(57)【要約】本発明は、１、２、３および４血清型デング熱ウイルス又は１、２、３および４血清型の抗原性キメラデング熱ウイルスのゲノムの３’非翻訳領域において３０ヌクレオチド欠失（Δ３０）を共通に含有するデング熱ウイルス四価ワクチンに関する。
2005532044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
四価であり、第１のデング熱ウイルスからの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列および第２のデング熱ウイルスからの非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸を含む１，２，３，４型デングの３’非翻訳領域に３０塩基欠失を共通して含む、免疫原性組成物であって、前記第２のデング熱ウイルスが、ＴＬ２ステム−ループ構造に対応する３’非翻訳領域からの約３０ヌクレオチドが欠失することにより弱毒化された免疫原性組成物。
【請求項２】
前記核酸が、ベロ細胞又はヒト肝細胞株ＨｕＨ−７における温度感受性、蚊細胞又はヒト肝細胞株ＨｕＨ−７における宿主細胞制限、ベロ細胞における複製改善のための宿主細胞適応、又はマウス又はサルにおける弱毒化のいずれかの表現型を有する突然変異体を産生する突然変異をさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が前記第２のデング熱ウイルスの血清型と同じである請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
前記血清型が１型である請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記欠失がおよそヌクレオチド１０５６２〜１０５９１間のＴＬ２ステム−ループ構造に対応する前記デング熱１型ゲノムの３’非翻訳領域からの約３０ヌクレオチドの欠失である請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記血清型が２型である請求項３記載の組成物。
【請求項７】
前記欠失がおよそヌクレオチド１０５４１〜１０５７０間のＴＬ２ステム−ループ構造に対応する前記デング熱２型ゲノムの３’非翻訳領域からの約３０ヌクレオチドの欠失である請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記血清型が３型である請求項３記載の組成物。
【請求項９】
前記欠失がおよそヌクレオチド１０５３５〜１０５６５間のＴＬ２ステム−ループ構造に対応する前記デング熱３型ゲノムの３’非翻訳領域からの約３０ヌクレオチドの欠失である請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記血清型が４型である請求項３記載の組成物。
【請求項１１】
前記欠失がおよそヌクレオチド１０４７８〜１０５０７間のＴＬ２ステム−ループ構造に対応する前記デング熱４型ゲノムの３’非翻訳領域からの約３０ヌクレオチドの欠失である請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が前記第２のデング熱ウイルスの血清型と異なり、そして核酸が核酸キメラである請求項１又は２記載の組成物。
【請求項１３】
前記欠失を有する前記第２のデング熱ウイルスの血清型が１型である請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が２型である請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が３型である請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が４型である請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１のヌクレオチド配列が前記第１のデング熱ウイルスの少なくとも２つの構造タンパク質をコードする請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記構造タンパク質がｐｒＭおよびＥタンパク質である請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記欠失がおよそヌクレオチド１０５６２〜１０５９１間のＴＬ２ステム−ループ構造に対応する前記デング熱１型ゲノムの３’非翻訳領域からの約３０ヌクレオチドの欠失である請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記欠失を有する前記第２のデング熱ウイルスの血清型が２型である請求項１２記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が１型である請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が３型である請求項２０記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が４型である請求項２０記載の組成物。
【請求項２４】
前記第１のヌクレオチド配列が前記第１のデング熱ウイルスの少なくとも２つの構造タンパク質をコードする請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記構造タンパク質がｐｒＭおよびＥタンパク質である請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
前記欠失がおよそヌクレオチド１０５４１〜１０５７０間のＴＬ２ステム−ループ構造に対応する前記デング熱２型ゲノムの３’非翻訳領域からの約３０ヌクレオチドの欠失である請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記欠失を有する第２のデング熱ウイルスの血清型が３型である請求項１２記載の組成物。
【請求項２８】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が１型である請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が２型である請求項２７記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が４型である請求項２７記載の組成物。
【請求項３１】
前記第１のヌクレオチド配列が前記第１のデング熱ウイルスの少なくとも２つの構造タンパク質をコードする請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記構造タンパク質がｐｒＭおよびＥタンパク質である請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
前記欠失がおよそヌクレオチド１０５３５〜１０５６５間のＴＬ２ステム−ループ構造に対応する前記デング熱３型ゲノムの３’非翻訳領域からの約３０ヌクレオチドの欠失である請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記欠失を有する第２のデング熱ウイルスの血清型が４型である請求項１２記載の組成物。
【請求項３５】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が１型である請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が２型である請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
前記第１のデング熱ウイルスの血清型が３型である請求項３４記載の組成物。
【請求項３８】
前記第１のヌクレオチド配列が前記第１のデング熱ウイルスの少なくとも２つの構造タンパク質をコードする請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記構造タンパク質がｐｒＭおよびＥタンパク質である請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
前記欠失がおよそヌクレオチド１０４７８〜１０５０７間のＴＬ２ステム−ループ構造に対応する前記デング熱４型ゲノムの３’非翻訳領域からの約３０ヌクレオチドの欠失である請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
１つ又は複数の核酸又は核酸キメラがウイルス又はウイルスキメラを含む請求項１〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
免疫応答の誘導に用いるための請求項１〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
被験者における免疫応答の誘導方法であって、有効量の請求項１〜４１のいずれか１項に記載の組成物を被験者に投与することを包含する免疫応答の誘導方法。
【請求項４４】
前記被験者がヒトである請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の組成物を含む四価ワクチン。
【請求項４６】
デング熱ウイルスにより引き起こされる疾患の予防に用いられるための請求項４５記載のワクチン。
【請求項４７】
被験者におけるデング熱ウイルスにより引き起こされる疾患の予防方法であって、有効量の請求項４５記載のワクチンを前記被験者に投与することを包含する予防方法。
【請求項４８】
前記被験者がヒトである請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
請求項１８、２５、３２又は３９記載の組成物を含む核酸キメラのキャプシドタンパク質および前膜タンパク質を分離する切断部位をコードする核酸と相補的な少なくとも５ヌクレオチド又は該ヌクレオチドの相補鎖を有し、前記核酸と選択的にハイブリダイズするプローブ又はプライマー。
【請求項５０】
ベロ細胞又はヒト肝細胞株ＨｕＨ−７における温度感受性、蚊細胞又はヒト肝細胞株ＨｕＨ−７における宿主細胞制限、ベロ細胞における複製改善のための宿主細胞適応、又はマウス又はサルにおける弱毒化からなる群から選択される突然変異を任意に含む組成物であって、以下のものからなる群から選択される核酸を含む組成物：
（１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（３０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（３１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（３２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（３３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（３４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（３５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（３６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（３７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（３８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（３９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（４０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（４１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（４２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（４３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（４４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（４５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（４６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（４７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（４８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（４９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（５０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（５１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（５２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（５３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（５４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（５５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（５６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（５７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（５８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（５９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（６０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（６１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（６２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（６３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（６４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（６５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（６６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（６７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（６８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（６９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（７０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（７１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（７２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（７３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（７４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（７５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（７６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（７７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（７８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（７９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（８０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（８１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（８２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（８３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（８４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（８５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（８６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（８７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（８８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（８９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（９０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（９１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（９２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（９３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（９４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（９５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（９６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（９７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（９８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（９９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１００）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１０１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１０２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１０３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１０４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１０５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１０６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１０７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１０８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１０９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１１０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１１１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１１２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１１３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１１４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１１５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１１６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１１７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１１８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１１９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１２０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１２１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１２２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１２３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１２４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１２５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１２６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１２７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１２８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１２９）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１３０）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１３１）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１３２）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１３３）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１３４）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１３５）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１３６）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１３７）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１３８）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１３９）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１４０）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１４１）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１４２）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１４３）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１４４）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１４５）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１４６）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１４７）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１４８）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１４９）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１５０）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１５１）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１５２）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１５３）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１５４）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１５５）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１５６）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１５７）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１５８）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１５９）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１６０）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１６１）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１６２）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１６３）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１６４）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１６５）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
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（１６７）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１６８）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１６９）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１７０）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１７１）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１７２）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１７３）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１７４）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１７５）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１７６）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１７７）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１７８）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１７９）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１８０）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１８１）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１８２）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１８３）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１８４）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１８５）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１８６）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１８７）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１８８）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１８９）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１９０）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１９１）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１９２）ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１９３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１９４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１９５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（１９６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（１９７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（１９８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（１９９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２００）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２０１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２０２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２０３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２０４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２０５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２０６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２０７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２０８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２０９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２１０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２１１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２１２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２１３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２１４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２１５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２１６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２１７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２１８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２１９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２２０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２２１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２２２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２２３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２２４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２２５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２２６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２２７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２２８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２２９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２３０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２３１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２３２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２３３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２３４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２３５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２３６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２３７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２３８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２３９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２４０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２４１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２４２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２４３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２４４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２４５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２４６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２４７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２４８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２４９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２５０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２５１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、
（２５２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、
（２５３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、
（２５４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、
（２５５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、および
（２５６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、１、２、３および４血清型デング熱ウイルス又は１、２、３および４血清型の抗原性キメラデング熱ウイルスのゲノムの３’非翻訳領域における共通３０ヌクレオチド欠失（Δ３０）を含有するデング熱ウイルス四価ワクチンに関する。
【０００２】
［発明の背景］
デング熱ウイルスは、フラビウイルス科フラビウイルス属に属する陽性センスＲＮＡウイルスである。デング熱ウイルスは、世界の熱帯および亜熱帯地域全体に広範に分布し、媒介動物である蚊によりヒトに伝染する。デング熱ウイルスは、少なくとも８つの熱帯アジア諸国における小児の入院および死亡の主因である（ＷＨＯ 1997 Dengue Haemorrhagic Fever: Diagnosis, Treatment, Prevention, and Control 2nd Edition, Geneva）。概算で年間５０００万〜１億例のデング熱、ならびに５００，０００例のデング出血熱／デング熱ショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）として既知のデング熱ウイルス感染のより重度の症例を引き起こす４つの血清型のデング熱ウイルス（ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４）が存在する（Gubler, D.J. and Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53: 35-70）。この後者の疾患は、第１のデング熱ウイルス感染とは異なる血清型を有する第２のデング熱ウイルス感染を経験している小児および成人において、ならびに循環デング熱特異的母性抗体を未だ有する乳児の初感染において主に観察される（Burke, D.S. et al.
1988 Am J Trop Med Hyg 38: 172-180; Halstead, S.B. et al. 1969 Am J Trop Med Hyg 18: 997-1021; Thein, S. et al. 1997 Am J Trop Med Hyg 56: 566-575）。デング熱ワクチンは、デング熱ウイルスにより引き起こされる疾患の症状を軽減するために必要とされるが、認可されたものはない。より重症な疾患と第２のデング熱ウイルス感染のためには、首尾よいワクチンが４つの血清型全てに対する免疫を同時に誘導しなければならない。免疫は主として、ビリオン構造タンパク質であるエンベロープ（Ｅ）糖タンパク質に対する中和抗体により媒介される。ある血清型による感染は、長期持続性ホモタイプ免疫および短期持続性へテロタイプ免疫を誘導する（Sabin, A. 1955 Am J Trop Med Hyg 4: 198-207）。したがって免疫感作の目標は、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４に対する長期持続性中和抗体応答を誘導することであり、これは生弱毒化ウイルスワクチンを用いることにより経済的に最良に達成され得る。世界の熱帯および亜熱帯地域に存在する別の蚊媒介性フラビウイルスである近縁の黄熱病ウイルスに対して生弱毒化ワクチンがすでに開発されているため、これは合理的な目標である（Monath, T.P. and Heinz, F.X. 1996 in: Fields Virology, Fields, D.M. et al. eds. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, pp. 961-1034）。
【０００３】
いくつかの生弱毒化デング熱ワクチン候補が開発され、ヒトおよび非ヒト霊長類において評価されてきた。最初の生弱毒化デング熱ワクチン候補は、マウスの脳における野生型デング熱ウイルスの連続継代とヒトに対して弱毒化された突然変異体を選択することにより開発された宿主域突然変異体であった（Kimura, R. and Hotta, S. 1994 Jpn J Bacteriol 1: 96-99; Sabin, A.B. and Schlesinger, R.W. 1945 Science 101: 640; Wisserman, C.L. et al. 1963 Am J Trop Med Hyg 12: 620-623）。これらの候補ワクチンウイルスはヒトにおいて免疫原性であったが、細胞培養におけるそれらの不十分な成長がさらなる開発を思いとどまらせた。さらなる生弱毒化ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４ワクチン候補は、非ヒト組織培養における連続継代（Angsubhakorn, S. et al. 1994 Southeast Asian J Trop Med Public Health 25: 554-559; Bancroft, W.H. et al. 1981 
Infect Immun 31: 698-703; Bhamarapravati, N. et al. 1987 Bull World Health Organ
65: 189-195; Eckels, K.H. et al. 1984 Am J Trop Med Hyg 33: 684-698; Hoke, C.H.
Jr. et al. 1990 Am J Trop Med Hyg 43: 219-226; Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19: 3179-3188）により、又は化学的突然変異誘発（McKee, K.T. et al. 1987 Am J Trop Med Hyg 36: 435-442）により開発されてきた。これらのアプローチを用いてデング熱ウイルスの４つの血清型の各々に関して弱毒化と免疫原性間の申し分ない平衡を達成し、さらに４つのデング熱ウイルスの各々が安全でかつ申し分ない免疫原性である四価ワクチンを処方することは非常に難しいことが判明した（Kanesa-Thasan, N. et al. 2001 Vaccine 19: 3179-3188; Bhamarapravati, N. and Sutee, Y. 2000 Vaccine 18: 44-47）。
【０００４】
組換えＤＮＡ技術を用いた２つの主要な進歩が、近年、さらなる見込みのある生弱毒化デング熱ウイルスワクチン候補を開発することを可能にした。第一に、デング熱ウイルスゲノムの全長ｃＤＮＡクローン由来のＲＮＡ転写物でトランスフェクトされた細胞から感染性デング熱ウイルスを回収する方法が開発され、これにより部位特異的突然変異誘発によりｃＤＮＡクローン中に導入された弱毒化突然変異を保有する感染性ウイルスを得ることが可能となった（Lai, C.J. et al. 1991 PNAS USA 88: 5139-5143）。第二に、デング熱ウイルスの全長ｃＤＮＡクローンの構造タンパク質コード領域が、異なるデング熱ウイルス血清型又はより多岐にわたるフラビウイルスの領域により置換された抗原性キメラウイルスを産生することが可能である（Bray, M. and Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88: 10342-10346; Chen, W. et al. 1995 J Virol 69: 5186-5190; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74: 3020-3028; Pletnev, A.G. and Men, R. 1998 PNAS USA 95: 1746-1751）。これらの技法を用いて、同種デング熱ウイルス抗原誘発に対してサルを防御するのに有効であることが示された型間キメラデング熱ウイルスが構築された（Bray, M. et al. 1996 J Virol 70: 4162-4166）。同様の戦略は、黄熱病ワクチンウイルスの弱毒化又は細胞培養継代デング熱ウイルスの弱毒化に基づいた弱毒化抗原性キメラデング熱ウイルスワクチンを開発するためにも用いられる（Monath, T.P. et al. 1999 Vaccine 17: 1869-1882; Huang, C.Y. et al. 2000 J. Virol 74: 3020-3028）。
【０００５】
別の研究は、部位特異的突然変異誘発によりその３’非翻訳領域に導入された３０−ヌクレオチド欠失（Δ３０）を保有し、アカゲザルに対して弱毒化されることが既に見いだされているＤＥＮ４突然変異体のヒトに対する弱毒化のレベルを調べた（Men, R. et al.
1996 J Virol 70: 3930-3937）。ＤＥＮ４ワクチン候補中に存在するこのΔ３０突然変異がサルに対するその弱毒化の主要決定因子であるか否かを調べるために、さらなる研究が実行された。Δ３０突然変異は実際にサルに対する弱毒化の主要決定因子であり、それはヒトに関する弱毒化と免疫原性間の申し分ない平衡を特定するということが判明した（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）。
【０００６】
［発明の要約］
３’−ＵＴＲからの３０ヌクレオチドの除去により４型デング熱ウイルス（ＤＥＮ４）において作製され、既に同定されているΔ３０弱毒化突然変異は、１型デング熱ウイルス（ＤＥＮ１）の野生型株も弱毒化し得る。Δ３０突然変異を包含するＤＥＮ４の領域と相同である高度保存領域におけるＤＥＮ１  ３’−ＵＴＲからの３０ヌクレオチドの除去は、組換えウイルスＤＥＮ４Δ３０と同様のレベルにアカゲザルに対する弱毒化組換えウイルスを産生した。これは、ＤＥＮ４以外のデング熱ウイルス型へのΔ３０突然変異の導入およびその弱毒化表現型を確立する。本研究により記載されたΔ３０突然変異の有効な運搬能は、商品化可能な任意の血清型のデング熱ウイルスワクチンを弱毒化し、その安全性を改善するためのΔ３０突然変異の有用性を確立する。各々Δ３０突然変異により弱毒化された１、２、３および４型デング熱ウイルスを含有する四価デング熱ウイルスワクチンを、本発明者らは構想する。１、２および３型デング熱ウイルスの構造遺伝子がＤＥＮ４
Δ３０の構造遺伝子を置換し、１、２および４型の構造遺伝子がＤＥＮ３Δ３０の構造遺伝子を置換し、１，３および４型の構造遺伝子がＤＥＮ２Δ３０の構造遺伝子を置換し、又は２、３および４型の構造遺伝子がＤＥＮ１Δ３０の構造遺伝子を置換した組換え抗原性キメラウイルスを含有する四価デング熱ウイルスワクチンも本発明者らは構想する。いくつかの場合、このようなキメラデング熱ウイルスはΔ３０突然変異によるだけでなく、それらのキメラ性によっても弱毒化される。各ウイルス構成成分におけるΔ３０弱毒化突然変異の存在は、型間組換えによる野生型ウイルスへの逆戻りを妨げる。さらに欠失突然変異に固有な遺伝的安定性のため、Δ３０突然変異は四価ワクチンの各構成成分間に共有される共通突然変異として用いるための優れた置換物の代表である。
【０００７】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
序論
分子アプローチは、これにより、遺伝子的に安定な生育が弱化された四価デング熱ウイルスワクチンを開発するために用いられる。四価ワクチン、即ちＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４の各構成成分は、弱毒化され、遺伝子的に安定であり、さらに免疫原性でなければならない。四価ワクチンは、４つのデング熱ウイルスの各々に対する同時防御を保証するために必要であり、それにより異型野生型デング熱ウイルスによる二次感染中のヒトにおいて起こるさらに重篤な疾病であるデング出血熱／デングショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）を発症する可能性が排除される。デング熱ウイルスは自然界で遺伝子組換えを受け得るため（Worobey, M. et al. 1999 PNAS USA 96: 7352-7）、四価ワクチンは、弱毒化突然変異を欠くウイルスの生成を引き起こす可能性がある、４つのウイルス構成成分間の組換えを受けることが遺伝子的に不可能である必要がある。四価デング熱ウイルスワクチンを開発するための従来のアプローチは、別個の突然変異誘発性手法、例えば異種宿主由来の組織培養細胞における継代により４つのウイルス構成成分の各々を独立して得ることを基礎にしてきた。この戦略により、弱毒化ワクチン候補が得られた（Bhamarapravati, N. and Sutee, Y. 2000 Vaccine 18: 44-7）。しかしながら、これらの独立して得られた四価ワクチンの４つの構成成分間の遺伝子交換がワクチン接種者の体内で起こり、おそらくは有毒組換えウイルスが作製され得るという可能性がある。組換えから得られる有毒ポリオウイルスは、三価ポリオウイルスワクチンの投与後にワクチン接種者の体内で生成された（Guillot, S. et al. 2000 J Virol 74: 8434-43）。
【０００８】
本発明は、１）既に報告されているｒＤＥＮ４Δ３０ワクチン候補の改良、２）ｒＤＥＮ４Δ３０組換えウイルスにおけるものと相同である３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一区分中に３０ヌクレオチド欠失（Δ３０）を含有する弱毒化ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０およびｒＤＥＮ３Δ３０組換えウイルス、３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０およびｒＤＥＮ４Δ３０から成る四価デング熱ウイルスワクチンの生成方法、４）弱毒化抗原性キメラウイルス、即ちｒＤＥＮ４Δ３０のＣＭＥ、ＭＥ又はＥ遺伝子領域がＤＥＮ１、ＤＥＮ２又はＤＥＮ３由来のもので置換されたｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０およびｒＤＥＮ３／４Δ３０、又はｒＤＥＮ３Δ３０のＣＭＥ、ＭＥ又はＥ遺伝子領域がＤＥＮ１、２又は４由来のもので置換されたｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０およびｒＤＥＮ４／３Δ３０、又はｒＤＥＮ２Δ３０のＣＭＥ、ＭＥ又はＥ遺伝子領域がＤＥＮ１、３又は４由来のもので置換されたｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０およびｒＤＥＮ４／２Δ３０、又はｒＤＥＮ１Δ３０のＣＭＥ、ＭＥ又はＥ遺伝子領域がＤＥＮ２、３又は４由来のもので置換されたｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０およびｒＤＥＮ４／１Δ３０、ならびに５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０およびｒＤＥＮ４Δ３０、又はｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０およびｒＤＥＮ３Δ３０、又はｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０およびｒＤＥＮ２Δ３０、そして又はｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０およびｒＤＥＮ１Δ３０から成る四価デング熱ウイルスワクチンの生
成方法について記述する。これらの四価ワクチンは、ワクチンの各々の構成成分が同一Δ３０弱毒欠失突然変異を保有するためにワクチン中に有毒野生型ウイルスを生成する可能性を排除する共通弱毒化突然変異を共有している点で独特である。さらに、ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０四価ワクチンは、Δ３０突然変異の安定性と広範な抗原性とを組合わせた最初のワクチンである。Δ３０欠失突然変異が各ウイルスの３’ＵＴＲ中に存在するため、４つの構成成分ウイルスのタンパク質の全てが防御免疫応答を誘導するために利用可能である。したがって本方法は、各デング熱ウイルス血清型中に存在する構造および非構造タンパク質の全てに対する体液性および細胞性免疫応答を誘導する４つのウイルスのタンパク質各々の全能力を保った状態でＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４ウイルスのタンパク質の各々を保持する弱毒化のメカニズムを提供する。
【０００９】
先に記載されたように、ＤＥＮ４組換えウイルスｒＤＥＮ４Δ３０（以前は２ＡΔ３０と呼ばれた）は、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲ中に３０ヌクレオチド欠失を含有するよう工学処理された（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13; Men, R. et al. 1996 J Virol 70: 3930-7）。アカゲザルにおける評価は、野生型親ウイルスに比して十分に弱毒化されるが、依然として高免疫原性および完全防御性であるウイルスを示した。さらにまた成人ボランティアにおける第Ｉ相臨床試験は、ｒＤＥＮ４Δ３０組換えウイルスが安全かつ十分な免疫原性であることを示した（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）。非翻訳領域中に共有弱毒化突然変異を保有する四価ワクチンを開発するために、Δ３０突然変異は、アカゲザルに対して野生型ＤＥＮ４ウイルスを弱毒化し、ヒトにおいて安全であったため、血清型１、２および３の野生型デング熱ウイルスを弱毒化するためにΔ３０突然変異を本発明者らは選択した（図１）。
【００１０】
Δ３０突然変異は、ＤＥＮ４ウイルスにおいて最初に報告され、特性化された（Men, R. et al. 1996 J Virol 70: 3930-7）。ＤＥＮ４では、突然変異は、ＴＬ２と呼ばれる推定ステム−ループ構造を形成する３’ＵＴＲのヌクレオチド１０４７８〜１０５０７（図２Ａ）を構成する３０連続ヌクレオチドの除去からなる（Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25: 1194-202）。フラビウイルスにおいて、ＵＴＲの大部分は高度保存二次構造を構成する（Hahn, C.S. et al. 1987 J Mol Biol 198: 33-41; Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25: 1194-202）。個々のヌクレオチドがこれらの領域に必ずしも保存されているわけではないが、一次配列のみを考慮すると容易には識別できないものの、各血清中において適切な塩基対合がステム−ループ構造を保存している。（図２Ｂ、Ｃ）。
【００１１】
免疫原性デングキメラおよびそれらの調製方法
免疫原性デングキメラおよびデングキメラの調製方法が本明細書中で提供される。免疫原性デングキメラは、デング熱ウイルスによる感染を最小限にし、抑制し又は個体又は動物を免疫感作するための免疫原性組成物として薬学的に許容可能な担体中で、単独又は組合せて用いた場合に有用である。
【００１２】
本発明のキメラは、一血清型のデング熱ウイルスの免疫原性をコードするヌクレオチド配列、ならびにさらに異なる血清型のデング熱ウイルスの主鎖から選択されるヌクレオチド配列を含む。これらのキメラは、デング熱ウイルスに対する免疫原性応答を誘導するために用いられ得る。
【００１３】
別の実施形態では、好ましいキメラは、第１の血清型のデング熱ウイルスからの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ならびに第１のものとは異なる第２の血清型のデング熱ウイルスからの非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸キメラである。別の実施形態では、第２の血清型のデング熱ウ
イルスはＤＥＮ４である。別の実施形態では、構造タンパク質は第１の血清型のデング熱ウイルスのＣタンパク質、第１の血清型のデング熱ウイルスのｐｒＭタンパク質、第１の血清型のデング熱ウイルスのＥタンパク質又はそれらの任意の組合せであり得る。
【００１４】
「残基」という用語は、アミノ酸（Ｄ又はＬ）、又はアミド結合によりペプチド中に組入れられるアミノ酸模倣物を指すために本明細書中で用いられる。このようなものとして、アミノ酸は天然アミノ酸であり得るし、又は別記しない限り、天然アミノ酸と同様に機能する天然アミノ酸の既知の類似体（即ちアミノ酸模倣物）を包含し得る。さらにアミド結合模倣物は、当業者に既知のペプチド主鎖修飾を含む。
【００１５】
さらに、アミノ酸配列における個々の置換、欠失又は付加、又は、コード配列中の単一アミノ酸又は小パーセンテージ（典型的に５％未満、より典型的には１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させるような該アミノ酸をコードするヌクレオチド配列における個々の置換、欠失又は付加は、保存的修飾変異であって、この場合、変更は、化学的に類似のアミノ酸による一アミノ酸の置換を生じる、と当業者は認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で既知である。以下の６群の各々は、互いに関する保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００１６】
本明細書中に用いる場合、「ウイルスキメラ」、「キメラウイルス」、「デングキメラ」および「キメラデング熱ウイルス」という用語は、一血清型のデング熱ウイルスの免疫原性をコードするヌクレオチド配列、ならびにさらに異なる血清型のデング熱ウイルスの主鎖由来のヌクレオチド配列を含む本発明の感染性構築物を意味する。
【００１７】
本明細書中で用いる場合、「感染性構築物」は、細胞を感染させるために用いられ得るウイルス、ウイルス構築物、ウイルスキメラ、ウイルス由来の核酸又はその任意の部分を示す。
【００１８】
本明細書中で用いる場合、「核酸キメラ」とは、一血清型のデング熱ウイルスの免疫原性をコードするヌクレオチド配列、ならびにさらに異なる血清型のデング熱ウイルスの主鎖由来のヌクレオチド配列を含む核酸を含む本発明の構築物を意味する。同様に、本発明の任意のキメラウイルス又はウイルスキメラは、核酸キメラの一例と認識されるべきものである。
【００１９】
本発明の構造および非構造タンパク質は、完全タンパク質、タンパク質のエピトープ、又は、これらのうち例えばその３つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含む任意の断片を含むタンパク質又はそれをコードする遺伝子を包含すると理解されるべきである。
【００２０】
デングキメラ
デング熱ウイルスは、蚊媒介性フラビウイルス病原体である。デング熱ウイルスゲノムは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、続いてのキャプシドタンパク質（Ｃ）コード領域、続いて前膜／膜タンパク質（ｐｒＭ）コード領域、続いてエンベロープタンパク質（Ｅ）コード領域、続いて非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）をコードする領域、最後に３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含有す
る。ウイルス構造タンパク質はＣ、ｐｒＭおよびＥであり、非構造タンパク質はＮＳ１〜ＮＳ５である。構造および非構造タンパク質は、単一ポリタンパク質として翻訳され、そして細胞質およびウイルスのプロテアーゼによりプロセシングを受ける。
【００２１】
本発明のデングキメラは、一血清型、例えばＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３又はＤＥＮ４のデング熱ウイルスからの構造タンパク質遺伝子を、異なる血清型、例えばＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３又はＤＥＮ４のデング熱ウイルスからの非構造タンパク質遺伝子と融合することにより形成される構築物である。
【００２２】
本明細書中で提供される弱毒化免疫原性デングキメラは、免疫原性が付与されるべき一血清型のデング熱ウイルスの１つ又は複数の構造タンパク質遺伝子又はその抗原性部分、ならびに異なる血清型のデング熱ウイルスの非構造タンパク質遺伝子を含有する。
【００２３】
本発明のキメラは、１つの血清型のデングゲノムをバックボーンとして有し、そのデングゲノムのＣ、ｐｒＭ、Ｅタンパク質、またはそれらの組合せをコードする構造タンパク質遺伝子が、防御されるべき別の血清型のデング熱ウイルスからの対応する構造タンパク質遺伝子で置換されたものである。その結果生じるウイルスキメラは、別の血清型のデング熱ウイルスを用いてキメラ化されるという理由で、弱毒化という特性を有し、したがって毒性が低減されるが、構造遺伝子産物の抗原性エピトープを発現しているため免疫原性である。
【００２４】
任意のデング熱ウイルスのゲノムは、本明細書中に記載された弱毒化キメラにおける主鎖として用いられ得る。主鎖は、デング熱ウイルスの弱毒表現型に関与するか、又は製造のために用いられる細胞基質、例えばベロ細胞中での複製を促す突然変異を含有し得る。突然変異は、非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、５’非翻訳領域又は３’非翻訳領域中に存在し得る。主鎖は、弱毒表現型の安定性を保持するための、そして弱毒化ウイルス又はキメラが有毒野生型ウイルスに逆戻りする可能性を低減するための突然変異もさらに含有し得る。例えば３’非翻訳領域中の第１の突然変異および５’非翻訳領域中の第２の突然変異は、所望により、さらなる弱毒表現型安定性を提供する。特に塩基１０４７８〜１０５０７間のＤＥＮ４ゲノムの３’非翻訳領域からの３０塩基の欠失である突然変異は、ＤＥＮ４ウイルスの弱毒化を生じる（Men et al. 1996 J. Virology 70: 3930-3933; Durbin et al. 2001 Am J Trop Med 65: 405-413, 2001）。したがってこの遺伝子座にこのような突然変異を含有する任意のデング４型ウイルスのゲノムは、本明細書中に記載された弱毒化キメラ中のバックボーンとして用いられ得る。さらに、他のデング熱ウイルス血清型のゲノムの３’非翻訳領域中に類似欠失突然変異を含有する他のデング熱ウイルスゲノムも、本発明のバックボーン構造として用いられ得る。
【００２５】
このような突然変異は、当業者に既知の技法を用いた部位特異的突然変異誘発により達成され得る。有毒性スクリーニング検定は、本明細書中に記載され、そして当該技術分野で既知であるように、毒性と弱毒化のバックボーン構造間を区別するために用いることができると当業者に理解される。
【００２６】
デングキメラの構築
本明細書中に記載されたデング熱ウイルスキメラは、免疫原性が所望される一血清型のデング熱ウイルスの少なくとも１つの構造タンパク質遺伝子を、当業者に既知の組換え工学処理技法を用いて、異なる血清型のデング熱ウイルスゲノムバックボーンに置換することにより、即ち一血清型のデング熱ウイルス遺伝子を除去し、そしてそれを異なる血清型のデング熱ウイルスの所望の対応する遺伝子で置き換えることにより産生され得る。又は、GenBankで提供される配列を用いて、デングタンパク質をコードする核酸分子が、既知
の核酸合成技法を用いて合成され、そして適切なベクター中に挿入され得る。したがって
弱毒化免疫原性ウイルスは、当業者に既知の組換え工学処理技法を用いて産生される。
【００２７】
上記のように、バックボーン中に挿入される遺伝子は、一血清型のデング構造タンパク質をコードする。好ましくは挿入される異なる血清型のデング遺伝子は、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質および／又はＥタンパク質をコードする遺伝子である。デング熱ウイルスバックボーン中に挿入される配列は、他の血清型のｐｒＭおよびＥ構造タンパク質をともにコードし得る。デング熱ウイルスバックボーン中に挿入される配列は、他の血清型のＣ、ｐｒＭおよびＥ構造タンパク質をコードし得る。デング熱ウイルスバックボーンは、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３又はＤＥＮ４ウイルスゲノム、又はこれらの血清型のいずれかの弱毒化デング熱ウイルスゲノムであり、そして異なる血清型のデング熱ウイルスのＣ、ｐｒＭおよび／又はＥ構造タンパク質（単数又は複数）をコードする置換遺伝子（単数又は複数）、又は異なる血清型のデング熱ウイルスのｐｒＭおよび／又はＥ構造タンパク質（単数又は複数）をコードする置換遺伝子（単数又は複数）を包含する。
【００２８】
血清型のいずれかのデング熱ウイルスの構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する適切なキメラウイルス又は核酸キメラは、免疫原性を保持したまま毒性における低減を示す弱毒化の表現型マーカーに対してそれらをスクリーニングすることにより、ワクチンとしての有用性に関して評価され得る。抗原性および免疫原性は、当業者に既知のルーチンスクリーニング手法を用いて、デング抗体又は免疫反応性血清とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ反応性を用いて評価され得る。
【００２９】
デング熱ワクチン
好ましいキメラウイルスおよび核酸キメラは、免疫原性又はワクチンとして有用な生育減衰ウイルスを提供する。好ましい実施形態では、キメラは高免疫原性を示すが、一方、同時に危険な病原性又は致死作用を生じない。
【００３０】
本発明のキメラウイルス又は核酸キメラは、一の血清型の野生型又は弱毒化デング熱ウイルスバックボーンにおいて、異なる血清型のデング熱ウイルスの構造遺伝子を含有し得る。例えばキメラは、一血清型のデングウイルス又は弱毒化デング熱ウイルスのバックグラウンドにおいて、異なる血清型のデング熱ウイルスの構造タンパク質遺伝子を発現し得る。
【００３１】
本明細書中に記載された、異なる血清型のデング熱ウイルスの構造タンパク質遺伝子を発現するための一血清型のデング熱ウイルスゲノムの非構造領域を含有する遺伝子バックグラウンドの使用、キメラ化、弱毒化の特性化に関する戦略は、所望の免疫原性の構造タンパク質遺伝子を発現する生きた弱毒化デング熱ワクチン候補の開発をもたらした。したがってデング熱病原体の制御のためのワクチン候補が示され得る。
【００３２】
本明細書中に記載されたキメラに用いられるウイルスは、典型的には当該技術分野で既知の技法を用いて増殖される。次にウイルスプラーク又はフォーカス形成単位（ＦＦＵ）のタイトレーションが実施され、そして細胞培養中に増殖したウイルスの生育可能性、力価および表現型特徴を評価するために、プラーク又はＦＦＵが計数される。弱毒化候補出発物質を得るために、野生型ウイルスが突然変異誘発される。
【００３３】
種々のデング血清型から、キメラ感染性クローンが構築される。ウイルス特異的ｃＤＮＡ断片のクローニングも、所望により成し遂げられ得る。種々のプライマーを用いてデングＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、構造タンパク質又は非構造タンパク質遺伝子を含有するｃＤＮＡ断片が増幅される。増幅断片は他の中間クローンの切断部位中でクローン化される。中間キメラデングクローンは次に、挿入デング特異的ｃＤＮＡの配列を確定するためにシーケンシングされる。
【００３４】
ベクター中にデング熱ウイルスの構造又は非構造タンパク質遺伝子領域を挿入することにより構築される全ゲノム長キメラプラスミドは、当業者に既知の組換え技法を用いて得ることが可能である。
【００３５】
投与方法
本明細書中に記載されたウイルスキメラは、ヒト又は動物への免疫原性又はワクチンとしての投与のための薬学的に許容可能な担体又はビヒクルと、個別に又は一緒に組合わされる。「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能なビヒクル」という用語は、悪い生理学的応答を引き起こすことなく生きた動物又はヒト組織と接触して用いるのに適した、そして組成物の他の構成成分と好ましくない相互作用しない任意の組成物又は化合物、例えば水又は生理食塩水、ゲル、軟膏、溶媒、希釈剤、流体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセル等（これらに限定されない）を意味するために本明細書中で用いられる。
【００３６】
免疫原性又はワクチン処方物は、便宜上、ウイルスプラーク形成単位（ＰＦＵ）又はフォーカス形成単位（ＦＦＵ）の投与形態で表され、慣用的薬学的技法を用いて調製され得る。このような技法は、活性成分および薬学的担体（単数又は複数）又は賦形剤（単数又は複数）を合わせる過程を包含する。概して処方物は、活性成分を液体担体と均一に且つ密接に合わせることにより調製される。非経口投与に適した処方物としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および処方物を指定のレシピエントの血液と等張にさせる溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。処方物は、単位用量又は多用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中に存在し、そして使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用の水の添加のみを要するフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時調合注射溶液および懸濁液は、当業者に一般に用いられる滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００３７】
好ましい単位投薬処方物は、投与成分の用量又は単位又はその適切な分画を含有するものである。特に上記した成分のほかに、本発明の処方物は当業者に一般的に用いられるその他の作用物質を含み得る、と理解されるべきである。
【００３８】
免疫原性又はワクチン組成物は、異なる経路により、例えば経口又は非経口的に投与され、例としては、頬および舌下、直腸、エーロゾル、鼻、筋肉内、皮下、皮内および局所経路が挙げられるがこれらに限定されない。組成物は異なる形態で投与され、例としては、溶液、乳濁液および懸濁液、ミクロスフェア、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。約１〜約５用量が免疫感作スケジュール当たりで必要とされる、と予測される。初回用量は、約１００〜約１００，０００ＰＦＵ又はＦＦＵの範囲であり、好ましい投薬量範囲は約５００〜約２０，０００ＰＦＵ又はＦＦＵ、さらに好ましい投薬量範囲は約１０００〜約１２，０００ＰＦＵ又はＦＦＵであり、最も好ましい投薬量範囲は約１０００〜約４０００ＰＦＵ又はＦＦＵである。追加免疫注射は、約１００〜約２０，０００ＰＦＵ又はＦＦＵの投薬量範囲であり、好ましい投薬量範囲は約５００〜約１５，０００ＰＦＵ又はＦＦＵであり、さらに好ましい投薬量範囲は約５００〜約１０，０００ＰＦＵ又はＦＦＵであり、最も好ましい投薬量範囲は約１０００〜約５０００ＰＦＵ又はＦＦＵである。例えば投与容量は、投与経路によって変わる。筋肉内注射は、容量で約０．１  ｍｌ〜１．０  ｍｌの範囲であり得る。
【００３９】
組成物は、約−１００℃〜約４℃の温度で保存され得る。組成物は、室温を含めた異なる温度で凍結乾燥状態でも保存され得る。組成物は、当業者に既知の慣用的手段により滅菌され得る。このような手段としては濾過が挙げられるが、これに限定されない。組成物は、静菌剤と組合せられて、細菌増殖を抑制し得る。
【００４０】
投与スケジュール
本明細書中に記載された免疫原性又はワクチン組成物は、ヒト、特にデング熱ウイルス感染が存在する地域に旅行する個体に、そしてそれらの地域の住人にも投与され得る。組成物の投与のための最適時間は、デング熱ウイルスへの初回接触の約１〜３ヶ月前である。しかしながら組成物は、疾患進行を改善するために初回感染後に、又は疾患を治療するために初回感染後にも投与され得る。
【００４１】
アジュバント
当業者に既知の種々のアジュバントが、本発明の免疫原性又はワクチン組成物中でキメラウイルスとともに投与され得る。このようなアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ポリマー、コポリマー、例えばポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、例えばブロックコポリマー、ポリマーｐ１００５、フロイント完全アジュバント（動物用）、フロイント不完全アジュバント；モノオレイン酸ソルビタン、スクアレン、ＣＲＬ−８３００アジュバント、明礬、ＱＳ２１、ムラミルジペプチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチドモチーフおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドモチーフの組合せ、トレハロース、細菌抽出物、例えばマイコバクテリア抽出物、解毒化内毒素、膜脂質又はそれらの組合せ。
【００４２】
核酸配列
一血清型のデング熱ウイルスのおよび異なる血清型のデング熱ウイルスの核酸配列は、高感受性および特異性を有する試料又は検体中のデング熱ウイルスキメラの検出のための核酸プローブおよびプライマーを設計するために有用である。デング熱ウイルスに対応するプローブ又はプライマーは、ワクチンウイルスの存在を検出するために用いられ得る。核酸および対応するアミノ酸配列は、生物体および疾患を試験するための、そして疾患の療法及び治療を開発するための実験室ツールとして有用である。
【００４３】
核酸プローブおよびプライマーは、デング熱ウイルスをコードする核酸分子又はその相補的配列と選択的にハイブリダイズする。「選択的」又は「選択的に」とは、デング熱ウイルス配列の適切な検出を妨げる他の核酸とハイブリダイズしない配列を意味する。したがって核酸をハイブリダイズするという意図において、選択性は試料中に存在する他の構成成分によって異なる。ハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする核酸のセグメントと少なくとも７０％の相補性を有するべきである。核酸を説明するために本明細書中で用いる場合、「選択的にハイブリダイズする」という用語は、無作為的にハイブリダイズする核酸を排除し、したがって「特異的にハイブリダイズする」と同じ意味を有する。本発明の選択的にハイブリダイズする核酸プローブおよびプライマーは、それがハイブリダイズする配列のセグメントと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％および９９％の相補性を有し、好ましくは８５％以上の相補性を有し得る。
【００４４】
本発明は、コード核酸又は核酸の相補的又は反対の鎖と選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーも意図する。核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、機能的種−種ハイブリダイゼーション能力が維持される限り、核酸における小修飾又は置換を伴って起こり得る。「プローブ」又は「プライマー」とは、それらの検出又は増幅のための相補的核酸配列との選択的ハイブリダイゼーションのためにプローブ又はプライマーとして用いられ得る核酸配列を意味し、これらのプローブ又はプライマーは約５〜１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜５０ヌクレオチド、最も好ましくは約１８〜２４ヌクレオチドの長さで変わり得る。ストリンジェントな条件下で種特異的核酸と選択的にハイブリダイズし、そしてMolecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1
989に記載されたような問題の配列と相補的な少なくとも５つのヌクレオチドを有するであろう単離核酸が、本明細書中で提供される。
【００４５】
プライマーとして用いられる場合、組成物は好ましくは、所望の領域を増幅するために、標的分子の異なる領域とハイブリダイズする少なくとも２つの核酸分子を含む。プローブ又はプライマーの長さによって、標的領域は７０％相補的塩基〜完全相補性の範囲であり得るし、そして依然としてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。例えばデング熱ウイルスの存在を検出する目的のために、ハイブリダイズする核酸（プローブ又はプライマー）とそれがハイブリダイズする配列との間の相補性の程度は、他の生物体からの核酸とのハイブリダイゼーションを区別するのに少なくとも十分である。
【００４６】
デング熱ウイルスをコードする核酸配列は、ベクター、例えばプラスミド中に挿入され、そして生きている生物体中で組換え的に発現されて、組換えデング熱ウイルスペプチドおよび／又はポリペプチドを生成する。
【００４７】
本発明の核酸配列は、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）、ならびにｃＤＮＡアンプリコンを増幅するよう意図されるフォワードおよびリバースアンプリマーを用いることによりウイルスゲノムＲＮＡ鋳型から増幅されるｃＤＮＡアンプリコンの検出に役立つ診断プローブを含む。ある場合には、アンプリマーの１つが、アンプリマーの３’末端にワクチンウイルス特異的突然変異を含有するよう設計され、これは、標的部位でのプライマーの延長およびその後の増幅が、ウイルスＲＮＡ鋳型がその特異的突然変異を含有する場合にのみ起こるため、試験を有効にワクチン株特異的にする。
【００４８】
自動ＰＣＲベースの核酸配列検出系が近年開発された。ＴａｑＭａｎ検定（Applied Biosystems）が広範に用いられている。診断的遺伝子試験のためにさらに最近開発された戦略は、分子ビーコンを使用する（Tyagi and Kramer, 1996 Nature Biotechnology 14: 303-308）。分子ビーコン検定は、ＴａｑＭａｎ検定に用いられるものとは異なるクエンチャーおよびレポーター染料を用いる。これらのおよびその他の検出系が、当業者により用いられ得る。
【実施例１】
【００４９】
デング熱ウイルスワクチン候補ｒＤＥＮ４Δ３０の改良
５．０ｌｏｇ１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）の用量を摂取した２０名のボランティアで、組換え生きた弱毒化デング熱−４ワクチン候補ｒＤＥＮ４Δ３０の安全性を評価した（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-413）。ワクチン候補は、ワクチンのすべてにおいて、安全で、十分な耐容性を示し、そして免疫原性であることが判明した。しかしながらワクチン接種者のうち５名はアラニンアミノトランスフェラーゼレベルの一過性上昇が表れ、３名は好中球減少が表れ、そして１０名のワクチン接種者は無症候性斑状皮疹を発症し、このことは、このワクチン候補をさらに弱毒化することが必要であることを示唆する。
【００５０】
現在、ｒＤＥＮ４Δ３０のヒト感染性用量５０（ＨＩＤ５０）を確定するために、無作為二重盲検プラセボ対照用量減少試験が実行されている。各用量群は、約２０名のワクチン接種者および４名のプラセボ受容者からなる。今までのところ、３．０ｌｏｇ１０ＰＦＵおよび２．０ｌｏｇ１０ＰＦＵの用量に関する完全データが収集されている。ｒＤＥＮ４Δ３０は、３．０ｌｏｇ１０ＰＦＵを投与した場合は接種者の１００％を、そして２．０ｌｏｇ１０ＰＦＵを投与した場合はワクチン接種者の９５％を感染させた（表１）。ワクチン候補は、いずれの用量でも症候性疾病を引き起こさなかった（表１）。３．０ｌｏｇ１０ＰＦＵを摂取した一ワクチン接種者はアラニンアミノトランスフェラーゼレベルの一過性上昇を経験し、そしてワクチン接種者のほぼ４分の１が両用量で好中球減少を経験
した（表１）。好中球減少は一過性で且つ軽症であった。ワクチン接種者の半数より多くが両用量で斑状皮疹を発症し、皮疹の発生率はワクチン接種用量と又はウイルス血症と相関しなかった（表１および表２）。ピーク力価もウイルス血症の開始も、３．０ｌｏｇ１０ＰＦＵおよび２．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ用量間で異なったが、しかしウイルス血症の両測定値は５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵの用量に関するものよりこれらの用量の方が有意に低かった（表３）。ワクチン候補は、両用量でワクチン接種者の９５％において免疫原性であり、中和抗体はワクチン接種後２８日目と４２日目との間に低下しなかった（表４）。ＨＩＤ５０は未だ確定されなかったが、しかしそれは明らかに２．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ未満である。興味深いことに、ワクチンの用量の低減は、免疫原性、ウイルス血症、良性好中球減少又は皮疹発生率に一貫した作用を及ぼさなかった。したがって、投与したウイルスの用量を低減することによりｒＤＥＮ４Δ３０をさらに弱毒化することは必ずしも可能ではなく、その他のアプローチを開発する必要がある。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
【表２】
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【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【００５５】
ｒＤＥＮ４Δ３０をさらに弱毒化するために、２つのアプローチが採用された。この第一のものは、５’フルオロウラシル突然変異誘発を用いたｒＤＥＮ４における弱毒化点突然変異の生成および特性化である（Blaney, J.E.Jr. et al. 2002 Virology 300: 125-139; Blaney, J.E.Jr. et al. 2001 J. Virol. 75: 9731-9740）。このアプローチは、ベロおよびＨｕＨ−７細胞における一連の温度感受性（ｔｓ）および小プラーク（ｓｐ）表現型、ならびに乳仔マウス脳およびＨｕＨ−７細胞を移殖されたＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウス）における弱毒化（ａｔｔ）表現型を付与する点突然変異のパネルを同定した。この例では、これらの突然変異のサブセットはｒＤＥＮ４Δ３０に導入され、そしてその結果生じたウイルスの表現型が評価された。
【００５６】
第二のアプローチは、ｒＤＥＮ４  ＮＳ５遺伝子中の荷電アミノ酸残基の連続対における一連の対合荷電アミノ酸→アラニン突然変異を作製することであった。先に実証されたように、ｒＤＥＮ４  ＮＳ５における荷電アミノ酸残基の３２の個々の連続対の突然変異は、ベロおよびＨｕＨ−７細胞における一連のｔｓ表現型、ならびに乳仔マウス脳における一連のａｔｔ表現型を付与した（Hanley, K.H. et al. 2002 J. Virol. 76: 525-531）。下記に示すように、これらの突然変異はＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおけるａｔｔ表現型も付与する。これらの突然変異は、それらがΔ３０突然変異と適合性であるか否か、そしてそれらがｒＤＥＮ４Δ３０のａｔｔ表現型を増強するか否かを確定するために、単一対又は２つの対の組として、ｒＤＥＮ４Δ３０中に導入された。
【００５７】
野生型ｒＤＥＮ４ウイルスと比較した場合の、組織培養中での温度感受性および／又は小プラーク表現型、ならびに乳仔マウス脳における種々のレベルの弱毒化複製を保有する個々の点突然変異を保有するｒＤＥＮ４ウイルスのパネルが特性化された（Blaney, J.E.
et al. 2002 Virology 300: 125-139; Blaney, J.E. et al. 2001 J. Virol. 75: 9731-9740）。Δ３０欠失突然変異と組合せて、アカゲザルにおけるｒＤＥＮ４Δ３０の複製を
さらに制限するそれらの能力を評価するために、３つの突然変異が選択された。第一に、ベロおよびＨｕＨ−７細胞における温度感受性ならびに乳仔マウス脳における複製制限を付与するヌクレオチド４９９５でのＮＳ３におけるミスセンス突然変異（Ｓｅｒ＞Ｐｒｏ）を予めΔ３０突然変異と組合せた（Blaney, J.E. et al. 2001 J. Virol. 75: 9731-9740）。その結果生じたウイルスｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５は、野生型ｒＤＥＮ４ウイルスと比較した場合、ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルス（＜５倍）より多くマウス脳複製において制限される（１，０００倍）ことが判明した。第二に、これもベロおよびＨｕＨ−７細胞における温度感受性ならびに乳仔マウス脳における１０，０００倍複製制限を付与するヌクレオチド８０９２でのミスセンス突然変異（Ｇｌｕ＞Ｇｌｙ）をここでΔ３０突然変異と組合せた。第三に、ベロおよびＨｕＨ−７細胞における温度感受性、ＨｕＨ−７細胞の小プラークサイズ化、ならびに乳仔マウス脳およびＨｕＨ−７細胞を移殖されたＳＣＩＤマウスにおける約１，０００倍の複製制限を付与するヌクレオチド１０６３４での３’ＵＴＲにおける置換をここでΔ３０突然変異と組合せた（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139）。
【００５８】
本発明の検査に関して、上記の突然変異を含有するｐ４（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）のサブクローン化断片をｐ４Δ３０ｃＤＮＡクローン中に導入した。ウイルスの転写および回収のために、ｃＤＮＡをＡｃｃ６５Ｉ（切断して単一３’ヌクレオチドのみを残すＫｐｎＩのアイソシゾマー）を用いて線状化し、先に記載されたように（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139）ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによる転写のための鋳型として用いた。リポソーム媒介性トランスフェクションを用いてＣ６／３６蚊細胞をトランスフェクトし、細胞培養上清を５〜７日目に回収した。回収ウイルスをベロ細胞中で最終的に２倍に希釈し、ベロ細胞中で２回（ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５）又は３回（ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４）継代した。
【００５９】
ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５、ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスの完全ゲノム配列を、上記のように確定した（Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65: 405-413）。予測どおり、各ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルス誘導体は、Δ３０突然変異を含有した。予期せぬことに、ｐ４Δ３０−４９９５ｃＤＮＡはＳｅｒ＞Ｐｒｏ変化を導入するよう設計されたため、ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５ウイルスでは、ヌクレオチド４９９５を含有するコドンのヌクレオチド変化は、Ｓｅｒ＞Ｐｒｏ変化というよりむしろＳｅｒ＞Ｌｅｕアミノ酸変化を生じた（表５）。ｐ４Δ３０−４９９５ｃＤＮＡクローンは実際、ヌクレオチド４９９５でのＳｅｒ＞Ｐｒｏ変化をコードすることが判明し、そこでウイルス集団がどのようにＳｅｒ＞Ｌｅｕ突然変異を獲得したかは不明である。それにもかかわらずこのウイルスを評価して、このミスセンス突然変異により特定される表現型を査定した。ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５ウイルスは、単一アミノ酸変化（Ｓｅｒ＞Ａｓｐ）を生じるヌクレオチド４７２５〜６での偶発的突然変異を含有する、ということも判明した。ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスは、適切なヌクレオチド置換、ならびにさらなる偶発的突然変異を、それぞれＥ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ４Ｂに含有した（表５）。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
３つの修飾ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスの複製を、乳仔マウス脳モデルおよびＨｕＨ−７細胞を移植されたＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウス）において、ｒＤＥＮ４Δ３０および野生型ｒＤＥＮ４ウイルスと比較した。上記のように実験を実行した（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139; Blaney, J.E. et al. 2001 J. Virol. 75: 9731-9740）。要するに、乳仔マウス脳の感染のために、６匹の７日齢マウスの群に４．０ｌｏｇ１０ＰＦＵを脳内接種して、各マウスの脳を５日後に取り出した。次に１０％脳懸濁液の清澄化上清を−７０℃で凍結して、ベロ細胞におけるプラーク検定によりウイルス力価を確定した。ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおけるＤＥＮ４ウイルス複製の分析のために、４〜６週齢ＳＣＩＤマウスに１０７個のＨｕＨ−７細胞を腹腔内注入した。移殖の５〜６週間後に、４．０ｌｏｇ１０ＰＦＵのウイルスを腫瘍中に直接接種することによりマウスを感染させて、７日目に尾に切込みを入れて、ウイルスタイトレーションのための血清を回収した。ベロ細胞におけるプラーク検定により、ウイルス力価を確定した。
【００６２】
野生型ｒＤＥＮ４ウイルスは、乳仔マウス脳において６．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｇに複製し、ｒＤＥＮ４Δ３０は０．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｇだけ複製を制限されたが、これは従来の観察と同様である（表６）（Blaney, J.E. et al. 2001 J. Virol. 75: 9731-9740）。ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５、ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスは、それぞれ３．３、２．８および２．４ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｇのｒＤＥＮ４ウイルスと比較した場合、乳仔マウス脳において複製制限を示す、ということが判明した。これらの結果は、さらなる弱毒化突然変異が５０倍（ｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４）〜４００倍（ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５）の範囲でマウス脳におけるｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスの複製をさらに制限するのに役立つ、ということを示す。ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスでは、ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスのウイルス力価は、ｒＤＥＮ４ウイルスより低い０．４ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであったが、これも従来の研究と同様である（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139）。各修飾化ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスは、ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおける複製においてさらに制限される、ということが判明した（表６）。ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５、ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスは、それぞれ野生型ｒＤＥＮ４ウイルスのレベルより低い２．９、１．１および２．３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｇのｒＤＥＮ４ウイルスと比較した場合、ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおける複製制限を示した。２つの重要な観察がなされた：（１）４９９５、８０９２および１０６３４突然変異は生育可能性に関してΔ３０突然変異に匹敵し、ならびに（２）これら３つの修飾ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスはｒＤＥＮ４野生型ウイルスと比較して複製が１０〜１，０００分の１に低減し、これにより、このモデルにおける広範囲の弱毒化を示すウイルスのサル又はヒトにおけるさらなる評価が可能になる。
【００６３】
【表６】
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【００６４】
ＤＥＮ４ウイルス感染の２つのマウスモデルにおける知見に基づいて、ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５、ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスの各々をＤＥＮ４感染のアカゲザルモデルにおいて評価した、と記載されている（Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65: 405-413）。要するに、４匹（ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５、ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４）又は２匹（ｒＤＥＮ４、ｒＤＥＮ４Δ３０、模倣物）のサルの群に、５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵウイルスを皮下接種した。サルを毎日観察し、血清を０〜６、８、１０および１２日目に回収して、ウイルス血症の測定のためにベロ細胞におけるプラーク検定によりウイルス力価を確定した。２８日目に、血清を回収し、先に記載されたようにベロ細胞におけるプラーク低減検定により中和抗体のレベルを検査した、と記載されている（Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65: 405-413）。
【００６５】
全てのサルにおいて感染後１日目からウイルス血症の検出が開始され、４日目に終了した。（表７、図３）。ウイルス血症は、ｒＤＥＮ４、ｒＤＥＮ４Δ３０又はｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスに感染した各サルにおいて存在したが、しかしｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５又はｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２ウイルスに感染した４匹のサルのうち２匹のみが検出可能ウイルス血症を有した。予測どおり、ｒＤＥＮ４ウイルスにより感染は、最高平均ウイルス血症日数／サル（３．０日）、ならびに平均ピークウイルス力価（２．２ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ）を生じた。ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスに感染したサルは、ｒＤＥＮ４ウイルスと比較して、低平均ウイルス血症日数／サル（２．０日）および平均ピークウイルス力価（１．１ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ）を有した。修飾ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスの各々に感染したサルの群は、さらに平均ウイルス血症日数が制限され、ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２ウイルスを接種したものは、ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスと比較して最低値０．５日、４分の１に低減した。ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５（０．９ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ）又はｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２（０．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ）に感染したサルの平均ピークウイルス力価も、ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスに感染したものより低かった。しかしながらｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４（１．３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ）に感染したサルの平均ピークウイルス力価は、特に２日目に、ｒＤＥＮ４Δ３０に感染したものよりわずかに高かった（図３）。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
０および２８日目に回収した血清を、ｒＤＥＮ４に対する中和抗体のレベルに関して検査した。サルはフラビウイルスに対する中和抗体に関して陰性であると予備スクリーニン
グされたため、予測どおり、０日目にＤＥＮ４に対して検出可能な中和抗体は見出されなかった（表７）。２８日目に、ｒＤＥＮ４に感染したサルは、ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスに感染したサル（１：１８１）より約２倍高い３９８という平均血清中和抗体力価（相互希釈）を有した。この結果ならびにｒＤＥＮ４ウイルス感染サルにおけるウイルス血症の２倍高いレベルは、先に得られた結果と同様である（Durbin et al. 2001 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65: 405-413）。ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５（１：７８）、ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２（１：６１）およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４（１：１０７）ウイルスに感染したサルは各々、ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスに感染したサルと比較して、平均血清中和抗体力価低減を示した。検出可能なウイルス血症を有さなかった４匹のサルは、血清中和抗体力価を有したが、このことはそれらが実際に感染したことを示す。ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスと比較した場合のｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスの平均ピークウイルス力価のわずかな増大にもかかわらず、ｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスは、ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスに感染したサルと比較してより低い平均血清中和抗体力価を有した。このことおよびより低い平均ウイルス血症日数／サルは、１０６３４突然変異がサルにおけるｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスの複製を弱毒化し得ることを示唆する。
【００６８】
接種後２８日目に、全てのサルを、５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵの野生型ｒＤＥＮ４ウイルスを皮下接種して抗原誘発した。サルを毎日観察し、そして２８〜３４日目、３６および３８日目に血清を回収し、抗原誘発後のウイルス血症の測定のためにベロ細胞におけるプラーク検定によりウイルス力価を確定した。ｒＤＥＮ４ウイルス抗原誘発の２８日後に、血清を回収し、ベロ細胞におけるプラーク低減検定により中和抗体のレベルを調べた。模倣物接種サルは、抗原誘発後に２．３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌの平均ピークウイルス力価を有し、３．５という平均ウイルス血症日数を示した（表８）。しかしながらｒＤＥＮ４、ｒＤＥＮ４Δ３０又は修飾ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスの各々を接種したサルは検出可能なウイルス血症を有さず、このことは、ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５、ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスの複製および免疫原性低減にもかかわらず、各々が、野生型ｒＤＥＮ４に対する防御を誘導するのに十分に免疫原性であった、ということを示す。平均中和抗体力価の増大は、模倣物感染を除いて全ての接種群において抗原誘発後に最小（＜３倍）であったが、これは、サルが抗原誘発から防御されたというさらなる証拠を提供する。
【００６９】
【表８】
2005532044.tif 000010
【００７０】
合わせて考えると、これらの結果は、上記の３つの点突然変異４９９５、８０９２およ
び１０６３４が、乳仔マウス脳、ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスおよびアカゲザルにおけるｒＤＥＮ４Δ３０ワクチン候補をさらに弱毒化する、ということを示す。各修飾ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルス中に存在するさらなる偶発的突然変異（表４）のために、表現型を個々の４９９５、８０９２および１０６３４点突然変異に直接的に帰することはできない。しかしながらこれらの３つの突然変異のうちの１つを保有する他のｒＤＥＮ４ウイルスにおける同様のマウス弱毒化表現型の存在は、４９９５、８０９２および１０６３４点突然変異が修飾ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスのａｔｔ表現型に関与する、という主張を支持する。ｒＤＥＮ４Δ３０−４９９５、ｒＤＥＮ４Δ３０−８０９２およびｒＤＥＮ４Δ３０−１０６３４ウイルスは防御的免疫を付与するのに十分な免疫原性を保持しながら、アカゲザルにおける複製低減を示したため、これらのウイルスはヒトのためのデング熱ワクチンとして意図される。
【００７１】
次に、Δ３０および荷電アミノ酸→アラニン突然変異をともに保有するＤＥＮ４ウイルスを生成した。ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおける複製が、１０分の１〜１，０００分の１に低減し、その非突然変異配列が４つのデング熱血清型を通して十分に保存された上記の７群の荷電アミノ酸→アラニン突然変異のサブセットを同定した。これらの突然変異を、単一対として、および２組の対として、慣用的クローニング技法を用いてｒＤＥＮ４Δ３０中に導入した。転写およびウイルスの回収ならびにウイルスの最終希釈を、上記と同様に実行した。ベロ細胞およびＨｕＨ−７細胞における荷電アミノ酸クラスター→アラニン突然変異型ウイルスの温度感受性のレベル、乳仔マウスの脳における複製のレベル、ならびにＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおける複製のレベルの検定を、上記と同様に実行した。
【００７２】
ｒＤＥＮ４中への１対の荷電アミノ酸→アラニン突然変異の導入は、全ての場合に回収可能なウイルスを生じた（表９）。２対の荷電アミノ酸→アラニン突然変異の導入は、３つの場合のうちの２つにおいて回収可能なウイルスを生じた（ｒＤＥＮ４Δ３０−４３６−４３７−８０８−８０９は回収可能でなかった）。
【００７３】
ｒＤＥＮ４Δ３０は、ベロ又はＨｕＨ−７細胞中ではｔｓでない。それに反して、本実施例に用いられる７組の荷電アミノ酸→アラニン突然変異のうちの７つがＨｕＨ−７細胞においてｔｓ表現型を付与し、そして５つはベロ細胞においてもｔｓ表現型を付与する。Δ３０および荷電アミノ酸→アラニン突然変異の両方を保有する６つのウイルスは全て、ベロおよびＨｕＨ−７細胞の両方においてｔｓ表現型を示した（表９）。ｒＤＥＮ４Δ３０は乳仔マウス脳においては弱毒化されないが、一方、７組の荷電アミノ酸→アラニン突然変異のうちの４つは乳仔マウス脳においてａｔｔ表現型を付与した（表１０）。Δ３０および荷電アミノ酸→アラニン突然変異の両方を保有するウイルスのうち４つは、乳仔マウス脳において弱毒化された（表１０）。ある場合（ｒＤＥＮ４Δ３０−２３−２４−３９６−３９７）には、単独で弱毒化しなかった２つの突然変異の組合せは、弱毒化ウイルスを生じた。一般にΔ３０および荷電アミノ酸→アラニン突然変異の両方を保有するウイルスは、ｒＤＥＮ４Δ３０よりもそれらの荷電アミノ酸→アラニン突然変異型親ウイルスに類似して、乳仔マウス脳における複製のレベルを示した。
【００７４】
ｒＤＥＮ４Δ３０は、本実施例において用いられる７つの荷電アミノ酸→アラニン突然変異型ウイルスのうちの６つの場合と同様に、ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおいて弱毒化される。Δ３０および荷電アミノ酸→アラニン突然変異の両方を保有するウイルスは、それらの荷電アミノ酸→アラニン突然変異型親ウイルスと比較して、ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおける複製と類似のレベルか又はわずかに低いレベルを示す傾向がある（表１０）。３例において、Δ３０および荷電アミノ酸→アラニン突然変異の両方を保有するウイルスは、ｒＤＥＮ４Δ３０より少なくとも５倍大きいＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおける低減を示した。
【００７５】
ベロ細胞中において３５℃で＞１０５ＰＦＵ／ｍｌに複製し、そしてＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおける１００倍又はそれ以上の複製低減を示した５つのウイルス（ｒＤＥＮ４−２００−２０１、ｒＤＥＮ４Δ３０−２００−２０１、ｒＤＥＮ４−４３６−４３７［クローン１］、ｒＤＥＮ４Δ３０−４３６−４３７およびｒＤＥＮ４−２３−２４−２００−２０１）の完全ゲノム配列を確定した（表１１）。５つのうちの各々は１つ又は複数の偶発的突然変異を含有した。１つのウイルスｒＤＥＮ４Δ３０−４３６−４３７において、１つのさらなる突然変異は前に、ベロ細胞適応と関連づけられた（Blaney, J.E. Jr. et al. 2002 Virology 300: 125-139）。残りのウイルスは各々、その表現型作用が未知である少なくとも１つの偶発的突然変異を含有した。その結果として、記載された表現型を、荷電アミノ酸→アラニン突然変異に直接的に帰することはできない。しかしながらｒＤＥＮ４ウイルスおよび同一荷電アミノ酸→アラニン突然変異を保有するｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスが類似の表現型を共有したという事実は、ｒＤＥＮ４Δ３０の弱毒化を強化する荷電アミノ酸→アラニン突然変異の能力を強く支持する。ｒＤＥＮ４−４３６−４３７［クローン１］は４つの偶発的突然変異を含有したため、このウイルスの第２のクローンを調製した。ｒＤＥＮ４−４３６−４３７［クローン２］は１つの偶発的突然変異のみを含有し（表１１）、そして細胞培養およびＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおけるｒＤＥＮ４−４３６−４３７と同一の表現型を示した。ｒＤＥＮ４−４３６−４３７［クローン２］を、下記のアカゲザル試験に用いた。
【００７６】
【表９】
2005532044.tif 000011
【００７７】
【表１０】
2005532044.tif 000012
【００７８】
【表１１】
2005532044.tif 000013
【００７９】
ＳＣＩＤ−ＨｕＨ７マウスモデルにおける弱毒化に基づいて、荷電アミノ酸→アラニン突然変異型ウイルスのうちの４つ（ｒＤＥＮ４−２００−２０１、ｒＤＥＮ４Δ３０−２
００−２０１、ｒＤＥＮ４−４３６−４３７［クローン２］、ｒＤＥＮ４Δ３０−４３６−４３７）を、上記と同様にアカゲザルにおいて評価した。弱毒点突然変異を保有するウイルスの試験に関する場合と同様に、ウイルス血症が全てのサルにおいて感染後１日目に検出され、そして４日目に終結された（図４、表１２）。ウイルス血症は感染したサルのほとんどにおいて検出された；ｒＤＥＮ４Δ３０−２００−２０１に感染した４匹のサルのうち１匹のみ、ならびにｒＤＥＮ４Δ３０−４３６−４３７に感染した４匹のサルのうちの１匹は、検出可能なウイルス血症を示さなかった。ｒＤＥＮ４に感染したサルは最高平均ピークウイルス力価を示した；そして各々の場合、Δ３０突然変異を保有するウイルスはそれらの親ウイルスに比して平均ピークウイルス力価において約０．５ｌｏｇの低減を、ならびにウイルス血症平均日数／サルにおいて０．５〜２日の低減を示した。Δ３０および荷電アミノ酸→アラニン突然変異を保有するウイルスに感染したサルは、ｒＤＥＮ４Δ３０に感染したサルに比して平均ピークウイルス血症の２倍の低減を示した。これは、荷電アミノ酸→アラニン突然変異の付加がアカゲザルに関してｒＤＥＮ４Δ３０をさらに弱毒化する、ということを示唆する。
【００８０】
予測どおり、この試験において０日目に検出可能レベルの中和抗体を示したサルはいなかった。２８日目に、ウイルスに感染した全てのサルが検出可能レベルの中和抗体を示したが、このことは、全てのサルが、検出可能なウイルス血症を示さなかったものでさえ、実際には感染していたことを示す。弱毒点突然変異の試験の場合と同様に、ｒＤＥＮ４に感染したサルは、ｒＤＥＮ４Δ３０に感染していたサルの約２倍の平均血清中和抗体力価（相互希釈）を有した。ｒＤＥＮ４−２００−２０１およびｒＤＥＮ４−４３６−４３７［クローン２］に感染したサルはｒＤＥＮ４と同様の平均中和抗体力価を有し、そしてｒＤＥＮ４Δ３０−２００−２０１およびｒＤＥＮ４Δ３０−４３６−４３７に感染したサルはｒＤＥＮ４と同様の平均中和抗体力価を有した。各々の場合、ウイルスへのΔ３０突然変異の付加は、中和抗体の２倍の低減を生じた。したがってｒＤＥＮ４Δ３０への荷電アミノ酸→アラニン突然変異の付加はｒＤＥＮ４Δ３０単独のものより低く平均ピークウイルス血症を低減したが、しかし中和抗体のレベルには影響を及ぼさなかった。
【００８１】
【表１２】
2005532044.tif 000014
【００８２】
２８日目にｒＤＥＮ４で攻撃誘発後、偽感染サルは１．５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌの平
均ピークウイルス力価および３．０の平均ウイルス血症日数を有した（表１３）。しかしながらｒＤＥＮ４、ｒＤＥＮ４Δ３０又は荷電アミノ酸→アラニン突然変異型ウイルスをあらかじめ接種したサルで、検出可能なウイルス血症を示したものはなかった。さらに血清中和抗体力価の４倍より大きい増大を示したサルもなかった。これらのデータはともに、Δ３０および荷電アミノ酸→アラニン突然変異をともに保有するウイルスを含めたウイルスのいずれかによる感染がｒＤＥＮ４による抗原誘発からアカゲザルを防御した、ということを示す。
【００８３】
【表１３】
2005532044.tif 000015
【００８４】
ｒＤＥＮ４Δ３０への荷電アミノ酸→アラニン突然変異の付加は、ベロおよびＨｕＨ−
７細胞において一連のｔｓ表現型を、ならびに乳仔マウス脳においてａｔｔ表現型を付与し、そしてＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおいて弱毒化を増強し得るか又は変化しないままにしておく。これらの突然変異の付加は、中和抗体力価又は防御効力を低減することなく、アカゲザルにおいてｒＤＥＮ４Δ３０により生成されるウイルス血症を低減し得る、ということが最も重要である。したがってｒＤＥＮ４Δ３０へのこのような突然変異の付加は、ヒトにおいて弱毒化増強として意図される。さらにまた突然変異は、弱毒化の全体的レベルを変更しないが、しかしΔ３０突然変異の非存在下でさえ突然変異がそれ自体で独立して弱毒化しているため、弱毒表現型を安定化するよう付加されるものとして意図される。構造遺伝子領域の外側で起こり、構造遺伝子キメラウイルスを弱毒化するために用いられ得るため、荷電アミノ酸→アラニン突然変異は特に有用である。さらにそれらは少なくとも３つのヌクレオチド変化を包含して、それらを野生型配列に戻る見込みがないようにする。
【００８５】
ベロ細胞組織培養におけるｒＤＥＮ４の複製を増強する一連の点突然変異が同定されている；これらは主にＮＳ４Ｂ遺伝子中に位置する（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139; Blaney, J.E. et al. 2001 J Virol. 75: 9731-9740）。ベロ細胞適応突然変異は、ワクチン候補に２つの望ましい特徴を付与する。第一に、それらは、ワクチン生産のための指定の基質であるベロ細胞中のウイルス収量を増強し、したがってワクチン生産をより費用効果的にさせる。第二に、これらのベロ適応突然変異の各々は点突然変異であるが、しかしそれらは、ベロ細胞中で選択的利益を提供するため、ワクチン製造中は非常に安定であると思われる。７１２９位での少なくとも１つのベロ細胞適応突然変異も、ｒＤＥＮ４の蚊感染性を低減することが示された；不十分な蚊感染性は、デング熱ワクチン候補のもう一つの望ましい特徴である。この知見の一般性を調べるために、感染性乾燥血液（blood meal）を餌とする蚊のネッタイシマカ（Aedes aegypti）を感染させるｒＤＥＮ４の能力に及ぼす残りのベロ細胞適応突然変異の作用を本発明者らは試験した。表１４は、高力価で単一ベロ細胞適応突然変異を保有する各ウイルスの感染性を示す。これらのうち、７１８２位の１つの突然変異のみが、蚊感染性における大きな低減と関連づけられた。したがって７１８２は、ベロ細胞におけるそして蚊における複製に及ぼす反対作用を有するので、ｒＤＥＮ４ワクチン候補に含むための特に有益な突然変異であり得る。
【００８６】
【表１４】
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【実施例２】
【００８７】
Δ３０突然変異を含有する組換えＤＥＮ１ウイルスの生成および特性化
Δ３０突然変異がＤＥＮ４血清型以外の野生型ＤＥＮウイルスを十分に弱毒化し得るか否かを、先ず本発明者らは確定しようと試みた。これを実行するために、Δ３０突然変異をＤＥＮ１に関するｃＤＮＡ（Western Pacific）中に導入した。ｐＲＳ４２４ＤＥＮ１ＷＰ  ｃＤＮＡクローン（Puri, B. et al. 2000 Virus Genes 20: 57-63）をＢａｍＨＩで切断（digest）し、これをＰＣＲの鋳型とし、フォワードプライマー３０（ＤＥＮ１  ｎｔ１０５１５〜１０５６１および１０５９２〜１０６０７）およびＭ１３リバースシーケンシングプライマー（ＤＥＮ１ゲノム配列の３’末端を越えた１０１ｎｔ）とＰｆｕポリメラーゼを用いたＰＣＲを行った。その結果生じたＰＣＲ産物は２９２ｂｐであり、Δ３０突然変異を含有した。ｐＲＳ４２４ＤＥＮ１ＷＰ  ｃＤＮＡをＡｐａＩで部分的に切断し、次にＳａｃＩＩで完全に切断して、ベクターをゲル単離し、ＰＣＲ産物と混合し、それを用いて酵母ＹＰＨ８５７株を形質転換して、トリプトファン欠乏プレート上で増殖させた（Polo, S. et al. 1997 J Virol 71: 5366-74）。ＰＣＲおよび制限酵素分析により、陽性酵母コロニーを確認した。２つの個々の酵母コロニーから単離したＤＮＡを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴＢＬ２株を形質転換した。ＲＮＡ転写体を生成するのに適したプラスミドＤＮＡを調製し、Δ３０突然変異の存在を配列分析により立証した。
【００８８】
ウイルスの転写および生成のために、ＳａｃＩＩで線状化されたｃＤＮＡ（ｐＲＳ４２４ＤＥＮ１Δ３０と呼ばれる）を、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写反応における鋳型として用いた（Polo, S. et al. 1997 J Virol 71: 5366-74）。転写反応物をＬＬＣ−ＭＫ２細胞中に電気穿孔して、ＣＰＥおよび免疫蛍光の観察により感染を確証し、１４日目に回収した。ウイルスストックをＣ６／３６蚊細胞上で増幅し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞上でタイトレーションした。その結果生じたウイルスｒＤＥＮ１Δ３０のゲノムをシーケンシングして、Δ３０突然変異の存在を確証した。Δ３０突然変異はＤＥＮ１のヌクレオチド１０５６２〜１０５９１を除去する（図２Ｂ、Ｃ）が、これはＤＥＮ１のＴＬ２に対応する。ウイルスはベロ細胞培養中で６．５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌの力価に効率的に複製するが、これは、Δ３０突然変異が、ワクチンの製造に不可欠な特性である細胞培養中のＤＥＮ１の効率的増殖と適合性であることを示す。同様の技法を用いて、親ウイルスｒＤＥＮ１を生成した。組織培養中でウイルス継代から生じる偶発的突然変異を、配列分析を用いてｒＤＥＮ１およびｒＤＥＮ１Δ３０の両方で同定した。結果を表１５に列挙する。ベロ細胞中でのトランスフェクションおよび増幅により、さらなるｒＤＥＮ１Δ３０ウイルスを得た。このウイルスは下記の試験で評価しなかったが、しかしその配列分析は表１５に含まれている。ｉｎ  ｖｉｖｏでのワクチンとしてのｒＤＥＮ１Δ３０の特性を次に検査した。
【００８９】
【表１５】
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【００９０】
若いアカゲザルにおけるｒＤＥＮ１Δ３０および野生型親ｒＤＥＮ１ウイルス（ｐＲＳ
４２４ＤＥＮ１ＷＰ  ｃＤＮＡ由来）の複製、免疫原性および防御効力の評価を、以下のように実施した。上部肩領域の各側２箇所に１  ｍｌ用量中の５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵのウイルスを分けてデング熱ウイルス血清陰性サルに皮下注射した。サルを毎日観察し、０〜１０日目、ならびに２８日目に血液を回収し、血清を−７０℃で保存した。既に報告されているベロ細胞中でのプラーク検定により、血清試料中のウイルスの力価を確定した（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）。２８日目血清試料に関するプラーク低減中和力価を既に報告されている方法で確定した（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）。５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵの野生型ｒＤＥＮ１の単回投与を用いて２８日目に全てのサルを抗原誘発し、血液を１０日間回収した。ベロ細胞中でのプラーク検定により、抗原誘発後血清中のウイルス力価を確定した。全長野生型ｒＤＥＮ１を接種したサルは２〜３日間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価は２．１ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであり（表１６）、ｒＤＥＮ１Δ３０を接種したサルは１日未満の間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価は０．８ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであったが、このことは、Δ３０突然変異がＤＥＮ１を弱毒化し得ることを示す。弱毒化ウイルスに関しては予測どおり、中和抗体力価により測定した場合の免疫応答は、野生型ｒＤＥＮ１を用いた接種と比較して、ｒＤＥＮ１Δ３０の接種後の方が低かった（表１６）が、依然として野生型ＤＥＮ１ウイルス抗原誘発に対して動物を防御するには十分に高かった。野生型ｒＤＥＮ１ウイルスはウイルス抗原誘発後に回収したいかなる血清試料中にも検出されなかったが、このことは、全長野生型ｒＤＥＮ１又は組換えウイルスｒＤＥＮ１Δ３０による免疫感作後に、サルは完全に防御されたことを示す。Δ３０突然変異により特定される弱毒化のレベルは、ＤＥＮ１およびＤＥＮ４遺伝子のバックグラウンドの両方において比較可能であった（図５）。
【００９１】
【表１６】
2005532044.tif 000018
【００９２】
前に報告されているように、ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおいて、ｒＤＥＮ４ウイル
スは６．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ／血清１ｍｌより多く複製したが、一方、Δ３０突然変異を有するｒＤＥＮ４ウイルスの複製は約１０分の１に低減された（Blaney, J.E.Jr. et al.
2002 Virology 300: 125-139）。ｒＤＥＮ１Δ３０の複製を、ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおいてｗｔｒＤＥＮ１の複製と比較した（表１７）。ｒＤＥＮ１Δ３０は、そのｗｔｒＤＥＮ１親の約１００分の１のレベルに複製した。この結果は、ＤＥＮウイルスの弱毒化株の評価のためのＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスモデルの使用の正当性をさらに立証し、結果はアカゲザルで観察されたものと密接に相関する。
【００９３】
【表１７】
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【００９４】
最後に、蚊に関するｒＤＥＮ１およびｒＤＥＮ１Δ３０の感染性を、実施例５に詳述した方法を用いて査定した。既に、Δ３０突然変異は、蚊の中腸バリアを超えて唾液腺感染を引き起こすｒＤＥＮ４の能力を低減することが示されている（Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 414-419）。しかしながらｒＤＥＮ１又はｒＤＥＮ１Δ３０は人工乾燥血液により効率的に蚊のネッタイシマカの中腸に感染できなかったため（表１８）、そこでΔ３０が唾液腺感染をさらに遮断し得るか否かを確定できなかった。従来の研究は、Δ３０が、胸郭内接種により感染した蚊のトキソリンキテススプレンデンス（Toxorhynchites splendens）に関するｒＤＥＮ４の感染性に及ぼす作用を有さない、ということも示した（Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 414-419）が、同様のパターンはｒＤＥＮ１およびｒＤＥＮ１Δ３０に関して観察された（表１８）。蚊の中腸にｒＤＥＮ１が感染できないという遺伝的基礎は、この時点では明らかにされなかった。しかしながら蚊の中腸に関する限定感染性という重要な特性は、それがワクチン接種者から媒介動物である蚊へのワクチンウイルスの伝達を大いに制限するのに役立つため、ワクチン候補において非常に望ましい。
【００９５】
【表１８】
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【００９６】
このようにして、ＤＥＮ４で最初に報告されたΔ３０突然変異を、ｒＤＥＮ１に移入す
ることに成功した。その結果生じたウイルスｒＤＥＮ１Δ３０は、サルおよびＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおいて組換えウイルスｒＤＥＮ４Δ３０と同様のレベルに弱毒化され、それにより異なるＤＥＮウイルスバックグラウンドにおいて、Δ３０突然変異により特定される弱毒表現型の保存が確立されることが示された。近年の臨床試験におけるｒＤＥＮ４Δ３０の有望な結果に基づいて（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65:
405-13）、ｒＤＥＮ１Δ３０はヒトにおいて適切に弱毒化される、と予測される。四価ワクチンを完成させるために、Δ３０突然変異を保有する弱毒化ｒＤＥＮ２およびｒＤＥＮ３組換えウイルスを調製することが考えられる。（下記の実施例３および４参照）。Δ３０突然変異が別のＤＥＮ血清型に運搬可能である表現型を特定するという実証は、四価ワクチンの開発に関して重要な意味を有する。これは、Δ３０突然変異がＤＥＮ２およびＤＥＮ３野生型ウイルスに対して対応する作用を有すると予測される、ということを示す。
【実施例３】
【００９７】
Δ３０突然変異を含有する組換えＤＥＮ２ウイルスの生成および特性化
ｒＤＥＮ１Δ３０の評価は、それが十分に弱毒化される、ということを示した。この結果に基づいて、ＤＥＮ２ワクチン候補の作製に本発明者らの技術を広げようと試みた。これを実行するために、Δ３０突然変異をＤＥＮ２のｃＤＮＡ中に導入した。トンガ王国における１９７４年のデング熱流行（トンガ／７４）からのＤＥＮ２ウイルス単離物（Gubler, D.J. et al. 1978 Am J Trop Med Hyg 27: 581-589）を、ｗｔＤＥＮ２を代表するものとして選択した。ＤＥＮ２（トンガ／７４）のゲノムを全部シーケンシングして、全長ｃＤＮＡクローンの構築のためのコンセンサス配列として役立てた（付録１）。ＤＥＮ２（トンガ／７４）のｃＤＮＡ断片を、図６Ａに示したゲノムの逆転写により生成した。各断片をプラスミドベクター中にサブクローニングして、それがウイルスについて決定されたコンセンサス配列と一致することを確認するためにシーケンシングした。これは、ゲノムに広がる７つのクローン化ｃＤＮＡ断片を生じた。クローン化断片を以下のように修飾した：ゲノムの５’末端を示す断片ＸをＳＰ６プロモーターに隣接させた；断片Ｌを、ゲノムヌクレオチド２３５３に翻訳的サイレントＳｐｅＩ制限部位を含有するよう修飾した；断片Ｒを、これもゲノムヌクレオチド２３５３に翻訳的サイレントＳｐｅＩ制限部位を含有するよう、最終的な全長クローンを安定化するよう修飾し、翻訳停止コドンがウイルスポリタンパク質を合成するために用いられたもの以外の全てのリーディングフレーム中に存在することを保証するように、ヌクレオチド２３６２〜２３６４および２３９７の２つのさらなる翻訳的サイレント突然変異を作製した。；断片Ａのヌクレオチド３５８２の天然ＳｐｅＩ制限部位を除去するよう、そしてヌクレオチド４４９７の天然ＫｐｎＩ制限部位を除去するよう修飾した；断片Ｃを、ヌクレオチド９３７４の天然ＫｐｎＩ制限部位を除去するよう修飾した；そしてゲノムの３’末端を表す断片ＹをＫｐｎＩ制限部位に隣接させた。各断片を、ＤＥＮ４  ｃＤＮＡクローンｐ４のＡｓｃＩおよびＫｐｎＩ制限部位間に増分的に付加して（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）、ｒＤＥＮ４およびｒＤＥＮ４Δ３０を生成するために首尾よく用いられた同一ベクターバックグラウンドで全長ＤＥＮ２  ｃＤＮＡクローン（ｐ２）を生成した。ｃＤＮＡクローンｐ２をシーケンシングして、ウイルスゲノム領域が、上記の翻訳的サイレント修飾を除いて、ＤＥＮ２（トンガ／７４）コンセンサス配列と一致することを確証した。Δ３０突然変異を断片Ｙ中に導入して、断片ＹΔ３０を生成した。ｐ２Δ３０を作製するために、ｐ２の断片Ｙ領域を断片ＹΔ３０で置換した（図６Ａ、Ｂ）。
【００９８】
転写および感染性ウイルスの生成のために、ｃＤＮＡ（ｐ２およびｐ２Δ３０）をＡｃｃ６５１（単一３’ヌクレオチドのみを残して切断するＫｐｎＩのアイソシゾマー）で線状化して、既に報告されているように（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139）、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応における鋳型として用いた。リポソーム媒介性トランスフェクションを用いて転写体をベロ細胞又はＣ６／３６蚊細胞中に導
入し、７日目に細胞培養上清を回収した。
【００９９】
ｒＤＥＮ２ウイルスをベロおよびＣ６／３６細胞の両方でｐ２  ｃＤＮＡから回収し、一方、ｒＤＥＮ２Δ３０は、Ｃ６／３６細胞でのみ、ｐ２Δ３０  ｃＤＮＡクローンから回収した（表１９）。ベロ又はＣ６／３６細胞においてプラークタイトレーションおよび免疫染色により検定した場合、Ｃ６／３６細胞において回収した感染性ウイルスのレベルは、ｐ２およびｐ２Δ３０  ｃＤＮＡクローンに関して比較可能であった。前に観察されたように、Ｃ６／３６細胞におけるトランスフェクションの効率は、ベロ細胞の場合より高かった。２つのｒＤＥＮ２Δ３０ウイルスを別個のｃＤＮＡクローン＃２および＃１０から回収した。
【０１００】
【表１９】
2005532044.tif 000021
【０１０１】
ｒＤＥＮ２およびｒＤＥＮ２Δ３０ウイルスのワーキングストックを生成するために、
トランスフェクション回収物を継代接種して、最終的にベロ細胞中で希釈して、ウイルスのゲノム配列を確定した。ｒＤＥＮ２ウイルスのベロ細胞トランスフェクション回収物を最終的にベロ細胞中で１回希釈し、そして個々のウイルスクローンをベロ細胞中で１回継代した。ｒＤＥＮ４  ＮＳ４Ｂ  ７１００〜７２００領域で同定された任意の相同ベロ細胞適応突然変異がこれらのウイルスクローン中に存在するか否かを査定するために、７つの個々の最終希釈クローンをこの領域全体でシーケンシングした。７つのｒＤＥＮ２ウイルスの各々は、ヌクレオチド７１６９にこの領域における単一ヌクレオチド置換（Ｕ＞Ｃ）を含有して、Ｖａｌ＞Ａｌａアミノ酸変化を生じた。このヌクレオチドはｒＤＥＮ４で同定された７１６２突然変異に対応し（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139）、これは、既知のベロ細胞適応表現型を有するが、このことは、この突然変異がｒＤＥＮ２ウイルスにおいて複製増強表現型を付与し得る、ということを示唆する。１つのｒＤＥＮ２ウイルスクローンを完全にシーケンシングして、７１６９突然変異のほかに、ミスセンス突然変異（Ｇｌｕ＞Ａｌａ）を残基３０５１のＮＳ５に見出した（表２０）。
【０１０２】
【表２０】
2005532044.tif 000022
【０１０３】
ベロ細胞中で増殖したｒＤＥＮ２およびｒＤＥＮ２Δ３０ウイルスはともに、既にｒＤＥＮ４で同定されたヌクレオチド７１６２のベロ細胞適応突然変異に対応する、ヌクレオ
チド７１６９での同一突然変異を獲得したため、この突然変異はベロ細胞におけるｒＤＥＮ２およびｒＤＥＮ２Δ３０の増殖適応と関連すると推論された。７１６９突然変異はベロ細胞中で直接ｒＤＥＮ２Δ３０を回収させ得る、と予測して、該突然変異をｒＤＥＮ２Δ  ３０  ｃＤＮＡプラスミド中に導入して、ｐ２Δ３０−７１６９を作製した。ｐ２Δ３０−７１６９、ならびにｐ２およびｐ２Δ３０から合成された転写体を、上記のようにリポソーム媒介性トランスフェクションを用いてベロ細胞又はＣ６／３６蚊細胞中に導入した。ウイルスｒＤＥＮ２Δ３０−７１６９を、ベロおよびＣ６／３６細胞の両方においてｐ２Δ３０−７１６９ｃＤＮＡから回収したが、一方、ｒＤＥＮ２Δ３０は、Ｃ６／３６細胞のみにおいてｐ２Δ３０  ｃＤＮＡクローンから回収した（表２１）。７１６９突然変異は、ベロ細胞中のｒＤＥＮ２Δ３０の回収のために必要且つ十分である。
【０１０４】
【表２１】
2005532044.tif 000023
【０１０５】
はじめに、動物モデルにおいてｒＤＥＮ２ウイルスを弱毒化するΔ３０突然変異の能力を査定するために、ＤＥＮ２（トンガ／７４）、ｒＤＥＮ２およびｒＤＥＮ２Δ３０ウイ
ルスの複製をＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおいて評価した。既に、ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおけるワクチン候補の弱毒化は感染のアカゲザルモデルにおける弱毒化の予測に役立つことが実証されている（実施例１および２）。この実験で試験した組換えウイルスをＣ６／３６細胞中で回収した。ＤＥＮ２トンガ／７４ウイルス単離物、ｒＤＥＮ２、ならびに２つの別個のｐ２Δ３０  ｃＤＮＡクローンから得た２つの別個のｒＤＥＮ２Δ３０ウイルス（クローン２０Ａおよび２１Ａ）をＣ６／３６細胞中で２回最終希釈した後、Ｃ６／３６細胞中でワーキングストックを生成した。これらのウイルスは、いかなるベロ細胞適応突然変異も含有すべきでない。ＤＥＮ２トンガ／７４ウイルスはＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスの血清中で６．２ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌの平均ウイルス力価に複製し、そしてｒＤＥＮ２ウイルスは類似レベルの５．６ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌに複製した（表２２）。両ｒＤＥＮ２Δ３０ウイルスは、ｒＤＥＮ２ウイルスと比較して複製に際して１００倍以上制限された。これらの結果は、Δ３０突然変異が、ｒＤＥＮ４およびｒＤＥＮ１ウイルスに関して観察されたものと同様に、ｒＤＥＮ２ウイルスの複製に及ぼす弱毒化作用を有する、ということを示す。
【０１０６】
【表２２】
2005532044.tif 000024
【０１０７】
ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおけるＤＥＮ２ウイルス複製も、ベロ細胞中で継代させたＤＥＮ２（トンガ／７４）、ｒＤＥＮ２およびｒＤＥＮ２Δ３０を用いて確定した（表
２０、脚注ｂおよびｄ参照）。ｒＤＥＮ２およびｒＤＥＮ２Δ３０はともに、ベロ細胞適応突然変異としてｒＤＥＮ４で同定された７１６２突然変異に対応する、ヌクレオチド７１６９のＮＳ４Ｂにおける突然変異を獲得していた。７１６９突然変異の存在下では、Δ３０突然変異はｒＤＥＮ２Δ３０の複製を１．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ低減した（表２３）。前に、Ｃ６／３６細胞中で増殖させた、７１６９突然変異を欠くウイルスを用いた場合には、Δ３０突然変異はｒＤＥＮ２Δ３０の複製を約２．５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ低減させることが示された（表２２）。これらの結果は、ＤＥＮ２におけるベロ細胞増殖適応はまた、ＨｕＨ−７肝細胞におけるわずかの増殖利点を付与し得る、ということを示す。それにもかかわらず、Δ３０突然変異により付与された弱毒化はこれらのベロ細胞増殖適応化ウイルスでは依然として認められる。
【０１０８】
【表２３】
2005532044.tif 000025
【０１０９】
若いアカゲザルにおけるｒＤＥＮ２Δ３０および野生型親ｒＤＥＮ２ウイルスの複製、
免疫原性および防御効力の評価を、以下のように実施した。上部肩領域の各側２箇所に１
ｍｌ用量中の５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵのウイルスを分けてデング熱ウイルス血清陰性サルに皮下注射した。サルを毎日観察し、０〜１０日目、ならびに２８日目に血液を回収し、血清を−７０℃で保存した。本実施例で用いられるウイルスはベロ細胞で継代し、組換えウイルスは表２０に示す突然変異を含有した（脚注ｂおよびｄ参照）。既に知られているベロ細胞中でのプラーク検定により、血清試料中のウイルスの力価を確定した（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）。２８日目血清試料に関するプラーク低減中和力価を既に報告されている方法で確定した（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）。５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵのｗｔＤＥＮ２（トンガ／７４）の単回投与を用いて２８日目に全てのサルを抗原誘発し、血液を１０日間回収した。ベロ細胞中でのプラーク検定により、抗原誘発後血清中のウイルス力価を確定した。ｗｔＤＥＮ２（トンガ／７４）又はｒＤＥＮ２を接種したサルは４〜５日間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価はそれぞれ２．１又は１．９ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０１１０】
ｒＤＥＮ２Δ３０を接種されたサルは２〜３日間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価は１．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであった（表２４、図７）が、これは、Δ３０突然変異がＤＥＮ２を弱毒化し得るが、しかしｒＤＥＮ１Δ３０で観察されたのと同一低レベルでない、ということを示す（表１６）。弱毒化ウイルスに関して予測されたように、免疫応答は、中和抗体力価で測定した場合、ｗｔＤＥＮ２（トンガ／７４）又はｒＤＥＮ２を用いた接種（表２４）と比較して、ｒＤＥＮ２Δ３０を用いた接種後に低下したが、依然としてｗｔＤＥＮ２ウイルス抗原誘発に対して動物を防御するには十分高かった（表２５）。したがってｒＤＥＮ２Δ３０に関するウイルス血症日数低減、平均ピーク力価低減および血清抗体応答低減は、Δ３０突然変異がアカゲザルに関してｒＤＥＮ２を弱毒化することを示す。
【０１１１】
【表２４】
2005532044.tif 000026
【０１１２】
【表２５】
2005532044.tif 000027
【０１１３】
人工乾燥血液を介した蚊であるネッタイシマカに関するＤＥＮ２（トンガ／７４）、ｒ
ＤＥＮ２およびｒＤＥＮ２Δ３０の感染性を、実施例５に詳述した方法を用いて評価した。しかしながら摂取された３．３〜３．５ｌｏｇ１０ｐｆｕの用量では、これら３つのウイルスはいかなる蚊にも感染せず、このことは、ＤＥＮ２（トンガ／７４）がネッタイシマカに対して貧感染性であることを示す。ｒＤＥＮ１を用いた場合と同様に、感染性のこの欠如に関する遺伝的基礎は未だ明らかにされていない。蚊の中腸に関する限定感染性という重要な特性は、それがワクチン接種者から媒介動物である蚊へのウイルスの伝達を大いに制限するのに役立つため、ワクチン候補においては非常に望ましい。
【０１１４】
ｒＤＥＮ４において同定されたいくつかのミスセンス突然変異は、乳仔マウス脳および／又はＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおいて弱毒化複製を付与することが実証されている（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139; Blaney, J.E. et al. 2001 J Virol 75: 9731-9740）。さらに、ベロ細胞中でのｒＤＥＮ４ウイルスの複製を増強するミスセンス突然変異が特性化されている。ＤＥＮウイルス血清型間の有意の配列保存は、ｒＤＥＮ４ウイルスにおいて同定された突然変異がｒＤＥＮ２ウイルスに同様の表現型を付与するものとして用いられると考える戦略を提供する。ｒＤＥＮ２ウイルス中で一部位に保存されるｒＤＥＮ４ウイルス中で同定された６つの突然変異は、ｐ２およびｐ２Δ３０  ｃＤＮＡクローン中に導入されるべきものである（表２６）。特に２つのｒＤＥＮ４突然変異ＮＳ３  ４８９１および４９９５（ベロ細胞適応表現型を付与し、マウス脳における複製を低減する）、１つの突然変異ＮＳ４Ｂ  ７１８２（ベロ細胞適応表現型を付与する）、ならびに３つの突然変異ＮＳ１  ２６５０、ＮＳ３  ５０９７および３’ＵＴＲ  １０６３４（マウス脳およびＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおける複製低減を付与する）が評価されるべきものである。これらの突然変異は、ｐ２およびｐ２Δ３０  ｃＤＮＡクローンのサブクローン化断片中に導入されており、そして突然変異型全長ｃＤＮＡクローンを生成するために用いられ（表２６）、これからウイルスがＣ６／３６細胞中で回収された（表２７）。これらの突然変異型ｒＤＥＮ２ウイルスの評価は、このような点突然変異が異なるＤＥＮウイルス血清型中に運搬され、そしてΔ３０欠失突然変異に関して実証されたように、同様に有用な表現型を付与し得るということを確定するものとして意図される。
【０１１５】
【表２６】
2005532044.tif 000028
【０１１６】
【表２７】
2005532044.tif 000029
【実施例４】
【０１１７】
Δ３０突然変異を含有する組換えＤＥＮ３ウイルスの生成および特性化
ｒＤＥＮ１Δ３０が十分に弱毒化されたため、ＤＥＮ３ワクチン候補の作製に本発明者らの技術を広げようと試みた。これを実行するために、ｒＤＥＮ２Δ３０を作製するために用いた方法と同様に、ＤＥＮ３のｃＤＮＡ中にΔ３０突然変異を導入した。田園地帯であるスレマン（中央インドネシア）における１９７８年のデング熱流行からのＤＥＮ３ウイルス単離物（スレマン／７８）（Gubler, D.J. et al. 1981 Am J Trop Med Hyg 30: 1094-1099）を、ｗｔＤＥＮ３を代表するものとして選択した。ＤＥＮ３（スレマン／７８）のゲノムを全部シーケンシングして、全長ｃＤＮＡクローンの構築のためのコンセンサス配列として役立てた（付録２）。ＤＥＮ３（スレマン／７８）のｃＤＮＡ断片を図８Ａに示したゲノムの逆転写により生成した。各断片をプラスミドベクター中にサブクローニングして、シーケンシングし、ウイルスにおいて確定されているコンセンサス配列と一致するかを確かめた。これは、ゲノムに広がる６つのクローン化ｃＤＮＡ断片を生じた。クローン化断片を以下のように修飾した：ゲノムの５’末端を示す断片５を、ＡｓｃＩ制限部位の後のＳＰ６プロモーターに隣接させた；断片１Ｌを、ゲノムヌクレオチド２３４５に翻訳的サイレントＳｐｅＩ制限部位を含有するよう修飾した；断片１Ｒを、これもゲノムヌクレオチド２３４５に翻訳的サイレントＳｐｅＩ制限部位を含有するよう、そして最終的な全長クローンを安定化するよう修飾し、ヌクレオチド２３５４〜２３５６、２３６０〜２３６２および２３９９の３つのさらなる翻訳的サイレント突然変異を作製して、翻訳停止コドンがウイルスポリタンパク質を合成するために用いられたもの以外の全てのリーディングフレーム中に存在する、ということを保証した；断片３を、ヌクレオチド９００７の天然ＫｐｎＩ制限部位を除去するよう修飾した；そしてゲノムの３’末端を表す断片４をＫｐｎＩ制限部位に隣接させた。各断片を、ＤＥＮ４  ｃＤＮＡクローンｐ４のＡｓｃＩおよびＫｐｎＩ制限部位間に増分的に付加して（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）、ｒＤＥＮ４およびｒＤＥＮ２を生成するために首尾よく用いられた同一ベクターバックグラウンドで全長ＤＥＮ３  ｃＤＮＡクローンを生成した。しかしながら断片１Ｌおよび１Ｒが同一ｃＤＮＡ分子に導入された場合、安定な全長クローンは大腸菌中で回収され得なかった。この不安定性を克服するために、正および逆オープンリーディングフレームの各々に重複した終止コドンを含有する合成ＤＮＡリンカー（図８Ａ）を、断片１Ｌが付加されて全長ｃＤＮＡ構築物が完成するのと同時にＳｐｅＩ制限部位に導入した。リンカー配列を含有するその結果生じたｐ３クローンは大腸菌中で安定であったが、これは、リンカー配列がこの領域に存在する有害要素を全て妨げるのに十分であった、ということを示す。ｃＤＮＡクローンｐ３をシーケンシングすると、ウイルスゲノムは、上記のリンカー配列および翻訳的サイレント修飾（付録２−除去されたリンカー配列とともに示される）を除いて、ＤＥＮ３（スレマン／７８）コンセンサス配列と一致することが判明した。Δ３０突然変異を断片４中に導入して、断片４Δ３０を生成し
た。ｐ３Δ３０を作製するために、ｐ３の断片４領域を断片４Δ３０で置換した（図８Ａ、Ｂ）。
【０１１８】
転写および感染性ウイルスの生成のために、ｃＤＮＡプラスミドｐ３およびｐ３Δ３０をＳｐｅＩで切断し、リンカー配列を除去するように再連結し、Ａｃｃ６５１（単一３’ヌクレオチドのみを残して切断するＫｐｎＩのアイソシゾマー）で線状化して、既に報告されているように、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応における鋳型として用いた（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139）。リポソーム媒介性トランスフェクションを用いて転写体をベロ細胞又はＣ６／３６蚊細胞中に導入し、１４日目に細胞培養上清を回収した。
【０１１９】
ｒＤＥＮ３ウイルスをベロおよびＣ６／３６細胞の両方でｐ３  ｃＤＮＡから回収し、一方、ｒＤＥＮ３Δ３０は、Ｃ６／３６細胞でのみ、ｐ３Δ３０  ｃＤＮＡクローンから回収した（表２８）。ベロ又はＣ６／３６細胞においてプラークタイトレーションにより検定した場合、Ｃ６／３６細胞において回収した感染性ウイルスのレベルは、ｐ３およびｐ３Δ３０  ｃＤＮＡクローンに関して比較可能であった。前に観察されたように、Ｃ６／３６細胞におけるトランスフェクションの効率は、ベロ細胞の場合より高かった。２つのｒＤＥＮ３Δ３０ウイルスを別個のｃＤＮＡクローン＃２２および＃４１から回収した。
【０１２０】
【表２８】
2005532044.tif 000030
【０１２１】
ウイルスのワーキングストックを生成するために、トランスフェクション回収物を継代接種して、ベロ細胞中で最終希釈して、ウイルスのゲノム配列を確定する。ベロ細胞にお
けるウイルス収率を改良するために、ヌクレオチド７１６２でｒＤＥＮ４で前に同定されたベロ細胞適応突然変異をｐ３およびｐ３Δ３０の相同ＮＳ４Ｂ領域に導入して、ｐ３−７１６４およびｐ３Δ３０−７１６４を作製した。この突然変異は、アミノ酸２３５７位でのＶａｌからＡｌａへの置換を生じる。ｒＤＥＮ２Δ３０に関して実証されたように、この突然変異は、ベロ細胞中でのウイルスの直接回収を可能にし（表２７）、そしてｒＤＥＮ３Δ３０に関して同一作用を有すると予測される。
【０１２２】
動物モデルにおいてｒＤＥＮ３ウイルスを弱毒化するΔ３０突然変異の能力を最初に査定するために、ＤＥＮ３（スレマン／７８）、ｒＤＥＮ３およびｒＤＥＮ３Δ３０ウイルスの複製をＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスおよびアカゲザルにおいて評価する。前に、ＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスにおけるワクチン候補の弱毒化は感染のアカゲザルモデルにおける弱毒化の予測に役立つことが実証されている（実施例１および２）。これらの突然変異型ｒＤＥＮ３ウイルスの評価は、Δ３０欠失突然変異がＤＥＮ３ウイルス血清型中に移入され、そしてＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ４に関して実証されたように、類似の有用な表現型を付与し得る、ということを確定すると考えられる。
【０１２３】
要するに、各血清型の野生型ＤＥＮウイルス中にΔ３０突然変異を導入して、適切に弱毒化された四価ワクチン処方物を生成するという戦略は、次の理由で独特のそして興味をそそるアプローチである。第一に、弱毒化に関与する突然変異は３’ＵＴＲにおける３０−ヌクレオチド欠失であり、したがって四価ワクチンの４つの構成成分の各々により発現される構造および非構造タンパク質は全て、真正野生型タンパク質であることを確証する。このような野生型タンパク質は、単にキメラデング熱ウイルスワクチン候補中に存在するＭおよびＥタンパク質によってというよりむしろ、広範なタンパク質によって抗体応答を発揮するはずである（Guirakhoo, F. et al. 2001 J Virol 75: 7290-304; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74: 3020-8）。このアプローチの独自性は、他の生弱毒化デング熱ウイルスワクチンがそれらの構造又は非構造タンパク質中に突然変異を有し（Butrapet, S. et al. 2000 J Virol 74: 3011-9; Puri, B. et al. 1997 J Gen Virol 78: 2287-91）、したがってこれらのウイルスにより誘導される免疫応答は野生型タンパク質に対してというよりむしろ突然変異型タンパク質に対してである、という事実に由来する。第二に、欠失突然変異は点突然変異より遺伝子的に安定であり、弱毒化表現型の復帰変異は考えられない。ヒトにおいて、ワクチン接種者の血清中に存在するＤＥＮ４Δ３０はそのΔ３０突然変異を保持しており、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその遺伝子安定性を確証する（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）。他の既存のデング熱生弱毒化ワ
クチン候補中の弱毒化突然変異は、低安定性点突然変異を基礎にしている（Butrapet, S.
et al. 2000 J Virol 74: 3011-9; Puri, B. et al. 1997 J Gen Virol 78: 2287-91）。第三に、Δ３０突然変異は四価ワクチンの４つのウイルスの各々に共通であるため、４つのワクチン血清型のいずれかの間の組換えは弱毒化突然変異の損失又は野生型表現型への復帰変異を引き起こさない。三価ポリオワクチンの構成成分間の組換えが観察されており（Guillot, S. et al. 2000 J Virol 74: 8434-43）、天然組換えデング熱ウイルスが記載されている（Worobey, M. et al. 1999  PNAS USA 96: 7352-7）が、これらは、２つの異なるウイルス間の遺伝子要素を交換するこのフラビウイルスの能力を示す。明らかに遺伝子交換は、組換えｃＤＮＡ技術を用いて異なるＤＥＮウイルス血清型間で容易に達成される（Bray, M. and Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88: 10342-6）。第四に、野生型構造タンパク質を有するウイルスは変更された構造タンパク質を有するウイルスより感染性であると思われる（Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74: 3020-80）。これは、最終ワクチン中の４つのウイルス構成成分の各々の少量の使用を可能にし、低コスト製造に寄与する。低コスト製造は、デング熱ウイルスワクチンの最終的有用性を明示するに際しての不可欠な要素である。
【実施例５】
【０１２４】
Δ３０突然変異を含有する型間キメラＤＥＮ２ウイルスの生成および特性化
ウイルスの構造タンパク質により誘導される抗体応答、主にエンベロープ（Ｅ）タンパク質に対する中和抗体応答により、デング熱ウイルスの４つの血清型を明らかにする。これらの構造タンパク質としては、Ｅ糖タンパク質、膜タンパク質（Ｍ）およびキャプシド（Ｃ）タンパク質が挙げられる。成熟ウイルス粒子は、脂質二分子膜を取り囲む十分に組織化された外部タンパク質殻、ならびに十分明らかにされていない内部ヌクレオキャプシドコアから成る（Kuhn, R.J. et al. 2002 Cell 108: 717-25）。Ｅ糖タンパク質は主要防御抗原であり、デング熱ウイルス感染に対する防御を付与するウイルス中和抗体を容易に誘導する。したがって有効なデング熱ワクチンは、４つの血清型、即ちＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４全てのＥタンパク質を最小限含有しなければならず、それにより広範な免疫を誘導して、ヘテロ型野生型デング熱ウイルスによる二次感染中にヒトにおいて起こるより重篤な疾病であるＤＨＦ／ＤＳＳの発症の可能性を排除する。前に報告された戦略（Bray, M. and Lai, C.J. 1991 PNAS USA 88: 10342-6）を基礎にして、組換えｃＤＮＡ技術を用いて、各血清型の構造タンパク質を保有する一組の型間キメラデング熱ウイルスから成る生弱毒化四価デング熱ウイルスワクチンを開発する。
【０１２５】
適切に弱毒化され、且つ免疫原性のＤＥＮ４組換えウイルス、即ちＤＥＮ４Δ３０の同定（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）後、ＤＥＮ４のＣ−Ｍ−Ｅ（ＣＭＥ）又はＭ−Ｅ（ＭＥ）遺伝子をプロトタイプＤＥＮ２ニューギニアＣ（ＮＧＣ）株由来の対応する遺伝子で置換したＤＥＮ４  ｃＤＮＡを基礎にしたキメラウイルスを生成した（図９Ａ）。ＣＭＥキメラウイルスを作製するために、ｒＤＥＮ４又はｒＤＥＮ４Δ３０いずれかに関するｃＤＮＡのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ領域を、ＤＥＮ２由来の類似の領域で置き換えた。同様にＭＥキメラウイルスを作製するために、ｒＤＥＮ４又はｒＤＥＮ４Δ３０いずれかにおけるｃＤＮＡのＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ領域を、ＤＥＮ２由来の相同領域に置き換えた。その結果生じた接合部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図９Ｂに示す。ｒＤＥＮ４Δ３０のヌクレオチド配列に関するGenBank寄託番号は、ＡＦ３２６８３７である。ＤＥＮ２  ＮＧＣに関するGenBank寄託番号はＭ２９０９５であって、これはＤＥＮ２  ＮＧＣのマウス神経毒性株を表し、下記の文献で既に用いられているプロトタイプ株とは異なる（Bray, M. et al. 1998 J Virol 72: 1647-51）。
【０１２６】
転写およびウイルスの生成のために、キメラｃＤＮＡクローンを線状化し、既に報告されているＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写反応（Durbin, A.P et al. 2001 Am J
Trop Med Hyg 65: 405-13）において、鋳型として用いた。リポソーム媒介性トランスフェクションを用いてベロ細胞中に転写体を導入し、組換えデング熱ウイルスを７日目に回収した。その結果生じたウイルスのゲノムを、既に報告されている回収ウイルスから単離したウイルスＲＮＡの配列を分析する方法により確証した（Durbin, A.P et al. 2001 Am
J Trop Med Hyg 65: 405-13）。組織培養中でのウイルス継代から生じた偶発的突然変異を全てのウイルスにおいて同定し、表２９に列挙する。注目すべきことに、各ウイルスが前に同定されたｒＤＥＮ４の突然変異に対応するＮＳ４Ｂにおけるミスセンス突然変異を含有し、これは、ベロ細胞中での複製への適応性に関連していた（ｒＤＥＮ４およびキメラウイルス間のヌクレオチド位置の相関に関しては表３０参照）。ウイルスは全て、ベロ細胞中で６．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌを超える力価に複製したが、このことは、キメラウイルスが、Δ３０突然変異を含有するものでさえ、細胞培養中で効率的に複製することを示し、これはワクチンの製造に不可欠な特性である。
【０１２７】
【表２９】
2005532044.tif 000031
【０１２８】
【表３０】
2005532044.tif 000032
【０１２９】
サルにおける安全性、免疫原性および効力試験の結果を、表３１に示す。野生型ＤＥＮ
２を接種したサルは、約５日間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価は２．１ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであったが、一方、キメラＤＥＮ２ウイルスのいずれかを接種したサルは１．２日又はそれ以下の間ウイルス血症を示し、１．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ未満の平均ピーク力価を有した。ウイルス血症の大きさおよび持続時間のこの低減は、ＤＥＮ２のＣＭＥ又はＭＥタンパク質を含有するキメラウイルスが親ＤＥＮ２  ＮＧＣウイルスより弱毒化された、ということを明らかに示す。野生型ＤＥＮ２を摂取した動物も、ＤＥＮ２／４キメラウイルスを摂取した動物も病気にならなかった。サルにおける弱毒化ウイルスの複製低減に伴って、接種サルの免疫応答の低下が起こる。これは、表３１に示されており、野生型ウイルスを接種した動物において達成された力価と比較した場合に、キメラウイルスによる接種後に中和抗体のレベルが約５分の１に低減した。ＣＭＥキメラウイルスへのΔ３０突然変異の付加はウイルスをさらに弱毒化し、したがってｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）はサルにおいて検出可能レベルに複製せず、検出可能免疫応答を誘導しなかった。このウイルスは過剰弱毒化されたと思われ、そして同様の結果がヒトで観察された場合は、このウイルスはワクチンとして用いるのに適していない。しかしながらＭＥキメラウイルスへのΔ３０突然変異の付加は、このキメラウイルスをさらに弱毒化せず、その結果生じたｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）ウイルスは、ワクチンとして用いるために十分に弱毒化され、免疫原性であると思われる。
【０１３０】
【表３１】
2005532044.tif 000033
【０１３１】
前の実施例に記載したように、ＨｕＨ−７細胞を移植されたＳＣＩＤマウスはデング熱
ウイルス弱毒化の評価のための感受性モデルである。各キメラＤＥＮ２／４ウイルスをＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスの群に接種し、血清中のウイルスのレベルを測定した（表３２）。キメラウイルスは、親ウイルス（ｒＤＥＮ４およびＤＥＮ２−ＮＧＣ）よりも２０〜１５０倍低いレベルに複製した。ＣＭＥキメラウイルスは、相当するＭＥキメラウイルスよりわずかに弱毒化され、Δ３０突然変異は０．５ｌｏｇ１０の複製低減を示した。Δ３０突然変異により発揮された弱毒化のこのレベルは、ｒＤＥＮ４Δ３０に関して前に観察されたものと同様であった。
【０１３２】
【表３２】
2005532044.tif 000034
【０１３３】
蚊における各ＤＥＮ２／４キメラウイルスの複製レベルを評価するために、蚊の２つの
異なる属を実験的に感染させた。ウイルス含有乾燥血液を摂取させることにより、ネッタイシマカを感染させた。中腸および頭部組織の両方におけるウイルス抗原の存在を評価することにより、局所組織（中腸）に関して感染性を確定し、そして中腸バリアを超えた組織（頭部）中で播種し、複製するウイルスの能力も測定することができた。頭部中のウイルスの存在は、中腸中で複製し、次に頭部の唾液腺に播種する摂取ウイルスの能力、ならびに唾液腺中で複製するウイルスの生得能力により限定される。トキソリンキテススプレンデンス（Toxothynchites splendens）中へのウイルスの胸腔内接種は、蚊の中腸バリアを迂回する。親ウイルスｒＤＥＮ４およびＤＥＮ２−ＮＧＣはネッタイシマカおよびトキソリンキテススプレンデンス（T. splendens）に容易に感染し（表３３）、ＤＥＮ２−ＮＧＣはT. splendensにおいてより感染性であると思われた。ｒＤＥＮ２／４キメラウイルスも各々、両方の蚊の型で試験した。多くの場合、いくつかのウイルスの非常に低い感染性のために、検出可能な感染を達成するのに十分な力価で非希釈ウイルスストックをネッタイシマカに接種することはできなかった。それにもかかわらず、ｒＤＥＮ２／４キメラウイルスが中腸および頭部に関して低感染性である、ということは明らかである。約４．０ｌｏｇ１０ＰＦＵの最大用量で投与される親ウイルスｒＤＥＮ４およびＤＥＮ２−ＮＧＣは、それぞれ中腸標本の７４％および９４％、そして頭部標本の３２％および７１％で検出可能であった。キメラウイルス間で、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）に関して観察されるように、最高レベルの感染性は、２６％の感染中腸試料および６％頭部試料のみを生じた。より許容的なトキソリンキテススプレンデンスでは、ｒＤＥＮ２／４キメラウイルスは一般に親ウイルスより低感染性で、ＣＭＥキメラウイルスはＭＥウイルスより低感染性であった。Δ３０突然変異は、ｒＤＥＮ２／４キメラウイルスに関して、既に観察されたもの（Troyer, J.M. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 414-419）と同様のトキソリンキテススプレンデンスにおけるウイルス感染性に及ぼす識別可能な作用を有さない、ということがＤＥＮ４に関して報告されている。
【０１３４】
【表３３】
2005532044.tif 000035
【０１３５】
ｒＤＥＮ４Δ３０ウイルスを用いたＤＥＮ２構造遺伝子のキメラ化は、いずれかの親ウイルスに比してベロ細胞中での複製低減を有するウイルスｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ
）を生じた。ベロ細胞中でのＤＥＮワクチン候補のウイルス収率増大の一手段としてのベロ細胞適応突然変異を評価するために（Blaney, J.E. et al. 2002 Virology 300: 125-139）、選定突然変異をこのキメラウイルス中に導入した。したがって適応突然変異を保有するｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）ウイルスを回収し、最終希釈して、ベロ細胞中のウイルス収率が増大され得るか否かを測定するためにＣ６／３６細胞中で増殖させた。
【０１３６】
ベロ細胞適応突然変異を保有するｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）ウイルスを、以下のように生成した。単一又は二重ＤＥＮ４ベロ細胞適応突然変異を包含するｒＤＥＮ４  ｃＤＮＡ構築物からＤＮＡ断片を切り出して、ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）のｃＤＮＡクローン中に導入した。配列分析によりベロ細胞適応突然変異の存在を確証し、そして突然変異型ｃＤＮＡクローン由来のＲＮＡ転写体をトランスフェクトし、最終希釈して、Ｃ６／３６細胞中で増殖させた。
【０１３７】
増殖動態の評価のために、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で指示ウイルスをベロ細胞に感染させた。二重反復２５ｃｍ３組織培養フラスコ中の集密的細胞単層を洗浄し、指示ウイルスを含有する接種物１  ｍｌを載せた。３７℃で２時間接種後、細胞をＭＥＭ中で３回洗浄し、２％ＦＢＳを補充したＭＥＭ  ５ｍｌを添加した。組織培養培地の１  ｍｌアリコートを取り出し、新鮮な培地と取り替えて、０日目時点とした。感染後の指示時点で、組織培養培地の１  ｍｌ試料を取り出し、遠心分離で清澄化して、−８０℃で凍結した。ウイルス複製のレベルをＣ６／３６細胞中でプラークタイトレーションにより検定し、イムノペルオキシダーゼ染色により可視化した。検出限界は、＜０．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０１３８】
ＮＳ４Ｂ−７１５３、−７１６２、−７１６３、−７１８２、ＮＳ５−７６３０に単一ベロ細胞適応突然変異又は突然変異の３つの組合せを保有するｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）ウイルスの増殖特性をベロ細胞でｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）ウイルスと比較した（図１０）。導入ベロ細胞適応突然変異を有さないｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）ウイルスは４．４ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌでピークを生じる。個々の適応突然変異および併合突然変異は各々、複製の実質的増大を付与した。特にｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）−７１８２は７．１ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌの最高力価に増殖し、これは収率５００倍増であった。ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）−７１６２は最低収率を有したが、しかしｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）ウイルスによる複製のレベルを上回る１２５倍増であった。ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＣＭＥ）ウイルスへの２つの適応突然変異の導入は、単一ベロ細胞適応突然変異を保有するウイルスの場合を上回るウイルス収率の顕著な増大は見られなかった。ここで観察されたキメラワクチン候補へのベロ細胞適応突然変異の導入によるウイルス収率の５００倍までの増大は、ＤＥＮウイルス中の特異的複製促進配列を同定し、特性化する価値を示す。
【０１３９】
これらの結果は、生弱毒化デング熱ウイルスワクチンの開発のために特に意義を有する。第一に、キメラ化は、アカゲザル、ＨｕＨ７−ＳＣＩＤマウスおよび蚊における研究によって示されたように、結果的に生じるウイルスの弱毒化をもたらす、ということが明らかである。この結論はＤＥＮ２／ＤＥＮ４又はＤＥＮ１／ＤＥＮ４キメラウイルスに関する従来の研究においてはなされなかった（Bray, M. et al. 1996 J Virol 70: 4162-6）が、しかしデータの注意深い検討は、キメラウイルスが野生型親ウイルスと比較して、サルにおいてより多く弱毒化される、ということを示唆する。第二に、Δ３０突然変異は、キメラ依存的方法でこの弱毒化をさらに増大する。特に本実施例においては、ＤＥＮ２のＣＭＥ領域を保有するキメラウイルスはΔ３０の付加により過剰弱毒化されたが、一方、ＤＥＮ２のＭＥ領域だけを保有するキメラウイルスの弱毒化表現型はΔ３０突然変異の付加により偏向されなかった。この予期せぬ知見は、Δ３０突然変異などの共有弱毒化突然変異を保有する個々の構成成分ウイルスからなる四価ワクチンにおいては、Δ３０突然変
異を保有するＣＭＥキメラウイルスはアカゲザルにおいて過剰弱毒化され、ヒトでは限定免疫原性を提供するに過ぎない可能性があるため、ＭＥキメラウイルスのみが利用され得る、ということを示す。
【実施例６】
【０１４０】
Δ３０突然変異を含有する型間キメラＤＥＮ３ウイルスの生成および特性化
インドネシアのスレマン地域での１９７８年のデング熱流行からのウイルス単離物であるＤＥＮ３（スレマン／７８）由来の対応する遺伝子で、ＣＭＥ又はＭＥ遺伝子が置換されたＤＥＮ４  ｃＤＮＡに基づいたキメラウイルスが生成されている（Gubler, D.J. et al. 1981 Am J Trop Med Hyg 30: 1094-1099）（付録２）。ＤＥＮ２キメラウイルスに関して実施例５に記載したように、ｒＤＥＮ４又はｒＤＥＮ４Δ３０に関するｃＤＮＡのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ領域をＤＥＮ３（スレマン／７８）由来の同様の領域で置き換えることにより、ＤＥＮ３に関するＣＭＥキメラウイルスを生成した（図１１Ａ）。同様に、ＭＥキメラウイルスを作製するために、ｒＤＥＮ４又はｒＤＥＮ４Δ３０のいずれかに関するｃＤＮＡのＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ領域をＤＥＮ３（スレマン／７８）由来の同様の領域で置き換えた。その結果生じた接合部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図１１Ｂに示す。その結果生じたウイルスのゲノムを、既に報告されている方法（Durbin, A.P et al.
2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-13）で、回収したウイルスから単離されたウイルスＲＮＡの配列分析により決定した。組織培養中でのウイルス継代から生じた偶発的突然変異を全てのウイルスにおいて同定し、表３４に列挙する。注目すべきことに、各ウイルスがｒＤＥＮ４からの前に同定された突然変異に対応するＮＳ４Ｂにおけるミスセンス突然変異を含有し、そしてベロ細胞中での増殖の適応性と関係していた（ｒＤＥＮ４およびキメラウイルス間のヌクレオチド位置の相関に関しては表３０参照）。ウイルスは全て、ベロ細胞中で５．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌを超える力価に複製したが、このことは、キメラウイルスが、Δ３０突然変異を含有するものでさえ、細胞培養中で効率的に複製することを示し、これはワクチンの製造に不可欠な特性である。
【０１４１】
【表３４】
2005532044.tif 000036
【０１４２】
前の実施例に記載したように、ＨｕＨ−７細胞を移殖されたＳＣＩＤマウスはデング熱
ウイルス弱毒化の評価のための感受性モデルである。各キメラＤＥＮ３／４ウイルスをＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスの群に接種し、血清中のウイルスのレベルを確定した（表３５）。キメラウイルスｒＤＥＮ３／４（ＣＭＥ）は弱毒化されなかったが、一方、残りのキメラウイルスは、親ウイルス（ｒＤＥＮ４およびＤＥＮ３−スレマン／７８）のいずれよりも４０〜４００倍低いレベルに複製した。ＣＭＥキメラウイルスでは、Δ３０突然変異は顕著な複製の２．７ｌｏｇ１０低減を示した。Δ３０突然変異により付与された弱毒化のこのレベルは、ｒＤＥＮ４Δ３０に関して前に観察されたものよりずっと大きかった。ｒＤＥＮ３／４（ＭＥ）ウイルスはいずれの親ウイルスに比しても複製が１００分の１に低減したが、このことは、ＭＥキメラ化がそれ自体弱毒性であったことを示す。ｒＤＥＮ３／４（ＭＥ）へのΔ３０突然変異の付加は、さらなる弱毒化を生じなかった。
【０１４３】
【表３５】
2005532044.tif 000037
【０１４４】
サルにおけるＤＥＮ３キメラ組換えウイルスおよび野生型ＤＥＮ３ウイルスの複製およ
び免疫原性の評価を、実施例５に記載したように実施した。サルにおけるこの安全性および免疫原性試験の結果を表３６に示す。ｒＤＥＮ３／４（ＣＭＥ）および野生型ＤＥＮ（スレマン／７８）を接種したサルは、それぞれ約２日間ウイルス血症を示し、平均ピーク力価は１．６〜１．８ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであったが、このことは、ＤＥＮ３のＣＭＥ構造遺伝子のキメラ化が、ＤＥＮ２キメラ化に関して観察されたものとは異なるパターンであるウイルス複製の弱毒化をもたらさなかった、ということを示す（表３１）。しかしながらＭＥ構造遺伝子のキメラ化はサルにおける検出不可能なウイルス血症を伴う弱毒化ウイルスを生じたが、しかし全てのサルが抗体陽転（seroconvert）し、血清抗体レベルは１０倍以上増大した。弱毒化ウイルスに関して予測されるように、免疫応答は、中和抗体力価により測定した場合、ｗｔＤＥＮ３（スレマン７８）による接種と比較してキメラウイルスのいずれかでの接種後により低かったが、ｗｔＤＥＮ３ウイルス抗原誘発に対して動物を防御するには依然として十分に高かった（表３７）。ｒＤＥＮ３／４（ＣＭＥ）へのΔ３０突然変異の付加が、結果的に生じるウイルスｒＤＥＮ３／４Δ３０（ＣＭＥ）をさらに弱毒化し得たことは明らかである。
【０１４５】
【表３６】
2005532044.tif 000038
【０１４６】
【表３７】
2005532044.tif 000039
【０１４７】
蚊における各ＤＥＮ３／４キメラウイルスの複製レベルを評価するために、ウイルス含
有乾燥血液を摂取させることにより、ネッタイシマカを感染させた（表３８）。親ウイルスｒＤＥＮ４およびＤＥＮ３（スレマン／７８）はネッタイシマカに容易に感染した。各々のｒＤＥＮ３／４キメラウイルスも試験した。多くの場合、いくつかのウイルスの非常に低い感染性のために、検出可能な感染を達成するのに十分な力価の非希釈ウイルスストックでネッタイシマカを感染させることはできなかった。約２．８〜２．９ｌｏｇ１０ＰＦＵの用量では、ｒＤＥＮ４、ＤＥＮ３（スレマン／７８）およびｒＤＥＮ３／４（ＣＭＥ）は等しく感染性であり、そして等しい効率で頭部に播種された。残りのキメラウイルスに関しては、感染は３．４ｌｏｇ１０ＰＦＵの用量でも検出可能でなかったが、このことは、ｒＤＥＮ３／４（ＭＥ）およびｒＤＥＮ３／４Δ３０（ＣＭＥ）の複製がネッタイシマカにおいて制限されることを示す。ｒＤＥＮ３／４（ＣＭＥ）およびｒＤＥＮ３／４Δ３０（ＣＭＥ）の感染性を比較することにより、Δ３０突然変異が蚊に関してキメラウイルスをさらに弱毒化し得る、ということは明らかである。
【０１４８】
【表３８】
2005532044.tif 000040
【実施例７】
【０１４９】
Δ３０突然変異を含有する型間キメラＤＥＮ１ウイルスの生成および特性化
プエルトリコでの１９９４年のデング熱流行からのウイルス単離物であるＤＥＮ１（プエルトリコ／９４）由来の対応する遺伝子で、ＣＭＥ又はＭＥ遺伝子が置換されたＤＥＮ４  ｃＤＮＡに基づいたキメラウイルスが生成されている（付録３および４）。ＤＥＮ２キメラウイルスに関して実施例４に記載したように、ｒＤＥＮ４又はｒＤＥＮ４Δ３０のいずれかに関するｃＤＮＡのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ領域をＤＥＮ１（プエルトリコ／９４）由来の同様の領域で置き換えることにより、ＤＥＮ１に関するＣＭＥキメラウイルスを生成した（図１２Ａ）。同様に、ＭＥキメラウイルスを作製するために、ｒＤＥＮ４又はｒＤＥＮ４Δ３０のいずれかにおけるｃＤＮＡのＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ領域をＤＥＮ１（プエルトリコ／９４）由来の同様の領域で置き換えた。その結果生じた接合部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図１２Ｂに示す。
【０１５０】
転写およびウイルスの生成のために、キメラｃＤＮＡクローンを線状化し、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写反応における鋳型として用いた。リポソーム媒介性トランスフェクションを用いてＣ６／３６蚊細胞中に転写体を導入し、組換えデング熱ウイルスを７〜１４日目に回収した。その後ベロ細胞中でウイルスを増殖させ、ベロ細胞中での最終希釈により生物学的にクローン化した。ウイルスは全て、ベロ細胞中で６．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌを超える力価に複製したが、このことは、キメラウイルスが、Δ３０突然変異を含有するものでさえ、細胞培養中で効率的に複製することを示す。組織培養中でのウイルス継代から生じる偶発的突然変異を同定するために、ゲノム配列分析が現在進行中である。
【０１５１】
蚊におけるＤＥＮ１／４（ＣＭＥ）およびｒＤＥＮ１／４Δ３０（ＣＭＥ）キメラウイルスの複製レベルを評価するために、ウイルス含有乾燥血液を摂取させることにより、ネッタイシマカを感染させた（表３９）。親ウイルスｒＤＥＮ４は、４．０ｌｏｇ１０ＰＦＵのＭＩＤ５０でネッタイシマカを感染させた。しかしながら親ウイルスＤＥＮ１（プエルトリコ／９４）は３．４ｌｏｇ１０ＰＦＵまでの用量ではネッタイシマカを感染させることができなかった。したがってＣＭＥキメラウイルスＤＥＮ１／４およびｒＤＥＮ１／４Δ３０は、何れもネッタイシマカへの感染能力がない。したがってＤＥＮ２／４およびＤＥＮ３／４キメラウイルスに関して用いたものと同様の方法でＤＥＮ１／４キメラウイルスの感染性に及ぼすΔ３０突然変異の作用を評価することは、ネッタイシマカにおいては必要ない。
【０１５２】
【表３９】
2005532044.tif 000041
【０１５３】
前の実施例に記載したように、ＨｕＨ−７細胞を移殖されたＳＣＩＤマウスはデング熱
ウイルス弱毒化の評価のための感受性モデルである。各キメラＤＥＮ１／４ウイルスをＳＣＩＤ−ＨｕＨ−７マウスの群に接種し、血清中のウイルスのレベルを確定した（表４０）。キメラウイルスは、親ウイルス、ｒＤＥＮ４およびＤＥＮ１（プエルトリコ／９４）のいずれよりも１５〜２５０倍低いレベルに複製した。ＣＭＥキメラウイルスは相当するＭＥキメラウイルスより多く弱毒化され、Δ３０突然変異は０．８ｌｏｇ１０の複製の低減を示した。ＣＭＥキメラウイルスにおいてΔ３０突然変異により発現したこの弱毒化のレベルは、ｒＤＥＮ４Δ３０に関して前に観察されたものと同様であった。しかしながらＭＥキメラウイルスにおけるΔ３０突然変異の弱毒作用は識別不可能である。
【０１５４】
【表４０】
2005532044.tif 000042
【０１５５】
平明および理解のために多少詳しく本発明を説明してきたが、本発明の真の範囲を逸脱
せずに形態および詳細における種々の変更がなされ得る、と当業者は認識する。上記で言及した図、表、付録、特許、特許出願および出版物は全て、参照により本明細書中で援用される。
【０１５６】
【表４１】
2005532044.tif 000043
【０１５７】
【表４２】
2005532044.tif 000044
【０１５８】
【表４３−１】
2005532044.tif 000045
【表４３−２】
2005532044.tif 000046
【表４３−３】
2005532044.tif 000047
【表４３−４】
2005532044.tif 000048
【表４３−５】
2005532044.tif 000049
【表４３−６】
2005532044.tif 000050
【表４３−７】
2005532044.tif 000051
【表４３−８】
2005532044.tif 000052
【表４３−９】
2005532044.tif 000053
【表４３−１０】
2005532044.tif 000054
【表４３−１１】
2005532044.tif 000055
【表４３−１２】
2005532044.tif 000056
【表４３−１３】
2005532044.tif 000057
【表４３−１４】
2005532044.tif 000058
【表４３−１５】
2005532044.tif 000059
【表４３−１６】
2005532044.tif 000060
【表４３−１７】
2005532044.tif 000061
【０１５９】
【表４４−１】
2005532044.tif 000062
【表４４−２】
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【表４４−３】
2005532044.tif 000064
【表４４−４】
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【表４４−５】
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【表４４−６】
2005532044.tif 000067
【表４４−７】
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【表４４−８】
2005532044.tif 000069
【表４４−９】
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【表４４−１０】
2005532044.tif 000071
【表４４−１１】
2005532044.tif 000072
【表４４−１２】
2005532044.tif 000073
【表４４−１３】
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【表４４−１４】
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【表４４−１５】
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【表４４−１６】
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【表４４−１７】
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【０１６０】
【表４５−１】
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【表４５−２】
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【表４５−３】
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【表４５−４】
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【０１６１】
【表４６−１】
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【表４６−２】
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【表４６−３】
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【表４６−４】
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【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】４つの血清型の各々を表すデング熱ウイルスを含有する生きた弱毒化四価デング熱ウイルスを示し、各血清型はその全組の非変更野生型の構造および非構造タンパク質、ならびに共通のΔ３０弱毒化突然変異を含有する。各構成成分の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中のΔ３０突然変異の相対位置を矢印で示す。
【図２】Ａ．  Δ３０突然変異は、ＤＥＮ４の３’ＵＴＲから３０連続ヌクレオチド（陰影部分）を除去する。ヌクレオチドは、３’末端から数える。Ｂ．  ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４のＴＬ２領域ならびにそれらのΔ３０誘導体のヌクレオチド配列アラインメント。４つのＤＥＮ血清型の各々に関して対応する領域も示す。大文字は４つの血清型全ての間の配列相同を示し、下線はステム構造を形成するヌクレオチド対合を示す。Ｃ．  各ＤＥＮ血清型のＴＬ２領域の予測二次構造。Δ３０突然変異により除去されるヌクレオチドを四角で囲む（ＤＥＮ１−ｎｔｓ１０５６２〜１０５９１の間、ＤＥＮ２トンガ／７４−ｎｔｓ１０５４１〜１０５７０の間、ＤＥＮ３スレマン／７８−ｎｔｓ１０５３５〜１０５６５の間およびＤＥＮ４−ｎｔｓ１０４７８〜１０５０７の間）。
【図３】５−ＦＵ由来突然変異を保有するｒＤＥＮ４ワクチン候補を接種されたアカゲザルにおけるウイルス血症レベル。４匹又は２匹（ｒＤＥＮ４およびｒＤＥＮ４Δ３０）のサルの群に５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵウイルスを皮下接種した。血清を毎日回収し、ベロ細胞におけるプラーク検定によりウイルス力価を確定した。ウイルス検出限界は、０．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであった。平均ウイルス力価を、各群に関して示す。
【図４】ＮＳ５における荷電アミノ酸→アラニン突然変異の対を保有するｒＤＥＮ４ワクチン候補を接種されたアカゲザルにおけるウイルス血症レベル。４匹又は２匹（ｒＤＥＮ４およびｒＤＥＮ４Δ３０）のサルの群に５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵウイルスを皮下接種した。血清を毎日回収し、ベロ細胞におけるプラーク検定によりウイルス力価を確定した。ウイルス検出限界は、１．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであった。平均ウイルス力価を、各群に関して示す。ウイルス血症は、４日目以後はいかなるサルにおいても検出されなかった。
【図５】Δ３０突然変異は、アカゲザルに関してＤＥＮ１およびＤＥＮ４の両方を弱毒化する。４匹のサルの群に５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵの指示ウイルスを皮下で免疫感作した。免疫感作後に毎日、血清を回収し、ウイルス力価を確定して、平均のｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ値として示す。
【図６】Ａ．  ｐ２（トンガ／７４）全長ｃＤＮＡプラスミドの略図。サブクローニングされた領域をプラスミドの上に示す。番号付けは、ウイルス配列の５’末端で開始する。Ｂ．  Δ３０突然変異は、３’ＵＴＲ配列から指示３０ヌクレオチドを除去して、ｐ２Δ３０を作製する。
【図７】ＤＥＮ２（トンガ／７４）、ｒＤＥＮ２およびｒＤＥＮ２Δ３０ワクチン候補を接種されたアカゲザルにおけるウイルス血症レベル。４匹のサルの群に５．０ｌｏｇ１０ＰＦＵウイルスを皮下接種した。血清を毎日回収し、ベロ細胞におけるプラーク検定によりウイルス力価を確定した。ウイルス検出限界は、０．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであった。平均ウイルス力価を、各群に関して示す。ウイルス血症は、８日目以後はいかなるサルにおいても検出されなかった。
【図８】Ａ．  ｐ３（スレマン／７８）全長ｃＤＮＡプラスミドの略図。サブクローニングされた領域をプラスミドの上に示す。番号付けは、ウイルス配列の５’末端で開始する。ＳｐｅＩリンカーの配列および挿入位置を示す。Ｂ．  Δ３０突然変異は、３’ＵＴＲ配列から指示３１ヌクレオチドを除去して、ｐ３Δ３０を作製する。
【図９】ＤＥＮ４遺伝子のバックグラウンド中にＤＥＮ２（トンガ／７４）のＣＭＥ又はＭＥ領域を導入することにより、組換えキメラデング熱ウイルスを構築した。３’ＵＴＲ中のΔ３０突然変異の相対的位置を矢印により示し、型間接合部１、２および３を示す。Ｂ．  型間接合部領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーに用いられる制限酵素認識部位を示す。
【図１０】単一又は組合せベロ細胞適応突然変異をコードするキメラｒＤＥＮ２／４Δ３０ウイルスのベロ細胞中の増殖動態。ベロ細胞を、０．０１のＭＯＩで指示ウイルスに感染させる。感染後の指示時点で、組織培養培地の試料１  ｍｌを取り出し、遠心分離により清澄化し、−８０℃で凍結させる。Ｃ６／３６細胞におけるプラークタイトレーションにより、ウイルス複製レベルを検定した。より低い検定限界は０．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌであった。感染後４日目の複製レベルを破線で示す。
【図１１】Ａ．  ＤＥＮ４遺伝子のバックグラウンド中にＤＥＮ３（スレマン／７８）のＣＭＥ又はＭＥ領域のいずれかを導入することにより、組換えキメラデング熱ウイルスを構築した。３’ＵＴＲ中のΔ３０突然変異の相対的位置を矢印により示し、型間接合部１、２および３を示す。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーに用いられる制限酵素認識部位を示す。Ｂ．  型間接合部領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーに用いられる制限酵素認識部位を示す。
【図１２】ＤＥＮ４遺伝子のバックグラウンド中にＤＥＮ１（プエルトリコ／９４）のＣＭＥ又はＭＥ領域のいずれかを導入することにより、組換えキメラデング熱ウイルスを構築した。３’ＵＴＲ中のΔ３０突然変異の相対的位置を矢印により示し、型間接合部１、２および３を示す。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーに用いられる制限酵素認識部位を示す。Ｂ．  型間接合部領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーに用いられる制限酵素認識部位を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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