０２０〜６０２８）ので、本発明者らはまた、Ｒｐｎ１０がインビボでユビキチン化タンパク質と結合し得るか否かを調査した。インビトロの結果に一致して、本発明者らは、Ｆｌａｇ−Ｒｐｎ１０が酵母細胞においてユビキチン化タンパク質と結合し得ることを見出した。
【０１０４】
（ＵＢＡ変異体は、インビボで基質を安定化できない）  次に本発明者らは、ＵＢＡドメインにおける変異がＲａｄ２３の生化学的特性への影響を有するか否かを調査した。第一に本発明者らは、Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３とタンパク質分解性の基質Ａｒｇ−βｇａｌとＵｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌの間での結合（これらの結合は、プロテアソームによってユビキチン化され、そして分解される）を測定した（２；Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２２；３８３〜３８７）。Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３は、ユビキチン化Ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌおよびＡｒｇ−βｇａｌを共免疫沈降し得たが、Ｍｅｔ−βｇａｌ（分解のための標的ではない）を共免疫沈降し得なかった。対照的に、ＵＢＡドメインに変異を含むＲａｄ２３誘導体は、ユビキチン化細胞性タンパク質と相互作用する能力と比例して、これらの基質との結合における様々な程度を減ぜられた。次の実験で、Ｆｌａｇ−ｒａｄ２３ｕｂａ２およびＦｌａｇ−ｒａｄ２３ｕｂａ１  ｕｂａ２変異体タンパク質の細胞性レベルは、Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３より約３倍高く、これは、結合された基質のより高いレベルの原因である。Ｆｌａｇ−ｒａｄ２３Δｕｂａ１およびＦｌａｇ−ｒａｄ２３ｕｂａ１  ｕｂａ２は、Ａｒｇ−βｇａｌおよびＵｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌと不十分に相互作用したが、Ｆｌａｇ−ｒａｄ２３ｕｂａ２は両方とタンパク質分解性基質との有意な相互作用を示した。
【０１０５】
Ｒａｄ２３の過剰発現は、酵母細胞におけるタンパク質分解性基質の安定化を引き起こす。それゆえ、本発明者らは、Ｆｌａｇ−ｒａｄ２３ｕｂａ１  ｕｂａ２とユビキチン化タンパク質の結合の失敗がＵｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌの構造分解を生じることを確認するためにパルス−チェイス方法によってタンパク質の安定性を測定した。予想されるように、Ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌは、効率的にユビキチン化され、そして野生型細胞中で分解された（ｔ１／２〜７分）（結果は示されない）が、Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３の過剰発現はＵｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌ上での多重Ｕｂ鎖の拡大を妨げ、これは強固な安定を生じた（ｔ１／２＞１００分）。Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３と対照的に、Ｆｌａｇ−ｒａｄ２３ｕｂａ１  ｕｂａ２は、Ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌの多重ユビキチン化（ｍｕｌｔｉ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）および多重分解を抑制せず（ｔ１／２〜１０分）、これは、Ｒａｄ２３中のＵＢＡドメインと基質上のＵｂ部分との間の相互作用が、タンパク質の安定性を制御するために重要であることを証明した。
【０１０６】
（Ｒａｄ２３は、ユビキチン化タンパク質と一過性の相互作用を形成する）  以前の研究により、本発明者らは、Ｒａｄ２３がプロテアソームにタンパク質分解性基質を送達するうえで役割を果たし得ることを提唱した（Ｌａｍｂｅｒｔｓｏｎら（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５３：６９〜７９；Ｓｃｈａｕｂｅｒら（１９９８）前出）。この考えを考察するために、さらに本発明者らは、タイムコースアッセイにおいてＲａｄ２３とユビキチン化タンパク質との間の相互作用を測定した。α−マッチング因子（αｍａｔｉｎｇ−ｆａｃｔｏｒ）を培地に添加することによって、酵母細胞の増殖は、Ｇ１期から解放された（Ｍａｄｕｒａら（１９９０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８：４７３７〜４７４２）。培養は、Ｇ１停止で停止され、そしておよそ２世代の間（本発明者らが３０分間隔でパルス−チェイス分析を実行する間）、同調して増殖させユビキチン化タンパク質とネイティブＲａｄ２３タンパク質との間の相互作用を測定した。本発明者らは、Ｒａｄ２３が細胞周期を通って高分子量で３５Ｓ放射性標識物質との結合を形成したことを見出した。以前に記載されたように、プロテアソームとの相互作用にも関わらず（Ｓｃｈａｕｂｅｒら（１９９８）前出）、ネイティブのＲａｄ２３は、安定である（Ｗａｔｋｉｎｓら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７７５７〜７７６５）。同じフィルターを、抗Ｕｂ抗体とともにインキュベートした場合、本発明者らは、高分子種に対する強い反応を検出し、これは、Ｒａｄ２３がユビキチン化された細胞性タンパク質と結合するという仮説と一致する。重大なことに、Ｒａｄ２３とユビキチン化タンパク質との間の相互作用は、チェイスの間に急速に減少した。本発明者らは、この減少はＲａｄ２３に結合されるユビキチン化タンパク質のプロテアソーム媒介性分解を反映することを予測する。
【０１０７】
（Ｒａｄ２３とユビキチン化タンパク質との間の相互作用は、後のＤＮＡ損傷を増大した。）  最近の報告は、ＵＢＡドメインがＲａｄ２３のＤＮＡ修復に特異的な機能のための必要とされないことを示した（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔら（２００１）前出）。ＮＥＲの間にＲａｄ２３とプロテアソームとの間の相互作用はタンパク質分解に関与しないこともまた、提唱された（Ｇｉｌｌｅｔｔｅら（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．１５：１５２８〜１５３９；Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３：６８７〜６９５）。しかし、遺伝的な結果は、Ｒａｄ２３がＲｐｎ１０（Ｌａｍｂｅｒｔｓｏｎら（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５３：６９〜７９）、プロテアソーム関連多重Ｕｂ鎖結合因子（ｖａｎ  Ｎｏｃｋｅｒら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：６０２０〜６０２８）と重複する役割を果たすことを示した。そのうえ、ヒトＲａｄ２３中のＵｂＬドメインは、Ｓ５ａ（Ｒｐｎ１０のヒトの相対物）と結合し得た。最近の研究は、Ｒａｄ２３がＵｂと結合し得ること（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔら（２００１）前出；Ｃｈｅｎら（２００１）前出；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら（２００１）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：９３９〜９４３）、ユビキチン化タンパク質と相互作用し、そして基質と結合された多重Ｕｂ鎖の集合調節し得ること（Ｏｒｔｏｌａｎら（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：６０１〜６０８）を示す。Ｒａｄ２３からのＵｂＬＲ２３の除去は、プロテアソームとの相互作用を妨げ（Ｓｃｈａｕｂｅｒら（１９９８）前出）、そしてＤＮＡ損傷に対する感受性を引き起こす（Ｗａｔｋｉｎｓら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７７５７〜７７６５）ので、Ｒａｄ２３は、その多様な生物学的活性においてタンパク質分解性の役割を実行する可能性がある。
【０１０８】
ＮＥＲとタンパク分解との間の関連を調査するために、本発明者らは、ＤＮＡ損傷後の、ユビキチン化タンパク質とのＲａｄ２３相互作用を試験した。活発に増殖する酵母細胞の培養物を、ＵＶ模倣薬剤４−ニトロソキノリン酸化物（４−ＮＱＯ）またはα接合因子に晒した。タンパク質抽出物を、調製し、そしてＦｌａｇ−Ｒａｄ２３を、沈殿させた。タンパク質を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写し、Ｕｂに対する抗体と共にインキュベートした。同量のユビキチン化タンパク質を、無処理細胞およびα因子処理細胞において、Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３に結合させた（結果は示さない）。対照的に、Ｒａｄ２３とユビキチン化タンパク質との間の相互作用は、４−ＮＱＯ処理後、約２倍増加した。これらの結果の定量を、沈殿させたＦｌａｇ−Ｒａｄ２３の量に合わせて調整した。ＤＮＡ損傷の効果をさらに特徴付けするため、本発明者らは、ユビキチン化タンパク質とＦｌａｇ−Ｒａｄ２３またはＦｌａｇ−ΔＵｂＬｒａｄ２３（ＤＮＡ修復における欠損を引き起こす変異体）（Ｗａｔｋｉｎｓら（１９９３）（前出））のどちらかとの間の結合を比較した。Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３またはＦｌａｇ−ΔＵｂＬｒａｄ２３のどちらかを発現する酵母細胞を、４−ＮＱＯに６０分間晒し、そして次にこのＤＮＡ損傷薬剤欠損培地中に再懸濁した。培養物のアリコートを、０分、１０分、３０分、および６０分後に回収し、そしてタンパク質抽出物を調製した。同量のタンパク質を、Ｆｌａｇ−アガロースと共にインキュベートし、そしてＲａｄ２３に結合させたユビキチン化タンパク質を、免疫ブロット法により検出した。本発明者らは、Ｒａｄ２３に結合させたユビキチン化タンパク質の全体量が、６０分の間にわたって減少したことを見出した。興味深いことに、本発明者らは、Ｆｌａｇ−Ｒａｄ２３に結合させたユビキチン化種が、インキュベーションの経過の間、より高分子量の形態に向かって再分配されることを観察した。Ｒａｄ２３とプロテオソームとの間の相互作用は、Ｃｉｍ５／Ｒｐｔ１の沈澱により明らかであるように、影響を受けなかった。これらの結果とは対照的に、Ｆｌａｇ−ΔＵｂＬｒａｄに結合されたユビキチン化種は、より大きさが不均質であり、そして本発明者らは、より高分子量の誘導体への有意な変換を観察しなかった。予期したように、Ｆｌａｇ−ΔＵｂＬｒａｄは、認め得るプロテオソームとの相互作用を行わなかった。２つのパネル（ＢおよびＥと同じフィルターである、ＤおよびＧ）を、抗Ｒａｄ２３抗体でプローブし、そしてＦｌａｇ−Ｒａｄ２３およびＦｌａｇ−ΔＵｂＬｒａｄの位置を示す。基質−ユビキチン化因子が、プロテオソームにおいて存在する（Ｔｏｎｇｏｎｋａｒら（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４６９１−４６９８；Ｖｅｒｍａら（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：３４２５−３４３９；Ｘｉｅら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）．９７：２４９７−２５０２）ので、これらの発見は、Ｒａｄ２３によるタンパク分解基質のプロテオソームへのトランスロケーション後に、タンパク分解基質の完全ユビキチン化が起こり得る可能性を、増大させる。
【０１０９】
（ＵＢＡ変異体は、ｒａｄ２３Δｒｐｎ１０Δの増殖およびタンパク分解性欠損を抑制しない。）ｒａｄ２３Δｒｐｎ１０Δ二重変異体は、アミノ酸アナログカナバニン存在下または低温度下では増殖できない（Ｌａｍｂｅｒｔｓｏｎら（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５３：６９−７９）。ｒａｄ２３Δｒｐｎ１０Δはまた、タンパク分解性欠損および細胞周期のＧ２期の期間の遅延を示した。これらの多面発現性表現型は、Ｒａｄ２３またはＲｐｎ１０のどちらかをコードするプラスミドでの形質転換後に、完全に抑制された。Ｒａｄ２３／プロテオソーム相互作用はこの抑制において役割を果たしているか否かを決定するため、本発明者らは、ΔＵｂＬｒａｄ２３をｒａｄ２３Δｒｐｎ１０Δにおいて発現させ、そしてどの欠損を軽減することも不可能であることを見出し、Ｒａｄ２３機能についてのプロテオソームの相互作用の重要性を強調した。ここで本発明者らは、Ｒａｄ２３とユビキチン化タンパク質との間の相互作用もまた、ｒａｄ２３Δｒｐｎ１０Δの欠損の抑制のために要求されるか否かを、調査した。本発明者らは、Ｆｌａｇ−ｒａｄ２３ｕｂａ１ｕｂａ２をｒａｄ２３Δｒｐｎ１０Δにおいて発現させ、この変異体は、低温度、またはアミノ酸アナログカナバニン存在下において増殖を復元できないことを見出した（今結果は示さない）。ＵＢＡ２における変異は、Ｆｌａｇ−ｒａｄ２３ｕｂａ２を、３０℃および２３℃で充分に増殖することができるようにしたが、１３℃では増殖させ得なかった（これは、ユビキチン化タンパク質との調節相互作用と一致した）。対照的に、Ｆｌａｇ−ｒａｄ２３ｕｂａ１ｕｂａ２は、３０℃、２３℃および１３℃でのｒａｄ２３Δｒｐｎ１０Δと同様に、増殖を損なわれた（ユビキチン化細胞タンパク質に結合できないことを反映する）。興味深いことに、両変異タンパク質とも、カナバニン含有培地において増殖できなかった。このことは、アミノ酸アナログによる損傷タンパク質の産生が、完全に機能するＲａｄ２３タンパク質を要求することを示す。総合すると、本発明者らの遺伝的結果および生化学的結果は、Ｒａｄ２３の生物学的活性と、ユビキチン化タンパク質との相互作用効率との間の一致を明らかにする。
【０１１０】
（Ｒａｄ２３はＲｐｎ１０を結合し、そしてユビキチン化タンパク質とプロテオソームとの間の相互作用を刺激する。）Ｒａｄ２３およびＲｐｎ１０は、異なった相互作用ドメインを通して、ユビキチン化タンパク質を結合し得（例えば、Ｂｅｒｔｏｌｅａｔら（２００１）（前出）を参照）、これらは、マルチ−Ｕｂ鎖における構造的に異なった特徴を認識することを示唆する。この議論を支持して、本発明者らは、１つまたは２つのＵｂ部分のみを含むタンパク分解基質は、Ｒｐｎにとって非常に質の悪い標的である（Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２；Ｔｈｒｏｗｅｒら（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：９４−１０２）が、Ｒａｄ２３と容易に同時に免疫沈降し得る（Ｏｒｔｏｌａｎら（２０００）（前出））ことを言及する。なお、Ｒｐｎ１０は、Ｒａｄ２３と異なり、モノ−Ｕｂとの認め得る相互作用を示さない。その結果、Ｒａｄ２３およびＲｐｎ１０は、基質のマルチ−Ｕｂ鎖に同時に結合し得る。
【０１１１】
Ｒａｄ２３の機能ははっきりと明らかにされるべきまま残っているが、本発明者らは、Ｒａｄ２３が、プロテオソームへのＲａｄ２３送達の制御によって、タンパク分解基質の安定性を調節し得ることを推測した（Ｌａｍｂｅｒｔｓｏｎら（１９９９）（前出）；Ｏｒｔｏｌａｎら（２０００）（前出）；Ｓｃｈａｕｂｅｒら（１９９８）（前出））。Ｒａｄ２３とＲｐｎ１０との間の遺伝的相互作用に基づき、両タンパク質は、この活性に関与するであろう。Ｒａｄ２３機能の魅力的なモデルは、２つのＵＢＡドメインを通してユビキチン化タンパク質を結合する一方で、その後のプロテオソーム（ＵｂＬＲ２３ドメインを含む）との相互作用は、タンパク分解基質のＲｐｎ１０への移動を許容する。多重Ｕｂ（ｍｕｌｔｉ−Ｕｂ）鎖の拡張は、このタンパク質がＲａｄ２３に結合される間、阻害される（インビトロおよびインビボの両方の結果と一致する）。Ｒａｄ２３における２つのＵＢＡドメインの存在は、Ｕｂへ連結されるタンパク分解基質との相互作用についての、機構的な根拠を提供する。
【０１１２】
以前、ヒトＲａｄ２３におけるＵｂＬドメインは、Ｓ５ａ（酵母Ｒｐｎ１０の相対物）を結合し得たこと（Ｈｉｙａｍａら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８０１９−２８０２５）が報告された。Ｒａｄ２３は、Ｒｐｎ１０欠損株においてプロテオソームを結合し得る（Ｌａｍｂｅｒｔｓｏｎら（１９９９）前出）が、Ｒｐｎ１０を含むプロテオソームにおける多様なサブユニットと相互作用し得た。なお、Ｒａｄ２３のＵｂＬドメインおよびＵＢＡドメインの両方における変異は、ｒａｄ２３Δｒｐｎ１０Δの欠損を抑制できなかったので、Ｒａｄ２３がＦｌａｇ−Ｒｐｎ１０と相互作用するか否かを、本発明者らは決定した。本発明者らは、Ｆｌａｇ−Ｒｐｎ１０もまた含む酵母株において、ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｒａｄ２３、ＧＳＴ−ΔＵｂＬｒａｄ２３およびＧＳＴ−ＵｂＬＲ２３を発現させた。同量のタンパク質抽出物を、グルタチオン−セファロースに適用してＧＳＴ融合タンパク質を沈殿させるか、またはＦｌａｇ−アガロースに適用してＦｌａｇ−Ｒｐｎ１０を沈殿させた。本発明者らは、ＧＳＴ−Ｒａｄ２３と共沈殿したＦｌａｇ−Ｒｐｎ１０を見出し、相反実験において、ＧＳＴ−Ｒａｄ２３を、Ｆｌａｇ−Ｒｐｎ１０と共精製した（結果は示さない）。興味深いことに、ＧＳＴ−ΔＵｂＬｒａｄ２３もまた、Ｆｌａｇ−Ｒｐｎ１０との効率的な相互作用を行った。このＲａｄ２３変異体はプロテオソームに結合し得ないので、Ｒａｄ２３およびＲｐｎ１０は、プロテオソームとの相互作用前に、ユビキチン化基質に結合し得る。しかし、この興味深い知見を分析するために、さらなる研究が必要とされる。非常に低いレベルのＧＳＴ−ＵｂＬＲ２３が、Ｆｌａｇ−Ｒｐｎ１０と共沈殿したが、相反実験においては、多量に検出された。Ｒｐｎ１０がＵｂＬＲ２３と直接相互作用するか否か、またはＦｌａｇ−Ｒｐｎ１０との共沈殿が起こるか否かは、明らかでない。なぜなら、両タンパク質ともプロテオソームに結合するからである。ヒトｈＨＲ２３−Ｂもまた、Ｆｌａｇ−Ｒｐｎ１０と相互作用した。このことは予期されていた。なぜなら、本発明者らはヒトｈＨＲ２３−Ｂが多重Ｕｂ鎖と相互作用し得たことを決定したからである。酵母Ｒａｄ２３とＲｐｎ１０との間の相互作用は、これらの２つのタンパク質についての重複機能を明らかにした、本発明者らの遺伝子研究（Ｌａｍｂｅｒｔｓｏｎら（１９９９）（前出））を支持する。
【０１１３】
Ｒａｄ２３／Ｒｐｎ１０相互作用の重要性を特徴付けるために、本発明者らは、ユビキチン化タンパク質のプロテオソームへの標的化が影響されたか否かを調査した。本発明者らは、エピトープタグ化プロテオソームサブユニット（Ｐｒｅ１−Ｆｌａｇ）を野生型細胞およびｒｐｎ１０Δ細胞において発現させ、同様に、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１プロモーターからＲＡＤ２３を高レベルで発現し得るプラスミドを、発現させた。プロテオソームを、Ｆｌａｇ−アガロース上で免疫精製し、そしてＳＤＳ／ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ニトロセルロースに移し、そして抗Ｕｂ抗体と共にインキュベートした。低レベルのユビキチン化タンパク質を、野生型細胞から免疫精製したプロテオソームと結合させた（結果は示さない）。対照的に、はるかに低いレベルのユビキチン化細胞タンパク質を、ｒｐｎ１０Δから免疫精製したプロテオソーム（この多重Ｕｂ鎖結合タンパク質の非存在に起因し得る）と結合させた。あるいは、プロテオソームは、ｒｐｎ１０Δにおいて不安定であると報告されており（Ｇｌｉｃｋｍａｎら（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９４：６１５−６２４）、これは、ユビキチン化基質の貧しい回収を生じるという結果となった。有意により多くの量のユビキチン化タンパク質は、Ｒａｄ２３を野生型細胞において過剰発現した場合に、プロテオソームと共に沈殿した。注目すべきことに、Ｒａｄ２３を、Ｒｐｎ１０欠損株において過剰発現した場合には、同様の増加は、検出されなかった。この結果により、なおさらより著しく、ｒｐｎ１０ΔにおけるＲａｄ２３の高発現が細胞内ユビキチン化タンパク質の劇的な増加量を生じた。集合的に、本発明者らの結果は、Ｒａｄ２３がユビキチン化基質を結合し、そしてプロテオソームにおけるＲａｄ２３のＲｐｎ１０への送達を調節するという仮説を支持する。
【０１１４】
（実施例２）
（Ｒａｄ２３は、インビボでユビキチン化タンパク質を結合し得る）  ヒトｈＨＲ２３−Ｂを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼへの融合体として発現させた。タンパク質抽出物を、グルタチオンセファロースに適用し、そしてＧＳＴ−ｈＨＲ２３−Ｂに結合するタンパク質を、免疫ブロット法において試験した。約２０ｋＤａから２００ｋＤａより多くまでにわたる有意な反応が、抗Ｕｂ抗体に対して検出された（結果は示さない）。これらのタンパク質は、非常に堅くｈＨＲ２３−Ｂに結合され、かつ、ＳＤＳでの処理によってのみ、解離され得た。抗Ｕｂ交差反応物質は、ＧＳＴのみを含有する第二レーンにおいて、検出されなかった。これらのデータは、ヒトＲａｄ２３が、次の単一の親和性工程において回収され得るユビキチン化タンパク質を結合することを、証明した。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ＵｂＬドメインを介するプロテアソームへのＲａｄ２３結合のモデルであり、多重Ｕｂ鎖がＵＢＡ配列を介して結合する。
【図２】酵母および両方のヒトＲａｄ２３タンパク質由来のＧＳＴ−ＵＢＡをコードする融合タンパク質を発現させ、そしてほぼ均質になるまで、Ｅ．ｃｏｌｉから精製した。これらの構築物全てを、細胞抽出物中のユビキチン化タンパク質との相互作用について試験し、そしてほとんど等価であることを見出した。
【図３】酵母Ｒａｄ２３由来のＧＳＴ−ＵＢＡ１を、セファロースマトリックス（ポリＵｂアフィニティービーズ）に架橋し、そして酵母、マウス、イヌおよびヒトの細胞から調製した等量のタンパク質抽出物と共にインキュベートした。ポリＵＢＡ１に適用されたタンパク質抽出物は、種にわたって、ユビキチン化タンパク質と相互作用した。このタンパク質抽出物を、抗ユビキチン抗体を使用して、イムノブロッティングによって試験した。パネルＡ：酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のタンパク質抽出物を、偽（−）またはポリＵｂアフィニティービーズ（＋）に適用した。パネルＢ：マウス由来のタンパク質抽出物を、偽（−）およびポリＵｂアフィニティービーズ（＋）に適用した。パネルＣ：ヒト培養細胞およびイヌ組織由来の全細胞抽出物を試験した。パネルＤ：パネルＣと同様のサンプルを、ポリＵｂアフィニティービーズに適用した。４個全てのフィルターを、抗ユビキチン抗体でプローブし、そして増加した化学発光によって発色させた。
【図４】Ｒａｄ２３の一般的なドメイン構造が示される。Ｒａｄ２３タンパク質は、酵母、植物、マウスおよびヒトから単離され、これらは、全て類似する。アミノ末端ユビキチン様（ＵｂＬ）ドメインは、触媒活性２６Ｓプロテアソームおよびアタキシン−３（ヒト神経変性条件Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＭＪＤ）における原因因子）と相互作用し得る。さらに、Ｒａｄ２３タンパク質は、２つのＵＢＡ配列を含み、これは、構造的に区別できない。ＵＢＡ１およびＵＢＡ２の両方が、ユビキチンおよび多ユビキチン鎖を結合し得ず、ＵＢＡ２のみが、ユビキチン化された他のタンパク質を結合する。この中で、タンパク質のセットは、ＨＩＶ−１コードタンパク質（Ｖｐｒ）；タンパク質脱グリコシル化酵素（Ｐｎｇ１）；メチルアデニンデグリコシラーゼＤＮＡ修復タンパク質（ＭＰＧ）；および転写アダプター分子（ｐ３００）である。ＵＢＡ２はまた、Ｐｄｓ１（ＤＮＡ傷害誘導性チェックポイント、およびＧ１期→Ｍ期細胞周期移行の制御因子）と相互作用しそうである。
【図５】Ｒａｄ２３タンパク質は、精製され、その結合された因子は、２Ｄゲル分析によって分離され、そして銀染色で可視化された。約１００のタンパク質スポットが、検出され得る。
【図６】タンパク質抽出物は、コントロールイヌ心臓組織（ｃｏｎｔ）から調製され、左心室高血圧症を罹患するイヌ（ＬＶＨ）から調製され、そして心不全に罹患した動物（ＬＶＨ／ＨＦ）から調製された。１次元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの左のレーンのセットは、有意によりユビキチン化されたタンパク質が、ｃｏｎｔ．抽出物と比べて、ＬＶＨ抽出物およびＬＶＨ／ＨＦ抽出物においてＧＳＴ−ＵＢＡを結合することを示す。免疫ブロットは、ユビキチンに対する抗体と反応され、化学蛍光の増加によって検出された。右の３レーンのセットは、ユビキチン化されたタンパク質の全レベルが、ＬＶＨ細胞およびＬＶＨ／ＨＦ細胞においてわずかに増加することを示す。
【図７】ヒト乳癌細胞は、ＤＮＡ損傷（ＵＶ光）に曝露され、そしてタンパク質抽出物は、ＧＳＴ−ＵＢＡとインキュベートされた。上のパネルは、バックグラウンドタンパク質が、親和性マトリックスにのみ存在することを示す。ゲルの真ん中の非常に多いスポットが、ＧＳＴ−ＵＢＡタンパク質を示し、顕著な分解生成物が主にＧＳＴを含むことは、留意のこと。しかし、乳癌細胞抽出物とのインキュベーションの後、種々のタンパク質が、ＧＳＴ−ＵＢＡカラム上で検出される（丸および線によって示される）。興味をそそることに、ＵＶ光での処理は、これらの因子のいくつかのレベルの顕著な減少を生じ、このことは、ストレス条件が、インビボでのタンパク質発現プロファイルを変更し得ることを示す。
【図８】技術のバリエーションにおいて、乳癌細胞抽出物は、ＧＳＴ−ＵＢＡと共にインキュベートされ、細胞骨格タンパク質の大きなセットは、質量分析法によって同定された。各主要バンドの同一性は、図の右に示される。元のゲルにおいて多くのさらなるタンパク質が可溶であるが、さらなる分析に供されなかったことは留意のこと。本出願人らは、これまでに、同定された全てのタンパク質が、細胞骨格の構成要素であることは重大であり、このことは、細胞分化および細胞形質転換をモニターするための特有の機会を提供し得ると考える。
【図９】図７に示されるように、ＧＳＴ−ＵＢＡは、乳癌細胞からタンパク質の大きなセットを単離するために使用される（第１適用）。しかし、第１適用からの上清が、真菌のＧＳＴ−ＵＢＡアフィニティーマトリックスに再適用された場合、本出願人は、非常に豊富な因子の全てが除去されたことを観察した。しかし、より少量の因子および少量の新種（矢印によって示される）が、検出された。この結果は、ＵＢＡドメインとの相互作用について、非常に豊富な因子とより少量のタンパク質との間に競合が存在することを示す。模擬反応は、右レーンに示される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月11日(2005.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005519589000001.app