(57)【要約】本発明は、増殖マーカーとしてエクオリンを含む改変酵母細胞、このような改変酵母細胞の製造方法、および、このような改変酵母細胞を用いる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成的酵母プロモーターの制御下にエクオリンをコードする配列を含む改変酵母細胞。
【請求項２】
構成的酵母プロモーターの制御下にエクオリンをコードする配列を含む改変酵母細胞を、エクオリンタンパク質が各細胞で永続的かつ同等に発現する条件下で培養すること、
該改変酵母細胞を試験される化合物と共にインキュベートすること、および
該化合物の存在下での増殖または生存の変化を、好ましくは、該化合物の非存在下または異種細胞表面タンパク質の非存在下での増殖または生存と比較して測定すること、
を含む、異種タンパク質が仲介する増殖を調節する化合物、または、毒性を示す化合物を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖マーカーとしてエクオリンを含む改変酵母細胞、このような改変酵母細胞の製造方法、および、このような改変酵母細胞の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクオリンは、発光クラゲＡｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａから単離された発光タンパク質である。
【０００３】
アポエクオリンは、セレンテラジンに結合すると、Ｃａ2+存在下でフォトンを放出するプロトタンパク質（ｐｒｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。
【０００４】
エクオリン複合体は、２２,５１４ＭＷのアポエクオリンタンパク質、分子状酸素、および、発光原子団のセレンテラジンを含む（Ｉｎｏｕｙｅ等、１９８９年；ＪｏｈｎｓｏｎおよびＳｈｉｍｏｍｕｒａ、１９７８年；ＳｈｉｍｏｍｕｒａおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９７８年）。この複合体に３個のＣａ2+イオンが結合すると、セレンテラジンはセレンテラミドに酸化され、その際に二酸化炭素と青い光とを放出する（最大放出は〜４６６ｎｍ）（図１０）。
【０００５】
このＣａ2+依存性の発光のために、エクオリン複合体は、細胞内Ｃａ2+のインジケーターとして広く用いられてきた。
【０００６】
エクオリンは、細胞の機能または胚の発生を妨害しないといわれている（Ｍｉｌｌｅｒ等、１９９４年）。
【０００７】
この発光タンパク質は、哺乳動物細胞で容易に発現可能である。これは、サイトゾルの遊離カルシウム濃度をモニターするのに用いることができる（ＴｈｏｍａｓおよびＤｅｌａｖｉｌｌｅ、１９９１年）（Ｓｈｅｕ等、１９９３年）（Ｓｔａｂｌｅｓ等、２０００年）。
【０００８】
エクオリンはまた、ミトコンドリアのような特定の細胞器官を容易に標的にすることができ（Ｂｒｉｎｉ等、１９９９年）（Ｒｉｚｚｕｔｏ等、１９９２年）、カルシウム恒常性の様々な観点をモニターすることができる。
【０００９】
エクオリンの様々な特性が医薬産業で大いに利用されており、特にハイスループットスクリーニングにおいて利用されている（Ｄｅｔｈｅｕｘ、２０００年）。小胞体からカルシウムが即座に放出されるため、発光タンパク質であるエクオリンの存在下でホスホリパーゼＣ変換経路に結合した受容体の活性化を容易に検出することができる。Ｄｅｔｈｅｕｘ等のＷＯ０００２０４５（ＥＵＲＯＳＣＲＥＥＮ  Ｓ．Ａ．）は、カルシウム結合受容体のアゴニストおよび／またはアンタゴニストのハイスループットスクリーニング診断および／または投与方法（哺乳動物細胞における）を説明しており、ここでエクオリンは受容体が刺激された場合の細胞内のカルシウム変化に関するマーカーとして用いられる。
【００１０】
これまでに、エクオリンを酵母で機能的に発現させて検出できることがわかっている。
【００１１】
Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｓｈｉｍａｄａ等（Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｓｈｉｍａｄａ等、１９９１ｂ）は、アポエクオリンｃＤＮＡ発現系を用いたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの細胞内カルシウムのモニタリングを説明している。ここで、エクオリンは、培地中のストレスまたはグルコース変動に関する細胞内のカルシウムのマーカーとして再度使用された。
【００１２】
哺乳動物のシグナル変換とは異なり、酵母細胞においては、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を活性化しても小胞体からの相当するＣａ2+の放出はみられない。細胞へα因子が追加されることにより（すなわちＧＰＣＲのＳｔｅ２の刺激）、細胞中で［Ｃａ2+］ｉが基底レベルの約１００ｎＭから数百ナノモル濃度に上昇し、同時にＣａ2+流入が誘導される。Ｃａ２（＋）欠乏媒体で細胞をα因子と共にインキュベートすると、Ｃａ2+流入がかなり減少するが、［Ｃａ2+］ｉの上昇は検出されない（Ｉｉｄａ等、１９９０年）。
【００１３】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは限られた数のレポーター遺伝子しか用いることができず、常に適切とは限らない。スクリーニング目的では、レポーター産物は簡単に検出されなければならず、その理由において便利なレポーター分析が必要である。最も一般的に用いられているレポーター遺伝子はＬａｃＺであり、これは極めて大きく安定な酵素β−ガラクトシダーゼをコードする。
【００１４】
エクオリン（２２５１４ＭＷ）は、β−ガラクトシダーゼ（１１６３５１ＭＷ）より５倍小さい。エクオリンはβ−ガラクトシダーゼより短い半減期を有するため、エクオリンは、増殖／増殖の停止を定量するのにより適切である。
【００１５】
まとめると、エクオリンは、非常に有用なレポーター遺伝子であり、哺乳動物細胞における細胞内のＣａ2+変動に関するマーカーである（Ｓｈｅｕ等、１９９３年）。エクオリンは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで機能的に発現可能である（Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｓｈｉｍａｄａ等、１９９１ａ）。エクオリンは、発光分析でセレンテラジンおよびＣａ2+の存在下で容易に検出される。
【００１６】
これまで、エクオリンは、酵母細胞で永続的に発現される増殖マーカーとしては用いられていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
増殖マーカーとしてエクオリンを用いるためには、レポーター遺伝子が永続的に発現されなければならない（エクオリンは構成的酵母プロモーターの制御下にある）。従って、細胞はいずれも相当量のレポータータンパク質を含む。ウェルあたり同数の細胞で分析を開始した場合、分析終了時には、各ウェルで検出されるエクオリンシグナルは増殖に（すなわち増加した細胞の数に）比例するものと思われる。β−ガラクトシダーゼより安定性は劣るが、エクオリンはより正確に増殖の変動を測定することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、構成的酵母プロモーターの制御下にエクオリンをコードする配列を含む改変酵母細胞に関する。本発明の特定の実施形態において、エクオリンをコードする配列は、配列番号１である。本発明のその他の特定の実施形態において、構成的酵母プロモーターは、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーターである。本発明のその他の実施形態において、その他の異種タンパク質、例えば異種キナーゼタンパク質が改変酵母細胞でさらに発現される。
【００１９】
本発明はまた、例えば化合物をスクリーニングするための上記改変酵母細胞の使用に関する。
【００２０】
酵母細胞の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈ
ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、および、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられ、これらは異種配列を導入することにより改変することができる。
【００２１】
異種タンパク質が仲介する増殖を調節する化合物、または、抗真菌活性を示す化合物を同定する方法において、構成的酵母プロモーターの制御下にエクオリンをコードする配列を含む改変酵母細胞を、エクオリンタンパク質が発現される条件下で培養する。この改変酵母細胞を、試験される化合物と共にインキュベートし、該化合物の存在下での増殖量を、好ましくは該化合物の非存在下または異種タンパク質の非存在下での増殖量と比較して測定する。
【００２２】
エクオリンは、β−ガラクトシダーゼより優れたマーカーとして、９６−ウェルプレートの１ウェルあたりの細胞数やハイスループット増殖分析において推測された情報を評価するのに利用できる。同種の分析においても、エクオリンを用いれば、β−ガラクトシダーゼを用いるより簡単に化合物の毒性を検出することができ、これは恐らく後者の高い安定性のためと思われる。
【００２３】
その他のタイプの試験において、エクオリンは、過剰に活性化されたキナーゼの毒性への適合を分析するのに十分に利用できる。
【００２４】
加えて、酵母分析では細菌汚染が起こる場合があり、汚染菌のほとんどは生理的にβ−ガラクトシダーゼを発現する。汚染された培養物は、β−ガラクトシダーゼ基質の存在下で極めて強いシグナルを発生させる可能性がある。エクオリンを使用すれば、汚染による誤った陽性の危険が排除される。
【００２５】
実施例１：材料および方法
酵母株として、Ｗ３０３ＭＡＴ  ａ、ｆａｒ：：ｈｉｓＧ、ｓｓｔ２：：ＵＲＡ３FOA、ｆｕｓ１：：ＨＩＳ３を用いた。
酢酸リチウム法（Ｉｔｏ等、１９８３年）により酵母株を様々なプラスミドで形質転換した。
【００２６】
実施例２：エクオリン発現ベクターの構築
完全長ｃＤＮＡエクオリン遺伝子をＰＣＲで増幅し、この際、テンプレートとしてキメラのミトコンドリアのエクオリンｍｔＡＥＱ（この場合、短縮化したＮ末端はヒトチトクロームＣターゲティングシグナルに融合される（Ｒｉｚｚｕｔｏ等、１９９２年））を用いた。５’ＰＣＲプライマーは、エクオリンの野生型配列の初めの５０個のヌクレオチドと、ＥｃｏＲＩ（以下、太字で示す）クローニング部位とを含む。３’プライマーは、クローニング部位を全く含まない。
【化１】
2005532032.tif 000002
【００２７】
次に、完全長野生型エクオリンのコーディング配列（図１）を、強い構成的発現ベクターである市販の酵母発現ベクター（Ｉｎｇｅｎｉｕｓ  Ｒ＆Ｄ）ｐＹＸ１３２ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、ＴＲＰ１マーカー、ＣＥＮ）（図２）にクローニングした。
【００２８】
実施例３：β−ガラクトシダーゼ発現ベクターの構築
比較するために、ＬａｃＺを、エクオリンと同じ方法で同じ発現ベクターにサブクローニングした（ただし、発現レベルを高めるためにしばしば行われる内因性遺伝子の５’配列との融合はなされなかった（Ｋｉｎｇ等、１９９０年））。
完全長Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列を、強い構成的発現ベクターであるベクターｐＹＸ１３２ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、ＴＲＰ１マーカー、ＣＥＮ）（図３）にクローニングした。
【００２９】
実施例４：エクオリンの検出
細胞を分配するか、および／または、白色の９６−ウェルプレートで１００μｌ量で培養した。測定時間の３０分前に、５μＭセレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）溶液１０μｌを各ウェルに分配し（最終濃度０.５μＭになった）、細胞をローディングした。
次に、プレートを残り３０分間を３０℃でインキュベートした。
注入システムを備えたルミノメーターでエクオリンを検出した（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）。各ウェルにおいて、１０ｍＭのＣａＣｌ2溶液を注入した直後に（Ｐｉｅｒｃｅ社製のリシス緩衝液Ｙ−ＰＥＲで希釈した１ＭのＣａＣｌ2）、１５秒間発光シグナルを統合した。
ローディングの中間工程を省くために、分析の最初から培地にセレンテラジンを加えてもよく、その場合、セレンテラジンは濃度０.５μＭで加えられる。
【００３０】
実施例５：β−ガラクトシダーゼの検出
細胞を分配するか、および／または、白色の９６−ウェルプレートで１００μｌ量で培養した。
測定時間に、各ウェルにβ−ガラクトシダーゼ検出ミックス（Ｇａｌ−ｓｃｒｅｅｎ，Ｔｒｏｐｉｘ）１００μｌを加えた。
プレートを、１時間、２８℃でインキュベートした。
β−ガラクトシダーゼシグナルをルミノメーターで読み取った；０.５秒間発光シグナルを統合した。
【００３１】
実施例６：増殖マーカー：エクオリンとｌａｃＺとの比較
実施例６．１：直線性
強い構成的な発現レベル（トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、１９８２年））を有する、細胞あたり再現可能な数のコピー（セントロメアの複製起点）を結合するため、ｐＹＸ１３２ＴＰＩ発現プラスミドを選択した。
ｐＹＸ１３２ＴＰＩ−ＡＥＱまたはｐＹＸ１３２ＴＰＩ−ＬａｃＺプラスミドのいずれかで形質転換された酵母株の３個のコロニーを、適切な培地（ＳＣグルコース−Ｔｒｐ）で定常期に達するまで培養し、続いて、同じ培地（エクオリン株に対しては０.５μＭセレンテラジンを含む）で連続的に希釈した（ウェルあたり１０6〜１０4細胞）。次に、プレートを３０℃で、７００ｒ．ｐ．ｍ．で、１.５時間振盪し、再度、指数増殖を開始させた。
図４は、２種のレポーター遺伝子で得られた直線性の差を示す：エクオリンは、ウェルあたり３〜４×１０5細胞までは適切であるが、ｌａｃＺシグナルは極めて速くプラトーに達した（直線性は１０5まで）。
【００３２】
実施例６．２：毒性または増殖の停止に関する安定性
ｐＹＸ１３２ＴＰＩ−ＡＥＱまたはｐＹＸ１３２ＴＰＩ−ＬａｃＺのいずれか、または何も挿入されていないｐＹＸ１３２ＴＰＩプラスミドで形質転換した酵母株の２個のコロニーを適切な培地（ＳＣグルコース−Ｔｒｐ）で定常期に達するまで培養し、続いて、以
下の３種の異なる培地で希釈した：
ＳＣグルコース−Ｔｒｐ（通常の増殖培地）；
１００μＭの毒性化合物（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに高い毒作用を示すカリウムチャンネルブロッカーであるジプラシドン）を含むＳＣグルコース−Ｔｒｐ；
ＳＣグルコース−Ｕｒａ（成長にウラシルが必要なため株が餓死する）。
結果を図５〜８に示す。
【００３３】
処理の５時間後（図５および図６）、両方のレポーター遺伝子によるのと同様、を光学密度（ＯＤ）測定においても毒作用が十分検出できた（ＯＤ630＝０.０５〜０.０７、および、０.０９〜０.１９）。
【００３４】
エクオリンは、ジプラシドンの存在下の細胞に関して、餓死細胞と同等のシグナル（それぞれ１０および１６ｒ．ｌ．ｕ．）を示し、一方、通常の培養では、エクオリンシグナルは１３８であった。言い換えれば、エクオリンは、毒性処理と通常の培養との間で１０倍の差を示した。
【００３５】
また、β−ガラクトシダーゼも毒性を示したが、比較すると極めて低かった：通常の培養は、２７６ｒ．ｌ．ｕ．のシグナルを示し、一方、ジプラシドン処理細胞は１１６ｒ．ｌ．ｕ．を発生し（すなわち通常のシグナルのわずか半分）、餓死細胞は６４ｒ．ｌ．ｕ．のシグナルを発生した。
【００３６】
処理した後２４時間で（図７および図８）、ウラシル欠乏培地中の細胞は増殖せず、ジプラシドンのそれらはジプラシドンの毒性を克服してＯＤ630＝０.５〜０.７まで増殖したが、適切な培地中の細胞は飽和するまで増殖した（すなわちＯＤ630が１を超過した）。その上、この効果は、エクオリンによりより顕著に示された：
エクオリンを用いると、毒素処理後、シグナルは５０ｒ．ｌ．ｕ．であり、通常の培養後では、１７５ｒ．ｌ．ｕ．であった；すなわち、３.５倍の差であった；
β−ガラクトシダーゼ株に関しては、処理細胞または非処理細胞において有意差はみられなかった（それぞれ１９２３、および、２２７５ｒ．ｌ．ｕ．）。
【００３７】
この実験によれば、β−ガラクトシダーゼは、短時間の分析（５時間）において、酵母細胞の影響を示すには不適切であることが示された。エクオリンを用いたほうが高い感受性が得られた。この結果は、タンパク質β−ガラクトシダーゼの高い安定性によるものと考えられる。
【００３８】
より長時間の分析（２４時間）では、２種のレポーターの感受性の差は、さらに顕著であると考えられる。
【００３９】
実施例７：ヒトキナーゼの阻害剤のスクリーニング
ヒトキナーゼは、可能性のある治療上の標的であり、これを構成的に活性になるように改変した。活性化されたキナーゼは、酵母に対して毒性であり、細胞死を誘導する。キナーゼおよびエクオリンのいずれも、ガラクトースの存在下でのみ誘導されるプロモーターの制御下にある。
細胞をＳＣグルコースで培養し、リンスし、ＳＣ／グルコースまたはＳＣ／ガラクトースで１０6細胞／ｍｌに希釈した。３０℃で３０時間インキュベートした後、セレンテラジンを加え、Ｃａ2+注入後に、エクオリンの検出方法に従ってエクオリンシグナルを測定した。
【００４０】
図９は、グルコース培地では、極めてわずかなエクオリン発現（ｖｅｒｙ  ｓｌｉｄｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｅｑｕｏｒｉｎ）しかみられなかったが、２種の株で
は同等の発現がみられたことを示す。ガラクトース培地において（エクオリンと活性キナーゼとの両方が発現される）、エクオリンシグナルは、毒性が全くない場合は極めて高かったが（７４５７相対光量単位）、活性キナーゼが発現されるとほとんど消失した（０.５ｒ．ｌ．ｕ．）。
この実施例は、キナーゼ阻害剤のスクリーニングに関して設定された予備試験である：細胞死を回避できる化合物は、キナーゼに対する潜在的な阻害活性に関して選択される。
【００４１】
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【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】エクオリンのオープンリーディングフレームである（配列番号１）。
【図２】ｐＹＸ１３２ＴＰＩ−エクオリンの制限地図である。
【図３】ｐＹＸ１３２ＴＰＩ−ｌａｃＺの制限地図である。
【図４Ａ】細胞を直線的に段階希釈した結果である。
【図４Ｂ】図４Ａの続きである。
【図５】増殖実験の結果である（５時間後の酵母の増殖）。
【図６】増殖実験の結果である（５時間後のレポーター検出）。
【図７】増殖実験の結果である（２４時間後の酵母の増殖）。
【図８】増殖実験の結果である（２４時間後のレポーター検出）。
【図９】キナーゼスクリーニングでの毒性検出の結果である。
【図１０】アポエクオリン（ＡＰＯ）およびセレンテラジンを含むエクオリン複合体によるＣａ2+依存性の発光の発生である（ＯｈｍｉｙａおよびＨｉｒａｎｏ、１９９６年）。
【図１】
2005532032.tif 000003
【図２】
2005532032.tif 000004
【図３】
2005532032.tif 000005
【図４Ａ】
2005532032.tif 000006
【図４Ｂ】
2005532032.tif 000007
【図５】
2005532032.tif 000008
【図６】
2005532032.tif 000009
【図７】
2005532032.tif 000010
【図８】
2005532032.tif 000011
【図９】
2005532032.tif 000012
【図１０】
2005532032.tif 000013
【配列表】
2005532032000001.app
【国際調査報告】
2005532032.tif 000014
2005532032.tif 000015
2005532032.tif 000016