(57)【要約】ヒトを含む、霊長類の動物の免疫応答を刺激する能力を有する、非回文配列モチーフＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を含むオリゴヌクレオチド（ここで、Ｘ1はＣまたはＴであり、Ｘ2はＣ、Ｔ、ＧまたはＡであり、Ｘ3はＴまたはＡであり、Ｘ4はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ5はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ6はＴまたはＧであり、Ｘ7はＧであり、かつＸ8はＴであり、そしてここで、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5及びＸ6のうち少なくとも２つがＴであり、そしてここで、ＣはＧの前にない（言い換えると、この核酸モチーフは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されない）が開示される。免疫応答の刺激は、Ｂ細胞における増殖、分化、サイトカイン産生及び抗体産生、ならびに形質細胞様樹状細胞における細胞分化及びサイトカイン産生の刺激によって特徴付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8
を有する非回文核酸配列モチーフを含む、約１４〜１００ヌクレオチドを有する免疫賦活オリゴヌクレオチドであって、ここで、Ｘ1はＣまたはＴであり、Ｘ2はＣ、Ｔ、ＧまたはＡであり、Ｘ3はＴまたはＡであり、Ｘ4はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ5はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ6はＴまたはＧであり、Ｘ7はＧであり、かつＸ8はＴであり、そしてここで、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5及びＸ6のうち少なくとも２つがＴであり；ただしＸ1がＣである場合、Ｘ2はＴ、ＧまたはＡであり、そして該モチーフにおいて、ＣはＧの前にない。
【請求項２】
以下の式：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8
を有する非回文核酸配列モチーフを含む、約１４〜１００ヌクレオチドを有する免疫賦活オリゴヌクレオチドであって、ここで、Ｘ1はＣであり、Ｘ2はＴ、ＧまたはＡであり、Ｘ3はＴまたはＡであり、Ｘ4はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ5はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ6はＴまたはＧであり、Ｘ7はＧであり、かつＸ8はＴであり、そしてここで、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5及びＸ6のうち少なくとも２つがＴであり；ただし該モチーフにおいて、ＣはＧの前にない。
【請求項３】
Ｘ1がＣである、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6及びＸ8の全てがＴである、請求項１または２に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8がＴＴＴＴＧＴからなる、請求項１〜４に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
Ｘ1がＣであり、Ｘ3がＴまたはＡであり、Ｘ4がＴであり、Ｘ5がＴであり、Ｘ6がＴまたはＧであり、Ｘ7がＧであり、そしてＸ8がＴである、請求項１〜２に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
約１４〜４０ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
改変ホスフェート骨格を有する、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
５’インターヌクレオチド結合（５’ｉｎｔｅｒ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）におけるホスフェート骨格改変を有する、請求項８に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
３’インターヌクレオチド結合（３’ｉｎｔｅｒ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）におけるホスフェート骨格改変を有する、請求項８に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記インターヌクレオチド結合の少なくとも１つがホスホロチオエート結合である、請求項１〜８に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
５’−ＮＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｎ−３’
を含む配列を有する、請求項１〜１１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチドであって、ここでＮは、約３〜４６ヌクレオチド、好ましくは約３〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
【請求項１３】
５’−ＮＣＸ2ＴＴＴＴＧＴＮ−３’
を含む配列を有する、請求項１２に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチドであって、ここでＸ2は、ＴまたはＧまたはＣまたはＡである。
【請求項１４】
【化１】
2005533491.tif 000073
【化２】
2005533491.tif 000074
【化３】
2005533491.tif 000075
から選択されるヌクレオチド配列からなる免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴ（配列番号２）
である、免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
【化４】
2005533491.tif 000076
【化５】
2005533491.tif 000077
【化６】
2005533491.tif 000078
【化７】
2005533491.tif 000079
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記免疫賦活オリゴヌクレオチドが徐放送達ビヒクル中にカプセル化されている、請求項１〜１６に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記免疫賦活オリゴヌクレオチドが薬学的に許容される担体に含まれる、請求項１〜１６に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１〜１６に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項２０】
前記免疫賦活オリゴヌクレオチドがプラスミドに含まれる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
抗原をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗原が、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、腫瘍細胞、毒素、アレルゲン、タンパク質、糖脂質及び多糖類からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記抗原がウイルス性抗原、細菌性抗原、ヒトもしくは動物の腫瘍細胞及び／または真菌性抗原である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗原がプラスミドによりコードされる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
液体または凍結乾燥形態である、請求項１９〜２４に記載の組成物。
【請求項２６】
被験体におけるＢ細胞活性化の誘導のための；免疫系障害の処置、予防もしくは軽減のための；腫瘍性疾患の処置、予防もしくは軽減のための；及び／または形質細胞様樹状細胞活性化の誘導のための医薬を製造するための、請求項１〜１６に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２７】
前記被験体がヒトである、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドが１つ以上の抗原と複合体化している、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチド及び抗原が同時期（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓｌｙ）または同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）に投与される、請求項２６に記載の使用。
【請求項３０】
前記医薬が筋内、経口、鼻内、肛門、膣または経皮経路により投与される、請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、特に、非回文配列モチーフ：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8
を含むオリゴヌクレオチドを言及する
（ここで、Ｘ1は、ＣまたはＴであり、Ｘ2はＣ、Ｔ、ＧまたはＡであり、Ｘ3はＴまたはＡであり、Ｘ4は、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｘ5は、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｘ6は、ＴまたはＧであり、Ｘ7は、Ｇであり、かつＸ8は、Ｔであり、そしてここで、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5及びＸ6のうち少なくとも２つは、Ｔであり、そしてここでＣは、Ｇの前にない）。これらのオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む霊長類の動物において免疫賦活性であることが示された。
【０００２】
関連の参考文献
特許文献
【０００３】
【表１】
2005533491.tif 000002
【０００４】
その他の参考文献
【０００５】
【表２】
2005533491.tif 000003
【０００６】
【表３】
2005533491.tif 000004
【０００７】
【表４】
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【０００８】
【表５】
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【０００９】
【表６】
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【００１０】
【表７】
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【００１１】
【表８】
2005533491.tif 000009
【００１２】
【表９】
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【００１３】
【表１０】
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【００１４】
【表１１】
2005533491.tif 000012
【００１５】
【表１２】
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【００１６】
【表１３】
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【００１７】
【表１４】
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【００１８】
【表１５】
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【００１９】
【表１６】
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【００２０】
【表１７】
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【００２１】
【表１８】
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【００２２】
【表１９】
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【００２３】
【表２０】
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【００２４】
【表２１】
2005533491.tif 000022
【背景技術】
【００２５】
発明の背景
免疫系
免疫系の主要な機能は、侵入する病原体から宿主を保護することである。多数の異なる細胞型（抗原非依存性及び抗原特異的の両方）が、これらの侵入する病原体を検出及び中和するように進化してきた。これらの中で、リンパ球は、重要な特徴を有し、それは抗原を特異的に認識するそれらの能力であり、他のいずれの細胞も保有していない特徴である。これは、抗原によって刺激された任意のリンパ球の機能がその抗原にのみ指向されることを意味する。
【００２６】
リンパ球は、２つの主要な群：Ｔ及びＢに分けられる。Ｔリンパ球は、免疫応答の調節において中心的な役割を有し、そのために、これらは、リンホカイン（即ちインターロイキン）を産生及び分泌する。一方、Ｂリンパ球は、抗原を認識しそして結合するタンパク質である、抗体を産生する唯一の細胞である。
【００２７】
いくつかのＴリンパ球は、Ｂ細胞が抗体を産生することを補助するので、ヘルパー（Ｔｈ−リンパ球）として知られている。Ｔリンパ球は、ＣＤ４で表される特徴的な膜分子を発現する。他のＴリンパ球は特定の細胞を殺傷することができるので、細胞傷害性（ＣＴＬ）として知られている。これらは、ＣＤ８で表される異なる特徴的な膜タンパク質を発現する。
【００２８】
マウスにおいて、Ｔｈリンパ球は、これらが産生するリンホカインに従って、Ｔｈ０、Ｔｈ１及びＴｈ２で表されるグループに分類されている。一般的に、Ｔｈ１リンパ球は、マクロファージ及びＣＴＬを刺激するリンホカイン（ＩＬ２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−β）を産生し；Ｔｈ２リンパ球は、Ｂリンパ球を刺激して増殖させそして抗体を産生するリンホカイン（ＩＬ２、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１３）を産生し；そしてＴｈ０リンパ球は、リンホカインの混合物を産生し、そしてＴｈ１リンパ球及びＴｈ２リンパ球が誘導される中間のステージであると考えられる。ヒトにおいて、Ｔｈ１及びＴｈ２様リンパ球は実証されているが、これらは、これらのサイトカイン分泌のパターンに関して比較的厳密な区別を示さないようである。
【００２９】
Ｔ及びＢ細胞の主要なマーカー（ｍａｋｅｒ）を欠く第三の集団のリンパ球としては、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、キラー細胞（Ｋ細胞）及びリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）が挙げられる。ＮＫ細胞は、特定の腫瘍細胞及びいくつかのウイルス感染した細胞を殺傷することができるが、細胞傷害性Ｔリンパ球とは異なり、これらは、特定の抗原を認識することができない。第一に、これらは、標的の表面上に膜侵襲複合体を形成するパーフォリン分子を分泌することによって、標的細胞において穴を開けることができる。次いで、ＮＫ細胞は、標的細胞に入って自殺をさせる酵素を分泌することができる。破壊の第二の機構として、Ｆａｓリガンド（ＮＫ細胞上に存在するタンパク質）は、Ｆａｓ（標的細胞の表面上に存在する別のタンパク質）と相互作用して、標的細胞にアポトーシスによる自殺をさせることができる。ＮＫ細胞もまた、これらに対する抗体を有する細胞に、これらの抗原結合領域を介して結合し、そしてこれらを殺傷することができる。ＬＡＫ細胞は、抗原を特異的に認識しないが、これらは、ＮＫ細胞より広範囲の標的を破壊することができる。
【００３０】
マクロファージ及び樹状細胞は、免疫応答の開始において決定的に重要な役割を果たし、Ｔ細胞が抗原に応答するのを助ける。
【００３１】
いくつかのクラスの抗体が存在する。ＩｇＧクラスは、循環抗体のほとんどを含み、そしてそれは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４で表される４つのサブクラスを有する。ＩｇＭクラスは、循環抗体の約１０％を含む。これらは、一次免疫応答の間に産生される主要な抗体である。ＩｇＡクラスは、粘膜で分泌される抗体のほとんどを含み、そして体内への抗原のアクセスをブロックすることによってその保護効果を発揮する。ＩｇＤクラスは、血清抗体の１％未満を含み、そしてその生物学的役割は、大部分が未知である。ＩｇＥクラスは、ほとんどの細胞及び好塩基球の表面に主に結合する抗体を含む。これらの抗体は、アレルギー反応を経験している個体において生じる反応に関連する。
【００３２】
ワクチン及びワクチンアジュバント
ワクチンは、動物を刺激してワクチンに含まれる抗原に対する免疫応答を付与する（ｍｏｕｎｔ）ために用いられる調製物である。
【００３３】
ワクチンは、しばしば、特定の抗原と組み合わせて用いられて単独で用いられる抗原より高い免疫をもたらす物質であるアジュバントを含む（Ｒａｍｏｎ、Ｇ．１９２６、Ｐｒｏｃｅｄｅｓ  ｐｏｕｒ  ａｃｃｒｏｉｔｅ  ｌａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｅｓ  ａｎｔｉｔｏｘｉｎｓ．Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ．４０、１〜１０）。
【００３４】
多くの種類の化合物がワクチンアジュバントとして機能する（Ｅｄｅｌｍａｎ、Ｒ．、２０００．Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｕｓｅ，ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｄ．Ｔ．Ｏ’Ｈａｇｅｎ，Ｅｄ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ．本文献中に引用される参考文献は、本明細書中に背景資料として援用される）。
【００３５】
しかし、現在、ヒトにおいて使用が承認されているアジュバントは、アルミニウム塩（Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．及びＲｏｓｔ，Ｂ．Ｅ．、２０００．Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｄ．Ｔ．Ｏ’Ｈａｇａｎ，Ｅｄ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）及び水中油型エマルジョンＭＦ５９（Ｏｔｔ，Ｇ．Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｍａｎ，Ｒ．Ｆａｎｇ，Ｊ．及びＨｏｒａ，Ｍ．、２０００．Ｔｈｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｍ  Ｆ５９：Ａ  １０−Ｙｅａｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｄ．Ｔ．Ｏ’Ｈａｇａｎ，Ｅｄ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）のみである。
【００３６】
免疫賦活化合物としての核酸
いくつかのポリヌクレオチドが、免疫賦活特性を有することが実証されている。例えば、ポリ（Ｉ，Ｃ）は、インターフェロン（ＩＦＮ）産生、マクロファージ活性化及びＮＫ細胞活性化の誘導物質であり（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．、Ａｄａｍｓ，Ｊ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．、Ｌｅｎｚ，Ｂ．、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．、Ｓｃｈｌｉｃｋ，Ｅ．、Ｒｕｆｆｍａｎｎ，Ｒ．、Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，Ｒ．Ｈ．、Ｃｈｉｒｉｇｏｓ，Ｍ．Ａ．１９８５．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ−Ｌ：−ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：１０５８；Ｗｉｌｔｒｏｕｔ，Ｒ．Ｈ．、Ｓａｌｕｐ，Ｒ．Ｒ．、Ｔｗｉｌｌｅｙ，Ｔ．Ａ．、Ｔａｌｍａｇｅ，Ｊ．Ｅ．１９８５．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄ．４：５１２）、ポリ（ｄＧ，ｄＣ）は、Ｂ細胞について有糸分裂促進性であり（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｇｉｌｋｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．、Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．１９９３．Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１４８）そしてＩＦＮ及びＮＫ活性を誘導する（Ｔｏｃｕｎａｇａ，Ｔ．、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．、Ｎａｍｂａ，Ｋ．１９８８．Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ，ｐｏｌｙ（ｄＧ，ｄＣ），ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α／β  ａｎｄ  −γ，ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７９：６８２）。
【００３７】
細菌ＤＮＡも免疫賦活特性を有することも報告されている。これらの特性としてはサイトカイン（インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、α（ＩＦＮα）及びβ（ＩＦＮβ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン６（ＩＬ６）、１２（ＩＬ１２）及び１８（ＩＬ１８））の誘導、及びＢ細胞の直接的な賦活が挙げられる（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．ら、１９８８．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  α／β  ａｎｄ  γ  ｗｉｔｈ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ）７９：８６６−８７３；Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓ．ら、１９９２．ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｆｒｏｍ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：９８３−９９７；Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．、Ｙｉ，Ａ−Ｋ．、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．、Ｃｏｎｏｖｅｒ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．、１９９６．ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  γ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、２８７９−２８８３．Ｈａｌｐｅｒｎ，Ｍ．Ｄ．，ら、１９９６．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  −γ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  −１２  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  −α．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：７２−７８．Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ，Ｔ．ら、１９９７．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｓｅｎｓｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｖｉａ  ＤＮＡ  ｍｏｔｉｆｓ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  −α−  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｈｏｃｋ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１６７１−１６７９；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．ら、１９９５．ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｄｉｒｅｃｔ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：３４５−３４９）。
【００３８】
対照的に、哺乳動物ＤＮＡが有意な免疫効果を有さないことが報告されている（Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．１９９６．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４２１−４２３；Ｍｅｓｓｉｎａら、１９９１．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９）。
【００３９】
合成ＤＮＡが非メチル化ＣｐＧモチーフを保有する場合にそれが免疫賦活性であることも報告されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓら；１９９２．Ｕｎｉｑｕｅ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＩＮＦ  ａｎｄ  ａｕｇｍｅｎｔ  ＩＮＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６；Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．，ら、；１９９６．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１８４０−１８４５；Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．、Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．２０００．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：９４４；Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．、Ｗｅｅｒａｔｎａ，Ｒ．Ｄ．、Ｂａｌｌａｓ，Ｚ．Ｋ．、Ｐａｙｅｔｔｅ，Ｐ．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｓ．、Ｓｕｐａｒｔｏ，Ｉ．、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｗ．Ｌ．、Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．、Ｓａｊｕｔｈｉ，Ｄ．、Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．、Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．、Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．２０００．Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣｐＧ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１６１７；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，Ｄ．、ｌｓｈｉｉ，Ｋ．Ｊ．、Ｇｕｒｓｅｌ，Ｍ．、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｆ．、Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．２００１．Ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２３７２）。しかし、ＣｐＧモチーフを欠くホスホロチオエート結合を含有する１つのオリゴヌクレオチドが、ヒトＢ細胞に対して幾分かの免疫賦活活性を有することが見出されている（Ｌｉａｎｇ，Ｈ．、Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｙ．、Ｒｅｉｃｈ，Ｃ．Ｆ．、Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，Ｄ．Ｓ．、Ｌｉｐｓｋｙ，Ｐ．Ｅ．１９９６．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１１１９）。ホスホロチオエート結合を保有するこの特定の非ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチド長のポリＴ鎖である。また、Ｖｏｌｌｍｅｒら（Ｖｏｌｌｍｅｒ  Ｊ、Ｊａｎｏｓｃｈ  Ａ、Ｌａｕｃｈｔ  Ｍ、Ｂａｌｌａｓ  ＺＫ、Ｓｃｈｅｔｔｅｒ  Ｃ、Ｋｒｉｅｇ  ＡＭ．Ｈｉｇｈｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＣｐＧ−ｆｒｅｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉ���ｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２：１６５−１７５、２００２）は、ホスホロチオエートポリＴ  ＯＤＮによる免疫賦活を報告した。これらの著者らは、ポリＴ  ＯＤＮがホスホロチオエートＯＤＮとしてのみ活性であり、そしてＣｐＧ  ＯＤＮより非常に低い活性を有することを指摘した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００４０】
ここで、以下の非回文配列モチーフ：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8
（ここで、Ｘ1はＣまたはＴであり、Ｘ2はＣ、Ｔ、ＧまたはＡであり、Ｘ3はＴまたはＡであり、Ｘ4はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ5はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ6はＴまたはＧであり、Ｘ7はＧであり、かつＸ8はＴであり、そしてＣはＧの前にない（言い換えると、この核酸モチーフは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるものではない））を含む非ＣｐＧオリゴヌクレオチドがヒトを含む霊長類の動物において強力な免疫賦活活性を有することが発見された。従って、これらのオリゴヌクレオチドが、「免疫系不全」を処置するために被験体に投与され得、またはワクチンに対するより良好な応答を有するように免疫系をブーストするために、ワクチンと組み合わせて、アジュバントとして用いられ得る。これらはまた、被験体に腫瘍に対する応答性を増加させるためにも投与され得る。
【００４１】
発明の要旨
ここで、以下の非回文配列モチーフ：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8
（ここで、Ｘ1はＣまたはＴであり、Ｘ2はＣ、Ｔ、ＧまたはＡであり、Ｘ3はＴまたはＡであり、Ｘ4はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ5はＴ、ＣまたはＧであり、Ｘ6はＴまたはＧであり、Ｘ7はＧであり、そしてＸ8はＴであり、そしてここで、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5及びＸ6のうち少なくとも２つはＴであり、そしてここでＣはＧの前にない（言い換えると、この核酸モチーフは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドから構成されるものではない））を保有する非ＣｐＧオリゴヌクレオチドがヒトを含む霊長類の動物において免疫応答を賦活する能力を有することが発見された。
【００４２】
好ましい実施形態によれば、Ｘ1は、Ｃからなる。免疫賦活モチーフのＸ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6Ｘ7Ｘ8がＴＴＴＴＧＴ、ＡＴＴＴＧＴまたはＡＴＴＧＧＴからなることが好ましい。Ｘ1がＣであり；Ｘ3がＴまたはＡであり；Ｘ4がＴであり；Ｘ5がＴであり、Ｘ6はＴまたはＧであり、Ｘ7がＧであり、そしてＸ8がＴである場合、なおより有利である。
【００４３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の抗原を含むワクチン処方におけるアジュバントとして有用である。この局面の実施形態において、ワクチン処方物は、投薬形態において液体であり得または凍結乾燥され得る。多くの投薬形態が当該分野において公知であり、そして本明細書中において適用され得る。この局面の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、約１０〜１０，０００μｇ／用量の用量で組成物中に存在する。これらの調製物において、本発明のオリゴヌクレオチドは、他の免疫賦活化合物と組み合わされ得る。周知の免疫賦活剤の例は：α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）及びＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【００４４】
好ましい実施形態において、ワクチンの抗原性成分は、以下の様なウイルス：ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２），ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、インフルエンザウイルス、ハンターンウイルス、ブンガウイルス（ｂｕｎｇａ  ｖｉｒｕｓ）、出血熱ウイルス、レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、デルタ型肝炎の分類されない因子、非Ａ型、非Ｂ型の肝炎の因子、の天然または組換えの１つ以上の抗原；または以下の様な感染性細菌：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｎｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔｈａｒｒａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｉｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、以下の様な感染性真菌：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、以下の様な原生生物：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ並びにヒト腫瘍細胞の１つ以上の抗原である。この局面の実施形態において、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチド及び抗原が、同時に局所的（経口、直腸、鼻内または経皮経路によって）または全身的に（皮内または筋肉注射によって）投与される。
【００４５】
本発明の１つの局面は、ヒトにワクチン接種するための医薬を製造するための本発明のオリゴヌクレオチドの使用である。ヒトは、予防的または治療的にワクチン接種され得る。
【００４６】
予防ワクチンは、特異的な免疫の誘導を介して、感染性因子により引き起こされる疾患からの保護を誘発するように設計される。
【００４７】
治療ワクチンは、疾病（すなわち、腫瘍及び転移またはヒト免疫不全ウイルスの様な感染性因子に関連する疾病）の寛解を誘導するように設計される。
【００４８】
ワクチン接種の方法は、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチド及び１つ以上の抗原を投与することを含む−すなわち、このワクチンは、１つの疾患標的または疾患標的の組み合わせに対して設計され得る。
【００４９】
本発明の別の局面は、腫瘍性疾患または免疫学的障害を有するヒトの処置方法（すなわち、ヒトの内因性免疫応答を刺激するための医薬を製造するための１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドの使用）である。腫瘍性疾患の例は：慢性骨髄性白血病、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、マントル細胞リンパ腫、小胞中心リンパ腫（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｃｅｎｔｅｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）（小胞及びびまん性）、辺縁帯Ｂリンパ腫、節外性リンパ腫、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（Ｎｏｄａｌ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（Ｓｐｌｅｎｉｃ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ヘアリーセル白血病、形質細胞腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（Ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、バーキットリンパ腫、ハイグレードＢ細胞リンパ腫、バーキット様、黒色腫、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、腎細胞癌、膀胱癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、結腸癌及び子宮癌である。免疫障害の例は：アレルギー、重症複合型免疫不全、慢性肉芽腫症、及び後天性免疫不全症である。
【００５０】
この局面の実施形態において、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドは、投薬形態において液体であり得または凍結乾燥され得る薬学的処方物中に存在する。多くの投薬形態が当該分野において公知であり、そして本明細書中で適用され得る。この局面の実施形態において、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドは、約１０〜１０，０００μｇ／用量の用量で組成物中に存在する。これらの調製物において、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドは、他の免疫賦活化合物と組み合わせられ得る。周知の免疫賦活剤の例は：α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ細胞である。また、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドは、抗感染症薬もしくは抗癌剤、または外科的処置と組み合わせられ得る。これらの全ての場合において、本発明のオリゴヌクレオチドは、代替手段である処置の前、後または同時に投与され得る。
【００５１】
本発明の別の局面は、腫瘍性疾患または免疫障害を有するヒトが、被験体由来のリンパ球または形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）と１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドとを「エキソビボ(ex vivo)」で接触させること及び活性化細胞を被験体に再投与することによって、処置されることである。この局面の実施形態において、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドは、インキュベーション培地中に約０．１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００５２】
発明の詳細な説明
定義
「アレルギー」とは、ある物質（アレルゲン）に対する後天的な過敏症を指す。アレルギーの例は、湿疹、アレルギー性鼻炎、喘息及びじんま疹である。
【００５３】
「免疫系不全」とは、免疫系が正常な能力で機能しない疾患を指す。
【００５４】
本明細書において用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、複合的ヌクレオチド（すなわち、ホスフェート基及び置換可能な有機塩基（これは置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである）に結合した糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。本明細書中で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）及びオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の両方を指す。用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオシド（すなわち、オリゴヌクレオチドからホスフェートを除いたもの）及び任意の他の有機塩基含有ポリマーも含む。オリゴヌクレオチドは、既存の核酸供給源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、好ましくは合成（例えば、オリゴヌクレオチド合成により産生される）である。
【００５５】
「オリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合により結合した複合的ヌクレオチドを指す。
【００５６】
「免疫賦活オリゴヌクレオチド」とは、免疫系の細胞（すなわち、リンパ球、マクロファージ）を、統計的に有意な様式で、刺激する（すなわち、有糸分裂効果を有する、またはサイトカイン発現を誘導または増加または減少する）オリゴヌクレオチドを指す。
【００５７】
「強力な免疫賦活オリゴヌクレオチド」とは、霊長類の動物の免疫系細胞を、「インビトロ」で、同じ実験条件下かつ同一の化学的骨格（すなわち、ホスホロチオエート骨格またはホスホジエステル骨格）を用いて、周知のＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６の免疫賦活活性の少なくとも６０％の活性で刺激するオリゴヌクレオチドを指す。
【００５８】
「ＣｐＧ」とは、シトシン−グアニンジヌクレオチドを指す。
【００５９】
「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」とは、免疫系の細胞を刺激しかつその免疫賦活活性がその配列中の少なくとも１つのＣｐＧの存在に決定的に依存するオリゴヌクレオチドを指す。
【００６０】
「非ＣｐＧオリゴヌクレオチド」とは、免疫系の細胞を刺激しかつその免疫賦活活性がその配列中のＣｐＧの存在に決定的に依存しないオリゴヌクレオチドを指す。
【００６１】
「被験体」とは、ヒトを含む霊長類の動物を指す。
【００６２】
本明細書中で用いられる場合、用語「処置する」とは、疾患（より詳細には、感染性疾患、腫瘍性疾患または免疫学的障害）の症状を、改善または完全に排除するプロセスを指す。
【００６３】
本明細書中で用いられる場合、用語「予防する」とは、疾患（より詳細には、感染性疾患または腫瘍性疾患または免疫学的障害）を、防ぐまたは遅延させるプロセスを指す。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドは、安定化オリゴヌクレオチドへと有利に改変される。そのような安定化免疫賦活オリゴヌクレオチドは、長期の免疫賦活を得るために特に有用であり得る。本明細書中で用いられる場合、「安定化オリゴヌクレオチド」とは、インビボでの分解（例えば、エキソ−またはエンド−ヌクレアーゼを介する）に対して比較的耐性であるオリゴヌクレオチドを指す。好ましい本発明の安定化オリゴヌクレオチドは、ホスフェート骨格の改変を含む。より詳細には、このホスフェート骨格の改変は、好ましくは、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の２つのヌクレオチドでの、５’インターヌクレオチド結合の改変（５’ｉｎｔｅｒ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。さらに、ホスフェート骨格の改変は、３’インターヌクレオチド結合の改変（３’ｉｎｔｅｒ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）でもよい。そのような場合、この改変は、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端の最後の２つのヌクレオチドで生じ得る。なおより好ましくは、本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合ヌクレオチド（すなわち、ホスフェートの酸素のうち少なくとも１つが硫黄により置換されている）を含むために、安定して改変され得る。最も好ましい実施形態において、本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドの、全てではなくともほとんどのヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合ヌクレオチドを含む。
【００６５】
他の安定化オリゴヌクレオチドとしては、代替的には：非イオンＤＮＡアナログ（例えば、アルキル−及びアリール−ホスホネート（ここで、荷電ホスホネート酸素がアルキルまたはアリール基によって置換されている））、ホスホジエステル及びアルキルホスホトリエステル（ここで、荷電酸素部分がアルキル化されている）が挙げられる。ジオール（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を、その一方または両方の末端に含むオリゴヌクレオチドも、ヌクレアーゼ分解に実質的に耐性であることが示されている。
【００６６】
本発明は、ヒトを含む霊長類の動物の免疫応答を増大させるための方法（１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドをワクチンに加えること、または腫瘍性疾患または免疫学的障害を有するヒトへの１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドの投与に基づく処置を実施すること、または腫瘍性疾患または免疫不全を有するヒトから得た白血球と１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドとを「エキソビボ(ex vivo)」で接触させ、そしてこれらの活性化白血球を同じヒトに再投与すること）を提供する。
【００６７】
１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含むワクチン組成物は、直接的に（すなわち、規定のタンパク質または多糖の形態で）または複合的な生物学的実体（すなわち、完全ウイルス；完全細菌細胞；細菌膜または多糖−タンパク質複合体のような人工複合体）の一部として抗原を提供し得る。これらの抗原は、複合的ワクチンにおいて組み合わせられ得る。
【００６８】
少なくとも１つの抗原を含むワクチン組成物は、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含むように処方される。
【００６９】
例えば、この抗原は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔｈａｒｒａｌｉｓの死細胞もしくはこれらの細胞の細胞内画分、または天然もしくはＤＮＡ組換え技術を用いて産生された、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原であり得る。１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドは、単独または１つ以上の抗原と一緒に、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬等も含み得る薬学的組成物へと処方され得る。
【００７０】
処方物は、液体であり得、または凍結乾燥され得る。薬学的組成物は、局所的または全身の処置のいずれが所望されるか、そして処置される領域によって多数の方法で投与され得る。投与は、局所的、経口、吸入または非経口で実施され得る。局所的投与のための処方物としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体及び散剤が挙げられ得る。薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤等が、必要または所望され得る。経口投与のための処方物としては、散剤または顆粒、水性または非水性媒中の懸濁液または溶液、カプセル、錠剤等が挙げられる。増粘剤、フレーバリング、希釈剤、乳化剤等が、必要または所望され得る。局所投与のための処方物としては、滅菌水溶液（緩衝剤、希釈剤及び他の添加物も含み得る）が挙げられる。１つ以上の抗原及び１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含むワクチンが、処方され得、そして予防または治療目的のために用いられ得る。
【００７１】
ウイルス性予防ワクチンに用いられる通常の抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス及びインフルエンザウイルス由来である。細菌性予防ワクチンに用いられる通常の抗原は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔｈａｒｒａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ）由来である。治療ワクチンに用いられる通常の抗原は、パピローマウイルス、ＨＩＶウイルス及び黒色腫細胞由来である。
【００７２】
ワクチン処方物のさらなる改良は、ワクチンの活性化合物の長時間にわたる徐放を提供するために、送達ビヒクルにアジュバント（単数／複数）としての１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチド及び抗原（単数／複数）を組み込むことである。このことは、当該分野において公知の種々の手段によって達成され得る。これらの手段の例は、Ｐｏｌｙ（ラクチド−コグリコリド）微粒子（Ｋｅｒｓｔｅｎ，Ｇ．Ｆ．Ａ．ａｎｄ  Ｇａｎｄｅｒ，Ｂ．１９９６．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｈｅｒｅｓ  ａｓ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ，ｉｎ：Ｓ．Ｈ．Ｅ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，ｅｄ．Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ．Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、リポソーム（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．ら、２０００．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ，ｉｎ：Ｓ．Ｈ．Ｅ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，ｅｄ．Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ．Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びポリ（メチルメタクリレート）ナノ粒子（Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．２０００．Ｐｏｌｙ  （Ｍｅｔｈｙｌ  Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ，ｉｎ：Ｓ．Ｈ．Ｅ．Ｋａｕｆｍａｎｎ，ｅｄ．Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ．Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）へのカプセル化である。
【００７３】
ワクチン処方物の別の改良は、抗原（単数／複数）と１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドとを化学的手段によって結合させることである（Ｍｉｅｒ  Ｗ、Ｅｒｉｔｊａ  Ｒ、Ｍｏｈａｍｍｅｄ  Ａ、Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ  Ｕ、Ｅｉｓｅｎｈｕｔ  Ｍ．２０００．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１１：８５５）。
【００７４】
多くのワクチン処方物が当該分野において公知であり、そして１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドで以前に知られているアジュバントを置換することまたは元の処方物に１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを単に加えることによって用いられ得る。
【００７５】
これらの免疫賦活特性に基づき、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドは、腫瘍性疾患または免疫系障害を処置するために、インビボで被験体に投与もされ得る。
【００７６】
一般的な腫瘍性疾患の例は：慢性骨髄性白血病、黒色腫、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、腎細胞癌、膀胱癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、結腸癌及び子宮癌である。一般的な免疫学的障害の例は：アレルギー、重症複合型免疫不全、慢性肉芽腫症及び後天性免疫不全症候群である。
【００７７】
これらの処置のための薬学的組成物は、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬等と共に１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含み得る。この処方物は、液体であり得、または凍結乾燥され得る。
【００７８】
薬学的組成物は、局所的または全身の処置のいずれが所望されるか、そして処置される領域によって多数の方法で投与され得る。投与は、局所的、経口、吸入または非経口で実施され得る。局所的投与のための処方物としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体及び散剤が挙げられ得る。薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤等が、必要または所望され得る。経口投与のための処方物としては、散剤または顆粒、水または非水溶媒中の懸濁液または溶液、カプセル、錠剤等が挙げられる。増粘剤、フレーバリング、希釈剤、乳化剤等が、必要または所望され得る。非経口投与のための処方物としては、滅菌水溶液（緩衝剤、希釈剤及び他の添加物も含み得る）が挙げられる。あるいは、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドが、腫瘍性疾患または免疫系不全を有する被験体から得られたイムノコンピテント細胞（すなわち、Ｂ細胞または形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ））と「エキソビボ(ex vivo)」接触され得、次いで活性化細胞が被験体に再導入され得る。
【００７９】
以下の実施例から明らかであるように、好ましいオリゴヌクレオチドは、霊長類の動物の免疫系の細胞を、「インビトロ」で、同一の実験条件下及び同一の化学的骨格を用いて、周知のＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６の免疫賦活活性の少なくとも６０％の活性で刺激するもの（すなわち、強力な免疫賦活オリゴヌクレオチド）である。
【００８０】
これらの中で、約１４〜４０ヌクレオチドを有するものが好ましく、ここで、Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8がＴＴＴＴＧＴからなり、最も好ましい強力な免疫賦活オリゴヌクレオチドは、ＩＭＴ５０４、すなわち、ＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴ（配列番号２）である。
【実施例】
【００８１】
実施例１
材料及び方法
概して、以下の材料及び方法を、実施例を通して用いた。
【００８２】
１）オリゴヌクレオチド
ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドを購入し、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＡｎｎｏｖｉｓ（Ａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）またはＯｌｉｇｓ  Ｅｔｃ（Ｂｅｔｈｅｌ、Ｍａｉｎｅ）製の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。発熱物質を除去した水（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ）中にＯＤＮを懸濁し、Ｌｉｍｕｌｕｓテストを用いてＬＰＳ汚染についてアッセイし、そして使用するまで−２０℃に維持した。純度を、ＨＰＬＣ及びＰＡＧＥアッセイによって評価した。ＬＰＳレベルが検出できなかった場合にＯＤＮ調製物を用いた。
【００８３】
２）抗体
アッセイに用いた抗体は、Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）から購入した。
【００８４】
３）末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）
血液を、健康なドナーから、抗凝固剤としてヘパリンを用い、静脈穿刺によって得た。ＰＭＢＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）密度勾配遠心分離によって単離した。簡単には、２．０ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び５０．０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｌｉｎｚ、Ａｕｓｔｒｉａ）中に１：２に希釈した血液サンプルを、２０℃、１０００×ｇで４０分間遠心分離した。ＰＭＢＣを単離し、洗浄し、そして１０％のウシ胎仔血清を添加した培地中に懸濁した。
【００８５】
４）細胞の精製
Ｂリンパ球及び形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）を、ＭＡＣＳマグネティックセルセパレーションシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるポジティブ選択によってヒトＰＭＢＣから精製した。
【００８６】
５）細胞増殖アッセイ
血液を、健康なドナーから、抗凝固剤としてヘパリンを用い、静脈穿刺によって得た。ＰＭＢＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）密度勾配遠心分離によって単離した。簡単には、２．０ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び５０．０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｌｉｎｚ、Ａｕｓｔｒｉａ）中に１：２に希釈した血液サンプルを、２０℃、１０００×ｇで４０分間遠心分離した。ＰＭＢＣを単離し、洗浄し、そして１０％のウシ胎仔血清を添加した培地中に懸濁した。
【００８７】
ＰＢＭＣを１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２．０ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び５０．０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。１×１０5細胞／ウェルを、５％ＣＯ2加湿雰囲気下で、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、Ｄｅｎｍａｒｋ）中、３７℃で、７２時間インキュベートした。ＰＢＭＣを、他のように示さない限り０．３７５μｇ／ｍｌでＯＤＮを用いて刺激した。細胞回収の１８時間前に、１μＣｉの3Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、比活性：２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を各々のウェルに添加した。細胞を、グラスファイバーフィルター上に回収し、そして3Ｈの取り込みをシンチレーションカウンティングによって測定した。４連のウェルの標準偏差は、１０％未満であった。
【００８８】
６）ＩＬ６アッセイ
ＰＢＭＣ（３×１０5／ウェル）を、ＯＤＮ（６μｇ／ｍｌ）と共に上記のように２４時間培養した。この後、上清を回収し、そしてＥＬＩＳＡによってＩＬ６レベルを測定した。簡単には、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を抗ＩＬ６抗体でコートし、そして１０％（ｖ／ｖ）の熱で不活化したＦＣＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地でブロックした。ＩＬ６を、ビオチン標識抗体、引き続きペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン、次いでペルオキシダーゼ特異的比色基質を用いて比色により検出した。標準曲線を、既知の量の組換えＩＬ６を用いて作成した。これらのアッセイの検出限界は、３０ｐｇ／ｍｌであった。全てのアッセイを２連で行った。
【００８９】
７）ＩＬ−１０アッセイ
ＰＢＭＣ（３×１０5／ウェル）を、ＯＤＮ（１．５μｇ／ｍｌ）と共に上記のように７２時間培養した。この後、上清を回収し、そしてＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０レベルを測定した。簡単には、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を抗ＩＬ−１０抗体でコートし、そして１０％（ｖ／ｖ）の熱で不活化したＦＣＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地でブロックした。ＩＬ−１０を、ビオチン標識抗体、引き続きペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン、次いでペルオキシダーゼ特異的比色基質を用いて比色により検出した。標準曲線を、既知の量の組換えＩＬ−１０を用いて作成した。これらのアッセイの検出限界は、２０ｐｇ／ｍｌであった。全てのアッセイを２連で行った。
【００９０】
８）ＩＬ−５アッセイ
ＰＢＭＣ（３×１０5／ウェル）を、ＯＤＮ（１．５μｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）と共に上記のように７２時間培養した。この後、上清を回収し、そしてＥＬＩＳＡによってＩＬ−５レベルを測定した。簡単には、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を抗ＩＬ−５抗体でコートし、そして１０％（ｖ／ｖ）の熱で不活化したＦＣＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地でブロックした。ＩＬ−５を、ビオチン標識抗体、引き続きペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン、次いでペルオキシダーゼ特異的比色基質を用いて比色により検出した。標準曲線を、既知の量の組換えＩＬ−５を用いて作成した。これらのアッセイの検出限界は、４０ｐｇ／ｍｌであった。全てのアッセイを２連で行った。
【００９１】
９）ＩｇＭ分泌アッセイ
ＰＢＭＣ（３×１０5／ウェル）を、ＯＤＮ（１．５μｇ／ｍｌ）と共に上記のように７２時間培養した。この後、上清を回収し、そしてＥＬＩＳＡによってＩｇＭを定量した。簡単には、９６マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を抗ＩｇＭ抗体でコートし、そしてＲＰＭＩ  １６４０培地でブロックした。ＩｇＭを、ペルオキシダーゼ標識抗体、引き続きペルオキシダーゼ特異的比色基質を用いて比色により検出した。標準曲線を、既知の量の精製ＩｇＭを用いて作成した。これらのアッセイの検出限界は、５０ｎｇ／ｍｌであった。全てのアッセイを２連で行った。
【００９２】
１０）フローサイトメトリー
表面抗原の染色を記載されているように実施した（Ｊ．Ｆｌｏ  ａｎｄ  Ｅ．Ｍａｓｓｏｕｈ．Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ４  ｒａｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２１：４４３−４５３、１９９７）。抗ＣＤ１９（クローンＬＴ１９）、ＣＤ８６（クローンＢＵ６３）、ＣＤ４０（クローンＬＯＢ７／６）、ＣＤ４（クローンＳ３．５）、ＭＨＣクラスＩ（クローンＷ６／３２）、ＭＨＣクラスＩＩ（クローンＷＲ１８）、抗ＣＤ４（クローンＳ３．５）及び抗ＣＤ１１ｃ（クローンＢＵ１５）抗体をＳｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ、ＵＳＡ）から購入した。アポトーシスを、Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ、ＵＳＡ）製のＡＮＮＥＸＩＮ  Ｖ：ＦＩＴＣアッセイキットを用いて評価した。
【００９３】
１０，０００細胞／サンプルのフローサイトメトリックデータを、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）上で得た。データを、コンピュータプログラムＷｉｎ  ＭＤＩ、２．８、Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｔｒｏｔｔｅｒ  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９９３−１９９８）を用いて解析した。
【００９４】
１１）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対するサルの免疫及び体液性応答の評価
１２匹のＣｅｂｕｓ  Ａｐｅｌｌａ種のサル（２．５〜３．５Ｋｇ）を、１０μｇのアルミナに吸着させたＨＢｓＡｇ（ＨＢｓＡｇ  １ｍｇ当り２５ｍｇのＡｌ3+）を含む、小児用量（ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｄｏｓｅ）のＡｇＢ（Ｐａｂｌｏ  Ｃａｓｓａｒａ、Ｂｕｅｎｏｓ  Ａｉｒｅｓ  Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）で免疫した。これを、単独（ｎ＝３（雌１、雄２））または示されたホスホロチオエートＯＤＮ（１５０μｇ／用量）との組み合わせ（ｎ＝３（雌１、雄２））で投与した。全てのワクチンを合計１ｍｌの容量で、四頭筋に筋内（ｉ．ｍ．）投与した。サルを、ＣＥＭＩＣ（Ｃｅｎｔｒｏ  Ｍｅｄｉｃｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｅｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｓ）、Ｂｕｅｎｏｓ  Ａｉｒｅｓ、Ａｒｇｅｎｔｉｎａの動物施設に預けた。動物は専門家によって毎日モニターされ、そして１週間に１度体重測定された。免疫前及び免疫後種々の回数での静脈（ｉ．ｖ．）穿刺により、血漿を回収し、そして直ぐに、市販のキットＡＵＳＡＢ（Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）を用いて抗体についてアッセイした。力価は、ミリ国際単位／ｍｌで表される。
【００９５】
実施例２
オリゴヌクレオチド配列の選択
ＷＯ９６／０２５５５及び米国特許第６，２３９，１１６号の特許は、免疫賦活性であるためには、オリゴヌクレオチドが非メチル化ＣｐＧモチーフを含む配列を必要とすると教示している（ＷＯ９６／０２５５５、カラム１３、１９〜２０行及び米国特許第６，２３９，１１６号、カラム６、１〜３行）。ＥＰ  ０  ４６８  ５２０は、免疫賦活性であるために、オリゴヌクレオチドが、少なくとも６ヌクレオチド長の回文配列を満たすことを必要とすると教示している（ＥＰ  ０  ４６８  ５２０、カラム１１、３４〜３７行）。従って、少なくとも６ヌクレオチド長の回文配列を有さない、いくつかの非ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、ヒト末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）に対して実施した増殖アッセイ、細胞分化アッセイ、サイトカインＩＬ６分泌アッセイ及びＩｇＭ分泌アッセイを用いて調査した。陽性コントロールとして、Ｈａｒｔｍａｎ及びＫｒｉｅｇ（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．、Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．２０００．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：９４４）に記載される、組成：
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’
かつホスホロチオエート結合のＣｐＧオリゴヌクレオチド２００６を用いた。バックグラウンドコントロールとして、ヒト細胞に対して非常に低い活性を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＭＴ  ０２３（配列番号９）またはＩＭＴ  ０２２（配列番号８）を用いた。
【００９６】
また、「推定」陰性コントロールとして、オリゴヌクレオチド２００６と同じ組成であるが全てのＣｐＧジヌクレオチドがＧｐＣジヌクレオチドによって置換されているオリゴヌクレオチド：
５’ＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴ３’
を用いた。このオリゴヌクレオチドをＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２１（配列番号１）と名付けた。
【００９７】
図１は、上記のオリゴヌクレオチドを用いて実施された増殖アッセイを示す。
【００９８】
驚くべきことに、非ＣｐＧオリゴヌクレオチドＩＭＴ  ０２１が、増殖アッセイにおいて、１．５μｇ／ｍｌで用いた場合に２００６ＣｐＧオリゴヌクレオチドと同様に活性であり、０．３７５μｇ／ｍｌで用いた場合に約４０〜６０％の活性であることが見出された（図１及び第１表）。
【００９９】
第１表
ホスホロチオエートＣｐＧ（２００６）及び非ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＩＭＴ  ０２１）による末梢白血球増殖の誘導
【０１００】
【表２２】
2005533491.tif 000023
【０１０１】
ＩＭＴ０２１（配列番号１）
Ａｖｇ．：平均；Ｎ：データ数；ＳＤ：標準偏差；ＯＤＮ（Ｓ）：ホスホロチオエートＯＤＮ
免疫賦活を、ヒトＢ細胞についての一般的なマーカーＣＤ１９及びヒトＢ細胞についての活性化マーカーＣＤ８６を用いるフローサイトメトリーによっても評価した。
【０１０２】
図２は、ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）２００６を用いるインキュベーションにより誘導される活性化と比較した、非ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）ＩＭＴ０２１と共にインキュベートしたヒトＢ細胞の活性化を示す。観察され得るように、１．５μｇ／ｍｌで用いられた場合、ＯＤＮ（Ｓ）ＩＭＴ  ０２３バックグラウンドコントロールと比較した際に、両方のＯＤＮは、同様の活性化パターンを示す。
【０１０３】
ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）２００６及び非ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）ＩＭＴ  ０２１と共にインキュベートしたＰＢＭＣの上清におけるＩＬ６分泌も評価した（第２表）
第２表
ホスホロチオエートＣｐＧ及び非ＣｐＧオリゴヌクレオチドである２００６及びＩＭＴ  ０２１によるヒトＩＬ−６分泌の誘導
【０１０４】
【表２３】
2005533491.tif 000024
【０１０５】
ＩＭＴ  ０２１（配列番号１）。１．５μｇ／ｍｌのＯＤＮ
このアッセイの結果も、１．５μｇ／ｍｌで用いられた場合、非ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）ＩＭＴ  ０２１が有効な免疫賦活剤であることを示す。従って、２００６オリゴヌクレオチドの他の非ＣｐＧ配列改変体を調査した。第３表は、これらの改変体（ここで、このＯＤＮの全てのＣｐＧのＣまたはＧが他のヌクレオチドによって置換されている）のうち６つの結果を示す。観察され得るように、ＯＤＮ（Ｓ）２００６におけるＣｐＧのＧは、Ｂ細胞増殖またはＩＬ６分泌に必ずしも必要ではない。しかし、ＣｐＧのＣの改変は、その置換がＡまたはＧである場合有害であるが、それがＴである場合有害でない。これらの結果は、明らかに、ＯＤＮ（Ｓ）２００６によるＢ細胞増殖及びＩＬ６分泌の刺激がＣｐＧグループの完全性とは関連しないことを示す。
【０１０６】
第３表
ＯＤＮ（Ｓ）２００６オリゴヌクレオチドの非ＣｐＧ改変体による末梢白血球増殖及びＩＬ６分泌の誘導
【０１０７】
【表２４】
2005533491.tif 000025
【０１０８】
ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）；ＩＭＴ  ５０５（配列番号３）；ＩＭＴ  ５０６（配列番号４）；ＩＭＴ  ５０１（配列番号５）；ＩＭＴ  ５０２（配列番号６）；ＩＭＴ  ５０３（配列番号７）
実施例３
非ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性に対する構造改変の効果：活性モチーフの定義
非ＣｐＧ  ＯＤＮの免疫賦活活性に対する一次構造の影響を研究するために、２００６及びＩＭＴ  ０２１  オリゴヌクレオチドのいくつかの改変体を合成した。第４表は、いくつかのＩＭＴ  ０２１改変体の一次構造及びその免疫賦活活性を評価するために実施した増殖及びＩＬ−６アッセイの結果を示す。
【０１０９】
ＯＤＮ（Ｓ）ＩＭＴ  ０２１は、第７位、第８位、第９位、第１０位、第１２位、第１５位、第１６位、第１７位、第１８位、第２０位、第２３位及び第２４位にＴを含む。これらのＴのＡ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２２）またはＣ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２３）での置換は、増殖アッセイ（夫々約７６％及び７５％）及びＩＬ−６分泌アッセイ（夫々約８４％及び８８％）において活性の非常に大きな損失をもたらす。これらの結果は、第７位、第８位、第９位、第１０位、第１２位、第１５位、第１６位、第１７位、第１８位、第２０位、第２３位及び第２４位におけるいくつかまたは全てのＴが、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２１の免疫賦活活性に決定的に重要であることを示す。
【０１１０】
第４表
免疫賦活ＩＭＴ  ０２１オリゴヌクレオチドから誘導されたホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる末梢白血球増殖及びＩＬ−６分泌の誘導
【０１１１】
【表２５】
2005533491.tif 000026
【０１１２】
ＩＭＴ  ０２１（配列番号１）；ＩＭＴ  ０２２（配列番号８）；ＩＭＴ  ０２３（配列番号９）
非ＣｐＧオリゴヌクレオチドの活性中心（モチーフ）の組成を調査するために、いくつかのＯＤＮを０．３７５μｇ／ｍｌでアッセイした（図３）。以下のことが見出された：
ａ）オリゴヌクレオチド中のＴＧグループの存在は、強力な免疫賦活のために十分でない（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２８、ＩＭＴ  ０４６、ＩＭＴ  ５４６、ＩＭＴ  ５４７及びＩＭＴ  ５５０（これらの全てが２つのＴＧを有する）は、非常に乏しい活性を有する。一方、ＴＧジヌクレオチドを保有しないＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４３は、同じ一般的組成を有するが２つのＴＧジヌクレオチドを有するＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４４と同じ（低い）活性を有する。
【０１１３】
ｂ）オリゴヌクレオチド中のテトラヌクレオチドＴＴＴＴの存在は、強力な免疫賦活のために十分でない（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０３４、ＩＭＴ  ０５７、ＩＭＴ  ０２８、ＩＭＴ  ５４３及びＩＭＴ  ５４４（これらは、２つのＴＴＴＴモチーフを有する）は、非常に乏しい活性を有する。
【０１１４】
ｃ）２５％より多いＴの存在は、強力な免疫賦活のために十分でない（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０３４（５０％  Ｔ）、ＩＭＴ  ０５７（７１％  Ｔ）、ＩＭＴ  ０２８（３３％  Ｔ）、ＩＭＴ  ５４３（５８％  Ｔ）、ＩＭＴ  ５４４（５０％  Ｔ）、ＩＭＴ  ０５９（８３％  Ｔ）、ＩＭＴ  ０４０（４２％  Ｔ）、ＩＭＴ  ０４６（３３％  Ｔ）、ＩＭＴ  ５４５（４２％  Ｔ）、ＩＭＴ  ５５０（３３％  Ｔ）及びＩＭＴ  ５４６（４２％  Ｔ）（これらのすべては、２５％より多いＴを有する）は、非常に乏しい活性を有する。
【０１１５】
ｄ）２５％より多いＴの存在及びＴＧジヌクレオチドの存在は、強力な賦活のために十分でない（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２８、ＩＭＴ  ０４６、ＩＭＴ  ５４４及びＩＭＴ  ５４６（これらは、２５％より多いＴ及び２つのＴＧを有する）は、非常に乏しい活性を有する。
【０１１６】
ｅ）２５％より多いＴの存在及びテトラヌクレオチドＴＴＴＴの存在は、強力な賦活のために十分でない（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０５９、ＩＭＴ  ０３４、ＩＭＴ  ０５７、ＩＭＴ  ０２８、ＩＭＴ  ５４３及びＩＭＴ  ５４４（これらは、２５％より多いＴ及び２つのＴＴＴＴを有する）は、非常に乏しい活性を有する。
【０１１７】
ｆ）ＴＧジヌクレオチドの存在及びテトラヌクレオチドＴＴＴＴの存在は、強力な賦活のために十分でない（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２８及びＩＭＴ  ５４４（これらは、２つのＴＧ及び２つのＴＴＴＴを有する）は、非常に乏しい活性を有する。
【０１１８】
ｇ）ＴＧジヌクレオチドの存在及びテトラヌクレオチドＴＴＴＴの存在、及び２５％より多いＴの存在は、強力な賦活のために十分でない（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２８及びＩＭＴ  ５４６（これらは、２つのＴＧ、２つのＴＴＴＴ及び２５％より多いＴを有する）は、非常に乏しい活性を有する。
【０１１９】
ｈ）いくつかのＴは、非ＣｐＧ  ＯＤＮの活性に関係し得るが、これらは、必ずしもＴＧジヌクレオチドまたはＴＴＴＴモチーフに関連しない。例えば、ＴＧにもＴＴＴＴモチーフにも関連しないＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４０における２つのＴの置換は、非常に有害である（ＯＤＮ  ５４５）。ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４０及びＩＭＴ  ５４５の両方が２５％より多いＴを有し、かつＴＴＴＴもＴＧモチーフも有さないことは注目に値する。免疫賦活性の乏しいＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４５において、２つのＴＧジヌクレオチド、２つのＴＴＴＴモチーフ及びＴの総量の増加を生じる２つのＴの置換（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４４）が活性を増加させないことも注目に値する（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。
【０１２０】
ｉ）テトラヌクレオチドＣＣＣＣの存在及び／または５０％より多いＣの存在は、強力な免疫賦活のために十分でない（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２３（これは、２つのＣＣＣＣ及び６３％のＣを有する）は、非常に乏しい活性を有する。
【０１２１】
ｊ）いくつかのＴリッチオリゴヌクレオチドにおけるＴのＣまたはＧでの置換は、活性を増加させる（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０５９における３つのＴの、Ｃによる置換（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０３７）は、統計的に有意に活性を増加させる。従って、いくつかのＴと組み合わせたＣの存在は、強力な免疫活性を達成するのに適切である。
【０１２２】
ｋ）一般的に、Ｔリッチオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格において幾分かの免疫賦活活性を有し得るが、ホスホジエステル骨格においては不活性である（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、第５表は、ＩＭＴ  ５３（２４ヌクレオチド長のポリＴ鎖からなる）がホスホロチオエート骨格においてＩＬ６の分泌を刺激することができるが、ホスホジエステル骨格においてはできないことを示す。２５％より多いＴ及び６つのＴＧジヌクレオチドを有するＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２１についても同じことが当てはまる。これらの２つのＯＤＮは、ホスホジエステル骨格においては、ＣＤ１９陽性（Ｂ）細胞に対する活性化マーカーＣＤ８６、ＣＤ４０及びＭＨＣクラスＩの発現を刺激することもできない（図４）。
【０１２３】
ｌ）一般的に、ホスホジエステル骨格における免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、二本鎖としては不活性である（ＷＯ  ０１−２２９７２との相違）。例えば、強力な刺激性ＯＤＮ  ２００６及びＩＭＴ  ５０４は、二本鎖としては不活性である（示さず）。マウスにおける同様の結果が、以下の文献に、記載されている：Ｚｅｌｅｎａｙ，Ｓ．、Ｅｌｉａｓ，Ｆ．及びＦｌｏ，Ｊ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１３８２−９２（２００３）。
【０１２４】
これらの全ての事実を考慮して、ホスホジエステル（天然）及び改変した骨格において、強力な免疫賦活活性を得るために非ＣｐＧオリゴヌクレオチド中に存在すべき、必要十分な最小限の配列はどれであるかを調査した。
【０１２５】
第５表
ホスホロチオエートまたはホスホジエステルのＰｙＮＴＴＴＴＧＴ  ＯＤＮによるＩＬ６分泌の誘導
【０１２６】
【表２６】
2005533491.tif 000027
【０１２７】
ＩＭＴ  ０２１（配列番号１）；ＩＭＴ  ０２２（配列番号８）；ＩＭＴ  ０５３（配列番号１９）；ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）；ＩＭＴ  ５０６（配列番号４）
（Ｓ）：ホスホロチオエート。（Ｏ）ホスホジエステル。ホスホロチオエートＯＤＮを０時間のインキュベーションで添加した（６μｇ／ｍｌ）。ホスホジエステルＯＤＮを以下のように添加した：インキュベーション０時間で３０μｇ／ｍｌ、４時間後に３０μｇ／ｍｌ、１６時間後に３０μｇ／ｍｌ。
【０１２８】
数百のＯＤＮの分析（示さず）により、Ｂ細胞増殖及びＩＬ６分泌により測定される非ＣｐＧ  ＯＤＮの強力な免疫賦活活性を担うコア配列（モチーフ）の決定が可能になった。このモチーフは、以下の通りである：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ7Ｘ8
ここで、Ｘ1はＣまたはＴであり、
ここで、Ｘ2はＣ、Ｔ、ＧまたはＡであり；
ここで、Ｘ3はＴまたはＡであり；
ここで、Ｘ4はＴ、ＣまたはＧであり；
ここで、Ｘ5はＴ、ＣまたはＧであり；
ここで、Ｘ6はＴまたはＧであり；
ここで、Ｘ7はＧであり；
ここで、Ｘ8はＴであり；
ここで、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5及びＸ6のうち少なくとも２つがＴである。
第６表は、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５０４中に存在する２つの非ＣｐＧモチーフ（モチーフ：ＣＡＴＴＴＴＧＴ）のヌクレオチドの各々における変化の効果を示す。このモチーフの第１位のＣの、Ａ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５３１）またはＧ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５３３）による置換は、活性の約５０％の損失を生じる。しかし、このＣのＴによる置換（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５３２）は、活性を変化させなかった。従って、最大の活性を得るために、このモチーフの第１位は、ピリミジンヌクレオチド（ＣまたはＴ）により占められているべきである。このモチーフの第２位において、Ａ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５０４）またはＴ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５３５）またはＣ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５３４）は、等価な選択肢である。
【０１２９】
このモチーフの第２位におけるＧヌクレオチドの影響を、ＣｐＧジヌクレオチドを導入することなく研究するために、このモチーフの第１位にＴを有するＯＤＮを合成した（第７表）。観察され得るように、このモチーフの第２位において任意のヌクレオチドが等価である。
【０１３０】
このモチーフの第７位におけるＧの、Ａ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４１）、Ｔ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４２）またはＣ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４３）による置換は、有害である（第５表）。従って、最大の活性を得るために、このモチーフの第７位は、好ましくは、Ｇである。
【０１３１】
Ｔにより占められているモチーフの位置に関して、最も感受性であるのは、第８位のものである。このＴのＡ（ＯＤＮ  ＩＭＴ５４３）またはＣ（ＯＤＮ  ＩＭＴ５９９）またはＧ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ６０４）での置換は、有害である。従って、最大の活性を得るために、このモチーフの第８位は、好ましくはＴである。このモチーフの第３位において、Ｔは、Ａ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ＩＭＴ５３７）によって、活性を損失することなく置換される。しかし、このＴのＣ（ＯＤＮ  ＩＭＴ５９５）またはＧ（ＯＤＮ  ＩＭＴ６００）による置換は、有害である。従って、最大の活性を得るために、このモチーフの第３位は、好ましくはＴまたはＡであるべきである。このモチーフの第４位において、Ｔは、Ｃ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ＩＭＴ５９６）またはＧ（ＯＤＮ  ＩＭＴ６０１）によって有意に活性を損失することなく置換される。しかし、このＴのＡ（ＯＤＮ  ＩＭＴ５３８）による置換は有害である。従って、最大の活性を得るために、このモチーフの第４位は、好ましくはＴまたはＣまたはＧであるべきである。このモチーフの第５位において、Ｔは、Ｃ（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ＩＭＴ５９７）またはＧ（ＯＤＮ  ＩＭＴ６０２）によって、有意に活性を損失することなく置換され得る。しかし、このＴのＡによる置換（ＯＤＮ  ＩＭＴ５３９）は、有害である。従って、最大の活性を得るために、このモチーフの第５位は、好ましくはＴまたはＣまたはＧであるべきである。このモチーフの第６位において、Ｔは、Ｇによって有意に活性を損失することなく置換される（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ＩＭＴ６０３）。しかし、このＴのＡによる置換（ＯＤＮ  ＩＭＴ５４０）は、有害である。従って、最大の活性を得るために、このモチーフの第６位は、好ましくはＴまたはＧであるべきである。
【０１３２】
このモチーフの第３位におけるＴのＡによる置換及びこのモチーフの第６位におけるＴのＧによる置換の同時置換は、活性の損失を生じなかった（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ６０８）。しかし、この場合において、最大の活性を得るために、第４位及び第５位は、Ｔにより占められているべきである（ＯＤＮ  ＩＭＴ６０９、ＩＭＴ６１０、ＩＭＴ６１１、ＩＭＴ６１２及びＩＭＴ６１４を参照のこと）。
【０１３３】
このモチーフ内の２つ以上のＴのＡによる置換は、７０％より多い活性の損失を生じる（ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５４５、ＩＭＴ  ５４６、ＩＭＴ  ５４７、ＩＭＴ  ５４８、ＩＭＴ  ５４９、ＩＭＴ  ５５０、ＩＭＴ  ５５１及びＩＭＴ  ５５２）。
【０１３４】
これらの結果を考慮して、強力な免疫賦活活性を得るために、このモチーフの第３位、第４位、第５位及び第６位のうち２つ以上がＴにより占められているべきであると結論付けることもできる。
【０１３５】
第６表
ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５０４から誘導した本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる末梢白血球増殖の誘導
【０１３６】
【表２７】
2005533491.tif 000028
【０１３７】
ＩＭＴ  ０２２（配列番号８）；ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）；ＩＭＴ  ５３１（配列番号１４）；ＩＭＴ  ５３２（配列番号１５）；ＩＭＴ  ５３３（配列番号１６）；ＩＭＴ  ５３３（配列番号１７）；ＩＭＴ  ５３４（配列番号１８）；ＩＭＴ  ５３５（配列番号１９）；ＩＭＴ  ５３７（配列番号３０）；ＩＭＴ  ５３８（配列番号３１）；ＩＭＴ  ５３９（配列番号３２）；ＩＭＴ  ５４０（配列番号３３）；ＩＭＴ  ５４１（配列番号３４）；ＩＭＴ  ５４２（配列番号３５）；ＩＭＴ  ５４３（配列番号３６）；ＩＭＴ  ５４４（配列番号３７）；ＩＭＴ  ５４５（配列番号３８）；ＩＭＴ  ５４６（配列番号３９）；ＩＭＴ  ５４７（配列番号４０）；ＩＭＴ  ５４８（配列番号４１）；ＩＭＴ  ５４９（配列番号４２）；ＩＭＴ  ５５０（配列番号４３）；ＩＭＴ  ５５１（配列番号４４）；ＩＭＴ  ５５２（配列番号４５）；ＩＭＴ  ５３９（配列番号８２）；ＩＭＴ  ５９７（配列番号８３）；ＩＭＴ  ６０２（配列番号８４）；ＩＭＴ  ５４０（配列番号８５）；ＩＭＴ  ６０３（配列番号８７）；ＩＭＴ  ５４４（配列番号８８）；ＩＭＴ  ５９９（配列番号８９）；ＩＭＴ  ６０４（配列番号９０）；ＩＭＴ  ６０８（配列番号７５）；ＩＭＴ  ６０９（配列番号７６）；ＩＭＴ  ６１０（配列番号７７）；ＩＭＴ  ６１１（配列番号７８）；ＩＭＴ  ６１２（配列番号７９）；ＩＭＴ  ６１４（配列番号８１）
第７表
免疫賦活モチーフの第２位に変化を有するホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる末梢白血球増殖及びＩＬ−６分泌の誘導
【０１３８】
【表２８】
2005533491.tif 000029
【０１３９】
ＩＭＴ  ５３２（配列番号１５）；ＩＭＴ  １９７（配列番号１０）；ＩＭＴ  １９８（配列番号１１）；ＩＭＴ  １９９（配列番号１２）
ＯＤＮ鎖内でのモチーフの位置の変化の効果を調査するために、ＯＤＮ  ＩＭＴ５０４中に存在する非ＣｐＧモチーフＣＡＴＴＴＴＧＴを、２４ヌクレオチド長のポリＴ鎖における種々の位置に導入した（図５）。見出され得るように、ポリＴ  ＯＤＮ（Ｓ）自体が有意な有糸分裂活性を有していた。一方、たった１つのＣＡＴＴＴＴＧＴモチーフの導入が、そのモチーフが配置された場所に依存して、ポリＴ鎖の免疫賦活活性の１．２〜１．８倍（増殖アッセイによる測定）または２．４〜３．５倍（ＩＬ−６分泌アッセイによる測定）の増加を生じた。５’末端から少なくとも２ヌクレオチドまたは３’末端から４の距離が、最大の活性を達成するために必要であるようである（ＯＤＮ  ＩＭＴ１７４〜ＩＭＴ  １７９）。最適な位置への２つのモチーフの導入（ＯＤＮ  ＩＭＴ１８２）は、ポリＴ鎖の免疫賦活活性の１．９倍（増殖アッセイによる測定）、または２．９倍（ＩＬ−６分泌アッセイによる測定）の増加を生じた。このことは、第２のモチーフの寄与が無視できることを示す。一方、ＯＤＮ  ＩＭＴ５０４のような最も有効なＯＤＮの活性は、増殖アッセイにより測定した場合でポリＴの活性より３倍を超えて高く、これは、ＯＤＮの全体的な活性に対して、本発明のモチーフの周辺の少なくともいくつかのヌクレオチドの組成の有意な影響があることを示唆する事実である。
【０１４０】
実施例４
本発明の非ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性に対する構造改変の影響：活性モチーフの外側のヌクレオチド組成の影響
図５に示される結果は、非ＣｐＧコアモチーフの外側のオリゴヌクレオチドの組成が最適な免疫賦活活性を達成するために重要であることを示す。従って、これらのモチーフの周囲のヌクレオチド組成における変化を有する多数のオリゴヌクレオチドを合成した。第８表は、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５０４の免疫賦活活性における、５’末端の最初の４ヌクレオチド及び３’末端の最後の４ヌクレオチドの組成における変化の効果を示す。観察され得るように、最適な選択は：これら２つのモチーフに対して−１位にＣまたはＧ、−２位にＣ、ＴまたはＧ、−３位及び−４位に任意のヌクレオチド、＋１位にＡまたはＴ、＋２位にＧ、＋３位に任意のヌクレオチド及び＋４位にＧ、である。
【０１４１】
当然、この表に示されていない他のヌクレオチドの組合せが、これらの非ＣｐＧ免疫賦活オリゴヌクレオチドの活性に対して同等またはより高い効果さえ有し得る。当業者は、他の効果的な組合せを経験的に決定し得る。
【０１４２】
第８表
２つの免疫賦活モチーフの外側の組成における変異を有する非ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）ＩＭＴ  ５０４による末梢白血球増殖の誘導
【０１４３】
【表２９】
2005533491.tif 000030
【０１４４】
ＩＭＴ  ５５２（配列番号４５）；ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）；ＩＭＴ  ５５９（配列番号４６）；ＩＭＴ  ５６０（配列番号４７）；ＩＭＴ  ５６１（配列番号４８）；ＩＭＴ  ５６２（配列番号４９）；ＩＭＴ  ５６３（配列番号５０）；ＩＭＴ  ５６４（配列番号５１）；ＩＭＴ  ５６５（配列番号５２）；ＩＭＴ  ５６６（配列番号５３）；ＩＭＴ  ５６７（配列番号５４）；ＩＭＴ  ５６８（配列番号５５）；ＩＭＴ  ５６９（配列番号５６）；ＩＭＴ  ５７０（配列番号５７）；ＩＭＴ  ５７１（配列番号５８）；ＩＭＴ  ５７２（配列番号５９）；ＩＭＴ  ５７３（配列番号６０）；ＩＭＴ  ５７４（配列番号６１）；ＩＭＴ  ５７５（配列番号６２）；ＩＭＴ  ５７６（配列番号６３）；ＩＭＴ  ５７７（配列番号６４）；ＩＭＴ  ５７８（配列番号６５）；ＩＭＴ  ５７８（配列番号６６）；ＩＭＴ  ５８０（配列番号６７）；ＩＭＴ  ５８１（配列番号６８）；ＩＭＴ  ５８２（配列番号６９）
実施例５
本発明の非ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫賦活活性に対する構造改変の効果：オリゴヌクレオチドのサイズの影響
第９表は、１つの免疫賦活モチーフを有するＯＤＮは、その鎖が１６以上のヌクレオチド長である場合に活性であることを示す。そのＯＤＮが２０〜２５ヌクレオチド長である場合、活性が最大である。本研究の間にアッセイした、少なくとも１つの本発明の非ＣｐＧモチーフを保有するこの範囲内の全ての（１００より多い）ＯＤＮは、非常に活性であった。
【０１４５】
第９表
Ｂ細胞増殖及びＩＬ６分泌に対するホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドのサイズの効果
【０１４６】
【表３０】
2005533491.tif 000031
【０１４７】
ＩＭＴ  １８７（配列番号７０）；ＩＭＴ  １８８（配列番号７１）；ＩＭＴ  １８９（配列番号７２）；ＩＭＴ  １７９（配列番号７３）；ＩＭＴ  １９１（配列番号７７）
実施例６
本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる末梢白血球のＩｇＭ分泌の誘導
末梢白血球におけるＩｇＭ分泌の誘導は、オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性の別の重要なマーカーである。第１０表は、上記のいくつかのホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによるＩｇＭ分泌の賦活を示す。観察され得るように、増殖及びＩＬ６分泌の誘導において最も活性の高い非ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）は、ＩｇＭ分泌の誘導においても最高であった。
【０１４８】
第１０表
本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる末梢白血球ＩｇＭ分泌の誘導
【０１４９】
【表３１】
2005533491.tif 000032
【０１５０】
ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）；ＩＭＴ  ５０５（配列番号３）；ＩＭＴ  ５０６（配列番号４）；ＩＭＴ  ５０３（配列番号７）；ＩＭＴ  ５０９（配列番号１３）
実施例７
本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによるＢリンパ球におけるＣＤ４０、ＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩの発現の刺激
ヒトＰＭＢＣをＯＤＮ  ＩＭＴ  ５０４、陽性コントロールとしてのＯＤＮ  ２００６及び陰性コントロールとしてのＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２２と共にインキュベートした（図６）。観察され得るように、ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５０４は、Ｂリンパ球上でのＣＤ４０、ＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩの発現の刺激についてＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６と同様に活性である。
【０１５１】
実施例８
本発明の非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる精製Ｂリンパ球の刺激
ヒトＣＤ１９+（Ｂ）細胞を、９５％より高い純度まで精製した。第１１表及び図７は、これらの精製細胞上での免疫賦活活性がヒトＰＭＢＣを用いて観察されるものに匹敵することを示す。これらの結果は、ヒト細胞に対する本発明の非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる刺激が直接的であることを示す。
【０１５２】
第１１表
本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる、精製Ｂ細胞に対する増殖、ＩＬ６及びＩｇＭ分泌の誘導
【０１５３】
【表３２】
2005533491.tif 000033
【０１５４】
ＩＭＴ  ０２２（配列番号８）；ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）；ＩＭＴ  ５０６（配列番号４）
実施例９
本発明のホスホジエステル非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる免疫賦活
図８及び第１２表は、ヒトＰＭＢＣに対する本発明のホスホジエステル非ＣｐＧオリゴヌクレオチドの効果を示す。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対して非常に感受性であるので、これらを、培地に３回（０、４、及び１６時間）、３０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。非常に強力なホスホジエステルＣｐＧ  ＯＤＮ（ＯＤＮ  ２０８０）を、サイトメトリックアッセイ（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｇ、Ｗｅｅｒａｔｎａ  Ｒ、Ｂａｌｌａｓ  ＺＫ、Ｐａｙｅｔｔｅ  Ｐ、Ｓｕｐａｒｔｏ  Ｉ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＷＬ、Ｗａｄｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ、Ｓａｊｕｔｈｉ  Ｄ、Ｐｕｒｃｅｌｌｓ  ＲＨ、Ｄａｖｉｓ  ＨＬ、Ｋｒｉｅｇ  ＡＭ．Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣｐＧ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４、１６１７〜１６２４（２０００））における陽性コントロールとして使用した。観察され得るように、これらの条件下では、本発明の非ＣｐＧモチーフを保有するホスホジエステルＯＤＮは、免疫賦活活性を有する。これに関し、これらの非ＣｐＧ  ＯＤＮと、ＷＯ  ０１／２２９７２において特許請求される非ＣｐＧ  ＯＤＮとの差異は、注目に値する（第５表及び図４を参照のこと）。
【０１５５】
第１２表
本発明のホスホジエステル非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる免疫賦活
【０１５６】
【表３３】
2005533491.tif 000034
【０１５７】
ＩＭＴ  ０２２（配列番号８）；ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）；ＩＭＴ  ０５３（配列番号１９）；ＩＭＴ  ５０６（配列番号４）
実施例１０
本発明の非ＣｐＧ  ＯＤＮによるＣｅｂｕｓ  ａｐｅｌｌａ及びＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ種のサルの末梢白血球における細胞増殖の誘導
本発明の非ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）は、マウス、ブタ及びヒツジにおいてあまり効果的な免疫賦活剤ではない。しかし、これらは、サルにおいては有効である。例えば、図９は、Ｃｅｂｕｓ  ａｐｅｌｌａ及びＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ種のサルの末梢白血球に対する非ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）の免疫賦活活性を示す。これらの結果に従い、非ヒト霊長類において最も有効な非ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＣＡＴＴＴＴＧＴモチーフを保有するものである。従って、サルは、これらの非ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｓ）の臨床応用に対する調査のために動物モデルとして用いられ得る。
【０１５８】
実施例１１
被験体のワクチン接種
本発明の非ＣｐＧ  ＯＤＮアジュバントを含むワクチン処方物が、被験体を種々の細菌性及びウイルス性疾患因子ならびに腫瘍細胞に対するワクチン接種をするために用いられ得る。第１３表は、組換えＢ型肝炎表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）及びアジュバントとしてのＯＤＮ  ＩＭＴ  ５０４の存在下または非存在下でアルミナを含むワクチン処方物を用いた、Ｃｅｂｕｓ  ａｐｅｌｌａ種のサルの接種の効果を示す。
【０１５９】
第１３表
ＩＭＴ  ＯＤＮを有するＨＢｓＡｇに対して免疫したＣｅｂｕｓ  ａｐｅｌｌａにおける抗ＨＢ応答
【０１６０】
【表３４】
2005533491.tif 000035
【０１６１】
観察されるように、ＨＢｓＡｇ単独でワクチン接種した動物と比較して、ＩＭＴ  ＯＤＮ（Ｓ）５０４を補充したＨＢｓＡｇでワクチン接種した動物において表題の抗ＨＢｓＡｇの劇的な増加が存在する。ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６は、アジュバントとして本発明の非ＣｐＧ  ＯＤＮと同様の能力を有する。
【０１６２】
詳細には、組換えＢ型肝炎表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）ならびにアジュバントとしてアルミナ及び１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含むワクチン処方物の投与によってヒトがＢ型肝炎に対してワクチン接種され得る。各々の用量におけるｒＨＢｓＡｇの量、及び投薬スケジュールは、そのヒトの年齢に従い変化し得る。例えば、出産あたりから約１２歳までのヒトについては、３回用量スケジュールの約２．５μｇ〜約５μｇのｒＨＢｓＡｇが、０、１〜３ヶ月後、及び４〜１８ヶ月後、好ましくは０、２及び６ヶ月に投与され得る。１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドが、１用量あたり約１０μｇ〜約１，０００μｇで処方物中に存在し得る。
【０１６３】
約１２〜６０歳のヒトについて、３回用量スケジュールの約５μｇ〜約４０μｇのｒＨＢｓＡｇが、０、１〜３ヶ月後及び４〜１８ヶ月後、好ましくは０、２及び６ヶ月で投与され得る。１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドが、１用量あたり約１０μｇ〜約１，０００μｇで処方物中に存在し得る。
【０１６４】
実施例１２
ホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる、悪性Ｂリンパ球における共刺激分子の発現の刺激
本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に罹患する患者の血液から回収した悪性Ｂリンパ球の刺激を、フローサイトメトリック（ＦＡＣＳ）分析によって試験した。代表的なＦＡＣＳ分析の結果を図１０に示す。見出され得るように、本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドＩＭＴ  ５０４は、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６と同様に、悪性Ｂリンパ球上でのＣＤ８６、ＣＤ４０及びＭＨＣクラスＩ表面共刺激分子の発現を刺激することができる。
【０１６５】
実施例１３
ホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる悪性Ｂ細胞アポトーシスの刺激
本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に罹患する患者の血液から回収した悪性Ｂリンパ球におけるアポトーシスの刺激を、アポトーシスマーカーとしてヨウ化プロピジウム及びアネキシンＶを用いるフローサイトメトリック（ＦＡＣＳ）分析によって試験した。代表的なＦＡＣＳ分析の結果を図１１に示す。観察され得るように、本発明の非ＣｐＧオリゴヌクレオチドＩＭＴ  ５０４は、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６と同様に、白血病細胞のアポトーシスを刺激することができる。
【０１６６】
実施例１４
本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる、形質細胞様樹状細胞上での共刺激分子の発現の刺激
本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる、正常なドナーの血液から回収した形質細胞様樹状細胞の刺激を、フローサイトメトリック（ＦＡＣＳ）分析によって試験した。代表的なＦＡＣＳ分析の結果を、図１２に示す。見出され得るように、本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドＩＭＴ  ５０４は、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６と同様に、形質細胞様樹状細胞上でのＣＤ８６、ＣＤ４０及びＭＨＣクラスＩ表面分子の発現を刺激することができる。
【０１６７】
第１４表は、オリゴヌクレオチド骨格がホスホジエステルである場合、本発明の非ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、インターフェロンαを分泌する精製したヒト形質細胞様樹状細胞も刺激することができることを示す。
【０１６８】
第１４表
本発明のホスホロチオエート及びホスホジエステル非ＣｐＧオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした精製形質細胞様樹状細胞によるインターフェロンα分泌
【０１６９】
【表３５】
2005533491.tif 000036
【０１７０】
ＩＭＴ  ０２２（配列番号８）；ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）。ホスホロチオエートＯＤＮを、インキュベーション０時間で添加した（１．５μｇ／ｍｌ）。ホスホジエステルＯＤＮを、以下の通り添加した：インキュベーション０時間で３０μｇ／ｍｌ、４時間後に３０μｇ／ｍｌそして１６時間後に３０μｇ／ｍｌ。
【０１７１】
実施例１５
腫瘍性疾患を有する被験体の処置
１つ以上の本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドを含む薬学的処方物は、種々の腫瘍性疾患に対して被験体を処置するために用いられ得る。特に、黒色腫を有するヒトは、活性成分として本発明のオリゴヌクレオチドを含む薬学的処方物の投与によって処置され得る。各々の用量におけるオリゴヌクレオチドの量、及び投与スケジュールは、被験体の体重及び腫瘍進行のステージに従い変化し得る。例えば、進行した切除不可能な転移性の黒色腫を有する約７０ｋｇのヒトについては、約１ｍｇの用量の本発明のオリゴヌクレオチドが、約１０週間にわたり、１週間に３回投与され得る。
【０１７２】
実施例１６
本発明のホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドによる、末梢白血球のＩＬ−１０分泌の誘導及びＩＬ−５分泌の阻害
ＩＬ−１０は、ＩｇＥ産生の強力なサプレッサーであり、そしてエピトープ特異的Ｔ細胞アネルギーの誘導及び維持は、増加したＩＬ−１０に関連する。図１３は、幾人かのドナーのＰＭＢＣにおける、ホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドＩＭＴ  ５０４及びコントロールによるＩＬ−１０の分泌の刺激を示す。観察され得るように、ＩＭＴ  ５０４は、ＣｐＧ陽性コントロールＯＤＮ  ２００６と同様に活性である。アレルゲン特異的Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−５を産生し、このＩＬ−５は、好酸球の分化、活性化及び生存を促進する。図１４は、ホスホロチオエート非ＣｐＧオリゴヌクレオチドＩＭＴ  ５０４及びＣｐＧ陽性コントロールＯＤＮ  ２００６が幾つかのヒトＰＭＢＣにおいてＩＬ−４及びＣｏｎ  Ａにより誘導されるＩＬ−５産生のリプレッサーであることを示す。
【０１７３】
実施例１７
アレルギー性疾患を有する被験体の処置
１つ以上の本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドを含む薬学的処方物は、種々のアレルギー性疾患に対して被験体を処置するために用いられ得る。
【０１７４】
特に、喘息を有するヒトが、活性成分として本発明のオリゴヌクレオチドを含むエアロゾル薬学的処方物の、気道における投与によって処置され得る。各々の用量におけるオリゴヌクレオチドの量、及び投与スケジュールは、被験体により変化し得る。
【０１７５】
本発明の範囲の外側であるオリゴヌクレオチド配列
以下のオリゴヌクレオチド配列（上に列挙される先行技術文献において開示されている）は、免疫賦活オリゴヌクレオチドの請求項の範囲から除外されるが：組成物及び使用の請求項の範囲内に含まれ得る：
【０１７６】
【化１】
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【０１７７】
【化２】
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【０１７８】
【化３】
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【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】図１は、ホスホロチオエートＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２３（配列番号９）またはホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６：５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’またはホスホロチオエート非ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２１（配列番号１）と共にインキュベートしたヒト末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）の増殖指数をプロットしたグラフである。データは、５回の独立したアッセイの平均及び標準偏差を示す。
【図２】図２は、Ｂ細胞集団の活性化に対するホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６：５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’またはホスホロチオエート非ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２１（配列番号１）の比較効果を決定するためのヒト末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）を用いるフローサイトメトリー法の結果を示す。Ｂ細胞活性化を、ＣＤ６９陽性細胞上でのＣＤ８６の誘導によって測定した。（ａ）ＯＤＮ  ＩＭＴ０２３（配列番号９）、２００６またはＩＭＴ０２１（配列番号１）によるＢ細胞活性化を比較する代表的なフローサイトメトリックダイヤグラム；ｂ）（ａ）に示されるフローサイトメトリックダイヤグラムの代表的ヒストグラム。
【図３】図３は、示したホスホロチオエートＯＤＮと共にインキュベートしたＰＢＭＣの増殖指数をプロットしたグラフである。データは、５回の独立したアッセイの平均及び標準偏差を示す。
【図４】図４は、ＷＯ  ０１／２２９７２において特許請求される非ＣｐＧ  ＯＤＮによる、ＣＤ１９＋（Ｂ）細胞におけるＣＤ８６及びＣＤ５６＋（ＮＫ）細胞におけるＣＤ６９の誘導を示す。示したホスホジエステルＯＤＮまたはコントロールと共に、ヒトＰＭＢＣを４８時間培養し、次いで蛍光抗ＣＤ１９／抗ＣＤ８６（ａ）または抗ＣＤ１９／抗ＣＤ４０（ｂ）または抗ＣＤ１９／抗ＭＨＣ  Ｉ（ｃ）を用いて染色した。フローサイトメトリーの結果を、ダブルポジティブゲート（ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｇａｔｅ）中の細胞に対応するヒストグラムとして示す。オープンヒストグラムは、ＯＤＮの非存在下で培養した細胞に対応し、そして影付のヒストグラムは、ＯＤＮの存在下で培養した細胞に対応する。ＯＤＮ（Ｏ）：ホスホジエステルＯＤＮ。ＯＤＮ２０８０、以下の配列：５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’のＣｐＧ  ＯＤＮを、陽性コントロールとして用いた。
【図５】図５は、ＰＭＢＣ増殖アッセイにおいて測定される非ＣｐＧ  ＯＤＮの免疫賦活活性に対する、本明細書中に開示される免疫賦活配列モチーフＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8の位置の影響を示す。データは、４連で実施した３回の独立したアッセイの平均及び標準偏差を示す。
【図６】図６は、本明細書中に開示される免疫賦活配列モチーフＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を保有する非ＣｐＧ−ＯＤＮによる、ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）におけるＣＤ４０、ＭＨＣ  Ｉ及びＭＨＣ  ＩＩの誘導を示す。ヒトＰＭＢＣを、示したＯＤＮと共に２４時間培養し、次いで、蛍光抗ＣＤ１９／抗ＣＤ４０（ａ）または抗ＣＤ１９／抗ＭＨＣ  Ｉ（ｂ）または抗ＣＤ１９／抗ＭＨＣ  ＩＩ（ｃ）を用いて染色した。フローサイトメトリーの結果を、ＣＤ１９＋細胞に対応するヒストグラムとして示す。オープンヒストグラムは、ＯＤＮの非存在下で培養した細胞に対応し、そして影付きヒストグラムはＯＤＮの存在下で培養した細胞に対応する。ＯＤＮ（Ｓ）は、ホスホロチオエートＯＤＮを意味する。
【図７】図７は、本明細書中に開示される免疫賦活配列モチーフＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を保有する非ＣｐＧ−ＯＤＮによる、精製したＢ細胞におけるＣＤ８６、ＣＤ４０及びＭＨＣ  Ｉの誘導を示す。ヒト精製Ｂ細胞を、示したＯＤＮと共に２４時間培養し、次いで蛍光抗ＣＤ１９／抗ＣＤ８６（ａ）または抗ＣＤ１９／抗ＣＤ４０（ｂ）または抗ＣＤ１９／抗ＭＨＣ  Ｉ（ｃ）を用いて染色した。フローサイトメトリーの結果を、ＣＤ１９＋細胞に対応するヒストグラムとして示す。オープンヒストグラムは、ＯＤＮの非存在下で培養した細胞に対応し、そして影付きヒストグラムはＯＤＮの存在下で培養した細胞に対応する。ＯＤＮ（Ｓ）は、ホスホロチオエートＯＤＮを意味する。
【図８】図８は、本明細書中に開示される免疫賦活配列モチーフＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を保有するホスホジエステル非ＣｐＧ−ＯＤＮによる、ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）におけるＣＤ８６、ＣＤ４０及びＭＨＣ  Ｉの誘導を示す。ヒトＰＭＢＣを、示したホスホジエステルＯＤＮと共に４８時間培養し、次いで蛍光抗ＣＤ１９／抗ＣＤ８６（ａ）または抗ＣＤ１９／抗ＣＤ４０（ｂ）または抗ＣＤ１９／抗ＭＨＣ  Ｉ（ｃ）を用いて染色した。フローサイトメトリーの結果を、ＣＤ１９＋細胞に対応するヒストグラムとして示す。オープンヒストグラムは、ＯＤＮの非存在下で培養した細胞に対応し、そして影付きヒストグラムはＯＤＮの存在下で培養した細胞に対応する。ＯＤＮ（Ｏ）は、ホスホジエステルＯＤＮを意味する。
【図９】図９は、非ヒト霊長類における、本明細書中に開示されるモチーフＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を保有する非ＣｐＧ−ＯＤＮによる、ＰＭＢＣ増殖の刺激を示す。Ｃｅｂｕｓ  ａｐｅｌｌａまたはＭａｃａｃｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ＰＭＢＣを、示したＯＤＮ（６μｇ／ｍｌ）と共に７２時間培養した。データは、４連の平均及び標準偏差を示す。
【図１０】図１０は、本明細書中に開示されるモチーフＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を保有する非ＣｐＧ−ＯＤＮによる、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）に罹患した患者のＣＤ１９＋（Ｂ細胞）におけるＣＤ８６、ＣＤ４０及びＭＨＣ  Ｉの誘導を示す。ＰＭＢＣを、示したＯＤＮと共に２４時間培養し、次いで蛍光抗ＣＤ１９／抗ＣＤ８６（ａ）または抗ＣＤ１９／抗ＣＤ４０（ｂ）または抗ＣＤ１９／抗ＭＨＣ  Ｉ（ｃ）を用いて染色した。フローサイトメトリーの結果を、ＣＤ１９＋細胞に対応するヒストグラムとして示す。オープンヒストグラムは、ＯＤＮの非存在下で培養した細胞に対応し、そして影付きヒストグラムはＯＤＮの存在下で培養した細胞に対応する。ＯＤＮ（Ｓ）は、ホスホロチオエートＯＤＮを意味する。
【図１１】図１１は、本明細書中に開示されるモチーフＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を保有する非ＣｐＧ−ＯＤＮによる、悪性Ｂ細胞アポトーシスの刺激を示す。ＰＭＢＣを、示したＯＤＮと共に１４時間または５日間培養し、次いでＳｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ、ＵＳＡ）製のＡＮＮＥＸＩＮ  Ｖ：ＦＩＴＣアッセイキットを用い、ヨウ化プロピジウム及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて染色した。フローサイトメトリーの結果を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ蛍光  対  ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）蛍光のドットプロットとして示す。このプロットは、３つの細胞集団を示す：ａ）低ＰＩ−低アネキシン（これは生きた細胞である）、ｂ）低ＰＩ−高アネキシン（これはアポトーシス細胞である）、及びｃ）高ＰＩ−高アネキシン（これは二次壊死細胞（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）である）。
【図１２】図１２は、本明細書中に開示されるモチーフＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8を保有する非ＣｐＧ−ＯＤＮによる、精製した形質細胞様樹状細胞におけるＣＤ８６、ＣＤ４０及びＭＨＣ  Ｉの誘導を示す。９５％より高い純度の形質細胞様樹状細胞を、示したＯＤＮと共に２４時間培養し、次いで蛍光抗ＣＤ４／抗ＣＤ１１ｃ／抗ＣＤ８６（ａ）または抗ＣＤ４／抗ＣＤ１１ｃ／抗ＣＤ４０（ｂ）または抗ＣＤ４／抗ＣＤ１１ｃ／抗ＭＨＣ  Ｉ（ｃ）を用いて染色した。フローサイトメトリーの結果を、ＣＤ４＋ＣＤ１１ｃ−細胞に対応するヒストグラムとして示す。オープンヒストグラムは、ＯＤＮの非存在下で培養した細胞に対応し、そして影付きヒストグラムはＯＤＮの存在下で培養した細胞に対応する。ＯＤＮ（Ｓ）は、ホスホロチオエートＯＤＮを意味する。
【図１３】図１３は、ホスホロチオエート非ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）、ホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６：５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’、またはホスホロチオエート非ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２２（配列番号１７５）と共に７２時間培養した５回の独立したヒト末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）の上清におけるＩＬ−１０レベルをプロットするグラフである。データは、５回の独立したアッセイの平均及び標準偏差を示す。
【図１４】図１４は、ホスホロチオエート非ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＩＭＴ  ５０４（配列番号２）、ホスホロチオエートＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６：５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’、またはホスホロチオエート非ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＩＭＴ  ０２２（配列番号１７５）と共に９６時間培養した５つの独立したヒト末梢血単核白血球（ＰＢＭＣ）の上清におけるＩＬ−５レベルをプロットするグラフである。データは、５回の独立したアッセイの平均及び標準偏差を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2005533491.tif 000088
【図１０】
2005533491.tif 000089
【図１１】
2005533491.tif 000090
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月7日(2004.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴ（配列番号２）
である、免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記免疫賦活オリゴヌクレオチドが徐放送達ビヒクル中にカプセル化されている、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記免疫賦活オリゴヌクレオチドが薬学的に許容される担体に含まれる、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項５】
前記免疫賦活オリゴヌクレオチドがプラスミドに含まれる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
抗原をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原が、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、腫瘍細胞、毒素、アレルゲン、タンパク質、糖脂質及び多糖類からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原がウイルス性抗原、細菌性抗原、ヒトもしくは動物の腫瘍細胞及び／または真菌性抗原である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗原がプラスミドによりコードされる、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
液体または凍結乾燥形態である、請求項６〜９に記載の組成物。
【請求項１１】
被験体におけるＢ細胞活性化を誘導する医薬を製造するための；免疫系障害の処置、予防もしくは軽減のための；腫瘍性疾患の処置、予防もしくは軽減のための；及び／または形質細胞様樹状細胞活性化の誘導のための、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１２】
前記被験体がヒトである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが１つ以上の抗原と複合体化している、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが抗原と同時期（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓｌｙ）または同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）に投与される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬が筋内、経口、鼻内、肛門、膣または経皮経路により投与される、請求項１１に記載の使用。
【国際調査報告】
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