(57)【要約】本発明は生育可能なＭＣＨ１Ｒ欠損マウスに関する。ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスは改変後の対立遺伝子からの機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を実施的に低下させるような改変を一方又は両方のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子に含む。ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスはＭＣＨ１Ｒ−／−ノックアウトマウスが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン凝集ホルモン１型受容体（ＭＣＨ１Ｒ）欠損マウスであって、そのゲノムにおいて一方又は両方のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子に改変を含み、前記改変が機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を実質的に低下させるような改変である、前記マウス。
【請求項２】
前記マウスが一方の対立遺伝子に前記改変を含み、前記改変が機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を停止するトランスジーン挿入を含む請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記マウスが両方の対立遺伝子に前記改変を含み、前記改変が機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を停止するトランスジーン挿入を含む請求項１に記載のマウス。
【請求項４】
前記マウスが一方の対立遺伝子に前記改変を含み、前記改変がＭＣＨ１Ｒをコードする核酸の完全除去を含む請求項１に記載のマウス。
【請求項５】
前記マウスが両方の対立遺伝子に前記改変を含み、前記改変がＭＣＨ１Ｒをコードする核酸の完全除去を含む請求項１に記載のマウス。
【請求項６】
ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子にＭＣＨ１Ｒ遺伝子の改変を含むＭＣＨ１Ｒ欠損マウスの作製方法であって、
（ａ）トランスジーンとの相同組換えによりマウス胚幹細胞で前記ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子を改変し、改変胚幹細胞を作製する段階と、
（ｂ）前記改変胚幹細胞をマウス胚盤胞に導入し、改変胚盤胞を作製する段階と、
（ｃ）前記改変胚盤胞を疑妊娠マウスに導入し、妊娠マウスを作製する段階と、
（ｄ）前記妊娠マウスに子を出産させる段階と、
（ｅ）改変ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子が存在するか否かについて前記子をスクリーニングし、前記ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスを同定する段階を含む前記方法。
【請求項７】
前記改変が機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を停止する改変である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
両方の対立遺伝子に改変ＭＣＨ１Ｒを含むＭＣＨ１Ｒ欠損マウスの作製方法であって、
（ａ）各々一方の対立遺伝子にＭＣＨ１Ｒの改変を含む２匹のマウスを交配させ、子を出産させる段階と、
（ｂ）両方の対立遺伝子に前記改変ＭＣＨ１Ｒが存在するか否かについて前記子をスクリーニングし、前記ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスを同定する段階を含む前記方法。
【請求項９】
前記改変が機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を停止するトランスジーン挿入を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変がＭＣＨ１Ｒをコードする核酸の完全除去を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
化合物がＭＣＨ１Ｒ欠損に及ぼす影響を測定する方法であって、請求項１から５のいずれか一項に記載のＭＣＨ１Ｒマウスに前記化合物を与える段階と、ＭＣＨ１Ｒ活性に関連する１種以上の表現型を測定する段階を含む前記方法。
【請求項１２】
前記表現型が摂食亢進又は摂食低下活性である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記表現型が脂肪量の変化である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記表現型が筋肉量の変化である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記表現型が運動活動の増加又は減少である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記表現型が微細運動の増加又は減少である請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記表現型が酸素消費量、二酸化炭素生産量、代謝率、疑似安静代謝率、呼吸交換比及び呼吸商から構成される群から選択される代謝指標の増加又は減少である請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物がＭＣＨ２Ｒに対して活性である請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ストレス、不安、疲労、運動活動、概日リズム又は睡眠に作用する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用してＭＣＨ１Ｒ活性を調節することが可能なＭＣＨ１Ｒ活性化合物を同定する段階と、
（ｂ）前記ＭＣＨ１Ｒ活性化合物がストレス、不安、疲労、運動活動、概日リズム又は睡眠に及ぼす能力をｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより測定する段階を含む前記方法。
【請求項２０】
前記方法がストレス又は不安に作用する化合物をスクリーニングするために実施され、前記段階（ａ）で同定される前記ＭＣＨ１Ｒ活性化合物はＭＣＨ１Ｒ活性を増加させ、前記段階（ｂ）で使用される前記ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは前記ＭＣＨ１Ｒ活性化合物がストレス又は不安を減少させる能力を測定する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が疲労に作用する化合物をスクリーニングするために実施され、前記段階（ａ）で同定される前記ＭＣＨ１Ｒ活性化合物はＭＣＨ１Ｒ活性を減少させ、前記段階（ｂ）で使用される前記ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは前記ＭＣＨ１Ｒ活性化合物が疲労に作用する能力を測定する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が概日リズムに作用する化合物をスクリーニングするために実施され、前記段階（ｂ）で使用される前記ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは前記ＭＣＨ１Ｒ活性化合物が概日リズムに作用する能力を測定する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が睡眠に作用する化合物をスクリーニングするために実施され、前記段階（ｂ）で使用される前記ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは前記ＭＣＨ１Ｒ活性化合物が睡眠に作用する能力を測定する請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が運動活動に作用する化合物をスクリーニングするために実施され、前記段階（ｂ）で使用される前記ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは前記ＭＣＨ１Ｒ活性化合物が運動活動に作用する能力を測定する請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＭＣＨ１Ｒ欠損マウスに関する。本願は２００１年３月２２日付け仮米国特許出願第６０／２７８，０６１号の優先権主張出願であり、その開示内容を参考資料として本明細書に組込む。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に引用する文献は特許請求の範囲に記載した発明の先行技術とは認められない。
【０００３】
視床下部に存在する神経ペプチドは体重調節に主要な役割を果たす（Ｆｌｉｅｒら，１９９８，Ｃｅｌｌ，９２，４３７−４４０）。メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）は神経ペプチドＮＥＩ及びＮＧＥをもコードするより大きいプレ−プロホルモン前駆物質の一部として視床下部で合成される環状１９アミノ酸神経ペプチドである（Ｎａｈｏｎら，１９９０，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，６３２−６３７）。ＭＣＨはサケ下垂体で最初に同定され、魚類ではＭＣＨはメラニン凝集に作用し、従って、皮膚色素沈着に作用する。マスとウナギでもＭＣＨはストレス性又はＣＲＦに刺激されるＡＣＴＨ放出に関与していることが示された（Ｋａｗａｕｃｈｉら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，３２１−３２３）。
【０００４】
ヒトでは脳に発現されるＭＣＨをコードする２種の遺伝子が同定されている（Ｂｒｅｔｏｎら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１８，２９７−３１０）。哺乳動物では、ＭＣＨは摂食量の調節に関与する視床下部の神経細胞体（外側視床下部の核周部と不確帯を含む）に主に同定されている（Ｋｎｉｇｇｅら，１９９６．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １７，１０６３−１０７３）。
【０００５】
薬理学及び遺伝学研究によると、主要なＭＣＨ作用は摂食促進（食欲促進）である。ＭＣＨ  ｍＲＮＡは絶食マウス及びラットやｏｂ／ｏｂマウスでアップレギュレートされる（Ｑｕら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，２４３−２４７）。ＭＣＨを中枢に注射（ＩＣＶ）すると摂食が刺激され、ＭＣＨはαメラノサイト刺激ホルモン（αＭＳＨ）に見られる摂食低下効果を抑制する（Ｑｕら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，２４３−２４７）。ＭＣＨ欠損マウスは痩せて摂食低下しており、代謝率が高い（Ｓｈｉｍａｄａら，１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  ３９６，６７０−６７３）。ＭＣＨを過剰発現するトランスジェニックマウスは摂食亢進し、インスリン抵抗性と軽度の肥満が見られる（Ｌｕｄｗｉｇら，２００１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７，３７９−３８６）。
【０００６】
ＭＣＨ作用は摂食量の調節に止まらず、視床下部−下垂体軸に作用することも報告されている（Ｎａｈｏｎ，１９９４．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８，２２１−２６２）。ＭＣＨはストレス性ＡＣＴＨ放出も調節できる（Ｎａｈｏｎ，１９９４．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８，２２１−２６２）。
【０００７】
数件の文献がＭＣＨに結合する受容体（「ＭＣＨ１Ｒ」）を記載している（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  ４００，２６１−２６５，Ｓａｉｔｏら，１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  ４００，２６５−２６９，Ｂａｃｈｎｅｒら，１９９９．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５７：５２２−５２４，Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，１９９９．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２６１，６２２−６２６）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は生育可能なＭＣＨ１Ｒ欠損マウスに関する。ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスは改変後の対立遺伝子からの機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を実施的に低下させるような改変を一方又は両方のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子に含む。ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスはＭＣＨ１Ｒ−／−ノックアウトマウスが好ましい。
【０００９】
機能的ＭＣＨ１Ｒの「発現を実質的に低下させる」ような改変とは、（１）改変後の対立遺伝子から活性ＭＣＨ１Ｒが生産されなくなるような改変又は（２）改変が両方の対立遺伝子に存在する場合にはＭＣＨ１Ｒ−／−ノックアウトマウスに関連する１種以上の表現型をもつＭＣＨ１Ｒ欠損マウスを生じるような改変である。機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を実質的に低下させる改変としては、ＭＣＨ１Ｒ発現が殆ど又は全くなくなるような改変や、発現されるが、活性を殆ど又は全く含まないＭＣＨ１Ｒ誘導体を生産するような改変が挙げられる。
【００１０】
ＭＣＨ１Ｒ−／−ノックアウトマウスに関連する表現型としては、脂肪量低下、マウスを普通飼料で飼育した場合の飼料消費量の増加、活動亢進、神経内分泌異常、間接熱量測定により測定した場合のエネルギー消費の増加、間接熱量測定により測定した場合の呼吸商の低下、食事性肥満に対する感受性の低下、ＭＣＨの脳室内投与の食欲亢進作用に対する耐性及びＭＣＨ１Ｒのペプチドアンタゴニストの脳室内投与の食欲抑制作用に対する耐性が挙げられる。
【００１１】
従って、本発明の第１の側面はそのゲノムにおいて一方又は両方のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子に改変を含むＭＣＨ１Ｒ欠損マウスに関する。改変は改変後の対立遺伝子からの機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を実質的に低下させるような改変である。
【００１２】
本発明の別の側面はＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子の改変を含むＭＣＨ１Ｒ欠損マウスの作製方法に関する。前記方法は、
（ａ）トランスジーンとの相同組換えによりマウス胚幹細胞でＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子を改変し、改変胚幹細胞を作製する段階と、
（ｂ）改変胚幹細胞をマウス胚盤胞に導入し、改変胚盤胞を作製する段階と、
（ｃ）改変胚盤胞を疑妊娠マウスに導入し、妊娠マウスを作製する段階と、
（ｄ）妊娠マウスに子を出産させる段階と、
（ｅ）改変ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子が存在するか否かについて子をスクリーニングし、ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスを同定する段階を含む。
【００１３】
本発明の別の側面は両方の対立遺伝子に改変ＭＣＨ１Ｒを含むＭＣＨ１Ｒ欠損マウスの作製方法に関する。前記方法は、（ａ）各々一方の対立遺伝子にＭＣＨ１Ｒの改変を含む２匹のマウスを交配させ、子を出産させる段階と、
（ｂ）両方の対立遺伝子に改変ＭＣＨ１Ｒが存在するか否かについて子をスクリーニングする段階を含む。
【００１４】
本発明の別の側面は化合物がＭＣＨ１Ｒ欠損に及ぼす影響を測定する方法に関する。前記方法は、ＭＣＨ１Ｒマウスに化合物を与える段階と、ＭＣＨ１Ｒ活性に関連する１種以上の表現型を測定する段階を含む。
【００１５】
本発明の別の側面は摂食量、代謝、ストレス、不安、疲労、運動活動、概日リズム又は睡眠に作用する化合物のスクリーニング方法に関する。前記方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用してＭＣＨ１Ｒ活性を調節することが可能なＭＣＨ１Ｒ活性化合物を同定し、ＭＣＨ１Ｒ活性化合物が摂食量、代謝、ストレス、不安、疲労、運動活動、概日リズム又は睡眠に及ぼす能力を測定することからなる。
【００１６】
本発明の他の特徴と利点は各種実施例を含む以下の付加説明に明示される。後期実施例は本発明の実施に有用な各種要素と手法を例証する。実施例は特許請求の範囲に記載した発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は本発明の実施に有用な他の要素と手法を認識し、利用することができる。
【００１７】
ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスは改変後の対立遺伝子からの機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を実質的に低下させるような改変を一方又は両方のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子に含む。ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスの作製は両方のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子からＭＣＨ１Ｒ発現を停止した生育可能なＭＣＨ１Ｒ−／−ノックアウトマウスにより例証される。本明細書ではこのような生育可能なＭＣＨ１Ｒ−／−マウスの作製について説明するが、この説明に基づき、一方又は両方のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子に種々の改変を含むＭＣＨ１Ｒ欠損マウスを作製することができる。
【００１８】
ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスはＭＣＨ１Ｒの生理的役割を試験するため、化合物がＭＣＨ１Ｒをターゲットする能力を評価するため、更には化合物がＭＣＨ１Ｒ欠損を補償する能力を評価するためのツールとして使用するなどの種々の用途がある。化合物がＭＣＨ１Ｒをターゲットする能力又はＭＣＨ１Ｒ欠損を補償する能力はＭＣＨ１Ｒ欠損に関連する１種以上の表現型の変化を測定することにより評価することができる。
【００１９】
ＭＣＨ１Ｒマウスに関する試験は、両方のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子に改変をもつマウスを使用して実施することが好ましい。一方の対立遺伝子に改変を含むマウスは両方の対立遺伝子に改変をもつマウスの初期作製における中間動物として使用することが好ましい。両方の対立遺伝子に改変をもつマウスの繁殖は両方のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子に改変を含む雌雄マウスを使用して行うことが好ましい。
【００２０】
ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスに観察される表現型としては、脂肪量低下、マウスを普通飼料で飼育した場合の飼料消費量の増加、活動亢進、神経内分泌異常、間接熱量測定により測定した場合のエネルギー消費の増加、間接熱量測定により測定した場合の呼吸商の低下、食事性肥満に対する感受性の低下、ＭＣＨの脳室内投与の食欲亢進作用に対する耐性及びＭＣＨ１Ｒのペプチドアンタゴニストの脳室内投与の食欲抑制作用に対する耐性が挙げられる。
【００２１】
ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスに観察される表現型にはエネルギー代謝改変に関連する付加表現型もある。このような付加表現型としては筋肉量の増加、例えば経口グルコース耐性試験又は腹腔内インスリン耐性試験により測定されるようになグルコース又はインスリン耐性の改変、ＭＣＨ１Ｒ及び他のエネルギー消費経路のペプチド及び非ペプチドアゴニスト及びアンタゴニストの脳室内投与に対する感受性の改変、並びに摂食経路及び他のエネルギー消費に作用する経路の調節に対する応答の改変の１種以上が挙げられる。
【００２２】
種々の改変をもつＭＣＨ１Ｒ欠損マウスはＭＣＨ１Ｒ−／−ノックアウトマウスに関連する表現型を種々の程度でもつことができる。後期実施例に記載する方法を使用する各種態様において、ＭＣＨ１Ｒ欠損をもつマウスはＭＣＨ１Ｒ野生型マウスよりも食物消費量が約１２％〜約１６％多く、ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスは野生型マウスに比較して暗期歩行活動が約２倍に増加する。
【００２３】
ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスの作製
本明細書に記載する指針に基づき、種々のＭＣＨ１Ｒ欠損マウスを作製することができる。ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスの作製方法の１好適例では改変ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子をもつ雌雄マウスを作製して交配させ、両方の対立遺伝子に改変をもつマウスを作製する。
【００２４】
改変ゲノムをもつマウスの作製方法は当分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２３，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，２００１）。改変ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子をもつマウスの作製方法の１例では、
（ａ）トランスジーンとの相同組換えによりマウス胚幹細胞でＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子を改変し、改変胚幹細胞を作製し、
（ｂ）改変胚幹細胞をマウス胚盤胞に導入し、改変胚盤胞を作製し、
（ｃ）改変胚盤胞を疑妊娠マウスに導入し、妊娠マウスを作製し、
（ｄ）妊娠マウスに子を出産させ、
（ｅ）改変ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子が存在するか否かについて子をスクリーニングし、ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスを同定する。
【００２５】
遺伝子発現に関与する遺伝エレメントとしては、プロモーター、転写因子結合部位、スプライシング部位、ポリアデニル化領域及びリボソーム結合部位等の転写及び翻訳エレメントが挙げられる。これらのエレメントを除去又は改変すると、ＭＣＨ１Ｒ遺伝子からのＭＣＨ１Ｒの生産が低下又は停止する。
【００２６】
ＭＣＨ１Ｒ構造遺伝子改変を使用すると、ＭＣＨ１Ｒ活性を殆ど又は全くもたないＭＣＨ１Ｒ誘導体を生産することができる。ＭＣＨ１Ｒ構造遺伝子の１好適改変例では遺伝子の実質的に全部を欠失させる。
【００２７】
ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子を欠失させるには付加核酸を挿入することができる。挿入可能な付加核酸としては独立プロモーターをもつ選択マーカーをコードする核酸と、ＭＣＨ１Ｒプロモーターに転写共役したレポータータンパク質をコードする核酸が挙げられる。キメラマウスで使用可能なレポータータンパク質の例はβガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）及びグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とその誘導体である。
【００２８】
初期改変は１種以上の選択マーカーと相同組換えによる挿入のためにＭＣＨ１Ｒをターゲットする核酸を含むトランスジーンを使用して実施することが好ましい。相同組換えを実施すると、ＭＣＨ１Ｒに改変を生じるか及び／又はＭＣＨ１Ｒ領域を除去することができる。マーカーを使用すると、マウスゲノムへの挿入、相同組換えにより生じる挿入（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２３，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，２００１）、及びＲＮＡ局在と発現をスクリーニングし易くなる。
【００２９】
相同組換えに使用するトランスジーンは挿入した核酸を切出すために使用可能なリコンビナーゼ系を加えてもよい。リコンビナーゼ系の例としてはバクテリオファージリコンビナーゼＣｒｅ／ｌｏｘＰ系と酵母リコンビナーゼＦｌｐ／ＦＲＴ系が挙げられる（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２３，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，２００１及び米国特許第５，５６４，１８２号）。Ｃｒｅリコンビナーゼにより除去及び切出す領域の３’及び５’側にｌｏｘＰ認識部位を配置することができる。同様に、Ｆｌｐリコンビナーゼにより除去及び切出す領域の３’及び５’側にｆｒｔ認識部位を配置することができる。
【００３０】
改変ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子を含むマウスのスクリーニングはＭＣＨ１Ｒ  ｍＲＮＡ転写産物の生産や、生産されたＭＣＨ１Ｒ転写産物と野生型転写産物との異同を測定する等の方法を使用して実施することができる。ＭＣＨ１Ｒ  ｍＲＮＡ転写産物及び転写産物の型の測定方法としては特定配列に特異的なより小さい核酸プローブを使用して転写産物の生産と寸法を検出することができるノーザンブロット分析等の核酸ハイブリダイゼーション分析が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用してＭＣＨ１Ｒ  ｍＲＮＡ転写産物を測定することもできる。
【００３１】
特定改変が機能的ＭＣＨ１Ｒの発現を実質的に低下させるか否かは、両方の対立遺伝子にこのような改変を含むマウスを作製することにより決定することができる。両方の対立遺伝子に改変を含むマウスの表現型はＭＣＨ１Ｒ−／−ノックアウトマウスとＭＣＨ１Ｒ野生型マウスの表現型を比較することにより決定される。
【００３２】
ＭＣＨ１Ｒマウスに関するアッセイ
ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスに関するアッセイを実施すると、化合物がＭＣＨ１Ｒ欠損に及ぼす影響を測定することができる。このようなアッセイは化合物がＭＣＨ１Ｒ欠損を補償する能力を評価したり、化合物がＭＣＨ１Ｒに選択的に作用する能力を評価する等の種々の目的で実施することができる。
【００３３】
化合物がＭＣＨ１Ｒ欠損に及ぼすｉｎ  ｖｉｖｏ影響はＭＣＨ１Ｒに関連する１種以上の表現型を測定することにより評価することができる。食物消費、体重、ストレス、不安、運動活動、睡眠、疲労、概日リズム及びエネルギー代謝等の種々の活性の測定方法は当分野で周知である（例えばＣｒａｗｌｅｙ，Ｊ．Ｎ．Ｗｈａｔ’ｓ  Ｗｒｏｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｍｙ  Ｍｏｕｓｅ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，２０００，Ｃｈｅｎら，２０００．Ｔｒａｎｓ．Ｒｅｓ．９，１４５−１５４及びＣｈｅｎら，２０００．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６，９７−１０２参照）。これらの種々の活性の一部の測定方法の例は後期実施例に記載する。
【００３４】
種々の態様において、ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスに投与する化合物はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用してＭＣＨ１Ｒ又はＭＣＨ２Ｒ活性化合物として既に同定されている。ＭＣＨ２ＲはＭＣＨに結合する別の受容体である。ＭＣＨ１Ｒ及びＭＣＨ２Ｒ活性化合物はＭＣＨ１Ｒ及びＭＣＨ２Ｒの一方又は両方の活性を調節する化合物であり、アゴニスト、アンタゴニスト及びアロステリックモジュレーターが挙げられる。
【００３５】
化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＣＨ１Ｒ又はＭＣＨ２Ｒ活性に作用する能力はクローン化受容体を使用し、受容体活性を測定することにより決定することができる。ヒトＭＣＨ１Ｒ及びＭＣＨ２Ｒのアミノ酸配列とコーディングｃＤＮＡ配列を配列番号１〜４に示す。配列番号１及び２はヒトＭＣＨ１Ｒのアミノ酸とコーディングｃＤＮＡを示す。配列番号３及び４はヒトＭＣＨ２Ｒのアミノ酸とコーディングｃＤＮＡを示す。
【００３６】
ＭＣＨ１Ｒ及びＭＣＨ２ＲはＧタンパク質共役型受容体である。ＭＣＨ１ＲはＧｉとＧｑの両者に共役し、ＭＣＨ２ＲはＧｑに共役する。Ｇｉの共役の結果、アデニル酸シクラーゼが阻害され、ｃＡＭＰ濃度が低下する。Ｇｑの共役によりホスホリパーゼＣが活性化し、細胞内Ｃａ２＋が増加する。
【００３７】
組換えにより発現した受容体を使用すると、化合物が当該受容体に対して活性であるか否かを容易に決定することができる。例えば、ＭＣＨ１Ｒ又はＭＣＨ２Ｒは通常は受容体を発現しないＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７及びＣＨＯ等の細胞系で発現ベクターにより発現させることができ、受容体をコードせず、発現ベクターをもつかもたない同一細胞系を対照として使用することができる。
【００３８】
Ｇｉ、Ｇｓ及びＧｑ等の種々のＧタンパク質活性の測定方法は当分野で周知である。Ｇｉ及びＧｓ活性は黒色素胞アッセイ、ｃＡＭＰ生産を測定するアッセイ、ｃＡＭＰ蓄積の阻害を測定するアッセイ、及び３５Ｓ−ＧＴＰの結合を測定するアッセイ等の方法を使用して測定することができる。ｃＡＭＰはラジオイムノアッセイ等の種々の方法を使用したり、ｃＡＭＰ応答性遺伝子レポータータンパク質により間接的に測定することができる。
【００３９】
Ｇｑ活性は細胞内Ｃａ２＋を測定する等の方法を使用して測定することができる。Ｃａ２＋を測定するために使用可能な当分野で周知の方法の例としては、Ｆｕｒａ−２等の色素の使用や、エクオリン等のＣａ２＋生物発光感受性レポータータンパク質の使用が挙げられる。Ｇタンパク質活性を測定するためにエクオリンを使用する細胞系の１例はＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７である（Ｂｕｔｔｏｎら，１９９３．Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  １４，６６３−６７１及びＦｅｉｇｈｎｅｒら，１９９９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，２１８４−２１８８）。
【００４０】
ＭＣＨ１Ｒ活性を調節する化合物としてはアゴニスト、アンタゴニスト及びアロステリックモジュレーターが挙げられる。試験化合物がＭＣＨ１Ｒを阻害する能力はＭＣＨ１Ｒアゴニストを使用して受容体を活性化し、試験化合物がＭＣＨ１Ｒ活性に及ぼす効果を測定することにより測定することができる。
【００４１】
ＭＣＨ１Ｒ及びＭＣＨ２Ｒ活性化合物は治療用途をもつ。このような用途としては体重減少（例えば肥満治療）、体重増加、癌（例えば直腸癌又は乳癌）治療、疼痛緩和、糖尿病治療、ストレス及び不安緩和、運動欠損治療、性機能不全治療、疲労治療又は睡眠障害治療の１種以上を達成する能力が挙げられる。
【００４２】
付加アッセイ
ＭＣＨ１Ｒ欠損マウスの運動活動の亢進はＭＣＨ１Ｒとストレス、不安、疲労、概日リズム及び睡眠の関連を示唆している。ストレス、不安、疲労、概日リズム又は睡眠に作用する化合物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＣＨ１Ｒアッセイ後にｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用することにより同定することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイはマウス、ラット、イヌ、フェレット又はサル等の哺乳動物で実施される。
【００４３】
運動活動、ストレス、不安、疲労、概日リズム又は睡眠に作用する化合物は研究ツールとして使用したり、患者で有用な効果を達成するために使用することができる。有用な効果としてはストレス、不安又は疲労の緩和や、睡眠パターンの改変が挙げられる。睡眠パターンの改変は例えば睡眠障害の治療や時差ぼけの治療に有用である。患者はヒト患者が好ましい。種々の態様において、ＭＣＨ１Ｒ活性化合物がＭＣＨ１Ｒ活性を増加する能力はストレス、不安又は運動活動の低下を測定するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで試験され、ＭＣＨ１Ｒ活性化合物がＭＣＨ１Ｒ活性を低下させる能力は疲労緩和を測定するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで試験され、化合物がＭＣＨ１Ｒ活性を調節する能力は概日リズム又は睡眠の改変を測定するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで試験される。
【００４４】
以下、実施例により本発明の種々の特徴を更に例証する。以下の実施例は発明の実施に有用な手法も例証する。これらの実施は特許請求の範囲に記載した発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００４５】
ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスの作製
組換え技術を使用してＭＣＨ１Ｒ＋／−マウスを得、ＭＣＨ１Ｒ＋／−マウスを交配させることによりＭＣＨ１Ｒ−／−マウスを作製した。ＭＣＨ１Ｒ＋／−マウスの作製にはＭＣＨ１Ｒターゲティングベクターを使用して胚幹（ＥＳ）細胞でＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子を破壊し、形質転換ＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、胚盤胞を疑妊娠雌に移植し、ＭＣＨ１Ｒ＋／−子を同定した。
【００４６】
マウス１２９ＳｖＪλゲノムライブラリー（Ｌａｍｂｄａ  ＦＩＸ  ＩＩ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からＭＣＨ１Ｒを含む１４Ｋｂマウスゲノムクローンを入手した。ラットＭＣＨ１Ｒ配列に由来するプライマーを使用してＰＣＲによりＭＣＨ１Ｒから作製した５００ｂｐマウスＭＣＨ１Ｒ  ｃＤＮＡプローブでライブラリーをスクリーニングすることによりクローンを同定した。ラットＭＣＨ１Ｒ配列はＬａｋａｙｅら，１９８８．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＡＣＴＡ  １４０１：２１６−２２０でラットＳＬＣ−１と呼ばれている。
【００４７】
ＭＣＨ１Ｒターゲティングベクターは陽性選択エレメントと陰性選択エレメントの２つの相同組換えターゲティング領域から構成した（図１）。２つの相同組換えターゲティング領域はマウスゲノムクローンから得た。第１の領域は６．５Ｋｂ  ５’ＭＣＨ１Ｒ  ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントとした。第２の領域は１．４Ｋｂ  ３’ＭＣＨ１Ｒ  ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントとした。
【００４８】
ＰＧＫｎｅｏを陽性選択エレメントとして使用し、ＨＳＶ−チミジンキナーゼを陰性選択エレメントとして使用した。ＰＧＫｎｅｏはネオマイシン耐性を付与し、マウスゲノムへの組込みの陽性選択に使用する。ＨＳＶ−チミジンキナーゼはアシクロビルとその類似体に対する感受性を付与し、相同組換えに無関係の組込みの陰性選択に使用する。
【００４９】
ターゲティングベクターをＮｏｔＩで直鎖化し、エレクトロポレーションによりＡＢ２．２ＥＳ細胞を形質転換することによりマウスゲノムへのターゲティングベクターの相同組換えを実施した。エレクトロポレーションはＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用して標準条件下にＡＢ２．２ＥＳ細胞１×１０７個とベクター２５μｇを使用して実施した（説明書，Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘａｓ  ７７３８１，カタログ番号Ｋ１００）。トランスフェクトした細胞を次に夫々陽性及び陰性選択用としてＧ４１８／ＦＩＡＵの存在下に培養した。ＦＩＡＵはウラシル誘導体２’−フルオロ−２’−デオキシ−１β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨード−ウラシルである。ネオマイシン耐性クローン約５００個を選択し、サザンブロット分析した処、１０個のＥＳ細胞クローンが正しくターゲットされ、２個のＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子の一方がＰＧＫ−ネオマイシン耐性カセットで確かに置換されていることが判明した。
【００５０】
この１０個のＥＳ細胞クローンを増殖させ、マウス胚盤胞にマイクロインジェクションにより注入した。マウス胚盤胞を疑妊娠雌マウスに移植した（Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｊｏｙｎｅｒ  Ａ．Ｌ．編，ＥＲＬ  ｐｒｅｓｓ，１９９３）。移植したマウスを満期出産させた。トランスジェニックＭＣＨ１Ｒ＋／−子をサザン分析により同定した。
【００５１】
雌雄ＭＣＨ１Ｒ＋／−マウスを交配させることによりトランスジェニックＭＣＨ１Ｒ−／−マウスを作製した。ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは予想メンデル比で産まれた。ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子が存在しないことをサザンブロットとＰＣＲゲノタイピングにより確かめた。ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは雌雄とも妊性であり、その成長率は約２０週齢まで野生型同腹対照と同等である。約２０週齢を過ぎたＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは野生型同腹マウスに比較して僅かではあるが有意な体重低下を示す。
【００５２】
ＰＣＲゲノタイピングはＱｉａｇｅｎ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＰＣＲキットをＱｉａｇｅｎプロトコールに従って使用して実施した。ノックアウト対立遺伝子を野生型対立遺伝子から区別するために３種の異なるオリゴヌクレオチドプライマー：
【００５３】
【化１】
2005502318.tif 000002
を使用した。プライマー対ＭＣＨ−５Ｌ２及びＭＣＨ−３ｔは野生型ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子から１９０ｂｐフラグメントを生成し、プライマー対ｎｅｏ−５及びＭＣＨ−３ｔは破壊したＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子から２６０ｂｐフラグメントを生成する。
【００５４】
サザンブロット分析は３’プローブとコーディング領域プローブを使用して実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９）。３’フランキングプローブはターゲティングベクターの短いアームの３’側１８０ｂｐに位置する０．９５ｋｂＰＣＲフラグメントである。ＥｃｏＲＶ−ＨｐａＩ消化後、プローブは野生型ＭＣＨ１Ｒ対立遺伝子から６．０ｋｂバンドを検出し、突然変異対立遺伝子から４．２ｋｂバンドを検出する（図１）。
【００５５】
コーディング領域プローブは停止コドンまでの最初の膜貫通ドメインを含むＭＣＨ１Ｒコーディング領域の一部に相当する１．１ｋｂ  Ｋｐｎ−ＢａｍＨＩフラグメントである。コーディング領域プローブもＥｃｏＲＶ−ＨｐａＩで消化されたゲノムＤＮＡ上で６．０ｋｂ野生型バンドを検出するが、ノックアウト対立遺伝子からはシグナルを検出しない。
【００５６】
ＭＣＨ１ＲをコードするマウスｃＤＮＡとマウスＭＣＨ１Ｒ配列を配列番号１０及び１１に示す。配列番号１０はｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１１はアミノ酸配列を示す。
【実施例２】
【００５７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスの脳にＭＣＨ１Ｒ  ｍＲＮＡが存在しないことを確かめるためにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスと年齢／性別をマッチさせた野生型対照マウスを断頭屠殺し、直ちに脳を摘出し、−４０℃イソペンタンで凍結し、使用時まで−８０℃で保存した。冠状脳切片（１４μＭ）をクリオスタットマイクロトームで−１７℃で切断し、熱したマイクロスライドに解凍マウントした。氷冷４％リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで固定後、組織切片を使用時まで４℃の９５％エタノール中で保存した。
【００５８】
ＭＣＨ１Ｒのコーディング領域に対する２種のオーバーラップしないアンチセンスオリゴヌクレオチドの等モル混合物から構成されるハイブリダイゼーションプローブ：
【００５９】
【化２】
2005502318.tif 000003
を使用してハイブリダイゼーションを実施した。プローブは［α−３３Ｐ］ｄＡＴＰと末端トランスフェラーゼで末端標識し、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件はＧｕａｎら，１９９８．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５９，２７３−２７９に記載されているように行った。野生型マウスではｍＲＮＡ転写産物が観察されたが、ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスでは観察されなかった。
【実施例３】
【００６０】
体組成の評価
５〜７月齢雌雄ＭＣＨ１Ｒ＋／＋、ＭＣＨ１Ｒ＋／−及びＭＣＨ１Ｒ−／−同腹マウスを使用して体組成の評価を行った。体組成はＱＤＲ  ４５００  Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓソフトウェアバージョン９．０を使用して二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ；ＱＤＲ４５００，Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
【００６１】
ＤＥＸＡの結果、５〜７月齢ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは雌雄とも野生型よりも有意に痩せていることが判明した（図２）。ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは雌雄とも野生型よりも脂肪量が〜５０％少なく、除脂肪体重が〜７％多かった。雌雄ＭＣＨ１Ｒ＋／−マウスは正常体組成を示した。第２代からの個別収容動物の各脂肪褥のサブセットの評価とＤＥＸＡ分析の結果、痩せの表現型が裏付けられた。
【実施例４】
【００６２】
摂食量測定
雌雄ＭＣＨ１Ｒ＋／＋、ＭＣＨ１Ｒ＋／−及びＭＣＨ１Ｒ−／−マウスを使用して摂食量測定を実施した。マウスは実験開始から少なくとも７日前の約１月齢で各マイクロアイソレーターケージに個別収容した。
【００６３】
ワイヤーケージ頂部に飼料ホッパーを取付けて普通マウス飼料（Ｔｅｋｌａｄ７０１２；脂肪５％、タンパク質１９％及び繊維５％；脂肪由来３．４１ｇ／ｋｃａｌ及び１４．８％ｋｃａｌ）をペレット飼料として９．５〜１０週齢マウスに与えた。飼料を４日間毎日計量した。４日間のマウス１匹１日当たりの平均飼料消費量として摂食量を記録し、表１に示す。
【００６４】
【表１】
2005502318.tif 000004
ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは雌雄とも有意に摂食亢進していた。雌雄ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは野生型対照マウスよりも飼料消費量が夫々約１２％及び１６％多かった。
【実施例５】
【００６５】
歩行活動と微細運動の評価
ＭＣＨ１Ｒ＋／＋、ＭＣＨ１Ｒ＋／−及びＭＣＨ１Ｒ−／−マウスを使用して歩行活動及び微細運動試験を行った。ケージラックＰｈｏｔｏｂｅａｍ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して雌雄ＭＣＨ１Ｒ＋／＋、ＭＣＨ１Ｒ＋／−及びＭＣＨ１Ｒ−／−８〜９週齢同腹マウスの運動活動を試験した。評価前数週間マウスを透明プレキシガラスケージ（４０×２０×２０ｃｍ）に個別収容した。
【００６６】
歩行活動及び微細運動試験の結果を表２及び３に示す。試験中、隣接光ビームで２回連続して光ビームが遮断された場合に歩行運動として記録した。同一光ビームで２回以上連続して光ビームが遮断され、それ以外の光ビームは遮断されない場合に微細運動として記録した。光周期の所与部分における歩行運動の合計数に２本の隣接光ビーム間の距離（０．０５３９７５ｍ）を掛け、光周期の前記所与部分で移動した合計距離を算出した。ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは雌雄とも暗期歩行活動に２倍の増加を示す。
【００６７】
【表２】
2005502318.tif 000005
【００６８】
【表３】
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【実施例６】
【００６９】
代謝率と呼吸商の評価
ＭＣＨ１Ｒ＋／＋及びＭＣＨ１Ｒ−／−マウスを使用して間接熱量測定により代謝率と呼吸商を評価した。１６チャンバー開回路Ｏｘｙｍａｘシステム（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して雄ＭＣＨ１Ｒ＋／＋及びＭＣＨ１Ｒ−／−１２週齢同腹マウスの運動活動を試験した。評価前数週間マウスを透明プレキシガラスケージ（４０×２０×２０ｃｍ）に個別収容した。
【００７０】
ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは活動亢進期間に時間的に相関した明暗周期の暗期の一部で有意に高い代謝率を示し（図３）、この代謝率の増加が活動亢進に続発することが示唆された。代謝燃料選好の指標である呼吸商は明期では雄ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスのほうが有意に低かったが、暗期では野生型と区別できず（図４）、ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは活発に摂食していない期間は遊離脂肪酸の酸化に依存し、解糖にはあまり依存しないと予想された。
【実施例７】
【００７１】
神経内分泌プロフィルの評価
雌雄ＭＣＨ１Ｒ＋／＋及びＭＣＨ−／−同腹マウスで神経内分泌プロフィルを評価した。血漿レプチン、インスリン、総Ｔ４及びコルチコステロン値をＲＩＡにより測定した。血漿グルコース及びトリグリセリド値を酵素−比色アッセイ（夫々ＳｉｇｍａとＲｏｃｈｅ）により測定した。
【００７２】
血漿グルコース、インスリン及びトリグリセリド値は５〜７月齢雌雄ＭＣＨ１Ｒ−／−及び野生型同腹子で有意差がなかった（表４）。血漿レプチン及び総チロキシン（Ｔ４）値は雄Ｍｃｈ１ｒ−／−マウスのほうが野生型よりも有意に低く、雌値も同様の傾向を示した（表４）。低いレプチン値は痩せ表現型に一致し、低いＴ４値はＭＣＨが甲状腺機能の調節に関与しているらしいという見解（Ｋｅｎｎｅｄｙら，２０００．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：３２６５−３２６８）を裏付けた。あるいは、Ｔ４値の変化はエネルギー消費の増加に対する補償応答を示すと思われる。血漿コルチコステロン値は６〜７月齢雄Ｍｃｈ１ｒ−／−マウスのほうが野生型同腹子よりも有意に高かった（表４）。これはＭＣＨ投与によりラットの基底及びストレス性血漿ＡＣＴＨ値が低下するという知見（Ｂｌｕｅｔ−Ｐａｊｏｔら，１９９５．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７：２９７−３０３）に一致し、ＭＣＨ１Ｒが副腎機能の調節に関与しているらしいことを示唆している。
【００７３】
【表４】
2005502318.tif 000007
【実施例８】
【００７４】
神経ペプチド発現の評価
脳におけるコルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）ｍＲＮＡ値をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより測定した。視床下部の傍室核（ＰＶＮ）におけるＣＲＦ  ｍＲＮＡ値は雄ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスのほうが野生型よりも有意に低かったが、小脳扁桃中心核（ＣＥＡ）では正常であった（ＰＶＮ：ＭＣＨ１Ｒ−／−、７９．５±９．６Ｃｉ／ｇ組織；ＭＣＨ１Ｒ＋／＋、１０５．３±１０．１Ｃｉ／ｇ組織；Ｐ＜０．０５；ＣＥＡ：ＭＣＨ１Ｒ−／−、５７．５±１．３Ｃｉ／ｇ組織；ＭＣＨ１Ｒ＋／＋、５７．０±５．９Ｃｉ／ｇ組織；ｎ＝５／遺伝子型）。これはコルチコステロン値の上昇が視床下部ＣＲＦの増加によるものでないことを示唆している。逆に、ＰＶＮにおけるＣＲＦ発現低下はコルチコステロン値上昇による負のフィードバックの結果であると考えられる。ＣＲＦとは対照的に、明期で測定した神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）、ガラニン、プロオピオメラノコルチン並びにコカイン及びアンフェタミン調節転写産物ｍＲＮＡの視床下部値はいずれもＭＣＨ１Ｒ−／−マウスで正常であった。
【実施例９】
【００７５】
食事性肥満に対する応答の評価
高脂肪飼料で７週間飼育した雌野生型マウスは普通飼料で飼育した野生型同腹子よりも体重が有意に増加した（図５）。一方、高脂肪飼料で飼育した雌ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスは普通飼料で飼育したＭＣＨ１Ｒ−／−同腹子と同一の体重増加であった。食事性肥満に対する感受性のこの低下は活動亢進とそれに伴うエネルギー消費増加の結果である可能性が非常に高い。興味深いことに、高脂肪飼料で飼育すると、普通飼料で飼育した場合に観察された有意摂食亢進（２４．３％）はなくなった（図６）。
【実施例１０】
【００７６】
中枢投与した食欲促進剤に対する応答の評価
ＭＣＨ１Ｒ−／−マウスはＮＰＹとＡｇＲＰの急性左外側及び背側第３脳室投与に対して正常応答を示し、ＭＣＨ１Ｒはそれらの食欲促進作用に必要ないことが判明した。更に、これらのデータは摂食亢進がＮＰＹ又はＡｇＲＰシグナル伝達亢進の結果ではないことを示唆している。ＭＣＨの急性投与は有意効果がなかったが、野生型のみの摂食量を増加する傾向があった。次に、ＭＣＨの慢性背側第３脳室注入に対するＭＣＨ１Ｒ−／−及び野生型同腹子の応答を評価した。６日間の慢性ＭＣＨ投与の結果、野生型では摂食量（図７）、体重増加（図８）及び体組成変化（図９）が有意に増加したが、ＭＣＨ１Ｒ−／−同腹子は変化せず、ＭＣＨの食欲促進作用にはＭＣＨ１Ｒが必要であることが判明した。
【００７７】
特許請求の範囲には他の態様も含む。以上、数種の態様を示し、説明したが、本発明の精神と範囲から逸脱せずに種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＭＣＨ１Ｒ遺伝子を破壊するために使用したストラテジー。「ＴＫ」はＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子を表す。「ＰＧＫｎｅｏ」はネオマイシン耐性遺伝子を表す。
【図２Ａ】５〜７月齢群収容雌雄ＭＣＨ１Ｒ＋／＋（白）、ＭＣＨ１Ｒ＋／−（斜線）及びＭＣＨ１Ｒ−／−（黒、ｎ＝１２〜１４／群）同腹マウスのＤＥＸＡ分析。全Ｐ値はＭＣＨ１Ｒ＋／＋及びＭＣＨ１Ｒ−／−同腹子間の比較による。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】５〜７月齢群収容雌雄ＭＣＨ１Ｒ＋／＋（白）、ＭＣＨ１Ｒ＋／−（斜線）及びＭＣＨ１Ｒ−／−（黒、ｎ＝１２〜１４／群）同腹マウスのＤＥＸＡ分析。全Ｐ値はＭＣＨ１Ｒ＋／＋及びＭＣＨ１Ｒ−／−同腹子間の比較による。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図３】〜８週齢個別収容雄ＭＣＨ１Ｒ＋／＋（ｎ＝１０、黒四角）及びＭＣＨ１Ｒ−／−（ｎ＝１３、白丸）同腹子の代謝率。１０ＰＭ〜５ＡＭで、ＭＣＨ１Ｒ−／−曲線はＭＣＨ１Ｒ＋／＋曲線と有意差があった（Ｐ＜０．０５）。黒横線は試験の暗期を表す。
【図４】図３のマウスの呼吸商（ＲＱ）。ＭＣＨ１Ｒ−／−曲線は全明期でＭＣＨ１Ｒ＋／＋曲線と有意差があった（Ｐ＜０．０１）。黒横線は試験の暗期を表す。
【図５】普通飼料（ＲＣ）又は高脂肪飼料（ＨＦ）で７週間同時に飼育した雌野生型（Ｍｃｈ１ｒ＋／＋）及びＭｃｈ１ｒ−／−同腹子の累積体重増加（ｎ＝９〜１２／群）。全群は体重をマッチさせ、全マウスは試験開始時に６〜８週齢とした。
【図６】図５のマウスの７週期における累積摂食量（ｎ＝９〜１２／群）。Ｐ値は同一遺伝子型の普通飼料群と高脂肪飼料群（＊）又は同一飼料で飼育したＭｃｈ１ｒ＋／＋及びＭｃｈ１ｒ−／−同腹子間（＊＊）の比較による。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】慢性ＭＣＨ注入が１日摂食量に及ぼす効果。雄１１〜１３週齢ＭＣＨ１Ｒ＋／＋（四角）及びＭＣＨ１Ｒ−／−（丸）同腹子の背側第３脳室にＭＣＨ（〜１２ｎｍｏｌ／匹／日、黒記号）又はビヒクル（白記号）を６日間慢性注入した（ｎ＝９〜１１／群）。−５日目にマウスにカニューレを挿入し、ビヒクルのみを加えた浸透圧ポンプを埋込んだ。０日目に元のポンプをビヒクル又はビヒクルに溶かしたＭＣＨを加えた新しいポンプに交換した。１日目に開始して全マウスを中脂肪飼料で飼育した。１〜６日目にＭＣＨ１Ｒ＋／＋のＭＣＨ処理曲線は他の３種の曲線と有意差があった（Ｐ＜０．００５）。
【図８】慢性ＭＣＨ注入が累積体重増加に及ぼす効果。図７のマウスの体重を毎日測定し、−４日からの値を使用して累積体重増加を計算した。１〜６日目にＭＣＨ１Ｒ＋／＋のＭＣＨ処理曲線は他の３種の曲線と有意差があった（Ｐ＜０．０００１）。
【図９】慢性ＭＣＨ注入が体組成に及ぼす効果。図７のマウスに６日間慢性注入後に体組成のＤＥＸＡ分析を行った（ＭＣＨ１Ｒ＋／＋：ビヒクル、白；ＭＣＨ、斜線；ＭＣＨ１Ｒ−／−：ビヒクル、黒；ＭＣＨ、横線）。Ｐ値は同一遺伝子型の処理群間（＊）又は同一処理の遺伝子型間（＊＊）の比較による。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502318.tif 000053
【国際調査報告】
2005502318.tif 000054
2005502318.tif 000055