(57)【要約】１以上のアミノ酸の変異および／または結合部分の含有により改変された、アデノウイルスｐIXタンパク質が記載されている。好ましくは、上記の改変は、ｐIXタンパク質のＮ末端部分またはＣ末端ロイシンリピートにおいて行われる。このような改変ｐIXタンパク質を含んだウイルスまたはウイルス様粒子は、改善された遺伝子送達効力を示すことが記載されている。更に、対応するアデノウイルスベクター、ウイルスまたはウイルス様粒子、宿主細胞、相補細胞系、およびこのようなウイルスまたはウイルス様粒子を製造する方法が記載されている。加えて、上記のようなアデノウイルスベクター、ウイルスもしくはウイルス様粒子、宿主細胞、または相補細胞系を含んでなる医薬組成物、およびその治療用途が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する野生型ｐIXタンパク質との比較における１以上のアミノ酸の変異により改変され、および／または結合部分を含むように改変された、アデノウイルスｐIXタンパク質であって、
ウイルスまたはウイルス様粒子中における前記改変ｐIXタンパク質の存在により、対応する前記野生型ｐIXタンパク質を含んでなる対応するウイルスまたはウイルス様粒子の遺伝子送達効力と比較して、標的細胞における前記ウイルスまたはウイルス様粒子の改善された遺伝子送達効力がもたらされる、アデノウイルスｐIXタンパク質。
【請求項２】
前記変異が、ｐIXタンパク質中における結合部分の存在をもたらすものである、請求項１に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質。
【請求項３】
前記結合部分が、標的細胞に結合しうるものである、請求項１または２に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質。
【請求項４】
前記変異にかかるアミノ酸が、前記タンパク質のＮ末端部分において選択されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質。
【請求項５】
前記変異にかかるアミノ酸が、前記タンパク質のＣ末端部分において選択されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質。
【請求項６】
前記変異にかかるアミノ酸が、前記タンパク質のＣ末端ロイシンリピートにおいて選択されるものである、請求項５に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質。
【請求項７】
（ａ）配列番号１の１１４位に相当する位置におけるロイシン残基のプロリン残基への置換、
（ｂ）１１７位に相当する位置におけるバリン残基の置換、および
（ｃ）配列番号１の１１４位および１１７位にそれぞれ相当する位置におけるロイシン残基およびバリン残基の、それぞれプロリン残基およびアスパラギン酸残基への置換
からなる群より選択される変異を有する、請求項６に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質。
【請求項８】
ポリリジンである結合部分を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質。
【請求項９】
配列番号３２または３３のアミノ酸配列を含んでなる、請求項８に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含んでなる、アデノウイルスベクター。
【請求項１２】
ウイルスまたはウイルス様粒子を製造する方法であって、
ａ．請求項１１に記載のアデノウイルスベクターで適切な宿主細胞を形質転換する工程、
ｂ．前記アデノウイルスベクターからのウイルスまたはウイルス様粒子の形成に適した条件下で前記形質転換細胞系を培養する工程、および
ｃ．工程（ｂ）で形成されたウイルスまたはウイルス様粒子を培養物から回収する工程を含んでなる、方法。
【請求項１３】
ウイルスまたはウイルス様粒子を製造する方法であって、
ａ．野生型ｐIXタンパク質をコードするアデノウイルスベクターで適切な宿主細胞を形質転換する工程、
ｂ．コードされるｐIXタンパク質が請求項１〜９のいずれか一項に記載のｐIXタンパク質となるように、前記アデノウイルスベクター中のｐIXタンパク質のコード配列を改変する工程、
ｃ． 工程（ｂ）のアデノウイルスベクターからのウイルスまたはウイルス様粒子の形成に適した条件下で前記宿主細胞を培養する工程、および
ｄ．工程（ｃ）で形成されたウイルスまたはウイルス様粒子を培養物から回収する工程を含んでなる、方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質、請求項１０に記載の核酸分子、もしくは請求項１１に記載のアデノウイルスベクターを含んでなるか、または請求項１２もしくは１３に記載の方法により得られる、ウイルスまたはウイルス様粒子。
【請求項１５】
宿主細胞と実質的に結合することができないものである、請求項１４に記載のウイルスまたはウイルス様粒子。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルスｐIXタンパク質、請求項１０に記載の核酸分子、もしくは請求項１１に記載のアデノウイルスベクターを含んでなるか、または請求項１４もしくは１５に記載のウイルスもしくはウイルス様粒子を感染させたかもしくはこれを含んでなる、真核宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４もしくは１５に記載のウイルスもしくはウイルス様粒子の製造、または請求項１２もしくは１３に記載の方法の適用に適した、相補細胞系。
【請求項１８】
請求項１１に記載のアデノウイルスベクター、請求項１４もしくは１５に記載のウイルスもしくはウイルス様粒子、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７に記載の相補細胞系、および所望により薬学上許容される担体を含んでなり、前記のアデノウイルスベクター、ウイルスもしくはウイルス様粒子、宿主細胞、または相補細胞系が、治療上有用な遺伝子を発現しうるものである、医薬組成物。
【請求項１９】
治療を必要とする患者における遺伝子療法を目的とする医薬組成物の製造のための、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター、請求項１４もしくは１５に記載のウイルスもしくはウイルス様粒子、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７に記載の相補細胞系の使用であって、前記のアデノウイルスベクター、ウイルスもしくはウイルス様粒子、宿主細胞、または相補細胞系が、治療上有用な遺伝子を発現しうるものである、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、新規の組換えおよび変異アデノウイルスｐIXポリペプチドおよびそれらをコードする核酸配列、その核酸配列を含んでなる新規のベクター、ならびにウイルスまたはウイルス様粒子、特に上記のｐIXポリペプチドまたは上記の核酸配列を含んでなるアデノウイルス粒子または偽アデノウイルス粒子に関する。更に、本発明は、アデノウイルス粒子または偽アデノウイルス粒子を製造するための方法；上記のポリペプチド、核酸配列、ウイルス、粒子または偽粒子を含んでなる細胞および組成物；その細胞を含んでなる組成物および治療用途または予防用途に関する。本発明は、特にヒトにおいて、遺伝子導入を用いる遺伝子療法または予防接種の展望に特に関連するものである。
【０００２】
遺伝子療法、更に広義には遺伝子予防接種とは、遺伝病または後天性疾患を治療または予防するための、または分子障害、細胞障害もしくは臓器障害を防ぐための、細胞または生体中への遺伝物質の導入と定義付けられる。遺伝子療法によりヒト疾患または障害を治療しうる可能性は、数年間で理論的考察の段階から臨床適用の段階へと移行してきた。ヒトに適用された最初のプロトコールは、１９９０年９月に米国で開始された。それは、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードする遺伝子に影響をおよぼす変異の結果として、遺伝的に免疫不全となった患者に関するものであった。この最初の成功例に次いで、現在進行中の遺伝子療法をベースにした多くの新たな適用および有望な臨床試験が続けられてきた（例えば、http://cnetdb.nci.nih.gov/trialsrch.shtmlまたはhttp://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/に掲載された臨床試験参照）。
【０００３】
遺伝子療法の成功は、生物の細胞で発現させる上で、対象の治療用遺伝子の効率的な送達に主に依存している。治療用遺伝子は様々なベクターを用いて細胞中へ導入でき、こうして宿主ゲノムの一過的発現または永久的な形質転換をもたらす。過去十年間で、多数のウイルスおよび非ウイルスベクターが遺伝子導入向けに開発されてきた（例えば、総説としてRobbins et al.,1998,Tibtech.,16,35-40およびRolland,1998,Therapeutic Drug Carrier Systems,15,143-198参照）。
【０００４】
今まで用いられてきた細胞内遺伝子送達メカニズムのほとんどは、第一のカテゴリー、即ちウイルスベクター、特にアデノ‐およびレトロウイルスベクターに関するものである。ウイルスは、細胞膜を通過し、リソソーム分解から逃れて、自身のゲノムを核へ運べる、多様で高度に機能化されたメカニズムを獲得しており、そのため多くの遺伝子送達用途に用いられてきた。それらの構造、組織および生態は、当業者に入手可能な文献に記載されている。
【０００５】
インビボ遺伝子導入で最も広く用いられているベクターの一つは、複製欠陥アデノウイルスベクターである。本来、アデノウイルスは多くの動物種で検出されている。それらは非組込み性で、さほど病原性がない。それらは様々な細胞型、即ち分裂細胞および静止細胞に感染しうる。それらは気道上皮への親和性を本来有している。加えて、それらは安全性に優れた生腸管系ワクチンとして長年にわたり用いられてきた。最後に、それらは容易に増殖させることができ、多量に精製することができる。これらの特徴により、治療目的およびワクチン用途の遺伝子療法ベクターとして使用する上で、アデノウイルスは特に適したものとされている。現在、いくつかのアデノウイルスが、遺伝子的および生化学的によく特徴付けられている。これは、例えば、ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）の場合であり、その配列はGenbankデータバンクで参照番号Ｍ７３２６０として開示されている（図６参照）。
【０００６】
アデノウイルスゲノムは、ウイルスサイクルを完結するために必要な約３０以上の遺伝子を有する、約３６ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡ分子からなる。初期遺伝子はアデノウイルスゲノムに分散した４領域（Ｅ１〜Ｅ４）に分割され、それら自身のプロモーターにより導かれる６つの転写単位を一緒に含んでいる。Ｅ１、Ｅ２およびＥ４領域はウイルス複製に必須であり、一方で、Ｅ３領域は抗ウイルス宿主免疫応答を調節するものと考えられており、インビトロではウイルス増殖にとり不要である。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）は、それらの大部分において、ウイルスキャプシドを構成する構造タンパク質をコードしている。それらは初期転写単位と少くとも一部重複しており、唯一のプロモーター（ＭＬＰ：Major Late Promotorの略）から転写される。加えて、アデノウイルスゲノムはＤＮＡ複製に必須のシス作用領域を両端に有している。これらは、５′および３′ＩＴＲ（Inverted Terminal Repeat）と、５′ＩＴＲ後のパッケージング配列である。
【０００７】
Ｅ１初期領域はアデノウイルスゲノムの５′末端に位置し、２つのウイルス転写単位Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂのそれぞれを含んでいる。この領域はウイルスサイクルのかなり初期に関与するタンパク質についてコードしており、アデノウイルスのほぼすべての他の遺伝子の発現にとって必須である。特に、Ｅ１Ａ転写単位は、特にＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２ＢおよびＥ４領域のプロモーターから転写を誘導することにより、他のウイルス遺伝子の転写をトランス活性化するタンパク質についてコードしている。
【０００８】
Ｅ２領域の産物は、これも２つの転写単位Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂを含んでおり、ウイルスＤＮＡの複製に直接関与する。この領域は、一本鎖ＤＮＡに強い親和性を示す７２ｋＤａタンパク質およびＤＮＡポリメラーゼの合成を特に支配している。
【０００９】
Ｅ３領域はウイルスの複製に必須ではない。それは、アデノウイルス感染への宿主免疫応答の抑制に関与すると考えられる、少くとも６つのタンパク質をコードしている。特に、ｇｐ１９ｋＤａ糖タンパク質は、宿主細胞障害性Ｔ細胞による感染細胞の溶解に関与するＣＴＬ応答を妨げると考えられている。
【００１０】
Ｅ４領域は、ウイルスＤＮＡ複製、後期ｍＲＮＡ合成、ウイルスアセンブリーおよび宿主タンパク質合成の停止に関与すると考えられている。それは、様々なポリペプチドをコードする複合転写単位である。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６および７によりコードされるものは、Ｅ２Ｆ転写因子との結合に際して細胞ＲＢタンパク質と競合し、これによりトランス活性化機能を付与するようである。ＯＲＦ４の発現産物は、細胞ホスファターゼ２Ａを結合および調節して、ウイルス（Ｅ１Ａ）および細胞転写因子の活性を制御しうる。ＯＲＦ３および６でコードされるポリペプチドは、アデノウイルスゲノム由来の一次２８ｋｂ転写物を成熟させて、細胞質中へのその運び込みを促進する能力を有するため、ウイルス増殖にとって必須である。これらが存在しない場合には、ウイルス増殖を行う上で、トランスで補われることがある。加えて、ＯＲＦ６ポリペプチドは、Ｅ１Ｂコード５５Ｋポリペプチドと相互作用して、細胞ｍＲＮＡの犠牲で後期メッセンジャーの細胞質蓄積を促す複合体を形成する。
【００１１】
遺伝子療法プロトコールで現在用いられているアデノウイルスベクターは、環境および宿主体内へのそれらの伝播を避けるために、Ｅ１領域のほとんどを欠いている。さらに、Ｅ３領域が失われると、クローニング能力が増加する。対象の遺伝子は、欠失領域の代わりに、ウイルスＤＮＡ中へ導入される。“第一世代”と称される、これらのベクターを用いた遺伝子導入の実現可能性は、いくつかのケースで証明されている。
【００１２】
ウイルス複製に必要なシス領域（ＩＴＲおよびパッケージング配列）を保有し、かつウイルス抗原の残留合成を止めるための実質的な遺伝子修飾を含んだ、別の構築物（“第二世代ベクター”）が作製された。その抗原は炎症応答の刺激に関与すると思われていた（例えば、Ｅ４相補を要しないＯＲＦ３またはＯＲＦ６／７を除いて、Ｅ４配列を一部欠失させた、アデノウイルスベクターについて開示している、国際出願ＷＯ９４／２８１５２またはＵＳ５，６７０，４８８参照）。すべてのアデノウイルス機能を欠いた最小ベクターも考えられる。総説については、Lusky et al.,J.Virol.,72(1998)2022-2032を参照されたい。
【００１３】
最後に、アデノウイルスの感染サイクルは２段階で行われる：
‐アデノウイルスゲノムの複製の開始に先立ち、ウイルスＤＮＡの複製および転写に関与する調節タンパク質の産生を行う初期段階、および
‐ウイルスＤＮＡの複製が開始された後に開始される後期遺伝子の転写。
【００１４】
後期遺伝子はアデノウイルスゲノムの大部分を占め、初期遺伝子の転写単位と一部重複している。しかしながら、それらは異なるプロモーターから異なるスプライシング様式で転写され、こうして同じ配列が異なる目的のために用いられている。後期遺伝子のほとんどは主要後期プロモーター（major late promoter：ＭＬＰ）から転写される。このプロモーターは長い一次転写物の合成を行うことができ、次いでこれは約２０のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に成熟して、そこからビリオンのキャプシドタンパク質が産生される。キャプシドを構成する構造タンパク質IX（ｐIX）をコードする遺伝子は、アデノウイルスゲノムの５′末端に位置し、その３′末端においてＥ１Ｂ領域と重複している。タンパク質IX転写単位は、Ｅ１Ｂ転写単位と同じ転写終結シグナルを利用している。
【００１５】
ｐIXは、ウイルス粒子または偽粒子、またはキャプシド中へ取り込まれる、１４０アミノ酸残基（１４．３ｋＤａ）の小さなポリペプチドである。更に詳しくは、上記のｐIXポリペプチドは、ヘキソンタンパク質と会合して、正二十面体の各面の中央部分を構成するグループ・オブ・ナイン(group-of-nine)ヘキソン（ＧＯＮ）を形成する（Boulanger et al.,1979,J.General Virology,44,783-800；Burnett,1985,J.Molecular Biology,185,125-143；Burnett et al.,1985,J.Molecular Biology,185,105-123）。このアセンブリーの化学量論量の正確な測定により、ＧＯＮ当たり４つのトリマーとして組織された１２分子のｐIXがあり、したがってキャプシド当たり２４０分子が存在することが明らかにされている（Steward et al.,1991,Cell,67,145-154）。ｐIXポリペプチドはキャプシドセメントとして働くため、ウイルス粒子の熱安定性を高める（Colby et al.,1981,J.Virol.,39,977-980；Furcinitti et al.,1989,EMBO J.,8,3563-3570）。しかしながら、ｐIXがアデノウイルスキャプシドを構築する上で必須であることは確立されたが、アデノウイルスゲノムの正しい包膜化または少くとも（アデノウイルスゲノムを含むか否かにかかわらず）粒子の形成を得る上で実際に必要な“最小”ｐIX配列を正確に描写しうるような結果は、まだ得られていない。
【００１６】
さらに、ｐIXが更に感染サイクルにも関与していることを強く示唆する観察結果も報告されている（Lutz et al., 1997, J.of Virology, 71, 5102-5109）：(ｉ)ｐIXをコードする遺伝子は、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下で発現されない構造タンパク質をコードする、唯一の遺伝子である；(ii)その発現パターンは他の構造タンパク質のものとは異なる時間経過をたどり、感染後（ｐ．ｉ．）中間期に始まり、他のすべての構造タンパク質のものよりも現実にはかなり早い；(iii)最後に、ｐIXは感染細胞の核に蓄積して点在分布する。この核局在化と一致するように、Lutzら（1997,Journal of Virology, 71, 5102-9）は、ｐIXがいくつかのウイルスおよび細胞ＴＡＴＡ含有プロモーターの転写アクチベーターであり、特にその遺伝子はＥ１ａ、Ｅ４およびＭＬＰプロモーターにより制御されていることを既に報告している。
【００１７】
治療用遺伝子を特定の細胞へ送達しうるウイルス性の遺伝子療法用ベクターのデザインは、今日の遺伝子療法研究において、主要な関心事および課題の一つである。ターゲティングベクターの使用は、ベクターの拡散を抑制することから、望ましい標的細胞に対する治療効力を高め、生じうる副作用を最小限に抑える。
【００１８】
アデノウイルスの広い組織親和性は、潜在的に有害なタンパク質（例えば、サイトカイン、細胞傷害性タンパク質、自殺遺伝子産物）をコードする遺伝子が、周辺の正常組織で発現されるときには、不利に働くことがある。更に、遺伝子送達の全体的インビボ効力も、非標的細胞の形質導入のために、生体におけるウイルスの相当な希釈によって低下することがある。したがって、感染力を標的に向けたアデノウイルスベクターの開発は、現在の遺伝子療法戦略の安全性および効力を著しく改善することになるであろう。そのため、ターゲティングアデノウイルスベクターは、不完全形質導入細胞（例えば、腫瘍細胞）への感染力増大および正常組織に対する毒性低下をもたらすことにより、遺伝子療法操作を改善しうるのである。
【００１９】
アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面に存在する細胞レセプターへのビリオンの付着性により決定される。この点に関して、ウイルスキャプシドの表面に存在するファイバーは細胞付着において重要な役割を果たし（Defer et al.,J.Virol.,64(1990)3661-3673）、ペントン基部は細胞インテグリンとの結合を介してインターナリゼーションを促進する（Mathias et al.,J.Virol.,68(1994)6811-6814）。最近の研究では、２型および５型アデノウイルスによるコクサッキーウイルスレセプター（ＣＡＲ）の使用が考えられている（Bergelson et al.,Science,275(1997)1320-1323）。特に、細胞表面へのアデノウイルス粒子の初期付着は、偏在ＣＡＲへのウイルスファイバータンパク質のノブ(knob)領域の結合により媒介される（Bergelson et al.,1997,Science,275,1320-1323；Tomko et al.,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,3352-3356）。ＣＡＲは、アデノウイルス血清型Ｃファイバー（例えばＡｄ５）と、Ａｄ５ファイバーと相互作用して細胞へのウイルス結合を促すことが最近示された細胞表面ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＨＳＧ）とに対する、一次レセプターとして特定されたものである（Dechecchi et al.,2000,Virology,268,382-390；Dechecchi et al.,2001,J.Virol.,75,8772-8780）。しかしながら、他の表面タンパク質、例えばHongら（EMBO J.,16(1997)2294-2306）により記載されたようなクラスＩ組織適合性抗原のα２ドメインも、ファイバー付着に関与することがある。そのファイバーは３領域から構成されている（Chroboczek et al.,Current Top.Microbiol.Immunol.,199(1995)165-200）：ペントン基部と相互作用して、キャプシドで足場を築く、タンパク質のＮ末端におけるテール、いくつかのβシートリピートとトリマー化シグナルを含むノブとから構成されるシャフト（Hong et al.,J.Virol.,70(1996)7071-7078）、およびレセプター結合部分（Henri et al.,J.Virol.,68(1994)5239-5246；Louis et al.,J.Virol.,68(1994)4104-4106）。
【００２０】
ＣＡＲ細胞レセプターのほぼ偏在した分布は、ヒト血清型Ｃアデノウイルスの広い細胞親和性に主に関与していると考えられている。この見解と一致するように、このレセプターの不在または発現低下は、アデノウイルス形質導入に対するある細胞型（例えば、リンパ球、平滑筋細胞）の感受性欠乏と相関していることが示されている（Leon et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,13159-13164；March et al.,1995,Hum.Gene Ther.,6,41-63）。更に、多くの研究では、一次腫瘍細胞が低レベルでＣＡＲを発現するにすぎないことが報告されている（Li et al.,1999,Cancer Res.,59,325-330；Miller et al.,1998,Cancer Res.,58,5738-5748）。
【００２１】
こうして、アデノウイルスが特定の細胞群へ効率的に形質導入する能力を欠いていることは、厳密な組織特異性を欠いていることと一緒になって、アデノウイルス親和性をその天然レセプターから特定の細胞表面分子へと変えようとする努力を一層促した。
【００２２】
最近、ＣＡＲとの相互作用を消失させる特異的ファイバー変異が特定され、精製組換えタンパク質の四次構造および全体的コンホメーションに悪影響を与えることなく、ファイバーノブドメインのＣＡＲ結合部位を変異させうることが証明されている（ＷＯ９８／４４１２１、ＷＯ０１／１６３４４およびＷＯ０１／３８３６１）。例えば、ＡＢループ（例えば、Ｓｅｒ４０８およびＰｒｏ４０９を含む）、ＤＧループ（例えば、Ｔｙｒ４７７を含む）およびβ鎖Ｆ（例えば、Ｌｅｕ４８５を含む）においてアミノ酸置換を有するか、またはＤＧループにおいて２つの連続アミノ酸を欠いたファイバータンパク質は、ＣＡＲ結合性を変えることが示されている（Bewley et al.,1999,Science,286,1579-1583；Kirby et al.,1999,J.Virol.,73,9508-9514；Kirby et al.,2000,J.Virol.,74,2804-2813）。これらのウイルスは天然ウイルスと構造的に同一であり、そのため、変異ファイバーにおけるターゲティングリガンド（結合部分）の挿入に適した基質となる。この点に関し、いくつかのグループは、ノブのＣ末端におけるリジン残基のストレッチの挿入により、マクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞またはＴリンパ球のようなＣＡＲ欠損細胞の感染効力として１０〜３００倍の増加により特徴付けられる、高力価ウイルスの作製に至ったことを報告している（Wickham et al.,1997,J.Virol.,71,8221-8229；Yoshida et al.,1998,Hum.Gene Ther.,9,2503-2515；Wickham et al.,1996,Nature Biotechnology,14,1570-1573；Bouri et al.,1999,Hum.Gene Ther.,10,1633-1640）。更に、ファイバーＨＩループにおいてトランスフェリンレセプターと結合するペプチドリガンドの導入により、このレセプターを過剰発現する細胞への遺伝子導入が促進されることが示されている（Xia et al.,2000,J.Virol.,74,11359-11366）。同様に、ＨＵＶＥＣ細胞結合ペプチドにより、形質導入に通常抵抗するこれらの細胞に対するリターゲティングベクターの形質導入効力が著しく増加した（Nicklin et al.,2000,Circulation,102,231-237）。
【００２３】
他の研究チームは、アデノウイルスファイバータンパク質を改変することにより、アデノウイルスターゲティングの問題に取り組んでいる。例えば、米国特許第５，８８５，８０８号明細書には、アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を該ウイルスの天然宿主細胞ではない標的細胞と結合させうるファイバータンパク質との融合タンパク質として組み込まれるペントンファイバーであって、アデノウイルスに対して異種の結合部分により付与された改変結合特異性を有するペントンファイバーを有するアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子について記載されており、上記のペントンファイバーは宿主細胞結合機能を壊すアミノ酸残基の挿入、欠失または置換により改変されているため、そのアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子は天然宿主細胞と実質的に結合しえないことにより特徴付けられる。
【００２４】
同様に、米国特許第６，０５７，１５５号明細書には、コンホメーション制約下での非天然アミノ酸配列の導入により野生型コートタンパク質とは異なるキメラアデノウイルスファイバータンパク質が記載されている。このようなキメラファイバータンパク質を含むベクターは、野生型アデノウイルスファイバータンパク質を含むこと以外は同一である対応のベクターよりも、効率的に細胞中へ直接入り込むことができる。その非天然アミノ酸配列は、細胞ターゲティングに用いうる、抗体用のエピトープまたは細胞表面レセプター用のリガンドを含んでなる、ペプチドモチーフでもよい。
【００２５】
米国特許第５，７５６，０８６号明細書には、望ましい細胞型の表面上に位置するレセプターに特異的なリガンドがアデノウイルスファイバータンパク質に含まれる、アデノウイルスについて開示されている。このアデノウイルスは、アデノウイルスファイバータンパク質の少くとも一部が除去され、望ましい細胞型のレセプターに特異的なリガンドで置き換えられていてもよく、あるいは、該アデノウイルスはアデノウイルスファイバータンパク質とリガンドとの融合タンパク質を含んでいてもよい。このようなアデノウイルスは治療剤をコードする遺伝子を含んでいてもよく、このような遺伝子を望ましい細胞型へ送達するように“ターゲティング”されていてもよい。
【００２６】
しかしながら、ｐIXタンパク質にターゲティングリガンドを含んでなるターゲティングアデノウイルスベクターを構築することは、先行技術として開示されていない。
【００２７】
それにもかかわらず、遺伝子療法の実用性を改善する上で、アデノウイルスに基づく更に最適化されたベクターの必要性がなお続いている。
【発明の概要】
【００２８】
そのため、本発明が解決しようとする技術的課題は、効率的な遺伝子送達に好適な、アデノウイルスに基づくウイルスおよびウイルス様粒子を製造するための代替手段および方法の提供である。好ましくは、ウイルスまたはウイルス様粒子は、特にターゲティング能力および／または望ましくない副作用の減少の面で、従来のウイルスまたはウイルス様粒子と比較して改善された遺伝子送達効力を示す。
【００２９】
この技術的課題は、特許請求の範囲で特徴付けられた態様を提供することによって解決される。
【００３０】
したがって、本発明は、対応する野生型ｐIXタンパク質との比較における１以上のアミノ酸の変異により改変され、および／または結合部分を含むように改変された、アデノウイルスｐIXタンパク質に関し、ウイルスまたはウイルス様粒子中における前記改変ｐIXタンパク質の存在により、対応する前記野生型ｐIXタンパク質を含んでなる対応するウイルスまたはウイルス様粒子の遺伝子送達効力と比較して、標的細胞における前記ウイルスまたはウイルス様粒子の改善された遺伝子送達効力がもたらされる。
【発明の具体的説明】
【００３１】
本発明は、添付した実施例で示された実験データに基づいている。特に、ｐIXコード配列の詳しい変異分析を行うことによってタンパク質の構造および転写特性に関与するｐIXの機能性ドメインを正確に把握することを目的として、この実験が行われた。更に詳しくは、タンパク質の高度に保存されたＮ末端部分はキャプシド構造性にとって必須であり、一方で、Ｃ末端ロイシンリピート（推定超らせんドメイン）はトランス活性化機能上重要であり、かつｐIXの構造的機能を変えることなく改変しうることが示されている。
【００３２】
アデノウイルス遺伝子療法ベクターのデザインに関する目的の一つは、ウイルスゲノムの不要部分を欠失させることである。本発明の基礎となる実験では、ｐIXタンパク質の一部を、最終産物、例えばアデノウイルス粒子の生存力または安定性などを損なうことなく、欠失または改変させうることが示された。したがって、本発明によれば、アデノウイルス特異性（例えば、感染しにくい細胞への形質導入強化または特定の細胞または細胞カテゴリーへの感染抑制）を改変するためのリガンド部分の挿入によるアデノウイルスｐIXタンパク質の改変が提供される。アデノウイルスライフサイクルにおいてｐIXタンパク質の機能を保存するために、ｐIXタンパク質中における特定の位置が、特にｐIXタンパク質のＣ末端部分内においてまたはＣ末端部分において、ターゲティング結合部分の組込み用として特定された。更に、本発明は、特にＣ末端ロイシンリピートドメインにおける、ｐIXタンパク質の特定の変異を提供するが、これはウイルスまたはウイルス様粒子の表面でこのような結合部分の呈示を高めることがある。
【００３３】
本発明において、「アデノウイルスｐIXタンパク質」という用語は、ウイルスまたはウイルス様粒子のキャプシド中へ組み込まれることが知られた、アデノウイルスゲノムによりコードされるｐIXタンパク質をいう。本発明は、完全コード配列（例えば、イニシエーターＡＴＧコドンから停止コドンまで）によりコードされる完全長アデノウイルスｐIXを包含する。しかしながら、ここで記載されているような性質を有する、内部切除または端部切除により作製されたその断片を用いることも可能である。例示すると、そのｐIXコード配列は慣用的組換え技術によりアデノウイルスゲノムから単離することができる。ｐIX遺伝子は、Ｅ１ＢとＥ２領域との間、例えばＡｄ５ゲノムのヌクレオチド（ｎｔ）３６０９‐４０３１に位置するアデノウイルスゲノムの左端に存在している（図６参照）。
【００３４】
本発明による改変アデノウイルスｐIXタンパク質の起源（即ち、本発明によるｐIXタンパク質を構築するための原配列）は、ヒトまたは動物（例えば、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、サルなど）のアデノウイルスでも、または多様な起源の断片を含んだハイブリッドでもよい。例えば、アデノウイルスには、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８、３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５、６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、４２〜４７）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４０、４１）またはいずれか他のアデノウイルス血清型がある。しかしながら、好ましくは、本発明による改変ｐIXはサブグループＣのアデノウイルスに由来するものであり、Ａｄ２またはＡｄ５血清型が特に好ましい。
【００３５】
ｐIXタンパク質は異なるヒトおよび動物アデノウイルス株間で異なることがあるが、それは異なる情報源（例えば、GenBankおよび公開文献のようなデータベース）から入手しうるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に基づいて、または（Genbankの受理番号Ｍ７３２６０またはChroboczek et al.,1992,Virology,186,280-285で開示されている）詳細に特徴づけられたＡｄ５配列との相同性から特定しうる。例示すると、Ａｄ５のｐIXタンパク質は、（配列番号１で示されているように）イニシエーターＭｅｔ残基を含む１４０のアミノ酸残基を含んでいる。更に、図１はいくつかのヒトおよび動物アデノウイルス株のｐIXタンパク質のアミノ酸配列を示している。
【００３６】
「１以上のアミノ酸の変異により改変された」という用語は、野生型ｐIXタンパク質との比較における１以上の残基の１以上の欠失、置換もしくは挿入、またはこれら可能性のあらゆる組合せに関する。いくつかの変異が考えられるとき、それらはｐIX配列のいずれかの位置における連続残基および／または非連続残基に関する。変異は、当業者に知られたいくつかの手法、例えば、ｐIXコードヌクレオチド配列の酵素開裂で得られた断片の改変および連結、部位特異的変異（例えば、Stratageneの“Quick Change部位特異的変異”システム）またはＰＣＲ技術を含めた、組換え技術を用いて導入することができる。欠失変異は、約１〜３０アミノ酸の、好ましくは１５アミノ酸を超えない残基を含んでなる。
【００３７】
一つの実施態様によれば、改変により、（後述するように）ｐIXタンパク質のＮ末端部分内においてもしくはＮ末端部分へ、またはＣ末端部分内においてもしくはＣ末端部分へ、特に好ましくは後者で、ｐIX配列中に結合部分の挿入がもたらされる。この点において、結合部分は、Ｃ末端において、またはＣ末端に先行する約３０以内、更に好ましくは約２０以内の残基において挿入しうる。結合部分の挿入は、２つのｐIX残基間において、または１以上のｐIX残基を置き換えることにより行なうことができる。
【００３８】
他の実施態様によれば、改変により、野生型ｐIXタンパク質と比較して少くとも１つのアミノ酸残基の置換がもたらされる。好ましくは、このような変異はｐIXタンパク質のＣ末端ロイシンリピート内に位置する。
【００３９】
他の具体的な実施態様によれば、改変により、翻訳停止活性を抑制するために、（例えば、アミノ酸コードコドンにおいて停止コドンを変異させることによる）ｐIX配列の停止コドンの変異がもたらされる。この実施態様では、翻訳は天然停止コドンを乗り越えて続けられ、ｐIXコード配列の下流に本来存在するｐｏｌｙＡ配列は、ｐIXタンパク質のＣ末端へ連結された結合部分として用いられるポリリジンのストレッチへと翻訳されることになる。
【００４０】
本発明において、「改善された遺伝子送達効力」という用語は、改変ｐIXタンパク質を有しない対応ウイルス様粒子との比較において、（１）より特異的に（即ち、標的および非標的細胞間における感染および／または遺伝子送達の比率増加を示す）、および／または（２）より効率的に（即ち、感染および／または遺伝子送達が絶対的な意味で高められる）、標的細胞に感染するおよび／または標的細胞へ対象遺伝子を送達する、本発明による改変ｐIXタンパク質を含むウイルスまたはウイルス様粒子の特性をいう。
【００４１】
改善された遺伝子送達効力は、インビトロ（例えば、培養細胞）またはインビボ（例えば、動物モデル）で、同一の実験条件下において、改変ｐIXを有するウイルスまたはウイルス様粒子と非改変（野生型）ｐIXタンパク質を有する関連ウイルスまたはウイルス様粒子とを、所定の対象遺伝子（例えば、リポーター遺伝子）を標的細胞および非標的細胞へ送達する感染特性または傾向について当技術分野の技術を用いて比較することにより、容易に調べることができる。適切な技術としては、適切な細胞系での細胞感染力試験、例えば（例えば、Roelvin et al.,1996,J.Virol.,70,7614-7621で記載されているように３Ｈ‐チミジンで標識された）標識ウイルスを用いた細胞付着性の評価が挙げられる。例えば、ｐIXタンパク質が結合部分を含むように改変されたとき、このようなアッセイには、感染の標準条件下における（例えば、結合部分により認識される抗リガンド分子をその表面に呈示する）標的細胞へのウイルスの露呈が含まれる。結果的に、本発明による改変ｐIXタンパク質を有するウイルスまたはウイルス様粒子は、非改変（野生型）ｐIXタンパク質を有する関連ウイルスまたはウイルス様粒子よりも良い効率で標的細胞へ感染する特性を示し、このことは、改変ｐIXタンパク質を有するウイルスまたはウイルス様粒子が（このような抗リガンド分子を表面に呈示しない）非標的細胞よりも効率的または迅速に上記の標的細胞へ感染し、一方で、野生型ｐIXタンパク質を有するウイルスまたはウイルス様粒子が非標的細胞と比較して低いまたは同等の効力で上記の標的細胞へ感染することを意味している。他方、本発明による改変ｐIXタンパク質によりもたらされる改善された遺伝子送達効力は、（例えば、リポーター遺伝子を用いて）遺伝子導入のレベルを測定することによっても評価することができる。このような測定は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫検出、酵素検出、生物活性などを含めた、当技術分野のいずれかの技術を用いて行うことができる。
【００４２】
有利には、本発明による改変ｐIXタンパク質は、このような改変ｐIXを有するウイルスまたはウイルス様粒子について測定された標的細胞への感染または対象遺伝子の送達が、野生型アデノウイルスｐIXを有するウイルスまたはウイルス様粒子で観察される場合と比較して、実質的に少くとも２倍増加したときに、遺伝子送達効力が改善されたものとされる。それは、対応する野生型ウイルスまたはウイルス様粒子で観察される場合と比較して、好ましくは少くとも約５倍、さらに好ましくは少くとも約１桁程度、さらに好ましくは少くとも約２桁程度増加するものとされる。
【００４３】
ここで用いられている「標的細胞」とは、本発明による改変ｐIXタンパク質を有するウイルスまたはウイルス様粒子の感染が期待される細胞のことである。≪標的細胞≫は単一体でも、または細胞の大集団の一部でもよい。細胞のこのような大集団には、例えば、細胞培養物（混合または純粋）、組織（例えば、上皮または他の組織）、臓器（例えば、心臓、肺臓、肝臓、膀胱、筋肉または他の臓器）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系、胃腸系、泌尿器系、神経系、外皮系または他の器官系）または生物（例えば、哺乳類、特にヒトなど）がある。本発明において、標的細胞は、好ましくは腫瘍細胞である。ｐIXタンパク質が結合部分を含むように改変されているとき、「標的細胞」とは、それらの表面上に、共通の特徴として、上記のｐIXタンパク質に含まれる結合部分により認識される抗リガンド分子を有する、唯一のタイプの細胞または異なるタイプの細胞グループを表わす。
【００４４】
本明細書において用いられる「および／または」という用語は、「および」、「または」および「上記の用語で繋がれた各要素のすべてまたはいずれか他の組合せ」の意味を含んでいる。
【００４５】
本明細書において用いられる「約」または「およそ」という用語は、所定の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、さらに好ましくは５％以内を意味する。
【００４６】
アデノウイルスゲノムのｐIX機能およびその機能のマッピングに関して本明細書に開示された結果から、新規のウイルスおよびウイルス様粒子を製造することが可能となり、その少くとも一部は、高い特異性で標的細胞と結合して、遺伝物質を標的細胞へ送達しうる；ウイルスおよびウイルス様粒子の少くとも一部は、好ましくはウイルスの天然宿主細胞と実質的に結合することなく、標的細胞と結合して、遺伝物質をそこへ送達しうる。
【００４７】
「結合部分」という用語は、標的細胞上の分子と結合しうる、ウイルスまたはウイルス様粒子の表面上に露呈された分子を意味する。「結合部分」は、結合特異性が変化するように改変された、ウイルスまたはウイルス様粒子上の分子であってもよく、または新たな結合特異性をもたらすようにウイルスまたはウイルス様粒子へ付加されてその表面上に露呈している分子であってもよい。
【００４８】
さらに、結合部分は、直接的にまたはスペーサー基を介して間接的に、ウイルスまたはウイルス様粒子と結合または融合されていることが好ましい。
【００４９】
本発明において、「結合部分を含むアデノウイルスｐIXタンパク質」という用語は、本発明による改変ｐIXタンパク質が結合部分に共有結合していることを意味する。好ましくは、結合部分への共有結合は、更に以下で示されているように、ｐIXタンパク質のＮ末端部分またはＣ末端部分、好ましくはＣ末端ロイシンリピート内に位置している。
【００５０】
好ましい実施態様によれば、結合部分は、該タンパク質のアミノ酸配列に融合されており、好ましくはｐIXタンパク質のＮ末端部分内もしくはＣ末端部分内において、またはＮ末端部分もしくはＣ末端部分に融合されており、好ましくはＣ末端ロイシンリピート内でまたはＣ末端ロイシンリピートに融合されている。言い換えると、この好ましい実施態様は、上記のようなｐIXタンパク質の１以上のアミノ酸の変異が、ｐIXタンパク質に結合部分の存在をもたらすことを意味している。
【００５１】
本発明によるｐIXタンパク質に含まれる結合部分は、更に以下で詳細に説明するように、標的細胞と結合しうることが特に好ましい。
【００５２】
オリゴ糖または脂質のような、いかなる細胞結合性のタンパク質、ペプチドまたは炭水化物も、好ましくはウイルスまたはウイルス様粒子を細胞へ向ける上で、結合部分として有用であるが、ポリペプチドが好ましい。例えば、アミノ酸の短い直鎖状ストレッチ、例えばペプチドホルモンを構成するものは、標的細胞と結合しうる構造へ独立して折り畳まれるポリペプチドのドメインの場合のように、有用であることがある。
【００５３】
一つの好ましい実施態様によれば、結合部分は、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、ＳｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ断片）、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）または抗体の最小認識単位とすることができる。標的細胞の結合部位は、標的細胞特異性抗原とすることができる。
【００５４】
結合部分は、モノクローナル抗体とすることができる。これら抗原の多くと結合するモノクローナル抗体は既に公知であるが、いかなる場合にも、モノクローナル抗体技術に関する今日の技術によれば、抗体はほとんどの抗原に対して作製しうる。結合部分は、抗体の一部（例えば、Ｆａｂ断片）であっても、あるいは合成抗体断片（例えば、ＳｃＦｖ）であってもよい。選択された抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば”Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”,H.Zola(CRC Press,1988)および”Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”,J.G.R.Hurrell(CRC Press,1982)に開示されている技術により作製しうる。適切に作製された非ヒト抗体は、公知の手法により、例えばヒト抗体のフレームワーク中へマウス抗体のＣＤＲ領域を挿入することにより、“ヒト化”しうる。抗体の可変重（Ｖ.sub.Ｈ）ドメインおよび可変軽（Ｖ.sub.Ｌ）ドメインが抗原認識に関与しており、これは初期のプロテアーゼ切断実験で最初に認識された事実である。さらなる確認は、げっ歯類抗体の“ヒト化”によりなされた。
【００５５】
抗原特異性は可変ドメインにより付与され、定常ドメインとは関係がなく、このことは、すべてが１以上の可変ドメインを含んだ抗体断片の細菌による発現を伴う実験から知られている。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Better et al.(1988)Science,240,1041）；Ｆｖ分子（Skerra et al.(1988)Science,240,1038）；ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルなオリゴペプチドで連結されたＳｃＦｖ分子（Bird et al.(1988)Science,242,423；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,5879）および単独Ｖドメインを含むｄＡｂ（Ward et al.(1989)Nature,341,544）がある。特異的結合部位を留めた抗体断片の合成に関する技術の総説は、Winter & Milstein(1991)Nature,349,293-299に記載されている。
【００５６】
「ＳｃＦｖ分子」という用語は、ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルなオリゴペプチドで連結された分子を意味する。
【００５７】
抗体全体よりもむしろ抗体断片を用いた方が有利であることもある。補体結合のような抗体全体のエフェクター機能は、このような断片を用いることによって排除してもよい。ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、他のポリペプチドとの融合体として発現させることもできる。
【００５８】
最小認識単位は、Ｆｖ断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１以上の配列から誘導しうる。抗体全体およびＦ（ａｂ′）２断片は「二価」である。「二価」とは、上記の抗体およびＦ（ａｂ′）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。逆に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄＡｂ断片および最小認識単位は一価であり、唯一の抗原結合部位を有している。
【００５９】
他の好ましい実施態様によれば、結合部分は標的細胞に特異的な細胞表面レセプターのリガンドの少くとも一部である。
【００６０】
特定の細胞表面レセプターは、狭いクラスの細胞型またはいくつかの細胞型にまたがる広いグループに存在しうる。本発明は、例えば、呼吸器系（気管、上部気道、下部気道、肺胞）、神経系および感覚器官（例えば、皮膚、耳、鼻、舌、目）、消化器系（例えば、口内上皮、唾液腺、胃、小腸、十二指腸、結腸、胆嚢、膵臓、直腸）、筋肉系（例えば、心筋、骨格筋、平滑筋、結合組織、腱など）、免疫系（例えば、骨髄、幹細胞、脾臓、胸腺、リンパ系など）、循環器系（例えば、筋肉結合組織、動脈、静脈、毛細血管の内皮など）、生殖系（例えば、精巣、前立腺、子宮頚部、卵巣）、泌尿器系（例えば、膀胱、腎臓、尿道）、内分泌または外分泌腺（例えば、乳房、副腎、下垂体）などを含めた器官または系内にある細胞をターゲティングする結合部分の使用をも包含する。
【００６１】
例えば、肝臓細胞を標的とする上で適した結合部分には、ＬＤＬレセプターと結合しうるＡｐｏＢ（アポリポタンパク質）、ＬＰＲレセプターと結合しうるα‐２‐マクログロブリン、アシアロ糖タンパク質レセプターと結合しうるα‐１酸糖タンパク質およびトランスフェリンレセプターと結合しうるトランスフェリンから誘導されるものがあるが、それらに限定されない。活性化された内皮細胞を標的とするための結合部分は、（ＥＬＡＭ‐１と結合しうる）シアリル-Lewis-Ｘ抗原、ＶＬＡ‐４（ＶＣＡＭ‐１レセプターと結合しうる）またはＬＦＡ‐１（ＩＣＡＭ‐１レセプターと結合しうる）から誘導することができる。ＣＤ３４から誘導される結合部分は、ＣＤ３４レセプターとの結合により造血前駆細胞を標的とする上で有用である。ＩＣＡＭ‐１から誘導される結合部分は、ＬＦＡ‐１レセプターとの結合によりリンパ球を標的とすることも考えられる。Ｔ‐ヘルパー細胞のターゲティングには、ＣＤ４レセプターと結合しうるＨＩＶ  ｇｐ‐１２０またはクラスII ＭＨＣ抗原から誘導される結合部分を用いてもよい。ニューロン、グリアまたは内皮細胞のターゲティングは、例えば組織因子レセプター（例えば、ＦＬＴ‐１、ＣＤ３１、ＣＤ３６、Ｃｄ３４、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＩＣＡＭ‐１；McCormick et al.,1998,J.Biol.Chem.,273,26323-26329）、トロンボモジュリンレセプター（Lupus et al.,1998,Suppl.,2 S120）、ＶＥＧＦＲ‐３（Lymboussaki et al.,1998,Am.J.Pathol.,153,395-403）、ＶＣＡＭ‐１（Schwarzacher et al.,1996,Artherosclerosis 122,59-67）または他のレセプターのための結合部分を使用することにより行なうことができる。血餅のターゲティングは、フィブリノーゲンまたはａIIｂｂ３ペプチドを介して行なうことができる。最後に、炎症組織は、セレクチン、ＶＣＡＭ‐１、ＩＣＡＭ‐１などを介して標的とすることができる。
【００６２】
さらに、適切な結合部分としては、インテグリンにより認識されるポリリジン、ポリアルギニンなどのような、アミノ酸の直鎖状ストレッチも挙げられる。また、結合部分は、常用タグペプチド（例えば、市販抗血清により認識されることが知られている短アミノ酸配列）、例えば、Shistosoma manosi由来のグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシンβガラクトシダーゼ、E.coli由来のマルトース結合タンパク質（ＭＰＢ）、ヒトアルカリホスファターゼ、ＦＬＡＧオクタペプチドまたは赤血球凝集素（ＨＡ）からの配列を含むことができる。
【００６３】
ポリペプチドである結合部分が組換えＤＮＡ技術を用いて都合よく作製可能であることは、当業者に明らかであろう。結合部分は、ウイルスまたはウイルス様粒子のｐIXタンパク質へ融合させてもよく、あるいは、それらは適切な宿主で適切なベクターから発現させて、ウイルスまたはウイルス様粒子とは無関係に合成してから、ウイルスまたはウイルス様粒子へ結合させてもよい。
【００６４】
潜在的に有用な多くのターゲティング結合部分をコードしている核酸配列、例えばペプチドホルモン、成長因子、サイトカインなどに関するものが知られており、また、ＥＭＢＬおよびGenBankのような公共のヌクレオチド配列データベースを参照することにより容易に見出すことができる。ヌクレオチド配列が判明すれば、例えば化学的ＤＮＡ合成技術を用いるか、またはポリメラーゼ連鎖反応を用いてゲノムＤＮＡまたは組織特異的ｃＤＮＡから必要なＤＮＡを増幅させることにより、選択された結合部分をコードするＤＮＡを作製することは、当業者にとって容易になしうることである。
【００６５】
ペプチドホルモン、成長因子、サイトカインなどをコードする多くのｃＤＮＡは、そのすべてが結合部分として有用である可能性があり、一般的には、例えばBritish Biotechnology Ltd,Oxford,ＵＫから入手することができる。
【００６６】
本発明によるｐIXタンパク質を含むウイルスまたはウイルス様粒子がその標的細胞へ結合したとき、それはその核酸を上記の標的細胞へ送達する、即ち標的細胞がウイルスまたはウイルス様粒子に感染することが好ましい。ウイルスまたはウイルス様粒子によりこうして感染した標的細胞、特に癌細胞は、それらの表面上でウイルス分子を発現し、免疫系により認識されて破壊される。当然のことながら、ウイルスの他の細胞毒性機能によっても細胞が死滅することもある。
【００６７】
ターゲティングは、細胞表面において適切なアドレスをまず特定し、次いで、このアドレスを認識しうる、結合部分を含んだｐIXタンパク質を含んでなるウイルスまたはウイルス様粒子を構築することにより行なうことができる。適切な標的細胞特異的アドレスおよびこれらアドレスと結合しうる分子の特定に関して、適切な方法が当技術分野における文献に記載されている。
【００６８】
例えば、ある細胞型または罹患細胞は特有の細胞表面マーカーを発現することが示されている。例えば、急速に増殖する腫瘍の内皮細胞は、静止状態の内皮に存在しない細胞表面タンパク質、例えばαＶνインテグリン（「Ｖ」はＡを上下に反転させた記号である：Brooks et al.,Science,264(1994)569）およびある血管新生成長因子用のレセプター（Hanahan,Science,277(1997)48）を発現する。これら特定の細胞表面マーカーと相互作用するペプチド配列を選択するためには、ファージディスプレーライブラリー選択法を用いることができる（例えば、米国特許第５，６２２，６９９号明細書、米国特許第５，２２３，４０９号明細書および米国特許第５，４０３，４８４号明細書参照）。このシステムでは、ランダムペプチドが、ファージ表面タンパク質の一つをコードする遺伝子への対応コード配列の融合により、ファージ表面で発現される。望ましいファージは、単離された器官断片（ex vivo操作）または培養細胞（インビトロ操作）のような標的へのそれらの結合に基づいて選択される。ターゲティングペプチドの特定は、ファージライブラリーをマウスへ注入した後に結合ファージを標的器官から取出すというインビボ操作によっても行うことができる。選択されたペプチドは、ディスプレーペプチドをコードするファージゲノムの領域を配列決定することにより特定される。インビボ器官スクリーニングも、脳および腎臓（Pasqualini et al.,Nature,380(1996)364-366）、肺臓、皮膚および膵臓の脈管構造（Rajotte et al.,J.Clin.Invest.,102(1998)430-437）およびいくつかの腫瘍タイプ（Pasqualini et al.,Nature Biotechnology,15(1997)542-546）へ選択的ファージ帰還性を付与したペプチド配列を単離する上で、良好に適用することができる。
【００６９】
さらに、腫瘍は、それらの脈管構造のみならず、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）または腫瘍細胞自身によっても標的とすることができる。血管は腫瘍中で常に変化するため、内皮は局所的に破壊され、これにより遺伝子療法ベクターが管外に遊出してＥＣＭおよび腫瘍細胞と相互作用する。ＥＣＭまたは腫瘍関連細胞表面マーカーと相互作用するペプチドも、ファージディスプレー技術を用いて選択することができる（Christiano et al.,Cancer Gene Therapy,3(1996)4-10；Croce et al.,Anticancer Res.,17(1997)4287-4292；Gottschalk et al.,Gene Ther.,1(1994)185-191；Park et al.,Adv.Pharmacol.,40(1997)399-435）。例えば、ＨＷＧＦモチーフは、腫瘍増殖、血管新生および転移に関与するマトリックスメタロプロテイナーゼのリガンドとして特定されている。腫瘍担持動物モデルにＨＷＧＦ含有ペプチドを投与すると、腫瘍増殖および侵襲が防止され、動物生存期間が延長される（Koivunen et al.,Nature Biotechnology,17(1999)768-774）。
【００７０】
最近、Romanczukら（Human Gene Therapy,10(1999)2615-2626）により、分化繊毛気道上皮細胞を標的とするペプチドの単離について報告されている。組換えアデノウイルスの表面への最良の結合ペプチドと二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのカップリングにより、組込まれるペプチドに依存した代替経路を介して標的細胞へ形質導入しうるベクターが得られている。
【００７１】
結合部分がｐIXタンパク質との融合タンパク質の一部ではない場合には、結合部分およびｐIXタンパク質は、ポリペプチドを架橋する慣用法、例えばO’Sullivanら（Anal.Biochem.(1979)100,100-108）によって一般的に記載された方法により、一緒に連結しうる。例えば、結合部分に多くのチオール基を付加して、ウイルスまたはウイルス様粒子の表面上に存在する分子、即ちｐIXタンパク質を、そのチオール基と反応しうる二官能剤、例えばヨード酢酸のＮ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＩＡ）またはＮ‐スクシンイミジル‐３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応させる。例えば、ｍ‐マレイミドベンゾイル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステルで得られるアミドおよびチオエステル結合は、一般に、ジスルフィド結合よりもインビボで安定である。
【００７２】
他の化学的操作も、オリゴ糖および脂質をポリペプチドへ結合させるために用いることができる。
【００７３】
結合部分とｐIXタンパク質との共有結合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体のようなポリマーを用いて行ってもよい（例えば、ＷＯ９９／４０２１４；Bioconjugate Techniques,1996,606-618；ed.G Hermanson,Academic Press and Frisch et al.,1996,Bioconjugate Chem.,7,180-186）。結合部分およびｐIXタンパク質は、例えば、静電気相互作用を介して、または双方のパートナーを会合させうる親和性成分、例えばプロテインＡ、ビオチン／アビジンの使用により、非共有結合させてもよい。免疫カップリングも、例えば選択された結合部分をｐIXタンパク質へ結合させる抗体を用いて、本発明において用いることができる。例えば、Rouxら（1989,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,86,9079）により開示された技術に従い、表面露呈ｐIXエピトープに対するビオチニル化抗体、および選択された結合部分に対するストレプトアビジン標識抗体を用いることが可能である。各々のカップリングパートナーに対する二官能性抗体もこの目的に適している。
【００７４】
結合部分はポリペプチドであることが好ましい。好ましくは、結合部分およびｐIXタンパク質の双方のポリペプチドが遺伝子工学の技術により融合体として生産されることによって、結合部分はｐIXタンパク質へ結合される。遺伝子工学技術の使用には、このようなポリペプチドの融合に際して、正確なコントロールが可能となる。そのため、好ましい実施態様によれば、本発明による改変ｐIXタンパク質は結合部分と未改変ｐIXタンパク質との融合体であり、有利には、結合部分はｐIXタンパク質のＮ末端へ融合される。さらに好ましくは、結合部分はｐIXタンパク質のＣ末端部分内において、またはＣ末端部分に融合される。一般に、その対応細胞表面パートナーへの結合部分の最大の呈示をもたらすように、および／またはｐIXと相互作用することが知られた他のキャプシドウイルスタンパク質（例えば、ファイバー、ペントン基部および／またはヘキソン）との相互作用を妨げないように、融合部位が選択される。
【００７５】
より厳密には、結合部分は、ｐIXタンパク質のＣ末端へ、またはＣ末端部分内に位置する２つの残基間で、あるいはｐIXタンパク質のＣ末端部分内に位置する１以上の残基の代わりに融合させることができる。第一の実施態様としては、停止コドンのすぐ上流における結合部分配列の融合が挙げられる。他の代替法として、停止コドンに続くｐIXポリＡ配列がいくつかのリジンのストレッチ（細胞表面インテグリンを認識しうる結合部分）に翻訳されるような、アミノ酸コードコドンにおける停止コドンの変異も考えられる。第二の実施態様としては、制限部位が野生型ｐIXの２残基間に位置する１以上のコドンをコードするように、結果的にｐIX配列中に制限部位（好ましくは、６ヌクレオチド長の制限部位）を挿入することによる、ｐIXタンパク質の２コドン間における結合部分コード配列の挿入が挙げられる。このような制限部位は、結合部分コード配列を融合させるために、都合よく用いることができる。このような第二の実施態様の好適な例としては、ｐIXタンパク質の１３１位のロイシン残基および１３２位のリジン残基をコードするコドン間における、ＢａｍＨＩ部位の挿入が挙げられる。第三の実施態様としては、野生型ｐIXタンパク質の残基１２８〜１４０との置換による結合部分の挿入が挙げられる。これは、残基１２７で結合部分と連結された末端切断型ｐIXタンパク質をもたらす。
【００７６】
好ましくは、融合は読み枠内で行われ、ｐIXオープンリーディングフレームを壊さないものとされる。最終的には、結合部分とｐIXタンパク質とは、１以上のスペーサー、例えば、結合部分のＮ末端における第一スペーサー、および場合により結合部分のＣ末端における第二スペーサーの使用により連結することができる。スペーサーは、好ましくは、結合部分がその対応細胞表面パートナーにより認識されるコンホメーションをとることを可能とする、高度な回転自由度をもつアミノ酸残基から構成されている。スペーサーとして好ましいアミノ酸残基は、アラニン、グリシン、プロリンおよび／またはセリンである。特定の実施態様によれば、スペーサーは、配列Ｓｅｒ‐Ａｌａ、Ｇｌｙ‐Ｓｅｒ、Ｐｒｏ‐Ｓｅｒ‐Ａｌａ、Ｐｒｏ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒまたはそれらの繰返しを含んでなるペプチドである。具体例としては、配列Ｇｌｙ‐Ｓｅｒ‐（Ｓｅｒ‐Ａｌａ）４‐Ｓｅｒがこのような使用に適している。
【００７７】
したがって、本発明は、結合部分とウイルスまたはウイルス様粒子のｐIXタンパク質との前記融合体をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００７８】
結合部分とウイルスまたはウイルス様粒子のｐIXタンパク質との融合体をコードするヌクレオチド配列は、好ましくはウイルスゲノムの改変により作製される。
【００７９】
前記ヌクレオチド配列は、固相ホスホルアミダイト化学を用いてデノボ合成してもよいが、第一が結合部分、第二がウイルスまたはウイルス様粒子のｐIXタンパク質をコードしている２つの部分から構築する方が、ヌクレオチド配列にとっては一般的である。その２つの部分は、制限エンドヌクレアーゼ切断または当業者により知られた他の方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応により、それらの各遺伝子から誘導することができる。
【００８０】
相補的付着末端を介して２つのヌクレオチド配列を機能しうる形で連結させる様々な方法が開発されている。例えば、１以上の制限部位を含んだ合成リンカーにより、２つのＤＮＡセグメントを一緒に結合させることが可能とされる。エンドヌクレアーゼ制限切断により作製された各ＤＮＡセグメントは、３′‐５′‐エキソヌクレアーゼ分解(exonucleolytic)活性によって突出３′一本鎖末端を除去し、かつ、重合活性によって陥凹(recessed)３′末端をフィルインする酵素、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはE.coli ＤＮＡポリメラーゼＩで処理することができる。
【００８１】
こうして、これら活性の組合せにより平滑末端ＤＮＡセグメントが作製される。次いで、平滑末端セグメントは、平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒しうる酵素、例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で、大モル過剰のリンカー分子と共にインキュベートされる。そのため、反応の産物は、末端にポリマーリンカー配列を有するＤＮＡセグメントとなる。次いで、これらのＤＮＡセグメントは適切な制限酵素で開裂され、ＤＮＡセグメントのものと適合する末端を作り出せる酵素で開裂された発現ベクターへ当てはめられる。
【００８２】
様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を有する合成リンカーは、International Biotechnologies Inc,New Haven,Conn.,USAなどのいくつかの供給元から市販されている。本発明による融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを作製する望ましい手法は、Saikiら(1988)Science,239,487-491により開示されているようなポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。
【００８３】
この方法において、融合される２つのポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の各々は、増幅ＤＮＡ中へ自ら組み込まれる２つの特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、酵素的に増幅される。上記の特定プライマーは、開示されているように、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて上記の２つのＤＮＡ分子を連結するために用いられる、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。
【００８４】
好ましい実施態様によれば、本発明は、野生型ｐIXタンパク質との比較におけるｐIXタンパク質の１以上のアミノ酸の変異により改変されたアデノウイルスｐIXタンパク質に関し、前記アミノ酸は前記タンパク質のＮ末端部分またはＣ末端部分、好ましくは前記タンパク質のＣ末端ロイシンリピートにおいて選択される。好ましくは、本発明によるアデノウイルスｐIXタンパク質は、前記タンパク質のＣ末端部分、好ましくはＣ末端ロイシンリピートに結合部分を含んでなる。有利な実施態様によれば、上記の結合部分は標的細胞と結合しうるものである。
【００８５】
本明細書において用いられる「Ｎ末端部分」という用語は、１位のアミノ酸残基付近から３９位のアミノ酸残基付近までの、ｐIXタンパク質の部分をいう。Ａｄ５ ｐIXタンパク質の場合、上記の用語は、更に厳密には、配列番号１に示される１位のメチオニン残基付近から３９位のバリン残基付近までの、ｐIXタンパク質の部分をいう。
【００８６】
本明細書において用いられる「Ｃ末端部分」という用語は、ロイシンリピートドメインの第一アミノ酸残基付近からｐIXタンパク質の最終アミノ酸残基付近までの、ｐIXタンパク質の部分をいう。Ａｄ５ ｐIXタンパク質の場合、上記の用語は、更に厳密には、配列番号１で示される１００位のロイシン残基付近から１４０位のバリン残基付近までの、ｐIXタンパク質の部分をいう。
【００８７】
他の好ましい実施態様によれば、本発明は、野生型ｐIXタンパク質との比較におけるｐIXタンパク質の１以上のアミノ酸の変異により改変されたアデノウイルスｐIXタンパク質に関し、前記アミノ酸は前記タンパク質のＣ末端ロイシンリピートにおいて選択される。好ましくは、前記改変ｐIXタンパク質は強固なヘリックス構造を有さないものとされる。
【００８８】
本明細書において用いられる「Ｃ末端ロイシンリピート」という用語は、疎水性アミノ酸残基（例えば、ロイシンおよび／またはバリン）に富むｐIXタンパク質の部分をいう。好ましくは、Ｃ末端ロイシンリピートは少くとも配列「（ＬＸＸＬＸＸＸＬＸＸ）ｎ」を含むものとされ、ここでＸはいずれかのアミノ酸残基であり、ｎは１〜４である。Ａｄ５ ｐIXタンパク質の場合、上記の用語は、更に厳密には、配列番号１で示される１００位のロイシン残基付近から１２１位のロイシン残基付近までの、ｐIXタンパク質の部分をいう。
【００８９】
好ましくは、Ｃ末端ロイシンリピート内の変異は、野生型ｐIXタンパク質においてそのＣ末端ロイシンリピートによりもたらされるヘリックス構造を不安定化させるためのものとされる。このような変異は、ヘリックス構造に関与する１以上の残基に影響を与えるものとされ、特に好ましくはロイシンおよび／またはバリンのような疎水性残基に影響を与えるものとされる。より厳密には、このような変異は、ロイシンリピートドメインの全部または一部の欠失、または野生型Ａｄ５ ｐIXタンパク質（配列番号１）の１００位ロイシン、１０３位ロイシン、１０４位ロイシン、１０６位グルタミン、１０７位ロイシン、１１０位ロイシン、１１３位グルタミン酸、１１４位ロイシン、１１７位バリン、および１２１位ロイシンからなる群より選択される１以上の残基に影響を与える変異とすることができる。さらに好ましくは、前記変異は、野生型Ａｄ５ ｐIXタンパク質（配列番号１）の残基１００、１０３、１０４、１０６、１０７、１１０、１１３、１１４、１１７または１２１に相当する１以上の残基の置換変異とされる。好ましい変異は、プロリンまたは荷電残基による前記残基の置換であり、最も好ましくは：
‐プロリンによる１１４位ロイシンの置換（Ｌ１１４Ｐ）、
‐アスパラギン酸による１１７位バリンの置換（Ｖ１１７Ｄ）、または
‐プロリンによる１１４位ロイシンの置換およびアスパラギン酸による１１７位バリンの置換（Ｌ１１４Ｐ‐Ｖ１１７ＤまたはＬ‐Ｖ）
である。
【００９０】
好ましい実施態様によれば、このような変異ｐIXタンパク質は、結合部分を含むようにさらに改変される。上記のように、結合部分は、好ましくは、変異ｐIXタンパク質のＣ末端部分内において、好ましくはロイシンリピートの後に（例えば、Ｃ末端、残基１３１と１３２との間、または残基１２７の後に）挿入される。
【００９１】
他の態様によれば、本発明は、上述のように、本発明によるアデノウイルスｐIXタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子に関する。
【００９２】
本発明において「核酸分子」という用語は、あらゆる鎖長のデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の重合形として定義づけられる。核酸分子は直線状または環状の一本鎖または二本鎖とすることができる。それは好ましくは二本鎖ＤＮＡ分子である。それは修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含んでいてもよい（修飾の例として、米国特許第５，５２５，７１１号明細書、米国特許第４，７１１，９５５号明細書または欧州特許出願公開ＥＰＡ３０２１７５号明細書を参照）。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、（例えば、標識成分との複合化により）ポリマーのアセンブリーの前または後に行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド要素により遮断してもよい。本発明による核酸分子は、完全長改変ｐIXタンパク質またはその断片（例えば、それから得られる制限エンドヌクレアーゼ産物断片およびＰＣＲ産物断片）をコードすることができる。本発明は（例えば、オリゴヌクレオチド合成により製造される）合成断片をも包含する。
【００９３】
本発明による核酸分子は、好ましくは、このような改変ｐIXタンパク質をクローニングまたは発現するためのベクターである。プラスミドまたはウイルス性、組込みまたは非組込み源のいずれであろうと、いかなるタイプのベクターも本発明において用いることができる。このようなベクターは市販されているか、または文献に記載されている。同様に、当業者であれば、本発明によるＤＮＡ断片の発現に必要な調節要素を調整しうる。好ましくは、上記ベクターは、（後述するように）本発明による改変ｐIXタンパク質を表面に有するウイルスまたはウイルス様粒子を適切な培養条件下で産生しうるアデノウイルスベクターである。
【００９４】
好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記のような結合部分と天然ｐIXタンパク質または変異ｐIXタンパク質との融合体をコードするものとされる。
【００９５】
他の態様によれば、本発明は、本発明による核酸分子を含んでなるアデノウイルスベクターに関する。「アデノウイルスゲノム」および「アデノウイルスベクター」という用語は同義語であり、一般に、ウイルスまたはウイルス様粒子、好ましくはアデノウイルスに含まれる遺伝物質をいう。より具体的には、これらの用語は、少くともアデノウイルスＩＴＲ５′、ＩＴＲ３′、およびアデノウイルス（またはビリオン）を産生するためにアデノウイルス粒子への上記アデノウイルスゲノムのパッケージングを促進しうる包膜化（ｐｓｉ）または「パッケージング」配列を含んでなる、アデノウイルス起源の核酸配列をいう。上記のゲノムまたはベクターは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、Ｅ４アデノウイルス領域の全部または一部を更に含んでもよい。本発明によるアデノウイルスベクターは、天然または野生型アデノウイルス、有利にはイヌ、トリまたはヒトアデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス２、３、４、５または７型、さらに好ましくはヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）のゲノムから誘導される。この後者の場合に、本発明によるアデノウイルスベクターの欠失は、GenBankデータバンクで参照番号Ｍ７３２６０として特定される、Ａｄ５ゲノムのヌクレオチドの位置を参照して示されている（図６および配列番号１参照）。
【００９６】
本発明によるアデノウイルスベクターは、好ましくは複製欠陥を有するが、ベクターを標的細胞へ送達する能力を有するものであるため、宿主細胞で自律複製しえない一方で感染力を有するようなアデノウイルスゲノムを含んでなるアデノウイルス粒子（欠陥アデノウイルスとも称される）を作製するように、欠損する産物をトランスで該ベクターに提供する相補細胞において複製および包膜化されうる。しかしながら、本発明によるアデノウイルスベクターは、複製コンピテントベクター（即ち、複製欠陥を有さない；Alemany et al.,2000,Nature Biotechnology,18,723-727）および条件付複製アデノウイルスベクター（ＣＲＡｄ；Heise and Kirn,2000,J,of Clinical Investigation,105,847-851）に関するものであってもよい。
【００９７】
好ましくは、本発明による核酸分子は、その核酸分子の発現を行わせる天然ｐIXプロモーターを用いて、野生型ｐIXコード遺伝子の代わりにアデノウイルスゲノムベクターへ置かれる。（例えば、欠失または変異により）野生型ｐIXコード遺伝子を不活化させることも可能であり、また、天然ｐIXプロモーターの制御下または異種プロモーター（例えば、誘導性または構成プロモーター）の制御下で、アデノウイルス領域の別の（非自然）位置に本発明による核酸分子を挿入して、所望時に（例えば、２９３またはＰＥＲ‐Ｃ６細胞系のような適切な細胞で、ウイルスまたはウイルス様粒子の産生プロセス中に）上記核酸分子を発現させることも可能である。対象遺伝子（または外来配列）に関連して記載されたプロモーターも、これに適している。
【００９８】
更に、本発明によるアデノウイルスベクターは、標的細胞でウイルス付着および／または侵入を通常媒介する細胞レセプターとの相互作用（例えば、ファイバーおよびＣＡＲレセプター間、ペントン基部およびインテグリン間などの相互作用）を特に低下または消失させるように、さらに改変してもよい。
【００９９】
この点で、Ａｄ２およびＡｄ５の宿主特異性は、ＣＡＲ媒介経路に関して、Ａｄ３およびＡｄ７のものと異なることが知られている。そこで、ＣＡＲレセプターと結合しうる上記ファイバーの能力を低下させるには、ＣＡＲ結合に関与するＡｄ５またはＡｄ２ファイバーの１以上の残基をＡｄ３またはＡｄ７ファイバーの対応領域に由来する対応残基で置き換えた方が有利であろう。実例として、適切なＣＡＲ切除変異にはＷＯ９８／４４１２１、ＷＯ０１／１６３４４、ＷＯ０１／０１３８３６１およびＷＯ００／１５８２３とKirbyら（2000,J.Virol.,74,2804-2813）およびLeissnerら（2001,Gene Ther.,8,49-57）で記載されたものがあるが、特に好ましいものはグルタミン酸残基によるＡｄ５ファイバーの４０８位セリンの置換である。
【０１００】
アデノウイルスファイバーは、例えば米国特許第５，９６２，３１１号明細書に記載されているように、例えばシャフト領域で更に改変して、≪短シャフト化≫ファイバーにしてもよい。「短シャフト化ファイバー」とは、シャフトが所定の天然、即ち野生型のアデノウイルスに存在するものよりも短いファイバーを意味する。例えば、シャフトはＡｄ２またはＡｄ５に存在するものよりも短い。シャフトは、異なる血清型のものでもよい短いファイバーで、長いファイバーを置き換えることにより、短縮してもよい。この点において、ファイバーシャフトおよびノブは同一の血清型でもよく、またはシャフトがある血清型で、ノブが別な血清型でもよい。例えば、Ａｄ９ファイバーシャフトはＡｄ２またはＡｄ５ノブと併用しうる。好ましくは、しかしながら、シャフトはシャフトの一部、好ましくはテールから遠位の完全リピートの欠失により短縮される。好ましくは、シャフトは少くとも約６つのリピート、更に好ましくは約６〜約１２のリピートを含んでなる。
【０１０１】
本発明において、アデノウイルスベクターは、標的細胞への外来ヌクレオチド配列（または対象遺伝子）の導入およびそこでのその発現を目的とするものである。「外来ヌクレオチド配列」とは、少くとも１つのコード配列と、好ましくはそのコード配列の発現を行わせる調節配列をも含んでなる核酸を意味するものと理解される。外来ヌクレオチド配列と、好ましくはそこに含まれるコード配列は、アデノウイルスのゲノムに通常存在していない配列である。外来ヌクレオチド配列は、好ましくは包膜化領域と３′ＩＴＲとの間において、遺伝子工学の標準技術（例えば、Sambrook and Russell(2001),Molecular Cloning,CSH Press,NY,USA参照）、好ましくはＥＰ７４２８３４に開示されているような相同的組換えにより、本発明によるアデノウイルスベクター中へ導入させることができる。外来ヌクレオチド配列を含んでなるこのようなアデノウイルスベクターは、「野生型」アデノウイルスベクター、または上記のように改変されているが、外来ヌクレオチド配列を含まない対応アデノウイルスベクターとは異なり、「組換え体」と称される。
【０１０２】
「遺伝子」という用語は、イントロンもしくはその断片、またはｃＤＮＡもしくはその断片を含むことがある、コード配列を含んでなる核酸をいう。
【０１０３】
好ましくは、外来ヌクレオチド配列は、遺伝子療法に適した、即ち治療上有用な遺伝子を含んでなる。
【０１０４】
本発明において好ましく用いることのできる対象遺伝子としては、以下のものが挙げられる：
‐インターフェロンα、インターフェロンγ、β‐インターフェロン、インターロイキンのようなサイトカイインについてコードする遺伝子；
‐病原体（ウイルス、細菌または寄生虫）、好ましくはＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）により認識されるレセプターのような膜レセプターについてコードする遺伝子；
‐因子VIIIおよび因子IXのような凝固因子についてコードする遺伝子；
‐ジストロフィンについてコードする遺伝子；
‐インスリンについてコードする遺伝子；
‐ＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症貫膜コンダクタンスレギュレーター）タンパク質のような、細胞イオンチャンネルに直接的または間接的に関与するタンパク質についてコードする遺伝子；
‐病原体のゲノムに存在する病原性遺伝子、または発現が調節解除された細胞遺伝子、例えば癌遺伝子により産生されるタンパク質の活性を抑制しうるアンチセンスＲＮＡまたはタンパク質についてコードする遺伝子；
‐α１‐抗トリプシンまたはウイルスプロテアーゼインヒビターのような、酵素活性を阻害するタンパク質についてコードする遺伝子；
‐例えば、標的配列との結合に際して天然タンパク質と競合し、こうしてＨＩＶの活性化を妨げる、ＨＩＶウイルスのＴＡＴタンパク質のトランス優性変種のような、生物機能を損なうように変異された、病原性タンパク質の変種についてコードする遺伝子；
‐宿主細胞免疫を賦活するために抗原エピトープについてコードする遺伝子；
‐主要組織適合性複合体クラスＩおよびIIタンパク質についてコードする遺伝子、およびこれら遺伝子のインデューサーであるタンパク質についてコードする遺伝子；
‐細胞酵素についてコードする遺伝子または病原体により産生されるもの；および
‐自殺遺伝子。ＴＫ‐ＨＳＶ‐１自殺遺伝子が特に例示される。ウイルスＴＫ酵素は、あるヌクレオシドアナログ（例えば、アシクロビアまたはガンシクロビア）に対し、細胞ＴＫ酵素と比較して著しく大きな親和性を示す。それはそれらを一リン酸化分子変換し、毒性のあるヌクレチド前駆体へ細胞酵素によりそれ自体が変換される。これらのヌクレオチドアナログは、合成中のＤＮＡ分子、ひいては複製状態にある細胞のＤＮＡへ主に組み込まれる。この組込みは、癌細胞のような分裂細胞を特に破壊しうる。
【０１０５】
このリストは限定的なものではなく、他の対象遺伝子も本発明において用いることができる。
【０１０６】
一つの実施態様によれば、その遺伝子は、直接的または間接的な細胞毒性機能を有する分子をコードする自殺遺伝子である。「直接的または間接的な」細胞毒性とは、その遺伝子によりコードされる分子がそれ自体毒性であるか（例えば、リシン、腫瘍壊死因子、インターロイキン‐２、インターフェロン‐γ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、Pseudomonas外毒素Ａ）、またはそれが代謝されて毒性産物を形成するか、またはそれが他の何かに作用して毒性産物を形成することを意味している。リシンｃＤＮＡの配列は、参照することにより本明細書の開示の一部とされるLamb et al.(1985)Eur.J.Biochem.,148,265-270に開示されている。
【０１０７】
例えば、本発明によるアデノウイルスベクターまたはそれを含んでなるウイルスもしくはウイルス様粒子を用いて、酵素をコードする外来ＤＮＡ配列を対象とすることが望ましく、その酵素は比較的無毒性のプロドラッグを毒性薬物へ変換するものである。酵素シトシンデアミナーゼは、５‐フルオロシトシン（５ＦＣ）を５‐フルオロウラシル（５ＦＵ）へ変換する（Mullen et al.(1922)PNAS,89,33）；ヘルペス単純酵素チミジンキナーゼは、抗ウイルス剤ガンシクロビア（ＧＣＶ）またはアシクロビアでの治療に対して細胞を感受性にさせる（Moolten(1986)Cancer Res.,46,5276；Ezzedine et al.(1991)New Biol.,3,608）。あらゆる生物、例えばE.coli（ＥＰ４０２１０８）またはSaccharomyces cerevisiae（Erbs et al.,1997,Curr.Gennet.,31,1-6；ＷＯ９３／０１２８１）のシトシンデアミナーゼも用いうる。
【０１０８】
このように、本発明の好ましい実施態様によれば、その遺伝子はシトシンデアミナーゼをコードする。この実施態様では、５ＦＣと、シトシンデアミナーゼを発現するウイルスまたはウイルス様粒子とを、患者へ同時に投与する。「同時」とは、５ＦＣが、腫瘍細胞のような標的細胞の形質転換に際して、上記の遺伝子から発現されたシトシンデアミナーゼにより５ＦＣが標的細胞で５ＦＵへ変換されるような時期に投与されることを意味する。約０．００１〜１００．０ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．１〜１０．０ｍｇ／ｋｇ／日の５ＦＣ用量が適切である。
【０１０９】
自殺遺伝子産物の組合せ、例えばシトシンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の使用も、本発明において考えられる。ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする適切な遺伝子には、E.coli（Anderson et al.,1992,Eur.J.Biochem.,204,51-56）およびSaccharomyces cerevisiae（Kern et al.,1990,Gene,88,149-157）からのものがある。有利には、本発明において使用される外来ＤＮＡ配列は、シトシンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を双方とも有するポリペプチドをコードしている。シトシンデアミナーゼは５ＦＣアナログを脱アミノ化して、５‐フルオロウラシル（５ＦＵ）を形成するが、これはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ作用により５‐フルオロＵＭＰへ変換されたときに、高度な細胞毒性を有する。このようなポリペプチドは、例えばＷＯ９６／１６１８３およびＷＯ９９／５４４８１に記載されている。
【０１１０】
酵素の作用により比較的無毒性の形から細胞毒性形へと変換される５ＦＣのような成分は、「プロドラッグ」と称される。
【０１１１】
プロドラッグ／酵素組合せの他の例には、Bagshaweら（ＷＯ８８／０７３７８）により開示されたもの、即ち様々なアルキル化剤およびPseudomonas spp.ＣＰＧ２酵素、およびEpenetos & Rowlinson-Busza（ＷＯ９１／１１２０１）により開示されたもの、即ち青酸系プロドラッグ（例えば、アミグダリン）および植物由来β‐グルコシダーゼがある。
【０１１２】
本発明のこの実施態様において有用な酵素には、リン酸含有プロドラッグをフリードラッグへ変換する上で有用なアルカリホスファターゼ；硫酸含有プロドラッグをフリードラッグへ変換する上で有用なアリールスルファターゼ；無毒性５‐フルオロシトシンを抗癌剤５‐フルオロウラシルへ変換する上で有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグをフリードラッグへ変換する上で有用な、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）のようなプロテアーゼ；Ｄ‐アミノ酸置換基を有するプロドラッグを変換する上で有用なＤ‐アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグをフリードラッグへ変換する上で有用な、β‐ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物開裂酵素；β‐ラクタムとして誘導された薬物をフリードラッグへ変換する上で有用なβ‐ラクタマーゼ；アミン窒素が各々フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導された薬物をフリードラッグへ変換する上で有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼがあるが、それらに限定されない。一方、当技術分野においてアブザイムとしても知られた、酵素活性を有する抗体も、本発明によるプロドラッグをフリー活性ドラッグへ変換するために用いることができる（例えば、R.J.Massey,Nature,328,pp.457-458(1987)参照）。
【０１１３】
同様に、プロドラッグには、その複合体から更に活性な細胞毒性フリードラッグへと酵素により変換されうる上記のプロドラッグ、例えば、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ‐アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β‐ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５‐フルオロシトシンおよび他の５‐フルオロウリジンプロドラッグがあるが、それらに限定されない。本発明において使用されるプロドラッグ形へ誘導しうる細胞毒性薬物の例には、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、シスプラチンおよびシスプラチンアナログ、ブレオマイシン類、エスペラマイシン類（ＵＳ特許４，６７５，１８７）、５‐フルオロウラシル、メルファランおよび他の関連窒素マスタードがあるが、それらに限定されない。
【０１１４】
他の実施態様によれば、標的細胞へ送達される遺伝子は、標的のＲＮＡまたはＤＮＡを開裂しうるリボザイムをコードしている。開裂される標的ＲＮＡまたはＤＮＡが細胞の機能に必須のＲＮＡまたはＤＮＡであれば、その開裂は細胞死をもたらし、開裂される標的ＲＮＡまたはＤＮＡが望ましくないタンパク質、例えば癌遺伝子産物をコードするＲＮＡまたはＤＮＡであれば、このＲＮＡまたはＤＮＡの開裂は細胞の癌化を防ぐことを可能とすることがある。
【０１１５】
さらに他の実施態様によれば、標的細胞へ送達される遺伝子はアンチセンスＲＮＡをコードしている。
【０１１６】
「アンチセンスＲＮＡ」という用語は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子、またはプレｍＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくはｒＲＮＡのような細胞内の他のＲＮＡ分子とハイブリッド形成して、その発現を妨げるか、あるいは遺伝子とハイブリッド形成して、その発現を妨げるような、ＲＮＡ分子を意味する。
【０１１７】
更に、標的細胞へ送達される遺伝子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはコサプレッション効果を発揮しうるＲＮＡ分子のような、細胞の遺伝子発現に影響を与えうる、他種のＲＮＡ分子をコードするものであってもよい。
【０１１８】
便宜上、アンチセンスＲＮＡを発現する遺伝子は、転写されるＲＮＡが標的ｍＲＮＡと相補的であるように、適切な向きでプロモーターと隣接するタンパク質をコードしたコード配列を挿入することにより構築することができる。適切には、アンチセンスＲＮＡは、癌遺伝子、例えばｒａｓ、ｂｃｌ、ｓｒｃまたは腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３およびＲｂのような望ましくないポリペプチドの発現を阻止するものである。
【０１１９】
アンチセンスＲＮＡとして発現させる上で適したＤＮＡ配列が、GenBankおよびＥＭＢＬのような公共データベースから容易にみられることも、また明らかであろう。
【０１２０】
本発明の他の実施態様によれば、その遺伝子は標的細胞において欠陥遺伝子の機能に置き換わる。欠陥遺伝子により引き起こされる、ヒトを含めた哺乳類の遺伝病としては数千種類の疾患がある。このような遺伝病の例には、ＣＦＴＲ遺伝子の変異により起きることが知られた嚢胞性繊維症；ジストロフィン遺伝子の変異により起きることが知られたDuchenne筋ジストロフィー；ＨｂＡ遺伝子の変異により起きることが知られた鎌状赤血球症がある。多くのタイプの癌は、欠陥遺伝子、特に癌原遺伝子、および変異した腫瘍抑制遺伝子により引き起こされる。
【０１２１】
このため、嚢胞性繊維症の治療に有用であるかもしれない、本発明によるアデノウイルスベクターまたはそれを含むウイルスもしくはウイルス様粒子は、欠陥ＣＦＴＲ遺伝子の機能に置き換わる機能性ＣＦＴＲ遺伝子を含有していることが好ましい。同様に、癌の治療に有用であるかもしれない、本発明によるアデノウイルスベクターは、欠陥癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の機能に置き換わる機能性癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を含有していることが好ましい。
【０１２２】
癌原遺伝子の例はｒａｓ、ｓｒｃ、ｂｃｌなどである；腫瘍抑制遺伝子の例はｐ５３およびＲｂである。
【０１２３】
遺伝子がアデノウイルスベクター内の好適な位置に導入されて、その発現を行わせるプロモーターおよび／またはエンハンサー要素を含有していることは、明らかであろう。
【０１２４】
プロモーターおよび／またはエンハンサー要素は、標的とされる細胞に応じて選択的であることが好ましい。組織または腫瘍特異性プロモーターの一部の例が以下で示されているが、本発明のこの実施態様において有用な新たなものも次々と発見されている。
【０１２５】
例えば、ムチン遺伝子ＭＵＣ１は、ＷＯ９１／０９８６７に記載されているように、非上皮細胞系ではなく、乳房および膵臓細胞系へ選択的に直接発現しうる５′フランキング配列を含んでいる。
【０１２６】
本発明において、外来ヌクレオチド配列は１以上の対象遺伝子からなってもよく、好ましくは治療向けである。本発明において、対象遺伝子は、例えばアンチセンスＲＮＡ、または対象タンパク質へ翻訳されるｍＲＮＡをコードしうる。対象遺伝子には、ゲノムタイプ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）タイプまたは混合タイプ（例えば、少くとも１つのイントロンが失われたミニ遺伝子）がある。それは成熟タンパク質、成熟タンパク質の前駆体、特に分泌させるための前駆体についてコードしてもよく、したがって対応するシグナルペプチド、多様な起源の配列の融合から得られるキメラタンパク質、または改善または改変された生物学的性質を示す天然タンパク質の変異体でもよい。このような変異体は、天然タンパク質をコードする遺伝子の１以上のヌクレオチドの変異、欠失、置換および／または付加により得られる。他の対象遺伝子は、例えば、トランスフェクトされた細胞で内在遺伝子の遺伝子発現を阻害しうる、リボザイムまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）構築物についてコードするものでもよい。リボザイムおよびＲＮＡｉ構築物を構築するための手段および方法は当業者に公知であり、関連文献に詳しく記載されている。
【０１２７】
対象遺伝子は、標的細胞での発現に適した要素の制御下に置かれる。「適した要素」とは、ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）への対象遺伝子の転写、およびタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳に必要な一連の要素を意味すると理解される。転写に必要な要素の中では、プロモーターが特に重要と思われる。それは構成プロモーターまたは調節プロモーターであり、真核またはウイルス源、更にはアデノウイルス源の遺伝子から単離しうる。一方、それは当該対象遺伝子の天然プロモーターでもよい。一般的には、本発明で用いられるプロモーターは調節配列を含むように改変してもよい。例として、本発明において使用される対象遺伝子は、リンパ球宿主細胞へのその導入を目標とすることが望まれるときに、免疫グロブリン遺伝子の１つのプロモーターの制御下に置かれる。多数の細胞型で発現しうる、ＴＫ‐ＨＳＶ‐１（ヘルペスウイルス、１型チミジンキナーゼ）遺伝子プロモーターまたはアデノウイルスＭＬＰプロモーター、特にヒトアデノウイルス２型からのものも挙げられる。
【０１２８】
好ましい実施態様によれば、転写制御配列はプロモーター要素を含んでなる。好ましくは、高発現プロモーターが用いられる。そのプロモーターは、例えば、ウイルスプロモーターおよび組織または細胞型特異性プロモーター、例えば筋肉特異性プロモーター、またはそれらの組合せからなる群より選択される。このようなウイルスプロモーターの例は、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、Rous Sarcoma Virus（ＲＳＶ）プロモーター、Cytomegalovirus（ＣＭＶ）前初期(immediate-early)プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＭＰＳＶプロモーター、７．５ｋプロモーター、ワクシニアプロモーターおよび主前初期（ＭＩＥ）プロモーターである。筋肉特異性プロモーターの例は、平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモーター、ミオシン軽鎖プロモーター、ミオシン重鎖プロモーター、骨格αアクチンプロモーターおよびジストロフィンプロモーターである。しかしながら、Cytomegalovirus（ＣＭＶ）前初期プロモーターが好ましい。β‐インターフェロンコード配列の天然プロモーターも用いてよい（米国特許第４，７３８，９３１号明細書）。プロモーターのポリヌクレオチド配列は、生体核酸物質から単離される天然プロモーター配列でも、または化学的に合成してもよい。プロモーター配列は、天然物の場合を超えた効力へ至るように、転写活性について既にスクリーニングされた要素をアセンブリーすることにより、人工的に構築してもよい（Li et al.,1999,Nature Biotech.,17,241-245）。（コード配列およびプロモーターを含む）発現カセットは、当業者に公知の通常クローニング技術を用いて構築しうる（例えば、Sambrook et al.,2001,前掲参照）。本発明の更に他の態様によれば、転写制御配列は少くとも１つのエンハンサー要素を更に含んでいる。「エンハンサー」という用語は、位置および配向非依存的に転写を活性化する調節要素をいう。いくつかのエンハンサー要素が多くの遺伝子で今までに特定されてきた。例えば、エンハンサー要素にはミオシン軽鎖エンハンサーがある。更に好ましくは、本発明の発現カセットで用いられるエンハンサーは脊椎動物源、更に好ましくは哺乳類源である。ラットミオシン軽鎖１／３エンハンサー（Donoghue et al.,1988,Gene & Dev.,2,1779-1790）が特に有用である。プロモーターへ操作可能に連結されたエンハンサー要素はそのプロモーターの上流または下流に位置し、いずれかの向きで用いられる。好ましい態様によると、転写コントロール配列はいくつかのエンハンサー配列を含んでおり、その配列は同一であるか、または互いに独立して選択される。好ましくは、転写コントロール配列は、転写ＲＮＡ分子のポリアデニル化を担う少くとも１つの配列を更に含んでいる。このような配列はｂＧＨ（牛成長ホルモン）ポリアデニル化シグナル（ＥＰ１７３５５２）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびグロビンポリアデニル化シグナルからなる群より選択され、タンパク質、例えばβ‐インターフェロンをコードする配列または発現させるＲＮＡの３′末端に通常位置する。
【０１２９】
更に、本発明の他の実施態様によれば、本発明によるアデノウイルスベクターは、好ましくは前記遺伝子に加えて、非アデノウイルス転写をトランス活性化するタンパク質をコードする非治療用遺伝子を含んでなる。当然のことながら、トランス活性化タンパク質をコードするＥ１Ａ領域の遺伝子は、その発現がアデノウイルスを非欠陥性にするおそれがあるため避ける。
【０１３０】
加えて、本発明は、次の工程を含んでなる、ウイルスまたはウイルス様粒子を製造する方法に関する：
（ａ）上記のような本発明によるアデノウイルスベクターで適切な宿主細胞を形質転換する工程；
（ｂ）上記のアデノウイルスベクターからのウイルスまたはウイルス様粒子の形成に適した条件下で前記形質転換細胞系を培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で形成されたウイルスまたはウイルス様粒子を培養物から回収する工程。
【０１３１】
本発明によるアデノウイルスベクターは、公知の技術、例えば、細胞核中へのマイクロインジェクション（Capechi et al.,1980,Cell,22,479-488）、例えばＣａＰＯ４によるトランスフェクション（Chen and Okayama,1987,Mol.Cell Biol.,7,2745-2752）、エレクトロポレーション（Chu et al.,1987,Nucleic Acid Res.,15,1311-1326）、リポフェクション／リポソーム融合（Felgner et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413-7417）、粒子衝突（Yang et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,9568-9572）、遺伝子銃、感染（例えば、上記のアデノウイルスベクターを含んだウイルスによる）、直接ＤＮＡ注入（Acsadi et al.,1991,Nature,352,815-818）、ミクロ発射衝突（Williams et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,2726-2730）などに従い、細胞中へ形質転換しうる。
【０１３２】
細胞系に関しては、細菌、酵母、植物および動物、例えばヒト細胞を含めた、原核および真核双方の細胞が用いうる。好ましくは、アデノウイルスベクターは複製欠陥を有し、上記の適切な宿主細胞は、最終的にはヘルパーウイルスと協同して、上記アデノウイルスベクターの少くとも１つの欠陥機能を補う。細胞系２９３（Graham et al.,1977,J.Gen.Virol.,36,59-72）およびＰＥＲＣ６（Fallaux et al.,1998,Human Gene Therapy,9,1909-1917）が、Ｅ１機能を補うために通常用いられる。他の細胞系も二重欠陥ベクターを補うように処理されている（Yeh et al.,1996,J.Virol.,70,559-565；Krougliak and Graham,1995,Human Gene Ther.,6,1575-1586；Wang et al.,1995,Gene Ther.,2,775-783；Lusky et al.,1998,J.Virol.,72,2022-2033；ＥＰ９１９６２７およびＷＯ９７／０４１１９）。
【０１３３】
一つの実施態様によれば、アデノウイルスベクターのゲノムは（野生型または改変）ｐIXコード配列の全部または一部を欠いており、本発明による方法では、好ましくは、本発明による改変アデノウイルスｐIXタンパク質、好ましくは遺伝子修飾されてＣ末端部分内で結合部分を発現するｐIXタンパク質を発現するように処理された宿主細胞を用いる。このような細胞系は、ゲノムまたはエピソーム形へ組み込まれた形で、本発明による改変アデノウイルスｐIXタンパク質をコードする核酸分子を含んでなる。当然のことながら、核酸分子は、上記の細胞系で改変ｐIXタンパク質を産生させるために、適切な翻訳および／または転写調節要素の制御下に置かれる。好ましくは、この細胞系は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５領域またはそれらいずれかの組合せによりコードされた機能からなる群より選択される、１以上のアデノウイルス機能を更に補いうる。それは、好ましくは、改変ｐIXタンパク質をコードする配列についてコードした発現ベクターをトランスフェクトすることにより、Ｅ１機能を補う２９３細胞系またはＰＥＲ‐Ｃ６細胞系から産生される。
【０１３４】
ウイルスまたはウイルス様粒子は、培養上澄からだけでなく、慣用的溶解技術（機械的、酵素的、凍結および解凍サイクル）後に細胞からも回収することができ、場合により標準技術（例えば、ＷＯ９６／２７６７７、ＷＯ９８／００５２４、ＷＯ９８／２６０４８およびＷＯ００／５０５７３に記載されたような超遠心、クロマトグラフィー）に従い更に精製してもよい。
【０１３５】
他の実施態様によれば、本発明は、次の工程を含んでなる、ウイルスまたはウイルス様粒子を製造する方法に関する：
（ａ）野生型ｐIXタンパク質をコードするアデノウイルスベクターで適切な宿主細胞を形質転換する工程；
（ｂ）コードされるｐIXタンパク質が本発明によるｐIXタンパク質となるように、前記アデノウイルスベクター中のｐIXタンパク質のコード配列を改変する工程；
（ｃ）工程（ｂ）のアデノウイルスベクターからのウイルスまたはウイルス様粒子の形成に適した条件下で前記宿主細胞を培養する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）で形成されたウイルスまたはウイルス様粒子を培養物から回収する工程。
【０１３６】
好ましくは、この方法には、表面で結合部分を発現するように遺伝子修飾されたウイルスまたはウイルス様粒子の細胞培養物における産生が伴い、これにより、この結合部分が本発明によるｐIXタンパク質に含まれる。ウイルスまたはウイルス様粒子は改変前にその宿主で増殖させるが、結合特異性を変える改変が行われると、そのウイルスまたはウイルス様粒子は標的細胞で増殖させる。そのため、例えば、結合部分が乳癌細胞抗原を認識する場合には、改変されたウイルスまたはウイルス様粒子はその抗原を発現する乳癌細胞培養物で増殖させる。
【０１３７】
他の実施態様によれば、本発明は、上記のアデノウイルスｐIXタンパク質、核酸分子または本発明によるアデノウイルスベクターを含んでなるか、または前記のようなウイルスまたはウイルス様粒子を製造する方法により得られる、ウイルスまたはウイルス様粒子に関する。
【０１３８】
有利には、本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子は、さらに、その宿主細胞と実質的に結合することができないものであり、即ち上記のウイルスまたはウイルス様粒子が誘導された野生型ウイルスまたはウイルス様粒子の天然宿主細胞とは結合しえない。「」誘導される」という用語は、例えばウイルスゲノムの非必須部分を欠失させるおよび／または発現させる異種配列を挿入することで、それを遺伝子送達に適合させる改変と、本明細書に記載されたようなｐIXタンパク質およびそのコード配列の改変とを除いて、野生型ウイルスまたはウイルス様粒子が本発明のこの実施態様によるウイルスまたはウイルス様粒子と構造的に対応していることを意味している。「その宿主細胞と実質的に結合することができないウイルスまたはウイルス様粒子」とは、改変ウイルスが宿主細胞に対する未改変ウイルスの結合親和性の２０％以下、好ましくは１０％以下、更に好ましくは５％以下、更に好ましくは１％以下を有していることを意味する。この結合性低下は、例えば、上記のように先行技術で開示されたようにファイバータンパク質を改変することにより得られる（例えば、米国特許第５，７５６，０８６号明細書、米国特許第５，８８５，８０８号明細書、ＥＰ９９１７６３、ＰＣＴ  ＦＲ００／０１５５９またはＰＣＴ  ＦＲ００／０３２６３）。
【０１３９】
本発明の好ましい実施態様によれば、ウイルスまたはウイルス様粒子は、ウイルスまたはウイルス様粒子を標的細胞と結合させるための結合部分を含んでいる、という意味で改変されたｐIX部分により付与される、改変された結合特異性を含んでなる。好ましくは、上記のウイルスまたはウイルス様粒子はその宿主細胞と実質的に結合することができないものである。
【０１４０】
本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子が感染能力に関して特異性を示す細胞を識別するために、本明細書においては「宿主細胞」と「標的細胞」とが区別されている。しかしながら、更に以下では、例えば標的細胞中における外来ヌクレオチド配列の機能が記載されている部分では、この区別は適用しなくてよい。したがって、「標的細胞」とは対照的に、「宿主細胞」という用語は、未改変ナイーブウイルスが、細胞の表面でそのレセプター様分子および同族レセプター様分子を用いることにより結合しうる、細胞をいう。一部の環境では、本発明のこの態様において、例えば同族レセプター様分子ではない存在を結合部分が宿主細胞で認識する場合には、宿主細胞は標的細胞でもある。
【０１４１】
本発明の好ましい実施態様によれば、標的細胞は真核細胞、特に哺乳類細胞であり、本発明は遺伝子療法および癌治療の分野で用途を有することが期待される。
【０１４２】
ウイルスまたはウイルス様粒子が「複製欠陥」であることも好ましい。「複製欠陥」とは、遺伝物質が操作された、感染した細胞で分裂または増殖しえないウイルスを意味する。
【０１４３】
本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子の結合部分は、標的細胞結合特異性をもたらす。
【０１４４】
一つの好ましい実施態様によれば、ウイルスまたはウイルス様粒子はアデノウイルスである。好ましくは、このようなウイルスまたはウイルス様粒子では、遺伝子産物がＥ１Ａタンパク質ともはや相互作用しないように、Ｅ１Ｂ遺伝子が実質的に欠失または改変されている。Ｅ１Ａタンパク質はアポトーシスを促すが、通常その作用はＥ１Ｂにより阻害される。便宜上、Ｅ１Ｂ遺伝子は挿入により不活化される；好ましくは、細胞毒性遺伝子は、以下で記載されているように、Ｅ１Ｂ遺伝子にまたはその近くで挿入される。
【０１４５】
Ｅ１、Ｅ３、およびＥ４の上流部位は、組換えアデノウイルスの作製に際して、外来ＤＮＡ配列の挿入のための部位として用いうる（例えば、Berkner and Sharp(1984)Nucl.Acids Res.,12,1925-1941；Chanda et al.(1990)Virology,175,535-547；HajAhmad and Graham(1986)J.Virol.,57,267-274；Saito et al.,(1985 )J.Virol.,54,711-719；すべて参考のためここに組み込まれる）。アデノウイルス粒子中へパッケージングされるＤＮＡ分子のサイズ上限は野生型ゲノムの約１０５％であり、約２ｋｂの余分なＤＮＡのみがウイルスＤＮＡの欠失を伴うことなく挿入しうる。Ｅ１は細胞培養でウイルス複製に必須であるが、Ａｄ５ ＤＮＡで形質転換されてＥ１を構造的に発現する２９３またはＰＥＲＣ６細胞でウイルスが増殖されるときには、外来ＤＮＡがＥ１配列の代わりに用いうる（参考のためここに組み込まれるGraham et al.,1977,J.Gen.Virol.,36,59-72およびＵＳ６，０３３，９０８参照）。Ａｄ５のＥ３から１．９ｋｂを欠失させたいくつかのベクターが、細胞培養でウイルス複製を妨げることなく構築された（参考のためここに組み込まれるGraham and Prevec(1992),”Vaccines:New Approaches to Immunological Problems”R.W.Ellis(Ed.),Butterworth-Heinemann,Boston,Mass.,page 364-390で総説されている）。このようなベクターでは４ｋｂ以内の外来ＤＮＡの挿入を行える。すべてのＡｄ許容細胞系でＥ３レプリケートにインサートを含む組換えアデノウイルス、およびＥ３インサートを含むいくつかのアデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボ双方で外来遺伝子を効率的に発現することが示された。上記のように、宿主細胞への野生型アデノウイルスおよびアデノウイルス様粒子の付着および侵入を通常媒介する細胞レセプターへの結合性を実質的に減少または消失させるように、アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子は（例えば、ファイバー、ペントン基部および／またはヘキソンで）改変してもよい。
【０１４６】
実質的に複製欠陥のアデノウイルスは、Ｅ１Ａタンパク質の欠損を生み出すことにより作製してもよい。適切には、Ｅ１Ａ遺伝子を欠失させるか、またはＥ１Ａタンパク質の発現を妨げる変異をＥ１Ａ遺伝子内で作製することにより、これが行われる。適切な変異の例は、Ｅ１Ａコード領域内の欠失、ナンセンス変異、およびフレームシフト変異である。
【０１４７】
本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子は、（Ｅ１、Ｅ２および／またはＥ４領域によりコードされる）ウイルス複製に必須のミッシング機能をトランスで発揮する相補細胞系で増殖させうる。広く用いられている相補系は、胚腎臓系２９３（Graham et al.,1977,J.Gen.Virol.,36,59-72）、９１１細胞（ＥＣＡＣＣにＮｏ．９５０６２１０１で寄託‐Fallaux et al.(1996),Hum.Gene Ther.,7 ,215-222）または胚網膜系ＰＥＲＣ６（ＥＣＡＣＣ Ｎ°９６０２２９４０）細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６細胞はＰＧＫ‐Ｅ１網膜芽細胞の略記である。Ｃ６はクローン数である。ＰＧＫ‐Ｅ１は、構築物のアデノウイルス５型Ｅ１Ａ領域がヒトＰＧＫプロモーターで駆動されることを表わしている。ＰＥＲ細胞は、アデノウイルス５型のＥ１配列（ｎｔ４５９‐３５１０）で形質転換されたヒト胚網膜芽細胞である（ＷＯ９７／００３２６）。
【０１４８】
本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子を増殖させる上で有用な細胞には、それに加えて、現存細胞系、例えば２９３またはＰＥＲ．Ｃ６細胞系からの誘導体もある。このような誘導細胞は、アデノウイルスゲノムで欠失をトランスで補うために必要な遺伝子を発現するか、または欠陥アデノウイルスベクターの複製を支えるべきである。このような細胞は、例えばＥ１、Ｅ２、Ｅ４および／または後期機能を発現しうる（例えば、ＥＰ９１９６２７、米国特許第６，０４０，１７４号明細書、米国特許第６，１３３，０２８号明細書、米国特許第６，０３３，９０８号明細書または米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照）。
【０１４９】
本発明において、「欠失」または「欠く」という用語は、標的領域における少くとも１つのヌクレオチドの欠損をいい、欠失はもちろん連続でもまたは不連続でもよい。一般的に、このような欠失は相応の変化をもたらす：例えば、欠失は、欠失のない相当遺伝物質と比較して、欠失のある遺伝物質によりコードされた産物の機能を毀損または改善することになる。例えば、Ｅ１領域の欠失はアデノウイルス複製の欠損をもたらす。これらの用語は、当業者に広く用いられている。アデノウイルスゲノムの領域の「全部または一部」が欠失してもよく、これは当該領域の全体または一部のみが除かれていることを意味する。上記領域によりコードされた少くとも１種の発現産物の産生を妨げるような欠失が好ましい。このように、それらはコード領域または調節領域、例えばプロモーター領域に存在してもよく、遺伝子の読取り枠を壊したり、またはプロモーター領域を非機能化させたりというように、少くとも１つのヌクレオチドに影響を与える。当該欠失には、上記領域の１以上の遺伝子またはその領域の全体における部分的欠失も含む。
【０１５０】
本明細書において用いられている「ウイルスまたはウイルス様粒子」という用語は、「アデノウイルスキャプシド」と同義であり、ひいては「アデノウイルス粒子」および「アデノウイルス偽粒子」の双方を表わす一般的用語である。「アデノウイルス粒子」とは、一般にアデノウイルスと称されるものを形成するか、あるいは核酸が、ウイルスポリペプチドと会合していながら、ウイルスキャプシドのようなウイルス要素中へ含まれていない複合体を形成する、ウイルスポリペプチドと会合した「アデノウイルスゲノム」（組換えまたは野生型）をいう（米国特許第５，９２８，９４４号明細書およびＷＯ９５２１２５９参照）。反対に、「非裸」とは、(ｉ)一般にウイルス（アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルスなど）と称されるものを形成するか、あるいは核酸が、ウイルスポリペプチドと会合していながら、ウイルスキャプシドのようなウイルス要素中へ含まれていない複合体を形成するウイルスポリペプチドと、上記の核酸が会合していることを意味する（米国特許第５，９２８，９４４号明細書およびＷＯ９５２１２５９参照）。本発明によるアデノウイルス粒子は、本発明によるアデノウイルスベクターに欠陥のある機能をトランスで発揮させる相補系、例えば従来の２９３系での継代により作製することができる。これらの作製技術は当業者に知られている（Graham and Prevec,1991,Methods in Molecular Biology,vol.7,109-128.Ed:E.J.Murey,The Human Press Inc.）。
【０１５１】
更に、本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子は、標的細胞へ非ウイルス高分子を導入する際に有用である。このような導入が行える手段には２つある。第一に、アデノウイルスベクターは、通常のアデノウイルス成分の代わりに、またはそれに加えて、そのアデノウイルスベクター内にパッケージングされた非ウイルス高分子を導入するために用いられる（Berkner,K.L.,BioTechniques,6,606-629(1988)）。例えば、アデノウイルスのゲノムは、外来ヌクレオチド配列を組み込むように改変しうる。次いで、その組換えアデノウイルスは、細胞へ侵入して、その外来ヌクレオチド配列を核へ導入しうる感染性ウイルスを構成するようにパッケージングされる（Rosenfeld et al.,Science,252,431-434(1991)；Rosenfeld et al.,Cell,68,143-155(1992)；Quantin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,89,2581-2584(1992)；Berkner,K.L.,BioTechniques,6,606-629(1988)）。
【０１５２】
第二に、ウイルスまたはウイルス様粒子は、アデノウイルスベクターの表面へ連結された、あるいは高分子がコインターナリゼーション(cointernalization)される「バイスタンダー」プロセスにより、アデノウイルスレセプター‐エンドソーム複合体にカーゴとして組み込まれた、非ウイルス高分子の導入を媒介するために用いられる（Otero et al.,Virology,160,75-80(1987)；FitzGerald et al.,Cell,32,607-617(1983)；Seth et al.,Mol.Cell Biol.,4,1528-1533(1984)；Yoshimura,Cell Struct.Funct.,10,391-404(1985)；Defer et al.,J.Virol.,64,3661-3673(1990)）。
【０１５３】
アデノウイルスが非ウイルス生体物質のインターナリゼーションを増大させるメカニズムは、標的細胞原形質膜の透過性を増すことによるか（Otero et al.,Virology,160,75-80(1987)）、またはそれより高い可能性で、アデノウイルスレセプター複合体が膜に集合してインターナライズされたときの、「無害なバイスタンダー」としての外来生体物質のコインターナリゼーションによる（FitzGerald et al.,Cell,32,607-617(1983)；Seth et al.,Mol.Cell Biol.,4,1528-1533(1984)；Yoshimura,Cell Struct.Funct.,10,391-404(1985)；Otero et al.,Virology,160,75-80(1987)；Defer et al.,J.Virol.,64,3661-3673(1990)）と考えられている。これらのプロセスはアデノウイルスに特異的なものではなく、同様の現象がピコルナウイルスのような他の非包膜ウイルス（Fernandez-Puentes et al.,Cell,20,769-775(1980)；Otero et al.,Virology,160,75-80(1987)；Carrasco,Virology,113,623-629(1981)）、並びにパラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルスおよびトガウイルスを含めた包膜ウイルス（Fernandez-Puentes et al.,Cell,20,769-775(1980)；Otero et al.,Virology,160,75-80(1987)；Yamaizumi et al.,Virology,95,216-221(1979)；Carrasco et al.,Virology,117,62-69(1982)）で観察されている。
【０１５４】
高分子のウイルス媒介コインターナリゼーションに関する研究対象のほとんどは、毒素および様々なリポータータンパク質を含めた、タンパク質のコインターナリゼーションに集中している（Ferna-Puentes et al.,Cell,20,769-775(1980)；FitzGerald et al.,Cell,32,607-617(1983)；Seth et al.,Mol.Cell Biol.,4,1528-1533(1984)；Otero et al.,Virology,160,75-80(1987)；Defer et al.,J.Virol.,64,3661-3673(1990)；Carrasco,Virology,113,623-629(1981)；Yamaizumi et al.,Virology,95,216-221(1979)；Carrasco et al.,Virology,117,62-69(1982)）。コインターナリゼーションが核酸のアデノウイルス媒介導入に用いうるという概念が、評価はないものの、Otero およびCarrasco（Otero et al.,Virology,160,75-80(1987)）により示唆された。事実、アデノウイルスを用いた核酸の導入に関する、それより最近のアプローチでは、細胞中へ侵入しうる分子への核酸の結合による核酸導入に集中していた。例えば、１つのアプローチでは、核酸は特定の細胞表面レセプターと結合しうるポリリジン‐糖タンパク質担体複合体の一部であるか、または荷電ポリペプチドのような非特異的リガンドと複合化される（Rosenfeld et al.,Science,252,431-434(1991)；Curiel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,88,8850-8854(1991)；Rosenfeld et al.,Cell,68,143-155(1992)；Quantin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,89,2581-2584(1992)；Curiel et al.,Hum.Gene Therapy,3,147-154(1992)；Cotten et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,89,6094-098(1992)；Cotten et al.,J.Virology,67,3777-3785(1993)）。更に最近のアプローチにおいて、核酸は、アデノウイルスキャプシドタンパク質に親和性を有する抗体への、ポリリジン残基を介した核酸の連結により、アデノウイルスキャプシドの外側へ結合させうる（Curiel et al.,Human Gene Ther.,3,147-154(1992)）。そのため、Oteroらによるこの初期の示唆にもかかわらず、核酸の導入のためにアデノウイルス駆動ＲＭＥを用いうる可能性がないことを、研究者らは明らかに認識していた。
【０１５５】
更に、核酸を導入する上でのウイルスまたはウイルス様粒子の使用は、用いられるリガンドに対する特異的レセプターにより制限され、即ち特異的レセプターはトランスフェクションが行われる細胞表面に存在していなければならない。加えて、ＤＮＡが細胞中への導入に際していかなる分子へも物理的に結合されていないときに、良いトランスフェクション結果が得られることが、最近発見された（Wolff et al.,Science,247,1465(1990)；Acsadi et al.,Nature,352,815(1991)）。この発見は、細胞トランスフェクションのために１以上の他の部分へのＤＮＡの結合を要するという、細胞へのＤＮＡのアデノウイルス媒介導入の現行アプローチにおける制限面を浮き彫りにしている。
【０１５６】
本発明は、本発明によるアデノウイルスｐIXタンパク質、核酸分子またはアデノウイルスベクターを含んでなるか、あるいは本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子に感染している、真核宿主細胞にも関する。その細胞は、有利には哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞であり、ゲノムに組み込まれた形、または好ましくは非組込み（エピソーム）形で、上記のベクターを含むことができる。
【０１５７】
本発明において、「真核宿主細胞」という用語は、哺乳類（好ましくはヒト）の組織、器官など、または単独細胞における具体的構成に関していかなる制限もない、と広く理解するべきである。このような細胞は唯一のタイプの細胞でもまたは異なるタイプの細胞のグループでもよく、哺乳類器官の培養細胞系、一次細胞および増殖細胞を含むが、特に好ましいものはヒト起源である。適切な宿主細胞には、造血細胞（全能性幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、樹状細胞、非ヒト細胞など）、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋、心筋または平滑筋）、繊維芽細胞があるが、それらに限定されない。
【０１５８】
本発明は、本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子の製造、あるいは上記のようにこのようなウイルスまたはウイルス様粒子を製造する方法の適用に適した、相補細胞系にも関する。
【０１５９】
このような相補系は、特に、５′ＩＴＲを除いてアデノウイルスのゲノムのＥ１領域の一部を含んでなる相補要素を含有してもよい；その相補要素は、欠陥アデノウイルスベクターをトランスで補えるものであり、上記相補系のゲノムへ組み込まれるか、または発現ベクター中へ挿入される。とりわけ宿主細胞へ含まれるアデノウイルスベクターに欠陥があるときには、特に本発明による真核宿主細胞は相補系の細胞である。
【０１６０】
本発明において、「相補系」という用語は、アデノウイルスベクターに欠陥がある機能をトランスで発揮しうる真核細胞をいう。言い換えると、それは、上記アデノウイルスベクターの複製および包膜化に必要なタンパク質、ウイルス粒子と結合するために必要な自らは産生しえない初期および／または後期タンパク質を産生しうる。当然のことながら、上記の部分はヌクレオチドの変異、欠失および／または付加により改変してもよいが、これらの改変がその相補能力を損なうものであってはならない。そのため、例えば、Ｅ１機能に欠陥のあるアデノウイルスベクターはＥ１用の（即ち、そのベクターが産生しえない、Ｅ１領域によりコードされたタンパク質または一連のタンパク質を、トランスで供給しうる）相補系で増殖されねばならず、Ｅ１およびＥ４機能に欠陥のあるベクターはＥ１およびＥ４用の（即ち、Ｅ１およびＥ４領域によりコードされた必要タンパク質を供給する）相補系で増殖され、最後に、Ｅ１、Ｅ２およびＥ４機能に欠陥のあるベクターはその３機能用の相補系で増殖される。上述のように、Ｅ３領域は非必須であり、特に補う必要はない。
【０１６１】
本発明による相補系は、無限に分裂しうる不死細胞系、または一次系から誘導しうる。本発明の目的によれば、本発明による相補系は、あらゆる欠陥アデノウイルスベクター、特に本発明による欠陥アデノウイルスベクターの包膜化に有用なものである。
【０１６２】
本発明はさらに、薬学上許容しうるビヒクルまたは担体と組み合わせて、治療剤および／または予防剤として、本発明によるアデノウイルスベクター、ウイルスもしくはウイルス様粒子、真核宿主細胞、または相補細胞系を含んでなる、医薬組成物に関する。上記薬剤は前記のような治療上有用な遺伝子を発現しうることが好ましい。
【０１６３】
本発明による医薬組成物はいかなる適切な経路で投与してもよい。脊椎動物標的組織、更に具体的には筋肉への投与は、異なる送達経路（全身送達および標的送達）により行なうことができる。本発明によれば、医薬組成物は好ましくは骨格筋中へ投与されるが、しかしながら、その投与は、例えば非骨格筋、皮膚、脳、肺臓、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、目、腺、結合組織、血液、腫瘍のものを含めて、脊椎動物の他の組織において行ってもよい。同様に、所定の作用部位への治療上有用な遺伝子の発現を導くために、標的細胞中へのその取込みを導けるターゲティング分子と、核酸が会合される。遺伝子療法に関する文献では、生体の細胞内における遺伝情報の効率的なターゲティング送達と発現に関して、多くのメカニズムを紹介している。医薬組成物の投与は、シリンジまたは他の器具で、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜腔内、冠動脈内または腫瘍内注入により行ってもよい。吸入またはエアロゾル経路のような経皮投与も考えられる。注入、特に腫瘍内、静脈内または筋肉内注入が好ましい。
【０１６４】
本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子は、希釈剤および担体、例えば等張塩水（静脈内投与されるとき）の標準無菌無発熱物質処方物として、いずれか適切な手法で、通常非経口で、例えば静脈内、腹腔内または膀胱内に投与しうる。
【０１６５】
医薬組成物は、重篤な免疫反応を引き起こす投与医薬組成物の大きなリスクなしに、患者への反復投与向けに設計または使用しうる。投与は、１回分の用量でまたは数回に分けた用量で、１回でまたはある時間間隔で数回に分けて行われる。反復投与の場合には、１回で投与される医薬組成物の用量を減少させてもよい。投与経路および適切な用量は、いくつかのパラメーター、例えば個々の患者、疾患の副作用または治療前のアルブミンレベルの相関関係に応じて変わる。
【０１６６】
投与容量は、好ましくは約１０：１〜５００ｍｌ、最も好ましくは約１００：１〜１００ｍｌである。投与容量は、投与経路、治療される患者および患者の体重に応じて変更しうる。
【０１６７】
本発明による医薬組成物は、遺伝病、例えば血友病、嚢胞性繊維症またはDucheneおよびBecker型ミオパシー、癌、例えば癌遺伝子またはウイルスにより誘導されるもの、レトロウイルス疾患、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染による後天性免疫不全症候群）、および再発性ウイルス病、例えばヘルペスウイルス性感染のような、障害の予防または治療用として特に考えられる。本発明による組成物は、癌に伴う障害、症状または疾患の予防または治療用として特に考えられる。「癌」という用語は、汎発または局在腫瘍、転移、癌性ポリープおよび前新生物性病変（例えば、異常形成）、並びに望ましくない細胞増殖による疾患を含めた、あらゆる癌性状態を包含している。様々な腫瘍が本発明の組成物による治療向けに選択される。一般的に、固形腫瘍が好ましいが、白血病およびリンパ腫も、特に、それらが固形の塊を形成するか、または腫瘍細胞が非病原性正常細胞から物理的に分けられるように適切な腫瘍関連マーカーが存在しているならば、治療しうる。例えば、急性リンパ性白血病細胞は、白血病特異性マーカー“ＣＡＬＬＡ”を有している点で、他のリンパ球から区別される。本発明において考えられる癌には、グリア芽腫、肉腫、黒色腫、肥満細胞腫、癌腫（例えば、結腸直腸および腎臓細胞癌腫）および乳房、前立腺、精巣、卵巣、子宮頚部（特に、パピローマウイルスにより誘導されるもの）、肺臓（例えば、大細胞、小細胞、扁平および腺癌を含めた肺癌腫）、腎臓、膀胱、肝臓、結腸、直腸、膵臓、胃、食道、喉頭、脳、咽喉、皮膚、中枢神経系、血液（リンパ腫、白血病など）、骨などの癌があるが、これらに限定されない。
【０１６８】
本発明による医薬組成物は常法で製造しうる。特に、治療有効量の治療剤または予防剤が希釈剤のようなビヒクルと組み合わされる。本発明による組成物は、エアロゾルにより、または当業界で使用上一般的な経路、特に経口、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、肺内または気管内経路で投与しうる。投与は１回分の用量で、またはある時間間隔で１回以上に分けた用量で行う。適切な投与経路および用量は、様々なパラメーター、例えば治療される個体または治療される障害、または一方で導入すべき対象遺伝子に応じて変わる。一般的には、本発明による医薬組成物は、１０４〜１０１４、有利には１０５〜１０１３、好ましくは１０６〜１０１１の本発明によるアデノウイルスの用量を含んでなる。医薬組成物、特に予防目的に用いられるものは、それに加えて、薬学上の観点から許容しうるアジュバントを含んでもよい。
【０１６９】
本発明は、治療有効量の本発明によるアデノウイルスベクター、ウイルスもしくはウイルス様粒子、真核宿主細胞、または相補細胞系が、このような治療を要する患者へ投与される、治療方法にも関する。好ましくは、その治療は遺伝子療法により、in vivoまたはex vivoのいずれの遺伝子療法でもよい。したがって、本発明は、このような予防、治療および／または予防接種の必要な患者の予防、治療および／または予防接種を目的とする医薬組成物の製造のための、本発明によるアデノウイルスベクター、ウイルスもしくはウイルス様粒子、真核宿主細胞、または相補細胞系の使用に関する。好ましくは、上記のアデノウイルスベクター、ウイルスもしくはウイルス様粒子、宿主細胞、または相補細胞系は、治療上有用な遺伝子を発現しうるものとされる。
【０１７０】
好ましい実施態様によれば、本発明による方法は、例えば血管またはリンパ管のような体液管中へ投与からなり、輸入性および／または輸出性体液管への注入を組み合わせて、その管の透過性を増加させることにより、有利に改善しうる。特に好ましい実施態様によれば、上記の増加は、静水圧の増加（即ち、流出および／または流入を妨げることによる）、浸透圧の増加（高張液による）および／または生物活性分子の導入（例えば、投与組成物中のヒスタミン）により得られる（例えば、ＷＯ９８／５８５４２参照）。
【０１７１】
予防剤および／または治療剤に加えて、本発明による医薬組成物は薬学上許容される担体を含有してもよい。
【０１７２】
「薬学上許容される担体」は、ヒトまたは動物の治療のための方法において、医薬組成物の使用を可能にする。その特定の場合において、担体は薬学上適切な注入可能担体または希釈剤である（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th ed.,1980,Mack Publishing Co.参照）。このような担体または希釈剤は薬学上許容され、即ち用いられる用量および濃度で受容者に対して無毒性なものである。それは好ましくは等張性、低張性または弱高張性であり、スクロース液によりもたらされるような、比較的低いイオン強度を有する。更に、それは何らかの関連溶媒、即ち水性または部分的水性の液体担体を含有してもよく、これは無菌無発熱物質水、分散媒体、コーティングおよび相当物、または希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、乳化剤、安定剤またはアジュバントからなる。医薬製剤のｐＨは、インビボ適用で有用となるように、適切に調整および緩衝化される。それは液体溶液として、または投与前に溶液へ懸濁しうる固体形（例えば、凍結乾燥品）として調製しうる。注入可能な処方物向けの担体または希釈剤の代表例には、水、好ましくは生理的ｐＨで緩衝化された等張液（例えば、リン酸緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液）、マンニトール、デキストロース、グリセロールおよびエタノール、並びにヒト血清アルブミンのようなポリペプチドまたはタンパク質がある。例えば、このような処方物は、１０mg/mlマンニトール、１mg/ml ＨＳＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２および１５０ｍＭ ＮａＣｌで本発明による使用に従い製造された、医薬組成物からなる。別の好ましい処方物は、１Ｍスクロース、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５４mg/Ｌ Ｔｗｅｅｎ８０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５を含んでなる。
【０１７３】
本発明のこれら治療的な態様によれば、好ましい実施態様は、好ましくは間接的細胞毒性機能を有する分子についてコードする遺伝子を含有した、本発明によるウイルスまたはウイルス様粒子の送達方法に関する。
【０１７４】
適切には、間接的細胞毒性機能とは、プロドラッグを毒性薬物へ変換する酵素をいう。このようなウイルスまたはウイルス様粒子の場合には、ウイルスまたはウイルス様粒子が標的細胞と結合し、その核酸を細胞へ送達して、間接的細胞毒性機能を発現すると、それには典型的には１日程度を要するのであるが、プロドラッグが投与される。ウイルスまたはウイルス様粒子とプロドラッグとの投与のタイミングは、創意工夫を必要とせずに最適化しうる。
【０１７５】
プロドラッグの用量は通常の基準に従い医師により選択される。ウイルスまたはウイルス様粒子の用量も、通常の基準に従い、腫瘍治療の場合には、特に腫瘍のタイプ、段階および位置と患者の体重を考慮して、同様に選択される。
【０１７６】
治療の期間は、ウイルスまたはウイルス様粒子との免疫反応の速さおよび程度に部分的に依存する。
【０１７７】
ウイルスまたはウイルス様粒子の一部は、それだけで、または適切なプロドラッグと一緒であれば、認識可能（表面）物を選択的に呈示する腫瘍または他のクラスの細胞で、原則的に細胞の破壊に適する。ウイルスまたはウイルス様粒子を用いて治療される癌のタイプの例は、前記のもの、特に乳房、前立腺、結腸、直腸、卵巣、精巣および脳の癌である。その化合物は主にヒトに向いているが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタおよびヒツジを含めた他の哺乳類を治療する上でも用いうる。
【０１７８】
他の好ましい実施態様によれば、本発明は、例えばβ‐インターフェロンとして治療上有用な遺伝子を発現するアデノウイルスベクターのような前記化合物に加えて、細胞でトランスフェクション能力または遺伝子発現を改善しうる少くとも１種のアジュバントを含んでなる、医薬組成物に関する。このようなアジュバントは、クロロキン、プロトン性化合物、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１‐メチル  Ｌ‐２‐ピロリドンまたはその誘導体、非プロトン性化合物、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ‐ｎ‐プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリルまたは誘導体からなる群より選択される。組成物は、有利には、ポリペプチドの形で、またはサイトカインをコードするポリヌクレオチドとして配合される、サイトカイン源も含んでよい。好ましくは、上記のサイトカインはインターロイキン１０（ＩＬ‐１０）（ＥＰ‐Ａ‐９６７２８９）である。治療用組成物は、アクチンＧのようなヌクレアーゼインヒビター、または特定濃度のマグネシウムもしくはリチウムを更に含むことができる。
【０１７９】
更に、特定の実施態様によれば、医薬組成物は、形質転換された宿主細胞、好ましくは更に被包されたヒト筋肉細胞を含んでなる。パーキンソン病（Tresco et al.,1992,ASAIO J.,38,17-23）または筋萎縮性側索硬化症（Aebischer et al.,1996,Hum.Gene Ther.,7,851-860）の治療で被包細胞の移植を行える細胞被包方法が、以前に記載されていた。その具体的な実施態様によれば、形質転換細胞は微孔質膜を形成する化合物により被包され、その被包細胞がインビボで更に移植される。対象の細胞を含有した、例えば長さ約１ｃｍのカプセルは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）から作製された中空微孔質膜を用いて製造される（Akzo Nobel Faser AG,Wuppertal,Germany；Deglon et al.,1996,Hum.Gene Ther.,7,2135-2146）。この膜は１，０００，０００Ｄａ以上の分子量カットオフ値を有しているため、カプセルの内部と外部との間でタンパク質および栄養素を自由に通過させ、一方で移植細胞と宿主細胞との接触を妨げる。捕捉細胞は、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜腔内、冠動脈内または腫瘍内に移植される。上記の形質転換宿主細胞が筋芽細胞である場合には、それは、注入部位から、対象遺伝子の発現（例えば、β‐インターフェロン）が生じうる筋肉へと移動しうる。
【０１８０】
本発明は、好ましい実施態様および具体例を参考にしながら説明されてきたが、当業者であれば、前記の明細書を読んだ後で、ここで記載されたプロセスおよび産生細胞に、様々な変更、相当物への置換および他の改変を加えられるであろう。したがって、ここで特許請求された保護は、添付された特許請求の範囲およびそれに相当するものに含まれた規定によってのみ限定されることになる。
【０１８１】
これらおよび他の態様は、開示されているか、または本発明の説明および例から明らかであり、そこに包含されている。本発明に従い用いられる方法、使用および化合物のいずれかに関する他の文献は、例えば電子機器を用いて、公共図書館から入手しうる。例えば、インターネットから、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlでアクセスしうる、公共データベース「Medline」が利用される。他のデータベースおよびアドレス、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov、http://www.infobiogen.fr、http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html、http://www.tigr.orgも当業者に知られており、例えばhttp://www.lycos.comを用いて得てよい。バイオテクノロジーに関する特許情報の概要と、従前のサーチおよび現行の知見に有用な特許情報に関する関連出所の通覧は、Berks,TIBTECH 12(1994)352-364でみられる。
【０１８２】
本発明は、例を挙げて説明されてきたが、用いられてきた専門用語は、限定というよりも、記載上の用語という性質を帯びている、と理解すべきである。明らかに、本発明の多くの修正およびバリエーションが上記開示からみて可能である。したがって、添付された特許請求の範囲内において、本発明はここで具体的に記載されたものとは異なって実施しうる、と理解すべきである。
【０１８３】
特許、文献およびデータベースエントリーに関する前記開示のすべては、このような個別の各特許、文献およびエントリーが具体的かつ個別的に示されて、参考のために組み込まれているのと同様に、それら全体で参考のためここで具体的に組み込まれる。
【実施例】
【０１８４】
下記例は、本発明の一態様のみを説明している。
【０１８５】
以下の構築は、Maniatisら（1989,Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.）で詳述されているように、遺伝子工学および分子クローニングの一般的技術に従い行われる。
【０１８６】
細菌プラスミドを用いたクローニングの回収ステップをEscherichia coli（E.coli）株５ＫまたはＢＪの継代により行い、一方でファージＭ１３由来のベクターを用いたものをE.coli ＮＭ５２２の継代により行う。ＰＣＲ増幅のステップについては、ＰＣＲ Protocols--A guide to methods and applications（1990,Ed.Innis,Gelfand,Sninsky and White,Academic Press Inc.）で記載されているようなプロトコールを適用する。
【０１８７】
下記の異なる構築物中へ挿入された断片は：
GenBankデータバンクで参照番号Ｍ７３２６０として開示されているような、Ａｄ５ゲノム
GenBankデータバンクで参照番号Ｊ０１９４９として開示されているようなアデノウイルス２型（Ａｄ２）ゲノム、GenBankデータバンクで参照番号Ｊ０２４００として開示されているようなＳＶ４０ウイルスゲノム
のヌクレオチド配列において、それらの位置に応じて正確に示されている。
【０１８８】
例中で記載された実験は次のように要約される：アデノウイルス（Ａｄ）５型遺伝子の産物（ｐIX）は、ウイルス正二十面体の安定性へ能動的に関与して、キャプシドセメントとして作用することが知られている。ｐIXはいくつかのウイルスおよび細胞ＴＡＴＡ含有プロモーターの転写アクチベーターでもあり、Ａｄ発現プログラムのトランス活性化に寄与しているらしいことが、以前に証明された。以下で記載されているように、様々な変異誘発により、ｐIX性質の各々に関与する機能性ドメインが把握しうる：高度保存Ｎ末端ドメインの残基２２‐２６はタンパク質のキャプシド組込みに重要である；Ｃ末端ロイシンリピートは自己および可能であれば他のタンパク質とのｐIX相互作用に関与し、その性質はｐIX転写活性に重要である。ｐIXが後期感染細胞のウイルス誘導性核再構成に関与することも示された：自己集合により、そのタンパク質は、免疫蛍光染色では散在核小球として、および電子顕微鏡観察では透明非晶質球状封入体として出現する、特別な核構造の形成を誘導する。ロイシンリピートの保全も、これら封入体の形成にとって必須である。総合すると、結果はｐIXの多機能性を証明して、Ａｄ生物学への新たな知見をもたらしている。
【０１８９】
序説
複製欠陥アデノウイルス（Ａｄ）は、様々な分裂および分裂終了細胞タイプ中へ候補の治療遺伝子を効率的に導入して発現させる。これらの理由から、このようなウイルスは直接的インビボ遺伝子療法に有効なベクターを構築している。しかしながら、毒性、宿主炎症応答または一過性インビボトランスジーン発現のようないくつかの欠点は、ヒト遺伝子療法プロトコールでＡｄベクターの完全な成功を損なう。多数のファクターが関与しており、その中では機能が十分に理解されていないウイルスタンパク質が一部ある。
【０１９０】
本発明では、Ａｄ血清型２および５（Ａｄ２およびＡｄ５）からの遺伝子IXの産物（ｐIX）に注目していた。ｐIXは１４０残基（１４．３ｋＤａ）の小さなポリペプチドであり、成熟ウイルスキャプシド中へ組み込まれる。それはヘキソンタンパク質と会合して、正二十面体の各面の中央領域を構成するグループ・オブ・ナインヘキソン（ＧＯＮ）を形成する。このアセンブリーの化学量論量の正確な測定では、ＧＯＮあたり４つのトリマー、したがってビリオン当たり２４０分子として構成される、１２分子のｐIXが存在することを示した。そのタンパク質はキャプシドセメントとして作用し、こうしてビリオンの熱安定性を高めている。それは、完全長Ａｄ ＤＮＡの１００％以上をパッケージングする上で必須である。それらだけでも、ｐIXのこれら性質はＡｄベクターのデザインに際して考慮する上で十分重要であるように思われる。
【０１９１】
追加観察では、ｐIXがキャプシドタンパク質より多く、感染サイクルに際して追加機能を発揮しうることを、強く示唆している：(ｉ)遺伝子IXは、Ａｄ主後期プロモーター（ＭＬＰ）から脱カップリングされる、唯一の構造タンパク質コード遺伝子である；(ii)その発現パターンは異なる時間経過を歩み、他のすべての構造タンパク質の場合よりもかなり早く、感染後（ｐｉ）中間期に始まる；(iii)最後に、ｐIXは感染細胞核に蓄積して点在する。この核局在化と一致するように、ｐIXはいくつかのウイルスおよび細胞ＴＡＴＡ含有プロモーター、特にＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ４およびＭＬＰプロモーターの転写アクチベーターであることが以前に示された。この発見から、ｐIXがＡｄゲノム発現のトランス活性化に関与しうる、という仮説に到達した。
【０１９２】
構造および転写性質に関与するｐIXの機能性ドメインを正確に把握するために、ｐIXコード配列の様々な変異分析が行われた。タンパク質の高度保存Ｎ末端部分はキャプシド構造性質にとり必須であることが示され、一方Ｃ末端ロイシンリピート（推定超らせんドメイン）はトランス活性化機能に重要である。ｐIXの蓄積は特殊な核構造（透明非晶質封入体）の形成をもたらすが、その機能は現在未知である。本結果は、これら構造の形成がその超らせんドメインを介してｐIXの自己集合を伴うことを示唆している。
【０１９３】
材料および方法
細胞およびウイルス
単層ヒトＡ５４９細胞を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）補充のダルベッコ培地で増殖させた。２９３細胞は２％ＦＣＳ補充のダルベッコ改変イーグル培地で増殖させた。Ａ５４９細胞（８０％集密度）を５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／  細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で野生型（ｗｔ）Ａｄ２またはＡｄ５により感染させた。変異ウイルスゲノムを（Chartier et al.,1996,J.Virol.,70,4805-4810）記載のようにEscherichia coliで相同的組換えにより感染プラスミドとして構築した。すべてのベクターは、遺伝子IXの改変（下記参照）に加えて、Ｅ１（ヌクレオチド４５９‐３３３１）およびＥ３（ヌクレオチド２８５９２‐３０４７０）の欠失（Ａｄ Ｅ１°Ｅ３°）を含んでいる。この明細書全体にわたるヌクレオチド番号は、Chroboczekらの場合と同じである。変異ウイルスを２９３細胞で増幅させた。ウイルス増殖、滴定および貯蔵も以前に記載されていた（Lusky et al.,J.Virol.,72,2022-2032）。
【０１９４】
組換え真核細胞発現ベクター
野生型（ｗｔ）ｐIXコード配列を、以前に記載されたように（Lutz et al.,1997,J.Virol.,71,5102-5109）、ＰＣＲ増幅によりＡｄ５ゲノムから誘導し、３タイプの発現ベクター中へ挿入した：(ｉ) ヒトエストロゲンレセプター（ｈＥＲ）のＦドメインをコードする配列の３′側に位置する部位において、そのＮ末端で標識されたｗｔ ｐIX融合タンパク質（Ｆ／IX）を産生するｐＡＴ４ベクター（M.Vigneron提供）；(ii)未標識タンパク質を産生するｐＸＪ４１ベクター；(iii) ｗｔ ｐIXをコードする配列が、ヒトエストロゲンレセプターのＦドメインをコードする配列の５′側に位置する部位で挿入されて、そのＣ末端で標識されたｐIX融合タンパク質（IX／Ｆ）を産生するｐＸＸベクター、ｐＳＧ５誘導性ベクター。これらのベクターにおいて、ｗｔまたは変異 ｐIX配列の発現をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーおよび単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ‐１）チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター（ｐＡＴ４およびｐＸＪ４１）、またはＳＶ４０プロモーター（ｐＳＧ５誘導性ｐＸＸ）により導いた。
【０１９５】
Ａｄ Ｅ１ａプロモーター配列（＋１００〜＋５６０位：Chroboczekらによる位置番号）を、以前に記載されたように（Lutz et al.,1997,J.Virol.,71,5102-5109）、プロモーターレスｐＢＬＣＡＴ６ベクターのクロラムフェニコールアセチルトランフフェラーゼ（ＣＡＴ）リポーター遺伝子の前でサブクローニングした。
【０１９６】
（図２Ａで示されているような）ｐIXコード配列の点変異および欠失を、“QuickChange部位特異的変異誘発”システム（Stratageneカタログ＃２００５１８）のプロトコールに従うことで作製した。すべてのプラスミドを配列決定により確認した。
【０１９７】
オリゴヌクレオチド配列：
欠失ＷＡ：５′ＧＡＣＡＡＣＧＣＧＣＡＴＧＣＣＣＣＣＡ＊ＧＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧＴＧ３′(配列番号２)および３′ＣＴＧＴＴＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＧＧＧＴ＊ＣＣＣＣＡＣＧＣＡＧＴＣＴＴＡＣＡＣ５′(配列番号３)
＊は６塩基５′ＴＧＧＧＣＣ３′(３６７２‐３６７７：Ａｄ５に関する)および３′ＡＣＣＣＧＧ５′の欠失である。
【０１９８】
欠失ＳＹＬ：５′ＧＡＴＧＧＡＡＧＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣ＊ＡＣＡＡＣＧＣＧＣＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＧＧＧ３′(配列番号４)および３′ＣＴＡＣＣＴＴＣＧＴＡＡＣＡＣＴＣＧ＊ＴＧＴＴＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＧＣＣＣＣ５′(配列番号５)
＊は９塩基５′ＴＣＡＴＡＴＴＴＧ３′(３６４５‐３６５３)および３′ＡＧＴＡＴＡＡＡＣ５′の欠失である。
【０１９９】
変異ＲＱＮ：５′ＣＣＣＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣ３′(配列番号６)および３′ＧＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣ５′(配列番号７)
【０２００】
変異ＧＳＳＩＤＧＲ：５′ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣ３′(配列番号８)および３′ＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＧＣＡＧＴＣＴＴＡＣＡＣＴＡＣＧＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＣＧ５′(配列番号９)
【０２０１】
変異Ｌ１１４Ｐ：５′ＧＧＡＴＴＣＴＴＴＧＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＴＧＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣ３′(配列番号１０)および３′ＣＣＴＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＧＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＧＴＣＧ５′(配列番号１１)
【０２０２】
変異Ｖ１１７Ｄ：５′ＧＧＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧ３′(配列番号１２)および３′ＣＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＣ５′(配列番号１３)
【０２０３】
変異Ｌ１１４Ｐ／Ｖ１１７Ｄ：５′ＧＧＡＴＴＣＴＴＴＧＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧ３′(配列番号１４)および３′ＣＣＴＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＧＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＣ５′(配列番号１５)
【０２０４】
変異ｐｏｌｙ ａｌａ：５′ＣＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＧ３′(配列番号１６)および３′ＧＣＧＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＣ５′(配列番号１７)
【０２０５】
変異Ｅ１１３Ｋ：５′ＧＧＡＴＴＣＴＴＴＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＣＴＴＡＡＴＧＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣ３′(配列番号１８)および３′ＣＣＴＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＧＴＣＧ５′(配列番号１９)
【０２０６】
変異Ｑ１０１６Ｋ：５′ＧＡＣＧＧＣＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴＧＡＣＣＣＧＧＧ３′(配列番号２０)および３′ＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＧＴＴＴＣＧＴＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＣＣ３′(配列番号２１)
【０２０７】
トランスフェクション、細胞抽出物およびWesternブロット
Ａ５４９細胞をリン酸カルシウム共同沈降によりトランスフェクトした。ＣＡＴアッセイのために、細胞をトランスフェクションから３６時間後に回収し、抽出物を調製し、タンパク質濃度で標準化された一部を記載のようにＣＡＴ活性について分析した（Bocco et al.,1993,Oncogene,8,2977-2986）。ＣＡＴ活性を少くとも３回の独立した実験から測定し、バイオイメージングアナライザー（Fuji Photo Film Co.）で定量した。
【０２０８】
免疫沈降のために、０．４Ｍ ＫＣｌを含有した緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．９；２０％グリセロール；１ｍＭ ＤＴＴ；および０．１％ＮＰ４０）で３サイクルの凍結‐解凍により、細胞をトランスフェクションから３６時間後に回収した。組換えタンパク質の発現をWesternブロットにより確認した。非特異的結合タンパク質を吸着するプロテインＧ‐セファロースで追加清澄化ステップ後に、細胞抽出物を抗Ｆ抗体１μｇと共に２時間インキュベートし、その後でプロテインＧ‐セファロースビーズ３０μＬを加え、インキュベートを更に２時間続けた。次いで、２００ｍＭ ＫＣｌおよび０．５％ ＮＰ４０を含有した緩衝液Ａ(マイルドな塩条件)で、ビーズを室温で３回洗浄した。次いで樹脂をＳＤＳサンプル緩衝液中で５〜１０分間煮沸することにより解離させた。結合タンパク質は、以前に記載されたように（Bocco et al.,1993,Oncogene,8,2977-2986）、ＥＣＬシステム(Amersham)を用いて、特異的抗体によりWesternブロットで検出した。精製組換えＧＳＴ-IX融合タンパク質（抗ｐIX）に対する抗ｐIXウサギポリクローナル抗体を作製した。ｈＥＲ（Ｍａｂ３Ａ６）のＦドメインに対するモノクローナル抗体が記載されている（Lutz et al.,1997,J.Virol.,71,5102-5109）。
【０２０９】
電子顕微鏡観察
密集に近いＡ５４９細胞を３０分間かけて５〜１０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩのＡｄ５で感染させた。次いで、単層をＰＢＳですすぎ、新鮮培地を加え、細胞を固定前に１６および３０時間にわたり再インキュベートした。Ａ５４９細胞を未標識ｗｔ ｐIX産生ベクターでトランスフェクトし、３６時間培養した。細胞を４〜８℃で１時間かけて０．１Ｍセーレンセンリン酸緩衝液、ｐＨ７．２中４％ホルムアルデヒド(Merck)で固定した。固定ステップに際して、細胞をそれらのプラスチック基板からこすりとり、遠心した。得られたペレットをメタノールで濃度を漸増させながら脱水し、Lowicryl Ｋ４Ｍ（Polysciences Europe GmbH,Germany）に包埋した。重合を長波長ＵＶ光（Philips 蛍光管ＴＬ６Ｗ）下−３０℃で５日間、次いで室温で１日間行った。極薄切片をメッシュ２００のFormvarカーボン被覆銅グリッドで集めた。
【０２１０】
ｐIXウイルスタンパク質を含有した構造を同定するために、Lowicryl切片を載せたグリッドを数滴のAurion ＢＳＡ‐Ｃ（Biovalley,Franceから購入）（ＰＢＳ中０．０１％）上に浮かべて、バックグランウンドを消去してから、ＰＢＳで１／５０希釈された抗ｐIXポリクローナル抗体の存在下でインキュベートした（室温で３０分間）。ＰＢＳで速やかな洗浄後に、グリッドを直径１０ｎｍの金粒子（British Biocell International LTD,Cardiff,ＵＫ）と複合化されたヤギ抗ウサギＩｇＧの存在下室温で３０分間インキュベートし、酢酸ウラニルで染色し、８０ｋＶおよび倍率６０００〜２２０００倍でPhilips 400透過型電子顕微鏡により観察した。二次抗体が生体物質と非特異的に結合していないことを確認するために、一次抗体が省略されたときに標識化が生じないことを証明した。
【０２１１】
免疫蛍光
免疫蛍光染色実験を以前に記載されたように行った（Lutz et al.,1997,J.Virol.,71,5102-5109）。Ａ５４９細胞をホルムアルデヒド(ＰＢＳ中２％vco/vol)で固定し、ＰＢＳ中０．１％ Triton X-100で透過性増大させた。一次抗体を０．１％ Triton X-100含有のＰＢＳで希釈した。抗ｐIXウサギポリクローナル抗体を記載されたように用い（Lutz et al.,1997,J.Virol.,71,5102-5109）、Ｍａｂ３Ａ６抗Ｆ抗体を０．１％ Triton X-100含有のＰＢＳ中１／５０００希釈で用いた。１時間のインキュベート後に、カバーガラスをＰＢＳ‐０．１％ Triton X-100で数回洗浄し、次いで供給業者推薦の濃度でヤギTexas-Red複合化抗ウサギＩｇＧおよび／またはロバＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Sigma)と共にインキュベートした。核をHoechst 33258で対比染色した。染色後、カバーガラスをマウントし、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Leica）を用いて分析した。画像向上ソフトウエアを用いてシグナル強度をバランス調整し、８倍で走査してノイズからシグナルを分離した。
【０２１２】
例1：ｐIXのペプチド配列および機能性ドメイン
ヒトおよび動物Ａｄ血清型のｐIXタンパク質間における多数の配列アライメント（図1）では、同一の亜族に属する血清型からのｐIXの全鎖長について、高度の同一性（９５％）を示した。異なる種の血清型間におけるホモロジーの程度は低いが、２つの保存ドメインが、ヒトおよび動物血清型を比較したときに特定された：ヒトＡｄ２血清型からのｐIX残基（Ａａ）の座標において、これらのドメインはｐIXのＮ末端（Ａａ８‐３９）およびＣ末端（Ａａ１００‐１２１）に各々位置する。ヒト血清型に特異的な、追加の、アラニンに富むドメインも把握できた（Ａａ６０‐６９）。
【０２１３】
具体的な構造モチーフはＮ末端ドメイン内で特定できなかった。特殊な構造をとりそうもない、アラニンに富むストレッチは、ｐIX分子のハーフ２つの間でフレキシブルな連結として働くかもしれない。逆に、Ｃ末端ドメインは、ヘリックスホイール表示で示唆されているように、ロイシンリピート（または超らせんドメイン）の特徴を明らかに呈していた（図２Ｂ）：３および４残基毎の間隔で１０の無極性アミノ酸残基（ロイシンおよびバリン）が、ホイールの一端で位置（ａ）および（ｄ）に並んでいる；これらの残基は、第二モノマーで対称的な（ａ′）および（ｄ′）に位置する類似残基と相互作用して（図２Ｂ）、超らせんコンホメーションをとらせるような、疎水性界面をおそらく形成している（３４、３５、３９、４０）。更に、Ａｄ２およびＡｄ５の場合には、位置（ｅ）および（ｇ）でヘリックスホイールの両端に位置する、反対荷電のイオン化残基は、位置（ｅ′）および（ｇ′）の対応残基と対称的に相互作用することにより、タンパク質アセンブリーを更に安定化させうる。
【０２１４】
これらドメインの機能的重要性を調べるために、保存配列要素を改変する一連の欠失または点変異の効果を試験した（図２Ａ）。ｐIXのＮ末端ハーフ内に、すべて（Ａａ１３‐１５、Ａａ２２‐２３、Ａａ２６‐２８、Ａａ３１‐３９）または一部（Ａａ６３‐７０）のヒトＡｄ血清型間で最も高度に保存されたアミノ酸ストレッチを欠失させた（Δ）。Ｃ末端ロイシンリピートは、ロイシン１１４およびバリン１１７を各々プロリンおよびアスパラギン酸へ別々にまたは同時に変えて、変異体Ｌ１１４Ｐ、Ｖ１１７ＤまたはＬ１１４Ｐ‐Ｖ１１７Ｄ（Ｌ‐Ｖ）を作製することにより破壊した。これらの残基による位置（ａ）および（ｄ）の無極性シリーズの干渉が、正しいアライメント（プロリン）または疎水性結合（アスパラギン酸）を妨げるであろう、と確かに予想された。Ａａ１０６またはＡａ１１３をリジン残基と交換させ（各々、変異体Ｑ１０６ＫおよびＥ１１３Ｋ）、タンパク質モノマー間で静電気反発力を誘起することにより、位置（ｅ）の正味荷電が反転された、ｐIXの２変異体も構築した。
【０２１５】
例２：ｐIXのＮ末端部分はそのキャプシド取込みにかなり寄与している
精製ＡｄビリオンおよびｐIX特異的抗血清の初期免疫電子顕微鏡観察研究では、ｐIXのＣ末端部分のみが抗体へ接近しうることを示した。著者らは、タンパク質のＣ末端部分がビリオンの表面に露呈して、そのＮ末端ドメインがウイルスキャプシドの内部に隠れている、と結論付けた。キャプシドアセンブリーに関与するｐIX要素を更に調べるために、上記の変異を相同的組換えによりＥ１欠失ウイルスゲノム中へ導入して、ウイルス産生に際してｐIX変種を発現するウイルスを作製した。すべてのウイルスがＥ１欠陥であるため、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ Ａｄ５遺伝子を構築的に発現する２９３細胞でそれらを産生させた。各ｐIX変異ウイルスを２９３細胞で増殖させ、ウイルス粒子を密度勾配遠心で簡単に精製した。滴定後、２．１０１０粒子ビリオン（ｖ）を、対応する感染粗製抽出物（ｅ）の一部と並行して、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥに付した（図３）。次いで、ｐIXの存在を、抗ｐIXポリクローナル抗体を用いて、Westernブロット分析により試験した。陽性コントロールとして、ｗｔ ｐIXタンパク質の存在を感染細胞抽出物および精製Ａｄ Ｅ１°ビリオンの双方で確認したが（図３、列３および４）、一方Ａｄ Ｅ１°欠損遺伝子IXに感染した細胞からの双方のフラクションでは不在であった（図３、列１および２）。
【０２１６】
Ｃ末端部分内でｐIXを改変する変異（Ｌ１１４Ｐ、Ｖ１１７ＤまたはＬ‐Ｖ）は、キャプシド中への変異タンパク質の取込みを妨げず（図３、列１２、１４および１６）、このことはロイシンリピートの保全がこの機能には不要であることを示していた。更に、キャプシド安定性も変化していないようであった（データ示さず）。逆に、ｐIXの保存Ｎ末端ドメイン内における欠失は、変異体Δ２２‐２３およびΔ２６‐２８の場合のように、ほぼ正常レベルのｐIX合成にもかかわらず、キャプシド中へのｐIXの取込みを完全に消失させた（図３、列５および７）。変異（Δ１３‐１５）はｐIXのビリオン挿入を損なわなかったが、得られるキャプシドは熱安定性測定で示されるように安定性が劣っていた（データ示さず）。
【０２１７】
総合すると、これらの結果は、ウイルスキャプシド中へのｐIXの正確で安定な取込みにとり重要であると、Ｎ末端領域Ａｓ２２‐２８を特徴づけている。
【０２１８】
例３：ｐIXのＣ末端ロイシンリピートおよび中央アラニンストレッチの保全は、その転写活性にとり必須である
ｐIXが転写性質を示すことは、以前に示されていた（Lutz et al.,1997,J.Virol.,71,5102-5109）。組換えｐIXは、用量依存的に、いくつかのウイルスおよび細胞ＴＡＴＡ含有プロモーターの活性を効率的に刺激した。ｐIXのトランス活性化ドメインを正確に把握するために、Ｅ１ａプロモーター活性におよぼす様々なｐIX変異の効果を試験した（図４）。この目的のために、Ｆエピトープタグと融合されたタンパク質（Ｆ／IX）として野生型または変異ｐIX配列を発現するベクターを、Ｅ１ａプロモーターにより駆動されるＣＡＴリポーター遺伝子と一緒にトレンスフェクトした。同レベルのｐIXが発現されることを確認した後、Ｆエピトープに対する抗体での免疫ブロットにより示されるように（データ示さず）、ＣＡＴ活性を測定した。これらの条件下で、相対的ＣＡＴ活性は各組換えタンパク質の固有転写活性化能力を反映することになる。
【０２１９】
初期の構造分析と一致するように、ロイシンリピートのｐIX欠損ハーフ（Ｆ／IX Δ１１１‐１４０）またはタンパク質のＮ末端ハーフ（Ｆ／IX Δ１１‐７４）のほとんどの端部切除バージョンは、それらのトランス活性化性質を失っていた（図４Ｂ、コラム２および１４または７を各々比較する）。
【０２２０】
ｐIXのＣ末端でロイシンリピートをコードする配列内における点変異は、リポーター刺激を著しく減少させた：単一（Ｌ１１４Ｐ、Ｖ１１７Ｄ）または二重改変（Ｌ‐Ｖ）は、タンパク質のＣ末端部分の完全欠失（ Δ１１１‐１４０）と類似した効果を有していた。点変異Ｑ１０６ＫおよびＥ１１３Ｋもトランス活性化を減少させ（図４Ｂ、コラム２および９‐１０の比較）、ｐIXモノマーの機能的アセンブリーにおける静電気相互作用の寄与を示唆している。対応ポリアラニンストレッチの欠失（ Δ６３‐７０）がリポーター刺激の強い減少に至ったことから、ｐIXのトランス活性化機能は中央ドメインの保全にも依存している（図４Ｂ、コラム２および８の比較）。逆に、非常に類似したレベルのトランス活性化がＦ／IX： Δ１１‐１５、Δ２２‐２３、Δ２６‐２８、Δ３１‐３９ｐIX変種および野生型タンパク質で得られたことから、ｐIXのＮ末端部分内の欠失はその固有の刺激活性について検知可能な効果を有していなかった（図４Ｂ、コラム２および３‐６の比較）。
【０２２１】
総合すると、ここで記載された結果は、ｐIXトランス活性化機能がＣ末端ロイシンリピートの保全および中央のアラニンに富む要素に依存することを示唆している。面白いことに、ｐIXのキャプシド組込みに大きく関与するＮ末端領域は、この機能に関与していない。
【０２２２】
例４：ｐIXのＣ末端ロイシンリピートおよび中央アラニンストレッチの保全は、その自己相互作用にとり必須である
ｐIXのＣ末端におけるロイシンリピートタイプの構造の存在は、タンパク質がこの要素を介する相互作用でダイマー化（またはマルチマー化）しうることを示唆している。この可能性を調べるために、非標識ｗｔ ｐIXを発現するベクターを、Ｆエピトープ標識野生型または変異ｐIXタンパク質（Ｆ／IX）を発現するベクターと共に、Ａ５４９細胞中へコトランスフェクトした。モノクローナル抗Ｆまたはポリクローナル抗ｐIX抗体で細胞抽出物のWesternブロット分析により示されるように、トランスフェクトされたベクターが、非常に類似したレベルで発現された（データ示さず）。
【０２２３】
これらの抽出物をマイルドな塩条件下にてモノクローナル抗Ｆ抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥへ付したとき、非標識ｗｔ ｐIXタンパク質の透明バンドも、Ｆ標識タンパク質変種に加えて、図５で示されているような抗ｐIX抗体で現れた。コントロールとして、非標識ｐIXがＦ標識ｐIXの不在下で発現されたが、抗Ｆ免疫沈降物では検出できなかった（示さず）。その結果は、非標識ｗｔ ｐIXがＦエピトープ標識ｗｔ ｐIXと一緒に共同沈降したことを強く示唆している（Ｆ／IXｗｔ、図５、列１）。この共同沈降にロイシンリピートドメインを要することは、この構造を破壊する単一点変異（Ｅ１１３Ｋ、Ｑ１０６Ｋ、Ｖ１１７Ｄ）または二重点変異（Ｌ‐Ｖ）がキャリー効果を減少または消失するという観察により証明された（図５、列１と列５‐８との比較）。同様に、ロイシンリピートのＣ末端中間部分を欠く変異体（ Δ１１１‐１４０）はｗｔ ｐIXを共同沈降させなかった（データ示さず）。予想どおりに、Ｎ末端ドメイン内の変異（Δ２２‐２３およびΔ２６‐２８、図５；またはΔ１３‐１５およびΔ３１‐３９、示さず）は相互作用に効果を有しなかった。逆に、ｐIXで中央のアラニンに富む要素（Δ６３‐７０）は共同沈降に必須であり（図５、列１および４の比較）、したがってオリゴマー化プロセスに関与している。更に、同変異がｐIXのトランス活性化および相互作用双方の性質に影響を与えるという観察は、その２つの活性が関連していることを示唆している。
【０２２４】
例５：ｐIXはウイルス誘導性透明非晶質封入体に蓄積し、それらの形成をそれだけで誘導する
以前に、タンパク質の転写性質と一致するように、ｐIXが主に感染細胞核と会合していることが、ｐIX特異性抗体での免疫蛍光染色により示された（Lutz et al.,1997,J.Virol.,71,5102-5109）。加えて、ｐIXの核染色は進化的であり、感染の後期に点在を示すことが観察された。ｐIXタンパク質の核内分布を更に詳しく調べるために、Ａｄ５感染Ａ５４９細胞を感染後（ｐｉ）異なる時期、１６〜３０ｈ ｐｉに免疫電子顕微鏡観察により調べて、感染に際する核変化の連続ステップの相関としてｐIXの蓄積を観察した。これらの実験は、タンパク質ｐIXが特殊な核透明非晶質(c.a.)封入体を能動的に誘導することを証明した：図７Ａは、ホルムアルデヒド固定細胞のLowicryl切片において抗ｐIXポリクローナル抗体でイムノゴールド標識用に処理された、核形質転換の中間段階（１４〜１６ｈ ｐｉ）におけるＡｄ２感染Ａ５４９細胞を表わしている。金粒子はウイルス領域の一成分、原繊維顆粒状ネットワーク（ｆｇ）に散在して、封入された小さな不規則形状透明非晶質封入体（c.a.封入体；星印）に蓄積する。ウイルス領域の他区画、ウイルス一本鎖ＤＮＡの蓄積部位は（ａ）、ｐIXタンパク質を完全に欠いている。（ｃ）細胞質。Ｂａｒ０．５μｍ。図７Ｂで示されているように、Ａｄ媒介核形質転換の後期段階（２４〜３０ｈ ｐｉ）は、子孫ウイルスの存在により特徴付けられる。粗い球状のc.a.封入体（星印）は、強く均一に標識されている。それは、中央に位置する大きなウイルス領域（ｖｒ）から宿主クロマチンの核周辺層（ｃｈ）を分離している、エレクトロントランスルーセント領域（ｅ）に位置している。エレクトロントランスルーセント領域に散在して、ウイルス領域内で集塊化している、一部のウイルス（ｖ）は、標識されている。Ｃ：細胞質、Ｂａｒ０．５μｍ。図７Ｃで示されているように、組換えｐIXタンパク質の過剰産生は、新たに形成されたc.a.封入体内でタンパク質の蓄積を誘導している：未標識野生型ｐIXを発現するベクターでＡ５４９細胞をトランスフェクトした。金粒子は核質に存在する卵形c.a.封入体の表面全体に蓄積する。明らかに、標識された封入体（星印）は、アデノウイルス感染後に（Ｂ）で観察されたものと類似しているらしい。
【０２２５】
標識化は、１６ｈ ｐｉ前に抗ｐIX抗体でさほど観察されなかった（示さず）。このとき、感染細胞は主に核変化の中間段階にあった。（ウイルスＤＮＡ複製、転写の部位およびウイルスゲノムまたは一本鎖ウイルスＤＮＡ蓄積の部位を含む）いくつかのウイルス誘導性構造の中では、ｐIXは小さな不規則形状または球状の透明非晶質封入体で検出された。後期段階（２４〜３０ｈ ｐｉ）で、中央ウイルス区画および核周辺エレクトロントランスルーセント領域がタンパク質結晶および単独ウイルスと共にみられるときには、より多く頻発して球状になるc.a.封入体内にｐIXは集中していた。時には、これら封入体のうち２つまたは３つが並置していた。加えて、ｐIXはウイルスの結晶配列および単独ウイルス粒子で観察された。
【０２２６】
このように、ｐIXタンパク質は効率的に新規合成され、感染の後期段階に属するため、核内で形状および位置が多様なc.a.封入体へそのタンパク質が主に会合している。細胞中におけるｐIXの量は感染が進むにつれて増加し、ｐIXタンパク質が核内に蓄積する。核内におけるそれらの形状、サイズおよび位置とは無関係に、それらは抗ｐIX抗体でいつも強く均一に標識されていた。
【０２２７】
超微細構造データは、ｐIXがウイルス誘導性c.a.封入体の主成分であることを示唆している。ｐIXがそれらの出現に直接関与しているか否かを調べるために、即ち他のいかなるウイルスタンパク質も存在しない状態で、野生型ｐIX発現ベクターでトランスフェクトすることにより、細胞でそのタンパク質を発現させることが試みられた。ｐIX発現細胞の形態は、溶解感染細胞で観察される場合と同一の、核質におけるc.a.封入体の追加存在以外は、非トランスフェクト細胞の場合と類似していた。発現ｐIXの量に応じて（即ち、トランスフェクション後における時間の関数として）、c.a.封入体はサイズおよび頻度に違いがあったが、同様の非晶質面をいつも示した（データ示さず）。ｐIXタンパク質のイムノゴールド検出では、各c.a.封入体の強い標識化と、周辺核質および細胞質のわずかな標識化とを示した。したがって、他のウイルスタンパク質の不在下では、ｐIXはＡｄ感染により誘導されるものと類似したc.a.封入体の形成を誘導しうる。
【０２２８】
ｗｔ Ａｄ５をもつかまたはｗｔ ｐIX発現ベクターでトランスフェクトされた細胞の特異的免疫蛍光染色では、核内でタンパク質の点在分布を呈したが、これはほぼまちがいなく電子顕微鏡で観察されたc.a.封入体内におけるｐIXの蓄積に相当する。c.a.封入体の形成に関与しうるｐIXのペプチドドメインを特定するために、トランスフェクトされた細胞でｐIXの核分布におよぼす変異の上記組合せ（図２Ａ参照）の効果を調べた。ｐIXのＮ末端（Δ１３‐１５、Δ２２‐２３、Δ２６‐２８、Δ３１‐３９）または中央（Δ６３‐７０）ドメインにおける変異は、それらすべてがトランスフェクションで野生型タンパク質として同様の点在分布（データ示さず）を生じることから、c.a.封入体の形成および核位置に影響を与えなかった。逆に、特定残基の正味荷電の変化によるｐIXのロイシンリピートの改変（変異Ｅ１１３ＫまたはＱ１０６Ｋ）は、免疫蛍光染色により示されるように、細胞質へ封じ込められた相当ｐIX変種の細胞内分布を劇的に変化させた。更に、変異体発現の全体的レベルは（Westernブロットで示されるように；データ示さず）野生型タンパク質の場合と類似していたが、この変種は細かな点在パターンで蓄積していた。
【０２２９】
同様に、ロイシンリピートの保全性に影響を与える点変異（Ｌ１１４Ｐ、Ｖ１１７Ｄ、Ｌ‐Ｖ）および欠失（Δ１１１‐１４０）の双方は、c.a.封入体の形成を消失させて、核および細胞質の全体で改変ｐIXの拡散分布をもたらした。野生型ｐIXのＣ末端におけるＦエピトープ‐タグの融合（IX／Ｆ）も、ロイシンリピートの保全にもかかわらず、タンパク質の核蓄積を妨げて、同様の拡散パターンを誘導した。この効果は、ほぼまちがいなくタグにより負わされた立体障害と関連しており、ロイシンリピートへの自由な接近がｐIXの核保持にとり必須であったことを示唆している。面白いことに、細胞が未標識（ｗｔ ｐIX）およびＣ末端Ｆ標識（IX／Ｆ）タンパク質を発現するベクターでコトランスフェクトされたときには、マージド(merged)免疫蛍光染色で示されるように、双方のタイプのタンパク質が同様の封入体内に蓄積した。したがって、非集中的IX／Ｆタンパク質分布が、同時発現ｗｔ ｐIXにより、対応する核蓄積部位へ向け直されたらしい。逆に、コトランスフェクションのＦ標識パートナーがロイシンリピート内で改変を有していたとき（IX／Ｆ：Ｌ‐Ｖ）、Ｆ標識変異体の永続的拡散分布パターンで示されるように、この取込みはほぼ消失した。
【０２３０】
総合すると、ここで示された結果は、ｐIXのロイシンリピートがc.a.封入体の形成および局在化に主に関連することを、明らかに示している。更に、ｐIX特異的封入体のアセンブリーがｐIX自体で駆動される能動的プロセスであることを、データは強く示唆している。
【０２３１】
考察
ウイルスは、絶対細胞寄生生物として、最少の犠牲で最も効率的な増殖速度に達するように、それらの構造および成分の最大可能な簡易度に向けて通常進化してきた。代わりの読取り枠を用いてそれらゲノムのコード能力を利用する上でも、更には多様な生物活性をもつタンパク質を産生する上でも、アデノウイルスはこの規則にかなっている。Ａｄ遺伝子IXの産物がこのような多機能性タンパク質の例である：ｐIX（１４０残基）はウイルスキャプシドの構造成分であり、転写アクチベーターとして作用し、機能が確立された状態で特殊な構造（c.a.封入体）として感染細胞核に蓄積する。本研究では、そのタンパク質の相当機能性ドメインを明確にするために、様々な一連のｐIXの部位特異的変異誘発を行った。
【０２３２】
ウイルスキャプシドアセンブリーにおけるｐIXの構造的関与
ｐIXタンパク質は、ウイルスヘキソン間のキャプシドセメントとして以前に記載されており、こうしてＡｄビリオンのＤＮＡパッケージング能力および熱安定性を最良なものにしている。免疫化学的アプローチに基づくと、ｐIXのＮ末端部分はキャプシドの内部に留まり、一方そのＣ末端部分は外側に向いていることが示唆された。ここで示された結果は、残基２２‐２８がキャプシド中へのｐIX取込み、ビリオン熱安定性および高ウイルス産生に必須であることを示している。これら残基の重要性は、ヒトおよび動物のＡｄ血清型間における高度の保存で更に支持されている。ｐIXのＮ末端領域内における他の残基もこの機能におそらく寄与しており、このことは、ｐIXキャプシド組込みを損なわないが、ビリオン安定性に影響を与えた、Δ１３‐１５欠失の効果で示唆されている。
【０２３３】
面白いことに、本結果では、これらキャプシド性質へのｐIXの推定超らせん要素のいかなる寄与も除外している。これは明らかに、相当するキャプシド相互作用が超らせんドメイン以外の要素により生じていることを示し、上記のＮ末端要素がこの機能を逐行していることを示唆している。よく知られた酵母ＧＣＮ４またはＨＩＶ‐１ ｇｐ４１のような他のタンパク質のトリマー化またはオリゴマー化に超らせん要素が寄与することが示されたため、ｐIXの超らせん要素も、それがＧＯＮ複合体で生じていることから、このタンパク質のトリマー化に関与しているのかもしれない。ｐIX分子がロイシンリピート変異体でトリマーとしてなお組織されるのかどうか、あるいは、ｐIXのＮ末端ドメインが、ヘキソン分子と密着して、ビリオンキャプシド中へのｐIXトリマーの組込みに主に関与しているのかどうか、という問題をこれは提起する。明らかに、共同沈降分析、三次元構造分析を含めた追加の実験が、これらの問題を解決するために必要とされるであろう。
【０２３４】
ｐIXの転写活性
組換えｐIXは、トランスフェクション実験または再構成インビトロ転写系でアッセイされたとき、転写アクチベーターの性質を示すことが、以前に報告されていた。本データによると、ｐIXのロイシンリピート要素の保全がこのトランス活性化機能に必須であり、一方その分子のＮ末端ハーフ内における高度保存残基がこの活性に関連していることが示された。Ｎ末端領域における大きな欠失（１１‐７４）またはアラニンに富む要素の切除（６３‐７０）も、超らせんドメインを保持しているにもかかわらず、ｐIX転写活性を損なった。予測構造分析で示されるように（データ示さず）、ポリアラニンストレッチはｐIX分子でヒンジ機能を発揮することがある。したがって、この要素の変異はｐIXの全体構造を破壊して、その本質的機能に影響を与えることが可能である。
【０２３５】
追加の証拠（M.R.C.et al.,準備中）では、細胞侵入およびビリオン除キャプシド直後に、関連キャプシドｐIXがすぐに４５min ｐｉからｈ ｐｉまで細胞核に蓄積することを示した。次いで、これらのｐIX分子は高度応答性Ｅ１ａプロモーターを活性化して、そのためＨＳＶ‐１感染の場合におけるＶＰ１６因子とかなり似て、すぐ使えるトランスアクチベーターとしてふるまうことがある。更に、中間期ｐｉに蓄積しはじめる、新規に合成されたｐIXも、ＭＬＰ活性を刺激することにより、Ａｄ感染の後期の活性化に寄与するようである。そのため、ｐIX媒介トランス活性化の分子メカニズムを解明してみると、面白いであろう。
【０２３６】
（真の塩基性ロイシンジッパーを作製する）ロイシンリピートに隣接する塩基性残基の不在と、いずれか他のＤＮＡ認識モチーフの欠損から予想されるように、ｐIXはＤＮＡ結合活性を有していない（データ示さず）。逆に、共同免疫沈降実験で示されるように、ロイシンリピートはｐIXとそれ自体との相互作用に関与し、超らせん構造を介してそのホモダイマー化またはオリゴマー化を行える。同様の変異がｐIX自己相互作用およびトランス活性化性質の双方に影響を与えるという事実は、２つの活性が直接的に相関することを示唆している。一方、またはそれに加えて、ｐIXはこのロイシンジッパー要素を介して転写装置の諸成分と相互作用しうる：もちろん、予備結果では、ｐIXが特異的ＲＮＡポリメラーゼIIサブユニットおよび一般的転写因子と接触して、Ａｄ Ｅ１ａ、ＨＳＶ‐１ ｐＸまたはＶＰ１６のような他のウイルストランスアクチベーターのようにふるまうことを示唆している。
【０２３７】
面白いことに、これまで分析されてきたすべてのｐIX応答性プロモーターに共通した１つの特徴は、ウイルスまたは細胞いずれの起源であろうと、標準ＴＡＴＡボックスの存在である。この特異的プロモーターターゲティングのメカニズムを解明できれば、面白いであろう。すべてのウイルスプロモーターが、Ｅ２プロモーターを除いて、ＴＡＴＡボックスを含有していることから、ｐIXに対するこのようなプロモーター親和性は、Ａｄ増殖にとりある程度有利であろう、と推測しうる。エピソーム遺伝子（即ち、プラスミドまたはウイルス形の双方）のみならず、染色体組込みリポーターさえも、ｐIXに応答することがわかったという事実から、この仮説は更に支持される。
【０２３８】
ｐIXの核蓄積構造
ペプチド配列において共通核局在化シグナル（ＮＬＳ）との検出可能なホモロジーの不在にもかかわらず、ｐIXは細胞核内に集中する。ここでは、ｐIXのロイシンリピートがこの核蓄積およびc.a.封入体の形成に必須であることが示された。総合すると、これらの観察は、ｐIXが、その低分子量（M.W.）のおかげで、ほぼまちがいなくロイシンリピートおよび特異的核成分の関与した相互作用を介して、細胞質からそれが留まる核へと自由に分散しうることを示している。予備生化学的証拠では、ｐIXが核マトリックスの分画と実際に会合していることを示唆している。したがって、ｐIXによる核マトリックスのターゲティングがc.a.封入体のアセンブリーで初期ステップとなり、ｐIXオリゴマー化のための核形成点をもたらすようである。これらの核構造はｐIX以外のウイルスタンパク質の不在下で構築されることから、それらがｐIXの固有性質を反映している、と結論付けられる。
【０２３９】
ロイシンリピートは、ｐIX転写活性およびc.a.封入体形成能力の双方で、中心的役割を果たしている。しかしながら、いくつかの証拠は、これらの機能がｐIXの２つの独立した性質であることを明らかに示している：(ｉ)感染の後期に、c.a.封入体はいつもウイルス転写部位から除外されていることがわかった；(ii)ＲＮＡポリメラーゼIIも一次転写物もＡｄ感染細胞または野生型ｐIX発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からのc.a.封入体内で検出できなかった（データ示さず）；(iii)アラニンに富む要素の一部を欠く変異体（Δ６３‐７０）は、Ｅ１ａプロモーターをトランス活性化する能力（図４）および免疫沈降条件下で自己会合する能力（図５）を失ったが、核c.a.封入体中へ蓄積する能力は留めていた（データ示さず）；(iv)逆に、ｐIXのＣ末端へのＦエピトープの融合（IX／Ｆ）は、核中でc.a.封入体を形成しうるタンパク質の能力を完全に消失させたが、ロイシンリピートの構造保全性に変わりがなければ（図４、列１６）、その転写性質に影響を与えなかった（図４、列１５）。これらｐIX機能の見掛け上無関係さを説明しうる最も簡単な解釈は、ｐIXが低濃度のときのみ（即ち、感染の初期およびｐIX合成の開始直後に）その転写性質を発揮し、一方では、感染の後期またはトランスフェクション後に観察されるように、核マトリックス構造に蓄積することでより高濃度に核封入体を形成しはじめる、というものである。したがって、ｐIXのＣ末端でＦ‐タグの付加がｐIX転写活性およびc.a.封入体形成に別々の影響を与えるという発見は、プロモータートランス活性化に必要なものと比較して、c.a.封入体のアセンブリーに関与する接触が特に毀損されたことを単に反映しているだけかもしれない。
【０２４０】
これらc.a.封入体の生理学的役割は不明確なままである。それらがウイルスタンパク質貯蔵部位を務めて、後のウイルスアセンブリーのための易可動性タンパク質源として働く可能性は、次の理由からありそうもない：(ｉ)それらの形成は排他的にｐIXのみで誘導され、その合成は他のすべてのビリオンタンパク質の場合と分断されている；(ii)少量のヘキソンが後期ｐｉでこれらの構造で観察されうるが、タンパク質およびファイバータンパク質は検出されない。
【０２４１】
類似した球状構造はＨＳＶ‐１で感染された細胞で記載されており、そこではウイルス誘導性“微細球状半透明パッチ”が感染後期に観察された。これらの構造は、ウイルスキャプシドタンパク質を含有し、それに加えて、正常ＰＭＬおよびＳＰ１００蓄積部位であるいわゆるＰＭＬ癌遺伝子ドメイン（ＰＯＤ）から誘導される、前骨髄球白血病（ＰＭＬ）およびＳＰ１００タンパク質のような特定の細胞タンパク質を凝縮させることが示された。Ａｄ感染細胞のc.a.封入体におけるＰＭＬおよびＳＰ１００タンパク質の検出は、２ウイルス誘導構造間の類似性を更に強調する。この観察は、ｐIXがＰＭＬおよび関連タンパク質の機能を妨げて、感染の後期に、ＰＭＬをＰＯＤから引き離して存在させることも示されたＡｄ初期Ｅ４ｏｒｆ３産物の効果を中継する、という面白い可能性も呈する。我々はこれらの仮説を現在検証している。
【０２４２】
このように、ｐIXは感染に際して多数の機能を発揮するようである。面白いことに、それは他のＡｄ中間遺伝子ｐIVａ２の産物とこれら機能の一部を共有しているが、双方のタンパク質とも転写アクチベーターであって、特殊な核封入体として蓄積することにより宿主細胞のウイルス誘導性改変に関与し、成熟ビリオン粒子中に存在する。これらの多面体ウイルスが解明すべき他の秘密をなお有しており、遺伝子療法プロトコール用のＡｄベースのベクターをデザインするとき、明らかに注目に値することは、間違いない。
【０２４３】
例６：ｐIXタンパク質におけるポリリジン結合部分の挿入
ヒト胚腎臓２９３細胞系（ＡＴＣＣ,Rockville,ＭＤ,ＵＳＡ）およびＣＨＯ細胞系（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ‐６１）を１０％牛胎児血清補充のＤＭＥＭ中３７℃で増殖させた。
【０２４４】
ｐIX改変ウイルスゲノムの構築
QuickChange部位特異的変異誘発システム（Stratagene）を用いて上記のようにｐIXコード配列を変異させて、ｐIXコード配列に変異：Ｌ１１４Ｐ、Ｖ１１７Ｄおよび二重変異Ｌ１１４Ｐ‐Ｖ１１７Ｄを各々導入した。
【０２４５】
ｐIXのＣ末端部分内でＬｅｕ１３１とＬｙｓ１３２残基との間における７ＫおよびＧｌｙ‐Ｓｅｒ‐（Ｓｅｒ‐Ａｌａ）４‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒ‐（Ｋ）７‐ペプチドの導入
QuickChange部位特異的変異誘発システム（Stratagene）を用いた方法で、ｐIXコード配列内においてＬｅｕ１３１およびＬｙｓ１３２をコードする塩基コドン間に制限部位ＢａｍＨＩを導入した。この場合に、下記のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた：５′‐ｃｇｃ  ｃａｇ  ｃａｇ  ｇｔｔ  ｔｃｔ  ｇｃｃ  ｃｔｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ‐  ａａｇ  ｇｃｔ  ｔｃｃ  ｔｃｃ  ｃｃｔ  ｃｃｃ  ａａｔ  ｇｃｇ  ｇ‐３′（配列番号２２）および５′‐ｃ  ｃｇｃ  ａｔｔ  ｇｇｇ  ａｇｇ  ｇｇａ  ｇｇａ  ａｇｃ  ｃｔｔ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｃａｇ  ｇｇｃ  ａｇａ  ａａｃ  ｃｔｇ  ｃｔｇ  ｇｃｇ‐３′（配列番号２３）
【０２４６】
オリゴヌクレオチド５′‐ｇａ  ｔｃｃ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ｔａａ  ｇ‐３′（配列番号２４）および５′‐ｇａ  ｔｃｃ  ｔｔａ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｔｇａ  ｔｃｃ  ｃｇｃ  ｃｇａ  ｃｇｃ  ｇｇａ  ｇｇｃ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ｇｃｔ  ｇ‐３′（配列番号２５）を互いにハイブリッド形成させ、ＢａｍＨＩ部位中へクローニングして、ｐIXのＣ末端部分内で７Ｋペプチドを直接導入した。一方、オリゴヌクレオチド５′‐ｇａ  ｔｃｃ  ａｇｃ  ｇｃｃ  ｔｃｃ  ｇｃｃ  ｔｃｃ  ｇｃｇ  ｔｃｇ  ｇｃｇ  ｇｇａ  ｔｃａ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ｔａａ  ｇ‐３′（配列番号２６）および５′‐ｇａ  ｔｃｃ  ｔｔａ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｔｇａ  ｔｃｃ  ｃｇｃ  ｃｇａ  ｃｇｃ  ｇｇａ  ｇｇｃ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ｇｃｔ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｇ‐３′（配列番号２７）を互いにハイブリッド形成させ、ＢａｍＨＩ部位中へクローニングして、スペーサーＧｌｙ‐Ｓｅｒ‐（Ｓｅｒ‐Ａｌａ）４‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒを介してｐIX配列へ連結された７Ｋ結合部分を直接導入した。
【０２４７】
ｐIXのＣ末端部分内でＱ１２７とＶａｌ１２８残基との間における７Ｋペプチドの導入
一方、QuickChange部位特異的変異誘発システム（Stratagene）を用いて、ｐIXのＣ末端部分内で残基Ｑ１２７とＶ１２８との間に２ステップで７Ｋペプチドも導入した。第一ステップでは下記のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド：５′‐ｇ  ｃｔｇ  ｔｔｇ  ｇａｔ  ｃｔｇ  ｃｇｃ  ｃａｇ  ｃａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａｇａ  ｔｃｔ  ｇｃｃ  ｃｔｇ  ａａｇ  ｇｃｔ  ｔｃｃ  ｔｃｃ  ｃｃｔ  ｃｃｃ  ａａｔ  ｇｃｇ  ｇ‐３′（配列番号２８）および５′‐ｃ  ｃｇｃ  ａｔｔ  ｇｇｇ  ａｇｇ  ｇｇａ  ｇｇａ  ａｇｃ  ｃｔｔ  ｃａｇ  ｇｇｃ  ａｇａ  ｔｃｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｇ  ｃｔｇ  ｇｃｇ  ｃａｇ  ａｔｃ  ｃａａ  ｃａｇ  ｃ‐３′（配列番号２９）、次いで第二ステップでは下記のオリゴヌクレオチド：５′‐ｇ  ｃｔｇ  ｔｔｇ  ｇａｔ  ｃｔｇ  ｃｇｃ  ｃａｇ  ｃａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａｇ  ａａａ  ａａａ  ａａａ  ｔａａ  ｔｃｔ  ｇｃｃ  ｃｔｇ  ａａｇ  ｇｃｔ  ｔｃｃ  ｔｃｃ  ｃｃｔ  ｃｃｃ  ａａｔ  ｇｃｇ  ｇ‐３′（配列番号３０）および５′‐ｃ  ｃｇｃ  ａｔｔ  ｇｇｇ  ａｇｇ  ｇｇａ  ｇｇａ  ａｇｃ  ｃｔｔ  ｃａｇ  ｇｇｃ  ａｇａ  ｔｔａ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｃｔｇ  ｃｔｇ  ｇｃｇ  ｃａｇ  ａｔｃ  ｃａａ  ｃａｇ  ｃ‐３′（配列番号３１）を用いた。
【０２４８】
改変ｐIXタンパク質のアミノ酸配列は、１００位のＬから出発すると、下記のように読むことができる（各々配列番号３２および３３参照）：
ＬＴＡＬＬＡＱＬＤＳＬＴＲＥＰ（１１４）ＮＶＤ（１１７）ＳＱＱＬＬＤＬＲＱＱＫＫＫＫＫＫＫ（７Ｋ結合部分）または
ＬＴＡＬＬＡＱＬＤＳＬＴＲＥＰ（１１４）ＮＶＤ（１１７）ＳＱＱＬＬＤＬＲＱＱＶＳＡＬＫＧＳ（ＳＡ）４ＳＫＫＫＫＫＫＫ（スペーサー／７Ｋ部分）
【０２４９】
すべてのベクターは、遺伝子ｐIXの改変に加えて、Ｅ１およびＥ３の欠失を含み、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＬａｃＺ遺伝子（β‐ガラクトシダーゼをコードしている）をＥ１の代わりに有している。
【０２５０】
いくつかの腫瘍細胞に対する７Ｋ含有ｐIX構築物の感染効率を、キャプシドファイバーに含まれた７Ｋ結合部分を含んでなる慣用的なターゲティングアデノウイルスと比較して評価した（Leissner et al.(2001,Gene therapy,8,49-57)で記載されているＡｄ Ｆｂ ７Ｋ）。
【０２５１】
７Ｋ改変Ａｄで感染された細胞系
ヒト腺癌前立腺ＰＣ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐１４３５）およびＬＮ‐ＣＡＰ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐１０９５５）細胞系、頭部および頚部ＳｑＣＣＹ１（Dr.Reuben,Lotan Univ.Texas,Houston,ＵＳＡ）細胞系からのヒト扁平癌腫、およびヒト乳癌Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ‐１３３）、Ｈ３３９６（ＢＭＳ）およびＳＫＢＲ３細胞系を、１０％牛胎児血清および抗体で補充されたＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ中３７℃で増殖させた。
【０２５２】
感染の条件
濃度範囲１０、１００および１０００粒子／細胞のウイルスを４℃で１時間にわたり標的細胞単層へ加えた。接種原を除去し、細胞を冷媒体で２回洗浄してから、それらを３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、細胞を固定し、P.Leissnerら(2001,Gene therapy,8,49-57)により以前記載されたように、β‐ガラクトシダーゼ活性を調べるために染色した。次いで、感染細胞をカウントした。一方、全細胞溶解物のβ‐ガラクトシダーゼ活性は、P.Leissnerら(2001,Gene therapy,8,49-57)でも記載されているように、化学発光基質（発光β‐ガラクトシダーゼ検出キット、Clontech.Palo Alto）を用いてモニターした。
【０２５３】
ヒトＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、Ｈ３３２６、Ａ５４９細胞およびネズミRenca、Ｂ１６Ｆ０を含めた、試験されるすべての腫瘍細胞系について、Ａｄ-ｐIX ７Ｋの感染力は、他のベクター、特にファイバーのＣ末端に７Ｋ結合部位を挿入した慣用的ターゲティングベクターＡｄ-Ｆｂ-７Ｋと比較して、１０〜１００倍優れていた。
【０２５４】
これらの研究において、ペプチド結合部分はＡｄ ｐＩＸタンパク質のＣ末端部分内に挿入しうることが証明された。様々なヒトおよびネズミ腫瘍細胞へのＡｄ-ｐIX ７Ｋの優れた感染力は、多くの腫瘍細胞がそれらの表面でヘパラン硫酸プロテオグリカンの発現を増大させるという事実と一致する。したがって、ｐIXタンパク質を用いて腫瘍特異性リガンドでベクターを再ターゲティングすることは、癌遺伝子療法へのアデノウイルスベクターの適応力を拡大することになるであろう。
【０２５５】
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【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】ｐIXの保存配列要素。左に示されているような、いくつかのヒト（上の８配列）および動物（ウシ‐ｂ‐、ブタ‐ｐ‐およびイヌ‐ｃ‐）Ａｄ血清型からのｐIXのアミノ酸配列アライメント（Clustal Ｘ）が行われた。アクセス番号は：Ａｄ２（ｐ０３２８２）、Ａｄ５（ｐ０３２８５）、Ａｄ３（Ｊ０１９６２）、Ａｄ７（０３２８３）、Ａｄ９（ｑ９ｙ１９７）、Ａｄ１２（０３２８４）、Ａｄ４０（ｐ４８３１２）、Ａｄ４１（ｐ３２５３９）、Ａｄ２ｂ（ｑ６５３７７）、Ａｄ３ｐ（ｑ９ｗ９ｘ３）、Ａｄ１ｃ（ｑ６５９４４）、Ａｄ２ｃ（ｐ１４２６８）である。ドットは、アライメントを最適化させるプログラムにより挿入されたギャップに相当する。保存配列要素はボックスで囲まれている。“＊”および“＾”（最下部）は、各々同一のおよび関連したアミノ酸残基を表わしている。括弧内の数値（最上部）は、出発メチオニンからの、ヒトＡｄ２およびＡｄ５ ｐIXにおけるアミノ酸の座標に関する。
【図２】ｐIXの特定サブドメインの略図。（Ａ）中央のヒト特異性ポリアラニンストレッチを含めた保存ｐIX配列ドメインが、Ａｄ２またはＡｄ５ｗｔ配列からの関連ペプチド要素および座標と共に、ボックスとして表わされている。点変異または小さな欠失は上に表示され、テキストで挙げられた大きな欠失は下に表示されている。（Ｂ）残基１００〔位置（ａ）の第一Ｌ〕から１３４〔位置（ｇ）のＳ〕までの、ヒトＡｄ２またはＡｄ５ ｐIXのＣ末端ロイシンリピートで予想されるヘリックスホイール表示が、同領域で対称に位置するホイールの近くに示されている。２ヘリックス間で生じうる疎水性相互作用〔（ａ）／（ｄ′）および（ｄ）／（ａ′）〕は、推定超らせん構造において、各々、位置（ａ）および（ｄ）と（ｄ′）および（ａ′）とで残基のアライメントにより示唆されている。これらの相互作用をおそらく安定化させる荷電残基（“＋”または“−”）が示されている。部位特異的変異誘発により変えられた（対応座標の）残基は太字で記載されている。
【図３】Ａｄ２ ｐIXの保存Ｎ末端ドメインの保全は、キャプシド取込みに必要である。ｗｔ ｐIX、非ｐIX（Ｅ１°IX°）または特異的ｐIX変種を発現するＣｓＣｌ精製Ａｄ５ Ｅ１°ビリオン（最上部に示されている；“Ｌ‐Ｖ”はＬ１１４Ｐ＋Ｖ１１７Ｄを意味する）は、ＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸して破壊し、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分別し、ポリクローナル抗ｐIX抗体を用いて免疫ブロットすることにより分析した（“ｖ”と記された偶数列）。同ウイルス（２０ＰＦＵ／  細胞のＭＯＩ）で感染させた２９３細胞から抽出物を調製して（４４）、３６ｈ ｐｉに集めた。一部は、対応ビリオンに次いで、免疫ブロットにより分析した（“ｅ”と記された奇数列）。ｐIXの予想位置が示されている。
【図４】ロイシンリピートおよび中央ヒンジ領域は、Ａｄ２ ｐIX転写活性にとり重要である。（Ａ）Ａｄ５ Ｅ１ａ転写単位のプロモーター領域がＣＡＴ遺伝子と融合されたキメラｐＥ１ａ‐ＣＡＴリポータープラスミドの構造。（Ｂ）Ａ５４９細胞を、Ｆ標識融合タンパク質として野生型または変異ｐIXを発現するプラスミド：Ｆ／IX誘導体（０．１μｇ；各々カラム２および３〜１４）またはIX／Ｆ誘導体（０．５μｇ；各々カラム１５および１６）と一緒に、または単独で（カラム１）、ｐＥ１ａ‐ＣＡＴリポータープラスミド１μｇでトランフフェクトした。細胞を３６時間後に集め、抽出物を調製した。相対的ＣＡＴ活性（３回の独立した実験からの平均）が相応の標準偏差で表されている。
【図５】ｐIXの自己相互作用。Ａ５４９細胞を、示されたように、Ｎ末端Ｆ標識ｗｔまたは変異ｐIXタンパク質を発現するベクターと一緒に、ｗｔ ｐIXを発現するベクターでトランフフェクトした。細胞抽出物を調製し、一部をＦエピトープに対するモノクローナル抗体で（ＩＰ）沈降させた。抗Ｆモノクローナル抗体で最初にプロービングして、免疫沈降物をWesternブロット分析（ＷＢ）に付した。暴露後に、同ブロットを洗浄し、ｐIXに対するポリクローナル抗体で再プロービングした。ｗｔおよびＦ標識ｐIXに相当するバンドの位置が示されている。星印で記されたバンドは、おそらくＦ標識誘導体のタンパク質分解産物に相当する。免疫グロブリン重サブユニット〔ＩｇＧ（Ｈ）〕の位置が記されており、同量の抗体がＩＰ反応で用いられたことを示している。
【図６】GenBankデータバンクで参照番号Ｍ７３２６０として開示されているようなアデノウイルスゲノム５の配列
【図７】ｐIXタンパク質が特異的核封入体を能動的に誘導することを示している。（Ａ）核形質転換の中間段階（１４〜１６ｈ ｐｉ）におけるＡｄ２感染Ａ５４９細胞を、ホルムアルデヒド固定細胞のLowicryl切片において、抗ｐIXポリクローナル抗体でのイムノゴールド(immunogold)標識用に処理した：原繊維顆粒状ネットワーク（ｆｇ）、c.a.封入体（星印）、ウイルス一本鎖ＤＮＡ（ａ）、細胞質（ｃ）。Ｂａｒ０．５μｇ。（Ｂ）核形質転換の後期段階（２４〜３０ｈ ｐｉ）；c.a.封入体（星印）、エレクトロントランスルーセント(electron-translucent)領域（ｅ）、宿主クロマチンの核周辺層（ｃｈ）、ウイルス領域（ｖｒ）、ウイルス（ｖ）、細胞質（ｃ）。Ｂａｒ０．５μｇ。（Ｃ）組換えｐIXタンパク質の過剰産生は、新たに形成されたc.a.封入体内でタンパク質の蓄積を誘導している；c.a.封入体（星印）、凝縮クロマチンの核周辺層（ｃｈ）、核小体（ｎｕ）、Ｂａｒ０．５μｇ。
【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005500828.tif 000131
2005500828.tif 000132
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