(57)【要約】本願は、ウイルス再生を含む種々の生物学的プロセスに関与する、新規なポリペプチド及び核酸を開示している。関連する方法及び組成物もまた記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４つのＳＨ３ドメインを含み、配列番号２又はその相補配列に少なくとも９０％一致するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも９５％一致する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ポリペプチド配列は、更にＲＩＮＧドメインを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記核酸は、細胞内の機能表現型のＰＯＳＨ喪失を軽減する、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
機能表現型のＰＯＳＨ喪失がＨＩＶウイルス様粒子産生の減少である、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
少なくとも４つのＳＨ３ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸であって、単離された核酸配列は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号１の相補配列、及び配列番号３の相補配列からなる群から選択される核酸にハイブリダイズする、単離された核酸。
【請求項７】
配列番号１、配列番号１の相補配列、配列番号３、及び配列番号３の相補配列からなる群から選択される核酸配列を含む、単離された核酸。
【請求項８】
前記ポリペプチドをコードする配列が少なくとも１つのイントロンによって分断される、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸配列。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列に作動可能に結合した転写調節配列をさらに含み、前記核酸を発現ベクターとして好適に使用されるようにしている、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター
【請求項１１】
原核細胞及び真核細胞の少なくとも１つにおいて複製する、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞がＰＯＳＨポリペプチドを発現する、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の前記宿主細胞によって発現された、精製されたＰＯＳＨポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３に記載の細胞をＰＯＳＨポリペプチドの発現に好適な細胞培養培地中で培養することを含む、組換え型ＰＯＳＨポリペプチドの作製方法。
【請求項１６】
前記ＰＯＳＨポリペプチドの純度を高めるための精製処理をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
融合蛋白質をコードする核酸であって、前記核酸は、第１の核酸配列と第２の核酸配列とを含み、前記第１の核酸配列は、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸であり、前記第２の核酸配列は、非相同のポリペプチドをコードし、前記第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、融合蛋白質をコードするように位置している、核酸。
【請求項１８】
前記非相同のポリペプチドは、（ｉ）検出可能な標識、又は（ｉｉ）マトリクス結合ドメインである、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
配列番号１及び/又は３、又はその相補配列に少なくとも９０％一致する核酸配列の５〜１０００の連続するヌクレオチドを含み、細胞に導入されたとき、ＰＯＳＨ ｍＲＮＡ及び/又はＰＯＳＨポリペプチドのレベルを減少させる、リボ核酸。
【請求項２０】
配列番号１及び/又は３、又はその相補配列の５〜１０００の連続するヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のリボ核酸。
【請求項２１】
配列番号１及び/又は３、又はその相補配列の１５〜３０の連続するヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のリボ核酸。
【請求項２２】
リボ核酸が二本鎖リボ核酸である、請求項１９に記載のリボ核酸。
【請求項２３】
ｓｉＲＮＡ及びリボザイムから選択される、請求項１９に記載のリボ核酸。
【請求項２４】
配列番号１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４及び２５のいずれをも含む群から選択される配列を含む、請求項１９に記載のリボ核酸。
【請求項２５】
請求項１９に記載のリボ核酸と、ならびに、リポソーム及び薬学的に有効な添加剤からなる群から選択される追加化合物とを含む、組成物。
【請求項２６】
局部投与用に製剤された、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
ａ）配列番号２に少なくとも９１％一致するアミノ酸配列、
ｂ）高ストリンジェントな条件下で配列番号１又は３のいずれかの核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされたアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、任意に（ｉ）前記ポリペプチドは、ＰＯＳＨ−ＡＰと相互作用し、及び/又は（ｉｉ）前記ポリペプチドのダウンレギュレーションがウイルス成熟を低下させる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドのダウンレギュレーションが、エンベロープウイルス、レトロイドウイルス及びＲＮＡウイルスからなる群から選択されるウイルスの成熟を低下させる、請求項２７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
ａ）前記レトロイドウイルスがレンチウイルスである、
ｂ）前記レトロイドウイルスがＨＩＶ１型レンチウイルスである、
ｃ）前記ＲＮＡウイルスがフィロウイルスである、または、
ｄ）前記ＲＮＡウイルスがエボラフィロウイルスである、請求項２８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドのダウンレギュレーションが、ＰＴＡＰまたはＰＰＥＹモチーフ含有ウイルスのウイルス成熟を低下させる、請求項２７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドは、４つのＳＨ３ドメイン及び/又はＲＩＮＧドメインを含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも８０％まで精製される、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドは、Ｅ２、ＰＯＳＨポリペプチド、ユビキチン及びGTPaseからなる群から選択されるＰＯＳＨ−ＡＰと相互作用する、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
前記GTPaseがRacである、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記Rac がRac1である、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが融合蛋白質である、請求項２７〜３０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記融合蛋白質は、２−ハイブリッドスクリーニングアッセイにおいて機能的である、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号２、配列番号２６及び配列番号３０からなる群から選択される配列のエピトープと特異的に免疫反応する、単離された抗体、またはそのフラグメント。
【請求項３９】
配列番号２のポリペプチドとＰＯＳＨ−ＡＰとの相互作用を破壊する、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fabフラグメントおよび一本鎖抗体からなる群から選択される、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４１】
前記抗体は、検出可能な標識で標識されている、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４２】
前記ＰＯＳＨ−ＡＰは、Ｅ２、ＰＯＳＨポリペプチド、ユビキチン及びGTPaseからなる群から選択される、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４３】
前記GTPaseがRacであり、前記Rac が任意にRac1である、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
（ｉ）請求項３８〜３９のいずれか１項に記載の抗体、及び（ｉｉ）前記抗体を検出するための検出可能な標識を含む、ヒトＰＯＳＨポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項４５】
ＰＯＳＨポリペプチド及び試験化合物を提供すること、及び
ＰＯＳＨポリペプチドと相互作用する試験化合物を同定すること
を含む、抗ウイルス薬を同定するための方法。
【請求項４６】
前記ＰＯＳＨポリペプチドは、配列番号 ２、５、７、９および１１、及び配列番号２、５、７、９および１１のいずれかに記載の少なくとも２０の連続するアミノ酸を含むフラグメントからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＰＯＳＨポリペプチドが細胞内で発現される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰＯＳＨポリペプチドが精製されたポリペプチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＯＳＨポリペプチドは、ＳＨ３ドメイン及びＲＩＮＧドメインからなる群から選択される、請求項４６〜４８のいずれかに記載の核酸。
【請求項５０】
前記試験物質は、ＳＨ３ドメイン及びＲＩＮＧドメインからなる群から選択されるドメインに結合する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記試験物質は、ポリペプチド、抗体、小分子またはペプチドミメティクスである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
ＰＯＳＨと相互作用する試験物質が、ＰＴＡＰまたはＰＰＥＹモチーフを含有するウイルスの成熟を低下させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
ＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出ポリペプチドおよび試験物質を提供すること、及び
ＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出ポリペプチドと相互作用する試験物質を同定することを含む、抗ウイルス薬を同定するための方法。
【請求項５４】
前記ＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出ポリペプチドは、ＰＯＳＨ、ＰＯＳＨマルチマー、ＲＩＮＧドメインとＳＨ３ドメインとを含むポリペプチド、Brca1、Bard1、Nef、Rac、 Rac1、 PAK1、 PAK2、 PAKファミリー、Vav、Cdc42、PI3K、Nedd4、src、srcファミリーポリペプチド、gag、tsg101、VASP、RNB6、WASP、N-WASP、KIAA0674からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記試験物質は、ポリペプチド、抗体、小分子またはペプチドミメティクスである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＰＯＳＨ核酸及び試験化合物を提供すること、及び
ＰＯＳＨ核酸と結合する試験化合物を同定すること
を含む、抗ウイルス薬を同定するための方法。
【請求項５７】
前記ＰＯＳＨ核酸は、配列番号１、３、４、６、８及び１０からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項５８】
前記試験物質は、リボ核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉコンストラクト、ＤＮＡ酵素及びリボザイムである、請求項５９に記載の方法。
【請求項５９】
前記試験物質と前記ＰＯＳＨ核酸との結合によって、ＰＯＳＨ転写のレベルを低下させる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６０】
ＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出核酸及び試験物質を提供すること、及び
ＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出核酸と相互作用する試験物質を同定すること
を含む、抗ウイルス薬を同定するための方法。
【請求項６１】
前記ＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出核酸は、ＰＯＳＨ、ＰＯＳＨマルチマー、ＲＩＮＧドメインとＳＨ３ドメインとを含むポリペプチド、Brca1、Bard1、Nef、Rac、 Rac1、 PAK1、 PAK2、 PAKファミリー、Vav、Cdc42、PI3K、Nedd4、src、srcファミリーポリペプチド、gag、tsg101、VASP、RNB6、WASP、N-WASP、KIAA0674からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記試験物質は、リボ核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉコンストラクト、ＤＮＡ酵素及びリボザイムである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
試験物質を含む組成物をウイルスゲノムの少なくとも１部でトランスフェクトされた細胞に投与すること、及び
試験物質の、ウイルス又はウイルス様粒子産生への影響を測定すること、
をさらに含む請求項４５〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
抗ウイルス薬は、エンベロープウイルス、レトロイドウイルス及びＲＮＡウイルスからなる群から選択されるウイルスに対して有効である、請求項４８〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
ａ）前記レトロイドウイルスがレンチウイルスである、
ｂ）前記レトロイドウイルスがＨＩＶ１型レンチウイルスである、
ｃ）前記ＲＮＡウイルスがフィロウイルスである、または、
ｄ）前記ＲＮＡウイルスがエボラフィロウイルスである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
配列番号２に少なくとも８０％一致するＰＯＳＨポリペプチド及び試験物質を提供すること、及び
前記ＰＯＳＨポリペプチドと結合する試験物質を同定すること、
を含む、抗アポトーシス薬を同定する方法。
【請求項６７】
前記試験物質がＳＨ３ドメインおよびＲＩＮＧドメインからなる群から選択されるドメインと結合する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリペプチドは、細胞中で発現される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＰＯＳＨポリペプチドが精製されたポリペプチドである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
ＰＯＳＨ核酸と結合する試験物質を同定するこを含む、抗アポトーシス薬を同定するための方法。
【請求項７１】
前記試験物質は、リボ核酸である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記試験物質を、ＰＯＳＨポリペプチドを過剰発現する細胞に投与すること、及び
試験物質のＰＯＳＨ誘導性アポトーシスを測定することをさらに含む、請求項６６〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
ＰＯＳＨ活性を阻害する物質の有効量を投与することを含む、それを必要とする被験体における感染を阻害する方法。
【請求項７４】
前記物質は、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を阻害する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記物質は、小分子、抗体、抗体のフラグメント、ペプチドミメティクス及びポリペプチドである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記物質は、ＰＯＳＨポリペプチドとＰＯＳＨ−ＡＰとの間の相互作用を阻害する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＰＯＳＨ−ＡＣは、Ｅ２、ＰＯＳＨポリペプチド、ユビキチン及びGTPaseからなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記GTPaseがRacである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記Rac がRac1である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉコンストラクト、ＤＮＡ酵素およびリボザイムからなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、配列番号１５、１８、１８、１９、２１、２２、２４及び２５のいずれをも含む群から選択される、請求項８０に記載のリボ核酸。
【請求項８２】
前記物質はＰＯＳＨ ｍＲＮＡのレベルを減少させる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
ＰＯＳＨ遺伝子の１以上の組換えコンストラクトを含有する、複数の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、前記ＰＯＳＨ遺伝子の発現が機能表現型のＰＯＳＨ喪失を軽減する、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８４】
前記１以上の組換えコンストラクトが胚形成期の前記動物または前記動物の祖先に導入される、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８５】
請求項８３に記載のトランスジェニック動物の単離された細胞。
【請求項８６】
前記細胞が生殖細胞である、請求項８５に記載の細胞。
【請求項８７】
前記細胞が体細胞である、請求項８５に記載の細胞。
【請求項８８】
全ての生殖細胞および体細胞が前記ＰＯＳＨ遺伝子の１以上の組換えコンストラクトを含む、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８９】
前記組換えコンストラクトは、マクロインジェクション、エレクトロポレーション、又はリポフェクションによって胚に導入される、請求項８４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９０】
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、雌牛及びサルから選択される、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９１】
前記ＰＯＳＨ遺伝子がヒトＰＯＳＨトランスジーンである、請求項８３に記載の非ヒト動物。
【請求項９２】
ＰＯＳＨトランスジーンを凍結卵子に導入すること、および前記凍結卵子を移植することを含む、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法。
【請求項９３】
機能表現型の前記ＰＯＳＨ喪失は、ウイルス／ウイルス様粒子の産生を低下させる、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法。
【請求項９４】
請求項８３に記載の非ヒト動物に試験化合物を投与すること、及び機能表現型のＰＯＳＨ喪失を促進するときの前記試験化合物の効果をアッセイすることを含む、ウイルス感染を治療するために使用される物質をスクリーニングする方法。
【請求項９５】
（ｉ）請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニック動物を、エンベロープウイルス、レトロイドウイルスおよびＲＮＡウイルスから選択されるウイルスで感染させること、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の非ヒトトランスジェニック動物を試験化合物と接触させること、及び（ｉｉｉ）治療された動物からのサンプルにおけるウイルス様粒子の作製と、治療されていないトランスジェニック動物又は対照物質を用いて治療されたトランスジェニック動物からのサンプルにおけるウイルス様粒子の作製とを比較することを含み、治療された動物のウイルス様粒子の作製の、治療されていないもしくは対照物質を用いて治療された場合のウイルス様粒子の作製の違いが、抗ウイルス可能性を示す、試験化合物の抗ウイルス可能性を評価する方法。
【請求項９６】
（ｉ）ヒトＰＯＳＨトランスジーンを発現する生殖細胞系列と体細胞、またはそれに由来する細胞のサンプルを持つ、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニック動物をエンベロープウイルス、レトロイドウイルスおよびＲＮＡウイルスから選択されるウイルスで感染させること、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の非ヒトトランスジェニック動物もしくはサンプルを試験化合物と接触させること、及び
（ｉｉｉ）トランスジェニック動物からの検体中又はその細胞のサンプル中におけるウイルス様粒子の生成を測定することを含み、
ウイルス様粒子の生成の、試験化合物を含まないウイルス様粒子の生成に対する、相対的な統計学的に重要な減少を示す、試験化合物の抗体ウイルス活性を評価する方法。
【請求項９７】
ａ）前記レトロイドウイルスがレンチウイルスである、
ｂ）前記レトロイドウイルスがＨＩＶ１型レンチウイルスである、
ｃ）前記ＲＮＡウイルスがフィロウイルスである、または、
ｄ）前記ＲＮＡウイルスがエボラフィロウイルスである、請求項９４〜９６のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン関連活性を阻害することを含む、ウイルス成熟を阻害する方法。
【請求項９９】
前記ＰＯＳＨポリペプチドが、配列番号２、５、７、９及び１１からなる群から選択され、フラグメントが配列番号２、５、７、９及び１１のいずれかに示された少なくとも２０のアミノ酸を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＰＯＳＨポリペプチドの前記ＲＩＮＧドメインの活性を阻害することを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
小分子、抗体、ペプチドミメティクスおよびポリペプチドからなる群から選択される物質を投与することによってウイルス成熟が阻害される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記物質が、配列番号３０に記載のエピトープと特異的に免疫反応する抗体もしくはそのフラグメントである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉコンストラクト、ＤＮＡ酵素及びリボザイムからなる群から選択される物質を投与することによってウイルス成熟が阻害される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、配列番号１５、１８、１８、１９、２１、２２、２４及び２５のいずれをも含む群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
エンベロープウイルス、レトロイドウイルスおよびＲＮＡウイルスから選択されるウイルスの成熟を阻害することを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０６】
ａ）前記レトロイドウイルスがレンチウイルスである、
ｂ）前記レトロイドウイルスがＨＩＶ１型レンチウイルスである、
ｃ）前記ＲＮＡウイルスがフィロウイルスである、または、
ｄ）前記ＲＮＡウイルスがエボラフィロウイルスである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
ユビキチン関連活性と互換可能な、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２及びＰＯＳＨポリペプチドを含む混合物を形成すること、及び
前記ユビキチンが前記ＰＯＳＨポリペプチドに結合するかどうかを検出すること
を含む、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン関連活性を試験する方法。
【請求項１０８】
前記ＰＯＳＨポリペプチドが、配列番号２、５、７、９、１１及び２６からなる群から選択される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ユビキチンが検出可能に標識されている、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＰＯＳＨポリペプチドが検出可能に標識されている、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記標識が、放射性同位体、蛍光化合物、酵素及び酵素コファクターから選択される、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
（ｉ）ユビキチン、Ｅ２およびＰＯＳＨポリペプチドを含む混合物を、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン化を促進する条件下で提供すること、
（ｉｉ）前記ユビキチン接合系を試験化合物と接触させること、
（ｉｉｉ）試験化合物の存在下での前記ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、及び
（ｉｖ）試験化合物の存在下での、ユビキチン化の測定されたレベルと、好適な参照とを比較することを含み、
候補物質の存在下での前記ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン化の低下が調節蛋白質のユビキチン化の阻害を示す、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン関連活性の阻害を同定するアッセイ。
【請求項１１３】
前記ユビキチンは、
-ユビキチン接合系がＥ１およびアデノシン三リン酸をさらに含む場合、非接合型ユビキチン、
-活性化されたＥ１：ユビキチン接合体、および
-活性化されたＥ２：ユビキチンチオエステル複合体から選択される、請求項１１２に記載のアッセイ。
【請求項１１４】
前記ユビキチンが検出可能に標識される、請求項１１２に記載のアッセイ。
【請求項１１５】
前記ＰＯＳＨポリペプチドが検出可能に標識される、請求項１１２に記載のアッセイ。
【請求項１１６】
ＰＯＳＨポリペプチド、配列番号２６に示されたポリペプチド、及び配列番号３０に示されたポリペプチドのいずれか１つの阻害剤ならびに薬学的に許容できる添加剤を含む、治療的組成物。
【請求項１１７】
前記阻害剤が、小分子、抗体、ポリペプチド及びペプチドミメティクスからなる群から選択される、請求項１１６に記載の治療的組成物。
【請求項１１８】
前記阻害剤が、ＰＯＳＨポリペプチドとＰＯＳＨ−ＡＰの間の相互作用を破壊し、及び/又はＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン関連活性を阻害する、請求項１１６に記載の治療的組成物。
【請求項１１９】
前記阻害剤は、配列番号３０に示されたポリペプチドである、請求項１１６に記載の治療的組成物。
【請求項１２０】
前記阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ酵素、ＲＮＡｉコンストラクトおよびリボザイムからなる群から選択される、請求項１１６に記載の治療的組成物。
【請求項１２１】
前記ＲＮＡｉコンストラクトが、配列番号１５、１８、１８、１９、２１、２２、２４及び２５のいずれをも含む群から選択される、請求項１１６に記載の治療的組成物。
【請求項１２２】
ＰＯＳＨポリペプチド及びユビキチンを含む組成物。
【請求項１２３】
ＰＯＳＨポリペプチド−ユビキチン接合体。
【請求項１２４】
ＰＯＳＨポリペプチド及びＰＯＳＨ−ＡＰを含む複合体。
【請求項１２５】
物質を、それを必要とする被験体に投与することを含み、前記物質がＰＯＳＨ媒介性のウイルス放出を阻害する、ウイルス感染を阻害する方法。
【請求項１２６】
前記物質が、ＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出ポリペプチドを阻害する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出ポリペプチドは、ＰＯＳＨ、ＰＯＳＨマルチマー、ＲＩＮＧドメインとＳＨ３ドメインとを含むポリペプチドをコードする核酸、Brca1、Bard1、Nef、Rac、 Rac1、 PAK1、 PAK2、 PAKファミリー、Vav、Cdc42、PI3K、Nedd4、src、srcファミリーポリペプチド、gag、tsg101、VASP、RNB6、WASP、N-WASP、KIAA0674からなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
ＰＯＳＨポリペプチドまたはＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出ポリペプチドのいずれかと関連するポリペプチドを同定することを含む、治療的インターベンションのための標的を同定する方法。
【請求項１２９】
前記ＰＯＳＨ媒介性ウイルス放出ポリペプチドは、ＰＯＳＨ、ＰＯＳＨマルチマー、ＲＩＮＧドメインとＳＨ３ドメインとを含むポリペプチドをコードする核酸、Brca1、Bard1、Nef、Rac、 Rac1、 PAK1、 PAK2、 PAKファミリー、Vav、Cdc42、PI3K、Nedd4、src、srcファミリーポリペプチド、gag、tsg101、VASP、RNB6、WASP、N-WASP、KIAA0674からなる群から選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２及びＰＯＳＨポリペプチドを含む混合物を形成すること、
試験化合物を添加すること、および
前記ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチンリガーゼ活性を検出することを含み、
前記ＰＯＳＨポリペプチドのリガーゼ活性を減少させる化合物が潜在的抗ウイルス薬である、化合物の抗ウイルス可能性を評価するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００１年１１月９日に出願された米国仮特許出願第60/345,846号及び２００２年３月１５日に出願された米国仮特許出願第60/364,530号の出願日の利益を主張する。これらの出願の内容全体を本明細書中に引用によって援用する。
【背景技術】
【０００２】
潜在的な薬物標的の評価は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白質分子が疾患のプロセスに関連しているかどうか、したがって、新たな治療薬開発のための好適な標的となるかどうかを決定することを含む。薬物の発見、それによって生理活性化合物が同定され、特徴づけられるプロセスは、ヒト疾患の新たな治療の開発における重要なステップである。薬物発見の背景は、ゲノム化学の革命のために劇的に変化している。ＤＮＡ及び蛋白質配列は、新たな薬物標的の宿主及び無数のの関連情報を生み出している。
【０００３】
種々の疾患状態、又は炎症や免疫反応などの重要な生物学的プロセスに関与する遺伝子及び蛋白質の同定は、薬物設計プロセスに不可欠の部分である。もし適切な分子標的を同定することができ、適切なアンタゴニストを開発することができれば、その状態の分子的病因に関わる１以上の遺伝子の発現を減少させることによって、多くの疾患及び障害を治療又は予防することができるであろう。例えば、１以上の細胞発癌遺伝子が活性化され、その結果として細胞周期プロセスの抑制されない進行が生じる癌を、適切な細胞周期コントロール遺伝子をアンタゴナイズすることによって治療することができるだろう。さらに、ハンチントン病のような、多くのヒト遺伝子病ならびに遺伝子的及び後成的因子の双方の影響を受けるいくつかのプリオン状態は、その機能の完全な喪失に反するような、ポリペプチドの不適切な活性によって生じる。したがって、そのような突然変異遺伝子の異常な機能をアンタゴナイズすることは、治療の手段を提供するだろう。さらに、そのような遺伝子の異常な機能は、治療手段を提供するだろう。さらに、ＨＩＶのような感染症は、ＨＩＶプロテアーゼまたは逆転写酵素などの特異的な必須のレトロウイルス蛋白質を標的とした分子アンタゴニストによる治療が功を奏してきた。そのような疾患及び障害を治療するための薬物療法は、疾患遺伝子のポリペプチド産物を標的とする分子アンタゴニストを頻用してきた。しかしながら、関連する遺伝子又は蛋白質標的の発見は、困難であり、時間がかかることが多い。
【０００４】
特に興味深い領域の１つは、ウイルスの生命周期中、ウイルスによって協調される宿主遺伝子及び蛋白質の同定である。多くのウイルス中に見られる高い突然変異の率と組み合わされた多くのウイルス病の重篤かつ不治の性質によって、抗ウイルス薬の同定が世界の健康の増進の最優先事項となっている。ウイルスの生命周期に関与する遺伝子及び蛋白質も研究対象となってきている。なぜなら、そのような遺伝子及び蛋白質は宿主の細胞中に典型的に付加的活性をもたらし、他の非ウイルス病の状態に役割を果たすかもしれないからである。
【０００５】
ウイルス成熟はＧａｇ蛋白質の蛋白分解処理と種々の宿主蛋白質の活性に関与する。エクソ／エンドサイト−シス及びユビキチン結合のための細胞の仕組みがその成熟に関与しているかもしれないと考えられている。特に、構築、出芽、及びそれに続くレトロイドウイルス、ＲＮＡウイルス及び種々のレトロウイルス、ラブドウイルス、レンチウイルス及びフィロウイルスなどのエンベロープウイルスの放出には、Ｇａｇポリ蛋白質が関与するかもしれない。合成後、Ｇａｇは、原形質膜を標的とし、そこで新生ウイルス粒子の出芽を誘導する。
【０００６】
ウイルスの構築におけるユビキチンの役割は、成長したウイルス粒子が非結合型ユビキチンに富んでいることを観察したDuniganら（1988、Virology 165、310、Meyersら、1991、Virology 180、602）によって示唆された。より最近になって、プロテアソーム阻害剤が、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ及びＲＳＶ Ｇａｇ由来のウイルス様粒子の放出を抑制することがわかった。また、阻害剤は、Ｇａｇプロセシング及び感染粒子への成長に影響を及ぼす（Schubertら、2000、PNAS 97、13057、Hartyら、2000、PNAS 97、13871、Strackら、 2000、PNAS 97、13063、Patnaikら、2000、PNAS 97、13069）。
【０００７】
ユビキチン媒介性の蛋白質分解は、真核細胞の細胞間蛋白質の選択的な、制御された分解のための経路である。細胞内の種々の蛋白質標的ユビキチン改変は、遺伝子発現、細胞周期の調節、細胞表面受容体の改変、リボゾームの生合成、ＤＮＡ修復の調節など多くの基礎的な細胞機能において重要と思われる。ユビキチン媒介系の主要な機能の１つは、細胞蛋白質の半減期の制御である。様々な蛋白質の半減期は、数分から数日の範囲となることができ、細胞のタイプ、栄養及び環境条件ならびに細胞周期の段階ににかなり依存して変化することができる。
【０００８】
恐らくユビキチン依存性プロテアソームの活性を介して選択的分解を行う標的蛋白質は、ユビキチンのＣ−末端グリシル残基と基質蛋白質の特異的なリシル残基との間のイソペプチド結合の形成を介してユビキチンで共有的にタグを付ける。このプロセスは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）及びユビキチン接合酵素（Ｅ２）によって触媒され、いくつかの例においては、このプロセスは、補助的な基質認識蛋白質（Ｅ３）も必要である。第１のユビキチン鎖の連結、ユビキチンの追加的な分子は、枝分かれした多ユビキチン鎖を形成するための、あらかじめ結合した部分のリジン側鎖に付着するのかもしれない。
【０００９】
ユビキチンと蛋白質基質との結合は、マルチステッププロセスである。最初のＡＴＰ要求ステップにおいて、ユビキチンのＣ末端とＥ１酵素の内部システイン残基との間にチオエステルが形成される。その後、活性化されたユビキチンは、複数のＥ２酵素のうちの１つの上の特異的なシステインに移されるようである。最後に、これらのＥ２酵素は、典型的には、ユビキチン酵素としても知られているＣ３蛋白質の援助を介して、ユビキチンを蛋白質基質に提供する。いくつかの例では、基質は、ユビキチン結合Ｅ２酵素によって直接的に認識される。
【００１０】
ユビキチン系は、細胞周期の進行、アポトーシス、及び多くの膜受容体の代謝回転を含む広範な細胞プロセスにおいて役割を果たす。ウイルス感染において、ユビキチン系は、構築、出芽及び放出のみならず、ウイルス誘導性新生物を導くこともあるｐ５３のような宿主蛋白質の抑制にも関与する。ＨＩＶ Ｖｐｕ蛋白質は、ＩκＢ分解を調節するＥ３蛋白質と相互作用し、ＮＦ−κＢ活性を間接的に阻害することによって、感染した細胞のアポトーシスを促進すると考えられている（Bourら（2001）J Exp Med 194: 1299-311；米国特許第5,932,425号）。ユビキチン系は、モノ−ユビキチン化（ubiquitinotin）及びポリユビキチン化（ubiquitinotin）の双方によって蛋白質機能を調節する。そして、ポリユビキチン化（ubiquitinotin）は、主に蛋白質分解と関連する。
【００１１】
小胞輸送システムは、細胞小器官、原形質膜及び細胞外媒体における蛋白質の分配の主要経路である。小胞輸送システムは、直接的又は間接的に種々の疾患の状態に関与している。真核生物の細胞の主要な小胞輸送システムは、クラスリンコートされた小胞及びコートマーコートされた小胞によって媒介される系を含む。クラスリンコートされた小胞は、原形質膜と初期のエンドソームとの間の、ならびにトランス-ゴルジ体ネットワークからエンドソームへのエンドサイトーシスを媒介する受容体などの場合、通常輸送に関与する。コートマーコートされた小胞は、コート蛋白質Ｉ（ＣＯＰ−１）コートされた小胞及びＣＯＰ−ＩＩコートされた小胞を含み、その両方は、ＥＲとゴルジ体システインの間の種々の分子の輸送を媒介する傾向がある。それぞれの場合において、小胞は、コート蛋白質でコートされた膜の蛋白質から出芽させることによって形成され、小胞は、標的分子に融合する前にそのコートを脱落させる。
【００１２】
クラスリンは、細胞質の膜表面の構築物をコートし、最終的に摘み取られて小胞となるピットを形成する。クラスリン自身は、クラスリン三本脚を形成する、クラスリン重鎖とクラスリン軽鎖の２つのサブユニットで構成される。クラスリンは、アッセンブリ蛋白質、ＡＰ１８０、アダプタ複合体（ＡＰ１、ＡＰ２、ＡＰ３及びＡＰ４）、β-アレスチン、アレスチン３、オーキシリン（auxilin）、エプシン、Ｅｐｓｌ５、ｖ−ＳＮＡＲＥ、アンピフィシン（amphiphysins）、ダイナミン、シナプトジャミン（synaptojanin）及びエンドフィリンを含む他の蛋白質の宿主と関連する。アダプタ複合体は、クラスリンケージ形成を促進し、クラスリンが膜、膜蛋白質及び前述の成分の多くと結合するのを助ける。ＡＰ１は、トランス-ゴルジ体ネットワーク由来のクラスリンコート小胞と関与し、γ、β１、μ１及びσ１ポリペプチド鎖を含有する。ＡＰ２は、 エンドサイトーシス性クラスリンコート小胞と関与し、α、β２、μ２及びσ２ポリペプチド鎖を含有する。クラスリン複合体及び他の蛋白質との相互作用は、SH3 (Srcホモロジー３)ドメイン、PH (プレクトスリンホモロジー) ドメイン、EH ドメインおよびNPFドメインなどの複合体蛋白質に見いだされる種々のドメインによって媒介される(Marshら、(1999) Science 285:215-20；Pearseら、(2000) Curr Opin Struct Biol 10(2):220-8)。
【００１３】
コートマーでコートされた小胞の形成は、その同族のグアニンヌクレオチド交換ファクタ（例えば、ＳＥＣ１２、ＧＥＡ１、ＧＥＡ２）によって、小さなGTPase（例えば、ＡＲＦ又はＳＡＲ）を補充することによって開始される。最初の複合体は、コート蛋白質複合体（ＣＯＰＩ又はＣＯＰＩＩ）によって認識される。その後コートは、膜全体に成長し、種々のcargo蛋白質が成長ネットワーク中に封入される。最終的に、膜は隆起し、小胞となる。コート蛋白質は、GTPase のGTPase活性を刺激し、ＧＴＰの加水分解によって、コート蛋白質は、複合体から放出され、小胞を脱コートする。コートマーでコートされた小胞と関連する他の蛋白質には、v-SNAREs、Rab GTPases及び、適切なcargo蛋白質の補充を助ける種々の受容体が含まれる（Springerら、（1999）Cell 97: 145-48）。
【００１４】
とりわけ、薬物スクリーニング方法において、これらのプロセスの１以上に関連する蛋白質を同定することは有益である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
部分的に、本願は、新規なユビキチンリガーゼ、ＰＯＳＨ（ＳＨ３ドメインに富んだ）核酸配列、及びそれによってコードされた蛋白質を提供する。いくつかの態様において、ＰＯＳＨは、ウイルス成熟において役割を果たす。任意に、ＰＯＳＨは、ウイルス放出を媒介する複合体の構築又は輸送において作用する。１つの態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、いくつかの蛋白質のユビキチン化を刺激するか、又は膜融合を刺激するか、又はその両方を行うことができる。当該技術の当業者が容易に理解できるであろうように、ＰＯＳＨ蛋白質は、多数の異なる複合体を異なる時期に形成することができる。いくつかの態様において、本発明は、ＰＯＳＨ（ＰＯＳＨ ＡＰ）と関連するポリペプチド及びＰＯＳＨが媒介する生物学的プロセスに関与するポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、小胞輸送において機能を果たす。更なる態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、Ｒａｃシグナリング経路を調節する。さらに別の態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、ＪＮＫ経路を調節する。さらに別の態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、ＮＦ−ｋＢを調節する。別の態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、アポトーシスを調節する。
【００１６】
いくつかの局面において、本発明は、核酸配列及びそれによってコードされる蛋白質、ならびにその核酸配列に由来するオリゴヌクレオチド、コードされた蛋白質に対する抗体、ＰＯＳＨを調節する物質を同定するためのスクリーニングアッセイ、ならびにウイルス、好ましくはエンベロープウイルス、ＲＮＡウイルス及び特にレトロイドウイルスに感染した細胞を検出する診断方法を提供する。 
【００１７】
ある局面において、本発明は、配列番号１、３、４、６、８及び/又は１０の配列又はそれらの相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供する。関連する態様において、核酸は、配列番号１、３、４、６、８及び/又は１０又はその相補配列の、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２５、少なくとも約４０、少なくとも約１００、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、又は少なくとも約２５００の連続するヌクレオチドから全長までに対応する配列に少なくとも約８０％、９０%、 ９５%又は９７〜９８%又は１００%一致する核酸である。
【００１８】
ある局面において、本発明は、配列番号３１〜３５の配列又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供する。関連する態様において、核酸は、配列番号３１〜３５の配列又はその相補配列の、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２５の連続するヌクレオチドから全長までに対応する配列に少なくとも８０％、９０%、 ９５%又は９７〜９８%又は１００%一致する。
【００１９】
他のいくつかの態様において、本発明は、配列番号１、３、４、６、８、及び/又は１０の配列又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は配列番号１、３、４、６、８及び/又は１０又はその相補配列の、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２５、少なくとも約４０、少なくとも約１００、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、又は少なくとも約２５００の連続するヌクレオチドから全長までに対応する配列に少なくとも８０％、９０%、 ９５%又は９７〜９８%又は１００%一致するヌクレオチド配列、及び前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結し、そのヌクレオチド配列を発現ベクターとして好適に使用できるようにした転写調節配列を含む核酸を提供する。別の態様において、核酸は、原核細胞又は真核細胞において複製することが可能な発現ベクター中に含まれていてもよい。関連する態様において、本発明は、発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号１、３、４、６、８及び/又は１０、又はその相補配列の少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２５、少なくとも約４０の連続するヌクレオチドから、前記配列がそのフラグメントである遺伝子の全長までに対応する、核酸プローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、略純粋な核酸を提供する。本発明はまた、配列番号１及び/又は３、又はその相補配列の、少なくとも１２、少なくとも２５又は少なくとも５０の連続するヌクレオチド全長までにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログを提供する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号２、５、７、９又は１１のいずれか、又はその相補配列に示されたアミノ酸配列をコードする核酸を含む核酸を提供する。関連する態様において、コードされたアミノ酸配列は、配列番号２、５、７、９又は１１の、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２５、又は少なくとも約４０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００又は少なくとも約５００の連続するアミノ酸から全長までに対応する配列に少なくとも約８０％、９０%、 ９５%又は９７〜９８%又は１００%一致する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供する。前記オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、４、６、８及び/又は１０又はその相補配列から選択されるセンスまたはアンチセンス配列の、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２５、少なくとも約４０の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含有する。好ましい態様において、プローブは、標的核酸に選択的にハイブリダイズする。別の態様において、プローブは、そこに付着され、取り外すことができる標識基を含んでもよい。該標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素及び酵素コファクターから選択される。本発明はさらに、固体支持体に付着された、上記の少なくとも約１０、少なくとも約２５、少なくとも約５０、又は少なくとも約１００の異なるプローブのアレイをさらに提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ポリペプチドを提供する。ある態様において、本発明は、配列番号１、３、４、６、８及び/又は１０、又はその相補配列、又はそれらの少なくとも約２５、又は少なくとも約４０のアミノ酸を含むフラグメントに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００２４】
好ましい態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、配列番号２、５、７、９又は１１のいずれかに一致する又は相同の配列を含む。例えば、ＰＯＳＨポリペプチドは、好ましくは配列番号２、５、７、９又は１１のいずれかによって表されるポリペプチドに少なくとも６０％相同する、及び、例えば、８０%、９０%又は９５%といった、より高い配列相同性を持つポリペプチドもまた意図されている。ＰＯＳＨポリペプチドは、配列表に表されているような全長蛋白質を含むことができる。あるいは、それはフラグメント、例えば、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００又は５００、又はそれ以上の長さのアミノ酸を含むことができる。
【００２５】
別の態様において、本願は、配列番号２６〜３０のいずれかに８０%、９０%又は９５%一致する、又は相同する配列を含むポリペプチドを提供する。
【００２６】
別の好ましい態様において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチドの精製されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチドを特徴とする。そのポリペプチドは、野生型ＰＯＳＨ蛋白質の活性を調節、例えば、模倣もしくはアンタゴナイズする能力を有している。好ましくは、ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、５、７、９又は１１のいずれかに示されたアミノ酸配列に一致するもしくは相同する配列を含む。
【００２７】
さらに、以下に示すように、ＰＯＳＨポリペプチドは、天然に存在する形態の蛋白質、例えば、ポリペプチドの生物学的活性の、アゴニスト（例えば、模倣物）あるいはアンタゴニストとなり得る。例えば、ＰＯＳＨ蛋白質又はＰＯＳＨ複合体の、固有の生物学的活性、例えば、酵素活性、他の細胞成分への結合、細胞の区分化、膜認識などを調節することができる。
【００２８】
対象の蛋白質は、融合蛋白質の形態などのキメラ分子として提供することもできる。例えば、ＰＯＳＨポリペプチドは、第２のポリペプチド部分、例えば、例えば、ＰＯＳＨに関連しない（非相同の）アミノ酸配列を持つ第２のポリペプチドを含む組換え融合蛋白質として提供することができる。例えば、第２のポリペプチド部分は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである、例えば、第２のポリペプチド部分は、アルカリホスファターゼのような酵素活性がある。例えば、第２のポリペプチド部分は、エピトープタグ標識である。
【００２９】
本発明のさらに別の局面は、免疫原調製においてＰＯＳＨポリペプチドを含む免疫原に関する。その免疫原は、ＰＯＳＨポリペプチドに特異的な免疫反応、例えば、液性応答、例えば、抗体反応、例えば、細胞反応を誘発することができる。好ましい態様において、免疫原は、配列番号２で表される蛋白質からの抗原決定基、例えば、独特の決定基を含む。
【００３０】
さらに別の局面において、本発明は、１以上のＰＯＳＨポリペプチドと免疫反応する抗体を提供する。１つの態様において、抗体は、ＰＯＳＨポリペプチド由来のＳＨ３ドメイン又はＲＩＮＧドメインに特異的である。１つのより具体的な態様において、ドメインは、配列番号２に示されたアミノ酸配列の一部である。一連の対応の例において、抗体は、配列番号２のアミノ酸１３７〜１９２、１９９〜２５８、４４８〜５０５及び８３２〜８８８及び、配列番号２７〜２０のいずれかによって示される１以上のＳＨ３ドメインに結合する。別の実施態様例において、抗体は、配列番号２のアミノ酸１２〜５２によって表され、配列番号２６に示されている、ＲＩＮＧドメインに結合する。別の態様において、抗体は、配列番号２に示されているアミノ酸配列に少なくとも８０％一致する、少なくとも９０%一致する、又は少なくとも９５%一致するアミノ酸配列を持つ１以上の蛋白質と免疫反応する。他の態様において、抗体は、配列番号２に示されているアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は一致するアミノ酸配列を持つ１以上の蛋白質と免疫反応する。
【００３１】
いくつかの態様において、対象となるＰＯＳＨ核酸は、転写調節配列、例えば、少なくとも１つの転写プロモーター又は転写エンハンサー配列を含む。その調節配列は、作動可能にＰＯＳＨ配列と結合している。そのような調節配列は、ＰＯＳＨ配列を発現ベクターとして好適使用できるものとしている。
【００３２】
さらに別の局面において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチドと、GTPase又はレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスの後のドメイン領域などのＰＯＳＨ関連蛋白質（ＰＯＳＨ−ＡＰ）との間の相互作用の阻害剤または促進剤としての試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。例えば方法は、（ｉ）ＰＯＳＨ−ＡＰ、ＰＯＳＨポリペプチド及び試験化合物を、例えば、試験化合物のない状態で、ＰＯＳＨポリペプチド及びＰＯＳＨ−ＡＰが相互作用できる条件で混合するステップ、及び（ｉｉ）ＰＯＳＨポリペプチド及びＰＯＳＨ−ＡＰを含む複合体の形成を検出するステップを含む。試験化合物の存在下での複合体の形成における、（試験化合物の非存在下で観察されるものに比べての）統計的に有意な変化、例えば減少は、ＰＯＳＨポリペプチド及びＰＯＳＨ−ＡＰ間の相互作用の調節、例えば、阻害を示すものである。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチド及びＰＯＳＨ−ＡＰ間の相互作用を阻害もしくは強化する試験化合物を同定するためのアッセイを提供する。それは、（ａ）ＰＯＳＨポリペプチド、ＰＯＳＨ−ＡＰ及び試験化合物の反応混合物を作製すること、及び前記ＰＯＳＨポリペプチドと前記ＰＯＳＨ−ＡＰとの結合を検出することを含む。試験化合物の存在下での前記ＰＯＳＨポリペプチドと前記ＰＯＳＨ−ＡＰとの結合の、試験化合物の非存在下での結合に対する相対的な変化は、前記試験化合物が、ＰＯＳＨポリペプチドとＰＯＳＨ−ＡＰとの間の結合を促進または阻害することを示す。
【００３４】
更なる態様において、本発明は、（ａ）ＰＯＳＨポリペプチド、ＰＯＳＨ-ＡＰ及び試験化合物を含む反応混合物を形成すること、ならびに（ｂ）該反応混合物と試験化合物とを接触させること、（ｃ）試験化合物の１以上の活性を測定することを含む蛋白質複合体のモジュレーターを同定する方法に関する。活性の例としては、蛋白質複合体のレベルの変化、複合体の酵素活性の変化、反応混合物が細胞全体である場合は、複合体又はその成分の細胞質膜における局在性の変化、又はＰＯＳＨポリペプチドとＰＯＳＨ-ＡＰの間の相互作用の変化を含む。
【００３５】
更なる態様は、ＰＯＳＨポリペプチドとＰＯＳＨ-ＡＰの間の相互作用を阻害するもしくは促進する物質を同定するためのスクリーニングアッセイであって、配列番号２のＰＯＳＨポリペプチド部分を含む第１の融合蛋白質及びＰＯＳＨ-ＡＰ部分を含む第２の融合蛋白質を含む２−ハイブリッドアッセイシステムを、前記２つのハイブリッドアッセイが前記第２の融合蛋白質のＰＯＳＨポリペプチド部分と前記第２のポリペプチドの前記ＰＯＨＳ-ＡＰ部分との相互作用に対して感受性を有する条件下において提供すること；試験化合物の存在下及び不存在下で前記融合蛋白質間の相互作用のレベルを測定すること；ならびに、前記融合蛋白質間の相互作用のレベルどうしを比較することを含み、相互作用のレベルの減少は、ＰＯＳＨポリペプチドとＰＯＳＨ-ＡＰ間の相互作用を阻害する物質であることを示す、スクリーニングアッセイである。
【００３６】
更なる局面において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチドと少なくとも１つのＰＯＳＨ-ＡＰの組合せを含む単離された蛋白質複合体を提供する。いくつかの態様において、ＰＯＳＨ複合体は、クラスリンで覆われた小胞体の形成に関する。更なる態様において、ＰＯＳＨ複合体は、Gagのようなウイルス蛋白質を含む。いくつかの態様において、ＰＯＳＨ複合体は、ユビキチンを含むＰＯＳＨ複合体（例えば、共有もしくは非共有のＰＯＳＨユビキチン接合体）、E2、E1又はユビキチン化された標的における場合のように、ＰＯＳＨのユビキチン関連活性に関する。
【００３７】
更なる局面において、本発明は、ＰＯＳＨを操作するための核酸治療を含む。ある態様において、本発明は、配列番号１及び/又は３又はその相補配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は任意に１００％一致する核酸配列の５〜１０００の連続するヌクレオチドを含むリボ核酸を提供する。任意にリボ核酸は、少なくとも１０、１５、２０、２５又は３０の連続するヌクレオチド、及びＰＯＳＨ核酸の１０００、７５０、５００及び２５０以下の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、リボ核酸は、ＲＮＡｉオリゴマー又はリボザイムである。好ましくは、リボ核酸は、ＰＯＳＨ ｍＲＮＡのレベルを減少させる。リボ核酸は、配列番号１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４及び２５のいずれかから選択される配列を含むことが好ましい。
【００３８】
本発明はまた、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、雌牛、又はトランスジーンを持つ非ヒト霊長類、例えば、本明細書に記載の異種の形態のＰＯＳＨ遺伝子を含む（好ましくは発現する）動物である、トランスジェニック非ヒト動物を特徴とする。そのようなトランスジェニック動物は、ＨＩＶ感染などのウイルス感染の研究の、又は、ウイルス感染のスクリーニングに用いる動物モデルとしての役割を果たす。
【００３９】
更なる局面において、本発明は、核酸治療の送達のための組成物、例えば、リポソーム及び/又は薬学的に許容できる添加物もしくは担体を含む組成物を提供する。
【００４０】
本発明のプラクティスは、特に記載のない限り、当該技術の技量の範囲内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の常法を採用する。そのような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第２版、Sambrook、Fritsch及びManiatis（Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989）； DNA Cloning、Ｉ、ＩＩ巻（D. N. Glover ed.、 1985）; Oligonucleotide Synthesis （M. J. Gait ed.、 1984）；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization （B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984）；Transcription And Translation （B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984）；Culture Of Animal Cells （R.1. Freshney、 Alan R. Liss、 Inc.、 1987）；I7nmobilized Cells And Enzymes （IRL Press、1986）；B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning （1984）；the treatise、 Methods In Enzymology （Academic Press、 Inc.、 N. Y.）; Gene Transfer Vectorss For Mammalian Cells （J. H. Miller and M. P. Calos eds.、1987、Cold Spring Harbor Laboratory）; Methods In Enzymology、Vols. 154 and 155 （Wuら、eds.）、 Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology （Mayer 及びWalker、eds.、Academic Press、London、1987）; Handbook Of Experimental Immunology、 VolumesI-IV （D. M. Weir 及びC. C. Blackwell、eds.、 1986）; Manipulating the Mouse Embryo、（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、 N. Y.、1986）を参照されたい。
【００４１】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
１．定義
用語「結合」は、生理学的条件下での、例えば、共有結合、静電結合、疎水結合、イオン結合及び/又は水素結合相互作用による２つの分子間の直接的な会合を意味する。
【００４３】
「キメラ蛋白質」又は「融合蛋白質」は、ポリペプチドをコードする第１のアミノ酸配列と、第１のアミノ酸配列のいずれのドメインとも異なり、実質的に相同でないドメインを定める第２のアミノ酸配列との融合である。キメラ蛋白質は、（異なる蛋白質中ではあるが）微生物中に見出される外来ドメインを提示することもあるし、又は、異なる種類の微生物によって発現される蛋白質構造の「種間」、「遺伝子間」融合などのこともある。
【００４４】
用語「化合物」、「試験化合物」及び「分子」は、本明細書において互換可能に用いられており、それは、限定されないが、ペプチド、核酸、炭水化物、有機小分子、天然産物の抽出ライブラリー、及び他のあらゆる分子（限定されないが、化学物質、金属及び有機金属化合物を含む）を含むことが意図されている。
【００４５】
「保存アミノ酸置換基」という表現は、いくつかの共通の特性を基礎としたアミノ酸の分類を意味する。個別のアミノ酸どうしの共通の特徴を定義するための機能的な方法は、相同微生物の対応する蛋白質の間のアミノ酸の変化の正規度数を分析することである（Schulz、G. E.及びR. H. Schirmer.、 Principles of Protein Structure、Springer-Verlag）。そのような分析にしたがって、アミノ酸の基を定義することができる。１つのグループ内のアミノ酸は、互いに交換でき、したがって、蛋白質構造全体に及ぼす影響において互いに多くの点で類似している（Schulz、 G. E.及びR. H. Schirmer、Principles of Protein Structure、Springer-Verlag）。アミノ酸のグループの例としては、
（ｉ）Glu 及びAsp、Lys、Arg及びHisからなる荷電グループ、
（ｉｉ）Lys、Arg 及びHisからなる正に荷電したグループ、
（ｉｉｉ）Glu 及びAspからなる負に荷電したグループ、
（ｉｖ）Phe、Tyr 及びTrpからなる芳香族グループ、
（ｖ）His及びTrpからなる窒素環グループ、
（ｖｉ）Val、Leu 及びIleからなる大脂肪族非極性グループ、
（ｖｉｉ）Met及びCysからなる微極性グループ、
（ｖｉｉｉ）Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln及びProからなる小残グループ、
（ｉｘ）Val、Leu、Ile、Met及びCysからなる脂肪族グループ、ならびに
（ｘ）Ser 及びThrからなる小ヒドロキシルグループ、があげられる。
【００４６】
上で示したグループに加えて、それぞれのアミノ酸残基は、それ自身のグループを形成することができ、その個別のアミノ酸によって形成されたグループは、単純に当該技術において通常用いられる１及び/又は３文字の短縮記号で表すことができる。
【００４７】
「保存残基」は、類似の蛋白質の範囲全体にわたって、比較的不変のアミノ酸である。しばしば、保存残基は、「保存アミノ酸置換基」について上記したように、類似のアミノ酸によって置換されることによってのみ変化する。
【００４８】
本明細書に用いられる、「ドメイン」という語は、特定の構造を含み、及び/又は、特定の機能を果たす蛋白質の領域を意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる、「エンベロープウイルス」という語は、ウイルス放出プロセスにおいて、細胞膜及び/又はあらゆる細胞小器官膜を用いるあらゆるウイルスを意味する。
【００５０】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間で類似した配列を意味する。相同性及び同一性は、比較する目的で並べることができる各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の等しい位置が、同じ塩基もしくはアミノ酸で占められているとき、分子はその位置において同一である。等しい部位が同じもしくは類似のアミノ酸残基（例えば、立体的性質、電気的性質）で占められているとき、その分子は、その位置において相同（類似）であると言える。相同性／類似性又は同一性のパーセンテージとしての表現は、比較する配列によって共有される位置における、同一もしくは類似のアミノ酸数の関数を基準とする。「関連がない」又は「非相同の」配列は、本発明の配列との同一性が４０％未満、好ましくは２５％未満の配列である。２つの配列を比較する際、残基（アミノ酸又は核酸）の不存在又は余剰残基の存在によっても相同性／類似性が減少する。
【００５１】
用語「相同性」は、類似の機能又はモチーフを有する遺伝子又は蛋白質を同定するために用いられる配列の類似性の数学的に基礎付けられた比較を説明する。本発明の核酸配列及び蛋白質配列は、例えば、他のファミリーメンバー、関連する配列もしくはホモログを同定するための「クエリー配列」として用いられることもある。そのような検索は、Altschulら （1990） J Mol. Biol. 215:403-10のNBLAST プログラム及び XBLASTプログラム（バージョン2.0）を用いて行われる。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いて行うことができる。BLAST蛋白質検索は、本発明の蛋白質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて行うことができる。比較の目的で、ギャップのある配列を得るために、Gapped BLASTを、Altschulら （1997） Nucleic Acids Res. 25（17）:3389-3402に記載のように用いることができる。BLASTプログラムとGapped BLAST プログラムを用いる際、それぞれのプログラム（例えば、XBLAST 及び BLAST）のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
【００５２】
本明細書において用いられる「同一性」は、配列のマッチングを最大限するように、即ち、ギャップ及び挿入を考慮して配列を並べたとき、２以上の配列の対応する部分における、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。同一性は、限定されないが、Computational Molecular Biology、 Lesk、 A. M.、 ed.、Oxford University Press、New York、 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects、 Smith、 D. W.、ed.、 Academic Press、 New York、 1993; Computer Analysis of Sequence Data、 Part I、 Griffin、 A. M.、及びGriffin、 H. G.、 eds.、 Humana Press、 New Jersey、 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje、G.、 Academic Press、1987; and Sequence Analysis Primer、Gribskov、M.及びDevereux、J.、eds.、M Stockton Press、New York、1991; ならびに Carillo、H.及びLipman、D.、 SIAM J. Applied Math.、48: 1073 （1988）に記載の方法を含む公知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための方法は、試験される配列の間のマッチングを最大限にするように設計される。さらに、同一性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに体系的にまとめられている。２つの配列の間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム方法としては、限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux、J.ら、Nucleic Acids Research 12（1）: 387 （1984））、 BLASTP、 BLASTN、 及びFASTA （Altschul、 S. F. ら、J. Molec. Biol. 215: 403-410 （1990）及びAltschulら、Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 （1997））があげられる。BLAST Xプログラムは、NCBIやその他のソースから公に入手可能である（BLAST Manual、Altschul、S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda、Md. 20894; Altschul、S.ら、J. Mol. Biol. 215: 403-410 （1990）。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に用いることができる。
【００５３】
用語「イントロン」は、最初はＲＮＡに転写されるが、後に除去され、その大半にがプロセシングされたｍＲＮＡ中には表れない核酸の部分を言う。イントロンの除去は、一般的にそれぞれ５’及び３’スプライス部位と言われる、５’末端及び３’末端における反応によって起こる。異なるスプライス部位の選択的な使用によって、スプライスバリアントが生じる。イントロンは必ずしも２つの「エクソン」の間、又はアミノ酸をコードする部分の間に位置する必要はなく、代わりに、例えば、プロモーターと第１のエクソンの間に位置していてもよい。イントロンは、自己スプライシングすることもあり、ｍＲＮＡからスプライスされることに細胞成分を要求することもある。「非相同のイントロン」は、天然にはコード配列に結合しないコード配列に挿入されるイントロンである。さらに、非相同のイントロンは、スプライス部位の１もしくは双方が望ましい資質を提供するように変化した、例えば、スプライス効率を上昇させる、もしくは減少させる、通常天然のイントロンでもよい。非相同のイントロンはしばしば、例えば、非相同の宿主中の遺伝子の発現を向上させるため、又はあるスプライスの他のスプライスに対する変形を増加させるために挿入される。一例として、ウサギβグロブリン遺伝子を用いることができ、それは、Promega Inc.からｐＣＩベクターにおいて購入することができる。イントロンの他の例が、Lacy-Hulbertら、2001） Gene Ther 8（8）:649-53に提供されている。
【００５４】
本明細書において対象としている蛋白質及び蛋白質複合体に関して用いられる「単離された」という用語は、例えば、その蛋白質又は蛋白質複合体が内因的に見出される細胞環境中で、蛋白質又は複合体とともに通常存在するであろう蛋白質を本質的に含まない蛋白質及び蛋白質複合体の調製を意味する。したがって、単離された蛋白質複合体は、通常「混入する」であろう又はそのモジュレーターをスクリーニングするときの単離物内の複合体の研究の妨げとなるであろう細胞成分から単離されている。しかしながら、そのような「単離された」複合体は、対象となる蛋白質又は蛋白質複合体によって、その調節が研究される他の蛋白質を組み込んでもよい。
【００５５】
ＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸に関して本明細書で用いられている「単離された」という用語は、天然に存在しない形態の分子を意味する。さらに、「単離された核酸」は、フラグメントとして天然に存在しない、天然の状態で存在しないであろう核酸フラグメントを含むことが意図される。
【００５６】
レンチウイルスとしては、霊長類レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルスＩ型及び２型（ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２）；チンパンジー（ＳＩＶｃｐｚ）、スーティーマンガベイ（ＳＩＶｓｍｍ）、アフリカミドリザル（ＳＩＶａｇｍ）、Syke'sサル（ＳＩＶｓｙｋ）、マンドリル（ＳＩＶｍｎｄ）及びマカキー（ＳＩＶｍａｃ）からのサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）がある。レンチウイルスにはまた、ネコレンチウイルス、例えば、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシレンチウイルス、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；ヒツジレンチウイルス、例えば、マエディ／ビスナウイルス（ＭＶＶ）及びヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ならびにウマレンチウイルス、例えば、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が含まれる。全てのレンチウイルスは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖ蛋白質に加えて、少なくとも２つの更なる調節蛋白質（Ｔａｔ、Ｒｅｖ）発現する。霊長類レンチウイルスは、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｖｐｘ及びＶｉｆを含む他のアクセサリー蛋白質を含む。通常、レンチウイルスは、免疫不全症に加えて、神経性変性症及び関節炎を含む種々の疾患の疾患の原因物質である。種々のレンチウイルスのヌクレオチド配列は、下記のアクセッションナンバー（from J. M. Coffin、 S. H. Hughes、及びH. E. Varmus、 "Retroviruses" Cold Spring Harbor Laboratory Press、 199、7 p 804）でジーンバンクに見出すことができる：１）ＨＩＶ−１： K03455、 M19921、 K02013、 M3843 1、 M38429、 K02007及びM17449；２）ＨＩＶ−２：M30502、J04542、M30895、J04498、M15390、M31113及びL07625；３）SIV:M29975、M30931、M58410、M66437、L06042、M33262、M19499、M32741、M31345及びL03295；４）ＦＩＶ：M25381、M36968 及びUl 1820；５）ＢＩＶ： M32690；６Ｅ１ＡＶ： M16575、M87581及びU01866；６）Ｖｉｓｎａ：M10608、M51543、L06906、M60609及びM60610；７）ＣＡＥＶ： M33677；ならびに８）ヒツジレンチウイルスM31646及びM34193。レンチウイルスＤＮＡは、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手することもできる。例えば、ネコ免疫不全ウイルスは、ＡＴＣＣ登録ナンバーVR-2333及びVR-3112で入手可能である。ウマ感染性貧血ウイルスＡは、ＡＴＣＣ登録ナンバーVR-778で入手可能である。ヤギ関節炎脳炎ウイルスは、ＡＴＣＣ登録ナンバーVR-905で入手可能である。ビスナウイルスは、ＡＴＣＣ登録ナンバーVR-779で入手可能である。本明細書で用いられるところの「核酸」という語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味する。この用語はまた、ヌクレオチド類似体によって作製されるＲＮＡまたはＤＮＡの類似体、また、記載の態様に適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを等価物として含むことを理解すべきである。
【００５７】
本明細書で用いられている「成熟」という用語は、産生、転写後プロセシング、構築、及び/又はウイルス粒子を形成する蛋白質の放出を意味する。したがって、これは、細胞膜から新生のビリオンのウイルス蛋白質を摘み出す処理を含む。
【００５８】
「膜結合蛋白質」は、内在性膜蛋白質である蛋白質ならびに安定に膜に結合している蛋白質を意味する。
【００５９】
本明細書で用いられている「p6」又は「p6gag」は、ウイルスＬドメインを含む蛋白質を意味する。p6ドメインに結合する抗体は、「抗p6抗体」と称する。p6はまた、人工的に作製された、例えば、一連のＬモチーフを含むＬドメインを含む蛋白質を意味する。「Gag蛋白質」又は「Gagポリペプチド」は、Gag活性を有するポリペプチド及び好ましくはＬ（即ちlate）ドメインを有するポリペプチドを意味する。Gag 蛋白質の例としては、PXXP、PPXY、RXXPXXP、RPDPTAP、RPLPVAP、RPEPTAP、YEDL、PTAPPEY 及び/又はRPEPTAPPEEなどのモチーフがあげられる。ＨＩＶ p24は、Gagポリペプチドの例である。
【００６０】
「ＰＯＳＨ核酸」は、配列番号１、３、４、６、８及び１０のいずれかに示されている配列ならびに本明細書に記載のバリアントのいずれかを含む核酸である。
【００６１】
「ＰＯＳＨポリペプチド」又は「ＰＯＳＨ蛋白質」は、配列番号２、５、７、９及び１１のいずれかに示されている配列、ならびに本明細書に記載の変形のいずれかを含むポリペプチドである。
【００６２】
「ＰＯＳＨ関連蛋白質」又は「ＰＯＳＨ−ＡＰ」は、ＰＯＳＨポリペプチドと相互作用する及び/又は結合することが可能な蛋白質を意味する。通常、ＰＯＳＨ−ＡＰは、ＰＯＳＨポリペプチドと直接的又は間接的に相互作用することができる。ＰＯＳＨ−ＡＰの例を全体において述べる。 
【００６３】
ペプチド、蛋白質及びポリペプチドという語は、互換可能に用いられる。
【００６４】
「精製された蛋白質」という語は、蛋白質又は好ましくは単離された形態、もしくは細胞又は細胞ライセート中の蛋白質と通常関連する他の細胞蛋白質を実質的に含まない蛋白質の調製物を意味する。「他の細胞蛋白質を実質的に含まない」（本明細書では「他の混入蛋白質が実質的に存在しない」とも言う）は、蛋白質を（乾燥重量で）２０％未満、好ましくは５％未満の混入蛋白質を含む、それぞれの成分蛋白質の別個の調製を包含するものであると定義される。機能的な形態のそれぞれの成分蛋白質は、添付の実施例に記載のようなクローニングされた遺伝子を用いることによって、精製された調製物として調製することができる。「精製された」は、再構成された蛋白質混合物を生成するために用いられる成分蛋白質調製について言う場合、提示の分子が、他の蛋白質（特に、精製された調製物として、又は対象となる再構成された混合物の機能において、実質的に、成分蛋白質の特徴をマスクする、減少させる、混乱させる又は変更する他の蛋白質）のような他の生物学的高分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味する。本明細書で用いられ「精製された」という語は、少なくとも乾燥重量で８０％、好ましくは８５重量％の範囲、より好ましくは９５〜９９重量％、そして最も好ましくは９９．８重量％の、同じ種類の生物学的高分子が存在する（しかし、水、緩衝液、及び他の小分子、特に分子量が５０００未満の分子が存在することができる）ことを意味する。本明細書で用いられる「純粋の」という語は、すぐ上で述べた「精製された」と同じ数量的限定を有することが好ましい。
【００６５】
「受容体」又は「受容体の機能を持つ蛋白質」は、細胞外リガンドもしくは細胞内であるが位相学的に細胞外の空間と等価の空間（例えば、ゴルジ体内部、核膜内部、リソソーム内部あるいは輸送小胞など）にあるリガンドと相互作用する蛋白質である。受容体の例は、本明細書において、種々の公的なデータベースと同様に注釈で示す。受容体はしばしば膜ドメインを持つ。
【００６６】
「組換え核酸」は、組換えＤＮＡ技術によって別の核酸に隣接して配置されたあらゆる核酸である。「組み換えられた核酸」はまた、例えば、形質転換や統合、トランスポゾンホッピング（transposon hopping）あるいはウイルス挿入などの実験室遺伝子的技術によって、第２の核酸の隣に配置されたあらゆる核酸である。一般的に、組み換えられた核酸は、第２の核酸に天然には隣接して位置づけられない。
【００６７】
用語「組換え蛋白質」は、組換えＤＮＡ技術によって作製された本発明の蛋白質を意味する。そこでは、通常、発現された蛋白質をコードするＤＮＡが、宿主細胞を形質転換して、非相同の蛋白質を作製するために使用されることになる好適な発現ベクターに挿入される。さらに、組換え蛋白質をコードする組換え遺伝子に関する「〜に由来する」という語は、「組換え蛋白質」の意味において、天然の蛋白質のアミノ酸配列、又は天然に存在する蛋白質の置換、欠失を含む突然変異によって生成されたものに類似するアミノ酸配列をもつ蛋白質を意味する。
【００６８】
「ＲＩＮＧドメイン」又は「リングフィンガー」は、所定のオクテットのシステイン及びヒスチジン残基をもつ亜鉛結合ドメインである。いくつかのＲＩＮＧドメインは、以下に示すコンセンサス配列（アミノ酸の名称は、表１に示す）：Cys Xaa Xaa Cys Xaa10 - 20 Cys Xaa His Xaa2-5 Cys Xaa Xaa Cys Xaa13-50 Cys Xaa Xaa Cys or  Cys Xaa Xaa Cys Xaa10 - 20 Cys Xaa His Xaa2-5 His Xaa Xaa Cys Xaa13-50 Cys Xaa Xaa Cysを含む。いくつかのＲＩＮＧドメインは、配列番号２及び配列番号２６のアミノ酸１２〜５２に少なくとも８０％一致するアミノ酸配列として表される。好ましいＲＩＮＧドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列に８５％、９０％、９５％、９８％及び最も好ましくは、１００％一致する。本発明の好ましいＲＩＮＧドメインは、種々の蛋白質パートナーと結合し、ユビキチンリガーゼ活性を持つ複合体を形成する。ＲＩＮＧドメインは、好ましくは少なくとも１つの下記の蛋白質型：Ｆボックス蛋白質、Ｅ２ユビキチン結合酵素及びcullinsと相互作用をする。
【００６９】
「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」は、標的細胞又は１以上の関連する遺伝子（特に対象となっている遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ）に相同な二本鎖ＲＮＡを導入することによって、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現が減少するあらゆる方法を言う。
【００７０】
本明細書で用いられる「小分子」は、分子量が約５ｋＤ未満、最も好ましくは２．５ｋＤ未満の組成物を意味することが意図されている。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質又はその他の有機（炭素含有）もしくは無機分子であることができる。多くの製薬会社は、小分子、しばしば、真菌、細菌、もしくは藻類抽出物のアレイを含む、化学的及び/又は生物学的混合物の広範囲にわたるライブラリを持っており、それは、本発明のアッセイのいずれを用いてもスクリーニングすることができる。
【００７１】
「ＳＨ３」又は「Src Homology３」ドメインは、通常約６０のアミノ酸残基の蛋白質ドメインであり、複数の原形質蛋白質チロシンキナーゼ（例えば、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、Ｌｃｋ）の非触媒部分における保存配列として最初に同定される。ＳＨ３ドメインは、プロリンに富むペプチドとの結合を介して特異的な蛋白質複合体の構築を媒介する。ＳＨ３ドメインの例としては、配列番号２のアミノ酸１３７〜１９２、１９９〜２５８、４４８〜５０５及び８３２〜８８８によって表され、配列番号２７〜３０に示されている。いくつかの実施形態において、ＳＨ３ドメインは、コンセンサス配列RXaaXaaPXaaX6P（下記の表１に示されているように、Ｘ６は疎水性アミノ酸である）。いくつかの実施形態において、ＳＨ３ドメインは、P（T/S）AP、PFRDY、RPEPTAP、RQGPKEP、RQGPKEPFR、RPEPTAPEE 及びRPLPVAPの配列の１以上と相互作用する。
【００７２】
本明細書で用いられている、「特異的にハイブリダイズする」という語は、本発明の核酸プローブ／プライマーが、ＰＯＳＨ配列又はその相補配列或いはその天然型変異体の少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又は１００の連続するヌクレオチドにハイブリダイズし、ＰＯＳＨ遺伝子以外の細胞性核酸（例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ）に対するバックグランドのハイブリダイゼーションが１５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満を持つ。種々のハイブリダイゼーション条件を用いて、特異的なハイブリダイゼーションを検出することができ、ストリンジェンシーは、主にハイブリダイゼーションアッセイの洗浄段階によって決定される。通常、高温、低塩濃度によって、高ストリンジェンシーとなり、一方、低温、高塩濃度によって低ストリンジェンシーとなる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、例えば、約２．０×ＳＳＣ、５０℃での洗浄によって達成され、高ストリンジェンシーは、約０．２×ＳＳＣ、５０℃で達成される。以下において、ストリンジェンシーについてさらに説明する。
【００７３】
ポリペプチドに適用されるとき、「実質的な配列同一性」は、例えば、デフォルトギャップを用いたプログラム、GAP又はBESTFITなどにより、最適に並べたとき、２つのペプチド配列が少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を持つことを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なった状態となっている。例えば、電荷もしくは極性などの類似の化学的特性を持つアミノ酸の置換基は、蛋白質の特性に影響を与える可能性は低い。例としては、アスパラギンをグルタミンに、又はアスパラギン酸をグルタミン酸に置換することを含む。
【００７４】
「転写調節配列」は、それらが作動可能に結合した配列をコードする蛋白質の転写を誘導又は制御する、開始シグナル、エンハンサー及びプロモーターなどのＤＮＡ配列を意味するために本明細書全体において用いられる一般用語である。好ましい態様において、組換え蛋白質遺伝子の転写は、発現が意図される細胞タイプにおける組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（又は他の転写調節配列）の制御下にある。組換え遺伝子は、天然に存在する形態の蛋白質の転写を制御する配列と同じ、又は異なる転写調節遺伝子が転写調節配列によって制御されることが理解され得るであろう。
【００７５】
本明細書で使用されるところの「トランスジェニック動物」は、該動物の細胞の１個もしくはそれ以上が、人為的に、例えば、当該技術分野において公知のトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を含有するあらゆる動物、好ましくは、非ヒト哺乳動物、鳥類、両生類である。細胞の前駆体に直接的もしくは間接的に導入することによって、組換えウイルスを用いたマイクロインジェクションもしくは感染といった意図的な遺伝子操作によって、核酸を細胞に導入する。遺伝子操作という語は、古典的な交差交配又はインビトロの受精を含まず、むしろ、組換えＤＮＡ分子の導入を指す。この分子は、染色体内に組み込まれてもよいし、又は染色体外でＤＮＡを複製するものでもよい。本明細書に記載されている典型的なトランスジェニック動物においては、導入遺伝子が細胞に組換えヒトＰＯＳＨ蛋白質を発現させる。本発明の「非ヒト動物」は、げっ歯類、非ヒトの霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、両生類、爬虫類などの脊椎動物が挙げられる。好ましい非ヒト動物は、ラットもしくはマウスのようなげっ歯類から選択される。最も好ましくはマウスであるが、アフリカツメガエル属のメンバーのようなトランスジェニック両生類、及びトランスジェニックニワトリもまた、例えば、胚形成及び組織形成を理解するための重要なツールを提供し得る。用語「キメラ動物」は、組換え遺伝子が見出される、又は、組換えが動物の全てではなく一部において発現する動物を意味するものとして本明細書では用いられている。用語「組織特異的キメラ動物」は、組換えヒトＰＯＳＨ遺伝子が、いくつかの組織だけにおいて存在し及び/又は発現していることを示す。
【００７６】
本明細書において用いられている「導入遺伝子」は、（例えば、ヒトＰＯＳＨポリペプチドをコードする）核酸配列を意味し、それは、部分的もしくは全体的に異種、すなわち、それが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞と異なる、又は、それが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞の内在遺伝子と同種であるが、該動物のゲノムに、それが導入された細胞のゲノムを変えるように、導入されることが意図されている、もしくは導入される（例えば、それは、天然の遺伝子とは異なる位置において導入されている、又はその挿入の結果がノックアウトである）。導入遺伝子は、１以上の転写調節配列及び、選択された核酸の好適な発現に必要なイントロンのような他の任意の核酸を含むことができる。
【００７７】
よく知られているように、特定のポリペプチドの遺伝子は、単一又は多数のコピーにおいて、個体のゲノム内に存在することができる。そのような重複遺伝子は、同一であってもよく、又はヌクレオチド置換、付加又は欠失を含む特定の変形であってもよい。その全ては依然として、実質的に同じ活性を持つポリペプチドをコードする。
【００７８】
「ビリオン」は、完全なウイルス粒子；核酸及びカプシド（及びいくつかのウイルスの中の脂質エンベロープ）である。
【００７９】
【表１】
2005519636.tif 000002
アミノ酸のクラスの短縮形は、
http://smart.embl-heidelberg.de/SMART_DATA/alignments/consensus/grouping.html.から採用した。
【００８０】
２．概説
いくつかの局面において、本発明は、新規なヒトＰＯＳＨ核酸及び蛋白質、ならびに関連する方法及び組成物に関する。いくつかの局面において、本発明は、いくつかの疾患の状態とＰＯＳＨ核酸及び蛋白質との間の新規な関連性に関する。ＰＯＳＨは、ＰＯＳＨポリペプチドのレベル及び/又は活性に影響を及ぼすことによって操作されうる広範な重要な細胞機能と相互作用し、及びそれを調節する。いくつかの局面において、ヒトＰＯＳＨ遺伝子を同定することによって、本発明は、ＰＯＳＨ遺伝子の欠損と関連する疾患を同定するための方法及びそのような疾患を回復するための方法を提供する。さらに別の局面において、本発明は、核酸物質（例えば、ＲＮＡｉプローブ、アンチセンス）、抗体関連物質、小分子及び他のＰＯＳＨ機能に影響を及ぼす物質を提供する。さらに別の局面において、本発明は、ＰＯＳＨ機能及びＰＯＳＨと関連する及び/又はＰＯＳＨ介在プロセスに関与する蛋白質の機能に影響を及ぼす物質を同定するための方法を提供する。他の局面及び態様を以下に記載する。
【００８１】
いくつかの局面において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチドがユビキチン系において、Ｅ３酵素として機能することの発見に関する。したがって、ＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性のダウンレギュレーション又はアップレギュレーションを使用して蛋白質ユビキチン化によって影響を受ける生物学的プロセスを操作することができる。ダウンレギュレーション又はアップレギュレーションは、ＰＯＳＨ形成及び転写調節、翻訳調節又は翻訳後調節を含む、調節のあらゆる段階において達成することができる。例えば、ＰＯＳＨ転写レベルは、ＰＯＳＨ遺伝子配列を標的としたＲＮＡｉによって減少することもある。別の例としては、ＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性は、ＰＯＳＨをＰＯＳＨ ＲＩＮＧドメインもしくは標的蛋白質（ＰＯＳＨ活性によって少なくとも部分的にユビキチン化された蛋白質）との相互作用を媒介するＰＯＳＨのドメインに結合して干渉する抗体に接触させることによって阻害することができる。別の例として、ＰＯＳＨもしくはその活性部分の発現を増加させることによってＰＯＳＨ活性を高めることができる。ＰＯＳＨのようなユビキチンリガーゼは、、ウイルスの細胞への浸入、ウイルス蛋白質の作製、ウイルス蛋白質の構築及び細胞からのウイルス粒子に放出などの、例えば、ウイルス生命の１以上の種々の段階を含む生物学的プロセスに関与することもある。ＰＯＳＨは、例えば、痴呆（例えば、アルツハイマー病やピック病）、封入体筋炎、及びミオパシー、ポリグルコサン体ミオパシーならびにいくつかの形態の筋萎縮性側索硬化症などの、ユビキチン化された蛋白質の蓄積によって特徴付けられる疾患に関与することもある。ＰＯＳＨは、過剰又は不適切なユビキチン活性及び/又は蛋白質分解によって特徴付けられる疾患に関与することもある。さらに、ＰＯＳＨは、細胞分解制御系の不全、細胞死の調節系の不全、及び機能亢進性の膜結合成長因子受容体などの機能亢進性の発癌遺伝子のダウンレギュレーション不全を含む腫瘍学的プロセスに関与することもある。いくつかのＰＯＳＨポリペプチドをユビキチンリガーゼとして同定することによって、本発明の局面は、当該技術分野の当業者が改変されたＰＯＳＨユビキチンリガーゼ活性と関連する疾患を同定することを可能とする。
【００８２】
いくつかの局面において、本発明は、特定のＰＯＳＨポリペプチドが、ウイルス粒子中での蛋白質の作製、転写後プロセス、構築及び/又は放出を含むウイルス成熟に関与することの発見に関する。したがって、ウイルス感染は、ＰＯＳＨの活性（例えば、ユビキチンリガーゼ活性又は標的蛋白質の相互作用）を阻害することによって改善することができる。そして、好ましい態様において、該ウイルスは、レトロイドウイルス、ＲＮＡウイルス、ならびにＨＩＶ、Ebola、ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＴＬＶを含むエンベロープウイルスである。更なるウイルス種を以下により詳細に示す。いくつかの例において、ＰＯＳＨ機能の減少は、ウイルス粒子の放出中にＰＯＳＨを用いるウイルスに感染した細胞にとって致命的である。メカニズムに拘束されることを望むわけではないが、そのような細胞におけるＰＯＳＨ機能の喪失は、細胞中におけるウイルス粒子もしくはその部分の過剰蓄積を通して細胞死を導く。いくつかの態様において、例えば、ｓｉＲＮＡノックダウンによるＰＯＳＨ活性の阻害を用いて、感染された細胞、ほぼ潜伏しているウイルスさえ破壊することができる。なぜなら、そのような細胞は、結果として生じる、ウイルス粒子もしくはその部分の過剰蓄積によって死ぬからである。
【００８３】
いくつかの局面において、本発明は、ｈＰＯＳＨがRac、小GTPaseと相互作用することの発見に関連する。Rho、Rac及びCdc42は一緒に作用し、アクチン細胞骨格及びＪＮＫ ＭＡＰキナーゼ経路の組織化を調節する。マウスＰＯＳＨ（“ｍＰＯＳＨ”）の異所性発現は、ＪＮＫ経路を活性化し、ＮＦ-κＢの核局在化を起こす。線維芽細胞中のｍＰＯＳＨの過剰発現は、アポトーシスを刺激する（Taponら、（1998） EMBO J. 17:1395-404）。ショウジョウバエにおいて、ＰＯＳＨは、別のGTPase、Rasと相互作用するか、そうでなければ、そのシグナリングに影響を及ぼす（Schnorrら、（2001） Genetics 159: 609-22）。ＪＮＫ経路及びNF-κＢは、例えば、免疫反応、炎症、細胞増殖及びアポトーシスに関与する重要な種々の遺伝子を調節する。例えば、NF-κBは、インターロイキン１、インターロイキン８、腫瘍壊死因子及び多くの細胞接着分子の生成を調節する。NF-κBは、細胞中でアポトーシス促進性及び抗アポトーシス性の両方の役割を果たす（例えば、ＦＡＳ誘導性細胞死及びＴＮＦαシグナリングのそれぞれにおいて）。NF-κB は、インヒビター蛋白質IκBα 及びIκBβ（まとめて、「IκB」と称する）によって部分的にマイナス方向に調節される。IκBのリン酸化は、NF-κBの活性化及び核局在化を可能にする。IκBのリン酸化は、ユビキチン系によるその分解を引き起こす。したがって、さらに別の態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、ＪＮＫ経路を刺激する。さらに別の態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、NF-κBの核局在化を促進する。さらに別の態様において、ＰＯＳＨレベル及び/又は活性の操作を用いてアポトーシスを操作することもできる。ＰＯＳＨをアップレギュレーションすることによって、アポトーシスをいくつかの細胞において刺激することができる。これは、通常過剰細胞増殖によって特徴付けられる状態（いくつかの癌）において望ましい。ＰＯＳＨをダウンレギュレーションすることによって、アポトーシスは、いくつかの細胞において減少するかもしれない。そしてこれは通常、過剰な細胞死によって特徴付けられる状態、例えば、心筋梗塞、発作、筋肉及び神経の変性疾患、ならびに移植前の臓器の保存にとって望ましいであろう。更なる態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、クラスリン含有複合体もしくはコートマー含有複合体、及び、特に核及び/又はゴルジ体に局在化する輸送複合体などの小胞輸送複合体と関連する。
【００８４】
３．核酸の例及び発現ベクターの例
いくつかの局面において、本発明は、例えば、配列番号２、５、７、９、１１、２６、２７、２８、２９及び３０などの、ＰＯＳＨポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明の核酸は、更に配列番号１、３、４、６、８、１０、３１、３２、３３、３４及び３５のバリアントを含む核酸を含むと理解される。バリアントヌクレオチド配列は、対立遺伝子のバリアントのような１以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失によって、異なる配列を含む。したがって、例えば、遺伝子コードの縮重によって、配列番号１、３、４、６、８、１０、３１、３２、３３、３４及び３５に示されたコード配列のヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含むであろう。別の態様において、バリアントはまた、高ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、４、６、８、１０、３１、３２、３３、３４及び３５のいずれかに示されたコード配列のヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列をも含む。本発明の好ましい核酸は、例えば、配列番号１、３、４、６、３１、３２、３３、３４、３５及びそのバリアント、ならびに配列番号２、５、７、２６、２７、２８、２９及び３０から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を含むヒトＰＯＳＨ配列である。
【００８５】
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は変更され得ることは当該技術の当業者は容易に理解するであろう。例えば、６．０×塩酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃でハイブリダイゼーションし、続いて２．０×ＳＳＣで約５０℃で洗浄することができるであろう。例えば、洗浄ステップでの塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ、約５０℃の低ストリンジェンシーから、約０．２×ＳＳＣ、約５０℃の高ストリンジェンシーの中から選択することができる。さらに、洗浄ステップの温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件に上昇させることができる。温度及び塩濃度の両方を変更させてもよい。又は、他の変数を変化させながら、温度又は塩濃度を一定に保ってもよい。ある態様において、本発明は、６×ＳＳＣ、室温、続いて２×ＳＳＣ、室温で洗浄するという低ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸を提供する。
【００８６】
遺伝子コードの縮重によって、配列番号１、３、４、６、８、１０、３１、３２、３３、３４及び３５とは異なる、単離された核酸も本発明の範囲に含まれる。例えば、アミノ酸の数は、１より多くのトリプレットによって指定される。同じアミノ酸を規定するコドン、すなわちシノニム（同義コドン）（例えば、ＣＡＵとＣＡＣはヒスチジンにとって同義コドンである）も、蛋白質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を結果として生じさることがある。しかしながら、対象の蛋白質のアミノ酸配列に変化を導くＤＮＡ配列の遺伝子多型は、哺乳動物の細胞中に存在するであろう。当該技術の当業者は、天然の対立遺伝子の変形によって、特定の蛋白質をコードする核酸の１以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％まで）におけるこれらの変形が所定の種の個体中に存在するかもしれないということを理解するであろう。そのようなヌクレオチドのあらゆる変形及び得られたアミノ酸遺伝子多型は、本発明の範囲である。
【００８７】
任意に、本発明のＰＯＳＨ核酸は、細胞中の機能表現型のＰＯＳＨ喪失を、部分的もしくは完全に、遺伝子的に補完するであろう。例えば、本発明のＰＯＳＨ核酸は、内因性ＰＯＳＨがＲＮＡｉによって減少した細胞において発現することができる。また、導入されたＰＯＳＨ核酸は、ＲＮＡｉに由来する表現型を緩和するであろう。機能表現型のＰＯＳＨ喪失の例としては、ウイルスベクター、任意には、ＨＩＶベクターを用いてトランスフェクトされた細胞中のウイルス様粒子産生の減少がある。いくつかの態様において、ＰＯＳＨ核酸は、効果的なレベルで細胞中に発現すると、アポトーシスを誘導する。
【００８８】
本発明の別の局面は、アンチセンス、ＲＮＡｉ又はリボザイムに用いられるＰＯＳＨ核酸に関する。本明細書において用いられているところの、核酸治療とは、細胞条件下で対象となるＰＯＳＨポリペプチドの１つをコードする細胞ｍＲＮＡ及び/又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする（例えば、結合する）核酸もしくはその誘導体を、投与又はｉｎ  ｓｉｔｕ発生させ、例えば、転写及び/又は翻訳を阻害することによって蛋白質の産生を阻害することを意味する。該結合は、通常の塩基対相補性、又は例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合する場合は、二重螺旋の主溝における特異的な相互作用によるものであるかもしれない。
【００８９】
本発明の核酸治療の構成物は、例えば、細胞内で転写される場合、ＰＯＳＨポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも１つの特有の部分に相補的なＲＮＡを作製する発現プラスミドとして送達することができる。あるいは、該構成物は、ex vivoで生成され、細胞中に導入されたとき、ＰＯＳＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及び/又はゲノム配列をハイブリダイズすることによって発現を阻害するオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、任意に改変されたオリゴヌクレオチドであり、それは、内在性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼに対して抵抗性があり、したがってインビボで安定している。アンチセンスオリゴヌクレオチドに用いる核酸分子の例は、ＤＮＡのホスホラミデート（phosphoramidate）、ホスホチオエート及びメチルホスホネート類似物である（米国特許第5,176,996号；第5,264,564号および第5,256,775号参照）。さらに、核酸治療に有用なオリゴマーを構築するための通常のアプローチを、例えば、van der Krolら、（1988） Biotechniques 6:958-976及びSteinら、（1988） Cancer Res 48:2659-2668.によって検討した。 
【００９０】
したがって、本発明の改変されたオリゴマーは、治療的、診断的及び研究的意味において有用である。治療的用途において、該オリゴマーは、核酸治療に一般的に適する方法で利用される。
【００９１】
治療における利用に加えて、本発明のオリゴマーは、それらが特異的に結合する、ＰＯＳＨ  ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の存在もしくは不存在を検出するため、例えば、本発明の遺伝子の発現のレベルを決定するため、もしくは本発明の遺伝子が遺伝的病変を含むかどうかを検出するための診断的試薬として使用することもできる。
【００９２】
本発明の別の局面において、対象となる核酸は、対象となるＰＯＳＨポリペプチドをコードする配列を含み、少なくとも１つの調節配列に作動可能に結合した発現ベクターにおいて提供される。調節配列は、当該技術分野において認識されており、ＰＯＳＨポリペプチドの発現を導くために選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメントを含む。調節配列の例は、Goeddel; Gene Expression Technology:  Methods in Enzymology、 Academic Press、San Diego、CA （1990）に記載されている。例えば、作動可能に結合されたとき、ＤＮＡ配列の発現を制御する、広範な発現制御配列のいずれも、ＰＯＳＨポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現するためのこれらのベクターに用いることができる。そのような有用な発現制御配列は、例えば、SV40の初期及び後期のプロモーター、tetプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、lac 系、trp 系、ＴＡＣもしくはＴＲＣ系、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が導かれるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要なオペレータ及びプロモーター領域、fdコート蛋白質の制御領域、３-ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のためのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、Pho5、酵母α接合型因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、及び原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られているその他の配列、ならびにそれらの種々の組み合わせを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び/又は発現されることが望ましい蛋白質の種類の選択といった因子に依存するかもしれないことを理解する必要がある。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数と、該ベクターによって他のあらゆる蛋白質、例えば、抗菌マーカーを制御する能力も考慮する必要がある。 
【００９３】
明らかなように、対象となる遺伝子コンストラクトは、培養物中に繁殖した細胞中で対象となるＰＯＳＨポリペプチドの発現を引き起こすために、精製のため、例えば、融合蛋白質又はポリペプチドを含む蛋白質又はポリペプチドを作製するために用いることができる。 
【００９４】
本発明は、１以上の対象となるＰＯＳＨポリペプチドのコード配列を含む、組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞のいずれでもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母又は哺乳動物細胞において発現させることもできる。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００９５】
したがって、本発明は、さらに対象となるポリペプチドを作成する方法に関する。例えば、ＰＯＳＨポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、適切な条件下で培養され、ポリペプチドの発現を起こすことができる。ポリペプチドは、ポリペプチドを含有する細胞混合物及び培地から分泌し、単離してもよい。あるいは、該ポリペプチドは、細胞質内に保留してもよい。そして、細胞を回収し、溶菌し、蛋白質を単離することができる。細胞培養液は、宿主細胞、培地及び他の副産物を含む。細胞培養のための好適な培地は、当該技術において公知である。ポリペプチドは、細胞培養液、宿主細胞又はその両方から、イオン変換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動法、及びポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いた免疫親和性生成を含む蛋白質を精製するための技術において公知の技術を用いて単離することができる。好ましい態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する、ＰＯＳＨ−ＧＳＴ融合蛋白質、ＰＯＳＨ-インテイン融合蛋白質、ＰＯＳH-セルロース結合ドメイン蛋白質、ＰＯＳＨ-ポリヒスチジン融合蛋白質などの融合蛋白質である。
【００９６】
ＰＯＳＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、微生物又は真核細胞プロセスを介して、組換え形態の蛋白質を作製するのに用いることができる。ポリヌクレオチド配列を、発現ベクターのような遺伝子コンストラクトに連結し、宿主、真核生物（酵母、鳥類、昆虫もしくは哺乳類）の細胞又は原核生物（細菌）の細胞に形質転換もしくはトランスフェクトすることは、標準的な手順である。
【００９７】
組換えＰＯＳＨ核酸は、クローニングされた遺伝子又はその一部を、原核細胞、真核細胞又はその両方において発現させるのに好適なベクターに連結することによって作製することができる。組換えＰＯＳＨポリペプチドの発現媒介物は、プラスミド及び他のベクターを含む。例えば、ＰＯＳＨポリペプチドの発現のための好適なベクターは、E. coli.のような原核細胞における発現のためのpBR322-由来のプラスミド、pEMBL-由来のプラスミド、pEX-由来のプラスミド、pBTac-由来のプラスミド及びpUC-由来のプラスミドといった種類のプラスミドを含む。
【００９８】
酵母中、組換え蛋白質の発現のために、多くのベクターが存在する。例えば、YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、及びYRP17をクローニングし、そして発現媒介物は遺伝子コンストラクトをS. cerevisiae （例えば、Broachら、（1983）、Experimental Manipulation of Gene Expression、ed. M. Inouye Academic Press、 p. 83、引用によって本明細書に援用）に導入するのに有用である。これらのベクターは、pBR322 oriの存在により、 E. coli 中で複製することができ、酵母２ミクロンプラスミドの複製決定基によってS. cerevisiae で複製することができる。さらにアンピシリンのような薬物耐性マーカーを用いることができる。
【００９９】
好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核細胞中で発現する１以上の真核転写ユニットとの双方を含む。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo及びpHyg由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、複製及び、原核細胞及び真核細胞の両方における薬物耐性の選択を促進するために、pBR322のような細菌プラスミドからの配列を用いて改質される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、又はエプスタイン・バーウイルス（pHEBo、 pREP-由来及びp205）などのウイルスの誘導体を真核細胞の蛋白質の一過性の発現のために用いることができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）の発現系の例は、下記の遺伝子治療送達系において見出すことができる。プラスミド及び宿主生物の形質転換の調製に採用される種々の方法は、当該技術において公知である。他の原核細胞及び真核細胞の双方ならびに一般的な組換え操作のための好適な発現系としては、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第２版、Sambrook編、Fritsch及びManiatis （Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989）、16、17章を参照されたい。いくつかの例において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えＰＯＳＨポリペプチドを発現させることが望ましいかもしれない。そのようなバキュロウイルス発現系の例には、pVL-由来ベクター（例えば、pVL1392、pVL1393及びpVL941）、pAcUW-由来ベクター（例えば、pAcUW1）、及びpBlueBac-由来ベクター（例えば、β-gal含有pBlueBac III）が含まれる。
【０１００】
Ｎ末端位のメチオニンは、酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を用いて酵素的に切断されることは当該技術において公知である。ＭＡＰをE. coli （Ben-Bassatら、（1987） J. Bacteriol. 169:751-757）及びネズミチフス菌からクローニングし、そのインビトロ活性を組換え蛋白質において実証した（Millerら、（1987） PNAS USA 84:2718-1722）。したがって、望ましければ、Ｎ末端メチオニンを、そのような組換えポリペプチドをＭＡＰを作製する宿主（例えば、E. coli もしくはCM89もしくはS.  S.  cerevisi）において発現させることによってインビボで、又は生成されたＭＡＰを用いてインビトロで（例えば、Millerらの処置）で達成することができる。
【０１０１】
あるいは、ポリペプチドのコード配列を、異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として組み込むことができる。この種の発現系は、例えば、ＰＯＳＨポリペプチドの免疫原性のフラグメントを作製することが望ましい条件下で有用とすることができる。例えば、ロタウイルスのＶＰ6カプシド蛋白質を、単一形態もしくはウイルス粒子の形態のいずれかで、ポリペプチド部分の免疫性の担体蛋白質として用いることができる。抗体が対するＰＯＳＨポリペプチドの部分に対応する核酸配列は、ワクシニアウイルス構造蛋白質のコード配列を含む融合遺伝子コンストラクトに組み込まれ、蛋白質の一部をビリオンの一部として含む融合蛋白質を発現する１セットの組換えウイルスを作製することができる。Ｂ型肝炎表面抗原も同様にこの役割に用いることができる。同様に、ＰＯＳＨポリペプチド及びポリオウイルスカプシド蛋白質の一部を含有する融合蛋白質をコードするキメラコンストラクト産生を高めることができる（例えば、欧州特許出願公開第0259149号; Evansら、 （1989） Nature 339:385; Huangら、（1988） J. Virol. 62:3855;及びSchliengerら、（1992） J. Virol. 66:2）。
【０１０２】
ペプチドベースの免疫化のための多数抗原ペプチド（Multiple Antigen Peptide）系を用いることができ、そこでは、ＰＯＳＨポリペプチドの望ましい部分が、オリゴマー分枝リジンコア上のペプチドの有機化学合成で直接的に得られる（例えば、Posnettら、（1988） JBC 263:1719及びNardelliら、（1992） J. Immunol. 148:914）。ＰＯＳＨポリペプチドの抗原決定基はまた、細菌細胞によって発現及び提示することができる。
【０１０３】
別の態様において、組換え蛋白質の望ましい部分のＮ末端におけるポリ-（ヒス）／エンテロキナーゼ切断部位配列のような精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、発現された融合蛋白質をＮｉ２＋金属樹脂を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製することを可能とする。精製リーダー配列をその後、引き続きエンテロキナーゼを用いた処理によって除去し、精製されたＰＯＳＨポリペプチドを作成することができる（例えば、Hochuli ら、（1987） J. Chromatography 411:177; 及びJanknechtら、PNAS USA 88:8972）。
【０１０４】
融合遺伝子を作製する技術は公知である。本質的には、様々なポリペプチドをコードする種々のＤＮＡフラグメントの結合が平滑末端と粘着末端の連結、適切な末端を提供するための制限酵素による消化、適切であれば付着末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的連結を用いる常法により行われる。別の態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡシンセサイザーを含む、常法により合成することができる。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子フラグメントの間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて行うことができ、それによって、続いてアニーリングされ、キメラ遺伝子配列が生成される（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、eds. Ausubelら、John Wiley & Sons: 1992参照）。
【０１０５】
【表２】
2005519636.tif 000003
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
さらに、下記の表は、核酸配列及び関連するヒトＰＯＳＨ蛋白質のドメインの配列番号及び本願において用いられる配列同定番号の要約を示す。
【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
４．ポリペプチドの例
本発明はまた、単離された及び/又は精製された形態の、蛋白質もしくは、その蛋白質を含む特定の複合体と通常関連するかもしれない他の細胞内蛋白質から単離された、又はそうでなければ、それを含まない、対象のＰＯＳＨポリペプチドを提供する。いくつか態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、配列番号２、５、７、９、１１、２６、２７、２８、２９及び３０にいずれかに示されたアミノ酸配列に少なくとも６０％一致するアミノ酸配列を有する。別の態様において、ポリペプチドは、配列番号２、５、７、９、１１、２６、２７、２８、２９及び３０にいずれかに示されたアミノ酸に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％一致するアミノ酸配列を持つ。 
【０１１１】
任意に、本発明のＰＯＳＨポリペプチドは、例えば、部分的もしくは完全に機能表現型のＰＯＳＨ喪失を軽減することによって、内因性ＰＯＳＨポリペプチドの代わりの機能を果たすであろう。例えば、本発明のＰＯＳＨポリペプチドは、内因性ＰＯＳＨポリペプチドがＲＮＡｉによって減少した細胞において、産生されることもある。また、導入されたＰＯＳＨポリペプチドは、ＲＮＡｉから得られた表現型を軽減するであろう。機能表現型のＰＯＳＨ喪失の例は、ウイルス性のベクター、任意にＨＩＶベクターによってトランスフェクトされた細胞中のウイルス様粒子産生の減少である。いくつかの態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、細胞中で効果的なレベルで産生されたとき、アポトーシスを誘導する。
【０１１２】
いくつかの態様において、本発明のＰＯＳＨポリペプチドは、１以上のＳＨ３ドメインを介して、ウイルス性のＧａｇ蛋白質と相互作用する。更なる態様において、ＰＯＳＨポリペプチドはまた、選択的に、ＲＩＮＧドメインの活性を介して部分的にユビキチン化において機能を果たすこともある。
【０１１３】
別の局面において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストであるポリペプチドを提供する。ＰＯＳＨポリペプチドの変種及びフラグメントは、機能亢進性又は構成的な活性をもつか、又は一方、ＰＯＳＨポリペプチドが１以上の機能を行うのを阻害する。例えば、１以上のドメインを欠く切断型は、ドミナントネガティブ効果を持つこともある。
【０１１４】
本発明の別の局面は、全長ＰＯＳＨポリペプチドに由来するポリペプチドに関する。対象となる蛋白質の単離されたペプチジル部分は、ポリペプチドをコードする核酸の対応するフラグメントから組換え的に作製されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、フラグメントは、従来のMerrifield solid phase f-Moc or t-Boc chemistryのような、当該技術において公知の技法を用いて化学的に合成することができる。例えば、対象となる蛋白質のいずれか１つを所望の長さの任意にフラグメントに、フラグメントのオーバーラップなく、分割することができる。該フラグメントは、（組換えによって、又は化学的合成によって）作製することができ、特異的な蛋白質複合体又はより一般的にはＰＯＳＨ複合体のアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとして機能することができるペプチジルフラグメントを同定するために、例えば、マイクロインジェクションアッセイによって、試験することができる。
【０１１５】
治療的又は予防的効果、又は安定性（例えば、生体外での有効期間及びインビボでの蛋白質分解に対する耐性）を高める目的などのために対象となるＰＯＳＨポリペプチドの構造を改変することが可能である。蛋白質の天然に存在する形態の、少なくとも１つの活性を維持するように設計されたとき、そのような改変されたポリペプチドは、本明細書においてより詳細に記載されているＰＯＳＨポリペプチドと機能的に等価であると考えられる。そのような改変されたポリペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失、又は付加によって作製することができる。
【０１１６】
例えば、ロイシンとイソロイシンもしくはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、トレオニンとセリンとの単離された置換、又は、アミノ酸と構造的に関連するアミノ酸（例えば、保存的突然変異）との類似の置換は、得られた分子の生物学的活性に大きな影響を及ぼさないであろう。保存的置換とは、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は、４つのファミリーに分類することができる。すなわち、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアミン、メチオニン、トリプトファン;及び（４）無電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、ときに芳香族アミノ酸として合わせて分類される。同様に、アミノ酸のレパートリーは、下記のように分類される。すなわち、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、尚、セリン及びトレオニンは、任意に個別に、脂肪族−ヒドロキシルとして分類される；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；及び（６）硫黄含有＝システイン及びメチオニン（例えば、Biochemistry、第２版、L. Stryer編、W.H. Freeman and Co.、1981参照）。ポリペプチドのアミノ酸配列の変化によって、機能的相同体が得られたかどうかは、バリアントのポリペプチドが細胞内において野生型の蛋白質と類似の反応を起こすことができる能力を評価することによって測定することができる。例えば、ＰＯＳＨポリペプチドのそのようなバリアントは、例えば、それらが別のポリペプチド、例えば、別のＰＯＳＨポリペプチド又はウイルスの成熟に関与する別の蛋白質と結合する能力について、評価される。複数の置換が生じるポリペプチドは、同様の方法で容易に試験することができる。
【０１１７】
本発明はさらに、対象となるＰＯＳＨポリペプチド複数のコンビナトリアル突然変異体、ならびに切断突然変異体を生成する方法を意図する。そしてそれは、特に潜在的なバリアントの配列（例えば、ホモログ）を同定するために特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストもしくはアンタゴニストとして機能することができ、又は一方、新規な活性を全て一緒に処理するＰＯＳＨホモログを生成することである。コンビナトリアル由来のホモログは、天然に存在するＰＯＳＨポリペプチドに対して相対的な選択的特性を持つように生成することができる。そのような蛋白質は、組換えＤＮＡコンストラクトから発現したとき、遺伝子治療プロトコルに用いることができる。
【０１１８】
同様に、変異原性は、対応する野生型蛋白質と比べて細胞内半減期が大幅に異なるホモログを発生させることができる。例えば、改変された蛋白質は、対象のＰＯＳＨポリペプチドの破壊、又はそうでなければ不活性化をもたらす蛋白質分解又は細胞プロセスに対してより安定な、又はあまり安定でなくすることができる。そのようなホモログ及びそれらをコードする遺伝子は、蛋白質の半減期を調節することによって、ＰＯＳＨレベルを改変するために用いることができる。例えば、短い半減期は、誘導性の発現系が細胞内で組換えＰＯＳＨレベルの制御をより緊密にすることができるとき、より一過性の生物学的効果を発生させることができる。上記のように、そのような蛋白質及び特にそれらの組換え核酸コンストラクトは、遺伝子治療プロトコルにおいて用いることができる。
【０１１９】
同様に、ＰＯＳＨホモログは、現在のコンビナトリアルアプローチによって、それらが対応する野生型蛋白質が機能することができる能力と干渉することができるように、アンタゴニストとして機能するように生成されることができる。
【０１２０】
この方法の代表的な態様において、ＰＯＳＨホモログの集団のためのアミノ酸配列を並べる、好ましくは、相同性を可能な限り高くするように並べる。そのようなバリアントの集団は、例えば、１以上の種からのホモログ、又は同じ種であるが突然変異によって異なっているホモログを含むことができる。並べられた配列の各位置に現れるアミノ酸を選択して、コンビナトリアル配列の縮重セットを生成することができる。好ましい態様において、コンビナトリアルライブラリーは、それぞれ潜在的ＰＯＳＨ配列の少なくとも１部を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって作製される。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、潜在的なＰＯＳＨヌクレオチド配列の縮重セットが個別のポリペプチドとして、又はより大きな融合蛋白質として（例えば、ファージディスプレイのために）発現しうるように遺伝子配列に酵素的に連結されることができる。
【０１２１】
潜在的ホモログのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチドから生成することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡシンセサイザーによって行い、次にその合成遺伝子を適切な発現のための遺伝子に連結する。遺伝子の縮重セットの目的は、１混合物において、潜在的ＰＯＳＨは配列の所望のセットをコードする全ての配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術において公知である（例えば、Narang、SA （1983） Tetrahedron 39:3; Itakuraら（1981） Recombinant DNA、Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules、 ed. AG Walton、Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakuraら、（1984） Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraら、（1984） Science 198:1056; Ike ら、（1983） Necleic Acid Res. 11:477参照）。そのような技術は、他の蛋白質の指示された進化において用いられてきた（例えば、Scottら、（1990） Science 249:386-390；Robertsら、（1992） PNAS USA 89:2429-2433；Devlinら、（1990） Science 249: 404-406; Cwirlaら、（1990） PNAS USA 87: 6378-6382；ならびに米国特許第5,223,409号、第5,198,346号、及び第5,096,815号）。
【０１２２】
一方、他の形態の突然変異誘発を、コンビナトリアルライブラリーを生成するために用いることができる。例えば、ＰＯＳＨホモログ（アゴニスト及びアンタゴニストの双方）は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発などを用いたスクリーニング（Rufら、（1994） Biochemistry 33:1565-1572；Wangら、（1994） J. Biol. Chem. 269:3095-3099；Balintら、（1993） Gene 137:109-118；Grodbergら、（1993） Eur. J. Biochem. 218:597-601；Nagashima ら、（1993） J. Biol. Chem. 268:2888-2892ら；Lowmanら（1991） Biochemistry 30:10832-10838；及びCunninghamら（1989） Science 244:1081-1085）、リンカースキャニング突然変異誘発 （Gustinら、（1993） Virology 193:653-660; Brownら、（1992） Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnightら、（1982） Science 232:316）；飽和突然変異誘発 （Meyersら、（1986） Science 232:613）；ＰＣＲ突然変異誘発（Leungら、（1989） Method Cell Mol Biol 1:11-19）；又は、化学的突然変異誘発などを含むランダム突然変異誘発、 （Millerら、 （1992） A Short Course in Bacterial Genetics、CSHL Press、 Cold Spring Harbor、 NY;及びGreenerら、（1994） Strategies in Mol Biol 7:32-34）によって単離することができる。特にコンビナトリアル設定における、リンカースキャニング突然変異誘発は、切断型（生理活性）形態のＰＯＳＨポリペプチドを同定するための魅力的な方法である。
【０１２３】
点突然変異及びトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする技術、及び、そのために特定の特性を持つ遺伝子産物のｃＤＮＡをスクリーニングする技術において様々な技法が公知である。そのような技法は、通常、ＰＯＳＨホモログのコンビナトリアル突然変位誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広範に用いられている技術は、典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクターにクローニングすること、得られたベクターのライブラリーを持つ適切な細胞を形質転換すること、及び望ましい活性の検出によって、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現することを含む。下に示す例示的なアッセイのそれぞれは、コンビナトリアル突然変位誘発の技法によって生成された多数の縮重した配列をハイスループット解析に適している。
【０１２４】
スクリーニングアッセイの例示的な態様において、対象となる蛋白質の候補コンビナトリアル遺伝子産物を細胞又はウイルスの表面に表示し、特定の細胞又はウイルス粒子がＰＯＳＨポリペプチドと結合する能力を「パニングアッセイ」において検出する。例えば、ＰＯＳＨバリアント変種のライブラリーを細菌細胞の表面膜蛋白質の遺伝子にクローニングすることができる（Ladnerら、 WO 88/06630; Fuchsら、（1991） Bio/Technology 9:1370-1371：及びGowardら、（1992） TIBS 18:136-140）、例えば、ＰＯＳＨポリペプチドに結合する、潜在的に機能的な相同体に刻み目を入れるためにＰＯＳＨポリペプチド蛍光標識された核を用いたパニングによって検出された、得られた融合蛋白質にクローニングする。細胞を目視検査し、蛍光顕微鏡で分離することができる。又は、細胞の形態学から可能であれば、蛍光活性細胞ソーターで分離することができる。
【０１２５】
類似の方法で、遺伝子ライブラリーを融合蛋白質として、ウイルス粒子の表面上で発現させることができる。例えば、繊維状ファージ系において、外来ペプチド配列を感染ファージの表面上で発現させ、それによって２つの重要な利益を付与することができる。第１に、これらのファージは、アフィニティマトリックスに非常に高濃度で適用することができるので、多数のファージを一度にスクリーニングすることができる。第２に、それぞれの感染ファージは、コンビナトリアル遺伝子産物をその表面に表示することができるので、もし特定のファージが、アフィニティマトリックスから低い収率で収集されれば、そのファージは、別の回の感染によって増幅することができる。ほぼ同一のE. coli 繊維状ファージである、M13、fd及びf1は、ファージディスプレイライブラリーに非常に頻繁に用いることができる。ファージ gIII又はファージgVIIIコート蛋白質は、ウイルス粒子の究極的なパッキングを破壊することなく、融合蛋白質を生成するのに使用することができる（Ladnerら、ＰＣＴ国際公開WO 90/02909号; Garrardら、ＰＣＴ国際公開WO 92/09690号; Marksら、（1992） J. Biol. Chem. 267:16007-16010; Griffithsら、（1993） EMBO J. 12:725-734; Clacksonら、（1991） Nature 352:624-628; 及びBarbasら、（1992）PNAS USA 89:4457-4461）。
【０１２６】
本発明はまた、対象となるＰＯＳＨポリペプチドを減少させ、ミメティクス、例えば、標品蛋白質と別の細胞パートナーとの結合を模倣することができるペプチド又は非ペプチド作用物質を生成する。そのような上記の突然変異誘発技法ならびにチオレドキシン系もまた、例えば、ウイルスの成熟に関与する蛋白質の互いに対する結合に関与する蛋白質−蛋白質相互作用に関与するＰＯＳＨポリペプチドの決定因子をマッピングする上で特に有用である。例えば、基質タンパク質の分子認識に関与するＰＯＳＨポリペプチドの重要な残基を決定し、基質蛋白質に結合し、また、ＰＯＳＨ結合を阻害することによって、その生物学的活性を阻害するために機能する、ＰＯＳＨポリペプチド由来のペプチドミメティクスを生成するために用いることができる。例えば、別のポリペプチドとの結合に関与するＰＯＳＨポリペプチドのアミノ酸残基をマッピングするための、スキャニング突然変異誘発を採用することによって、ペプチドミメティクス化合物を生成することができ、それは、結合に関与するそれらの残基に類似している。例えば、そのような残基の非加水分解可能なペプチドアナログは、ベンゾジアゼピン （例えば、Freidingerら、in Peptides: Chemistry and Biology、 G.R. Marshall ed.、 ESCOM Publisher: Leiden、 Netherlands、 1988参照）、アゼピン（例えば、Huffmanら、in Peptides: Chemistry and Biology、 G.R. Marshall ed.、 ESCOM Publisher: Leiden、 Netherlands、 1988）、置換されたγラクタム環（Garveyら、in Peptides: Chemistry and Biology、G.R. Marshall ed.、 ESCOM Publisher: Leiden、 Netherlands、 1988）、ケトメチレンシュードペプチド（Ewensonら、 （1986） J. Med. Chem. 29:295; 及びEwensonら、in Peptides: Structure and Function （Proceedings of the 9th American Peptide Symposium） Pierce Chemical Co. Rockland、 IL、 1985）、ｂ−回転ジペプチドコア（b-turn dipeptide cores）（Nagaiら、（1985） Tetrahedron Lett 26:647; 及びSatoら、（1986） J Chem Soc Perkin Trans 1:1231）、及びb-アミノアルコール（Gordonら、（1985） Biochem Biophys Res Commun 126:419及びDannら、 （1986） Biochem Biophys Res Commun 134:71） を用いて生成することができる。
【０１２７】
以下の表は、ＲＩＮＧドメイン及び種々のＳＨ３ドメインの配列を示す。
【０１２８】
【表６】
2005519636.tif 000007
【０１２９】
５．抗体及びその使用
本発明の別の局面は、ＰＯＳＨポリペプチドと特異的に反応する抗体に関する。例えば、ＰＯＳＨポリペプチド由来の免疫原を用いることによって（例えば、ｃＤＮＡ配列に基づく）、抗蛋白質／抗ペプチド血清又はモノクローナル抗体を標準的なプロトコルによって作製することができる（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual、Harlow及びLane編 （Cold Spring Harbor Press: 1988））。マウス、ハムスター又はウサギのような哺乳動物に対して免疫原の形態のペプチド（例えば、ＰＯＳＨポリペプチド又は抗体反応を引き出すことが可能な抗原フラグメント、又は上記の融合たんぱく質）を免疫することができる。蛋白質又はペプチドの免疫原性を付与するための技法としては、担体との接合、又は、当該技術において公知の他の技法が含まれる。ＰＯＳＨポリペプチドの免疫原性の部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体価を検出することによってモニターすることができる。免疫原を抗体のレベルを推定するための抗原として用いた、標準的なELISAや他のイムノアッセイを用いることができる。好ましい態様において、対象となる抗体は、哺乳動物のＰＯＳＨポリペプチドの抗原決定基、例えば、配列番号２に示された蛋白質の抗原決定基に対して免疫特異的である。
【０１３０】
ある態様において、抗体は、ＲＩＮＧドメイン又はＳＨ３ドメインに対して特異的であり、また、該ドメインは、ＰＯＳＨポリペプチドの一部であることが好ましい。より具体的な態様において、該ドメインは、配列番号２に示されたアミン酸配列の一部である。一連の典型的な態様において、抗体は、配列番号２のアミノ酸１３７〜１９２、配列番号２のアミノ酸１９９〜２５８、配列番号２のアミノ酸４４８〜５０５及び/又は配列番号２のアミノ酸８３２〜８８８によって表された１以上のＳＨ３ドメインと結合する。別の態様例において、抗体は、配列番号２のアミノ酸１２〜５２によって示されるＲＩＮＧドメインに結合する。別の態様において、抗体は、配列番号２に示されたアミノ酸配列に少なくとも８０％一致するアミノ酸配列を有する１以上の蛋白質と免疫反応する。他の態様において、抗体は、配列番号２に示されているアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は一致するアミノ酸配列を持つ１以上の蛋白質と免疫反応する。
【０１３１】
動物に対して、ＰＯＳＨポリペプチドの抗原製剤を免疫した後、抗ＰＯＳＨ抗血清を得ることができる。また、望ましければ、ポリクローナル抗ＰＯＳＨ抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を作製するために、抗体産生細胞（リンパ球）を、免疫された動物から回収し、ミエローマ細胞のような細胞を不死化してハイブリドーマ細胞を産出することを含む、標準的な体細胞融合処置によって融合することができる。そのような技法は、当該技術において公知であり、技術の例としては、例えば、ハイブリドーマ技法（Kohler及びMilsteinによって初めて開発された。（1975） Nature、 256: 495-497）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbarら、（1983） Immunology Today、 4: 72）、及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Coleら、（1985） Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、 Alan R. Liss、 Inc. pp. 77-96）があげられる。ハイブリドーマ細胞は、本発明の哺乳動物ＰＯＳＨポリペプチドと特異的に反応する抗体を作製するために免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体は、そのようなハイブリドーマ細胞を含む培養液から単離することができる。ある態様において、抗ヒトＰＯＳＨ抗体は、配列番号２の核酸によってコードされる蛋白質と特異的に反応する。
【０１３２】
本明細書で用いられる、抗体という語は、対象のＰＯＳＨポリペプチドの１つと特異的に反応するそのフラグメント（断片）を含むことが意図されている。抗体は、常法を用いて断片化することができ、そのフラグメント（断片）は、全体としての抗体について上記したのと同様の方法で使用するためにスクリーニングされる。例えば、F（ab）2 フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。得られたF（ab）2 フラグメントを処理して、ジスルフィドブリッジを還元し、Fab フラグメントを作製することができる。本発明の抗体はさらに、二重特異性、一本鎖、ならびに、該抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与されたＰＯＳＨポリペプチドに対するアフィニティをもつキメラ及びヒト化分子を含むことが意図されている。好ましい抗体の態様において、抗体はさらに、貼り付け、そして剥がすことのできる標識を含む（例えば、その標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素又は酵素コファクターとすることができる）。
【０１３３】
抗ＰＯＳＨ抗体は、例えば、個体におけるＰＯＳＨポリペプチドレベル、特に、患者がＲＮＡウイルス、レトロイドウイルス及びエンベロープウイルスなどのウイルスに感染しているかどうかを決定するため、又はそのような障害に罹患した個体のための所与の治療計画の効率の決定を可能とするために、原形質膜におけるＰＯＳＨの存在をモニターするために使用することができる。さらに、ＰＯＳＨポリペプチドは、場合によっては、放出されたウイルス粒子に局在化されることが期待される。ウイルス粒子は、ＰＯＳＨポリペプチドの存在を調べるために、収集され、アッセイすることができる。ＰＯＳＨポリペプチドのレベルは、例えば、細胞などの種々のサンプル中、及び/又は血液サンプルのような体液中において測定することもできる。
【０１３４】
本発明の抗ＰＯＳＨ抗体の別の用途は、gt11、gt18-23、ZAP及びORF8などの発現ベクター中に構築されたｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニングである。正しい読み取り枠及び方向で挿入されたコード配列を有するこの種のメッセンジャーライブラリは、融合蛋白質を産生することができる。例えば、gt11は、そのアミノ末端がβガラクトシダーゼアミノ酸配列からなり、そしてそのカルボキシ末端が外来ポリペプチドからなる融合蛋白質を産生する。ＰＯＳＨポリペプチドの抗原性のエピトープ、例えば、特定の蛋白質の他のオルソログ又は同じ種からの他のパラログを次に、例えば、反応感染したプレートからリフトされたニトロセルロースフィルタと適切な抗ＰＯＳＨ抗体とを反応させながら、抗体を用いて検出することができる。このアッセイによって検出された陽性ファージを、感染したプレートから単離することができる。したがって、ＰＯＳＨホモログの存在を検出することができ、ヒトからのアイソフォーム（スプライスバリアントを含む）を改変することができるように、他の動物からクローニングすることができる。
【０１３５】
６．ヌクレオチド及びポリペプチド配列の相同性の検索
本発明のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、GenBank、SwissProt、BLOCKS及びPima IIなどのデータベースに対するクエリー配列として使用してもよい。これらのデータベースは、BLAST（Basic Local Alignment Search Toolを表す）を用いた相同性（類似性）の領域をサーチすることができる、あらかじめ同定され、注釈をつけられていた配列を含んでいる（Altschul S F （1993） J Mol Evol 36:290-300；Altschul、 S Fら、（1990） J Mol Biol 215:403-10）。
【０１３６】
BLASTは、ヌクレオチドとアミノ酸配列の双方のアライメントを生成し、その配列類似性を決定する。アライメントの局所的性質のために、BLASTは、正確なマッチングの決定、又は原核（細菌）オリジンでもよく、又は真核（動物、真菌もしくは植物）オリジンでもよい相同体の同定に特に有用である。一次配列パターン及び２次構造ギャップペナルティを扱う際、引用によって本明細書に援用した。Smith、 R. F. and T. F. Smith （1992; Protein Engineering 5:35-51）に記載されているもののような他のアルゴリズムを使用することもできる。本願において開示されているように、配列は、少なくとも４９ヌクレオチド長であり、不定の（uncalled）塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴよりむしろＮが記録されている場合）は１２％を超えないものとする。
【０１３７】
Karlin及びAltschul （1993; Proc Nat Acad Sci 90:5873-7）に詳細に示され、引用によって本明細書に援用したBLASTアプローチは、見出されたあらゆるマッチングの統計学的な重要性を評価し、ユーザが選択した重要性の閾値を満足する、唯一のマッチングを報告するために、クエリー配列とデータベース配列との間のマッチングを検索する。その閾値は、ヌクレオチドでは１０〜２５そしてペプチドでは３〜１５に設定されることが好ましい。
【０１３８】
７．トランスジェニック動物及びその使用
本発明の別の局面は、異種のＰＯＳＨ遺伝子、好ましくは、本発明のヒトＰＯＳＨ遺伝子を発現し、及び/又は、該動物の少なくとも１つの組織又は細胞タイプにおいて破壊された内因性のＰＯＳＨ遺伝子１つもしくは２つの複製ーを有するするトランスジェニック非ヒト動物を特徴とする。したがって、本発明は、ウイルス感染用の動物モデルを特徴とする。ある態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、雌牛などの哺乳動物、又は非ヒト霊長類である。理論に拘束されるわけではないが、そのような動物は、エンベロープウイルス、レトロイドウイルス及び、種々のラブドウイルスレンチウイルス及びフィロウイルスなどのＲＮＡウイルスに感染しやすいことが提案されている。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、そのようなウイルスが原因となる疾患の進行の研究のために有用な動物モデルの役割を果たすかもしれない。あるいは、そのような動物は、１以上の他のヒトトランスジーンを導入して、レトロイドウイルスもしくはＲＮＡウイルス及びエンベロープウイルスによって引き起こされる感染に関与する多数のヒト遺伝子を持つトランスジェニックを作製するための基礎として有用となりうる。レトロイドウイルスは、ＨＩＶのようなレンチウイルスを含む。他のＲＮＡウイルスは、エボラウイルスなどのフィロウイルスを含む。多数のヒトトランスジーンの導入の結果、トランスジェニック動物は、いくつかのウイルスに感染しやすくなり、したがって、これらのウイルス感染の研究のために有用な動物モデルとなるかもしれない。
【０１３９】
好ましい態様において、ヒトＰＯＳＨ遺伝子を持つトランスジェニック動物は、Cyclin Ｔ１、ＣＤ３４、ＣＣＲ５及びfusin （ＣＲＣＸ４）などのＨＩＶ感染に関与する、その他のヒト遺伝子を導入するための基礎として有用である。更なる態様において、追加的ヒトトランスジーンは、ＡＩＤＳに関連する疾患又は状態（例えば、高血圧、カポジ肉腫、カヘキシーなど）に関与する遺伝子である。そのような動物は、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ及び関連する疾患の発生の研究のための動物モデルとして有用であるかもしれない。
【０１４０】
本発明の別の局面は、本発明のトランスジーンを含み、好ましくは、（任意ではあるが）該動物の１以上の細胞において外因性のＰＯＳＨ蛋白質を発現する（その動物の）細胞からなるトランスジェニック動物に関する。ＰＯＳＨトランスジーンは、野生型の蛋白質をコードすることができ、そのホモログならびにアンチセンスコンストラクトをコードすることができる。さらに、異種のＰＯＳＨトランスジーンを、ＰＯＳＨ遺伝子発現のタイミング又はレベルを調節することができるように発現することが望ましいかもしれない。そのような条件付発現は、原核生物の蛋白質にＰＯＳＨトランスジーンの発現を促進するために同時に発現することを要求する原核生物のプロモーター配列を用いて提供され得る。プロモーターの例及び対応するトランス活性化原核生物蛋白質は、米国特許第4,833,080号に記載されている。
【０１４１】
さらに、組織特異的発現を示すトランスジェニック動物は、例えば、エンハンサーなどの調節エレメントに特異的な組織を、トランスジーンに挿入することによって生成することができる。例えば、内因性のＰＯＳＨ遺伝子プロモーターもしくはその部分は、別のプロモーター及び/又はエンハンサー、例えば、ＣＭＶもしくはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター及び/又はエンハンサーで置換することができる。
【０１４２】
あるいは、脳においてＨＩＶトランスジーンを発現するだけの非ヒトトランスジェニック動物は、脳特異的プロモーター（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター）、ニューロフィラメント蛋白質（ＮＦ−Ｌ）プロモーター、性腺刺激ホルモン放出ホルモンプロモーター、バソプレッシンプロモーター及び神経特異的エノラーゼプロモーターを用いて生成され得る。So Forss-Petterら、Neuron、5、187、（1990）を参照されたい。そのような動物は、潜在的抗ＨＩＶ薬が血液脳関門を横断する可能性を評価するための有用なインビボモデルを提供することができる。特異的プロモーターを使用することができる他の標的細胞は、例えば、マクロファージ、Ｔ細胞及びＢ細胞である。他の組織特異的プロモーターは、当該技術において公知である。例えば、R.Jaenisch、Science、240、1468（1988）を参照されたい。
【０１４３】
誘導性のＰＯＳＨトランスジーンを含む非ヒトトランスジェニック動物は、当該技術において公知の誘導性の調節エレメント（例えば、メタロチオネインプロモーター）を用いて生成することができる。次に、ＰＯＳＨトランスジーン発現は、動物に遺伝子発現を誘導する化合物（例えば、重金属）を投与することによって、これらの動物において開始することができる。別の好ましい誘導系は、テトラサイクリン誘導性の転写活性剤を含む（1997年8月5日付けでBujard 及びGossenに対して発行された米国特許第5,654,168号、ならびに1997年7月22日付けでBujardらに対して発行された米国特許第5,650,298号）。
【０１４４】
一般的に、トランスジェニック動物系列は、それらのゲノムに少なくとも１つのトランスジーンを組み込み、これらの動物から少なくとも１つの原種を選択し、その原種もしくは複数の原種を増殖させて、それらのゲノムに選択されたトランスジーンが組み込まれたトランスジェニック動物の少なくとも１つの系列を確立することによって、得ることができる。
【０１４５】
トランスジェニック動物を産生させるための卵子もしくはその他の有核細胞（例えば、胚性幹細胞）を得るための動物は、Charles River Laboratories （Wilmington、 Mass.）、Taconic （Germantown、 N.Y.）、Harlan Sprague Dawley（Indianapolis、Ind.）などの標準的な商業的供給源から取得することができる。
【０１４６】
卵子は好適な動物から、例えば、卵管から流し出すことによって、又は米国特許第5、489、742号（1996年2月6日Hammer及びTaurogに発行）；米国特許第5,625,125号（1997年4月29日Bennettらに発行）；Gordonら、1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384； Gordon & Ruddle、1981、Science 214: 1244-1246；T. E. Wagner及びP. C. Hoppeに対する米国特許第4,873,191号；米国特許第5,604,131号；Armstrongら（1988） J. of Reproduction、 39:511 又はMehtaliらによるＰＣＴ特許国際公開出願第 PCT/FR93/00598 （WO 94/00568）号に記載の方法によって取得することができる。卵子を取得する前に、メスを過剰排卵を促進するのに有効なホルモン条件にしておくことが好ましい。
【０１４７】
ＤＮＡを卵子又は他の有核細胞に導入するために、外因性のＤＮＡのキャリアとしての精子を用いたインビトロ受精（「精子媒介性遺伝子の移入」、例えば、Lavitranoら、1989、Cell 57: 717-723）;マイクロインジェクション、遺伝子標的化（Thompsonら、1989、Cell 56: 313-321）、エレクトロポレーション（Lo、1983、Mol. Cell. Biol. 3: 1803-1814）、トランスフェクション、又はレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Van der Puttenらｌ、1985、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152）を含む、多くの方法を使用することができる。そのような技法を検討するためには、Gordon （1989）、Transgenic Animals、Intl. Rev. Cytol. 115:171-229を参照されたい。
【０１４８】
精子を媒介とした遺伝子移入以外は、卵子は、他のトランスジーン移入技法とあわせて（その前、最中もしくは後）に受精する必要がある。卵子を受精させる好ましい方法は、メスを繁殖製のオスと一緒に育てることである。しかしながら、卵子は、インビトロ受精技法によって受精させることもできる。
【０１４９】
その後、受精した、トランスジーン含有卵子を偽妊娠動物（「里親動物」とも称する）に、好適な技法を用いて移入する。偽妊娠動物は、例えば、４０〜８０日齢のメス動物（８週齢を超えているもの）を不妊のオス、例えば、精管切除術を受けたオスと一緒にケージに入れることによって得ることができる。翌朝、メスの膣栓を確認する。精管切除術を受けたオスと交配したメスを移入時まで別にして保存する。
【０１５０】
レシピエントメスは、例えば、GNRH agonist （GnRH-a）: des-gly10、 （D-Ala6）-LH-RH Ethylamide、 SigmaChemical Co.、St. Louis、 Mo.を用いて同調することができる。あるいは、左子宮角の嚢膜を「剥離」することを含む簡単な外科的処置によって、片側性妊娠を達成することもできる。その後注入された胚を左子宮角に卵管漏斗を介して移入することができる。潜在的トランスジェニック原種は、典型的に内因性の同腹仔から生まれた時点ですぐに同定することができる。胚性幹細胞からトランスジェニック動物を産生させるために、例えば、Teratocarcinomas and embryonic stem cells、a practical approach、ed. E. J. Robertson（IRL Press 1987）、又はPotterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81、 7161 （1984）を参照されたい。その教示を引用によって本明細書中に援用する。
【０１５１】
次に遺伝子を発現する原種を育成して、トランスジェニック系列を確立することができる。したがって、原種動物を、交配、同系交配、異種交配又は非近交配させ、本発明の動物のコロニーを作製することができる。多数のトランスジーンを含む動物は、異なる原種動物（例えば、ＨＩＶトランスジェニック動物及びヒトＣＤ４を発現するトランスジェニック動物）と交配させることによって、ならびにトランスジーンを上記のように卵子や胚細胞に導入することによって産生させることができる。さらに、Ａ−トランスジェニック動物からの胚は、必要時に解凍して偽妊娠動物に移植される凍結胚として保存しておくことができる（例えば、Hirabayashi ら、（1997） Exp Anim 46: 111及びAnzai （1994） Jikken Dobutsu 43: 247参照）。
【０１５２】
本発明は、その全ての細胞中にトランスジーンを持つトランスジェニック動物、ならびに全てではないがいくつかの細胞中にトランスジーンを持つ動物、すなわちモザイク動物を提供する。トランスジーンは、単一のトランスジーンとして組み込むこともできるし、又は、タンデム型、例えば、ヘッド・ツー・ヘッドタンデムもしくは、ヘッド・ツー・テイルタンデムもしくはマルチプルコピーとして組み込むこともできる。
【０１５３】
トランスジーンの正常な発現は、当該技術の当業者に公知のいくつかの手段のいずれによっても検出することができる。限定されない例としては、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのインサイチュイブリダイゼーション、ウエスタンブロット解析、免疫組織化学的方法及び蛋白質発現のＦＡＣＳ解析がある。
【０１５４】
さらに別の局面において、本発明は、ＰＯＳＨトランスジーン、優先的には、ヒトＰＯＳＨトランスジーンを含有する非ヒト動物細胞を特徴とする。例えば、動物細胞（例えば、体細胞又は生殖細胞（すなわち、卵子もしくは精子））は、該トランスジェニック動物から取得することができる。トランスジェニック体細胞もしくは細胞系列は、例えば、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。一方、トランスジェニック生殖細胞は、上記のようにトランスジェニック子孫を産生させるために用いることができる。
【０１５５】
本発明はさらに、ウイルス治療、すなわち、ウイルス感染によって引き起こされる疾患又は状態（たとえば、ＡＩＤＳ）の発生を治療及び/又は予防するために有用な化合物の安全性及び/又は効果を同定（スクリーニング）又は決定するための方法を提供する。さらに、例えば、それらの構造を改変して、安定性及び/又は活性及び/又は毒性を増加させることによって、公知の抗ウイルス化合物をさらに改善するために該アッセイは有用である。
【０１５６】
トランスジェニック動物は、ウイルス治療薬を同定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで用いることができる。例えば、該動物は、ウイルス生命周期のあらゆる相、例えば、１以上のウイルス遺伝子の発現、１以上のウイルス蛋白質の活性化、１以上のウイルス蛋白質のグリコシル化、１以上のウイルス蛋白質のプロセシング、ウイルス複製、ビリオンの構築、及び/又は感染性ビリオンの出芽の減少又は阻害を行う化合物を同定するためのアッセイにおいて用いることができる。
【０１５７】
ある態様例において、アッセイは、試験化合物をＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、レトロイドウイルス及び/又はエンベロープウイルスを含むウイルスに感染した、本発明のトランスジェニック動物に投与すること、及びその動物における表現型変化と試験化合物を投与しなかったトランスジェニック動物とを比較することを含む。例えば、その動物がＨＩＶに感染している場合、その表現型の変化は、エイズ関連症候群（ＡＲＣ）、白内障、中枢神経系（ＣＮＶ）の炎症性疾患/病変、軽度の腎臓硬化性の疾患／病変、又は乾癬性皮膚炎、角化性疾患/病変、カポジ肉腫、カヘキシーなど皮膚疾患/病変の寛解であることができる。該化合物のカポジ肉腫の阻害に対する効果は、例えば、Gallo らのPCT/US97/11202（WO97/49373）、に記載のように測定することができる。これら及び他のＨＩＶ関連症候群もしくは表現型については、さらにLeonardら（1988）Science 242:1665に記載されている。
【０１５８】
別の態様において、表現型の変化は、ウイルス粒子の放出／出芽である。さらに別の態様において、表現型な変化は、CD4+ Ｔ細胞の数、又はCD4+ Ｔ細胞対CD8+ Ｔ細胞の比率である。ＨＩＶ感染ヒト、ならびにＨＩＶトランスジェニックマウスにおいて、リンパ節の分析をしたところ、CD4+ Ｔ細胞の数は減少しており、CD8+ Ｔ細胞の数は増加している。CD4+ Ｔ細胞とCD8+ Ｔ細胞の数は、例えば、Santoroら、前掲に記載のように、例えば、間接的な免疫蛍光法及びフローサイトメトリーによって測定することができる。
【０１５９】
一方、表現型の変化、例えば、ＨＩＶ遺伝子の発現レベルにおける変化をモニターすることができる。ＨＩＶ ＲＮＡは、 gag ｍＲＮＡ、gag-pro-pol ｍＲＮＡ、vif ｍＲＮＡ、vprｍＲＮＡ、tatｍＲＮＡ、revｍＲＮＡ、vpu/envｍＲＮＡ、nefｍＲＮＡ、及びｖｐｘmRNAからなる群から選択することができる。ＨＩＶ蛋白質は、Pr55 Gag 及びそのフラグメント（p17 MA、p24 CA、p7 NC、p1、p9、p6及びp2）、Pr160 Gag-Pro-Pol及びそのフラグメント（p10 PR、 p51 RT、 p66 RT、 p32 IN）、 p23 Vif、 p15 Vpr、 p14 Tat、 p19 Rev、 p16 Vpu、 gPr 160 Env 又はそのフラグメント （gp120 SU and gp41TM）、 p27 Nef及びp14 Vpxからなる群から選択することができる。これらのｍＲＮＡ又は蛋白質のいずれのレベルも、皮膚生検などの組織サンプルからの細胞において、例えば、GalloらのPCT/US97/11202 （W097/49373）に記載のように測定することができる。ＨＩＶ ｍＲＮＡ及び蛋白質の定量化は、本明細書の他の箇所及び例えば、Dickie ら（1996） AIDS Res. Human Retroviruses 12:1103においてさらに記載されている。好ましい態様において、ＰＢＭＣの表面におけるgp120のレベルが測定される。これは、例えば、動物から取得したＰＢＭＣ上で 免疫蛍光法によって行うことができる。
【０１６０】
さらなる表現型の変化は、動物の血清及び/又は組織におけるウイルス粒子の産生レベル又は割合である。これは、例えば、逆転写酵素（ＲＴ活性）又はウイルス量を測定することによって、本明細書の他の箇所及び例えば、Gallo らのPCT/US97/11202 （WO97/49373）に記載されているように、p24抗原を測定することによって測定することができる
【０１６１】
ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの進行を示す、さらに別の表現型の変化は、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＴＮＦ−αなどの炎症性のサイトカインの産生である。したがって、抗ＨＩＶ治療薬としての化合物の効果は、これらのサイトカインのいずれか又は全ての血清レベルの低下を調べるＥＬＩＳＡ試験によって評価することができる。
【０１６２】
試験抗原を本発明のトランスジェニック動物に投与することによって、ワクチンを試験することができる。該動物に対して、同じもしくは異なる抗原を追加免疫することができる。次にそのような動物に対してＨＩＶなどのウイルスを感染させる。次いでウイルス粒子の作製又はウイルス蛋白質の発現を試験ワクチンの投与後の様々な時点で測定する。作製されたウイルス粒子量又はウイルス発現の減少は、試験ワクチンがウイルス産生及び/又は発現を減少又は阻害するのに有効であることを示すであろう。動物によって、ワクチン抗原に反応して産生された抗体の量は、当該技術において公知の方法によって決定することができ、その粒子状抗原の免疫原性の相対的な指標を提供する。
【０１６３】
本発明のトランスジェニック動物からの細胞を、培養液中で確立し、細胞系列を確立するよう不死化することができる。、例えば、不死化された細胞系列は、Buleraら、（1997） Hepatology 25： 1192に記載されているように、トランスジェニックラットの肝臓から確立することができる。他のタイプの細胞の細胞系列も当該技術において公知の方法にしたがって確立することができる。
【０１６４】
ある細胞ベースアッセイにおいて、ＰＯＳＨトランスジーンを発現する細胞を、対象となっているウイルスに感染させ、試験化合物又は対照化合物の存在下でインキュベートすることができる。次いで、ウイルス粒子の作製を比較する。したがって、このアッセイ系は、例えば、ウイルス放出／出芽と干渉させることによって機能する分子アンタゴニストを同定する手段を提供する。
【０１６５】
細胞ベースアッセイはまた、ウイルス遺伝子の発現を調節し、ウイルスｍＲＮＡの転写を調節する、又はウイルスｍＲＮＡもしくは蛋白質の安定性を調節する化合物を同定するために使用することができる。したがって、対象となっているウイルスに感染した細胞を試験化合物とともにインキュベートすることができ、そして細胞培地中で産生されたウイルス蛋白質の量を測定し、試験化合物に接触させていない細胞から産生されたものと比較することができる。特定のウイルス遺伝子の発現を調節する化合物の特異性は、種々の対照解析、例えば、１以上の対照遺伝子の発現を測定することによって確認することができる。このタイプの細胞アッセイは、アンチセンス分子又はリボザイムの効果を決定するために、特に有用である。
【０１６６】
８．リボザイム、アンチセンス及びＤＮＡ酵素のＲＮＡ干渉 
いくつかの局面において、本発明は、ＲＮＡｉ、リボザイム、アンチセンス及び、ＰＯＳＨ活性を操作する（典型的には減少させる）ための、他の核酸に関連する方法及び組成物に関する。ＲＮＡｉ、リボザイム分子の例としては、配列番号１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４及び２５のいずれかに示されている配列を含むことができる。
【０１６７】
本発明のいくつかの態様は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、１以上のＰＯＳＨ遺伝子のノックダウンに影響を及ぼすための物質及び方法を使用する。ＲＮＡｉは、真核細胞において発生し得る、配列特異的な転写後遺伝子リプレッションのプロセスである。通常、このプロセスは、配列に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される特定の配列のｍＲＮＡの分解を含む。例えば、特定の一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓ ｍＲＮＡ）に対応する長ｄｓＲＮＡの発現は、メッセージを不安定にし、それによって対応する遺伝子の発現と「干渉」する。したがって、選択されたあらゆる遺伝子は、その遺伝子のｍＲＮＡの全てのもしくは実質的な部分に対応するｄｓＲＮＡを導入することによって抑制してもよい。長いｄｓＲＮＡは発現すると、まずリボヌクレアーゼIIIによって、２１〜２２といった短い塩基対長の短ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドにプロセシングされる。さらに、したがって、ＲＮＡｉは、相対的に短い相同的なｄｓＲＮＡの導入又は発現によって影響を受けることもある。実際、相対的に短い相同的なｄｓＲＮＡは、以下に示すいくつかの利点を有しているかもしれない。
【０１６８】
哺乳動物細胞は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって影響を受ける経路を少なくとも２つ有する。ＲＮＡｉ（配列特異的）経路において、開始ｄｓＲＮＡは、上記したように、まず、短干渉（ｓｉ）ＲＮＡに分割される。ｓｉＲＮＡは、各３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを備えた約１９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを構成する、約２１ヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖を有している。短干渉ＲＮＡは、特異的なメッセンジャーＲＮＡが分解の標的とされることができるような配列情報を提供すると考えられている。対照的に、非特異的経路は、少なくとも約３０の塩基対長を持つあらゆる配列のｄｓＲＮＡによって惹起される。非特異的な効果は、ｄｓＲＮＡが２つの酵素：その活性形態において、翻訳開始ファクターeIF2をリン酸化して全ての蛋白質合成を停止するＰＫＲ、及び全てのｍＲＮＡを標的とする非特異的な酵素Rnase Lを活性化する分子を合成する２’、５’オリゴアデニレート合成酵素（２’、５’−ＡＳ）を活性化することによって生じる。非特異的な経路は、ストレス又はウイルス感染に反応する宿主を表すこともある。通常、非特異的な経路の効果は、本発明の好ましい方法によって最小化されることが好ましい。非常に長いｄｓＲＮＡは、非特異的な経路を誘導することが必要とされているようである。したがって、ＲＮＡｉによる遺伝子抑制に効果を及ぼすためには、約３０塩基対より短いｄｓＲＮＡが好ましい（Hunterら、（1975） J Biol Chem 250: 409-17; Mancheら、（1992） Mol Cell Biol 12: 5239-48; Minksら、（1979） J Biol Chem 254: 10180-3;及びElbashirら（2001） Nature 411: 494-8参照）。   
【０１６９】
ＲＮＡｉは、エレガンス線虫（例えば、Fireら （1998） Nature 391: 806-11参照）、マウス卵子及び胚（Wiannyら（2000） Nature Cell Biol 2: 70-5; Svoboda ら（2000） Development 127: 4147-56）、ならびにRAT-1 線維芽細胞 （Bahraminaら（1999） Mol Cell Biol 19: 274-83）を含む、様々な微生物におけるＰＯＳＨ 遺伝子の発現を緩和又は除去するのに効果的であることが示されている。また、真核植物及び動物において取得することができる古くから進化してきた経路でもあるようである（Sharp （2001） Genes Dev. 15: 485-90）。ＲＮＡｉは、HeLa 細胞、NIH/3T3細胞、COS 細胞、293細胞及びBHK-21細胞を含む種々の細胞タイプにおける遺伝子発現を減少させ、典型的には遺伝子の発現を、アンチセンス技法を用いて得られたものより低いレベルにまで減少させる、そして実際は、多くの場合発現を全体として削除する際に効果的であることが示されている（Bass （2001） Nature 411: 428-9参照）。哺乳動物細胞において、ｓｉＲＮＡは、アンチセンスの実験に典型的に用いられる濃度より数オーダー低い濃度において効果的である。（Elbashirら、（2001） Nature 411: 494-8）。 
【０１７０】
ＲＮＡｉを生じさせるために用いられる二本鎖オリゴヌクレオチドは、３０塩基対長であることが好ましい。また、リボ核酸の約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８又は１７の塩基対を含むことがより好ましい。任意に、本発明のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３’オーバーハング末端を含んでもよい。２-ヌクレオチド３’オーバーハングの例は、あらゆる種類のリボヌクレオチド残基から構成されていてもよく、また、２’−デオキシチミジン残基から構成されていてもよく、それは、ＲＮＡ合成のコストを下げ、また、細胞培養培地中及びトランスフェクトされた細胞中のｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗を高めるかもしれない（Elbashiら、（2001） Nature 411: 494-8参照）。５０、７５、１００またさらには５００塩基対以上の長いｄｓＲＮＡsも、本発明のいくつかの態様において用いることができる。ＲＮＡｉを生じさせるｄｓＲＮＡ濃度の例は、約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭ、２５ｎＭ又は１００ｎＭである。もっとも、処理される細胞の性質、遺伝子標的及び当業者によって容易に認識可能な他のファクターによっては、他の濃度も使用することができる。ｄｓＲＮＡの例は、化学的に合成することもでき、又は、インビトロ又はインビボで適切な発現ベクターを用いて作製することもできる。合成ＲＮＡの例は、当該技術において公知の方法を用いて化学的に合成された２１ヌクレオチドＲＮＡを含む（例えば、Expedite ＲＮＡ ホスホラミダイト及びチミジンホスホラミダイト（Proligo、 Germany）。合成オリゴヌクレオチドは、当該技術において公知の方法を用いて脱保護され、ゲル精製されることが好ましい（例えば、 Elbashirら、（2001） Genes Dev. 15: 188-200）。長いＲＮＡは、当該技術において公知のT７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのようなプロモーターから転写される。インビトロプロモーターの下流において可能な双方の方向に配置された、単一のＲＮＡ標的は、所望の標的配列のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを作製するための標的の双方の鎖を転写するであろう。上記ＲＮＡ種のいずれも、例えば、ストリンジェントな条件下及び/又は生理学的な条件下で配列番号１、３、４、６、８及び１０の配列又はその相補配列のいずれかにハイブリダイズするＰＯＳＨ核酸に表された核酸配列の一部を含むように設計される。
【０１７１】
オリゴヌクレオチドの設計に用いられる特異的な配列は、発現された標的の遺伝子メッセージ中に含有されるヌクレオチドのあらゆる連続的な配列とすることができる。当該技術において公知のプログラム及びアルゴリズムを用いて、適切な標的配列を選択することができる。さらに、最適な配列は、記載されている一本鎖核酸配列の２次構造を予測するために設計されたプログラムを用いて選択してもよい。それらの配列の選択を折り畳みｍＲＮＡの露出された一本鎖の領域において生じるようにすることができる。適切なオリゴヌクレオチドを設計するための方法及び組成物は、例えば、米国特許第6,251,588号に見出すことができる。その内容を引用によって本明細書に援用する。メッセンジャーＲＮＡ（mＲＮＡ）は、通常、蛋白質の合成を導くための情報をリボヌクレオチドの配列に含む線形分子であると考えられている。しかしながら、大半のｍＲＮＡには、複数の２次構造及び３次構造が含まれることが研究からわかってきた。ＲＮＡの２次構造エレメントは、主に同じＲＮＡ分子の異なる領域間のワトソン−クリック型相互作用によって形成される。重要な２次構造的エレメントは、分子間二本鎖領域、ヘアピンループ、二本鎖ＲＮＡ中の隆起、及び内部ループを含む。３次構造エレメントは、二次構造エレメントが相互にもしくは一本鎖領域と接触したときに形成され、より複雑な３次元構造を形成する。多くの研究によって、多数のＲＮＡ二本鎖構造の結合エネルギーを測定し、ＲＮＡの二次構造を予測するために使用することができる、一連の法則を導いた（例えば、Jaeger ら、（1989） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706 （1989）;及びTurnerら、（1988） Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 17:167）。該法則は、ＲＮＡ構造エレメントの同定、特に、ｍＲＮＡの好ましいセグメントを表す一本鎖ＲＮＡ領域を同定し、サイレンシングＲＮＡｉ、リボザイム又はアンチセンステクノロジーを標的化するのに有用である。したがって、ｒＲＮＡ標的の好ましいセグメントは、ｄｓＲＮＡ オリゴヌクレオチドを媒介するＲＮＡｉの設計、ならびに適切なリボザイム及びハンマーヘッドリボザイム組成物の設計のために同定することができる。 
【０１７２】
ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、当該技術において公知の、リポゾームのような担体組成物（例えば、付着性の細胞系列の製造業者（Life Technologies）により記載されているLipofectamine 2000）を用いて、異種の標的遺伝子でトランスフェクションすることによって細胞に導入してもよい。ｄｓＲＮＡ折後ヌクレオチドの標的遺伝子のためのトランスフェクションはオリゴフェタミン（Life Technologies）を用いて行うことができる。トランスフェクション効率は、hGFP-コードpAD3のコトランスフェクション後、蛍光顕微鏡を用いて、哺乳動物の細胞系列を確認してもよい（Kehlenback ら （1998） J Cell Biol 141: 863-74）。ＲＮＡｉの有効性は、ＲＮＡの導入後の多数のアッセイのいずれによって評価してもよい。これらには、新たな蛋白質合成を抑制した後、内因性のプールの十分な時間のターンオーバーに続いて、ＰＯＳＨ遺伝子産物を認識する抗体を用いるウエスタンブロット解析、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応及び存在するＰＯＳＨ標的ｍＲＮＡのレベルを決定するノーザンブロット解析が含まれる。
【０１７３】
更なる組成物、方法及びRNAi技法の用途が、米国特許法第6、278、039号、第5、723、750号及び第5、244、805号に記載されている。それらを引用によって本明細書に援用する。
【０１７４】
ＰＯＳＨ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子もまた、対象となるＰＯＳＨ ｍＲＮＡの翻訳及び/又はＰＯＳＨの発現を阻害するために使用することができる（例えば、ＰＣＴ国際公開WO90/11364号（1990年10月4日公開）； Sarverら（1990） Science 247:1222-1225 及び米国特許第5、093、246号参照）。リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒することが可能な酵素ＲＮＡ分子である（参考として、Rossi （1994） Current Biology 4: 469-471）。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的な標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続く、エンドヌクレアーゼ切断を含む。リボザイム分子の組成は、ＰＯＳＨ mＲＮＡに相補的な１以上の配列及びmＲＮＡ切断を担う公知の触媒的配列又は機能的に等価な配列を含むことが好ましい（例えば、米国特許第5、093、246号を参照されたい。その内容の全体を引用によって本明細書に援用する。
【０１７５】
部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムは、標的ｍＲＮＡを破壊するために使用することができる場合、ハンマーヘッドリボザイムを使用することが好ましい。ハンマーヘッド リボザイムは、標的ｍＲＮＡを持つ相補的な塩基対を形成する隣接領域によって示された位置においてｍＲＮＡを切断する。標的ｍＲＮＡは、２つの塩基５’-UG-３’の配列を持つことが好ましい。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び作製は、当該技術において公知であり、Haseloff及びGerlach （（1988） Nature 334:585-591に十分に記載されている。また、ＰＣＴ出願WO89/05852号を参照されたい。その内容を引用によって本明細書に援用する）。ハンマーヘッドリボザイム配列は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のような安定なＲＮＡに包埋し、インビボでの切断効果を高めることができる（Perrimanら、（1995） Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 92: 6175-79; de Feyter、 and Gaudron、 Methods in Molecular Biology、 Vol. 74、 Chapter 43、 "Expressing Ribozymes in Plants"、 Edited by Turner、 P. C、 Humana Press Inc.、 Totowa、 N.J）。特に、tＲＮＡ融合リボザイムのＲＮＡポリメラーゼIII−媒介性の発現は、当該技術において公知である（Kawasakiら、（1998） Nature 393: 284-9; Kuwabaraら、（1998） Nature Biotechnol. 16: 961-5;及びKuwabara ら（1998） Mol. Cell 2: 617-27; Kosekiら（1999） J Virol 73: 1868-77; Kuwabaraら（1999） Proc Natl Acad Sci USA 96: 1886-91; Tanabe ら（2000） Nature 406: 473-4を参照されたい）。典型的に、多くの潜在的なハンマーヘッドリボザイム切断部位が所与の標的ｃＤＮＡ配列内に存在する。該リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端の近くに位置づけられ、効率を高め、非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞間蓄積を最少化するように操作されることが好ましい。さらに、例えば、長短の形態の標的のＣ末端アミノ酸ドメインの様々な部分をコードする標的配列に位置づけられたいずれの切断部位を用いても、１以上の他の標的を選択的に標的化することができ、それによって標的遺伝子産物の１以上に対する選択的効果を有することになる。
【０１７６】
遺伝子標的リボザイムは、必然的に２つの領域に相補的なハイブリダイゼーション領域を含むことが好ましい。そしてそのそれぞれは、少なくとも５つ、好ましくは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の連続するヌクレオチド長のＰＯＳＨ  ｍＲＮＡ、例えば、配列番号１、３、４、６、８又は１０のいずれかに示された配列に記載のｍＲＮＡである。さらに、リボザイムは、高度に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を有する。それは、自己触媒的に標的センスｍＲＮＡを切断する。本発明は、治療薬標的候補遺伝子のようなＰＯＳＨ遺伝子をコードするセンスｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって該センスｍＲＮＡにハイブリダイズし、その結果、機能的なポリペプチド産物を合成するように翻訳されることがないようにしている。
【０１７７】
本発明のリボザイムはまた、テトラヒメナ好熱菌（IVS、又はL-19 IVS RNAとして既知）に天然に存在するものなどのＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、Cech型リボザイムと称する）を含む。それは、Thomas Cech and collaborators （Zaugら、（1984） Science 224:574-578; Zaugら、（1986） Science 231:470-475; Zaugら、（1986） Nature 324:429-433; 国際公開特許出願第WO88/04300号 University Patents Incによる.; Beenら （1986） Cell 47:207-216）に詳細に記載されている。Cech-typeリボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし、その後標的部位の切断が行われる、８つの塩基対活性部位を持つ。本発明は、標的遺伝子又は核酸配列に存在する８個の塩基対活性部位配列を標的とするCech-typeリボザイムを包含する。
【０１７８】
リボザイムは、改変されたオリゴヌクレオチド（例えば、安定性の向上、標的化など）で構成することもでき、そしてインビボで標的遺伝子を発現する細胞に送達する必要がある。好ましい送達方法は、強い構成pol III or pol II プロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡコンストラクトを用いることを含む。その結果トランスフェクトされた細胞は、十分な量のリボザイムを産生し、内因性の標的メッセージを破壊し、翻訳を阻害する。リボザイムは、アンチセンス分子とは違って触媒的であるので、効率化のためにより低い濃度が要求される。
【０１７９】
いくつかの態様において、リボザイムは、まずＲＮＡｉによって効果的なノックダウンを引き起こすのに十分な配列部分を同定することによって設計してもよい。次にその同じ配列部分をリボザイムに組み込んでもよい。本発明のこの局面において、リボザイム又はＲＮＡｉの遺伝子標的部分は、実質的に、少なくとも５つ、好ましくは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０又はそれ以上の連続するヌクレオチド長のＰＯＳＨ核酸、例えば、配列番号１、３、４、６、８又は１０のいずれかに示された配列に記載の核酸とほぼ同じである。長い標的ＲＮＡ鎖において、相当な数の標的部位がリボザイムに到達できない。なぜなら、それらは２次構造もしくは３時構造内に隠れているからである（Birikhら、（1997） Eur J Biochem 245: 1-16）。標的ＲＮＡの到達可能性の問題を克服するために、コンピュータが生成した二次構造の予測を典型的に用いて、たいていは一本鎖であるか、又は「オープン」な構成をもっている標的を同定することができる（Jaegerら、（1989） Methods Enzymol 183: 281-306を参照されたい）。他のアプローチは、二次構造の予測に対する体系的なアプローチを利用する。それは、オリゴヌクレオチド分子をハイブリダイズする、大多数の候補を評価することを含む（Milnerら、（1997） Nat Biotechnol 15: 537-41; and Patzel and Sczakiel （1998） Nat Biotechnol 16: 64-8を参照されたい。さらに、その内容を本明細書中に引用によって援用した米国特許第6、251、588号は、標的核酸へのハイブリダイゼーションの可能性を予測するためのオリゴヌクレオチドプローブ配列を評価する方法を記載している。本発明の方法は、本発明のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド及びリボザイムの双方を設計する際に、一本鎖であると予測され、さらに、便宜的なそれの使用、又はほぼ同一の標的ｒＲＮＡ配列のために、好ましくは標的ｍＲＮＡの１０〜２０の連続的なヌクレオチドを含む、標的ｍＲＮＡ配列の好ましいセグメントを選択するためのそのような方法の使用を提供する。
【０１８０】
本発明の更なる局面は、単離された「アンチセンス」核酸を使用して、例えば、対象となるＰＯＳＨ核酸の転写及び/又は翻訳を阻害することによって発現を阻害することに関する。該アンチセンス核酸は、従来の塩基対の相補性によって、又は、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合する場合は、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を介して、潜在的な薬物標的に結合することもできる。通常、これらの方法は、当該技術において通常採用される技法の範囲であり、オリゴヌクレオチド配列に対する特異的な結合に依存するあらゆる方法を含む。
【０１８１】
本発明のアンチセンスコンストラクトは、例えば、細胞内に転写されたとき、ＰＯＳＨポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも１つの特有の部分に対して相補的なＲＮＡを産生する発現プラスミドとして、送達することができる。あるいは、アンチセンスコンストラクトは、生体外で生成され、細胞内に導入されたとき、ＰＯＳＨ核酸のmＲＮＡ及び/又はゲノム配列ハイブリダイズすることによって、発現の阻害を引き起こすオリゴヌクレオチドプローブである。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、内因性のヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼに対して耐性があり、 したがって、インビボで安定である、改変されたオリゴヌクレオチドであることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための核酸分子の例は、ＤＮＡのホスホラミデート、ホスホチオエート及びメチルホスホネート類似物である（米国特許第5,176,996号；第5,264,564号および第5,256,775号参照）さらに、アンチセンス治療に有用なオリゴマーを構築するための通常のアプローチを、例えば、van der Krolら、（1988） Biotechniques 6:958-976及びSteinら、（1988） Cancer Res 48:2659-2668によって検討した。
【０１８２】
翻訳開始部位由来のアンチセンスＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド、例えば、−１０〜＋１０の間の領域のＰＯＳＨ遺伝子が好ましい。アンチセンスアプローチは、ＰＯＳＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の設計に関与する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を阻害する。絶対的な相補性は、好ましいが必要ではない。二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖を試験してもよいし、又は、三重形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイゼーション能力は、相補性の度合いと、アンチセンス核酸の長さの双方に依存する。通常、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それが含有し、なお二本鎖（場合によっては３本）を形成するかもしれないＲＮＡとのミスマッチが多くなる。当該技術の当業者は、ハイブリダイズされた複合体の融点を測定するための標準的な処置を用いてミスマッチの許容度を確認することができる。
【０１８３】
mＲＮＡの５' 末端、例えば、５' 非翻訳配列から上流へそして、ＡＵＧ開始コドンに相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害するのにもっとも効果的に機能するはずである。しかしながら、近年、ｍＲＮＡの３' 非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳の阻害に効果的であることがわかってきた（Wagner、R. 1994. Nature 372:333）。したがって、５'又は３'非翻訳、非コード領域の遺伝子に相補的はオリゴヌクレオチドがそのｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて用いられることができるであろう。ｍＲＮＡの５'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補配列を有しているべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり効果的に翻訳を阻害しないが、本発明において用いられることができるであろう。ｍＲＮＡの５'、３'あるいはコード領域のいずれかにハイブリダイズするように設計されていれば、アンチセンス核酸が少なくとも６ヌクレオチドの長さであり、また、好ましくは、約１００未満、より好ましく約５０、２５、１７もしくは１０ヌクレオチドの長さであるべきである。
【０１８４】
インビトロ研究は、まず、アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を阻害する能力を定量化するために行われることが好ましい。これらの研究は、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的な生物学的効果の間の違いを区別する対照を用いることが好ましい。これらの研究は、標的ＲＮＡ又は蛋白質のレベルを内部コントロールＲＮＡ又は蛋白質のレベルと比較することが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と比較してもよい。対照オリゴヌクレオチドは、試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであること、そして、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が標的配列への特異的なハイブリダイゼーションの阻害に必要な分だけアンチセンス配列と異なることが好ましい。
【０１８５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はキメラ混合物又は誘導体又はその改変型、一本鎖もしくは二本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドは、その塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において改変され、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを向上させることができる。オリゴヌクレオチドは、他の付加された基、例えば、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体を標的とするため）、又は細胞膜の輸送を容易にする物質において（例えば、Letsingerら、 1989、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre ら、 1987、 Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; ＰＣＴ国際公開W088/09810、1988年12月15日公開を参照されたい）。又は血液−脳関門（例えば、ＰＣＴ広報第W089/10134号、1998年4月25日公開）、ハイブリダイゼーション誘発性切断物質（例えば、Krolら、1988、BioTechniques 6:958- 976を参照されたい）又は、層間物質（intercalating agents）（例えば、Zon、1988、Pharm. Res. 5:539-549を参照されたい）。この目的のために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤などと結合させてもよい。
【０１８６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を含んでもよい。それは、限定されないが、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４-アセチルシトシン、５-（カルボキシヒドロキシチエチル（carboxyhydroxytiethyl）ウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、５- カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-Ｄ-ガラクトシルキノシン（galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２、２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-アデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、β-Ｄ-マンノシルキノシン（mannosylqueosine）、５'-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキシウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、バイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キノシン（queosine）、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、５-メチル-２-チオウラシル、３-（３-アミノ-３- Ｎ-２-カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２、６-ジアミンプリンを含む。
【０１８７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されないが、アラビノース、２-フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースから選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含んでもよい。
【０１８８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性のペプチド様骨格を含有することもできる。そのような分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）-オリゴマーと呼ばれ、例えば、Perry-O'Keefeら（1996） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14670 and in Eglomら（1993） Nature 365:566に記載がある。ＰＮＡの１つの利点は、それらがＤＮＡの中性骨格ゆえに培地のイオン強度とは本質的に独立して、相補的なＤＮＡに結合することができることである。さらに別の局面において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホジラミデート（phosphordiamidate）、メチルホスホン酸、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタール（formacetal）又はその類似体から選択される少なくとも１つの改変されたリン酸骨格を含む。
【０１８９】
さらに別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α-アノマーオリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のアンチパラレル配向とは対照的に、鎖が互いにパラレルである相補的なＲＮＡとともに特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Gautierら、1987、Nucl. Acids Res. 15:6625-6641）。オリゴヌクレオチドは、２'-０-メチルリボヌクレオチド（Inoueら、1987、Nucl. Acids Res. 15:6131-6148）、又はキメラＲＮＡ-ＤＮＡ類似体（Inoueら、1987、FEBS Lett. 215:327-330）である。
【０１９０】
ＰＯＳＨ ｍＲＮＡ配列のコード領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用することができるとき、転写された非翻訳領域に相補的なものも用いることができる。
【０１９１】
いくつかの例において、内因性のｍＲＮＡ上の翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞間濃度を達成することは困難かもしれない。したがって、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、強いpol IIIもしくはpol IIプロモーターの制御下に配置された組換えＤＮＡコンストラクトを用いる。標的細胞をトランスフェクトするために、そのようなコンストラクトを使用することによって、内因性の潜在的薬物標的転写物に対する相補的な塩基対を形成するであろう一本鎖のＲＮＡの十分な量の転写を結果として行い、それによって翻訳を阻害するであろう。例えば、ベクターは、細胞に取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を導くように導入されることができる。そのようなベクターは、それが転写され、所望のアンチセンスＲＮＡを作製する限り、エピソームのままであることができ、又は、染色体に統合されることもできる。そのようなベクターは、当該技術において標準的な組換えＤＮＡテクノロジーの方法によって構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス又は当該技術において公知のその他のものとすることができ、哺乳動物細胞における複製及び発現に用いることができる。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物中で機能する、当該技術において公知のあらゆるプロモーターによって行うことができる。そのようなプロモーターは、誘導性又は構成的であることができる。そのようなプロモーターは、限定されないが、SV40初期プロモーター領域 （Bernoist及びChambon、1981、Nature 290:304-310）、３'長末端反復のラウス肉腫ウイルス中に含有されるプロモーター （Yamamotoら、1980、Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら、1982、 Nature 296:39-42）などを含む。組換えＤＮＡコンストラクトを調製するために、あらゆる種類のプラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターを用いることができ、それらは、直接的に組織の部位に導入することができる。
【０１９２】
一方、ＰＯＳＨ遺伝子発現は、遺伝子の調節領域（すなわち、プロモーター及び/又はエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して、体内の標的細胞中の遺伝子の転写を阻害する三重らせん構造を形成することによって、減少させることができる（一般的に、Helene、 C. 1991、 Anticancer Drug Des.、 6（6）:569-84; Helene、 C.ら、1992、 Ann. N.Y. Acad. Sci.、 660:27-36；及びMaher、 L.J.、 1992、 Bioassays 14（12）:807-15を参照されたい）。
【０１９３】
転写を阻害するために、三重らせん体形成において用いられる核酸分子は、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドで構成されることが好ましい。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成物は、フーグスティーン型塩基対形成の法則によって三重らせん体形成を促進するはずである。それは通常、二本鎖のうちの１つに存在するプリン又はピリミジンのいずれかがかなりの大きさの伸長が必要である。ヌクレオチド配列は、ピリミジンベースであり、それによって、ＴＡＴ及びＣＧＣトリプレットが生じる。得られた三重らせん体の３つの関連する鎖にわたって存在する。ピリミジンに富んだ分子は、二本鎖のうちの一本鎖において、プリンに富んだ領域に相補的な塩基を提供する。さらに、核酸分子は、プリンに富み、Ｇ残基の伸長を含有するように選択することができる。これらの分子は、ＧＣ対に富んだＤＮＡ二本鎖を持つ三重らせん体を形成するだろう。 そこでは、プリン残基の大多数が、標的二本鎖のうちの一本鎖上に位置づけられ、その結果、三重構造内の三重鎖にわたって、ＣＧＣトリプレットが生じる。
【０１９４】
あるいは、潜在的な三重らせん体形成の標的とすることができるＰＯＳＨ配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を生成することによって増加させることができる。スイッチバック分子は、５'−３'、 ３'−５'を交互に用いる方法によって合成することができ、その結果、それらは二本鎖のうちの最初の一方の鎖、次いで、他方の鎖と塩基対を形成し、二本鎖のうちの１つに存在するプリン又はピリミジンのいずれかがかなりの大きさの伸長を有する必要はなくなる。
【０１９５】
本発明のさらに別の局面は、ＰＯＳＨ遺伝子の発現を阻害するためのＤＮＡ酵素の使用に関する。ＤＮＡ酵素は、アンチセンス及びリボザイムテクノロジーの双方の機構的な特徴のいくつかを組み込む。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと非常によく似ており、特定の標的核酸配列を認識するように設計される。しかしながら、リボザイムと非常によく似て、それらは、標的核酸を触媒的及び特異的に切断する。
【０１９６】
現在、２つの基本的なタイプのＤＮＡ酵素が存在する。これらの双方はSantoro及びJoyceによって同定されたものである（例えば、米国特許第6110462号を参照されたい）。10-23 ＤＮＡ酵素は、２つの腕に接続したループ構造を含む。この２つの腕は、特定の標的核酸配列を認識することによって、特異性を提供する。一方、そのループ構造は、生理学的条件のもとで触媒的な機能を提供する。
【０１９７】
簡潔に言えば、標的核酸を特異的に認識し、切断する理想的なＤＮＡ酵素を設計するためには、当該技術の当業者は、まず、特有の標的配列を同定しなければならない。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのために概説されたものと同じアプローチを用いて行うことができる。好ましくは、該特有の、又は実質的な配列は、Ｇ／Ｃに富んだ約１８〜２２のヌクレオチドである。Ｇ／Ｃ含有率が高いことによって、ＤＮＡ酵素と標的配列の間の相互作用がより強くなる。
【０１９８】
ＤＮＡ酵素を合成する場合、酵素をメッセージに対する標的とする特異的なアンチセンス認識配列を、それがＤＮＡの２つの腕を含むように分割する。また、ＤＮＡ酵素のループを２つの特異的な腕の間に配置する。 
【０１９９】
ＤＮＡ酵素を作製し、投与する方法は、例えば、米国特許第6110462号に見出すことができる。同様に、ＤＮＡリボザイムをインビボ又はインビトロで送達する方法は、上で詳細に示したように、ＲＮＡリボザイムを送達する方法を含む。さらに、当該技術の当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様、ＤＮＡ酵素を任意に改質して、安定性及び分解に対する抵抗性を向上させることができる。
【０２００】
本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ 及び三重らせん体分子は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を合成する技術において公知のあらゆる方法によって調製することができる。これらの技術としては、当該技術において公知のオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する技法、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成がある。あるいは、ＲＮＡ分子を、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビボ及びインビトロ転写によって生成してもよい。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ様々なベクターに組み込むことができる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的又は誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡコンストラクトを、用いられるプロモーターに依存して、細胞系列に安定に導入することができる。さらに、細胞間の安定性及び半減期を上昇させる手段として、核酸分子に対して種々の公知の改変を導入してもよい。可能な改変としては、限定されないが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの隣接する配列を分子の５’末端及び/又は３’末端に追加すること、又はオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合よりもむしろ、分子又はホスホロチオエートもしくは２’ Ｏ-メチルを使用することが含まれる。
【０２０１】
９．薬物スクリーニングアッセイ
いくつかの局面において、本発明はまた、ＰＯＳＨ機能と干渉するか、それを促進する治療薬を同定するためのアッセイを提供する。いくつかの態様において、本発明の薬剤は、ウイルスの成熟に任意に干渉する抗ウイルス薬であり、該ウイルスは、レトロイドウイルス、ＲＮＡウイルス及びエンベロープウイルスであることが好ましい。いくつかの好ましい態様において、抗ウイルス薬は、ＰＯＳＨのユビキチンリガーゼ触媒的活性と干渉することが好ましい（例えば、ＰＯＳＨ自動ユビキチン化又は標的部位への移入）。いくつかの好ましい態様において、抗ウイルス薬は、ＰＯＳＨとＰＯＳＨ−ＡＰポリペプチドとの間の相互作用と干渉する。例えば、抗ウイルス薬は、ＰＯＳＨとＰＯＳＨ−ＡＰポリペプチド、例えば、別のＰＯＳＨポリペプチド（ＰＯＳＨダイマー、２つの異なるＰＯＳＨポリペプチドのヘテロダイマー、ホモマルチマー及びヘテロマルチマーのような場合）； GTPase（例えば、Rac、Rac1、Rho、Ras）；Ｅ２酵素及びユビキチン、又は任意にcullin；クラスリン；AP-1；AP-2；HSP70； HSP90、 Brca1、 Bard1、 Nef、 PAK1、 PAK2、 PAKファミリー、Vav、 Cdc42、 PI3K（例えば、p85もしくはp110）、Nedd4、src（srcファミリー）、Gag、特にＨＩＶ Gag、Tsg101、 VASP、 RNB6、 WASP、 N-WASP及びKIAA0674、Spred-2と同様に、ならびにいくつかの態様において、クラスリンコート小胞と関連することが既知の蛋白質及び又は、蛋白質選別に関与する蛋白質との間の相互作用を破壊するか、又は、不可逆とする。さらに別の態様において、本発明の薬剤は、JNK及び/又はNF-κBシグナリングと干渉する抗アポトーシス剤である。さらに別の態様において、本発明の薬剤は、Rac又はRasなどのGTPaseのシグナリングと干渉し、任意にＰＯＳＨポリペプチドとRac蛋白質との間の相互作用を破壊する。いくつかの態様において、本発明の薬剤は、ＰＯＳＨのユビキチンリガーゼ活性を調節し、また、ユビキチンリガーゼ活性に関連するいくつかの疾患を治療するために使用することができる。
【０２０２】
いくつかの態様において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチンに関連する活性を増加又は減少する活性を同定、最適化又はそうでなければ評価するためのアッセイを提供する。ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチンに関連する活性は、通常、ユビキチンのＥ２酵素からＰＯＳＨポリペプチドへの移入に関与する、ＰＯＳＨポリペプチドの自己ユビキチン化活性、及び通常ユビキチンのＰＯＳＨポリペプチドから標的蛋白質への転位に関与する標的蛋白質のユビキチン化を含むことができる。いくつかの態様において、ＰＯＳＨ活性は、少なくとも部分的に、ＰＯＳＨ ＲＩＮＧドメインによって媒介される。
【０２０３】
いくつかの態様において、アッセイは、ＰＯＳＨポリペプチド、E2ポリペプチド及びユビキチン源（ユビキチンと予め混合されているE2ポリペプチドであってもよい）を含む混合物を形成することを含む。任意に、該混合物は、E１ポリペプチドを含み、任意に、該混合物は、標的ポリペプチドを含む。該混合物の追加的成分は、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン化に矛盾しない条件を提供するように選択することができる。ＰＯＳＨ−ユビキチン接合体、E２−ユビキチンチオエステル、遊離ユビキチン及び標的ポリペプチド−ユビキチン複合体などの、１以上のパラメータのばらつきを検出してもよい。本明細書において「検出する」という用語は、対象となる検出（例えば、ＰＯＳＨ−ユビキチン、Ｅ２−ユビキチン、など）の存在もしくは不存在、対象となる検出の量の定量的測定、又は対象となる検出の存在、不存在又は量の、他のパラメータに基づく数学的計算を含むものとして用いられている。「検出する」という用語は、検出対象が感受性を持たない、もしくはそのレベル以下であると判定される状況を含む。検出は、標識（例えば、蛍光標識、放射性同位体標識及び下記に記載のその他のもの）、解像度及び大きさによる同定（例えば、SDS-PAGE、質量分光法）、精製及び検出、及び当該技術の当業者が本明細書に鑑み、入手可能である他の方法の検出を含むことができる。例えば、放射性同位体標識化は、シンチレーション計数、又は写真用エマルジョンに曝した後の濃度計測によって、又はPhosphorimager. Likewiseのような装置を用いることによって、測定することができる。濃度計測を用いて、酵素標識を用いたとき不透明な産物を生成する酵素標識基質と反応した後、ユビキチンとの結合を測定してもよい。好ましい態様において、アッセイは、ＰＯＳＨ−ユビキチン接合体を決定することを含む。
【０２０４】
いくつかの態様において、アッセイは、ＰＯＳＨ ポリペプチド、標的ポリペプチド及びユビキチン源（ユビキチンと予め混合されているE2ポリペプチドであってもよい）を含む混合物を形成することを含む。任意に、該混合物は、Ｅ１及び/又はＥ２ポリペプチドを含み、任意に、該混合物は、Ｅ２−ユビキチンチオエステルを含む。該混合物の追加的成分は、標的ポリペプチドのユビキチン化に矛盾しない条件を提供するように選択することができる。ＰＯＳＨ−ユビキチン接合体、E２−ユビキチンチオエステル、遊離ユビキチン及び標的ポリペプチド−ユビキチン複合体などの、１以上のパラメータのばらつきを検出してもよい。好ましい態様において、アッセイは、標的ポリペプチド−ユビキチン接合体を検出することを含む。別の好ましい態様において、アッセイは、ＰＯＳＨ−ユビキチン接合体を検出することを含む。
【０２０５】
上記のアッセイは、ＰＯＳＨポリペプチドのユビキチンに関連する活性を調節する薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて用いてもよい。スクリーニングアッセイは、通常上記アッセイのうちの１つ、又はＰＯＳＨポリペプチドのユビキチン関連活性活性を評価するため設計された他のいずれかのアッセイに試験物質を添加することを含む。又は、スクリーニングアッセイにおいて検出されたパラメーターは、好適な参照と比較してもよい。好適な参照は、以前に、平行してもしくは後から行われたアッセイであってもよい。好適な参照はまた、試験化合物を用いずに以前に測定されたものの平均であってもよい。通常、スクリーニングアッセイ混合物の化合物は、評価すべき活性全体に矛盾しない順序で添加してもよいが、いくつかの変形は好ましい。例えば、いくつかの態様において、試験物質及びＥ３（例えば、ＰＯＳＨポリペプチド）をプレインキュベートし、その後試験物質を除去し、他の成分を添加してアッセイを完了することが望ましいかもしれない。この方法で、薬剤のみがＰＯＳＨポリペプチドに及ぼす効果を評価してもよい。いくつかの好ましい態様において、抗ウイルス薬のためのスクリーニングアッセイは、Ｌドメイン及び好ましくはＨＩＶＬドメインを含む標的ポリペプチドを採用する。
【０２０６】
いくつかの態様において、アッセイはハイスループット形式で行われる。例えば、混合物の成分の１つを固体基質に付着させることができ、そして１以上の他の成分を標識する。例えば、ＰＯＳＨポリペプチドは、９６ウェルプレートのような表面に付着してもよく、ユビキチンを溶液中に入れ、標識する。E２及びE１もまた溶液中に入れ、ＰＯＳＨ−ユビキチン接合体形成を固体表面を洗浄し、混合されなかった、標識されたユビキチンを除去し、結合して残っているユビキチンを検出することによって測定してもよい。他の変形例を用いてもよい。例えば、溶液中のユビキチンの量を検出してもよい。いくつかの態様において、ユビキチン複合体の形成は、F RETのような、相互作用的技法によって測定してもよい。そこでは、ユビキチンを第１の標識によって標識し、所望の複合体パートナー（例えば、ＰＯＳＨポリペプチド又は標的ポリペプチド）を第２の標識によって標識し、第１及び第２の標識が近接して変化した信号を作製するときにとき相互作用する。FRETにおいては、第１及び第２の標識は、蛍光体である。FRETについて、以下において、より詳細に説明する。ポリユビキチン複合体の形成は、ポリユビキチンを形成する時に相互作用する、異なるように標識付けされたユビキチンの２つ以上のプールを混合することによって形成してもよい（例えば、米国特許第20020042083号を参照されたい）。ハイスループットは、溶液中と同様、FRETのような相互作用的アッセイを行うことによって達成することができる。さらに、もしＰＯＳＨポリペプチド又は標的ポリペプチドなどの混合物中のポリペプチドを容易に精製することが可能であれば（例えば、特異的な抗体を用いて、又はビオチン、FLAG、ポリヒスチジンなどのタグを介して）、その反応を溶液中で行うことができ、タグをつけられたポリペプチドを、タグをつけられたポリペプチドと関連するユビキチンなどのあらゆるポリペプチドと一緒に迅速に単離することができる。蛋白質はまた、検出のためにSDS-PAGE によって分解してもよい。
【０２０７】
いくつかの態様において、ユビキチンは、直接的又は間接的に標識される。これによって、典型的に、連結されたユビキチンの検出及び測定を容易かつ迅速に行うことができ、アッセイを、ハイスループットスクリーニング用途に有用なものとする。上記したように、いくつかの態様は、１以上の、タグを付けられた、もしくは標識付けされた蛋白質を採用する。「タグ」は、タグをつけられたポリペプチドの迅速な単離を促進する部分を含むことが意図されている。タグは、ポリペプチドを表面に付着するのを容易にするために用いることができる。「標識」は、標識されたポリペプチドの検出を容易にする部分を含むことが意図されている。いくつかの部分は、標識として及びタグとして用いることができる（例えば、容易に精製され、よく特徴付けられた抗体を用いて検出されたエピトープタグ）。ポリペプチドのビオチン化もよく知られている。例えば、蛋白質、核酸、炭水化物及びカルボン酸のビオチン化のためのアミン反応性及びチオール反応性物質を含む、多くのビオチン化物質が公知である。Molecular Probes Catalog；Haugland、第６版、1996、第４章を参照されたい。本明細書中に引用によって援用する。ビオチン化された基質は、アビジン又はストレプトアビジンを介して、ビオチン化された成分に付着することができる。同様に、多くのハプテン化試薬（haptenylation reagents）も公知である。
【０２０８】
「E１」は、ユビキチン活性化酵素である。好ましい態様において、E１は、ユビキチンをＥ２に移入することができる。好ましい態様において、Ｅ１は、ユビキチンとの高エネルギーチオエステル結合を形成し、それによってユビキチンを「活性化」する。「Ｅ２」は、ユビキチン担体酵素である（ユビキチン結合酵素としても知られている）。好ましい態様において、ユビキチンは、E１からＥ２へ移入される。好ましい態様において、転移の結果、Ｅ２とユビキチンの間にチオエステル結合が生じる。好ましい態様において、Ｅ２は、ユビキチンからＰＯＳＨポリペプチドへの転移を可能にする。
【０２０９】
別の態様において、ＰＯＳＨポリペプチド、Ｅ２又は標的ポリペプチドを、任意にタグの援助を受けて、ビーズに結合させる。連結後、そのビーズは、結合していないユビキチンから分離し、結合しているユビキチンを測定することができる。好ましい態様において、ＰＯＳＨポリペプチドをビーズに結合する。また用いられる組成物は、標識されたユビキチンを含む。この態様において、結合ユビキチンを持つビーズは、蛍光活性化セルソーティング （FACS）装置を用いて分離してもよい。そのような使用方法は、米国特許出願第09/047,119号に記載されている。その全体を本明細書中に引用によって援用する。次に、結合しているユビキチンの量を測定することができる。
【０２１０】
スクリーニングアッセイにおいて、試験物質の効果は、例えば、試験物質のカイネティクス、定常状態及び/又は反応の指標に及ぼす影響を評価することによって評価してもよい。
【０２１１】
本明細書で提供される種々のアッセイ混合物の成分は、量を変化させて比較してもよい。好ましい態様において、ユビキチン（又は、Ｅ２複合体化ユビキチン）を、反応溶液１００マイクロリットルあたり、５〜２００ngの最終濃度で組み合わせる。任意に、Ｅ１を、反応溶液１００マイクロリットルあたり、１〜５０ngの最終濃度で組み合わせる。任意に、Ｅ２を、反応溶液１００マイクロリットルあたり、１０〜１００ngの最終濃度で組み合わせる。好ましい態様において、ＰＯＳＨポリペプチドを、反応溶液１００マイクロリットルあたり、１〜５００ngの最終濃度で組み合わせる。
【０２１２】
通常、アッセイ混合物は、ユビキチンリガーゼ活性及び/又はユビキチン化活性に都合がよいように調製される。通常、これは、５０〜２００ｍＭの塩（例えば、NaCl、KCl）、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８といった生理学的条件であろう。そのような条件は、試行錯誤によって最適化することができる。最適な活性を促進するための温度、典型的には、４〜４０℃でインキュベーションすることができる。インキュベーション時間は、最適な活性化を行い、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするように選択することができる。典型的には、０．５〜１．５時間で十分であろう。組成物中に様々な他の試薬を含んでもよい。これらは、塩、溶媒、緩衝液、中性蛋白質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような、ユビキチン化酵素活性を促進し、及び/又は、非特異的又は背景相互作用を減少させる、試薬をを含んでもよい。また、その他の点では、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効果を高める試薬を用いてもよい。組成物は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）含むことが好ましいであろう。ユビキチンリガーゼ活性を促進する、又は候補調節効果の同定を最適化するあらゆる順序で、成分の混合物を添加してもよい。好ましい態様において、ユビキチンは、反応緩衝溶液中において提供され、その後、ユビキチン化酵素を添加する。別の好ましい態様において、ユビキチンは、反応緩衝溶液において提供され、候補調節物質が添加され、次にユビキチン化酵素が添加される。
【０２１３】
通常、ＰＯＳＨユビキチンに関連する活性を減少させる試験物質を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＯＳＨ機能を阻害することができる。一方、ＰＯＳＨユビキチンに関連する活性を増加させる試験物質を用いて、インビボでのＰＯＳＨ機能を刺激してもよい。試験物質は、インビボでの使用のために、例えば、エステルのような疎水部分を添加することによって改質してもよい。
【０２１４】
本発明のいくつかの態様は、ＰＯＳＨポリペプチド、任意にＳＨ３又はＲＩＮＧドメインのようなＰＯＳＨの特定のドメインと結合する物質を同定するためのアッセイに関する。好ましい態様において、ＰＯＳＨポリペプチドは、ｈＰＯＳＨの第４のＳＨ３ドメイン（配列番号３０）を含むポリペプチドである。この目的のために標識されたインビトロ蛋白質−蛋白質結合アッセイ、電気泳動的移動度シフトアッセイ、蛋白質結合のためのイムノアッセイなどを含む、様々なアッセイを用いることができる。精製された蛋白質はまた、細胞内相互作用のモデル化及び試験物質の設計に用いることができる、３次元結晶構造を測定するために用いることができる。ある態様において、アッセイは、１以上のＰＯＳＨポリペプチドの相互作用をＰＯＳＨ−ＡＰを用いて阻害する物質を検出する。別の態様において、アッセイは、酵素活性、他の細胞成分との結合、細胞区画化などのＰＯＳＨポリペプチド又はＰＯＳＨ複合体の固有の生物学的活性を調節する物質を検出する。
【０２１５】
１つの局面において、本発明は、ＰＯＳＨポリペプチドの機能と干渉する組成物の同定のための方法及び組成物を提供する。ウイルス生成におけるＰＯＳＨポリペプチドの役割を例にとれば、ＰＯＳＨポリペプチド間の蛋白質−蛋白質相互作用の形成又は安定性を不安定にする組成物及びそれらが、例えば、ＰＯＡＨ−ＡＰ、特にウイルス蛋白質を含むＰＯＳＨ複合体と相互作用する蛋白質は、ウイルス感染の治療のための候補製剤となる。
【０２１６】
メカニズムに拘束されることを望むわけではないが、ＰＯＳＨポリペプチドが、ビリオン及び他の生物学的プロセスにおいて重要な蛋白質複合体の構築を促進することは自明のことと考えられる。本発明の複合体は、ＰＯＳＨポリペプチドと１以上の下記のＰＯＳＨ−ＡＰとの組み合わせを含んでもよい。ＰＯＳＨ−ＡＰ、ＰＯＳＨポリペプチド（ＰＯＳＨダイマー、２つの異なるＰＯＳＨポリペプチドのヘテロダイマー、ホモマルチマー及びヘテロマルチマーのような場合）； GTPase（例えば、Rac、Rac1、Rho、Ras）；Ｅ２酵素及びユビキチン、又は任意にcullin；クラスリン；AP-1；AP-2；HSP70； HSP90、 Brca1、 Bard1、 Nef、 PAK1、 PAK2、 PAKファミリー、Vav、 Cdc42、 PI3K（例えば、p85もしくはp110）、Nedd4、src（srcファミリー）、Gag、特にＨＩＶ Gag、Tsg101、 VASP、 RNB6、 WASP、 N-WASP及びKIAA0674、Spred-2と同様に、ならびにいくつかの態様において、クラスリンコート小胞と関連することが既知の蛋白質及び又は、蛋白質選別経路に関与する蛋白質。
【０２１７】
ＰＯＳＨポリペプチドによて形成される複合体の種類は、蛋白質内に存在するドメインに依存する。限定することを意図されるわけではないが、潜在的な相互作用をする蛋白質のドメインの例を以下に示す。ＲＩＮＧドメインは、cullins、Ｅ２酵素、AP-1、AP-2及び/又はユビキチン化のための基質（例えば、いくつかの例において、Gag Ｌドメインを含む蛋白質）と相互作用することが期待される。ＳＨ３ドメインは、Gag Ｌドメイン及び配列モチーフP（T/S）AP、 RXXP（T/S）AP、 PXXDY、 PXXP、 PPXY 又はRXXPXXPをもつ例えば、RQGPKEPFR、 PFRDY、 PTAP及びRPEPTAP などのHIV Gag配列のような配列をもつその他の蛋白質と相互作用することができる。
【０２１８】
抗ウイルス薬又は抗アポトーシス剤のための好ましいアッセイでは、試験物質について、それがＰＯＳＨポリペプチド及びRacポリペプチド、特にRac1のようなヒトRacポリペプチドの複合体の形成を分解するもしくは阻害することができる能力を持つかどうかを評価される。
【０２１９】
種々のアッセイ形態が可能であろう。そして、本明細書に明確に記載されていないものであっても、当該技術の当業者によって本開示に鑑み、予期されるであろう。蛋白質複合体の形成のような条件に近似するアッセイ形態、酵素活性、及びさらにはＰＯＳＨポリペプチド媒介性膜認識又は小胞形成活性は、様々な形式で生成されることができ、それは、無細胞系を基礎としたアッセイ、例えば、精製された蛋白質又は細胞ライセート、ならびにインタクト細胞を利用する細胞ベースアッセイを含む。単純な結合アッセイも、ＰＯＳＨと結合する物質を検出するために用いることができる。そのような結合アッセイはまた、ＰＯＳＨポリペプチドとＰＯＳＨ相互作用蛋白質との間の相互作用、又はＰＯＳＨポリペプチド及びＰＯＳＨ相互作用蛋白質、又は基質との複合体を破壊することによって機能する物質を同定することもできる。試験される物質は、例えば、細菌、酵母、又は、化学的に合成された（例えば、ペプチドミメティクスを含む小分子）もしくは組換えによって生成されたその他の有機物（例えば、天然の産物）によって作製されることができる。好ましい態様において、試験物質は、例えば、ペプチド又はオリゴヌクレオチド以外の、分子量約２０００ダルトン未満の有機物小分子である。
【０２２０】
化合物のライブラリー及び天然の抽出物を試験する、多くの薬物スクリーニングプログラムにおいては、所与の期間において調べる化合物の数を最大にするためにハイスループットアッセイが望ましい。例えば、精製されたもしくは半精製された蛋白質もしくはライセートを用いて開発されてもよい、無細胞系において行われる本発明のアッセイは、それらが生成されて急速な進行及び、試験化合物によって媒介される分子標的における変化の比較的容易な検出を可能にする「一次」スクリーンとして、しばしば好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性及び/又び生物学的利用能は、通常インビトロ系においては無視することができる。該アッセイは、他の蛋白質との結合アフィニティの改変又は分子標的の酵素的ペプチドの変化において明らになるであろう、薬物の分子標的に及ぼす効果に主に注目している。 
【０２２１】
本発明のアッセイの好ましいインビトロの態様において、再構成されたＰＯＳＨ複合体は、少なくとも半精製蛋白質を含む再構成された混合物を含む。半精製されていることによって、再構成された混合物に用いられた蛋白質があらかじめ他の細胞もしくはウイルス蛋白質から分離されていることを意味する。例えば、細胞ライセートとは対照的に、ＰＯＳＨ複合体形成に関与する蛋白質は、混合物中に、他の全ての蛋白質に対して、少なくとも５０％、より好ましくは９０〜９５％の純度で存在する。対象となる方法のいくつかの態様において、再構成された蛋白質は、高度に精製された蛋白質と混合することによって誘導される。その結果、再構成された混合物は、ＰＯＳＨ複合体構築及び/又は分解を測定する能力と干渉し、そうでなければそれを変更する、他の蛋白質（例えば、細胞もしくはウイルス起源）を実質的に欠く。
【０２２２】
候補阻害剤の存在下及び非存在下で、ＰＯＳＨ複合体をアッセイすることは、反応物を含有するのに好適なあらゆる容器において達成される。例としては、マイクロタイタープレート、試験管、及びマイクロ遠心チューブがある。
【０２２３】
本発明のある態様において、ＰＯＳＨ複合体の構築又は安定性に干渉することができる能力を基礎として、阻害剤を検出する薬物スクリーニングアッセイを生成することができる。結合アッセイの例において、対象となる化合物を、ＰＯＳＨポリペプチド及び少なくとも１つの相互作用ポリペプチドを含む混合物と接触させる。ＰＯＳＨ複合体の検出及び定量化は、化合物が２つのポリペプチド間の相互作用を阻害する（あるいは高める）効力を測定する手段を提供する。該化合物の効力は、試験化合物の種々の濃度を用いて得たデータからの用量反応曲線を作成することによって評価することができる。さらに、対照アッセイを行って、比較のための基本線を提供することもできる。対照アッセイにおいて、複合体の形成は、試験化合物の不存在下で定量される。
【０２２４】
ＰＯＳＨポリペプチドと基質ポリペプチドの間の複合体形成は、上記した種々の技法によって検出してもよく、その多くは効率的に上述される。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識された（例えば、放射性標識された、蛍光標識された、又は酵素的に標識された）蛋白質を用いて、イムノアッセイ又はクロマトグラフィーによる検出によって、定量化することができる。例えば、Biacore International AB （Uppsala、Sweden）から入手可能なものような表面プラスモン反応系を用いて、蛋白質−蛋白質相互作用を検出することもできる。
【０２２５】
しばしば、ポリペプチドの１つを固定化し、蛋白質の非複合体形状から複合体を分離することを容易にすること、及び該アッセイの自動化に対応することが望ましいであろう。ある例示的態様において、蛋白質が不溶性のマトリクスと結合することを可能にするドメインを追加した融合蛋白質を提供することができる。例えば、ＧＳＴ−ＰＯＳＨ融合蛋白質は、グルタチオンセファロースビーズ上（Sigma Chemical、 St. Louis、 MO）又はグルタチオン由来のマイクロタイタープレート上に吸着することができる。次いでそれを、潜在的な相互作用をする蛋白質、例えば、３５Ｓ標識ポリペプチド及び試験化合物と組み合わせ、複合体形成に導かれる条件下でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、相互作用するあらゆる結合していない蛋白質を除去し、放射性標識されたマトリックスビーズ結合を直接（例えば、シンチラント中に配置されたビーズ）、又は、例えば、マクロタイタープレートを用いたときは複合体を解離した後の上清中で測定する。あるいは、非結合の蛋白質を洗浄した後、複合体をマトリクスから解離し、SDS-PAGEゲルによって分離する。そして、標準的な電気泳動技法を用いて、ゲルから相互作用をするポリペプチドのレベルを定量化する。
【０２２６】
さらに別の態様において、ＰＯＳＨに結合する物質は、固定化されたＰＯＳＨを用いて同定してもよい。例示的な態様において、融合蛋白質を提供し、蛋白質が不溶性のマトリクスと結合することを可能にするドメインを追加することができる。例えば、ＧＳＴ−ＰＯＳＨ融合蛋白質は、グルタチオンセファロースビーズ上（Sigma Chemical、 St. Louis、 MO）又はグルタチオン由来のマイクロタイタープレート上に吸着することができる。次いでそれを、潜在的な標識結合物質と組み合わせ、複合体形成に導かれる条件下でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、相互作用するあらゆる結合していない物質を除去し、放射性標識されたマトリックスビーズ結合を直接、又は、結合物質を解離した後の上清中で測定する。
【０２２７】
さらに別の態様において、ＰＯＳＨポリペプチド及び潜在的な相互作用をするポリペプチドを用いて、蛋白質との相互的な結合を破壊する物質を検出するための、続く相互作用トラップアッセイを生成する（また、米国特許第5,283,317号、Zervosら（1993） Cell 72:223-232; Madura ら（1993） J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel ら、（1993）Biotechniques 14:920-924; 及びIwabuchiら、（1993） Oncogene 8:1693-1696を参照されたい）。
【０２２８】
特に、該方法は、ハイブリッド蛋白質を発現するキメラ遺伝子を用いる。例えば、第１のハイブリッド遺伝子は、「餌」蛋白質、例えば、蛋白質相互作用部分と結合するための十分な長さのＰＯＳＨポリペプチドのコード配列にフレームで、融合することができる転写活性剤のＤＮＡ結合ドメインのコード配列を含む。第２のハイブリッド蛋白質は、「フィッシュ」蛋白質、例えば、餌融合蛋白質のＰＯＳＨポリペプチド部分と相互作用するのに十分な長さの潜在的相互作用蛋白質をコードする遺伝子に、フレームで、融合する転写活性剤ドメインをコードする。もし餌及びフィッシュ蛋白質が相互作用することができれば、例えば、ＰＯＳＨ複合体を形成することができえれば、それらは、転写活性剤の２つのドメインに密接に近接する。転写活性剤の２つのドメインとの、この近接は、転写活性剤に反応する転写調節部位と作動可能に連結するレポーター遺伝子の転写を生じさせ、レポーター遺伝子の発現が検出され、餌蛋白質とフィッシュ蛋白質との相互作用を得るために用いることができる。
【０２２９】
本発明において、該方法は、宿主細胞、好ましくは、酵母細胞、例えば、キラー酵母（Kluyverei lactis）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、イモチ病菌ウイルス（Ustilago maydis）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、アカパンカビ（Neurospora crass）、クロカビ（Aspergillus niger）、偽巣性コウジ菌（Aspergillus nidulans）、Pichia pastoris、カンジダトロピカリス（Candida tropicalis）、及びHansenula polymorphaであり、最も好ましくは、出芽酵母または分裂酵母である、宿主細胞を提供することを含む。該宿主細胞は、餌蛋白質に用いられる転写活性剤のＤＮＡ結合ドメインの結合部位を持つレポーター遺伝子を含有し、その結果、レポーター遺伝子は、該遺伝子が転写的に活性化されたとき、検出可能な産物を発現する。第１のキメラ遺伝子は、宿主細胞宿主細胞の染色体に存在していてもよく、又は、発現ベクターの一部として存在していてもよい。相互作用トラップアッセイはまた、哺乳動物細胞型及び細菌細胞型として行うこともできる。
【０２３０】
宿主細胞はまた、宿主細胞中で発現することができる第１のキメラの遺伝子を含む。該遺伝子は、（ｉ）宿主細胞のレポーター遺伝子上の応答エレメントを認識する、ＤＮＡ結合ドメイン、及び（ｉｉ）ＰＯＳＨポリペプチド配列のような餌蛋白質、を含むキメラ蛋白質をコードする。 
【０２３１】
第２のキメラ遺伝子はまた、宿主細胞において発現することができ、「フィッシュ」融合蛋白質をコードするように提供される。ある態様において、第１及び第２のキメラ遺伝子は、プラスミドの形態で宿主細胞に導入される。しかしながら、好ましくは、第１のキメラ遺伝子は、宿主細胞宿主細胞の染色体に存在し、第２のキメラ遺伝子はプラスミドの形態で宿主細胞に導入されることが好ましい。
【０２３２】
第１のハイブリッド蛋白質のＤＮＡ結合ドメイン及び第２のハイブリッド蛋白質の転写活性化ドメインは、分離可能なＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを持つ転写活性剤に由来することが好ましい。例えば、これらの分離したＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインは、酵母GAL４蛋白質中に見出されることがわかっており、また、酵母GCN４及びADR１中に見出されることがわかっている。転写に関与する多くの他の蛋白質も、本発明にとって有用な結合ドメイン及び転写活性化ドメインを持ち、例えば、LexA及びVP16蛋白質を含む。他の（実質的に）転写的に不活性なＤＮＡ結合ドメインを、ACE1、 lcI、 lacリプレッサー、jun もしくはfosのドメインのような対象となるコンストラクトに用いることができる。別の態様において、ＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインは、異なる蛋白質から構成されていてもよい。LexA ＤＮＡ結合ドメインを使用することによって、いくつかの利点がもたらされる。例えば、酵母において、LexA部分は、活性化機能を含有しておらず、酵母の転写に及ぼす公知の効果がない。さらに、LexAを使用することによって、アッセイの感受性 を相互作用のレベルに制御することが可能となる（例えば、Brentら、ＰＣＴ国際公開WO94/10300号を参照されたい）。
【０２３３】
好ましい態様において、餌又はフィッシュ蛋白質と関連する、あらゆる酵素活性が不活性化される。例えば、ＰＯＳＨポリペプチドのドミナントネガティブ又は他の突然変異を用いることができる。
【０２３４】
さらに、例示的な例では、もしあれば、宿主細胞中の餌蛋白質とフィッシュ融合蛋白質の間の、ＰＯＳＨポリペプチド媒介型相互作用によって、活性化ドメインが、レポーター遺伝子の転写の活性化を引き起こす。その方法は、第１のキメラ遺伝子及び第２のキメラ遺伝子を宿主細胞中に導入し、その細胞を餌及びフィッシュ融合蛋白質がレポーター遺伝子を活性化するのに十分な量で発現する条件下におくことによって行われる。ＰＯＳＨ−ＰＯＳＨ-ＡＰ複合体の形成によって、レポーター遺伝子の発現によって生成される検出可能な信号が生じる。したがって、試験化合物の存在下及び試験化合物の不存在下における複合体の形成のレベルは、それぞれのケースにおけるレポーター遺伝子の発現のレベルを検出することによって、評価することができる。種々のレポーターコンストラクトは、本発明の方法において用いることができ、例えば、そのような検出可能なシグナルを酵素シグナル、蛍光シグナル、リン光シグナル及び薬物抵抗性から選択されるように信号を生成するレポーター遺伝子を含む。
【０２３５】
本発明の１つの局面は、ＰＯＳＨポリペプチド及び１以上の相互作用するポリペプチドを含む、再構成された蛋白質製剤を提供する。
【０２３６】
本発明のアッセイのさらに別の態様において、ＰＯＳＨ複合体は、対象となるアッセイを支持するための細胞培養技法の利点を用いて、細胞全体において生成される。例えば、以下に述べるように、ＰＯＳＨ複合体は、哺乳動物細胞や酵母細胞を含む真核細胞培養系において構成されることができる。しばしば、１以上のウイルス蛋白質（例えば、Gag又はEnv）を、対象となるＰＯＳＨ ポリペプチドに沿った細胞において発現することが望ましいだろう。細胞を関連するウイルスに感染させることも望ましいかもしれない。対象となるアッセイを、インタクト細胞において生成させることの利点は、環境において、阻害剤の治療的使用が要求する環境により近づける機能を果たす阻害剤を検出することができることを含み、薬剤が細胞に入る能力を含む。さらに、いくつかのアッセイのインビボ環境での態様において、例えば、下記の例は、候補物質のハイスループット分析に適用される。
【０２３７】
ＰＯＳＨ複合体の成分は、アッセイを支持するために選択された細胞に対して内因性である。あるいは、一部もしくは全ての成分を外因性のソースから導くことができる。例えば、融合蛋白質は、組換え技法（例えば、発現ベクターの使用によって）によって、ならびに融合蛋白質そのもの又は該融合蛋白質をコードするｍＲＮＡをマイクロインジェクションによって細胞中に導入することができる。
【０２３８】
多くの態様において、細胞は、候補物質とともにインキュベートした後、操作される。そしてＰＯＳＨ活性についてアッセイする。いくつかの態様において、ＰＯＳＨ活性は、ウイルス様粒子の生成によって表される。本明細書において実証されているように、ＰＯＳＨ活性を破壊する物質は、ウイルス様粒子の生成を減少させる。ＰＯＳＨ活性のための他のバイオアッセイは、アポトーシスアッセイ（例えば、細胞生存アッセイ、アポトーシスレポーター遺伝子アッセイなど）及びNF-κB核局在化アッセイ（例えば、Taponら、（1998） EMBO J. 17: 1395-1404を参照されたい）を含む。いくつかの態様において、ＰＯＳＨ活性は、限定されないが、複合体形成、ユビキチン化及び膜融合現象（例えば、ウイルス出芽の放出もしくは小胞の融合）を含む。ＰＯＳＨ複合体形成は、免疫沈降及び共免疫沈降された蛋白質の分析又はアフィニティ精製及び共精製された蛋白質の分析によって評価することができる。蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence Resonance Energy Transfer）（FRET）ベースのアッセイを用いて、複合体形成を測定することもできる。互いに近接して接触している適切な発光スペクトル及び励起スペクトルを有する蛍光分子は、FRETを示すことができる。蛍光分子は、分子のうちの１つの分子（ドナー分子）の発光スペクトルが他の分子（アクセプター分子）の励起スペクトルと重なるように、選択される。ドナー分子は、ドナー励起スペクトル内で、適切な強度の光によって励起される。次にドナーは、蛍光として吸収されたエネルギーを発する。それが生成する蛍光エネルギーは、アクセプター分子によって急冷される。FRETは、ドナーからの蛍光シグナルの強度の減少、その励起された状態の寿命の減少、及び/又は長い波長（低エネルギー）での蛍光の特徴のアクセプターの再発光として明確に示され得る。蛍光蛋白質が分離されたとき、FRET効果は、減少又は除去される（米国特許第5,981,200号）。
【０２３９】
例えば、シアン蛍光蛋白質を、およそ４２５〜４５０ｎｍの波長の光によって励起し、４５０〜５００ｎｍの波長の光を発光する。黄色蛍光蛋白質を、５００〜５２５ｎｍの波長の光によって励起し、５２５〜５００ｎｍの波長の光を発光する。これら２つの蛋白質を溶液中に入れ、シアン及び黄色の機構を別々に視覚化してもよい。しかしながら、これら２つの蛋白質を互いに近接させると、蛍光特性は、ＦＲＥＴによって変わるだろう。CFPから発光された青色の光はYFPによって吸収され、黄色の光として再び発光されるであろう。このことは、蛋白質が波長４５０ｎｍの光によって刺激されたとき、シアン発光が大いに減少し、通常この波長では刺激されない黄色の光が大いに増加することを意味する。FRET は、典型的に、ドナーの刺激範囲の光による刺激に反応して発光された光のスペクトルを測定し、ドナー発光性の光とアクセプター発光性の光との間の率を計算することによってモニターする。ドナー発光性の光：アクセプター発光性の光の率が高いとき、FRETは生じず、２つの蛍光蛋白質は、近接していない。ドナー：アクセプターの発光の率が低いとき、FRETが生じ、２つの蛍光蛋白質は、近接している。この方法において、第１と第２のポリペプチドの間の相互作用を計算してもよい。 
【０２４０】
FRETの発生はまた、ドナー蛍光部分の寿命を減少させる原因となる。この蛍光寿命の変化は、蛍光寿命イメージングテクノロジー（FLIM）と呼ばれる技法を用いて測定することができる （Verveerら、（2000） Science 290: 1567-1570; Squireら、（1999） J. Microsc. 193: 36; Verveerら、（2000） Biophys. J. 78: 2127）。FLIMデータを分析するための全体的分析技法が開発されてきた。これらのアルゴリズムは、ドナー蛍光部分が、そのそれぞれが異なる蛍光寿命をもつ限られた状態においてのみ存在するという理解を用いている。各状態の定量マップをピクセルごとに生成することができる。
【０２４１】
FRETベースのアッセイを行うために、対象となるＰＯＳＨポリペプチド及び相互作用を行う蛋白質を双方とも蛍光標識する。好適な蛍光標識は、本明細書に鑑み、当該技術において公知である。例を以下に記載する。しかし、特に記載されていない好適な蛍光標識も当該技術の当業者は入手することができる。蛍光標識は、蛍光蛋白質、例えば、クラゲ、サンゴ及び他の腔腸動物から単離された蛍光蛋白質をもつ融合蛋白質として、ポリペプチドを発現することによって、達成してもよい。蛍光蛋白質の例としては、Aequoria victoriaの緑蛍光蛋白質（GFP）の多くの変種が含まれる。変種は、より明るくてもよいし、薄暗くてもよい。又は、異なる励起及び/又は発光スペクトルを持っていてもよい。いくつかの変形例は、それらがもはや緑として現れず、青、シアン、黄色もしくは赤として現れる（それぞれ、BFP、CFP、YFP及びRFPと呼ぶ）ように変化させる。蛍光蛋白質は、例えば、ペプチド結合（例えば、融合蛋白質として発現）、化学的架橋及びビオチン−ストレプトアビジン結合を含む、種々の共有結合及び非共有結合を介して安定にポリペプチドに付着してもよい。蛍光蛋白質の例としては、米国特許第5、625、048号；第5、777、079号；第6、066、476号；第6、124、128号；Prasherら、（1992） Gene、 111:229-233; Heimら、（1994） Proc. Natl. Acad. Sci.、 USA、 91:12501-04；Wardら、（1982） Photochem. Photobiol.、 35:803-808； Levineら、（1982） Comp. Biochem. Physiol.、 72B:77-85; Tersikhら、（2000） Science 290: 1585-88を参照されたい。
【０２４２】
当該技術において公知の他の蛍光部分の例としては、フルオレセインの誘導体、ベンゾオキサジアゾール（benzoxadioazole）、クマリン、エオシン、ルシファーイエロー、ピリジルオキサゾール及びローダミンがあげられる。こららの及び他の例の蛍光部分が、そのような部分を持つポリペプチドを改質するための方法とともにHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals （2000、 Molecular Probes、 Inc.）に見出されるであろう。蛍光部分と組み合わせたときに蛍光発光する蛋白質の例としては、Vibrio fischeri （Baldwin et al. （1990） Biochemistry 29:5509-15）からの黄色蛍光蛋白質、渦鞭毛藻類からのペリジニン−クロロフィルａ（peridinin-chlorophyll a）蛍光蛋白質（Morrisら、（1994） Plant Molecular Biology  24:673:77）及びSynechococcusなどの海生ラン藻からのフィコビリンタンパク質、例えば、フィコエリトリン及びフィコシアニン（Wilbanksら （1993） J. Biol. Chem. 268:1226-35）が含まれる。これらの蛋白質は、それぞれ蛍光共因子としてのフラビン、ペリジニン−クロロフィルａ（peridinin-chlorophyll a）及び種々フィコビリンが必要である。
【０２４３】
FRETベースのアッセイは、細胞ベースのアッセイ及び無細胞アッセイに用いることができる。FRETベースのアッセイは、蛍光活性化細胞ソーティング及びマイクロタイターの蛍光走査を含むハイスループットスクリーニング法の対象となる。
【０２４４】
さらなる態様において、ＰＯＳＨによって調節される遺伝子を同定するために、転写レベルをより高い又は低いレベルのＰＯＳＨ活性を持つ細胞内で測定することができる。そのような遺伝子（そのような遺伝子のより大きな部分）のプロモーター領域は、レポーター遺伝子と作動可能に連結し、レポーター遺伝子ベースのアッセイにおいて用いて、ＰＯＳＨ調節遺伝子発現を高めたり、又は減少させる物質を検出することができる。転写レベルは、当該技術において公知のあらゆる方法、例えば、ノーザンブロッティング、RT-PCR、マイクロアレイなどによって測定することができる。ＰＯＳＨ活性の上昇は、例えば、強いＰＯＳＨ発現ベクターを導入することによって達成することができる。ＰＯＳＨ活性の減少は、例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンス、リボザイム、遺伝子ノックアウトなどによって達成することができる。
【０２４５】
通常、スクリーニングアッセイは、結合アッセイ（蛋白質−蛋白質結合、物質−蛋白質結合など）であり、標識が直接的又は間接的に検出可能なシグナルを提供する場合、１以上の分子を標識に結合することができる。種々の標識としては、放射性同位体、螢光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁気粒子などが含まれる。特異的結合分子は、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどの対を含む。特異的結合部位としては、通常、相補的な部分が、検出のために用いられる分子によって、公知の方法にしたがって標識される。
【０２４６】
さらにさらなる態様において、本発明は、治療的介入のための標的を同定するための方法を提供する。ＰＯＳＨと相互作用する又はＰＯＳＨ媒介性のプロセス（例えば、ウイルス成熟）に関係するポリペプチドを、候補治療薬を同定するために用いることができる。そのような標的は、ＰＯＳＨ （ＰＯＳＨ−ＡＰｓ）と関連する蛋白質を同定することによって同定することができる。例えば、抗ＰＯＳＨ抗体を用いた免疫沈降、コンピュータでのハイスループットの結合データ分析、２ハイブリッドスクリーン、及び本開示を鑑み、当該技術において公知の本明細書及び他の箇所で記載されている他の蛋白質−蛋白質相互作用アッセイによって同定することができる。そのような標的に結合する又はそれらの蛋白質−蛋白質相互作用を破壊する、又はそれらの生化学的活性を阻害する物質を、そのようなアッセイにおいて用いることができる。そのようなアプローチによって同定されるかもしれない標的としては、GTPase （例えば、Rac、Rac1、Rho、Ras）； E2酵素、cullin；クラスリン；AP-1；AP-2；HSP70； HSP90、 Brca1、 Bard1、 Nef、 PAK1、 PAK2、 PAKファミリー、Vav、 Cdc42、 PI3K（例えば、p85もしくはp110）、Nedd4、src（srcファミリー）、Gag、特にＨＩＶ Gag、Tsg101、 VASP、 RNB6、 WASP、 N-WASP及びKIAA0674、Spred-2と同様に、ならびにいくつかの態様において、クラスリンコート小胞と関連することが既知の蛋白質及び又は、蛋白質選別経路に関与する蛋白質、Rac シグナリング経路に関与する蛋白質が含まれる。
【０２４７】
スクリーニングアッセイには、種々の他の試薬を導入することができる。これらは、塩、溶媒、緩衝液、中性蛋白質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような最適な蛋白質間結合を容易とし、ユビキチン化酵素活性を促進し、及び/又は、非特異的又は背景の相互作用を減少させる、試薬をを含んでもよい。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効果を高める試薬を用いてもよい。成分の混合物は、必要な結合を提供するあらゆる順序で添加される。インキュベーションは、あらゆる好適な温度、典型的には、４℃〜４０℃で行われる。インキュベーション時間は、最適な活性化を行い、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするように選択することができる
【０２４８】
いくつかの態様において、試験物質について、ＰＯＳＨポリペプチドの局在化、例えば、ＰＯＳＨの核及び/又はゴルジ体ネットワークに、局在化を不安定にすることができる能力があるかどうかを評価する。
【０２４９】
１０．ウイルス性障害の治療のための方法及び組成物
さらなる局面において、本発明は、ウイルス性障害、特に、レトロイドウイルス、ＲＮＡウイルス及び/又は限定されないがレトロウイルス、ラブドウイルス、レンチウイルス及びフィロウイルスなどを含むのエンベロープウイルスによって引き起こされる障害の治療のための方法及び組成物を提供する。本発明の好ましい治療薬は、ウイルス成熟におけるＰＯＳＨポリペプチド又はＰＯＳＨ複合体の生物学的活性を破壊することによって機能する。
【０２５０】
本発明の治療薬の例としては、例えば、 ＲＮＡｉコンストラクト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びＤＮＡ酵素などの核酸治療薬が含まれる。他のＰＯＳＨ治療薬としては、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、抗体及び小分子を含む治療薬がある。
【０２５１】
本発明のアンチセンス治療としては、ＰＯＳＨポリペプチドの発現を破壊するためのアンチセンス核酸、又はＰＯＳＨ機能に必要な蛋白質を導入する方法が含まれる。
【０２５２】
ＲＮＡｉ治療は、ＲＮＡｉコンストラクトをＰＯＳＨポリペプチドの発現をダウンレギュレーションするためのコンストラクト、又はＰＯＳＨ機能に必要な蛋白質を導入する方法が含まれる。ＲＮＡｉ治療薬の例は、配列番号１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４及び２５のいずれか１つを含む。.
【０２５３】
治療用ポリペプチドは、ポリペプチドをＰＯＳＨ複合体、例えばSH3又はRINGドメインの形成において重要ないくつかの蛋白質ドメインを模倣するように設計することによって生成することができる。例えば、配列番号３０に示されたSH３ドメインのようなＰＯＳＨ SH3 ドメインを含むポリペプチドを、ＰＯＳＨ SH3ドメインに結合するよう競合させ、よってパートナー蛋白質の結合を破壊する機能を果たす。ある態様において、結合パートナーはGagとすることができる。別の態様において、結合パートナーはRacとすることができる。さらに別の態様において、Lドメインに類似するポリペプチドは、ＰＯＳＨ複合体へのGagの再構成を破壊することもできる。
【０２５４】
本明細書に鑑み、ＰＯＳＨ及びＰＯＳＨ相互作用蛋白質のエピトープに対する抗体を生成する方法は、当該技術において公知である。抗体は、種々の方法によって細胞に導入することができる。１つの方法の例は、ＰＯＳＨ複合体を破壊することが可能な一本鎖抗体をコードする核酸を生成することを含む。そのような核酸は、標的細胞の表面上のレセプターと結合する抗体と結合することができる。いくつかの態様において、該抗体は、感染した細胞の表面に存在するウイルス蛋白質を標的とすることができ、このようにして感染した細胞のみに核酸を送達すると考えられている。標的細胞の表面に結合すると、該抗体は、エンドサイトーシスによって取り込まれ、接合型の核酸が転写及び翻訳されて、標的ＰＯＳＨ複合体と相互作用し、そしてそれを破壊する一本鎖の抗体を作製する。所望の一本鎖の抗体を発現する核酸はまた、ウイルストランスフェクション（例えば、アデノウイルス系を用いて）、又はリポソーム媒介型のトランスフェクションなどの種々のより便利な技法を用いて、細胞に導入することができる。
【０２５５】
本発明の小分子を、上記のように、ＰＯＳＨ複合体の形成を調節する能力によって同定され得る。
【０２５６】
本明細書の教示に鑑み、当該技術の当業者は、本発明の方法が例えば、レトロイドウイルス、ＲＮＡウイルス及びエンベロープウイルスなどの広範囲のウイルスに適用できることを理解するであろう。好ましい態様において、本発明は、レトロイドウイルスに適用できる。より好ましい態様において、本発明は、レトロウイルス（レトロウイルス科）にさらに適用できる。別のさらに好ましい態様において、本発明は、霊長類レンチウイルス群を含むレンチウイルスに適用できる。最も好ましい態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）に適用できる。   
【０２５７】
限定することを意図するわけではないが、関連するレトロウイルスは、Northern Pike においてリンパ肉腫を引き起こすＣ型レトロウイルス、ミンクを感染させるＣ型レトロウイルス、ヒツジを感染させるヤギレンチウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ブタを感染させるＣ型レトロウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＳＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、サル白血病ウイルス（ＳＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）及びヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）を含む。
【０２５８】
本発明の方法及び組成物はさらに、ssＲＮＡマイナス鎖ウイルス及びssＲＮＡプラス鎖ウイルスを含むＲＮＡウイルスに適用できる。ssＲＮＡプラス鎖ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含む。好ましい態様において、本発明は、フィロウイルスを含むモノネガウイルス目に適用できる。フィロウイルスは、さらに、エボラウイルス及びマールブルグウイルスを含む。
【０２５９】
他のＲＮＡウイルスは、エンテロウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス及びＡ型肝炎ウイルスなどのピコルナウイルス、ノーウォーク様ウイルスを含むカリチウイルス、狂犬病ウイルスを含むラブドウイルス、αウイルスを含むトーガ（toga）ウイルス、セムリキ森林ウイルス、 デングウイルス、黄熱病ウイルス及び風疹ウイルス、Ａ、Ｂ及びＣ型インフルエンザウイルスを含むオルソミクソウイルス、リフトバレーウイルス及びハンタウイルスを含むブニアウイルス、エボラウイルス及びマールブルグウイルスなどのフィロウイルス、ならびにおたふく風邪ウイルス及びはしかウイルスを含むパラミクソウイルスを含む。治療できるかもしれない追加的ウイルスとして、ヘルペスウイルスがある。.
【０２６０】
１１．効果的な用量
そのような化合物の毒性及び治療効果は、細胞培養中又は実験動物での標準的な製剤の処置、例えば、５０％致死量（Ｌｄ５０）（母集団の５０％が死に至る用量）及び５０％有効量（Ｅｄ５０）（母集団の５０％において治療的に有効な用量）の測定によって決定することができる。毒性と治療効果の比率は、治療的指標である。そして、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０と表すことができる。大きな治療的誘発を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよい。感染していない細胞に対する潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を減少させるために、そのような化合物を罹患組織の部位に標的化する送達系を設計は注意深く行う必要がある。
【０２６１】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータを、ヒトに使用するための用量範囲を処方する際に用いることができる。そのような化合物の用量は、毒性が少ないもしくは全くもたないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、採用された投与形態及び用いられる投与経路に依存してこの範囲内で変化してもよい。本発明の方法に用いられるあらゆる化合物について、治療的に有効な用量は、まず、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて処方して、細胞培養において決定するように、ＩＣ５０（すなわち、症状の半最大抑制を達成する化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲を達成することもできる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０２６２】
１２．製剤及び使用
本発明において使用される薬学的組成物は、１以上の生理学的許容できる担体又は添加剤を用いた常法により製剤することができる。したがって、化合物及びそれらの生理学的に許容できる塩及び溶媒は、例えば、注射、吸入又は注入（口もしくは鼻から）又は経口、頬側、非経口又は直腸投与によって投与するように製剤することができる。
【０２６３】
本発明の組成物の例としては、リポソーム系のような送達系と組み合わされた、任意に許容される添加物を含むＲＮＡｉを含む。好ましい態様において、組成物は、例えば、ヘルペスウイルス感染のための局所投与用に製剤することができる。
【０２６４】
そのような治療のために、本発明の化合物は、全身投与及び局所又は限局的投与を含む、様々な量の投与のために製剤することができる。技法及び製剤は一般的に、Remmington’s Pharmaceutical Sciences、 Meade Publishing Co.、 Easton、 PAを参照することができる。全身投与については、筋肉内、静脈内、腹腔内及び皮下といった注射が好ましい。注射には、本発明の化合物は、液体溶液、好ましくは、ハンクス液又はリンゲル溶液などの生理学的に適合性のある緩衝液中で製剤することができる。さらに、該化合物は、溶液剤型に製剤してもよく、また、使用直前に再び溶解もしくは懸濁させる剤型に製剤してもよい。凍結乾燥剤型も含まれる。
【０２６５】
経口投与では、薬学的組成物は、例えば、薬学的許容される添加剤、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；分解物質disintegrants（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ナトリウムラウリル硫酸塩）などを用いて従来の手段によって調製された錠剤又はカプセルの形状を取ることができる。錠剤は、当該技術において公知の方法によってコーティングすることができる。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、懸濁液の形状を取ることができる。又は使用前に、水もしくは好適な賦形剤を用いて構成するための乾燥産物として存在させることもできる。そのような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンもしくはアカシア）；非水系賦形剤（例えば、アチオンドオイル（ationd oil）、油性エステル、エチルアルコールもしくは分画された植物油）:及び保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシオキシベンゾエート又はソルビン酸）などの薬学的に許容できる添加物を用いて従来の手段で調製することができる。製剤は、適切であれば、緩衝塩、香味剤、着色剤及び甘味料を含有することができる。
【０２６６】
経口投与用製剤は、活性化合物の放出を制御するように好適に製剤することができる。頬側投与としては、常法によって調剤された錠剤又はロゼンジの剤型を取ることができる。吸入による投与としては、本発明で使用するための化合物を、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくはその他の好適な気体などの好適な噴霧剤を用いて、加圧パック又はネブライザーから出されるエアゾールスプレーの剤型で送達することが好都合である。加圧されたエアゾールの場合、用量単位は、測定された量を送達するための弁をもうけることによって測定することができる。例えば、吸入器又は注入器に用いられるゼラチンのカプセル及び薬包は、化合物及びラクトース又はデンプンなどの好適な粉末基剤を含有して調剤することができる。
【０２６７】
化合物は、注射、例えば、ボーラス注射又は連続的な注入によって、非経口投与用に調剤することができる。注射のための調剤は、例えば、アンプルもしくは多回用量容器中で、保存料を添加した単位用量の剤型とすることができる。組成物は、油性もしくは水溶性添加剤中の懸濁液、溶液もしくはエマルジョンの形状を取ることができ、懸濁剤、安定化剤、及び/又は分散剤などの製剤物質を含有することができる。あるいは、使用前には、活性成分を、例えば、無菌発熱物質自由水のような好適な添加剤を持つコンストラクトの粉末の剤型とすることができる。
【０２６８】
化合物はまた、例えば、ココアバター又は他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含有する、例えば、坐薬もしくは保留浣腸のような直腸用組成物とすることもできる。
【０２６９】
すでに述べた調剤に加えて、化合物はまた、デポー剤として調剤することができる。そのような長く機能する調剤は、埋め込み（例えば、皮下もしくは筋肉内）又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、該化合物は、好適なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂、又は溶解性が限られている誘導体、例えば、溶解性が限られている塩と一緒に調剤することができる。
【０２７０】
全身投与はまた、経粘膜もしくは経皮手段によって行うことができる。経粘膜もしくは経皮投与としては、通過すべきバリアにとって適切な浸透剤を調剤中に用いることができる。そのような浸透剤は、当該技術において一般的に知られており、そして例えば、経粘膜投与としては、界面活性剤に加えて、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を用いて、浸透を容易にすることができる。経皮投与は、点鼻薬を介して行われてもよい。局所投与としては、本発明のオリゴマーは、軟膏、膏薬、ジェルもしくはクリーム上に、当該技術において通常知られているように調剤される。洗浄液を用いて、局所的に用いて、外傷や炎症を治療し、癒合を早めることもできる。
【０２７１】
望ましければ、組成物は、活性成分を含有する１以上の単位用量の剤型を含有することができるパック中又はディスペンサー装置中に入れておくこともできる。パックは例えば、ブリスター包装のように、金属もしくはプラスチック箔を含むことができる。パック又はディスペンサー装置は、投与のための指示にしたがって行うことができる。
【０２７２】
核酸の投与を含む治療としては、本発明のオリゴマーを、全身投与及び局所もしくは局部投与を含む、種々の投与形態に調剤することができる。技法及び製剤は一般的に、Remmington’s Pharmaceutical Sciences、 Meade Publishing Co.、 Easton、 PAを参照することができる。全身投与については、筋肉内、静脈内、腹腔内、結節内、及び皮下といった注射が好ましく、本発明のオリゴマーは、液体溶液、好ましくは、ハンクス液又はリンゲル溶液などの生理学的に適合性のある緩衝液中で製剤することができる。さらに、該化合物は、溶液剤型に製剤してもよく、また、使用直前に再び溶解もしくは懸濁させる剤型に製剤してもよい。凍結乾燥剤型も含まれる。
【０２７３】
全身投与はまた、経粘膜もしくは経皮手段によって行うことができる、又は化合物は経口投与することができる。経粘膜もしくは経粘膜投与としては、通過すべきバリアにとって適切な浸透剤を調剤中に用いることができる。そのような浸透剤は、当該技術において一般的に知られており、そして例えば、経粘膜投与としては、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を用いて、浸透を容易にすることができる。さらに界面活性剤を用いて浸透を加速することもできる。経粘膜投与は、点鼻薬を介して行われてもよい。経口投与には、オリゴマーは、カプセル、錠剤及び強壮剤tonicsといった通常の経口投与の剤型に調剤される。局所投与としては、本発明のオリゴマーは、軟膏、膏薬、ジェルもしくはクリーム状に、当該技術において通常知られているように調剤される。
【０２７４】
実施例
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は下記の実施例をを参照することによって、より容易に理解されるであろう。実施例は、本発明のいくつかの局面及び態様を単に説明する目的のために含まれるものであって、本発明を限定することは意図されていない。
【実施例】
【０２７５】
１．ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の出芽におけるＰＯＳＨの役割
１．目的  
ＰＯＳＨ遺伝子の発現を阻害するためにＲＮＡｉを使用する。治療された及び治療されていない細胞中における、ウイルス出芽の効率とＧＡＧの発現およびプロセシングとを比較する。
【０２７６】
２．研究計画
標的蛋白質をノックダウンするために、ｍＲＮＡ特異的ＲＮＡｉでHeLa SS-6細胞をトランスフェクトする。ＲＮＡｉによる標的蛋白質の減少が最大に達するのは４８時間後であるので、細胞を２回、すなわち、最初は、標的mＲＮＡを減少させるために、次いで、ウイルス性Gag蛋白質を発現させるために、トランスフェクトする。２回目のトランスフェクションは、pNLenv（ＨＩＶをコードするプラスミド）及び低量のＲＮＡｉを用いて行い、gagの発現とVLPの出芽の間、標的蛋白質のノックダウンを維持する。ＲＮＡｉの効果によるmＲＮＡレベルの減少は、標的mＲＮＡのRT-PCR増幅によって確認する。
【０２７７】
３．方法、材料、溶液
ａ．方法
ｉ．製造業者のプロトコルにしたがった、処置に記載どおりのトランスフェクション
ｉｉ．Bradfordアッセイによる蛋白質の測定
ｉｉｉ．Hoeffer miniVE電気泳動システムにおけるSDS-PAGE。Bio-Rad mini-protean IIウェットトランスファーシステムにおける転写。Typhoonシステム及びImageQuant software （ABbiotech）を用いて視覚化したブロット。
【０２７８】
ｂ．材料
【表７】
2005519636.tif 000008
【０２７９】
ｃ．溶液
【表８】
2005519636.tif 000009
【０２８０】
４．処置
ａ．スケジュール
【表９】
2005519636.tif 000010
【０２８１】
ｂ．１日目
HeLa SS-6細胞を、６-ウェルプレート（３５ｍｍウェル）中で、濃度５×１０５細胞/ウェルで平板培養する。
【０２８２】
ｃ．２日目
トランスフェクションの２時間前に、成長培地を、抗生物質を含まない２ｍｌの成長培地で置換する。
【０２８３】
トランスフェクションＩ
【表１０】
2005519636.tif 000011
【０２８４】
トランスフェクション
反応ごとに、LF2000混合物：２５０μｌのOptiMEM＋５μｌのLF2000を調製する。反転で５回混合する。室温で５分間インキュベートする。
OptiMEM （表１、Ａ欄）中ＲＮＡ希釈液を調整する。LF2000混合物を、希釈されたＲＮＡ（表１、Ｂ欄）中に滴下する。ボルテックスで穏やかに混合する。室温で２５分間インキュベートし、アルミニウム箔で覆う。
５００μｌのトランスフェクション混合物を細胞に滴下し、左右に揺り動かして混合する。
一晩インキュベートする。
【０２８５】
ｄ．３日目
２４時間後、１：３に分割する（３つのウェル中に平板培養する反応２を除き、各反応につき、４ウェルを平板培養する）。
【０２８６】
ｅ．４日目
トランスフェクションの２時間前に、培地を、抗生物質を含まないＤＭＥＭ成長培地で置換する。
【０２８７】
トランスフェクションＩＩ
【表１１】
2005519636.tif 000012
【０２８８】
反応ごとに、LF2000混合物：２５０μｌのOptiMEM＋５μｌのLF2000を調製する。反転で５回混合する。室温で５分間インキュベートする。
OptiMEM（トランスフェクションＩＩ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ）中に希釈させたＲＮＡ＋ＤＮＡを調製する。
LF2000混合物（トランスフェクションＩＩ、Ｄ）を希釈ＲＮＡ＋ＤＮＡに滴下し、ボルテックスで穏やかに混合し、アルミニウム箔を用いて遮光しながら１時間インキュベートする。
LF2000とＤＮＡ＋ＲＮＡを細胞に５００μｌ/ウェルで添加し、穏やかに揺らしながら混合し、一晩インキュベートする。
【０２８９】
ｆ．５日目
下記の処置（各サンプルの１つのウェルからの細胞を取り出し、RT-PCRによってＲＮＡアッセイを行う）によって、ＶＬＰアッセイ（トランスフェクションの約２４時間後）のためにサンプルを回収する。
【０２９０】
ｇ．細胞抽出物
ｉ．浮遊細胞を遠心分離（５分間、３０００ｒｐｍ、４℃）によってペレット化し、上清を保存し（ステップｈに続いてすぐの上清）、ウェルに残っている培地中の残りの細胞を掻き取り、対応する浮遊細胞ペレットに添加し、５分間、１８００ｒｐｍ、４℃で遠心分離を行う。
ｉｉ．細胞ペレットを氷冷ＰＢＳで２回洗浄する。
ｉｉｉ．細胞ペレットを１００μｌの溶解緩衝液中に再懸濁し、２０分間氷上でインキュベートする。
ｉｖ．１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清を清潔な管に移す。これが細胞抽出物である。
ｖ．SDS-PAGE サンプル緩衝液を1Xに添加し、１０分間沸騰させることによって、SDS-PAGEのための１０μｌの細胞抽出物のサンプルを調製する。蛋白質の測定をするための、残りのサンプルのアリコートを除去し、開始物質の合計を確認する。残りの細胞抽出物を−８０℃で保存する。
【０２９１】
ｈ．細胞培地からのＶＬＰの精製
ｉ．ステップｇからの上清を、０．４５ｍフィルターに通して濾過する。
ｉｉ．１４０００ｒｐｍ、４℃で少なくとも２時間、上清を遠心分離する。
ｉｉｉ．上清を注意深く吸引する。
ｉｖ．ＶＬＰペレットを熱い（少なくとも１０分間１００℃で温めた）1X サンプル緩衝液に際懸濁させる。
ｖ．サンプルを１０分間１００℃に沸騰させる。
【０２９２】
ｉ．ウエスタンブロット解析
ｉ．ステージＡ及びＢの全てのサンプルをトリス-グリシンSDS-PAGE １０％（１２０Ｖ、１．５時間）に流す。
ｉｉ．サンプルをニトロセルロース膜に移す（６５Ｖ、１．５時間）
ｉｉｉ．膜を赤橙色のＳ溶液で着色する。
ｉｖ．TBS-T中１０％低脂肪乳で１時間ブロックする。
ｖ．抗ｐ２４ウサギ１：５００TBS-T o/nでインキュベートする。
ｖｉ．TBS-Tで３回、それぞれ７分ずつ洗浄する。
ｖｉｉ．二次抗体抗ウサギｃｙ５ １：５００を用いて３０分間インキュベートする。
ｖｉｉｉ．TBS-T中で１０分間５回洗浄する。
ｉｘ．Typhoonゲルイメージングシステム （Molecular Dynamics/APBiotech）中で蛍光シグナルを観察する。
結果を図１１〜１３に示す。
【０２９３】
２．ＰＯＳＨ ＲＴ-ＰＣＲプライマー及びｓｉＲＮＡ二本鎖の例
ＲＴ-ＰＣＲプライマー
【表１２】
2005519636.tif 000013
【０２９４】
siＲＮＡ二本鎖：
siＲＮＡ No: 153
siＲＮＡ名:  POSH-230 
mＲＮＡ中の位置 426-446
標的配列: 5’ AACAGAGGCCTTGGAAACCTG 3’ 配列番号: 14
siＲＮＡのセンス鎖:  5’  dTdTCAGAGGCCUUGGAAACCUG 3’ 配列番号: 15
siＲＮＡのアンチセンス鎖: 5’dTdTCAGGUUUCCAAGGCCUCUG 3’ 配列番号: 16
siＲＮＡ番号:  155
siＲＮＡ名:  POSH-442 
mＲＮＡ中の位置 638-658
標的配列: 5’  AAAGAGCCTGGAGACCTTAAA 3’ 配列番号: 17
siＲＮＡのセンス鎖:  5’  ddTdTAGAGCCUGGAGACCUUAAA 3’ 配列番号: 18
siＲＮＡのアンチセンス鎖: 5’  ddTdTUUUAAGGUCUCCAGGCUCU 3’ 配列番号: 19
siＲＮＡ番号:  157
siＲＮＡ名:  POSH-U111  
mＲＮＡ中の位置 2973-2993
標的配列: 5’ AAGGATTGGTATGTGACTCTG  3’ 配列番号: 20
siＲＮＡのセンス鎖:  5’  dTdTGGAUUGGUAUGUGACUCUG 3’ 配列番号: 21
siＲＮＡのアンチセンス鎖: 5’  dTdTCAGAGUCACAUACCAAUCC 3’ 配列番号: 22
siＲＮＡ番号:  159
siＲＮＡ名:  POSH-U410 
mＲＮＡ中の位置 3272-3292
標的配列: 5’ AAGCTGGATTATCTCCTGTTG 3’ 配列番号: 23
siＲＮＡセンス鎖:  5’  ddTdTGCUGGAUUAUCUCCUGUUG 3’ 配列番号: 24
siＲＮＡアンチセンス鎖: 5’  ddTdTCAACAGGAGAUAAUCCAGC 3’ 配列番号: 25
【０２９５】
３．ＰＯＳＨ ＲＮＡｉのＨＩＶ放出に及ぼす影響：カイネティックス
Ａ１.トランスフェクション
１．トランスフェクションの１日前、細胞を５×１０６細胞/ウェルの濃度で１５ｃｍプレート中で平板培養を行った。
２．トランスフェクションの２時間前、細胞培地を抗生物質を含まない２０ｍｌのＤＭＥＭと置き換えた。
３．ＤＮＡ希釈：トランスフェクションごとに、下記の表にしたがって、２．５ｍｌのOptiMEM中６２．５μｌのＲＮＡｉで希釈する。 ＲＮＡｉ保存液は２０μＭ （推奨される濃度：５０ｎＭ培地全体量中の希釈液１：４００）
４．LF 2000 希釈：トランスフェクションごとに、２．５ｍＬOptiMEM中５０μｌのリポフェクタミン2000試薬で希釈する。
５．希釈されたＲＮＡｉ及びLF 2000を室温で５分間インキュベートする。
６．希釈されたＲＮＡｉ及びLF 2000を混合し、室温で２０〜２５分間インキュベートする。
７．混合物を細胞に添加（滴下）し、CO2インキュベータ中で、３７℃で２４時間インキュベートする。
８．ＲＮＡｉ トランスフェクションの１日後、細胞を分ける（完全MEM 培地中から、２つの１５ｃｍプレート及び６ウェルプレート中１つのウェルへ）。
９．細胞を分けた１日後、SP 30-012-01にしたがってＨＩＶトランスフェクションを行う。
１０．ＨＩＶトランスフェクションの６時間後、培地を完全ＭＥＭ培地と置き換える。
＊ＰＯＳＨに対してRT-PCRを行って、確実にノックダウンすることが重要である。
【０２９６】
Ａ２．総ＲＮＡ精製
１．トランスフェクションの１日後、細胞を無菌ＰＢＳで２回洗浄する。
２．２．３ｍｌ/２００μｌ（１５ｃｍプレート/６ウェルプレート中１つのウェル） 中Tri試薬（スクレーパーを用いる）の細胞を掻き落とし、−７０℃で凍結する（ＲＮＡ精製及びRT-PCRは、分子生物学単位で行う）、ラックＮｏ．Ａ１６−ＲＴ用サンプル。
【０２９７】
【表１３】
2005519636.tif 000014
【０２９８】
Ｂ．標識化
１．飢餓培地を取り出し、解凍し、３７℃の場所に置く。
２．成長培地中の細胞を掻き落とし、穏やかに１５ｍｌの円錐形チューブに移す。
３．１８００ｒｐｍ、５分間、室温で遠心分離し、細胞をペレット化する。
４．上清を吸引し、チューブを１０秒間放置する。残りの上清を２００μｌのピペットマンを用いて除去する。
５．１０ｍｌの温めた飢餓培地を穏やかに添加し、１０ｍｌピペットを用いて注意深く再懸濁させる。上下に正確に回転させ、細胞ペレットを溶解させない。
６．細胞を１０ｍｌのチューブに移し、６０分間インキュベータ中に置く。エッペンドルフサーモミキサーを３７℃に設定する。
７．１８００ｒｐｍ、５分間、室温で遠心分離し、細胞をペレット化する。
８．上清を吸引し、チューブを１０秒間放置する。残りの上清を２００μｌのピペットマンを用いて除去する。
９．２００μｌのチップを末端から切断し、細胞を穏やかに１５０μｌの飢餓培地中に再懸濁させる（１５０μｌ Metを含まないＲＰＭＩ中、〜１．５ １０７細胞、但し、細胞が多いとき、２５０μｌを超えないようにする）。細胞をエッペンドルフチューブに移し、サーモミキサー中に置く。１０秒間待って、必要であれば、残りの細胞を１０ｍｌチューブからエッペンドルフチューブに移し、さらに５０μｌを追加し、残りの細胞を流し出す（全ての検体は、同量の標識反応物を有していなければならない）。
１０．パルス：５０μｌの35Ｓ-メチオニン（特異的活性１４．２μＣｉ/μｌ）、チューブをきつく絞り、サーモミキサー中に置く。混合スピードを可能な限り一番低く設定し（７００rpm）、２５分間インキュベートする。
１１．１ｍｌの氷冷チェース/ストップ培地を添加することによってパルスをとめる。チューブを非常に穏やかに２回振とうし、細胞を６０００ｒｐｍで６秒間ペレット化する。
１２．１ｍｌのチップを用いて上清を除去する。１ｍｌの氷冷チェース/ストップ培地をペレット化した細胞に穏やかに添加して、穏やかにインバートして、再懸濁させる。
１３．チェース：全てのチューブをサーモミキサーに移し、必要なチェース時間インキュベートする（830:１、２、３、４及び５時間； 828: ３時間のみ）。全チェース時間後、チューブを氷上に置き、１ｍｌの氷冷チェース/ストップ培地を添加し、細胞を１４０００ｒｐｍで１分間ペレット化する。上清を除去し、上清を第２のエッペンドルフチューブに移す。全てのチューブが準備できるまで、細胞ペレットを−８０℃で凍結する。
１４．上清を２時間、１４０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離する。上清を非常に穏やかに除去し、チューブ中に２０ｍｌを放置し（Ｖと標識付けする）、コースが終了するまで−８０℃で凍結しておく。
***全てのステップは、氷冷緩衝液上で行う。
１５．コースが終了したとき、−８０℃で全てのチューブを除去する。５００μｌの溶解緩衝液（溶液を参照されたい）を添加することによって、Lyse VLPペレット（ステップ１４）及び細胞ペレット（ステップ１３）を溶解させ、上下３回、ピペットで採取することによって、よく再懸濁させる。氷上で１５分間インキュベートし、エッペンドルフ遠心分離中で１５分間、４℃、１４０００ｒｐｍで回転させる。上清を新鮮なチューブに取り出し、ペレットを捨てる。
１６．全てのサンプルについて、抗ｐ２４ヒツジを用いてＩＰを行う。
【０２９９】
Ｃ．免疫沈降
１．プレクリーニング：全てのサンプルに１５μｌのImmunoPure PlusG （Pierce）を添加する。サイクラー中で、４℃で１時間回転させ、４℃で５分間スピンさせ、ＩＰのための新たなチューブに移す。
２．全てのサンプルに２０μｌのp24-蛋白質G接合ビーズを添加し、サイクラー中で、４℃で１時間インキュベートする。
３．免疫沈降後、全ての免疫沈降物を新鮮なチューブに移す。
４．ビーズを、高塩緩衝液で１回、培地塩緩衝液で１回、そして低塩緩衝液で１回洗浄する。各スピンがすべての溶液を除去しないうちに、５０ｍｌの溶液をビーズ上に放置する。最後のスピン後、ローディングチップを用いて、上清を注意深く除去し、〜１０μｌ溶液を放置する。
５．２０μｌの2x SDSサンプル緩衝液をそれぞれのチューブに添加する。７０℃に１０分間加熱する。
６．サンプルを１０％SDS-PAGE上で分離した。
７．２５％エタノール及び１０％酢酸中でゲルを１５分間固定する。
８．固定化液を流し出し、ゲルをAmplify solution （NAMP 100 Amersham）に１５分間浸漬する。
９．ゲルを、温めた（６０〜８０℃）プレート上で真空乾燥させる。
１０．ゲルを２時間スクリーンに露出し、スキャンする。
【０３００】
４．ヒトPOSHに対するsiＲＮＡの、HeLa 細胞感染ウイルスの産生に及ぼす影響
下記の計画は、標準的なsiＲＮＡ トランスフェクションプロトコルにしたがうものである。
【０３０１】
計画
【表１４】
2005519636.tif 000015
【０３０２】
siＲＮＡとして下記を用いた。
＃１３（＝Lamin 対照）
＃１５３（＝ヒトＰＯＳＨ Ｕｂリガーゼ）
【０３０３】
３日目（１回目のsiＲＮＡトランスフェクション後の日）
HeLa細胞を回収し、新鮮なＤＭＥＭ中、再び１：３に分割し、T75 フラスコ中に播いた。
【０３０４】
４日目
・培地を除去し、新鮮なＤＭＥＭを添加し、下記のＨＩＶ１型発現プラスミドのうちの１つと組み合わせて、細胞をsiＲＮＡで再びトランスフェクトした。
-env 遺伝子に欠失を伴うEnv- （HIV-1NL4-3 （Adachiら、1986） は、他のＨＩＶ−１プラスミドと違い、Envを発現することができない）、及びVSV-G （小胞の口内炎ウイルスG蛋白質の発現ベクター由来のCMV）。この組み合わせによって、VSV-Gで感染後、子孫ウイルスとして１回感染が可能である。偽型ウイルスは、Env 糖蛋白質を含まない。
-多回感染のためのEnv+ （HIV-1 NL4-3 野生型）。
注：コンストラクトEnv-及びEnv＋含有ＥＧＦＰを、HIV-1NL4-3のnef 読取り枠中にクローニングした。この方法で、全ての細胞をトランスフェクトし、感染させた。活性遺伝子発現を伴う細胞を、自己蛍光（T. Fukunori ら2000、 Lenardo ら 2002に基づく）によって検出することができる。
対照として、１つのＴ２５フラスコをGFP-N1 （単純なGFPのためのCMV発現ベクター）でトランスフェクトした。
【０３０５】
５日目
GFP-N1トランスフェクト培養中の蛍光細胞を計数し、ＦＡＣＳ解析によってトランスフェクション効率を推定した。
【０３０６】
５．５日目
・２回目のトランスフェクションの３６時間後、ウイルスを回収した。下記のように保存ウイルスを作製した。HeLa 細胞を掻き落とし、ウイルス含有上清を遠心分離（１０００x g、５分間）によって浄化し、０．４５μｍ孔径のフィルターに通して濾過し、細胞残滓と細胞片を除去した。保存細胞をアリコートし、−８０℃で凍結した。生化学的分析のために、上清のアリコートからのビリオンをペレット化し（９９分間、１４０００rpm、４℃）、溶解した（Ottら、2002に従った）。細胞及びウイルス断片のサンプルを抗-CA抗体を用いてウエスタンブロットによって解析した。
・感染性のアッセイのために、保存ウイルスの連続希釈をRPMI培地中で調製し、ジャーカット細胞を感染させるために使用した。
・感染の３日後、パラレル培地中の感染細胞のパーセンテージをFACS解析によって推定した。各感染実験は、９６ウェルプレート中の３つのパラレル培地中に設定した（Boltonら、2002に基づく）。
・対照として、１つの培養液を細胞培養上清を用いてインキュベートし、細胞をGFP-N1でトランスフェクトした。蛍光細胞は検出されず、ウイルス産生細胞からのＧＦＰを持つ細胞の非特異的な染色が存在しないことが証明された。
【０３０７】
注：ラミントランスフェクト培養と比較したとき、ヒトＰＯＳＨトランスフェクト培養において、ウイルス産生中、（いくつかのＨＩＶ関連細胞変性効果以外の他）毒性効果は観察されなかった。
【０３０８】
図１９に示された結果は、ノックダウンＰＯＳＨが、ＨＩＶ１感染性を４ログ減少させることを示している。
【０３０９】
５．ノックダウンヒトＰＯＳＨのPTAP- 及びPPEY-媒介性ウイルス放出への影響
実験１日目、HeLa SS6 細胞を６-ウェルプレートに５×１０５ 細胞/ウェルの密度で置いた。その細胞を、２日目、LF2000試薬及びＲＮＡｉのラミン、TSG101及びhPOSH （５０ｎＭ/ウェル）を用いてトランスフェクトした。
３日目、細胞を１：２に分け、４日目、支持用量（１０ｎＭ/ウェル） の同じＲＮＡｉ及びＤＮＡ（１μｇ/ウェル）: PTAPを含むラミン、ATAPを含むラミン、PPEYを含むラミン、 PRAPを含むTSG101、PPEYを含むTSG101、ATAPを含む TSG101、 PTAPを含むhPOSH、PPEYを含むhPOSH、及びATAPを含むhPOSH用いて、細胞を再びトランスフェクトした（LF2000試薬を用いた）。２４時間後、ＶＬＰの上清を遠心分離し、細胞から蛋白質を抽出した。全てのサンプルを１２％トリスグリシンゲルに置き、ニトロセルロース膜上に写し、αｐ２４を用いてインキュベートする。
【０３１０】
図２０に示された結果は、ノックダウンＰＯＳＨのウイルス放出の阻害効果は、非特異的ＨＩＶ Ｌドメインモチーフとは無関係であることを示している。換言すれば、ヒトＰＯＳＨは、PTAP- 及びPPEY-媒介性ウイルス放出の双方にとって重要であるようである。このことは、ヒトＰＯＳＨレベル/活性を阻害することは、PTAP- 及びPPEY-モチーフを含有するあらゆるウイルスの感染性を阻害することに対して潜在的に有効であり得る。ＨＩＶ（ＰＴＡＰを含有）及びエボラウイルス（ＰＰＥＹを含有）はそのようなウイルスの例である。
【０３１１】
６． RING 及びSH3の欠失の、HIV-1放出への影響
次に、HeLa細胞をヒトＰＯＳＨ及びpNLenv-1の欠失コンストラクト用いてトランスフェクトした（４８時間以内）。この実験に用いられる欠失コンストラクトは、dRING （RING ドメイン欠失）、dSH３４ （４番目のSH3ドメイン欠失）、dSH３ １ （１番目のSH3 ドメイン欠失） 及びdSH3３３（３番目のドメイン欠失）であった。対照として、次にHela細胞を偽型及びpNLenv-１で、ならびに偽型及びpNLenv-1ATAPでそれぞれトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞のパルス−チェイス実験を行った。ウイルス蛋白質を細胞ライセートから免疫沈降させ、ペレット化したビリオンをSDS-PAGEによって分離し、フルオログラフィーによって分析した。２つの主なＣＡ産物の位置p24 及びp25を、二重の矢印で示す。細胞内で異なる時点で検出された、ＣＡ対Pr55のPr55の比率を計算することによって、Pr55のプロセシングの比率を推定した。図２１に示された結果は、ｈＰＯＳＨのＲＩＮＧ欠失によって、ATAP突然変異対照と比較して、完全な出芽の阻害が導かれることを示している。SH34 ドメイン欠失の効果もＲＩＮＧ欠失と同様である。
【０３１２】
７．ヒトＰＯＳＨ自己ユビキチン化のインビトロアッセイ
組換えhＰＯＳＨを、各レーンに示したように E1、E2及びユビキチンの存在下でATPを用いてインキュベートした。３７℃で３０分間のインキュベート後、SDS-PAGEサンプル緩衝液を添加することによって反応を停止した。続いてサンプルを10%ポリアクリルアミドゲル上で分解した。次に分離したサンプルをニトロセルロースに移し、抗ユビキチンポリクローナル抗体を用いて免疫ブロット解析を行った。分子量マーカーの移動の位置を右上に示す。
ポリ−Ub：Ub-hPOSH接合体は、E1、E2及びユビキチンを含有する反応のみにおける高い分子量アダクトとして検出された。ｈＰＯＳＨ-１７６及びｈＰＯＳＨ-１７８は、（それぞれ）細菌により発現されたｈＰＯＳＨの短い及び長い誘導体である。Ｃ、対象Ｅ３
ハイスループットスクリーン中の予備的ステップ。
【０３１３】
目的
１．Ｅ３の機能としてのＵｂ鎖におけるＵｂ検出（ＨＲＤ１）及びＰＯＳＨ自己ユビキチン化を試験する。
２．Boston Biochem 試薬を試験する。
【０３１４】
材料
１．バキュロウイルスからのＥ１組換え
２．細菌からのE2 Ubch5c
３．ユビキチン
４．ＰＯＳＨ #178 （1-361） gst融合体、精製されているが劣化している。
５．ＰＯＳＨ # 176 （1-269） gst融合体、精製されているが劣化している。
６．hsHRD1 可溶環含有領域
５．緩衝液２（Tris 7.6 、４０ｍＭ、ＤＴＴ １ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ＡＴＰ ２ｕＭ）
６．希釈緩衝液（Tris 7.6 、４０ｍＭ、ＤＴＴ １ｍＭ、オボアルブミン１ug/ul）
【０３１５】
プロトコル
【表１５】
2005519636.tif 000016
【０３１６】
１．３７℃で３０分インキュベートする。
２．１２％  SDS PAGEゲルをニトロセルロース膜に流して移す。
３．抗ユビキチン抗体を用いてインキュベートする。
図２２に示された結果は、ヒトＰＯＳＨがユビキチンリガーゼ活性を有することを示す。
【０３１７】
８．myc-タグを付けられた、活性化されたｈＰＯＳＨ（Ｖ１２）とドミナントネガティブ（N17） Rac1の共免疫沈降
Hela細胞を、myc-Rac1、myc-Rac1、V12又はN17と、hPOSHdelRING-V5との組み合わせを用いて、トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後（GFPによる測定による効率は８０％）、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、低張溶解緩衝液中（10mM HEPES pH=7.9、15mM KCl、0.1mM EDTA、2mM MgCl2、1mM DTT及びプロテアーゼ阻害剤）で膨張させた。細胞は、dounce ホモジナイザーを用いて、１０回の動作で溶解させ、３０００xgで１０分間遠心分離し、上清（断片１）及び核を得た。核を、断片２緩衝液（0.2% NP-40、10mM HEPES pH=7.9、40mM KCl、5% グリセロール）で洗浄し、周辺蛋白質を除去した。核を遠心沈澱し、上清を回収した（断片２）。核蛋白質は、寒冷中で３０分回転させることによって、断片３緩衝液（20mM HEPES pH=7.9、0.42M KCl、25% グリセロール、0.1mM EDTA、 2mM MgCl2、1mM DTT）中に溶離した。不溶性蛋白質は、14000xgで遠心沈澱し、断片４緩衝液中（1% Fos-Choline 14、50mM HEPES pH=7.9、150mM NaCl、10% グリセロール、1mM EDTA、1.5mM MgCl2、2mM DTT）で可溶化した。全抽出物の半分を、蛋白質Ａセファロースに対して、１．５時間予め浄化し、１μｇの抗ｍｙｃ（9E10、 Roche 1-667-149）及び蛋白質Ａセファロースを用いて２時間ＩＰに使用した。免疫複合体を徹底的に洗浄し、SDS-PAGEサンプル緩衝液に溶離した。図２３のように、免疫ブロットのためにゲルを流し、蛋白質をニトロセロースに電子転移した。内因性ＰＯＳＨ及びトランスフェクトされたhPOSHdelRING-V5を、複合体として、Myc-Rac1 V12/N17とともに沈降させた。図２３に示された結果は、ＰＯＳＨがRac1と共沈降することを示している。
【０３１８】
９．ｈＰＯＳＨエントラップＨＩＶウイルス粒子の細胞間小胞体中でのノックダウン
siＲＮＡ及び全長HIV プラスミド（エンベロープコード領域をを欠く）トランスフェクションの後、ＨＩＶウイルス放出を電子顕微鏡で分析した。成熟ウイルスは、ＨＩＶプラスミド及び関連のないsiＲＮＡ（対照、下側のパネル）でトランスフェクトした細胞によって分泌させた。Tsg101蛋白質のノックダウンの結果、出芽の欠損が生じ、放出されたウイルスは、未成熟表現型を有していた（上側のパネル）。ｈＰＯＳＨレベルのノックダウンの結果、細胞間小胞体において、細胞内にウイルスの蓄積が生じた（中間パネル）。図２４に示された結果は、ｈＰＯＳＨを阻害することによって、ＨＩＶウイルス粒子が細胞内小胞体に封入されることを示している。ＨＩＶウイルス粒子が細胞内に蓄積することで、細胞死が加速され、したがってｈＰＯＳＨの阻害は、ＨＩＶに感染した細胞を殺すことによってＨＩＶ貯蔵部位を破壊する。
【０３１９】
１０．１つは核及び他の１つはゴルジ体（Ｃ）の２つの部位にＰＯＳＨを局在化する。ＨＩＶトランスフェクション後、ＰＯＳＨのゴルジ体への補充が上昇する（Ｄ）
HeLa 及び293T細胞を、pNenv-1を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＰＯＳＨに対する一次抗体と、抗-p24 Gag（Ｂ）又は下記のオルガネラマーカー、すなわち、BiP- エンドプラスマティック細網（データは示していない）、GM130-ゴルジ体（Ｃ、Ｄ）ヌクレオポリン−核マトリクス（Ｅ、Ｆ）及びヒストンＨ１核（データは示していない）のいずれかとを一緒に用いてインキュベートした。２つの異なる蛍光標識２次抗体を用いた。レーザー走査共焦顕微鏡用いて特異的なシグナルを得、それぞれのシグナル部分を重ね、それらの相対的な位置を評価した。図７に示すように、ＰＯＳＨ（Ａ）は核に局在し、また部分的に、トランスフェクション後の核マトリックス（Ｂ）と思われる核外部においてＨＩＶ-１ Gagと共局在した。
【０３２０】
引用による援用
本明細書において引用した全ての特許及び出版物を引用によって援用する。
【０３２１】
等価物：  当業者であれば、ルーチンの実験法を用いるのみで、本明細書に記載された特定の態様及び方法の数多くの等価物を認識し、又は確かめることができるであろう。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】図１は、ヒトＰＯＳＨコーディング配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、ヒトＰＯＳＨアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、ヒトＰＯＳＨ ｃＤＮＡ配列 （配列番号３）を示す。
【図４】図４は、ヒトＰＯＳＨの５'ｃＤＮＡフラグメント（公開gi：10432611、配列番号４）を示す。
【図５】図５は、ｈＰＯＳＨのＮ末端蛋白質フラグメント（公開gi:10432612 ; 配列番号 :5）を示す。
【図６】図６は、ｈＰＯＳＨの３'ｍＲＮＡフラグメント（公開gi：7959248、配列番号６）を示す。
【図７】図５は、ｈＰＯＳＨのＣ末端蛋白質フラグメント（public gi：7959249、配列番号７）を示す。
【図８】図８は、ヒトＰＯＳＨ全長ｍＲＮＡの注釈付きの配列を示す。
【図９】ヒトＰＯＳＨのドメイン分析を示す。
【図１０】ヒトＰＯＳＨ核酸の略図を示す。該略図は、全長ＰＯＳＨ遺伝子及びＲＴ−ＰＣＲによって増幅された、又は、図１１で用いられるｓｉＲＮＡによって標的化された領域の位置を示す。
【図１１】図１１は、ｓｉＲＮＡ二本鎖によるＰＯＳＨ ｍＲＮＡのノックダウンを示す。HeLa SS-6細胞は、ラミンＡ／Ｃ（レーン１、２）又はＰＯＳＨ（レーン３〜１０）に対するｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた。ＰＯＳＨ ｓｉＲＮＡは、コーディング領域（１５３−レーン３、４；１５５−レーン５、６）又は３'ＵＴＲ（１５７−レーン７、８；１５９−レーン９、１０）に誘導された。トランスフェクトの２４時間後、細胞を集め、ＲＮＡを抽出し、ＰＯＳＨ ｍＲＮＡレベルを、ＰＯＳＨ遺伝子（図１０参照）のコーディング領域中の別の配列のＲＴ−ＰＣＲで比較した。各反応において、GAPDH１０がRT-PCR対照として用いられた。
【図１２】図１２は、ＰＯＳＨが細胞からのＶＬＰ放出に影響を及ぼすことを示す。Ａ）３５Ｓパルス−チェイス標識Ｇａｇ蛋白質の、免疫沈降のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルのPhosphohimagesが細胞ごとに示されている。Gag蛋白質が、細胞ならびに未処理又はＰＯＳＨ ＲＮＡｉ（５０ｎＭ、４８時間）で処理されている、トランスフェクトされたHeLaからのウイルス溶菌液について提示されている。チェイス期間（パルス後、１、２、３、４及び５時間）の間の時間が、左から右にイメージごとに提示されている。
【図１３】図１３は、安定した状態での細胞からのＶＬＰの放出を示す。ＨＩＶコードプラスミド及びsiRNAでトランスフェクトした。レーン１、３及び４は、野生型ＨＩＶコードプラスミドでトランスフェクトされたものを示す。レーン２は、ｐ６（ＰＴＡＰ〜ＡＴＡＰ）中の点突然変異を含むＨＩＶコードプラスミドでトランスフェクトされたものを示す。対照siRNA （ラミンＡ/Ｃ）は、レーン１及び２の細胞にトランスフェクトされた。レーン４では、siＲＮＡからTsglOlにトランスフェクトされており、レーン３では、siＲＮＡからＰＯＳＨにトランスフェクトされている。
【図１４】図１４は、マウスＰＯＳＨ ｍＲＮＡ配列（公開ｇｉ：10946921、配列番号８）を示す。
【図１５】図１５は、マウスＰＯＳＨ蛋白質配列（公開ｇｉ：10946922、配列番号９）を示す。
【図１６】図１６は、ショウジョウバエＰＯＳＨ ｍＲＮＡ配列（公開ｇｉ：17737480; 配列番号: １０）を示す。
【図１７】図１７は、ショウジョウバエＰＯＳＨ 蛋白質配列（公開ｇｉ：17737481; 配列番号: １１）を示す。
【図１８】図１８は、ＰＯＳＨドメイン分析を示す。
【図１９】図１９は、ヒトＰＯＳＨの部分的ノックダウンによって、ＨＩＶ１感染力が４ログ減少することを示す。感染力アッセイの結果を略図に示す。縦軸は、感染した標的細胞のパーセンテージを示し、横軸は、用いられるウイルス保存液の希釈倍率を示す（実験の詳細は、実施例４を参照されたい）。白抜きの四角（上の線）は、対照からの結果を示し、黒塗りの四角（下の線）は、RNAiをもつ細胞をＰＯＳＨへトランスフェクトした結果を示す。
【図２０】図２０は、ＨＩＶとの関連における、PTAP-及びPPEY-媒介ウイルス様粒子の放出を媒介するヒトのＰＯＳＨ蛋白質を示す。３５Ｓパルス−チエイス標識Ｇａｇ蛋白質の免疫沈降の、ＳＤＳ- ＰＡＧＥゲルのPhosphohimagesが、細胞ならびにトランスフェクトされたHeLa細胞からのウイルス溶菌液について示されている。HeLa細胞を、ＨＩＶコードプラスミド及びsiＲＮＡでトランスフェクトした。左から右へ：左のパネルは、野生型ＨＩＶコードプラスミドでトランスフェクトされたものを示す。中央のパネルは、点突然変異（ＰＰＥＥ〜ＰＰＥＹ）を含有するＨＩＶコードプラスミドでトランスフェクトされたものを示す。右のパネルは、ｐ６（ＰＴＡＰ〜ＡＴＡＰ）中の点突然変異ＨＩＶコードプラスミドでトランスフェクトされたものを示す。上から下へ：対照siＲＮＡ（ラミンＡ/Ｃ）は、一番上のパネルにおいてトランスフェクトされたものを示す。中央のパネルは、siRNAからTsglOlにトランスフェクトされたものを示し、一番下のパネルには、siRNAからPOSH にトランスフェクトされたものを示している。チェイス時間（パルス後、１、２、３、４及び５時間）が、パネルごとに左から右へ提示されている。
【図２１】図２１は、ヒトＰＯＳＨ蛋白質におけるＲＩＮＧドメイン及び第４のＳＨ３ドメインの欠失がＨＩＶ１ウイルス粒子の放出を阻害することを示している。
【図２２】図２２は、ヒトＰＯＳＨがユビキチンリガーゼ活性を持つことを示している。
【図２３】図２３は、ＲＡＣ１を用いたヒトＰＯＳＨ共免疫沈降を示す。
【図２４】図２４は、ヒトＰＯＳＨのノックダウンが細胞間小胞内の捕捉ＨＩＶウイルス粒子を封入することを示している。ＨＩＶウイルスの放出は、電子顕微鏡によって分析され、続いてsiRNA 及び全長HIV プラスミドのトランスフェクションが行われる。成熟ウイルスがＨＩＶプラスミド及び非関連のsiＲＮＡ（対照、下のパネル）を用いてトランスフェクトされた細胞によって分泌されたものを示している。TsglOl蛋白質のノックダウンの結果、出芽に欠損が生じ、放出されたウイルスは、未成熟の表現型（上のパネル）を有していた。ｈＰＯＳＨレベルのノックダウンの結果、細胞間小胞内の細胞内においてウイルスの蓄積が生じる（中央のパネル）。
【図２５】図２５は、ヒトＰＯＳＨが、１つは核、１つはゴルジ体（C）の２つの部位に位置することを示す。ＨＩＶトランスフェクション後、ＰＯＳＨ  ゴルジ体の局在化が向上する（Ｄ）。HeLa 及び293T細胞をpNLenv-1で処理した。２４時間のトランスフェクション後、細胞をＰＯＳＨに対する一次抗体で、抗p24 Gag（B）又は細胞小器官マーカーを用いて以下のようにインキュベートした。２つの異なる蛍光標識２次抗体を用いた。共焦点レーザー走査顕微鏡によって特異的なシグナルを得た。そして個別のシグナルを重ね合わせて、それらの相対的な位置を評価した。ＰＯＳＨ（Ａ）は核に局在し、また部分的に、トランスフェクション後の核マトリックス（Ｂ）と思われる核外部においてＨＩＶ-１ Gag及びゴルジマーカーと共局在した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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