(57)【要約】本発明はポリ不飽和脂肪酸の伸長に関与する数種の遺伝子（即ち「エロンガーゼ」）の同定とその使用に関する。これらの遺伝子の少なくとも２種はモノ不飽和脂肪酸の伸長にも関与している。特に、エロンガーゼはγ−リノレン酸（ＧＬＡ）からジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）への変換やＡＡからアドレン酸（ＡＤＡ）、又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）からω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）への変換に使用される。ＤＧＬＡは医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品（例えば化粧品）に添加することができるアラキドン酸（ＡＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ＥＰＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸等のポリ不飽和脂肪酸の生産に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エロンガーゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメントであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１２１を含むアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性をもつ前記単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメント。
【請求項２】
配列番号１１９を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性をもつヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメント。
【請求項３】
前記配列がポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする請求項１又は２に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記配列が藻類に由来する請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記藻類がパブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）種である請求項１４に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の前記単離ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質。
【請求項７】
ポリ不飽和脂肪酸を伸長し、請求項６に記載の前記蛋白質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸同一性をもつ精製ポリペプチド。
【請求項８】
ａ）配列番号１１９を含むヌクレオチド配列を単離する段階と、
ｂ）ｉ）前記単離ヌクレオチド配列をｉｉ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターを構築する段階と、
ｃ）エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含むエロンガーゼ酵素の生産方法。
【請求項９】
ａ）配列番号１１９を含むヌクレオチド配列をｂ）プロモーターに機能的に連結してなるベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載の前記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現の結果として、前記植物細胞、植物又は植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が産生される前記植物細胞、植物又は植物組織。
【請求項１２】
前記ポリ不飽和脂肪酸がＡＤＡ及びω３−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択される請求項１１に記載の植物細胞、植物又は植物組織。
【請求項１３】
請求項１１に記載の前記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は酸。
【請求項１４】
請求項９に記載の前記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現の結果として、前記トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が産生される前記植物トランスジェニック植物。
【請求項１５】
ａ）配列番号１１９を含むヌクレオチド配列を単離する段階と、
ｂ）前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、
ｃ）前記単離ヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と、
ｄ）基質ポリ不飽和脂肪酸を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を前記基質に暴露する段階を含むポリ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項１６】
夫々前記基質ポリ不飽和脂肪酸がＡＡ及びＥＰＡから構成される群から選択され、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がＡＤＡ及びω３−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を少なくとも１種のデサチュラーゼに暴露する段階を更に含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記産物ポリ不飽和脂肪酸がＡＤＡ及びω３−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択され、前記別のポリ不飽和脂肪酸がω６−ドコサペンタエン酸、ω３−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択され、前記少なくとも１種のデサチュラーゼがω６−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸の生産の場合にはΔ４−デサチュラーゼであり、ω３−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸の生産の場合にはΔ１９−デサチュラーゼである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記別のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のエロンガーゼ及び少なくとも１種の別のデサチュラーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階を更に含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記最終ポリ不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の方法により生産された前記産物ポリ不飽和脂肪酸、請求項１７に記載の方法により生産された前記別のポリ不飽和脂肪酸、及び請求項１９に記載の方法により生産された前記最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む組成物。
【請求項２２】
前記産物ポリ不飽和脂肪酸がＡＤＡ及びω３−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択される請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記別のポリ不飽和脂肪酸がω６−ドコサペンタエン酸、ω３−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記最終ポリ不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
予防又は治療を行うために十分な量の請求項２１に記載の前記組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の摂取不足に起因する状態の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は長鎖ポリ不飽和脂肪酸の伸長に関与する数種の遺伝子（即ち「エロンガーゼ」）の同定とその使用に関する。特に、エロンガーゼは脂肪酸相互の変換に利用される。例えば、エロンガーゼはγ−リノレン酸（ＧＬＡ）からジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−６）への変換やステアリドン酸（ＳＴＡ，１８：４ｎ−３）から（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）への変換を触媒する。エロンガーゼはアラキドン酸（ＡＡ，２０：４ｎ−６）からアドレン酸（ＡＤＡ，２２：４ｎ−６）への変換、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ｎ−３）からω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）への変換、及びα−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３ｎ−３）から２０：３ｎ−３への変換も触媒する。例えばＤＧＬＡは医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品（例えば化粧品）に添加することができるアラキドン酸（ＡＡ）等のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生産に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
従来同定されているエロンガーゼは作用する基質に関して多様である。更に、動物と植物の両者に存在する。哺乳動物に存在するものは飽和、モノ不飽和及びポリ不飽和脂肪酸に作用することができる。他方、植物に存在するものは飽和又はモノ不飽和脂肪酸に特異的である。従って、植物でポリ不飽和脂肪酸を生産するためには、ＰＵＦＡ特異的エロンガーゼが必要である。
【０００３】
植物と動物の両者において、伸長プロセスは４段階メカニズムの結果であると考えられている（Ｌａｓｓｎｅｒら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：２８１−２９２（１９９６））。ＣｏＡはアシルキャリヤーである。第１段階はマロニル−ＣｏＡと長鎖アシル−ＣｏＡの縮合により二酸化炭素とアシル部分を炭素原子２個分伸長したβ−ケトアシル−ＣｏＡを生じる。後続反応はβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、及び第２の還元により伸長アシル−ＣｏＡを生じる。最初の縮合反応は基質特異的段階であるばかりでなく、律速段階でもある。
【０００４】
上述のように、エロンガーゼ、より特定的にはＰＵＦＡを基質として利用するエロンガーゼは多数の重要な機能をもつ長鎖ポリ不飽和脂肪酸の生産に不可欠である。例えば、ＰＵＦＡは細胞の原形質膜の重要な成分であり、リン脂質形態で存在する。ＰＵＦＡは哺乳動物プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン及びプスタグランジンの前駆物質としても機能する。更に、ＰＵＦＡは発育中の乳児脳の適正な発育と組織形成及び修復に必要である。ＰＵＦＡの生物学的意義に鑑み、ＰＵＦＡとその生産につながる中間体を効率的に生産する試みが続けられている。
【０００５】
ＰＵＦＡ生合成にはエロンガーゼ（ｅｌｏ）を含む多数の酵素が関与している（図１参照）。例えば、リノレン酸（ＬＡ，１８：２−Δ９，１２又は１８：２ｎ−６）はオレイン酸（１８：１−Δ９又は１８：１ｎ−９）からΔ１２−デサチュラーゼにより生産される。ＧＬＡ（１８：３−Δ６，９，１２）はリノレン酸からΔ６−デサチュラーゼにより生産される。ＡＡ（２０：４−Δ５，８，１１，１４）はジホモγ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３−Δ８，１１，１４）からΔ５−デサチュラーゼにより生産される。上述のように、ＤＧＬＡはＧＬＡからエロンガーゼにより生産される。
【０００６】
動物はΔ９位を越えて脱飽和することができないため、オレイン酸をリノレン酸に変換できないことに注目されたい。同様に、哺乳動物はΔ１５デサチュラーゼ活性をもたないため、α−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３−Δ９，１２，１５又は１８：３ｎ−３）を合成することができない。他方、α−リノレン酸は哺乳動物と藻類でΔ６−デサチュラーゼによりステアリドン酸（ＳＴＡ，１８：４−Δ６，９，１２，１５）に変換され（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１３５９１と米国特許第５，５５２，３０６号参照）、その後、（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４−Δ８，１１，１４，１７又は２０：４ｎ−３）まで伸長することができる。このポリ不飽和脂肪酸（即ち２０：４−Δ８，１１，１４，１７）はその後、Δ５−デサチュラーゼによりエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５−Δ５，８，１１，１４，１７）に変換することができる。真菌類や植物等の他の真核生物は炭素１２（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１１５１６と米国特許第５，４４３，９７４号参照）及び１５（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１１２４５参照）で脱飽和する酵素をもつ。従って、動物の主要なポリ不飽和脂肪酸は食物及び／又はリノレン酸もしくはα−リノレン酸の脱飽和と伸長から誘導される。動物はこれらの必須長鎖脂肪酸を生産できないので、これらの脂肪酸を天然に生産する種からＰＵＦＡ合成に関与する遺伝子を単離し、商業的量の１種以上のＰＵＦＡを生産できるように改変可能な微生物、植物又は動物系でこれらの遺伝子を発現させることは非常に有益である。従って、エロンガーゼ酵素、この酵素をコードする遺伝子、及びこの酵素の組換え生産方法が明白に必要である。更に、天然濃度よりも高濃度のＰＵＦＡを含有する油類と、新規ＰＵＦＡを高度に含有する油類も必要である。このような油類はエロンガーゼ遺伝子の単離と発現によってしか製造することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した最も重要な長鎖ＰＵＦＡの１種はアラキドン酸（ＡＡ）である。ＡＡは糸状菌に含まれており、肝臓や副腎等の哺乳動物組織からも精製できる。上述したように、ＤＧＬＡからのＡＡ生産はΔ５−デサチュラーゼにより触媒され、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）からのＤＧＬＡ生産はエロンガーゼにより触媒される。しかし、長鎖ＰＵＦＡと、特にＡＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アドレン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６ｎ−３）、ω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）又はω６−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）の生産経路で基質脂肪酸に作用するエロンガーゼは本発明以前には同定されていなかった。
【０００８】
本発明のエロンガーゼ遺伝子の調査には２種の遺伝子が有用であると思われた。特に、ホホバβ−ケトアシル−補酵素Ａシンターゼ（ＫＣＳ）ないしホホバＫＣＳ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｕ３７０８８）は脂肪アシル−ＣｏＡ伸長経路の初期反応（即ちマロニル−ＣｏＡと長鎖アシル−ＣｏＡの縮合（Ｌａｓｓｎｅｒら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：２８１−２９２（１９９６））を触媒する。ホホバＫＣＳ基質優先は１８：０、２０：０、２０：１、１８：１、２２：１、２２：０及び１６：０である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｃｙｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエロンガーゼ（ＥＬＯ２）も長鎖飽和及びモノ不飽和脂肪酸の変換を触媒し、高レベルの２２：０、２４：０、更に１８：０、１８：１、２０：０、２０：１、２２：０、２２：１、及び２４：１を生産する（Ｏｈら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２（２８）：１７３７６−１７３８４（１９９７）；ＥＬＯ２の配列を含むヌクレオチド配列については米国特許第５，４８４，７２４号も参照；実施例５に記載するグリコシル化阻害因子の配列の考察についてはＰＣＴ公開ＷＯ８８／０７５７７参照）。これらの２種の遺伝子間の相同性の検討とＰＵＦＡ−エロンガーゼ活性の発現スクリーニングによりＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａで長鎖ＰＵＦＡ特異的エロンガーゼの調査が開始した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は配列番号１（図６）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約５０％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列に関する。この単離は配列番号１により表すことができる。この配列はポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。特に、この配列はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属真菌に由来するものとすることができ、特にＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａから単離することができる。更に、本発明はポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列にも関する。前記ポリペプチドは配列番号１３に対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性をもつアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明は上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質と、ポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を伸長し、上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１３）に対して少なくとも約５０％のアミノ酸類似度をもつ精製ポリペプチドにも関する。
【００１１】
更に、本発明はａ）配列番号１（図６）を含むヌクレオチド配列を単離する段階と；ｂ）ｉ）前記単離ヌクレオチド配列をｉｉ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターを構築する段階と；ｃ）エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含むエロンガーゼ酵素の生産方法にも関する。宿主細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。
【００１２】
原核細胞としては例えば大腸菌細胞、藍色細菌細胞又は枯草菌細胞が挙げられる。真核細胞としては例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞が挙げられる。真菌細胞としては例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ種、Ｙａｒｒｏｗｉａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種又はＰｉｃｈｉａ種が挙げられる。特に、真菌細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種等の酵母細胞とすることができ、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種又はＰｉｃｈｉａ種が挙げられる。
【００１３】
本発明はａ）配列番号１（図６）を含むヌクレオチド配列をｂ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターと、このベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主は真核細胞でも原核細胞でもよい。原核細胞の適切な例としては例えば大腸菌細胞、藍色細菌細胞又は枯草菌細胞が挙げられる。真核細胞の適切な例としては例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞が挙げられる。真菌細胞としては例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ種、Ｙａｒｒｏｗｉａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種及びＰｉｃｈｉａ種が挙げられる。特に、真菌細胞は例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種等の酵母細胞とすることができ、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種及びＰｉｃｈｉａ種が挙げられる。
【００１４】
本発明は上記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として植物細胞、植物又は植物組織によりモノ不飽和脂肪酸とポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種の脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。ポリ不飽和脂肪酸は例えばジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、２０：４ｎ−３、及びアドレン酸（ＡＤＡ）とすることができる。本発明は上記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は脂肪酸にも関する。更に、本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果としてトランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。
【００１５】
更に、本発明はプロモーターに機能的に連結したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。ＤＮＡ配列は配列番号１（図６）により表すことができる。本発明は前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくとも１種のエロンガーゼ又はその産物（例えばＤＧＬＡ、ω６−ドコサＡペンタエン酸、ＡＤＡ及び／又は２０：４ｎ−３（図１参照））を含む液体（例えば乳）にも関する。
【００１６】
更に、本発明はａ）配列番号１（図６）を含むヌクレオチド配列を単離する段階と；ｂ）前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と；ｃ）前記単離ヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と；ｄ）「基質」ポリ不飽和脂肪酸を「産物」ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を前記基質に暴露する段階を含むポリ不飽和脂肪酸の生産方法にも関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＴＡ）及びアラキドン酸（ＡＡ）から構成される群から選択することができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、及びＡＤＡから構成される群から選択することができる。方法は更に産物ポリ不飽和脂肪酸を「別の」ポリ不飽和脂肪酸に変換するために産物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のデサチュラーゼに暴露する段階を含む。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、及びＡＤＡから構成される群から選択することができる。夫々別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ω６−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択することができ、少なくとも１種のデサチュラーゼはＡＡ又はＥＰＡの生産の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の生産の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。方法は更に別のポリ不飽和脂肪酸を「最終」ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記別のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のエロンガーゼと少なくとも１種の別のデサチュラーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階を含む。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ＡＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００１７】
本発明は上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、及びＡＤＡから構成される群から選択することができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。栄養組成物は例えば乳児用調製乳、栄養補助食品又は代用食品とすることができ、ヒト又は動物に投与することができ、経腸又は非経口投与することができる。栄養組成物は更にヤシ油、大豆油、キャノーラ油、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、蔗糖、食用乳糖、電気透析乳清、電気透析脱脂乳、乳清、大豆蛋白質、蛋白質加水分解物、ヒマワリ油、サフラワー油、コーン油、及び亜麻仁油から構成される群から選択される少なくとも１種の主要栄養素を添加することができる。更に、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＢ複合体から構成される群から選択される少なくとも１種のビタミンと、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレン及び鉄から構成される群から選択される少なくとも１種のミネラルも添加することができる。
【００１８】
更に、本発明は１）上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸と、２）医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する医薬組成物に関する。組成物はヒト又は動物に投与することができる。組成物は更にビタミン、ミネラル、塩、炭水化物、アミノ酸、遊離脂肪酸、防腐剤、賦形剤、抗ヒスタミン剤、増殖因子、抗生物質、希釈剤、リン脂質、酸化防止剤、及びフェノール化合物から構成される群から選択される少なくとも１種の成分を添加することができる。組成物は経腸、非経口、局所、直腸、筋肉内、皮下、皮内、又は他の適当な任意手段により投与することができる。
【００１９】
本発明は更に上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含有する動物飼料に関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、及びＡＤＡとすることができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００２０】
更に、本発明は更に上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択されるポリ不飽和脂肪酸を含有する化粧品に関する。
【００２１】
更に、本発明は予防又は治療を行うために十分な量の上記栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の摂取又は生産不足に起因する状態の予防又は治療方法に関する。
【００２２】
本発明は更に配列番号２（図２２）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約３５％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列に関する。この配列は配列番号２により表すことができる。この配列はポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。この配列は例えばＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属の真菌に由来することができる。特に、Ｍ．ａｌｐｉｎａに由来することができる。更に、本発明は配列番号３１に対して少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性をもつアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、エロンガーゼをコードする単離ヌクレオチド配列にも関する。
【００２３】
更に、本発明は上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質（配列番号３１）と、ポリ不飽和脂肪酸を伸長し、精製蛋白質のアミノ酸配列（配列番号３１）に対して少なくとも約３０％のアミノ酸配列同一性をもつ精製ポリペプチドに関する。
【００２４】
本発明は更に上記エロンガーゼ酵素の生産方法にも関する。ベクターに挿入される配列は配列番号２（図２２）により表される。宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。適切な例は上記の通りである。
【００２５】
本発明は更にａ）配列番号２（図２２）に示すヌクレオチド配列をｂ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターと、このベクターを含む宿主細胞にも関する。この場合も、宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。適切な例は上記の通りである。
【００２６】
本発明は上記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として植物細胞、植物又は植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。更に、本発明は前記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は脂肪酸にも関する。
【００２７】
更に、本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列（配列番号２）の発現の結果として前記トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。
【００２８】
本発明は更にプロモーターに機能的に連結したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。本発明は更にこのトランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくとも１種のエロンガーゼ又はその産物を含む液体にも関する。
【００２９】
本発明は更にａ）配列番号２（図２２）により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と；ｂ）前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と；ｃ）前記単離ヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と；ｄ）基質ポリ不飽和脂肪酸を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を前記基質に暴露する段階を含むポリ不飽和脂肪酸の生産方法にも関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばＧＬＡ、ＳＴＡ、又はＡＡとすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。方法は更に産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を少なくとも１種のデサチュラーゼに暴露する段階を含むことができる。夫々産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができ、別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができ、少なくとも１種のデサチュラーゼはＡＡ又はＥＰＡの生産の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の生産の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。方法は更に別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記別のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のエロンガーゼと少なくとも１種の別のデサチュラーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階を含むことができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばドコサヘキサエン酸、ＡＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００３０】
本発明は更に配列番号２について記載した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号２について記載した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸及び配列番号２について記載した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、及びＡＤＡから構成される群から選択することができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、及びω６−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択することができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、ＡＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、及びω３−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択することができる。組成物の他の属性は投与、特性決定、成分等について上述したと同一である。
【００３１】
本発明は更に１）配列番号２について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号２について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び配列番号２について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸と、２）医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する医薬組成物に関する。上記医薬組成物の特徴（例えば投与、成分等）はこの組成物にも当てはまる。
【００３２】
本発明は更に配列番号２について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号２について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び配列番号２について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含有する動物飼料に関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００３３】
本発明は更に配列番号２について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号２について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び配列番号２について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択されるポリ不飽和脂肪酸を含有する化粧品に関する。
【００３４】
更に、本発明は予防又は治療を行うために十分な量の上記栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の摂取又は生産不足に起因する状態の予防又は治療方法に関する。
【００３５】
更に、本発明は配列番号３（図４３）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約３５％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列に関する。この配列は配列番号３により表すことができる。この配列はポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。この配列は例えばヒト等の哺乳動物に由来することができる。更に、本発明はポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列にも関し、ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号６１に対して少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性をもち、エロンガーゼ活性をもつ。
【００３６】
本発明は更にこのヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質（配列番号６１）にも関する。更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を伸長し、この精製蛋白質のアミノ酸配列（配列番号６１）に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似度をもつ精製ポリペプチドに関する。
【００３７】
更に、本発明はａ）配列番号３（図４３）により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と；ｂ）ｉ）単離ヌクレオチド配列をｉｉ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターを構築する段階と；ｃ）エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含むエロンガーゼ酵素の生産方法にも関する。宿主細胞は配列番号１又は２を利用する対応方法について上述したと同一とすることができる。
【００３８】
本発明は更にａ）配列番号３（図４３）により表されるヌクレオチド配列をｂ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターと、このベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は上記と同一とすることができる。
【００３９】
更に、本発明は配列番号３を含む上記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として植物細胞、植物又は植物組織によりモノ不飽和脂肪酸とポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種の脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。本発明は更に前記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は酸にも関する。
【００４０】
本発明は更に配列番号３を含むベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として前記トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。
【００４１】
更に、本発明はプロモーターに機能的に連結したエロンガーゼをコードするヒトＤＮＡ配列をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。ＤＮＡ配列は配列番号３（図４３）により表される。本発明は更に前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくとも１種のエロンガーゼ又はその産物を含む液体にも関する。
【００４２】
本発明は更にａ）配列番号３（図４３）を含むヌクレオチド配列を単離する段階と；ｂ）前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と；ｃ）前記単離ヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と；ｄ）基質ポリ不飽和脂肪酸を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を前記基質に暴露する段階を含むポリ不飽和脂肪酸の生産方法にも関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばＧＬＡ、ＳＴＡ、又はＡＡとすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。方法は更に産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換するために産物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のデサチュラーゼに暴露する段階を含むことができる。夫々産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、及びＡＤＡとすることができ、別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、及びω６−ドコサペンタエン酸とすることができ、少なくとも１種のデサチュラーゼはＡＡ又はＥＰＡの生産の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の生産の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。方法は更に別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記別のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のエロンガーゼと少なくとも１種の別のデサチュラーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階を含むことができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、及びω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００４３】
本発明は更に配列番号３について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号３について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸及び配列番号３について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。栄養組成物の他の特性又は特徴（例えば投与、成分等）は他の栄養組成物について上述したと同一である。
【００４４】
更に、本発明は１）配列番号３について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号３について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び配列番号３について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸と、２）医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する医薬組成物に関する。組成物の他の特性（例えば投与、付加成分等）は他の医薬組成物について上述したと同一である。
【００４５】
本発明は更に配列番号３について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号３について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び配列番号３について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含有する動物飼料に関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００４６】
更に、本発明は配列番号３について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号３について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び配列番号３について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択されるポリ不飽和脂肪酸を含有する化粧品に関する。
【００４７】
更に、本発明は予防又は治療を行うために十分な量の配列番号３について上述した栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の摂取不足に起因する状態の予防又は治療方法に関する。
【００４８】
更に、本発明は配列番号４（図４６）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約３５％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列に関する。この配列は配列番号４により表すことができる。この配列はポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。この配列はＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属の線虫から誘導又は単離することができ、特に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓから単離することができる。更に、本発明はポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列にも関し、ポリペプチドは配列番号６２に対して少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、エロンガーゼ活性をもつ。
【００４９】
本発明は更に上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質（配列番号６２）にも関する。本発明は更にポリ不飽和脂肪酸を伸長し、前記精製蛋白質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似度をもつ精製ポリペプチドに関する。
【００５０】
更に、本発明はａ）配列番号４（図４６）により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と；ｂ）ｉ）単離ヌクレオチド配列をｉｉ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターを構築する段階と；ｃ）エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含むエロンガーゼ酵素の生産方法にも関する。宿主細胞の特性は配列番号１、配列番号２及び配列番号３について上述したと同一とすることができる。
【００５１】
本発明は更にａ）配列番号４（図４６）により表されるヌクレオチド配列をｂ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターと、このベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は配列番号１、配列番号２及び配列番号３について上記に挙げた宿主細胞について上述したと同一の特性をもつことができる。
【００５２】
更に、本発明は配列番号４を含む上記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現の結果として、植物細胞、植物又は植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。本発明は更にこの植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は脂肪酸にも関する。
【００５３】
本発明は更に配列番号４に対応するヌクレオチド配列を含む上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として前記トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。
【００５４】
更に、本発明はプロモーターに機能的に連結したエロンガーゼをコードするＣ．ｅｌｅｇａｎｓＤＮＡ配列をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。ＤＮＡ配列は配列番号４（図４６）により表すことができる。本発明は更にこのトランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくとも１種のエロンガーゼ又はその産物を含む液体にも関する。
【００５５】
本発明は更にａ）配列番号４（図４６）により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と；ｂ）前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と；ｃ）前記単離ヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と；ｄ）基質ポリ不飽和脂肪酸を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を前記基質に暴露する段階を含むポリ不飽和脂肪酸の生産方法にも関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばＧＬＡ、ＳＴＡ、又はＡＡとすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。方法は更に前記産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を少なくとも１種のデサチュラーゼに暴露する段階を含むことができる。夫々産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができ、別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができ、少なくとも１種のデサチュラーゼはＡＡ又はＥＰＡの生産の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の生産の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。方法は更に別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記別のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のエロンガーゼと少なくとも１種の別のデサチュラーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階を含むことができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００５６】
本発明は更に配列番号４について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号４について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸及び配列番号４について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。組成物の他の特徴は栄養組成物について上述したと同一である。
【００５７】
更に、本発明は１）配列番号４について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号４について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び配列番号４について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸と、２）医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する医薬組成物に関する。組成物は他の医薬組成物について上述したと同一の他の特性（例えば投与、付加成分等）をもつ。
【００５８】
本発明は更に配列番号４について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号４について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び配列番号４について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含有する動物飼料に関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、又はＡＤＡとすることができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００５９】
更に、本発明は配列番号４について上述した方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号４について上述した方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び配列番号４について上述した方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択されるポリ不飽和脂肪酸を含有する化粧品に関する。
【００６０】
更に、本発明は予防又は治療を行うために十分な量の配列番号４について上述した栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の摂取又は生産不足に起因する状態の予防又は治療方法に関する。
【００６１】
更に、本発明は配列番号５（図５４）を含むヌクレオチド配列の少なくとも約３５％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列に関する。従って、配列は配列番号５により表されるものとすることができる。この配列はポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードすることができる。この配列は例えばマウス等の哺乳動物に由来することができる。
【００６２】
本発明は更に上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質（配列番号６５）と、ポリ不飽和脂肪酸を伸長し、前記蛋白質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸配列同一性をもつ精製ポリペプチドに関する。更に、本発明はポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列にも関し、ポリペプチドは配列番号６５に対して少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、エロンガーゼ活性をもつ。
【００６３】
更に、本発明は単離ヌクレオチド配列が配列番号５又は配列番号６のいずれかを含む上記のようなエロンガーゼ酵素の生産方法にも関する。使用する宿主細胞は上記の通りである。
【００６４】
本発明は更にａ）配列番号５（図５４）を含むヌクレオチド配列（又は配列番号６（図５８）を含むヌクレオチド配列）をｂ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターと、このベクターを含む宿主細胞にも関する。この場合も、宿主細胞は本発明の他のヌクレオチド配列を使用する関連方法について上述した通りとすることができる。
【００６５】
更に、本発明は配列番号５又は６を含むベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として、植物細胞、植物又は植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。ベクターのヌクレオチド配列が配列番号５を含む場合には、ポリ不飽和脂肪酸はＡＡ、ＡＤＡ、ＧＬＡ及びＳＴＡから構成される群から選択される。本発明は更に前記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は酸にも関する。
【００６６】
本発明は更に上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として前記トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。
【００６７】
更に、本発明はプロモーターに機能的に連結したエロンガーゼをコードするヒトＤＮＡ配列をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関し、ＤＮＡ配列は配列番号５（図５４）（又は配列番号６（図５８））を含む。更に、本発明はこのトランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくとも１種のエロンガーゼ又はその産物を含む液体にも関する。
【００６８】
本発明は更に単離ヌクレオチド配列が配列番号５（図５４）を含む以外は上記と同様のポリ不飽和脂肪酸の生産方法に関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸はＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＡ、ＡＤＡ及びＡＬＡから構成される群から選択することができ、産物ポリ不飽和脂肪酸はＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸及びＳＴＡから構成される群から選択することができる。方法は更に産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を少なくとも１種のデサチュラーゼに暴露する段階を含むことができる。夫々産物ポリ不飽和脂肪酸はＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡ及びω６−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択することができ、別のポリ不飽和脂肪酸はＡＡ、ＥＰＡ、ω６−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択され、少なくとも１種のデサチュラーゼはＡＡ又はＥＰＡの生産の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の生産の場合にはΔ４−デサチュラーゼであり、ドコサヘキサエン酸の生産の場合にはΔ１９−デサチュラーゼである。方法は更に別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記別のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のエロンガーゼと少なくとも１種の別のデサチュラーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階を含むことができる。最終ポリ不飽和脂肪酸はＡＤＡ、ω３−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択することができる。
【００６９】
本発明は上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物ポリ不飽和脂肪酸はＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸及びＳＴＡから構成される群から選択することができる。別のポリ不飽和脂肪酸はＡＡ、ＥＰＡ、ω６−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される。最終ポリ不飽和脂肪酸はＡＤＡ、ω３−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される。栄養組成物は乳児用調製乳、栄養補助食品及び代用食品から構成される群から選択することができる。
【００７０】
本発明は更に１）上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸と、２）医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する医薬組成物に関する。
【００７１】
更に、本発明は上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含有する動物飼料に関する。産物ポリ不飽和脂肪酸はＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸及びＳＴＡから構成される群から選択することができる。別のポリ不飽和脂肪酸はＡＡ、ＥＰＡ、ω６−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択することができる。最終ポリ不飽和脂肪酸はＡＤＡ、ω３−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択することができる。
【００７２】
更に、本発明は更に上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択されるポリ不飽和脂肪酸を含有する化粧品に関する。
【００７３】
更に、本発明は予防又は治療を行うために十分な量の上記栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の摂取不足に起因する状態の予防又は治療方法に関する。
【００７４】
更に、本発明は配列番号６（図５８）を含むヌクレオチド配列の少なくとも約３５％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列に関する。単離ヌクレオチド配列は配列番号６を含むことができる。本発明は更に上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質（配列番号６６）にも関する。更に、本発明はポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列にも関し、ポリペプチドは配列番号６６に対して少なくとも約３５％のアミノ酸配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、エロンガーゼ活性をもつ。
【００７５】
更に、本発明は配列番号７（図７２）に示すヌクレオチド配列の少なくとも約３５％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列に関する。この単離ヌクレオチド配列は配列番号７により表すことができる。この配列はポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードする。特に、この配列はＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の真菌に由来するものとすることができ、特にＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍから単離することができる。本発明は更にポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列にも関し、ポリペプチドは配列番号８０に対して少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性をもつアミノ酸配列を含み、エロンガーゼ活性をもつ。
【００７６】
本発明は更に上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質（配列番号８０）と、ポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を伸長し、上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％のアミノ酸同一性をもつ精製ポリペプチドにも関する。
【００７７】
更に、本発明はａ）配列番号７（図７２）により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と；ｂ）ｉ）前記単離ヌクレオチド配列をｉｉ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターを構築する段階と；ｃ）エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含むエロンガーゼ酵素の生産方法にも関する。宿主細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。
【００７８】
原核細胞としては例えば大腸菌細胞、藍色細菌細胞又は枯草菌細胞が挙げられる。真核細胞としては例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞が挙げられる。真菌細胞としては例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ種、Ｙａｒｒｏｗｉａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種又はＰｉｃｈｉａ種が挙げられる。特に、真菌細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種等の酵母細胞とすることができ、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種又はＰｉｃｈｉａ種が挙げられる。
【００７９】
本発明はａ）配列番号７（図７２）により表されるヌクレオチド配列をｂ）プロモーターに機能的に連結してなるベクターと、このベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主は真核細胞でも原核細胞でもよい。原核細胞の適切な例としては大腸菌細胞、藍色細菌細胞又は枯草菌細胞が挙げられる。真核細胞の適切な例としては哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞が挙げられる。真菌細胞としては例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ種、Ｙａｒｒｏｗｉａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種及びＰｉｃｈｉａ種が挙げられる。特に、真菌細胞は例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種等の酵母細胞とすることができ、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種及びＰｉｃｈｉａ種が挙げられる。
【００８０】
本発明は上記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として植物細胞、植物又は植物組織によりモノ不飽和脂肪酸とポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種の脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。ポリ不飽和脂肪酸は例えばジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、エイコサテトラエン酸、アドレン酸及びω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。本発明は上記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は植物酸にも関する。更に、本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果としてトランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。
【００８１】
更に、本発明はプロモーターに機能的に連結したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。ＤＮＡ配列は配列番号７（図７２）により表すことができる。本発明は更に前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくとも１種のエロンガーゼ又はその産物（例えばＤＧＬＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡ及び／又は２０：４ｎ−３（図１参照））を含む液体（例えば乳）にも関する。
【００８２】
更に、本発明はａ）配列番号７（図７２）により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と；ｂ）前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と；ｃ）前記単離ヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と；ｄ）「基質」ポリ不飽和脂肪酸を「産物」ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を前記基質に暴露する段階を含むポリ不飽和脂肪酸の生産方法にも関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばγ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＴＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）及びＥＰＡから構成される群から選択することができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、ＡＤＡ及びω３−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択することができる。方法は更に産物ポリ不飽和脂肪酸を「別の」ポリ不飽和脂肪酸に変換するために産物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のデサチュラーゼに暴露する段階を含む。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、及びＡＤＡから構成される群から選択することができる。夫々別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ω６−ドコサペンタエン酸から構成される群から選択することができ、少なくとも１種のデサチュラーゼはＡＡ又はＥＰＡの生産の場合にはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の生産の場合にはΔ４−デサチュラーゼである。方法は更に別のポリ不飽和脂肪酸を「最終」ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記別のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のエロンガーゼと少なくとも１種の別のデサチュラーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階を含む。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００８３】
更に、本発明は上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、及びＡＤＡから構成される群から選択することができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。栄養組成物は例えば乳児用調製乳、栄養補助食品又は代用食品とすることができ、ヒト又は動物に投与することができ、経腸又は非経口投与することができる。栄養組成物は更にヤシ油、大豆油、キャノーラ油、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、蔗糖、食用乳糖、電気透析乳清、電気透析脱脂乳、乳清、大豆蛋白質、蛋白質加水分解物、ヒマワリ油、サフラワー油、コーン油、及び亜麻仁油から構成される群から選択される少なくとも１種の主要栄養素を添加することができる。更に、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＢ複合体から構成される群から選択される少なくとも１種のビタミンと、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩化物、ヨウ素、セレン及び鉄から構成される群から選択される少なくとも１種のミネラルも添加することができる。
【００８４】
更に、本発明は１）上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸と、２）医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する医薬組成物に関する。組成物はヒト又は動物に投与することができる。組成物は更にビタミン、ミネラル、塩、炭水化物、アミノ酸、遊離脂肪酸、防腐剤、賦形剤、抗ヒスタミン剤、増殖因子、抗生物質、希釈剤、リン脂質、酸化防止剤、及びフェノール化合物から構成される群から選択される少なくとも１種の成分を添加することができる。組成物は経腸、非経口、局所、直腸、筋肉内、皮下、皮内、又は他の適当な任意手段により投与することができる。
【００８５】
本発明は更に上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含有する動物飼料に関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３、及びＡＤＡとすることができる。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ、ＥＰＡ、又はω６−ドコサペンタエン酸とすることができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＨＡ、アドレン酸（ＡＤＡ）、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。
【００８６】
更に、本発明は更に上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択されるポリ不飽和脂肪酸を含有する化粧品に関する。
【００８７】
更に、本発明は予防又は治療を行うために十分な量の上記栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の摂取又は生産不足に起因する状態の予防又は治療方法に関する。
【００８８】
更に、本発明はエロンガーゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメントに関し、ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１２１を含むアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性をもつ。更に、本発明は配列番号１１９を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性をもつヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメントに関する。上記ヌクレオチド配列はポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なエロンガーゼをコードすることができる。更に、この配列はＰａｖｌｏｖａ種の属に由来することができる。
【００８９】
本発明は更に上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質と、ポリ不飽和脂肪酸を伸長し、配列番号１２１を含む精製蛋白質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸同一性をもつ精製ポリペプチドに関する。
【００９０】
更に、本発明は配列番号１１９を含むヌクレオチド配列を単離する段階と；ｉ）単離ヌクレオチド配列をｉｉ）プロモーター又は他の調節配列に機能的に連結してなるベクターを構築する段階と；エロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含むエロンガーゼ酵素の生産方法にも関する。宿主細胞は例えば上記配列（例えば、配列番号５、配列番号７等）について上述した宿主細胞の任意１種以上とすることができる。
【００９１】
更に、本発明はａ）配列番号１１９を含むヌクレオチド配列をｂ）プロモーター又は少なくとも１種の調節配列に機能的に連結してなるベクターにも関する。本発明はこのベクターを含む宿主細胞にも関する。この場合も、宿主細胞は上記配列（例えば、配列番号５、配列番号７等）について上述した宿主細胞の任意１種以上とすることができる。
【００９２】
更に、本発明は配列番号１１９を含むベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として、植物細胞、植物又は植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。より詳細には、ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＤＡ又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。本発明は更に前記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は酸にも関する。本発明は更に上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として前記トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。
【００９３】
更に、本発明はプロモーター又は１種以上の調節配列に機能的に連結したエロンガーゼをコードするヒトＤＮＡ配列をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関し、ＤＮＡ配列は配列番号１１９を含む。本発明は更にこのトランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくとも１種のエロンガーゼ又はその産物を含む液体にも関する。
【００９４】
更に、本発明は配列番号１１９を含むヌクレオチド配列を単離する段階と；前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と；前記単離ヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と；基質ポリ不飽和脂肪酸を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を前記基質に暴露する段階を含むポリ不飽和脂肪酸の生産方法にも関する。基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ又はＥＰＡとすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＤＡ又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる（図１参照）。この方法は更に産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記発現エロンガーゼ酵素を少なくとも１種のデサチュラーゼに暴露する段階を含むことができる。この方法では、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＤＡ又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができ、別のポリ不飽和脂肪酸は例えばω６−ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸とすることができる。少なくとも１種のデサチュラーゼは例えばω６−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸の生産の場合にはΔ４−デサチュラーゼとし、ω３−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸の生産の場合にはΔ１９−デサチュラーゼとすることができる。方法は更に別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記別のポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１種のエロンガーゼと少なくとも１種の別のデサチュラーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階を含むことができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばドコサヘキサエン酸とすることができる。
【００９５】
本発明のエロンガーゼは図１に示す経路のいくつかで使用することができ、同図では少なくとも１種のデサチュラーゼ及び／又は少なくとも１種の「他の」エロンガーゼが基質又は産物に作用している。例えば、ＤＧＬＡがΔ５−デサチュラーゼによりＡＡに変換されると、本発明のエロンガーゼはＡＤＡを生産するためにＡＡに作用することができる。別の例では、ＳＴＡをエロンガーゼによりＥＴＡに変換した後に、Δ５−デサチュラーゼによりＥＰＡに変換することができる。次に、ＥＰＡを本発明のエロンガーゼによりω３−ドコサペンタエン酸に変換することができる（図１参照）。従って、本発明は本発明のエロンガーゼが関与する任意経路を含む。
【００９６】
本発明は上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物、「別の」及び最終ポリ不飽和脂肪酸は例えば配列番号１２１について上述したものとすることができる。この栄養組成物は例えば乳児用調製乳、栄養補助食品及び代用食品とすることができる。
【００９７】
本発明は更に１）上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された「別の」ポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸と、２）医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する少なくとも１種の医薬組成物に関する。
【００９８】
更に、本発明は上記方法により生産された産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された別のポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含有する動物飼料に関する。
【００９９】
更に、本発明は予防又は治療を行うために十分な量の上記栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の摂取不足に起因する状態の予防又は治療方法に関する。
【０１００】
本明細書に引用する全米国特許及び刊行物はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０１】
本発明はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａに由来するエロンガーゼｃＤＮＡ、ヒトに由来するエロンガーゼｃＤＮＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに由来するエロンガーゼｃＤＮＡ、マウスに由来する２種のエロンガーゼｃＤＮＡ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍに由来するエロンガーゼｃＤＮＡ及びＰａｖｌｏｖａ種４５９に由来するエロンガーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれらによりコードされるアミノ酸配列に関する。更に、本発明はｃＤＮＡとこれらの遺伝子によりコードされる蛋白質の使用に関する。例えば、遺伝子と対応酵素は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料、化粧品、及び他の有価製品に添加可能なポリ不飽和脂肪酸及び／又はモノ不飽和脂肪酸（例えばＤＧＬＡ，ＡＡ，ＡＤＡ，ＥＰＡ及び／又はＤＨＡ）の生産に使用することができる。
【０１０２】
エロンガーゼ遺伝子とこれらの遺伝子にコードされる酵素
上述のように、エロンガーゼｃＤＮＡによりコードされるエロンガーゼ酵素は種々のポリ不飽和脂肪酸、特に炭素数２０〜２４のＰＵＦＡの生産に不可欠である。本発明に関して、単離Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼｃＤＮＡ（ＭＡＥＬＯ）のヌクレオチド配列を図６に示し、このヌクレオチド配列によりコードされる対応する精製蛋白質又は酵素のアミノ酸配列を図７に示す。更に、単離ＧＬＡエロンガーゼｃＤＮＡ（ＧＬＥＬＯ）のヌクレオチド配列を図２２に示し、このヌクレオチド配列によりコードされる対応する精製蛋白質又は酵素のアミノ酸配列を図２３に示す。単離ヒト配列１（ＨＳＥＬＯ１）エロンガーゼのヌクレオチド配列を図４３に示し、この配列によりコードされる対応する精製蛋白質又は酵素のアミノ酸配列を図４４に示す。更に、単離Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓエロンガーゼｃＤＮＡ（ＣＥＥＬＯ１）のヌクレオチド配列を図４６に示し、この配列によりコードされる対応する精製蛋白質又は酵素のアミノ酸配列を図４７に示す。更に、単離マウスＰＵＦＡ伸長酵素（ＭＥＬＯ４）のヌクレオチド配列を図５４に示し、この配列によりコードされる対応する精製蛋白質又は酵素のアミノ酸配列を図５５に示す。更に、第２のマウスＰＵＦＡ伸長酵素（ＭＥＬＯ７）のヌクレオチド配列を図５８に示し、この配列によりコードされる対応する精製蛋白質又は酵素のアミノ酸配列を図５９に示す。更に、単離Ｔ．ａｕｒｅｕｍエロンガーゼｃＤＮＡ（ＴＥＬＯ１）のヌクレオチド配列を図７２に示し、この配列によりコードされる対応する精製蛋白質又は酵素のアミノ酸配列を図７９に示す。更に、単離Ｐａｖｌｏｖａ種４５９エロンガーゼｃＤＮＡ（ＰＥＬＯ１）のヌクレオチド配列を図９１に示し、この配列によりコードされる対応する精製蛋白質又は酵素のアミノ酸配列を図９３に示す。
【０１０３】
１例として、本発明のｃＤＮＡによりコードされる単離エロンガーゼの数種はＧＬＡをＤＧＬＡに伸長するか又はＳＴＡを２０：４ｎ−３に伸長するか又はＡＡをＡＤＡに伸長する。その後、例えばΔ５−デサチュラーゼの触媒作用によりＤＧＬＡからアラキドン酸又は２０：４ｎ−３からＥＰＡが生産される。従って、少なくとも１種のエロンガーゼｃＤＮＡ又はそれによりコードされる酵素の不在下ではＡＡ（又はＥＰＡ）、ＤＧＬＡ（又は２０：４ｎ−３）、ＡＤＡ（又は３−ドコサペンタエン酸）のいずれも合成することができない。
【０１０４】
本発明は配列番号１（即ち本明細書に記載するＭＡＥＬＯ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図６参照））中のヌクレオチドの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％を含むか又はこれに相補的な配列をもつヌクレオチド配列（及びこれによりコードされる対応する蛋白質）にも関することに留意すべきである。更に、本発明は配列番号２（即ち本明細書に記載するＧＬＥＬＯ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図２２参照））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％を含むか又はこれに相補的な配列をもつヌクレオチド配列（及びこれによりコードされる対応する蛋白質）にも関する。更に、本発明は配列番号３（即ち本明細書に記載するヒト配列１（ＨＳＥＬＯ１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図４３参照））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％を含むか又はこれに相補的な配列をもつヌクレオチド配列（及びこれによりコードされる対応する蛋白質）にも関する。更に、本発明は配列番号４（即ち本明細書に記載するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｃＤＮＡ，ＣＥＥＬＯ１のヌクレオチド配列（図４６参照））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％を含むか又はこれに相補的な配列をもつヌクレオチド配列（及びこれによりコードされる対応する蛋白質）にも関する。更に、本発明は配列番号５又は配列番号６（即ち本明細書に記載するマウスＰＵＦＡエロンガーゼＭＥＬＯ４及びＭＥＬＯ７のヌクレオチド配列（夫々図５４及び５８参照））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％を含むか又はこれに相補的な配列をもつヌクレオチド配列（及びこれによりコードされる対応する蛋白質）にも関する。更に、本発明は配列番号７（即ち本明細書に記載するＴ．ａｕｒｅｕｍエロンガーゼ遺伝子ＴＥＬＯ１のヌクレオチド配列（図７２参照））中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％を含むか又はこれに相補的な配列をもつヌクレオチド配列（及びこれによりコードされる対応する蛋白質）にも関する。更に、本発明は配列番号１１９中のヌクレオチドの少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％を含むか又はこれに相補的な配列をもつヌクレオチド配列（及びこれによりコードされる対応する蛋白質）にも関する。各場合に記載する「最も好ましい」範囲は１０％ずつ増加できることに留意すべきである。例えば、特定配列について「少なくとも５５％」が最も好ましい範囲であると上記に記載した場合には、このような範囲は必然的に「少なくとも６５％の同一性」、「少なくとも７５％の同一性」、「少なくとも８５％の同一性」、及び「少なくとも９５％の同一性」を含む。
【０１０５】
上記百分率の同一性をもつ配列又は相補的配列は元の配列を単離、誘導した起源に由来するものでもそれ以外の起源に由来するものでもよく、例えば真核生物（例えばＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種（例えばＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍやＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種（例えばＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ種（例えばＣｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｎａｎｏｄｅｓ）、Ｅｎｔｏｍｏｒｐｈｔｈｏｒａ種（例えばＥｎｔｏｍｏｒｐｈｔｈｏｒａ  ｅｘｉｔａｌｉｓ）、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ種（例えばＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａやＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）、Ｌｅｐｔｏｍｉｔｕｓ種（例えばＬｅｐｔｏｍｉｔｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ種、Ｐｙｔｈｉｕｍ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ種（例えばＰｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ種、Ｐｈｙｔｏｐｈａｔｈｏｒａ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｃｏｉｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ｍｕｃｏｒ種（例えばＭｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓやＭｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒｉ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ、Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｃａｒｔｅｒａｅ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ  ｏｖａｔａ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｇｏｎｙａｕｌａｘ  ｐｏｌｙｅｄｒａ、Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ種（例えばＧｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｎｅｌｓｏｎｉ）、Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ種（例えばＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）、Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  ＭＫ８８０５、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｆｒｕｓｔｕｌｕｍ、Ｐａｖｌｏｖａ種（例えばＰａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ  ｃｏｒｄａｔｕｍ、Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ  ｌｅｎｓ、及びＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）、低温細菌（例えばＶｉｂｒｉｏ種（例えばＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ））、酵母（例えばＤｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ  ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔａ）、ハエ類（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）やＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ種（例えばＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）等の非哺乳動物生物、又は哺乳動物（例えばヒト又はマウス）が挙げられる。このような配列はａｌｐｉｎａ種以外のＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属に由来するものでもよく、例えばＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ、及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ、ｖａ．ａｎｇｕｌｉｓｐｏｒａが挙げられる。
【０１０６】
更に、本発明は本発明のヌクレオチド配列（即ち配列番号１（ＭＡＥＬＯ）、配列番号２（ＧＬＥＬＯ）、配列番号３（ＨＳＥＬＯ１）、配列番号４（ＣＥＥＬＯ１））、配列番号５（ＭＥＬＯ４）、配列番号６（ＭＥＬＯ７）、配列番号７（ＴＥＬＯ１）、及び配列番号１１９（ＰＥＬＯ１））と、上記のような非Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ又は非哺乳動物起源等に由来し、上記相補性又は対応性／同一性をもつ対応配列のフラグメント及び誘導体にも関する。上記配列の機能的等価物（即ちエロンガーゼ活性をもつ配列）も本発明に含まれる。
【０１０７】
本発明の趣旨では、「相補性」とは２種のＤＮＡセグメント間の関連度として定義される。これは一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖と適当な条件下でハイブリダイズして二重螺旋を形成する能力を測定することにより決定される。二重螺旋では一方の鎖にアデニンが現れ、他方の鎖にチミンが現れる。同様に、一方の鎖にグアニンが存在する場合には、他方にシトシンが存在する。２種のＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連度が大きいほど、２種のＤＮＡセグメントの鎖間にハイブリッドデュプレクスを形成する能力は高い。
【０１０８】
「同一性」なる用語は特定比較窓又はセグメントにおける２種の配列のヌクレオチド間の関連度を意味する。即ち、同一性とは２種のＤＮＡセグメント（又は２種のアミノ酸配列）の同一鎖（センス又はアンチセンス）間の同一、対応又は等価度として定義される。「配列同一性百分率」は２種の最適に整列させた配列を特定領域にわたって比較し、両者配列で塩基又はアシノ酸が一致する位置の数を測定して整合位置数を求め、このような位置数を比較するセグメントの合計位置数で割って１００を掛けることにより計算される。最適配列整列はＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法及び関連アルゴリズムを実行するコンピュータープログラム（例えばＣｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら，ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により実施することができる。（米国特許第５，９１２，１２０号参照。）
【０１０９】
２種のアミノ酸配列間の「類似度」とは両者配列における一連の一致する保存アミノ酸残基の存在として定義される。２種のアミノ酸配列間の類似度が高いほど、２種の配列の対応、同一又は等価度は高い。（２種のアミノ酸配列間の「同一性」とは両者配列における一連の厳密に同一ないし不変のアミノ酸残基の存在として定義される。）「相補性」、「同一性」及び「類似度」の定義は当業者に周知である。
【０１１０】
「〜によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ポリペプチド配列又はその一部は核酸配列によりコードされるポリペプチドからの少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、更に好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
本発明はエロンガーゼ活性をコードし、上記ヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸に適度にストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能な単離ヌクレオチド配列も含む。核酸分子の１本鎖形が適当な温度及びイオン強度条件下で別の核酸分子とアニールできるときに核酸分子は別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。温度及びイオン強度条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」には２種の核酸が相補的配列を含んでいることが必要である。他方、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間にミスマッチが生じる場合がある。核酸をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェンシーは核酸の長さと相補度に依存する。このような変数は当業者に周知である。より具体的には、２種のヌクレオチド配列間の類似度又は相同度が高いほどこれらの配列をもつ核酸のハイブリッドのＴｍ値は大きい。１００ヌクレオチド長を越えるハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。もっと短い核酸とのハイブリダイゼーションではミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。
【０１１２】
本明細書で使用する「単離核酸フラグメント又は配列」とは場合により合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含む１本鎖又は２本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離核酸フラグメントはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１個以上のセグメントから構成され得る（特定ポリヌクレオチドの「フラグメント」とは特定ヌクレオチド配列のある領域に同一又は相補的な少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。）（通常はその５’−一リン酸形で存在する）ヌクレオチドはその１文字表記により次のように表す。「Ａ」はアデニル酸又はデオキシアデニル酸（夫々ＲＮＡ又はＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸又はデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸又はデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（Ａ又はＧ）、「Ｙ」はピリミジン（Ｃ又はＴ）、「Ｋ」はＧ又はＴ、「Ｈ」はＡ又はＣ又はＴ、「Ｉ」はイノシン、「Ｎ」は任意ヌクレオチドを表す。
【０１１３】
「機能的に等価であるフラグメント又はサブフラグメント」及び「機能的に等価なフラグメント又はサブフラグメント」なる用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語はフラグメント又はサブフラグメントが活性酵素をコードするか否かに関係なく遺伝子発現を改変するか又は所定表現型を生産する能力を維持する単離核酸フラグメントの一部又はサブ配列を意味する。例えば、フラグメント又はサブフラグメントをキメラ構築物の設計に使用し、形質転換植物で所望表現型を生産することができる。キメラ構築物は活性酵素をコードするか否かに関係なく核酸フラグメント又はそのサブフラグメントを植物プロモーター配列に対して適当な方向で連結することにより同時抑制又はアンチセンスで使用するように設計することができる。
【０１１４】
「相同性」、「相同」、「実質的に類似｜及び「実質的に対応」等の用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語はフラグメント間で１個以上のヌクレオチド塩基が相違するが、遺伝子発現を媒介又は所定表現型を生産する能力は変わらない核酸フラグメントを意味する。これらの用語は得られる核酸フラグメントの機能的性質が元の未改変フラグメントに対して実質に変わらない本発明の核酸フラグメントの変異（例えば１個以上のヌクレオチドの欠失又は挿入）も意味する。従って、当業者に自明の通り、本発明は特定例示配列以外の配列も含むものとする。
【０１１５】
「遺伝子」とはコーディング配列に先行する調節配列（５’非コーディング配列）と後続する調節配列（３’非コーディング配列）を含めた特定蛋白質を発現する核酸フラグメントを意味する。
【０１１６】
「天然遺伝子」とはそれ自体の調節配列と共に天然に存在する遺伝子を意味する。これに対して「キメラ構築物」とは通常は天然に共存しない核酸フラグメントの組み合わせを意味する。従って、キメラ構築物は異なる起源に由来する調節配列とコーディング配列を含むか、又は同一起源に由来するが、通常天然に存在するとは異なる方法で配置された調節配列とコーディング配列を含むことができる（「単離」なる用語は配列をその天然環境から取出すことを意味する。）
【０１１７】
「外来」遺伝子とは宿主生物に通常存在しないが、遺伝子導入により宿主生物に導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は非天然生物又はキメラ構築物に挿入された天然遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」とは形質転換法によりゲノムに導入された遺伝子である。
【０１１８】
「コーディング配列」とは特定アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「調節配列」とはコーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内部、又は下流（３’非コーディング配列）に配置され、関連コーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性又は翻訳に作用するヌクレオチド配列を意味する。調節配列としては限定されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化認識配列が挙げられる。
【０１１９】
「プロモーター」とはコーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は近位及び遠位上流エレメントから構成され、後者エレメントはエンハンサーと呼ぶことが多い。従って、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することが可能なＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有エレメントでもよいし、プロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントでもよい。調節配列（例えばプロモーター）は遺伝子の転写部分の内部に配置してもよいし、及び／又は転写配列の下流に配列してもよい。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来するものでもよいし、天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成してもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含むものでもよい。当業者に自明の通り、種々のプロモーターが種々の組織もしくは細胞型で、又は種々の発生段階で、又は種々の環境条件に応答して遺伝子の発現を誘導することができる。殆どの細胞型で殆どの時点に遺伝子を発現させるプロモーターを一般に「構成的プロモーター」と言う。植物細胞で有用な種々の型の新規プロモーターが絶えず発見されつつあり、ＯｋａｍｕｒｏとＧｏｌｄｂｅｒｔ，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ  １５：１−８２に多数の例がまとめられている。更に、殆どの場合に調節配列の厳密な境界は完全に決定されていないので、所定変異のＤＮＡフラグメントが同一プロモーター活性をもつこともあると考えられる。
【０１２０】
「イントロン」は蛋白質配列の一部をコードしない遺伝子の介在配列である。従って、このような配列はＲＮＡに転写されるが、その後、切出され、翻訳されない。この用語は切出されたＲＮＡ配列にも使用される。「エキソン」は転写される遺伝子の配列の一部であり、遺伝子から誘導される成熟メッセンジャーＲＮＡに存在するが、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部ではない。
【０１２１】
「翻訳リーダー配列」とは遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列の間に配置されたＤＮＡ配列を意味する。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流の完全にプロセスされたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は一次転写産物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性又は翻訳効率に作用し得る。翻訳リーダー配列の例は文献に記載されている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．とＦｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２２５）。
【０１２２】
「３’非コーディング配列」とはコーディング配列の下流に配置されたＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル化認識配列やｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に作用することが可能な調節配列をコードする他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは一般にｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に作用することを特徴とする。種々の３’非コーディング配列の使用がＩｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：６７１−６８０に例示されている。
【０１２３】
「ＲＮＡ転写産物」とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写により得られる産物を意味する。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるときには一次転写産物と言うが、一次産物の転写後プロセシングにより誘導されるＲＮＡ配列でもよく、その場合には成熟ＲＮＡと言う。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とはイントロンをもたないＲＮＡであり、細胞により蛋白質に翻訳できるものを意味する。「ｃＤＮＡ」とはｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、逆転写酵素を使用してこの鋳型から合成されるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは１本鎖でもよいし、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを使用して２本鎖に変換してもよい。「センス」ＲＮＡとはｍＲＮＡを含み、細胞内又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写産物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」とは標的一次転写産物又はｍＲＮＡの全部又は一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写産物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡは特定遺伝子転写産物のどの部分と相補的でもよく、即ち、５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロン、又はコーディング配列のいずれでもよい。「機能的ＲＮＡ」とはアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ又は翻訳できないが、細胞プロセスに作用する他のＲＮＡを意味する。「相補鎖」及び「逆相補鎖」なる用語は本明細書ではｍＲＮＡ転写産物に関して同義に使用し、メッセージのアンチセンスＲＮＡを意味する。
【０１２４】
「内在ＲＮＡ」なる用語は天然であるか又は非天然である（即ち組換え手段、突然変異誘発等により導入される）かを問わずに本発明の組換え構築物による形質転換前に宿主のゲノムに存在する任意核酸配列によりコードされる任意ＲＮＡを意味する。
【０１２５】
「非天然」なる用語は通常天然に存在するものと一致しない人工を意味する。
【０１２６】
「機能的に連結」なる用語は一方の核酸配列の機能が他方により調節されるように単一核酸フラグメント上で核酸配列が相互に連関していることを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節できるとき（即ちコーディング配列がプロモーターの転写制御下にあるとき）にプロモーターはコーディング配列に機能的に連結している。コーディング配列はセンス又はアンチセンス方向のいずれで調節配列に機能的に連結してもよい。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域を標的ｍＲＮＡの５’又は標的ｍＲＮＡの３’又は標的ｍＲＮＡの内部に直接又は間接的に機能的に連結してもよいし、第１の相補領域を標的ｍＲＮＡの５’に機能的に連結し、その相補鎖を３’に機能的に連結してもよい。
【０１２７】
本明細書で使用する「発現」なる用語は機能的最終産物の生産を意味する。遺伝子の発現には遺伝子の転写とｍＲＮＡから前駆物質又は成熟蛋白質への翻訳が必要である。「アンチセンス阻害」とは標的蛋白質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写産物の生産を意味する。「同時抑制」とは同一又は実質的に類似する外来又は内在遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写産物の生産を意味する（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【０１２８】
「成熟」蛋白質とは翻訳後プロセシングしたポリペプチド、即ち一次翻訳産物に存在するプレ又はプロペブチドを除去したポリペプチドを意味する。「前駆物質」蛋白質とはｍＲＮＡの一次翻訳産物、即ちプレ及びプロペブチドがまだ存在するものを意味する。プレ及びプロペブチドとしては限定されないが、細胞内局在シグナルが挙げられる。
【０１２９】
「安定な形質転換」とは宿主生物のゲノムに核酸フラグメントを導入し、遺伝的に安定な遺伝を得ることを意味する。これに対して、「一過性形質転換」とは核酸フラグメントを宿主生物の核又はＤＮＡ含有オルガネラに導入し、組込み又は安定な遺伝なしに遺伝子発現させることを意味する。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と言う。コメ、トウモロコシ及び他の単子葉植物の好ましい細胞形質転換法は粒子加速又は「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号）、又はトランスジーンを含む適当なＴｉプラスミドを使用するアグロバクテリウム法（Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ．ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。本明細書で使用する「形質転換」なる用語は安定な形質転換と一過性形質転換の両者を意味する。
【０１３０】
本発明で使用する標準組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と言う）により詳細に記載されている。
【０１３１】
「組換え」なる用語は例えば化学合成又は遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作により、元は分離している２つの配列セグメントの人工的組合せを意味する。
【０１３２】
「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は大量の特定ＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復サイクルから構成される（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。一般に、２本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２種のプライマーを低温でアニールした後、中温で伸長させる。これらの３連続段階１組を１サイクルと言う。
【０１３３】
ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は短時間で鋳型の反復複製によりＤＮＡを数百万倍に増幅するために使用される強力な技術である。（Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，ヨーロッパ特許出願第５０，４２４号；ヨーロッパ特許出願第８４，７９６号；ヨーロッパ特許出願第２５８，０１７号；ヨーロッパ特許出願第２３７，３６２号；Ｍｕｌｌｉｓ，ヨーロッパ特許出願第２０１，１８４号，Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈ，米国特許第４，５８２，７８８号；及びＳａｉｋｉら，米国特許第４，６８３，１９４号）。この方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した特定オリゴヌクレオチドの組合せを利用してＤＮＡ合成を開始する。プライマーの設計は分析しようとするＤＮＡ配列に依存する。この方法は鋳型を高温で溶融し、プライマーを鋳型内の相補的配列にアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼで鋳型を複製するサイクルを多数回（通常は２０〜５０回）行うことにより実施される。
【０１３４】
ＰＣＲ反応産物はアガロースゲルで分離後に臭化エチジウム染色とＵＶ照射可視化より分析される。あるいは、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに加えて産物にラベルを取込ませてもよい。この場合には、ゲルをＸ線フィルムに露光することによりＰＣＲ産物を可視化する。放射性標識ＰＣＲ産物には個々の増幅産物レベルを定量できるという利点もある。
【０１３５】
本明細書では「組換え構築物」、「発現構築物」及び「組換え発現構築物」なる用語を同義に使用する。これらの用語は当業者に周知の標準方法を使用して細胞のゲノムに挿入することができる遺伝子材料の機能単位を意味する。このような構築物をそのまま使用してもよいし、ベクターに組込んで使用してもよい。ベクターを使用する場合には、ベクターの選択は当業者に周知の通り、宿主植物を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。本発明の単離核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を有効に形質転換し、選択し、増殖させるためにベクター上に配置する必要がある遺伝子要素は当業者に周知である。種々の独立した形質転換イベントの結果として各種レベル及びパターンの発現が生じる（Ｊｏｎｅｓら，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）ので、所望発現レベル及びパターンを示す系列を得るためには多重イベントをスクリーニングする必要があることも当業者に自明である。このようなスクリーニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、蛋白質発現のウェスタン分析、又は表現型分析により実施することができる。
【０１３６】
エロンガーゼ酵素の生産
エロンガーゼ酵素をコードする遺伝子を単離したら、その後、ベクター又は構築物を使用することにより原核又は真核宿主細胞に導入することができる。ベクター（例えばバクテリオファージ、コスミド又はプラスミド）はエロンガーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列と、宿主細胞で機能的であり且つヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現を誘導することが可能な任意調節配列（例えばプロモーター）を含むことができる。調節配列（例えばプロモーター）はヌクレオチド配列に機能的に連関又は機能的に連結している。（調節配列（例えばプロモーター）はコーディング配列の転写又は発現に作用する場合にコーディング配列に「機能的に連結している」と言う。）適切なプロモーターとしては例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセル酸キナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメロガロウイルス最初期、乳清酸性蛋白質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターや、ガラクトースの存在下に活性化されるプロモーター（例えばＧＡＬ１及びＧＡＬ１０）が挙げられる。更に、他の蛋白質、オリゴ糖、脂質等をコードするヌクレオチド配列や、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ−４０Ｔ−抗原、オボアルブミン又はウシ成長ホルモンのポリＡシグナル）等の他の非プロモーター調節配列もベクターに組込むことができる。構築物に組込む配列の選択は所望発現産物と宿主細胞の種類に依存する。
【０１３７】
上述のように、ベクターを構築したら、次に例えばトランスフェクション、形質転換及びエレクトロポレーション等の当業者に公知の方法により選択宿主細胞に導入することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。その後、ＰＵＦＡの発現を可能にする適切な条件下で宿主細胞を培養した後にＰＵＦＡを回収し、精製する。
【０１３８】
２種以上のｃＤＮＡ（例えばＭＡＥＬＯ、ＧＬＥＬＯ、ＨＳＥＬＯ１、ＣＥＥＬＯ１、ＴＥＬＯ１、及び／又はＰＥＬＯ１）のヌクレオチド配列を含む１個の構築物又はベクターを使用するならばユニークなトリグリセリド又は油を設計できることも留意すべきである。このベクターをその後、１種の宿主細胞に導入することができる。あるいは、配列の各々を別のベクターに導入してもよい。これらのベクターをその後、夫々２種の宿主細胞又は１種の宿主細胞に導入することができる。
【０１３９】
適切な原核宿主細胞の例としては例えば大腸菌、枯草菌及び藍色細胞（例えばＳｐｉｒｕｌｉｎａ種、即ち藍藻）等の細菌類が挙げられる。適切な真核宿主細胞の例としては例えば哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種（例えばＹａｒｒｏｗｉａ（Ｃａｎｄｉｄａ）種）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種又はＨａｎｓｅｎｕｌａ種）、又は真菌細胞（例えば糸状菌細胞、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）細胞を利用するのが好ましい。
【０１４０】
宿主細胞での発現は一過的又は安定的に行うことができる。一過的発現は導入構築物が宿主細胞で機能的な発現シグナルを含む場合に生じ得るが、当該構築物は複製されず、宿主細胞に殆ど組込まれないか又は宿主細胞は増殖していない。一過的発現は目的遺伝子に機能的に連結した調節プロモーターの活性を誘導することによっても得られるが、このような誘導系は基底発現レベルが低いことが多い。安定的発現は宿主ゲノムに組込むことができるか又は宿主細胞で自律複製する構築物を導入することにより得られる。発現構築物に配置するか又は発現構築物と同時トランスフェクトする選択マーカーを使用して目的遺伝子の安定的発現を選択した後に、マーカーを発現する細胞を選択することができる。組込みの結果として安定的発現が得られる場合には、構築物の組込み部位は宿主ゲノム内にランダムに存在していてもよいし、宿主遺伝子座との組換えをターゲットするために十分な宿主ゲノムと相同性の領域を含む構築物を使用してターゲットしてもよい。内在遺伝子座に構築物をターゲットする場合には、転写及び翻訳調節領域の全部又は一部を内在遺伝子座により提供することができる。
【０１４１】
上記の１つ又は両方のヌクレオチド配列によりコードされる目的酵素（即ちエロンガーゼ）を発現させるためにトランスジェニック哺乳動物を使用することもできる。より具体的に言うと、上記構築物を作製したら、胚の前核に挿入すればよい。その後、胚をレシピエント雌に移植すればよい。あるいは、核導入法も利用できる（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２１３０−２１３３（１９７７））。その後、妊娠及び出産させることができる（例えば米国特許第５，７５０，１７６号及び米国特許第５，７００，６７１号参照）。その後、子孫からの乳汁、組織又は他の体液試料は非トランスジェニック動物に通常検出される濃度とは異なる濃度のＰＵＦＡを含有しているはずである。後続世代をモニターし、改変又は増加濃度のＰＵＦＡが生産されているかどうかを調べ、従って所望エロンガーゼ酵素をコードする遺伝子がそのゲノムが組込まれているかどうかを調べることができる。宿主として利用する哺乳動物は例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシから構成される群から選択することができる。もっとも、目的酵素をコードするＤＮＡをそのゲノムに組込む能力をもつものであれば任意哺乳動物を使用することができる。
【０１４２】
エロンガーゼポリペプチドを発現させるには、エロンガーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的転写及び翻訳開始及び終結領域を機能的に連結する。転写及び翻訳開始及び終結領域は発現させようとするＤＮＡ、所望系で発現できることが分かっているか又はそう思われている遺伝子、発現ベクター、化学合成、又は宿主細胞の内在遺伝子座等の種々の非排他的起源に由来する。植物組織及び／又は植物部分における発現は特に組織又は部分が種子、葉、果実、花、根等の早期収穫されるものである場合に所定効率を示す。米国特許第５，４６３，１７４号、４，９４３，６７４号、５，１０６，７３９号、５，１７５，０９５号、５，４２０，０３４号、５，１８８，９５８号及び５，５８９，３７９号に記載されているような特定調節配列を利用することにより植物でその位置に発現をターゲットすることができる。あるいは、発現される蛋白質は産物を生産する酵素とすることができ、この産物は直接又は更に改変後に宿主植物からの液体フラクションに組込むことができる。エロンガーゼ遺伝子又はアンチセンスエロンガーゼ転写産物の発現は、植物部分及び／又は植物組織に存在する特定ＰＵＦＡ又はその誘導体の濃度を変化させることができる。エロンガーゼポリペプチドコーディング領域を単独又は他の遺伝子と共に発現させ、より高濃度の所望ＰＵＦＡを含有するか又はＰＵＦＡ組成が母乳により近似する組織及び／又は植物部分を作製することもできる（Ｐｒｉｅｔｏら，ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２４４９４）。終結領域は開始領域を得た遺伝子の３’領域に由来するものでもよいし、別の遺伝子に由来するものでもよい。同一及び異なる属及び種からの多数の終結領域が知られており、種々の宿主で満足できるとして知られている。終結領域は特定性質よりもむしろ便宜上から選択するのが一般的である。
【０１４３】
上述のように、植物（例えばＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（大豆）又はＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ））、植物細胞、植物組織、トウモロコシ、ジャガイモ、ヒマワリ、サフラワー又はアマを夫々エロンガーゼ酵素の発現用宿主又は宿主細胞として利用し、エロンガーゼ酵素をＰＵＦＡの生産に利用してもよい。より具体的に言うと、所望ＰＵＦＡを種子で発現させることができる。種子油の分離方法は当分野で公知である。即ち、ＰＵＦＡ源の提供に加え、エロンガーゼ遺伝子と恐らくデサチュラーゼ遺伝子の発現により種子油成分を操作し、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料及び化粧品に添加可能な種子油を提供することができる。この場合にも、プロモーターに機能的に連結したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列を含むベクターをエロンガーゼ遺伝子の発現に十分な時間と条件下に植物組織又は植物に導入する。ベクターは更に他の酵素（例えばΔ４−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ９−デサチュラーゼ、Δ１０−デサチュラーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１３−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ及び／又はΔ１９−デサチュラーゼ）をコードする１種以上の遺伝子も含むことができる。植物組織又は植物は酵素の作用を受ける該当基質（例えばＤＧＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＥＰＡ、２０：４ｎ−３等）を生産することができ、あるいはこのような基質を生産する酵素をコードするベクターを該当植物組織、植物細胞、植物、又は宿主細胞に導入することができる。更に、適当な酵素を発現する植物組織に基質を噴霧してもよい。これらの種々の技術を使用して、該当植物細胞、植物組織、植物、又は宿主細胞の使用によりＰＵＦＡ（例えばＤＧＬＡ、ＡＡもしくはＡＤＡ等のｎ−６不飽和脂肪酸、又はＥＰＡもしくはＤＨＡ等のｎ−３脂肪酸）を生産することができる。本発明は更に上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として例えばトランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関するにことに留意すべきである。
【０１４４】
天然又は組換えにより宿主細胞により生産され得る基質と、後から宿主細胞に導入するベクターに存在するＤＮＡ配列によりコードされ得る酵素を図１に示す。
【０１４５】
上記に鑑み、本発明は１）エロンガーゼｃＤＮＡの所望ヌクレオチド配列を単離する段階と、２）前記ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、３）エロンガーゼ酵素の生産に十分な時間及び条件で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含むエロンガーゼ酵素の１種の生産方法にも関する。
【０１４６】
本発明はエロンガーゼが酸をポリ不飽和脂肪酸に変換するように上記のように生産されたエロンガーゼに酸を暴露する段階を含むポリ不飽和脂肪酸の生産方法にも関する。例えば、ＧＬＡをエロンガーゼに暴露すると、ＤＧＬＡに変換される。次にＤＧＬＡをΔ５−デサチュラーゼに暴露すると、ＤＧＬＡをＡＡに変換することができる。次に、Δ１７−デサチュラーゼを使用することによりＡＡをＥＰＡに変換することができ、更にエロンガーゼとΔ４−デサチュラーゼの使用によりＤＨＡに変換することができる。あるいは、エロンガーゼを使用して１８：４ｎ−３を２０：４ｎ−３に変換した後にΔ５−デサチュラーゼに暴露してＥＰＡに変換することができる。エロンガーゼを使用して１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に変換した後にΔ８−デサチュラーゼにより２０：４ｎ−３に変換することもできる。従って、エロンガーゼは個々の有益な目的に使用することができるポリ不飽和脂肪酸の生産に使用することができる。（エロンガーゼ酵素が数種の生合成経路で果たす多数の重要な役割の例証としては図１参照。）
【０１４７】
エロンガーゼ遺伝子とこの遺伝子によりコードされる酵素の使用
【０１４８】
上述のように、単離エロンガーゼｃＤＮＡとそれによりコードされる対応するエロンガーゼ酵素（又は精製ポリペプチド）は多くの用途がある。例えば、各ｃＤＮＡと対応する酵素は単独又は組合せて間接又は直接的にポリ不飽和脂肪酸（例えばＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、２０：４ｎ−３又はＥＰＡ）の生産に使用することができる。（「直接」なる語は酵素が酸から別の脂肪酸への直接変換を触媒するために使用される状況（例えばＧＬＡからＤＧＬＡへの変換）を含む）。「間接」とはある脂肪酸がエロンガーゼにより別の脂肪酸（即ち経路中間体）（例えばＧＬＡからＤＧＬＡ）に変換された後にこの脂肪酸がエロンガーゼ以外の酵素の使用により更に別の脂肪酸（例えばΔ５−デサチュラーゼによりＤＧＬＡからＡＡ）に変換される状況を含む）。これらのポリ不飽和脂肪酸（即ちエロンガーゼ酵素の活性により直接又は間接的に生産されたもの）は例えば栄養組成物、医薬組成物、化粧品及び動物飼料に添加することができ、これらのいずれも本発明に含まれる。このような使用について以下に詳述する。
【０１４９】
栄養組成物
本発明は栄養組成物を含む。本発明の趣旨では、このような組成物としては体内に取込まれると、（ａ）組織を滋養もしくは強化又はエネルギーを供給し、及び／又は（ｂ）十分な栄養状態又は代謝機能を維持、回復又は補助するにように作用するヒト消費用（経腸及び／又は非経口消費用を含む）任意食品又は製剤が挙げられる。
【０１５０】
本発明の栄養組成物は夫々のエロンガーゼ遺伝子を使用して生産された少なくとも１種のエロンガーゼの使用により生産された少なくとも１種の油又は酸を含み、固体形態でも液体形態でもよい。更に、組成物は特定用途に必要な量の食用主要栄養素、ビタミン及び／又はミネラルを添加することができる。これらの成分の量は組成物を健常幼児、児童又は所定の代謝状態（例えば代謝障害）をもつ等の特殊な必要性をもつ成人に使用するのかによって異なる。
【０１５１】
組成物に添加できる主要栄養素の例としては限定されないが、食用脂肪、炭水化物及び蛋白質が挙げられる。このような食用脂肪の例としては限定されないが、ヤシ油、大豆油並びにモノ及びジグリセリドが挙げられる。このような炭水化物の例としては限定されないが、蔗糖、食用乳糖及び加水分解澱粉が挙げられる。更に、本発明の栄養組成物で利用可能な蛋白質の例としては限定されないが、大豆蛋白質、電気透析乳清、電気透析脱脂乳、乳清、又はこれらの蛋白質の加水分解物が挙げられる。
【０１５２】
ビタミンとミネラルについては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、並びにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ及びＢ複合体を本発明の栄養組成物に添加できる。他の同様のビタミンとミネラルも添加できる。
【０１５３】
本発明の栄養組成物で利用する成分は半精製又は精製物に由来する。半精製又は精製とは、天然材料の精製又は合成により製造した材料を意味する。
【０１５４】
本発明の栄養組成物の例としては限定されないが、乳児用調製乳、栄養補助食品、代用食品及び再水和組成物が挙げられる。特に有利な栄養組成物としては限定されないが、経腸及び非経口乳児用補給剤、特殊乳児用調製乳、高齢者用補給剤、及び胃腸障害及び／又は吸収不良者用補給剤が挙げられる。
【０１５５】
本発明の栄養組成物は食事の補充を必要としない場合にも食品に添加できる。例えば、組成物は任意種の食品に添加することができ、限定されないがマーガリン、調整バター、チーズ、ミルク、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック菓子、サラダ油、調理用油、調理用脂肪、肉類、魚肉及び飲料が挙げられる。
【０１５６】
本発明の好適態様では、栄養組成物は経腸栄養製剤であり、成人又は小児経腸栄養製剤がより好ましい。この組成物は慢性又は急性疾患状態によるストレスや特殊処置が必要な成人又は小児に投与することができる。組成物は本発明により生産されたポリ不飽和脂肪酸に加え、上記のような主要栄養素、ビタミン及びミネラルを添加することができる。主要栄養素は母乳に含まれる量と等価の量を添加するか又はエネルギー換算即ちカロリー当たりの換算で添加することができる。
【０１５７】
液体又は固体経腸及び非経口製剤の製剤化方法は当分野で周知である。（下記実施例も参照されたい。）
経腸製剤は例えば滅菌後に即製（ＲＴＦ）式で利用してもよいし、濃縮液体又は粉末で保存してもよい。粉末は上記のように調製した製剤を噴霧乾燥して製造し、濃縮物を再水和して再構成することができる。成人及び小児栄養製剤は当分野で公知であり、市販されている（例えばＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）及びＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標）がＲｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏから市販されている）。本発明により生産された油又は脂肪酸をこれらの製剤の任意のものに添加することができる。
【０１５８】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態の場合には約０．６ｋｃａｌ〜約３ｋｃａｌ／ｍｌとすることができる。固体又は粉末形態の場合には、栄養補給剤は約１．２〜＞９ｋｃａｌ／ｇ、好ましくは約３〜７ｋｃａｌ／ｇとすることができる。一般に、液体製剤の浸透圧は７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満とする。
【０１５９】
栄養製剤には本発明により生産されたＰＵＦＡ以外に上記のような主要栄養素、ビタミン及びミネラルを添加することができる。これらの付加成分の存在は個体がこれらの成分の最小１日必要量を摂取するのを助ける。ＰＵＦＡの供給に加え、亜鉛、銅、葉酸及び酸化防止剤を組成物に加えると望ましい場合もある。これらの物質はストレス下の免疫系を強化するので、組成物を投与する個体に更に有利であると考えられる。これらの成分は医薬組成物にも添加できる。
【０１６０】
より好ましい態様では、栄養組成物は酸化防止剤と少なくとも１種のＰＵＦＡに加えて炭水化物源を含み、炭水化物の少なくとも５重量％は食用オリゴ糖である。より好ましい態様では、栄養組成物は更に蛋白質、タウリン及びカルニチンを含む。
【０１６１】
上述のように、本発明により生産されたＰＵＦＡ又はその誘導体は代用食品又は補助食品、特に乳児用調製乳に添加し、点滴栄養患者や、栄養不良又は他の状態もしくは疾患状態の予防又は治療に用いることができる。背景として、母乳はＤＨＡ約０．１５％〜約０．３６％、ＥＰＡ約０．０３％〜約０．１３％、ＡＡ約０．３０％〜約０．８８％、ＤＧＬＡ約０．２２％〜約０．６７％、及びＧＬＡ約０．２７％〜約１．０４％の脂肪酸プロフィルをもつことに留意すべきである。従って、本発明により生産されたＤＧＬＡ、ＡＡ、ＥＰＡ及び／又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の脂肪酸は例えば母乳のＰＵＦＡ含量をより忠実に再現するように乳児用調製乳の組成を変更したり、非ヒト哺乳動物乳に通常含まれるＰＵＦＡ含量を変えるために使用することができる。特に、薬剤又は食品補給剤、特に母乳代用剤又は補給剤に使用する組成物はＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの１種以上を含むことが好ましい。組成物はＡＡ約０．３〜３０％、ＤＧＬＡ約０．２〜３０％及び／又はＧＬＡ約０．２〜約３０％を含むことがより好ましい。
【０１６２】
トリグリセリドとして計算した場合に脂肪酸約２〜約３０重量％を含む非経口栄養組成物が本発明に含まれる。好適組成物は合計ＰＵＦＡ組成物の約１〜約２５重量％をＧＬＡとする（米国特許第５，１９６，１９８号）。場合により、他のビタミン、特に脂溶性ビタミン（例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ）やＬ−カルニチンも添加してもよい。所望により、約０．１重量％のα−トコフェロール等の防腐剤を添加してもよい。
【０１６３】
更に、ＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの比は特定最終用途に合わせて調節することができる。母乳補給剤又は代用剤として処方する場合には、夫々約１：１９：３０〜約６：１：０．２の比でＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの１種以上を含む組成物が提供される。例えば、動物の母乳は１：１９：３０〜６：１：０．２のＡＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡ比をとることができ、約１：１：１、１：２：１、１：１：４の中間比をとることが好ましい。宿主細胞で一緒に生産させる場合には、ＧＬＡやＤＧＬＡ等の前駆物質基質からＡＡへの変換速度及び百分率の調節を使用してＰＵＦＡ比を厳密に制御することが好ましい。例えば、ＡＡ対ＤＧＬＡ比を約１：１９にするには５％〜１０％のＤＧＬＡからＡＡへの変換率を使用することができ、ＡＡ対ＤＧＬＡ比を約６：１にするには約７５％〜８０％の変換率を使用することができる。従って、細胞培養系中であるか宿主動物中であるかに関係なく、エロンガーゼ発現のタイミング、程度及び特異性と、他のデサチュラーゼの発現の調節を使用してＰＵＦＡ濃度及び比を調節することができる。本発明により生産されたＰＵＦＡ／酸（例えばＡＡ及びＤＧＬＡ）をその後、所望濃度及び比で他のＰＵＦＡ又は他のＰＵＦＡ／酸（例えばＧＬＡ）と配合してもよい。
【０１６４】
更に、本発明により生産されたＰＵＦＡ又はこれらのＰＵＦＡを含む宿主細胞を動物飼料補給剤として使用し、動物の組織又は乳脂肪酸組成をヒト又は動物消費により望ましいものに改変することもできる。
【０１６５】
医薬組成物
本発明は本明細書に記載する方法によりエロンガーゼｃＤＮＡの少なくとも１種を使用して生産された脂肪酸及び／又はその産物である油の１種以上を含む医薬組成物にも関する。より具体的には、このような医薬組成物は酸及び／又は油の１種以上と医薬的に許容可能な標準周知非毒性キャリヤー、アジュバント又は溶媒、例えばリン酸緩衝食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤又はエマルション（例えば水／油エマルション）を含むことができる。組成物は液体形態でも固体形態でもよい。例えば、組成物は錠剤、カプセル剤、飲用液剤もしくは散剤、注射剤、又は局所軟膏もしくはクリームの形態とすることができる。例えば分散液の場合には必要粒度を維持し、界面活性剤を使用することにより適正な流動性を維持することができる。例えば糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を加えると望ましい場合もある。このような不活性希釈剤以外に、湿潤剤、乳化懸濁剤、甘味料、調味料及び香料等のアジュバントを組成物に加えてもよい。
【０１６６】
懸濁液は活性化合物以外に例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル類、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天−寒天及びトラガカントガム又はこれらの物質の混合物等の懸濁剤を含むことができる。
【０１６７】
錠剤やカプセル剤等の固体剤形は当分野で周知の技術を使用して製造することができる。例えば、本発明により生産されたＰＵＦＡに乳糖、蔗糖及びコーンスターチ等の慣用錠剤基剤と結合剤（例えばアラビアガム、コーンスターチ又はゼラチン）、崩壊剤（例えばジャガイモ澱粉又はアルギン酸）及び滑沢剤（例えばステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム）を加えて錠剤化することができる。カプセル剤は酸化防止剤と該当ＰＵＦＡと共にこれらの賦形剤をゼラチンカプセルに封入することにより製造することができる。酸化防止剤とＰＵＦＡ成分は上記ガイドラインの範囲に納まるようにする。
【０１６８】
静脈内投与には、本発明により生産されたＰＵＦＡ又はその誘導体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（登録商標）等の市販製剤に配合すればよい。典型的な健常成人血漿脂肪酸プロフィルはＡＡ６．６４〜９．４６％、ＤＧＬＡ１．４５〜３．１１％、及びＧＬＡ０．０２〜０．０８％を含む。患者で正常な脂肪酸プロフィルに達するようにこれらのＰＵＦＡ又はその代謝前駆物質を単独又は他のＰＵＦＡと併用して投与することができる。所望により、製剤の各成分を個々に提供してもよいし、１回又は複数回使用するキット形態で提供してもよい。特定脂肪酸の典型的な用量は１日に０．１ｍｇ〜２０ｇ（１００ｇまで）であり、１日に約１０ｍｇ〜約１、２、５又は１０ｇが好ましい。
【０１６９】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては例えば経腸（例えば経口及び直腸）と非経口が挙げられる。例えば、液体製剤を例えば経口又は直腸投与することができる。更に、均一混合物を水に完全に分散し、滅菌条件下に生理的に許容可能な希釈剤、防腐剤、緩衝液又は推進剤と混合し、スプレー又は吸入剤を形成することができる。
【０１７０】
投与経路は当然のことながら所望効果に依存する。例えば、肌荒れ、乾燥又は老化した皮膚の治療や、皮膚損傷又は火傷の治療や、疾病又は障害により損傷した皮膚又は毛髪の治療に組成物を利用する場合には、局所塗布することができる。
【０１７１】
組成物の患者投与量は当業者が決定することができ、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態等の種々の因子により異なる。
【０１７２】
剤形としては、組成物は例えば液剤、分散液、懸濁液、エマルション又は後で再構成する滅菌粉末とすることができる。
【０１７３】
本発明は更に本明細書に記載する医薬及び／又は栄養組成物の使用による各種疾患の治療にも関する。特に、本発明の組成物は血管形成後再狭窄の治療に使用することができる。更に、炎症、関節リウマチ、喘息及び乾癬の症状も本発明の組成物で治療することができる。ＰＵＦＡはカルシウム代謝に関与していることも分かっているので、本発明の組成物は骨粗鬆症や腎臓又は尿管結石の治療又は予防にも利用できる。
【０１７４】
更に、本発明の組成物は癌の治療にも使用できる。悪性細胞は脂肪酸組成が変化していることが示されている。脂肪酸を加えるとその増殖を抑制し、細胞死をもたらし、化学治療剤感受性を増すことが示されている。更に、本発明の組成物は癌に伴う悪液質の治療にも有用であると思われる。
【０１７５】
本発明の組成物は糖尿病の治療にも使用することができる（例えば米国特許第４，８２６，８７７号とＨｏｒｒｏｂｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｖｏｌ．５７（Ｓｕｐｐｌ．）７３２Ｓ−７３７Ｓ参照）。糖尿病動物では脂肪酸代謝及び組成の変化が示されている。
【０１７６】
更に、エロンガーゼ酵素の使用により直接又は間接的に生産されたＰＵＦＡを含む本発明の組成物は湿疹治療、血圧降下、及び検査数値の改善にも使用できる。更に、本発明の組成物は血小板凝固の抑制、血管拡張の誘導、コレステロールレベル低下、血管平滑筋及び繊維組織の増殖抑制（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８３，ｐ．８５−１０１，１９７６）、胃腸出血及び非ステロイド抗炎症薬の他の副作用の緩和又は予防（米国特許第４，６６６，７０１号参照）、子宮内膜症や月経前症候群の予防又は治療（米国特許第４，７５８，５９２号参照）、並びにウイルス感染後の筋肉脊髄炎及び慢性疲労の治療（米国特許第５，１１６，８７１号参照）にも使用できる。
【０１７７】
本発明の組成物の他の用途としてはＡＩＤＳ、多発性硬化症及び炎症性皮膚疾患の治療と、健康維持が挙げられる。
【０１７８】
更に、本発明の組成物は化粧目的にも利用できる。混合物を形成するように既存化粧品組成物に添加してもよいし、単独組成物として使用してもよい。
【０１７９】
獣医用途
動物は要求及び条件の多くがヒトと同一であるので、上記医薬及び栄養組成物は動物（即ち家畜又は非家畜）でもヒトと同様に利用できることに留意すべきである。例えば、本発明の油又は酸は動物飼料添加物、動物代用飼料、動物ビタミン又は動物局所軟膏に利用することができる。
【０１８０】
以下、実施例により本発明を説明するが、これにより発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１８１】
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａにおけるコドン使用の分析
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーから１０００個のランダムｃＤＮＡクローンの５’末端を配列決定した。ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））とＦａｓｔＡアルゴリズム（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））を使用して６個の読み枠で配列を翻訳し、特にＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（ＧｅｎｅＢｉｏ，Ｇｅｎｅｖａ，スイス）を使用してクエリー配列と同一型（核酸又は蛋白質）の配列群の類似性を検索した。クローンの多くが既知遺伝子との蛋白質配列相同性により推定ハウスキーピング遺伝子として同定された。データベースの既知ハウスキーピング遺伝子とマッチした２１個のＭ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡ配列を選択した（下表１参照）。これらの２１個の配列と全長Ｍ．ａｌｐｉｎａΔ５−（図１８参照）、Δ６−、及びΔ１２−デサチュラーゼ配列に基づいてＭ．ａｌｐｉｎａコドンバイアス表（表２参照）を作成した。Ｍ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡ配列によりコードされる推定蛋白質と既知蛋白質配列のＦａｓｔＡアラインメントは所定領域で弱いので、相同性の高い領域からのコドンのみを使用した。
【０１８２】
【表１】
2005527238.tif 000002
【０１８３】
【表２】
2005527238.tif 000003
【実施例２】
【０１８４】
Ｍ．ａｌｐｉｎａ由来全長エロンガーゼ様ｃＤＮＡのクローニング
ホホバ由来β−ケトアシル補酵素Ａシンターゼ（ＫＣＳ）とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエロンガーゼ（ＥＬＯ２）を整列させ、アミノ酸相同領域を決定した（図２参照）。２種のエロンガーゼ間の相同アミノ酸に対応する配列領域にコドンバイアスを適用し、このバイアス配列に基づいてプライマーを設計した（図３参照）。平均インサートサイズ１．１Ｋｂのクローン約６×１０５個を含むＭ１１  Ｍ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｋｎｕｔｚｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））からｃＤＮＡを切り出した。切り出したｃＤＮＡを内部プライマーＲＯ３３９（５’−ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＣＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ−３’）とベクターフォワードプライマーＲＯ３１７（５’−ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  Ｇ−３’）で増幅した。切り出したＭ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリー３００ｎｇ、各プライマー５０ｐｍｏｌｅ、１０Ｘ緩衝液１０μｌ、１０ｍＭ  ＰＣＲヌクレオチドミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）１μｌ及びＴａｑポリメラーゼ１．０Ｕを含有する１００μｌ容量中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）のサーモサイクラー条件は９４℃２分間の後、９４℃１分、５８℃２分、及び７２℃３分を３０サイクルとした。ＰＣＲ後に７２℃で７分間の付加伸長を実施した。
【０１８５】
ＰＣＲ増幅産物をゲル泳動させ、約３６０ｂｐの増幅フラグメントをゲル精製し、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して単離フラグメントを直接配列決定した。ＧＣＧの配列分析パッケージを使用し、得られた配列を既知配列と比較した。ＧＣＧ分析プログラムでＦａｓｔＡアルゴリズム（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，前出）を使用して全６個の読み枠で配列を翻訳した。蛋白質のＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（ＧｅｎｅＢｉｏ，Ｇｅｎｅｖａ，スイス）を検索した。この翻訳ｃＤＮＡフラグメントは推定蛋白質配列とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＥＬＯ２（ＧＮＳ１）の相同性により６３アミノ酸に４１．３％の同一性をもつ推定エロンガーゼの一部として同定された。
【０１８６】
推定エロンガーゼ配列とＭ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用したベクターｐＺＬ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）配列に基づいて新規プライマーを設計した。付加ＢａｍＨＩ制限部位（下線部）をもつプライマーＲＯ３５０（５’−ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＴＧ−３’）とベクターリバースプライマーＲＯ３５２（５’−ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＡＡ  ＡＧＣ  ＴＴＧ−３’）を使用して切り出したＭ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーを再びＰＣＲ増幅し、上記条件を使用して全長Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼｃＤＮＡを単離した。約１．５Ｋｂ  ＰＣＲ増幅フラグメントの末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）でフィルインし、平滑末端を作製し、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。この結果、ｐＲＡＥ−１及びｐＲＡＥ−２の２個のクローンが得られた（図４Ａ参照）。（プラスミドＤＮＡ  ｐＲＡＥ−２はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に１９９８年８月２８日付けで寄託し、寄託番号ＡＴＣＣ  ２０３１６６を付与された。）これらのベクターからのエロンガーゼｃＤＮＡをＥｃｏＲＩフラグメントとして切断し、ＥｃｏＲＩで消化したｐＹＸ２４２（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクターにクローニングした。クローンｐＲＡＥ−５及びｐＲＡＥ−６（図４Ｂ参照）は夫々ｐＲＡＥ−１及びｐＲＡＥ−２からのエロンガーゼｃＤＮＡをもつ。（プラスミドＤＮＡ  ｐＲＡＥ−５はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９に１９９８年８月２８日付けで寄託し、寄託番号ＡＴＣＣ  ２０３１６７を付与された。）ｐＲＡＥ−５とｐＲＡＥ−６を配列決定した処、ｐＲＡＥ−５のエロンガーゼ遺伝子の５’未翻訳領域はｐＲＡＥ−６よりも１６ｂｐ短いことが判明した（図５参照）。ｐＲＡＥ−２から完全Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼｃＤＮＡ配列ＭＡＥＬＯが得られた（図６参照）。図７はＭＡＥＬＯの翻訳から得られたアミノ酸配列である。翻訳ＭＡＥＬＯを使用してＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（ＧｅｎｅＢｉｏ，Ｇｅｎｅｖａ，スイス）を再び上記のように検索した処、ＭＡＥＬＯはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＮＳ１（ＥＬＯ２）と３１７アミノ酸で同一性４４．３％であり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＲ４（ＥＬＯ３）と３１８アミノ酸で同一性４４．７％であることが判明した。３種のエロンガーゼのＦａｓｔＡアラインメントを図８に示す。ヌクレオチドレベル（図９参照）では、ＭＡＥＬＯはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＮＳ１（ＥＬＯ２）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｓ７８６２４）と��４９ｂｐオーバーラップで同一性５７．４％である。他方、９５４ｂｐの完全ＭＡＥＬＯ遺伝子とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＮＳ１（ＥＬＯ２）の同一性は３３．０％である。
【実施例３】
【０１８７】
パン酵母におけるＭ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼｃＤＮＡの発現
構築物ｐＲＡＥ−５及びｐＲＡＥ−６をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，Ｇｅｎｅ  ８３：５７−６４（１９８９））に形質転換し、エロンガーゼ活性をスクリーニングした。ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にホホバＫＣＳを組込んだプラスミドｐＣＧＮ７８７５（Ｃａｌｇｅｎｅ  ＬＬＣ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）を陽性対照として使用した。Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）でエロンガーゼ活性を検出するために使用した基質はＧＬＡであり、ホホバＫＣＳではオレイン酸（ＯＡ）を使用した。陰性対照株はｐＹＸ２４２を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４とした。培養物を選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１３，ｐ．３−５（１９９２））で特定基質の存在下に４０〜４８時間２５℃で増殖させた。ｐＹＥＳ２にクローニングしたホホバＫＣＳ遺伝子の発現はＧＡＬ１プロモーターの制御下に行い、ｐＹＸ２４２のプロモーターは構成的なＴＰ１である。従って、３３４（ｐＣＧＮ７８７５）及び３３４（ｐＹＥＳ２）培養物はガラクトースで誘導した。各細胞ペレットの脂質フラクションのＧＣ−ＦＡＭＥ分析を従来記載されているように実施した（Ｋｎｕｔｚｏｎら，前出）。
【０１８８】
各種実験のエロンガーゼ活性結果を図１０Ａ及び１０Ｂに示す。ホホバＫＣＳは長鎖モノ不飽和脂肪酸１８：１ｎ−９を２０：１ｎ−９に伸長した。Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＥＬＯ２及びＥＬＯ３のアミノ酸相同性から、これらの遺伝子によりコードされる蛋白質は類似の基質特異性をもつことが示唆された。Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の活性は長鎖モノ不飽和及び飽和脂肪酸の伸長であり、１８：１ｎ−９から２０：１ｎ−９への変換だけでなく２４：０の合成にも認められる。対照株３３４（ｐＹＸ２４２）は２０：１と２４：０の量が殆ど又は全く検出できない（図１０Ａ参照）。Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）は少なくとも１種のＰＵＦＡにも作用し、１８：３ｎ−６（ＧＬＡ）を２０：３ｎ−６（ＤＧＬＡ）に変換する。総脂質中の２０：３ｎ−６の百分率はＭ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）ｃＤＮＡをもつ３３４（ｐＲＡＥ−５）及び３３４（ｐＲＡＥ−６）株のほうが対照３３４（ｐＹＸ２４２）よりも高い。２０：３ｎ−６の生産率は３３４（ｐＹＸ２４２）では０．０９２％であるが、３３４（ｐＲＡＥ−５）では０．３２４％であり、３３４（ｐＲＡＥ−６）では０．２６９％である（図１０Ａ及び１０Ｂの括弧内に示す）。この脂肪酸プロフィルの相異は２０：３ｎ−６の総生産量にも認められる。２０：３ｎ−６は３３４（ｐＹＸ２４２）では０．２２６μｇしか生産されなかったが、夫々３３４（ｐＲＡＥ−５）は２．５０４μｇ、３３４（ｐＲＡＥ−６）は１．００６μｇの２０：３ｎ−６を生産した。また、基質を添加しないと、２０：３ｎ−６レベルは検出できない。
【０１８９】
２０：３ｎ−６がＭ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）により生産されると、Δ５−デサチュラーゼはこれを所望発現システムでＡＡに変換することができる。この仮説をを試験するために、構築物ｐＲＡＥ−５及びｐＣＧＲ−４（Δ５−デサチュラーゼを含むプラスミド）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４に同時形質転換し、ＡＡ生産をスクリーニングした。使用した基質は２５μＭ  ＧＬＡ（１８：３ｎ−６）とした。Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）が酵母で活性であるならば、基質はＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）に変換され、更にΔ５−デサチュラーゼによりＡＡ（２０：４ｎ−６）に変換されるであろう。図１１の結果からＡＡの生産、従って、Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の活性が確認される。
【０１９０】
酵母でΔ５−、Δ６−、及びΔ１２−デサチュラーゼをエロンガーゼと共に発現させると、脂肪酸を外部から供給する必要なしにＡＡが生産されると思われる（図１参照）。
【実施例４】
【０１９１】
パン酵母におけるＭ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼｃＤＮＡ  ＭＡＥＬＯとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエロンガーゼＥＬＯ２の発現の比較
（夫々）制限部位（下線部）ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを組込んだプライマーＲＯ５１４（５’−ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＧＧＡ ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＴＡＴＧ−３’）及びＲＯ５１５（５’−ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＡＡＧ ＣＴＴ  ＴＴＡ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＡＧ−３’）を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムライブラリー（Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から酵母エロンガーゼをコードするＥＬＯ２遺伝子をクローニングした。ＥＬＯ２遺伝子をベクターｐＹＸ２４２のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし（ｐＲＥＬＯと命名する）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前出）に形質転換し、ＰＵＦＡエロンガーゼ活性をスクリーニングした。ベクタープラスミドを陰性対照として使用し、３３４（ｐＲＡＥ−５）を増殖させてＰＵＦＡエロンガーゼ活性を比較した。ガラクトースを培地に添加せず、２５μＭ  ＧＬＡを基質として添加した以外は上述のように培養物を増殖させた。図１２に示すように、３３４（ｐＲＡＥ−５）により生産された（１８：３ｎ−６又はＧＬＡから伸長した）２０：３ｎ−６又はＤＧＬＡの量は未改変ベクターｐＹＸ２４２を含む陰性対照の約４倍であったが、２個の個体クローン３３４（ｐＲＥＬＯ−１）及び３３４（ｐＲＥＬＯ−２）は陰性対照の２倍にとどまった。更に、ＤＧＬＡ生産量を総脂質の百分率（図１２の括弧内に示す）で表すと、クローン３３４（ｐＲＥＬＯ−１）及び３３４（ｐＲＥＬＯ−２）は夫々０．１５３％と０．２％のＤＧＬＡを生産し、３３４（ｐＹＸ２４２）は０．１８５％のＤＧＬＡを生産した。従って、これらの全株は同程度の百分率のＤＧＬＡを生産した。他方、３３４（ｐＲＡＥ−５）は０．２７９％のＤＧＬＡを生産し、３３４（ｐＹＸ２４２）（陰性対照）よりも５０．８％増加した。これらのデータはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエロンガーゼ遺伝子ＥＬＯ２を酵母で過剰発現させても効果的にＧＬＡをＤＧＬＡに伸長しないことを示す。対照３３４（ｐＹＸ２４２）よりもＤＧＬＡ生産量が多いことから明らかなようにＭ．ａｌｐｉｎａ  ＰＵＦＡエロンガーゼ活性はこの変換に特異的である。
【実施例５】
【０１９２】
ＭＡＥＬＯを使用した他の起源からのエロンガーゼの同定
ＴＦａｓｔＡアルゴリズム（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，前出）を使用してクエリーペプチド配列と６個の読み枠の各々で翻訳されたデータベースＤＮＡ配列の類似性を検索した。翻訳ＭＡＥＬＯをクエリーとしてＧＣＧのＧｅｎＥＭＢＬデータベース（６／９８）でＧＣＧのＴＦａｓｔＡ検索に使用し、翻訳ＭＡＥＬＯとのそのアミノ酸類似性比較により他の潜在的エロンガーゼ配列を同定した。例えば、染色体ＩＩＩに由来する２種の異なるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列とＭＡＥＬＯの翻訳産物の２種のアラインメントを図１３及び１４に示す。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｚ６８７４９）はＧＮＳ１（ＥＬＯ２）と類似性があると注釈付けされ、他方のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｕ６１９５４）はＧＮＳ１及びＳＵＲ４（ＥＬＯ３）の両者と類似性があると注釈付けされている。これらはイントロンがゲノム配列から除去され、エキソンが集合及び翻訳されたスプライスＤＮＡフラグメントである。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに由来する推定ＰＵＦＡエロンガーゼと翻訳ＭＡＥＬＯのアミノ酸同一性は約３０％である。これは脂肪酸代謝における一般機能、例えばＰＵＦＡエロンガーゼに相当すると思われる。図１５は染色体ＩＩＩに由来する翻訳Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ配列の別例（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ００３１３４）である。ＤＮＡ配列はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＥＬＯ２とＤＮＡ相同性をもつとして同定された。このＤＮＡ配列とそのアミノ酸翻訳産物を更に分析すると、翻訳ＭＡＥＬＯと相同性があることが分かった。従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓはＰＵＦＡエロンガーゼを含むと思われる。
【０１９３】
図１６は夫々マウスとヒトに由来する翻訳ＤＮＡ配列と翻訳ＭＡＥＬＯのアラインメントを示す。マウス配列ＣＩＧ３０（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｕ９７１０７）は褐色脂肪組織から単離され、「酵母ＳＵＲ４蛋白質に類似する」と報告されている。図１６に示すように、Ｕ９７１０７翻訳産物のアミノ酸１３０〜１５２は翻訳ＭＡＥＬＯと高度の類似性がある。染色体４に由来するヒト配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＣ００４０５０）はＨＴＧＳ（高スループットゲノム配列）から単離された。この配列に注釈は付いていなかった。しかし、翻訳ＡＣ００４０５０は翻訳ＭＡＥＬＯと１５０アミノ酸で同一性２８．７％であった。この遺伝子フラグメントは翻訳ＭＡＥＬＯとのそのアミノ酸類似性により、ヒトＰＵＦＡエロンガーゼのフラグメントであると思われる。
【０１９４】
図１７は翻訳ＭＡＥＬＯと、その発現により誘導される蛋白質がグリコシル化阻害因子であると主張されている哺乳動物配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｉ０５４６５，国際公開第ＷＯ８８／０７５７７号）のアミノ酸アラインメントを示す。２種の蛋白質間のアミノ酸一致はＰＵＦＡエロンガーゼ活性等の関連機能があることを示している。
【０１９５】
他の翻訳ＤＮＡ配列と翻訳ＭＡＥＬＯに対するそれらの相同性を示したこれらの例から明らかなように、上記例のいずれも潜在的にＰＵＦＡエロンガーゼであると考えられる。これらの例は考えられるエロンガーゼの全てではない。しかし、ＭＡＥＬＯ又はそのアミノ酸翻訳産物をデータベース検索のクエリーとして使用すると、ＰＵＦＡエロンガーゼ活性をもつ他の遺伝子を同定することができる。
【実施例６】
【０１９６】
プラークハイブリダイゼーション法を使用したＭ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
Ｍ．ａｌｐｉｎａから他のＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子を単離するために、慣用プラークハイブリダイゼーション法を使用してλベクターで作製したＭ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ＭＡＥＬＯヌクレオチド配列に基づいてＤＮＡプローブを作製し、これを使用してＺｉｐｌｏｘベクター（Ｋｎｕｔｚｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））で作製したＭ７＋８  Ｍ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【０１９７】
ライブラリーのスクリーニング用ＤＮＡプローブを作製するために、ＭＡＥＬＯ  ｃＤＮＡをＮｓｐＩ及びＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。平均サイズ約３００ｂｐの３個の小ＤＮＡフラグメントを作製し、プローブとして使用した。断片化ＭＡＥＬＯ  ｃＤＮＡの混合物を使用する根拠はＭ．ａｌｐｉｎａに存在する種々のＰＵＦＡエロンガーゼ間で保存されているアミノ酸配列の共通領域ないしドメインが存在するという前提による。ＭＡＥＬＯ  ＤＮＡプローブを使用し、ｃＤＮＡライブラリーを標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）に従ってプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。
【０１９８】
要約すると、５０，０００個の初代クローンをプレーティングし、ナイロンメンブレンに移した。メンブレンを変性させ、２０％ホルムアルデヒド、０．２％  ＰＶＰ，ＢＳＡ，Ｆｉｃｏｌｌ，０．１％  ＳＤＳ及び０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有するハイブリダイゼーション用緩衝液中でα３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ＭＡＥＬＯ  ＤＮＡプローブと一晩ハイブリダイズさせた。フィルターを０．５Ｘ  ＳＳＣで３７℃にて洗浄し、オートラジオグラフィー用Ｘ線フィルムに露光した。この手順を３回繰返した。反復ハイブリダイズした４個のクローン（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，及びＦ４と呼ぶ）を釣菌し、７％  ＤＭＳＯを加えたＳＭ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）に懸濁した。
【０１９９】
各候補の最大オープンリーディングフレームを酵母発現ベクターｐＹＸ２４２（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）にサブクローニングした。ｃＤＮＡクローンＦ１及びＦ３をｐＹＸ２４２のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、Ｆ２とＦ４をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。各候補を含む組換え体ｐＹＸ２４２を酵母で発現させるためにＳＣ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前出）に形質転換した。エロンガーゼ活性と基質特異性を試験するために、各ｃＤＮＡクローンを含むＳＣ３３４を実施例３に記載したように２５μＭのＧＬＡ基質の存在下にロイシン欠損最小培地で増殖させた。Ｋｎｕｔｚｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））に記載されているように脂肪酸分析を実施した。その結果、これらの４個のｃＤＮＡクローンのいずれもＧＬＡからＤＧＬＡへの変換に有意活性を示さないことが分かった。従って、ハイブリダイゼーションアプローチは他のＰＵＦＡエロンガーゼの同定に失敗したように思われた。
【実施例７】
【０２００】
酵母におけるＭ．ａｌｐｉｎａの直接ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築
ＭＡＥＬＯ以外のＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子を同定するために、別のアプローチでＭ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。特に、パン酵母は夫々のデサチュラーゼとエロンガーゼの不在により長鎖ＰＵＦＡを生産することができないので、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでＭ．ａｌｐｉｎａのｃＤＮＡライブラリーを構築しようと試みた。ＧＡＬ１プロモーターを含むベクターｐＹＥＳ２（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｃＤＮＡライブラリーの発現に選択した。
【０２０１】
ライゲーションＤＮＡ混合物の直接エレクトロポレーションによる変換効率は精製スーパーコイルプラスミドＤＮＡの効率に比較して非常に低いので、従来のｃＤＮＡライブラリー作製方法（即ちｃＤＮＡ／ベクターライゲーションＤＮＡ混合物を宿主細胞に形質転換する方法）は酵母では困難である。しかし、この方法の大きな利点はライブラリーを大腸菌で中間体として作製する場合に生じる初代クローンの増幅を避けるという点である。スクリーニングするコロニー数が限られているため、まずｃＤＮＡ／ベクターライゲーションミックスを使用して各種Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株における形質転換効率を最適化することにした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＣ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前出）で最良の結果が得られ、ライゲーションしたＤＮＡμｇ当たり形質転換細胞４〜５ｘ１０５個の効率であった。
【０２０２】
直接Ｍ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡ発現ライブラリーを酵母で作製するために、全ＲＮＡを真菌から単離した。Ｍ．ａｌｐｉｎａ真菌（ＡＴＣＣ  ＃３２２２１）をコーンミール寒天（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）にプレーティングし、室温で３〜４日間増殖させた。真菌増殖が目に見えるようになったら、ポテトデキストロースブロス５０ｍｌに接種し、室温で非常にゆっくりと振盪し、胞子を形成させた。胞子が目に見えるようになったら、培養液５０ｍｌをポテトデキストロース培養液１リットルに接種し、胞子を７２時間増殖させた。滅菌ガーゼで濾過した後、将来のＲＮＡ抽出に備えて細胞をすぐに液体窒素で凍結した。熱フェノール／ＬｉＣｌ抽出法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）を使用して細胞ペレット３６ｇから全ＲＮＡを作製した。細胞ペレットを１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＳＤＳ及び２００ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．８溶液でホモジナイズした。フェノールとクロロホルムをホモジネートに加え、水層を抽出した。水層ををフェノールとクロロホルムで１回逆抽出した。次に、等容量の４Ｍ塩化リチウムを加えた。サンプルを氷上で３時間エタノール沈殿させ、遠心によりペレットを得た。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。全ＲＮＡを分光分析により定量し、アガロースゲル電気泳動により可視化し、２８Ｓ及び１８Ｓリボソームバンドの存在を確認した。細胞ペレット３６ｇから全ＲＮＡ約１５ｍｇが得られた。
【０２０３】
標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）に従って、ライブラリーを構築した。オリゴｄＴセルロースアフィニティー精製を使用して全ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを作製した。ＡＭＶ逆転写酵素を使用してＸｈｏＩ制限部位を含むオリゴｄＴプライマーでメッセンジャーＲＮＡを逆転写した。第１鎖ｃＤＮＡ合成後に、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ及びＲＮＡｓｅ  Ｈを添加することにより第２鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０２０４】
ＥｃｏＲＩアダプターをＴ４  ＤＮＡリガーゼにより平滑末端ｃＤＮＡにライゲーションした。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してｃＤＮＡサンプルをキナーゼ処理し、ＸｈｏＩで消化し、カラム緩衝液で希釈し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラムに通した。ＤＮＡサンプルを高塩濃度緩衝液により溶離した。４００〜５，０００ｂｐのＤＮＡを含むサンプルをプールし、ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へのライゲーションに使用した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＹＥＳ２ベクターにライゲーションした。酵母の直接形質転換には大量のライゲーションＤＮＡ（２〜３μｇ）が必要なため、大規模ライゲーション反応を実施した。
【０２０５】
酵母細胞をｃＤＮＡ／ｐＹＥＳ２ライゲーション混合物で直接形質転換するために、ＬｉＡｃ  ＴＲＡＦＯ法（Ｇｉｅｔｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，５：２５５−２６９，１９９５）を使用してコンピテントＳＣ３３４細胞を作製した。要約すると、プレートからの新鮮なＳＣ３３４培養液をＹＰＤ培地５０ｍｌに接種した。ＯＤ６００が１．０に達するまで培養液を３０℃で振盪下に増殖させた。このスターター３０ｍｌをＹＰＤ液体培地３００ｍｌに接種し、培養液の細胞数が〜３−５ｘ１０６個／ｍｌに達するまで（約３〜４時間）振盪培養した。細胞を回収し、滅菌水で洗浄した。完全細胞ペレットを新たに調製した１Ｘ  ＴＥ／ＬｉＡｃ（０．１Ｍ  ＬｉＡｃ）１．５ｍｌに再懸濁した。これらの細胞を直ちに形質転換に使用した。
【０２０６】
コンピテントＳＣ３３４細胞７５０μｌを１５ｍｌファルコンチューブに分注した。ｃＤＮＡ／ｐＹＥＳ２ライゲーションＤＮＡ約２μｇをキャリヤーＤＮＡと共に細胞に加え、穏かに混合した。滅菌４０％ＰＥＧ／ＬｉＡｃ３ｍｌを細胞に加え、穏か且つ十分に混合した。細胞を３０℃で３０分間振盪培養した後、４２℃で１５分間熱ショックを与えた。細胞を冷却し、ペレット化し、１Ｘ  ＴＥ５ｍｌに再懸濁した。上記細胞の１００μｌアリコートをウラシル欠損１５０ｍｍ選択寒天プレート（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）５０個にプレーティングし、３０℃で３日間インキュベートした。合計８ｘ１０５個の初代クローンが得られた。コロニー５個をウラシル欠損最小培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）１ｍｌにプールし、グリセロールを加えてストックを作製した。合計５，０００個のプールをスクリーニング用に作製した。
【実施例８】
【０２０７】
酵母におけるＭＡＤ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ直接）スクリーニング
ライブラリーにおけるｃＤＮＡの平均サイズを測定することによりライブラリーの品質を分析した。ライブラリーのスクリーニングはｃＤＮＡの発現に依存したので、ライブラリーに存在するｃＤＮＡの平均サイズを測定することが重要であった。最長ｃＤＮＡを含む発現ライブラリーが目的全長ｃＤＮＡを単離するのに最適な選択であると思われる。このために、ランダムに選択したプールを実施例７に記載したように選択寒天プレートにプレーティングし、個体コロニーを得た。４０個の別個の酵母コロニーをランダムに釣菌し、各コロニーを（実施例７に記載したように）ウラシル欠損選択液体培地５ｍｌに接種し、振盪下に２４時間３０℃で増殖させた。ビーズ破砕法（Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｇｅｎｅ  ５７：２６７（１９８７））を以下のように応用することによりプラスミドＤＮＡをこれらのコロニーから抽出した。
【０２０８】
培養液５ｍｌからのペレットを１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％  ＳＤＳ溶液０．５ｍｌに溶解させた。等容量の滅菌０．５ｍｍガラスビーズを加え、３分間手動ボルテックスした。同一緩衝液２００μｌを加え、混合物を更に１分間ボルテックスした。サンプルを２分間高速遠心した後、細胞質抽出液を別のチューブに移した。等容量のフェノール／ＣＨＣｌ３をサンプルに加え、ボルテックスし、再び２分間遠心した。水層を２回再抽出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウムとエタノール約２．５倍容量で３０分間−２０℃にて沈殿させた。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、水に再懸濁した。ＲＮＡと蛋白質汚染を除去するために、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用して４０個の異なるサンプルから単離したプラスミドＤＮＡを更に精製した。次に、プラスミドＤＮＡサンプルをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで制限消化してｃＤＮＡフラグメントを遊離させ、消化産物を１％アガロースゲルで分析した。その結果、直接ライブラリーのｃＤＮＡの大半は０．８Ｋｂ〜１．５Ｋｂ長であることが分かった。
【０２０９】
ライブラリーをスクリーニングするために、グリセロールストックを融解し、約０．５ｍｌをウラシル欠損液体選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）５ｍｌに加え、３０℃で２４時間増殖させた。次に、２％ガラクトースと２５μＭ  ＧＬＡ（エロンガーゼ酵素の基質）を添加したウラシル欠損液体選択培地５０ｍｌに培養液を２４時間２５℃で振盪下に導入した。各誘導培養の細胞ペレット中の脂質含量のＧＣ−ＦＡＭＥ分析を従来記載されているように実施した（Ｋｎｕｔｚｏｎら，前出）。ＭＡＥＬＯ（ロイシン欠損選択培地で増殖させたｐＹＸ２４２中のｐＲＡＥ−５）を各バッチ試験で陽性対照として使用した。ＭＡＥＬＯは常に１．５％のＧＬＡをＤＧＬＡに変換することがてけきた（実施例３参照）。
【実施例９】
【０２１０】
潜在的ＰＵＦＡエロンガーゼをコードするｃＤＮＡの同定
約７５０個の個体プールを実施例８に記載したようにスクリーニング及びＧＣ−ＦＡＭＥ分析後、コロニー５個からなる１個のプール（即ちＭＡＤ７０８）がＧＬＡからＤＧＬＡへの変換に有意な酵素活性をもつように思われた。この活性をＤＧＬＡ／ＧＬＡ比（図１９）で表すと、Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ活性（ＭＡＥＬＯ）の約５倍であることが判明した。このプールを同一アッセイ条件で再試験し、最初の知見を確認した。反復実験は９．５％のＧＬＡからＤＧＬＡへの変換を示し、やはりＭ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ活性（ＭＡＥＬＯ）の約５倍であった。これらの結果はＭＡＤ７０８プールが基質としてのＧＬＡに特異的なエロンガーゼ候補を含むことを強く示唆した。ＭＡＤ７０８は５個の異なるクローンのプールであったので、このプールからのエロンガーゼ活性をコードする個体ｃＤＮＡクローンを単離することが必要であった。これを行うために、元のＭＡＤ７０８グリセロールストックをウラシル欠損選択培地寒天プレート（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）にプレーティングした。３０個の個体コロニーを釣菌し、ＧＬＡの存在下で実施例８に記載したように２％ガラクトースを加えたウラシル欠損液体選択培地で増殖させた。各培養から得られた細胞ペレットを次に３３４（ｐＲＡＥ−５）（ｐＹＸ２４２中ＭＡＥＬＯ）の陽性対照と共に脂肪ＧＣ−ＦＡＭＥ分析した（Ｋｎｕｔｚｏｎら，前出）。酵母でのＭＡＤ７０８発現プールからの３０個の個体クローンの脂肪酸分析の結果、３０個のクローンのうちの５個がＧＬＡをＤＧＬＡに変換するエロンガーゼ活性を示すことが判明した。活性クローンＭＡＤ７０８−２、ＭＡＤ７０８−１０、ＭＡＤ７０８−１８、ＭＡＤ７０８−１９及びＭＡＤ７０８−３０の脂肪酸プロフィルを図２０に示す。同図に示すように、ＭＡＤ７０８−２、１０、及び３０はＤＧＬＡ生産が最高であり、ＭＡＥＬＯ（ｐＲＡＥ−５）の約２５倍であった。これらの３種は４１％〜４９％のＧＬＡをＤＧＬＡに変換した。他のクローンＭＡＤ７０８−１８及びＭＡＤ７０８−１９は夫々８％と２１％のＧＬＡをＤＧＬＡに変換した。全ＭＡＤ７０８クローンはＭＡＥＬＯにコードされるエロンガーゼ（３．４％）よりも高い百分率でＧＬＡをＤＧＬＡに変換した。
【実施例１０】
【０２１１】
エロンガーゼをコードするｃＤＮＡの特性決定
有意なＧＬＡ特異的エロンガーゼ活性を示したＳＣ３３４酵母クローン（ＭＡＤ７０８プール）から実施例８に記載したようにビーズ破砕法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。ｃＤＮＡインサートのサイズを測定するために、推定エロンガーゼクローンから得られた各プラスミドＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲを実施した。ｐＹＥＳ２ベクターのマルチクローニング部位に含まれるフォワードプライマーＲＯ５４１（５’−ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＴＡＡ  ＴＡＣ−３’）とリバースプライマーＲＯ５４０（５’−ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＡＡ−３’）を使用してＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位内のｃＤＮＡインサートを増幅した。ＰＣＲ反応はプラスミドＤＮＡ４μｌ、各プライマー５０ｐｍｏｌｅ、１０Ｘ緩衝液５μｌ、１０μＭ  ＰＣＲヌクレオチドミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）１μｌ及びＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）０．５μｌを含有する５０μｌ容量中で実施した。増幅は次のように実施した。２分間９４℃で変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で２分間、及び７２℃で３分間を３０サイクル実施し、増幅後に７分間７２℃で伸長させた。ＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲルで分析した処、エロンガーゼｃＤＮＡのサイズは約１．０〜１．２Ｋｂであることが判明した。潜在的エロンガーゼｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡをｐＲＰＢ２、ｐＲＰＢ１０、ｐＲＰＢ１８、ｐＲＰＢ１９、及びｐＲＰＢ３０と命名した。ｃＤＮＡライブラリーはｐＹＥＳ２ベクターのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位で作製したので、上記プラスミドをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化することにより各プラスミドに存在するｃＤＮＡのサイズを更に確認した。
【０２１２】
酵母から単離したプラスミドＤＮＡをｃＤＮＡクローンの長期保存とＤＮＡシーケンシングに備えて大腸菌で再増幅した。大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）細胞を製造業者のプロトコールに従ってｐＲＰＢ組換えプラスミドで形質転換した。各プラスミドＤＮＡから得られた形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢに接種し、３７℃で一晩振盪下に増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用してこれらの培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。精製したプラスミドＤＮＡを次に５’及び３’末端の両方からシーケンシングに使用した。ＤＮＡシーケンシングは３７３Ａ  Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＡＢＩ自動ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用することにより実施した。シーケンシングに使用したプライマーはｐＹＥＳ２ベクターのマルチクローニング部位に含まれるフォワードプライマーＲＯ５４１（５’−ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＴＡＡ  ＴＡＣ−３’）とリバースプライマーＲＯ５４０（５’−ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＡＡ−３’）とした。得られたヌクレオチド配列を分析のためにＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアプログラム（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に移した。ＤＮＡ配列分析の結果、全５個のエロンガーゼｃＤＮＡは３０１ヌクレオチドの共通オーバーラップをもつ同一ヌクレオチド配列を含むことが判明した。各ＤＮＡ配列は５’末端の始点に推定開始部位と３’部位の終点にｐｏｌｙＡテールをもつ終止コドンを含む。この候補はエロンガーゼ活性が最高であったので、ＤＮＡ配列を更に確認するために、内部フォワードプライマーＲＯ７２８（５’−ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＴＣＧ−３’）及びＲＯ７３０（５’−ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＴＧＡ  ＡＣＴ  ＣＧ−３’）とリバースプライマーＲＯ７２９（５’−ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＧＡＡ  Ｃ−３’）及びＲＯ７３１（５’−ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＡＣＧ  ＴＧ−３’）をｃＤＮＡ内で設計し、ｐＲＰＢ２のシーケンシングに使用した。完全ヌクレオチド配列をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒプログラム（図２１）により分析した処、ｐＲＰＢ２の完全ｃＤＮＡ配列から推定される最長オープンリーディングフレームは９５７ｂｐ長であると思われた（図２２）。次に、推定オープンリーディングフレームを対応するアミノ酸配列に翻訳し、この予想配列を図２３に示す。Ｍ．ａｌｐｉｎａから同定されたｃＤＮＡ（ｐＲＰＢ２）によりコードされるエロンガーゼは翻訳ＭＡＥＬＯとサイズがほぼ一致する３１８アミノ酸長であると思われる。この新規エロンガーゼｃＤＮＡを「ＧＬＥＬＯ」と命名し、これによりコードされる蛋白質を「ＧＬＡエロンガーゼ」と命名した。
【０２１３】
プラスミドＤＮＡ  ｐＲＰＢ２はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９に１９９９年７月２２日付けで寄託した。このプラスミドはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４０２を付与された。
【実施例１１】
【０２１４】
ＧＬＡエロンガーゼ（ＧＬＥＬＯ）の生化学的特性決定
Ａ．ＧＬＡエロンガーゼ活性の確認
ｐＲＰＢ２組換えプラスミドによりコードされるＧＬＡエロンガーゼの活性を更に確認するために、ｐＲＰＢ２プラスミドを含む酵母クローンＳＣ３３４でエロンガーゼ活性スクリーニングを実施した。この実験を実施したのは４回の独立実験を平均することにより安定した脂質抽出を確保すると共にＧＬＡエロンガーゼの活性を検出するためでもあった。ｐＲＰＢ２を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４グリセロールストックをウラシル欠損最小培地寒天プレートにプレーティングした。実施例８に記載したように個体コロニーをランダムに釣菌し、ウラシル欠損最小培地で増殖させた。４個の別々の培養液を合わせ、５ｍｌアリコートを４個の別個の５０ｍｌ培養液の接種材料として使用した。次に、実施例８に記載したように培養液をＧＬＡの存在下に増殖させ、ｐＹＥＳ２を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４の陰性対照と共に脂肪酸分析した。２５μＭ  ＧＬＡの存在下の３３４（ｐＲＰＢ２）の４個の独立した培養液からの平均エロンガーゼ活性を図２４に示す。３３４（ｐＲＰＢ２）の４個の独立サンプルの各々のＧＬＡエロンガーゼ活性はＧＬＡからＤＧＬＡへの平均変換率６２％で安定しているように思われた。
【０２１５】
Ｂ．ＧＬＡエロンガーゼに対するＧＬＥＬＯ基質特異性の分析
ＧＬＡエロンガーゼの基質特異性を分析するために、３３４（ｐＲＰＢ２）の培養液をＧＬＡ以外の種々の脂肪酸基質（例えばＳＡ（１８：０），ＯＡ（１８：１），ＬＡ（１８：２ｎ−６），ＡＡ（２０：４ｎ−６），ＡＤＡ（２２：４ｎ−６），ＡＬＡ（１８：３ｎ−３），ＳＴＡ（１８：４ｎ−３），及びＥＰＡ（２０：５ｎ−３））で試験した。同一アッセイ条件下でエロンガーゼ酵素により利用された唯一の他の基質はｎ−３経路からの脂肪酸であるＳＴＡであった。ＧＬＡエロンガーゼはＳＴＡの７３％を２０：４ｎ−３に変換することができた（図２５）。これらの実験から、ＧＬＡエロンガーゼはＧＬＡとＳＴＡの両者に基質特異性をもつと結論することができ、ｎ−６及びｎ−３経路によるエロンガーゼ活性をもつと考えられる。
【０２１６】
Ｃ．酵母における真菌ＧＬＥＬＯとΔ５−デサチュラーゼ遺伝子の同時発現
ＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）がＧＬＡエロンガーゼにより生産されると、Δ５−デサチュラーゼはこれを所望同時発現システムでＡＡ（２０：４ｎ−６）に変換することができる。図１に示すようなこのスキームはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４をプラスミドｐＲＰＢ２及びｐＲＰＥ３１（ＥｃｏＲＩ部位にクローニングしたΔ５−デサチュラーゼｃＤＮＡ（図１８）を含む組換えプラスミドｐＹＸ２４２）と同時形質転換することにより試験することができる。同時形質転換酵母培養物に２５μＭ  ＧＬＡを添加し、ＡＡ生合成を分析した。エロンガーゼ及びΔ５−デサチュラーゼ酵素の両方が発現されるならば、ＧＬＡ基質はＤＧＬＡに変換され、その後、ＡＡに変換されるであろう。図２６Ａの結果に示すように、ＧＬＡエロンガーゼとΔ５−デサチュラーゼがＧＬＡ基質に順次作用する結果としてＧＬＡからＡＡへの平均変換率２７％が得られた。従って、ＧＬＡエロンガーゼはｎ−６ＰＵＦＡ合成経路で他の酵素と共同して所望脂肪酸を生産することができる。
【０２１７】
上記変換がｎ−３経路にも当てはまるか否かを調べるために、２５μＭ  ＳＴＡの存在下に同様の同時発現実験を実施した。この場合にも両方の酵素が発現されるならば、ＳＴＡ基質は２０：４ｎ−３に変換された後に、Δ５−デサチュラーゼによりＥＰＡ（２０：５ｎ−３）に変換されるであろう。図２６Ｂに結果を示すように、ＥＰＡ（約４０％）の生産が観察される。この場合にも、ＧＬＡエロンガーゼはｎ−３経路でΔ５−デサチュラーゼと共同して所望脂肪酸を生産できることが明らかである。
【実施例１２】
【０２１８】
ＧＬＥＬＯと他の真菌エロンガーゼの配列比較
ＧＣＧの配列分析パッケージ（実施例１参照）を使用してＧＬＥＬＯ配列を既知蛋白質配列と比較した。まずＧＬＥＬＯオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列をクエリー配列として使用するアミノ酸配列に翻訳し、ＦａｓｔＡアルゴリズム（実施例１参照）を使用してＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（実施例１参照）を検索した。アミノ酸配列類似性により、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＪＴ６（未知アノテーション付きＥＳＴ）と１８９アミノ酸オーバーラップで同一性３３．９％、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）と２９５アミノ酸オーバーラップで同一性２５．８％、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）と３１３アミノ酸オーバーラップで同一性２５．２％の最良マッチが検出された。ＧＬＥＬＯとＭＡＥＬＯのＦａｓｔＡアラインメントは２７５アミノ酸で同一性３０．９％を示した（図２７）。ＧＣＧ  Ｐｉｌｅｕｐプログラムは累進ペアワイズアラインメントを使用して１群の関連配列から多重配列アラインメントを作成するものであり（実施例１参照）、上記エロンガーゼで使用した。Ｐｉｌｅｕｐの結果、エロンガーゼ間には推定ヒスチジンボックス（下線部）を含む多数の保存領域があることが分かった（Ｋｎｕｔｚｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６，１９９８）（図２８）。従って、ＧＬＥＬＯはＭＡＥＬＯと類似性をもつが、それらによりコードされるエロンガーゼが相異するのはその基質優先によると予想される。ＧＬＡエロンガーゼはＭ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼよりも高い百分率でＧＬＡをＤＧＬＡに変換することができる。更に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでＭＡＥＬＯを発現させると、ＧＬＡからＤＧＬＡへの伸長に加えて飽和及びモノ不飽和脂肪酸も伸長することが分かった（実施例３参照）。
【実施例１３】
【０２１９】
哺乳動物におけるＭ．ａｌｐｉｎａ  ＭＡＥＬＯホモログの同定
ＭＡＥＬＯ翻訳配列を使用してＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１００  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  Ｒｄ．，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６００６４のＵｎｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｄａｔａｂａｓｅを検索した。「クエリーが蛋白質であるかＤＮＡであるかに関係なく入手可能な全配列データベースを探索するように設計された１組の類似性検索プログラム」であるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用してこのデータベースを検索した。特に、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用した（即ち６個の読み枠で翻訳されたヌクレオチドデータベースに対する蛋白質クエリー検索）。Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｄａｔａｂａｓｅのコンティグ（ＣＣ）配列は規定配列相同性に基づいてクラスターされると共に配列オーバーラップに基づいてアセンブルされるＥＳＴの公共ドメインとＩｎｃｙｔｅ  ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベース（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，３１７４  Ｐｏｒｔｅｒ  Ｄｒｉｖｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ  ９４３０４）に由来する発現配列タグ（ＥＳＴ）ｃＤＮＡ群に相当するコンセンサス配列である。このデータベースに由来する２種の配列ＣＣ０６７２８４Ｒ１及びＣＣ１４８４５４８Ｔ１は翻訳ＭＡＥＬＯ配列に対して夫々２４２アミノ酸オーバーラップで同一性２８％及び２６６アミノ酸オーバーラップで同一性２８．６％であった。２種の誘導編集配列を夫々ｈｓ１及びｈｓ２と命名し、ＧＣＧの配列分析ソフトウェアパッケージ（実施例１参照）にコピーした。夫々図２９及び３０に示すように、ＦａｓｔＡアルゴリズムを使用して翻訳ＭＡＥＬＯ配列を翻訳ＨＳ１（２４２アミノ酸で同一性２８．５％）及びＨＳ２（２６６アミノ酸で同一性２８．２％）ｃＤＮＡ配列と整列させた。ＨＳ１  ｃＤＮＡヌクレオチド配列は更にＩ０５４６５ヌクレオチド配列（実施例５参照）と８４４ｂｐで同一性８６．９％であった。翻訳ＨＳ２  ｃＤＮＡ配列はアクセション番号Ｗ７４８２４のＧｅｎＢａｎｋからのアミノ酸配列（公開ＰＣＴ出願第Ｗ０９８３９４４８号参照）と同一性１００％であった。
【０２２０】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を使用し、ｔｂｌａｓｔｎとＡＣ００４０５０（ＴＦａｓｔＡ検索で同定されたヒト配列，実施例５参照）から翻訳された２８アミノ酸配列（ＤＴＩＦＩＩＬＲＫＱＫＬＩＦＬＨＷＹＨＨＩＴＶＬＬＹＳＷ）を使用してデータベース検索を実施した。このアミノ酸配列はデサチュラーゼの注釈付きモチーフ（Ｋｎｕｔｚｏｎら，前出）とＭＡＥＬＯ及びＧＬＥＬＯ（図２８参照）の両者のＰＵＦＡエロンガーゼをもつヒスチジンボックス（下線部）を含む。実施例５に示した翻訳マウス配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｕ９７１０７）と翻訳Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｕ４１０１１）はこの２８アミノ酸クエリーと最高のマッチであった。翻訳Ｕ４１０１１をクエリーとして使用してＮＣＢＩマウスＥＳＴデータベースを再びｔｂｌａｓｔｎで検索した。「脂肪酸伸長に関与が推定される」と注釈付けされた別のマウス配列が同定された（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ０１４０３３．１）。翻訳ＡＦ０１４０３３．１によるマウスＥＳＴデータベースのｔｂｌａｓｔｎ検索により、３個のもっと長い配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃  ＡＡ５９１０３４，ＡＡ１８９５４９，及びＡＡ８３９３４６）も同定され、１つの配列にしてｍｍ２と命名した。翻訳ｍｍ２とＭＡＥＬＯのＦａｓｔＡアラインメント（実施例１参照）を図３１に示す。同一ではないが関連する別のマウス配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＩ２２５６３２）もＡＦ０１４０３３．１によるマウスＥＳＴデータベースのｔｂｌａｓｔｎ検索で同定された。翻訳ＡＩ２２５６３２とＭＡＥＬＯのＦａｓｔＡアラインメントを図３２に示す。翻訳ＭＭ２とＡＩ２２５６３２は翻訳ＭＡＥＬＯに対して夫々１９１及び１１５アミノ酸オーバーラップで同一性３０．４％であった。翻訳ＭＡＥＬＯとこれらの２種の翻訳マウス配列のアミノ酸同一性レベルにより、これらの配列はＰＵＦＡエロンガーゼの推定ホモログとして同定される。
【実施例１４】
【０２２１】
哺乳動物におけるＭ．ａｌｐｉｎａ  ＧＬＥＬＯホモログの同定
６個の読み枠の各々で翻訳されたデータベースＤＮＡ配列と蛋白質配列を比較するＴＦａｓｔＡアルゴリズムを使用し、翻訳ＧＬＥＬＯをクエリーとして使用した。ＧＣＧのＧｅｎＥＭＢＬデータベースを使用して翻訳ＧＬＥＬＯとのそのアミノ酸類似性により他の潜在的エロンガーゼ配列を同定した。３個のヒト配列がＧＬＥＬＯアミノ酸配列とマッチすることが判明した。これらの配列はＧｅｎＢａｎｋアクセション番号１）ＡＩ８１５９６０，２）ＡＬ０３４３７４，及び３）ＡＣ００４０５０である。ＡＩ８１５９６０はヒトＥＳＴ配列であり、翻訳ＧＬＥＬＯと１４４アミノ酸オーバーラップで同一性４０．３％である（図３３参照）。染色体ＶＩに由来するヒトゲノム配列の翻訳領域であるＡＬ０３４３７４は翻訳ＧＬＥＬＯと６０アミノ酸オーバーラップで同一性４６．７％である。ＡＬ０３４３７４のこの相同領域は翻訳ＭＡＥＬＯと相同性をもつことが判明したＨＳ１アミノ酸（実施例１３参照）の一部であると思われた。従って、ＨＳ１配列はＭＡＥＬＯ（図２９参照）とＧＬＥＬＯ（図３４参照）の両方に類似性をもつ。染色体ＩＶに由来するヒトゲノム配列の翻訳領域ＡＣ００４０５０は翻訳ＧＬＥＬＯと８９アミノ酸オーバーラップで同一性３４．８％である（図３５参照）。ＧＬＥＬＯとこれらのヒト配列のアミノ酸同一性はこれらのヒト配列から誘導される蛋白質がＰＵＦＡエロンガーゼ活性等の関連機能をもつ可能性を示すものである。
【０２２２】
ＧＬＥＬＯに類似するマウスｃＤＮＡを同定するために、翻訳ＧＬＥＬＯをクエリーとして使用してＧｅｎＥＭＢＬデータベースでＴＦａｓｔＡ検索を実施した。ＴＦａｓｔＡ検索から、翻訳ＧＬＥＬＯと最高のマッチをもつ３種のマウス配列が同定された（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号１）ＡＦ１０４０３３，２）ＡＩ５９５２５８，及び３）Ｕ９７１０７）。ＡＦ１０４０３３は「酵母ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）に相同な推定脂肪酸エロンガーゼをもつＭＵＥＬ蛋白質」と注釈付けされ、ＭＭ２配列の一部である。ＭＭ２配列はＡＦ１０４０３３マウス配列から最初に誘導されたが、完全ＭＭ２配列は最終的に別のマウスＥＳＴデータベース検索により得られ、翻訳ＭＡＥＬＯと相同であることも判明した（実施例１３及び図３１参照）。ＦａｓｔＡを使用してこのＭＭ２アミノ酸配列を翻訳ＧＬＥＬＯ配列と整列させると、２１１アミノ酸オーバーラップで同一性３４．６％が検出され（図３６参照）、ＭＭ２はＧＬＥＬＯとも相同であることが分かった。ＡＩ５９５２５８は酵母ＥＬＯ３エロンガーゼと５’類似性をもつマウスｃＤＮＡクローンであり、マウスＥＳＴ  ｃＤＮＡ  ＡＩ２２５６３２の一部である。ＡＩ２２５６３２マウス配列はＡＩ５９５２５８よりも長く、翻訳ＭＡＥＬＯと類似性をもつことが判明した（図３２参照）。ＡＩ２２５６３２を翻訳ＧＬＥＬＯとも整列させ、ＦａｓｔＡアラインメントを図３７に示す。１９９アミノ酸オーバーラップで同一性３５．３％が検出された。第３の配列であるＵ９７１０７はマウス配列であり、「酵母ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）遺伝子に類似する」と注釈付けされている。翻訳ＧＬＥＬＯとＵ９７１０７のＦａｓｔＡアラインメントを図３８に示すように、２７９アミノ酸オーバーラップで同一性２３．７％が検出された。先に、Ｕ９７１０７はＦａｓｔＡアラインメントによりＭＡＥＬＯと高い相同度をもつことも分かっている（実施例５及び図１６参照）。
【０２２３】
上記検索はＭＡＥＬＯ又はＧＬＥＬＯのいずれかをクエリーとして使用することにより同一のヒト及びマウス配列が得られたことを明白に示している。
【実施例１５】
【０２２４】
他のＰＵＦＡ産生生物におけるＭ．ａｌｐｉｎａ  ＧＬＥＬＯ及びＭＡＥＬＯホモログの同定
Ａ）Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ：
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの染色体配列から誘導される推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｕ４１０１１）はＧＬＡエロンガーゼ（ＧＬＥＬＯ）及びＭ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の両者とアミノ酸類似性をもつマウスＭＭ２推定ＰＵＦＡエロンガーゼに含まれる部分配列を同定することができた。従って、ＧＬＥＬＯ又はＭＡＥＬＯのＣ．ｅｌｅｇａｎｓホモログが線虫データベースに存在するのではないかと考えられた。ＧＬＥＬＯ及びＭＡＥＬＯ配列から誘導されるアミノ酸配列を個々にクエリーとして使用して線虫データベースを検索した。夫々Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノムシーケンシングプロジェクト又はＥＳＴとその対応ｃＤＮＡ配列から得られる予想蛋白質とｃＤＮＡであるｗｏｒｍｐｅｐ１６（ｂｌａｓｔｐはアミノ酸クエリー配列をヌクレオチド配列データベースに比較する）とｗｏｒｍｐｅｐ１６ｃＤＮＡ（ｔｂｌａｓｔｎ）データベースでＢＬＡＳＴ検索（実施例１３参照）を実施した。これらの配列データはＣ．ｅｌｅｇａｎｓシーケンシンググループとＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒの共同により作成され、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｗｏｒｍｐｅｐ／から入手することができる。ＧＬＥＬＯ及びＭＡＥＬＯの両者の翻訳アミノ酸配列に対するそのアミノ酸配列相同性により少なくとも７個の推定Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ翻訳配列が同定された。推定アミノ酸を含むこれらのゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号はＺ１９１５４、Ｕ６８７４９（２個の推定蛋白質（Ｆ５６Ｈ１１．４及びＦ５６Ｈ１１．３（ｗｏｒｍｐｅｐ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃））、Ｕ４１０１１、Ｕ６１９５４（２個の推定蛋白質（Ｆ４１Ｈ１０．７及びＦ４１Ｈ１０．８（ｗｏｒｍｐｅｐ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃））、及びＺ８１０５８であった。下線で示した配列は翻訳ＭＡＥＬＯをクエリーとして使用した先の検索で同定されたものである（実施例５参照）。１例として、翻訳Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）と翻訳ＧＬＥＬＯ及びＭＡＥＬＯのＦａｓｔＡアミノ酸アラインメントを図３９及び４０に示す。翻訳Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）はＭ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼ及びＧＬＡエロンガーゼの両者と約２００アミノ酸オーバーラップで同一性２５〜３０％である（図３９及び４０参照）。全７個の翻訳推定Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｃＤＮＡで、翻訳ＧＬＥＬＯとのＦａｓｔＡアラインメントは２００アミノ酸オーバーラップで同一性２５〜３０％であり、翻訳ＭＡＥＬＯとは少なくとも１８８アミノ酸オーバーラップで同一性２６〜３４％であった。アラインメントの類似性は、エロンガーゼ活性をもつＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来潜在遺伝子を同定するために翻訳ＧＬＥＬＯ又はＭＡＥＬＯを使用できることを示している。
【０２２５】
Ｂ）Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ：
ゲノム配列Ｕ４１０１１（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）からの翻訳推定ｃＤＮＡはＮＣＢＩ（実施例１３参照）による「他のＥＳＴ」データベースの（ヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチドデータベースと比較する）ｂｌａｓｔｎ検索でＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥＳＴ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＩ１３４１７３）と最高のマッチがあったので、オーバーラップするＤＮＡ  ＥＳＴフラグメント（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＩ５１７２５５）とアセンブルした。ＧＣＧ（実施例１参照）でＦａｓｔＡを使用して２個のオーバーラップする配列から誘導された翻訳ＤＮＡフラグメントＤＭ１を翻訳ＧＬＥＬＯ及びＭＡＥＬＯ（図４１及び４２参照）と整列させた。アラインメントはＧＬＡエロンガーゼと２０６アミノ酸オーバーラップで同一性２７．２％を示し、Ｍ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼと２３７アミノ酸オーバーラップで同一性３０％を示した。従って、アミノ酸類似性によると、ＤＭ１はＰＵＦＡエロンガーゼ−様活性をもつＧＬＥＬＯ又はＭＡＥＬＯの潜在的ホモログであると考えられる。更に、ＧＬＥＬＯ及びＭＡＥＬＯのＤＮＡ配列をデータベース検索用クエリーとして使用し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａに由来するＰＵＦＡエロンガーゼ活性をもつホモログを同定することができる。
【実施例１６】
【０２２６】
ヒトＰＵＦＡエロンガーゼホモログのクローニングと発現
翻訳ＧＬＥＬＯ及び／又はＭＡＥＬＯとのそのアミノ酸類似性に基づき、多数の潜在的ＰＵＦＡエロンガーゼ配列が同定された。これらの配列の潜在的エロンガーゼ活性を測定するために、次に、本実施例に実証するように、全長蛋白質をコードするｃＤＮＡを同定し、クローニングし、発現させた。
【０２２７】
推定ＨＳ１配列に基づいてプライマーＲＯ７１９（５’−ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＴＣ−３’）及びＲＯ７２０（５’−ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＣＣＧ−３’）を設計し、ヒト肝Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を増幅するために使用した。ヒト肝Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ５μｌ、各プライマー５０ｐｍｏｌｅ、１０ｍＭ  ＰＣＲヌクレオチドミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）１μｌ、１０Ｘ緩衝液５μｌ及びＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）１．０Ｕを含有する５０μｌ容量中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）のサーモサイクラー条件は９４℃２分間の後、９４℃１分、５８℃２分、及び７２℃３分を３０サイクルとした。ＰＣＲ後に７２℃で７分間の付加伸長サイクルを実施した。
【０２２８】
ＰＣＲ増幅産物をゲル泳動させ、約９６０ｂｐの増幅フラグメントをゲル精製し、フラグメントの末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で埋めて、製造業者のプロトコールに従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。新規プラスミドをｐＲＡＥ−５２と命名し、ＡＢＩ  ３７３Ａ  Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してこのクローンの推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡを配列決定した。プラスミドｐＲＡＥ−５２の推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡ配列を図４３に示し、翻訳配列を図４４に示す。
【０２２９】
プラスミドｐＲＡＥ−５２からの推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡを次にＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製し、ｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）にライゲーションした。新規プラスミドをｐＲＡＥ−５８−Ａ１と命名した。（プラスミド５８−Ａ１はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に１９９９年８月１９日付けで寄託し、寄託番号ＰＴＡ−５６６を付与された。）
【０２３０】
構築物ｐＲＡＥ−５８−Ａ１をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前出）に形質転換し、エロンガーゼ活性をスクリーニングした。陰性対照株はｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４とした。培養物を選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）で２５μＭのＧＬＡ又はＡＡの存在下に２４時間３０℃で増殖させた。この試験では、夫々ＤＧＬＡ又はアドレン酸（ＡＤＡ，２２：４ｎ−６）がヒトエロンガーゼ活性の予想産物であった。ＧＬＡを基質として使用した場合には、ヒトエロンガーゼｃＤＮＡを含む酵母細胞は対照細胞に比較して高レベルのＤＧＬＡを含んでおり、夫々総脂肪酸の２．７５％と０．０９％であった（図４５参照）。ＡＡを基質として使用した場合には、ヒトエロンガーゼｃＤＮＡを含む酵母細胞は対照細胞に比較して高レベルのＡＤＡを含んでおり、夫々総脂肪酸の１．２１％とゼロであった。従って、ヒトエロンガーゼは１８及び２０炭素鎖長の両者のＰＵＦＡを夫々の伸長脂肪酸に変換することができる  ヒトエロンガーゼｃＤＮＡを含む酵母細胞は１８：１ｎ−７、２０：１ｎ−７、２０：１ｎ−９、及び１８：１ｎ−５等のモノ不飽和脂肪酸レベルも対照株より高かった。従って、これらの結果は同定されたヒトエロンガーゼがＰＵＦＡとモノ不飽和脂肪酸を基質として利用できることを示している。ヒト配列ＨＳＥＬＯ１とそれによりコードされる蛋白質（ＨＳＥＬＯ１ｐ）は基質特異性に依存せずにエロンガーゼ活性をもつ。
【０２３１】
本明細書でＨＳＥＬＯ１と呼ぶ上記伸長酵素の基質特異性を更に確認するために、ｎ−６脂肪酸ＧＬＡ、ＡＡ、又はｎ−３脂肪酸ＡＬＡ、ＳＴＡ、もしくはＥＰＡを添加した最小培地で組換え酵母株３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）を増殖させた。これらの酵母培養物の脂質プロフィルをＧＣとＧＣ−ＭＳにより試験した処、夫々ＤＧＬＡ、ＡＤＡ、ω３−エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、Ｃ２０：３ｎ−３）、ＥＴＡ、及びＤＰＡの蓄積が認められた（図５１）。これらの脂肪酸のレベルはｐＲＡＥ−５８−Ａ１配列を含む株の総脂肪酸の夫々７．２９％（ＤＧＬＡ）、６．２６％（ＡＤＡ）、６．１５％（ＥＴｒＡ）、１０．０６％（ＥＴＡ）、及び６．６６％（ＤＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々７８．３％、４２．７％、３０．４％、７９．２％、及び７１．７％であった。
【０２３２】
組換えＨＳＥＬＯ１配列を発現する酵母細胞は対照細胞に比較してＣ１８：１ｎ−７とＣ２０：１ｎ−７のレベルも有意に増加し、程度は劣るがエイコセン酸（ＥＡ、Ｃ２０：１ｎ−９）も増加していた（図４５）。この知見は組換えＨＳＥＬＯ１蛋白質（ＨＳＥＬＯ１ｐ）が１６又は１８炭素長のモノ不飽和脂肪酸の伸長にも関与している可能性を示唆した。この仮説を確認するために、組換え酵母株３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）に２５μＭの外来ＯＡを基質として添加した。インキュベーション後に総脂肪酸の２．２５％のＥＡが蓄積し、発現されたＨＳＥＬＯ１酵素がモノ不飽和脂肪酸を伸長できることが立証された（図５１）。他方、組換えＨＳＥＬＯ１ｐによるＯＡからＥＡへの変換率は８．９％に過ぎず、この変換率はＣ１６：１ｎ−７（からＣ１８：１ｎ−７へ）又はＣ１８：１ｎ−７（からＣ２０：１ｎ−７へ）の変換率（夫々２０．４％と５８．１％）よりも有意に低かった。
【０２３３】
基質濃度が１８及び２０炭素脂肪酸から夫々の伸長産物への変換に影響を与えるか否かを調べるために、２種の濃度のＧＬＡ、ＡＡ、及びＥＰＡを試験した（図５２）。２５μＭの基質ＧＬＡ、ＡＡ、及びＥＰＡを外部から添加した処、２炭素伸長による脂肪酸の生産レベルは３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）の溶解液中の総脂肪酸の夫々３．９５％（ＤＧＬＡ）、２．９１％（ＡＤＡ）、及び４．８２％（ＤＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々６２．４％、２７．５％、及び７０．３％であった。１００μＭの基質ＧＬＡ、ＡＡ、及びＥＰＡを添加した処、２炭素伸長による脂肪酸の生産レベルは３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）の溶解液中の総脂肪酸の夫々９．５６％（ＤＧＬＡ）、３．９０％（ＡＤＡ）、及び１１．５０％（ＤＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々３９．８％、１５．７％、及び４５．７％であった。基質添加量を更に増やすと２炭素伸長産物の百分率は上がったが、総変換率は少なくとも３５％低下した。
【０２３４】
ＨＳＥＬＯ１ｐの基質特異性を更に確認するために、２５μＭの飽和、モノ不飽和又はＰＵＦＡを添加した最小培地で組換え酵母株３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）を増殖させた。これらの各種基質の脂質プロフィルによると、ＨＳＥＬＯ１ｐはパルミチン酸（ＰＡ、Ｃ１６：０）、ステアリン酸（ＳＡ、Ｃ１８：０）、アラキドン酸（ＡＲＡ、Ｃ２０：０）、ベヘン酸（ＢＡ、Ｃ２２：０）等の飽和脂肪酸の伸長には関与していないことが判明した（図５３Ａ）。ＨＳＥＬＯ１ｐはモノ不飽和脂肪酸ＯＡ及びＥＡの伸長にも関与していない。ＰＴＡを基質として添加した場合には、総脂肪酸の１２．７６％がＯＡであった。しかし、ＰＴＡを添加しないサンプルではいずれもＯＡは総脂肪酸の２５〜３１％であったので、ＰＴＡを添加しないサンプルに比較してＯＡレベルは増加していない。ＨＳＥＬＯ１ｐはｎ−６ＰＵＦＡであるＬＡ、ＧＬＡ、及びＡＡの伸長に関与しているが、ＤＧＬＡ又はＡＤＡには関与していない（図５３Ｂ）。これらの酵母培養物の脂質プロフィルによると、夫々Ｃ２０：２ｎ−６、ＤＧＬＡ、及びＡＤＡが蓄積したが、Ｃ２２：３ｎ−６又はＣ２４：４ｎ−６は蓄積していないことが分かった。これらの脂肪酸のレベルは３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）の溶解液中の総脂肪酸の夫々０．７４％（Ｃ２０：２ｎ−６）、２．４６％（ＤＧＬＡ）、及び２．１４％（ＡＤＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々１３．２％、５１．４％、及び２７．１％であった。ＨＳＥＬＯ１ｐはｎ−３ＰＵＦＡであるＡＬＡ、ＳＴＡ、及びＥＰＡの伸長にも関与しているが、ＤＰＡには関与していない（図５３Ｃ）。これらの酵母培養物の脂質プロフィルによると、夫々ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、及びＤＰＡが蓄積したが、Ｃ２４：５ｎ−３は蓄積していないことが分かった。これらの脂肪酸のレベルはｐＲＡＥ−５８−Ａ１配列を含む株の総脂肪酸の夫々１．０３％（ＥＴｒＡ）、２．２４％（ＥＴＡ）、及び３．１９％（ＤＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々２２．２％、６１．９％、及び３９．５％であった。全結果から、酵母でヒト肝由来ＨＳＥＬＯ１を発現させるとｎ−６及びｎ−３脂肪酸経路で種々の長鎖ＰＵＦＡが伸長することが確認された。
【実施例１７】
【０２３５】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＰＵＦＡエロンガーゼのクローニング、発現及び特性決定
翻訳ＧＬＥＬＯ及びＭＡＥＬＯの両者に対してアミノ酸相同性をもつ数種の推定Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓエロンガーゼが同定された。ヒトＣＤＮＡ配列の場合と同様に酵母におけるｃＤＮＡのクローニングと発現を使用し、確かにＰＵＦＡエロンガーゼであるかどうかを調べた。ゲノム配列Ｕ６８７４９（ｗｏｒｍｐｅｐ  ｃＤＮＡ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｆ５６Ｈ１１．４．）に含まれる推定ｃＤＮＡ配列に基づいて制限部位ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ（下線部）を夫々もつプライマーＲＯ７３８（５’−ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  Ｃ−３’）及びＲＯ７３９（５’−ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＣＡＣ−３’）を設計した。切り出したＣ．ｅｌｅｇａｎｓライブラリーｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）２５０ｎｇ、各プライマー５０ｐｍｏｌｅ、１０Ｘ反応緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）１０μｌ、１０ｍＭ  ＰＣＲヌクレオチドミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）１μｌ、及びＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）２．５Ｕを含有する１００μｌ容量中でＰＣＲ増幅を実施した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）のサーモサイクラー条件は９５℃で５分間の後、９４℃で３０秒、５５℃で２分間、及び７２℃で２分間を２５サイクルとした。ＰＣＲ後に７２℃で７分間の付加サイクルを実施した。
【０２３６】
ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルから精製し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を製造業者のプロトコールに従って使用してｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで直鎖化）にライゲーションし、大腸菌Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。新規プラスミドをｐＲＥＴ−２１及びｐＲＥＴ−２２（ライゲーションによる２個の個体クローン）と命名し、３７３Ａ  Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＡＢＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で配列決定した処、ｃＤＮＡ配列は同一であった。推定エロンガーゼを含むプラスミドｐＲＥＴ−２２の８６７塩基ｃＤＮＡヌクレオチド配列を図４６に示し、２８８アミノ酸の翻訳配列を図４７に示す。（プラスミドｐＲＥＴ−２２はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に１９９９年８月１９日付けで寄託し、寄託番号ＰＴＡ−５６５を付与された。）
【０２３７】
プラスミドｐＲＥＴ−２１及び−２２を上述のようにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４に形質転換し（実施例３参照）、得られた酵母培養物（３３４（ｐＲＥＴ−２１）及び３３４（ｐＲＥＴ−２２））をロイシン欠損選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）１００ｍｌ中で５０μＭのＧＬＡとＡＡの存在下に４８時間２０℃にて増殖させた。細胞ペレットを集めて脂肪酸分析し、結果を図４８に示す。ＧＬＡ伸長の予想産物であるＤＧＬＡは陰性対照（プラスミドｐＹＸ２４２を含む３３４）では０．１３％であるが、上記２個のサンプルでは総脂質の平均１．７９％であることが判明し、ｐＲＥＴ−２１とｐＲＥＴ−２２の両者によりコードされる酵素はＧＬＡエロンガーゼ活性をもつことが分かった。３３４（ｐＲＥＴ−２１）と３３４（ｐＲＥＴ−２２）によるＧＬＡからＤＧＬＡへの変換率は夫々１１．１％と１９．４％であり、平均１５．２５％であった。興味深いことに、ＡＡ又は内在脂肪酸の伸長はほとんど観察されなかった（図４８）。これらの結果から、この新規に同定されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｃＤＮＡであるＣＥＥＬＯ１によりコードされるエロンガーゼはＧＬＡをＤＧＬＡに特異的に伸長することができると判明し、ＧＬＡエロンガーゼのＣ．ｅｌｅｇａｎｓホモログであると思われる。
【０２３８】
ＣＥＥＬＯ１のＧＬＡ伸長活性を更に確認するために、ＧＬＡとＡＡを別々に３３４（ｐＲＥＴ−２２）の培養物に添加した以外は上記パラグラフに記載した実験を繰返した。この場合も、ＧＬＡはＤＧＬＡに伸長され、変換率は３８．２％であった。図６１から明らかなようにＡＡの伸長活性は検出されなかった。この場合には、変換率は上記結果に記載した変換率（図４８参照）の２倍であると思われるが、これは付加基質（ＡＡ）の不在又は酵母の継代培養によるものと考えられる。ＣＥＥＬＯ１は内在１６：１ｎ−７を１８：１ｎ−７に伸長する付加活性をもち、変換率は同一条件下で対照培養物３３４（ｐＹＸ２４２）の３．９％に比較して９．１２％である。従って、このＣ．ｅｌｅｇａｎｓ伸長酵素はＣ１８ポリ不飽和脂肪酸に対する主伸長活性とＣ１６モノ不飽和脂肪酸に対する副次的な活性をもつ。
【０２３９】
更に、ＣＥＥＬＯ１の基質特異性を更に検討するために、ＧＬＡ以外の各基質（例えばＳＡ（１８：０）、ＯＡ（１８：１）、ＬＡ（１８：２ｎ−６）、ＤＧＬＡ（２０：３ｎ−ｇ）、ＡＡ（２０：２ｎ−６）、ＡＤＡ（２２：４ｎ−６）、ＡＬＡ（１８：３ｎ−３）、ＰＡ（１８：０）、ＥＰＡ（２０：５ｎ−３）及びＳＴＡ（１８：４ｎ−２））５０μＭを３３４（ｐＲＥＴ−２２）の培養物に個々に添加し、実施例１７に記載したように４８時間２０℃で増殖させた。外部から添加した基質で伸長したのはＳＴＡのみであった。ＣＥＥＬＯ１はＥＴＡ（２０：４ｎ−３）に添加したＳＴＡの１３％を伸長した（図６２参照）。
【０２４０】
実施例３及び１１と同様に、プラスミドｐＲＥＴ２２のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＣＥＥＬＯ１遺伝子とＭ．ａｌｐｉｎａ  Δ５デサチュラーゼ（ｐＣＧＲ−４；実施例３参照）を酵母で同時発現させ、外部から添加したＧＬＡ又はＳＴＡから夫々ＡＡ又はＥＰＡを生産できるか否かを調べた。ロイシンとウラシルを欠損する培地で５０μＭのＧＬＡ又はＳＴＡの存在下にｐＲＥＴ２２及びｐＣＧＲ４プラスミドの両者を含む酵母培養物を増殖させた処、夫々ＡＡとＥＰＡの最終産物への変換率は同一であることが判明した（変換率２７％）（図６３参照）。従って、ＣＥＥＬＯ１とΔ５デサチュラーゼの同時異種発現の結果、酵母でＧＬＡとＳＴＡから夫々ＡＡとＥＰＡが生合成される。
【実施例１８】
【０２４１】
ＡＣ００４０５０配列に基づく推定ヒトエロンガーゼｃＤＮＡの単離
ＡＣ００４０５０配列に基づいて全長推定エロンガーゼｃＤＮＡを単離するために、プライマーＲＰ７３５（５’−ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＱＡ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＴＴＣ−３’）及びＲＯ７３（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’）を使用してヒト肝Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲはＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）とヒト肝Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ５μｌと各プライマー５０ｐｍｏｌｅを製造業者の指示に従って使用して実施した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）のサーモサイクラー条件は９４℃２分間の後、９４℃１分、５８℃２分、及び７２℃３分を３０サイクルとした。ＰＣＲ後に７２℃で７分間の付加伸長を実施した。
【０２４２】
ＰＣＲ増幅産物をゲル泳動させ、約１Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製し、フラグメントの末端を製造業者の指示に従ってＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で埋めた。新規プラスミドをｐＲＡＥ−５９と命名し、ＡＢＩ  ３７３Ａ  Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してこのプラスミドの推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡ（ＨＳ３と呼ぶ）を配列決定した。推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡ配列ＨＳ３を図４９に示し、翻訳配列を図５０に示す。
【実施例１９】
【０２４３】
マウスＰＵＦＡ伸長酵素のクローニングと発現
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用し、ｂｌａｓｔｎとマウスＥＳＴ配列ＡＩ２２５６３２（実施例１３参照）を併用してデータベース検索を実施した。３個のマウスＥＳＴ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＩ４２８１３０，ＡＩ５９５２５８，及びＡＡ０６１０８９）が同定され、これらをアセンブルして推定全長伸長酵素配列を作製し、ＭＥＬＯ４と命名した。推定全長マウス伸長酵素配列に基づいてプライマーＲＯ８１９（５’−ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＴＴＧ−３’）及びＲＯ８２０（５’−ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＣ−３’）を設計し、マウス脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を増幅するために使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を上述のように実施した（実施例１６）。ＰＣＲ増幅産物をゲル泳動させ、約１，０００ｂｐの増幅フラグメントをゲル精製し、フラグメントの末端をＮｃｏＩとＤｒａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で消化し、フラグメントをｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）にクローニングした。新規プラスミドをｐＲＡＥ−８４と命名し、ＡＢＩ  ３７３Ａ  Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してこのクローンの推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡを配列決定した。プラスミドｐＲＡＥ−８４の推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡ配列を図５４に示し、翻訳配列を図５５に示す。
【０２４４】
構築物ｐＲＡＥ−８４をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前出）に形質転換し、エロンガーゼ活性をスクリーニングした。陰性対照はｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４とした。培養物を選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）で２５μＭのＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、又はＤＰＡの存在下に４２〜４８時間３０℃にて増殖させた。これらの酵母培養物の脂質プロフィルによると、ＧＬＡはＤＧＬＡの予想産物まで伸長されないことが分かった。他方、ＡＤＡ、ω６−テトラコサテトラエン酸（ＴＴＡ、Ｃ２４：４ｎ−６）、ＥＴＡ、ＤＰＡ、及びω３−テトラコサペンタエン酸（ＴＰＡ、Ｃ２４：５ｎ−３）が夫々蓄積した（図５６）。ｎ−６脂肪酸基質ＡＡはＡＤＡに変換された後にＴＴＡに変換され、ｎ−３脂肪酸ＥＰＡはＤＰＡに変換された後にＴＰＡに変換された。これらの脂肪酸のレベルはｐＲＡＥ−８４配列を含む株の総脂肪酸の夫々０．６４％（ＡＤＡ）、１．０７％（ＴＴＡ）、１．４７％（ＤＰＡ）、及び７．０６％（ＴＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々１０．４％、６２．６％、３２．７％、及び８２．８％であった。Ｃ２２基質ＡＤＡ及びＥＰＡは総脂肪酸の２．４％（ＴＴＡ）及び３．８２％（ＴＰＡ）まで伸長された。これらを基質脂肪酸の変換率で表すと、夫々９．２％と４３．９％であった。酵母でＭＥＬＯ４を発現させると、Ｃ２０及びＣ２２脂肪酸が夫々の伸長産物に変換された。外部添加基質がＣ２０脂肪酸である場合にＣ２２からＣ２４脂肪酸への変換率は著しく高い。
【０２４５】
ＭＥＬＯ４蛋白質（ＭＥＬＯ４ｐ）の基質特異性を更に確認するために、２５μＭの飽和、モノ不飽和又はポリ不飽和脂肪酸を添加した最小培地で組換え酵母株３３４（ｐＲＡＥ−８４）を増殖させた。これらの各種基質の脂質プロフィルによると、ＭＥＬＯ４ｐはＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、又はＢＡ等の飽和脂肪酸の伸長に関与しないことが判明した（図５７Ａ）。ＭＥＬＯ４ｐはＰＴＡ、ＯＡ、又はＥＡ等のモノ不飽和脂肪酸の伸長にも関与していない。ＭＥＬＯ４ｐはｎ−６ＰＵＦＡであるＡＡとＡＤＡの伸長に関与するが、ＬＡ又はＤＧＬＡには関与しない（図５７Ｂ）。これらの酵母培養物の脂質プロフィルによると、ＡＤＡとＴＴＡが蓄積したが、Ｃ２０：２ｎ−６又はＣ２２：３ｎ−６は蓄積しないことが分かった。ＡＡを外部から添加すると、産物脂肪酸レベルはｐＲＡＥ−８４配列を含む株の総脂肪酸の０．５％（ＡＤＡ）と０．３９％（ＴＴＡ）であり、ＡＤＡを外部から添加すると、産物脂肪酸レベルは１．３％（ＴＴＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々８．７％、４３．８％、及び７．３％であった。ＭＥＬＯ４ｐはＧＬＡからＤＧＬＡへの伸長にも関与している。ＧＬＡの存在下におけるｐＲＡＥ−８４配列を含む株の脂質プロフィルはＤＧＬＡ０．４３％であり、ＧＬＡからＤＧＬＡへの変換率で表すと１４．７％に相当する。ＭＥＬＯ４ｐはｎ−３ＰＵＦＡであるＥＰＡとＤＰＡの伸長にも関与している（図５３Ｃ）。これらの酵母培養物の脂質プロフィルによると、ＤＰＡとＴＰＡが蓄積していることが分かった。ＥＰＡを添加すると、これらの脂肪酸のレベルはｐＲＡＥ−８４配列を含む株の総脂肪酸の１．２１％（ＤＰＡ）と３．３８％（ＴＰＡ）であり、ＤＰＡを添加すると、産物脂肪酸のレベルは３．０９％（ＴＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々２４．０％、７３．６％、及び４６．４％であった。ＭＥＬＯ４ｐはＳＴＡからＣ２２：４ｎ−３への伸長にも関与している。ＳＴＡを添加すると、２炭素伸長により生産される脂肪酸のレベルは０．３％（ＥＴＡ）と０．２３％（Ｃ２２：４ｎ−３）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々１１．１％と４３．４％であった。ＭＥＬＯ４ｐはＡＬＡの伸長にも関与していると思われるが、２炭素伸長により生産される脂肪酸の量は少なく（ＥＴｒＡ０．１６％）、有意とは言えない。全結果から、酵母でマウス脳由来ＭＥＬＯ４を発現させるとｎ−６及びｎ−３脂肪酸経路でＣ２０及びＣ２２長鎖ＰＵＦＡが伸長することが確認された。
【実施例２０】
【０２４６】
マウス由来ＨＳＥＬＯ１ホモログの同定、クローニング、及び発現
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用し、ｂｌａｓｔｎとＨＳＥＬＯ１配列を併用してデータベース検索を実施した。２個のヒトＥＳＴ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＩ７８７９２５及びＡＩ７４６８３８）が同定され、夫々のｃＤＮＡクローン（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ  ２０７６８３１及び２０６１８２）をＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から購入した。夫々推定マウス伸長酵素とｃＤＮＡクローンベクターの５’配列に基づいてプライマーＲＯ８３３（５’−ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  Ｃ−３’）及びＲＯ８３２（５’−ＣＧＡ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＣＡ−３’）を設計した。プライマーＲＯ８３３及びＲＯ８３２を使用してマウスｃＤＮＡクローン２０７６１８２を増幅した。ポリメラーゼ（ＰＣＲ）連鎖反応を上述のように実施した（実施例１６）。ＰＣＲ増幅産物の末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で埋め、５’領域をＮｃｏＩで消化した。修飾フラグメントをゲル泳動させ、約２．４Ｋｐの増幅フラグメントをゲル精製し、フラグメントをｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ）にクローニングした。新規プラスミドをｐＲＡＥ−８７と命名し、ＡＢＩ  ３７３Ａ  Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してこのクローンの推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡ（ＭＥＬＯ７）を配列決定した。プラスミドｐＲＡＥ−８７における推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡ配列（ＭＥＬＯ７）を図５８に示し、翻訳配列を図５９に示す。
【０２４７】
構築物ｐＲＡＥ−８７をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前出）に形質転換し、エロンガーゼ活性をスクリーニングした。陰性対照はｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４とした。培養物を選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）で２５μＭのＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、又はＡＤＡの存在下に４２〜４８時間３０℃にて増殖させた。ＭＥＬＯ７を発現する酵母培養物の脂質プロフィルによると、夫々ＤＧＬＡ、ＡＤＡ、及びＥＴＡが蓄積したことが分かった（図６０）。これらの脂肪酸のレベルはｐＲＡＥ−８４配列を含む株の総脂肪酸の夫々４．１％（ＤＧＬＡ）、６．３３％（ＡＤＡ）、３．４％（ＥＴＡ）、及び６．１８％（ＤＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々７８．７％、３６．０％、８１．０％、及び５７．４％であった。ＭＥＬＯ７蛋白質（ＭＥＬＯ７ｐ）はＡＤＡの伸長に関与していなかった。ＭＥＬＯ７ｐはＥＰＡを基質として添加した場合とＤＰＡを添加した場合に２炭素伸長により生産される脂肪酸ＤＰＡを更にＴＰＡへと伸長するのにも関与していると思われた。しかし、産物脂肪酸量は少なく（ＴＰＡ０．２７％及び０．２５％）、有意とは言えない。組換えＭＥＬＯ７配列を発現する酵母細胞は対照細胞に比較してＣ１８：１ｎ−７とＣ２０：１ｎ−７も有意に高レベルであった。全結果から、酵母でマウス胚由来ＭＥＬＯ７を発現させるとｎ−６及びｎ−３脂肪酸経路で各種長鎖ＰＵＦＡが伸長し、ＭＥＬＯ７はＨＳＥＬＯ１のホモログであることが確認された。
【実施例２１】
【０２４８】
真菌ＰＵＦＡ伸長酵素のクローニングと発現
４種のエロンガーゼＨＳＥＬＯ１、ＭＥＬＯ４、ＧＬＥＬＯ、及びＣＥＥＬＯの翻訳アミノ酸配列を整列させ、相同領域を同定した（図６４）。類似性を示す配列ブロック（下線部）に基づいてプライマーを設計した。プライマーＲＯ８９５（５’−ＧＴＡ  ＧＴＡ  ＷＧＡ  ＧＴＡ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＷＡＣ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＲＡＡ  ＷＧＡ  ＧＴＴ  ＷＡＧ−３’）とベクタープライマーＲＯ８９８（５’−ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  Ｇ−３’）を使用してＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ  ７０９１（Ｔ７０９１）に由来するｃＤＮＡを増幅した。Ｔ７０９１ｃＤＮＡ１μｌ、ｄＮＴＰミックス０．２μＭ、各プライマー５０μＭ、１０Ｘ緩衝液５μｌ、５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４  １．５μｌ、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕを含有する５０μｌ容量中でＰＣＲを実施した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００のサーモサイクラー条件は９４℃で３分間の後、９５℃で４５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で２分間を３０サイクルとした。ＰＣＲ増幅混合物をゲル泳動させ、約７５０ｂｐの増幅フラグメントをゲル精製し、単離したフラグメントをｐＣＲ−ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。
【０２４９】
１２個のクローンを作製し、配列決定した。全１２個のクローンは同一配列であり、コンセンサス配列をｃ１ｄ６（図６５）と命名した。ｃ１ｄ６の翻訳アミノ酸配列（図６６）はＨＳＥＬＯ１と１９０アミノ酸で同一性３４．７％であり、ＭＥＬＯ４と１８７アミノ酸で同一性３５．８％であり、ＧＬＥＬＯと１６０アミノ酸で同一性４５．６％であり、ＣＥＥＬＯと１５５アミノ酸で同一性３２．９％であった。最初のＭｅｔのｃ１ｄ６の５’配列に基づいて新規プライマーを設計した。付加ＮｃｏＩ部位（下線部）をもつＲＯ１１６０（５’−ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＣＣＡ ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＧ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  ＡＴＧ−３’）と、ベクタープライマーＲＯ８９９（５’−ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ−３’）を使用してＴ７０９１ｃＤＮＡを増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を上述のように実施した。ＰＣＲ増幅産物をゲル泳動させ、約１．２Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製し、フラグメントの末端をＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で消化し、フラグメントをｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）にクローニングした。新規プラスミドをｐＲＡＴ−４−Ａ１、ｐＲＡＴ−４−Ａ２、ｐＲＡＴ−４−Ａ３、ｐＲＡＴ−４−Ａ４、ｐＲＡＴ−４−Ａ６、ｐＲＡＴ−４−Ａ７、及びｐＲＡＴ−４−Ｄ１と命名した。（プラスミドＤＮＡｐＲＡＴ−４−Ａ７はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に２００１年４月１９日付けで寄託し、アクセション番号ＰＴＡ−３３０１を付与された。）ＡＢＩ  ３７３Ａ  Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してこれらのクローンの推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡを配列決定した。夫々プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１〜ｐＲＡＴ−４−Ｄ１の推定ＰＵＦＡ伸長酵素ｃＤＮＡ配列を図６７〜７３に示し、翻訳配列を図７４〜８０に示す。
【０２５０】
構築物ｐＲＡＴ−４−Ａ１〜ｐＲＡＴ−４−Ｄ１をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前出）に形質転換し、エロンガーゼ活性をスクリーニングした。未改変ｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４を陰性対照として使用した。培養物を選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）で２５μＭのＧＬＡ又はＥＰＡの存在下に４８時間２４℃にて増殖させた。この試験では、夫々ＤＧＬＡ又はω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ，２２：５ｎ−３）がエロンガーゼ活性の予想産物であった。これらの酵母培養物の脂質プロフィルによると、ＧＬＡは３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ３）を除く全サンプルでＤＧＬＡに伸長された（図８１）。これは、ｐＲＡＴ−４−Ａ３のｃＤＮＡ配列が配列の５’末端に数個の終止コドンをもつ結果として翻訳酵素の切断形が生じたものと予想された（図７６）。３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ２）ではＤＧＬＡレベルは非常に低かったが、このサンプルのＧＬＡレベルは最低であったため、脂肪酸からその伸長形への変換率は２８．４％と有意であった。発現された酵素間に明白な基質特異性があったことは予想外であった。３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ１）と３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ２）の培養物はＥＰＡを基質として添加した場合にＤＰＡレベルが非常に低く、これらの培養物で発現された酵素は２０鎖長ＰＵＦＡであるＥＰＡよりも１８炭素鎖長ＰＵＦＡの伸長を優先すると思われた。３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ４）、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ６）、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ７）、及び３３４（ｐＲＡＴ−Ｄ１）の培養物はいずれもＤＰＡレベルが有意であり、これらの培養物で発現された酵素は１８炭素長と２０炭素長のＰＵＦＡの両者から夫々の伸長脂肪酸への伸長に関与していると思われた。
【０２５１】
６個の活性クローンのアミノ酸配列を比較し、基質優先が翻訳配列に依存するのかどうかを調べた（図８２）。ｐＲＡＴ−４−Ａ１とｐＲＡＴ−４−Ａ２のｃＤＮＡ配列は他の配列と異なり、夫々Ｙ３７７ＣとＶ３７１Ａに突然変異があった。これが２０炭素鎖伸長のための酵素の必須領域であると思われる。他の配列にも突然変異ｐＲＡＴ−４−Ａ４（（Ｉ４７５Ｖ），ｐＲＡＴ−４−Ａ６（Ｄ２６Ｇ及びＶ４５８Ａ），及びｐＲＡＴ−４−Ｄ１（Ｋ１８２Ｒ及びＥ２６９Ｖ）があったが、これらの突然変異は２０炭素鎖伸長を妨げないようであった。ｐＲＡＴ−４−Ａ７  ｃＤＮＡはコンセンサス配列に比較して塩基７２６に単一サイレント突然変異があった。
【０２５２】
コンセンサスＴＥＬＯ１配列の翻訳アミノ酸配列はＨＳＥＬＯ１と２６５アミノ酸で同一性３４．０％（図８３）、ＭＥＬＯ４と２６７アミノ酸で同一性３４．１％（図８４）、ＧＬＥＬＯと２４４アミノ酸で同一性４３．４％（図８５）、ＣＥＥＬＯと２３９アミノ酸で同一性３４．３％（図８６）であった。
【０２５３】
真菌エロンガーゼｃＤＮＡを含む酵母細胞は対照株に比較してモノ不飽和脂肪酸１８：１ｎ−７も高レベルであった（図８１）。従って、これらの結果から、同定された真菌エロンガーゼはＰＵＦＡとモノ不飽和脂肪酸を基質として利用できることが分かった。従って、これらの真菌配列ＴＥＬＯ１とそれによりコードされる蛋白質（ＴＥＬＯ１ｐ）は基質特異性に依存せずにエロンガーゼ活性をもつ。
【０２５４】
本明細書でＴＥＬＯ１と呼ぶ上記真菌伸長酵素の基質特異性を更に確認するために、ｎ−６脂肪酸ＧＬＡ、ＡＡ、又はｎ−３脂肪酸ＳＴＡもしくはＥＰＡを添加するか又は基質を添加せずに最小培地で組換え酵母株３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ４）、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ６）、３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ７）、及び３３４（ｐＲＡＴ−４−Ｄ１）を増殖させた。これらの酵母培養物の脂質プロフィルをＧＣとＧＣ−ＭＳにより試験した処、夫々ＤＧＬＡ、ＡＤＡ、ＥＴＡ、ω３−ドコサテトラエン酸（ＤＴＡ、Ｃ２２：４ｎ−３）、及びＤＰＡが蓄積されていることが分かった（図８７）。これらの脂肪酸のレベルはＴＥＬＯ１配列を含む株における総脂肪酸の夫々３．８８〜５．４２％（ＤＧＬＡ）、０．１８〜０．７５％（ＡＤＡ）、２．２７〜４．０１％（ＥＴＡ）、０．１６〜１．１０％（ＤＴＡ）、及び０．５４〜１．７４％（ＤＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々６４．０〜７７．２％、１．０〜５．０％、７９．３〜８９．６％、３．８〜３２．６％、及び３．４〜１３．３％であった。
【０２５５】
組換えＴＥＬＯ１配列を発現する酵母細胞は対照細胞に比較して有意に高レベルのＣ１８：１ｎ−７と低レベルのＣ１６：１ｎ−７も含有していた（図８７）。この知見から、組換えＴＥＬＯ１蛋白質（ＴＥＬＯ１ｐ）が１６炭素長のモノ不飽和脂肪酸の伸長にも関与しているのではないかと思われた。
【０２５６】
ＴＥＬＯ１ｐの基質特異性を更に確認するために、２５μＭの各種ＰＵＦＡを添加した最小培地で組換え酵母株３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ７）を増殖させた。これらの各種基質の脂質プロフィルによると、ＴＥＬＯ１ｐはｎ−６ＰＵＦＡであるＬＡ、ＧＬＡ、及びＡＡの伸長に関与しているが、ＤＧＬＡには関与していないことが判明した（図８８）。これらの酵母培養物の脂質プロフィルは夫々Ｃ２０：２ｎ−６、ＤＧＬＡ、及びＡＤＡが蓄積し、Ｃ２２：３ｎ−６は蓄積しないことを示した。これらの脂肪酸のレベルは３３４（ｐＲＡＴ−４−Ａ７）の溶解液中の総脂肪酸の夫々１．０７％（Ｃ２０：２ｎ−６）、５．８４％（ＤＧＬＡ）、及び０．７６％（ＡＤＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々２３．２％、７８．６％、及び３．５％であった。ＴＥＬＯ１ｐはｎ−３ＰＵＦＡであるＡＬＡ、ＳＴＡ、及びＥＰＡの伸長にも関与している（図８８）。これらの酵母培養物の脂質プロフィルは夫々ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、及びＤＰＡの蓄積があることを示した。これらの脂肪酸のレベルはＴＥＬＯ１配列を含む株における総脂肪酸の夫々２．７１％（ＥＴｒＡ）、４．１９％（ＥＴＡ）、及び１．９９％（ＤＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々４３．３％、８５．３％、及び１１．５％であった。ＳＴＡを基質として添加すると、培養物にはＤＴＡも蓄積した。この脂肪酸のレベルは０．７４％であり、基質ＳＴＡから炭素原子２個を伸長した産物であるＥＴＡへの変換率で表すと１５．０％であった。全結果から、酵母でＴ７０９１からＴＥＬＯ１を発現させるとｎ−６及びｎ−３脂肪酸経路で各種長鎖ＰＵＦＡが伸長することが確認された。
【実施例２２】
【０２５７】
藻類Ｐａｖｌｏｖａ種（ＣＣＭＰ４５９）からの新規エロンガーゼ遺伝子の単離
藻類Ｐａｖｌｏｖａ種（ＣＣＭＰ４５９）（Ｐａｖ４５９）の脂肪酸組成を検討し、この生物により産生されるポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を分析した。この藻類はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ｎ−３）とドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６ｎ−３）を含む実質的量の長鎖ＰＵＦＡを示した。従って、このＰａｖ４５９はΔ４−デサチュラーゼによりＤＨＡに変換することができるω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ，２２：５ｎ−３）にＥＰＡを変換することが可能なエロンガーゼをもつと予想された。従って、目的はＰａｖ４５９から予想されるエロンガーゼ遺伝子を単離し、代替宿主で発現させることにより酵素の機能性を確かめることであった。
【０２５８】
Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ（ＣＣＭＰ，Ｗｅｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）からＰａｖ４５９の凍結ペレットを入手した。これらのペレットを液体窒素で粉砕し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用することにより全ＲＮＡをＰａｖ４５９から抽出した。オリゴｄＴセルロース樹脂を使用してこの全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した後に、ｐＳｐｏｒｔ  １ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してｃＤＮＡライブラリーの構築に使用した。こうして作製したｃＤＮＡをｐＳｐｏｒｔ１ベクターに指向性クローニングした（５’ＳａｌＩ／３’ＮｏｔＩ）。Ｐａｖ４５９ライブラリーは各々平均インサートサイズ約１２００ｂｐのクローン約６．１ｘ１０５個／ｍｌを含んでいた。Ｔ７プロモータープライマー（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＧＧ−３’）を使用してこのライブラリーに由来する初代クローン２５００個を５’末端から配列決定した。配列決定はＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅシーケンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）とＭｅｇａＢａｓｅ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＮＡシーケンサー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して実施した。
【０２５９】
２，５００個のライブラリークローンのシーケンシングから２個のクローン「ｐａｖ０６−Ｃ０６」及び「ｐａｖ０７−Ｇ０１」が得られ、整列させてこの新規エロンガーゼの５’末端を含む５００ｂｐ配列を得た。このフラグメントはマウスエロンガーゼＭＥＬＯ４と３３．３％のアミノ酸配列同一性であり、Ｔ．ａｕｒｅｕｍエロンガーゼＴＥＬＯ１と３２．７％のアミノ酸配列同一性であった。全長遺伝子を単離するために、ＥＳＴクローンｐａｖ０６−Ｃ０６を鋳型とし、５’プライマーＲＯ１３２７（５’−ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＴＡＧ  ＴＧ−３’）１０ｐｍｏｌとベクタープライマーＲＯ８９８（５’−ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  Ｇ−３’）１０ｐｍｏｌを使用してＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ増幅はＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、１μｌのｃＤＮＡクローンｐａｖ０６−Ｃ０６、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．４，５０ｍＭ  ＫＣｌ（終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸各２００μＭ、プライマー各１０ｐｍｏｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及びＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（ＨＦ）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを含有する総容量５０μｌ中で実施した。増幅はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９７００マシンを使用して９４℃で３分間の初期変性後に、９４℃で４５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分間を３５サイクル実施した。４℃で反応を終了した。ＰＣＲ増幅混合物をゲル泳動させ、約１．３Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製し、単離したフラグメントをｐＣＲ−ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。ＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、組換えプラスミドベクターを作製した。作製した組換えプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ゲル泳動させ、約１．２Ｋｂの消化フラグメントをゲル精製し、ｐＹＸ２４２（ＥｃｏＲＩ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。新規プラスミドをｐＲＰＬ−６−１と命名した。
【０２６０】
プラスミドｐＲＰＬ−６−１を作製し、ＡＢＩ  ３７３Ａ  Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。プラスミドｐＲＰＬ−６−１における推定伸長酵素ｃＤＮＡ配列を図８９に示し、推定アミノ酸配列を図９０に示す。ｐＲＰＬ−６−１におけるｃＤＮＡの翻訳アミノ酸配列はＭＥＬＯ４と２６１アミノ酸で同一性３３．７％であり、ＧＬＥＬＯと２４０アミノ酸で同一性３３．８％であり、ＨＳＥＬＯ１と２７４アミノ酸で同一性２８．１％であり、ＴＥＬＯ１と２４６アミノ酸で同一性３２．５％であった。
【０２６１】
構築物ｐＲＰＬ−６−１をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前出）に形質転換し、エロンガーゼ活性をスクリーニングした。未改変ｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４を陰性対照として使用した。培養物を選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）で２５μＭのＧＬＡ又はＥＰＡの存在下に４４時間２４℃にて増殖させた。この試験では、夫々ＤＧＬＡ又はω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ，２２：５ｎ−３）がエロンガーゼ活性の予想産物であった。これらの酵母培養物の脂質プロフィルによると、ＧＬＡからＤＧＬＡへの変換は全く認められなかったが、ＥＰＡは非常に低レベルでＤＰＡに伸長された（ＤＰＡは総脂肪酸の０．３４％であり、ＥＰＡは総脂肪酸の３２．２８％であった）。従って、この培養物で発現された酵素は１８炭素鎖長ＰＵＦＡであるＧＬＡよりも２０炭素鎖長ＰＵＦＡの伸長を優先することが分かった。発現された酵素の完全活性を阻害する突然変異がＤＮＡ配列に存在するらしいことも分かった
突然変異のない全長遺伝子を単離するために、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを反応のターゲットとして使用した。この材料を作製するために、全ＲＮＡ約５μｇを使用し、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（登録商標）酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して逆転写させ、ｃＤＮＡターゲットを作製した。次にこのｃＤＮＡを鋳型とし、５０ｐｍｏｌの５’プライマーＲＯ１３２７と３０ｐｍｏｌのＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）３’プライマー（５’−ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  Ｇ−３’）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ増幅はＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、ＲＡＣＥ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ２μｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．４，５０ｍＭ  ＫＣｌ（終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸各２００μＭ、プライマー各１０ｐｍｏｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及びＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（ＨＦ）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを含有する総容量５０μｌ中で実施した。増幅はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００マシンを使用して９４℃で３分間の初期変性後に、９４℃で４５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分間を３５サイクル実施した。４℃で反応を終了した。
【０２６２】
ＰＣＲ増幅混合物をゲル泳動させ、約１．２Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製し、単離したフラグメントをＰＣＲ−ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。ベクターをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、組換えプラスミドを作製した。作製した組換えプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ゲル泳動させ、約１．２Ｋｂの消化フラグメントをゲル精製し、ｐＹＸ２４２（ＥｃｏＲＩ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。新規プラスミドをｐＲＰＬ−６−Ｂ２及びｐＲＰＬ−６−Ａ３と命名した。
【０２６３】
プラスミドｐＲＰＬ−６−Ｂ２及びｐＲＰＬ−６−Ａ３を作製し、ＡＢＩ  ３７３Ａ  Ｓｔｒｅｔｃｈ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。プラスミドｐＲＰＬ−６−Ｂ２及びｐＲＰＬ−６−Ａ３における推定伸長酵素ｃＤＮＡ配列を夫々図９１及び９２に示し、推定アミノ酸配列を図９３及び９４に示す。ｐＲＰＬ−６−Ｂ２におけるｃＤＮＡの翻訳アミノ酸配列はＭＥＬＯ４と２６１アミノ酸で同一性３４．１％であり（図９５）、ＧＬＥＬＯと２４０アミノ酸で同一性３３．８％であり（図９６）、ＨＳＥＬＯ１と２７４アミノ酸で同一性２８．５％であり（図９７）、ＴＥＬＯ１と２４６アミノ酸で同一性３２．５％であった（図９８）。（プラスミドｐＲＰＬ−６−Ｂ２はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託し、アクセション番号ＰＴＡ−４３５０を付与された。）
構築物ｐＲＰＬ−６−Ｂ２及びｐＲＰＬ−６−Ａ３をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら，前出）に形質転換し、エロンガーゼ活性をスクリーニングした。未改変ｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４を陰性対照として使用した。培養物を選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出）で２５μＭのＧＬＡ又はＥＰＡの存在下に４４時間２４℃にて増殖させた。この試験では、夫々ＤＧＬＡ又はω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ，２２：５ｎ−３）がエロンガーゼ活性の予想産物であった。これらの酵母培養物の脂質プロフィルによると、どのサンプルでもＧＬＡはＤＧＬＡまで伸長されなかった（データは示さず）。３３４（ｐＲＰＬ−６−Ｂ２）と３３４（ｐＲＡＴ−６−Ａ３）の培養物は基質ＥＰＡからＤＰＡへの変換レベルが有意であり（図９９）、これらの培養物で発現された酵素は１８炭素鎖長ＰＵＦＡであるＧＬＡよりも２０炭素鎖長ＰＵＦＡの伸長を優先することが分かった。
【０２６４】
３個のクローンのアミノ酸配列を比較し、基質変換レベルが翻訳配列に依存するのかどうかを調べた（図１００）。ｐＲＰＬ−６−１のｃＤＮＡ配列はｐＲＰＬ−６−Ｂ２に比較してＡ５１２Ｇで相異していた。この単一突然変異により、Ｃ２０基質脂肪酸からその伸長産物への変換率は劇的に減少した。これが２０炭素鎖伸長のための酵素の必須領域であると思われる。ｐＲＰＬ−６−Ａ３のｃＤＮＡ配列はｐＲＰＬ−６−Ｂ２に比較してＤ１６９ＮとＣ７４５ＲＧで相異していた。これらの突然変異により、Ｃ２０基質脂肪酸からその伸長産物への変換率は減少したが、発現された酵素はある程度の活性を維持することができた。
【０２６５】
本明細書でＰＥＬＯ１ｐと呼ぶ上記藻類伸長酵素の基質特異性を更に確認するために、ｎ−６脂肪酸ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、又はｎ−３脂肪酸ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、又は２０：０、又は２０：１を添加した最小培地で組換え酵母株３３４（ｐＲＰＬ−６−Ｂ２）を増殖させた。これらの酵母培養物の脂質プロフィルをＧＣとＧＣ−ＭＳにより試験した処、夫々アドレン酸（ＡＤＡ，２２：４−６）とＥＰＡが蓄積されていることが分かった（図１０１）。これらの脂肪酸のレベルはＰＥＬＯ１配列を含む株における総脂肪酸の夫々１．４０％（ＡＤＡ）及び２．５４％（ＥＰＡ）であった。これらは基質脂肪酸から炭素原子２個を伸長した産物への変換率で表すと、夫々１４．０％と１４．１％であった。飽和脂肪酸２０：０、又はモノ不飽和脂肪酸２０：１の伸長は全く認められなかった。また、Ｃ１８基質ＬＡ、ＧＬＡ、ＡＬＡ、又はＳＴＡの伸長も全く認められなかった。これらの結果から、３３４（ｐＲＰＬ−６−Ｂ２）株で発現された酵素活性は２０炭素鎖長ＰＵＦＡの伸長に特異的であり、１８鎖長ＰＵＦＡや２０炭素鎖長飽和又はモノ不飽和脂肪酸には特異的でないことが分かった。
【０２６６】
栄養組成物
詳細な説明に記載したＰＵＦＡは種々の栄養補給剤、乳児用調製粉乳、代用栄養剤及び他の栄養溶液で利用することができる。
【０２６７】
Ｉ．乳児用調製粉乳
Ａ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）鉄分配合調製豆乳：
用途：牛乳アレルギー又は過敏症の乳児、幼児及び成人用飲料。乳糖を避けなければならない疾患（ラクターゼ欠乏症、乳糖不耐症及びガラクトース血症）の患者への栄養。
【０２６８】
特徴：
−牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物（コーンシロップと蔗糖）を使用。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）を配合。
−推奨値のビタミンとミネラルを配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
−乳白色、乳状コンシステンシー及びよい香り。
【０２６９】
成分：（パルベ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖質（蔗糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２７０】
Ｂ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＤＦ下痢用調製豆乳：
用途：乳幼児の下痢の食物管理用短期摂取食。
【０２７１】
特徴：
−特に下痢管理用として大豆繊維からの食物繊維を加えた最初の乳児用調製乳である。
−乳児の軽度から重度の下痢期間に水状軟便期間を短くすることが臨床的に判明した。
−乳児の栄養要件を満足するように栄養学的に完全である。
−Ｌ−メチオニンを添加した大豆蛋白単離物は乳児の全必須アミノ酸の必要値を満足するか又はこれを上回る。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物（コーンシロップと蔗糖）を使用。
−米国小児科学会栄養委員会により推奨され、乳児用調製乳法に規定されるビタミン及びミネラル値を満足するか又はこれを上回る。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）を配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
【０２７２】
成分：（パルベ）水８６％、コーンシロップ４．８％、糖質（蔗糖）２．５％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物２．０％、ヤシ油１．４％、大豆繊維０．７７％、クエン酸カルシウム０．１２％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム０．１０％、塩化カリウム、第一リン酸カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２７３】
Ｃ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＳＦ鉄分入り無蔗糖調製豆乳：
用途：牛乳蛋白アレルギーもしくは過敏症又は蔗糖不耐の乳児、幼児及び成人用飲料。乳糖と蔗糖を避けなければならない疾患の患者への栄養。
【０２７４】
特徴：
−牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした（炭水化物源はＰｏｌｙｃｏｓｅ（登録商標）グルコースポリマーである）。
−蔗糖不耐患者のために無蔗糖とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（１８０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）を配合。
−推奨値のビタミンとミネラルを配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
−乳白色、乳状コンシステンシー及びよい香り。
【０２７５】
成分：（パルベ）水７５％、加水分解コーンスターチ１１．８％、大豆油４．１％、大豆蛋白単離物４．１％、ヤシ油２．８％、改質コーンスターチ１．０％、第三リン酸カルシウム０．３８％、クエン酸カリウム０．１７％、塩化カリウム０．１３％、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラギナン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２７６】
Ｄ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）２０即製鉄分配合調製豆乳、２０Ｃａｌ／液量オンス：
用途：大豆摂取を必要とする場合。
【０２７７】
成分：（パルベ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖質（蔗糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２７８】
Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）乳児用調製乳：
用途：乳児用調製乳を必要とする場合：１歳未満で授乳の中断を決定した場合、授乳の補完が必要な場合、又は授乳を採用しない際の日常食として。
【０２７９】
特徴：
−良好な成長に適した品質と量の蛋白質を配合すると共に、熱変性により乳関連腸内失血の危険を減らした。
−（二重均質化）植物油ブレンドに由来する脂肪を使用し、吸収し易い必須リノレン酸を提供する。
−母乳に似た割合で乳糖として炭水化物を配合した。
−成長中の臓器へのストレスを最小限にするために低腎溶質負荷とした。
−粉末、濃厚液及び即製形態。
【０２８０】
成分：（−Ｄ）水、脱脂乳、乳糖、大豆油、ヤシ油、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、アスコルビン酸、カラギナン、塩化コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２８１】
Ｆ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＮｅｏＣａｒｅ鉄分入り早産児用調製乳：
用途：退院後の早産児の特殊栄養要件を満たす。Ｓｉｍｉｌａｃ  ＮｅｏＣａｒｅは成長の遅れを取り戻し、成長を助けるために必要な付加熱量、蛋白質、ビタミン及びミネラルを提供するために開発された栄養学的に完全な処方である。
【０２８２】
特徴：
−熱量とビタミン補給の必要を減らす。標準処方（２０Ｃａｌ／液量オンス）よりも高熱量（２２Ｃａｌ／液量オンス）。
−早産児の特殊消化要件を満足し易くするために中鎖トリグリセリド（ＭＣＴｏｉｌ）を加えた高吸収脂肪ブレンドを配合。
−入院中に開始した栄養補給を延長するためにより高値の１００カロリー当たり蛋白質、ビタミン及びミネラルを配合。
−骨無鉱化を改善するためにカルシウム及びリン濃度を高くした。
【０２８３】
成分：−Ｄコーンシロップ固形分、脱脂乳、乳糖、濃縮ホエイ蛋白、大豆油、高オレイン酸サフラワー油、分留ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、ヤシ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、塩化コリン、パルミチン酸アスコルビル、Ｌ−カルニチン、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、混合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、βカロチン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２８４】
Ｇ．Ｓｉｍｉｌａｃ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｒｅ即製低鉄分母乳強化剤、２４Ｃａｌ／液量オンス：
用途：母乳と混合するか又は出産時体重の少ない乳児に母乳の代用として与える。
【０２８５】
成分：−Ｄ水、脱脂乳、加水分解コーンスターチ、乳糖、分留ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、濃縮ホエイ蛋白、大豆油、ヤシ油、第三リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、塩化コリン、ｍ−イノシトール、タウリン、ナイアシンアミド、Ｌ−カルニチン、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、塩化カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二銅、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンＤ３、亜セレン酸ナトリウム及びシアノコバラミン。
【０２８６】
本発明の種々のＰＵＦＡは上記乳児用調製乳及び当分野で公知の他の乳児用調製乳に代用及び／又は添加することができる。
【０２８７】
ＩＩ．栄養製剤
Ａ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥは経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することを主目的とする低残渣液体食品である。ＥＮＳＵＲＥは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。主に経口補給剤であるが、経管供給することもできる。
【０２８８】
患者状態：
−調整食摂取患者。
−危険な栄養状態にある高齢者。
−不随意体重減少患者。
−病気又は手術から回復中の患者。
−低残渣食が必要な患者。
【０２８９】
成分：−Ｄ水、糖質（蔗糖）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、大豆蛋白単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム。
【０２９０】
Ｂ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＢＡＲＳ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＢＡＲＳは食間又は食事と共に補充する完全にバランスのとれた補助栄養である。他のスナック菓子に代用する美味しく栄養分の高い代用食である。ＥＮＳＵＲＥ  ＢＡＲＳは１本当たり乳糖含有量が＜１ｇであり、チョコレートファッジブラウニーフレーバーは無グルテンである。（ハニーグラハムクランチフレーバーはグルテンを含む。）
患者状態：
−付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする患者。
−十分な熱量と栄養を取込めない者に特に有用である。
−噛む能力と飲込む能力のある者。
−落花生アレルギー又は任意型のナッツアレルギーのある者には使用できない。
【０２９１】
成分：ハニーグラハムクランチ−高果糖コーンシロップ、大豆蛋白単離物、ブラウンシュガー、蜂蜜、マルトデキストリン（トウモロコシ）、クリスプライス（米粉、糖質［蔗糖］、食塩［塩化ナトリウム］及び麦芽）、オート麦ぬか、部分加水分解綿実油及び大豆油、大豆多糖、グリセリン、濃縮ホエイ蛋白、ポリデキストロース、果糖、カゼイン酸カルシウム、ココア粉末、人工フレーバー、キャノーラ油、高オレイン酸サフラワー油、脱脂粉乳、ホエイ粉末、大豆レシチン及びコーン油。ナッツ加工施設で製造。
【０２９２】
ビタミン及びミネラル：第三リン酸カルシウム、第二リン酸カリウム、酸化マグネシウム、食塩（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、アスコルビン酸、オルトリン酸第二鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、酸化亜鉛、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マンガン、リボフラビン、βカロチン、塩酸ピリドキシン、一硝酸チアミン、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２９３】
蛋白質：ハニーグラハムクランチ−蛋白源は大豆蛋白単離物と乳蛋白のブレンドである。
大豆蛋白単離物                          ７４％
乳蛋白                                  ２６％。
【０２９４】
脂肪：ハニーグラハムクランチ−脂肪源は部分加水分解綿実油及び大豆油、キャノーラ油、高オレイン酸サフラワー油、並びに大豆レシチンのブレンドである。
部分加水分解綿実油及び大豆油            ７６％
キャノーラ油                            ８％
高オレイン酸サフラワー油                ８％
コーン油                                ４％
大豆レシチン                            ４％。
【０２９５】
炭水化物：ハニーグラハムクランチ−炭水化物源は高果糖コーンシロップ、ブラウンシュガー、マルトデキストリン、蜂蜜、クリスプライス、グリセリン、大豆多糖及びオート麦ぬかの組合せである。
高果糖コーンシロップ                    ２４％
ブラウンシュガー                        ２１％
マルトデキストリン                      １２％
蜂蜜                                    １１％
クリスプライス                          ９％
グリセリン                              ９％
大豆多糖                                ７％
オート麦ぬか                            ７％。
【０２９６】
Ｃ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮは食事に付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする者のための濃縮高蛋白液体食品である。経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮは無乳糖無グルテンであり、一般外科手術又は股関節骨折から回復中の者や、ストレス潰瘍の危険のある患者が使用するのに適している。
【０２９７】
患者状態：
−付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする患者、例えば一般外科手術又は股関節骨折から回復中の者、ストレス潰瘍の危険のある患者及び低コレステロール食患者。
【０２９８】
特徴：
−低飽和脂肪。
−１缶当たり総脂肪６ｇ、コレステロール＜５ｍｇを含有。
−濃厚でクリーミーな食感。
−優良な蛋白、カルシウム並びに他の必須ビタミン及びミネラル源。
−低コレステロール食用。
−無乳糖で消化し易い。
【０２９９】
成分：
バニラシュプリーム：−Ｄ水、糖質（蔗糖）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、大豆蛋白単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０３００】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム      ８５％
大豆蛋白単離物                          １５％。
【０３０１】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油及び大豆油の３種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油                ４０％
キャノーラ油                            ３０％
大豆油                                  ３０％。
【０３０２】
ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮの脂肪値は米国心臓協会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮ中の脂肪６ｇは総熱量の２４％に相当し、脂肪の２．６％は飽和脂肪酸に由来し、７．９％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量＜３０％、飽和脂肪酸由来熱量＜１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０３０３】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味とフレーバーバラエティ（バニラシュプリーム、チョコレートロイヤル、ワイルドベリー及びバナナ）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、フレーバー疲労を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０３０４】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖                                    ６０％
マルトデキストリン                      ４０％。
【０３０５】
チョコレート：
蔗糖                                    ７０％
マルトデキストリン                      ３０％。
【０３０６】
Ｄ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＬＩＧＨＴ
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴは経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用することを目的とする低脂肪液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０３０７】
患者状態：
−ＥＮＳＵＲＥよりも脂肪が５０％少なく、熱量が２０％少ない補給剤で付加栄養を必要とする正常体重又は超過体重患者。
−食事が適正ではなく、付加栄養を必要とする健康な成人。
【０３０８】
特徴：
−低脂肪及び低飽和脂肪。
−１缶当たり総脂肪３ｇ、コレステロール＜５ｍｇを含有。
−濃厚でクリーミーな食感。
−優良なカルシウム並びに他の必須ビタミン及びミネラル源。
−低コレステロール食用。
−無乳糖で消化し易い。
【０３０９】
成分：
フレンチバニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、カゼイン酸カルシウム、高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、第二リン酸カリウム、第二リン酸マグネシウム、天然及び人工フレーバー、第三リン酸カルシウム、セルロースゲル、塩化コリン、大豆レシチン、カラギナン、食塩（塩化ナトリウム）、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０３１０】
蛋白質：蛋白源はカゼイン酸カルシウムである。
カゼイン酸カルシウム                    １００％。
【０３１１】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油とキャノーラ油の２種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油                ７０％
キャノーラ油                            ３０％。
【０３１２】
ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴの脂肪値は米国心臓協会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴ中の脂肪３ｇは総熱量の１３．５％に相当し、脂肪の１．４％は飽和脂肪酸に由来し、２．６％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量＜３０％、飽和脂肪酸由来熱量＜１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０３１３】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。チョコレートフレーバーはコーンシロップも含有している。マイルドな甘味とフレーバーバラエティ（フレンチバニラ、チョコレートシュプリーム、ストロベリースワール）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、フレーバー疲労を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０３１４】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖                                    ５１％
マルトデキストリン                      ４９％。
【０３１５】
チョコレート：
蔗糖                                    ４７．０％
コーンシロップ                          ２６．５％
マルトデキストリン                      ２６．５％。
【０３１６】
ビタミン及びミネラル：ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴの８液量オンス缶は２４種の主要ビタミン及びミネラルのＲＤＩの少なくとも２５％を提供する。
【０３１７】
カフェイン：チョコレートフレーバーは８液量オンス当たりカフェイン２．１ｍｇを含有している。
【０３１８】
Ｅ．ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳは通常蛋白濃度で付加熱量及び栄養を必要とする場合に使用する高熱量低残渣液体食品である。経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することを主目的とする。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳは無乳糖無グルテンである。主に経口栄養補給剤であるが、経管供給することもできる。
【０３１９】
患者状態：
−量を制限しながら通常蛋白濃度で付加熱量及び栄養を必要とする患者。
−体重増加又は健康体重の維持を必要とする患者。
【０３２０】
特徴：
−濃厚でクリーミーな食感。
−良好な必須ビタミン及びミネラル源。
【０３２１】
成分：
バニラ：−Ｄ水、コーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、糖質（蔗糖）、大豆蛋白単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０３２２】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム      ８４％
大豆蛋白単離物                          １６％。
【０３２３】
脂肪：脂肪源はコーン油である。
コーン油                                １００％。
【０３２４】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート、イチゴ、コーヒー、バターピーカン及びエッグノッグ）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０３２５】
バニラ、イチゴ、バターピーカン、及びコーヒーフレーバー：
コーンシロップ                          ３９％
マルトデキストリン                      ３８％
蔗糖                                    ２３％。
【０３２６】
チョコレート及びエッグノッグフレーバー：
コーンシロップ                          ３６％
マルトデキストリン                      ３４％
蔗糖                                    ３０％。
【０３２７】
ビタミン及びミネラル：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳの８液量オンス缶は２５種の主要ビタミン及びミネラルのＲＤＩの少なくとも１５％を提供する。
【０３２８】
カフェイン：チョコレートフレーバーは８液量オンス当たりカフェイン３．１ｍｇを含有している。コーヒーフレーバーは微量のカフェインを含有している。
【０３２９】
Ｆ．ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）ＨＮ
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ  ＨＮは熱量及び蛋白必要値が高いか又は耐容量の低い者を対象とした栄養学的に完全な高熱量高窒素液体食品である。経口補充用として使用してもよいし、完全経管栄養補充用として使用してもよい。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ  ＨＮは無乳糖無グルテンである。
【０３３０】
患者状態：
−手術又は怪我後のように熱量及び蛋白必要値が高い患者。
−耐容量が低い早期満腹患者。
【０３３１】
特徴：
−補助又は完全栄養。
−経口又は経管供給。
−１．５ＣａＶｍＬ。
−高窒素。
−高熱量密度。
【０３３２】
成分：
バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、コーン油、糖質（蔗糖）、大豆蛋白単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、カラギナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０３３３】
Ｇ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲ（水で再構成）は経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用することを主目的とする低残渣液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０３３４】
患者状態：
−調整食摂取患者。
−危険な栄養状態にある高齢者。
−病気／手術から回復中の患者。
−低残渣食が必要な患者。
【０３３５】
特徴：
−混合し易く簡便。
−低飽和脂肪。
−１回分当たり総脂肪９ｇ、コレステロール＜５ｍｇを含有。
−高ビタミン及びミネラル。
−低コレステロール食用。
−無乳糖で消化し易い。
【０３３６】
成分：−Ｄコーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、大豆蛋白単離物、人工フレーバー、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、第三リン酸カルシウム、塩化カリウム、大豆レシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、塩酸チアミン、硫酸第二銅、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０３３７】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム      ８４％
大豆蛋白単離物                          １６％。
【０３３８】
脂肪：脂肪源はコーン油である。
コーン油                                １００％。
【０３３９】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲはコーンシロップとマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲのマイルドな甘味にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、フレーバー疲労を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０３４０】
バニラ：
コーンシロップ                          ３５％
マルトデキストリン                      ３５％
蔗糖                                    ３０％。
【０３４１】
Ｈ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＵＤＤＩＮＧ
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＵＤＤＩＮＧは食事と共にもしくは食間に使用する非液体形態でバランスのとれた栄養を提供する濃厚栄養補給剤である。コンシステンシー調整食（例えば軟食、ピューレ又は全液）や、飲込み障害のある者に適している。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＵＤＤＩＮＧは無グルテンである。
【０３４２】
患者状態：
−コンシステンシー調整食（例えば軟食、ピューレ又は全液）摂取患者。
−飲込み障害のある患者。
【０３４３】
特徴：
−濃厚でクリーミーな良好な食感。
−良好な必須ビタミン及びミネラル源。
−冷蔵不要で簡便。
−無グルテン。
【０３４４】
５オンス当たり栄養プロフィル：熱量２５０、蛋白１０．９％、総脂肪３４．９％、炭水化物５４．２％。
【０３４５】
成分：
バニラ：−Ｄ脱脂乳、水、糖質（蔗糖）、部分水素化大豆油、改質食物澱粉、硫酸マグネシウム、ラクチル酸ステアロイルナトリウム、第二リン酸ナトリウム、人工フレーバー、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、塩化コリン、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃイエロー＃５、クエン酸カリウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、ＦＤ＆Ｃイエロー＃６、葉酸、ビオチン、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０３４６】
蛋白質：蛋白源は脱脂乳である。
脱脂乳                                  １００％。
【０３４７】
脂肪：脂肪源は水素化大豆油である。
水素化大豆油                            １００％。
【０３４８】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＵＤＤＩＮＧは蔗糖と改質食物澱粉の組合わせを含有している。マイルドな甘味とフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート、バタースコッチ及びタピオカ）によりフレーバー疲労を防止する。製品は１個当たり乳糖９．２ｇを含有している。
【０３４９】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖                                    ５６％
乳糖                                    ２７％
改質食物澱粉                            １７％。
【０３５０】
チョコレート：
蔗糖                                    ５８％
乳糖                                    ２６％
改質食物澱粉                            １６％。
【０３５１】
Ｉ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲは強化食物繊維及び栄養を利用できる者を対象とした栄養学的に完全な繊維含有液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲは低残渣食を必要としない者に適している。経口又は経管供給することができ、通常食の栄養補給剤として又は適量を代用食として使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０３５２】
患者状態：
−強化食物繊維及び栄養を利用できる患者。
【０３５３】
特徴：
−低飽和脂肪、高ビタミン及びミネラルの新規改良処方。
−１缶当たり総脂肪６ｇ、コレステロール＜５ｍｇを含有。
−濃厚でクリーミーな食感。
−良好な繊維源。
−優良な必須ビタミン及びミネラル源。
−低コレステロール食用。
−無乳糖無グルテン。
【０３５４】
成分：
バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、オート麦繊維、高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油、大豆蛋白単離物、コーン油、大豆繊維、第三リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースゲル、大豆レシチン、第二リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、天然及び人工フレーバー、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラギナン、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０３５５】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム      ８０％
大豆蛋白単離物                          ２０％。
【０３５６】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油及びコーン油の３種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油                ４０％
キャノーラ油                            ４０％
コーン油                                ２０％。
【０３５７】
ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲの脂肪値は米国心臓協会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲ中の脂肪６ｇは総熱量の２２％に相当し、脂肪の２．０１％は飽和脂肪酸に由来し、６．７％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量≦３０％、飽和脂肪酸由来熱量≦１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量≦１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０３５８】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味とフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート及びバターピーカン）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、フレーバー疲労を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０３５９】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
マルトデキストリン                      ６６％
蔗糖                                    ２５％
オート麦繊維                            ７％
大豆繊維                                ２％。
【０３６０】
チョコレート：
マルトデキストリン                      ５５％
蔗糖                                    ３６％
オート麦繊維                            ７％
大豆繊維                                ２％。
【０３６１】
繊維：ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲで使用される繊維ブレンドはオート麦繊維と大豆多糖から構成される。このブレンドの結果、８液量オンス缶当たり約４ｇの総食物繊維が得られる。不溶性繊維と可溶性繊維の比は９５：５である。
【０３６２】
上記各種栄養補給剤は当業者に公知であり、本発明により生産されたＰＵＦＡに代用及び／又は補充することができる。
【０３６３】
Ｊ．Ｏｘｅｐａ（登録商標）栄養製剤
ＯｘｅｐａはＡＲＤＳ患者又はその危険のある患者の食事管理を目的とする低炭水化物高密度熱量経腸栄養製剤である。エイコサペンタエン酸（魚油由来ＥＰＡ）、γ−リノレン酸（ルリヂサ油由来ＧＬＡ）及び高濃度酸化防止剤を含有する特許油ブレンドを含む特殊な成分組合せをもつ。
【０３６４】
熱量分布：熱量密度はエネルギー要求を満たすために必要な容量を最小にするように高く、１．５Ｃａｌ／ｍＬ（３５５Ｃａｌ／８液量オンス）である。Ｏｘｅｐａの熱量分布を表Ａに示す。
【０３６５】
【表３】
2005527238.tif 000004
【０３６６】
脂肪：
−Ｏｘｅｐａは８液量オンス缶当たり２２．２ｇ（９３．７ｇ／Ｌ）の脂肪を含有している。
−脂肪源はキャノーラ油３１．８％、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）２５％、ルリヂサ油２０％、魚油２０％、及び大豆レシチン３．２％からなる油ブレンドである。Ｏｘｅｐａの典型的な脂肪酸プロフィルを表Ｂに示す。
−Ｏｘｅｐａは表ＶＩに示すようにバランスのとれた量のポリ不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸を提供する。
−脂肪ブレンドの２５％に相当する中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）は胆汁酸により乳化されずに腸管に吸収されるので胃を空にし易い。
【０３６７】
Ｏｘｅｐａ（登録商標）栄養製剤の各種脂肪酸成分は本発明により生産されたＰＵＦＡに代用及び／又は補充することができる。
【０３６８】
【表４】
2005527238.tif 000005
脂肪酸は総脂肪の約９５％である。
【０３６９】
【表５】
2005527238.tif 000006
【０３７０】
炭水化物：
−炭水化物含量は８液量オンス缶当たり２５．０ｇ（１０５．５ｇ／Ｌ）である。
−炭水化物源はマルトデキストリン（複合炭水化物）４５％と蔗糖（単糖）５５％であり、いずれも消化吸収し易い。
−Ｏｘｅｐａは二酸化炭素（ＣＯ２）生産を最小にするように高脂肪低炭水化物である。ＣＯ２濃度が高いと、人工呼吸器依存患者の離乳が難しくなる可能性がある。低炭水化物濃度はストレス性高血糖症患者にも有用であると思われる。
−Ｏｘｅｐａは無乳糖である。
【０３７１】
食物炭水化物、蛋白由来アミノ酸及び脂肪のグリセロール部分は体内でグルコースに変換することができる。この過程を通してグルコース依存組織（例えば中枢神経系や赤血球）の炭水化物必要量は満たされる。しかし、炭水化物を除去した食事では組織蛋白の過剰異化であるケトーシスや、水分及び電解質低下を生じる恐れがある。これらの影響は熱量摂取量が十分であるならば、食用炭水化物を毎日５０〜１００ｇ摂取することにより防ぐことができる。エネルギー必要量を満足しているならばＯｘｅｐａの炭水化物値は糖新生を最小にするにも十分である。
【０３７２】
蛋白質：
−Ｏｘｅｐａは８液量オンス缶当たり１４．８ｇ（６２．５ｇ／Ｌ）の蛋白質を含有している。
−総熱量窒素比（１５０：１）はストレス患者の必要量を満たす。
−Ｏｘｅｐａは呼吸問題を生じずに同化と除脂肪体重の維持を助長するために十分な蛋白を提供する。高蛋白摂取量は呼吸不全患者で問題となる。蛋白はＣＯ２生産に殆ど影響しないが、高蛋白食は換気欲求を増す。
−Ｏｘｅｐａの蛋白源はカゼイン酸ナトリウム８６．８％とカゼイン酸カルシウム１３．２％である。
−Ｏｘｅｐａの蛋白系のアミノ酸プロフィルは米国科学アカデミーにより設定された高品質蛋白標準を満たすか又はそれを上回る。
【０３７３】
＊Ｏｘｅｐａは無グルテンである。
【０３７４】
分析プログラムのデフォルト設定
【０３７５】
【表６】
2005527238.tif 000007
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【図面の簡単な説明】
【０３７６】
【図１】種々の脂肪酸生合成経路を示す。エロンガーゼ酵素（ｅｌｏ）の役割に注目されたい。
【図２】ホホバＫＣＳ（配列番号８）とＥＬＯ２（配列番号９）のアミノ酸配列の類似度百分率と同一性百分率を示す。
【図３】図２のホホバＫＣＳ配列（下線はプライマー配列）に相同なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＥＬＯ２配列（配列番号１０）を示す。
【図４Ａ】ＭＡＥＬＯ  ｃＤＮＡを含むｐＲＡＥ−２の物理的マップを示す。
【図４Ｂ】酵母でのエロンガーゼ酵素生産に使用した構成的発現ベクターｐＲＡＥ−５の物理的マップを示す。
【図５】クローンｐＲＡＥ−５（配列番号１１）及びｐＲＡＥ−６（配列番号１２）のヌクレオチド配列の比較を示す。
【図６】Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図７】ＭＡＥＬＯ（図６参照）から翻訳されたＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａエロンガーゼのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【図８Ａ】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）（配列番号１４）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）（配列番号１５）及び図７に示すような翻訳ＭＡＥＬＯ配列の３種のエロンガーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図８Ｂ】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）（配列番号１４）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）（配列番号１５）及び図７に示すような翻訳ＭＡＥＬＯ配列の３種のエロンガーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図９Ａ】ＭＡＥＬＯのヌクレオチド配列（配列番号１６）とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＥＬＯ２のヌクレオチド配列（配列番号１７）の比較を示す。
【図９Ｂ】ＭＡＥＬＯのヌクレオチド配列（配列番号１６）とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＥＬＯ２のヌクレオチド配列（配列番号１７）の比較を示す。
【図１０Ａ】パン酵母で発現させたＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図１０Ｂ】パン酵母で発現させたＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図１１】ＡＡを生産するためにＭ．ａｌｐｉｎａに由来するΔ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共発現させた場合のＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図１２】パン酵母におけるＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＥＬＯ２の過剰発現と比較する。
【図１３】ＧｅｎＥＭＢＬデータベースのＣ．ｅｌｅｇａｎｓヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸配列と翻訳ＭＡＥＬＯ（配列番号１８と配列番号１９）の比較を示す。
【図１４】ＧｅｎＥＭＢＬデータベースのＣ．ｅｌｅｇａｎｓヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸配列と翻訳ＭＡＥＬＯ（配列番号２０と配列番号２１）の比較を示す。
【図１５】ＧｅｎＥＭＢＬデータベースのＣ．ｅｌｅｇａｎｓヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸配列と翻訳ＭＡＥＬＯ（配列番号２２と配列番号２３）の比較を示す。
【図１６】ＧｅｎＥＭＢＬデータベースの２種の異なる哺乳動物配列のアミノ酸翻訳産物と翻訳ＭＡＥＬＯ（配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６及び配列番号２７）の比較を示す。
【図１７】翻訳ＤＮＡ配列（公開ＰＣＴ出願第ＷＯ８８／０７５７７号参照）とデータベース検索中に検出されたＭＡＥＬＯから誘導されるアミノ酸配列（配列番号２８と配列番号２９）の比較を示す。
【図１８】Ｍ．ａｌｐｉｎａに由来する５−デサチュラーゼの完全ヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。
【図１９】ＭＡＤ７０８プールの初期ＧＣ−ＦＡＭＥ分析を示す。ＤＧＬＡ（Ｃ２０：３ｎ−６）ピークの検出に注目されたい。
【図２０】基質としてＧＬＡを添加した場合の酵母における５個のＭＡＤ７０８クローンのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。全クローンは明白なエロンガーゼ活性をもつ。
【図２１】プラスミドｐＲＰＢ２のＤＮＡシーケンシング分析を示す。分析の結果、９５７ｂｐ長のオープンリーディングフレームが判明した。
【図２２】プラスミドｐＲＰＢ２に含まれるＭ．ａｌｐｉｎａ  ｃＤＮＡ（ＧＬＡエロンガーゼ活性をもつことからＧＬＥＬＯと呼ぶ）の完全ヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図２３】ＧＬＥＬＯ（図２２参照）から翻訳されたＭ．ａｌｐｉｎａエロンガーゼのアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。
【図２４】ＧＬＡを添加した場合の３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導培養物におけるｎ−６  ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図２５Ａ】他の脂肪酸基質２５μＭを添加した場合の３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導培養物におけるｎ−３及びｎ−６  ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図２５Ｂ】他の脂肪酸基質２５μＭを添加した場合の３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導培養物におけるｎ−３及びｎ−６  ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図２６Ａ】ＡＡを生産するためにＧＬＡを基質として添加し、Ｍ．ａｌｐｉｎａ  Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共培養した場合のＧＬＥＬＯのエロンガーゼ活性を示す。
【図２６Ｂ】ＥＰＡを生産するためにＳＴＡを基質として添加し、Ｍ．ａｌｐｉｎａ  Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共発現させた場合のＧＬＥＬＯのエロンガーゼ活性を示す。
【図２７】翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号３２）（図２３参照）と翻訳ＭＡＥＬＯ配列（配列番号３３）（図７参照）の比較を示す。
【図２８Ａ】ＧＬＥＬＯ（図２３参照）、ＭＡＥＬＯ（図７参照）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）の４種のエロンガーゼのアミノ酸配列の比較を示す。ヒスチジンボックスを下線で示す。
【図２８Ｂ】ＧＬＥＬＯ（図２３参照）、ＭＡＥＬＯ（図７参照）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）の４種のエロンガーゼのアミノ酸配列の比較を示す。ヒスチジンボックスを下線で示す。
【図２９】翻訳ＭＡＥＬＯ配列（配列番号３４）と翻訳推定ヒトホモログＨＳ１配列（配列番号３５）のアラインメントを示す。
【図３０】翻訳ＭＡＥＬＯ配列（配列番号３６）と翻訳推定ヒトホモログＨＳ２配列（配列番号３７）のアラインメントを示す
【図３１】翻訳ＭＡＥＬＯ配列（配列番号３８）と翻訳推定マウスホモログＭＭ２配列（配列番号３９）のアラインメントを示す。
【図３２】翻訳ＭＡＥＬＯ（配列番号４０）と翻訳推定マウスホモログＡＩ２２５６３２配列（配列番号４１）のアラインメントを示す。
【図３３】翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号４２）と翻訳ヒトホモログＡＩ８１５９６０配列（配列番号４３）のアラインメントを示す。
【図３４】翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号４４）と翻訳推定ヒトホモログＨＳ１配列（配列番号４５）のアラインメントを示す。
【図３５】翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号４６）とＡＣ００４０５０からの翻訳推定ヒトホモログ配列（配列番号４７）のアラインメントを示す。
【図３６】翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号４８）と翻訳推定マウスホモログＭＭ２配列（配列番号４９）のアラインメントを示す。
【図３７】翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号５０）と翻訳推定マウスホモログＡＩ２２５６３２配列（配列番号５１）のアラインメントを示す。
【図３８】翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号５２）と翻訳推定マウスホモログＵ９７１０７（配列番号５３）のアラインメントを示す。
【図３９】翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号５４）と翻訳推定Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）ホモログ配列（配列番号５５）のアラインメントを示す。
【図４０】翻訳ＭＡＥＬＯ配列（配列番号１３）と翻訳推定Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）ホモログ配列（配列番号５６）のアラインメントを示す。
【図４１】翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号５７）と翻訳推定Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒホモログ配列ＤＭ１（配列番号５８）のアラインメントを示す。
【図４２】翻訳ＭＡＥＬＯ配列（配列番号５９）と翻訳推定Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒホモログ配列ＤＭ１（配列番号６０）のアラインメントを示す。
【図４３】ヒトエロンガーゼＨＳＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図４４】ヒトエロンガーゼＨＳＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号６１）を示す。
【図４５】ＧＬＡ又はＡＡを添加した場合の３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）の誘導培養物の（ＰＵＦＡ及び他の）エロンガーゼ活性を示す。
【図４６】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓエロンガーゼＣＥＥＬＯの完全ヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図４７】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓエロンガーゼＣＥＥＬＯの推定アミノ酸配列（配列番号６２）を示す。
【図４８】ＧＬＡとＡＡを添加した場合の３３４（ｐＲＥＴ−２１）及び３３４（ｐＲＥＴ−２２）の誘導培養物のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図４９】推定ヒトエロンガーゼ遺伝子ＨＳ３の完全ヌクレオチド配列（配列番号６３）を示す。
【図５０】推定ヒトエロンガーゼ酵素ＨＳ３の推定アミノ酸配列（配列番号６４）を示す。
【図５１】ＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、ＯＡ、又はＡＬＡを添加した場合にパン酵母で発現されたＨＳＥＬＯ１の（ＰＵＦＡ及び他の）エロンガーゼ活性を示す。
【図５２】２５ｍＭ又は１００ｍＭのＧＬＡ、ＡＡ、又はＥＰＡを添加した場合にパン酵母で発現されたＨＳＥＬＯ１の（ＰＵＦＡ及び他の）エロンガーゼ活性を示す。
【図５３Ａ】ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、もしくはＤＰＡを添加するか又は基質を添加しない場合にパン酵母で発現されたＨＳＥＬＯ１の（ＰＵＦＡ及び他の）エロンガーゼ活性を示す。
【図５３Ｂ】ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、もしくはＤＰＡを添加するか又は基質を添加しない場合にパン酵母で発現されたＨＳＥＬＯ１の（ＰＵＦＡ及び他の）エロンガーゼ活性を示す。
【図５３Ｃ】ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、もしくはＤＰＡを添加するか又は基質を添加しない場合にパン酵母で発現されたＨＳＥＬＯ１の（ＰＵＦＡ及び他の）エロンガーゼ活性を示す。
【図５４】マウスエロンガーゼＭＥＬＯ４の完全ヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図５５】マウスエロンガーゼＭＥＬＯ４の推定アミノ酸配列（配列番号６５）を示す。
【図５６】ＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、又はＤＰＡを添加した場合にパン酵母で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図５７Ａ】ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、もしくはＤＰＡを添加するか又は基質を添加しない場合にパン酵母で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図５７Ｂ】ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、もしくはＤＰＡを添加するか又は基質を添加しない場合にパン酵母で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図５７Ｃ】ＰＡ、ＳＡ、ＡＲＡ、ＢＡ、ＰＴＡ、ＯＡ、ＥＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、もしくはＤＰＡを添加するか又は基質を添加しない場合にパン酵母で発現されたＭＥＬＯ４のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図５８】マウスエロンガーゼＭＥＬＯ７の完全ヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
【図５９】マウスエロンガーゼＭＥＬＯ７の推定アミノ酸配列（配列番号６６）を示す。
【図６０】ＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡ、又はＤＰＡを添加した場合にパン酵母で発現されたＭＥＬＯ７の（ＰＵＦＡ及び他の）エロンガーゼ活性を示す。
【図６１】基質を添加しない場合とＡＡ又はＧＬＡを添加した場合に酵母で発現されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓエロンガーゼの活性を示す。
【図６２Ａ】５０μＭの種々の基質を添加した場合の３３４（ｐＲＥＴ２２）の誘導培養物のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図６２Ｂ】５０μＭの種々の基質を添加した場合の３３４（ｐＲＥＴ２２）の誘導培養物のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図６３Ａ】夫々ＡＡ又はＥＰＡを生産するためにＧＬＡ（図６３Ａ）又はＳＴＡ（図６３Ｂ）を基質として添加し、Ｍ．ａｌｐｉｎａ  Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共培養した場合のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図６３Ｂ】夫々ＡＡ又はＥＰＡを生産するためにＧＬＡ（図６３Ａ）又はＳＴＡ（図６３Ｂ）を基質として添加し、Ｍ．ａｌｐｉｎａ  Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共培養した場合のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す。
【図６４Ａ】ＨＳＥＬＯ１（図４４）、ＭＥＬＯ４（図５５）、ＧＬＥＬＯ（図２３）、及びＣＥＥＬＯ（図４７）の４種のエロンガーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図６４Ｂ】ＨＳＥＬＯ１（図４４）、ＭＥＬＯ４（図５５）、ＧＬＥＬＯ（図２３）、及びＣＥＥＬＯ（図４７）の４種のエロンガーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図６５】部分的Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）７０９１エロンガーゼ遺伝子のコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６７）を示す。
【図６６】図６５のＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼ遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号６８）を示す。
【図６７】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号６９）を示す。
【図６８】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ２に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号７０）を示す。
【図６９】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ３に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号７１）を示す。
【図７０】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ４に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号７２）を示す。
【図７１】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ６に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号７３）を示す。
【図７２】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ７に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図７３】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ｄ１に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号７４）を示す。
【図７４】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号７５）を示す。
【図７５】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ２に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号７６）を示す。
【図７６】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ３に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号７７）を示す。
【図７７】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ４に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号７８）を示す。
【図７８】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ６に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号７９）を示す。
【図７９】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ７に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号８０）を示す。
【図８０】プラスミドｐＲＡＴ−４−Ｄ１に由来するＴ．ａｕｒｅｕｍ  ７０９１エロンガーゼＴＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号８１）を示す。
【図８１Ａ】ＧＬＡ又はＥＰＡを添加した場合にパン酵母で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を示す。
【図８１Ｂ】ＧＬＡ又はＥＰＡを添加した場合にパン酵母で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を示す。
【図８２Ａ】７種のプラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１（図７４）、ｐＲＡＴ−４−Ａ２（図７５）、ｐＲＡＴ−４−Ａ３（図７６）、ｐＲＡＴ−４−Ａ４（図７７）、ｐＲＡＴ−４−Ａ６（図７８）、ｐＲＡＴ−４−Ａ７（図７９）、及びｐＲＡＴ−４−Ｄ１（図８０）に由来するＴＥＬＯ１エロンガーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図８２Ｂ】７種のプラスミドｐＲＡＴ−４−Ａ１（図７４）、ｐＲＡＴ−４−Ａ２（図７５）、ｐＲＡＴ−４−Ａ３（図７６）、ｐＲＡＴ−４−Ａ４（図７７）、ｐＲＡＴ−４−Ａ６（図７８）、ｐＲＡＴ−４−Ａ７（図７９）、及びｐＲＡＴ−４−Ｄ１（図８０）に由来するＴＥＬＯ１エロンガーゼのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図８３】翻訳ＴＥＬＯ１配列（配列番号８２）と翻訳ＨＳＥＬＯ１配列（配列番号８３）のアラインメントを示す。
【図８４】翻訳ＴＥＬＯ１配列（配列番号８４）と翻訳ＭＥＬＯ４配列（配列番号８５）のアラインメントを示す。
【図８５】翻訳ＴＥＬＯ１配列（配列番号８６）と翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号８７）のアラインメントを示す。
【図８６】翻訳ＴＥＬＯ１配列（配列番号８８）と翻訳ＣＥＥＬＯ配列（配列番号８９）のアラインメントを示す。
【図８７Ａ】ＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡを添加するか又は基質を添加しない場合にパン酵母で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を示す。
【図８７Ｂ】ＧＬＡ、ＡＡ、ＳＴＡ、ＥＰＡを添加するか又は基質を添加しない場合にパン酵母で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を示す。
【図８８】ＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＡ又はＥＰＡを添加した場合にパン酵母で発現されたＴＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を示す。
【図８９】プラスミドｐＲＰＬ−６−１に由来するＰａｖｌｏｖａ種４５９エロンガーゼＰＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号１１７）を示す。
【図９０】プラスミドｐＲＰＬ−６−１に由来するＰａｖｌｏｖａ種４５９エロンガーゼＰＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号１１８）を示す。
【図９１】プラスミドｐＲＰＬ−６−Ｂ２に由来するＰａｖｌｏｖａ種４５９エロンガーゼＰＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号１１９）を示す。
【図９２】プラスミドｐＲＰＬ−６−Ａ３に由来するＰａｖｌｏｖａ種４５９エロンガーゼＰＥＬＯ１の完全ヌクレオチド配列（配列番号１２０）を示す。
【図９３】プラスミドｐＲＰＬ−６−Ｂ２に由来するＰａｖｌｏｖａ種４５９エロンガーゼＰＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号１２１）を示す。
【図９４】プラスミドｐＲＰＬ−６−Ａ３に由来するＰａｖｌｏｖａ種４５９エロンガーゼＰＥＬＯ１の推定アミノ酸配列（配列番号１２２）を示す。
【図９５】翻訳ＰＥＬＯ１配列（配列番号１１８）と翻訳ＭＥＬＯ４配列（配列番号６５）のアラインメントを示す。
【図９６】翻訳ＰＥＬＯ１配列（配列番号１１９）と翻訳ＧＬＥＬＯ配列（配列番号６２）のアラインメントを示す。
【図９７】翻訳ＰＥＬＯ１配列（配列番号１１８）と翻訳ＨＳＥＬＯ１配列（配列番号６１）のアラインメントを示す。
【図９８】翻訳ＰＥＬＯ１配列（配列番号１１８）と翻訳ＴＥＬＯ１配列（配列番号７５）のアラインメントを示す。
【図９９】ＧＬＡ又はＥＰＡを添加した場合にパン酵母で発現されたＰＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を示す。
【図１００】３種のプラスミドｐＲＰＬ−６−Ｂ２、（図９３）、ｐＲＰＬ−６−Ａ３（図９４）、及びｐＲＰＬ−６−１（図９０）に由来するＰＥＬＯ１エロンガーゼ（夫々配列番号１２１、配列番号１２２及び配列番号１１８参照）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１０１】ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、２０：０、又は２０：１を添加した場合にパン酵母で発現されたＰＥＬＯ１のエロンガーゼ活性を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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【図８２Ａ】
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【図８２Ｂ】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７Ａ】
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【図８７Ｂ】
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【図８８】
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【図８９】
2005527238.tif 000181
【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
2005527238.tif 000187
【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
2005527238.tif 000191
【図１００】
2005527238.tif 000192
【図１０１】
2005527238.tif 000193
【国際調査報告】
2005527238.tif 000194
2005527238.tif 000195