(57)【要約】本発明は、第２次元の分析を必要に応じて併用することで、等電点によって生体分子を分析するための、マトリックス、アレイ、システムおよび方法に関する。本明細書中で提供されるマトリックス、アレイ、システムの各種取り合わせは、電場の影響下での生体分子を、その生体分子の等電点と同じｐＨ値を備えるＩＥＦバッファへと蓄積させることを引き起こすのに有用である。本方法は、例えば、研究目的および診断目的について有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）バッファが０．１ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、分離された等電点電気泳動（ＩＥＦ）バッファまたは該ＩＥＦバッファを含むセルを含む、マトリクス層。
【請求項２】
前記ＩＥＦバッファまたは前記ＩＥＦバッファを含むセルが０．０２ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、請求項１に記載のマトリクス層。
【請求項３】
前記マトリクス層が複数の分離された等電点電気泳動（ＩＥＦ）バッファまたはＩＥＦバッファを含む分離されたセルを含む、請求項１に記載のマトリクス層。
【請求項４】
前記ＩＥＦバッファまたは前記セルが、０．１ｐＨ単位以下のｐＨステップを有する、請求項３に記載のマトリクス層。
【請求項５】
前記ｐＨステップが０．０２ｐＨ単位以下である、請求項４に記載のマトリクス層。
【請求項６】
前記ＩＥＦバッファまたセルの一つの側を除いて全ての側が、生体分子不透過性領域であり、そして必要に応じてイオン不透過性領域である、請求項１に記載のマトリクス層。
【請求項７】
前記複数のＩＥＦバッファまたセルの一つの側を除いて全ての側が、生体分子不透過性であり、そして必要に応じてイオン不透過性領域である、請求項３に記載のマトリクス層。
【請求項８】
システムであって、以下：
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセル；
（ｃ）ＩＥＦバッファまたはセルの内外で交流電場を生成するためのデバイス；ならびに必要に応じて
（ｄ）該ＩＥＦバッファまたはセルに亘って該泳動バッファを循環するためのデバイス
を備える、システム。
【請求項９】
前記ＩＥＦバッファが０．１ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ＩＥＦバッファが０．０２ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記システムが複数のＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセルを備える、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記複数の、ＩＥＦバッファまたはセルが互いに分離されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルが０．１ｐＨ単位以下のｐＨステップを有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルが０．０２ｐＨ単位以下のｐＨステップを有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記ＩＥＦバッファまたはセルにわたって前記泳動バッファを循環させるためのデバイスをさらに備える、請求項８に記載のシステム。
【請求項１６】
前記電場に対して平行に整列して配置されているときに、前記複数の、ＩＥＦバッファまたはセルが互いに分離されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルが互いに平行にかつ前記電場の方向に平行に整列して配置されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記複数のセルがマトリクスに固定されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルがセルの相互接続チェーンへと分離可能であるマトリクスを形成する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項２０】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが０．１ｍｍ〜２．０ｍｍの長さを有している、請求項８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが２ｍｍの長さを有している、請求項８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが０．１ｍｍ〜２．０ｍｍの幅を有している、請求項８に記載のシステム。
【請求項２３】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが１ｍｍの幅を有している、請求項８に記載のシステム。
【請求項２４】
前記ＩＥＦバッファが緩衝剤を含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項２５】
前記ＩＥＦバッファが前記電場の中で狭いｐＨ勾配を形成する、請求項８に記載のシステム。
【請求項２６】
前記複数の、ＩＥＦバッファまたはセルが、互いと比較して複数の異なるｐＨ範囲を有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項２７】
前記セルの壁が生体分子またはイオンに対して透過性である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項２８】
前記ＩＥＦバッファまたセルの一つの側を除いて全ての側が、生体分子不透過性領域であり、そして必要に応じてイオン不透過性領域である、請求項８に記載のシステム。
【請求項２９】
サンプル中の生体分子を等電点電気泳動するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）ＩＥＦバッファまたは該ＩＥＦバッファを含むセルの内外で方向付けられる交流電場に該サンプルを供し、そして必要に応じて、該ＩＥＦバッファに該生体分子を含む泳動バッファを循環する工程；および
（２）該ＩＥＦバッファ中で該生体分子を捕捉する工程；
を包含する、方法。
【請求項３０】
サンプル中の生体分子を特徴付けるための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＩＥＦバッファの内外で方向付けられる交流電場に該サンプルを供し、そして必要に応じて、該ＩＥＦバッファに該サンプルを含む泳動バッファを循環する工程；および
（２）別のサンプル由来の生体分子に対して該ＩＥＦバッファ中の生体分子を比較する工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
サンプル中の生体分子を定量するための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＩＥＦバッファの内外で方向付けられる交流電場に該サンプルを供し、そして必要に応じて、該ＩＥＦバッファにわたって該サンプルを含む泳動バッファを循環する工程；および
（２）該ＩＥＦバッファ中の生体分子の量を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
サンプル中の生体分子の存在または非存在を決定づける方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＩＥＦバッファの内外で方向付けられる交流電場に該サンプルを供し、そして必要に応じて、該ＩＥＦバッファにわたって該サンプルを含む泳動バッファを循環する工程；および
（２）該生体分子が該ＩＥＦバッファ中に存在するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３３】
被験体における疾患状態の診断または予備診断を行う方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＩＥＦバッファの内外で方向付けられる交流電場に被験体由来の生体分子を含むサンプルを供し、そして必要に応じて、該ＩＥＦバッファにわたって該サンプルを含む泳動バッファを循環する工程；および
（２）疾患を有さないかまたは該疾患を有する素因がない正常な被験体に由来のサンプルからの生体分子と工程（１）に供した生体分子を比較する工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記正常な被験体に由来の生体分子が、ＩＥＦバッファの内外で方向付けられた交流電場に、正常な被験体に由来するサンプルを供することによって調製され、そして必要に応じて、該ＩＥＦに亘って該生体分子を含む泳動バッファを循環する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
生体分子を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）ＩＥＦの内外で交流電場を生成することによって該ＩＥＦバッファにおける生体分子を捕捉し、そして必要に応じて該ＩＥＦに亘って該生体分子を含む泳動バッファを循環する工程および
（２）生体分子を回収する工程
を包含する、方法。
【請求項３６】
生体分子を分類する方法であって、該方法は、以下の工程：
請求項８〜１４のいずれかに１項に記載のシステムにおいて泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加して、交流電場を生成して、そして必要に応じて、前記ＩＥＦバッファに亘って該泳動バッファを循環させる工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
被験体における疾患状態の診断または予備診断を行う方法であって、該方法は以下の工程：
（１）請求項８〜１４のいずれかに１項に記載のシステムにおいて泳動バッファに生体分子を含むサンプルを添加して、前記交流電場を生成して、そして、必要に応じて、前記ＩＥＦバッファに亘って該泳動バッファを循環させる工程；および
（２）該被験体由来の該ＩＥＦバッファ中の生体分子を、疾患を有さないかまたは該疾患を有する素因がない正常な被験体に由来のサンプルからの生体分子に対して比較する工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記正常な被験体に由来の生体分子が、請求項８〜１４のいずれかに１項に記載のシステム中の泳動バッファに該正常な被験体由来の生体分子を含むサンプルを添加して、前記交流電場を生成して、そして、必要に応じて、前記ＩＥＦバッファに亘って該泳動バッファを循環させることによって調製される、方法。
【請求項３９】
前記生体分子を第２次元の分析に供する工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２次元の分析が前記生体分子の質量による分析である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２次元の分析がポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分析である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２次元の分析が質量分析法、キャピラリー電気泳動、および液体クロマトグラフィーによる分析である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
請求項３９に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ａ）前記第２次元の分析における生体分子の存在を、該第２次元の分析における別の生体分子に対して比較する工程；
（ｂ）該第２次元の分析における該生体分子の量を決定する工程；
（ｃ）該生体分子が第２次元の分析において存在するか否かを決定する工程；および
（ｄ）該第２次元の分析における生体分子を回収する工程
からなる群より選択される工程
をさらに包含する、方法。
【請求項４４】
分離したＩＥＦ／レーンユニットを含むマトリクス層であって、該ＩＥＦ／レーンユニットが、以下：
（ａ）分離された等電点電気泳動（ＩＥＦ）バッファまたはＩＥＦバッファを含む分離されたセル；および
（ｂ）レーン
を備え、ここで、該ＩＥＦバッファは、０．１単位以下のｐＨ範囲を有する、
マトリクス層。
【請求項４５】
前記ＩＥＦバッファが、０．０２ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、請求項４４に記載のマトリクス層。
【請求項４６】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが前記レーンと接触するかまたは該レーンに接続可能である、請求項４４に記載のマトリクス層。
【請求項４７】
複数の同一方向を向いたＩＥＦ／レーンユニットを備える、請求項４４に記載のマトリクス層であって、前記ＩＥＦバッファまたはセルの各々が互いに分離されている、マトリクス層。
【請求項４８】
前記複数のＩＥＦバッファまたは前記セルが、０．１ｐＨ単位以下のｐＨステップを有する、請求項４７に記載のマトリクス層。
【請求項４９】
前記ｐＨステップが０．０２ｐＨ単位以下である、請求項４７に記載のマトリクス層。
【請求項５０】
前記ＩＥＦ／レーンユニットが生体分子不浸透領域（ＢＩＡ）によってその長さおよび幅に沿って支持されている、請求項４４に記載のマトリクス層。
【請求項５１】
前記レーンがドデシル硫酸ナトリウムおよびポリアクリルアミドゲルを備える、請求項４４に記載のマトリクス層。
【請求項５２】
前記レーンがマトリクス層と別の層との間に位置付けられている、請求項５１に記載のマトリクス層であって、ここで、両方の層は、生体分子不透過性かつイオン不透過性である、マトリクス層。
【請求項５３】
マトリクス層および第２層を備えるアレイであって、該マトリクス層はＩＥＦレーンユニットおよび生体分子不透過性領域（ＢＩＡ）を備え、ここで、
該ＩＥＦ／レーンユニットは、以下：
（ａ）ＩＥＦバッファまたはＩＥＦを含むセル；および
（ｂ）レーン
を備え、ここで、該ＢＩＡはその長さおよび幅に亘って該レーンと接触しており、ここで、
該第２層は、該レーンの長さおよび幅と同じかまたはそれらを超える長さおよび幅であるレーンスクリーニング領域（ＬＳＡ）を備えており、ここで、該ＬＳＡがイオンに対して透過性であり、かつ生体分子に対して不透過性であり；そして
該レーンは、該マトリクス層と該ＬＳＡとの間に位置づけられている、
アレイ。
【請求項５４】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが前記レーンと接触しているかまたは該レーンに接続可能である、請求項５３に記載のアレイ。
【請求項５５】
請求項５３に記載のアレイであって、ここで前記第２層は、該第２層の面に垂直なパーフォレーションをさらに備え、ここで、該パーフォレーションが該ＩＥＦバッファまたはセルの上に位置付けられるように配置される、アレイ。
【請求項５６】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが、０．１ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有して売る、請求項５３に記載のアレイ。
【請求項５７】
前記ｐＨ範囲が０．０２ｐＨ単位以下である、請求項５６に記載のアレイ。
【請求項５８】
請求項５３に記載のアレイであって、前記マトリクス層が複数の同一方向を向いたＩＥＦ／レーンユニットを備え、そして前記第２層は、該レーンがマトリクスとＬＳＡとの間に位置付けられるように配置される複数のＬＳＡ備える、アレイ。
【請求項５９】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルが互いに分離されている、請求項５８に記載のアレイ。
【請求項６０】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルが重なり合うｐＨ範囲を有さない、請求項５９に記載のアレイ。
【請求項６１】
２つ以上のＩＥＦバッファの間のｐＨステップが０．１ｐＨ単位以下である、請求項５８に記載のアレイ。
【請求項６２】
２以上のＩＥＦバッファの間のｐＨステップが０．０２ｐＨ単位以下である、請求項６１に記載のアレイ。
【請求項６３】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが目的の生体分子を捕捉するために予め選択されていたｐＨ範囲を含む、請求項５３または５８に記載のアレイ。
【請求項６４】
各レーンの幅が２０ミクロン〜１ｍｍから選択され、そして各レーンの長さが３〜１０ｍｍから選択される、請求項５８に記載のアレイ。
【請求項６５】
各レーンの幅が１００ミクロンである、請求項５８に記載のアレイ。
【請求項６６】
マトリクス層の厚さが１ｍｍである、請求項５３に記載のアレイ。
【請求項６７】
前記第２層の厚さが１００ミクロンである、請求項５３に記載のアレイ。
【請求項６８】
前記アレイの面積が１ｃｍ×１ｃｍ〜１０ｃｍ×１０ｃｍで選択される、請求項５８に記載のアレイ。
【請求項６９】
前記アレイの面積が５ｃｍ×５ｃｍまたは４ｃｍ×１０ｃｍである、請求項６８に記載のアレイ。
【請求項７０】
前記レーンがドデシル硫酸ナトリウムおよびポリアクリルアミドゲルである、請求項５３に記載のアレイ。
【請求項７１】
前記第２層が前記マトリクス層に接続されている、請求項５３に記載のアレイ。
【請求項７２】
前記ＬＳＡが伝導性ではない、請求項５３に記載のアレイ。
【請求項７３】
システムであって、以下：
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）分離したＩＥＦ／レーンユニットを含むマトリクス層であって、該ＩＥＦ／レーンユニットが、以下：
（ｉ）ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセル；および
（ｉｉ）レーン
を備える、マトリクス層；
（ｃ）ＩＥＦバッファまたはセルの内外で方向付けられた交流電場を生成するためのデバイス；
（ｄ）該レーンの長さに沿って該ＩＥＦまたはセルから離れるように電場を方向付けるためのデバイス；および必要に応じて
（ｅ）ＩＥＦバッファまたはセルに亘って該泳動バッファを循環させるためのデバイス
を備える、システム。
【請求項７４】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが前記レーンに接触しているかまたは該レーンと接続可能である、請求項７３に記載のシステム。
【請求項７５】
システムであって、以下；
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）マトリクス層および第２層を備えるアレイであって、ここで、該マトリクス層は、ＩＥＦ／レーンユニットおよび生体分子不透過性領域（ＢＩＡ）を含み、ここで、該ＩＥＦ／レーンユニットが、以下：
（ｉ）ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセル；および
（ｉｉ）レーン
を備え、ここで、該ＢＩＡが該レーンとその長さおよび幅に亘って接触し、
ここで、該第２層が該レーンの長さおよび幅と同じかまたはそれらを超える長さおよび幅であるレーンスクリーニング領域（ＬＳＡ）を備え、ここで、該ＬＳＡはイオンに対して透過性でありかつ生体分子に対して不透過性であり、
ここで、該レーンは、該マトリクス層と該ＬＳＡとの間に位置付けられている、
アレイ；
（ｃ）ＩＥＦバッファまたはセルの内外で方向付けられた交流電場を生成するためのデバイス；
（ｄ）該レーンの長さに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように電場を方向付けるためのデバイス；および必要に応じて
（ｅ）ＩＥＦバッファまたはセルに亘って該泳動バッファを循環させるためのデバイス
を備える、システム。
【請求項７６】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが０．１ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、請求項７３〜７５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７７】
前記ｐＨ範囲が０．０２ｐＨ単位以下である、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
複数のＩＥＦ／レーンユニットを備える、請求項７３〜７５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７９】
前記ＩＥＦ／レーンユニットの中の前記ＩＥＦバッファまたはセルが互いに分離されている、請求項７８に記載のシステム。
【請求項８０】
前記ＩＥＦバッファまたはセルが前記レーンに接触しているかまた接続可能である、請求項７３〜７５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８１】
請求項７５に記載のシステムであって、前記第２層は、該第２層の面に垂直なパーフォレーションをさらに備え、ここで、該パーフォレーションが該ＩＥＦバッファまたはセルの上に位置付けられる、システム。
【請求項８２】
請求項７５に記載のシステムであって、前記第２層が、前記レーンが前記マトリクス層と前記ＬＳＡとの間に位置付けられるように配置された複数のＬＳＡを備える、システム。
【請求項８３】
請求項７８に記載のシステムであって、前記第２層は、該第２層の面に垂直な複数のパーフォレーションをさらに備え、ここで、該パーフォレーションが該ＩＥＦバッファまたはセルの上に位置付けられる、システム。
【請求項８４】
前記交流電場の方向が前記マトリクス層の面に垂直であるように前記マトリクスが前記チャンバ中で位置付けられる、請求項７３に記載のシステム。
【請求項８５】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルの前記ｐＨ値が互いに重なり合わない、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８６】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルが０．１ｐＨ単位以下のｐＨステップを有する、請求項７８に記載のシステム。
【請求項８７】
前記ｐＨステップが０．０２ｐＨ単位以下である、請求項８６に記載のシステム。
【請求項８８】
各レーンの幅が２０ミクロン〜１ｍｍから選択されかつ各レーンの長さが３〜１０ｍｍから選択される、請求項７８に記載のシステム。
【請求項８９】
各レーンの幅が１００ミクロンである、請求項７８に記載のシステム。
【請求項９０】
前記マトリクスの厚さが１ｍｍである、請求項７３または７５に記載のシステム。
【請求項９１】
前記第２層が１００ミクロンである、請求項７５に記載のシステム。
【請求項９２】
前記アレイの面積が１ｃｍ×１ｃｍ以上かつ１０ｃｍ×１０ｃｍ以下である、請求項７５に記載のシステム。
【請求項９３】
前記アレイの面積が５ｃｍ×５ｃｍまたは４ｃｍ×１０ｃｍである、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９４】
前記レーンがドデシル硫酸ナトリウムおよびポリアクリルアミドゲルを含む、請求項７３または７５に記載のシステム。
【請求項９５】
前記第２層が前記マトリクス層に接続されている、請求項７５に記載のシステム。
【請求項９６】
前記ＬＳＡが伝導性でない、請求項７５に記載のシステム。
【請求項９７】
請求項７３または７５に記載のシステムであって、該システムは、以下：
（１）前記レーン中のサンプルの生体分子を検出するためのデバイス；
（２）該検出デバイスからのデータを受信するデバイス；
（３）受信したデータを処理するためのデバイス
を備える、システム。
【請求項９８】
複数のレーンからの信号を検出、受信、および処理するためのスキャニングミクロデンシトメーターをさらに備える、請求項７３〜７５に記載のシステム。
【請求項９９】
請求項９８に記載のシステムであって、該システムは以下：
（１）サンプルフィーダ；
（２）廃棄物処理器；
（３）バッファフィーダ；
（４）染色試薬フィーダ；
（５）アレイ操作システム、および
（６）ディスプレイ
からなる群より選択されるデバイスのうちのいずれか１つを備える、システム。
【請求項１００】
自動化された、請求項７５また７８に記載のシステム。
【請求項１０１】
サンプル中の生体分子を分類する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）ＩＥＦ／レーンユニットのＩＥＦバッファの内外で方向付けされている交流電場に該サンプルを曝露し、そして必要に応じて該ＩＥＦバッファに亘って泳動バッファを循環する工程；および
（２）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファから離れるように交流電場を生成する工程
を包含する、方法。
【請求項１０２】
サンプル中の生体分子を特徴付けるための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＩＥＦ／レーンユニットのＩＥＦバッファの内外で方向付けされている交流電場に該サンプルを曝露し、そして必要に応じて該ＩＥＦバッファに亘って泳動バッファを循環する工程；および
（２）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファから離れるように交流電場を生成する工程；および
（３）別のサンプルに由来する生体分子に対して該レーンにおける生体分子を比較する工程
を包含する、方法。
【請求項１０３】
サンプル中の生体分子を定量するための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＩＥＦ／レーンユニットのＩＥＦバッファの内外で方向付けされている交流電場に該サンプルを曝露し、そして必要に応じてＩＥＦバッファに亘って泳動バッファを循環する工程；
（２）該レーンに沿って該ＩＥＦから離れるように交流電場を生成する工程；
（３）該レーンにおける生体分子の量を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１０４】
サンプル中の生体分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＩＥＦ／レーンユニットのＩＥＦバッファの内外で方向付けされている交流電場に該サンプルを曝露し、そして必要に応じてＩＥＦバッファに亘って泳動バッファを循環する工程；および
（２）該レーンに沿って該ＩＥＦから離れるように交流電場を生成する工程；
（３）該レーンにおけて生体分子が存在するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１０５】
被験体における疾患状態の診断または予備診断を行うための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＩＥＦ／レーンユニットのＩＥＦバッファの内外で方向付けされている交流電場に該サンプルを曝露し、そして必要に応じて該ＩＥＦバッファに亘って泳動バッファを循環する工程；および
（２）該レーンに沿って該ＩＥＦから離れるように交流電場を生成して、該生体分子のパターンを形成する工程；
（３）該疾患を有していないかまたは疾患を有する素因がない正常な被験体に由来するサンプルからの生体分子のパターンに対して該レーンにおける生体分子のパターンを比較する工程
を包含する、方法。
【請求項１０６】
請求項１０５に記載の方法であって、前記正常な被験体に由来する生体分子のパターンが、以下：
（１）ＩＥＦ／レーンユニットのＩＥＦバッファの内外で方向付けされている交流電場に該正常な被験体に由来するサンプルを曝露し、そして必要に応じて該ＩＥＦバッファに亘って泳動バッファを循環する工程；および
（２）該レーンに沿って該ＩＥＦから離れるように電場を生成して該レーンにおける生体分子のパターンを形成する工程
を包含する、方法。
【請求項１０７】
被験体における疾患状態の診断または予備診断を行うための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）ＩＥＦ／レーンユニットのＩＥＦバッファの内外で方向付けされている交流電場に該被験体に由来する生体分子を含むサンプルを曝露し、そして必要に応じて該ＩＥＦバッファに亘って泳動バッファを循環する工程；および
（２）該レーンに沿って該ＩＥＦから離れるように交流電場を生成する工程；および
（３）該疾患を有していないかまたは疾患を有する素因がない正常な被験体に由来するサンプルからの生体分子に対して該レーンにおける生体分子を比較する工程
を包含する、方法。
【請求項１０８】
請求項１０７に記載の方法であって、前記正常な被験体に由来するサンプルが、以下：
（１）ＩＥＦ／レーンユニットのＩＥＦバッファの内外で方向付けされている交流電場に該正常な被験体に由来する生体分子を含むサンプルを曝露し、そして必要に応じてＩＥＦバッファに亘って泳動バッファを循環する工程；および
（２）該レーンに沿って該ＩＥＦから離れるように交流電場を生成する工程；
によって調製される、方法。
【請求項１０９】
サンプル中の生体分子を等電点電気泳動するための方法であって、該方法は、以下の工程：
請求項７３〜７８に記載のいずれか１項に従うシステム中の泳動バッファに、該生体分子を含むサンプルを添加して、該ＩＥＦバッファまたはセルの内外で交流電場を生成し、そして該泳動バッファを該ＩＥＦまたはセルに亘って循環させる工程を包含する、方法。
【請求項１１０】
サンプル中の生体分子を分離するための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）請求項７３〜７８のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）交流電場を生成する工程；および
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程
を包含する、方法。
【請求項１１１】
サンプル中の生体分子を特徴付けるための方法であって、該方法は、以下：
（１）請求項７３〜７８のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）交流電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該レーンにおける生体分子の位置を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１１２】
サンプル中の生体分子の量を定量する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項７３〜７８のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）交流電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該レーンにおける該生体分子の量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１１３】
サンプル中の生体分子の存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項７３〜７８のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、サンプルを添加する工程；
（２）交流電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該レーンにおいて該生体分子が存在するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１１４】
被験体における疾患状態を診断するかまたは予備診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項７３〜７８のいずれか１項に記載のシステムの泳動バッファに、該疾患状態に罹患してるかまたはこの状態に罹患しやすくなっていることが疑われる被験体に由来する該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）交流電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該疾患を有していないかまたは疾患を有する素因がない正常な被験体に由来するサンプルからの生体分子のパターンに対して該レーンにおける生体分子のパターンを比較する工程；
を包含する、方法。
【請求項１１５】
請求項１１４に記載の方法であって、前記正常な被験体に由来するサンプルが、以下：
（１）請求項７３〜７８のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、該正常な被験体に由来する生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）交流電場を生成する工程；および
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成して、生体分子のパターンを形成する工程；
から調製される、方法。
【請求項１１６】
被験体における疾患状態を診断するかまたは予備診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項７３〜７８のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、該疾患状態に罹患してるかまたはこの状態に罹患しやすくなっていることが疑われる被験体に由来する該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）交流電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該疾患を有していないかまたは疾患を有する素因がない正常な被験体に由来するサンプルからの生体分子対して該レーンにおける生体分子を比較する工程；
を包含する、方法。
【請求項１１７】
請求項１１４に記載の方法であって、前記正常な被験体に由来するサンプルが、以下：
（１）請求項７３〜７８のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、該正常な被験体に由来する生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）交流電場を生成する工程；および
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；
によって調製される、方法。
【請求項１１８】
前記デバイスが、交流電場の工程の間にＩＥＦバッファまたはセルの亘って泳動バッファを循環させる、請求項１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記サンプルがヒト由来である、請求項１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記生体分子はアミノ酸を含む、請求項１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記レーンがドデシル硫酸ナトリウムおよびポリアクリルアミドゲルを含む、請求項１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
請求項１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法であって、
ドデシル硫酸ナトリウムが、交流電場を生成する工程の後および
前記レーンの長さに沿って前記ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように交流電場を生成する工程の間またはその前に、
前記泳動バッファに添加される、方法。
【請求項１２３】
請求項１１０〜１１７のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、質量分析法、キャピラリー電気泳動、および液体クロマトグラフィーからなる群より選択される方法によって、前記生体分子を分析する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１２４】
サンプル中の標的生体分子（「ＴＢ」）の存在、非存在、または量を分析するためのＴＢシステムであって、該システムは、以下：
ａ．請求項８〜１２のいずれか１項に記載のシステム；および
ｂ．複合体でＴＢに対して結合する標的認識分子（「ＴＲＭ」）；
を含み、ここで、該システムのセルのうちの少なくとも１つの中にあるＩＥＦバッファはＴＢに結合したＴＲＭを含む複合体の等電点（ｐＩ）に等しいｐＨ値を含む、システム。
【請求項１２５】
サンプル中の標的生体分子（「ＴＢ」）の存在、非存在、または量を分析するためのＴＢシステムであって、該システムは、以下：
ａ．請求項７３〜８０のいずれか１項に記載のシステム；および
ｂ．複合体でＴＢに対して結合する標的認識分子（「ＴＲＭ」）；
を含み、ここで、該システムのセルのうちの少なくとも１つの中にあるＩＥＦバッファはＴＢに結合したＴＲＭを含む複合体の等電点（ｐＩ）に等しいｐＨ値を含む、システム。
【請求項１２６】
等電点電気泳動システムのセルにおけるＴＢに結合したＴＲＭを含む複合体を検出するデバイスをさらに備える、請求項１２４または１２５に記載のシステム。
【請求項１２７】
前記ＴＲＭが抗体である、請求項１２４または１２５に記載のシステム。
【請求項１２８】
前記ＴＲＭが標識されているかまたは検出部分に結合している、請求項１２４または１２５に記載のシステム。
【請求項１２９】
前記ＴＲＭが蛍光発光団で標識されている、請求項１２４または１２５に記載のシステム。
【請求項１３０】
前記システムが既知量の複数の既知分子をさらに含みそしてＩＥＦバッファのサブセットが該既知分子のｐＩ値に等しいｐＨ値を含む、請求項１２４または１２５に記載のシステム。
【請求項１３１】
前記システムが被験体の疾患または状態の診断に対して使用される、請求項１２４または１２５に記載のシステム。
【請求項１３２】
前記ＩＥＦのセルがチップの中にある、請求項１２４または請求項１２５に記載のシステム。
【請求項１３３】
ＴＢ−ＴＲＭ複合体を分類する方法であって、ＩＥＦバッファの内外で方向付けられている交流電場にＴＢ−ＴＲＭ複合体を曝露する工程を包含し、ここで、該ＩＥＦバッファは、ＴＢ−ＴＲＭ複合体のｐＩ値と同じｐＨ値を含む、方法。
【請求項１３４】
サンプル中のＴＢの存在、非存在、または量を分析するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．ＴＢとＴＲＭとが結合することを可能にする条件下で該サンプルをＴＲＭと合わせる工程；および
ｂ．ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセルの内外の交流電場を生成することによって、泳動バッファを含むチャンバ中の未結合ＴＢからＴＲＭに結合したＴＢを含む複合体を分離して、そして必要に応じて該ＩＥＦバッファに亘って泳動バッファを循環させる工程：ならびに
ｃ．該ＩＥＦバッファ中のＴＢ−ＴＲＭ複合体の存在、非存在、または量を観察する工程；
を包含し、ここで、該ＩＥＦバッファは、ＴＢ−ＴＲＭ複合体のｐＩ値と同じであるｐＨ値を含む、
方法。
【請求項１３５】
サンプル中のＴＢの存在、非存在、または量を分析するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．ＴＢとＴＲＭとが結合することを可能にする条件下で該サンプルをＴＲＭとを合わせる工程；および
ｂ．ＩＥＦ／レーン単位のＩＥＦバッファの内外の交流電場を生成することによって、泳動バッファを含むチャンバ中の未結合ＴＢからＴＲＭに結合したＴＢを含む複合体を分離して、そして必要に応じて該ＩＥＦバッファに亘って該泳動バッファを循環させる工程：  
ｃ．該レーンに沿って該ＩＥＦバッファから離れるように電場を生成する工程；ならびに
ｄ．該レーン中のＴＢ−ＴＲＭ複合体の存在、非存在、または量を観察する工程；
を包含し、ここで、該ＩＥＦバッファは、ＴＢ−ＴＲＭ複合体のｐＩ値と同じであるｐＨ値を含む、
方法。
【請求項１３６】
サンプル中のＴＢの存在、非存在、または量を分析するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．ＴＢとＴＲＭとが結合することを可能にする条件下で該サンプルをＴＲＭと合わせる工程；および
ｂ．請求項１２４に記載のＴＢシステムにおいて未結合のＴＢからＴＲＭに結合したＴＢを含む複合体を分離する工程であって、そして、必要に応じて、前記ＩＥＦバッファに亘って前記泳動バッファを循環させる工程；ならびに
ｃ．該ＩＥＦバッファ中のＴＢ−ＴＲＭ複合体の存在、非存在、または量を観察する工程；
を包含し、ここで、該ＩＥＦバッファは、ＴＢ−ＴＲＭ複合体のｐＩ値と同じであるｐＨ値を含む、
方法。
【請求項１３７】
サンプル中のＴＢの存在、非存在、または量を分析するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．ＴＢとＴＲＭとが結合することを可能にする条件下で該サンプルをＴＲＭと合わせる工程；および
ｂ．請求項１２５に記載のＩＥＦ／レーンユニットのＩＥＦバッファを使用するＴＢシステムにおいて未結合のＴＢからＴＲＭに結合したＴＢを含む複合体を分離する工程であって、そして、必要に応じて、前記ＩＥＦバッファに亘って前記泳動バッファを循環させる工程；ならびに
ｃ．該レーンに沿って該ＩＥＦバッファから離れるように電場を生成する工程；
ｄ．該レーン中のＴＢ−ＴＲＭ複合体の存在、非存在、または量を観察する工程；
を包含する、
方法。
【請求項１３８】
前記ＴＲＭが検出部分に結合してるかまたは標識されている、請求項１３４〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ＴＲＭが蛍光発光団で標識されている抗体である、請求項１３４〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
請求項１１０〜１１７および１３４〜１３７のいずれか１項に記載の方法であって、既知量の複数の既知分子が、以下：
（１）該既知分子を工程（ａ）のサンプルに添加する工程および
（２）該既知分子の各々をセル中で分離および集積されることを可能する工程
によって、較正曲線を作成するのに使用される、方法。
【請求項１４１】
動物の疾患または状態の診断を行うために使用される、請求項１３４〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
生物学的事象を観察するために使用される、請求項１３４〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
化学的化合物または生体分子をスクリーニングするために使用される、請求項１３４〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
システムであって、以下：
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）０．１ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、ＩＥＦまたはＩＥＦバッファを含むセル；
（ｃ）該ＩＥＦバッファへと第１電場方向付けるためのデバイス；および必要に応じて
（ｄ）該ＩＥＦまたはセルに亘って該泳動バッファを循環するためのデバイス
を備える、システム。
【請求項１４５】
システムであって、以下：
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）分離したＩＥＦ／レーンユニットを含むマトリクス層であって、該ＩＥＦ／レーンユニットが、以下：
（ｉ）ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセル；および
（ｉｉ）レーン
を備え、ここで、該ＩＥＦバッファまたは該ＩＥＦを含むセルが０．１ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、マトリクス層；
（ｃ）第１の次元において、該ＩＥＦバッファへと方向付けられた交流電場を生成するためのデバイス；
（ｄ）該レーンの長さに沿って該ＩＥＦまたはセルから離れるように電場を方向付けるためのデバイス；および必要に応じて
（ｅ）ＩＥＦバッファまたはセルに亘って該泳動バッファを循環させるためのデバイス
を備える、システム。
【請求項１４６】
システムであって、以下；
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）マトリクス層および第２層を備えるアレイであって、ここで、該マトリクス層は、ＩＥＦ／レーンユニットおよび生体分子不透過性領域（ＢＩＡ）を含み、ここで、該ＩＥＦ／レーンユニットが、以下：
（ｉ）ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセル；および
（ｉｉ）レーン
を備え、ここで、該ＢＩＡが該レーンとその長さおよび幅に亘って接触し、
ここで、該第２層が該レーンの長さおよび幅と同じかまたはそれらを超える長さおよび幅であるレーンスクリーニング領域（ＬＳＡ）を備え、ここで、該ＬＳＡはイオンに対して透過性でありかつ生体分子に対して不透過性であり、
ここで、該レーンは、該マトリクス層と該ＬＳＡとの間に位置付けられている、
ここで、該ＩＥＦバッファまたは該ＩＥＦを含むセルが０．１ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、マトリクス層；
（ｃ）第１の次元において、ＩＥＦバッファまたはセルに対して電場を方向付けるためのデバイス；
（ｄ）該レーンの長さに沿って該ＩＥＦまたはセルから離れるように電場を方向付けるためのデバイス；および必要に応じて
（ｅ）ＩＥＦバッファまたはセルに亘って該泳動バッファを循環させるためのデバイス
を備える、システム。
【請求項１４７】
前記ＩＥＦバッファが０．０２ｐＨ単位以下のｐＨ範囲を有する、請求項１４４〜１４６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４８】
複数のＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセルを備える、請求項１４４〜１４７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４９】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルが互いに分離されている、請求項１４８に記載のシステム。
【請求項１５０】
前記複数のＩＥＦバッファまたはセルが０．０２ｐＨ単位以下のｐＨステップを有する、請求項１４８に記載のシステム。
【請求項１５１】
前記ＩＥＦバッファまたはセルに亘って泳動バッファを循環させるためのデバイスをさらに備える、請求項１４４〜１４６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５２】
前記第１の次元の電場がＡＣ電圧デバイスまたはＤＣ電圧デバイスから生成される、請求項１４４〜１４６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５３】
前記ＩＥＦバッファまたはセルがレーンに接触するかまたは該レーンに接続可能である、請求項１４５〜１４６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５４】
前記第２層が、第２層の面に垂直なパーフォレーションをさらに備え、ここで、該パーフォレーションがＩＥＦバッファまたはセル上に位置付けられてる、請求項１４６に記載のシステム。
【請求項１５５】
前記第２層が、前記レーンがマトリクス層とＬＳＡ層との間に位置付けられるように配置された複数のＬＳＡを備える、請求項１４６に記載のシステム。
【請求項１５６】
前記第２層が、第２層の面に垂直な複数のパーフォレーションをさらに備え、ここで、該パーフォレーションが複数のＩＥＦバッファまたはセル上に位置付けられてる、請求項１５５に記載のシステム。
【請求項１５７】
サンプル中の生体分子を等電点電気泳動するための方法であって、該方法は、以下の工程：
請求項１４４〜１５２のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、該生体分子を含むサンプルを添加する工程；該ＩＥＦバッファまたはセルに対して電場を生成する工程；および必要に応じて、該ＩＥＦバッファまたはセルの亘って該泳動バッファを循環する工程
を包含する、方法。
【請求項１５８】
サンプル中の生体分子を分離するための方法であって、以下の工程：
（１）請求項１４５〜１５２のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；および
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように電場を生成する工程；
を包含する、方法。
【請求項１５９】
サンプル中の生体分子を特徴付けるための方法であって、該方法は、以下：
（１）請求項１４４または１４７〜１５２のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファに対して電場を生成する工程；
（３）該ＩＥＦバッファ中に該生体分子が存在するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１６０】
サンプル中の生体分子を特徴付けるための方法であって、該方法は、以下：
（１）請求項１４５〜１５２のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦに対して電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該レーンにおける生体分子の位置を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１６１】
サンプル中の生体分子の量を定量する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１４４または１４７〜１５２のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該ＩＥＦバッファ中の該生体分子の量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１６２】
サンプル中の生体分子の量を定量する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１４５〜１５２のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該レーンにおける該生体分子の量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１６３】
サンプル中の生体分子の存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１４４または１４７〜１５２のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、サンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該ＩＥＦバッファ中に該生体分子が存在するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１６４】
サンプル中の生体分子の存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１４７〜１５２のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、サンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該レーンにおいて該生体分子が存在するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１６５】
被験体において疾患状態を診断するかまたは予備診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１４４または１４７〜１５２のいずれか１項に記載のシステムの泳動バッファに、該疾患状態に罹患してるかまたはこの状態に罹患しやすくなっていることが疑われる被験体に由来する該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該疾患を有していないかまたは疾患を有する素因がない正常な被験体に由来するサンプルからの生体分子のパターンに対して該レーンにおける生体分子のパターンを比較する工程；
を包含する、方法。
【請求項１６６】
被験体における疾患状態を診断するかまたは予備診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１４７〜１５２のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、該疾患状態に罹患してるかまたはこの状態に罹患しやすくなっていることが疑われる被験体に由来する該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成して、生体分子のパターンを形成する工程；および
（４）該疾患を有していないかまたは疾患を有する素因がない正常な被験体に由来するサンプルからの生体分子のパターンに対して該レーンにおける生体分子のパターンを比較する工程；
を包含する、方法。
【請求項１６７】
システムであって、以下：
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）分離したＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含む分離したセル；
（ｃ）ＩＥＦバッファへと電場を方向付けるデバイス；ならびに必要に応じて
（ｄ）該ＩＥＦまたはセルに亘って該泳動バッファを循環するためのデバイス
を備える、システム。
【請求項１６８】
システムであって、以下：
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）分離したＩＥＦ／レーンユニットを含むマトリクス層であって、該ＩＥＦ／レーンユニットが、以下：
（ｉ）分離したＩＥＦバッファまたは分離したＩＥＦバッファを含むセル；および
（ｉｉ）レーン
を備える、マトリクス層；
（ｃ）第１の次元でＩＥＦバッファへと方向付けられた電場を生成するためのデバイス；
（ｄ）該レーンの長さに沿って該ＩＥＦまたはセルから離れるように電場を方向付けるためのデバイス；および必要に応じて
（ｅ）ＩＥＦバッファまたはセルに亘って該泳動バッファを循環させるためのデバイス
を備える、システム。
【請求項１６９】
システムであって、以下；
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）マトリクス層および第２層を備えるアレイであって、ここで、該マトリクス層は、ＩＥＦ／レーンユニットおよび生体分子不透過性領域（ＢＩＡ）を含み、ここで、該ＩＥＦ／レーンユニットが、以下：
（ｉ）分離したＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含む分離したセル；および
（ｉｉ）レーン
を備え、ここで、該ＢＩＡが該レーンとその長さおよび幅に亘って接触し、
ここで、該第２層が該レーンの長さおよび幅と同じかまたはそれらを超える長さおよび幅であるレーンスクリーニング領域（ＬＳＡ）を備え、ここで、該ＬＳＡはイオンに対して透過性でありかつ生体分子に対して不透過性であり、
ここで、該レーンは、該マトリクス層と該ＬＳＡとの間に位置付けられている、
マトリクス層；
（ｃ）第１の次元においてＩＥＦバッファまたはセルに対して電場を方向付けるためのデバイス；
（ｄ）該レーンの長さに沿って該ＩＥＦまたはセルから離れるように電場を方向付けるためのデバイス；および必要に応じて
（ｅ）ＩＥＦバッファまたはセルに亘って該泳動バッファを循環させるためのデバイス
を備える、システム。
【請求項１７０】
０．１ｐＨ単位以下または０．０２ｐＨ単位以下の前記ＩＥＦバッファがｐＨ範囲を有している、請求項１６７〜１６９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７１】
前記複数のＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセルを含む、請求項１６７〜１７０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７２】
前記複数のＩＥＦバッファが０．０２ｐＨ単位以下のｐＨステップを有する、請求項１７１に記載のシステム。
【請求項１７３】
前記ＩＥＦバッファまたはセルに亘って泳動バッファを循環させるためのデバイスをさらに備える、請求項１６７〜１７０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７４】
前記電場がＡＣ電圧デバイスまたはＤＣ電圧デバイスから生成される、請求項１６７に記載のシステム。
【請求項１７５】
前記第１の次元の電場がＡＣ電圧デバイスまたはＤＣ電圧デバイスから生成される、請求項１６８〜１６９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７６】
前記ＩＥＦバッファまたはセルがレーンに接触するかまたは該レーンに接続可能である、請求項１６８〜１６９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７７】
前記第２層が、第２層の面に垂直なパーフォレーションをさらに備え、ここで、該パーフォレーションがＩＥＦバッファまたはセル上に位置付けられてる、請求項１６９に記載のシステム。
【請求項１７８】
前記第２層が、前記レーンがマトリクス層とＬＳＡ層との間に位置付けられるように配置された複数のＬＳＡを備える、請求項１６９に記載のシステム。
【請求項１７９】
前記第２層が、第２層の面に垂直な複数のパーフォレーションをさらに備え、ここで、該パーフォレーションが複数のＩＥＦバッファまたはセル上に位置付けられてる、請求項１６９に記載のシステム。
【請求項１８０】
サンプル中の生体分子を等電点電気泳動するための方法であって、該方法は、以下の工程：
請求項１６７〜１７４のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、該生体分子を含むサンプルを添加する工程；該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；および必要に応じて、該ＩＥＦバッファまたはセルの亘って該泳動バッファを循環する工程
を包含する、方法。
【請求項１８１】
サンプル中の生体分子を分離するための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）請求項１６８〜１７４のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）ＩＥＦに対して電場を生成する工程；および
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程
を包含する、方法。
【請求項１８２】
サンプル中の生体分子を特徴付けるための方法であって、該方法は、以下：
（１）請求項１６７または１７０〜１７４のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該レーンにおける生体分子の位置を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１８３】
サンプル中の生体分子を特徴づけるための方法であって、該方法は以下の工程：
（１）請求項１６８〜１７４のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；および
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程
（４）該レーンの中の生体分子の位置を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１８４】
サンプル中の生体分子の量を定量する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１６７または１７０〜１７３のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；および
（３）該ＩＥＦバッファにおける該生体分子の量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１８５】
サンプル中の生体分子の量を定量する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１６７〜１７４のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該レーンにおける該生体分子の量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１８６】
サンプル中の生体分子の存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１６７または１７０〜１７４のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、サンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；および
（３）該ＩＥＦバッファにおいて該生体分子が存在するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１８７】
サンプル中の生体分子の存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１６８〜１７４のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、サンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成する工程；および
（４）該レーンにおいて該生体分子が存在するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１８８】
被験体における疾患状態を診断するかまたは予備診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１６７または１７０〜１７４のいずれか１項に記載のシステムの泳動バッファに、該疾患状態に罹患してるかまたはこの状態に罹患しやすくなっていることが疑われる被験体に由来する生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該疾患を有していないかまたは疾患を有する素因がない正常な被験体に由来するサンプルからの生体分子のパターンに対して該レーンにおける生体分子のパターンを比較する工程；
を包含する、方法。
【請求項１８９】
被験体における疾患状態を診断するかまたは予備診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１６８〜１７４のいずれか１項に記載のシステムにおける泳動バッファに、該疾患状態に罹患してるかまたはこの状態に罹患しやすくなっていることが疑われる被験体に由来する該生体分子を含むサンプルを添加する工程；
（２）該ＩＥＦバッファへと電場を生成する工程；
（３）該レーンに沿って該ＩＥＦバッファまたはセルから離れるように該電場を生成して、生体分子のパターンを形成する工程；および
（４）該疾患を有していないかまたは疾患を有する素因がない正常な被験体に由来するサンプルからの生体分子のパターンに対して該レーンにおける生体分子のパターンを比較する工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、電場における等電点による１次元での分離に基づき、生体分子を調製、分類、蓄積または分析するため、そして必要に応じて引き続き第２次元での第２の分析ための、マトリクス、アレイ、システムおよび方法、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
等電点集束、またはｐＨ勾配中での集束の背景にある基本原理は、荷電した分子が、その等電点（正味の電荷が０）に等しいｐＨ勾配中の位置に移動する場合、電場中で動かなくなることである。このプロセスは、溶液中の特定のタンパク質の開始位置から独立して起こる。これは、ｐＨがｐＩに等しい領域に移動する場合のタンパク質の実効電荷の消失の結果である。
【０００３】
タンパク質の等電点を決定するための種々の技術が記載されている。代表的には、目的のタンパク質はｐＨ勾配を含有するゲル中に直接注入されるかまたは与えられ、ここで、このｐＨ勾配は電場の方向に平行であり、そしてタンパク質は、単に、その等電点に等しいｐＨ環境に達する前に、多くの異なるｐＨ環境を通って一方向に移動することによって、他のタンパク質から分離され得るだけである。これらの技術は、以下の不都合を欠点として持つ：（１）これら技術は、タンパク質を分離するために比較的長時間を要する。なぜなら、分画速度は０に漸近する傾向にあるからである；（２）これら技術は、比較的高電圧（代表的に、１０００Ｖ以上）を要し、そして（３）これら技術は冷却機構を要する。従来のＩＥＦ方法は、労力がかかり、時間を消費し、標準化されておらず、高価でありそして感度が良くない。従来の等電点集束ゲルの別の実践的な制限は、タンパク質の直線的な分散を向上させるために、ｐＨ勾配内に漸増性の小さなｐＨ変化を有するゲルを製造することが困難であることである。
【０００４】
上記の等電点集束工程を使用する、タンパク質の２次元分析は、同じ問題を欠点として持つ。例えば、Ｚｕｏら、（２０００）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４：２６６−２７８は、ｐＨ範囲を通る一方向性の移動によって、等電点に基づくタンパク質の分離、その後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を記載する。Ｂｅｃｋｅｒら、（１９９８）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．８：２４−２８は、ｐＨの一定範囲を通る、タンパク質の一方向性の移動、その後の平面チップ上での第２次元の分離をも記載する。米国特許第６，２５４，７５４号（Ｒｏｓｓ）も参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、これらの制限に起因して、１次元分析および２次元分析のための、特定のセル、レーンおよびマトリクスの設計、ならびにチャンバー中でのセル、レーンおよびマトリクスの配向ならびに特定のシステムのみが可能であり、これによってサンプルの１次元分析および２次元分析のための、より速い方法、より感度が良い方法、より正確な方法、より柔軟な方法およびより安価な方法（自動化システム、高スループット分析システムを含む）の開発を制限する。生体分子の１次元分析および２次元分析のためのより良いツールおよび方法は、例えば、薬物開発、医療研究、ならびに疾患の前診断および／または診断に有用である。特に、より良いツールおよび方法は、プロテオーム分析のために必要である。本発明は、これらの問題および他の問題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（本発明の要旨）
生体分子を、その等電点によって１次元で分析または調製するため、そして必要に応じて他の分析方法と組み合わせられる、マトリクス、アレイ、システム、および方法が開発された。このアレイは、チャンバーまたはセルを備え、その中で、生体分子が、等電点集束（「ＩＥＦ」）バッファを通ってその中を移動することによって、単離され得る。ＩＥＦバッファのｐＨ範囲は、非常に狭く（例えば、０．１以下のｐＨ単位；０．０２以下のｐＨ単位；または０．０１以下のｐＨ単位にわたる）。１つの実施形態によると、生体分子は、チャンバーの泳動バッファを通って移動し、そしてチャンバー内のＩＥＦバッファ中か、またはＩＥＦバッファを含むセル中に捕捉されるようになる。ＩＥＦバッファのｐＨ値と同じではないｐＩ値を有する生体分子は、電場の方向を変更することによって取り除かれる。このチャンバーまたはセルが閉口してその結果、電流がＩＥＦバッファまたはセルへの入口の反対側から出ることを妨げている場合、１つの好ましい実施形態によると、電場は可逆的である。このチャンバーまたはセルが開口している場合、電場は一方向性であり得る。
【０００７】
泳動バッファ中の生体分子の移動は、電場によって形成される対流熱によって増加され得る。別の実施形態によると、泳動バッファ中の生体分子の移動は、ＩＥＦバッファを横切る生体分子を含む泳動バッファを循環させるデバイスによって、増加され得る（例えば、攪拌子、ポンプ、または泳動バッファに対するＩＥＦバッファの移動による）。
【０００８】
別の実施形態によると、泳動バッファを含有するチャンバーは、複数のＩＥＦバッファおよび／またはセルを備え、これらは、物理的な分離によるか、または泳動バッファを通ってではなくむしろ、１つのＩＥＦバッファ／セルから別のＩＥＦバッファ／セルへの直接の生体分子の移動を実質的に妨げる基板によって、互いから隔てられる。生体分子は、最初に、泳動バッファを通って移動し、異なるＩＥＦバッファまたはセルに到達する。別の実施形態において、ＩＥＦバッファまたはセルは、同じｐＨ値または異なるｐＨ値を有する。なお別の実施形態によると、このデバイスは、非常に狭く、実質的に重ならないｐＨ範囲を有する、多数の個別の隔てられたＩＥＦバッファを備え、その結果、分離された物質の得られる画像は、従来のＩＥＦゲルからの画像と位置的に同等であるが、従来のＩＥＦゲルよりも高い分離能を有する。
【０００９】
生体分子は、等電点に基づき、単一実体としてか、または複合体の一部として分離され得る。例えば、生体分子（「標的生体分子」）は、これを特異的に認識する他の分子（「標的認識分子」）と共に複合体を形成し得る。この複合体は、複合体の等電点に基づき、他の非複合体化生体分子から分離され得る。複数の別個の単離されたＩＥＦバッファを狭いｐＨ範囲および段階（例えば、０．１以下のｐＨ単位）で使用する、１次元分析方法または２次元分析方法が、提供される。より好ましくは、このｐＨ範囲または段階は、０．０２以下のｐＨ単位だけ離れたｐＩ値を有する生体分子を分析するために、０．０２以下のｐＨ単位である。このことは、生体分子に対して非透過性であるメンブレンまたは材料を使用することによって、１つのセルから隣接するセル中（例えば、僅かに異なるｐＨ値を有するＩＥＦバッファを含むセルの間）への生体分子の拡散を避ける。ＩＥＦバッファまたはそのＩＥＦバッファを含む各セルは、物理的に分離された、不連続の個別の実体である。
【００１０】
随意にｋＶ範囲の電源の使用を避けて、低い印加電圧で高電場を使用することを可能にする分析方法が開発されている。１つの好ましい実施形態において、セルにおいてＩＥＦバッファのインおよびアウトの電場を可逆的に方向付けるためのデバイス、および随意に、複数のセルの周囲に同時にバッファを循環させるためのデバイスは、この方法およびシステムにおいて使用される。チャンバーを冷却するためのデバイスを、僅かに必要とするか必要としない分析方法もまた提供される。２次元のマトリクスは、１次元目の分離および第２次元の分離の間に、生体分子の操作を最低限に必要とするかまたは必要とせず、これによって時間および労力を減らし、そして試験される生体分子の損失を最低限にする。
【００１１】
別の実施形態は、分析の第２の手段（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、親和性クロマトグラフィー、ゲル電気泳動など）と組み合わせた使用に適切なＩＥＦ技術を提供する。
【００１２】
このシステムおよび方法は、少量または多量の特定の生体分子（例えば、タンパク質または核酸分子）を分離および／または精製することが可能である。標的認識生体分子（「ＴＲＢ」）と複合体化した標的生体分子（「ＴＢ」）を検出するための方法もまた、提供される。この標的生体分子は、複合体形成を促進するかまたは阻止する環境において、ＴＢと複合体を形成し得る。１つの実施形態において、標識した標的認識生体分子は、標的分子含有サンプルの導入前に、ＩＥＦバッファセル、レーンまたはマトリクス中に直接置かれる。
【００１３】
１次元分析および２次元分析のためのこれらのシステムおよび／または方法は、薬物スクリーニング、医学的研究（例えば、薬物発見、薬物治療のモニタリング、遺伝子分析もしくはプロテオーム分析、および医療診断に対する生物学的な応答様式の増強された検出）、ならびに診断学（例えば、プロテオーム分析）のための、サンプルの高スループット分析のために、小型化され得、そして自動化され得る。このシステムは、自動化された相互作用する構成要素（例えば、ｐＨ溶液またはゲル（イモビリン（ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）または両性電解質混合物、など）でチャネルを充填するための滴定装置、ＩＥＦバッファを含むセルから生体分子を回収するための抽出器、生体分子を染色するためのデバイス、生体分子を検出および走査するためのデバイス、ならびに画像を記録および分析するためのデバイス）を有するように構築され得る。このシステムおよび／または方法は、所望される薬物の効能について有用な候補の高スループットスクリーニングのために、自動化され得る。
【００１４】
このシステムの発明は、種々の摂動および刺激（例えば、薬物、薬物候補、または生物学的経路を探査するために設計された実験状態、ならびに特定の疾患もしくは疾患状態、または特定の疾患もしくは疾患状態の処置に対応するヒトおよび動物における変化）に応答する生体分子の検出を増強するための方法を提供する。
【００１５】
（詳細な説明）
（Ｉ．ＩＥＦシステム）
ＩＥＦシステムは、以下の要素を備える：１以上のＩＥＦバッファ、電気泳動バッファ、バッファを含むようにチャンバおよび／またはセルを備えるデバイス、ならびにこのデバイスに電流を印可するための手段。このシステムはまた、デバイスを冷却するための手段、および標的認識生体分子（「ＴＲＢ」）を含み得る。
【００１６】
（Ａ．ＩＥＦバッファ）
所定のｐＨ値付近の緩衝化能を有する成分（緩衝剤）またはｐＨ勾配を形成するように構成された成分（例えば、両性電解質、固定化剤または緩衝剤の組み合わせ）を含む。このＩＥＦバッファは、液体もしくはスラリーまたはゲルの形態であり、その結果、生体分子のｐＩが、ＩＥＦバッファのｐＨ範囲内になければ、生体分子は、ＩＥＦバッファを通過し得る。ＩＥＦバッファは、必要に応じて、他の成分（例えば、尿素、界面活性剤、および還元剤）を含み得る。例えば、Ｍａｌｌｏｙら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８０：１〜１０頁（２０００）を参照のこと。ＩＥＦバッファが、電場の影響下で、機能的に安定であることが望ましい。
【００１７】
ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセルは、手動により、または種々のデバイスにより形成され得る。例えば、ＩＥＦバッファは、基質の表面上または基質の溝またはチャネル中に沈着（例えば、コート、プリントまたはスポット）され得る。この基質は、以下に記載されるようなマトリクス、またはこのマトリクスと同一の材料から製造されたビーズであり得る。一つの実施形態に従って、ＩＥＦバッファは、酸性溶液および塩基性溶液を混合し、所望のｐＨ値を有するバッファを形成するデバイス（「滴定器」）によって作製され得る。このバッファは、モノマー（例えば、アクリルアミド）および重合化剤と合わせられ、そしてマトリクス上の所望の位置にＩＥＦバッファを配する別のデバイス（「マトリクスプリンター」）に充填される。例えば、図２５を参照のこと。これらのデバイスは、自動化システムに取り込まれ得る。
【００１８】
両性電解質は、両性であり（すなわち、酸性媒体中で正に荷電され、そして塩基性媒体中で負に荷電される）、可溶性であり、そして約３００ｕ〜１０００ｕのＭｒ値を有する、一連の種々のオリゴアミノ酸および／またはオリゴカルボン酸である。両性電解質は、調製されるか、または購入され得る。例えば、種々のキャリア両性電解質が、当該分野で公知である（例えば、３１〜５０頁，Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．，（１９８３）Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｔ．Ｓ．ＷｏｒｋおよびＲ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；米国特許第３，４８５，７３６号）。あるいは、市販の両性電解質としては、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓ（ＬＫＢ）、Ｓｅｒｖａｌｙｔｅｓ（Ｓｅｒｖａ）、ＢｉｏｌｙｔｅｓおよびＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。
【００１９】
固定化剤は、一般式：ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒの両性ではない二官能性アクリルアミド誘導体である。固定化剤は、調製されるか、または購入され得る。例えば、固定化剤を合成するための方法は、当該分野で公知である（Ｂｊｅｌｌｑｕｉｓｔら，（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，６：３１７）。この固定化剤を、アクリルアミドを用いて共重合して、ＩＰＧ（固体化されたｐＨ勾配）を形成し得る。ＩＰＧは、当該分野で公知の方法によって調製され得るか、または購入され得る。
【００２０】
ｐＨ勾配は、両性バッファまたは両性でないバッファを混合することによって形成され得る。例えば、このような緩衝剤の組み合わせは、Ａｌｌｅｎ，ＲＣら，Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｂｅｒｌｉｎ：Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ＆  Ｃｏ．（１９８４）；および米国特許第５，４４７，６１２号（Ｂｉｅｒ）に記載されている。いくつかのＩＥＦ緩衝剤は、５０ｍＭのグリシン；１４ｍＭのＮａＯＨ；５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１２ｍＭのＮａＯＨ；５０ｍＭのＴＨＭＡ、４４．６ｍＭのＨＣｌ；５２ｍＭのクエン酸；９６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；５０ｍＭのＢＩＣＩＮＥ、１８ｍＭのＮａＯＨ；および５０ｍＭのＤＭＧＡ、４０ｍＭのＮａＯＨを含む。
【００２１】
各セル中のＩＥＦバッファによって形成されるｐＨ勾配は、狭いｐＨ範囲または広いｐＨ範囲を有し得る（例えば、それぞれ、ｐＨ６．８〜ｐＨ７．８またはｐＨ６．８〜ｐＨ１２．８）。ＩＥＦバッファは、極度に狭いｐＨ範囲（例えば、５．５０〜５．６０（０．１ｐＨ単位以下の差））または極端に狭いｐＨ範囲（例えば、５．５２〜５．５４（０．０２ｐＨ単位以下の差））を有し得る。このことは、ＩＥＦバッファが、特定のｐＨ値に調整された一つの緩衝剤であり得るので可能である。この場合において、ＩＥＦバッファのｐＨ範囲は、緩衝剤が調整されたｐＨ値付近の緩衝剤の緩衝化能と等しい。
【００２２】
用語「間隔」は、ＩＥＦバッファによって形成されたｐＨ勾配内での、ｐＨ値の増分差をいう。用語「ステップ」は、２種の異なるＩＥＦバッファ間でのｐＨ値の増分差をいう。例えば、一つのセル内で、この間隔は、そのセル内における全ｐＨ範囲（例えば、このセル内におけるｐＨ６．８、ｐＨ７．０、ｐＨ７．２など）にわたり、０．０２ｐＨ単位程度の小ささであり得る。別の例において、セル番号１中のＩＥＦバッファとセル番号２中のバッファとの間のｐＨ「ステップ」は、０．１ｐＨ単位であり得る。例えば、セル番号１中のＩＥＦバッファは、ｐＨ６．８で開始してｐＨ７．８で終了するｐＨ勾配を有し得、セル番号２中のＩＥＦバッファは、ｐＨ７．９で開してｐＨ８．９で終了するｐＨ勾配をを有し得る（すなわち、ｐＨ７．９−ｐＨ７．８）。用語「ｐＨ範囲」は、ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセル中で、最も高いｐＨ値〜最も低いｐＨ値（例えば、ｐＨ７．９〜ｐＨ８．９）をいうか、またはＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセル中で、最も高いｐＨ値と最も低いｐＨ値との間の差（例えば、１．０ｐＨ単位）をいう。セル内の間隔は、均一でなければならないわけではない。さらに、複数のセルうちの２つのセル間のｐＨステップも、均一でなければならないわけではない。一つの実施形態に従って、このマトリクスは、ＩＥＦバッファ、あるいは極度に狭いｐＨ範囲または極端に狭いｐＨ範囲、および各セル間に小さなｐＨステップを有する、ＩＥＦバッファを有するセルを含む。
【００２３】
一つの実施形態に従って、セル中のＩＥＦバッファのｐＨ範囲は、狭いｐＨ勾配（例えば、１未満のｐＨ単位または数ｐＨ単位まで）である。別の実施形態に従って、セル中のｐＨ勾配は、数ｐＨ単位を超える。一つの実施形態に従って、ＩＥＦバッファのｐＨ間隔は、０．１ｐＨ単位以下である。別の実施形態において、ＩＥＦバッファのｐＨ間隔は、０．０２単位以下である。一つの実施形態に従って、２以上のＩＥＦバッファ間のｐＨステップは、０．０１単位以下である。別の実施形態に従って、２以上のＩＧＦバッファ間のｐＨステップは、０．０２単位以下である。
【００２４】
（Ｂ．セル）
セルは、その中に、そして／またはその壁に組み込まれたＩＥＦバッファを有する中空構造である。そのセルは、球形、三角形、正方形、矩形および円柱形を含む任意の形状を有し得る。セルは、その構造の形状に依存して、１つ以上の壁を有し得る。このセルの壁は、その構造の中心に向いた内部側壁、およびこのセルの外側に向いた外部側壁を有し得る。例えば、図１を参照のこと。所望の用途に依存して、セルの壁は、生体分子透過性、生体分子不透過性、および／または電場透過性もしくは電場不透過性である、メンブレン、メッシュまたは固体から作製され得る。
【００２５】
このセルの壁のいくらかは、電場に対して不透過性であり得る。しかし、このセル壁は、電流がこのセルへと通過するように構築されなければならない。ＩＥＦバッファは、このセルの壁に組み込まれ得る。例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｄガラス繊維フィルタディスクは、アクリルアミドに漬けられ、これは、重合してゲルになり得、次いで、ＩＥＦバッファに浸漬される。従って、このディスクは、セルの壁を形成するために使用され得る。従って、生体分子は、この生体分子のｐＩ値と同じｐＨ値のＩＥＦバッファ中に浸漬された壁を有するセル中でトラップされ得る。
【００２６】
目的の生体分子を含むサンプルが、このシステムの泳動バッファに添加される場合、少なくとも１つのセル壁は、この目的の生体分子の１つ以上に対して透過性でなければならない。一実施形態において、セル壁の全てが、目的の生体分子に対して透過性である。別の実施形態において、１つを除いて全てのセル壁が、生体分子不透過性および／または電場不透過性である。一実施形態において、一次元の電場に向いた一次元の電場と同じ方向のセル壁は、目的の生体分子に対して透過性である。代替の実施形態によると、目的の生体分子が、（１）目的の生体分子を含むサンプルを、このシステム中のセル中のＩＥＦバッファに添加し、そして（２）目的ではない生体分子および／またはイオンを、このセルの外に移動させることによって、調製される場合、セル壁は、この目的の生体分子に対して実質的に不透過性であり得る。このように、このセルは、マトリクス、アレイ、システムおよび方法と組み合わせて、一次元工程で使用され得る。
【００２７】
セルは、いくつかの様式で空間的に配置され得る。例えば、このセルは、隣接して配置され得、例えば、ここで、生体分子透過性材料または生体分子不透過性材料は、別のセルに隣接したセルを離す。例えば、図６ａおよび６ｂを参照のこと。一実施形態によると、ＩＥＦバッファまたはセルは、「分離され」、その結果、生体分子は、あるＩＥＦバッファを通って直接別のＩＥＦバッファに至るか、またはあるセルの壁を通って直接別のセルに至るよりむしろ、ＩＥＦバッファまたはセルの周りを循環する泳動バッファを通って移動することによって、あるＩＥＦバッファから別のＩＥＦバッファまで、実質的に移動する。例えば、図５ａ、５ｂまたは２を参照のこと。一実施形態によると、この分離されたセルは、隣接しているが、これらを分離する生体分子不透過性材料を有する。例えば、図６を参照のこと。あるいは、分離されたＩＥＦバッファまたはセルは、隣接していない。一実施形態によると、ＩＥＦバッファまたはセルが、隣接して配置される場合、別のＩＥＦバッファまたはセルに隣接していないＩＥＦバッファまたはセルの壁の少なくとも１つは、泳動バッファと接触し、そして試験されている生体分子に対して透過性である。ＩＥＦバッファまたはセルは、マトリクスの一部を形成し得る。ＩＥＦバッファまたはセルは、このセルが、一次元の電場に対して平行に配置される場合、互いに連続して隣接されなくてもよい。
【００２８】
生体分子透過性材料または生体分子不透過性材料は、所望の結果に依存して、メンブレンであり得る。このメンブレンは、これがメンブレンの細孔中の電場中に正味の電荷を実質的に有さない様に、調製され得る。代替の実施形態において、メンブレンのｐＨは、このメンブレンの両側のｐＨの中間のｐＨ値であり得る。このことは、メンブレン上の電荷の存在または捕捉により生じる、メンブレンを通るバルク流体の流れ（電気浸透）を最小限にするために望ましい。所望の結果に依存して、有用なメンブレンとしては、Ｍａｒｔｉｎの米国特許第４，２４３，５０７に記載されるメンブレンが挙げられる。あるいは、メンブレンは、Ｆａｕｐｅｌの米国特許第４，９７１，６７０に記載されるような、イモビリン（ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）に共有結合されたメンブレンを含み得る。
【００２９】
セルが、泳動バッファと接触し得る限り、このセルは、チャンバに直接的または間接的に連結され得る。例えば、このセルは、チャンバの底部または側面に直接連結されるか、または絶縁支持体によって、チャンバに取り付けられ得る。例えば、図５ａまたは５ｃを参照のこと。あるいは、このセルは、チャンバに連結されるかまたはこのチャンバに連結されたポストに連結されたマトリクス中に配置され得る。なお別の実施形態において、緩衝剤であるＩＥＦバッファを含むセルは、泳動バッファ中を自由に浮遊し得るが、このセルは、セル中のＩＥＦバッファのｐＨ範囲を示すように、区別されるべきである。例えば、図５ｂを参照のこと。マトリクスまたは個々のセルは、チャンバに連結され得、その結果、これらは、このチャンバ内で回転する。
【００３０】
これらの方法およびシステムの感度は、ＩＥＦバッファまたはセルのサイズが減少するにつれて、増加する。一実施形態によると、ＩＥＦバッファまたはセルのサイズ、特に、ＩＥＦバッファまたはセルの長さは、可能な限り小さい。ＩＥＦバッファまたはセルの長さとは、第２次元の電場の方向に対して平行なＩＥＦバッファまたはセルの最も広い断面をいう。このＩＥＦバッファまたはセルの幅とは、第２次元の電場の方向に対して垂直のＩＥＦバッファまたはセルの最も広い断面をいう。一実施形態において、セルの長さは、任意のサイズ（例えば、１０μｍ〜５．０ｍｍ）であり得る。別の実施形態において、セルの幅は、任意のサイズ（例えば、１０μｍ〜１０．０ｍｍ）であり得る。
【００３１】
レーンは、種々のサイズであり得る。一実施形態によると、このレーンの幅は、２０μｍ〜１ｍｍである。例えば、このレーンの幅は、１００μｍであり得る。別の実施形態によると、各レーンの幅は、３〜１０ｍｍである。
【００３２】
このレーンは、分離技術（例えば、サイズ、形状、電荷、親和性またはこれらの組合せによる）に適切な材料を含み得る。このような材料としては、クロマトグラフィー、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゾーン電気泳動、アフィニティ電気泳動、キャピラリー電気泳動）、および通電クロマトグラフィーに適切な材料が挙げられ得る。従って、一実施形態において、このレーンは、クロマトグラフ物質（例えば、液体クロマトグラフィー）または電気泳動（例えば、キャピラリーゾーン電気泳動、架橋ゲルまたは非架橋ゲルを使用するキャピラリーゲル電気泳動）およびキャピラリー等電集束法に有用な物質で満たされたキャピラリー管であり得る。一実施形態によると、第２次元は、電場媒介分離技術である。
【００３３】
一実施形態に従うレーンは、電気泳動分離に適切なゲル様材料を含み得る（例えば、ＵＳ６，１９７，１７３（Ｋｉｒｐａｔｒｉｃｋ））。このゲル様材料は、重合されたモノマーから構成され得る。このゲルは、問題の生体分子を変性させ得るかまたは変性させ得ない。このゲルは、種々の細孔サイズを有し得る。従って、このレーンは、さらなる成分（例えば、ウレア、界面活性剤および還元剤）を必要に応じて含み得る。例えば、Ｍａｌｌｏｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８０：ｐｐ．１−１０（２０００）を参照のこと。このレーン自体が、一次元のＩＥＦバッファ中に蓄積された生体分子のさらなる分離のためのＩＥＦバッファを含み得る。あるいは、ＩＥＦバッファを含むレーンは、ＳＤＳを泳動バッファに添加することによって、ＳＤＳ−含有ゲルに変換され得、従って、生体分子は、分子量に基づいて二次元で分離され得る。
【００３４】
一実施形態によると、このレーンは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルおよびポリアクリルアミドゲルを含むように予め作製される。別の実施形態によると、このレーンのある長さは、２つの生体分子不透過性層の間に挟まれる。さらなる実施形態によると、このレーンがＳＤＳゲルおよびポリアクリルアミドゲルを含む場合、このレーンは、マトリクス層と別の層との間に挟まれ得、ここで、両方の層は、電場がこのレーンを透過し得、そして電場をＩＥＦバッファからレーンに向かって下向きに方向付け得る限り、生体分子不透過性かつイオン不透過性であり得る。例えば、図１６を参照のこと。
【００３５】
このレーンは、手により形成され得るか、または種々のデバイスにより形成され得る。例えば、アクリルアミド溶液および重合剤が、デバイス（「マトリクスプリンター」）に充填され得、このデバイスは、レーンを、アレイ上の所望の位置に配置する。例えば、図２６を参照のこと。改変されたオフィスインクジェットプリンターは、一例である。このようなデバイスは、自動化システムに組み込まれ得る。
【００３６】
一次元工程および／または二次元工程における使用のためのゲルを作製するために、従来のアクリルアミド／ビス−アクリルアミド溶液またはアガロース溶液に加えて、種々のモノマーが使用され得る。従来の化学重合ゲルにおいて、ヒドロキシエチルメタクリレートおよび他の低分子量アクリレート型化合物をモノマーとして使用することが知られている；これらは、「Ｌｏｎｅ−Ｒａｎｇｅｒ」ゲルとして市販されている。１つ以上のアクリレート型基で置換されたポリマーの使用もまた、水と混和性の有機溶媒（例えば、アルコールまたはアセトン）との混合溶媒における分離のために特に適切であるとして、文献（ＺｅｗｅｒｔおよびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １３：ｐｐ．８２４−８３１，（１９９２））に記載されている。ゲル形成モノマーはまた、架橋を形成し得る材料と組み合わせた、光重合性反応性基を含む実質的に水溶性の任意の分子であり得るが、ただし、この組合せは、一旦重合されると、特定の型の電気泳動に適切なゲルを形成する。
【００３７】
例示的な材料としては、以下が挙げられる：メチレン−ビス−アクリルアミドまたは他の公知の架橋剤と組み合わせた、アクリルアミド；ヒドロキシエチルメタクリレート、ならびにアクリル酸、メタクリル酸およびそれらのアルキル置換誘導体の他の低分子（約３００ダルトン未満）誘導体（例えば、クロトン酸）；ビニルピロリドンおならびに他の低分子量ビニル化合物および低分子量アリル化合物；非イオンポリマーのビニル誘導体、アリル誘導体、アクリル誘導体およびメタクリル誘導体（アガロース（「Ａｃｒｙｌａｉｄｅ」架橋剤、ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．）、デキストランおよび他の多糖類のこのような誘導体を含む）、ならびに誘導体（例えば、セルロース誘導体（ヒドロキシエチルセルロースを含む））；ポリビニルアルコール；グリコールのモノマー誘導体、オリゴマー誘導体およびポリマー誘導体（エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシドおよびそれらのコポリマーのポリマーを含む）；他の水混和性ポリマーのアクリル誘導体、ビニル誘導体またはアリル誘導体（例えば、ポリＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルアクリル酸）、ポリマーＮ−イソプロピルアクリルアミド（これは温度感受性である）、マレイン酸ポリマーおよびコポリマー、部分的に加水分解されたＥＶＡＣ（エチレンと酢酸ビニルとのポリマー）、エチレンイミン、ポリアミノ酸、ポリヌクレオチド、ならびにこれらのサブユニットの互いとの、およびより疎水性の化合物（例えば、ピリジン、ピロリドン、オキサゾリジン、スチレンおよびヒドロキシ酸）とのコポリマー）。重合性材料は、特に、溶媒または界面活性剤が、このゲル形成溶液中に含まれる場合、水溶性であることを全く必要としない。
【００３８】
一般的なポリマーの重合性誘導体を作製するための方法は、当該分野で公知である；例えば、ヒドロキシル基へのアリルグリシジルエーテルの付加は、酸、無水物またはアシルクロリド（例えば、無水アクリル酸）とのヒドロキシルのエステル化と同様に、公知である。アミンは、アシル無水物またはアシルクロリドで容易に誘導体化される。上記の誘導体化ポリマーの多くは、１つより多い活性基を含み、その結果、自己架橋性である。架橋剤（一分子あたり平均して１つより多い反応性基を含む）の添加は、わずか１つの反応性基を有するモノマー（例えば、アクリルアミド）からゲルを形成するために必要である。これには、多重誘導体化ポリマーに加えて、メチレンビス−アクリルアミド、エチレングリコールジアクリレートおよび１つより多いエチレン性不飽和官能性を有する他の低分子（例えば、アクリル、ビニルまたはアリル）が挙げられる。
【００３９】
候補非アクリルアミドモノマーとしては、例えば、以下が挙げられ得る：アリルアルコール、ＨＥＭＡ（ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート）、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールモノアクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ビニルカプロラクタム、ビニルピロリドン、アリルグリシジルデキストラン、ポリビニルアルコールのアリルグリシジル誘導体、およびセルロールおよび誘導体のアリルグリシジル誘導体、酢酸ビニル、ならびに１つ以上のアクリル基、ビニル基またはアリル基を含む他の分子。
【００４０】
ＩＥＦ／レーンユニットは、レーンと共にＩＥＦバッファを含むＩＥＦバッファまたはセルである。一実施形態において、ＩＥＦ／レーンユニットは、予め作製され、その結果、ＩＥＦバッファは、レーンと接触する。例えば、図１６Ｄを参照のこと。別の実施形態において、ＩＥＦ／レーンユニットは、予め作製され得、その結果、ＩＥＦバッファおよびレーンは、別個であるが、互いに連結され得る。例えば、ＩＥＦバッファおよびレーンは、マトリクス中で移動可能であり得、その結果、これらは、所望の時間に、一緒にされ得る。別の例において、このＩＥＦバッファおよびレーンは、これら２つを一緒に連結するゲルプラグを介して連結され得る。ＩＥＦバッファまたはセルが、レーンに連結される場合、このＩＥＦバッファまたはセルとレーンとの間の連結は、目的または問題の生体分子の移動に対して許容性でなければならない。
【００４１】
（Ｃ．マトリクス）
マトリクス（またはマトリクス層）は、固体材料または半固体材料（例えば、セラミック、ガラス、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリレート）（例えば、ルサイト）、またはゲル）であり、これは、１つまたは複数のセルおよび／またはＩＥＦ／レーンユニットを構成する。一実施形態によると、このマトリクスを形成する材料は、導電性が乏しい。別の実施形態によると、このマトリクスは、部分的または全体的に、レーンの長さに接触するように、生体分子不透過性かつイオン不透過性（ＢＩＡ）である材料から作製される。ＩＥＦ／レーンユニットは、例えば、ゲルとしてのマトリクスの表面上に配置され得、図１５のマトリクスＢまたはＣは、マトリクス層中のエッチングされた溝部内に配置され得るか、またはＩＥＦバッファまたはセルが一次元の泳動バッファと接触し得る限り、このマトリクス層を通って延び得る。一実施形態によると、ＩＥＦバッファ、セルまたはレーンが、マトリクスを通って延びる場合、ＩＥＦバッファ、セルまたはレーンの側面のうち泳動バッファと接触している１つは、生体分子不透過層で覆われる。このマトリクスは移動可能であるか、またはチャンバ内にあり得る。
【００４２】
このマトリクスは、例えば、マトリクスの１つの側面を通ってこのマトリクスの反対の側面まで通る穴をあけ、チャネルをＩＥＦバッファで満たし、そしてこのチャネル内の開口部をイオン透過性のタンパク質透過性メンブレンで密閉することによって、作製され得る。あるいは、このチャネルは、特定のｐＨ範囲を有するゲルへと固化するＩＥＦバッファと混合された、ポリマー（例えば、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル）で満たされ得る。このマトリクス中のセルはまた、１つの溝部または複数の溝部（これは、マトリクス、例えば、図１５のマトリクスＡまたはＤ）の反対側を通って延びない）を生成することにより、作製され得る。これらの溝部は、マトリクスの任意の側面上に作製され得る。一実施形態によると、これらの溝部は、マトリクスの一方の側面上にある。これらの溝部は、１種または複数種のＩＥＦバッファで満たされ得る。
【００４３】
１つの実施形態に従って、ＩＥＦバッファまたはセルは、生体分子がＩＥＦバッファまたはセルから別のＩＥＦバッファまたはセルへと、互いに直接的に移動する代わりに、電気泳動バッファを介して、実質的に移動するように、分離される。セルがマトリクスの１つの側面を通ってマトリクスの反対の側面に伸長する場合、それは、チャネルと呼ばれ得る。マトリクス内のチャネルは、代表的に、互いに平衡に配置される。１つの実施形態に従って、マトリクス層は、複数の同一の配向のＩＥＦ／レーンユニットを含む。別の実施形態に従って、複数の同一の配向のＩＥＦ／レーンユニットは、互いに平行におよび／またはタンデムに配置され得る。別の実施形態に従って、マトリクスまたはチップは、較正曲線を作製する際に使用するためのＩＥＦバッファを含むか、または他のセルからの結果と比較するための標準を有する、サブセットのセルを含むように予め設計される（例えば、図１５）。別の実施形態に従って、マトリクスまたはチップは、目的の公知の生体分子（例えば、疾患状態に対する生体分子マーカー）または疾患状態を示す一連の生体分子のｐＩに対応するｐＨ値を有する、予め選択されたセットのＩＥＦバッファを含む予め作製された診断ツールである。
【００４４】
較正曲線は、サンプル中の標的生体分（「ＴＢ」）の量を決定するのに有用である。定量的な較正曲線は、既知の濃度の既知の生体分子または既知の生体分子を含む複合体を混合し、そして適切なＩＥＦバッファを有するセル中で既知の生体分子または複合体の蓄積を評価することによって作成され得る。好ましくは、ＴＢおよび／または標的認識分子（「ＴＲＭ」）が市販されるかまたは容易に入手可能である場合、市販または容易に入手可能なＴＢを、既知の生体分子として使用するか、または較正曲線のための複合体を形成するために、市販または容易に入手可能なＴＲＭと接触させる。既知の生体分子は、標識付けされ得るか、または標識された複合体中に存在し得る。好ましくは、同じ標識が較正曲線を作成し、そしてサンプルを試験するプロセスにおいて使用される。電気泳動バッファに添加される既知の生体分子または複合体の濃度は、蓄積されるセルにおけるシグナルの量に対してグラフ化され得る。このグラフは、蓄積されるセルにおけるシグナルの量に基づいて、サンプル中のＴＢの濃度を外挿するための手段として使用され得る。例えば、図２９を参照のこと。
【００４５】
複合体が各セルに分離された後、複合体は、第２次元における分析（すなわち、セルの外側の分析）に供され得る。例えば、第２次元の分析は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、質量分析法、およびＨＰＬＣクロマトグラフィーのような分析の方法を含む。
【００４６】
第１次元の電場は、ＩＥＦバッファへと通過し得るべきである。電場の方向とマトリクスとの間の角度は、電場が、チャネル内のＩＥＦバッファ中を通過し得る限り、互いに対して＋９０°〜−９０°の間であり得る。１つの実施形態において、角度は、＋９０°である。別の実施形態において、電流は、可逆ではなく、システムを横切って単一方向に流れ、ここで、ＩＥＦバッファおよびセルは、隣接せず、そして問題の生体分子に対して透過性の壁は、電流の方向に対して垂直に配向され、サンプルが、電気泳動バッファに直接添加される。別の実施形態において、このシステムは、攪拌手段（例えば、磁性攪拌バー）を備える。なお別の実施形態において、実験の間、電気泳動バッファ内に生成される対流は、このシステムが攪拌される唯一の手段である。
【００４７】
１つの実施形態において、サンプルのハイスループットスクリーニングのために、セルを含むマトリクスが小さなチップ様構造である場合、有用である。チップは、所望の小型化した表面特徴を有するために、マイクロ製造され得る（例えば、ドライエッチ、ウェットエッチ、レーザーエッチまたは機械加工、成型もしくはエンボス加工され得る）任意の材料から作製され得る。チップは、ポリマー、セラミック、ガラス、その複合体、その積層体などであり得る。実施における、マイクロ製造技術（例えば、バルクエッチング、表面マイクロ機械加工、厚膜プロセシング、レーザーアブレーション、レーザーエッチング、成型およびエンボス加工）の使用によって、マイクロスケールの成分および構造の整列において高い程度の正確性が可能である（例えば、Ｅ．Ｗ．Ｂｅｃｋｅｒら、（１９８６）Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：３５−５６）。１つの実施形態において、チップは、複数のセルを含み、ここで、２つ以上のセルは、異なるＩＥＦバッファを有する。例えば、図１１を参照のこと。別の実施形態において、サブセットのセルのＩＥＦバッファのｐＨ値は、ＴＢを含む複合体が蓄積しているセルのＩＥＦバッファのｐＨと同じではない。
【００４８】
マトリクスの寸法は、例えば、１×１ｃｍ〜１０×１０ｃｍであり得る。１つの実施形態に従って、マトリクスは、レーンの数、それらのレーンの長さおよびそれらの間の間隔に依存して、５×５ｃｍまたは４×１０ｃｍである。１つの実施形態に従って、マトリクスの厚みは、１ｍｍである。
【００４９】
（Ｄ．アレイ）
アレイは、第２の層をさらに含むマトリクスである。第２の層は、一般的に、サンプル中の実質的な量の生体分子がＩＥＦ分離工程の間にレーンにおいて局在化することを妨げるように、レーンの１つの側面を覆うように機能するが、電場が、第２次元の工程の間、レーンを貫通することを可能にする。従って、第２の層は、レーンの長さおよび幅と同じかまたはそれより大きいレーンスクリーニング領域（ＬＳＡ）を含み、ここで、このＬＳＡは、生体分子に対して不透過性であり、そしてイオンに対して透過性である。第２の層は、全体的に、ＬＳＡ材料から作製され得るか、またはレーンの寸法を有するＬＳＡ材料の一部を有するように構築され得る。１つの実施形態に従って、ＬＳＡは、伝導性ではない。別の実施形態に従って、レーンは、マトリクス層とＬＳＡとの間に挟まれる。
【００５０】
生体分子不透過性であるがイオン透過性である材料は、当該分野において公知である（例えば、セロハン、ポリエーテルスルホン、ナイロン、セルロースアセテート、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ペルフルオロスルホネートカチオン交換メンブレン（例えば、Ｎｆｉｏｎメンブレン）および他のペルフルオロ化イオン交換メンブレン）。
【００５１】
第２の層は、必要に応じてさらに、第２の層の平面を通る穿孔を含む。この穿孔は、この穿孔が、ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセル上に位置付けられるように、配置され得る。穿孔の機能は、ＩＥＦ分離工程の間、ＩＥＦバッファまたはセルにサンプル中の生体分子がアクセスし得ることである。例えば、図１６ａおよびｂを参照のこと。第２の層は、マトリクスから脱着可能であり得るか、マトリクスに永久的に結合可能であり得るか、または全くマトリクスに結合され得ない。アレイの例は、図１５Ｂおよび１６Ｃならびに図１７の「第２」および「マトリクス」の組合せに見られ得る。
【００５２】
（Ｅ．チャンバ）
チャンバは、電気泳動バッファを含む容器である。例えば、図２を参照のこと。１つの実施形態に従って、チャンバは、小容量の電気泳動バッファ（すなわち、電場がＩＥＦバッファまたはセルおよびレーンに通過し得るように、セルおよび電極と接触するのに必要とされる最小量）を保持するように設計される。別の実施形態に従って、チャンバの外側は、さらに、電流がチャンバを通って電極へと通るのを可能にするためのコネクタをさらに含む。なお別の実施形態に従って、チャンバは、使い捨て可能である。
【００５３】
（Ｆ．電気泳動バッファ）
電気泳動バッファは、電流を伝達し得るチャンバ中の溶液である。例えば、電気泳動バッファは、０．０１Ｍ  Ｋ２ＳＯ４であり得る。電気泳動バッファは、他の薬剤（例えば、生体分子の活性および／または安定性を維持するために有用な薬剤（例えば、ピプロテアーゼインヒビターまたは洗浄剤））を含み得る。第１次元において使用される電気泳動バッファは、必要に応じて、第２次元の工程において、同じバッファまたは異なるバッファに変更され得る。あるいは、第２次元の工程において、電気泳動バッファは存在しない。１つの実施形態に従って、電気泳動バッファは、複合体が適切なセルに蓄積し得るように、ＩＥＦバッファのｐＨ範囲および目的の生体分子について最適化される。電気泳動バッファは、ＩＥＦバッファまたはセルに入る生体分子の移動度を増加または減少させるｐＨ値であるように調節され得る。
【００５４】
（Ｇ．電場を作製および／または電場を方向付けするためのデバイス）
ＩＥＦバッファまたはセルを通る電場を方向付けするためのデバイスは、例えば、カソード電極およびアノード電極ならびに電圧電源の使用を含む。１つの実施形態に従って、デバイスは、交流電場を作製し得る。電極は、電場がＩＥＦバッファまたはセル内を通過するように、ＩＥＦバッファまたはセルの反対側に配置され得る。１つの実施形態に従って、電極は、ワイヤである。別の実施形態に従って、電極は、ワイヤまたは薄いプレートの平行なセットである。例えば、図２〜６を参照のこと。デバイスは、ＡＣ電圧またはＤＣ電圧を供給し得る。ＩＥＦバッファまたはセルが閉鎖系である（例えば、電場がＩＥＦバッファまたはセルの１つの側を通って、ＩＥＦバッファまたはセルの反対側から外に通過できない）場合、このデバイスは、ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含むセルの内外に電場を方向付ける（すなわち交流電場）ことができることが有利である。交流電場の配向は、アレイの面またはＩＥＦバッファまたはセルの面に対して垂直である必要はない。これは、アレイの面に対して＋９０°と−９０°との間であり得、ＩＥＦバッファまたはセルの軸に対して平行な電場成分を常に供給する。
【００５５】
１つの実施形態に従って、電極は、白金またはチタンから作製されるか、あるいは、白金またはチタンでコーティングされる。１つの実施形態に従って、電極は、０．５ｃｍ〜１０ｃｍの間の距離で離れる。別の実施形態に従って、電極は、５ｃｍ離れる。さらなる実施形態に従って、電極間の距離は、電気泳動バッファが依然としてセルを横切って循環し得る最小距離である。さらなる実施形態に従って、電極は、マトリクスまたはセルの長さとほぼ同じ距離離れる。
【００５６】
電気泳動バッファに印加される電圧は、ＤＣまたはＡＣであり得る。ＩＥＦバッファまたはセルが閉じており、そして印加される電圧がＤＣである場合、電場がＩＥＦバッファまたはセルの内外に方向付けられるように、電場の方向を手動的にまたは自動的に交互させるための方法がなければならない。１つの実施形態に従って、電場の方向は、例えば、手動的にまたは自動的に、印加される電圧の極性を切り換えるか、または一定の電場内でＩＥＦバッファまたはセルを１８０°回転させることによって、変更され得る。１つの好ましい実施形態に従って、電圧は、ＡＣである。
【００５７】
（Ｈ．バッファを循環させるための方法）
ＩＥＦバッファまたはセルを横切って電気泳動バッファを循環させるためのデバイスは、同時に、例えば、当該分野で公知の液体を循環させるための磁性プレートまたは他のデバイス（例えば、ポンプ、振動子（例えば、ピエゾ振動子、攪拌機、可傾式（ｔｉｌｔｉｎｇ）デバイス）によって制御されるチャンバ内に配置される攪拌バーを備える。図２を参照のこと。別の実施形態において、循環させるためのデバイスは、電気泳動バッファに対してＩＥＦバッファまたはセルを移動させるための機構であり得る。例えば、ＩＥＦバッファまたはセルは、電気泳動バッファ中で回転し得る。このようなデバイスの活動は、この方法およびシステムにおいて、第１次元の工程（ＩＥＦ工程）の間、有用である。電気泳動バッファの循環または電気泳動バッファに対するセルの循環は、それらのそれぞれのＩＥＦバッファまたはセルに対する目的の生体分子の高速な曝露を促進する。あるいは、この方法およびシステムは、このような循環デバイスを欠き得る。別の実施形態において、循環は、単に、等電集束法の間に自然に生成される対流によって提供される。１つの実施形態に従って、生体分子を循環させるのに十分な対流エネルギーの量は、電気泳動バッファ１ｃｍ３当たり、１０−１０ジュールである。
【００５８】
（Ｉ．電場を方向付けるための手段）
ＩＥＦバッファまたはセルから離れてレーンの長さの下方に電場を方向付けるためのデバイスは、構成要素のいくつかの異なる配置を含み得る。このデバイスは、ＩＥＦバッファ内の生体分子をレーン中に下へと移動させるように機能する。従って、レーン分離を含む、第２次元の電場の方向は、主に、ＩＥＦバッファから離れてレーンの下方向であるべきである。例えば、１つの電極は、ＩＥＦ／レーンユニットの一端（例えば、ＩＥＦバッファの先端）に配置され得、そして別の電極は、ＩＥＦ／レーンユニットの他端（例えば、レーンの末端）に配置され得る。あるいは、１つの電極は、レーンの末端に配置され得、そして他の電極は、ＩＥＦ分離工程の前に使用されたものであり得る。図２８を参照のこと。供給される電圧は、ＤＣであり得る。電源およびＤＣ電流を供給し得る電極は、市販され、そして当該分野で公知である。
【００５９】
（Ｊ．システムまたはキット）
システムは、分解されているかまたは組み立てられたキットとして販売され得るいくつかの構成要素を備える。キットの構成要素としては、以下が挙げられる：ＩＥＦバッファ、セル、マトリクスまたはアレイ；および必要に応じて、ＩＥＦバッファおよびセルならびに／または電気泳動バッファを含むチャンバの内外に電場を方向付けるためのデバイス。このシステムはまた、必要に応じて、ＩＥＦバッファまたはセルから離れて、レーンの長さの下方に電場を方向付けるためのデバイスを備える。このシステムは、必要に応じて、さらに、ＩＥＦバッファまたはセルを横切る電気泳動バッファを循環させるためのデバイスを備える。システムの例は、図１７および図２８に示される。１つの実施形態に従って、チャンバは、使い捨て可能であり、電圧供給源と接触させるために、チャンバの底面または側面に接続されるコネクタを有する。
【００６０】
システムは、さらに以下のいずれか１つを備え得る：セルまたはレーン内のサンプルの生体分子を方向付けるためのデバイス；検出デバイスからデータを受信するためのデバイス；および受信されたデータを処理するためのデバイス。１つの実施形態に従って、走査型ミクロデンシトメーターが、セルまたはレーンからのシグナルを検出、受信および処理する。
【００６１】
（検出デバイス）
セルまたはレーンのサンプル中の生体分子を検出し、検出デバイスからのデータを受信し、そして受信されたデータを処理するために必要な１つ以上のデバイスがコンピューターにパッケージされ得る。
【００６２】
検出デバイスは、スペクトルの波長、複数の波長または１つの波長である電磁放射を、同時にまたは連続的に、レーンに投射するように設計され得る。１つの実施形態に従って、照射光源は、単色である。例えば、検出デバイスは、狭いスペクトルの光が、それぞれのＩＥＦバッファ、セルまたはレーン上に投射された後に、特定の波長のそれぞれのＩＥＦバッファ、セルまたはレーンからの吸収の大きさを迅速に連続的に読み取る特注の光度計であり得る。あるいは、検出デバイスは、それぞれのＩＥＦバッファ、セルまたはレーンを同時に読み取り、そして／またはいくつかの波長におけるそれぞれのＩＥＦバッファ、セルまたはレーンから発せられる電磁放射に関連する読み取りを行うように設計され得る。
【００６３】
適切な検出デバイスとしては、肉眼、分光光度測定検出機器、化学発光検出機器、光度測定／濃度測定検出機器、電気化学検出機器または放射化学検出機器が挙げられるがこれらに限定されず、このデバイスは、生体分子が標識されるか否か、および標識の型に依存する。この標識は、シグナルを発生する反応を引き起こすためかまたは上で言及した方法に従って検出可能なシグナルを増加させるために、他の成分を必要とし得る。適切なシグナル発生システムの詳細な議論は、Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第５，１８５，２４３号（１１〜１３欄）（これは、本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。標識を結合するための技術の詳細は、当該分野で公知である。例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５）１５１：２０５−２０９、およびＥｎｇｅｌｈａｒｄｔら、欧州特許出願番号０３０２１７５を参照のこと。
【００６４】
（コンピューター性能）
１つの実施形態に従って、コンピューターは、モジュールを備え、このモジュールは、コンピューターに以下の工程を実行させ得る：（ａ）レーンからの実験データを受容する工程、ならびに（ｂ）サンプル中の生体分子および／またはサンプル中の目的の生体分子に代表的なプロフィールを作成する工程。このような分子は、疾患において、より機能的に注釈した薬物標的を迅速に同定し、選別し、そして選択する際に有用であり得る。別の実施形態に従って、このコンピューターは、モジュールを備え、このモジュールは、コンピューターに以下の工程を実行させ得る：（ａ）レーンからの実験データを受容して、サンプル中の生体分子のプロフィールを作成する工程；（ｂ）参照プロフィールを受容する工程；ならびに、（ｃ）これら２つのプロフィール間の類似性の客観的な測定値を算出する工程。この参照プロフィールは、当該分野で公知の値であり得るか、または研究者によってプログラム化された値であり得る。
【００６５】
（ネットワーキング）
コンピューターは、ネットワークに接続され得、このネットワークは、他のローカルコンピューターシステム、リモートコンピューターシステム、またはワイドエリア通信ネットワーク（例えば、Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）へのイーサネット（登録商標）リンクの一部であり得る。このネットワークリンクは、コンピューターがデータおよび処理タスクを他のコンピューターリンクと共有することを可能にする。共有データへのアクセスは、診断目的、予備診断目的、または一般的な研究目的のための遺伝子分析またはプロテオーム分析のために、特に有用である。例えば、このコンピューターは、既知の情報を使用して特定の疾患状態または特定の疾患に対する感受性の指標である特定のプロフィール（例えば、タンパク質またはＲＮＡ発現パターン）を認識するように、予め設定され得る。次いで、被験体由来のサンプルが、このシステムを使用して試験され、このサンプル中の生体分子が同じプロフィールを示すか否かが決定され得る。
【００６６】
（サンプルおよびバッファ操作）
さらになお、このシステムは、以下のうちの、少なくとも１つ、組み合わせまたは全てをさらに備え得る：サンプル供給器、廃液処理器、バッファ供給器、染色試薬供給器、アレイ操作システム、およびディスプレイ。サンプル供給器は、サンプルのアリコートをチャンバに加えるようにプログラムされ得る。廃液処理器は、分析の間いつでも、廃棄物質（例えば、その使用後の移動バッファ）を排出するようにプログラムされ得る。バッファ供給器は、分析間いつでも、新たなバッファまたは異なるバッファを放出するようにプログラム化され得る。染色試薬供給器は、設定期間にわたって、染料を放出し、生体分子をこの染料に曝すようにプログラム化され得る。アレイ操作システムは、分析の間、必要な場合に、マトリクス、アレイまたはチャンバを移動させるようにプログラム化され得る。ディスプレイは、第１次元または第２次元の分析結果に関する情報を与える、スクリーンまたは他のデバイスであり得る。例えば、図２７を参照のこと。
【００６７】
（自動化）
１つの実施形態に従って、このシステムは、全体または一部が自動化されており、その結果、１つまたは多くのサンプルが、この方法に従って分析され得る。例えば、サンプルは、このシステムに加えられ得、このシステムは、第１次元または第２次元の分析の全ての工程を実行し、レーンの画像を回収し、受容し、処理し、そして特定の生体分子または生体分子のパターンが存在するか否かを決定するようにプログラムされる。
【００６８】
システムは、さらなる自動化された相互作用構成要素（例えば、チャネルを、ｐＨ溶液またはゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ、両性電解質混合物など）で充填するための滴定器（ｔｉｔｒａｔｏｒ）、および生体分子をＩＥＦバッファ、セルまたはレーンから回収するための抽出器）を有するように構築され得る。１つの実施形態に従って、このシステムは、サンプル、化合物または薬物の高スループットスクリーニングのために自動化される。
【００６９】
（ＩＩ．分析または分離されるべきサンプル）
（Ａ．分析または分離されるべき生体分子）
生体分子は、電荷を有する生物学的サンプル中に存在する任意の有機分子（例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴ糖類、脂質、ステロイド、プロスタグランジン、プロスタシクリン、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む））を含む。本明細書中で使用される場合、用語「生体分子」は、未改変の生体分子、糖化生体分子、非糖化生体分子、リン酸化生体分子、非リン酸化生体分子、および他の改変生体分子を含む。例えば、生体分子は、（例えば、３５Ｓ−メチチオニン標識または３２Ｐ−標識によって）第１次元での分離前に、標識され得る。１つの実施形態に従って、この生体分子は、タンパク質であり、これは、人為的に作製されても天然に存在していてもよい。タンパク質は、以下からなる群より選択されるがこれらに限定されない長さを有し得るペプチドである：５００未満の残基、３００未満の残基、２００未満の残基、１００未満の残基、５０未満の残基、２５未満の残基、および１５未満の残基。
【００７０】
（Ｂ．標的生体分子および標的認識分子）
標的生体分子（「ＴＢ」）は、標的認識分子（「ＴＲＭ」）によって特異的に認識可能な、目的の生体分子である。１つの実施形態において、この標的生体分子は、疾患または状態についてのマーカーである。この標的生体分子は、サンプルに対して内因的であるかまたはサンプルに対して外因的である（すなわち、サンプルまたは移動バッファに加えられる）生体分子であり得る。目的の生体分子は改変され得、その結果、この生体分子は、ＴＲＭに対してそれ以上の親和性を有するＴＢである。例えば、目的の生体分子は、ＴＲＭ（例えば、抗体）に特異的に結合するエピトープを含むペプチドをさらに含有するように、共有結合によって改変され得る。
【００７１】
ＴＲＭは、ＴＢの一部に特異的に結合する分子である。ＴＲＭは、検出のためのシグナルを提供または増幅するため、および／あるいはバックグラウンドを越えて識別可能なシグナルを提供するために有用であり得る。例えば、ＴＲＭは、ＴＢを特異的に認識する標識された抗体（例えば、一価（モノエピトープ（ｍｏｎｏｅｐｉｔｏｐｉｃ））または多価（ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ））の、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’など）であり得る。さらに、特定の標的生体分子に対する結合親和性が維持される限り適切である場合、凝集体、ポリマー、および免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの結合体が使用され得る。この標的生体分子が抗体である場合において、抗体に特異的に結合する抗体が、使用され得る。別の例において、ＴＢがそれぞれ、レセプターまたはリガンドである場合、ＴＲＭは、このＴＢに結合するリガンドまたはレセプターであり得る。なお別の例において、このＴＲＭは、ＴＢが核酸分子である場合、ＴＢに特異的に結合するかまたはＴＢに特異的にハイブリダイズする一本鎖核酸分子であり得る。あるいは、このＴＲＭは、核酸分子に結合する核酸結合タンパク質（例えば、転写因子、スプライシング因子、ヒストンなど）であり得る。なお別の例において、ＴＢが酵素である場合、ＴＲＭは、その酵素の活性部位に特異的に結合する分子であり得る。
【００７２】
従って、ＴＢおよびＴＲＭは、以下であり得る：ｓｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖；ポリヌクレオチド結合剤（例えば、制限酵素、アクチベーター、レプレッサ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヒストン、修復酵素、化学療法剤（これらに限定されない））；抗原および抗体；非免疫学的対（例えば、アビジンおよびビオチン）；レセプターおよびリガンド（膜結合レセプター（例えば、Ｇタンパク質レセプター（例えば、ムスカリン性レセプター、アドレナリン作用性レセプター、プロスタグランジンレセプターおよびドーパミンレセプター（例えば、Ｄ２レセプター））、チロシンキナーゼ（インスリン様ＩＧＦ、表皮ＥＧＦ、神経ＮＧＦ、線維芽細胞型ＦＧＦ増殖因子）、イオンチャネルならびにＴ細胞レセプター）を含む）。
【００７３】
（Ｃ．生体分子のための標識またはタグ）
生体分子は、ＩＥＦ分離工程の前または第２次元での分離の後に、例えば、肉眼、分光光度測定手段、化学発光手段、光度測定／濃度測定手段、電気化学手段もしくは放射化学手段によってか、または表面プラズモン共鳴像によって検出するために、タグ化され得る。このタグは、標識されるかまたは内因的に検出可能であり、かつこの生体分子を特異的に認識する、検出可能な分子（例えば、化合物、核酸またはタンパク質（例えば、抗体））である。この生体分子がＩＥＦ分離工程の前にタグ化される場合において、この生体分子のｐＩは、そのタグの存在に起因して変化するようであり、それによって、このＩＥＦバッファまたはセルのｐＨ値は、複合体を捕捉するために、従って変化する。この生体分子は、第２次元での後、当該分野で公知の方法（例えば、ウエスタンブロッティング）によって、タグ化され得る。
【００７４】
生体分子のための数種の非特異的染料（例えば、クマシーブルー、銀染色、ヘキスト色素および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’，６−ｄｉａｍｉｄｏｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）（ＤＡＰＩ））は、当該分野で公知であり、生体分子をタグ化するために有用である。使用される染料およびタグは、目的の生体分子に従って、変更される。
【００７５】
生体分子を検出するために有用な標識としては、以下が挙げられ得る：蛍光発光団、基質、電子伝達剤、補酵素、エンハンサー、酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、アクチベーター、補因子、インヒビター、清掃細胞、金属イオン、およびシグナル発生物質の結合のために必要とされる特定の結合物質。標識の例としては、以下のような蛍光発光団が挙げられる：フルオレセイン、シアニン色素、クマリン、フィコエリトリン、フィコビリンタンパク質（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）、塩化ダンシル、イソチオシアネート、ローダミン化合物、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、ならびにフルオレサミンおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ。適切な標識としては、例示目的であって制限ではないが、以下が挙げられる：酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、グリコール−６−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）および西洋ワサビペルオキシダーゼ）；プロモーター；色素；電子発光標識（例えば、ルテニウムキレート）；化学発光剤（例えば、イソルミノール）；感作物質；補酵素；酵素基質；放射標識（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、５７Ｃｏおよび７５Ｓｅ）。適切な酵素および補酵素は、Ｌｉｔｍａｎらに対する米国特許第４，２７５，１４９号（１９−２８欄）、およびＢｏｇｕｌａｓｋｉに対する米国特許第４，３１８，９８０号（１０−１４欄）に開示されており；適切な蛍光剤および化学蛍光剤は、Ｌｉｔｍａｎら（３０−３１欄）に開示されている（これらは、本明細書中で参考として援用される）。
【００７６】
目的の生体分子に対して開発された抗体は、蛍光発光団で標識され得る。この蛍光発光団は、特定の波長における高い吸収係数または高い蛍光収率を有するように選択され得る。
【００７７】
標識を有さない検出（例えば、表面プラズモン共鳴）を使用して、単一の生体分子または複合体を検出し得る。例えば、セルまたはマトリクスは、チャンバ内の固体支持体上に配置され得、これは、様々なｐＨ範囲のセルが１種以上のビオチン分子上に配置される様式でビオチン化されている。標的生体分子または標的認識分子は、ストレプトアジピンに結合されるように改変され得、次いでセルまたは移動バッファに導入され得る。適切なｐＩの複合体は、適切なｐＨを保有する１つ以上のセルに拡散し、そして存在するビオチン分子とともに３元複合体を形成する。このような結合は、固相状態の下にある表面プラズモン共鳴センサによって検出され得、この共鳴シグナルは、この検出手段によって、検出および処理される。
【００７８】
ＴＢおよびＴＲＭを含む複合体（ここで、この複合体の成分は、互いに共有結合または非共有結合している）は、ＴＢおよびＴＲＭのみを含み得るか、または他の分子（例えば、他の生体分子、金属イオン、検出部分または標識）をさらに含み得る。この複合体の全体のｐＩ値は、この複合体が特定のセル内に蓄積するかまたは装置のいずれのセルでも蓄積しないのかを決定する。目的の複数の複合体が単一サンプル中でモニタリングされる場合、これらの複合体は、同じｐＩ値も有さないし同じ標識も使用しないことが、非常に望ましい。
【００７９】
（Ｄ．サンプル）
サンプルは、任意の生存する生物から得られたか、任意の生存する生物によって排出されたか、または任意の生存する生物によって分泌された、任意の固体サンプルまたは液体サンプルをいい、これらの生物としては、単細胞微生物（例えば、細菌および酵母）および多細胞生物（例えば、植物および動物（例えば、脊椎動物または哺乳動物）、および特に、健康もしくは適度に健康なヒト被験体、または診断もしくは調査されるべき状態もしくは疾患に罹患したヒト患者）が挙げられる。生物学的サンプルは、任意の部位から得られた生物学的流体（例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、滑液、脳脊髄液、羊水、精液、頚管粘液、痰、唾液、歯肉滲出液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の体内分泌液）、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍または感染もしくは炎症の任意の他の部位から得られる流体）、あるいは関節（例えば、正常な関節、または慢性関節リウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎もしくは敗血性関節炎のような疾患によって影響を受けた関節）から得られる流体であり得る。
【００８０】
あるいは、サンプルは、任意の器官または組織（生検または剖検標本を含む）から得られ得るか、あるいは細胞（初代細胞または培養細胞のいずれか）または任意の細胞、組織もしくは器官によって調整された媒体を含み得る。所望ならば、この生物学的サンプルは、予備プロセス（予備分離技術を含む）に供され得る。例えば、細胞または組織は抽出され、そして異なる非細胞分画（例えば、細胞の異なる部分において見出される、タンパク質または薬物）において、生体分子の別々の分析のために非細胞分画に供され得る。Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻、１４７−２３８頁（１９９０）を参照のこと。
【００８１】
（ＩＩＩ．使用方法）
（Ａ．分析）
研究者が、広範囲または狭い範囲の異なるｐＨ値を試験することを可能にすることによって、生体分子のｐＩを迅速に決定するための、マトリクス、アレイ、システムおよび方法が有用である。１つの実施形態において、サンプル中の目的の生体分子は、異なるｐＨ範囲で複数のセルに直接配置され得、そして前述の検出デバイスおよび検出システムによって、手動または自動で分析され得る。別の実施形態において、サンプル中の目的の生体分子は、ＩＥＦバッファ／セルまたはレーンを用いて移動バッファ中に直接配置され得、そして前述の検出デバイスおよび検出システムによって、手動または自動で分析され得る。
【００８２】
分別、分離、特徴付け、定量、および／または他の分子に対して比較された生体分子は、当該分野で公知の方法および市販のシステム（例えば、銀染色、免疫染色、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、遠心分離、勾配ゲル電気泳動、等電点集束技術、タンパク質含有領域の切り出し後の当該分野で公知の他の分析方法（例えば、質量分析、例えば質量分析（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＢｒｕｋｅｒ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  Ｉｏｎ−Ｔｒａｐ  ＭＳ））によって、さらに評価され得る。従来のＩＥＦ集束後のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ分光分析とは異なり、このシステムは、少量の生体分子の検出を可能にする。例えば、このシステムは、銀染色を用いて１０〜２００ｋＤの標準的範囲でフェムトモル量程度の量のタンパク質、高いアトモル量のタンパク質、または１〜２００ｐｇのタンパク質を検出することができる。
【００８３】
これは、レーンユニットにつきＩＥＦバッファを含む５ｃｍ×５ｃｍ以下のマトリクスを用いる小規模の二次元分析を実施し、従来のより大きなＩＥＦ集束ゲル上で分離された生体分子に対して、分離された生体分子を比較し、そして別の技術（例えば、質量分析）によるさらなる分析のために従来のＩＥＦ集束ゲル上に切り出されるべき適当な領域の位置を決定するために、より小さな規模の分析を用いることにより達成され得る。拡大鏡および特注カッターを備えた特別ホルダーは、目的の生体分子を含む位置の切り出しを容易にし得る。切り出された部分におけるタンパク質の量は、例えば、本方法により分離された既知量の生体分子を染色することにより調製された光学密度較正スケールを用いることにより、概算され得る。
【００８４】
このように、このシステムは、質量分析により検出可能な生体分子の範囲を拡張し、そして細胞において低レベルで発現されがちであるタンパク質の分析を可能にする。従って、ピコグラム量以下の範囲のタンパク質が、質量分析により検出および可視化され得る。このシステムは、生体分子のｐＩ値およびその質量を観察するための正確かつ再現性のある方法を提供する。
【００８５】
サンプル中のタンパク質が血液または組織サンプルに由来する場合、疾患特異的タンパク質が、一次元または二次元で分離され得、そしてレーン中のこれらのタンパク質は、当該分野で公知の方法（例えば、銀染色、免疫染色、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、遠心分離、勾配ゲル電気泳動、等電点集束技術、タンパク質含有領域の切り出し後の当該分野で公知の他の分析方法（例えば、質量分析など））によって評価され得る。
【００８６】
１つ以上の生体分子が、ｐＩに従って集められ、分別され、分離され、精製され、特徴付けられ、定量され、および／または他の生体分子に対して比較され得る。これらの生体分子の濃度は、サンプル中で増大もしくは減少し得るか、または事象に応じて物理的に改変され得る。例えば、本方法およびシステムは、疾患状態、薬物処置、ライフサイクル、または他の刺激因子に応じた生体分子における変化を定量的かつ／または定性的にモニターし得る。例えば、タンパク質のリン酸修飾またはタンパク質レベルが、タンパク質またはタンパク質周囲の環境を刺激因子で処理する前および後に、モニターされ得る。このシステムおよび方法は、刺激因子での処理後に異なるｐＨ値を有するセルにおけるタンパク質の蓄積を観察するために使用され得る。
【００８７】
非疾患動物または植物に対する、動物または植物由来のサンプルにおけるタンパク質の異常な発現は、特定の疾患の証明であり得る。生体分子の相対的な豊富さは、疾患（例えば、癌）の診断または予備診断のために正常なパターンに対して比較され得る。セルにおける生体分子の相対的な豊富さは、分離前にサンプルに既知量の特定のタンパク質を導入し、そして添加されたタンパク質の光学密度に対して光学密度測定値を比較することによって標準化され得る。代替の実施形態では、正常な動物または植物に比較した試験動物または植物における生体分子の物理的特徴の出現または消失または移動が、疾患状態を診断または予備診断するために使用され得る。なお別の実施形態では、正常な動物または植物に比較した試験動物または植物における生体分子の改変が、疾患状態を診断または予備診断するために使用され得る。
【００８８】
疾患状態は、サンプルにおける生体分子の変化（例えば、糖尿病被験体におけるヘモグロビン）または生体分子の欠失または付加（例えば、細菌感染由来のタンパク質）によって検出され得る任意の疾患である。例えば、以下の遺伝病は、ＤＮＡまたはタンパク質レベルの変化によって診断され得る：ハンティングトン病、前立腺癌、ぜい弱Ｘ症候群Ａ型、筋緊張性ジストロフィーＩ型ケネディ病、マチャド−ジョセフ病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、および脊髄延髄筋萎縮症。疾患または状態はまた、遺伝子（例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＰＣをコードする遺伝子；ジストロフィン、β−グロビン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩｃ因子、オルニチン−ｄ−アミノトランスフェラーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、もしくは嚢胞性線維症膜貫通レセプター（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子；またはプロトオンコジーン）に関連し得る。モニターされ得るタンパク質の例は、前立腺癌について前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、心臓病について心臓酵素である。あるいは、タンパク質の群がモニターされ得る。なお別の実施形態では、潜在的な疾患状態を決定するために、特定のｍＲＮＡ濃度プロフィールが分析され得る。
【００８９】
なお別の代替の実施形態では、サンプルは、細胞培養物または細胞のないインビトロアッセイから得られ得る。例えば、細胞画分の使用を含むアッセイ由来のサンプルが、細胞画分が、薬物またはいくつかの他の刺激因子によって撹乱される前および後に、一次元または二次元の分析に供せられ得る。別の実施形態では、発達中の生物に由来または被験体の組織に由来する抽出物が、そのライフサイクルの間にその生物または動物において生じる変化を理解するために分析され得る。例えば、生物学的事象の阻害剤、増強剤、または開始剤である化合物が同定され得る。これらのアッセイの全てにおいて、ＴＢおよびＴＲＭは、試験されるべき抽出物、被験体、または生物に刺激因子が適用された後、抽出物に添加され得る。１つの実施形態では、生物学的事象を引き起こす候補分子（タンパク質および化合物を含む）の高スループットスクリーニングのための方法（これは、システムまたは方法を用いてサンプルにおけるＴＢ（１つまたは複数）を検出する工程を包含する）が企図される。
【００９０】
一実施形態によれば、ＴＲＭが、ＴＢを含むサンプルを泳動バッファに添加する前または後に、サンプルに添加され得る。１つの実施形態によれば、ＴＲＭは、サンプルが泳動バッファに添加される前に、ＴＢを含むサンプルに添加される。全ての場合において、互いに対するそれらの結合を阻害も破壊もしない条件下で、互いに対してＴＢおよびＴＲＭを曝露することが最も望ましい。
【００９１】
用語「プロテオーム」は、ゲノムによって発現されるタンパク質の全てを指す。プロテオミクスは、身体におけるタンパク質の同定および研究、ならびに生理的機能および病理生理機能におけるそれらの役割の決定を包含する。この方法、マトリクス、アレイおよびシステムは、プロテオームをモニターするためのより迅速なより感度の高い技術を可能にする。本発明により、細胞活性のより詳細かつ正確な機能的プロテオミクスマップが開発され得、このことは、疾患のよりよい理解および新規な医薬の発見につながる。
【００９２】
本明細書中で使用される用語「モニター」は、連続した測定ならびに終末測定を包含することが意図される。いくつかの実施形態では、サンプルの生体分子が、連続的に測定される。他の実施形態では、生体分子は、細胞または被験体が刺激されるか、またはそれ以外に撹乱される（例えば、薬物の添加または細胞もしくは被験体の周囲の環境の変化によって）前および後に分析される。さらに他の実施形態では、生体分子は、撹乱されなかったサンプルのコントロール群において測定され、そしていくつかの実験群の細胞構成要素が測定され、コントロール群の構成要素と比較される。他の実験設計もまた、撹乱に応じた生体分子の変化を検出するための方法に適切であることが当業者に明らかである。
【００９３】
（Ｂ．分離）
本システムは、サンプル中の生体分子を互いから分別する方法を提供する。この方法の一実施形態によれば、生体分子を含むサンプルがシステムに添加され、ＩＥＦバッファまたはセルを横断して循環され、ＩＥＦバッファまたはセルの中および外の交互に可逆性の電場に曝露され；次いで、必要に応じて、二次元に分離される（例えば、ＩＥＦバッファまたはセルからレーンの下側に向かう電場に生体分子を曝露することにより）。
【００９４】
このシステムは、サンプル中の生体分子を特徴付ける方法を提供する。一実施形態によれば、ＩＥＦ装置において泳動バッファにサンプルを添加し、電場を生成し、泳動バッファを循環させ、そして電場の方向を周期的に逆にすることにより、目的の生体分子（単数または複数）が、一次元に分離され、調製され、および／または分析され得る。あるいは、サンプルは、セル、チャネル、またはレーンに直接添加され得る。この方法の別の実施形態によれば、生体分子を含むサンプルがシステムに添加され、ＩＥＦバッファまたはセルを横断して循環され、ＩＥＦバッファまたはセルの中および外の交流電場に曝露され；二次元に分離される（例えば、ＩＥＦバッファまたはセルからレーンの下側に向かう電場に生体分子を曝露し、次いでレーン中の生体分子の位置または量を決定することにより）。レーン中の生体分子の位置または量の同定は、生体分子のｐＩ、生体分子の分子量、および／またはその改変状態を決定する際に有用であり得る。コントロールサンプル中の同じ生体分子に比較した試験サンプル中の生体分子の位置の変化は、生体分子の改変（例えば、リン酸化など）を示し得る。コントロールサンプル中の同じ生体分子に比較した試験サンプル中の生体分子の量の変化は、例えば、生体分子の発現の変化または生体分子の安定性の変化に起因する、試験した生体分子の量の増加または減少を示し得る。
【００９５】
このシステムは、マトリクス、アレイ、またはシステムを用いてサンプル中の生体分子の量を定量する方法を提供する。レーン中の生体分子の量は、上述したように当該分野で公知の機器で検出され得る。あるいは、レーン中の生体分子は、当該分野で公知の機器によって検出可能である別の分子と結合され得る。生体分子の量は、同じ生体分子または同様のタイプの生体分子（タンパク質決定のためのＢＳＡ）の既知量を用いた標準曲線から外挿され得る。レーン中の生体分子はまた、分析および定量のためにレーンから切り出され得る。
【００９６】
この方法の一実施形態によれば、１つの生体分子がモニターされる。この方法の別の実施形態によれば、複数の生体分子がコンピューターによってモニターされる。さらなる実施形態によれば、試験サンプル中の生体分子または目的の複数の生体分子に対応するデータが、疾患を有さない被験体または疾患を有する素因のない被験体（すなわち、正常な被験体）からの生体分子または複数の目的の生体分子に対応するデータに比較される。コンピューターが、２セットのデータ間の類似点および相違点を比較および計算することができることが望ましい。コンピューターのパラメーターは、正または負の結果が示されるのを上回る閾値を達成するように設定され得る。
【００９７】
別の実施形態によれば、システムは、目的の生体分子を含むサンプルをシステム中のセルに添加することにより、目的の生体分子からサンプル中の生体分子および／またはイオンを取り出すために使用され得る。この場合、セル中のＩＥＦバッファは、目的の生体分子のｐＩを取り囲むｐＨ値（単数または複数）を有する。従って、システム中の可逆性の電場および循環手段が適用される場合、他の生体分子またはイオンはセルの外に移動するが、目的の生体分子はセル中に留まる。目的の生体分子は、ＩＥＦバッファまたはセルから回収され得る。あるいは、サンプルがセル中に配置され、そして電流が、バッファまたはセルの生体分子透過壁の面に垂直な一方向にＩＥＦバッファまたはセルを通過し得る。
【００９８】
明細書全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなその変形は、述べた整数または整数群を含むが、いかなる他の整数または整数群も排除しないことを示すことが理解される。
【００９９】
本明細書中に引用した全ての参考文献、特許、および特許出願は、参考として援用されている。米国仮出願第６０／３０５，８０２号（２００１年７月１６日に出願）；第６０／３１０，３１６号（２００１年８月６日に出願）；第６０／３４０，６９８号（２００１年１０月２８日に出願、および第６０／３７７，０４４号（２００２年４月３０日に出願）は、本明細書中に参考として援用される。
【０１００】
多数の実施形態を提供したが、基本的な構成が、組成物および方法を利用する他の実施形態を提供するように変更され得ることは明らかである。従って、範囲は、以下に記載する特定の実施例よりむしろ本明細書中で言及される本発明の実施形態および明細書によって包含されることが理解される。
【実施例】
【０１０１】
（実施例１）
（分子量標準）
０．１ｍｍ×０．１ｍｍ×３．０ｍｍの大きさの溝を、薄層パラメトキシメチルアンフェタミン（ＰＭＭＡ）プレート中に刻んだ。この溝に１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを満たした。レーンの一方の端に、８．８０の固定化ｐＨ（任意に選択した）を有するＩＥＦバッファのスポットを堆積させた。タンパク質１００ｎｇ毎に、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈによるラダーマーカーＲＰＮ８００（分子量１０〜２５０ｋＤ）をスポットに注入した。金属性電極を固定化ｐＨ勾配ゲルに連結し、そして別の金属性電極をこのｐＨから最も遠く離れたレーンの末端に連結した。
【０１０２】
このプレートを１％ＳＤＳ  ５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−グリシンバッファ（ｐＨ８．３）中に浸漬させた。３６ボルトの電圧（電場約１００ｖ／ｃｍ）を５分間電極に印加した。次に、このレーンを銀染色し、固定した。図１８は、顕微鏡下で観察される分離したバンドの光学走査である。
【０１０３】
（実施例２）
（ｐＨ８．６５±０．０５における血漿のタンパク質の二次元分析）
ｐＨ値８．６５±０．０５を有するｐＨゲルの１００ミクロン直径のスポット（緩衝溶液と混合されたポリアクリルアミドゲル）を、ポリマーウエハ（例えば、１ｃｍ×１ｃｍ×０．３ｍｍのＰＭＭＡ）上に沈着させた。このウエハを、スターラーバーを備え、そして泳動バッファとして１Ｍの硫酸ナトリウムバッファを充填された小さいチャンバに入れた。１００ｎｇの血漿サンプルを、２００μｌの泳動バッファを含むチャンバ（１ｃｍ×１ｃｍ×０．２ｃｍ）に導入した。５０Ｖの電圧を、０．５分ごとに電流の方向を１８０°変化させながら、ウエハの面に対して垂直に、５分間印加した。次に、このウエハを泳動バッファから取り出し、そして蒸留水でリンスした。ゲルスポットをウエハから取り出し、そして実施例１に記載されるように、プレート上のレーン（１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の一端に配置した。
【０１０４】
このプレートを、１％ＳＤＳ  ５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−グリシンバッファ（ｐＨ８．３）に浸漬した。３６ボルトの電圧（電場約１００ｖ／ｃｍ）を、電極に５分間印加した。次に、レーンを銀染色し、そして定着させた。図１９は、約８．６５±０．０５の等電点を有し、そしてレーンにおいてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した、血漿サンプル中のタンパク質の光学走査である。このレーンは、顕微鏡下で観察される場合に現れるとおりである。
【０１０５】
（実施例３）
（ｐＨ７．５０〜８．５０における血漿の二次元分析）
（１）ＩＥＦバッファ
０．０２ｐＨ単位刻みで７．５０〜８．５０までのｐＨ値を有する５０のＩＥＦバッファを調製した。
【０１０６】
（ａ．ｐＨ７．５０〜７．６８のＩＥＦバッファ、１０％ポリアクリルアミド）
２５ｍｌの０．１Ｍ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン（ｈｙｄｒｏｓｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｓｉｎｅ）−Ｎ−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）（２５，２３２ｇ／Ｌ）を、５グラムのポリアクリルアミド（Ｂｉｏｒａｄ）および以下に示される体積の０．１Ｍ  ＮａＯＨと混合した。この混合物の体積を、２５℃の水を用いて５０ｍｌに増加させた。
【０１０７】
【表１】
2005526949.tif 000003
（ｂ．ｐＨ７．７０〜７．８８のＩＥＦバッファ、７％ポリアクリルアミド）
２５ｍｌの０．１Ｍ  Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシメチル）グリシン（ＢＩＣＩＮＥ）（１６，３１７ｇ／Ｌ）を、３．５グラムのポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）および以下に示される体積の０．１Ｍ  ＮａＯＨと混合した。この混合物の体積を、２５℃の水で５０ｍｌに増加させた。
【０１０８】
【表２】
2005526949.tif 000004
（ｃ．ｐＨ７．９０〜８．２６を有するＩＥＦバッファ、１０％ポリアクリルアミド）
５０ｍｌの０．１Ｍ  トリス−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）（１２．１１４ｇ／Ｌ）を、７．０グラムのポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）および以下に示される量の０．１Ｍ  ＨＣｌと混合した。この混合物の体積を、水で１００ｍｌに増加させた。
【０１０９】
【表３】
2005526949.tif 000005
（ｄ．ｐＨ８．３０〜８．５０を有するＩＥＦバッファ、８％ポリアクリルアミド）
１００ｍｌの０．０４Ｍ  ５，５−ジエチルバルビツラールＮａ（ｖｅｒｏｎａｌ  Ｎａ）を、８．９グラムのポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）および以下に示される体積の０．２Ｍ  ＨＣｌと混合した。
【０１１０】
【表４】
2005526949.tif 000006
ＩＥＦバッファを、個々に過硫酸アンモニウムと混合し、そして薄いルサイトチップ上の平行な線に沈着させた。各線は、１００ミクロンの幅および厚さ、および１ｃｍの長さ、ならびに異なるｐＨを有した。ＩＥＦバッファを沈着させたチップの寸法は、１．２ｃｍ×１．２ｃｍであった。
【０１１１】
（２）泳動バッファ
脱イオン蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）中の７Ｍ尿素、２．２Ｍチオ尿素、１．１％（ｗ／ｖ）テトラデカノイルアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホネート（ＡＳＢ１４）、１０％（ｗ／ｖ）ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、０．５５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の最終濃度を有する５ｍｌの溶液を、３０ＥＣで、回転テーブル上で３０分間、溶解するまで混合した。溶解のために必要である場合、５ｍｌのｄｄＨ２Ｏを添加した。次に、０．４ｇのアンバーライトを添加し、そしてこの溶液を３２ＥＣで１０分間回転させた。次いで、この溶液を、０．４５Φｍシリンジフィルタに、気泡を形成せずに通過させた。次に、以下の成分を、水と共に、以下の最終濃度で添加した：２％クエン酸−クエン酸Ｎａバッファ（ｐＨ４．０）（ｗ／ｖ）、２ｍＭトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）；２ｍＭアクリルアミド；１％グリセリン。最終体積：１０ｍｌ。泳動バッファの成分のいくつかの最終濃度は、以下の通りである：７．７Ｍ尿素、２．２Ｍチオ尿素、１．１％  ＡＳＢ１４、１１％  ＤＭＡｃ、０．５５ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【０１１２】
泳動バッファのｐＨを、塩化水素で４．０に調整した。
【０１１３】
（３）第一の次元の分離：等電集束工程
第一の次元の分離（ＩＥＦ）を実施するために、上記ＩＥＦバッファを沈着させたチップを、１ｃｍの間隔を空けた２つの電極間のチャンバに入れた。このチャンバは、２ｍｌ体積の容量を有した。しかし、この工程においては、ルサイトチップの端部が０．２ｍｍの深さまで泳動バッファで覆われるような量の泳動バッファでのみ満たした。その結果、レーンの面積全体ではなく、レーンの各々の端部における小さい面積が、泳動バッファに覆われた。１マイクログラムのヒト血漿タンパク質混合物を、泳動バッファに添加した。電場をこのチップに印加した。この電場を、＋８０Ｖ〜−８０Ｖおよび１ＨＺの周波数の矩形波形によって発生させた。１０分間、スターラーバーを使用してこの血漿タンパク質をチャンバにわたって、そしてＩＥＦバッファへと循環させた。
【０１１４】
（４）第二の次元での分離：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
第一の次元での分離を実施した後に、１．３ｃｍの間隔を空けた２つの電極の間に発生する電場がレーンに対して平行であり、そしてレーン上の領域から離れる方に向くように、これらの電極の間のチャンバ内にチップを再度配向させ、そして同じ泳動バッファで覆った（ここで、ＩＥＦ工程において蓄積されたタンパク質は、このレーンの反対の端部に向かう）。３％  ＳＤＳ溶液を、最終濃度２％  ＳＤＳ泳動バッファまで、泳動バッファに添加した。ＳＤＳの添加の直後に、１００Ｖを使用して約５分間、電場を発生させた。
【０１１５】
第二の次元での分離の後に、チップを硝酸銀溶液に浸漬し、そしてＵＶ光に露光して、迅速に銀染色した。銀染色後、このチップを、市販のオフィススキャナ（ＵＭＡＸ  ＡＳＴＲＡ  ２２００）によって走査した。走査された画像をデジタル化し、そして１０倍に拡大した（図７Ａ）。図７Ｂは、従来の等電集束法を使用した、７．５０〜８．５０のｐＩを有するヒト血漿の、銀染色したゲルの光学走査である（Ｓｗｉｓｓ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅから入手した）。図２１Ａおよび２１Ｂにおけるタンパク質の多くの位置は、同じである。図２１Ａは、マトリクス、アレイ、システムおよび方法の使用が、従来の方法よりずっと良好な結果を与えることを示す。二次元ＩＥＦ−ＳＤＳ分析の分解能および感度は、かなり改善される。
【０１１６】
（実施例４）
（ｐＨ５．５０〜６．００における血漿の二次元分析）
（１）ＩＥＦバッファ
０．０２ｐＨ単位刻みで５．５０〜６．００までのｐＨ値を有する２５のＩＥＦバッファを調製した。
【０１１７】
（ａ．ｐＨ５．５０〜５．７２のＩＥＦバッファ、７％ポリアクリルアミド）
２５ｍｌの０．１Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリン）エタノールスルホン酸（ＭＥＳ）を、３．５グラムのポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）および以下に示される体積の０．１Ｍ  ＮａＯＨと混合した。この混合物の体積を、水で５０ｍｌに増加させた。
【０１１８】
【表５】
2005526949.tif 000007
（ｂ．ｐＨ５．７４〜５．９８を有するＩＥＦバッファ、９％ポリアクリルアミド）
２５ｍｌの０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｉｌ））アミノメタン−マレエート（Ｔｒｉｓ−マレエート）を、９グラムのポリアクリルアミド（Ｂｉｏｒａｄ）および以下に示される体積の０．２Ｍ  ＮａＯＨと混合した。この混合物の体積を、水で１００ｍｌに増加させた。
【０１１９】
【表６】
2005526949.tif 000008
ＩＥＦバッファを、過硫酸アンモニウムと個々に混合し、そして薄いルサイトチップ上の平行な線上に沈着させた。各線は、１００ミクロンの幅および厚さ、および１ｃｍの長さ、ならびに異なるｐＨを有する。ＩＥＦバッファが沈着されるチップの寸法は、１．２ｃｍ×１．２ｃｍであった。
【０１２０】
（２）泳動バッファ
泳動バッファは、実施例３に記載されたものと同じであった。
【０１２１】
（３）第一の次元での分離：等電集束工程
第一の次元の分離（ＩＥＦ）を実施するために、上記ＩＥＦバッファを沈着させたチップを、１ｃｍの間隔を空けた２つの電極間のチャンバに入れた。このチャンバは、２ｍｌ体積の容量を有した。しかし、この工程において、ルサイトチップの端部が０．２ｍｍの深さまで泳動バッファで覆われるような量の泳動バッファでのみ満たした。その結果、レーンの面積全体ではなく、レーンの各々の端部における小さい面積が、泳動バッファに覆われた。１マイクログラムのヒト血漿タンパク質混合物を、泳動バッファに添加した。電場をこのチップに印加した。この電場を、＋８０Ｖ〜−８０Ｖおよび１ＨＺの周波数の矩形波形によって１０分間発生させた。この１０分の間、スターラーバーを使用してこの血漿タンパク質をチャンバにわたって、そしてＩＥＦバッファへと循環させた。
【０１２２】
（４）第二の次元での分離：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
第一の次元での分離を実施した後に、１．３ｃｍの間隔を空けた２つの電極の間に発生する電場がレーンに対して平行であり、そしてレーン上の領域から離れる方に向くように、これらの電極の間のチャンバ内にチップを再度配向させ、そして同じ泳動バッファで覆った（ここで、ＩＥＦ工程において蓄積されたタンパク質は、このレーンの反対の端部に向かう）。３％  ＳＤＳ溶液を、泳動バッファ中２％  ＳＤＳの最終濃度に、泳動バッファに添加した。ＳＤＳの添加の直後に、１００Ｖを使用して約５分間、電場を発生させた。
【０１２３】
第二の次元での分離の後に、チップを硝酸銀溶液に浸漬し、そしてＵＶ光に露光して、迅速に銀染色した。銀染色後、このチップを、市販のオフィススキャナ（ＵＭＡＸ  ＡＳＴＲＡ  ２２００）によって走査した。走査された画像をデジタル化し、そして１０倍に拡大した（図２２Ｂ）。図２２Ａは、従来の等電集束法を使用した、５．５０〜６．００のｐＩを有するヒト血漿の、銀染色したゲルの光学走査である（Ｓｗｉｓｓ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅから入手した）。
【０１２４】
図２２Ａおよび２２Ｂにおけるタンパク質の多くの位置は、同じである。図２２Ｂは、マトリクス、アレイ、システムおよび方法の使用が、従来の方法よりずっと良好な結果を与えることを示す。二次元ＩＥＦ−ＳＤＳ分析の分解能および感度は、かなり改善される。
【０１２５】
（実施例５）
（アレイを使用する二次元分析）
１つのＩＥＦ／レーンユニットを備えるアレイを構築し、そして二次元分離において使用した。
【０１２６】
（１）アレイ
２％  ＳＤＳを含む１０％ポリアクリルアミドゲルを、１ｍｍの厚さのルサイトウエハ上の狭いレーンとして沈着した。このレーンの寸法は、１０ｍｍ長さ、０．１ｍｍ幅および５０ミクロン厚さであった。次いで、このレーンを、２００ミクロンの直径の円形穿孔を有する１００ミクロンの厚さのセロハン層で覆った。このセロハンの層をレーンと整列させ、その結果、この円形穿孔は、このレーンの一端に位置した。
【０１２７】
ポリアクリルアミドゲル、ｐＨ７．００のバッファ、および過硫酸アンモニウムを混合することによって、ＩＥＦバッファを調製し、７％ポリアクリルアミドゲルを形成した。５０ｍｌのＮ−エチルモルホリン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）を８ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌおよび４２ｍｌの水と混合することによって、ｐＨ７．００のバッファを調製した。１滴のＩＥＦバッファを穿孔内に沈着させ、そして固化させた。
【０１２８】
（２）第一の次元での分離：等電集束法
上記のように調製したアレイを、泳動バッファ（ｐＨ６．９）、スターラーバーおよび電極を含むチャンバに入れた。この泳動バッファは、ＨＣｌと混合された１μＭ  Ｋ２ＳＯ４からなった。１マイクログラムのヒト血漿タンパク質を含有するサンプルを、この泳動バッファに添加した。＋３０Ｖ〜−３０Ｖの電圧および１Ｈｚの周波数の矩形波を８分間発生させ、この間に、泳動バッファを循環させた。
【０１２９】
（３）第二の次元での分離：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
第二の次元での分離のために、３０ＶのＤＣ電圧を、レーンに沿って５分間印加した。
【０１３０】
第二の次元での分離の後に、アレイを硝酸銀溶液に浸漬して、このレーンを染色した。このレーンを、紫外線照射のもとで３分間、銀染色した。
【０１３１】
図２３は、銀染色されたウエハの拡大された光学走査を示す。暗領域は、染色されたヒト血漿タンパク質（約７．０の値のｐＩを有する）である。
【０１３２】
（実施例６）
（３つの電極を使用する二次元分析）
実施例５に記載されたようなアレイを調製した。
【０１３３】
（１）第一の次元での分離：等電集束法
アレイを、泳動バッファ（ｐＨ６．９）、スターラーバーおよび３つの電極を含むチャンバに入れた。この泳動バッファは、ＨＣｌと混合された１μＭ  Ｋ２ＳＯ４からなった。１マイクログラムのヒト血漿タンパク質を含有するサンプルを、この泳動バッファに添加した。アレイの面に平行な２つの電極を使用して、＋３０Ｖ〜−３０Ｖの電圧および１Ｈｚの周波数の矩形波を８分間発生させ、この間に、泳動バッファを循環させた。
【０１３４】
（２）第二の次元での分離：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
第二の次元での分離のために、３０ＶのＤＣ電圧を、レーンに沿って５分間印加した。このことを、ＩＥＦ工程において使用された電極の１つを電源から取り外し、この電極をレーンのＩＥＦバッファから最も遠い端部に再度取り付け、そして電場を活性化させることによって、達成した（例えば、図２８）。この場合には、小さいが望ましくない、レーンに平行ではない電気力が存在し、有意により大きい電気力が、ＩＥＦバッファから離れる方向でこのレーンに沿って印加されており、これによって、このレーンにおけるタンパク質の有意かつ効率的な分離が可能になる。
【０１３５】
第二の次元での分離の後に、アレイを硝酸銀溶液に浸漬して、このレーンを染色した。このレーンを、紫外線照射のもとで３分間、銀染色した。
【０１３６】
図２４は、拡大された、銀染色されたウエハーの、拡大された光学的スキャンを示す。暗い領域は、約７．０のｐＩ値を有する、染色されたヒト血漿タンパク質である。
【０１３７】
（実施例７）
（Ｌｕｃｉｔｅ  Ｍａｔｒｉｘを用いるタンパク質混合成分の分離）
直径１ｍｍで２ｍｍの深さの２５個の穴を、矩形のプラスチック（Ｌｕｃｉｔｅ）プレートの表面に空け、そして２％のアガロースゲルで充填した。これらの穴（本明細書中において以降「チャネル」と示す）を、互いに約３ｍｍの距離を空けて、グリット様の様式で配置した。各々のチャネルの一方の側面を、市販のナイロンメンブレン（ＩＣＮ、Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）から作製されるタンパク質イオン透過メンブレンを用いて密封した。
【０１３８】
シトクロムＣ、デオキシヘモグロビン、ヘモグロビンα２β２、Ｃ−フィコシアニン、レンズマメレクチン、およびフェリチン（ＢｉｏＲａｄ）の等電点ｐＩに対応するｐＨ値を有するアイソフォーカシング（ｉｓｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）バッファを調製した。チャネルバッファ（本明細書中において以降、「ＩＥＦバッファ」と示す）を、グリシン、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、トリス（ヒドロキシメチル）アミンメタン（ＴＨＭＡＭ）、クエン酸、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシメチル）グリシンまたはβ，β−ジメチルグルタル酸（ＤＭＧＡ）のいずれかと水とを混合し、そして各々のＩＥＦバッファを、水酸化ナトリウム、塩酸またはＮａ２ＨＰＯ４を用いて異なるｐＨに滴定することにより調製した。以下の表Ｉを参照のこと。
【０１３９】
（表Ｉ．ＩＥＦバッファおよび対応するタンパク質）
【０１４０】
【表７】
2005526949.tif 000009
マトリクスにおける各連の垂直のチャネルを、３μｌの１つの型のＩＥＦバッファ（表１）で充填した。充填したチャネルを、タンパク質イオン透過メンブレン（上記のものと同じ）で密封した。
【０１４１】
チャネルおよびＩＥＦバッファを含むマトリクスを、幅５０ｍｍ、高さ１００ｍｍ、および長さ５０ｍｍの内側寸法を有するチャンバーにおける２つの白金電極の間に配置した。各々の電極は、このマトリクスとほぼ同じ寸法を有し、そして互いから約５ｃｍ間隔で幾何学的に平行に構成された。このチャンバーは、このマトリクスおよび電極がこの電気泳動バッファに浸漬されるように５０ｍｌの０．０１Ｍ  Ｋ２ＳＯ４の電気泳動バッファをさらに含んだ。撹拌棒が、このチャネル全域で電気泳動バッファの循環を確保するようにチャンバー中に存在した。このチャンバーを、マグネチックスターラー上に配置した。
【０１４２】
以下のタンパク質のいずれか１つ（１μｇ）を、このチャンバー中の電気泳動バッファに添加した：シトクロムＣ、デオキシ−ヘモグロビン、ヘモグロビンα＋２β＋２、Ｃ−フィコシアニン、レンズマメレクチン、およびフェリチン（ＢｉｏＲａｄ）。これらのタンパク質を、チャンバー中で２５ＥＣで撹拌しながら、１００Ｖの直流電圧（Ｅ＝２０Ｖ／ｃｍ）を、この電極に２分間、印加した。その後さらに２分間、電場の方向を、反転させた。この工程を、５回繰り返した。
【０１４３】
各々のタンパク質のタンパク質分類を、チャネルの垂直の列（カラム）のうちの１つへのタンパク質の蓄積を観察することによって観察した。一般的に、タンパク質分類は、１０分間以内に完了した。
【０１４４】
（実施例８）
２５個のチャネルのマトリクスを、チャネルの５つの垂直の列の各々を以下のもので充填したことを除いて実施例７に記載するように調製した：表Ｉからのバッファ番号６、バッファ番号４、およびバッファ番号３。図９の左から右を、夫々、参照のこと。次いで、マトリクスを、実施例７に記載されるような電気泳動バッファを有するチャンバー内に配置した。１μｇのフェリチン、フィコシアニン（ＢｉｏＲａｄにおけるカタログ番号第１６１〜０３１０のＩＥＦ標準の第一のバンド）、フィコシアニン（ＢｉｏＲａｄにおけるカタログ番号第１６１〜０３１０のＩＥＦ標準の第二のバンド）およびヘモグロビンα＋２β＋２を、電気泳動バッファに添加した。これらのタンパク質を、チャンバー中で２５ＥＣで撹拌しながら、１００Ｖの直流電圧（Ｅ＝２０Ｖ／ｃｍ）を、この電極に２分間、印加した。その後、さらに２分間、電場の方向を反転させた。この工程を、５回繰り返した。この工程を、５回繰り返した。
【０１４５】
各々のタンパク質のタンパク質分類を、チャネルの第一の垂直の列へのフェリチンの蓄積、チャネルの第二の垂直の列へのフィコシアニン（第一のバンド）の蓄積、チャネルの第三の垂直の列へのフィコシアニン（第二のバンド）の蓄積、およびチャネルの第五の垂直の列へのヘモグロビンα＋２β＋２の蓄積を観察することによって観察した。図９を参照のこと。陰性コントロール（すなわち、チャネルの第４の垂直の列）は、いずれのタンパク質の蓄積も示さなかった。さらに、タンパク質の等電点に対応しないｐＨ値を有するＩＥＦバッファを含むチャネルにおいて、タンパク質の蓄積は、ほとんど観察されなかったか、または全く観察されなかった。一般的に、タンパク質分類は、１０分間以内に完了した。
【０１４６】
（実施例９）
（糖尿病を診断する方法）
糖尿病の診断のためのホールマークは、試験される患者の血液中の糖化されたヘモグロビンの量の増加である。血液中の糖化されたヘモグロビンの量は、糖化されたヘモグロビン対総ヘモグロビンのパーセント比として表現され得る。従って、糖化されたヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）および糖化されていないヘモグロビン（ＨｂＡ１）の濃度が、糖尿病を診断するために測定されるべきである。
【０１４７】
糖化されたヘモグロビンおよび糖化されていないヘモグロビンのｐＩを、従来のＩＥＦゲル電気泳動を用いて、夫々、ｐＨ６．９５およびｐＨ７．２２であると決定した。従って、２つのｐＨコンパートメント（すなわち、ｐＨ６．９５およびｐＨ７．２２）を備える診断チップを調製した。  
【０１４８】
このチップを、直径２ｍｍで１ｍｍの深さの２つの穴を、矩形のプラスチック（Ｌｕｃｉｔｅ）プレートの表面に空け、そして３％のポリアクリルアミドゲルで充填することによって作製した。これらの穴（本明細書中において以降「チャネル」と示す）を、互いに約３ｍｍの距離を空けて配置した。各々のチャネルの一方の側面を、市販のナイロンメンブレン（ＩＣＮ、Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）から作製されるタンパク質イオン透過メンブレンを用いて密封した。
【０１４９】
ｐＨ６．９５の値を有する等電点電気泳動バッファを、２２．４ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨを５０ｍｌの０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４とを混合し、そして総容積１００ｍｌのＨ２Ｏを添加することによって調製した。ｐＨ７．２２のｐＨ値を有する等電点電気泳動バッファを、３６ｍｌの０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４を、１４ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４と混合し、そして１００ｍｌの総容量のＨ２Ｏを添加することによって調製した。ＩＥＦバッファを、アクリルアミド過硫酸塩と混合した。これらの混合物を、別個のチャネルに添加し、そしてその中で重合した。充填したチャネルを、タンパク質イオン透過メンブレン（上記と同じもの）を用いて密封した。
【０１５０】
チップを、図２に示されるような２つの白金電極の間の分離チャンバーに配置した。分離チャンバーの内側寸法は、幅５０ｍｍ、高さ１００ｍｍおよび長さ５０ｍｍであった。各々の電極は、このマトリクスとほぼ同じ寸法を有し、そして互いから約５ｃｍ間隔で幾何学的に平行に構成された。このチャンバーは、このマトリクスおよび電極がこの電気泳動バッファに浸漬されるように１０ｍｌの１０％ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４４）電気泳動バッファをさらに含んだ。スターラー（攪拌棒）が、このチャネルの全域で電気泳動バッファの循環を確保するようにチャンバー中に存在した。このチャンバーを、マグネチックスターラー上に配置した。電極を、極性を反転し得る電源に接続した。
【０１５１】
糖化されたヘモグロビンを、Ａｂｂｏｔ［Ｎ１Ａ８６−１０］から入手した。夫々、較正曲線の作成において使用するために、糖化されていないヘモグロビンＨ−３８８３を、Ｓｉｇｍａ［９００８−０２−０］から入手した。較正曲線のための各々の混合物を調製する前に、糖化されたヘモグロビンおよび糖化されていないヘモグロビンの吸光率を、複数の濃度で、測定して、これらが、較正曲線のために用いられる範囲を超えて一定であることを確認した。例えば、以下の表１および図１３を参照のこと。各々についての吸光率は、その濃度の２桁上を通して一定であった。測定を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製の市販の分光光度計ＬＫＢ  ２２０２を用いて実施した。
【０１５２】
【表８】
2005526949.tif 000010
較正曲線を作成するために、各々が２つのセル（ｐＨ．６．９５セルおよびｐＨ７．２２セル）を有する６つのマルチセルチップを、種々の比率の市販のヘモグロビンおよび糖化されたヘモグロビンを有する混合物に曝した。例えば、糖化されていないＨｂへの糖化されたＨｂの混合物を、一定の容量のＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。表２を参照のこと。６１０ｎｍの吸光度の読み値を、各々のセルについて得た。吸光度％を、糖化されたヘモグロビンについての吸光度の読み値を、糖化されたヘモグロビンおよびヘモグロビンについての吸光度の読み値の合計で割ることによって算出した。各々の混合物についての糖化されたヘモグロビンの濃度％（ｘ軸）を、各々の混合物において、既知のモル濃度の糖化されたヘモグロビンを既知の糖化されたヘモグロビンおよび糖化されていないヘモグロビンの総モル濃度で割ることにより算出した。糖化されたヘモグロビンの吸光度％  対  濃度％に対して相関する直線を、算出されたデータから作成した。「ｘ」は、ｐＨ６．９５およびｐＨ７．２２でのサンプルについての吸光度の読み値から算出された吸光度％が生じた、較正曲線上の場所を示す。サンプル中の総ヘモグロビンに対する糖化されたヘモグロビンの％を、較正曲線から外挿した。表２を参照のこと。
【０１５３】
（表２．種々の濃度のＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ１を用いる較正）
【０１５４】
【表９】
2005526949.tif 000011
各々の混合物について、上記のチップを備えるチャンバーに１０ｕｌのサンプルを添加し、そして１０分間にわたり１５０Ｖに供した。電場の方向を、１回／分で反転させた。ヘモグロビンは、本アッセイで検出し得る６１０ｎｍで強い吸収を有した。従って、糖化されたヘモグロビンまたは糖化されていないヘモグロビンを検出するために、ＴＲＭも標識も添加する必要はなかった。
【０１５５】
ｐＨ６．９５およびｐＨ７．２２のコンパートメントにおいて蓄積された、夫々、糖化されたヘモグロビンおよび糖化されていないヘモグロビンの吸光度を、分光光度計を用いて測定した。これらの結果を、総ヘモグロビンに対する糖化されたヘモグロビンの、濃度％  対  吸光度％として表した（それぞれ  Ｘ軸  対  Ｙ軸）。図１４を参照のこと。詳細には、試験される混合物における糖化されたヘモグロビンの吸光度％を、ｐＨ６．９５のコンパートメントからの吸光度の読み値を、ｐＨ６．９５およびｐＨ７．２２のコンパートメントからの吸光度の読み値の合計により割り、そして１００倍することによって、算出した。各々の混合物についての糖化されたヘモグロビンの濃度％を、各々の混合物についての糖化されたヘモグロビンの既知の濃度を、各々の混合物中の糖化されたヘモグロビンおよび糖化されていないヘモグロビンの既知の総濃度の合計で割ることによって算出した。糖化されたヘモグロビンの吸光度％  対  濃度％に対して相関する直線を、算出されたデータから作成した。図１４を参照のこと。
【０１５６】
次いで、血液サンプルを、患者から得た。血液を、５００ｇで遠心分離した。上清の１０ｕｌのアリコートを、上記のチップを備えるチャンバーに添加し、そして１０分間にわたり１５０Ｖに供した。サンプル中の糖化されたヘモグロビンの吸光度％（「Ｙ」値）を、上記のように算出した。サンプルについての糖化されたヘモグロビンの濃度％は、図１４に作成された直線からの外挿に基づき、約５．２％であった。この結果は、試験されたヒトが糖尿病を有することを示す。この％は、制御下にあるが、正常の範囲の３〜４％より高い糖尿病を有する人について典型的である。
【０１５７】
（実施例１０）
（等電点電気泳動についての収集効率（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を決定する方法）
タンパク質が等電点電気泳動プロセスにより分離される効率を決定するための手段として、既知の量のＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ｐＩ＝８．２）を、システムの電気泳動バッファ中に沈殿させた。このチャンバーは、「分離チップ」：直径１００ミクロンおよび総容積１ｎｌの単一のチャネルを備える。各々のチャネルは、ｐＨ８．２±０．０５ｐＨ単位のｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファを有した。このＩＥＦバッファを、Ｔｒｉｓ  Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ８．２０±０．０５ｐＨ単位、Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６１−０７７１）を、標準ポリアクリルアミドゲルへと混合することにより作製した。
【０１５８】
このシステムを較正するために、１０，０００分子、５０，０００分子、１００，０００分子、３００，０００分子、７００，０００分子、および１，０００，０００分子の上記ＩｇＧを、アクリルアミドに添加し、そして個々のｐＨ８．２のチャネルにおいて重合した。それらの蛍光を、蛍光強度を定量するために、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００蛍光顕微鏡を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ２．０５を用いて使用して、測定した。蛍光マーカーの蛍光強度  対  濃度の較正曲線を、実験値の蛍光強度との比較のために作成した。
【０１５９】
次いで、５０，０００分子および１００，０００分子、および１，０００，０００分子の上記ＩｇＧを、上記システムにおいて試験した。各々の量を、チャンバーの電気泳動バッファ中に個々に沈殿させた。等電点電気泳動を、固定した分離条件下で、上記のように（３０Ｖの直流電流で、０．１ｍｌのＴｒｉｓ  Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ４．８）において、狭い範囲のｐＨのチャネルを通して１０分間）、同一の分離チップを用いて各々の量について実施した。各々の実験の後で、蛍光強度を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００蛍光顕微鏡を用いて測定し、そして較正結果と比較した。
【０１６０】
これらの結果は、このプロセスの回収効率が、ｒ＝０．９９９９の相関関数で１００％に近いこと示し、このことは、これらのタンパク質のほとんど全てが、この実験の１０分間の持続時間の間にこれらのｐＨチャンバーへと分離されることを示す。図２９を参照のこと。このフィッティングについてのＳ値は、４５．８５であった。横座標は、較正の実施において測定された蛍光値を表し、一方、縦座標は、等電点電気泳動実施後に得られた蛍光値を表す。これらの数値は、サンプル中のタンパク質分子の総数を表し、これは、狭いｐＨチャネルにおける高感度の等電点電気泳動を実証する。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１は、（Ａ）ＩＥＦバッファを収容し、そしてタンパク質を有するセル、およびセルの対向する側にあるイオン透過性メンブレン、ならびに（Ｂ）複数のセルを備えるマトリクス、を示す。
【図２】図２は、チャンバーのいずれかの側に２つの電極板を備える装置、およびその電極間にある、複数のセルを備えるマトリクスを示す。このチャンバーはマグネチックスターラーの上にある。この電場の方向は可逆的である。
【図３】図３は、２つの電極板の間のチャンバーの底の上で浮遊したマトリクスを含む装置を示し、ここで、泳動バッファは、スターラーバーによって補助されて、マトリクス周囲に流れ得る。この電場の方向は可逆的である。
【図４】図４は、マトリクスが回転して、泳動バッファ中の生体分子をセル開口部にわたって分散させる装置を示す。随意に、このチャンバーはまた泳動バッファを循環させるためのスターラーバーを有し得る。この電場の方向は可逆的である。
【図５】図５は、３つの装置を示す：（Ａ）ここで、複数のセルは、チャンバー中かつ２つの電極板の間に、泳動バッファ中の遮断された支持体上に個別にかつランダムに取り付けられる；（Ｂ）ここで、複数のセルは、２つの電極板の間で、チャンバ中で自由に漂っている；そして（Ｃ）ここで、複数のセルは互いに取り付けられ、そして２つの電極板の間で回転する。スターラーバーは泳動バッファを循環させるために使用される。この電場の方向は可逆的である。
【図６】図６は、列になって隣接し、各セル中に存在するｐＨ範囲を実質的に維持するメンブレンによって隔てられ、そして電場の方向に対して（Ａ）平行に配置されるかまたは（Ｂ）垂直に配置される、複数のセルを備えるチャンバーの頂面図を示す。スターラーバーは泳動バッファを循環させるために使用される。この電場の方向は可逆的である。
【図７】図７は、第２次元でＳＤＳ−ＰＡＧＥキャピラリー電気泳動に供されている、マトリクスのセル中での生体分子を示す。
【図８】図８は、セルが第２次元での電気泳動のためのＳＤＳポリアクリルアミドゲルに取り付けるために線形に連続して調整され得る、マトリクスを示す。
【図９】図９は、チャネルが複数のＩＥＦバッファを含んでいるアガロースゲルから構成されるマトリクスを示す。各々の垂直方向のカラムのチャネルは、バッファを収容しない第４カラムのチャネル以外は、同じＩＥＦバッファを収容する。フェリチン、フィコシアニン（第１のバンド）、フィコシアニン（第２のバンド）およびヘモグロビンは、それぞれ第１垂直カラム、第２垂直カラム、第３垂直カラムおよび第４垂直カラムに蓄積した。
【図１０】図１０は、サンプル中の３つの標的生体分子を分析するように設計されたチップの図である。第１列、第２列および第３列におけるチップの各セル中の各ＩＥＦバッファは、種々のＴＢ／ＴＲＭを含む複合体（例えば、それぞれ、ＴＢ１／ＴＲＭ１、ＴＢ２／ＴＲＢ２またはＴＢ３／ＴＲＭ３）のｐＩと同じｐＨを有する。第４列は、較正曲線を作成するためのコントロール、標準またはデータ点として使用のために、泳動バッファに添加された非ＴＢ分子を受容するように設計されたセルを含む。従って、第４列のＩＥＦバッファは、非ＴＢ生体分子のｐＩ値と同じｐＨ値を有する。
【図１１】図１１は、２つの電極板の間に位置するマルチセルチップを含むチャンバーの図である。このチャンバーは、電場の極性を逆転させ得る電源へと取り付けられ得る。このチャンバーはさらに、マルチセルチップのいずれかの側上の両区画中に、泳動バッファを撹拌するための機構を備え得る。
【図１２】図１２は、マルチセルチップのための検出デバイスのイメージである。１個以上の複合体が、チップ中の複数のセルに受容された後、このチップは、検出デバイス中に配置され得る。マルチセルチップ中の蛍光標識された複合体は、検出用の光源（例えば、単色光源）によって刺激され、次いで標識から放射した光が、フォトダイオードによって捕捉され、電気信号に変換され（読出しユニット）、そしてコンピュータによって分析され得る。このチップは、光源およびダイオードに対して移動可能であるホルダー中に入れられ得る。あるいは、光源およびダイオードは、このチップに対して移動可能であり得る。
【図１３】図１３は、種々の濃度のヘモグロビンの６１０ｎｍにおける吸光度のグラフ表示である。各データポイントは、異なる濃度のヘモグロビンを有する溶液を充填した長方形の標準キュベットから取った吸光度の読取り値を表す。
【図１４】図１４は、糖尿病について試験された血液サンプルの較正曲線のグラフ表示である。Ｘ軸は、糖化ヘモグロビンのモル濃度  対  糖化ヘモグロビンと未糖化ヘモグロビンとのモル濃度の合計の比であり、百分率で表現されている。Ｙ軸は、糖化ヘモグロビンの吸光度  対  糖化ヘモグロビンと未糖化ヘモグロビンとの吸光度の合計の百分率比である。
【図１５】図１５は、マトリクスおよびアレイの例を示す。図１５Ａは、それぞれＩＥＦバッファ（「ｂ」）を含む４つのマトリクスの例の側面図を示す。マトリクスＡおよびＤは、ＩＥＦバッファを含む溝を有する。マトリクスＢおよびＣは、マトリクスの表面上にＩＥＦバッファを有する。マトリクスＣおよびＤは、「ｃ」と示した領域を有し、この領域は、レーンである。マトリクスＡ〜Ｄは、２次元分析のためのシステムにおいて第２層と組み合わせて使用され得る。等電点電気泳動工程のための電場の方向は、「Ｅ１」として示される。マトリクスＡおよびＢ中の「ｂ」の一部はまた、（例えば、二次元分離の間に電気泳動バッファにドデシル硫酸ナトリウムを添加することによって）二次元分離のためのレーンとして役立ち得る。別の実施形態に従って、マトリクスＡ〜Ｄは、等電点電気泳動工程の間に、同一のＥ１場において任意の方向に９０°回転され得る（示さず）。図１５Ｂは、アレイを示し、ここで、穿孔を含む第２層がマトリクス上に配置され得、その結果、このマトリクス中のＩＥＦバッファは、一次元での分離の間に、電気泳動バッファと接触し得る。
【図１６−１】図１６は、アレイの例に関する。図１６（Ａ）は、アレイの第２層の例の上面図である。この例において、第２層は、電気泳動バッファ中で、生物学的分子に対して不透過性であるが、イオンに対して透過性である材料から製造される。図１６（Ｂ）は、マトリクスの例の上面図である。このマトリクスは、レーンを形成するためにゲルで充填される矩形溝およびＩＥＦバッファで充填される円形溝を備える。図１６（Ｃ）は、図１６（Ｂ）のマトリクスの上に合わされた図１６（Ａ）に示される第二層の上面図であり、その結果、ＩＥＦバッファが、この第二層における穿孔を介して曝される。図１６（Ｄ）は、図１６（Ｃ）のアレイのＩＥＦ／レーンユニットの一つの側面図である。図１６（Ｅ）は、図１６（Ｃ）のアレイの一部の側面の拡大図（点線の円）である。この頂部層は、図１６（Ａ）に示される第二層であり、そしてこの底部層は、図１６（Ｂ）に示されるマトリクスである。
【図１６−２】図１６は、アレイの例に関する。図１６（Ａ）は、アレイの第２層の例の上面図である。この例において、第２層は、電気泳動バッファ中で、生物学的分子に対して不透過性であるが、イオンに対して透過性である材料から製造される。図１６（Ｂ）は、マトリクスの例の上面図である。このマトリクスは、レーンを形成するためにゲルで充填される矩形溝およびＩＥＦバッファで充填される円形溝を備える。図１６（Ｃ）は、図１６（Ｂ）のマトリクスの上に合わされた図１６（Ａ）に示される第二層の上面図であり、その結果、ＩＥＦバッファが、この第二層における穿孔を介して曝される。図１６（Ｄ）は、図１６（Ｃ）のアレイのＩＥＦ／レーンユニットの一つの側面図である。図１６（Ｅ）は、図１６（Ｃ）のアレイの一部の側面の拡大図（点線の円）である。この頂部層は、図１６（Ａ）に示される第二層であり、そしてこの底部層は、図１６（Ｂ）に示されるマトリクスである。
【図１７】図１７は、電気泳動バッファを含むチャンバ中にアレイを備えるシステムの例の上面図である。攪拌棒は、「ｂ」においてＩＥＦバッファまたはセルを横切る生体分子の循環を可能にするようにチャンバ中にある。電極Ａ１およびＢ１は、等電点電気泳動工程の間、周期的に方向を逆にする電場を形成する。
【図１８】図１８は、下記実施例１に記載されるように調製された市販のタンパク質標準の銀染色したゲルの電子走査である。
【図１９】図１９は、下記実施例２に記載されるように調製されたヒトの血漿の銀染色したゲルの光学走査である。
【図２０】図２０は、７．５〜８．５のｐＩを有するヒトの血漿タンパク質の分離に使用されるマトリクスの上面図である。このマトリクスは、１×１ｃｍ  ＬＵＣＩＴＥＴＭチップである。マトリクス上の各レーンは、ＩＥＦバッファおよびアクリルアミド混合物を堆積する改変インクジェットによって、ゲルのレーンが平行になるように引かれ、ここで、各レーンは、均一な幅および１００ミクロンの厚さおよび１ｃｍの長さを有したが、異なるｐＨ（すなわち、ｐＨ７．５０、７．５２、７．５４、７．５６、７．５８などで開始して８．５０まででの５０のレーン）を有した。このマトリクスは、チャンバ中のいくらかの電気泳動バッファ中に配置され、その結果、レーンの各々の一方の端部が、電気泳動バッファ中に浸漬される。ヒトの血漿サンプルを、周期的に方向を逆にする電場を電気泳動バッファに適用させながら、攪拌棒を用いて、レーンの端部を横切って電気泳動バッファ中で循環させた。数分後、この電場は、スイッチが切られ、３％のＳＤＳ溶液を、この電気泳動バッファに添加し、そして全チップを、電気泳動バッファ中に浸漬させた。次いで、このレーンに対して並行な一方向の電場を、等電点電気泳動工程で使用したＩＥＦバッファの端部から離れる、レーンの長さの下に向かう方向に適用した。次いで、このチップを、銀染色した。図２０において観測可能な灰色のスポットおよび黒色のスポットは、銀染色されたタンパク質である。
【図２１】図２１は、２次元分析に従って、および伝統的な２次元ＩＥＦ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従って調製されたヒト血漿の比較である。図２１（Ａ）は、実施例３において使用した銀染色チップのデジタル化光学走査である。この走査は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２Ｄ画像との比較のために、スケールが拡大されている。図２１（Ｂ）は、７．５０〜８．５０のｐＩを有するヒト血漿タンパク質の、公開された銀染色２次元ゲルである。
【図２２】図２２は、二次元分析に従って、および伝統的な二次元ＩＥＦ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従って調製されたヒト血漿の比較である。図２２（Ａ）は、５．５０から６．００のｐＩを有するヒト血漿タンパク質の、公開された銀染色２次元ゲルである。図２２（Ｂ）は、実施例４において使用した銀染色チップの、デジタル化光学走査である。この走査は、１０倍に拡大されている。
【図２３】図２３は、単一のキャピラリーＳＤＳ−ＰＡＧＥレーンの光学走査である。このレーンの暗色領域は、約７．０のｐＩを有する銀染色ヒト血漿タンパク質である。ヒト血漿タンパク質を、実施例５に記載されるように、調製したアレイを使用して分離に供した。
【図２４】図２４は、単一のキャピラリーＳＤＳ−ＰＡＧＥレーンの光学走査である。レーン中の暗色領域は、約７．０のｐＩを有する銀染色ヒト血漿タンパク質である。ヒト血漿タンパク質を、実施例６に記載されるように、３電極システムにおいて実施例５に記載されるように調製したアレイを使用して、分離に供した。
【図２５】図２５は、マトリクス上でＩＥＦバッファ領域を形成し得る装置の概略図である。酸性溶液および塩基性溶液を混合して、所望のｐＨ値を有するバッファを形成するデバイス（「滴定器」）が、使用される。このバッファは、モノマー（例えば、アクリルアミド）および重合化剤と合わせられ、アレイ上の所望の位置にＩＥＦバッファを配する別のデバイス（「マトリクスプリンター」）に充填される。
【図２６】図２６は、マトリクス上にレーンを形成し得る装置の概略図である。アクリルアミド溶液および重合化剤が、アレイ上の所望の位置にレーンを配するデバイス（「マトリクスプリンター」）に充填される。
【図２７】図２７は、一つの自動化システムの概略例である。このシステムは、例えば、二次元電気泳動分析チャンバにサンプルを供給するためのデバイス（「サンプル供給器」）、廃棄物を除去するためのデバイス（「廃棄物処理器」）、新しい電気泳動バッファを添加するためのデバイス（「バッファ供給器」）、二次元分析後にマトリクスを染色するためのデバイス（「染色剤供給器」）、染色されたチップをスキャナにもたらすためのデバイス、（「アレイ操作システム」）、チップを走査するためのデバイス（「スキャナー」）、走査された画像を受容および記録するためのデバイス（「コンピュータ」）、記録した画像を分析するためのデバイス（「ソフトウェア」）、および記録された画像を表示するためのデバイス（「ディスプレイ」）を提供する。
【図２８】図２８は、三電極システムの例の図である。
【図２９】図２９は、ゲル中への標識されたタンパク質の分散  対  等電点電気泳動の１０分後の標識された抗体の観察された蛍光によって決定される、較正された蛍光をプロットすることによってＩＥＦシステム内の分離効率を示す図である。この数は、サンプル中のタンパク質分子の総数を示し、タンパク質分離においてほぼ１００％の効率を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年1月19日(2004.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）用マトリクスであって、該マトリクスは、区画またはセル内に第一のＩＥＦバッファを含む、少なくとも１つの該区画またはセル、および第二の異なるＩＥＦバッファを含む、該区画またはセルに隣接する少なくとも１つの領域、を備え、ここで、該ＩＥＦバッファは、０．１ｐＨ単位未満のｐＨ差を有する、マトリクス。
【請求項２】
前記ＩＥＦバッファが、０．０２ｐＨ単位未満のｐＨ差を有する、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項３】
前記マトリクスが、ＩＥＦバッファを含む複数の区画またはセルを含む、請求項１に記載のマトリクス層。
【請求項４】
分子不透過性領域を含む、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項５】
イオン不透過性領域を含む、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項６】
前記ＩＥＦバッファまたはセルに亘って、泳動バッファを循環させるためのデバイスをさらに含むシステム中の、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項７】
電場に対して垂直に配置される場合に互いに分離されている、前記複数のＩＥＦバッファ、区画またはセルを含む、請求項３に記載のマトリクス。
【請求項８】
前記複数のＩＥＦバッファ、区画またはセルが、アレイ中に配置される、請求項３に記載のマトリクス。
【請求項９】
前記複数の区画またはセルが、マトリクス中に固定されている、請求項３に記載のマトリクス。
【請求項１０】
ポリアクリルアミドゲルをさらに含む、請求項１に記載のマトリクス。
【請求項１１】
システムであって、以下：
（ａ）泳動バッファを含むチャンバ；
（ｂ）ＩＥＦバッファまたはＩＥＦバッファを含む区画もしくはセル；
（ｃ）該ＩＥＦバッファまたはセルの内外で交流電場を生成するためのデバイス；ならびに必要に応じて
（ｄ）該ＩＥＦバッファまたはセルに亘って該泳動バッファを循環するためのデバイス、
を備える、システム。
【請求項１２】
前記ＩＥＦバッファが、０．１ｐＨ単位未満のｐＨ差を有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
直流を発生させるためのデバイスをさらに備える、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
複数の分離されたＩＥＦバッファ、ＩＥＦバッファを含む区画またはセルを備える、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記区画またはセルの１つ以上の表面が、分子およびイオンに対して透過性である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記区画またはセルの１つ以上の表面が、不透過性領域であり、かつ必要に応じてイオン不透過性領域である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１７】
サンプル中の分子を等電点電気泳動するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）請求項１〜１６のいずれかに記載のマトリクスまたはシステムを使用して、ＩＥＦバッファまたは該ＩＥＦバッファを含むセルの内外で方向付けられる電場に該サンプルを供し、そして必要に応じて、該ＩＥＦバッファに亘って該分子を含む泳動バッファを循環する工程；および
（２）該ＩＥＦバッファ中で該分子を捕捉する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
サンプル中の分子を特徴付けるための、請求項１７に記載の方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）ＩＥＦバッファの内外で方向付けられる電場に該サンプルを供し、そして必要に応じて、該ＩＥＦバッファに亘って該サンプルを含む泳動バッファを循環する工程；および
（２）該ＩＥＦバッファ中に該分子が存在するか否かを決定し、そして必要に応じて、別のサンプル由来の分子に対して該ＩＥＦバッファ中の分子を比較するか、または該分子を定量する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
被験体における疾患状態を診断または予備診断するための、請求項１８に記載の方法であって、該方法は、前記分子と、疾患を有さないか、または該疾患に罹りやすい素因を有さない正常な被験体由来のサンプルからの分子とを比較する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
分子を調製するための、請求項１７に記載の方法であって、該方法は、ＩＥＦバッファの内外で電場を生成することによって、該ＩＥＦバッファ中の分子を捕捉する工程、そして必要に応じて、該ＩＥＦバッファに亘って該分子を含む泳動バッファを循環させる工程、および該分子を回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２１】
前記分子を、第２次元の分析に供する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２次元の分析が、ゲル電気泳動、質量分析法、キャピラリー電気泳動、または液体クロマトグラフィーによる分析である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
被験体における疾患状態を診断または予備診断するための、請求項１７に記載の方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）該疾患状態に罹患しているか、または該疾患状態に罹りやすい素因を有することが疑われている被験体由来の分子を含むサンプルを、該システムに添加する工程；
（２）交流電場を生成して、該分子を分子パターンへと分離する工程；および
（３）該分子パターンを、疾患を有さないか、または該疾患に罹りやすい素因を有さない正常な被験体由来のサンプルからの分子パターンと比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
サンプル中の標的分子（ＴＭ）の存在、非存在または量を分析するための、ＴＭシステムであって、該システムは、等電点電気泳動システムを備え、該当電点電気泳動システムは、複合体中にＴＭに結合する標的認識分子（「ＴＲＭ」）を含み、ここで、該システムの少なくとも１つのセル中のＩＥＦバッファは、ＴＭに結合したＴＲＭを含む該複合体の等電点（ｐＩ）と等しいｐＨ値を含む、システム。
【請求項２５】
前記マトリクスが、請求項１〜１０のいずれかにより規定されるマトリクスである、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記システムが、請求項１１〜１６のいずれかにより規定されるシステムである、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
前記等電点電気泳動システム中に、ＴＭに結合したＴＲＭを含む前記複合体を検出するためのデバイスをさらに備える、請求項２５または２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記ＴＲＭが抗体である、請求項２４〜２７のいずれかに記載のシステム。
【請求項２９】
複数の既知の分子の既知の量、および該既知の分子のｐＩ値と等しいｐＨ値を含むＩＥＦバッファのサブセットをさらに含む、請求項２４〜２８のいずれかに記載のシステム。
【請求項３０】
サンプル中の標的分子（「ＴＭ」）の存在、非存在または量を分析するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．ＴＭおよびＴＲＭを結合させる条件下で、標的認識分子（「ＴＲＭ」）とサンプルを合わせる工程；ならびに
ｂ．請求項２４〜２９のいずれかにより規定されるシステムまたはマトリクスにおいて、ＴＲＭに結合した該ＴＭを含む複合体を、未結合のＴＭから分離する工程、
を包含する、方法。
【国際調査報告】
2005526949.tif 000045
2005526949.tif 000046
2005526949.tif 000047