(57)【要約】  高精度の計測を実現するべく電気穿孔システムにおける抵抗の計測を安定化させると共に、電気穿孔パルスのパルス持続時間（即ち、時定数）を制御するシステム、方法、及び装置である。例えば、電気穿孔キュベット内に提供されたサンプルなどの電気穿孔システムにおけるサンプルの抵抗を正確に判定するための回路が提供されている。更には、サンプルの抵抗を自動的に計測し、静電容量を判定すると共に、電気穿孔パルスの所望のパルス持続時間（時定数）を実質的に提供する並列付加抵抗を判定するための抵抗制御システムが提供されている。
2005511097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気穿孔システムにおいて、所望の持続時間にわたって、サンプルに電気パルスを印加する方法であって、
所望のパルス持続時間を識別する段階と、
前記サンプルの抵抗Ｒｓを自動的に計測する段階と、
前記サンプルと直列に配置される静電容量Ｃを自動的に選択する段階と、
時定数Ｔ＝Ｃ×Ｒ（ここで、Ｒ＝（Ｒｓ×Ｒ２）／（Ｒｓ＋Ｒ２）である）が前記所望のパルス持続時間と実質的に等しくなるように、前記サンプルと並列に配置される抵抗Ｒ２を自動的に判定する段階と、
を有する方法。
【請求項２】
識別段階は、パルス持続時間をユーザー入力として受領する段階を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
静電容量Ｃを選択する段階は、一定範囲の静電容量値の中から、前記所望の時定数をわずかに上回る時定数を実現する最小限の静電容量値を選択する段階を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
一定範囲の抵抗値の中から、前記判定された抵抗Ｒ２に最も近い抵抗値を選択する段階を更に含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
複数のコンデンサ及び抵抗器の中からコンデンサと抵抗器を選択して前記サンプルに接続する段階を更に有し、前記コンデンサ及び抵抗器は、前記選択した静電容量Ｃ及び判定された抵抗Ｒ２に実施的に等しい値を有している請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルの抵抗Ｒｓを自動的に計測する段階は、
結合コンデンサ及び駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第１入力信号を印加する段階であって、前記第１入力信号は、第１周波数ｆ１を有する入力電圧Ｅｉｎを有しており、前記駆動抵抗器回路は、抵抗Ｒ１を有している、段階と、
前記第１周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ１を計測する段階と、
前記駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第２入力信号を印加する段階であって、前記第２入力信号は、第２周波数ｆ２を有する前記入力電圧Ｅｉｎを有している、段階と、
前記第２周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ２を計測する段階と、
前記結合コンデンサの前記静電容量を使用することなしに、Ｅｉｎと前記計測された値Ｅ１及びＥ２を使用して前記サンプル抵抗Ｒｓを判定する段階と、
を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
電気穿孔システムにおいて、サンプルの抵抗を自動的に判定する方法であって、
結合コンデンサ及び駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第１入力信号を印加する段階であって、前記第１入力信号は、第１周波数ｆ１を有する入力電圧Ｅｉｎを有しており、前記駆動抵抗器回路は、抵抗Ｒ１を有している、段階と、
前記第１周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ１を計測する段階と、
前記駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第２入力信号を印加する段階であって、前記第２入力信号は、第２周波数ｆ２を有する前記入力電圧Ｅｉｎを有している、段階と、
前記第２周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ２を計測する段階と、
前記結合コンデンサの静電容量を使用することなしに、Ｅｉｎと前記計測された値Ｅ１及びＥ２を使用して前記サンプル抵抗Ｒｓを判定する段階と、
を有する方法。
【請求項８】
判定段階は、前記駆動回路の抵抗Ｒ１、前記入力電圧Ｅｉｎ、前記計測値Ｅ１及びＥ２、及び前記周波数ｆ１及びｆ２のみを使用して前記サンプル抵抗Ｒｓを判定する段階を含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
判定段階は、次式を使用して前記サンプル抵抗Ｒｓを判定する段階を有する請求項７記載の方法。
Ｒｓ＝［Ｋ３Ｒ１ｆ２（Ｋ３＋Ｋ４）／（Ｋ４ｆ１＋Ｋ３ｆ２）］＋Ｋ３（Ｒ１）２／ｆ１
ここで、Ｋ１＝Ｅｉｎ−Ｅ１、Ｋ２＝Ｅｉｎ−Ｅ２、Ｋ３＝Ｅ１／Ｋ１、Ｋ４＝Ｅ２／Ｋ２である。
【請求項１０】
電気穿孔システムにおいて、サンプルの抵抗を自動的に判定する方法であって、
結合コンデンサ及び駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第１入力信号を印加する段階であって、前記第１入力信号は、第１周波数ｆ１を有する入力電圧Ｅｉｎを有しており、前記駆動抵抗器回路は、抵抗Ｒ１を有している、段階と、
前記第１周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ１の第１計測値を取得する段階と、
前記結合コンデンサ及び駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第２入力信号を印加する段階であって、前記第２入力信号は、第２周波数ｆ２を有する前記入力電圧Ｅｉｎを有している、段階と、
前記第２周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ２の第２計測値を取得する段階と、
前記第１及び第２計測値間における前記結合コンデンサの静電容量Ｃの変化とは無関係にＲｓが判定されるように、Ｅｉｎと前記計測値Ｅ１及びＥ２を使用して前記サンプル抵抗Ｒｓを判定する段階と、
を有する方法。
【請求項１１】
電気穿孔システムにおいて、所望の持続時間にわたって、サンプルに電気パルスを印加するシステムであって、
所望のパルス持続時間を識別する手段と、
前記サンプルの抵抗Ｒｓを自動的に計測する手段と、
前記サンプルと直列に配置される静電容量Ｃを自動的に選択する手段と、
時定数Ｔ＝Ｃ×Ｒ（ここで、Ｒ＝（Ｒｓ×Ｒ２）／（Ｒｓ＋Ｒ２）である）が前記所望のパルス持続時間と実質的に等しくなるように、前記サンプルと並列に配置される抵抗Ｒ２を自動的に判定する手段と、
を有するシステム。
【請求項１２】
前記サンプルの前記抵抗Ｒｓを自動的に計測する前記手段は、
結合コンデンサ及び駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第１入力信号を印加する手段であって、前記第１入力信号は、第１周波数ｆ１を有する入力電圧Ｅｉｎを有しており、前記駆動抵抗器回路は、抵抗Ｒ１を有している、手段と、
前記第１周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ１を計測する手段と、
前記駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第２入力信号を印加する手段であって、前記第２入力信号は、第２周波数ｆ２を有する前記入力信号Ｅｉｎを有している、手段と、
前記第２周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ２を計測する手段と、
前記結合コンデンサの前記静電容量を使用することなしに、Ｅｉｎと前記計測値Ｅ１及びＥ２を使用して前記サンプル抵抗Ｒｓを判定する手段と、
を含む請求項１１記載のシステム。
【請求項１３】
電気穿孔システムにおいて、サンプルの抵抗を自動的に判定するシステムであって、
結合コンデンサ及び駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第１入力信号を印加する手段であって、前記第１入力信号は、第１周波数ｆ１を有する入力電圧Ｅｉｎを有しており、前記駆動抵抗器回路は、抵抗Ｒ１を有している、手段と、
前記第１周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ１を計測する手段と、
前記駆動抵抗器回路の両端において、前記サンプルに第２入力信号を印加する手段であって、前記第２入力信号は、第２周波数ｆ２を有する前記入力電圧Ｅｉｎを有している、手段と、
前記第２周波数における前記サンプルの両端の電圧Ｅ２を計測する手段と、
前記結合コンデンサの静電容量を使用することなしに、Ｅｉｎと前記計測値Ｅ１及びＥ２を使用して前記サンプル抵抗Ｒｓを判定する手段と、
を有するシステム。
【請求項１４】
サンプルの抵抗を判定するべく構成された電気穿孔システム内の回路構成であって、
結合コンデンサ及び駆動抵抗器の両端において、サンプルに正弦波電圧信号を供給する信号源と、
前記信号源に接続された周波数スイッチであって、前記信号源によって印加される前記電圧信号の周波数を調節するべく構成された周波数スイッチと、
前記周波数スイッチ、前記信号源の出力、及び前記サンプルに接続されたマイクロプロセッサであって、該マイクロプロセッサは、前記周波数スイッチを介して前記信号源を制御し、第１周波数において前記サンプルに第１電圧信号を、第２周波数において前記サンプルに第２電圧信号を印加し、前記第１及び第２電圧信号は、実質的に同一の電圧振幅を有している、マイクロプロセッサと、
を有し、
前記マイクロプロセッサは、前記第１及び第２電圧信号の前記印加電圧振幅と、前記第１及び第２周波数における前記サンプル両端の検出電圧レベルと、に基づいて、前記サンプル抵抗Ｒｓを判定するべく構成されている回路構成。
【請求項１５】
前記マイクロプロセッサは、前記信号源の出力を基準信号として受信するように、増幅回路とＡＤ変換器モジュールを介して前記信号源の出力に接続されている請求項１４記載のシステム。
【請求項１６】
前記マイクロプロセッサは、増幅器回路及びＡＤ変換器モジュールを介して前記サンプルに接続されている請求項１４記載のシステム。
【請求項１７】
前記マイクロプロセッサは、次のアルゴリズムを適用することにより、前記サンプル抵抗Ｒｓを判定する請求項１４記載のシステム。
Ｒｓ＝［Ｋ３Ｒ１ｆ２（Ｋ３＋Ｋ４）／（Ｋ４ｆ１＋Ｋ３ｆ２）］＋Ｋ３（Ｒ１）２／ｆ１
ここで、Ｋ１＝Ｅｉｎ−Ｅ１、Ｋ２＝Ｅｉｎ−Ｅ２、Ｋ３＝Ｅ１／Ｋ１、Ｋ４＝Ｅ２／Ｋ２であり、Ｅｉｎは、前記印加電圧信号の振幅であり、Ｅ１は、前記第１周波数における前記サンプル両端の計測電圧振幅であり、Ｅ２は、前記第２周波数における前記サンプル両端の計測電圧振幅であり、Ｒ１は、前記駆動抵抗器の抵抗であり、ｆ１は、前記第１周波数であり、ｆ２は、前記第２周波数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する参照）
本発明は、２００１年１２月６日付けて出願された「電気穿孔装置用の抵抗回路安定化及びパルス持続時間制御システム（ＲＥＳＩＳＴＡＮＣＥ  ＣＩＲＣＵＩＴ  ＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＬＳＥ  ＤＵＲＡＴＩＯＮ  ＣＯＮＴＲＯＬ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＥＬＥＣＴＲＯＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ）」という名称の米国仮特許出願第６０／３３７，１０３号の利益を主張するものであり、その開示内容は、本引用により、そのすべてが本明細書に包含される。
本発明は、一般に、電気穿孔システムに関し、更に詳しくは、電気穿孔システムにおいて、抵抗の計測を安定化させると共に、印加した電気パルスの持続時間を制御するためのシステム及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
短時間の間、強力な電界に細胞を一時的にさらすことにより、細胞膜が不安定化することが知られている。この効果は、細胞膜を横断して誘起される電位による絶縁破壊として説明され、電気穿孔と呼ばれている。電気穿孔法は、モノクローナル抗体の生成、細胞融合、細胞／組織融合、膜蛋白の挿入、及び形質転換を含む様々な手順において使用されている。電気穿孔法を使用する生体外細胞注入手順においては、通常、成長表面に二次元で付着した１つ又は複数の細胞の懸濁液を使用する。一方、生体内電気穿孔法の場合には、組織が関係していることから、より複雑なものになる。組織は、総体として三次元構造を構成する個々の細胞から構成されているからである。但し、いずれの場合にも、細胞に対する効果は、略同一である。
【０００３】
細胞又は組織を電界にさらすには、１つ又は複数の直流パルスを印加する。結果として、細胞毒性を最小限に抑えつつ、細胞膜が一時的に不安定になるように、電気的な処理を施すのである。この電気的処理の強度は、通常、印加した電界の強度によって表される。電界は、電極に印加した電圧を電極間の距離で除算したものによって定義されている。生体内に微粒子を供給するには、通常、１０００〜５０００Ｖ／ｃｍの範囲の電界強度が使用されているが、これは、調査対象の細胞又は組織に応じて異なる。
【０００４】
米国特許第６，２５８，５９２号、第５，７２９，４２６号、第５，６５６，９２６号、第５，６４２，０３５号、及び第４，７５０，１００号（これらは、いずれも、本引用により、その開示内容のすべてが本明細書に包含される）には、電気穿孔システムの例と、電圧制御サブシステムなどの様々なサブシステムについて開示されている。通常の電気穿孔システムにおいては、内部電荷貯蔵器（例：コンデンサ）によって、電気エネルギー（電荷）を保存している。そして、この電荷貯蔵器を、高電圧スイッチにより、電気穿孔の対象である細胞を格納するキュベットに接続し、保存されている電荷を（通常は、１つ又は複数のパルスとして）サンプル内に放電する。これらのパルスは、通常、幾何級数的に減衰する形状を有しているが、方形波も使用されている。それぞれのパルスの持続時間は、パルス幅と呼ばれており、従来、微粒子の注入は、数マイクロ秒（μｓ）〜数ミリ秒（ｍｓ）の範囲のパルス幅によって実行されている。そして、通常、電気的処理の際には、１つ又は複数のパルスが利用されている。
【０００５】
問題点の１つは、サンプルが広範囲の抵抗値を有しているのに対して、電気穿孔の効果が最高効率を有するのが、パラメータ（例：パルス電圧及びパルス持続時間）の狭い範囲に限定されていることである。電気穿孔と感電死の間には、紙一重の違いしかなく、パルスの持続時間が長過ぎたり、電界強度が大き過ぎると、細胞を溶解（破壊）してしまう。しかし、条件を最低限のものにすれば、電気穿孔の効率が低下することになる。従って、電気穿孔パルスのパルス持続時間（即ち、時定数）を制御するシステム及び方法を提供することが望ましい。
【０００６】
又、サンプルを損傷しないように、適切な電圧をサンプルに印加することが望ましい。従って、サンプルの抵抗を正確に判定することが重要である。電気穿孔システムにおいて抵抗を計測すると共に、直列保護抵抗を補正する方法及び装置については、米国特許第５，７２９，４２６号、第５，６４２，０３５号、及び第５，６５６，９２６号に開示されている（これらはいずれも、引用により、あらゆる目的のために、その開示内容のすべてが既に本明細書に包含されている）。しかしながら、これらの明細書に開示されている抵抗計測回路は、高精度の計測を実現するために、結合コンデンサの十分な安定性を必要としている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、電気穿孔システムおける抵抗の計測を安定化させて高精度の計測を実現するシステム、方法、及び装置を提供すると共に、電気穿孔パルスのパルス持続時間（即ち、時定数）を制御するシステム及び方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、高精度の計測を実現するべく、電気穿孔システムにおいて抵抗の計測を安定化させるシステム、方法、及び装置を提供する。又、本発明は、電気穿孔パルスのパルス持続時間（即ち、時定数）を制御するシステム、方法、及び装置をも提供する。
【０００９】
本発明によれば、例えば、電気穿孔キュベット内に提供されたサンプルなどの電気穿孔システム内におけるサンプルの抵抗を正確に判定する回路が提供される。更には、サンプルの抵抗を自動的に計測し、静電容量を判定すると共に、電気穿孔パルスの所望のパルス持続時間（時定数）を実質的に提供する並列付加抵抗を判定する抵抗制御システムが提供される。
【００１０】
本発明の一態様によれば、所望の持続時間にわたって、サンプルに電気パルスを印加する方法が提供される。この方法は、通常、所望のパルス持続時間を識別する段階と、サンプルの抵抗Ｒｓを自動的に計測する段階と、サンプルと直列に配置される静電容量Ｃを自動的に選択する段階と、時定数Ｔ＝Ｃ×Ｒ（ここで、Ｒ＝（Ｒｓ×Ｒ２）／（Ｒｓ＋Ｒ２）である）が所望のパルス持続時間と実質的に等しくなるように、サンプルと並列に配置される抵抗Ｒ２を自動的に判定する段階と、を含んでいる。特定の態様において、Ｒ２は、１つの抵抗器又は複数の抵抗器構成を使用して実装可能であるが、一般的には、Ｒ２は、回路構成及び選択された１つ又は複数のコンポーネントにおいて連続した抵抗を有する合成抵抗である。同様に、Ｃについても、回路構成及び選択された１つ又は複数のコンポーネントにおいて連続した静電容量を有する合成静電容量であってよい。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、電気穿孔システムにおけるサンプルの抵抗を自動的に判定する方法が提供される。この方法は、通常、結合コンデンサ及び駆動抵抗器回路の両端において、サンプルに第１入力信号を印加する段階と（この第１入力信号は、第１周波数ｆ１を有する入力電圧Ｅｉｎを有しており、駆動抵抗器回路は、抵抗Ｒ１を有している）、第１周波数におけるサンプルの両端の電圧Ｅ１を計測する段階と、を含んでいる。又、この方法は、通常、駆動抵抗器回路の両端において、サンプルに第２入力信号を印加する段階と（この第２入力信号は、第２周波数ｆ２を有する入力電圧Ｅｉｎを有している）、第２周波数におけるサンプルの両端の電圧Ｅ２を計測する段階と、を含んでいる。更に、この方法は、通常、結合コンデンサの静電容量を使用することなしに、Ｅｉｎと計測値Ｅ１及びＥ２を使用してサンプル抵抗Ｒｓを判定する段階を含んでいる。
【００１２】
本発明の更に別の態様によれば、サンプルの抵抗を判定するべく構成された電気穿孔システム内の回路構成が提供される。この構成は、通常、結合コンデンサ及び駆動抵抗器の両端において、サンプルに正弦波電圧信号を供給する信号源と、この信号源に接続された周波数スイッチと（このスイッチは、信号源によって印加される電圧信号の周波数を調節するべく構成されている）、周波数スイッチ、信号源の出力、及びサンプルに接続されたマイクロプロセッサと、を含んでいる。マイクロプロセッサは、通常、周波数スイッチによって信号源を制御し、第１周波数において、サンプルに第１電圧信号を、第２周波数において、サンプルに第２電圧信号を印加する（これら第１及び第２電圧信号は、実質的に同一の電圧振幅を有している）。このマイクロプロセッサは、通常、結合コンデンサの静電容量を使用することなく、第１及び第２電圧信号の印加電圧振幅と、第１及び第２周波数においてサンプルの両端で検出された電圧レベルと、に基づいて、サンプル抵抗Ｒｓを判定するべく構成されている。
【００１３】
図面、請求項、及び付属書を含む本明細書の残余の部分を参照することにより、本発明のその他の特徴及び利点について理解されよう。以下、本発明の更なる特徴及び利点、並びに本発明の様々な実施例の構造及び動作について、添付の図面との関連で、詳細に説明する。尚、これらの図面においては、同様の参照符号により、同一又は機能的に類似した要素を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、電気穿孔装置又はシステムの高電圧供給システム内の内部保護抵抗器の補正を実現する電気穿孔（トランスフェクション）システムにおいて使用する抵抗計測システム及び方法を提供する。内部保護抵抗器とは、通常、アークの際に発生する大電流から、高ジュールスイッチ内のシステムの半導体制御整流器（Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ：ＳＣＲ）を保護するべく、提供されるものである。尚、抵抗を計測すると共に、直列保護抵抗を補正する方法は、引用によって既に本明細書に包含されている米国特許第５，７２９，４２６号、第５，６４２，０３５号、及び第５，６５６，９２６号の主題となっている。しかしながら、これらの明細書に開示されている従来から使用される抵抗計測回路は、結合コンデンサの十分な安定性を必要としている。
【００１５】
図１は、本発明の実施例による、外部サンプルに対するハードウェア接続を有する抵抗計測システムのブロックダイアグラムを示している。図示のごとく、信号生成器１０が、ソース信号を生成する。一実施例においては、この信号生成器は、２０〜２５ＫＨｚの正弦波信号を生成し、これにより、駆動抵抗器１５、結合回路２０（及び保護用のクランプ）を通じて、最終的にサンプル２５に電流が流れる。そして、サンプルの抵抗に応じて、サンプル抵抗Ｒｓを示す電圧がサンプルの両端に生成される。この電圧が、第２結合回路３０（及びクランプ）、第１増幅器３５（任意選択の利得選択器４０を有している）、及び第１ピーク検出器４５を通じて伝達される。これらの結合回路及びクランプは、サンプルの両端に現れる高電圧から保護するためのものである。サンプル電圧のピーク値が、マイクロプロセッサ５０のＡ／Ｄチャネルの中の１つによって、デジタル信号に変換される。
【００１６】
一実施例においては、第２増幅器及びピーク検出器６５により、ソース信号の増幅及びピーク検出を実行し、基準信号を供給している。この基準信号は、マイクロプロセッサ５０の第２Ａ／Ｄチャネルにより、デジタル信号に変換される。この基準により、マイクロプロセッサ５０は、ソース信号の振幅変化を補償することができため、マイクロプロセッサに供給するこの基準信号の追加は、従来の抵抗計測システムに対する改善点である。又、マイクロプロセッサ５０は、周波数スイッチ６０を介してソース信号の周波数を監視及び変更するべく構成されている（又、これは、ソース信号の振幅を変更することも可能である）。
【００１７】
図１に示されているブロックダイアグラムは、周波数スイッチ６０と第２増幅器及びピーク検出器６５の追加を除いて、以前のシステムと略同様のものになっている。サンプル回路は、図２に示されているように単純化することができる。
【００１８】
本発明によって解決される１つの問題点は、温度に伴う結合コンデンサＣの変化（及び経年変化などのその他のコンデンサの変化）の影響である。従来のシステムでは、コンデンサの値が変化する可能性があり、この結果、抵抗計測に誤差が生じることになる。従って、このようなシステムに期待できる抵抗計測精度は低いものであった。温度の変化に伴って、Ｃのリアクタンスが変化し、Ｅｏに影響を与えるからである。本発明の一実施例によれば、２つの異なる周波数において、負荷Ｒｓの両端の電圧を計測する方法が提供される。この２つの周波数の使用は、従来の抵抗計測回路に対する更なる重要な改善点である。特定の態様においては、これらの周波数は、サンプルの抵抗Ｒｓが２つの周波数において実質的に一定に維持されるように選定される（例：２０ＫＨｚ及び２５ＫＨｚ。但し、その他の周波数も使用可能であることを理解されたい）。しかしながら、これらの別個の周波数において、コンデンサのリアクタンスが変化した場合には、次のように２つの式を生成し、２つの未知数（実際のＣとサンプルの抵抗Ｒｓ）を解明することができる。
【００１９】
周波数ｆ１において、Ｅｏ１＝Ｅｏと仮定し、
周波数ｆ２において、Ｅｏ２＝Ｅｏと仮定すれば、
Ｅｏ１＝ＲｓＥｉｎ／（（１／２πｆ１Ｃ）＋Ｒ１＋Ｒｓ）
Ｅ０２＝ＲｓＥｉｎ／（（１／２πｆ２Ｃ）＋Ｒ１＋Ｒｓ）
Ｒｓ＝（Ｅｏ１／（Ｅｉｎ−Ｅｏ１））（（１／２πｆ１Ｃ）＋Ｒ１）
Ｒｓ＝（Ｅｏ２／（Ｅｉｎ−Ｅｏ２））（（１／２πｆ２Ｃ）＋Ｒ１）であり、
従って、Ｃ＝［（Ｅｏ２／（Ｅｉｎ−Ｅｏ２）（２πｆ２））−Ｅｏ１／（Ｅｉｎ−Ｅｏ１）（２πｆ１）］／｛［（Ｒ１Ｅｏ１）／（Ｅｉｎ−Ｅｏ１）］−（Ｒ１Ｅｏ２／（Ｅｉｎ−Ｅｏ２）｝であり、
Ｋ１＝Ｅｉｎ−Ｅｏ１、Ｋ２＝Ｅｉｎ−Ｅｏ２、Ｋ３＝Ｅｏ１／Ｋ１、Ｋ４＝Ｅ０２／Ｋ２の場合には、
Ｒｓ＝［Ｋ３Ｒ１ｆ２（Ｋ３＋Ｋ４）／（Ｋ４ｆ１＋Ｋ３ｆ２）］＋ｋ３（Ｒ１）2／ｆ１
【００２０】
従って、２つの異なる周波数を使用すれば、Ｃの変化とは無関係に、Ｒｓを判定することができる。尚、マイクロプロセッサ５０は、Ｒｓを自動的に判定するべく構成することが好ましいが、適切なデータ信号を別の処理ユニットに送信することも可能である。
【００２１】
図３及び図４は、本発明の特定の一実施例による図１の回路要素の詳細を示している。尚、これらの回路要素の値及び設計における変形と代替回路要素及び構成を使用可能であることを理解されたい。
【００２２】
付属書Ａには、２つの未知数Ｃ及びＲｓを解明する方法に関する更なる詳細が提供されている。
【００２３】
本発明の実施例によれば、電気穿孔システム（電気穿孔機）は、サンプルの抵抗を計測すると共に、所望の時定数を実現するべく、サンプルと並列に内部抵抗を自動的に接続させるように構成された抵抗制御システムを含んでいる。図５及び図６は、本発明の特定の実施例による抵抗制御システムの回路図である。尚、これらの回路要素の値及び設計における変形と代替回路要素及び構成を使用可能であることを理解されたい。図示のごとく、一実施例においては、抵抗制御システムは、５０〜１０００（及び無限大）Ωの範囲において、５０オームの増分により、抵抗器を切り替えるべく構成されている。尚、その他の抵抗の範囲及び増分も実装可能であることを理解されたい。
【００２４】
動作の際には、操作者が所望の時定数を選択又は入力する。すると、本システムは、並列抵抗を選択する前に、（例えば、前述のように）サンプルの抵抗を計測する。又、本システムは、一定範囲のコンデンサの中から１つの静電容量を自動的に選択する。例えば、図６に示されている一実施例においては、２５ｍｆｄ〜３３７５ｍｆｄの範囲の合計静電容量を有する低電圧コンデンサを、２５ｍｆｄの増分により、選択することが可能であり、或いは、５０、２５、及び１０ｍｆｄの高電圧コンデンサを選択することもできる。尚、その他の静電容量の範囲及び増分も実装可能であることを理解されたい。米国特許第５，７２９，４２６号、第５，６５６，９２６号、及び第５，６４２，０３５号には、コンデンサの選択を電気的に制御するシステム及び方法が開示されている。
【００２５】
例えば、操作者が、時定数として５．０ｍｓを選択し、本システムがサンプルの抵抗を２００Ωと計測した場合には、本システムは、２５ｍｆｄの静電容量を選択するだけでよい。しかしながら、操作者が、この同一の２００オームのサンプル負荷において、７．０ｍｓの時定数を選択した場合には、本システムは、更に大きな静電容量（例：５０ｍｆｄ）を自動的に選択することになる。しかしながら、５０ｍｆｄの場合には、１０ｍｓのパルス持続時間（時定数）が生成されることになる。従って、本システムは、並列抵抗を切り替えることにより、この時定数を削減する。即ち、本システムは、次の式を使用し、必要な抵抗を判定／算出することになる。
【００２６】
Ｒ＝（Ｒ１×Ｒｓ）／（Ｒ１＋Ｒｓ）
【００２７】
ここで、Ｒ１は、所望の並列付加抵抗であり、Ｒｓは、（判定された）サンプルの抵抗である。所望の時定数が７ｍｓ＝ＲＣであり、Ｃ＝５０ｍｆｄであるため、Ｒ＝７ｍｓ／５０ｍｆｄ＝１４０Ωである。従って、１４０＝（Ｒ１×２００）／（Ｒ１＋２００）である。これを解けば、Ｒ１は、約４６７Ωである。但し、この例においては、設定可能なＲ１の増分単位は、５０オームであるため、最も近い並列付加抵抗は、４５０オームであり、この場合には、所望の７ｍｓに近い６．９２ｍｓという時定数が実際に提供されることになる。一実施例において、本システムは、この実際に実現される時定数（例：「６．９２ｍｓ」）を表示する。
【００２８】
一実施例においては、抵抗を極大化させる。この実施例の場合には、本システムは、選択した並列付加抵抗なしに、所望の時定数をわずかに上回る時定数を実現可能な最小限の静電容量を選択する。これにより、並列付加抵抗の選択値を極大化させることができる。この結果、付加抵抗におけるエネルギーの浪費が極小化されることになる。別の実施例においては、静電容量を極大化させている。
【００２９】
付属書Ｂには、本発明の更なる特徴について記述されている。
【００３０】
本発明は、２００１年１２月６日付けで出願された米国仮特許出願第６０／３３７，０９５号の優先権を主張する本出願と同日付で出願された同時継続中の米国特許出願第１０／［］号（Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．００２５５８−０６６９１０ＵＳ）（これらは、いずれも、「自動電気穿孔最適化システム（ＡＵＴＯＭＡＴＩＣ  ＥＬＥＣＴＲＯＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ）」という名称であり、いずれも、本引用により、その開示内容のすべてが本明細書に包含される）に開示されている自動電気穿孔最適化システムにおいて、特に有用である。例えば、このようなシステムに本発明を実装することにより、電気穿孔システムは、一連の電気穿孔パルスのそれぞれについて、追加する最適な静電容量及び抵抗を自動的に選択できるようになる。
【００３１】
又、本発明は、例えば、２００１年１２月６日付けで出願された米国仮特許出願第６０／３３７，０９７号の優先権を主張する本出願と同日付で出願された同時継続中の米国特許出願第１０／［］号（Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．００２５５８−０６７２１０ＵＳ）（これらは、いずれも、「細胞膜に基づいた融合を促進するための電気穿孔キュベットインサート（ＥＬＥＣＴＲＯＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＣＵＶＥＴＴＥ  ＩＮＳＥＲＴ  ＦＯＲ  ＦＡＣＩＬＩＴＡＴＩＮＧ  ＭＥＭＢＲＡＮＥ０ＢＡＳＥＤ  ＦＵＳＩＯＮ）」という名称であり、いずれも、本引用により、その開示内容のすべてが本明細書に包含される）の開示内容を使用する電気的な融合実験においても利用可能である。
【００３２】
以上、例を使用し、特定の実施例の観点から、本発明について説明したが、本発明は、これら開示した実施例に限定されるものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、当業者には明らかな様々な変更及び類似の構成をも包含することを意図するものである。従って、添付の特許請求の範囲には、これらの変更及び類似の構成を包含するべく、最も広範な解釈を付与することを要するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の実施例による、外部サンプルに対するハードウェア接続を有する抵抗計測システムのブロックダイアグラムを示している。
【図２】図１に示されているサンプル回路の一部を単純化した図を示している。
【図３−４】本発明の実施例による図１の回路要素の詳細を示している。
【図５−６】本発明の実施例による抵抗制御システムの回路図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３】
2005511097.tif 000006
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2005511097.tif 000008
【図４】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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