(57)【要約】多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳを発症する危険性のあるヒトの診断方法が記載される。この方法は、以下の工程、多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳを発症する危険性のあるヒト由来の体液または組織の試料を提供する工程であって、該試料が、ＭＳまたはＭＳとなる危険性のないヒトから採取された場合に野生型ＳＣＦ−アポトーシス応答遺伝子−（ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−）タンパク質およびｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸のうち少なくとも１つを含む工程、該試料中の、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する工程、ならびにｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸が該試料中に存在しない場合、ＭＳまたはＭＳとなる危険性があると診断する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳを発症する危険性のあるヒトの診断方法であって、該方法が、以下の工程、
多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳを発症する危険性のあるヒト由来の体液または組織の試料を提供する工程であって、該試料が、ＭＳまたはＭＳとなる危険性のないヒトから採取された場合に野生型ＳＣＦ−アポトーシス応答遺伝子−（ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−）タンパク質およびｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸のうち少なくとも１つを含む工程、
該試料中の、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する工程、ならびに
ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸が該試料中に存在しない場合、ＭＳまたはＭＳとなる危険性があると診断する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記試料が、ヒトの血液、血漿、血清、リンパ液、神経細胞を含む組織、脳脊髄液、腫瘍組織、骨髄、神経組織、皮膚、髪、涙、羊水穿刺材料を含む胎児材料、子宮組織、唾液、糞便または精子に由来する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記試料中の、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する工程が、さらにＳＡＲＧ−１またはＳＡＲＧ−１−タンパク質の非ｗｔ形態の存在の検出を含む請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＳＡＲＧ−１の非ｗｔ形態が、それぞれ、１つの核酸残基またはアミノ酸残基においてｗｔ−ＳＡＲＧ−１またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質とは異なる請求項３記載の方法。
【請求項５】
ｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸が、核酸増幅法、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限分析、マイクロアレイ技術、プロテオミクスなどからなる群から選択される方法によって検出される請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
前記核酸増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応法である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質が、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質抗体、とくにモノクローナル抗体を用いて検出される請求項１、２、３、４、５または６記載の方法。
【請求項８】
前記ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する工程が、スクリーニング試験において行われる請求項１、２、３、４、５、６または７記載の方法。
【請求項９】
癌または癌となる危険性のあるヒトを診断する方法であって、該方法が、以下の工程
癌または癌となる危険性のあるヒト由来の体液または組織の試料を提供する工程であって、該試料が、癌または癌となる危険性のないヒトから採取された場合に野生型ＳＣＦ−アポトーシス応答遺伝子−（ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−）タンパク質およびｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸のうち少なくとも１つを含む工程、
該試料中の、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する工程、ならびに
ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸が該試料中に存在しない場合、癌または癌となる危険性があると診断する工程、
を包含する方法。
【請求項１０】
前記試料が、ヒトの血液、血漿、血清、リンパ液、神経細胞を含む組織、脳脊髄液、腫瘍組織、骨髄、神経組織、皮膚、髪、涙、羊水穿刺材料を含む胎児材料、子宮組織、唾液、糞便または精子に由来する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記試料中の、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する工程が、さらにＳＡＲＧ−１またはＳＡＲＧ−１−タンパク質の非ｗｔ形態の存在の検出を含む請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
ＳＡＲＧ−１の非ｗｔ形態が、それぞれ、１つの核酸残基またはアミノ酸残基においてｗｔ−ＳＡＲＧ−１またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質とは異なる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸が、核酸増幅法、ポリメラーゼ連鎖反応法、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限分析、マイクロアレイ技術またはプロテオミクスからなる群から選択される方法によって検出される請求項９、１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質が、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質抗体、とくにモノクローナル抗体を用いて検出される請求項９、１０、１１、１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する工程が、スクリーニング試験において行われる請求項９、１０、１１、１２、１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１の配列を含む核酸分子。
【請求項１７】
配列番号１の配列を含む核酸分子であって、該核酸分子において１つの核酸残基が、異なる核酸分子に変更され、好ましくは、該変更により異なるＳＡＲＧ−１−タンパク質アミノ酸配列を生じる核酸分子。
【請求項１８】
前記変更が、配列番号１の６７位でのＴからＣへの変更、配列番号１の７４位でのＡからＧへの変更、配列番号１の８９位でのＡからＧへの変更、配列番号１の２８９位でのＣからＴへの変更および配列番号１の３５９位でのＣからＴへの変更から選択される請求項１７記載の核酸分子。
【請求項１９】
コード領域に欠失を含み、該欠失が、好ましくは３核酸残基長である請求項１６記載の核酸分子。
【請求項２０】
配列番号１およびその変異形態から選択される核酸フラグメントを含む請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の方法を行うための核酸プローブであって、該フラグメントが、１２以上、好ましくは１５以上、とくに２０以上の核酸残基の長さを有する核酸プローブ。
【請求項２１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリペプチドにおいて１つのアミノ酸残基が、変更または欠失されているポリペプチド。
【請求項２３】
前記変更が、Ｐｈｅ２３からＬｅｕ２３への変更、 Ａｓｐ２５からＧｌｙ２５への変更、 Ｇｌｕ３０からＧｌｙ３０への変更、Ｈｉｓ９７からＴｙｒ９７への変更およびＳｅｒ１２０からＰｈｅ１２０への変更から選択される請求項２２記載のポリペプチド。
【請求項２４】
抗体調製物の作製方法であって、該方法が、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異形態を含むポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを動物に投与する工程、該動物に該ポリペプチドに対する抗体を産生させる工程、該動物由来の抗体を含有する体液または組織を抽出する工程、および該ポリペプチドに対する抗体調製物を該体液または組織から調製する工程を包含する方法。
【請求項２５】
抗体調製物の作製方法であって、該方法が、配列番号２のアミノ酸配列またはその変異形態を含むポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを動物に投与する工程、該動物に該ポリペプチドに対する抗体を産生させる工程、該動物の脾臓を採取する工程、該脾臓と適切なハイブリドーマ生成細胞との融合細胞を調製する工程、該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する工程、該ハイブリドーマ細胞をクローニングおよび培養し、それによってモノクローナル抗体を発現する工程、ならびに該モノクローナル抗体を調製する工程を包含する方法。
【請求項２６】
ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する手段を含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の方法を行うためのキット。
【請求項２７】
前記手段が、抗ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質抗体、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１に選択的に結合する核酸プローブ、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１に選択的な領域を規定する核酸プライマー、該核酸プローブもしくは該核酸プライマーを含むチップまたはタンパク質がＳＡＲＧ−１に結合するアッセイから選択される請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
前記タンパク質がＳＡＲＧ−１に結合するアッセイが、変異特異的抗体を含む抗体またはペプチドを用いるアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティングアッセイ、フローサイトメトリーアッセイおよび共焦点顕微鏡を含む免疫組織化学技術を使用するアッセイから選択される請求項２７記載のキット。
【請求項２９】
変異または欠失したＳＡＲＧ−１を含む非ヒト遺伝子組換え動物であって、該変異または欠失したＳＡＲＧ−１が、組換え核酸技術によって該動物のゲノムに導入され、かつそこに安定に組み込まれている遺伝子組換え動物。
【請求項３０】
前記導入が、前記動物の胚幹細胞において行われている請求項２９記載の非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項３１】
前記動物がマウスである請求項３０記載の非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項３２】
ＳＡＲＧ−１またはＳＡＲＧ−１変異体の活性を調節するためのＳＡＲＧ−１結合タンパク質の使用。
【請求項３３】
ＳＡＲＧ−１結合タンパク質の活性を調節するためのＳＡＲＧ−１またはそのフラグメントの使用。
【請求項３４】
多発性硬化症の治療または予防用医薬を調製するためのＳＡＲＧ−１結合タンパク質の使用。
【請求項３５】
多発性硬化症の治療または予防用医薬を調製するためのＳＡＲＧ−１またはそのフラグメントの使用。
【請求項３６】
癌、好ましくは、骨髄増殖症候群、多血症、脊髄形成異常症および骨髄性白血病、とくに急性骨髄性白血病の治療または予防用医薬を調製するためのＳＡＲＧ−１結合タンパク質の使用。
【請求項３７】
癌、好ましくは、骨髄増殖症候群、多血症、脊髄形成異常症および骨髄性白血病、とくに急性骨髄性白血病の治療または予防用医薬を調製するためのＳＡＲＧ−１またはそのフラグメントの使用。
【請求項３８】
前記ＳＡＲＧ−１結合タンパク質が、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、微小管結合タンパク質１Ａ（ＭＡＰ１Ａ）、ＡＴＰａｓｅ、Ｎａ＋／Ｋ＋  トランスポーティング  β１  ポリペプチド（ＡＴＰ１Ｂ１）、ＳＷＩ／ＳＮＦ  複合体  ６０ｋＤａサブユニット（ＢＡＦ６０ｃ）、α−アクチニン２、エキソン１６、ｒａｂ  ＧＤＰ解離インヒビター（ＧＤＩ１）およびプロテオソーム  ２６  Ｓ  サブユニット、ＡＴＰａｓｅ３（ＰＳＭＣ３）からなる群から選択されることを特徴とする請求項３２、３３、３４および３６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳを発症する危険性のあるヒトの診断方法に関する。さらに、本発明は、癌または癌となる危険性のあるヒトの診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、北ヨーロッパのカフカス人の最大０．１％の人口が冒される末梢神経系（ＣＮＳ）の一般的な脱髄疾患であり、そして未同定の末梢神経組織の抗原に対して指向される自己免疫症候群であると考えられている。ＭＳ発症に対する感受性の決定は複雑であり、そして環境的な因子および遺伝的な因子(およそ２０％の患者が、１人以上の罹患した親族を有している（Chataway et al, 1998）)の両方に左右される（Ebers et al, 1995; Sawcer and Goodfellow, 1998; Sadovnick et al, 2000）。多原発生疾患(polygenetic disease)であると考えられているが、ＭＳに関連する遺伝子を単離するために、候補遺伝子アプローチが取られている（Weinshenker and Kantarci, 2000）。カフカス人のハプロタイプＤＲＢ*１５０１−ＤＱＡ１*０１０２−ＤＱＢ１*０６０２（Haines et al, 1998）およびプロテインチロシンホスファターゼレセプタータイプＣ(protein tyrosine phosphatase receptor-type C)における点突然変異（Jacobsen et al, 2000）との関連性が、同様の症例に関連する。最近、ＭＳにおけるＴ細胞排除、ならびに神経および希突起膠細胞の損傷の両方において、アポトーシスの重要性が認識されている（reviewed in Zipp, 2000）。
【０００３】
しかし、ＭＳの少なくとも一部の症例において家族性遺伝的継承が明らかであるが、今日まで明らかなマーカーは報告されていない。単なるＭＳの認識、または危険の関連性の提供でさえも、治療または予防的措置の早期開始に非常に有益である。
【０００４】
したがって、本発明の目的は、ＭＳに対する明らかな徴候、および明らかな相関性を与える、ＭＳのための有効な診断系を提供することである。
【発明の開示】
【０００５】
したがって、本発明の内容は、多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳを発症する危険性のあるヒトの診断方法であって、該方法は、以下の工程によって特徴付けられる：
多発性硬化症（ＭＳ）またはＭＳを発症する危険性のあるヒト由来の体液または組織の試料を提供する工程であって、該試料が、ＭＳまたはＭＳとなる危険性のないヒトから採取された場合に野生型ＳＣＦ−アポトーシス応答遺伝子１−（SCF Apoptosis-Response Gene1-）（ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−）タンパク質およびｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸のうち少なくとも１つを含む工程、
該試料中の、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する工程、ならびに
ｗｔ−ＳＡＲＧ−１−タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸が該試料中に存在しない場合、ＭＳまたはＭＳとなる危険性があると診断する工程。
【０００６】
驚くべきことに、ＳＡＲＧ−１タンパク質は、ＭＳの非常に特異的なマーカーであることが判明した。変異ＳＡＲＧ−１タンパク質を有するヒトか、またはＳＡＲＧ−１における変異のためにいかなるＳＡＲＧ−１タンパク質も発現しないヒトは、ＭＳの明らかに高い危険性を有する。ＳＡＲＧ−１タンパク質の免疫組織化学的局在性に対する研究によると、このタンパク質はＣＮＳの灰白質または白質に局在することを示した。アポトーシス誘導におけるＳＡＲＧ−１の役割は、家族性ＭＳの場合、ＳＡＲＧ−１の変異状態を解析するために、候補遺伝子アプローチを進展させるものである。実際、２０人の非関連性の家族性ＭＳ患者由来のＤＮＡが、ＳＡＲＧ−１座のＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定によって調査され、そして、健常な対照由来のＳＡＲＧ−１配列と比較された。全ての対照試料は、野生型ＳＡＲＧ−１ゲノム配列を示すが、ＭＳ患者由来のＤＮＡにおいては、２０中６のＤＮＡ試料のみが、ＰＣＲによって増幅可能であったことが見出された。すなわち、２０中１４は、いかなる検出可能なＳＡＲＧ−１シグナルをも示さなかった。ほかの６人の患者のうち４人において、遺伝的な変更が見られた。ヌクレオチド６７位でのＴ→Ｃの点突然変異は、アミノ酸２３位でのフェニルアラニンのロイシンへの置換を生じる（アミノ酸およびヌクレオチドの番号は、図４〜８による）。ヌクレオチド３５９位でのＣ→Ｔの点突然変異は、アミノ酸１２０位でのセリンのフェニルアラニンへの置換を生じる（図１６）。ヌクレオチド８９位でのＡ→Ｇの点突然変異は、アミノ酸３０位でのグルタミン酸のグリシンへの置換を生じる（図１７）。アミノ酸１１６と１２１との間のコドンの欠失は、セリン残基の消失を生じる（図１８）。２０以上の対照ＤＮＡ試料の配列決定では、野生型配列のみを示した。
【０００７】
驚くべきごとに、野生型のＳＡＲＧ−１またはＳＡＲＧ−１タンパク質における変化がいくつかの癌細胞においても見られることが観察された。３０以上の癌細胞の配列解析において、Ｇ残基は通常２８０位に存在するので、９４位はバリン（Ａヌクレオチド）またはメチオニン（Ｔヌクレオチド）の代わりにロイシン残基となる。ヒトメラノーマ細胞系において、ＳＡＲＧ−１に２つの変異が見られれる：アスパラギン酸のグリシンへの置換を生じるヌクレオチド７４位のＡ→Ｇの点突然変異およびアミノ酸９７位のヒスチジンのチロシンへの置換を生じるヌクレオチド２８９位のＣ→Ｔの点突然変異。
【０００８】
これらの変異に関与する制限部位が多く存在する：ヌクレオチド６７位でのＴ→Ｃは、多くの制限部位、Ｅｃｏ８８Ｉ、ＸｈｏＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、Ｓｆｒ２７４Ｉ、Ａｍａ７８１Ｉ、ＢｃｏＩ、ＢｓｏＢＩ、ＡｖａＩを生じる；ヌクレオチド３５９位でのＣ→Ｔは、さらなる制限部位ＢｓｅＲＩを生じる。
【０００９】
したがって、本発明のさらなる目的は、癌または癌となる危険性のあるヒトの診断方法に関し、該方法は、以下の工程によって特徴付けられる：
癌または癌となる危険性のあるヒト由来の体液または組織の試料を提供する工程であって、該試料が、癌または癌となる危険性のないヒトから採取された場合にｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質およびｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸のうち少なくとも１つを含む工程、
該試料中の、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する工程、ならびに
ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸が該試料中に存在しない場合、癌または癌となる危険性があると診断する工程。
【００１０】
試料の出所は、通常、診断されるべき癌または疾患の性質に依存する。本発明によるとくに好ましい試料は、ヒトの血液、血漿、血清、リンパ液、神経細胞を含む組織、脳脊髄液、腫瘍組織、骨髄、神経組織、皮膚、髪、涙、羊水穿刺材料を含む胎児材料（fetal material including amniocentesis material）、子宮組織、唾液、糞便、精子などを含む全生検材料を由来とするものである。
【００１１】
基本的には、試料中の、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出するためのいかなる方法も、本発明にしたがい適用され得る。好ましくは、ＳＡＲＧ−１変異体が存在する場合、変異体が存在するという情報を与えるか、または変異形態（mutant form）の性質を詳細に分析するかのいずれかによって、特定のＳＡＲＧ−１変異体を特徴付ける方法が適用される。
【００１２】
とくに、点突然変異（すなわち、それぞれ１つの核酸残基または１つのアミノ酸残基においてｗｔ−ＳＡＲＧ−１またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質とは異なるＳＡＲＧ−１の非ｗｔ形態）の存在の検出は、本発明おいて好ましくあり得る。本発明による方法は、それらの点突然変異、とくに異なるアミノ酸配列となる点突然変異（たとえば、野生型ＳＡＲＧ−１タンパク質からの１つのアミノ酸残基の変更）を同定するために設計され得る。
【００１３】
ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質またはコードする核酸の存在を検出するための適切な方法は、当技術分野において公知であり、好ましくは、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸は、核酸増幅方法（とくにポリメラーゼ連鎖反応法）、一本鎖構造多型（single-strand conformation polymorphism）（ＳＳＣＰ）分析、制限分析、マイクロアレイ技術、プロテオミクスなどによって検出される。これらの方法は、ハイスループット基準において、迅速で信頼性が高く、かつ容易に実施可能であることが示されている。これらの試験は、標準組織または体液試料（たとえば、血液、髪または唾液）に対して実施できる。
【００１４】
一方、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質の存在を検出するための好ましい方法は、たとえば、ＥＬＩＳＡ形式において、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質抗体（とくに、モノクローナル抗体）の適用を包含する。このような抗体は、高度な規格化の潜在性とともに工業的な規模で容易に産生され得る。
【００１５】
本発明による方法は、とくにスクリーニング試験形式に適用するのに適する。
【００１６】
ＳＡＲＧ−１のイントロン／エキソン構造を図１９において提供する。翻訳開始部位のイニシエーターコンセンサスＹＹＣＡＲＲに下線を付す。ドナー（ＧＵ）およびアクセプター（ＡＧ）のスプライス部位にイタリック体で下線を付す。エキソンは太字である。コードエキソン配列はイタリック体である。ＳＡＲＧ−１はヒト染色体２０ｑ１２〜１３．１２に位置される。
【００１７】
本発明はまた、さらなる態様、すなわち、ヒトの野生型ＳＡＲＧ−１をコードする配列番号１（図４）による配列を含む核酸分子に関する。このような核酸は、診断のために使用されるだけでなく、治療的な分子または遺伝子配列を提供することによって（たとえば、アンチセンス方法、すなわち低分子薬の設計によって）、遺伝子治療の態様のために使用され得る。
【００１８】
本発明はまた、配列番号１の配列を含む核酸分子を包含する。ここで、該核酸分子において、１つの核酸残基が、異なる核酸残基によって変更され（たとえば、ＴがＣ、ＧまたはＡで置換される）、該変更が、好ましくは異なるＳＡＲＧ−１タンパク質のアミノ酸配列を生じる。
【００１９】
とくに好ましい変更は、配列番号１の６７位におけるＴからＣへの変更、配列番号１の７４位におけるＡからＧへの変更、配列番号１の８９位におけるＡからＧへの変更、配列番号１の２８９位におけるＣからＴへの変更、および配列番号１の３５９位におけるＣからＴへの変更から選択される。これらの変更は、ＭＳ患者または癌細胞においてすでに観察された変更に関する。生存可能な表現型において生じるさらなる変更もまた好ましい。
【００２０】
本発明による核酸分子における他の好ましい変異は、コード領域における欠失、好ましくは１つ以上のコドン（たとえば、３つの核酸、または６、９、１２個の核酸など）の欠失を含む。それらの変異の１つは、アミノ酸１１６と１２１との間のコドンの欠失を導き、セリン残基の消失を生じる（図１９）。ＳＡＲＧ−１タンパク質において非機能的なＳＡＲＧ−１を導く変異はまた、制御領域内（５’または３’）および／または配列内（とくに正確なスプライシングに重要な位置）に位置され得る。
【００２１】
本発明による核酸分子が診断目的で使用される場合、全配列を使用する必要はない。プローブとしての使用または本発明による方法の実施のために、配列番号１のフラグメント、好ましくは１２以上、より好ましくは１５以上、とくに２０以上の核酸残基の長さを有するフラグメントは、たとえば、核酸試料もしくは染色体試料でさえも同定もしくは単離するためのプローブ、またはＰＣＲプライマーなどとして、様々な試験、とくにそれらのプローブを用いる診断試験を実施するのに適する。
【００２２】
本発明による核酸分子は、配列番号１によるコード配列に限定されるものではなく、この遺伝子の全エキソン／イントロン構造を含むゲノム複製体（genomic counterparts）にも関し、とくに非野生型形態のタンパク質（または非翻訳形態のタンパク質）を生じる非コード領域における模倣体もまた、本発明に包含される。
【００２３】
本発明はまた、この核酸分子によってコードされるポリペプチド（たとえば、配列番号２によるアミノ酸配列を含む）にも関する。コンセンサスＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（アミノ酸残基１３１〜１３３）を含む単一の潜在的なＮ−グリコシル化部位が存在する。
ＭＤＰＮＰＲＡＡＬＥＲＱＱＬＲＬＲＥＲＱＫＦＦＥＤＩＬＱＰＥＴＥＦＶＦＰＬＳＨＬＨＬＥＳＱＲＰＰＩＧＳＩＳＳＭＥＶＮＶＤＴＬＥＱＶＥＬＩＤＬＧＤＰＤＡＡＤＶＦＬＰＣＥＤＰＰＰＴＰＱＳＳＧＶＤＮＨＬＥＥＬＳＬＰＶＰＴＳＤＲＴＴＳＲＴＳＳＳＳＳＳＤＳＳＴＮＬＨＳＰＮＰＳＤＤＧＡＤＴＰＬＡＱＳＤＥＥＥＥＲＧＤＧＧＡＥＰＧＡＣＳ
【００２４】
全てのトレオニンおよびセリン残基は、Ｏ−グリコシル化され得る。コンピューターの予想は、セリン残基９１、１０８、１１３、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４および１３３、ならびにトレオニン残基８８、１０７、１１１、１１２、１１５および１２５のグリコシル化の高い可能性を示す。
【００２５】
同様に、全てのトレオニンおよびセリン残基は、リン酸化され得る。コンピューターの予想は、セリン残基５４、９２、１０８、１１３、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２９、１３３および１４４、ならびにトレオニン残基６１、８８、１０７、１１２および１３９のリン酸化の高い可能性を示す。
【００２６】
潜在的なプロテインキナーゼ認識部位の他に、シグナル配列、特徴的なドメインまたは他の３次元構造は全く検出されなかった。もちろん、アミノ酸残基の変更または欠失を有するアミノ酸配列もまた、本発明によって包含される。
【００２７】
本発明によるポリペプチドのアミノ酸残基の変更は、好ましくは、アミノ酸残基Ｐｈｅ２３、Ａｓｐ２５、Ｇｌｕ３０、Ｈｉｓ９７およびＳｅｒｌ２０、とくにＰｈｅ２３からＬｅｕ２３への変更、 Ａｓｐ２５からＧｌｙ２５への変更、 Ｇｌｕ３０からＧｌｙ３０への変更、Ｈｉｓ９７からＴｙｒ９７への変更、およびＳｅｒｌ２０からＰｈｅｌ２０への変更から選択される。
【００２８】
本発明は、以下に記載するように、（急性）骨髄性白血病または他の白血病サブタイプのための特異的なマーカーとして、ＳＡＲＧ−１変異体形態を提供する。ＳＡＲＧ−１遺伝子の欠失は、マーカーとして機能するために部分的または完全であり得る。そのようなマーカーの存在または非存在をスクリーニングする診断試験は、当業者に容易に想到でき、かつ実施できる。
【００２９】
本発明による好ましいポリペプチドは、組換え的に産生される。それは、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質と比較して構造的な相違（たとえば、示差的グリコシル化、とくに非相同グリコシル化）を示す。
【００３０】
本発明はまた、抗体調製物の作製方法にも関する。この方法は、本発明によるポリペプチドを動物に投与する工程、該動物に該ポリペプチドに対する抗体を産生させる工程、抗体を含有する体液または組織を該動物から抽出する工程、および該ポリペプチドに対する抗体調製物を、該体液または組織から調製する工程を含む。この方法は、とくにポリクローナル抗体の作製に適用可能である。
【００３１】
モノクローナル抗体の作製に関しては、そのような抗体調製物を作製する方法が好ましく、その方法は、本発明によるポリペプチドを動物に投与する工程、該動物に該ポリペプチドに対する抗体を産生させる工程、該動物の脾臓を採取する工程、該脾臓細胞とハイブリドーマ生成細胞との融合細胞を調製する工程、該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する工程、該ハイブリドーマ細胞をクローニングおよび培養し、それによってモノクローナル抗体を発現する工程、ならびに該モノクローナル抗体を調製する工程を含む。当業者は、それによって、このような目的に容易に利用可能である方法（たとえば、"Antibodies: A laboratory manual" by Ed Harlow, ColdSpring Harbor Laboratory; David Lane, Imperial Cancer ResearchFund Laboratories, 1988に記載された方法）に基づく。もちろん、ファージディスプレイペプチドもまた容易に作製され得る。
【００３２】
本発明はまた、インビトロでの本発明による診断方法を実施するためのキットに関する。このキットは、少なくともｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質またはｗｔ−ＳＡＲＧ−１をコードする核酸の存在を検出する手段を含む。当業者は、本出願の開示を基に、大多数の適切な代替物（たとえば、抗ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質抗体、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１に選択的に結合する核酸プローブ、ｗｔ−ＳＡＲＧ−１に選択的な領域を規定する核酸プライマー、該核酸プローブまたは該核酸プライマーを含むチップ）を予見できる。他の好ましい手段またはアッセイは、タンパク質がＳＡＲＧ−１（たとえば、変異特異的抗体を含む抗体またはペプチド）に結合するアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティングアッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、および共焦点顕微鏡を含む免疫組織化学技術を使用するアッセイである。
【００３３】
本発明のさらなる局面は、本発明の遺伝子組換え非ヒト動物モデル、とくにＳＡＲＧ−１遺伝子が変異またはノックアウトされた動物モデルに関する。ＳＡＲＧ−１ノックアウトマウスはとくに好ましい。そのようなモデル（とくにマウスモデル）を提供する方法は、当業者に容易に利用可能である。そのような動物モデルは、ＳＡＲＧ−１の遺伝的な変化（variations）および変異の研究に非常に有用である（とくにそのＭＳ関連障害に関して）。
【００３４】
用語「遺伝子組換え（transgenic）」は、本明細書において、哺乳類細胞（とくに生存動物の哺乳類細胞）のゲノムに人工的に挿入されている、またはそうしようとする遺伝的材料を記載するために使用される。導入遺伝子は、永続的または一時的な遺伝的変化（好ましくは、永続的な遺伝的変化）を意味する、細胞の形質転換のために使用され、それは、外因性のＤＮＡの挿入ののちに細胞において誘導される。永続的な遺伝的変化は、通常、細胞のゲノムにＤＮＡを導入することによって達成される。安定な組込みのためのベクターとしては、プラスミド、レトロウイルスおよび他の動物ウイルス、ＹＡＣなどがあげられる。目的の遺伝子組換え動物としては、たとえば、ウシ、豚、ヤギ、ウマなど、とくにげっ歯類（ラット、マウスなど）があげられる。
【００３５】
遺伝子組換え動物は、染色体外の要素として存在する外因性の核酸配列を含有し、安定にその細胞（とくに生殖細胞）の全てまたは一部に組み込まれる。他に示されない限り、遺伝子組換え動物は、生殖細胞の配列に安定な変化を含むと仮定される。動物の最初の構築の間、細胞の一部のみが変更されたゲノムを有する「キメラ」または「キメラ動物」が作製される。キメラは、主に、所望の遺伝子組換え動物を作製するために、育種目的に使用される。ヘテロ接合性の変更（heterozygous alteration）を有する動物は、キメラの育種によって作製される。オスおよびメスのヘテロ接合体は、代表的には、ホモ接合体の動物を産生するために飼育される。
【００３６】
遺伝子組換え動物は２つの群に分類され、口語で「ノックアウト」および「ノックイン」と称する。本発明において、ノックアウトは、内因性ＳＡＲＧ−１の１つまたは両方の対立遺伝子における部分的または完全な機能の消失を有する。ノックインは、内因性の遺伝子から変更された遺伝子配列および機能を有する導入された導入遺伝子を有する。このノックアウトとノックインとは組み合わされ得、その結果、自然に存在する遺伝子は無効にされ、そして、変更された形態が導入される。
【００３７】
ノックアウトにおいて、好ましくは、標的遺伝子の発現は検出不可能であるか、または少量である。ＳＡＲＧ−１のノックアウトは、本明細書において記載されるように、ヒトにおける情勢に適切なモデルとして実施するために、ＳＡＲＧ−１タンパク質の機能が実質的に減少されており、その結果、発現が検出不可能であるか、または少量レベルのみ存在するか、または本発明の教示により変異されることを意味する。これは、コード配列の変異または破壊の導入（たとえば、１つ以上の終始コドンの挿入、ＤＮＡフラグメントの挿入など）、コード配列の欠失、終始コドンのコード配列への置換などを含む種々の機構によって達成され得る。いくつかの場合、外因性の導入遺伝子は、最終的にゲノムから欠失されるので、本来の配列へ純変化（net change）する。「ノックアウト」を達成するために、異なるアプローチが使用され得る。本来の遺伝子の全てまたは一部の染色体の欠失が誘導され得る。その欠失としては、非コード領域（とくにプロモーター領域、３’調節配列、エンハンサー）の欠失、またはＳＡＲＧ−１の発現を活性化する遺伝子の欠失があげられる。機能的ノックアウトはまた、本来の遺伝子の発現をブロックするアンチセンス構築物の導入によって達成され得る（たとえば、Li and Cohen (1996) Cell 85: 319-329参照）。「ノックアウト」はまた、条件付きのノックアウト（たとえば、ここで、標的遺伝子の変更を促進する基質に対する動物の暴露、標的遺伝子部位での組換えを促進する酵素（たとえば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系におけるＣｒｅ）の導入、または出生後に標的遺伝子の変更を指向する他の方法によって、標的遺伝子の変更が生じる）を含む。
【００３８】
標的遺伝子の「ノックイン」は、本来のＳＡＲＧ−１の変更された発現または機能を生じる、宿主細胞ゲノムにおける変更を意味する。増大した（異所性を含む）または減少した発現は、標的遺伝子のさらなるコピーの導入によって、または標的遺伝子の内因性コピーの促進された発現を提供する調節配列を作動可能に挿入することによって達成され得る。それらの変化は構成的または条件付きである。すなわち、アクチベーターまたはリプレッサーの存在に依存する。
【００３９】
外因性遺伝子は、通常、その動物宿主とは異なる種から得られるか、またはそのコード配列もしくは非コード配列において変更されるかのいずれかである。導入された遺伝子は、野生型遺伝子、自然に存在する多型または変異、あるいは遺伝的に操作された配列（たとえば、コード領域または非コード領域に、欠失、置換または挿入を有する配列）であり得る。導入された配列は、野生型のヒトもしくは動物のＳＡＲＧ−１タンパク質またはその変異体をコードし得る、あるいはレポーター遺伝子に作動可能に連結されたＳＡＲＧ−１プロモーターを利用し得る。導入された遺伝子がコード配列である場合は、構成的または誘導性であり得るプロモーター、および宿主動物における発現に必要な他の調節配列に、通常、作動可能に連結される。「作動可能に連結される（された）（operably linked）」によって、適当な分子（たとえば、転写アクチベータータンパク質）が調節配列に結合される場合に遺伝子発現を可能にするような方法で、ＤＮＡ配列および調節配列が結合されることを意味する。
【００４０】
目的の特定の構築物としては、アンチセンスＳＡＲＧ−１（本来のＳＡＲＧ−１発現、ドミナントネガティブＳＡＲＧ−１変異体の発現、およびＳＡＲＧ−１の過剰発現を遮断し得る）があげられるが、これに限定されるものではない。ｌａｃＺなどの検出可能なマーカーは遺伝子座に導入され得る。ここで、発現のアップレギュレーションが、表現型に容易に検出される変化をもたらす。レポーター遺伝子またはコード領域と組合わせた、ＳＡＲＧ−１プロモーター領域を利用する構築物がまた目的とされる。
【００４１】
ＤＮＡ結合、転写調節などにおける異なるエキソンの役割を決定するために、一連の少量の欠失および／または置換がＳＡＲＧ−１になされ得る。ＳＡＲＧ−１タンパク質が正常に産生されない細胞におけるＳＡＲＧ−１タンパク質の発現の提供によって、細胞行動に変化を誘導できる。
【００４２】
相同組換えのためのＤＮＡ構築物は、所望の遺伝子修飾を有する少なくとも一部のＳＡＲＧ−１を含み、かつ標的化された遺伝子座と相同な領域を含む。無作為な組込みのためのＤＮＡ構築物は、組換えを仲介するために相同な領域を含む必要がない。都合のよいことに、陽性および陰性選択のためのマーカーを含む。相同組換えを介した標的遺伝子修飾を有する細胞を作製する方法は、当技術分野において公知である。哺乳類細胞をトランスフェクションする種々のな技術については、Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537を参照されたい。
【００４３】
胚幹（ＥＳ）細胞については、ＥＳ細胞系が使用されるか、または胚細胞が宿主（たとえば、マウス、ラット、モルモットなど）から新鮮に得られ得る。そのような細胞は、適当な線維芽細胞フィーダー層において増殖されるか、または白血病阻害因子（ＬＩＦ）などの適当な増殖因子の存在下で増殖される。ＥＳ細胞が形質転換される場合、それらは遺伝子組換え動物を産生するために使用される。形質転換ののち、適当な培地中のフィーダー層上に細胞が置かれる。前記構築物を含む細胞は、選択培地を使用することによって検出され得る。コロニーが成長するための充分な時間ののち、コロニーが採取され、そして構築物の相同組換えまたは組込みの発生が分析される。陽性であるコロニーは、ついで胚操作および胚盤胞注入（blastocyst injection）のために使用され得る。胚盤胞は４〜６週齢の過剰排卵したメスから得られる。ＥＳ細胞は、トリプシン処理され、そして、その修飾細胞は、胚盤胞の胞胚腔に注入される。注入ののち、胚盤胞は、偽妊娠のメスの各子宮角（uterine horn）に戻される。メスは、ついで期間が空けられ、そして、得られる同腹子は、構築物を有する変異細胞についてスクリーニングされた。様々な表現型の胚盤胞およびＥＳ細胞を提供することによって、キメラの子孫は容易に検出され得る。
【００４４】
キメラ動物は、修飾遺伝子の存在がスクリーニングされ、そして、該修飾を有するオスおよびメスは、ホモ接合体の子孫を産生するために交配される。遺伝子の変更が成長でのいくつか時点で致死を引き起こす場合、組織もしくは器官は、同種または類似遺伝子性のグラフトもしくはトランスプラント、またはインビトロ培養物として維持され得る。
【００４５】
ヒトＳＡＲＧ−１の結合パートナーとしては、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＯＭＴ１）、微小管結合タンパク質１Ａ（ＭＡＰ１Ａ）、ＡＴＰａｓｅ、Ｎａ＋／Ｋ＋  トランスポーティング  β１  ポリペプチド（Na+/K+ transporting beta 1 polypeptide）（ＡＴＰ１Ｂ１）、ＳＷＩ／ＳＮＦ  複合体  ６０ｋＤａサブユニット（ＢＡＦ６０ｃ）、α−アクチニン２、エキソン１６、ｒａｂ  ＧＤＰ解離インヒビター１（ＧＤＩ１）およびプロテオソーム  ２６Ｓ  サブユニット、ＡＴＰａｓｅ３（ＰＳＭＣ３）があげられる。
【００４６】
ＳＡＲＧ−１タンパク質（変異体を含む）の活性を調節するためのＳＡＲＧ−１結合タンパク質を使用することは、本発明のさらなる態様であり、かつ逆もまた同様である。さらに、ＳＡＲＧ−１（野生型）またはＳＡＲＧ−１結合タンパク質は、有効量のＳＡＲＧ−１またはＳＡＲＧ−１結合タンパク質（あるいはその複合体）を、ＭＳまたは癌患者に投与することによって、ＭＳまたは癌、好ましくは、骨髄増殖症候群、多血症、脊髄形成異常症および骨髄性白血病（とくに急性骨髄性白血病）の治療のために使用され得る。ｗｔ−ＳＡＲＧ−１タンパク質の代わりに、そのような患者の有利な治療に適し得るＳＡＲＧ−１のフラグメント（たとえば、ＳＡＲＧ−１結合タンパク質に結合するフラグメント）もまた使用され得る。そのようなフラグメントの最小の必要条件は、当業者（とくに本明細書に記載したマウスモデルを使用する当業者）に容易に見出される。
【００４７】
さらに、前記方法を実施例および図面によって記載するが、それらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
幹細胞アポトーシス中に誘導される新規ＳＣＦ−アポトーシス応答遺伝子（ＳＡＲＧ−１）の同定
ＳＣＦ依存性骨髄単球の祖先（SCF dependent myelomonocytic progenitors）からの増殖因子の除去は、細胞周期非依存性アポトーシス（cell cycle-independent apoptosis）を急速に誘導する結果となる。９５％以上のＳＣＦ剥奪培養物は、増殖因子除去から１２時間後にバイタルダイ（vital dyes）を除くにもかかわらず、この時点ののちのＳＣＦによる再刺激に対して増殖性の応答は見られない。ディファレンシャルディスプレイスクリーニングを行ない、骨髄単球幹細胞の自己再生および増殖因子除去により誘導されたアポトーシスの過程中の、中期〜初期（４時間）のｍＲＮＡ発現の差異を調査した。規定されたプライマー（Bauer et al, 1993）のセット（ディスプレイ系）を用いるディファレンシャルディスプレイＰＣＲ（Liang and Pardee 1992,1995; Liang et al, 1993）による、全細胞性ｍＲＮＡ種のおよそ１／３の増幅は、自己再生前駆体に存在しないアポトーシスの際に誘導される１つのフラグメントを同定した。このバンドのゲル切出し、および再増幅のｐＣＲδＩＩベクター（Invitrogen）へのＴＡクローニングののち、特異的発現の誘導を、非依存的培養物から単離調製した放射線標識化ｃＤＮＡとハイブリダイズしたドットブロットしたプラスミド調製物を示す逆ノーザン法において確認した（図１）。全ての陽性と同定された示差的に調節されたクローンを配列決定し、そして同一の３４２塩基対の挿入物（下流および上流のディファレンシャルディスプレイプライマー対を除く）が含まれることを見出した。
【００４９】
ＳＡＲＧ−1ｃＤＮＡの分子量および組織発現。胚発達中の調節
前記で見出された３４２ｂｐのフラグメントの放射性標識、および多様な組織のノーザンブロット（Clontech）の調査により、およそ１３００ｂｐ長の成熟ｍＲＮＡが、ラット、マウスおよびヒトの組織において示された。偏在的な低発現が見られるなか、脳および心臓において最高の発現レベルが見られた（図２）。様々な段階のマウスの胚発達から単離された固定化ｍＲＮＡのノーザンブロットを、放射性標識された３４２ｂｐのフラグメントで調査し、７日後にＳＡＲＧ−１  ｍＲＮＡが最高レベルであった発達の間および１７日目の遺伝子産物の再発現の間の、ＳＡＲＧ−１  ｍＲＮＡの調節を証明した（図３）。
【００５０】
ラット、マウスおよびヒトの全長ＳＡＲＧ−１のクローニング
さらなるＳＡＲＧ−１配列情報を、ラット脳のＭａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Clontech）に連結したアダプターから、ポリメラーゼ連鎖反応による５’ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）法によって得た。プライマーを３４２ｂｐの配列の３’隣接末端で構築し、そして、ＰＣＲ産物をｐＣＲ（登録商標）ＴＡクローニングベクター（Invitrogen）にクローニングし、そして配列決定した。全長のＳＡＲＧ−１の１０６２ｂｐ遺伝子転写物を配列決定し、そしてそれは１５８アミノ酸のタンパク質をコードする４７９ｂｐのオープンリーディングフレームを有する。全長のラットＳＡＲＧ−１ｃＤＮＡを有するマウス株１２９ＳｖＪ由来の細菌の人工染色体バンクをスクリーニングすることによって、マウスＳＡＲＧ−１を単離した。相同のクローンを単離し、そしてＸｈｏＩフラグメントを配列決定した。ついで、マウスの成熟ＳＡＲＧ−１のＲＮＡを、マウス脳ｃＤＮＡからＰＣＲによって同定した。ヒトＳＡＲＧ−１を、脳ｃＤＮＡのファージバンクから全長のラット配列との相同性によって単離し、そして配列決定した。全長のヒトＳＡＲＧ−１遺伝子座を、健常なボランティアの末梢血単核細胞から単離した染色体ＤＮＡ由来のＳＡＲＧ−１ｃＤＮＡにわたる（spanning）プライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。ラット、マウスおよびヒトのＳＡＲＧ−１の全長配列を図４、５および６に示す。
【００５１】
ラット、マウスおよびヒトの配列間の相同性
ラットおよびマウスのＳＡＲＧ−１は、それぞれ核酸において９３％、そして予想タンパク質レベルにおいて９６％の相同である。ヒトのＳＡＲＧ−１は、マウスおよびラットのＳＡＲＧ−１に対して、それぞれ核酸レベルにおいて８３％および８４％、そして予想タンパク質レベルにおいて８４％および８６％の相同性を示し（図７および８）、２０番染色体長腕に位置しており（２０ｑ１３．１２（Deloukas et al., 2001））、広範囲の脊髄増殖症候群において共通してその染色体の欠失が起こる（Wattel et al, 1993 and Bench et al., 2000）。配列は潜在的なＰＥＳＴ領域（Rechsteiner et al. 1996）（＋）、単一の保存された潜在的なＮ−グリコシル化部位（＃）、および３つの保存されたＰＫＣ（§）ならびにカゼインキナーゼＩＩ（*）リン酸化部位を含む（図５Ｂ参照）。
【００５２】
抗ＳＡＲＧ−１抗体によるＳＡＲＧ−１分布の分析
ＳＡＲＧ−１抗体を、最初の１５アミノ酸、ならびにキーホールリンペットヘモシアニンに結合するマウス、ラットおよびヒトのＳＡＲＧ−１のＣ末端部分に対応するペプチド（ＭＤＰＮＰＲＡＡＬＥＲＱＱＬＲおよびＤＥＥＥＥＲＧＤＧＧＡＥＰＧＡ）でニワトリを免疫することによって調製した。ＩｇＹを卵黄から調製し、そして特異的抗体をカラム固定化ペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって調製した。
【００５３】
マウス組織の５ｍｍのアセトン固定化切断面の免疫組織化学分析において、特異的抗ＳＡＲＧ−１  ＩｇＹ抗体を、２次抗体を結合した抗ＩｇＹペルオキシダーゼによって視覚化し、神経組織におけるＳＡＲＧ−１タンパク質の広範囲の発現を検出した。ＳＡＲＧ−１染色は、大脳皮質全体（図９Ａ）、および小脳の顆粒、プルキニェ細胞および分子細胞層（図９Ｂ）で見られた。脊髄において、ＳＡＲＧ−１は、神経細胞体、樹状突起、グリア細胞および血管を含む灰白質、ならびに大部分が有髄神経線維からなる白質の両方で発現された（図９Ｃ）。ＳＡＲＧ−１発現はまた、予備末梢神経プロセスとともに局在化する（colocalised）（図９Ｄ）。ＳＡＲＧ−１はまた、心筋（図９Ｅ）、肺の繊毛上皮（図９Ｆ）ならびに回腸および結腸の上皮細胞（データは示さない）において偏在的に発現される。マウス胚組織の染色は、神経組織、脳、心臓、胎盤、子宮、コルチ器官、真皮（顆粒層）および内臓の内層の強度の染色を証明した（データは示さない）。
【００５４】
ＳＡＲＧ−１過剰発現細胞の作製
ＭｅｌＪＵＳＯメラノーマ細胞株を、１０％のウシ胎仔血清、ならびに１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（全てＧｉｂｃｏＢＲＬ製）を含有する抗生物質−抗カビ物質の混合物を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃で５％ＣＯ2を含有する完全な湿潤空気環境下で維持した。ヒトＳＡＲＧ−１コード配列（ｈＳＡＲＧ−１486）を、標準的な分子生物学的手法（Sanbrook et al, 1989）によりＣ末端の血球凝集素（ＨＡ）ペプチド配列とインフレームでＣＭＶプロモーターの制御下のｐＭＨ発現ベクター（Ｒｏｃｈｅ）にクローン化した。６ウェルプレートにおける半混合培養物を、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で、このベクター（ｐＭＨ−ＳＡＲＧ−１−ＨＡ）または空のベクターでトランスフェクションし、そしてネオマイシンに対して耐性を示すクロ−ンを単離した。
【００５５】
神経細胞の培養系においてＳＡＲＧ−１の発現および機能を調査するために、標準的な分子生物学的手法（Sanbrook et al, 1989）を用いて、ＳＡＲＧ−１477および増強緑色蛍光タンパク質の両方の内部のＩＲＥＳ配列を介してバイシストロニックに翻訳するＣＭＶプロモーターの制御下にあるｐＩＲＥＳＳＩＩ−ＥＧＦＰ真核生物発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にラットＳＡＲＧ−１コード配列（ｒＳＡＲＧ−１479）をクローニングした。ラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞株を、８％のウマ血清、８％のウシ胎仔血清、ならびに１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（全てＧｉｂｃｏＢＲＬ製）を含有する抗生物質−抗カビ物質の混合物を補充したＤＭＥＭで、３７℃で５％ＣＯ2を含有する完全な湿潤空気環境下で維持した。６穴プレートにおける半混合培養物を、無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）においてＤＮＡに対して６：１の比の取り込み増強カチオン性脂質（the uptake enhancing cationic lipid mix）の混合物ｐＦｘ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ−ＳＡＲＧ−１または空のベクターで１８時間トランスフェクションした。８００ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ）における選択ののち、トランスフェクションした安定なコロニーを個々のウェルから採取し、そして同様のＥＧＦＰ蛍光を有するクローンを独立したトランスフェクションから展開した。
【００５６】
ラットおよびヒトの成熟タンパク質の翻訳後修飾
アミノ酸配列から予想したラット、マウスおよびヒトのＳＡＲＧ−１タンパク質の分子量は、それぞれ１７１８６．５２、１７１９３．５２および１７４９２．７６である。ＳＡＲＧ−１に対するＩｇＹ抗体は、ウエスタンブロッティングにおいて、天然のＰＣ１２細胞において低レベルで発現した２８ｋＤの種を検出する。それらの細胞へのｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ−ＳＡＲＧ−１のトランスフェクションの際に、この種の発現レベルが増大する。ヒトＳＡＲＧ−１タンパク質の分子量を、ｐＭＨ−ＳＡＲＧ−１−ＨＡでトランスフェクションされたＭｅｌＪＵＳＯメラノーマ細胞由来の細胞抽出物のウエスタンブロッティングによって検出した。抗ＨＡモノクローナル抗体３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ）は、２８ｋＤで移動する単一の種を検出した（図１０）。
【００５７】
トランスフェクションされたＳＡＲＧ−１タンパク質の細胞レベル下の局在
ＳＡＲＧ−１でトランスフェクションしたＰＣ１２細胞の免疫組織化学染色により、ＳＡＲＧ−１遺伝子産物の限定的な細胞質の局在を証明した。抗ＨＡモノクローナル抗体３Ｆ１０による免疫組織化学分析もまた、小胞体のためのマーカーとして使用される結合タンパク質（ｂｉｐ）の発現とともに主に局在化する、ＳＡＲＧ−１タンパク質の限定的な細胞質の局在を証明した（図１１）。ＨＡ−ＳＡＲＧ−１のゴルジ特異的抗原コートタンパク質（ｂ−ｃｏｐ）との共通の局在は最小である。対照的に、ＳＡＲＧ−１発現は、リソソーム特異的タンパク質ＬＡＭＰ−２の発現と部分的に重複する。
【００５８】
アポトーシスにおけるＳＡＲＧ−１の役割、および神経細胞培養物の分化
プロテインキナーゼインヒビターであるスタウロスポリンによるＰＣ１２細胞の処理は、１００ｎＭの濃度で神経突起という結果（outgrowth）を誘導し（Hashimoto and Hagino, 1989）、そして１ｍＭ以上の濃度でアポトーシスを誘導する（Fu et al, 1999）。神経突起という結果を生じるベクター対照培養物（図１２）と比較して、ＳＡＲＧ−１の過剰発現ＰＣ１２細胞では、１００ｎＭのスタウロスポリン（Calbiochem）による処理において生存率が迅速に消失した。ＳＡＲＧ−１の過剰発現ＰＣ１２培養物における細胞死は、細胞減少、プログラム細胞死特有の形態の発生、およびアポトーシスプロセス特有のフローサイトメトリーによる細胞周期分析（図１３）におけるエタノール固定化細胞由来のＤＮＡの消失（Fraker et al, 1995）を伴う。スタウロスポリン類似物Ｋ２５２ａ（Ａｌｅｘｉｓ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼインヒビターＬＹ−２９４００２（Ａｌｅｘｉｓ）もしくはＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼインヒビターＰＤ９８０５９（Ａｌｅｘｉｓ）またはプロテインキナーゼＣインヒビターＢｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ｉ（Ａｌｅｘｉｓ）では同様の効果は見られない。ＳＡＲＧ−１の過剰発現もまた、神経成長因子により誘導されたＰＣ１２細胞の末端分化を促進する（図１４）。
【００５９】
ＳＡＲＧ−１結合タンパク質の単離
酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、市販のClontech製マッチメーカーシステム（Matchmaker system）により実行可能である。標準的な方法を用いてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いるＰＣＲによって、全長ｈＳＡＲＧ−１コード配列をｐＧＢＫＴ７シャトルベクター（Clontech）にクローニングすることによって、ベイトプラスミドを構築する（シャトルベクターｐＧＢＫＴ７：ｈＳＡＲＧ−１のコード領域を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いるＰＣＲ増幅によって、酵母ＡＤＨ１プロモーター（Ｐ）の制御下で、ｃ−ｍｙｃタグを含むＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）のアミノ酸１〜１４７に、Ｃ末端が融合するようにクローニングし、そしてＴＲＰ１栄養マーカーを用いて酵母において選択する）。ついで、この構築物を、ＭＡＴａ酵母株ＡＨ１０９（アデニン（Ａｄｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）について栄養要求性であり、合成脱落（ＳＤ）−Ｔｒｐ培地上での増殖によってｐＧＢＫＴ７で選択される）を使用し、リチウムアセテート形質転換した。ＭＡＴα  Ｙ１８７（Ａｄｅ-、Ｈｉｓ-、Ｌｅｕ-およびＴｒｐ-）酵母株において予め形質転換されたｐＡＣＴ２において一方向に構築したヒト脳のマッチメーカーライブラリー（Clontech）を購入し、そして少なくとも３×１０6クローンを、ｈＳＡＲＧ−１−１で形質転換されたＡＨ１０９と接合させた（シャトルベクターｐＡＣＴ２：ヒト脳ライブラリー挿入物は、酵母ＡＤＨ１プロモーター（Ｐ）の制御下で、ＧＡＬ４活性化ドメインのアミノ酸７６８〜８８１、ＳＶ４０Ｔ抗原核移行配列、およびＨＡエピトープタグに、Ｃ末端が融合するようにインフレームで一方向にクローニングされ、そしてＬＥＵ２栄養マーカーを用いて酵母において選択される）。接合体は、それぞれＬｅｕ-およびＴｒｐ-選択、ならびに、これと同時に、Ｘ−α−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含有する−Ｈｉｓ、−Ａｄｅプレート上でＨＩＳ３、ＡＤＥ２およびＭＥＬ１のレポーター遺伝子活性化によるタンパク質相互作用によって単離される。陽性コロニーを再ストリークし、さらにβ−ガラクトシダーゼによるｌａｃＺレポーターの活性化について試験した。陽性コロニーの挿入物をＰＣＲによって増幅し、制限消化によって繰り返し部分を同定し、そして陽性の相互作用物を、その挿入物のアダプター末端から短時間配列決定（short run sequencing）によって同定した。潜在的な相互作用物の同一性を、それぞれバイオテクノロジー情報に関する公衆センター（the national centre for biotechnology information）（www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/）および欧州バイオインフォマティクス研究所（European bioinformatics institute）（www. ebi. ac. uk/fasta33/）の重複のない発現配列タグデータベース（non-redundant and expressed sequence tag data bases）に対するＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴサーチによって確認し、ＧＡＬ４活性化ドメインとインフレームでクローニングされた特徴付けられたタンパク質を同定した。ついで、単一のｐＡＣＴ２プラスミドを、アンピシリン選択下でのＥ．Ｃｏｌｉの形質転換およびｐＧＢＫＴ７−ＳＡＲＧ−１と、−Ａｄｅ、−Ｈｉｓ、−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、Ｘ−α−ｇａｌプレート上での青色コロニー成長によって選択されるライブラリー挿入物を含むｐＡＣＴ２とでのＡＨ１０９の共形質転換によって再試験された陽性相互作用によって回収した。ベイトおよびライブラリーの遺伝子を、適当なｃ−ｍｙｃおよびＨＡエピトープタグ化真核生物発現ベクターにクローニングし、さらに相互作用物を、インビトロで翻訳されたか、または一時的に共トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞由来かのいずれかの、共免疫沈降タンパク質のウエスタンブロッティングによって確認した。後者はまた、全長のコード配列のクローニングおよび単離ののちの共焦点顕微鏡分析によって共局在化実験される。相互作用のパートナーのＳＡＲＧ−１との細胞共発現を、利用可能な抗体を用いて得られる一連の発生学的スライドの染色または同定配列のインサイチュハイブリダイゼーションのいずれかによって調査した。既知の結合パートナーの同定は、アンチセンスまたはＲＮＡｉ方法の開発により、標的発現を特異的に減少させることができる、または特異的機能的インヒビターの使用により、ＰＣ−１２アポトーシスおよび分化で見られた表現型の変化をさらに特徴付けることができる。結合パートナーの同定はまた、特異的に阻害もされ得るＳＡＲＧ−１発現によって影響される生化学的経路を同定する。同定された結合パートナーのノックアウトモデルは、ＳＡＲＧ−１欠損マウスと交配され得る。
【００６０】
ピットフォール分析（Pitfall analysis）
関連組織を、ＳＡＲＧ−１がどこで高度に発現し、かつ細胞株モデルにおける分化およびアポトーシスにおいて役割を果たすのか解析した。ヒト遺伝子バンクを分析することにより、既知ＲＮＡ配列の迅速な同定が可能である。ＳＡＲＧ−１配列は、転写の活性化を減少できる細胞質移行シグナルを含まない。ＳＡＲＧ−１のトランスフェクションは、ＰＣ−１２またはＭｅｌＪｕｓｏ細胞に対して直接的に害はないので、酵母において害とは考えられない。マッチメーカーシステムは、人工産物を排除するために種々のプロモーター構築物を有する多様なレポーター遺伝子を使用し、そして多くの結合パートナーを単離するために使用されている（Corset et al, 2000; Galiegue et al, 1999; Ono et al, 2000; White et al, 2000）。ベクター構築物の効果的な一時的共トランスフェクションが可能である真核細胞系（ＨＥＫ２９３）を、推定結合パートナーを迅速にスクリーニングするために使用した。
【００６１】
ベイトとしてヒトＳＡＲＧ−１タンパク質を用いてヒト脳ｃＤＮＡバンクをスクリーニングするための酵母ツーハイブリッド分析において、以下の結合パートナーを単離した。
１：ホモサピエンスのタンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、（ＬＣ２）ｍＲＮＡ：（ｇｉ：１２７３４９１６）
２：ホモサピエンスの微小管結合タンパク質１Ａ（ＭＡＰ１Ａ）、ｍＲＮＡ（ＸＭ＿０１２３８７）
３：ホモサピエンスのＡＴＰａｓｅ、Ｎａ＋／Ｋ＋  トランスポーティング  β１  ポリペプチド（ＡＴＰ１Ｂ１）、ｍＲＮＡ（ｇｉ：４５０２２７６）
４：ヒトのＳＷＩ／ＳＮＦ  複合体  ６０ｋＤａサブユニット（ＢＡＦ６０ｃ）ｍＲＮＡ（ｇｉ：１５４９２４６）
５：ホモサピエンスのα−アクチニン２に関するＡＣＴＮ２遺伝子、エキソン１６（ｇｉ：６４４８５５７）
６：ホモサピエンスのｒａｂ  ＧＤＰ解離インヒビター（ＧＤＩ１）、ｍＲＮＡ（ｇｉ：４５０３９７０）
７：ホモサピエンスのプロテオソーム（プロソーム（prosome）、マクロパイン（macropain））  ２６Ｓ  サブユニット、ＡＴＰａｓｅ３（ＰＳＭＣ３）、ｍＲＮＡ（ｇｉ：４５０６２１０）
これら結合タンパク質のうち、とくにＡＴＰａｓｅ  β１ポリペプチドが、ＳＡＲＧ−１との結合に関して、薬剤の標的としての使用にとくに興味深いものである。
【００６２】
条件付きＳＡＲＧ−１ノックアウトマウスの作製
ベクター構築物と染色体の標的配列との間の効果的な相同組換えは、通常、薬剤耐性カセットに近接する少なくとも２ｋｂの相同物を有する、７ｋｂの相同性の種特異的領域によって達成される（Johnson et al., 1995）。マウスのＳＡＲＧ−１遺伝子座を、ＰＣＲによって完全に増幅し（２４２０ｂｐ）、そして３つのイントロンが存在することを配列決定により証明した。
【００６３】
置換ベクターの構築について、ＳＡＲＧ−１遺伝子座に隣接するおよそ２．５ｋｂの付加的な非コード染色体配列情報を、１２９ＳｖＪマウスにおいて得る。この目的を達成するために、放射線標識化ＳＡＲＧ−１ｃＤＮＡ配列または完全なｍＳＡＲＧ−１遺伝子座のＰＣＲ産物を使用して、１２０ｋｂの平均挿入物サイズを有する１２９ＳｖＪマウスの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）または９〜２３ｋｂの挿入物サイズを有するＬａｍｄａ  Ｆｉｘ（登録商標）ＩＩファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において構築された１２９ＳｖＪマウスゲノムライブラリーを、標準的な方法でスクリーニングした。クローニングまたはファージの単離ののち、コード領域に隣接するゲノム配列（およそ２．５ｋｂ）を、ＳＡＲＧ−１コード配列内部に対するプライマーを用いる単離されたクローンの直接的な配列決定、ＳＡＲＧ−１配列を有するクローン化された制限断片の配列決定、または逆ＰＣＲのいずれかによって特徴付けた。得られた配列情報を使用して、ＰＣＲプライマーを設計し、１２９ＳｖＪ  ｍＳＡＲＧ−１ゲノム配列を、条件付／ハイポモルフｐＤＥＬＢＯＹ−３Ｘ標的化ベクターに挿入した（Rossi et al, 2001）。このベクターは、遺伝子欠失に潜在的に関連する問題を克服する性質を有する。人工的な表現型が、調節の崩壊、ならびに標的遺伝子座および隣接遺伝子のスプライシングを導き得る、ネオマイシンカセットの転写活性のために、ノックアウトマウスにおいて出現した（Pham et al, 1996; Olson et al, 1996）。ｐＤＥＬＢＯＹ−３Ｘベクター中のネオマイシンカセットは、Ｆｌｉｐレコンビナーゼ（ｆｒｔ）部位に隣接される。Ｆｌｉｐレコンビナーゼ（ｆｒｔ）部位は、インビトロおよびインビボでの選択カセットの効果的な切出しを可能にする。ｐＤＥＬＢＯＹ−３Ｘで安定にトランスフェクションされた細胞の、Ｆｌｐレコンビナーゼを発現するベクターによる一時的なトランスフェクションにより、ネオマイシンカセットが切出される。
【００６４】
最近開発されたツール（たとえば、Ｆｌｐレコンビナーゼ−ＧＦＰ融合タンパク質ベクター）は、たとえば、蛍光活性化細胞の選別によってインビトロでのＦｌｐ−触媒組換え事象を富化させる（Sabath et al., 2000）。逆に、マウスの、増強されたＦＬＰを偏在的に発現する１２９ＳｖＪ  ＦＬＰｅｒ欠損マウスとのかけ合わせにより、インビボにおいてネオマイシンカセットが切出される。さらに、ｐＤＥＬＢＯＹ−３Ｘベクター中のｌｏｘＰ部位間のＳＡＲＧ−１コード配列のクローニングは、インビトロでのｃｒｅレコンビナーゼ発現プラスミドでのトランスフェクションか、または組織特異的な領域（manor）においてｃｒｅレコンビナーゼ発現動物を用いて作製されたマウスのインビボでのかけ合わせのいずれかによって、ヌル対立遺伝子が出現する。この方法により、ヘテロ接合体の胚の致死性に関連する問題が排除され、そしてタンパク質機能の正確な組織特異的分析がなされる。ノックアウトマウスは標準的な手順で作製される（Papaioannou and Johnson, 2000; Gu et al, 1993）。手短に言うと、胚幹細胞（ＥＳ）を線状のｐＤＥＬＢＯＹ−３Ｘ−ＳＡＲＧ−１によって電気穿孔法によってトランスフェクションし、そして相同組換え事象をネオマイシン／ガンシクロビア処理によって選択し、そしてクローンをＰＣＲ、または標的化配列外部に対する放射線標識化プローブによるサザンブロッティングによってスクリーニングする。胚盤胞を、ＥＳクローンを注入された妊娠３．５日目のマウスから単離し、そして偽妊娠マウスに再移植した。キメラの毛色選択ののち、動物を正常１２９ＳｖＪマウスと交配させ、育種株（breeding line）を作製した。そののち、ホモ接合体を、相互交配によって得る。マウスの表現型を、標準的な手順によってスクリーニングする。胚および成体組織から調製された組織学的切片の分析、細胞死アッセイと組合わせた磁気共鳴画像分析（たとえば、ＴｄＴ−触媒ｄＵＴＰ−Ｘニック末端標識（TdT-mediated dUTP-X nick end labelling）（ＴＵＮＥＬ））は、それぞれ、発生中の分化およびアポトーシスにおけるＳＡＲＧ−１の役割の直接的な証拠を提供する。細胞分析としては、造血幹細胞の特徴付け（コロニー形成アッセイ、分化抗原のクラスターのためのフローサイトメトリー分析）および神経培養系におけるアポトーシス応答測定があげられる。
【００６５】
ピットフォール解析
前記したように、ｐＤＥＬＢＯＹ−３Ｘベクターは、ネオマイシンカセットからの転写によって産生された人工産物を排除し、そしてヘテロ接合体の胚の致死性という問題を克服する。スクリーニングはまた、ｃ−ｋｉｔ遺伝子に単一の変異を有する動物の利用可能性によって補助される。ＳＡＲＧ−１結合パートナーの同定について、ノックアウトマウスの存在が、ＳＡＲＧ−１欠損マウスとの交配を可能にし、これにより表現型がさらに明らかとなる。
【００６６】
細胞の局在性
Ｂａｌｂ／ｃマウスを交配させ、そして胚を７、１１日（タイラー段階１０〜１９）、１４および１７日目に単離し、そして液体窒素で素早く凍結させた。５μｍの矢状横断連続切片（transverse and sagittal consecutive sections）をクリオスタット上で作製し、必要になるまで凍結した。ＳＡＲＧ−１発現を、アセトン固定化ｍＳＡＲＧ−１を検出する抗ＳＡＲＧ−１  ＩｇＹを用いて、切片に対して標準的な免疫組織化学分析により分析する。発現パターンを、標準的な発生学のテキスト（Kaufman, 1992）およびマウスアトラスならびに遺伝子発現データベースプロジェクト（http://genex.hgu.mrc.ac.uk/）を参考にして同定する。１７日目の胚における発現パターンを、成体マウス組織で見られた発現パターンとさらに関連付ける。ＳＡＲＧ−１結合パートナーの同定ののち、共発現研究を、免疫組織化学（抗体が利用できる場合）か、またはインサイチュハイブリダイゼーションのいずれかによって行う。
【００６７】
エピトープタグ化ＳＡＲＧ−１の細胞レベル下の局在性および生化学的特徴
細胞質、小胞の細胞レベル下のＳＡＲＧ−１の局在性を、エピトープタグ化ＳＡＲＧ−１で安定的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３、ＭｅｌＪｕｓｏまたはＰＣ−１２細胞の二重染色によって決定する。ＨＡタグを、ラットモノクローナル抗ＨＡ  ｍＡｂで染色し、そしてビオチン標識化モノクローナル抗アイソタイプｍＡｂ、続いて、蛍光色素標識ストレプトアビジンで視覚化する（ＦＩＴＣ、Ｓ、フィコエリトリンまたはｃｙ５）。細胞小器官に局在化する抗原を、直接的に標識するか、または二次抗体を使用するかのいずれかで、Ｂｉｐ／ＧＲＰ７８（小胞体）、β−ｃｏｐ（ゴルジ複合体）、Ｌａｍｐ−１（リソソーム）およびＡｂ−２（ミトコンドリア）対する抗体で検出し、Ｚｅｉｓｓレーザースキャン顕微鏡で分析した。クローニングされかつ天然のＳＡＲＧ−１（予想質量１７Ｋｄ）は、ＳＤＳ−ＦＡＧＥにおいて２８Ｋｄで移動する。ＨＡタグ化ＳＡＲＧ−１のグリコシル化を、まず、抗ＨＡマトリクスに対する免疫沈降および過ヨウ素酸酸化によるグリコシル化残基の検出、ビオチンヒドラジドの取り込みおよびウエスタンブロット上でのストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼでの検出によって調べた。Ｎ−およびＯ−特異的な酵素的脱グリコシル化反応を、それぞれ、ＰＮＧａｓｅＦおよびＯ−グリコシダーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により実施し、そしてＳＡＲＧ−１の分子量をウエスタンブロッティングによって観察する。ＳＡＲＧ−１配列は、保存的なプロテインキナーゼＣおよびカゼインキナーゼＩＩの部位（これらは、アポトーシスレギュレーター（apoptotic regulators）をリン酸化することで知られる）を含む（Verma et al, 2001）。ＮＧＦ（ＰＫＣ活性化を導く）によるＴｒｋ活性化（Patapoutian et al., 2001）と、ＰＣ−１２におけるプロテインキナーゼインヒビタースタウロスポリン（リン酸化によりＳＡＲＧ−１機能を調節すると示唆される）による処理との間で、表現型に相違が見られた。可能性のあるＳＡＲＧ−１リン酸化を調べるために、免疫沈降されたＳＡＲＧ−１を、ウエスタンブロッティング分析においてホスホトレオニンおよびホスホセリンに対するポリクローナル抗体により調査し、そしてホスファターゼ処理したタンパク質と比較した。ついで、変異ＳＡＲＧ−１の真核生物系発現プラスミドを、潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を欠失するために、部位特異的変異によって作製し、これを使用してＰＣ−１２細胞をトランスフェクションし、プロテインキナーゼインヒビタースタウロスポリンの効果を観察する。
【００６８】
ＭＳ試料中の変異の分析
ＳＡＲＧ−１タンパク質のＣＮＳの灰白質および白質への免疫組織化学的局在性ならびにアポトーシス誘導におけるＳＡＲＧ−１の役割は、家族性ＭＳの症例におけるＳＡＲＧ−１の変異状態を分析するための候補遺伝子アプローチを促進した。２０人の血縁関係のない家族性多発性硬化症患者由来のＤＮＡを、ＳＡＲＧ−１遺伝子座のＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定によって調査し、そして健常な対照とＳＡＲＧ−１配列を比較した。全対照試料は、野生型ＳＡＲＧ−１ゲノム配列を示した。ＭＳ患者のうち、２０人中６人のみのＤＮＡ試料を、ＰＣＲによって増幅することができた。使用したプライマーセットは、全コード領域、イントロン２／エキソン３、ならびにエキソン１、２および３に特異的なプライマーの対に及んだ。対照ＧＡＰＤＨプライマーを、全試料について陽性であった。ＰＣＲ産物を産生した２０人中６人の試料において、増幅物をｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＡクローニングし、そして配列決定した。６人中４人の患者において、遺伝子の変更が見られた。ヌクレオチド６７位でのＴ→Ｃの点突然変異は、アミノ酸２３位でのフェニルアラニンのロイシンへの置換を生じる（図１６）。ヌクレオチド３５９位でのＣ→Ｔの点突然変異は、アミノ酸１２０位でのフェニルアラニンのセリンへの置換を生じる（図１７）。ヌクレオチド８９位でのＡ→Ｇの点突然変異は、アミノ酸３０位でのグリシンのグルタミン酸への置換を生じる（図１８）。アミノ酸１１６と１２１との間のコドンの欠失は、セリン残基の消失を生じる（図１９）。２０以上の対照ＤＮＡ試料の配列決定では、野生型の配列のみを示した。
【００６９】
多型および他の変異
３０以上の癌細胞株の配列分析において、ヒト配列におけるヌクレオチド２８０位（コード配列）の多型は、アミノ酸配列の９４位でのバリン（ｇ残基（示した））、メチオニン（ａ）またはロシン（ｔ）残基のいずれかとなる。ヒトメラノーマ細胞株において、ＳＡＲＧ−１における２つの変異が見出される（ヌクレオチド７４位でのＡ→Ｇの点突然変異は、アスパラギン酸のグリシンへの置換を生じ、そしてヌクレオチド２８９位でのＣ→Ｔの点突然変異は、アミノ酸９７位でのヒスチジンのチロシンへの置換を生じる）。したがって、そのようなＳＡＲＧ−１変異は、ヒトメラノーマの適切なマーカーである。
【００７０】
表
67  Ｔ → Ｃ    ＝    Ｆ → Ｌ    23
74  Ａ → Ｇ    ＝    Ｅ → Ｇ    25
89  Ａ → Ｇ    ＝    Ｅ → Ｇ    30
289 Ｃ → Ｔ    ＝    Ｈ → Ｙ    97
359 Ｃ → Ｔ    ＝    Ｓ → Ｆ    120
Δ                    Ｓ          116-121
【００７１】
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【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】アポトーシスの際のラットＳＡＲＧ−１遺伝子の誘導を証明する逆ノーザンブロット（reverse northern blot）を示す。プラスミドＤＮＡをナイロン膜上にスポットし、そしてアポトーシス幹細胞から単離された放射線標識化ｃＤＮＡとハイブリダイズした。ＳＡＲＧ−１の５’領域（矢印）を含むプラスミドは、アポトーシス細胞に存在するｃＤＮＡのみとハイブリダイズする。自己再生細胞由来の対照ｃＤＮＡは、背景レベルしか示さなかった（データは示さない）。
【図２】ラットの多様な組織のノーザンブロットを示す。３４２ｂｐのＳＡＲＧ−１フラグメントを放射線標識し、そして異なるラットの組織から単離されたＲＮＡとハイブリダイズした。およそ１．４Ｋｂの種（species）が、偏在した組織分布で観察され、そして脳および心臓において最も高い発現が観察された。
【図３】マウスの胚組織のノーザンブロットを示す。３４２ｂｐのＳＡＲＧ−１フラグメントを放射線標識し、そして胚発達の様々な段階から単離されたＲＮＡとハイブリダイズした。１．４Ｋｂの種の明らかな調節が、７日後に最高レベルで見られ、そして遺伝子産物の再発現は１７日目に見られた。
【図４−１】ラット、マウスおよびヒトのＳＡＲＧ−１の全長ｃＤＮＡ配列を示す。
【図４−２】ラット、マウスおよびヒトのＳＡＲＧ−１の全長ｃＤＮＡ配列を示す。
【図５−１】ラット、マウスおよびヒト間の、ＳＡＲＧ−１の全長ｃＤＮＡ配列の比較を示す。
【図５−２】ラット、マウスおよびヒト間の、ＳＡＲＧ−１の全長ｃＤＮＡ配列の比較を示す。
【図６】推定アミノ酸配列に対応して、ラット、マウスおよびヒトのＳＡＲＧ−１の全長コード配列を示す。
【図７】ラット、マウスおよびヒト間の、ＳＡＲＧ−１のＤＮＡコード配列の比較を示す。
【図８】ラット、マウスおよびヒト間の、ＳＡＲＧ−１のアミノ酸コード配列の比較を示す。
【図９】抗ＳＡＲＧ−１ペプチド抗体による、マウス組織の免疫組織化学分析を示す。茶色の反応産物はＳＡＲＧ−１発現を示す。Ａ：マウスの大脳皮質（倍率×４０）、Ｂ：小脳（×４０）、Ｃ：脊髄（×４０）、Ｄ：末梢神経（×６０）、Ｅ：心臓（×４０）およびＦ：肺組織（×４０）
【図１０】ｐＭＨ−ＳＡＲＧ−１−ＨＡでトランスフェクションされたＭｅｌＪＵＳＯメラノーマ細胞由来の細胞抽出物のウエスタンブロットにより検出されたＳＡＲＧ−１タンパク質を示す。抗ＨＡモノクローナル抗体３Ｆ１０は、２８ｋＤで移動する単一の種を検出した。
【図１１】抗−ＨＡモノクローナル抗体３Ｆ１０によって検出されるｐＭＨ−ＳＡＲＧ−１−ＨＡでトランスフェクションされたＭＥＬｊｕｓｏ細胞において、タンパク質の細胞質の局在性を証明する、ヒトＳＡＲＧ−１タンパク質の免疫組織化学分析を示す。
【図１２】１００ｎＭのスタウロスポリン処理された、空のベクターまたはｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ−ＳＡＲＧ−１でトランスフェクションされたＰＣ１２培養物の生存率を示す。
【図１３】２４時間、１００ｎＭのスタウロスポリン処理された、空のベクターまたはｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ−ＳＡＲＧ−１でトランスフェクションされたＰＣ１２細胞のフローサイトメトリー分析を示す。アポトーシスの誘導を特徴付けるサブＧ0／Ｇ1ピークが、ＳＡＲＧ−１過剰発現細胞においてのみ見られた。
【図１４】空のベクターでトランスフェクションされた細胞（◆）と比較した際の、促進されたＮＧＦ−仲介末端分化（NGF-mediated terminal differentiation）を受けるＳＡＲＧ−１タンパク質を過剰発現するＰＣ１２細胞（黒四角）を示す。
【図１５】家族性多発性硬化症における遺伝子変更を示す。ヌクレオチド６７位のＴ→Ｃの点突然変異は、アミノ酸２３位のロイシンのフェニルアラニンへの置換を生じる。
【図１６】家族性多発性硬化症における遺伝子変更を示す。ヌクレオチド３５９位のＣ→Ｔの点突然変異は、アミノ酸１２０位のフェニルアラニンのセリンへの置換を生じる。
【図１７】家族性多発性硬化症における遺伝子変更を示す。ヌクレオチド８９位のＡ→Ｇの点突然変異は、アミノ酸３０位のグリシンのグルタミン酸への置換を生じる。
【図１８】家族性多発性硬化症における遺伝子変更を示す。アミノ酸１１６と１２１との間のコドンの欠失は、セリン残基の消失を生じる。
【図１９−１】ＳＡＲＧ−１イントロン／エキソン構造を示す。
【図１９−２】ＳＡＲＧ−１イントロン／エキソン構造を示す。
【図２】
2005500038.tif 000002
【図３】
2005500038.tif 000003
【図４−１】
2005500038.tif 000004
【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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