(57)【要約】表面に抽出相がコーティングされ、配置装置と連結されたファイバーが、生体組織検査のために動物の体内又は動物組織から関心のある成分の吸着を行うと説明されている。質量分析、ＬＣ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ及びＣＥ、及び直接分光器によるファイバー上の測定を含む分析器へのいくつかのインタフェースが開示されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の体内又は動物組織内の１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別する方法において、
前記動物の体内又は組織内にファイバーを配置するステップであって、前記ファイバーが前記動物の体内又は組織から前記１つ又は複数の関心のある成分を吸着するために少なくとも一部が抽出相でコーティングされており、前記抽出相が前記動物の体内又は組織内に位置付けられている前記ステップと、
所定の時間の間、前記１つ又は複数の関心のある成分を前記抽出相に吸着させるステップと、
前記動物の体内又は組織から前記ファイバーを取出すステップと、
前記１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別のために前記抽出相から分析器に脱着させるステップとからなる、
方法。
【請求項２】
前記抽出相が前記１つ又は複数の関心のある成分を特定的に吸着する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記抽出相が前記ファイバーの末端に位置する、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
前記所定の時間が前記関心のある成分の平衡時間と同じである、請求項１から３のいずれかの方法。
【請求項５】
前記所定の時間が前記関心のある成分の平衡時間よりも短い、請求項１から３のいずれかの方法。
【請求項６】
前記１つ又は複数の関心のある成分がバクテリア、ウイルス、亜細胞要素、生体高分子、ＤＮＡ、蛋白質、薬物、薬代謝物、ホルモン、ビタミン、環境汚染物質、化学薬品、及び細胞からなるグループから選択される、請求項１から５のいずれかの方法。
【請求項７】
前記動物が単細胞動物、生卵子、マウス、ネズミ、ウサギ、犬、羊、豚、猿及び人間からなるグループから選択される、請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項８】
前記動物組織が単離された細胞及び器官からなるグループから選択される、請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項９】
前記ファイバーが血管内に配置され、前記１つ又は複数の関心のある成分が前記血管内を流れる血液から吸着される、請求項１から７のいずれかの方法。
【請求項１０】
前記ファイバーを配置するステップがカテーテルを使用してファイバーを血管内の適所に導くことからなる、請求項９の方法。
【請求項１１】
(ａ)前記ファイバーが、前記動物の筋肉、脳、軟部組織又は器官の中に配置され、前記１つ又は複数の関心のある成分が間質液又は細胞内液から吸着されるか、（ｂ）前記ファイバーが脊柱、頭蓋骨又は骨格の中に配置され、前記関心のある成分が骨、脊髄液を含む内液、骨髄又は脳漿から吸着されるか、又は（ｃ）前記ファイバーが動物の細胞内に配置され、成分が細胞内液又は動物の単細胞の亜細胞要素から抽出される、請求項１から４のいずれかの方法。
【請求項１２】
前記ファイバーが配置される間、シールされた挿入端を有するハウジング内に置かれ、前記方法が前記ファイバーが一旦動物内に配置されると前記挿入端を開口し、前記動物内に前記抽出相を曝すステップを含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記ファイバーが前記配置の間不活性であり、その後関心のある成分の吸着を可能にするために電位の変化又は光学的方法を使用して前記抽出相を活性化する、請求項１から１１のいずれかの方法。
【請求項１４】
前記ファイバーが列又は束にされた複数のファイバーからなり、前記ファイバーが前記動物内において単一の箇所に配置される、請求項１から１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
前記ファイバーが列又は束にされた複数のファイバーからなり、前記ファイバーが前記動物内において１箇所以上に配置される、請求項１から１３のいずれかの方法。
【請求項１６】
前記抽出相が、さらに、吸着ステップの間において前記抽出相に保持される、強く結合した検量体からなる、請求項１から１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
前記抽出相が、さらに、吸着ステップにおいて対流状態又は拡散係数によって前記抽出相から開放される弱く結合した検量体からなる、請求項１から１５のいずれかの方法。
【請求項１８】
前記関心のある成分と反応する強く結合した試薬が抽出前に前記抽出相に加えられる、請求項１から１７のいずれかの方法。
【請求項１９】
前記強く結合した試薬が蛍光タグで関心のある成分を分類する、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記試薬が酵素であり、関心のある成分が酵素の基質である、請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記基体が蛋白質であり、前記酵素がファイバーに直接前記蛋白質を消化する、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記試薬がトリプシン又はトリプシン共同因子である、請求項２０の方法。
【請求項２３】
前記関心のある成分に反応する試薬が吸着ステップ後に抽出相に加えられる、請求項１から１７のいずれかの方法。
【請求項２４】
前記試薬が噴霧又は浸けることにより前記抽出相上に加えられる、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記試薬が蛍光タグで前記関心のある成分を分類する、請求項２３又は２４の方法。
【請求項２６】
前記試薬が酵素で前記関心のある成分が酵素の基質である、請求項２３又は２４の方法。
【請求項２７】
前記試薬がトリプシンで、前記関心のある成分が蛋白質であり、前記蛋白質が前記抽出相上で消化される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記関心のある成分がＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントであり、前記ファイバーが周期的に交互に繰返される冷却及び加熱を受け、前記試薬がポリメラーゼ及び核酸酸からなり、且つ、該方法が結果として抽出相上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を起こす、請求項２３又は２４の方法。
【請求項２９】
前記試薬がマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）において利用されるイオン化マトリックスからなる、請求項１８、２３及び２４のいずれかの方法。
【請求項３０】
前記関心のある成分を前記抽出相から分析器へ脱着させるために前記ファイバーのレーザー照射を可能にするため、吸着ステップ後、前記分析器内にファイバーを配置するステップを含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記ファイバーが前記抽出相のコーティングされていない領域で照射される、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記ファイバーが複数の光ファイバーからなる、請求項３０の方法。
【請求項３３】
前記分析器が飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）及びイオン移動性分析計からなるグループから選択される分析計である、請求項３０の方法。
【請求項３４】
脱着ステップ前に前記ファイバーを直接質量分析計に導入するステップをさらに含む、請求項１から２８のいずれかの方法。
【請求項３５】
前記ファイバーを質量分析計に導入するステップがナノスプレー針内の少ない溶剤容量への挿入、その後の脱着ステップ及び脱着された関心のある成分のエレクトロ・スプレーを行うことを含む、請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記動物の体内又は組織から前記ファイバーを取出した後、前記ファイバーを高電圧に曝し、その結果として前記関心のある成分が前記抽出相から直接前記質量分析器へフィールド脱着される、請求項３４の方法。
【請求項３７】
前記脱着ステップが前記抽出相からの関心のある成分の分離、及びガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、キャピラリ電気泳動機器、キャピラリ電気クロマトグラフィ機器及びマイクロ流体装置からなるグループから選択された前記分析器内における成分の測定又は識別からなる、請求項１から２８のいずれかの方法。
【請求項３８】
前記分離が分離キャピラリ又は分析器のチャンネル内で直接おこる、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記脱着ステップが脱着溶液が入った小穴カートリッジ内において遂行され、続いて分析器内で関心のある成分を自動化測定又は識別する、請求項１から２８のいずれかの方法。
【請求項４０】
前記ファイバーが動物又は組織内からファイバーを取除くステップの直後に小穴カートリッジ内に配置され、カートリッジがその後自動化測定又は識別前にシールされる、請求項３９の方法。
【請求項４１】
薬物動態学的検査に用いられる、請求項１から４０のいずれかの方法。
【請求項４２】
少なくとも部分的にコーティングされた端を有する１つ又は複数のファイバーであって、前記端が１つ又は複数の関心のある成分を吸着するために少なくとも部分的に抽出相でコーティングされているファイバーと、
前記ファイバーの少なくとも部分的にコーティングされた端を動物の体内又は動物組織内の適所に導くための配置装置とからなる、
動物の体内又は動物組織から１つ又は複数の関心のある成分を吸着する装置。
【請求項４３】
前記ファイバーの直径がミリメートルからナノメートルの範囲である、請求項４２の装置。
【請求項４４】
前記ファイバーが溶融石英、プラスチック、カーボン及び金属ワイヤからなるグループから選択された物質からなる、請求項４２又は４３の装置。
【請求項４５】
前記ファイバーが溶融石英から形成された複数の光ファイバーからなる、請求項４４の装置。
【請求項４６】
前記ファイバーがチューブの内側面が前記抽出相でコーティングされた中空のチューブからなる、請求項４２の装置。
【請求項４７】
前記チューブからサンプルを吸引又は放出するために該チューブと連通しているポンプをさらに有する、請求項４６の装置。
【請求項４８】
前記ファイバーが内側面にコーティングされた前記抽出相を有する中空のチューブであり、前記チューブが一端においてシールされ、該チューブ中に流体を流すために該チューブと連通しているポンプを有し、かくして、前記チューブを消耗し、前記抽出相の表面積を増加させる、請求項４２の装置。
【請求項４９】
前記流体がガスである、請求項４８の装置。
【請求項５０】
さらに、保護及び簡単なハンドリングのために前記ファイバーを囲むシースを含む、請求項４２の装置。
【請求項５１】
前記抽出相が生物学的適合性を有する、請求項４２から５０のいずれかの装置。
【請求項５２】
前記ファイバーが、さらに、少なくとも部分的に生物学的適合性を有する保護層でコーティングされている、請求項４２から５１のいずれかの装置。
【請求項５３】
前記生物学的適合性を有する保護層が前記抽出相を囲む、請求項５２の装置。
【請求項５４】
前記生物学的適合性を有する保護層がポリピロール又は誘導されたセルロースからなる、請求項５２又は５３の装置。
【請求項５５】
前記抽出相が置換又は非置換したポリ（ジメチルシロキサン）、ポリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）及びポリピロールからなるグループから選択されたポリ合成からなる、請求項５２又は５３の装置。
【請求項５６】
前記抽出相がその表面上の生体親和力剤からなり、前記生体親和力剤が精選された穴、分子認識部位、分子インプリントポリマー、及び固定化抗体からなるグループから選択される、請求項５２又は５３の装置。
【請求項５７】
前記抽出相が置換又は非置換のポリ（ジメチルシロキサン）、ポリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）及びポリピロールからなるグループから選択されたポリ成分からなり、またさらに、前記抽出相がその表面上の生体親和力剤からなり、前記生体親和力剤が精選された穴、分子認識部分、分子インプリントポリマー、及び固定された抗体からなるグループから選択される、請求項４２から５４のいずれかの装置。
【請求項５８】
前記抽出相がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析の抽出及びイオン化マトリックスである、請求項４２から５７のいずれかの装置。
【請求項５９】
前記抽出相が検量体分子を含む、請求項４２から５８のいずれかの装置。
【請求項６０】
前記抽出相が強く結合した試薬を含む、請求項４２から５９のいずれかの装置。
【請求項６１】
前記試薬が蛍光分類部分及び酵素からなるグループから選択される、請求項６０の装置。
【請求項６２】
前記試薬がトリプシン及びポリメラーゼからなるグループから選択された酵素からなる、請求項６１の装置。
【請求項６３】
前記ファイバーが動物の体内又は動物組織内に適当に配置されている際にファイバーを曝すために開口されるように一端が閉じられたハウジング内に収納されている、請求項４２から６２のいずれかの装置。
【請求項６４】
前記ハウジングがシールリーフ構造により一端が閉じられたチューブである、請求項６３の装置。
【請求項６５】
前記配置装置がカテーテルからなる、請求項４２から６４のいずれかの装置。
【請求項６６】
前記配置装置がｘ−ｙ−ｚマイクロ配置ステージからなる、請求項４２から６４のいずれかの装置。
【請求項６７】
前記ファイバーが動物の体内又は動物組織内において１箇所以上に配置されるために複数のファイバーからなる、請求項４２から６６のいずれかの装置。
【請求項６８】
前記複数のファイバーがその表面に同じ前記抽出相をコーティングされている、請求項６７の装置。
【請求項６９】
前記複数のファイバーの少なくとも２つがその表面に異なる前記抽出相をコーティングされている、請求項６７の装置。
【請求項７０】
前記複数のファイバーの少なくとも２つが前記異なる関心のある成分を特定的に吸着するための抽出相を有する請求項６９の装置。
【請求項７１】
前記配置装置が自動化システムからなる、請求項４２から７０のいずれかの装置。
【請求項７２】
前記自動化システムが動物又は動物組織に装着可能である、請求項７１の装置。
【請求項７３】
前記配置装置が、さらに、前記ファイバーを前記抽出相からの関心のある成分を脱着させるために分析器内に配置するために使用される、請求項４２から７２のいずれかの装置。
【請求項７４】
前記配置装置が、さらに、前記ファイバーを直接分離キャピラリ又はチャンネル内に配置するために使用される、請求項４２から７２のいずれかの装置。
【請求項７５】
前記配置装置が、さらに、前記ファイバーを前記抽出相からの関心のある成分の脱着を容易にするレーザー光線に連結するのに使用される、請求項４２から７２のいずれかの装置。
【請求項７６】
前記配置装置が前記関心のある成分の分析器への脱着を容易にする、請求項７５の装置。
【請求項７７】
さらに、前記ファイバーの少なくとも部分的にコーティングされた端における動きを生成する撹拌機を有する、請求項４２の装置。
【請求項７８】
前記撹拌機が生成する動きが前記ファイバーに対して軸方向又は水平である、請求項７７の装置。
【請求項７９】
前記ファイバーがその内側面にコーティングされた前記抽出相を有する中空のチューブからなり、前記撹拌機が前記チューブ内にサンプルを吸引させるように働く、請求項７７の装置。
【請求項８０】
前記撹拌機が前記チューブ内にサンプルを吸引するように該チューブに働きかける圧力差を生成する、請求項７９の装置。
【請求項８１】
前記撹拌機が膨張可能なバルーンからなる、請求項７７の装置。
【請求項８２】
前記装置が薬物動態学的研究に使用される、請求項４２から８１のいずれかの装置。
【請求項８３】
動物の体内又は動物組織内の１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別する方法において、前記方法が請求項４２の方法で動物の体内又は相物組織内に装置を配置し、所定の時間前記１つ又は複数の関心のある成分を前記装置の抽出相に吸着し、前記動物の体内又は組織から装置を取出し、前記抽出相から前記１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別のために分析器へ脱着するステップからなる、動物の体内又は動物組織内の１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別する方法。
【請求項８４】
前記ファイバーが光ファイバーであり、方法が生動物の体内において直接行われる、請求項８３の方法。
【請求項８５】
さらに、前記抽出相に弱く結合された前記選択された化合物を含むことにより、選択された化合物を前記動物又は組織に送込むステップを含む、請求項８３の方法。
【請求項８６】
所定の時間後、前記抽出相が測定のために残留している選択された化合物を脱着するため分析器へ導入される、請求項８５の方法。
【請求項８７】
所定の時間後、前記抽出相が測定又は識別のために前記選択された化合物の代謝物を脱着するため分析器へ導入される、請求項８５の方法。
【請求項８８】
前記ファイバーが配置の間一端で閉じられているハウジングにより守られており、その後、前記動物の体内又は動物組織内に前記ファイバーを曝すために前記ハウジングを開口する、請求項８３の方法。
【請求項８９】
さらに、前記ファイバーを前記動物の体内又は動物組織内において撹拌するステップからなる、請求項８３の方法。
【請求項９０】
前記撹拌ステップが前記ファイバーの軸方向又は水平移動を生成する、請求項８９の方法。
【請求項９１】
前記撹拌ステップが圧力差によりサンプルを中空ファイバーに入れる働きをする、請求項８９の方法。
【請求項９２】
薬物動態学的研究に使用される、請求項８３から９１のいずれかの方法。
【請求項９３】
マルチウェルプレートの複数の穴内に入っている液体サンプル中の１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別する方法において、
前記方法が複数のファイバーの末端を同時に前記複数の穴にそれぞれ沈められ、液体サンプルから関心のある成分を吸着させるために各ファイバーの末端が少なくとも部分的に抽出相でコーティングされているステップと、
所定の時間、前記関心のある成分を前記抽出相に吸着させるステップと、
穴から同時に前記ファイバーを取出すステップと、
脱着のために前記抽出相を分析器へ配置し、前記関心のある成分の測定又は識別をするステップとからなる、
方法。
【請求項９４】
前記分析器がＭＡＬＤＩ分析器及びマルチチャンネル・マイクロ機械・マイクロ流体装置からなるグループから選択される、請求項９３の方法。
【請求項９５】
前記マルチウェルプレートの複数の穴内に入った液体サンプルから１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別する請求項９３の方法を用いた装置において、
それぞれが少なくとも部分的にコーティングされた末端を有し、前記端が前記関心のある成分を吸着するために少なくとも部分的に前記抽出相でコーティングされている複数のファイバーと、
前記ファイバーを前記穴から取出し、前記ファイバーを分析器へ配置するために前記マルチウェルプレートの複数の穴内の液体に沈む箇所に前記ファイバーのコーティングされた末端を導くための配置装置とからなる、
装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年３月１１日に出願の米国特許出願第60/364,214号、２００２年７月３日に出願の米国特許出願第60/393,309号、２００２年１０月２５日に出願の米国特許出願第60/421,001号、２００２年１０月２８日に出願の米国特許出願第60/421,510号及び２００２年１１月２１日に出願の米国特許出願第60/427,833号の利益を主張するものであり、これらの優先権を主張し、各文書全ては本文中において参照として一体化されるものである。
【０００２】
本発明は、全体として、動物等の生体組織内の関心のある成分の量を測ったり、識別したりするための装置及び方法に関する。
【発明の背景】
【０００３】
現在、生動物の体内における化学物質又は薬剤の濃度を検査しようとする場合、検査用の血液又は組織のサンプルを動物の体内から採取し、分析研究所においてそのサンプル中から関心のある化学物質を抽出し、その量を測定する。一般的に、第一段階は、サンプルをより化学物質採取に適した形状に変えるための、サンプルの前処理である。血液の場合においては、血清又は血漿の調整によって、血液細胞及び／又は若干の血液成分を取除くことによりなすことができる。組織サンプルの場合においては、凍結、磨砕、均質化、酵素処理（例えば、プロテアーゼ又はセルラーゼ）又は加水分解を含む多くの方法によりなすことができる。その後、被処理サンプルから関心のある化学物質が抽出され、凝集される。例えば、血清サンプルは、液液抽出、固相抽出又は蛋白質を抽出した後乾燥したり、また注入溶剤内で再構成することができる。一部の注入溶剤は、クロマトグラフィ分離及び定量分析のための分析機器に導入される。この方法は、関心のある化合物に対して高い特異性を有する正確な結果が得られるが、時間と手間がかかる。また、その過程において多くのステップを必要とするため、サンプル調製中に、結果に影響を与えるミスをする可能性が十分ある。この方法は、対象化合物に対し高い感度、選択性及び正確性を有するが、動物の体内に存在する化学物質の化学物質バランスが、サンプリングの間に崩れてしまうという点において限度がある。多くの場合、このようにバランスが崩れることは得られた結果の価値を減らし、場合によっては、この技術は分析に不適当となる。マウスを使った場合によく見られるように、動物の血液量全体に対して高い割合の血液量が採取されると、結果として動物が死亡してしまう。これは、各データポイント及び各繰返しの度に、異なる動物を使用しなければならないことを意味する。この場合における血液の採取の必要性を除去することによって、検査のために必要な動物の数がより少なくなり、また結果中の動物間の偏差を大きく改善することができる。
【０００４】
或いは、動物の体内における化学物質濃度の分析に利用するためのバイオセンサが開発されてきた。この場合、関連付けられたトランスデューサを有する特定の検出部からなる装置が埋め込まれ、電子データロガーにより集められセンサが反応する化学物質と比例する信号を生成する。この種の装置の主な限界は、これらの装置が、特異性を有する単一の化学物質に反応するのではなく、通常、或る範囲の化学物質に反応するということである。センサが反応する範囲の化学物質のなかでも、或る物質ではより反応大きく、また或る他の物質ではより反応が小さい。センサは、また、組織体内に存在する他の化学物質が、対象の化学物質により生じる反応を干渉することの影響を受けやすい。これらの理由により、バイオセンサは通常、正確性及び精度の点において限界がある。最後に、バイオセンサは、上記の従来の分析技術及び固相マイクロ抽出において使用される質量分析計のようなスタンドアロン型検出器ほど、低い化学物質濃度に敏感でない。この技術の長所は、検査用組織体の化学物質バランスが乱れないことである。
【０００５】
ここで説明される生体内での方法は、検査用組織体の一部をその自然環境から採取し、関心のある化合物を抽出し、実験室の環境において分析する従来の「サンプリング」技術から、大きく発展したものである。これらの種の構成を研究した動機は２つある。第一は、通常の生組織体の生化学環境に関連して、化学プロセスを研究したいという願望であり、第二は、生組織体から採取する適当なサンプルの大きさにしばしば関連する、入手の可能性不足又は実行不能性である。このような機器の開発に当たり、マイクロファイバー上に外側がコーティングされた抽出相を利用している、従来のＳＰＭＥ（固相マイクロ抽出）技術の適用性をさらに伸ばした新たな方法が、必然的に目標となるようである。いずれのマイクロ抽出と同様、関心のある組織体から検査用の化合物が余すところなく採取されるわけではないので、化合物全体に対して小さな割合の量だけ採取され、いずれの基質も採取されない状態が作り出され、故に、化学成分の通常のバランスの乱れを防ぐ。これは、非常に小さい組織部位又はサンプルの非破壊的分析において役立つことができる。最後に、抽出した化学物質はクロマトグラフィーにより分離され、非常に鋭敏な分析機器により計量されるため、高い正確性、高感度及び選択性が達成される。
【０００６】
現在市販のＳＰＭＥ装置においては、固定抽出ポリマーが、溶融石英ファイバー上にコーティングされる。コーティングされるファイバー部分は一般的に長さ１ｃｍであり、コーティングの厚さは様々である。ファイバーはステンレス鋼鉄製のサポート管に取付けられており、使いやすいように、注射器状の器具に収納されている。抽出は、抽出ポリマーを一定の時間サンプルに接触させ、サンプル成分が抽出相と平衡状態になるようにすることにより行われる。抽出後、ファイバーは、抽出した成分を脱着し分析する分析機器（通常、ガス又は液体クロマトグラフ）へ挿入される。抽出される成分の量は、サンプル内の成分の濃度に比例している（J. Pawliszyn 米国特許第5691206号  「固相マイクロ抽出及び脱着の方法及び装置」）。
【０００７】
現在まで、生組織体の直接分析に、市販のＳＰＭＥ装置が使用されてきた。例えば、これらはそれぞれ、昆虫(Moneti, G.; Dani, F. R.; Pieraccini, G. T.S. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997,11, 857-862. ), (Frerot, B.; Malosse, C.; Cain, A. H. J. High Resolut. Chromatogr. 1997,20, 340-342. )及び蛙(Smith, B. P.; Zini, C. A.; Pawliszyn, J.; Tyler,M. J.; Hayasaka, Y.;Williams, B.; Caramao, E. B. Chemistry and Ecology 2000,17, 215-225. )による化学的伝達において使用される、空気伝搬フェロモン及び信号化学物質の分析に適用されてきた。これらの場合において、動物周辺の空気中の化学物質濃度を検査することにより、生きている動物に、侵略的でなく長時間モニタでき、複雑な動的プロセスを干渉なく研究する便利な手段を提供した。
【０００８】
しかしながら、現在市販されている装置では、生きている動物体内における生体内分析において限界がある。第一に、動物体内における化学物質分析に使用するには、抽出相及びサポーティング・ファイバーコアの両方が、より頑健性を必要とする。また、現在使用されているほとんどの抽出相は、揮発性が大きく極性の小さい化合物により適している。１つの相のみ、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）の利用（カーボワックス／型どりされた樹脂）に適している。生組織体内を循環している、関心のある検体は、揮発性がより大きく極性のより小さい化合物であり、ＬＣ分析を必要とするため、新しい又は改良された抽出相が必要となる。現在使用されている装置の全体寸法は、直接生体内分析及びマイクロ分析システムへの直接連結には大きすぎ、ＬＣ抽出相がサンプル内の化学物質と平衡状態に入るのに必要な時間が比較的長く（よくかきまぜたサンプル内において、通常約１時間又はそれ以上）、また、分析はサンプル内における対流度に影響されやすい。また、現在使用されているＳＰＭＥ装置は、生組織体内において明確に定められた部分の生体内検査に必要な配置装置に適切に連結することができない。
【０００９】
従って、生物組織への侵略を最小限に抑えたサンプリング、生物組織の定量化又は分析を可能にする方法及び装置を提供することが望ましい。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、生体組織内において関心のある成分を検査するための、従来の装置及び方法の欠点の少なくとも１つを除去又は軽減することである。
【００１１】
本発明は、動物の体内又は動物組織内の１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別するための方法を提供し、前記方法は、前記動物の体内又は組織内にファイバーを配置し、前記ファイバーは前記動物又は組織から前記１つ又は複数の関心のある成分を吸収するための抽出相に少なくとも部分的にコーティングされており、前記抽出相は前記動物又は組織内に配置されている第一段階、所定の時間前記１つ又は複数の関心のある成分を抽出相に吸収する第二段階、前記動物又は組織からファイバーを取出す第三段階、及び測定又は識別のために抽出相から前記１つ又は複数の関心のある成分を分析機器へ脱着させる第３段階からなる。  
【００１２】
本発明はさらに、少なくとも部分的にコーティングされた端を有する１つ又は複数のファイバー、前記端は１つ又は複数の関心のある成分を吸収するために少なくとも部分的に抽出相にコーティングされている前記端、及び前記ファイバーの少なくとも部分的にコーティングされた端を動物の体内又は動物組織内の適所へ導く配置装置からなる、動物の体内又は動物組織から１つ又は複数の関心のある成分を吸収する装置を提供する。
【００１３】
また、本発明は、マルチウェルプレート(multiwell plate)の複数の穴に入っ ている液体サンプル中の１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別する方法を提供し、前記方法は、前記複数の穴内において複数のファイバーの末端を同時に液体中に沈め、各ファイバーの末端が、液体サンプルから採取される関心のある成分を吸収するために、それぞれ抽出相に少なくとも部分的にコーティングされている第一段階、所定の時間関心のある成分を抽出相に吸収させる第二段階、穴から同時にファイバーを取出す第３段階、及び関心のある成分を脱着、及び測定又は識別するために抽出相を分析機器に配置する第４段階からなる。
【００１４】
本発明の他の側面及び特徴は、当業者であれば、添付の図面とともに、本発明の具体的な実施形態の以下の説明を参照すれば明らかになるであろう。
【００１５】
本発明の実施形態を、添付図面に基づいて以下に説明する。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、配置装置と選択的に組み合わせられる、コーティングされたファイバーに基づく方法及びマイクロ装置、すなわち、特に、動物の体内又は動物の体の一部分内の関心のある化合物の生体内研究（識別及び濃度）に有用である分離技術及び検出技術に関する。
【００１７】
動物の体内又は動物組織内の１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別する方法は、動物の体内又は組織内にファイバーを配置するステップからなり、このときファイバーは、動物又は組織内の関心のある成分を吸収するため、少なくとも部分的に抽出相でコーティングされている。抽出相は、前記動物の体内又は組織内に配置されており、故に、関心のある成分は、所定の時間、抽出相に吸収される。これに続いて、ファイバーは動物の体内又は組織から取出され、関心のある成分は、測定又は識別のため、抽出相から分析機器へ脱着される。本発明の方法は、長時間にわたる生体組織内の検体レベルの観察を、少量の血液又は全く血液を使わず、或いは組織から採取した少量の体液だけを使用して遂行できることが望ましい、薬物動態学研究において使用することができる。通常であれば、薬物動態学研究のために、血液サンプルを定期的に採取する場合において、本発明は対象物から血液量を採取することなく、同様の観察を可能にする。
【００１８】
抽出相は特に、１つ又は複数の関心のある成分を吸収することができ、好ましくは、ファイバーの終端（又は末端）に配置される。
【００１９】
動物の体内又は動物組織内にファイバーを配置する時間は、関心のある成分の検出可能な量の吸収が可能であるという条件を満たす時間であれば、任意である。例えば、この時間は関心のある成分の平衡時間と同等であってもよく、或いは、関心のある成分の平衡時間より少なくてもよい。
【００２０】
関心のある成分は、如何なる望ましい成分であってもよい。例えば、これはバクテリア、ウイルス、亜細胞性の成分、生体高分子、ＤＮＡ、蛋白質、薬品、薬代謝物、ホルモン、ビタミン、環境汚染物質、化学薬品又は細胞であってよい。検出可能な如何なる成分も選択することができる。
【００２１】
検査する動物又は動物組織は、単細胞動物、生きている卵、マウス、ネズミ、ウサギ、犬、羊、豚、猿、人間からなるグループから選択することができる。以下本文中で説明するとおり、本発明の実施形態はサンプルのみを必要としており、必ずしも動物の体内又は動物組織内において行われるというわけではない。例えば、動物組織は分離した細胞又は器官であってよい。
【００２２】
ファイバーは血管内に配置することができ、この実施形態は前記血管中を流れる血液から吸収される関心のある成分の分析を可能にする。前記ファイバーを配置するステップは、選択的に、カテーテルを使用してファイバーを血管中の適所に導くことを含む。ファイバーを配置することができる動物体内の他部分は、第一に前記動物の筋肉、脳、軟部組織又は器官であり、ここにおいては関心のある成分は間質液又は細胞内液から吸収され、第二に脊柱、頭蓋骨又は骨格の内側部分であり、ここにおいては関心のある成分は骨、髄液を含む内液、骨髄又は脳漿から吸収され、第三に動物の細胞であり、ここにおいて吸収された成分は、動物の単細胞の細胞内液又は亜細胞要素から抽出される。当然のことながら、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２３】
配置をする間、ファイバーはシールされた挿入端を有するハウジング内に配置されていてもよい。この場合、方法は、動物の体内において一旦ファイバーが望ましく配置されると、挿入端を開き、前記動物体内において抽出相を曝すステップを含んでもよい。
【００２４】
或いは、ファイバーは前記位置決めの間不活性とし、続いて、前記関心のある成分の吸収を可能にするために電位を変化させたり光学的手段を利用して抽出相を活性化してもよい。この例は、ファイバーが特定の成分を引きつけるように活性化される金属から作られている場合に可能である。ファイバーの電気活性化のその他の可能性は、本発明の範囲内である。
【００２５】
本発明は１つのファイバー、又は列又は束にされている複数のファイバーを使用することができる。ここで使用しているように、文章中、「ファイバー」を単数として説明した場合においても、１つ又は複数のファイバーや、又はファイバーの束の使用は排除しない。複数のファイバーが使用された場合、これらのファイバーは動物の体内において単一の位置に配置されてもよいし、同時に多数の位置から記録を得るために、前記動物体内において１箇所以上の位置に配置してもよい。ファイバーは、光学繊維の束のような、１つ又は複数の光学繊維であってよい。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、抽出相はさらに、吸着工程中に抽出相において保持される強結合検量体からなってもよい。或いは、対流状態及び拡散係数による吸収ステップの間、抽出相から放出される、弱結合検量体を使用することができる。所定の時間後残留している、弱結合検量体の量を観測することができる。これは、所望の化合物を動物の体内又は動物組織に送るのにも使用することができる。
【００２７】
もう１つの実施形態においては、抽出の前に、強結合試薬を抽出相に加えてもよい。この試薬は、関心のある成分に反応する強結合試薬であってよい。このような強結合試薬の例は、関心のある成分を蛍光標識で分類するものである。他の例としては、酵素のような試薬があげられ、この場合、関心のある成分はこの酵素の基質であってもよい。このような酵素は、例えば、トリプシン又はトリプシン共同因子のような、ファイバー上に直接蛋白質を蒸解するものであってもよい。さらに試薬は、吸着工程後、抽出相に加えてもよく、この場合、その後、試薬は関心のある成分と反応する。
【００２８】
試薬を抽出相上へ吹き付けるか又は浸漬することによって、試薬を抽出相に加えることができる。
【００２９】
本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が抽出相上で直接行われるものである。このような実施形態では、関心のある成分はＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントであり、ファイバーは、或る周期で、交互に冷却・加熱され、試薬はポリメラーゼ及び核酸からなり、この方法によって、抽出相上におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を生じる。
【００３０】
試薬は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）において使用されるイオン化マトリックスからなることができる。抽出相のＭＡＬＤＩ分析は、このような測定又は化合物識別の方法に修正可能な、本発明の任意の実施形態に行うことができる。飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）又はイオン移動度分析計等、任意の数の分析機器を本発明で使用することができる。抽出相から関心のある成分を脱着した後、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、キャピラリ電気泳動機器、キャピラリ通電クロマトグラフィ機器及びマイクロフルイディック装置等の分析機器内において、成分の測定又は識別が行われる。
【００３１】
本発明は、吸着工程の後、ファイバーを分析機器内へ配置するステップを含んでもよい。これは、例えば、関心のある成分を抽出相から分析機器へ脱着するための、ファイバーのレーザー照射を含む。このような場合、抽出相にコーティングされていない範囲においてファイバーに照射し、成分を脱着する。
【００３２】
本発明は、脱着工程の前にファイバーを直接質量分析計に導入することができる。ファイバーは、ナノスプレー針内の小溶剤体積中への挿入することにより、質量分析計に導入することができ、後に、脱着工程及び脱着された関心のある成分のエレクトロ・スプレーの工程が続く。
【００３３】
動物の体内又は組織からファイバーを取出した後、ファイバーは高圧に曝されるため、関心のある成分の抽出相から質量分析計への直接的なフィールド脱着が生じる。
【００３４】
分析機器の分離キャピラリ又はチャンネルにおいて、直接、関心のある成分を抽出相から分離することができる。脱着工程は、脱着溶剤が入った小孔カートリッジ内において行われ、その後分析機器内において関心のある成分の自動化された測定又は識別が行われる。このような場合において、ファイバーは、動物の体内又は組織からファイバーを取出す工程の直後、小孔カートリッジ内に配置され、このカートリッジは直ちに分析することもできるが、自動化した測定又は識別の前に、シールして輸送したり保管しておくことが可能である。
【００３５】
本発明はまた、動物の体内又は動物組織から１つ又は複数の関心のある成分を吸着する装置にも関する。前記装置は、少なくとも部分的にコーティングされた端を有する、１つ又は複数のファイバーからなる。前記端は、１つ又は複数の関心のある成分を吸着するために、少なくとも部分的に抽出相でコーティングされている。前記装置はまた、少なくとも部分的にコーティングされたファイバーの端を動物の体内又は動物組織内の適所へ導くための配置装置からなる。
【００３６】
ファイバーの直径は、選択的にミリメートルからナノメートルの長さとすることができ、ファイバーは任意の適切な原料で作ることができ、利用しようとするものにあわせて変更可能である。このような原料には、溶融石英、プラスチック、カーボン又は金属ワイヤ等が含まれる。ファイバーは溶融石英で作られる複数の光学繊維であってもよい。
【００３７】
ファイバーは、選択的に管の内面が抽出相でコーティングされた、中空の管であってもよい。この例においては、管からサンプルを吸引したり排出したりすることが可能なポンプと組み合わせることができる。ポンプは、管とともに使用する上で適当な任意の周知のものであってよい。或いは、ファイバーは、管の外面上が抽出相でコーティングされた中空の管であってもよい。この場合、管は１つの端においてシールすることができ、また、この管に連通し、ガス又は液体等の流体を管内へ送るポンプを有する。これにより管は必要に応じて拡大することが可能となり、必要に応じて抽出相の表面積を増やすことができる。
【００３８】
本発明の装置はまた、ファイバーの周りを覆い、ファイバーを保護し、容易な取扱いを可能にするシースを有する。
【００３９】
抽出相は、必要に応じて、生体適合性があると都合がよい。ファイバーはまた、選択的に、少なくとも部分的に、抽出相を囲むことができる生体適合性保護層でコーティングされていてもよい。このような生体適合性保護層は、ポリピロール又は誘導セルロース、又は保護を提供するこの種の任意のポリマーであってもよい。
【００４０】
抽出相自体は、関心のある成分と結合可能な任意の構成物質で構成することができる。これは、例えば、置換又は非置換のポリ（ジメチルシロキサン）、ポリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）又はポリピロール等の重合体構成要素であってもよい。或いは、抽出相はその表面に、選択的キャビティ、分子認識部位、分子インプリントポリマー、又は固定化抗体等の生体親和性を有する作用因子を有してもよい。抽出相はこれらの任意の組合わせを含むことができる。
【００４１】
抽出相は他にも、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析の抽出及びイオン化マトリックスであることができ、上記のように検量体分子を含んでもよい。
【００４２】
ファイバーは、一端において閉じているハウジング内に収められており、動物の体内又は動物組織内の適所に配置されているとき、この閉じている一端を開けてファイバーを曝すことができる。このようなハウジングは、シールされたリーフ構造又は開口可能な任意のシーラントであってもよい。
【００４３】
上記においてより詳しく説明したとおり、ファイバーを静脈のような血管又はその他の管状の生体構造に導く場合、配置装置自体はカテーテルであってもよい。さらに、配置装置はｘ−ｙ−ｚマイクロ配置ステージであってもよく、これはこのようなステージ上に細胞が配置される場合に適しており、またこの移動は微細にコントロールできる。配置装置は、動物又は動物組織に取付可能である、自動化されたシステムからなる。配置装置はまた、抽出相から関心のある成分を脱着させるため、分析機器内の前記ファイバーを配置するために使用できる。配置装置は任意に、直接分離キャピラリ又はチャンネル内にファイバーを配置するのに使用することができ、また抽出相から関心のある成分を脱着させるのを助けるレーザー光線にファイバーを連結するのにも使用することができる。配置装置は分析機器への関心のある成分の脱着を容易にするために使用することもできる。  
【００４４】
複数のファイバーが使用される場合、これらのファイバーはファイバー上を同一又は異なる抽出相でコーティングされているため、複数の関心のある成分が検出可能である。複数の抽出相をファイバーに結合することができるため、様々な関心のある成分を検出することができる。
【００４５】
装置は加えて、例えば、ファイバーの軸方向又は水平方向移動のような、ファイバーのコーティングされた端の移動を惹き起こすためのアジテータを有することができる。ファイバーが、抽出相で内面をコーティングした中空管を有する場合、アジテータは、管が管内にサンプルを吸引させるようにする。これは機械的手段又は管内にサンプルを吸引させるように圧力差をつくることによって行うことができる。アジテータは膨張可能なバルーンを有してもよい。
【００４６】
本発明は、さらにマルチウェルプレート上の複数の穴に配置されている液体サンプル中の１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別する方法に関する。これは、複数の穴の中の複数のファイバーの末端を同時にそれぞれを液体中に沈めることを含み、このときファイバーの末端は、液体サンプルから関心のある成分を吸着するために、少なくとも部分的に抽出相でコーティングされている。これに続いて、関心のある成分は所定の時間、抽出相に吸着される。ファイバーはその後、穴から同時に取出され、脱着及び抽出相からの関心のある成分の測定又は識別のために分析機器へかけられる。このような分析機器は、ＭＡＬＤＩ分析装置又はマルチチャンネルのマイクロ機械化されたマイクロ流体装置等の、上記の任意の機器であってもよい。
【００４７】
マルチウェルプレート上の複数の穴に配置された液体サンプルから１つ又は複数の関心のある成分を測定又は識別するための発明装置をここで説明する方法で使用する場合、装置は複数のファイバーからなり、前記各ファイバーは少なくとも部分的にコーティングされた末端を有し、前記端は関心のある成分を吸収するために少なくとも部分的に抽出相でコーティングされている。配置装置は、前記ファイバーのコーティングされた末端をマルチウェルプレート上の複数の穴中の水中位置へ導き、前記ファイバーを前記穴から取出し、また前記ファイバーを分析装置内に配置するために使用される。
【００４８】
１つの実施形態においては、結合している抽出相にコーティングされた、小さい直径のファイバーを含む小型滅菌装置が使用される。抽出相は、１つ又は複数の関心のある化合物に対して親和力を有する。生体内で抽出相を曝露した後、装置は分析機器内における定量分析又は定性分析のために取出すことができる。
【００４９】
化学物質濃度の生体内研究のための装置は、ファイバー、すなわち、ワイヤ及び結合している抽出相から構成されている。ファイバー、すなわち、ワイヤは融解石英、金属、カーボン、グラファイト、又はポリマー材料でできていてもよい。装置は、取付けられているか、又は取外し可能なハンドルを有するか、又は有さなくてもよい。装置は、装置の検査する組織へのアクセスを提供するために、外側ニードル・シース等の、結合した、又は取外し可能なハウジングを有してもよい。装置は、カテーテル又はマイクロダイアリシス・カニューレ等の標準医療配置装置を経て、検査する組織に導入されることが好ましい。抽出後、ハウジングは、脱着に関連して使用される場合においてはそこに保持しておいてもよく、それほど必要ないのであれば廃棄してもよい。検査する組織へのアクセスを提供するために医療装置が使用される場合、例えば、各抽出のために毎回、肌や他の組織を穿刺する必要をなくすために、多様な装置を単一カテーテルとともに使用することができる。
【００５０】
生体内固相マイクロ抽出の工程は、関連する抽出相を有するファイバーを使用し、このファイバーは関連するハウジングを有しても、有さなくてもよい。いずれにせよ、望ましい抽出のために、装置を組織内に配置するための手段が提供される。抽出のために、装置は組織内の化学物質の平衡、対流力への無感受性、及び／又は最大限の感度を可能にするため、十分な時間、検査する組織と接触したままにされる。装置は人間の体内、ドブネズミ、ハツカネズミ、犬、羊又はウサギ等の実験的動物内の化学物質濃度をモニタリングするために使用されると考えられる。サンプリングに続いて、装置を適当な分析装置又は脱着装置内に配置し、抽出された少なくとも１種類の化学物質成分を脱着し量を測る。
【００５１】
上述の装置又は工程は、生きている動物の生体内における化学物質濃度を、動物組織内の機能バランスを干渉することなく、モニタリングするのに使用される。いくつかの特定の利点を説明することができる。まず、分析のために血液を採取する必要がないため、動物は受けるストレスがより少ない。これにより、薬物動態学的プロファイル用により多くのデータポイントを収集することが可能となり、またドラッグデザインの決定をするためにより良いデータが収集可能となる。また、これにより、動物の体内の異なった箇所における異なる代謝プロセスの影響をよりよく評価するために、動物の体内の多数箇所における血液又は組織薬物濃度のサンプリングが可能になる。一匹の動物からより多くのデータポイントを収集した場合、結果中における動物間の偏差の減少がおこる。この偏差はしばしば真の薬物動態学的傾向を不明確にし、故にこれを除去することにより、より良い薬物動態学的データが収集できる。動物の体内から特定の血液／組織のサンプルを採取する従来のサンプリングでは、動物の通常の化学物質バランスへの干渉が生じてしまう。連続したサンプリングのそれぞれが、動物の通常の機能への影響を強めてしまう。関心のある検体のごく僅かな量のみを採取する本発明のサンプリングによれば、通常の化学物質バランスは乱れることなく、故にサンプリングそのものの結果に対する影響を排除できる。全人口中の薬代謝の遺伝的変異は、個人間の同じ薬物の薬物動態の変異を惹き起こしている。上述の装置及び工程は、遺伝的変異の体内に存在する薬物の代謝に対する影響をモニタリングすること、及び、新しい薬のデザインが、調合されたドラッグデザインに対する様々な遺伝子プロファイルの利点を得ることの両方の点において有益である。
【００５２】
装置の較正（キャリブレーション）はいくつかの方法でなすことができる。平衡抽出が達成される場合、生体外の一致するサンプルに対比する較正は単純且つ効果的である。非平衡抽出下又は生体内組織と生体外のサンプルが一致しない場合においては、較正は、ファイバーを適当な検量体に予め負荷することにより達成される。また、ファイバーからの直接の検体の分光学的分析を使った、検体物理化学特性に基づいた直接の定量化も可能である。
【００５３】
装置は生体内検体抽出の間に、サンプリング及びサンプル調製の両方を果たす。サンプル調製はサンプル・マトリックスからの分離及び抽出相中での濃縮に限定される。また、これはファイバー上での追加的処理を含んでもよい。これの例としては、生成物極性の変更又は蛍光標識により検出の感度が高い形態に検体を誘導体化すること、ＤＮＡ分析の場合において信号強度を向上させる検体コピー数の増大、及び通常の生体分子（例えば、蛋白質）の場合において蛋白質又は酵素を分解し蛋白質又は酵素をより機器分析に敏感に反応する形態（例えば、ペプチドフラグメント）に変えることがある。全ての場合において、このファイバー上の処理の目的は、標的である検体の検出と測量を向上させることである。
【００５４】
従来のＳＰＭＥ装置において、装置デザインの最も重要な目的は、分析感度を最大限に増加させるため、ファイバー上の抽出相に対する検体の親和力を最大限に利用することだった。生体内分析の場合、コーティング生体適合性の問題は、等しく重要である。装置デザインは、生体適合性及び抽出相における親和力を考慮にいれなければならない。
【００５５】
装置デザイン及び工程の両方に内在する単純性のため、サンプリング及び分析の両方における多重化はより実用的であり、従来の分析にとってそうであった。ファイバーは、同じ又は異なるコーティングを有するファイバーごとに、一緒に束にしてひとまとめにされ、一度に１つでなく、一度に多くのファイバーのサンプリング及び定量化を可能にした。
【００５６】
装置及び工程のもう１つの利点は、定量化がサンプリングとは別に、従来の高感度機器分析を使用して行われるということである。これは、バイオセンサの場合のように、検出が直接サンプリング／サンプル調製に結びついている場合に成遂げられる感度及び選択性よりもより良い感度及び選択性が得られる。インタフェースは、ファイバーを分析機器に連結するために用いられる。これは、マルチウェルプレートの穴に入った溶剤へ検体を入れるオフライン脱着と同じくらい単純であることも可能であるが、熱脱着、電界脱着、溶剤脱着、又はレーザー脱着のより精巧な専用インタフェースであってもよい。溶剤脱着専用のインタフェースの場合、効率的に溶剤を流すとともに内径を小さくすることで脱着力が高まり、検体をファイバーからできるだけ速く取除くことができる。
【００５７】
上記説明は、ここまで、関心のある化合物を最初抽出相にロードせずに生体組織内の化学物質濃度を検査する装置の利用に焦点をおいてきたが、上記の装置は、正確な量の化学化合物を正確に標的となっている組織へ送るのにも等しく適している。仮に所定の量の関心のある化合物が最初に装置にロードされている場合には、装置を関心のある箇所に正確に配置し、そこで、動力学的及び／又は熱力学的原理に従って化合物が装置から出ることで、化学物質を組織に供給することができる。これは、特定の組織のみを薬物に曝す場合の的を絞った薬物投与に価値のあるものとなる。
【００５８】
図１Ａは、組織内に装置を正確な位置に配置するための配置装置とともに使用され、本質的に、ファイバー、すなわち、ワイヤ２にコーティングされた抽出相４からなる抽出装置１を示す。装置全体は、オートクレーブ、エチレンオキシド、ＵＶ照射又はガンマ照射等の従来の１つ又は複数の滅菌手段を使用して滅菌することが可能である。ワイヤのコーティングされていない端は、装置の配置を容易にするためのハンドル８を含んでも含まなくてもよい。ワイヤの長さは、使用条件によって変わる変数７である。抽出相４は、ワイヤ表面に形成されたポリマー層、ワイヤ表面に接着剤で貼りつけられるか他の方法で貼りつけられた微粒子吸着質材料又は吸着質材材料、又は抗体ヌクレオチドや蛋白質受体等の固定化生体認識作用因子であってもよい。後述のステンレス鋼線から作られている場合、抽出装置は実に柔軟である。これは、血管又はカテーテル内の曲線で同じように曲がり、通常取出した際にはまっすぐな形状に戻る。装置は、シングル・ポイント・モニタリング又はマルチプル・ポイント・（時間進行）モニタリングにおける、薬物の濃度及血液中又は他の組織内における代謝のモニタリングの使用に役立つ。
【００５９】
図１Ｂは、カテーテル本体部１０及びシール隔壁１２（ＰＲＮ）を有する、標準の医療カテーテルを概略図に示している。ＰＲＮは、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから販売され、貫通することが可能な隔壁を含む、カテーテルをシールするための静脈アダプタに対して通常使われる用語である。本文の後半において、静脈サンプリング用のこの種のカテーテルを使用した応用例が説明される。実際には、カテーテルは他の血管にも使用可能であり、故にその使用は静脈のものに限定されない。例えば、同様の装置を利用して、動脈、器官内の血管、又は毛細血管にもアクセスすることが可能である。
【００６０】
図１Ｃは、支持棒もハンドルもない単独の抽出装置からなる実施形態を、ＰＲＮ１２が取付けられ予め配置された医療カテーテル１２を通して血管に導入している様子を示している。抽出相４を有する抽出装置の端は、ＰＲＮを貫通し、カテーテルへのアクセスを提供するのに使用される滅菌した皮下注射針を含む。抽出装置を、支持ワイヤ２によりカテーテルに部分的に押込み、皮下注射針を引っ込める。この場合、ＰＲＮは失血を防ぐために、装置の周りにシールをもたらす。それから抽出装置１を適量だけカテーテル及び血管に押込み、抽出相は流れる血液に曝される。カテーテルはその後カテーテル内において凝固するのを防ぐため、塩水で洗い流す。薬物及び代謝物の抽出に必要な時間の後、皮下注射針は再度ＰＲＮに突入し、抽出装置の取外し口をもたらすために使用される。抽出装置はその後ハウジングから取出され、すすいでから分析のために運搬するために包装される。カテーテル又は他の配置装置をより簡単に扱うために、コーティングされたファイバーは、米国特許第5691206号において説明のとおり、マイクロ注射器内に配置することができる。
【００６１】
図２は、抽出相４を通り過ぎる血流１６を有する血管２２内にＰＲＮ１２を有する抽出装置９を配置するために、肌２０及び血管壁１８を通過する医療カテーテル１０の使用状態を示す。この位置において、抽出装置はカテーテルを通して完全に押下げられているため、抽出相はカテーテルの外側の流血に完全に曝されている。ＰＲＮ１２は、カテーテルの開通を確保するための洗い流しを可能にするために、常にアクセスできる状態にある。
【００６２】
図３はポリピロール重合反応の概略図である。抽出相の例として、ポリピロールは、電位が制御された状態において電解酸化により細い金属ワイヤの表面上に蒸着される。ポリマーは、後述のとおり、薄いステンレス鋼ワイヤ上に取付けることができる。結果として生じるポリマーは、それから血管内の血流から濃縮前の薬化合物を直接抽出するための抽出相としての役割を果たすことができる。ポリピロールを有するコーティングされたステンレス鋼ワイヤの例示的調製は実施例１においてなされている。
【医療サンプリング装置】
【００６３】
使用中においては、関心のある組織位置へのアクセスを可能にするため、ハウジングやシースを用意するのが望ましい。ハウジングはまた、検査する組織や部位の特定の位置において装置の正確な配置位置を確保するためにも重要である。これは、肌及び／又は血管の穿刺に続いて、分析のため特定箇所へ抽出相を配置し、多数のファイバーと撹拌手段を組み合わせることによりなされる。ハウジングはまた、サンプリングの間、血液が装置を通過して漏れるのを防ぐシールをもたらすことができる。結合させるハウジングの性質は、サンプルをとる箇所により異なる。
【００６４】
図４から図９は、装置のオプションの概略図であり、以下に説明する。
図４は、市販のカテーテルを使用したマルチ・ファイバー・サンプリングのための装置及びハウジングの改良型を示す。ファイバー２４、２６及び２８はコーティング３０、３２及び３４によりそれぞれコーティングされており、このコーティングとして、装置の吸収力を増加させるために同一の種のコーティングを使用することも可能であるが、或いは優先的に各ファイバーは生きている動物の体内において関心のある成分のみを認識する抗体等の異なる高選択的なコーティングを有することもできる。
【００６５】
装置はまたマイクロダイアリシス・カニューレ等の加圧されていない医療ポートからのサンプリングにも使用可能である。この種のポートは加圧されないため、サンプリングの間、流体が装置を通過して流出するのを防ぐシールの必要性がなくなり、これによりサンプリングの間において追加的なシースや特殊なハウジングの必要性がなくなる。装置は、組織からサンプルへ流体を追加したり除去したりする必要がないため、従来のマイクロダイアリシス・サンプリングにおいて多大な利点を有する。従来のマイクロダイアリシス分析においては、周囲の組織からカニューレに広まる流体の一部が分析のために採取される。或いは、合成流体がカニューレに送り込まれ、その後半継続的モニタリングのために分析機器へ送り込まれる。両方の例において、組織の流体バランスは、サンプリングの間、第一段階における体積の減少及び第二段階における希釈により崩れる。本発明の装置を使用した分析においては、このようなアンバランスが起こらないため、組織内における生化学バランスは崩れない。
【００６６】
図５Ａは改良されたハウジングを示し、図５Ｂは軟部組織からの直接のサンプリングに適当な抽出装置を示す。装置が引込んだ位置にあるとき、図５Ａに示されたハウジングはハンドル４６を有する剛性管４０から構成され、軟部組織に突入するためのシールされた先端４４を有する。先端は、切れ目、すなわち、スロット４２によりハウジングから互いに離れた１つ又は複数の片から構成されており、これらは通常先端をシールするためのバネの働きによりともに保持されている。図５Ｂは、針端の片を開口し抽出相を曝しサンプリングができるようにするための厚い管６に支持されている抽出装置を示す。
【００６７】
図６は軟部組織サンプリングのための抽出装置及びハウジングの使用状態を示す概略図である。図６Ａは、ハウジング内の引込んだ位置にある抽出装置４７を示す。図６Ｂは、ハウジング４５内の露出した位置にある抽出相４７を示す。支持ワイヤ６は、抽出相がワイヤを通過できるように、針の先端において片を開口させるために、抽出装置とともに移動する。
【００６８】
図７は、高分解ダイヤル５４を有する”Ｚ”垂直配置ステージ５２及び適当なダイヤル５６及び５８を有し、サンプル５０内において抽出相４の正確な配置を可能にするｘ−ｙステージ５５から構成されるｘ−ｙ−ｚ配置装置６０内に取付けられた、ハウジング４５及び抽出装置を示す。この配置システムは、挿入及びサンプリング工程をモニタリングするために、通常、顕微鏡を使用する。ハウジングはまず最初に、サンプリングに必要な位置において装置のチャンネルを準備するために用いられる（図７Ａ参照。）。ハウジングはその後、抽出相がまだ保持されている間に僅かに引抜かれる。このような方法で、装置の抽出相はハウジングによって具えられたチャンネルを囲む組織と接触し、故に、一片の組織がハウジング内に移動するのを防ぎ、また抽出相自体が組織内のチャンネルを開けざるを得なくするのを防ぐ。この場合装置は、組織蛋白質又はメンブレインに結合した化学物質はサンプリングしないため、組織内の間質性流体又は細胞間流体の化学物質濃度をモニタリングするために使用される。これは、サンプリングの簡略化及び組織破壊を減少させるという両方の点において、生検より好まれる。
【００６９】
図８はファイバーの下部７０において内側の側面がコーティングされた中空ファイバー３８を有するカテーテルを示す。この概略断面図は、内側ファイバー側面６２上の２層コーティング６６及び６４を示す。外側コーティング６６には蛋白質の吸収を除去するため、生体適合性を有するものが選択され、内側コーティング６４はチャンネル６８を経て内側ファイバーに導入されたサンプルからの特定成分の採取を容易にする抽出相である。サンプルは、中空ファイバーに連結された注射器又は定量ポンプ等の圧力差を生成する装置７２を使用して中空ファイバーへ吸引される。サンプルの吸引及び射出の実施は撹拌が生じ、従って抽出率を促進する。管はカテーテル内に取付けられるが、図７に図示の配置装置にも取付けることができる。
【００７０】
図９は、中空ファイバー３８を有するカテーテルを示し、伸長可能なコーティングが一端をシールし、中空ファイバーの自由端に連結された小型圧縮機又は二酸化炭素のボンベ、マイクロ・レギュレータ等の加圧ガス送給装置７４を使用してコーティングを膨らますことで小型の風船構造７５を形成できる。コーティングの材料又はその変形する表面７６はサンプルから化学物質を抽出するように設計することができる。膨張したコーティングはより大きな表面積を有するため、抽出率が増大する。また、コーティングの膨張及び収縮が繰返されることにより、対流が誘発され、さらに抽出率が増大する。
【小型化】
【００７１】
上述の装置は実に小さい（直径１２７μｍ）が、特に、単細胞の検査において、さらなる小型化が有利となる。プローブの寸法が小さくなるにつれて、抽出相の周りの理論上の境界層の寸法の抽出率への影響は、微小電極の場合と同様、減少する（Heinze, J. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.1993, 32, 1268-1288.）。実際には、これはサンプル内の対流度が抽出率に余り影響を及ぼさないことを意味する。これは、単細胞の場合のように静的抽出が行われなければならないか又は静脈のサンプリングの場合のように撹拌度が異なる組織のサンプリングにおいても重要である。さらに、抽出相の大きさもまた抽出平衡に影響を与える。より薄い抽出相はより速く平衡化し、またサンプル対流からの影響がより小さい。全体の大きさが１〜１０μｍの範囲にある装置は単細胞の内側をモニタリングするのに適しており、一方、ミクロン以下の範囲の装置は細胞内の細胞小器官をモニタリングするのに便利である。現在のところ、細胞内でおこる化学物質の濃縮を正確に評価する実行可能な手段はない。現在使用可能な手段は、この殺滅は誤った結果を生み出す細胞の殺滅（例えば、溶菌に続いてマイクロチャンネル内にサイトゾル成分のＣＥ（キャピラリ電気泳動））が必要であったり、精度に乏しかったりする（特定化合物の蛍光標識付け）。コーティングされたファイバー技術の主な長所は、非破壊的な方法で細胞プロセスをモニタできるということである。ごく僅かな量の化学物質が採取されるだけで、細胞プロセスは乱されないままである。顕微鏡に連結されたｘ−ｙ−ｚステージを使用する市販のマイクロ配置装置は、検査中の組織の特定の箇所にファイバーのコーティングされた端を配置するのに用いることができる。
【００７２】
細胞の遺伝子操作のために開発されてきた技術は、細いキャピラリを使用し、細胞内の遺伝物質をサンプリングしたり、細胞内に遺伝物質を導入し、細いキャピラリはマイクロマニピュレータによりコントロールされ、立体顕微鏡によりモニタされる。細胞は操作の間、一般的に適当な緩衝剤が入った皿又はバイアル瓶内に入れて、等張性環境において保持される。同様の機器をファイバー・プローブを有する細胞の配置及びサンプリングに使用することができる。
【携帯型自動化サンプリング】
【００７３】
上述の装置及び方法はサンプリング及びサンプル調製を大いに単純化するので、連続的な人間の関与が必要ない組織濃度の自動化されたサンプリングが可能となる。オンライン・マイクロダイアリシス・サンプリングにおいては、モニタされる動物は固定支持部にテザーでつながれ、マイクロダイアリシス・カニューレや分析機器（ＣＥ又はＬＣ（液体クロマトグラフィー））に／から流体を送る管はテザー内に含まれる。実施形態において、モニタされる動物は鎖等でつながれる必要はなく、むしろ、カテーテル、カニューレ又は他のサンプリング・ポートの中又は外に所定の時間、自動的にプローブを移動させる装置を有することができる。サンプリングの後、装置は、後で回収及び定量化できるようにプローブを保持しておく。この実施形態は、人間の関与が少なくそれ故にサンプリング・エラーを減少できるという点においてマイクロダイアリシスと同様な利点を有しており、検査中の動物は拘束されることやストレスを受けることがより少なく、より通常の環境を体験するというさらなる利点を有する。これは、ストレスが結果の完全性に与える影響を少なくする。
【使い捨て装置の方策】
【００７４】
現在まで、ＳＰＭＥ装置は多数回再利用できるように設計されていた。上述のポリピロールにコーティングされたファイバー（ワイヤ）装置の再利用は可能であるが、この装置を使い捨て装置として使用するのは有利である。特に、装置が血液に曝されている場合の実施においては、装置及び関連したハウジングを再利用のために十分にきれいにすることは、実用的ではない。製造の目的は、使用者が装置を使用後、破棄するのが費用効率が良いと思うように費用を最低限に抑えることでなければならない。
【コーティングの方策】
【００７５】
特定の状況下で、これらの装置の設計において望ましい、いくつかのさらなるコーティングの方策がある。これらは上述の用途のための装置の有用性を伸ばし、それらをさらなる用途への使用を可能にする。
【００７６】
抽出相内の生体適合性が向上すると、抽出相が組織と接触する時間を延ばしたり、１箇所から作ることができるサンプリングの数を増やすのに有利である。これは２つの方法によってなされる。より良い生体適合性を有する新しい抽出相を選択するか、又は生体適合性のある外側層をより低い生体適合性を有する内側抽出相とともに使用するかのいずれかである。
【００７７】
ポリピオールそのものは、良好な生体適合性を有する。これは数年間もの間、毒性、免疫発生（免疫反応の始まり）又は血栓発生（血塊反応の始まり）の形跡なしに、バイオセンサ装置において使用されてきた。これは、検査対象の組織に直接曝すのに適している抽出相の例である。より生体適合性のない抽出相を使用するのが望ましい場合には、装置は誘導セルロース等の生体適合性のある外側層を有する抽出相をコーティングすることにより生体適合性を有するようにすることができる。関心のある検体は、この外側層を通って自由に広がり、また内側層上の抽出相より抽出される。これは、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリアクリレート又はポリ（エチレングリコール）等のより従来の抽出相に、抽出の関心がある場合に有効である。
【００７８】
抽出相からなるか又は低い抽出親和力を有する他の抽出相に固定化された生体認識実体は、高い選択性及び高い感度の両方をもたらすことができる。親和力がより高くなると、感度がより高くなり、より容易にプローブ滞留時間をより短くすることが可能になる。選択性がより高くなると、検査する組織への妨害が少なくなり、さらなる選択性の増大及び抽出における競合の懸念の減少が可能になる。これは、競合する化合物が高濃度において存在する場合において、低濃度において存在する１つの化合物の定量分析を可能にする。
【００７９】
抽出相における生体認識は、不活性で生体適合性のある抽出相において生体認識が可能な他の分子又は抗体の包括によりなすことができる。これは、ジアゼパム固有の抗体を包括するためにポリピロールを使用した場合のものを示す。
【００８０】
図１０は、ポリピロールのみを有する装置を使用した場合と、反ジアゼパム抗体を有する装置を使用した場合のジアゼパムを含むサンプルの抽出を比較したクロマトグラムを示す。この場合、抗体に対する検体親和力は、ポリピロールに対するものよりも、非常に高い。或いは、抗体、核酸又は他の分子は定型的な固定化方策を使用してファイバーに共有結合して結合することもでき、又は現在のブロッティング技術において使用される核酸のニトロセルロースへの固定化と同様の手段により静電気を使って固定することもできる。共有結合による固定化のために、ランダム又は指向の方策が１つの応用又はその他の応用に使用される。
【００８１】
図１１は表面１７０における抗体１７２の配向固定化及び抗体−抗原複合体１７６を形成するための抗原１７４の親和力の概略図である。ジアゼパムは、抗体蛋白質の一時的又は永続的な変性により複合体から遊離させて定量化することができる。
【００８２】
非常に高い選択性を有するプローブがある場合、場合によっては関心のある化合物のみを抽出することが可能であり、故に分析におけるクロマトグラフィの必要性がなくなる。定量化のために質量分析計へ直接導入することにより、分析プロセスはさらに単純化する。この種の実体は、抗体、抗体フラグメント、蛋白質、蛋白質サブユニット又はペプチド・シーケンス、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はポリヌクレオチド又はこれらのいずれかと結合する抗原又は基質からなる。このような生体認識実体は、吸着、静電気、共有結合又は他のマトリックス内におけるエントラップメントにより固定される。共有結合固定化は、ランダム又は配向手段のどちらによってなされてもよい。
【００８３】
生体認識はまた、分子インプリントポリマーを用いても達成される。この場合、ポリマーは、関心のある検体があるところに具え付けられるポリマーは検体と静電気で相互作用する官能基を有する。重合の後、検体は取除かれ、内側に適当な官能基が配置されているキャビティがポリマーに残る。抽出に使用された場合、サンプル中を自由に可溶な検体はキャビティに引きつけられ、静電気力によりそこに保持される。これらのポリマーは、その関心のある検体のための高い選択性を理由に、合成抗体として見る者もいる。この種のポリマーは、本発明の装置内の抽出相として使用された場合、選択性の増大をもたらす。
【００８４】
また、コーティングの抽出効率を、抽出の直前にコントロールしたり活性化させたりすることができるコーティングを具えることも可能である。これは、装置を特定の箇所に予め配置することを可能にし、その後、抽出の開始と同時に抽出相を活性化させる。ポリピロールは導電性重合体であるため、これはファイバーに小さい電荷を印加することにより達成される。これは、ポリマーの酸化状態をコントロールすることによるイオン化合物の抽出に便利である。或いは、これは軟部組織サンプリング用の図８に図示の装置を使用してもなすことができる。装置はまず始めに所望の位置に配置されるが、ファイバーを組織に曝すことはサンプリングを始める適当な時まで遅らせることができる。
【指標化合物の使用】
【００８５】
生体分析的分析において一般的且つ有用なツールは、生化学経路に特有な指標化合物の出現及び消失をモニタリングすることである。これは、例えば、特定の細胞又はバクテリアの存在、又は遊離酵素の存在をモニタリングするために使用される。典型的な化学反応においては、基質（Ｓ）は単一酵素又は共同因子と結合した酵素システムと相互作用することにより、生成物（Ｐ）に形質転換される。酵素はこのプロセスにおいて形質転換されるか、又はされなくてもよい。指示物質は基質であってもよく、この場合その消失はモニタされ、また指示物質は生成物であってもよく、この場合その出現がモニタされる。特定の時間に形成される指示物質の量は、存在する標的酵素の量及び活性と相関している。指示物質が抽出相への親和力を有する場合、酵素活性及び／又は代謝率がその場でモニタされる。基質はファイバーにロードされているか又は細胞懸濁液又は酵素溶液の中に入れられる。ファイバーが溶液に入れられる場合、指示物質はファイバーに固定され、その後分析機器によって定量化されることができる。
【検量体のファイバーへの事前ローディング】
【００８６】
従来のＳＰＭＥ分析において共通の難点は定量化の正確な手段を考案する際にある。生体外分析において、定量化はしばしば周知の量の標準物質をサンプルに加え、その後分析を実行することによりなされる。これは、内部標準又は標準追加による較正と称される。回復される標準物質の量は回復される未知の検体の量と相関していると考えられており、割合は未知の物質の元の濃度を測定するために算出される。生体内及びその場での分析において、分析下の組織に標準物質を加えることは通常実用的ではない。これまで較正の最も実用的な手段は、サンプルにできるだけ近く一致する一連の合成標準物質を具えること及び未知の物質の標準物質分析の結果の比較によるものである。この方法は、図１２に基づいて生体内薬物動態学的検査におけるポリピロール装置の較正に対して上記で説明した。この場合、供給業者から犬の全血液を得て、様々な薬物濃度のサンプルが準備された。分析と同時に較正・カーブが形成され、このカーブは未知の薬物濃度を推定するため、未知の検出反応を挿入するために用いられる。方法は概念的には単純であるが、生体内の箇所における僅かな変化が結果に及ぼす影響に対応できないため、常に厳密に正確ではない。
【００８７】
従来の内部標準較正の替わりとして、標準物質を分析前にファイバー（抽出相）にロードし、ファイバーから標準物質が消失する様子を機器を用いてモニタリングすることができる。内部標準検体のファイバーへの吸収の速動性は脱着の速動性（結合は可逆である）と同じであり、吸収及び脱着はサンプル内の拡散によりコントロールされ、ファイバーからの標準物質の消失率はファイバーによる検体の採取と相関している。消失した検体の量は吸収された量と相関しており、また結果的に未知のサンプル濃度とも相関している。この方策を用いることにより、サンプル対流における変化は、ファイバーから消失した検量体の量を未知の検体に関連付けることにより、コントロールされる。又は、対流状態及びそれ故の物質移動率が知られているか又はコントロールされている場合、ファイバー上に不可逆的に結合された検量体を使用することができる。ファイバーは、まず最初に、検体の周知の濃度を有するマトリックスに一致する標準物質に曝される。ファイバーはその後未知のサンプルに曝される。未知の物質とファイバーから検出された標準物質の割合は、未知の物質と標準物質サンプルの濃度の割合に反映する。(G. Xiong, Y. Chen and J. Pawliszyn"On-site calibration method based on stepwise solid-phase microextraction", J. Chromatogr. in press).
【００８８】
ファイバーへ化合物を予めロードしておくことは、化合物を正確な組織領域にキャリブレートして運ぶのにも利用される。予めロードしておいた化合物のファイバーに対する親和力が低いか中程度である場合、化合物は抽出の間、ファイバーから外に出て、周りの組織に入る。これは、薬物又は他の関心のある化合物を１つの標的組織領域のみに投与する手段として使われ、治療薬物処方に共通して見られるケースのように、動物の体全体に投与することを避ける。組織投薬量コントロールは、抽出時間を正確にコントロールすることにより達成することができる。投薬量はそれから残留物質量を定量化するために、残留検体を分析装置に脱着することにより確認することができ、求められている量を算出することを可能にする。検量体の例示的使用は、実施例４に基づいて後述されている。
【マルチプル・ファイバーの使用】
【００８９】
マルチプル・ファイバー・コーティング方策の開発は、いくつかの利点を有する。特定の使用のために選択された装置に、より柔軟性をもたらすことに加えて、サンプル中に存在する化合物の種類及び量のさらに完全なプロファイリングをもたらすことに並行してマルチプル装置が使用される。これは、マルチプル・ファイバーをサンプルと平行に曝すか、又は１つのファイバーにマルチプル吸着剤を具えることにより達成される。
【マイクロ化学反応を実施するファイバー】
【００９０】
ファイバー上反応は関心のある化合物の検出を著しく向上させることができる。例えば、ファイバー上の蛍光ラベリングは微量レベルの毒素の検出における検出限度を改善してきた(A. Namera, A. So, J. Pawliszyn"Analysis of Anatoxin-a in Aqueous Samples by Solid-Phase Microextraction Coupled to High- Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection and On-Fiber"Derivatization J. Chromatogr. 963,295-302 (2002))。ジェノミクス及びプロテオミクス研究における分子キャクタリゼーションにとって最も重要な化学反応の２つは、ＤＮＡ増幅及び酵素の蛋白質分解である。両方のプロセスは、さらなる処理ステップを続けるか又は直接分析される生成物を使って、生体外で行われる酵素反応である。
【００９１】
ＤＮＡ増幅において、少数のＤＮＡ又はポリヌクレオチド・フラグメントは酵素ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される。酵素及び適当な基質の活性により、ＤＮＡのコピー数は僅か数時間で指数的に増加する。プロセスは高適合度を特徴としており、従って最終生成物は同一のＤＮＡフラグメントの非常に純粋な溶液である。通常、元々存在するＤＮＡの量がさらなる処理及び／又は分析キャラクタリゼーションに不十分であるのに対して、最終生成物の濃度は十分である。生成物はヌクレオチド含量及び配列を特徴とするか、又はＤＮＡ配列により符号化されたペプチド又は蛋白質を具えるのに使用される。
【００９２】
酵素蛋白質分解において、蛋白質サンプルは特定の箇所においてポリペチド連鎖を切断する酵素により分解される。結果として生じるポリペチド・フラグメントは分子量又はペプチド含量及び配列を特徴とする。通常、完全な蛋白質は直接のキャクタリゼーションには大きすぎるため、蛋白質は１つ又は複数の酵素開裂により生じるポリペチド・フラグメントのパターンの「指紋」分析を特徴とする。又は、ポリペプチドは配列され、元の蛋白質の配列は復元することができる。これは例えば、蛋白質のためのＤＮＡ配列符号はゲノム内におけるその位置を識別するための目的又は多量の蛋白質を生成するための発現系の開発のために測定されることを可能にする。
【００９３】
マイクロ機械型又はＴＡＳ装置を利用したゲノム及び蛋白質性の分析において継続的に小型化する場合に、サンプル調製及びその前の導入段階の小型化の必要がある。これらの小型化された分析の種は、サンプルの費用が高いためにサンプルの大きさが小さい、ジェノミクス及びプロテオミクスの分野においてますます重要である。また小型化は、ヒトゲノム解析計画の完成により可能になった非常にたくさんの数のサンプルをより効果的に処理するために、分析における並行化及び高い処理量を可能にする。細いファイバー、すなわち、ワイヤに取付けられた多孔性ポリマーは、これらの酵素反応を小規模で行うのに理想的な媒体であり、これは反応が完了した際、装置はまた反応生成物を直接マイクロ分析システムに導入するのに適しているというさらなる利点を有する。
【インタフェース】
【００９４】
上述したとおり、上述の装置及び方法の利点の１つは、一旦サンプリング及びサンプル調製（予め濃縮し、マトリックスの除くこと）が完了すると、本発明の装置は抽出された検体を分離及び定量化機器に直接導入するのに理想的に適しているということである。
【００９５】
従来のＳＰＭＥ装置は、抽出された化合物の量の定量化のためにＧＣ（ガスクロマトグラフィー）装置又はＬＣ装置に連結されている。 ＧＣ装置の場合において、ファイバーは従来の注射器射出を行う方法と同様に、加熱された射出スリーブ内で曝される。ＧＣ分析用の検体は、ＧＣ射出内で通常使用される温度において必ず揮発性であり、これらはまた射出スリーブを通って分離管へ流れる熱いキャリアガス内で効果的に脱着される。ＬＣにより分析される化合物は通常非揮発性及び／又は熱的に不安定であるため、脱着に熱を使うことができない。ＬＣ脱着において、まず最初にファイバーから検体を取除き、それらを溶剤に移動するために専用のインタフェースが必要である。この溶剤の一部又は全ては、その後分析用機器に注入される。商用のインタフェースにおいて、ファイバーは機器の注入口に連結されているバルブ内の溶剤に満たされたチェインバー内において脱着される。脱着後、バルブは機器の加圧された溶剤の流れと一致してスイッチングが行われ、溶解した検体を有する脱着溶液の全体の容量が機器に導入される。
【効果的なＬＣ定量化のための改良】
【００９６】
この技術は商用脱着インタフェース（１００μＬ）の比較的大きい容量に限定されてきた。ＬＣ（約５０μＬ）用の商用ＳＰＭＥ装置の相の厚さのため、この大きい容量は必要である。脱着容量が減少されると、かなりの量の検体がファイバーから取除かれない。脱着溶剤の容量が５０μＬ以下に減少されるため、２０％以内のキャリーオーバーは普通である（使用される特定の検体及び脱着溶液に左右される）。これらの容量は、しかしながら、射出容量が１０−２０μＬ以内であるため、特に、ＬＣ／ＭＳ（質量分析法）適用の典型的なＬＣ適用にはあまりに大きすぎる。これらの分析における大きい射出容量は通常、受入れがたく幅広いクロマトグラフィ・ピーク及び不良な分解を生じてしまう。全体の脱着溶剤の僅かな量のみが注入される場合、劣った感度が結果となる。本発明の装置の１つの強さは、抽出された検体の全てを定量化用機器に導入する機能である。これは最大限の高感度を可能になる。薬物動態学的分析のために上述したポリピロールにコーティングされたワイヤのように、かなり減少された相厚を有するファイバーは１０−２０μＬの脱着溶剤中で効果的に脱着される。 全体の脱着溶液は、その後定量化のために注入される。結果は鮮明であり、図１３に図示の対称のピークは、正確に一体化され良好なクロマトグラフィ分解が可能である。
【００９７】
上述で静的脱着の使用を説明したが、検体の動的脱着もまた或る種の応用では関心のあることである。これは脱着の間、脱着溶剤をファイバーの上に移動させることにより達成される。ファイバーは新しい脱着溶剤に継続的に曝されるため、定量脱着は理論的に可能である。脱着率は、ファイバー上の溶剤の流動率に左右される。流動がより速ければ、脱着がより速くなる。できるだけ最速の脱着を達成し、余りに大きすぎる溶剤射出プラグを防ぐために、脱着チェインバーの内側の直径が可能な限り小さいことが必要である。容量流体が一定である場合、より速いリニア流体が小さい直径のチェインバー内において達成される。これは結果として脱着時間をより短くし、故に総脱着容量を減らす。
【ＬＣ定量の自動化】
【００９８】
現在まで使用されてきた容量が減らされたＨＰＬＣインタフェースはファイバーからの検体を機器に効果的に移動させることが可能であるが、プロセスは部分的にのみ自動化されている。現在までプローブ・ワイヤをインタフェースへ／からの導入及び取外しは、各射出ごとに手動で行われなければならない。
【００９９】
図１４は、その小さい穴７９の中にコーティングされた一片のファイバーを含み、プラグ７８でシールしている、マイクロ・カートリッジ７７を示す。穴７９は脱着溶剤で満たすことができる。抽出後、コーティング４を有するコーティングされた一片のファイバーは保管及び移動中の保護のためにカートリッジ７７の穴７９に配置される。抽出された化合物の測定は、カートリッジの用途に採用される自動化された機器において実行することができる。
【ＣＥ用インタフェース、動電学的堆積の使用】
【０１００】
上述のとおり、特に、市販のＳＰＭＥ装置よりももっと小さい装置が使用された場合、本発明の装置は、マイクロ分析機器用のインタフェーシング・サンプリング及びサンプル調製のための理想的手段を提供する。キャピラリ電気泳動及びその関連技術において、検体は、通常直径が５０μｍのキャピラリ（毛管）に分けられる。これは従来の注射器射出にはあまりにも小さい。射出は一般的に流体力学的又は動電学的手段による。流体学的射出については、サンプルはキャピラリの一端に結合された緩衝剤貯槽内に配置される。その端は、所定の時間、所定の量により、対向する端上に持ち上げられる。キャピラリに入れるサンプルの量は、時間、標高差、キャピラリの直径及び溶液の粘性から算出することができる。サンプル溶液はその後分離電圧を印加する前に、流れている緩衝液と交換される。単純ではあるが、この技術は射出容量の不正確性及び１つの検体から次の検体への再現性が乏しいという欠点がある。動電学的射出については、サンプルはキャピラリの一端に取付けられた緩衝貯槽内に再び配置される。射出電圧は貯槽全体に印加され、溶液内の検体は電動力によりキャピラリへ移動する。一旦十分な物質が注入されると、電圧は取除かれ、サンプル溶液は分離電圧を印加する前に流れている緩衝液と再び交換される。この方法は、検体間における電気泳動移動性の偏差により射出内の不正確性が生じるという欠点がある。これは、結果として射出された存在する異なる化合物の量の違いを生じる。抽出された検体を有する小さい直径のファイバーは、流れている緩衝液に満たされたＣＥ分離キャピラリに直接導入される(Whang, C. W., Pawliszyn, J. Anal. Commun. , 1998,35, 353- 356)。これは、検体の分離に正確性及び定量の導入を可能にする。
【０１０１】
ＣＥ分析のこの技術の改良として、ファイバーの外側の直径と分離キャピラリの内側の直径を慎重に一致させることにより、分離結果の前に検体の堆積が生じる。これは、より優れた分解を可能にする。電気泳動速度は、分離キャピラリ内部の断面積に反比例している。この面積が減少した場合、電場勾配の増加により結果として速度の増加が生じる。ファイバーがＣＥキャピラリ内に導入された際、ファイバーとキャピラリの間のスペースは、緩衝液のみがキャピラリ内に存在するファイバー後のスペースによりも、もっと小さい断面積を有する。ファイバーが存在し、分離電圧が印加されている場合、検体はファイバーから外へ急速に制限されたチャンネルに沿って移動する。それらが開いた領域に着いたとき、キャピラリ移動は急激に低下し、検体は狭いバンドの内に集中する。分離の間、一方可能であるよりもより高い分解能が達成される。
【０１０２】
図１５はファイバー・バンドルを使用したｘ−ｙ−ｚ配置装置を示す。個々のファイバーは脱着前に分離キャピラリ内に正確に配置されることができる。この場合、図１５（１３２）に図示のように、抽出相はファイバーの最先端上のみ以上にコーティングされ脱着はレーザー・パルシングによってよりもむしろ適当な電位を適用することにより達成される。
【ナノスプレー・ネビュライザによるＭＳへの直接導入】
【０１０３】
いくつかの例においては、定量化前に抽出された検体をクロマトグラフィで分離する必要はない。これは、ファイバーが、関心のある検体のみが干渉物質なくして抽出されるほど非常に高い選択性を有している場合である。これはまた質量分析が検出／定量化に使用された場合や化合物が定量化前に時間よりもむしろ質量により分離された場合にもいえることである。ＭＳ適用において、ファイバーをエレクトロスプレー・イオン化源内のネビュライザ可動子の中に直接配置することが可能である。
【０１０４】
図１６はこのプロセスを概略的に示す。ネビュライザ１５０中を流れる溶剤は霧状にされる前にファイバー１６４から検体を効果的に脱着し、質量分析計気圧イオン化源１５６内のプルーム１５６へ吹付けられる。イオン化はそれからＭＳ検出を有する標準ＥＳＩにより達成され、即ちプルーム１５６内の溶滴は乾燥され、オリフィス１６６の辺りにおいてイオン１５４が形成するまで熱ガス流動１５２によりサイズを小さくされる。これらはその後機器内の質量分析器１６２に送られる。
【ＭＡＬＤＩ分析への適用】
【０１０５】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）はレーザーをエネルギー源として使用した分子イオン化の技術である。非常にソフトなイオン化方法として、ＭＡＬＤＩは主に単独にチャージ（荷電）されたプロトン化した分子を収量し、これらはその後イオン移動度分析又は飛行時間型質量分析装置により便利に定量化される。この特色により、ＭＡＬＤＩは高分子量、不揮発性及び熱変化しやすい検体用のイオン化機器として普及した。ＭＡＬＤＩは、ペプチド及び蛋白質のような大きい重分子のルーチン測定を可能にした(PE. Jackson, PF. Scholl, and JD. Groopman, Molecular Medicine Today, 2000,6,271.)。
【０１０６】
本発明のファイバー装置がＭＡＬＤＩに取付けられている本発明の実施形態は、重分子分析のために融解石英光ファイバーの先端上にサンプル抽出とイオン化の工程の結合を可能にする。ファイバーのサンプル端は、マトリックス溶液におけるペプチド及び／又は蛋白質の抽出のためにコーティングされていた。エンケファリン及び物質Ｐの場合において、使用されたマトリックスはアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ−シナミニック酸であった。光ファイバーは従ってサンプル抽出表面、サンプルさらにマトリックスの支持、及びレーザーからサンプルへレーザー・エナジーを送るための光パイプとしての役割を果たした。レーザー・エネルギーはイオン化のために光ファイバーの他方の端を通って送られ、次の分析のために重分子を脱着した。このファイバー／ＭＡＬＤＩ結合は、ＭＡＬＤＩ信号の検出のために、（別個の実験において）イオン移動度分析計及びタンデム四極子／飛行時間型質量分析計と結合された。
【０１０７】
図１７は、ファイバー／ＭＡＬＤＩ−ＩＭＳ(イオン移動度分析)インタフェース及び機器の概略図を示す。これは、レーザー源９６と、ｘ−ｙ−ｚ配置アレイ８４に保持されレーザー光をファイバーのコーティングされていない端に焦点をあわせる合焦レンズ８０からなる。配列移動は手動又は自動化することができる。ファイバー８６は源から質量分析器９０（この場合においてはイオン移動度分析計）のｘ−ｙ−ｚ配置可能インレット８８へ光を伝送する。インレット８８においてファイバー８６のコーティングされた端は、２つのシリコン隔壁９４及び支持管９２の一部分により適所に維持されている。ファイバーの最先端９８のみが抽出相でコーティングされている。感光性ダイオード８２はレーザー源８４に配置され、脱着レーザー・パルスを検出し、データ収集１００を開始する。
【０１０８】
図１８は、このシステムを利用して、エンケファリン及び物質Ｐのイオン移動質量スペクトルが得られたことを示す。ＭＡＬＤＩ／ＩＭＳインタフェースの１つの利点は、ＭＡＬＤＩ源が従来のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析法の場合と同様、高真空の替わりに大気圧で作動されているということである。また、ドリフト管に送られるサンプルの減失は大気圧においてごく僅かであり、大気圧ＭＡＬＤＩは通常大気圧において均一なイオン雲を生成することが最近報告された。イオン化プロセスは従来の高真空ＭＡＬＤＩよりもずっとソフトであり、小さい蛋白質のためのプロトン化した分子イオンを生成することが可能である。これは、従来の真空ＭＡＬＤＩと比較したイオン化プロセス中の準安定フラグメンテーション及び区別の相対非共存を理由に、高分子のＭＡＬＤＩ分析に便利である。この大気インタフェースの最も有望な利点は、同じ機器をエレクトロスプレー及びＭＡＬＤＩサンプル導入の両方に交換して利用可能であることである。
【０１０９】
図１９はレーザー脱着インタフェースのイオン形成の概略図を示す。この場合、２つの飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ）が使用され、１つは陽イオン１１０のサンプルを、もう１つは陰イオン１１２のサンプルを採取するために使用される。レーザー・パルスは抽出相１１４からの脱着を始め、分極化されたプレート１１６は適当な質量分析器に適当なイオンを加速させる。
【０１１０】
ＭＡＬＤＩはペプチド及び蛋白質等の大きな重分子のルーチン測定を可能にしたが、定量ＭＡＬＤＩ分析を開発することは常に関心が大きかった。ＭＡＬＤＩ分析を使った定量作業において、レーザー光線は標的プレート上のサンプル域全体にスキャンされ、各サンプル点はこの特定の点上に負荷されているサンプルのほとんどが除去されたことを示す信号検出の急減少が生じるまでマルチプル・レーザー・ショットにより照射される。従って、スキャニング・プロセスを終了するためには何十から何百ものレーザー・ショットを発射する必要があり、最終的なスペクトルは概して各レーザー・ショットから得られた全スペクトルの合計又は平均値である。このサンプリング・プロセスは、ショットからショットへ及び点から点へのサンプル再現性に劣ることを避けられず、ＭＡＬＤＩ分析における定量化手段の根本的限界と考えられてきた。
【０１１１】
本発明の装置とＭＡＬＤＩの結合は、サンプル抽出とイオン化工程を溶融石英光ファイバーの先端上において結合するため、技術的に上記の問題点を解決した。光ファイバーは従ってサンプル抽出表面、マトリックスを加えたサンプルの支持部、及び、レーザー源をレーザーからサンプルへ送る光学パイプとしての役割を果たした。サンプルは直接ファイバーの先端に負荷されていたため、サンプルの大きさはレーザー放射照度面積のものと同一であり、点から点への脱着差が存在しなかった。また、ファイバー内部における多重反射によって、主なレーザー・プロファイルは端ファイバー表面サンプルにおいて均一な強度プロファイルに変えられる。これはレーザー放射がファイバー先端表面全体において均一であることを意味する。この方法は単一レーザー・ショットを使用してファイバー先端に抽出された全てのサンプル脱着を達成するために開発された。この状況が満たされる限り、点から点へ及びショットからショットへのスペクトル格差もまた最小におさえられる。このような方法で、ＭＡＬＤＩの定量化の面を劇的に改良すると同時に、膨大な長さの分析時間及び膨大な量の検体を節約した。ファイバー／ＭＡＬＤＩ法の定量化の点を調べるために、検体化合物としてＴＯＡＢ（テトラオクチルアンモニウムブロミド）が選ばれ、全ての実験はＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）のマトリックスにおいて実行された。図１７に図示のファイバー／ＭＡＬＤＩ−ＩＭＳシステムが定量化に使用された。
【０１１２】
先の実験の抽出段階において、ファイバー／ＭＡＬＤＩファイバーの先端はサンプル及びマトリックスの両方を含んだ溶液に浸漬された。この予め混合された抽出方法において、検体とマトリックスの割合は予め最適化され、最良の実行のために固定されており、これは未知の濃度の本当のサンプル内の検体の検出する場合には、ほぼ不可能である。一方、抽出相は非常に小さい容量を有するため、検体とマトリックスの間で競争が存在し、これは抽出可能な検体の量のさらなる限界を生じてしまう。より実用的な方法は、サンプル抽出後の第二段階においてマトリックスを負荷することである。ネビュライザを使用するスプレー方法は、１００ｎｍより小さい非常に微細な滴を形成するため、これに理想的な候補方法である。サンプル抽出後、マトリックス溶液はネビュライザを用いて負荷される。霧のようなマトリックス滴はダイバー先端表面上にさらに均一な共結晶体を形成するのを助ける。ファイバー上に負荷されたマトリックスの量又はマトリックスと検体の割合はマトリックス溶液の濃度及びスプレー時間を変化させることにより簡単に調整可能である。
【０１１３】
実施例２はノイズの減少に関連するＭＡＬＤＩ／ＩＭＳインタフェースの使用を説明する。ノイズの減少は、便利ではあるが、必要ではない。従って、レーザーをサンプル表面へ入念に配置することは、ファイバーそのものがこれを達成可能であるため、任意である。しかし替わりの策として、レーザーがファイバーの表面に向けられる従来のＭＡＬＤＩ分析を実行することはまだ可能である。これは装置が非光伝導ファイバーから作られることを可能にし、また分析前に選択的に装置とレーザーを結合する必要性をなくす。
【並行抽出及び定量化のための多重化】
【０１１４】
上述の装置は、その円筒形状及び分析方法の単純化の両方により、サンプリング及び定量化段階の両方における並行化に便利である。
【０１１５】
図１５は並行サンプリングが、一度に多数のサンプルを検査するか又は多数の検体における単一サンプルを検査するために、同一又は異なるコーティングを有する多数のファイバーを束ねることにより達成される様子を示す。ファイバーの束はまた抽出の間、効率的な攪拌を提供するために使用することができる。抽出はマルチウェル・自動サンプル・プレートから行うことができ、異なったサンプルが入った各穴は単一ファイバーにより抽出され、高並行測定を容易にする。束状抽出装置は、上述のＭＡＬＤＩプロセスにより定量化に使用することができた。この束は光源に多重送信され、それぞれの個々のプローブは、源をそれぞれの個々のファイバーにおいて向けることにより、順番に照射される。同時に、各ファイバーのサンプル端は分析用機器に配置される。図１５に示すように、レーザー源１２０は、配置装置１２２を使用することによりファイバー束１３０中の各ファイバーに順番に照射される。束中のファイバーのサンプル端は、抽出／脱着メッシュ１２６に導かれる。この場合、ファイバーの先端のみがレーザー光によって照射された表面であるため、抽出相１３２にコーティングされる。サンプル端は、第二配置装置１２４を用いて配置可能である。各ファイバーは脱着の準備が整っているため、配置装置１２４により質量分析計１２８のサンプリング・オリフィスに配置され、脱着を始めるためにレーザー１２０が発射される。
【０１１６】
又は、プローブ束はＬＣ／ＭＳによる定量化により、同時に個々の溶剤脱着穴に脱着される。
【０１１７】
ファイバーＭＡＬＤＩ分析とマルチウェル・プレートの結合はまた配置装置が各穴の小さい開口部内に各コーティングされたファイバーの末端を正確に配置することを可能にし、故に抽出相が液体中に入ることを可能にする。この方法は、単一高密度マルチウェル・プレート内に多数の穴を収納するために、比較的小さいデザイン及び正確な配置装置を必要とする。現在の技術では１つのプレート上に１，０００以上の穴を設けることが可能である。他の導入技術は、特に、各ファイバーを収納するためにたくさんのマイクロ流体チャンネルが１つのマイクロ流体装置に配置されているマイクロ機械化されたマイクロ流体システムを使用して、サンプル又はファイバーを穴の中に導入するために用いられる。これは、全てのファイバーがマイクロ構造内で並行して脱着されるＭＳへのナノスプレー導入と組合わせて実行され、同時に各脱着溶液は順番にＭＳへ導入される。
（実施例１）
（ステンレス鋼ワイヤ上のポリピロール・コーティングの製法及び生体組織における使用）
【０１１８】
ステンレス鋼ワイヤ（グレードＴ−３０４Ｖ，０．００５)はスモール・パーツ社（フロリダ州、マイアミ・レイクス）のものを使用した。過塩素酸リチウム（９５％）及びポリピロール（９８％）はシグマ・オールドリッチ社（オンタリオ州、ミシソーガ）のものを使用した。ポリピロールは開封後１ヶ月のものが使用され、冷蔵して保存され、ボトルは各使用後、窒素で層状に重ねられた。ポリピロール（ＰＰＹ）フィルムが、水性の電解質溶液（対イオン）の存在下においてピロール・モノマーのアノード酸化により支持電極表面（ステンレス鋼ワイヤ）上に析出した。ポテンシオスタット／ガルバノスタット（モデル２７３、ＥＧ＆Ｇ  プリンストン・アプライド・リサーチ社）が電着に用いられた。ワイヤの最後１５ｍｍは、２０分間０．８Ｖで電位静的にコーティングされた。ワイヤの端から１５ｍｍの位置へのシリコン隔壁の配置は、コーティング長さの正確なコントロールを可能にした。使用されたコーティング溶液は水中のピロール（０．１Ｍ）及び過塩素酸塩（０．１Ｍ）であり、毎日新しいものが用意された。コーティングは通るカスタム設計された５０ｍＬのフロースルー型ガラス・コンパートメントにおいて行われた。コーティング溶液は、各脱着の間（５０ｍＬ／２０ｍｉｎ）１つの完全な溶液交換を可能にするため、継続的にコンパートメントへポンプで送込まれた。ステンレス鋼ワイヤはかみそりの刃で１０．７ｃｍの部分に切分けられ、コーティングされる端は、４００グリットのシリコン・カーバイド研磨紙によってエッチングされた。ワイヤはその後酸化物又は他の汚染物質がワイヤ表面上に蓄積するのを防止することが必要となるまで、アセトン内において超音波で破壊された。使用直前に、ワイヤは水で簡単に流され、作業電極として取付けられた。対向電極は、直径約１．５ｃｍのコイルの中へ形成されたプラチナ・ワイヤ（外径０．７５ｍｍ）の約１０ｃｍ部分から構成されている。ステンレス鋼ワイヤはこのコイルの中心においてコーティング溶液内へ入れられた。カロメル基準電極が使用された。ポリピロール・コーティングの厚さは１０μｍ厚さ未満であると推定された。用意されたプローブはその後、抽出相をカバーするのに十分な緩衝剤が入ったガラス瓶に入れられ、滅菌のためにオートクレーブされた。
【０１１９】
上記の通りに用意されたワイヤは一連のガラス瓶実験に特徴があった。ベンゾジアゼピン標準液（メタノール中１ｍｇ／ｍＬ）はCerilliant社（テキサス州、オースティン）から購入した。これらはサンプル調製及び機器較正で使用する様々な濃度の混合物を用意するために、メタノール中で希釈された。サンプルは緩衝剤、犬の血漿又は犬の血液から調整され、適当な量の関心のある検体に加えられた。装置は、一定期間、適当なポリプロピレン・サンプル・ガラス瓶に収納されたサンプル内に直接配置された。抽出後、プローブは流水で簡単に洗い流され、直ちに分析されるか又は分析前に乾かされた。薬物は、少なくとも２４時間室内温度で乾燥した状態で保管された場合、抽出相において安定していた。
【０１２０】
図２０及び図２１はこの方法によって達成される装置反応の２つの代案を示す。図２０においてサンプル及び本来のポリピロールにコーティングされたワイヤの間に速い初期の平衡が見られる。より長い期間の後、追加的検体がポリマー膨張として抽出され、抽出のために追加的部位を曝す。
【０１２１】
図２１は、抽出前に膨張したポリマーを提供するために、ポリマーがメタノールと予め調整されたことを示す。その結果、図２０中に見られる初期の遅延時間がなくなること及び、検体が膨張の間に曝された追加部位にアクセスするためにポリマーのバルク全体に広まる３０分後に最大抽出により抽出された量の即時の増加が見られる。これは応答時間がより遅くなる替わりに感度が向上する。
【０１２２】
図２２は緩衝剤及び血漿からの生体外抽出較正の結果を示す。装置は遊離薬物のみを抽出し、また検査する薬物は蛋白質に陰極９０％で結合しているため、検査される血漿濃度は緩衝剤よりも１０倍高い。緩衝剤中、薬物の１００％は遊離であり、蛋白質が存在しないため蛋白質に結合している薬物は０％である。血漿中、薬物の１０％以下は遊離であると考えられる。図２２は達成される直線飛程は、結合されていない薬物濃度に基づいて、緩衝剤及び血漿において同様であることを示す。この図はまたポリマー抽出が１００−２００ｎｇ／ｍＬの遊離薬物を有する溶液中において最大容積に達することを示す。
【０１２３】
抽出（生体内又は生体外における）後、装置上の化合物は少ない量（１０−２０μＬ）の脱着溶剤（この場合、メタノール７５％）に脱着される。最大脱着は僅か２０秒で示される。脱着溶剤の全て又は一部は分析用の分析機器に注入される。これは定型の注入口の位置がＬＣ上にある専用注入インタフェース内でオンラインで達成されるか、又は小さい脱着チェインバー内でオフラインで達成され、その後市販のオートサンプラーによる脱着溶剤の標準注射器注入が行われる。  
【０１２４】
図１２は血液凝固阻止剤で処理された全血液からの較正の結果を示す。この図は示された薬物（遊離及び結合したもの）全体の範囲以上の抽出における良好な直線性を示す。
【０１２５】
図１３は犬の血漿から１００ｎｇ／ｍＬで薬物を抽出した後に得られたクロマトグラムを示し、この方法により得られる良好なクロマトグラフィ・ピークの形状を示している。この場合、注入量は約１１μＬであり、上述の脱着溶剤が使用された。
【０１２６】
図２３から図２６は、犬の薬物動態学的検査において上述のカテーテル・サンプリング方法により装置を使用した結果を示す。この場合、０：００にジアゼパムが犬に投与された。マルチプル・サンプリングは引続き１２時間以上カテーテルから実行された。全血液中の外部較正から得た結果と比較すると、較正は図１２に示されたものと同様であった。他に示されているのは、従来技術の説明において上述した従来のサンプル調製及び分析をして同期間の間における多数回の血液採取により得られた結果との比較である。これらの結果は、装置が上述の適用に便利であり、上述の方法が攻撃的な先行技術のサンプリング技術を使用した装置及び方法に良好に一致した結果を生むことを示す。
【０１２７】
表１は、本発明に従って形成されたプローブのための緩衝剤及び全血液中において達成される検出の限界を示す。これらのデータから分かるように、装置及び方法は関心のある検体（この場合ジアゼパム、ノルジアゼパム、及びオキサゼパム）の非常に高感度な検出を可能にする。
【表１】
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（実施例２）
【ＭＡＬＤＩ分析】
【０１２８】
この実施例において、医療用エアロゾル・コンプレッサがマトリックス・スプレーとして使用され、１０ｍｇ／ｍＬのマトリックスＤＨＢ溶液がネビュライザ瓶内へ脱着された。検体検出後、ファイバーの先端はネビュライザ瓶の１．５ｃｍ上に配置され、コンプレッサを作動させることによりマトリックスＤＨＢ溶液の非常に微細な滴が形成され、ファイバーの先端に付着した。８００μｍファイバーはスプレー法を利用して０．０５ｍｇ／ｍＬのＴＯＡＢサンプル溶液でテストされた。マトリックス適用のための時間はより低い検体濃度を考慮して、それぞれ４５秒と３０秒にセットされた。２回の３分間空気乾燥時間がマトリックスのスプレーの前後において適用された。
【０１２９】
図２７はこの分析からのＩＭＳスペクトルを示す。検出の限界はＳ／Ｎ−２を有する０．０２ｍｇ／ｍＬであることが分かった。このレベルは、予め混合された方法を使用して４００μｍファイバーにより画定された先の０．２ｍｇ／ｍＬよりも１０分の1以下である。感度は劇的に増加した。この大改良はズプレー法と同様に表面積が大きいことによるものと考えられる。
【０１３０】
上記の作業においてレーザー・パルスはファイバーの芯に射出された。上記のノイズの減少に伴う利点に加えて、これはサンプル表面にレーザーを慎重に配列する必要がないため、便利である。ファイバーそのものがこれを達成する。しかし、替わりの策として、レーザーが直接ファイバーの表面に向けられる従来のＭＡＬＤＩ分析をより多く行うことは、まだ可能である。これはプローブが非光伝導ファイバーから構成されることを可能にし、プローブ及びレーザーを分析前に光学的に連結させる必要性がなくなる。
（実施例３）
【ファイバー上及び針内における実験】
【０１３１】
マイクロ機械化された装置において、流動をコントロールすることは、ポンプや電気浸透流動手段を必要とするため、単純ではない。また、小さいチャンネル内で検体を混合することはかなり困難である。より効果的な方法は、サンプル処理を表面上又は表面に隣合う薄い層上において行うことである。この実施例において選択される構造は、ファイバーの外面である。又は、管状ファイバーの内面を使用することができる。本実施例は、小さい対象物から検体を採取するための便利なサンプリング方法を示すために、小さいファイバーを使用する。この作業において、蛍光検出を有するキャピラリ電気泳動がファイバーから抽出された検体の少量の検出を容易にするために用いられた。
【化学薬品及び物質】
【０１３２】
４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）はフルカ（シグマ−オールドリッチ・カナダ社、オンタリオ州、オークヴィル）から購入した。Ｂｒｉｊ３５（登録商標）及び全てのアミノ酸（グリシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン酸塩、及びＬ−アスパラギン酸塩）はシグマ−オールドリッチ・カナダ社（カナダ、オンタリオ州、オークヴィル）から得た。ホウ酸ナトリウムはフィッシャー・サイエンティフィック（カナダ、オンタリオ州、ネピアン）から購入した。使用された全ての溶剤は、濾過されて脱ガス処理されているＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）グレードのものであり、全ての水溶サンプルは脱イオン処理された水（ナノピュア（NANOpure）、ウルトラピュア・ウォーター・システム）によって準備された。手動のＳＰＭＥアセンブリ及びカーボワックスにテンプレートされた樹脂（ＣＷ−ＴＰＲ，５０μｍ）でコーティングされた取替え可能な抽出ファイバーはスペルコ社（カナダ）から購入した。
【機器】
【０１３３】
ＣＥシステムへの高圧電源は、アメリカ合衆国、ニューヨーク州、プレインビューにあるスペルマン・ハイ・ボルテージ・エレクトロニクス社から購入した。ＣＥ分離キャピラリ及びシリカ・ファイバーは、アメリカ合衆国、アリゾナ州、フェニックスにあるポリミクロ・テクノロジー社から購入した。
【０１３４】
レーザー誘起蛍光検出（ＬＩＦ）の基本的な構成部材は、レーザー、焦点レンズ、対物レンズ、インターフェアレンス・フィルタ及び光電子増倍管である。アルゴンイオン（Ａｒ＋）レーザー（−５ｍＷ）が励起源であった。これは、４８８ｎｍ（その最大）の励起波長を提供した。顕微鏡対物レンズ（ＩＯｘ）及インターフェアレンス・フィルタとしてのローパスフィルタ（５３０ｎｍ）はメレス・グリオット（カナダ、オンタリオ州、トロント）から購入した。光電子増倍管（ＰＭＴ）及びこれの高電圧源を含んだソケットは、ハママツ（Ｒ９２８及びＣ６２７１、アメリカ合衆国、ニュージャージー州、ブリッジウォーター）から購入した。デザインにおいて、間接的に信号を強化するために光学チョッパー及びロック・イン・アンプリファイヤーが使用された。光学チョッパー（ＳＲ−５４０）及びロック・イン・アンプリファイヤー（ＳＲ−５１０）はスタンフォード・リサーチ・システムズ（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サニーヴェール）から購入した。ロック・イン・アンプリファイヤーからのアナログ出力信号は、２０Ｈｚで記録され、その後アナログ信号をデジタル化するプラグ・イン・データ取得カード（Ｓｔａｒ４．５，バリアン）によって読込まれた。
【ＣＥシステム・セットアップ】
【０１３５】
ＣＥシステムは、高圧電源及び４５ｃｍ（内径７５μｍ及び外径３８５μｍ）の効果的な長さを有する分離キャピラリから構成されていた。流れている緩衝剤は、２０ｍＭ（ミリモル）のホウ酸ナトリウム、１０ｍＭのＢｒｉｊ３５（登録商標）、及び２．５％のメタノールであった。キャピラリは、０．１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水及び流れている緩衝剤でそれぞれ１５分間調整された。作動の間に、キャピラリは０．１ＭＮａＯＨで４分間再調整され、続いて流れている緩衝剤で２分間再調整された。作動電圧は１２ｋＶであった。射出は、キャピラリ・インレットを５秒間５ｃｍ上げることにより、流体力学的に行われた。
【溶液中の誘導体化反応】
【０１３６】
反応溶液は、１０μｌの各アミノ酸（水中０．０１ｍＭ）、１０μｌの１ｍｇ／ｍｌのＮＢＤ−Ｆ及び６０μｌの１０ｍＭホウ酸塩緩衝剤をｐＨ８で混合することにより準備された。この混合物を３０秒間攪拌し、６０℃の水槽に様々な期間（２，５，１０，３０及び６０分）保持された。反応溶液は流れる緩衝剤によって８００μｌの最終的容量に希釈され、分析を待つ間アイス・バス内で保存された。
【ファイバー上の誘導体化反応】
【０１３７】
ファイバーはまず最初にエタノールに浸すことにより洗浄された。これはその後、１０００ｒｐｍの磁気攪拌を使用して１５分間、ＮＢＤ−Ｆ（エタノール中２−３ｍｇ／ｍｌ）が入ったバイアル瓶に浸された。その後、ファイバーはホウ酸ナトリウム緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）内の２００μｌのアミノ酸（０．１ｍＭ）を含む１−ｍｌのテフロン遠心機管へ送り込まれ、サンプルに２０分間浸される。１ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を含む４−ｍｌのアンバー・バイアル瓶は、６０℃の水槽内で保持された。このバイアル瓶のヘッドスペースは基本的だった。抽出された検体を有するファイバーがそれに曝された際、誘導体反応がおこった（１５分）。
（ファイバー／ＣＥによる全ブドウ・サンプリング：インタフェース及びオフ−分離管脱着）
【０１３８】
オフ−分離管脱着を有するファイバー／ＣＥインタフェースは既に説明した。脱着溶剤（２μｌ）はＳＰＭＥファイバー・コーティングの表面に配置された。この小さな溶滴はファイバー・コーティングの表面周辺で手動で転がした。最後にこの溶滴は石英管の一部分の上に配置され、キャピラリ・インレットが取付けられている管の他端にすべり落ちた。キャピラリ・インレットは約２秒間この溶滴に接触した。この石英管が緩衝剤バイアル瓶の１０ｃｍ上に配置されていたことから、溶液は流体力学的に注入された。キャピラリ電気泳動は、その後開始された。この種のインタフェースには、スペルコ社が市販しているカーボワックス／ＴＰＲ  ＳＰＭＥファイバーが使用された。
【ファイバー／ＣＥインタフェース：オン−分離管脱着】
【０１３９】
オンー分離管脱着は、ファイバー／ＣＥインタフェースの欄で既に説明した。ＳＰＭＥマイクロ・ファイバーは、２ｃｍの長さのシリカ・キャピラリ（直径１００μｍ）をポリイミドにコーティングされた１０ｃｍのシリカ・ファイバー（内径１００μｍ×外径３６５μｍ）にエポキシ糊を使用して接着させることにより作られた。ユニットは一晩空気乾燥させた。マイクロ・ファイバーはさらに５０％のＨＦ（フッ化水素）を使用して、直径約５０μｍにエッチングした。これらのファイバーは最後にステンレス鋼管に収納され、カーボワックスでコーティングするために、ペンシルバニア州、ベルフォンテにあるレステック社に送られた。
【結果及び考察：アミノ酸誘導体の分離】
【０１４０】
Ｂｒｉｊ３５（登録商標）の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は０．９ｍＭである。これらの実験において使用されたＣＥ流動緩衝剤は、１０ｍＭのＢｒｉｊ３５（登録商標）を含んでいた。Ｂｒｉｊ３５（登録商標）は分離分解を改善するためにミセルを形成するだけでなく、アミノ酸誘導体の蛍光強度をも強化する。いくつかの研究において、Ｂｒｉｊ３５（登録商標）は少なくとも３度にわたってこのような誘導体の蛍光信号を強化することを示した流動緩衝剤内のメタノール（２．５％）は、有機修飾剤として機能した。これは溶質の溶解度の増加を助け、移動時間窓を拡大した。その結果より良好な分解度が達成された。これらの状況下において、５つのアミノ酸誘導体（フェニルアラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸塩及びアスパラギン酸）の混合物が２０分内で分析された。
【アミノ酸のファイバー上の誘導体化反応】
【０１４１】
ＮＢＤ−Ｆを有するアミノ酸のファイバー上誘導体化はまず始めに上述のファイバー／ＨＰＬＣ／蛍光検出システムに設置された。ファイバー上誘導体化及びＣＥ／ＬＩＦ検出システムは、実験の欄で説明した。アミノ酸誘導体の分離は確認された。ＮＢＤ−Ｆは温和で基本的な状況下においてアミン及び求核基に反応する。ｓｐ−ａの観測されたピークはＮＢＤ−Ｆ及びＴＥＡの反応の副生成物を示した。観測されたｓｐ−ｂのピークは、水溶緩衝剤成分及びサンプル・マトリックスを有するＮＢＤ−Ｆの反応の副生成物を示すものである。ＮＢＤ−ＯＨは水溶液を有するＮＢＤ−Ｆの反応において形成される主な副生成物である。グリシン誘導体は１つの副生成物ピークであるｓｐ−ｂで相互溶離されたため、グリシンはこれらの状況下で分析されることが不可能であった。グリシンは、６分４７秒（ＲＳＤ（相対標準偏差）＝１．３７％）の平均移行時間を有する。同様の手順を使用して、ファイバー／ＣＥ／ＬＩＦ検出システムがアミノ酸分析に使用された。この検査において、オフ・分離管脱着を有するファイバー／ＣＥが使用された。
（全ブドウ・サンプリング：オフ−分離管脱着ファイバー／ＣＥインタフェース）
【０１４２】
この技術のＣＥ／ＬＩＦ検出システムに結合されたファイバー上誘導体化を使用した小さい生対象物への直接分析への適用を例証するために、全ブドウがサンプＮＢＤ−Ｆにドーピングされたファイバーを使用した場合、サンプリング手順及び誘導体化反応はそれぞれ２０秒間及び２０分間かかった。緑のブドウ（Ｇ）及び赤の種なしブドウ（Ｒ）を用いたこの方法から出た結果の電気泳動図は、緑のブドウサンプルにおいて７分５秒でグルタミン誘導体が発見され、赤の種なしブドウサンプルにおいては７分１秒で発見されたことを示している。これらの移行時間は、標準物質のＬ−グルタミン酸塩の７分４秒と一致した。ファイバー／ＣＥ実験において、ほとんどのピークは、フェニルアラニン及びプロリン誘導体が飽和信号に隠されるように飽和した。サンプル中のアミノ酸のさらなる識別のため、ブドウから採取された汁を分析した。ブドウ汁サンプル中で、グルタミン酸の形でグルタミン酸塩も発見された。
【オン−分離管脱着ファイバー／ＣＥインタフェース】
【０１４３】
オフ−分離管脱着において、カーボワックス／ＴＰＲコーティングを有するファイバーがサンプリングに使用され、一方、オン−分離管脱着には、より薄いコーティングを有するマイクロ・ファイバーが使用された。これらのマイクロ・ファイバーは７５−５０μｍの直径を有していたため、より小さな生対象物のサンプルを採取するために用いることができた。これらのマイクロ・ファイバーはカーボワックスでコーティングされた。ファイバーを視覚化するために電子顕微鏡検査が用いられ、ファイバー・コーティングは約１０ｎｍであることが分かった。
【０１４４】
これらのファイバーをＣＥ／ＬＩＦ検査システムに連結したファイバー上ラベリング反応に使用する実施可能性が試験された。まず第一に、無色のＮＢＤ−Ｆ溶液がファイバー及び脱着されたオン−分離管により抽出された。ＮＢＤ−Ｆのドーピングは成功した。アミノ酸標準液のサンプリング及びＴＥＡヘッドスペースでの反応後、１つの生成物も検出されなかった。
（実施例４）
【較正化合物がロードされたファイバーを使用した機器及び方法較正】
【０１４５】
本発明の主な利点は、抽出された成分を、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、キャピラリ電気泳動、マイクロ−チャンネル装置等の分析機器へ非常に便利に導入することができ、また質量分析計や検出機器にも直接導入することが可能であるということである。この特色はさらに分析機器に較正標準液を送るために探査されることができる。現在、標準液は適当な較正化合物を含む溶剤混合物を注入することにより機器に送られている。しかし溶剤の存在はしばしば較正工程の妨げのなる。従って、較正工程からの溶剤の排除は使用者にとって利点となる。これは標準液をロードしたファイバーを適当な機器に脱着することにより達成することができる。
【０１４６】
ファイバーへのローディングは吸着剤がコーティングされたファイバー（抽出相がコーティングされた）ファイバーを標準液の供給源に曝すことにより達成することができる。標準液はそれからファイバー・コーティング上に吸着される。他の方法は、化学反応を経て化学標準液をファイバーに固定させ、その後温度、光、化学ポテンシャル、移動相が増加した状況下において機器に放出されることである。第二の方法は検量体の安定性を保証するが、この実施例が例証するように、第一の方法もまた非常に効果的である。
【０１４７】
２つの較正法が使用された。第一の方法は固体吸着剤がコーティングされたファイバーを使用した。方法の１つは、較正化合物をＳＰＭＥファイバーを利用して分析機器へ送ることである。標準液はまず最初に強力な吸着剤を使用して標準液混合物から抽出され、続いて標準液がコーティングされたファイバーの較正を必要とする分析機器への導入が行われる。この方法において、液体射出が避けられるため、トレースＶＯＣ（揮発性成分）の測定に対する溶剤の干渉が排除される。７５μｍのｃａｒｂｏｘｅｎ（登録商標）／ポリジメチルシロキサン（ＣＸ／ＰＤＭＳ）ファイバー／コーティングが使用された際、メタノール、アセトン、ジクロロメタン及びクロロホルム等の非常に揮発性のある化合物に順調な較正・カーブが得られた。標準ガス又はＶＯＣｓ（揮発性有機化合物）のガス混合物がガス・チェインバーに結合されたＮＩＳＴトレース可能保障浸透管を使用するか又はマイクロ波に支持された蒸着により用意された。「順次進行」はファイバーのオン−サイト較正のこの作業の間に開発された第二較正法への方法である。この方法においてＣＸ／ＰＤＭＳでコーティングされたファイバーには標準液がロードされ、続いて調査システムに曝され、その後分析のためにＧＣシステムに導入された。検体の蓄積時間は標準液のものと同一又は異なって設定することが可能であり、また検体の反応ファクタはそれに応じて調整可能である。ＢＴＥＸ（ベンゼン・トルエン・エチルベンゼン・キシレン）の反応ファクタの再現性は、段階的工程により得られた。
ガソリンスタンド・エア内のＢＴＥＸの定量分析におけるこの方法を使用することにより満足な結果が得られた。段階的工程を経た標準液の導入はこの技術を分野適用においてさらに有用にする。この方法は、いくつかの点において標準液追加、また外部較正にも類似している。これは漏れ、汚染及び分析機器に導入するために標準液をファイバーにロードする時間のロスを検出するために使用することができる。
【標準ガス及び混合ガスの調整法】
【０１４８】
現在まで、標準ガスの調整のためのいくつかの方法が開発されてきた。この作業において必要な標準ガス又は混合ガスを調整するために２つの方法が使用された。
【ＮＩＳＴ浸透管を使用したＢＴＥＸの混合ガスの調整法】
【０１４９】
ＢＴＥＸ（ベネゼン、トルエン、エチルベネゼン、ｐ−キシレン及びｏ−キシレン）の標準混合ガスはＮＩＳＴ（National Bureau of Standards）のトレース可能保障浸透管（テキサス州、ラ・マルク、Ｋｉｎ−Ｔｅｃｈ研究所）及び我々の研究所内にあるガス・チェインバーにより生成された。これは、標準ガス（又は混合ガス）の一定濃度を得ることができるフロー・スルーシステムであった。温度は５０度に、気流量は毎分３００ｍｌに設定された。混合ガスはガスチェインバーからサンプルを採取する。
【ＶＯＣｓの標準ガスのマイクロ波支持生成】
【０１５０】
家庭用電子レンジ（１０００Ｗ、ＭＷ５４９０Ｗ型、サムスン社、韓国製）及び１−Ｌガス・サンプリング・バルブ（ペンシルバニア州、ベルフォント、スペルコ社）が標準ガス及び異なった濃度を有する調査済ＶＯＣｓの混合ガスを調整するために使用された。ガラス・バルブの内壁はシラン処理により不活性化され、バルブは使用前に窒素を流すことにより洗浄された。ＢＴＥＸ、１，３−ジクロロベンゼン、１，１，２−トリエタン及びテトラクロロエチレンの標準ガス又は混合ガスの調整においてガラスウールの純粋な一片（約１０ｍｇ）をバルブのサンプリング・ポートの内部にその都度セットし、脱イオン化した水（１５μＬ）で湿らせた。水は、マイクロ波源を吸収し、その後マイクロ波の吸収に劣る化合物の蒸着を促進するために使用した。標準ガスの調整において、アセトン、メタノール、ジクロロメタン及びクロロホルムが必要であったが、ガラス・ウール及び水は全く必要ではなかった。ガラス・バルブのポートは、表面がテフロンのシリコン・ゴムの隔壁でシールされ、この隔壁を通って標的化合物（又はいくつかの化合物の混合物）の特定の容積がグラスウール上に注入された。最後に、バルブをマイクロ波放射を受けるために９０秒間電子レンジ内に配置した。マイクロ波出力は常に最大力レベルに設定された。スペルコ・バルブを室内温度まで冷やした後、隔壁が配置されているバルブのサンプリング・ポートを通して、標準ガス分析が行われた。
【装置及び段階的工程】
【０１５１】
使用したファイバー・コーティング及び従来のサンプラーは、スペルコ社（ペンシルバニア州、ベルフォンテ）より提供された。コーティングは、７５μｍのＣａｒｂｏｘｅｎ（登録商標）／ポリジメチルシロキサン（ＣＸ／ＰＤＭＳ）、８５μｍのポリアクリレート（ＰＡ）、１００μｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）及び６５μｍのポリジメチルシロキサン／ジビニルベンゼン（ＰＤＭＳ／ＤＶＢ）が使用された。
【０１５２】
段階的工程は次のように行われた。まず第一に、ファイバーをバルブ内のテトラクロロエチレン標準ガスに曝し、その後２分間の抽出の後、ファイバーを針内に引っ込め、サーモグリーン隔壁（ＬＢ−２、スペルコ社）を使用して、針の先端をシールした。フィールド・ＳＰＭＥサンプラーを使用する際、別個のシーリング隔壁は必要ない。テトラクロロエチレンがロードされたファイバーをその後チェインバー内のＢＴＥＸ標準ガス又は実際のエア・サンプルに数分間曝した。最後に、ファイバーを標準液及び検体を同時に脱着するためにＧＣインジェクタに送った。
【検体のＧＣ−ＦＩＤ分析】
【０１５３】
水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を具えたバリアン・モデル３５００ＧＣをサンプル分析に使用した。スペルコ社（ペンシルバニア州、ベルフォンテ）のＳＰＢ−５キャピラリ分離管（３０ｍ×０．２５ｍｍ×１μｍ）を使用し、キャリアガスとして平方インチあたり３０ポンドの水素を使用した。分離管は次のようにプログラムした。始めは３５℃で１分間保持、１分間に１０℃の割合で１３５℃に上昇させ、１分間保持した。検出器は２８０℃で保たれた。ＰＡ、ＰＤＭＳ及びＰＤＭＳ／ＤＶＢファイバーにおいては、インジェクタは２５０℃でコントロールされ、脱着時間は１分間であった一方、ＣＸ／ＰＤＭＳファイバーは３００℃で２分間脱着された。
（標準液の注射器射出及び標準液がロードされたファイバーによるＧＣシステムへのＶＯＣｓ標準液の導入の比較）
【０１５４】
アセトン、クロロホルム、ジクロロメタン及びメタノール等のいくつかの非常に揮発性の高い化合物が検査に使用するために選ばれた。標準液は溶剤としてメタノールが使用され、各化合物に対するアセトン、ジクロロメタン及びクロロホルムの濃度は１０μｇ／ｍｌであった。ＧＣシステムに０．１μｌの標準液を注入することにより得られたＧＣ−ＦＩＤクロマトグラムは、溶剤ピークが他の化合物のピークに比べて大きすぎるため良好に分離できないことを示し、故にこれらのトレース成分を正確に判定するのを困難にした。
【０１５５】
一方、標準液がロードされたファイバーをＧＣシステムに注入することによって得られたクロマトグラムにおいては大きな溶剤ピークは示されず、従ってＶＯＣｓの理想的な分離及び識別が達成された。標準ガス混合物の分析は７５μｍのＣＸ／ＰＤＭＳファイバーを使用して３分間行われ、標準ガス混合物中のアセトン、クロロホルム、ジクロロメタン及びメタノールの濃度は各化合物に対して５０．５μｇ／Ｌであった。溶剤射出を避けることにより、微量のＶＯＣ標準液やかなり短い保持時間を有する非常に揮発性の高い化合物であっても満足なクロマトグラムを得ることが容易になった。
【０１５６】
また、トレース分析の定量化範囲に一致するために非常に小さい容積（＜＜０．１μｌ）の液体標準液をＧＣシステムに正確に注入することは困難であるため、多量の溶剤の導入を避けるために、個々のＶＯＣの純液又はＶＯＣｓの混合液体をＧＣシステムに直接注入することにより較正カーブを得ることは困難である。
（いくつかのＶＯＣｓのＧＣ分析においてこの技術により得られた較正カーブ）
【０１５７】
２つの異なるグループのＶＯＣｓの標準ガス混合物を抽出するために２つの異なるファイバーが使用された。アセトン、クロロホルム、ジクロロメタン及びメタノールを含む非常に揮発性の高い化合物は、上述したようにＶＯＣｓに対して高い親和力を有する７５μｍのＣＸ／ＰＤＭＳファイバーを用いて抽出された。ＢＴＥＸは、１００μｍのＰＤＭＳファイバーを用いて抽出された。ＰＤＭＳファイバーは標的化合物を吸収により抽出する一方、ＣＸ／ＰＤＭＳファイバーは吸着により抽出することが知られている。ＶＯＣｓ標準液をファイバーを用いてＧＣシステムに導入することにより、上述のＶＯＣｓ分析におけるＳＰＭＥ−ＧＣ−ＦＩＤの濃度反応関係に関する満足な較正カーブが得られ、図２に図示された。関連する較正の方程式を以下に示す。
メタノール：A = 767.69 C+ 3564,R = 0.9937  （１−ａ）
アセトン：A = 3234.8C +22693, R2 = 0.9952  （１−ｂ）
ジクロロメタン：A = 1004.6C + 7271. 5, R2=0. 9965  （１−ｃ）
クロロホルム：A = 980.46 C + 719.5,R2 = 0.9993  （１−ｄ）
ベンゼン：A = 106.18 C-1069.5, R2=0. 995  （２−ａ）
トルエン：A = 326.42 C-4320.8,R = 0.9993  （２−ｂ）
エチルベンゼン：A = 711. 53 C-6136.8, R2=0. 9958  （２−ｃ）
ｐ−キシレン：A = 868.43 C-10704,R2 = 0.9994  （２−ｄ）
ｏ−キシレン：A = 995.98 C-9588.1,R2 = 0.9972  （２−ｅ）
ここに、Ａはクロマトグラフィのピーク面積（計数）であり、ＣはＶＯＣｓ標準ガスの濃度（ｇ／Ｌ）である。
【０１５８】
実験結果は調査済ファイバーが較正カーブを得るための溶剤の注入なしにＶＯＣｓ標準液をＧＣシステムに導入するのに効果的であり、ファイバーＧＣがＶＯＣｓの定量分析、また非常に揮発性の高い化合物の定量分析において高い実行可能性のある方法であることを示した。
【０１５９】
またさらに、ＳＰＭＥファイバーを用いて標準液を導入することにより、ＶＯＣｓのＧＣ分析における「質量：反応」較正カーブを確定することが可能である。吸収タイプのファイバーが抽出検体に使用された場合、方程式３−ａによると、サンプル中の原基検体濃度（Ｃｏ）とファイバーから平衡に抽出された検体の量（ｎ）の間には直接的関係がある。
【数１】
2005519669.tif 000004
ここに、Ｋｆはファイバー／サンプル分配計数であり、Ｖｆはファイバーコーティングの容積、Ｖｓはサンプル容積である。吸着タイプのＳＰＭＥ法においては、ファイバーにより平衡に抽出された検体Ａの量（ｎ）はまた、飽和吸着に達する前のサンプル中の原基検体濃度（ＣｏＡ）の増加に伴って多くなる。
【数２】
2005519669.tif 000005
ここに、ＫＡは検体の吸着平衡定数であり、ＣｆＡは安定した状態にあるファイバー上の検体Ａの濃度であり、Ｃｆｍａｘは表面上における活性サイトの濃度（表面上における最大の達成可能な検体濃度に一致する）であり、Ｖｓ及びＶｆはそれぞれサンプル及びファイバー・コーティングの容積である。
（コーティングをゼロ・エアに曝した後の抽出相コーティング上のＶＯＣｓの安定性）
【０１６０】
サンプル中に存在する検体は、吸収又は吸着によりサンプルから標的化合物をコーティングへ集めるか、又は濃縮する。しかし、他の抽出方法と同様に、濃縮はコーティング相から抽出された化合物を解放するという反対の工程が続く。従って、若干のＶＯＣｓがロードされたコーティングを純粋な空気に曝した場合、抽出物の一部は空気中に移動し、その後、その抽出物はコーティング及び空気相の間において平衡分布に達する傾向がある。コーティング相からの抽出物の解放は主に化合物及びコーティングの性質、環境温度、コーティング相、サンプル中及び環境における化合物濃度の差等の要因に左右される。８５μｍのＰＡ、１００μｍのＰＤＭＳ及び６５μｍのＰＤＭＡＳ／ＤＶＢコーティング上のいくつかのＶＯＣｓ（ＢＴＥＸが含まれる）の残留物は、コーティングを１分間室内温度でゼロ・エアに曝した後、０から９１．５％の範囲にわたることが表２において示された。しかし、７５μｍのＣＸ／ＰＤＭＳコーティングは、同じ状況下において６分間ゼロ・エアに曝した場合においても、８９．９％から９７．２％ほどの抽出物を蓄積することができた。実際に、曝す時間が４分間以内に制御されている場合、７５μｍのＣＸ／ＰＤＭＳコーティング上における殆どの抽出物に明らかな損失は発見されなかった。従って、ＣＸ／ＰＤＭＳコーティングを用いた段階的工程を実行することは可能となり、すなわち、このコーティングは第一段階において化合物を抽出するのに使用され、その後、先に抽出された化合物がコーティングにまだ残留している間、他の化合物を抽出するために移動される。
【段階的工程を使用したＢＴＥＸ分析の内部標準液の選択】
【０１６１】
１，３−ジクロロベンゼン、１，１，２−トリエタン及びテトラクロロエチレンがテストされ、７５μｍのＣＸ／ＰＤＭＳが使用された場合にそれぞれＢＴＥＸ分析の内部標準液として使用された。ＣＸ／ＰＤＭＳはこれらの化合物に対して強い親和力を有しており、ＣＸ／ＰＤＭＳコーティング上におけるこれらの蓄積はＢＴＥＸのものに近かった。これらのクロマトグラフィの作用を考慮すると、テトラクロロエチレンが、ＢＴＥＸから良好に分離され、またこのピークがクロマトグラムの中心部に位置することから、ＢＴＥＸ分析の最良の内部標準液である。さらなる検査は、特定の状況下でファイバーへテトラクロロエチレンをロードすることがＢＴＥＸに影響を与えず、ＢＴＥＸもまたファイバー上のテトラクロロエチレンの蓄積に影響を与えないことを示した。ＢＴＥＸ分析の内部標準液としてのテトラクロロエチレンは、そのバックグラウンドが通常石油のような主なＢＴＥＸ源に存在しないというもう１つの利点を有する。しかし、テトラクロロエチレンには欠点もある。これはハロゲン化された化合物であり、これに対するＧＣ−ＦＩＤ反応はＢＴＥＸほど感度は高くない。テトラクロロエチレンの測定感度に関する問題点は、ＭＳＤ（質量分析検出器）又はＦＰＤ（炎光光度検出器）等の選択的検出器を使用することにより解決することができる。
（テトラクロロエチレンが内部標準液として使用された場合のＢＴＥＸの反応ファクタ）
【０１６２】
クロマトグラフ分析において、反応ファクタ（Ｆ）は以下の式で定められる。
【数３】
2005519669.tif 000006
ここに、Ａｘ及びＡｓは検体Ｘ及び内部標準液のピーク面積であり、Ｃｘ及びＣｓはこれらが混合された後の検体Ｘ及び標準液の濃度である。テトラクロロエチレンを上述の段階的工程を追ってＢＴＥＸ分析の内部標準液として使用する場合、標準液は検体がＳＰＭＥファイバー上に抽出される前に検体と混ぜられない。このような場合、Ｃｓは標準ガスのテトラクロロエチレンの濃度を表し、Ｃｘはサンプル中の各ＢＴＥＸの濃度を表す。
【０１６３】
ＢＴＥＸの順次進行のＧＣ／ＦＩＤ分析において、反応ファクタが測定された。ＢＴＥＸの時間は２分間であり、これは標準液のものと同等であった。反応ファクタは２回繰返したテスト中ほとんど全ての場合において、大いに一致したことが分かる。これによって、ＣＸ／ＰＤＭＳコーティングが使用された場合、段階的工程は実行可能であり、またＢＴＥＸのＧＣ分析の内部標準液を導入するための実用的方法であると考えられる。
【段階的工程における抽出時間の反応ファクタへの影響】
【０１６４】
上述の反応ファクタは各ＢＴＥＸのＧＣ／ＦＩＤ測定の感度に関するだけではなく、これらのＳＰＭＥ効率にも左右されることに注意しなければならない。標準液及びＢＴＥＸは段階的工程の間に同時に抽出されたのではないことから、ＢＴＥＸの時間は標準液のものと同等又は異なるようにコントロールすることができる。当然、時間のコントロールは反応ファクタに多大な影響を与える。これは内部標準液を使用するための従来の方法と区別すべく、順次工程の特別な特色の１つである。従来の方法においては、検体と内部標準液の抽出は同時に行われている。反応ファクタは、テトラクロロエチレン（標準液）のＳＰＭＥ時間が一定に２分間にコントロールされている場合において、ＢＴＥＸのＳＰＭＥ時間と１分間から５分間の範囲内において線状に変化したことが判明した。得られた線形方程式は以下のとおりである。
ベンゼン：F= 4. 265t +1.301,Ruz = 0.9979  （５−ａ）
トルエン：F= 5. 776t + 0.402,R2 = 0.9981  （５−ｂ）
エチルベンゼン：F = 4. 663t-0.031,ruz = 0.9996  （５−ｃ）
ｐ−キシレン：F = 4. 623t-0. 247,R2 = 0.9993   （５−ｄ）
ｏ−キシレン：F = 4. 767t-0. 703,R2 = 0.9963  （５−ｅ）
ここに、Ｆは反応ファクタであり、ｔはＢＴＥＸの単位を分とする時間である。
【０１６５】
標準液及び検体の両方の濃度は、内部標準液が使用された際、直線飛程内にあった。ＧＣ−ＦＩＤは、非常に広い飛程内においてＶＯＣｓに対して直線反応を有することが知られており、ＣＸ／ＰＤＭＳコーティングの発明工程においてもまた同じである。抽出時間によって変化するＢＴＥＸの反応ファクタの優れた直線性はまた直線飛程内に検査される化合物の濃度が位置することに反映される。
【ガソリンスタンドの空気中におけるＢＴＥＸのフィールド適用分析】
【０１６６】
我々の研究室から徒歩５分のところにあるガソリンスタンドから、７５μｍのＣＸ／ＰＤＭＳコーティングを有する自家製のフィールド・サンプラーを使ってＶＯＣｓ（ＢＴＥＸが関心であった）のサンプルを採取した。サンプリングが行われたこの日は晴天であり、温度は約２４度であった。テトラクロロエチレン（８．１μｇ／Ｌ）の標準ガスが入ったガラス・バルブがフィールドに運ばれ、ＢＴＥＸの前にテトラクロロエチレンの分析が行われた。標準液のサンプリング時間は２分間、ガソリンスタンドの空気のサンプリング時間は４分間であった。サンプリング終了直後、サンプラーは研究室に運ばれ、その後ファイバーは直ちにＧＣ−ＦＩＤに導入された。各ＢＴＥＸの識別は、保持時間及び５９７３ＭＳＤを具えたヒューレット・パッカード６８９０ＧＣ（アメリカ合衆国、アジレント・テクノロジー社）を用いたＧＣ−ＭＳ分析法に基づいて行われた。テトラクロロエチレンは、ガソリンスタンドの空気そのもののからは発見されなかった。抽出物の他の化合物からの標準液及びＢＴＥＸの分離は非常に良好であり、ただ１つのピークが、精選のクロマトグラフィの状態下において互いから分離できなかったｍ−キシレン及びｐ−キシレンを含むことがあった。最後に得られたピーク面積（Ａｓ及びＡｘ）、標準液濃度（Ｃｓ）及び５−ａから５−ｅの方程式から得た反応ファクタ（Ｆ）を使用して、空気中のＢＴＥＸの濃度が方程式４により算出された。
【結論】
【０１６７】
空気中においてＶＯＣｓのＧＣ分析の較正・カーブを得るために、ファイバーはＶＯＣｓ標準液をＧＣシステムに溶剤射出なく導入するために効率よく使用された。発明の技術に溶剤射出を避けたことは、微量のＶＯＣ標準液及び非常に短い保持時間を有する非常に揮発性の高い化合物の場合においても、満足なクロマトグラムを得るのを容易にした。さらに順次進行方法がフィールド適用におえるＢＴＥＸのＧＣ分析の内部標準液を導入するために開発された。ＣＸ／ＰＤＭＳは、そのＶＯＣｓに対する非常に強い親和力により、この方法に適した唯一のコーティングであると証明された。テトラクロロエチレンは、ＧＣ分析のＢＴＥＸの保持時間と比較して正確な保持時間を有し、ＣＸ／ＰＤＭＳコーティング上においてＢＴＥＸと同様の作用をし、環境内における主なＢＴＥＸ汚染源の非常に低いバックグラウンドを有することなどの理由から、内部標準液に選ばれた。開発された方法を使用すると、分析結果はサンプルに標準材を加える必要性なくキャリブレートされ、故にフィールド適用において発明の方法をさらに有利にする。しかし、標準液はサンプル及び標準液の検体に直接加えられず、検体は順次進行に行われることから、この方法はＢＴＥＸ分析上のエア・マトリックスの影響の較正の必要性に応じない。この方法はまた、結果として検体及び標準液の損失を生じる漏れ等のフィールド装置内におけるファイバーの蓄積に関する問題点を検出するのに適している。技術のさらなる開発は認定された標準液の製造を容易にする化合物の化学固定化を含むことができる。
（実施例５）
【挿入により調整された非均一チャンネル内の電気泳動】
【０１６８】
異なる断面を有する２つの部分から構成されるキャピラリ内での検体の電気泳動作用が検査された。分離経路の調整は異なる深さにおいて円筒状のファイバーをキャピラリに挿入することにより成された。下部断面の端及び適当な帯域においてロードされたサンプルは、示されたように、キャピラリの２つの部分における電界強度割合によって広いキャピラリ部分において空間的に狭くなっている。また、低伝導のサンプル緩衝剤はさらなる信号の狭量を高め、エレクトロインジェクションによりキャピラリに導入された全プローブの量を増加する。この濃縮技術の適用は、分離又は例えば、ＵＶビジブル、蛍光、電気化学、ＮＭＲ又は質量分析検出を使用した直接検出の前に、脱着後、ＳＰＭＥファイバーから電気泳動的分離へ焦点を合わせることを含む。また、緩衝剤中に存在する検体に焦点を合わせることは、分離又は直接検出の前に異なる形状のインサートを挿入することにより可能である。インサートのチャンネルへの周期的な挿入は検体の濃度を調整し、これは分離チャンネルに連結しているシステムの分離及びモニタリングを容易にする。調整インプットはランダムであってよく、信号はそれから交差相関等の複合データ処理技術により分析することができる。チャンネルの直径の調整はまた外圧又は電気パルスを適用することにより成され、これはまた結果としてインサートがチャンネルに入ったり出たりする移動の必要性なく焦点を合わせることができるようにする。後述する結果は、チャンネル断面の直径が２つのチャンネルが出会う場所において実質的に増加することから、焦点調節は、チャンネルを横切った位置でおこることを示す。これは第２チャンネルにおける分離の前又は第２チャンネル内での第２次元分離の前に２つのチャンネルの間のインタフェースにおける焦点調整を第１チャンネル内での分離の後におこなう場合の２つの次元分離の前に検体の濃縮を容易にするために効果的に使用される。
【概論】
【０１６９】
電気泳動の分離チャンネルの非定的な型は、関係するプロセスに重要な役割を果たすいくつかのパラメーター（電界強度、温度、ｐＨ）の分散を提供する方法である。適当なスムーズ機能を得るためスムーズ型の変化が必要である。電気泳動カメラの断面を変えることにより、電場勾配が得られ、この勾配はいわゆる勾配焦点技術に使用される他の力と合わせて使用するか又はそれ自体で電流密度の減少を提供し、チェインバーのデザインは十分な温度差を作りだすのに適当である。後の効果は内部ジュール加熱によって生じる熱勾配のＩＥＦにおいて使用された。
【０１７０】
各パーツがそれぞれ不変の型であるいくつかの異なるパーツからなる分離チャンネルはむしろサンプル導入、検出、マイクロ配列等における複数段階分析開発に使用される。本文中に説明した結果はまた、サンプル適用工程が分離キャピラリに長い物（例えば、マイクロファイバー）を挿入することと関連している方法論にとって重要である。
【実験用装置】
【０１７１】
ＵＶ吸光度の全分離管画像検出（ＷＣＩＤ）は、ｉＣＥ２８０のＣＩＥＦ機器（コンバージェント・バイオサイエンス社、カナダ、トロント）内において２８０ｎｍの固定した波長で行われた。１００μｍのＩＤを有し、内部をフルオロカーボン（カリフォルニア州、フォルサム、Ｊ＆Ｗサイエンティフィック社）でコーティングされた短い溶融石英キャピラリはカートリッジ型（コンバージェント・バイオサイエンス社）内に集められた。キャピラリ検査、サンプル注入、データ収集及び処理の全てのプロセスは、パーソナルコンピュータにより行われ、また電気泳動図はアノードへの距離に対する吸光度として記録された。
【物質及び化学薬品】
【０１７２】
５０及び６１．５μｍの芯を有する光ファイバー（ＦＨＰ０５００５５０６５及びＦＶＰ６００７２０８２）はポリマーイクロ・テクノロジー社（アリゾナ州、フェニックス）から購入した。ｐＩマーカー及び緩衝剤化学薬品はバイオ・ラッド社から得られた。水はウルトラピュア・ウォーター・システム（バーンステッド／サーモライン社、アイオワ州、デュビュク）を使用して浄水され、全ての溶液に使用された。
【工程】
【０１７３】
ファイバーが異なる間隔でキャピラリ内に挿入され、キャピラリは流れる緩衝剤（バイオ・ラッド社製のＰｈｏｓｇａｔｅ５−１００ｍＭ）で満たされた。その後サンプルは、第１キャピラリ部分（挿入されたマイクロファイバーを含む）の完全な補充を成すために特別に決められた射出時間、動電学的に射出された。その後、電極リザーバは洗浄され、所望の緩衝剤が配置され、電気泳動的行程が実行された。
【結果及び考察】
【０１７４】
初期ゾーンの幅はＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）において重要な事柄である。サンプル濃度が高感度検出を提供するには不十分である場合、多数のオンライン予備濃縮が呈される。この最も単純な電気泳動に基づいた技術は、特別な伝導性プロファイルの作成と関係があり、濃縮メカニズムは異なるが（例えば、ＣＥ又はＩＴＰ（等速電気泳動）に基づくもの）サンプルゾーンの位置においてより高い電界強度値を成すことを可能にする。電界強化の同様の効果は順次進行の断面変化により得ることができる。
【０１７５】
これらの実験において、円筒状のマイクロファイバーを挿入することにより、分離チャンネルの断面は調整された。サンプルは５００ボルトで動電学的に注入され、電圧パルスの所要時間はキャピラリの第１部分を完全に満たすようにコントロールされた。
【０１７６】
初期起動ゾーンは、（キャピラリの半分ほどが容積がないことを考慮すると）むしろ幅広かった。その後、断面差から始まる予想可能な割合で、効率的に圧縮された。２つの同軸シリンダの場合、断面割合（Ｒ＝Ｓ２／Ｓ１）はＲ＝Ｄ２／（Ｄ２−ｄ２）であり、このときＤはキャピラリの直径であり、ｄは挿入されたマイクロファイバーの直径である。一定の伝導性の仮定をもとに、狭い部分（Ｅ１／Ｅ２）における電界増加はＳ２／Ｓ１により測定され、初期ゾーンの長さはほぼ同じ割合で狭くなるはずである。
【０１７７】
観測された効果は、サンプル予備濃縮に従来使用された方法と組合されることができる。低い伝導性緩衝剤を使用することで、ピーク幅の変化はより明白ではなかったが、導入されたプラグ内における主な濃縮サンプル増加を達成することを可能にした。
【０１７８】
上記のこの効果は、サンプルゾーンの容積が一定に保たれなければならず、またサンプルプラグが狭くなるのはその形の変化によるものであるため、導入されたプローブ内においてこれ自体では濃度増加は全くもたらさない。しかし、この単純で明らかに見られる効果は、第一に、必要に応じて「初期幅」ゾーンから分離を開始するために、多数の重要な適用を提供する。例えば、発明の技術を使って作業する場合、キャピラリにマイクロファイバーを挿入し、かなり広い起動ゾーンを得て、電界適用により起動ゾーンはマイクロファイバーの端において効果的に狭くされることができる。後の効果は当然ながら挿入されたマイクロファイバーの相対的サイズに左右され、高ゾーンを狭くするためには（Ｄ−ｄ）差は十分小さくなければならない。
【０１７９】
固相マイクロ抽出及び蛍光ラベル検体の分離チャンネルへの脱着が観測された。プロセスは蛍光全分離管画像検出によりモニタされる。励起光はファイバーを利用して分離チャンネルに送られる。この作業は、ＬＩＦ画像検出を使用してＣＥにインタフェースを連結する場合におこる積重プロセスを示している。蛍光強度の強化に基づいて、濃縮効率は１０倍ほど高くまで近くなることができる。インタフェースの形状のさらなる最適化及び分離キャピラリ及びファイバーの大きさ、緩衝剤の濃度及び適用された電圧等の実験の条件によって、より高い濃縮効率が期待される。このようなインタフェースにより生成される積重効果は分離効率及びＣＥ分離の検出感度に有利である。
【０１８０】
本発明の上記実施例は、単なる例であるものと意図されている。特定の実施例の改造、修正及び変形は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者によりなされ得るものであり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ定められるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】本発明の実施例の装置デザインの全体概略図。
【図２】静脈中に正確に装置を配置するため、医療カテーテルを使用している状態を示す図。
【図３】ポリピロール重合反応を示す概略図。
【図４】複数のコーティングされたファイバーを有するカテーテルの概略図。
【図５】軟部組織サンプリングのハウジング及び装置の概略図。
【図６】軟部組織サンプリングのハウジング及び装置の操作を示す図。
【図７】ｘ−ｙ−ｚステージを有するサンプリングに装置を配置するために、軟部組織サンプリング・ハウジングを使用している状態を示す概略図。
【図８】カテーテル配置装置を有し、内側の側面がコーティングされている中空ファイバーを有する、本発明の実施例の装置を示す図。
【図９】一端が柔軟な抽出相でシールされている中空ファイバーを有する、本発明の実施例の装置を示す図。
【図１０】ポリピロールのみを有するファイバーからのジアゼパム抽出物とポリピロール中に閉じ込められた反ジアゼパム抗体を比較したクロマトグラムを示すグラフ。
【図１１】表面に固定した反ジアゼパム抗体を使用した、ジアゼパム抜粋抽出を示す図。
【図１２】装置反応を較正するために用いる全ての血液中の較正を示すグラフ。
【図１３】血漿から装置抽出物のＬＣ／ＭＳによる定量化をした後に得たクロマトグラフ例を示すグラフ。
【図１４】ファイバーを保持しているカートリッジを示す図。
【図１５】並行抽出のためのバッチ法及び、レーザー源及びファイバー吸着端の両方にある配置装置を使った、複数のＭＡＬＤＩ吸着を示す概略図。
【図１６】ナノスプレー噴射器及びＥＳＩ  ＭＳを使用している発明装置の概略図。
【図１７】本発明のファイバー／ＭＡＬＤＩ−ＩＭＳシステムの概略図。
【図１８】本発明のファイバー／ＭＡＬＤＩ−ＩＭＳシステムから得られた、典型的質量スペクトラムを示すグラフ。
【図１９】ファイバー／ＭＡＬＤＩ源の概略図。
【図２０】標準装置における抽出反応に対する時間を示すグラフ。
【図２１】予め調整された装置における抽出反応に対する時間を示すグラフ。
【図２２】緩衝液及び血漿中の較正の比較及びリニア反応限度の例証を提供するグラフ。
【図２３】ジアゼパムの典型的な薬物動態学的プロファイルを示すグラフ。
【図２４】ｙ軸を拡張したジアゼパムの典型的な薬物動態学的プロファイルを示すグラフ。
【図２５】ノルジアゼパムの典型的な薬物動態学的プロファイルを示すグラフ。
【図２６】オクサゼパムの典型的な薬物動態学的プロファイルを示すグラフ。
【図２７】０．０５ｍｇ／ｍｌのマトリックス・スプレー法により得たイオン移動性スペクトルを示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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