(57)【要約】シュードモナス・アエルギノーザ感染を抑制、調節、または診断する方法を開示する。１つの実施態様において、本法は、患者に有効量のＰｃｒＶ抗原を接種することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス・アエルギノーザ感染を抑制する方法であって、患者に有効量のＰｃｒＶ抗原を接種することを含む方法。
【請求項２】
ＰｃｒＶ抗原がＰｃｒＶタンパク質の断片であり、該断片はＶ抗原に特異的な免疫応答を誘導できる、請求項１の方法。
【請求項３】
患者に、ＰｃｒＶをコード化するＤＮＡを含む遺伝子ワクチンを接種する、請求項１の方法。
【請求項４】
ＤＮＡがＰｃｒＶタンパク質の断片をコード化し、該断片はＰｃｒＶ抗原に特異的な免疫応答を誘導できる、請求項３の方法。
【請求項５】
患者がヒト患者である、請求項１の方法。
【請求項６】
シュードモナス・アエルギノーザ感染を診断する方法であって、患者のサンプルをヌクレオチドプローブにさらす段階を含み、ここで、該プローブはＰｃｒＶコード化核酸に特異的にハイブリッド化し、他の核酸にはハイブリッド化しない方法。
【請求項７】
患者がヒト患者である、請求項６の方法。
【請求項８】
シュードモナス・アエルギノーザ感染を診断する方法であって、
ａ）患者のサンプルを、ｐｃｒＶ遺伝子を増幅するように設計されたヌクレオチドプライマーにさらし、
ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応を行い、ここで、ｐｃｒＶ遺伝子が存在すればサンプル中で増幅され、そして
ｃ）シュードモナス・アエルギノーザ感染を増幅産物の存在と相関させる
各段階を含む方法。
【請求項９】
患者がヒト患者である、請求項８の方法。
【請求項１０】
シュードモナス・アエルギノーザ感染を診断する方法であって、
ａ）患者のサンプルをＰｃｒＶ抗原にさらし、そして
ｂ）シュードモナス・アエルギノーザ感染をＰｃｒＶ特異的抗体／抗原複合体の存在と相関させる
各段階を含む方法。
【請求項１１】
シュードモナス・アエルギノーザ感染を抑制する方法であって、患者に有効量の遺伝子ワクチンを接種することを含み、ここで、該遺伝子ワクチンはＰｃｒＶ抗原をコード化する方法。
【請求項１２】
遺伝子ワクチンが全ＰｃｒＶタンパク質をコード化する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
遺伝子ワクチンがＰＣＲ  ＰｃｒＶタンパク質の断片をコード化し、該断片はＰｃｒＶ抗原に特異的な免疫応答を誘導できる、請求項１１の方法。
【請求項１４】
患者がヒト患者である、請求項１１の方法。
【請求項１５】
シュードモナス・アエルギノーザ感染を治療または予防する方法であって、ヒト化またはヒトＰｃｒＶ抗体または抗体断片を得て、そして、該抗体を全身投与する各段階を含み、ここで、該抗体はシュードモナス・アエルギノーザ感染を抑制または予防する方法。
【請求項１６】
シュードモナス・アエルギノーザ感染を治療または予防する方法であって、ヒト化またはヒトＰｃｒＶ抗体または抗体断片を得て、そして、抗体を治療剤として肺に投与する各段階を含む方法。
【請求項１７】
シュードモナス・アエルギノーザ感染を治療する方法であって、シュードモナス・アエルギノーザ感染患者に有効量のＰｃｒＶ抗原を接種する段階を含む方法。
【請求項１８】
ＰｃｒＶ抗原に対して特異的な抗体。
【請求項１９】
抗体がモノクローナルである、請求項１８の抗体。
【請求項２０】
抗体がｍａｂ １６６である、請求項１９の抗体。
【請求項２１】
ＰｃｒＶポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸残基１４４および２５７を含むエピトープを認識する抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項２２】
ＰｃｒＶポリペプチドアミノ酸配列におけるアミノ酸残基１４４〜２５７を含むエピトープを認識する抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項２３】
図７に示される軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列のＣＤＲを含むモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項２４】
図６Ｂに示される重鎖ポリペプチドアミノ酸配列のＣＤＲを含むモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項２５】
図７に示される軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列のＣＤＲと、図６Ｂに示される重鎖ポリペプチドアミノ酸配列のＣＤＲとを含むモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項２６】
図７に示される軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列のＦＲ領域をさらに含む、請求項２３および２５のいずれかのモノクローナル抗体または断片。
【請求項２７】
図６Ｂに示される重鎖ポリペプチドアミノ酸配列のＦＲ領域をさらに含む、請求項２４および２５のいずれかのモノクローナル抗体または断片。
【請求項２８】
図６Ｂに示される重鎖ポリペプチドアミノ酸配列のＦＲ領域と、図７に示される軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列のＦＲ領域とをさらに含む、請求項２５のモノクローナル抗体または断片。
【請求項２９】
ヒト化されている、請求項２１〜２８のいずれかの抗体または断片。
【請求項３０】
ヒト型である、請求項２１〜２８のいずれかの抗体または断片。
【請求項３１】
請求項２１〜３０のいずれかの抗体または断片と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項２１〜３０のいずれかの抗体または断片を、患者におけるシュードモナス感染を処置または防止するために効果的な量で含む薬学的組成物。
【請求項３３】
請求項２１〜３０のいずれかの抗体または断片を、患者におけるシュードモナスの病原性を低下させるために効果的な量で含む薬学的組成物。
【請求項３４】
患者におけるシュードモナス感染を処置または防止するための方法であって、請求項３１または３２の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項３５】
患者におけるシュードモナスの病原性を低下させるための方法であって、請求項３１または３３の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項３６】
ヒト細胞に対するシュードモナスの細胞傷害性を調節するための方法であって、ヒト細胞の存在下で該シュードモナスを請求項２１〜３０のいずれかの抗体または断片と接触させることを含む方法。
【請求項３７】
請求項２１〜３０のいずれかの抗体または断片をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【連邦政府後援の研究開発に関する記述】
【０００１】
本発明は、以下の機関により与えられた米国政府支援によりなされた。ＮＩＨ／ＮＩＡＤＡ許可番号Ｒ０１  Ａ１３１６６５−０８、Ｋ０４  ＡＩ０１２８９−０４およびＲ０１  ＨＬ５９２３９−０２。米国は本発明に一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００２】
シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、重病の個体において致命的な急性肺感染を引き起こすことのできる日和見細菌病原体である（１）。細菌の肺上皮傷害能は、III型媒介分泌および転位機構を介して、真核細胞に直接注入される毒素の発現と関連している（２、３）。
【０００３】
Ｐ．アエルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）III型分泌および転位装置によりコード化されるタンパク質は、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）Ｙｏｐレギュロンのメンバーと高レベルのアミノ酸同一性を示す（４−６）。グラム陰性細菌に発見された全III型系の中で、唯一、Ｐ．アエルギノーザが、エルシニアＶ抗原であるＰｃｒＶに相同性を有する（III型系の概観については６参照）。分泌および転位装置に相同なタンパク質は、植物および動物の両方の病原性細菌によりコード化される。これらの生物は、サルモネラ・チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・フレクスナー（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、腸病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種などのヒト病原体、およびキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、エルシニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）およびラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）などの植物病原体を含む。しかし、唯一、Ｐ．アエルギノーザおよびエルシニアが、Ｖ抗原をコード化する。
【０００４】
ヤール（Ｙａｈｒ）等、１９９７は、ＰｃｒＶをコード化するオペロンの配列を開示し、この配列をＬｃｒＶタンパク質と比較している。それゆえに、ＰｃｒＶのアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋの寄託番号ＡＦ０１０１４９で入手できる。
【発明の要約】
【０００５】
本発明は、シュードモナスＶ抗原は、致命的な肺感染から動物を守るために使用できるという我々の観察から発展させた方法および組成物を含む。
【０００６】
１つの実施態様において、本発明は、患者（ｐａｔｉｅｎｔ、患者または患蓄）に有効量のＰｃｒＶ抗原を接種することを含む、シュードモナス感染を抑制する方法である。別の実施態様において、ＰｃｒＶをコード化するＤＮＡを、遺伝子ワクチンとして使用する。
【０００７】
１つの好ましい実施態様において、抗原は、組換えタンパク質として発現され、危険にさらされている患者を免疫化するために使用する。
【０００８】
好ましくは、患者は、感染から完全に守られる。
【０００９】
別の実施態様において、ＰｃｒＶをコード化するＤＮＡ（ｐｃｒＶと呼ぶ）またはＤＮＡ断片は、Ｐ．アエルギノーザ感染を検出するために診断的に使用することができる。
【００１０】
別の実施態様において、組換えタンパク質（ｒＰｃｒＶ）は、患者から抗体を検出するために診断的に使用する。ＰｃｒＶに対する患者の抗体応答は、予後に関連し得る。それ故、この実施態様において、組換えタンパク質は、患者の抗体力価を測定することにより、予後の指標として使用する。
【００１１】
本発明はまた、個体を、有効量のＰｃｒＶ抑制剤、特にＰｃｒＶ抗体、抗体誘導体もしくは断片、または抗体擬似体と接触させることにより、個体のシュードモナス感染を抑制する方法を提供する。ＰｃｒＶ抗体、抗体誘導体および抗体断片もまた提供される。
【００１２】
本発明の目的は、シュードモナス感染に対して患者を能動および受動免疫化することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、Ｐ．アエルギノーザ感染を診断的に検出することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、シュードモナス患者から抗体を診断的に検出することである。
【００１５】
本発明の別の目的、特徴および利点は、明細書、特許請求の範囲および図面を概観した後、当業者には明らかとなろう。
【発明の説明】
【００１６】
我々は、本明細書で、ＰｃｒＶは、III型分泌産物の発現に対して新規な調節効果を有し、III型毒素の転位に関与し、Ｐ．アエルギノーザ感染により誘導される肺損傷から守る最初の抗原であることを開示する。抗ＰｃｒＶ  ＩｇＧを気腔に滴下注入する前に、ＰｃｒＶに対してワクチン接種することにより、攻撃された動物の生存が保証されただけでなく、細菌により引き起こされる肺炎症および損傷も減少した。
【００１７】
ＬｃｒＶ、またはＶ抗原は、Ｙｏｐエフェクタータンパク質の分泌および転位を調節し、エルシニア感染に対するホストサイトカイン応答を変化させることにより、病理発生に細胞外的役割を果たしている、多機能性タンパク質である（７−１１）。この危険な病原因子の唯一の既知の相同体は、ＰｃｒＶと呼ばれる、Ｐ．アエルギノーザによりコード化される細胞外タンパク質である。
【００１８】
本発明の１つの実施態様は、有効量のＰｃｒＶ抗原を用いて患者を免疫化することにより、シュードモナス感染を緩和または抑制する方法である。ここで「有効量」とは、抗原で処置されていない対照被検者または動物と比較して、シュードモナス感染のいくらかの緩和または抑制が示されるに有効な量のＰｃｒＶ抗原を意味する。
【００１９】
ここで「緩和」とは、感染が、非免疫化動物と比較して、少なくとも５０％抑制されることを意味する。好ましくは、感染は完全に予防される。感染の定量評価は、好ましくは、血流または胸水中の細菌量の検査および／または肺損傷パラメーターの検査を含む。例えば、血流または胸水中での細菌の非存在は、感染の予防を示す。肺損傷パラメータ−の減少は、感染の緩和を示す。
【００２０】
感染は、痰、血液または胸水中の細菌容量の減少、浸潤物のサイズの減少、酸素付加改善、機械的換気時間の長さの減少、熱降下、および白血球数の減少を含む、いくつかの他の臨床指標により定量的に評価できる。
【００２１】
ここで「ＰｃｒＶ抗原」とは、感染を予防または緩和する免疫応答を引き出すのに必要なＰｃｒＶタンパク質の一部または断片を意味する。我々は、全長ＰｃｒＶタンパク質を、保護を誘導するための抗原として使用している。さらに、我々は、保護的なエピトープを、ＰｃｒＶのアミノ酸１４４〜２５７を含む断片に特定している。このエピトープを特定するために、感染および細胞毒性から守るモノクローナル抗体を、段々と小さくした形態の組換えＰｃｒＶに対する結合性について試験した。（ここで「組換えＰｃｒＶ」または「ｒＰｃｒＶ」とは、非天然ホストに配置しておいたＰｃｒＶ遺伝子から産生されたタンパク質を意味する。）この保護により、その領域が突き止められた。
【００２２】
ＰｃｒＶ抗原は、我々が使用した方法、すなわちノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から市販で入手可能な細菌性発現プラスミドｐｅｔ１６ｂにより、最も容易に得られ得る。ｐｃｒＶ遺伝子は、初めて、オペロンの一部として、Ｐ．アエルギノーザ染色体からクローン化された。コード領域を増幅し、２つの異なるベクターに挿入した。１つのベクターは、図１で示すように、Ｐ．アエルギノーザからの発現用である。これは、ＰｃｒＶ発現が、細菌の残りの輸送および中毒装置と協調的に調節されるように、適切なプロモーター配列を含むように我々が修飾した、ハーバート・シュバイツァーからのベクター（参考文献１９）である。第二のプラスミドであるｐＥＴ１６ｂは、大腸菌からの発現および精製目的用である。
【００２３】
この系の利点は、Ｐ．アエルギノーザタンパク質の汚染を心配する必要がなく、タンパク質は非常に大量に産生され、そして１段階精製プロセスであるということである。この状況において、ＰｃｒＶコード領域を増幅し、ｐＥＴ１６ｂベクター上に提供されたヒスチジン標識を有するフレーム内でクローン化する。ＰｃｒＶのアミノ末端に融合した複数のヒスチジン残基により、ニッケル−ＮＴＡカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーが可能となる。それ故、好ましいＰｃｒＶ抗原は、組換えバージョンの天然ＰｃｒＶタンパク質である。
【００２４】
免疫化は、全身的にまたは鼻腔内に実施し得る。これらの個体の免疫化は、好ましくは、他の小児期疾患の普通のワクチン接種法中に開始する。我々は、おそらく５および１０歳頃でのブースター用量により保護の永続を予測する。
【００２５】
別の実施態様において、Ｐ．アエルギノーザ感染を診断的に検出するために、ＰｃｒＶタンパク質をコード化するＤＮＡ、またはこのＤＮＡの相補体を使用する。ＧｅｎＢａｎｋＡＦ０１０１４９でＰｃｒＶ抗原のＤＮＡ配列が得られる。ＰｃｒＶのコード領域は、ヌクレオチド６２６−１５１０である。また、このコード領域の断片またはこの断片の相補体の使用を選択してもよい。成功するプローブは、ＰｃｒＶ  ＤＮＡに特異的にハイブリッド化し、他の領域にはハイブリッド化しないものである。
【００２６】
好ましくは、抗原配列内で少なくとも４０個連続したヌクレオチドのハイブリッド形成プローブ、または配列内で少なくとも２５個連続したヌクレオチドの２つのプライマーを使用する。当業者は、多くの標準的な型の核酸診断技術が適切であることを理解し、例えば、患者の痰から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡに対する一本鎖４０ヌクレオチドプローブのハイブリッド形成がある。別の例では、患者の痰を、細菌性ＤＮＡまたはＲＮＡ源として使用し、それぞれ、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応の鋳型として使用する。
【００２７】
また、個体から得られたサンプルを、ＰｃｒＶに特異的な抗体と接触させ、対照サンプルと比較して増強した抗体結合を、個体のシュードモナス・アエルギノーザ感染と相関させることにより、個体におけるシュードモナス・アエルギノーザ感染を決定する。
【００２８】
追加の実施態様において、ＰｃｒＶをコード化するＤＮＡを、標準的な分子生物学的方法を使用して、遺伝子ワクチンとして使用する。例えば、当業者には公知の技術について、以下の参考文献を概観し得る。デイビス・エイチ・エル（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．）等、「Ｂ型肝炎のＤＮＡワクチン：チンパンジーにおける免疫原性の証拠および他のワクチンとの比較」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：７２１３−７２１８、１９９６；バリー・エム・エー（Ｂａｒｒｙ，Ｍ．Ａ．）等、「発現−ライブラリー免疫化を使用したマイコプラズマ感染からの保護」、Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：６３２−６３５、１９９５；キシアング・ゼット・キュー（Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．）等、「狂犬病ウイルスの核酸ワクチンに対する免疫応答」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０９：５６９−５７９、１９９５。ここで「有効量」の遺伝子ワクチンとは、シュードモナス感染またはシュードモナス感染症状を緩和または排除するに有効な量のワクチンを意味する。
【００２９】
タンパク質または抗原は、患者の抗体を検出するために診断的に使用することもでき、したがって、患者の感染状態を予測できる。好ましくは、シュードモナス感染が疑われる個体から得られたサンプルを、ＰｃｒＶタンパク質またはその断片と接触させ、タンパク質／抗体結合を検出する。その後、（対照サンプルと比較して）増強した抗体結合を、個体のシュードモナス・アエルギノーザ感染と相関させる。
【００３０】
別の実施態様において、本発明は、ＰｃｒＶを阻止することができ、そしてまた長期間にわたって動物において単鎖抗体の産生を生じさせる真核生物ベクターが送達される遺伝子送達実験において配列を利用することできる組換え単鎖抗体を製造するための抗体配列（これは下記および配列番号１〜４に報告される）の使用である。この配列はまた、ネズミのモノクローナル抗体をヒト化して、ヒト患者の治療において利用され得る製造物を製造するために利用することができる。
【００３１】
抗体がヒト使用に安全であるとなれば、（ａ）それを全身投与でき、また（ｂ）予防処置または治療法として肺に投与できる。ヒトでＰｃｒＶ抗体を使用するために、抗体は好ましくは「ヒト化」する。一般に、モノクローナル抗体が得られれば、重鎖および軽鎖可変領域をクローン化する。これらのクローン化した断片は、その後、ヒト抗体骨格（定常領域）に挿入する。このようにして、我々は、結合特異性を提供することに加えて、抗体のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ等）を調節できる。
【００３２】
本発明での使用において、ＰｃｒＶ抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナルでもよい。抗体は、特に治療適用のために、ヒトまたはヒト化され得る。抗体断片または誘導体、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）2またはＦｖも使用してよい。例えば、フストン（Ｈｕｓｔｏｎ）等（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９５−２１７、１９９３）に記載のような単鎖抗体は、本明細書に記載の方法にも用途を見出し得る。ここで「有効量」のＰｃｒＶ抗体または抗体断片とは、シュードモナス感染または感染症状を緩和または排除するに十分な量を意味する。
【００３３】
好ましくは、ＰｃｒＶに対するヒトまたはヒト化モノクローナルまたはポリクローナル抗体を投与し、Ｐ．アエルギノーザによる感染を予防または治療する。Ｐ．アエルギノーザ感染にさらされる危険性の高い患者において、抗体を、感染の予防のために投与できる。さらに、抗体は、感染を治療するために、感染の開始後に、投与してもよい。この場合、抗体は、単独で、または抗生物質と組合せて投与できる。抗生物質と共に抗体を投与することにより、より短いクールまたは低用量の抗生物質の投与が可能となり得、よって、抗生物質耐性生物の出現の危険性が減少する。
【００３４】
我々は、仮定上の少なくとも３つの型の患者を想定する。（１）重度の損傷または熱傷にさらされる危険性のある健康な個体（消防士、軍人、警官）を、永続する保護を与える方法（注射または鼻腔内のいずれか）によりワクチンで免疫化する。ブースターは、損傷後に病院の許可を得て投与する（筋肉内注射）。（２）機械的換気を受けている患者。（３）嚢胞性繊維症と遺伝子診断された患者。
【００３５】
ＰｃｒＶ抗体および抗体断片に加えて、小分子ペプチド擬似体または非ペプチド擬似体を、おそらくＰｃｒＶの作用を妨害することによる、シュードモナス感染の抑制または調節におけるＰｃｒＶ抗体の作用を擬似するように設計できる。かかる小分子擬似体を設計する方法は公知である（例えば、リプカ（Ｒｉｐｋａ）およびリッチ（Ｒｉｃｈ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４４１−４５２、１９９８；フアング（Ｈｕａｎｇ）等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４２：３６７−３８２、１９９７；アル−オベイジ（ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ）等、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２０５−２２３、１９９８参照）。ＰｃｒＶ抗体に基づき設計した小分子抑制剤を、ＰｃｒＶ−ＰｃｒＶ抗体結合相互作用を妨害する能力についてスクリーニングした。かかるアッセイで活性を示す候補小分子を、例えば、インビトロスクリーニングアッセイを含む、当分野で公知の方法により最適化し得、本明細書に記載の方法のいずれかにより、または当分野で公知のように、シュードモナス感染の抑制または調節についてインビボアッセイでさらに精製し得る。かかる小分子のＰｃｒＶ作用抑制剤は、シュードモナス感染の抑制または調節において本法に有用である。
【００３６】
本発明の別の態様において、ＰｃｒＶタンパク質は、ホスト細胞、特にヒト細胞、より特定すると、ヒト上皮細胞またはマクロファージに存在し得るＰｃｒＶレセプターを同定するために使用し得る。ＰｃｒＶレセプターの同定により、組合せライブラリーなどの小分子ライブラリーを、ＰｃｒＶ結合を妨害する候補についてスクリーニングすることが可能となる。かかる分子は、シュードモナス感染を抑制または調節する方法にも有用である。
【００３７】
レセプター同定における我々の最初の試みは、プルダウン実験でＰｃｒＶを使用することである。ＰｃｒＶを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させ、可溶化細胞抽出物のアフィニティークロマトグラフィーのカラムマトリックスに付着させる。ＰｃｒＶに特異的に結合しているタンパク質を溶出し、同定のためにアミノ末端シークエンスにかけた。平行実験で、ＰｃｒＶを、酵母二重ハイブリッド分析にかける。この場合、ＰｃｒＶは、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインを有するフレーム内に融合させる。クローンが得られれば、適切な酵母ホスト株に形質転換する。Ｇａｌ４ＰｃｒＶ作成物を含む酵母株を、Ｇａｌ４活性化ドメインを有するフレーム内にクローン化したＨｅｌａ細胞ｃＤＮＡバンクを用いて形質転換する。ヒスチジンを利用し、βガラクトシダーゼ（ＰｃｒＶと相互作用するタンパク質）を産生する能力を補完した二重形質転換体を、遺伝学的におよびヌクレオチド配列レベルで分析する。レセプターが細胞糖脂質である場合、我々は、糖脂質を、薄層クロマトグラフィーにより分離し、その後、放射標識細菌でプローブする、オーバーレイ技術を利用する。特異的成分への結合は、オートラジオグラフィーにより監視する。同じように、上皮およびマクロファージタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースにブロットし、放射標識細菌または標識ＰｃｒＶをのせる。ここでも、細菌が結合したタンパク質成分を、その後、オートラジオグラフィーにより同定する。
【００３８】
シュードモナス種は、動物界およびさらには植物界内の広範囲のホストを感染することが知られている。当業者には明らかなように、本明細書で開示した組成物および方法は、シュードモナス種による感染から生じた疾患または状態の抑制または調節において、広範囲の生物に使用し得る。本発明の組成物および方法は、特にシュードモナス・アエルギノーザへの適用について記載するが、本明細書に教示した方法を他の種に適用することは当業者の能力の十分範囲内である。
【実施例】
【００３９】
１．細胞毒性におけるＰｃｒＶの役割
III型媒介調節／分泌におけるＰｃｒＶの役割を決定するために、我々は、ＰｃｒＶの非極性対立遺伝子を作成し、この作成物を使用して、Ｐ．アエルギノーザＰＡ１０３株（インビトロで細胞毒性が高く（３）、インビボで肺上皮傷害を引き起こす（１２、１３）株である）の野生型対立遺伝子を置換した。細胞毒性および肺損傷は、特異的な細胞毒ＥｘｏＵの産生に起因する（３）。
【００４０】
ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶは、ＥｘｏＵ細胞毒（３）、ＰｃｒＶ（５）、および毒素の転位に必要なタンパク質ＰｏｐＤ（１４）を含む、Ｐ．アエルギノーザIII型系により分泌されるいくつかの細胞外産物の発現により特徴づけられた。濃縮培養上清のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、親株ＰＡ１０３は、カルシウムキレート剤であるニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）を含む培地中での増殖により、III型タンパク質の産生および分泌が誘導されることが示された（図１）。ＰｃｒＶをコード化する発現クローンが、親株においてトランスで提供される場合、ＮＴＡの存在または非存在に応答する細胞外タンパク質産生は正常である。ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶは、カルシウム盲目表現型を示し、細胞外タンパク質産生は、ＮＴＡの存在および非存在の両方で強く誘導される。これらの結果は、分泌系は、完全に機能しているが、調節は解除されていることを示唆する。この調節の解除された表現型は、細胞外Ｙｏｐｓを産生できず、カルシウムの存在または非存在にかかわらず３７℃で増殖し、ほんの一部しかＹｏｐｓの誘導を示さない、ＬｃｒＶ欠損株で報告されたカルシウム非依存性表現型と対照的である（７）。ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶを、野生型ＰｃｒＶを発現するクローンで補完することにより、ＮＴＡ誘導に応答した、正常な細胞外タンパク質産生調節が回復した。
【００４１】
Ｐ．アエルギノーザ病理発生に対するＰｃｒＶの寄与を試験するために、２つの感染モデルを使用した。インビトロモデルにおいて、親および数個の変異誘導体株を、ＣＨＯ細胞感染アッセイで、細胞毒性を引き起こす能力について比較した（３）。この実験の陰性対照は、III型病原性決定要因の転位が欠損していることが以前に示されたＰＡ１０３ｐｏｐＤ：：Ω（１４）、およびＥｘｏＵが産生されないために、細胞毒性のないＰＡ１０３ΔｅｘｏＵを含んだ（３、１５）。
【００４２】
３時間感染後、ＣＨＯ細胞は、野生型およびＰｃｒＶを発現するプラスミド作成物で補完したΔｐｃｒＶ株で、トリパンブルーを除外できなかった。ＣＨＯ細胞を、陰性対照株またはＰＡ１０３ΔｐｃｒＶで感染させた場合、染色は起こらなかった（データは示していない）。これらの結果により、ＰｃｒＶ発現は細胞毒性に必要であることが示唆される。精製組換えＰｃｒＶは、外因的に組織培養細胞に加えた場合、細胞毒性ではなかった。転位に必要なIII型タンパク質の分泌は、ｐｃｒＶの欠失により影響を受けなかったので（図１ＡおよびＢ）、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶには、ＥｘｏＵ転位が欠損しているようである。
【００４３】
図１Ａおよび１Ｂは、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶの表現型分析を示す、染色ゲル（図１Ａ）およびウエスタンブロット（図１Ｂ）である。トランスのＰｃｒＶを発現するプラスミドを含む、または含まない、親およびΔｐｃｒＶ誘導体を、Ｐ．アエルギノーザのIII型分泌の誘導物質、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）の非存在下または存在下で増殖させた。細胞外タンパク質プロフィル（図１Ａ）を、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％）上で分析した。Ｐ．アエルギノーザコード化III型タンパク質の移動は左に示し、分子量マーカーの移動は右に示す。図１Ｂは、結合したＩｇＧを検出するために、ＥｘｏＵ、ＰｃｒＶ、およびＰｏｐＤに特異的な抗体および125Ｉ−プロテインＡを使用した重複ゲルのウエスタンブロットである。
【００４４】
野生型および変異Ｐ．アエルギノーザ株は、低および高攻撃用量の細菌を使用して、急性肺感染モデルで試験した。生存測定により、ＰｃｒＶおよびＰｏｐＤが、致命的感染の誘導に必要であることが示された（図２Ａ）。３つの独立した肺損傷測定を利用した実験において（肺の気腔から血流への標識アルブミンの流入、肺の気腔から胸水への標識アルブミンの流入、および肺浮腫を測定する湿潤／乾燥比）、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶ、ベクター対照株（ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶｐＵＣＰ１８）、およびＰＡ１０３ｐｏｐＤ：：Ωにより引き起こされる損傷度は、非感染対照動物と全く異ならなかった（図２Ｂ）。ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶをトランスのｐｃｒＶで補完することにより、肺損傷レベルは、親株ＰＡ１０３で測定されたものに戻った。合わせると、これらのデータにより、ＰｃｒＶ発現は、急性肺感染モデルにおけるＰ．アエルギノーザの病原性に必要であり、ＰｃｒＶの機能の一部は、III型エフェクタータンパク質を真核細胞に転位する能力に関連があるようである。
【００４５】
図２Ａおよび２Ｂは、Ｐ．アエルギノーザ親および変異株の生存および肺損傷を示す、グラフ（図２Ａ）および棒グラフのセット（図２Ｂ）である。図２Ａに関して、マウスを、５×１０5ｃｆｕの示された各株で攻撃し、生存を１週間監視した。図２Ｂに関して、肺損傷を、肺の気腔から血液への（肺上皮損傷）、胸水への（胸水）標識アルブミンの流入により、または湿潤／乾燥比（肺浮腫）の測定により評価した。２つの細菌感染用量を使用し、黒棒および縞棒により表した。対照ないし試験群での有意差（＊ｐ＜０．００１）を、一方向性分散分析およびダネット（Ｄｕｎｎｅｔ）複数比較試験により決定した。以下の略称を使用した。ＰＡ１０３、親野生型株；ΔｐｃｒＶ、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶ；ΔｐｃｒＶｐＵＣＰｐｃｒＶ、ＰｃｒＶを発現するプラスミドで補完したＰＡ１０３ΔｐｃｒＶ；ΔｐｃｒＶｐＵＣＰ、ベクター対照を有するＰＡ１０３ΔｐｃｒＶ；ｐｏｐＤ：：Ω、転位欠損株であるＰＡ１０３ｐｏｐＤ：：Ω。
２．ＰｃｒＶを用いた免疫化
【００４６】
ＰｃｒＶを用いた免疫化により致命的な肺感染から動物が守られるかを決定するために、組換えＰｃｒＶ（ｒＰｃｒＶ）またはＥｘｏＵ（ｒＥｘｏＵ）を、ヒスチジン標識融合タンパク質として精製し、抗原として使用した。マウスを免疫化し、その後、気腔を介して、致死量のＰＡ１０３株で攻撃した。生存を測定すると、両方のワクチンがマウスを保護した（図３Ａ）。肺損傷を評価すると、ＰｃｒＶワクチン接種を受けた動物のみにおいて、上皮傷害および肺浮腫が有意に低かった（図３Ｂ）。ＰｃｒＶワクチンで免疫化した動物は、その肺における細菌が有意に低く、このことは、シュードモナスＶ抗原の遮断により、肺からの細菌の迅速な除去が促進され、重度の上皮損傷から動物が守られることを示唆する（図３Ｂ）。
【００４７】
図３Ａおよび３Ｂは、生存、肺損傷、および細菌コロニー化に対する免疫化の効果を示す、グラフ（図３Ａ）および棒グラフのセット（図３Ｂ）である。図３Ａに関して、マウスを、示されたように免疫化し（ＰｃｒＶ、ｎ＝１０；ＥｘｏＵ、ｎ＝５；対照、ｎ＝１０）、５×１０5ＣＦＵ／動物のＰＡ１０３株で攻撃した。生存動物の比率を、１週間決定した。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ  ｌｏｇ  ｒａｎｋ検定によりｐ＜０．０５。図３Ｂに関して、ＰＡ１０３の設置４時間後の、ワクチン接種動物の肺損傷評価および細菌コロニー形成。肺上皮損傷、肺浮腫、および細菌負荷；ＰｃｒＶ、ｎ＝９；ＥｘｏＵ、ｎ＝４；および対照、ｎ＝８。肺の細菌の最終数は、Ｙ軸×１０4ＣＦＵの数として示される。ダネット複数比較試験により決定、肺損傷（ｐ＜０．０１）、肺浮腫（ｐ＜０．０５）、および細菌数（ｐ＜０．０５）の有意差（＊）。肺損傷における一方向性分散分析、ｐ＝０．０００５；肺浮腫、ｐ＝０．０４３７；細菌負荷、ｐ＝０．００７５。
【００４８】
治療介入が可能であるかを決定するために、５×１０5ＣＦＵ／マウスの濃度のＰＡ１０３を気腔滴下する１時間前に、マウスを、免疫前のウサギＩｇＧ、またはｒＰｃｒＶ、ｒＥｘｏＵ、またはｒＰｏｐＤに特異的なウサギＩｇＧを用いて受動免疫化した。ｒＰｃｒＶに対する抗体により、致命的感染に対する完全な保護が提供された（図４）。抗ｒＥｘｏＵ  ＩｇＧにより部分的生存が提供され、これは、対照ＩｇＧの投与とは有意に異なっていたが、全ての生存動物が試験中に重病であるようであった。生存は、別のIII型転位タンパク質ＰｏｐＤに対する抗体の受動移動により向上しなかった。これらの結果から、我々は、ＰｃｒＶに対する抗体は、急性肺感染モデルで高度に保護的であり、ＰｃｒＶは、細菌表面上にさらされ得るか、または抗体−抗原相互作用に利用可能な可溶形であり得ると結論する。
【００４９】
図４は、５×１０5ＣＦＵ／マウスのＰＡ１０３株で攻撃して生存した動物数のグラフである。動物を、免疫ＩｇＧ１００μｇまたは非免疫化ウサギ由来の対照ＩｇＧ（ｒＰｃｒＶ、免疫前の血清）で前処置した。各群についてＮ＝１０；Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ  ｌｏｇ  ｒａｎｋ検定により、抗ＰｃｒＶおよび抗ＥｘｏＵ  ＩｇＧ調製物での処理において、＊ｐ＜０．０５対対照群。
【００５０】
ＰｃｒＶが、中和を受け易い場合、抗ｒＰｃｒＶ  ＩｇＧと細菌種菌の併用投与により、肺損傷および致死から完全に守られる。ＩｇＧ調製物を、細菌を肺に滴下注入する前に、種菌（致死種菌よりも１０倍高い用量）と混合し、生存を測定した。唯一、抗ｒＰｃｒＶ  ＩｇＧのみが、この極度な感染から保護した（図５Ａ）。肺損傷は、正常致死量である５×１０5細菌で感染させた動物で測定した。肺の気腔からの標識アルブミンの流出は、抗ｒＰｃｒＶ  ＩｇＧの同時投与後、非感染対照よりも僅か３％高かった（図５Ｂ）。肺から胸水への標識タンパク質の流出減少は、抗ＰｃｒＶを種菌と共に含めた場合、非感染対照と同じであった。珍しいことに、湿潤／乾燥比により測定した肺浮腫は、抗ｒＰｃｒＶまたは抗ｒＰｏｐＤの添加により有意に減少した（図５Ｂ）。従って、細菌と抗ｒＰｃｒＶ  ＩｇＧの併用投与は、ワクチン接種よりも、全ての肺損傷パラメーターを規格化する上で、さらにより効果的であった。これらのデータは、ＰｃｒＶが抗体媒介中和を受け易いことを支持し、肺損傷の臨床関連減少を文書で裏付け；ＰｃｒＶに対する抗体は、シュードモナス・アエルギノーザにより引き起こされる重度の院内肺炎の治療における治療薬として使用し得る。
【００５１】
図５は、ＩｇＧおよび細菌攻撃の併用投与による肺損傷からの生存および保護を示す、グラフ（図５Ａ）および棒グラフのセット（図５Ｂ）である。ＩｇＧ（５μｇ）を、５×１０6（生存アッセイ用、１群あたりｎ＝１０）または５×１０5（肺損傷測定用、１群あたりｎ＝４〜６動物）のＰ．アエルギノーザＰＡ１０３株と混合した。この混合物を、肺に滴下注入し、生存（図５Ａ）または肺損傷（図５Ｂ）を評価した。生存では、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ  ｌｏｇ  ｒａｎｋ検定による抗ＰｃｒＶにおいて＊ｐ＜０．０５対対照ＩｇＧ；肺上皮損傷および肺浮腫では、ダネット複数比較試験により、＊ｐ＜０．０５対対照ＩｇＧ。肺損傷における一方向性分散分析、ｐ＝０．０２６、および肺浮腫、ｐ＜０．０００５。
【００５２】
急性Ｐ．アエルギノーザ感染では、III型媒介中毒の実効効果は、上皮を超えて細菌の播種を促進し、胸水、脾臓、肝臓、および血流の感染をもたらし得ることである。急性換気装置関連肺炎からの、または熱傷感染からの、Ｐ．アエルギノーザによる血液由来感染の結果、活発な抗生物質処置にもかかわらず、死亡率は４０−８０％であり得る（１６）。ＰｃｒＶは、Ｐ．アエルギノーザのIII型転位複合体の成分であるに違いない。なぜなら、このタンパク質の産生が欠損している変異体は、転位に必要なIII型エフェクターおよびタンパク質を産生および分泌できるにもかかわらず、ＣＨＯ細胞を中毒させることができないか、または肺上皮損傷を引き起こすことができないからである。ＰｏｐＤ（これもまた転位に必要である）と異なり、ＰｃｒＶは、抗体媒介中和を受け易く、これは、抗体は急性感染の有用な治療剤であり得ることを示唆する。
【００５３】
３．実施例１および２の方法
ＰｃｒＶの非極性挿入物の作成および補完。ｐｃｒＧＶＨｐｏｐＢＤおよびフランキング配列をコード化する５．０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ制限断片を、対立遺伝子置換ベクターｐＮＯＴ１９にクローン化した（１７）。２つのＮｏｔＩ部位（１つはｐｃｒＧ内で、１つはｐｏｐＢ内）を、スカルプター（Ｓｃｕｌｐｔｏｒ）変異誘発系（アマシャム）を使用して、挿入配列から除去した。内部ＳｓｔＩ制限断片を、ｐｃｒＶから欠失させ、残基１７−２２１をインフレーム欠失させた（ｐＮＯＴΔｐｃｒＶ）。プラスミドの組込みを選択するために、テトラサイクリン耐性（ＴｃΩ）をコード化する遺伝子を、ベクターのＨｉｎｄIII部位にクローン化した（ｐＮＯＴΩΔｐｃｒＶ）。ＭＯＢカセット（１７）を、ＮｏｔＩ断片として加えた。部分二倍体の選択、プラスミド配列の分解能、および対立遺伝子置換の確認を、前記した通り行なった（１８）。シャトルプラスミド（ｐＵＣＰ、１９）を使用して、ｐｃｒＶ欠失を補完したクローンを作成した。ＰｃｒＶのコード配列を増幅し、ＥｘｏＳプロモーター領域の制御下でクローン化した（２０）。ＥｘｏＳの転写は、Ｐ．アエルギノーザにおけるIII型分泌および転位を調節するオペロンと協調的に調節されている（２）。ヌクレオチド配列は、部位特異的変異、ＰＣＲ増幅、またはインフレーム欠失を含む、各ＤＮＡ作成物について確認した。
【００５４】
分泌産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析。Ｐ．アエルギノーザを、誘導（＋ＮＴＡ）または非誘導条件下（−ＮＴＡ）で、III型分泌産物を発現させるために増殖した（１８）。培養物を、５４０ｎｍでの光学密度測定に基づき収集し、上清画分を、硫酸アンモニウムの飽和溶液を最終濃度が５５％となるように添加して濃縮した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１１％）の各レーンに、３μｌの２０倍濃縮した上清をのせ、クーマシーブルーで染色した。同一のゲルを、ＥｘｏＵ、ＰｏｐＤ、およびＰｃｒＶを特異的に認識する、ウサギ抗血清のカクテルを使用して、前記の通り（３−５）ウエスタンブロット分析にかけた。125Ｉで標識したプロテインＡを、第二試薬として使用して、結合したＩｇＧを同定した。
【００５５】
感染モデルおよび肺損傷評価。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、細胞毒性およびIII型転位を測定するために設計した、インビトロ感染モデルに使用した（２１）。簡潔には、細菌種菌を、血清を含まない組織培養培地で調製した。血清含有培地中で繁殖させたＣＨＯ細胞を洗浄し、５：１の感染多重度で、様々なＰ．アエルギノーザ株で感染させた。培養物を、組織培養条件下（３７℃、５％ＣＯ2）で３時間インキュベートし、洗浄し、トリパンブルーで染色した。色素への透過性は、位相差写真から決定した。ＥｘｏＵを発現する親株ＰＡ１０３での感染により、インキュベートの３時間後、単層の約８０％がトリパンブルー染色され、インキュベートの４−５時間後、単層は完全に破壊される。マウス感染および肺損傷の評価は、前記した通りに行なった（１６）。簡潔には、雄で８−１２週令の病原体のないＢＡＬＢ／ｃマウスを、シモンセン（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ）研究所（ギルロイ、カリフォルニア）から購入し、柵のある状態に飼った。マウスを、簡潔には、吸入メトファン（メトキシフルラン、ピットマン−ムーア（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ）、マンデライン（Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ）、イリノイ）で麻酔し、約３０°の角度で、仰臥位に配置した。１５μｌの細菌性種菌を、中咽頭を介して気管に挿入した修飾２４ゲージ動物栄養補給針（ポッパー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｐｏｐｐｅｒ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューハイドパーク、ニューヨーク）を使用して、左葉にゆっくりと滴下注入した。肺損傷評価を測定する場合、５％マウスアルブミンと共に、リンガーラクテート１ｍｌ中、０．５μＣｉの131Ｉ標識ヒト血清アルブミン（メルク−フロスト（Ｆｒｏｓｓｔ）、ケベック、カナダ）、０．０５μｇの無水エバンスブルーを滴下注入液に加えた。感染の４時間後、マウスを麻酔し、血液を頚動脈穿刺により集め、正中胸骨切開を行なった。肺、胸水、気管、中咽頭、胃、および肝臓を収集し、放射活性を測定した。滴下注入した肺に残り、循環または胸水に侵入した、放射活性アルブミンの比率を、血液量（体重×０．０７）に、終末血液サンプルで測定された計数（１ｍｌあたり）を掛けることにより計算した。肺の湿潤／乾燥比は、１ｍｌの水を肺に加え、混合物をホモジナイズすることにより決定した。ホモジネートは、前以て秤量したアルミニウム皿に置き、８０℃のオーブンで３日間一定重量になるまで乾燥させた。肺ホモジネートは、連続希釈し、細菌を定量評価するためにヒツジ血液寒天上に置いた。
【００５６】
ＰｃｒＶ、ＰｏｐＤ、およびＥｘｏＵに対するウサギ抗血清の産生。ｒＰｃｒＶ、ｒＰｏｐＤ、およびｒＥｘｏＵは、ｐＥＴ１６ｂにおいてヒスチジン標識融合タンパク質として産生し、前記した通りニッケルクロマトグラフィーにより精製した（２２）。ウサギに、フロイント完全アジュバント中で乳化した３００μｇの組換えタンパク質を皮内注射（１０部位）し、フロイント不完全アジュバント中の抗原をブースター投与し、７日間間隔で周期的に採血した。受動免疫化するために、ＩｇＧ画分を、プロテインＡカラムクロマトグラフィー（ピアスケミカルズ、ロックフォード、イリノイ）を使用して単離した。マウスに、５×１０5ＣＦＵのＰＡ１０３株で攻撃する１時間前に、１００μｇのＩｇＧ（腹腔内注射）を注射した。ｒＰｃｒＶおよびｒＥｘｏＵを用いて能動免疫化するために、エンドトキシンを、１％トリトンＸ−１１４での抽出により、タンパク質調製物から除去した（２３）。抽出後、トリトンＸ−１１４を、セファクリルＳ−２００クロマトグラフィーにより除去した。全ワクチン調製物が、リムルスアメーバ様細胞ライセートアッセイ（バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ウォーカースヴィレ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）、メリーランド）の使用により決定されたように、４０μｇの組換えタンパク質あたり、１ｎｇ以下のエンドトキシンを含んだ。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、フロイント完全アジュバント中、１０μｇの組換えタンパク質を皮下注射した。３０日目に、マウスを、フロイントの不完全アジュバント中、追加の１０μｇの抗原をブースター投与した。５１日目に、マウスを、その左肺へのＰ．アエルギノーザの滴下注入により攻撃した。
【００５７】
４．モノクローナル抗体の合成
マウスを、フロイントの完全アジュバント中、１０μｇの精製、ＬＰＳ非含有、組換えＰｃｒＶを用いて免疫化し、２週間後に、フロイントの不完全アジュバント中で乳化した、同量の抗原を用いてブースター投与した。免疫化は皮下で行なった。フロイントの不完全アジュバント中のＰｃｒＶのブースター用量の１週間後に、脾臓をマウスから収集した。
【００５８】
単一の脾臓を、血清を含有しない組織培養培地５ｍｌに置き、片に切断し、穏やかにホモジナイズした。組織の大片を、ホモジネートおよび上清から沈降させ、単一細胞懸濁液を取り出し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。ペレット化した細胞を、１０ｍｌ溶液に再懸濁し、赤血球を５分間溶解し、引き続き、１０ｍｌのウシ胎児血清を敷いた。物質を、１２００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を３０ｍｌの培地に懸濁した。脾臓細胞およびミエローマ細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）を、１２００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集し、各ペレットを、別々に、１０ｍｌの組織培養培地に懸濁した。１０8脾臓細胞および２×１０7ミエローマ細胞を混合し、１２００ｒｐｍで６分間の遠心分離により一緒にペレット化させた。上清を吸引により取り出し、１ｍｌの３５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を加えた。細胞をこの溶液に穏やかに懸濁し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。いくつかの実験では、遠心分離は省いた。
【００５９】
ＰＥＧ添加から正確に８分後、２５ｍｌの培地を加え、細胞を穏やかに再懸濁した。５分間の１２００ｒｐｍでの遠心分離段階の後、細胞ペレットを、３０％ならし培地および７０％完全培地（血清含有）中１ｍｌあたり１×１０6の密度で懸濁した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。次の日、細胞を遠心分離により収集し、２００ｍｌの３０％ならし培地およびヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含む７０％完全培地中に懸濁した。
【００６０】
１ウェルあたり、約０．２ｍｌのこの細胞懸濁液を、１０個の９６ウェルプレート（９６ウェルプレートあたり１２ｍｌ）に加えた。残りの細胞の密度は、１ｍｌあたり２．５×１０5に調整し、細胞を９６ウェル型式で培養した。プレートを、単一のコロニーについて顕微鏡でスクリーニングし、その後、上清を、抗原として組換えＰｃｒＶを使用して、酵素結合免疫吸着検定法により抗体産生について試験した。ＰｃｒＶに反応性の抗体を産生するクローンを、より大きな培養皿に継代培養し、その後、アイソタイプを決定した。
【００６１】
抗体の結合は、ウェルを覆膜する抗原（ヒスチジン標識タンパク質）として組換えＰｃｒＶを使用して、酵素結合免疫吸着検定法で試験した。モノクローナル抗体は、ヒスチジン標識を有さない天然ＰｃｒＶを含むＰ．アエルギノーザ上清を使用して、ウエスタンブロット反応でも試験した。
【００６２】
５．ＰｃｒＶ抗原の同定
我々は、標識されたＰｃｒＶと結合する抗体を産生する約３００個の細胞株を得た。これらの最初の細胞株は保管のために液体窒素で保存された。すべての細胞株は、安定なクローンを単離するために継代培養された。安定なクローンを単離することと同時に、我々は、インビトロアッセイを、動物感染モデルにおける中毒からの保護に対する相関関係を示すものとして開発した。
【００６３】
安定に継代培養され、そしてＥＬＩＳＡにおいてＰｃｒＶに対して反応性の抗体を依然として産生するハイブリドーマ（約８０個の細胞株）を、続いて、下記の技術および仮定を使用して蛍光活性化細胞分取器で試験した。抗体がタイプIII中毒システムを阻止する場合、阻止するモノクローナル抗体が存在するもとでは、より少数の細胞が我々のトキシンによって殺されると推論した。細胞を８０個のモノクローナル抗体のそれぞれにさらし、毒性の細菌を加え、インキュベーションして、死細胞のＤＮＡに対してのみ透過性である色素（ヨウ化プロピジウム）を加えた。過剰な色素を洗い流し、細胞を集め、固定して、ＦＡＣＳによって分析した。死細胞は、色素が漏入し、色素により核内のＤＮＡが染色されるので蛍光を発する。
【００６４】
細胞がウサギポリクローナル抗ＰｃｒＶ、マウスポリクローナル抗ＰｃｒＶまたはｍａｂ１６６および細菌とインキュベーションされた場合、関連しないポリクローナル抗体（抗ＰｏｐＤ）またはそれ以外の７８個のモノクローナル抗体とインキュベーションされたコントロールの場合よりも少数の細胞が死亡したことを我々は見出した。
【００６５】
ｍａｂ１６６は、細菌によってコードされるタイプIII分泌因子（これはＰｃｒＶと名付けられた）に結合することが特異的に見出された。ＰｃｒＶは、細胞死を引き起こす細菌トキシンの輸送を促進する、Ｐ．アエルギノーザと肺細胞との相互作用を媒介する。この反応は、Ｐ．アエルギノーザに対する固有的な免疫応答に関与する肺細胞の除去をもたらすと考えられる。これらの細胞の死は、宿主の上皮細胞をＰ．アエルギノーザのコロニー形成ならびに胸膜液および血流への広がりに対して無防備の状態にする。細菌が血流中に進入すると、Ｐ．アエルギノーザによってコードされる抗生物質抵抗性により、効果的な処置は有効でなくなる。
【００６６】
Ｐ．アエルギノーザによる急性肺感染の動物モデルにおける細菌の滴下注入前および滴下注入後にｍａｂ１６６によってもたらされる保護は顕著である。ヒトのＰ．アエルギノーザ感染症における介入のための抗体処置様式を設計するためには、ヒトのモノクローナル抗体を製造するか、またはｍａｂ１６６によって規定されるＰｃｒＶの保護的なエピトープで危険性の患者を免疫化するかのいずれかが必要である。下記に記載される研究の目的は、ｍａｂ１６６が結合するＰｃｒＶのアミノ酸配列を明らかにすることである。
【００６７】
結果
我々は、ｍａｂ１６６が結合するアミノ酸残基を明らかにするために分子遺伝学的方法を使用した。ＰｃｒＶは２９４個のアミノ酸を有する。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して分子の一部をヌクレオチド配列レベルで欠失することからなった。各生成物を、グルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子と読み枠を合わせてタンパク質発現ベクターにクローン化した。この方法では、少数のＰｃｒＶアミノ酸をコードする欠失体が、ウエスタンブロット技術またはドットブロット技術を使用して確実に検出され得る。グルタチオンＳトランスフェラーゼのみをコードするコントロールの細菌溶解物は、我々の抗ＰｃｒＶポリクローナル抗体またはｍａｂ１６６モノクローナル抗体のいずれに対しても反応性を示さなかった。
【００６８】
（１つの全長ＰｃｒＶ発現プラスミドとともに）合計で６６個のクローンを構築し、発現させ、そしてウサギポリクローナル抗ＰｃｒＶ抗血清に対する反応性について調べた。１個のクローンを除くすべてが抗ＰｃｒＶウサギ抗体に結合した。このことにより、発現したタンパク質はＰｃｒＶと読み枠が一致していることが確認された。１個の非反応性クローンは分析から除かれた。Ｃ端欠失体（ｎ＝５個の構築物）はどれもｍａｂ１６６と結合しなかった。このことは、エピトープがタンパク質のＣ末端側の半分に存在することを示唆している。ＰｃｒＶのアミノ酸（ａａ）１３９〜２９４をコードするＮ端短縮タンパク質（ｎ＝８個の構築物）のうちの１個だけがｍａｂ１６６に結合した。この実験により、ｍａｂ１６６のエピトープはタンパク質のカルボキシル端側の半分によってコードされているという我々の仮説が確認された。残る５１個の構築物は分子の様々な内部欠失体をコードしていた。下記の表１にまとめられた結合性分析により、ｍａｂ１６６によって認識される最小エピトープがＰｃｒＶのａａ１４４〜２５７から構成されることが明らかにされた。
【００６９】
【表１−１】
2005500250.tif 000002
【００７０】
【表１−２】
2005500250.tif 000003
【００７１】
【表１−３】
2005500250.tif 000004
【００７２】
６．ＰｃｒＶ特異的抗体の試験
方法
ポリＡ＋ＲＮＡの抽出。ハイブリドーマ細胞株ｍ１６６を、４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭの２−メルカプトエタノール、３ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンを含む完全ダルベッコ最少必須培地で培養した。細胞が７５ｃｍ2フラスコにおいてコンフルエンス状態に達した後、細胞を６００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって集めた。細胞のペレットを２ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）においてホモジネートした。総ＲＮＡ（１００μｇ）が、クロロホルム分画、イソプロパノール沈殿および７０％エタノール洗浄の後で抽出された。ポリＡ＋ＲＮＡ（４μｇ）を、オリゴテックスｍＲＮＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて抽出した。
【００７３】
ＲＮＡオリゴのキャッピング。ｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）を、非ｍＲＮＡまたは短縮化ｍＲＮＡを脱リン酸化するためにウシ腸ホスファターゼとともに５０℃で１時間インキュベーションした。反応後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、脱リン酸化ＲＮＡをタバコ酸性ピロホスファターゼとともに３７℃で１時間インキュベーションして、５’−キャップ構造を全長ｍＲＮＡから除いた。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、合成ＲＮＡオリゴ（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡオリゴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて３７℃で１時間、脱キャップ化ＲＮＡに連結した。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、ＲＮＡを１３μＬのジエチルピロカルボネート処理水に懸濁した。
【００７４】
ｍＲＮＡの逆転写。ＲＮＡ−オリゴが連結された全長ｍＲＮＡ（１３μＬ）を、１８ヌクレオチドのｄＴテールを含有する５４塩基対プライマー（ＧｅｎｅＲａｃｅｒオリゴｄＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を用いて、２０μＬの反応において４２℃で１時間逆転写した。反応後、サンプルを滅菌水で４倍に希釈した。
【００７５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡ端の増幅。１マイクロリットルのｃＤＮＡをＰＣＲのために使用した。合成ＲＮＡオリゴ配列に由来する５’プライマー（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびネズミ免疫グロブリンγ２ｂ鎖ＣＨ１領域特異的プライマーまたはネズミ免疫グロブリンκ鎖ＣＬ領域特異的プライマーを使用した。ＰＣＲ反応のために使用されたサイクル処理パラメーターは下記の通りであった。１）９４℃で２分、１サイクル、２）９４℃で３０秒および７２℃で１分、５サイクル、３）９４℃で３０秒、７０℃で３０秒および７２℃で１分、５サイクル、４）９４℃で３０秒、６８℃で３０秒および７２℃で１分、２０サイクル、５）７２℃で１０分。
【００７６】
サブクローニングおよびＤＮＡ配列決定。ＰＣＲ産物（ネズミ免疫グロブリンγ２ｂ鎖ＣＨ１領域由来の断片およびネズミ免疫グロブリンκ鎖ＣＬ領域由来の断片）をｐＣＲＩＩベクター（ＴＯＰＯクローニング、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化し、そしてＤＮＡ配列を分析するためにＵＣＳＦ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒに付託した。
【００７７】
配列番号１はｍ１６６重鎖ｍＲＮＡのＤＮＡ配列であり、配列番号２はｍ１６６重鎖（ＩｇＧＩＩb）のアミノ酸配列であり、配列番号３はｍ１６６軽鎖ｍＲＮＡのＤＮＡ配列であり、配列番号４はｍ１６６軽鎖のアミノ酸配列である。図６Ａ、図６Ｂおよび図７により、配列が調べられ、より細部が示される。
【００７８】
商業的意義
本発明の抗体配列は、ＰｃｒＶを阻止することができ、そしてまた長期間にわたって動物において単鎖抗体の産生を生じさせる真核生物ベクターが送達される遺伝子送達実験において配列を利用することができる組換え単鎖抗体を製造するために使用することができる。最後に、本発明の抗体配列は、ネズミのモノクローナル抗体をヒト化して、ヒト患者の治療において利用され得る製造物を製造するために利用することができる。当業者は、ヒト化抗体を作製するために、齧歯類の抗体の可変領域に由来する抗原結合性の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトの可変ドメインにつなぐことなどの標準的な方法に注目する。
【００７９】
７．ＰｃｒＶに対する単鎖抗体
ａ．単鎖抗体の組み立て
ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子が、それぞれの遺伝子について特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。増幅されたＶＨ断片およびＶＬ断片は、プライマーとともにＰＣＲを使用することによってリンカーとともに組み立てられた。組み立てられた単鎖抗体遺伝子（リンカーを伴うｓｃＦｖ：：ｍ１６６：ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子）をクローニングベクターｐＣＲ４Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に移した。その後、ｓｃＦｖ：：ｍ１６６のコード配列を、宿主大腸菌としてのＬＭＧ１９４における大腸菌発現ベクターｐＢＡＤ／ｇIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。
【００８０】
ｂ．タンパク質の誘導および精製
タンパク質誘導のために、０．２％グルコースおよび１００μｇのアンピシリンを含有するＲＭ培地において、形質転換大腸菌をオービタル振とう機（２００ｒｐｍ）にて３７℃で一晩培養した。翌日、５ｍＬの培養された大腸菌を５００ｍＬの同じ培地に移して、１００ｒｐｍにおいて室温で３時間インキュベーションした。Ｌ−アラビノースを０．００４％の濃度で加えた後、大腸菌を一晩培養した。３日目に、タンパク質を浸透圧ショック法によって大腸菌の細胞周辺腔から集めた。浸透圧ショック由来のペリプラズムタンパク質を含む溶液を溶解緩衝液に対して一晩透析した。４日目のとき、透析された溶液をニッケル−ＮＴＡカラムに負荷して、ヘキサヒスチジン標識の単鎖抗体を精製した。ニッケルカラムからの溶出液をリン酸塩緩衝化生理的食塩水に対して一晩透析した。５日目に、透析された溶液を遠心分離濃縮器に加えて、より高濃度のｓｃＦｖ：ｍ１６６を作製した。
【００８１】
ｃ．結合試験
精製された単鎖抗体（ｓｃＦｖ：：ｍ１６６）を、組換えＰｃｒＶに対する酵素結合免疫吸着アッセイを使用することによって、そして組換えＰｃｒＶタンパク質およびＰ．アエルギノーザＰＡ１０３の未変性ＰｃｒＶの両方に対する免疫ブロット（ウエスタンブロット）によって調べた。
【００８２】
本発明の単鎖抗体により、我々は、様々なファージディスプレー技術を利用して抗体をヒト化することができ、そしてこれらの技術を使用して抗体の親和性を改善することができる。本発明の単鎖抗体は、（組織学のための）診断ツールとして利用することができるが、治療剤としては利用されない。しかし、単鎖抗体に対する遺伝子は遺伝子治療において利用することができ、その結果、動物は、ある期間にわたって単鎖抗体を産生し、それにより、Ｐ．アエルギノーザ感染からの保護を生じさせることができる。
【００８３】
８．参考文献
１．ウィーナー−クロニッシュ・ジェイ・ピー（Ｗｉｅｎｅｒ−Ｋｒｏｎｉｓｈ，Ｊ．Ｐ．）、サワ・ティー（Ｓａｗａ，Ｔ．）、クラハシ・ケー（Ｋｕｒａｈａｓｈｉ，Ｋ．）、オーハラ・エム（Ｏｈａｒａ，Ｍ．）、およびグロッパー・エム・エー（Ｇｒｏｐｐｅｒ，Ｍ．Ａ．）、「細菌性肺炎に関連した肺浮腫」、肺浮腫（マタイ・エム・エー（Ｍａｔｔｈａｙ，Ｍ．Ａ．）およびイングバー・ディー・エイチ（Ｉｎｇｂａｒ，Ｄ．Ｈ．）編）ｐｐ．２４７−２６７（マーセル・デッカー・インコーポレイテッド（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９９８）。
２．フランク・ディー・ダブリュー（Ｆｒａｎｋ，Ｄ．Ｗ．）、「シュードモナス・アエルギノーザの細胞外酵素Ｓレギュロン」、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：６２１−６２９（１９９７）。
【００８４】
３．フィンク−バーバンコン・ヴィー（Ｆｉｎｃｋ−Ｂａｒｂａｎｃｏｎ，Ｖ．）等、「シュードモナス・アエルギノーザによるＥｘｏＵ発現は、急性細胞毒性および上皮損傷と相関する」、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：５４７−５５７（１９９７）。
４．ヤー・ティー・エル（Ｙａｈｒ，Ｔ．Ｌ．）、ゴランソン・ジェイ（Ｇｏｒａｎｓｏｎ，Ｊ．）およびフランク・ディー・ダブリュー、「シュードモナス・アエルギノーザの細胞外酵素は、III型経路により分泌される」、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：９９１−１００３（１９９６）。
５．ヤー・ティー・エル、メンデ−ミュエラー・エル・エム（Ｍｅｎｄｅ−Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．）、フリーズ・エム・ビー（Ｆｒｉｅｓｅ，Ｍ．Ｂ．）、およびフランク・ディー・ダブリュー、「シュードモナスアエルギノーザ細胞外酵素ＳレギュロンのIII型分泌産物の同定」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７１６５−７１６８（１９９７）。
６．ウエック・シー・ジェイ（Ｈｕｅｃｋ，Ｃ．Ｊ．）、「動物および植物の細菌病原体におけるIII型タンパク質分泌系」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：３７９−４３３（１９９８）。
７．スクルジペック・イー（Ｓｋｒｚｙｐｅｋ，Ｅ．）およびストラレイ・エス・シー（Ｓｔｒａｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．）、「Ｖ抗原の分泌に対する、ｌｃｒＶの欠失の異なる効果、低Ｃａ2+応答の調節、およびエルシニア・ペスティスの病原性」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２５３０−２５４２（１９９５）。
８．ナカジマ・アール（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｒ．）およびブルベーカー・アール・アール（Ｂｒｕｂａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．）、「エルシニア・ペスティスの病原性ないしγインターフェロンおよび腫瘍壊死因子αの抑制の関連」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２３−３１（１９９３）。
【００８５】
９．ナカジマ・アール、モティン・ヴィー・エル（Ｍｏｔｉｎ，Ｖ．Ｌ．）およびブルベーカー・アール・アール、「タンパク質Ａ−Ｖ抗原融合ペプチドによるマウスのサイトカインの抑制および能動免疫による合成の回復」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３０２１−３０２９（１９９５）。
１０．ネディアルコフ・ワイ・エー（Ｎｅｄｉａｌｋｏｖ，Ｙ．Ａ．）、モティン・ヴィー・エルおよびブルベーカー・アール・アール、「エルシニア・ペスティスＶ抗原−ポリヒスチジン融合ペプチドにより媒介されるリポ多糖に対する耐性：インターロイキン−１０の増幅」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１１９６−１２０３（１９９７）。
１１．ニレス・エム・エル（Ｎｉｌｌｅｓ，Ｍ．Ｌ．）、フィールズ・ケー・エー（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｋ．Ａ．）、およびストラレイ・エス・シー、「エルシニア・ペスティスのＶ抗原は、ＹｏｐＢおよびＬｃｒＧに対する効果を介して、Ｙｏｐベクター標的化並びにＹｏｐ分泌を調節する」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：３４１０−３４２０（１９９８）。
【００８６】
１２．クドー・アイ（Ｋｕｄｏｈ，Ｉ．）、ウィーナー−クロニッシュ・ジェイ・ピー、ハシモト・エス（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．）、ピテット・ジェイ・−エフ（Ｐｉｔｔｅｔ，Ｊ．−Ｆ．）、およびフランク・ディー・ダブリュー、「シュードモナス・アエルギノーザ株の細胞外産物分泌は、肺胞上皮損傷の重度に影響を及ぼす」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｌ５５１−Ｌ５５６（１９９４）。
１３．アポダカ・ジー（Ａｐｏｄａｃａ，Ｇ．）等、「シュードモナス・アエルギノーザ誘導ＭＤＣＫ細胞損傷の特徴づけ：グリコシル化欠損ホスト細胞は、細菌殺滅に耐性である」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１５４１−１５５１（１９９５）。
１４．ヤール・ティー・エル（Ｙａｈｒ，Ｔ．Ｌ．）、バリス・エー・ジェイ（Ｖａｌｌｉｓ，Ａ．Ｊ．）、ハンコック・エム・ケー（Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｍ．Ｋ．）、バービエリ・ジェイ・ティー（Ｂａｒｂｉｅｒｉ，Ｊ．Ｔ．）、およびフランク・ディー・ダブリュー、「シュードモナス・アエルギノーザIII型系により分泌される新規アデニル酸シクラーゼであるＥｘｏＹ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、印刷中（１９９８）。
【００８７】
１５．フィンク−バーバンコン・ヴィー（Ｆｉｎｃｋ−Ｂａｒｂａｎｃｏｎ，Ｖ．）、ヤール・ティー・エル、およびフランク・ディー・ダブリュー、「ＥｘｏＵ細胞毒の効率的分泌に必要なシャペロンＳｐｃＵの同定および特徴づけ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．印刷中（１９９８）。
１６．サワ・ティー（Ｓａｗａ，Ｔ．）、コリー・ディー・ビー（Ｃｏｒｒｙ，Ｄ．Ｂ．）、グロッパー・エム・エー、オーハラ・エム、クラハシ・ケーおよびウィーナー−クロニッシュ・ジェイ・ピー、「ＩＬ−１０は、シュードモナス・アエルギノーザ肺炎における肺損傷および生存を改善する」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：２８５８−２８６６（１９９７）。
【００８８】
１７．シュバイツァー・エイチ・ピー（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｐ．）、「新規ＣｏｌＥ１型ベクターおよび携帯型ｏｒｉＴおよび対抗選択可能な枯草菌ｓａｃＢマーカーを含むファミリカセットを使用した、シュードモナス・アエルギノーザの対立遺伝子交換」、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：１１９５−１２０４（１９９２）。
１８．フランク・ディー・ダブリュー、ナイアー・ジー（Ｎａｉｒ，Ｇ．）、およびシュバイツァー・エイチ・ピー、「シュードモナス・アエルギノーザ細胞外酵素Ｓトランス調節座位の染色体挿入変異の作成および特徴づけ」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：５５４−５６３（１９９４）。
【００８９】
１９．シュバイツァー・エイチ・ピー、「ｐＵＣ１８／１９から得られるエセリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）−シュードモナスシャトルベクター」、Ｇｅｎｅ  ９７：１０９−１１２（１９９１）。
２０．ヤール・ティー・エル、ホベイ・エー・ケー（Ｈｏｖｅｙ，Ａ．Ｋ．）、クリッヒ・エス・エム（Ｋｕｌｉｃｈ，Ｓ．Ｍ．）、およびフランク・ディー・ダブリュー、「シュードモナス・アエルギノーザ細胞外酵素Ｓ構造遺伝子の転写分析」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１１６９−１１７８（１９９５）。
２１．バリス・エー・ジェイ（Ｖａｌｌｉｓ，Ａ．Ｊ．）、ヤール・ティー・エル、バービエリ・ジェイ・ティー（Ｂａｒｂｉｅｒｉ，Ｊ．Ｔ．）、およびフランク・ディー・ダブリュー、「組織培養条件に応答したシュードモナス・アエルギノーザによるＥｘｏＳ産生の調節」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．提出。
【００９０】
２２．ヤール・ティー・エル、バービエリ・ジェイ・ティーおよびフランク・ディー・ダブリュー、「シュードモナス・アエルギノーザ由来の細胞外酵素Ｓの５３ないし４９ｋＤａ形の遺伝子関係」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１４１２−１４１９（１９９６）。
２３．アイジ・ワイ（Ａｉｄｉ，Ｙ．）およびパブスト・エム・ジェイ（Ｐａｂｓｔ，Ｍ．Ｊ．）、「トリトンＸ−１１４を使用した相分離によるタンパク質溶液からのエンドトキシンの除去」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：１９１−１９５（１９９０）。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶの表現型分析を示す、染色ゲル（図１Ａ）およびウエスタンブロット（図１Ｂ）である。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、Ｐ．アエルギノーザ親および変異株の生存および肺損傷を示す、グラフ（図２Ａ）および棒グラフのセット（図２Ｂ）である。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、生存、肺損傷、および細菌コロニー形成に対する免疫化の効果を示す、グラフ（図３Ａ）および棒グラフのセット（図３Ｂ）である。
【図４】図４は、ＰｃｒＶ、ＥｘｏＵ、ＰｏｐＤに特異的なポリクローナル抗体または非免疫化動物由来の対照ＩｇＧを受動投与した後、５×１０5ＣＦＵ／マウスのＰＡ１０３株で攻撃して生存した動物数のグラフである。
【図５】図５は、異なる細菌性抗原に対するＩｇＧおよび細菌攻撃の併用投与による、肺損傷からの生存および保護を示す、グラフ（図５Ａ）および棒グラフのセット（図５Ｂ）である。肺損傷の一方向性分散分析は、ｐ＝０．０２６、および肺浮腫では、ｐ＜０．０００５。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、さらなる説明情報を伴う配列番号１および配列番号２のプリントアウトである。図６Ａは配列番号１である。図６Ｂは配列番号２である。
【図７】図７は、さらなる説明情報を伴う配列番号３および配列番号４のプリントアウトである。
【図８】図８は、合成された組換え単鎖抗体（ＳＣＦＶ−Ｍ１６６）（配列番号５および配列番号６）である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2005500250.tif 000019
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
2005500250.tif 000021
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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