(57)【要約】本発明は、哺乳動物に神経保護を提供する方法であって、神経細胞に対する有害作用に曝されているか、または曝される恐れのある哺乳動物に、リアノジン拮抗剤であるダントロレンを有効量で投与して、神経細胞損傷または神経細胞死を抑制または防止することを含んで成る方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性および慢性神経障害のヒト患者において神経保護を提供する方法であって、薬学的に許容し得る賦形剤中の有効量の化合物、すなわちリアノジン受容体拮抗剤を、前記障害の患者に投与して、神経細胞損傷または神経細胞死を抑制または防止する方法。
【請求項２】
障害が、原発性開放隅角緑内障、慢性閉塞隅角緑内障および正常眼圧緑内障を包含する緑内障である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
障害が糖尿病性網膜症である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
障害が加齢性黄斑変性である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
障害が卒中である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
障害が急性脳損傷である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
障害がアルツハイマー病である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
障害がパーキンソン病である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
障害が、神経細胞に対するグルタメート誘発性興奮毒性作用の結果である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
化合物を、ＮＭＤＡ拮抗剤と組み合わせて投与する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＭＤＡ拮抗剤がメマンチンである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化合物を、抗血管形成剤と組み合わせて投与する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物がダントロレンである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
化合物を、血清濃度０．０１ｎＭないし５μＭを達成するのに充分な量で投与する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
化合物を、経口的、局所的に、または眼内注射、筋肉内注射によって投与する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
化合物が、水溶液、懸濁液、軟膏、ゲルまたはゼリー中に存在する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経学および眼科学に関し、特に、卒中、急性脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、緑内障、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性を包含する疾患状態において、細胞内ストアからのカルシウム放出による細胞内遊離カルシウムの異常上昇によって起こる損傷から神経組織を保護することに関する。
【背景技術】
【０００２】
急性神経損傷（例えば卒中）から、より慢性的な状態（例えばアルツハイマー病）に至る範囲の病理学的状態下に、異常上昇した細胞内遊離カルシウムは、ニューロン損傷を導く一連の反応の初期事象の一つであることが充分証明されている。高レベル細胞内遊離カルシウムは、ミトコンドリア損傷を起こし得、様々な種類の酵素（例えばプロテアーゼ、一酸化窒素シンターゼおよびエンドヌクレアーゼ）を活性化し得る。このようなカルシウムによって誘発され／活性化される細胞応答は、細胞毒性（最終的にはニューロン死をもたらす）を仲介すると考えられる。
【０００３】
細胞内遊離カルシウムの上昇を引き起こし得るメカニズムは主に二つある：１）細胞膜上のカルシウムチャネルおよび非選択的カチオンチャネルを通しての、細胞外空間からのカルシウム流入、並びに２）特殊な受容体−チャネル複合体（例えばリアノジン受容体チャネル）を通しての、細胞内ストア（例えば小胞体およびミトコンドリア）からのカルシウム放出。これら二つのメカニズムはしばしば相互作用する。例えば細胞膜上のイオンチャネルを通って細胞内に入ったカルシウムが、細胞内ストアからの更なるカルシウム放出の引き金と成り得る。このカルシウム誘発性カルシウム放出（ＣＩＣＲ）は、病理学的状態においてニューロン損傷の一因となることが証明されている。
【０００４】
クルタメートは、脳（網膜を包含する）における主要な興奮性神経伝達物質である。その生物学的作用は、様々なグルタメート受容体、例えばＮＭＤＡ受容体、すなわちカルシウム透過性の高い非選択的カチオンチャネルとカップリングしたイオンチャネル型受容体（ionotropic receptor）によって仲介される。病理学的状態において、グルタメートは、急性神経損傷（例えば卒中）ないしより慢性的な状態（例えばアルツハイマー病）のいずれにおいてもニューロン損傷を起こす神経毒となる。このグルタメート興奮毒性は概ね、ＮＭＤＡ受容体がその高カルシウム透過性の故に仲介する。グルタメートの過剰放出または再吸収低下の故にＮＭＤＡ受容体が過度に刺激されると、細胞内カルシウム過負荷が起こり、これは最終的にニューロン死を導き得る。ＮＭＤＡチャネルを通ってニューロンに入ったカルシウムは、特殊なリガンド活性化チャネル（例えばリアノジンチャネル）を介する細胞内ストアからの更なるカルシウム放出を刺激し得る。このカルシウム誘発性カルシウム放出は、ＮＭＤＡ受容体活性化によって引き起こされる細胞応答を増幅し、病理学的状態における興奮性毒性の一因となることがわかっている。
【０００５】
緑内障は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ、網膜の出力ニューロン）の進行性死によって特徴付けられる神経変性性網膜疾患であり、進行性の視力障害をもたらし、最終的には完全な盲目に至らしめる。緑内障は二つの主なカテゴリーに分類することができる：高眼圧性および正常眼圧性。緑内障の病因は未だよくわかっていない。二タイプの緑内障の初期状態は異なるようである。高眼圧緑内障の主要な危険因子は高眼圧であると考えられ、正常眼圧緑内障の発症および進行には血管異常が特に関与すると考えられる。初期状態に相異はあるものの、進行性ＲＧＣ死は、両タイプの緑内障に共通する特徴であるようである。
【０００６】
グルタメート誘発性興奮毒性が緑内障の病理学に大きく関与しているという証拠が増えつつある。緑内障患者の硝子体液中のグルタメート濃度が健常者のそれよりも顕著に高く、硝子体グルタメート濃度が緑内障の場合年月の経過につれて上昇することがわかっている。また、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤のメマンチンが緑内障サルにおいてＲＧＣ損失を軽減することが示されており、このことは、ＮＭＤＡ受容体が、緑内障におけるグルタメート誘発性ＲＧＣ損傷を少なくとも部分的に仲介することを示唆している。
【０００７】
進行性視力障害をもたらす慢性変性性網膜疾患としては、糖尿病性網膜症もある。最近の研究が示すところによると、虚血およびグルタメート興奮毒性が糖尿病性網膜症のニューロン損傷の原因となる。このことは、細胞内ストアからのカルシウム放出が糖尿病性網膜症の病理学に関与するらしいことを示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
様々な有害刺激によって引き起こされる細胞内遊離カルシウムの異常上昇の結果としてＣＮＳニューロンが進行性損傷を受けるのを、阻止または遅延することができる、神経保護作用を有する剤が求められていることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
骨格筋弛緩剤ダントロレンは、リアノジン受容体−チャネル複合体の拮抗剤であることがわかっている（Ｂiochemistry  ２００１、４０、５３１−５４２参照）。ダントロレンは、該受容体に結合するとリアノジンチャネルからのカルシウム放出を阻害する。
【００１０】
ダントロレンは、１−［［５−（ｐ−ニトロフェニル）フルフリリデン］アミノ］ヒダントインである。
【化１】
2005533087.tif 000002
【００１１】
哺乳動物の網膜および他の脳部分のニューロンを有害刺激から保護する新規方法を見出した。本発明の方法では、リアノジン受容体チャネルを介する細胞内ストアからの過剰カルシウム放出をもたらす有害刺激によって引き起こされるＣＮＳニューロン損傷を阻止または軽減するために、リアノジン受容体拮抗剤を使用する。該有害刺激（興奮毒性、虚血、低酸素、ミトコンドリア機能不全、および酸化的傷害を包含する）は、急性および慢性神経障害、例えば緑内障、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、卒中、急性脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病に関与する。本発明の方法は、１種またはそれ以上のリアノジン受容体拮抗剤（例えばダントロレン）を有効量で、哺乳動物に、全身的、局所的、硬膜外に、または眼内注射によって投与することを含んで成る（詳細は後述）。
【００１２】
緑内障、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性に罹患したヒトの網膜ニューロンを保護するために、本発明の活性化合物(またはその混合物もしくは塩)を、本発明に従って、眼科学的に許容し得る担体と混合して眼に投与する。適当な(例えば従来の)眼科学的に許容し得る担体のいずれを使用してもよい。被投与眼に対して、長期的または永久的な悪影響を実質的に及ぼさない担体は、眼科学的に許容し得る。眼科学的に許容し得る担体の例は、生理食塩水および他の水性媒体を包含する。本発明によると、活性化合物は好ましくは、溶液として眼に投与できるように、投与に用いる担体に可溶である。しかし、活性化合物(またはその混合物もしくは塩)の、適当な担体中の懸濁液を使用してもよい。
【００１３】
本発明によると、活性化合物の有効量を眼にデリバーするように、眼科学的に許容し得る担体中に充分な濃度で存在する活性化合物(またはその混合物もしくは塩)を投与する。眼科用処置溶液は、１種またはそれ以上の活性化合物を、好ましくは約０.０００１〜１０％(w／v)、より好ましくは約０.００５〜０.５％(w／v)の濃度範囲で含有する。
【００１４】
本発明に従って活性化合物を処置する眼に投与するために、哺乳動物の眼に直接に薬物を投与するためのどのような方法を用いてもよい。「直接投与」とは、結果として化合物が全身的に利用可能となる通常の全身的薬物投与方法（例えば患者血管への直接注射、経口投与など）を除外することを意図する。活性化合物を哺乳動物眼に直接投与することによる、哺乳動物に対する主な作用は、好ましくは眼圧低下である。より好ましくは、有用な活性化合物を眼に局所適用するか、または眼に直接注射する。化合物を眼科用溶液（点眼剤）として眼に局所適用した場合に、特に良好な結果が得られる。
【００１５】
局所的な眼科用製剤、例えば点眼剤、ゲルまたはクリームの使用は、適用、および用量デリバリーが容易で、全身的副作用(例えば、心臓血管血圧降下)が少ない故に好ましい。眼科用局所製剤の例を表１に示す。略号q．s．は、所望の効果または体積を達成するのに充分な量を意味する。
【表１】
2005533087.tif 000003
【００１６】
表１に記載の眼科用製剤中に、種々の保存剤を使用し得る。好ましい保存剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀および硝酸フェニル水銀を包含するが、それらに限定されない。同様に、上記のような眼科用製剤中に、種々の好ましい賦形剤を使用し得る。そのような賦形剤は、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、および精製水を包含するが、それらに限定されない。
【００１７】
浸透圧調節剤は、必要に応じて、または好都合に加え得る。浸透圧調節剤は、塩(とりわけ、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど)、マンニトールおよびグリセリン、または他の適当な眼科学的に許容し得る浸透圧調節剤を包含するが、それらに限定されない。
【００１８】
眼科学的に許容し得る製剤が得られるのであれば、どのような緩衝剤およびpＨ調節手段を用いてもよい。緩衝剤は、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤およびホウ酸緩衝剤を包含するが、それらに限定されない。製剤のpＨを調節するために、必要に応じて酸または塩基を使用し得る。
【００１９】
同様に、眼科学的に許容し得る抗酸化剤は、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソールおよびブチル化ヒドロキシトルエンを包含するが、それらに限定されない。
【００２０】
眼科用溶液（点眼剤）は、硝子体内に神経保護をもたらす所望の濃度を得るのに必要な頻度で哺乳動物眼に投与し得る。ＡＲＭＤのレーザー処置における光保護のような鋭敏な神経保護効果を達成するためには、処置に先立って保護剤を投与してレーザー処置中に最適な保護を提供することが有利であり得る。網膜神経節細胞を、例えば緑内障またはドライＡＲＭＤの神経損傷作用による損傷から保護する場合のように長期的な処置を行うためには、所望の硝子体内濃度または濃度範囲を常に維持するのに必要な頻度で薬物を投与し得る。換言すれば、リアノジン拮抗剤を活性成分として含有する眼科用溶液（または他の製剤）を、眼において活性成分の有益な神経保護作用を維持するのに必要な頻度で哺乳動物眼に投与する。当業者は理解するであろうが、投与頻度は活性成分の性質および眼科用製剤中のその濃度によって変化する。このような記載において、本発明の眼科用製剤を哺乳動物眼に、およそ１日１回または２回投与し得ると考えられる。
【００２１】
本発明の新規方法は、予防的処置として、すなわち神経に損傷が起こる前に、または病態（例えば緑内障、糖尿病性網膜症またはＡＲＭＤ）の長期進行が起こる前に投与を行う場合に、特に有効である。本発明化合物が神経保護において果たす役割に関して特定の理論で制限することを意図するわけではないが、出願人は、本発明の化合物および方法が細胞内Ｃa２＋放出を阻止すると仮定する（例えば米国特許第５８９１９１１号参照）。
【００２２】
従って、本発明の化合物は、細胞死を抑制する化合物と組み合せて有利に使用し得ることも意図される。そのような細胞死抑制化合物は、ＮＭＤＡ拮抗剤、特にメマンチンを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、ＣＮＳニューロン、特に網膜ニューロンを、急性的および慢性的有害刺激によって引き起こされる損傷から保護するために、リアノジン受容体拮抗剤を使用する方法に関する。
【００２４】
前述のように、疾患状態における細胞内ストアからの過剰カルシウム放出は、ニューロンに対し細胞毒性である。ＮＭＤＡ受容体が仲介する興奮毒性は、上記急性および慢性疾患に共通する、細胞内ストアからの過剰カルシウム放出を誘発し得る一因であると考えられる。例えば、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤のメマンチンは、緑内障サルのＲＧＣを保護するが、これはＮＭＤＡ受容体が緑内障においてグルタメート興奮毒性を少なくとも部分的に仲介することを示唆する。
【００２５】
ＣＮＳニューロンの損傷にはしばしば二つの段階、すなわち一次的および二次的変性があることを示す強力な証拠がある。最初に、直接的なニューロン損傷、例えば局所的虚血、外傷などが、冒されたニューロンの変性をもたらす。しかし、損傷ニューロンにおいて生じる付随する病態生理学的および生化学的事象は恐らく、一次的損傷によって直接に冒されなかった隣接ニューロンがその後に進行性（二次的）変性を起こすことによる。それら二次的作用が主として長期の機能的な結果を決定する。
【００２６】
損傷直後に誘発される応答は、その後の変性応答に強い影響を及ぼす。したがって、この一次的損傷を減少又は緩和する処置は、二次的な変性過程を防止又は遅延させることによって最適な結果をもたらすと考えられる。
【００２７】
網膜ニューロンに対する一次的傷害の前又は後の期間（ただし細胞死の前）に、リアノジン拮抗剤（例えばダントロレン）を哺乳動物の網膜に投与することにより、網膜ニューロンに対して神経保護が付与されることをここに発見した。
【００２８】
有害作用または有害刺激とは、神経細胞に有害または破壊的な事象であると定義される。これは処置を受ける哺乳動物に対する外的な事象に限定されず、疾患状態および病理学的事象（例えば卒中または心臓発作）であって、一連の事象によって神経細胞に有害または破壊的なものを包含する。有害作用の例は、圧迫性もしくは機械的作用または外傷もしくはストレス因子を包含し、これは例えばグルタメート神経毒性、神経への血流障害（虚血）、および網膜に関しては緑内障、糖尿病性網膜症、網膜色素変性および加齢性黄斑変性であるが、それらに限定されない。
【００２９】
ヒト用量と投与
本発明の方法は、ヒトを含む任意の哺乳動物の処置に有効である。
本発明では、有害刺激が神経細胞の死滅又は永続的損傷をもたらさない期間又は時点に、哺乳動物を医薬的に有効な量の神経保護剤で処置する。保護剤は経口投与または眼に局所投与してもよいし、下記の又は当技術分野で知られる他の任意の適当なデリバリー手段で投与してもよい。
【００３０】
本発明によれば、神経損傷を処置するため又は神経細胞死を予防するために、医薬有効量の保護剤を単独で投与することができる。別法として、保護剤を他の薬物と連続して、又は同時に投与してもよい。例えば、抗緑内障剤（例えばβ遮断剤、α２作動剤、ピロカルピンなどのムスカリン剤、炭酸脱水酵素阻害剤（ＣＡＩ）、または他の眼圧（ＩＯＰ）降下剤）と共に、保護剤を使用し得る。また、ＡＲＭＤおよび糖尿病性網膜症の処置のための抗血管形成剤と共に保護剤を使用してもよい。保護剤の最も有効な投与法及び用量管理法は、処置しようとする疾患のタイプ、その疾患の重篤度と経過、過去の治療、その患者の健康状態とその薬剤に対する反応、及び治療医の判断に依存し得る。一般に、神経保護剤は、血清又は硝子体内濃度を０．０１ｎＭ〜５０μＭとする用量で投与すべきである。神経が損傷を受ける前に保護剤を投与することが好ましい。ただし、効果は減少するものの、損傷が起こってから投与することもできる。
【００３１】
神経保護剤の従来の投与法と標準的な用量管理法を使用することができる。ＩＯＰ降下剤などの薬物と神経保護剤の併用に関する最適な用量は、当技術分野で知られる方法を用いて決定することができる。神経保護剤の投与量は、その保護剤と併用する薬物の用量及びその処置法に対するその患者の反応に基づいて、個々の患者について調節することができる。神経保護剤は一度に患者に投与してもよいし、一連の処置として患者に投与してもよい。
【００３２】
薬剤は、局所的に（例えば眼神経保護のために眼内注射によって硝子体内に、又は脊髄保護のために蜘蛛膜下もしくは硬膜外に）投与することができる。本発明の薬剤の多くは、全身的投与、例えば経口投与、もしくは静脈内投与、又は筋肉内注射することができる。更に、網膜および視神経保護用の薬剤であって、角膜を透過し得、充分な硝子体液内濃度を達成するものは、眼に局所投与することもできる。
【００３３】
また、本発明の処置に使用する組成物は種々の形態をとりうる。例えば固体、半固体又は液体剤形（錠剤、丸剤、散剤、防腐または非防腐溶液剤又は懸濁剤、リポソーム、坐剤、注射及び注入溶液など）が挙げられる。これらの組成物が、当業者に知られる従来の医薬的に許容できる担体を含むことも好ましい。
【００３４】
以下の非限定的実施例に、1）神経保護剤の効果の評価、及び2）ダントロレン以外のリアノジン拮抗剤の選択、に使用されるアッセイと測定法について説明する。
【実施例１】
【００３５】
ウサギモデルにおいて神経保護を評価するための実験方法
ＮＭＤＡ誘発性のＲＧＣ損傷に対するダントロレン（ＤＴＬ）のインビボ神経保護効果を評価するために、摘出網膜のＲＧＣ層の細胞数をカウントするための画像化方法を開発した。すなわち、賦形剤または種々の被験剤の硝子体内注射から２週間後にウサギを安楽死させ、処置眼を摘出した。視神経乳頭の直ぐ下から網膜の一片（直径８mm）を切り取り、ＨＥＰＥＳ緩衝Ａmes培地を入れたプラスチック槽内に平らに載せ、epi−fluorescence装置を取り付けたＯlympus顕微鏡（ＢＸ５０ＷＩ）を用いて４０×液浸対物レンズを使用して５×５列の２５視野を画像化した。画像は、Ｈamamatsu  Ｃ４７４２−９５デジタルカメラおよびＩmage−Ｐro Ｐlusソフトウェア（Ｖ４．５）で記録した。その２５視野内の神経節細胞層におけるニューロン総数をカウントした。一つの対照群（賦形剤で処置したウサギ）と、1)ＮＭＤＡ、2)ダントロレン＋ＮＭＤＡ、3)細胞内ナトリウム過負荷により網膜神経節細胞を損傷する神経毒であるベラトリジン（Ｖerat）、および4)ダントロレン＋ベラトリジンで処置した四つの試験群において、同じ測定を行った。四試験群の結果を、対照の結果に関して正規化した。
【００３６】
結果を図１に示す。ＮＭＤＡはＲＧＣ層において５３％の細胞損失をもたらした。ダントロレンで前処置した場合は、ＮＭＤＡ誘発性細胞死は３５％と明らかに低下した。ダントロレンは、ベラトリジンによる細胞損失をも５６％から５０％に減少させた。
【実施例２】
【００３７】
ダントロレン以外のリアノジン拮抗剤を選択するためのアッセイ
リアノジン拮抗剤を決定するアッセイを、Ｌaverら（Ｊ．Ｐhysiol．５３７：７６３−７７８、２００１）の方法を改変して行い得る。すなわち、精製リアノジン受容体−チャネル複合体を平板状リン脂質二重層に組み込み、静止時のカルシウム濃度差は静止時の正常ニューロンと同様とする（１００nＭ細胞質および１mＭ腔）。リアノジン受容体を活性化する種々のリガンドの存在下に、チャネル活性化レベルを測定することができる。作動剤誘発性のチャネル活性化を差し引くことによって、選択しようとする化合物の有効拮抗作用を測定することができる。拮抗剤の特異性は、標準的な市販のスクリーン、例えばＮovaＳcreensによって評価することができる。
【００３８】
本発明の様々な実施例および態様に関して説明したが、本発明はそれらに制限されず、特許請求の範囲によってのみ解釈されるべきであると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、ウサギにおいてインビボでＮＭＤＡが誘発する網膜神経節細胞損傷に対する、ダントロレンの神経保護作用を示す棒グラフである。ＮＭＤＡの硝子体内注射は、対照動物に網膜神経節細胞損失をもたらした。ダントロレンを投与すると、ＮＭＤＡ誘発性の神経節細胞損傷が軽減された。
【図１】
2005533087.tif 000004
【国際調査報告】
2005533087.tif 000005
2005533087.tif 000006
2005533087.tif 000007
2005533087.tif 000008
2005533087.tif 000009