(57)【要約】【解決手段】  湿った環境でサンプルを視覚化する方法は、サンプルを湿った環境の標本エンクロージャ内に導入し、走査型電子顕微鏡において該標本エンクロージャ内の該サンプルを走査し、これにより、該サンプルを視覚化する、各工程を備える。
2005529341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
湿った環境でサンプルを視覚化する方法であって、
サンプルを湿った環境の標本エンクロージャ内に導入し、
走査型電子顕微鏡において前記標本エンクロージャ内の前記サンプルを走査し、これにより、該サンプルを視覚化する、各工程を備える、方法。
【請求項２】
前記サンプルの走査工程前に、前記サンプルの複数の要素の間のコントラストを向上させる工程を更に備える、請求項１に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の前記複数の要素のうち少なくとも一部分を特異的に標識形成する工程を備える、請求項２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の分子を特異的に標識形成する工程を備える、請求項２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内のリセプターを特異的に標識形成する工程を備える、請求項２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の細胞小器官を特異的に標識形成する工程を備える、請求項２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の結合箇所を特異的に標識形成する工程を備える、請求項２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の構造要素を特異的に標識形成する工程を備える、請求項２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の機能的要素を特異的に標識形成する工程を備える、請求項２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０】
前記走査工程では、構成原子の原子数の差異に起因したコントラストを有する、前記サンプル内の要素を視覚化する、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１】
前記コントラスト向上工程では、前記サンプルの要素の構成原子の原子数に差異を導入する、請求項２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２】
前記走査工程では、前記サンプル内の脂質含有物を視覚化する、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３】
前記走査工程では、前記サンプル内の核酸含有物を視覚化する、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４】
前記走査工程では、前記サンプル内の蛋白質含有物を視覚化する、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１５】
前記走査工程では、前記サンプル内の炭水化物含有物を視覚化する、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１６】
前記走査工程では、前記サンプル内の金属含有物を視覚化する、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１７】
前記走査工程では、前記サンプル内のヨウ素含有物を視覚化する、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１８】
前記サンプルは、生物学的サンプルである、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１９】
前記生物学的サンプルは、液体中の細胞を含む、請求項１８に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項２０】
前記サンプルは細胞内の脂質を含み、前記走査工程では、該脂質を視覚化する、請求項１９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項２１】
前記走査工程では、前記サンプル内の細胞を視覚化する、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。  
【請求項２２】
前記走査工程では、組織スライス内の組織を視覚化する、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項２３】
前記走査工程では、組織を視覚化する、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項２４】
前記走査工程では、電子ビーム透過性膜に接着している前記サンプル内の細胞を視覚化する、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項２５】
前記標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、前記方法は、前記走査工程前に前記電子ビーム透過性膜上の細胞を成長させる工程を更に備える、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項２６】
前記標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、前記方法は、前記走査工程前に前記電子ビーム透過性膜上の細胞を操作する工程を更に備える、請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項２７】
前記走査工程では、前記サンプルへの外来分子の導入の結果を視覚化する、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項２８】
前記走査工程の結果として前記サンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える、請求項１乃至２７のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項２９】
前記電磁放射を分析する工程を更に備える、請求項２８に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３０】
前記電磁放射を分析する工程には、スペクトル分析が含まれる、請求項２９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３１】
前記走査工程の結果として、前記サンプルから後方散乱された電子ビーム並びに前記サンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える、請求項１乃至３０のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３２】
前記電磁放射は、Ｘ線放射を含む、請求項３１に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３３】
前記電磁放射は、可視光を含む、請求項３１又は３２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３４】
前記電磁放射は、２００〜１０００ｎｍの範囲の波長を有する放射を含む、請求項３１乃至３３のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３５】
前記電磁放射は、前記サンプルの分子構造に関連した情報を提供する放射を含む、請求項３１乃至３４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３６】
前記電磁放射は、前記サンプル内の材料分布に関連した情報を提供する放射を含む、請求項３１乃至３４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３７】
前記走査工程は、多数の異なる電子エネルギーレベルで走査型電子顕微鏡の前記標本エンクロージャ内の前記サンプルを走査する工程を含む、上記請求項のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３８】
前記多数の電子エネルギーレベルにおける前記サンプルの多数の視覚化画像を使用することにより、前記サンプルの３次元画像を再構成する工程を更に備える、請求項３７に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項３９】
前記サンプルは、多成分サンプルであり、前記走査工程は、走査型電子顕微鏡の前記標本エンクロージャ内の前記多成分サンプルを走査し、これにより、該多成分サンプルの少なくとも１つの成分を視覚化する工程を含む、請求項１乃至３８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４０】
検査されるべき前記サンプルを取得する工程を更に備え、該サンプルは湿った環境にある、請求項１乃至３９のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４１】
湿った環境でサンプルを視覚化する方法であって、
湿った環境の標本エンクロージャ内にサンプルを導入し、
多数の異なる電子エネルギーレベルで、走査型電子顕微鏡の前記標本エンクロージャ内の前記サンプルを走査する、各工程を備える、方法。
【請求項４２】
前記多数の電子エネルギーレベルにおける前記サンプルの多数の視覚化画像を使用することにより、前記サンプルの３次元画像を再構成する工程を更に備える、請求項４１に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４３】
前記サンプルの走査工程前に、前記サンプルの複数の要素の間のコントラストを向上させる工程を更に備える、請求項４２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４４】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の前記複数の要素のうち少なくとも一部分を特異的に標識形成する工程を備える、請求項４３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４５】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の分子を特異的に標識形成する工程を備える、請求項４３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４６】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内のリセプターを特異的に標識形成する工程を備える、請求項４３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４７】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の細胞小器官を特異的に標識形成する工程を備える、請求項４３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４８】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の結合箇所を特異的に標識形成する工程を備える、請求項４３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項４９】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の構造要素を特異的に標識形成する工程を備える、請求項４３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５０】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の機能的要素を特異的に標識形成する工程を備える、請求項４３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５１】
前記走査工程では、構成原子の原子数の差異に起因したコントラストを有する、前記サンプル内の要素を視覚化する、請求項４１乃至５０のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５２】
前記コントラスト向上工程では、前記サンプルの要素の構成原子の原子数に差異を導入する、請求項４３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５３】
前記走査工程では、前記サンプル内の脂質含有物を視覚化する、請求項４１乃至５２のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５４】
前記走査工程では、前記サンプル内の核酸含有物を視覚化する、請求項４１乃至５２のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５５】
前記走査工程では、前記サンプル内の蛋白質含有物を視覚化する、請求項４１乃至５２のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５６】
前記走査工程では、前記サンプル内の炭水化物含有物を視覚化する、請求項４１乃至５２のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５７】
前記走査工程では、前記サンプル内の金属含有物を視覚化する、請求項４１乃至５２のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５８】
前記走査工程では、前記サンプル内のヨウ素含有物を視覚化する、請求項４１乃至５２のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項５９】
前記サンプルは、生物学的サンプルである、請求項４１乃至５８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６０】
前記生物学的サンプルは、液体中の細胞を含む、請求項５９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６１】
前記サンプルは細胞内の脂質を含み、前記走査工程では、該脂質を視覚化する、請求項６０に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６２】
前記走査工程では、前記サンプル内の細胞を視覚化する、請求項４１乃至６１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。  
【請求項６３】
前記走査工程では、組織スライス内の組織を視覚化する、請求項４１乃至６１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６４】
前記走査工程では、組織を視覚化する、請求項４１乃至５１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６５】
前記走査工程では、電子ビーム透過性膜に接着している前記サンプル内の細胞を視覚化する、請求項４１乃至６４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６６】
前記標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、前記方法は、前記走査工程前に前記電子ビーム透過性膜上の細胞を成長させる工程を更に備える、請求項４１乃至６５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６７】
前記標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、前記方法は、前記走査工程前に前記電子ビーム透過性膜上の細胞を操作する工程を更に備える、請求項４１乃至６６のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６８】
前記走査工程では、前記サンプルへの外来分子の導入の結果を視覚化する、請求項４１乃至６７のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項６９】
前記走査工程の結果として前記サンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える、請求項４１乃至６８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７０】
前記電磁放射を分析する工程を更に備える、請求項６９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７１】
前記電磁放射を分析する工程には、スペクトル分析が含まれる、請求項７０に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７２】
前記走査工程の結果として、前記サンプルから後方散乱された電子ビーム並びに前記サンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える、請求項４１乃至７１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７３】
前記電磁放射は、Ｘ線放射を含む、請求項７２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７４】
前記電磁放射は、可視光を含む、請求項７２又は７３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７５】
前記電磁放射は、２００〜１０００ｎｍの範囲の波長を有する放射を含む、請求項７２乃至７４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７６】
前記電磁放射は、前記サンプルの分子構造に関連した情報を提供する放射を含む、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７７】
前記電磁放射は、前記サンプル内の材料分布に関連した情報を提供する放射を含む、請求項７２乃至７５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項７８】
湿った環境で多成分サンプルの少なくとも１つの成分を視覚化する方法であって、
湿った環境の標本エンクロージャ内に多成分サンプルを導入し、
走査型電子顕微鏡の前記標本エンクロージャ内の前記多成分サンプルを走査し、これにより、該多成分サンプルの少なくとも１つの成分を視覚化する、各工程を備える、方法。
【請求項７９】
前記サンプルの走査工程前に、前記サンプルの複数の要素の間のコントラストを向上させる工程を更に備える、請求項７８に記載の湿った環境で多成分サンプルの少なくとも１つの成分を視覚化する方法。
【請求項８０】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の前記複数の要素のうち少なくとも一部分を特異的に標識形成する工程を備える、請求項７９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８１】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の分子を特異的に標識形成する工程を備える、請求項７９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８２】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内のリセプターを特異的に標識形成する工程を備える、請求項７９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８３】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の細胞小器官を特異的に標識形成する工程を備える、請求項７９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８４】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の結合箇所を特異的に標識形成する工程を備える、請求項７９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８５】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の構造要素を特異的に標識形成する工程を備える、請求項７９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８６】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の機能的要素を特異的に標識形成する工程を備える、請求項７９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８７】
前記走査工程では、構成原子の原子数の差異に起因したコントラストを有する、前記サンプル内の要素を視覚化する、請求項７８乃至８６のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８８】
前記コントラスト向上工程では、前記サンプルの要素の構成原子の原子数に差異を導入する、請求項７９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項８９】
前記走査工程では、前記サンプル内の脂質含有物を視覚化する、請求項７８乃至８８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９０】
前記走査工程では、前記サンプル内の核酸含有物を視覚化する、請求項７８乃至８８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９１】
前記走査工程では、前記サンプル内の蛋白質含有物を視覚化する、請求項７８乃至８８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９２】
前記走査工程では、前記サンプル内の炭水化物含有物を視覚化する、請求項７８乃至８８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９３】
前記走査工程では、前記サンプル内の金属含有物を視覚化する、請求項７８乃至８８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９４】
前記走査工程では、前記サンプル内のヨウ素含有物を視覚化する、請求項７８乃至８８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９５】
前記サンプルは、生物学的サンプルである、請求項７８乃至８８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９６】
前記生物学的サンプルは、液体中の細胞を含む、請求項９５に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９７】
前記サンプルは細胞内の脂質を含み、前記走査工程では、該脂質を視覚化する、請求項９６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項９８】
前記走査工程では、前記サンプル内の細胞を視覚化する、請求項７８乃至９７のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。  
【請求項９９】
前記走査工程では、組織スライス内の組織を視覚化する、請求項７８乃至９７のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１００】
前記走査工程では、組織を視覚化する、請求項７８乃至９７のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０１】
前記走査工程では、電子ビーム透過性膜に接着している前記サンプル内の細胞を視覚化する、請求項７８乃至１００のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０２】
前記標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、前記方法は、前記走査工程前に前記電子ビーム透過性膜上の細胞を成長させる工程を更に備える、請求項７８乃至１０１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０３】
前記標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、前記方法は、前記走査工程前に前記電子ビーム透過性膜上の細胞を操作する工程を更に備える、請求項７８乃至１０２のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０４】
前記走査工程では、前記サンプルへの外来分子の導入の結果を視覚化する、請求項７８乃至１０３のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０５】
前記走査工程の結果として前記サンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える、請求項７８乃至１０４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０６】
前記電磁放射を分析する工程を更に備える、請求項１０５に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０７】
前記電磁放射を分析する工程には、スペクトル分析が含まれる、請求項１０６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０８】
前記走査工程の結果として、前記サンプルから後方散乱された電子ビーム並びに前記サンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える、請求項７８乃至１０７のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１０９】
前記電磁放射は、Ｘ線放射を含む、請求項１０８に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１０】
前記電磁放射は、可視光を含む、請求項１０８又は１０９に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１１】
前記電磁放射は、２００〜１０００ｎｍの範囲の波長を有する放射を含む、請求項１０８乃至１１０のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１２】
前記電磁放射は、前記サンプルの分子構造に関連した情報を提供する放射を含む、請求項１０８乃至１１１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１３】
前記電磁放射は、前記サンプル内の材料分布に関連した情報を提供する放射を含む、請求項１０８乃至１１１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１４】
前記走査工程は、走査型電子顕微鏡における前記標本エンクロージャ内の前記サンプルを多数の異なる電子エネルギーレベルで走査する工程を含む、請求項７８乃至１１３のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１５】
湿った環境でサンプルを視覚化する方法であって、
湿ったサンプルを取得し、
前記湿ったサンプルを、光の回折限界により制限されない解像度で走査型電子顕微鏡内で走査し、
前記湿ったサンプルから放射された光を検出する、各工程を備える、方法。
【請求項１１６】
前記サンプルの走査工程前に、前記サンプルの複数の要素の間のコントラストを向上させる工程を更に備える、請求項１１５に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１７】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の前記複数の要素のうち少なくとも一部分を特異的に標識形成する工程を備える、請求項１１６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１８】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の分子を特異的に標識形成する工程を備える、請求項１１６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１１９】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内のリセプターを特異的に標識形成する工程を備える、請求項１１６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２０】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の細胞小器官を特異的に標識形成する工程を備える、請求項１１６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２１】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の結合箇所を特異的に標識形成する工程を備える、請求項１１６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２２】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の構造要素を特異的に標識形成する工程を備える、請求項１１６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２３】
前記コントラスト向上工程は、前記サンプル内の機能的要素を特異的に標識形成する工程を備える、請求項１１６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２４】
前記走査工程では、構成原子の原子数の差異に起因したコントラストを有する、前記サンプル内の要素を視覚化する、請求項１１５乃至１２３のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２５】
前記コントラスト向上工程では、前記サンプルの要素の構成原子の原子数に差異を導入する、請求項１１６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２６】
前記走査工程では、前記サンプル内の脂質含有物を視覚化する、請求項１１５乃至１２５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２７】
前記走査工程では、前記サンプル内の核酸含有物を視覚化する、請求項１１５乃至１２５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２８】
前記走査工程では、前記サンプル内の蛋白質含有物を視覚化する、請求項１１５乃至１２５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１２９】
前記走査工程では、前記サンプル内の炭水化物含有物を視覚化する、請求項１１５乃至１２５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３０】
前記走査工程では、前記サンプル内の金属含有物を視覚化する、請求項１１５乃至１２５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３１】
前記走査工程では、前記サンプル内のヨウ素含有物を視覚化する、請求項１１５乃至１２５のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３２】
前記サンプルは、生物学的サンプルである、請求項１１５乃至１３１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３３】
前記生物学的サンプルは、液体中の細胞を含む、請求項１３２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３４】
前記サンプルは細胞内の脂質を含み、前記走査工程では、該脂質を視覚化する、請求項１３３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３５】
前記走査工程では、前記サンプル内の細胞を視覚化する、請求項１１５乃至１３４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。  
【請求項１３６】
前記走査工程では、組織スライス内の組織を視覚化する、請求項１１５乃至１３４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３７】
前記走査工程では、組織を視覚化する、請求項１１５乃至１３４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３８】
前記走査工程では、電子ビーム透過性膜に接着している前記サンプル内の細胞を視覚化する、請求項１１５乃至１３７のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１３９】
前記標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、前記方法は、前記走査工程前に前記電子ビーム透過性膜上の細胞を成長させる工程を更に備える、請求項１１５乃至１３８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４０】
前記標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、前記方法は、前記走査工程前に前記電子ビーム透過性膜上の細胞を操作する工程を更に備える、請求項１１５乃至１３９のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４１】
前記走査工程では、前記サンプルへの外来分子の導入の結果を視覚化する、請求項１１５乃至１４０のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４２】
前記走査工程の結果として前記サンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える、請求項１１５乃至１４１のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４３】
前記電磁放射を分析する工程を更に備える、請求項１４２に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４４】
前記電磁放射を分析する工程には、スペクトル分析が含まれる、請求項１４３に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４５】
前記走査工程の結果として、前記サンプルから後方散乱された電子ビーム並びに前記サンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える、請求項１１５乃至１４４のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４６】
前記電磁放射は、Ｘ線放射を含む、請求項１４５に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４７】
前記電磁放射は、可視光を含む、請求項１４５又は１４６に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４８】
前記電磁放射は、２００〜１０００ｎｍの範囲の波長を有する放射を含む、請求項１４５乃至１４７のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１４９】
前記電磁放射は、前記サンプルの分子構造に関連した情報を提供する放射を含む、請求項１４５乃至１４８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１５０】
前記電磁放射は、前記サンプル内の材料分布に関連した情報を提供する放射を含む、請求項１４５乃至１４８のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１５１】
前記走査工程は、走査型電子顕微鏡における前記標本エンクロージャ内の前記サンプルを多数の異なる電子エネルギーレベルで走査する工程を含む、請求項１１５乃至１５０のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１５２】
前記多数の電子エネルギーレベルにおける前記サンプルの多数の視覚化画像を使用することにより、前記サンプルの３次元画像を再構成する工程を更に備える、請求項１５１に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１５３】
前記サンプルは、多成分サンプルであり、前記走査工程は、走査型電子顕微鏡の前記標本エンクロージャ内の前記多成分サンプルを走査し、これにより、該多成分サンプルの少なくとも１つの成分を視覚化する工程を含む、請求項１１５乃至１５２のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１５４】
検査されるべき前記サンプルを取得する工程を更に備え、該サンプルは湿った環境にある、請求項１１５乃至１５３のいずれか１項に記載の湿った環境でサンプルを視覚化する方法。
【請求項１５５】
生体互換性インプラントを製造するための方法であって、
生体互換性材料から生体互換性インプラントを形成し、
湿った環境で、走査型電子顕微鏡内で前記生体互換性インプラントの少なくとも一部分を検査し、
前記検査工程の結果を分析し、
前記分析工程の結果に従って、検査された前記生体互換性インプラントを分類する、各工程を備える、方法。
【請求項１５６】
前記検査工程は、
前記少なくとも一部分を備えるサンプルを、湿った環境の標本エンクロージャ内に導入し、
前記走査型電子顕微鏡の前記標本エンクロージャ内の前記サンプルを走査し、これにより、該サンプルを視覚化する、各工程を備える、請求項１５５に記載の生体互換性インプラントを製造するための方法。  
【請求項１５７】
微生物学的実体の検出、同定又は特徴化のための方法であって、
少なくとも１つの微生物学的実体を含む、湿ったサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で前記湿ったサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査し、
前記走査工程の結果を分析する、各工程を備える、方法。
【請求項１５８】
前記走査工程は、
前記少なくとも１つの微生物学的実体を含む、湿ったサンプルを、湿った環境の標本エンクロージャ内に導入し、
前記走査型電子顕微鏡内で前記標本エンクロージャ内の前記湿ったサンプルを走査し、これにより、該湿ったサンプルを視覚化する、各工程を備える、請求項１５７に記載の微生物学的実体の検出又は同定のための方法。
【請求項１５９】
前記湿ったサンプルは、尿を含む、請求項１５７又は１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記湿ったサンプルは、排泄物を含む、請求項１５７乃至１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記湿ったサンプルは、血液を含む、請求項１５７乃至１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記湿ったサンプルは、唾液を含む、請求項１５７乃至１６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記湿ったサンプルは、呼吸器系の洗浄物を含む、請求項１５７乃至１６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記湿ったサンプルは、生体検査組織を含む、請求項１５７乃至１６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記湿ったサンプルは、環境サンプルを含む、請求項１５７乃至１６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記湿ったサンプルは、脳脊髄流体を含む、請求項１５７乃至１６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記湿ったサンプルは、土壌サンプルを含む、請求項１５７乃至１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記湿ったサンプルは、食物を含む、請求項１５７乃至１６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記湿ったサンプルは、工業製品を含む、請求項１５７乃至１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記湿ったサンプルは、医療装置、工業装置又は家庭内装置を含む、請求項１５７乃至１６９のいずれか１項に記載の微生物学的実体を特徴付けるための方法。
【請求項１７１】
前記サンプルを特異的に染色する工程を更に備える、請求項１５７乃至１７０のいずれか１項に記載の微生物学的実体を特徴付けるための方法。
【請求項１７２】
前記微生物学的実体を化学物質で処理する工程を更に備える、請求項１５７乃至１７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記微生物学的実体に放射を印加する工程を更に備える、請求項１５７乃至１７２のいずれか１項に記載の微生物学的実体を特徴付けるための方法。
【請求項１７４】
前記分析工程は、前記微生物学的実体の形態を分析する工程を含む、請求項１５７乃至１７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７５】
生体膜を特徴付けるための方法であって、
生体膜の湿ったサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で前記生体膜の湿ったサンプルを走査し、
前記走査工程の結果を分析する、各工程を備える、方法。
【請求項１７６】
前記走査工程は、
前記生体膜を含む前記湿ったサンプルを湿った環境の標本エンクロージャ内に導入し、
前記走査型電子顕微鏡内の前記湿った標本エンクロージャ内の前記湿ったサンプルを走査し、これにより該湿ったサンプルを視覚化する、各工程を備える、請求項１７５に記載の生体膜を特徴付けるための方法。
【請求項１７７】
サンプルを視覚化する方法であって、
サンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内の湿った環境で前記サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、中間の凝固工程、被覆工程及びスライス切り工程無しに走査し、これによって前記サンプルを視覚化する、各工程を備える、方法。
【請求項１７８】
サンプルを視覚化する方法であって、
サンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内の湿った環境で前記サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、走査前に形態的に衝撃を加えること無しに走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１７９】
サンプルを視覚化する方法であって、
サンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内の湿った環境で前記サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、走査前の高々固定化及び染色工程に続いて走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１８０】
サンプルを視覚化する方法であって、
サンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内の湿った環境で前記サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、走査前の高々少なくとも１つの水成溶液を用いた処理に続いて走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１８１】
サンプルを視覚化する方法であって、
サンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内の湿った環境で前記サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、走査前に非水成溶液で処理されること無しに走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１８２】
サンプルを視覚化する方法であって、
２０ミクロンを超える厚さのサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で、前記サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１８３】
脂肪組織を検査する方法であって、
脂肪組織のサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で、前記脂肪組織のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１８４】
前記サンプルは、前記走査前に染色されていない、請求項１８３に記載の脂肪組織を検査する方法。
【請求項１８５】
脂肪組織を検査する方法であって、
脂肪組織のサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で、前記脂肪組織のサンプルを、該サンプルが走査前に染色されること無しに、走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１８６】
サンプルを視覚化する方法であって、
走査型電子顕微鏡内で、前記サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する工程を備え、
前記走査型電子顕微鏡のステージに対して前記サンプルが移動すること無く、２５平方ミリメートルを超える前記サンプルの面積に亘って、前記走査工程が実行される、方法。
【請求項１８７】
細胞外基質を検査する方法であって、
細胞外基質のサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で、前記細胞外基質のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１８８】
皮覆組織を検査する方法であって、
皮覆組織のサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で、前記皮覆組織のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１８９】
腎臓組織を検査する方法であって、
腎臓組織のサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で、前記腎臓組織のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１９０】
生体検査組織を検査する方法であって、
生体検査組織のサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で、前記生体検査組織のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１９１】
生物学的材料を検査する方法であって、
生物学的材料を免疫標識形成し、
走査型電子顕微鏡内で、前記免疫標識形成された生物学的材料を、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１９２】
組織を検査する方法であって、
組織を免疫標識形成し、
走査型電子顕微鏡内で、前記免疫標識形成された組織を、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１９３】
サンプルを検査する方法であって、
走査型電子顕微鏡内で、前記サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査し、
前記サンプルを光学顕微鏡を使用して検査する、各工程を備える、方法。
【請求項１９４】
化学物質又は化学物質の組み合わせにさらしたときの毒性効果を分析するための方法であって、
実験動物を、前記化学物質又は化学物質の組み合わせにさらし、
前記実験動物からサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で、前記実験動物からの前記サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１９５】
環境条件にさらした後に続く毒性効果を分析する方法であって、
前記環境条件にさらされた少なくとも１つの個体を同定し、
前記少なくとも１つの個体の少なくとも１つから少なくとも１つのサンプルを取得し、
走査型電子顕微鏡内で、前記少なくとも１つのサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１９６】
化学的実体を特徴付ける方法であって、
ＳＥＭ互換性サンプルエンクロージャ内で化学的実体を細胞に印加し、
走査型電子顕微鏡内で、前記細胞を、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える、方法。
【請求項１９７】
細胞形状の変化を分析する工程を更に備える、請求項１９６に記載の化学的実体を特徴付ける方法。
【請求項１９８】
前記細胞の細胞骨格を分析する工程を更に備える、請求項１９６又は１９７に記載の化学的実体を特徴付ける方法。
【請求項１９９】
前記細胞の生態分子の分布を分析する工程を更に備える、請求項１９６乃至１９８のいずれか１項に記載の化学的実体を特徴付ける方法。
【請求項２００】
前記サンプルの領域からのＸ線を検出し、
前記サンプル内で、ヨウ素、金属及びリンのうち少なくとも１つの存在を検出するため前記Ｘ線を分析する、各工程を備える、上記請求項のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０１】
ヨウ素、金属及びリンのうち前記少なくとも１つの濃度を決定する工程を更に備える、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記サンプルは、電子透過性で流体不透過性の膜を通過した電子により衝突される、上記請求項のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記サンプルを前記電子透過性で流体不透過性の膜に押し付ける工程を更に備える、請求項２０２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願人は、「自動化ＳＥＭを使用した、無傷の細胞の分子の定量パターン分析」という標題で、２００２年７月８日に出願された、米国仮特許出願シリアル番号６０／３９３，７４７号、「走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の検査システムのための標本エンクロージャ」という標題で、２００３年２月２０日に出願された、米国仮特許出願シリアル番号６０／４４８，８０８号、「走査型電子顕微鏡と蛍光性又はシンチレーションとを持つマーカーとを使用した、生体サンプルの蛍光画像形成のための装置」という標題で、２００２年６月５日に出願された、イスラエル特許出願シリアル番号１５００５４号、並びに、「湿った環境におけるサンプルの走査型電子顕微鏡による画像形成のための自動化適合性の装置」という標題で、２００２年６月５日に出願された、イスラエル特許出願シリアル番号１５００５５号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、概して、サンプルを含む流体のＳＥＭ検査のための方法に係り、より詳しくは、湿った環境においてサンプルを視覚化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
以下の列挙された文献が、当該技術分野の現在の状態を表すと考えられ、ここで参照されたことにより各々の開示内容が本願に組み込まれる。
生体細胞及び組織の顕微鏡検査は、臨床診断並びに生命科学の研究の多様な分野において中枢をなすツールである。光学顕微鏡（ＬＭ）は、薄い（数ミクロン）サンプルで実行され、該サンプルには、細胞、無細胞材料、又は、組織の薄い層若しくは薄片が含まれており、これらは、例えば、化学薬品等のコントラスト剤又は抗体で染色することができる。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、通常、特殊に形成準備された超薄型の薄片（０．１ミクロン以下）を必要とし、細胞内情報の豊富さを明らかにする。前述した技術の各々は、制約を持っている。即ち、光学顕微鏡の解像度は、回折により約０．２５ミクロンに制限され、ＴＥＭの使用は、サンプルの広範囲に亘る処理により妨げられ、サンプルの構造をかなり変えてしまうおそれがある。標準的なＴＥＭのためのサンプルの準備は、特殊な技術を必要とし、達成するまでに少なくとも数日はかかる。非常に薄い切片は、サンプルの非常に制限された、しばしば任意的となる部分を与え、多重連続薄片の画像形成を必要としている。
【０００４】
高い解像度の画像は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって達成することもできる。走査型電子顕微鏡では、合焦された電子ビームがサンプルを連続的に走査し、続いて連続的に生じる信号が画像を発生するため使用される。非常にしばしば、２次電子が検出され、サンプルの表面トポグラフィーに関する情報を与える。後方散乱電子の検出は、表面より下方の短距離、典型的には数ミクロンまでの距離にあるサンプルの領域の材料分布に関する情報を与える。ＳＥＭは、電子が、画像を生じさせるためサンプルを横断する必要がないという意味で、画像形成処理の反射モードである。このため、サンプルは、任意の厚さを持っていてもよく、薄片にする必要はない。しかし、サンプルは、走査電子ビームの妨げられない運動を可能にするため真空環境に置かなければならない。従って、サンプルは、広範囲に亘って、脱水され、乾燥されなければならない。更には、乾燥されたとき、生体及び他の有機サンプルは、電気的に絶縁されるようになり、電子ビームによるサンプルの帯電に起因して人為構造をもたらす。それによって、サンプルは、通常、カーボン又は金属の導電層で被覆されている。
【０００５】
広範囲に亘る乾燥無しに、生体又は他の湿ったサンプルを観察する一つのアプローチが環境ＳＥＭ及び類似の技術の開発であってきた。これらの方法は、差動ポンプ及び多重アパーチャに基づいており、走査電子ビームの経路のほとんどを通して高真空を維持しつつ、サンプルの近傍領域で水蒸気圧力に近い局所化された圧力を可能にする。これらの方法では、サンプルは、部分的真空にさらされており、脱水状態を維持するために、低温、及び、複雑化した手動による正圧の維持の両方が要求される。実際に、この技術を使用した生体研究の公開された報告のうち少数が、高い水準で首尾一貫した結果を得る困難さを証明している。
【０００６】
高解像度の画像形成は、生物学上幅広い用途を持っている。これらの用途には、細胞、組織、微生物、及び、ウィルス、並びに、例えば生物学的な環境上若しくは工業上の流体、乳濁液及び懸濁液等の無細胞サンプルの画像形成が含まれている。
【０００７】
最近のレビューは、臨床診断における電子顕微鏡の使用を論じている（タッカー、Ｊ．Ａ．２０００）。少ないが有意な比率のケース（３〜８％）において、適切な診断が、電子顕微鏡に基づいてのみなすことができることが見出されている。このことは、特に、腫瘍学、及び、腎臓疾患等の選択された領域で断言することができる（タッカー２０００）。これらの数は、おそらくは過小評価である。電子顕微鏡の使用は、主要には、ユーティリティの欠如によっては制限されないが、コスト、結果を生成するのに必要となる時間、及び、低いスループットを考慮することによって制限されるからである。かくして、光学顕微鏡と互換性のあるサンプル準備手続きで電子顕微鏡の高い解像度を達成する、生体組織及び細胞のための画像形成システムに対する、かなりの必要性が存在している。
【０００８】
【非特許文献１】Tucker, J.A. (2000) The continuing value of electron microscopy in surgical pathology. Ultrastructural Pathology 24:383-9
【非特許文献２】Mathews, R.A. and Donald, A.M. (2002) Conditions for imaging  emulsions in the environmental scanning electron microscope. Scanning 24:75-85.
【非特許文献３】Mittler, M.A., Walters, B.C. and Stopa, E.G. (1996) Observer reliability in histological grading of astrocytoma stereotactic biopsies. J. Neurosurg 85:1091-4.
【非特許文献４】Levit-Binnun, N., Lindner A.B., Zik 0., Eshhar Z. and Moses, E. (2003) Quantitative detection of protein arrays. Anal. Chem. 75:1436-41.
【非特許文献５】.      Becker, R.P. and Sogard, M. (1979) Visualization of subsurface structures in cells and tissues by backscattered electron imaging. Scan. Electron. Microsc. 1979 (I1): 835-70.
【非特許文献６】Sedar, A.W., Silver, M.J. and Ingerman-Wolenski, C.M. (1983) Backscattered electron imaging to visualize arterial endothelial detachment in the scanning electron microscope. Scan. Electron. Microsc. 1983 (II): 969-74.
【非特許文献７】.      Burns, W.A., Zimmerman, H.J., Hammond, J., Howatson, A. Katz, A and White, J. (1975) The clinician's view of diagnostic electron microscopy. Hum. Pathol. 6:467-78.
【非特許文献８】Gyorkey, F., Min, K.W., Krisko, I. And Gyorkey, P. (1975) The usefulness of electron  microscopy in the diagnosis of human tumors. Hum. Pathol. 6:421-41.
【非特許文献９】Hayat, M.A. (2000) Principles and Techniques of Electron Microscopy - Biological Applications (Fourth edition; Cambridge University Press)
【非特許文献１０】Hermann, R., Walther, P. and Muller, M. (1996) Immunogold-labeling in SEM. Histochem. Cell. Biol. 106:31-39.
【非特許文献１１】Spargo, B.H. (1975) Practical use of electron microscopy for the diagnosis of glomerular disease. Hum. Pathol. 6:405-20.
【非特許文献１２】Gu, X. and Herrera, G.A. (2002) The value of electron microscopy in the diagnosis of IgA nephropathy. Ultrastruct. Pathol. 26:203-10
【非特許文献１３】Fisher, C, Ramsay, AD, Griffiths, M and McDougall, J. (1985) An assessment of the value of electron microscopy in tumor diagnosis. J. Clin. Pathol. 38:403-8
【非特許文献１４】Brocker, W, Pfefferkorn G. (1975) Applications of the cathodoluminescence method in biology and medicine. Scan. Electron. Microsc. 1979;(II):125-32
【非特許文献１５】Carlen, B. and Englund, E. (2001) Diagnostic value of electron microscopy in a case of juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis. Ultrastruct. Pathol. 25:285-8
【非特許文献１６】Hollinshead M, Sanderson J. & Vaux D.J. (1997). Anti-biotin antibodies offer superior organelle-specific labeling of mitochondria over avidin or streptavidin. J J Histochem. Cytochem. 45:1053-7
【非特許文献１７】Kristiansen, E. and Madsen, C. (1995) Induction of protein droplet (alpha-2 microglobulin) nephropathy in male rats after short-term dosage with 1,8-cineole and l-limonene. Toxicol. Letters 80:147-52.
【非特許文献１８】Goldstein, J.L., Newbury, D.E., Echlin, P., and Joy, D. (1992). Scanning Electron Microscopy and X-ray microanalysis: a text for biologists, matrials scientists, and geologists. Plenum Press, 1992.
【非特許文献１９】Schlessinger, J. (2002)   Ligand-induced, receptor-mediated dimerization and activation of EGF receptor. Cell 110:669-72.
【特許文献１】米国特許番号3,218,459
【特許文献２】米国特許番号3,378,684
【特許文献３】米国特許番号4,037,109
【特許文献４】米国特許番号4,071,766
【特許文献５】米国特許番号4,115,689
【特許文献６】米国特許番号4,448,311
【特許文献７】米国特許番号4,587,666
【特許文献８】米国特許番号4,596,928
【特許文献９】米国特許番号4,618,938
【特許文献１０】米国特許番号4,705,949
【特許文献１１】米国特許番号4,720,622
【特許文献１２】米国特許番号4,720,633
【特許文献１３】米国特許番号4,880,976
【特許文献１４】米国特許番号4,929,041
【特許文献１５】米国特許番号4,992,662
【特許文献１６】米国特許番号5,103,102
【特許文献１７】米国特許番号5,250,808
【特許文献１８】米国特許番号5,323,441
【特許文献１９】米国特許番号5,326,971
【特許文献２０】米国特許番号5,362,964
【特許文献２１】米国特許番号5,406,087
【特許文献２２】米国特許番号5,412,211
【特許文献２３】米国特許番号5,811,803
【特許文献２４】米国特許番号5,898,261
【特許文献２５】米国特許番号5,945,672
【特許文献２６】米国特許番号6,025,592
【特許文献２７】米国特許番号6,072,178
【特許文献２８】米国特許番号6,114,695
【特許文献２９】米国特許番号6,130,434
【特許文献３０】米国特許番号6,365,898
【特許文献３１】米国特許番号6,452,177
【特許文献３２】ＰＣＴ国際公開出願番号 WO02/14830- PCT/IL01/00764.
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
「走査型電子顕微鏡を使用した、非真空環境に置かれたサンプルの検査のための装置及び方法」と題された、本願発明者の一人による、現在係属中のＰＣＴ／ＩＬ０１／０１１０８は、大気圧近傍圧力で、幅広い温度範囲に亘って、湿った環境中の湿ったサンプルの画像形成を可能にする、非真空式走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）装置を開示している。これは、広範なサンプル準備手続きのための必要性を無くし、かくして、例えば高い解像度及び高いコントラスト又は信号対ノイズ比等といった電子顕微鏡の利点と、例えばサンプル準備手続きの容易さ及び迅速さといった光学顕微鏡の利点とを結合させる。このことは、電子に対しては透過性であるが流体に対しては不透過性であると共に、典型的には大気圧である容器の内部とＳＥＭの画像形成領域における真空との間の圧力差に耐えるのに十分に強い、薄い仕切り膜により覆われたサンプル容器の使用により達成される。この種の膜は、以下では、仕切り膜、又は、電子透過性で流体不浸透性の膜と称される。
【００１０】
非真空式ＳＥＭの前述した特徴は、次の態様で、流体含有サンプル、特に生物学的サンプルの観察に適用される。
【００１１】
１．  真空からのサンプルの分離は、湿ったサンプルの直接的な視覚化を可能にする。これは、水置換及び臨界点乾燥を含む、全ての脱水処置に対する必要性を直ちに無くす。湿った状態は、サンプルの自然な状態にほとんど似ており、脱水の間に歪められ又は破壊されるおそれのある特徴を保存する。この利点は、真の構成が細胞及び細胞外基質の両方を含む、組織の観察において特に重要となる。更には、サンプル内及びサンプルの回りの流体の存在は、効率的な電荷及び余剰熱の消失を可能にする。これは、サンプル帯電に起因した人為構造、並びに熱損傷を無くす。
【００１２】
２．  生物学的組織の電子顕微鏡検査は、非常にしばしば、２つの画像形成モードでなされる。透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）は、サンプルを透過した電子を利用する。即ち、サンプルの全厚さは、画像に寄与する。透過技術は、サンプルの厚さに関して厳しい制約を課す。典型的には、要求される厚さは５０ｎｍであり、これは、超高電圧顕微鏡では３μｍまで増大させることができる。走査型電子顕微鏡検査は、反射モードを使用し、最も頻繁にはサンプルの表面形状のみを画像形成する２次電子を検出する。非真空式ＳＥＭ技術は、走査型電子顕微鏡で後方散乱電子の検出を使用する。電子ビームは、サンプル内を貫通し、後方散乱された電子は、サンプル表面を越えて数ミクロンの深さまでのサンプル特徴を明らかにする。かくして、画像形成の電子散乱／反射モードが陥られるが、画像は、表面には限定されず、サンプルの内部構造が明らかにされる。更には、検出が反射モードでなされるので、相互作用する体積部分を越えて存在する任意材料は、画像形成には効果を及ぼさない。従って、サンプルは、画像形成される領域を遙かに超える厚さを持つことができる。典型的には、数ミリメートル厚の組織断片を見ることができる。表面に最も近接している数マイクロメートル以下の材料層のみが、サンプルのバルク部からの干渉無しに、走査画像に寄与する。画像形成された領域の厚さは、電子ビームの加速電圧を変化させることにより、変調することができる。非真空式ＳＥＭは、かくして、サンプルの実際の薄片化の必要無しに、「仮想的薄片」を与える。これは、サンプルを埋め込んだり、凍結させたりする必要性を無くす。そうでなければ、サンプルの薄片化を可能にすることが要求される。最終的には、電子後方散乱効率のサンプル材料組成（原子番号Ｚによる）の依存性は、ＴＥＭ画像形成の特徴である重金属染色が無い場合でさえもコントラストを形成する。生体サンプル内部の脂質、リン、塩の濃度の局所的な差異に基づいて細胞小器官を識別することができる。幅広い範囲の染色及び標識工程を、コントラストを向上させるため使用することができる。
【００１３】
非真空式ＳＥＭ技術の追加の能力は、電子ビームで走査する間にサンプルから放射された光を同時に検出する能力である。走査電子ビームは、サンプル内の分子を励起し、これにより当該分子は、特徴的な波長（陰極ルミネッセンス）で光を放射することができる。光強度は、輝く分子の分布の画像を導出するため使用される。該分子は、生物学的サンプルに外的要因無しに特有のものであるか、又は、外的に導入することができる標識のいずれかである。この画像は、電子物質相互作用により制限される解像度で、光の回折によってではない、後方散乱電子（ＢＳＥ）による画像形成と同時に得られる。同様に、走査されたサンプルから放射されるＸ線を、従来の検出器及び方法を使用して検出することができ、材料組成及び完全に水和されたサンプルの分布に関する追加の情報を与える。詳しくは、Ｘ線分析を、例えばカルシウム、鉄、ナトリウム、カリウム、銅若しくは亜鉛等の金属、又はヨウ素、硫黄若しくは蛍光体等の他の元素を含む領域を探し当て、定量化するため使用することができる。
【００１４】
本発明の別の目的は、湿ったサンプル、詳しくは生物学的サンプルの自動電子顕微鏡検査のための手段を提供することである。そのような自動化された電子顕微鏡検査は、半導体産業で幅広く応用されてきた。自動化電子顕微鏡検査の湿ったサンプルへの応用の主要な障壁は、例えば、乾燥、埋め込み、薄片化若しくは薄片化等のサンプル準備手続きを用いる必要性である。これらは、非常に複雑であり、自動化に従うことができない。本発明は、走査型電子顕微鏡において湿ったサンプルの直接画像形成のための手段を提供し、かくして、前述した準備手続きのための必要性を無くす。本発明は、このようにして、湿ったサンプルの自動化された電子顕微鏡検査のための手段を提供する。
【００１５】
以上により、本発明の好ましい実施形態によれば、湿った環境でサンプルを視覚化する方法が提供され、該方法は、サンプルを湿った環境の標本エンクロージャ内に導入し、走査型電子顕微鏡において標本エンクロージャ内のサンプルを走査し、これにより、該サンプルを視覚化する、各工程を備える。
【００１６】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、湿った環境でサンプルを視覚化する方法が更に提供され、該方法は、湿った環境の標本エンクロージャ内にサンプルを導入し、多数の異なる電子エネルギーレベルで、走査型電子顕微鏡の標本エンクロージャ内のサンプルを走査する、各工程を備える。
【００１７】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、湿った環境で多成分サンプルの少なくとも１つの成分を視覚化する方法が更に提供され、該方法は、湿った環境の標本エンクロージャ内に多成分サンプルを導入し、走査型電子顕微鏡の標本エンクロージャ内の多成分サンプルを走査し、これにより、該多成分サンプルの少なくとも１つの成分を視覚化する、各工程を備える。
【００１８】
本発明のなお別の好ましい実施形態によれば、湿った環境でサンプルを視覚化する方法が更に提供され、該方法は、湿ったサンプルを取得し、該湿ったサンプルを、光の回折限界により制限されない解像度で走査型電子顕微鏡内で走査し、該湿ったサンプルから放射された光を検出する、各工程を備える。
【００１９】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本方法は、サンプルの走査工程前に、前記サンプルの複数の要素の間のコントラストを向上させる工程を更に備える。好ましくは、該コントラスト向上工程は、サンプル内の複数の要素のうち少なくとも一部分を特異的に標識形成する工程を備える。代替例として、該コントラスト向上工程は、サンプル内の分子を特異的に標識形成する工程を備える。別の好ましい実施形態によれば、コントラスト向上工程は、サンプル内のリセプターを特異的に標識形成する工程を備える。代替例として、コントラスト向上工程は、サンプル内の細胞小器官を特異的に標識形成する工程を備える。更には、コントラスト向上工程は、サンプル内の結合箇所を特異的に標識形成する工程を備える。好ましくは、コントラスト向上工程は、サンプル内の構造要素を特異的に標識形成する工程を備える。代替例として、コントラスト向上工程は、サンプル内の機能的要素を特異的に標識形成する工程を備える。
【００２０】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、走査工程では、構成原子の原子数の差異に起因したコントラストを有する、サンプル内の要素を視覚化する。
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、コントラスト向上工程において、サンプルの要素の構成原子の原子数に差異を導入する。
【００２１】
好ましくは、上記走査工程では、サンプル内の脂質含有物を視覚化する。代替例として、走査工程では、サンプル内の核酸含有物を視覚化する。更には、走査工程では、サンプル内の蛋白質含有物を視覚化する。本発明の別の好ましい実施形態によれば、走査工程では、サンプル内の炭水化物含有物を視覚化する。代替例として、走査工程では、サンプル内の金属含有物を視覚化する。更には、走査工程では、サンプル内のヨウ素含有物を視覚化する。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、サンプルは、生物学的サンプルである。加えて、生物学的サンプルは、液体中の細胞を含む。好ましくは、サンプルは細胞内の脂質を含み、走査工程では、該脂質を視覚化する。
【００２３】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、走査工程では、サンプル内の細胞を視覚化する。代替例として、走査工程では、組織スライス内の組織を視覚化する。好ましくは、走査工程では、組織を視覚化する。本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、走査工程では、電子ビーム透過性膜に接着しているサンプル内の細胞を視覚化する。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、本方法は、走査工程前に電子ビーム透過性膜上の細胞を成長させる工程を更に備える。代替又はこれに加えて、標本エンクロージャは、電子ビーム透過性膜を備え、上記方法は、走査工程前に電子ビーム透過性膜上の細胞を操作する工程を更に備える。これに加えて又は代替として、走査工程では、サンプルへの外来分子の導入の結果を視覚化する。
【００２５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本方法は、走査工程の結果としてサンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える。これに加えて、本方法は、電磁放射を分析する工程を更に備えていてもよい。好ましくは、電磁放射を分析する工程には、スペクトル分析が含まれる。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本方法は、走査工程の結果として、サンプルから後方散乱された電子ビーム並びにサンプルから放射された電磁放射を検出する工程を更に備える。好ましくは、電磁放射は、Ｘ線放射を含む。この代替として又はこれに加えて、電磁放射は、可視光を含んでいてもよい。更に加えて又は代替として、電磁放射は、２００〜１０００ｎｍの範囲の波長を有する放射を含む。この代替として又はこれに加えて、電磁放射は、サンプルの分子構造に関連した情報を提供する放射を含む。更に加えて又は代替として、電磁放射は、前記サンプル内の材料分布に関連した情報を提供する放射を含む。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、走査工程は、多数の異なる電子エネルギーレベルで走査型電子顕微鏡の標本エンクロージャ内のサンプルを走査する工程を含む。これに加えて、本方法は、多数の電子エネルギーレベルにおけるサンプルの多数の視覚化画像を使用することにより、該サンプルの３次元画像を再構成する工程を更に備える。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記サンプルは、多成分サンプルであり、上記走査工程は、走査型電子顕微鏡の前記標本エンクロージャ内の該多成分サンプルを走査し、これにより、該多成分サンプルの少なくとも１つの成分を視覚化する工程を含む。これに加えて又は代替として、本方法は、検査されるべきサンプルを取得する工程を更に備え、該サンプルは湿った環境にある。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、生体互換性インプラントを製造するための方法が更に提供され、該方法は、生体互換性材料から生体互換性インプラントを形成し、湿った環境で、走査型電子顕微鏡内で該生体互換性インプラントの少なくとも一部分を検査し、該検査工程の結果を分析し、該分析工程の結果に従って、検査された生体互換性インプラントを分類する、各工程を備える。
【００３０】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記検査工程は、上記少なくとも一部分を備えるサンプルを、湿った環境の標本エンクロージャ内に導入し、走査型電子顕微鏡の標本エンクロージャ内の該サンプルを走査し、これにより、該サンプルを視覚化する、各工程を備える。
【００３１】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、微生物学的実体の検出、同定又は特徴化のための方法が提供され、該方法は、少なくとも１つの微生物学的実体を含む、湿ったサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、湿ったサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査し、該走査工程の結果を分析する、各工程を備える。
【００３２】
好ましくは、上記走査工程は、少なくとも１つの微生物学的実体を含む、湿ったサンプルを、湿った環境の標本エンクロージャ内に導入し、走査型電子顕微鏡内で標本エンクロージャ内の湿ったサンプルを走査し、これにより、該湿ったサンプルを視覚化する、各工程を備える。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記湿ったサンプルは、尿を含む。代替例として、湿ったサンプルは、排泄物を含む。これに加えて、湿ったサンプルは、血液を含む。これに加えて又は代替として、湿ったサンプルは、唾液を含む。本発明の別の好ましい実施形態によれば、湿ったサンプルは、呼吸器系の洗浄物を含む。加えて、湿ったサンプルは、生体検査組織を含む。代替として、湿ったサンプルは、環境サンプルを含む。これに加えて又は代替として、湿ったサンプルは、脳脊髄流体を含む。本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、湿ったサンプルは、土壌サンプルを含む。代替として、湿ったサンプルは、食物を含む。これに加えて、湿ったサンプルは、工業製品を含む。代替として又はこれに加えて、湿ったサンプルは、医療装置、工業装置又は家庭内装置を含む。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、本方法は、サンプルを特異的に染色する工程を更に備える。これに加えて、本方法は、微生物学的実体を化学物質で処理する工程を更に備える。代替として又はこれに加えて、本方法は、微生物学的実体に放射を印加する工程を更に備える。これに加えて又は代替として、分析工程は、微生物学的実体の形態を分析する工程を含む。
【００３５】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、生体膜を特徴付けるための方法が提供され、該方法は、生体膜の湿ったサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で該生体膜の湿ったサンプルを走査し、該走査工程の結果を分析する、各工程を備える。
【００３６】
好ましくは、上記走査工程は、生体膜を含む、湿ったサンプルを湿った環境の標本エンクロージャ内に導入し、走査型電子顕微鏡内の湿った標本エンクロージャ内の湿ったサンプルを走査し、これにより該湿ったサンプルを視覚化する、各工程を備える。
【００３７】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、サンプルを視覚化する方法が提供され、該方法は、サンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内の湿った環境で該サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、中間の凝固工程、被覆工程及びスライス切り工程無しに走査し、これによって該サンプルを視覚化する、各工程を備える。
【００３８】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、サンプルを視覚化する方法が更に提供され、該方法は、サンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内の湿った環境で該サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、走査前に形態的に衝撃を加えること無しに走査する、各工程を備える。
【００３９】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、サンプルを視覚化する方法が更に提供され、該方法は、サンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内の湿った環境で、該サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、走査前の高々固定化及び染色工程に続いて走査する、各工程を備える。
【００４０】
本発明のなお別の好ましい実施形態によれば、サンプルを視覚化する方法が更に提供され、該方法は、サンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内の湿った環境で、該サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、走査前の高々少なくとも１つの水成溶液を用いた処理に続いて走査する、各工程を備える。
【００４１】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、サンプルを視覚化する方法が更に提供され、該方法は、サンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内の湿った環境で、該サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に、走査前に非水成溶液で処理されること無しに走査する、各工程を備える。
【００４２】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、サンプルを視覚化する方法が更に提供され、該方法は、２０ミクロンを超える厚さのサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、該サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００４３】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、脂肪組織を検査する方法が提供され、該方法は、脂肪組織のサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、該脂肪組織のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００４４】
好ましくは、上記サンプルは、走査前に染色されていない。
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、脂肪組織を検査する方法が更に提供され、該方法は、脂肪組織のサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、該脂肪組織のサンプルを、該サンプルが走査前に染色されること無しに、走査する、各工程を備える。
【００４５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、サンプルを視覚化する方法が更に提供され、該方法は、走査型電子顕微鏡内で、サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する工程を備え、走査型電子顕微鏡のステージに対してサンプルが移動すること無く、２５平方ミリメートルを超えるサンプルの面積に亘って、走査工程が実行される。
【００４６】
本発明のなお別の好ましい実施形態によれば、細胞外基質を検査する方法が提供され、該方法は、細胞外基質のサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、該細胞外基質のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００４７】
本発明のなお別の好ましい実施形態によれば、皮覆組織を検査する方法が提供され、該方法は、皮覆組織のサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、皮覆組織のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、腎臓組織を検査する方法が提供され、該方法は、腎臓組織のサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、該腎臓組織のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００４９】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、生体検査組織を検査する方法が提供され、該方法は、生体検査組織のサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、該生体検査組織のサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００５０】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、生物学的材料を検査する方法が更に提供され、該方法は、生物学的材料を免疫標識形成し、走査型電子顕微鏡内で、該免疫標識形成された生物学的材料を、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００５１】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、組織を検査する方法が提供され、本方法は、組織を免疫標識形成し、走査型電子顕微鏡内で、該免疫標識形成された組織を、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００５２】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、サンプルを検査する方法が更に提供され、該方法は、走査型電子顕微鏡内で、サンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査し、該サンプルを光学顕微鏡を使用して検査する、各工程を備える。
【００５３】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、化学物質又は化学物質の組み合わせにさらしたときの毒性効果を分析するための方法が提供され、該方法は、実験動物を、化学物質又は化学物質の組み合わせにさらし、実験動物からサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、実験動物からのサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００５４】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、環境条件にさらした後に続く毒性効果を分析する方法が更に提供され、該方法は、環境条件にさらされた少なくとも１つの個体を同定し、少なくとも１つの個体の少なくとも１つから少なくとも１つのサンプルを取得し、走査型電子顕微鏡内で、該少なくとも１つのサンプルを、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００５５】
本発明のなお別の好ましい実施形態によれば、化学的実体を特徴付ける方法が更に提供され、該方法は、ＳＥＭ互換性サンプルエンクロージャ内で化学的実体を細胞に印加し、走査型電子顕微鏡内で、該細胞を、水の蒸気圧を超える圧力により特徴付けられる環境内に存在する間に走査する、各工程を備える。
【００５６】
好ましくは、本方法は、細胞形状の変化を分析する工程を更に備える。これに加えて又は代替として、本方法は、細胞の細胞骨格を分析する工程を更に備える。加えて、本方法は、細胞の生態分子の分布を分析する工程を更に備える。
【００５７】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本方法は、サンプルの領域からのＸ線を検出し、該サンプル内で、ヨウ素、金属及びリンのうち少なくとも１つの存在を検出するため該Ｘ線を分析する、各工程を備える。好ましくは、本方法は、ヨウ素、金属及びリンのうち前記少なくとも１つの濃度を決定する工程を更に備える。
【００５８】
本発明の更に別の好ましい実施形態によれば、上記サンプルは、電子透過性で流体不透過性の膜を通過した電子により衝突される。加えて、本方法は、該サンプルを電子透過性で流体不透過性の膜に押し付ける工程を更に備える。
【００５９】
本発明は、添付図面と関連付けられた次の詳細な説明からより完全に理解され、認められるであろう。
【実施例】
【００６０】
本発明は、非真空で湿った環境におけるサンプルの電子顕微鏡による検査のための方法に関する。より詳しくは、本発明は、重要な詳細構造を破壊して観察されるべきサンプルに擬似物を導入するおそれのある水置換及び臨界点乾燥を始めとする脱水処置を施す必要無しに、走査型電子顕微鏡でサンプルを視覚化するための方法に関する。本発明の方法を用いない場合、電子顕微鏡で試験されるべきサンプルは、真空又は真空に近い状態でしか移動することができない電子ビームによる妨げられないアクセスを可能にするため、真空又は真空に近い状態で保持されなければならない。
【００６１】
本発明の方法は、走査されるべきサンプルがその中に配置されるところの、後述される新規なＳＥＭサンプル容器を有利に用いている。サンプルの水和及び大気圧状態は、ＳＥＭステージに配置し、ＳＥＭ走査チャンバーを退去させた後でさえも、維持される。
【００６２】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解されたＳＥＭ互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である、図１Ａ乃至図５Ｂを参照する。図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、ＳＥＭ互換性サンプル容器は、閉鎖の容易さ及び速さを向上させるため配列された、参照番号１００及び１０２により指し示された、第１及び第２の互いにねじ込まれるエンクロージャ要素を備えている。エンクロージャ要素１００及び１０２は、好ましくは、プラスチックから成形され、導電性金属コーティングで被覆される。
【００６３】
第１のエンクロージャ要素１００は、好ましくは、液体サンプルエンクロージャを形成し、略中央アパーチャ１０６を持つベース表面１０４を有する。図２Ａ及び図２Ｂに詳細に示される、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜サブアッセンブリ１０８は、図３Ａ、３Ｂ及び図５Ａ、５Ｂに示されるように、アパーチャ１０６に対向してこれを覆って、エンクロージャ要素１００の内部に着座している。エンクロージャ要素１００内に適切に配置されたサブアッセンブリ１０８を備えるサンプル皿部は、図３Ａ乃至図５Ｂに示されるように、参照番号１０９により指し示されている。
【００６４】
更に図２Ａ及び図２Ｂを参照すると、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０が、接着剤により、機械式支持格子１１２に接着される。該膜１１０は、アメリカ合衆国、ＵＴ、オレムのモックステック社から市販されている、カタログ番号ＬＷＮ０００３３等のポリイミド膜を含むのが好ましい。格子１１２は、図面で縮尺通りには示されておらず、該格子としては、アメリカ合衆国、ニューヨークのコートランドのバックビーメアズから市販されている、カタログ番号ＢＭ００９０−０１が好ましい。接着剤は、アメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されており、カタログ番号ＮＯＡ６１であるのが好ましい。液体サンプルエンクロージャ形成リング１１４は、好ましくは、例えばアメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されているカタログ番号ＮＯＡ６１の接着剤により、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０に接着されている。リング１１４は、スペイン、バルセロナ市のイルペンから市販されている、例えばカタログ番号６９２１０６００１０００等のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）から形成されるのが好ましく、約２０マイクロリットルの体積で約２ｍｍの高さを備えた液体サンプルエンクロージャを画定するのが好ましい。好ましくは、リング１１４は、傾斜壁を有する液体サンプルエンクロージャ１１６を画定するように構成される。
【００６５】
代替例として、膜１１０は、ポリアミド、ポリアミド−イミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、「パーロディオン」、「コロディオン」、「カプトン」、「フォームバー」、「ビニレック」、「バットバー」、「ピオロフォルム」、「パリレーネ」、二酸化シリコン、一酸化シリコン、又は、カーボン、或いは、前掲したものの任意の組み合わせ、又は、他の任意の適切な材料から形成されてもよい。
【００６６】
Ｏリング１１８は、リング１１４と、第２のエンクロージャ要素１０２の内部表面との間に配置されているのが好ましい。Ｏリング１１８は、エンクロージャ要素１００及び１０２が緊密なねじ込み係合であるとき、要素１００及び１０２のねじ込み係合が密封係合であるべき必要性を無くすように作用する。
【００６７】
第２のエンクロージャ要素１０２には、走査型電子顕微鏡の標本ステージの適切な凹部（図示せず）に着座するように配列された、略中央スタブ１２２が形成されるのが好ましい。図１Ａ乃至図１０に示される容器は、従来の走査型電子顕微鏡の従来のスタブ用凹部に適合するサイズで働き、それが何であれ、変形する必要はないことが、本発明の特別な特徴である。スタブの様々な形態及びサイズを、様々な走査型電子顕微鏡に適合するように提供することができることが認められよう。
【００６８】
エンクロージャ要素１００及び１０２は、容器を、適切な多重容器ホルダー内に容易に着座させることを可能にし、更にユーザーがエンクロージャ要素１００及び１０２をねじ込み開閉することを援助するため、径方向に延在する夫々の位置決め保持突起部１２４及び１２５が設けられるのが好ましい。好ましくは、各々のエンクロージャ要素１００及び１０２上の突起部１２４及び１２５の相対的な方位角方向の配置は、図４Ａ及び図４Ｂに示されるように、これら突起部間の相対的な方位角方向の整列が、要素間のねじ込み閉鎖の所望の度合いを指し示すようになっているのが好ましい。
【００６９】
本発明の別の実施例では、サンプル皿部がエンクロージャ１００及び１０２を備えていてもよいことが認められよう。
ここで、図１Ａ乃至図５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である、図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃを参照する。図６Ａは、エンクロージャ要素１００及び１０２をねじ込み閉鎖する前の図１Ｂに示される配位で配列されている、液体サンプル１３０を蓄えた図１Ａ乃至図５Ｂの容器を示している。なお、液体サンプルは、表面張力に起因して、液体サンプルエンクロージャ１１６からは流れ出ない。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０が、図６Ａにおいて、略平坦であるように示されている。
【００７０】
図６Ｂは、周囲からの液体サンプルエンクロージャ１１６の密封を生成するエンクロージャ要素１００及び１０２の間の完全なねじ込み係合に続く中間状態にある、図６Ａの容器を示している。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０と、その支持格子１１２とが、この態様におけるその密封の結果生じた液体サンプルエンクロージャ１１６の圧力形成に起因して、外方にしなっていることが見て取れる。
【００７１】
図６Ｃは、典型的には、１０−２〜１０−６ミリバールの真空でＳＥＭの脱ガス環境に配置されたときの図６Ｂの容器を示している。この環境では、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０と支持格子１１２とが、図６Ｂの周囲環境に配置されたときよりも、より大きい度合いで外方にしなっていることが見て取れる。更には、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０は、図６Ｂの周囲環境で生じたものよりも大きい度合いで格子１１２の隙間を通って隙間内に入り込もうとしていることが理解できる。
【００７２】
ここで、図１Ａ乃至図６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、細胞成長、液体除去、液体追加、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である、図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ及び７Ｅを参照する。典型的な細胞培養状況を示す、図７Ａを参照すると、サブアッセンブリ１０８を内部に配置させたエンクロージャ要素１００は、図１Ａに示された配置態様にあり、液体媒体１４２内の細胞１４０は液体サンプルエンクロージャ１１６内に配置され、これらの細胞１４０が、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０に接触して横たわっている。
【００７３】
図７Ｂは、典型的には吸引によって液体サンプルエンクロージャ１１６から液体を除去した状態を示し、図７Ｃは、液体サンプルエンクロージャ１１６に液体を追加した状態を示している。液体の除去及び追加を多数回に亘って液体サンプルエンクロージャ１１６内のサンプルに関して実行してもよい。好ましくは、液体除去及び追加のため用いられる装置は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０の意図しない破裂を防止するように、設計され、備え付けられるのがよい。
【００７４】
図７Ｄは、図７Ｃに示される細胞１４０を液体媒体１４２内に含む容器の閉鎖状態を示している。図７Ｅは、ＳＥＭ１４６のステージ１４４上に挿入される閉鎖容器を図１Ｂの配位で示している。容器の配位が図７Ｅに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【００７５】
図７Ａ乃至図７Ｄは、液体サンプルエンクロージャ１１６に関する液体の追加又は除去に拘わらず、サンプルを含む液体の少なくとも一部分が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０と接触したままとなる状況を例示している。この状況は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０に、サンプルの一部が吸収され、そうでなければ、接着される状況を含んでいてもよい。サンプルを含む液体の例は、細胞、培養菌、血液、バクテリア及び無細胞材料を含んでいてもよい。
【００７６】
図１Ａ乃至図６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０と接触したサンプル含有液体、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である、図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃを参照する。図８Ａ乃至図８Ｃは、サンプルを含む液体１６０の少なくとも一部分が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０と接触しているが、それに接着されていない状況を例示している。サンプルを含む液体の例には、例えば、ミルク、化粧用クリーム、ペイント、インク、及び、液体形態の薬剤等、様々な乳濁液及び懸濁液がある。図８Ａ乃至図８Ｂで、サブアッセンブリ１０８を内部に配置させたエンクロージャ要素１０は、図１Ａに示される配位にあることが見て取れよう。
【００７７】
図８Ｂは、サンプル１６０を含む容器の閉鎖状態を示している。図８Ｃは、ＳＥＭ１４６のステージ１４４上に挿入された、図１Ｂの配位にある、閉鎖容器を示している。容器の配位が図８Ｃに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【００７８】
ここで、図１Ａ乃至図６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である、図９を参照する。図９に示されるように、参照番号１７０により指し示された容器は、ＳＥＭにより発生された電子ビーム１７２が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０を通過し、容器１７０内のサンプル１７４を含む液体に照射されように、ＳＥＭ１４６のステージ１４４上に配置されている。サンプル１７４からの後方散乱電子は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０を通過し、ＳＥＭの一部を形成する検出器１７６により検出される。例えば２次電子検出器等の１つ以上の追加の検出器を設けてもよい。電子ビーム励起に起因してサンプル１７４により放射されるＸ線放射を検出するためのＸ線検出器（図示せず）を設けてもよい。
【００７９】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る容器１７０内のサンプル１７４との電子ビーム相互作用の詳細を概略的に示す図１０を追加的に参照する。なお、本発明は、図１０に示されるように、それらの平均的な原子番号により互いから区別される特徴群の高いコントラストの画像形成を可能にしている。図１０では、比較的高い平均原子番号を有する、細胞核１８０は、周囲の核質１８２よりも電子をより大きく後方散乱させることが示されている。
【００８０】
なお、本発明の好ましい実施例によれば、約２ミクロンまでの深さのサンプル内部の画像形成は、図１０に示されるように、５０ＫｅＶより低いエネルギーレベルを有する電子に対して達成可能であり、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１０より下方に位置する細胞核１８０が画像形成される。
【００８１】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解された走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である、図１１Ａ乃至図１５Ｂを参照する。図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、ＳＥＭ互換性サンプル容器は、閉鎖の容易さ及び速さを向上させるように配列された、参照番号２００及び２０２により指し示された、第１及び第２の相互にねじ込まれるエンクロージャ要素を備えている。エンクロージャ要素２００及び２０２は、プラスチックから成形され、導電性金属コーティングで被覆されるのが好ましい。
【００８２】
第１のエンクロージャ要素２００は、好ましくは、液体サンプルエンクロージャを形成し、略中央アパーチャ２０６を持つベース表面２０４を有する。図１２Ａ及び図１２Ｂに詳細に示される、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜サブアッセンブリ２０８は、図１３Ａ、１３Ｂ及び図１５Ａ、１５Ｂに示されるように、アパーチャ２０６に対向してこれを覆って、エンクロージャ要素２００の内部に着座している。エンクロージャ要素２００内に適切に配置されたサブアッセンブリ２０８を備えるサンプル皿部は、図１３Ａ乃至図１５Ｂに示されるように、参照番号２０９により指し示されている。
【００８３】
更に図１２Ａ及び図１２Ｂを参照すると、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０が、接着剤により、機械式支持格子２１２に接着される。該膜２１０は、アメリカ合衆国、ＵＴ、オレムのモックステック社から市販されている、カタログ番号ＬＷＮ０００３３等のポリイミド膜を含むのが好ましい。格子２１２は、図面で縮尺通りには示されておらず、該格子としては、アメリカ合衆国、ニューヨークのコートランドのバックビーメアズから市販されている、カタログ番号ＢＭ００９０−０１が好ましい。接着剤は、アメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されており、カタログ番号ＮＯＡ６１であるのが好ましい。液体サンプルエンクロージャ形成リング２１４は、好ましくは、例えばアメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されているカタログ番号ＮＯＡ６１の接着剤により、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０に接着されている。リング２１４は、スペイン、バルセロナ市のイルペンから市販されている、例えばカタログ番号６９２１０６００１０００等のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）から形成されるのが好ましく、約２０マイクロリットルの体積で約２ｍｍの高さを備えた液体サンプルエンクロージャを画定するのが好ましい。好ましくは、リング２１４は、傾斜壁を有する液体サンプルエンクロージャ２１６を画定するように構成される。
【００８４】
ダイヤフラム２１８が、リング２１４と、第２のエンクロージャ要素２０２の内側表面２１９との間に配置されるのが好ましい。好ましくは、ダイヤフラム２１８は、Ｏリング部２２０から一体成形され、該Ｏリング部２２０には、伸張可能シート部２２１が密封されている。ダイヤフラム２１８は、約５０のショア硬度を有するシリコンゴムから成形されるのが好ましく、シート部２２１は、０．２〜０．３ｍｍの厚さを有するのが好ましい。ダイヤフラム２１８は、エンクロージャ要素２００及び２０２が、緊密なねじ込み係合にあるとき、要素２００及び２０２のねじ込み係合が密封係合であるべき必要性を無くすように、並びに、その動的圧力及び静的圧力を提供するように作動する。
【００８５】
第２のエンクロージャ要素２０２には、走査型電子顕微鏡の標本ステージの適切な凹部（図示せず）に着座するように配列された、貫通ボア２２３を有する略中央スタブ２２２が形成されるのが好ましい。ボア２２３は、ダイヤフラム２１８の一方の側と（ＳＥＭ）互換性サンプル容器が配置されている環境との間に流体連通チャンネルを形成することにより、ダイヤフラム２１８が圧力リリーフを提供することを可能にする。図１１Ａ乃至図２０に示される容器は、従来の走査型電子顕微鏡の従来のスタブ用凹部に適合するサイズで働き、それが何であれ、変形する必要はないことが、本発明の特別な特徴である。スタブの様々な形態及びサイズを、様々な走査型電子顕微鏡に適合するように提供することができることが認められよう。
【００８６】
エンクロージャ要素２００及び２０２は、容器を、適切な多重容器ホルダー内に容易に着座させることを可能にし、更にユーザーがエンクロージャ要素２００及び２０２をねじ込み開閉することを援助するため、径方向に延在する夫々の位置決め保持突起部２２４及び２２５が設けられるのが好ましい。好ましくは、各々のエンクロージャ要素２００及び２０２上の突起部２２４及び２２５の相対的な方位角方向の配置は、図１４Ａ及び図１４Ｂに示されるように、これら突起部間の相対的な方位角方向の整列が、要素間のねじ込み閉鎖の所望の度合いを指し示すようになっているのが好ましい。
【００８７】
ここで、図１１Ａ乃至図１５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である、図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃを参照する。図１６Ａは、エンクロージャ要素２００及び２０２をねじ込み閉鎖する前に、図１１Ｂに示された配位で配列されている、液体サンプル２３０を蓄えた図１１Ａ乃至図１５Ｂの容器を示している。なお、液体サンプルは、表面張力に起因して、液体サンプルエンクロージャ２１６からは流れ出ない。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０が、図１６Ａにおいて、略平坦であるように示されている。
【００８８】
図１６Ｂは、周囲からの液体サンプルエンクロージャ２１６の密封を生成するエンクロージャ要素２００及び２０２の間の完全なねじ込み係合に続く中間状態にある、図１６Ａの容器を示している。ダイヤフラム２１８が、この態様におけるその密封の結果生じた液体サンプルエンクロージャ２１６の圧力形成に起因して、外方にしなっていることが見て取れる。本実施例では、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０及びその支持格子２１２も、この態様におけるその密封の結果生じた液体サンプルエンクロージャ１１６の圧力形成に起因して、外方にしなっているが、ダイヤフラム２１８の作用に起因して、かなりより小さい程度にしか、しなっていない。これは、図１６Ｂと図６Ｂとを比較することにより、理解することができる。
【００８９】
図１６Ｃは、典型的には、１０−２〜１０−６ミリバールの真空でＳＥＭの脱ガス環境に配置されたときの図１６Ｂの容器を示している。この環境では、ダイヤフラム２１８が、図１６Ｂの周囲環境のときよりもより大きい度合いで外方にしなり、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０と支持格子２１２とが、図１６Ｂの周囲環境に配置されたときよりも、より大きい度合いで外方にしなっているが、ダイヤフラム２１８の作用に起因して、図６Ｃの実施例のときよりも、かなり小さい度合いでしかしなっていないことが見て取れる。これは、図１６Ｃと図６Ｃとを比較することにより、理解することができる。
【００９０】
なお、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０は、図１６Ｂの周囲環境で生じたものよりも大きい度合いで格子２１２の隙間を通って隙間内に入り込もうとしているが、ダイヤフラム２１８の作用に起因して、図６Ｃの実施例のときよりもかなり小さい度合いでしかしなっていないことが理解できる。これは、図１６Ｃと図６Ｃとを比較することにより、理解することができる。
【００９１】
ここで、図１１Ａ乃至図１６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、細胞成長、液体除去、液体追加、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である、図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ及び１７Ｅを参照する。図７Ａと同一で、典型的な細胞の培養状況を示す、図１７Ａを参照すると、サブアッセンブリ２０８を内部に配置させたエンクロージャ要素２００が、図１１Ａに示される配位にあり、液体媒体２４２中の細胞２４０が、液体サンプルエンクロージャ２１６内に配置され、細胞２４０が、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０に接触して横たわっていることが示されている。
【００９２】
図７Ｂと同一の図１７Ｂは、典型的には吸引により、液体サンプルエンクロージャ２１６からの液体の除去を示し、図７Ｃと同一の図１７Ｃは、液体サンプルエンクロージャ２１６への液体の追加を示している。液体の除去及び追加を多数回に亘って液体サンプルエンクロージャ２１６内のサンプルに関して実行してもよい。好ましくは、液体除去及び追加のため用いられる装置は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０の意図しない破裂を防止するように、設計され、備え付けられるのがよい。
【００９３】
図１７Ｄは、図１７Ｃに示される細胞２４０を液体媒体２４２内に含む容器の閉鎖状態を示している。図１７Ｅは、ＳＥＭ２４６のステージ２４４上に挿入される閉鎖容器を図１１Ｂの配位で示している。容器の配位が図１７Ｅに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【００９４】
図１７Ａ乃至図１７Ｄは、液体サンプルエンクロージャ２１６に関する液体の追加又は除去に拘わらず、サンプルを含む液体の少なくとも一部分が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０と接触したままとなる状況を例示している。この状況は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０に、サンプルの一部が吸収され、そうでなければ、接着される状況を含んでいてもよい。サンプルを含む液体の例は、細胞、培養菌、血液、バクテリア及び無細胞材料を含んでいてもよい。
【００９５】
図１１Ａ乃至図１６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０と接触したサンプル含有液体、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である、図１８Ａ、１８Ｂ及び１８Ｃを参照する。図１８Ａ乃至図１８Ｃは、サンプルを含む液体２６０の少なくとも一部分が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０と接触しているが、それに接着されていない状況を例示している。サンプルを含む液体の例には、例えば、ミルク、化粧用クリーム、ペイント、インク、及び、液体形態の薬剤等、様々な乳濁液及び懸濁液がある。図１８Ａ乃至図１８Ｂで、サブアッセンブリ２０８を内部に配置させた、エンクロージャ要素２００は、図１１Ａに示される配位にあることが見て取れよう。図１８Ａは図８Ａと同一である。
【００９６】
図１８Ｂは、サンプル２６０を含む容器の閉鎖状態を示している。図１８Ｃは、ＳＥＭ２４６のステージ２４４上に挿入された、図１１Ｂの配位にある、閉鎖容器を示している。容器の配位が図１８Ｃに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【００９７】
ここで、図１１Ａ乃至図１６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である、図１９を参照する。図１９に示されるように、参照番号２７０により指し示された容器は、ＳＥＭにより発生された電子ビーム２７２が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０を通過し、容器２７０内のサンプル２７４を含む液体に照射されように、ＳＥＭ２４６のステージ２４４上に配置されている。サンプル２７４からの後方散乱電子は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０を通過し、ＳＥＭの一部を形成する検出器２７６により検出される。例えば２次電子検出器等の１つ以上の追加の検出器を設けてもよい。電子ビーム励起に起因してサンプル２７４により放射されるＸ線放射を検出するためのＸ線検出器（図示せず）を設けてもよい。
【００９８】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る容器２７０内のサンプル２７４との電子ビーム相互作用の詳細を概略的に示す図２０を追加的に参照する。なお、本発明は、図２０に示されるように、それらの平均的な原子番号により互いから区別される特徴群の高いコントラストの画像形成を可能にしている。図２０では、比較的高い平均原子番号を有する、細胞核２８０が、周囲の核質２８２よりも電子をより大きく後方散乱させることが示されている。
【００９９】
なお、本発明の好ましい実施例によれば、約２ミクロンまでの深さのサンプル内部の画像形成は、図２０に示されるように、５０ＫｅＶより低いエネルギーレベルを有する電子に対して達成可能であり、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１０より下方に位置する細胞核２８０が画像形成される。
【０１００】
ここで、図１Ａ乃至図２０に示された型式のＳＥＭ互換性サンプル容器で使用する顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーの簡略的な分解図である、図２１Ａ及び図２１Ｂを参照する。更に、顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーを、覆われていない状態、及び、覆われて組み立てられた状態で各々示した、簡略図である、図２２Ａ及び図２２Ｂを参照する。
【０１０１】
図２１Ａ及び図２１Ｂに示されるように、顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーは、ベース部３００と、頂部要素３０２と、カバー３０４と、を備えるのが好ましい。好ましくは、カバー３０４が顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーの内部に無菌状態を維持するため設けられる。
【０１０２】
ベース部３００は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、容器支持収容部３０６の列を形成する。各々の容器支持収容部３０６は、光透明底部壁を有する凹部３０８により形成されるのが好ましい。該光透明底部壁を通して光学顕微鏡の検査を実行することができる。図１Ａ乃至図８Ｃで参照番号１００により指し示されたエンクロージャ要素で、各凹部３０８に隣接して、図１Ａ乃至図４Ｂで参照番号１２４により指し示された突起部を収容するように配置された、一対の互いに整列した対の直立相互間隔突起部３１０が形成され、これにより方位角方向の整列を固定するのが好ましい。
【０１０３】
ベース部３００は、顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーの内部で所望レベルの湿度を維持するため使用される液体を保持するようになった、複数の液体リザーバー３１２を形成するのが好ましい。ベース部３００は、床部３２０が形成されるのが好ましい。ベース部３００の所望の配列で、図３Ａ乃至図５Ｂの参照番号１０９により指し示されたサンプル皿部を保持するように、頂部要素３０２は、取り外し可能にベース部３００とスナップ式に係合するため配列されている。頂部要素３０２には、容器支持収容部３０６で着座されたサンプル皿部１０９の上を横たわるように配列されたアパーチャ３２４の列を有する、平坦表面３２２が形成されている。アパーチャ３２４のサイズは、サンプル皿部１０９が通過することを防止するように、エンクロージャ要素１００のサイズよりも小さくなるように選択されるのが好ましい。平坦表面３２２は、液体リザーバー３１２と連通するアパーチャ３２６を備えるのが好ましい。
【０１０４】
頂部要素３０２は、位置決め案内部３２８と、ダミーアパーチャ３３０とを更に提供する。ダミーアパーチャは、図２３Ａ及び図２３Ｂを参照して後述されるように、これと連結された吸引装置により使用するため設けられている。組み合わせダミーアパーチャ３３２も設けられている。各アパーチャ３３２の一部分だけが液体リザーバー３１２を覆い、各アパーチャ３３２の残りが、吸引装置のためのダミーアパーチャとして機能する。
【０１０５】
カバー３０４が、顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーの内部の無菌状態を維持するため提供される。カバー３０４は、図２２Ｂに示されるように光に対して透明であるのが好ましい。図２１Ａ乃至図２２Ｂの顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーは、光学顕微鏡、遠心分離機及び自動位置決め装置等の従来の細胞生物学的設備と互換性があるように寸法が定められるのが好ましい。好ましい寸法は、８５ｍｍ×１２７ｍｍである。
【０１０６】
ここで、吸引装置及びピペットを伴った、図２１Ａ乃至図２２Ｂの顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーの簡略図である、図２３Ａ、２３Ｂ及び２３Ｃを参照する。図２３Ａを参照すると、参照番号３５０により指し示された吸引装置が吸引源に導管３５４を介して連結されたマニホルド３５２を備えることが示されている。マニホルド３５２は、均一に間隔を隔てられたニードル３５６の直線状列と連通するのが好ましい。一対のスペーサー３５８が、マニホルド３５２に取り付けられるか、又は、マニホルドと一体成形されている。スペーサー３５８は、ニードル３５６の直線状列と一列に並んで配置される。これらのスペーサー３５８は、頂部要素３０２の両側にある隣接する位置決め案内部３２８の中間のところでベース部３０の床部３２０と係合するのが好ましい。スペーサー３５８は、ニードル３５６が図１Ａ乃至図１０で参照番号１１０により指し示された電子ビーム透過性で流体不透過性の膜と係合しないことを確実にする。
【０１０７】
図２３Ａに示されるように、容器支持収容部３０６は、顕微鏡検査前の多重サンプルホルダー上で互い違いの列に配列されている。かくして、図２３Ｂに示されるように、列毎に、ニードル３５６のうち３つがアパーチャ３２４と係合し、ニードル３５６のうち２つがダミーアパーチャ３３０と係合し、ニードル３５６のうち一つが、ダミーアパーチャとして機能するアパーチャ３３２の一部と係合する。
【０１０８】
図２３Ｃは、従来のピペット３６０を用いて個々のサンプル皿部１０９に液体を追加した状態を示している。図１Ａ乃至図１０で参照番号１１０により指し示された電子ビーム透過性で流体不透過性の膜とピペットとの意図しない係合を防止するため、カラー要素３６２が、ピペット３６０と連係して使用するため設けられてもよい。
【０１０９】
ここで、図１Ａ乃至図１０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図２４Ａ、２４Ｂ及び２４Ｃを参照する。図２４Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部４００と、密封カバー４０４とを備えるのが好ましい。ベース部４００は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、容器支持収容部４０６の列を形成する。各々の容器支持収容部４０６は、アパーチャ４０８により形成されるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。図１Ａ乃至図８Ｃで参照番号１００により指し示されたエンクロージャ要素で、各アパーチャ４０８に隣接して、サンプル皿部４２５の突起部４２４を収容するように配列された、一対の互いに整列した対の直立相互間隔突起部４１０が形成されるのが好ましい。サンプル皿部４２５は、図３Ａ乃至図５Ｂに示されたサンプル皿部１０９と略同一であってもよいが、ねじ込み式機構又は他の取り付け機構を必要としない。
【０１１０】
ベース部４００は、顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーの内部で所望レベルの湿度を維持するため使用される液体を保持するようになった、複数の液体リザーバー４１２を形成してもよい。
【０１１１】
密封カバー４０４は、サンプル皿部４２５の各々と個々に密封係合するように配列されている。好ましくは、密封カバー４０４は、その下側に、図２４Ｃに示されたＯリング４２６が提供される。Ｏリング４２６は、密封カバー４０４が、適所に、好ましくはベース部４００との取り外し可能なスナップ式の係合で配置されたとき、サンプル皿部４２５の各々の頂部リム表面と密封係合するように、そこに密封され配列されている。
【０１１２】
図２４Ｂは、１つのサンプル皿部４２５がベース部４００の皿支持収容部４０６に配置された状態の図２４Ａの装置を示している。図２４Ｃは、ベース部４００とスナップ式に係合する密封カバー４０４を示している。密封カバー４０４は、これにより、Ｏリング４２６と、周囲を取り囲む密封カバー４０４の一部分とを用いてサンプル皿部４２５の各々の個々の密封を提供する。
【０１１３】
ここで、図１１Ａ乃至図２０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図２５Ａ、図２５Ｂ及び図２５Ｃを参照する。図２５Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部４５０と、密封カバー４５４とを備えるのが好ましい。ベース部４５０は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、皿支持収容部４５６の列を形成する。各々の皿支持収容部４５６は、アパーチャ４５８により形成されるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。各アパーチャ４５８に隣接して、サンプル皿部４７５の突起部４７４を収容するように配列された、一対の互いに整列した対の直立相互間隔突起部４６０が形成されるのが好ましい。サンプル皿部４７５は、図１３Ａ乃至図１５Ｂに示されたサンプル皿部１０９と略同一であってもよいが、ねじ込み式機構又は他の取り付け機構を必要としない。
【０１１４】
ベース部４５０は、顕微鏡検査用の多重サンプルホルダーの内部で所望レベルの湿度を維持するため使用される液体を保持するようになった、複数の液体リザーバー４６２を形成してもよい。
【０１１５】
密封カバー４５４は、図２５Ｃに示される、ダイヤフラム４７６とサンプル皿部４７５の各々とを個々に密封係合するため配置される。該ダイヤフラムは、密封カバー４５４に形成されたアパーチャ４７８を覆って密封式に取り付けられている。好ましくは、図１１Ａ乃至図２０を参照して上述されたダイヤフラム２１８と同一であってもよい、ダイヤフラム４７６の列が、密封カバー４５４の下側に設けられている。個々のダイヤフラム４７６は、密封カバー４５４が、適所に、好ましくはベース部４５０との取り外し可能なスナップ式の係合で配置されたとき、サンプル皿部４７５の各々の頂部リム表面と密封係合するように配列されている。
【０１１６】
図２５Ｂは、１つのサンプル皿部４７５がベース部４５０の皿支持収容部４５６に配置された状態の図２５Ａの装置を示している。図２５Ｃは、ベース部４５０とスナップ式に係合する密封カバー４５４を示している。密封カバー４５４は、これにより、ダイヤフラム４７６を用いてサンプル皿部４７５の各々の個々の密封を提供する。
【０１１７】
本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図２６Ａ及び図２６Ｂを参照する。図２６Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部５００と、密封カバー５０４とを備えるのが好ましい。ベース部５００は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、サンプル容器５０６の列を形成する。各々のサンプル容器５０６は、アパーチャ５０８を備えるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。図２６Ｂに示される電子ビーム透過性で流体不透過性の膜５１０が各アパーチャ５０８を覆って密封する。膜５１０は、図１Ａ乃至図１０を参照して上述された膜１１０と同一であるのが好ましい。密封カバー５０４は、サンプル容器５０６の各々と個々に密封係合するように配列されている。
【０１１８】
図２６Ｂは、図２６Ａの装置が密封係合した状態を示している。この密封係合により、サンプル容器５０６の各々の個々の密封が提供される。
本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図２７Ａ及び図２７Ｂを参照する。図２７Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部５５０と、密封カバー５５４とを備えるのが好ましい。ベース部５５０は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、サンプル容器５５６の列を形成する。各々のサンプル容器５５６は、アパーチャ５５８を備えるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。図２７Ｂに示される電子ビーム透過性で流体不透過性の膜５６０が各アパーチャ５５８を覆って密封する。膜５６０は、図１１Ａ乃至図２０を参照して上述された膜２１０と同一であるのが好ましい。密封カバー５５４は、例えば、約５０のショア硬度を有する、０．２〜０．３ｍｍの厚さのシリコンゴム等から成形された弾性シート材料から形成されたダイヤフラムであるのが好ましく、サンプル容器５５６の各々と個々に密封係合するように配列されている。
【０１１９】
図２７Ｂは、図２７Ａの装置が密封係合した状態を示している。この密封係合により、サンプル容器５５６の各々の個々の密封が提供される。
ここで、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である、図２８を参照する。図２８に示されるように、複数の顕微鏡検査前の多重サンプルホルダー６００は、各々が図１Ａ乃至図２０に示された型式の多数のＳＥＭ互換性サンプル容器６０２を含み、細菌培養器６０４内に配置された状態で示されている。好ましくは、関心のあるサンプルを同定するため、参照番号６０６で示されるように、容器６０２がホルダー６００内に取り付けられた状態で、容器６０２内のサンプルの光学顕微鏡検査が実行される。好ましくは、倒立光学顕微鏡６０８がこの目的のため用いられる。
【０１２０】
好ましくは、図示のような例えばロボットアーム等の自動位置決めシステムが、システムを通して、顕微鏡検査前多重サンプルホルダー６００及び容器６０２を搬送するため使用される。１つ以上のステージで手動介入操作が適宜用いられてもよいことが認められよう。
【０１２１】
その後、個々の容器６０２は、ホルダー６００から取り外され、取り外し可能な電子顕微鏡標本ステージ６１０に配置され、次に、走査型電子顕微鏡６１２内に導入される。その結果得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ６１４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０１２２】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である、図２９を参照する。図２９に示されるように、複数の顕微鏡検査前の多重サンプルホルダー６５０は、各々が図２４Ａ乃至図２５Ｃに示された型式のうちいずれかの多数のＳＥＭ互換性サンプル容器６５２を含み、細菌培養器６５４内に配置された状態で示されている。好ましくは、関心のあるサンプルを同定するため、参照番号６５６で示されるように、サンプル皿部がホルダー６５０内に取り付けられた状態で、皿部６５２内のサンプルの光学顕微鏡検査が実行される。好ましくは、倒立光学顕微鏡６５８がこの目的のため用いられる。
【０１２３】
好ましくは、図示のような例えばロボットアーム等の自動位置決めシステムが、システムを通して、サンプル皿部６５２を含む顕微鏡検査前多重サンプルホルダー６５０を搬送するため使用される。１つ以上のステージで手動介入操作が適宜用いられてもよいことが認められよう。
【０１２４】
その後、ホルダー６５０は、電子顕微鏡標本ステージ６６０に配置され、次に、走査型電子顕微鏡６６２内に導入される。その結果得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ６６４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０１２５】
ここで、本発明の更に別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である、図３０を参照する。図３０に示されるように、複数の顕微鏡検査前の多重サンプルホルダー６７０は、各々が図２６Ａ乃至図２７Ｂのいずれか１つに示された多数のＳＥＭ互換性サンプル容器６７２を形成し、細菌培養器６７４内に配置された状態で示されている。好ましくは、関心のあるサンプルを同定するため、参照番号６７６で示されるように、サンプル容器６７２内のサンプルの光学顕微鏡検査がホルダーの位置で実行される。好ましくは、倒立光学顕微鏡６７８がこの目的のため用いられる。
【０１２６】
好ましくは、図示のような例えばロボットアーム等の自動位置決めシステムが、システムを通して、顕微鏡検査前多重サンプルホルダー６７０を搬送するため使用される。１つ以上のステージで手動介入操作が適宜用いられてもよいことが認められよう。
【０１２７】
その後、ホルダー６７０は、電子顕微鏡標本ステージ６８０に配置され、次に、走査型電子顕微鏡６８２内に導入される。その結果得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ６８４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０１２８】
本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解された操作型電子顕微鏡（ＳＥＭ）互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である、図３１Ａ乃至図３５Ｂを参照する。図３１Ａ及び図３１Ｂに示されるように、ＳＥＭ互換性サンプル容器は、閉鎖の容易さ及び速さを向上させるため配列された、参照番号１１００及び１１０２により指し示された、第１及び第２の互いにねじ込まれるエンクロージャ要素を備えている。エンクロージャ要素１１００及び１１０２は、好ましくは、プラスチックから成形され、導電性金属コーティングで被覆される。
【０１２９】
第１のエンクロージャ要素１１００は、好ましくは、液体サンプルエンクロージャを形成し、略中央アパーチャ１１０６を持つベース表面１１０４を有する。図３２Ａ及び図３２Ｂに詳細に示される、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜サブアッセンブリ１１０８は、図３３Ａ、３３Ｂ及び図３５Ａ、３５Ｂに示されるように、アパーチャ１１０６に対向してこれを覆って、エンクロージャ要素１１００の内部に着座している。エンクロージャ要素１１００内に適切に配置されたサブアッセンブリ１１０８を備えるサンプル皿部は、図３３Ａ乃至図３５Ｂに示されるように、参照番号１１０９により指し示されている。
【０１３０】
更に図３２Ａ及び図３２Ｂを参照すると、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０が、接着剤により、機械式支持格子１１１２に接着される。該膜１１１０は、アメリカ合衆国、ＵＴ、オレムのモックステック社から市販されている、カタログ番号ＬＷＮ０００３３等のポリイミド膜を含むのが好ましい。格子１１１２は、図面で縮尺通りには示されておらず、該格子としては、アメリカ合衆国、ニューヨークのコートランドのバックビーメアズから市販されている、カタログ番号ＢＭ００９０−０１が好ましい。接着剤は、アメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されており、カタログ番号ＮＯＡ６１であるのが好ましい。サンプルエンクロージャ形成リング１１１４は、好ましくは、例えばアメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されているカタログ番号ＮＯＡ６１の接着剤により、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０に接着されている。リング１１１４は、スペイン、バルセロナ市のイルペンから市販されている、例えばカタログ番号６９２１０６００１０００等のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）から形成されるのが好ましく、約２０マイクロリットルの体積で約２ｍｍの高さを備えた液体サンプルエンクロージャを画定するのが好ましい。好ましくは、リング１１１４は、傾斜壁を有する液体サンプルエンクロージャ１１１６を画定するように構成される。
【０１３１】
第１のＯリング１１１８は、第２のエンクロージャ要素１１０２の内側表面と、接続要素１１２２との間に配置されているのが好ましい。接続要素１１２２は、プラスチックから成形され、導電性金属コーティングで被覆されているのが好ましい。第２のＯリング１１２３は、接続要素１１２２と、サブアッセンブリ１１０８のリング１１１４との間に配置されているのが好ましい。Ｏリング１１１８及び１１２３は、エンクロージャ要素１１００及び１１０２と接続要素１１２２とが緊密なねじ込み係合であるとき、要素１１００及び１１０２のねじ込み係合が密封係合であるべき必要性を無くすように作用する。
【０１３２】
接続要素１１２２は、凹部１１２４を有するのが好ましい。接続要素１１２２には、図３５Ａ及び図３５Ｂに示される、突起部１１２６が形成され、該突起部は凹部１１２４内に突出している。
【０１３３】
ポジショナー１１２８は、２つの直立した可撓性突起部１１３０から構成されるのが好ましく、各々は、突起部１１３０の端部１１３４に形成されたリッジ１１３２を備える。ポジショナー１１２８は、プラスチックから成形されるのが好ましい。図３５Ａ及び３５Ｂに示されるように、突起部１１３０は、接続要素１１２２の凹部１１２４内に挿入されたとき互いに押圧し、一旦、リッジ１１３２が接続要素１１２２の突起部１１２６に着座されたならば、直立位置へとスナップ式に戻る。
【０１３４】
ポジショナー１１２８は、リム１１３７から延在する、夫々の径方向に延在する位置決め保持突起部１１３６が設けられているのが好ましい。位置決め保持突起部１１３６は、ポジショナー１１２８の回転を防止するためリング１１１４のサンプルエンクロージャ１１１６の傾斜壁に形成されたアパーチャ１１４０内に着座されている。
【０１３５】
コイルスプリング１１４２は、リム１１３７と、突起部１１３０のリッジ１１３２との間にポジショナー１１２８に配置されている。スプリング１１４２は、硬化ステンレス鋼から形成されるのが好ましい。
【０１３６】
ポジショナー１１２８及びスプリング１１４２は、エンクロージャ要素１１００及び１１０２と接続要素１１２２とが密接にねじ込み係合した状態にあるとき、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０に接触して非液体サンプルを上方に移動させるように作用する。
【０１３７】
第２のエンクロージャ要素１１０２には、走査型電子顕微鏡の標本ステージの適切な凹部（図示せず）に着座するように配列された、略中央スタブ１１５０が形成されるのが好ましい。図３１Ａ乃至図４０に示される容器は、従来の走査型電子顕微鏡の従来のスタブ用凹部に適合するサイズで働き、それが何であれ、変形する必要はないことが、本発明の特別な特徴である。スタブの様々な形態及びサイズを、様々な走査型電子顕微鏡に適合するように提供することができることが認められよう。
【０１３８】
エンクロージャ要素１１００及び１１０２は、容器を、適切な多重容器ホルダー内に容易に着座させることを可能にし、更にユーザーがエンクロージャ要素１１００及び１１０２をねじ込み開閉することを援助するため、径方向に延在する夫々の位置決め保持突起部１１５４及び１１５５が設けられるのが好ましい。好ましくは、各々のエンクロージャ要素１１００及び１１０２上の突起部１１５４及び１１５５の相対的な方位角方向の配置は、図３４Ａ及び図３４Ｂに示されるように、これら突起部間の相対的な方位角方向の整列が、要素間のねじ込み閉鎖の所望の度合いを指し示すようになっているのが好ましい。
【０１３９】
ここで、図３１Ａ乃至図３５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である、図３６Ａ、３６Ｂ及び３６Ｃを参照する。図３６Ａは、エンクロージャ要素１１００及び１１０２と接続要素１１２２をねじ込み閉鎖する前の図３１Ｂに示される配位で配列されている、組織サンプル１１６０を蓄えた図３１Ａ乃至図３５Ｂの容器を示している。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０が、図３６Ａにおいて、略平坦であるように示されている。
【０１４０】
図３６Ｂは、周囲からの組織サンプルエンクロージャ１１１６の密封を生成するエンクロージャ要素１１００及び１１０２と接続要素１１２２との間の完全なねじ込み係合に続く中間状態にある、図３６Ａの容器を示している。なお、組織サンプル１１６０はポジショナー１１２８により発揮された力に起因して、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０と緊密に接触している。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０と、その支持格子１１１２とが、この態様におけるその密封の結果生じた組織サンプルエンクロージャ１１１６の圧力形成に起因して、外方にしなっていることが見て取れる。
【０１４１】
図３６Ｃは、典型的には、１０−２〜１０−６ミリバールの真空でＳＥＭの脱ガス環境に配置されたときの図３６Ｂの容器を示している。この環境では、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０と支持格子１１１２とが、図３６Ｂの周囲環境に配置されたときよりも、より大きい度合いで外方にしなっていることが見て取れる。更には、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０は、図３６Ｂの周囲環境で生じたものよりも大きい度合いで格子１１１２の隙間を通って隙間内に入り込もうとしていることが理解できる。
【０１４２】
ここで、図３１Ａ乃至図３６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルを含む組織とＳＥＭへの挿入とを示す、簡略図及び断面図である、図３７を参照する。
図３７は、ＳＥＭ１１６６のステージ１１６４に挿入される、図３１Ｂの配位にある閉鎖容器を示している。容器の配位が図３７に示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【０１４３】
ここで、図３１Ａ乃至図３５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の様々な作動配位を４つの作動段階で示した、４つの断面図である、図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ及び３８Ｄを参照する。図３８Ａは、図３１Ａ乃至図３５Ｂの容器と同一である容器１１７０を示し、それ以外では、該容器は、以下で特定されるように、細胞成長プラットフォーム１１７４上で成長する細胞１１７２を有するサンプルを含み、エンクロージャ要素１１００及び１１０２と接続要素１１２２とのねじ込み閉鎖前に、図３１Ｂに示された配位に配列されている。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０が、略平坦であるように図３８Ａに示されている。細胞成長プラットフォーム１１７４は、図３１Ａ乃至図３７の実施例のポジショナー１１２８に対応する、適切に構成されたポジショナー１１７６に取り外し可能に取り付けられている。典型的には、細胞は、プラットフォーム１１７４がポジショナー１１７６上に取り付けられていない間にも、細胞成長プラットフォーム１１７４上で成長する。プロットフォーム１１７４の取り付けは、典型的には、ＳＥＭ検査が行われる直前に行われる。
【０１４４】
図３８Ｂは、周囲からの、参照番号１１７８により指し示された細胞サンプルエンクロージャの密封を生成するエンクロージャ要素１１００及び１１０２と接続要素１１２２との間の完全なねじ込み係合に続く中間状態にある、図３８Ａの容器を示している。なお、細胞１１７２を含むサンプルはポジショナー１１７６により発揮された力に起因して、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０と緊密に接触している。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０と、その支持格子１１１２とが、この態様におけるその密封の結果生じた細胞サンプルエンクロージャ１１７８の圧力形成に起因して、外方にしなっていることが見て取れる。
【０１４５】
図３８Ｃは、典型的には、１０−２〜１０−６ミリバールの真空でＳＥＭの脱ガス環境に配置されたときの図３８Ｂの容器を示している。この環境では、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０と支持格子１１１２とが、図３８Ｂの周囲環境に配置されたときよりも、より大きい度合いで外方にしなっていることが見て取れる。更には、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０は、図３８Ｂの周囲環境で生じたものよりも大きい度合いで格子１１１２の隙間を通って隙間内に入り込もうとしていることが理解できる。
【０１４６】
図３８Ｄは、ＳＥＭ１１６６のステージ１１６４に挿入される、図３１Ｂの配位にある閉鎖容器１１７０を示している。容器の配位が図３８Ｄに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【０１４７】
ここで、図３１Ａ乃至図３７のＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である、図３９を参照する。図３９に示されるように、参照番号１１８０により指し示された容器は、ＳＥＭにより発生された電子ビーム１１８２が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０を通過し、容器１１８０内のサンプル１１８４を含む組織に照射されように、ＳＥＭ１１６６のステージ１１６４上に配置されている。サンプル１１８４からの後方散乱電子は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０を通過し、ＳＥＭの一部を形成する検出器１１８６により検出される。例えば２次電子検出器１１８８等の１つ以上の追加の検出器を設けてもよい。電子ビーム励起に起因してサンプル１１８４により放射されるＸ線放射を検出するためのＸ線検出器（図示せず）を設けてもよい。
【０１４８】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る容器１１８０内のサンプル１１８４との電子ビーム相互作用の詳細を概略的に示す図４０を追加的に参照する。なお、本発明は、図４０に示されるように、それらの平均的な原子番号により互いから区別される特徴群の高いコントラストの画像形成を可能にしている。図４０では、比較的高い平均原子番号を有する、細胞核１１９０は、周囲の核質１１９２よりも電子をより大きく後方散乱させることが示されている。
【０１４９】
なお、本発明の好ましい実施例によれば、約２ミクロンまでの深さのサンプル内部の画像形成は、図４０に示されるように、５０ＫｅＶより低いエネルギーレベルを有する電子に対して達成可能であり、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０より下方に位置する細胞核１１９０が画像形成される。
【０１５０】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解された走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である、図４１Ａ乃至図４５Ｂを参照する。図４１Ａ及び図４１Ｂに示されるように、ＳＥＭ互換性サンプル容器は、閉鎖の容易さ及び速さを向上させるように配列された、参照番号１２００及び１２０２により指し示された、第１及び第２の相互にねじ込まれるエンクロージャ要素を備えている。エンクロージャ要素１２００及び１２０２は、プラスチックから成形され、導電性金属コーティングで被覆されるのが好ましい。
【０１５１】
第１のエンクロージャ要素１２００は、好ましくは、サンプルエンクロージャを形成し、略中央アパーチャ１２０６を持つベース表面１２０４を有する。図４２Ａ及び図４２Ｂに詳細に示される、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜サブアッセンブリ１２０８は、図４３Ａ、４３Ｂ及び図４５Ａ、４５Ｂに示されるように、アパーチャ１２０６に対向してこれを覆って、エンクロージャ要素１２００の内部に着座している。エンクロージャ要素１２００内に適切に配置されたサブアッセンブリ１２０８を備えるサンプル皿部は、図４３Ａ乃至図４５Ｂに示されるように、参照番号１２０９により指し示されている。
【０１５２】
更に図４２Ａ及び図４２Ｂを参照すると、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０が、接着剤により、機械式支持格子１２１２に接着される。該膜２１０は、アメリカ合衆国、ＵＴ、オレムのモックステック社から市販されている、カタログ番号ＬＷＮ０００３３等のポリイミド膜を含むのが好ましい。格子１２１２は、図面で縮尺通りには示されておらず、該格子としては、アメリカ合衆国、ニューヨークのコートランドのバックビーメアズから市販されている、カタログ番号ＢＭ００９０−０１が好ましい。接着剤は、アメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されており、カタログ番号ＮＯＡ６１であるのが好ましい。サンプルエンクロージャ形成リング１２１４は、好ましくは、例えばアメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されているカタログ番号ＮＯＡ６１の接着剤により、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０に接着されている。リング１２１４は、スペイン、バルセロナ市のイルペンから市販されている、例えばカタログ番号６９２１０６００１０００等のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）から形成されるのが好ましく、約２０マイクロリットルの体積で約２ｍｍの高さを備えた液体サンプルエンクロージャを画定するのが好ましい。好ましくは、リング１２１４は、傾斜壁を有する液体サンプルエンクロージャ１２１６を画定するように構成される。
【０１５３】
好ましくは、ダイヤフラム１２１８が、Ｏリング部２２０から一体成形され、該Ｏリング部２２０には、伸張可能シート部２２１が密封されているのがよい。ダイヤフラム１２１８は、第２のエンクロージャ要素１２０２の内側表面１２１９と、接続要素１２２２との間に配置されるのが好ましい。接続要素１２２２は、好ましくは、プラスチックから成形され、導電金属コーティングで被覆されている。ダイヤフラム１２１８は、約５０のショア硬度を有するシリコンゴムから成形されるのが好ましく、シート部１２２１は、０．２〜０．３ｍｍの厚さを有するのが好ましい。
【０１５４】
Ｏリング１２２３は、接続要素１２２２と、サブアッセンブリ１２０８のリング１２１４との間に配置されているのが好ましい。ダイヤフラム１２１８及びＯリング１２２３は、エンクロージャ要素１２００及び１２０２と接続要素１２２２とが緊密なねじ込み係合にあるとき、要素１２００及び１２０２と接続要素１２２２とのねじ込み係合が密封係合であるべき必要性を無くすように、並びに、その動的圧力及び静的圧力リリーフを提供するように作動する。
【０１５５】
接続要素１２２２は、中央凹部１２２４を有するのが好ましい。接続要素１２２２には、凹部１２２４内に突出する、図４５Ａ及び４５Ｂに示される突起部１２２６が形成されている。
【０１５６】
ポジショナー１２２８が、２つの直立した可撓性突起部１２３０から構成されるのが好ましく、各々は、突起部１２３０の端部１２３４に形成されたリッジ１２３２を備える。ポジショナー１２２８は、プラスチックから成形されるのが好ましい。図４５Ａ及び４５Ｂに示されるように、突起部１２３０は、接続要素１２２２の凹部１２２４内に挿入されたとき互いに押圧し、一旦、リッジ１２３２が接続要素１２２２の突起部１２２６に着座されたならば、直立位置へとスナップ式に戻る。
【０１５７】
ポジショナー１２２８は、リム１２３７から延在する、夫々の径方向に延在する位置決め保持突起部１２３６が設けられているのが好ましい。位置決め保持突起部１２３６は、ポジショナー１２２８の回転を防止するためリング１２１４のサンプルエンクロージャ１２１６の傾斜壁に形成されたアパーチャ１２４０内に着座されている。
【０１５８】
コイルスプリング１２４２は、リム１２３７と、突起部１２３０のリッジ１２３２との間でポジショナー１２２８上に配置されている。スプリング１２４２は、硬化ステンレス鋼から形成されるのが好ましい。
【０１５９】
ポジショナー１２２８及びスプリング１２４２は、エンクロージャ要素１２００及び１２０２と、接続要素１２２２とが密接にねじ込み係合した状態にあるとき、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０に接触して非液体サンプルを上方に移動させるように作用する。
【０１６０】
第２のエンクロージャ要素１２０２には、走査型電子顕微鏡の標本ステージの適切な凹部（図示せず）に着座するように配列された、貫通ボア１２５２を有する略中央スタブ１２５０が形成されるのが好ましい。ボア１２５２は、ダイヤフラム１２１８の一方の側と（ＳＥＭ）互換性サンプル容器が配置されている環境との間に流体連通チャンネルを形成することにより、ダイヤフラム１２１８が圧力リリーフを提供することを可能にする。図４１Ａ乃至図５０に示される容器は、従来の走査型電子顕微鏡の従来のスタブ用凹部に適合するサイズで働き、それが何であれ、変形する必要はないことが、本発明の特別な特徴である。スタブの様々な形態及びサイズを、様々な走査型電子顕微鏡に適合するように提供することができることが認められよう。
【０１６１】
エンクロージャ要素１２００及び１２０２は、容器を、適切な多重容器ホルダー内に容易に着座させることを可能にし、更にユーザーがエンクロージャ要素１２００及び１２０２をねじ込み開閉することを援助するため、径方向に延在する夫々の位置決め保持突起部１２５４及び１２５５が設けられるのが好ましい。好ましくは、各々のエンクロージャ要素１２００及び１２０２上の突起部１２５４及び１２５５の相対的な方位角方向の配置は、図４４Ａ及び図４４Ｂに示されるように、これら突起部間の相対的な方位角方向の整列が、要素間のねじ込み閉鎖の所望の度合いを指し示すようになっているのが好ましい。
【０１６２】
図４１Ａ乃至図４５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である、図４６Ａ、４６Ｂ及び４６Ｃを参照する。図４６Ａは、エンクロージャ要素１２００及び１２０２と接続要素１２２２とをねじ込み閉鎖する前に、図４１Ｂに示された配位で配列されている、組織サンプル１２６０を蓄えた図４１Ａ乃至図４５Ｂの容器を示している。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０が、図４６Ａにおいて、略平坦であるように示されている。
【０１６３】
図４６Ｂは、周囲からの組織サンプルエンクロージャ１２１６の密封を生成するエンクロージャ要素１２００及び１２０２の間の完全なねじ込み係合に続く中間状態にある、図４６Ａの容器を示している。なお、組織サンプル１２６０は、ポジショナー１２２８により発揮された力に起因して、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０と緊密に接触した状態にある。ダイヤフラム１２１８は、この態様におけるその密封の結果生じた組織サンプルエンクロージャ１２１６の圧力形成に起因して、外方にしなっていることが見て取れる。本実施例では、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０及びその支持格子１２１２も、この態様におけるその密封の結果生じた組織サンプルエンクロージャ１２１６の圧力形成に起因して、外方にしなっているが、ダイヤフラム１２１８の作用に起因して、かなりより小さい程度にしか、しなっていない。これは、図４６Ｂと図３６Ｂとを比較することにより、理解することができる。
【０１６４】
図４６Ｃは、典型的には、１０−２〜１０−６ミリバールの真空でＳＥＭの脱ガス環境に配置されたときの図４６Ｂの容器を示している。この環境では、ダイヤフラム１２１８が、図４６Ｂの周囲環境のときよりもより大きい度合いで外方にしなり、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０と支持格子１２１２とが、図４６Ｂの周囲環境に配置されたときよりも、より大きい度合いで外方にしなっているが、ダイヤフラム１２１８の作用に起因して、図３６Ｃの実施例のときよりも、かなり小さい度合いでしかしなっていないことが見て取れる。これは、図４６Ｃと図３６Ｃとを比較することにより、理解することができる。
【０１６５】
なお、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０は、図４６Ｂの周囲環境で生じたものよりも大きい度合いで格子１２１２の隙間を通って隙間内に入り込もうとしているが、ダイヤフラム１２１８の作用に起因して、図３６Ｃの実施例のときよりもかなり小さい度合いでしかしなっていないことが理解できる。これは、図４６Ｃと図３６Ｃとを比較することにより、理解することができる。
【０１６６】
ここで、図４１Ａ乃至図４６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルを含む組織とＳＥＭへの挿入とを示す、簡略図及び断面図である、図４７を参照する。
図４７は、ＳＥＭ１２６６のステージ１２６４に挿入される、図４１Ｂの配位にある閉鎖容器を示している。容器の配位が図４７に示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【０１６７】
ここで、図４１Ａ乃至図４５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の様々な作動配位を４つの作動段階で示した、４つの断面図である、図４８Ａ、４８Ｂ、４８Ｃ及び４８Ｄを参照する。図４８Ａは、図４１Ａ乃至図４５Ｂの容器と同一である容器１２７０を示し、それ以外では、該容器は、以下で特定されるように、細胞成長プラットフォーム１２７４上で成長する細胞１２７２を有するサンプルを含み、エンクロージャ要素１２００及び１２０２と接続要素１２２２とのねじ込み閉鎖前に、図４１Ｂに示された配位に配列されている。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０が、略平坦であるように図４８Ａに示されている。細胞成長プラットフォーム１２７４は、図４１Ａ乃至図４７の実施例のポジショナー１２２８に対応する、適切に構成されたポジショナー１２７６に取り外し可能に取り付けられている。典型的には、細胞は、プラットフォーム１２７４がポジショナー１２７６上に取り付けられていない間にも、細胞成長プラットフォーム１２７４上で成長する。プロットフォーム１２７４の取り付けは、典型的には、ＳＥＭ検査が行われる直前に行われる。
【０１６８】
図４８Ｂは、周囲からの、参照番号１２７８により指し示された細胞サンプルエンクロージャの密封を生成するエンクロージャ要素１２００及び１２０２と接続要素１２２２との間の完全なねじ込み係合に続く中間状態にある、図４８Ａの容器を示している。なお、細胞１２７２を含むサンプルはポジショナー１２７６により発揮された力に起因して、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０と緊密に接触している。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０と、その支持格子１２１２とが、この態様におけるその密封の結果生じた細胞サンプルエンクロージャ１２７８の圧力形成に起因して、外方にしなっているが、ダイヤフラム１２１８の作用に起因して、図３８Ｂの実施例のときよりもかなり小さい度合いでしかしなっていないことが見て取れる。これは、図４８Ｂと図３８Ｂとを比較することにより、理解することができる。
【０１６９】
図４８Ｃは、典型的には、１０−２〜１０−６ミリバールの真空でＳＥＭの脱ガス環境に配置されたときの図４８Ｂの容器を示している。この環境では、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０と支持格子１２１２とが、図４８Ｂの周囲環境に配置されたときよりも、より大きい度合いで外方にしなっていることが見て取れる。更には、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０は、図４８Ｂの周囲環境で生じたものよりも大きい度合いで格子１２１２の隙間を通って隙間内に入り込もうとしているが、ダイヤフラム１２１８の作用に起因して、図３８Ｃの実施例のときよりもかなり小さい度合いでしかしなっていないことが見て取れる。これは、図４８Ｃと図３８Ｃとを比較することにより、理解することができる。
【０１７０】
図４８Ｄは、ＳＥＭ１２６６のステージ１２６４に挿入される、図４１Ｂの配位にある閉鎖容器１２７０を示している。容器の配位が図４８Ｄに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【０１７１】
ここで、図４１Ａ乃至図４７のＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である、図４９を参照する。図４９に示されるように、参照番号１２８０により指し示された容器は、ＳＥＭにより発生された電子ビーム１２８２が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０を通過し、容器１２８０内のサンプル１２８４を含む組織に照射されように、ＳＥＭ１２６６のステージ１２６４上に配置されている。サンプル１２８４からの後方散乱電子は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０を通過し、ＳＥＭの一部を形成する検出器１２８６により検出される。例えば２次電子検出器１２８８等の１つ以上の追加の検出器を設けてもよい。電子ビーム励起に起因してサンプル１２８４により放射されるＸ線放射を検出するためのＸ線検出器（図示せず）を設けてもよい。
【０１７２】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る容器１２８０内のサンプル１２８４との電子ビーム相互作用の詳細を概略的に示す図５０を追加的に参照する。なお、本発明は、図５０に示されるように、それらの平均的な原子番号により互いから区別される特徴群の高いコントラストの画像形成を可能にしている。図５０では、比較的高い平均原子番号を有する、細胞核１２９０は、周囲の核質１２９２よりも電子をより大きく後方散乱させることが示されている。
【０１７３】
なお、本発明の好ましい実施例によれば、約２ミクロンまでの深さのサンプル内部の画像形成は、図５０に示されるように、５０ＫｅＶより低いエネルギーレベルを有する電子に対して達成可能であり、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０より下方に位置する細胞核１２９０が画像形成される。
【０１７４】
ここで、図３１Ａ乃至図４０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図５１Ａ、５１Ｂ及び５１Ｃを参照する。図５１Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部１４００と、密封カバー１４０４とを備えるのが好ましい。ベース部１４００は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、容器支持収容部１４０６の列を形成する。各々の容器支持収容部１４０６は、アパーチャ１４０８により形成されるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。各アパーチャ１４０８に隣接して、サンプル皿部１４２５の突起部１４２４を収容するように配列された、一対の互いに整列した対の直立相互間隔突起部１４１０が形成されるのが好ましい。サンプル皿部１４２５は、図３３Ａ乃至図３５Ｂに示されたサンプル皿部１１０９と略同一であってもよいが、ねじ込み式機構又は他の取り付け機構を必要としない。
【０１７５】
密封カバー１４０４は、サンプル皿部１４２５の各々と個々に密封係合するように配列されている。好ましくは、密封カバー１４０４は、その下側に、図５１Ｃに示されたＯリング１４２６が提供される。Ｏリング１４２６は、密封カバー１４０４が、適所に、好ましくはベース部１４００との取り外し可能なスナップ式の係合で配置されたとき、サンプル皿部１４２５の各々の頂部リム表面と密封係合するように、そこに密封され配列されている。
【０１７６】
好ましくは、密封カバー１４０４は、その下側で、図５１Ｃに示された、突起部１４２８の列が設けられ、サンプル皿部１４２５に着座された電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１１１０（図３１Ａ乃至図４０に示された）と接触し、その上方に非液体サンプルを移動させるように配列されている。個々のポジショナー１４２８は、図５１Ｃに示されるように、コイル１４３０内に吊り下げられている。
【０１７７】
図５１Ｂは、１つのサンプル皿部１４２５がベース部１４００の皿支持収容部１４０６に配置された状態の図５１Ａの装置を示している。図５１Ｃは、ベース部１４００とスナップ式に係合する密封カバー１４０４を示している。密封カバー１４０４は、これにより、Ｏリング１４２６と、周囲を取り囲む密封カバー１４０４の一部分とを用いてサンプル皿部１４２５の各々の個々の密封を提供する。
【０１７８】
ここで、図４１Ａ乃至図５０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図５２Ａ、５２Ｂ及び５２Ｃを参照する。図５２Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部１４５０と、密封カバー１４５４とを備えるのが好ましい。ベース部１４５０は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、皿部支持収容部１４５６の列を形成する。各々の皿部支持収容部１４５６は、アパーチャ１４５８により形成されるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。各アパーチャ１４５８に隣接して、サンプル皿部１４７５の突起部１４７４を収容するように配列された、一対の互いに整列した対の直立相互間隔突起部１４６０が形成されるのが好ましい。サンプル皿部１４７５は、図４３Ａ乃至図４５Ｂに示されたサンプル皿部１２０９と略同一であってもよいが、ねじ込み式機構又は他の取り付け機構を必要としない。
【０１７９】
好ましくは、密封カバー１４５４は、その下側に、図５２Ｃに示されたＯリング１４７６が提供される。Ｏリング１４７６は、密封カバー１４５４が、適所に、好ましくはベース部１４５０との取り外し可能なスナップ式の係合で配置されたとき、サンプル皿部１４７５の各々の頂部リム表面と密封係合するように、そこに密封され配列されている。
【０１８０】
密封カバー１４５４は、図５２Ｃに示されるダイヤフラム１４７７を備えた、サンプル皿部１４７５の各々の個々の密封係合のため配列されている。該ダイヤフラムは、密封カバー１４５４に形成されたアパーチャ１４７８を覆って密封式に取り付けられている。好ましくは、図４１Ａ乃至図５０を参照して上述されたダイヤフラム１２１８と同一であってもよい、ダイヤフラム１４７７の列が、密封カバー１４５４の下側に設けられている。個々のダイヤフラム１４７７は、密封カバー１４５４が、適所に、好ましくはベース部１４５０との取り外し可能なスナップ式の係合で配置されたとき、サンプル皿部１４７５の各々の頂部リム表面と密封係合するように配列されている。
【０１８１】
好ましくは、密封カバー１４５４には、ポジショナー１４８０の列が設けられている。個々のポジショナー１４８０は、サンプル皿部１４７５に着座された電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１２１０（図４１Ａ乃至図５０に示された）と接触し、その上方に非液体サンプルを移動させるように配列されている。個々のポジショナー１４２８は、図５１Ｃに示されるように、コイル１４３２内に吊り下げられている。
【０１８２】
図５２Ｂは、１つのサンプル皿部１４７５がベース部１４５０の皿支持収容部１４５６に配置された状態の図５２Ａの装置を示している。図５２Ｃは、ベース部１４５０とスナップ式に係合する密封カバー１４５４を示している。密封カバー１４５４は、これにより、ダイヤフラム１４７６を用いて、サンプル皿部１４７５の各々の個々の密封を提供する。
【０１８３】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図５３Ａ及び５３Ｂを参照する。図５３Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部１５００と、密封カバー１５０４とを備えるのが好ましい。ベース部１５００は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、サンプル容器１５０６の列を形成する。各々のサンプル容器１５０６は、アパーチャ１５０８を備えるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。図５３Ｂに示された、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１５１０が、各アパーチャ１５０８を覆って密封されている。膜１５１０は、図３１Ａ乃至図４０を参照して上述された膜１１１０と同一であるのが好ましい。密封カバー１５０４は、サンプル容器１５０６の各々と個々に密封係合するように配列されている。
【０１８４】
好ましくは、密封カバー１５０４には、図５３Ｂに示されるポジショナー１５２０の列が設けられている。個々のポジショナー１５２０は、図５３Ｂに示されるように、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１５１０と接触し、その上方に非液体サンプルを移動させるように、コイル１５２２内に吊り下げられている。
【０１８５】
図５３Ｂは、１つのサンプル皿部１４７５がベース部１４５０の皿支持収容部１４５６に配置された状態の図５２Ａの装置を示している。図５２Ｃは、ベース部１４５０とスナップ式に係合する密封カバー１４５４を示している。密封カバー１４５４は、これにより、ダイヤフラム１４７６を用いて、サンプル皿部１４７５の各々の個々の密封を提供する。
【０１８６】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図５３Ａ及び５３Ｂを参照する。図５３Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部１５００と、密封カバー１５０４とを備えるのが好ましい。ベース部１５００は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、サンプル容器１５０６の列を形成する。各々のサンプル容器１５０６は、アパーチャ１５０８を備えるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。図５３Ｂに示された、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１５１０が、各アパーチャ１５０８を覆って密封されている。膜１５１０は、図３１Ａ乃至図４０を参照して上述された膜１１１０と同一であるのが好ましい。密封カバー１５０４は、サンプル容器１５０６の各々と個々に密封係合するように配列されている。
【０１８７】
図５３Ｂは、図５３Ａの装置が密封係合した状態を示している。この密封係合により、サンプル容器１５０６の各々の個々の密封が提供される。
ここで、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図５４Ａ及び図５４Ｂを参照する。図５４Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部１５５０と、密封カバー１５５４とを備えるのが好ましい。ベース部１５５０は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、サンプル容器１５５６の列を形成する。各々のサンプル容器１５５６は、アパーチャ１５５８を備えるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。
【０１８８】
図５４Ｂに示される電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１５６０が各アパーチャ１５５８を覆って密封する。膜１５６０は、図４１Ａ乃至図５０を参照して上述された膜１２１０と同一であるのが好ましい。密封カバー１５５４は、例えば、約５０のショア硬度を有する、０．２〜０．３ｍｍの厚さのシリコンゴム等から成形された弾性シート材料から形成されたダイヤフラム１５６２であるのが好ましい。ダイヤフラム１５６２は、密封カバー１５５４に形成されたアパーチャ１５６４を覆って密封式に取り付けられ、サンプル容器１５５６の各々と個々に密封係合するように配列されている。
【０１８９】
好ましくは、密封カバー１５５４には、図５４Ｂに示されたポジショナー１５７０の列が設けられている。個々のポジショナー１５７０は、図５４Ｂに示されるように、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜１５６０と接触し、その上方に非液体サンプルを移動させるように、コイル１５７２内に吊り下げられている。
【０１９０】
図５４Ｂは、図５４Ａの装置が密封係合した状態を示している。この密封係合により、サンプル容器１５５６の各々の個々の密封が提供される。
ここで、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である、図５５を参照する。図５５に示されるように、好ましくは、図示のような例えばロボットアーム等の自動位置決めシステムが、システムを通して、多数のＳＥＭ互換性サンプル容器１６０２を搬送するため使用される。１つ以上のステージで手動介入操作が適宜用いられてもよいことが認められよう。
【０１９１】
その後、個々の容器１６０２は、電子顕微鏡標本ステージ１６１０に配置され、次に、走査型電子顕微鏡１６１２内に導入される。その結果得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ１６１４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０１９２】
ここで、本発明の更に別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である、図５６を参照する。図５６に示されるように、複数の顕微鏡検査用の多重サンプルホルダー１６５０は、各々が図５１Ａ乃至図５２Ｃに示された型式のいずれかの多数のＳＥＭ互換性サンプル皿部１６５２を形成し、テーブル１６５４に載った状態で示されている。好ましくは、関心のあるサンプルを同定するため、参照番号１６５６で示されるように、サンプル皿部１６５２内のサンプルの光学顕微鏡検査がサンプル皿部がホルダー１６５０に取り付けられている間に実行される。好ましくは、解剖顕微鏡１６５８がこの目的のため用いられる。
【０１９３】
好ましくは、図示のような例えばロボットアーム等の自動位置決めシステムが、システムを通して、顕微鏡検査用多重サンプルホルダー１６５０を搬送するため使用される。１つ以上のステージで手動介入操作が適宜用いられてもよいことが認められよう。
【０１９４】
その後、ホルダー１６５０は、電子顕微鏡標本ステージ１６６０に配置され、次に、走査型電子顕微鏡１６６２内に導入される。その結果得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ１６６４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０１９５】
ここで、本発明の更に別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である、図５７を参照する。図５７に示されるように、複数の顕微鏡検査用の多重サンプルホルダー１６７０は、図５３Ａ乃至図５４Ｂのいずれかに示されるように、各々が多数のＳＥＭ互換性サンプル皿部１６７２を形成し、テーブル１６７４に載った状態で示されている。好ましくは、関心のあるサンプルを同定するため、参照番号１６７６で示されるように、サンプル容器１６７２内のサンプルの光学顕微鏡検査がホルダーの位置で実行される。好ましくは、解剖顕微鏡１６７８がこの目的のため用いられる。
【０１９６】
好ましくは、図示のような例えばロボットアーム等の自動位置決めシステムが、システムを通して、顕微鏡検査用多重サンプルホルダー１６７０を搬送するため使用される。１つ以上のステージで手動介入操作が適宜用いられてもよいことが認められよう。
【０１９７】
その後、ホルダー１６７０は、電子顕微鏡標本ステージ１６８０に配置され、次に、走査型電子顕微鏡１６８２内に導入される。その結果得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ１６８４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０１９８】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解された操作型電子顕微鏡（ＳＥＭ）互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である、図５８Ａ乃至図６２Ｂを参照する。図５８Ａ及び図５８Ｂに示されるように、ＳＥＭ互換性サンプル容器は、閉鎖の容易さ及び速さを向上させるため配列された、参照番号２１００及び２１０２により指し示された、第１及び第２の互いにねじ込まれるエンクロージャ要素を備えている。エンクロージャ要素２１００及び２１０２は、好ましくは、プラスチックから成形され、導電性金属コーティングで被覆される。
【０１９９】
第１のエンクロージャ要素２１００は、好ましくは、液体サンプルエンクロージャを形成し、略中央アパーチャ２１０６を持つベース表面２１０４を有する。図５９Ａ及び図５９Ｂに詳細に示される、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜サブアッセンブリ２１０８は、図６０Ａ、６０Ｂ及び図６２Ａ、６２Ｂに示されるように、アパーチャ２１０６に対向してこれを覆って、エンクロージャ要素２１００の内部に着座している。エンクロージャ要素２１００内に適切に配置されたサブアッセンブリ２１０８を備えるサンプル皿部は、図６０Ａ乃至図６２Ｂに示されるように、参照番号２１０９により指し示されている。
【０２００】
更に図５９Ａ及び図５９Ｂを参照すると、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０が、接着剤により、機械式支持格子２１１２に接着される。該膜２１１０は、アメリカ合衆国、ＵＴ、オレムのモックステック社から市販されている、カタログ番号ＬＷＮ０００３３等のポリイミド膜であるのが好ましい。格子２１１２は、図面で縮尺通りには示されておらず、該格子としては、アメリカ合衆国、ニューヨークのコートランドのバックビーメアズから市販されている、カタログ番号ＢＭ００９０−０１が好ましい。接着剤は、アメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されており、カタログ番号ＮＯＡ６１であるのが好ましい。液体サンプルエンクロージャ形成リング２１１４は、好ましくは、例えばアメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されているカタログ番号ＮＯＡ６１の接着剤により、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０に接着されている。リング２１１４は、スペイン、バルセロナ市のイルペンから市販されている、例えばカタログ番号６９２１０６００１０００等のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）から形成されるのが好ましく、約２０マイクロリットルの体積で約２ｍｍの高さを備えた液体サンプルエンクロージャを画定するのが好ましい。好ましくは、リング２１１４は、傾斜壁を有する液体サンプルエンクロージャ２１１６を画定するように構成される。
【０２０１】
Ｏリング２１１８は、リング２１１４と、第２のエンクロージャ要素２１０２の内部表面２１２０との間に配置されているのが好ましい。Ｏリング２１１８は、エンクロージャ要素２１００及び２１０２が緊密なねじ込み係合であるとき、要素２１００及び２１０２のねじ込み係合が密封係合であるべき必要性を無くすように作用する。
【０２０２】
第２のエンクロージャ要素２１０２には、走査型電子顕微鏡の標本ステージの適切な凹部（図示せず）に着座するように配列された、貫通ボア２１２３を有する略中央スタブ２１２２が形成されるのが好ましい。
【０２０３】
エンクロージャ要素２１００及び２１０２は、容器を、適切な多重容器ホルダー内に容易に着座させることを可能にし、更にユーザーがエンクロージャ要素２１００及び２１０２をねじ込み開閉することを援助することを可能にする。好ましくは、各々のエンクロージャ要素２１００及び２１０２上の突起部２１２４及び２１２５の相対的な方位角方向の配置は、図６１Ａ及び図６１Ｂに示されるように、これら突起部間の相対的な方位角方向の整列が、要素間のねじ込み閉鎖の所望の度合いを指し示すようになっているのが好ましい。
【０２０４】
ＳＥＭ検査の間に電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０に面していないサンプル側から、液体サンプルエンクロージャ２１１６内のサンプルからの光を受け取るように、光案内部２１２６が設けられている。
【０２０５】
光案内部２１２６は、切頭錐体先端部２１２８を備えたシリンダーから形成され、スタブ２１２２のボア２１２３内に挿入される。光案内部２１２６は、好ましくは、アメリカ合衆国、ＣＴ、ポムフレットの１２ファイバーＲｄのファイバーオプティックステクノロジー社から市販されている、数値アパーチャ０．６６の、プラスチック若しくはガラス製のクラッドを用いた光案内部であり、接着剤等の任意の従来手段により、エンクロージャ２１０２に密封されている。
【０２０６】
錐体先端部２１２８の壁は所定角度をなして構成され、該所定角度は、サンプルから放射された入射光子が光案内部２１２６内で反射されることを確実にするように、臨界反射角より小さくされている。
【０２０７】
ここで、図５３Ａ乃至図６２ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である、図６３Ａ、６３Ｂ及び６３Ｃを参照する。図６３Ａは、エンクロージャ要素２１００及び２１０２をねじ込み閉鎖する前の図５８Ｂに示される配位で配列されている、液体サンプル２１３０を蓄えた図５８Ａ乃至図６２Ｂの容器を示している。なお、液体サンプルは、表面張力に起因して、液体サンプルエンクロージャ２１１６からは流れ出ない。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０が、図６３Ａにおいて、略平坦であるように示されている。
【０２０８】
図６３Ｂは、周囲からの液体サンプルエンクロージャ２１１６の密封を生成するエンクロージャ要素２１００及び２１０２の間の完全なねじ込み係合に続く中間状態にある、図６３Ａの容器を示している。光案内先端部２１２８は、液体サンプル２１３０内に浸漬された状態で示されている。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０と、その支持格子２１１２とが、この態様におけるその密封の結果生じた液体サンプルエンクロージャ２１１６の圧力形成に起因して、外方にしなっていることが見て取れる。
【０２０９】
図６３Ｃは、典型的には、１０−２〜１０−６ミリバールの真空でＳＥＭの脱ガス環境に配置されたときの図６Ｂの容器を示している。この環境では、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０と支持格子２１１２とが、図６３Ｂの周囲環境に配置されたときよりも、より大きい度合いで外方にしなっていることが見て取れる。更には、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０は、図６３Ｂの周囲環境で生じたものよりも大きい度合いで格子２１１２の隙間を通って隙間内に入り込もうとしていることが理解できる。
【０２１０】
ここで、図５８Ａ乃至図６３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、細胞成長、液体除去、液体追加、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である、図６４Ａ、６４Ｂ、６４Ｃ、６４Ｄ及び６４Ｅを参照する。典型的な細胞培養状況を示す、図６４Ａを参照すると、サブアッセンブリ２１０８を内部に配置させたエンクロージャ要素２１００は、図５８Ａに示された配置態様にあり、液体媒体２１４２内の細胞２１４０は液体サンプルエンクロージャ２１１６内に配置され、これらの細胞２１４０が、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０に接触して横たわっている。
【０２１１】
図６４Ｂは、典型的には吸引によって液体サンプルエンクロージャ２１１６から液体を除去した状態を示し、図６４Ｃは、液体サンプルエンクロージャ２１１６に液体を追加した状態を示している。液体の除去及び追加を多数回に亘って液体サンプルエンクロージャ２１１６内のサンプルに関して実行してもよい。好ましくは、液体除去及び追加のため用いられる装置は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０の意図しない破裂を防止するように、設計され、備え付けられるのがよい。
【０２１２】
図６４Ｄは、図６４Ｃに示される細胞２１４０を液体媒体２１４２内に含む容器の閉鎖状態を示している。光案内先端部２１２８が、液体サンプル２１４０の液体媒体２１４２内に浸漬されている状態で示されている。図６４Ｅは、ＳＥＭ２１４６のステージ２１４４上に挿入される閉鎖容器を図５８Ｂの配位で示している。容器の配位が図６４Ｅに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【０２１３】
図６４Ａ乃至図６４Ｄは、液体サンプルエンクロージャ２１１６に関する液体の追加又は除去に拘わらず、サンプルを含む液体の少なくとも一部分が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０と接触したままとなる状況を例示している。この状況は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０に、サンプルの一部が吸収され、そうでなければ、接着される状況を含んでいてもよい。サンプルを含む液体の例は、細胞、培養菌、血液、バクテリア及び無細胞材料を含んでいてもよい。
【０２１４】
ここで、図５８Ａ乃至図６３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０と接触したサンプル含有液体、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である、図６５Ａ、６５Ｂ及び６５Ｃを参照する。図６５Ａ乃至図６５Ｃは、サンプルを含む液体２１６０の少なくとも一部分が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０と接触しているが、それに接着されていない状況を例示している。サンプルを含む液体の例には、例えば、ミルク、化粧用クリーム、ペイント、インク、及び、液体形態の薬剤等、様々な乳濁液及び懸濁液がある。図６５及び図６５Ｂで、サブアッセンブリ２１０８を内部に配置させた、エンクロージャ要素２１００は、図５８Ａに示される配位にあることが見て取れよう。
【０２１５】
図６５Ｂは、サンプル２１６０を含む容器の閉鎖状態を示している。図６５Ｃは、ＳＥＭ２１４６のステージ２１４４上に挿入された、図５８Ｂの配位にある、閉鎖容器を示している。容器の配位が図６５Ｃに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【０２１６】
ここで、図５８Ａ乃至図６３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルの光検出を用いたＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である、図６６を参照する。図６６に示されるように、参照番号２１７０により指し示された容器は、ＳＥＭ２１４６のステージ２１４４で凹部２１７１に配置された状態で示されている。ステージ２１４４は、ＳＥＭ検査の間、サンプル２１７４を含む液体内の関心のある領域を検査するため、電子ビーム２１７２の下方に容器２１７０を配置することを可能にするように、回転動作する。
【０２１７】
ＳＥＭにより発生された電子ビーム２１７２は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０を通過し、容器２１７０内のサンプル２１７４を含む液体に照射される。サンプル２１７４からの後方散乱電子は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０を通過し、ＳＥＭの一部を形成する検出器２１７６により検出される。例えば２次電子検出器２１７８等の１つ以上の追加の検出器を設けてもよい。電子ビーム励起に起因してサンプル２１７４により放射されるＸ線放射を検出するためのＸ線検出器（図示せず）を設けてもよい。
【０２１８】
電子ビーム励起に起因して液体サンプル２１７４から放射される光子２１８０は、図５８Ａ乃至図６３Ｃの光案内部２１２６と同じである、参照番号２１８４により指し示された第１の光案内部を通って、第２の光案内部２１８６へと伝達される。第２の光案内部２１８６は、光子２１８０を、例えば光増幅管（ＰＭＴ）２１８８等の光検出器へと伝達するように作動する。光検出器２１８８から得られた光強度の時間依存測定は、走査電子ビームの位置に関する情報と組み合わされ、当該技術分野で知られた方法によりサンプル２１７４の画像を生成するように、好ましくは、コンピュータ２１８９上のデジタル画像として、結合される。
【０２１９】
好ましくは、第２の光案内部２１８６は、屈折に起因した光案内部２１８４及び２１８６の間の通路内の光子の損失を最小にし、２つの光案内部の相対的整列をずらすように、第１の光案内部２１８４の断面領域の直径よりも大きい直径を備えた断面領域を有する。
【０２２０】
図示の実施例では、第２の光案内部２１８６は、好ましくはＬ字形状湾曲部内に形成されるのが好ましく、第２の光案内部２１８６の長さを通して光子２１８０の内部反射を確実にする角度でＬ字形状の光案内部２１８６に沿って配置された、多数の光ファイバーを備えるのが好ましい。
【０２２１】
本発明では、光子２１８０は、第１の光案内部２１８４から、第２の光案内部２１８６を介して、ＳＥＭ２１４６の床部の下方に配置された光検出器まで垂直下方に伝達され得ることが認められよう。代替例として、光子２１８０は、第１の光案内部２１８４から光検出器まで伝達されてもよく、第２の光案内部２１８６を省略してもよい。
【０２２２】
本発明の別の実施例では、光子２１８０は、フィルター、回折格子又はプリズム（図示せず）等の従来手段により、光検出器２１８８による検出前に、スペクトル分析されてもよい。これは、１つ以上の特定の範囲内にある波長の光子の検出を可能にし、サンプル２１７４の組成及び構造又はサンプル２１７４内部の特徴に関する追加の情報をもたらす。
【０２２３】
加えて、例えば、光案内部２１８４及び２１８６の屈折率に類似した屈折率のオイル若しくはゲル（図示せず）等の液体は、光子２１８０が光案内部２１８４及び２１８６の外部に散乱することを防止するため、光案内部２１８４及び２１８６の間に配置されてもよい。
【０２２４】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る容器２１７０内のサンプル２１７４との電子ビーム相互作用の詳細を概略的に示す図６７を追加的に参照する。なお、本発明は、図６７に示されるように、それらの平均的な原子番号により、又は、電子の励起に起因したそれらの平均的な発光収量により、互いから区別される特徴群の高いコントラストの画像形成を可能にしている。図６７では、比較的高い平均原子番号を有する、細胞核２１９０は、周囲の核質２１９２よりも電子をより大きく後方散乱させることが示されている。
【０２２５】
光子２１８０は、細胞核２１９０から放射され、光案内部２１８４を介して、光検出器２１８８（図６６に示される）へと伝達される。なお、後方散乱電子の検出器により得られたコントラスト、及び、光子検出により得られたコントラストは、異なる物理的プロセスに起因し、サンプル内部の特徴の化学的特性に起因しており、従って、一般には重なり合わない。
【０２２６】
なお、本発明の好ましい実施例によれば、約２ミクロンまでの深さのサンプル内部の画像形成は、図６７に示されるように、５０ＫｅＶより低いエネルギーレベルを有する電子に対して達成可能であり、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０より下方に位置する細胞核２１９０が画像形成される。
【０２２７】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解された走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である、図６８Ａ乃至図７２Ｂを参照する。図６８Ａ及び図６８Ｂに示されるように、ＳＥＭ互換性サンプル容器は、閉鎖の容易さ及び速さを向上させるため配列された、参照番号２２００及び２２０２により指し示された、第１及び第２の互いにねじ込まれるエンクロージャ要素を備えている。エンクロージャ要素２２００及び２２０２は、好ましくは、プラスチックから成形され、導電性金属コーティングで被覆される。
【０２２８】
第１のエンクロージャ要素２２００は、好ましくは、液体サンプルエンクロージャを形成し、略中央アパーチャ２２０６を持つベース表面２２０４を有する。図６９Ａ及び図６９Ｂに詳細に示される、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜サブアッセンブリ２２０８は、図７０Ａ、７０Ｂ及び図７２Ａ、７２Ｂに示されるように、アパーチャ２２０６に対向してこれを覆って、エンクロージャ要素２２００の内部に着座している。エンクロージャ要素２２００内に適切に配置されたサブアッセンブリ２２０８を備えるサンプル皿部は、図７０Ａ乃至図７２Ｂに示されるように、参照番号２２０９により指し示されている。
【０２２９】
更に図６９Ａ及び図６９Ｂを参照すると、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０が、接着剤により、機械式支持格子２２１２に接着されている状態が示されている。該膜２２１０は、アメリカ合衆国、ＵＴ、オレムのモックステック社から市販されている、カタログ番号ＬＷＮ０００３３等のポリイミド膜を含むのが好ましい。格子２２１２は、図面で縮尺通りには示されておらず、該格子は、アメリカ合衆国、ニューヨークのコートランドのバックビーメアズから市販されている、カタログ番号ＢＭ００９０−０１であるのが好ましい。接着剤は、アメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されているカタログ番号ＮＯＡ６１であるのが好ましい。液体サンプルエンクロージャ形成リング２２１４は、好ましくは、例えばアメリカ合衆国、ＮＪのグランベリーのノーランドプロダクツ社から市販されているカタログ番号ＮＯＡ６１の接着剤により、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０に接着されている。リング２２１４は、スペイン、バルセロナ市のイルペンから市販されている、例えばカタログ番号６９２１０６００１０００等のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）から形成されるのが好ましく、約２０マイクロリットルの体積で約２ｍｍの高さを備えた液体サンプルエンクロージャを画定するのが好ましい。好ましくは、リング２２１４は、傾斜壁を有する液体サンプルエンクロージャ２２１６を画定するように構成される。
【０２３０】
好ましくは、ダイヤフラム２２１８が提供され、動的及び静的な圧力リリーフを提供するように作動する。好ましくは、ダイヤフラム２２１８は、Ｏリング部２２２０から一体成形され、該Ｏリング部２２２０には、伸張可能シート部２２２１が密封されている。ダイヤフラム２２１８は、約５０のショア硬度を有するシリコンゴムから成形されるのが好ましく、シート部２２２１は、０．２〜０．３ｍｍの厚さを有するのが好ましい。
【０２３１】
ダイヤフラム２２１８は、第２のエンクロージャ要素２２０２の壁の外側表面に形成された第１のアパーチャ２２２２内に挿入される。図７２Ａ及び図７２Ｂに示される第２のアパーチャ２２２３は、第２のエンクロージャ要素２２０２の壁の内側表面に形成される。第１のアパーチャ２２２２及び第２のアパーチャ２２２３は、ダイヤフラム２２１８が、ダイヤフラム２２１８の一方の側部とＳＥＭ互換性サンプル容器が配置されている環境との間に流体連通チャンネルを形成することにより圧力リリーフを提供することを可能にする。アパーチャ２２２２内にダイヤフラム２２１８を保持するためプラグ２２２４が設けられるのが好ましい。プラグ２２２４は、好ましくは、略中央アパーチャ２２６を有するリング２２２５から形成され、例えば緊密な適合等の任意の従来手段により、アパーチャ２２２２により形成された第２のエンクロージャ要素２２０２の内側表面に取り付けられている。
【０２３２】
Ｏリング２２２８は、リング２２１４と、第２のエンクロージャ要素２２０２の内部表面２２３０との間に配置されているのが好ましい。Ｏリング２２２８は、エンクロージャ要素２２００及び２２０２が緊密なねじ込み係合であるとき、要素２２００及び２２０２のねじ込み係合が密封係合であるべき必要性を無くすように作用する。
【０２３３】
第２のエンクロージャ要素２２０２には、走査型電子顕微鏡の標本ステージの適切な凹部（図示せず）に着座するように配列された、貫通ボア２２３３を有する略中央スタブ２２３２が形成されるのが好ましい。
【０２３４】
エンクロージャ要素２２００及び２２０２は、容器を、適切な多重容器ホルダー内に容易に着座させることを可能にし、更にユーザーがエンクロージャ要素２２００及び２２０２をねじ込み開閉することを援助するため、径方向に延在する夫々の位置決め保持突起部２２３４及び２２３５が設けられるのが好ましい。好ましくは、各々のエンクロージャ要素２２００及び２２０２上の突起部２２３４及び２２３５の相対的な方位角方向の配置は、図７１Ａ及び図７１Ｂに示されるように、これら突起部間の相対的な方位角方向の整列が、要素間のねじ込み閉鎖の所望の度合いを指し示すようになっているのが好ましい。
【０２３５】
ＳＥＭ検査の間に電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０に面していないサンプル側から、液体サンプルエンクロージャ２２１６内のサンプルからの光を受け取るように、光案内部２２３６が設けられている。
【０２３６】
光案内部２２３６は、切頭錐体先端部２２３８を備えたシリンダーから形成され、スタブ２２３２のボア２２３３内に挿入される。光案内部２２３６は、好ましくは、アメリカ合衆国、ＣＴ、ポムフレットの１２ファイバーＲｄのファイバーオプティックステクノロジー社から市販されている、数値アパーチャ０．６６の、プラスチック若しくはガラス製のクラッドを用いた光案内部であり、接着剤等の任意の従来手段により、エンクロージャ２２０２に密封されている。
【０２３７】
錐体先端部２２３８の壁は所定角度をなして構成され、該所定角度は、サンプルから放射された入射光子が光案内部２２３６内で反射されることを確実にするように、臨界反射角より小さくされている。
【０２３８】
ここで、図６８Ａ乃至図７２ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である、図７３Ａ、７３Ｂ及び７３Ｃを参照する。図７３Ａは、エンクロージャ要素２２００及び２２０２をねじ込み閉鎖する前に、図６８Ｂに示された配位で配列されている、液体サンプル２２３９を蓄えた図６８Ａ乃至図７２Ｂの容器を示している。なお、液体サンプルは、表面張力に起因して、液体サンプルエンクロージャ２２１６からは流れ出ない。電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０が、図７３Ａにおいて、略平坦であるように示されている。
【０２３９】
図７３Ｂは、周囲からの液体サンプルエンクロージャ２２１６の密封を生成するエンクロージャ要素２２００及び２２０２の間の完全なねじ込み係合に続く中間状態にある、図７３Ａの容器を示している。ダイヤフラム２２１８が、この態様におけるその密封の結果生じた液体サンプルエンクロージャ２２１６の圧力形成に起因して、外方にしなっていることが見て取れる。本実施例では、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０及びその支持格子２２１２も、この態様におけるその密封の結果生じた液体サンプルエンクロージャ２２１６の圧力形成に起因して、外方にしなっているが、ダイヤフラム２２１８の作用に起因して、図６３Ｂの実施例のときよりも、かなりより小さい程度にしか、しなっていない。これは、図７３Ｂと図６３Ｂとを比較することにより、理解することができる。
【０２４０】
図７３Ｃは、典型的には、１０−２〜１０−６ミリバールの真空でＳＥＭの脱ガス環境に配置されたときの図７３Ｂの容器を示している。この環境では、
ダイヤフラム２２１８が、図７３Ｂの周囲環境のときよりもより大きい度合いで外方にしなり、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０と支持格子２２１２とが、図７３Ｂの周囲環境に配置されたときよりも、より大きい度合いで外方にしなっているが、ダイヤフラム２２１８の作用に起因して、図６３Ｃの実施例のときよりも、かなり小さい度合いでしかしなっていないことが見て取れる。これは、図７３Ｃと図６３Ｃとを比較することにより、理解することができる。
【０２４１】
なお、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０は、図７３Ｂの周囲環境で生じたものよりも大きい度合いで格子２２１２の隙間を通って隙間内に入り込もうとしているが、ダイヤフラム２２１８の作用に起因して、図６３Ｃの実施例のときよりもかなり小さい度合いでしかしなっていないことが理解できる。これは、図７３Ｃと図６３Ｃとを比較することにより、理解することができる。
【０２４２】
ここで、図６８Ａ乃至図７３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、細胞成長、液体除去、液体追加、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である、図７４Ａ、７４Ｂ、７４Ｃ、７４Ｄ及び７４Ｅを参照する。図６４Ａと同一で、典型的な細胞の培養状況を示す、図７４Ａを参照すると、サブアッセンブリ２２０８を内部に配置させたエンクロージャ要素２２００が、図６８Ａに示される配位にあり、液体媒体２２４２中の細胞２２４０が、液体サンプルエンクロージャ２２１６内に配置され、細胞２２４０が、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０に接触して横たわっていることが示されている。
【０２４３】
図６４Ｂと同一の図７４Ｂは、典型的には吸引により、液体サンプルエンクロージャ２２１６からの液体の除去を示し、図６４Ｃと同一の図７４Ｃは、液体サンプルエンクロージャ２２１６への液体の追加を示している。液体の除去及び追加を多数回に亘って液体サンプルエンクロージャ２２１６内のサンプルに関して実行してもよい。好ましくは、液体除去及び追加のため用いられる装置は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０の意図しない破裂を防止するように、設計され、備え付けられるのがよい。
【０２４４】
図７４Ｄは、図７４Ｃに示される細胞２２４０を液体媒体２２４２内に含む容器の閉鎖状態を示している。光案内先端部２２３８が液体サンプルの液体媒体２２４２内に浸漬されている状態で示されている。図７４Ｅは、ＳＥＭ２２４６のステージ２２４４上に挿入される閉鎖容器を図６８Ｂの配位で示している。容器の配位が図７４Ｅに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【０２４５】
図７４Ａ乃至図７４Ｄは、液体サンプルエンクロージャ２２１６に関する液体の追加又は除去に拘わらず、サンプルを含む液体の少なくとも一部分が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０と接触したままとなる状況を例示している。この状況は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０に、サンプルの一部が吸収され、そうでなければ、接着される状況を含んでいてもよい。サンプルを含む液体の例は、細胞、培養菌、血液、バクテリア及び無細胞材料を含んでいてもよい。
【０２４６】
図６８Ａ乃至図７３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２１１０と接触したサンプル含有液体、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である、図７５Ａ、７５Ｂ及び７５Ｃを参照する。図７５Ａ乃至図７５Ｃは、サンプルを含む液体２２６０の少なくとも一部分が電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０と接触しているが、それに接着されていない状況を例示している。サンプルを含む液体の例には、例えば、ミルク、化粧用クリーム、ペイント、インク、及び、液体形態の薬剤等、様々な乳濁液及び懸濁液がある。図７５及び図７５Ｂで、サブアッセンブリ２２０８を内部に配置させた、エンクロージャ要素２２００は、図６８Ａに示される配位にあることが見て取れよう。図７５Ａは図６５Ａと同一である。
【０２４７】
図７５Ｂは、サンプル２２６０を含む容器の閉鎖状態を示している。図７５Ｃは、ＳＥＭ２２４６のステージ２２４４上に挿入された、図６８Ｂの配位にある、閉鎖容器を示している。容器の配位が図７５Ｃに示されたものとは反対であるＳＥＭが存在することが認められよう。
【０２４８】
ここで、図６８Ａ乃至図７３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルの光検出を用いたＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である、図７６を参照する。図７６に示されるように、参照番号２２７０により指し示された容器は、ＳＥＭ２２４６のステージ２２４４上で凹部２２７１に配置された状態で示されている。ステージ２２４４は、ＳＥＭ検査の間、サンプル２２７４を含む液体内の関心のある領域を検査するため、電子ビーム２２７２の下方に容器２２７０を配置することを可能にするように、回転動作する。
【０２４９】
ＳＥＭにより発生された電子ビーム２２７２は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０を通過し、容器２２７０内のサンプル２２７４を含む液体に照射される。サンプル２２７４からの後方散乱電子は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０を通過し、ＳＥＭの一部を形成する検出器２２７６により検出される。例えば２次電子検出器２２７８等の１つ以上の追加の検出器を設けてもよい。電子ビーム励起に起因してサンプル２２７４により放射されるＸ線放射を検出するためのＸ線検出器（図示せず）を設けてもよい。
【０２５０】
電子ビーム励起に起因して液体サンプル２２７４から放射される光子２２８０は、図６８Ａ乃至図７３Ｃの光案内部２２２６と同じである、参照番号２２８４により指し示された第１の光案内部を通って、第２の光案内部２２８６へと伝達される。第２の光案内部２２８６は、光子２２８０を、例えば光増幅管（ＰＭＴ）２１８８等の光検出器へと伝達するように作動する。この光増倍管には、日本国、静岡県、浜松市砂山町３２５−６の浜松フォトニクスで市販されているカタログ番号Ｈ６１８０−０１等がある。光検出器２２８８から得られた光強度の時間依存測定は、走査電子ビームの位置に関する情報と組み合わされ、当該技術分野で知られた方法によりサンプル２２７４の画像を生成するように、好ましくは、コンピュータ２２８９上のデジタル画像として、結合される。
【０２５１】
好ましくは、第２の光案内部２２８６は、屈折に起因した光案内部２２８４及び２２８６の間の通路内の光子の損失を最小にし、２つの光案内部の相対的整列をずらすように、第１の光案内部２２８４の断面領域の直径よりも大きい直径を備えた断面領域を有する。
【０２５２】
図示の実施例では、第２の光案内部２２８６は、好ましくはＬ字形状湾曲部内に形成されるのが好ましく、第２の光案内部２２８６の長さを通して光子２２８０の内部反射を確実にする角度でＬ字形状の光案内部２２８６に沿って配置された、多数の光ファイバーを備えるのが好ましい。
【０２５３】
本発明では、光子２２８０は、第１の光案内部２２８４から、第２の光案内部２２８６を介して、ＳＥＭ２２４６の床部の下方に配置された光検出器まで垂直下方に伝達され得ることが認められよう。代替例として、光子２２８０は、第１の光案内部２２８４から光検出器まで伝達されてもよく、第２の光案内部２２８６を省略してもよい。
【０２５４】
本発明の別の実施例では、光子２２８０は、フィルター、回折格子又はプリズム（図示せず）等の従来手段により、光検出器２２８８による検出前に、スペクトル分析されてもよい。これは、１つ以上の特定の範囲内にある波長の光子の検出を可能にし、サンプル２２７４の組成及び構造又はサンプル２２７４内部の特徴に関する追加の情報をもたらす。
【０２５５】
加えて、例えば、光案内部２２８４及び２２８６の屈折率に類似した屈折率のオイル若しくはゲル（図示せず）等の液体は、光子２２８０が光案内部２２８４及び２２８６の外部に散乱することを防止するため、光案内部２２８４及び２２８６の間に配置されてもよい。
【０２５６】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る容器２２７０内のサンプル２２７４との電子ビーム相互作用の詳細を概略的に示す図７７を追加的に参照する。なお、本発明は、図７７に示されるように、それらの平均的な原子番号により、又は、電子の励起に起因したそれらの平均的な発光収量により、互いから区別される特徴群の高いコントラストの画像形成を可能にしている。図７７では、比較的高い平均原子番号を有する、細胞核２２９０は、周囲の核質２２９２よりも電子をより大きく後方散乱させることが示されている。
【０２５７】
光子２２８０は、図示のように、細胞核２２９０から放射され、光案内部２２８４を介して、光検出器２２８８（図７６に示される）へと伝達される。なお、後方散乱電子の検出器により得られたコントラスト、及び、光子検出により得られたコントラストは、異なる物理的プロセスに起因し、サンプル内部の特徴の化学的特性に起因しており、従って、一般には重なり合わない。
【０２５８】
なお、本発明の好ましい実施例によれば、約２ミクロンまでの深さのサンプル内部の画像形成は、図７７に示されるように、５０ＫｅＶより低いエネルギーレベルを有する電子に対して達成可能であり、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２２１０より下方に位置する細胞核２２９０が画像形成される。
【０２５９】
図２１Ａ乃至図２２Ｂで上記示された顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーが、図５８Ａ乃至図７７に示された型式のＳＥＭ互換性サンプル容器で使用するため設けられてもよいことが認められよう。加えて、顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーは、図２３Ａ、２３Ｂ及び２３Ｃで上記のように示された吸引装置及びピペットと連係されてもよい。
【０２６０】
ここで、図５８Ａ乃至図６７で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図７８Ａ、７８Ｂ及び７８Ｃを参照する。図７８Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部２４００と、密封カバー２４０４とを備えるのが好ましい。ベース部２４００は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、皿部支持収容部２４０６の列を形成する。各々の皿部支持収容部２４０６は、アパーチャ２４０８により形成されるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。各アパーチャ２４０８に隣接して、サンプル皿部２４２５の突起部２４２４を収容するように配列された、一対の互いに整列した対の直立相互間隔突起部２４１０が形成されるのが好ましい。サンプル皿部２４２５は、図６０Ａ乃至図６２Ｂに示されたサンプル皿部２１０９と略同一であってもよいが、ねじ込み式機構又は他の取り付け機構を必要としない。
【０２６１】
ベース部２４００は、顕微鏡検査用の多重サンプルホルダーの内部で所望レベルの湿度を維持するため使用される液体を保持するようになった、複数の液体リザーバー２４１２を形成するのが好ましい。
【０２６２】
密封カバー２４０４は、サンプル皿部２４２５の各々と個々に密封係合するように配列されている。好ましくは、密封カバー２４０４は、その下側に、図７８Ｃに示されたＯリング２４２６の列が提供される。Ｏリング２４２６は、密封カバー２４０４が、適所に、好ましくはベース部２４００との取り外し可能なスナップ式の係合で配置されたとき、サンプル皿部２４２５の各々の頂部リム表面と密封係合するように、そこに密封され配列されている。
【０２６３】
密封カバー２４０４は、光検出の間に、サンプル皿部２４２５内のサンプルから光を受け取るように配列された光案内部２４３０の列が設けられているのが好ましい。光案内部２４３０は、密封カバー２４０４上に形成されたアパーチャ２４３２内に挿入される。
【０２６４】
図７８Ｂは、１つのサンプル皿部２４２５がベース部２４００の皿支持収容部２４０６に配置された状態の図７８Ａの装置を示している。図７８Ｃは、ベース部２４００とスナップ式に係合する密封カバー２４０４を示している。密封カバー２４０４は、これにより、Ｏリング２４２６と、周囲を取り囲む密封カバー２４０４の一部分とを用いてサンプル皿部２４２５の各々の個々の密封を提供する。
【０２６５】
ここで、図６８Ａ乃至図７７で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図７９Ａ、図７９Ｂ及び図７９Ｃを参照する。図７９Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部２４５０と、密封カバー２４５４とを備えるのが好ましい。ベース部２４５０は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、皿支持収容部２４５６の列を形成する。各々の皿支持収容部２４５６は、アパーチャ２４５８により形成されるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。各アパーチャ２４５８に隣接して、サンプル皿部２４７５の突起部２４７４を収容するように配列された、一対の互いに整列した対の直立相互間隔突起部２４６０が形成されるのが好ましい。サンプル皿部２４７５は、図７０Ａ乃至図７２Ｂに示されたサンプル皿部２２０９と略同一であってもよいが、ねじ込み式機構又は他の取り付け機構を必要としない。
【０２６６】
ベース部２４５０は、顕微鏡検査用の多重サンプルホルダーの内部で所望レベルの湿度を維持するため使用される液体を保持するようになった、複数の液体リザーバー２４６２を形成してもよい。
【０２６７】
密封カバー２４５４は、サンプル皿部２４７５の各々と個々に密封係合するように配列されている。好ましくは、密封カバー２４５４は、その下側に、図７８Ｃに示されたＯリング２４７６の列が提供される。Ｏリング２４７６は、密封カバー２４５４が、適所に、好ましくはベース部２４５０との取り外し可能なスナップ式の係合で配置されたとき、サンプル皿部２４７５の各々の頂部リム表面と密封係合するように、そこに密封され配列されている。
【０２６８】
密封カバー２４５４には、図６８Ａ乃至図７７を参照して上述されたダイヤフラム２２１８と同一であり得る、図７９Ｃに示された、ダイヤフラム２４７７の列が設けられている。個々のダイヤフラム２４７７は、密封カバー２４５４内に形成されたアパーチャ２４７９に亘って取り付けられたリング２４７８に着座されている。
【０２６９】
好ましくは、密封カバー２４５４は、光検出の間に、サンプル皿部２４７５のサンプルから光を受け取るように配列された光案内部２４８０の列が設けられているのが好ましい。光案内部２４８０は、密封カバー２４５４上に形成されたアパーチャ２４８２内に挿入される。個々の光案内部２４８０は、ＳＥＭ検査の間に、サンプル皿部２４７５内のサンプルから光を収集するため設けられている。
【０２７０】
図７９Ｂは、１つのサンプル皿部２４７５がベース部２４５０の皿支持収容部２４５６に配置された状態の図７９Ａの装置を示している。図７９Ｃは、ベース部２４５０とスナップ式に係合する密封カバー２４５４を示している。密封カバー２４５４は、これにより、Ｏリング２４７６を用いてサンプル皿部２４２５の各々の個々の密封を提供する。
【０２７１】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図８０Ａ及び図８０Ｂを参照する。図８０Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部２５００と、密封カバー２５０４とを備えるのが好ましい。ベース部２５００は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、サンプル容器２５０６の列を形成する。各々のサンプル容器２５０６は、アパーチャ２５０８を備えるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。図８０Ｂに示される電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２５１０が各アパーチャ２５０８を覆って密封する。膜２５１０は、図５８Ａ乃至図６７を参照して上述された膜２１１０と同一であるのが好ましい。密封カバー２５０４は、サンプル容器２５０６の各々と個々に密封係合するように配列されている。
【０２７２】
密封カバー２５０４は、光検出の間に、サンプル皿部２４２５内のサンプルから光を受け取るように配列された光案内部２５１４の列が設けられているのが好ましい。個々の光案内部２５１４は、密封カバー２５０４上に形成されたアパーチャ２５１６内に挿入される。
【０２７３】
図８０Ｂは、図８０Ａの装置が密封係合した状態を示している。この密封係合により、サンプル容器２５０６の各々の個々の密封が提供される。
ここで、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である、図８１Ａ及び図８１Ｂを参照する。図８１Ａに示されるように、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーは、ベース部２５５０と、密封カバー２５５４とを備えるのが好ましい。ベース部２５５０は、好ましくは、プラスチック材料から射出成形され、サンプル容器２５５６の列を形成する。各々のサンプル容器２５５６は、アパーチャ２５５８を備えるのが好ましい。該アパーチャを通してＳＥＭ顕微鏡の検査を実行することができる。
【０２７４】
図８１Ｂに示された電子ビーム透過性で流体不透過性の膜２５６０が各アパーチャ２５５８を覆って密封する。膜２５６０は、図６８Ａ乃至図７７を参照して上述された膜２２１０と同一であるのが好ましい。
【０２７５】
好ましくは、密封カバー２５５４には、図６８Ａ乃至図７７を参照して上述されたダイヤフラム２２１８と同一であってもよい、図８１Ｂに示されたダイヤフラム２５６１の列が設けられている。個々のダイヤフラム２５６１は、密封カバー２５５４に形成されたアパーチャ２５６３を覆って取り付けられたリング２５６２内に着座されている。
【０２７６】
密封カバー２５５４は、光検出の間に、サンプル容器２５５６内のサンプルから光を受け取るように配列された光案内部２５６４の列が設けられているのが好ましい。個々の光案内部２５６４は、密封カバー２５５４上に形成されたアパーチャ２５６６内に挿入される。
【０２７７】
図８１Ｂは、図８１Ａの装置が密封係合した状態を示している。この密封係合により、サンプル容器２５５６の各々の個々の密封が提供される。
ここで、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である、図８２を参照する。図８２に示されるように、複数の顕微鏡検査前の多重サンプルホルダー２６００は、各々が図５８Ａ乃至図７７に示された型式の多数のＳＥＭ互換性サンプル容器２６０２を含み、細菌培養器２６０４内に配置された状態で示されている。好ましくは、関心のあるサンプルを同定するため、参照番号２６０６で示されるように、容器２６０２がホルダー２６００内に取り付けられた状態で、容器２６０２内のサンプルの光学顕微鏡検査が実行される。好ましくは、倒立光学顕微鏡２６０８がこの目的のため用いられる。
【０２７８】
好ましくは、図示のような例えばロボットアーム等の自動位置決めシステムが、システムを通して、顕微鏡検査前多重サンプルホルダー２６００及び容器２６０２を搬送するため使用される。１つ以上のステージで手動介入操作が適宜用いられてもよいことが認められよう。
【０２７９】
その後、個々の容器２６０２は、ホルダー２６００から取り外され、取り外し可能な電子顕微鏡標本ステージ２６１０に配置され、次に、走査型電子顕微鏡２６１２内に導入される。
【０２８０】
ＳＥＭ検査から結果的に得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ２６１４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０２８１】
容器２６０２内のサンプルの光検査が、容器２６０２がＳＥＭ２６１２内に配置された状態で実行される。好ましくは、光案内部２６２０が、容器２６０２内に挿入された光案内部（図示せず）からの光を受け取り、該光を例えばＰＭＴ２６２２等の光検出器へと送り出すため用いられる。
【０２８２】
光検査から結果的に得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ２６２４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０２８３】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である、図８３を参照する。図８３に示されるように、複数の顕微鏡検査用の多重サンプルホルダー２６５０は、各々が図７８Ａ乃至図７９Ｃに示された型式のうちいずれかのＳＥＭ互換性サンプル皿部２６５２を含み、細菌培養器２６５４内に配置された状態で示されている。好ましくは、関心のあるサンプルを同定するため、参照番号２６５６で示されるように、サンプル皿部がホルダー２６５０内に取り付けられた状態で、サンプル皿部２６５２内のサンプルの光学顕微鏡検査が実行される。好ましくは、倒立光学顕微鏡２６５８がこの目的のため用いられる。
【０２８４】
好ましくは、図示のような例えばロボットアーム等の自動位置決めシステムが、システムを通して、サンプル皿部２６５２を備えた顕微鏡検査用多重サンプルホルダー２６５０を搬送するため使用される。１つ以上のステージで手動介入操作が適宜用いられてもよいことが認められよう。
【０２８５】
その後、ホルダー２６５０は、電子顕微鏡標本ステージ２６６０上に配置され、次に、走査型電子顕微鏡２６６２内に導入される。
その結果得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ２６６４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０２８６】
好ましくは、サンプル皿部２６５２内のサンプルの光検査が、サンプル皿部２６５２がＳＥＭ２６６２内に配置された状態で実行される。好ましくは、光案内部２６６６が、サンプル皿部２６５２内に挿入された光案内部（図示せず）からの光を受け取り、該光を例えばＰＭＴ２６６８等の光検出器へと送り出すため用いられる。
【０２８７】
光検査から結果的に得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ２６６９で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０２８８】
ここで、本発明の更に別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である、図８４を参照する。図８４に示されるように、複数の顕微鏡検査用の多重サンプルホルダー２６７０は、各々が図８０Ａ乃至図８１Ｂのいずれかに示された多数のＳＥＭ互換性サンプル容器２６７２を形成し、細菌培養器２６７４内に配置された状態で示されている。好ましくは、関心のあるサンプルを同定するため、参照番号２６７６で示されるように、サンプル容器２６７２内のサンプルの光学顕微鏡検査がホルダーの位置で実行される。好ましくは、倒立光学顕微鏡２６７８がこの目的のため用いられる。
【０２８９】
好ましくは、図示のような例えばロボットアーム等の自動位置決めシステムが、システムを通して、顕微鏡検査用多重サンプルホルダー２６７０を搬送するため使用される。１つ以上のステージで手動介入操作が適宜用いられてもよいことが認められよう。
【０２９０】
その後、ホルダー２６７０は、電子顕微鏡標本ステージ２６８０上に配置され、次に、走査型電子顕微鏡２６８２内に導入される。その結果得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ２６８４で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０２９１】
好ましくは、容器２６７２内のサンプルの光検査が、容器２６７２がＳＥＭ２６８２内に配置された状態で実行される。好ましくは、光案内部２６８６が、容器２６７２内に挿入された光案内部（図示せず）からの光を受け取り、該光を例えばＰＭＴ２６８８等の光検出器へと送り出すため用いられる。
【０２９２】
光検査から結果的に得られた画像は、オペレータにより視覚的に検査され、及び／又は、典型的にはコンピュータ２６８９で具現化される従来の画像分析機能により分析される。
【０２９３】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、サンプルＳＥＭ検査の簡略部分図の部分断面図である、図８５を参照する。図８５に示されるように、サンプル３００２を蓄えたサンプル容器３０００は、電子銃アッセンブリ３０１０のルーフ３００６内に形成された略中央アパーチャ３００４に着座され、ＳＥＭ検査の間、サンプル３００２上に合焦した電子銃３０１２の突き当たりを可能にするように、配置され、サイズが定められている。
【０２９４】
容器３０００は、ルーフ３００６の内側表面３０１６に配置されたＯリング３０１４を覆って着座している。容器３０００は、サンプル容器３０００の周辺リング３０２２の下側に接着された、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜３０２０を備える。サンプル３００２は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜３０２０に亘って存在する。
【０２９５】
ＳＥＭ検査アッセンブリの一部分である、電子銃アッセンブリ３０１０には、電子ビーム３０１２を略上方向に極部品３０２４を通して放射するように作動する電子銃（図示せず）が設けられている。
【０２９６】
電子銃により発生された電子ビーム３０１２は、経路３０２６に沿って移動するように示されている。電子ビーム３０１２は、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜３０２０を介して通過し、サンプル容器３０００内のサンプル３００２に突き当たる。電子がサンプル３００２から後方散乱され、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜３０２０を通過して戻り、電子銃アッセンブリ３０１０内で、後方散乱電子の検出器３０３０により検出されるのが好ましい。
【０２９７】
電子ビーム３０２０は、サンプル３００２にその下側で突き当たり、これにより、電子ビーム透過性で流体不透過性の膜３０２０に接触して存在するサンプル領域を検査するというのが本発明の特別の特徴である。
【０２９８】
電子銃アッセンブリ３０１０は、電子銃アッセンブリ内部体積部３０３２を形成する。内部体積部３０３２は、ＳＥＭ検査の間に、典型的には１０−２〜１０−６ミリバールの真空に、内部体積部３０３２内で、脱ガス環境を維持するように、電子銃アッセンブリ３０１０及び容器３０００の壁により密封されている。
【０２９９】
電子銃アッセンブリ３０１０は、安全バルブシステムの内部体積部３０４０を形成する、空気ロック部３０４０と、頂部壁３０４２と、を備える安全バルブシステムを有する。容器３０００の除去前に、空気ロック部３０４０は、容器除去の間に、典型的には１０−２〜１０−６ミリバールの真空に、内部体積部３０４４内で脱ガス環境を維持するように、固定化される。空気ロック部３０４０がロックされた後、ガス、典型的には窒素は、電子銃アッセンブリ３０１０の内部体積部３０３２へと入口管３０４６を介して導入される。容器３０００は、除去され、好ましくは、置換される。代替例として、別の容器３０００は、サンプル皿部アッセンブリ３０１０内に配置されてもよい。容器３０００又は別の容器が電子銃アッセンブリ３０１０内に導入された後、ガスは、ポンプ（図示せず）により、典型的には出口管３０４８を介して流出され、空気ロック部３０４０が解除される。
【０３００】
空気ロック部３０４０は、サンプル容器３０００又はアパーチャ３００４を通過し又は電子ビーム透過性で流体不透過性の膜３０２０の傷を通過する漏れに起因して周囲から電子銃アッセンブリ３０１０に入り込むことができる流体から、内部体積部３０４４を急激に断絶させるように作動する。
【０３０１】
本発明の別の好ましい実施例によれば、電子銃アッセンブリ３０１０は、サンプル容器３０００のための調整可能なシートを備えている。調整可能なシートは、サンプル３００２内部の様々な領域の高倍率画像形成を可能にする。
【０３０２】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動する、組織サンプル切り取りアッセンブリの簡略部分図の部分断面図である、図８６Ａ乃至図８７Ｂを参照する。図８６Ａに示されるように、複数の積み重ね式取り外し可能な矩形形状の厚板３０５０がステージ３０５２上に取り付けられている。略中央アパーチャ３０５６が、個々のスラブ３０５０の各々に形成され、凹部３０５８の一部を形成する。好ましくは、従来の切り取り器具３０６０、例えば剃刀ブレード３０６２が、設けられ、凹部３０５８に着座された組織サンプル３０６４を切り取るように作動する。組織サンプル３０６４が、スラブ３０５０のスタックの頂部を超えて延在するように図８６Ａに示されている。
【０３０３】
図８６Ｂは、頂部スラブ３０６６を始めとして、組織サンプルの厚さＸ１を提供する、複数のスラブ３０５０を示している。切り取り器具３０６０は、組織サンプル３０６４を２つの部分、即ち、頂部３０６８及び底部３０７０へと切り取り、生じた底部３０７０は、厚さＸ１を有する。
【０３０４】
図８７Ａは、厚さＸ２の組織サンプル厚さを提供する、複数のスラブ３０７０を備える、図８６Ａの組織サンプル切り取りアッセンブリを示し、ここで、Ｘ２＜図８６Ａ及び図８６ＢのＸ１である。図８７Ａに示されるように、切り取り器具３０６０は、組織サンプル３０６４を２つの部分、即ち、頂部３０７４及び底部３０７６へと切り取り、生じた底部３０７６は、厚さＸ２を有する。
【０３０５】
本発明は、走査型電子顕微鏡内のサンプルを、大気圧近傍で、任意の所望の温度、好ましくは、０℃〜５０℃の範囲の温度で、湿った状態に維持しつつ、該湿ったサンプルを画像形成する方法を提供する。これは、ＳＥＭの脱ガス環境からサンプルを密封する。ＳＥＭ互換性サンプル容器にサンプルを配置することにより達成される。当該サンプルは、該サンプル又はその一部分が、電子透過性の仕切り膜と、好ましくは、５ミクロンよりも小さい距離で近接した状態に、配置されるように、ＳＥＭ互換性サンプル容器内に配置されている。ＳＥＭ内のサンプルの検査は、ＳＥＭ内にサンプルを含むＳＥＭ互換接着サンプル容器を配置し、電子透過性仕切り膜を通してサンプルに走査電子ビームを差し向けることにより実行される。
【０３０６】
本発明の好ましい実施例によれば、ＳＥＭ検査法は、例えば、培養細胞、組織切片又は断片、臓器切片、生体検査材料、液体懸濁液内の細胞、細針吸引物、呼吸器系又は消化器系の洗浄物等、幅広い生物学的材料に対して提供される。更に加えて、生体流体、例えば、尿、脳脊髄液、ミルク、唾液、血漿、粘液、侵入型流体、精液も本発明の方法を使用して検査してもよい。また、本発明に含まれるものは、例えば、排泄物、嘔吐物、土壌サンプル、植物脂肪、植物組織及び、例えば、バクテリア、菌類、藻類、マイコプラズマ、及びウィルス等の生物スラリーのＳＥＭ検査である。上記掲げられた材料は、本発明の方法を使用して検査されてもよい生物学的材料だけを表していることが認められよう。検査されるべき材料は、均一なサンプル、又は、オプションで幾つかの異なる種類の生物学的材料の異種混合物のいずれかであってもよい。オプションで、非生物学的材料も含まれてもよい。
【０３０７】
本発明の別の好ましい実施例によれば、細胞は、細胞培養条件の下で、画像形成前に、ＳＥＭ互換性サンプル容器若しくはそのサブアッセンブリ内で維持される。この細胞培養条件には、例えば、バクテリアに対しては３７℃のＬＢ媒体等の成長媒体内に浸漬させた条件、又は、動物細胞に対しては、５％ＣＯ２を含む加湿大気中で１０％の牛胎児血清が添加された３７℃のダルベッコ改変エッセンシャル培地（ＤＭＥＭ）内に浸漬させた条件がある。本実施例では、ＳＥＭ互換性サンプル容器又はサブアッセンブリは、細胞の成長及び／又は操作のため、例えばペトリ皿、細胞培養皿、細胞培養フラスコ、及び／又は、多重井戸プレート等の従来容器に類似した実験容器として機能する。更には、細胞を含むサンプル及び他のサンプルは、実験若しくは分析の対象に応じて、サンプル容器若しくはサブアッセンブリ内に置かれている間に、ミトゲン、薬剤、ホルモン、サイトカイン、抗生物質、有毒材料、ウィルス、バクテリア、生体染色若しくは他の染色溶液の添加、異種細胞の混合（共同培養）、ＤＮＡの細胞へのトランスフェクション、超音波、Ｘ線又はγ線等の放射、例えば血清が無い媒体等の他の媒体での成長媒体の置換等を始めとした様々な処置を受け得るが、これらの例に限定されるものではない。
【０３０８】
本発明の更に別の好ましい実施例によれば、例えば、化粧用クリーム、粘土、使用済み機械若しくはモーターのオイル、処理済み食品製造物、及び、薬剤処方物等の、非生物サンプル及び生物学的材料から直接生み出すことができないサンプルのＳＥＭ視覚化のための方法が提供される。
【０３０９】
本発明の別の好ましい実施例によれば、固定化されていないサンプルの画像形成のための方法が、提供される。これらのサンプルとして、ＳＥＭ互換性サンプル容器内で培養された動物若しくは人間の細胞、サンプル容器内に導入された、動物、人間、原生動物、菌類、植物若しくはバクテリアの細胞、サンプル容器内に導入された、動物、人間若しくは植物組織の切片又は他の液体サンプルが掲げられるが、これらの例に限定されるものではない。顕微鏡においては、観察までに経過した時間の間及び準備工程の間にサンプルの構造的完全さ又はサンプル内部の特徴を保存するため、サンプル取得工程及び画像形成工程の間で透過化、脱水化、埋め込み、薄片化、染色等の固定化プロセスが用いられる。本発明の方法は、前述した準備工程のいずれも実行すること無くサンプルの画像形成を可能にする。
【０３１０】
本発明の別の好ましい実施例によれば、サンプルは、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等、又は、それらの混合物等のアルデヒドの添加、メタノールの添加、又は、４酸化オスミウムの添加等の従来の固定化方法を使用して画像形成前に準備することができる。
【０３１１】
本発明の更に別の好ましい実施例によれば、電子顕微鏡の重金属染色による特徴化無しにサンプルを視覚化するための方法が提供される。電子後方散乱の効率は、例えばサンプルを構成する様々な原子若しくはその化合物の原子番号又はＺ値に応じて変化する、走査されたサンプルの材料組成の関数である。例えば、異なる原子のＺ値の差異から生じる、電子後方散乱におけるこれらの定量的差異は、重金属の染色が無い場合でさえもコントラストを提供する。本発明の方法は、サンプルの分子組成を、あるとしても僅かにだけしかかき乱さないので、サンプルの組成は、平均的なＺ値において互いに異なる化合物の局所的濃度の差異に基づいて区別することができる。例えば、生体サンプルにおける細胞小器官を、それらの各々の組成、及び、脂質、燐酸、蛋白質及び塩類の濃度における差異に基づいて区別することができる。同様に、ミルク若しくは汚物のもののような複雑な混合物の組成も、それらの材料組成、例えば、それらのＺ値等の差異に基づいて、区別することができる。
【０３１２】
加えて、サンプルは、従来の非特異的及び／又は特異的な染色剤で染色されてもよい。例えば、典型的には高いＺ値を有する、ウラニルアセテート、４酸化オスミウム、鉄含有フェリシアン化カリウム、クエン酸鉛、及び、燐酸等の非特異的染色剤が、サンプルの特徴群に付着し、又は、他の仕方で同伴し、これによりサンプルの特徴群のコントラストを強化する。従来の特異的染色剤は、サンプルが従来の方法により染色剤に浸透可能にされる場合、サンプルの表面又はその内部に、特異的ターゲットとなる分子又は構造に選択的に結合し、又は他の仕方で接着する。特異的な染色剤は、ターゲットとなる分子又は構造に高い選択的な親和力を有する分子を含み、これにより、ターゲットの分子又は構造に結合し、又は他の仕方で同伴する。そのようなターゲットとなる分子の例は、抗体、リセプターリガンド、ホルモン、酵素、酵素基体、アビジン、ストレプトアビジン、レクチン、及び、核酸である。原子を提供する、少なくとも１つの高いＺ値のＥＭコントラスト成分が、高い選択的な親和性分子に、従来の方法により連結されてもよい。ターゲットとなる分子又は構造に結合されるか又は他の仕方で同伴されたとき、ターゲットとなる分子又は構造は、高い選択的な親和性分子に連結された少なくとも１つの高いＺ値の原子の存在によって、走査型電子顕微鏡内で画像形成されるときに同定される。本方法は、当該技術分野では、しばしば、直接標識形成と称される。
【０３１３】
加えて、原子を提供する少なくとも１つの高いＺ値のＥＭコントラスト成分は、高い選択的な親和性分子に連結される必要はないが、間接的な標識形成法により取り付けられてもよい。その代わりに、原子を提供する少なくとも１つのＥＭコントラスト成分は、第２の高い選択的な親和性分子に従来の方法により連結されてもよい。この第２の高い選択的な親和性分子は、その親和力が第１の高い選択的な親和性分子に向けられている。第１の高い選択的な親和性分子は、ターゲットとなる分子又は構造に結合されるか又は他の仕方で同伴されることを可能にされ、次に、原子を提供する少なくとも１つのＥＭコントラスト成分を備えた第２の高い選択的な親和性分子は、第１の高い選択的な親和性分子に連結され、これにより、ターゲットとなる分子又は構造を同定する。
【０３１４】
以上のような第１及び第２の高い選択的な親和性の分子の従来例には、２つの異なる有機体からの２つの異なる抗体があり、１つの有機体からの第１の抗体は、ターゲットとなる分子又は構造へと結合されることを可能にされ、第２の有機体からの、原子を提供する少なくとも１つのＥＭコントラスト成分に連結された、第２の抗体が、ターゲットとなる分子又は構造に結合された第１の抗体に結合することを可能にされる。本方法は、間接標識形成として知られている。本発明の趣旨における間接的な標識形成の主要な利点は、薬剤を提供する少なくとも１つのＥＭコントラスト成分に結合された第２の高い選択的な親和性試薬が、市販されており、そのような連結分子を改めて形成する必要性を無くすということである。
【０３１５】
別の従来例は、ビオチンの少なくとも１つの分子が、被ターゲット分子又は構造への高い選択的親和力で、従来の方法により抗体又は他の分子に連結され、原子を提供する少なくとも１つのＥＭコントラスト成分は、蛋白質アビジン又は蛋白質ストレプトアビジンのいずれかに連結される。ビオチンに連結される抗体は、ターゲットとなる分子又は構造に結合され、次に、原子を提供する少なくとも１つのＥＭコントラスト成分に連結された、蛋白質アビジン又は蛋白質ストレプトアビジンのいずれかに結合され、これにより、ビオチンに連結された分子により結合されたターゲット分子又は構造を同定することを可能にされている。
【０３１６】
追加の従来例は、第１の抗体が、そのターゲット分子又は構造に結合し、次に、原子を提供する少なくとも１つのＥＭコントラスト成分に連結された蛋白質Ａ又は蛋白質Ｇのいずれかが、第１の抗体に特異的に結合し、これによりターゲット分子又は構造を同定することを可能にされている。
【０３１７】
本発明の更に別の実施例によれば、細胞培養、細胞懸濁及び液体サンプルとは対照的に、厚い「固体」サンプルを画像形成するための方法が提供される。本実施例を参照すると、「固体」という用語は、硬質のコラーゲン基質、骨及び硬質植物組織、並びに、例えば胸腺組織若しくは膵臓組織等の柔らかい組織や、血の塊り、寒天ゲル等のゲル状材料を始めとして、ある範囲の軟度のものを指し示している。これらのサンプルには、既に説明した組織又は生体組織検査用の組織の部分、天然及び人工のゲル及び基質、アガローセ等の半固体媒体、多細胞アッセンブリ、又は、厚い固体基質の表面上に堆積された薄いサンプル等が含まれている。
【０３１８】
本実施例では、本方法は、仕切り膜との密接な接触を提供するための追加の工程を備えている。仕切り膜との適切な接触を維持するため、サンプルは、かなり滑らかな表面が形成されている。この表面は、例えば、組織サンプルの一部分である保護層ライニング等のサンプルの天然エッジであってもよく、又は、剃刀又は切り取り器具で組織部分を切断することにより、好ましくは、図８６Ａ乃至８７Ｂに表された装置及び方法により若しくはバイブラトーメ（Ｒ）等の機械器具を用いて別の好ましい実施例において、形成されてもよい。加えて、本実施例では、組織は、典型的には、例えば、位置決め装置、好ましくは図３１Ａ乃至図５０に示された装置により、仕切り膜に接触して押される必要がある。
【０３１９】
サンプルの準備及び画像形成は、後述されることを除き、その他の点で細胞のための準備及び画像形成と類似している。組織は、一切の処理、即ち、次の固定化、又は、次の染色／標識形成無しに画像形成されてもよい。固定化処置は、それが使用される場合には、固定剤を用いた血管局所潅流により実行されるか、又は、小さな組織断片を固定剤中に浸漬させることにより、実行される。染色及び標識形成は、細胞に対して後述されるものに類似した処理を使用してなされる。一つの重要な差異は、サンプル容器の仕切り膜に接着された細胞を含むサンプルが、容器内の流体を交換することにより処理されることができるのに対して、組織断片を含むサンプルは、サンプル容器への導入前に処理されるのが好ましいという点である。これらの処置は、実験結果の観点で、組織断片で使用するため僅かに修正される必要があり得ることは、当業者により認められよう。
【０３２０】
本発明の更に別の好ましい実施例によれば、サンプル及び／又は該サンプル上の特異的な構造を視覚化するための方法も提供される。後方散乱電子の検出に加えて、ＳＥＭは、電子ビーム走査の結果として生成される光を検出するため、図５８Ａ乃至図８４に示されるように光子検出器が設けられていてもよい。２つの有意な利点は、従来の配位とは異なる、図５８Ａ乃至図８４に開示された光子検出器の配位に伴っている。第１に、サンプルは、ＳＥＭの走査チャンバー内で真空から完全に孤立され、大気圧近傍圧力で湿った状態に維持することができる。第２には、光検出器に導く光案内手段は、サンプルの略同じ側面側に配置されている従来の陰極ルミネッセンス検出器とは異なり、後方散乱電子の検出器に対してサンプルの略反対側に配置されている。本発明では、２つの検出モードに対して使用される検出器は、同じ空間を競合せず、光及び後方散乱電子の両方の非常に効率的な好ましくは同時的な収集を可能にする。走査電子ビームは、サンプル内の分子を、直接的又は間接的に励起させ、特徴的な波長で可視光を放射させることができる。これは、陰極ルミネッセンス又はシンチレーションとして幅広く知られているプロセスである。放射光の強度及び／又はスペクトル特性は、サンプル中で自発発光している分子から導き出されたサンプル画像を構成するために使用される。サンプルを構成する様々な構成要素又は分子のＺ値における固有の差異を、後方散乱電子に基づく顕微鏡写真図を構成するため利用することができるので、サンプルを構成する様々な構成要素又は分子により放射された陰極ルミネッセンスの強度及び波長における固有の差異を、従来の方法により、サンプルの顕微鏡写真図を構成するために使用することができる。
【０３２１】
代替例として、当該技術分野で知られている、外因性の陰極ルミネッセンス標識を、陰極ルミネッセンス染色としてサンプルと接触させることができる。そのような陰極ルミネッセンス標識の例は、アメリカ合衆国、オレゴン州、ユジン、分子プローブ、カタログ番号Ｆ−８８１４等の「ＦＬＵＯＳＯＨＥＲＥＳ」であり、アメリカ合衆国、ＮＪ、ピスカタウェイ、アメルシャム生命科学のカタログ番号ＰＲＮＱ０００６等のシンチレーション近接分析（ＳＰＡ）ビーズであるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明の方法は、特異的な陰極ルミネッセンス染色を提供する。特異的な陰極ルミネッセンス染色は、上述された直接的又は間接的な標識形成技術に類似しており、原子を提供する少なくとも１つの高いＺチャンネルのＥＭコントラスト成分の代わりに、少なくとも１つの陰極ルミネッセンスの片割れが、当該技術分野で知られている方法により、直接又は間接的なターゲット分子に連結されている。ＳＥＭ画像は、陰極ルミネッセンスのみに基づいて導出されてもよく、又は、後方散乱電子に基づいて構成されたＳＥＭ画像と関連して導出されてもよい。本発明の別の実施例では、陰極ルミネッセンス検出システムは、走査されたサンプルから放射された光のスペクトル分解のための従来手段が備え付けられている。スペクトル分解のためのそのような手段の例には、フィルター、回折格子及びプリズムがあるが、これらに限定されるものではない。かくして、本実施例は、選択された波長の光の測定、又は、選択された範囲内にある波長の測定を提供し、例えば、サンプル中の異なる材料により放射された光を区別することを可能にし、特定材料又は材料のクラスを検出し、又は、信号の信号対ノイズ特性を改善する。
【０３２２】
本発明の更に別の好ましい実施例によれば、従来の方法に従って、サンプルからの更なる情報を、電子ビームとの相互作用の結果としてサンプルから放射されたＸ線の検出及びスペクトル分析によって得ることができる。そのような分析は、サンプル又は該サンプル内の領域の元素組成及び分布に関する、特異的及び定量的な情報を提供する。
【０３２３】
更には、任意の与えられたサンプルに対して、異なる染色及び標識形成法を、画像形成及び分析の必要性に応じて組み合わせてもよい。限定されない例として、後方散乱電子及び陰極ルミネッセンスを、同じサンプルの走査中に検出することができ、サンプルの同じ領域の２つの画像を生じさせることができる。別の例では、後方散乱電子の検出を、従来の方法を使用して、走査領域全体又はより小さい領域からのＸ線検出と組み合わせることができる。
【０３２４】
本発明の別の好ましい実施例によれば、サンプルの表面下数ミクロンのところのＳＥＭ画像形成のための方法が提供される。従来のＳＥＭでは、サンプルの表面トポロジーが、反射モードを使用して画像化され、走査電子ビームによりサンプルの表面から除去されて検出された２次電子からの画像を構成する。本発明は、主要検出モードとして、後方散乱電子の検出を使用し、そのような後方散乱電子は、サンプルの表面下、数ミクロンまで存在し得るサンプルの構成要素と走査電子ビームとの相互作用から生じる。画像は、検出された後方散乱電子から導出されるので、サンプルの実際の厚さは、本発明のサンプル容器の深さによってのみ、任意的に限定される。関心のある特徴群のコントラスト、即ちサンプルの表面上の特徴群及びサンプルの下方にある特徴郡の両方のコントラストは、非特異的染色又は特異的染色のいずれか１つ又は適切な組み合わせを用いることにより強化することができる。
【０３２５】
本発明のなお別の好ましい実施例によれば、サンプルの仮想連続的な薄片化のための方法が提供される。当該サンプルは、最初に低加速エネルギーの電子ビームで走査され、仕切り膜に最も近いサンプルの領域の画像を形成する。電子ビームの加速エネルギーを増加させることにより、該ビームが、僅かに増大した深さにまでサンプル内に貫通することが可能となり、その結果生じた後方散乱電子から当該深さにおけるサンプルの内部の画像を導出することができる。引き続く画像は、加速エネルギーを逐次的に増大させることにより類似の態様で得られ、これにより、電子ビームが、数ミクロンの深さにまでサンプル内により深く貫通していくとき、各深さレベルにおける画像を導出していく。加速エネルギー値は、約８ｋｅＶ及び約３０ｋｅＶの間の範囲に亘るのがこのましい。このようにして得られた一連の画像は、サンプル内の異なる深さに存在する特徴群を同定するように機能するか、又は、適切なアルゴリズムを使用して、そのような特徴群の３次元的分布を再構成するための生データとして機能することができる。
【０３２６】
本発明の更に別の好ましい実施例によれば、外科手術の時間フレーム内で急速な組織病理分析に適した方法が提供される。その分析及び結果が手術の持続及び進路を決定するため使用される、外科的病理分析は、現在のところ疾患組織の凍った薄片の光学顕微鏡検査に基づいて構築される。この技術は約３０分以内に達成することができるが、使用される天然凍結技術は、組織の構造にかなりの損傷を引き起こし、詳細な細部の損失をもたらす。本発明の方法は、固定化、染色、乾燥の工程無しに、大気圧の下で、要求された時間フレーム内で、疾患組織のより高い分解能のＳＥＭ検査を可能にし、これにより、サンプルの詳細な細部を保存する。更には、追加のより詳細な分析が要求される場合には、非特異的及び特異的な染色、並びに、より穏やかな固定化技術を用いることができる。
【０３２７】
別の好ましい実施例によれば、画像形成能力を提供する本発明の方法は、顕微鏡画像形成を使用する、研究、診断、医療、工業的又は調整的検査における任意のプロセスを置換し又は改善するため使用することができる。
【０３２８】
上述したように、従来の電子顕微鏡は、光学顕微鏡の分解能が不十分である、例えば腎臓病理学又は腫瘍学等、特殊ケースの小さい比率部分（３〜８％）を検査するため使用される。本発明の方法は、特に、一般的病理学及び外科的な病理学のためＳＥＭのより広範囲な使用を可能にする。更には、本発明の方法を、光学顕微鏡を現在使用する組織学又は細胞学的検査の代わりに、又は、それに加えて、使用することができる。本発明の方法により提供される利点は、速度、自然な状態により近い状態でのサンプルの保存、薄い薄片化の必要性を無くすこと、又は、新規な画像形成モードの他の特徴に関連する。これらの利点は、現在の方法が不十分である医療分野で特に重要となり得る。このような医療分野には、例えば、脳腫瘍及び一般的な神経病理学の正確なステージング、例えば甲状腺若しくは胸部組織の細針吸引等による疾患細胞標本の細胞学的検査、及び、血管サンプル等がある。
【０３２９】
本発明の方法は、以下に記載される選択された用途で使用するため特に適している。これらの例は、開示の目的のみのため使用され、これに限定することを意図したものではない。
【０３３０】
（肥満及び糖尿病：太った細胞、白色及び茶色の脂肪組織の脂質小滴）
従来のＴＥＭのためのサンプルの準備には、通常、例えばアルコール又は無色溶媒等の有機溶媒で置換することによる水の完全な除去工程を含んでいる。これらの溶媒は、脂質を分解し、サンプルから脂質を損失させる。脂質分子を架橋する４酸化オスミウムを用いた固定化は、例えば、脂質２分子膜等の薄い構造に脂質を保存するように作用する。しかし、例えば脂質小滴又は含脂肪細胞（太った細胞）の脂質成分等のより大きい脂質構造を用いた場合、オスミウムは、表面上の脂質と迅速に反応し、４酸化オスミウムに対して浸透性がより少ない「外皮」を形成し、かくして、脂質構造の内部が固定化されていない状態のままとなり、後に破壊されるか又は分解され得る。
【０３３１】
本発明の方法は、組織抽出及び脂質固定化のための必要性を回避することにより、生物学的サンプルにおける脂質リッチな成分を観察する独自の能力を提供する。この能力は、肥満及び糖尿病の医療分野で有用性を有する。肥満及びタイプＩＩの糖尿病のための処理は、本発明の方法を使用して直接評価することができる、次のパラメータのうち１つ以上における変化をもたらす。これらのパラメータとは、即ち、脂肪細胞（含脂肪細胞）における脂質の分布、含脂肪細胞の数及びサイズの測定、茶色脂肪組織（ＢＡＴ）及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）を始めとした解剖的及び新陳代謝的に異なる含脂肪細胞の間の区別、様々な解剖位置からの脂肪組織、若者対老人からの脂肪組織である。加えて、診断手段を用いて、人間、実験動物から生じた含脂肪細胞又は前含脂肪細胞において、又は、連続的な細胞ラインにおいて脂質分布を測定することができる。
【０３３２】
（腎臓、肝臓における脂肪質変化）
多数の組織タイプ、最も顕著には、肝臓、腎臓及び筋肉の病理学的状態は、細胞の内外における脂質小滴の急速な蓄積、所謂、脂肪質変化に関連する。脂肪質変化の臨床的な観察は、様々な腎臓病理学及び動脈疾患の、アルコール及び他の肝臓損傷因子に起因した組織損傷の早期のサインである。より稀ではあるが、有意には、脂肪過多変化は、梗塞、血液欠如、又は、退行性疾患に起因した心臓壁損傷も示唆している。脂肪質変化を監視することは、肝臓移植の間においても、手術の進路の判断や、様々な患者のための肝臓の適正を方向付ける上で有用となる。
【０３３３】
（腎臓病理学）
腎臓病理学は、電子顕微鏡が、臨床診断のため現在使用されている主要な分野の一つである。電子顕微鏡（ＥＭ）は、最小変化疾患、薄い基盤膜の腎臓疾患、遺伝性腎炎（アルポート症候群）、及び、繊維質糸球体腎炎を始めとした、多数の腎炎疾患の診断にとって必要である。ＥＭは、免疫複合体沈着の正確な位置決め、ループス腎炎及びＨＩＶ関連の腎臓病における管状網状含有物の同定も可能にする。本発明の方法は、腎臓サンプルの高解像度の画像形成のより迅速且つより容易な性能を可能にする。
【０３３４】
（毒物学）
毒物学研究は、動物又は人間において実行される。後者の場合には、倫理的に制御された研究又は不注意な接触の結果を調査研究するかのいずれかで実行される。毒物学的効果は、顕微鏡分析を使用してしばしば評価することができる。多数の毒物は、主要には、選択されたターゲット組織、肝臓、腎臓、肺及び消化器系に非常に高い頻度で影響を及ぼす。本発明の方法は、これらの及び他の組織から導出されたサンプルの感度の良い迅速な分析のための手段を提供する。そのような分析は、例えば、環境上の毒物、職業上の毒物及び栄養学的な毒物、並びに、薬剤の毒性副作用に対してテストするときの用途を持っている。本発明の別の好ましい実施例では、そのような分析は、Ｘ線検出を使用して実行される。該Ｘ線検出は、様々な要素の分布及び濃度に関する情報を与え、これは、肺又は肺胞のマクロファージにおける微粒子汚染の検出において有用性を持っている。
【０３３５】
（ＣＮＳ：ミエリン、ＭＳ、神経トラウマ及び再生、並びに、腫瘍）
神経プロセスのミエリン鞘は、本発明の方法において明瞭に目に見える、非常に脂質の豊富な構造である。神経髄鞘形成範囲の変化、及び、神経線維及びこれに連係するミエリン鞘の構造における変化は、幅広い臨床的な神経組織変性状況に伴っている。このような状況には、例えば、多発性硬化症等の自己免疫不全、ギラン・バレー症候群、神経性セロイドリポフスチン症等の先天性蓄積症（ＯＭＩＭ２５６７３０、子供における神経組織変性病の最も一般的なグループの可能性有り）、例えば、ジフテリア、ＨＩＶ、又は、プリオン病の感染病の複合、及び、トラウマ等がある。これらの場合には、本発明の方法は、例えば、生体検査又は脳脊髄流体等の小さいサンプルの迅速な高分解能画像形成に基づく診断に、患者又は動物のいずれかにおける疾患組織の顕微鏡病理分析に、寄与することができる。更には、高分解能で神経組織の組織を観察する能力は、神経系の疑わしい腫瘍の分析で用いることができる。
【０３３６】
（細胞外基質）
そのほとんどが蛋白質、糖蛋白質、オリゴ糖類及び多糖類鎖から構成される細胞外基質（ＥＣＭ）は、組織及び臓器の構造的基礎である。ＥＣＭは、形態形成、器官形成、細胞成長の調整、軸索成長等の、移動及び極展開を含む多様なプロセスにおいて、決定的な役割を演じる。幾つかの遺伝的及び退行性疾患は、例えば、ビタミンＣの欠乏に起因した壊血病等の細胞外基質の構造における変化を伴っている。ビタミンＣの欠乏は、コラーゲンの不完全な変形及び接続組織の一般的な分解、接続組織の変化をもたらす加齢によるコラーゲンの変形、例えば骨形成不全症（コラーゲンＩ突然変異）、エーラス・ダンロス症候群及び様々な関節炎状態等、コラーゲン遺伝子における突然変異に起因した遺伝病へと導く。加えて、癌細胞は、周囲の細胞外基質と特殊な相互作用を持ち得る。例えば、癌細胞は、周囲の基質の構造を変化させる酵素を生成し、密かに隠しておく。そのような酵素の生成及び隠しは、癌細胞の特有の性質に伴い得る。このような特有な性質には、予後及び処置に関して重要で密接な係わり合いを持ち得る、癌転移活動が含まれる。
【０３３７】
本発明の方法は、細胞外基質の構造及び組成のための独自の画像形成能力を可能にする。そのような画像形成は、患者及び実験動物における、診断又は薬剤作用の分析を提供することができる。癌の状況では、腫瘍から又は生体外での癌細胞の培養から直接引き出したサンプルの細胞外基質の分析を、本発明の方法に従って実行することができる。そのような分析は、処置のプロトコルを示し、処置の進行を評価するための、腫瘍の特徴に関するデータを提供することができる。
【０３３８】
（皮覆組織）
本発明の方法は、皮覆組織を見る、直接的で効果的な手段を提供する。皮覆組織は、それが、仕切り膜と接触するか又は近接するように、サンプル容器内に直接配置されている。容器は、ＳＥＭ内に密封され、配置され、本発明の実施例に係る走査型電子顕微鏡により、画像形成される。皮覆組織は、下層の組織に接着している間に画像形成されてもよく、又は、画像形成前にそのような組織から除去されてもよい。更に、皮覆組織は、画像形成のための除去前に身体内にその自然な位置でそのような接着無しに存在し得る。これらの用途には、消化器系統、呼吸器系統、内分泌腺及び外分泌腺等の疾患、血管系疾患、皮膚病、眼病等の、皮覆組織の構造に影響を与え得る多数の病気の診断が含まれている。
【０３３９】
（血液学及び免疫学）
本発明の方法は、組織検査における毛細管内部、又は、特に炎症箇所若しくは例えば血液又は細針吸引物等の流体サンプル等の血管外部における、例えば、胸腺、リンパ節又は骨髄の組織を生体検査する状況において、赤血球生成系統の細胞の分析の手段を提供する。組織における赤血球形成細胞の豊富さ又は配列に関する情報を、例えばリウマチ性関節炎、狼ソウ、他の自己免疫性病、関節病等の炎症、及び、外傷治療を始めとした様々な病理状況における処理プロトコルに関して、診断したり、決定を方向付けるため使用することができる。独自の重要性の別の用途は、例えば心臓等の移植組織の拒絶反応の早期且つ正確な検出である。そのような移植組織の受容者は、一般に、移植の拒絶反応を防止するため長期間に亘って免疫抑制処理の下に置かれる。しかし、移植は、しばしば拒絶反応の早期の兆候を監視されなければならず、該兆候があったときは、即時に調整処置を施さなければならない。そのような監視は、現在のところ、例えば、週単位の間隔で実行される組織生体検査の顕微鏡検査により達成されている。本発明の方法は、そのような生体検査から移植状態を評価するための、より感度の高く正確な手段を提供することができる。
【０３４０】
（癌）
外科的に除去された腫瘍の一部分及び腫瘍から導出されて生体外条件で維持された細胞の、腫瘍顕微鏡画像形成、生体検査、針吸引、又は、疑わしい腫瘍からの細胞懸濁液は、腫瘍の診断、分類、及び、腫瘍の格付けにおいて、並びに、患者処置の予後及び進路を決定する上で、重要な役割を果たす。本発明で提供される方法は、例えば、高解像度、容易且つ迅速なサンプルの準備、サンプル準備に起因した人為構造の減少、独自のコントラスト機構等、顕微鏡画像形成のための新しい能力を提供する。この能力は、腫瘍の診断、分類、及び、腫瘍の格付けにおいて、並びに、患者処置の予後及び進路を決定する上で、改善をもたらし、又は、独自の手段として使用することができる。
【０３４１】
（微生物学的実体）
本発明の別の好ましい実施例によれば、本方法は、バクテリア、始原菌、菌類、原生動物、ジアルディア、寄生組織、ニューモシスチスカリニ菌、バクテリア及び菌類のコロニー、菌糸体、バクテリア及び菌類の生体膜、及び、ウィルスを始めとした、微生物学的実体の画像形成を提供するが、これらの例に限定されない。微生物学的実体は、例えば、血液、汗、涙、大便、唾液、小便、膿、脳脊髄流体、組織標本、肺若しくは気管支若しくは消化器系統の洗浄物、環境サンプル、土壌サンプル、及び、植物サンプル等の幾つかの種類のサンプル内で画像形成することができる。そのような検査は、患者、動物若しくは植物における微生物学的汚染、又は、医療、工業若しくは家庭内の装置の微生物学的汚染を検出するため使用することができる。
【０３４２】
更には、微生物学的実体のＳＥＭ検査は、例えば、バクテリアを菌類若しくはウィルスから区別するか、又は、微生物学的実体の幅広い若しくは独自の分類を決定するものとして、実体を同定するため、サンプル内のそのような実体の存在を検出するように使用することができる。加えて、ＳＥＭ検査は、微生物学的実体の特性を特徴付けるため使用してもよい。例えば、１つ以上の抗生物質に対するバクテリアの感度又は抵抗性は、好ましくは、幾つかの平行して行われる実験の各々において、異なる濃度の抗体を使用し、抗生物質でそのようなバクテリアの少数を培養し、個々の細胞に与える効果を検出するのに十分な時間、典型的には、ペニシリンに対しては１時間未満の時間が経過した後、本発明の方法に係るＳＥＭによりバクテリアを検査することによって、迅速に検査することができる。抗生物質は、鋭敏なバクテリアの形態的変化又は分解を引き起こし得るが、その一方で、同じ抗生物質が、抵抗性のあるバクテリアにはそのような変化を誘起せず、これによって、バクテリアにおける抗生物質への感度又は抵抗を迅速に評価するための基準を確立することができる。
【０３４３】
（細胞被覆装置、インプラント、ステント）
本発明の別の態様は、装置から導出されたサンプルの画像形成、又は、生体医療インプラントとして若しくは生命工学用の細胞キャリアとして使用される装置若しくはフォーミュレーション、又は、手術若しくは格納の間の生体材料と接触し得る他の医療若しくは工業装置若しくはフォーミュレーションから導き出されたサンプルの画像形成を提供する。これらのサンプルのための共通の特徴は、人間、動物、原生動物又は微生物の細胞を始めとした細胞が、装置又はフォーミュレーションの表面に接着されるか又はその表面上で成長されるということである。本装置又はフォーミュレーションは、一般に電子又は光が透過できないほどの厚さ又は材料組成を持つことができ、かくして、透過型電子顕微鏡又は透過光型顕微鏡における直接画像形成を除外している。本発明の方法を使用して、そのようなサンプルは、関心のある表面が、電子透過性の仕切り膜に近くなるように、サンプル容器内に配置することができる。前述されたように、本発明の画像形成の反射モードは、表面上に存在する任意の細胞を始めとしてサンプルの表面層を画像形成することを可能にする。そのようなサンプルの例には、例えば、ステント、カバー付きステント、バルブ、バイパス、又は、代用動脈等の心臓関連のインプラントが含まれている。これらの装置は、典型的には、金属、合成若しくは天然のポリマー若しくは組織、又は、それらの組み合わせである。そのような装置の使用に関する主要な関心事項は、移植前の、細胞、特に菌類及び微生物の存在、通常の内皮による覆い、及び、塊形成へと導く望ましくない反応の防止を含んでいる。インプラントは、移植前、実験中若しくは品質制御状態で、細胞若しくはバクテリアが生体外条件で培養された後、又は、人間に移植された後、インプラントがもはや要求されないと考えられる後若しくはそれが失敗したと考えられる後に、検査することができる。
【０３４４】
心臓関連のインプラント等のインプラント、又は、人工補てつ物、縫合糸、硬質若しくは軟質組織のインプラントを、製造プロセスの一部として本発明の方法により更に検査することができる。インプラントの材料及び構造特性に関する情報、又は、インプラントの他の任意の機能的態様、例えば、生体外条件又は生体内条件における様々な処理に対する応答等に関する情報を導き出すことができる。試験は、インプラント又はインプラントの製造で使用される材料及び部品の開発中になすことができる。他の実施例では、試験は、製造バッチの一部又は製造された全てのサンプル上で実行することができる。
【０３４５】
望ましくない材料の表面への堆積を被るおそれがある医療装置には、様々なカテーテル、腎臓透析装置、点滴チューブ、内視鏡装置、及び、医学的又は栄養学的に使用されるべき材料と接触するおそれがある、任意の容器又はチューブが含まれているが、これらについても本発明の方法により検査することもできる。装置上に堆積し得る材料の例には、バクテリア、バクテリア生体膜、菌類、原生動物、マイコプラズマ、有機若しくは無機質の沈殿物若しくは接着相、例えば血小板、マイクロファージ、白血球等の血液細胞が含まれている。
【０３４６】
更には、組織エンジニアリングで使用される材料及びフォーミュレーションには、典型的には、合成若しくは生物学的に導出された基質、オプションで、そのような基質の内部又は表面上に沈着した細胞が含まれており、これらについても本発明の方法により検査することができる。バイオテクノロジー及びバイオエンジニアリングの用途で使用される、マイクロキャリア、ファイバーベッド、中空ファイバー、積み重ね式プレートモジュール、を含む、細胞取り付け又は成長のための、容器、チューブ、フィルター、下層も、本発明の方法により検査することができる。細胞成長マイクロキャリアの例には、アメルシャムバイオサイエンスから市販されている「ＣＹＴＯＬＩＮＥ（Ｒ）」及び「ＣＹＴＯＤＥＸ（Ｒ）」及びアメリカ合衆国、ＵＴ，ローガンのヒクロンから市販されている「ＣＵＬＴＩＳＰＨＥＲ（Ｒ）」が含まれるが、これらの限定されるものではない。中空ファイバーの例には、アメリカ合衆国、ＭＤ、フレドリックのファイバーセルシステムから市販されている「ファイバーセル（Ｒ）」が含まれるが、これに限定されるものではない。容器、チューブ及び下層は、培養された細胞、細胞成長媒体、及び／又は、クリーニング溶液と接触するに至る。培養細胞、及び、そのような細胞の層及び集団の、配列、密度、完全さ、及び、構造は、そのような細胞のバイオテクノロジー的用途において重要な結果をもたらし、本発明の方法を使用して監視され、分析されることができる。異常な細胞又は細胞アッセンブリ、病原菌、病原菌生体膜、菌類、原生動物、マイコプラズマ、有機若しくは無機質の沈殿物若しくは接着相を始めとした、容器、チューブ及び下層上への望ましくないものの堆積又は成長も、本発明の方法を使用して監視し、分析することができる。
【０３４７】
（生体分子の定量的パターン分析）
本発明の別の態様では、サンプル内の特定分子の量及び空間的分布を決定するための方法が提供される。そのような分析の必要性は、多数の状況で生じ、そのうちの幾つかが以下に詳細に説明される。
【０３４８】
生物学的サンプルの生体分子の定量化は、現在のところ以下の手段を含む様々な手段により、なされている。
【０３４９】
１．  多数の細胞における生体分子の総量が測定されるところの生物化学的及び免疫学的分析評価には、例えば、放射性リガンド結合検定、放射性免疫測定法、蛍光ベースの結合検定、酵素活性検定、免疫ブロッティング等がある。そのような方法は、サンプル中の生体分子の総量の正確な測定を与える一方で、空間的分布、サンプル中の異なる細胞の濃度差に関する情報は一切与えない。更には、感度について２つの問題が生じる。第１には、検出感度に関する限界は、多数の細胞の使用、又は、測定のための大量の組織を必要とし得る。第２には、細胞内部の細胞一部組織又は組織サンプル等、細胞の限定された領域に非常に集中した生体分子は、生体分子を含んでいないサンプルの領域からの過剰な材料で希釈され、かくして、検出感度を制限する。
【０３５０】
２．  細胞学又は病理学的サンプルの抗体、付与原子又は酵素をベースとした、染色及び光学顕微鏡による検出が挙げられる。典型的には、サンプルは、関心のある生体分子に特異的に結合する抗体を含む溶液で培養される。抗体は、光学顕微鏡により見ることができる片割れ標識に、直接又は間接的に連結される。そのような片割れ標識は、フルオロフォア、色生成粒子群、光若しくは散乱光に不透明である粒子であり、又は、フルオロフォア、色生成粒子群、不透明若しくは非常に散乱される材料の局所化された濃度を発生する酵素である。光学顕微鏡で画像形成する工程及び画像分析する工程に連結された、そのような方法は、ターゲットとなる生体分子の量及び分布の両方に関する情報を与える。そのような技術の限界には、分解能（光回折により約２５０ｎｍまでに制限される）、特に拡散分布の生体分子を分析するときの信号対ノイズ比、感度、蛍光性色素の漂白、制限されたダイナミックレンジ、及び、非線形応答が含まれる。
【０３５１】
３．  細胞学若しくは病理学的なサンプルの抗体若しくはリガンドベースの染色と、電子顕微鏡（ＥＭ）による検出が挙げられる。一般原理において光学顕微鏡ベースの方法に類似して、ここでいう検出は、電子密集又は電子散乱物質に基づいている。このような物質には、例えば、コロイド状金粒子、フェリチン、例えば燐酸鉛等の沈殿物、重金属又は４酸化オスミウムで染色されたポリマー化されたジアミノベンジジンが含まれている。生体分子のＥＭベースの検出、定量化、及び、パターン分析は、非常に高い解像度に到達することができる（透過型ＥＭでは１ｎｍより良好、走査型ＥＭでは、５〜１０ｎｍより良好である）。生体分子の蛍光ベースの定量化に対して比較されたＥＭベースの分析によれば、感度、信号対ノイズ比及びダイナミックレンジの点で、金コロイドを用いたＥＭベース検出法にかなりの利点があると報告されている（リビット−ビナン・Ｎ、リンドナー・ＡＢ、ジック・Ｏ、エッシャー・Ｚ、モーゼ・Ｅによる、２００３年度、化学分析、７５（６）：１４３６−４１に記載された「蛋白質アレイの定量的検出」、並びに、特許出願ＷＯ０２／１４８３０−ＰＣＴ／ＩＬ０１／００７６４）。
【０３５２】
例えば細胞又は組織等の生態サンプル中の生体分子のＥＭベースの定量化及びパターン分析のための現在の方法は、電子顕微鏡に典型的であるサンプル準備手続きを要求している。透過型ＥＭに関しては、埋め込み又は迅速凍結と、これに続く超薄薄片化とが要求される。その結果としての一つの制限は、細胞又は組織の、小さく、しばしば任意の部分のみが、薄片に存在するということである。例えば、細胞膜と連係する蛋白質を検出し、定量化しようとするとき、薄片は、細胞膜全体のうち非常に小さい部分のみを含んでいる。完全又は透過性の細胞を標識形成し画像形成することは、画像形成のためサンプルが薄片化される必要が無い走査型ＥＭを検出するため使用されるとき可能とされる。サンプルが例えば臨界点乾燥等の方法により乾燥される必要がある標準ＳＥＭは、乾燥プロセスに起因した人為構造といった問題、並びに、サンプルが被覆され、２次電子検出により画像形成されるときには、標識粒子を明瞭に同定する上で問題を被る。
【０３５３】
本発明の方法は、現存する技術の多数の制限を独自に克服する、生体分子の検出及び定量化のモードを提供する。ＥＭベースの検出は、高い感度、ダイナミックレンジ、及び、信号対ノイズ比を提供し、高い分解能の画像形成、及び、コロイド状金粒子等の離散標識の片割れの選択的使用は、生体分子の空間的分布を高分解能でマップすることを可能にする。完全な細胞又は透過性であるが他の態様で完全な細胞を観察する能力は、検査される、細胞、細胞表面又は組織を通した生態分子の分布の全体的な視野を与え、脱水、乾燥及び埋め込み無しで細胞及び組織を観察する能力は、これらのプロセスと連係する可能性がある人為構造を無くす結果をもたらす。
【０３５４】
生体分子の量及び空間的分布が重要なパラメータである用途の例には以下のものが含まれるが、これらに限定するものではない。
【０３５５】
細胞表面上のリセプターの分布
例えばホルモン等の分子、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、細胞外基質、細胞間相互作用、細胞接着分子、及び、細胞対病原体相互作用を信号で知らせるための細胞表面のリセプターは、不均一分布で細胞表面上にしばしば分布され、そのようなリセプターの量及び分布の両方は、信号への反応に影響を及ぼし、信号への応答で変調され得る。かくして、細胞及び組織における細胞表面上のリセプターの量及び分布は、特性、外部刺激に対する応答性、細胞及び組織の重要な予測因子である。更には、信号の適用時のリセプターの量及び分布における変化は、信号への応答に関する独自の情報を与える。広範囲に研究されたケースは、例えば、細胞性表皮成長因子（ＥＧＦ）リセプター等の成長因子リセプターの二量体化及び多量体化を含んでいる。ＥＧＦの結合前にはモノマー形態にあり得る、ＥＧＦリセプターは、ＥＧＦの結合時には、二量体及びより大きな多量体へと急激に集成する。この集成は、形質導入プロセスの少なくとも一部分において必要且つ十分なステップである。初期の集成の後、リセプターは、量及び表面分布を変化させる追加のプロセス、即ち、更なる集成、及び、細胞外部からアクセスすることができない細胞内部室への内在化を経験し得る。これらのプロセスは、信号形質導入、活動状態の持続、引き続く信号に対する感度を変調させることにおいても重要な役割を果たしている。
【０３５６】
生体分子と、同一又は別の生体分子との連合
例えば蛋白質等の生体分子は、しばしば、小単位が同一（ホモ二量体、ホモオリゴマー）又は異種（ヘテロ二量体、ヘテロオリゴマー）であり得る二量体又はより大きなオリゴマーとして機能する。例えば、ＨＥＲ１としても示される、ＥＧＦリセプターは、他のＨＥＲ１分子、又は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４と称される類似のリセプター分子の群のうち任意のもの二量体を形成することができる。実際、ＨＥＲ１〜４蛋白質は、様々なホモ二量体及びへテロ二量体を伴い得る。そのような二量体の各々の形成は、幾つかのＥＧＦ状リガンドの任意のものの結合により、異なる仕方で影響を及ぼされ、異なる生物学的結果を伴い得る。最終的に、リセプターのＨＥＲファミリーは、幾つかの種類の癌で異なる仕方で表される。多数論じられた例は、胸部癌におけるＨＥＲ−２の高い流布である。実際、癌におけるＨＥＲ２の高い流布は、貧弱な予後に連係しており、「Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）」等の薬剤が、このリセプターを特異的にターゲットとする。リセプター及び他の蛋白質の二量体及びより大きなオリゴマーへの連合が、バルク技術を使用して、又は、フルオレン分子と、異なる蛋白質に付着されたオロフォアとの間の距離に依存するエネルギー転移により、調査研究されてきた。このバルク技術では、（例えば、）一般的な架橋分子が、接近している分子を共有結合するため使用される。本発明の方法は、本発明の方法に係るＳＥＭ検査により互いから区別することができる標識で、生体分子の各々を標識形成することにより、類似の又は異なる生体分子の連合の範囲を測定することを独自に可能にする。そのような識別可能な標識の例には、異なるサイズ（例えば、１０ｎｍ及び２０ｎｍ、１５ｎｍ、２５ｎｍ及び３５ｎｍ等）のコロイド状金粒子や、後方散乱電子及び光の同時的検出により同じサンプル内で視覚化される、陰極ルミネッセンス標識と電子密集標識との組み合わせがある。
【０３５７】
（乳濁液及び懸濁液）
例えば、オイル及び水等の混合不可能相の微細な混合物を備える乳濁駅と、液体中の固体粒子の微細な混合物である懸濁液とは、現在の電子顕微鏡技術を使用して分析するのが非常に困難である。固定化又は凍結のためのほとんど全ての方法は、サンプルの顕微鏡的構造に損傷を与えるか又はかなり変えてしまう可能性がある。環境ＳＥＭを使用したそのようなサンプルの観察は、固定化されていないサンプルの組成を維持するための困難さに起因して、信頼できない。
【０３５８】
本発明の方法は、そのようなサンプルを画像形成する独自の手段を提供する。例えば、日々の製品、バター、マーガリン及び代替品、化粧用クリーム等を含む他の食製品、日焼け止めクリーム、機械及びモーターオイルや潤滑油、粘土、及び、薬剤フォーミュレーション、例えば乳、血液、血漿及びリンパ液、排泄物及び環境サンプル等の生物学的流体等のサンプルを画像形成する独自の手段を提供する。
【０３５９】
（自動化ＳＥＭ）
本発明の別の目的は、生体サンプルに特異的な、湿ったサンプルの自動化電子顕微鏡のための手段を提供することである。そのような自動化顕微鏡は、半導体工業で幅広く適用されてきた。湿ったサンプルに自動化電子顕微鏡を適用する上での主要な障壁は、非常に複雑で、自動化に追従しない、例えば乾燥、埋め込み、薄片化又はコーティング等のサンプルの準備手続きを用いる必要性である。本発明は、走査型電子顕微鏡において湿ったサンプルの直接的な画像形成のための手段を提供し、かくして、前述した準備手続きを不要にする。実際、生体又は他の湿ったサンプルのサンプル容器への導入及び画像形成のための準備は、高々、液体の皿部への一連の追加及び除去しか含んでいない。適切に設計されたピペット及び流体吸引器により実行されるそのような操作は、例えば薬剤スクリーニング及びゲノム配列決定等の用途で大量スケールでなされるように、容易に自動化される。本発明の方法により提供される自動化サンプルの準備は、ＳＥＭへの自動導入、自動位置決め、位置マーカーの登録、観察のため関心のある領域の選択及び画像分析等の技術分野で知られている他の自動化工程に連結することができ、本質的に、要求される自動化の任意のレベルを提供することができる。そのような自動化システムの有用性の例には、高い分解能で測定され、前述した章で開示された、例えば細胞における薬剤誘起構造的変化、又は、細胞表面リセプターの豊富さ若しくは分布における薬剤誘起変化等のパラメータを使用する、薬剤スクリーニング、並びに、例えば薬剤や他の化学工業における品質保証用途が含まれているが、これらに限定するものではない。
【０３６０】
本発明の一般的なプロトコル
本発明の方法で使用されるプロトコルの一般的なアウトラインは、以下に開示される。これらのプロトコルが、一般的な範疇にあり、検査される特定のサンプルの状況及び所望の分析に適するように構成され又は変形することができることは、電子顕微鏡の分野の当業者により認められよう。
【０３６１】
ここで、本発明の方法を構成する、主要なプロトコルの工程を概略的に表す、図８８を参照する。必ずしも全ての実施例が、以下に列挙された工程の全てを含むわけではないことが理解されよう。個々で開示された方法は、サンプルを準備し、視覚化する際に所望の度合いの柔軟性を提供することが理解されよう。
【０３６２】
プロトコルを構成する個々の工程を、より詳細に説明する。全てのプロトコルでは、全ての操作は、他の仕方で特定化されない場合、室温で実行される。「洗浄」手段は、サンプル容器から液体を除去し、適切な洗浄液体を追加し、約５分間に亘って培養する。
【０３６３】
１．  電子透過性仕切り膜のコーティング
画像形成されるべきサンプルは、電子透過性仕切り膜に近接して、好ましくは接触するように保持されなければならない。幾つかのサンプルは、特殊な処理無しに仕切り膜に直接接着することができる。他のサンプルは、サンプルが容器内に配置され、仕切り膜に適用される前に、接着剤で被覆されるならば、より良好に接着する。一般的な接着剤の例は、ポリ−Ｌ−リジンであるが、これに限定されるものではない。ポリ−Ｌ−リジンは、非接着性動物細胞（例えば、血液細胞）、バクテリア、原生動物、及び、細胞状粒子（例えば、懸濁液中の微粒子物質）を含む様々なサンプルで使用することができる。当該技術分野で知られている接着剤の他の例は、フィブロネクチン、コラーゲン、ゲラチン、ラミニン、又は、マトリゲル（Ｒ）（インビトロゲン）等の細胞外基質成分であるが、これらに限定されるものではない。細胞外基質成分は、典型的には、培養された又は主要な動物細胞が、培養条件の下で一定期間（数時間又は数日）の間、仕切り膜に維持されるべきであるとき、接着剤として使用される。サンプルの特定の成長要求、及び、もしあるならば仕切り膜上で実行される生体実験の性質に基づいて、特定の接着剤が選択される。
【０３６４】
次の例は、電子透過性仕切り膜を被覆するため使用することができる、本発明の方法の例であるが、これに限定されるものではない。
【０３６５】
（ａ）  フィブロネクチンコーティング
材料
フィブロネクチン０．１％ｗ／ｖ（例えば、シグマ化学社のカタログ番号Ｆ−１１４１）
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、例えば、インビトロゲンのカタログ番号１４０４０）
処置
ＰＢＳでフィブロネクチンを１：１０で希釈（フィブロネクチンの最終濃度０．０１％）
希釈溶液の１５μｌを仕切り膜に適用し、室温で３０分間培養する。
溶液を除去し、ＰＢＳで５回洗浄する。
適切な成長媒体（例えば、アルファ−ミネラル  エッセンシャル媒体、１０％牛胎児血清を備えたα−ＭＥＭ）で２回洗浄する。
【０３６６】
（ｂ）  ポリ−Ｌ−リジンコーティング
材料
水中のポリ−Ｌ−リジン０．１％ｗ／ｖ（例えば、シグマ化学社のカタログ番号Ｐ８９２０）
ＰＢＳ
処置
ポリ−Ｌ−リジン０．１％溶液の１５μｌを仕切り膜に適用し、室温で１時間培養する。
溶液を除去し、蒸留水で５回洗浄する。
ＰＢＳ又は適切な媒体で２回洗浄する。
【０３６７】
２．  容器内にサンプルを配置し、仕切り膜に適応する
液体サンプル又は細胞懸濁液が、容器内に配置され、該液体又は細胞懸濁液を容器の膜へと直接ピペットで注入することにより、仕切り膜に適用される。細胞及び粒子は、通常、重力により又はランダム運動により膜に到達し、接着する。接着は、受動的なプロセスであり、例えば、静電相互作用により、仲立ちされる。動物細胞の場合には、接着は、しばしば、新陳代謝エネルギーに依存し得るリセプターにより仲立ちされる特有のプロセスであり、次いで、細胞が仕切り膜に広がっていく。細胞濃度が低いか又は細胞が膜に容易に吸着されない場合には、細胞は、サンプル容器内で静かに遠心分離されてもよく（例えば、５分間、５００×ｇ）、これにより、細胞を仕切り膜に集中させる。
【０３６８】
更には、細胞は、標準のポリスチレン組織培養皿部上の成長と同一又は非常に類似した条件の下、オプションの被覆された仕切り膜上で成長することができる。細胞は、広がり、増殖し、隣接する細胞と相互作用し、外因性又は内因性信号に応答する。典型的には、細胞は、例えば、３７℃で５％のＣＯ２を含む加湿大気中で、１０％の牛胎児血清で増補された、ダルベッコ改変エッセンシャル培地（ＤＭＥＭ）又はハムのＦ−１２等の成長媒体で維持される。加えて、細胞にＤＮＡを導入するか、又は、ウィルス又は遺伝子組み換えウィルスベクターで細胞を感染させることが可能となる。
【０３６９】
図８８に示されるように、サンプルを、追加の処理無しに画像形成することができ（以下のステップ７を参照せよ）、又は、後述されるように、オプションで、サンプルのコントラストを向上させるか又は特定の構成要素を標識形成するように、更に処理されてもよい。
【０３７０】
３．  固定化
前段階で固定化無しに非特異的及び特異的の両方でサンプルをオプションで染色することは可能であるが、サンプルは、通常、オプションの染色工程前に固定化される。固定化は、細胞構造を可能な限り生きている状態に近い状態に保存し、サンプルが形態的に変化すること及び引き続く処理の間に損傷を被ることから該サンプルを保護する。更には、固定化は、引き続く観察のためサンプルを特定の状態に永久的に安定化することができ（凍結）、遷移状態が視覚化されるべき場合には特に有用となる。
【０３７１】
細胞学、免疫染色、電子顕微鏡の分野において知られている幅広い範囲の固定化技術を使用することができる。一つの固定剤は必ずしも全ての細胞構造を保存せず、かくして、固定剤の正確な選択は、サンプルに依存し、視覚化されるべき特定の特徴に依存する。サンプルが、固定化に引き続く免疫染色等の特有の染色を経験するべき場合、抗原及び抗体の性質も、固定化処置の選択に影響を及ぼす。
【０３７２】
固定化工程は、典型的には、培養媒体を洗い出し、サンプルを適切な時間間隔で固定化溶液で培養し、固定剤を除去する、各工程を含んでいる。
次のものが、本発明の方法で使用することができる、固定化プロトコルの例であるが、これらに限定されるものではない。オプションで、当該技術分野で知られている他の固定化処置は、サンプル、染色、標識形成及び視覚化目的の詳細事項により規定されるように使用されてもよい。
特に断りのない限り、ここで記載された全ての方法は室温で実行される。
【０３７３】
（ａ）  マイルドホルムアルデヒドの固定化（オプションで、ターゲットとなる箇所への損傷を最小にするため、特異的な染色前に使用される）：
材料
パラホルムアルデヒド、ＥＭグレード（例えば、１６％溶液、電子顕微鏡科学、カタログ番号１５７１０）
ＰＢＳ
処置
ＰＢＳ中のパラホルムアルデヒド４％溶液の準備
サンプルをＰＢＳで数回洗浄
室温で１５分間パラホルムアルデヒド４％で固定化
ＰＢＳで５回洗浄
【０３７４】
（ｂ）  グルタルアルデヒド／ホルムアルデヒド固定化（オプションで、例えばウラニルアセテート等、活動的な染色処置の以前に使用されている）
材料
ＰＢＳ
洗浄溶液：０．１Ｍカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．４，１％ショ糖、５ｍＭＣａＣｌ２．
固定剤溶液：洗浄溶液中に２％グルタルアルデヒド、３％ホルムアルデヒド
処置
ＰＢＳ中でサンプルを５回洗浄
室温で１時間の間、固定化溶液中で培養
洗浄溶液で５回洗浄
水で５回洗浄
【０３７５】
（ｃ）  低温メタノール固定化（オプションで特異的標識形成前に使用される。ホルムアルデヒドを用いた処理がそのような標識形成に干渉し得る場合）
材料
−２０℃まで冷却したメタノール
ＰＢＳ
処置
室温でサンプルをＰＢＳを用いて５回洗浄
仕切り膜の氷との直接接触を回避するため注意を払いつつ、氷の上にサンプル容器を配置
ＰＢＳを除去し、予め冷却した（−２０℃）メタノールを追加
５分間、−２０℃に転移
室温で、ＰＢＳを用いて５回洗浄
染色又は標識形成反応への進行
【０３７６】
４．  非特異的な染色
サンプルの全体的な電子顕微鏡コントラストは、当該技術分野で知られている、非特異的染色及び染色処置を使用することにより強めることができる。これらの処置で共通しているものは、それらが、サンプル又はサンプル中の構造に、高い原子番号（Ｚ値）の原子の吸着又は集中を生じさせるということである。
【０３７７】
次のものは、当該技術分野で知られている染色処置の例であるが、これらに限定されるものではない。オプションで、当該技術分野で知られている他の染色処置を、サンプル、標識形成及び視覚化目的により規定されるように使用することができる。
【０３７８】
（ａ）  ウラニルアセテート（ＵＡ）染色
材料
タンニン酸、水中１％（ｗ／ｖ）溶液（シグマ化学社のカタログ番号から準備されている）
酸性ウラニルアセテート（ＵＡ）濃度：ＨＣＬでｐＨ３．５まで調整された、水中で５％（ｗ／ｖ）ＵＡ
ＵＡ染色溶液：水中で５％ＵＡ濃度から希釈により新たに準備された０．１％ＵＡ
処置
グルタルアルデヒド／ホルムアルデヒド処置に記載されているようにサンプルを固定化
蒸留水で５回洗浄
タンニン酸溶液を追加、５分間培養
水中で５回洗浄
ＵＡ染色溶液を追加、２０分間培養
水中で５回洗浄  画像形成のため水中に残す
４酸化オスミウム（ＯｓＯ４）の染色
材料
ＯｓＯ４染色溶液：市販の４％在庫溶液から希釈された、水中の１％（ｗ／ｖ）４酸化オスミウム
処置
グルタルアルデヒド／ホルムアルデヒド処置に記載されているようにサンプルを固定化
蒸留水で５回洗浄
ＯｓＯ４の染色溶液追加、３０分間培養
水中で５回洗浄  画像形成のため水中に残す
【０３７９】
５．特異的標識形成
サンプル内での特定の分子及び／又は構造の位置及び量を、被ターゲット分子及び／又は構造と結合するか又は他の仕方で連係する特異的なターゲット分子の使用により測定することができる。特異的なターゲット分子に直接又は関節的に連結される少なくとも１つの高いＺ値の原子は、被ターゲット分子及び／又は構造のためのコントラスト向上を提供する。代替例として、特異的ターゲット分子は、本発明の方法により視覚化されたとき、被ターゲット分子及び／又は構造の近傍に測定可能なコントラストを発生する局所化された物質の蓄積を形成することができる。
【０３８０】
被ターゲット分子及び／又は構造と結合するか又は他の仕方で連係する特異的なターゲット分子として使用することができる市販の分子の例には、抗体、蛋白質Ａ、及び、ストレプトアビジン；抗体、蛋白質Ａ、及び、コロイド状金粒子が連結されたストレプトアビジン；抗体、蛋白質Ａ、及び、セイヨウワサビセロキシダーゼが連結されたストレプトアビジンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０３８１】
標識形成の片割れが、高いＺ値の原子に限定される必要はないことは、当業者により認められよう。ＳＥＭ機器に、光検出器及び／又はＸ線検出器が備え付けられている場合、特異的ターゲット分子は、高いＺ値原子の代わりに電子ビームに応答して光又はＸ線を放射する連結片割れであってもよい。
【０３８２】
一般に、特異的標識形成処置は、少なくとも１つの高いＺ値の原子が、ターゲット分子に直接的又は間接的のいずれかに連結されているかに応じて、４つ又は５つの主要工程からなっている。即ち、オプションのサンプル準備、オプションの固定化、非特異的結合のオプションのブロッキング、ターゲット分子による被ターゲット分子又は構造の結合、並びに、余剰の非結合ターゲット分子のオプションの除去である。ターゲット分子が少なくとも１つの高いＺ値の原子に既に連結されている場合、標識形成プロセスは完了し、サンプルは視覚化の準備ができていることになる。ターゲット分子が標識形成されていない場合、高いＺ値の原子が第２のターゲット分子により第１のターゲット分子に結合されている視覚化工程の前に、１つ以上の追加の工程が、必要とされる。
【０３８３】
表面分子又は構造は、生きている細胞か又は固定化された細胞上に標識形成することができる。細胞内抗原を、固定化された透過性細胞に標識形成することができる。固定化処置は、エピトープをマスクし又は変化させることができ、かくして、各ターゲット分子に対する最適な固定化処置が、実験的に決定されるべきであることが当業者により認められよう。非特異的な背景のための最適なブロッキング、ターゲット分子の濃度、及び、培養時間は、被ターゲット分子及び／又は構造及び問題とするターゲット分子に依存するパラメータであることも、当業者により認められよう。幾つかのケースでは、特異的培養及び洗浄緩衝は、被特異的結合を回避するため要求されている。かくして、全ての標識形成のために作用する標準的な処置は存在しない。特定のターゲット分子及びターゲットを用いる以前の経験に基づいて、又は、蛍光性顕微鏡において蛍光標識及び視覚化を使用した予備実験を実行することにより、オプションの条件を確立することができる。
【０３８４】
次のものは、当該技術分野で知られている特異的な標識形成処理の例であるが、これらに限定されるものではない。オプションで、当該技術分野で知られている他の特異的な標識形成処置を、サンプル、染色及び視覚化目的により規定されるように使用することができる。
【０３８５】
（ａ）  細胞表面リセプターの特異的標識形成
材料
ＰＢＳ
ブロッキング剤：牛血清アルブミン、（ＢＳＡ）又は通常の血清
所望のリセプターにターゲットにされた主要又は第１の抗体
１次即ち第１の抗体に結合され得るか又は他の仕方で連係され得る金粒子接合
蒸留されたＨ２Ｏ
銀強化キット（例えば、AURIN R-GENT SE-EM(R) カタログ番号500.033）
処置
マイルドホルムアルデヒド処置を用いて細胞を固定化
３０分間、ＰＢＳ内で、例えば３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、又は、２次抗体を介して間接的標識形成が使用されるべき場合には２次抗体の種からの通常の１〜５％の血清等の溶液を含んだ蛋白質で細胞を培養
上記と同じブロッキング溶液で１次抗体で細胞を培養（典型的には３０〜６０分間）
幾つかの抗体に対しては、標識形成は、３７℃で培養することにより、又は、４℃でより長い培養（数時間から一晩中）を行うことにより、改善することができる。
【０３８６】
上記のような制御反応であるが、１次抗体無しの制御反応を実行
細胞をＰＢＳで数回洗浄
例えば、１〜３％ＢＳＡ又は１〜５％の通常血清等の溶液を含む蛋白質において金で標識形成された共役物（例えば、１次抗体に対してターゲットとなる金接合２次抗体、又は金接合蛋白質Ａ又はＧ；１次抗体がビオチン化される場合には、金接合ストレプトアビジン、又は、アビジンを使用することができる）で培養
未結合抗体を除去するためＰＢＳで広範囲に洗浄
コロイド状金粒子が、非常に小さくてＳＥＭで有効に見ることができない場合（典型的には、熱電子銃を用いたＳＥＭでは３０ｎｍ未満、フィールド放射電子銃を用いたＳＥＭでは１０ｎｍ未満）には、高いＺ粒子のサイズを増大させるため銀強化法を使用することができる。銀強化法は、例えば、AURION R-GENT SE-EM(R) カタログ番号５００．０３３等の市販されているキットを使用してなすことができる。
蒸留水で数回洗浄
【０３８７】
（ｂ）  細胞内部の分子又は構造の特異的標識形成
内部分子又は構造の特異的標識形成のための処置は、細胞は、固定化の後、透過性を持たねばならないことを除いて、表面分子に対するものと事実上同じである。
（追加材料）
ＰＢＳ中で０．２％トリトンＸ−１００
ＰＢＳ中で１％トリトンＸ−１００
（処置）
パラホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド固定細胞に対しては、５〜１５分間、０．２％トリトンＸ−１００／ＰＢＳで培養することにより細胞を透過的にする（メタノール固定化が使用される場合には、追加の透過性処理は要求されない）
ＰＢＳで５回洗浄
上記のように、特異的標識形成処置を実行
引き続く視覚化処置が余剰の背景信号に関する問題を暴露する場合、例えば、トリトンＸ−１００／ＮＰ４０（１％ｖ／ｖ）等のマイルドな洗浄剤を、１次抗体で培養した後、使用される洗浄緩衝剤に添加
大きい（例えば、２０〜４０ｎｍ）コロイド状金粒子よりも、容易に固定透過性細胞を貫通する、小さい金粒子（例えば、０．８ｎｍコロイド金粒子）又は他のコントラスト発生材料（例えば、ペルオキシダーゼ／ジアミノベンジン／４酸化オスミウム）を使用するのが好ましい。
【０３８８】
（ｃ）  酵素架橋ターゲット分子を使用した特異的標識形成
本発明の別の方法では、特異的標識形成は、ターゲット分子に直接連結された高いＺ値のコントラスト発生剤を持つこと無しに達成される。むしろ、ターゲット分子は、コントラスト発生分子の局所的蓄積をその近傍で引き起こす。これに限定されない例として、このことは、高いＺ番号の原子を含む材料の沈積を引き起こす、酵素的若しくは他の化学的反応により達成することができる。当該技術分野で知られている例は、抗体に共有結合されているセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の酵素活性を使用する標識形成処置である。酵素は、ジアミノベンジン（ＤＡＢ）のポリマー化及び不溶解化に触媒作用を及ぼす。ポリマー化されたＤＡＢは、例えば、４酸化オスミウム又はサンプルの周囲材料よりも遙かに高い親和性を持つ金属成分等の高いＺ反応剤と結合し、蓄積し、高いコントラストを生じさせる。
【０３８９】
次のものがＨＲＰを使用した特異的標識形成処置の例であるが、これらに限定されるものではない。
【０３９０】
材料
上述されたような固定化及び免疫染色のための全ての試薬；第２の抗体はＨＲＰに共役接合される（例えば、カタログ番号アメルシャム）
ジアミノベンジン染色キット（例えば、ベクター研究所のカタログ番号ＳＫ−４１００）
水中の０．０５％４酸化オスミウム（４％濃度から希釈される）
処置
マイルドホルムアルデヒドを用いたサンプルの固定化、上述されたような第１の抗体で染色
２次抗体、抗マウスペルオキシダーゼで培養（１：１００希釈、１ｈ）
ＰＢＳで５回洗浄
蒸留水で３回洗浄
キットプロトコルに従ってＤＡＢ染色（ベクター研究所のカタログ番号ＳＫ−４１００）を実行
水で３回洗浄
１分間、０．０５％の４酸化オスミウムで培養
蒸留水で５回戦場、画像形成前に水中に保持
【０３９１】
６．  固定化無しの特異的標識形成（細胞外分子又は構造に限定された）
処置が実行される間に、被ターゲット表面の蛋白質又は構造が、再分布もせず、細胞内に吸収もされないと仮定した上で、上記プロセスを使用して固定化無しで表面蛋白質又は構造を特異的に標識形成することがしばしば可能となる。０℃〜４℃で培養を実行することにより、ターゲットの再分布又は内部吸収プロセスを抑制することができる。培養回数は、これに従って増大させる必要があり得る。
【０３９２】
７．  画像形成
サンプル準備が完了し、サンプルがサンプル容器内に配置された後、例えば、容器の底部及び一部分を嵌合させることにより、サンプル容器は、密封され、ＳＥＭのサンプルステージ上に配置される。画像形成は、サンプル容器外部の真空度が、サンプルの画像形成にも安定さにも実質的な影響を及ぼさないので、高い真空又は「低い真空」モードのいずれでもなされる。しかしながら、万全を期すため、仕切り膜が破れる稀なケースで顕微鏡が汚染される可能性を防止するため、ＳＥＭ画像エネルギー形成を低真空条件で実行することができる。
【０３９３】
画像形成は、一般に、１０から３０ＫｅＶで設定された電子ビームを用いてなされる。熟練したＳＥＭのオペレータにより決定されたとき、サンプルに対して最適な画像形成パラメータ（ビームエネルギー、電流、スポットサイズ、走査率、コントラスト及び明るさの設定等々）が使用される。
【０３９４】
代替例として、サンプル容器内の導入前に、サンプルが固定化され、染色され、及び／又は、特異的に標識形成される。このオプションは、図８８の一番左側の矢印で示唆されている。これによって、このように処理されたサンプルは、「サンプル」として認識される。そのようなサンプル容器内への導入前のサンプルの処置は、特に、サンプル容器内の導入の後実行するのが困難であるサンプルに対して適用可能であるが、細胞サンプル又は他の液体サンプルに対しても適用可能である。
【０３９５】
次のプロトコルは、サンプル容器及び仕切り膜への導入前の非接着性細胞サンプルの準備及び免疫染色を例示している。
本発明は、厚い固体サンプルを画像形成するための方法を提供する。本発明の方法に係る、そのようなサンプルのＳＥＭ検査は、本発明のサンプル容器の仕切り膜と密接に接触した状態で画像形成されるようにサンプルの表面を配置する工程と、サンプル容器を密封する工程と、サンプル容器を走査型電子顕微鏡内に配置する工程と、サンプルを電子ビームを用いて走査する工程と、を最小でも含んでいる。
【０３９６】
好ましくは、サンプルの画像形成表面を、実質的な領域に亘って仕切り膜と接触するように作ることができるようにするべきである。実際、このことは、サンプルがサンプル容器に配置される前か又はサンプルを仕切り膜に対して当接するように圧力を印加した後のいずれかで、画像形成表面が略平坦であるか、又は、適度の湾曲若しくは不規則性を持つべきであることを意味している。
【０３９７】
固体サンプルは、そのような表面、例えば、組織若しくは器官の自然なエッジ、又は、組織を裏打ちする表面保護層を持っていてもよい。他のケースでは、例えば、個体組織の内部領域が視覚化されるべきとき、画像表面は、サンプルを切断することにより発生される。この切断工程は、外科用メス又は剃刀ブレードを用いて手で達成することができ、切断表面の平坦さ及び位置のより良好な制御を提供する支持スペーサーにより支持される剃刀ブレードを使用する。そのような支持スペーサーは、図８６Ａ乃至８７Ｂに例示されている。代替例として、例えば、バイブラトーム（Ｒ）又は組織スライサー（ＥＭＳ科学）等の機械加工装置を、幅広く多様なサンプルから平坦で損傷を受けていない表面を形成するため、使用することができる。なお、本発明の方法のための固体サンプルの準備は、薄片が要求されないという点で、ほとんどの他の画像形成モードとは異なっている。薄片化（ＬＭに対しては数ミクロンまでのスライス、ＴＥＭに対しては０．１ミクロン未満までのスライス）は、サンプルが硬化されるべきことを要求するが、これは、パラフィン及びエポキシ樹脂等の固体媒体に埋め込むか、又は、低温で急速凍結及び薄片化することにより、達成される。本発明のほとんどの態様では、そのような硬化手段は要求されず、脱水又は凍結のための必要性を無くし、サンプル準備時間を短縮化する。
【０３９８】
サンプルが、サンプル容器の内部体積のサイズより大きい場合、サンプルの追加のトリミング（画像形成表面とは異なる側で）を実行することができる。これに限定されない例として、サンプル容器は、３ｍｍの直径及び３ｍｍの高さを備えたシリンダーとして形成された内部体積を持つことができ、固体サンプルは、サンプル容器内に導入されるように、これらの寸法よりい小さくなるように、区分化され又は切り取られなければならない。様々なサイズ及び形状のサンプル容器を、画像形成のより大きな連続的サンプルが所望されたならば、使用することができる。
【０３９９】
前述したプロトコルにおける細胞サンプルに対して記載されているように、本発明の方法は、（オプションの）切断及びトリミング工程とは異なる処理を用いること無く、固体の厚いサンプルのＳＥＭ検査を提供する。そのような未処理サンプルにおける材料分布に起因したコントラストは、有意な情報を明らかにすることができる。オプションで、構造的特徴を保存し、前段の固定化に依存した染色処置を可能にするため、サンプルを固定化することができる。オプションで、サンプルは、コントラストを向上させ、構造要素の同定及び定量化を可能にするため当該技術分野で知られている方法を使用して染色することができる。後述される３つのプロトコルは、組織の画像形成で使用されるプロトコルを例示している。
【０４００】
未処理の心臓組織の画像形成
材料
ＰＢＳ
処置
実験動物の心臓を取得（例えば、窒息により捧げられたマウスから）
処理が容易されるまで氷上でＰＢＳ内に保存（好ましくは、１時間未満）
組織断片を２ｍｍ以下の任意の寸法に外科用メスで切断
所望の表面が仕切り膜に面した状態で、図３１Ａ乃至図５０に記載されているサンプル容器内に配置
図３６Ａ乃至図３６Ｃで一例として示されるように、図３０Ａのサンプルポジショナー１１２８により圧力を印加する間に容器を密封
例えば、図３７及び図３９乃至図４０に示されるように、ＳＥＭ内で検査
【０４０１】
ホルムアルデヒドへの浸漬を用いた固定化
材料
ＰＢＳ
濃縮ホルムアルデヒド溶液（１６％又は３７％）；好ましくは、パラホルムアルデヒドから準備され、新鮮な状態又は密封して凍結保存された状態のいずれかの部分標本が使用される。代替例として、一般には純度がより少ないが、同様な濃度のホルマリン溶液を使用してもよい。
ホルムアルデヒド作業溶液：ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド（新たに希釈される）
処置
動物又は人間のソースから組織を取得
余剰の血液を除去するためＰＢＳで短時間洗浄
組織を（一つの次元寸法で）２ｍｍ以下の厚さの部品に切断
ホルムアルデヒド作業溶液の大きな体積（少なくとも２０倍、ｖ／ｗ）に配置
少なくとも１時間に亘って固定化
新鮮なホルムアルデヒド作業溶液中に格納
上述されたような画像形成のためのプロセス又は染色工程への移行
【０４０２】
血管局所潅流による固定化
材料
洗浄溶液
１ｍｌのヘパリン溶液（１０００ユニット／ｍｌ）
１ｍｌの亜硝酸ナトリウム
１０００ｍｌの脱イオン水
８．５ｇの塩化ナトリウム
ｐＨを７．２〜７．４に調整
局所潅流溶液（マクドウェルの及びトランプの４Ｆ：１Ｇ固定剤）
次のものを連続的に添加して掻き混ぜる
７１ｍｌ蒸留水
２５ｍｌの１６％ＰＦＡ（ＥＭグレード）
４ｍｌの２５％グルトアルデヒド（ＥＭグレード）
１．１６ｇのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ
〜０．２７ｇのＮａＯＨ（ｐＨチェック及び１ＮのＮａＯＨで７．２〜７．４に調整）
ＰＢＳ
処置
ラットを麻酔にかける
心臓を露出するため切開
針を左心室に挿入
流体排除を可能にするため右心房に孔貫通
３７℃まで予め暖められた少なくとも２５０ｍｌの洗浄溶液で動物を肝臓が青白くなるまで潅流
３７℃まで予め暖められた局所潅流溶液２５０ｍｌで潅流
動物を切開、関心のある器官又は組織（例えば、腎臓）を取り出す
必要ならば器官を更に切開、局所潅流溶液中に４℃で断片を保存
【０４０３】
固定化組織のウラニルアセテートによる染色
染色溶液は拡散によりサンプル内を浸透し、それにより、理に適った時間内での最良の染色は、表面に近いところで達成される。従って、画像形成されるべき表面を、染色溶液に直接、露出することが好ましい。この表面が、サンプルの元々のエッジではない場合、組織を切除し、所望の内部表面を露出させることが好ましい。
材料
固定剤溶液（例えば、ホルムアルデヒド作業溶液又はトランプの固定剤）
ＰＢＳ
水
１％のタンニン酸溶液
０．１％のウラニルアセテート溶液（５％ｗ／ｖストックから新たに希釈される。ｐＨ３．５）
処置
浸漬又は血管局所潅流により組織を固定化
所望のサイズの断片に組織を切断し、画像形成されるべき表面を露出
全ての固定剤及び燐酸イオンを除去するため水で広範囲に洗浄
５分間、１%タンニン酸で培養
水で３回洗浄、各洗浄毎に５分間
ウラニルアセテート溶液に１０分間浸漬
水で５回洗浄
【０４０４】
組織の免疫染色
材料
固定剤：ＰＢＳ内の４％パラホルムアルデヒド
ＰＢＳ
ブロッキング溶液：１％ＢＳＡを含み、ｐＨ８．２のＰＢＳ
１°抗体
洗浄溶液
２°抗体／金
銀強化キット
処置
混合、固定、ブロック、ブロッチ、洗浄、監視
【０４０５】
本発明の例
本発明の例は、図示のものとして与えられ、開示された特有の例に本発明を限定するものではない。当業者は、本願で開示された方法が本明細書で説明されていない追加のサンプルの詳細な特徴へと変形され又は適合させることができることを、理解するであろう。
【０４０６】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、培養されたチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）のＳＥＭ顕微鏡写真図を示す、図８９を参照する。図１１Ａ乃至図２０に示された容器等のサンプル容器は、フィブロネクチンの溶液で処理され、次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ＣＨＯ細胞は、通常の成長媒体（１０％牛胎児血清が補充されたＤＭＥＭ）内で培養基培養される。一晩かけた培養の間に、細胞は、電子透過性で流体不透過性の膜２１０に接着し、該膜上に広がっていく。サンプル容器は、密封され、ＳＥＭ内に配置される。ＳＥＭの内部はガスを抜かれ、真空に維持されているが、サンプル容器内の流体は、完全に保持され、細胞は、媒体内に残ってその組成を維持する。このようにして得られたＳＥＭ顕微鏡写真図は、細胞の構成成分に起因した材料コントラストが、細胞３２００の輪郭を視覚化し、並びに、細胞核３２０２及び脂質小滴３２０４を含む細胞内の内部構造を識別するのに十分であることを実証している。図８９は、更に、例えば脂質リッチ構造、例えば脂質小滴３２０４が、染色剤又は固定剤等の異質の物質の添加無しで、周囲の水様液に対して、鮮やかに見えることを実証している。
【０４０７】
本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ヒーラー細胞のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９０Ａ及び図９０Ｂを参照する。好ましくは、図１１Ａ乃至図２０に記載されているようなサンプル容器は、フィブロネクチンの溶液で処理され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、ヒーラー細胞は、通常の成長媒体（１０％牛胎児血清が補充されたＤＭＥＭ）内で培養基培養される。一晩かけた培養の間に、細胞は、仕切り膜２１０に接着し、該膜上に広がっていく。媒体は、好ましくは、図１７Ｂに示されるように、吸引により除去され、膜２１０に接着したままとなっている細胞は、上記詳細に説明したように、ウラニルアセテート染色工程を施される。
【０４０８】
図９０Ａ及び図９０Ｂは、細胞核３２１０と、核小体３２１２と、アクチンストレスファイバー３２１４と、皮質のアクチン３２１６と、を含む、高いレベルの詳細構造を示している。図９０Ａ及び図９０Ｂは、例えばウラニル化合物等の一般的なコントラスト強化剤によって、コントラスト及び解像度を向上させることができ、特定の生物学的構造を同定することができる、ことを実証している。
【０４０９】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って、反上皮細胞増殖因子で固定化され染色され、次に２０μｍのコロイド状金粒子に連結された第２の抗体が続くＡ４３１細胞の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９１Ａ及び図９１Ｂを参照する。図９１Ｂは、図９１Ａの暗い長方形３２２０によりマークされた領域の拡大図を表している。２０ｎｍ金粒子は、図９１Ｂでは輝点として目に見ることができる。図９１Ａで用いられているより低い倍率では、金粒子は、分解されていないが、金コロイドの分布は、電子後方散乱電子の強度の変化として示されている。
【０４１０】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って、抗ＣＤ２５の抗体で標識形成され、湿った状態で画像形成された、人間のインターロイキン−２のリセプターＣＤ２５の暗号化遺伝子が一時的にトランスフェクトされたヒーラー細胞のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９２を参照する。ＣＤ２５蛋白質を表していない、ヒーラー細胞は、ＦＵＧＥＮ−６試薬（スイス、バースル市にあるロッシュ診断社のカタログ番号１  ８１４，４４３）を使用してポリエステル培養皿内で人間のＣＤ２５遺伝子を暗号化するプラスミドがトランスフェクトされる。２日後、細胞は、トリプシンを使用して皿から取り出され、好ましくは、フィブロネクチン被覆仕切り膜２２０を備えた図１１Ａ乃至図２０で説明されたようなサンプル容器内で培養基培養される。更なる培養のための２４時間後、細胞は、ホルムアルデヒドで固定化され、抗ＣＤ２５抗体で染色され、次に３０ｎｍコロイド状金粒子に連結された２次抗体が続いた。最終的には、サンプルは、銀強化処理された。
【０４１１】
当該技術で知られているように、トランスフェクション処置は、細胞群のうち一部で、トランスフェクトされたＤＮＡの取り込み及び表現を生じさせ、その一方で、他の細胞は、トランスフェクトされた遺伝子を取り込まず表現もしない状態を生じさせる。このことは、図９２に明瞭に示されている。図９２では、例えば、細胞核３２３２が輝いた楕円体として明瞭に見える１つの細胞３２３０が、明るい斑点で示されるように、金に連結された抗体で非常に染色されているが、隣接する細胞は、抗体により染色されず、その細胞核３２３６が、サイトプラズマからのその生得的な材料コントラストに起因して見えている。この画像は、本発明の方法で達成することができる、優れた信号対ノイズ特性を例示している。
【０４１２】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に従って、抗ビオチン抗体で浸透化され標識形成され、湿った状態で画像形成された、ヒーラー細胞のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９３Ａ、９３Ｂ及び９３Ｃを参照する。図９０Ａで表されたようなフィブロネクチンで被覆された仕切り膜上で成長した細胞は、ＰＢＳで４回洗浄され、１５分間、ＰＢＳ内の４％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドの溶液を添加することにより固定化される。次に、当該溶液は、除去され、細胞は、ＰＢＳで４回洗浄され、ＰＢＳ内の０．１％トリトンＸ−１００の溶液で５分回培養することにより浸透化される。次に、細胞は、ブロッキング溶液内で３０分間処理される。該ブロッキング溶液は、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び５％（ｖ／ｖ）通常ヤギ血清を含むＰＢＳである。次に、細胞は、ブロッキング溶液で抗ビオチン抗体で１時間の間培養され、続いてＰＢＳで４回洗浄される。これらの細胞は、ブロッキング溶液において、例えばアメリカ合衆国、ＰＡ、Ｆｔ．ワシントン、電子顕微鏡科学社のカタログ番号２５３７１等の０．８ｎｍ金コロイドに連結された２次抗体を用いて１時間に亘って培養され、ＰＢＳで４回洗浄され、５分間、ＰＢＳ内の２％グルタルアルデヒドを用いて固定化された。次に、細胞は、蒸留水で６回洗浄され、市販のキット（アウリオン  Ｒ−ＧＥＮＴ  ＳＥ−ＥＭ）を使用して銀強化処理を施される。この実験で使用される抗ビオチン抗体は、共有結合したビオチンの片割れを含む蛋白質（酵素）を検出する。そのような酵素は、ミトコンドリアの内部基質内に優先的に配置され、従って、この細胞部分の良好なマーカーとなる（参照：ホリンシード  Ｍ等、１９９７年）。図９３Ａ及び９３Ｂは、上述されたように標識形成されたヒーラー細胞の２つの異なる倍率を示している。図９３Ｃは、抗ビオチン抗体が省略されているということを除いて、同一の態様で実施される制御実験を示している。図９３Ａ乃至図９３Ｃは、明るいひも状構造として示されている、ミトコンドリア（３２４０）の特異的な標識形成を明らかに実証している。図９３Ａ及び図９３Ｃの両方に示された、細胞核３２４２及び脂質小滴３２４４等の構造は、抗体を用いた特異的標識形成に起因するものではない。むしろ、それらは、図８９の議論で実証された自然のコントラストに起因するものであり、銀強化試薬を用いた一般的な染色からの寄与に由来している。なお、図９３Ａ乃至図９３Ｃに関して詳細に説明された方法と、図９１Ａ乃至図９２で使用される方法との間に有意な差異が存在する。図９３Ａ乃至図９３Ｃでは、細胞内部の分子の抗体による十分な標識形成を可能にするため、特殊な工程が採用されている。即ち、第１の工程では、細胞は、洗剤（トリトンＸ−１００）で浸透化され、抗体の侵入を可能にする。第２の工程では、境界の抗体を視覚化するため使用されるコロイド金粒子は、非常に小さく（０．８ｍｍ）、典型的な抗体分子よりは大きくはなく、該金コロイドの細胞内の箇所への容易な侵入と、該細胞内との平衡状態とを可能にする。最後の工程では、銀強化処理が、ＳＥＭ内の金コロイドの視覚化を可能にするため使用される。銀強化処理（実際に、金コロイドを大きくする）の程度は、所望の解像度を維持するように制御される。
【０４１３】
図９１Ａ乃至図９３Ｃは、特異的な抗体又は他のリガンドを利用することによって、特異的なターゲット分子の位置及び量を、光学顕微鏡よりも遙かに勝った解像度及び精度で測定する本発明の能力を示している。更に、本発明の方法は、ＥＭ画像を取得するのに要求されるサンプル準備に通常伴っている、冗長で有害な可能性のある工程を回避する。
【０４１４】
上記能力は、細胞表面分子、細胞内分子、後述する図１０６に示されるように、細胞外構造にまで拡張することができる。
ここで、本発明の更に別の好ましい実施例に従って、ポリリシン被覆膜に接着され、湿った状態で画像形成された、バクテリア（大腸菌及び枯草菌）のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９４Ａ及び９４Ｂを参照する。成長媒体（ＬＢ，ＤＩＦＣＯ）におけるバクテリア細胞は、記載したように、仕切り膜２１０が以前にはポリＬレジンで被覆されていたところの好ましくは図１１Ａ乃至図２０に記載されているようなサンプル容器に適用される。３０分後、媒体は除去され、細胞は、ＰＢＳで４％ホルムアルデヒドで固定化された。図９４Ａの細胞は、更なる処理無しにＳＥＭで画像形成された。その一方で、図９４Ｂの細胞は、水で洗浄され、上述されたようにウラニルアセテートで染色され、ＳＥＭで画像形成された。図９４Ａの大腸菌細胞３２５０は、染色されておらず、詳細な構造は、図８９と同様に、自然の材料のコントラストに起因して目に見えている。図９４Ｂの枯草菌細胞３２５５は、ウラニルアセテートで染色され、そのコントラストは、ほとんどウラニルからくるものである。図９４Ａ乃至図９４Ｂは、微生物学的実体を画像形成する方法の能力と、通常では本発明のサンプル容器の電子透過性仕切り膜に接触しない細胞を付着する一般的な能力と、を実証している。
【０４１５】
本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは図１１Ａ乃至図２０で説明されたように、固定化され、ウラニルアセテートで染色され、湿った状態において、走査電子ビームの異なるエネルギーレベル１２ＫｅＶ、１５ＫｅＶ及び２５ＫｅＶで各々画像形成された、ＣＨＯ細胞のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９５Ａ、９５Ｂ及び９５Ｃを参照する。図９５Ａは、仕切り膜に垂直な方向に細胞の全厚さよりもかなり薄い仕切り膜２１０に最近接した細胞３２６０の層を独占的に示している。図９５Ｂ及び図９５Ｃは、仕切り膜から漸次より大きな距離のところの細胞の層からの画像への寄与を表している。このように図９５Ａ乃至図９５Ｃは、画像形成の異なる深さを表す、「仮想的区分」を見るため本発明の方法により提供された能力を例示している。この能力は、引き続く３次元画像再構築のための基礎ともなり得る。
【０４１６】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは、図４１Ａ乃至図５０の説明に従って、サンプル容器内への処理無しに挿入され、湿った状態で画像形成された、ハツカネズミ心臓の断片の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９６Ａ及び図９６Ｂを参照する。なお、細胞３２７０の全体的な構成は、図９６Ａ乃至図９６Ｂでより低い倍率で示され、細胞内部詳細構造（細胞核３２７２と、明るい細胞部分３２７４、おそらくはミトコンドリア）は、図９６Ｃでより高い倍率で示されている。例えば、図９６Ａ乃至図９６Ｃに示された膜支持格子は、本発明の方法により提供された、サンプル中の自然な材料分布から画像形成コントラストを発生する能力を再び実証しているが、より重要なことは、外科手術中に採取された生体検査組織又はサンプル等である組織を取得した後、非常に短い時間（５〜１０分）以内でその画像を発生する能力である。
【０４１７】
ここで、本発明の別の好ましい実施例、好ましくは図４１Ａ乃至図５０の記載に従って、更なる染色無しで（図９７Ａ乃至図９７Ｃ）、又は、ウラニルアセテート染色に続いて（図９７Ｄ）、グルタルアルデヒドで固定化され、湿った状態で画像形成された、豚類の脂肪組織の断片のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９７Ａ、９７Ｂ、９７Ｃ及び９７Ｄを参照する。含脂肪細胞（太った細胞）は、大きい（５０〜１００μｍ）暗い楕円体３２８０として示されている。暗い領域は、暗い脂質リッチ領域を取り囲む明るい領域として目に見える（細胞のサイトプラズマ及び細胞核、並びに、細胞外材料）水成材料３２８２により取り囲まれた、含脂肪細胞（大きな脂質小滴）内部の脂質リッチ領域である。脂質は、最も一般的なサンプル準備処置の間に失われ、それにより、本発明の方法は、脂質のための独自の画像形成能力を提供する。組織内の脂質及び他の領域の間の自然のコントラスト差は、ウラニルアセテート染色により細胞核３２８４及びサイトプラズマ３２８６がマークされる図９７Ｄに示されるように、染色を使用して達成することができる。
【０４１８】
ここで、本発明の好ましい実施例、好ましくは図４１Ａ乃至図５０の記載に従って、ホルマリンで固定化され、染色無しにＳＥＭ内に挿入され、湿った状態で画像形成された、ウサギの眼の網膜色素の皮覆組織（ＲＰＥ）の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９８Ａ及び図９８Ｂを参照する。この非染色サンプルでは、示された最も顕著な特徴は、明るいシガー形状の対象として現われる、メラノソーム３２９０である。皮覆組織の輪郭は、この皮覆組織内の細胞の表面上で細繊毛内に座して、メラノソームの略多角形クラスターとして、図９８に概略示されている。図９８Ａ及び図９８Ｂは、本発明の方法を使用して得られる、サンプル内の材料分布からの自然のコントラストを再び実証している。サンプル内の材料は、この場合には、ＲＰＥの細繊毛におけるメラノソーム（細胞内のメラニンの豊富なボディ）である。
【０４１９】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは、図４１Ａ乃至図５０の説明に従って、グルタルアルデヒドで固定化され、染色無しにＳＥＭ内に挿入され、湿った状態で画像形成された、ラットの脊髄の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である、図９９Ａ及び図９９Ｂを参照する。脊髄の全断面を包含する低倍率図を示す、図９９Ａは、より明るい領域３３００と、より暗い領域３３１０とを区別しており、より明るい領域は、ニューロン及びグリア細胞の細胞体の豊富なところであり、より暗い領域は、ミエリン鞘の神経線維が豊富であり、より高い脂質の含有量に起因してより明るい領域から区別されている。これは、図９９Ａの長方形３３２０で示された領域をより高い倍率で示した、図９９Ｂでより詳細に現われている。ここで、軸索が、暗い脂質リッチなミエリン鞘３３４０により取り囲まれた明るい領域３３３０として示されている。図９９Ａ及び図９９Ｂは、成分の間の材料差からきたコントラストに基づいて未染色サンプルで異なる成分を決定する本発明の方法により提供される能力を再び例示している。更には、脂質リッチ相及び水成相の並置を一般に含む神経組織の独自の画像は、ミエリン鞘脱落、トラウマ、及び、再生、炎症、及び、癌を含む、神経障害の研究、診断及び処理の重要な能力を与えることができる。
【０４２０】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは、図４１Ａ乃至図５０の説明に従って、ホルムアルデヒドで固定化され、ウラニルアセテートで染色され、湿った状態で画像形成された、ハツカネズミの膵臓の断片の、走査電子ビームの異なるエネルギーレベルにおけるＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１００Ａ及び図１００Ｂを参照する。３０ｋＶの電子ビームエネルギーで取られた顕微鏡写真図である、図１００Ａは、外分泌腺膵臓の幾つかの腺房３３４０の組織を示している。細胞のエッジは、一般に目に見える。１５ｋＶの電子ビームエネルギーで取られた図１００Ｂは、より低いエネルギー電子のより限定された貫通に起因した、仕切り膜（図４１の１２１０）に近接して配置された細胞外基質３３５０の繊維のみを示している。図１００Ａ乃至図１００Ｂは、湿った状態で画像形成されたサンプルの３次元情報を得るための本発明の方法により提供される能力を実証している。更には、図１００Ｂは、細胞外基質の構造を湿った状態で画像形成する能力を実証している。
【０４２１】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは、図４１Ａ乃至図５０の記載に従って、ホルムアルデヒドでコテかされ、ウラニルアセテートで染色され、湿った状態で画像形成された、ハツカネズミの膵臓、ラットの尾、マウスの十二指腸の断片の、各々のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１０１Ａ、１０１Ｂ及び図１０１Ｃを参照する。図１０１Ａ、１０１Ｂ及び１０１Ｃ、並びに、図１００Ｂにおける画像は、膵臓（３３６０）、尾（３３７０）及び十二指腸（３３８０）の細胞外基質の繊維を示している。かくして、本発明の方法は、異なる組織及び病理状態において劇的に構造が異なる、ＥＣＭの独自の見方を提供する。この構造は、一般の顕微鏡検査のための他の方法がなされるように、サンプルが脱水又は凍結するとき破壊される可能性がある。
【０４２２】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは、図４１Ａ〜５０の記載に従って、血管局所潅流により固定化され、ウラニルアセテートで染色され、湿った状態で画像形成された、ハツカネズミの腎臓の断片のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１０２Ａ、１０２Ｂ、図１０２Ｃ及び１０２Ｄを参照する。図１０２Ａは、外皮から取られた、糸球体の一部を示し、図１０２Ｂは、同じもののより高い倍率の画像である。明瞭に見えるものは、細胞の細胞核３３９０と基底膜３３９２とである。図１０２Ｃは、髄質の領域の顕微鏡写真図であり、図１０２Ｄは、同じもののより高い倍率の画像である。該図には、腎臓の尿細管３３９４が、皮覆組織細胞３３９６及び基底膜３３９８と共に、示されている。図１０２Ａ乃至１０２Ｄは、乾燥、凍結、埋め込み、又は、薄片化無しに、組織断片の高い倍率及び解像度で画像を得るという本発明の方法により提供される一般的な能力を実証しており、例えば、糸球体及び管状基底膜等、医療及び診断上で重要なものの特徴の詳細図を与えている。
【０４２３】
本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは、図４１Ａ乃至図５０の記載に従って、ホルムアルデヒドで固定化され、ウラニルアセテートで染色され、湿った状態で画像形成された、ラットの心臓筋肉の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１０３Ａ及び図１０３Ｂを参照する。組織の細胞組織は、図１０３Ａに明瞭に示されている。図１０３Ｂで使用されるより高い倍率は、心臓筋肉細胞の筋状の構造等の細胞内部特徴を明らかにする。図１０３Ａ乃至図１０３Ｂは、高い解像度で様々な構造を画像形成するという本発明の方法により提供される能力を更に実証している。心臓及び他の筋状筋肉を画像形成する特定の能力は、心臓筋疾患、筋肉変性疾患を含む、心臓及び骨格筋肉の異常に関する、研究、診断及び処理に有用となり得る。
【０４２４】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは、図４１Ａ乃至図５０の記載に従って、ホルムアルデヒドで固定化され、ウラニルアセテートで染色され、湿った状態で画像形成された、人間の甲状腺の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１０４Ａ及び図１０４Ｂを参照する。図１０４Ａは、濾胞細胞３４０２の皮覆組織により取り囲まれた、甲状腺濾胞３４００の管腔と、濾胞を取り囲む接続組織３４０４の領域とを示している。図１０４Ｂは、濾胞細胞３４０２を含む濾胞３４００の領域のより高い倍率を示している。濾胞細胞の間の接続部３４０６は、ほとんど多角形の配列で明るい染色された薄いラインとして明瞭に示されている。図１０４Ａ及び１０４Ｂは、本発明の方法により提供される能力を実証している。
【０４２５】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に従って、好ましくは、図４１Ａ乃至図５０の記載に従って、ホルムアルデヒドで固定化され、ウラニルアセテートで染色され、湿った状態で画像形成された、ラットの胸腺のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１０５を参照する。異なる細胞種類が、それらが相互に配列されるように、示されている（リンパ球３４１０及びマクロファージ３４１２）。例えば、リンパ球及びマクロファージ等の赤血球形成細胞の画像形成及び同定は、炎症、自己免疫病、動脈病、傷治療及び癌を含む様々な病気の研究、診断及び処理において有用性を持ち得るが、これらの例に限定されるものではない。
【０４２６】
ここで、本発明の更に別の好ましい実施例に従って、好ましくは、図４１Ａ乃至図５０の記載に従って、湿った状態で画像形成された、免疫標識形成されたラットの腎臓のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１０６Ａ及び図１０６Ｂを参照する。雄のラットは、Ｄリモネンで処理され、特に、腎臓の皮質細管におけるアルファ−２マイクログロブリンの蓄積をもたらす（クリスチアンセン及びマッドセン、１９９５）。ラットは犠牲にされ、その腎臓が血管局所潅流により固定化され、断片へと切断され、該断片は、抗アルファ−２マイクログロブリン抗体で処理され、次に２次抗体が０．８ｎｍの金コロイドに連結され、最後に、銀強化処理により処理される。図１０６Ａは、このように標識形成され画像形成された腎臓の断片の画像を示している。図１０６Ｂは、抗アルファ−２マイクログロブリン抗体が省略されたという点を除いて、同一工程で処理された、腎臓の同じ一般領域からの別の断片を示している。免疫標識が、銀強化金コロイドを表す明るいスポット３４２０として図１０６Ａに示されている。ここで、そのような免疫標識が図１０６Ｂには存在せず、標識形成の特異性を実証している。図１０６Ａ及び図１０６Ｂは、湿った、スライス切りされていない組織サンプルにおける特異的な生体分子を高い解像度で視覚化している。そのような能力は、病気の研究、診断及び処理において重要であり得る。
【０４２７】
ここで、本発明の更に別の好ましい実施例に従って、好ましくは、図１８Ａ乃至図２０に示されるように、ＳＥＭ内に直接挿入され、２つの異なる倍率で画像形成された、市販の牛乳（１．５％）のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１０７Ａ及び図１０７Ｂを参照する。ミルクは、乳濁液であり、水成媒体中に脂質小滴を含んでいる。図１０７Ａ乃至図１０７Ｂは、ミルクの水成媒体である明るい背景３４３２上の暗い領域として様々なサイズの脂質小滴３４３０を示している。図１０７Ｂは、より高い倍率で、画像のおおよその解像度を画定する１２０ｎｍ程度の大きさの脂質小滴（３４３４）を示している。
【０４２８】
ここで、本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは、図１８Ａ乃至図２０に示されるように、ＳＥＭ内に直接挿入され、２つの異なる倍率で画像形成された、新鮮な人間の乳のＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１０８Ａ及び図１０８Ｂを参照する。脂質小滴３４３６は、図１０７Ａ及び図１０７Ｂの液滴小滴３４３２とは異なる全体形状及び細部分布を備えた暗いスポットとして図１０７Ａ及び図１０７Ｂに示されている。図１０７Ａ乃至図１０８Ｂは、走査型電子顕微鏡において、乳濁液をそれが何であれ、処理無しに画像形成するという本発明の方法により提供される能力を実証している。そのような能力は、生物学的流体、食品、化粧品、及び、調剤薬を含む様々なサンプルの研究、分析及び品質保証における使用において発揮される。
【０４２９】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に従って、ＳＥＭ互換性サンプルエンクロージャ内に形成されたピロアンチモン酸塩の結晶の、湿った状態で画像形成されたＳＥＭ顕微鏡写真図である、図１０９を参照する。ヒーラー細胞は、図９０Ａ及び図９０Ｂを参照して記載されたように、サンプル容器内で成長する。これらの細胞は、２％（ｗ／ｖ）ピロアンチモン酸カリウム及び４％グルタルアルデヒドの溶液中で固定化される。培養の間、ピロアンチモン酸の結晶は、細胞のところで大部分は核を形成し、多重リッジ３４３８として見えている。図１０９は、結晶化プロセスを画像形成するという本発明の方法により提供された能力を実証している。そのような能力は、調剤薬及び他の工業調合剤を含む様々なサンプルの研究、分析及び品質保証における使用において発揮される。
【０４３０】
ここで、本発明の更に別の好ましい実施例に従って、好ましくは、図５８Ａ乃至図７７に従って、走査型電子顕微鏡における後方散乱電子検出及び光検出により各々得られた、ＣＨＯ細胞の顕微鏡写真図である、図１１０Ａ及び図１１０Ｂを参照する。これらの細胞は、仕切り膜２１１０上で成長し、例えば固定化又は染色等の処理無しに直接画像形成される。図１１０Ａは、図８９に示されるものに略類似した画像を示している。即ち図１１０Ａによれば、細胞の概略的輪郭３４４０と、細胞核を示す明るい領域３４４２と、脂質小滴を示す暗いスポット３４４４と、が示されている。この画像におけるコントラストは、電子後方散乱の反射効率における材料差に起因している。図１１０Ｂは、ＳＥＭ走査の間にサンプルから放射された光子から導き出された、同時的に得られた画像である。この画像では、細胞の輪郭３４５０は、細胞核を示す明るい領域３４５２と、脂質小滴を示す暗い領域３４５４と、が表されている。図１１０Ｂにおけるコントラストは、図１１０Ａにおけるコントラストとは全体として異なる機構から、即ち陰極ルミネッセンスの効率から導き出されている。この場合には、陰極ルミネッセンス画像は、標本内部の材料分布に関する独自の情報を生じさせることができる。
【０４３１】
本発明の好ましい実施例に従って、好ましくは、図５８Ａ乃至図７７に従って、走査型電子顕微鏡における後方散乱電子検出及び光検出により各々得られた、２００ｎｍ直径の蛍光性ビーズ（アメリカ合衆国、インディアナ州、ＢＬＩから、サーフグリーン蛍光色素を備えたポリスチレンビーズ）の顕微鏡写真図である、図１１１Ａ及び図１１１Ｂを参照する。図１１１Ａで後方散乱電子画像でかろうじて識別可能であるビード３４６０は、図１１１Ｂでは、明るい陰極ルミネッセンス球体３４６２として示されている。図１１１Ａ及び図１１１Ｂは、光学顕微鏡で利用可能であるものを超える解像度で、光放射を画像形成するという本発明の方法により提供された能力を実証する。
【０４３２】
ここで、本発明の好ましい実施例に従ってＸ線検出を使用したサンプルのＳＥＭ検査の顕微鏡写真図である、図１１２Ａ及び図１１２Ｂを参照する。図１１２Ａは、図１１Ａ乃至図２０に示されたようなサンプル容器内の水中のヒーラー細胞の水成サンプルの、Ｘ線分光計を使用したＳＥＭ検査結果を示している。当該分析結果は、主要成分としての酸素３４７４を、より少ない量の炭素３４７２と共に同定している。これらは、水中の細胞の分析から予想された結果である。図１１２Ｂは、真空グリースの類似の分析を示している。即ち、炭素３４７６、酸素３４７７、及び、フッ素３４７８が、主要な元素である。
【０４３３】
ここで、本発明の好ましい実施例に係る、患者を検査するための方法を示す概略図である、図１１３を参照する。少なくとも１つのサンプルが、患者から得られており、該患者は、サンプルを取得する前の処理をオプションで受けていてもよい。少なくとも１つのサンプルは、当該技術分野で知られている方法、例えば、血液サンプルの抜き出し、経口抜き取り、脳脊髄流体の抜き出し、尿、唾液若しくは排泄物の取得、洗浄、組織生体検査、外科切開、又は、検死解剖等によって、得ることができる。
【０４３４】
少なくとも１つのサンプルは、本発明の方法に従って、ＳＥＭで検査される。オプションで、サンプルは、画像形成前のサンプル準備工程無しで検査されてもよく、又は、オプションの固定化、染色又はそれらの組み合わせ工程の後、検査されてもよい。本発明の別の実施例では、患者からの別個のサンプル又は該患者のサンプルの別個の部分を、追加の情報を得るように、各々異なるプロトコルを使用して、ＳＥＭ検査のため準備し、又は、検査することができる。
【０４３５】
ここで、本発明の別の好ましい実施例に係る、実験動物への処置効果をテストするための方法を示す概略図である、図１１４を参照する。そのようなテストは、例えば、薬剤、環境、栄養又は職業上の条件の毒性又は疑わしい毒性をテストする際に、薬剤発見又は開発における工程として使用することができる。少なくとも１つのサンプルが、少なくとも１つの動物から得られ、該動物は、サンプルを取得する前の処理をオプションで受けていてもよい。少なくとも１つのサンプルは、当該技術分野で知られている方法、例えば、血液サンプルの抜き出し、経口抜き取り、脳脊髄流体の抜き出し、尿、唾液若しくは排泄物の取得、洗浄、組織生体検査、又は、生きている若しくは死んでいる動物の解剖等によって、得ることができる。
【０４３６】
少なくとも１つのサンプルは、本発明の方法に従って、ＳＥＭで検査される。オプションで、サンプルは、画像形成前のサンプル準備工程無しで検査されてもよく、又は、オプションの固定化、染色又はそれらの組み合わせ工程の後、検査されてもよい。本発明の別の実施例では、動物からの別個のサンプル又は該動物のサンプルの別個の部分を、追加の情報を得るように、各々異なるプロトコルを使用して、ＳＥＭ検査のため準備し、又は、検査することができる。
【０４３７】
ここで、本発明の方法に係る、ＳＥＭ検査を含む製造プロセスの概略図である、図１１５を参照する。かくして、原料、製造プロセスの中間製造物及び製造品を含む、製造プロセスの任意のステージから導き出された実体のサンプルを検査することができる。これらの実体のサンプルは、本発明の方法に係るＳＥＭで取得し、検査される。オプションで、画像形成前のサンプル準備工程無しで、又は、オプションの固定化、染色又はそれらの組み合わせの後に、サンプルを検査することができる。本発明の別の実施例では、実体からの別個のサンプル、又は、実体のサンプルの別個の部分を、追加の情報を得るように、各々異なるプロトコルを使用して、ＳＥＭ検査のため準備し、又は、検査することができる。次に、ＳＥＭ検査の結果は、品質基準に基づいて評価され、原料、製造プロセスの中間製造物及び製造品の個々のもの又はそれらのバッチを受諾するか又は却下する決定がなされる。
【０４３８】
ここで、医薬物、又は、販売中止若しくは既知の有毒物質を生物検定するための方法の概略図である、図１１６を参照する。細胞が、図１Ａ乃至図８４のうち任意のものに記載されているような１つ以上のサンプルエンクロージャへと導入され、医薬品、又は、疑わしいか若しくは既知の毒物が細胞に適用される。これらの細胞は、本発明の方法に従って、ＳＥＭ内で検査される。オプションで、画像形成前のサンプル準備工程無しで、又は、オプションの固定化、染色又はそれらの組み合わせの後に、サンプルを検査することができる。本発明の別の実施例では、別個のサンプル容器内の細胞を、追加の情報を得るように、各々異なるプロトコルを使用して、ＳＥＭ検査のため準備し、又は、検査することができる。ＳＥＭ検査の結果は、分析され、その分析結果は、医薬品、又は、疑わしいか若しくは既知の毒物の効果を評価するため適用される。
【０４３９】
本発明は、特定に示され、上述されたものに限定されないことは当業者により認められよう。本発明の範囲は、前記した明細書を読むとき当業者に想到され、従来技術には存在しないような、上述された様々な特徴の組み合わせ及びサブコンビネーションの両方、並びに、それらの変形及び変更を網羅している。
【図面の簡単な説明】
【０４４０】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解されたＳＥＭ互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、図１Ａ及び図１Ｂの容器のサブアッセンブリの、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、図１Ａ乃至図２ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を部分的に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、図１Ａ乃至図３ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を完全に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略図である。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、図３Ａ及び図３Ｂで、各々、ラインＶＡ−ＶＡ及びラインＶＢ−ＶＢに沿って取られた、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図６】図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、図１Ａ乃至図５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である。
【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ及び７Ｅは、図１Ａ乃至図６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、細胞成長、液体除去、液体追加、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である。
【図８】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、図１Ａ乃至図６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルを含む液体、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である。
【図９】図９は、図１Ａ乃至図６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である。
【図１０】図１０は、図９の状況においてサンプルのＳＥＭ検査状態を拡大した簡略図である。
【図１１】図１１Ａ及び図１１Ｂは、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解されたＳＥＭ互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、図１１Ａ及び図１１Ｂの容器のサブアッセンブリの、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図１３】図１３Ａ及び図１３Ｂは、図１１Ａ乃至図１２ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を部分的に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図１４】図１４Ａ及び図１４Ｂは、図１１Ａ乃至図１３ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を完全に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略図である。
【図１５】図１５Ａ及び図１５Ｂは、図１３Ａ及び図１３Ｂで、各々、ラインＸＶＡ−ＸＶＡ及びラインＸＶＢ−ＸＶＢに沿って取られた、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図１６】図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃは、図１１Ａ乃至図１５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である。
【図１７】図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ及び１７Ｅは、図１１Ａ乃至図１６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、細胞成長、液体除去、液体追加、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である。
【図１８】図１８Ａ、１８Ｂ及び１８Ｃは、図１１Ａ乃至図１６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルを含む液体、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である。
【図１９】図１９は、図１１Ａ乃至図１６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である。
【図２０】図２０は、図１９の状況においてサンプルのＳＥＭ検査状態を拡大した簡略図である。
【図２１】図２１Ａ及び図２１Ｂは、図１Ａ乃至図２０に示された型式のＳＥＭ互換性サンプル容器で使用する顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーの簡略的な分解図である。
【図２２】図２２Ａ及び図２２Ｂは、顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーを、覆われていない状態、及び、覆われて組み立てられた状態で各々示した、簡略図である。
【図２３】図２３Ａ、２３Ｂ及び２３Ｃは、吸引装置及びピペットを伴った、図２１Ａ乃至図２２Ｂの顕微鏡検査前の多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図２４Ａ】図２４Ａは、図１Ａ乃至図１０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、図１Ａ乃至図１０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、図１Ａ乃至図１０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図２５Ａ】図２５Ａは、図１１Ａ乃至図２０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、図１１Ａ乃至図２０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、図１１Ａ乃至図２０で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図２６】図２６Ａ及び図２６Ｂは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図２７】図２７Ａ及び図２７Ｂは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図２８】図２８は、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である。
【図２９】図２９は、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である。
【図３０】図３０は、本発明の更に別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である。
【図３１】図３１Ａ及び図３１Ｂは、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解されたＳＥＭ互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図３２】図３２Ａ及び図３２Ｂは、図３１Ａ及び図３１Ｂの容器のサブアッセンブリの、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図３３】図３３Ａ及び図３３Ｂは、図３１Ａ乃至図３２ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を部分的に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図３４】図３４Ａ及び図３４Ｂは、図３１Ａ乃至図３３ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を完全に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略図である。
【図３５】図３５Ａ及び図３５Ｂは、図３３Ａ及び図３３Ｂで、各々、ラインＸＸＸＶＡ−ＸＸＸＶＡ及びラインＸＸＸＶＢ−ＸＸＸＶＢに沿って取られた、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図３６】図３６Ａ、３６Ｂ及び３６Ｃは、図３１Ａ乃至図３５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である。
【図３７】図３７は、図３１Ａ乃至図３６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルを含む組織とＳＥＭへの挿入とを示す、簡略図及び断面図である。
【図３８】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ及び３８Ｄは、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、作動の様々な段階及びＳＥＭへの挿入を各々示す該ＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様の簡略断面図である。
【図３９】図３９は、図３１Ａ乃至図３７のＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である。
【図４０】図４０は、図３９の状況においてサンプルのＳＥＭ検査状態を拡大した簡略図である。
【図４１】図４１Ａ及び図４１Ｂは、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解されたＳＥＭ互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図４２】図４２Ａ及び図４２Ｂは、図４１Ａ及び図４１Ｂの容器のサブアッセンブリの、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図４３】図４３Ａ及び図４３Ｂは、図４１Ａ乃至図４２ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を部分的に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図４４】図４４Ａ及び図４４Ｂは、図４１Ａ乃至図４３ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を完全に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略図である。
【図４５】図４５Ａ及び図４５Ｂは、図４３Ａ及び図４３Ｂで、各々、ラインＸＬＶＡ−ＸＬＶＡ及びラインＸＬＶＢ−ＸＬＶＢに沿って取られた、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図４６】図４６Ａ、４６Ｂ及び４６Ｃは、図４１Ａ乃至図４５ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である。
【図４７】図４７は、図４１Ａ乃至図４６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルを含む組織及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図及び簡略図である。
【図４８】図４８Ａ、４８Ｂ、４８Ｃ及び４８Ｄは、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、作動の様々な段階及びＳＥＭへの挿入を各々示す該ＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様の簡略断面図である。
【図４９】図１９は、図１１Ａ乃至図１６ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である。
【図５０】図５０は、図４９の状況においてサンプルのＳＥＭ検査状態を拡大した簡略図である。
【図５１Ａ】図５１Ａは、図３１Ａ乃至図４０に示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する顕微鏡検査用の多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５１Ｂ】図５１Ｂは、図３１Ａ乃至図４０に示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する顕微鏡検査用の多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５１Ｃ】図５１Ｃは、図３１Ａ乃至図４０に示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する顕微鏡検査用の多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５２Ａ】図５２Ａは、図４１Ａ乃至図５０に示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する顕微鏡検査用の多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５２Ｂ】図５２Ｂは、図４１Ａ乃至図５０に示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する顕微鏡検査用の多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５２Ｃ】図５２Ｃは、図４１Ａ乃至図５０に示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する顕微鏡検査用の多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５３Ａ】図５３Ａは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５３Ｂ】図５３Ｂは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５４Ａ】図５４Ａは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５４Ｂ】図５４Ｂは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図５５】図５５は、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である。
【図５６】図５６は、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である。
【図５７】図５７は、本発明の更に別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である。
【図５８】図５８Ａ及び図５８Ｂは、本発明の更に別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解されたＳＥＭ互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図５９】図５９Ａ及び図５９Ｂは、図５８Ａ及び図５８Ｂの容器のサブアッセンブリの、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図６０】図６０Ａ及び図６０Ｂは、図５８Ａ乃至図５９ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を部分的に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図６１】図６１Ａ及び図６１Ｂは、図５８Ａ乃至図５９ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を完全に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略図である。
【図６２】図６２Ａ及び図６２Ｂは、図６０Ａ及び図６０Ｂで、各々、ラインＬＸＩＩＡ−ＬＸＩＩＡ及びラインＬＸＩＩＢ−ＬＸＩＩＢに沿って取られた、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図６３】図６３Ａ、６３Ｂ及び６３Ｃは、図５８Ａ乃至図６２ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である。
【図６４】図６４Ａ、６４Ｂ、６４Ｃ、６４Ｄ及び６４Ｅは、図５８Ａ乃至図６３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、細胞成長、液体除去、液体追加、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である。
【図６５】図６５Ａ、６５Ｂ及び６５Ｃは、図５８Ａ乃至図６３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルを含む液体、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である。
【図６６】図６６は、図５８Ａ乃至図６３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である。
【図６７】図６７は、図６６の状況においてサンプルのＳＥＭ検査状態を拡大した簡略図である。
【図６８】図６８Ａ及び図６８Ｂは、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、分解されたＳＥＭ互換性サンプル容器の、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図６９】図６９Ａ及び図６９Ｂは、図６８Ａ及び図６８Ｂの容器のサブアッセンブリの、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図７０】図７０Ａ及び図７０Ｂは、図６８Ａ乃至図６９ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を部分的に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略的な分解図である。
【図７１】図７１Ａ及び図７１Ｂは、図６８Ａ乃至図６９ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器を完全に組み立てた状態で示した、各々反対側に向いた簡略図である。
【図７２】図７２Ａ及び図７２Ｂは、図７０Ａ及び図７０Ｂで、各々、ラインＬＸＸＩＩＡ−ＬＸＸＩＩＡ及びラインＬＸＸＩＩＢ−ＬＸＸＩＩＢに沿って取られた、各々反対側に向いた簡略的な部分図の部分断面図である。
【図７３】図７３Ａ、７３Ｂ及び７３Ｃは、図６８Ａ乃至図７２ＢのＳＥＭ互換性サンプル容器の作動態様を作動の３段階で各々示した３つの断面図である。
【図７４】図７４Ａ、７４Ｂ、７４Ｃ、７４Ｄ及び７４Ｅは、図６８Ａ乃至図７３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、細胞成長、液体除去、液体追加、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である。
【図７５】図７５Ａ、７５Ｂ及び７５Ｃは、図６８Ａ乃至図７３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルを含む液体、密封及びＳＥＭへの挿入の各状態の簡略断面図である。
【図７６】図７６は、図６８Ａ乃至図７３ＣのＳＥＭ互換性サンプル容器を使用した、サンプルのＳＥＭ検査の簡略図及び断面図である。
【図７７】図７７は、図７６の状況においてサンプルのＳＥＭ検査状態を拡大した簡略図である。
【図７８Ａ】図７８Ａは、図５８Ａ乃至図６７で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図７８Ｂ】図７８Ｂは、図５８Ａ乃至図６７で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図７８Ｃ】図７８Ｃは、図５８Ａ乃至図６７で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図７９Ａ】図７９Ａは、図６８Ａ乃至図７７で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図７９Ｂ】図７９Ｂは、図６８Ａ乃至図７７で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図７９Ｃ】図７８Ｃは、図６８Ａ乃至図７７で示された型式のＳＥＭ互換性サンプル皿部で使用する、顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図８０Ａ】図８０Ａは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図８０Ｂ】図８０Ｂは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図８１Ａ】図８１Ａは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図８１Ｂ】図８１Ｂは、本発明の好ましい実施例に係る、複数のＳＥＭ互換性サンプル容器を形成する顕微鏡検査用多重サンプルホルダーの簡略図である。
【図８２】図８２は、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である。
【図８３】図８３は、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である。
【図８４】図８４は、本発明の更に別の好ましい実施例に従って構成され、作動するＳＥＭベースのサンプル検査システムの簡略図である。
【図８５】図８５は、本発明の別の好ましい実施例に従って構成され、作動する、サンプルＳＥＭ検査の簡略部分図の部分断面図である。
【図８６Ａ】図８６Ａは、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動する、組織サンプル切り取りアッセンブリの簡略部分図の部分断面図である。
【図８６Ｂ】図８６Ｂは、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動する、組織サンプル切り取りアッセンブリの簡略部分図の部分断面図である。
【図８７Ａ】図８７Ａは、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動する、組織サンプル切り取りアッセンブリの簡略部分図の部分断面図である。
【図８７Ｂ】図８７Ｂは、本発明の好ましい実施例に従って構成され、作動する、組織サンプル切り取りアッセンブリの簡略部分図の部分断面図である。
【図８８】図８８は、本発明の好ましい実施例に係る、非真空下で湿った生体環境サンプルを電子顕微鏡検査するための方法を含む、主要工程の概略図である。
【図８９】図８９は、本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、培養されたチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９０】図９０Ａ及び図９０Ｂは、本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ヒーラー細胞のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９１】図９１Ａ及び図９１Ｂは、本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成されたＡ４３１細胞の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９２】図９２は、本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ヒーラー細胞のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９３】図９３Ａ、９３Ｂ及び９３Ｃは、本発明の別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ヒーラー細胞のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９４】図９４Ａ及び９４Ｂは、本発明の更に別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、大腸菌バクテリア及び枯草菌バクテリアのＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９５】図９５Ａ、９５Ｂ及び９５Ｃは、本発明のなお別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成されたＣＨＯ細胞の、走査電子ビームの異なるエネルギーレベルで取られたＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９６】図９６Ａ及び図９６Ｂは、本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ハツカネズミの心臓の断片の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９７】図９７Ａ、９７Ｂ、９７Ｃ及び９７Ｄは、本発明の別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、豚類の脂肪組織の断片のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９８】図９８Ａ及び図９８Ｂは、本発明の更に別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ウサギの眼の網膜色素の皮覆組織（ＲＰＥ）の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図９９】図９９Ａ及び図９９Ｂは、本発明の更に別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ラットの脊髄の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１００】図１００Ａ及び図１００Ｂは、本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ハツカネズミの膵臓の断片の、走査電子ビームの異なるエネルギーレベルにおけるＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１０１】図１０１Ａ、１０１Ｂ及び図１０１Ｃは、本発明の別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ハツカネズミの膵臓、ラットの尾、マウスの十二指腸の断片の、各々のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１０２】図１０２Ａ、１０２Ｂ、図１０２Ｃ及び１０２Ｄは、本発明の更に別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ハツカネズミの腎臓の断片のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１０３】図１０３Ａ及び図１０３Ｂは、本発明のなお別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ラットの心臓筋肉の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１０４】図１０４Ａ及び図１０４Ｂは、本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、人間の甲状腺の、２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１０５】図１０５は、本発明の別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ラットの胸腺のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１０６】図１０６Ａ及び図１０６Ｂは、本発明の更に別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、免疫標識形成されたラットの腎臓のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１０７】図１０７Ａ及び図１０７Ｂは、本発明の更に別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、市販の１．５％脂肪牛乳の２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１０８】図１０８Ａ及び図１０８Ｂは、本発明の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、新鮮な人間の乳の２つの異なる倍率におけるＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１０９】図１０９は、本発明の別の好ましい実施例に従って準備され、画像形成された、ピロアンチモン酸塩の結晶のＳＥＭ顕微鏡写真図である。
【図１１０】図１１０Ａ及び図１１０Ｂは、本発明の更に別の好ましい実施例に従って、走査型電子顕微鏡において、後方散乱電子検出及び光検出により各々得られた、ＣＨＯ細胞の顕微鏡写真図である。
【図１１１】図１１１Ａ及び図１１１Ｂは、本発明のなお別の好ましい実施例に従って、走査型電子顕微鏡において、後方散乱電子検出及び光検出により各々得られた、蛍光性ビーズの顕微鏡写真図である。
【図１１２】図１１２Ａ及び図１１２Ｂは、本発明の好ましい実施例に従ってＸ線検出を使用したサンプルのＳＥＭ検査の顕微鏡写真図である。
【図１１３】図１１３は、本発明の好ましい実施例に係る、患者を検査するための方法を示す概略図である。
【図１１４】図１１４は、本発明の別の好ましい実施例に係る、実験動物への処置効果をテストするための方法を示す概略図である。
【図１１５】図１１５は、本発明の更に別の好ましい実施例に係る、ＳＥＭ検査を含む製造プロセスの概略図である。
【図１１６】図１１６は、本発明のなお別の好ましい実施例に係る、医薬物、又は、販売中止若しくは既知の有毒物質を生物検定するための方法の概略図である。
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【図９】
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【図１０】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４７】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１Ｃ】
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【図５２Ｃ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図６６】
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【図６７】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８Ｃ】
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【図７９Ｃ】
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【図８０Ｂ】
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【図８１Ｂ】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６Ａ】
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【図８６Ｂ】
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【図８７Ａ】
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【図８７Ｂ】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９２】
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【図１０５】
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【図１０９】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【国際調査報告】
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