(57)【要約】グラム陰性細菌感染に対する免疫応答を引き出すための組成物と、該組成物を製造する方法を提供する。前記組成物はグリコシル化されたピリンを含んでおり、該ピリンは標的グラム陰性細菌のＯ抗原でグリコシル化される。前記組成物を投与することによって免疫応答を引き出す方法についても提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化ピリンを製造する方法であって、
グラム陰性細菌のＯ抗原をエンコードする遺伝子を含むベクターを、pilＯ遺伝子を含む緑膿菌の菌株に導入することにより、前記Ｏ抗原を緑膿菌の中に発現させ、ピリンを、グラム陰性細菌のＯ抗原でグリコシル化し、
グリコシル化されたピリンを単離すること、
を含んでいる方法。
【請求項２】
グリコシル化ピリンを製造する方法であって、
グラム陰性細菌のＯ抗原をエンコードする遺伝子を含むベクターを、緑膿菌の1244菌株へ導入することにより、Ｏ抗原を発現させ、菌株1244ピリンを、グラム陰性細菌のＯ抗原でグリコシル化し、
グリコシル化されたピリンを単離すること、
を含んでいる方法。
【請求項３】
グリコシル化ピリンを製造する方法であって、
大腸菌のＯ抗原をエンコードする遺伝子を含むベクターを、緑膿菌の1244菌株に導入することにより、Ｏ抗原を発現させ、菌株1244ピリンを、大腸菌のＯ抗原でグリコシル化し、
グリコシル化されたピリンを単離すること、
を含んでいる方法。
【請求項４】
グリコシル化ピリンを製造する方法であって、
緑膿菌の菌株011のＯ抗原をエンコードする遺伝子を含むベクターを、緑膿菌の1244菌株へ導入することにより、Ｏ抗原を発現させ、菌株1244ピリンを、緑膿菌の菌株O11のＯ抗原でを用いてグリコシル化し、
グリコシル化されたピリンを単離すること、
を含んでいる方法。
【請求項５】
脊椎動物のグラム陰性細菌感染に対する免疫応答を引き出す方法であって、
グラム陰性細菌のＯ抗原をエンコードする遺伝子を含むベクターを、pilＯ遺伝子を含む緑膿菌の菌株へ導入することにより、Ｏ抗原を緑膿菌の菌株中に発現させ、ピリンを、グラム陰性細菌のＯ抗原でグリコシル化し、
グリコシル化されたピリンを単離し、
グリコシル化されたピリンを薬学的に適当なキャリヤーに入れて脊椎動物に投与すること、
を含んでいる方法。
【請求項６】
緑膿菌の菌株は菌株1244である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
グラム陰性細菌は大腸菌である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
グラム陰性細菌は緑膿菌の菌株011である請求項５に記載の方法。
【請求項９】
グリコシル化ピリンを脊椎動物に投与することによって生成された抗体を単離することを更に含んでいる請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
グラム陰性細菌感染に罹患している脊椎動物へ抗体を投与し、感染に対する受動免疫を与えることを更に含んでいる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
(ａ)グラム陰性細菌感染に罹患していると考えられる脊椎動物のサンプルを抗体と接触させること、及び
(ｂ)Ｏ抗原と該Ｏ抗原に特異的な抗体との間で生成された複合体(complex)の有無を検出することによって、グラム陰性細菌感染の有無を検出すること、
を更に含んでいる請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
(ａ)グラム陰性細菌感染に罹患していると考えられる脊椎動物のサンプルをグリコシル化ピリンと接触させること、及び
(ｂ)サンプル内で、グリコシル化ピリンと該グリコシル化ピリンに特異的な抗体との間で生成した複合体の有無を検出することによって、グラム陰性細菌感染の有無を検出すること、
を更に含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
脊椎動物に免疫応答を引き出すための組成物であって、
薬学的に許容されるキャリヤーの中にグリコシル化ピリンを含んでおり、
該グリコシル化ピリンは、pilＯ遺伝子を含む緑膿菌の菌株ではないグラム陰性細菌に由来するＯ抗原を含んでいる、組成物。
【請求項１４】
グラム陰性細菌からの感染を有する脊椎動物に免疫応答を引き出すための方法であって、
グリコシル化ピリンを薬学的に許容されるキャリヤーに入れて該脊椎動物に投与することを含んでおり、
該グリコシル化ピリンは、pilＯ遺伝子を含む緑膿菌の菌株ではないグラム陰性細菌に由来するＯ抗原を含んでいる、方法。
【請求項１５】
グリコシル化ピリンからアミノグリカンを単離する方法であって、
前記グリコシル化ピリンとタンパク質分解酵素を、ピリンタンパク質からアミノグリカンを完全にタンパク質分解するのに十分な時間混合し、
該アミノグリカンを精製すること、を含んでいる方法。
【請求項１６】
アミノグリカンをキャリヤータンパク質に共有結合させ、アミノグリカンと輸送タンパク質のコンジュゲートを生成することを更に含んでいる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
輸送タンパク質は、オボアルブミン、線毛(pili)、キーホールリンペットヘモシニアン及びエクソトキシンＡトキソイドから成る群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
２以上のグラム陰性細菌から単離されたアミノグリカンを混合し、混合されたアミノグリカンを輸送タンパク質に共有結合させることにより、アミノグリカンと輸送タンパク質が混合されたコンジュゲートを生成することを更に含んでいる請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
輸送タンパク質は、オボアルブミン、線毛、キーホールリンペットヘモシニアン及びエクソトキンＡトキソイドから成る群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
(ａ)グラム陰性細菌感染に罹患していると考えられる脊椎動物のサンプルを、単離されたアミノグリカンと接触させ、
(ｂ)サンプル内で、アミノグリカンと、該アミノグリカンに特異的な抗体との間に生成される複合体の有無を検出することにより、グラム陰性細菌感染の有無を検出すること、を更に含んでいる請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
グラム陰性細菌感染に罹患している脊椎動物の免疫応答を引き出す方法であって、
請求項１６のアミノグリカンと輸送タンパクのコンジュゲートを、薬学的に許容されるキャリヤーにて該脊椎動物に投与すること、を含んでいる方法。
【請求項２２】
アミノグリカンとタンパク質のコンジュゲートを投与することによって生成した抗体を単離することを更に含んでいる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
グラム陰性細菌感染に罹患している脊椎動物に抗体を投与し、感染に対する受動免疫を与えることを更に含んでいる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
(ａ)グラム陰性細菌感染に罹患していると考えられる脊椎動物のサンプルを抗体と接触させ、
(ｂ)グラム陰性細菌のＯ抗原と、該Ｏ抗原に特異的な抗体との間で生成された複合体の有無を検出することによって、グラム陰性細菌感染の有無を検出すること、を更に含んでいる請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
グラム陰性細菌感染に罹患している脊椎動物の免疫応答を引き出す方法であって、
請求項１８のアミノグリカンと輸送タンパクが混合されたコンジュゲートを、薬学的に許容されるキャリヤーにて該脊椎動物に投与すること、を含んでいる方法。
【請求項２６】
アミノグリカンとタンパク質のコンジュゲートを投与することによって生成した抗体を単離することを更に含んでいる請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
グラム陰性細菌感染に罹患している脊椎動物に抗体を投与し、感染に対する受動免疫を与えることを更に含んでいる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫応答は防御である請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
免疫応答は防御である請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、グラム陰性細菌感染に対して免疫応答を引き出す組成物、該組成物を製造する方法、及び該組成物の投与によって免疫応答を引き出す方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌性敗血症及びこれに関連する敗血性ショックは、癌に関連する外科手術、外傷及び免疫抑制、移植治療又はその他の病気に起因する感染によって引き起こされ、致死状態になるときもしばしばある。グラム陰性細菌感染は、今日病院で見られる最も深刻な感染症問題であり、現在、年間何千もの感染があり、総死亡率も高い。
【０００３】
これまで何十年もの間、病院で感染する最も感染性の高い病気は、ブドウ球菌(Staphylococcus)や連鎖球菌(Streptococcus)などの急性グラム陰性細菌によるものであった。しかしながら、最近の３０年間では、大腸菌(Escherichia coli)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)及びその他のグラム陰性細菌の院内感染の発生率が、次第に高くなってきている。その増加は医療の進歩に起因しており、免疫力の低下した宿主が長期に亘って生きることになり、病院環境で広範囲にわたる抗生物質の使用の普及率が増加するためである。
【０００４】
抗癌化学療法又は免疫抑制治療の後に臓器移植又は細胞移植を受ける患者や、グラム陰性細胞感染の危険性が高い他の患者には、嚢胞性線維症(cystic fibrosis; CF)や熱傷の患者が含まれている。CF患者の致死率が９０％よりも高いのは緑膿菌感染によるものである。免疫不全宿主が感染すると、一般的には、多くの抗生物質に耐性を示すか、又は、長期に亘って感染の耐性を発現するため、従来の治療では困難になる。抗生物質の拡大使用による薬物耐性菌が自然淘汰されて、グラム陰性細菌が病原体の主な臨床的有意性をもつに至っている。
【０００５】
様々な要因が、グラム陰性細菌の病原性をもたらしている。上記のように、多くのグラム陰性細菌は、抗生物質に対して耐性が高い。さらに、多くのグラム陰性細菌は、細胞生成物及び細胞外生成物を合成して、それらの宿主を感染させる。細胞生成物(cellular products)として、リポ多糖(LPS)、線毛(pili)、(緑膿菌中の)アルギン酸塩、細胞を食作用(phagocytosis)から守ると考えられるムコイド多糖が挙げられる。LPSは、様々な形態で製造され、高い免疫原性を有しており、真核細胞への侵入を仲介し、細菌を宿主側防御(host defensives)から保護する。
【０００６】
緑膿菌及び他のグラム陰性細菌のLPSは、多様なグラム陰性細菌属に広く受け入れられる保存構造から成っている。コア構造は、(1)Ｏ抗原(三糖乃至五糖の繰返し単位から成るＯ多糖体)、(2)内コア及び外コア、(3)リピドＡ、の３領域から成る。Ｏ抗原は、コア領域を通じてリピドＡに結合し、リピドＡ部分は、有機体の外膜に埋め込まれ、そこでLPSのアンカーとしての役割を果たす。緑膿菌は、一般的に、その外膜、Ａ帯及びＢ帯の上に異なる２種類のLPSを発現する。Ｂ帯LPSは、免疫支配抗原(Immunodominant Antigen)であり、有機体をセログループとサブグループに区分するのに用いられる。これは、LPSを有する他の幾つかのグラム陰性細菌にも見られる。
【０００７】
LPSのリピドＡは、グルコサミンの二糖バックボーンにアシル化された短いリン酸化リピドから成り、LPSの最も毒性の強い部分であると考えられる。これは、エンドトキシンＡとしても知られており、免疫系の炎症反応を過剰誘発して、敗血性ショックを起こして死に至ることもある。敗血性ショックは、血圧の低下を引き起こし、腎臓、肺及び胃腸管に有害となる。
【０００８】
線毛(ピリ)もまた、重要な毒性因子である。線毛は、毛髪状繊維であり、細菌細胞から外側へ伸びて、細菌を表面と接触できるようにし、細菌を宿主細胞に初期結合する役割を有するものと考えられる。宿主細胞に結合する力が無ければ、細菌はそれほど毒性は強くない。例えば、チャレンジアッセイ法において、同種で抗繊毛抗血清(anti-pilus antisera)を使用すると、頬の上皮細胞への結合を妨げられることが示されている[Wood et al.(1980)]。
【０００９】
緑膿菌の繊毛(pilus)は、グリコシル化されることが示され[Castric, 1995, Microbiology, 141:1247-1254]、他のIV型ピリン細菌も同様にグリコシル化されると考えられる。構造解析の報告[Castric, et al., Journal of Biological Chemistry, 276:26479-26485]によれば、ピリングリカン(pilin glycan)は、この微生物のＯ抗原繰返し単位と同一の三糖類であり、Ｏ抗原の生合成経路に由来することが示されている(観察結果は未公開)。ピリングリカンは、繊毛の主たるＢ細胞エピトープである。マウスに対して純グリコシル化緑膿菌1244線毛で皮下免疫すると、グリカン(Ｏ抗原)特異的抗体が製造された。ELISA法及びウエスタンブロット法により、これらの抗体は、緑膿菌1244に由来するLPSであることが確認された。また、LPS特異IgAは、気管支洗浄において、グリコシル化緑膿菌の刺激によって生成されるが、このLPS特異IgAでマウスの鼻腔を免疫すると、このマウスは緑膿菌1244による挑戦から保護された。これらの結果から、緑膿菌ピリングリカンは、抗LPS応答作用を有することを示している。
【００１０】
Ｏ抗原繰返し単位を繊毛に結合させるには、機能性pilＯ遺伝子が必要であり[Castric, 1995, Microbiology, 141:1247-1254]、緑膿菌1244中のpilＯタンパク質は、Ｏ抗原繰返し単位については、極度に非特異的であることが分かった。例えば(後の実施例でより詳細に説明する)、大腸菌Ｏ157Ｏ抗原の合成をコードする遺伝子クラスターは、広宿主域コスミッド中でクローン化され、緑膿菌1244中に大腸菌Ｏ157を生成した。この菌株によって製造されたピリンのサブユニットは、Ｏ157抗原又は宿主細胞繰返し単位のどちらかによってグリコシル化された(後の実施例で示す)。これと同じ非特異性は、クローン化された異種緑膿菌Ｏ抗原遺伝子クラスターにも見られた。
【００１１】
数多くの研究で確認されているように、LPSのＯ抗原繰返し単位は、免疫応答の主たる標的である。しかしながら、複数の菌株からＯ抗原に対する異種ワクチンを開発することは、困難であることがわかった。例えば、高分子量のＯ抗原に対するマウスの免疫応答についての研究は、緑膿菌血清グループのＯ2菌株(Ｏ2a-Ｏ2f)を用いて行われた。同種Ｏ抗原は、少ない投与量でより多くの免疫原性を示し、保護性オプソニン抗体を誘発した[Hatano and Pier, 1998]。異種Ｏ抗原としてワクチン接種された場合、抗体は全ての菌株に対して生成したが、交差反応性オプソニン抗体は、試験された菌株では増加せずに、減少した[Hatano and Pier, 1998]。
【００１２】
LPSベースのワクチンはLPS分子の毒性部分(リピドＡ)を含んでいるので、これを使用すると、上記の多価ワクチンの場合と同様、重大な欠点がある。それゆえ、脊椎動物のグラム陰性細菌感染に対する免疫応答を引き出す組成物を開発することにより、自然免疫応答を促進して前記感染を克服することは常に要請されている。
【発明の開示】
【００１３】
＜発明の要旨＞
本発明は、グリコシル化されたピリンを製造する方法を提供するものであって、グラム陰性細菌のＯ抗原繰返し単位(repeating unit)の生合成に必要な遺伝子を含むベクターを緑膿菌へ導入することを含んでいる。これらの遺伝子が緑膿菌の中で発現すると、この有機体によって産生した線毛が、標的グラム陰性細菌の中の所定Ｏ抗原繰返し単位でグリコシル化される。グリコシル化された線毛は、単離された後、組成物の中に含められ、標的グラム陰性細菌のＯ抗原に対する免疫応答を引き出すために、脊椎動物へ投与される。注目すべきことは、このワクチンを製造する際、(Ｏ抗原遺伝子クラスターをクローン化すること以外)病原体の取扱いを必要としないことである。本発明の方法においては、Ｏ抗原経路遺伝子は、クローン化され、緑膿菌の中で発現し、そこでピリンをグリコシル化するためのグリカンが作られる。
【００１４】
本発明の更なる特徴は、Ｏ抗原繰返し単位が、精製されたグリコシル化線毛から単離されることである。この分子は、当該分野で知られた化学的手法を用いて、輸送タンパク質に結合される。１種又は異なる２種以上の当該グラム陰性細菌のＯ抗原繰返し単位を、輸送タンパク質又はグリコシル化された線毛へ同時に結合させて、多価組成物を製造することができる。
【００１５】
細胞表面から伸びる真性線毛(true pili)のタンパク質繊維は、特定種のグラム陰性細菌にのみ存在する。線毛は、幾つかの種類に分けられ、その内の１つはIV型と呼ばれる。IV型の線毛の特徴として、1)伸縮能力、2)細胞の位置(通常はクラスターの中の細胞極に存在する)、3)ピリンのサブユニットの特徴的な配列構造(固定Ｎ末端領域及び可変Ｃ末端領域)、が挙げられる。多くの重要なグラム陰性病原菌が作るIV型線毛として、例えばNeisseria meningitidis、N. gonorrhoeae、Vibro cholerae、特定の大腸菌株, Moraxella種及びレジオネラ種などがある。
【００１６】
係属中の米国特許出願第０９／３３７,３９３号に記載された方法では、ピリンをグリコシル化するタンパク質をエンコードする遺伝子(pilＯ遺伝子)の他に、所望の免疫原性の標的であるピリンに関する構造情報をエンコードする遺伝子(pilA遺伝子と表される)が、IV型ピリンの製造が可能なグラム陰性細菌にクローン化されている。宿主細胞自身のピリンアッセンブリ機構を用いると、当該ピリンは、宿主細菌のＯ抗原繰返し単位を用いて、pilＯを介してグリコシル化される。従って、この方法では、ピリンのアッセンブリ機構を有する宿主細胞、即ちIV型線毛生成細菌を使用せねばならないため、Ｏ抗原を有するグリコシル化ピリンの製造は、これらのピリン生成細胞からの製造に限られていた。
【００１７】
しかしながら、多くのグラム陰性病原体は、IV型線毛を作らない。この病原体は、Salmonella、Shigella、Hemophilus、Bordetella、Yersinia、Francisella、Brucella、Burkholderia、Bartonella、Pasteurella、Proteus、及びProvidenciaの病原体を含んでいる。また、IV型線毛を作らない他のグラム陰性病原体として、リケッチア(コクシエラ種を含む)及び大腸菌型細菌(多くの大腸菌株を含む)がある。
それゆえ、本発明は、従来の方法よるも数多くの細菌種のＯ抗原を、緑膿菌のピリンに結合する方法を提供するものである。最近では、様々なグラム陰性細菌に由来するＯ抗原遺伝子クラスターのクローンを作ることができるので、従来の方法では標的にされることがなかったグラム陰性細菌を含む異なる菌株のグラム陰性細菌に対して特異的なワクチンの設計が可能となる。緑膿菌pilＯタンパク質は、基質に関しては非特異的であることが示されているので、実質的に如何なるタイプのグラム陰性細菌からのＯ抗原も、緑膿菌のピリンに結合させることができると考えられる。
【００１８】
本発明の更なる利点は、単一のＯ抗原繰返し単位がピリン又は他の輸送タンパク質に結合された時に引き起こされる免疫応答の性質に由来することである。このグリカンとピリン又は他のタンパク質との共有結合の場合、Ｔ細胞依存性プロセスで行われるため、免疫応答は、(LPS又は分離したＯ抗原多糖体によって引き起こされるＴ細胞に非依存性応答と比べて)より強く長く持続する。Ｏ抗原繰返し単位がピリン又は他の輸送タンパク質に結合されるとき、エピトープのサイズ、方向性及び組織は、LPS上に存在するものとは異なり、Ｏ抗原繰返し単位は鎖状に配列されている。Ｏ抗原のサイズが小さくなると、引き起こされる免疫応答はより強くなると考えられる。さらに、エピトープがより小さくなると、１回当たりのワクチン投与について、Ｂ細胞との相互作用がより多くなる。特に重要なのは、Ｏ抗原繰返し単位の末端糖残基(terminal sugar residue)を高いモル比で利用できることである。自由末端残基は、各々のLPS又はＯ抗原多糖体において一度存在するだけである。
【００１９】
本発明では、純度とプロセスについても改良されている。例えば、リピドＡが存在しないだけでなく、グリコシル化された線毛は、LPS調製物の中にしばしば存在する汚染タンパク質や核酸を含んでいない。LPSコアが存在せず、標的抗原だけが送達されるので、免疫抑制の問題は回避される。また、Ｏ抗原多糖の製造に使用される酸処理では、一部のＯ抗原が破壊されるが、本発明では、そのような酸処理は不要である。
【００２０】
重要なことには、本発明の方法を使用することにより、グリカンエピトープの工学的処理が可能なことである。例えば、２以上のソースから所望される特定の組合せのグリカンを有するピリン又は輸送タンパク質を製造することができ、最も効果的なエピトープを同定し、免疫応答を引き出す組成物の中で使用することができる。これらのエピトープは、選択的にピリン又はその他の輸送タンパク質に結合され、構造的に類似しないエピトープを引き出すので、これまでの多価LPSワクチンで見られる抗原抑制の問題は解消される。
【００２１】
LPSの精製は、時間がかかり、高価で、困難であるが、グリコシル化された線毛(ピリ)は、培養液(broth cultures)又は固体培地(solid media)のどちらでも、大量に製造することができる。グリコシル化線毛の精製は、迅速に行われ、安価であり、一般的な実験室での手順だけを必要とする。
【００２２】
それ故に、本発明の目的は、グリコシル化ピリン(glycosylated pilin)を製造する方法を提供することであって、該方法により、ピリンは、関連あるグラム陰性細菌のＯ抗原を用いてグリコシル化される。
本発明の更なる目的は、グリコシル化ピリンを含む組成物を提供することである。
本発明の更なる目的は、細菌感染に抵抗性をもたらすために、グリコシル化ピリンを含む組成物を脊椎動物に投与することである。
【００２３】
本発明の更なる目的は、グリコシル化ピリンを含む組成物を投与することにより、脊椎動物内に免疫応答を引き出す方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、単離されたＯ抗原繰返し単位構造を提供することであり、該構造は、ワクチン又は感染の存在を検出するための診断キットに使用されるピリン又はその他の輸送タンパク質に結合されることができる。
発明のこれら及びその他の目的は、以下の詳細な説明、実施例及び請求の範囲の記載から容易に理解されるであろう。
【００２４】
この特許の書類は、少なくとも１枚のカラー図面を含んでいる。この特許のカラー図面コピーは、所定料金の納付と請求により、特許商標局から得ることができる。
なお、図面に示される本発明は、その図面に限定されるものではない。
【００２５】
＜望ましい実施例の詳細な説明＞
本発明は、グリコシル化ピリンを製造する方法を提供するものであって、該方法は、グラム陰性細菌のＯ抗原をエンコードする遺伝子を含有するベクターを、pilＯ遺伝子を含有する緑膿菌の菌株へ導入することを含んでいる。Ｏ抗原は、緑膿菌の菌株中で発現し、ピリンは、前記グラム陰性細菌のＯ抗原とによってグリコシル化される。次に、グリコシル化ピリンが単離される。緑膿菌の菌株1244を使用することが望ましいが、pilＯ遺伝子を有する他の菌株も適当であり、それらは、本発明の範囲内に含まれるものである。
【００２６】
コアＯオリゴ糖とＯ抗原を生合成するための遺伝子クラスターは、クローン化され、幾つかの細菌種によって特徴付けられる。前記細菌種の一部に、非腸溶性の属、例えばBordetella、Haemophilus、Neisseria、Vibrio、Amormutharia及びXanthomonasからの細菌種がある。例えば、米国特許第５,９９４,０７２号及びその中の引用文献を参照することができる。この特許には、緑膿菌及び他の種のＯ抗原遺伝子クラスターを単離することが説明されている。また、次の文献を参照することもできる[1) Maurer, J.J. et al. 1999. Development of Primers to 0-antigen Biosynthesis Genes for specific Detection of Escherichia coli 0157 bv PCR. Appl Environ Microbiol. 65: 2954-2960; 2) Goldberg, J.B. et al. 1992.  Cloning and surface expression of Pseudomonas aeruginosa O-antigen in escherichia coli. Proc Natl Acad Sci, USA. 89: 10716-10720; 3) Burrows, L.L. et al. 1996.  Molecular characterization of the Pseudomonas aeruginosa 05 (P. aeruginosa 01) B-band lipopolysaccharide gene cluster. Mol Microbiol. 22: 481-495; and 4) Belanger, M.L. et al. 1999. Functional analysis of genes responsible for synthesis of B-band O-antigen of Pseudomonas aeruginosa serotype 06. Microbiology. 145: 3505-3521.] これらの参考文献は、Ｏ抗原遺伝子クラスターを単離する方法を更に説明している。
【００２７】
当該分野で周知の方法を使用することにより、標的グラム陰性細菌の標的Ｏ抗原に関する遺伝子クラスターを単離し、適当なベクターにクローン化することができる。標的グラム陰性細菌は緑膿菌又は大腸菌が望ましいが、他のグラム陰性細菌も適しており、それらは、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００２８】
ベクターは、該分野で知られた適当なベクターを使用することができる。適当なベクターとして、例えば、pLAFR 1ベクター[Friedman, et al. 1982 Gene 18 289-286]や、pIJ2300ベクター[Liu, et AL., 1990 Mol. Gen. Genet. 220 433-440]が挙げられる。Ｏ抗原遺伝子クラスター内に存在するプロモーターは、遺伝子の発現を十分に調節することができるので、ハイパー発現(hyperexpression)は不要である。Ｏ抗原遺伝子クラスターを含むベクターは、緑膿菌の中で発現し、ピリンのグリコシル化タンパク質は、標的細菌からのＯ抗原繰返し単位のサブユニットを、コアピリンに加えることができ、グリコシル化ピリンが生成される。このグリコシル化ピリンを単離して、細菌感染に耐性をもたらすために使用したり、診断アッセイに使用することができる。例えば、プラスミドpDIG4(材料と方法については後で記載する)は、大腸菌Ｏ157:H7由来のＯ抗原遺伝子クラスターを含んでおり、前記プラスミドが広宿主域発現ベクターpLAFR1の中に配置された。Ｏ抗原が発現し、緑膿菌によって製造された線毛は、大腸菌由来の抗原を用いてグリコシル化された。一般的なクローン化方法として、例えば次の文献を参照することができる：Maniatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982) or DNA Cloning Volumes I and II (D.N. glover ed. 1985) for general cloning methods。
【００２９】
本発明のグリコシル化された線毛は、当該分野で周知の方法を使用して単離することができる。又は同時係属出願である米国特許出願０９／３３７,３９３号に記載の新規な大規模生産方法によって単離することもできる。この特許出願は、引用を以て本願に組み入れるものとする。グリコシル化された線毛は、宿主菌による細菌感染に耐性を与える組成物に使用することができるし、又は宿主菌感染を検出するための診断ツールとして使用することもできる。異なるソースのＯ抗原繰返し単位が含まれるグリコシル化線毛は、単一の菌株ではなく、混合して用いられ、様々な菌株又は種に対して免疫応答を引き出すことができる多価組成物を提供することができる。
【００３０】
本発明の更なる特徴は、Ｏ抗原繰返し単位は、単離されたグリコシル化ピリンから、更に単離できることである。精製されたグリコシル化ピリンの完全なタンパク質分解によって、セリン残基(ピリン残基に結合している)に共有結合されたグリカンが放出される。アミノグリカンは、ゲル濾過及び薄膜クロマトグラフィーによって精製される。このようにした単離されたアミノグリカンは、当該分野で広く知られた化学的方法によって、輸送タンパク質に共有結合される。例えば、アミノグリカンは、オボアルブミン又は他の適当な輸送タンパク質(例えばキーホールリンペットヘモシニアン)やエクソトキシンＡのトキソイドに結合される。その方法として、輸送タンパク質をリン酸塩緩衝溶液(PBS)の中に溶解した後、アミノグリカンを加え、その後、0.2％グルタルアルデヒドをPBSに滴下する。該溶液を、室温で１時間撹拌し、この時、グリシンを加えて、架橋反応をクエンチする。混合物を透析し、冷凍保存することができる。１種又は２種以上の異なるグラム陰性細菌に由来するアミノグリカンは、同じ輸送タンパク質又はグリコシル化ピリンに結合され、免疫応答を引き出すのに使用される多価組成物が製造される。或いはまた、異なる輸送タンパク質上に異なるＯ抗原を有する組成物を調製することにより、キャリヤーによってもたらされる有害反応を低減できる。
【００３１】
前述の精製溶液はどの溶液も、当該分野で公知の方法によって脊椎動物に投与できるように調製される。この方法には、例えば、溶液を濾過して殺菌すること、溶液を希釈すること、補助剤(adjuvant)を加えること及び溶液を安定化させることを含んでいる。組成物は、運搬及び保存を容易にするために、凍結乾燥して乾燥形態に作ることができる。更に、該組成物は、添加される抗原が組成物の有効性を妨げず、副作用や有害反応が生じたり又は相乗的に作用しない限り、前述した１種又は２種以上の異なるグリカンが結合されたグリコシル化線毛、混合グリコシル化線毛又は輸送タンパク質と、少なくとも１種の他の抗原を含む混合形態に調製されることもできる。
【００３２】
本発明の更なる特徴として、単離されたグリコシル化ピリン又は単離されたアミノグリカンを用いて、免疫応答の存在を示す抗体の存在を調べて、感染している脊椎動物を検査することができる。当該分野で広く知られた標準的な方法を使用して、診断アッセイを構築することができる。このアッセイは、例えば、微量滴定プレート又はニトロセルロースその他の膜などの表面(即ち、固体支持体)の上に、グリコシル化線毛、Ｏ抗原繰返し単位含有輸送タンパク質、又は単離されたＯ抗原繰返し単位構造の全部又は特定の部分をコーティングし、それを、グラム陰性細菌感染の疑いがある動物の血清と接触させることにより行なう。血清の中で、グリコシル化ピリン又はアミノグリカンと、それらに特異的な抗体との間で形成される複合体の存在は、例えば、当該分野で公知の蛍光抗体分光法又は比色法によって検出することができる。この検出方法は、例えば、グラム陰性細菌感染症の診断及び分類(typing)のために使用される。また、抗LPS抗体の精製は、アミノグリカンをゲルマトリクス(即ちデキストラン)に共有結合させることによって行なうことができる。アフィニティークロマトグラフィーを用いると、免疫性を与えられた脊椎動物の血清の抗体を、単離し精製することができる。
【００３３】
この明細書で使用する「脊椎動物」なる語は、動物界において脊椎骨を有する全ての種類を意味し、哺乳類(ヒトを含む)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類が含まれる。
【００３４】
この明細書で使用する「免疫応答を引き出す(eliciting an immune response)」なる表現は、例えば、抗体応答を引き出す本発明の方法及び組成物の能力を意味する。そのように引き出された抗体は、当該分野で既知の方法によって精製され、ELISA、ウェスタンブロット又は表面プラズモン共鳴等の技術を用いて、臨床的環境で使用されることにより、グラム陰性細菌に感染している脊椎動物中に存在する有機体を迅速に同定することができる。
【００３５】
更に、これらの抗体は、抗血清として使用し、適当なキャリヤーの中に含めて脊椎動物に投与することにより、グラム陰性細菌感染に対する消極的抵抗力が脊椎動物に付与され、その感染と戦う際に、動物生来の免疫応答を補助する役割を果たす。
【００３６】
本発明の更なる特徴として、「免疫応答を引き出す」という表現は、適当なキャリヤーの中に含めて脊椎動物に投与したとき、グリコシル化線毛又はグリコシル化輸送タンパク質が防御免疫を付与できる能力を意味する。
【００３７】
組成物は、密封したバイアルやアンプルなどに保存できる。本発明の組成物は、一般的には、液体又は懸濁液の形態で投与される。組成物が乾燥形態の場合、組成物を投与する前に、組成物は、殺菌された蒸留水の中で溶解又は懸濁させる。一般的に、組成物は、経口投与、皮下投与又は皮内注射、筋肉注射される。呼吸器感染の場合、抗体を中和し、感染又は疾患に抵抗性をもたらすのに有効な量を、経鼻投与することが望ましい。
【００３８】
＜実施例＞
以下の実施例は、本発明の例示であって、いかなる意味でも発明を限定するものと解すべきではない。
【００３９】
＜材料及び方法＞
Ａ．媒体及び条件
全ての培養物(cultures)は、特に記載のない限り、３７℃のLB(Luria Bertani)培養液又はLB寒天プレート(pH 7.3)の中で培養される。各プラスミドの構築(construct)に必要な抗生物質の条件を、表１に記載している。
【００４０】
Ｂ．トリパレンタル・メイティング(Triparental Mating)
プラスミド構築物の緑膿菌1244への移動は、トリパレンタル・メイティング法(Ruvikin及びAusubel(1981)に記載)により行なった。移動させるプラスミドは、受容細胞の緑膿菌1244に発現する遺伝子の他に、ColE1複製起点(oriR)、転移起点(oriT)を含んでいる。自己伝達性(self-transmissible)プラスミドpRK2013は、その伝達遺伝子(transfer(tra) genes)が発現すると、移動可能な(mobilizable)プラスミドが大腸菌1244へ移動することができる。トリパレンタル・メイティングの過程で、自己伝達性プラスミドは、移動可能プラスミドを含む有機体の中に移動し、そこでtra遺伝子が発現する。発現したtra遺伝子は、次に、oriTにて移動可能プラスミドを開裂し(cleave)、移動可能プラスミドの受容体細胞への移動を容易にする。緑膿菌1244、大腸菌HB101(pRK2013)及び移動可能プラスミド構築物の３種類の細菌株を含む細菌株を、適当な抗生物質と共にシェーキングしながら一晩培養した。使用する各培養物の細胞が確実に等量となるように、一晩培養後の光学濃度を測定した。３種類の培養物を混合し、ペレット化し、200μlのLB培養液の中に再懸濁した。次に、0.45μMのフィルター(Millipore, Bedford MA)を、各々のLB寒天プレートの上に載せて一晩培養した。細胞をフィルターから取り除き、5.0mlのLB培養液に再懸濁した。この懸濁液のアリコートを、適当な抗生物質が入れられた寒天プレート上に散布し、移動可能プラスミドが含まれる(harboring)緑膿菌1244コロニーを単離する。
【００４１】
Ｃ．ＬＰＳの抽出
HitchcockとBrown(1981)に記載の方法を使用して、LPSを、細菌株から抽出した。一晩培養した培養物から2mlの細胞をペレット化し、排出し、200μlの1X SDSローディングバッファー(50mM Tris/HCl pH 6.8, 100mM DTT, 2％SDS, 0.01％ブロモフェノール・ブルー, 10％グリセロール及び0.001％β-メルカプト-エタノール)に再懸濁した。該サンプルを95℃で10分間加熱し、その後25μgのプロテイナーゼKを用いて、60℃で１時間処理した。
【００４２】
Ｄ．細菌株及びプラスミド
表１は、この実験で使用した全ての細菌株及びプラスミドのリストを含んでいる。各細菌株及びプラスミドの簡単な説明を、選択的媒体条件を挙げて記載している。
【００４３】
Ｅ．グリコシル化された緑膿菌1244ピリンの調製
１．少量(small-scale)のピリン抽出
緑膿菌をピリン製造のために試験する場合について、少量のピリンを抽出した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)のために、全体の細胞からピリンを調製した。一晩培養後のプレート培養物を、5.0mlのLB培養液に懸濁し、ペレット化し、1.0mlの1X SDSローディングバッファーの中で再懸濁した。この懸濁液を分析前に95℃に加熱した。等電点電気泳動を行なうために、一晩培養したプレート培養物を、5.0mlのLB培養液に懸濁し、渦流作用によって脱毛した(depiliated)。細胞残屑を遠心作用によって除去し、上澄み(supernatant)に存在する残りの線毛を0.5M NaCl及び3％PEGで析出させた。析出物を、遠心作用によって除去し、1％n-オクチル-β-D-グルコピラノシド(BOG)の中で再懸濁した。
【００４４】
【表１】
2005526500.tif 000002
【００４５】
２．大量(large-scale)のピリン抽出及び精製
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化(MALDI)分析のために大量のピリン(0.5-0.6mg)が必要な場合、大量ピリン抽出及び精製プロトコルを使用した(Castric, 未公開プロトコル)。このプロトコルの各析出ステップでは、懸濁液の最終濃度を、3.0％ポリエチレングリコール(PEG)及び0.5M NaCl又は0.5M MgCl2に調節して行なった。所望のプラスミド構築物が含まれる緑膿菌1244を、冷凍保存培養物から選択的寒天プレート上で単一コロニーにストリークし、一晩培養した。次に、一晩培養したプレートの単一コロニーを用いて、10mlの液体培地を接種し、225rpmでシェーキングしながら一晩培養した。次に、一晩培養した培養物を、２つのパイレックス深皿(204X345X50mm)に投入した選択的寒天培地に分散させた。次の日、細胞を採取し、300mlのLB培養液の中で懸濁し、渦流によって脱毛した。細胞残屑を遠心力(5000rpm/15分/GSA Sorvall rotor)によって除去し、残りの上澄みを、PEG及びMgCl2により、４℃で4〜5時間かけて析出させた。析出物を、遠心力(9000rpm/30分/GSA Sorvall rotor)により除去し、20％スクロースを含有する300mlの10.0mM Tris/HCl, pH 7.60の中で再懸濁し、４℃で一晩培養した。次の日、混合物を撹拌し、残留屑を遠心力(4000rpm/15分/GSA Sorvall rotor)により除去した。上澄みを前述同様に析出させ、４℃で２時間保持した。析出物は、遠心力(9000rpm/30分/GSA Sorvall rotor)により除去し、300mlの脱イオン化H2Oの中で再懸濁し、室温で30分間保持した。析出物を遠心力(4000rpm/15分/GSA Sorvall rotor)によって除去し、廃棄した。PEG及びMgCl2を上澄みに加えて、氷の上で30分間保持した。懸濁液を、遠心力(9000rpm/30分/GSA Sorvall rotor)により除去し、150mlの脱イオンH2Oの中で再懸濁し、保存した。遠心力(4000rpm/15分/GSA Sorvall rotor)によって除去した後、ペレットを廃棄し、上澄みをPEG及びNaClによって析出させた。懸濁液を氷の上で30分間保持し、ペレット化し(4000rpm/30分/GSA Sorvall rotor)、排出した。次に、ペレットを、30分間室温で保存した75mlの脱イオン化H2Oの中で再懸濁し、等量を３本の遠心分離管に分配し、遠心力(5000rpm/15分/SS34 Sorvall rotor)によりペレット化した。析出物を廃棄し、上澄みをPEG及びMgCl2で析出させた。懸濁液を、氷の上で30分間保持し、ペレット化し(9000rpm/30分/SS34 rotor)、排出した。各ペレットを、9.6mlの脱イオンH2Oの中で再懸濁し、室温で30分間保存し、1.2mlアリコートを、1.5mlマイクロ遠心分離管に投入した。析出物を遠心力によって除去し、上澄みを新しい管の中に入れ、再度PEG及びMgCl2で析出させた。混合物を、氷の上で30分間保存し、ペレット化し、排出し、1.2mlの脱イオンH2Oの中で再懸濁し、室温で30分間保存した。次に、最後の析出ステップを繰り返した。ピリンは、Bio-Rad Protein Assayを用いて定量し、SDS-PAGEと銀染色によって分析して純度を調べた(これらの方法については後で説明する)。このプロトコルから単離されたピリンを、-20℃で乾燥保存、又は４℃で湿潤保存した。
【００４６】
Ｆ．LPS及びピリンタンパク質の特徴付け
１．ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)
LPSとピリン抽出物の分離は、Laemmli(1970)の標準的方法に係るSDS-PAGEにより、Novex X-Cell Surelock(TM)Mini-Cellシステムを用いて行なった。ポリアクリルアミドゲルを、分離されたゲルに対して、12％T〜15％Tの範囲の濃度で、1.0mmのInvitrogenカセット(Carlsbad, CA)の中に投入した。サンプルの調製は、前述のとおり行なった。ゲルは、1X Tris/グリシン・バッファー(25mM Tris, 250mMグリシン, 0.1％SDS)の中に入れた。カレイドスコープ及びSDS-PAGEの広範囲染色標準(Bio-Rad, Hercules, CA)を各ゲルと共に用いた。この方法の変形形態が用いられたのは、泳動バッファーだけを、Tris/グリシンからTris/Tricineに変えた場合である。この方法では、Novex装置を使用し、インナーチャンバーのカソードバッファーは、0.1 M Tris, 0.1 M Tricine, 0.1％SDSであり、アウターチャンバーのアノードバッファーは0.2 M Tris/HCl pH 8.9)である。
【００４７】
２．ウエスタン免疫ブロット分析
ウエスタン免疫ブロット分析により、LPSとピリンサンプルについて、モノクローナル抗血清とポリクローナル抗血清の血清型特異反応を可視化した。PAGE分離が完了した後、Bio-Rad Mini Trans-blot(商標登録)の電気泳動用輸送細胞を、Trans-blottバッファー(25nM Tris, 192mMグリシン, 20％メタノール, pH約8.3)の中で、定電圧100Vにて20分間処理することにより、LPSと線毛を0.2-0.45μmのニトロセルロース(NC)紙(Micron Separations Inc. Westborough, MA)上にエレクトロブロットした。完了後、NC紙を除去し、ウシ血清アルブミン10gを含有するKiller Filler(KF)(カゼイン10gを添加した200mlの0.1M NaOH)中に20分間ブロックし、1.8Lのリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)[5.3L脱イオンH2O, 28g NaCl, 0.7mlg KCl, 4.0g Na2HPO4, 0.35g CaCl2-2H2O, 0.53g MgCl2-6H2O]に加えた。溶液のpHは、7.4に調節し、次に、フェノールレッド0.2g及びアジ化ナトリウム3.6g[Lynette Young of the Walter Reed Army INstitute of Research, personal communication]を加えた。完了後、NC紙を、KF中に1:1000に希釈した一次抗体溶液(表２)で一晩処理した。PBSによるNC紙の洗浄を、10分間隔で３回行なった。NC紙を十分に洗浄した後、KF中で1:1000に希釈したホスファターゼ共役ヤギ抗マウス二次抗体又はヤギ抗ラビット二次抗体(表２)を、90分間加えた。二次抗体処理の後、NC紙をPBSで２回洗浄し、50mM Tris/HCl pH8.0で１回洗浄した。10mgのNapthol AS-MXリン酸塩(Sigma Chemical, St. Louis, MO)と、10mlの50mM Tris/HCl pH8.0に溶解したFast-Red(Sigma Chemical, St. Louis, MO)を20mg含む現像液(developer)を、緩やかにシェーキングしながら添加すると、反応は可視化した。レッドバンドの出現は、陽性反応を意味する。NC紙を数秒間水道水で洗い流し、反応を終了させた。
【００４８】
【表２】
2005526500.tif 000003
【００４９】
３．SDS-PAGEゲルの銀染色
SDS-PAGEゲル上で分離されたLPS及び線毛を、Nesterenko(1994)に記載された銀染色法によって可視化した。完全に分離させた後、SDS-PAGEゲルを1.5mlの50％トリクロロ酢酸及び27μlの37％ホルムアルデヒド含有50％アセトン60.0mlの中に、５分間入れた。ゲルを、dH2Oの中で５分間洗浄し、50％アセトン60mlで５分間処理し、60mlのdH2O中で、100μlのNa2S2O3・5H2Oで１分間前処理した。ゲルをAgNO3ストック(0.8ml AgNO3, 0.6ml 37％ホルムアルデヒド, 60ml dH2O)に８分間含浸させた後、ゲルをdH2Oで洗浄し、現像液(0ml dH2O中、1.2g Na2CO2, 25μl 37％ホルムアルデヒド, 25μl Na2S2O3・5H2O)の中で10-20秒間保持し、可視化した。LPS又はピリンのバンドが観察された時に、１％氷酢酸を添加して反応を終了させた。次に、ゲルを脱染色液(destain)で洗浄し、Gel Wrap(BioDesign Inc.)及び安定化カセット(Carmel, NY)の中で空気乾燥させた。
【００５０】
４．等電点ゲル電気泳動法(Isoelectric Focusing Gel Electrophoresis)
等電点電気泳動法を使用して、ピリンタンパク質の等電点を求めた。この実験では、等電点電気泳動法は、LKB-Pharmacia Phastsystemを使用し、そのプロトコルの記載に基づいて、0.2% ポリアクリルアミド・プレキャストPhastgels(TM)・IEF 3-9 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を用いて行なった。タンパク質を分離する前に、ゲルは、IEF用のpH 3.5-9.5となるように予め混合した10mlのLKB Pharmacia Ampholine (TM)(Uppsala, Sweden)と2% BOGの中に、30分間浸漬した。ピリンのサンプルを、前述の要領にて抽出し、1% BOGの中で懸濁させた。分離が完了した後、タンパク質を、拡散ブロッティングにより、2.5時間かけて、0.2μm PVDF膜(Bio Rad Laboratories, Hercules CA)に移動させた。このステップの前に、PVDF膜は、10mlの50％メタノールの中で培養しておいた。PVDF膜は、吸収されたタンパク質を含んでおり、次に、KFの中でブロックし、ウエスタンブロットプロトコルの記載に基づいて処理した。
【００５１】
５．コロニー免疫ブロッティング
コロニーが血清型特異的Ｏ抗原が発現したかどうかを調べるために、コロニー免疫ブロットを行なった。細胞を、適当な選択的抗体を含む寒天プレート上に散布し、一晩培養した。OsmonicsTMNitrobindニトロセルロース転移膜0.45μm, 82mm(Minnetonka, MN)を、コロニー上に直接載せ、寒天プレート上の方向をマークした後、慎重にリフトした。次に、適当な陽性対照と陰性対照を、消毒済みの楊枝を用いて膜の上に載せた。次に、前記膜をKFでブロックし、ウエスタンブロットプロトコルの記載に基づいて処理した。
【００５２】
６．スライド凝集反応血清試験
スライド凝集反応血清試験は、表面抗原と血清型特異的抗体との反応性を調べるための簡単且つ迅速な方法である。この試験を使用して、大腸菌Ｏ157:H7のＯ抗原エピトープが緑膿菌1244の表面に存在するかどうかを調べた。全ての試験は、陽性[大腸菌LE392(pDS300)]と陰性[緑膿菌]対照と共に行なった。大腸菌Ｏ157:H7のＯ抗原遺伝子クラスターを含むプラスミドが存在する緑膿菌1244を、選択的寒天プレート上で単一コロニーになるまで培養した。単一コロニーを、10μlのリン酸塩緩衝液(PBS)の中で懸濁し、顕微鏡用スライドに載せた。5μlの大腸菌Ｏ157:H7ポリクローナル血清(Beckton Dickinson, Cockeysville, MD)を加え、2-3分培養した後、懸濁液を解剖用顕微鏡で観察した。細胞が粒状に凝集すると陽性反応を意味し、これは、陰性対照の大腸菌HB101とは明らかに区別される。
【００５３】
７．タンパク質定量法
ピリンタンパク質を定量する必要がある場合、Bio-Rad Protein Assay(Hercules, CA)を使用することができる。この方法は、Bradford (1976)に記載された検定法に基づいており、ウシ血清アルブミン(BSA)を対照として使用し、様々な濃度のタンパク質に応じて、染色溶液の色変化を測定するものである。簡単に説明すると、タンパク質のサンプルを、200μlのBio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrateの中で懸濁させ、dH2Oを用いて最終体積を1 mlにした。次に、吸収度を、UNICO 2400 UV Spectrophotometer(Dayton, NJ)を用い、95nmにて測定した。次に、関連サンプルのタンパク質濃度を、標準曲線(Ｙ軸が対照O.D.595、Ｘ軸が対照タンパク質濃度)の対照の吸収度値と比較することによって推定した。
【００５４】
８．マトリックス支援レーザーイオン化(MALDI)質量分析法
精製したピリンをMALDI分析する必要がある場合、タンパク質をまず定量し、10mM酢酸アンモニウムで透析し、Virtis Research Lyophilizer (Gardiner, NY)を使用して凍結乾燥した。次に、乾燥したピリンサンプルの分析を、カーネギー・メロン・ユニバーシティ、分子分析メロン・インスティチュート・センターのDr. Mark Bierによる方法にて、DE及び高m/z検出器を有するPerseptive Biosystems Voyager STRを用いて行なった。
【００５５】
Ｇ．DNA技術
１．アガロースゲル電気泳動法
プラスミドとゲノムDNAの抽出結果と制限酵素の消化の結果を、アガロースゲル電気泳動法により分析した。更にまた、この方法を用いて、クローン化に使用する前にDNAを精製した。この実験で使用したアガロースの割合は、0.4％〜0.8％であり、International Biotechnologies, Inc. (IBI) (New Haven, CT)のミニ・ゲル装置又はIBIのミディアム・ゲル装置に投入した。ミニ・ゲル装置は定電圧100Vにて、ミディアム・ゲル装置は100-150Vにて運転し、1X TBEバッファー(89 mM tris, 89mMホウ酸, 2mM EDTA, pH8.3)の中でゲルを泳動させた。DNAサンプルは、Roche Molecular Biochemicalsの分子量標準、1 kb DNAラダー又はλ Hind III digest (Mannheim, Germany)に基づいて泳動させた。泳動後、アガロースゲルを、臭化エチジウム(EtBr)(dH2O中、2.5μg/ml)の中で10分間染色し、その後、更なる10分間、dH2Oの中で脱染色した。Spectroline Model TR-302 UVのトランスイルミネータの上にゲルを載せ、Fisher Scientific ELECTROPHORESIS System(Pittsburgh, PA)のフォトドキュメンテーションカメラで写真撮影した。
【００５６】
２．プラスミドDNA及びゲノムDNAの単離
プラスミドDNAの少量調製物及び大量調調製物の単離は、Maniatis (1982)に記載された標準のアルカリ溶菌法により行なった。ゲノムDNAは、一晩培養した1.0mlの培養物から調製し、遠心力によりペレット化し、400μlの溶菌バッファー(13.5mM EDTA, 50mM NaCl, 10mM Tris/HCl及び0.5 mg/mlリゾチーム, pH8.0)の中で再懸濁し、37℃で15分培養した。この混合物に、2.0μlのRnase溶液(10mg/ml)(Sigma Chemical. St. Louis. MO)を加え、37℃で15分培養した。完了後、100μlのPronase溶液(5mg/ml)(Sigma Chemical. St. Louis. MO)を加え、37℃で15分培養した。次に、サンプルを２本の遠心分離管に分配し、トリス飽和フェノールで２回抽出し、クロロホルム／イソアミルアルコール(24:1)で２回抽出した。次に、−20℃の２容積の無水エタノールの中で20分間保存して、ゲノムDNAを析出させ、遠心作用によってペレット化した。ペレットを70％エタノールで洗浄し、真空デシケーターの中で乾燥し、PCRに対しては脱イオン水、制限消化に対してはTEバッファー(10mM Tris/HCl, pH7.4, 1mM EDTA)を用いて再懸濁した。
【００５７】
３．フェノール／クロロホルムの抽出
フェノールとクロロホルムの抽出は、プラスミドDNAの制限酵素消化後に行ない、クローン化を妨げるタンパク質又は他の汚染物質を除去した。この方法では、等量のフェノール(1.0M Tris/HCl, pH8.0で中和)を、DNA溶液に加え、その後、渦流及び遠心力を作用させた。上部の水相を取り除き、新しいバイアルに入れ、フェノール：クロロホルム：イソアミル・アルコール(25:24:1)で処理し、再び、渦流及び遠心力を作用させた。最後に、水相を除去し、クロロホルム：イソアミル・アルコール(24:1)だけで処理し、微量のフェノールを全て取り除いた。遠心分離後、水相のDNAを、エタノールで析出させて回収した。
【００５８】
４．DNAのエタノールによる析出
エタノールにより、水溶液からDNAを析出させて回収した。この方法では、DNA溶液を、1.0μlのグリコーゲン(20μl/ml, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)、0.25容積10M酢酸アンモニウム及び２容積の無水エタノールと混合し、次に、-80℃で15分間保存した。培養後、DANを遠心作用によってペレット化し、Savant Instruments SC110 speed vacuumで乾燥させた。次に、特に説明しない限り、DNAペレットを、10mM Tris/HCl, pH8.5の中で再懸濁した。
【００５９】
５．DNAの定量化
挿入DNAがプラスミドDNAにライゲーション(ligation)する前にライゲーション反応を最大にするために、両者を定量化した。この実験では、DNAを、アガロースゲル電気泳動法及び紫外分光法によって定量化した。アガロースゲル電気泳動法によるDNA定量化では、サンプルDNAを、既知濃度の異なる量のλファージDNAと共に泳動させた。EtBr染色の後、サンプルDNA断片の強度を、λファージDNAの強度と比較し、適当な濃度を決定した。更に、Perkin Elmer MBA 2000 UV 分光光度計を使用し、その仕様書の記載に基づいて、DNAを定量化した。
【００６０】
６．高分子量DNAの部分消化条件の構築
これは、高分子量DNAから20Kb断片を調製するのに、Maniatis(1987)が記載した標準プロトコルの変形形態を用いて行なった。調製した反応混合物は最終容積が150μlで、１μgの高分子量DNAとEcoR I制限酵素バッファーを含んでおり、十分に混合した。このDNA溶液30μlを、ラベル１の遠心分離管に分配し、DNA溶液15μlを、ラベル２〜９の８本の遠心分離管に分配した。９本の管の全てを、氷の上で30分間冷やした。４単位の制限酵素EcoRIを管１に加え、その後、内容物が良く混合されるように、管を反転する操作を繰り返して行なった。次に、この反応物15μlを、管２へ移し、前述のとおり混合した。２倍連続希釈法を管８まで繰り返したが、管９には何も加えなかった。９本の全ての管を、37℃で１時間培養し、その後、60℃で20分間加熱して、反応を停止させた。次に、アガロースゲル電気泳動法により、0.4％アガロースゲルを、定電圧10Vで一晩泳動させて分析した。20Kb領域にDNA断片を含むレーンを選択し、この部分消化を得るのに使用した酵素の量を計算した。
【００６１】
７．pDOG1-6の構築
大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原遺伝子クラスターは、Denise Schmidt (Schmidt, 1996; Maurer ET AL., 1999)によるコスミッドクローニングから製造され、Dr. John Maurer (the University of Georgia, School of Veterinary Medicine)から贈られたpDS300の30Kb断片の中に含まれている。pDS300は、緑膿菌1244の中で複製することができないから、大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原遺伝子クラスターを、広宿主域コスミッドベクターpLAFR1にサブクローニングした。これは、上記の方法を使用して、pDS300の部分消化を25-30Kb断片に構築することにより行なった。25-30Kb DNA断片を、EcoRIの消化によって単離し、EcoRI処理されたpLAFR1に連結した。次に、クローン化されたコスミッドベクターpLAFR1を、Stratagene Gigapack(TM)XL-11のパッケージングシステムを用いて、バクテリオファージラムダ粒子としてパッケージし、大腸菌HB101に感染させるために使用した。トランスフェクタント(transfectants)を、LB Tcプレート上に選択した。ここで、Ｏ157:H7-陽性クローンは、Ｏ157-特異的抗血清(図１)を使用して、コロニー免疫ブロットによって同定した。これらのプレートの中で、Ｏ157-特異的抗血清と強い反応を示した６個のＯ157:H7陽性クローンを選択し、両培養物の中で培養した。その次の日、プラスミドを各クローンから単離し、EcoR1で処理し、EcoR1完全消化のpDS300を対照として使用したアガロースゲル電気泳動法によって分離した。アガロースゲルの結果から、６個のＯ157:H7陽性クローンの全てが、pDS300と同じサイズのDNA断片を含んでいることがわかった(図２、パネルＡ及びＢ)。
【００６２】
次のステップは、各大腸菌HB101クローンのLPSが、Ｏ157:H7Ｏ抗原を発現したことを確認することである。次に、各陽性クローンのLPSを、HitchcockとBrown(1983)が記載した方法を使用して抽出し、ウエスタンブロット法によって分析した。図３は、６つの大腸菌HB101クローンの各々がＯ157:H7抗血清と反応し、大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原遺伝子クラスターの単離を確認するものである。次に、大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原遺伝子クラスターを含むコスミッドを、pDIG1-6と称している。これは、図２のパネルＢのコスミッドのレーンの番号による。これらの結果は、全てが、大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原遺伝子クラスターの単離及び広宿主域コスミッドベクターpLAFR1のクローニングし、pDIG1-6を形成することを確認するものである。
【００６３】
８．クローニングのためのプラスミドDNA及び挿入DNAの調製
プラスミド調製物のDNAを、製造業者の仕様に推奨された制限酵素で処理し、クローニングのためのプラスミドを調製するか、又は別のプラスミドにクローニングするためにDNA断片を取り除く。プラスミドDNAが同一の末端を含む場合、プラスミドをCalf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)で処理した。複数のクローニング領域から制限部位を除去する必要がある状況において、プラスミドを、認識部位が取り除かれるべき酵素で消化させ、次に、T4ポリメラーゼで処理した。挿入DNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(後で説明する)により、又は、制限酵素消化後のプラスミドから単離した。両方の場合とも、挿入DNAを、アガロースゲル電気泳動法により精製し、Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit (Valencia, CA)を使用し、その製造プロトコルに基づいて、アガロースから抽出した。この時点で、プラスミドと挿入DNAは両方とも、ライゲーションの準備ができている。
【００６４】
９．プラスミドDNA及び挿入DNAのライゲーション；大腸菌への導入
プラスミドDNAと挿入DNAを調製し定量化した後、T4 DNAリガーゼを使用して、プラスミドDNA：挿入DNAの比を100:200ngで結合させた。ライゲーション反応後、形質転換(transformation)又はトランスフェクションの何れかによって、DNAを大腸菌へ移動させた。形質転換反応のために、クローン化したプラスミドDNAを、大腸菌DH5α Competant Cells (Gibco BRL, Life Techinilogies, Carlsbad, CA)へ移した。更に、クローン化したコスミッドDNAを、Stratagene Gigapack(商標)のIII XLパッケージング抽出物(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて、バクテリオファージλ粒子としてパッケージし、それを用いて大腸菌HB101を形質導入した。形質転換とトランスフェクションの両反応は、製造業者の仕様書の記載に基づいて行なった。
【００６５】
１０．緑膿菌に対する対立遺伝子の交換方法
対立遺伝子(allele)の交換は、Schweizer (1992)が記載した方法によって行なった。この方法では、プラスミドは、ColE1型oriR、複数のクローニング部位、oriT、逆選択可能な(counter-selectable)sacB遺伝子、及び大腸菌中のプラスミドの選択が可能な抗生物質抵抗マーカーを含んでいる。これらのプラスミドの特有の性質は、sacB遺伝子であって、これは、グラム陰性細菌中に発現するとき、有機体をスクロースに反応し易くする。この方法では、置き換えられるべき対立遺伝子の複製は、対立遺伝子交換プラスミドにクローン化され、選択可能な抗生物質抵抗マーカーによって挿入突然変異が行われる。遺伝子が一旦クローン化され突然変異が起こると、プラスミドは、トリパレンタル・メイティングによって、大腸菌から緑膿菌へ移される。このクローン化プラスミドは、ColE1 oriRの存在により、緑膿菌中で複製できないから、２つの事象のうちの１つは、緑膿菌が、所望の対立遺伝子を突然変異させるのに使用されるマーカーへの抵抗性が得られるようにせねばならない。第１に、プラスミドは、１つの相同的組換え事象によって染色体と一体になり、部分倍数体(merodiploid)を形成する。第２に、二重交差事象(double cross-over event)が起こり、野生型対立遺伝子の損失と、突然変異した対立遺伝子の獲得が起こる。この対立遺伝子交換方法を使用すると、第２の事象の単離は、スクロース含有媒体上で二重交差事象を選択することによって増加する。
【００６６】
１１．rpoN対立遺伝子交換プラスミドの構築
Schweizer (1992)が開発した対立遺伝子交換技術は、緑膿菌に用いるために特に構築されたプラスミドを利用している。この技術を、緑膿菌1244のrpoN突然変異菌株の単離に用いるには、rpoN遺伝子は、図４に示す対立遺伝子交換プラスミドのうちの１つにクローン化されていなければならない。一旦クローン化されると、前記遺伝子は、選択可能な抗生物質抵抗性マーカーの挿入によって突然変異し、遺伝子内部の独自の部位に配置される。rpoN遺伝子は、およそ1.5Kbであり、１つのPst1認識部位を含んでいる。抗生物質抵抗カセットをPst1認識部位へ挿入すると、マーカーの何れかの側にある野生型ＤＮＡ配列のおよそ0.9kbと0.6Kbに夫々に分離し、相同的組換えによる対立遺伝子の交換が十分に可能となる。更に、両方の対立遺伝子交換ベクターに関する複数のクローニング部位もPstI認識部位を含んでいるが、EcoRI制限部位とHindIII制限部位の間に配置されている(図４)。従って、どちらのベクターをEcoRI及びHindIIIで処理しても、PstI認識部位の損失を招く結果となる。当初、この手法は、緑膿菌1244ゲノムからrpoN遺伝子を増幅させるものであった。この方法では、EcoRI制限部位5'と HindIII制限部位3'をrpoN遺伝子に組み入れたPCRプライマーを発現した。アガロースゲル電気泳動法及び酵素処理による精製後、導入されたHindIII制限部位は、一連のライゲーション反応によって機能しておらず、PCR産物はそれ自体に結合できなかった(データは示さず)。この問題を修正するために、導入されたHindIII制限部位を含む２種類の追加プライマーを発現させたが、結果は、新しいプライマーの両方の場合とも同じであった。
【００６７】
rpoN遺伝子は、pKI11のKpnI制限遺伝子の内部にも含まれている(Ishimoto and Lory, 1989)。このプラスミドは、菌株1244N3を単離するために使用されたものであって、rpoN遺伝子のPstI制限部位の中のTcrカセットを含んでいる。別の方法では、この突然変異遺伝子を、KpnIの消化によって単離し、対立遺伝子交換プラスミドのうちの１つにクローン化した。Tcカセットを、別のマーカーと置き換えた。まず、rpoN遺伝子内のTcrカセットを置き換えるために、PstI部位を、pEX18Gmの複数のクローニング領域から取り除かねばならなかった。これは、PstIで処理したpEX18GmT4ポリメラーゼを使用し、その後、一晩ライゲーション反応させることによって行なった。次に、このライゲーション反応から得たDNAを使用して、大腸菌DH5α細胞を形質転換し、その後、寒天プレート上のプラスミドGm耐性マーカーを選択した。総計30個のGm耐性コロニーを単離し、その内の６個を更に分析した。６個のコロニー全てを培養液中で培養し、プラスミドを抽出し、PstIで消化した。６個のプラスミドのうちの２個は、PstIで消化することが出来ず、pAD99を形成した(図５)。このプラスミドを単離した後、rpoN::Tcrカセットを、KpnIの消化によってpKI11から取り除き、アガロースゲル電気泳動法によって精製し、同様に処理したpAD99と結合させた。このpAD99は、Calf Intestical Alkaline Phosphatase (CIAP)で脱ホスホリル化された。ライゲーションの後、DNAは、大腸菌DH5αに形質転換され、Gm及びTcを含む寒天プレート上で選択された。３個のGm及びTc耐性コロニーを単離し、rpoN特異的プライマーを使用して、(Pst I, Kpn I, 及びEcoR I)及びPCRを酵素消化することによって試験し、プラスミドの構築を確認した(結果は図示せず)。確認後、生じたプラスミドをpAD100と名付けた(図５)。
【００６８】
次に、pAD200(図６)とpAD300(図７)を、新たに生成したpAD100から構築した。pAD200は、Tcrカセットを、pKT210由来クロラムフェニコール(Cmr)遺伝子と置き換えることによって作製した(図６)。
【００６９】
pAD300の構築は、pAD100のTcrカセットを、pUC-4K由来のカナマイシン(Kmr)カセットと置き換えることによって行なった(図６)。rpoN対立遺伝子交換方法の汎用性を増やすために、rpoN::Kmrカセットを、KpnIの消化によってpAD300から取り除き、pEX18Tcにクローン化し、pAD400を作った(図８)。pAD400を通じてpAD200が構築されたことは、pAD100と同じ要領にて確認した。
【００７０】
１２．DNAの増幅
DNAの増幅は、既知のDNA配列から発現したプライマー(Gibco BRL, Life Technologies, Carlsbad, CA)とのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行なった。表３は、この実験で使用したプライマーのリストである。Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler又はPerkin Elmer GeneAmp(TM) PCR 2400 systemを使用して、ゲノムDNAとプラスミドDNAの両方から、DNAを増幅した。1.5〜4Kbの範囲のDNA標的配列を、Perkin Elmer GeneAmp(TM)のCore Reagent Kit (Perkin Elmer Branchburgh, NJ)を使用して増幅した。各反応は、50μl容積中で行ない、各dNTP200μM、Taqポリメラーゼ1.25ユニット、フォワード及びリバースプライマー１μm、MgCl2、1X PCR BufferII2.5mM及びテンプレートDNA１ngの構成である。実施したPCRステップサイクルは、開始ステップが１分間97℃、25サイクルが(１分間95℃、１分間52℃、１分間72℃)、最終ステップが72℃で10分間である。
【００７１】
DNA増幅は、13〜17Kbの範囲の標的DNAについても試みた。この反応では、Perkin Elmer GeneAmp(TM)のXL PCR Kitを使用し、広範囲PCRを用いた。この方法には、Perkin Elmer AmpliWax(TM)のP-GEM Systemを利用したHot Start技術が含まれている。下側の試薬の総容量は、40μlであり、1X 3.3X XL PCR Buffer II、各dNTP200μM、フォワード及びリバースプライマー0.1〜0.5μM、Mg(OAc)21mMの構成である。この混合物に対して、AmpliWax(TM)のビードを加え、80℃で5分間加熱した。混合物は、固体ワックス層が下部試薬の上に形成されるまで冷却させた。上部試薬の総容積は60μlであり、1X3.3XXLPCRバッファII、rT番目のDNAポリメラーゼXL4ユニット、及びゲノムDNAテンプレート1ngからなる。上部試薬を、ワックス層の上部に直接加えた。実施したPCRステップサイクルは、開始ステップが94℃で1分間、(94℃で15秒間、60℃で12分間)が25サイクル、最終ステップが72℃で20分間である。
【００７２】
【表３】
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【００７３】
Ｈ．サザンブロット分析
１．プローブDNAの調製
野生型rpoN遺伝子を、この実験のサザンブロット分析のプローブとして選択した。BioNick(TM)Labelling System (Gibco, BRL Life Technologies, Carlsbad, CA)を使用し、そのプロトコルに記載に基づくニックトランスレーション法により調製した。rpoN遺伝子を、PCR増幅によって緑膿菌1244ゲノムから単離し、精製し、アガロースゲル電気泳動法によって定量化し、ニックトランスレーションの前に、前述のアガロースから抽出した。およそ１μgのプローブDNAが調製された。
【００７４】
２．ゲノムDNAの調製及びニトロセルロースへのブロッティング
野生型緑膿菌1244と推定突然変異菌株緑膿菌1244Q13の両方から、前述の如く、ゲノムDNAを単離した。各ゲノムDNA20μgを、BamHI及びHindIIIで16時間消化させ、翌日、0.8％アガロースゲル上で分離した。分離後、ゲルを、300mlのGel Soak I (1.5M NaCl, 0.5M NaOH)の中に浸漬し、室温にて20分間、緩やかに撹拌した。このステップをもう１度繰り返した。次に、該ゲルを、300mlのGel Soak II (1.5M NH3OAc, 0.5M NaOH)に、20分間室温でやさしく混ぜながら吸収させた。このステップを１回繰り返した。次に、キャピラリーブロット装置を、Maniatis (1982)に記載のとおり組み立てて、DNAを、アガロースゲルから、0.45μM NC紙(Micron Separations Inc. Westborough, MA)へ移した。ブロッティング処理は24時間行なった。翌日、NC紙をゲル表面から取り除き、50mlの6X SSC媒体(20X SSC: 3M NaCl2, 0.3M Na3 Citrate, pH7.0)の中に５分間浸漬した。NC紙を6XSSC媒体から取り除き、２枚の3MMワットマン紙の間に配置し、室温で10分間乾燥させた。次に、NC紙を、80℃の真空オーブンの中で、２時間ベーキング処理した。この段階で、NC紙は、プレ・ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションステップのための準備が整っている。
【００７５】
３．DNAプローブのNC紙へのプレ・ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション
ベーキング後、NC紙を実験室の作業台の上で10分間冷却し、50mlの2X SSCで水和し、密封可能なナイロン袋の中に入れた。5.0mlのプレ・ハイブリダイゼーション溶液(50％ホルムアルデヒド, 5X SSC, 5Xデンハート溶液[50Xデンハート溶液: 1％(w/v) Ficoll, 1％(w/v)ポリビニルピロリドン, 1％(w/v) BSA], 0.025M NaPO3, pH6.5, 0.5mg/mlサケ精子DNA)を、95℃で10分間加熱し、室温まで冷却し、NC紙に添加した。袋を密封し、十分に混合し、42℃で２時間培養した。培養終了直前に、5.0mlのプローブ／ハイブリダイゼーション溶液(45% ホルムアルデヒド, 5XSSC, 1Xデンハート溶液, 0.020 M NaPO3, pH6.5, 0.5％硫酸デキストラン, 0.2mg/mlサケ精子DNA, 200ng/mlのプローブDNA)を、95℃で10分間加熱し、室温まで冷却した。プレ・ハイブリダイゼーション溶液を排出し、プローブ／ハイブリダイゼーション溶液と交換し、42℃で一晩培養した。
【００７６】
４．ハイブリダイゼーション後の洗浄
その次の日、NC紙を、プローブ／ハイブリダイゼーション溶液から取り除き、ペーパータオルでぬぐい取って乾燥させた。NC紙を、250mlのハイブリダイゼーション後の溶液１(2X SSC, 0.1％ SDS)で15分間２回洗浄し、250mlのポスト・ハイブリダイゼーション溶液２(0.2X SSC, 0.1％ SDS)で15分間２回洗浄し、250mlのハイブリダイゼーション後の溶液３(0.16X SSC, 0.1％ SDS)で15分間２回洗浄し、2XSSCを用いて室温で３分間洗浄した。
【００７７】
５．検出
次に、NC紙を、25mlのBuffer 1 (0.1M Tris/HCl, 0.15M NaCl, pH7.5)で１分間洗浄し、BSA0.3gが加えられたBuffer 1を10ml入れた新しいプラスチック袋の中に入れた。その袋を、65℃で１時間培養した。BluGENE(TM)の非放射性核酸検出システムを使用し、その仕様に基づいて、NC紙を処理した。簡単に説明すると、溶液を、袋から取り出し、7.0mlのストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ共役(7.0ml BufferI, ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ)と取り替え、よく混ぜて、室温で10分間培養した。次に、NC紙を取り除き、ペーパータオルでぬぐい取って乾燥させ、280mlのBuffer Iで10分間３回洗浄し、その後、Buffer II (0.1M Tris/HCl, 0.1M NaCl, 0.05M MgCl2, pH9.5)で10分間洗浄した。次に、NC紙を、7.5mlの新しい可視用溶液(Visualization solution)(ニトロブルーテトラゾリウム2.5mg, 5-ブロモ-4-クロロ-3インドリルフォスフェート12.5mg、Buffer IIが7.5ml)が入れられた新しいプラスチック袋に入れ、暗室で5-30分間室温で培養した。反応の終了は、水道水でブロット(染み)を洗浄して、バンドが所定強度に達した時である。
【００７８】
＜実験１＞
緑膿菌PA103に由来するクローン化された血清型Ｏ11Ｏ抗原遺伝子クラスターは、緑膿菌1244LPSの中でＯ抗原ソースとして作用する。
Ｏ抗原の生合成経路が、ピリングリカンのソースとしての役割を果たすかを調べるために、緑膿菌の血清型Ｏ11由来のＯ抗原多糖体をエンコードする遺伝子クラスターを、緑膿菌1244に移し、この有機体のLPS上における血清型特異的Ｏ抗原の発現を試験した。最初の実験に緑膿菌Ｏ11のＯ抗原を選んだのは、これらの遺伝子は、単離され、特徴付けられており(Goldberg st al., 1992)、Ｏ抗原の糖残基は、緑膿菌1244LPSのLPS上に存在するものとは、構造的に非常に異なっているからである。緑膿菌Ｏ11の遺伝子クラスターは、pLPS2上の15Kb断片の中に含まれており、これは、Dr. Joanna Goldberg (University of Virginia Health Sciences Center)から贈られた。このプラスミドは、Ruvkin and Ausubel (1981)に記載されたトリパレンタル・メイティング法によって結合され、緑膿菌1244に移入され、プラスミドテトラサイクリン耐性マーカー(Tc)を選択することによりスクリーニングされた。
【００７９】
プラスミドが確実に緑膿菌1244へ導入されるように、まず、各Tc耐性コロニー上でプラスミドの抽出を行なった(結果は示さず)。次に、pLPS2プラスミドを保有する各1244菌株由来のLPSを、Hitchcock and Brouwn (1981) に記載された方法を用いて、一晩かけて培養物から抽出し、抗1244LPSモノクローナル抗体(mAb), 11.14(図９、パネルＡ)、及び抗Ｏ11 LPS mAb, 16.13(図９、パネルＢ)を使用して、ウエスタンブロット法によって分析した。パネルＡのレーン４〜５に見られるように、緑膿菌1244/pLPS2は、野生型1244菌株において観察される特異的Ｏ抗原ラダーを生成した(パネルＡ、レーン１)。大腸菌HB101を含むレーン２及び大腸菌HB101/pLPS2を含むレーン３では、どんな反応も見られなかった。パネルＢでは、緑膿菌1244菌株と、pLPS2(パネルＢ、レーン３〜５)を含む大腸菌HB101菌株だけが、16.13と反応することができた。これらの結果は、緑膿菌1244/pLPS2のLPSは、野生型と血清型の両方のＯ11 Ｏ抗原を含んでいることを示すものである。菌株1244と血清型Ｏ11 Ｏ抗原が、緑膿菌1244/pLPS2の中の別個のLPS鎖上で発現するかどうかを調べるために、この有機体のLPSを、ゲル分取用コームを使用し、ウエスタンブロット法により分析した。このブロットの半分は、mAb 11.14で反応し、残りの半分は、mAb 16.13抗血清で反応した。図１０に見られるように、Ｏ抗原ラダーの検出されたパターンは、各抗血清と反応すると、かなり異なる。これは、緑膿菌1244が、菌株1244Ｏ抗原又は血清型Ｏ11 Ｏ抗原のどちらかを含む別個のLPS分子を生成することを示している。
【００８０】
＜実験２＞
緑膿菌PA103に由来するクローン化された血清型Ｏ11遺伝子クラスターは、緑膿菌1244においてピリングリカンのソース(source)として作用する。
緑膿菌1244/pLPS2のLPS上にＯ11 Ｏ抗原が発現した後、この有機体の線毛について、Ｏ11 Ｏ-多糖類の存在を調べた。LPS Ｏ抗原ラダーは、ピリン分析をマスクするから、タンパク質は、等電点電気泳動法による電気泳動によって分離される。LPSは、強い負に帯電している構造であるから、電気泳動ゲル(focusing gel)から離れて移動する。この様にして分離されたピリンタンパク質は、LPSをうまく取り除く。緑膿菌1244/pLPS2由来のピリンを、一晩のプレート培養で抽出し、１％ n-オクチル-β-D-グルコピラノシド(BOG)の中に懸濁した。BOGは、天然状態の膜結合性タンパク質の溶解に用いられるた非イオン系洗剤であるから、この方法で使用した。ピリンは、pH勾配3.0〜9.0にて等電点電気泳動により分離され、拡散ブロッティングによってPVDF膜へ移し、菌株1244抗Ｏ11 mAb 6.45(図１１、パネルＡ)、抗Ｏ11 LPS mAb 16.13(図１１、パネルＢ)及び菌株1244 anti-LPS mAb, 11.14(図１１、パネルＣ)と反応させた。mAb 6.45を用いた電気泳動ゲルの結果では、緑膿菌1244/pLPS2は、酸性ピリンと中性ピリンの異なる２種類のピリンを生成することを示している(パネルＡ、レーン３)。組換え有機体に由来する酸性ピリンは、およそ4.75のpIに電気泳動されており、電荷は、野生型緑膿菌1244ピリン(パネルＡ、レーン１)の場合のpIに一致している。緑膿菌/pLPS2に由来する中性ピリンは、およそ6.25のpIに電気泳動されており、これは、グリコシル化されていない緑膿菌1244ピリン(パネルＡ、レーン２)の場合のpIと同じ値である。mAb 6.45を用いて電気泳動を行なうと、反応は、pI 6.25の時にだけ観察され(パネルＢ；レーン３)、パネルＡで観察された中性ピリンの等電点と同じである。ピリンが、mAb 11.14で電気泳動されたものを分析すると、反応は、pI 4.75のピリンについてのみ観察され(パネルＣ；レーン１及び３)、電荷は野生型菌株1244のピリンの場合と同様である。
【００８１】
これらの結果の確認は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析法を使用して製造したピリンを、質量分析することによって行なった。緑膿菌1244/pLPS2により製造された線毛は、一晩のプレート培養で単離され、前記の如く精製した(Castric, 1995)。この調製物の純度は、SDS-PAGEゲルの銀染色により求めた(図１８)。BSAを標準とするBradford Protein Assayで測定したところ、サンプルは約1.7mgのピリンを含んでいることが分かった。定量化によって純度を求めた後、調製物を、10mMの酢酸アンモニウムで一晩透析し、質量分析に悪影響を及ぼすポリエチレングリコールと塩が取り除かれた。
【００８２】
緑膿菌1244により製造されたピリンの予測質量は、16,331である(その内の15,648はタンパク質で、その残りは07繰返し単位)。このピリンをMALDI分析すると、16,307(+/- 25)の値が与えられていた。上記の実験において、011繰返し単位が、菌株1244ピリンのサブユニットの位置にあれば、明確に異なる２種類のピリンの質量が観察されるであろう。一方は、16,331(07繰返し単位を含む1244ピリンを表す)であり、他方は、16,183(15,648はピリンタンパク質で、その残りは011繰返し単位)となる。緑膿菌1244/pLPS2のMALDI分析では、16,316(+/- 25)及び16,187(+/- 10)の２つのピークが存在する。これらの結果は、異種のグリコシル化が行なわれていることを示すもので、この有機体のグリコシル化装置は極めて非特異的であることを示している。
【００８３】
異なる２つのピリン種を同定すると、別個のピリンモノマーは、天然又はPA103のＯ抗原繰返し単位のどちらかでグリコシル化されることを示す。結局のところ、これらの結果は、Ｏ抗原生合成経路が、緑膿菌1244のピリングリコシル化のソースとして機能していることを示し、また、pilＯがグリカン基質に対して非特異的であることを示している。
【００８４】
先の実験結果では、Ｏ抗原生合成経路は、緑膿菌1244におけるピリングリコシル化の代謝性ソースであることを明白に示している。緑膿菌内部でのpilＯグリカン基質は、非特異性として認識されるので、次の実験では、このタンパク質が他種由来のＯ抗原をピリングリカンのソースとして利用できるかを調べることにより、pilＯ基質の特異性の大きさを求めることを目的としている。
【００８５】
＜実験３＞
クローン化された大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原遺伝子クラスターは、緑膿菌1244LPSのＯ抗原ソースとして作用する。
大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原が、緑膿菌1244 LPSの上に発現することを調べるために、新たに構築されたコスミッドのうちの１つであるpDIG4を緑膿菌1244へ移入し、Ｏ抗原の発現を調べた。緑膿菌1244/pLPS2の場合と同様、このメイティングから２つのコロニーを選択し、更なる分析を行なった。最初に、緑膿菌1244へのpDIG4の導入の確認は、各Tc耐性コロニー上にプラスミドを抽出することによって行なった(結果は示さず)。次に、pDIG4プラスミドを保有する各1244菌株由来のLPSを、一晩の培養液培養によって抽出し、mAb 11.14(図１２、パネルＡ)及び大腸菌Ｏ157:H7特異的抗血清(図１２、パネルＢ)を使用し、ウエスタンブロット法によって試験した。この図は、菌株1244/pDIG4が、通常のＯ抗原ラダーを製造することを示しており、このラダーは、mAb 11.14で分析したときに、野生型1244の中で観察される(パネルＡ、レーン４)。また、大腸菌HB101/pDIG4を含むレーン２と、大腸菌HB101を含むレーン５では反応は認められなかった。この図のパネルＢでは、pDIG4を保有する緑膿菌1244と大腸菌HB101菌株だけが、Ｏ157:H7抗血清と反応することができた(パネルＢ、レーン１及び２)。菌株1244/pLPS2の場合と同様、菌株1244/pDIG4に由来するLPSを、ウエスタンブロット法で試験を行ない、この有機体は、別個のLPS鎖の上に菌株1244及び大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原を載置したかどうかを調べた。菌株1244/pDIG4 LPSは、ゲル分取用コームを用いて、SDS-PAGEにより分離し、ウエスタンブロット法によって分析した。このブロットの半分は、mAb 11.14と反応し、残りの半分は、Ｏ157:H7抗血清と反応した。図１３を参照すると、Ｏ抗原ラダーのパターンは、各抗血清と反応すると異なることが示されている。これは、菌株1244/pDIG4が、菌株1244Ｏ抗原又は大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原のどちらかを含む別個のLPS分子を生成することを示している。
【００８６】
陽性対照となる大腸菌HB101及び陰性対照となるLE392/pDS300を有する緑膿菌1244/pDIG4について、スライド凝集反応血清試験を、大腸菌Ｏ157:H7抗血清を用いて行なった。各々の場合とも、解剖顕微鏡で緑膿菌1244/pDIG4細胞の顕著な凝集が観察され、陽性反応であることを示した(結果は示さず)。これらの結果により、緑膿菌1244/pDIG4は、そのLPS上に、野生型Ｏ抗原と大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原の両方を発現できることが確認される。
【００８７】
＜実験４＞
クローン化された大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原遺伝子クラスターは、緑膿菌1244においてピリングリカンのソースとして作用する。
緑膿菌1244 LPS上に大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原の発現が確認された後、この菌株の線毛に、大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原が存在するかを調べた。緑膿菌1244/pDIG4に由来する線毛は、一晩のプレート培養によって抽出し、１％BOGの中に懸濁した。次に、ピリンサンプルを、pH勾配3.5〜9.5の条件で等電点電気泳動法によって分離し、拡散ブロッティングによりPVDF膜へ移し、mAb 6.45(図１４、パネルＡ)、大腸菌Ｏ157:H7特異的抗血清(図１４、パネルＢ)及びmAb 11.14(図１４、パネルＣ)と反応させた。mAb 6.45を使用した電気泳動ゲルの結果により、緑膿菌1244/pDIG4は、酸性ピリン及び中性ピリンの異なる２種類のピリンを生成していることがわかる(パネルＡ、レーン３)。組換え有機体に由来する酸性ピリンは、およそ4.75のpIに電気泳動されており、電荷は、野生型緑膿菌1244ピリン(パネルＡ、レーン１)の場合のpIに一致している。菌株1244/pDIG4に由来する中性ピリンは、およそ6.25のpIに電気泳動されており、これは、グリコシル化されていない緑膿菌1244ピリン(パネルＡ、レーン２)の場合のpIと同じ値である。大腸菌Ｏ157:H7抗血清と共に電気泳動が行なわれて分析すると、反応は、pI 6.25の時にだけ観察され(パネルＢ；レーン３)、パネルＡで観察された中性ピリンの等電点と同じである。ピリンが、mAb 11.14と共に電気泳動され、これを分析すると、反応は、pI 4.75のピリンについてのみ観察され(パネルＣ；レーン１及び３)、電荷は野生型菌株1244のピリンの場合と同様である。
【００８８】
緑膿菌1244/pDIG4によって生産された線毛を、実験２に記載の方法を使用して製造した。純度を求めた(図１８)。また、タンパク質の定量化により、約1.4mgのタンパク質の存在が示された。この物質のMALDI分析は、現在実施中である。
【００８９】
これらの結果によれば、大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原生合成経路は、ピリングリカンのソースであることを示している。菌株1244/pLPS2の場合と同様、菌株1244/pDIG4が、異なる２種のピリンを製造していることは明らかである。これは、pilＯが、個々の菌株1244ピリンモノマーを、野生型Ｏ抗原又は大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原のどちらかでグリコシル化していることを示している。これは、２つのＯ抗原繰返し単位どうしの構造的差異を考えると、意外なことである。このように、これらの結果は、pilＯがグリカン認識に対して非特異的であることを示している。
【００９０】
＜実験５＞
混合グリカンを含む線毛の特性
通常の場合、ピリンは、一晩のプレート培養によって少量しか得られないが、その理由は、緑膿菌が培養液中でシェーキングされると、線毛化(piliation)が抑制されるからである(Yee and Castric, 未発表の観察)。この実験では、緑膿菌1244N3(Ramphal et al., 1991)は、不活性rpoN遺伝子のためにピリンを製造できない突然変異体であり、tacプロモーター遺伝子の制御下においては、菌株1244pilA及びpilＯ遺伝子を含むプラスミドであるpPAC46で相補されるとき、培養液でのシェーキングによる線毛抑制は起こらないことを示した(Yee and Castric, 未発表の観察結果)。IPTGの存在下で増殖する場合、この有機体は、グリコシル化菌株1244線毛を非常に多く発現させることができる(Yee and Castric, 未発表の観察結果)。緑膿菌1244のrpoN突然変異菌株は、pPAC46及びpDIG4又はpLPS2のどちらかとで相補されると、緑膿菌抗原型Ｏ11又は大腸菌Ｏ157:H7グリカンのどちらか一方を有する大量のピリンを製造できると考えられる。このことは、構造分析だけでなく、将来のワクチン構築のために単離できるように、十分にグリコシル化できることを意味する。残念ながら、緑膿菌1244N3がこれらの実験に使用することはできないが、それは、rpoN突然変異体は、pDIG4及びpLPS2と同じ選択可能なマーカーであるテトラサイクリンカセットでマークされているからである。従って、テトラサイクリン以外のマーカーによるrpoN突然変異体の単離は、Schweizer(1992)が初めて記載した緑膿菌の遺伝子交換技術を用いて行なわれた。
【００９１】
１．緑膿菌1244のrpoN突然変異菌株の単離
ａ．緑膿菌1244のrpoN遺伝子の対立遺伝子交換
緑膿菌1244のrpoN対立遺伝子交換を実行するために、pAD400を選択し、トリパレンタル・メイティング法によって結合され、緑膿菌1244に移入された。メイティング混合物を寒天プレート上に選択した。前記寒天は、選択されたどの大腸菌に対しても菌株1244プラスミド成分Spectinomysinを同定できるKmと、プラスミドが切除された菌株を単離するための7.5％スクロースを含んでいる。コロニーは、37℃で18時間培養した後に発現を開始し、室温で更に24〜28時間増殖させると、コロニー免疫ブロッティングに適したサイズに達した。培養の後、各メイティング混合プレートに対して、コロニー免疫ブロッティングを行ない、mAb 6.45と反応させて、ピリンの生成を調べた(結果は示さず)。合計数169のコロニーを単離したが、mAb 6.45とは反応せず、これらの細胞は、rpoN遺伝子の対立遺伝子交換が行なわれたことを表している。これらのコロニーのうちの４個を選択して更なる分析を行なった。それらのコロニーは、緑膿菌1244Ｏ7、1244Ｑ3、1244Ｑ13及び1244Ｒ10と名付けた。
【００９２】
ｂ．推定rpoN突然変異体の表現型分析
rpoN::Kmrカセットは、pAD400に由来しているので、各菌株について、プラスミドの切除が確実に行われるためのTc感受性を調べた。４つの菌株は全てTc5であった。次に、各々の推定rpoN突然変異体に由来するLPSを、前述の様に、一晩の培養によって抽出し、菌株1244抗LPS mAb 11.14を用いて、ウエスタンブロット法による分析を行ない、各菌株が緑膿菌1244に由来することを調べた。図１６のパネルＡに示されるように、４個の推定rpoN突然変異体は全て、野生型菌株1244(パネルＡ、レーン１)と同様、菌株1244抗血清型特異的Ｏ抗原(パネルＡ、レーン３〜６)を生成した。これらの結果は、４個の推定rpoN突然変異菌株は全て、野生型菌株1244に由来することを示している。
【００９３】
ピリン生成の損失を調べるために、各々の推定rpoN突然変異体の細胞抽出物を、一晩のプレート培養から得て、抗ピリンmAb 6.45を使用し、ウエスタンブロットにより分析した。図１６のパネルＢに見られるように、４個の推定rpoN突然変異体(レーン３〜６)のどれも、野生型菌株1244(レーン１)で観察されたような反応はなかった。これらの結果は、推定rpoN突然変異体はピリンを製造せず、そのrpoN遺伝子は、突然変異したrpoN対立遺伝子とうまく置換されたことを示している。
【００９４】
ｃ．推定rpoN突然変異菌株1244Q13のサザンブロット分析
野生型rpoN遺伝子が、突然変異したrpoN対立遺伝子とうまく置換されたかどうかを調べるために、推定rpoN突然変異体1244Q13に対してサザンブロットを行なった。菌株1244ゲノムDNAの分析により、HindIII制限配列は、rpoN遺伝子の上流の約3Kbに位置し、BamH I制限配列は、rpoN遺伝子の下流約4.2Kbに位置することがわかった(図１７ａ)。それ故、両方の制限酵素で同時消化すると、約8.5KbのDNA断片を生じることになる(図１７ａ)。さらに、rpoN遺伝子を突然変異させるのに用いられるKmrカセットは、内部にHind IIIサイトを含んでいる。対立遺伝子の交換が行われた場合、菌株1244Q13ゲノムDNAのHind III及びBamH Iによる制限消化により、約4.5と5.2Kbの２つのDNA断片が現れることになる(図１７ａ)。図１７ｂは、Hind III及びBamH Iで消化された菌株1244及び1244Q13ゲノムDNAのサザンブロットを示しており(1244がパネルＡのレーン２、1244Q13がパネルＡのレーン３)、PCRで単離されたビオチニル化rpoN遺伝子で調べた(1244がパネルＢのレーン２、1244Q13がパネルＢのレーン３)。プローブは、菌株1244の消化(パネルＢ、レーン２)では約8.6Kb DNA断片と反応し、菌株1244Q13の消化(パネルＢ、レーン３)では約4.5及び5.2Kbの２つのDNA断片と反応した。また、菌株1244及び1244Q13ゲノムDNAを有するrpoN特異的プライマーを用いたPCR増幅は、1244(図１７ｃ、レーン１)が1.5Kbであるのに対し、1244Q13(図１７ｃ、レーン２)では2.7KbのDNA断片であった。これらの結果は、1.2Kb Kmrカセットを野生型rpoN対立遺伝子へ挿入した場合と一致している。従って、1244Q13は、ピリンを製造できないrpoN::Kmr突然変異菌株である。
【００９５】
＜実験６＞
単離された緑膿菌1244ピリンアミノグリカンとオボアルブミンの共有結合
純粋緑膿菌1244ピリンから分画されたアミノグリカン・フラクションを、前述と同じように単離した(Castric, P. et a.. 2001. J. Biol. Chem. 276:26479-26485)。簡単に説明すると、10〜20mgの純粋線毛の完全なタンパク質分解を意味する。この処理により、セリン残基(ピリン残基に結合している)に共有結合されたグリカンが放出された。アミノグリカンは、ゲル濾過(Sephadex G-25)及び薄層クロマトグラフィーによって精製された。
【００９６】
以下の要領にて、この分子を、アミノグリカンのアミノ基を通じて、オボアルブミンに結合した。10ml容量のビーカーの中で、7.9mg(173nmol)のオボアルブミンを、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)2.0mlに溶解した。これに20nmolのアミノグリカンを加えた。0.2％グルタルアルデヒド含有PBS2.0mlを、ゆっくりと滴下した。この物質を、室温で１時間撹拌し、0.5mlの1.0Mグリシンを加えて、架橋反応をクエンチした。この反応混合物を、完全に透析し、冷凍保存した。
【００９７】
グリカン特異的モノクローナル11.14をプローブとして使用し、共有結合したアミノグリカンの存在を、ドットプロットによって調べた(図１９)。これらの結果では、複合タンパク質は、ピリングリカンエピトープを獲得したことを示しており、これは、単離されたピリングリカンを、ピリン以外の輸送タンパク質に結合することができることを意味する。
【００９８】
本発明の特定の実施例を例示の目的で説明してきたが、当該分野の専門家であれば、本発明の詳細に関して、特許請求の範囲に規定される発明から逸脱することなく、様々な変型を為し得ることを理解し得るであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】pLAFR1にサブクローニングされたpDS300ライブラリで形質導入された(transduced)大腸菌HB101のコロニー免疫ブロットを示す図である。Maniatis(1987)が記載しているように、pDS300は30Kbのセグメントの中へ部分的に消化され、EcoR 1で処理されたpLAFR 1にクローン化される。このDNAは、バクテリオファージ・ラムダ粒子としてパッケージされ、大腸菌HB101を導入するために使用した。コロニーは、0.45μmのニトロセルロース膜を各プレート上に直接置くことによってリフトされる。各免疫ブロットは、大腸菌Ｏ157:H7抗血清と反応させた。赤色は、陽性反応を示している。
【図２】大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原遺伝子クラスターを、広宿主域コスミッド中でベクターpLAFR1にクローニングすることを示す図である。パネルＡは、レーン１：pLAFR1；レーン２：pDS300(EcoR 1)であり、パネルＢは、レーン１〜６：大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原陽性pLAFR1クローン(EcoR 1)である。コロニー免疫ブロット(図１)から６個の陽性クローンを選択し、さらなる分析を行なった。コスミッドは、各クローンから単離され、EcoR1(パネルＢ：レーン１〜６)で処理し、pLAFR1（パネルＡ：レーン１)とpDS300(パネルＡ：レーン２)の全消化(total digestion)と比較した。コスミッドは、同様なDNA断片を含んでおり、それぞれ、pDIG1及びpDIG6と名付けた。矢印は、DNAサイズマーカー(Kb)を示している。
【図３】大腸菌HB101 LPS上における大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原の発現を示す図である(レーン１：大腸菌LE392/pDS300；レーン２：大腸菌HB101；レーン３〜８：夫々、大腸菌HB101/pDIG1〜pDIG6)。LPSは、17.5％のSDS-PAGEゲル上で分離され、ニトロセルロース紙へエレクトロブロットした。矢印は、分子量マーカー(kDa)を示している。このブロットは、大腸菌Ｏ157:H7の抗血清で分析した。
【図４】緑膿菌中の対立遺伝子交換用として、Schweizer(1992)とHoang et al.(1998)によって特に開発された対立遺伝子交換プラスミド(allele replacement plasmids)を示す図である。これらプラスミドは、ColE1タイプの複製起点(oriR)を含んでいるので、緑膿菌の中で、複数のクローニング領域、転移起点(oriT)、対向選択可能な(counter-selectable)sacB遺伝子、及び大腸菌中のプラスミドの選択を許容する抗生物質耐性マーカーを複製することができない。これらのプラスミドに対する特異な特徴は、sacB遺伝子であり、該遺伝子がグラム陰性細菌中に発現すると、スクロースに敏感な有機体となる。
【図５】rpoN対立遺伝子交換プラスミドpAD100の構造を示す図である。pEX18Gmの複数のクローニング領域内のPst1認識領域は、T4ポリメラーゼを使用して除去され、pAD99が形成される。次に、rpoN::Tcrカセットは、Kpn1の消化によってpK111から除去され、同様に処理されたpAD99にクローン化され、pAD100が形成される。
【図６】rpoN対立遺伝子交換プラスミドpAD200の構造を示す図である。pAD200は、Tcrカセットをクロラムフェニコール(Cmr)カセットと置き換えることによって構築される。Tcrカセットは、Pst1の消化によってpAD100から除去され、同様な酵素処理の後、pKT210から生じたCmrカセットと置き換えられる。
【図７】rpoN対立遺伝子交換プラスミドpAD300の構造を示す図である。pAD300は、pAD100のTcrカセットをカナマイシン(Kmr)と置き換えることによって構築される。Tcrカセットは、Pst 1の消化によってpAD100から除去され、同様な酵素処理の後、pUC-4Kから生じたKmrカセットと置き換えられる。
【図８】rpoN対立遺伝子交換プラスミドpAD400の構造を示す図である。pAD400を構築するために、rpoN::Km'カセットは、Kpn1の消化によってpAD300から除去され、同様に処理されたpEX18Tcにクローン化された。
【図９】緑膿菌1244/pLPS2から生じたLPSのウエスタンブロット分析を示す図である。パネルＡ：レーン１：緑膿菌1244；レーン２：大腸菌HB101；レーン３：大腸菌HB101/pLPS2；レーン４及び５：緑膿菌1244/pLPS2。パネルＢ：レーン１：緑膿菌1244；レーン２：大腸菌HB101；レーン３：大腸菌HB101/pLPS2；レーン４及び５：緑膿菌1244/pLPS2。LPSは、12.5％のSDS-PAGE2ゲル上で分離され、0.2μmのニトロセルロース紙にエレクトロブロットされた。矢印は、分子量マーカー(kDa)を示している。パネルＡ：mAb 11.14で分析、緑膿菌1244LPSに対して特異的な抗血清；パネルＢ：anti-PA 011 LPS mAb, 16.13で分析した。
【図１０】緑膿菌1244/pLPS2から生じた分離LPS鎖のウエスタンブロットである。LPSは、12.5％のポリアクリルアミドゲル上の１レーンで分離され、0.2μmのニトロセルロース紙にエレクトロブロットされた。矢印は、分子量マーカー(kDa)を示している。パネルＡ：anti-011 mAb 16.13で分析；パネルＢ：1244 anti-LPS mAb 11.14で分析した。
【図１１】緑膿菌PA103Ｏ抗原を発現する緑膿菌1244/pLPS2線毛の等電点電気泳動の結果をを示す図である。パネルＡ、Ｂ及びＣ；レーン１：緑膿菌1244グリコシル化ピリン；レーン２：緑膿菌1244非グリコシル化ピリン；レーン３：緑膿菌1244/pLPS2。等電点電気泳動は、LKB-Pharmacia Phastsystemを使用し、その製造仕様書の記載に基づいて行なった。ピリンは、拡散ブロッティングによってPVDF膜に送られた。pI値は、試料と同じゲルに標準を集中させることによって決定した。パネルＡは1244 anti-pilin mAb 6.45で分析し、パネルＢはmAb 16.1で分析し、パネルＣはmAb 11.14で分析した。
【図１２】緑膿菌1244/pDIG4に由来するLPSのウエスタンブロット分析を示す図である。パネルＡ：レーン１：緑膿菌1244/pDIG4；レーン２：大腸菌HB101/pDIG4；レーン３：空；レーン４：緑膿菌1244；レーン５：大腸菌HB101。パネルＢ：レーン１：緑膿菌1244/pDIG4；レーン２：大腸菌HB101/pDIG4；レーン３：空；レーン４：緑膿菌1244；レーン５：大腸菌HB101。LPSは、12.5％のSDS-PAGE2ゲル上で分離され、0.2μmのニトロセルロース紙へエレクトロブロットされた。矢印は、分子量マーカー(kDa)を示している。パネルＡはmAb 11.14で分析し、パネルＢは大腸菌Ｏ157:H7抗血清で分析した。
【図１３】緑膿菌1244/pDIG4に由来するLPSのウエスタンブロット分析を示す図である。LPSは、12.5％ポリアクリルアミドゲルの１つのレーンで分離され、0.2μmのニトロセルロース紙へエレクトロブロットされた。矢印は、分子量マーカー(kDa)を示している。パネルＡは大腸菌Ｏ157:H7抗血清で分析し、パネルＢ：1244 anti-LPS mAb 11.14で分析した。
【図１４】大腸菌Ｏ157:H7Ｏ抗原を発現する緑膿菌1244/pLPS2線毛の等電点電気泳動の結果を示す図である。パネルＡ、Ｂ及びＣ：レーン１：緑膿菌1244グリコシル化ピリン；レーン２：緑膿菌1244非グリコシル化ピリン；レーン３：緑膿菌1244/pDG4。等電点電気泳動は、LKB-Pharmacia Phastsystemを使用し、その製造仕様書の記載に基づいて行なった。ピリンは、拡散ブロッティングによってPVDF膜に送られた。パネルＡはmAb 6.45で分析し、パネルＢ：大腸菌Ｏ157:H7抗血清で分析し、パネルＣはmAb 11.14で分析した。
【図１５】緑膿菌1244中のrpoN遺伝子の対立遺伝子交換を示す図である。この図のステップ１は、pAD400が、野生型rpoN遺伝子にある緑膿菌1244染色体へ組み込まれ、部分倍数体を形成することを示している。この菌株は、現在KmrTcrとびスクロースである。ステップ２は、相同的組み換えによるプラスミドDNAの切除を示しており、これは、スクロース及びKmの耐性を選択することによって促進される。rpoN遺伝子は、現在、突然変異rpoN対立遺伝子と置き換えられており、その結果、rpoN遺伝子中にKm挿入突然変異体が含まれる有機体を生じる。
【図１６】ウエスタンブロットによる、推定rpoN突然変異体の表現型分析を示す図である。パネルＡ及びＢ：レーン１：緑膿菌1244；レーン２：大腸菌HB101；レーン３：1244O7；レーン４：1244Q3；レーン５：1244Q13；レーン６：1244R10。パネルＡは、12.5％のポリアクリルアミドゲル上で分離され、一方、パネルＢは、13.75％のポリアクリルアミドゲル上で分離された。両方のゲルは、ニトロセルロース紙にエレクトロブロットされた。矢印は、分子量マーカー(kDa)を示している。パネルＡは1244 anti-LPS mAb 11.14で分析した。パネルＢは1244 anti-pilin mAb 6.45で分析した。
【図１７】rpoN突然変異菌株1244Q13のゲノム解析を示す図である。(a)菌株1244ゲノムDNAを分析すると、両酵素の消化後に8.5Kb DNA断片を生成するHINDIII及びBamHI制限配列であることがわかった。カナマイシンカセットが、rpoN位置で菌株1244染色体へ挿入されている場合、HINDIII及びBamHIの消化により、4.5KB及び5.2KbのDNA断片が単離される。(b)パネルＡ：レーン１：ビオチン化ラムダHINDIIIの消化；レーン２：菌株1244HINDIII及びBamHIのゲノム消化；レーン３：HINDIII及びBamHIによる菌株1244Q13のゲノム消化。パネルＢ：rpoN対立遺伝子をプローブとして使用し、ゲノム消化をサザンブロット分析。(c)rpoN特異的プライマーを使用し、菌株1244のゲノムDNA(レーン１)及び1244Q13のゲノムDNA(レーン２)をPCR増幅。矢印は、DNAのサイズマーカー(Kb)を示している。
【図１８】緑膿菌1244/pLPS2及び緑膿菌1244/pDIG4から抽出したピリンの精製分析を示す図である。菌株1244/pLPS2及び菌株1244/pDIG4からのピリン抽出物の純度は、銀染色されたSDS-PAGEゲルによって分析した。レーン１：緑膿菌1244(2.0μｇ)；レーン２：菌株1244/pLPS2(4.3μｇ)；レーン３：菌株1244/pLPS2(8.6μｇ)；レーン４：菌株1244/pLPS2(12.9μｇ)；レーン５：菌株1244/pDIG4(3.4μｇ)；レーン６：菌株1244/pDIG4(6.8μｇ)；レーン７：菌株1244/pDIG4(10.2μｇ)。矢印は、分子量マーカー(kDa)を示している。
【図１９】オボアルブミン−ピリンアミノグリカン共役(conjugate)と、グリカン特異的モノクローナル11.14との反応を示す図である。オボアルブミン−ピリンアミノグリカン共役(レーン１及び３)と、未反応オボアルブミン(レーン２及びレーン４)は、ニトロセルロース紙にスポットされた。各タンパク質の初期濃度は2.0mg/mlであった。スポットされた紙は、ピリンアミノグリカン特異的モノクローナル11.14又はピリンタンパク質特異的モノクローナル5.44のどちらかでプローブされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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