(57)【要約】  花弁、葉又は花弁と葉が非突然変異体マリーゴールド中の比に対して高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含むマリーゴールド植物、その再生可能な部分及び種子が開示される。このような植物の花弁はまた典型的にはこのような花弁中に通常見られないゼータ-カロテンを含む。また、このような植物の調製方法、このようなカロテノイド比を有するオレオレジン及び食用物質が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサントフィルがアルコールとしてアッセイされる非突然変異体マリーゴールド（測定可能な量のゼータ-カロテンを含む花弁又は花弁を有する葉を生じた植物）の花弁、葉又は花弁と葉の両方中に存在するような比と較べて高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含むことを特徴とするマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項２】
ゼアキサンチン比が約1:10より大きい、請求項１記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項３】
前記花弁が乾燥重量1g当り約４〜約25mgのキサントフィル含量を有する、請求項２記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項４】
葉が高められたゼアキサンチン比を示す、請求項１記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項５】
前記葉が乾燥重量1g当り約0.2〜約1.25mgのキサントフィル含量を有する、請求項４記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項６】
花弁が高められたゼアキサンチン比を示す、請求項１記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項７】
ゼアキサンチン比が約2:10より大きい、請求項６記載のマリーゴールド花弁。
【請求項８】
約2:10より大きいゼアキサンチン対ゼアキサンチン＋ルテインの比を含むマリーゴールド花弁であって、前記ゼアキサンチン及びルテインがケン化後にアルコールとしてアッセイされる脂肪酸エステルとして花弁中に存在することを特徴とするマリーゴールド花弁。
【請求項９】
ハイブリッドからのものである、請求項８記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１０】
微粉砕形態で存在する、請求項８記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１１】
非突然変異体マリーゴールド植物に対し高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の少なくとも一つを更に示す、請求項８記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１２】
ゼアキサンチン比が約3:10より大きい、請求項８記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１３】
花弁、葉又は花弁と葉の両方が、キサントフィルがアルコールとしてアッセイされる非突然変異体マリーゴールド（測定可能な量のゼータ-カロテンを含む花弁又は花弁を有する葉を生じた植物）の花弁、葉又は花弁と葉の両方中に存在するような比と較べて高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含むことを特徴とするマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項１４】
花弁のゼアキサンチン比が約1:10より大きい、請求項１３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項１５】
前記花弁が乾燥重量1g当り約４〜約25mgのキサントフィル含量を有する、請求項１３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項１７】
葉が高められたゼアキサンチン比を示す、請求項１３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項１８】
非突然変異体マリーゴールド（キサントフィルがアルコールとしてアッセイされる）の花弁、葉又は花弁と葉の両方中に存在するような比と較べて高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の少なくとも一つを更に示す、請求項１３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項１９】
ゼアキサンチン比が約2:10より大きい、請求項１３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２０】
ハイブリッドである、請求項１３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２１】
再生可能な部分が胚、分裂組織、花粉、葉、やく、根、根先端、及び花からなる群から選ばれた細胞、又はこれらに由来するプロトプラストもしくはカルスである、請求項１３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２２】
花弁、葉又は花弁と葉の両方が約2:10より大きいゼアキサンチン対ゼアキサンチン＋ルテインの比を含み、前記ゼアキサンチン及びルテインがケン化後にアルコールとしてアッセイされる脂肪酸エステルとして花弁中に存在することを特徴とするマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２３】
花弁、葉又は花弁と葉の両方が非突然変異体マリーゴールド（キサントフィルがアルコールとしてアッセイされる）の花弁、葉又は花弁と葉の両方中に存在するような比と較べて高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の少なくとも一つを更に示す、請求項２２記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２４】
花弁、葉又は花弁と葉の両方が約0.2〜約１のネオキサンチン＋ビオラキサンチン比を示す、請求項２３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２５】
花弁が約0.05〜約0.9のβ-カロテン比を示す、請求項２３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２６】
葉が約１のβ-カロテン比を示す、請求項２３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２７】
花弁が約0.25〜約0.9であるα-クリプトキサンチン対α-クリプトキサンチン＋ルテインの比（ケン化後にアルコールとしてアッセイされる場合）を示す、請求項２３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２８】
花弁が約0.3〜約１のフィトエン比を示す、請求項２３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２９】
花弁が約0.2〜約１のフィトフルエン比を示す、請求項２３記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３０】
花弁が約0.25〜約0.9であるα-クリプトキサンチン対α-クリプトキサンチン＋ルテインの比（ケン化後にアルコールとしてアッセイされる場合）を示すことを特徴とするマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３１】
請求項１３記載のマリーゴールド植物の花粉。
【請求項３２】
請求項１３記載のマリーゴールド植物の胚珠。
【請求項３３】
好適な環境に植え付け、成熟まで成長させて、請求項１３記載のキサントフィルマリーゴールド植物を生じる種子。
【請求項３４】
食用媒体中に溶解又は分散されたゼアキサンチン及びルテインの混合物を含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物であって、ゼアキサンチン比が約1:10より大きいことを特徴とする組成物。
【請求項３５】
ゼアキサンチン比が約2:10より大きい、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
食用媒体中に溶解又は分散されたゼアキサンチン及びルテインの脂肪酸エステルの混合物を含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物であって、ゼアキサンチン比が約1:10より大きいことを特徴とする組成物。
【請求項３７】
ゼアキサンチン比が約2:10より大きい、請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
前記食用媒体が食用油である、請求項３６記載の組成物。
【請求項３９】
前記食用媒体が医薬上許される結合剤である、請求項３６記載の組成物。
【請求項４０】
突然変異体マリーゴールドのオレオレジンであって、前記オレオレジンが非突然変異体マリーゴールドからのオレオレジンに対し高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を有することを特徴とするオレオレジン。
【請求項４１】
遊離キサントフィル、カロテン及びクロロフィルを含む、請求項４０記載のオレオレジン。
【請求項４２】
キサントフィルエステル、カロテンを含み、かつクロロフィルを殆ど含まない、請求項４０記載のオレオレジン。
【請求項４３】
α-クリプトキサンチンを含む着色カロテノイドを含むことを特徴とするマリーゴールド花弁。
【請求項４４】
α-クリプトキサンチンが花弁中に存在する最も多量のカロテノイドである、請求項４３記載のマリーゴールド花弁。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は2001年６月29日に出願された米国特許出願第60/302,460号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は通常の比以外で存在するカロテノイド色素を含むマリーゴールド植物に関する。更に特別には、本発明は花弁、葉又は花弁と葉の両方がルテインに対し高められた比の一種以上のカロテノイド化合物を含む、マリーゴールド植物、その再生可能な部分、ハイブリッド又はその後の世代、そしてまたこのようなマリーゴールド植物を生じる種子、このような花又は葉から生じたオレオレジン並びにゼアキサンチン及びルテインを使用してつくられた食用製品に関する。このような意図されたマリーゴールドの花弁はまた典型的には測定可能な量のゼータ-カロテン（マリーゴールド花弁中に通常見られない化合物）を含む。
【０００３】
発明の背景
種々の集団における多くの疫学的研究はカロテノイドに富むかなりの量の果実及び野菜の消費が幾つかの型の癌になるリスクを低減し得ることを示していた。結果として、科学者らは癌、心血管疾患及び眼の疾患の予防におけるベータ（β）-カロテンの如きカロテノイドの保護効果の研究に集中していた。これらの研究はβ-カロテンがその消費が健康上の利益と関連していた果実及び野菜に見られる唯一の主要なカロテノイドであるという事実にもかかわらず行なわれていた。このような集中の理由はβ-カロテンのプロビタミンＡ活性及びその他の主要な食物カロテノイドの制限された商用上の利用可能性に起因し得る。
食事から入手でき、人体により吸収、代謝、又は利用し得る40〜50種のカロテノイドの中で、わずかに13種のカロテノイド及びそれらの立体異性体のうちの12種がヒト血清及び母乳中に尋常に見られる〔Khachikら, Anal. Chem., 69:1873-1881 (1997)を参照のこと〕。加えて、３種の食物カロテノイド：ルテイン、ゼアキサンチン及びリコペンの一連の酸化還元反応から生じる８種のカロテノイド代謝産物及び一種の立体異性体がヒト血清又は血漿中にある。これらの代謝産物が最初にKhachikらにより単離され、特性決定された〔Khachikら, Anal. Chem., 64:2111-2122 (1992)を参照のこと〕。
別の研究において、食物(3R,3'R,6'R)-ルテイン及び(3R,3'R)-ゼアキサンチンの精製サプリメントの摂取はヒト中のこれらの化合物の血液レベルの増大をもたらすだけではなく、血漿中のそれらの酸化代謝産物の濃度の増大をもたらすことが示された〔Khachikら, J. Cellular Biochem., 22: 236-246 (1995)を参照のこと〕。これらの知見はカロテノイドが疾患予防において酸化防止剤として機能し得るという予備の証拠を与えた。加えて、これらの結果はまた非ビタミンＡ活性食物カロテノイド、特に、ルテイン、ゼアキサンチン、及びリコペンの重要性を証明した。
【０００４】
黄斑色素カロテノイド、ルテイン及びゼアキサンチンは年齢関連黄斑変性(ARMD)、白内障形成、及びその他の光誘導酸化的眼損傷の予防に重要な役割を果たし得るという証拠が増しつつある。1985年及び1993年に、Boneらはヒト黄斑色素がルテイン及びゼアキサンチンの組み合わせであることを実証し、これらの食物カロテノイドが眼疾患ARMDの予防に役割を果たし得ると考察した〔Boneら, Vision Research, 25:1531-1535 (1985)及びBoneら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 34: 2033-2040 (1993)を参照のこと〕。特にルテイン及びゼアキサンチンに富む、果実及び野菜の高消費がその後のARMDの43％低いリスクと相関関係があるというケースコントロール疫学的研究における更なる研究がその考察を確認した〔Seddonら, J. A. Med. Assoc., 272(18) 1413-1420 (1994)を参照のこと〕。また、β-カロテン以外の血清カロテノイドの増大されたレベルは心臓疾患の低い罹患率と関連することが報告されていた〔Morrisら, J. Amer. Med. Assoc., 272(18):1439-1441 (1994)を参照のこと〕。
Bernsteinらはヒトの眼の全ての組織中の食物カロテノイド及びそれらの酸化代謝産物を同定し、定量し、ガラス体、角膜及び強膜を除く試験した殆ど全ての眼の構造が定量可能なレベルの食物(3R,3'R,6'R)-ルテイン、ゼアキサンチン、それらの幾何(E/Z)異性体だけでなく、それらの代謝産物、(3R,3'S,6'R)-ルテイン(3'-エピルテイン)及び3-ヒドロキシ-β,ε-カロテン-3'-オンを有すると報告した。虹彩中で、これらの色素はおそらく光障害性短波長可視光をフィルターするのに役割を果たし、毛様体中で酸化防止剤として作用すると考えられた。両方のメカニズムが網膜色素上皮／脈絡膜（RPE/脈絡膜）中で機能性であり得る〔Bernsteinら, Exp. Eye Research, 72(3): 215-223 (2001)を参照のこと〕。
【０００５】
ヒト網膜中の黄斑色素立体異性体の分布の研究は成人網膜、特に斑点中の(3S,3'S)-ゼアキサンチンを同定した。食事ルテイン及びゼアキサンチンは血清中に見られるのと同じ比率で個体の網膜に輸送されるが、２種の色素は血液中に見られる比とは異なる比で眼中に存在することが提案された。こうして、ゼアキサンチンはか領域中で2:1より大きい比だけルテインよりも優位であり、黄斑色素光学密度が100倍だけ低下し、ゼアキサンチン対ルテイン比が約1:2に反転する〔Boneら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 29:843-849 (1988)を参照のこと〕。若干のルテインが主として黄斑中で非食事メソ-ゼアキサンチンに変換される〔Boneら, Exp. Eye Res., 64(2): 211-218 (1997)を参照のこと〕。このような論文は眼のカロテノイドの重要な役割を支持し、それ故、一般に食事カロテノイド、特にルテイン及びゼアキサンチンの商用生産の重要性を支持する。
タゲテス属はキク科の一員であり、強いかおりのある一年草又は多年草の30種ほどの種を含む。タゲテスはアリゾナ及びニューメキシコからアルゼンチンまで自生している〔Hortus Third A Concise Dictionary of Plants Cultivated in the United States and Canada, MacMillan Publishing Company (1976)を参照のこと〕。培養された属として、タゲテス・エレクタ(Tagetes erecta)（普通アフリカンマリーゴールドと称される）、タゲテス・パツラ(Tagetes patula)（普通フレンチマリーゴールドと称される）、タゲテス・エレクタ x パツラ（普通三倍体マリーゴールドと称される）、及びタゲテス・テヌイフォリア(Tagetes tenuifolia)（またミニマリーゴールド又はシグネット(signet)マリーゴールドとして知られている）が挙げられる。
マリーゴールド花序は数百の無柄又は亜無柄の小さい花（また小花として知られている）の稠密な花房を含む単頂である。マリーゴールドは舌状又は中央の管形中心小花のまわりのストラップ形である外部舌状小花を有する放線状花頭を有する。マリーゴールド花頭の幾つかの形態はそれらの中心花の殆どが舌状花に変形されており、あったとしても、わずかな中心花を含む。このような花頭が八重咲き性と称される。
【０００６】
舌状花又は小花はまた花頭を花と称し得る取り木人により花弁としばしば称される。容易な理解のために、マリーゴールド花頭は本明細書中花又は花頭と称され、一方、花の頭成分の花又は小花は花弁と称される。
培養されたマリーゴールドは目のさめるような美しい花を有し、観賞目的に有益である。加えて、その属は天然着色剤、必須オイル、及びチオフェンの源として認められている。乾燥マリーゴールド花弁及び所謂キサントフィルマリーゴールドから得られたマリーゴールド花弁濃厚物は養鶏工業で飼料添加剤として使用されて卵黄及びブロイラー皮膚の黄色を強化する〔Piccaliaら, Ind. Crops and Prod., 8:45-51 (1998)を参照のこと〕。家禽組織中に所望されるカロテノイドはそれらの食事濃度の関数である。何とならば、家禽はカロテノイドを新たに合成する能力を有しないからである〔Balnaveら, Asian-Australiasian J. Animal Sci., 9(5): 515-517 (1996)を参照のこと〕。
キサントフィルマリーゴールドは観賞用マリーゴールドとは幾つかの特徴を異にする。第一に、かつ真っ先に、キサントフィルマリーゴールドはカロテノイドの抽出可能な源として使用され、観賞用マリーゴールドとは異なる植物習性を有する。観賞用マリーゴールドは典型的には地面からわずかに約45〜約60cmまで成長し、一方、キサントフィルマリーゴールドは地面から約65〜約70cmまで成長する。キサントフィルマリーゴールドは観賞用マリーゴールドよりも良く茂る習性で成長し、ロークロップのように生育でき、一方、観賞用マリーゴールドは典型的にはそれができない。キサントフィルマリーゴールドは典型的には色が暗オレンジであり、一方、観賞用は色が白色、黄色、又はオレンジであり、又はアントシアニン色素の存在のためにマホガニー色を含む、混合色を有し得る。
マリーゴールド花弁粉の着色能力は主としてキサントフィル、主にルテインエステルとして知られている酸素化カロテノイドフラクションにある〔Piccaliaら, Ind. Crops and Prod., 8:45-51 (1998)を参照のこと〕。またマリーゴールド花弁中に見られる、キサントフィルゼアキサンチンは、ブロイラー着色剤として有効であり、高度に許される黄色〜黄色-オレンジ色を生じることが示されていた〔Marusichら, Poultry Sci., 55:1486-1494 (1976)を参照のこと〕。キサントフィルのうち、色素ルテイン及びゼアキサンチンが商用で入手し得るハイブリッド中で最も多量である。ルテイン及びゼアキサンチンに関する構造式が以下に示される。
【０００７】
【化１】
2005511003.tif 000002
ルテイン
【０００８】
【化２】
2005511003.tif 000003
ゼアキサンチン
ルテイン及びゼアキサンチンの夫々はそれらの末端環構造の夫々中に一つのヒドロキシル基を含み、その結果、夫々の分子は二つのヒドロキシル基を含む。ルテインはα-カロテンの二つの別々のヒドロキシル化により生物学的に生成されると考えられ、一方、ゼアキサンチンはβ-カロテンの二つの別々のヒドロキシル化により生物学的に生成されると考えられる。α-カロテン及びβ-カロテンの両方はγ-カロテン（それ自体はリコペンの環化により生成される）に対する適当なシクラーゼ酵素の作用により生成されると理解される。リコペン、γ-カロテン、α-カロテン及びβ-カロテンは夫々炭化水素カロテノイドである。
図１は経路中の第一C40カロテノイドである、フィトエンからのルテイン及びゼアキサンチン並びにその後の生成物の生成のための生物学的合成経路の略図を示す。ルテイン及びゼアキサンチンは主として脂肪酸のモノエステル及びジエステルとしてマリーゴールド花弁中に存在する。図１はまたゼアキサンチンから生じ得るエポキシドを含むその後の生成物を示し、そのうちのビオラキサンチンはアブシジン酸生合成経路の中間体である。
飼料添加剤工業について、キサントフィルマリーゴールドは主としてメキシコ、ペルー、アフリカ、インド、中国及びタイで生産される。最新の商用品種として、初期のキサントフィル生成品種の一種である、“オレンジエード(Orangeade)”、及び一層大きい花及び一層大きい色素歩留りを有する“ディープオレンジエード”を含む、“オレンジエード”の商用改良、並びにキサントフィル濃度の改良である“スカーレットエード(Scarletade)”が挙げられる。こうして、“オレンジエード”は乾燥全花頭（がくを含む）1g当り約9-12mgのキサントフィルを含むと報告され、また“ディープオレンジエード”は1g当り約10-13mgのこれらの色素を有すると報告され、“スカーレットエード”はがくとともに計量された乾燥花頭1g当り約12-18mgのキサントフィル色素を含むと言われている。これらの品種はパンアメリカン・シード社（622タウン・ロード、ウェスト・シカゴ、IL 60185）から入手し得る。
【０００９】
ルテインはマリーゴールド花中の主要キサントフィルであり、一方、幾つかの現在の品種は典型的には３〜５％範囲のゼアキサンチン比〔ゼアキサンチン／（ルテイン＋ゼアキサンチン）〕を有する抽出生成物を生じる（Product Profile, Kemin Foods L.C., 600 E. Court Ave. Suite A, Des Moines, IA 50309を参照のこと）。以下の結果からわかるように、“スカーレットエード”を使用して得られたゼアキサンチン対ルテイン比は典型的には約４〜約７％である。
Moehsら, Plant Mol. Biol., 45:281-293 (2001)は暗オレンジの花を有する所謂野生型を含む、アフリカンマリーゴールドの観賞品種、並びに黄色、淡黄色及び白色の花を有する植物中のカロテノイドの生合成を分析した。その他の知見の中で、これらの研究者らは異なる植物が白色から暗オレンジに至る花の色の範囲を有するが、これらの花の色の相違は異なるカロテノイド生成物又は中間体の蓄積よりむしろ、非常に異なる量の同カロテノイド、ルテインの蓄積のためであると言われると報告した。研究した植物間の相違は生成されたカロテノイドの特定の型又は生合成中間体の蓄積ではなく、主としてカロテノイド経路中のフラックスの調節に関連することが明らかであった。
【００１０】
加えて、所謂野生型及び突然変異体の葉は花の色にかかわらず、ほぼ同じ量のカロテノイド色素を含むと報告された。これらの色素は花弁中に存在する色素とは異なった。こうして、花弁について報告された唯一の色素はルテインであり、一方、葉はルテインだけでなく、β-カロテン、ビオラキサンチン及びネオキサンチンを含むと報告された。図１からわかるように、ルテインではなくβ-カロテンが後者の２種の色素の前駆体であり得る。
Moehsらの著者らはまた彼らが単離したアフリカンマリーゴールド遺伝子をアラビドプシス・タリアーナ(Arabidopsis thaliana) (下記のPogsonらの文献)から得られた同様のカロテノイド生成遺伝子と比較した。約70〜約80％の遺伝子産物間の同一性はタンパク質レベルで報告され、シグナルペプチドを標的とする推定プラスチドが排除された場合には高レベルであり、またDNAレベルでは低レベルの同一性であった。A.タリアーナの葉中で、ルテインが主要カロテノイドであり、またβ-カロテン、ビオラキサンチン及びネオキサンチンが生成されるが、ゼアキサンチンは通常蓄積されない。
アフリカンマリーゴールド中のカロテノイド生合成は多くの遺伝子そしておそらく二つの経路を伴う複雑な系である。カロテノイド生成に関する遺伝子突然変異の影響は優先を予測し得ない。しかしながら、古典的育種技術は上昇したレベルの上記キサントフィルを生じる“オレンジエード”、“ディープオレンジエード”及び“スカーレットエード”アフリカンマリーゴールド品種を生産した。これらの比較的最近育種された入手し得る品種はゼアキサンチン比を増大しようと試みて遺伝子突然変異を誘発する処理にかけられていなかった。
【００１１】
幾人かの研究者らはマリーゴールドを含む、顕花植物に関する突然変異原、例えば、γ放射線、エチルメタンスルホネート(EMS)及びニトロソメチル尿素(NMU)の効果を調べていた。例えば、Zahariaら, Buletinul Institutului Agronomic Cluj-Napoca. Seria Agricultura 44(1): 107-114 (1991)はジニア・エレガンス(Zinnia elegans)、アフリカンマリーゴールド及びカリステパス・チャイネンシス(Callistephus chinensis)の種が種々の量のγ放射線で照射された後の子葉鞘中のカロテノイドのクロロフィル欠乏効果について報告した。Geethaらによる論文、Acta Botanica Indica, 20(2): 312-314 (1992)はフレンチマリーゴールドに関するγ放射線のクロロフィル欠乏効果について報告している。
Diaconu, Agronomie, 34(1): 17-21 (1991)は通称ポットマリーゴールド、又はカレンジュラ(Calendula)（これらはタゲテス属のうちで同等ではない）のF2多交雑からの種子の発芽に関するEMSの効果について報告した。これらの研究者らは花の色、花序構造、M2-M4植物中の生物学的に活性な物質の歩留まり及び含量の広い変化に注目した。
Pogsonら, Plant Cell, 8:1627-1639 (1996)による研究はEMSを使用してアラビドプシス・タリアーナの植物を突然変異誘発した。4000のM2系列のこの詳細な研究はγ-カロテンからのルテインの生成と関係する葉中のカロテノイド生合成経路中の二つの遺伝子座を見つけたと報告した。これらの遺伝子座がlut1及びlut2と称された。lut2遺伝子座はリコペンε-環シクラーゼ酵素と関連すると報告され、一方、lut1遺伝子座はリコペンε-環ヒドロキシラーゼと関連すると報告された。これらの研究者らはルテイン生成の減少がその他のカロテノイドの存在量の等モル変化により相殺されるが、わずかに少量のこれらの変化がゼアキサンチンの増大された生成のためであることに注目した（1631頁）。
Cetlら, Folia Fac. Sci. Nat. Univ. Purkynianae Brun Biol., 21(1):5-56 (1980)は不十分な記載から全てが観賞品種であることが明らかであるアフリカンマリーゴールド及びその他のタゲテス種を用いる広範な研究を報告した。これらの研究中で、これらの著者らはアフリカンマリーゴールド種子に関するNMUの種々の濃度の効果を調べ、約2000より多い植物を調べた。親交雑の表現型から逸脱する全てのM2植物が記録され、表現型の異なる植物のM2種子からのM3植物が研究された。
【００１２】
これらの研究者らは植物の高さ、植物の直径、花頭の直径及び花頭の高さだけでなく、開花の時期、分枝量、分枝の長さ、子葉及び葉のサイズ、並びに花柄の長さをアッセイした。花の色又は葉もしくは花弁中のカロテノイドレベルに関して言及されていない。
DellaPennaらの公開されたPCT出願WO 00/32788はマリーゴールド中のカロテノイド生合成を調節する方法を主張している。これらの研究者らはリコペンからのゼアキサンチンの調製に必要とされるリコペンβ-環シクラーゼ及びリコペンβ-環ヒドロキシラーゼをコードするものであると言われているポリヌクレオチド配列を提供する。また、リコペンからのα-カロテンの調製のためにリコペンβ-環シクラーゼとともに有益なリコペンε-環シクラーゼが開示されている。ルテイン生成に必要とされるリコペンε-環ヒドロキシラーゼの教示は示されていない。
カロテノイド生合成はPCT出願WO 00/32788では先に注目されたものの如きマリーゴールド中に既に存在するカロテノイド合成酵素をコードする遺伝子の発現により、又は提供されたこのようなヌクレオチド配列によりコードされたアンチセンスRNAの使用により調節されると言われている。このような調節の証拠はその出願には示されていない。相同遺伝子の追加が天然遺伝子及びトランスジーンの両方を発現させない同時抑制として知られている現象はこれらの研究者らにより取り扱われていない〔例えば、Frayら, Plant Mol. Biol., 22:589-692 (1993)又はFinneganら, Bio/Technology 12:883-888 (1994年９月)を参照のこと〕。
ゼアキサンチン対ルテインの増大された比はまた赤色キサントフィル、アスタキサンチンを含む付加的なキサントフィルのバイオテクノロジー的生成に魅力的な基質を与え得る。アスタキサンチンは培養された魚及び貝の着色剤として広く使用される。アスタキサンチンの完全な生物医学的性質は解明されるべく残っているが、初期の結果はそれが癌及び腫瘍予防に重要な役割を果たし得るだけでなく、免疫系からの積極的な応答を誘発することを示唆する〔Tanakaら, Carcinogenesis 15(1): 15-19 (1994); Jyonouchiら, Nutrition and Cancer 19(3):269-280 (1993)及びJyonouchiら, Nutrition and Cancer 16(2): 93-105 (1991)を参照のこと〕。
【００１３】
生物学的源、例えば、甲殻類、酵母及び緑藻類から供給されたアスタキサンチンは有機合成方法により得られたものと比較される場合に低い歩留まり及びコストのかかる抽出方法により制限される。しかしながら、通常の合成方法は許容し得ないと考えられる副生物を生成する。それ故、水産養殖における飼料サプリメントとして、またその他の工業用の有益な薬品として使用される(3S,3'S)アスタキサンチンの比較的安価な源を見つけることが望ましい。
生物学的系中のアスタキサンチン生成の生産性を増大するための一つのアプローチは遺伝子操作技術を使用することである。この変換に適した遺伝子が報告されていた。
例えば、Misawaら（米国特許第6,150,130号を参照のこと）は海洋細菌アグロバクテリウム・アウランチアカス(Agrobacterium aurantiacus) sp. nov. MK1又は4-ケトゼアキサンチンにより基質としてのゼアキサンチンからのアスタキサンチンの生成に使用される遺伝子（crtWと称される）をコードするアルカリゲネス(Alcaligenes) sp. PC-1から単離されたものを含むDNA配列を特定した。Kajiwaraら（米国特許第5,910,433号を参照のこと）は宿主微生物又は植物からの(3S,3'S)アスタキサンチンの生成のためのβ-C-4-オキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヘマトコッカス・プルビアリス(Haematococcus pluvialis)から単離されたポリヌクレオチド分子（bktと称される）を同定した。加えて、Hirschbergら（米国特許第5,965,795号を参照のこと）は4-ケトゼアスタンチンによりゼアスタンチンからアスタキサンチンを合成する酵素をコードするヘマトコッカス・プルビアリスからの別のDNA遺伝子配列（crtOと称される）を記載した。更に、Cunningham（WO 99/61652を参照のこと）は一部ケトカロテノイドアスタキサンチンの蓄積のために暗赤色の花の色を有する植物種、アドニス・エスチバリス(Adonis aestivalis)からのケトラーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAの単離を報告した。
それ故、花弁もしくは葉又はその両方が商業上有益な量のキサントフィル並びにルテイン及びゼアキサンチンの変化された比を含み、その結果、通常報告された４〜約７％のゼアキサンチンレベルが上昇され、ルテインの量が減少されたマリーゴールド植物が提供し得ることは有益であろう。また、その他の色素の比が上昇され、またこのような植物がそれに隣接して生育された通常のマリーゴールド植物と実質的に同じ表現型の特徴を有することは有益であろう。本発明は幾つかのこのような植物、花弁、葉、それらを生じる種子、ハイブリッド、オレオレジン、ゼアキサンチンとルテインの混合物、及びゼアキサンチン、ルテイン、α-クリプトキサンチン、アンテラキサンチン、ネオキサンチン及びビオラキサンチンを含む食用物質、並びに食用媒体中に溶解又は分散されたβ-カロテンを提供する。
【００１４】
発明の要約
本発明は花弁、葉又は花弁と葉の両方が非突然変異体マリーゴールド中に存在するような比と較べて高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含むマリーゴールド植物を意図している。加えて、花弁は典型的には測定可能な量のゼータ-カロテン（ζ-カロテン）を含み、一方、その化合物は非突然変異体マリーゴールド植物の花弁中では測定可能ではなく、即ち、0.1％未満で存在する。
記載された比は以下に説明されるクロマトグラフィー技術により測定してその色素とルテインの％の合計により割られた最初の名前の色素の％として測定される。こうして、ゼアキサンチン比は本明細書中でゼアキサンチン／（ゼアキサンチン＋ルテイン）と例示して定義される。
このような植物の花弁、葉又は花弁と葉の両方は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までのゼアキサンチン比を少なくとも示すことが好ましい。その比は１までであってもよい。何とならば、ルテインは幾つかの葉中に検出し得ないからである。幾つかの実施態様において、花弁が採取される花は乾燥重量1g当り約４〜約25mgのキサントフィル含量を有し、一方、その他の植物では、花弁キサントフィル含量が低いことがある。葉のキサントフィル含量は典型的には乾燥重量1g当り約0.5〜約1.25mgである。花弁及び葉は典型的には微粉砕形態で存在する。
【００１５】
所望の花弁及び葉を生じた植物はカロテノイド以外の表現型が隣接して生育された非突然変異体植物のそれと実質的に同じであってもよく、又は表現型が異なってもよい突然変異体である。一局面において、意図されるマリーゴールド植物は別の意図される突然変異体植物と非突然変異体（その非突然変異体植物はその親のいずれもが突然変異体ではないハイブリッドである）のハイブリッドである。
本発明の別の局面は花弁もしくは葉又は花弁と葉の両方が高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含み、好ましくは約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までのゼアキサンチン比を少なくとも含むマリーゴールド植物、又はその再生可能な部分を意図している。意図される植物の花弁は典型的には、先に説明したように、測定可能な量のゼータ-カロテンを含む。
一実施態様において意図される植物はハイブリッド又はその後の世代のハイブリッドである。一局面の意図されるマリーゴールド植物は乾燥花1kg当り約４〜約25g又は乾燥重量1g当り約４〜約25mgである花から抽出可能なケン化色素として測定される、キサントフィルの量を含む。別の局面の意図されるマリーゴールドはそれより少ないキサントフィル含量を含む。このような植物の花粉及び胚珠がまた別に意図されている。このような意図される植物の再生可能な部分は胚、分裂組織、花粉、葉、やく、根、根先端、及び花を含む細胞、又はそれに由来するプロトプラストもしくはカルスを含む。
【００１６】
別の実施態様は適当な環境に植え付け、成熟まで成長させて花弁もしくは葉又はその両方が高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含み、好ましくは約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までのゼアキサンチン比を少なくとも含むマリーゴールド植物を生じる種子を意図している。意図される植物の花弁は再度典型的には先に説明したように、測定可能な量、典型的には少なくとも１％以上のゼータ-カロテンを含む。
非突然変異体マリーゴールドからのオレオレジンに対し高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含み、好ましくは約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までのゼアキサンチン比を少なくとも有する突然変異体マリーゴールド植物オレオレジンがまた意図されている。意図されるオレオレジンはまた通常先に説明したように、測定可能な量のゼータ-カロテンを含む。
食品又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物がまた意図されている。食品又は飼料サプリメントは食用媒体中に溶解又は分散されたゼアキサンチン及びルテイン脂肪酸エステルの混合物を含み、そのゼアキサンチン比は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までである。食品又は飼料サプリメントとしての使用に適した別の組成物は食用媒体中に溶解又は分散されたゼアキサンチン及びルテインを含み、そのゼアキサンチン比は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までである。
【００１７】
本明細書に使用される“ゼアキサンチン比”という用語は花弁又は葉中に存在するゼアキサンチン＋ルテインの量により割られた乾燥花弁又は葉中に存在するゼアキサンチンの量〔ゼアキサンチン／（ルテイン＋ゼアキサンチン）〕と定義される。“ネオキサンチン＋ビオラキサンチン比”はこれらの２種の色素＋ルテインの合計により割られたネオキサンチン＋ビオラキサンチンの比として同様に計算される。“β-カロテン比”、“α-クリプトキサンチン比”、“フィトエン比”及び“フィトフルエン比”は分子としての適当な色素量及び分母としてのいずれかの色素＋ルテインの合計を使用して同様に計算される。これらの色素量は以下に説明されるような乾燥花弁又は葉抽出物のケン化後に高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定され、その結果、ルテイン及びゼアキサンチン（又はその他の色素）の夫々の量が生の花弁中に存在するエステル化形態、及び葉抽出物中に存在することがあり、分解されるクロロフィルではなく、ケン化後に存在する遊離化合物形態、例えば、ルテイン及びゼアキサンチンについてのアルコール形態で測定される。
“オレオレジン”という用語は本明細書中で時折或る量のその他の植物産物及び色素、例えば、β-カロテンの如きその他のカロテノイドだけでなく、少量の溶媒、例えば、ヘキサン又はアセトン、典型的には１％未満の有機溶媒により随伴された、本明細書に説明された植物色素、例えば、キサントフィルをそれらのエステル化形態で含む植物組織の抽出物を意味するのに使用される。キサントフィルは典型的には花弁中にモノエステル又はジエステルとして存在し、典型的にはマリーゴールドの葉中に遊離アルコールとして存在する。カロテン、例えば、β-カロテン又はリコペンは遊離の、非化学的に化合された化合物として存在する。クロロフィルはマリーゴールドの葉中に存在し、花弁中には殆ど不在である。こうして、花弁から調製されたオレオレジンはキサントフィルエステルを含み、クロロフィルを殆ど含まず、一方、マリーゴールドの葉から調製されたオレオレジンはクロロフィル及び遊離キサントフィルを含む。クロロフィルエステル及びキサントフィルエステルの両方はオレオレジンのケン化により分解される。意図されるオレオレジンは固体又は半固体の物質である。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明はマリーゴールド植物、種子、花弁、葉及びこれらから調製し得る物質を意図している。意図される植物は既に知られているマリーゴールド植物と較べて高められたカロテノイド比を含む花弁、葉又はこれらの両方を更に有する。こうして、意図される植物の花弁及び／又は葉は高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含む。意図される植物の葉はルテインを含まなくてもよい。これらの意図されるマリーゴールド植物はフレンチマリーゴールドもしくはメキシカンマリーゴールド、又はその他のタゲテス種と較べてアフリカンマリーゴールドである。加えて、意図される植物はこのような植物が先に記載され、また当業者により理解されるように、キサントフィルマリーゴールドであってもよい。
マリーゴールド花弁中のゼアキサンチン対ゼアキサンチン＋ルテインの通常の比は約1:15〜約1:25のオーダであり、その結果、ゼアキサンチン及びルテインの量のみが計算に使用される場合、ゼアキサンチンはルテイン＋ゼアキサンチンの量の約５〜約７％である。Quackenbushらによる文献、J. Assoc. Off. Agri. Chem., 55:617-621 (1972)は約1:4.4と異常に高いアメリカの黄色のアフリカンマリーゴールド花弁の一つのグループにおけるゼアキサンチン対ルテイン比を報告し、一方、これらの花弁中のキサントフィルの全濃度は乾燥重量1g当り約0.4mgと異常に低かった。メキシコ品種は凍結乾燥花弁がアッセイされる場合には11.1％のゼアキサンチン、また生の花弁がアッセイされる場合には3.8％を含むとこれらの著者らにより言われた。その高い値はデータの残部と一致しておらず、不正確であると考えられる。ここで意図される花弁中の好ましいゼアキサンチン比は以下に説明されるように、一層大きく、約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、花弁キサントフィルの量は好ましくは乾燥重量1g当り少なくとも約4mgである。
【００１９】
意図されるマリーゴールド植物は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きいゼアキサンチン比を含む花弁を有する。更に好ましくは、意図されるマリーゴールド植物は約3:10より大きいゼアキサンチン比を含む花弁を有する。最も好ましくは、その比は5:10より大きく、約1.0であってもよい。花弁が採取される花は乾燥重量1g当り約４〜約25mg、好ましくは乾燥重量1g当り約10〜約20mgのキサントフィル含量を有する。このようなマリーゴールド植物はまた好ましくは約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きいゼアキサンチン比を含む葉を有する。更に好ましくは、意図されるマリーゴールド植物は約3:10より大きいゼアキサンチン比を含む葉を有する。最も好ましくは、その比は5:10より大きく、約1.0であってもよい。意図される葉は乾燥重量1g当り約0.2〜約1.25mg、好ましくは乾燥重量1g当り約0.5〜約1mgのキサントフィル含量を有する。
幾つかの実施態様において、意図される植物の花弁のルテイン濃度は親の、非突然変異体植物中に存在するルテインの約80〜約90％を含む。その他の実施態様において、ルテインの量は非突然変異体植物中に存在する量の約75％未満である。更に別の実施態様において、花弁中に存在するルテインの量は非突然変異体マリーゴールド植物の花弁中に存在する量の約15％未満である。
意図されるマリーゴールドはまたルテインに対する一種以上のその他の色素の比の相違を示し得る。こうして、親植物中のネオキサンチン＋ビオラキサンチン比は非突然変異体花弁抽出物について約0.01〜約0.022、また葉中では約0.17〜約0.33であってもよい。一つの好ましい実施態様の意図される突然変異体植物の花弁及び葉中のその比は約1:5(0.2)〜約1:1(1)である。ネオキサンチン及びビオラキサンチンは一緒に測定される。何とならば、それらはクロマトグラフィーで分離し難いからである。
非突然変異体植物中のβ-カロテン比は典型的には花弁について約0.007未満であり、また葉について約0.3〜約0.4である。その比は突然変異体マリーゴールド植物の花弁について約0.05〜約0.9であり、また葉について約１である。
【００２０】
α-クリプトキサンチンは典型的には非突然変異体植物花弁の着色カロテノイドの１％未満を構成し、その結果、α-クリプトキサンチン比は非突然変異体花弁中で約0.01である。α-クリプトキサンチン比は幾つかの好ましい突然変異植物の花弁中で約0.25〜約0.9である。
フィトエンは非突然変異体植物中のカロテノイドの約３〜約0.3％で花弁中に存在することがあり、典型的には減少された量のルテインを含む幾つかの突然変異体花弁中に約35％で存在し得る。例示のフィトエン比は非突然変異体植物中の約0.003〜約0.03のフィトエン比と較べて意図される植物中に約0.3〜約１であり得る。フィトエン濃度は非突然変異体植物の葉と較べて突然変異体植物の葉中で殆ど変化されない。
非突然変異体植物花弁中のフィトフルエン量は典型的にはフィトエンについて観察された量とほぼ同じであり、一方、意図される突然変異体植物の花弁中に存在する量は一般にフィトエン量の約40〜約70％である。非突然変異体植物に関するフィトフルエン比は通常約0.005〜約0.03であり、一方、意図される突然変異体植物に関するその比は約0.2〜約１である。フィトフルエンは葉抽出物中に観察されなかった。
上記比で観察される増大は典型的には少なくとも約２倍である。特別な実施態様において、比は約10〜約100倍だけ高められる。
特別な植物の花弁もしくは葉又はその両方は上記の高められた比の一つ以上を有し得る。通例では、前記の高められた比の二つ以上が存在する。こうして、例えば、ゼアキサンチン比及びβ-カロテン比が高められ、又はゼアキサンチン比及びネオキサンチン＋ビオラキサンチン比が高められる。同様に、これらの比の三つ以上が高められる。
【００２１】
α-クリプトキサンチンは幾つかの突然変異体中で比較的高いレベルで存在することがわかり、それ以外では容易に入手し得ない点で特に重要な化合物である。こうして、α-クリプトキサンチンは幾つかの突然変異体中の着色カロテノイドの約20〜約40％で存在した。このような植物のα-クリプトキサンチン比は従って花弁が通常の量よりも多いカロテノイドを含むこれらの植物と較べて大いに高められた。
意図される植物の花弁は典型的には測定可能な量のゼータ-カロテン（ζ-カロテン）を含み、一方、その色素は非突然変異体マリーゴールド植物の花弁中に測定可能な量で存在せず、即ち、0.1％未満で存在する。典型的には、ゼータ-カロテンは花弁カロテノイドの少なくとも約１％の量で存在する。ゼータ-カロテンのその量は幾つかの実施態様では約３〜約７％の範囲であることがあり、またその他の実施態様では約20％であり得る。
既に注目されたように、キサントフィル、例えば、ルテイン及びゼアキサンチンは花弁中に遊離化合物ではなく、主として脂肪酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等のモノエステル又はジエステルとして存在する。このようなものとして、ゼアキサンチン又はその他のキサントフィル比が本明細書中に説明される場合、その比は一種以上の花弁をヘキサン又はその他の適当な溶媒で抽出してエステル化キサントフィルを含むオレオレジンの如き組成物を得ることにより測定される。次いでその組成物が塩基、例えば、水酸化カリウムを使用してケン化されてエステルを開裂し、遊離カロテノイドアルコールを生成する。遊離カロテノイドキサントフィルアルコールはその後にケン化反応混合物から分離され、所望により高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して分離される。存在する物質の比は通常の積分方法を使用して適当なHPLCピークの下の面積により測定される。
色素比を測定するのにここで利用される分析方法は以下に例示され、他者により公表されたのと同様の結果を与え、異なる特定技術が主として便宜の理由のために異なる研究所により使用される。ここで好ましい操作を使用して、約98％充分に開いた花が分析に選ばれる。花弁が選ばれた花から花の中心からの距離の約1/3除去される。
葉が実質的にあらゆる時期で回収され、抽出し得る。キサントフィルは典型的にはカロテンのように葉中に遊離化合物として存在する。葉中に存在するクロロフィルがまたカロテノイド色素とともに抽出され、こうしてアッセイが抽出物のケン化後に行なわれる。何とならば、その処理がクロロフィルを破壊するからである。葉が花弁と同様にカロテノイド含量についてアッセイされる。
【００２２】
植物抽出物中のカロテノイドレベルを測定するのに工業で使用される通常の分析方法はAOAC 1984, Official Methods of Analysis (第14編), the Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, USAの方法であり、そのアッセイの結果はここで得られた結果と同様である。
意図されるマリーゴールド植物は親系列の突然変異体である。即ち、第一系列もしくは交雑又は種子が突然変異原で処理されて（突然変異誘発されて）典型的には１回以上自家受粉（自殖）される突然変異誘発植物を得る。ここに意図される植物は突然変異誘発それ自体、自殖の一つ、又は別の突然変異誘発植物もしくは非突然変異誘発植物との突然変異誘発植物もしくは子孫の交雑から生じ得る。
実質的にあらゆる種類の突然変異原が意図される植物を生産するのに使用でき、例示の突然変異原が以下に説明される。幾つかの意図される突然変異体マリーゴールドは隣接して生育された非突然変異体マリーゴールド親植物の表現型とは実質的に異なる表現型を有するが、その他の意図される突然変異体は、カロテノイドに関係する表現型形質以外は、隣接して生育される非突然変異体親植物の表現型と実質的に同じ表現型を示す。後者の植物について更に詳しくは、植物の性質、例えば、植物高さ、植物直径、花頭直径、花頭高さ、開花の時期、分枝量、分枝の長さ、花柄長さ、胚軸長さ、子葉長さ及び子葉幅を親と突然変異体植物の間で比較する場合、幾つかの意図される突然変異体植物に関するこれらの性質の値は夫々親植物の値の約90％以内である（測定における標準偏差を含む）。更に好ましくは、突然変異体のこれらの性質に関する値は親の約95％以内であり、最も好ましくは、これらの値は標準偏差内で同じである。一方、その他の突然変異体植物は一つ以上の表現型形質を大いに異にする。
【００２３】
親植物と突然変異体植物の間のカロテノイド関連表現型の相違は突然変異体の花から得られるキサントフィル色素の量である。親植物、例えば、“スカーレットエード”又は“ディープオレンジエード”は典型的には乾燥全花頭重量1g当り約10〜約18mgの抽出可能なキサントフィル色素を有する。意図される突然変異体植物は花弁中にほぼ同じ量のカロテノイドを含むことが好ましいが、特にゼアキサンチン対ルテインの比が約9:1以上のように非常に高い場合に、乾燥重量1g当り約4mg程度に少量を含み得る。
意図されるマリーゴールドの葉はまたカロテノイド含量だけでなく、ケン化オレオレジン中で測定して葉中に存在する先に説明したカロテノイド比の一つ以上について親植物と突然変異体植物の間で表現型の相違を示し得る。Moehsらの先に注目された論文、Plant Mol. Biol., 45:281-293 (2001)は葉カロテノイド比及び含量が一定であり、一方、花弁中のカロテノイド濃度が異なると報告した。ここで、突然変異体植物中の前記ゼアキサンチン比、アンテラキサンチン比、ネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、フィトエン比、フィトフルエン比、β-カロテン比及びα-クリプトキサンチン比の一つ以上は親の非突然変異体植物とはかなり異なったことがわかる。加えて、突然変異体植物の夫々の花弁は測定可能な量のゼータ-カロテンを示し、一方、測定可能な量のゼータ-カロテンが親の非突然変異体植物中に存在することが観察されなかった。
表現型の比較が隣接して生育された植物の間でなされる。本明細書に使用される“隣接して生育された”という用語は成長条件が表現型を支配しないように得られるのと同様の光、熱、生育媒体、湿度及び栄養の条件下で生育された植物を意味するのに使用される。温室生育植物について、“隣接して生育された”は同じベンチでできるだけ同様の条件下で生育された植物を意味する。現地生育植物について、“隣接して生育された”は同じ現地又は隣接現地でできるだけ同様の条件下で生育された植物を意味する。
植物を変化するのに有益な変異原がこのような薬剤の使用の方法と同様に当業界で公知である。例示の化学突然変異原として、ニトロソメチル尿素(NMU)、エチルメタンスルホネート(EMS)、メチルメタンスルホネート、ジエチル硫酸、ニトロソグアニジン、及びエチルニトロソ尿素が挙げられ、そのうちでEMSがここでは好ましい。NMUはCetlら, Folia Fac. Sci. Nat. Univ. Purkynianae Brun. Biol., 21(1): 5-56 (1980)に説明されたように使用でき、一方、EMSは典型的には約0.25〜約１容量％(v/v)、好ましくは約0.2〜約0.8％で利用される。ガンマ放射線がまた種子を200〜約20,000ラド（0.2〜約20キロラド）の線量で照射するのに使用される場合に有益な変異原である。
【００２４】
使用される変異原にもかかわらず、カロテノイド関連形質、例えば、ゼアキサンチン比及び花弁中のキサントフィルの量を含む、得られる突然変異体植物の表現型は通常親のそれと実質的に同じであり、その結果、得られた突然変異体の非常に大比率が有益ではない。加えて、親と同じ表現型を有すると思われる植物は所望の突然変異体植物を配置するためにスクリーニングされる必要がある。これらのスクリーニングは、面倒ではあるが、ルーチンで行なわれており、一種以上の単一の花弁もしくは葉又はその両方からのカロテノイド色素の分析を伴う。こうして、所望の突然変異体の調製は比較的稀であるが、反復可能なイベントである。例えば、本明細書における一つの研究において、わずかに23種の有益な突然変異体が試験したほぼ22,000の突然変異体植物から得られた。別の研究において、約8,200の試験した植物からの約24の有益な突然変異体が得られた。
既に注目されたように、意図される植物は突然変異誘発種子から成長する植物であってもよく、又は自家受粉又は交雑であってもよい。一つの好ましい実施態様において、意図されるマリーゴールドは独立のM1植物からの２種の異なる突然変異誘発植物から生じた２種の植物の花を交雑することにより生成されたハイブリッド（M2 x M2）である。別の実施態様において、意図されるマリーゴールドは一つの突然変異誘発植物から生じた一つの植物の花を非突然変異誘発植物と交雑することにより生成されたハイブリッドである。更に別の実施態様において、意図される植物はハイブリッドをその直ぐ親の花の一方又は他方と戻し交雑することにより生成されたハイブリッドである。２種の異なるハイブリッド植物の交雑の産物がハイブリッドの自家受粉の産物と同様に意図されている。
【００２５】
本発明はまた意図される植物の花粉及び胚珠を意図している。意図される植物の再生可能な部分がまたそれ自体意図され、胚、分裂組織、花粉、葉、やく、根、根先端、及び花からなる群から選ばれた細胞、又はそれらに由来するプロトプラストもしくはカルスを含む。植物を細胞から再生するための方法は当業者に公知であり、マリーゴールドの如き双子葉植物がこのような再生を特に受け易い。
ゼアキサンチン比が約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きいルテイン及びゼアキサンチンの脂肪酸エステルを含むマリーゴールドオレオレジンがまた意図されている。更に好ましくは、その比は約3:10より大きく、最も好ましくは約1.0である。意図されるマリーゴールドオレオレジンは先に説明した意図されるマリーゴールドの花弁又は葉中に存在するようなゼアキサンチン比を含む。オレオレジンは商用の品目であり、ヒト又はその他の動物の食品又は飼料サプリメントの製造における更なる処理のために加工業者に販売される。意図されるオレオレジンはまた典型的には測定可能な量のゼータ-カロテンを含む。
例示のマリーゴールドオレオレジン調製において、キサントフィルエステル、即ち、ゼアキサンチン又はゼアキサンチンエステル及びルテインエステルそしておそらくその他のキサントフィルエステルの混合物並びにカロテン、例えば、ゼータ-カロテンは乾燥マリーゴールド花からヘキサン、アセトン、酢酸エチル、トルエン、テトラヒドロフラン(THF)等の有機溶媒、又はこれらの混合物で抽出される。抽出は当業界で知られている操作に従って行なわれる。一種以上の溶媒が除去されて、典型的には高レベルのキサントフィルエステルを含み、抽出有機溶媒約99％、好ましくは約99.9％含まず、即ち、約１重量％未満、好ましくは約0.1重量％未満の有機溶媒を含む抽出物をもたらす。得られる無溶媒抽出物はマリーゴールドオレオレジンと称される。葉抽出物が同様に調製され、遊離キサントフィル、カロテン及びクロロフィルを含む。
ヒト又はその他の動物、例えば、ニワトリ及びシチメンチョウのような家禽、マス及びサケのような魚並びにシュリンプ、ロブスター及びカニのような甲殻類の食品又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物がまた意図されている。意図される食品又は飼料サプリメントは色をこれらの動物の皮膚及び脂肪だけでなく、このような動物、特にニワトリの卵黄に与えるのに使用し得る。
【００２６】
一種の食品又は飼料サプリメントはゼアキサンチン単独又はマリーゴールドオレオレジン中に存在するようなゼアキサンチン、ルテイン及びその他のカロテノイドの脂肪酸エステルの混合物を含む。殆ど脂肪酸エステルのその混合物が食用媒体に溶解又は分散され、ゼアキサンチン及びルテインの脂肪酸エステルが約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、更に好ましくは約3:10より大きく、約1.0までであるゼアキサンチン比で存在する。こうして、この食品又は飼料サプリメントは溶解及び濾過によるような前記オレオレジンの好適な精製、続いて適当な食用媒体中の精製混合エステルの溶解又は分散により調製し得る。
幾つかの実施態様において、食用媒体は食用トリグリセリドオイルであり、一方、その他の実施態様において、食用媒体はピル及び錠剤の如き医薬製品中に頻繁に見られるような結合剤（医薬上許される結合剤）である。錠剤又はカプセルについて、遊離キサントフィルとして測定される混合物のキサントフィルエステル含量は典型的には錠剤又はカプセル当り約0.1〜約25mg、更に通常錠剤又はカプセル当り約５〜約20mgである。
結合剤及び接着剤は充分な凝集を固体に加えて通常の加工、例えば、サイジング、潤滑、圧縮及び包装を可能にすることが好ましいが、錠剤又はカプセルが崩壊し、組成物が摂取後に溶解することを依然として可能にする。例示の結合剤として、ラクトース一水和物、アカシア、トラガカント、蔗糖、ゼラチン、グルコース、セルロース又はサッカリド物質、例えば、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPLC)、ヒドロキシプロピルセルロース（クルセルTM）、エチルセルロース（エトセルTM）、メチルセルロース及びナトリウムカルボキシメチルセルロース（例えば、タイロースTM）（これらに限定されない）、前ゼラチン化澱粉（例えば、ナショナルTM1511及びスターチ1500）、ポリサッカリド酸、アルギン酸及びアルギン酸の塩、マグネシウムアルミニウムシリケート、ポリエチレングリコール、グアーガム、ベントナイト、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、並びにポリメタクリレートが挙げられる。
【００２７】
例示の食用油として、カンデリラ油、ヤシ油、タラ肝臓油、綿実油、ニシン科の油、オリーブ油、パーム油、トウモロコシ油、大豆油、落花生油、ポピー実油、サフラワー油及びヒマワリ油が挙げられる。比較的高い濃度の不飽和脂肪酸を有する油の使用が好ましく、即ち、約100-150のヨウ素価を有する油の使用が好ましい。混合は公知であるように、典型的には高せん断混合装置を使用して行なわれる。補助溶媒及び添加剤、例えば、エタノール及びα-トコフェロールが夫々また米国特許第5,382,714号に記載されるように存在し得る。
別の実施態様において、ゼアキサンチンとルテインの混合物、ゼアキサンチン単独、又はその他のカロテノイド混合物が0.5〜約20％、好ましくは約１〜約４％のキサントフィルを含む概して球形の小ペレット（これらは通常“ビードレット”と称される）の形態で用意される。これらのビードレットは所望の量で米国特許第5,270,063号に開示されているような穀物を食するのに供されるようなヒト食品に混合されて使用でき、又は米国特許第5,849,345号、同第5,695,794号、同第5,605,699号及び同第5,043,170号に飼料添加剤について開示されたビードレット又はその他の粒子のようにニワトリもしくはその他の動物飼料に混合し得る。
例示のビードレットは水不溶性であり、米国特許第4,670,247号に開示されているように架橋ゼラチン又はアルギン酸ナトリウムの如きアルギン酸塩によるキサントフィル組成物のカプセル化により調製される。一種以上の所望のカロテノイドを含む水不溶性ビードレットは一種以上のカロテノイド、水、ゼラチン、及び糖を含むエマルションを生成することにより調製される。エマルションは液滴からの粒子がそれらの粒状形態が永久に確立されるまで互いに分離されて保たれるような様式で澱粉状の粉末の塊中に個々に集められる液滴に変換される。カロテノイドを含む粒子は澱粉状の回収粉末から分離され、約90℃〜約180℃の温度で熱処理される。熱処理工程は糖のカルボニル基とゼラチン分子の遊離アミノ部分との間の反応によりビードレットのゼラチンマトリックスを不溶化する。得られるビードレットは水不溶性であり、飼料ペレット化の応力に対する増大された安定性を示す。架橋プロセスはビードレットをつくる際に使用される成分を利用し、組成物への架橋試薬又は添加剤の添加を必要としない。
【００２８】
米国特許第5,695,794号は家禽飼料用の添加剤としてのここの使用に適し得るビードレットの別の形態を開示している。こうして、約30〜約55ミクロンの直径を有するビードレットが水添植物油、例えば、水添綿実油、小麦胚油、サフラワー油、大豆油等（これはまた水添大豆モノグリセリド及びジグリセリド、綿実モノグリセリド及びジグリセリドから調製されたもののようなモノグリセリド及びジグリセリドだけでなく、酸化防止剤としてのクエン酸及び2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノール(BHT)を含んでもよい）中の所望の量の一種以上のカロテノイド、即ち、ゼアキサンチン、ゼアキサンチンとルテインの混合物、又は本明細書に記載されたその他のカロテノイド混合物の融解溶液を噴霧することにより調製される。その他の酸化防止剤、例えば、エトキシキン、ビタミンＥ等が公知であるようにまた使用し得る。溶融混合物は約160°F（約70℃）の温度で噴霧冷却器（例えば、ニロ社（コロンビア、Md.）から入手し得る）のサイクロン空気流に噴霧されて冷却すると固化するビードレットを生じる。冷却されたビードレットがサプリメントとして飼料に添加されることが好ましいビードレットを生成するのに公知であるようなケーキング防止剤、例えば、ヒュームドシリカ、リン酸カルシウム、粉末澱粉又はセルロースで散粉される。例示のビードレットは1g当り約10〜約100mg（mg/g）、好ましくは約10〜約50mg/gのゼアキサンチンを含む。
意図されるゼアキサンチン又はゼアキサンチン-ルテイン混合物が添加される動物飼料は当業界で公知である。上記米国特許第5,849,345号、同第5,695,794号、同第5,605,699号及び同第5,043,170号が家禽に特に有益である例示の食を提供する。米国特許第5,935,624号及び同第2,918,370号が更なる例示の家禽食を提供する。
米国特許第5,258,189号はβ-カロテンが植物油に分散された、又は乾燥形態の調理された穀物製品と混合されるヒト用の穀物製品を食するのに供されるためのβ-カロテンの添加を教示している。本明細書のいずれかに説明されたようなゼアキサンチン又はゼアキサンチンとルテインの混合物は同様の食品中にβ-カロテンに代えて所望のレベルで使用し得る。
【００２９】
食品又は飼料サプリメントとしての使用に適した別の組成物は食用媒体に溶解又は分散されたゼアキサンチンとルテインの混合物を含み、存在するゼアキサンチン比は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までである。この組成物はマリーゴールドオレオレジン中に存在するエステルと較べて遊離ゼアキサンチン及びルテインであるケン化キサントフィルを含む。
マリーゴールドオレオレジンをケン化して遊離キサントフィルを得るための方法は公知である。例えば、Tyczkowskiら, Poultry Sci. 70(3): 651-654, 1991、及び米国特許第5,382,714号を参照のこと。そのルテインは有機溶媒の添加によりケン化マリーゴールドオレオレジンから結晶化された。
加えて、Ausichらの米国特許第5,648,564号はオレオレジンをプロピレングリコール及びアルカリ水溶液、好ましくは水酸化カリウムを含む組成物と混合してオレオレジン及びプロピレングリコールが一緒に少なくとも75重量％を構成する反応混合物を生成することによるマリーゴールドオレオレジンからの結晶性ルテインの製造を教示している。こうして生成された反応混合物がキサントフィルエステルをケン化し、結晶の形態の遊離キサントフィルを含むケン化反応混合物を生成するのに充分な時間の期間（典型的には少なくとも３時間）にわたって約65℃〜約80℃の温度に保たれる。ケン化抽出物が希釈量の水と混合されて水溶性不純物を溶解し、反応混合物の粘度を低下する。希釈された混合物が均一まで穏やかに混合され、次いで濾過されてキサントフィル結晶を集める。集められたキサントフィル結晶が温かい水で洗浄され、乾燥される。プロピレングリコール以外の有機溶媒はキサントフィルエステルを含むオレオレジンからのキサントフィルの単離及び精製に使用されない。こうして生成された乾燥キサントフィル結晶が典型的には先に説明したトリグリセリドの如き食用媒体と混合される。混合物のキサントフィル含量は典型的には約0.1〜約35重量％、好ましくは約１〜約10重量％である。
更に説明しないが、当業者は先の記載を使用して本発明をその最も充分な程度まで利用し得ると考えられる。それ故、下記の好ましい特別な実施態様は単なる例示と見なされるべきであり、開示の残部の限定と何ら見なされるべきではない。
【００３０】
実施例１：アフリカンマリーゴールド“スカーレットエード”のEMS処理
“スカーレットエード”と称されるアフリカンマリーゴールドキサントフィルマリーゴールドの種子（パンアメリカン・シード社（622タウンロード、ウェスト・シカゴ、IL60185）から市販されている）をエチルメタンスルホネート（EMS、シグマ・ケミカル社（セントルイス、MO63178）から市販されている）で処理した。約2,500の種子を0.4％(v/v)又は0.8％(v/v)のEMS 400mlに添加し、周囲温度で８時間にわたって穏やかに撹拌した。EMS処理後の４時間の期間中に、種子を16回洗浄し、夫々の洗浄は蒸留水400mlと一緒の連続撹拌を使用した。次いで処理された種子（M1種子と同定された）を無土壌鉢植えミックスを含むトレイ中に植え付けた。
数週後に、幼植物を無土壌鉢植えミックスを含む鉢に移植し、温室中で管理した。これらの植物により生じた花を自然に自家受粉させた。得られる種子（M2種子と同定された）を約2,300の植物から回収した。これらの2,300の植物のうち、約1,500を0.4％のEMSで処理された種子から生育し、約800を0.8％のEMSで処理された種子から生育した。突然変異体植物の同定を促進するために、50のM1植物の夫々からのM2種子を一つのロットに合わせ、合計47の種子ロットを生じた。2000年の夏中に、47のロットの夫々からの500の種子を植え付け、得られる植物をパンアメリカン・シード社（サンタ・パウラ、CA93060）で現地生育した。
【００３１】
実施例２：EMS処理アフリカンマリーゴールド“スカーレットエード”のHPLCスクリーニング
EMS処理“スカーレットエード”植物をパンアメリカン・シード社（サンタ・パウラ、CA93060）で現地生育し、変化したゼアキサンチン比についてHPLCによりスクリーニングした。約98％充分に開いた花を分析のために選んだ。夫々の花から、一つの花弁を花の中心からの距離の1/3だけ除去し、ガラスビーズ約5gを含む3.5”x0.75”のガラスバイアルに入れた。バイアルにドライアイスを詰め、その後に-80℃で貯蔵した。
分析のために、溶媒送出及びアリコート除去を単一インジェクター弁ギルソン232XL及び402 2S1V希釈装置を含むロボット系〔ギルソン社、米国、3000Wベルトライン・ハイウェイ、ミドルトン、WI〕で行なった。ケン化のために、50％の水酸化カリウム水性エタノール溶液（４水：１エタノール）3mlを夫々のバイアルに添加し、続いてオクタノール3mlを添加した。ケン化処理を15時間にわたって250運動／分でIKA HS 501水平シェーカー〔ラブワールド-オンライン社、ウィルミントン、NC〕上に維持されたバイアルを用いて室温で行ない、続いて約１時間の静止期があった。
ケン化後に、上澄みをメタノール0.9mlで希釈した。メタノールの添加を加圧下で行なってサンプル均一性を確実にした。0.25mlのシリンジを使用して、アリコート0.1mlを除去し、分析のためにHPLCバイアルに移した。
【００３２】
HPLC分析のために、クォータナリーポンプ、真空脱気系、６方向注入弁、温度調節オートサンプラー、カラムオーブン及び光ダイオードアレイ検出器で完成した、ヒューレット・パッカード1100HPLCを使用した〔ウルトラ・サイエンティフィック社（250スミス・ストリート、ノース・キングスタウン、RI）により入手し得るアギレント・テクノロジーズ〕。カラムは同じ材料のガードカラム〔ウォーターズ、34メープル・ストリート、ミルフォード、MA〕を備えたウォーターズYMC30、５ミクロン、4.6x250mmであった。移動相用の溶媒は0.2％のBHT（2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノール）で安定化された81メタノール：４水：15テトラヒドロフラン(THF)であった。注入は20μlであった。分離は30℃で1.7ml/分の流量で無勾配であった。ピーク応答を447nmにおける吸光度により測定した。
このプロトコルを使用して、最初の2,546のサンプルからの結果を統計分析してルテイン及びゼアキサンチン含量に関する平均値を確立した。これは半定量分析スクリーンであったので、ピーク面積値を使用した。平均より高いルテイン及び／又はゼアキサンチン濃度を有する突然変異体を同定するために、平均より大きい三つの標準偏差の値を計算した。計算したピーク面積平均、標準偏差及びゼアキサンチン比を下記の表１に示す。
【００３３】
【表１】
2005511003.tif 000004
【００３４】
上記値に基づいて、1565より大きいルテインピーク面積及び／又は91より大きいゼアキサンチンピーク面積を有するサンプルを選んだ。また、サンプルを高ルテインピーク面積についてのみ、また10％より大きいゼアキサンチン比について選んだ。これらの選択パラメーターを使用して、合計88の突然変異体を21.754のアッセイしたサンプルから同定した。夫々のEMS種子処理から得られる突然変異体の合計数を下記の表２に示す。
【００３５】
【表２】
2005511003.tif 000005
【００３６】
ルテイン及びゼアキサンチンの相対レベルについてのこれらのアッセイの更に特別な結果を下記の表３に示す。
【００３７】
【表３】
2005511003.tif 000006
【００３８】
約21,700の植物は約４〜約７％（約1:25〜約1:15）の典型的なゼアキサンチン比を示した。上記データは意図される突然変異の相対的稀度だけでなく、低下されたゼアキサンチンレベルを示すほぼ等しい数の植物を示す。また、データは変異原対ここで使用されたその他のものの一つのレベルの使用についての優位性を示さない。
実施例３：アフリカンマリーゴールド13819のEMS処理
13819と称されるアフリカンマリーゴールドキサントフィルマリーゴールド（パンアメリカン・シード社（622タウン・ロード、ウェスト・シカゴ、IL60185）の独占育種選択）の種子をエチルメタンスルホネート（EMS、シグマ・ケミカル社（セントルイス、MO63178）から市販されている）で処理した。約7,000の種子を0.2％(v/v)又は0.4％(v/v)のEMS 600mlに添加し、周囲温度で８時間にわたって穏やかに撹拌した。EMS処理後の４時間の期間中に、種子を16回洗浄し、夫々の洗浄は蒸留水600mlと一緒の連続撹拌を使用した。
次いで処理された種子（M1種子と同定された）を無土壌鉢植えミックスを含むトレイ中に植え付けた。３〜４週後に、幼植物を現地に移植した。これらの植物により生じた花をバッグに入れて交雑受粉を防止し、自然に自家受粉させた。得られる種子（M2種子と同定された）を約2,391の植物から回収した。これらの植物のうち、約951を0.2％のEMSで処理された種子から生育し、約1,440を0.4％のEMSで処理された種子から生育した。
突然変異体植物の同定を促進するために、50の植物の夫々からのM2種子を一つのロットに合わせた。このグルーピングは合計48の種子ロットを生じた。2000年の10月後半から11月中ごろまでに、0.4％のEMS処理の15のロットの夫々からの1000の種子を植え付け、夫々のロットの700の植物をシービュー・ナーサリー（エル・リオ、CA93060にある）で温室生育した。加えて、48のロットの全てからの1,500の種子を2000年10月後半に植え付け、ロットの夫々からの765の植物をゼミラス・パンアメリカン・チャイルLTDA（ピチデグア、チャイルにある）で現地生育した。
【００３９】
実施例４：EMS処理アフリカンマリーゴールド13819のHPLCスクリーニング
EMS処理13819 M2植物をシービュー・ナーサリー（エル・リオ、CA93060にある）で温室生育し、またセミラス・パンアメリカン・チャイルLTDA（ピチデグア、チャイルにある）で現地生育し、変化したゼアキサンチン比についてスクリーニングした。約98％充分に開いた花を分析のために選んだ。これらの花から、花弁を花の中心からの距離の1/3だけ除去した。花弁組織約100mgをプラスチックバッグに入れ、分析まで凍結して貯蔵した。乾燥重量をガラスビーズ約5gを含む3.5”x0.75”のガラスバイアルに入れられた二つの花弁について測定した。
分析のために、溶媒送出及びアリコート除去を単一インジェクター弁ギルソン232XL及び402 2S1V希釈装置を含むロボット系で行なった。ケン化のために、50％の水酸化カリウム水性エタノール溶液（４水：１エタノール）3mlを夫々のバイアルに添加し、続いてオクタノール3mlを添加した。ケン化処理を15時間にわたって250運動／分でIKA HS 501水平シェーカー上に維持されたバイアルを用いて室温で行ない、続いて約１時間の静止期があった。
ケン化後に、上澄みをメタノール0.9mlで希釈した。メタノールの添加を加圧下で行なってサンプル均一性を確実にした。0.25mlのシリンジを使用して、アリコート0.1mlを除去し、分析のためにHPLCバイアルに移した。
HPLC分析のために、クォータナリーポンプ、真空脱気系、６方向注入弁、温度調節オートサンプラー、カラムオーブン及び光ダイオードアレイ検出器で完成したヒューレット・パッカード1100HPLCを使用した。カラムは同じ材料のガードカラムを備えたウォーターズYMC30、５ミクロン、4.6x250mmであった。標準物質をDHI-ウォーター＆エンビロンメント（DK-2970ホースホルム、デンマーク）及びシグマ・ケミカル社（セントルイス、MO 63178）から得た。移動相用の溶媒は0.2％のBHTで安定化された81メタノール：４水：15テトラヒドロフランであった。注入は20μlであった。分離は30℃で1.7ml/分の流量で無勾配であった。ピーク応答を447nmで測定した。
このプロトコルを使用して、最初の507のサンプルからの結果を統計分析してルテイン及びゼアキサンチン含量に関する平均値を確立した。平均より高いか、又は低いルテイン及び／又はゼアキサンチン濃度を有する突然変異体を同定するために、平均より大きいか、又は小さい三つの標準偏差の値を計算した。計算した平均、標準偏差及びゼアキサンチン比を下記の表４に示す。
【００４０】
【表４】
2005511003.tif 000007
【００４１】
上記値に基づいて、10％より大きいゼアキサンチン比、1.12mg/g生重量より大きい合計ルテイン及びゼアキサンチン含量並びに0.24mg/g生重量未満の合計ルテイン及びゼアキサンチン含量を有するサンプルを選んだ。これらの選択パラメーターを使用して、1.12mg/gより大きいルテイン＋ゼアキサンチンの合計を有する合計347の突然変異体を同定し、また10％より大きいゼアキサンチン比を有する43の突然変異体を8192のサンプルから同定した。夫々のEMS種子処理から得られる突然変異体の合計数を下記の表５に示す。
【００４２】
【表５】
2005511003.tif 000008
【００４３】
約10％のゼアキサンチンより大きいゼアキサンチン比を有する突然変異体のうち、約47％が10％から13％未満までを有し、一方、53％が13％以上を示した。
実施例５：選択マリーゴールドの花弁中のカロテノイド組成
カロテノイド組成を“スカーレットエード”野生型及び実施例２に記載されたスクリーニング操作で同定されたものから選ばれた突然変異体サンプルについて測定した。花弁サンプルを突然変異体が同定されるまで-80℃の冷蔵庫中で貯蔵した。サンプルを凍結乾燥し、乾燥組織を分析に供するまでアルゴン雰囲気下で-80℃で貯蔵した。
抽出操作を赤色光のもとで行なった。乾燥した花弁を粉砕してNo. 40の篩メッシュサイズに通した。粉砕サンプルを正確に計量し、100mlの赤色のメスフラスコに移した。サンプルに、H2O 500マイクロリットル（μl）を添加し、その混合物を１分間撹拌した。抽出溶媒（ヘキサン10ml＋アセトン7ml＋無水アルコール6ml＋トルエン7ml）30mlを添加し、フラスコを160rpmで10分間振とうした。
ケン化のために、40％のメタノール性KOH2mlをフラスコに添加し、次いでこれを１分間撹拌した。フラスコを56℃の水浴に20分間入れた。エアーコンデンサーを取り付けて溶媒の損失を防止した。サンプルを取り付けたコンデンサーで１時間にわたって暗所で冷却した。冷却後、ヘキサン30mlを添加し、フラスコを160rpmで10分間振とうした。
振とうしたサンプルを10％の硫酸ナトリウム溶液で或る容積(100ml)まで希釈し、１分間激しく振とうした。サンプルが暗所に少なくとも30分間留まった。アリコート35mlを約50mlの上相から除去し、サンプルカップに移した。ヘキサン更に30mlをフラスコに添加し、次いでこれを160rpmで10分間振とうした。約１時間後に、上相を合わせた。HPLC分析のために、アリコート10mlを窒素雰囲気下で乾燥させ、アルゴン雰囲気下で-80℃で貯蔵した。
【００４４】
HPLC装置は冷凍オートサンプラー、カラムヒーター及びウォーターズ光ダイオードアレイ996検出器（ウォーターズ社、34メープル・ストリート・ミルフォード、MA01757）を備えたアライアンス2690を含んでいた。分離を同じ材料のガードカラムを備えたYMC C30 カラム、３μm、2.0x150mmで得た。標準物質をICCヨードファイン・ケミカルズ（サマービル、ニュージャージー088876）及びDHI-ウォーター＆エンビロンメント（DK-2970ホースホルム、デンマーク）から得た。
乾燥した突然変異体サンプルをテトラヒドロフラン及びメタノール中で200μlの合計容積まで再懸濁させ、濾過し、一方、対照を更に濃縮しなかった。勾配方法を使用してカロテノイドを分離した。初期の勾配条件は0.4ミリリットル/分(ml/分)の流量で90％メタノール：５％水：５％メチルtert-ブチルエーテルであった。０分から15分まで、移動相を初期条件から80メタノール：５水：15メチルtert-ブチルエーテルに変え、15分から60分まで20メタノール：５水：75メチルtert-ブチルエーテルに変えた。その後の10分間にわたって、移動相を初期条件に戻し、カラムを更に10分間にわたって平衡にした。カラム温度を27℃に維持し、流量は0.4ml/分であった。注入は10μlであった。ピーク応答の大半を450nmで測定し、追加の面積を286、348、400及び472nmの抽出チャンネルから加えた。
全面積の％としてのピーク面積を使用して、選ばれた突然変異体のカロテノイドプロフィールに関する値を下記の表6a、6b及び6cに示す。示された化合物同定は抽出されたスペクトル及び夫々のクロマトグラム中の主要ピークについて得られたエタノール中の最大吸光度（ラムダ最高；ETOH）に基づき、これらの幾つかを既知の標準物質の保持時間により確かめた。値は同じ化合物の推測異性体を合わせる。幾つかの化合物はわずかな不純物を含み得る。Quackenbushら, J. Assoc. Off. Anal. Chem., 55(3):617-621 (1972)に記された黄色のアメリカンマリーゴールド（黄色マリーゴールド）に関する値が表に含まれる。単一エントリーをここで使用された操作により分離し得なかったネオキサンチン／ビオラキサンチン化合物対及びクリサンテマキサンチン／フラボキサンチン化合物対について表6a-6c中に使用する。
【００４５】
【表６】
2005511003.tif 000009
【表７】
2005511003.tif 000010
【００４６】
【表８】
2005511003.tif 000011
【００４７】
【表９】
2005511003.tif 000012
【表１０】
2005511003.tif 000013
【００４８】
実施例６：選択マリーゴールドの葉中のカロテノイド組成
幾つかのマリーゴールド植物の葉を存在する着色カロテノイドの相対濃度についてアッセイした。“スカーレットエード”及び13819からの葉を突然変異体植物からの葉との比較のための対照として使用した。アッセイを実施例５のように行ない、下記の表7a及び7bに示し、そこでは単一エントリーを分離し得なかったネオキサンチン／ビオラキサンチン化合物対及びクリサンテマキサンチン／フラボキサンチン化合物対について使用する。表7a及び7b中のデータを異なる条件下で生育された植物の異なるグループから集めた。
【００４９】
【表１１】
2005511003.tif 000014
【００５０】
【表１２】
2005511003.tif 000015
【００５１】
本明細書に引用された特許及び文献の夫々は参考として含まれる。冠詞“a”又は“an”の使用は一種以上を含むことが意図されている。
以上の記載及び実施例は例示として意図され、限定と解されるべきではない。本発明の精神及び範囲内の更なるその他の変化が可能であり、当業者に容易にわかるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】植物中のルテイン及びゼアキサンチンの生成のための生物学的合成経路の略図であり、その経路における最初のC40カロテノイドである、フィトエンが数工程（四つの矢印）でリコペン次いでγ-カロテン（これは一つのβ-環を含む）に変換され、その後に、経路が分かれて一つのε-環及び一つのβ-環を含むα-カロテン又は二つのβ-環を含むβ-カロテンを生成し、そして数工程後に、夫々、ルテイン又はゼアキサンチン、並びにエポキシド含有キサントフィル、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン及びネオキサンチンへと続くゼアキサンチン分枝へと至る。
【図１】
2005511003.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月8日(2004.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサントフィルがアルコールとしてアッセイされる非突然変異体マリーゴールド（測定可能な量のゼータ-カロテンを含む花弁又は花弁を有する葉を生じた植物）の花弁、葉又は花弁と葉の両方中に存在するような比と較べて高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含むことを特徴とするマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項２】
ゼアキサンチン比が約2:10より大きい、請求項１記載のマリーゴールド花弁。
【請求項３】
約2:10より大きい比のゼアキサンチン対ゼアキサンチン＋ルテインを含むマリーゴールド花弁であって、前記ゼアキサンチン及びルテインがケン化後にアルコールとしてアッセイされる脂肪酸エステルとして花弁中に存在することを特徴とするマリーゴールド花弁。
【請求項４】
微粉砕形態で存在する、請求項３記載のマリーゴールド花弁。
【請求項５】
ゼアキサンチン比が約3:10より大きい、請求項３記載のマリーゴールド花弁。
【請求項６】
花弁、葉又は花弁と葉の両方が、キサントフィルがアルコールとしてアッセイされる非突然変異体マリーゴールド（測定可能な量のゼータ-カロテンを含む花弁又は花弁を有する葉を生じた植物）の花弁、葉又は花弁と葉の両方中に存在するような比と較べて高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含むことを特徴とするマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項７】
再生可能な部分が胚、分裂組織、花粉、葉、やく、根、根先端、及び花からなる群から選ばれた細胞、又はこれらに由来するプロトプラストもしくはカルスである、請求項６記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項８】
花弁、葉又は花弁と葉の両方が約2:10より大きい比のゼアキサンチン対ゼアキサンチン＋ルテインを含み、前記ゼアキサンチン及びルテインがケン化後にアルコールとしてアッセイされる脂肪酸エステルとして花弁中に存在することを特徴とするマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項９】
花弁、葉又は花弁と葉の両方が非突然変異体マリーゴールド（キサントフィルがアルコールとしてアッセイされる）の花弁、葉又は花弁と葉の両方中に存在するような比と較べて高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の少なくとも一つを更に示す、請求項８記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項１０】
花弁、葉又は花弁と葉の両方が、約0.2〜約１のネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、約0.05〜約0.9の花弁におけるβ-カロテン比、約１の葉におけるβ-カロテン比、約0.25〜約0.9であるα-クリプトキサンチン対α-クリプトキサンチン＋ルテインの花弁における比（ケン化後にアルコールとしてアッセイされる場合）、約0.3〜約１の花弁におけるフィトエン比、及び約0.2〜約１の花弁におけるフィトフルエン比の少なくとも1つを示す、請求項９記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項１１】
請求項６記載のマリーゴールド植物の花粉。
【請求項１２】
請求項６記載のマリーゴールド植物の胚珠。
【請求項１３】
好適な環境に植え付け、成熟まで成長させて、請求項６記載のキサントフィルマリーゴールド植物を生じる種子。
【請求項１４】
食用媒体中に溶解又は分散されたゼアキサンチン及びルテインの混合物を含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物であって、ゼアキサンチン比が約1:10より大きいことを特徴とする組成物。
【請求項１５】
食用媒体中に溶解又は分散されたゼアキサンチン及びルテインの脂肪酸エステルの混合物を含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物であって、ゼアキサンチン比が約1:10より大きいことを特徴とする組成物。
【請求項１６】
前記食用媒体が食用油又は医薬上許される結合剤である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
突然変異体マリーゴールドのオレオレジンであって、前記オレオレジンが非突然変異体マリーゴールドからのオレオレジンに対し高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を有することを特徴とするオレオレジン。
【請求項１８】
α-クリプトキサンチンを含む着色カロテノイドを含むことを特徴とするマリーゴールド花弁。
【国際調査報告】
2005511003.tif 000017
2005511003.tif 000018