(57)【要約】  本発明は、Ｇタンパク質共役レセプターのスーパーファミリーに属する新たに同定されたレセプターに関する。本発明はまた、このレセプターをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、レセプター媒介性障害における診断および処置のための標的としてレセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを使用する方法に関する。本発明はさらに、診断および処置のためのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための、レセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを使用する薬物スクリーニング方法に関する。本発明はさらに、レセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを生成するための手順に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるポリペプチドのレベルまたは活性を調節するための方法であって、該方法は、該ポリペプチドを発現する細胞を因子と、該因子が該ポリペプチドのレベルまたは活性を調節し得る条件下で接触させる工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；および、
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
からなる群より選択され、そして該細胞は、脳細胞、脊髄細胞、後根神経節細胞、三叉神経節細胞、および上頸神経節細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記因子が、抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、インビトロにある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、インビボにある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、該細胞が関連する障害を有する被験体由来である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記調節が、疼痛が関連する障害を有する被験体または該障害を有しやすい被験体における調節である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞におけるポリペプチドのレベルまたは活性を調節するための方法であって、該方法は、該ポリペプチドを発現する細胞を因子と、該因子が該ポリペプチドのレベルまたは活性を調節し得る条件下で接触させる工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該配列改変体は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有し、かつ配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該配列改変体は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有し、かつ配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該配列改変体は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有し、かつ配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該配列改変体は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有し、かつ配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチド；
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該配列改変体は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有し、かつ配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチド；
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該配列改変体は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有し、かつ配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチド；
（ｇ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該配列改変体は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有し、かつ配列番号２に示されるヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、該ストリンジェントな条件は、約４５℃にて６×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションに続き、６５℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける１回以上の洗浄を含む、ポリペプチド；
（ｈ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該配列改変体は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有し、かつ配列番号４に示されるヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、該ストリンジェントな条件は、約４５℃にて６×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションに続き、６５℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける１回以上の洗浄を含む、ポリペプチド；
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸６〜３４２として示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；ならびに、
（ｊ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸６〜３４２として示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
からなる群より選択され、そして該細胞は、脳細胞、脊髄細胞、後根神経節細胞、三叉神経節細胞、および上頸神経節細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
前記因子が、抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、インビトロにある、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、インビボにある、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、該細胞が関連する障害を有する被験体由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記調節が、疼痛が関連する障害を有する被験体または該障害を有しやすい被験体における調節である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
細胞における核酸分子のレベルを調節するための方法であって、該方法は、該核酸分子を含む細胞を因子と、該因子が該核酸分子のレベルを調節し得る条件下で接触させる工程を包含し、ここで、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列；および、
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、そして該細胞は、脳細胞、脊髄細胞、後根神経節細胞、三叉神経節細胞、および上頸神経節細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
前記細胞が、インビトロにある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、インビボにある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、該細胞が関連する障害を有する被験体由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記調節が、疼痛が関連する障害を有する被験体または該障害を有しやすい被験体における調節である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
細胞における核酸分子のレベルを調節するための方法であって、該方法は、該核酸分子を含む細胞を因子と、該因子が該核酸分子のレベルを調節し得る条件下で接触させる工程を包含し、ここで、該核酸分子は、以下：
（ａ）Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ストリンジェントな条件は、約４５℃にて６×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションに続き、６５℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける１回以上の洗浄を含む、ヌクレオチド配列；
（ｅ）Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｇ）Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに、
（ｈ）Ｇタンパク質媒介シグナル伝達活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ストリンジェントな条件は、約４５℃にて６×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションに続き、６５℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳにおける１回以上の洗浄を含む、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、そして該細胞は、脳細胞、脊髄細胞、後根神経節細胞、三叉神経節細胞、および上頸神経節細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項１９】
前記細胞が、インビトロにある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、インビボにある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、該細胞が関連する障害を有する被験体由来である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記調節が、疼痛が関連する障害を有する被験体または該障害を有しやすい被験体における調節である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｇタンパク質共役レセプターのサブファミリーに属する新規に同定されたレセプターに関連する。本発明はまた、このレセプターをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、レセプター媒介性障害の診断および処置のための標的として、レセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを使用する方法に関する。本発明はさらに、診断および処置のためのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためにレセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを使用する薬物スクリーニング法に関する。本発明はさらに、このレセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドに基づくアゴニストおよびアンタゴニストを包含する。本発明はさらに、このレセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを生成するための手順に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（Ｇタンパク質共役レセプター）
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、細胞内におけるシグナル伝達を担うタンパク質の主要なクラスを構成する。ＧＰＣＲは、以下の３つの構造ドメインを有する：アミノ末端細胞外ドメイン、７回膜貫通セグメント、３つの細胞外ループおよび３つの細胞内ループを含む膜貫通ドメイン、ならびにカルボキシ末端細胞内ドメイン。ＧＰＣＲの細胞外部分に対してリガンドが結合するときに、細胞の生物学的特性または生理学的特性における変化を生じるシグナルが細胞内で変換される。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質およびエフェクター（Ｇタンパク質によって調節される、細胞内酵素およびチャネル）とともに、細胞外インプットに細胞内第２メッセンジャーの状態を接続するモジュラーシグナル系の構成要素である。
【０００３】
ＧＰＣＲ遺伝子およびＧＰＣＲ遺伝子産物は、疾患を引き起こす潜在的な因子である（Ｓｐｉｅｇｅｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１１１９−１１２５（１９９３）；ＭｃＫｕｓｉｃｋら，Ｊ；Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３０：１−２６（１９９３））。ロドプシン遺伝子およびＶ２バソブレッシンレセプター遺伝子の特異的な欠損は、種々の形態の網膜炎色素症（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）（Ｎａｔｈａｎｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２６：４０３−４２４（１９９２））、および腎性糖尿病無味症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｓｉｐｉｄｕｓ）を引き起こすことが示されている（Ｈｏｌｔｚｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１２０１−１２０４（１９９３））。これらのレセプターは、中枢神経系および末梢神経系の生理学的プロセスの両方に対して臨床的に重要である。進化的解析によって、これらのタンパク質の祖先は、もともと、複雑なボディプランおよび神経系に呼応して発達してきたことが示唆されている。
【０００４】
ＧＰＣＲタンパク質サブファミリーは、以下の５つのファミリーに分類され得る：ファミリーＩ（このファミリーは、ロドプシンおよびβ２アドレナリン作動性レセプターによって代表されかつ現在においては２００を超える固有のメンバーによって代表されるレセプターである（Ｄｏｈｌｍａｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：６５３−６８８（１９９１）））；ファミリーＩＩ（上皮小体ホルモン／カルシトシン／セレクチンレセプターファミリー（Ｊｕｐｐｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１０２４−１０２６（１９９１）；Ｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１０２２−１０２４（１９９１）））；ファミリーＩＩＩ（代謝調節型のグルタミン酸レセプターファミリー（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８  ５９７：６０３（１９９２））；ファミリーＩＶ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの走化性および発生において重要なｃＡＭＰレセプターファミリー（Ｋｌｅｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１４６７−１４７２（１９８８）））；ならびにファミリーＶ（真菌類の交配フェロモンレセプター（例えば、ＳＴＥ２）（Ｋｕｒｊａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１０９７−１１２９（１９９２）））。
【０００５】
７つの推定疎水性セグメントを提供しかつＧＰＣＲとは無関係であるような他のタンパク質の少数のメンバーもまた存在し；これらは、Ｇタンパク質に結合することは示されていない。ショウジョウバエは、光レセプター特異的タンパク質である、「ｂｒｉｄｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（ｂｏｓｓ）」（これは、広範に研究されておりかつＧＰＣＲであるとの証拠が示されていない７回膜貫通セグメントタンパク質である）を発現する（Ｈａｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５０４７−５０５１（１９９３））。このショウジョウバエの遺伝子である「ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ｆｚ）」はまた、７回膜貫通セグメントを有するタンパク質と考えられている。ｂｏｓｓと同様に、ｆｚは、Ｇタンパク質に結合することが示されていない（Ｖｉｎｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２６３〜２６４（１９８９））。
【０００６】
Ｇタンパク質は、グアニンヌクレオチドに結合する、αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットから構成されるヘテロ三量体タンパク質のファミリーを表している。これらのタンパク質は、細胞表面レセプター（例えば、７回膜貫通セグメントを含むレセプター）に通常は連結している。リガンドがＧＰＣＲに結合した後に、コンフォメーション変化はＧタンパク質に伝達され、これによって、このαサブユニットに、結合したＧＤＰ分子をＧＴＰ分子へと交換させ、そして、βγサブニットから解離させる。αサブユニットのＧＴＰ結合形態は、代表的には、エフェクター調節部分として機能し、第２メッセンジャー（例えば、（例えば、アデニルシクラーゼの活性化による）ｃＡＭＰ）、ジアクリルグリセロールまたはイノシトールホスフェートの産生を引き起こす。２０を超える異なる型のαサブユニットがヒトにおいては公知である。これらのサブユニットは、βサブユニットおよびγサブユニットのより小さいプールと結合する。哺乳動物のＧタンパク質の例としては、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、ＧｓおよびＧｔが挙げられる。Ｇタンパク質は、Ｌｏｄｉｓｈら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）（この内容は、本明細書中おいて、参考して援用される）において広範に記載されている。ＧＰＣＲ系（Ｇタンパク質およびＧタンパク質結合エフェクターならびに第２メッセンジャー）は、「Ｔｈｅ  Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔ  Ｂｏｏｋ」（Ｗａｔｓｏｎら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４））において概説される。
【０００７】
ＧＰＣＲは、薬物作用および薬物開発のための主要な標的である。したがって、これまで未知のＧＰＣＲを同定および特徴づけするための薬物開発の分野において有益である。本発明は、これまでの未知であったヒトＧＰＣＲを提供することによって技術状態を推し進める。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
新規のＧＰＣＲを同定することが本発明の目的である。
【０００９】
ＧＰＣＲ媒介性障害の処置および診断に適用可能なレセプターアッセイにおける試薬または標的として有用である新規のＧＰＣＲポリペプチドを提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１０】
ＧＰＣＲ媒介性障害の処置および診断に適用可能なレセプターアッセイにおける試薬および標的として有用でありそして組換え法による新規のレセプターペプチドを産生するのに有用である新規のＧＰＣＲレセプターポリペプチドに対応するポリヌクレオチドを提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１１】
本発明の具体的な目的は、アゴニストおよびアンタゴニストとして作用しかつ新規のレセプターの発現を調節する化合物を同定することである。
【００１２】
本発明のさらなる具体的な目的は、ＧＰＣＲ関連障害の処置および診断のためのレセプターの発現を調節する化合物を提供することである。
【００１３】
したがって、本発明は、新規のＧＰＣＲの同定に基づき、１５６２５レセプターとして示される。
【００１４】
本発明は、配列番号１において示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離された１５６２５レセプターポリペプチドを提供する。
【００１５】
本発明はまた、配列番号２に示される配列を有する単離された１５６２５レセプター核酸分子を提供する。
【００１６】
本発明はまた、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む改変体レセプターポリペプチドを提供する。
【００１７】
本発明はまた、配列番号４に示される配列を有する核酸分子を含む単離された改変体レセプター核酸分子を提供する。
【００１８】
本発明はまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列（例えば、配列番号３において示される配列）を有する改変体ポリペプチドを提供する。
【００１９】
本発明はまた、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と実質的に相同である改変体核酸配列（例えば、配列番号４において示される配列）を提供する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号１において示されるポリペプチド配列および配列番号２に示される核酸配列のフラグメント、ならびにこのポリペプチドまたは核酸のフラグメントに実質的に相同なフラグメントを提供する。
【００２１】
本発明はまた、このレセプター核酸分子およびレセプターポリペプチドを発現するためのベクターおよび宿主細胞ならびに特に組換えベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００２２】
本発明はまた、これらのベクターおよび宿主細胞を作製するための方法およびこれらのベクターおよび宿主細胞を使用してレセプター核酸分子およびレセプターポリペプチドを生成するための方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、レセプターポリペプチドおよびレセプターフラグメントに選択的に結合する抗体を提供する。
【００２４】
本発明はまた、このレセプターポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。調節は、ポリペプチドレセプターのレベルまたはレセプターポリペプチドを発現する核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の発現をコントロールするレベルであり得る。
【００２５】
本発明はまた、レセプターポリペプチド活性を調節するための（特にスクリーニングされた化合物を使用する）プロセス（このレセプターポリペプチドの発現に関連した状態を処理することを含む）を提供する。
【００２６】
本発明はまた、生物学的サンプルの中の、レセプターポリペプチド分子またはレセプター核酸分子の存在およびレベルを決定するための診断アッセイを提供する。
【００２７】
本発明はまた、レセプターポリペプチド分子またはレセプター核酸分子における変異の存在またはレベルを決定するための診断アッセイを提供する。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
（レセプター機能／シグナル経路）
１５６２５レセプタータンパク質は、シグナル伝達経路に関与するＧＰＣＲである。本明細書中で使用される場合、「シグナル伝達」または「シグナル伝達経路」は、ＧＰＣＲ（１５６２５タンパク質）へのリガンドの結合のときの細胞機能または細胞活性の調節（例えば、刺激または阻害）をいう。このような機能の例としては、シグナル伝達経路に関与する細胞内分子（ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、イノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）およびアデニレートシクラーゼ）の動員；細胞膜の局在；分子の産生または分泌；細胞内成分の構造の変化；細胞増殖、例えば、ＤＮＡ合成；細胞移動；細胞分化：ならびに細胞生存が挙げられる。
【００２９】
ヒト組織における１５６２５発現の分析によって、１５６２５が、脳（特に、星状細胞）、脊髄（特に、星状細胞）および脊髄神経節（実験の節を参照）において高度に発現されていることが示されている。１５６２５はまた、付随体細胞グリア（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ  ｇｌｉａ）および三叉神経グリアならびに上頸部グリアにおける小型ニューロンおよび付随体細胞を含む他の型の神経系細胞において高レベルに発現している。三叉神経および脊髄神経節における高レベルの１５６２５発現は、疼痛伝達を調節することにおけるこのレセプターの役割を支持している。１５６２５はまた、巨核球を含むがこれらに限定されない骨髄ＣＤ３４＋細胞において高度に発現している。これはまた、休止Ｂリンパ球において中程度に発現し（これらのリンパ球が活性化されるときにこのレベルは低下する）、そして、骨格筋においても中程度に発現している。この遺伝子はまた、リンパ節、脾臓、胸腺、肝臓、扁桃、結腸、心臓、顆粒球、および赤芽球においても発現されている。これはまた、胎盤および膵臓においても発現されている。従って、１５６２５レセプタータンパク質シグナル伝達経路に関わる細胞としては、これらの組織のうちの任意のものに由来する細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３０】
このレセプタータンパク質によって媒介される応答は、細胞型に依存している。例えば、いつかの細胞において、このレセプタータンパク質に対するリガンドの結合は、ホスファチジルイノシトールまたは環状ＡＭＰの代謝および代謝回転を介する化合物の放出、チャネルの開閉、細胞接着、移動、分化などのような活性を刺激し得るが、他の細胞においては、このリガンドの結合は、異なる結果を生じる。レセプタータンパク質によって調節される細胞活性／応答に関わらず、タンパク質がＧＰＣＲでありかつＧタンパク質と相互作用して、種々の細胞内シグナル伝達経路（例えば、細胞内における、ホスファチジルイノシトールまたは環状ＡＭＰの代謝および代謝回転）において１以上の第２シグナルを生成することは普遍的である。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「ホスファチジルイノシトールの代謝回転および代謝」とは、ホスファチジルイノシトール４，５ビスホスフェート（ＰＩＰ２）の代謝回転および代謝に関与する分子をいい、そして、それらの分子の活性をいう。ＰＩＰ２は、細胞膜の細胞質リーフレット（ｌｅａｆｌｅｔ）において見出されるリン脂質である。レセプターに対するリガンドの結合によって、幾つかの細胞においては、細胞膜酵素のホスホリパーゼＣ（これは、順に、ＰＩＰ２を加水分解して１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）を産生する）を活性化させる。一旦形成されると、ＩＰ３は小胞体表面に散在し得、ここでは、ＩＰ３は、ＩＰ３レセプター（例えば、ＩＰ３結合部位を含むカルシウムチャネルタンパク質）に結合し得る。ＩＰ３結合は、チャネルの開口を誘導し得、カルシウムイオンが細胞質中に放出されることを可能にする。ＩＰ３はまた、特定のキナーゼによってリン酸化され、カルシウムが細胞外媒体から細胞質へと入ることを可能にする分子であるイノシトール１，３，４，５テトラホスフェート（ＩＰ４）を形成する。ＩＰ３およびＩＰ４は、その後それぞれは不活性産物であるイノシトール１，４−ビホスフェート（ＩＰ２）およびイノシトール１，３，４−トリホスフェートへと非常に迅速に加水分解され得る。これらの不活性産物は、ＰＩＰ２を合成するために細胞により再利用され得る。ＰＩＰ２、すなわち、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の加水分解によって生成される他の第２のメッセンジャーは、細胞膜内にとどまっており、ここで、これは、酵素であるプロテインキナーゼＣを活性するための役割を担い得る。プロテインキナーゼＣは、通常、細胞の細胞質中で溶解して見出されるが、細胞内カルシウム濃度の増加に従い、この酵素は細胞膜へと移動し得、ここで、これはＤＡＧによって活性化され得る。様々な細胞におけるプロテインキナーゼＣの不活性化によって、種々の細胞応答（例えば、グリコーゲンシンターゼのリン酸化または種々の転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ）のリン酸化）を生じる。「ホスファチジルイノシトール活性」という語句は、本明細書中で使用される場合、ＰＩＰ２の活性またはその代謝活性をいう。
【００３２】
このレセプターが関わり得る別のシグナル伝達経路は、ｃＡＭＰ代謝回転経路である。本明細書中で使用される場合、「環状ＡＭＰ代謝回転および環状ＡＭＰ代謝」とは、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の代謝回転および代謝ならびにこれらの分子の活性に関与する分子をいう。環状ＡＭＰは、特定のＧタンパク質共役レセプターのリガンド誘導刺激に応答して産生される第２メッセンジャーである。ｃＡＭＰシグナル伝達経路において、ＧＰＣＲに対するリガンドの結合によって、ｃＡＭＰ合成を触媒する酵素であるアデニルシクラーゼの活性化を生じ得る。新規に合成されたｃＡＭＰは、順に、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを活性化し得る。この活性化されたキナーゼは、電位依存型カリウムチャネルタンパク質（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）または結合タンパク質をリン酸化し得、そして、活動電位の間にこのカリウムチャネルが開口しないようにし得る。このカリウムチャネルが開口し得ないことは、カリウムの外向きの流れの減少を生じ、ニューロンの膜を正常に再分極させ、長期化した膜脱分極に導き得る。
（ポリペプチド）
本発明は、新規Ｇ共役タンパク質レセプターの発見に基づく。具体的には、発現配列タグ（ＥＳＴ）が、Ｇタンパク質共役レセプター配列に対する相同性に基づいて選択された。このＥＳＴは、それが含む配列に基づいてプライマーを設計するために使用され、ヒトｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを同定するのに使用された。ポジティブクローンが配列決定され、そしてオーバーラップしたフラグメントはアセンブリされた。このアセンブリされた配列の分析によって、クローニングされたｃＤＮＡ分子は、Ｇタンパク質共役レセプターをコードすることが明らかにされた。
【００３３】
したがって、本発明は、図１（配列番号１）において示される推定アミノ酸配列を有する新規のＧＰＣＲに関する。
【００３４】
「１５６２５レセプターポリペプチド」または「１５６２５レセプタータンパク質」は、配列番号１におけるポリペプチドをいう。しかし、「レセプタータンパク質」または「レセプターポリペプチド」という用語はさらに、本明細書中に記載されるような多くの改変体ならびに全長１５６２５ポリペプチドおよび改変体（例えば、配列番号３）に由来するフラグメントを含む。
【００３５】
従って、本発明は、単離されたかまたは精製された１５６２５レセプターポリペプチドならびにそれらの改変体およびフラグメントを提供する。
【００３６】
その１５６２５ポリペプチドは、３つの主要な構造ドメインを提示する３４２残基のタンパク質である。このアミノ末端細胞外ドメインは、配列番号１における残基の１〜約２５において存在すると同定される。膜貫通ドメインは、配列番号１における残基の約２６〜約３０２において存在すると同定されている。カルボシキル末端細胞内ドメインは、配列番号１の約３０３位〜約３４２位の残基内にあることが同定さている。この膜貫通ドメインは、膜にわたる７つのセグメントを含む。膜貫通セグメントは、アミノ酸の約２６位〜アミノ酸の約４７位、アミノ酸の約５９位〜アミノ酸の約７９位、アミノ酸の約９９位〜アミノ酸の約１２０位、アミノ酸の約１４３位〜アミノ酸の約１６２位、アミノ酸の約１８９位〜アミノ酸の約２１２位、アミノ酸の約２３８位〜アミノ酸の約２５５位、ならびにアミノ酸の約２８４位〜アミノ酸の約３０２位において見出される。３つの細胞内ループおよび３つの細胞外ループが、膜貫通ドメイン全体に亘る領域中に存在する。３つの細胞内ループは、アミノ酸の約４８位〜アミノ酸の約５８位、アミノ酸の約１２１位〜アミノ酸の約１４２位、およびアミノ酸の約２１３位〜アミノ酸の約２３７において見出される。３つの細胞外ループは、アミノ酸の約８０位〜アミノ酸の約９８位、アミノ酸の約１６３位〜アミノ酸の約１８８位、およびアミノ酸の約２５６位〜アミノ酸の約２８３において見出される。
【００３７】
膜貫通ドメインは、残基１２１−１２３でＧＰＣＲシグナル伝達サイン、ＤＲＹを含む。この配列としては、ＧＰＣＲにおける不変のアミノ酸である残基１２２のアルギニンが挙げられる。
【００３８】
Ｐｆａｍ分析に基づいて、１５６２５は、ＧＰＣＲのロドプシンファミリーについてのコンセンサス配列と高い配列類似性を示す。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、組換え細胞および非組換え細胞から単離される際、細胞物質を実質的に含まない場合、または化学合成される際に、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合、ポリペプチドは、「単離」または「精製」されたといわれる。しかし、ポリペプチドは、細胞に通常結合しておらず、なお「単離」または「精製」されていると考えられる別のポリペプチドに結合され得る。
【００４０】
レセプターポリペプチドは、均一に精製され得る。しかし、ポリペプチドが均一に精製されていない調製物は、有用であり、そして単離された形態のポリペプチドを含むと考えられることが理解される。重要な特徴は、この調製物が、顕著な量の他の成分の存在下でさえもポリペプチドの所望の機能を可能にすることである。従って、本発明の種々の程度の精製を包含する。
【００４１】
１つの実施形態において、言語「細胞物質を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量）の他のタンパク質（すなわち、汚染タンパク質）、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、または約５％未満の他のタンパク質を有するレセプターポリペプチドの調製物が挙げられる。レセプターポリペプチドが、組換え生成される場合、これはまた、培養培地を実質的に含み得ない（すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満を示す）。
【００４２】
言語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、レセプターポリペプチドの調製物を含み、ここでこれは、その合成に関する化学物質前駆体または他の化学物質から分離される。１つの実施形態において、言語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」としては、約３０％未満（乾燥重量）の化学物質前駆体または他の化学物質、約２０％未満の他の化学物質前駆体または他の化学物質、約１０％未満の他の化学物質前駆体または他の化学物質、あるいは約５％未満の化学物質前駆体または他の化学物質を有するポリペプチドの調製物が挙げられる。
【００４３】
１つの実施形態において、レセプターポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む。しかし、本発明はまた、配列改変体を包含する。改変体としては、生物において同じ遺伝子座によってコードされる実質的に相同なタンパク質が挙げられる（すなわち、対立遺伝子改変体）。１５６２５レセプターは、ＡＦＭ１６４ＹＧ９マーカーの近位である第３染色体にマッピングされている。改変体はまた、生物中の他の遺伝子座由来だが、配列番号１の１５６２５レセプタータンパク質に実質的に相同なタンパク質を有するタンパク質を包含する。改変体はまた、１５６２５レセプタータンパク質に実質的に相同性だが、別の生物に由来するタンパク質（すなわち、配列番号３におけるようなオルソログ）を含む。改変体はまた、化学合成によって生成される１５６２５レセプタータンパク質に実質的に相同であるタンパク質を含む。改変体はまた、組換え方法によって生成された１５６２５レセプタータンパク質に実質的に相同性であるタンパク質を含む。しかし、改変体が本発明の前に開示された、いずれのアミノ酸配列も含まないことが理解される。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約５０〜５５％、約５５〜６０、代表的には少なくとも約７０〜７５％、より代表的には少なくとも約８０〜８５％、そして最も代表的には少なくとも約９０〜９５％以上相同性である場合に、実質的に相同性である。本発明に従う実質的に相同なアミノ酸配列は、以下により完全に記載されるようなストリンジェントな条件下で、配列番号２に示される配列の核酸配列またはその一部にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。
【００４５】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性％を決定するために、この配列は、最適な比較目的で整列される。２つの配列間の同一性％は、配列によって共有される同一部位の数の関数（すなわち、同一性％＝位置の同一位置（例えば、重複位置）の数／位置の総数×１００）である。１つの実施形態において、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間の同一性％は、ギャップを許容するか、または許容しない以下に記載される技術と類似の技術を用いて決定され得る。同一性％の計算において、代表的な正確な一致が計数される。
【００４６】
２つの配列間の同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。２つの配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７で改変されたようなＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のキナーゼ核酸分子に相同性であるヌクレオチド配列を得るためにＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２）を用いて実行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のキナーゼプロテイン分子に相同であるアミノ酸配列を得るためにＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝３）を用いて実行され得る。比較目的のためのギャップ化整列を得るために、ギャップＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行するために使用され得る。ＢＬＡＳＴプログラム、ギャップＢＬＡＳＴプログラム、およびＰＳＩ  Ｂｌａｓｔプログラムを使用する際、各プログラムの初期パラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用され得る。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。配列の比較のために利用される別の好ましいアルゴリズムの例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する際に、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、そして４のギャップペナルティーが、使用され得る。初期パラメータを用いる好ましいプログラムは、Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）である。
【００４７】
本発明はまた、１５６２５ポリペプチドによって実行される１つ以上の同じ機能を実行するために低い程度の同一性を有するが、十分な類似性を有するポリペプチドを包含する。類似性は、保存アミノ酸置換によって決定される。このような置換は、同様の特徴の別のアミノ酸によってポリペプチド中の所定のアミノ酸を置換する置換である。保存的置換は、表現型的にサイレントであるようである。代表的に保存的置換とみなされるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの互いか、その間での置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、および芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。アミノ酸変化が表現型的にサイレントであるようであると考えられるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出される。
【００４８】
【表１】
2005511024.tif 000002
。
【００４９】
本発明の核酸配列およびタンパク質配列は、公共のデータベース（例えば、他のファミリーメンバーまたは関連の配列を同定するためのデータベース）に対して検索を実行するために「照合配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いて実行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、語長＝３）を用いて実行され得る。比較目的のためのギャップ整列を得るために、ギャップＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７））に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴプログラムおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００５０】
改変体ポリペプチドは、１つ以上の置換、欠失、挿入、転移、融合、および短縮またはこれらのいずれかの組み合わせによってアミノ酸配列と異なり得る。
【００５１】
改変体ポリペプチドは、１つ以上の活性において、完全に機能的であり得るか、または機能を欠き得る。従って、この場合において改変体は、例えば、リガンド結合、膜会合、Ｇタンパク質結合およびシグナル伝達に対応する領域の１つ以上の機能に影響し得る。
【００５２】
完全に機能的な改変体は、代表的に保存的改変体、または重要でない残基もしくは重要でないよう領域中の改変のみを含む。機能的改変体はまた、機能において何の変化も生じないか、または意見のない、重要でない変化を生じる類似のアミノ酸の置換を含み得る。あるいは、このような置換は、いくらかの程度で機能にポジティブにまたはネガティブに影響し得る。
【００５３】
非機能的改変体は、代表的に、１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、転移、または重要な残基もしくは重要な領域における短縮または置換、挿入、転移または欠失を含む。
【００５４】
示されるように、改変体は、天然に存在し得るか、または組換え手段もしくは化学合成によって作製され得、レセプターポリペプチドに有用かつ新規な特徴を提供する。これは、タンパク質凝集を予防することによって薬学的処方物からの免疫原性を予防する工程を包含する。
【００５５】
有用な改変体は、リガンド結合特性の改変をさらに含む。例えば、１つの実施形態は、リガンドの結合を生じるが、放出を生じないか、または遅い放出（ｓｌｏｗｅｒ  ｒｅｌｅａｓｅ）を生じる結合部位での改変を含む。同じ部位でのさらなる有用な改変は、リガンドについて高い親和性を生じ得る。有用な改変としてはまた、別のリガンドへ親和性を提供する変化が挙げられる。別の有用な改変としては、結合を可能にするが、リガンドによる活性化を防ぐことを可能にする改変が挙げられる。別の有用な改変としては、膜貫通Ｇタンパク質結合／シグナル伝達ドメインにおける改変が挙げられ、これは、適切なＧタンパク質による結合の減少または増加を提供するか、あるいはレセプターが正常に会合しているものとは異なるＧタンパク質による結合を提供する。別の有用な改変は、融合タンパク質を提供し、ここで１つ以上のドメインまたはサブ領域が、別のＧタンパク質結合レセプター由来の１つ以上のドメインまたはサブ領域に必要に応じて融合される。
【００５６】
機能にとって必須のアミノ酸は、当該分野において公知の方法（例えば、部位特異的変異、またはアラニンスキャニング変異（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））によって同定され得る。後者の手順は、分子中の各々の残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、生じた変異分子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合、もしくはインビボでの生物学的活性）、またはインビトロでの増殖活性について試験される。リガンドレセプター結合に重要な部位はまた、構造分析（例えば、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）；ｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））によって決定され得る。
【００５７】
全体の核酸配列またはアミノ酸配列、あるいはこれらの配列のフラグメントに対して実質的に相同であり得る。
【００５８】
従って、本発明はまた、１５６２５レセプタータンパク質のポリペプチドフラグメントを含む。フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来し得る。しかし、本発明はまた、本明細書中に記載されるような１５６２５レセプタータンパク質の改変体のフラグメントを包含する。
【００５９】
しかし、本発明に関するフラグメントは、本発明の前に開示され得るフラグメントを包含するように構築されない。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、フラグメントは、アミノ酸１〜アミノ酸２８０、およびアミノ酸２９１〜アミノ酸３４２の少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む。フラグメントは、タンパク質の生物学的活性（例えば、Ｇタンパク質またはリガンドに結合する能力）、およびレセプター抗体を生成するための免疫原として使用され得るフラグメントの１つ以上を保持する。
【００６１】
生物学的に活性なフラグメント（例えば、１０、１２、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００以上のアミノ酸長であるペプチド）は、ドメインまたはモチーフ（例えば、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインまたはループ、１つ以上の膜貫通セグメント、またはその一部、Ｇタンパク質結合部位、またはＧＰＣＲサイン、グリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼおよびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ、およびプロテインキナーゼＣのリン酸化部位、およびミリストイル化部位）を含み得る。
【００６２】
可能性のあるフラグメントとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：１）配列番号１の約アミノ酸１〜約アミノ酸２５の全体のアミノ末端細胞外ドメイン、またはその一部を含む可溶性ペプチド；２）配列番号１の約アミノ酸３０３〜約アミノ酸３４２の全体のカルボキシ末端細胞内ドメイン、またはその一部を含むペプチド；３）約アミノ酸２６〜約アミノ酸３０２の全体膜貫通ドメインにわたる領域を含むペプチド；４）任意の特定の膜貫通セグメント、またはその一部；５）任意の３つの細胞内ループまたは細胞外ループ、あるいはその一部。
【００６３】
フラグメントは、タンパク質の生物学的活性（例えば、Ｇタンパク質またはリガンドに結合する能力）の１つ以上を保持し得る。フラグメントはまた、レセプター抗体を生成する免疫原として有用であり得る。
【００６４】
生物学的に活性なフラグメントは、ドメインまたはモチーフ（例えば、細胞外ドメインもしくは細胞内ドメインまたはループ、１つ以上の膜貫通セグメント、またはその一部、Ｇタンパク質結合部位、またはＧＰＣＲサイン、グリコシル化、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、およびＮミリストイル化部位）を含み得る。このようなペプチドは、例えば、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００以上のアミノ酸長であり得る。
【００６５】
可能性のあるフラグメントとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：１）配列番号１の約アミノ酸１〜約アミノ酸２５の全体のアミノ末端細胞外ドメイン、またはその一部を含む可溶性ペプチド；２）配列番号１の約アミノ酸３０３〜約アミノ酸３４２の全体のカルボキシ末端細胞内ドメイン、またはその一部を含むペプチド；３）約アミノ酸２６〜約アミノ酸３０２の全体膜貫通ドメインにわたる領域を含むペプチドまたはその一部を含むペプチド；４）約アミノ酸２６〜約アミノ酸４７、約アミノ酸５９〜約アミノ酸７９、約アミノ酸９９〜約アミノ酸１２０、約アミノ酸１４３〜約アミノ酸１６２、約アミノ酸１８９〜約アミノ酸２１２、約アミノ酸２３８〜約アミノ酸２５５、および約アミノ酸２８４〜約アミノ酸３０２の任意の特定の膜貫通セグメントまたはその一部；５）約アミノ酸４８〜約アミノ酸５８、約アミノ酸１２１〜約アミノ酸１４２、約アミノ酸２１３〜約アミノ酸２３７、約アミノ酸８０〜約アミノ酸９８、約アミノ酸１６３〜約アミノ酸１８８、および約アミノ酸２５６〜約アミノ酸２８３の任意の３つの細胞内ループもしくは３つの細胞外ループ、またはその一部。フラグメントとしては、上記のフラグメントの組み合わせ（例えば、１つ以上の膜貫通セグメントと組み合わされたアミノ末端ドメイン、および付随の細胞外ループもしくは細胞内ループまたは１つ以上の膜貫通セグメント、および付随の細胞内ループもしくは細胞外ループおよびカルボキシ末端ドメイン）がさらに挙げられる。従って、任意の上記のフラグメントが組み合わせられ得る。他のフラグメントとしては、約アミノ酸６〜３４２の成熟タンパク質が挙げられる。他のフラグメントは、本明細書中に記載される種々の機能的部位（例えば、グリコシル化部位、ｃＡＭＰプロテインキナーゼリン酸化部位およびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、Ｎ−ミリストイル化部位、およびＧＰＣＲサイン配列を含む配列）を含む。例えば、フラグメントは、機能的部位から一方、または両方の方向に伸長して５、１０、１５、２０、３０、４０、５０から１００までのアミノ酸を含み得る。さらに、フラグメントは、上記の特定のドメインのサブフラグメントを含み得、このサブフラグメントは、その由来するドメインの機能を保持する。
【００６６】
フラグメントはまた、図３において高い抗原性指標を有することが示されている抗原フラグメントおよび特異的フラグメントを含む。
【００６７】
従って、可能性のあるフラグメントとしては、以下が挙げられる：リガンド結合部位を規定するフラグメント、膜会合を規定するフラグメント、Ｇタンパク質とシグナル伝達との相互作用を規定するフラグメント、ならびにグリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位およびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、およびＮ−ミリストイル化部位を規定するフラグメント。関連の機能を提供するか、または同定される関連の機能を可能にする別個のフラグメントによって、これは意図される。好ましい実施形態において、このフラグメントは、リガンド結合部位を含む。
【００６８】
本発明はまた、免疫原性の特徴を有するフラグメントを提供する。これらは、１５６２５レセプタータンパク質および改変体のエピトープ保有部位を含む。これらのエピトープ保有ペプチドは、レセプターポリペプチドもしくは領域もしくはフラグメントに特異的に結合する抗体を惹起するために有用である。これらのペプチドは、少なくとも１０、１２、少なくとも１４、または少なくとも約１５〜約３０アミノ酸の間を含み得る。
【００６９】
抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドの非制限的な例としては、以下が挙げられる：アミノ末端細胞外ドメイン、または任意の細胞外ループ由来のペプチド。高い抗原性指標を有する領域は、図３に示される。しかし、細胞内産抗体（「細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」）もまた包含され、これは、細胞内レセプターペプチド領域を認識する。
【００７０】
レセプターポリペプチド（本発明の以前に開示され得た改変体およびフラグメントを含む）は、ＧＰＣＲに関する生物学的アッセイについて有用である。このようなアッセイは、ＧＰＣＲ関連状態の診断および処置に有用な既知のＧＰＣＲの機能または活性または特性のいずれかを含む。
【００７１】
エピトープ保有レセプターおよびポリペプチドは、任意の従来法（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５））によって生成され得る。同時多ペプチド合成は、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。
【００７２】
フラグメントは、別個（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合していない）であり得るか、またはより大きいポリペプチド内であり得る。さらに、いくつかのフラグメントは、単一のより大きいポリペプチド内に含まれ得る。１つの実施形態において、宿主中での発現のために設計されたフラグメントは、レセプターフラグメントのアミノ末端に融合した異種プレポリペプチドおよびプロポリペプチド、ならびにフラグメントのカルボキシ末端に融合したさらなる領域を有し得る。
【００７３】
従って、本発明は、キメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。これらは、レセプタータンパク質に実質的に相同性ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に作動可能に連結したレセプタータンパク質を含む。「作動可能に連結した」は、レセプタータンパク質および異種タンパク質がインフレームで融合されていることを示す。異種タンパク質は、レセプタータンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【００７４】
１つの実施形態において、融合タンパク質は、本質的にレセプター機能に影響しない。例えば、融合タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質であり得、ここでレセプター配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合している。他の型の融合タンパク質としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：酵素融合タンパク質（例えば、βガラクトシダーゼ機能、酵素ツーハイブリッドＧＡＬ融合物、ポリＨｉｓ融合物およびＩｇ融合物）。このような融合タンパク質（特に、ポリＨｉｓ融合物）は、組換えレセプタータンパク質の精製を容易にし得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列を用いることによって増加され得る。故に、別の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。
【００７５】
ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４６４  ５３３は、免疫グロブリン定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。Ｆｃは、治療および診断において有用であり、従って、例えば、改善された薬物動態学の特徴を生じる（ＥＰ−Ａ  ０２３２  ２６２）。薬物送達において、例えば、ヒトタンパク質は、アンタゴニストを同定するための高処理スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合された。Ｂｅｎｎｅｔｔら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．８：５２−５８（１９９５））およびＪｏｈａｎｓｏｎら（Ｊ；Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１６：９４５９−９４７１（１９９５））。従って、本発明はまた、種々のサブクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖または軽鎖の定常領域のレセプターポリペプチドおよび種々の部分を含む可溶性融合タンパク質を含む。融合がヒンジ領域で生じるヒトＩｇＧ（特に、ＩｇＧ１）の重鎖定常部分が、免疫グロブリンとして好ましい。いくつかの使用のために、融合タンパク質が意図された目的のために使用された後（例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用された際）にＦｃが除去されることが望ましい。特定の実施形態において、Ｆｃ部分は、切断配列によって単純な方法で除去され得、これはまた組み込まれてＸａ因子を用いて切断され得る。
【００７６】
キメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術によってインフレームで一緒にライゲーションされる。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成を含む従来技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを用いて実行され得、これは２つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的オーバ−ハングを発生させ、これは、その後アニールされ再増幅されキメラ遺伝子配列を生じ得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２を参照のこと）。さらに、多くの発現ベクターが、市販されており、これらはすでに融合部分（例えば、ＧＳＴタンパク質）をコードしている。レセプタータンパク質コード核酸は、このような発現ベクターにクローン化され得、その結果、融合部分は、インフレームでレセプタータンパク質に連結される。
【００７７】
融合タンパク質の別の形態は、レセプター機能に直接影響する。従って、レセプターポリペプチドは、本発明によって包含され、ここでレセプタードメイン（またはその一部）の１つ以上は、別のＧタンパク質共役レセプターまたは他の型のレセプターから相同ドメイン（またはその一部）によって置換されている。従って、種々の置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）が可能である。アミノ末端細胞外ドメイン、またはそのサブ領域（例えば、リガンド結合）は、別のリガンド結合レセプタータンパク質からドメインまたはサブ領域で置換され得る。あるいは、全体の膜貫通ドメイン、または任意の７つのセグメントもしくはループ、またはその一部（例えば、Ｇタンパク質結合／シグナル伝達）が、置換され得る。最終的に、カルボキシ末端細胞内ドメインまたはサブ領域が、置換され得る。従って、キメラレセプターは、１つ以上のネイティブドメインまたはサブ領域が置換されて形成され得る。
【００７８】
単離されたレセプタータンパク質は、本明細書中に開示されるように、それを天然に発現する細胞（例えば、脳（特にグリア細胞）、脊髄、三叉神経節または後根神経節、特定の頸部神経節、ＣＤ３４＋細胞）、およびそれを発現するように改変（組換え）された細胞株（例えば、ＨＥＫ  ２９３およびＪｕｒｋａｔ）から精製されたか、または公知のタンパク質合成方法を用いて合成された系統から合成され得る。
【００７９】
１つの実施形態では、このタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生成される。例えば、このレセプターポリペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクターへクローン化され、この発現ベクターが、宿主細胞へ導入され、そしてこのタンパク質がその宿主細胞中で発現される。次いで、このタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームにより細胞から単離され得る。
【００８０】
ポリペプチドは、しばしば、２０個の天然に存在するアミノ酸と通常いわれる２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含む。さらに、多くのアミノ酸（末端のアミノ酸を含む）は、天然のプロセス（例えば、プロセシングおよび他の翻訳後修飾）によるか、または当該分野で周知の化学的改変技術により、改変され得る。ポリペプチドにおいて天然に生じる通常の改変は、基本書、詳細な論文および研究文献に記載され、そしてこれらは、当業者に周知である。
【００８１】
従って、このポリペプチドはまた、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基ではないか、置換基が含まれているか、成熟ポリペプチドが別の化合物（例えば、そのポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合されているか、またはさらなるアミノ酸（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチドもしくはプロプロテイン配列の精製のための配列）が成熟ポリペプチドに融合されている、誘導体またはアナログを包含する。
【００８２】
公知の改変は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド生成、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒロドキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
このような改変は、当業者に周知であり、科学文献により詳細に記載される。いくつかの特定の一般的な改変（例えば、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、ヒロドキシル化およびＡＤＰ−リボシル化）は、最も基本的な文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第二版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）など）に記載される。多くの詳細な概説は、本テーマに対して利用可能である（Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １〜１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６（１９９０）およびＲａｔｔａｎら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８〜６２などによる）。
【００８４】
ポリペプチドは、常に完全に直線ではないこともまた、周知である。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝され得、そして天然のプロセシング事象を含む翻訳後事象および天然には生じない人為的操作によって引き起こされる事象の結果として一般的に分枝を有するかまたは有さない環状であり得る。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳自然プロセスによっておよび合成方法によって合成され得る。
【００８５】
改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含むポリペプチドにおいてどこにでも生じ得る。共有改変による、ポリペプチドにおけるアミノ基もしくはカルボキシル基、または両方の妨害は、天然に存在するポリペプチドおよび合成ポリペプチドにおいて一般的である。例えば、タンパク質分解性プロセシングの前にＥ．ｃｏｌｉによって作製されるポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンである。
【００８６】
改変は、タンパク質が作製される方法の関数であり得る。例えば、組換えポリペプチドについて、改変は、宿主細胞翻訳後改変能力によって決定され、そして改変は、ポリペプチドアミノ酸配列に伝達する。従って、グリコシル化が、所望される場合、ポリペプチドは、グリコシル化宿主（一般的に真核生物細胞）において発現されるべきである。昆虫細胞は、しばしば哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化を実行し、この理由で、昆虫細胞発現システムは、グリコシル化のネイティブパターンを有する哺乳動物タンパク質を有効に発現するよう開発される。同様の考察は、他の改変に適用する。
【００８７】
改変の同じ型は、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じかまたは異なる程度で存在し得る。また、所定のポリペプチドは、１つより多くの型の改変を含み得る。
【００８８】
上記の開示は一般的に、配列番号３に示されるポリペプチド配列に対してもまた当てはまる。推測されるドメインおよび機能部位は、当業者に公知であり、そして容易に利用可能であるコンピュータープログラム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ分析）によって、容易に同定可能である。
【００８９】
（ポリペプチドの使用）
このレセプターポリペプチドは、１５６２５レセプタータンパク質、１５６２５レセプター領域または１５６２５レセプターフラグメントに特異的な抗体を産生するのに有用である。高度な抗原性指標スコアを有する領域を、図３に示す。
【００９０】
このレセプターポリペプチド（本発明以前に開示され得た改変体およびフラグメントを含有する）は、ＧＰＣＲに対する生物学的アッセイに有用である。このようなアッセイは、ＧＰＣＲに関係する状態の診断および処置に有用な、任意の既知のＧＰＣＲ機能または活性または特性に関する。
【００９１】
このレセプターポリペプチドはまた、薬物スクリーニングアッセイ、細胞ベースの系または無細胞系において有用である。細胞ベースの系は、バイオプシーとして、または細胞培養において拡大された、ネイティブ（すなわち、レセプタータンパク質を正常に発現する細胞）であり得る。しかし、１つの実施形態において、細胞ベースのアッセイはレセプタータンパク質を発現する組換え宿主細胞を含む。
【００９２】
このポリペプチドを使用して、レセプター活性を調節する化合物を同定し得る。１５６２５タンパク質ならびに適切な改変体およびフラグメントのいずれも、ハイスループットスクリーニングにおいて使用して、レセプターに結合する能力について、候補化合物をアッセイし得る。これらの化合物をさらに機能性レセプターに対してスクリーニングして、その化合物のレセプターに対する作用を決定し得る。レセプターを所望の程度に活性化する（アゴニスト）かまたは不活性化する（アンタゴニスト）化合物を、同定し得る。
【００９３】
このレセプターポリペプチドを使用して、レセプタータンパク質と、レセプタータンパク質と正常に相互作用する標的分子との間の相互作用を、刺激または阻害する能力について、化合物をスクリーニングし得る。この標的は、レセプタータンパク質が正常に相互作用する、リガンドまたはシグナル伝達経路の成分（例えば、ｃＡＭＰもしくはホスファチジルイノシトール代謝回転および／またはアデニル酸シクラーゼ、あるいはホスホリパーゼＣの活性化に関係するＧタンパク質あるいは他の相互作用因子）であり得る。このアッセイは、レセプタータンパク質またはフラグメントが標的化合物と相互作用し得る条件下で、レセプタータンパク質を候補化合物と組み合わせる工程、およびそのタンパク質と標的との間の複合体形成を検出する工程またはそのレセプタータンパク質と標的との相互作用（例えば、Ｇタンパク質リン酸化、ｃＡＭＰまたはホスファチジルイノシトールの代謝回転、およびアデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣの活性化のような、シグナル伝達の任意の関連作用）の生化学的結果を検出する工程を、包含する。
【００９４】
候補化合物としては、例えば、以下が挙げられる：１）可溶性ペプチドのようなペプチド（Ｉｇテール化された融合タンパク質およびランダムベプチドライブラリーのメンバーを含む（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４〜８６（１９９１）を参照のこと）、ならびにＤ配置および／またはＬ配置のアミノ酸から作製されるコンビナトリアル化学由来の分子ライブラリー；２）ホスホペプチド（例えば、ランダムかつ部分的に縮退した、指向性のホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ  ７２：７６７〜７７８（１９９３）を参照のこと）；３）抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イデオタイプ抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、および抗体のエピトープ結合フラグメント）；ならびに４）有機低分子および無機低分子（例えば、コンビナトリアルライブラリーおよび天然産物ライブラリーから得られた分子）。
【００９５】
１つの候補化合物は、可溶性の全長のレセプターまたはリガンド結合に対して競合するフラグメントである。他の候補化合物としては、変異レセプターまたは適切なフラグメント（レセプター機能に影響し、従ってリガンドに対して競合する変異体を含む）が挙げられる。従って、リガンドに対して競合するフラグメント（例えば、高い親和性で）、またはリガンドを結合するが放出させないフラグメントは、本発明によって包含される。
【００９６】
本発明は、レセプター活性を調節（刺激または阻害）する化合物を同定するための、他の目的を提供する。このアッセイは、代表的には、レセプター活性を示すシグナル伝達経路における事象のアッセイを含む。従って、レセプタータンパク質依存性のシグナル伝達カスケードに応答して上方制御または下方制御される遺伝子の発現をアッセイし得る。１つの実施形態において、このような遺伝子の調節領域は、容易に検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）と作動可能に連結される。あるいは、レセプタータンパク質、またはレセプタータンパク質標的のリン酸化もまた測定され得る。
【００９７】
レセプターによって媒介される、任意の生物学的機能または生化学的機能は、目的のアッセイとして使用され得る。これらの目的のアッセイは、本明細書中、本明細書中に列挙された参考文献（これらの目的のアッセイ標的について、参考として包含される）に記載された全ての生化学的事象または生化学的／生物学的事象、ならびに当業者に公知の他の機能の全てを含む。
【００９８】
化合物の結合および／または活性化もまた、アミノ末端の細胞外ドメインもしくはその部分、膜貫通ドメイン全体、またはそのサブ領域（ｓｕｂｄｏｍａｉｎ）（例えば、任意の７つの膜貫通セグメントまたは任意の細胞内ループもしくは細胞外ループ、ならびにカルボキシ末端細胞内ドメインもしくはその部分は、異種性のドメインまたはサブ領域により置き換えられ得たキメラレセプタータンパク質を使用することにより、スクリーニングされ得る。例えば、異なるＧタンパク質と相互作用し、次いでネイティブなレセプターによって認識される、Ｇタンパク質結合領域を使用し得る。従って、異なるセットのシグナル伝達成分は、活性化のための目的のアッセイとして利用可能である。あるいは、膜貫通部分全体またはサブ領域（例えば、膜貫通セグメント、または細胞内ループもしくは細胞外ループ）は、アミノ末端細胞外ドメインおよび／またはＧタンパク質結合領域が由来する宿主とは異なる宿主に特異的な、膜貫通部分全体または膜貫通サブ領域全体と置き換えられ得る。このことは、そのレセプターが由来する特定の宿主細胞以外の細胞においてアッセイを実施することを可能にする。あるいは、アミノ末端細胞外ドメイン（および／またはリガンド結合領域）は、異なるリガンドを結合するドメイン（または他の結合領域）により置き換えられ得、これによって、異種性のアミノ末端細胞外ドメイン（または領域）と相互作用するが、以前としてシグナル伝達を生じる試験化合物についてのアッセイを提供する。最終的に、ネイティブなシグナル伝達経路の一部である転写調節配列と作動可能に連結された、容易に検出可能なコード領域を含むレポーター遺伝子によって、活性化を検出し得る。
【００９９】
レセプターポリペプチドはまた、このレセプターと相互作用する化合物を発見するために設計された方法での競合結合アッセイにおいて、有用である。従って、化合物がこのポリペプチドを結合することを可能にするか、またはそうでなければポリペプチドと相互作用することを可能にする条件下で、その化合物をレセプターポリペプチドに曝す。また、可溶性ポリペプチドレセプターをその混合物に添加する。試験化合物が可溶性レセプターポリペプチドと相互作用する場合、この化合物は形成される複合体の量またはレセプター標的からの活性を低下させる。この型のアッセイは、レセプターの特定の領域と相互作用する化合物を求める場合に特に有用である。従って、標的のレセプター領域と競合する可溶性ポリペプチドを、目的の領域に対応するペプチド配列を含むように設計する。
【０１００】
無細胞薬物スクリーニングアッセイを実施するために、ならびにこのアッセイの自動化に適応するために、タンパク質の片方または両方の複合体化していない形態からの複合体の分離を容易にするよう、レセプタータンパク質もしくはフラグメント、またはその標的分子のいずれかを固定化することが望ましい。
【０１０１】
タンパク質をマトリクス上に固定化するための技術を、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用し得る。１つの実施形態において、そのタンパク質をマトリクスに結合することを可能にするドメインを付加した、融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／１５６２５融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、またはグルタチオンで誘導化されたマイクロタイタープレート上に吸着し得、次いでこれらを細胞溶解物（例えば、３５Ｓ標識された細胞溶解物）および候補化合物と混ぜ合わせ、そしてこの混合物を、複合体形成を成す条件下（例えば、生理的条件の塩およびｐＨ）でインキュベートする。インキュベートの後、そのビーズを洗浄して未結合の標識をすべて取り除き、そしてこのマトリクスを固定しそして放射性標識を直接的に測定するか、またはこの複合体の解離の後に上清中の放射性標識を測定する。あるいは、この複合体をマトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてビーズ画分中に見出されるレセプター結合性タンパク質のレベルを、標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量する。例えば、当該分野で周知の技術を使用するビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化を利用して、ポリペプチドまたはその標的分子のいずれかを固定化し得る。あるいは、タンパク質と反応性であるが、そのタンパク質が標的分子に結合することを阻害しない抗体を、プレートの壁へと誘導体化し得、そしてそのタンパク質を抗体結合体によってウェル中に捕捉し得る。レセプター結合性タンパク質および候補化合物の調製物を、レセプタータンパク質が存在するウェル中でインキュベートし、そしてウェル中に捕捉された複合体の量を定量し得る。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固定化複合体についての上記の方法に加えて、レセプタータンパク質標的分子と反応性の抗体、またはレセプタータンパク質と反応性でありかつ標的分子と競合する抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびに標的分子と関連する酵素活性の検出に基づく、酵素連結アッセイが挙げられる。
【０１０２】
これらの薬物スクリーニングアッセイに従って同定されたレセプタータンパク質活性のモジュレーターを使用して、１５６２５タンパク質を発現する細胞（例えば、脳（特にグリア細胞）、脊髄、脊髄神経節、三叉神経節、上頸神経節、骨髄ＣＤ３４＋細胞（巨核球、休眠Ｂリンパ球を含むが、これらに限定されない）、および骨格筋において）を処理することによって、このレセプター経路によって媒介される障害を患う被検体を処置し得る。他の組織としては、リンパ節、脾臓、心臓、胸腺、肝臓、扁桃腺、結腸、顆粒球、胎盤、膵臓、および赤血球が挙げられる。これらの処置方法は、本明細書中に記載されるような薬学的組成物中のタンパク質活性のモジュレーターを、このような処置を必要とする被検体に投与する工程を包含する。
【０１０３】
この１５６２５は、侵害受容性刺激を検出するのに重要な役割を果たす組織である、三叉神経節および脊髄神経節において高度に発現されるので、１５６２５は疼痛の伝達に関連する障害または状態の調節または処置において有用であり、これら疼痛としては、例えば、血管痛（激痛を含む）、虚血性筋肉痛（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐａｉｎ）、片頭痛、腰痛、骨盤痛、および関節炎に関連した炎症を含む交換神経作動、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
この１５６２５レセプターは、脳において高度に発現され、従って、以下に挙げられる脳に関与する疾患に関与する障害と関連性があるが、これらに限定されない：ニューロンに関連する障害、およびグリア（例えば、星状細胞、稀突起膠細胞、上衣細胞、および小グリア細胞）に関連する障害；頭蓋内圧およびヘルニア形成から生じる脳水腫、ならびに水頭症；奇形および発育疾患（例えば、神経管欠損、前脳奇形、後窩奇形、および脊髄空洞症および水脊髄症）；周期性脳損傷；脳血管疾患（例えば、低酸素症、虚血、および梗塞形成に関連する障害（低血圧症、低灌流、および低流状態（全大脳虚血および局所大脳虚血）、局所血液供給の閉塞からの閉塞症を含む）、頭蓋内出血（大脳内（実質内）出血、クモ膜下出血および破裂性漿果状動脈瘤、および大動脈奇形を含む）、高血圧脳血管疾患（窩梗塞、細隙出血、および高血圧性動脈硬化症を含む））；感染（例えば、急性髄膜炎（急性化膿（菌）髄膜炎および急性無菌性（ウイルス）髄膜炎を含む）、急性化膿性感染（脳腫瘍、硬膜下蓄膿症、および硬膜外蓄膿症を含む）、慢性細菌性髄膜脳炎（結核症およびミコバクテリア症を含む）、神経梅毒、および神経ボレリア症（Ｌｙｍｅ疾患）、ウイルス髄膜脳炎（節足動物骨（Ａｒｂｏ）ウイルス脳炎、単純疱疹ウイルス１型、単純疱疹ウイルス２型、Ｖａｒｉｃａｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）、サイトメガロウイルス、灰白髄炎、狂犬病、およびヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１髄膜脳炎（亜急性脳炎）を含む）、空胞脊髄症、ＡＩＤＳ関連脊髄症、末梢神経障害、および小児のＡＩＤＳ、進行性多病巣性白質脳症、亜急性硬化性汎脳炎、真菌髄膜脳炎、神経系の他の感染疾患）；伝達可能海綿状脳障害（プリオン疾患）；脱髄疾患（多発性硬化症、多発性硬化症変異体、急性播種性脳脊髄炎および急性壊死性出血性脳脊髄炎、および他の脱髄を伴う疾患を含む）；変性疾患（例えば、大脳皮質に影響を与える変性疾患（アルツハイマー病およびＰｉｃｋ病を含む）、脳幹神経節および脳幹の変性疾患（振せん麻痺、特発性パーキンソン病（振せん麻痺）を含む）、進行性核上性麻痺、皮質基底変性、多発系萎縮症（線条体黒質、シャイ−ドレーガー症候群、およびオリーブ橋小脳萎縮症、およびハンチントン病を含む））；脊髄小脳変性（脊髄小脳性運動失調（フリートライヒ運動失調、および毛細管拡張性運動失調を含む）、運動神経に影響を与える変性疾患（筋萎縮側索硬化症（運動ニューロン疾患）、延髄脊髄萎縮症（ケネディ症候群）、および脊髄筋萎縮症を含む））；先天性代謝異常（例えば、白質萎縮症（クラッベ病、異染性白質萎縮症、副腎脳白質ジストロフィー、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病、およびキャナヴァン病を含む）、脳心筋炎（リー病および他の脳心筋炎を含む））；中毒性および後天性代謝疾患（ビタミン欠乏（例えば、チアミン（ビタミンＢ１）欠乏およびビタミンＢ１２欠乏）を含む）、代謝妨害の神経続発症（低血糖症、高血糖症、および肝性脳障害を含む）、毒性障害（一酸化炭素、メタノール、エタノールおよび放射線（メトトレキサートと放射線誘導傷害の組み合わせを含む））；腫瘍（例えば、神経膠腫（星状細胞腫（原線���（拡散）星状細胞腫およびグリア芽細胞腫多形）を含む）、ピロサイト（ｐｉｌｏｃｙｔｉｃ）星状細胞腫、多形性黄色星状膠細胞腫、および脳幹神経膠腫、乏突起膠腫、および脳室上衣細胞腫および関連室傍質量損傷、神経腫瘍、未分化型新生物（髄芽腫を含む）、他の実質性腫瘍（原始脳リンパ腫）、生殖細胞腫瘍、および松果体実質性腫瘍、髄膜腫、転移性腫瘍、新生物随伴症候群、末梢神経鞘腫瘍（神経鞘腫、神経線維腫、および悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性神経鞘腫）を含む）、および神経皮膚症候群（母斑症）（神経線維腫症（１型神経線維腫症（ＮＦ１）および２型神経線維腫症（ＮＦ２）を含む）を含む）、結節硬化症、およびフォン・ヒッペルリンダウ病）。
【０１０５】
この遺伝子は、本発明者らによって分析された全ての血液細胞前駆体において、有意なレベルで発現される。これは、骨髄（ＣＤ３４＋）、Ｇ−ＣＳＦ移動性末梢血（骨髄由来の循環前駆体を含む）および臍帯血前駆体において、高度に発現される。従って、この遺伝子の発現は、分化した血液細胞および／または成熟した血液細胞の形成と関連した障害を処置するのに適切である。このことに関して、特に関連する障害としては、貧血、好中球減少症、および血小板減少症が挙げられ得る。
【０１０６】
処置とは、疾患、疾患症状または疾患への予兆を、治療（ｃｕｒｅ）、治癒（ｈｅａｌ）、改善、緩和、変更、治療（ｒｅｍｅｄｙ）、回復、改善または作用する目的で、患者に対する治療剤の適用または投与としてか、または疾患、疾患症状、または疾患への予兆を有する患者由来の単離された組織または細胞株に対する治療剤の適用または投与として規定される。「被検体」とは、本明細書中で使用される場合、哺乳動物、例えはヒト、または実験モデル、もしくは動物モデル、もしくは疾患モデルをいう。被検体はまた、非ヒト哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギまたは他の家畜）が挙げられる。治療剤としては、低分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１０７】
レセプターポリペプチドはまた、特に脳（特にグリア細胞）、脊髄、脊髄神経節、三叉神経節、上頸神経節、および骨髄ＣＤ３４＋細胞（巨核球を含むがこれに限定されない）において、そしてまた心臓、胎盤、膵臓、休止Ｂリンパ球、骨格筋、リンパ節、脾臓、胸腺、肝臓、扁桃腺、結腸、顆粒球および赤血球における処置に関して上で考察したように、疾患を分析するための標的または、レセプタータンパク質によって媒介される疾患に対する素因を提供するのに有用である。従って、細胞、組織または生物体におけるレセプタータンパク質の存在またはレベルを検出するための方法が提供される。この方法は、レセプタータンパク質と相互作用し得る化合物とを、生物学的サンプルと接触させ、それによって、相互作用を検出し得る工程を包含する。
【０１０８】
レセプタータンパク質を検出するための１つの薬剤は、レセプタータンパク質に選択的に結合し得る抗体である。生物学的サンプルとしては、被検体から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに被検体中に存在する組織、細胞および流体が挙げられる。
【０１０９】
レセプタータンパク質はまた、改変体レセプタータンパク質を有する患者における活発な疾患または疾患に対する素因を診断するための標的を提供する。従って、レセプタータンパク質は、生物学的サンプルから単離され得、異常なレセプタータンパク質を生じる遺伝子性変異の存在についてアッセイし得る。このこととしては、アミノ酸の置換、欠失、挿入、（異常なスプライシング事象の結果としの）再配置、および不適切な翻訳後修飾が挙げられる。分析方法としては、変化した電気泳動移動度、変化したトリプシンペプチド消化物、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイにおける変化したレセプター活性、リガンド結合様式または抗体結合様式における変化、変化した等電点、直接のアミノ酸配列決定、およびタンパク質中の変異を検出するのに有用な、任意の他の公知アッセイ技術が挙げられる。
【０１１０】
レセプタータンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素連結イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光検査が挙げられる。あるいは、被検体に標識した抗レセプター抗体を導入することによって、被検体中のタンパク質をインビボで検出し得る。例えば、被検体の中で存在および位置を標準的な画像化システムによって検出し得る、放射性マーカーを用いて、抗体を標識し得る。被検体中に発現したレセプタータンパク質の対立遺伝子改変体を検出する方法、およびサンプル中のレセプタータンパク質のフラグメントを検出する方法は、特に有用である。
【０１１１】
レセプターポリペプチドはまた、ゲノム薬理学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ）分析に有用である。ゲノム薬理学は、変更された薬物の性質（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）および罹患した患者における異常な作用に起因した薬剤に対する応答における臨床的に有意な遺伝的改変を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５（１９９６））およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６（１９９７））を参照のこと。これらの改変の臨床的成果は、代謝における個々の改変の結果として、特定の個体における治療薬の重篤な毒性、または特定の個体における薬物の治療不全を生じる。よって、個体の遺伝子型は、治療化合物が体内で作用する方法または身体がその化合物を代謝する方法を決定し得る。さらに、薬物代謝酵素の活性は、薬物の作用の強度および持続の両方に影響する。よって、個体のゲノム薬理学は、個体の表現型に基づく予防処置または治療処置のために効果的な化合物およびこのような化合物の効果的な投薬量の選択を可能にする。いくつかの薬物代謝酵素における遺伝的多型の発見は、幾人かの患者がなぜ期待された薬物効果を得ないのか、なぜ誇張された薬物効果を示すのか、またはなぜ標準的薬物投薬量からの重篤な毒性を被るのかを説明した。多型は、広範な代謝薬（ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）の表現型およびわずかな代謝薬の表現型において示され得る。よって、遺伝的多型は、レセプタータンパク質の対立遺伝子タンパク質改変体を導き得、ここで、１つの集団における１つ以上のレセプター機能は、別の集団におけるレセプター機能とは異なる。よって、このポリペプチドは、標的に処置モダリティーに影響し得る遺伝的素因を確認させる。よって、リガンドベースの処置において、多型は、アミノ末端細胞外ドメインならびに／またはリガンド結合およびレセプター活性化の際により活性であるかもしくはより活性でない他のリガンド結合領域に生じ得る。よって、リガンド用量は、多型を含む所定の集団内での治療効果を最大化するために改変される必要がある。遺伝子型決定の代替として、特定の多型ポリペプチドが同定され得る。
【０１１２】
レセプターポリペプチドはまた、臨床試験および他の処置の間の治療効果をモニタリングするために有用である。よって、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはレセプター活性を増加または減少させるように設計されている薬剤の治療的有効性は、終点標的（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ｔａｒｇｅｔ）としてこのレセプターポリペプチドを使用して、処置の経過にわたってモニタリングされ得る。
【０１１３】
レセプターポリペプチドはまた、レセプター関連障害を処置するために有用である。よって、処置方法は、可溶性レセプターまたはリガンド結合に競合するそのレセプタータンパク質のフラグメントの使用を包含する。これらのレセプターまたはフラグメントは、効果的な競合を提供するために、リガンドに対するより高い親和性を有し得る。
【０１１４】
上記の開示は、一般に、配列番号３に示される配列にもまた適用する。
【０１１５】
（抗体）
本発明はまた、１５６２５レセプタータンパク質ならびにその改変体およびフラグメントに選択的に結合する抗体を提供する。抗体は、レセプタータンパク質と実質的に相同ではない他のタンパク質にもまた結合する場合でさえ、選択的に結合するとみなされる。これらの他のタンパク質は、このレセプタータンパク質のフラグメントまたはドメインと相同性を共有する。特定の領域におけるこの保存は、相同配列のために両方のタンパク質に結合する抗体を惹起する。この場合、このレセプタータンパク質に結合する抗体はなお選択的であることが理解される。
【０１１６】
抗体を作製するために、単離されたレセプターポリペプチドが、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物について標準的技術を使用して抗体を作製するために、免疫原として使用される。全長タンパク質または抗原性ペプチドフラグメントのいずれかが使用され得る。高い抗原性指標を有する領域を、図３に示す。
【０１１７】
抗体は、好ましくは、これらの領域から、またはこれらの領域内の別々のフラグメントから調製される。しかし、抗体は、本明細書中に記載されるようなペプチドの任意の領域から調製され得る。好ましいフラグメントは、リガンド結合を減少させるかまたは完全に阻止する抗体を生成する。抗体は、完全なレセプターまたはそのレセプターの一部（例えば、細胞内カルボキシ末端ドメイン、アミノ末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン全体または特定のセグメント、任意の細胞内ループまたは細胞外ループ、あるいは上記の任意の部分）に対して生じさせられ得る。抗体はまた、特定の機能的部位（例えば、リガンド結合部位、Ｇタンパク質結合部位、またはグリコシル化、リン酸化もしくはミリストイル化されている部位）に対して生じさせられ得る。
【０１１８】
抗原性フラグメントは、典型的に、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基を含む。しかし、抗原性ペプチドは、少なくとも１２アミノ酸残基、少なくとも１４アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含み得る。１つの実施形態において、フラグメントは、タンパク質の表面上に位置する領域（例えば、親水性領域）に対応する。しかし、これらのフラグメントは、本発明より前に開示され得るフラグメントのいずれかを含むと解釈されるべきではない。
【０１１９】
抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。
【０１２０】
検出は、検出可能な物質に抗体を結合させる（すなわち、物理的に結合する）によって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１２１】
適切な免疫原性調製物は、ネイティブなタンパク質、組換え発現されたタンパク質または化学合成されたペプチド由来であり得る。
【０１２２】
（抗体用途）
抗体を使用して、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的技術によってレセプタータンパク質を単離し得る。抗体は、細胞からの天然のレセプタータンパク質、および宿主細胞中に発現される組換え的に産生されたレセプタータンパク質の精製を容易にし得る。
【０１２３】
抗体は、生物における種々の組織の中でのレセプターの発現パターンおよび正常な発達の経過にわたるレセプターの発現パターンを決定するために、細胞または組織におけるレセプタータンパク質の存在を決定するために有用である。
【０１２４】
抗体を使用して、発現の量およびパターンを評価するために、インサイチュで、インビトロで、または細胞溶解物中もしくは細胞上清中でレセプタータンパク質を検出し得る。
【０１２５】
抗体を使用して、発達中の異常な組織分布または異常な発現を評価し得る。
【０１２６】
全長レセプタータンパク質の循環するフラグメントの抗体検出を使用して、レセプターの代謝回転を同定し得る。
【０１２７】
さらに、抗体を使用して、疾患状態における（例えば、その疾患の活性段階において、またはレセプター機能に関連する疾患に対する素因を有する個体において）レセプター発現を評価し得る。レセプタータンパク質の不適切な組織分布、発生的発現、または発現レベルによって障害を生じる場合、抗体は、正常なレセプタータンパク質に対して調製され得る。障害がレセプタータンパク質中の特定の変異によって特徴付けられる場合、この変異タンパク質に対して特異的な抗体を使用して、特定の変異レセプタータンパク質の存在についてアッセイし得る。しかし、細胞内レセプターペプチド領域を認識する細胞内で生じた抗体（「細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」がまた、含まれる。
【０１２８】
抗体をまた使用して、生物における種々の組織中の細胞の正常な細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）局在および異常な細胞内局在を評価し得る。抗体は、レセプター全体またはそのレセプターの一部（例えば、アミノ末端細胞外ドメインまたは細胞外ループ）に対して生じさせられ得る。
【０１２９】
診断的用途は、遺伝的試験においてのみならず、処置モダリティーをモニタリングする際に適用され得る。よって、処置が究極的にレセプター発現レベルまたは異常なレセプターの存在および異常な組織分布または発生的発現を補正することを目的とする場合、レセプターまたは関連するフラグメントに対して指向される抗体を使用して、治療効率をモニタリングし得る。
【０１３０】
さらに、抗体は、ゲノム薬理学分析に有用である。よって、多型レセプタータンパク質に対して調製された抗体を使用して、改変された処置モダリティーを必要とする個体を同定し得る。
【０１３１】
抗体はまた、電気泳動的移動度、等電点、ペプチドのトリプシン消化、および当業者に公知の他の物理的アッセイによって分析される異常なレセプタータンパク質についての免疫学的マーカーとしての診断ツールとして有用である。
【０１３２】
抗体はまた、組織タイピングに有用である。よって、特定のレセプタータンパク質が特定の組織における発現と相関された場合、このレセプタータンパク質に特異的な抗体を使用して組織型を同定し得る。
【０１３３】
抗体はまた、法医学的同定に有用である。よって、個体が、特定の多型タンパク質を生じる特定の遺伝的多型と相関された場合、この多型タンパク質に特異的な抗体は、同定の補助として使用され得る。
【０１３４】
抗体はまた、レセプター機能を阻害する（例えば、リガンド結合をブロックする）ために有用である。
【０１３５】
これらの用途はまた、処置が、レセプター機能を阻害することを包含する治療の状況において適用され得る。抗体を使用して、例えば、リガンド結合を阻害し得る。抗体は、機能に必要とされる部位を含む特定のフラグメントに対して、または細胞と結合するインタクトなレセプターに対して調製され得る。
【０１３６】
本発明はまた、生物学的サンプル中のレセプタータンパク質の存在を検出するための抗体を使用するためのキットを含む。本キットは、標識された抗体または標識可能な抗体のような抗体、および生物学的サンプル中のレセプタータンパク質を検出するための化合物または薬剤；このサンプル中のレセプタータンパク質の量を決定するための手段；ならびにこのサンプル中のレセプタータンパク質の量をコントロールと比較するための手段、を備え得る。この化合物または薬剤は、適切な容器中にパッケージングされ得る。本キットはさらに、レセプタータンパク質を検出するためのキットを使用するための指示書を備え得る。
【０１３７】
上記の開示は、一般に、配列番号３に示される配列にもまた適用する。
【０１３８】
（ポリヌクレオチド）
具体的に開示されたｃＤＮＡは、コード領域ならびに５’および３’非翻訳配列を含む（配列番号２）。
【０１３９】
ヒト１５６２５レセプターｃＤＮＡは、約２２８６ヌクレオチド長であり、そして約３４２アミノ酸残基長である全長タンパク質をコードする。この核酸は、本明細書中で開示されるように（例えば、脳において、特に、グリア細胞、ＣＤ３４＋細胞、２９３細胞株およびＪｕｒｋａｔ細胞株において）発現される。配列番号１のアミノ酸配列の構造分析は、図３のヒドロパシープロットに提供される。この図は、７つの膜貫通セグメント、アミノ末端細胞外ドメインおよびカルボキシ末端細胞内ドメインの推定の構造を示す。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、用語「膜貫通セグメント」は、原形質膜にわたる疎水性ヘリックスを含む構造的アミノ酸モチーフをいう。膜貫通ドメイン全体は、およそのアミノ酸２６〜およそのアミノ酸３０２にわたる。７つのセグメントは膜にわたり、そしてこのドメイン中に３つの細胞内ループおよび３つの細胞外ループが存在する。
【０１４１】
本発明は、１５６２５レセプタータンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。用語「１５６２５ポリヌクレオチド」または「１５６２５核酸」は、配列番号２に示される配列をいう。用語「レセプターポリヌクレオチド」または「レセプター核酸」はさらに、配列番号４に示されるもののような１５６２５ポリヌクレオチドの改変体およびフラグメントを含む。
【０１４２】
「単離された（単離した）」レセプター核酸は、このレセプター核酸の天然の供給源に存在する他の核酸とは別の核酸である。好ましくは、「単離された（単離した）」核酸は、その核酸が由来する生物中のゲノムＤＮＡ中のその核酸に天然に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。しかし、例えば、約５ｋＢまでのいくつかの隣接ヌクレオチド配列であり得る。重要な点は、その核酸が隣接配列から単離されており、その結果、本明細書中に記載される特定の操作（例えば、組換え発現、プローブおよびプライマーの調製、ならびにレセプター核酸配列に特異的な他の用途）に供され得る。
【０１４３】
さらに、「単離された（単離した）」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、他の細胞性物質を、または組換え技術によって産生される場合は培養培地を、または化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を、実質的に含み得ない。しかし、核酸分子は、他のコード配列または調節配列に融合され得、そしてなお単離されたと認識される。
【０１４４】
例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、単離されたと認識される。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明の単離されたＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明に従う単離された核酸分子はさらに、合成により産生されるこのような分子を含む。
【０１４５】
レセプターポリヌクレオチドは、成熟タンパク質と、さらなるアミノ末端アミノ酸もしくはカルボキシル末端アミノ酸、または（例えば、成熟形態が１つより多いポリペプチド鎖を有する場合）成熟ポリペプチドの内部アミノ酸とをコードし得る。このような配列は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシングにおける役割を果たし得るか、タンパク質輸送、タンパク質半減期の延長もしくは短縮を容易にするか、または特にアッセイまたは産生のためにタンパク質の操作を容易にする。インサイチュでの場合に一般的であるように、さらなるアミノ酸は、細胞内酵素によって成熟タンパク質からプロセスされ得る。
【０１４６】
レセプターポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのみをコードする配列、成熟ポリペプチドおよびさらなるコード配列（例えば、リーダー配列または分泌配列（例えば、プレプロタンパク質配列またはプロタンパク質配列））をコードする配列）、さらなるコード配列を伴うかもしくは伴わない成熟ポリペプチドをコードする配列とさらなる非コード配列（例えば、イントロンならびに非コード５’配列および非コード３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性における役割を担う、転写されるが翻訳されない配列）。さらに、ポリヌクレオチドは、例えば、精製を容易にするペプチドをコードするマーカー配列に融合され得る。
【０１４７】
レセプターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡ（クローニングによって、または化学合成技術によって、あるいはその組み合わせによって得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）の形態であり得る。核酸、特にＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）であっても非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【０１４８】
１つのレセプター核酸は、ヒト脳ｃＤＮＡに対応する、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
１つの実施形態において、レセプター核酸は、コード領域のみを含む。
【０１５０】
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因してよって配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同一のタンパク質をコードする、配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは異なる改変体レセプターポリヌクレオチドおよびそのフラグメントを提供する。
【０１５１】
本発明はまた、本明細書中に記載される改変体ポリペプチドをコードするレセプター核酸分子を提供する。このようなポリヌクレオチドは、対立遺伝子改変体（同一の遺伝子座）（ＡＦＭ１６４ＹＧ９付近の第３染色体にマッピングされる）、ホモログ（異なる遺伝子座）、およびオルソログ（異なる生物）（例えば、配列番号４に示される配列）のように、天然に存在し得るか、あるいは、組換えＤＮＡ法または化学合成によって構築され得る。このような天然に存在しない改変体は、変異誘発技術（ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用される技術を含む）によって作製され得る。よって、上記のように、改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失、転位および挿入を含み得る。
【０１５２】
バリエーションは、コード領域および非コード領域のいずれかまたは両方に生じ得る。バリエーションは、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方を生成し得る。
【０１５３】
オルソログ、ホモログおよび対立遺伝子改変体は、当該分野において周知の方法を使用して同定され得る。これらの改変体は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列またはこの配列のフラグメントに対して、５０％、少なくとも約５５％、典型的には少なくとも約７０〜７５％、より典型的には少なくとも約８０〜８５％、最も典型的には少なくとも約９０〜９５％またはそれより高く相同であるレセプターをコードするヌクレオチド配列を含む。このような核酸分子は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列またはこの配列のフラグメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るとして、容易に同定され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、一般的な相同性に起因する場合に実質的な相同性を示さないことが理解される（例えば、ポリＡ配列、または全てのタンパク質もしくはほとんどのタンパク質に共通する配列、全てのＧＰＣＲ、あるいは全てのファミリーＩ  ＧＰＣＲ）。さらに、改変体は、本発明より前に開示されていたかもしれない核酸配列のいずれもを含まないということが、理解される。
【０１５４】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載する。ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。水性および非水性の方法がこの参考文献中に記載され、そしていずれかが使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、５５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。特に好ましいストリンジェンシー条件（そして分子が本発明のハイブリダイゼーション制限内であるか否かを決定するためにどのような条件が適用されるべきかについて、実験者が確信をもてない場合に使用されるべき条件）は、約６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中、続いて、６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。好ましくは、配列番号２または配列番号４の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。
【０１５５】
さらに、本発明は、全長レセプターポリヌクレオチドのフラグメントを含むポリヌクレオチドを提供する。このフラグメントは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、そしてＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。このフラグメントは、コード配列または非コード配列のいずれか由来であり得る。
【０１５６】
フラグメントは、ヌクレオチド１〜およそのヌクレオチド５００からの１２個より多い連続するヌクレオチド配列、およそのヌクレオチド４７６〜およそのヌクレオチド１０９６からの２４個より多い連続するヌクレオチド配列、およびおよそのヌクレオチド１１４７〜およそのヌクレオチド１７１５からの１２個より多い連続するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１５７】
単離されたレセプター核酸フラグメントは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。他の実施形態において、この核酸は、少なくとも３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長または５００ヌクレオチド長である。
【０１５８】
別の実施形態において、単離されたレセプター核酸は、アミノ酸１〜アミノ酸３４２のコード領域全体をコードする。別の実施形態において、この単離されたレセプター核酸は、成熟タンパク質のおよそのアミノ酸６〜アミノ酸３４２に対応する配列をコードする。他のフラグメントは、本明細書中に記載されるアミノ酸フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む。さらなるフラグメントは、本明細書中に記載される特定のドメインまたは部位のサブフラグメントを含み得る。本発明に従う核酸フラグメントは、本発明より前に開示されていたかもしれないフラグメントを含むと解釈されるべきではない。
【０１５９】
レセプター核酸フラグメントはさらに、本明細書中に記載されるドメイン、また記載されるサブ領域、および特定の機能的部位に対応する配列を含む。レセプター核酸フラグメントはまた、そのドメイン、セグメント、ループ、および上記される他の機能的部位の組み合わせを含む。よって、例えば、レセプター核酸は、アミノ末端細胞外ドメインおよび１つの膜貫通フラグメントに対応する配列を含み得る。当業者は、可能である多くの順列を認識する。
【０１６０】
しかし、レセプターフラグメントが、遺伝子全体を含まない核酸配列のいずれかを含むことが、理解される。
【０１６１】
レセプター核酸フラグメントは、以下を含む：アミノ酸残基１〜約２５を含むアミノ末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（アミノ酸残基約２６〜約３０２）にわたる領域を含むポリペプチド、カルボキシ末端細胞内ドメイン（アミノ酸残基約３０３〜約３４２）を含むポリペプチド、およびＧタンパク質レセプター特性（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）をコードするポリペプチド（１２１〜１２３または約１１０〜約１３３の周辺アミノ酸残基）、７つの膜貫通セグメントのいずれかをコードする核酸分子、細胞外ループまたは細胞内ループ、ならびにグリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存的タンパク質キナーゼリン酸化部位およびｃＧＭＰ依存的タンパク質キナーゼリン酸化部位、タンパク質キナーゼＣリン酸化部位、およびＮ−ミリストイル化部位。これらのドメインの位置がコンピューター分析によって予測された場合、当業者は、これらのドメインを構成するアミノ酸残基がこれらのドメインを規定するために使用される基準に依存して変動し得るということを認識する。
【０１６２】
本発明はまた、本明細書中に記載されるレセプタータンパク質のエピトープ保有領域をコードするレセプター核酸フラグメントを提供する。
【０１６３】
単離されたレセプターポリヌクレオチド配列、および特にフラグメントは、ＤＮＡプローブおよびプライマーとして有用である。
【０１６４】
例えば、レセプター遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のヌクレオチド配列を使用して単離され得る。次いで、標識されたプローブを使用して、コード領域に対応する核酸を単離するために、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、またはｍＲＮＡをスクリーニングし得る。さらに、プライマーは、レセプター遺伝子の特定の領域をクローニングするためにＰＣＲ反応において使用され得る。
【０１６５】
プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、配列番号２のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖または他のレセプターポリヌクレオチドの、少なくとも約１２個、典型的には約２５個、より典型的には約４０個、５０個または７５個の連続するヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。プローブはさらに、標識（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子）を含む。
【０１６６】
上記の開示はまた、一般に配列番号４に示される配列に適用する。
【０１６７】
（ポリヌクレオチド用途）
レセプターポリヌクレオチドは、プローブ、プライマーについて、および生物学的アッセイにおいて有用である。ポリヌクレオチドを使用してＧＰＣＲ特性またはＧＰＣＲ機能を評価する場合、例えば、本明細書中に記載されるアッセイにおいて、全て以下のｃＤＮＡ全体が有用であり得る。この場合、本発明より前に公知であり得るフラグメントでさえ含まれる。よって、例えば、ＧＰＣＲ機能に特異的に指向されるアッセイ（例えば、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を評価すること）は、公知のフラグメントの使用を含む。さらに、レセプター機能を評価するための診断法はまた、任意のフラグメント（本発明より前に公知であり得るフラグメントを含む）を用いて実施され得る。同様に、レセプター機能不全の処置を含む方法において、当該分野において公知であり得るフラグメントを含む全てのフラグメントが含まれる。
【０１６８】
レセプターポリヌクレオチドは、全長ｃＤＮＡおよび配列番号１に記載されるポリペプチドをコードするゲノムクローンを単離するため、ならびに配列番号１に示される同一のポリペプチドを産生する改変体または本明細書中に記載される他の改変体に対応するｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離するための、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして有用である。改変体は、配列番号１に示されるポリペプチドが単離された同一の組織および生物、同一の生物由来の異なる組織、または異なる生物から単離され得る。発生的に制御されており、ゆえに、生物の発生における異なる時点での同一組織または異なる組織において発現され得る遺伝子およびｃＤＮＡを単離するために、本方法は有用である。
【０１６９】
プローブは、レセプターをコードする遺伝子の全長に沿う任意の配列に対応し得る。よって、プローブは、５’非コード領域、コード領域、および３’非コード領域由来であり得る。しかし、議論したように、フラグメントは、本発明より前に開示されたフラグメントを含みえるように解釈されるべきではない。
【０１７０】
核酸プローブは、例えば、配列番号２、配列番号４の全長ｃＤＮＡ、またはそのフラグメント（例えば、少なくとも１２ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド）であり得、そしてｍＲＮＡまたはＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするに十分であり得る。
【０１７１】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドのフラグメントはまた、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのより長いフラグメントまたは全長を合成するために有用である。例えば、フラグメントは、ｍＲＮＡの任意の部分にハイブリダイズし得、そしてより長いｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡが産生され得る。
【０１７２】
フラグメントはまた、所望の長さおよび配列のアンチセンス分子を合成するために有用である。
【０１７３】
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプターポリヌクレオチドの任意の所定の領域を増幅するための、ＰＣＲについてのプライマーとして有用である。
【０１７４】
レセプターポリヌクレオチドはまた、組換えベクターを構築するために有用である。このようなベクターとしては、レセプターポリペプチドの一部または全部を発現する発現ベクターが挙げられる。ベクターとしてはまた、レセプター遺伝子および遺伝子産物のインサイチュでの発現を変更するために別のポリヌクレオチド配列に（例えば、細胞ゲノムに）組み込むために使用される挿入ベクターが挙げられる。例えば、内因性レセプターコード配列は、１つ以上の特異的に導入された変異を含むコード領域の全てまたは一部と相同組換えを介して置換され得る。
【０１７５】
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプタータンパク質の抗原性部分を発現するために有用である。
【０１７６】
レセプターポリヌクレオチドはまた、インサイチュハイブリダイゼーション法によってレセプターポリヌクレオチドの染色体部分を決定するためのプローブとして有用である。
【０１７７】
レセプターポリヌクレオチドプローブはまた、組織分布に関してレセプターおよびその改変体をコードする遺伝子の存在のパターンを決定するために（例えば、遺伝子複製（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が生じるのか否か、そして、この複製が組織の全てもしくはあるサブセットのみで生じるのか否かを決定するために）有用である。遺伝子は、天然に存在しても、細胞中、組織中もしくは生物中に外因的に導入されていてもよい。
【０１７８】
レセプターポリヌクレオチドはまた、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドをコードする遺伝子から産生されるｍＲＮＡの全てまたは一部に対応するリボザイムを設計するために有用である。
【０１７９】
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプターポリヌクレオチドおよびレセプターポリペプチドの全てまたは一部を発現する宿主細胞を構築するために有用である。
【０１８０】
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプターポリヌクレオチドおよびレセプターポリペプチドの全てまたは一部を発現するトランスジェニック動物を構築するために有用である。
【０１８１】
レセプターポリヌクレオチドは、レセプターポリペプチドの全てまたは一部を発現するベクターを作製するために有用である。
【０１８２】
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプター核酸発現のレベルを測定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。よって、このプローブを使用して、細胞中、組織中および生物中のレセプター核酸の存在を検出し得、そしてレセプター核酸のレベルを測定し得る。そのレベルが測定される核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。よって、本明細書中に記載されるポリペプチドに対応するプローブを使用して、所定の細胞中、組織中、または生物中の遺伝子コピーの数を評価し得る。これは、レセプター遺伝子の増幅が存在する場合に特に適切である。
【０１８３】
あるいは、プローブをインサイチュハイブリダイゼーションにおいて使用して、染色体外エレメント上の場合または染色体中に組み込まれた場合（ここで、このレセプター遺伝子は通常は見出されない）、レセプター遺伝子の余分なコピーの位置を、例えば、均一な染色領域として評価し得る。
【０１８４】
これらの用途は、正常な結果と比較してレセプター発現の増加または減少に関連する障害の診断に適切である。
【０１８５】
ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１８６】
プローブは、例えば、被験体由来の細胞サンプル中のレセプターコード核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）のレベルを測定することによって、あるいはレセプター遺伝子が変異されたか否かを決定することによって、レセプタータンパク質を発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用され得る。
【０１８７】
核酸発現アッセイは、レセプター核酸発現を調節する化合物を同定するための薬物スクリーニングに有用である。
【０１８８】
従って、本発明は、レセプター遺伝子の核酸発現に関連する障害を処置するために使用され得る化合物を同定するための方法を提供する。本方法は、典型的には、レセプター核酸の発現を調節する化合物の能力をアッセイする工程、および、よって所望されないレセプター核酸発現によって特徴付けられる障害を処置するために使用され得る化合物を同定する工程、を包含する。
【０１８９】
このアッセイは、細胞ベースの系および無細胞系において行われ得る。細胞ベースのアッセイは、レセプター核酸を天然に発現する細胞、または特定の核酸配列を発現するように遺伝子操作されている組換え細胞を含む。
【０１９０】
あるいは、候補化合物が、患者またはトランスジェニック動物においてインビボでアッセイされ得る。
【０１９１】
レセプター核酸発現についてのアッセイは、核酸レベル（例えば、ｍＲＮＡレベル）の直接アッセイ、またはこのシグナル伝達経路（例えば、ｃＡＭＰまたはホスファチジルイノシトールの代謝回転）に関与する付随的な化合物に対する直接アッセイを含み得る。さらに、レセプタータンパク質シグナル伝達経路に応じてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子の発現もまたアッセイされ得る。この実施形態において、これらの遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に作動可能に連結され得る。
【０１９２】
よって、細胞が候補化合物と接触されそしてｍＲＮＡ発現が測定されるような方法において、レセプター遺伝子発現のモジュレーターが同定され得る。候補化合物の存在下でのレセプターｍＲＮＡ発現レベルは、候補化合物の非存在下でのレセプターｍＲＮＡ発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて核酸発現のモジュレーターとして同定され得、そして、例えば、異常な核酸発現によって特徴付けられ得る障害を処置するために使用され得る。ｍＲＮＡ発現が候補化合物の存在下でその非存在下よりも統計的に有意に高い場合、この候補化合物は、核酸発現の刺激因子として同定される。核酸発現が候補化合物の存在下でその非存在下よりも統計的に有意に低い場合、この候補化合物は、核酸発現のインヒビターとして同定される。
【０１９３】
従って、本発明は、レセプター核酸発現を調節する遺伝子モジュレーターとして薬物スクリーニングを介して同定された化合物を標的としての核酸とともに使用する処置方法を提供する。調節は、アップレギュレート（すなわち、活性化またはアゴニスト化）またはダウンレギュレート（抑制または拮抗）の両方あるいは核酸発現を含む。
【０１９４】
あるいは、レセプター核酸発現のモジュレーターは、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイを使用して同定される低分子または薬物であり得る（この薬物または低分子がレセプター核酸発現を阻害する限り）。
【０１９５】
レセプターポリヌクレオチドはまた、臨床試験または処置レジメンにおけるレセプター遺伝子の発現または活性に対する調節化合物（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の有効性をモニタリングするために有用である。よって、遺伝子発現パターンは、その化合物（特に、患者が耐性を発症し得る化合物）での処置の持続有効性についてのバロメータとして働き得る。遺伝子発現パターンはまた、冒された細胞のその化合物に対する生理学的応答を示すマーカーとして働き得る。よって、このようなモニタリングは、この化合物の増加投与または患者が耐性にならなかった代替の化合物の投与のいずれかを可能にする。同様に、核酸発現レベルが所望のレベル未満になる場合、この化合物の投与は、比例して減少され得る。
【０１９６】
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプター核酸の定性的変化（特に、病理につながる定性的変化において）についての診断アッセイに有用である。このポリヌクレオチドを使用して、レセプター遺伝子および遺伝子発現産物（例えば、ｍＲＮＡ）中の変異を検出し得る。このポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、レセプター遺伝子中に天然に存在する遺伝子変異を検出し、これによりこの変異を有する被験体がこの変異によって生じる障害の危険性があるか否かを決定し得る。変異としては、遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換、染色体再構築（例えば、逆位または転位）、ゲノムＤＮＡの改変（例えば、異常なメチル化パターン）、あるいは遺伝子コピー数の変化（例えば、増幅）が挙げられる。機能不全に関連するレセプター遺伝子の変異形態の検出は、活性な疾患について、または疾患に対する感受性（その疾患がレセプタータンパク質の過剰発現、過少発現または変更された発現により生じる場合）についての診断ツールを提供する。
【０１９７】
レセプター遺伝子中に変異を保有する個体は、種々の技術によって核酸レベルで検出され得る。ゲノムＤＮＡは、直接分析されても、分析前にＰＣＲを用いることによって増幅されてもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡは、同一の方法で使用され得る。
【０１９８】
特定の実施形態において、変異の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）、あるいはライゲーション連鎖反応（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）；ならびにＮａｋａｚａｗａら、ＰＮＡＳ  ９１：３６０−３６４（１９９４）を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は、遺伝子中の点変異を検出するために特に有用である（Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５）を参照のこと）。本方法は、患者から細胞サンプルを収集する工程、このサンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはこれらの両方）を単離する工程、（存在するならば）遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、この核酸サンプルをその遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびコントロールサンプルとその長さを比較する工程、を包含し得る。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズ変化によって検出され得る。点変異は、増幅されたＤＮＡを正常なＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定され得る。
【０１９９】
あるいは、レセプター遺伝子中の変異は、例えば、ゲル電気泳動によって測定される制限酵素消化パターンにおける変更によって、直接同定され得る。
【０２００】
さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）を使用して、リボザイム切断部位の発達または喪失により特定の変異の存在についてスコア付けし得る。
【０２０１】
完全に一致した配列は、ヌクレアーゼ切断消化アッセイによって、または融点の差異によって、ミスマッチした配列と区別され得る。
【０２０２】
特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ１保護）または化学的切断法によって評価され得る。
【０２０３】
さらに、変異体レセプター遺伝子と野生型遺伝子との間の配列差異は、直接的ＤＮＡ配列決定によって測定され得る。診断アッセイ（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８）を行う場合、種々の自動化配列決定手順（質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；およびＧｒｉｆｆｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９（１９９３）を参照のこと）を含む）が利用され得る。
【０２０４】
遺伝子中の変異を検出するための他の方法としては、以下が挙げられる：切断剤からの保護は、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出するために使用される方法（Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２（１９８５）；Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、変異体核酸および野生型核酸の電気泳動的移動度が比較される方法（Ｏｒｉｔａら、ＰＮＡＳ  ８６：２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；およびＨａｙａｓｈｉら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））、ならびに変異体フラグメントおよび野生型フラグメントのある勾配の変性剤を含むポリアクリルアミドゲルにおける移動が変性勾配ゲル電気泳動によってアッセイされる方法（Ｍｙｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５（１９８５））。点変異を検出するための他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、および選択的プライマー伸長が挙げられる。
【０２０５】
レセプターポリヌクレオチドはまた、必ずしも疾患を生じないが、それにもかかわらず処置モダリティーに影響を与える遺伝子型について個体を試験するために有用である。よって、このポリヌクレオチドを使用して、個体の遺伝子型と処置に使用される化合物に対する個体の応答との間の関係（ゲノム薬理学的関係）を研究し得る。この場合、例えば、リガンドに対する変更された親和性を生じるレセプター遺伝子中の変異は、このレセプターを活性化するリガンドの標準的な濃度で、過剰な薬物効果または減少された薬物効果を生じ得る。よって、本明細書中に記載されるレセプターポリヌクレオチドを使用して、処置のために適切な化合物または投薬レジメンを選択するために、個体におけるレセプター遺伝子の変異含量を評価し得る。
【０２０６】
従って、処置に影響する遺伝的バリエーションを示すポリヌクレオチドは、個体において処置をあつらえる（ｔａｉｌｏｒ）ために使用され得る診断標的を提供する。よって、これらの多型を含む組換え細胞および動物の産生は、処置化合物および投薬レジメンの効果的な臨床的設計を可能にする。
【０２０７】
レセプターポリヌクレオチドはまた、その配列が個々の染色体そしてその染色体上の特定の位置に同定される場合に、染色体同定のために有用である。第１に、ＤＮＡ配列は、インサイチュハイブリダイゼーションまたは他の染色体特異的ハイブリダイゼーションによってその染色体に一致させられる。配列はまた、所望の種由来の個々の染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用され得るＰＣＲプライマーを調製することによって特定の染色体に相関され得る。そのプライマーに相同な遺伝子を含む染色体を含有するハイブリッドのみが、増幅フラグメントを与える。亜局在化（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、染色体フラグメントを使用して達成され得る。他のストラテジーとしては、標識したフローソート（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔ）した染色体を用いるプレスクリーニングおよび染色体特異的ライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ選択が挙げられる。さらなるマッピングストラテジーとしては、伝統的に使用されるプローブより短いプローブを用いるハイブリダイゼーションを可能にする蛍光インサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。染色体マッピングのための試薬が、単一染色体または染色体上の単一部位をマーキングするために個々に使用されるか、あるいは試薬のパネルが、複数の部位および／または複数の染色体をマーキングするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、マッピング目的に好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内でより保存されているようであり、よって染色体マッピングの間の交差ハイブリダイゼーションの機会を増加させる。
【０２０８】
レセプターポリヌクレオチドはまた、小さな生物学的サンプルから個体を同定するために使用され得る。これは、例えば、個体を同定するために制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を使用して行われ得る。よって、本明細書中に記載される多型は、ＲＦＬＰのためのＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５，２７２，０５７号を参照のこと）。
【０２０９】
さらに、レセプター配列を使用して、個体のゲノム中の選択されたフラグメントの真のＤＮＡ配列を決定する代替の技術を提供し得る。よって、本明細書中に記載されるレセプター配列を使用して、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、続く配列決定のために個体からＤＮＡを増幅し得る。
【０２１０】
この様式で調製された個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体がこのようなＤＮＡ配列の独特なセットを有する場合、独特な個体の同定を提供する。ヒトにおける対立遺伝子バリエーションが各５００塩基当たりおよそ１回の頻度で生じることが、見積もられる。対立遺伝子バリエーションは、これらの配列のコード領域においていくらかの程度で生じ、非コード領域においてより高程度で生じる。レセプター配列を使用して、個体および組織からこのような同定配列を取得し得る。この配列は、ヒトゲノムの独特なフラグメントを示す。本明細書中に記載される各配列は、いくらかの程度で標準として使用され得、ここで、個体からのＤＮＡは、同定目的のために比較され得る。
【０２１１】
これらの配列からの試薬のパネルを使用して個体に対する独特な同定データベースを生成する場合、これらの同じ試薬を後程使用して、その個体由来の組織を同定し得る。独特な同定データベースを使用して、個体のポジティブ同定（生か死）は、非常に小さな組織サンプルからなされ得る。
【０２１２】
レセプターポリヌクレオチドはまた、法医学的同定手順において使用され得る。ＰＣＲ技術を使用して、非常に小さな生物学的サンプル（例えば、単一の毛包、体液（例えば、血液、唾液、または精液）から得られたＤＮＡ配列を増幅し得る。次いで、増幅された配列は、そのサンプルの起源の同定を可能にする標準と比較され得る。
【０２１３】
従って、レセプターポリヌクレオチドを使用して、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座に標的化されるポリヌクレオチド試薬（例えば、ＰＣＲプライマー）を提供し得、この試薬は、例えば、別の「同定マーカー」（すなわち、特定の個体に独特なべつのＤＮＡ配列）を提供することによって、ＤＮＡベースの法医学的同定の信頼度を増加させ得る。上記のように、真の塩基配列情報が、制限酵素によって生成されたフラグメントによって形成されるパターンに対する正確な代替として同定に使用され得る。非コード領域に標的化される配列は、特に有用である。なぜなら、より多い多型が、非コード領域に生じ、この技術を使用して個体を差別化することを容易にするからである。
【０２１４】
レセプターポリヌクレオチドをさらに使用して、ポリヌクレオチド試薬（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション技術において使用され得る、例えば、標識されたプローブまたは標識可能なプローブ）を提供して、特定の組織を同定し得る。これは、法医学の病理学者が未知の起源の組織を与えられる場合に有用である。レセプタープローブのパネルを使用して、種および／または器官型で組織を同定し得る。
【０２１５】
同様の様式において、これらのプライマーおよびプローブを使用して、組織培養物を夾雑物についてスクリーニングし得る（すなわち、培養物中の異なる細胞型の混合物の存在についてスクリーニングし得る）。
【０２１６】
あるいは、レセプターポリヌクレオチドを直接使用して、アンチセンス構築物またはリボザイム構築物によってレセプター遺伝子配列の転写または翻訳をブロックし得る。よって、レセプター遺伝子の異常に高い発現または所望されない発現によって特徴付けられる障害において、核酸は、処置のために直接使用され得る。
【０２１７】
従って、レセプターポリヌクレオチドは、細胞中、組織中および生物中でのレセプター遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構築物として有用である。ＤＮＡアンチセンスポリヌクレオチドは、転写に関連する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、レセプタータンパク質の転写、ゆえにその産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡにハイブリダイズし、よってｍＲＮＡのレセプタータンパク質への翻訳をブロックする。
【０２１８】
核酸発現を阻害するに有用なアンチセンス分子の例としては、配列番号２の５’非翻訳領域のフラグメントに相補的なアンチセンス分子（これはまた、開始コドンを含む）、および配列番号２の３’非翻訳領域のフラグメントに相補的なアンチセンス分子が挙げられる。
【０２１９】
あるいは、あるクラスのアンチセンス分子を使用して、レセプター核酸の発現を減少するためにｍＲＮＡを不活化し得る。よって、これらの分子は、レセプター核酸の異常な発現または所望されない発現により特徴付けられる障害を処置し得る。この技術は、ｍＲＮＡが翻訳される能力を減弱させる、ｍＲＮＡ中の１つ以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むリボザイムによる切断を含む。可能性のある領域は、コード領域、特に、レセプタータンパク質の触媒活性および他の機能的活性（例えば、リガンド結合）に対応するコード領域を含む。
【０２２０】
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプター遺伝子発現が異常である細胞を含む患者における遺伝子治療のためのベクターを提供する。よって、エキソビボで操作された患者の細胞を含みそして患者に戻される組換え細胞が、個体に導入され、ここで、この細胞は、その個体を処置するために所望のレセプタータンパク質を産生する。
【０２２１】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるレセプター核酸の存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは、生物学的サンプル中のレセプター核酸を検出し得る標識核酸もしくは非標識核酸または薬剤のような試薬；サンプル中のレセプター核酸の量を決定するための手段；およびサンプル中のレセプター核酸の量と標準とを比較するための手段を含む。この化合物または薬剤は、適切な容器にパッケージされ得る。このキットはさらに、レセプターのｍＲＮＡまたはＤＮＡを検出するのにこのキットを使用するための指示書を含む。
【０２２２】
上記の開示はまた、配列番号４に示される配列に適用する。
【０２２３】
（ベクター／宿主細胞）
本発明はまた、レセプターポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。用語「ベクター」は、レセプターポリヌクレオチドを輸送し得るビヒクル（好ましくは、核酸分子）をいう。ベクターが核酸分子である場合、レセプターポリヌクレオチドは、ベクター核酸に共有結合される。本発明のこの局面において、ベクターとしては、プラスミド、一本鎖または二本鎖のファージ、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクター、あるいは人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、またはＭＡＣ）が挙げられる。
【０２２４】
ベクターは、染色体外エレメントとして宿主細胞中で維持され得、染色体外で複製し、そしてレセプターポリヌクレオチドのさらなるコピーを生成する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノムに統合され得、そして宿主細胞が複製する際にレセプターポリヌクレオチドのさらなるコピーを生成する。
【０２２５】
本発明は、レセプターポリヌクレオチドの維持のためのベクター（クローニングベクター）または発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはその両方（シャトルベクター）において機能し得る。
【０２２６】
発現ベクターは、ベクター中で、レセプターポリヌクレオチドに作動可能に連結されたシス作用性調節領域を含み、それによって、宿主細胞中でのポリヌクレオチドの転写を可能とする。ポリヌクレオチドは、転写に影響し得る別個のポリヌクレオチドと共に、宿主細胞中に導入され得る。従って、第２のポリヌクレオチドは、ベクターからのレセプターポリヌクレオチドの転写を可能とするよう、シス作用性調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供し得る。あるいは、トランス作用性因子は、宿主細胞により供給され得る。最後に、トランス作用性因子は、ベクター自体から産生され得る。
【０２２７】
しかし、いくつかの実施形態において、レセプターポリヌクレオチドの転写および／または翻訳は、無細胞系で起こり得ることが理解される。
【０２２８】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドが作動可能に連結される調節配列としては、ｍＲＮＡ転写を指示するプロモーターが挙げられる。これらとしては、バクテリオファージλ由来の左プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃプロモーター、ＴＲＰプロモーター、およびＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０由来の初期プロモーターおよび後期プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター、アデノウイルス初期プロモーターおよびアデノウイルス後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長末端反復が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２９】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、レセプター結合部位およびエンハンサーのような転写を調節し得る領域を含み得る。例として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、およびレトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
【０２３０】
転写の開始および制御のための部位を含むことに加えて、発現ベクターはまた、転写終結に必要とされる配列、および転写される領域においては、翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。発現のための他の調節制御エレメントとしては、開始コドンおよび終止コドンならびにポリアデニル化シグナルが挙げられる。当業者は、発現ベクターにおいて有用な多数の調節配列を認識している。このような調節配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９）に記載されている。
【０２３１】
種々の発現ベクターが、レセプターポリヌクレオチドを発現するために使用され得る。このようなベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント（酵母人工染色体を含む）、ウイルス（バキュロウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）由来のベクター）が挙げられる。ベクターはまた、これらの供給源の組み合わせから獲得され得る（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメントから得られるベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））。原核生物宿主および真核生物宿主のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９）に記載されている。
【０２３２】
調節配列は、１つ以上の宿主細胞において構成的な発現を提供し得る（すなわち、組織特異的）か、または１つ以上の宿主型において誘導性の発現（例えば、温度、栄養供給、または他の外因性因子（例えば、ホルモンまたは他のリガンド））を提供し得る。原核生物宿主および真核生物宿主において構成的発現および誘導性発現を提供する種々のベクターは、当業者に周知である。
【０２３３】
レセプターポリヌクレオチドは、周知方法によりベクター核酸に挿入され得る。一般的に、最終的に発現されるＤＮＡ配列は、１つ以上の制限酵素でＤＮＡ配列および制限酵素を切断し、次いでフラグメントをひとつに連結することにより、発現ベクターに連結される。制限酵素消化および連結の手順は、当業者に周知である。
【０２３４】
適切なポリヌクレオチドを含むベクターは、周知技術を用いて、増殖または発現のために適切な宿主細胞に導入され得る。細菌細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられるがこれらに限定されない。真核生物細胞としては、酵母、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞）、および植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３５】
本明細書中に記載されるように、融合タンパク質としてポリペプチドを発現することが望ましくあり得る。従って、本発明は、レセプターポリペプチドの生成を可能にする融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組換えタンパク質の発現を増大し得、組換えタンパク質の可溶性を増大し得、そして例えば、アフィニティー精製のためのリガンドとして作用することにより、このタンパク質の精製を補助し得る。タンパク質分解切断部位は、融合部位の連結部に導入され得、その結果、所望のポリペプチドが、最終的に、融合部位から分離され得る。タンパク質分解酵素としては、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられるがこれらに限定されない。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０（１９９８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）（それぞれ、標的組換えタンパク質に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合する）が挙げられる。適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５（１９８８））およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：６０−８９（１９９０））が挙げられる。
【０２３６】
組換えタンパク質の発現は、宿主細菌において、その宿主細胞が組換えタンパク質をタンパク質分解切断する能力を損傷しているという遺伝的背景を提供することにより最大化され得る（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｓ．、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。あるいは、目的のポリヌクレオチドの配列は、特定の宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する優先的なコドンの使用を提供するよう変更され得る（Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８（１９９２））。
【０２３７】
レセプターポリヌクレオチドはまた、酵母において機能する発現ベクターにより発現され得る。酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎら、Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３（１９８７））、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。
【０２３８】
レセプターポリヌクレオチドはまた、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞において発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９（１９８９））が挙げられる。
【０２３９】
本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０（１９８７））およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５（１９８７）が挙げられる。
【０２４０】
本明細書中に列挙される発現ベクターは、レセプターポリヌクレオチドを発現するのに有用な、当業者に利用可能な周知ベクターの例示のみの目的で提供される。当業者は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの維持、増殖、または発現のために適切な他のベクターを認識している。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９において見出される。
【０２４１】
本発明はまた、本明細書中に記載される核酸配列が、逆方向でベクター中にクローニングされているが、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にする調節配列に作動可能に連結されているベクターを包含する。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列の全てまたは一部（コード領域および非コード領域の両方を含む）に対するアンチセンス転写物が、生成され得る。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関連する上記パラメータの各々の影響を受ける（調節配列、構成性発現または誘導性発現、組織特異的発現）。
【０２４２】
本発明はまた、本明細書中に記載されるベクターを含む組換え宿主細胞に関する。従って、宿主細胞としては、原核生物細胞、下等真核生物細胞（例えば、酵母）、他の真核生物細胞（例えば、昆虫細胞）、および高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）が挙げられる。
【０２４３】
組換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な技術によって、本明細書中に記載されるベクター構築物をこの細胞に導入することにより調製される。これらとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、および他の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載される技術）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４４】
宿主細胞は、１つより多くのベクターを含み得る。従って、異なるヌクレオチド配列は、同じ細胞の異なるベクターに導入され得る。同様に、レセプターポリヌクレオチドは、単独でかまたはそのレセプターポリヌクレオチドと関連しない他のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクターに対するトランス作用性因子を提供するポリヌクレオチド）と共に導入され得る。１つより多くのベクターが細胞中に導入される場合、ベクターは、独立して導入され得るか、同時に導入され得るか、またはレセプターポリヌクレオチドベクターに連結され得る。
【０２４５】
バクテリオファージおよびウイルスベクターの場合、これらは、感染および形質導入の標準的な手順によって、パッケージウイルスまたはカプセル化ウイルスとして細胞中に導入され得る。ウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製不全であり得る。ウイルス複製が不能である場合、複製は、その欠失を補完する機能を提供する宿主細胞中で起こる。
【０２４６】
ベクターは、一般的に、組換えベクター構築物を含む細胞の亜集団の選択を可能にする選択マーカーを含む。このマーカーは、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドを含む同じベクター中に含まれ得るか、または別のベクターに含まれ得る。マーカーとしては、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子（原核生物宿主細胞）およびジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性（真核生物細胞）が挙げられる。しかし、表現型特性についての選択を提供する任意のマーカーが有効である。
【０２４７】
成熟タンパク質が、適切な調節配列の制御下で、細菌、酵母、哺乳動物細胞、および他の細胞において生成され得るが、無細胞転写および翻訳系もまた、本明細書中に記載されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてこれらのタンパク質を生成するために使用され得る。
【０２４８】
ポリペプチドの選択が所望される場合、適切な分泌シグナルが、ベクター中に導入される。シグナル配列は、レセプターポリペプチドに対して内因性であり得るか、またはこれらのポリペプチドに対して異種であり得る。
【０２４９】
ポリペプチドが培地に分泌されない場合、タンパク質は、標準的な手順（凍結解凍、超音波破砕、機械的破壊、溶解剤の使用等）によって宿主細胞から単離され得る。次いで、このポリペプチドは、周知の精製方法（硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー）によって収集および精製され得る。
【０２５０】
本明細書中に記載されるポリペプチドの組換え生成における宿主細胞に依存して、このポリペプチドは、その細胞に依存する種々のグリコシル化パターンまたは、おそらく、細菌において生成される場合、非グリコシル化パターンを有し得る。さらに、ポリペプチドは、宿主により媒介されるプロセスの結果として、いくつかの場合、開始の改変メチオニンを含み得る。
【０２５１】
上記の開示はまた、配列番号３および４に示される配列に適用する。
【０２５２】
（ベクターおよび宿主細胞の使用）
本明細書中に記載されるポリペプチドを発現する宿主細胞および、特に、組換え宿主細胞は、種々の用途を有する。第１に、この細胞は、レセプタータンパク質またはポリペプチドを生成するのに有用であり、これらは、所望の量のレセプタータンパク質またはフラグメントを生じるようさらに精製される。従って、発現ベクターを含有する宿主細胞は、ポリペプチド生成に有用である。
【０２５３】
宿主細胞はまた、レセプターまたはレセプターフラグメントに関する細胞ベースのアッセイを実施するのに有用である。従って、ネイティブのレセプターを発現する組換え宿主細胞は、レセプター機能を刺激または阻害する化合物についてのアッセイに有用である。これとしては、リガンド結合、転写または翻訳のレベルでの遺伝子発現、Ｇタンパク質相互作用、およびシグナル伝達経路の成分が挙げられる。
【０２５４】
宿主細胞はまた、これらの機能に影響を及ぼすレセプター変異を同定するのに有用である。この変異が天然で生じ、そして病理を引き起こす場合、この変異を含む宿主細胞は、ネイティブレセプターに対するそれらの効果により示され得ない、変異レセプターに対する所望の効果（例えば、機能の刺激または阻害）を有する化合物をアッセイするのに有用である。
【０２５５】
組換え宿主細胞はまた、異種アミノ末端細胞外ドメイン（または他の結合領域）による活性化を活性化または抑制する化合物を評価するために本明細書中に記載のキメラポリペプチドを発現するのに有用である。あるいは、膜貫通領域全体（またはその一部）にまたがる異種領域は、任意の所定の宿主細胞に対する所望のアミノ末端細胞外ドメイン（または他の結合領域）の効果を評価するために使用され得る。この実施形態において、特定の宿主細胞と適合する膜貫通領域全体（またはその一部）にまたがる領域が、キメラベクターを作製するために使用される。あるいは、異種カルボキシ末端細胞内ドメイン（例えば、シグナル伝達ドメイン）が、宿主細胞中に導入され得る。
【０２５６】
さらに、変異レセプターは、１つ以上の種々の機能（例えば、リガンド結合またはＧタンパク質結合）が増加または減少するよう設計され得、そして個体においてレセプタータンパク質を増強または置換するために使用される。従って、宿主細胞は、異常なレセプターを置換することによるか、または治療的結果を提供する異常なレセプターを提供することにより治療的利益を提供し得る。１つの実施形態において、この細胞は、異常な活性のレセプターを提供する。
【０２５７】
別の実施形態において、この細胞は、異常に不活性なレセプターを提供する。これらのレセプターは、個体において内因性レセプターと競合し得る。
【０２５８】
別の実施形態において、活性化され得ないレセプターを発現する細胞は、リガンドに対する内因性レセプターと競合するよう個体に導入される。例えば、過剰なリガンドが処置様式の一部である場合、処置の特定の時点でこのリガンドを不活性化する必要があり得る。リガンドについて競合するが、レセプター活性化により影響を受け得ない細胞を提供することは、有益である。
【０２５９】
宿主細胞ゲノムにおいて内因性レセプターポリヌクレオチドのインサイチュでの変更を可能にする相同組換え宿主細胞がまた、生成され得る。この技術は、ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９１／１２６５０、および米国特許第５，６４１，６７０号により十分に記載されている。簡単に言うと、レセプターポリヌクレオチドに対応する特定のポリヌクレオチド配列またはレセプター遺伝子の近位もしくは遠位の配列は、相同組換えにより宿主細胞ゲノムに統合され、遺伝子の発現が影響され得る。１つの実施形態において、内因性配列の発現を増加または減少させる調節配列が、導入される。従って、レセプタータンパク質は、通常それを産生しない細胞において産生され得るか、またはレセプタータンパク質の増加した発現が、通常特定のレベルでそのタンパク質を産生する細胞において生じ得る。あるいは、遺伝子全体が欠失され得る。なおさらに、特定の変異が、その遺伝子の任意の所望の領域に導入され得、変異レセプタータンパク質が生成される。このような変異は、例えば、特定の機能的領域（例えば、リガンド結合部位またはＧタンパク質結合部位）に導入され得る。
【０２６０】
１つの実施形態において、宿主細胞は、変更されたレセプター遺伝子を含むトランスジェニック動物を生じ得る受精卵または胚性幹細胞であり得る。あるいは、宿主細胞は、細胞の特定のサブセットを生じる幹細胞または他の初期組織前駆体であり得、動物中でトランスジェニック組織を生じるのに使用され得る。相同組換えベクターの詳細については、Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３（１９８７）を参照のこと。このベクターは、胚性幹細胞株に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、そして導入遺伝子が内因性レセプター遺伝子と相同組換えされた細胞が選択される（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ  ６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に導入され、凝集キメラが形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと）。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌養母動物に移植され得、そして胎仔が産み出される。その生殖細胞において相同組換えＤＮＡを有する子孫は、その動物の全ての細胞が、導入遺伝子の伝達により相同組換えＤＮＡを含む動物を飼育するために使用され得る。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ、（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９ならびにＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；およびＷＯ９３／０４１６９にさらに記載されている。
【０２６１】
遺伝子操作された宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。トランスジェニック動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）であり、この動物の１つ以上の細胞が導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、トランスジェニック動物を生じる細胞のゲノムに統合され、そしてトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織において成熟動物のゲノムで維持される外因性ＤＮＡである。これらの動物は、レセプタータンパク質の機能を研究するためおよびレセプタータンパク質活性のモジュレーターを同定および評価するために有用である。
【０２６２】
トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、および両生類が挙げられる。
【０２６３】
１つの実施形態において、宿主細胞は、レセプターポリヌクレオチド配列が導入された受精卵または胚性幹細胞である。
【０２６４】
トランスジェニック動物は、受精卵の雄前核に核酸を導入し（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により）、そして卵母細胞を偽妊娠雌養母動物において成長させることにより生成され得る。任意のレセプターヌクレオチド配列が、導入遺伝子として、非ヒト動物（例えば、マウス）のゲノムに導入され得る。
【０２６５】
発現ベクターにおいて有用な任意の調節配列または他の配列は、トランスジェニック配列の一部を形成し得る。これは、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを含む（必ずしも含むとは限らないが）。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作動可能に連結されて、特定の細胞に対するレセプタータンパク質の発現を指示する。
【０２６６】
胚操作およびマイクロインジェクションを通じてトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製する方法は、当該分野で慣習的となっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号（両方ともＬｅｄｅｒらによる）、米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒらによる）、およびＨｏｇａｎ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）に記載される。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノムにおける導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞におけるトランスジェニックｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を保有するさらなる動物を飼育するために使用され得る。さらに、導入遺伝子を有するトランスジェニック動物はさらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物へと飼育され得る。トランスジェニック動物としてはまた、その動物全体または動物中の組織が、本明細書中に記載される相同組換え宿主細胞を用いて生成された動物が挙げられる。
【０２６７】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が、作成され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の詳細については、例えば、Ｌａｋｓｏら、ＰＮＡＳ  ８９：６２３２−６２３６（１９９２）を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５（１９９１））。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が、導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要とされる。このような動物は、「二重」トランスジェニック動物の構築を通じて（例えば、一方は、トランスジェニック動物（１匹は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方は、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することによって）提供され得る。
【０２６８】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７）ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載される方法に従って生成され得る。簡単に言うと、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして成長期を出て、Ｇ０期に移行するよう誘導され得る。次いで、静止細胞は、例えば、電気パルスの使用を通じて、静止細胞が単離されたのと同一種の動物由来の除核卵母細胞に融合され得る。次いで、再構築された卵母細胞は培養され、それによって、桑実胚または胚盤胞に成長し、次いで偽妊娠雌養母動物に移される。この雌養母動物の子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０２６９】
本明細書中に記載されるポリペプチドを発現する組換え細胞を含むトランスジェニック動物は、インビボ状況で本明細書中に記載されるアッセイを実施するのに有用である。従って、インビボで存在し、リガンド結合、レセプター活性化、およびシグナル伝達をもたらし得る種々の生理学的因子は、インビトロ無細胞アッセイまたは細胞ベースのアッセイから明らかではあり得ない。従って、インビボレセプター機能（リガンド相互作用、レセプター機能およびリガンド相互作用に対する特異的な変異レセプターの効果、ならびにキメラレセプターの効果を含む）をアッセイするために、非ヒトトランスジェニック動物を提供するためが有用である。ヌル変異体（１つ以上のレセプター機能を実質的または完全に失った変異体）の効果を評価することもまた可能である。
【０２７０】
上記の開示はまた、配列番号３および４に示される配列に適用する。
【０２７１】
（薬学的組成物）
レセプター核酸分子、タンパク質（特に、アミノ末端細胞外ドメインのようなフラグメント）、タンパク質のモジュレーター、および抗体（本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）は、被験体（例えば、ヒト）に投与するのに適切な薬学的組成物中に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的には、核酸分子、タンパク質、モジュレーター、または抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。
【０２７２】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性の、任意および全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のための、このような媒体および因子の使用は、当該分野で周知である。任意の従来型の媒体または因子が活性化合物に不適合性である範囲を除いて、このような媒体は、本発明の組成物において使用され得る。補充の活性化合物もまた、この組成物中に組み込まれ得る。本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路に適合性であるように処方される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与）、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される、溶液または懸濁液としては、以下の構成成分が挙げられ得る：滅菌希釈液（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸）；緩衝液（例えばアセテート、シトレートまたはホスフェート）、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張性を調整するための因子。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または塩化ナトリウム）で調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て可能なシリンジ、または複数用量のバイアルに封入され得る。
【０２７３】
注射可能な使用に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（ここでは、水溶液）または分散剤、および注射可能な溶液または分散剤の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、滅菌でなければならず、そして容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。この組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって、達成され得る。多くの場合において、組成物中に、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅滞させる因子（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）をこの組成物中に含めることによって、もたらされ得る。
【０２７４】
滅菌注射可能な溶液は、上で列挙した構成成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に、必要量の活性化合物（例えば、レセプタータンパク質または抗レセプター抗体）を組み込み、所望される場合、続いて滅菌濾過することによって、調製され得る。一般的に、分散剤は、活性化合物を、上で列挙した、塩基性分散媒体および必要とされる他の構成成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって、調製される。滅菌注射可能な溶液の調製用の滅菌粉末の場合において、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって、活性成分およびさらなる任意の所望な成分の粉末が、予め滅菌濾過したその溶液から得られる。
【０２７５】
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含有する。これらは、ゼラチンカプセル内に封入され得るか、または錠剤内に圧縮され得る。経口投与について、因子は、胃に残るように腸溶性形態で含まれ得るか、または公知の方法によってＧＩ管の特定の領域に放出されるように、さらにコーティングもしくは混合され得る。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための流体キャリアを使用して、調製され得、ここで、この流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、うがいされて（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合可能な結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の構成成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）；崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ）；潤滑剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または、香料剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料）。
【０２７６】
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器もしくはディスペンサ、または噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０２７７】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によってであり得る。経粘膜投与または経皮投与のために、バリアに浸透するのに適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般に、当該分野で公知であり、そしてこれらの浸透剤としては、例えば、経粘膜投与用の、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、当該分野で一般に公知の、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
【０２７８】
この化合物はまた、坐剤の形態（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来型の坐剤ベースを用いる）または直腸送達用の保持浣腸剤の形態で調製され得る。
【０２７９】
１つの実施形態において、活性化合物は、キャリアを用いて調製され、このキャリアは、身体からの急激な排出（例えば、移植およびマイクロカプセル化送達系を含む、制御された放出処方）に対して、この化合物を保護する。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が、使用され得る。このような処方物を調製するための方法は、当業者に明らかである。この材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からも商業的に入手され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２８０】
投与を容易にし、そして投薬量を均一にするために、投薬単位形態の経口用組成物または非経口用組成物を処方することが、特に有利である。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態とは、処置されるべき被験体に対する単一投薬量として適した、物理学的に別々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと結合して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての仕様は、活性化合物の独自の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置に対してこのような活性化合物を配合する技術における固有の制限によって決定され、そしてそれらに依存して直接決定される。
【０２８１】
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）によってか、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ  ９１：３０５４〜３０５７（１９９４））によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれた徐放性マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）が組換え細胞からインタクトに産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１種以上の細胞を含み得る。
【０２８２】
薬学的組成物は、投与用の説明書と一緒に、コンテナ、パック、またはディスペンサ内に含まれ得る。
【０２８３】
上記の開示はまた、配列番号３および配列番号４に示される配列にも適用する。
【０２８４】
本発明は、異なる多くの形態で具体化され得るが、本明細書中に示される実施形態に制限されるようには解釈されるべきではなく；むしろ、これらの実施形態は、この開示により、本発明が当業者に完全に伝わるように、提供される。前述の記載において示された教示の利点を有する本発明の多くの改変および他の実施形態が、本発明が属する分野の当業者に思い浮かべられる。特定の用語が用いられるが、これらの用語は、他に指示がない限り、当該分野で用いられるのと同じように使用される。
【実施例】
【０２８５】
（１．実施例１：インサイシュハイブリダイゼーションによる１５６２５発現の分析）
１５６２５の発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって、種々の組織において検出した。結果を、表２に示す。
【０２８６】
【表２】
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。
【０２８７】
（２．実施例２：定量的逆転写酵素ＰＣＲによる１５６２５発現の分析）
種々のヒト組織における１５６２５の発現を、定量的逆転写酵素ＰＣＲによって決定した。結果を、表３に示す。
【０２８８】
【表３】
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。
【図面の簡単な説明】
【０２８９】
【図１Ａ】図１Ａは、１５６２５のヌクレオチド配列（配列番号２）およびその推定１５６２５のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。アミノ酸１〜２５がアミノ末端細胞外ドメインを構成し、アミノ酸の２６位〜３０２位は、膜貫通ドメインに亘る領域を構成し、そして、アミノ酸３０３〜３４２は、カルボキシ末端細胞内ドメインを構成することが予測されている。この膜貫通ドメインは、７つの膜貫通セグメント、３つの細胞外ループ、および３つの細胞内ループを含む。この膜貫通セグメントは、アミノ酸の約２６位〜アミノ酸の約４７位、アミノ酸の約５９位〜アミノ酸の約７９位、アミノ酸の約９９位〜アミノ酸の約１２０位、アミノ酸の約１４３位〜アミノ酸の約１６２位、アミノ酸の約１８９位〜アミノ酸の約２１２位、アミノ酸の約２３８位〜アミノ酸の約２５５位およびアミノ酸の約２８４位〜アミノ酸の約３０２位において見出される。膜貫通ドメインの全体におよぶ領域内に、３つの細胞内ループおよび３つの細胞外ループが存在する。この３つの細胞内ループは、アミノ酸の約４８位〜アミノ酸の約５８位、アミノ酸の約１２１位〜アミノ酸の約１４２位、およびアミノ酸の約２１３位〜アミノ酸の約２３７位において見出される。３つの細胞外ループは、アミノ酸の約８０位〜アミノ酸の約９８位、アミノ酸の約１６３位〜アミノ酸の約１８８位、およびアミノ酸の約２５６位〜アミノ酸の約２８３位において見出される。
【０２９０】
この膜貫通ドメインは、ＧＰＣＲシグナル伝達のサインである、ＤＲＹを残基１２１〜１２３において含む。この配列は、残基１２２においてアラニン（ＧＰＣＲの不変のアミノ酸である）を含む。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１５６２５のヌクレオチド配列（配列番号２）およびその推定１５６２５のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。アミノ酸１〜２５がアミノ末端細胞外ドメインを構成し、アミノ酸の２６位〜３０２位は、膜貫通ドメインに亘る領域を構成し、そして、アミノ酸３０３〜３４２は、カルボキシ末端細胞内ドメインを構成することが予測されている。この膜貫通ドメインは、７つの膜貫通セグメント、３つの細胞外ループ、および３つの細胞内ループを含む。この膜貫通セグメントは、アミノ酸の約２６位〜アミノ酸の約４７位、アミノ酸の約５９位〜アミノ酸の約７９位、アミノ酸の約９９位〜アミノ酸の約１２０位、アミノ酸の約１４３位〜アミノ酸の約１６２位、アミノ酸の約１８９位〜アミノ酸の約２１２位、アミノ酸の約２３８位〜アミノ酸の約２５５位およびアミノ酸の約２８４位〜アミノ酸の約３０２位において見出される。膜貫通ドメインの全体におよぶ領域内に、３つの細胞内ループおよび３つの細胞外ループが存在する。この３つの細胞内ループは、アミノ酸の約４８位〜アミノ酸の約５８位、アミノ酸の約１２１位〜アミノ酸の約１４２位、およびアミノ酸の約２１３位〜アミノ酸の約２３７位において見出される。３つの細胞外ループは、アミノ酸の約８０位〜アミノ酸の約９８位、アミノ酸の約１６３位〜アミノ酸の約１８８位、およびアミノ酸の約２５６位〜アミノ酸の約２８３位において見出される。
【０２９１】
この膜貫通ドメインは、ＧＰＣＲシグナル伝達のサインである、ＤＲＹを残基１２１〜１２３において含む。この配列は、残基１２２においてアラニン（ＧＰＣＲの不変のアミノ酸である）を含む。
【図２】図２は、タンパク質パターンのＰｆａｍデータベースに対する１５６２５レセプターの比較を示し、特に、ＧＰＣＲの７回膜貫通セグメントロドプシンファミリーに対して高いスコアを示す。
【図３】図３は、以下の１５６２５アミノ酸配列の分析を示す：αβターンおよびコイル領域；親水性領域；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数；および表面確率プロット。
【図４】図４は、配列番号１のアミノ酸の１５６２５レセプターの疎水性プロットを示す。それぞれ、疎水性残基は、水平線よりも上に示されており、そして、それぞれ、親水性残基は、その水平線よりも下に示されている。ヒト１５６２５のアミノ酸配列（配列番号１において示されている）に対応する番号が示されている。
【図５】図５は、特定の機能部位に対応するアミノ酸についての１５６２５のオープンリーディングフレームの分析を示している。Ｎ−グリコシル化部位は、アミノ酸の約６位〜９位および約１３位〜１６位において見出されている。ｃＡＭＰ依存性およびｃＧＭＰ依存性のプロテインキナーゼリン酸化部位が、アミノ酸の約１７３位〜約１７６位において見出されている。プロテインキナーゼＣのリン酸化部位が、アミノ酸の約１２６位〜約１２８位、約１６３位〜約１６５位および約３０４位〜約３０６位において見出されている。Ｎ−ミリストリル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ）部位がアミノ酸の約３９位〜約４４位および約３３３位〜約３３８位に見出されている。さらに、ＧＰＣＲのサインに対応する位置に対応しかつ不変アルギニンを含むアミノ酸は、配列ＤＲＹ（アミノ酸１２１〜１２３）に見出される。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒト１５６２５レセプターのアミノ酸およびヌクレオチド配列に対応する、非ヒト霊長類（ｍａｃａｑｕｅ  ｂｒａｉｎ）についてのｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：４）およびその推定アミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ヒト１５６２５レセプターのアミノ酸およびヌクレオチド配列に対応する、非ヒト霊長類（ｍａｃａｑｕｅ  ｂｒａｉｎ）についてのｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：４）およびその推定アミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005511024.tif 000014
【図６Ａ】
2005511024.tif 000015
【図６Ｂ】
2005511024.tif 000016
【国際調査報告】
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