(57)【要約】インフルエンザM2タンパク質と結合するヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体。上記抗体は、とりわけ、治療、診断、M2またはインフルエンザウイルスの精製および単離、ならびにサンプルまたは被験体中のM2またはインフルエンザウイルスの存在の同定に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体を含む、インフルエンザタンパク質M2と特異的に結合する抗体。
【請求項２】
M2細胞外ドメインのまたはM2細胞外ドメインのサブ配列の少なくとも一部分と結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
細胞外ドメインがアミノ酸配列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号１）を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
サブ配列がSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号１）中の４以上の連続アミノ酸を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
細胞外ドメインがアミノ酸配列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号１）のアミノ酸置換、挿入、欠失または付加を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
細胞外ドメインが：SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD、またはSLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD（それぞれ配列番号２〜８）から選択されるアミノ酸置換を有する配列を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
サブ配列がSLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD、またはSLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD（それぞれ配列番号２〜８）中の４以上の連続アミノ酸を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
抗体がIgG、IgA、IgM、IgE、およびIgDアイソタイプから選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
アイソタイプがIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から選択される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体の結合特異性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体と同じまたは実質的に同じ結合親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
親和性が対照抗体の約5〜100倍以内、または対照抗体の約5〜5000倍以内である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
細胞のウイルス感染、ウイルス増殖またはウイルス複製をin vitroまたはin vivoで抑制する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
細胞のインフルエンザ結合をin vitroまたはin vivoで抑制する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
ウイルス力価の増加を抑制し、ウイルス力価を低下し、ウイルス複製もしくは増殖を低下し、または被験体のウイルス感染に関連する１以上の症候もしくは合併症を低下する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
被験体がウイルスに曝されるかまたは感染してしまった後に、ウイルス力価の増加を抑制し、ウイルス力価を低下し、ウイルス複製または増殖を低下し、または被験体のウイルス感染に関連する１以上の症候または合併症を低下する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
症候または合併症が悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、洞うっ血、鼻感染症、洞感染症、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、耳の痛みおよび死から選択される、請求項１６または１７に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体の結合特異性または結合親和性を有する、請求項１６または１７に記載の抗体。
【請求項２０】
被験体のウイルス感染を抑制しかつ番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体と同じまたは実質的に同じ結合特異性もしくは結合親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
被験体のウイルス感染に対する感受性を低下する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体の結合特異性または同じもしくは実質的に同じ結合親和性を有する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＡ型ウイルスを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２４】
インフルエンザウイルスがA/PR/34、A/HK8/68、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2およびH5N3を含む、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
細胞に基づくELISAアッセイにより決定して、MDCK細胞のインフルエンザウイルス感染の抑制に対して3.0μg/mlより低いEC50を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２６】
インフルエンザウイルスがA/PR/8/34、A/HK8/68、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2およびH5N3を含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体の結合特異性または同じもしくは実質的に同じ結合親和性を有する、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２８】
細胞ベースのELISAアッセイにより決定される、MDCK細胞とのM2結合の抑制に対して3.0μg/mlより低いEC50を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２９】
番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体の結合特異性または同じもしくは実質的に同じ結合親和性を有する、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
２以上のインフルエンザウイルス株または単離体と特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３１】
異なる配列を有する２以上のM2タンパク質と特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３２】
M2タンパク質が細胞外ドメインを含む、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
M2タンパク質細胞外ドメインがSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD、またはSLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD（それぞれ配列番号１〜８）から選択される、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
請求項１の抗体のアミノ酸サブ配列。
【請求項３５】
サブ配列が請求項１の結合特異性または結合親和性を有する、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
サブ配列が重および軽鎖可変域（VHおよびVL）、Fab、Fab’、（Fab’）2、Fv、Fd、scFv、およびsdFvから選択される、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３７】
抗体多量体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３８】
さらに１以上の異種ドメインを含む、請求項１に記載の抗体またはそのサブ配列。
【請求項３９】
異種ドメインがアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
異種ドメインが結合タンパク質、酵素活性、薬物、抗ウイルス薬、毒素、免疫モジュレーター、検出可能部分またはタグを含む、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４１】
請求項１に記載の二特異的または二機能性抗体。
【請求項４２】
請求項１に記載の抗体を発現する宿主細胞。
【請求項４３】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体の結合特異性または同じもしくは実質的に同じ結合親和性を有する、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４５】
細菌、酵母、植物または動物である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４６】
請求項１に記載の抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物または植物。
【請求項４７】
番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体をコードする核酸。
【請求項４８】
さらにベクターを含む、請求項４７に記載の核酸。
【請求項４９】
さらに抗ウイルス薬を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５０】
さらにインフルエンザウイルス感染に関連する１以上の症候または合併症を抑制する作用薬を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５１】
症候または合併症が悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、洞うっ血、鼻感染症、洞感染症、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、耳の痛みおよび死から選択される、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
請求項１の抗体ならびに製薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５３】
請求項１に記載の抗体ならびに１以上のインフルエンザウイルス株もしくは単離体による被験体の感染を治療し、抑制し、防止し、もしくは感受性を低下するための指示書を含むキット。
【請求項５４】
さらに、粘膜組織に送達するための製造器具を含む、請求項５３のキット。
【請求項５５】
製造器具が被験体への吸入または鼻投与のために好適な吸入器、エーロゾル、スプレーまたは押出しボトルを含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５６】
粘膜組織が鼻通路、洞、口、咽頭、喉頭、または肺を含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５７】
さらに抗ウイルス薬を含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５８】
さらに１以上のインフルエンザウイルス感染に関連する症候または合併症を抑制する作用薬を含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５９】
インフルエンザウイルス被験体の感染を治療する方法であって、被験体のインフルエンザウイルス感染を治療するために有効なインフルエンザM2と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体の量を被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項６０】
被験体の感染前に、感染と実質的に同時に、または感染後に抗体を投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
被験体の感染と実質的に同時に、または感染後に抗体を投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
投与が治療上の利益を提供する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
治療上の利益が、ウイルス力価の増加を抑制し、ウイルス力価を低下し、ウイルス複製の増加を抑制し、ウイルス複製を低下し、ウイルス増殖の増加を抑制するか、もしくはウイルス増殖を低下し、または被験体のウイルス感染に関連する１以上の症候もしくは合併症を低下することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
症候または合併症が悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、洞うっ血、鼻感染症、洞感染症、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、耳の痛みおよび死から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
治療上の利益がインフルエンザウイルス感染からの被験体の回復を促進することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体の結合特異性または同じもしくは実質的に同じ結合親和性を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
抗体が細胞ベースのELISAアッセイにより決定される、MDCK細胞のインフルエンザウイルス感染の抑制に対して3.0μg/mlより低いEC50を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
インフルエンザウイルスがA/PR/8/34、A/HK8/68、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2およびH5N3を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
１以上のインフルエンザウイルス株または単離体による被験体の感染を抑制する方法であって、１以上のインフルエンザウイルス株または単離体による被験体の感染を抑制するために有効な量のインフルエンザM2と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項７１】
被験体のウイルス感染前に、感染と実質的に同時に、または感染後に抗体を投与する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
被験体のウイルス感染と実質的に同時に、または感染後に抗体を投与する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
投与が治療上の利益を提供する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
治療上の利益がウイルス感染から被験体を保護するかまたは被験体のウイルス感染からの感受性を低下することを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体の結合特異性または同じもしくは実質的に同じ結合親和性を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
抗体が細胞ベースのELISAアッセイにより決定される、MDCK細胞のインフルエンザウイルス感染の抑制に対して3.0μg/mlより低いEC50を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
インフルエンザウイルスがA/PR/8/34、A/HK8/68、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2およびH5N3を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
抗体が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示されるハイブリドーマまたはCHO細胞系統により産生される抗体の重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８０】
抗体が配列番号９および配列番号１０に示す核酸配列、または配列番号９および配列番号10に関する核酸配列縮重物によりコードされた重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８１】
抗体が配列番号１１および配列番号１２に示す重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８２】
抗体がヒトIgG1サブタイプを含む、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願優先権に関する情報
本出願は、2002年3月13日に出願した米国仮特許出願第60/364,997号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、インフルエンザウイルスM2タンパク質と特異的に結合する、抗体、さらに特定すればヒト、ヒト化およびキメラ抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
インフルエンザＡまたはＢ型ウイルスは、全ての国においてほとんど毎冬、流行性疾患を引起し、開発途上国における死因の先頭に立っている。米国において、これらの冬型インフルエンザ流行により人口の10％〜20％が発病し、毎年平均20,000人の死者および114,000人の入院患者に関連がある。インフルエンザ抑制に対する現在の対策は、毎年実施される不活化全ウイルスまたはサブユニットワクチンを用いたワクチン接種である。インフルエンザウイルスの主な中和抗原は赤血球凝集素（HA）である（Fraceら, Vaccine 17:2237 (1999)）。しかし、多発しかつ予測し得ないHAの抗原性変異により、ワクチンはしばしば多様なウイルス株に対する最適な保護免疫を提供することができない。さらに、高齢患者、癌患者ならびにその他の実施中の治療および／または疾患により免疫不全である患者などの免疫無防備状態の個人に対して、ワクチン接種は有効な保護を提供することができない。
【０００４】
赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）は、抗体産生を刺激する２種の主要抗原である。これら２種のタンパク質は抗原性変異が多発するので、治療薬開発の最適な標的ではない。インフルエンザＡ型ウイルスの第３の膜貫通タンパク質であるマトリックスタンパク質2（M2）はウイルス感染細胞により豊富に発現され、ウイルス複製にとって必須な膜貫通プロトンフラックスを与えると考えられる（Ciamporら, Virus Research 22:247 (1992)；GrambasおよびHay, Virology 190:11 (1992)；Sugrueら, EMBO Journal 9:3469 (1990)）。HAおよびNAと異なり、M2は保存されるのでインフルエンザ患者に対する、抗体に基づく受動免疫療法を開発するための標的となり得る（Itoら, J. Virology 65:5491 (1991)；Slepushkinら, Vaccine 13:1399 (1995)；Neirynckら, Nature Med. 5:1157 (1999)）。
【０００５】
バキュロウイルスが発現するM2タンパク質を用いたマウスのワクチン接種は、マウス肺からウイルスのクリアランスを促進しかつ同種および異種両方のインフルエンザＡ型ウイルスによる致死チャレンジからマウスを保護することが報じられている（Slepushkinら, Vaccine 13:1399 (1995)）。さらに最近の報告は、M2の細胞外ドメインを肝炎Ｂ型ウイルスコアタンパク質（HBc）と融合してM2HBcをコードする融合遺伝子を作製し、これをワクチンとして用いると、マウスの致死的ウイルスチャレンジに対して90〜100％保護を与えうることを示している（Neirynckら, Nature Med. 5:1157 (1999)）。この保護は、M2HBcワクチン接種したマウス由来の血清を用いて非ワクチン接種マウスに受動的に移すことができる。Zebedeeらは、プラークアッセイにおいて、抗M2マウスモノクローナル抗体がインフルエンザウイルスの増殖に中度の影響を与えることを実証した。A/Udorn/72ウイルスについては、抗体がインキュベーション中に存在すると、プラークサイズは（プラーク数ではないが）小さくなった。A/WSN/33株については、プラークサイズまたはプラーク数に何の影響も観察されず、この特定のモノクローナル抗体は様々なインフルエンザ株に広く影響を与えるものでないことを示した（ZebedeeおよびLamb, J. Virol 62:2762 (1988)）。この抗体をウイルスチャレンジの１日前にマウスに受動的に移すと、肺における感染後３〜４日後のウイルス複製のレベルは、無関係の抗体を受けた動物のそれよりほぼ100倍低くなった（Treanorら, J. Virol 64:1375）。しかし、この抗体をウイルス感染の１日前にSCIDマウスに投与すると、肺ウイルス力価は対照マウスの力価と差がなかった（Palladinoら, J. Virol.  69:2075 (1995)）。Mozdzanowskaら（Virology 254:138 (1999)）は同じマウス抗M2モノクローナル抗体、14C2を用いて、ウイルスプラークアッセイにおいて、抗M2モノクローナル抗体がウイルス力価を低下しうることを実証することはできたが、Zebeedeeらの結果と一致して、インフルエンザ株A/PR/8/34のウイルス力価を低下することはできず、14C2はインフルエンザに対して広く保護を与えるものでないことを示した。
【発明の開示】
【０００６】
概要
本明細書に開示した完全ヒト、ヒト化およびキメラ（例えば、ヒト／マウスキメラ）抗M2モノクローナル抗体はA/PR/8/34およびA/HK/8/68株を認識することができ、インフルエンザＡ型に対して広い反応性を示す。さらに、動物がインフルエンザＡ型に感染した後に、本明細書に開示したヒト、ヒト化およびキメラ抗M2モノクローナル抗体を投与すると、本抗体はマウスをA/PR/8/34インフルエンザＡ型株の致死チャレンジから保護することができる。
【０００７】
従って、本発明は、インフルエンザウイルスタンパク質M2と結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を含む組成物、ヒト、ヒト化およびキメラ抗体を含有する医薬組成物および上記抗体を含有するキットを提供する。本発明のヒト、ヒト化およびキメラ抗体は、感染前（予防）または感染後（治療）を含めて、インフルエンザに罹ったもしくはインフルエンザに罹るリスクのある被験体のインフルエンザを治療するために；ウイルス力価の測定を含むインフルエンザ診断のために；完全ウイルスまたはM2タンパク質を精製または単離することを含む精製／単離のために；ならびにその他のアッセイシステムのために有用である。従って、本発明はまた、治療（例えば、インフルエンザ感染の治療）、診断（サンプル中のインフルエンザまたはM2タンパク質の量を検出する）および精製（インフルエンザウイルスまたはM2タンパク質を精製または単離する）において抗体を利用する方法も提供する。
【０００８】
一実施形態においては、少なくともM2細胞外ドメインの一部分と特異的に結合するヒト抗体が提供される。ある特定の態様においては、細胞外ドメインはアミノ酸配列：SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号１）、そのサブ配列またはそのアミノ酸変異体（例えば、アミノ酸置換、挿入、欠失または付加）を含む。他の態様においては、アミノ酸置換は、SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD、またはSLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD（それぞれ、配列番号２〜８）から選択される。
【０００９】
本発明の抗体はポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにその混合物を含み、IgG、IgA、IgM、IgE、IgDのいずれか、およびそのいずれかのアイソタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4を含みうる。抗体は、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖（例えば、重および軽鎖可変域）をもつ無傷のヒト、ヒト化およびキメラ免疫グロブリン分子、ならびに親の無傷のヒト、ヒト化およびキメラ抗体の機能（M2結合特異性、M2結合親和性または抗インフルエンザウイルス活性）の少なくとも一部分を保持するM2と特異的に結合する重および軽鎖のサブ配列を含む。サブ配列の例は、無傷のヒトまたはヒト化免疫グロブリンのFab、Fab’、(Fab’)2、Fv、Fd、一本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド連結したFv（sdFv）およびVLまたはVH、または他のM2タンパク質結合フラグメントを含む。従って本発明の抗体は、番号2074（ATCC PTA-4025）、161（ATCC PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）として示されたハイブリドーマまたはCHO細胞系により産生される抗体の重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む。
【００１０】
様々な態様においては、抗体は番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、161（ATCC寄託番号PTA-4026；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）として示された細胞系統（例えば、ハイブリドーマまたはCHO細胞系統）により産生される。
【００１１】
抗体はさらに、本発明のヒト、ヒト化およびキメラ抗体の結合特異性および結合親和性を有するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を含む。一実施形態においては、抗体は番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、161（ATCC寄託番号PTA-4026；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC Deposit No.；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）として示された細胞系統（例えば、ハイブリドーマまたはCHO細胞系統）により産生された抗体の結合特異性を有する。他の実施形態においては、抗体は番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、161(ATCC寄託番号PTA-4026；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC Deposit No.；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）として示された細胞系統（例えば、ハイブリドーマまたはCHO細胞系統）により産生された抗体の結合親和性を有する。
【００１２】
本発明の抗体は、さらに、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、161(ATCC寄託番号PTA-4026；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC Deposit No.；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）として示された細胞系統（例えば、ハイブリドーマまたはCHO細胞系統）により産生された例示の抗体のように、ウイルス感染をin vitroまたはin vivoで抑制するかまたは細胞のM2結合を抑制する能力を有するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を含む。一実施形態においては、抗体はMDCK細胞のインフルエンザウイルス感染の抑制に対して、細胞に基づくELISAアッセイにより測定して、3.0μg/mlより低いEC50を有する。様々な態様においては、そのインフルエンザウイルスはA/PR/8/34またはA/HK8/68などのインフルエンザＡ型ウイルスである。
【００１３】
本発明の抗体はさらに、場合によっては異なるインフルエンザウイルス（例えば、株または単離体）上に存在してもよい異なるアミノ酸配列を有する２以上のM2タンパク質と結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を含む。一実施形態においては、抗体はM2細胞外ドメイン配列の少なくとも１部分と結合する。特定の態様においては、M2細胞外ドメイン配列は、アミノ酸配列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号１）、そのサブ配列またはSLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD（配列番号２）などのそのアミノ酸変異体（例えば、アミノ酸置換、挿入、欠失または付加）を含む。他の特定の態様においては、M2細胞外ドメイン配列は、SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD、およびSLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD（それぞれ、配列番号２〜８）から選択される。
【００１４】
本発明の抗体は、改変されていて、例えばオリゴマー化ドメイン（例えば、ロイシンジッパーモチーフ）の結合を介してまたは架橋剤（例えば、化学架橋リンカー）を経由してオリゴマーを形成する抗体を含む。従って、本発明の抗体は、多量体型、例えば、２量体、３量体、４量体または高次のヒト、ヒト化およびキメラ抗体オリゴマーを含む。かかる抗体多量体は、典型的には単量体抗体と比較してM2に対するアビディティの増加を示す。
【００１５】
本発明の抗体はさらに、M2と結合するヒトまたはヒト化抗体に、別の機能または活性を与える１以上の異種ドメインを含む。抗体がアミノ酸異種ドメインを含むというのは、１以上のアミノ酸が抗体と異なる（すなわち、それらは自然の抗体の一部分でない）ことを意味する。一実施形態においては、異種ドメインは、結合タンパク質（例えば、レセプターまたはリガンド結合）、酵素活性、薬物、抗ウイルス薬、毒素、免疫調節薬、検出可能部分またはタグを含む。一態様においては、結合タンパク質は、インフルエンザタンパク質M2と特異的に結合するヒト、ヒト化またはキメラ抗体と異なる結合特異性または親和性を有する抗体を含む。従って、本発明は、多特異的および多機能性抗体（例えば、それぞれ２以上の抗原と結合するまたは２以上の機能もしくは活性を有する抗体などの二特異的および二機能性抗体）をさらに提供する。
【００１６】
本発明の抗体は、場合によっては１以上のインフルエンザ株または単離体上に存在するインフルエンザタンパク質M2と結合することができる。従って抗体は、M2またはインフルエンザウイルス感染性、複製、増殖、力価、インフルエンザに関連する１以上の症候もしくは合併症の重篤度もしくは期間、またはインフルエンザウイルス感染の感受性、すなわち、抗インフルエンザウイルス活性に１以上の影響を与える。一実施形態においては、ヒト、ヒト化およびキメラ抗体は、in vitroまたはin vivoで１以上のインフルエンザ株または単離体による細胞の感染を抑制する。他の実施形態においては、ヒト、ヒト化およびキメラ抗体は、１以上のインフルエンザ株または単離体のインフルエンザウイルス力価またはインフルエンザウイルスタンパク質の量を低下する。さらに他の実施形態においては、ヒト、ヒト化およびキメラ抗体は、１以上のインフルエンザ株または単離体のインフルエンザウイルス力価またはインフルエンザウイルスタンパク質の量の増加を抑制するかまたは防止する。なおさらに他の実施形態においては、ヒト、ヒト化およびキメラ抗体は、１以上のインフルエンザ株または単離体による感染から被験体を保護するかまたは感染に対する被験体の感受性を低下する。さらなる実施形態においては、ヒト、ヒト化およびキメラ抗体は１以上のインフルエンザ株または単離体による感染に関連する１以上の症候または合併症（例えば、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、洞うっ血、鼻感染症、洞感染症、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、または耳の痛み）を軽減する。様々な態様においては、ヒト、ヒト化およびキメラ抗体を全身に（例えば、静脈注射、皮下注射、静脈輸液、筋内注射）、または局所的に被験体の粘膜組織（例えば、鼻通路、洞、咽頭、喉頭、食道、耳または耳管）または肺に投与する。様々な態様においては、インフルエンザ株は、A/PR/8/34もしくはA/HK/8/68から、またはH1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2およびH5N3から選択した他の株から選択される。
【００１７】
本発明のヒト、ヒト化およびキメラ抗体を発現する宿主細胞も提供される。細胞は、限定されるものでないが、細菌、酵母、植物、動物（例えば、ハイブリドーマ細胞系統およびCHO細胞系統などの哺乳類動物細胞）ならびに本発明のヒト、ヒト化およびキメラ抗体を発現する非ヒト動物および植物などの全生物を含む。
【００１８】
そのサブ配列および変異体を含む本発明の抗体をコードする核酸がさらに提供される。核酸は、核酸のクローニングもしくは他の遺伝子操作のためのまたは溶液、細胞、もしくはいずれかの生物において発現するためのベクターを含む。
【００１９】
本発明の抗体を含む組合わせ組成物も提供される。一実施形態においては、組成物はインフルエンザM2タンパク質と結合するヒト、ヒト化またはキメラ抗体および抗ウイルス薬を含む。他の実施形態においては、組成物はインフルエンザM2タンパク質と結合するヒト、ヒト化またはキメラ抗体および１以上のインフルエンザ感染に関連する症候または合併症（例えば、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、洞感染または耳感染）を抑制する作用薬を含む。
【００２０】
本発明の抗体および製薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。一実施形態においては、担体は被験体の粘膜組織（例えば、鼻通路、洞、咽頭、喉頭、食道）または肺に投与するのに好適である。
【００２１】
容器内に１以上の本発明の抗体を含むキットも提供される。一実施形態においては、キットは、１以上のインフルエンザ株または単離体による被験体のインフルエンザウイルス感染に関連する１以上の症候または合併症を、治療する（予防または治療）、抑制する、防止する、感受性を低下する、または軽減するための指示書を含む。他の実施形態においては、容器は被験体への吸入または鼻投与に好適であるエーロゾル、スプレーまたは押出しボトルを含む。さらに他の実施形態においては、キットまたは容器は、抗ウイルス薬（例えば、抗体または薬物）または１以上のインフルエンザ感染に関連する症候または合併症作用薬を抑制する作用薬を含む。
【００２２】
被験体のインフルエンザ感染を治療する方法が提供される。一実施形態においては、方法は、被験体に、被験体のインフルエンザ感染を治療するために有効な量のインフルエンザM2と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を投与することを含む。一態様においては、抗体を、被験体の感染と実質的に同時にまたはその後に投与する、すなわち治療処置をする。他の態様においては、抗体は治療上の利益を提供する。様々な態様においては、治療上の利益は、インフルエンザ感染の１以上の症候または合併症、ウイルス力価、ウイルス複製または１以上のインフルエンザ株のウイルスタンパク質の量を軽減するかまたは低下することを含む。軽減または低下することができるインフルエンザ感染の症状または合併症は、例えば、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、洞うっ血、鼻感染症、洞感染症、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、または耳の痛みを含む。さらに他の態様においては、治療上の利益は被験体のインフルエンザ感染からの回復を促進することを含む。
【００２３】
１以上のインフルエンザ株または単離体による被験体の感染を抑制する方法も提供される。一実施形態においては、方法は、１以上のインフルエンザ株または単離体によるインフルエンザ感染に対する被験体の感染を抑制するかまたは被験体の感受性を低下するために有効な量のインフルエンザM2と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を被験体に投与することを含む。様々な態様においては、抗体を被験体の感染前に（予防）、感染と実質的に同時に、または感染後に投与する。他の態様においては、抗体は治療上の利益を提供する。様々な態様においては、治療上の利益は、インフルエンザ感染の１以上の症候または合併症（例えば、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、洞うっ血、鼻感染症、洞感染症、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、または耳の痛み）、１以上のインフルエンザ株のウイルス力価またはウイルスタンパク質もしくは単離体の量、または１以上のインフルエンザ株または単離体による感染に対する被験体の感受性を軽減するかまたは低下することを含む。
【００２４】
被験体のインフルエンザウイルス力価、ウイルス複製、ウイルス増殖またはインフルエンザウイルスタンパク質の量の増加を防止する方法がさらに提供される。一実施形態においては、方法は、被験体におけるインフルエンザウイルス力価、ウイルス複製または１以上のインフルエンザ株または単離体のインフルエンザウイルスタンパク質の量の増加を防止するために有効な量のインフルエンザM2と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を被験体に投与することを含む。
【００２５】
被験体を、１以上のインフルエンザ株または単離体による感染から保護するまたは感染に対する被験体の感受性を低下する方法がさらに提供される。一実施形態においては、方法は、１以上のインフルエンザ株または単離体による感染から被験体を保護するために有効な、または感染に対する被験体の感受性を低下するために有効な量のインフルエンザM2と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を被験体に投与することを含む。一態様においては、保護は、１以上のインフルエンザ感染に関連する症候または合併症（例えば、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、洞うっ血、鼻感染症、洞感染症、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、または耳の痛み）を軽減または低下することを含む。
【００２６】
本発明の方法は、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、161(ATCC寄託番号PTA-4026；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC Deposit No.；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）およびL17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）として示された細胞系統（例えば、ハイブリドーマまたはCHO細胞系統）により産生された抗体の結合特異性または結合親和性を有する抗体を用いて実施することができる。抗体は、被験体に投与する前に製薬上許容される担体または賦形剤に含ませてもよい。
【００２７】
治療、診断および精製／単離を含む本発明の方法は、いずれのインフルエンザ株／単離体または株/単離体の組合わせにも応用することができる。様々な実施形態においては、インフルエンザ株はA/PR/8/34もしくはA/HK/8/68、またはH1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2およびH5N3から選択した他の株から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明は少なくとも部分的にヒト、ヒト化およびキメラ抗M2モノクローナル抗体に基づくものである。本発明の抗体のいくつかは、多様なインフルエンザＡ型ウイルス株に基づく様々なM2細胞外ドメイン配列に対して広い反応性を有する。本発明のヒト抗M2モノクローナル抗体の受動転移（passive transfer）は、予防（ウイルス感染前）および治療（ウイルス感染後）マウスインフルエンザモデルの両方において、インフルエンザA/PR/8/34の致死用量チャレンジから動物を保護した。従って本発明の抗体は、広範囲のインフルエンザ株または単離体を処置するのに有用である。加えて、本発明の抗体はヒト抗体であるので、おそらく反復投与により過敏症を誘発することは少なく、おそらく長期にわたり被験体（例えばヒト）の体内に残留すると思われる。
【００２９】
従って、本発明によれば、インフルエンザM2タンパク質と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体が提供される。一実施形態においては、インフルエンザタンパク質M2細胞外ドメインと特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体が提供される。特定の態様においては、細胞外ドメインはアミノ酸配列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号１）、その一部分またはSLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD（配列番号２）などのそのアミノ酸変異体（例えば、アミノ酸置換、挿入、欠失または付加）を含むものである。特定の態様においては、アミノ酸置換を有する細胞外ドメインは、SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD、およびSLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD（それぞれ、配列番号２〜８）から選択される。
【００３０】
用語「抗体」は、重および軽鎖可変ドメイン、それぞれVHおよびVLを経由して他の分子（抗原）と結合するタンパク質を意味する。「抗体」は、IgM、IgG、IgA、IgE、IgDなどの免疫グロブリン分子、およびそのいずれかのサブクラスを意味する。用語「抗体」はまた、特に断らなければ、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、Fd、scFvおよびsdFvなどの免疫グロブリン分子の機能性フラグメントも意味する。
【００３１】
用語「M2抗体」または「抗M2抗体」は、インフルエンザM2タンパク質と特異的に結合する抗体を意味する。特異的結合は、M2タンパク質に存在するエピトープに対して選択性のある結合である。すなわち、M2でないタンパク質との結合がM2の検出を有意に妨害することはない。選択的結合は、当技術分野で公知のアッセイを用いて非選択的結合から識別することができる。
【００３２】
本発明の抗体の例は、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）として示される。重鎖可変配列および軽鎖可変配列の例は、それぞれ配列番号11および配列番号12に記述されたアミノ酸配列である。
【００３３】
本明細書に使用される用語「モノクローナル」は、抗体を意味して使われる場合、いずれかの真核生物、原核生物、またはファージクローンも含む単一クローンに基づく、から取得された、または、から誘導された抗体を意味する。従って、「モノクローナル」抗体は、本明細書においては構造的に定義されるものであり、それを産生する方法によるのではない。本明細書に使用されるハイブリドーマまたは他の細胞系統に付与された特定の名称、数字または他の記号、例えば番号2074、161、N547、L66およびC40G1はまた、抗体の名称を意味するためにも使用される。
【００３４】
用語「ヒト（human）」は、抗体を意味して使用される場合、抗体のアミノ酸配列が全てヒトであることを意味する。従って「ヒトM2抗体」または「ヒト抗M2抗体」は、M2と特異的に結合するヒト免疫グロブリンアミノ酸配列、すなわちヒト重および軽鎖可変および定常域を有する抗体を意味する。すなわち、全ての抗体アミノ酸はヒトであるかまたはヒト抗体中に存在する。従って、例えば、非ヒトである抗体は、非ヒトアミノ酸残基をヒト抗体に存在するアミノ酸残基と置き換えることにより全てヒト抗体にすることができる。ヒト抗体、CDR域マップおよびヒト抗体コンセンサス残基中に存在するアミノ酸残基は当技術分野で公知である（例えば、Kabat, 「免疫学的に重要なタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」, 第４版, US Department of Health and Human Services. Public Health Service (1987)；ならびにChothiaおよびLesk J. Mol. Biol. 186:651 (1987)を参照）。22の既知ヒトVHIII配列の調査に基づくヒトVHサブグループIIIのコンセンサス配列、および30の既知ヒトκI配列の調査に基づくヒトVLκ鎖サブグループIのコンセンサス配列は、Padlan, Mol. Immunol. 31:169 (1994)；およびPadlan, Mol. Immunol. 28:489 (1991)に記載されている。
【００３５】
用語「ヒト化」は、抗体を意味して使用される場合、抗体のアミノ酸配列が、アクセプターヒト免疫グロブリン分子中に所望抗原（例えば、M2）と特異的に結合する１以上の相補性決定領域（CDRs）の非ヒトアミノ酸残基（例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギなど）、およびCDRにフランキングするアミノ酸残基であるFvフレームワーク領域（FR）中に１以上のヒトアミノ酸残基を有することを意味する。免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域残基は、対応する非ヒト残基と置換えてもよい。従って、ヒトフレームワーク領域の残基を非ヒトCDRドナー抗体由来の対応する残基により置換えて、例えば、抗原親和性または特異性を改変する、一般的には改善することができる。さらに、ヒト化抗体は、ヒト抗体にもドナーCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。例えば、ヒト抗体またはドナー非ヒト抗体に見出されない特定の位置におけるフレームワーク置換がその位置におけるヒト抗体の結合親和性または特異性を改善することが予測されうる。分子モデルに基づく抗体フレームワークおよびCDR置換は当技術分野では周知であり、例えば、CDRとフレームワーク残基の相互作用のモデル化により抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定し、かつ配列比較により特定位置における異常なフレームワーク残基を同定する（例えば、米国特許第5,585,089号；およびRiechmannら, Nature 332:323 (1988）を参照)。当技術分野で「霊長類化」と呼ばれる抗体は、アクセプターヒト免疫グロブリン分子およびフレームワーク領域アミノ酸残基がいずれかのヒト残基に加えていずれかの霊長類残基であってもよいことを除くと、本明細書に使用される「ヒト化」の意味の範囲内にある。
【００３６】
本明細書に使用される用語「キメラ」およびその文法的変化は、抗体の意味で使用されるとき、その抗体のアミノ酸配列が２以上の異なる種から誘導されたか、取得もしくは単離されたか、またはそれらに基づく１以上の部分を含有することを意味する。すなわち、例えば、抗体のある部分はヒト（例えば、定常域）であってもよくそして抗体の他の部分は非ヒト（例えば、マウスの可変域）であってもよい。従って、キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる種起源からなる分子である。ヒト化抗体と異なり、キメラ抗体は抗体のいずれの領域に異なる種の配列を有してもよい。キメラ抗体の例は、マウスλ軽鎖およびヒトγ重鎖を有する抗体番号2074である。
【００３７】
本明細書に使用される用語「M2」、「M2タンパク質」、「M2配列」および「M2ドメイン」は、いずれかの天然のもしくは人工的に作られたインフルエンザウイルス株または単離体から単離されたか、それらに基づくか、またはそれらの中に存在するM2タンパク質配列（例えば、細胞外ドメインなどのサブ配列）の全てまたは一部分を意味する。従って、用語M2などは、ウイルスライフサイクル中の突然変異により産生したまたは選択圧力に応答して産生した（例えば、薬物治療、宿主細胞向性（tropism）または感染性の拡大など）天然のM2配列変異体、ならびに組換えまたは合成的に作製したM2配列を含む。
【００３８】
本発明のM2抗体は、以下に詳しく記載するように、κまたはλ軽鎖配列、または天然抗体のように全長、それらの混合物（すなわち、κとλ鎖配列の融合体）、およびそれらのサブ配列を有する抗体を含む。天然の抗体分子は２つのκと２つのλ軽鎖を含有する。κとλ軽鎖の間の主な相違は定常域の配列にある。
【００３９】
本発明のM2抗体は、本明細書に例示したM2抗体の結合特異性を有する、例えば番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）に示された抗体の結合特異性を有する抗体を含む。一態様においては、M2抗体は番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）のいずれかに示されたその重（H）もしくは軽（L）鎖配列、またはサブ配列を有する抗体であって、抗体の重もしくは軽鎖配列、またはサブ配列が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）の結合特異性を有することを条件とする上記抗体である。
【００４０】
用語「結合特異性」は、抗体の意味で使用されるとき、抗体は対照抗体が特異的に結合するのと同じ抗原性エピトープの全てまたは一部分と特異的に結合することを意味する。従って、番号2074で示された抗体の結合特異性を有するM2抗体は、番号2074で示されたM2抗体が特異的に結合するのと同じエピトープの全てまたは一部分と特異的に結合し；161で示された抗体の結合特異性を有するM2抗体は、161で示されたM2抗体が特異的に結合するのと同じエピトープの全てまたは一部分と特異的に結合し；N547で示された抗体の結合特異性を有するM2抗体は、N547で示されたM2抗体が特異的に結合するのと同じエピトープの全てまたは一部分と特異的に結合し；L66で示された抗体の結合特異性を有するM2抗体は、L66で示されたM2抗体が特異的に結合するのと同じエピトープの全てまたは一部分と特異的に結合し；C40G1で示された抗体の結合特異性を有するM2抗体は、C40G1で示されたM2抗体が特異的に結合するのと同じエピトープの全てまたは一部分と特異的に結合するという具合である。
【００４１】
抗原性エピトープの一部分はエピトープのサブ配列または一部分を意味する。例えば、もしエピトープが８連続アミノ酸を含むのであれば、エピトープのサブ配列および、従って一部分はこの８アミノ酸配列エピトープの範囲内の７以下のアミノ酸であってもよい。さらに、もしエピトープが、お互いに連続していないがタンパク質フォールディングに因ってエピトープを形成する５アミノ酸配列および８アミノ酸配列のような非連続アミノ酸配列を含むのであれば、エピトープのサブ配列および、従って一部分は５アミノ酸配列または８アミノ酸配列単独であってもよい。
【００４２】
本明細書に例示したM2抗体の結合特異性を有する抗体は、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）の結合と競合する。本明細書に例示したM2抗体の結合特異性を有する本発明の抗体は、当技術分野で公知の競合結合を決定するいずれかの方法、例えば、本明細書に開示されるイムノアッセイにより特性を決定することができる。結合親和性は例示の抗体と異なってもよいので、M2との結合を競合する抗体の能力は様々でありうる。特定の実施形態においては、抗体は競合して結合を少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも65％、少なくとも60％、少なくとも55％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも35％、または少なくとも30％、またはそれ以下だけ抑制する。
【００４３】
エピトープは、典型的には短いアミノ酸配列であり、例えば長さが約５〜15アミノ酸である。エピトープを同定する体系的技術は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第4,708,871号に記載されている。簡単に説明すると、M2抗原から誘導された重複するオリゴペプチドのセットを合成し、それぞれのピンにユニークなオリゴペプチドを有するピンの固相アレイと結合させてもよい。ピンのアレイが96マイクロタイタープレートからなり、全ての96オリゴペプチドを、例えば抗M2モノクローナル抗体との結合について同時にアッセイできるようにしてもよい。あるいは、エピトープマッピング用のファージディスプレイライブラリーキット（New England BioLabs）が現在市販されている。これらの方法を用いて連続アミノ酸のすべての可能なサブセットとの結合親和性を確認し、特定の抗体が結合するエピトープを同定することができる。また、エピトープ長さのペプチド配列を用いて動物を免疫感作してその動物からペプチド配列と結合する抗体が得られるときは、推論によりエピトープを同定することもできる。
【００４４】
本発明のM2抗体はまた、本明細書に例示したM2抗体と同じ結合親和性を有するおよび実質的に同じ結合親和性を有するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を含む。例えば、本発明のM2抗体は、対照抗体より2〜5、5〜10、10〜100、100〜1000または1000〜10,000倍大きいかまたは小さい親和性を有しうる。従って、本発明のさらなる実施形態においては、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）に示した抗体と同じ結合親和性を有するおよび実質的に同じ結合親和性を有するM2抗体であって、重もしくは軽鎖配列、またはそのサブ配列が番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）の結合特異性を有することを条件とする上記抗体を提供する。
【００４５】
本明細書に使用される用語「同じ」は、抗体結合親和性の意味で使用されるとき、解離定数（KD）が対照抗体の約5〜100倍以内（対照抗体より5〜100倍大きい親和性または小さい親和性）であることを意味する。用語「実質的に同じ」は、抗体結合親和性の意味で使用されるとき、解離定数（KD）が対照抗体の約5〜5000倍以内（対照抗体より5〜5000倍大きい親和性または小さい親和性）であることを意味する。
【００４６】
本発明に含まれるさらなる抗体は、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）に示された抗体の結合特異性、ならびに5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M、および10-15Mより低い解離定数（Kd）をもつM2との結合親和性を有する。
【００４７】
本発明のヒトM2抗体は、本明細書に例示したM2抗体の１以上の抗インフルエンザ活性の少なくとも一部分を有する（例えば、in vitroまたはin vivoで細胞のインフルエンザウイルス感染を抑制する、インフルエンザウイルス増殖または複製を抑制する、インフルエンザウイルス感染に関連する１以上の症候または合併症を軽減する、インフルエンザウイルス感染の感受性を低下するなど）抗体を含む。従って、さらなる実施形態においては、本発明は、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）に示した抗体の１以上の抗インフルエンザ活性の少なくとも一部分を有するM2抗体を提供する。
【００４８】
用語「活性」は、抗体を対照抗体と比較するのに使用するときは、抗体が対照抗体の活性の少なくとも一部分、例えば、結合親和性、結合特異性または抗インフルエンザ活性を有することを意味する。従って、N547で示されるM2抗体の活性を有する抗体は、N547で示されるM2抗体の１以上の活性の少なくとも一部分を有し；L66で示されるM2抗体の活性を有する抗体は、L66で示されるM2抗体の１以上の活性の少なくとも一部分を有し；C40G1で示されるM2抗体の活性を有する抗体は、C40G1で示されるM2抗体の１以上の活性の少なくとも一部分を有するという具合である。用語「少なくとも一部分」は、抗体は少ない活性しか有していないが、抗体が対照M2抗体の活性の少なくとも若干、例えば、少なくとも部分的なM2との結合親和性、少なくとも部分的な抗インフルエンザ活性などを保持しうることを意味する。
【００４９】
例示したヒトM2抗体の活性を有する抗体は、コーティング抗原としてプレートに結合したM2ペプチドによる結合アッセイ（ELISA）、ウイルス感染MDCK細胞上M2タンパク質との結合アッセイ（細胞に基づくELISA）、および抗体とウイルス感染MDCK細胞上M2との結合のM2ペプチド（M2細胞外部分）による特異的抑制を利用して同定することができる。さらなるアッセイは、インフルエンザウイルスによるin vitro細胞感染性アッセイ（Zebedeeら J. Virology 62:2762(1988)）ならびに実施例１、３および４に説明したin vivo動物アッセイを含む。
【００５０】
ヒト抗体を産生する方法は本明細書に開示されかつ当技術分野で公知である。例えば、本明細書に開示されるように、KLHまたはBSAと結合したM2タンパク質を用いてヒト染色体導入KMマウス（WO 02/43478）またはHACマウス（WO 02/092812）を免疫感作した。KMマウスまたはHACマウスはヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する。通常のハイブリドーマ技術を用いて、M2抗原に対して高い応答をする免疫感作マウス由来の脾細胞を単離し、骨髄腫細胞と融合した。M2ペプチドおよび／またはM2-BSA結合体と反応するがBSAまたはKLH担体とは結合しない12モノクローナル抗体を得たので、番号2074、C40、L17、L30、L40、L66、N547、S212、S80、S900、F1、およびF2で示した。ヒト抗体を産生する技術の概観は、LonbergおよびHuszar, Int. Rev. Immunol. 13:65 (1995)に記載されている。内因性免疫グロブリンを発現しない１以上のヒト免疫グロブリン遺伝子（κまたはλ）をもつトランスジェニック動物は、例えば米国特許第5,939,598号に記載されている。ヒト抗体はまた、Abgenix. Inc.（Freemont、CA）およびGenpharm（San Jose、CA）などの販売業者から市販されている。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するさらなる方法は記載されている（例えば、WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；米国特許第5,413,923号；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；および5,939,598を参照）。
【００５１】
M2モノクローナル抗体はまた、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合わせを含む他の技術（米国特許第4,902,614号、第4,543,439号、および第4,411,993号を参照；「モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学分析の新次元（Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses）」, Plenum Press, Kennett, McKearnおよびBechtol (編), 1980；ならびにHarlowら, 「抗体：研究室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988も参照）を用いて容易に作製することができる。さらに本方法に使用しうる好適な技術としては、M2親和性精製、非変性ゲル精製、HPLCもしくはRP-HPLC、タンパク質Ａカラム上の精製、またはこれらの技術のいずれかの組合わせが挙げられる。抗体アイソタイプはELISAアッセイを用いて決定することができ、例えば、ヒトIgは、マウスIgに吸収された抗ヒトIgを用いて同定することができる。
【００５２】
抗体は当技術分野で公知の様々な技術を用いてヒト化することができ、例えば、CDR-グラフト化（EP 239,400；W091/09967；米国特許第5,225,539号；第5,530,101号；および第5,585,089号）、ベニヤリング（veneering）または再表面作成（EP 592,106；EP 519,596；Padlan, Molecular Immunol. 28:489 (1991）；Studnickaら, Protein Engineering 7:805 (1994); Roguska.ら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:969 (1994))、およびチェーンシャッフリング（chain shuffling）（米国特許第5,565,332号）が挙げられる。ヒトコンセンサス配列（Padlan  Mol. Immunol. 31:169 (1994)；およびPadlan Mol. Immunol. 28:489 (1991)）が抗体をヒト化するために、従来利用されている（Carterら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)；and Prestaら J. Immunol.151:2623 (1993)）。
【００５３】
キメラ抗体を産生する方法は当技術分野で公知である（例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985)；Oiら, BioTechniques  4:214 (1986)；Gilliesら, (1989) J. Immunol. Methods 125:191；および米国特許第5,807,715号；第4,816,567号；および第4,816,397号）。１つの種の抗体由来の可変ドメインが他の種の可変ドメインと置換えられたキメラ抗体は、例えば、Munro, Nature 312:597 (1984)；Neubergerら, Nature 312:604 (1984)；Sharonら, Nature 309:364 (1984)；Morrisonら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)；Boulianneら, Nature 312:643 (1984)；Caponら, Nature 337:525 (1989)；およびTrauneckerら, Nature 339:68 (1989)に記載されている。
【００５４】
抗体を作成するために好適なM2タンパク質は、当技術分野で公知の様々な標準タンパク質精製または組換え発現技術のいずれかにより産生することができる。例えば、M2は固相合成などの標準ペプチド合成技術により産生することができる。タンパク質の一部分は、発現または合成されたM2の精製を容易にするための、T7タグまたはポリヒスチジン配列などのアミノ酸配列を含有してもよい。M2ペプチドを細胞に発現させて、細胞により発現されたタンパク質を精製してもよい。組換え法により、M2タンパク質をさらに大きいタンパク質の一部分として発現させてもよい。
【００５５】
免疫応答を産生するために好適なM2の形態は、全長M2（例えば、典型的には４〜５以上の長さのアミノ酸）のペプチドサブ配列を含む。さらなるM2の形態は、M2を含有する調製物または抽出物、部分的に精製したM2、ならびにM2を発現する細胞またはウイルスまたはかかる発現細胞またはウイルスの調製物を含む。
【００５６】
免疫感作しうる動物は、マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、またはモルモットを含み；かかる動物を遺伝的に改変してヒトIgG遺伝子座を含ませてもよい。さらに、免疫応答を増加するために、M2を卵白アルブミンもしくはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などの他のタンパク質、サイログロブリンおよび破傷風トキソイドと組合わせて、またはフロイント完全または不完全アジュバントと混合してもよい。最初のおよびいずれかの任意のその後の免疫感作は、腹腔内、筋内、眼内、または皮下経路を通して行ってもよい。その後の免疫感作は同じまたは異なる濃度のM2抗原調製物であってもよいし、規則的または不規則な間隔であってもよい。
【００５７】
従って、他の実施形態においては、本発明は、インフルエンザウイルス感染、複製、増殖、または力価を抑制する、またはウイルス複製、増殖または力価の増加を抑制する、またはインフルエンザ感染に関連する１以上の症候または合併症の重篤度または期間、または感染の感受性を軽減する、または様々なインフルエンザウイルス株または単離体に対する広い反応性を有するなどの１以上の抗インフルエンザ活性を有する抗体を含むヒトM2抗体を産生する方法を提供する。一実施形態においては、方法は、M2またはその免疫原性フラグメントをヒト免疫グロブリンを発現できる動物（例えば、マウス）に投与し；動物をヒトM2抗体の発現についてスクリーニングし；ヒトM2抗体を産生する動物を選択し；ヒトM2抗体を産生する動物から抗体を単離し；そしてそのヒトM2抗体がM2と結合するかどうかを確認することを含む。他の実施形態においては、方法は、ヒト免疫グロブリンを発現することができる動物（例えば、マウス）にヒトM2またはその免疫原性フラグメントを投与し；ヒトM2抗体を発現する動物から脾細胞を単離し；脾細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生し；そしてハイブリドーマを、抗インフルエンザ活性を有するヒトM2抗体の発現についてスクリーニングすることを含む。
【００５８】
本発明はさらに改変されているヒトM2抗体を提供する。改変の例は抗体の１以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含み、ここで改変された抗体が未改変M2抗体の活性の全てまたは少なくとも一部分、例えば、抗インフルエンザ活性を有することを条件とする。
【００５９】
改変の特定の例は、本発明の抗体が改変されて、例えば重鎖定常域の置換（例えば、実施例２を参照）により、異なるアイソタイプまたはサブクラスを有する場合である。M2抗体C40のIgサブクラスのIgG4からIgG1への変更は抗インフルエンザ活性の改善をもたらす。従って、改変は、本発明の抗体由来のアミノ酸配列の大きな領域を欠失させ、その領域を他のアミノ酸配列の領域により置換えることを含み、その際、その配列の長さが欠失した領域より長いか短いかは問わない。
【００６０】
本発明に含まれるM2抗体のさらなる改変体は、抗体誘導体、すなわち、いずれかの型の分子の抗体への共有結合によるものである。抗体誘導体の特定の例は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、ホルミル化、ユビキチン化、ならびに保護／ブロッキング基および多数の化学的修飾のいずれかにより誘導体化されている抗体を含む。
【００６１】
個々のアミノ酸置換は、天然L-アミノ酸をD型アミノ酸により置換することを除いて、同じアミノ酸であってもよい。アミノ酸置換は保存的または非保存的であってもよく、かつ抗体の定常または可変域であってもよい。定常または可変域の１または数個の保存的アミノ酸置換はおそらく許容しうる。保存的アミノ酸置換の具体例は、Ile、Val、LeuまたはAlaをお互いに；LysおよびArgをお互いに；GluおよびAspをお互いに；そしてGlnおよびAsnをお互いに行う置換である。超可変域における多重アミノ酸の非保存的置換はおそらく結合活性、特異性または抗体機能または活性に影響を与える。従って、超過変域における置換は、これらの置換が無置換の抗体の結合活性、特異性または抗体機能または活性の少なくとも一部分を保持するかどうかを確認するために、その影響についてアッセイを行ってもよい。未改変ヒトM2抗体の結合特異性、結合親和性、または抗インフルエンザ活性の少なくとも一部分が置換した抗体により保持される限り、かかるアミノ酸置換を有する抗体は本発明に含まれる。
【００６２】
従って、本発明のヒトモノクローナルM2抗体は、本明細書に説明したサブ配列（例えばフラグメント）および改変型（例えば配列変異体）を含む。特定の実施形態においては、ヒトM2抗体サブ配列は、Fab、Fab'およびF(ab')2、Fd、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Fv（sdFv）およびVLまたはVHドメインフラグメントを含む。特定の態様においては、Fab、Fab'およびF(ab')2、Fd、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Fv（sdFv）およびVLまたはVHドメインサブ配列は、対照M2抗体（例えば、全長または未改変M2抗体）と同じ結合親和性、実質的に同じ結合親和性、同じ結合特異性、または１以上の抗インフルエンザ活性、例えば、細胞のインフルエンザ感染をin vitroまたはin vivoで抑制する効能を有する。一本鎖抗体を含むM2-結合抗体サブ配列は、可変域を単独でまたは１以上の次のヒンジ域、CH1、CH2、およびCH3ドメインの全てまたは一部分と組合わせて含んでもよい。また、可変域とヒンジ域、CH1、CH2、およびCH3ドメインとのいずれの組み合わせの抗原-結合サブ配列も含まれる。
【００６３】
本発明のM2抗体サブ配列（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、scFv、sdFvおよびVLまたはVH）は、抗体のタンパク分解的加水分解により、例えば、全抗体のペプシンまたはパパイン消化により調製することができる。用語「機能性サブ配列」および「機能性フラグメント」は、本発明の抗体を意味するとき、１以上の無傷の対照抗体の機能または活性の少なくとも一部分を保持する抗体の一部分を意味する。
【００６４】
抗体フラグメントはペプシンによる酵素切断により作ることができ、F(ab')2で示される5Sフラグメントを得る。このフラグメントをさらにチオール還元剤を用いて切断し、3.5S Fab’一価フラグメントを作ることができる。あるいは、ペプシンを用いる酵素切断は２つの一価Fab’フラグメントおよびFcフラグメントを直接生じる（例えば、Goldenberg, 米国特許第4,036,945号および第4,331,647号；ならびにEdelmanら Methods in Enymology 1:422 (1967)を参照）。抗体を切断する他の方法、例えば、重鎖を分離して一価の軽-重鎖フラグメントを作り、さらにフラグメントを他の酵素によりもしくは化学的に切断する方法を利用してもよい。遺伝子技術は、Cos細胞または大腸菌（E. coli）などの宿主細胞中へのM2抗体遺伝子の全てまたは一部分の発現を含む。組換え宿主細胞は、無傷のまたはscFvなど一本鎖抗体を合成する（例えば、Whitlowら, In: 「方法：酵素学の方法の手引き（Methods: A Companion to Methods in Enzymology）」 2:97 (1991)、Birdら, Science 242:423 (1988)；および米国特許第4,946,778号を参照）。一本鎖Fvおよび抗体は、米国特許第4,946,778号および第5,258,498号；Hustonら, Methods Enzymol. 203:46 (1991)；Shuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995 (1993)；およびSkerraら, Science 240:1038 (1988)に記載のとおり産生することができる。
【００６５】
アミノ酸付加を有する改変されたM2抗体の他の特定の例は、第２の異種配列、すなわち異なる相補的機能を抗体に与える異種機能性ドメインを結合した抗体である。例えば、M2またはインフルエンザウイルスの精製または検出を容易にする目的で、T7またはポリヒスチジンなどのアミノ酸タグをM2抗体に結合することができる。さらに他の例は、インフルエンザに感染した細胞を標的としてウイルス死滅、増殖抑制、複製抑制などを行うための、抗ウイルス薬を結合したM2抗体である。従って、本発明の他の実施形態においては、抗体上に、M2抗体および異なる機能を与える異種ドメイン、すなわち異種機能性ドメインを提供する。
【００６６】
異種機能性ドメインはアミノ酸残基に制限されるものでない。従って、異種機能性ドメインは、いずれの様々な異なる型の小さいまたは大きい機能性部分から構成されてもよい。かかる部分は、核酸、ペプチド、炭水化物、脂質または薬物（例えば、抗ウイルス薬）などの低分子有機化合物を含む。
【００６７】
リンカー配列を抗体配列と異種機能性ドメインの間に挿入して、両者が、少なくとも部分的に、異なる機能または活性を維持するようにしてもよい。リンカー配列は１以上の特性を有してもよく、例えば柔軟性のあるコンフォメーション、規則正しい二次構造を形成できないようにすること、またはいずれかのドメインを増進するかまたはそれらと相互作用しうる疎水性または帯電特性を含む。柔軟性のあるタンパク質領域に典型的に見出されるアミノ酸は、Gly、AsnおよびSerを含む。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばThrおよびAlaなどもリンカー配列に利用することができる。リンカー配列の長さは、融合タンパク質の機能または活性に有意な影響を与えることなく変えることができる（例えば、米国特許第6,087,329号を参照）。
【００６８】
異種機能性ドメインのさらなる例は検出可能な標識である。従って他の実施形態においては、本発明は検出可能な標識を付したヒトM2抗体を提供する。
【００６９】
検出可能な標識の特定の例は、蛍光体、発色団、放射性同位体（例えば、S35、P32、I125）、高電子密度試薬、酵素、リガンドおよびレセプターを含む。酵素は、典型的にはその活性により検出する。例えば、西洋わさびペルオキシダーゼは、通常、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）などの基質を青色染料に転化するその能力により検出して、数値化することができる。リガンドは、他の分子、例えばアビジンまたはストレプトアビジンと結合しうるビオチン、およびタンパク質Ａと結合しうるIgGなどと結合することができる。
【００７０】
M2抗体が２以上の改変、修飾または標識を有しうることは理解される。例えば、モノクローナル抗体をビオチンと結合してその存在をアビジンにより検出してもよいし、またはI125により標識して検出可能なシグナルを提供してもよい。他の組み合わせと可能性は、当業者には容易に明らかであり、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００７１】
本発明はさらに、改変型、フラグメント、キメラなどを含む本発明のヒトM2抗体をコードする核酸を提供する。特定の実施形態においては、核酸は番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）で示される無傷のまたは一本鎖のM2抗体をコードする。
【００７２】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）を含む核酸の全ての型を意味する。核酸は二本鎖、一本鎖、または三本鎖、直鎖または環状であってもよい。核酸は、ゲノムDNA、cDNA、およびアンチセンスを含む。RNA核酸は、スプライスしたまたはスプライスしてないmRNA、rRNA、tRNAまたはアンチセンスであってもよい。本発明の核酸は、天然核酸、合成核酸ならびにヌクレオチド類似体および誘導体を含む。例えば、かかる改変または修飾されたポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を与える類似体を含む。
【００７３】
核酸はいずれの長さであってもよい。例えば、１以上の抗インフルエンザ活性を有するタンパク質をコードする、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）のいずれのサブ配列であってもよい。特定の実施形態においては、核酸は配列番号９および配列番号10に示される重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む。他の特定の実施形態においては、核酸は配列番号11および配列番号12に示される重鎖可変配列および軽鎖可変配列をコードする。
【００７４】
遺伝子コードの縮重の結果として、核酸は、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025）、161（ATCC寄託番号PTA-4026）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）をコードする配列の縮重体である配列、そのサブ配列および本明細書に説明した改変型を含む。
【００７５】
核酸は、周知の標準クローニングおよび化学合成法のいずれの変法を用いて作ってもよく、かつ当業者に公知の位置指定突然変異または他の組換え技術により意図的に改変してもよい。ポリヌクレオチドの純度は配列決定、ゲル電気泳動などを介して決定することができる。
【００７６】
本発明の核酸を核酸構築物中に挿入し、核酸構築物中で核酸の発現を、本明細書で「発現カセット」と呼ぶ「発現制御エレメント」により影響を与えるかまたは調節してもよい。用語「発現制御エレメント」は、それに機能しうる形で連結された核酸配列の発現を調節するかまたは影響を与える１以上の核酸配列エレメントを意味する。発現制御エレメントは、適当に、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、遺伝子サイレンサー、タンパク質をコードする遺伝子の前方の開始コドン（例えば、ATG）などを含みうる。
【００７７】
核酸配列と機能しうる形で連結された発現制御エレメントは、転写および、適当に、核酸配列の翻訳を制御する。用語「機能しうる形で連結された」は、参照される成分がそれらの意図する方法で機能しうる関係に並置されていることを意味する。典型的には、発現制御エレメントは遺伝子の5’または3’末端に並置されるが、イントロンであってもよい。
【００７８】
発現制御エレメントは、構成的に転写を活性化し、誘導しうる（inducible）（すなわち、活性化に外部シグナルを必要とする）かまたは脱抑制しうる（derepressible）（すなわち、転写をターンオフするにはシグナルを必要とする；シグナルが存在しないときは転写は活性化または「脱抑制（derepressed）」される）エレメントを含む。本発明の発現カセットにはまた、特定の細胞型もしくは組織に対して遺伝子発現を制御できるようにするために十分な制御エレメント（すなわち組織特異的制御エレメント）も含まれる。典型的には、かかるエレメントはコード配列の上流または下流（すなわち5'および3'）に配置される。プロモーターは一般的にコード配列の5'に位置する。組換えDNAまたは合成技術により作ったプロモーターを、本発明のポリヌクレオチドを転写するために利用することができる。「プロモーター」は転写を指令するために十分な最小限の配列エレメントを意味する。
【００７９】
本発明の核酸をプラスミド中に挿入して宿主細胞中への伝播、およびもし所望であれば次いで遺伝子操作を行うことができる。プラスミドは、宿主細胞内で安定して伝播しうる核酸であり、プラスミドは場合によっては宿主細胞内でM2抗体をコードする核酸の発現を駆動するために発現制御エレメントを含有してもよい。本明細書ではベクターをプラスミドと同義で使用し、また宿主細胞内発現のための発現制御エレメントも含む。プラスミドおよびベクターは一般的に少なくとも細胞内伝播のための複製起点およびプロモーターを含有する。従って、プラスミドおよびベクターは、例えば、M2抗体またはアンチセンスを産生するM2抗体をコードする核酸の遺伝子操作、および、宿主細胞または生物においてM2抗体を発現するために有用である。
【００８０】
抗体の重および軽鎖の可変域をコードするかまたは全長抗体の重および軽鎖をコードする核酸をハイブリドーマから単離することができる。単離した核酸を好適な発現ベクター中に挿入して酵母またはCHO細胞などの好適な宿主細胞中に導入し、そしてこれらを培養して組換えM2抗体を産生することができる。
【００８１】
細菌系プロモーターは、T7ならびにバクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）およびテトラサイクリン応答プロモーターなどの誘導プロモーターを含む。昆虫細胞系プロモーターは、構成または誘導プロモーター（例えば、エクジソン（ecdysone））を含む。哺乳類動物細胞の構成プロモーターはSV40、RSV、ウシ乳頭腫ウイルス（BPV）および他のウイルスプロモーター、または哺乳類動物細胞（例えば、メタロチオネインIIAプロモーター；熱ショックプロモーター）からもしくは哺乳類動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；誘導マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復配列）から誘導される誘導プロモーターを含む。あるいは、レトロウイルスゲノムを遺伝子操作で改変して、適当な宿主細胞内にM2抗体を導入しかつ発現を指令させることができる。
【００８２】
発現系はさらに、in vivo用に設計されたベクターを含む。限定されるものでない特定の例は、アデノウイルスベクター（米国特許第5,700,470号および第5,731,172号）、アデノ随伴ウイルスベクター（米国特許第5,604,090号）、ヘルペスウイルスベクター（米国特許第5,501,979号）、レトロウイルスベクター（米国特許第5,624,820号、第5,693,508号および第5,674,703号）、BPVベクター（米国特許第5,719,054号）およびCMVベクター（米国特許第5,561,063号）を含む。
【００８３】
酵母ベクターは、構成および誘導プロモーターを含む（例えば、Ausubelら, In:「現代の生物分子学プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」 , Vol.2, Ch.13, 編, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988；Grantら 「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」, 153:516 (1987), 編, Wu & Grossman；Bitter 「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」, 152:673 (1987), 編 Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.；ならびに、Strathernら, 「酵母サッカロミセスの分子生物学（The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces）」 (1982) 編 Cold Spring Harbor Press, Vols.IおよびIIを参照）。ADHまたはLEU2などの構成的酵母プロモーターまたはGALなどの誘導プロモーターを利用することができる（R. Rothstein In: 「DNAクローニング、実用的手法（DNA Cloning, A Practical Approach）」, Vol.11, Ch. 3, 編 D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986）。外来核酸配列の酵母染色体中への組込みを、例えば相同組換えを経由して容易にするベクターは当技術分野で公知である。挿入するポリヌクレオチドが通常のベクターにとって大き過ぎる（例えば、ほぼ12kbより大きい）場合、典型的には酵母人工染色体（YAC）を利用する。
【００８４】
ヒトM2抗体をコードする核酸を含む宿主細胞も提供される。一実施形態においては、宿主細胞は原核生物細胞である。他の実施形態においては、宿主細胞は真核生物細胞である。様々な態様においては、真核生物細胞は酵母または哺乳類動物（例えば、ヒト、霊長類など）細胞である。
【００８５】
本明細書に使用される「宿主細胞」は、その中に核酸を導入する細胞であって、核酸は伝播され、転写され、またはコードされたM2抗体が発現される。この用語はまた、宿主細胞のいずれの子孫またはサブクローンも含む。子孫細胞およびサブクローンは、複製および増殖中に突然変異が起こりうるので親細胞と同一である必要はない。しかしかかる細胞は本発明の宿主細胞であると考えられる。
【００８６】
宿主細胞は、限定されるものでないが、細菌および酵母などの微生物；ならびに植物、昆虫および哺乳類動物細胞を含む。例えば、組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸またはコスミド核酸発現ベクターにより形質転換された細菌；組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）に感染したまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）により形質転換された植物細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；および組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染した動物細胞系、または安定な発現をするように遺伝子操作された形質転換動物細胞系が提供される。
【００８７】
発現ベクターはまた、選択圧力に対する耐性を与える選択マーカーまたは同定可能なマーカー（例えば、β-ガラクトシダーゼ）を含有してもよく、それにより選択されるべきベクターを有する細胞を増殖しかつ拡大することができる。あるいは、選択マーカーが第２ベクター上にあって、本発明のポリヌクレオチドを含有する第１ベクターとともに宿主細胞中に同時トランスフェクトされてもよい。
【００８８】
選択系は、限定されるものでないが、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wiglerら, 細胞11:223 (1977)）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Szybalskaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowyら, 細胞22:817 (1980)）を含み、これらはそれぞれtk-、hgprt_またはaprt_細胞において使用することができる。さらに、抗代謝産物耐性を選択の基準として利用することができ、メトトレキセート耐性を与えるdhfr（O'Hareら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)）；ミコフェノール酸耐性を与えるgpt遺伝子（Mulliganら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)）；アミノグリコシドG-418耐性を与えるネオマイシン遺伝子（Colberre-Garapinら, J. Mol. Biol. 150:1(1981)）；ピューロマイシン；およびハイグロマイシン耐性を与えるハイグロマイシン遺伝子（Santerreら, Gene 30:147 (1984)）が挙げられる。さらなる選択可能な遺伝子は、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用しうるようにするtrpB；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用しうるようにするhisD（Hartmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988）)；およびオルチニンデカルボキシラーゼインヒビター、2-(ジフルオロメチル)-DL-オルチニン、DFMO耐性を与えるODC（オルチニンデカルボキシラーゼ）（McConlogue (1987) In: 「分子生物学の最近の通信（Current Communications in Molecular Biology）」, Cold Spring Harbor Laboratory）を含む。
【００８９】
被験体のインフルエンザウイルス感染を治療する方法は、被験体のインフルエンザウイルス感染を治療するために有効な量のインフルエンザM2タンパク質と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を、被験体に投与することを含む。抗体は、被験体の感染前に、すなわち予防として、感染と実質的に同時または感染後に、すなわち治療処置として投与することができる。
【００９０】
本発明の方法は、被験体に治療上の利益を提供すること、例えば、インフルエンザウイルス感染に関連する１以上の症候または合併症を軽減するかまたは低下すること、ウイルス力価、ウイルス複製、ウイルス増殖、または１以上のインフルエンザウイルス株または単離体のウイルスタンパク質の量を軽減するかまたは増加を抑制することを含む。軽減または低減しうるインフルエンザウイルス感染に関連する症候または合併症は、例えば、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、洞うっ血、鼻感染症、洞感染症、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、または耳の痛みを含む。治療上の利益はまた、被験体のインフルエンザウイルス感染に対する感受性を軽減することまたは被験体のインフルエンザウイルス感染からの回復を促進することも含む。
【００９１】
一実施形態においては、方法は、１以上のインフルエンザウイルス株または単離体による被験体のウイルス感染を抑制するために、または被験体のウイルス感染に対する感受性を軽減するために有効な量のインフルエンザウイルスM2と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を、被験体に投与すること方法を含む。様々な態様においては、抗体は、被験体の感染前に（予防）、感染と実質的に同時にまたは感染後に（治療）投与する。抗体は治療上の利益を提供することができ、その治療上の利益は、例えばインフルエンザウイルス感染の１以上の症候または合併症（例えば、悪寒、発熱、咳、咽頭炎、鼻うっ血、洞うっ血、鼻感染症、洞感染症、身体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染症、または耳の痛み）の重篤度または期間、１以上のインフルエンザウイルス株または単離体のウイルス力価もしくはウイルスタンパク質の量、または被験体の１以上のインフルエンザウイルス株または単離体による感染に対する感受性を軽減するかまたは低下することを含む。
【００９２】
治療上の利益および、従って被験体中のインフルエンザウイルス力価、ウイルス複製、ウイルス増殖またはインフルエンザウイルスタンパク質の量の増加を防止または抑制する方法がさらに提供される。一実施形態においては、方法は、被験体中のインフルエンザウイルス力価、ウイルス複製または１以上のインフルエンザ株または単離体のインフルエンザウイルスタンパク質の量の増加を防止するために有効な量のインフルエンザM2と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を、被験体に投与することを含む。
【００９３】
１以上のインフルエンザ株または単離体による感染から被験体を保護し、感染に対する被験体の感受性を低下し、そして感染からの被験体の回復を促進する方法がさらに提供される。一実施形態においては、方法は、１以上のインフルエンザウイルス株または単離体によるウイルス感染から被験体を保護するために有効な、ウイルス感染に対する被験体の感受性を低下するかまたはウイルス感染からの被験体の回復を促進するために有効な量のインフルエンザM2と特異的に結合するヒト、ヒト化およびキメラ抗体を、被験体に投与することを含む。
【００９４】
本発明の方法は、番号2074（ATCC寄託番号PTA-4025；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、161（ATCC寄託番号PTA-4026；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、N547（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L66（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、C40G1（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA、2003年3月11日ATCCにより受入れられた）、L17（ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）、およびC40、L30、L40、S212、S80、S900（それぞれ、ATCC寄託番号；American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）に示された細胞系統（例えば、ハイブリドーマまたはCHO細胞系統）により産生された抗体の結合特異性または同じもしくは実質的に同じ結合親和性を有するいずれかの抗体を用いて実施することができる。
【００９５】
治療、診断および精製／単離方法を含む本発明の方法は、いずれのインフルエンザ株／単離体または株／単離体の組合わせにも応用しうる。限定されるものでないが、インフルエンザ株の特定の例は、A/PR/8/34もしくはA/HK/8/68、またはH1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、H2N1、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2およびH5N3から選択したその他の株である。
【００９６】
本発明のヒト、ヒト化およびキメラM2抗体は、単独でまたは抗インフルエンザ活性を有する治療薬、例えばインフルエンザウイルス感染、複製、増殖を抑制するまたはインフルエンザウイルス感染に関連する１以上の症候または合併症の重篤度または期間を軽減する治療薬と組合わせて利用することができる。かかる組合わせの例は、異なる結合特異性、結合親和性、またはin vitroもしくはin vivoで細胞のインフルエンザウイルス感染を抑制する効能をもつ２以上の異なるM2抗体を含有するプールされたモノクローナル抗体を含む。従って、M2抗体を含む組合わせ組成物、ならびにかかる組合わせを本発明の方法に従って利用する方法が提供される。
【００９７】
インフルエンザまたはインフルエンザウイルス感染に関連する障害または合併症を治療することを含む本発明の方法は、おそらく被験体の症状の改善、インフルエンザウイルス感染に関連する１以上の症候または合併症の重篤度または期間の軽減、または被験体の発症するまたは感染を受けるリスク、例えばインフルエンザウイルス感染に対する感受性の低下をもたらす。従って、改善は、ウイルス増殖、複製、もしくは力価、またはインフルエンザウイルス感染に関連する症候もしくは合併症の１以上の低下または軽減を含む。改善はまた、インフルエンザウイルス感染もしくはインフルエンザウイルス感染に関連する症候もしくは合併症を有するかまたはリスクのある被験体を治療するために使用する、抗ウイルス薬または他の作用薬の投与頻度または量を減少することも含む。
【００９８】
改善はインフルエンザウイルス感染に関連するいずれかまたは全ての症候または合併症の完全な消失を必要としない。むしろ、治療は、本明細書に説明したいずれかの測定しうるまたは検出しうる抗インフルエンザウイルス効果または改善であってもよい。従って、短または長期にわたって、被験体の症状または関連する症候または合併症に増分的改善または部分的軽減、または症状悪化の抑制があるときは、満足な臨床目標が達成されたことになる。
【００９９】
治療に適当な被験体は、インフルエンザウイルス感染を有するかまたは有するリスクのある被験体を含む。標的被験体はまた、インフルエンザに関連する症候または合併症が発生するリスクのある被験体を含む。従って本発明の方法は、インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染に関連する合併症のリスクを有する被験体を治療するために応用することができる。従って予防法が含まれる。
【０１００】
治療に適当な、リスクを有する被験体は、インフルエンザウイルスを有する他の被験体に曝された、またはウイルス感染性または細胞向性（cell tropism）、免疫学的感受性（例えば、免疫無防備状態の被験体）、または環境因子の変化により、インフルエンザウイルス感染のリスクが増加している場合の被験体を含む。
【０１０１】
M2抗体は単一または多重用量として、例えば、毎週１回、約1〜10週間、または、例えば、１以上のインフルエンザウイルス感染に関連する症候または合併症の重篤度の軽減を達成するまで、適当なだけ長く投与してもよい。用量は、処置が予防であるかまたは治療であるか、治療する関連する症状または合併症の重篤度、所望の臨床目標または以前に行ったもしくは同時に行う治療、被験体の一般的健康、年齢、性別または人種、および当技術分野の技術者が評価しうる他の因子に依存して変化してもよい。技術者は、治療上の利益を得る十分な量を与えるために必要な用量およびタイミングに影響を与える因子を評価しうる。用量は実験的に決定するかまたは動物疾患モデルを用いてもしくは場合によってはヒト臨床試験において決定することができる。
【０１０２】
用語「被験体」は、動物、典型的には哺乳類動物、例えば非ヒト霊長類（類人猿、ギボン、チンパンジー、オランウータン、マカク）、愛玩動物（イヌおよびネコ）、飼育動物（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）およびヒトを意味する。被験体は、動物疾患モデル、例えば、本明細書に例示したインフルエンザ感染のマウス動物モデルを含む。
【０１０３】
改変型、変異体およびそのサブ配列を含む本発明のM2抗体、ならびにM2抗体をコードする核酸を医薬組成物中に組込むことができる。かかる医薬組成物は被験体へのin vivoまたはex vivo投与に有用である。
【０１０４】
抗体は、被験体への投与前に製薬上許容される担体または賦形剤に含有させてもよい。本明細書に使用される用語「製薬上許容される」または「生理学的に許容される」は、医薬投与と共存しうる溶媒（水性または非水性）、溶液、乳濁液、分散媒、コーティング、等張および吸収促進または遅延剤を含む。かかる製剤は、錠剤（コーティングしたまたはしない）、カプセル（硬質または軟質）、マイクロビーズ、乳濁液、粉末、顆粒、結晶、分散液、シロップまたはエリキシルに含有させることができる。補助活性化合物（例えば、保存剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）を組成物中に組込んでもよい。
【０１０５】
医薬組成物は特定の投与経路に適合しうるように製剤することができる。従って、医薬組成物は、様々な経路による投与に好適である担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
【０１０６】
経粘膜または経皮投与用には、浸透すべきバリヤーに適当な透過剤を製剤に用いる。かかる透過剤は一般的に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経皮投与用には、活性化合物を、当技術分野で公知のエーロゾル、スプレー、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム中に製剤する。
【０１０７】
本発明の組成物および方法に適当な医薬製剤および送達系は当技術分野で公知である（例えば、「レミントンの製薬科学（Remington’s Pharmaceutical Sciences）」 (1990) 第18版, Mack Publishing Co., Easton, PA；「メルクインデックス（The Merck Index）」 (1996) 第12版, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ；「固体投与剤形の製薬原理（Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms）」, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993)；およびPoznanskyら, 「薬物送達系（Drug Delivery Systems）」, R. L. Juliano, 編, Oxford, N.Y. (1980), pp.253-315を参照）。
【０１０８】
医薬製剤は、投与を容易にしかつ投与量を均一化するために単位投与量剤形で包装してもよい。本明細書で使用される単位投与量剤形は、治療すべき被験体に対する単位投与量として好適な物理的に区切られた単位を意味し；それぞれの単位は、所望の治療上の利益を得るように計算して予め定めた量の活性化合物を製薬担体または賦形剤と一緒に含有する。
【０１０９】
本発明は、好適な包装材料中に包装されたM2抗体、M2抗体をコードする核酸、およびそれらの医薬製剤を含んでなるキットを提供する。キットは典型的には、成分の説明または同封成分のin vitro、in vivo、またはex vivoでの使用の指示書を含む標識または包装挿入物を含む。キットはかかる成分のコレクション、例えば、２以上のヒトM2抗体を単独でまたは抗ウイルス薬または薬物と組合わせて含有してもよい。
【０１１０】
用語「包装材料」は、キットの成分を収納する物理的構造を意味する。包装材料は成分を無菌で保持することができ、かつかかる目的に通常使用される材料（例えば、紙、コラゲート繊維、ガラス、プラスチック、フォイル、アンプルなど）で製作することができる。標識および包装挿入物は適当な文書による指示書を含んでもよい。
【０１１１】
従って、本発明のキットはさらに、キット成分を本発明の方法に使用するための標識または指示書を含んでもよい。指示書は、治療、検出、監視または診断法を含む本明細書に記載した本発明の方法のいずれかを実施する指示書を含んでもよい。従って、例えばキットは、本明細書に説明した１以上の抗インフルエンザ活性を有するヒトM2抗体と一緒に、本発明の治療方法で抗体を投与するための指示書を含んでもよい。
【０１１２】
指示書は、「印刷物」上に、例えばキットに入ったもしくは添付した紙もしくはカード板上に、またはキットもしくは包装材料に付された標識上にあってもよく、またはキットの成分を含有するバイアルもしくはチューブに付けられていてもよい。指示書はさらに、ディスク（フロッピーディスケットまたはハードディスク）、光学的CD、例えばCD-またはDVD-ROM/RAM、磁気テープ、電気的保存媒体、例えばRAMおよびROM、ならびにこれらのハイブリッド、例えば磁気的／光学的保存媒体などのコンピューター可読媒体に含まれてもよい。
【０１１３】
本発明のキットはさらに、増殖培地（例えば、M2抗体を産生する細胞系統のための）、バッファー剤、またはヒトM2抗体を含有する医薬製剤中の保存剤もしくは安定剤を含む。キットの各成分を個々の容器内に封入し、そして様々な容器を全て１つの包装物内に納めてもよい。本発明のキットは冷蔵用に設計することができる。本発明のキットはさらに、ヒトM2抗体を産生するハイブリドーマまたは他の宿主細胞（例えば、CHO細胞）を含有するように設計してもよい。キット内の細胞は、細胞を使用する準備ができるまで、適当な保存条件のもとで保持してもよい。例えば、１以上のハイブリドーマまたは他の細胞を含むキットは、細胞を解凍し増殖することができる適当な細胞保存培地（例えば、DMEM、α-MEMなどの10-20％DMSOを含む組織培養増殖培地）を含有してもよい。
【０１１４】
本発明のヒトM2抗体は、M2ポリペプチドを単離し、検出しまたは精製するために有用である。かかる方法は、M2を含有すると思われるサンプル（溶液中、固相中、in vitroもしくはin vivo、または無傷の細胞もしくは生物内の）とM2抗体とを、結合が可能な条件のもとで接触させ、そしてM2の存在を検出するかまたは結合したM2タンパク質を精製することを含む。
【０１１５】
従って本発明はまた、試験サンプル中のM2またはインフルエンザウイルスを検出する方法も提供する。一実施形態においては、方法は、M2またはインフルエンザウイルスを有するかまたは有すると思われるサンプルとヒトM2抗体とを、サンプル中のM2が検出な条件のもとで接触させ、そして試験サンプル中にM2が存在するかどうかを決定することを含む。M2またはインフルエンザウイルスの検出は、免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫組織化学的染色またはフローサイトメトリーなどの通常の方法により実施することができる。
【０１１６】
M2およびインフルエンザウイルス検出法は、M2およびインフルエンザウイルスを検出する診断プロトコルに有用である。例えば、インフルエンザウイルスレベルの増加または低下がインフルエンザ感染の進展または退行に関連している場合、本発明の抗体を用いてM2またはインフルエンザウイルスのいずれの増加または低下も検出することができる。加えて、M2またはインフルエンザウイルスレベルを低下する治療法の後に、M2またはインフルエンザウイルスレベルの監視が所望であれば、本発明の抗体を用いて、長期間または短期間にわたり、治療前、中または後のM2またはインフルエンザウイルスレベルのかかる増加または低下を検出してもよい。
【０１１７】
従って本発明はまた、被験体の（生物学的液体、細胞、または生検などの組織もしくは器官サンプルを含有する）試験サンプル中のM2またはインフルエンザウイルスの存在を検出する方法も提供する。一実施形態においては、方法は、被験体から得たM2またはインフルエンザウイルスを有するかまたは有すると思われるサンプルとヒトM2またはインフルエンザウイルス抗体とを、M2またはインフルエンザウイルスが検出可能な条件のもとで接触させ、そして被験体からの試験サンプル中にM2またはインフルエンザウイルスが存在するかどうかを決定することを含む。
【０１１８】
ヒトM2抗体はまた、被験体の診断のためのまたは治療後のM2またはインフルエンザウイルスの存在を監視するために、または被験体中のM2のin vivoレベルを測定するために利用することもできる。例えば、M2またはインフルエンザウイルスを含有すると思われる痰を、上記のように、結合が起こりうる条件のもとでM2抗体とともにインキュベートして、M2またはインフルエンザウイルスの存在を検出する。
【０１１９】
特に断らない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載したのと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することはできるが、本明細書では好適な方法および材料を記載した。
【０１２０】
本明細書に引用した全ての出願、公告、特許および他の参考文献、GenBank引用およびATACC引用は参照によりそのまま組込まれる。係争の場合には、定義を含む明細書が統制する。
【０１２１】
本明細書に使用される、単数形「１つの（a、anおよびthe）」は、文脈が明らかに他の意味を示すことがなければ、複数の意味を含む。従って、例えば、「１つの（an）M2抗体」は複数のかかる抗体を含み、かつ「１つの（an）抗インフルエンザ活性または機能」は１以上の活性または機能を含みうるという具合である。
【０１２２】
多数の本発明の実施形態が記載されている。しかし、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な改変が行われうることは理解されるであろう。従って、以下の実施例は添付した請求項に記載した本発明の範囲を限定するためでなく、説明することを意図する。
【実施例】
【０１２３】
実施例1
本実施例は様々な材料および方法を記載する。
【０１２４】
ペプチド合成およびペプチド-KLH結合体：M2ペプチドをマルチペプチドシステム（Multiple Peptide Systems）（San Diego、CA）により合成した。ペプチド純度はHPLC後に＞95％であった。次いでM2ペプチドを、同社製のKLH（M2-KLH）およびBSA（M2-BSA）と結合した。細胞外の23アミノ酸M2ペプチドの配列は：SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号１）である。
【０１２５】
マウス：ヒト免疫グロブリン領域を含有するヒト染色体断片を抱くヒト染色体導入マウス（IshidaおよびLonberg, IBC’s 11th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2000)；およびKataoka, S. IBC’s 13th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2002)）はKirin Brewery Co., Ltd.（日本）から入手し、La Jolla Institute for Allergy and Immunologyの動物施設に収容した。C57BL/6JマウスはJackson Laboratories（Bar Harbor、ME）から購入し、La Jolla Institute for Allergy and Immunologyの動物施設に収容した。
【０１２６】
免疫感作：M2-KLHまたはM2-BSAを含むPBS（GIBCO BRL、Rockville、MD）を、等容積の完全フロイントアジュバント（complete Freund’s adjuvant）（CFA）（Sigma、St. Louis、MO）と混合して乳濁液を調製した。マウスを20μgのM2-KLHまたはM2-BSAを含むCFAを用いて皮下に免疫感作し、21日後に、皮下に20μgのM2-KLHまたはM2-BSAを含む不完全フロイントアジュバント（incomplete Freund’s adjuvant）(IFA）（Sigma、St. Louis、MO)を注射するかまたは腹腔内にRIBI（Corixa、Hamilton、MT）を注射して追加免疫感作し、そしてさらに21日後にもう１回繰返した。融合の３日前に、最後のアジュバントなしの10μgのM2ペプチドの腹腔内および静脈注射を行った。
【０１２７】
ELISA：ハイブリドーマによる抗体力価および抗体特異性ならびに抗体産生を、ELISAにより確認した。簡単に説明すると、50μlのM2-BSAまたはM2ペプチドを、96ウエル平底プレート（Nunc、デンマーク）上に炭酸塩バッファー（pH9.6）を用いて1μg/mlの濃度で4℃にて一夜または37℃にて1時間コーティングした。PBS/0.1％Tween20を用いて２回洗浄した後、プレートをPBS/1％BSA（Sigma、St. Louis、MO）を用いて37℃にて30分間ブロックし、抗体または血清をウエルに加え、そしてプレートを37℃にて1時間インキュベートした。４回洗浄した後、希釈したHRP結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンγ鎖特異的抗体（Jackson Immunoresearch Laboratory、West Grove、PA）をウエルに加え、1時間、37℃にてインキュベートした。４回洗浄した後、TMB基質溶液（DAKO、CA）を加え、30分間、室温にてインキュベートした。450nmにおける光学密度（OD）をマイクロプレートリーダーにより測定した。
【０１２８】
アイソタイプELISA：ハイブリドーマが産生した抗体のアイソタイプをELISAにより確認した。簡単に説明すると、50μlのM2-BSAまたはM2ペプチドを96-ウエル平底プレート（Nunc、Denmark）上に炭酸塩バッファー（pH9.6）を用いて1μg/mlの濃度で4℃にて一夜または37℃にて1時間コーティングした。PBS/0.1％Tween20を用いて２回洗浄した後、プレートをPBS/1％BSA（Sigma、St. Louis、MO）を用いて室温にて1時間ブロックし、抗体をウエルに加え、プレートを室温にて1時間インキュベートした。３回洗浄した後、希釈したHRP結合マウス抗ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4重鎖検出抗体（Zymed、San Francisco、CA）をウエルに加え、1時間室温にてインキュベートした。３回洗浄した後、TMB基質溶液（DAKO、CA）を加え、30分間室温にてインキュベートした。450nmにおける光学密度をマイクロプレートリーダーにより測定した。
【０１２９】
インフルエンザＡ型ウイルス感染細胞に基づくELISA：MDCK細胞（Madin-Darbyイヌ腎上皮細胞；ATCC、Rockville、MD）を、96ウエル平底プレート（Falcon(登録商標)）中に1.5x105細胞/mLおよび150μl/ウエルでまいて48時間、7％CO2中で培養した。48時間後、プレートを２回PBSを用いて洗浄し、そして室温にて30分間、100倍TCID50インフルエンザＡ型ウイルス（A/PR/8/34またはA/HK/8/68；ATCC、Rockville、MD）30μlを用いて定期的に旋回しながら感染させた。感染後、プレートを１回、PBSを用いて洗浄し、そしてトリプシン1μg/mLを含む最小必須培地（Invitrogen Corp、CA）150μlを加え、プレートを27時間インキュベートした。感染後、細胞単層をPBS/1％FCS（GIBCO BRL、Rockville、MD）を用いて３回洗浄し、PBS/1％BSA/5％FCSを用いて室温で30分間ブロックした。抗体を希釈し、50μlを各ウエルに加え、室温で45分間インキュベートした。４回洗浄した後、HRP結合ウサギ抗ヒト免疫グロブリンγ鎖抗体（DAKO、Denmark）を1:3000に希釈し、50μlを各ウエルに加え、そしてプレートを室温で30分間インキュベートした。５回洗浄した後、1mMレバミゾール溶液（Vector Laboratories Inc.、Burlingame、CA）を含有するTMB基質（DAKO、Denmark）100μlを加え、プレートを室温で15分間インキュベートした。50μlの上清を、100μl停止溶液（1N H2SO4）を含有する新しい96ウエルプレート（Nunc, Denmark）に移し、そして450nmにおける光学密度をマイクロプレートリーダーにより測定した。各抗体のEC50を、先に記載（Setteら Nature 328:395 (1987)）のとおり計算した。番号2074抗体の10μg/mlにおけるODデータを内部対照として100％に設定した。
【０１３０】
インフルエンザＡ型ウイルス感染細胞に基づくELISAにおけるペプチド競合：ウイルス感染MDCK細胞を上記のように調製した。M2ペプチドと抗M2抗体とを混合し、室温で30分間インキュベートした。インキュベーションの後、ペプチドと抗体との混合物50μlをブロックした細胞に加え、室温で30分間インキュベートした。４回洗浄した後、HRP結合ウサギ抗ヒト免疫グロブリンγ鎖抗体（DAKO、Denmark）を1:3000に希釈し、50μlを各ウエルに加え、そしてプレートを室温で30分間インキュベートした。５回洗浄した後、1mMレバミゾール溶液（Vector Laboratories Inc.、Burlingame、CA）を含有する100μlのTMB基質（DAKO、Denmark）を加え、プレートを室温で15分間インキュベートした。50μlの上清を、100μl停止溶液（1N H2SO4）を含有する新しい96ウエルプレート（Nunc, Denmark）に移し、そして450nmにおける光学密度をマイクロプレートリーダーにより測定した。
【０１３１】
ハイブリドーマ産生：最高の抗体力価を有するマウスを選択し、モノクローナル抗体を産生するために利用した。脾臓を収穫し、単一細胞懸濁液を骨髄腫系統（SP2/O-Ag14）（ATCC、Rockville、MD）と3:1の比で50％PEG（Boehringer Mannheim、Indianapolis, IN）を用いて融合させた。融合体を96-ウエルプレート上にある光学密度でまいて、完全RPMI-10培地（10％FCSを用いたRPMI 1640、1％非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、50μM 2-ME、100U/ml ペニシリンおよび100μg/ml ストレプトマイシン硫酸塩）中で、5％CO2、37℃のインキュベーターにて培養した。ほぼ2000の各融合体ハイブリドーマ増殖ウエルをELISAによりスクリーニングした。M2ペプチドとの結合に対してポジティブな細胞を24ウエルプレートに移し、４ラウンドの限界希釈（limiting dilution）を実施してモノクローナル抗体を得た。抗M2モノクローナル抗体をさらにインフルエンザＡ型ウイルス感染細胞に基づくELISAにより確認した。
【０１３２】
抗体精製：抗体を精製するために、ハイブリドーマをIntegraシステム（INTEGRA Bioscience. Inc、Ijamsville、MD）においてハイブリドーマ-SFM（GIBCO BRL、Rockville、MD)を用いて培養した。ヒトモノクローナル抗体を培地からタンパク質Ａ-セファロースファストフローゲル（Protein A-Sepharose Fast Flow gel）（Amersham Pharmacia Cat#17-0618-02、Uppsala、スウェーデン）を用いて精製した。簡単に説明すると、カラム能力に対して適当な量の抗体を含有する馴化培地（conditioned medium）を、0.22μmディスクフィルター（Minisarto-plus、Sartorius Cat#17822、Gettingen、ドイツ）を用いて濾過し、そしてリン酸バッファー生理食塩水（PBS）を用いて平衡化した2.0mlタンパク質Ａ-セファロースファストフローカラム上に供給した。カラムを40mlを超えるPBSを用いて洗浄し、抗体を0.1M Gly-HCl、pH3.6、0.15M NaClを用いて溶出した。溶出バッファーの最初の1.0mlが通過した後に、３つの分離した溶出画分を5.0ml/チューブの容積で回収し、そして直ぐに250μlの1M Tris-HCl、pH8.0を用いて中和した。この精製操作を全ての馴化培地が処理されるまで繰返した。抗体濃度はヒトIgG特異的ELISAを用いて決定し、そして抗体を含有する全ての画分をプールし、遠心濃縮機（Vivaspin 20、30,000MWCO：Sartorius Cat#VS2022、Gettingen、ドイツ）を用いて濃縮した。
【０１３３】
発熱物質を除去するために、濃縮サンプルを20mMリン酸ナトリウム、pH6.6にバッファー交換し、そして上記バッファーを用いて平衡化した0.5ml SP-セファロースHPカラム（Amersham Pharmacia、Cat#17-1087-01、Uppsala、Sweden）に供給した。最初にサンプルを、SP-セファロースHPカラムと直列に接続した2ml Q-セファロースファストフローカラム（Amersham Pharmacia、Cat#17-0510-01、Uppsala、Sweden）を通過させることにより、発熱物質を除去した。適用した後に、Q-セファロースファストフローカラムを取除いて、抗体を0〜0.5M塩化ナトリウムの範囲の直線勾配により溶出した。抗体は280nmにて検出し、抗体を含有する画分をプールした。サンプルを遠心濃縮機を用いて濃縮し、そしてNAP25脱塩カラム（Amersham Pharmacia、Cat#17-0852-02、Uppsala、Sweden）を用いることによりPBSにバッファー交換した。抗体濃度はヒトIgG特異的ELISAにより数値化した。サンプルの発熱物質レベルは、リムルス（カブトガニ）アメーバ様細胞溶解産物（Limulus Amebocyte Lysate；LAL）アッセイ（Associates of Cape Cod, Inc.、Falmouth、MA）により、0.13EU/mgタンパク質より低いことを確認した。
【０１３４】
ヒト抗M2抗体（C40）遺伝子の単離：
C40抗体（アイソタイプ：IgG4）を産生する培養ハイブリドーマ細胞（113C-40-H-22）を、遠心分離により回収した。これらの細胞から240マイクログラムの全RNAを、ISOGEN (NIPPONGENE, Co., Ltd.)を用いて精製し、次いで120マイクログラムの全RNAから3マイクログラムのポリA+ RNAを、OligotexTM-dT30<SUPER>（Takara Shuzo, CO.、Ltd.、日本）を用いて精製した。SMART RACE cDNA増幅キット（Clontech, Co.、Ltd.、CA）を用いて、供給源としてのハイブリドーマ細胞のポリA+ RNAから免疫グロブリン遺伝子可変域のcDNAをクローニングした。簡単に説明すると、第１ストランドcDNAを2マイクログラムのポリA+ RNAから逆転写酵素により調製した。このcDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のテンプレートとして利用し、リーダー配列を含む重鎖および軽鎖の両方の可変域（それぞれHVおよびLV）を増幅した。反応は次のとおり行った；2.5U TaKaRa LA TaqTM DNAポリメラーゼ（Takara Shuzo, Co.,）；片側に対する0.2μMプライマー（重鎖用：IgG1p、軽鎖用：hk-2、表１を参照）；他の片側に対する0.2μMプライマー（SMART RACEキットに添付されたUMPプライマー）；400μMのそれぞれのdNTPミックス；LA PCR バッファーII（Mg2+プラス）（最終濃度は1x）；およびcDNAテンプレート。
【０１３５】
サーモサイクリングプログラムは、94℃にて5分間；次いで94℃にて10秒間および68℃にて1分間さらに72℃にて7分間伸長の30サイクルとした。増幅したDNA断片をエタノール沈降後に回収し、次いでアガロース電気泳動を実施し、そしてQIA迅速ゲル抽出キット（Quick Gel Extraction Kit；Qiagen Co. Ltd.、ドイツ）により精製した。両方のPCR増幅産物（HVおよびLV）のヌクレオチド配列を特異的プライマー（HV：hh-4、LV：hk-5およびhk-6、プライマーの配列は表１を参照）を用いて確認した。精製したHVおよびLVのDNA断片をpGEM(登録商標)-Tイージーベクターシステム（T Easy Vector System；Promega Co.）中に組込んで、それぞれの構築物プラスミドを大腸菌（E. coli）にエレクトロポレーションし、次いでクローニングした。構築物プラスミド中のそれぞれのインサート（HVおよびLV）のヌクレオチド配列を特異的プライマー（SP6およびT7、表１を参照）を用いて分析した。構築物プラスミドからの両方のHVおよびLVのヌクレオチド配列はPCR産物からのヌクレオチド配列と完全に一致した。HVおよびLVのヌクレオチド配列ならびにこれらのアミノ酸配列を以下に示す。
【０１３６】
C40重鎖可変域(HV)のcDNAのヌクレオチド配列（開始コドン(ATG)から可変域末端まで）：
2005519619.tif 000002
C40軽鎖可変域(LV)のcDNAのヌクレオチド配列（開始コドン(ATG)から可変域末端まで）：
2005519619.tif 000003
C40重鎖可変域(HV)のcDNAのアミノ酸配列（リーダー配列（下線部）および可変域）：
2005519619.tif 000004
C40軽鎖可変域(LV)のcDNAのアミノ酸配列（リーダー配列（下線部）および可変域）：
2005519619.tif 000005
アイソタイプを変えたヒト抗M2抗体（C40-IgG1型）の発現ベクターの作製：
IgG1型アイソタイプに切替えられたC40抗体（元来のアイソタイプはIgG4であった）を作るために、新しいDNAベクターを構築した。簡単に説明すると、LVの両側に制限酵素に感受性のある領域を有するLVのPCR用プライマーセットを設計した。使用したプライマーセットはM240L5BGLおよびM240L3BSI（表１）であり、LVの構築物プラスミドをテンプレートとして利用した。精製したLVのPCR増幅産物をpGEM(登録商標)-Tイージーベクターシステム（Promega Co.）中にサブクローニングした。インサートのヌクレオチド配列を確認した。プラスミドDNAを２つの制限酵素、BglIIおよびBsiWIにより消化し、0.4キロ塩基DNAインサート（フラグメントＡ、図１を参照）を単離し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。
【０１３７】
プラスミドベクター（IDEC Pharmaceuticals, CA、N5KG1-Val Lark（米国特許第6,001,358号中のN5KG1の改変ベクター））を、IgG1の軽および重鎖両方の定常域を含有するIgG1を産生するための発現ベクターとして用いた。ベクターDNAを２つの酵素、BglIIおよびBsiWIにより消化し、次いでアルカリホスファターゼ（Takara Shuzo, Co., Ltd.、日本）を用いて処理してDNA末端の脱リン酸を行った。8.9キロ塩基DNA断片（fragment B）をアガロースゲル電気泳動およびDNA精製キットにより単離した。
【０１３８】
２つのDNA断片、AおよびBをT4 DNAリガーゼ（Takara Shuzo, Co., Ltd.、日本）を用いてライゲートし、ライゲートした構築物（N5KG1_C40Lv）を大腸菌（E. coli）DH5α株中にエレクトロポレーションして形質転換体を作製した。ポジティブな大腸菌（E. coli）形質転換体を選択した。
【０１３９】
第２ステップとして、HVをN5KG1_C40LvのDNAベクター中に次のとおり挿入した：DNAベクターを２つのDNA制限酵素、NheIおよびSalIにより消化し、次いで脱リン酸した。9.2キロ塩基DNA断片（断片C）を単離した。軽鎖構築物と同様に、HVの両側に制限酵素に対する感受性領域を有するHVのPCR用のプライマーセットを設計した。使用したプライマーセットはM240H5SALおよびM240H3NHE（表１）であり、HVの構築物プラスミドをテンプレートに利用した。精製したHVのPCR増幅産物をpGEM(登録商標)-Tイージーベクターシステム中にサブクローニングした。サブクローニングした構築物中のインサートのヌクレオチド配列を確認した。プラスミドDNAを２つの酵素、NheIおよびSalIにより消化し、0.44キロ塩基DNAインサート（フラグメントＤ、表１を参照）を単離し、アガロースゲル電気泳動の後に精製した。
【０１４０】
２つのDNA断片、CおよびDをT4 DNAリガーゼを用いてライゲートし、ライゲートした構築物（N5KG1_M2C40）を大腸菌（E. coli）DH5α株中にエレクトロポレーションして形質転換体を作製した。ポジティブな大腸菌（E. coli）形質転換体を選択した。この発現ベクターを精製し、LVおよびHV域の両方のヌクレオチド配列を確認した。以上のプロセスの間に突然変異は導入されていなかった。
【表１】
2005519619.tif 000006
【０１４１】
アイソタイプを変えたヒト抗M2抗体（IgG4型-C40）の発現ベクターの作製：
IgG4型C40のDNA構築物を作製するために、N5KG1-Val Larkベクターの代わりにN5KG4PE DNAベクターを使用した。このDNAベクターはIgG4の軽鎖および重鎖両方の定常域を含有する。C40のIgG4ベクターを作製する手順はIgG1型C40を作製する手順と同じであった。
【０１４２】
CHO細胞から組換えヒト抗M2抗体の産生:
組換え抗体を産生するために、作製したDNAベクターを宿主細胞中にトランスフェクトし、抗体をトランスフェクトした細胞の上清から単離した。簡単に説明すると、DNAベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞、ATCC #CRL-9096）中にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。20マイクログラムの精製DNA発現ベクターN5KG1_M2C40をDNA制限酵素AscIにより直鎖にして、そのDNAをBio Radエレクトロポレーター（350V、500mF）を用いて4x106細胞のCHO細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を96ウエル培養プレートに接種し、そして細胞をゲネチシン（Geneticin）（Gibco-BRL）入り培地において培養して、上記DNAベクターを含有するCHO細胞を選択した。複数の安定にトランスフェクトされた株を選択した後、ヒトIgGの高産生株をELISAによりスクリーニングし、組換え抗体を産生するために使用した。
【０１４３】
組換え抗体タンパク質の単離と精製:
組換え抗体を発現するCHO細胞を、EX-CELL培地325-PE（JRH Bioscience, Co.、Ltd.）を用いて培養した。10リットルの使用済み培地上清を用いて、抗体タンパク質を次のとおり精製した：上清をMabSelectタンパク質Ａカラム（Amersham Pharmacia Biotech, Co., Ltd.）に適用した。抗体のタンパク質Ａへの吸収用にリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を使用し、そして溶出用に20mMクエン酸ナトリウムバッファーおよび50mM塩化ナトリウム（pH2.7）を使用した。溶出画分のpHは、50mMリン酸バッファー（pH 7.0）を加えて5.5に調節した。抗体のさらなる精製は、SPセファロースカラム（Amersham Pharmacia Biotech, Co., Ltd.）を用いて実施し、PBSを溶出バッファーとして使用した。
【０１４４】
精製抗体は、Super Cup 100カプセルメンブランフィルター（0.22μm直径、内孔サイズ）を用いて濾過により無菌化した。精製抗体の濃度は、280nmにおける分光光度法により測定したが、ここで1mg/mlのタンパク質は280nmで1.4のOD値を示す。17mgの組換えC40-IgG1抗体を10リットルのCHO細胞培養上清から精製した。
【０１４５】
実施例2
本実施例は、ヒトおよびキメラM2モノクローナル抗体の産生と特性決定を記載する。
【０１４６】
KMマウスまたはHACマウスを、担体のKLHまたはBSAと結合したM2細胞外ドメイン由来の配列に基づく合成M2ペプチドを用いて免疫感作した。ほとんどのマウスは、コーティング抗原としてM2ペプチドを用いたELISAにより検出すると、M2抗原に高い力価で応答した。高応答の６マウスから得た脾細胞と骨髄腫細胞との融合により、複数の抗M2ヒトモノクローナル抗体を作製した。12のモノクローナル抗体（番号2074、C40、L17、L30、L40、L66、N547、S212、S80、S900、F1、およびF2として示した）を得て、これらはM2ペプチドおよび／またはM2-BSA結合体と反応したが、表２に示すように、BSA、KLH（免疫感作用の担体）、mGAD（マウスグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）から誘導された無関係な合成ペプチド、アミノ酸246〜266）に対しては応答しなかった。C40G1（IgG1）およびC40G4（IgG4）のコード配列を元来のC40遺伝子からクローニングして、CHO細胞に発現させた（実施例1）。
【０１４７】
ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体、番号2074および全ヒト抗体C40G1、S212、S80、S900、N547、L66、F1、およびF2はIgG1アイソタイプである。C40はIgG4アイソタイプであり、L40はIgG3アイソタイプであり、そして抗体L17およびL30はIgG2アイソタイプである(表２)。
【表２】
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【０１４８】
全ての抗体は、インフルエンザA/PR/8/34またはA/HK/8/68株に感染したMDCK細胞上に発現したM2を認識し、これらの抗体は、細胞外ドメインの配列がわずかに異なっていても、２つの異なる株により発現されるM2の自然型を認識することを示した（図２）。さらに、感染細胞との抗体結合は、M2ペプチドが存在すると特異的に抑制された（代表的データを表３に示す）。
【０１４９】
これら２種のウイルス株の間のM2配列細胞外部分は、単一アミノ酸だけ：すなわちA/PR/8/34株のM2の細胞外部分の位置20におけるアスパラギン酸のグリシンへの置換が異なる。A/HK/8/68由来の配列、いわゆる普遍的M2細胞外部分（universal M2 extracellular porion）は、ほとんどのインフルエンザ株間で共有される（Neirynckら, Nature Med. 5:1157 (1999)）。しかし、この１つの突然変異は異なるマウス抗M2モノクローナル抗体、14C2による結合を無効化した（Gerhard et. al. Immunological Rev.159:95 (1997)）。
【０１５０】
A/PR/8/34ウイルス株に対して、抗体、番号2074、N547、L66、L17、C40G1の反応性は比較しうるものであり、抗体、C40G4、S212、およびS80の反応性よりほぼ3〜5倍大きく、そしてF1およびF2より100倍大きかった（図２および表４）。
【０１５１】
A/HK/8/68感染細胞上のM２への応答については、S212、S80、S900、F1およびF2は、他の抗体よりほぼ100倍低かった（表４）。予想通り、無関係なヒト抗HSA抗体（抗ヒト血清アルブミン）と整合するアイソタイプはいずれの反応性も示さなかった。
【表３】
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【表４】
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【０１５２】
抗M2抗体の突然変異M2ペプチドに対する結合活性を、インフルエンザＡ型ウイルスで報じられている８種の異なるM2ペプチド（配列番号１〜８、表５）を用いてELISAアッセイで分析した。抗M2抗体番号2074、C40、C40G1、L66およびN547は、M2ペプチドならびに元来のM2ペプチドに対して結合活性を示した（表６）。特に、C40G1およびN547は、本研究に使用した８種全てのM2ペプチドと結合した。
【０１５３】
A/HK/8/68およびA/PR/8/34ウイルス株は、M2タンパク質中にそれぞれ配列番号１および９に掲げたペプチド配列を有する。上記の抗M2抗体は、これら２種のウイルス株のいずれかに感染したMDCK細胞の細胞表面M2タンパク質と結合するので、これらの抗体はまた、配列番号９（すなわちM2G、表５）に説明されたM2ペプチドとも結合することができる。
【０１５４】
これらの結果は、本発明の抗M2抗体が、突然変異インフルエンザＡ型ウイルス株において観察される様々なM2突然変異ペプチドと結合する広い特異性を有することを示す。
【表５】
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【表６】
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【０１５５】
実施例3
本実施例は、動物がインフルエンザウイルスに感染する前および後における本発明のM2モノクローナル抗体の投与がウイルスの致死チャレンジに対して保護することを示す動物モデル研究を記載する。
【０１５６】
マウスインフルエンザＡ型ウイルスモデルにおける、抗M2mAbの予防処置（ウイルス感染前）のin vivo有効性:
動物モデルにおける抗M2ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体の有効性を評価するために、抗体番号2074を200μg/マウスの用量で雌性C57BL/6Jマウス（8〜10週齢）に腹腔内投与した。処置開始の1日後、麻酔したマウス（アベルチン（Avertin）（2,2,2トリブロモエタノール:tert-アミル-OHの1:1 w/v配合物、Sigma、St. Louis, MO）15μl/g）に、インフルエンザA/PR/8/34（ATCC）の致死用量の30μl（300pfU/30μl）を鼻腔内感染させた。感染の２日後、マウスは番号2074抗体（200μg/マウス）のさらなる用量を腹腔内に受けた。マウスを27日間、生存率分析について毎日観察した。その時点の後に、生存マウスを犠牲にし、肺を取除いてウイルスの検出および組織学的分析を実施した。生存率分析を図５に示した。対照として、KMマウスから作製されたアイソタイプの整合したヒトモノクローナル抗HSA-IgG1抗体を用いた（Kirin、日本）。結果を表７に説明した。
【０１５７】
対照群では、12マウスのうちの11が感染後18日以内に死亡した。対照的に、抗M2抗体番号2074で処置したマウスは有意に保護された。12マウスのうち10が観察期間27日にわたりなお生存した。生存マウス（抗M2処置群からの10および対照群からの1）を第27日に犠牲にし、肺を取除いてウイルス力価および組織分析を実施した。ウイルスプラークアッセイによりいずれの群のマウスの肺からもウイルスは検出されなかったが、ポジティブ対照については、A/HK/8/68ウイルスの力価が5.95x103pfU/mlであった（表７）。このデータは、抗M2抗体の投与はマウスの肺のウイルス力価の増加を防止することができ、最終的にマウスの身体中のウイルスのクリアランスを容易にすることを示す。
【表７】
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【０１５８】
マウスインフルエンザＡ型ウイルスモデルにおける、抗M2mAbの治療処置（ウイルス感染後）のin vivo効果
麻酔した雌性C57BL/6Jマウス（8〜10週齢）にインフルエンザA/PR/8/34（ATCC）の致死用量を鼻腔内感染させた。麻酔は上記のアベルチンを用いて実施した。マウスを毎日24時間観察して生存率分析を行った。
【０１５９】
抗M2モノクローナル抗体のインフルエンザウイルスの治療処置に対する有効性を評価するために、抗体をウイルス感染後に投与した。インフルエンザA/PR/8/34の致死用量のウイルスチャレンジをC57BL/6Jマウスに与えた後の第２日および第４日に、抗M2抗体番号2074を200μg/マウスにて各時点で腹腔内注射により投与した（全部で12マウス）。対照群（全12マウス）はアイソタイプが整合した無関係なヒトモノクローナル抗体（抗HSA(IgG1)、Kirin Brewery Co., Ltd., Japan)から）を受けた。
【０１６０】
対照群では、12マウスのうち11が感染の18日後に死亡した（図６）。抗体番号2074群では、12マウスのうち９がウイルスチャレンジの第24日に生存した。従って、抗M2ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体番号2074は、A/PR/8/34ウイルスに感染したマウスの生存率を有意に増加した。
【０１６１】
データは、抗M2抗体がウイルス感染後の投与によってもなお効果的であることを示した。これは、抗体を予防だけでなく治療用にも利用しうることを示唆する。
【０１６２】
他の２セットの評価研究を実施した。インフルエンザA/PR/8/34の致死用量ウイルスチャレンジをC57BL/6Jマウスに与え、そして１、２および３日後に、抗M2抗体C40G1、C40G4、L30、F1、F2および番号2074（ポジティブ対照として）を200μg/マウスにて各時点で腹腔内注射により投与した（それぞれの群についてn＝８または12マウス）。対照群（全８または12マウス）は抗HSA特異的ヒトIgG1抗体注射を受けた。L30、C40G4、F1およびF2抗体は、対照群と比較して、ウイルス感染マウスの生存率を延長しなかった（図3A、B）。対照的に、C40G1抗体はウイルスチャレンジから明白な保護を与え、この群の全てのマウスは感染の30日後でもなお生存することを示した（図3A）。
【０１６３】
C40G1、L30およびC40G4抗体のA/PR/8/34感染細胞上に発現したM2（図4B、表４）またはM2-BSA結合体（図4A）に対する結合親和性は、お互いに有意差がなかった。C40G1とC40G4は、それらが両方ともC40抗体由来であるので、同じ抗原結合部位を有する。L30（IgG2）およびC40G4（IgG4）はウイルスチャレンジからの保護を与えなかったがC40G1は有意に保護を与えたので、IgG1型抗体は潜在的にin vivo用途のより優れた候補である。対照的に、F1およびF2抗体はウイルス感染細胞上のM2との結合は弱いが、これらの抗体はM2-BSA結合体とよく結合する（図4A、B、表4）。F1およびF2抗体のウイルス感染細胞上のM2との結合が弱いのは、in vivoの保護効果が欠けることを説明しうる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】C40抗体の免疫グロブリン軽鎖可変域（C40Lv（配列番号10））および重鎖可変域（C40Hv（配列番号9））のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図解する。
【図２】抗体番号2074、N547、L66およびC40G1が、A)A/PR/8/34およびB)A/HK/8/68ウイルスに感染したMDCK細胞のM2と結合することを示す。
【図３】A)C40G1、C40G4およびL30；ならびにB)番号2074、F1およびF2抗体の保護有効性の比較を示し、そしてIgG1アイソタイプM2抗体は、ウイルス感染MDCK細胞上M2との結合親和性が弱い抗体（すなわちF1およびF2）より大きい致死的ウイルスチャレンジからの動物の保護を与えることを示す。
【図４】A)M2ペプチド／BSAとのM2抗体結合およびB)インフルエンザウイルス感染細胞上に発現したM2に対するM2抗体結合の比較を図解する。
【図５】M2抗体番号2074を投与した動物の予防保護を示す。
【図６】M2抗体番号2074を投与した動物の治療保護を示す。
【配列表】
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2005519619.tif 000022
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005519619.tif 000027
【図６】
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【国際調査報告】
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