(57)【要約】脂肪酸生合成、特にデサチュラーゼおよびまたは伸長酵素の酵素活性を調節することができる潜在的治療薬の同定のためのハイスループットスクリーニング分析法が、脂肪酸代謝関連疾患の予防およびまたは治療のための前記分析法によって同定された薬剤の治療的使用とともに開示される。前記分析法に有用な基質もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デサチュラーゼ調節剤の同定方法であって、
ａ）デサチュラーゼ反応性炭素原子に結合するトリチウム標識を構成する基質の存在下、およびトリチウム化水の放出とともに前記の反応性炭素原子が関与する二重結合を形成するために、前記反応性炭素原子位置で前記基質の不飽和化を促進する条件下で、化合物とデサチュラーゼ酵素活性を持つミクロソームを接触させ、
ｂ）前記トリチウム化水の生成を検出し、
ｃ）段階ａ）の化合物が存在しない場合と比較した、前記トリチウム化水の生成量または率の違いを検出し、
それによりデサチュラーゼ活性の調節剤を同定することより成ることを特徴とする同定方法。
【請求項２】
前記調節が、デサチュラーゼ活性の減少であることを特徴とする請求項１記載の同定方法。
【請求項３】
前記調節が、デサチュラーゼ活性の増加であることを特徴とする請求項１記載の同定方法。
【請求項４】
前記段階ｃ）の違いが、前記の検出されたトリチウム化水の量における違いであることを特徴とする請求項１記載の同定方法。
【請求項５】
前記段階ｃ）の違いが、前記トリチウム化水の生成率における違いであることを特徴とする請求項１記載の同定方法。
【請求項６】
前記トリチウム標識が、基質分子の一つの反応性炭素原子のみに付着することを特徴とする請求項１記載の同定方法。
【請求項７】
前記トリチウム標識が、基質分子の二つの反応性炭素原子に付着することを特徴とする請求項１記載の同定方法。
【請求項８】
前記デサチュラーゼが、デルタ−５デサチュラーゼであることを特徴とする請求項１記載の同定方法。
【請求項９】
前記基質が、２０炭素原子長の骨格を持つ脂肪酸の補酵素Ａ結合型であることを特徴とする請求項８記載の同定方法。
【請求項１０】
前記基質が、ジホモガンマリノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ６）、２０：４ｎ３および２０：２ｎ９より成るグループから選択された一つの補酵素Ａ結合型であることを特徴とする請求項８記載の同定方法。
【請求項１１】
前記トリチウム標識が、基質の炭素原子５および６にあることを特徴とする請求項１０記載の同定方法。
【請求項１２】
前記基質が、２０：３ｎ６、２０：４ｎ３および２０：２ｎ９より成るグループから選択された一つの補酵素Ａ結合型であることを特徴とする請求項８記載の同定方法。
【請求項１３】
前記トリチウム標識が、基質の炭素原子５および６にあることを特徴とする請求項１２記載の同定方法。
【請求項１４】
前記デサチュラーゼが、デルタ−６デサチュラーゼであることを特徴とする請求項１記載の同定方法。
【請求項１５】
前記基質が、１８あるいは２４炭素原子長の骨格を持つ脂肪酸の補酵素Ａ結合型であることを特徴とする請求項１４記載の同定方法。
【請求項１６】
前記基質が、リノール酸（１８：２ｎ６）、２４：４ｎ６、アルファ−リノレン酸（１８：３ｎ３）、２４：５ｎ３および１８：１ｎ９より成るグループから選択された一つの補酵素Ａ結合型であることを特徴とする請求項１４記載の同定方法。
【請求項１７】
前記トリチウム標識が、基質の炭素原子６および７にあることを特徴とする請求項１６記載の同定方法。
【請求項１８】
伸長酵素およびまたはデサチュラーゼ調節剤の同定方法であって、
ａ）伸長酵素と伸長酵素の基質であってデサチュラーゼ活性酵素の基質ではないものの存在下、前記デサチュラーゼの基質であり、デサチュラーゼ反応性炭素原子に結合するトリチウム標識を構成する伸長産物を形成するために前記基質の伸長を促進する条件下、およびトリチウム化水の放出とともに前記デサチュラーゼ反応性炭素原子の関与する二重結合を形成するために前記サチュラーゼの基質の不飽和化を促進する条件下で、化合物をデサチュラーゼ酵素活性を持つミクロソームに接触させ、
ｂ）前記トリチウム化水の生成を検出し、
ｃ）段階ａ）の化合物が存在しない場合と比較した、前記トリチウム化水の生成量または率の違いを検出し、
それにより伸長酵素およびまたはデサチュラーゼ活性の調節剤を同定することより成ることを特徴とする同定方法。
【請求項１９】
前記調節が、デサチュラーゼおよびまたは伸長酵素活性の減少であることを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２０】
前記調節が、デサチュラーゼおよびまたは伸長酵素活性の増加であることを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２１】
前記段階ｃ）の違いが、前記の検出されたトリチウム化水の量における違いであることを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２２】
前記段階ｃ）の違いが、前記トリチウム化水の生成率における違いであることを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２３】
前記トリチウム標識が、基質分子の一つのデサチュラーゼ反応性炭素原子のみに付着することを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２４】
前記トリチウム標識が、基質分子の二つのデサチュラーゼ反応性炭素原子に付着することを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２５】
前記デサチュラーゼが、デルタ−５デサチュラーゼであることを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２６】
前記伸長酵素の基質が、１６、１８、２０あるいは２２炭素原子の骨格を持つ脂肪酸を含むことを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２７】
前記伸長酵素の基質が、ｎ７あるいはｎ９経路の基質であることを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２８】
前記伸長酵素の基質が、１８：２ｎ９、２０：３ｎ９、１８：１ｎ９、２０：１ｎ９、２２：１ｎ９、１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ７および２０：１ｎ７より成るグループから選択された一つであることを特徴とする請求項１８記載の同定方法。
【請求項２９】
伸長酵素調節剤の同定方法であって、
ａ）伸長酵素および伸長酵素の基質の存在下で、化合物を、デサチュラーゼ酵素活性を持つミクロソームと接触させ、ここで前記化合物は請求項１記載の同定方法を用いて示される前記デサチュラーゼ活性の調節因子ではなく、また前記基質は、前記デサチュラーゼ酵素活性の基質ではなく、またこの接触は、前記デサチュラーゼの基質であり、デサチュラーゼ反応性炭素原子へのトリチウム標識結合を構成する伸長産物を形成するために前記基質の伸長を促進する条件下、およびトリチウム化水の放出をとともに前記のデサチュラーゼ反応性炭素原子の関与する二重結合を形成するために前記デサチュラーゼの前記基質の不飽和化を促進する条件下で行われ、
ｂ）前記トリチウム化水の生成を検出し、
ｃ）段階ａ）の化合物が存在しない場合と比較した、前記トリチウム化水の生成量または率の違いを検出し、
それにより伸長酵素活性の調節剤を同定することより成ることを特徴とする同定方法。
【請求項３０】
前記調節が、デサチュラーゼおよびまたは伸長酵素活性の減少であることを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項３１】
前記調節が、デサチュラーゼおよびまたは伸長酵素活性の増加であることを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項３２】
前記段階ｃ）の違いが、前記の検出されたトリチウム化水の量における違いであることを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項３３】
前記段階ｃ）の違いが、前記トリチウム化水の生成率における違いであることを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項３４】
前記トリチウム標識が、基質分子の一つのデサチュラーゼ反応性炭素原子のみに付着することを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項３５】
前記トリチウム標識が、基質分子の二つのデサチュラーゼ反応性炭素原子に付着することを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項３６】
前記デサチュラーゼが、デルタ−５デサチュラーゼであることを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項３７】
前記伸長酵素の基質が、１８炭素原子の骨格を持つ脂肪酸を含むことを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項３８】
前記伸長酵素の基質が、ｎ７あるいはｎ９経路の基質であることを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項３９】
前記伸長酵素の基質が、１８：２ｎ９、２０：３ｎ９、１８：１ｎ９、２０：１ｎ９、２２：１ｎ９、１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ７および２０：１ｎ７より成るグループから選択された一つであることを特徴とする請求項２９記載の同定方法。
【請求項４０】
脂肪酸レベルの調節に有益な治療薬の同定方法であって、請求項１、１８あるいは２９記載の同定方法に従って薬剤を同定することより成り、さらに前記薬剤を動物に投与し、前記投与に続いて脂肪酸レベルにおける変化を検出し、それによりこのような治療薬を同定することより成ることを特徴とする同定方法。
【請求項４１】
前記動物が、変化した脂肪酸レベルに由来する代謝障害に苦しむ動物、あるいは脂肪酸レベルを変化させることが治療効果をもたらす代謝障害に苦しむ動物であることを特徴とする請求項４０記載の同定方法。
【請求項４２】
前記動物が、ヒトであることを特徴とする請求項４０記載の同定方法。
【請求項４３】
動物の脂肪酸代謝疾患の治療方法であって、請求項１、１８、２９あるいは４０記載の同定方法を用いて初めてデサチュラーゼおよびまたは伸長酵素調節剤であることが同定された化合物の治療的に有効な量を、前記疾患に苦しむ動物に投与することより成ることを特徴とする治療方法。
【請求項４４】
前記動物が、ヒトであることを特徴とする請求項４３記載の治療方法。
【請求項４５】
動物の脂肪酸代謝関連疾患の予防方法であって、請求項１、１８、２９あるいは４０記載の同定方法を用いて初めてデサチュラーゼおよびまたは伸長酵素調節剤であることが同定された化合物の治療的に有益な量を、前記疾患にかかり易い動物に投与することより成ることを特徴とする予防方法。
【請求項４６】
前記動物が、ヒトであることを特徴とする請求項４５記載の治療方法。
【請求項４７】
前記動物が、遺伝子的に前記疾患にかかり易いことを特徴とする請求項４５記載の治療方法。
【請求項４８】
ある成果を生み出す方法であって、請求項１、１８、２９あるいは４０記載の同定方法に従って薬剤を同定することより成り、ここで前記成果が前記同定方法の結果として前記薬剤に関して収集されたデータであり、またここで前記データが前記薬剤の化学的構造およびまたは性質を伝達するのに十分なものであることを特徴とする方法。
【請求項４９】
脂質関連疾患あるいは状態の予防方法であって、請求項１、１８、２９あるいは４０記載の同定方法において活性が示された薬剤の治療的に有効な量を、前記疾患が発症する危険性のある患者に投与することより成ることを特徴とする予防方法。
【請求項５０】
前記薬剤が、前記同定方法を用いて前記活性を持つことが初めて同定されたことを特徴とする請求項４９記載の予防方法。
【請求項５１】
前記疾患あるいは状態が、皮膚炎、循環器病、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス性疾患、ウイルス感染後の疲労、体重障害、精神障害、ガン、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール依存症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫性疾患、アトピー性疾患、急性呼吸困難症候群、関節軟骨分解、糖尿病、および糖尿病の合併症より成るグループから選択された一つであることを特徴とする請求項４９記載の予防方法。
【請求項５２】
脂質関連疾患あるいは状態の治療方法であって、請求項１、１８、２９あるいは４０記載の同定方法において活性が示された薬剤の治療的に有効な量を、脂質関連疾患あるいは状態に苦しむ患者に投与することより成ることを特徴とする治療方法。
【請求項５３】
前記薬剤が、前記同定方法を用いて活性を持つことが初めて同定されたことを特徴とする請求項５２記載の治療方法。
【請求項５４】
前記疾患あるいは状態が、皮膚炎、循環器病、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス性疾患、ウイルス感染後の疲労、体重障害、精神障害、ガン、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール依存症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫性疾患、アトピー性疾患、急性呼吸困難症候群、関節軟骨分解、糖尿病、および糖尿病の合併症より成るグループから選択された一つであることを特徴とする請求項５２記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年８月２９日に出願された合衆国仮出願６０／３１５７６３号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、潜在的な治療薬の同定に用いられるハイスループットスクリーニング分析、および前記分析により同定された薬剤の、脂肪酸代謝関連疾患の予防およびまたは治療のための使用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アシルデサチュラーゼ酵素は、食料源あるいは肝臓におけるｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって作られる脂肪酸中の二重結合の形成を触媒する。哺乳類は最低３つの異なるデサチュラーゼを合成し、前記の３つの異なるデサチュラーゼは、脂肪酸の不飽和化を異なる位置で触媒する。これらの酵素は、二重結合が挿入される炭素番号により言及され、二重結合はΔ９、Δ６およびΔ５位で起こり得る。結果として生じた一価不飽和脂肪酸あるいは多価不飽和脂肪酸は、リン脂質、トリグリセリドおよびコレステロールエステルへの組み込みのための基質である。
【０００４】
ヒトおよび他の哺乳類の細胞において、必須脂肪酸であるリノール酸（１８：２ｎ−６）およびアルファリノレン酸（１８：３ｎ−３）のミクロソームΔ６不飽和化は、ｎ−６およびｎ−３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）の生合成における最初の段階であり、また律速段階でもある。ミクロソームフラクションは、超遠心分離に続く粗面小胞体の破壊によって生じる、微粒子および他の組成物より成るフラクションであり、多くの主要な細胞性酵素の容易に産生可能な形態である。上述の反応の生成物は、続いてそれぞれ伸長してジホモガンマリノレン酸（ＤＧＬＡ）（２０：３ｎ−６）および２０：４ｎ−３生成物になる、ガンマリノレン酸（１８：３ｎ−６）およびステアリドン酸（１８：４ｎ−３）である。この結果生じた脂肪酸は、アラキドン酸（２０：４ｎ−６）および２０：５ｎ−３を産生するΔ５デサチュラーゼの基質として用いられる。アラキドン酸（２０：４ｎ−６）および２０：５ｎ−３は、さらに、それぞれ２２：４ｎ−６および２２：５ｎ−３に伸長し、最終的に２４：４ｎ−６および２４：５ｎ−３を形成するために用いられる。２０：３ｎ９（あるいはミード酸）を産生するデルタ−５デサチュラーゼは、ＤＧＬＡからアラキドン酸を産生する酵素と同じ酵素ではない。
【０００５】
前記に加え、第二ミクロソームΔ６不飽和化はＰＵＦＡｓで起こる。この不飽和化の生成物である、２４：５ｎ−６および２４：６ｎ−３は、ペルオキシソ−ムβ酸化によってそれぞれ２２：５ｎ−６および２２：６ｎ−３に変換される（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｈ．（２０００年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４８６巻、２１９から２３１ページ）。更に、２０：４ｎ−３の二配列伸長（すなわち、２２：４ｎ−３および２４：４ｎ−３）は、２２：６ｎ−３の合成における推定された選択的な段階の一部としてＳａｕｅｒｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌによって開示された（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ，Ｔ．Ｕ．、Ｈａｃｈｅｙ，Ｄ．Ｌ．、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｌ．、Ｃｈｅｎ，Ｈ．、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｈｅｉｒｄ  Ｗ．Ｃ．（１９９７年）Ｐｅｄｉｔａｒ．  Ｒｅｓ．４１巻、１８３から１８７ページ）。これらの著者は、２４：４ｎ−３が、Δ６デサチュラーゼの基質として作用することができる２４：５ｎ−３へのΔ９不飽和化を受けることが可能であると示唆している。１８：２ｎ−６、１８：３ｎ−３および２０：３ｎ−６の直接の伸長もまた報告されている。
【０００６】
１８炭素不飽和脂肪酸（１８：２ｎ−６あるいは１８：３ｎ−３）を認識するΔ６デサチュラーゼが、２４炭素基質を不飽和化する酵素と同一であることが証明されている（Ｄｅ  Ａｎｔｕｅｎｏ，Ｒ．Ｊ．、Ｋｎｉｃｋｌｅ，ＬＣ、Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．、Ｅｌｌｉｏｔ，Ｍ．Ｌ．、Ａｌｌｅｎ，Ｓ．Ｊ．、Ｎｗａｋａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｍ．Ｄ．（２００１年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５０９、７７から８０ページ、およびＩｎｎｉｓ，Ｓ．Ｍ．、Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｈ．、Ｈａｃｈｅｙ，Ｄ．、Ｅｄｍｏｎｄ，Ｊ．  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．（１９９９年）Ｌｉｐｉｄｓ．３４巻、１３９から１４９ページ）。Ｃｈｏと同僚はこのヒトΔ６デサチュラーゼを最初にクローン化し、一般に使用される１８炭素ＰＵＦＡ基質でのその活性を試験した者である（Ｃｈｏ，Ｈ．Ｐ．、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｄ．（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４巻、４７１から４７７ページ）。さらに、Ｓａｕｅｒｗａｌｄとその同僚（１９９７年）は、１８：３ｎ−３および１８：２ｎ−６で活性を持つ二つのΔ６不飽和化段階が互いに競合するだけでなく、２４：５ｎ−３および２４：４ｎ−６とも競合するであろうと示唆した。これについて取り組んでいる最近の評論において、Ｓｐｒｅｃｈｅｒは、単一の酵素がｎ−６およびｎ−３ファミリーの４つの異なる脂肪酸において活性を持つならば、Δ６デサチュラーゼの調節は動物あるいはヒトの研究においてかなり興味深いことだと強調している（参照、Ｓｐｒｅｃｈｅｒ、ｓｕｐｒａ）。
【０００７】
デルタ−６デサチュラーゼは、最低４つの異なる基質、１８：３ｎ６、２４：４ｎ６、１８：３ｎ３および２４：５ｎ３における不飽和化を行なった。参照、Ｄｅ  Ａｎｔｕｅｎｏ  ＲＪ．、Ｋｎｉｃｋｌｅ  ＬＣ．、Ｓｍｉｔｈ  Ｈ．、Ｅｌｌｉｏｔ  ＭＬ．、Ａｌｌｅｎ  ＳＪ．、Ｎｗａｋａ  Ｓ．、Ｗｉｎｔｈｅｒ  ＭＤ．、“Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｄｅｌｔａ５  ａｎｄ  Ｄｅｌｔａ６  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅｓ  ｏｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎ−３  ａｎｄ  ｎ−６ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ”、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１１月３０日、５０９巻（１）：７７から８０ページ（２００１年）；Ｄ′ａｎｄｒｅａ  Ｓ．、Ｇｕｉｌｌｏｕ  Ｈ．、Ｊａｎ  Ｓ．、Ｃａｔｈｅｌｉｎｅ  Ｄ．、Ｔｈｉｂａｕｌｔ  ＪＮ．、Ｂｏｕｒｉｅｌ  Ｍ．、Ｒｉｏｕｘ  Ｖ．、Ｌｅｇｒａｎｄ  Ｐ．、“Ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｒａｔ  Ｄｅｌｔａ−６ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｎｏｔ  ｏｎｌｙ  ａｃｔｓ  ｏｎ  １８−  ｂｕｔ  ａｌｓｏ  ｏｎ  ２４−ｃａｒｂｏｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｖｅｒｙ−ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．”Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３６４巻（Ｐｔ１）：４９から５５ページ（２００２年５月１５日）。さらに、１８：１ｎ９（オレイン酸）はまた、基質である（しかしながら、おそらく低親和性である）。
【０００８】
哺乳類の細胞にはいくつかの異なった伸長酵素が存在し、これらは異なった脂肪酸基質で活性を持つ。これらのいくつかの特性は示された（参照、Ｗｉｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ  ０２／４４３２０）。最低一つの例において、ヒト伸長酵素における遺伝的欠損はヒト疾患と関連しており、この酵素ファミリーの治療上の標的としての重要性を指摘している（Ｚｈａｎｇ，Ｋ．、Ｋｎｉａｚｅｖａ，Ｍ．、Ｈａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２７巻、８９から９３ページ）。
【０００９】
デルタ−９デサチュラーゼ活性は、溶液の状態でステアロイルＣｏＡのＣ９およびＣ１０位からのトリチウムの放出を測定することにより、ミクロソーム分析で間接的に測定することが可能である。本発明に従って、この種の分析は、効果的でかつ経済的なトリチウムを基本にした分析を使用して、他の広範囲なデサチュラーゼおよび伸長酵素に適用可能である。ここに開示された方法を用いて、脂肪酸あるいはトリグリセリド代謝の調節因子は容易に同定される。
【発明の開示】
【００１０】
（発明の簡単な要約）
一見地において、本発明はデサチュラーゼ調節剤を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）デサチュラーゼ反応性炭素原子に結合するトリチウム標識を構成する基質の存在下、およびトリチウム化水の放出とともに前記の反応性炭素原子が関与する二重結合を形成するために、前記の反応性炭素原子位置で前記基質の不飽和化を促進する条件下で、化合物とデサチュラーゼ酵素活性を持つミクロソームを接触させ、
ｂ）前記トリチウム化水の生成を検出し、
ｃ）段階ａ）の化合物が存在しない場合と比較した、前記トリチウム化水の生成量または率の違いを検出し、
それによりデサチュラーゼ活性の調節剤を同定することより成る。
【００１１】
その具体例として、調節は、デサチュラーゼ活性の増加あるいは減少であり得る。また調節は、検出された前記トリチウム化水の量における差異およびまたは前記トリチウム化水の生成率における差異として測定され得る。さらに、トリチウム標識は、デサチュラーゼ反応性炭素原子（すなわち、不飽和化反応の結果として二重結合を形成する炭素原子）の一方あるいは両方に存在し得る。好ましい実施例において、デサチュラーゼは、デルタ−５デサチュラーゼあるいはデルタ−５デサチュラーゼである。
【００１２】
デルタ−５デサチュラーゼの好ましい基質は、特にここでトリチウム標識が基質の炭素原子５および６にあるジホモガンマリノレン酸（２０：３ｎ６，ＤＧＬＡ）、２０：４ｎ３および２０：２ｎ９の補酵素Ａ結合型等の、２０炭素骨格脂肪酸を含む。
【００１３】
デルタ−６デサチュラーゼの好ましい基質は、１８炭素原子あるいは２４炭素原子の骨格を持つ脂肪酸の補酵素Ａ結合型、好ましくはα−リノレン酸（１８：３ｎ３）、２４：５ｎ３、リノール酸（１８：２ｎ６）、１８：１ｎ９あるいは２４：４ｎ６の補酵素Ａ結合型、特にここでトリチウム標識が基質の炭素原子６および７にある基質を含む。
【００１４】
他の一見地において、本発明は伸長酵素およびまたはデサチュラーゼ調節剤を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）伸長酵素とその基質であってデサチュラーゼ酵素活性の基質ではないものの存在下、前記デサチュラーゼの基質であり、デサチュラーゼ反応性炭素原子に結合するトリチウム標識を構成する伸長産物を形成するために前記基質の伸長を促進する条件下、およびトリチウム化水の放出とともに前記デサチュラーゼ反応性炭素原子の関与する二重結合を形成するために前記デサチュラーゼの基質の不飽和化を促進する条件下で、化合物をデサチュラーゼ酵素活性を持つミクロソームに接触させ、
ｂ）トリチウム化水の生成を検出し、
ｃ）段階ａ）の化合物が存在しない場合と比較した、前記トリチウム化水の生成量または率の違いを検出し、
それにより伸長酵素およびまたはデサチュラーゼ活性の調節剤を同定することより成る。
【００１５】
好ましい実施例は、前記調節がデサチュラーゼおよびまたは伸長酵素活性における増加あるいは減少であり、好ましくは、デサチュラーゼはデルタ−５デサチュラーゼであり、伸長酵素のための基質は１６、１８、２０あるいは２２炭素原子骨格脂肪酸であることを含む。
【００１６】
伸長酵素の基質はまた、ｎ９経路（オレイン酸１８：１ｎ９で始まる）およびｎ７経路（パルミチン酸（１６：０）で始まる）の基質であり得る。伸長の基質は、１８：２ｎ９、２０：３ｎ９、１８：１ｎ９、２０：１ｎ９、２２：１ｎ９、１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ７、２０：１ｎ７である。
【００１７】
さらなる一見地において、本発明は伸長酵素調節剤を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）伸長酵素およびその基質の存在下で、化合物を、デサチュラーゼ酵素活性を持つミクロソームと接触させ、ここで前記化合物はデサチュラーゼ活性の調節因子を決定するための伸長酵素を伴わないここで開示された方法を用いて示された前記デサチュラーゼ活性の調節因子ではなく、またここで前記基質は、前記デサチュラーゼ酵素活性の基質ではなく、またこの接触は、前記デサチュラーゼの基質であり、またデサチュラーゼ反応性炭素原子に結合するトリチウム標識を構成する伸長産物を形成するために前記基質の伸長を促進する条件下、およびトリチウム化水の放出とともに前記のデサチュラーゼ反応性炭素原子の関与する二重結合を形成するために前記デサチュラーゼの前記基質の不飽和化を促進する条件下で行われ、
ｂ）前記トリチウム化水の生成を検出し、
ｃ）段階ａ）の化合物が存在しない場合と比較した、前記トリチウム化水の生成量または率の違いを検出し、
それにより伸長酵素活性の調節剤を同定することより成る。
【００１８】
好ましい実施例は、前記調節がデサチュラーゼおよび伸長酵素活性における増加あるいは減少であり、好ましくは、デサチュラーゼはデルタ−５デサチュラーゼであり、また伸長酵素のための基質は１８、２０あるいは２２炭素原子骨格脂肪酸である。
【００１９】
伸長酵素の基質はまた、ｎ９経路（オレイン酸１８：１ｎ９で始まる）およびｎ７経路（パルミチン酸（１６：０）で始まる）の基質を含み得る。伸長基質は、１８：２ｎ９、２０：３ｎ９、１８：１ｎ９、２０：１ｎ９、２２：１ｎ９、１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ７、２０：１ｎ７であり得る。
【００２０】
さらなる一見地において、本発明は、各種の疾患における診療を実現するために、脂肪酸レベルの調節に有益な治療薬を同定するための方法に関し、前記方法は、本発明の調節剤決定方法に従って薬剤を同定することより成り、さらに、前記薬剤を動物に投与し、つづいて前記投与後の前記トリグリセリドレベルの減少を検出し、それにより、治療薬を同定することより成る。その好ましい実施例は、変化した脂肪酸代謝を示している代謝性疾患に苦しむ動物を含み、最も好ましくは、前記動物はヒトである。
【００２１】
またさらなる一見地において、本発明は、動物の脂肪酸代謝疾患を治療するための方法に関し、前記方法は、前記疾患に苦しむ動物に、本発明にしたがってここで開示された分析法を用いて初めてデサチュラーゼおよびまたは伸長酵素調節剤として同定された化合物の治療的に有効な量を投与することより成り、特にここで前記動物はヒトである。
【００２２】
またさらなる一見地において、本発明は脂肪酸代謝関連疾患を予防するための方法に関し、前記方法は、前記疾患にかかり易い動物に、本発明の分析法を用いて初めてデサチュラーゼあるいは伸長酵素調節剤として同定された化合物の治療的に有効な量を投与することより成り、好ましくはここで前記動物はヒトであり、最も好ましくは、遺伝子的に前記疾患にかかり易いヒトである。
【００２３】
またさらなる一見地において、本発明はある成果を生み出す方法に関し、前記方法は、本発明の任意の分析方法に従って薬剤を同定することより成り、ここで前記成果は前記方法の結果としての前記薬剤に関して収集されたデータであり、またここで前記データは前記薬剤の化学構造およびまたは性質を伝えるのに十分なものである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、潜在的治療薬の同定のためのハイスループットスクリーニング分析およびその使用法に関し、特に、前記分析は、デサチュラーゼおよび伸長酵素の両方の酵素のミクロソーム源を用いる。
【００２５】
本発明の分析は、脂肪酸合成に関与する特定の植物あるいは動物のデサチュラーゼおよび伸長酵素の調節因子を同定する。全ての分析は、当該特異的デサチュラーゼあるいは伸長酵素により認識される特定の不飽和化部位でトリチウム化された脂肪酸基質からの、水の形でのトリチウム放出を測定する。各分析法は、特定のデサチュラーゼあるいは伸長酵素の調節因子、特に小分子調節因子の同定に有効である単純で非常に有効なハイスループット分析である。次に述べられているように、これらの調節因子およびその類似体は、広範囲にわたるヒトの疾患において潜在的治療活性を持つ。
【００２６】
この経路において知られている酵素は、ヒトΔ５デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号  ＡＦ２２６２７３）、ヒトΔ６デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号  ＡＦ１２６７９９）およびＭｕｋｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ（ＷＯ  ００／１２７２０）に記載された酵素であり、また新しいヒト伸長酵素が“Ｈｕｍａｎｎ  Ｅｌｏｎｇａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ、Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｓａｍｅ”（参照  Ｗｉｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ、ＷＯ０２／４４３２０）に示されており、この開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【００２７】
本発明の分析において有効な酵素が厳密な基質特異性を持っていることは、十分に考慮すべきである。従って、本発明にしたがって、適切なトリチウム化基質を加えることにより、この基質を利用する酵素の調節因子は容易に同定される。
【００２８】
星印（＊）はトリチウム標識の存在を指す。全てのケースにおいて、トリチウム標識は不飽和化反応が起こる場所に位置する。表１は、本発明に従って分析した基質特異性酵素を開示する。
【００２９】
本発明の好ましい分析は、特定のトリチウム化基質を滴下したラットあるいはマウス肝臓ミクロソーム分析である。
【００３０】
【表１】
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前記にしたがって、本発明はデサチュラーゼ調節剤を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）デサチュラーゼ反応性炭素原子に結合するトリチウム標識を構成する基質の存在下、およびトリチウム化水の放出とともに前記の反応性炭素原子の関与する二重結合を形成するために、前記の反応性炭素原子位置で前記基質の不飽和化を促進する条件下で、化合物とデサチュラーゼ酵素活性を持つミクロソームを接触させ、
ｂ）前記トリチウム化水の生成を検出し、
ｃ）段階ａ）の化合物が存在しない場合と比較した、前記トリチウム化水の生成量または率の違いを検出し、
それによりデサチュラーゼ活性の調節剤を同定することより成る。
【００３１】
この方法の具体的な実施例において、調節は、デサチュラーゼ活性の増加あるいは減少であり、また段階（ｃ）の違いが、検出された前記のトリチウム化水の量の違いおよびまたは前記トリチウム化水の生成率における違いである実施例を含む。例えば、阻害剤が酵素の不可逆的阻害剤である場合、反応は完了しないかもしれない。従って、前記反応の特定期間後に検出されたトリチウム化水の量は、試験される化合物が存在しない場合よりも少ない。代わって、前記化合物がデサチュラーゼの競合的あるいは非競合的阻害剤である場合、反応速度は時間的に異なり得るが、トリチウム化水の全体的な生成は同じであろう。加えて、本発明の方法でのトリチウム化水の検出は、定性的あるいは定量的であり、従って、生成物の実際量は測定できる。また、調節活性について試験される化合物の存在下での反応は、化合物が存在しない場合のケースと比較され得る。更に、トリチウム化水の生成測定は、ある試験化合物の活性と他の化合物の活性を比較するのに用いられ得る。例えば、化合物１がトリチウム化水の生成率を化合物２による引き下げの２倍引き下げる場合、化合物１は本発明において、化合物２よりも酵素の調節あるいは阻害において２倍の有効性があると考えられ得る。一連の試験化合物をスクリーニングすることで、最も有効な化合物を見つけることが可能である。
【００３２】
不飽和化のための基質は、もちろん炭素−炭素二重結合を含む生成物に変換される。デサチュラーゼとの反応の結果として二重結合を形成する基質における炭素原子は、ここではデサチュラーゼ反応性炭素原子と呼ばれる。これは、トリチウムが別の飽和した炭素原子の一つの水素を置き換えるトリチウム標識を含むこれらの炭素原子の一つまたは両方である。従って、本発明の一つの実施例において、トリチウム標識は、基質分子の一つの反応性炭素原子のみに付着するが、別の実施例においては、トリチウム標識は同じ基質分子の二つの反応性炭素原子に付着する。どちらの実施例も、ここに開示された発明の全体的有用性を制限するにいたらない。
【００３３】
本発明の方法の他の具体的な実施例において、デサチュラーゼはデルタ−５デサチュラーゼである。さらなる実施例において、基質は、デサチュラーゼがデルタ−５デサチュラーゼである、２０炭素原子長の骨格を持つ脂肪酸の補酵素Ａ結合型である。好ましい実施例において、前記デサチュラーゼの基質は、例えば表１において開示された基質であり、特に、基質は、ジホモガンマリノレン酸、ＤＧＬＡ（２０：３ｎ６）、２０：２ｎ９および２０：４ｎ３より成るグループから選択された一つの補酵素Ａ結合型である。その具体的な実施例において、トリチウム標識は、基質の炭素原子５および６に付く。
【００３４】
本発明の方法のさらなる実施例において、デサチュラーゼはデルタ−６デセサチュラーゼである。他の実施例において、基質は、１８炭素原子あるいは２４炭素原子長の骨格を持つ脂肪酸の補酵素Ａ結合型である。好ましい実施例において、基質は、表１の基質の一つなどのここで列挙されたものの一つであり、好ましくは、基質は、リノール酸（１８：２ｎ６）、アルファ−リノレン酸（１８：３ｎ３）、オレイン酸（１８：１ｎ９）、２４：４ｎ６および２４：５ｎ３より成るグループから選択された一つの補酵素Ａ結合型である。その非常に好ましい実施例において、トリチウム標識は、基質の炭素原子６および７に付く。
【００３５】
本発明はさらに、伸長酵素およびまたはデサチュラーゼ調節剤の同定方法に関し、前記方法は、
ａ）伸長酵素およびデサチュラーゼ酵素活性の基質ではない前記伸長酵素の基質の存在下、デサチュラーゼの基質であり、またデサチュラーゼ反応性炭素原子に結合するトリチウム標識を構成する伸長産物を形成するために前記基質の伸長を促進する条件下、およびトリチウム化水の放出とともに前記デサチュラーゼ反応性炭素原子が関与する二重結合を形成するために、前記デサチュラーゼの前記基質の不飽和化を促進する条件下で、化合物とデサチュラーゼ酵素活性を持つミクロソームを接触させ、
ｂ）前記トリチウム化水の生成を検出し、
ｃ）段階ａ）の化合物が存在しない場合と比較した、前記トリチウム化水の生成量または率の違いを検出し、
それにより、伸長酵素およびまたはデサチュラーゼ活性の調節剤を同定することより成る。
【００３６】
この様な方法の具体例において、調節は、デサチュラーゼおよびまたは伸長酵素活性の減少あるいは増加である。他の好ましい実施例において、前記の段階ｃ）における違いは、上述のように、前記の検出されたトリチウム化水の量における違い、あるいは前記トリチウム化水の生成率における違いであり、また前記トリチウ標識は、基質分子の一つのデサチュラーゼ反応性炭素原子のみに付着するか、あるいは同じ基質分子の二つのデサチュラーゼ反応性炭素原子に付着する。好ましい実施例において、デサチュラーゼはデルタ−５デサチュラーゼである。他の好ましい実施例において、前記伸長酵素の基質は、１６、１８、２０あるいは２２炭素原子骨格脂肪酸、最も好ましくは１８炭素を含む。
【００３７】
伸長酵素の基質はまた、ｎ９経路の基質（オレイン酸１８：１ｎ９で始まる）およびｎ７経路の基質（パルミチン酸（１６：０）で始まる）であり得る。好ましい伸長基質は、１８：２ｎ９、２０：３ｎ９、１８：１ｎ９、２０：１ｎ９、２２：１ｎ９、１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ７、２０：１ｎ７である。表１に記された（そしてＣ２およびＣ３と標識された）ＥＰＡの基質のために、基質は二度の連続した伸長およびトリチウム化水産物を放出するためのデルタ−６不飽和化を受けることは考慮すべきである。この様な分析において、いずれか一方の段階は試験化合物によって阻害され得るが、全体的な結果として、さらなるスクリーニングのための比較的少数の化合物が産生されるであろう。
【００３８】
本発明に必要なトリチウム化基質を作成するための種々の合成経路は、この分野における通常の知識を有する者に知られている。デルタ−５デサチュラーゼ反応に用いるＤＧＬＡ基質が一つの例である。この２０：３ｎ−６脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＡ）を形成するためのデルタ−５不飽和化段階を測定する為に、（ＣＯＯＨあるいはＣｏＡの先頭グループから数えて）Ｃ５およびＣ６炭素上にトリチウム炭素を必要とする。トリチウム化水およびデルタ−５デサチュラーゼの存在下でのＡＡ−ＣｏＡの酵素の逆変換が技法に含まれる。この反応は、単純にデルタ−５デサチュラーゼの可逆的酵素活性を用い、トリチウム化マロニル−ＣｏＡの存在下で、過剰のＡＡ−ＣｏＡおよび植物、藻類あるいは微生物に基づいた合成によって促進される。この反応において、藻類、植物細胞または微生物（あるいはそれらの抽出物）は、Ｃ１４：０基質およびトリチウム化マロニル−ＣｏＡとともに与えられる。これらの生物体内の自然酵素は、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１およびＣ１８：２基質を形成するために鎖を伸長する。Ｃ１６：０の産生に十分な時間の経過後、反応は、非放射性（あるいはトリチウム化してない）マロニルＣｏＡで浸される。鎖伸長は、非放射性マロニル−ＣｏＡとともに継続する。その結果生じたＣ１８：２生成物はその後、Ｃ５−Ｃ６炭素位置でトリチウムの付着したＤＧＬＡを産生する為に、デルタ−６デサチュラーゼおよび伸長酵素と接触させられる。加えて、脂肪酸の完全合成は、数々のグループによって調査されてきた。収率は低いが、Ｃ５−Ｃ６炭素位置でトリチウム化した一組の炭素に加え、二つの炭素基質からＤＧＬＡを産生することが可能である。全ての炭素でトリチウム化しているＤＧＬＡを使用することもまた可能である。この基質は市販されている。豊富なデルタ−５デサチュラーゼ活性を持つミクロソーム抽出物中で使用された場合、優勢の、またおそらく排他的な減少がＣ５−Ｃ６で起こる。完全にトリチウム化した基質を用いる場合、一般に高レベルのバックグラウンドがあるが、分析条件は、他の反応とデルタ−５デサチュラーゼ活性を区別するために、この分野における通常の知識を有する者により最適化することが可能である。有効な合成方法はまた、合衆国特許第６４４１０３５号（２００２年８月２７日）に見られ、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【００３９】
ここで用いられたように、スクリーニング分析との関係において、“デルタ−５デサチュラーゼ”、“デルタ−６デサチュラーゼ”およびまたは“伸長酵素”は、全ての知られている、あるいはまだ発見されていない、遺伝子あるいはタンパク質の対立遺伝子、変異体、多形あるいは突然変異体を含み、また特に、前記のヒト、ネズミおよびラット等、他の哺乳類、他の脊椎動物、および無脊椎動物、単細胞生物およびウイルスなどに見られるあらゆる生物種由来の全てのオルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）およびホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）を含む、基になる遺伝子またはタンパク質の機能的な全ての変異体（使用に基づく）を含むように考慮すべきである。もちろん、スクリーニング分析は、活性を阻害する化合物を同定するために必要な生物学的活性を持つ酵素を用いることを必要とする。これらの化合物は、本発明の治療薬あるいはそれらの類似体である。好ましい実施例において、スクリーニング分析は、哺乳類細胞あるいは機能的な形の遺伝子を含んでいるプラスミド発現構成物で形質転換した組換え細胞のミクロソーム抽出物などの哺乳類形態の遺伝子を用いる。この分野における通常の知識を有する者は、遺伝子あるいはタンパク質配列の公のデータベース（すなわちＧｅｎＢａｎｋ）からこの様な変異体やオルトログをどのように同定するか知っており、あるいは、正確な遺伝子あるいはタンパク質の配列がまだ知られていない動物細胞から、ミクロソーム抽出物を調製することができる。
【００４０】
脂肪酸代謝の酵素を調節する化合物が、トリグリセリド代謝に関連する多くの疾患などの脂肪酸代謝の異常により引き起こされ、あるいはこのような異常に関連する疾患の患者の有害な影響を調節するのに有効なため、本発明は多くの治療学的用途を持つ。（例えば図２および３に見られる）デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼおよび伸長酵素により調節される脂肪酸代謝経路に関連することがこの分野において知られており、また本発明のスクリーニング分析によって同定される化合物が使用され得る疾患および障害の限定されない概要は、炎症、痛み、無痛覚症、血管疾患および循環器疾患、異常脂質血症、糖尿病（Ｉ型あるいはＩＩ型）、肥満、代謝病、代謝性症候群および皮膚病（皮膚ガンを含む）である。これらの広範な種類は、この分野における通常の知識を有する者に知られる広範囲の特異的疾患および異常に及ぶ。
【００４１】
本発明はさらに、伸長酵素調節剤の同定方法に関し、前記方法は、
ａ）伸長酵素およびその基質の存在下で、化合物を、デサチュラーゼ酵素活性を持つミクロソームと接触させ、ここで前記化合物は請求項１記載の方法を用いて示される前記デサチュラーゼ活性の調節因子ではなく、また前記基質は前記デサチュラーゼ酵素活性の基質ではなく、またこの接触は、前記デサチュラーゼの基質であり、デサチュラーゼ反応性炭素原子へのトリチウム標識結合を構成する伸長産物を形成するために前記基質の伸長を促進する条件下、およびトリチウム化水の放出とともに前記のデサチュラーゼ反応性炭素原子の関与する二重結合を形成するために前記デサチュラーゼの前記基質の不飽和化を促進する条件下で行われ、
ｂ）前記トリチウム化水の生成を検出し、
ｃ）段階ａ）の化合物が存在しない場合と比較した、前記トリチウム化水の生成量または率の違いを検出し、
それにより伸長酵素活性の調節剤を同定することより成る。
【００４２】
すでに開示されたように、調節が、デサチュラーゼおよびまたは伸長酵素活性の減少あるいは増加であり、前記の段階ｃ）における違いが検出されたトリチウム化水の量における違いあるいは前記トリチウム化水の生成率における違いであり、また前記トリチウム標識が基質分子の一つのデサチュラーゼ反応性炭素原子のみ、あるいは同一基質分子の二つのデサチュラーゼ反応性炭素原子に付着する場合が実施例に含まれる。
【００４３】
この方法の好ましい実施例において、デサチュラーゼはデルタ−５あるいはデルタ−６デサチュラーゼである。より好ましい実施例において、前記伸長酵素の基質は、１８炭素原子の骨格を持つ脂肪酸より成るため、生成物は２０炭素原子の骨格を持つ（一般的にデルタ−５デサチュラーゼは、基質として２０炭素原子脂肪酸のみを利用するため）。分析に用いられたデサチュラーゼが伸長酵素の対応産物を基質として受容する限り、伸長酵素の基質は任意の数、一般的に偶数の炭素を持ち得るので、これはもちろん、決して伸長酵素活性の調節剤を検出するための発明の有用性を制限するものではない。
【００４４】
伸長酵素の他の基質は、１６、１８、２０および２２炭素原子骨格脂肪酸、特に１８炭素原子を含む。伸長酵素の基質はまた、ｎ９経路（オレイン酸１８：１ｎ９で始まる）およびｎ７経路（パルミチン酸（１６：０）で始まる）の基質であり得る。好ましい伸長基質は、１８：２ｎ９、２０：３ｎ９、１８：１ｎ９、２０：１ｎ９、２２：１ｎ９、１６：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ７、２０：１ｎ７であり得る。
【００４５】
また、このような薬剤は、特に、一生のうちにこの様な疾患を遺伝的にまたは別の要因で発病し易い動物、好ましくはヒトにおけるこの様な疾患の発病の予防に利用することができる。従って、本発明はまた、上昇したトリグリセリドレベルを引き下げるために有益である治療薬を同定するための方法に関し、前記方法は、本発明の方法に従ってデサチュラーゼおよびまたは伸長酵素調節剤を同定することより成り、さらに、前記薬剤を動物に投与し、続いてトリグリセリドレベルの低下を検出し、それにより、このような治療薬を同定することより成る。その好ましい実施例において、前記動物は、上昇したトリグリセリドレベルに苦しむ動物である。より好ましい実施例において、前記動物はヒトである。
【００４６】
この様な治療あるいは調査目的に用いられる場合、本発明の分析方法によって同定された化合物あるいは他の薬剤は通常、液体、懸濁液あるいは別の形状で、任意の有用な希釈剤あるいは賦形剤を含む薬学的許容担体中に存在する。ここで有益な薬学的化合物は、化合物を受容した個体に有害な抗体の産生を誘導せず、過度の毒性無く投与することができる任意の薬剤を含む。薬学的許容担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含むがこれに限定されるものではない。静脈内投与が好まれるが、例えば、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、脳室内、関節包内、脊髄内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、あるいは経口投与などの任意の適切な投与経路を用いることができる。治療上の処方は、液体あるいは懸濁液の形状であり得る。経口投与に対しては、処方は錠剤あるいはカプセルの形状であり、鼻腔内投与に対しては、粉末、点媚薬あるいはエアロゾルの形状であり得る。
【００４７】
薬学的許容単体、希釈液および他の賦形剤についての詳細な検討は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に示されている。非経口投与処方には、例えば、賦形剤、減菌水あるいは生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物性オイルあるいは水素化ナフタレンが含まれ得る。生体適合性の生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーあるいはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、化合物の放出を調節するために用いられ得る。本発明の作用薬のための他の潜在的に有効な非経口的送達系は、エチレンビニル酢酸塩コポリマー粒子、浸透圧性ポンプ、移植可能な注入システムおよびリポソームを含む。吸入のための処方には、賦形剤あるいは例えばラクトースを含み、または例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であり、あるいは点鼻薬の形状あるいはゲルとしての投与のための油剤であり得る。
【００４８】
本発明はまた、ある成果を生み出す方法を構成する方法に関し、前記方法は、本発明で開示された薬剤同定法の一つに従って薬剤（すなわち、ここで開示されたデサチュラーゼおよびまたは伸長酵素活性の調節剤、および本発明の分析法を用いて同定できる、脂肪酸代謝の他の全ての調節剤）を同定することより成り、前記成果は、前記同定法あるいは分析法の結果として前記薬剤に関して収集されたデータであり、前記データは前記薬剤の化学的特性およびまたは構造およびまたは性質を伝達するのに十分なものである。例えば、本発明は特に、本発明の分析法の使用者が望ましい酵素調節活性を持つ化合物をスクリーニングするために分析法を用い、化合物を同定し、その後、薬剤を複製し、本発明に従って治療あるいは調査目的で薬剤を投与するために情報を利用する他の使用者に情報（すなわち、構造、投与量などについての情報）を伝達する状況を意図する。例えば、この分析法の使用者（使用者１）は、化合物の構造あるいは同一性を知らずに多数の試験化合物をスクリーニングし（例えば、多数のコード番号が用いられ、前記コード番号のみが付けられたサンプルが使用者１に渡される）、本発明の一つあるいはそれ以上の分析法を用いてスクリーニングを行なった後、特定の調節活性を持つ化合物を同定するための十分な情報（例えば、コード番号と対応する結果）を、口頭または文章あるいは同等の方法で、第２の使用者（使用者２）に伝え得る。この、使用者１から使用者２への情報の伝達は、本発明によって特に意図されている。
【００４９】
ここで考察された酵素は臨床上関連するため、本発明はまた脂質関連疾患あるいは状態の予防方法に関し、前記方法は、前記疾患が発症する危険性を持つ患者に、本発明の任意のスクリーニング法など、ここに開示された任意の分析法において活性が示された薬剤の治療上効果的な量を投与することより成る。好ましい実施例において、前記方法は、前記薬剤が前記分析法を用いて活性を持つことが初めて同定されたものである。従って、本発明の分析法の一つあるいはそれ以上において活性を持ちあるいは持ち得る任意の薬剤は、前記疾患あるいは状態の予防に有効である。
【００５０】
ここで用いられたように、“疾患あるいは状態”という用語は、特に医師団に認識された疾病、および技術的な理由で一般的に“疾患”として明確に定義あるいは認識できない状態、例えば過体重の状態、あるいは原因物質が同定されておらずまたは明確な一連の兆候以外の病因が開示されていないために、疾患ではなく症候群と考えられている状態に関する。
【００５１】
さらに本発明は、脂質関連疾患あるいは状態の治療方法に関し、前記方法は、脂質関連疾患あるいは状態に苦しむ患者に、本発明の分析法を用いて活性が認められている薬剤の治療上効果的な量を投与することより成る。その好ましい実施例において、前記薬剤は、前記分析法を用いて活性を持つことが初めて同定されたものである。
【００５２】
本発明の方法によって意図された脂質関連疾患および状態は、任意の脂肪酸代謝疾患を含む。本発明の好ましい実施例において、治療およびまたは予防されるべき脂質関連疾患あるいは状態は、皮膚炎、循環器病、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス性疾患、ウイルス感染後の疲労、体重障害、精神障害、ガン、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール依存症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫性疾患、アトピー性疾患、急性呼吸困難症候群、関節軟骨分解、糖尿病、および糖尿病の合併症より成るグループから選択されたひとつである。
【００５３】
研究論文、および公開された特許出願を含むここで引用された全ての刊行物の開示が、全体で引用例としてここに組み込まれるとみなされることは考慮すべきである。
【００５４】
本発明の方法の実施において、特定の緩衝液、培養液、試薬、細胞、培養条件およびその他同種のものについての参照は、限定することを意図するものではなく、この分野における通常の知識の一つが、本文で述べられた議論の特定状況において有効あるいは有用であると認めた全ての関連物質を含むように解釈されるべきである。例えば、一つの緩衝液系統あるいは培養液を他のものと置換することがしばしば可能であり、置換後も、同一でなくとも同様の結果を得ることができる。この分野における通常の知識を有する者は、必要以上の実験なしで、ここに開示された方法の実施における目的を最適に果たすように前記置換をすることができるように、前記系統および手順の十分な知識を備えている。
【００５５】
本発明は、以下の限定されない実施例において、詳細に開示されている。これらの方法および実施例が本発明をここに開示された実施例に限定するものではなく、また他の実施例および使用法が、確実にこの分野における通常の知識を有する者に示されていることは理解されるべきである。
【００５６】
以下の実施例において、“脂肪酸”という用語は、本発明の方法が、測定されるべき酵素活性（デルタ−５またはデルタ−６デサチュラーゼ）および組織源に依存して広範囲の異なった基質を試験することを可能にするので、基質として用いられる特異な脂肪酸のことを示す。脂肪酸が選択される場合に、この脂肪酸はトリチウム標識および非標識溶液の両方（実施例において開示されたように試薬５および６）に用いられる。脂肪酸基質の適切な選択およびトリチウム標識の位置は、分析を成功させるのに重要である。ここに開示された放射標識化合物は、遊離脂肪酸としてであろうと、補酵素Ａに結合している場合であろうと、完全に新規のものである。
【００５７】
複数の伸長酵素が存在し、また開示された分析法が、適切な基質が用いられていれば、任意の複数の伸長酵素を分析する為に用いることができることは、さらに考慮されるべきである。さらに、細胞あるいは組織抽出物は、当該伸長酵素が十分に存在する場合には、試料として用いることができる。
【実施例１】
【００５８】
肝ミクロソームにおけるデルタ−５あるいはデルタ−６デサチュラーゼ活性分析のための大量法
Ａ．緩衝液および試薬
１．  １Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４
約８００ｍｌの水に１２０ｇのＮａＨ２ＰＯ４を加え、
水を加え１Ｌ容積にし、
室温で保存する。
【００５９】
２．  １Ｍ  ＰＫ緩衝液
約８００ｍｌの水に１７４．１８ｇのＫ２ＨＰＯ４を加え、
１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４を用いてｐＨ７．２に調整し、
水を加え１Ｌ容積にし、
０．１Ｍ  ＰＫ緩衝液を産生するために、水を加えてこの水溶液を１０倍に希釈し、
室温で保存する。
【００６０】
３．  １０ｍＭ  ＮａＡｃｅｔａｔｅ：５０％エタノール溶液
約８００ｍｌの水に８２．０３ｇのＮａＣ２Ｈ３Ｏ２を加え、
氷酢酸を用いてｐＨ５．６に調整し、
水を加え１Ｌ容積にし、
２０ｍＭ貯蔵物を産生するために、この水溶液を５０倍に希釈し、ｐＨ５．６を確認し、
最終１０ｍＭ  ＮａＣ２Ｈ３Ｏ２／５０％エタノール水溶液を産生するために、１０ｍｌの２０ｍＭ貯蔵物を１０ｍｌの１００％エタノールに加え、
室温で保存する。
【００６１】
４．  ２０ｍＭ  ＮＡＤＨ（シグマ番号Ｎ−８１２９）
０．１Ｍ  ＰＫ緩衝液（毎日新しい物を作るべきである）の１ｍｌあたり１４．２１３ｍｇのＮＡＤＨを加え、乾燥機中に−２０℃で結晶状態で保存し、使用するまで２０ｍＭの水溶液を氷上で保存する。
【００６２】
５．  １．５ｍＭ脂肪酸−ＣｏＡ
正確な量の脂肪酸を１０ｍＭ  ＮａＣ２Ｈ３Ｏ２／５０％エタノール水溶液（毎日新しく作るべきである）に加え、これを結晶状態で−２０℃で保存し、使用するまで１．５ｍＭ水溶液を氷上で保存する。
【００６３】
６．  ３Ｈ−標識された脂肪酸、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから取り寄せたようなもの。脂肪酸の選択は、どの酵素が分析されるかに依存する
デルタ−６デサチュラーゼに対して、基質はリノール酸（６、９、１２−オクタデカジエン酸）あるいはアルファ−リノレン酸（９、１２、１５−オクダデカトリエン酸）、２４：４ｎ６あるいは２４：５ｎ３の補酵素Ａ結合型であり得る
デルタ−５デサチュラーゼに対して、基質はジホモガンマリノレン酸（８、１１、１４−エイコサトリエン酸）あるいは２０：４ｎ３のＣｏＡ結合型であり得る。全ての場合において、トリチウム標識は、不飽和化反応が起こる場所に位置する
１−２μＣｉ／分析点を用い、
貯蔵濃度は１ｍＣｉ／ｍｌであり、
−２０℃で保存し、ピペッティングの間、溶媒の蒸発を最小限に抑えるために、氷上に置いておく。
【００６４】
７．  １０倍ＰＢＳストック
８００ｍｌの水に
８０ｇのＮａＣＬ
２ｇのＫＣｌ
１１．５ｇのＮａ２ＨＰＯ４
２ｇのＫＨ２ＰＯ４を加え、
１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調整し、
１０倍のストックを産生するために１Ｌにする
備考：１倍ＰＢＳ培養液を作るために、１０倍ストックを蒸留水で１０倍に希釈する
室温で保存する。
【００６５】
８．  活性炭水溶液
１Ｌの１倍ＰＢＳ培養液に１００ｇの活性炭（シグマ番号Ｃ−３０１４）を加え、４℃で保存する。使用前および使用中、活性炭を懸濁液として保つために、この水溶液を常に攪拌しなければならない。
【００６６】
９．  ６％ＰＣＡ水溶液
９００ｍｌの水に過塩素酸の６０％ストック水溶液を１００ｍｌ加え、室温で保存する。
【００６７】
１０．  肝ミクロソーム
ストック濃度は、５ｍｇ総タンパク質量／０．１Ｍ  ＰＫ緩衝液ｍｌであり、−８０℃で保存する。酵素活性の低下を最小限に抑えるために、一度凍結融解する。
【００６８】
ある実施例において、分析方法に、以下の大容量“ベンチ”法が用いられ得る。
【００６９】
ベンチ法の手順は、分析点ごとに１．１ｍｌの総容量（０．２ｍｌの反応、０．２ｍｌのＰＣＡおよび０．７ｍｌの活性炭）を産生する。
【００７０】
１．  以下の化合物での分析前混合物の作成（分析点ごとに）
４μｌの１．５ｍＭ脂肪酸−補酵素Ａ（最終０．０３ｍＭ）
１μｌの１ｍＣｉ／ｍｌ  放射性３Ｈ脂肪酸（１μＣｉ）
２０μｌの２０ｍＭ  ＮＡＤＨ（最終２ｍＭ）
１５５μｌの０．１Ｍ  ＰＫ緩衝液
【００７１】
Ｎ個の分析点用に分析前混合物を作るために、
ａ．試薬容量をＮ倍に増やし、
ｂ．５％“クッション”（液体の取り扱いの正確さ次第で増減調整が可能である）を産生するために、結果的に生じた生成物を各試薬当たり１．０５倍に増やす。
【００７２】
２．  反応を開始するために行う２０μｌのミクロソームへの分析前混合物（１８０μｌ／分析点）の添加
ａ．反応は室温で起こり、
ｂ．反応維持時間は５分から３０分の範囲である
分析前混合物の添加の前に、前インキュベーション期間のときに、ミクロソームに“試験”化合物を加えることが得策である。
【００７３】
３．  反応を抑えるために行う１００μｌの６％ＰＣＡの添加および混合するために行うサンプルのボルテックス
【００７４】
４．  未反応基質の沈降のために行う７００μｌの活性炭懸濁液の添加
【００７５】
５．  混合するために行うサンプルの強いボルテックス
【００７６】
６．  １３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間のサンプルの遠心分離
【００７７】
７．  ４００μｌの上清の除去および計数バイアルへの移送（また、これは放射性基質を含んでいるため、表面に残っている活性炭ペレットあるいは薄膜を回収しないように注意する必要がある）
【００７８】
８．  ５ｍｌの液体シンチレーション計数（ＬＳＣ）用混合液の添加、混合およびサンプルの計数
【００７９】
バックグランド放射の測定のために、ミクロソーム酵素活性のない上清中に残存する３Ｈの量として定義したバックグランドシグナルを測定するために、“ブランク”を用いた。ブランクは、１８０μｌの反応混合物の添加の前にＰＣＡが添加されたサンプルである。新規に購入された放射性脂肪酸−ＣｏＡに対し、ブランクはシグナルの最大値の２％以下であった。ブランク値の上昇およびシグナル規模の減少は、保存中の基質分解を示すものである。
【実施例２】
【００８０】
少量法
また、分析法には少量“ＨＴＳ”法を利用することができる。少量ＨＴＳ法の手順は、分析点ごとに０．２１ｍｌの総容量（０．１ｍｌの反応、０．０１ｍｌのＰＣＡおよび０．１ｍｌの活性炭）を産生する。緩衝液組成は実施例１で述べられている。
【００８１】
１．  総容量を０．２１ｍｌに減少させるために、分析前混合物（分析点ごとの容量）に以下の変換を行なった
２μｌの１．５ｍＭ脂肪酸−補酵素Ａ（またはａ
１μｌの１ｍＣｉ／ｍｌ放射性３Ｈ脂肪酸−ＣｏＡ
１０μｌの２０ｍＭ  ＮＡＤＨ
６７μｌの０．１Ｍ  ＰＫ緩衝液
Ｎ個の分析点用の分析前混合物を作るために、
ａ．試薬容量をＮ倍に増やし、
ｂ．５％“クッション”を産生するために、結果的に生じた生成物を各試薬当たり１．０５倍に増やす
ｃ．備考：このクッションは、液体の取り扱いの正確さ次第で増減調整が可能である。
【００８２】
２．  反応を開始するために行なう２０μｌのミクロソームへの分析前混合物（８０μｌ／分析点）の添加
【００８３】
３．  １０μｌの６０％ＰＣＡの添加および混合するために行なうサンプルのボルテックス
【００８４】
４．  １００μｌの活性炭懸濁液の添加
【００８５】
５．  混合するために行なうサンプルの強いボルテックス
【００８６】
６．  １３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間のサンプルの遠心分離
【００８７】
７．  ５０μｌの上清の除去および計数バイアルへの移送（放射性基質が存在するために、表面に残っている活性炭ペレットあるいは薄膜を回収しないように注意する必要がある）
【００８８】
８．  ＬＳＣ用混合液の添加、混合およびサンプルの計数
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】特定の脂肪酸を説明するための、ここで用いた命名法を示した図
【図２】ヒトＮ−７およびＮ−９脂肪酸の生合成に関与する段階を示した図
【図３】Ｎ−３およびＮ−６多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）のヒトの生合成における主要な段階および関連酵素を示した図
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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