(57)【要約】本発明は、新規ポリペプチドＮＳ４およびそれのポリペプチドをコード化する核酸分子に関する。また、そのような核酸配列を含むベクターおよび宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドに結合する抗体、および本発明のポリペプチドの生成方法がさらに提供される。さらに、体重異常（例えば、肥満、悪液質または摂食異常）の治療方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列を有するＮＳ４ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子、あるいは（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対し、少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
（ｉ）図１（配列番号１）の約４８６または約５４３から約７４６、（ｉｉ）図２（配列番号２）の約１７８４または約１８４１から約２０６８、または（ｉｉｉ）図３（配列番号３）の約４４７または約５０４から約７３１のヌクレオチド位置の配列を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列をコード化するヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
（ａ）（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたヒトｃＤＮＡによりコード化された成熟ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子、あるいは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対し、少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む、単離された核酸分子。
【請求項５】
（ａ）（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたヒトｃＤＮＡによりコード化されるその成熟ポリペプチドをコード化するＤＮＡ、あるいは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を含む、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
（ａ）（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたヒトｃＤＮＡの完全長ポリペプチドコード化配列、あるいは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対し、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有するＤＮＡを含む、単離された核酸分子。
【請求項７】
（ａ）（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの完全長ポリペプチドコード化配列、あるいは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を含む、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸をコード化する核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡを含むＮＳ４ポリペプチドをコード化する、単離された核酸分子。
【請求項９】
核酸が、（ｉ）図１（配列番号１）の約４８６または約５４３から約７４６、（ｉｉ）図２（配列番号２）の約１７８４または約１８４１から約２０６８、または（ｉｉｉ）図３（配列番号３）の約４４７または約５０４から約７３１のヌクレオチドをそれぞれ含む、（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸をコード化する、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
ハイブリダイゼーションがストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下で行われる、請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
少なくとも３１のヌクレオチドを含み、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列を有するＮＳ４ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子、あるいは、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、試験ＤＮＡ分子とをハイブリダイズすること、および試験ＤＮＡ分子を単離することにより生成される、単離された核酸分子。
【請求項１２】
（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
ベクターにより形質転換した宿主細胞により認識される制御配列に、前記核酸分子が作用可能にリンクする、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
登録番号（ｉ）ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）、（ｉｉ）ＰＴＡ−１６２７で、または（ｉｉｉ）ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、大腸菌および酵母からなる群から選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の宿主細胞を、前記ＮＳ４ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること、および細胞培地から前記ＮＳ４ポリペプチドを回収することを含む、ＮＳ４ポリペプチド生成方法。
【請求項１９】
（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列に対し、少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、単離されたＮＳ４ポリペプチド。
【請求項２０】
（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸残基を含む、請求項１９に記載の単離されたＮＳ４ポリペプチド。
【請求項２１】
（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入によりコードされるポリペプチドに対し、少なくとも約８０％の配列同一性を有する、単離されたＮＳ４ポリペプチド。
【請求項２２】
（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入によりコードされる、請求項２１に記載の単離されたＮＳ４ポリペプチド。
【請求項２３】
（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列、あるいは、抗ＮＳ４抗体に結合部位を提供するのに十分なその断片を含む、単離されたＮＳ４ポリペプチド。
【請求項２４】
（ｉ）ストリンジェントな条件の下で、（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列を含むＮＳ４ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子、あるいは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、試験ＤＮＡ分子とをハイブリダイズすること、（ｉｉ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で前記試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を培養すること、および（ｉｉｉ）細胞培地から前記ポリペプチドを回収することにより生成される、単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
（ａ）または（ｂ）に対して前記試験ＤＮＡが少なくとも約８０％の配列同一性を有する、請求項２４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
異種アミノ酸配列に融合されたＮＳ４ポリペプチドを含むキメラ分子。
【請求項２７】
前記異種アミノ酸配列は、エピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項２６に記載のキメラ分子。
【請求項２８】
ＮＳ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２９】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、および抗体断片からなる群から選択される、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
製薬的に許容される担体を含む混合材料中に、（ａ）ＮＳ４ポリペプチド、（ｂ）ＮＳ４ポリペプチドのアゴニスト、（ｃ）ＮＳ４ポリペプチドのアンタゴニスト、または（ｄ）抗ＮＳ４抗体を含む物質の組成物。
【請求項３１】
ａ）ＮＳ４の試料に候補生物活性剤を加えること、および
ｂ）前記ＮＳ４に対する前記候補剤の結合を決定すること
を含み、ＮＳ４に対する結合能を有する生物活性剤のスクリーニング方法であって、結合が生物活性剤のＮＳ４に対する結合能を示す、方法。
【請求項３２】
ＮＳ４の活性を調節する能力を有する生物活性剤のスクリーニング方法であって、
ａ）ＮＳ４の試料に候補生物活性剤を加えること、および
ｂ）ＮＳ４の生物学的活性における変調を決定すること
を含み、変調がＮＳ４の活性を調節する生物活性剤の能力を示す、スクリーニング方法。
【請求項３３】
ＮＳ４のレセプターを同定する方法であって、ＮＳ４に細胞膜物質を含む組成物を組み合わせ、ＮＳ４を細胞膜物質上のレセプターと複合させることと、前記レセプターをＮＳ４レセプターとして同定することを含む同定方法。
【請求項３４】
ＮＳ４は前記レセプターに結合し、前記ＮＳ４とレセプターを架橋する段階をさらに含む、請求項３３に記載の同定方法。
【請求項３５】
前記組成物が細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が細胞膜抽出調製物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
体重異常を有する個体の治療法であって、治療的に有効量のＮＳ４を含む組成物を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項３８】
体重異常が肥満、悪液質および摂食障害からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記肥満の治療方法が、さらに、肥満に関連する状態の治療に繋がる、請求項３８に記載の治療方法。
【請求項４０】
前記ＮＳ４が、図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）または図４（ｃ）（配列番号６）に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
個体の総体重を減少させる方法であって、治療的に有効量のＮＳ４を前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
前記総体重の減少が、前記個体の体脂肪の減少を含む、請求項３７に記載の治療方法。
【請求項４３】
前記ＮＳ４が、図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）または図４（ｃ）（配列番号６）に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３７に記載の治療方法。
【請求項４４】
治療的に有効量のＮＳ４を前記個体に投与することを含む、個体における少なくとも１種のトリグリセリドまたは遊離脂肪酸のレベルを減少させる方法。
【請求項４５】
前記ＮＳ４が、図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）または図４（ｃ）（配列番号６）に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
治療的に有効量のＮＳ４を個体に投与することを含む、個体の代謝率を上昇させる方法。
【請求項４７】
前記ＮＳ４が、図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）または図４（ｃ）（配列番号６）に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＮＳ４をコード化する導入遺伝子を含むゲノムを有する齧歯動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の体重制御に関わる新規遺伝子である、ヒトＮＳ４遺伝子を含めたＮＳ４遺伝子に関する。本発明の範囲には、本明細書でＮＳ４ポリペプチドと称される新規ポリペプチドをコード化する新規ＤＮＡの同定および単離と、その組み換え生産と、哺乳類の体重制御に関与するそのようなポリペプチドを使用する方法、組成物およびアッセイとを含む。本発明は、ＮＳ４核酸のヌクレオチド配列、宿主細胞発現系、およびトランスジェニック動物を含め、そのような発現系により形質転換した宿主を包含する。さらには、ＮＳ４タンパク質、ＮＳ４アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびペプチド、ＮＳ４タンパク質の融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、ならびにそれらに特異的に結合する抗体も本発明に含まれる。
【０００２】
本発明はまた、肥満、悪液質、および摂食障害を含む哺乳類の体重異常の診断と治療、ならびに、そのような異常に陥り易い対象を特定するための、方法および組成物に関する。さらに、本発明は、ＮＳ４ポリペプチドの発現および／またはＮＳ４ポリペプチドの活性を調節する組成物を同定するための、本発明のＮＳ４ポリペプチドの使用法に関する。そのような化合物は、肥満、悪液質、および摂食障害を含む哺乳類の体重異常の治療における治療薬として有用である。
【背景技術】
【０００３】
肥満は、現代社会に広く（壮年人口の３０から５０％）蔓延する慢性病である。神経性食欲不振症および神経性過食症などの他の体重異常も健康に対する深刻な脅威となっている。さらに、摂食障害および悪液質（消耗）などの障害は、癌、嚢胞性繊維症、およびＡＩＤＳなど、他の疾病の顕著な兆候である。肥満、または除脂肪体重に対する体脂肪の過多は、社会的不名誉だけでなく、寿命短縮、有害な心理的発達、生殖疾患、例えば多嚢胞卵巣、感染症、静脈瘤、黒色表皮腫、及び湿疹などの皮膚疾患、運動不耐性症、代謝異常、摂食亢進、糖尿病 、インシュリン抵抗症、高血圧、高コレステロール血症、脳卒中、高脂血症、胆石症、骨関節炎、整形外科的傷害、血栓疾患、癌、及び心臓冠状動脈疾患を含む多くの医学的課題と関連がある。（Rissanen他、British Medical Journal, 301: 835-837, 1990年; Nishina, P.M.他、Metab. 43: 554-558, 1994年; Grundy, S.M. & Barnett, J.P., Dis. Mon. 36: 641-731, 1990年）。
【０００４】
肥満は単に行動上の問題、つまり自発的過食ではない。むしろ、肥満体の対象と正常体重の対象との間に見られる身体の差異は、代謝および神経性／代謝性相互作用に起因している。これらの差異は、或る程度までは、遺伝子発現、および／または遺伝子産物または遺伝子活性の差異によるものである（Friedman, J.M.他, Mammalian Gene 1: 130-144, 1991年）。
【０００５】
肥満疫学は、この障害が遺伝的特徴を提示することを強く示している（Stunkard, N. Eng. J. Med. 322: 1438, 1990年）。Mollらは、多くの人種において肥満は少数の遺伝子座によって制御されると思われると報告している（Moll他、Am. J. Hum. Gen. 49: 1243, 1991年）。加えて、ヒト双生児の研究は、体重管理は実質的に遺伝子に基づくことを強く示唆し、その遺伝率は８０−９０％と推定している（Simopoulos, A.P. & Childs, B., Eds., 1989年、”Genetic Variation and Nutrition in Obesity”, World Review of Nutrition and Diabetes 63, S. Karger, Basel, Switzerland; Borjeson, M., 1976年, Acta. Paediatr. Scand. 65: 279-287）。
【０００６】
他の研究では、体系的に過食することにより意図的に体重増加を試みた非肥満の人は、そのような体重増加に対する耐性が比較的大きく、非常に高カロリーの摂取によってのみ増加した体重を維持することができた。対照的に、自然的に肥満の人は、通常または中程度の高カロリー摂取のみで肥満状態を維持できた。加えて、異なる系統の豚、牛等が肥満に対して異なる傾向を有していることは、動物管理において常識的である。ヒト肥満および肥満の動物モデルの遺伝子研究は、肥満が、食物摂取および食事誘発性エネルギー消費の両方、ならびに脂肪の身体同化作用と非脂肪の身体同化作用とのバランスの、複合的な制御欠陥に起因することを示している。
【０００７】
ヒトおよびその他の種には、顕著な症状に肥満を特徴とする多くの遺伝病があり、多くの場合異常形態的特徴および精神発達遅滞を伴う。例えば、プラダー・ウィリ症候群（PWS; Knoll, J.H.他、Am. J. Med. Genet. 46: 2-6, 1993年参照）は約出生２０，０００件のうち１件に発生し、新生児の筋緊張不足、顔面および生殖器の奇形、ならびに一般的肥満を伴う。
【０００８】
ＰＷＳに加え、その他多くの多面的症候群が、その症状に肥満を含むことを特徴としている。これら症候群は遺伝的に単純で、常染色体劣性対立遺伝子に関与しているように思われる。このような疾病には、中でも、アールストロム（Ahlstroem）症候群、カーペンター症候群、バルデー−ビードル症候群、コーエン症候群、モルガニー−スチュワート症候群およびモルガニー−モネル症候群が含まれる。
【０００９】
肥満の研究には、多くのモデルが存在する（例えば、Bray, G. A., Prog. Brain Res. 93: 333-341, 1992年; Bray, G.A., Amer. J. Clin. Nutr. 5: 891-902, 1989年を参照）。例えば、肥満の症状を含む症候群を引き起こす突然変異を有する動物も同定されている。このような動物を肥満研究のモデルとして使用しようとする試みが行われており、遺伝的肥満のためにこれまでに最も良く研究された動物モデルはマウスである。（参考文献として、例えば Friedman, J.M.他、Mamm. Gen. 1: 130-144, 1991年; Friedman, J.M.およびLiebel, R.L., Cell 69: 217-220, 1992年を参照のこと。）
【００１０】
マウスを使った研究により、肥満が、遺伝率の高い非常に複雑な性質を有することが確認された。多数の遺伝子座における突然変異が肥満表現形に繋がることが同定されている。これらには、常染色体劣性突然変異ｏｂｅｓｅ（ｏｂ）、ｄｉａｂｅｔｅｓ（ｄｂ）、ｆａｔ（ｆａｔ）およびｔｕｂｂｙ（ｔｕｂ）を含む。
【００１１】
アグーチ座における優性のＹｅｌｌｏｗ突然変異（Ａｙ）は、中程度の成人発症肥満、黄色の毛色、腫瘍形成の高発症率の原因となる多面的症候群（Herberg, L.およびColeman, D.L., Metabolism 26:59, 1977年）、ならびに体脂肪の異常な解剖学的分布（Coleman, D.L., Diabetologia 14: 141-148, 1978年）を引き起こす。突然変異により、通常は新生児の皮膚のみでしか見られないタンパク質の広範囲に亘る発現が見られる（Michaud, E. J.他、Genes Devel. 8: 1463-1472, 1994年）。アゴーチタンパク質は、インビトロにおけるメラノコルチンレセプターＭＣ１−ＲおよびＭＣ４−Ｒに結合するａ−ＭＳＨの競合アンタゴニストであることが報告されており（Lu他、Nature 371: 799-802, 1996年）、その中で著者は、アゴーチの制御されていない偏在性発現が、毛嚢外に発現したメラノコルチンレセプターの拮抗作用により、肥満を引き起こすと推察している。
【００１２】
したがって、要約すると、肥満は世界的に重要な健康問題であり、遺伝率の高い複合型疾病である。このような疾患の重大性、高い罹患率、不均一性の可能性を考えると、体重管理に関わる遺伝子の同定に対するニーズは大きい。
【００１３】
我々の社会における肥満の蔓延と、上述したようなそれに関する深刻な結果を考えると、肥満患者の減量に有効である可能性のある治療薬は、患者の健康に大きな効果を持ちうる。製薬業界では、大きな副作用無しに肥満患者の総体重を理想体重まで減少させ、肥満患者がその減少した体重を維持するのを助ける薬剤が必要とされている。
【００１４】
肥満に対する現在既知の治療法は、標準的な食事療法および運動、低カロリーの食事、行動療法、食欲抑制剤、発熱薬剤、食事吸収阻害剤に関する薬物療法、顎配線、ウェストコード及び風船のような機械装置、及び手術を含む。（Jung及びChong, Clinical Endocrinology, 35: 11-20(1991)；Bray, Am. J. Clin. Nutr., 55: 538S-544S, 1992年)。タンパク質節約修飾絶食が、思春期の減量において効果的であることが報告されている。（Leeら., Clin. Pediatr., 31:234-236, 1992年４月）。肥満の治療としてのカロリー制限は、貯蔵体タンパク質の異化を引き起こし、負の窒素バランスを起こす。従って、タンパク質補給食事療法は、カロリー制限下での窒素減少を少なくする手段として人気を得ている。残念なことには、このような食事療法では、単に緩やかな窒素節約しか生じないので、細い体容積と貯蔵タンパク質を維持するためのより効果的な方法が必要である。更に、肥満の理想的な治療には、体脂肪の減少を加速させることが含まれる。このような処置への種々の手段は、Weintraub及びBray, Med. Clinics N. Amer., 73: 237(1989)；Bray, Nutrition Reviews, 49:33(1991)で論じられているものを含む。
【００１５】
このように、肥満患者の体重を正常で理想的な体重に戻すのに有用な治療法が求められている。
【００１６】
さらに、長期的に低体重を維持できる、肥満およびその他体重異常の療法が求められている。
【発明の開示】
【００１７】
（本発明の概要）
本発明は、体重の制御に関与し、さらには肥満、悪液質および摂食障害などの哺乳類の体重異常に関わる新規ポリペプチドをコード化する核酸の同定に関する。核酸分子は、ヒトＮＳ４ポリヌクレオチドを含む哺乳類ＮＳ４ポリヌクレオチドに対応するヌクレオチド配列を示す。本発明の核酸分子の具体的な例を、本明細書ではＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１、ＤＮＡ１４９９８６−２８８３およびＤＮＡ１４９９９５−２８７１と表示する。
【００１８】
一実施形態では、本発明はＮＳ４ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。特に、このようなＮＳ４ポリペプチドは、ＰＲＯ１９６５２ポリペプチド、ＰＲＯ１９８１６ポリペプチド、ＰＲＯ１９６５０ポリペプチドでありうる。
【００１９】
一実施態様では、単離された核酸分子は、（ａ）概ね（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列を有するポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子、あるいは、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、または少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
別の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列を有するＮＳ４ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列、あるいは、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を含む。
【００２１】
さらに別の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）概ね（ｉ）図１（配列番号１）の４８６または約５４３から約７４６、（ｉｉ）図２（配列番号２）の１７８４または約１８４１から約２０６８、または（ｉｉｉ）図３（配列番号３）の４４７または約５０４から約７３１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子、あるいは、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、または少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
また別の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）（ｉ）図１（配列番号１）の約４８６または約５４３から約７４６、（ｉｉ）図２（配列番号２）の約１７８４または約１８４１から約２０６８、または（ｉｉｉ）図３（配列番号３）の約４４７または約５０４から約７３１のヌクレオチド配列、あるいは、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖を含む。
【００２３】
また別の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７（ＤＮＡ１４９９８６−２８８３）で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコード化されるその成熟ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子、あるいは、（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖に対し、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
また別の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７（ＤＮＡ１４９９８６−２８８３）で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたＤＮＡの完全長ポリペプチドコード化配列、あるいは、（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖に対し、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７（ＤＮＡ１４９９８６−２８８３）で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたＤＮＡの完全長ポリペプチドコード化配列、あるいは、（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【００２５】
さらに別の態様では、単離された核酸分子は、概ね（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の１または約２０から約９５のアミノ酸残基をコード化する核酸配列、あるいは、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖、の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む後述の活性ＮＳ４ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列である。
【００２６】
さらに別の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）（ｉ）図１（配列番号１）の約４８６または約５４３から約７４６、（ｉｉ）図２（配列番号２）の約１７８４または約１８４１から約２０６８、または（ｉｉｉ）図３（配列番号３）の約４４７または約５０４から約７３１のヌクレオチドの間の核酸配列、あるいは、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖、の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む後述の活性ＮＳ４ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列である。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行われる。
【００２７】
さらに別の態様では、単離された核酸は、少なくとも約２２のヌクレオチド残基を含むヌクレオチド配列であって、（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列を有するＮＳ４ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子、あるいは、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対し、試験ＤＮＡ分子が、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％，又は９９％の核酸配列同一性を有するストリンジェントな条件下で、試験ＤＮＡ分子をハイブリダイゼーションすること、および試験ＤＮＡ分子を単離することにより生じるヌクレオチド配列である。
【００２８】
さらに別の態様では、単離された核酸分子は、Ｎ末端シグナル配列および／または開始メチオニンを持たないＮＳ４ポリペプチドをコード化するか、またはそのようなコード化核酸分子と相補的であるＤＮＡを含む。シグナルペプチドを、それぞれ図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）（配列番号４、５および６）の約アミノ酸１位から約アミノ酸１９位から伸びていると仮に同定した。しかしながら、シグナルペプチドのＣ末端境界は様々であるが、本明細書の冒頭で述べたように、シグナルペプチドＣ末端境界のいずれの側においても約５アミノ酸を超えないと考えるのが妥当であることに注意されたい。この場合、シグナルペプチドのＣ末端境界は、そのようなタイプのアミノ酸配列エレメントを同定する技術において通常採用される基準に従って同定することができる（例えば、Nielsen他、Prot. Eng. 10:1-6, 1997年およびvon Heinje他、Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690, 1986年）。さらに、分泌ポリペプチド由来のシグナル配列の分割が完全に均一でなく、その結果分泌種が複数になる場合があることが認識されている。本発明では、これらのポリペプチド、およびそれらをコード化するポリヌクレオチドについて考慮する。このため、本発明の用途のための、図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）（配列番号４、５および６）にそれぞれ示すＮＳ４ポリペプチドのシグナルペプチドは、図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）のアミノ酸１からＸからそれぞれ伸びている。ここで、Ｘは、図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）（配列番号４、５および６）それぞれのアミノ酸１４ないし２４のいずれか１つである。したがって、本発明に含まれるＮＳ４ポリペプチドの成熟形態は、：（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）のＸから８７；（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）のＸから９５、および（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）のＸから９５アミノ酸残基を含むものを含む（Ｘは図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）および図４（ｃ）（配列番号６）の１４ないし２４のいずれか１つのアミノ酸であり、その変異体は後述する）。これらポリペプチドをコード化する単離された核酸分子についても考慮する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、例えばハイブリダイゼーションプローブとしての使用が可能なコード化配列を含むか、または抗ＮＳ４抗体に対する結合部位を含むポリペプチドを随意的にコード化しうるＮＳ４ポリペプチドの断片をコード化するための、ＮＳ４ポリペプチド配列の断片を提供する。このような核酸断片は、通常は少なくとも約６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００，１０５，１１０，１１５，１２０，１２５，１３０，１３５，１４０，１４５，１５０，１５５，１６０，１６５，１７０，１７５，１８０，１８５，１９０，１９５，２００，２１０，２２０，２３０，２４０，２５０，２６０，２７０，２８０，２９０，３００，３１０，３２０，３３０，３４０，３５０，３６０，３７０，３８０，３９０，４００，４１０，４２０，４３０，４４０，４５０，４６０，４７０，４８０，４９０，５００，５１０，５２０，５３０，５４０，５５０，５６０，５７０，５８０，５９０，６００，６１０，６２０，６３０，６４０，６５０，６６０，６７０，６８０，６９０，７００，７１０，７２０，７３０，７４０，７５０，７６０，７７０，７８０，７９０，８００，８１０，８２０，８３０，８４０，８５０，８６０，８７０，８８０，８９０，９００，９１０，９２０，９３０，９４０，９５０，９６０，９７０，９８０，９９０，又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列断片は図１（配列番号１）、図２（配列番号２）または図３（配列番号３）に示したヌクレオチド配列のコード化領域のいずれかから得られる。ＮＳ４ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、よく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用してＮＳ４ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのＮＳ４ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することによって、常套的に決定し得ることを理解されたい。そのようなＮＳ４ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全てがここで考慮され、実験を過度に行うこと無しに決定される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコード化されるＮＳ４ポリペプチド断片、好ましくは抗ＮＳ４抗体に対する結合部位を含んでなるＮＳ４ポリペプチド断片である。
【００３０】
さらに別の態様では、本発明はＮＳ４またはその変異体をコード化するヌクレオチド配列を含むベクター（例えば発現ベクター）を提供する。このベクターは、上述の単離された核酸分子配列のいずれかを含むことができる。このようなベクターを含む宿主細胞も提供される。宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞、大腸菌、バキュロウイルス、感染昆虫細胞、または酵母である。一態様では、本発明は、トランスジェニック動物を含め、ＮＳ４コード化ヌクレオチド配列により形質変換した宿主生物を含む。
【００３１】
別の実施態様では、本発明のトランスジェニック動物はＮＳ４変異体、特に肥満、悪液質または摂食障害などの体重異常に関連した変異体を提供する。特に、そのようなトランスジェニック動物は、通常よりも高いか、または低いレベルでＮＳ４導入遺伝子を発現するものを含む。別の特定の態様では、トランスジェニック動物は細胞のすべて又は一部（「モザイク」）でＮＳ４を発現するものを含む。さらに別の特異的態様では、そのようなトランスジェニック動物は、ＮＳ４核酸が特定のタイプの細胞のみに導入されて発現しているものをさらに含む。さらに別の特異的態様では、本発明は「ノックアウト」動物、またはＮＳ４ポリヌクレオチドを発現しないように、またはその発現量が低くなるように修飾された動物を含む。
【００３２】
さらに別の実施態様では、本発明は、上記で同定した単離された核酸配列によりコード化される単離されたＮＳ４ポリペプチドを提供する。一態様では、本発明は単離された天然配列ＮＳ４ポリペプチドを提供し、それは一部の実施形態において、概ね、（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の１または約２０から８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の１または約２０から約９５、または（ｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の１または約２０から約９５の残基を含むアミノ酸配列を含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、概ね（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の１または約２０から８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の１または約２０から約９５、または（ｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列に対し、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＮＳ４ポリペプチドを提供する。
【００３４】
さらに別の態様では、単離されたＮＳ４ポリペプチドは、（ｉ）２００１年５月１５日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３３７６（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）で、（ｉｉ）２０００年４月４日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１６２７（ＤＮＡ１４９９８６−２８８３）で、または（ｉｉｉ）２０００年５月３１日にＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９７１（ＤＮＡ１４９９９５−２８７１）でＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコード化されたアミノ酸配列に対し、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３５】
さらに別の態様では、単離されたＮＳ４ポリペプチドは、Ｎ末端シグナル配列および／または開始メチオニンを持たないポリペプチドを含み、先述したようなアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列によりコード化される。この製造方法も本明細書で開示する。これらの方法は、ＮＳ４ポリペプチドの発現に適した条件下において適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む細胞を培養することと、細胞培地からＮＳ４ポリペプチドを回収することとを含む。
【００３６】
さらに別の態様では、単離されたＮＳ４ポリペプチドは、（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の１または約２０から８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の１または約２０から約９５、または（ｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列か、または生物学的に活性であるかまたは抗ＮＳ４抗体に対する結合部位を提供するに十分なそのような配列の断片（ここで、生物学的活性を呈するか、または抗ＮＳ４抗体に対する結合部位を提供するＮＳ４ポリペプチド断片の同定は、当技術分野でよく知られた技術を使用して常套的に行うことができる）を含むポリペプチドである。好ましくは、ＮＳ４断片は、その性質上、肥満を治療する能力を含めた天然ＮＳ４ポリペプチドの生物学的活性を保持している。
【００３７】
さらに別の態様では、単離されたＮＳ４ポリペプチドは、（１）試験ＤＮＡ分子が、（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５のアミノ酸残基の配列を有するＮＳ４ポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子、あるいは、（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するストリンジェントな条件下で、試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズすること、（２）ポリペプチドの発現に適した条件の下で試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を培養すること、および（３）細胞培地からポリペプチドを回収することにより、生成されるポリペプチドである。
【００３８】
さらに別の実施形態では、本発明は、異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合したＮＳ４ポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。ここで、ＮＳ４ポリペプチドは、先述したＮＳ４ポリペプチド、その変異体または断片を含んでよい。このようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのエピトープタグ配列、またはＦｃ領域に融合したＮＳ４ポリペプチドを含む。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、先述のＮＳ４ポリペプチドと特異的に結合する以下に定義する抗体を提供する。随意で、抗体は、モノクロナール抗体、抗体断片、または一本鎖抗体である。
【００４０】
さらに別の実施形態では、本発明は天然ＮＳ４ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを提供する。特定の実施形態では、アゴニストまたはアンタゴニストは、小分子、ＮＳ４ポリペプチドによりコード化されるアミノ酸配列に対する抗体、アンチセンスまたはリボザイム分子またはＤＮＡ、あるいは、ＮＳ４ポリペプチドの発現を阻害または増強するために使用できる制御配列置換構築物である。
【００４１】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＮＳ４ポリペプチドに候補分子を接触させること、および前記ＮＳ４ポリペプチドが媒介する生物学的活性をモニターすることからなる、ＮＳ４ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法を提供する。特定の態様では、ＮＳ４ポリペプチドは天然配列ＮＳ４ポリペプチドである。
【００４２】
さらに別の実施形態では、本発明は、担体と共に、ＮＳ４ポリペプチド、またはここに開示するＮＳ４ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、または抗ＮＳ４抗体を含む物質の組成物を、提供する。随意で、担体は、製薬的に許容される担体である。そのようなアゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、小分子、ＮＳ４ポリペプチドに対する抗体、アンチセンスおよびリボザイムの分子およびＤＮＡ、またはＮＳ４ポリヌクレオチドの発現を阻害するか増強するために使用可能な制御配列置換構築物を含む。
【００４３】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＮＳ４ポリペプチド、そのアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは抗ＮＳ４抗体に反応する状態の治療に有用な薬物の調製のための、ＮＳ４ポリペプチド、あるいは上述したＮＳ４ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは抗ＮＳ４抗体の使用法を提供する。
【００４４】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＮＳ４に結合できる生物活性剤のスクリーニング方法を提供する。一態様では、本方法は、ＮＳ４の試料に候補生物活性剤を加えることと、前記候補剤が前記ＮＳ４に結合するかの判断を行うこと（結合は、生物活性剤のＮＳ４に対する結合能を示す）を含む。
【００４５】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＮＳ４の活性を調節することができる生物活性剤のスクリーニング方法を提供する。一態様では、本方法は、候補生物活性剤をＮＳ４の試料に加える過程と、ＮＳ４の生物学的活性の変調を判断する工程を有し、ここで、変調は生物活性剤がＮＳ４の活性を調節できることを示している。特定の一態様では、ＮＳ４活性は細胞中のグルコース取り込みを減少させる。別の特異的実施態様では、ＮＳ４活性は細胞からのレプチン放出を増大させる。さらに別の特異的態様では、ＮＳ４活性はグルコースの取り込み低下と細胞からのレプチン放出の増大の両方を行う。さらに別の特異的態様では、細胞は含脂肪細胞である。別の態様では、ＮＳ４活性は脂質および炭水化物の酸化を増大させる。さらに別の特異的態様では、細胞は肝細胞または筋肉細胞である。
【００４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＮＳ４のレセプターの同定方法を提供する。一態様では、本方法はＮＳ４と細胞膜物質を含む組成物を組み合わせ、細胞膜物質上のレセプターとＮＳ４を複合させることと、前記レセプターをＮＳ４レセプターとして同定することを含む。一態様では、本方法は前記ＮＳ４とレセプターを架橋する工程を含む。細胞膜は無傷細胞か、または細胞膜抽出標本由来でありうる。
【００４７】
さらに別の実施形態では、細胞、好ましくは含脂肪細胞からのレプチン放出を誘導する方法が提供される。一態様では、本方法は、少なくともレプチン放出を誘導するのに有効な量のＮＳ４を細胞に対して投与することを含む。
【００４８】
さらに別の実施形態では、細胞内、好ましくは含脂肪細胞内へのグルコース摂取の低下を誘導する方法が提供される。一態様では、本方法は、少なくともグルコース摂取の低下を誘導するのに有効な量のＮＳ４を細胞に対して投与することを含む。
【００４９】
さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも治療上有効な量のＮＳ４ポリペプチドを含む組成物の投与を含む、体重異常について個体を治療する方法を提供する。一態様では、体重異常は肥満、悪液質、または摂食障害である。さらなる態様では、体重異常は、嚢胞性卵巣病、皮膚感染、静脈瘤、黒色表皮腫、及び湿疹、運動不耐性症、代謝異常、摂食亢進、糖尿病 、インシュリン抵抗症、高血圧、高コレステロール血症、脳卒中、高脂血症、動脈硬化、胆石症、骨関節炎、整形外科的傷害、血栓疾患、癌、及び冠状動脈心疾患である。さらに別の態様では、治療対象となる体重異常は、癌、嚢胞性繊維症またはＡＩＤＳに関連している。
【００５０】
さらに別の実施形態では、本発明は少なくとも治療上有効な量のＮＳ４ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストの個体への投与を含む、体重異常を被っている個体の治療方法を提供する。一態様では、個体の総体重が減少する。別の態様では、総体重に占める脂肪の割合が低下する。さらに別の態様では、総体重に占める除脂肪体重（非脂肪性組織）の割合が増大する。さらに別の態様では、個体の血清中の少なくとも１種のトリグリセリドまたは遊離脂肪酸の値が低下する。さらに別の態様では、個体の代謝率が上昇または低下する。
【００５１】
さらに別の実施形態では、本発明は、哺乳類の体重異常の診断、ならびにそのような障害を生じ易い患者の識別のための方法を提供する。一態様では、本方法は、このような体重異常が疑われる患者からの試料のＮＳ４の発現を測定することと、当該発現レベルを正常値と比較し、差異が認められる場合に体重異常を検出することとを含む。別の態様では、本方法は、体重異常の存在と相関する、患者の試料のＮＳ４ポリヌクレオチド中の突然変異を検出することを含む。さらに別の態様では、本方法は、診断的ＤＮＡ増幅分析のためのプライマーとして、または診断的ハイブリダイゼーションプローブとして、ＮＳ４核酸分子を使用することにより、ＮＳ４ ＤＮＡ突然変異、対立遺伝子の変化、または制御欠陥、例えばＮＳ４ポリヌクレオチドの発現の欠陥を同定することを含む。さらに別の態様では、本発明は、特定のＮＳ４突然変異、対立遺伝子の変化、または制御欠陥に関連する体重異常を生じ易い個体の同定のための、ＤＮＡ増幅分析の使用に関する。
【００５２】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＮＳ４ポリヌクレオチドおよび／またはＮＳ４ポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための細胞および非細胞アッセイを提供する。特定の態様では、本発明による細胞ベースアッセイは、ＮＳ４ポリペプチドを発現する細胞、細胞系、あるいは構築細胞または細胞系を使用する。
【００５３】
さらに別の実施形態では、本発明は、哺乳類ＮＳ４ポリヌクレオチドの発現および／またはその生物学的活性のレベルを調節する化合物を同定する方法を提供する。一態様では、本方法は：
（ａ）ＮＳ４ポリヌクレオチドを発現する細胞に化合物を接触させること、
（ｂ）細胞中のＮＳ４ ＤＮＡ発現レベルを測定すること、および
（ｃ）（ｂ）で獲得したレベルを、化合物が存在しない状態で獲得されたＮＳ４発現レベルと比較すること
を含み、化合物が存在しない状態で獲得されたレベルと（ｂ）で取得したレベルとが相違する場合、ＮＳ４活性を調節する化合物が同定される。
【００５４】
さらに別の実施形態では、本発明は：
（ａ）ＮＳ４ポリペプチドを含む細胞に化合物を接触させること、
（ｂ）細胞中のＮＳ４ポリペプチド、または活性のレベルを測定すること、および
（ｃ）（ｂ）で得られたレベルを、化合物が存在しない状態で得られたＮＳ４ポリペプチドまたは活性のレベルと比較すること
を含み、化合物が存在しない状態で得られたレベルと（ｂ）で得られたレベルとが相違する場合にＮＳ４活性を調節する化合物が同定される、ＮＳ４ポリペプチドの生物学的活性を調節する化合物の同定方法を提供する。
【００５５】
さらに別の実施形態では、本発明は：
（ａ）宿主（例えば、ＮＳ４導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物）に化合物を投与すること、
（ｂ）ＮＳ４遺伝子転写物、ＮＳ４発現またはＮＳ４活性のレベルを測定すること、および
（ｃ）（ｂ）で獲得したレベルを、化合物が存在しない状態のレベルまたは活性と比較すること
を含み、化合物が存在しない状態で獲得されたレベルと（ｂ）で獲得したレベルとが相違する場合、ＮＳ４活性を調節する化合物が同定される、ＮＳ４ポリペプチドの生物学的活性を調節する化合物の同定方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＮＳ４ポリペプチド」「ＮＳ４タンパク質」及び「ＮＳ４」という用語は、天然配列ＮＳ４、ＮＳ４ポリペプチド変異体（ここでさらに定義される）を含む。ＮＳ４ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え及び／又は合成方法によって調製してもよい。「ＮＳ４ヌクレオチド」という用語は、この段落に記載されるポリペプチドをコード化する核酸を含む。
【００５７】
「天然配列ＮＳ４」には、天然由来のＮＳ４と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。このような天然配列ＮＳ４は、自然から単離することもできるし、組換え及び／又は合成手段により産生することもできる。「天然配列ＮＳ４」という用語には、特に、ＮＳ４の自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及び自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明のある実施態様では、天然配列ＮＳ４は、（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または２０から約９５のアミノ酸を含む、成熟または完全長天然配列ＮＳ４である。また、図４（ａ）、図４（ｂ）および図４（ｃ）に開示されたＮＳ４ポリペプチドは、本明細書においてアミノ酸位１として表すメチオニン残基で開始するように示されている一方、図４（ａ）（配列番号４）、（ｂ）（配列番号５）および（ｃ）（配列番号６）におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基を各ＮＳ４ポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
【００５８】
ＮＳ４ポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＮＳ４ポリペプチドの形態を意味する。通常、ＮＳ４ポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＮＳ４ポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。状況に応じては、従って、ＮＳ４ポリペプチドの細胞外ドメインは、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン／細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約５を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
【００５９】
ここに開示する種々のＮＳ４ポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書及び／又は添付の図面に示す。例えば、ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１（配列番号１）、ＤＮＡ１４９９８６−２８８３（配列番号２）およびＤＮＡ１４９９９５−２８７１（配列番号３）によってコード化されるタンパク質については、シグナル配列はそれぞれ図１、２、および３に同定されている。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ-末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸以下である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全に均一ではなく、１つ以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに同定されるシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未以下で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【００６０】
「ＮＳ４変異体ポリペプチド」（「ＮＳ４突然変異」または「ＮＳ４多型」を含む）とは、（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５、（ｂ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）のＸから８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）のＸから９５、および（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）のＸから９５（ここでＸは図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）および図４（ｃ）（配列番号６）の１４から２４のアミノ酸のいずれか）、あるいは、（ｃ）図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）（配列番号４、５、６）にそれぞれ示すアミノ酸配列の特に得られた断片のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するとここで定義するような活性ＮＳ４ポリペプチドを意味する。このようなＮＳ４変異体ポリペプチドには、例えば、図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）および図４（ｃ）（配列番号６）の配列のＮ-および／またはＣ-末端および１又は複数の内部ドメインにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＮＳ４ポリペプチドが含まれる。通常、ＮＳ４ポリペプチド変異体は、（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５、（ｂ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）のＸから８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）のＸから９５、および（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）のＸから９５（ここでＸは図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）および図４（ｃ）（配列番号６）の１４から２４のアミノ酸のいずれか）、あるいは、（ｃ）図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）（配列番号４、５、６）にそれぞれ示すアミノ酸配列の特に得られた断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＮＳ４変異体ポリペプチドは天然ＮＳ４ポリペプチド配列を明確に包含しないものである。通常、ＮＳ４変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０，１３０，１４０，１５０，１６０，１７０，１８０，１９０，２００，２１０，２２０，２３０，２４０，２５０，２６０，２７０，２８０，２９０，３００，３１０，３２０，３３０，３４０，３５０，３６０，３７０，３８０，３９０，４００，４１０，４２０，４３０，４４０，４５０，４６０，４７０，４８０，４９０，５００，５１０，５２０，５３０，５４０，５５０，５６０，５７０，５８０，５９０，６００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００６１】
ここで同定したＮＳ４ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性を得るために、必要ならば配列を整列させて間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない後の、特定のＮＳ４ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMegalign(ＤＮＡSTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087で登録されている。ALIGN-2はジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００６２】
アミノ酸配列比較のために用いるALIGN-2の状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのプログラムのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、「ＮＳ４」が対象となる仮説的ＮＳ４ポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となるＮＳ４ポリペプチドが比較されているアミノ酸配列を表し、そして「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＮＳ４」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。特に断らない限りは、ここで使用する全ての％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2比較コンピュータプログラムを用いた即前出のパラグラフに記載のようにして得られる。
【００６３】
「ＮＳ４変異体ポリヌクレオチド」又は「ＮＳ４変異体核酸配列」とは、ここで定義されるように、活性ＮＳ４ポリペプチドをコードし、（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５、（ｂ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）のＸから８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）のＸから９５、および（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）のＸから９５（ここでＸは図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）および図４（ｃ）（配列番号６）の１４から２４のアミノ酸のいずれか）、あるいは、（ｃ）図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）（配列番号４、５、６）にそれぞれ示すアミノ酸配列の特に得られた断片のアミノ酸残基をコード化する核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、ＮＳ４変異体ポリヌクレオチドは、（ａ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）の約１または約２０から約８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）の約１または約２０から約９５、または（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）の約１または約２０から約９５の残基をコード化する核酸配列、（ｂ）（ｉ）図４（ａ）（配列番号４）のＸから８７、（ｉｉ）図４（ｂ）（配列番号５）のＸから９５、および（ｉｉｉ）図４（ｃ）（配列番号６）のＸから９５（ここでＸは図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）および図４（ｃ）（配列番号６）の１４から２４のアミノ酸のいずれか）のアミノ酸をコード化する核酸配列、あるいは、（ｃ）図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）（配列番号４、５、６）にそれぞれ示すアミノ酸配列の特に得られた断片をコード化する核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，又は９９％の核酸配列同一性を有している。ＮＳ４ポリペプチド変異体は、天然ＮＳ４ヌクレオチド配列を含まない。
【００６４】
通常、ＮＳ４変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００，１０５，１１０，１１５，１２０，１２５，１３０，１３５，１４０，１４５，１５０，１５５，１６０，１６５，１７０，１７５，１８０，１８５，１９０，１９５，２００，２１０，２２０，２３０，２４０，２５０，２６０，２７０，２８０，２９０，３００，３１０，３２０，３３０，３４０，３５０，３６０，３７０，３８０，３９０，４００，４１０，４２０，４３０，４４０，４５０，４６０，４７０，４８０，４９０，５００，５１０，５２０，５３０，５４０，５５０，５６０，５７０，５８０，５９０，６００，６１０，６２０，６３０，６４０，６５０，６６０，６７０，６８０，６９０，７００，７１０，７２０，７３０，７４０，７５０，７６０，７７０，７８０，７９０，８００，８１０，８２０，８３０，８４０，８５０，８６０，８７０，８８０，８９０，９００，９１０，９２０，９３０，９４０，９５０，９６０，９７０，９８０，９９０，又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
【００６５】
ここで同定されるＮＳ４ポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば配列を整列させ、間隙を導入した後の、ＮＳ４ポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者は、比較する配列の全長に亘る最大アラインメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムを含め、アラインメント測定に適したパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所,ワシントン D.C.，20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087で登録されている。ALIGN-2は ジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００６６】
ここでの目的のために、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのプログラムのアラインメントによって同一であるとスコアされたヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチドである。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４及び５が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＮＳ４ ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００６７】
他の実施態様では、ＮＳ４変異体ポリヌクレオチドとは、活性ＮＳ４ポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、図４（ａ）（配列番号４）、図４（ｂ）（配列番号５）、または図４（ｃ）（配列番号６）に示す完全長ＮＳ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションすることができる。ＮＳ４変異体ポリペプチドは、ＮＳ４変異体ポリヌクレオチドによってコードされているものであり得る。
【００６８】
ここで開示する種々のポリペプチドを記載するために使用される「単離」とは、自然環境の成分から同定及び分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、自然的に結合していたすべての成分との結合が無くなったものである。その自然環境の夾雑成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに十分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた、非還元又は還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによって均一となるまで精製される。単離されたポリペプチドには、ＮＳ４の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００６９】
「単離された」ＮＳ４ポリペプチドをコードする核酸は、同定され、ＮＳ４コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は天然に付随する全ての構成成分から遊離されている。単離されたＮＳ４コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＮＳ４コード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＮＳ４ポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＮＳ４を通常発現する細胞に含まれるＮＳ４コード化核酸分子を含む。
【００７０】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、状況に応じてはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００７１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００７２】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗ＮＳ４モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗ＮＳ４抗体組成物、一本鎖抗ＮＳ４抗体、及び抗ＮＳ４抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
【００７３】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェンシーを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。
【００７４】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度のストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高度のストリンジェントな洗浄を用いるものによって同定される。
【００７５】
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載されているように同定され、上記のストリンジェンシーより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件は、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
【００７６】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」と融合したＮＳ４ポリペプチド又は抗-ＮＳ４抗体を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有し、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜約２０の残基)を有する。
【００７７】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA（IgA-1及びIgA-2を含む）、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００７８】
ここでの目的に対する「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＮＳ４の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＮＳ４の形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＮＳ４によって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ＮＳ４が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＮＳ４が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。好ましい生物学的活性には、体重減少、脂肪過多症（体重に占める脂肪率）の減少、体重に占める除脂肪体重割合の増加のうち１または複数を含む。生物学的活性の別の定義は、個体における、代謝（または代謝率）の増大、含脂肪細胞無いへのグルコース取り込みの減少、含脂肪細胞からのレプチン放出の増大、トリグリセリドの減少、遊離脂肪酸の減少を含む。ＮＳ４の活性には、ＮＳ４により直接的に誘導されるものと、間接的に誘導されるものとがあるが、いずれもＮＳ４の存在によるもので、ＮＳ４が存在しない場合には同様の結果は得られない。
【００７９】
「治療」とは、障害の進行を防ぐ、または障害の症状を変化させる目的で行われる介入である。したがって、「治療」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は減退（減少）させることである。治療を必要とするものには、疾患にすでに罹っているもの、ならびに、疾患が予防されるべきものを含む。体重異常の治療において、治療薬は、障害の病理的構成要因の反応の大きさを直接的に減少、または増大させることができる（例えば、総体重を減少させる、体重に占める脂肪の割合を低下させる、体重に占める除脂肪体重の割合を上昇させる）か、疾病を、他の治療薬または方法による治療の効果が出易いものにする。治療の効果の別の測定基準には、含脂肪細胞へのグルコース取り込みの減少、含脂肪細胞からのレプチン放出の増大、血清トリグリセリドまたは脂肪酸レベルの低下、代謝率の上昇などが含まれる。
【００８０】
「有効量」とは、体重異常のインビトロ細胞ベースモデルにおいて、検知可能な改善を引き起こす、誘導する、またはそのような改善に帰結する、ＮＳ４の少なくとも最小の濃度である。例えば、含脂肪細胞へのグルコース取り込みの減少、含脂肪細胞からのレプチン放出の増大等である。さらに、「治療的有効量」とは、体重異常に関連する病理的症状を少なくとも緩和するか、または改善させるのに有効な、哺乳類に投与されるＮＳ４少なくとも最小の濃度（量）である。例えば、体重減少、体重に占める脂肪率の低下、体重に占める除脂肪体重割合の上昇、代謝率の上昇、血清トリグリセリドまたは脂肪酸の低下等である。
【００８１】
「治療」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は減退（減少）させることである。治療を必要とするものには、疾患に罹りやすいものと同時に疾患にすでに罹っているもの、又は疾患が予防されるべきものを含む。
【００８２】
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
【００８３】
治療のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、フェレットなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００８４】
「個体」とは、対象となるあらゆる患者であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００８５】
「体重異常」は、異常な体重（例えば、正常よりも大きいか、または小さい）を特徴とする障害である。例えば、肥満度指数（ボディマスインデックス、ＢＭＩ）が１９．９未満または２５．９以上である場合が体重異常である。体重異常の例としては、肥満、悪液質、摂食障害、過食症、嚢胞性卵巣病、、頭蓋咽頭腫、プラダー・ウィリー症候群、フレーリッヒ 症候群、II型糖尿病、成長ホルモン欠乏患者、正常範囲内の低身長変異、ターナー症候群が挙げられる。
【００８６】
「肥満」は、（体重（ｋｇ）をメートルで表した身長の２乗で割ることで計算する、哺乳動物の肥満度指数（ボディマスインデックス、ＢＭＩ）の少なくとも２５．９の状態に相当する。通常は、平均的な体重の人間は、１９．９から２５．９未満のＢＭＩである。ここでの肥満とは、遺伝的又は環境的な原因であろうと、すべての原因に起因しうる。結果として肥満となりうる、又は肥満の原因となりうる疾患の例としては、食べ過ぎ及び過食症、多嚢胞性卵巣症候群、頭蓋咽頭腫、プラダー・ウィリー症候群、フレーリッヒ 症候群、II型糖尿病、成長ホルモン欠乏患者、正常範囲内の低身長、ターナー症候群、並びに、例えば急性リンパ性白血病の子供など、代謝活性が低下や全無脂肪量のパーセントとしての安静時エネルギー消費量の低下を示す他の生理学的症状を含む。
【００８７】
「肥満に関連する症状」とは、皮膚疾患に限定されないが、例えば感染症、静脈瘤、黒色表皮腫、及び湿疹、運動不耐性、糖尿病、インシュリン抵抗性、過食症、高血圧、高コレステロール血症、高脂血症、胆石症、変形性関節症、整形外科的傷害、血栓疾患、癌、及び冠動脈（または循環器）心疾患、特に個体における高トリグリセリド及び遊離脂肪酸に関連した心疾患などの、肥満の結果の又は肥満によって悪化する症状に相当する。
【００８８】
１つ又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）投与及び任意の順序での連続投与を含む。
【００８９】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＮＳ４ポリペプチドの生物活性を部分的に又は完全に阻止、阻害、又は中和するあらゆる分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＮＳ４ポリペプチドの生物活性を模倣するあらゆる分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＮＳ４ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。ＮＳ４ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＮＳ４ポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニスト分子と接触させ、ＮＳ４ポリペプチドに通常は関連している１つ又は複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含みうる。
【００９０】
ここで用いられる「担体」は、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；EDTA等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（登録商標)、ポリエチレングリコール（PEG）、及びPLURONICS(登録商標)を含む。
【００９１】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００９２】
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab')2断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を架橋結合することができる。
【００９３】
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各可変ドメインの３つのCDRが相互作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、6つのCDRが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００９４】
また、Fab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの1つ又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりFab'断片と相違する。ここで、Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つFab'を表す。F(ab')2抗体断片は、最初はFab'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００９５】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
【００９６】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2に分類される。
【００９７】
「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合にとって望ましい構造の形成を可能にする、VH及びVLドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。sFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００９８】
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH-VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第404,097号;WO93/11161;及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【００９９】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び/又は回収されたものである。その自然環境の夾雑成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリー法で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を越えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
【０１００】
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」又は「特異的である」抗体は、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
【０１０１】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自体検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
【０１０２】
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。ある実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
【０１０３】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＮＳ４ポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
【０１０４】
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【０１０５】
表１
2005500030.tif 000002
2005500030.tif 000003
2005500030.tif 000004
2005500030.tif 000005
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2005500030.tif 000009
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2005500030.tif 000011
2005500030.tif 000012
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2005500030.tif 000014
2005500030.tif 000015
2005500030.tif 000016
2005500030.tif 000017
2005500030.tif 000018
【０１０６】
表２
ＮＳ４                XXXXXXXXXXXXXXX         (長さ＝15アミノ酸)
比較タンパク質        XXXXXYYYYYYY            (長さ＝12アミノ酸)
％アミノ酸配列同一性＝
(ALIGN-2で決定される２つのポリペプチド配列の間の一致するアミノ酸残基の数)÷(ＮＳ４ポリペプチドのアミノ酸残基の総数)＝
5÷15＝ 33.3%
【０１０７】
表３
ＮＳ４                XXXXXXXXXX              (長さ＝10アミノ酸)
比較タンパク質        XXXXXYYYYYYZZYZ         (長さ＝15アミノ酸)
％アミノ酸配列同一性＝
(ALIGN-2で決定される２つのポリペプチド配列の間の一致するアミノ酸残基の数)÷(ＮＳ４ポリペプチドのアミノ酸残基の総数)＝
5÷10＝ 50%
【０１０８】
表４
ＮＳ４−ＤＮＡ        NNNNNNNNNNNNNN          (長さ＝14ヌクレオチド)
比較ＤＮＡ            NNNNNNLLLLLLLLLL        (長さ＝16ヌクレオチド)
％核酸配列同一性＝
(ALIGN-2で決定される２つの核酸配列の間の一致するヌクレオチドの数)÷(ＮＳ４-ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの総数)＝
6÷14＝ 42.9%
【０１０９】
表５
ＮＳ４−ＤＮＡ        NNNNNNNNNNNN            (長さ＝12ヌクレオチド)
比較ＤＮＡ            NNNNLLLVV               (長さ＝9ヌクレオチド)
％核酸配列同一性＝
(ALIGN-2で決定される２つの核酸配列の間の一致するヌクレオチドの数)÷(ＮＳ４-ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの総数)＝
4÷12＝ 33.3%
【０１１０】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．完全長ＮＳ４ポリペプチド
本発明は、本出願でＮＳ４（又はUNQ5830、UNQ5924、UNQ5830、とも）と呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、ＮＳ４ポリペプチドをコードするcＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるPRO番号が与えられるが、UNQ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ＤＮＡ146649-1789R1、ＤＮＡ149986-2883又はＤＮＡ149995-2871によってコードされるタンパク質並びに上記のＮＳ４の定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体（時に、ＰＲＯ１９６５２、ＰＲＯ１９８１６およびＰＲＯ１９６５０とも称される）は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＮＳ４」と称する。
【０１１１】
下記の実施例に開示するように、ここでＤＮＡ146649-1789R1、ＤＮＡ149986-2883又はＤＮＡ149995-2871と称されるcＤＮＡクローンがATCCに寄託されている。該クローンの正確なヌクレオチド配列は、当業者によって当該分野の常套的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技術を用いて決定できる。ここに記載したＮＳ４ポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【０１１２】
Ｂ．ＮＳ４変異体
ここに記載した完全長天然配列ＮＳ４ポリペプチドに加えて、ＮＳ４変異体も調製できると考えられる。ＮＳ４変異体は、ＮＳ４ ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＮＳ４ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＮＳ４の翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
【０１１３】
天然完全長配列ＮＳ４又はここに記載したＮＳ４の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＮＳ４と比較してＮＳ４のアミノ酸配列が変化するＮＳ４をコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＮＳ４の１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＮＳ４の配列を相同な既知のタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、全長又は成熟天然配列によって示される活性に関し、得られた変異体を試験することにより決定される。
【０１１４】
ＮＳ４ポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、ＮＳ４ポリペプチドの所望の生物活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
【０１１５】
ＮＳ４断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＮＳ４断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5'及び3'プライマーで用いられる。好ましくは、ＮＳ４ポリペプチド断片は、図４（ａ）、図４（ｂ）又は図４（ｃ）（それぞれ配列番号：４−６）に示した天然ＮＳ４ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１１６】
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換との見だしにて表６に示す。このような置換が生物活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【０１１７】
表６
2005500030.tif 000019
【０１１８】
ＮＳ４ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対する効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
【０１１９】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、より好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【０１２０】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発などの当該技術分野において公知の方法を用いて実施することができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の既知の技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＮＳ４変異体ＤＮＡを作成することもできる。
【０１２１】
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【０１２２】
Ｃ．ＮＳ４の修飾
ＮＳ４の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の１つの型は、ＮＳ４ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＮＳ４の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＮＳ４を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ＮＳ４抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸とのエステル、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【０１２３】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１２４】
本発明の範囲内に含まれるＮＳ４ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＮＳ４に見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＮＳ４に存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【０１２５】
ＮＳ４ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＮＳ４（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＮＳ４アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＮＳ４ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【０１２６】
ＮＳ４ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【０１２７】
ＮＳ４ポリペプチド上に存在する糖鎖部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【０１２８】
ＮＳ４の共有結合的修飾の他の型は、ＮＳ４ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【０１２９】
また、本発明のＮＳ４は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＮＳ４を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【０１３０】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＮＳ４との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＮＳ４のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＮＳ４のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＮＳ４を容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5［Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体［Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体［Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、Flagペプチド［Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210(1988)］；KT3エピトープペプチド［Martinら, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)］を含む。
【０１３１】
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＮＳ４の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はIgG分子のFc領域であり得る。免疫グロブリン融合体は、好ましくは免疫グロブリン分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＮＳ４ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の生成については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【０１３２】
Ｄ．ＮＳ４の調製
以下の説明は、主として、ＮＳ４核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＮＳ４を生成する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＮＳ４を調製することができると考えられる。例えば、ＮＳ４配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＮＳ４の種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長ＮＳ４を生成してもよい。
【０１３３】
１．ＮＳ４をコードするＤＮＡの単離
ＮＳ４をコードするＤＮＡは、ＮＳ４ mＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＮＳ４ ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＮＳ４-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
【０１３４】
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＮＳ４に対する抗体又は少なくとも約20-80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＮＳ４をコードする遺伝子を単離する他の方法はPCR法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１３５】
下記の実施例には、cＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookらに示されている。
【０１３６】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の限定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
【０１３７】
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cＤＮＡに逆転写されていないmＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらに記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたcＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【０１３８】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＮＳ４生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
【０１３９】
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質移入の方法、例えば、CaCl2、CaPO4、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者にとって公知のものである。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらに記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開のWO89/05859に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。そのような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又はポリブレン、ポリオルニチンなどのポリカチオンなどを使用してもよい。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１４０】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公的に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌などの腸内細菌科、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日発行のDD266,710に記載されたバチルス・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスを含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えＤＮＡ生産物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanrを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１４１】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＮＳ４コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行の欧州特許第139,383号);クルベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol.154(2): 737-742 [1983])、クルベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、クルベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、クルベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、クルベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、クルベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クルベロミセス・サーモトレランス(K. thermotolerans)及びクルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第402,226号);ピチア・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第183,070号; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]);カンジダ;トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(欧州特許第244,234号);アカパンカビ(Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]);シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日発行の欧州特許第394,538号);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日発行の国際公開91/00357);及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルスニダランス(Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びアスペルギルスニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで増殖可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１４２】
グリコシル化ＮＳ４の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドプテラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より詳細な例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7,ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))ヒト肺細胞 (W138,ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2,HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562,ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術内にある。
【０１４３】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＮＳ４をコードする核酸(例えば、cＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、1つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、1つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の1つ又は複数を含む適当なベクターの構築には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【０１４４】
ＮＳ４は直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＮＳ４-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行の欧州特許第362179号)、又は1990年11月15日に公開されたWO90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１４５】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【０１４６】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１４７】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのようにＮＳ４-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaubらにより Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcombら, Nature, 282:39(1979);Kingsmanら, Gene, 7:141(1979);Tschemperら, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で増殖する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
【０１４８】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＮＳ４-コード化核酸配列に作用可能に結合し、mＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Changら, Nature, 275:615 (1978)； Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター［deBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたＮＳ４をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０１４９】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０１５０】
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第73,657号に更に記載されている。
【０１５１】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＮＳ４転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス(1989年7月5日公開のUK2,211,504)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス2)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス及びサルウイルス40（SV40）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【０１５２】
より高等の真核生物によるＮＳ４をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー（100-270塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＮＳ４コード化配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
【０１５３】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はcＤＮＡの通常は5’、時には3'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＮＳ４をコードするmＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１５４】
組換え脊椎動物細胞培養でのＮＳ４の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許第117,060号；及び欧州特許第117,058号に記載されている。
【０１５５】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０１５６】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＮＳ４ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＮＳ４ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１５７】
５．ポリペプチドの精製
ＮＳ４の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン（登録商標）-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＮＳ４の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
【０１５８】
ＮＳ４を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過；IgGのような夾雑物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＮＳ４のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選択される精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定のＮＳ４の性質に依存する。
【０１５９】
Ｅ．ＮＳ４の用途
ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列（又はそれらの補体鎖）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＮＳ４核酸も、ここに記載される組換え技術によるＮＳ４ポリペプチドの調製に有用である。
【０１６０】
完全長天然配列ＮＳ４ ＤＮＡ（配列番号：１）又はその一部は、完全長ＮＳ４ cＤＮＡの単離又は図１（配列番号：１）、図２（配列番号：２）又は図３（配列番号：３）に開示した天然ＮＳ４配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のcＤＮＡ（例えば、ＮＳ４の自然発生変異体又は他の種からのＮＳ４をコードするもの）の単離のためのcＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約20〜約50塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的には、配列番号：１−３のヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＮＳ４のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から決定され得る。例えば、スクリーニング法は、ＮＳ４遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約40塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、32P又は35S等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＮＳ４遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブリッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【０１６１】
本出願で開示する任意のEST配列は、プローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
【０１６２】
ＮＳ４核酸の他の有用な断片は、標的ＮＳ４ mＲＮＡ（センス）又はＮＳ４ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＮＳ４ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14から30ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするcＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48: 2659: 1988）及び van der Krolら,（BioTechniques 6: 958, 1988）に記載されている。
【０１６３】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の中途での停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＳ４タンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、WO91/06629に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１６４】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等のインターカレート剤、アルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０１６５】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、CaPO4-媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスM-MuLVから誘導されるもの、N2（M-MuLVから誘導されたレトロウイルス）、又はDCT5A、DCT5B及びDCT5Cと命名されたダブルコピーベクター（WO90/13641参照）を含む。
【０１６６】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との結合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の結合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【０１６７】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【０１６８】
また、プローブは、PCR技術に用いて、密接に関連したＮＳ４コード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
【０１６９】
また、ＮＳ４をコードするヌクレオチド配列は、ＮＳ４をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子障害を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの構築にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０１７０】
ＮＳ４のコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＮＳ４がレセプター又は共リガンドである場合）、ＮＳ４は、結合相互作用に関与している他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＮＳ４は関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＮＳ４又はＮＳ４のレセプターの生物活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーのハイスループットスクリーニングにも使用可能なアッセイを含み、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【０１７１】
また、ＮＳ４又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、また、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＮＳ４をコードするcＤＮＡは、ＮＳ４をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ＮＳ４をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＮＳ４導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＮＳ４コード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＮＳ４をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
【０１７２】
あるいは、ＮＳ４の非ヒト相同体は、動物の胚幹細胞に導入されたＮＳ４をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＮＳ４をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、欠損した又は変更されたＮＳ４コード化遺伝子を有するＮＳ４「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＮＳ４をコードするcＤＮＡは、確立された技術に従い、ＮＳ４をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＮＳ４をコードするゲノムＤＮＡの一部は、組込みをモニターするために使用可能な選択マーカーをコード遺伝子のような他の遺伝子によって欠失させたり、置換させることが可能である。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(5'と3'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択された［例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＮＳ４ポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０１７３】
また、ＮＳ４ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はmＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１７４】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzauら, Trends in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０１７５】
ここに記載したＮＳ４ポリペプチドをタンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
【０１７６】
ここに記載したＮＳ４ポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定が必要である。本発明の各ＮＳ４核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
【０１７７】
また、本発明のＮＳ４ポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＮＳ４ポリペプチドは、一方の組織において他方に比較して異なる発現をする。ＮＳ４核酸分子には、PCR、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【０１７８】
ここに記載したＮＳ４ポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＮＳ４ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、このＮＳ４生成物は薬学的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed., [1980])、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；EDTA等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(登録商標)、PLURONICS(登録商標)又はPEG等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１７９】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
【０１８０】
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
【０１８１】
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での局所投与などの注射又は注入、又は徐放系による。
【０１８２】
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できる指針を提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【０１８３】
ＮＳ４ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約10 ng/kgから100 mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10 mg/kg/日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
【０１８４】
ＮＳ４ポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＮＳ４ポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＮＳ４ポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（rhGH）、インターフェロン-（rhIFN-）、インターロイキン-２、及びMN rgp120で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p.439-462; WO97/03692, WO96/40072, WO96/07399；及び米国特許第5,654,010号。
【０１８５】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-グリコール酸（PLGA）コポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。PLGAの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
【０１８６】
ここに開示されるＮＳ４を含む治療薬および組成物は、多くの用途に使用可能である。そのような用途には、肥満または肥満に関連する状態の治療を含む。一態様では、その必要がある患者に対し、そのような状態を治療するのに有効な量のＮＳ４を投与する。好ましくは、そのような状態とは、代謝の上昇、体重の減少、体脂肪の減少、トリグリセリドの減少、遊離脂肪酸の減少、含脂肪細胞からのグルコース放出の増大、インシュリン感受性の上昇および／または含脂肪細胞からのレプチン放出の増大のうち少なくとも１つを必要とする治療が必要な状態である。これらの各パラメータは、標準的な方法によって、例えば酸素消費を測定して代謝率を測ることによって、重量測定の計器を用いて、並びに大きさを計って脂肪を測定することによって、測定することができる。さらに、トリグリセリド、遊離脂肪酸、グルコース及びレプチンの存在及び量は標準的な方法によって決定することができる。これらの各パラメータは、具体的な実施例で下記に例示する。
【０１８７】
ＮＳ４およびＮＳ４を含む組成物は、好ましくはインビボで使用される。しかしながら、先述したようにインビトロでも投与は可能で、その例としてＮＳ４のモジュレーターのスクリーニング方法を後述する。とはいえ、ＮＳ４のモジュレーターは、動物モデルおよび患者由来の試料を使用して同定することもできることに注意されたい。
【０１８８】
本発明は、ＮＳ４ポリペプチドに類似する又は増強するもの（アゴニスト）、又はＮＳ４ポリペプチドの効果を阻害または抑制するもの（アンタゴニスト）を同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アゴニストおよびあんたごにすとはここでモジュレーターと称される。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＮＳ４ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
【０１８９】
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
【０１９０】
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＮＳ４ポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０１９１】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＮＳ４ポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＮＳ４ポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＮＳ４ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１９２】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＮＳ４ポリペプチドに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られている方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように、Fields及び共同研究者ら［Fields及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母ベースの遺伝子系を用いることによってモニターすることができる。酵母GAL4などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前出の文献に記載された酵母発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用し、並びに２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。GAL1-lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性基質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定へ拡大適用することができる。
【０１９３】
ここで同定されたＮＳ４ポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常、反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、これら２つの生成物の相互作用及び結合が可能な条件下及び時間に渡って含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターされる。試験化合物を含有する反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が、遺伝子産物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【０１９４】
アンタゴニストをアッセイするためには、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともにＮＳ４ポリペプチドを細胞へ添加してもよく、ＮＳ４ポリペプチド存在下における対象活性を阻害する化合物の能力は、化合物がＮＳ４ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、ＮＳ４ポリペプチドと膜結合ＮＳ４ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを有する潜在的アンタゴニストを競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることによって、アンタゴニストを検出してもよい。放射活性などでＮＳ４ポリペプチドを標識することが可能であり、潜在的アンタゴニストの有効性を判断するためにレセプターに結合したＮＳ４ポリペプチド分子の数を利用することができる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びFACSソートによって同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): 第５章(1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＮＳ４ポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたcＤＮＡライブラリーがプールに分配され、COS細胞又はＮＳ４ポリペプチドに対して反応性ではない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで増殖させた形質移入細胞を、標識したＮＳ４ポリペプチドと接触させる。このＮＳ４ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１９５】
レセプター同定の代替的方法として、標識ＮＳ４ポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をPAGEで分離し、Ｘ線フィルムへ暴露する。レセプターを含む標識複合体を切り出し、ペプチド断片へ分解し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するcＤＮＡライブラリーをスクリーニングする縮重オリゴヌクレオチドプローブの一組の設計に用いられる。
【０１９６】
アンタゴニストの他のアッセイでは、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＮＳ４ポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
【０１９７】
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＮＳ４ポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限定しないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＮＳ４ポリペプチドの作用を競合的に阻害するＮＳ４ポリペプチドの変異形態であってもよい。
【０１９８】
競合的結合アッセイを行う本発明の一実施形態では、ＮＳ４レセプターまたはＮＳ４に対する抗体を競合相手として使用することができる。
【０１９９】
他の潜在的なＮＳ４ポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ構築物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的mＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりmＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＮＳ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 (1988); Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＮＳ４ポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでmＲＮＡにハイブリッド形成してmＲＮＡ分子のＮＳ４ポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＮＳ４ポリペプチドの生成を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０２００】
潜在的アンタゴニストは、ＮＳ４ポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＮＳ４ポリペプチドの正常な生物活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物を含む。
【０２０１】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いで内ヌクレオチド結合分解性切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、上掲のRossi, Current Biology 4:469-471 (1994)及びPCT公報番号、WO97/33551（1997年9月18日公開）を参照。
【０２０２】
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンの相当量の伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、PCT公報番号、WO97/33551、上掲を参照。
【０２０３】
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの１つ又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０２０４】
ここで提供されているすべてのアッセイは、幅広い種々の候補生物活性剤をスクリーニングすることに用いることができる。ここで用いられている「候補生物活性剤」、「候補薬剤」又は「候補薬」、又はここで用いられている文法的に同等の用語は、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖類、ポリヌクレオチド、プリン類似体などの細胞活性表現型、又は核酸配列及びタンパク質配列の双方を含むＮＳ４配列の発現の何れかを直接的又は間接的に変化させることができる生物活性剤のために試験されるすべての分子を表す。
【０２０５】
候補薬剤は、主として有機分子であるが、多くの化学物質を包含し、好ましくは１００を越え、約２，５００ダルトン（ｄ）より小さい分子量を有する小有機化合物である。小分子は、ここで更に、５０ｄと２０００ｄの間の分子量を有すると定義される。その他の実施態様では、小分子は１５００より小さい、又は１２００より小さい、又は１０００より小さい、又は７５０より小さい、又は５００ｄより小さい分子量を有する。一実施態様では、ここで用いられる小分子は、約１００から２００ｄの分子量を有する。候補薬剤は、タンパク質との構造的な相互作用に必要な官能基を含み、特には水素結合、そして主には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシ又はカルボキシ基、好ましくは少なくとも２つの官能基を含む。候補薬剤は、１つ又は複数の上記の官能基で置換された環状炭素又はヘテロ環状構造及び／又は芳香族又は多芳香族構造を頻繁に含む。また、候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体又はその組み合わせの中に見出される。特に好まれるのはペプチドである。
【０２０６】
候補薬剤は、合成又は天然化合物のライブラリを含む幅広い種々のソースから得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、幅広い種々の化合物及び生物分子のランダム及び直接合成のための多くの手段を利用することができる。あるいは、細菌、糸状菌、植物及び動物抽出物のライブラリを利用することができるか、又は容易に作製することができる。更には、通常の化学的、物理的及び生化学的手段によって、天然又は合成的に作製されたライブラリ及び化合物を容易に修飾できる。構造類似体を作製するために、既知の薬理学的な薬剤にアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの直接又はランダム化学修飾を施してもよい。
【０２０７】
好ましい実施態様では、候補生物活性薬剤はタンパク質である。ここで「タンパク質」によってとは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合的に結合しているアミノ酸を意味する。このタンパク質は、天然発生アミノ酸及びペプチド結合、又は合成ペプチド模倣構造で構成されうる。従って、ここで用いられる「アミノ酸」、又は「ペプチド残基」とは、天然発生及び合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは、本発明の目的のアミノ酸であると考えられている。また、「アミノ酸」は、プロリン及びヒドロキシプロリンのようなイミノ酸残基を含む。その側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）配置の何れかである。好ましい実施態様では、このアミノ酸は（Ｓ）又はＬ−配置である。非天然発生側鎖が用いられる場合には、非アミノ酸置換基が、例えばインビボでの分解を防いだり、遅くしたりすることに用いられてもよい。
【０２０８】
好ましい実施態様では、候補生物活性薬剤は、天然発生タンパク質又は天然発生タンパク質の断片である。従って、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物のランダム又は直接消化物を用いてもよい。この方法では、原核生物及び真核生物タンパク質のライブラリは、本発明の方法でのスクリーニングのために作製される。特に、この実施態様で好まれるのは、細菌、糸状菌、ウイルス、及び哺乳動物タンパク質のライブラリであり、後者は好まれており、そしてヒトタンパク質が特に好まれている。
【０２０９】
好ましい実施態様では、候補生物活性剤は、約５から約３０アミノ酸のペプチドで、約５から約２０アミノ酸が好まれ、そして約７から約１５が特に好まれる。このペプチドは、上記で概説したように、ランダムペプチド、又は「偏向」ランダムペプチドで、天然発生タンパク質の消化物でありうる。「ランダム化」又はここで文法的に同等な表現によって、各核酸及びペプチドは、基本的に、各々ランダムヌクレオチド及びアミノ酸で構成されていると言われている。一般的に、これらランダムペプチド（又は核酸、下記にて記載）は化学的に合成されることから、それらは、任意のヌクレオチド又はアミノ酸を任意の位置へ取り入れうる。この合成工程は、ランダム化タンパク質又は核酸を生成し、配列の長さにわたってすべて又は殆どの可能性ある組み合わせの形成を許容するために設計することができ、故にランダム化候補生物活性タンパク質性剤のライブラリを形成する。
【０２１０】
１つの実施態様では、すべての位置において配列優先又は一定さをともなわずに、ライブラリは完全にランダム化される。好ましい実施態様では、ライブラリは偏っている。すなわち、配列内のある位置は、一定に保たれているか、限られたメンバーの可能性から選択されるかの何れかである。例えば、好ましい実施態様では、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体構造的に偏った（小さい又は大きいのどちらか）残基の明確な種類において、核酸結合ドメインの作成、システインの作成、架橋結合のため、ＳＨ−３ドメインのプロリン、セリン、スレオニン、チロシン又はヒスチジンのリン酸化部位など、又はプリンに対するなどのために、ヌクレオチド又はアミノ酸残基はランダム化されている。
【０２１１】
好ましい実施態様では、候補生物活性剤は核酸である。「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又はここでの文法的に同等の表現によって、少なくとも２つのヌクレオチドが共有結合的にともに結合していると意味される。本発明の核酸は、概してリン酸ジエステル結合を含んでいるが、下記に概説するように、幾つかの場合は、代替バックボーンを有しうる核酸類似体が含まれ、この代替バックボーンは、例えば、ホスホルアミド（Beaucageら, Tetrahedron 49(10): 1925(1993)及びその参考文献；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800(1970)；Sprinzlら., Eur. J. Biochem. 81:579(1977)；Letsingerら., Nucl. Acids Res. 14:3487(1986)；Sawaiら, Chem. Lett. 805(1984), Letsingerら., J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988)；及びPauwelsら., Chemica Scripta 26:141 (1986)）、ホスホロチオエート（Magら., Nucleic Acids Res. 19:1437(1991)；及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオアート（Briuら., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321(1989)）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照のこと）、及びペプチド核酸バックボーン及び結合（Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895(1992)；Meierら., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008(1992)；Nielsen, Nature, 365:566(1993)；Carlssonら., Nature 380:207(1996)、すべて参考文献によって取り入れている）を含んでなる。他の類似核酸は、ポジティブ（陽性）バックボーン（Denpcyら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097(1995)；非イオンバックボーン(米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号及び第４，４６９，８６３号；Kiedrowshiら., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423(1991)；Letsingerら., J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988)；Letsingerら., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597(1994)；第２章及び３章、ASC Symposium Series 580，"Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui 及びP. Dan Cook；Mesmaekerら., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395(1994)；Jeffsら., J. Biomolecular NMR 34:17(1994)；Tetrahedron Lett. 37:743(1996)）並びに非リボゾームバックボーンを含み、それらは米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号、及び第６及び７章、ACS Symposium Series 580, "Carbohydrate Modification in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui及びP. Dan Cookに記載のものを含む。１つ又は複数の炭素環糖を含む核酸もまた、核酸の定義に含まれる（Jenkinsら., Chem. Soc. Rev.(1995)pp169-179）。幾つかの核酸類似体は、Rawls, C & E News June 2, 1997 35ページに記載されている。この結果、これら参考文献のすべてが、参考文献によって明らかに取り入れられている。リボース−リン酸バックボーンの修飾は、標識のような付加的物質の付加を容易にするためか、または生理的環境下におけるそのような分子の安定性と半減期を増すためにに施されるであろう。更には、天然発生核酸と類似体の混合物を作製することができる。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、及び天然発生核酸と類似体の混合物を作製してもよい。この核酸は、仕様としては、一本鎖又は二本鎖でもよく、或いは二本鎖又は一本鎖配列の双方の部分を含んでもよい。この核酸が任意のデオキシリボ-及びリボ-ヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む任意の塩基の組み合わせを含む場合には、この核酸は、Ｄ��Ａ、ゲノム及びｃＤＮＡの双方、ＲＮＡ又はハイブリッドでもよい。
【０２１２】
タンパク質に関する上記の一般的な記述のように、核酸候補生物活性剤は、天然発生核酸、ランダム核酸、又は「偏向」ランダム核酸でよい。例えば、タンパク質に関して上記にて概説しているように、原核生物又は真核生物ゲノムの消化物を用いてもよい。
【０２１３】
好ましい実施態様では、候補生物活性剤は、有機化学的物質であり、その幅広い多くのものを文献から得ることが可能である。
【０２１４】
上記にて概説した好ましい実施例では、個々の遺伝子と遺伝子の産物（タンパク質）についてスクリーニングを行ってもよい。好ましい実施態様では、遺伝子又はタンパク質は、特定の組織と関連した別々に発現した遺伝子であり、よって条件はこれら組織に関連しているとして、下記の実施例に記載されているように同定された。従って、一実施態様では、スクリーニングは、ＮＳ４へ結合することができる候補薬剤を最初に見出すように設計され、次いで、候補薬剤のＮＳ４活性を調節する能力を評価するアッセイに、これら薬剤は用いられうる。従って、当該分野において認識されているように、実行しうる異なった数多くの方法がある。
【０２１５】
ＮＳ４の活性を調節する薬剤のスクリーニングも実行される。好ましい実施態様では、ＮＳ４の活性を調節することができる生物活性剤のスクリーニングの方法は、ＮＳ４の試料へ候補生物活性剤を添加し、ＮＳ４の生物学的活性の変化を測定する段階を含む。「ＮＳ４の活性を調節すること」は、活性の増加、活性の低下、又は存在する活性の型や種類の変化を含む。従って、この実施態様では、候補薬剤は、ＮＳ４へ結合するはずであるし（これは、必修でなくてもよいが）、そしてここで定義されるＮＳ４の生物学的又は生化学的活性を変化するはずである。この方法は、上記にて全般的に概説したインビトロスクリーニング法、及びＮＳ４の存在、発現、分布、活性、量での変化に関する細胞のインビボスクリーニング法の両方を含む。
【０２１６】
従って、この実施態様では、これらの方法は、試料と候補生物活性剤を組み合わせること、並びにＮＳ４活性への効果を評価することを含む。「ＮＳ４タンパク質活性」又はここでの文法的に同等の用語によって、上記に記載した、少なくともＮＳ４タンパク質の生物学的活性が表される。
【０２１７】
好ましい実施態様では、ＮＳ４タンパク質の活性が上昇する；その他の好ましい実施態様では、ＮＳ４タンパク質の活性が低下する。従って、アンタゴニストである生物活性剤は、ある実施態様で好まれ、アゴニストである生物活性剤は、他の実施態様で好まれうる。
【０２１８】
本発明の一態様では、ＮＳ４に対する薬剤候補物質の効果を評価することで、ＮＳ４配列を含む細胞は薬剤スクリーニングアッセイで用いられる。細胞型は、正常細胞、腫瘍細胞、及び脂肪細胞を含む。
【０２１９】
グルコース取り込み、レプチン放出、新陳代謝、トリグリセリド及び遊離脂肪酸レベル、体重及び体脂肪の変化ようなＮＳ４活性を評価する方法は、当該分野で知られており、下記の実施例において例示されている。
【０２２０】
好ましい実施態様では、上記の定義のように、この方法は、ＮＳ４を含む細胞へ候補生物活性剤を添加することを含む。好ましい細胞型は、殆どすべての細胞を含む。これらの細胞は、好ましくは組み換え体であるが、ＮＳ４タンパク質をコードする核酸を含む。好ましい実施態様では、候補薬剤のライブラリは、多数の細胞で試験される。
【０２２１】
一態様では、このアッセイは、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、活動電位、化学療法剤を含む薬理学的薬剤、放射線、発癌物質、又は他の細胞（すなわち、細胞間接触）などの生理学的シグナルへの存在下又は非存在下での、又は先だっての又は後での曝露で評価される。その他の実施例では、測定は、細胞周期プロセスの異なった段階で確定される。
【０２２２】
また、ここで提供されるＮＳ４配列は、診断方法で用いることができる。ＮＳ４の過剰発現は異常に高い代謝速度を示し、発現抑制は肥満の傾向を示す。更には、変異又は機能失調のＮＳ４に関して、患者からの試料を分析してもよい。一般的には、そのような方法は、患者からの試料を比較すること、及びＮＳ４の発現をコントロールのそれと比較することを含む。
【０２２３】
Ｆ．抗ＮＳ４抗体
本発明は、さらに抗ＮＳ４抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【０２２４】
１．ポリクローナル抗体
抗ＮＳ４抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するのであればアジュバントを、１つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫剤は、ＮＳ４ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０２２５】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗ＮＳ４抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【０２２６】
免疫剤は、典型的には対象とするＮＳ４ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBLs」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０２２７】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
【０２２８】
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＮＳ４に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【０２２９】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
【０２３０】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０２３１】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrisonら, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０２３２】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【０２３３】
また、一価抗体の調製にはインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０２３４】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗ＮＳ４抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０２３５】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０２３６】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生成が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marksら, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonbergら, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０２３７】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合においては、結合特異性の一方はＮＳ４に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
【０２３８】
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０２３９】
所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０２４０】
WO96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０２４１】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、F(ab')2二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら,  Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に転換される。次に、Fab'-TNB誘導体の一つをメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０２４２】
大腸菌からFab'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab')2分子の製造を記述している。各Fab'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びErbB2レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０２４３】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短かすぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０２４４】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＮＳ４ポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗ＮＳ４ポリペプチドのアームは、特定のＮＳ４ポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28、又はB7)等の白血球上のトリガー分子又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgG(FcγR)に対するFcレセプターに結合するアームと組合わせてもよい。また、二重特異性抗体は特定のＮＳ４ポリペプチドを発現する細胞に細胞障害性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＮＳ４結合アーム及び細胞障害性薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。対象となる他の二重特異性抗体はＮＳ４ポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（TF）に結合する。
【０２４５】
５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO91/00360；WO92/200373；EP03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されたものが含まれる。
【０２４６】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体を、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるためにエフェクター機能について改変することが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞障害性（ADCC）を有する可能性がある。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolffら, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０２４７】
７．免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
【０２４８】
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上述した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、ツルレイシインヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reが含まれる。
【０２４９】
抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートHCL等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO94/11026参照。
【０２５０】
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞障害性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０２５１】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
【０２５２】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab'断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０２５３】
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＮＳ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
【０２５４】
ＮＳ４ポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、その機能を促進させる薬剤、例えば細胞障害性薬、サイトカイン、化学療法剤又は増殖阻害剤などを含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２５５】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 上掲に開示されている。
【０２５６】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２５７】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリルアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S-S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０２５８】
Ｇ．抗ＮＳ４抗体の一般用途
本発明の抗ＮＳ４抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗ＮＳ４抗体は、ＮＳ４の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、滑液、血漿／血清又は尿における発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature 144:945 (1962)；Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981)；及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
【０２５９】
また、抗ＮＳ４抗体は、組換え細胞培地又は天然の供給源からのＮＳ４の親和性精製に利用できる。この方法において、ＮＳ４に対する抗体を、当分野でよく知られた方法を用いてSephadex樹脂又は濾紙等の適した支持体に固定化する。次いで、固定化した抗体をＮＳ４を含む試料と接触させて精製し、その後、固定化した抗体と結合したＮＳ４以外の試料中の実質的には全ての物質を取り除きうる適した溶媒で、支持体を洗浄する。最後に、支持体を抗体からＮＳ４を引き離しうる他の適した溶媒で洗浄する。
【０２６０】
後述の実施例は、例示のみを目的としており、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものではない。
【０２６１】
Ｈ．トランスジェニック動物
新規ヒトＮＳ４又は他の供給源、例えばマウスからの類似ＮＳ４をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、また、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＮＳ４をコードするcＤＮＡは、ＮＳ４をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ＮＳ４をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＮＳ４導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＮＳ４コード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＮＳ４をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
【０２６２】
あるいは、ＮＳ４の非ヒト相同体は、動物の胚幹細胞に導入されたＮＳ４をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＮＳ４をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、欠損した又は変更されたＮＳ４コード化遺伝子を有するＮＳ４「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＮＳ４をコードするcＤＮＡは、確立された技術に従い、コードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＮＳ４をコードするゲノムＤＮＡの一部（例えば、エキソン）は、組込みをモニターするために使用可能な選択マーカーをコード遺伝子のような他の遺伝子によって欠失させたり、置換させたりすることが可能である。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(5'と3'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択された［例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、移植を受け入れる能力、癌を拒絶する能力および感染症から防御する能力によって特徴付けられ、基礎免疫生物学の研究に利用することができる。
【０２６３】
トランスジェニック動物の創造に使用される特定の一技術は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を使用する。酵母人工染色体は、酵母染色体のエレメントから構築されたクローニングベクターであり、インビボでベクターを酵母細胞に複製および維持することを可能にする。酵母エレメントには、セントロメア、自律増殖配列、一対のテロメア、酵母選択可能マーカー、およびバクテリア中のＹＡＣベクターアームの選択と複製のための、通常バクテリア由来の複製および選択可能マーカーが含まれる。
【０２６４】
宿主動物のゲノムへの挿入のための内在遺伝子座の遺伝子ターゲティングと組み合わせてＹＡＣを使用することができる。ＹＡＣを使用することの利点は、数百キロベースのＤＮＡを宿主細胞に挿入できることである。したがって、ＹＡＣクローニング媒体の使用により、かなり多くの導入遺伝子領域を含めることが可能になる。さらなる利点は、酵母において高頻度相同性組換えを利用することで、ＹＡＣ上の配列を削除したり、ＹＡＣ上に配列を挿入したりすることができることである。これにより、ＹＡＣ導入遺伝子の設計が容易になる。
【０２６５】
ヒト抗体を創造する場合などに、ヒト核酸の大セグメントを動物へ組み込むという別の方法は、「小座位アプローチ」として知られている。「小座位アプローチ」は、遺伝子座を有する個々の遺伝子の導入による（免疫グロブリンなどの）対象遺伝子の遺伝子座の複製に関する。例えば、遺伝子座が免疫グロブリンである場合、構成遺伝子は、１または複数のＶＨ遺伝子、１または複数のＤＨ遺伝子、１または複数のＪＨ遺伝子、ｍｕ定常領域、第２の定常領域であり得、それらは動物への挿入のために単一構造に形成させることができる。このアプローチの例は、Surani他による米国特許第5,545,807号、LonbergおよびKayによる米国特許第5,545,806号、同第5,625,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、5,770,429号、同第5,789,650号および同第5,814,318号、KrimpenfortおよびBernsによる米国特許第5,591,669号、Berns他による米国特許第5,612,205号、同第5,721,367号、同第5,789,215号、ChoiおよびDunnによる米国特許第5,643,763号、欧州特許第0546073B1号、国際公開番号WO92/3918、WO92/22645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852、WO98/24884に記載されている。他の例は、Taylor他、Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295, 1992年；Chen他、Inter. Immunol. 5: 647-656, 1993年; Tuaillon他、J. Immunol. 154: 6453-6465, 1995年; Choi他、Nature Genetics 4: 117-123, 1993年、Lonberg他、Nature 368:856-859, 1994年、Taylor他、Internat. Immunol. 6: 579-591, 1994年、Tuaillon他、J. Immunol 154: 6453-6465, 1995年、およびFishwild他、Nature Biotech. 14: 845-851, 1996年に紹介されている。
【０２６６】
ヒト核酸を哺乳類細胞へ導入するためのさらに別の方法は、「微小核細胞融合」と称されている。微小核細胞融合では、欧州特許出願公開番号第0843961号に記載のように、ヒト染色体の一部または全部をマウスに導入することができる。この方法により導入遺伝子が相当量の遺伝子材料を含むことになるので、特定の座位に多数の遺伝子が含まれる場合、特定の遺伝子それぞれの発現プロファイルに対して可能な制御は一般に大きくない。微小核細胞融合の別の問題点は、導入染色体の有糸分裂および減数分裂ともに不安定なことである。例えば、導入遺伝子が免疫グロブリン遺伝子座であったとき、ヒトＩｇＨ、ＩｇＫまたはその両方をコード化する導入染色体は８０％に近い頻度で失われた。
【０２６７】
Ｉ．体重関連の異常、治療および診断のためのＮＳ４ポリヌクレオチドポリペプチドおよびそれによってコードされたポリペプチドの使用
本発明は、また、肥満、悪液質および摂食障害などの体重異常の診断および治療に関連した様々な特異的使用のためのＮＳ４ ＤＮＡ、それからコード化されたポリペプチド（そのペプチド断片およびそれに対する抗体を含む）、ならびにペプチド断片も目的としている。
【０２６８】
後述する使用の各々は主に体重異常に対するものであるが、後述の診断的および治療的処置はそのような体重異常に関連する他の欠陥、例えば多嚢胞卵巣、感染症、静脈瘤、黒色表皮腫、及び湿疹などの皮膚疾患、運動不耐性症、代謝異常、摂食亢進、糖尿病 、インシュリン抵抗症、高血圧、高コレステロール血症、脳卒中、高脂血症、胆石症、骨関節炎、整形外科的傷害、血栓疾患、癌、及び心臓冠状動脈疾患に関して使用することもできる。
【０２６９】
そのような使用とは、例えば、（１）体重異常の予防的および診断的評価およびそのような異常が進行する危険を有する個体の識別；（２）体重異常の治療方法；（３）ＮＳ４ ＤＮＡの発現を調節する化合物の同定、（４）またはＮＳ４ポリペプチドの活性を調節する化合物の同定である。さらに具体的には、個体に対するそのような使用には、ＮＳ４突然変異の存在の検知、あるいは、野生型発現レベル、病的状態と相関する遺伝子プロフィールを有する非病的生物、またはそのような体重異常の罹患率と比較したＮＳ４ポリペプチドの発現過剰または発現不足の検知を含む。
【０２７０】
ここに開示する方法は、例えば、少なくとも１つのここに開示した特定のＮＳ４核酸または抗ＮＳ４ポリペプチドを含む予めパッケージされた診断用キットを利用することにより実行することができ、それにより、体重異常を示す個体をスクリーニングおよび診断し、次いで体重異常を患う疾病素質を有する個体をスクリーニングすることもできる。
【０２７１】
ＮＳ４突然変異の検出において、問題の個体由来の有核細胞をゲノム核酸の供給源として使用することができる。ＮＳ４発現の検出において、ＮＳ４ ＤＮＡが発現される任意の細胞型または組織、例えば、ＮＳ４ ＤＮＡを発現することが本明細書で示されている組織または細胞を使用することができる。核酸に基づく検出技術およびタンパク質に基づく検出技術の両方について後述する。
【０２７２】
（１）ＮＳ４核酸の検出
ＮＳ４ ＤＮＡ内部における突然変異または多型は、多数の技術により検出可能である。そのようなアッセイ技術の開始点として、任意の有核細胞由来の核酸を使用し、当技術分野で周知の標準的な核酸調製手順に従って単離することができる。
【０２７３】
生物学的試料のハイブリダイゼーションまたは増殖アッセイにゲノムＤＮＡを使用して、点突然変異、挿入、欠失および染色体再配列を含め、ＮＳ４遺伝子構造に伴う異常性を検出することができる。このようなアッセイは、サザン分析、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、およびＰＣＲ分析を含み、またそれらに限定されない。
【０２７４】
ＮＳ４遺伝子に特異的な突然変異の検出のための診断方法では、例えば、試料由来の（患者の試料、またはその他適切な細胞供給源から取得するなどした）核酸を、１または複数の標識された核酸試薬（組換えＤＮＡ分子、クローン化遺伝子、またはその縮重変異体を含む）に、これら試薬をＮＳ４遺伝子に隣接するまたはその内部の相補的配列に対して特異的にアニーリングするのに適した条件下で接触させてインキュベートすることを含みうる。好ましくは、そのような核酸試薬の長さは少なくとも１５から３０ヌクレオチドである。
【０２７５】
培養後、アニーリングされていない核酸を核酸から取り除く：ＮＳ４分子ハイブリッド。次いでハイブリダイズした核酸の存在を（そのような核酸が存在する場合は）検出する。このような検出方式を使用することにより、対象とする細胞型または組織由来の核酸を、例えば、膜、あるいはマイクロタイタプレート又はポリスチレンビーズ上の可塑性表面などの固体の担体に固定化することができる。この場合、培養後、アニーリングされていない標識核酸試薬は容易に除去される。アニーリングされ、標識された残存するＮＳ４核酸試薬の検出は、当技術分野において周知の標準的な技術を使用して行う。核酸試薬をアニーリングしたＮＳ４ ＤＮＡ配列を正常ＮＳ４ ＤＮＡ配列に予想されるアニーリングパターンと比較することにより、ＮＳ４ ＤＮＡ突然変異が存在するかどうかを決定することができる。
【０２７６】
好ましい実施形態では、基質または「遺伝子チップ」に固定されたＮＳ４核酸配列のマイクロアッセイを使用することにより、ＮＳ４遺伝子突然変異または多型性を検出することができる（Cronin,他、Human Mutation 7: 244-255, 1996年参照）。
【０２７７】
患者の試料またはその他適切な細胞供給源におけるＮＳ４遺伝子に特異的な核酸分子の検出のための別の診断方法は、例えばＰＣＲ（米国特許第4,683,202号に開示された実験形態）によりそれらを増幅し、それに続いて、たとえば上記に列挙した当技術分野で周知の技術を使用して増幅分子を分析することを含む。その結果得られる増幅配列を、増幅された核酸がＮＳ４遺伝子の正常なコピーのみを含む場合に予想されるものと比較することにより、ＮＳ４遺伝子突然変異が存在するかどうかを決定することができる。
【０２７８】
そのような増幅に関連する診断的スクリーニング分析に好ましいそれらＮＳ４核酸配列は、ＮＳ４エクソン配列を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーである。したがって、このようなオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、後述するようなエクソン全体またはコード化領域の分析を可能にするために、ＮＳ４イントロン配列から取得するのが好ましい。ＮＳ４エクソンの増幅に有用なプライマーの対は、好ましくは、隣接するイントロンから取得する。２５個のＮＳ４エクソンの各々を増幅することにより適切なプライマーの対を選択することができる。
【０２７９】
ＮＳ４エクソンを増幅するためのプライマーは、図１、２、および３に示すＮＳ４のコーディングおよび非翻訳配列を使用することにより、当技術分野の従来技術の１つにより常套的に設計することができる。このような増幅に関連する分析に好ましい付加的なＮＳ４核酸配列は、ＮＳ４多型性の存在を検出する配列である。このような多型性には、肥満、悪液質、または摂食障害などの体重異常に関連する突然変異を示すものを含む。
【０２８０】
さらに、肥満、悪液質、または摂食障害などの体重異常に関連する突然変異を含め、ＮＳ４遺伝子自体の突然変異に非常に近似する多型性に対し、周知の遺伝子型特定技術を実施してもよい。ＮＳ４遺伝子の突然変異を保持していると思われる系統の固体を特定するために、そのような多型性を使用することができる。多型性がＮＳ４遺伝子の突然変異との連鎖不平衡を示す場合、多型性を使用してそのような突然変異を保持していると思われる個体を集団全体から識別することができる。
【０２８１】
この方法に使用できる多型性は、一塩基多型性、および単純配列長多型（ＳＳＬＰ）制限酵素標的配列、に配列変化を伴う制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む。例えば、米国特許第5,075,217号には、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎ短縦列反復のブロックの長さ多型性に基づくＤＮＡマーカーが開示されている。（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎブロックの平均分離は、３０，０００−６０，０００ｂｐと推定されている。接近して配置されたマーカーは高頻度の共通遺伝を示し、ＮＳ４遺伝子の突然変異などの遺伝子突然変異の同定、およびＮＳ４遺伝子の突然変異に関連する疾病および障害の診断に極度に有益である。
【０２８２】
また、米国特許第5,364,759号には、短いトリおよびテトラヌクレオチド反復配列を検出するためのＤＮＡプロファイリングアッセイが開示されている。この方法は、ＮＳ４遺伝子などの目的のＤＮＡを抽出すること、抽出したＤＮＡを増幅すること、および反復配列に標識して患者のＤＮＡの遺伝子型地図を形成することを含む。
【０２８３】
加えて、ＮＳ４プローブを使用して直接ＲＦＬＰを同定することができる。さらに、ＮＳ４配列から獲得したＮＳ４プローブまたはプライマーを使用して、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ，コスミド、ファージ、またはプラスミドなどの遺伝子クローンを単離することができる。
【０２８４】
標準的ハイブリダイゼ―ションまたは配列決定法を使用して、これらのクローンに含まれるＤＮＡを一塩基多型性についてスクリーニングすることができる。ＮＳ４遺伝子発現のレベルもアッセイすることができる。例えば、ＮＳ４遺伝子を発現していることが分かっているか、疑われている細胞型または組織、例えば筋肉、脳、腎臓、精巣、心臓、肝臓、肺、皮膚、視床下部、脾臓、および脂肪性組織由来のＲＮＡを単離し、上述のハイブリダイゼーション、またはＰＣＲ技術を使用して試験してもよい。単離される細胞は細胞培地または患者から得てもよい。培地から取得した細胞の分析は、細胞ベース遺伝子治療技術の一部として使用されるか、あるいは、ＮＳ４遺伝子の発現に対する化合物の効果を試験するための、細胞の評価において必要な過程でありうる。このような分析により、ＮＳ４遺伝子発現の活性または非活性を含め、ＮＳ４遺伝子の発現パターンの量的および質的な面の両方を明らかにすることができる。
【０２８５】
このような検出体系の一実施形態では、（例えば、ＲＮＡ分子をｃＤＮＡに逆転写することにより）目的のＲＮＡ分子からｃＤＮＡ分子を合成する。次いで、その結果得られるＤＮＡの全てまたは一部を、ＰＣＲ増幅反応などの核酸増幅反応の鋳型として使用する。本方法の逆転写および核酸増幅の過程において合成開始試薬（例えば、プライマー）として使用される核酸試薬は、ここに開示するＮＳ４遺伝子核酸試薬から選択される。
【０２８６】
このような核酸試薬に好ましい長さは、少なくとも９−３０ヌクレオチドである。増幅産物の検出のために、放射性的にまたは非放射性的に標識したヌクレオチドを使用して核酸増幅を実行してもよい。あるいは、標準的な臭化エチジウム染色によるか、またはその他任意の適切な核酸染色法を使用することにより産物を可視化するのに十分な増幅産物を作成してもよい。
【０２８７】
適切な細胞の十分量を取得できるのであれば、増幅技術の代替法として、標準的なノーザン分析法を実行することにより、ＮＳ４遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定することができる。加えて、そのようなＮＳ４遺伝子発現アッセイを「インサイツ」で、つまり、細胞診または切除術によって取得した患者組織の組織分画（固定および／または凍結）で直接的に実行することが可能であり、よって核酸の精製が不要である。ここに開示するような核酸試薬を、そのようなインサイツ処理においてプローブおよび／またはプライマーとして使用してもよい（例えば、Nuovo, G.J., 1992年、”PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications”, Raven Press, NY参照）。
【０２８８】
（２）ＮＳ４遺伝子産物の検出
天然配列、変異体、およびそのポリペプチド断片を含むＮＳ４遺伝子産物の検出に、そのようなＮＳ４遺伝子産物に対する抗体を使用してもよい。このような抗ＮＳ４抗体は、体重異常の診断および予後に使用してもよい。ＮＳ４遺伝子発現、またはＮＳ４遺伝子産物合成のレベルにおける異常、またはＮＳ４遺伝子産物の構造、一時的発現、および／または物理的位置の異常を発見するために、このような方法を使用できる。ここに開示する抗体およびイムノアッセイ方法は、例えば、肥満、悪液質、および摂食障害などの体重異常の治療の効果を評価する際に重要なインビトロでの用途を有する。抗体、または抗体の断片（例えば以下に記すもの）を使用して、インビトロで潜在的治療化合物をスクリーニングし、ＮＳ４遺伝子発現およびＮＳ４遺伝子産物生成に対するその効果を決定することができる。肥満、悪液質、摂食障害などの体重異常に有利な効果を有する化合物を同定し、治療的有効量を決定することができる。
【０２８９】
また、インビトロのイムノアッセイを使用して、例えば、肥満、悪液質、および摂食障害を含む体重異常に対する細胞ベース遺伝子療法の効果を評価してもよい。ＮＳ４遺伝子産物に対する抗体をインビトロで使用して、例えば、ＮＳ４遺伝子産物を生成するように遺伝子設計されている細胞におけるＮＳ４遺伝子発現レベルを決定してもよい。細胞内ＮＳ４遺伝子産物の場合、そのような評価は、好ましくは細胞ライセートをまたは抽出物を使用して行う。この分析により、インビボでの治療効果、ならびに遺伝子置換プロトコルの最適化を達成するのに必要な形質転換した細胞の数を決定することができる。
【０２９０】
分析対象の組織または細胞型は通常ＮＳ４遺伝子を発現していることが分かっているか、または疑われているものを含む。ここで使用するタンパク質単離方法は、例えば、HarlowおよびLaneにより開示されたもの（1988年、”Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）などでよい。単離された細胞は、細胞培地または患者から採取することができる。培地から取得した細胞の分析は、細胞ベース遺伝子治療技術の一部として使用されるか、あるいは、ＮＳ４遺伝子の発現に対する化合物の効果を試験するための、細胞の評価において必要な過程である。
【０２９１】
ＮＳ４遺伝子産物、保存変異体、またはそのペプチド断片の好ましい診断法には、例えば、ＮＳ４遺伝子産物または保存的な変異体またはペプチド断片を、抗ＮＳ４遺伝子産物に特異的な抗体とそれらとの相互作用により検出する、イムノアッセイを使用できる。
【０２９２】
例えば、上述のような抗体、または抗体の断片を使用して、ＮＳ４遺伝子産物または保存的な変異体またはそのペプチド断片の存在を量的または質的に検出してもよい。これは、例えば、蛍光標識した抗体を光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量的検出と組み合わせて使用する免疫蛍光技術により行うことができる。この技術は細胞表面に発現したＮＳ４遺伝子産物のために特に好ましい。
【０２９３】
加えて、ＮＳ４遺伝子産物、保存的な変異体またはそれらのペプチド断片をインサイツで検出するために、本発明において有用な抗体（またはその断片）を、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法において組織学的に使用してもよい。インサイツでの検出は、患者から組織学的標本を取り出し、それに対してＮＳ４ポリペプチドに結合する標識した抗体を加えることより達成できる。抗体（又は断片）の添加は、生物学的試料に標識した抗体（または断片）をオーバーレイすることにより行うのが好ましい。本方法の使用により、ＮＳ４遺伝子産物、保存的な変異体またはペプチド断片の存在だけでなく、試験された組織内におけるその分布も決定することが可能である。本発明の使用により、多種多様な組織学的方法（例えば染色法）を修正してＮＳ４遺伝子産物のインサイツでの検出を達成することが可能であることが、当業者には容易に理解できるであろう。
【０２９４】
ＮＳ４遺伝子産物、保存的な変異体またはそのペプチド断片のイムノアッセイは、一般に、（１）生体液、組織抽出物、収集直後の細胞、または細胞のライセートなどの試料を、ＮＳ４遺伝子産物、保存的な変異体またはそのペプチド断片を同定することのできる、検出可能に標識された抗体の存在下で培養すること、および（２）当技術分野で周知の多数の技術のうちのいずれか１つにより結合した抗体を検出すること、を含む。
【０２９５】
細胞、細胞片又は可溶性蛋白質を固定化することができるニトロセルロースなどの固相支持体または担体に、生物学的試料を接触させて固定する。次いで支持体を適切な緩衝液で洗浄し、その後検出可能に標識したＮＳ４遺伝子産物に特異的な抗体で処理する。緩衝液で固相支持体の２度目の洗浄を行い、非結合抗体を除去する。その後、固相支持体上の結合標識の量を、従来からある手段により検出する。
【０２９６】
「固体相支持体または担体」とは、抗原または抗体に結合可能な任意の支持体を意味する。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および加工セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、および磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的のために、担体の性質は、ある程度可溶性でもよく、または非可溶でもよい。支持体の材料は、結合分子が抗原または抗体に結合できる限り、可能な構造的構成のいずれを有するものでもよい。したがって、支持体の構造は、ビーズのような球状、または試験管の内部表面やロッドの外部表面のような円柱状でよい。あるいは、表面はシート、試験用ストリップなどのように平坦でもよい。好ましい支持体にはポリスチレンのビーズが含まれる。抗体または抗原の結合に使用できるその他多数の適切な担体が当業者に既知であり、当業者は常套的実験の使用によりそのような担体を確認することができる。
【０２９７】
ＮＳ４遺伝子産物に特異的な抗体を検出可能に標識する方法は、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）などの検出が容易な酵素の使用である（Voller, A., “The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) II, Diagnostic Horizons 2: 1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD, 1978年; Voller, A.他、J. Clin. Pathol. 31, 507-520, 1978年; Butler, J.E., Meth. Enzymol. 73: 482-523, 1981年; Maggio, E.（編）、 Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980年; Ishikawa, E.他(編), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, 1981年）。抗体に結合する酵素は好適な基質、好ましくは色素産生基質に反応し、分光光度手段、蛍光手段、視覚的手段などにより検出可能な化学成分を生じる。抗体を検出可能に標識する酵素は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸、脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリリン酸、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素グルコアミラーゼおよびアセチルコリネステラーゼを含み、またそれらに限定されない。検出は、酵素に色素産生基質を使用する比色分析方法により実行可能である。基質の酵素反応範囲を、同様に調製した基準と比較する視覚的比較により検出を行ってもよい。
【０２９８】
様々な他のイムノアッセイのいずれかを使用して検出を行うこともできる。例えば、抗体または抗体断片を放射標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用してＮＳ４遺伝子産物を検出することが可能である（例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, 1986年3月）。そのような手段をガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターとして使用するか、またはオートラジオグラフィーにより、放射活性同位元素を検出することができる。
【０２９９】
抗体を蛍光性化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適切な波長の光に曝すと、蛍光によりその存在を検出することができる。最も広く使用されている蛍光標識用化合物は、フルオレセインイソチオシアン酸塩、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、O−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンである。
【０３００】
１５２Ｅｕなどのフルオレセイン放出金属、またはランタニド系のその他金属を使用して、抗体を検出可能に標識することができる。これら金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート群を使用して、抗体に添付することができる。
【０３０１】
抗体は、化学発光化合物に結合させることにより検出可能に標識することができる。この時、化学発光タグの付いた抗体の存在は、化学反応の過程で生じるルミネセンスの存在を検出することにより決定される。特に有益な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸塩エステルを含む。
【０３０２】
同様に、生物発光化合物を使用して本発明の抗体を標識してもよい。生物発光とは、触媒タンパク質により化学発光反応の効率が上昇する、生物学系に見られる化学蛍光の一つの型である。生物発光タンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することで決定することができる。標識のために重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０３０３】
（３）ＮＳ４核酸または遺伝子産物と相互作用する化合物のスクリーニングアッセイ
以下のアッセイは、ＮＳ４遺伝子産物、ＮＳ４遺伝子産物と相互作用するタンパク質、またはタンパク質の一部に結合する化合物、ＮＳ４遺伝子産物とタンパク質との相互作用を阻害する化合物、およびＮＳ４遺伝子の活性を調節する（すなわち、ＮＳ４遺伝子の発現レベルを調節する、および／またはＮＳ４遺伝子産物の活性を調節する）化合物を同定するように設計されている。本アッセイはまた、ＮＳ４遺伝子制御配列（例えば、プロモーター配列；例えば、Platt, J. Biol. Chem. 269: 28558-28562, 1994年参照。参照により本文献全体を本発明に包含する）に結合し、ＮＳ４遺伝子発現のレベルを調節できる化合物を同定するために使用できる。このような化合物は、血液脳関門を通過でき、適切な細胞内へ達し及び／又は進入し、ＮＳ４遺伝子または体重制御経路に関わるその他複数の遺伝子の発現、または細胞内タンパク質に影響できるような小有機分子を含むことができ、またそれに限定されない。
【０３０４】
このようなタンパク質の同定方法について以下に説明する。本タンパク質は体重の管理および／または制御に関与できる。さらに、これら化合物の中には、ＮＳ４遺伝子発現レベルおよび／またはＮＳ４遺伝子の生産活動に影響を与え、肥満、悪液質、および摂食障害を含む体重異常の治療に使用できる化合物がある。
【０３０５】
化合物は、例えば、Ｉｇ−端融合ペプチドおよびランダムなペプチドライブラリ（例えば、Lam他、Nature 354: 82-84, 1991年；Houghten他、Nature 354: 84-86, 1991年）、およびＤ−構造および／またはＬ−構造のアミノ酸からなる化学的に得られた組み合わせの分子ライブラリのメンバーを非限定的に含む可溶ペプチドなどのペプチド、（ランダムなまたは一部縮小した、特定のリンタンパク質ライブラリを非限定的に含む）リン酸ペプチド（例えば、Songyang他、Cell 72: 767-778, 1993年）、（多クローン性、単一クローン性、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、およびＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）、およびＦＡｂ発現ライブラリ断片、およびそのエピトープ結合断片を非限定的に含む）抗体、および小有機または無機分子を含み、またそれらに限定されない。
【０３０６】
ここに開示するようなアッセイにより同定された化合物は、例えば、ＮＳ４遺伝子産物の生物学的機能を確定するのに、および肥満、悪液質、または摂食障害などの体重異常を改善するのに有用である。
【０３０７】
（ａ）ＮＳ４遺伝子産物に結合する化合物のインビトロスクリーニングアッセイ
本発明のＮＳ４遺伝子産物に結合できる化合物を同定するためのインビトロシステムを設計することができる。同定された化合物は、例えば、無傷の、および／または突然変異のＮＳ４遺伝子産物の活性を調節する際、ＮＳ４遺伝子産物の生物学的機能を確定する際、正常ＮＳ４遺伝子産物の相互作用を妨害する化合物を同定するスクリーニングにおいて、有用であるか、あるいはそれ自体そのような相互作用を妨害することができる。
【０３０８】
ＮＳ４遺伝子産物に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの基本方式は、ＮＳ４遺伝子産物と試験化合物の反応混合物を、それら２要素が相互作用して結合するのに十分な時間と条件の下で調整し、それにより、反応混合物中で除去および／または検出できる複合体を形成することを含む。これらのアッセイは、様々な方法で実施することができる。例えば、このようなアッセイを行う方法は、ＮＳ４遺伝子産物または試験物質を固体の支持体上に係留し、反応の終わりに、固体の支持体上に形成されたＮＳ４遺伝子産物／試験化合物複合体を検出することを含む。このような方法の一実施形態では、ＮＳ４遺伝子産物を固体の支持体上に係留することができ、係留されない試験化合物を直接的にまたは間接的に標識することができる。
【０３０９】
実際には、マイクロタイタプレートを固体の支持体として利用する。係留した成分は、非共有または共有接着により固定化できる。非共有接着は、単に固体表面をタンパク質の溶液で被覆し、乾燥させることにより行うことができる。あるいは、タンパク質の固定化に特異的な、固定化された抗体、好適にはモノクローナル抗体を、タンパク質を固体表面上に係留するために使用できる。表面を事前に準備し、保存しておくことも可能である。
【０３１０】
アッセイを実行するために、係留された成分を含む被覆表面に非固定化成分を加える。反応完了後、形成された複合体が固体表面に固定化されて残るようにして、反応しなかった成分を（例えば洗浄により）除去する。表面上に係留された複合体の検出は、多くの方法で行うことができる。予め固定化されていない成分に事前に標識している場合、表面上に固定化されていない標識が検出されるということは、複合体が形成されたことを示す。予め固定化されていない成分に事前に標識しない場合、表面上に係留した複合体を検出するために間接的標識を使用することができる；例えば、予め固定化されていない成分に特異的な標識抗体を使用する（抗体を、標識抗―Ｉｇ抗体で直接的または間接的に標識できる）。
【０３１１】
あるいは、液体相で反応を行い、無反応成分から反応産物を分離し、複合体を検出する；例えば、ＮＳ４遺伝子産物または試験化合物に特異的な固定化抗体を使用することにより溶液中に形成された複合体、及び可能な複合体のその他の成分に特異的な標識抗体を係留し、係留された複合体を検出する。
【０３１２】
（ｂ）ＮＳ４遺伝子産物と相互作用するタンパク質のアッセイ
タンパク質−タンパク質相互作用の検出に適した任意の方法を使用して、ＮＳ４遺伝子産物−タンパク質相互作用を同定することができる。使用可能な伝統的な方法としては、勾配またはクロマトグラフのカラムによる共精製、架橋および共免疫沈降を挙げることができる。このような方法を利用することで、ＮＳ４遺伝子産物と相互作用するタンパク質を同定することができる。これに限定されないが、このようなタンパク質はＮＳ４遺伝子産物を含みうる。単離後、そのようなタンパク質を同定し、標準的技術と共に使用することにより、それが相互作用するタンパク質を同定することができる。例えば、ＮＳ４遺伝子産物と相互作用するタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部は、エドマン分解法といった当技術分野で周知の技術を使用して確認することができる（例えば、Creighton, “Proteins: Structures and Molecular Principle”, W.H. Freeman & Co., N.Y., 34-49頁、1983年参照）。このようなタンパク質をコード化する遺伝子配列のスクリーニングに使用できるオリゴヌクレオチドの混合物の生成のためのガイドとして、取得したアミノ酸配列を使用してもよい。スクリーニングは、例えば、標準的なハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術により行うことができる。オリゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングの方法は周知である（例えば、Ausubel, 上掲、および1990年、”PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, Innis他、編  Academic Press, Inc., New Yorkを参照）。
【０３１３】
加えて、ＮＳ４遺伝子産物と相互作用するタンパク質をコード化する遺伝子の同時同定を行う方法を採用することも可能である。これらの方法には、例えば、Ｘｇｔ１１ライブラリの抗体プローブの周知の技術と同様にしてＮＳ４遺伝子産物を使用し、標識されたＮＳ４遺伝子産物での発現ライブラリをプローブすることが含まれる。インビボでのタンパク質の相互作用を検出する一方法であるハイブリッドシステムについて、限定的にでなく、例示のみを目的に説明する。このシステムの一バーションは公開されており（Chien,他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582, 1991年）、クローンテック社（米国カリフォルニア州パロアルト）から市販されている。簡潔に説明すると、このシステムの使用により、２つのハイブリッドタンパク質をコード化するプラスミドが構築される。その一方はＮＳ４遺伝子産物に融合する転写活性タンパク質のＤＮＡ結合ドメインから構成されており、他方は、未知のタンパク質に融合する転写活性タンパク質の活性ドメインから構成されている。このとき、未知のタンパク質は、ＤＮＡライブラリの一部としてこのプラスミドに組換えされたｃＤＮＡによりコード化されている。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリは、転写活性対結合際とをその制御領域に含むリポーター遺伝子を有する酵母Saccharomyces cerevisiae種に形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質も単独でリポーター遺伝子の転写を活性化することはできない（ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは活性機能を提供しないため。また、活性ドメインハイブリッドは活性因子の結合部位を局在化しないため）。２つのハイブリッドタンパク質が相互作用することにより、機能活性タンパク質が再構成され、リポーター遺伝子が発現するので、リポーター遺伝子をリポーター遺伝子産物のアッセイにより検出する。
【０３１４】
２―ハイブリッドシステムまたはそれに関連する方法論を使用して、「ベイト」遺伝子産物と相互作用するタンパク質について活性ドメインライブラリをスクリーニングしてもよい。限定的にではなく例示的に、ＮＳ４遺伝子産物をベイト遺伝子産物として使用することができる。ゲノムまたはｃＤＮＡ配列の合計を活性ドメインをコード化するＤＮＡに融合する。
【０３１５】
ＤＮＡ結合ドメインに融合させたベイトＮＳ４遺伝子産物のハイブリッドをコード化するプラスミドおよびこのライブラリを、酵母リポーター種に形質転換し、結果として得られた形質転換体をリポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば、ベイトＮＳ４遺伝子配列、例えばＮＳ４遺伝子のオープンリーディングフレームをベクターにクローン化し、よってＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコード化するＤＮＡにそのまま融合させることができる。これらコロニーを精製し、リポーター遺伝子発現を引き起こすライブラリプラスミドを単離する。次いでＤＮＡ配列を使用してライブラリプラスミドによりコード化されたタンパク質を同定する。
【０３１６】
ベイトＮＳ４遺伝子産物と相互作用するタンパク質が検出される細胞系のｃＤＮＡライブラリは、当技術分野で常套的に実施される方法を使用して作成することができる。ここに開示する特定のシステムに従って、例えばｃＤＮＡ断片をベクターに挿入し、よってＧＡＬ４の転写活性化ドメインにそのまま融合することができる。ＧＡＬ４活性配列を含むプロモーターにより、このようなライブラリを、ＬａｃＺ遺伝子を含む酵母種に、ベイトＮＳ４遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドに沿って共形質変換することができる。
【０３１７】
ｃＤＮＡコード化タンパク質は、ベイトＮＳ４遺伝子産物と相互作用するＧＡＬ４転写活性ドメインに融合されており、活性ＧＡＬ４タンパク質を再構築し、それによりＨＩＳ３遺伝子の発現を得る。ヒスチジンを有さない半固体の寒天ベースの媒体を含むペトリ皿で成長させることにより、ＨＩＳ３を発現するコロニーを検出することができる。
【０３１８】
次いで、このような種からｃＤＮＡを精製し、当技術分野の常套的技術を使用してベイトＮＳ４遺伝子産物と相互作用するタンパク質を生成および単離する。
【０３１９】
（ｃ）ＮＳ４遺伝子産物の巨大分子を阻害する化合物のアッセイ
ＮＳ４遺伝子産物は、タンパク質などの巨大分子の１つまたは複数とインビボで相互作用することができる。例えば、ＮＳ４遺伝子−産物は、ＮＳ４遺伝子産物とインビボで相互作用できる。ＮＳ４遺伝子産物と相互作用するその他の巨大分子は、核酸分子およびここに開示するような方法により同定されるタンパク質を含み、またそれらに限定されない。本明細書での説明において、巨大分子を「結合パートナー」と称する。結合パートナーに結合するＮＳ４遺伝子産物を阻害する化合物は、ＮＳ４遺伝子産物、特に突然変異ＮＳ４遺伝子産物の活性を調節するのに有用な場合がある。このような化合物は、タンパク質などの分子を含み、またそれに限定されない。
【０３２０】
ＮＳ４遺伝子産物と（１または複数の）結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物の同定に使用されるアッセイシステムの基本方式は、ＮＳ４遺伝子産物と結合パートナーの反応混合物を、それら２要素が相互作用して結合するのに十分な時間と条件の下で調整し、それにより複合体を形成することを含む。化合物の抑制的活性を試験するために、反応混合物を試験化合物が存在する状態および存在しない状態で調製する。試験化合物は反応混合物に最初から含んでもよく、またはＮＳ４遺伝子産物と結合パートナー添加後のある時点で加えてもよい。試験化合物が無い状態と、複合体の形成をブロックすることが知られている化合物の存在下で、対照反応混合物を培養する。その後、ＮＳ４遺伝子産物と結合パートナーとの間に形成されたいかなる複合体も検出する。対照の反応物に複合体がが形成されたのに試験化合物を含む反応混合物に複合体が形成されていないことは、化合物がＮＳ４遺伝子産物と結合パートナーとの相互作用を妨害したことを示す。また、試験化合物と正常なＮＳ４遺伝子産物を含む反応混合物中に複合体が形成されていれば、試験化合物と突然変異ＮＳ４遺伝子産物を含む対照混合物中の複合物形成と比較する。この比較作業は、突然変異ＮＳ４遺伝子産物の相互作用を阻害したいが正常なＮＳ４遺伝子産物の相互作用は阻害したくない場合、重要である。
【０３２１】
ＮＳ４遺伝子産物と結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物のアッセイは、異質様式でも相同様式でも実施できる。異質アッセイには、ＮＳ４遺伝子産物または結合パートナーを固体の支持体に係留することと、反応の最後に固体の支持体上に形成された複合体を検出することを含む。相同アッセイでは、反応全体を液体相で実施する。いずれの方法でも、試験している化合物に関する異なる情報を得るために、反応物質の添加順序を変えることができる。例えば、ＮＳ４遺伝子産物と結合パートナーとの相互作用を（例えば競合により）妨害する試験化合物を、試験物質の存在下で、つまり、ＮＳ４遺伝子産物および相互作用的細胞内結合パートナーの添加の前またはそれらと同時に試験物質を反応混合物に加え、反応させることにより、同定することができる。あるいは、予め形成されていた複合体を阻害する試験化合物、例えば複合体の成分の１つを置き換える結合定数のより大きい化合物を、複合体の形成後に反応混合物に試験化合物を加えることにより試験することができる。様々な様式を以下に簡潔に記載する。
【０３２２】
相同アッセイシステムでは、ＮＳ４遺伝子産物または相互作用的結合パートナーを固体表面に係留する一方、係留しない方に直接的または間接的に標識する。実際には、従来的にマイクロタイタプレートを使用する。係留した方を非共有接着または共有接着により固定化する。非共有接着は、単純に、固体表面をＮＳ４遺伝子産物または結合パートナーの溶液で被覆し、乾燥させることにより実施することができる。あるいは、係留しようとするものに特異的な固定化した抗体を使用して固体表面に係留することができる。表面は事前に調製して保存してもよい。
【０３２３】
アッセイを行うために、試験化合物を持つか、または持たない被覆表面に固定化する種のパートナーを曝す。反応完了後、反応しなかった成分を（例えば洗浄により）除去し、形成された複合体は固体表面に固定化されて残る。固体表面上に係留された複合体の検出は多くの方法で行うことができる。固定化しない種に事前に標識してある場合、表面上に固定化された標識が検出されるということは、複合体が形成されたことを意味する。固定化しない種に事前に標識していない場合、表面上に係留する複合体を検出するために間接的標識、例えば最初に固定化しない種に特異的な標識した抗体（抗体は標識した抗−Ｉｇ抗体で直接的または間接的に標識できる）を使用できる。反応成分の添加順序によって、複合物の形成を抑制する、または事前に形成された複合体を疎外する試験化合物を検出することができる。
【０３２４】
あるいは、試験化合物の存在下、または試験化合物が存在しない状態で、反応を液体相において実施し、反応産物を無反応成分から分離し、例えば、結合成分の一方に特異的な固定化した抗体を使用することにより溶液中に形成されたいかなる複合体をも係留し、また他方に特異的な標識した抗体を使用することにより係留した複合体を検出することにより、複合物を検出することができる。ここでも、液体相に反応物質を添加する順序によって、複合体の形成を抑制する試験化合物、または予め形成されていた複合体を阻害する試験化合物を同定することができる。
【０３２５】
本発明の別の実施形態では、相同アッセイを使用できる。この方法では、事前に形成されていたＮＳ４遺伝子産物と相互作用的結合パートナーの複合体を調節する際に、ＮＳ４遺伝子産物、またはその結合パートナーに標識するが、標識により生じる信号は複合体形成により抑えられる（例えば、この方法をイムノアッセイに使用したRubensteinによる米国特許第4,109,496号を参照）。予め形成されていた複合物の成分と競合し、置換する試験物質を添加することにより、先述の信号が生成される。このようにして、ＮＳ４遺伝子産物／結合パートナー相互作用を阻害する試験物質が同定される。
【０３２６】
本発明の別の実施形態では、一方または両方の完全長タンパク質の代わりに、ＮＳ４遺伝子産物および／または結合パートナー（結合パートナーがタンパク質である場合）の結合ドメインに相当するペプチド断片を使用して、これらと同じ技術を採用する。結合部位の同定には、当技術分野で常套的に使われるいかなる方法も使用できる。これらの方法は、タンパク質の１つをコード化する遺伝子の突然変異生成、および免疫沈降アッセイにおける結合阻害のスクリーニングを含み、またそれらに限定されない。次いで、複合体の第２の成分をコード化する遺伝子の相補的突然変異を選択することができる。各タンパク質をコード化する遺伝子の配列分析により、相互作用的結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異が明らかになる。あるいは、前セクションに記載の方法を使用して固体表面に１つのタンパク質を係留し、トリプシンなどのタンパク分解性酵素で処理しておいたその結合パートナーと相互作用させ、さらに結合させることが可能である。洗浄後、結合ドメインを含む、標識した短ペプチドが固体材料に関連して残余する場合があり、アミノ酸配列によりそれを同定することができる。また、セグメントをコード化する遺伝子を加工してタンパク質のペプチド断片を発現したら、結合活性について試験し、精製するか、または合成することができる。
【０３２７】
限定的な意味ではなく、例示として挙げると、本セクションでは、ＧＳＴ−１融合タンパク質を作成し、それをグルタチオンアガロースのビーズに結合させることにより、上述のようにＮＳ４遺伝子産物を子滞在用に係留することができる。結合パートナーは３５Ｓなどの放射活性アイソトープで標識することができ、トリプシンなどのタンパク質分解性酵素で分解することができる。次いで、係留したＧＳＴ−１融合タンパク質に分解産物を加え、結合させることができる。結合しないペプチドを洗浄後、結合パートナーの結合ドメインを表す標識した結合物質を、周知の方法によりアミノ酸配列について、抽出、精製、および分析することができる。このようにして同定されたペプチドは、人工的に製造可能であるか、組換えＤＮＡ技術を使用して製造可能である。
【０３２８】
（ｄ）体重異常の治療に有用な化合物を同定するためのアッセイ
先述したようなアッセイ技術により同定される結合化合物を含む、またそれに限定されない化合物を、体重異常の症状を治療する能力について試験することができる。ここに開示するアッセイは、ＮＳ４遺伝子発現に作用することにより、またはＮＳ４遺伝子産物活性のレベルに作用することにより、ＮＳ４活性に影響する化合物を同定することができる。例えば、ＮＳ４遺伝子および／またはＮＳ４遺伝子産物が含まれる経路の別の段階、例えばＮＳ４遺伝子が媒介する経路の段階の「上流」または「下流」において、化合物を同定してもよい。このような化合物は、これと同じ経路に作用することにより、体重異常の進行に対するＮＳ４の効果を調節できる。このような化合物を障害の治療法の一部として使用することが可能である。
【０３２９】
以下に記載するのは、体重異常症状を改善する能力を示す化合物を同定するための細胞ベースアッセイおよび動物アッセイである。まず、細胞ベースシステムを使用して体重異常の症状を改善する作用を有する化合物を同定することができる。このような細胞システムは、例えば、組換えまたは非組換え細胞、例えばＮＳ４遺伝子を発現する細胞系を含む。
【０３３０】
このよな細胞システムを利用する際は、体重異常の症状を改善する能力を示すと思われる化合物にＮＳ４を接触させる。その際、接触させる細胞においてそのような症状の改善が明らかになるのに十分な濃度および十分な時間で接触させる。接触後、細胞をアッセイし、例えばＮＳ４  ｍＲＮＡ転写のための細胞ライセートをアッセイ（例えばノーザン分析により）することによりＮＳ４遺伝子の発現の変化を測定する、または細胞が発現するＮＳ４遺伝子産物を得ることができる。ＮＳ４遺伝子の発現を調節する化合物は治療薬として好ましい候補である。
【０３３１】
これに加えて、哺乳類の体重異常の動物モデル、例えばヒトＮＳ４遺伝子またはＮＳ４遺伝子の変調型を含むトランスジェニックマウス、または動物に基づくシステムを使用して、この異常の症状を改善できる能力を有する化合物を同定することができる。薬物、製薬、治療法、介入の同定のために、このような動物モデルを試験物質として使用できる。例えば、体重異常の症状を改善する能力を示すと思われる化合物に動物モデルを接触させる。その際、接そのような症状の改善が明らかになるのに十分な濃度および十分な時間で接触させる。障害の症状の後退を評価することにより、接触に対する動物の反応をモニターしてもよい。
【０３３２】
本発明では、体重異常様の症状のいずれかの面を後退させる任意の治療が、そのような障害のヒトの治療的行為の候補として考慮される。
【０３３３】
（４）体重異常の治療のための化合物および方法
肥満、悪液質、および摂食障害を含む体重異常を治療できる方法と化合物について以下に述べる。そのような方法には、例えば、哺乳類ＮＳ４遺伝子および／または哺乳類ＮＳ４遺伝子産物の合成または活性の発言を調節する化合物を投与することにより体重異常の症状を改善することが含まれる。あるいは、哺乳類の体重異常がＮＳ４遺伝子突然変異に起因している場合は、そのような方法は、哺乳類に無傷のＮＳ４遺伝子産物をコード化する核酸分子を供給し、それにより無傷のＮＳ４遺伝子産物を発現させ、異常症状を改善することを含むことができる。ＮＳ４遺伝子突然変異に起因する哺乳類の体重異常の治療法の別の実施形態では、当方法は、無傷のＮＳ４遺伝子産物をコード化する核酸分子を含む細胞を哺乳類に供給することにより、細胞に無傷のＮＳ４遺伝子産物を発現させ、異常症状を改善することを含むことができる。
【０３３４】
あるいは、特定の体重異常、例えば、正常体重より低い体重を発現型として伴う悪液質、摂食障害の症状は、ＮＳ４遺伝子発現および／またはＮＳ４遺伝子産物の活性を増大させることにより改善することができる。
【０３３５】
（ａ）抑制的アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん法
別の実施形態では、体重異常の症状は、ＮＳ４遺伝子配列を周知のアンチセンス、「ノックアウト」遺伝子、リボザイムおよび／または三重らせん方法と組み合わせて使用し、ＮＳ４遺伝子発現のレベルを下げることにより、ＮＳ４遺伝子発現レベルおよび／またはＮＳ４遺伝子産物活性レベルを低下させて、改善することができる。哺乳類の体重異常の症状を改善する能力を含め、ＮＳ４遺伝子の活性、発現または合成を調節する能力を示す化合物として、アンチセンス、リボザイム、および三重らせん分子を挙げることができる。無傷の、または適切であれば突然変異の標的遺伝子活性を、低下させる、または抑制するように、そのような分子を設計してもよい。そのような分子の生成および使用のための技術は当技術分野において周知である。
【０３３６】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的のｍＲＮＡにハイブリダイゼーションすることにより、およびタンパク質の転換を防止することにより、ｍＲＮＡの転写を直接的にブロックするように作用する。アンチセンス法には、標的遺伝子ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計が含まれる。アンチセンスヌクレオチドは、相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ転写に結合し、転換を防止する。絶対的相補性は好ましいが、必須ではない。
【０３３７】
本明細書で言うＲＮＡの一部に「相補的」な配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズするのに十分に相補的で、安定したデュプレックスを形成する配列を意味する。二重鎖アンチセンスの場合、デュプレックスＤＮＡの一本鎖はこのようにして試験される。またはトリプレックス形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイゼーションの能力は、相補性の度合いと、アンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長い程、それに含まれるＲＮＡにベースの不一致が多く、依然として安定したデュプレックス（または場合に応じてトリプレックス）を形成する。当業者であれば、標準的方法を使用してハイブリダイズした複合体の融点を決定することにより、不一致の許容範囲を確定することができる。
【０３３８】
一実施形態では、ＮＳ４遺伝子の非コード化領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンス法に使用して、内因性ＮＳ４  ｍＲＮＡの転換を抑制することができた。アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチド長でなければならず、好ましくは６から５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは少なくともヌクレオチドであり、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０３３９】
標的配列の選択にかかわらず、インビトロでの研究を初めに行い、アンチセンスヌクレオチドの遺伝子発現抑制を定量化することが好ましい。好ましくは、この研究では、アンチセンスの遺伝子抑制とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果との差異化のために対照群を使用する。また、この研究では、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを内部の対照ＲＮＡまたはタンパク質と比較することが好ましい。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して得られた結果を対照ヌクレオチドと比較することが考えられる。好ましくは、対照ヌクレオチドは試験するオリゴヌクレオチドと概ね同じ長さであり、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列とアンチセンス配列との差異は、標的配列への特異的なハイブリダイゼーションを防ぐのに必要量を超えない。
【０３４０】
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はそのキメラ混合物又は誘導体又は修飾された種類、一本鎖又は二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善するために修飾してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボにおいて、宿主細胞のレセプターを標的化するための）、又は細胞膜（例えば、Letsinger等, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86:6553-6556；Lemaitre等, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652；PCT公報、WO88/09810, 1988年12月15日発行を参照のこと）又は血管−脳関門（例えば、PCT公報、WO89/10134, 1988年4月25日発行を参照のこと）輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーション−トリガー切断剤（例えば、Krol等, 1988, BioTechniques 6:958-976を参照のこと）又はインターカレーティング剤（Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549）などの付加的な他の集団を含んでもよい。このために、オリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション−トリガー架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション−トリガー切断剤、などと結合してもよい。
【０３４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定はしないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルクエオシン、イノシン、NG−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−D−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−N６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（V）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（V）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−N−２−カルボキシプロピル）ウラシル、(acp3)w、及び２，６−ジアミノプリンを含む集団から選択される少なくとも一つの修飾された塩基部分を含んでもよい。
【０３４２】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定はしないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む集団から選択される少なくとも一つの修飾された糖部分を含んでもよい。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はその類似体から成る集団から選択される少なくとも一つの修飾されたリン酸骨格を含む。あるいはまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα-アノメリックオリゴヌクレオチドである。α-アノメリックオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成するが、通常の~-ユニットとは反対に、鎖は互いに平行に並ぶ（Gautier等, Nucl. Acids. Res. 15:6625-6641, 1987年）。オリゴヌクレオチドは2'-O-メチルリボヌクレオチド（Inoue等, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148, 1987年）、又はキメラＲＮＡ-ＤＮＡ類似体である（Inoue等, Febs Lett. 215:327-330, 1987年）。
【０３４３】
本発明のオリゴヌクレオチドは当該技術分野において既知の標準的な方法、例えば、自動ＤＮＡ合成機（Biosearch, Applied Biosystems, などから購入できるような）の使用により合成してもよい。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein等の方法（1988, Nucl. Acids Res. 16:3209）によって合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、調整された孔のガラスポリマー支持体などを用いて調製することができる（Sarin 等, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:7448-7451）。
【０３４４】
標的遺伝子コーディング領域の配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用することが可能であるが、転写された非翻訳領域に相補的であるものが最も好ましい。
【０３４５】
アンチセンス分子をインビボで標的遺伝子を発現する細胞に供給する必要がある。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に供給する多くの方法がある。例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注することができる。あるいは、所望の細胞を標的とするように修飾したアンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現した受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合するアンチセンス）を全身投与することができる。
【０３４６】
しかしながら、アンチセンスの細胞内濃度を内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分にするのは困難な場合が多い。したがって、好ましい方法では、強力なＰｏｌ  ＩＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下でアンチセンスオリゴヌクレオチドが配置される組換えＤＮＡ構成を利用する。そのような構成を使用して標的細胞を患者に形質移入することにより、内因性の標的遺伝子の転写物と相補的な塩基対を形成し、よって標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を防止する一本鎖ＲＮＡが、十分な量で転写される。例えば、細胞に摂取されてアンチセンスＲＮＡの転写を誘導するようにベクターを導入することができる。そのようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを精製するように転写できるものである限り、エピソームとして残るか、または染色体性に統合することができる。このようなベクターは、当技術分野において常套的な組換えＤＮＡ技術方法により構築可能である。ベクターは、哺乳類細胞における複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルス性、またはその他当技術分野において既知のものでよい。アンチセンスＲＮＡをコード化する配列は、当技術分野で哺乳類、好ましくはヒトの細胞に作用するとして知られる任意のプロモーターによって発現させることができる。このようなプロモーターは、誘導性でも構成性でもよい。このようなプロモーターは、ＳＶ４０早期プロモーター領域（BernoistおよびChambon, Nature 290: 304-310, 1981年）、ラウス肉腫ウイルスの３末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamoto,他, Cell 22: 787-797, 1980年）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445, 1961年）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinster他、Nature 296: 39-42, 1982年）などを含み、またこれらに限定されない。いかなる種類のプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターも、組織サイトに直接導入可能な組換えＤＮＡ構成の調製に使用できる。あるいは、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターを使用することができ、この場合別の経路による投与（例えば全身投与）を行う。標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物を触媒分割するように設計されたリボザイム分子も、標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を防止し、よって標的遺伝子産物の発現を防止するために使用するこができる（例えば、1990年10月4日公開のＰＣＴ国際出願公開WO90/11364; Sarver他、Science 247: 1222-1225, 1990年参照）。
【０３４７】
リボザイムはＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。（Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)参照。リボザイム活性のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断を含む。リボザイム分子の組成物は標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な一以上の配列を含み、ｍＲＮＡ切断ぬ応答可能な既知の触媒配列を含むはずである。この様な配列については米国特許第5,093,246号を参照のこと。この文献は開示によってここにその全体を取り込むものとする。
【０３４８】
特異的な認識部位でmＲＮＡを切断するリボザイムは標的遺伝子mＲＮＡを破壊するために使用可能であるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的mＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置でmＲＮＡを切断する。唯一の条件は、標的mＲＮＡは以下の２塩基配列：5'-UG-3'を持つことである。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び生産は当該技術分野においてよく知られており、その全体としてここに文献により取り込まれているMyers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, （特に、833ページの図４を参照のこと(1995)、並びにHaseloff及びGerlach, 1988, Nature, 334:585-591 (1988)により詳細に記載されている。
【０３４９】
好ましくはリボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子mＲＮＡの5'末端近くに位置するように、即ち、効率を増大し、非機能的なmＲＮＡ転写の細胞内蓄積を最小にするために加工される。
【０３５０】
また、本発明のリボザイムは、テトラヒメナ  サーモフィラ（IVS、又はL-19 IVSＲＮＡとして知られる）中で天然に産生され、Thomas Cech及び共同研究者（Zaug等, 1984, Science, 224:574-578；Zaug及びCech, 1986, Science, 231:470-475；Zaug等, 1986, Nature, 324:429-433；University Patents Inc.による、公開された国際特許出願番号WO88/04300；Been及びCech, 1986, Cell, 47:207-216）により広範に記述されてきたＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（「Cech-タイプリボザイム」と後述される）も含む。Cech-タイプリボザイムは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズした後、標的ＲＮＡの切断が生じる８塩基対の活性部位を持つ。本発明は標的遺伝子中に存在する８塩基対の活性配列を標的とするこれらCech-タイプリボザイムを包含する。
【０３５１】
アンチセンスのアプローチにおいて、リボザイムは、修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、改善された安定、標的化などのために）で構成され、インビボで標的遺伝子を発現する細胞へ送達される。送達の好ましい方法は、形質移入された細胞が、内在性の標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生産するように、強力で構成的なpol III又はpol IIプロモーターのコントロール下において、リボザイムを「コードする」ＤＮＡコンストラクトを用いることを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒的であるため、低い細胞内濃度が効率化のために要求される。
【０３５２】
内因性標的遺伝子の発現は、標的とする相同性組換えを使用して、標的遺伝子、またはそのプロモーターを非活性化、または「ノックアウト」することによっても減少させることができる（例えば、Smithies他、Nature 317: 230-234, 1985年; ThomasおよびCapecchi, Cell 51: 503-512, 1987年; Thompson他、Cell 5: 313-321, 1989年参照）。例えば、内因性標的遺伝子に相同性のＤＮＡによってはさまれた非機能的標的遺伝子（標的遺伝子のコード化領域または制御領域）である突然変異を、選択可能マーカーおよび／または非選択可能マーカーと共に、またはそれら無しで使用し、インビボで標的遺伝子を発現する細胞を形質移入することができる。標的とする相同性組換えによるＤＮＡ構成の挿入により、標的遺伝子は非活性化される。このようなアプローチは、ＥＳ（胚幹）細胞の修飾を使用することにより非活性標的遺伝子を持つ動物子孫を産むことが可能な農業の分野に特に適している（例えば、ThomasおよびCapecchi, 1987年、およびThompson, 1989年、上掲を参照）。しかしながら、適切なウイルスベクターを使用して組換えＤＮＡ構成が所望のインビボサイトに直接投与されるか、または向けられるのであれば、このアプローチをヒトに使用することも可能である。
【０３５３】
あるいは、標的遺伝子の制御領域（つまり、標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的し、体内の標的細胞中の標的遺伝子の転写を防ぐ三重らせん構造を形成することによっても、内因性標的遺伝子の発現を減少させることができる（概論は、Helene, Anticancer Drug Des., 6(6): 569-584, 1991年; Helene他、Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27-36, 1992年; およびMaher, Bioassays 14(12): 807-815, 1992年を参照）。
【０３５４】
転写防止のための三重らせん形成に使用される核酸分子は、一本鎖であり、且つデオキシヌクレオチドからなるものでなければならない。これらオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合則により三重らせん形成を促進するように設計される必要がある。この対合則は、一般に、二重鎖のうちの一本に存在するために、プリンまたはピリミジンの大きな伸張を必要とする。ヌクレオチド配列は、結果として得られる三重らせんに関連する３つの鎖に亘りＴＡＴおよびＣＧＣ＋を生じるピリミジン塩基でよい。高濃度のピリミジンを含む分子は、高プリン濃度を有する二重鎖のうちの一本鎖の領域に相補的な塩基を提供する。加えて、プリンの濃度が高い、例えばＧ残基の伸張を有する核酸分子を選択することができる。これら分子は、ＧＣ対の豊富なＤＮＡデュプレックスを有する三重らせんを形成する。このような三重らせんでは、プリン残基の多くは標的デュプレックスの一本鎖に位置し、よってトリプレックスの３つの鎖にＧＧＣトリプレットが生じる。
【０３５５】
あるいは、三重らせん形成のために標的とされる可能性のある配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を創造することにより増加させることができる。スイッチバック分子は、５’−３’、３’−５’を交互に行うことにより合成され、その結果、それらの塩基対は、最初はデュプレックスの一方を有し、次は他方を有すことになり、デュプレックスの一鎖に存在するためにプリンまたはピリミジンの伸張を必要とすることは無くなる。
【０３５６】
突然変異遺伝子発現を抑制するために、アンチセンス、リボザイム、および／または三重らせん分子を利用する技術は、正常な標的遺伝子の対立遺伝子により生成されるｍＲＮＡの転写（三重らせん）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を非常に効率よく低減まてたは抑制できるので、存在する正常標的遺伝子産物の濃度を正常表現型に必要な量よりも低くできるという可能性が生じる。したがって、このような場合、遺伝子活性の正常レベルを確実に維持するために、以下に記載するような、使用されるアンチセンス、リボザイム、または三重らせんの影響を受ける配列を含まない遺伝子療法により、正常な標的遺伝子の活性を示す標的遺伝子のポリペプチドをコード化および発現する核酸分子を細胞に導入してもよい。あるいは、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコード化する場合、標的遺伝子活性に必須のレベルを維持するために、正常標的遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましい。
【０３５７】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および三重らせん分子は、上述のように、当技術分野で知られているいずれのＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成方法によっても調製できる。これらには、当事業分野において周知の、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術、例えば固体相ホスホラミダイト化学合成などを含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子をコード化するＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によりＲＮＡ分子を生成してもよい。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６モリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む多種多様なベクターに包含される。あるいは、使用するプロモーターに応じて、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成を細胞系に適切に導入することが可能である。
【０３５８】
（ｂ）遺伝子置換療法
ここに開示するＮＳ４遺伝子核酸を、肥満、悪液質および摂食障害を含む哺乳類体重異常の治療に利用することができる。そのような治療は遺伝子置換療法の形態を取ることができる。特に、正常なＮＳ４遺伝子機能を示すＮＳ４遺伝子産物の生成を促す正常ＮＳ４遺伝子またはＮＳ４遺伝子の一部の１以上の複写を、それらに限定されないが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスベクター、ならびに細胞内へＤＮＡを導入するリポゾームなどのその他分子を含むベクターを使用して、患者の適切な細胞に挿入することができる。
【０３５９】
ＮＳ４遺伝子は脳内に発現するので、このような遺伝子置換療法技術は、患者のこのような種類の細胞にＮＳ４遺伝子配列を供給することができる。このように、一実施形態では、当技術分野において周知の技術（例えば、1988年4月25日公開のPCT出願公開WO89/10134を参照）を使用して、ＮＳ４遺伝子配列が血液脳関門を通過し、配列を脳内細胞に供給することができる。血液脳関門を通過することができる供給に関しては、例えば上述のようなウイルスベクターが好ましい。
【０３６０】
別の実施形態では、供給のための技術は、ＮＳ４遺伝子配列が発現する細胞のサイトにこのようなＮＳ４遺伝子配列を直接投与することを伴う。
【０３６１】
ＮＳ４遺伝子発現および／またはＮＳ４遺伝子産物活性の全体的レベルを上昇させるために使用できるその他の方法には、異質ＤＮＡ制御エレメントを挿入し、挿入した制御エレメントが問題の内因性ＮＳ４遺伝子と作用的にリンクすることにより、細胞または微生物内の内因性ＮＳ４遺伝子の発現の特徴を修正するため、標的相同性組換え方法を使用することを含む。このように、標的とする相同組換えは、「転写的に沈黙の」（つまり、通常は発現しない）内因性ＮＳ４遺伝子の転写を活性化するため、または通常発現する内因性ＮＳ４遺伝子の発現を亢進するために使用される。
【０３６２】
さらに、適切なＮＳ４発現細胞、好ましくは自己細胞を、体重異常の症状を改善するのに十分な位置および数で、患者に導入することにより、ＮＳ４遺伝子発現および／またはＮＳ４遺伝子産物活性の全体的なレベルを上昇させることができる。このような細胞は組換え細胞でもそうでなくともよい。
【０３６３】
患者のＮＳ４遺伝子発現の全体的なレベルを上昇させるために投与できる細胞には、ＮＳ４遺伝子を発現する正常細胞、好ましくは脳細胞がある。あるいは、細胞、好ましくは自己細胞をＮＳ４遺伝子配列を発現するように加工し、それを体重異常の症状の改善に好ましい位置で患者に導入することができる。あるいは、無傷のＮＳ４遺伝子を発現するＭＨＣ一致個体由来の細胞を利用することができ、それは例えば脳細胞を含む。ＮＳ４遺伝子配列の発現は、適切な遺伝子の制御配列によって管理することにより、必要な細胞型で発現させることができる。このような遺伝子制御配列は当業者に周知である。このような細胞ベース遺伝子療法技術は当技術分野で周知である（例えば米国特許第5,399,349号参照）。非自己細胞に細胞を投与するとき、投与には、導入する細胞に対する宿主の免疫反応防ぐ周知の技術を使用することができる。例えば、細胞外環境との直接的な成分交換が可能である一方、導入細胞が宿主の免疫系に認識されることのない密封形式で細胞を導入することができる。
【０３６４】
加えて、本明細書に開示する技術により同定されるような、ＮＳ４遺伝子産物の活性を変調させることができる化合物は、当技術分野において周知の標準的技術を使用して投与することもできる。投与される化合物が脳細胞との相互作用を伴う場合には、投与技術は、血液脳関門を通過させる周知の技術を含む。
【０３６５】
本明細書中で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０３６６】
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【実施例１】
【０３６７】
ヒトＮＳ４をコードするcＤＮＡクローンの単離（ＤＮＡ１４９９８６−２８８３およびＤＮＡ１４４９９９５−２８７１）
（シグナル配列を持たない）ＯＰＧリガンドをコードする配列（アミノ酸６９−３１７；Anderson他、Nature, 390: 175, 1997年）を、配列データベースの検索に使用した。データベースは、公的データベース（例えば、GenBank）含んでいた。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２[Altschul他、Methods in Enzymology, 266: 460-480, 1996年]を使用して行われ、その結果ゲノム配列（ＡＣ０１０９６９）が同定された。このゲノムＤＮＡ配列を、スタンフォード大学からライセンスされた遺伝子予測プログラムGENSCANを用いて分析した。GENSCAN分析は、潜在的なオープンリーディングフレームを持つＤＮＡ配列を作成する遺伝子のコーディング領域を予測する。ゲノムＤＮＡ配列ＡＣ０１０９６９のヌクレオチド６４０７０−６４２４３に対する一致を示すコンセンサスＤＮＡ配列を構築した（ＤＮＡ１４３７４６）。翻訳されたリーディングフレームにおいて、ＤＮＡ１４３７４６は、ＯＰＧリガンドに対して約６０％のアミノ酸配列の同一性を示す５７の接在残基の領域を含む。
【０３６８】
コンセンサス配列に基づき、１）PCRにより対象とする配列を含むcＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）PROの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるためにオリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100-1000 bp長のPCR産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に40-55bp長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約1-1.5kbpより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, 上掲のように、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
【０３６９】
PCRプライマー（正方向と逆方向）を合成した：
正方向PCRプライマー 5'-GATTGGGCAAACGTCTCCAACATGACT-3' (配列番号：７)
逆方向PCRプライマー 5'-TTGGTCATGTTTCCAAGAAGAAAGACTCGT-3' (配列番号：８)。
【０３７０】
更に、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを次のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ144306配列から構築した：
ハイブリダイゼーションプローブ 5'-CAGCAACGGAAAACTAAGAGTCAAAGGCATTTATTACCGGAATGCCGACATTTGCTCTCGA- 3' (配列番号：９)。
【０３７１】
ＤＮＡ１４９９８６−２８８３（配列番号２）およびＤＮＡ１４９９９５（配列番号３）の単離に用いたｃＤＮＡライブラリの構築のためのＲＮＡをヒト致死組織から単離した。５０の異なるヒトcＤＮＡライブラリーをプールし、ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１のクローニングに使用した。cＤＮＡクローンの単離に用いたcＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって構築した。cＤＮＡは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（pRK5B又はpRK5D等；pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【０３７２】
上記のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定は、完全長ポリペプチドＰＲＯ１９６５２、ＰＲＯ１９８１６およびＰＲＯ１９６５０をそれぞれコード化する、完全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１（配列番号１）、ＤＮＡ１４９９８６−２８８３（配列番号２）およびＤＮＡ１４９９９５−２８７１（配列番号３）を提供する。
【０３７３】
こうして同定された全長クローンは、ヌクレオチド位置４８６−４８８に明確な翻訳開始部位を有する一つのオープンリーディングフレームを、および、ヌクレオチド位置７４７−７４９に停止シグナルを含んでいた（図１、配列番号：１）。予想されるポリペプチド前駆体は、８７アミノ酸長であり、およそ９９５８ダルトンの算定分子量及びおよそ９．７０の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ１４９９８６−２８８３は、ヌクレオチド位置１７８４−１７８６に明らかな翻訳開始部位を有する一つのオープンリーディングフレームを、およびヌクレオチド位置２０６９−２０７１に停止シグナルを含んでいた（図２；配列番号：２）。予想されるポリペプチド前駆体は９５アミノ酸長であり、およそ１０７３４ダルトンの算定分子量およびおよそ１０．００の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ１４９９９５−２８７１は、ヌクレオチド位置４４７−４４９に明らかな翻訳開始部位を有する一つのオープンリーディングフレームを、およびヌクレオチド位置７３２−７３４に停止シグナルを含んでいた（図３；配列番号：３）。予想されるポリペプチド前駆体は９５アミノ酸長であり、およそ１０７０４ダルトンの算定分子量およびおよそ１０．００の推定ｐＩを有する。
【０３７４】
図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）それぞれ配列番号４、５および６）に示される完全長ポリペプチド配列の分析により、様々な重要ポリペプチドドメインの存在が図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）に示すように明らかであり、それら重要ポリペプチド領域の位置は概ね上述の通りである。
【０３７５】
ＰＲＯ１９６５０ポリペプチドとＰＲＯ１９８１６ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位５を除いて同一であり、ＰＲＯ１９６５０のアミノ酸位５はスレオニンが、ＰＲＯ１９８１６の同アミノ酸位はメチオニンが、それぞれ占めている。アミノ酸配列ＰＲＯ１９６５２は、ＰＲＯ１９６５０の短縮型変異体として現われ、該変異体はＣ末端が短く、残余する３Ｃ末端残基が異なっている。ポリペプチドの比較を図６に示す。
【０３７６】
クローンＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１、ＤＮＡ１４９９９５−２８７１およびＤＮＡ１４９９８６−２８８３は、２００１年５月１５日、２０００年５月３１日、および２０００年４月４日にそれぞれＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ３３７６、ＰＴＡ１９７１およびＰＴＡ１６２７をそれぞれ割り振られている。
【実施例２】
【０３７７】
ハイブリダーゼーションプローブとしてのＮＳ４の使用
以下の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのSRTをコードするヌクレオチド配列の使用について記述する。
【０３７８】
完全長又は成熟SRTのコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織cＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリー中において相同なＤＮＡ（SRTの天然に生じる変異体をコードするものなど）に関しスクリーニングするためのプローブとして用いられる。
【０３７９】
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高い緊縮性の条件下にて実施される。放射性標識化SRT由来のプローブのフィルターに対するハイブリダイゼーションは、50% ホルムアミド, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% ピロリン酸ナトリウム, 50mM リン酸ナトリウム, pH 6.8, 2x デンハード溶液及び10% 硫酸デキストランの溶液中、42℃で20時間実施される。フィルターの洗浄は0.1x SSC及び0.1% SDSの水溶液中にて42℃で実施される。
【０３８０】
全長天然配列SRTをコードするＤＮＡと望ましい配列同一性を有するＤＮＡは、その後、当該分野で既知の標準的な技術を用いて同定された。
【０３８１】
標準的ノーザンブロッティング技術（クローンテック社）を使用して、ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１（配列番号１）が図７（ａ）、７（ｂ）および７（ｃ）に報告されているような様々な組織、および図７（ｄ）に報告されているような様々な腫瘍細胞系に、発現を示すことが分かった。
【実施例３】
【０３８２】
大腸菌におけるＮＳ４の発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるＮＳ４の非グリコシル化型の調製を例証する。
【０３８３】
ＮＳ４をコードするＤＮＡ配列は選択されたPCRプライマーを利用して最初に増幅される。このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来;Bolivarら, Gene, 2:95 (1977)を参照のこと)がある。ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、PCR増幅配列がベクターにライゲーションされる。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、ＮＳ４コード化領域、ラムダ転写集結因子及びargU遺伝子をコードする配列を含む。
【０３８４】
次いで、Sambrookら, 上掲に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をLBプレート上でのその増殖能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、それを制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
【０３８５】
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたLBブロスのような液体培地で一晩かけて増殖させることができる。この一晩の培養を、引き続きより大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。細胞を所望の光学密度になるまで増殖させると、その間に発現プロモーターが作用し始める。
【０３８６】
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したＮＳ４タンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
【０３８７】
以下の手法を用いて、ポリ-Hisタグ形態でＮＳ４を大腸菌で発現させてもよい。ＮＳ４をコードするＤＮＡを選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、PCR増幅されたポリ-Hisタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中で、30℃で振盪しながら3-5のO.D.600に達するまで増殖させた。ついで培養液をCRAP培地(3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSO4の混合で調製)中にて50-100倍希釈し、30℃で振盪によって約20-30時間増殖させた。SDS-PAGE分析により発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。精製及びリフォールディングまで、細胞ペレットを凍結させた。
【０３８８】
0.5から1Lの発酵(6-10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をBeckman Ultracentifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3-5容量で希釈し、透明にするために0.22ミクロンフィルターを通して濾過した。透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む更なるバッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
【０３８９】
試料を20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50から100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールディング溶液を4℃で12-36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はTFAを最終濃度0.4%(約3のpH）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10%で添加した。再生したタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%TFAの移動バッファーと10から80%のアセトニトリル勾配での溶離を行うことでクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質形態は、これらの形態が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って折り畳まれたタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
【０３９０】
所望する折り畳みのＮＳ４ポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に調製した。
【実施例４】
【０３９１】
哺乳動物細胞におけるＮＳ４の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＮＳ４の調製を例証する。
【０３９２】
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP307,247参照）を用いた。場合によっては、ＮＳ４ ＤＮＡを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上記のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＮＳ４ ＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＮＳ４と呼ばれる。
【０３９３】
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞でもよい。ヒト293細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したDMEMなどの培地中で組織培養プレートにおいて増殖させて集密化した。約10μgのｐＲＫ５−ＮＳ４ ＤＮＡを約1μgのVA ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、500μlの1mM トリス-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2に溶解させた。この混合物に、500μlの50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4を一滴づつ添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加した。293細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
【０３９４】
形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は200μCi/ml35S-システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＮＳ４ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０３９５】
これに代わる技術において、ＮＳ４は、Somparyracら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に一過的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで増殖させ、700μgのｐＲＫ５−ＮＳ４ ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＮＳ４を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
【０３９６】
他の実施態様では、ＮＳ４をCHO細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＮＳ４は、CaPO4又はDEAE-デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は35S-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＮＳ４ポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＮＳ４を含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０３９７】
また、エピトープタグＮＳ４は、宿主CHO細胞において発現させてもよい。ＮＳ４はpRK5ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-hisタグＮＳ４挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで（上記のように）形質移入できる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-hisタグＮＳ４を含む培地は、次いで濃縮し、Ni2+-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【０３９８】
またＮＳ４は、一過性発現法によりCHO及び／又はCOS細胞で、あるいは他の安定な発現方法によりCHO細胞で発現させてもよい。
【０３９９】
CHO細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコーディング配列（例えば、細胞外ドメイン）がIgG1のヒンジ、CH2及びCH2ドメインを含む定常領域配列に融合した、及び／又はポリ-Hisタグ形態である、IgG構築物（イムノアドヘシン）として発現された。
【０４００】
PCR増幅に続いて、各ＤＮＡを、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングした。CHO発現ベクターは、対象とするＤＮＡの5'及び3'に適合する制限部位を有し、cＤＮＡの便利なシャトル化ができるように構築される。ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにCHO細胞での発現を用い、対象とするcＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）の発現の制御にSV40初期プロモーター／エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
【０４０１】
所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約1千万のCHO細胞に導入する。細胞は、上記のLucas等に記載されているように増殖させた。約3x10-7細胞を、下記のような更なる増殖及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【０４０２】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mLスピナーに分ける。1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。さらに2-3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x105細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1．2x106細胞／mLで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、30mLの500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤（例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）をとった。生産を通して、pHは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【０４０３】
ポリ-Hisタグ作成物について、タンパク質はNi-NTAカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes,pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムへ4-5ml/分の流速によって4℃でポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトール, pH6.8を含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、-80℃で貯蔵した。
【０４０４】
イムノアドヘシン（Fc含有）作成物を、以下の通りに条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー，pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）へポンプ注入した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μLの1Mトリスバッファー，pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルとエドマン（Edman）分解によるN-末端アミノ酸配列決定により評価した。
【実施例５】
【０４０５】
酵母菌でのＮＳ４の発現
以下の方法は、酵母菌中でのＮＳ４の組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのＮＳ４の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＮＳ４をコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＮＳ４の細胞内発現を指示する。分泌のために、ＮＳ４をコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＮＳ４シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＮＳ４の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
【０４０６】
酵母菌株AB110などの酵母菌株は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS-PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
【０４０７】
続いて組換えＮＳ４は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＮＳ４を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【実施例６】
【０４０８】
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＮＳ４の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＮＳ４の組換え発現を記載する。
【０４０９】
ＮＳ４をコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-hisタグ及び免疫グロブリンタグ（IgGのFc領域など）を含む。pVL1393（Novagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＮＳ４又はＮＳ４コード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、5'及び3'領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5'プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
【０４１０】
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Sf9」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０４１１】
次に、発現されたポリ-hisタグＮＳ４は、例えばNi2+-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出物は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製した。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mLのHepes, pH7.9;12.5mMのMgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP-40;0.4MのKCl）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を充填バッファー（50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ni2+-NTAアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mLの総容積で調製し、25 mLの水で洗浄し、25 mLの充填バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5 mLでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで充填バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMリン酸塩；300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0）で洗浄した。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、SDS-PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したNi2+-NTAでのウェスタンブロットで分析した。溶離したHis10-タグＮＳ４を含む画分をプールして充填バッファーで透析した。
【０４１２】
あるいは、IgGタグ（又はFcタグ）ＮＳ４の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【実施例７】
【０４１３】
ＮＳ４に結合する抗体の調製
この実施例は、ＮＳ４に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＮＳ４、ＮＳ４を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＮＳ４を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
【０４１４】
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したＮＳ４免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL-TDMアジュバント（Ribi Immunochemical Research, ハミルトン, モンタナ）に乳化し、動物の後フットパッドに注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＮＳ４抗体の検出のためのエライザアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０４１５】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＮＳ４静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（35%ポリエチレングリコールを用いて）、ATCCから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
【０４１６】
ハイブリドーマ細胞は、ＮＳ４に対する反応性についてのエライザでスクリーニングされる。ＮＳ４に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
【０４１７】
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗ＮＳ４モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで増殖させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【実施例８】
【０４１８】
特異的抗体を用いたＮＳ４ポリペプチドの精製
天然又は組換えＮＳ４ポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、pro-ＮＳ４ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はpre-ＮＳ４ポリペプチドは、対象とするＮＳ４ポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＮＳ４ポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
【０４１９】
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr-活性化セファロース（商品名）（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【０４２０】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＮＳ４ポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＮＳ４ポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、界面活性剤の添加又はこの分野で公知の方法により分画遠心法を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により得られる。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＮＳ４ポリペプチドは、細胞が増殖する培地中に有用な量で分泌される。
【０４２１】
可溶化ＮＳ４ポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＮＳ４ポリペプチドの好ましい吸着を可能ならしめる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＮＳ４ポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約2-3といった低pHバッファー、又は高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＮＳ４ポリペプチドが回収される。
【実施例９】
【０４２２】
薬物スクリーニング
本発明は、ＮＳ４ポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングにとって特に有用である。そのような試験に用いられるＮＳ４ポリペプチド又は断片は、溶液中に遊離した状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、ＮＳ４ポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、ＮＳ４ポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＮＳ４ポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
【０４２３】
従って、本発明は、ＮＳ４ポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で良く知られている手法により、その試薬をＮＳ４ポリペプチド又は断片に接触させ、(I)試薬とＮＳ４ポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)ＮＳ４ポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＮＳ４ポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、遊離なＮＳ４ポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、遊離又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＮＳ４ポリペプチドに結合する又はＮＳ４ポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０４２４】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についてのハイスループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＮＳ４ポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＮＳ４ポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＮＳ４ポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＮＳ４ポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
【０４２５】
また、本発明は、ＮＳ４ポリペプチドに結合可能な中和抗体がＮＳ４ポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＮＳ４ポリペプチドで、１つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【実施例１０】
【０４２６】
合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物活性ポリペプチド（例えば、ＮＳ４ポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＮＳ４ポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＮＳ４ポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
【０４２７】
１つの方法において、ＮＳ４ポリペプチド、又はＮＳ４ポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ-線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＮＳ４ポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＮＳ４ポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＮＳ４ポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthaudaら,J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０４２８】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
【０４２９】
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のＮＳ４ポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したＮＳ４ポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【実施例１１】
【０４３０】
ＮＳ４トランスジェニックマウスにおける体重、レプチンレベル、食物摂取、尿生産、酸素消費、ならびにトリグリセリドおよび遊離脂肪酸レベルの調査
ＮＳ４をコードする１つのオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片をＰＣＲを使用して増幅し、制限酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶをしよして切断した。次にＤＮＡをゲル精製し、事前に同一酵素で消化した発現ベクターに結合した。
【０４３１】
次に、ヒトＮＳ４をコードするｃＤＮＡを、ミオシンＬ鎖（ＭＬＣ）を含むプラスミドにクローン化した。このプロモーターの量は、導入遺伝子の筋肉に特異的な転写に十分であった。発現レベルを上げるため、スプライスアクセプターおよびスプライスドナーも５’ＮＳ４  ｃＤＮＡに含めることができる。さらに、スプライスドナーおよびスプライスアクセプターはまた、発現レベルを増大させるために、５’末端でＮＳ４  ｃＤＮＡに結合できる。さらに、ポリＡ追加信号を有するスプライスドナーおよびスプライスアクセプターはまた、転写レベルを増大させ、且つ転写末端サイトを提供するために、３’末端でＮＳ４  ｃＤＮＡに結合できる。
【０４３２】
ＭＬＣプロモーターを包含するＤＮＡ、５’末端スプライスアクセプターおよびドナー、ＮＳ４  ｃＤＮＡおよび３’末端スプライスアクセプターおよびドナー、ならびに転写末端サイト（導入遺伝子）を、適切な制限酵素を使用して細菌ベクターから放出し、アガロースゲル上のサイズ分画に従って精製した。精製したＤＮＡをマウスの受精卵の前核に注入し、先述のようにトランスジェニックマウスを産出し、精製した（Tim Stewart, “Genetic Modification of Animals”, Exploring Gnentic Mechanisms, 565-598頁、1997年、編集M SingerおよびP Berg; University Science Books; カリフォルニア州Sausalito）。特に断らない限り、マウスは温度と湿度が管理された環境において標準的な実験飼料で維持した。標準的実験飼料は、Ｐｕｒｉｎａ５０１０（Harlen Teklab, ウィスコンシン州マディソン）であった。後述の高脂肪（５８％ｋＪ脂肪）および低脂肪（１０．５％ｋＪ脂肪）の等カロリーの食餌は、Surwitらによる食餌（Surwit, R.S.他、Metabolism: Clinical & Experimental 44, 645-651, 1995年）に基づくもので、リサーチダイエット社（ニュージャージー州ニューブランズウィック）から購入した。12時間（午後６時／午前６時）の照明周期を使用した。NS4トランスジェニックマウスの歳が８ヶ月になった後、同齢の非トランスジェニックマウスと共にｐＤＥＸＡ  Ｓａｂｒｅ  Ｘ線骨デンシトメーター（Norland Medical Systems, Inc.）を使用して分析した。マウスは６−８分間麻酔した（anethetize）。非トランスジェニック対照群と比較すると、ＮＳ４トランスジェニックマウスの総体重または脂肪含有量（体重に対する割合（％））における減少が明らかで、体重異常に対する有用性を示していた。
【０４３３】
加えて、（酸素消費率によって証明される）食物摂取および代謝率を増加させた場合の影響も測定した。体重減少と食物摂取増大が共に見られ、一般的に脂肪過多症レベルの低下が示された。さらに、食物摂取と尿生産が共に増大し、水の摂取量に増加が見られないことから、代謝の増大が示された。
【０４３４】
肥満、およびトリグリセリドと遊離脂肪酸の上昇は心臓血管系の疾病の危険因子である。ＮＳ４がトリグリセリドまたは遊離脂肪酸のレベルを低下させることができるかどうか調査した。
【０４３５】
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（アメリカ合衆国、２０１１０−２２０９、バージニア州マナッサス、ユニバーシティ・ブルバード１０８０１）（ＡＴＣＣ）へ寄託した：
材料                  ATCC登録番号         寄託日
ＤＮＡ146649-1789R1      PTA-3376              2001年5月15日
ＤＮＡ149986-2883        PTA-1627              2000年4月4日
ＤＮＡ149995-2871        PTA-1971              2000年5月31日
【０４３６】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０４３７】
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死滅もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０４３８】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０４３９】
【図１】図１は、天然配列ＮＳ４コード化ポリヌクレオチドを示し、本明細書で「ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１」と呼ぶ天然配列ＮＳ４のコード化配列（ヌクレオチド４８６−７４６）を含むcＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、天然配列ＮＳ４コード化ポリヌクレオチドを示し、本明細書で「ＤＮＡ１４９９８６−２８８３」と呼ぶ天然配列ＮＳ４のコード化配列（ヌクレオチド１７８４−２０６８）を含むcＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、天然配列ＮＳ４コード化ポリヌクレオチドを示し、本明細書で「ＤＮＡ１４９９９５−２８７１」と呼ぶ天然配列ＮＳ４のコード化配列（ヌクレオチド４４７−７３１）を含むcＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図４】図４（ａ）ないし（ｃ）は、配列番号１、２および３からそれぞれ得られた天然配列ＮＳ４ポリペプチドの各アミノ酸配列（配列番号４、５および６）と、その他複数の重要ポリペプチドドメインの凡その位置を示す。
【図５】図５（ａ）はＮＳ４（ＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１）トランスジェニックマウスの体重が非トランスジェニック同腹子より小さいことを、図５（ｂ）はトランスジェニックマウスの総体重に占める脂肪の割合が非トランスジェニック同腹子より小さいことを、図５（ｃ）はトランスジェニックマウスの総体重に占める除脂肪体重の割合が非トランスジェニック同腹子より大きいことを、それぞれ示している。
【図６】図６は、天然配列ＮＳ４ポリペプチドＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１（配列番号１）、ＤＮＡ１４９９８６−２８８３（配列番号２）およびＤＮＡ１４９９９５−２８７１（配列番号３）によりコード化されたポリペプチドの比較を示す。
【図７】図７は、複数種のヒト組織ライブラリへのハイブリダイゼーションを示すＤＮＡ１４６６４９−１７８９Ｒ１（配列番号１）のノーザンブロットであり、図７（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は提示された複数種の組織中の発現レベルを示しており、図７（ｄ）は腫瘍細胞系における発現を示している。左から右へ、ＨＬ−６０（前骨髄球性白血病）、Ｈｅｌａ  Ｓ３（子宮頚部上皮悪性腫瘍）、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）、ＭＯＬＴ−４（リンパ芽球性白血病）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、ＳＷ４８０（結腸直腸腺癌）、Ａ５４９（肺悪性腫瘍）およびＧ３６１（黒色腫）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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