(57)【要約】タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列またはタンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列およびグルタミンシンセターゼをコード化している外因性ＤＮＡ配列で形質移入されたグルタミン栄養要求性ヒト細胞であって、これらの外因性ＤＮＡ配列は１つの又は２以上のＤＮＡ構築物上に配置され、前記形質移入された細胞は前記タンパク質を産生する能力を有し且つ無グルタミン培地中で成長する能力を有する細胞。
2005532033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列またはタンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列およびグルタミンシンセターゼをコード化している外因性ＤＮＡ配列で形質移入されたグルタミン栄養要求性ヒト細胞であって、これらの外因性ＤＮＡ配列は１つの又は２以上のＤＮＡ構築物上に配置され、前記形質移入された細胞は前記タンパク質を産生する能力を有し且つ無グルタミン培地中で成長する能力を有する細胞。  
【請求項２】
前記外因性ＤＮＡ配列が２以上のＤＮＡ構築物上に配置される、請求項１記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。  
【請求項３】
前記グルタミン栄養要求性ヒト細胞が不死化されたグルタミン栄養要求性ヒト細胞である、請求項１または２記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。  
【請求項４】
前記不死化されたグルタミン栄養要求性ヒト細胞がヒト線維肉腫細胞である、請求項３記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。  
【請求項５】
前記ヒト線維肉腫細胞がＨＴ１０８０株化細胞である、請求項４記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。  
【請求項６】
前記形質移入された細胞が足場非依存性であり、無血清、無グルタミン培地において浮遊成長能力を有する、請求項１〜５の何れか１項に記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞。  
【請求項７】
タンパク質の産生のための方法であって、
ａ）請求項１記載のグルタミン栄養要求性ヒト細胞を培養液中で前記タンパク質の発現に適切な条件下で培養することと、および
ｂ）前記タンパク質を回収することと、
を含む方法。  
【請求項８】
請求項７記載の方法であって、前記タンパク質がグリコシル化タンパク質である方法。  
【請求項９】
グルタミン栄養要求性ヒト細胞における選択可能なマーカーとしてのグルタミンシンセターゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【記載】
【０００１】
本発明は、タンパク質を産生する能力を有し且つ無グルタミン培地（ａ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ）中で成長する能力を有する新規のグルタミン栄養要求性ヒト細胞（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ）に関する。更に、タンパク質を産生する新規方法に関し、また、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ；ｇｌｕｔａｍｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）のグルタミン栄養要求性ヒト細胞における選択可能なマーカーとしての使用に関する。  
【０００２】
哺乳類細胞の培養によるタンパク質産生を使用して、治療上および診断上の適用のためのタンパク質が提供される。現在、哺乳類細胞の培養は、ヒトおよび動物の医療に使用するための、多くの重要なタンパク質の好適な供給源である（特に相対的に大きく、複雑（ｃｏｍｐｌｅｘ）で、グリコシル化されたもの）（Ｎ．  Ｂ．  Ｆｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９０，  ｅｄ．  Ａ．  Ｓ．  Ｌｕｂｉｎｉｅｃｋｉ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。  
【０００３】
例えば、細胞培養によるヒトタンパク質エリスロポエチン（ＥＰＯ）の産生は、ＷＯ  ９３／０９２２２に記載されている。ヒトＥＰＯは、ヒトＥＰＯをコード化している外因性遺伝子で形質移入したヒト線維芽細胞を利用して、評価しえる（ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅ）規定生産速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ）で取得されている。ヒトＥＰＯ（ＷＯ  ９４／１２６５０）の産生のための更なる方法において、内因性にコード化されたＥＰＯを活性化することが可能なＤＮＡ配列で形質移入されたヒトの線維肉腫（ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）の株化細胞ＨＴ１０８０が適用されている。類似するアプローチは、ＷＯ  ９９／０９２６８に記載されている。Ｎａｍａｌｗａ、Ｈｅｌａ  Ｓ３およびＨＴ  １０８０のような不死化されたヒト細胞が、内因性にコード化されたＥＰＯを活性化することが可能なＤＮＡ配列で形質移入されている。  
【０００４】
ＷＯ  ９３／０９２２２、ＷＯ  ９４／１２６５０およびＷＯ  ９９／０９２６８に記載され、ヒトＥＰＯの産生に使用された細胞は、全てがグルタミンを含有している培地で培養された。これは不利な状況である、つまりグルタミンがエネルギー基質（ｅｎｅｒｇｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）として培養細胞によって使用される場合、アンモニアが産生されるカタボライト（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ）であり、これは細胞毒性を呈するため細胞成長を阻害し得る。  
【０００５】
更に、それはタンパク質のグリコシル化を、細胞のゴルジ内のｐＨに対する効果により阻害し得る。  
【０００６】
組織プラスミノゲンアクチベーター（グリコシル化タンパク質）の高レベルの産生は、ＷＯ  ８７／０４４６２に記載されている。本発明においてＧＳは、グルタミン原栄養性（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で、該細胞にＧＳをコード化している遺伝子を形質移入することにより組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）をコード化している遺伝子を共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）するための増幅システムとして使用されている。しかし、ＥＰ−Ａ  １４８  ６０５に認められるように、ＣＨＯ細胞をグリコシル化されたヒトタンパク質の生産のために使用することは不利である。ＣＨＯ細胞によって合成されたタンパク質は、それらの平均的な炭水化物の位置がグリコシル化されたヒトタンパク質で天然に生じたものと異なっている可能性がある。これは、ヒト細胞がα２．３シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）およびα２．６シアリルトランスフェラーゼ酵素を具備していることに起因する。ＣＨＯ細胞は、α２．３シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のみを具備しており、それゆえ末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）のシアル酸をオリゴ糖部分にα２．６結合させることができない。ＣＨＯ細胞は、炭水化物構造（ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）の硫酸化（ｓｕｌｐｈａｔｉｏｎ）に関する酵素を欠損している。また、ＣＨＯ細胞は、α１−３フコシルトランスフェラーゼ（末端のフコース残基に付着する）を欠損しているが、α１−６フコシルトランスフェラーゼ（コアのフコース残基に付着する）を有している。ヒト細胞は、両方のフコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）を有している（Ｇｕｍｍｉｎｇ  Ｄ．  Ａ．，  １９９１，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏ１，  Ｎｏ．２，  １１５−１３０，  Ｊｅｎｋｉｎｓ  Ｎ．  ａｎｄ  Ｃｕｒｌｉｎｇ  Ｅ．Ｍ．  Ａ．，  １９９４，  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｏｒｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１６，  ３５４−３６４．  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２６４，  １３８４８−１３８５５）。従って、ＣＨＯ細胞によって合成されたグリコシル化タンパク質は、所望の特徴（例えば、ヒト細胞において産生されるもののような、インビボの生物学的活性）を有していない可能性がある。  
【０００７】
ＷＯ  ８９／１０４０４には、ミエローマ細胞（例えば、マウスハイブリドーマ、マウスプラズマ細胞腫およびラットハイブリドーマ細胞）を、ＧＳで形質転換することによってグルタミン非依存性にする方法が報告されている。本明細書において更に、ＧＳをミエローマ細胞株において、免疫グロブリン分子の軽鎖および重鎖をコード化している遺伝子の共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に使用できること、また線維素溶解性酵素（ａ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）をコード化している遺伝子の共増幅に使用できることが記載される。  
【０００８】
しかし、齧歯類の細胞株は不利な点を示した、即ち、Ｎ‐アセチルノイラミン酸の代わりにＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）残基が結合すること、硫酸化の実施の不能（ｉｎａｂｉｌｉｔｙ）およびα１．３ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素の存在である。  
【０００９】
げっ歯類細胞において合成される糖蛋白質のオリゴ糖構造は、それゆえにヒトにおいて免疫原性であると予想し得る。  
【００１０】
本発明の課題は、タンパク質の生産に関する（特に糖蛋白質の生産に関する）上記の不利な点を有さない、高いタンパク質力価を生じる改善された方法を提供することである。  
【００１１】
この課題は、請求項１に記載の新規グルタミン栄養要求性ヒト細胞および請求項７に記載の新規方法によって達成された。
【００１２】
本発明によりグルタミン栄養要求性ヒト細胞が提供され、該細胞はタンパク質をコード化している（第１）外因性ＤＮＡ配列またはタンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列で、および更にグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、好ましくは哺乳類のＧＳをコード化している（第２）外因性ＤＮＡ配列で形質移入され（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）、これらの外因性ＤＮＡ配列は１つの又は２以上のＤＮＡ構築物上に配置され、前記形質移入された細胞は前記タンパク質を産生する能力を有し且つ無グルタミン培地中で成長する能力を有する。  
【００１３】
「タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列」または「タンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列」および「ＧＳをコード化している外因性ＤＮＡ配列」は、通常は発現ベクターまたは感染性ベクター（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ）のようなＤＮＡ構築物上に配置される。発現ベクターとして、プラスミドを使用することが可能である。  
【００１４】
使用し得る感染性ベクターとして、例えば、レトロウイルス、ヘルペス、アデノウイルス、アデノウイルス関連（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、おたふく風邪およびポリオウイルスのベクターがある。好ましくは、発現ベクター、特にプラスミドが使用される。  
【００１５】
「タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列」は、外因性遺伝子の発現に通常使用されるプロモーターおよび／またはエンハンサー、ポリアデニレーション部位、スプライス部位などの制御配列などの付加的な配列を含んでいてもよい、または付加的に１以上の別々のターゲティング配列（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）および随意にＷＯ  ９３／０９２２２に記載されたような選択可能なマーカーをコード化しているＤＮＡを含んでいてもよい。
【００１６】
「タンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列」は、前記タンパク質の遺伝子産物をコードせず、その遺伝子産物の一部（例えば、エクソン）をコードする外因性ＤＮＡ配列を含んでいてもよい、また、制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）およびスプライス部位（ｓｐｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）など、外因性ＤＮＡ配列の発現に通常使用される付加的な配列を含んでいてもよい。それらは、更にターゲティング配列および随意に選択可能なマーカー（ＷＯ  ９３／０９２２２に記載されているような）をコード化しているＤＮＡを含んでいてもよい。
【００１７】
通常、「タンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列」は、前記細胞へのトランスフェクション後に前記細胞の染色体ＤＮＡに挿入される。相同的組換え又はターゲティングを、ここで使用して、前記内因性遺伝子に通常関連する制御領域が特定の制御配列で置換されるか又は無能（ｄｉｓａｂｌｅ）にされる。機能し得る制御配列としては、例えば、前記遺伝子に作用して、対応する非形質移入の細胞において明瞭なレベルよりも高いレベルで発現させるプロモーターおよび／またはエンハンサーがある（例えば、ＷＯ  ９３／０９２２２に記載されているような）。適切なプロモータは、制御可能な又は構成的に発現させるプロモータであってもよい。適切なプロモータは、強いプロモータ（使用される細胞株に依存する）であってもよく、例えば、ヒトサイトメガロウイルス主要な最初期プロモータ（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）、ＳＶ４０初期および後期プロモータ、アデノウイルスの他のプロモータ、ポリオーマウイルスまたはパポバウイルスの何れかの初期および後期プロモータ、インターフェロンα１プロモータ、マウス・メタロチオネインプロモータ、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復配列プロモータ、β−グロビンプロモータ、コンアルブミン（ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎ）プロモータ、卵白アルブミンプロモータ、マウスβ−グロビンプロモータおよびヒトβ−グロビンプロモータであってもよい。  
【００１８】
本発明による「ＧＳをコード化している外因性ＤＮＡ配列」は、強いプロモータの制御下であってもよく、同様に弱いプロモータの制御下であってもよい。  
【００１９】
前記外因性ＤＮＡ配列がＧＳをコード化している遺伝子を単に発現させるために必要とされる場合、強いプロモータが使用される。前記外因性ＤＮＡ配列が選択可能なマーカーとして使用されている場合およびＧＳが増幅のために使用される場合、弱いプロモータが使用される。適切なプロモータは、制御可能な又は構成的に発現させるプロモータであってもよい。例えば、ＧＳが形質移入された細胞の成長に十分な濃度で発現されるが、高いレベルのグルタミンカタボライト産物アンモニアを細胞培養において産生しないように（通常は４ｍＭ以下、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは２ｍＭ未満のアンモニア）、前記プロモータを選択してもよい。  
【００２０】
「選択可能なマーカー」は、選択可能な表現型を与え、これにより受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）を同定および分離することが可能である。ＧＳをコード化している外因性ＤＮＡ配列が導入されて発現する、形質移入されたグルタミン栄養要求性ヒト細胞を首尾よく選択するために、ＧＳを本発明の選択可能なマーカーとして使用することが可能である。
【００２１】
強いプロモータは、使用される細胞株によって、例えば、ｈＣＭＶ−ＭＩＥ、ＳＶ４０初期および後期プロモータ、アデノウイルスの他のプロモータ、ポリオーマウイルスまたはパポバウイルスの何れかの初期および後期プロモータ、インターフェロンα１プロモータ、マウス・メタロチオネインプロモータ、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復配列プロモータ、β−グロビンプロモータ、コンアルブミン（ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎ）プロモータ、卵白アルブミンプロモータ、マウスβ−グロビンプロモータおよびヒトβ−グロビンプロモータであってもよい。  
【００２２】
弱いプロモータは、使用される細胞株によって、例えば、マウス白血病ウイルスの長い末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼおよびマウス乳房腫瘍ウイルスの長い末端反復配列であってもよい。好ましくは、ＧＳをコード化している遺伝子は、強いプロモータの制御下に配置され、より好ましくはｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモータの制御下に配置される。実施可能な態様、増幅可能な哺乳類ＧＳ配列（ハムスターより）と哺乳類細胞における選択可能なマーカーとしてのその使用とは、当該技術において周知であり、例えばＷＯ  ８７／０４４６２、ＷＯ  ９１／０６６５７およびＷＯ  ８９／０１０３６に記載されている；本発明の例示は、かかるハムスターＧＳ発現ユニットおよび文献に記載されたとおりの個々の選択方法を実施する。  
【００２３】
「タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列」または「タンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列」および「ＧＳをコード化している外因性ＤＮＡ配列」は、１つの又は２以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）ＤＮＡ構築物上に配置される。好ましくは、これらの外因性ＤＮＡ配列は２以上、より好ましくは２つのＤＮＡ構築物上に配置される。これらの外因性ＤＮＡ配列が１つのＤＮＡ構築物上に配置される場合、それらは機能的に結合（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ）されてもよく、例えば、それらの発現は同じ調節配列（例えば、ＷＯ  ８９／１０４０４に記載されているプロモーターおよび／またはエンハンサーなど）により駆動される。
【００２４】
グルタミン栄養要求性ヒト細胞は、ＧＳを発現しない又はＧＳを不十分に発現する全てのヒト細胞を意味し、したがってグルタミンを含有している培養液において成長能力を有しているが、無グルタミン培地においては成長できないか又はほんの僅かに成長する。本発明に使用されるグルタミン栄養要求性ヒト細胞は、必滅の（ｍｏｒｔａｌ）グルタミン栄養要求性ヒト細胞または不死化したグルタミン栄養要求性ヒト細胞である。必滅のグルタミン栄養要求性ヒト細胞は、培養中で限られた寿命（ｌｉｆｅｓｐａｎ）を呈するグルタミン栄養要求性ヒト細胞である。不死化（「永久の（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）」または「樹立された（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）」とも称される）されたグルタミン栄養要求性ヒト細胞は、当業者に周知のとおりに、正しく（ｄｕｌｙ）継代およびサブカルチャーされた場合に、培養において明らかに非限定の寿命を呈するグルタミン栄養要求性の細胞である。
【００２５】
必滅のグルタミン栄養要求性ヒト細胞の例は、ヒト繊維芽細胞およびヒト胎児肺組織細胞（ｈｕｍａｎ  ｆｏｅｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｅｌｌｓ）であってもよい。不死化したグルタミン栄養要求性ヒト細胞の例は、ＨＴ１０８０細胞株のようなヒト線維肉腫細胞（例えば、ＤＳＭＺ  Ｎｏ．ＡＣＣ−３１５またはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  １２１）およびＨＬ６０のようなＢ−リンパ芽球腫ヒト細胞（ＤＳＭＺ  Ｎｏ．Ａｃｃ−３）であってもよい。好ましくは、本発明に使用されるものは、不死化したグルタミン栄養要求性ヒト細胞である。更に好ましくは、かかる不死化したグルタミン栄養要求性ヒト細胞は、Ｂ−リンパ芽球細胞（Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ）または線維肉腫細胞（ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはＨＴ１０８０株化細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  １２１）である。  
【００２６】
前記グルタミン栄養要求性ヒト細胞を、既知の遺伝子工学技術により外因性ＤＮＡ配列で形質移入できる。  
【００２７】
外因性ＤＮＡ配列での形質移入は、前記配列が１つの又は２以上のＤＮＡ構築物上に配置されるかに依存する。前記配列が２以上のＤＮＡ構築物上に配置される場合、形質移入を各配列で別々に生じさせるか又はコトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって生じさせることが可能である。形質移入が各配列で別々に生じる場合、前記配列の形質移入の順番は通常は任意（ｏｐｔｉｏｎａｌ）である。各配列による形質移入は、好ましくは第一に「前記タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列」または「前記タンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列」で、第二に「ＧＳをコード化している外因性ＤＮＡ配列」で別々に生じる。形質移入したグルタミン栄養要求性細胞は、各々別々の形質移入後に培養され、タンパク質産生に関して評価されてもよい。  
【００２８】
首尾よく形質移入された細胞を選択するために、これらを無グルタミン培地中で成長させる。細胞は、無グルタミン培地中で直接成長させてもよい、または無グルタミン培地へと段階的に希釈されるグルタミンを含有している培地で最初に成長させてもよく、例えば、１０ｍＭのグルタミン濃度で開始してもよく、これは２ｍＭ〜０ｍＭへと段階的に希釈されてもよい。適切な選択手順は、使用された細胞株に依存して選択されてもよい。上記記載から明らかなように、本発明の、タンパク質を産生する能力を有し「無グルタミン」培地中で成長する能力を有するグルタミン栄養要求性ヒト細胞は、前記細胞を、前記タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列または前記タンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列およびグルタミンシンセターゼをコード化している外因性ＤＮＡ配列（これらの外因性ＤＮＡ配列は１つの又は２以上のＤＮＡ構築物上に配置される）で、形質移入することによって取得可能である。  
【００２９】
タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列またはタンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性配列は、形質移入した後に、例えばＷＯ  ９４／１２６５０に記載されているとおりの既知の遺伝子増幅方法にしたがって増幅されてもよい。例えば、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＧＳ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔ  ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ）、メタロチオネイン−１、オルニチンデカルボキシラーゼ、Ｐ−糖蛋白質、リボヌクレオチド・レダクターゼ、チミジンキナーゼまたはキサンチン−グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼのような酵素をコード化している増幅可能な遺伝子をこの目的に使用できる。これらの遺伝子の増幅されたコピーを含有している細胞は、例えば前記酵素の代謝産物を欠除している培地における又は対応する選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）を含有している培地における処理で生存可能なものである。対応する選択剤は、例えばＤＨＦＲの場合にはメトトレキセート（ＭＴＸ）、またＧＳの場合にはメチオニン・サルフォキシミン（ＭＳＸ；ｍｅｔｈｉｏｎｉｎ  ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）である。
【００３０】
本発明の形質移入したグルタミン栄養要求性ヒト細胞により産生されたタンパク質は、非−グリコシル化（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）およびグリコシル化タンパク質である。グリコシル化タンパク質は、少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有しているタンパク質を意味する。  
【００３１】
非グリコシル化タンパク質に関する例は、例えば、非グリコシル化ホルモン、たとえば黄体形成ホルモン放出ホルモン、甲状腺ホルモン放出ホルモン、インシュリン、ソマトスタチン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン形成細胞刺激ホルモン、バソプレッシン、および、その誘導体、例えば、デスモプレシン、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、又は、その断片（例えば、ＰＴＨ（Ｉ−４３））、ガストリン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンギオテンシン、ヒト胎盤ラクトゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、セルレインおよびモチリン；非グリコシル化鎮痛性物質、例えば、エンケファリン、および、その誘導体（ＵＳ−Ａ  ４  ２７７  ３９４およびＥＰ−Ａ  ０３１５６７を参照）、エンドルフィン、ダイノルフィン（ｄａｙｎｏｒｐｈｉｎ）およびキョートルフィン；非グリコシル化酵素、たとえば、非グリコシル化神経伝達物質、例えば、ボンベシン、ニューロテンシン、ブラジキニンおよびサブスタンスＰ；神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリーの、上皮成長因子（ＥＧＦ）の、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーの非グリコシル化成長因子並びにホルモンおよび成長因子に対する非グリコシル化受容体である。  
【００３２】
グリコシル化タンパク質に関する例は、ホルモンおよびホルモン放出因子、たとえば成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ＥＰＯ、リポタンパク質、アルファ―１―アンチトリプシン、濾胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子、たとえば、ＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子、およびフォンウィルブランド因子、抗凝固因子、たとえば、プロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質（ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、プラスミノゲン・アクチベータ、たとえば、ウロキナーゼまたはヒトの尿もしくは組織型プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔ−ＰＡ）、トロンビン、造血性成長因子、エンケファリナーゼ、ランテス（活性化において制御される、通常はＴ−細胞で発現および分泌される）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（Ｍ１Ｐ−１−アルファ）、血清アルブミン  たとえばヒト血清アルブミン、ミューラー阻害物質（ｍｕｌｌｅｒｉａｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、リラキシンＡ−鎖、リラキシンＢ−鎖、プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、微生物のタンパク質、たとえばベーターラクタネース（ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｎａｓｅ）、ＤＮａｓｅ、インヒビン、アクチビン、レニン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ホルモンまたは成長因子に対するレセプター、インテグリン、プロテインＡもしくはＤ、リウマチ因子、神経栄養因子  たとえば骨由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３，−４，−５もしくは−６（ＮＴ−３，  ＮＴ−４，  ＮＴ−５もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子  たとえばＮＧＦ−３、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子  たとえばＦＧＦおよびｂＦＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）  たとえばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−β１，  ＴＧＦ−β２，  ＴＧＦ−β３，  ＴＧＦ−β４もしくはＴＧＦ−β５を含む、インシュリン様成長因子Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ），  ｄｅｓ  （１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＦ−１）、インシュリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤタンパク質（分化タンパク質のクラスター）  たとえばＣＤ−３，  ＣＤ−４，  ＣＤ−８およびＣＤ−１９、骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）、イムノトキシン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ；ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、サイトカイン及びそのレセプター、同様に、それらのレセプターのサイトカインを含むキメラタンパク質であって、次を含むもの、例えば、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ、それらのレセプター（ＴＮＦＲ−１，  ＥＰ４１７５６３，およびＴＮＦＲ−２，  ＥＰ４１７０１４）及びそれらの誘導体、インターフェロン  たとえばインターフェロン−アルファ、−ベータ、およびガンマ、コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩���促進因子（ｄｅｃａｙ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ウイルス抗原  たとえばＡＩＤＳエンベロープの一部、輸送タンパク質（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ホーミング受容体（ｈｏｍｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、アドレッシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｓ）、制御タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、抗体、キメラタンパク質、たとえばイムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎｓ）、並びに任意の上記にリストされたグリコシル化タンパク質の断片である。好ましくは、グリコシル化タンパク質は、本発明において産生されるものである。より好ましくは、Ｎ−グリコシル化タンパク質は、本発明において産生されるものである。  
【００３３】
最も好ましくは、Ｎ−グリコシル化され、そのホルモンの生理活性がそれに依存的であるＥＰＯのようなグリコシル化ホルモンが、または特にＥＰＯが産生される。  
【００３４】
当該技術分野において既知の任意の適切な培養手順および培養装置を、本発明の形質移入したヒト細胞を成長させるために使用し得る。培養液として、通常の無グルタミン基礎培地（ｃｏｍｍｏｎ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｆｒｅｅ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）に約０．１〜２０％、好ましくは０．５〜１５％血清を添加したもの、同様に無血清、無グルタミンの通常の基礎培地（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｆｒｅｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）を使用できる。また、動物由来のタンパク質がフリーの通常の無グルタミン基礎培地を使用できる。  
【００３５】
好ましくは、無血清  無グルタミンの通常の基礎培地が使用される。  
【００３６】
使用し得る血清（Ｓｅｒａ）は、例えば胎児ウシ血清（ｆｏｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）または成体ウシ血清である。好ましくは、胎児ウシ血清が使用される。使用し得る通常の無グルタミン基礎培地は、例えば、無グルタミンのイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）  培地、無グルタミンのイーグル培地のダルベッコ修飾培地（ＤＭＥＭ）、無グルタミンのイスコブのＤＭＥＭ培地（Ｎ．  Ｉｓｃｏｖｅ  ａｎｄ  Ｆ．  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９７８，  １４７，  ９２３）、無グルタミンのハムＦ１２培地（Ｒ．  Ｇ．  Ｈａｍ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９６５，  ５３，  ２８８）、無グルタミンのＬ−１５培地（Ａ．  Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ，  １９６３，  ７８，  １７３）、無グルタミンのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  １９６７，  １９９，  ５１９）、無グルタミンの専売培地（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｍｅｄｉｕｍ）およびその適切な比の混合物である。高密度細胞培養のための通常の細胞培養成長培地（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉａ）の栄養強化（Ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、当該技術において周知であり、例えばＧＢ  ２２５１２４９に記載されている。それは本発明の無グルタミン培地に良好に適用できる。  
【００３７】
通常のサプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）を、通常の無グルタミン基礎培地に添加してもよい。  
【００３８】
通常付加し得るサプリメントは、血清中に通常存在するタンパク質および随意に細胞成長および／または細胞生存度にポジティブな効果を有する更なる成分を含有する。血清中に通常存在するタンパク質は、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、トランスフェリンおよび／またはインシュリンである。細胞成長（ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ）および／または細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）にポジティブな効果を有する更なる成分は、例えば、大豆脂質、セレニウムおよびエタノールアミンである。グルタミンと置き換わるアミノ酸および／またはヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）を、細胞株に応じて培養液に添加してもよい。アミノ酸の例は、イソロイシン、ロイシン、バリン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アラニンである。随意、グルタミンを、通常の無グルタミン基礎培地に低い濃度、通常１ｍｇ／ｌ未満、好ましくは０．５ｍｇ／ｌ未満を添加して、その生合成の機能（例えば、アミノ基転移反応）を維持してもよい。  
【００３９】
タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列またはタンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性配列は、増幅可能な遺伝子を用いた形質移入後に増幅され、対応する選択剤が通常の無グルタミン基礎培地に添加される。前記選択剤の適用される濃度範囲は、使用される細胞株に依存する。通常、１０μＭ以上の濃度が使用される。  
【００４０】
グルタミン栄養要求性ヒト細胞（この細胞は本発明による形質移入したグルタミン栄養要求性ヒト細胞を取得するための開始材料として使用でき、この形質移入した細胞はタンパク質を産生する能力を有し且つ更に本発明による無グルタミン培地中で成長する能力を有する）は、足場依存性または足場非依存性であってもよい。足場依存性のヒト細胞（例えばＨＴ１０８０株化細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＣＬ１２１））が使用された場合、それを無血清培地において成長する能力を有する足場非依存性ＨＴ１０８０株化細胞に適応させることが可能である（これは文献にいまだ記載されていない）。  
タンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列、またはタンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列およびＧＳをコード化している外因性ＤＮＡ配列での形質移入の前または後で適応が生じてもよい。
【００４１】
好ましくは、前記細胞は、第一にタンパク質をコード化している外因性ＤＮＡ配列またはタンパク質をコード化している内因性遺伝子の発現を変更する能力を有する外因性ＤＮＡ配列で形質移入され、第二に無血清培地の懸濁液中での成長に適応させられ、次にＧＳをコード化している外因性ＤＮＡ配列で更に形質移入される。必要であれば、形質移入した細胞は、再び成長に関して浮遊状態で（ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）無血清、無グルタミン培地中で適応させてもよい。  
【００４２】
本発明の形質移入したグルタミン栄養要求性ヒト細胞は、足場依存性または足場非依存性であってもよく、また、無血清、無グルタミン培地において浮遊成長能力を有するものであってもよい。好適な形質移入したグルタミン栄養要求性ヒト細胞は、足場非依存性であり、無血清、無グルタミン培地において浮遊成長能力を有するものである。  
【００４３】
無血清培地において浮遊成長能力を有する足場非依存性細胞であるための適応は、細胞を第一工程において血清含有培地を用いて足場非依存性に適応させることにより達成可能である。これは、例えば、細胞のトリプシン処理および引き続く撹拌または攪拌による細胞の解放によって実施できる。次に第二工程で前記細胞を無血清培地に、血清含有量の引き続く減少化によって適応させる。  
【００４４】
適応の間の選択剤（使用する場合）の量を、前記細胞の成長に阻害的である場合には減らしてもよい。しかしながら、前記細胞を、同様に第一工程で無血清培地における成長に血清含有量の引き続く減量によって適応させ、そして第二工程で浮遊成長能力を有する足場非依存性細胞に、例えば前記細胞のトリプシン処理および引き続く撹拌または撹拌による前記細胞の解放によって適応させてもよい。両方の工程を、同様に同時に適用してもよい。  
【００４５】
好ましくは、第一工程で前記細胞を、血清含有培地を用いて攪拌により前記細胞を解放（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ）することにより足場非依存性に適応させ、そして次にそれらを第二工程で無血清培地に血清含有量（ｓｅｒｕｍ  ｃｏｎｔｅｎｔ）の引き続く減少化（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）によって適応させる。  
【００４６】
血清含有培地の基礎（ｂａｓｉｓ）として、上記の培養液を使用してもよい。  
【００４７】
本明細書中で規定される選択剤を、培養液に添加してもよい。選択剤の適用される濃度範囲は、使用される細胞株に依存する。通常、１０μＭ以上が使用される。血清含有培地には、約０．１〜２０％、好ましくは０．２〜１０％、最も好ましくは０．５〜５％の血清が通常添加される。使用し得る血清は、上記のとおりである。引き続く血清含有量の減少化は、血清含有量を段階的に例えば１０％〜１％〜０％に減少させることにより達成し得る。
【００４８】
本発明の形質移入したグルタミン栄養要求性ヒト細胞は、タンパク質の生産のための方法であって、前記細胞を培養液中で前記タンパク質の発現に適切な条件下で培養すること及び前記タンパク質を回収すること、による方法に使用される。生産されるタンパク質は、上記のとおりである。培養液として、上記のような、通常の無グルタミン基礎培地および通常のサプリメントを使用できる。適切な培養条件は、哺乳類細胞のインビトロ培養に関して従来使用される条件である（例えば、ＷＯ  ９６／３９４８８に記載されているような）。
【００４９】
タンパク質は、細胞培養物から従来の分離技術（例えば、免疫親和性に基づく分画またはイオン−交換カラム；沈殿；逆相ＨＰＬＣ；クロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ゲル濾過など）により分離し得る。当業者は、所望のポリペプチドに適切な精製方法が、組換え型細胞培養物における発現に際するポリペプチドの特性の変化に応じて、修正を必要とするだろうことを理解する。  
【実施例】
【００５０】
実施例１．  ヒト線維肉腫株化細胞ＨＴ１０８０−Ｒ２２３の供給
ヒトＥＰＯ遺伝子の複数のコピーを含んでいる足場依存性のヒトＨＴ１０８０−Ｒ２２３株化細胞は、産業的なＥＰＯ生産に使用された株化細胞であり、トランスカリオティック・セラピーズ（Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ  ０２１３９  （ＵＳ））によって最初に作出された。これは足場依存性のヒト線維肉腫ＨＴ  １０８０株化細胞に由来する。親ＨＴ１０８０株化細胞（ＡＴＴＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  １２１）は、ＥＰＯ産生能力をＤＮＡ構築物ｐＲＥＰ０２２で形質移入されることにより獲得しており、この構築物はＷＯ  ９５／３１５６０に記載された  ＤＮＡ構築物ｐＲＥＯ０１８と類似している（ただし、ＤＨＦＲ遺伝子は逆の配向で配置されており、またｐＲＥＰ０２２はｐＲＥＰ０１８よりも約６００塩基対  低相同性の配列（６００  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ  ｌｅｓｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでいる）。この株化細胞は、さらに略してＲ２２３株化細胞と称される。  
【００５１】
実施例２．  無血清培地中で浮遊状態での成長に対するＲ２２３株化細胞の適応
静的な（ｓｔａｔｉｃ）フラスコで付着培養によって成長させた細胞は、トリプシン処理によって解離されて、１０％の透析された胎児のウシ血清（ｄＦＢＳ）および５００ｎＭ  ＭＴＸが添加された「ＨＭ９」と称される、専売のグルタミン含有無血清培地中に再懸濁され、そして振盪フラスコ培養としてインキュベートされた。６日後に成長を開始し、そして細胞を同じ培地にサブカルチャーした（図１）。一旦、成長の確実なパターン（ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｐａｔｔｅｒｎ）が達成された場合、培地の血清含有量は１％に減量された。再度、確実な成長が、血清サプリメント（ｓｅｒｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）の完全な除去前に再達成された。  
【００５２】
血清が添加された及び無血清の培養物を、生産性を評価するため過成長（ｏｖｅｒｇｒｏｗｎ）させた。  
【００５３】
結果は、付着培養のデータと共に表１に示される。適切な適応後の浮遊培養の比成長速度は、血清がない条件でさえ、血清が添加された付着培養でのそれと同等であった。  
【００５４】
血清添加培地で付着培養から浮遊培養へ適応する際に、ＥＰＯ合成の比速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒａｔｅ）は２４から１２ＥＵ／１０６細胞／ｈまで５０％減少していた。しかしながら、次の無血清成長への適応（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）で、この速度は実質的に１８ＥＵ／１０６細胞／ｈに回復した。  
【００５５】
【表１】
2005532033.tif 000003
【００５６】
実施例３．  無血清培地中で浮遊状態での成長に対するＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１２１）の適応
ＨＴ１０８０株化細胞ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１２１を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ）から取得した。初めに、細胞を、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）含有のＤＭＥＭで付着培養により成長させた。  
【００５７】
浮遊および無血清への適応に対しての工程は、図２で表される模式図に従って実施できる。浮遊培養を開始するために、細胞をトリプシン処理によって付着培養から解離させ、そして、解離した細胞を２％ＦＢＳを加えたＨＭ９に再懸濁した。これらを次に振盪培養物としてインキュベートした。一旦２％ＦＢＳを加えたＨＭ９で細胞の浮遊成長が達成されたら、培養物を同じ培地で希釈して娘培養物（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を作出した。ＨＴ１０８０株化細胞の確実な（Ｒｅｌｉａｂｌｅ）浮遊成長は、培養３０日後に達成された（図３）。その後、培地の血清含有量を減らし、最終的に完全に排除した。細胞は、血清非存在下の連続的なサブカルチャーにおいて成長し続けた。  
【００５８】
実施例４．  Ｒ２２３株化細胞の成長および生産性におけるアンモニアの効果
アンモニアは、グルタミンがエネルギー基質として使用されたときに培養細胞によって産生されるカタボライトである。それは、細胞傷害性であり、また細胞成長を阻害し得る。更に、それはタンパク質のグリコシル化を、そのｐＨに対する効果（細胞のゴルジ内での）により阻害できる。フラスコ培養のＲ２２３細胞は、典型的には栄養素を与えられない培養では５ｍＭの、栄養物供給を受ける発酵培養（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）では１０ｍＭのアンモニアを産生する。  
【００５９】
アンモニアの効果の最初の検討では、Ｒ２２３細胞を振盪フラスコ中で、アンモニア添加なしか、又は、２、５若しくは１０ｍＭのアンモニア添加の何れかで成長させた。アンモニア複製培養（ａｍｍｏｎｉａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の各濃度は、オーバーレイガスのＣ０２含量を変えることによって、３つの異なったｐＨ値でセットアップされた。ここでの主要目的は、アンモニアにより及ぼされる成長阻害の程度を決定すること、および減少したｐＨがこの成長阻害を克服するか否かを試験することであった。  
【００６０】
アンモニアが細胞成長を阻害することが認められたが（表２）、減少したｐＨはアンモニアの阻害作用を緩和しなかった。但し、ｐＨを減少させるために必要なｐＣ０２の上昇は、それ自身何らかの成長阻害を生じさせているであろう。  
【００６１】
培養は、ほんの３日後に終了した。非揮発性酸のカタボライトの蓄積が原因となって、全培養物のｐＨをｐＨユニットで数ポイントまで減少させたので、これ以上継続することは妥当（ｖａｌｉｄ）ではなかった。  
【００６２】
【表２】
2005532033.tif 000004
【００６３】
引き続く実験（表３）では、オーバーレイガスのＣＯ２含有量（ｃｏｎｔｅｎｔ）を非阻害的濃度に保っている間、ｐＨを培地のＮａＨＣ０３含有量を調整することによって変化させた。試験されたｐＨの範囲は、ｐＨ７．０から７．５であった。（フラスコ培養のｐＨが、培養の最初の２日間でさえ、調節することができず、実質的に低下することは強調されなければならない。指定されたｐＨ値は、各培養物の最初の（ｉｎｉｔｉａｌ）ｐＨである。）比成長速度は、ｐＨ７．５（３ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３）で最大であったが、しかし、このｐＨで、成長速度および最大細胞濃度の両方が１０ｍＭアンモニアの存在によって半減し、一方でＥＰＯ合成の比速度は４倍減少していた（表３）。  
【００６４】
ｐＨ７．２５（１．５ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３）で比成長速度は減少し、そしてＥＰＯ合成の比速度はｐＨ７．５での培養物と比較して増加した。しかしながら、成長速度はあまり影響されなかった、そして、ＥＰＯ合成の比速度は、１０ｍＭアンモニアの存在によって影響されなかった。  
【００６５】
調査された中で最も低いｐＨ７．０（０．７５ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３）では、比成長速度はさらに減少したが、ここでも比成長速度のアンモニアによる影響はｐＨ７．５よりも小さかった。ＥＰＯ合成の比速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒａｔｅ）は、添加されたアンモニアの存在条件下で増加した（これは成長速度の減少に起因しているかもしれない）。  
【００６６】
【表３】
2005532033.tif 000005
【００６７】
実施例５．  ５リットルスケールの発酵槽培養でのＲ２２３株化細胞の生産性
Ｒ２２３株化細胞のために、５リットルの３つの発酵が実行され、これらは６．９５および７．１５の間の異なるｐＨ値に制御された（表４を参照されたい）。各培養物には、主に消費された栄養分を十分な濃度に維持するように設定された、アミノ酸およびグルコースを含む、濃縮された栄養性飼料が与えられた。培養は、ｐＨ７．１５およびｐＨ７．０５においてはよく成長したが、しかし、ｐＨ６．９５における培養は、おそらくそのｐＨを制御するのに必要とされる高濃度のＣＯ２が原因で成長できなかった。  
【００６８】
【表４】
2005532033.tif 000006
【００６９】
実施例６．  ＧＳでのＲ２３３の形質移入、およびＧＳ形質移入体の付着培養における生産性。
形質移入に使用された細胞は、実施例２のＲ２３３株化細胞の浮遊適応した無血清ストックからのものであった。これらの細胞が大きい多細胞性の凝集体として成長した際に、それらを、それらを実質的に単一の細胞懸濁液に変えるためにトリプシン処理した。  
【００７０】
形質移入のために、実施例２で得られた約１０７の単一の浮遊適応したＲ２２３株化細胞のアリクォット（カルシウムもしくはマグネシウムなしのリン酸緩衝生理食塩水中）を、ＧＳ遺伝子を含む２０μｇの直線化ＤＮＡ（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，  １６９−１７５に記載されたＤＮＡ  シークエンス  ｐＣＭＧＳ  ｂａｍ  Ｈ１  ）と混合し、そしてバイオラッド社  ジーンパルサーを用いてエレクトロポレーション（４５０ボルト，  ２５０μＦ）した。コントロールとして、等アリクォット（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ａｌｉｑｕｏｔ）の細胞を、ＤＮＡの付加なしでエレクトロポレーションにかけた。  
【００７１】
細胞をＨＭ９培地（ＭＴＸなし０％または１０％のｄＦＢＳ含有）で希釈し、９６ウェル培養プレートまたは２５ｃｍ２フラスコに分配し、３５．５〜３７℃でインキュベートした。
【００７２】
ＨＭ９培地は最初２ｍＭグルタミンを含んでいたが、これを、１日後に０．５ｍＭに希釈し、それから１０日後にグルタミンを含まないＨＭ９培地に取り替えた。１日目または１０日目に、ＭＴＸ（５００ｎＭ）を培養に再導入した。  
【００７３】
ＤＮＡの付加なしでエレクトロポレーションにかけられたコントロール細胞の培養に関しては、いかなる成長も得られなかった。  
【００７４】
ＤＮＡと共にエレクトロポレーションされた細胞に関しては、６枚の９６ウェルプレート中で１５のＧＳ形質移入体が同定された。ＧＳ形質移入体は、ＭＴＸを含むもの及び含まないもの両方の初期培地（ｉｎｉｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）において取得された。１５のＧＳ形質移入体のうち、７つは首尾よくフラスコ培養に拡大された（表５）。残りの８つのＧＳ形質移入体は、異常な細胞形態を示したか、または成長が不十分であったため、捨てられた。  
【００７５】
分離された最初の７つのＧＳ形質移入体のそれぞれのために、１０％血清補充された無グルタミンＨＭ９培地を用いて、一群の複製静置フラスコ培養（ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｓｔａｔｉｃ  ｆｌａｓｋ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を用意した。１〜４日間のインターバルで、培養物を、細胞を数えたり、ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡによるＥＰＯ濃度を測定するために犠牲にした。これらのデータを重ねあわせることにより、ＥＰＯ合成の比速度を、各ＧＳ形質移入体に関して見積ることができた。データを表５に要約する、比較のために非形質移入のＲ２２３株化細胞に関するデータを含める。全てのＧＳ形質移入体は、非形質移入のＲ２２３株化細胞と比べて、ＥＰＯ合成の比速度の上昇を示した。最も良いＧＳ形質移入体（３Ｅ１０）は、非形質移入のＲ２２３株化細胞よりも５〜６倍高い合成速度（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒａｔｅ）を有していた。  
【００７６】
【表５】
2005532033.tif 000007
【００７７】
実施例７．  浮遊培養および無血清培地へのＧＳ形質移入体の適応。
実施例６で得られた７つのＧＳ形質移入体のうち、ＧＳ形質移入体＃３Ｅ１０およびＧＳ形質移入体＃８Ｇ３を浮遊培養に進行させた。  
【００７８】
細胞を無グルタミンＨＭ９培地（１０％ｄＦＢＳおよび５００ｎＭ  ＭＴＸを添加）で静置フラスコ中で付着培養として、３５．５〜３７℃で成長させた。細胞を、５日もしくは６日後に攪拌により解離して、同じ培地中に再懸濁し、同じ温度で振とうフラスコ培養としてインキュベートした。成長が、ほんの２日または３日後に開始された。  
【００７９】
細胞を、一度同じ培地でサブカルチャーし、次に過成長させて生産性を評価した。力価および産物合成速度は、１０％ｄＦＢＳおよび５００ｎＭ  ＭＴＸの条件下で成長させた非形質移入のＲ２２３株化細胞よりも、少なくとも２倍高かった（表６）。  
【００８０】
【表６】
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【００８１】
ＧＳ形質移入体３Ｅ１０および８Ｇ３の双方の浮遊培養に関して、無グルタミンＨＭ９培地のｄＦＢＳ含有量は、３Ｅ１０に関しては１０％から２％、１％、０．２％、０．１％、０％へと、また８Ｇ３に関しては１０％から２％、１％へと段階的に減少させられ、確実な細胞成長が更なる減少の前に各々のｄＦＢＳ濃度で達成可能である。８Ｇ３は、１％ｄＦＢＳ未満への適応はされなかった。  
【００８２】
実施例８．  無血清浮遊培養におけるＧＳ形質移入体３Ｅ１０の生産性および代謝。
実施例７での無血清成長に適応させたＧＳ形質移入体３Ｅ１０を、無血清  無グルタミンのＨＭ９培地の浮遊培養で３５．５〜３７℃で培養した。ＧＳ形質移入体３Ｅ１０株化細胞では、グルタミンを含むＨＭ９培地で同じ条件下で培養された、形質移入されていないＲ２２３株化細胞よりも、２〜３倍高いＥＰＯ合成の比速度が得られた（表７）。  
【００８３】
【表７】
2005532033.tif 000009
【００８４】
ＧＳ形質移入細胞のより高いＥＰＯ−生産性は、代謝性アンモニア放出の減少を伴うものであった。６ｍＭグルタミンを含むＨＭ９培地で非形質移入のＲ２２３株化細胞をフラスコ培養した際には典型的に５ｍＭアンモニアが産生されたのに対し、ＧＳ形質移入体３Ｅ１０は、無グルタミンのＨＭ９培地の中で僅か１．８ｍＭアンモニアを産生した（表８）。  
【００８５】
【表８】
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【００８６】
実施例９．  製品品質（Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｑｕａｌｉｔｙ）の分析。
ＧＳ形質移入体３Ｅ１０のフラスコ培養で産生されたＥＰＯを、免疫精製し、その糖化形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）の分布に関して分析した。図４は、実施例８で記載した、ピーク細胞濃度で得られたＥＰＯおよび無グルタミンＨＭ９培地で成長した３Ｅ１０細胞の培養物の収穫物の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル分析を示している。ＨＭ９培地で生育した非形質移入のＲ２２３株化細胞からの対応する（Ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）サンプルを含める。ＧＳ形質移入体３Ｅ１０から産生されたＥＰＯは、非形質移入のＲ２２３株化細胞（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｒ２２３  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）と比べて、より酸性のアイソフォームの増大を示した。ＩＥＦゲルのスキャニングにより、アイソフォーム分布の定量化および理論上のアイソフォーム相対活性（ＩＲＡ；ｉｓｏｆｏｒｍ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）の計算が可能であった。  
【００８７】
【表９】
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【００８８】
データは、ＧＳ形質移入体３Ｅ１０における製品品質の顕著な向上を示し、非形質移入のＲ２２３株化細胞のコントロール培養よりも、ほとんど２倍高いＩＲＡを有するものであった（表９および１０）。  
【００８９】
また、理論的のＮ−グリカン電荷「Ｚ」が、ＧＳ形質移入体３Ｅ１０のＥＰＯに関して決定された。
「Ｚ」は、表１０において非形質移入のＲ２２３株化細胞に関しては決定されなかった。しかし、ＧＳ形質移入体３Ｅ１０（ピーク細胞濃度での２７３および収穫での２６５）の「Ｚ」値は、非形質移入のＲ２２３株化細胞のフラスコ培養（１８２〜２２８）から得られた値を超えた。「Ｚ」をＨｅｒｍｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９６，  ６，  ２１７−２３０にしたがい決定した；Ｚは、特定のシアル化アイソフォームの各自の％シェアに前記アイソフォームの対応する負電荷（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅ）を乗じることによって得られ、これはアシアロ（ａｓｉａｌｏ）／中性、モノシアロ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）、トリ‐、テトラ−、またはペンタアシアロ（ｐｅｎｔａｓｉａｌｏ）であるかどうかに依存する。前記積項（ｓａｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｔｅｒｍｓ）の数学的な和が、Ｚである。Ｚ数は、特定の治療における糖タンパク質のインビボでのクリアランス速度と相関する（Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ，  上記）。  
【００９０】
【表１０】
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【００９１】
実施例１０．  ６リットル発酵槽の無血清浮遊培養における、ＧＳ形質移入体３Ｅ１０の生産性、代謝、および製品品質
ＧＳ形質移入体３Ｅ１０を、エアリフト発酵槽でバッチ培養で成長させた。培養培地は、無グルタミンＨＭ９であった（血清なし）。各培養には、主に消費された栄養分を十分な濃度に維持するように設定された、アミノ酸およびグルコースを含む、濃縮された栄養性飼料が与えられた。  
結果を表１１に示す、非形質移入の親Ｒ２２３の発酵に関するデータを比較のために含める。
【００９２】
ＧＳ形質移入体は、生存度の増大（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を示し、結果として培養期間の増加を示した。産物合成の比速度は、変化のない非形質移入の親株化細胞のそれと同等であったが、しかし、より拡大した培養寿命（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）は最大産物濃度の増加をもたらした。アンモニア蓄積は、ＧＳ形質移入体に関して少なくとも４倍低かった。ＩＲＡによって測定された製品品質は、ＧＳ形質移入体に関して改善された。  
【００９３】
【表１１−１】
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【００９４】
実施例１１．  イスコブベース培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）の無血清浮遊培養におけるＧＳ形質移入体の生産性および代謝
実施例７で無血清成長に適応したＧＳ形質移入体３Ｅ１０を、振盪フラスコで無血清  無グルタミンのイスコブ培地のバージョンで培養した。親株化細胞（Ｒ２２３）を、グルタミンを添加した同等の（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）培地で並行して成長させた。  
【００９５】
使用した培地は、イスコブの修飾ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）に、イスコブのサプリメント（０．４ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、３０ｍｇ／Ｌのヒトのホロ−トランスフェリン）、１０ｍｇ／Ｌの組換え型のヒトインシュリン、１ｇ／Ｌのルトロール（Ｌｕｔｒｏｌ）Ｆ６８、および６０μＬ／Ｌのエタノールアミン）を加えたものであった。培地は、株化細胞Ｒ２２３の培養に関しては４ｍＭグルタミンを含んでいたが、ＧＳ形質移入された株化細胞に関してはグルタミンは排除され、４ｍＭグルタミン酸ナトリウム＋４ｍＭアスパラギンに置き換えられた。  
【００９６】
ＧＳ形質移入された株化細胞（３Ｅ１０）の産物合成の比速度は、非形質移入の親株Ｒ２２３より約５０％高かった（表１２）。形質移入された株化細胞３Ｅ１０は、アンモニア産生の比速度が７倍低かった（表１３）。  
【００９７】
産物をこれらの培養の各々から精製し、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルで分析した。この分析の結果は図５に示され、この図は染色後のＩＥＦゲルを示している。ｐＨ２．５から６．５のＩＥＦゲルを変性条件下で泳動し、クーマシーブルーで染色した。  
【００９８】
【表１１−２】
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【００９９】
Ｒ２２３の産物に関して、ゲルの長さに渡って広がる少なくとも１３の可視バンドが存在する。ＧＳ形質移入の株化細胞３Ｅ１０が産生する産物に関して、より塩基性のバンド（ゲルの上部に分離した）は、株化細胞Ｒ２２３からの産物に関して低い強度であり、一方、より酸性のバンド（ゲルの下部の）は、株化細胞３Ｅ１０に関して強度が増加している。またＧＳ−形質移入体３Ｅ１０を用いて作製された産物に、少なくとも１つの検出可能な余分の酸性バンドが存在するが、それは親株Ｒ２２３からの産物では検出可能ではない。これは、ＧＳ形質移入された株３Ｅ１０によって産生された産物に対するシアル酸付加度の増加を示している。  
【０１００】
【表１２】
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【０１０１】
【表１３−１】
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【０１０２】
図５のゲルデータは、ＩＥＦ−ゲル写真をデンシトメータでスキャンすることによって、さらに定量化された。各バンドによって表された産物の相対的な比率が定量化された。データを表１４に要約する、ここで各々のバンドの相対的な比率は、ゲルの各レーン上のトータル産物のパーセンテージとして表される。  
【０１０３】
より酸性のバンド（８〜１４）は、最大の生物活性を有しており、一方より酸性度の低いバンドは、活性が相対的に僅かであるか又は活性がない。ゲル（図５）およびデンシトメータによるスキャンクロマトグラム（ゲルレーン４に関して図６およびゲルレーン５に関して図７）から、ＧＳ−形質移入された細胞株であるＧＳＲ２２３の産物が、より酸性のアイソフォームに集中していることが明瞭である。非形質移入の株化細胞（Ｒ２２３）に関しては、バンド８〜１４が全産物の４４％を示し、一方、ＧＳ−形質移入された株化細胞（ＧＳＲ２２３）に関しては、この比が７３％まで増加する。図６および７では、図５のゲルバンドの番号付けにしたがいピークに識別番号（ｉｄｅｎｔｉｆｙｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｓ）が割り当てられる。  
【０１０４】
【表１３−２】
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、無血清培地での株化細胞Ｒ２２３の浮遊培養への適応を示す（繰り返された連続サブカルチャーの間の細胞濃度のプロファイル）。
【図２】図２は、ＨＴ１０８０細胞の無血清培地における浮遊培養への適応の概略図を示す。
【図３】図３は、無血清培地中での株化細胞ＨＴ１０８０の浮遊培養への適応を示す（繰り返された連続サブカルチャーの間の細胞濃度のプロファイル）。
【図４】図４はＧＳ形質移入体３Ｅ１０と、産業用高密度成長培養液で成長させた非形質移入のＲ２２３株化細胞とから免疫精製されたＥＰＯのＩＥＦ分析を示す。  レーン２：  ３Ｅ１０収穫物（ｈａｒｖｅｓｔ）レーン３：  ３Ｅ１０  ピークレーン４：  非形質移入の（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）Ｒ２２３株化細胞  ピークレーン５：  非形質移入のＲ２２３株化細胞  収穫物
【図５】図５は、Ｒ２２３株化細胞のＧＳ−Ｒ２２３形質移入体３Ｅ１０と、通常のイスコブ培地で成長させた非形質移入のＲ２２３株化細胞とから免疫精製されたＥＰＯのＩＥＦ分析を示す。  レーン４：  グルタミン添加したイスコブにおける非形質移入のＲ２２３株化細胞  収穫物。レーン５：  無グルタミン・イスコブにおける収穫時のＧＳ−２２３株化細胞３Ｅ１０。
【図６】図６は、図５に示されるゲルレーン４の上端から下端までのデンシトメータによるスキャンのクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、図５で示された、ゲルレーン５の上端から下端までのデンシトメータによるスキャンのクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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