(57)【要約】免疫グロブリンまたはその断片以外の受容体と結合可能なリガンドと連結した36個から50個のアミノ酸のβ-ガラクトシダーゼ断片を酵素ドナーとして、酵素断片相補アッセイにおいて使用することにより、改良された結果が得られた。便利なことに、酵素アッセイにおいて、酵素結合部位阻害剤は酵素ドナーと結合し、それにより、検出可能なシグナルを作ることができるEAおよび基質の存在下で、酵素が結合部位阻害剤と結合するとβ-ガラクトシダーゼの回転速度が低下する結果となる。同様に膜受容体の測定のために、膜受容体のリガンドをEDと結合させることができるかもしれない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質受容体とリガンドの結合事象の測定を行なうための方法であって、当該蛋白質受容体は抗体またはその多価断片以外であって、β-ガラクトシダーゼの酵素ドナー断片を酵素アクセプター断片との複合化の標識として使用し、
酵素ドナーとして36個から50個のアミノ酸のβ-ガラクトシダーゼ断片を採用することを改良してなる、上記方法。
【請求項２】
前記酵素ドナー断片はその末端の近傍に1個から2個のシステインを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記蛋白質受容体が酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記蛋白質受容体が膜受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記蛋白質受容体が無傷細胞の成分である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記蛋白質受容体がアッセイ溶媒中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記酵素ドナー（ED）は36個から45個のアミノ酸であり、その末端の近傍に1個から2個のシステインを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
酵素の活性部位を検出する方法であって、
前記酵素を含むと考えられるサンプル、及び少なくとも約10-8Mの結合定数を有する酵素結合部位阻害剤と結合した36個から50個のアミノ酸のEDのED結合体から形成された複合体をアッセイ溶媒中に混合する工程であって、そのうえに酵素アクセプター（EA）とβ-ガラクトシダーゼ基質が検出可能な産物を産生する上記工程；および
前記酵素の存在を示唆する生じた信号を検出する工程、
からなる上記方法。
【請求項９】
前記複合体は、前記サンプルと前記ED結合体を混合し、少なくとも15分間インキュベートすることによって形成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記EDは36個から45個のアミノ酸であり、その末端の近傍に1個から2個のシステインを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記信号は光放射である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素はPKC-αであり、前記結合部位阻害剤はスタウロスポリンである、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
受容体と、36個から50アミノ酸のEDと結合した前記受容体と結合しているリガンドとの複合体。
【請求項１４】
前記リガンドは前記EDのN末端およびC末端の両者において結合している、請求項１３記載の複合体。
【請求項１５】
前記EDは36個から45個のアミノ酸である、請求項１３記載の複合体。
【請求項１６】
前記受容体は酵素である、請求項１３記載の複合体。
【請求項１７】
前記受容体は膜受容体である、請求項１３記載の複合体。
【請求項１８】
前記リガンドは125から1000ダルトンの環式の有機分子である、請求項１３記載の複合体。
【請求項１９】
前記リガンドはステロイドである、請求項１８記載の複合体。
【請求項２０】
前記リガンドはヌクレオチドである、請求項１８記載の複合体。
【請求項２１】
受容体リガンドと結合した36個から50個のアミノ酸のβ-ガラクトシダーゼ断片の酵素ドナー、β-ガラクトシダーゼ酵素アクセプターの起源、必要に応じてβ-ガラクトシダーゼ基質、および請求項１記載の方法を行なうための指示書を備えるキット。
【請求項２２】
前記指示書が電子的形式である、請求項２１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般として標識されたリガンドを使用した蛋白質受容体の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在する受容体は細胞の生理において鍵となる要素である。受容体とは酵素および複合体を形成する蛋白質を意図するものであり、抗体またはその断片（特に例えばF(ab’)などの多価断片）よりはむしろ例えば膜受容体である。受容体と抗体の機能には本質的な差がある。受容体特に酵素は、それらのリガンドに対して高い親和性を有さず、酵素の場合には、それらの基質はリガンドである。そこで多くの場合、受容体との結合におけるリガンドの親和性は、抗体と比較してかなり低い。酵素の場合には、基質が結合し、生成物へ変換され、そして活性部位から放出して新たな基質を結合させなければならない。受容体の場合には、リガンドの結合により受容体は種々の構造変化と化学変化を受ける。活性であり続けるために、リガンドが放出されるか又は複合体がエンドサイトーシスされなければならず、ここでリガンドが分解され、細胞膜に戻った受容体または複合体が分解される。受容体へ結合する薬剤についてアッセイするために、受容体への結合を同定することまたは競合的なリガンドを提供することは、大いに興味深いままである。
【０００３】
酵素ドナー（”ED”）として知られているβ-ガラクトシダーゼの小断片は、診断のアッセイにおける標識として広い用途が知られている。他の分子に結合してβ-ガラクトシダーゼの大きな断片と複合体を形成したときに、活性な酵素は高い回転率で産生され、例えば蛍光、吸光、または化学発光シグナルなどの光学的なシグナルを与えることができる基質上で作用する。EDの大きさが低下するにつれて、観察された回転率は実質的に低下すると文献は示唆する。大部分では約90アミノ酸のEDが商業的に使用され、N-末端とC-末端のアミノ酸は機能化されたときには、各末端において１つずつ、２つのリガンドが存在するであろう。抗体に結合するときに、その２つのリガンドは、リガンドと抗体の両者が２つの結合部位を持つことにより、非常に高い結合活性を提供する。得られた複合体は非常に好適である。受容体においては対照的であり、受容体は通常単一の結合部位を有し、そのためにEDに結合した２つのリガンドが存在しても、抗体において観察されたのと同様の結合活性を提供することはないであろう。
【０００４】
受容体について観察された結合親和性の低下ために、リガンドに結合した任意の標識はリガンドの結合親和性を更に低下させてはならない。標識はリガンドの構造、結合する部位、およびリガンドと受容体表面の接触に影響してはならず、一方同時に、EAへの効率的な結合のために利用可能であって高い回転率を提供しなければならない。開発されたリガンドが天然のリガンドよりも高い親和性を有し、多くの同様の用途が考えられることさえある。
【０００５】
そこで、感度が良い受容体の検出を可能とし、競合アッセイを可能として結合体（conjugate）または融合した蛋白質として容易に作製できる試薬の開発に興味がもたれる。
【０００６】
（関連文献）
米国特許番号4,378,428；4,708,929；5,037,735；5,106,950；5,362,625；5,464,747；5,604,091；5,643,734；およびPCT出願番号WO96/19732；およびWO98/06648は酵素断片の相補を使用したアッセイを述べる。PCT出願番号WO00/039348は上記で示したように、プロテアーゼアッセイについて述べており、その中のマーカーは特定のプロテアーゼ開裂部位を有する蛋白質と融合したβ-ガラクトシダーゼ断片である。アッセイシステム中でのβ-ガラクトシダーゼ断片の使用に関連する参照文献は他に多くある。下記は例示である。DouglasらはProc.Natl.Acad.Sci.USA 1984,81:3983-7で、ATP-2とlacZの融合蛋白質について述べている。WO92/03559は、プロテイナーゼ測定のためにβ-ガラクトシダーゼのα-相補を採用した融合蛋白質を述べている。WO01/0214は、融合蛋白質としてβ-ガラクトシダーゼのα-ペプチドを使用した構造的相補によって評価した蛋白質のフォールディングおよび/または溶解性について述べている。WO01/60840は、蛋白質のフォールディングおよび溶解性を測定するための酵素ドナーβ-ガラクトシダーゼからなる融合蛋白質を含む融合蛋白質について述べている。HommaらはBiochem.Biophys.Res.Commun.,1995,215,452-8で、融合蛋白質の安定性におけるβ-ガラクトシダーゼのα-断片の効果を述べている。Abbas-TerkiらはEur.J.Biochem.1999,266,517-23で、酵母中の分子チャペロン熱ショック蛋白質のためのインビボのモデル基質としての、α-相補されたβ-ガラクトシダーゼを述べている。MillerらはGene,1984,29,247-50で、ヒトインスリンβ鎖ペプチドを含んでいる融合蛋白質のための定量的なβ-ガラクトシダーゼα-相補アッセイを述べている。Thomas とKunkelはProc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90:7744-8で、変異率を測定するためのプラスミドを含んでいるEDを述べている。
【発明の開示】
【０００７】
（発明の概要）
短いβ-ガラクトシダーゼ断片、酵素ドナー断片（”ED”）、および受容体に対するリガンド（抗体およびその断片、特に多価断片以外の、酵素および複合体形成蛋白質）の新たな試薬が提供され、ここでEDはリガンドの受容体への結合に殆ど干渉せず、高い回転率のために、β-ガラクトシダーゼ断片、酵素アクセプター断片（”EA”）と効率的に複合体化する。特に興味が持たれるのは酵素のためのアッセイであり、ここでより小さなEDにおいてより大きな活性が観察された。試薬は結合体（conjugate）または融合蛋白質である。該試薬は受容体の検出または競合アッセイにおいて使用できる。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
受容体結合部位の有効性を測定するための試薬およびアッセイが提供された。試薬は結合体（conjugate）または融合蛋白質であり、ここで活性本体はβ-ガラクトシダーゼの小さな断片、酵素ドナー（”ED”）、および天然リガンドまたは模倣の類似物質である。リガンドがポリペプチドであるときには該試薬は融合蛋白質であってもよく、一方リガンドがポリペプチド以外であるときには、該試薬は１つから２つのリガンドを有する結合体であろう。（結合体とは、アミノ酸から、アミノ酸またはポリペプチド以外のリガンドへ共有結合を通じて連結されたポリペプチドを意図するものである。）該アッセイは、ED、受容体、大きなβ-ガラクトシダーゼ断片（酵素アクセプター（”EA”））、および基質を含む試薬を、アッセイ溶媒の中に有することにより行なわれる。基質は検出可能な生成物を提供し、ここでその検出可能な生成物は受容体の存在の表示として測定される。
【０００９】
EDは任意の起源から得られ、活性本体として全体で約35個から50個のアミノ酸を、一般的には36個、通常は37個から50個のアミノ酸と、連結のために１つまたは２つのシステイン追加して有するかもしれない。EDは上記の参考文献、米国特許番号4,708,929に広範囲に述べられており、特にその第６節の全体を本願に引用して援用する。そこで、β-ガラクトシダーゼ配列は通常は単細胞微生物、特に大腸菌から得られるであろう。しかし、天然由来のアミノ酸についてアミノ酸の３個以内を置換することができるであろう。大部分において同類置換が関与しており、ここでG,A,V,LおよびIなどの非極性（非イオン性）脂肪族アミノ酸を相互に置換することができ、C,M,S,T,NおよびQなどの荷電していない極性アミノ酸を相互に置換することができ、荷電アミノ酸はKおよびR；並びにDおよびEなどの同じ荷電について相互に置換することができ、芳香族アミノ酸のF,WおよびYは互いに置換することができる。興味の対象である化合物、特にポリペプチドのいずれかの末端において結合する以外には、一般的には分子の活性部分は荷電していないであろう。その上に１つまたは２つのシステインアミノ酸が、末端のアミノ酸の６個以内、通常は３個以内の末端の近傍に付加される。merの数は、EDの中に天然に存在しているアミノ酸のことである。EDはアミノ酸リンカーによって興味の対象であるポリペプチドと結合し、一般的には約1個から10個アミノ酸であり、通常は天然由来のアミノ酸である。リンカーは通常はEDに続くβ-ガラクトシダーゼの天然配列ではなく、そのために、活性配列に続くアミノ酸は文献中で例示されていることが見出されるアミノ酸以外のものであろう。多くの配列が”929”の中に示されており、それらはこの中で使用されることもあり、そして 融合蛋白質以外であるときには、リガンドと結合するためのNまたはC-末端近傍のシステインを有してもよい。
【００１０】
システインは、チオールと共有結合を形成するリガンドとして使用すると結合部位として作用する。種々の官能基がチオールと反応することができ、その例には、例えばアクリロイル官能基を有する活性化オレフィン、例えばハロメチルカルボニルなどの活性ハロゲンまたは擬ハロゲンが含まれ、チオールはジスルフィイドなどを形成する。そこでシステインの数に依って、１つから２つのリガンドを有することができる。反応官能基はリガンドと直接に又は連結鎖を介して結合してもよく、通常は約1から12原子からなる無害の連結鎖であって、そのリンカーは親水性、溶解性、金属イオン封鎖能（sequestration capacity）などの何らかの機能性を与えてもよい。
【００１１】
EDにおける興味の対象となる配列には：
SLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEA（37mer）（配列番号１）、
SLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEARTDCPSQQL（46mer）（配列番号６）が含まれる。
【００１２】
非ペプチドリガンドとの結合において特に興味が持たれるEDは、１つから２つのシステインを含む一方で、各々のシステインが、末端にある場合を含めて、ED末端の６アミノ酸、通常は３アミノ酸以内にあるものである。アミノ酸が51個以下であるこれらのEDは既知の技術により、特に今日一般的に入手可能な自動化された装置、例えばアプライト・バイオシステムズ社、アマシャムなどから入手されるものによって容易に正確に合成することができる。新たに合成されたEDはその後支持体から遊離するか、又はリガンドと結合し、一方支持体上では引き続いて結合体が遊離する。特に興味がもたれるEDはβ-ガラクトシダーゼのN末端近傍領域の45個のアミノ酸および1から2個のシステインを有するものであり、各々のシステインはそれぞれのN末端およびC末端４アミノ酸内にある。
【００１３】
興味がもたれるリガンドには天然由来および合成のリガンドが含まれ、一般的には約125から500,000ダルトンの分子量の範囲内にある。小さな有機分子、特に合成の有機分子については、分子量は通常約125から2000ダルトンの範囲内であろうし、例えばポリペプチドおよびポリケタイド（polyketide）などのオリゴマーについては約250から5,000であり、一方例えば蛋白質および多糖などのポリマーについては、分子量は一般的に2000ダルトンから約500kダルトンの範囲内、通常は約250kダルトン以内であろう。リガンドは非環式または環式、炭素環式または複素環式のものである。通常リガンドは、特に酵素阻害剤は、少なくとも約10-7M、より一般的には少なくとも10-8M、およびしばしばそれより高い結合親和性を有するであろう。リガンドは天然由来のリガンドであっても、模倣的リガンド、アゴニスト、アンタゴニストなどでもよい。
【００１４】
非多量体有機分子は天然由来の物または合成物であってもよく、天然由来および合成の薬剤、ステロイド、ポリケタイド（polyketide）、アミノ酸、脂質、糖、D-アミノ酸などの希少な天然由来アミノ酸などを含む。例示されるリガンドには、ステロイド、ヌクレオチド、例えばトリフォスフェート、ホルモン、薬剤、酵素基質などがふくまれる。多量体リガンドは天然由来の物または合成物であってもよく、ホルモン、多糖、特に糖蛋白質と結合したもの、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン、モルフォゲンなどが含まれ、これらの蛋白質は通常は酵素でも膜受容体でもないであろう。
【００１５】
受容体は他の分子、リガンドと結合する蛋白質であり、リガンドは他の蛋白質または他の分子であることがある。受容体の大部分は一価の結合蛋白質であるが、Fab断片などの一価の蛋白質は通常は受容体のファミリーに含まれない。結合事象には酵素がそれらの各々の基質またはアゴニストに結合すること、例えばホルモンとその膜受容体などの蛋白質リガンドの間の複合体形成、例えばリボソーム、スプライセオソーム、転写開始複合体などの、転写因子、機能構造成分の間の複合体形成、インテグリンと接着分子の結合のみならず、一つまたはそれ以上の蛋白質の間および蛋白質及び非蛋白質の間の複合体形成に関与する他の天然由来の事象が含まれる。膜受容体は細胞膜または核受容体などの内部膜であってもよい。
【００１６】
興味がもたれる蛋白質の領域の中で、転写因子、阻害物質、制御因子、酵素、膜蛋白質、構造蛋白質、インテグリン、接着分子およびこれらの蛋白質のいずれかと複合する蛋白質には興味がもたれる。特定の蛋白質にはアミド開裂ペプチダーゼで例示される加水分解酵素などの酵素が含まれ、例えばカスパーゼ、トロンビン、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、ジペプチジルペプチダーゼ、前立腺特異的抗原、エラスターゼ、コラゲナーゼ、エキソペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、メタロプロテイナーゼがあり、セリン／スレオニンプロテアーゼおよびチロシンプロテアーゼの両者が含まれ；アセチルコリンエステラーゼ、サッカリダーゼ、リパーゼ、アシラーゼ、ATPシクロヒドロラーゼ、セレブロシダーゼ、ATPアーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、フォスファターゼ、フォスフォジエステラーゼ、ヌクレアーゼ、エンド-およびエキソヌクレアーゼの両者などの加水分解酵素；チトクローム蛋白質などの酸化還元酵素、NAD依存性デヒドロゲナーゼ、キサンチンデヒドロゲナーゼ、ジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼ、アロマターゼなどのデヒドロゲナーゼ；アルドラーゼ還元酵素、HMG-CoA還元酵素、トリパノチオン還元酵素などの還元酵素、および例えばミエロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼなど他の酸化還元酵素、モノアミンオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼなどの酸化酵素、およびNO合成酵素、チオレドキシンレダクターゼ、ドパミンβ-ヒドロキシラーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、nox-1オキシゲナーゼなどのクラス内の他の酵素；およびトランスアミナーゼ、GABAトランスアミナーゼ、合成酵素、β-ケトアシル担体蛋白質合成酵素、チミジレート合成酵素、アミノ酸tRNA合成酵素などの合成酵素、エノール-ピルビルトランスフェラーゼなどのトランスフェラーゼ、グリシナミド・リボヌクレオチド・トランスフォルミラーゼ、COX-1および-2、アデノシンデアミナーゼなどの他のクラスの酵素が含まれる。
【００１７】
チロシンキナーゼ、MAPキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、GTPキナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ、Chk1および2などのキナーゼは特に重要である。
【００１８】
α1-アンチトリプシン、アンチトロンビン、シクロフィリン阻害剤、プロテアソーム阻害剤などの酵素阻害剤も興味がもたれる。
【００１９】
β-アミロイドなどの神経蛋白質、TNF、プリオン、APP、ドパミントランスポーターなどの輸送体、NMDA受容体、AMDA受容体、ドパミン受容体、チャネルなどの受容体。
【００２０】
他のクラスの蛋白質は転写因子とそれらの阻害剤または制御蛋白質であって、例えばAdr, Ace, Amt, AP, Atf, Att, Baf, Brn, Btf, C Ebp, C Jun, C Ets, CREB, CF, Chop, DP, E2F, Elk, Gata, Hnf, Iii, A-H, Irf, NY Y, Otf, NFκB, NF-AT, Oct-1, Pea, Pit, PU, S, SP, Stat, Tef, TFIII, TFIIII, UbfおよびUsfなどであり、一方、その阻害剤にはErk, IκB, LIF, Smad, RANTES, Tdgなどのみならず、転写因子の合成、活性化または阻害を誘導する経路と関連している他の蛋白質も含まれる。
【００２１】
いくつかの事例においては、トリカルボン酸サイクル、クレブスサイクル、グリコーゲン合成などに関与している蛋白質などのハウスキーピング蛋白質に興味がもたれるであろう。
【００２２】
アッセイは細胞内または細胞外であってもよい。細胞内であるときには、細胞は細胞内に存在する機能を有するEAを有することが必要とされるであろうが、それは、細胞培地へ添加された細胞透過性EAを有することによる、細胞内でのEAの発現またはEAの誘導の結果である。加えて、米国特許番号5,208,148および5,576,424の中で開示された基質など、細胞透過性の基質が採用される。代わりに細胞を溶解し、溶解物を直接に又は受容体濃度を増加させた後にアッセイする。例えば競合アッセイなどの他のアッセイを細胞由来以外で行なうことができ、そのアッセイにおいてはリガンドの受容体への結合に興味がもたれる。
【００２３】
アッセイは通常は、ED結合体における標的の望む結合親和性を得るために選択された水性の緩衝培地の中で行なわれる。培地のpHは通常は約3から11の範囲内であろうし、より通常には約5から9の範囲内であろう。アッセイ組成物の容量は本来は便宜の一つであり、試薬の価格、利用できる装置、行なわなければならないアッセイの数、検出の感度などが考慮される。アッセイを、約96ウェルのプレートから約1536ウェルのプレートの範囲にあるマイクロタイタープレートのウェルの中で行なうことができる。容量は約10nlから1mlであり、通常は約50nlから500μlまで変化する。試薬の濃度、ED結合体およびEAは、興味がもたれる蛋白質結合候補の濃度範囲により変化するであろう。試薬の濃度、ED結合体およびEAおよび標的蛋白質は、特定の蛋白質のためのアッセイの感度を最適化するために実験により決定されるであろう。競合アッセイにおいては一般的に、ED結合体の濃度は試験化合物の約1から100、通常は約2から25倍であろうが、試験化合物の量が未知である状況では、推測できる最大および最小濃度の平均の倍数となる。非競合アッセイについては、推測可能な最大および最小濃度の平均を出発濃度として再び使用することができ、そして濃度を最適化できる。EAは少なくともED結合体と同等であろうし、実質的に過剰であってもよく、通常は実質的に過剰であり、一般的には約103から106倍過剰である。濃度を規定するための数式を米国特許番号4,378,428の中に見出すことができる。
【００２４】
標的蛋白質が試薬の一つであるときは、望む親和性を有する候補化合物における複合速度の変化を最適化するために濃度が選択されるであろう。一般的にはアッセイの経過中における基質の回転率の少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約15％の変化を見ることを望むであろう。多くの場合には標的蛋白質は抗体と比較して比較的弱い結合親和性を有するであろうし、複合体の完全な動態範囲（dynamic range）を達成することはできないであろう。通常はアッセイにおいて完全な動態範囲の少なくとも約20％、好ましくは少なくとも約35％、より好ましくは少なくとも約50％で十分であろう。（「完全な動態範囲」とは、標的蛋白質の非存在下における結果から、標的蛋白質が存在するED-結合体の飽和時における結果までの範囲であろう。）
【００２５】
アッセイを実施するにあたり、試薬の混合物および／または試薬およびサンプルを反応が起こるのに十分な時間の間インキュベートし、それは通常では少なくとも約10分、より通常では少なくとも約15分であり、それによって十分な結合が起こって信頼できる値が提供されるであろう。基質の添加は、試薬を混合した時又は十分なインキュベーション期間の後に行う。検出可能な生成物を提供する多数の基質が知られており、その生成物は例えば比色分析または蛍光分析など、光の吸収または放射によって検出可能である。基質の例としては、ジ-β-ガラクトシジルフルオロセイン、β-ガラクトシジルウンベリフェロンなどが含まれる。
【００２６】
便宜のためにキットが提供される。インビトロの競合アッセイのために、ED結合体、標的蛋白質、基質およびEAが提供され、例えばEAと基質など、成分の１つ又はそれ以上を混合できる。非競合アッセイにおいては、標的蛋白質がコントロールとして存在する以外には、キットは同じ構成成分を必要とするであろう。細胞内アッセイの場合には成分は改変され、細胞中へ導入されるEAの発現のためのコンストラクトとしてEAは提供されるか、または細胞内でEAを提供するように適切に改変された細胞が提供される。通常該キットには、アッセイを実施するための指示書を有する添付物が含まれるであろう。その指示書は印刷されているか、例えばCDまたはフロッピー（登録商標）ディスクなどの電子的なものでもよい。該キットは製品のマーケティングにおいて使用され、且つ研究のためのアッセイおよび商業的な場面での使用促進においても使用される。
【００２７】
下記の実施例は説明を意図したものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２８】
材料および方法
Fmoc保護されたアミノ酸は全て、ノバ・バイオケム、サンディエゴ、カリフォルニアから取り寄せた。第１のアミノ酸が搭載されたPEG樹脂およびカイザー試験試薬は、アプライド・バイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニアから取り寄せた。他の試薬は全てフィッシャー・サイエンティフィックおよびシグマ・ケミカルズ、セントルイスから取り寄せた。
【００２９】
ED断片の合成
β-ガラクトシダーゼの短いED断片は、窒素攪拌下でのFmoc化学を手動で用いた固相ペプチド化学を使用して合成した。適切に搭載された第１のFmocアミノ酸残基を使用し、少量を搭載したPEG樹脂（0.1-0.2 ミリモル/g樹脂の搭載）を使用して合成を行なった。4当量のFmoc保護されたアミノ酸、4当量のベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-フォスフォニウム・ヘキサフルオロフォスフェート（ByBop）、4当量の1,ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、および8当量のジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）試薬を使用してカップリングを行った。DMF中の20％ピペリジンを採用して、Fmoc基の脱保護を行なった。全てのカップリングと脱保護はDMF中で行なわれた。100℃でカイザー試験によりカップリングを観測した。第２のアミノ酸の場合には、クロラニル試験によってカップリングの効率を観測した。困難なペプチドカップリングはDMF中の0.1％トライトンX-100の中で、長期の期間行なわれた。10mer毎に等量の樹脂を採取し、スカベンジャーのカクテルを含む、純粋なトリフルオロ酢酸（TCA）を用いて脱保護し、RP-HPLC（C18, 300Å）により精製し、ESIMS/MALDI-MSによって分子量を確認した。ペプチド樹脂をチオアニソール、エタンジチオール、水およびフェノールを含む純粋なTFAで室温で5時間処理することにより、最終ペプチドを得た。樹脂を濾過し、濾液を真空内で濃縮した。冷却した無水エーテルを添加すると、白い粉末として租ペプチドが得られた。C18カラム上で逆相条件下でそれを最終的に精製し、ESIMSによって分子量を確認した。
【００３０】
EAとED相補アッセイ
全てのED断片についての相補の速度動力学を多ウェルプレート上で行なった。相補のための1XのEA（0.18mg/ml）試薬を有する種々の酵素断片（出発範囲1nM）の一連の希釈系列を採用した。アッセイプロトコールは以下のようである：20μlのアッセイ緩衝液に、10μlのED（ED希釈緩衝液中の希釈系列）および1XのEA試薬を添加した。室温で2時間インキュベートした後、10μlの蛍光（0.4mg/mlレソルフィンガラクトシド、モレキュラープローブス、ユージェーン、オレゴン）または化学発光（ガラクトン-スター/エメラルド II, ABI, フォスター市、カリフォルニア）試薬を添加した。10分間の間隔で2時間の間、パッカードプレートリーダーを使用してプレートを読んだ。蛍光基質のために、530nmの励起波長と610nmの発光波長を1100VのPMTセットと共に使用した。アッセイは4連で行なった。
【００３１】
１．LQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEARTDCPSQQL（41mer）（配列番号２）
２．IDPCASSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPF（36mer）（配列番号３）
３．SPGNIDPCASSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPF（40mer）（配列番号４）
４．QSSPGNIDPCASSNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPF（42mer）（配列番号５）
６．SLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEA（37mer）（配列番号１）
７．SLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEARTDCPSQQL（46mer）（配列番号６）
８．CSLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEARTDCPSQQL（47mer）（配列番号７）
精製および開裂タグを有する酵素断片
９．AWRHPQFGGSLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEA（37mer中のStrep タグ）（配列番号８）
１０．HHHHHHSLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEA（37mer中の6 Hisタグ）（配列番号９）
１１．DYKDDDYKSLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEA（37mer中のFlagタグ）（配列番号１０）
１２．HHHHHHSLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEALVPRGS（C末端にトロンビン開裂部位を有する37mer中の6 Hisタグ）（配列番号１１）
１３．HNHNHNHNHNHNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNKLAAHPPFASWRNSEEALVPRGS｛C末端にトロンビン開裂部位を有する37mer中の6(His-Asn)タグ｝（配列番号１２）
１７．ED28（90mer）（配列番号１３）
【００３２】
結果：
１．天然の90mer（ED28）DX 400090のSAR研究により、37merのDX 400045は60分で0.0123nMの濃度のEDにおいて相補活性の45％を保持することが示された。
２．45+1merの相補活性は同じ濃度で72％であった。
３．種々の精製タグの添加のみならずトロンビン開裂部位の添加（37mer）は相補の速度動力学を5-10％改善した。
４．37merより短く調製された他の短い酵素ドナー断片は（示さず）天然の90merの3-6％の活性を保持した。（配列番号１７）
５．配列番号１の検出の最低限度はサブピコモルの範囲であり、天然の90merと比較したときにそれがその感度を維持してしていることを示唆している。（配列番号１７）
【００３３】
スタウロスポリン-N-メチルカルボン酸、メチルエステルの調製
1バイアルのスタウロスポリン（0.5mg, 1,07マイクロモル）にジメチルフォルムアミド（250μL）に添加した。適切なサイズとした磁気攪拌子をそのバイアルに添加した。これにメチル・ブロモアセテート（4.8mg, 31マイクロモル）とジイソプロピルエチルアミン（0.6mL）を添加した。反応混合液を一晩攪拌させた。ファーマシューティカルC18上での高速液体クロマトグラフィーおよび0（100％C）から100％D（緩衝液C:HPLC水の中の0.1％TFAおよび緩衝液D:HPLCアセトニトリル中の0.1％TFA）のグラジエントの解析により、反応は一つの主要な生成物として完結することが示された。HPLCでスタウロスポリン-N-メチルカルボン酸、メチルエステルを精製し、エレクトロ−スプレイ・マススペクトル測定（ESI-MS）により生成物の同一性を確認した（M+1=539）。生成物画分を一晩凍結乾燥した。これを次の合成段階で使用した。
【００３４】
スタウロスポリン-N-メチルカルボン酸、メチルエステルの加水分解
スタウロスポリン-N-メチルカルボン酸、メチルエステルを含んでいるバイアル（〜0.5-0.6mg）へ、HPLCグレードのメタノール（250μL）およびHPLCグレードの水（250μL）を加えた。適切なサイズとした磁気攪拌子を反応バイアルに添加した。反応液に水酸化ナトリウム（1N 100μL）を添加した。反応混合液を一晩攪拌した。HPLCによる反応混合液の解析により、一つの主要生成物のピークが見られた。生成物をHPLCで単離し、ESI-MS（M+1=525）により生成物の同一性が確認された。反応混合液を一晩凍結乾燥した。この量を次の段階の合成に使用した。
【００３５】
スタウロスポリン-N-（メチルカルボキシ-（2-マレイミドエチル）-アミド）；スタウロスポリン-CM-MEAの調製
スタウロスポリン-N-メチルカルボン酸のバイアルへ（〜0.5mg, 〜0.9マイクロモル）へ、HPLCグレードのジメチルフォルムアミド（250μL）を加えた。これにHPLCグレードのDMSO（125μL）を添加した。適切なサイズとした磁気攪拌子をそのバイアルに添加した。反応混合液にマレイミドエチルアミンHCl（1.1mg, 6.2マイクロモル）を添加した。HBTU-HOBT溶液は、95mgのO-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’,テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロフォスフェートを、HPLCグレードDMF中の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の0.5M溶液の1mlの中へ溶解して調製した。HBTU-HOBT（10μL, 〜5マイクロモル）を反応混合液へ添加した。その反応物を氷上に置いた。ジイソプロピルエチルアミン（1.1μL, 〜6マイクロモル）を反応バイアルへ添加することにより反応を開始した。氷上で反応物を5分間攪拌した。反応混合物の解析をHPLCで行なうことにより、出発材料の完全な消滅が見られた。生成物をHPLCで精製し、ESI-MSにより生成物を確認した（M+1=647）。精製された画分を結合において直接使用した。
【００３６】
（スタウロスポリン-CM-MEA）2-ED28 90mer（DX 400090）の調製
適切な試験チューブに入ったED28（〜0.25mg, 26ナノモル）の燐酸ナトリウム緩衝液（0.160mL）の脱塩溶液へ、前の段階由来の精製したスタウロスポリン-CM-MEAの溶液を添加した。pHを7.0に調整するために、燐酸ナトリウム緩衝液（100mM, pH8.5, 200-300μL）を反応液へ添加した。反応を1-2時間の間続行させた。反応混合液をHPLC（Vydac由来のC4蛋白質カラム、1×25cm, 5マイクロ微粒子）で精製した。20％D（80％C）から60％Dへの段階グラジエントをこの精製で使用した。4ml/分の流速で結合体は20分で溶出した。この結合体についてε280=86,000M-1cm-1であると推定し、可視-紫外分光光度計で結合体を定量した。結合体をESI-MS（M+1=11,082）により定量した。
【００３７】
（スタウロスポリン-CM-MEA）2-47mer（DX 400060）の調製
適切な試験チューブに入った、DX 400060（〜0.25mg, 26ナノモル）の燐酸ナトリウム緩衝液（0.160mL）の脱塩溶液へ、前の段階に由来する精製したスタウロスポリン-CM-MEAの溶液を添加した。pHを7.0に調製するために、燐酸ナトリウム緩衝液（100mM, pH8.5, 200-300μL）を反応液へ添加した。反応を1-2時間の間続行させた。反応混合液をHPLC（C18, Zorbax由来の300Åカラム、1×25cm, 5マイクロ微粒子）で精製した。20％D（80％C）から60％Dへの段階グラジエントをこの精製で使用した。4ml/分の流速で結合体は24分で溶出した。この結合体についてε280=80,000M-1cm-1であると推定し、可視-紫外分光光度計で結合体を定量した。結合体をESI-MS（M+1=6641）により定量した。
【００３８】
スタウロスポリン結合体のためのアッセイ
スタウロスポリン（STA）または任意の他の薬剤化合物の一連の希釈系列を、30mM HEPES, pH=7.4, 10mM MgCl2, 0.4mM EGTA, 20mM NaCl, 0.01%ツイーン20, 0.1%ウシベータ-グロブリンを含むアッセイ緩衝液（ASB）中で調製する。各希釈液の10μLを、384穴のプレート中へピペットする。二連で行なうこと。ASBで貯蔵溶液（3.2 mM）を希釈することにより、36μMのペプチド（キナーゼの基質）を調製する。
【００３９】
4×の酵素作動溶液を調製する（PKC）。ASBと、10mM MES, pH=6.5, 200mM NaCl, 10mM EGTA, 2mg/ml BSA断片、14.6mM NaN3を含む酵素ドナー希釈緩衝液（EDDB）の1:1の混合溶液で希釈することにより、0.25nMのED28-STAを調製する。同量のペプチド、酵素作動溶液、およびED-STAを混合する。30μLのペプチド/PKC/ED28-STA混合物を、各ウェル中へ分注したスタウロスポリン希釈液を10μL含んでいるプレート上へピペットする。プレートをタッピングする。室温で60分間インキュベートする。100mM PIPES, pH=6.83, 400mM NaCl, 10mM EGTA, 0.005%ツウィーン20, 150mM NaOH, 10 mM 酢酸マグネシウム、14.3mM NaN3を含む酵素アクセプター希釈緩衝液（EADB）で希釈された0.006mgの酵素アクセプター（EA）を10μL添加する。ベータ-ガラクトシダーゼ（トロピックス）のために15μLのガラクトン-スター/エメラルドII（ケミルミセッセント）基質を添加する。10-15分間インキュベートする。EA試薬を添加して１時間以内に化学発光を読む。飽和結合研究においてED28-STAは、20nMのPKC濃度で20nMの親和性を有していた。競合実験において、スタウロスポリンは16nMの効力で置換できることが示された。更なる結果につおいては図１０を見よ。
【００４０】
プロゲステロン誘導体：（DX-200350）
4-プレグナン-21-オール-3,20-ジオン-21-マレイミドエチルアミノ・ヘミサクシネートの調製
150μLの無水DMFおよび350μLの無水DMSOの中に4-プレグナン-21-オール-3,20-ジオン-21-ヘミサクシネート（5.2mg）を溶解した。塩酸マレイミドエチルアミン（5mg）を200μLの無水DMFの中に溶解した。マレイミド溶液をアミン溶液中にゆっくりと添加し、氷浴中で攪拌することにより反応物を混合した。反応混合液に、O-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロフォスフェートと1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（DMF中0.25M, 30μL）およびジイソプロピルエチルアミド（10μL）を添加した。生成物を逆相カラム（C4）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
【００４１】
PL47DiCys（配列番号７）と4-プレグナン-21-オール-3,20-ジオン-21-マレイミドエチルアミノ・ヘミサクシネートの結合体の調製
PL47DiCys（1mg）を、1mLの燐酸緩衝液（100mMで2mM EDTAを含む, pH6.5）、1mLの無水DMF、および1mLのHPLCグレードのアセトニトリルの中に溶解した。4-プレグナン-21-オール-3,20-ジオン-21-マレイミドエチルアミノ・ヘミサクシネート（0.6mg）を、1mLの燐酸緩衝液（100mMで2mM EDTAを含む, pH6.5）、0.5mLのHPLCグレードのアセトニトリル、および1mLの無水DMF中に溶解した。ボルテックスで攪拌しながら、マレイミド溶液をPL47DiCysへゆっくりと添加した。2時間後に、逆相カラム（C4）上で生成物を高速液体クロマトグラフィーにより精製した。生成物の同一性をMS解析により確認した（M+=6495）。
【００４２】
ED[45+2]プロゲステロン結合体による酵素断片の相補に基づいたプロゲステロン受容体アッセイ
種々の濃度のプロゲステロン（ステラロイド社、ニューポート、ロードアイランド）溶液を、メタノール中の10mMストック溶液の系列希釈により作った。系列希釈はアッセイ緩衝液（50mM HEPES, 150mM NaCl, および0.1%ウシガンマグロブリン（BGG）, pH7.4）中で行なわれた。1.0のμLプロゲステロン（種々の濃度における）に、25μLのプロゲステロン受容体及び酵素アクセプター（15μL のPRおよび10μLの1.8μM EA）を添加した。混合液をマイクロタイタープレート中で60分間インキュベートした。10μLのED-プロゲステロン結合体（10mM MES, pH5.5, 200mM NaCl, 10mM EGTA, 2mg/mlウシ血清アルブミン断片および14.6mM NaN3からなるED希釈緩衝液中に0.5nM）および10μLの化学発光試薬、エメラルドを有するガラクトン・スター（アプライド・バイオサイエンス、フォスター市、カリフォルニア）を共に添加し、ルミカウント上でプレートを読んだ（パッカード、メリディエン、コネチカット）。結合体は1.60e-7のEC50で約10-6から10-8の動態範囲を有することが見出された。
【００４３】
エストロゲン誘導体：（DX-200350）
1,3,5(10)-エストラトリエン-3,17-ジオール-17-(2-マレイミドエチルアミノ)-ヘミサクシネートの調製
1,3,5(10)-エストラトリエン-3,17-ジオール-17-(2-マレイミドエチルアミノ)-ヘミサクシネート（5.2mg）を150μLの無水DMFおよび350μLの無水DMSOの中に溶解した。塩酸マレイミドエチルアミン（5mg）を200μLの無水DMFの中に溶解した。マレイミド溶液をアミン溶液へゆっくりと添加し、ボルテックスにより反応液を氷浴中で混合した。反応混合液に、O-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロフォスフェートと1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（DMF中0.25M、30μL）の溶液、およびジイソプロピルエチルアミン（9.6μL）を添加した。生成物を逆相カラム（C18）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
【００４４】
PL47DiCys（配列番号７）と1,3,5(10)-エストラトリエン-3,17-ジオール-17-(2-マレイミドエチルアミノ)-ヘミサクシネートの結合体の調製
PL47DiCys（0.55mg）を、0.5mLの燐酸緩衝液（100mMで2mM EDTAを含む, pH6.5）と0.5mLのHPLCグレードのアセトニトリル中に溶解した。1,3,5(10)-エストラトリエン-3,17-ジオール-17-(2-マレイミドエチルアミノ)-ヘミサクシネート（0.35mg）を、1.5mLの燐酸緩衝液（100mMで2mM EDTAを含む, pH6.5）および3mLの無水DMF中に溶解した。ボルテックスで攪拌しながらPL47DiCys溶液へマレイミド溶液をゆっくりと添加した。2時間後、生成物を逆相カラム（C4）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。生成物の同一性をMS解析により確認した（M+=6479）。
【００４５】
GTPγ-S結合体
GTPγ-S-BMH誘導体の調製
GTPγ-S（2mg）の燐酸ナトリウム（100mM, pH6.9, 1mM）溶液に200μLのDMFを添加した。最小量のDMF（〜200μL）にビス-マレイミドヘキサン（4mg）を溶解した。GTPγ-S溶液へマレイミド溶液をゆっくりと添加し、ボルテックスにより反応物を混合した。生成物を逆相カラム（C18）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。分子量をEMI-MS解析により確認した（M+=811）。
【００４６】
GTPγ-S-BMOE誘導体の調製
GTPγ-S（2mg）の燐酸ナトリウム（100mM, pH6.9, 1mM）溶液に200μLのDMFを添加した。最小量のDMF（〜200μL）にビス-マレイミドエタン（4mg）を溶解した。マレイミド溶液をGTPγ-S溶液へゆっくりと添加し、ボルテックスにより反応物を混合した。生成物を逆相カラム（C18）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。分子量をEMI-MS解析により確認した（M+=755）。
【００４７】
ED[45+2]とGTPγ-S-BMHの結合体の調製
ED[45+2]（0.3mg）とGTPγ-S-BMH（50mlの水の中0.25mg）を、100mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.9）の中で結合させた。1時間後、生成物を逆相カラム（C18）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。分子量をEMI-MS解析により確認した（M+=7013）。
【００４８】
ED[45+2]とGTPγ-S-BMOEの結合体の調製
ED[45+2]（0.3mg）をGTPγ-S-BMOE（水50mlの中0.25mg）と、100mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.9）の中で結合させた。1時間後、生成物を逆相カラム（C18）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。生成物の同一性をEMI-MS解析により確認した（M+=6901）。P38 MAPキナーゼ誘導体：
【００４９】
4-(4-フルオロフェニル)-5-(4-ピリジル)-2-(4,O-カルボキシメチルオキシ)フェニル）イミダゾール・メチル・エステル（FHPI-cm-OMe）の調製
4-(4-フルオロフェニル)-5-(4-ピリジル)-2-(4-ヒドロキシフェニル)イミダゾール（FHPI）(SB 202190), 2mg)のメタノール溶液中に、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（0.5N, 20μL）を添加した。高い真空の下でメタノールを除去した。残渣に無水ジメチルフォルムアミドおよびメチルブロモアセテート（2μL）を添加した。反応混合物を30分間攪拌した。反応をトリフルオロ酢酸により抑制し、生成物を逆相カラム（C18）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。ピーク生成物を凍結乾燥し、次の段階において使用した。
【００５０】
4-(4-フルオロフェニル)-5-(4-ピリジル)-2-(4,O-カルボキシメチルオキシ)フェニル）イミダゾール・メチル・エステル（FHPI-cm-OH）の加水分解
前の段階の生成物をメタノール（0.5mL）中に溶解した。これに水（0.5mL）と水酸化ナトリウム溶液（1N, 0.2mL）を添加した。混合物を2時間攪拌した。反応をトリフルオロ酢酸により抑制し、生成物を逆相カラム（C18）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。ピーク生成物を凍結乾燥し、次の段階において使用した。
【００５１】
4-(4-フルオロフェニル)-5-(4-ピリジル)-2-(4,O-カルボキシ-(2-マレイミドエチル)メチルオキシ)フェニル）イミダゾール（FHPI-cm-MEA）の調製
FHPI-cm-OH（1.1mg）をジメチルスルフォキシド（100μL）およびジメチルフォルムアミド（100μL）中に溶解した。これに、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロフォスフェート（HBTU, 3.2mg）、塩酸マレイミドエチルアミン（MEA.HCL, 1.5mg）、およびジイソプロピルエチルアミン（DIEA, 2.0μL）を添加した。反応をトリフルオロ酢酸により抑制し、生成物を逆相カラム（C18）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。電子スプレイイオン化（p+）マススペクトル測定による生成物の解析により、生成物が確実に同定された（M+1=512）。
【００５２】
4-(4-フルオロフェニル)-5-(4-ピリジル)-2-(4,O-カルボキシ-(2-マレイミドエチル)メチルオキシ)フェニル）イミダゾールとED[45+2]の結合
燐酸ナトリウム緩衝液（100mM, pH=7.0）中で、ED[45+2]（0.25mg）を4-(4-フルオロフェニル)-5-(4-ピリジル)-2-(4,O-（カルボキシ-(2-マレイミドエチル)メチルオキシ)フェニル）イミダゾール（0.3mg）と結合した。1時間後に、生成物を逆相カラム（C18）上で高速液体クロマトグラフィーにより精製した。MALDI-TOF解析により、生成物が確実に同定された（M+1=6413）。
【００５３】
誘導体の構造：
2005527239.tif 000002
【００５４】
FHPI（SB202190）とED[45+2]FHPI-cm-mea結合体による酵素断片相補に基づいた競合アッセイ（図１１を見よ）
DMSO中の15mMストック溶液を系列希釈して、種々の濃度のFHPI（SB 202190, カルビオケム、カリフォルニア）の溶液を作った。アッセイ緩衝液中で希釈系列を行なった。20μlのFHPI化合物を、10μlの酵素アクセプター（EA, 450nM）およびキナーゼ（40nM, p38-GST, カルビオケム、カリフォルニア）と、30から60分間インキュベートした。ED[45+2]FHPI-cm-mea結合体（10μL, 0.25nM）を添加し、反応混合液を更に30分間インキュベートした。10μlの化学発光基質、エメラルドを有するガラクトンスター（アプライド・バイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア）を添加し、30から60分後に読んだ。アッセイをマイクロタイタープレート上で行い、ルミカウント（パッカ−ド、メリディエン、コネチカット）上で読んだ。FHPI（SB202190）のEC50は26nMであった。
【００５５】
結合緩衝液（1mM DTTまたは0.01% CHAPSを含む50mM HEPES, 20mM NaCl, 10mM MgCl2）中の膜蛋白質（CHO-M1由来の10μg）20μlを、種々の濃度の10μlの酵素ドナーGTPγ-S結合体と、室温で60分間インキュベートした。10μlの酵素アクセプター（0.18μM）および15μlの化学発光試薬、エメラルドをプラスしたガラクトンスター（アプライド・バイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア）を添加し、ルミカウント（パッカ−ド、メリディエン、コネチカット）上でマイクロタイタープレートを読んだ。ED46merをコントロールとして使用して読み値を下記に表とした。オープンとクローズは、遊離の酵素ドナー結合体および酵素アクセプターと結合した酵素ドナー結合体を意味する。阻害のパーセンテージは、（オープン−クローズ）／オープンの読み値により計算される。
【００５６】
【表１】
2005527239.tif 000003
【００５７】
阻害を調節できるかどうか試験するために、膜調製物をGTPγ-S（10μMを10μl）とインキュベートして実験を行なった。シグナルを増強して非特異的結合を最小化するために、他の界面活性剤であるサポニンと共により高い濃度の酵素ドナーを試した。
【００５８】
結合緩衝液（0.01% CHAPSまたは0.01% サポニンを含む50mM HEPES, 20mM NaCl, 10mM MgCl2）中の10μlの膜蛋白質（CHO-M1由来の10μl）を、10μlのGTPγ-Sと室温で30分間インキュベートした。10μlの酵素ドナー結合体を種々の濃度で添加し、混合液を室温で60分間インキュベートした。10μlの酵素アクセプター（0.45μM）と15μlの化学発光試薬、エメラルドをプラスしたガラクトンスター（アプライド・バイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア）を添加し、ルミカウント（パッカ−ド、メリディエン、コネチカット）上でマイクロタイタープレートを読んだ。ED46merをコントロールとして使用して読み値を下記に表とした。オープンとクローズは、遊離の酵素ドナー結合体および酵素アクセプターと結合した酵素ドナー結合体を意味する。阻害のパーセンテージは（オープン−クローズ）／オープンの読み値により計算され、それはGTPγ-S非存在下におけるものである。
【００５９】
阻害を調節できるかどうか試験するために、膜調製物をGTPγ-S（10μMを10μl）とインキュベートして実験を行なった。シグナルを増強して非特異的結合を最小化するために、他の界面活性剤であるサポニンと共により高い酵素ドナー濃度を試した。
【００６０】
結合緩衝液（0.01% CHAPSまたは0.01% サポニンを含む50mM HEPES, 20mM NaCl, 10mM MgCl2）中の10μlの膜蛋白質を、10μlのGTPγ-Sと室温で30分間インキュベートした。10μlの酵素ドナー結合体を種々の濃度で添加し、混合液を室温で60分間インキュベートした。10μlの酵素アクセプター（0.45μM）と15μlの化学発光試薬、エメラルドをプラスしたガラクトンスター（アプライド・バイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア）を添加し、ルミカウント（パッカ−ド、メリディエン、コネチカット）上でマイクロタイタープレートを読んだ。ED46merをコントロールとして使用して読み値を下記に表とした。オープンとクローズは、遊離の酵素ドナー結合体および酵素アクセプターと結合した酵素ドナー結合体を意味する。阻害のパーセンテージは（オープン−クローズ）／オープンの読み値により計算され、それはGTPγ-S非存在下におけるものである。
【００６１】
【表２】
2005527239.tif 000004
【００６２】
上記の結果から、アッセイにおいて使用するため、検体を測定するため、細胞内事象を追跡するため等の目的において望まれる感度レベルを、短いEDが提供できることは明らかである。十分に短くて容易に合成できるために、ポリペプチドおよび非アミノ酸置換の両者を有するための柔軟性が提供される。この方法により、開裂、分解、複合体形成、転座（translocation）などの結果をもたらす種々の反応を研究することができ、短いEDはこれらの過程を妨害する可能性を減少させる一方で、これらの事象を観測するのに十分な感度を提供する。
【００６３】
上記の実施例を参照して本発明を述べてきたが、修正や改変は本発明の精神および範囲の内に包含されることは理解されるであろう。従って、本発明は下記の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、種々の経過時間および種々のED濃度におけるEAによる90merのDX400090の相補の速度のグラフであり、EA濃度は1xEA（0.18mg/ml）であり、示された最低検出濃度（”LLD”）を有する。
【図２】図２は、より小さい濃度範囲における図１の速度測定の一部分の繰り返しである。
【図３】図３は、図１の測定の繰り返しであり、45+1merのDX400060を採用している。
【図４】図４は、図２の測定の繰り返しであり、45+1merのDX400060を採用している。
【図５】図５は、図１の測定の繰り返しであり、37merのDX400045を採用している。
【図６】図６は、図２の測定の繰り返しであり、37merのDX400045を採用している。
【図７】図７は、先の図の結果を比較した棒グラフである。
【図８】図８は、60分におけるLLDを示す表であり、標準偏差に基いてZは信頼できる測定レベルである。
【図９】図９は、精製を可能とするために種々の長さを有する種々のEDの相補の反応動力学を比較した棒グラフである。
【図１０】図１０は、濃度を変えて2つの異なったED-スタウロスポリン結合体を用いたアッセイのグラフであり、より短いED-46+2-2C-SSは酵素PKC-アルファに対してより高い親和性を有することを示している。
【図１１】図１１は、SB-202191を用いたp38-MAPキナーゼの標準曲線のグラフである。
【図１】
2005527239.tif 000005
【図２】
2005527239.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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