(57)【要約】  本発明は、Ｃｙｐ７ａ、Ｃｙｐ８ｂ、リン脂質輸送タンパク質、回腸胆汁酸結合タンパク質、タウロコール酸ナトリウム共輸送体タンパク質、肝臓脂肪酸結合タンパク質および胆汁酸塩排出ポンプなどのＦＸＲ核ホルモン受容体によって調節される遺伝子を調節する方法および組成物に関する。好ましい態様において、該方法は、コレステロール排出における主要な経路に関与する酵素、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の調節を伴う。本発明はまた、ＦＸＲ核ホルモン受容体に結合し、そして該受容体を活性化するかまたは阻害する化合物、およびＦＸＲ核ホルモン受容体を活性化するかまたは阻害する化合物をスクリーニングする方法にも関する。
2005511519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＸＲの活性化を調節することを含んでなる、ＦＸＲ依存性生理学的プロセスを調節する方法。
【請求項２】
前記ＦＸＲ依存性生理学的プロセスがコレステロール代謝である、請求項１の方法。
【請求項３】
ＦＸＲ標的遺伝子の発現を調節することを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ＦＸＲ標的遺伝子が、コレステロール７ａ−ヒドロキシラーゼ、Ｃｙｐ８ｂ、リン脂質輸送タンパク質、回腸胆汁酸結合タンパク質、タウロコール酸ナトリウム共輸送体タンパク質、肝臓脂肪酸結合タンパク質および胆汁酸塩排出ポンプからなる群より選択されるタンパク質またはペプチドをコードする、請求項３の方法。
【請求項５】
前記ＦＸＲ標的遺伝子がＣｙｐ７ａをコードする、請求項４の方法。
【請求項６】
ＦＸＲの活性化を調節することによってＣｙｐ７ａ発現を調節する、請求項５の方法。
【請求項７】
Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に高い発現レベルに上方制御することによって、コレステロール異化を増加させる、請求項２の方法。
【請求項８】
ＦＸＲの活性化を阻害することによって、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現の上方制御を達成する、請求項７の方法。
【請求項９】
前記ＦＸＲをＦＸＲアンタゴニストと接触させることによって、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現の上方制御を達成する、請求項８の方法。
【請求項１０】
Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に低い発現レベルに下方制御することによって、コレステロール代謝を減少させる、請求項２の方法。
【請求項１１】
ＦＸＲの活性化を増加させることによって、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現の下方制御を達成する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記ＦＸＲをＦＸＲアゴニストと接触させることによって、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現の下方制御を達成する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
Ｃｙｐ８ｂ発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に高い発現レベルに上方制御する、請求項４の方法。
【請求項１４】
Ｃｙｐ８ｂ発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に低い発現レベルに下方制御する、請求項４の方法。
【請求項１５】
ＦＸＲの活性化を阻害することによって、Ｃｙｐ８ｂをコードする遺伝子の発現の上方制御を達成する、請求項１３の方法。
【請求項１６】
ＦＸＲの活性化を増加させることによって、Ｃｙｐ８ｂをコードする遺伝子の発現の下方制御を達成する、請求項１４の方法。
【請求項１７】
リン脂質輸送タンパク質発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に高い発現レベルに上方制御する、請求項４の方法。
【請求項１８】
リン脂質輸送タンパク質発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に低い発現レベルに下方制御する、請求項４の方法。
【請求項１９】
ＦＸＲの活性化を増加させることによって、リン脂質輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現の上方制御を達成する、請求項１７の方法。
【請求項２０】
ＦＸＲの活性化を阻害することによって、リン脂質輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現の下方制御を達成する、請求項１８の方法。
【請求項２１】
回腸胆汁酸結合タンパク質発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に高い発現レベルに上方制御する、請求項４の方法。
【請求項２２】
回腸胆汁酸結合タンパク質発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に低い発現レベルに下方制御する、請求項４の方法。
【請求項２３】
ＦＸＲの活性化を増加させることによって、回腸胆汁酸結合タンパク質をコードする遺伝子の発現の上方制御を達成する、請求項２１の方法。
【請求項２４】
ＦＸＲの活性化を阻害することによって、回腸胆汁酸結合タンパク質をコードする遺伝子の発現の下方制御を達成する、請求項２２の方法。
【請求項２５】
タウロコール酸ナトリウム共輸送体タンパク質発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に高い発現レベルに上方制御する、請求項４の方法。
【請求項２６】
タウロコール酸ナトリウム共輸送体タンパク質発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に低い発現レベルに下方制御する、請求項４の方法。
【請求項２７】
ＦＸＲの活性化を阻害することによって、タウロコール酸ナトリウム共輸送体タンパク質をコードする遺伝子の発現の上方制御を達成する、請求項２５の方法。
【請求項２８】
ＦＸＲの活性化を増加させることによって、タウロコール酸ナトリウム共輸送体タンパク質をコードする遺伝子の発現の下方制御を達成する、請求項２６の方法。
【請求項２９】
肝臓脂肪酸結合タンパク質発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に高い発現レベルに上方制御する、請求項４の方法。
【請求項３０】
肝臓脂肪酸結合タンパク質発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に低い発現レベルに下方制御する、請求項４の方法。
【請求項３１】
ＦＸＲの活性化を増加させることによって、肝臓脂肪酸結合タンパク質をコードする遺伝子の発現の上方制御を達成する、請求項２９の方法。
【請求項３２】
ＦＸＲの活性化を阻害することによって、肝臓脂肪酸結合タンパク質をコードする遺伝子の発現の下方制御を達成する、請求項３０の方法。
【請求項３３】
胆汁酸塩排出ポンプ発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に高い発現レベルに上方制御する、請求項４の方法。
【請求項３４】
胆汁酸塩排出ポンプ発現を、前記細胞で天然に生じるよりも実質的に低い発現レベルに下方制御する、請求項４の方法。
【請求項３５】
ＦＸＲの活性化を増加させることによって、胆汁酸塩排出ポンプをコードする遺伝子の発現の上方制御を達成する、請求項３３の方法。
【請求項３６】
ＦＸＲの活性化を阻害することによって、胆汁酸塩排出ポンプをコードする遺伝子の発現の下方制御を達成する、請求項３４の方法。
【請求項３７】
前記ＦＸＲ依存性生理学的プロセスがトリグリセリド代謝である、請求項１の方法。
【請求項３８】
ＦＸＲの活性化を増加させることによってトリグリセリドレベルを減少させる、請求項３７の方法。
【請求項３９】
ＦＸＲの活性化を阻害することによってトリグリセリドレベルを増加させる、請求項３７の方法。
【請求項４０】
式Ｉ：
【化１】
2005511519.tif 000012
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４いずれかと同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
に記載の化合物と、前記ＦＸＲを接触させることを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項４１】
式Ｉの前記化合物が、クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂからなる群より選択される、請求項４０の方法。
【請求項４２】
式Ｉの前記化合物がクロトリマゾールである、請求項４０の方法。
【請求項４３】
式Ｉの前記化合物が化合物Ｂである、請求項４０の方法。
【請求項４４】
化合物がＦＸＲ受容体を活性化するかまたは該受容体の活性化を阻害するか決定することを含んでなる、薬理学的活性化合物に関してスクリーニングする方法。
【請求項４５】
コレステロール異化およびトリグリセリド代謝からなる群より選択される、ＦＸＲ依存性生理学的プロセスを調節可能な化合物に関してスクリーニングする方法である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
化合物がＦＸＲ活性化を阻害して、それによってコレステロール異化を増加させるかどうかを決定することを含んでなる、請求項４５の方法。
【請求項４７】
ＦＸＲが仲介する遺伝子転写を調節する際に有用である化合物に関してスクリーニングする方法であって、ＦＸＲおよびＲＸＲの混合物を化合物と接触させ、そして前記化合物が、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体および活性化補助因子間の相互作用、またはＦＸＲおよび活性化補助因子間の相互作用を促進するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法。
【請求項４８】
ＦＸＲアンタゴニスト活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、ＦＸＲおよびＲＸＲおよび既知のＦＸＲアゴニストの混合物を、少なくとも１つの前記化合物と接触させ、そして前記化合物が、アゴニストが促進する、ＦＸＲの活性化またはＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体の活性化を阻害するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法。
【請求項４９】
前記の既知のＦＸＲアゴニストが、式Ｉ：
【化２】
2005511519.tif 000013
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４いずれかと同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
の化合物である、請求項４８の方法。
【請求項５０】
式Ｉの前記化合物が、クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂからなる群より選択される、請求項４９の方法。
【請求項５１】
式Ｉの前記化合物がクロトリマゾールである、請求項５０の方法。
【請求項５２】
式Ｉの前記化合物が化合物Ｂである、請求項５０の方法。
【請求項５３】
ＲＸＲが、ＲＸＲ突然変異体（ＲＸＲｍ）であって、機能するＤＮＡ結合ドメインを含有し、そしてリガンド結合ドメインに、ＲＸＲリガンドによる実質的な活性化を妨げるが、その他の点では、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成する能力に実質的に影響を及ぼさない突然変異を有する、前記ＲＸＲ突然変異体である、請求項４７、４８、４９、または５０の方法。
【請求項５４】
コレステロール異化を調節する活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって：
（１）（ｉ）ＦＸＲ受容体、
（ｉｉ）ＲＸＲ受容体、および
（ｉｉｉ）リガンド−ＦＸＲ−ＲＸＲ複合体のＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合するヌクレオチド配列を含有する、標識ＤＮＡプローブ
を含有する、第一の混合物を提供し；
（２）（ｉ）ＦＸＲ受容体、
（ｉｉ）ＲＸＲ突然変異受容体（「ＲＸＲｍ」）であって、機能するＤＮＡ結合ドメインを含有し、そしてリガンド結合ドメインに、ＲＸＲリガンドによる実質的な活性化を妨げるが、その他の点では、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成する能力またはこうしたヘテロ二量体が活性化補助因子を補充する能力に実質的に影響を及ぼさない突然変異を有する、前記ＲＸＲ突然変異受容体、および
（ｉｉｉ）リガンド−ＦＸＲ−ＲＸＲ複合体のＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合するヌクレオチド配列を含有する、標識ＤＮＡプローブ
を含有する、第二の混合物を提供し；
（３）スクリーニングする化合物と、前記の第一の混合物および第二の混合物を接触させ；
（４）該化合物が、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体と活性化補助因子の相互作用、またはＦＸＲと活性化補助因子の相互作用を引き起こすかどうかを決定し；そして
（５）スクリーニングする化合物が、ＦＸＲ−ＲＸＲｍヘテロ二量体と活性化補助因子の相互作用を引き起こすかどうかを決定する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項５５】
前記の第一の混合物および第二の混合物を、既知のＦＸＲリガンドと接触させ、そして前記の既知のＦＸＲリガンドが、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体と活性化補助因子の相互作用、またはＦＸＲと活性化補助因子の相互作用を引き起こす能力を阻害する化合物を選択することをさらに含んでなる、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記の既知のＦＸＲアゴニストが、式Ｉ：
【化３】
2005511519.tif 000014
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４と同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
の化合物である、請求項５５の方法。
【請求項５７】
式Ｉの前記化合物が、クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂからなる群より選択される、請求項５６の方法。
【請求項５８】
式Ｉの前記化合物がクロトリマゾールである、請求項４８の方法。
【請求項５９】
式Ｉの前記化合物が化合物Ｂである、請求項４８の方法。
【請求項６０】
ＦＸＲ、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体またはＦＸＲ−ＲＸＲｍヘテロ二量体と活性化補助因子の実質的な相互作用を引き起こさない化合物を選択することをさらに含んでなる、請求項５５の方法。
【請求項６１】
ＦＸＲが仲介する遺伝子転写を調節する際に有用な化合物に関してスクリーニングする方法であって、ＦＸＲ、ＲＸＲおよび活性化補助因子の混合物を化合物と接触させ、そして前記化合物が、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体またはＦＸＲによる活性化補助因子の補充を促進するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法。
【請求項６２】
ＦＸＲアンタゴニスト活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、ＦＸＲ、ＲＸＲ、活性化補助因子および既知のＦＸＲアゴニストの混合物を、少なくとも１つの前記化合物と接触させ、そして前記化合物が、アゴニストが促進する、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体またはＦＸＲによる活性化補助因子の補充を阻害するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法。
【請求項６３】
前記の既知のＦＸＲアゴニストが、式Ｉ：
【化４】
2005511519.tif 000015
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４と同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
の化合物である、請求項６２の方法。
【請求項６４】
式Ｉの前記化合物が、クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂからなる群より選択される、請求項６３の方法。
【請求項６５】
式Ｉの前記化合物がクロトリマゾールである、請求項６４の方法。
【請求項６６】
式Ｉの前記化合物が化合物Ｂである、請求項６４の方法。
【請求項６７】
ＲＸＲが、ＲＸＲ突然変異体（「ＲＸＲｍ」）であって、機能するＤＮＡ結合ドメインを含有し、そしてリガンド結合ドメインに、ＲＸＲリガンドによる実質的な活性化を妨げるが、その他の点では、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成する能力またはこうしたヘテロ二量体が活性化補助因子を補充する能力に実質的に影響を及ぼさない突然変異を有する、前記ＲＸＲ突然変異体である、請求項６１または６２の方法。
【請求項６８】
ＲＸＲｍが、ヒトＲＸＲαのＡｓｐ３３２→Ｐｒｏ突然変異体である、請求項５３の方法。
【請求項６９】
ＲＸＲｍが、ヒトＲＸＲαのＡｓｐ３２２→Ｐｒｏ突然変異体である、請求項５４、５５または６０の方法。
【請求項７０】
ＲＸＲｍが、ヒトＲＸＲαのＡｓｐ３２２→Ｐｒｏ突然変異体である、請求項６７の方法。
【請求項７１】
活性化補助因子が、リガンド依存性方式で、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体と相互作用するペプチドモチーフを含有するポリペプチドまたはその活性断片である、請求項６１または６２の方法。
【請求項７２】
活性化補助因子が、リガンド依存性方式で、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体と相互作用するペプチドモチーフを含有するポリペプチドまたはその活性断片である、請求項６７の方法。
【請求項７３】
活性化補助因子が、ＳＲＣ−１、ＧＲＩＰ、ＡＣＴＲおよびＰＢＰ／ＤＲＩＰ２０５／ＴＲＡＰ２２０から選択される、請求項６１または６２の方法。
【請求項７４】
活性化補助因子が、ＳＲＣ−１、ＧＲＩＰ、ＡＣＴＲおよびＰＢＰ／ＤＲＩＰ２０５／ＴＲＡＰ２２０から選択される、請求項６７の方法。
【請求項７５】
活性化補助因子がＧＲＩＰ１である、請求項６１または６２の方法。
【請求項７６】
活性化補助因子がＧＲＩＰ１である、請求項６７の方法。
【請求項７７】
ＤＮＡプローブが、配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５４、５５、または６０の方法。
【請求項７８】
ＦＸＲが仲介する遺伝子転写を調節する際に有用な化合物に関してスクリーニングする方法であって：
（ａ）機能可能なプロモーターの調節下にＦＸＲをコードする遺伝子で、哺乳動物細胞をトランスフェクションし；
（ｂ）プロモーターの調節下の機能可能なレポーター遺伝子であって、リガンドに活性化されたＦＸＲまたはＦＸＲ複合体が結合して前記レポーター遺伝子の転写を開始する、機能可能な応答配列をコードするＤＮＡ配列が連結した、前記レポーター遺伝子で、前記細胞をトランスフェクションし；
（ｃ）スクリーニングする化合物の存在下で、前記細胞を培養し；そして
（ｄ）ＦＸＲ活性化の指標として、レポーター遺伝子の転写または発現に関して、前記細胞を監視する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項７９】
機能可能なプロモーターの調節下にＲＸＲまたはＲＸＲｍをコードする遺伝子で、前記細胞をトランスフェクションする、請求項７８の方法。
【請求項８０】
機能可能なプロモーターの調節下に胆汁酸輸送体分子をコードする遺伝子で、前記細胞をトランスフェクションする、請求項７８の方法。
【請求項８１】
機能可能なプロモーターの調節下に胆汁酸輸送体分子をコードする遺伝子で、前記細胞をトランスフェクションする、請求項８０の方法。
【請求項８２】
既知のＦＸＲリガンドの存在下で前記細胞を培養し、そしてレポーター遺伝子の転写または発現の減少が、スクリーニングする化合物がＦＸＲアンタゴニストであることの指標である、請求項７８、７９、８０または８１の方法。
【請求項８３】
前記の既知のＦＸＲアゴニストが、式Ｉ：
【化５】
2005511519.tif 000016
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４いずれかと同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
の化合物である、請求項８１の方法。
【請求項８４】
式Ｉの前記化合物が、クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂからなる群より選択される、請求項８３の方法。
【請求項８５】
式Ｉの前記化合物がクロトリマゾールである、請求項８３の方法。
【請求項８６】
式Ｉの前記化合物が化合物Ｂである、請求項８３の方法。
【請求項８７】
コレステロール異化を増加させるのに有用な化合物を同定するのに使用する、請求項７７の方法。
【請求項８８】
請求項４７、４８、４９、５０、５４、５５、５６、５７、６０、６１、６２、７８、７９、８０または８１の方法によって選択される、非天然発生化合物。
【請求項８９】
請求項５３の方法によって選択される、非天然発生化合物。
【請求項９０】
請求項６３の方法によって選択される、非天然発生化合物。
【請求項９１】
請求項８８の化合物の療法的にまたは予防的に有効な量を、薬学的に許容しうるキャリアーと組み合わせて含んでなる、薬剤組成物。
【請求項９２】
請求項８９の化合物の療法的にまたは予防的に有効な量を、薬学的に許容しうるキャリアーと組み合わせて含んでなる、薬剤組成物。
【請求項９３】
請求項９０の化合物の療法的にまたは予防的に有効な量を、薬学的に許容しうるキャリアーと組み合わせて含んでなる、薬剤組成物。
【請求項９４】
請求項９１の薬剤組成物の有効量を投与することを含んでなる、高コレステロール血症に関して哺乳動物を治療する方法。
【請求項９５】
請求項９２の薬剤組成物の有効量を投与することを含んでなる、高コレステロール血症に関して哺乳動物を治療する方法。
【請求項９６】
請求項９３の薬剤組成物の有効量を投与することを含んでなる、高コレステロール血症に関して哺乳動物を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
［０００１］本出願は、１９９９年３月２６日出願の仮出願第６０／１２６，３３４号の優先権を請求する、２０００年３月２４日出願の先の同時係属出願第０９／５３３，８６２号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
背景
技術分野
［０００２］本発明は、ＦＸＲ「オーファン受容体」に依存する生理学的プロセスを調節する方法、およびこうしたプロセスを調節する化合物を同定する方法に関する。ＦＸＲおよびＦＸＲに依存するプロセスを調節する化合物もまた、提供する。
【０００３】
背景技術の考察
［０００３］コレステロールは、膜生合成、ステロイドおよび胆汁酸生合成、カベオラ形成および共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ）タンパク質修飾を含む、多様な細胞活性に必須である。異なる代謝経路に広くコレステロールが利用されていることから、最適な健康のために、最小限の血中濃度が維持されなければならないことが示される。一方、過剰な循環コレステロールは、アテローム性動脈硬化性心臓疾患を発展させる主要なリスク要因であり、該疾患は、米国において、毎年ほぼ５００，０００人の死因となる、唯一最大の原因である。
【０００４】
［０００４］循環コレステロールレベルは、細胞取り込み、合成および分解によって制御される（ＢｒｏｗｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ，８９：３３１−３４０，１９９７）。コレステロールが不溶性脂質であり、その大部分が細胞膜内に包埋されているため、過剰なコレステロールを体から除去するのは複雑である。コレステロール分解の主要な経路は、胆汁酸への代謝変換であり、胆汁酸はより疎水性でなく、そしてそのため、コレステロールよりも細胞からより容易に取り除かれる。胆汁酸への変換は、もっぱら肝臓で起こる。この変換の１つの化学的経路は、この経路の律速酵素である、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（Ｃｙｐ７ａ）によって始まる。ヒトでは、コレステロールは、７α−ヒドロキシラーゼ経路およびステロール２７−ヒドロキシラーゼ経路の両方で胆汁酸に変換される。
【０００５】
［０００５］ｉｎ  ｖｉｖｏでは、胆汁酸は肝細胞および腸微生物によって代謝され、多数の異なる産物を生じる。化学的に関連する非常に多くの産物が存在し、そして生化学経路が複雑であるため、特に丸ごとの動物において、個々の構成要素の影響を分離し、そして研究することは困難である。ＥｌｌｉｏｔｔおよびＨｙｄｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，５１：５６８−５７９（１９７１）を参照されたい。例えば、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ；５β−コラン酸−３α，７α−ジオール）およびコール酸（ＣＡ；５β−コラン酸−３α，７α，１２α−トリオール）が胆汁酸生合成の２つの主要な最終産物である（Ｃｈｉａｎｇ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，３：Ｄ１７６−１９３（１９９８）；Ｖｌａｈｃｅｖｉｃら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１３：５９０−６００（１９９１））。どちらももっぱら肝臓で産生され、ここで、タウリンまたはグリシンとのコンジュゲート化によって、さらに代謝される可能性がある。これらの胆汁酸は、腸に分泌され、回腸で再吸収され、そして門脈循環を介して肝臓に再度輸送される。腸におけるこれらの輸送中、ＣＤＣＡおよびＣＡなどの一次胆汁酸は、微生物に仲介される７α−脱水酸化を経て、そしてそれぞれ、リトコール酸（ＬＣＡ；５β−コラン酸−３α−オール）およびデオキシコール酸（ＤＣＡ；５β−コラン酸−３α，１２α−ジオール）に変換される（ＥｌｌｉｏｔｔおよびＨｙｄｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，５１：５６８−５７９（１９７１）；Ｈｙｌｅｍｏｎ，  “Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｂｉｌｅ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ”Ｓｔｅｒｏｌｓ  ａｎｄ  Ｂｉｌｅ  Ａｃｉｄｓ中，Ｈ．ＤａｎｉｅｌｓｓｏｎおよびＪ．Ｓｊｏｖａｌｌ監修（ニューヨーク，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），ｐｐ．３３１−３３４，１９８５）。
【０００６】
［０００６］代謝機能に加えて、胆汁酸はまた、それ自体の生合成を負に制御するシグナル伝達分子としても作用する。特に、胆汁構成要素は、Ｃｙｐ７ａ酵素の発現を阻害することによって、胆汁酸産生を制限する負のフィードバックループ中で作用する。いくつかの胆汁酸構成要素が、この負のフィードバック制御を誘導可能であることが知られているが、胆汁酸シグナルを伝達する胆汁酸センサーの性質およびその伝達機構は、これまで、未知のままであった。しかし、Ｃｙｐ７ａの阻害は、転写レベルで生じることが知られ、そして負の胆汁酸応答配列がＣｙｐ７ａプロモーターに見出されている。胆汁酸はまた、異なる経路を通じて、コレステロールから胆汁酸への変換に関与する酵素である、ステロール２７−ヒドロキシラーゼを下方制御することも示されている。Ｔｗｉｓｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０５：５０５−５１１（１９９５）を参照されたい。
【０００７】
［０００７］核受容体は、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモンおよびレチノイドホルモンの転写上の効果を仲介する、リガンドに調節される転写因子である。これらの受容体は、標的遺伝子のプロモーター中のシス作用領域でＤＮＡに特異的に結合する、保存されるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、および特定のホルモンまたは他の因子による受容体の特異的活性化を可能にするリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を有する。核受容体の標的遺伝子の転写活性化は、循環するリガンドがＬＢＤに結合し、そして活性化補助因子の補充を促進する、受容体のコンホメーション変化を誘導した際に起こる。活性化補助因子が補充されることによって、特定のＤＮＡ領域に高い親和性を有し、そして特定の遺伝子の転写を調節可能な受容体複合体が生じる。アゴニスト結合後に活性化補助因子が補充されると、受容体が転写を活性化することが可能になる。受容体アンタゴニストが結合すると、活性化補助因子が補充されても、標的遺伝子の基本的転写機構と非生産的な相互作用しか生じないような、異なるコンホメーション変化が受容体に誘導される。当業者に明らかであるように、特定の遺伝子に、負の転写調節を達成する受容体のアゴニストは、実際に、遺伝子発現を減少させるだろう。逆に、こうした受容体のアンタゴニストは、遺伝子発現を増加させるだろう。
【０００８】
［０００８］少なくとも２種類の核受容体活性化補助因子が同定されてきている。第一の種類には、ヒストンアセチラーゼ活性によってクロマチン構造を調節するＣＢＰおよびＳＲＣ−１関連タンパク質が含まれる。第二の種類には、ＰＢＰ／ＤＲＩＰ２０５／ＴＲＡＰ２２０が含まれ、該タンパク質は、基本的転写機構と直接相互作用すると仮定される、巨大転写複合体の一部である。
【０００９】
［０００９］特定の同定されるホルモンに応答する、既知の古典的な核ホルモン受容体に加えて、既知のリガンドを欠く、いくつかのオーファン受容体が同定されている。これらのオーファン受容体には、例えば、ＦＸＲ、ＣＡＲβ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＴＲ２−１１、ＬＸＲα、ＧＣＮＦ、ＳＦ１、ＲＯＲα、Ｎｕｒｒ１、ＤＡＸおよびＥＲＲ２が含まれる。オーファン受容体ＦＸＲ（ファルネソイドＸに活性化される受容体）はＣｙｐ７ａを阻害することが知られる。ＦＸＲは、ＲＸＲリガンドによって活性化可能であるＲＸＲ（９−シス・レチノイン酸受容体）とのヘテロ二量体として応答配列に結合する。
【００１０】
［０００１０］オーファン受容体が、脂肪酸、プロスタノイド、並びにファルネソールの代謝産物およびコレステロールの代謝産物を含む、いくつかの代謝シグナルのセンサーとして作用すると仮定されてきている。ｌａｃオペロンに対する先駆的な研究以来、中間代謝産物が、細菌および酵母において、シグナル伝達分子として働くことがよく確立されてきている（Ｇａｎｃｅｄｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：３３４−３６１（１９９８）；Ｕｌｌｍａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，６７：２９−３４（１９８５））。哺乳動物細胞における代謝産物調節を理解するには、代謝シグナルおよびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）センサーの同定が必要であることが、こうした理解を妨げてきた。
【００１１】
［０００１１］肝臓における胆汁酸シグナル伝達経路に関する先の研究は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）動物または培養肝細胞を用いて行われた。これらの系においては、胆汁酸は腸微生物および／または肝臓特異的酵素による代謝変換に供されて、いくつかの異なる産物を生じるため、この設計の研究を用いる研究者は、どの化合物が最終的な胆汁酸シグナル伝達分子であるのかを発見不能であった。したがって、コレステロールおよび胆汁酸シグナルのセンサーとして働く受容体は同定されてきていなかった。
【００１２】
［０００１２］胆汁酸によるコレステロール異化の阻害は、胆汁酸として排出可能なコレステロールの量を制限するため、胆汁酸代謝およびコレステロール代謝を制御する核受容体が同定されれば、高コレステロール血症、またはこの受容体に制御される遺伝子の活性化レベルに関連する他の状態を有する個体のため、治療様式を発展させるのに、大きな利点となるであろう。現在、胆汁酸に制御される遺伝子の転写または発現に干渉することが不能であり、例えばコレステロール異化に対して胆汁酸による負のフィードバックが課せられるが、これは、これらの遺伝子に関連する状態、例えば高コレステロール血症を有する個体を治療するのに、深刻な障害をもたらす。胆汁酸核受容体に調節される遺伝子を制御するのに欠陥を伴う状態はいずれも、受容体活性の修飾によって改良される（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）であろう。核胆汁酸センサーは、標的遺伝子転写を刺激するかまたは抑制するかいずれかによって、胆汁酸に応答することが示されてきている。これらの活性は、これらの遺伝子内の陽性ＦＸＲ応答配列によって仲介される。例えば、胆汁酸は、肝臓および回腸／腎臓特異的胆汁酸輸送体（Ｔｏｒｃｈｉａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２２５：１２８−１３３（１９９６））、ステロール２７−ヒドロキシラーゼ（Ｃｙｐ２７）（Ｔｗｉｓｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０５：５０５−５１１（１９９５））およびステロール１２α−ヒドロキシラーゼ（Ｃｙｐ１２）（Ｅｉｎａｒｓｓｏｎら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，３３：１５９１−１５９５（１９９２））の転写を、同等に抑制する。したがって、胆汁酸受容体標的遺伝子の刺激または抑制いずれかによって改良可能な、有害な代謝状態は、胆汁酸受容体リガンドで治療可能である。
【００１３】
［０００１３］その結果、Ｃｙｐ７ａなどの胆汁酸によって制御される遺伝子の発現を調節する化合物および方法に対する必要性がある。胆汁酸が制御する遺伝子の転写制御を修飾する、薬理学的介入を提供可能な化合物を同定するスクリーニング法に対するさらなる必要性が存在する。こうした化合物および方法は、高コレステロール血症を患う個体など、胆汁酸が制御する遺伝子転写の修飾から利益を得るであろう患者に、有益であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の概要
［０００１４］したがって、本発明は、ＦＸＲの活性化を調節することを含んでなる、ＦＸＲ依存性生理学的プロセスを調節する方法を提供する。該生理学的プロセスがコレステロール代謝であることが可能である。好ましい方法には、ＦＸＲ標的遺伝子、例えばＣｙｐ７ａ、Ｃｙｐ８ｂ、リン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）、回腸胆汁酸結合タンパク質（ＩＢＡＢＰ）、タウロコール酸ナトリウム共輸送体タンパク質（Ｎｔｃｐ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）および胆汁酸塩排出ポンプ（Ｂｓｅｐ）をコードする遺伝子の発現を調節することを含んでなるものが含まれる。
【００１５】
［０００１５］ＦＸＲ依存性生理学的プロセスを調節する方法には、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現を、細胞で天然に生じるよりも実質的に高い発現レベルに上方制御することによって、コレステロール代謝を増加させるものが含まれる。Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現のこの上方制御は、アンタゴニストまたは遮断化合物などでＦＸＲの活性化を阻害することによって、達成可能である。Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現を、細胞で天然に生じるよりも実質的に低いレベルに下方制御することによって、コレステロール代謝を減少させる方法もまた、本発明に提供する。ＦＸＲアゴニストを適用することによるなど、ＦＸＲの活性化を増加させることによって、Ｃｙｐ７ａをコードする遺伝子の発現の下方制御を達成可能である。
【００１６】
［０００１６］Ｃｙｐ８ｂリン脂質輸送タンパク質、回腸胆汁酸結合タンパク質、タウロコール酸ナトリウム共輸送体タンパク質、肝臓脂肪酸結合タンパク質または胆汁酸塩排出ポンプをコードする遺伝子の上方制御または下方制御を同じ方式で達成して、胆汁酸取り込み、肝臓からの胆汁酸分泌およびトリグリセリドレベルの制御など、それぞれの代謝プロセスに影響を及ぼすことが可能である。
【００１７】
［０００１７］本発明はまた、トリグリセリド代謝のＦＸＲ依存性生理学的プロセスを調節する方法も提供する。これらの方法において、ＦＸＲの活性化を増加させることによってトリグリセリドレベルを減少させ、そしてＦＸＲの活性化を阻害することによってトリグリセリドレベルを増加させる。
【００１８】
［０００１８］本発明はまた、式Ｉ：
【００１９】
【化１】
2005511519.tif 000003
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４いずれかと同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
に記載の化合物と、ＦＸＲを接触させることを含んでなる方法も提供する。有用であり得る式Ｉの化合物には、化合物Ａおよび化合物Ｂが含まれ、これらの構造は以下の表ＩＩに示される。
【００２０】
［０００１９］本発明はまた、化合物がＦＸＲ受容体を活性化するかまたは該受容体の活性化を阻害するか決定することを含んでなる、薬理学的活性化合物に関してスクリーニングする方法も提供する。こうした方法は、コレステロール代謝およびトリグリセリド代謝からなる群より選択される、ＦＸＲ依存性生理学的プロセスを調節可能な化合物に関してスクリーニングするために使用可能である。方法には、化合物がＦＸＲ活性化を阻害して、それによってコレステロール異化を増加させるかどうかを決定することを伴う方法が含まれることが可能である。
【００２１】
［０００２０］本発明はまた、ＦＸＲが仲介する遺伝子転写を調節する際に有用である化合物をスクリーニングする方法であって、ＦＸＲおよびＲＸＲの混合物を化合物と接触させ、そして該化合物が、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体および活性化補助因子間の相互作用、またはＦＸＲおよび活性化補助因子間の相互作用を促進するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法も提供する。
【００２２】
［０００２１］さらなる態様において、ＦＸＲアンタゴニスト活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、ＦＸＲおよびＲＸＲおよび既知のＦＸＲアゴニストの混合物を、少なくとも１つの化合物と接触させ、そして該化合物が、アゴニストが促進する、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体の活性化を阻害するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法も提供する。該方法で有用であり得る、既知のＦＸＲアゴニストには、式Ｉ：
【００２３】
【化２】
2005511519.tif 000004
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４いずれかと同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
の化合物が含まれる。例えばクロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂなどの化合物がこれらの方法に有用であり得る。
【００２４】
［０００２２］該方法には、ＲＸＲが、ＲＸＲ突然変異体（ＲＸＲｍ）であって、機能するＤＮＡ結合ドメインを含有し、そしてリガンド結合ドメインに、ＲＸＲリガンドによる実質的な活性化を妨げるが、その他の点では、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成する能力に実質的に影響を及ぼさない突然変異を有する、前記ＲＸＲ突然変異体であるものが含まれる。
【００２５】
［０００２３］さらなる態様において、本発明は、コレステロール異化を調節する活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって：（１）ＦＸＲ受容体、ＲＸＲ受容体、および標識ＤＮＡプローブであって、リガンド−ＦＸＲ−ＲＸＲ複合体のＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合するヌクレオチド配列を含有する、前記標識ＤＮＡプローブを含有する、第一の混合物を提供し；（２）ＦＸＲ受容体、ＲＸＲ突然変異受容体（ＲＸＲｍ）であって、機能するＤＮＡ結合ドメインを含有し、そしてリガンド結合ドメインに、ＲＸＲリガンドによる実質的な活性化を妨げるが、その他の点では、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成する能力またはこうしたヘテロ二量体が活性化補助因子を補充する能力に実質的に影響を及ぼさない突然変異を有する、前記ＲＸＲ突然変異受容体、および標識ＤＮＡプローブであって、リガンド−ＦＸＲ−ＲＸＲ複合体のＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合するヌクレオチド配列を含有する、前記標識ＤＮＡプローブを含有する、第二の混合物を提供し；（３）スクリーニングする化合物と、第一の混合物および第二の混合物を接触させ；（４）該化合物が、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体と活性化補助因子の相互作用、またはＦＸＲと活性化補助因子の相互作用を引き起こすかどうかを決定し；そして（５）スクリーニングする化合物が、ＦＸＲ−ＲＸＲｍヘテロ二量体と活性化補助因子の相互作用を引き起こすかどうかを決定することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２６】
［０００２４］こうした方法は、第一の混合物および第二の混合物を、既知のＦＸＲリガンドと接触させ、そしてこの既知のＦＸＲリガンドが、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体と活性化補助因子の相互作用、またはＦＸＲと活性化補助因子の相互作用を引き起こす能力を阻害する化合物を選択することをさらに含んでなることが可能である。該方法で有用であり得る、既知のＦＸＲアゴニストには、式Ｉ：
【００２７】
【化３】
2005511519.tif 000005
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４いずれかと同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
の化合物が含まれる。例えばクロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂなどの化合物が該方法に有用であり得る。さらに、該方法は、ＦＸＲ、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体またはＦＸＲ−ＲＸＲｍヘテロ二量体の活性化補助因子との実質的な相互作用を引き起こさない化合物を選択することをさらに含んでなることが可能である。
【００２８】
［０００２５］さらなる態様において、本発明は、ＦＸＲが仲介する遺伝子転写を調節する際に有用な化合物に関してスクリーニングする方法であって、ＦＸＲ、ＲＸＲおよびＦＸＲ／ＲＸＲ活性化補助因子の混合物を化合物と接触させ、そして該化合物が、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体による活性化補助因子の補充を促進するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２９】
［０００２６］さらなる態様において、本発明は、ＦＸＲアンタゴニスト活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、ＦＸＲ、ＲＸＲ、ＦＸＲ／ＲＸＲ活性化補助因子および既知のＦＸＲアゴニストの混合物を、少なくとも１つの化合物と接触させ、そして該化合物が、アゴニストが促進する、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体による活性化補助因子の補充を阻害するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法を提供する。これらの方法で有用であり得る、既知のＦＸＲアゴニストには、式Ｉ：
【００３０】
【化４】
2005511519.tif 000006
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４と同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
の化合物が含まれる。クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂは、この方法で使用可能な化合物の例である。
【００３１】
［０００２７］好ましい方法には、ＲＸＲが、ＲＸＲ突然変異体（ＲＸＲｍ）であって、機能するＤＮＡ結合ドメインを含有し、そしてリガンド結合ドメインに、ＲＸＲリガンドによる実質的な活性化を妨げるが、その他の点では、ＲＸＲ突然変異受容体がＦＸＲとヘテロ二量体を形成する能力またはこうしたヘテロ二量体が活性化補助因子を補充する能力に実質的に影響を及ぼさない突然変異を有する、前記ＲＸＲ突然変異体である方法が含まれる。好ましい方法にはまた、活性化補助因子が、リガンド依存性方式で、ＦＸＲ、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体、またはＦＸＲ−ＲＸＲｍヘテロ二量体と相互作用するペプチドモチーフを含有するポリペプチドまたはその活性断片である方法も含まれる。該方法で使用するのに適した活性化補助因子には、ＳＲＣ−１、ＧＲＩＰ（ＧＲＩＰ１）、ＡＣＴＲおよびＰＢＰ／ＤＲＩＰ２０５／ＴＲＡＰ２２０が含まれる。該方法で使用するのに適したＤＮＡプローブには、配列番号３および配列番号４のものが含まれる。
【００３２】
［０００２８］さらなる態様において、本発明は、ＦＸＲが仲介する遺伝子転写を調節する際に有用な化合物に関してスクリーニングする方法であって、（ａ）機能可能なプロモーターの調節下にＦＸＲをコードする遺伝子で、哺乳動物細胞をトランスフェクションし；（ｂ）プロモーターの調節下の機能可能なレポーター遺伝子であって、リガンドに活性化されたＦＸＲまたはＦＸＲ複合体が結合して該レポーター遺伝子の転写を開始する、機能可能な応答配列をコードするＤＮＡ配列が連結した、前記レポーター遺伝子で、該細胞をトランスフェクションし；（ｃ）スクリーニングする化合物の存在下で、該細胞を培養し；そして（ｄ）ＦＸＲ活性化の指標として、レポーター遺伝子の転写または発現に関して、該細胞を監視することを含んでなる、前記方法を提供する。方法にはまた、既知のＦＸＲリガンドの存在下で細胞を培養し、そしてレポーター遺伝子の転写または発現の減少が、スクリーニングする化合物がＦＸＲアンタゴニストであることの指標である方法も含まれる。これらの方法で有用であり得る、既知のＦＸＲリガンドには、式Ｉ：
【００３３】
【化５】
2005511519.tif 000007
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４と同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
の化合物が含まれる。クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂが使用可能な化合物である。これらの方法を用いて、コレステロール異化を増加させるのに有用な化合物を同定することが可能である。
【００３４】
［０００２９］さらなる態様において、本発明は、上述の方法いずれかによって選択される、非天然発生化合物または天然化合物を提供する。さらなる態様において、本発明は、上述の方法にしたがって選択した、単数または複数の化合物の療法的にまたは予防的に有効な量を、薬学的に許容しうるキャリアーと組み合わせて含んでなる、薬剤組成物を提供する。
【００３５】
［０００３０］さらなる態様において、本発明は、上述の薬剤組成物いずれかの有効量を投与することを含んでなる、高コレステロール血症に関して哺乳動物を治療する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
発明の詳細な説明
［０００４７］本発明は、ＦＸＲ受容体と同定されている、胆汁酸核受容体（ＢＡＲ）に制御される遺伝子の転写を調節する方法を提供する。本発明はまた、ＦＸＲを活性化するかまたは阻害し、そして該方法に有用である化合物を同定する方法も提供する。
【００３７】
［０００４８］胆汁抽出物が、オーファン受容体ＦＸＲを特異的に活性化することが見出されてきている。この受容体を活性化する、活性内因性胆汁酸シグナル伝達分子が均質に精製され、そしてケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）と同定された。さらなる解析および構造−活性研究によって、ＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡもまた、ＦＸＲを活性化することが明らかになった。さらに、ＬＣＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化補助因子補充を促進することが見出された。
【００３８】
［０００４９］胆汁酸構成要素がＦＸＲオーファン受容体に結合し、そして該受容体を活性化することが可能であることを検証するため、ブタ胆汁（Ｓｉｇｍａ）の抽出物を調製し、そしていくつかのオーファン核受容体に関して試験した。試験しようとする受容体を、ＣＯＳ細胞に由来するＣＶ−１細胞において発現させた。該細胞は、Ｂｏｙｅｒら，  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２６６：Ｇ３８２−Ｇ３８７（１９９４）に記載される。
【００３９】
［０００５０］胆汁酸応答性を再構成するのに、標準的なモデル異種細胞系を使用することによって、試験中のプロセスを不明瞭にする可能性がある代謝事象の非存在下で、活性を監視することが可能になる。受容体、レポーター遺伝子、応答配列等を発現する適切なＤＮＡで細胞を一過性にトランスフェクションすることが可能である限り、潜在的なまたは既知の胆汁酸核受容体リガンドの活性化を試験するのに、いかなる適切な異種細胞系も使用可能である。１以上の必要な遺伝子を恒常的に発現する細胞もまた、使用可能である。哺乳動物遺伝子の一過性発現に適しており、そして培養中の維持になじみやすい細胞系が、当業者に周知である。
【００４０】
表Ｉ．オーファン受容体活性化アッセイのためのレポーター／受容体対
【００４１】
【表１】
2005511519.tif 000008
［０００５１］胆汁酸による多様なオーファン受容体の活性化を試験するため、当該技術分野に知られる方法にしたがって、適切なレポーター構築物とともに、図１に示す受容体の発現ベクターで、ＣＶ−１細胞を一過性にトランスフェクションした。適切なレポーター遺伝子構築物は、生化学および分子生物学の分野の当業者に周知である。図１に報告するアッセイで用いるレポーター／受容体対を表Ｉに列挙する。すべてのトランスフェクションは、内部対照として、ＣＭＶ−βｇａｌをさらに含有した。これらの研究で使用するのに適した構築物は、好適に、ｐＣＭＶにクローニング可能である。ｐＣＭＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写のため、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、その後、バクテリオファージＴ７プロモーターを含有する。当該技術分野に知られる他のベクターが、本発明の方法に使用可能である。
【００４２】
［００５２］本明細書に記載する研究で使用するのに適した、以下の先に記載される全長タンパク質をコードする遺伝子をｐＣＭＶにクローニングした：ラットＦＸＲ（寄託番号Ｕ１８３７４）、ヒトＲＸＲα（寄託番号Ｘ５２７７３）、ヒトＴＲβ（寄託番号Ｘ０４７０７）、ヒトＬＸＲα（寄託番号Ｕ２２６６２）、マウスＰＰＡＲα（寄託番号Ｘ５７６３８）、マウスＰＰＡＲδ（寄託番号Ｕ１０３７５）、ヒトＴＲ２−１１（寄託番号Ｍ２９９６０）、マウスＧＣＮＦ（寄託番号Ｕ１４６６６）、マウスＳＦ１（寄託番号Ｓ６５８７８）。本出願のすべての寄託番号は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を指す。ｐＳＧ４２４（ＳａｄｏｗｓｋｉおよびＰｔａｓｈｎｅ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １７：７５３９（１９８９））由来の酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）のＣ末端に以下のタンパク質配列を融合させることによって、受容体断片を含有するＧＡＬ４融合体を構築した：ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲ（ヒトＲＸＲα  Ｇｌｕ２０３〜Ｔｈｒ４６２）、ＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲ（ラットＦＸＲ  ＬＢＤ  Ｌｅｕ１８１〜Ｇｌｎ４６９）、ＧＡＬ−ＲＯＲα（ヒトＲＯＲα１  Ａｒｇ１４０〜Ｇｌｙ５２３、寄託番号Ｕ０４８９７）、ＧＡＬ−Ｎｕｒｒ１（マウスＮｕｒｒ１、Ｃｙｓ３１８〜Ｐｈｅ５９８、寄託番号Ｓ５３７４４）、ＧＡＬ−ＤＡＸ（ヒトＤＡＸ−１、寄託番号Ｕ３１９２９）、ＧＡＬ−ＥＲＲ２（ヒトＥＲＲ２、Ｇｌｕ１７１〜Ｖａｌ４３３、寄託番号Ｘ５１４１７）、ＧＡＬ−ＣｏＡ（ヒトＳＲＣ−１  Ａｓｐ６１７〜Ａｓｐ７６９、寄託番号Ｕ５９３０２）。
【００４３】
［０００５３］ＲＸＲ  ＬＢＤ発現構築物Ｌ−ＲＸＲは、ヒトＲＸＲα  ＬＢＤ（Ｇｌｕ２０３〜Ｔｈｒ４６２）の上流に融合させたＳＶ４０  ＴＡｇ核局在化シグナル（ＡＰＫＫＫＲＫＶＧ（配列番号１））を含有する。ＶＰ−Ｌ−ＦＸＲは、ラットＦＸＲ  ＬＤＢ（Ｌｅｕ１８１〜Ｇｌｎ４６９）のアミノ末端に連結させた７８アミノ酸のヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化ドメインを含有する。試験中の受容体または受容体ドメインの活性化と比較するための対照遺伝子として使用するＣＭＶ−βｇａｌは、ｐＣＨ１１０（寄託番号Ｕ０２４４５）由来の大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ・コード配列を含有する。この遺伝子は本明細書で好適に用いられるが、入手可能であり、そしてその活性を測定するため、好適なアッセイが存在しているならば、いかなる非関連遺伝子も、本発明の方法で対照として用いることが可能である。
【００４４】
［０００５４］胆汁によってどのオーファン受容体または受容体類が活性化され、そして外因性に操作されて、胆汁酸応答遺伝子の転写を修飾することが可能であるかを決定するため、トランスフェクションした細胞を、ブタ胆汁抽出物で処理した。この胆汁抽出物は、以下のように調製された。胆汁（Ｓｉｇｍａ、１ｇ）を水に溶解し、そしてｐＨ４．０に調整した。水不溶性成分をメタノールでさらに抽出した。メタノール可溶性成分を乾燥させ、そして１００μｇ／ｍｌに再溶解した。
【００４５】
［０００５５］１０％樹脂チャコール処理（ｒｅｓｉｎ  ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ）中、５％ＣＯ２中、３７℃で活性化アッセイ用のＣＶ−１細胞を増殖させた。トランスフェクション１日前、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳを用いて、細胞を５０〜８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に蒔いた。
【００４６】
［０００５６］リポフェクションによって、細胞を一過性にトランスフェクションした。内部対照としてのＣＭＶ−β−ｇａｌ（５００ｎｇ／１０５細胞）とともに、レポーター構築物（３００ｎｇ／１０５細胞）およびサイトメガロウイルス駆動発現ベクター（２０〜５０ｎｇ／１０５細胞）を添加した。２時間後、リポソームを取り除き、そして試験胆汁酸および他の化合物を含有する、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳで、およそ４５時間、細胞を処理した。
【００４７】
［０００５７］ＦＸＲを活性化する候補である、いかなる化合物もこの方法で試験可能である。一般的に、化合物はいくつかの異なる濃度で試験して、あるとすれば、受容体の活性化が検出され、そして認識されるであろう可能性を最適にする。リガンドへの曝露後、細胞を採取し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性（対照）および特定のレポーター遺伝子の活性に関してアッセイした。本明細書に開示したすべてのアッセイを３つ組で行い、そしてその変動は実験内で１５％未満であった。各実験を３回以上行って、同様の結果を得た。
【００４８】
［０００５８］レポーター遺伝子の活性を好適に内部対照に規準化して、そして未処理細胞に比較した倍活性化として、データをプロットすることが可能である。胆汁抽出物によるオーファン受容体の活性化を示すデータに関しては、図１を参照されたい。図に示すように、胆汁抽出物は、ＦＸＲの強い活性化因子（５６倍）であるが、試験した他のオーファン受容体にはほとんどまたはまったく影響を及ぼさなかった。
【００４９】
［０００５９］上に論じるように、ＦＸＲは、ＲＸＲ（９−シス・レチノイン酸受容体）とのヘテロ二量体として、その応答配列に結合する。このヘテロ二量体は、ＦＸＲ結合リガンドによって、またはＲＸＲ結合リガンドによって活性化可能である（Ｆｏｒｍａｎら，Ｃｅｌｌ  ８０３−８１２（１９９５）；Ｚａｖａｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９４：７９０９−７９１４（１９９７））。胆汁抽出物によるＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体の活性化は、ＦＸＲまたはＲＸＲのどちらのリガンドの存在も反映する可能性があるため、ＲＸＲリガンドへの応答に欠陥があるＦＸＲ−ＲＸＲ複合体を生成して、ＦＸＲ特異的活性化因子に関してスクリーニングした。ＲＸＲｍは、単一の点突然変異（Ａｓｐ３２２→Ｐｒｏ）を含有するヒト９−シス・レチノイン酸受容体リガンド結合ドメインである。この突然変異した受容体ドメインは、ＤＮＡに結合する能力、およびＦＸＲとヘテロ二量体複合体を形成する能力を保持するが、野生型受容体ドメインが有する、低濃度のリガンドに応答する能力を欠く。この欠陥ＲＸＲリガンド結合ドメインが利用可能であることから、ＲＸＲの影響の非存在下で、胆汁酸核受容体の活性化を検出し、そうでなければ生じるであろうような偽陽性結果を妨げることが可能になる。
【００５０】
［０００６０］ＲＸＲ突然変異体がこの方法で機能するには、受容体は、ＲＸＲリガンドによっては最小限しか活性化されず、そしてＲＸＲリガンドに曝露された際には活性化補助因子を補充するのに失敗するが、ＦＸＲと二量体を形成し、そしてＦＸＲとのヘテロ二量体としてＤＮＡに結合する能力を保持しなければならない。最後に、突然変異体は、胆汁酸核受容体の正常な活性に実質的に干渉してはならない。これらの品質を確認するため、以下のように、突然変異体リガンド結合ドメインに対して試験を行った。他の突然変異体もまた、同じ方式で試験して、本発明の方法で使用する際の適切さを決定することが可能である。
【００５１】
［０００６１］これらのアッセイにおいて、ＬＢＤに単一の点突然変異（Ａｓｐ３２２→Ｐｒｏ）を含有するＲＸＲ突然変異体（ＲＸＲｍ）が特によく機能することが見出された。胆汁酸によるオーファン受容体の活性化に関して、図１のデータについて記載するのと同じ方式で、合成ＲＸＲ特異的リガンド（ＬＧ２６８、６−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）シクロプロピル］ニコチン酸）への応答に関して、野生型ＲＸＲ（ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲ）またはＲＸＲｍ（ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲｍ）いずれかのリガンド結合ドメインに融合させた酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインを含有するキメラ受容体を試験した。ＵＡＳＧｘ４レポーターおよびβガラクトシダーゼの発現ベクター、およびＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲまたはＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲｍ  ＬＢＤ突然変異体いずれかの発現ベクターで、ＣＶ−１細胞を一過性にトランスフェクションした。トランスフェクション後、図２に示す濃度のＬＧ２６８で細胞を処理した。突然変異体ＲＸＲリガンド結合ドメインを有する二量体は、野生型ＲＸＲリガンド結合ドメインを有する二量体よりも、活性化強度を１０倍減少させることが立証された。図２を参照されたい。同様の結果が全長ＲＸＲおよびＲＸＲｍ受容体で観察された（データ未提示）。
【００５２】
［０００６２］この突然変異体の適切さをさらに確認するため、野生型ＲＸＲおよびＲＸＲｍがリガンドに応答してＤＮＡに結合し、そして活性化補助因子を補充する能力を比較した。まず、１．２μｌのｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳したＲＸＲ（図３、上部パネル）またはＲＸＲｍ（図３、下部パネル）、５μｇの精製組換えＧＳＴ−ＧＲＩＰ１活性化補助因子（以下に記載）、および３２Ｐ標識ＤＲ１プローブ（５’−ＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴＡＧＣＴ−３’；配列番号２）の混合物と、増加する量のＲＸＲリガンドＬＧ２６８（０〜１０００ｎＭ）をともにインキュベーションすることによって、電気泳動移動度シフト実験を行った。本明細書に開示するＲＸＲホモ二量体試験すべてには、配列番号２のＤＲ１プローブを用いた。リガンドが占有するヘテロ二量体が、用いる検出法に十分なアビディティーでプローブに結合する限り、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列に実質的に相同である核酸プローブのいずれをこうしたアッセイに用いることも可能である。同様に、混合物中の複合体の存在を検出するのに十分に感受性が高い、ヌクレオチドプローブ用の好適な標識はいずれも、本発明の方法で使用するために意図される。
【００５３】
［０００６３］インキュベーション中、複合体が形成され、ここで二量体が活性化補助因子を補充し、そして標識ＤＮＡプローブに結合する。インキュベーション後、混合物を非変性条件下で電気泳動に供する。このアッセイのため、４５ｍＭホウ酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基緩衝液中、５％ポリアクリルアミドゲルを通じて、複合体を室温で電気泳動した。ゲルをオートラジオグラフィーに供して、標識複合体および他の構成要素を検出した。
【００５４】
［０００６４］図３において、ＣｏＡは、活性化補助因子ＧＲＩＰ１由来の３つの受容体相互作用ドメインを含有するＧＳＴ融合体を示す。電気泳動移動度シフトの結果から、ＲＸＲｍは、野生型ＲＸＲに比較して、強度にして１００倍の減少で、活性化補助因子を補充することが示される。突然変異受容体および野生型受容体はどちらもＤＮＡに結合する（図３、レーン１）が、ＲＸＲｍは、野生型受容体による最大補充に十分なリガンド濃度でも、活性化補助因子を補充するのに失敗した（図３、上部パネルおよび下部パネル、レーン２〜６を比較されたい）。
【００５５】
［０００６５］オートラジオグラムのホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）解析によって、図３に示すＲＸＲ−活性化補助因子複合体量の定量化を行い、そしてＬＧ２６８濃度の関数としてプロットした。このデータによって、ＲＸＲｍによる活性化補助因子の補充は、およそ１００倍高い濃度のリガンドを必要とすることが示された（図４）。ＲＸＲ突然変異体は、ＦＸＲとのヘテロ二量体としてＤＮＡに結合する能力を保持する（図５および未提示データ）が、低濃度のリガンドに強く応答する能力を欠くため、多様なリガンドを用いた試験において、ＦＸＲ−ＲＸＲｍヘテロ二量体を用い、ＦＸＲサブユニットの活性化を検証することが可能である。したがって、ＦＸＲを活性化する化合物、およびしたがって受容体によって制御される遺伝子の転写を修飾可能な化合物に関してスクリーニングする方法において、こうしたヘテロ二量体を好適に使用可能である。
【００５６】
［０００６６］ＲＸＲリガンドおよびＦＸＲリガンドによる活性化に関して、ＦＸＲ−ＲＸＲ二量体およびＦＸＲ−ＲＸＲｍ二量体を試験することによって、解析法の確認を達成した。図５に示す受容体ドメインを宿するプラスミドでＣＶ−１細胞をトランスフェクションし、そして１００ｎＭ  ＬＧ２６８（左のパネル）またはブタ胆汁のメタノール抽出物（２００μｇ／ｍｌ、右のパネル）いずれかで処理した。ＬＧ２６８はＲＸＲ（ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲ）およびＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体を活性化したが、ＦＸＲ−ＲＸＲｍは、ＲＸＲ特異的リガンドＬＧ２６８に対して、ほとんどまたはまったく応答しなかった（図５、左のパネル）。対照的に、胆汁抽出物は、ＦＸＲ−ＲＸＲｍを活性化する能力を保持したが、ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲｍにはほとんど影響を及ぼさなかった（図５、右のパネル）。欠陥ＡＦ２トランス活性化ドメインを含有する、異なるＲＸＲ突然変異体（Ｐｈｅ４５０→Ａｌａ、Ｓｃｈｕｌｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：３８０７−３８１３（１９９６））をＲＸＲｍの代わりに用いると、同様の結果が得られた（データ未提示）。したがって、この種のアッセイは、ＲＸＲリガンドおよびＦＸＲリガンドによる活性化の間を特異的に区別可能である。これらの特定のデータによって、胆汁抽出物が、ＦＸＲ特異的活性化因子を含有することが示される。
【００５７】
［０００６７］さらなるデータによって、この活性化には、ＦＸＲのＡＦ２トランス活性化ドメインが必要であることが示された（データ未提示）。さらに、予期される動力学で、胆汁酸が活性化を誘導した（活性は、細胞にリガンドを添加した１時間以内に観察される；データ未提示）。総合すると、本明細書に提供するデータによって、ＦＸＲが内因性胆汁酸センサーであり、適切なリガンドで外因性に操作して、コレステロール代謝の調節に関与する重要な遺伝子など、ＦＸＲを介する活性化に依存する遺伝子の制御を修飾可能であることが立証される。
【００５８】
［０００６８］化学的分画計画を考案して、ＦＸＲに結合し、そしてＦＸＲを活性化する、胆汁抽出物中の胆汁構成要素を同定し、そして精製した。最初の工程として、シリカゲルクロマトグラフィーによって、メタノール−水・胆汁抽出物を分画した。簡潔には、抽出物をカラムに適用し、そして続いて、８：１および４：１の比のクロロホルム−メタノールを用いて、その後、１００％メタノールを用いて、溶出した。５６分画を収集し、プールし、そしてＦＸＲ−ＲＸＲｍを活性化する能力に関して試験した。分取用薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）によって活性分画をさらに精製し、そして５分画（Ａ〜Ｅ）に分離した。
【００５９】
［０００６９］これらの分画中の成分によるＦＸＲ活性化を試験するため、図６に示す受容体ドメインを宿するプラスミドで、ＣＶ−１細胞をトランスフェクションし、そして２５μｇ／ｍｌの５つのＰＴＬＣ分画各々で処理した。分画Ｂ（ＰＴＬＣ  ０．３５＜Ｒｆ＜０．５２）が最も活性が高かった（ＲＸＲの活性化に比較して、ＦＸＲ−ＲＸＲｍを３０倍高く活性化）。図６を参照されたい。
【００６０】
［０００７０］ＰＴＬＣ分画Ｂの活性成分を、Ｃ１８カラム上の逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した。２００ｎｍで吸光度を監視した。３つの主要ピークが分離された（ピークＸ、ＹおよびＺ；図７）。これらの３つのピークを分離して収集した。残った分画をプールして、第四分画（Ｗ）とした。上述のようにＦＸＲ−ＲＸＲｍの活性化に関して、４つの分画を試験した。簡潔には、図８に示す受容体ドメインを宿するプラスミドでＣＶ−１細胞をトランスフェクションし、そして２５μｇ／ｍｌの濃度の各ＨＰＬＣ分画で処理した。分画Ｗ、ＸおよびＹはほとんどまたはまったく活性を持たなかった（図８）。ピークＺは、著しく劇的に、ＦＸＲ−ＲＸＲｍの１０２倍の活性化を誘導したが、ＲＸＲに対して影響を及ぼさなかった。これらのデータによって、ピークＺ中の成分は、ＦＸＲを強力に活性化するだけでなく、いかなるＲＸＲ活性化成分も含有しないことが示された。したがって、構造解析にピークＺ中の成分を選択した。
【００６１】
［０００７１］ピークＺ中の成分をメチル化した後、タンデムガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を行った。ガスクロマトグラムによって、ピークＺが１つの主要なピークを含有することが示され、活性構成要素がほぼ均質に精製されていることが示された。化合物Ｚは、このアッセイで１４．４１分の保持時間を有し、そして合成ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）標準と区別不能であった。ピークＺの成分の質量分析もまた、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）標準のものと区別不能であった。この成分の同一性をさらに確認するため、１３Ｃ−ＮＭＲ、１Ｈ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ＤＱＦＣＯＳＹおよびＨＭＱＣスペクトル（データ未提示）を得て、そしてＣＤＣＡ標準と同一であることを見出した。したがって、このアッセイにおいて胆汁酸核受容体を活性化するブタ胆汁抽出物中の構成要素は、ＣＤＣＡと同定された。
【００６２】
［０００７２］既知のＦＸＲ−ＲＸＲ（図９；左のパネル）およびＦＸＲ−ＲＸＲｍ（図９、右のパネル）を活性化する能力に関して、多様な商業的に入手可能な胆汁酸（Ｓｉｇｍａ）を試験した。比較用の試験リガンドとして、ＲＸＲリガンドＬＧ２６８および幼若ホルモンＩＩＩもまた含めた。これらのアッセイのため、ＥｃＲＥｘ６レポーター、並びにβガラクトシダーゼおよびＦＸＲ＋ＲＸＲ（左のパネル）またはＦＸＲ＋ＲＸＲｍ（右のパネル）の発現ベクターでＣＶ−１細胞をトランスフェクションし、そして示す胆汁酸（１００μＭ）、幼若ホルモンＩＩＩ（ＪＨ  ＩＩＩ、５０μＭ）またはＬＧ２６８（１００ｎＭ）で処理した。胆汁酸を、図に以下のように示す：ＣＡ、コール酸；ＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸；ＤＣＡ、デオキシコール酸；ＬＣＡ、リトコール酸；ＵＤＣＡ、ウルソデオキシコール酸。胆汁酸抽出物の研究から予測されるように、合成ＣＤＣＡは、ＦＸＲの非常に有効な活性化因子であることが立証された（３４６倍の活性化；図９、左のパネル）。ＣＤＣＡは、ＲＸＲα；ＰＰＡＲα、γおよびδ；ＶＤＲ；Ｔ３Ｒβ；ＲＡＲ；ＰＸＲ；ＬＸＲαおよびＣＡＲβを含む他の受容体を活性化するのに失敗した（データ未提示）。
【００６３】
［０００７３］二次胆汁酸、ＣＤＡおよびＬＣＡもまた、非常に有効であり、それぞれ、ＦＸＲ−ＲＸＲの２４６倍および１０６倍の活性化を誘導した。ＦＸＲ−ＲＸＲｍを用いても定性的に類似の結果が見られ（図９、右のパネル）、これによって、これらの胆汁酸がすべて、ＦＸＲサブユニットを通じて作用することが示された。ＣＤＣＡの７β−エピマーであるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ、５β−コラン酸−３α，７β−ジオール）は不活性であったが、７位のヒドロキシル基をケトンで置換して生じる化合物（７−ケトリトコール酸、５β−コラン酸−３α−オール−７−オン）は、ＣＤＣＡおよびＵＤＣＡの中間の活性を有した（図９、１５）。したがって、７位の周囲の立体配置はＦＸＲ活性の重大な決定要因であり、７α−ＯＨ＞＞７−ケト＞＞７β−ＯＨである。７−ケトリトコール酸および３，７−ジケトコラン酸（５β−コラン酸−３，７−ジオン）を比較すると、３α−ヒドロキシル基よりも、３位のケトンが好ましいと示唆される。６位にヒドロキシル基を持つ、いくつかのジヒドロキシおよびトリヒドロキシ胆汁酸は不活性であり（ムロコール酸、ヒオコール酸およびα−ムリコール酸）、デヒドロコール酸（５β−コラン酸−３，７，１２−トリオン）も同様であった。総合すると、これらのデータによって、３，７−および３，１２−置換胆汁酸は、ＦＸＲの非常に有効な活性化因子であることが示唆される。図１２は、重要な胆汁酸の化学構造およびＦＸＲ活性化因子としての有効性を比較した要約である。
【００６４】
表ＩＩ．  ＦＸＲのアゾールアンタゴニストの化学構造
【００６５】
【化６】
2005511519.tif 000009
［０００７４］本明細書に開示するＦＸＲ受容体活性化アッセイは、上述のようなＦＸＲの活性化に関して化合物を試験するだけでなく、ＦＸＲ活性化と拮抗する化合物に関して試験するのにも使用可能である。候補アンタゴニスト化合物と組み合わせて、既知のＦＸＲアゴニスト、例えばＣＤＣＡで細胞を処理するか、またはＦＸＲアゴニストの混合物で細胞を処理して、該化合物がＦＸＲ活性化と拮抗するかどうかを決定することが可能である。こうしたアッセイ結果を図１６に示す。実施例７を参照されたい。ヒト、ラットおよびマウス由来のＦＸＲのＣＤＣＡ活性化と拮抗する能力に関して、化合物、ケトンアゾール（ｋｅｔｏｎａｚｏｌｅ）、クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂ（上の表ＩＩを参照されたい）を試験した。ケトンアゾールは不活性であるが、残りの化合物はＦＸＲ活性化の阻害を示した。活性化合物の相対活性は、クロトリマゾール＞化合物Ｂ＞＞化合物Ａであった。化合物Ａは有意であるが弱い活性を示し、一方、クロトリマゾールは強く活性であった。
【００６６】
［０００７５］ファルネソイド代謝産物は、先に、ＦＸＲを活性化することが示されているため（Ｆｏｒｍａｎら，Ｃｅｌｌ，８１：６８７−６９３（１９９５））、最も活性であるファルネソイド活性化因子の１つ、幼若ホルモンＩＩＩ（ＪＨ  ＩＩＩ、５０μＭ）の活性を試験した。この化合物は活性であったが、最も有効な胆汁酸に比較して、はるかに弱い活性を有した（図９）。
【００６７】
［０００７６］ＣＤＣＡおよびＣＡはどちらも、古典的な経路を介して産生される主要な胆汁酸であるが、ＣＤＣＡがＦＸＲの極度に有効な活性化因子であるのに対して、ＣＡは不活性であった。ＣＡおよびコンジュゲート化胆汁酸はどちらも、比較的親水性の化合物であり、細胞膜を容易には横断しない。該アッセイにおいて、胆汁酸核受容体の活性化はまったく検出されないが、化合物自体が活性でないためではなく、単に、十分に高い濃度で、細胞に進入することが不能であるためである可能性があった。補助なしでは細胞膜を横断不能である化合物による活性化に関して、有効に試験可能な、胆汁酸核受容体活性化に関する第二のアッセイを考案した。
【００６８】
［０００７７］肝臓および回腸は、これらの化合物の効率的な取り込みのため、組織特異的胆汁酸輸送タンパク質を発現する（Ｃｒａｄｄｏｃｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７４：Ｇ１５７−１６９（１９９８））。これらの輸送体はいずれも、上で用いたＣＶ−１／ＣＯＳ細胞では発現されなかった。したがって、ＣＶ−１細胞をヒト肝臓胆汁酸輸送体（寄託番号Ｌ２１８９３）で同時トランスフェクションした。この輸送体の使用によって、親水性胆汁酸または胆汁酸由来化合物、あるいは胆汁酸への構造的類似性のため、輸送体によって輸送される化合物を、細胞内胆汁酸核受容体の活性化に関して試験することが可能になる。腎臓および回腸組織由来の胆汁酸輸送体もまた、有効に使用可能である。いかなる適切な非特異的輸送体もまた、使用可能である。
【００６９】
［０００７８］親水性胆汁酸による胆汁酸核受容体活性化のアッセイのため、ＣＶ−１細胞をＥｃＲＥｘ６、レポーター、並びにβ−ガラクトシダーゼおよびＦＸＲ＋ＲＸＲ単独の発現ベクターでトランスフェクションし（図１０、左のパネル）、そしてさらに肝臓胆汁酸輸送体の発現ベクターでもトランスフェクションした（図１０、右のパネル）。トランスフェクション後、１００μＭ濃度の示す胆汁酸で細胞を処理した。
【００７０】
［０００７９］ＣＡは胆汁酸輸送体の非存在下では不活性であった（図１０、左のパネル）が、肝臓胆汁酸輸送体を同時発現すると、ＣＡが劇的な１７０倍のＦＸＲ活性化を示すことが可能になった（図１０、右のパネル）。同様に、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡのグリシンおよびタウリン・コンジュゲートが、第一のアッセイでは弱いかまたは不活性であった一方、これらのより親水性の胆汁酸は、肝臓胆汁酸輸送体を発現している細胞において、非常に有効であった（図１０、左のパネルおよび右のパネルを比較されたい）。回腸特異的胆汁酸輸送体で、同様の結果が見られた（データ未提示）。したがって、このアッセイは、細胞内ＣＡが有効なＦＸＲ活性化因子であり、活性遊離胆汁酸のグリシンおよびタウリン・コンジュゲートも同様であると立証することが可能であった。このアッセイを用いて、胆汁酸輸送体によって輸送される化合物および輸送されない化合物両方を試験可能であった。結果によってまた、ＦＸＲおよび胆汁酸輸送体が重複する特異性を共有することも立証される。
【００７１】
［０００８０］構造−活性研究に加えて、いくつかの胆汁酸核受容体リガンドに関して、用量−反応解析を行った。図１１に示す、これらの解析のため、上述のようにＣＶ−１細胞を肝臓胆汁酸輸送体でトランスフェクションし、そして多様な濃度の示す胆汁酸各々で処理した。ＣＤＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡは各々、およそ５０μＭのＥＣ５０を示した。ＦＸＲに対する胆汁酸の構造−活性関係（図９、１０および１２）および用量−反応プロフィール（図１１）は、内因性胆汁酸センサーに関して報告されるものと類似である（Ｃｈｉａｎｇ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ，３：Ｄ１７６−１９３（１９９８）；Ｋａｎｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３０：２６１−２６５（１９９８）；Ｔｗｉｓｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０５：５０５−５１１；Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２４２４−２４２８（１９９８））。これは、これらの研究で用いたモデルを認証し、このアッセイによって決定した結果が、ｉｎ  ｖｉｖｏ結果とよく相関することを示す。
【００７２】
［０００８１］さらに、胆汁酸核受容体に対する胆汁酸のＥＣ５０および胆汁酸の生理学的濃度は、緊密に相関している。例えば、ＣＤＣＡおよびＤＣＡの転写効果は、約５０〜２５０μＭの濃度で生じる（Ｋａｎｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３０：２６１−２６５（１９９８）；Ｔｗｉｓｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０５：５０５−５１１（１９９５）；Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２４２４−２４２８（１９９８））。この濃度は、胆汁酸核受容体に関して本研究で見出されたＥＣ５０（５０μＭ）と非常に近く、そして胆汁におけるこれらの化合物の内因性濃度（ＣＤＣＡ：１０〜１５０μＭ；ＤＣＡ  ５μＭ）（Ｍａｔｏｂａら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，２７：１１５４−１１６２（１９８６））および腸液における内因性濃度（ＣＤＣＡ：５０μＭ；ＤＣＡ：３２０μＭ；ＬＣＡ：１２０μＭ）（ＭｃＪｕｎｋｉｎら，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，８０：１４５４−１４６４（１９８１））と一致する。胆汁酸核受容体のＥＣ５０もまた、報告される、肝臓および回腸胆汁酸輸送タンパク質の３〜１００μＭのミカエリス定数（Ｋｍ）と一致した（Ｂｏｙｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６６：Ｇ３８２−Ｇ３８７（１９９４）；Ｗｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１３４０−１３４７（１９９４））。実際、胆汁酸核受容体は、胆汁酸輸送体によって確立される細胞内濃度で、胆汁酸に有効に応答する。図１０、右のパネルを参照されたい。
【００７３】
［０００８２］上に論じるように、古典的核受容体は、異種ＤＮＡ結合ドメインにリガンド応答性を与えるモジュラーＬＢＤを含有する。胆汁酸核受容体がまた、内因性リガンドの高親和性結合のために、ヘテロ二量体パートナーとの相互作用も必要とするかどうかを試験するため、ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲ、ＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲ、またはＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲとＬ−ＲＸＲを同時発現する細胞において、ＣＤＣＡおよびＬＣＡが受容体を活性化する能力を試験した。予期されるように、ＣＤＣＡおよびＬＣＡは、ＧＡＬ−Ｌ−ＲＸＲキメラを活性化しなかった。図１３を参照されたい。しかし、ＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲとともにＲＸＲ  ＬＢＤ（Ｌ−ＲＸＲ）を同時発現すると、ＣＤＣＡおよびＬＣＡ両方に応答性である複合体が生じた（図１３）。１つのＬＢＤのみ（ＲＸＲまたはＦＸＲいずれか）を発現する細胞は、どちらの胆汁酸でも活性化されなかった。これらのデータは、胆汁酸応答性がＦＸＲ  ＬＢＤによって仲介され、損なわれていないＦＸＲ  ＡＦ２トランス活性化ドメインを必要とするだけでなく、受容体の活性化には、二量体化パートナーとの会合が必要であることを明らかにする。さらに、時間経過実験によって、ＬＣＡおよびＣＤＣＡが核受容体リガンドに関して予期される動力学で、ＦＸＲを活性化する、すなわち活性が細胞への添加１時間以内に観察されることが示された（データ未提示）。
【００７４】
［０００８３］ＣＤＣＡおよびＬＣＡが活性化補助因子補充を誘導する能力を評価するため、ＵＡＳＧｘ４レポーター、並びにβ−ガラクトシダーゼおよびＧＡＬ−ＣｏＡ（活性化補助因子ＳＲＣ−１の３つの受容体相互作用ドメインを含有するＧＡＬ４融合構築物）の発現ベクターで、ＣＶ−１細胞をトランスフェクションした。図１４に示す場合、ＲＸＲのリガンド結合ドメインを含有する構築物（Ｌ−ＲＸＲ）および／またはＶＰ１６トランス活性化ドメインをＦＸＲのリガンド結合ドメインに融合させたものを含有する構築物（ＶＰ−Ｌ−ＦＸＲ）でも細胞を同時トランスフェクションした。トランスフェクション後、１００μＭのＣＤＣＡまたはＬＣＡで細胞を処理した。ＣＤＣＡまたはＬＣＡはいずれも、ＧＡＬ４−活性化補助因子融合タンパク質（ＧＡＬ−ＣｏＡ）およびＦＸＲ  ＬＢＤに融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインを含有するキメラ（ＶＰ−Ｌ−ＦＸＲ）間の機能的相互作用を促進することが不能であった。しかし、ＲＸＲ  ＬＢＤの存在下で、胆汁酸は活性の４〜７倍の増加を誘導した（図１４）。
【００７５】
［０００８４］活性化補助因子補充アッセイは、オーファン受容体リガンドを同定し、そしてその活性を試験する、信頼しうる方法として確立されてきている（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２：１２６９−１２７７（１９９８）；Ｆｏｒｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，３９５：６１２−６１５（１９９８）；Ｋｌｉｅｗｅｒら，Ｃｅｌｌ，９２：７３−８２（１９９８）；Ｋｒｅｙら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１１：７７９−７９１（１９９７））。本発明にしたがって、胆汁酸核受容体に制御される遺伝子の転写を修飾するリガンドの能力の試験として、哺乳動物２ハイブリッドｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化補助因子補充アッセイを開発して、推定上のリガンドが、ＦＸＲおよび活性化補助因子間（またはＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体および活性化補助因子間）の機能する会合を促進可能であるかどうかを調べた。活性化補助因子は、リガンド依存方式で、ＦＸＲ、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体またはＦＸＲ−ＲＸＲｍヘテロ二量体と機能的に相互作用する、天然または合成いずれかの、あるいはその活性断片のペプチドまたはポリペプチドいずれかと定義される。
【００７６】
［０００８５］以下の構成要素の混合物をリガンドに添加することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化補助因子補充アッセイを行った：ＦＸＲ、９−シス・レチノイン酸受容体、活性化補助因子、および標識ＦＸＲ応答配列（プローブ）。活性化補助因子ＧＲＩＰ１の受容体相互作用ドメインを含有するポリアミノ酸を活性化補助因子として使用可能であるが、いかなる機能する活性化補助因子または活性化補助因子複合体も、このアッセイでの使用に意図される。これらのアッセイのため、ＧＲＩＰ１を細菌で発現させ、そして精製した。ＧＲＩＰ１活性化補助因子を細菌で発現させるため、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合させたマウスＧＲＩＰ１の３つの受容体相互作用ドメイン（Ａｒｇ６２５〜Ｌｙｓ７６５、寄託番号Ｕ３９０６０）を含有するＧＳＴ−ＧＲＩＰ１構築物を生成した。他の適切な活性化補助因子が当該技術分野に知られ、例えばＰＢＤ／ＤＲＩＰ２０５／ＴＲＡＰ２２０があり、そして本明細書に開示する本発明の方法が使用可能である。このアッセイで使用するのに適した応答配列は、胆汁酸核受容体の標的ＤＮＡ配列に、実質的に相同であるいかなる核酸プローブであることも可能である。
【００７７】
［０００８６］アッセイ系と適合するいかなる応答配列も使用可能である。核受容体が結合するＤＮＡ結合領域に実質的に相同なオリゴヌクレオチド配列が本発明の方法で使用するのに意図される。実質的に相同な配列（プローブ）は、アッセイ条件下で、リガンドに活性化された受容体に結合する配列である。応答配列は、当該技術分野に知られる方法によって修飾して、核受容体への応答配列の結合を増加させるかまたは減少させることが可能である。
【００７８】
［０００８７］本明細書に例示する特定のアッセイにおいて、以下の応答配列を用いた：ｈｓｐ２７  ＥｃＲＥｘ６（Ｙａｏら，Ｎａｔｕｒｅ，３６６：４７６−４７９（１９９３））、ＵＡＳＧｘ４、ＰＰＲＥｘ３（Ｆｏｒｍａｎら，Ｃｅｌｌ，８１：６８７−６９３（１９９５））、βＲＥ２ｘ３（Ｆｏｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３９５：６１２−６１５（１９９８））、ＬＸＲＥｘ３（Ｗｉｌｌｙら，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１０３３−１０４５（１９９５））、Ｔ３ＲＥ（ＭＬＶ）ｘ３（Ｐｅｒｌｍａｎｎら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，７：１４１１−１４２２（１９９３））、ＳＦ１ｘ４（５’−ＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴ；配列番号３）およびＤＲ０ｘ２（５’−ＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＴＴ；配列番号４）。
【００７９】
［０００８８］上述の構成要素混合物に推定上のリガンドを添加して、そして混合した後、混合物を条件下でインキュベーションする。図１５に示すように、電気泳動移動度シフトによって、混合物中の複合体の形成を解析したが、混合物中の他の構成要素から、標識複合体を分離するのに十分である限り、混合物中で形成された複合体を、個々の構成要素から分離する、いかなる方法も使用可能である。例えば、薄層クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降、免疫分離技術、または当該技術分野に知られる他の好適な方法いずれかなどの技術が使用可能である。
【００８０】
［０００８９］予期されるように、リガンドの非存在下では、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体は、活性化補助因子を補充するのに失敗した（図１５、レーン１）。図１５に提供するデータで重要なのは、ＬＣＡを添加すると、活性化補助因子ＧＲＩＰ１を含む複合体中に、ヘテロ二量体の大部分がシフトしたことである（レーン２）。糖−ＬＣＡ（レーン３）、およびＬＧ２６８（レーン４）で同様の結果が見られた。ＦＸＲサブユニットおよびＲＸＲサブユニットを通じた結合を区別するため、ＲＸＲをＲＸＲｍに置換して、活性化補助因子補充アッセイを繰り返した。図１５、レーン５〜８を参照されたい。重要なことに、ＬＣＡ（レーン６）および糖−ＬＣＡ（レーン７）はどちらも活性化補助因子を補充し、一方、ＬＧ２６８は不活性であった（レーン８）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果によって、ＬＣＡおよびそのグリシン・コンジュゲートは、ＦＸＲ特異的リガンドであることが立証される。
【００８１】
［０００９０］ＬＣＡおよび糖−ＬＣＡは、リガンド結合活性の標準的プローブであるｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化補助因子補充アッセイで活性であったが、ＣＡ、ＣＤＣＡ、およびＤＣＡを含む他の活性胆汁酸は、ＧＲＩＰ１または関連活性化補助因子ＳＲＣ−１およびＡＣＴＲを補充するのにより有効でなかった（データ未提示）。これらが共有する構造、活性および活性化動力学に基づいて、ＣＡ、ＣＤＣＡおよびＤＣＡはすべてＦＸＲリガンドであるが、これらはまた、最近記載されてきている多くの他の核受容体活性化補助因子の１つも利用する可能性もある。例えばＢｌａｎｃｏら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２：１６３８−１６５１（１９９８）；Ｆｏｎｄｅｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１９５９−１９６４（１９９９）を参照されたい。
【００８２】
［０００９１］活性化補助因子補充アッセイは、胆汁酸核受容体（ＦＸＲ）標的遺伝子を制御するＤＮＡの応答配列と、機能する結合関係を形成可能な化合物を、効率的に検出した。胆汁酸は、Ｃｙｐ７ａおよびステロール２７−ヒドロキシラーゼを含む、いくつかの遺伝子の転写を阻害可能である（Ｃｈｉａｎｇ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，３：Ｄ１７６−１９３（１９９８））。胆汁酸最終産物に阻害されるのに加えて、Ｃｙｐ７ａ転写は、その基質、コレステロールの集積によって刺激される。このコレステロールに対する応答は、オキシステロール受容体、ＬＸＲα（Ｐｅｅｔら，Ｃｅｌｌ，９３：６９３−７０４（１９９８））に仲介される。したがって、胆汁酸へのコレステロール異化の調節および胆汁酸による負のフィードバックは、以下の図式に例示されるとおりである：
【００８３】
【化７】
2005511519.tif 000010
［０００９２］ＦＸＲリガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）、ＦＸＲ活性の阻害剤を投与することによって、あるいはＦＸＲ受容体でＦＸＲ受容体を発現する細胞に向けられるリボザイムまたはアンチセンス療法によって、Ｃｙｐ７ａ、Ｃｙｐ８ｂ、リン脂質輸送タンパク質、回腸胆汁酸結合タンパク質、タウロコール酸ナトリウム共輸送体タンパク質、肝臓脂肪酸結合タンパク質、胆汁酸塩排出ポンプなどのＦＸＲ標的遺伝子、またはＦＸＲ標的遺伝子いずれかの転写を調節可能である。外因性ＦＸＲリガンドを用いて、Ｃｙｐ７ａ（または他のＦＸＲ標的遺伝子いずれか）転写またはＦＸＲに制御される遺伝子いずれかの転写の制御を修飾することが可能である。したがって、受容体結合アゴニストまたはアンタゴニストを用いるか、あるいはリガンドまたは受容体調節因子いずれかを用いて、ＦＸＲを操作すると、高コレステロール血症、上昇したトリグリセリドレベル、およびＦＸＲを通じて調節可能な他の代謝プロセス障害いずれかの治療が提供される。ＦＸＲ調節リガンドの２つの主要な影響のうち、ＦＸＲのアゴニストはトリグリセリドレベルを低下させ、一方、ＦＸＲのアンタゴニストはコレステロールレベルを低下させる。こうしたリガンドは、天然胆汁酸の誘導体、合成または半合成分子であることが可能である。例えば、クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂはすべて、多様な強度で、天然アゴニストＣＤＣＡの作用と拮抗することが見出されている。ＦＸＲに結合し、そしてＦＸＲを調節するのに有用な化合物には、式Ｉ：
【００８４】
【化８】
2005511519.tif 000011
［式中、（ａ）は０〜３の整数に相当し、そして各（ｂ）は同一であることもまたは異なることも可能であり、そして０〜５の整数に相当し；
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、他のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４いずれかと同一であることもまたは異なることも可能であり、そしてＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルケニル、アリール、アルキルアリール、ハロ、トリハロメチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ジチオリル、オキサチオリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、ジオキサゾリル、イソオキサジニルおよびピペラジニルからなる群より選択される部分に相当し、そして
前記部分が、未置換であることも、またはメチル、エチル、アミノ、ハロ、トリハロメチルおよびニトロからなる群より選択される１以上の置換基で置換されていることも可能である］
の化合物が含まれる。これらの化合物はまた、スクリーニングアッセイにおいて新規化合物を発見するためのリード化合物としても有用である。該アッセイは、本明細書に記載したアッセイいずれかであることも、または当該技術分野に知られる他のアッセイいずれかであることも可能である。
【００８５】
［０００９３］本発明の方法を用いて、ＦＸＲ受容体または推定上のＦＸＲ遮断因子において、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用可能であり、そしてしたがって、療法的にまたは予防的にコレステロール代謝の調節のために使用可能である、推定上のＦＸＲリガンドをスクリーニングすることが可能である。本発明はまた、こうした方法によって産生される化合物も提供する。
【００８６】
［０００９４］上述のアッセイおよび以下に例示するアッセイは、ＦＸＲに制御される遺伝子の転写を調節する化合物を選択する方法を提供する。例えば、上述の式Ｉ記載の化合物は、本発明の方法で使用するのに適した化合物である。特に、クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂが本発明の方法によって選択され、そしてＦＸＲに調節される内因性遺伝子またはレポーター遺伝子の転写を調節することが見出されてきている。本発明を以下の実施例にさらに記載し、そして例示するが、これらに限定することを意図しない。
【実施例】
【００８７】
実施例
（実施例１）
ＦＸＲ活性に関する一過性トランスフェクションアッセイ
［０００９５］１０％樹脂−チャコール処理ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ）中、５％ＣＯ２中、３７℃でＣＶ−１細胞を増殖させた。トランスフェクション１日前、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳを用いて、細胞を５０〜８０％集密に蒔いた。記載されるように、リポフェクションによって、細胞を一過性にトランスフェクションした（Ｆｏｒｍａｎら，Ｃｅｌｌ，８１：６８７−６９３（１９９５））。内部対照としてのＣＭＶ−β−ｇａｌとともに、エクジソン応答配列６コピー（ＥｃＲＥｘ６）に連結したヘルペスウイルス・チミジンキナーゼプロモーター（−１０５／＋５１）を含有するルシフェラーゼレポーター構築物（３００ｎｇ／１０５細胞）およびサイトメガロウイルス駆動発現ベクター（２０〜５０ｎｇ／１０５細胞）を添加した。哺乳動物発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写のため、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、その後、バクテリオファージＴ７プロモーターを含有する、ＣＭＶ発現ベクターに由来した。２つのアッセイを平行して行い、一方は、ＥｃＲＥｘ６レポーター、並びにβ−ｇａｌ、ＦＸＲおよびＲＸＲを含有する発現ベクターでトランスフェクションした細胞を用い、そして一方は、ＥｃＲＥｘ６レポーター、並びにβ−ｇａｌ、ＦＸＲおよびＲＸＲｍを含有する発現ベクターでトランスフェクションした細胞を用いた。リポソームと２時間インキュベーションした後、リポソームを取り除き、そして１００μＭ  ＣＤＣＡを含有する、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳで、およそ４５時間、細胞を処理した。リガンドに曝露した後、細胞を採取し、そして既知の方法にしたがって、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。図９を参照されたい。すべての点を３つ組でアッセイし、そしてその変動は１５％未満であった。各実験を３回以上行って、同様の結果を得た。
【００８８】
（実施例２）
親水性化合物に適した、ＦＸＲ活性に関する一過性トランスフェクションアッセイ
［０００９６］ＥｃＲＥｘ６レポーター、並びにβ−ｇａｌ、ＦＸＲおよびＲＸＲまたはＲＸＲｍを含有する発現ベクターでトランスフェクションした細胞を用いるが、細胞をまた、ヒト肝臓胆汁酸輸送体のｐｃＤＮＡ発現ベクターでも同時トランスフェクションすることを除いて、実施例１と同じアッセイを行った。図１０を参照されたい。
【００８９】
（実施例３）
胆汁酸核受容体標的遺伝子の転写を調節する化合物に関するスクリーングアッセイ
［０００９７］１０％樹脂−チャコール処理ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを補ったダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２中、３７℃でＣＶ−１細胞を増殖させる。トランスフェクション１日前、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳを用いて、細胞を５０〜８０％集密に蒔く。製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示にしたがって、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−アンモニウムメチルサルフェートを用いたリポフェクションによって、細胞をトランスフェクションする。
【００９０】
［０００９８］ＦＸＲおよび／またはＲＸＲを含有する発現ベクター、並びに示したコピー数の応答配列ｈｓｐ２７  ＥｃＲＥｘ６に連結したヘルペスウイルス・チミジンキナーゼプロモーター（−１０５／＋５１）を含有するルシフェラーゼレポーター構築物でＣＶ−１細胞をトランスフェクションする。ＲＸＲ（寄託番号Ｘ５２７７３）のリガンド結合ドメインをＲＸＲｍのリガンド結合ドメインと交換して、平行アッセイを行う。トランスフェクション後、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳ中、多様な濃度の候補胆汁酸受容体アゴニストまたはアンタゴニスト化合物で、およそ４５時間、細胞を処理する。化合物に曝露した後、細胞を採取し、そしてルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイする。
【００９１】
（実施例４）
胆汁酸核受容体標的遺伝子の転写を調節する化合物に関するスクリーニングアッセイ
［０００９９］細胞を、ヒト肝臓胆汁酸輸送体のｐｃＤＮＡ発現ベクターでもまた同時トランスフェクションすることを除いて、実施例３にしたがって、スクリーニングアッセイを行う。
【００９２】
（実施例５）
胆汁酸核受容体標的遺伝子の転写を調節する化合物に関するスクリーニングアッセイ
［０００１００］ＲＸＲｍを含有する発現構築物を用いた平行アッセイを省くことを除いて、実施例３にしたがって、スクリーニングアッセイを行う。
【００９３】
（実施例６）
活性化補助因子補充アッセイ
［０００１０１］ＧＳＴ−ＧＲＩＰ１を大腸菌で発現し、そしてグルタチオン−セファロースカラム上で精製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳したＦＸＲ＋ＲＸＲ（図１５、左のパネル）またはＦＸＲ＋ＲＸＲｍ（図１５、右のパネル）およびＧＳＴ−ＧＲＩＰ１（５μｇ）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５０ｍＭ  ＫＣｌ、６％グリセロール、０．０５％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＤＴＴ、１２．５ｎｇ／μｌポリｄＩ・ｄＣ中のクレノウ標識ｈｓｐ２７  ＥｃＲＥプローブ（５’−ＡＧＣＴＣＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＡＡＧＣＴＴ；配列番号５）１００，０００ｃｐｍおよび活性化補助因子補充に関して試験しようとするリガンドと、室温で３０分間インキュベーションした。０．５ｘＴＢＥ（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、４５ｍＭホウ酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の５％ポリアクリルアミドゲルを通じて、複合体を室温で電気泳動した。電気泳動移動度は、活性化補助因子の補充を示した。
【００９４】
（実施例７）
ＦＸＲ受容体アンタゴニスト化合物の選択
［０００１０２］１０％樹脂−チャコール処理ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２中、３７℃でＣＶ−１細胞を増殖させた。トランスフェクション１日前、フェノールレッド不含ＤＭＤＭ−ＦＢＳを用いて、細胞を５０〜８０％集密に蒔いた。製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示にしたがって、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−アンモニウムメチルサルフェートを用いたリポフェクションによって、細胞をトランスフェクションした。図１６に示すように、ＦＸＲ（なし、−；ヒト、ｈＦＸＲ；ラット、ｒＦＸＲ；またはマウス、ｍＦＸＲ）およびＲＸＲを含有するＣＭＶ発現ベクターで細胞をトランスフェクションした。ルシフェラーゼレポーター構築物は、６コピーの応答配列ｈｓｐ２７  ＥｃＲＥに連結したヘルペスウイルス・チミジンキナーゼプロモーター（−１０５／＋５１）を含有した。トランスフェクション後、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳ中、５０μＭのＣＤＣＡおよび２０μＭの合成アゾール化合物または両方で、細胞を処理した。用いたアゾール化合物（クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂ）の化学構造を、上の表ＩＩに提供する。アゴニストおよび候補アンタゴニスト化合物に曝露した後、細胞を採取し、そしてルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。結果を図１６に提供する。これらのアゾール化合物は３つともアンタゴニスト特性を示し、クロトリマゾールが最強の効果を有した。したがって、ＦＸＲ受容体アンタゴニストとして、スクリーニングから、クロトリマゾール、化合物Ａおよび化合物Ｂを選択した。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】［００３１］図１は、胆汁抽出物を用いた、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体およびいくつかの他のオーファン受容体の活性化アッセイからのデータを提供する。各々、当該技術分野に知られ、そしてＧｅｎｂａｎｋ寄託番号によって本明細書にさらに同定される受容体は、ＣＡＲβ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＴＲ２−１１、ＬＸＲα、ＧＣＮＦ、ＳＦ１、ＲＯＲα、Ｎｕｒｒ１、ＤＡＸ、およびＥＲＲ２である。
【図２】［０００３２］図２は、合成特異的ＲＸＲリガンド、ＬＧ２６８による、野生型ＲＸＲリガンド結合ドメインまたは突然変異体ＲＸＲ（ＲＸＲｍ）リガンド結合ドメインに融合させた酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインを含有するキメラ受容体の活性化を比較するデータを提供する。
【図３】［０００３３］図３は、増加する濃度のＲＸＲリガンド、ＬＧ２６８を用いて、野生型ＲＸＲとの受容体−活性化補助因子複合体（ＲＸＲ−ＣｏＡ）または突然変異体ＲＸＲとの受容体−活性化補助因子複合体（ＲＸＲｍ−ＣｏＡ）の形成を立証する、電気泳動移動度実験の結果を示すオートラジオグラムである。
【図４】［０００３４］図４は、図３に示す結果の定量的データを提供する。
【図５】［０００３５］図５は、ＲＸＲリガンドＬＧ２６８および胆汁抽出物による、ＲＸＲおよびＦＸＲヘテロ二量体の活性化を比較するデータを提供する。
【図６】［０００３６］図６は、胆汁抽出物の分取用薄層クロマトグラフィーから得た分画のＦＸＲ、ＲＸＲおよびＲＸＲｍ活性化データを示す。
【図７】［０００３７］図７は、図６の分画Ｂの逆相ＨＰＬＣ吸光度追跡を示す。
【図８】［０００３８］図８は、図７のＨＰＬＣピークＺがＦＸＲ−ＲＸＲｍを強力に活性化するが、ＲＸＲにはまったく影響を及ぼさないことを示すデータを提供する。
【図９】［０００３９］図９は、いくつかの異なる遊離胆汁酸によるＦＸＲ活性化レベルを示す。幼若ホルモンＩＩＩおよびＲＸＲリガンドＬＧ２６８は対照として含めた。ＵＤＣＡは、ウルソデオキシコール酸（５β−コラン酸−３α，７β−ジオール）を示す。
【図１０】［０００４０］図１０は、肝臓胆汁酸輸送体の存在下または非存在下で、非コンジュゲート化の、あるいはグリシンまたはタウリンいずれかとコンジュゲート化したＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡによるＦＸＲ活性化のレベルを示す。
【図１１】［０００４１］図１１は、ＣＤＣＡ、ＤＣＡおよびＬＣＡのＦＸＲ活性化用量−反応データを提供する。各化合物のＥＣ５０は、およそ５０μＭであった。
【図１２】［０００４２］図１２は、先の図に提供したデータから得られる構造−活性情報を要約する。＋＋は、ＦＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体の＞２００倍の活性化を示し、そして＋は１００〜１５０倍の活性化を示す。
【図１３】［０００４３］図１３は、ＣＤＣＡおよびＬＣＡがどちらも、ＧＡＬ−Ｌ−ＦＸＲキメラおよびＲＸＲ  ＬＤＢ（Ｌ−ＲＸＲ）を同時発現する細胞において、転写を活性化することを示すデータを提供する。
【図１４】［０００４４］図１４は、哺乳動物２ハイブリッドアッセイにおいて、ＲＸＲおよびＦＸＲ  ＬＢＤ両方の存在に依存する、ＧＡＬ−４活性化補助因子融合タンパク質（ＧＡＬ−ＣｏＡ）の補充後の活性化を立証するデータを示す。
【図１５】［０００４５］図１５は、ＦＸＲおよびＲＸＲまたはＦＸＲおよびＲＸＲｍの存在下で、異なるリガンドによる活性化補助因子補充を立証する、電気泳動移動度データを示す。
【図１６】［０００４６］図１６は、式Ｉに記載の３つのアゾール化合物によるＦＸＲの阻害を示すデータを提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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