(57)【要約】本発明は、偽島の調製のための方法に関する。さらに、本発明は、また、本明細書に記載される方法により同定される化合物を投与することにより、糖尿病及び糖尿病−関連障害を処置する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素消化を用いて膵島を処理し；そして
消化された島を、容器の表面積が容器の上部から容器の底に向かって減少する容器中に播種する段階を含んでなる、偽島（ｐｓｅｕｄｏ  ｉｓｌｅｔｓ）の調製方法。
【請求項２】
該島を遠心して島を凝集させる段階をさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項３】
該偽島を凍結する段階をさらに含んでなる請求項２の方法。
【請求項４】
該酵素がトリプシン、ＤＮａｓｅ  １又はジスパーゼである請求項１の方法。
【請求項５】
該消化された島を播種の前に濾過する請求項１の方法。
【請求項６】
該偽島を哺乳類膵臓組織から単離する請求項１の方法。
【請求項７】
該哺乳類膵臓組織がヒトである請求項５の方法。
【請求項８】
該偽島を新しい膵臓組織から単離する請求項５の方法。
【請求項９】
該偽島を凍結膵臓組織から単離する請求項５の方法。
【請求項１０】
該容器がＶ−底プレートである請求項１の方法。
【請求項１１】
偽島を線維芽細胞と共−培養する段階をさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項１２】
請求項１の方法により偽島を単離し；
単離された偽島に試験化合物を加え；そして
インスリン分泌への該化合物の効果を測定する
段階を含んでなる向インスリン性化合物の同定方法。
【請求項１３】
必要のある患者に請求項１０の方法により同定される化合物の有効量を投与する、糖尿病又は糖尿病−関連障害の処置方法。
【請求項１４】
該糖尿病−関連障害が高血糖症、高インスリン血症、耐糖能障害、空腹時糖障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ）、異常脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高トリグリセリド血症、シンドローム  Ｘ、インスリン抵抗性、肥満、アテローム性動脈硬化疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高血圧、心臓血管病、脳血管病、末梢血管病、狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発ガン及び過形成より成る群から選ばれる請求項１１の方法。
【請求項１５】
請求項１０の方法により同定される化合物の有効量を製薬学的に許容され得る担体と組み合わせて含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１６】
消化酵素及び容器の表面積が容器の上部から容器の底に向かって減少する容器を含んでなる偽島の調製のためのキット。
【請求項１７】
請求項１の方法により偽島を単離し；
単離された偽島に試験化合物を加え；そして
インスリン含有量への該化合物の効果を測定する
段階を含んでなるインスリン生合成の分析方法。
【請求項１８】
必要のある患者に請求項１７の方法により同定される化合物の有効量を投与する、糖尿病又は糖尿病−関連障害の処置方法。
【請求項１９】
請求項１の方法により偽島を単離し；
単離された偽島に試験化合物を加え；そして
グルカゴン含有量への該化合物の効果を測定する
段階を含んでなるグルカゴン放出の測定方法。
【請求項２０】
必要のある患者に請求項１９の方法により同定される化合物の有効量を投与する、糖尿病又は糖尿病−関連障害の処置方法。
【請求項２１】
請求項１の方法により偽島を単離し；
単離された偽島に試験化合物を加え；そして
ソマトスタチン含有量への該化合物の効果を測定する
段階を含んでなるソマトスタチン放出の測定方法。
【請求項２２】
必要のある患者に請求項２１の方法により同定される化合物の有効量を投与する、糖尿病又は糖尿病−関連障害の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年３月２２日に申請された米国暫定出願出願番号第６０／３６６，７２８号の利益を請求し、該出願は引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、機能性の偽島（ｐｓｅｕｄｏ  ｉｓｌｅｔｓ）の調製方法に関する。さらに、本発明は、また、本明細書に記載される方法により同定される化合物の投与による糖尿病及び糖尿病−関連障害の処置方法も目的とする。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
糖尿病は損なわれたグルコース代謝を特徴とし、他の症状の中でも糖尿病患者における高い血液グルコースレベルにより顕症する。基となる欠陥から、糖尿病は２つの主な群：患者にβ−細胞（β−細胞は膵腺中でインスリンを生産する）が欠けている場合に起こる１型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）ならびに損なわれたβ−細胞機能及びインスリン作用における変調を有する患者において起こる２型糖尿病又は非−インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に分類される。
【０００４】
２型糖尿病は、より普通の型の糖尿病であり、高血糖症患者の９０〜９５％がこの型の糖尿病を経験する。２型糖尿病の病因はインスリン抵抗性及びインスリン不全を特徴とする。インスリン抵抗性の患者は、膵臓β−細胞がインスリン抵抗性を補償するのに十分な量のインスリンを放出する能力を保持していれば正常血糖を維持し、明白な糖尿病を発現しない。しかしながら、β−細胞はこの高いインスリンの生産量を維持できず、結局グルコース−誘導インスリン分泌は低下し、グルコースホメオスタシスの悪化及び続く明白な糖尿病の発現を生ずる。この高インスリン血症はインスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の血漿濃度の向上にも結びつく。インスリン抵抗性及び高インスリン血症のこれらの代謝障害との連合は「シンドローム  Ｘ」と呼ばれ、高血圧及び冠動脈疾患の危険の増加に強く結びつけられてきた。
【０００５】
糖尿病の製薬学的処置への１つの方法は、膵島（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ）機能を向上させること、特にグルコース−刺激インスリン放出を強化することである。すなわちグルコース−依存性インスリン分泌を産み出す薬剤は、低血糖を引き起こさずに、又は不適切に高いインスリンレベルを生じずに、疾患と関連する高血糖を低下させるであろう。しかしながら、そのような向インスリン性化合物（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の同定及び開発は、グルコース−依存性インスリン放出を評価するための効率の高い力強い（ｒｏｂｕｓｔ）方法を必要とする。
【０００６】
インスリン分泌に影響を与える他に、糖尿病（例えば１型、２型、損なわれたグルコース許容性）の処置のための他の方法は、β−細胞の量（ｍａｓｓ）の保存又は復活であることができる。最近の研究は、ＧＬＰ−１及び類似体、例えばエキセンジン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）がβ−細胞新生及び増殖の増加によりβ−細胞の量を増大させることを示した（非特許文献１；非特許文献２）。アポプトシス、新生又は増殖に影響することによりβ−細胞の量に影響する薬剤は、１型及び２型糖尿病の処置のための有用な薬剤となるはずである。かくしてインスリン生合成を増加させる薬剤の同定は、β−細胞不全を予防するか又は遅らせることによる糖尿病及び関連障害のための処置として有益であろう。
【０００７】
現在、ほとんどの培養膵臓β−細胞系はグルコースの生理学的濃度に応答せず、従ってグルコース−調節インスリン放出を標的とする化合物の試験に適していない。単離される一次膵島はグルコース−応答性を保持している；しかしながら、これらの細胞の有用性は：（１）島の群の間で大きな変動を生ずる膵島の不均一な性質；ならびに（２）単離され得る機能性の島の限られた数により制限される。
【０００８】
トリプシンを用いて膵島組織を単細胞中に分散させることにより、膵島の間の変動を軽減するいくつかの試みが成されてきた。しかしながら、これらの分散された島細胞は、グルコース及び他の分泌促進物質に応答してインスリンを放出する能力を失う。機能のためには何らかの細胞−細胞相互作用が必要であることが確定された。従って、分散された島細胞の再−凝集は、局所解剖学的構造の回復及び生理学的に調節されたインスリン放出の復活のための手段であり得る。
【０００９】
偽島の形成のための分散された島細胞の再−凝集は、複数の方法、例えば数日間の島細胞の培養（非特許文献３）、２時間の細胞の機械的回転（非特許文献４）又は細胞とビーズとの混合（非特許文献５）により達成され得る。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、且つ偽島のサイズ及び収率の両方において大きな変動を生ずる。これらの制限のために、これらの方法は薬剤発見のために適していない。
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：２００３年，３６５−３７１
【非特許文献２】Ｆａｒｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：２００２年，４３９７−４４０８
【非特許文献３】Ｗｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３３：１９８４年，３３−４４７
【非特許文献４】Ｐｉｐｅｌｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１７：１９８５年，８０６−８１６
【非特許文献５】Ｈｏｐｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１７：１９８５年，２０７３−２０８０
【発明の開示】
【００１０】
本発明は偽島の均一な集団を調製するための新規な方法を提供する。膵臓β−細胞を標的とする化合物のスクリーニングのため及びこれらの化合物のインスリン放出についての能力の評価のために本発明の方法を用いることもできる。
【００１１】
発明の概略
本発明は、偽島の均一な集団の調製のための新規な方法を提供する。１つの態様において本発明の方法は、膵島を酵素消化に供し、分散された島を容器中に播種する段階を含み、ここで容器の表面積は容器の上部から容器の底に向かって減少する（例えば「Ｖ−底」プレート、遠心管、コニカルチューブ）。他の態様において、偽島の調製のための方法は、遠心の追加の段階を含む。特定的には、分散された島細胞を、容器に島細胞を加えた後に遠心する。さらに別の態様において、膵島の消化に用いられる酵素は、例えばトリプシン及びＤＮＡｓｅ  １を含む。本発明の他の側面において、消化された膵島細胞を容器中への播種の前に濾過することができる。
【００１２】
本発明の他の側面において、偽島を新しいかもしくは凍結された膵島から単離することができる。さらに、哺乳類を含むいずれの動物からも偽島を単離することができる。
【００１３】
本発明の方法により調製される偽島を複数のアッセイのために用いることができる。１つの側面において、例えば向インスリン性又は他の化合物のスクリーニング及び評価にために偽島を用いることができる。他の態様において、例えばインスリン含有量の測定及びインスリン生合成の分析のために偽島を用いることができる。さらに別の態様において、本発明の方法により調製される偽島を、二次メッセンジャー活性〔例えばｃＡＭＰ、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、カルシウム）への化合物の効果の特性化のために用いることができる。本発明のさらに別の態様は、島細胞の代謝生成物の測定のための偽島の使用に関する。さらに、グルカゴン及びソマトスタチン放出ならびに種々の化合物によるグルカゴン及びソマトスタチンの調節の測定のために、本発明の方法の偽島を用いることができる。
【００１４】
本発明の他の側面において、偽島を他の細胞型（例えば線維芽細胞）と共−培養することができる。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載される方法により同定される化合物を、必要のある患者に投与することによる、糖尿病及び糖尿病−関連障害の処置の方法にも関する。
【００１６】
本発明の他の態様は、偽島の調製のためのキットに関する。１つの態様において、キットは例えば消化酵素及び容器（例えば「Ｖ−底」プレート）を含むことができる。他の態様において、キットは例えばフィルター（例えばナイロンフィルター）及び緩衝溶液も含むことができる。
【００１７】
図面の記述
図１．  図１は、本発明の方法により調製される偽島の特性化を示す。特定的には、偽島をグルコース（パネルＡ）、アセチルコリン（パネルＢ）、ＧＬＰ−１（パネルＣ）及びグリベンクラミド（ｇｌｙｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ）（パネルＤ）と一緒にインキュベーションし、インスリン放出へのこれらの化合物の効果を評価した。
【００１８】
図２．  図２は、本発明の方法により調製される偽島の特性化を示す。特定的には、偽島をインスリン放出分泌促進物質（フォルスコリン及びＩＢＭＸ）ならびにインスリン放出阻害剤（ソマトスタチン及びノルエピネフリン）と一緒にインキュベーションし、これらの化合物のインスリン放出への効果を評価した。
【００１９】
図３．  図３は、線維芽細胞と共−培養された偽島の特性化を示す。偽島を線維芽細胞と共−培養し、増加する量のＧＬＰ−１と一緒にインキュベーションし、インスリン放出への共−培養の効果を評価した。
【００２０】
図４．  図４は、本発明の方法により調製される偽島を用いる、未知化合物によるインスリン分泌の評価を示す。特定的には、ＧＬＰ−１の存在下又は不在下で偽島を未知化合物と一緒にインキュベーションし、インスリン放出へのこれらの化合物の効果を評価した。
【００２１】
発明の記述
本発明が、記載される特定の方法、案、細胞系、動物の種又は属ならびに試薬により制限されず、従って変化し得ることは理解されねばならない。本明細書で用いられる用語は、特定の態様を記述する目的のためのみであり、添付の請求項のみにより制限される本発明の範囲を制限することは意図されていないことも理解されるべきである。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、単数形の「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、状況が明らかに他の場合を指示していなければ、複数の言及（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を含むことが注目されねばならない。かくして、例えば「ａ  ｃｅｌｌ」への言及は、１個もしくはそれより多い細胞への言及であり、且つ当該技術分野における熟練者などに既知のそれらの同等事項を含む。
【００２３】
他にことわらなければ、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の熟練者に普通に理解されると同じ意味を有する。
定義
便宜的に、明細書、実施例及び請求項において用いられるある用語及び句の意味を下記に示す。
【００２４】
膵島という用語は、小さくてわずかに粒状の内分泌細胞の群を指し、それは膵臓の細管及び腺胞の間で吻合する小柱を形成し、且つインスリン、グルカゴン及びソマトスタチンを分泌する。
【００２５】
偽島は、再−凝集した分散された膵島細胞を指す。
【００２６】
無損傷の島は、自然の局所解剖学を維持している単離された膵島を指す。
【００２７】
向インスリン性という用語は、インスリンの生産及び活性を刺激するか又はそれに影響することを指す。
【００２８】
動物という用語はすべての哺乳類、例えばネズミ類（例えばラット、マウス、モルモット、ハムスター）、ヒト及びサルを含む霊長類、ヒツジ、イヌ類（例えばイヌ）、ネコ類、ウシ類及びブタ類（例えばブタ）を含む。
【００２９】
容器という用語は、入れ物の表面積が入れ物の上部から入れ物の底に向かって減少するいずれかの入れ物を指す。例えば容器は「Ｖ」−底プレート、「Ｕ」−底プレート、遠心管、コニカルチューブ、培養管、９６−ウェルプレート、３８４−ウェルプレートであることができるが、これらに限られない。
【００３０】
化合物という用語は、アゴニスト、アンタゴニスト、小分子及び抗体を含むことができるが、これらに限られない。例えば「アゴニスト」という用語は、タンパク質の生物学的活性を模するか又は上方−調節する（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ）（例えば、力を与えるか又は補足する）薬剤を指すものとする。アゴニストは、野生−型タンパク質又は野生−型タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を有するそれらの誘導体であることができる。アゴニストは、遺伝子の発現を上方−調節するか、又はたんぱく質の少なくとも１つの生物学的活性を向上させる化合物であることもできる。アゴニストは、ポリペプチドと他の分子、例えば標的ペプチド又は核酸との相互作用を向上させる化合物であることもできる。
【００３１】
「アンタゴニスト」は、タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を下方−調節する（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ）（例えば、抑制するか又は阻害する）薬剤を指すものとする。アンタゴニストは、タンパク質と他の分子、例えば標的ペプチド又は酵素基質の間の相互作用を阻害するか、又は低下させる化合物であることができる。アンタゴニストは、遺伝子の発現を下方−調節するか、又は存在する発現されたタンパク質の量を減少させる化合物であることもできる。
【００３２】
「小分子」は核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭水化物、脂質又は他の有機もしくは無機分子を指す。
【００３３】
「抗体」という用語は、例えば、いずれかのイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の全抗体を含み、且つそれらのフラグメントを含むことが意図されている。通常の方法を用いて抗体をフラグメント化することができ、フラグメントを使用のためにスクリーニングすることができる。かくして該用語は、ある種のタンパク質と選択的に反応することができる、タンパク質分解的に切断されたか又は組換え的に調製された抗体分子の部分のセグメントを含む。そのようなタンパク質分解及び／又は組換えフラグメントの制限ではない例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ及びペプチドリンカーにより連結されたＶ［Ｌ］及び／又はＶ［Ｈ］ドメインを含有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖ’ｓは共有結合的又は非−共有結合的に連結し、２個もしくはそれより多い結合部位を有する抗体を形成することができる。本発明はポリクローナル、モノクローナル又は他の抗体の精製調製物及び組換え抗体を含む。
【００３４】
本発明は、偽島の均一な集団の調製及び向インスリン性化合物の研究及び開発におけるその適用を記載する。
【００３５】
今日まで、インスリン放出を研究するために細胞培養プレート中で島細胞を用いる多数の試みが、２つの主な理由：１）膵島の局所解剖学的構造の喪失及びかくしてインスリン分泌促進物質への応答の喪失；ならびに２）長期間の培養の後のこれらの細胞のプレートへの付着の不足のために失敗してきた。
【００３６】
これらの困難を克服するために、本発明は、島細胞インキュベーション法を用いる新規な方法を提供する。本発明の方法の決定的な段階は、分散された島細胞を容器中に播種し、ここで容器の表面積が容器の上部から容器の底に向かって減少する（例えば「Ｖ−底」プレート）ことである。次いで遠心の後に偽島を生成させる。この型の容器の使用の利点は、分散された島細胞が容器の底に集められ、細胞クラスターを形成することである。この細胞のクラスターが偽島を形成する。この細胞収集段階を平底プレート中で行なうことはできず、それは遠心がプレートの底に沿って細胞を分散させるのみであり、かくして、細胞が偽島を形成できないからである。
【００３７】
遠心はこの偽島法のための他の重要段階である。分散された細胞を容器中に播種した後、個々の細胞は容器の底を横切って不均一に広がり得る。これらの不均一な細胞クラスターはサイズが異なり得、従ってインスリン放出における大きな変動を生じ得る。容器の表面積が容器の上部から容器の底に向かって減少する容器と遠心の組み合わせは、類似の偽島の生成を可能にする。かくして、この偽島調製の方法は高度に有効であり且つ力強いものである。終夜培養に続き、インスリン放出が復活し、且つ偽島はグルコース及び他の分泌促進物質に応答性である。さらに、この方法は、実験の間に数回起こり得る培地の交換の間の細胞損失を最小にする。
【００３８】
古典的な静置島インキュベーション法（ｓｔａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）と比較すると、本発明の島細胞法には２つの主な利点がある。第１に、この方法は無損傷の島からのインスリン放出の変動を有意に減少させる。膵島はα−、β−及びδ−細胞から成り、これらの細胞型の組成は種々の島の間で変化する。さらに、各島に関する細胞の合計数は１，０００〜１０，０００個の細胞の範囲であり得る。かくして島は不均一性の器官である。島を同じ条件下で処理しても、島の不均一性が、異なる島の間でインスリン放出における大きな変動を生ずることが示された（Ｈｏｐｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｈｏｒｍｏｎ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．１７：１９８５年，５５９−５６１；Ｃｏｌｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３７：１９８５年，１０５９−１０６５）。この変動は、製薬工業における静置島インキュベーションの使用を顕著に制限する。本発明の方法では、トリプシンを用いて島組織を個々の細胞に分散させ、これらの島細胞を次いで容器中に播種して偽島を形成する。従って島の間の不均一性は克服され、かくして各実験の質を有意に向上させる。
【００３９】
第２に、本発明の方法はアッセイ性能を有意に向上させる。古典的な静置島インキュベーションは、各インキュベーションウェルに少なくとも５個の島を加えることを必要とする（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４０５：１９９８年，１−１３）が、本発明の方法はわずか２，５００個の島細胞を必要とする（それは１個の小さい島と大体同じサイズである）。さらに、無損傷の島の使用は類似のサイズの島の群を必要とし、かくして単離される島の一部を用いることができるのみなので、研究のサイズが制限される。しかしながら、本発明の方法は分散された島細胞を用い、かくしてすべての単離された島を研究に用いることができる。さらに、本発明の方法は各島の手動による選択を避けており、従って試料の調製に関する有意な時間が省かれる。
【００４０】
全体的に本発明の方法は、現在用いられている島細胞精製法を超える向上を与え、島細胞調製の効率及び特定の実験のアッセイ容量を顕著に向上させる。
【００４１】
この新規な方法を用い、古典的な膵島系におけるインスリン分泌を活性化又は阻害する化合物及びペプチドを特性化した。例えばグルコースは、膵臓β−細胞からのインスリン放出に関する一次生理学的調節物質である。血液グルコースレベルが５ｍＭ未満かもしくはそれに等しい場合、基礎インスリン放出は非常に低い。しかしながら、５ｍＭから１５ｍＭに増加する血液グルコースレベルは、インスリン放出の増加のために血漿インスリンレベルを有意に高めるであろう。このグルコース応答性は、単離される膵島において非常に良く保存され、島調製物及び静置島インキュベーションの質の評価のための重要な基準として働く。本発明の方法を用い、分散された島細胞を２．５〜２０ｍＭの範囲の濃度においてグルコースと一緒にインキュベーションした。β−細胞からのインスリン放出は、培地のグルコース濃度の増加に従って徐々に高められ、１５ｍＭグルコースにおいてプラトーに達した（図１，パネルＡ）。この結果は、本発明の分散される島細胞法により調製される偽島がグルコース応答性及びインスリン放出を保存していることを示す。
【００４２】
追加の研究において、本発明の方法により調製される偽島を用い、インスリン放出へのアセチルコリン、ＧＬＰ−１及びグリベンクラミドの効果を分析した。アセチルコリン（Ａｃｈ）は、グルコース−依存的やり方でインスリン放出を刺激する神経伝達物質であり、ＧＬＰ−１は、グルコース−刺激インスリン放出に力を与える内分泌物である。本発明の方法により調製された分散された島細胞を、８ｍＭグルコース及びＡｃｈ又はＧＬＰ−１を含有する培地を用いてインキュベーションした。Ａｃｈ及びＧＬＰ−１の存在下でインスリン分泌への有意な刺激効果が観察され、ＥＣ５０値はそれぞれ１０．１μＭ及び４．８μＭであった（図１，パネルＢ及びＣ）。このデータは、本発明の方法により調製される分散された島細胞が、無損傷の島において観察される応答と比較して類似の応答をＡｃｈ及びＧＬＰ−１に示すことを示している（Ｇｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２２：２００１年，５６５−６０４；Ｓｉｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２９：１９９９年，６１０−６１４）。
【００４３】
グリベンクラミドは、ＫＡＴＰチャンネルの遮断及び細胞内カルシウムレベルの増加によりインスリン放出を刺激する。この向インスリン効果は、低（３ｍＭ）及び高（≧８ｍＭ）グルコース濃度の両方において起こる。この特徴的な効果は、無損傷の島の研究において十分に実証されている（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｍｅｄ．８９：１９９０年，３Ｓ−１０Ｓ）。本発明の方法により調製される分散された島細胞は、文献で報告されている応答に類似のインスリン放出応答を示す（Ｓａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３５：１９８６年，９４４−９４９）。８ｍＭのグルコース濃度におけるインスリン放出へのグリベンクラミドのＥＣ５０は０．３７μＭである（図１，パネルＤ）。
【００４４】
細胞二次メッセンジャー、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）もグルコース−刺激インスリン放出において重要な役割を果たす。無損傷の島を用いる研究において、フォルスコリン及びＩＢＭＸは両方とも膵島組織中のｃＡＭＰ含有量を増加させ、且つインスリン放出を刺激する（Ｇｒｏｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．４３５：１９９８年，５８３−５９４；Ａｍｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２６：１９８４年，３６４−３６７；Ｚｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｇｅｒ．４１：１９８２年，１１７１−１１７７）。本発明の方法により調製される分散された島細胞は、インスリン放出への類似のフォルスコリン及びＩＢＭＸ効果を示す（図２，パネルＡ）。８ｍＭの濃度におけるグルコースの存在下での分散された島細胞のインスリン放出へのフォルスコリン及びＩＢＭＸのＥＣ５０は、それぞれ０．９μＭ及び２１．９μＭである。
【００４５】
グルコース−刺激インスリン放出は、神経伝達物質であるノルエピネフリン（ＮＥ）により、又は腸ホルモンであるソマトスタチンにより強く阻害され、無損傷の島の研究において十分に実証されている（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１：１９８２年，６４８−６５３；Ｃｌａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌ（Ｃｏｐｅｎｈ）８５：１９７７年，３７９−３８８）。本発明の方法により調製される分散された島細胞は、ＮＥ及びソマトスタチンの両方がグルコース−刺激インスリン放出を用量−依存的やり方で、それぞれ５６．７ｎＭ及び０．９ｎＭのＩＣ５０を以って阻害することを示す（図２，パネルＢ）。
【００４６】
組織培養における島β−細胞生存及び機能を、他の細胞との島の共−培養により助長することができ、それは島細胞単層培養に関して報告されている（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２８（１２）：１９７９年，１１０８−１３）。本発明の方法により調製される分散された島細胞は、偽島を線維芽細胞と共−培養すると、高められたＧＬＰ−１媒介インスリン分泌を示す（図３）。
【００４７】
本発明の方法により調製される分散された島において、向インスリン性化合物を、グルコースの存在下ならびにＧＬＰ−１の存在下及び不在下でインスリン分泌に力を与えるそれらの能力に関して評価することができる（図４）。
【００４８】
要するに、上記の研究の結果は、本発明の方法により調製される分散された島細胞が無損傷の膵島を用いるデータと類似であることを立証する。従って、本発明の方法により調製される分散された島細胞は、古典的な静置島インキュベーション法にとって代わるのに適しており、向インスリン性化合物のスクリーニング及び評価に用いられ得る。さらに、インスリン含有量を測定するため、インスリン生合成を調べるため、例えばｃＡＭＰへの化合物の効果を調べるため（例えばＤｉｒｅｃｔ  ＳＰＡ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｒａｋ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ならびに島細胞中の代謝生成物を測定するため（例えば分光測定又は蛍光測定酵素アッセイ、あるいは当該技術分野における熟練者に既知の他の方法）に、本発明の方法により調製される偽島を用いることもできる。
【００４９】
さらに、本発明の方法により調製される偽島中には有意な数のα−細胞がある。かくしてグルカゴン放出の測定のためにもこれらの偽島細胞を用いることができる。高グルカゴン血症は２型糖尿病における普通の現象である。グルカゴンの主な生理学的効果は、肝臓グルコース生産の増加である。２型糖尿病患者における循環グルカゴンレベルの強化は、空腹時（ｆａｓｔｉｎｇ）高血糖に有意に寄与する。かくしてグルカゴン放出の阻害又は標的組織へのグルカゴン効果の減少は、糖尿病の処置のための他の方法である。本発明の方法により調製される分散された島細胞は、グルカゴン放出及び多様な化合物によるその調節の測定のための強健な方法を与える。
【００５０】
本発明の方法を用い、２型糖尿病（関連する糖尿病性異常脂肪血症及び他の糖尿病性合併症を含む）ならびに他の糖尿病−関連障害、例えば高血糖症、高インスリン血症、耐糖能障害、空腹時糖障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ）、異常脂肪血症、高トリグリセリド血症、シンドローム  Ｘ、インスリン抵抗性、肥満、アテローム性動脈硬化疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高血圧、心臓血管病（アテローム性動脈硬化症、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患及び高血圧を含む）、脳血管病、末梢血管病、狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発ガン及び過形成の処置において有効な化合物を同定することができる。
【００５１】
本発明の方法により同定される化合物の活性を、当該技術分野で周知の複数の生体内アッセイを介して示すことができる。例えば糖尿病及び関連障害、例えばシンドローム  Ｘ、耐糖能障害、空腹時糖障害及び高いインスリン血症又はアテローム性動脈硬化疾患及び関連障害、例えば高トリグリセリド血症及び高コレステロール血症の処置のための製薬学的薬剤の有効性を示すために、以下のアッセイを用いることができる。
【００５２】
血液グルコースレベルの測定方法。  ｄｂ／ｄｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから得た）を出血させ（目又は尾静脈により）、均等平均血液グルコースレベル（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｍｅａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｅｖｅｌｓ）に従って群に分ける。それらに試験化合物を１日１回、１４日間経口的に投薬する（製薬学的に許容され得るビヒクル中における強制投与により）。この時点に、再び目もしくは尾静脈により動物を出血させ、血液グルコースレベルを決定する。それぞれの場合、グルコースレベルはＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ  ＸＬ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を用いて測定される。
【００５３】
トリグリセリドレベルの測定方法。  ｈＡｐｏＡ１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ  ＭＥから得た）を出血させ（目又は尾静脈により）、均等平均血清トリグリセリドレベルに従って群に分ける。それらに１日１回８日間、試験化合物を経口的に投薬する（製薬学的に許容され得るビヒクル中における強制投与により）。次いで再び目もしくは尾静脈により動物を出血させ、血清トリグリセリドレベルを決定する。それぞれの場合、トリグリセリドレベルはＴｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ａｘｏｎ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を用いて測定される。
【００５４】
ＨＤＬ−コレステロールレベルの測定方法。  血漿ＨＤＬ−コレステロールレベルの決定のために、ｈＡｐｏＡ１マウスを出血させて均等平均血漿ＨＤＬ−コレステロールレベルを用いて群に分ける。マウスに１日１回７日間、ビヒクル又は試験化合物を経口的に投薬し、次いで８日に再び出血させる。Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＸ４）（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用い、ＨＤＬ−コレステロールに関して血漿を分析する。
【００５５】
総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、トリグリセリド及びグルコースレベルの測定方法。  別の生体内アッセイにおいて、肥満のサルを出血させ、次いで１日１回４週間、ビヒクル又は試験化合物を経口的に投薬し、次いで再び出血させる。Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＸ４）（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用い、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、トリグリセリド及びグルコースに関して血清を分析する。Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２００１年，５３０６−５３１１）により記載されている通りに、ＮＭＲ分光分析によりリポタンパク質サブクラス分析を行なう。
【００５６】
心臓血管パラメーターへの効果の測定方法。  心臓血管パラメーター（例えば心拍数及び血圧）も評価される。ＳＨＲラットに１日１回２週間、ビヒクル又は試験化合物を経口的に投薬する。Ｇｒｉｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１３：２０００年，３７０−３７５）により記載されている通りに、テイル−カフ法（ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて血圧及び心拍数を決定する。サルにおいて、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２７８：１９９６年，１４３５−１４４３）により記載されている通りに血圧及び心拍数を監視する。
【００５７】
上記の方法又は哺乳類における上記で同定された状態の処置のための有効性を決定するために用いられる他の周知のアッセイに基づき、且つこれらの結果をこれらの状態の処置に用いられる既知の薬剤の結果と比較することにより、化合物の有効用量をそれぞれの所望の適応症の処置に関して容易に決定することができる。これらの状態の１つの処置において投与されるべき活性成分の量は、用いられる特定の化合物及び投薬量単位、投与の様式、処置の期間、処置される患者の年齢及び性別ならびに処置される状態の性質及び程度のような考慮事項に従って広く変わり得る。
【００５８】
投与されるべき活性成分の合計量は、一般に１日当たり体重の１ｋｇにつき約０．００１ｍｇ〜約２００ｍｇ、好ましくは体重の１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲であることができる。単位投薬量は約０．０５ｍｇ〜約１５００ｍｇの活性成分を含有することができ、１日に１回もしくはそれより多く投与されることができる。静脈内、筋肉内、皮下及び非経口的注入ならびに輸液法の使用を含む注入による投与のための毎日の投薬量は、約０．０１〜約２００ｍｇ／ｋｇであることができる。毎日の直腸的投薬量管理は、合計体重の１ｋｇ当たり０．０１〜２００ｍｇであることができる。経皮的濃度は、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇの毎日の投薬量を保持するのに必要な濃度であることができる。
【００５９】
もちろん、それぞれの患者のための特定の初期及び継続投薬量管理は、診療する診断医により決定される状態の性質及び重度、用いられる特定の化合物の活性、患者の年齢、患者の食事、投与の時間、投与の経路、薬剤の排泄の速度、薬剤の組み合わせなどに従って変わるであろう。所望の処置の様式及び化合物の投薬の回数は、通常の処置試験を用いて当該技術分野における熟練者により突き止められ得る。
【００６０】
必要のある患者に適切に調製された製薬学的組成物において投与することにより、本発明の方法により同定される化合物を所望の薬理学的効果を達成するために用いることができる。本発明の目的の場合、患者は、特定の状態又は疾患に関する処置の必要があるヒトを含む哺乳類である。従って本発明は、製薬学的に許容され得る担体及び本明細書に記載される方法により同定される化合物の製薬学的に有効な量を含む製薬学的組成物を包含する。製薬学的に許容され得る担体は、比較的無毒性であり且つ活性成分の有効活性と一致する濃度において患者に害がなく、担体に帰せられ得る副作用が活性成分の有益な効果を損なわないいずれかの担体である。化合物の製薬学的に有効な量は、処置されている特定の状態に結果を生ずるか又は影響を及ぼす量である。本明細書に記載される方法により同定される化合物は製薬学的に許容され得る担体と一緒に、例えば、即時の及び時間調節された（ｔｉｍｅｄ）放出調製物、経口用、非経口用、局所用などを含む有効な通常の投薬単位形態を用いて投与され得る。
【００６１】
経口的投与のために、化合物を固体又は液体調製物、例えばカプセル、丸薬、錠剤、トローチ、ロゼンジ、融解剤（ｍｅｌｔｓ）、粉剤、溶液、懸濁剤又は乳剤に調製することができ、製薬学的組成物の製造のための技術分野に既知の方法に従って調製することができる。固体単位投薬形態はカプセルであることができ、それは例えば界面活性剤、滑択剤、及び不活性充填剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチを含有する通常の硬質−又は軟質−殻ゼラチン型のものであることができる。
【００６２】
他の態様において、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤；投与に続く錠剤の破壊及び溶解を助けることを目的とする崩壊剤、例えばポテトデンプン、アルギン酸、コーンスターチ及びグアゴム；錠剤顆粒化の流れを向上させ、錠剤ダイ及びパンチの表面への錠剤材料の接着を妨げることを目的とする滑択剤、例えばタルク、ステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム、カルシウムもしくは亜鉛；色素；着色剤；ならびに錠剤の美的質を強化し、錠剤を患者により許容され得るものとすることを目的とする風味剤と組み合わせてラクトース、スクロース及びコーンスターチのような通常の錠剤基剤を用い、本発明の方法により同定される化合物を錠剤化することができる。経口的液体投薬形態において用いるのに適した賦形剤には、製薬学的に許容され得る界面活性剤、懸濁化剤又は乳化剤が添加されているか又は添加されていない希釈剤、例えば水及びアルコール類、例えばエタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコールが含まれる。種々の他の材料がコーティングとして、又は投薬単位の物理的形態を他に改変するために存在することができる。例えば錠剤、丸薬又はカプセルをシェラック、砂糖又は両方でコーティングすることができる。
【００６３】
分散可能な粉末及び顆粒は水性懸濁剤の調製に適している。それらは分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１種もしくはそれより多い防腐剤と混合された活性成分を与える。適した分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、すでに上記で挙げたものにより代表される。追加の賦形剤、例えば上記のもののような甘味剤、風味剤及び着色剤も存在することができる。
【００６４】
本発明の製薬学的組成物は、水中油型乳剤の形態にあることもできる。油相は植物油、例えば液体パラフィン又は植物油の混合物であることができる。適した乳化剤は（１）天然に存在するゴム、例えばアラビアゴム及びトラガカントゴム、（２）天然に存在するホスファチド類、例えば大豆及びレシチン、（３）脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導されるエステル又は部分的エステル、例えばソルビタンモノオレートならびに（４）該部分的エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレートであることができる。乳剤は甘味剤及び風味剤を含有することもできる。
【００６５】
植物油、例えばアラキス油、オリーブ油、ごま油又はココナツ油；あるいは鉱油、例えば液体パラフィン中に活性成分を懸濁させることにより、油性懸濁剤を調製することができる。油性懸濁剤は増粘剤、例えば蜜蝋、硬質パラフィン又はセチルアルコールを含有することができる。懸濁剤は１種もしくはそれより多い防腐剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルもしくはｎ−プロピル；１種もしくはそれより多い着色剤；１種もしくはそれより多い風味剤；ならびに１種もしくはそれより多い甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンを含有することもできる。
【００６６】
甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースを用いてシロップ及びエリキサーを調製することができる。そのような調剤は粘滑薬及び防腐剤、風味剤及び着色剤を含有することもできる。
【００６７】
本発明の方法により同定される化合物を非経口的に、すなわち皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内に、製薬学的担体と一緒の生理学的に許容され得る希釈剤中の化合物の注入可能な投薬として投与することもでき、担体は水、食塩水、デキストロース水溶液又は関連する糖溶液；アルコール類、例えばエタノール、イソプロパノール又はヘキサデシルアルコール；グリコール類、例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコール；グリセロールケタール類、例えば２，２−ジメチル−１，１−ジオキソラン−４−メタノール、エーテル類、例えばポリ（エチレングリコール）４００；油；脂肪酸；脂肪酸エステル又はグリセリド；あるいはアセチル化脂肪酸グリセリドのような無菌の液体又は液体の混合物であることができ、製薬学的に許容され得る界面活性剤、例えばせっけん又は洗剤、懸濁化剤、例えばペクチン、カーボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロース又は乳化剤及び他の製薬学的添加剤が添加されるか又は添加されない。
【００６８】
本発明の非経口用調剤において用いられ得る油の例は石油、動物、植物もしくは合成起源のもの、例えばピーナツ油、大豆油、ごま油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラタム及び鉱油である。適した脂肪酸にはオレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が含まれる。適した脂肪酸エステルは、例えばオレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルである。適したせっけんには脂肪アルカリ金属、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩が含まれ、適した洗剤にはカチオン性洗剤、例えばジメチルジアルキルアンモニウムハライド、アルキルピリジニウムハライド及びアルキルアミンアセテート；アニオン性洗剤、例えばアルキル、アリール及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリドサルフェートならびにスルホスクシネート；非イオン性洗剤、例えば脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー；ならびに両性洗剤、例えばアルキル−ベータ−アミノプロピオネート及び２−アルキルイミダゾリン第４級アンモニウム塩ならびに混合物が含まれる。
【００６９】
本発明の非経口用組成物は、典型的には約０．５重量％〜約２５重量％の活性成分を溶液中に含有することができる。防腐剤及び緩衝剤も有利に用いられ得る。注入の部位における刺激を最小にするか又は取り除くために、そのような組成物は約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する非−イオン性界面活性剤を含有することができる。そのような調剤中の界面活性剤の量は約５重量％〜約１５重量％の範囲である。界面活性剤は上記のＨＬＢを有する単一の成分であることができるか、あるいは所望のＨＬＢを有する２種もしくはそれより多い成分の混合物であることができる。
【００７０】
非経口用調剤中で用いられる界面活性剤の例はポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルの種類、例えばソルビタンモノオレート及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合により生成するエチレンオキシドと疎水性塩基の高分子量付加物である。
【００７１】
製薬学的組成物は無菌の注入可能な水性懸濁剤の形態にあることができる。そのような懸濁剤は既知の方法に従い、適した分散剤もしくは湿潤剤及び懸濁化剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴム；天然に存在するホスファチド類、例えばレシチン、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分的エステルの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレートあるいはエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分的エステルの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレートであることができる分散剤又は湿潤剤を用いて調製され得る。
【００７２】
無菌の注入可能な調製物は、無毒性の非経口的に許容され得る希釈剤もしくは溶媒中の無菌の注入可能な溶液又は懸濁剤であることもできる。用いられ得る希釈剤及び溶媒は、例えば水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の固定油が溶媒又は懸濁媒体として通常用いられる。この目的のために、合成モノもしくはジグリセリドを含むいずれの無刺激の固定油を用いることもできる。さらにオレイン酸のような脂肪酸を注入可能なものの調製において用いることができる。
【００７３】
本発明の組成物を、薬剤の直腸的投与のための座薬の形態で投与することもできる。これらの組成物は、常温で固体であるが直腸温度で液体であり、従って直腸で融解して薬剤を放出する適した無−刺激性賦形剤と薬剤を混合することにより調製され得る。そのような材料は、例えばココアバター及びポリエチレングリコールである。
【００７４】
本発明の方法において用いられる他の調剤は、経皮送達装置（「パッチ」）を用いる。制御された量で本発明の化合物を連続的又は不連続的に注入するためにそのような経皮パッチを用いることができる。製薬学的薬剤の送達のための経皮パッチの構成及び使用は当該技術分野において周知である（例えば引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる米国特許第５，０２３，２５２号明細書を参照されたい）。そのようなパッチを製薬学的薬剤の連続的、パルス的あるいはオンデマンド送達用に構成することができる。
【００７５】
機械的送達装置を介して製薬学的組成物を患者に導入するのが望ましいか、又は必要であり得る。製薬学的薬剤の送達のための機械的送達装置の構成及び使用は当該技術分野において周知である。例えば、脳に直接薬剤を投与するための直接法は、通常、血液−脳関門を迂回するために患者の脳室系内に薬剤送達カテーテルを置くことを含む。体の特定の解剖学的領域に薬剤を輸送するために用いられる１つのそのような移植可能な送達システムは、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる米国特許第５，０１１，４７２号明細書に記載されている。
【００７６】
本発明の組成物は、一般に、担体又は希釈剤と呼ばれる他の通常の製薬学的に許容され得る配合成分も必要通りもしくは所望通りに含有することができる。本発明の組成物のいずれも、アスコルビン酸のような酸化防止剤の添加により又は他の適した防腐剤により防腐することができる。適した投薬形態におけるそのような組成物の調製のための通常の方法を用いることができる。
【００７７】
組成物をその意図される投与の経路のために適宜調製するのに用いられ得る通常用いられる製薬学的成分には：酸性化剤、例えばこれらに限られないが酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、硝酸；ならびにアルカリ性化剤、例えばこれらに限られないがアンモニア水、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、トロラミンが含まれる。
【００７８】
他の製薬学的成分には、例えば、吸着剤（例えば粉末セルロース及び活性炭）；エアゾールプロペラント（例えば二酸化炭素、ＣＣｌ２Ｆ２、Ｆ２ＣｌＣ−ＣＣｌＦ２及びＣＣｌＦ３）；空気置換剤（例えば窒素及びアルゴン）；抗菌・カビ性防腐剤（例えば安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム）；抗微生物性防腐剤（例えばベンズアルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド、ベンジルアルコール、セチルピリジニウムクロリド、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ））；酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート、メタ重亜硫酸ナトリウム）；結合材料（例えばブロックポリマー、天然及び合成ゴム、ポリアクリレート、ポリウレタン、シリコーン及びスチレン−ブタジエンコポリマー）；緩衝剤（例えばメタリン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、無水クエン酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウム二水和物）；保有剤（ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えばアカシアシロップ、芳香性シロップ、芳香性エリキサー、チェリーシロップ、ココアシロップ、オレンジシロップ、シロップ、コーン油、鉱油、ピーナツ油、ごま油、制菌性塩化ナトリウム注入及び注入用の制菌性水）；キレート化剤（例えばエデテート二ナトリウム及びエデト酸）；着色剤（例えばＦＤ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．２０、ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．６、ＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  Ｎｏ．２、Ｄ＆Ｃ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｏ．５、Ｄ＆Ｃ  Ｏｒｅｎｇｅ  Ｎｏ．５、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｎｏ．８、カラメル及び酸化第二鉄赤）；透明化剤（例えばベントナイト）；乳化剤（これらに限られないがアラビアゴム、セトマクロゴール（ｃｅｔｏｍａｃｒｏｇｏｌ）、セチルアルコール、グリセリルモノステアレート、レシチン、ソルビタンモノオレート、ポリエチレン５０ステアレート）；カプセル封入剤（例えばゼラチン及び酢酸フタル酸セルロース）；風味剤（例えばアニス油、シナモン油、ココア、メントール、オレンジ油、ペパーミント油及びバニリン）；保湿剤（例えばグリセリン、プロピレングリコール及びソルビトール）；研和剤（例えば鉱油及びグリセリン）；油（例えばアラキス油、鉱油、オリーブ油、ピーナツ油、ごま油及び植物油）；軟膏基剤（例えばラノリン、親水性軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ペトロラタム、親水性ペトロラタム、白色軟膏（ｗｈｉｔｅ  ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、黄色軟膏及びバラ水軟膏）；浸透増進剤（経皮送達）（例えばモノヒドロキシもしくはポリヒドロキシアルコール、飽和もしくは不飽和脂肪アルコール、飽和もしくは不飽和脂肪エステル、飽和もしくは不飽和ジカルボン酸、精油、ホスファチジル誘導体、セファリン、テルペン、アミド、エーテル、ケトン及びウレア）；可塑剤（例えばフタル酸ジエチル及びグリセリン）；溶媒（例えばアルコール���コーン油、綿実油、グリセリン、イソプロピルアルコール、鉱油、オレイン酸、ピーナツ油、精製水、注入用水、注入用の無菌水及び灌注のための無菌水）；堅化剤（ｓｔｉｆｆｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えばセチルアルコール、セチルエステルワックス、微結晶性ワックス、パラフィン、ステアリルアルコール、白蝋及び黄蝋）；座薬基剤（例えばココアバター及びポリエチレングリコール（混合物））；界面活性剤（例えばベンズアルコニウムクロリド、ノノキシノール１０、オクストキシノール９（ｏｘｔｏｘｙｎｏｌ  ９）、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム及びソルビタンモノパルミテート）；懸濁化剤（例えば寒天、ベントナイト、カーボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カオリン、メチルセルロース、トラガカント及びビーゴム）；甘味剤、例えばアスパルテーム、デキストロース、グリセリン、マンニトール、プロピレングリコール、サッカリンナトリウム、ソルビトール及びスクロース）；錠剤抗−接着剤（例えばステアリン酸マグネシウム及びタルク）；錠剤結合剤（例えばアラビアゴム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、圧縮可能な糖（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｕｇａｒ）、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、メチルセルロース、ポビドン及び予備ゼラチン化デンプン）；錠剤及びカプセル希釈剤（例えば二塩基性リン酸カルシウム、カオリン、ラクトース、マンニトール、微結晶性セルロース、粉末セルロース、沈降炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトール及びデンプン）；錠剤コーティング剤（例えば液体グルコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース及びシェラック）；錠剤直接圧縮賦形剤（例えば二塩基性リン酸カルシウム）；錠剤崩壊剤（例えばアルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、微結晶性セルロース、ポラクリリンカリウム、アルギン酸ナトリウム、ナトリウムデンプングリコレート及びデンプン）；錠剤滑り剤（例えばコロイドシリカ、コーンスターチ及びタルク）；錠剤滑択剤（例えばステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ステアリン酸及びステアリン酸亜鉛）；錠剤／カプセル不透明化剤（例えば二酸化チタン）；錠剤研磨剤（例えばカルナバワックス及び白蝋）；増粘剤（例えば密蝋、セチルアルコール及びパラフィン）；等張剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔｓ）（例えばデキストロース及び塩化ナトリウム）；粘度向上剤（例えばアルギン酸、ベントナイト、カーボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポビドン、アルギン酸ナトリウム及びトラガカント）；ならびに湿潤剤（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、レシチン、ポリエチレンソルビトールモノオレート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート及びポリオキシエチレンステアレート）が含まれるがこれらに限られない。
【００７９】
本明細書に記載される方法により同定される化合物は、単独の製薬学的薬剤として又は１種もしくはそれより多い他の製薬学的薬剤と組み合わせて投与することができ、ここで組み合わせは許容され得ない不利な影響を引き起こさない。例えば、本発明の化合物を既知の抗−肥満薬と、又は既知の抗糖尿病薬もしくは他の指示薬（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）などとならびにそれらの混合物及び組み合わせと組み合わせることができる。
【００８０】
本明細書に記載される方法により同定される化合物を、研究及び診断において、あるいは分析の参照標準などとして用いることもできる。従って、本発明は、不活性担体及び本明細書に記載される方法により同定される化合物又はその塩もしくはエステルの有効量を含む組成物を包含する。不活性担体は、担持されるべき化合物と相互作用せず且つ支持、輸送の手段、かさ、追跡可能な材料などを担持されるべき化合物に与えるいずれかの材料である。化合物の有効量は、行なわれている特定の方法に結果を生ずるか又は影響を及ぼす量である。
【００８１】
皮下、静脈内、筋肉内などのために適した調剤；適した製薬学的担体；ならびに調製及び投与のための方法は、当該技術分野において周知の方法のいずれかにより準備され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００を参照されたい）。
【００８２】
以下の実施例は、本明細書に記載される発明を例示するために示されるが、全く本発明の範囲を制限するとみなされるべきではない。
【実施例】
【００８３】
カプセル調剤
カプセル調剤を：
活性成分                    ４０ｍｇ
デンプン                    １０９ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    １ｍｇ
から調製する。
【００８４】
成分を配合し、適したメッシュ篩に通過させ、硬質ゼラチンカプセル中に充填する。
錠剤調剤
錠剤を：
活性成分                            ２５ｍｇ
セルロース、微結晶性                ２００ｍｇ
コロイド二酸化ケイ素                １０ｍｇ
ステアリン酸                        ５．０ｍｇ
から調製する。
【００８５】
成分を混合し、圧縮して錠剤を形成する。適した水性及び非−水性コーティングを適用し、より口に合うようにし、優雅さ及び安定性を向上させるか又は吸収を遅らせることができる。
無菌静脈内（ＩＶ）溶液
活性成分の５ｍｇ／ｍｌ溶液を無菌の注入可能な水を用いて作り、必要ならｐＨを調節する。無菌の５％デキストロースを用い、投与のために溶液を１〜２ｍｇ／ｍｌに希釈し、６０分に及ぶ静脈内輸液として投与する。
筋肉内用懸濁剤
以下の筋肉内用懸濁剤を調製する：
活性成分                                  ５０ｍｇ／ｍｌ
ナトリウムカルボキシメチルセルロース      ５ｍｇ／ｍｌ
ＴＷＥＥＮ  ８０                          ４ｍｇ／ｍｌ
塩化ナトリウム                            ９ｍｇ／ｍｌ
ベンジルアルコール                        ９ｍｇ／ｍｌ
懸濁液を筋肉内に投与する。
硬質殻カプセル
標準的なツーピース硬質ガランチンカプセルにそれぞれ１００ｍｇの粉末活性成分、１５０ｍｇのラクトース、５０ｍｇのセルロース及び６ｍｇのステアリン酸マグネシウムを充填することにより、多数の単位カプセルを調製する。
軟質ゼラチンカプセル
大豆油、綿実油又はオリーブ油のような消化可能な油中の活性成分の混合物を調製し、容量形ポンプにより溶融ゼラチン中に注入し、１００ｍｇの活性成分を含有する軟質ゼラチンカプセルを形成する。カプセルを洗浄し、乾燥する。活性成分をポリエチレングリコール、グリセリン及びソルビトールの混合物中に溶解し、水混和性薬剤混合物を調製することができる。
即時放出錠剤／カプセル
これらは通常の方法及び新規な方法により作られる固体の経口的投薬形態である。これらの単位は薬物の即時の溶解及び送達のために、水なしで経口的に摂取される。活性成分は、糖、ゼラチン、ペクチン及び甘味剤のような成分を含有する液体中に混合される。これらの液体を凍結乾燥及び固体状態抽出法により固体の錠剤又はカプセルに固化させる。粘弾性及び熱弾性糖及びポリマー又は泡起性成分と一緒に薬剤化合物を圧縮し、水の必要のない即時放出を目的とする多孔質マトリックスを作ることができる。
【００８６】
実施例
本発明を以下の実施例によりさらに例示し、実施例は全く制限とみなされるべきではない。本出願全体を通じて引用されたすべての参照文献（論文の参照文献、発行された特許、公開された特許出願及び同時係属特許出願を含む）の内容は、引用することにより明らかに本明細書の内容となる。
実施例１：９６−ウェルプレートにおける偽島の調製
４匹のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットからの膵臓を、寸法が約１ｍｍ２又はそれより小さい小片に分割した。次いで組織をＨａｎｋｓ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１２７ｍＭ  ＮａＣｌ，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，４．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２／５ｍＭ  グルコース）で３回濯ぎ、コラゲナーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ，０．２５ｍｇ／ｍｌ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用い、水浴振盪機中で３７℃において１０分間消化した。
【００８７】
消化された膵臓組織を５０ｍｌのＨａｎｋｓ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液で３回濯ぎ、コラゲナーゼを除去した。次いで２５０μｍのフィルターを介して組織ペレットを濾過し、濾液をＨａｎｋｓ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液中の２７％  Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｗ／ｖの１６ｍｌと混合した。次いで３種のＦｉｃｏｌｌの層（それぞれ２３％、２０．５％及び１１％；８ｍｌの各濃度）を、２７％  Ｆｉｃｏｌｌ中の島組織の混合物に上に乗せ、勾配を形成した。
【００８８】
次いでＦｉｃｏｌｌ勾配を１，６００ｒｐｍで室温において１０分間遠心した。膵島は、島のサイズに依存して１１％と２０．５％の間及び２０．５％と２３％の間の界面に濃縮された。２つの界面から島を集め、Ｃａ＋＋−非含有Ｈａｎｋｓ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液で２回濯いだ。次いで１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する５ｍｌのＣａ＋＋−非含有Ｈａｎｋｓ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に島を懸濁させ、室温で８分間インキュベーションした。
【００８９】
島懸濁液にトリプシン及びＤＮＡｓｅ  １をそれぞれ２５μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌの最終的濃度まで加えた。この懸濁液を３０℃で１０分間、振盪しながらインキュベーションした。１０％  ＦＢＳを含む４０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を加えることにより、トリプシン消化を停止させた。トリプシン消化された島細胞を次いで６３μｍのナイロンフィルター（ＰＧＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を介して濾過し、大きな細胞クラスターを除去した。
【００９０】
分散された島細胞を次いで洗浄し、顕微鏡下で血球計を用いて計数し、「Ｖ−底」９６−ウェルプレート中に播種した（ウェル当たり２，５００個の細胞）。しかしながらウェル当たり１，０００〜１０，０００個の細胞の範囲を用いることができる。分散された島細胞懸濁液を次いで１，０００ｒｐｍで５分間遠心した。Ｈａｎｋｓ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液を除去し、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有する２００μｌのＲＰＭＩ  １６４０培地で置き換えた。次に９６−ウェルプレートを１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、プレートのＶ−底に濃縮されて偽島を形成する分散された島細胞を集めた。これらの偽島を次いで、５％  ＣＯ２を有する３７℃における細胞培養インキュベーター中で終夜培養し、次いでアッセイのために用いた。
実施例２：線維芽細胞と一緒の偽島インキュベーション
分散された島細胞（実施例１に記載した方法により調製）を、１０％  ＦＢＳを含む通例のＲＰＭＩ  １６４０培地で洗浄し、顕微鏡下で血球計を用いて計数し、線維芽細胞と一緒に「Ｖ−底」９６−ウェルプレート中に播種した（ウェル当たり２，５００個の島細胞及び１，２５０個の線維芽細胞）。次いで細胞懸濁液を１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、プレートのＶ−底に濃縮されて偽島を形成する分散された島細胞を集めた。これらの偽島を次いで５％  ＣＯ２を有する３７℃における細胞培養インキュベーター中で終夜、繊維芽細胞と共−培養し、次いでアッセイのために用いた。
実施例３：偽島の凍結及び解凍
分散された島細胞（実施例１に記載した方法により調製）を上記の通りに計数し、１０％  ＦＢＳ及び１０％  ＤＭＳＯを含む通例のＲＰＭＩ  １６４０倍地中でｍｌ当たり２ｘ１０５個の細胞の濃度に希釈した。アリコート（１ｍｌ）をクライオ管（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）に移し、クライオ管を液体窒素タンク内の蒸気相中の棚内に置いてから液体窒素中で凍結させた。
【００９１】
細胞を解凍し、次いで通例の培地で洗浄し、「Ｖ−底」９６−ウェルプレート中に播種した（ウェル当たり５，０００個の細胞）。次に９６−ウェルプレートを１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、プレートのＶ−底に濃縮されて偽島を形成する分散された島細胞を集めた。これらの偽島を次いで５％  ＣＯ２を有する３７℃における細胞培養インキュベーター中で終夜培養し、次いでアッセイのために用いた。
実施例４：インスリン放出アッセイのための静置偽島インキュベーション
実施例１に記載した方法により偽島を調製した。終夜のインキュベーションに続き、ＲＰＭＩ  １６４０培地を除去し、１００μｌのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１１５ｍＭ  ＮａＣｌ，５．０ｍＭ  ＫＣｌ，２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，２．２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．２５％  ＢＳＡ，０．００２％  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ，ｐＨ  ７．３５−７．４０）により置き換えた。次いで細胞懸濁液を１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、分散された島細胞をペレット化した。
【００９２】
予備−インキュベーションのために、９６−ウェルプレート中の偽島を３７℃における水浴中で、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を継続的に通気して（ｇａｓｓｅｄ）、３０分間インキュベーションした。予備−インキュベーション緩衝液を除去し、種々の試験基質を含有する５０μｌのインキュベーション緩衝液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液，ｐＨ７．３５−７．４０）で置き換えた。
【００９３】
９６−ウェルプレートを再度１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、偽島を形成した。これらの９６−ウェルプレート中の偽島を３７℃における水浴中で、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を継続的に通気し、静置して６０分間インキュベーションした。６０−分間のインキュベーションの後、インキュベーション緩衝液（２５μｌ）を集め、インスリン含有量アッセイのために用いた（ＥＬＩＳＡアッセイ，ＡＬＰＣＯ，ＮＨ）。
実施例５：インスリン生合成のための静置偽島インキュベーション
実施例１に記載した通りに偽島を調製した。終夜の培養の後、３ｍＭ  グルコースを含有するＫＲＢＨ（１３５ｍＭ  ＮａＣｌ，３．６ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，０．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．１％  ウシ血清アルブミン）中で３７℃において３０分間、偽島を予備インキュベーションし、次いで試験化合物及び２μＭ  ３Ｈ−ロイシン（１００μＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と一緒に３７℃で９０分間インキュベーションした。次いで偽島を１ｍＭ  ロイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するＫＲＢＨで３回洗浄し、２ｍＭ  酢酸（１００μｌ）中でライシスし、１５秒間音波処理し、１０Ｎ  ＮａＯＨ（２０μｌ）を用いて中和した。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）を加えて体積を１ｍｌとし、試料を１７５０ｘｇで１０分間、高速回転させた。プロテイン  Ａ  アガロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ａｇａｒｏｓｅ）（試料当たり５０μｌ）を抗−インスリン抗体（Ｌｉｎｃｏ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）（試料当たり１００μｌ）と一緒に２時間予備インキュベーションし、２回洗浄した。７５０μｌの試料に抗体ビーズ混合物（５０μｌ）を加え、４℃で終夜インキュベーションした。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）を用いて免疫沈降物を３回洗浄した。次いでシンチレーションカウンターにおいてビーズを計数した。
実施例６：グルカゴン放出のための静置偽島インキュベーション
実施例１に記載した通りに偽島を調製した。終夜のインキュベーションに続き、ＲＰＭＩ  １６４０培地を除去し、１００μｌのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１１５ｍＭ  ＮａＣｌ，５．０ｍＭ  ＫＣｌ，２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，２．２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．２５％  ＢＳＡ，０．００２％  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ，ｐＨ  ７．３５−７．４０）により置き換えた。次いで細胞懸濁液を１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、分散された島細胞をペレット化した。
【００９４】
予備−インキュベーションのために、９６−ウェルプレート中の偽島を３７℃における水浴中で、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を継続的に通気して、３０分間インキュベーションした。予備−インキュベーション緩衝液を除去し、種々の試験化合物を含有する５０μｌのインキュベーション緩衝液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液，ｐＨ７．３５−７．４０）で置き換えた。
【００９５】
９６−ウェルプレートを再度１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、偽島を形成した。これらの９６−ウェルプレート中の偽島を３７℃における水浴中で、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を継続的に通気し、静置して６０分間インキュベーションした。６０−分間のインキュベーションの後、インキュベーション緩衝液（２５μｌ）を集め、グルカゴン含有量アッセイのために用いた（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ＲＩＡキット；Ｌｉｎｃｏ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）。
実施例７：向インスリン性化合物の同定のためのアッセイ
実施例１に記載した通りに偽島を調製した。分散された島細胞を次いで洗浄し、血球計を用いて計数し、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有する２００μｌのＲＰＭＩ  １６４０培地と一緒に「Ｖ−底」９６−ウェルプレート中に播種した（ウェル当たり２，５００個の細胞）。次に９６−ウェルプレートを１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、プレートのＶ−底に濃縮されて偽島を形成する分散された島細胞を集めた。これらの偽島を次いで、５％  ＣＯ２を有する３７℃における細胞培養インキュベーター中で終夜培養した。
【００９６】
終夜のインキュベーションに続き、ＲＰＭＩ  １６４０培地を除去し、３ｍＭのグルコースを含む１００μｌのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液（１１５ｍＭ  ＮａＣｌ，５．０ｍＭ  ＫＣｌ，２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，２．２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．２５％  ＢＳＡ，０．００２％  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ，ｐＨ  ７．３５−７．４０）により置き換えた。次いで細胞懸濁液を１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、分散された島細胞をペレット化した。
【００９７】
予備−インキュベーションのために、９６−ウェルプレート中の偽島を３７℃における水浴中で、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を継続的に通気して、３０分間インキュベーションした。予備−インキュベーション緩衝液を除去し、試験化合物を含有する５０μｌのインキュベーション緩衝液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液，ｐＨ７．３５−７．４０）で置き換えた。９６−ウェルプレートを再度１，０００ｒｐｍで５分間遠心し、偽島を形成した。これらの偽島を次いで３７℃における水浴中で、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を継続的に通気し、静置して３０分間インキュベーションした。３０−分間のインキュベーションの後、インキュベーション緩衝液（２５μｌ）を集め、インスリン含有量アッセイのために用いた。
【００９８】
記載した方法及び本発明のシステムの種々の修正及び変更は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当該技術分野における熟練者に明らかであろう。特定の好ましい態様に結び付けて本発明を記載してきたが、特許請求された本発明はそのような特定の態様に不当に制限されるべきではないことが理解されねばならない。実際は、当該技術分野における熟練者に明らかな本発明を実施するために記載した様式の種々の修正が、特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】本発明の方法により調製される偽島の特性化のためのグラフ。
【図２】本発明の方法により調製される偽島の特性化のためのグラフ。
【図３】線維芽細胞と共−培養された偽島の特性化のためのグラフ。
【図４】本発明の方法により調製される偽島を用いる、未知化合物によるインスリン分泌の評価のグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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