(57)【要約】生体活性分子アッセイ法について表現型を検出するための方法及び組成。より具体的には、一つまたは複数の候補化合物の、微生物及び癌の生体活性分子を抑制する能力に対する適合性を、化学療法または抗感染療法に先立って、またはそれらの療法の過程において、決定するための方法及び組成を提供するものである。また、薬剤発見のための表現型アッセイ法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体活性分子を生成し評価する方法であって、
a）生体活性分子を含む核酸配列を提供する段階と、
b）段階(a)で得られた核酸配列によってコードされる生体活性分子を発現する段階であって、発現する生体活性分子が検出可能な表現型を持っている、段階と、
c）段階(b)で得られた生体活性分子を一つの化合物と接触させる段階と、
d）段階(c)で導入された化合物の存在下または非存在下において生体活性分子の表現型を検出する段階と
を含む、生体活性分子を生成し評価する方法。
【請求項２】
生体活性分子が、ウイルス分子、細菌分子、真菌分子、原生動物分子、ヒトの分子、及び動物の分子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
生体活性分子が、レトロウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、ハンタウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質、インフルエンザタンパク質、ミクソウイルスタンパク質、ピコルナタンパク質、アデノウイルスタンパク質、ポックスウイルスタンパク質、フラビウイルスタンパク質、またはコロナウイルスタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
生体活性分子が、連鎖球菌タンパク質、ブドウ球菌タンパク質、腸球菌タンパク質、ナイセリアタンパク質、サルモネラタンパク質、ミコバクテリアタンパク質、バシラスタンパク質、ミコプラズマタンパク質、クラミジアタンパク質、フランシセラタンパク質、パスツレラタンパク質、ブルセラタンパク質、シュードモナスタンパク質、リステリアタンパク質、クロストリジウムタンパク質、エルシニアタンパク質、ビブリオタンパク質、赤痢菌タンパク質、または腸内細菌タンパク質を更に含むタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
生体活性分子が、プラズモジウムタンパク質、トリパノソーマタンパク質、またはクリトスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
生体活性分子が、カンジダタンパク質、クリプトコッカスタンパク質、マラセジアタンパク質、ヒストプラズマタンパク質、コクシジオイデスタンパク質、ヒフォミセスタンパク質、ブラストミセスタンパク質、アスペルギルスタンパク質、青カビタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、フザリウムタンパク質、ペシロミセスタンパク質、ケカビ／クモノスカビタンパク質、ニューモシスティスタンパク質、リノスポリジウムタンパク質、スポロトリクスタンパク質、白癬菌タンパク質、小胞子菌タンパク質、表皮菌タンパク質、バシディオボールスタンパク質、コニディオボールスタンパク質、クモノスカビタンパク質、カニンガメリアタンパク質、パラコクシジオイデスタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、またはリノスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
生体分子をコードする核酸配列が、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
生体活性分子をコードする核酸配列が、転移RNAまたはポリA＋RNAを更に含む、請求項1または請求項7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
生体活性分子がタンパク質、糖タンパク質、多糖、ムコ多糖、リポ多糖、リポタンパク質、炭水化物または核酸を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな真核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな原核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の翻訳系において発現する、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
核酸配列によってコードされ、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する生体活性分子が、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ポリA＋RNA、tRNA、rRNAからなる群より選択される核酸である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
生体活性分子をコードする核酸配列が、該生体活性分子に機能的に結合する第二の核酸配列を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
第二の核酸配列が調節エレメントを含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
第二の核酸配列が精製モチーフを含む、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
第二の核酸配列が、精製モチーフを含む遺伝子産物またはその断片をコードする、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
生体活性分子を、抗ウイルス化合物、抗細菌化合物、抗真菌化合物、抗癌化合物、抗免疫抑制化合物、ホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、酵素、ポリペブチド、ポリヌクレオチド、及びヌクレオシド類似体からなる群より選択される化合物と接触させる、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の構造をアッセイする段階を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
生体活性分子の構造をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型を予測する段階を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
生体活性分子を生成し評価する方法であって、
a）生体活性分子を含む核酸配列をセルフリー系において増幅する段階と、
b）段階(a)で得られた核酸配列によってコードされる生体活性分子を発現する段階であって、発現する生体活性分子が検出可能な表現型を持っている、段階と、
c）段階(b)で得られた生体活性分子を一つの化合物と接触させる段階と、
d）段階(c)で導入された化合物の存在下または非存在下において生体活性分子の表現型を検出する段階と
を含む、生体活性分子を生成し評価する方法。
【請求項２７】
生体活性分子をコードする核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、核酸配列に基づいた増幅反応、鎖置換増幅反応からなる群より選択される反応によって増幅される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
生体分子をコードする核酸を増幅する段階が、一つまたは複数のネスト化プライマーセットを更に含むポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
生体分子をコードする核酸を増幅する段階が、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項26または請求項28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
生体活性分子が、ウイルス分子、細菌分子、真菌分子、原生動物分子、ヒトの分子、及び動物の分子からなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
生体活性分子が、レトロウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、ハンタウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質、インフルエンザタンパク質、ミクソウイルスタンパク質、ピコルナタンパク質、アデノウイルスタンパク質、ポックスウイルスタンパク質、フラビウイルスタンパク質、またはコロナウイルスタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
生体活性分子が、連鎖球菌タンパク質、ブドウ球菌タンパク質、腸球菌タンパク質、ナイセリアタンパク質、サルモネラタンパク質、ミコバクテリアタンパク質、バシラスタンパク質、ミコプラズマタンパク質、クラミジアタンパク質、フランシセラタンパク質、パスツレラタンパク質、ブルセラタンパク質、シュードモナスタンパク質、リステリアタンパク質、クロストリジウムタンパク質、エルシニアタンパク質、ビブリオタンパク質、赤痢菌タンパク質、または腸内細菌タンパク質を更に含むタンパク質である、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
生体活性分子が、プラズモジウムタンパク質、トリパノソーマタンパク質、またはクリトスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項26記載の方法。
【請求項３４】
生体活性分子が、カンジダタンパク質、クリプトコッカスタンパク質、マラセジアタンパク質、ヒストプラズマタンパク質、コクシジオイデスタンパク質、ヒフォミセスタンパク質、ブラストミセスタンパク質、アスペルギルスタンパク質、青カビタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、フザリウムタンパク質、ペシロミセスタンパク質、ケカビ／クモノスカビタンパク質、ニューモシスティスタンパク質、リノスポリジウムタンパク質、スポロトリクスタンパク質、白癬菌タンパク質、小胞子菌タンパク質、表皮菌タンパク質、バシディオボールスタンパク質、コニディオボールスタンパク質、クモノスカビタンパク質、カニンガメリアタンパク質、パラコクシジオイデスタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、またはリノスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項26記載の方法。
【請求項３５】
生体分子をコードする核酸配列が、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を更に含む、請求項26記載の方法。
【請求項３６】
生体活性分子をコードする核酸配列が、転移RNAまたはポリA＋RNAを更に含む、請求項26または請求項35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
生体活性分子がタンパク質、糖タンパク質、多糖、ムコ多糖、リポ多糖、リポタンパク質、炭水化物または核酸を更に含む、請求項26記載の方法。
【請求項３８】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな真核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項26記載の方法。
【請求項３９】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな原核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項26記載の方法。
【請求項４０】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の翻訳系において発現する、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
核酸配列によってコードされ、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する生体活性分子が、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ポリA＋RNA、tRNA、rRNAからなる群より選択される核酸である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
生体活性分子をコードする核酸配列が、該生体活性分子に機能的に結合する第二の核酸配列を更に含む、請求項26記載の方法。
【請求項４４】
第二の核酸配列が調節エレメントを含む、請求項44記載の方法。
【請求項４５】
第二の核酸配列が精製モチーフを含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
第二の核酸配列が、精製モチーフを含む遺伝子産物またはその断片をコードする、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
生体活性分子を、抗ウイルス化合物、抗細菌化合物、抗真菌化合物、抗癌化合物、抗免疫抑制化合物、ホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、酵素、ポリペブチド、ポリヌクレオチド、及びヌクレオシド類似体からなる群より選択される化合物と接触させる、請求項26記載の方法。
【請求項４８】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階を更に含む、請求項26記載の方法。
【請求項４９】
生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階を更に含む、請求項26記載の方法。
【請求項５１】
生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の構造をアッセイする段階を更に含む、請求項26記載の方法。
【請求項５３】
生体活性分子の構造をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型を予測する段階を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
生体活性分子を生成し評価する方法であって、
a）生体活性分子を含む核酸配列をセルフリー系において増幅する段階と、
b）段階(a)で得られた核酸配列によってコードされる生体活性分子を発現する段階であって、発現する生体活性分子が検出可能な表現型を持っている、段階と、
c）段階(b)で得られた生体活性分子を一つの化合物と接触させる段階と、
d）段階(c)で導入された化合物の存在下または非存在下において生体活性分子の表現型を検出する段階と
を含む、生体活性分子を生成し評価する方法。
【請求項５５】
生体活性分子をコードする核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、核酸配列に基づいた増幅反応、鎖置換増幅反応からなる群より選択される反応によって増幅される、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
生体分子をコードする核酸を増幅する段階が、一つまたは複数のネスト化プライマーセットを更に含むポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
生体分子をコードする核酸を増幅する段階が、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項54または請求項56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
生体活性分子が、ウイルス分子、細菌分子、真菌分子、原生動物分子、ヒトの分子、及び動物の分子からなる群より選択される、請求項54記載の方法。
【請求項５９】
生体活性分子が、レトロウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、ハンタウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質、インフルエンザタンパク質、ミクソウイルスタンパク質、ピコルナタンパク質、アデノウイルスタンパク質、ポックスウイルスタンパク質、フラビウイルスタンパク質、またはコロナウイルスタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項54記載の方法。
【請求項６０】
生体活性分子が、連鎖球菌タンパク質、ブドウ球菌タンパク質、腸球菌タンパク質、ナイセリアタンパク質、サルモネラタンパク質、ミコバクテリアタンパク質、バシラスタンパク質、ミコプラズマタンパク質、クラミジアタンパク質、フランシセラタンパク質、パスツレラタンパク質、ブルセラタンパク質、シュードモナスタンパク質、リステリアタンパク質、クロストリジウムタンパク質、エルシニアタンパク質、ビブリオタンパク質、赤痢菌タンパク質、または腸内細菌タンパク質を更に含むタンパク質である、請求項54記載の方法。
【請求項６１】
生体活性分子が、プラズモジウムタンパク質、トリパノソーマタンパク質、またはクリトスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項54記載の方法。
【請求項６２】
生体活性分子が、カンジダタンパク質、クリプトコッカスタンパク質、マラセジアタンパク質、ヒストプラズマタンパク質、コクシジオイデスタンパク質、ヒフォミセスタンパク質、ブラストミセスタンパク質、アスペルギルスタンパク質、青カビタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、フザリウムタンパク質、ペシロミセスタンパク質、ケカビ／クモノスカビタンパク質、ニューモシスティスタンパク質、リノスポリジウムタンパク質、スポロトリクスタンパク質、白癬菌タンパク質、小胞子菌タンパク質、表皮菌タンパク質、バシディオボールスタンパク質、コニディオボールスタンパク質、クモノスカビタンパク質、カニンガメリアタンパク質、パラコクシジオイデスタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、またはリノスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項54記載の方法。
【請求項６３】
生体分子をコードする核酸配列が、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を更に含む、請求項54記載の方法。
【請求項６４】
生体活性分子をコードする核酸配列が、転移RNAまたはポリA＋RNAを更に含む、請求項54または請求項63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
生体活性分子がタンパク質、糖タンパク質、多糖、ムコ多糖、リポ多糖、リポタンパク質、炭水化物または核酸を更に含む、請求項54記載の方法。
【請求項６６】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな真核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項54記載の方法。
【請求項６７】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな原核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項54記載の方法。
【請求項６８】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の翻訳系において発現する、請求項66記載の方法
【請求項６９】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
核酸配列によってコードされ、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する生体活性分子が、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ポリA＋RNA、tRNA、rRNAからなる群より選択される核酸である、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
生体活性分子をコードする核酸配列が、該生体活性分子に機能的に結合する第二の核酸配列を更に含む、請求項54記載の方法。
【請求項７２】
第二の核酸配列が調節エレメントを含む、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
第二の核酸配列が精製モチーフを含む、請求項71記載の方法。
【請求項７４】
第二の核酸配列が、精製モチーフを含む遺伝子産物またはその断片をコードする、請求項71記載の方法。
【請求項７５】
生体活性分子を、抗ウイルス化合物、抗細菌化合物、抗真菌化合物、抗癌化合物、抗免疫抑制化合物、ホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、酵素、ポリペブチド、ポリヌクレオチド、及びヌクレオシド類似体からなる群より選択される化合物と接触させる、請求項54記載の方法。
【請求項７６】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階を更に含む、請求項54記載の方法。
【請求項７７】
生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階を更に含む、請求54記載の方法。
【請求項７９】
生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の構造をアッセイする段階を更に含む、請求項54記載の方法。
【請求項８１】
生体活性分子の構造をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型を予測する段階を含む、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
生体活性分子を生成し評価する方法であって、
a）疾病に関連した生体活性分子を含む一つまたは複数の検体試料を、疾病を患う患者から抽出する段階と、
b）生体活性分子を含む核酸配列であって、段階(a)で抽出された検体試料より得られた核酸配列を、セルフリー系において増幅する段階と、
c）段階(b)で得られた核酸配列によってコードされる生体活性分子を発現する段階であって、発現する生体活性分子が検出可能な表現型を持っている、段階と、
d）段階(c)で得られた生体活性分子を一つの化合物と接触させる段階と、
e）段階(d)で導入された化合物の存在下または非存在下において生体活性分子の表現型を検出する段階と
を含む、生体活性分子を生成し評価する方法。
【請求項８３】
生体活性分子をコードする核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、核酸配列に基づいた増幅反応、鎖置換増幅反応からなる群より選択される反応によって増幅される、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
生体分子をコードする核酸を増幅する段階が、一つまたは複数のネスト化プライマーセットを更に含むポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項82記載の方法。
【請求項８５】
生体分子をコードする核酸を増幅する段階が、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項82または請求項84のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
生体活性分子が、ウイルス分子、細菌分子、真菌分子、原生動物分子、ヒトの分子、及び動物の分子からなる群より選択される、請求項82記載の方法。
【請求項８７】
生体活性分子が、レトロウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、ハンタウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質、インフルエンザタンパク質、ミクソウイルスタンパク質、ピコルナタンパク質、アデノウイルスタンパク質、ポックスウイルスタンパク質、フラビウイルスタンパク質、またはコロナウイルスタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項82記載の方法。
【請求項８８】
生体活性分子が、連鎖球菌タンパク質、ブドウ球菌タンパク質、腸球菌タンパク質、ナイセリアタンパク質、サルモネラタンパク質、ミコバクテリアタンパク質、バシラスタンパク質、ミコプラズマタンパク質、クラミジアタンパク質、フランシセラタンパク質、パスツレラタンパク質、ブルセラタンパク質、シュードモナスタンパク質、リステリアタンパク質、クロストリジウムタンパク質、エルシニアタンパク質、ビブリオタンパク質、赤痢菌タンパク質、または腸内細菌タンパク質を更に含むタンパク質である、請求項82記載の方法。
【請求項８９】
生体活性分子が、プラズモジウムタンパク質、トリパノソーマタンパク質、またはクリトスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項82記載の方法。
【請求項９０】
生体活性分子が、カンジダタンパク質、クリプトコッカスタンパク質、マラセジアタンパク質、ヒストプラズマタンパク質、コクシジオイデスタンパク質、ヒフォミセスタンパク質、ブラストミセスタンパク質、アスペルギルスタンパク質、青カビタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、フザリウムタンパク質、ペシロミセスタンパク質、ケカビ／クモノスカビタンパク質、ニューモシスティスタンパク質、リノスポリジウムタンパク質、スポロトリクスタンパク質、白癬菌タンパク質、小胞子菌タンパク質、表皮菌タンパク質、バシディオボールスタンパク質、コニディオボールスタンパク質、クモノスカビタンパク質、カニンガメリアタンパク質、パラコクシジオイデスタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、またはリノスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項82記載の方法。
【請求項９１】
生体分子をコードする核酸配列が、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を更に含む、請求項82記載の方法。
【請求項９２】
生体活性分子をコードする核酸配列が、転移RNAまたはポリA＋RNAを更に含む、請求項82または請求項91のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
生体活性分子がタンパク質、糖タンパク質、多糖、ムコ多糖、リポ多糖、リポタンパク質、炭水化物または核酸を更に含む、請求項82記載の方法。
【請求項９４】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな真核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項82記載の方法。
【請求項９５】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな原核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項82記載の方法。
【請求項９６】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の翻訳系において発現する、請求項94記載の方法。
【請求項９７】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
核酸配列によってコードされ、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する生体活性分子が、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ポリA＋RNA、tRNA、rRNAからなる群より選択される核酸である、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
生体活性分子をコードする核酸配列が、該生体活性分子に機能的に結合する第二の核酸配列を更に含む、請求項82記載の方法。
【請求項１００】
第二の核酸配列が調節エレメントを含む、請求項99記載の方法。
【請求項１０１】
第二の核酸配列が精製モチーフを含む、請求項99記載の方法。
【請求項１０２】
第二の核酸配列が、精製モチーフを含む遺伝子産物またはその断片をコードする、請求項99記載の方法。
【請求項１０３】
生体活性分子を、抗ウイルス化合物、抗細菌化合物、抗真菌化合物、抗癌化合物、抗免疫抑制化合物、ホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、酵素、ポリペブチド、ポリヌクレオチド、及びヌクレオシド類似体からなる群より選択される化合物と接触させる、請求項82記載の方法。
【請求項１０４】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階を更に含む、請求項82記載の方法。
【請求項１０５】
生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階を更に含む、請求82記載の方法。
【請求項１０７】
生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項106記載の方法。
【請求項１０８】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の構造をアッセイする段階を更に含む、請求項82記載の方法。
【請求項１０９】
生体活性分子の構造をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型を予測する段階を含む、請求項108記載の方法。
【請求項１１０】
生体活性分子を生成し評価する方法であって、
a）疾病に関連した生体活性分子を含む少なくとも一つの生物または組織を分離する段階と、
b）生体活性分子を含む核酸配列であって、段階(a)で分離された生物または組織より得られた核酸配列を、セルフリー系において増幅する段階と、
c）段階(b)で得られた核酸配列によってコードされる生体活性分子を発現する段階であって、発現する生体活性分子が、第一の化合物に対する耐性を更に含む検出可能な表現型を持っている、段階と、
d）段階(c)で得られた生体活性分子を第二の化合物と接触させる段階と、
e）段階(d)で導入された第二の化合物の存在下または非存在下において生体活性分子の表現型を検出する段階と
を含む、生体活性分子を生成し評価する方法。
【請求項１１１】
生体活性分子をコードする核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、核酸配列に基づいた増幅反応、鎖置換増幅反応からなる群より選択される反応によって増幅される、請求項110記載の方法。
【請求項１１２】
生体分子をコードする核酸を増幅する段階が、一つまたは複数のネスト化プライマーセットを更に含むポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項110記載の方法。
【請求項１１３】
生体分子をコードする核酸を増幅する段階が、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項110または請求項112のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
生体活性分子が、ウイルス分子、細菌分子、真菌分子、原生動物分子、ヒトの分子、及び動物の分子からなる群より選択される、請求項110記載の方法。
【請求項１１５】
生体活性分子が、レトロウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、ハンタウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質、インフルエンザタンパク質、ミクソウイルスタンパク質、ピコルナタンパク質、アデノウイルスタンパク質、ポックスウイルスタンパク質、フラビウイルスタンパク質、またはコロナウイルスタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項110記載の方法。
【請求項１１６】
生体活性分子が、連鎖球菌タンパク質、ブドウ球菌タンパク質、腸球菌タンパク質、ナイセリアタンパク質、サルモネラタンパク質、ミコバクテリアタンパク質、バシラスタンパク質、ミコプラズマタンパク質、クラミジアタンパク質、フランシセラタンパク質、パスツレラタンパク質、ブルセラタンパク質、シュードモナスタンパク質、リステリアタンパク質、クロストリジウムタンパク質、エルシニアタンパク質、ビブリオタンパク質、赤痢菌タンパク質、または腸内細菌タンパク質を更に含むタンパク質である、請求項110記載の方法。
【請求項１１７】
生体活性分子が、プラズモジウムタンパク質、トリパノソーマタンパク質、またはクリトスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項110記載の方法。
【請求項１１８】
生体活性分子が、カンジダタンパク質、クリプトコッカスタンパク質、マラセジアタンパク質、ヒストプラズマタンパク質、コクシジオイデスタンパク質、ヒフォミセスタンパク質、ブラストミセスタンパク質、アスペルギルスタンパク質、青カビタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、フザリウムタンパク質、ペシロミセスタンパク質、ケカビ／クモノスカビタンパク質、ニューモシスティスタンパク質、リノスポリジウムタンパク質、スポロトリクスタンパク質、白癬菌タンパク質、小胞子菌タンパク質、表皮菌タンパク質、バシディオボールスタンパク質、コニディオボールスタンパク質、クモノスカビタンパク質、カニンガメリアタンパク質、パラコクシジオイデスタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、またはリノスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項110記載の方法。
【請求項１１９】
生体分子をコードする核酸配列が、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を更に含む、請求項110記載の方法。
【請求項１２０】
生体活性分子をコードする核酸配列が、転移RNAまたはポリA＋RNAを更に含む、請求項110または請求項119のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
生体活性分子がタンパク質、糖タンパク質、多糖、ムコ多糖、リポ多糖、リポタンパク質、炭水化物または核酸を更に含む、請求項110記載の方法。
【請求項１２２】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな真核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項110記載の方法。
【請求項１２３】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな原核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項110記載の方法。
【請求項１２４】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の翻訳系において発現する、請求項122記載の方法。
【請求項１２５】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する、請求項124記載の方法。
【請求項１２６】
核酸配列によってコードされ、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する生体活性分子が、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ポリA＋RNA、tRNA、rRNAからなる群より選択される核酸である、請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
生体活性分子をコードする核酸配列が、該生体活性分子に機能的に結合する第二の核酸配列を更に含む、請求項110記載の方法。
【請求項１２８】
第二の核酸配列が調節エレメントを含む、請求項127記載の方法。
【請求項１２９】
第二の核酸配列が精製モチーフを含む、請求項127記載の方法。
【請求項１３０】
第二の核酸配列が、精製モチーフを含む遺伝子産物またはその断片をコードする、請求項127記載の方法。
【請求項１３１】
生体活性分子を、抗ウイルス化合物、抗細菌化合物、抗真菌化合物、抗癌化合物、抗免疫抑制化合物、ホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、酵素、ポリペブチド、ポリヌクレオチド、及びヌクレオシド類似体からなる群より選択される化合物と接触させる、請求項110記載の方法。
【請求項１３２】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階を更に含む、請求項110記載の方法。
【請求項１３３】
生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項132記載の方法。
【請求項１３４】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階を更に含む、請求項110記載の方法。
【請求項１３５】
生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項134記載の方法。
【請求項１３６】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の構造をアッセイする段階を更に含む、請求項110記載の方法。
【請求項１３７】
生体活性分子の構造をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型を予測する段階を含む、請求項136記載の方法。
【請求項１３８】
生体活性分子を生成し評価するキットであって、
a）生体活性分子を含む核酸配列をセルフリー系において増幅する試薬と、
b）段階(a)で得られた核酸配列によってコードされる生体活性分子を発現する試薬であって、発現する生体活性分子が検出可能な表現型を持っている、試薬と、
c）段階(b)で得られた生体活性分子を一つの化合物と接触させる試薬と、
d）段階(c)で導入された化合物の存在下または非存在下において生体活性分子の表現型を検出する試薬と、
e）段階(a)から段階(d)で指定された試薬を含む第一のパッケージ材料セット、及び第一のパッケージ材料セットと利用者説明書とを含む第二のパッケージ材料セットと
を含む、生体活性分子を生成し評価するキット。
【請求項１３９】
生体活性分子をコードする核酸を増幅する試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応用試薬、リガーゼ連鎖反応用試薬、転写仲介増幅反応用試薬、核酸配列に基づいた増幅反応用試薬、及び鎖置換増幅反応用試薬を含む、請求項138記載のキット。
【請求項１４０】
生体活性分子をコードする核酸を増幅する試薬が、一つまたは複数のネスト化プライマーセットを更に含む試薬を含む、請求項138記載のキット。
【請求項１４１】
生体活性分子をコードする核酸を増幅する試薬が、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4の配列を更に含む試薬を含む、請求項138または請求項140のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４２】
生体活性分子が、ウイルス分子、細菌分子、真菌分子、原生動物分子、ヒトの分子、及び動物の分子からなる群より選択される、請求項138記載のキット。
【請求項１４３】
生体活性分子が、レトロウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、ハンタウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質、インフルエンザタンパク質、ミクソウイルスタンパク質、ピコルナタンパク質、アデノウイルスタンパク質、ポックスウイルスタンパク質、フラビウイルスタンパク質、またはコロナウイルスタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項138記載のキット。
【請求項１４４】
生体活性分子が、連鎖球菌タンパク質、ブドウ球菌タンパク質、腸球菌タンパク質、ナイセリアタンパク質、サルモネラタンパク質、ミコバクテリアタンパク質、バシラスタンパク質、ミコプラズマタンパク質、クラミジアタンパク質、フランシセラタンパク質、パスツレラタンパク質、ブルセラタンパク質、シュードモナスタンパク質、リステリアタンパク質、クロストリジウムタンパク質、エルシニアタンパク質、ビブリオタンパク質、赤痢菌タンパク質、または腸内細菌タンパク質を更に含むタンパク質である、請求項138記載のキット。
【請求項１４５】
生体活性分子が、プラズモジウムタンパク質、トリパノソーマタンパク質、またはクリトスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項138記載のキット。
【請求項１４６】
生体活性分子が、カンジダタンパク質、クリプトコッカスタンパク質、マラセジアタンパク質、ヒストプラズマタンパク質、コクシジオイデスタンパク質、ヒフォミセスタンパク質、ブラストミセスタンパク質、アスペルギルスタンパク質、青カビタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、フザリウムタンパク質、ペシロミセスタンパク質、ケカビ／クモノスカビタンパク質、ニューモシスティスタンパク質、リノスポリジウムタンパク質、スポロトリクスタンパク質、白癬菌タンパク質、小胞子菌タンパク質、表皮菌タンパク質、バシディオボールスタンパク質、コニディオボールスタンパク質、クモノスカビタンパク質、カニンガメリアタンパク質、パラコクシジオイデスタンパク質、シュードアレシェリアタンパク質、またはリノスポリジウムタンパク質を更に含むタンパク質である、請求項138記載のキット。
【請求項１４７】
生体分子をコードする核酸配列がデオキシリボ核酸またはリボ核酸を更に含む、請求項138記載のキット。
【請求項１４８】
生体活性分子をコードする核酸配列が、転移RNAまたはポリA＋RNAを更に含む、請求項138または請求項147のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４９】
生体活性分子がタンパク質、糖タンパク質、多糖、ムコ多糖、リポ多糖、リポタンパク質、炭水化物または核酸を更に含む、請求項138記載のキット。
【請求項１５０】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな真核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項138記載のキット。
【請求項１５１】
核酸によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな原核細胞溶解物の翻訳系において発現する、請求項138記載のキット。
【請求項１５２】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の翻訳系において発現する、請求項150記載のキット。
【請求項１５３】
増幅された核酸配列によってコードされる生体活性分子が、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する、請求項152記載のキット。
【請求項１５４】
核酸配列によってコードされ、セルフリーな網状赤血球溶解物の転写／翻訳共役系において発現する生体活性分子が、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ポリA＋RNA、tRNA、rRNAからなる群より選択される核酸である、請求項153記載のキット。
【請求項１５５】
生体活性分子をコードする核酸配列が、該生体活性分子に機能的に結合する第二の核酸配列を更に含む、請求項138記載のキット。
【請求項１５６】
第二の核酸配列が調節エレメントを含む、請求項155記載のキット。
【請求項１５７】
第二の核酸配列が精製モチーフを含む、請求項155記載のキット。
【請求項１５８】
第二の核酸配列が、精製モチーフを含む遺伝子産物またはその断片をコードする、請求項155記載のキット。
【請求項１５９】
生体活性分子を、抗ウイルス化合物、抗細菌化合物、抗真菌化合物、抗癌化合物、抗免疫抑制化合物、ホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、酵素、ポリペブチド、ポリヌクレオチド、及びヌクレオシド類似体からなる群より選択される化合物と接触させる、請求項138記載のキット。
【請求項１６０】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階を更に含む、請求項138記載のキット。
【請求項１６１】
生体活性分子の酵素活性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項160記載のキット。
【請求項１６２】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階を更に含む、請求138記載のキット。
【請求項１６３】
生体活性分子の化合物への親和性をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型に関して生体活性分子をアッセイする段階を更に含む、請求項162記載のキット。
【請求項１６４】
生体活性分子の表現型を検出する段階が、生体活性分子の構造をアッセイする段階を更に含む、請求項138記載のキット。
【請求項１６５】
生体活性分子の構造をアッセイする段階が、化合物への耐性の表現型を予測する段階を含む、請求項164記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生体活性分子アッセイ法（bioactive molecule assays）について表現型を検出するための方法と組成を提供するものである。より具体的には、本発明は一つまたは複数の候補化合物の、微生物及び癌の生体活性分子を抑制する能力に対する適合性を、化学療法または抗感染療法に先立って、またはそれらの療法の過程において、決定するための方法と組成を提供するものであり、そして導入遺伝子療法における発現のアッセイ法としての適合性を決定する方法と組成を提供するためのものである。本発明はまた、薬剤発見のための表現型アッセイ法をも提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
微生物は進化を通じて薬剤に対して耐性を持つようになることが一般に知られている。微生物中の抗感染剤に対する耐性は、患者の抗感染療法の過程で発達する。分子レベルにおける突然変異現象を通じて、微生物はそのタンパク質、最も一般的には成長や代謝を統制する酵素の、分子構造を変化させる。突然変異は特異なものではなく、抗感染療法が存在しない時にも起こるものであるが、抗ウイルス性治療剤、抗細菌治療剤または抗真菌性治療剤のターゲットであるタンパク質に突然変異が生じると、ターゲットと治療剤との親和性が変化したり、ターゲットの活性部位への相互作用またはアクセスが妨げられたりして、治療剤が治療効果を発揮して微生物を破壊する能力が無効になる。薬剤治療法は微生物が生き続けることができるようにする突然変異が残るような淘汰の圧力を微生物に与え、結果として患者は薬剤に対する耐性を備えた新たな表現型を示す微生物に再感染することになる。
【０００３】
薬剤耐性は現在では患者の治療においてよく生じる治療上の問題として、基本的にすべての感染症に対する薬剤について認知されている。例えば、ペニシリン、メチシリン及びバンコマイシンに対する耐性は抗細菌性治療においてしばしば見られ、また抗レトロウイルス剤に対する耐性は抗HIV療法において一般に報告されている。薬剤耐性は特定の病気のための限られた方法によってのみ測定することができ、HIV感染症は、そのよく研究された例である。HIV感染症においては、ウイルス負荷検査（PCR、bDNA、NASBAなど）を患者におけるウイルス繁殖レベルを測定するために用いることができる。患者が抗レトロウイルス治療を受けている間に実質的なウイルス負荷の増加があった場合、この増加は通常薬剤に対する耐性ができたことを示している。しかしながら、ウイルス負荷検査はウイルスの抗ウイルス化合物に対する感受性を直接査定するものではない。したがって、負荷検査は耐性を有する疑いのあるウイルスを持つ患者を識別するために用いることはできるが、この方法は患者の治療にどの薬剤が最も効果的かを決定するために利用することはできない。患者の治療開始時及び治療の過程において、化学療法の投薬計画を評価し監視する方法が求められている。
【０００４】
現在、HIVをはじめとするウイルス感染及び細菌感染の抗感染剤に対する耐性を測定する方法として最も一般的に用いられているのは、遺伝子型検査法と表現型検査法である。遺伝子型検査法は、ある特定の薬剤に対して耐性を生じることが知られている具体的な突然変異の存在を探す方法である。遺伝子型検査法は非常に時間を要するもので、最終的な結果を出すには1、2週間かかり、また更なる欠点もある。例えば、突然変異が新しい種類のものであったり、あるいはあまりよく特性の分かっていないものである場合には、突然変異の分析データを患者の治療に役立つ有意義な臨床情報に翻訳することが難しい。実際に、HIVの遺伝子型検査法は臨床研究施設で広く使われているが、この種のアッセイ法は他の病気に関してはそこまで確立されていない。科学者や臨床医に使用されているコンピュータによる突然変異解読プログラムの数々は、まだ標準の分析アルゴリズムを共有しておらず、これらのアルゴリズムを科学文献に報告される最新の突然変異現象に遅れをとらないよう保つのは困難である。
【０００５】
表現型検査法は、微生物の特定の薬剤に対する実際の感受性を測定するものである。従来の表現型アッセイ法では、培地中で病気を引き起こす微生物を成長させる能力が必要とされる。薬剤が細菌の成長を抑える能力を測定することは、長年にわたり研究上でよく行われる作業であった。患者の検体から病気を引き起こす微生物を培養する能力は、微生物を識別し治療計画を決める最初の方法となる。これらのアッセイ法はまた、治療の過程において抗感染剤に対する薬剤耐性や薬剤感受性を評価するための信頼性のあるインビトロの方法をも提供するものであるため、薬剤耐性の発生またはその可能性を監視するのに使用することができる。
【０００６】
しかしながら、ウイルスまたは癌ならびに特定の真菌類及び細菌については、表現型の分析は費用がかかるうえに時間もかかり、完了するまでに何週間、何ヶ月という時間を要する。この欠点はCMVやHSVのようなウイルスに関してよく行われる薬剤耐性分析の妨げになってきた。更に表現型検査は、HCVなどの培養することができないウイルスには適用できない。HIVについては、患者から採取したHIV遺伝物質の主要成分を増幅したものを、HIVの人工参照ベクターに挿入してこのプロセスを短縮することにより、組換え表現型アッセイ法が開発されている。本明細書に参考文献として組み入れられるPetropoulosら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy，44：920-928（2000）、及びHertogsら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy，42：269-276（1998）の両方を参照していただきたい。ウイルスの培養及び増殖にかかる時間は短縮されたものの、この方法ではまだ検査結果を出すまでに2週間から4週間を要する。更に、このアッセイ法は労働集約型で長く手間のかかるもので、ベクターの分子構築、細胞の培養及びトランスフェクション、ウイルス粒子の収集、ならびに感染を必要とする。
【０００７】
したがって、様々な病気における薬剤耐性を測定するための、よりコスト効率が良く迅速な表現型アッセイ法が、当技術分野において求められている。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、疾病で苦しむ患者のための化学療法の適合性を評価する表現型検査アッセイ法及び手法を提供するものである。本発明の態様には、例えばウイルス感染症、細菌感染症、真菌類感染症、自己免疫疾患、遺伝障害、癌などによる様々な疾病への応用例がある。
【０００９】
一態様において本発明は、疾病の状態にある個人から核酸を抽出して精製するための試薬と、個人に発現した生体活性分子であって、疾病と関係している生体活性分子を一つ以上コードする核酸配列を増幅するための試薬と、生体活性分子をコードする増幅した核酸転写産物をセルフリー翻訳するために生体活性分子をコードする増幅した核酸配列をセルフリー転写するための試薬と、生体活性分子の翻訳によって生じたポリペプチドの表現型特性を決定するための試薬とを含む診断アッセイ法であって、その表現型が疾病状態を改善するために設計された少なくとも一つの治療法に対して、個人の反応を迅速に評価したり予測したりするのに役立つデータを提供する、診断アッセイ法である。
【００１０】
別の態様では、生体活性分子をコードする核酸配列を増幅するための試薬が、複数の核酸プライマーのような核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅に使用される。更に別の態様では、核酸プライマーはネストされる。また別の態様においては、プライマーは、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、及び配列番号：4（表1参照）からなる群より選択される配列を持つ。なお、本発明の別の局面においては、生体活性分子をコードする核酸の増幅は更に、一つ以上の二次的核酸配列を、生体活性分子をコードする核酸配列に増幅段階の途中で加えることを含む。一態様においては、これらの配列は増幅された核酸の転写を制御することができる。別の態様では、これらの配列は、生体活性分子の精製、例えば金属キレートクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、粒径排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオンクロマトグラフィーなどによる生体活性分子の精製を容易にするポリペプチドをコードする。一態様においては、例えば、ある濃度範囲の1種類以上の抗ウイルス試薬の存在下でのヌクレオチド取入アッセイ法によって、ウイルスポリメラーゼまたはそのドメインの一つの生体活性を示す変化から、及びDNA重合の触媒としての機能性の変化から、精製した生体活性分子の表現型の変化を調べる。ターゲット／リガンド結合解離の力学を決定するだけでなく、酵素の構造と機能とを決定するために本発明にとって有用なアッセイ法及び手法の例には、放射性リガンド結合アッセイ法、タンパク質共免疫沈降、サンドイッチELISA、蛍光共鳴発光トモグラフィー（FRET）、表面プラズモン共鳴（SPR）、質量分析、2-D NMRを含む核磁気共鳴、及びX線結晶学が含まれる。
【００１１】
本発明の一態様における表現型アッセイ法は、生体活性分子をコードする増幅された核酸の配列の転写のため、そしてこうして作られた核酸転写産物をセルフリー翻訳するための、セルフリーに基づいたアッセイ法及び手法を含む。他の一態様においては、転写と翻訳とを組み合わせた系、例えばウサギの網状赤血球溶解物の系を用いる。現在において好ましい態様の転写／翻訳共役系では、ポリメラーゼ連鎖反応増幅産物の初期精製を必要としない。こうして本発明は、例えば24時間、48時間または約一週間といったように迅速な表現型の特性検査に望ましい十分な量の生体活性分子を生成することのできるアッセイ法及び手法を含む。
【００１２】
一態様において本発明は、一種のウイルス、例えばB型肝炎ウイルスに感染した個人から核酸を分離することを含むアッセイ法及び手法を提供する。ある局面において、生体活性のあるB型肝炎ウイルスポリメラーゼまたはそのドメインをコードするウイルス核酸配列がポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、感染した個人より分離した核酸から、そのポリメラーゼはセルフリーな系で転写され翻訳される。他の一態様においては、表現型を決定するためにウイルスポリメラーゼまたはそのドメインにおける生体活性の特性を検査する。これにより、B型肝炎感染症を治療するために設計した療法の少なくとも1種類に対する個人の反応を迅速に評価したり予測したりするのに有用なデータがもたらされる。
【００１３】
本発明のアッセイ法及び手法は、化学療法の全ての分野に応用される。ある一局面において、本発明は抗細菌療法の分野で応用でき、患者の疾病の原因となっている細菌に関する表現型の情報を医師に提供し、その情報を使って抗細菌化学療法の投薬計画の選択と監視を行う。他の局面において、本発明は抗ウイルス療法の分野に応用でき、患者の疾病の原因となっているウイルスに関する表現型の情報を医師に提供し、その情報を使って抗ウイルス化学療法の投薬計画の選択と監視を行う。更なる他の局面において、本発明は抗真菌療法の分野に応用でき、患者の疾病の原因となっている真菌に関する表現型の情報を医師に提供し、その情報を使って抗真菌化学療法の投薬計画の選択と監視を行う。また更なる他の局面において、本発明は癌療法の分野に応用でき、患者の疾病の原因となっている癌に関する表現型の情報を医師に提供し、その情報を使って抗癌化学療法の投薬計画の選択と監視を行う。他の一局面において、本発明は自己免疫疾患に対する療法の分野に応用でき、患者の疾病の原因となっている自己免疫疾患に関する表現型の情報を医師に提供し、その情報を使って適切な化学療法の投薬計画の選択と監視を行う。他のもう一つの局面において、本発明のアッセイ法は、遺伝子置換え療法の実施中にタンパク質の発現及びタンパク質マーカーを監視するために使われ、発現した遺伝子産物と、代謝経路への影響とに関する表現型の情報を医師に提供する。これらの態様において本発明は、疾病状態の示す生体活性分子に対応した表現型アッセイ法を可能なものとし、この疾病状態を改善するために設計された患者への化学療法の投薬計画が実施される間または実施される前に生体活性分子を予測したり監視したりする方法を可能なものとし、患者の疾病を治療するために新規に開発した薬剤の可能性を評価することを可能なものとする。
【００１４】
本明細書に例示した方法と組成は、ヒト及び動物に対しての使用を想定したものである。動物に対しての使用は、牛、馬、羊、ヤギ、豚、犬、猫、ウサギ、及び全ての齧歯動物を含む。また本発明の方法は、家畜またはペットに晒されてかかってしまった感染症に対処する農業従事者及びペットの所有者にとっても有用である。
【００１５】
本発明の一つの局面において、表現型データは様々な生体活性分子から得ることができる。この表現型データは、コンピューターの記憶装置またはプリントアウトした資料といった実体のある媒体を介して記録する。このデータは、市販されている標準的なアナログ／デジタル（A/D）装置によって自動的に入力し格納できる。またデータは、所望のように読み出して書類にしたり表示したりでき、瞬時にしてデータ関連を最善な形で提示できる。従って、本方法で利用するために適した装置やソフトウエアは本発明の範囲内のものと考える。同様にして、生体活性分子に対する表現型情報のデータベースも掲載するものである。このデータベースは標準的なリレーショナルデータベースのソフトウエアを利用し、その内容は例えばCD ROMまたはインターネットを介して提供する。
【００１６】
本発明のキットは、一つの生体活性分子を形成する核酸の配列をセルフリー系で増幅するための試薬と、この核酸配列でコードされ、検出可能な表現型を一つ持つ生体活性分子を発現する試薬と、生体活性分子を一つの化合物と接触させる試薬と、化合物の存在下または非存在下において生体活性分子の表現型を検出するための試薬と、指定された試薬を含む第一のセットのパッケージ材料、及び第一のセットのパッケージ材料とユーザー取扱説明書とを含む第二のセットのパッケージ材料とを含む。特に「キット」の形でパッケージしたアッセイシステムに関しては、アッセイ構成成分を別々の容器に入れ、一つ一つの容器に少なくとも一回のアッセイに十分足る量の試薬が含まれることが好ましい。本明細書で更に述べるように、一つ以上の試薬がラベルリングされていても良いし、代わりに別の容器に入れたラベル用薬剤をキットの一部として提供しても良い。
【００１７】
発明の詳細な説明
定義
本明細書及び請求項の範囲で使われているとおり、次の用語は下記の意味である。
【００１８】
「ウイルス性の疾病状態」とは、ヒトまたは動物における組織の局所的なウイルス感染、または全身の感染（ウイルス血症）のことである。ウイルスの生体活性分子が検出され、その表現型が観察される。本明細書に開示する発明による検出及び監視に適応するウイルス性感染症の例には、アデノウイルス感染症（小児胃腸炎、急性出血性膀胱炎、非細菌性肺炎、ウイルス性結膜炎等）、ハンタウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症（I型、II型単純ヘルペス、水痘（水疱瘡）、サイトメガロウイルス、ならびに単球増加症（Epstein-Barrウイルス）等）、ポックスウイルス感染症（天然痘（大痘瘡及び小痘瘡）、ワクシニアウイルス、及び伝染性軟属腫等）、ピコルナウイルス感染症（ライノウイルス（一般の風邪、またはコロナウイルスにも起因する）、ポリオウイルス（灰白髄炎））、オルトミクソウイルス感染症またはパラミクソウイルス感染症（インフルエンザ、及び呼吸器合胞体ウイルス（RSウイルス））、パラインフルエンザ（おたふく風邪等の病気を含む）、ならびに麻疹（はしか）、ラブドウイルス感染症（狂犬病）、水疱性口内炎（VSV）、脳炎（EEE、WEE、VEE）等のトガウイルス感染症、テング熱、西ナイル熱、黄熱、及び脳炎等のフラビウイルス感染症、ブンヤウイルス及びアレナウイルス、風疹（ドイツはしか）等のトガウイルス感染症、レオウイルス感染症、コロナウイルス感染症、肝炎ウイルス感染症、乳頭腫ウイルス等のパポバウイルス感染症、HIV、HTLV-1、HTLV-II等のレトロウイルス感染症、等がある。
【００１９】
「細菌性の疾病状態」とは、ヒト及び動物におけるグラム陽性の細菌性感染症やグラム陰性の細菌性感染症を意味する。細菌の生体活性分子を検出しその表現型を観察する。グラム陽性の細菌種の例としては、表皮ブドウ球菌及び黄色ブドウ球菌等のブドウ球菌属；球菌属；化膿レンサ球菌、ストレプトコッカスエクイス、溶血鎖球菌、ストレプトコッカスエクィシミリス、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカスアガラクティエ等の連鎖球菌属；コルネバクテリウムパイオゲネス、コルネバクテリウムシュードツベルクローシス等のコリネバクテリア属；ブタ丹毒菌等のエリジペロスリックス属；リステリアモノサイトゲネス等のリステリア属；炭素菌等のバシラス属；ウェルシュ菌等のクロストリジウム属；ヒト型結核菌、らい菌等のマイコバクテリウム属、を含む属がある。グラム陰性の細菌種の例としては、大腸菌O157等のエシェリキア属；腸チフス菌及び鶏チフス菌等のサルモネラ属；志賀赤痢菌等の赤痢菌属；コレラ等のビブリオ属；ペスト菌及びエルシニアエントロコリチカ等のエルシニア属；プロテウスミラビリス等のプロテウス属；気管支敗血症菌等のボルデテラ属；緑脳菌等のシュードモナス属；肺炎桿菌等のクレブシエラ属；家禽コレラ菌等のパスツレラ属；非発酵陰性桿菌等のモラクセラ属；セラチアマルセセンス等のセラチア属；インフルエンザ等のヘモフィルス属；カンピロバクター菌種、を含む属があるが、これに限定されない。本発明のアッセイ法に適する他の種としては、エンテロコッカス属、ナイセリア属、マイコプラズマ属、クラミジア属、フランシセラ属、パスツレラ属、ブルセラ菌属、腸内細菌属等が含まれる。更に、本発明によって阻害される病原菌種の例は、「Bergey's Manual of Determinative Bacteriology」（第9版、1994年、Williams and Wilkins、メリーランド州ボルチモア）等の標準的な分類学の解説書を参考にすれば得ることができる。
【００２０】
「真菌性の疾病状態」とは、ヒト及び動物における真菌性感染症を意味する。真菌の生体活性分子を検出しその表現型を観察する。真菌種の例としては、カンジダアルビカンス等のカンジダ属；クリプトコッカスネオフォルマンス等のクリプトコッカス属；マラセジア（ピチロスポルム）属；ヒストプラスマカプスラーツム等のヒストプラスマ；コクシジオイデスイミティス等のコクシジオイデス属；ヒフォミケスデストルエンス等のヒフォミケス属；ブラストミセスデルマティティジス等のブラストミセス属；アスペルギルスフミガタス等のアスペルギルス属；ペニシリウムマルネフェイ等のペニシリウム属；シュードアレシェリア属；フザリウム属；ペシロミセス属；ケカビ／クモノスカビ；ニューモシスティスカリニ等のニューモシスティス等がある。リノスポリジウム属及びスポロトリクス属における種のように、ならびに皮下真菌、白癬菌属及び小胞子菌属における種のように、皮膚糸状菌は、本明細書に記載の本発明の態様による予防と治療に対して敏感に反応する。他の疾病をもたらす真菌は、白癬菌属、小胞子菌属；表皮菌；バシディオボールス属；コニディオボルース属；クモノスカビ・カニンガメラ属；リゾムコール属；パラコクシジオデス属；シュードアレシェリア属；リノスポリジウム属；及びスポロトリクス属を含む。
【００２１】
「原生動物性の疾病状態」とは、単一または複数の、通常は微小な、単細胞真核生物による感染症を指し、このような生物には、アメーバ、繊毛虫、鞭毛虫、及び胞子虫等が含まれ、例としてはプラスモジウム属、トリパノソーマ属、またはクリプトスポリジウム属等がある。原生動物の生体活性分子が検出され、その表現型が観察されている。
【００２２】
「癌性の疾病状態」とは、周辺組織に侵入し、身体の別の部位へ転移する傾向を持つ、未分化細胞の増殖を特徴とする種々の悪性腫瘍を指す。その例としては、肺癌、膵臓癌、大腸癌、卵巣癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、甲状腺濾胞腺癌、膀胱癌、グリオーマ、骨髄異形成症候群、乳癌、または前立腺癌がある。病変した細胞の生体活性分子と、その表現型とが観察されている。
【００２３】
「自己免疫疾患の疾病状態」とは、自分自身の組織、細胞、または分子の一つに対する自分の身体自体による免疫反応が、病理学的な疾病状態を生み出すことを指す。病理的免疫反応の生体活性分子が検出され、その表現型が観察されている。免疫疾患の例としては、全身性紅斑性狼瘡（SLE）、リウマチ性関節炎、クローン病、喘息、ディジョージ症候群、家族性地中海熱、高IgM免疫不全症、重症複合免疫不全症、潰瘍性大腸炎、グレーブス病、自己免疫性肝炎、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、シェーグレン症候群、強皮症がある。
【００２４】
「遺伝性の疾病状態」とは、ある遺伝子の発現の産物が疾病を引き起こす場合、またはそれに寄与する生体活性分子である場合、その遺伝子の存在の結果生じる疾病状態を指す。また健康な個人において、ある遺伝子の発現の産物が疾病状態を改善する生体活性分子、または予防する生体活性分子である場合は、その遺伝子の欠如の結果生じる疾病状態を指す。発現した導入遺伝子の生体活性分子が検出され、その表現型が観察されている。前者の例としては、CFTRタンパク質の突然変異が疾病を引き起こす嚢胞性線維症がある。後者の例としては、フェニルアラニンを代謝させる酵素が欠如することによって引き起こされる疾病であるPKUがある。本アッセイ法及び手法を使用するスクリーニングに適した遺伝障害の例としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、アンジェルマン症候群、シャルコー・マリー・ツース病、てんかん、本態性振戦、脆弱X症候群、フリードライヒ失調症、ハンティントン病、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、プラダー・ウィリー症候群、レット症候群、脊髄小脳萎縮症、ウィリアムズ症候群、エリス・ファン・クレフェルト症候群、マルファン症候群、筋強直性ジストロフィー、白質ジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、ベスト病、ゴーシェ病、グルコース・ガラクトース吸収不全症、脳回転状網脈絡膜萎縮症、若年発症糖尿病、肥満症、発作性夜間血色素尿症、フェニールケトン尿症、レフサム病、タンジール病がある。
【００２５】
「増幅反応混合物」及び「ポリメラーゼ連鎖反応混合物」とは、ポリメラーゼ連鎖反応の遂行に適した試薬の、一つの組み合わせを指す。通常、反応混合物は適切な緩衝溶液中のオリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオチドトリホスフェート、及びDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼで構成される。
【００２６】
本明細書で使用されている「増幅条件」とは、ターゲットとなる核酸配列の増幅に適した反応条件を指す。増幅条件とは、反応中に使用される増幅反応混合物と、温度循環条件との両方を指す。
【００２７】
ある物質または組成の「抗微生物」作用とは、一つまたは複数の微生物の成長を阻害する能力を意味するものである。例えば本明細書で説明される抗微生物組成とは、細菌、藻類、真菌、原生動物、ウイルスの属及びその種に対し、それらの成長を阻害するか、それらを殺すものである。抗生物質開発の当業者間では、成長の阻害を引き起こす物質は、微生物にとっては致死性（例えば微生物が細菌の場合は、殺菌性）ともなり得ることが広く認識されている。
【００２８】
「生体活性分子」とは、微生物または組織の中で起こる生合成反応または代謝プロセスや再生産プロセスにおいて、律速化合物に関与する、律速化合物を制御する、もしくは律速化合物である、核酸、リボ核酸、ポリペプチド、グリコポリペプチド、ムコ多糖、リポタンパク質、リポ多糖、炭水化物、酵素もしくは補酵素、ホルモン、ケモカイン、リンフォカイン、または同類の化合物を意味する。このような生体活性分子は、一般的な薬物治療ターゲットであり、その例はインターフェロン、TNF、v-Ras、c-Ras、逆転写酵素、g結合タンパク質受容体（GPCR）、FcεR、FcγR、ニコチニコイド受容体（ニコチン性受容体、GABAA受容体、GABAC受容体、グリシン受容体、5-HT3受容体、及びグルタミン酸活性陰イオンチャンネルの一部）、ATPゲートチャンネル（P2Xプリン受容体とも呼ばれる）、グルタミン酸活性陽イオンチャンネル（NMDA受容体、AMPA受容体、カイニン酸受容体など）、血球凝集素（HA）、EGF、PDGF、NGF、及びインスリン受容体型チロシンキナーゼ等の受容体型チロシンキナーゼ（RTK）、SH2ドメインタンパク質、PLC-γ、c-Ras関連GTPase活性タンパク質（RasGAP）、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ（PI-3K）ならびにタンパク質ホスファターゼ1C（PTP1C）、同様にSrc型チロシンキナーゼのような細胞内タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）、グルタミン酸活性陽イオンチャンネル（NMDA受容体、AMPA受容体、カイニン酸受容体等）、タンパク質チロシンホスファターゼを含むが、これらに限定されるものではない。受容体型チロシンホスファターゼの例には、受容体型チロシンホスファターゼrho、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体J、受容体型チロシンホスファターゼD30、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体C型ポリペプチド関連タンパク質、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体T型、受容体型チロシンホスファターゼγ、白血球関連Ig様受容体1Dイソ型、LAIR-1D、LAIR-1C、MAPキナーゼ、ノイラミニダーゼ（NA）、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、二次メッセンジャー、転写因子、その他代謝系の重要な基礎的要素や調節因子が含まれる。実質上は、どの生体活性分子も本発明によって観察することが可能である。
【００２９】
「ブロードスペクトラム」な抗微生物作用とは、お互いに比較的関連の無い生物の成長を阻害する能力を意味する。例えば、ある物質が有するグラム陽性及びグラム陰性両方の細菌種の成長を阻止する能力は、細菌及び真菌のように異なる微生物の成長を阻止する能力であり、ブロードスペクトラム作用と考えられる。
【００３０】
「ハイブリダイゼーション」とは、2つの一本鎖核酸が、相補的塩基の対合により二重構造を形成することを指す。ハイブリダイゼーションは、完全に（完璧に）相補的な核酸鎖間で、または重要でない箇所の不整合を含むが「実質的に相補的な」核酸鎖間で発生する。完全に相補的な核酸鎖だけがハイブリダイズする条件は、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と呼ばれる。実質的に補完的な配列の安定した二重構造は、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で達成することが可能である。核酸技術の当業者であれば、その技術が提供するガイダンスに基づき、二重構造の安定性を経験的に判断することが可能である（例えば参考文献として本明細書に組み入れられるSambrookら、「Molecular Cloning-A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.,（1989）を参照）。
【００３１】
「ネスト化」及び「ネスト化プライマー」とは、第一のプライマー配列（内側の配列）の少なくとも一つが、別のプライマー（外側の配列）の一部分を含み、少なくとも2つの核酸オリゴヌクレオチド配列でネスト化プライマーセットを構成することを指す。ネスト化プライマーPCRには通常、ネスト化プライマーセットを対で（例えば、上流におけるネスト化プライマーセットと、下流におけるネスト化プライマーセットとで）含み、例えば、鋳型に使用する開始物質が十分にない場合、または試料が他の核酸物質に汚染され、望ましくない不正確なプライミング鋳型が提供された場合に、所望の増幅ターゲットの産生を増加させるために利用するが、これらに制限されるものではない（ネスト化プライマーの設計と利用に関する詳細は、Sambrookら（1989）を参照）。
【００３２】
「核酸」とは、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含む）、プリン塩基またはピリミジン塩基のN-グリコシド、もしくは修飾したプリン塩基またはピリミジン塩基であるポリヌクレオチドのいかなる他の種類をも総称するものである。これらの用語は、分子の基本構造だけに言及される。したがってこれらの用語には、二本鎖DNA及び一本鎖DNAだけでなく、tRNAを含む二本鎖RNA及び一本鎖RNAが含まれる。「核酸プライマー」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、増幅または検出されるプライマー、プローブ、及びオリゴマーの断片を意味する。「核酸プライマー」及び「オリゴヌクレオチド」という用語の間には、長さについて恣意的な差は無く、これらの用語は同じ意味で使用される。
【００３３】
「表現型の検出」とは、生体活性分子の物理的特性を検出することを意味し、例えば、薬剤耐性表現型、薬剤感受性表現型、生体活性分子の動態変化または特定のリガンドもしくは治療剤の結合親和性の変化、エピトープの変化、触媒部位やその他の構造の生体活性分子への変化、機能の喪失または獲得、及びこれらの特質を分析する目的で使用された質的または量的な試験または診断が含まれる。従って表現型とは、生体活性分子の観察可能な物理的及び生化学的特質、または遺伝的または環境的な影響等に基づいて生体活性分子を発現する生物の特性を指すものである。
【００３４】
「プライマー」とは、ある核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘起される条件下において、言い換えれば、適切な温度の適切な緩衝溶液中に4種類の異なるヌクレオシドトリホスフェートと重合の作用物質（つまり、DNAポリメラーゼまたはDNA逆転写酵素）とが存在するような状況において、DNA合成の開始点として機能することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが望ましい。プライマーの適切な長さは、そのプライマーの使用目的によって異なるが、通常の長さは、ヌクレオチド10から50個である。低温で鋳型を使用して十分に安定したハイブリッド構造を形成するには、一般に短いプライマーが必要とされる。プライマーは、鋳型の核酸配列を精密に反映させる必要はないが、その鋳型とのハイブリッド形成が可能なほどに相補的でなければならない。プライマーには、DNA合成の開始点として機能するという基本的特質を変えずにプライマーの検出や固定化を可能にする他の機能を含ませることができる。例えば、そのターゲット核酸とハイブリダイズすることは無いが、増幅産物のクローニングを容易にする核酸配列を、プライマーの5'側末端に一つ追加することは可能である。本明細書では、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的なプライマー領域を、ハイブリダイズ領域と呼ぶ。
【００３５】
オリゴヌクレオチドとターゲット配列間に存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドとターゲットでない配列間に存在するミスマッチの数より少ない場合、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、そのターゲット配列に「特異化」されたものである。安定した二重構造が形成される、プライマーとPCR用鋳型配列とのハイブリダイズ条件は、存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドとそのターゲット配列との間に存在するミスマッチの数よりも多くない場合にのみ選択することができる。このような条件下において、ターゲットに特異的なオリゴヌクレオチドは、ターゲット配列とだけ安定した二重構造を形成できる。適切にストリンジェントな増幅条件においてターゲットに特異的なプライマーを使用すると、ターゲットプライマー結合部位を含むこれらのターゲット配列を特定的に増幅することができる。同様に、適切にストリンジェントなハイブリダイズ条件においてターゲットに特異的なプローブを使用すると、特異的なターゲット配列を検出することができる。
【００３６】
「ターゲット領域」及び「ターゲット核酸」とは、増幅、検出、分析の対象となる核酸領域を指す。プライマーやプローブとハイブリダイズする配列は、「ターゲット」と呼ぶことができる。
【００３７】
「耐熱DNAポリメラーゼ」とは、熱に対して比較的安定性を持つ酵素である。この酵素は、ヌクレオシドトリホスフェートを重合化する触媒作用を有し、ターゲット配列の核酸鎖の一つに相補的なプライマー伸長産物を形成する。この酵素は、プライマーの3'側末端で合成を開始し、合成が終了するまで鋳型の5'側末端の方向へ進む。精製された耐熱DNAポリメラーゼは、パーキンエルマー（Perkin-Elmer）社（コネチカット州ノーウォーク）で市販されている。
【００３８】
「上流」のプライマーとは、プライマーの伸長産物がコーディング鎖のサブ配列となるプライマーを意味し、「下流」のプライマーとは、プライマーの伸長産物が相補的な非コーディング鎖のサブ配列となるプライマーを意味する。「RTプライマー」と呼ぶ、逆転写に使われるプライマーはコーディング鎖とハイブリダイズし、従って下流プライマーである。
【００３９】
分子生物学及び核酸化学の従来技術は、当業者の範疇に属し、文献に詳細に説明されている。例としてSambrookら、1989、「Molecular Cloning-A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Oligonucleotide Synthesis（M.J．Gait編、1984）；「Nucleic Acid Hybridization」（B.D．Hames及びS.J．Higgins.編、1984）；「Methods in Enzymology」シリーズ（Academic Press，Inc.）等の文献があり、これらは全て参考文献として本明細書に組み入れられる。また本明細書に記述されている特許、特許出願、刊行物は、上述、後述の両方を含め、全て参考文献として本明細書に組み入れられる。
【００４０】
図の詳細な説明
図1は、B型肝炎ウイルス（HBV）の突然変異体及び野生型双方の、DNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を測定したアッセイを図示している。本明細書に示されるDNAポリメラーゼアッセイ法は非放射性アッセイ法を提供し、この非放射性アッセイ法は、修飾したヌクレオチドを新たに合成されるDNAへと取り込む酵素の能力を測定するものである。サンドイッチELISAのプロトコールに続き、DNAポリメラーゼ活性のパラメーターとして合成されたDNAの検出を行う。試料の吸光度は、その試料におけるDNAポリメラーゼの活性レベルと直接的な相関関係にある。HBV-WTは、HBVポリメラーゼの野生型を指す。HBV-Mは、表現型的にラミブジン耐性に関与しているタイプI変異体（L528M及びM552V）を含むHBVポリメラーゼを指す。PC及びNCはそれぞれ、陽性対照及び陰性対照を指す（例1を参照）。
【００４１】
図2は、抗ウイルス化合物ラミブジン-TPの阻害曲線と、野生型HBVポリメラーゼ活性に対するこの薬剤の濃度範囲にわたっての影響を図示している。ラミブジン-TPは、0、20、40、60、80、100、200、及び300nMの最終濃度範囲にわたって、ポリメラーゼアッセイ法に加えられた。薬剤濃度に対するDNAポリメラーゼ活性の阻害（％）が図示されている。この曲線は、化合物のこの範囲にわたっての酵素の感受性を定義している。
【００４２】
図3は、抗ウイルス剤ラミブジン-TPの阻害曲線であり、野生型HBVポリメラーゼ（HBV-WT）、タイプI変異体HBVタンパク質（HBV-M、HM2、HM5）、及びタイプII変異体（M552Iを示し、表現型的にラミブジン耐性に関与しているHM1及びHM3）に対し、野生型HBVポリメラーゼ活性におけるこの薬剤の濃度範囲にわたっての影響を図示している。ラミブジン-TPは、0、60、100、200nMの最終濃度範囲にわたって、ポリメラーゼアッセイ法に加えられた。薬剤濃度に対するDNAポリメラーゼ活性の阻害（％）が図示されている。このように、ある表現型、及びラミブジンに対し感受性と耐性を持つHBVポリメラーゼの表現型が検出される。
【００４３】
詳細な説明
本発明は、一つまたは複数の疾病を持つ患者に対する化学療法投薬計画の適合性を評価する表現型検査のアッセイ法及び手法を提供するものである。この発明は、様々な種類の疾病に応用できる。しかし本明細書に開示するアッセイ法及び手法に特に適している病気とは、表現型可能な活性を示す生体活性分子がその疾病に関与していると考えられるか、またはそうした活性がその疾病に存在すると認識されている、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌類感染症、自己免疫疾患、遺伝障害、癌である。化学療法の薬剤に関しては、生体活性分子が直接的なターゲットであることが望ましい。それによってその分子の表現型と薬剤の臨床効果の間に直接的な相関関係を作ることが可能である。しかしこの発明はまた、検出できる表現型を示す生体活性分子が、その直接的な薬物ターゲットではなく、その薬物ターゲットからの代謝経路の下流、言い換えれば、酵素カスケードまたは酵素サイクルなどの下流に位置する場合のアッセイ法に応用されうる。臨床医に補足データを提供するうえで、表現型可能な生体活性分子は、律速反応に関与していること、特定の感染性微生物に特有であること、正常な組織と比較して病気の組織において、例えば定量的RT-PCRによる検出が可能であるように、測定可能なほど異なるレベルで発現さていることが望ましいが、これらは必須条件ではない。PCR及び同様の増幅技術は、癌組織などの組織または複製の遅いウイルスもしくは微生物中において、弱くまたは一時的に発現された低レベルの転写産物でさえも増幅できる程十分な感受性を有する。
【００４４】
患者は身体組織の検査を通して、医師によって疾病状態にあると診断される。身体組織の例には経口、口腔、肛門、膣腔の表面に存在する組織などを含む表皮組織及び粘膜組織がある。感染は専門の医療分野の当業者に認識されている基準に従って診断され、その例には炎症、または色、乾燥、剥離、滲出、化膿、筋、もしくは表面の完全性への損傷などに関する異常な斑が含まれるが、これらに限定されるものではない。膿瘍、髄膜炎、皮膚炭疽、敗血症性関節炎、気腫、膿痂疹、蜂巣炎、肺炎、副鼻腔感染症、及び結核性疾患など、本明細書に記述される組成及び方法で治療される典型的な症状は高熱を伴う。診断は、標準的なELISAベースのキットを使用しながら、培養、従来の染色、直接試料または患者からの接種材料から培養された生物の顕微鏡検査によって確認することができる。診断の確認に好ましい方法は、本明細書に記述されるように、ある疾患に特異的なポリヌクレオチドまたはポリペプチドを個人から分離し識別することである。診断によって、一人の患者に一つまたは複数の疾病が発見されることはよくある。例えば、白血病や後天性免疫不全症候群などの基礎疾患が原因となり、重度の免疫障害を起こす患者、または癌の化学療法もしくは臓器移植を受ける患者は、特に日和見真菌感染症に罹り易い。単一のPCR増幅にプライマーセットを複数利用する等、この発明は特に一つまたは複数の疾病の病因的物質から複数の生体活性分子を一回のアッセイ法で検出することに適している。
【００４５】
増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅プロセスはこの分野で既知の技術であり、本明細書に参考文献として組み入れられる米国特許第4,683,195号；米国特許第4,683,202号；米国特許第4,965,188号に記述されている。パーキンエルマー（Perkin-Elmer）社（コネチカット州ノーウォーク）等の一般供給会社が、PCR試薬の販売及びPCRプロトコールの開示を行っている。本発明の利点の理解を容易にするため、PCRの要約を示す。
【００４６】
PCR増幅の各サイクルにおいて、二本鎖ターゲット配列が変性され、その変性されたターゲットの各鎖にプライマーがアニールし、そしてDNAポリメラーゼの働きによってプライマーが伸長する。このプロセスは通常7回から最高35回まで繰り返されるが、所望の実験条件によってその回数は異なる。2つのプライマーは、各プライマーの伸長産物がそのターゲット配列の相補的な複製になるような向きで、そしてその相補体から分離された際にもう一方のプライマーにハイブリダイズできるように、ターゲット核酸配列の相対する末端側へアニールする。各サイクルが100％の効率であれば、存在するターゲット配列の数はサイクル毎に倍増する。
【００４７】
PCRでは、DNAまたはRNAいずれのターゲット配列の増幅も可能である。本明細書に記述するHBV核酸の増幅のようにRNAがターゲットの場合は、第一段階はターゲット配列のDNAコピー（cDNA）を合成することである。逆転写は別の段階で実行するか、または好ましくはRNA増幅用に修正されたポリメラーゼ連鎖反応である逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）で実行可能である。RNAのRT-PCR増幅はこの分野で既知の技術であり、本明細書にそれぞれ参考文献として組み入れられる米国特許第5,322,770号及び米国特許第5,310,652号；Myers及びGelfand，Biochemistry 30（31）：7661-7666（1991）；Youngら、J．Clin．Microbiol．31（4）：882-886（1993）；ならびにYoungら、J．Clin．Microbiol．33（3）：654-657（1995）に記述されている。
【００４８】
RT-PCRに適した様々な試料準備法が文献の中で説明されている。例えば、生体試料からリボ核酸を抽出する技術は、Rotbartら、「PCR Technology」（Erlich編、Stockton Press，N.Y.（1989））、及びHanら、Biochmistry 2：1617-1625（1987）に記述されており、両者とも本明細書に参考文献として組み入れられる。使用されたこの特定の方法は本発明の重要箇所ではない。この分野での技術を利用し、既存の試料調製法の使用と合わせて反応条件を最適化することができる。PCRプロセスにより非常に大量の増幅が可能となるため、鋳型DNAを意図的に付加しなくとも、高DNAレベルの試料によるDNA汚染、陽性対照鋳型によるDNA汚染、または前増幅によるDNA汚染を低く抑えたPCR産物を作ることができる。お互いの汚染を最小限に抑えられる実験器具及び技術は、本明細書に参考文献として組み入れられるKwok及びHiguchi，Naure，339：237-238（1989）、ならびにKwok及びOrrego、Innisら編、「PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications」、Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.（1990）に記述されている。前の反応で増幅された核酸によるPCR汚染の問題を軽減するための、酵素による方法は、PCT特許公報第US91/05210号、米国特許第5,418,149号及び米国特許第5,035,996号に記述されており、これらは本明細書に参考文献として組み入れられる。
【００４９】
増幅反応混合物は通常、プライマーのハイブリダイズの特異性を保証するために必要な温度に比べ十分に低い室温で作られる。室温ではプライマーが部分的にのみ相補的な核酸配列と非特異的に結合し、意図しない核酸配列の合成を開始することがあるため、特異性の無い増幅が起こる可能性がある。新たに増幅されたこれらの意図しない配列は、増幅反応の最中に意図したターゲット配列と競合し、意図した配列の増幅効率を大幅に低下させることがある。非特異的増幅は「ホットスタート」によって低減することができる。ホットスタートでは、必要なハイブリダイズの特異性を提供するに十分なレベルに温度が上昇するまでプライマー伸長が抑制される。
【００５０】
ホットスタートの一つの方法では、必要なハイブリダイズの特異性を提供するのに十分なレベルに温度が上昇するまで、一つまたは複数の試薬を反応混合物に加えない。ワックス等のような熱変性物質を使用して反応成分を分離または抑制するホットスタート法は、米国特許第5,411,876号及びChouら、Nucl．Acids Res．，20（7）：1717-1723（1992）に記述されており、これらはどちらも参考文献として本明細書に組み入れられる。別のホットスタート法では、逆不活性化されたDNAポリメラーゼが使用される。このDNAポリメラーゼは、増幅の前に、または増幅の第一段階として、高温培養によって活性化されるまでプライマー伸長を触媒することは無い。また非特異的増幅は、その増幅の最初の高温段階以前に作られた伸長産物を酵素的に分解することによって、低減することが可能である。これは米国特許第5,418,149号に記述されており、本明細書に参考文献として組み入れられる。
【００５１】
本発明における核酸の増幅は、リガーゼ連鎖反応法（LCR）、転写媒介性増幅法（TMA）、核酸配列に基づく増幅法（NASBA）、ライゲーション活性転写法（LAT）、および鎖置換増幅法（SDA）等の増幅方法によっても達成可能である。これらの技術は、フェムトモルのターゲット鋳型濃度から、マイクロモルの濃度で生体活性分子（核酸）を提供することができる。
【００５２】
リガーゼ連鎖反応法（LCR）は、目的の配列を半分に分け、それぞれに異なる標識をつけて使用することによって機能する。これら目的の配列の両半分は、試料内に連続する配列がある場合、リガーゼによって共有結合され、新しいターゲットを一つ形成する。LAT法は、一本鎖鋳型と、部分的に一本鎖の箇所と二本鎖の箇所とをもつ単独プライマーを使用することで機能する。増幅はcDNAをプロモーターオリゴヌクレオチドにライゲートすることから始まり、数時間のうちに108倍から109倍に増幅する。鎖置換活性化（SDA）による核酸増幅は、HincIIが認識する部位を持つ短いプライマーと、ターゲットDNAに結合する5'側末端の短い突出部とを使用する。DNAポリメラーゼは、突出部の反対側に位置するプライマーのこの部位に、含硫アデニン類似体を満たす。増幅に続いて、変性されていないDNA鎖に切れ目を入れるために、HincIIを付加する。5'エクソヌクレアーゼ活性を欠如するDNAポリメラーゼがその切れ目の部位に入り、重合を開始し、元のプライマー鎖を下流へ置換しながら、更なるプライマーとして機能する新しい一つの鎖を形成する。SDA法は、37℃で107倍以上の増幅を2時間で達成する。PCR法やLCR法とは異なり、SDA法には計器による温度サイクルが不要である。核酸増幅方法については、本明細書に参考文献として組み入れられる米国特許第6,312,908号及び米国特許第6,316,200号を参照のこと。本発明にはPCR法がより適しているが、発明の方法で記述されているように、ターゲット核酸の増幅には他の方法も使用可能である。
【００５３】
プライマー
オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば配列のクローニング及び制限、ならびに直接化学合成等、様々な適当な方法で準備できる。このような方法には、Narangら、1979，Meth．Enzymol．68：90-99に記述されているリン酸トリエステル法；Brownら、1979，Meth．Enzyme．68：109-151に記述されているホスホジエステル法；Beaucageら、1981，Tetrahedron Lett．22：1859-1862に記述されているジエチルホスホアミダイト法；及び米国特許第4,458,066号の個体支持法等がある。これらは全て参考文献として本明細書に組み入れられる。標識付けしたオリゴヌクレオチドの合成方法は、Agrawal及びZamecnik，1990，Nucl．Acids．Res．18（18）：5419-5423；MacMillan及びVerdine，1990，J．Org．Chem．55：5931-5933；Pielesら、1989，Nucl．Acids．Res．17（22）：8967-8978；Rogetら、1989，Nucl．Acids．Res．17（19）：7643-7651；ならびにTeslerら、1989，J．Am．Chem．Soc．111：6966-6976に記述されおり、これらは全て本明細書に参考文献として組み入れられる。合成方法のレビューは、1990，Bioconjugate Chemistry  1（3）：165-187に掲載されており、本明細書に参考文献として組み入れられる。表1は、HBVポリメラーゼをコードするウイルス遺伝子の増幅に使用される、本発明のネスト化されたプライマーセットを図示している。実験の戦略によっては、生体活性分子をコードする核酸配列に、一つまたは複数の二次的核酸配列を、PCR法によって増幅段階の最中に付加することも可能である。例えばこのような二次的核酸配列は、Hisタグ、HAやFLAGエピトープ、その他の免疫学ベースの精製モチーフ、GST、ストレプトアビジンもしくはMBPタンパク質、核酸配列、またはその他の精製モチーフを含む。遺伝子組換えタンパク質の精製方法は詳細に説明されており、本発明に適用可能な方法には、メタルキレートクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィー等がある。これらの精製技術は、ガスクロマトグラフ、HPLC、又はFPLC等のクロマトグラフィーシステムとしても応用できる。二次的核酸配列は、増幅された核酸中で遺伝子の転写または翻訳を調節する調節エレメントをコードする配列を含むことがある。これは例えば、ADH、T7、RSV、もしくはCMV等のプロモーターの付加によって、またはKozak配列もしくはステムループターミネーション配列の付加によってなされるが、これらに制限されるものではない。その他のレポーター遺伝子またはドメインは、目的のポリペプチドと共に、例えばGEP融合タンパク質またはβ-ガラクトシダーゼ融合タンパク質等の融合タンパク質の作成に使用されることもある。また本発明では、単一の反応から一つまたは複数の生体活性ターゲットを増幅する目的で、複数のプライマーセットの使用が可能であるという点を検討する。生体活性分子をコードする核酸配列が、単一のPCR反応から直接精製またはクローニングされ、それにより表現型アッセイ法にとってのタンパク質をも生成されることが望ましい場合に、二次的核酸配列の使用により、本発明における特定の利点が提供される。
【００５４】
【表１】
2005500022.tif 000002
【００５５】
インビトロ転写及び翻訳
本発明のアッセイ法及び手法には、生体活性分子をコードする増幅cDNAの転写用発現系と、セルフリーの発現系においてRNAを生体活性分子へ翻訳するための発現系とが含まれる。出発物質には、線状DNAつまりPCR増幅DNAの使用が可能な転写／翻訳共役系を使用することが望ましい。タンパク質発現用鋳型としてPCR増幅核酸を直接使用するため、タンパク質発現及び細胞培養のためのプラスミドベースのクローニング処置が不要になる（参考文献として本明細書に組み入れられるLiら、Biochem．Cell Biol.，77：119-126（1999），Kimら、Virus Gene，19：123-130（1999），Qadriら、J．Biol．Chem.，274：31359-31365（1999），Xiongら、Hepatology，28：1669-1673（1998），Seiferら、J．Virol.，72：2765-2776（1998），Leeら、Biochem．Biophys．Res．Comm.，223：401-407（1997），Landfordら、J．Virol.，69：4431-4439（1995），Tavisら、Proc．Natl  Acad．Sci．90：4107-4111（1993）、及び米国特許第5,655,563号；米国特許第5,552,302号；米国特許第5,492,817号；米国特許第5,324,637号；米国特許第4,966,964号を参照）。市販されている発現系には、プロメガ（Promega）社のTNT(登録商標)SP6 Coupled Reticulocyte Lysate System，TNT(登録商標)T7 Coupled Reticulocyte Lysate System，TNT(登録商標)T3 Coupled Reticulocyte Lysate System，TNT(登録商標)T7/T3 Coupled Reticulocyte Lysate System，TNT(登録商標)T7/SP6 Coupled Reticulocyte Lysate System，及びTNT(登録商標)T7 Quick for PCR Coupled Reticulocyte Lysate Systemがある。これらのアッセイ法のテクニカルマニュアルは、参考文献として本明細書に組み入れられる。ターゲットを増幅し、二次的核酸配列をT7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーターのようなアンプリコンへ取り込む能力により、単一のセルフリー反応で、例えば酵素と補因子、または一つの酵素の複数のサブユニットドメイン等、複数のポリペプチドの発現が可能になる。その他の発現系を当業者は周知しており、本明細書に記述する本発明にも有用である。これらの他のシステムは、本発明の範囲下にあると考慮される。例えば、大腸菌溶解物系も使用されている（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）。グリコシル化のようなRNAプロセッシングまたはタンパク質プロセッシング等、生体活性分子の正確な翻訳後修飾を保証するため、理論に制限されることなく、共役発現系は哺乳動物細胞または真核細胞からの溶解物を使用することが望ましい。現在の好ましい実用法において、翻訳系または転写／翻訳共役系には、ポリメラーゼ連鎖反応増幅産物の最初の精製が不要であり、増幅段階から直接タンパク質の発現を行うことが可能である。通常は、約1〜500pMolの核酸で十分にこの翻訳反応を行うことができ、0.1〜100μMolのタンパク質が生成される。この発現系は、本発明の範囲下にあると考慮される合成核酸配列も含め、全ての核酸に対して機能する。
【００５６】
表現型アッセイ法
生体活性分子の表現型は、例えば、ウイルスポリペプチドまたはそのドメインの生体活性を示す変化によって、そして一つまたは複数の抗ウイルス剤が存在する、または欠如するヌクレオチド取り込みアッセイ法におけるその効果によって、観察され、検出される。実施例1はこのようなアッセイ法の一つを説明しており、これは抗ウイルス剤のある濃度範囲において、蛍光標識ヌクレオチドの新生DNAへの取り込みを触媒するウイルスポリメラーゼの能力を測定する。表現型の検出が可能なもう一つのアッセイ法は、実施例2で説明されているHIVプロテアーゼアッセイ法である。酵素の構造及び機能を決定するアッセイ法、ならびにターゲットとリガンドとの結合及び分離の力学を決定するアッセイ法等、他のアッセイ法及び手法は、本発明に有用である。このようなアッセイ法には、放射性リガンド結合アッセイ法、ELISA、移動度シフトアッセイ法、DNAse超高感度アッセイ法、DNA及びRNAのフットプリントアッセイ法等が含まれる。その他の検出システムには、蛍光共鳴発光移動（FRET）、表面プラズモン共鳴（SPR）、タンパク質の共免疫沈降、GC-MSを含む質量分析、2-D NMRを含む核磁気共鳴、及びX線拡散結晶学が含まれる。生体活性分子の構造変化では、例えば、エリスロマイシン耐性大腸菌においてリボソームへの構造変化を検出する方法（参考文献として本明細書に組み入れられる、Weisblum，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，39：577-585（1995））といった、現在好まれる表現型の検出方法が提供される。
【００５７】
放射性リガンド結合アッセイ法は、化合物の濃度範囲の1pMから10,000μMにわたり平衡結合定数（KD）を誘導し、比較する目的で利用することができ、10pMol程の低い生体活性分子濃度でも機能する。タンパク質及びそのリガンド向けのKD値は、IC50（または50％の阻害を示している阻害剤濃度）に関連しており、その一般的等価物と考えられる。化合物の感受性の変化は、患者の試料から得られた生体活性分子のIC50と、野生型または他の許容可能な標準のIC50との比較から計算できる。野生型のKD値と突然変異生体活性分子のKD値との間の相対的親和性の変化が僅か1〜5％であっても、放射性リガンド結合アッセイ法によって検出可能である。KDまたはIC50のいかなる変化も重要であるが、相対的親和性についての5％から10％の変化は治療用化合物の臨床的有効性が明らかに低下したことを示し、50％の変化は有効性が実質的に低下したことを示し、そして100％の変化は、結合の実効的損失及び治療可能性の実効的損失、つまり薬剤耐性表現型を示している。
【００５８】
SPRシステムは、リガンドとそのターゲットとの結合及び分離をリアルタイムで監視するアッセイ法を提供する。これらの装置は、化合物の濃度範囲の0.1pMから10,000μMにわたり、平衡結合定数（KD）を導き、比較する目的で使用でき、1pMol程の低い生体活性分子濃度でも機能する。薬剤の感受性の変化は、患者の試料のIC50と、野生型の標準のIC50との比較から計算できる。SPRでは、野生型のKD値と突然変異生体活性分子のKD値との間の相対的親和性の変化が僅か1％であっても検出可能である。KDやIC50の変化は全て重要であるが、相対的親和性については5％から10％の変化は治療用化合物の臨床的有効性が明らかに低下したことを示し、50％の変化は有効性の実質的な低下を示し、そして100％の変化は、結合の実効的損失及び治療可能性の実効的損失を示す。こうしてSPRにより、生体活性分子の表現型を観察するための優れた検出システムが提供される。
【００５９】
市販されているSPRシステムには、ビアコアAB（Biacore AB）社のBIAlite(商標)装置及びBIAcore(商標)装置、アフィニティーセンサーズリミテッド（Affinity Sensors Limited）社（英国）のIAsys(商標)装置、アーティフィカルセンサーインストゥルメンツ（Artificial Sensor Instruments）社（スイス、チューリッヒ）のBIOS-1装置等が含まれる。これらのシステムのテクニカルマニュアルは、参考文献として本明細書に組み入れられる。例えば、このような装置のセンサー表面に添付された生体活性分子のリガンドまたは薬剤分子を置換または分離することによって質量が相対的に低減するが、これは容易に検出可能である。SPRが最適に機能するのは、質量の純変化が大きく、検出が容易である場合である。例えば薬剤がステロイド又はペプチドのように低分子量の化合物である場合、薬剤と生体活性ペプチドとの間により大きな分子量の格差をもたらすために、その類縁物質を高分子量の物質へ結合させることがある。結合に適した高分子量物質には、オボアルブミンやウシ血清アルブミン（BSA）等のタンパク質、または脂質等の他の物質がある。これらの物質は、酵素、放射性標識、蛍光タグもしくは化学発光タグ、レドックス標識、又は有色粒子等の従来の標識ではなく、単に薬剤とそのターゲットとの間に分子量の格差を作り出すものであることに注意するべきである。一方、治療用薬剤がペプチドである場合は、ペプチドを融合タンパク質の一部として利用することによって、ペプチドの分子量が生体活性分子に対して相対的に増加することがある。好都合なことにペプチドは、ポリペプチドのN末端に、またより望ましくはC末端に融合することができる。このような融合タンパク質をコードするDNA配列の構築方法は、当業者に周知である。
【００６０】
また質量分析は、例えば、分子構成、分子量を決定し、かつ結合化合物候補の存在や欠如を決定する手段も提供し、それによって表現型の検出を可能にする。質量分析は、フェムトモル濃度レベルの生体活性分子でも可能であるという利点がある。生体活性分子の表現型の研究に有用であるこのような装置は、例えば、高速原子衝撃質量分析器（例えば、参考文献として本明細書に組み入れられるKosterら、Biomedical Environ．Mass Spec．14：111-116（1987）を参照）；プラズマ脱離質量分析器；エレクトロスプレー／イオンスプレー（例えば、Fennら、J．Phys．Chem．88：4451-59（1984）、PCT出願番号国際公開公報第90/14148号、Smithら、Anal．Chem．62：882-89（1990）を参照）；及びマトリックス支援レーザー脱離／イオン化器（Hillenkampら、「Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization：A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules」、「Biological Mass Spectrometry」（Burlingame及びMcCloskey編）、Elsevier Science Publishers、Amsterdam，pp.49-60、1990）；Huth-Fehreら、「Matrix Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry of Oligodeoxythymidylic Acids」、Rapid Communications in Mass Spectrometry、6：209-13（1992））等を含む。
【００６１】
本発明のアッセイ法及び手法は、抗細菌治療、抗ウイルス治療、抗真菌治療等の抗微生物治療のあらゆる分野に応用できる。
【００６２】
抗感染化学療法に使用される抗細菌剤または抗細菌化合物には、βラクタム系抗生物質（例えばペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、及びモノバクタム）、グリコペプチド（例えばバンコマイシン及びテイコプラニン）、アミノグリコシド系抗生物質（例えばカナマイシン、ゲンタマイシン、及びアミカシン）、セフェム系抗生物質（例えばセフィキシム、セファクロール）、マクロライド系抗生物質（例えばエリスロマイシン）、テトラサイクリン系抗生物質（例えばテトラサイクリン、ミノサイクリン、ストレプトマイシン）、キノロン系抗生物質、リンコサミド系抗生物質、トリメトプリム、スルホンアミド、イミペネム、イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジナミド、エタンブトール、ビスマスアセテートやクエン酸ビスマス等を含むビスマス塩、メトロニダゾール 、ミコナゾール、カスガマイシン、ならびにオフロキサシン、ロメフロキサシン、及びシプロフロキサシン等のキノロン系化合物が含まれる。現在はこれらの化合物が抗細菌剤として好まれるが、本発明のアッセイ法及び手法の使用に適した新しい化合物が開発中である。
【００６３】
抗感染化学療法に利用される抗真菌剤または抗真菌化合物には、例えばアムホテリシンBもしくは類縁物質、またはその誘導体（14(s)-ヒドロキシアムホテリシンBメチルエステル、アムホテリシンBと1-アミノ-4-メチルピペラジンとのヒドラジド、及びその他の誘導体を含む）を含むラパマイシンまたはラバログ、あるいはナイスタチン、カンジシジン、ピマリシン、及びナタマイシン等の他のポリエンマクロライド系抗生物質；フルシトシン；グリセオフルビン；自然発生及び半合成の類縁物質を含むエキノカンジンやオーレオバシジン；ジヒドロベンゾ[a]ナフタセンキノン；ポリオキシン及びニッコーマイシンを含むヌクレオシドペプチド系抗真菌剤；ナフチフィン及びその他のスクアレンエポキシダーゼ阻害剤等のアリルアミン；ならびに例えばクロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、テルコナゾール、イトラコナゾール、またはフルコナゾール等のアゾール、イミダゾール、及びトリアゾールが含まれる。現在はこれらの化合物が抗真菌剤として好まれるが、本発明のアッセイ法及び手法の使用に適した新しい化合物が開発中である。既存の抗真菌剤及び開発中の新薬剤の更なる情報は、Turner及びRodriguez，1996，Recent Advances in the Medicinal Chemistry of Anti-fungal Agents，Current Pharmaceutical Design，2，209-224を参照のこと。
【００６４】
抗感染化学療法に利用される抗ウイルス剤または抗ウイルス化合物には、例えばラミブジン、ペンシクロビル、ファムシクロビル、アデフォビル、ロビリド、アフィジコリン、ティビラピン、エンテカビル、クレブジン、カルボビル、シドフォビル、フォスカルネット、ガンシクロビル（GCV）、ジドブジン（AZT）、ジダノシン（ddI）、スタブジン（d4T）、ネビラピン（NVP）、デラビルジン（DLV）、エファビレンツ（EFN）、サキナビル（SQV）、インジナビル（IDV）、リトナビル（RTV）、ネルフィナビル（NFV）、アバカビル（ABC）、アンプレナビル（AMP）、αインターフェロン、β-2',3'-ジデオキシシチジン（ddC）、(±)-2-アミノ-1,9,ジヒドロ-9-[(1α,3β,4α)-3-ヒドロキシ-4-(ヒドロキシメチル)シクロペンチル]-6H-プリン-6-オン（2'-CDG）、及び2',3'-ジデオキシ-5-フルオロ-3'-チアシチジン（FTC）を含み、同様にアンプレナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、KNI-272を含むプロテアーゼ阻害剤を含み、同様に高活性抗レトロウイルス療法（HAART）等の治療用の組み合わせを含む。現在はこれらの化合物が抗ウイルス剤として好まれるが、本発明のアッセイ法及び手法の使用に適した新しい化合物が開発中である。本明細書に参考文献として組み入れられるSquires KE，Antivir Ther，6 Suppl 3：1-14（2001）を参照のこと。
【００６５】
抗感染化学療法に使用される化学療法剤あるいは化合物のうち、本発明への使用に適したものは、ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド、ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスフォラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、テモゾロミド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、6-メルカプトリン、6-チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、ゲムシタビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、パクリタキセル、ミトラマイシン、デオキシコフォルマイシン、マイトマイシン-C、L-アスパラギナーゼ、インターフェロン、エトポシド、テニポシド、17α-エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゴセレリン、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシウレア、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミゾール、ナベルビン、CPT-11、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、ドロロキサフィン、ゲムシタビン、パクリタキセル、及びヘキサメチルメラニンを含む。現在はこれらの化合物が抗がん剤として好まれるが、本発明のアッセイ法及び手法の使用に適した新しい化合物が開発中である。
【００６６】
自己免疫疾患の状態を治療する化合物には、Cox2特異的NSAIDS様セレコキシブ及びロフェコキシブを含むイブプロフェン、アスピリン、ケトプロフェン、インドメタシン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、メクロフェナム酸等の非ステロイド系の抗炎症剤、プレドニゾン及びプレドニゾロン等のステロイド剤、ヒドロキシジンフェキソフェニジン、セチラジン、ロラタジン、ジフェンヒドラミン等の抗ヒスタミン剤、IL-1伝達物質、TNF伝達物質、インターフェロン伝達物質、プロスタグランジン伝達物質、抗リューマチ化合物、ならびにインフリキシマブ、バシリキシマブ、パビツマブ、及びトラスチマブ等の単クローン抗体を含む。シクロホスファミド、プレドニゾン、レバミゾール、コルヒチン、及びプロベネシド等の抗腫瘍薬もまた、自己免疫疾患に対して広く使用されている。
【００６７】
本発明においては通常これらの作用物質あるいは化合物は、化合物と生体活性分子のIC50の既知値の0.01から100倍の濃度範囲に渡って生体活性分子に接触するよう、使用されている。例えば、阻害曲線を定めるデータポイントを拡充するため、またはIC50値が未知の場合において幅広い範囲や投薬量を決定するために、より多量の化合物もしくは少量の化合物を加えることも可能である。本発明はインビトロアッセイ法を提供しているものであり、実験上の投薬量の範囲は、これら化合物が実際に人体へ投与される場合の範囲とは異なることもあり得る。例えばインビトロでの100倍の投薬量は、ターゲット化合物の生体活性を根絶するのに十分な量かもしれないが、そのような極端な投薬量の変更は人体への投与に関しては容認されない。これら化合物の人体への投薬量に関しては、参考文献として本明細書に組み入れられる「Physician's Desk Reference」（2001）に示されている。この参考文献には、本明細書に開示されているアッセイ法によって検出された生体活性分子の表現型が含まれ、医師あるいは同等の同業者は実験データを調べ、臨床治療への適合性あるいは応用を判断することが可能である。このように本発明は前記の化合物に対する患者の化学療法の投薬計画を予測観察するための表現型アッセイ法及び手法を提供し、また患者の病気を治療するために新しく開発された薬剤の可能性を評価する方法を提供する。
【００６８】
本発明は表現型の検出と特性決定のために最適かつ十分な量の生体活性分子を、24時間、48時間、約1週間といった迅速な期間で生成することが可能なアッセイ法及び手法によって構成されている。PCR、LCR、TMA、NASBA、及びSDAの増幅方法を通じて、ターゲット配列は数時間で増幅する。記述した転写／翻訳共役系を使用することで、タンパク質発現と精製は1日で達成される。本明細書に記述したアッセイ法を使用することで、ターゲットの機能的特性（表現型）への薬剤の効果に関する検出と分析は、約24時間から48時間のうちに達成する。本発明は、化学療法の投薬計画における薬剤の可能性を評価するための迅速な方法を提供するものである。本明細書に開示された本アッセイ法及び手法に適合する生体活性分子の例を更に表2に示す。
【００６９】
【表２】
2005500022.tif 000003
【００７０】
本明細書で用いられる下記の実施例は、本明細書に記述する発明の特定の態様を例示している。
【００７１】
実施例1．B型肝炎ウイルス（HBV）
B型肝炎ウイルス（HBV）は急性肝炎及び慢性肝炎の原因となる物質であり、全世界で約2億の患者を苦しめている（参考文献として本明細書に組み入れられるZuckerman A.J.，Trans．R．Soc．Trop．Med．Hygiene，76：711-718（1982）を参照）。成人後のB型肝炎ウイルスへの感染は、多くの場合臨床的な顕在性がなく、急性感染の成人の多くはこの疾患から完全に回復しウイルスを排除できている。しかし、まれに、この急性肝臓病が重くなり患者が劇症肝炎で死ぬこともある。ウイルスに継続的に侵され様々な重症度の慢性肝臓病を患うことになるのは急性感染した成人のうち少数の割合、おそらく5〜10％である。しかしB型肝炎ウイルスに新生児が感染した場合はウイルスを排除できることはまれで、感染した小児の90％以上が慢性的な患者となっている。通常、HBVはアフリカ及びアジアの人口密集地域において、感染者の母親から新生児に広まっているため、全世界で数億人がその生涯の大半をB型肝炎ウイルスに継続的に侵され、肝硬変と肝細胞癌（HCC）を引き起こす危険性が非常に高い様々な重症度の慢性肝臓病に苦しんでいる。実際のところ、HCCに罹患する危険性は慢性肝炎の患者では100倍に増加し、出生時に感染した男性の生涯に渡ってのHCCの罹患率は40％に達している（参考文献として本明細書に組み入れられるBeasley R.P.ら、Lancet（1981）2，1129-1133を参照）。従って、世界人口のかなりの割合がこれらHBV感染の合併症に暫く後になって罹り死亡している。抗HBV剤の開発は長らく待たれてきたが、HBVの宿主が極端に限られていることが障害となっていた。HBVは実験動物や培養細胞ではなく、主に人体及びチンパンジーの肝臓において複製されるのである。参考文献として本明細書に組み入れられるTiollais，Pら、Nature（London）（1985）317，489-495を参照。
【００７２】
B型肝炎ウイルスは小型のゲノム構造を持つDNAウイルスである。その小さく環状の3200の塩基対の配列にも関わらず、HBVのDNAは4組のウイルス生成物をコードし、複雑な多粒子性構造を持っている。HBVは4つの重複する遺伝子S、C、P、及びXからタンパク質をコードするという効率的な戦略によってゲノムの経済性を達成している。HBVはヘパドナウイルスという動物ウイルスの一種で、ヘパドナウイルス1型に分類される。類似のウイルスはある種のウッドチャック、地上に生息するリス、樹上に生息するリス、及び北京ダックに感染する。HBVを含む全てのヘパドナウイルスは次のような特徴を共有している。1）形態学上特徴的な3つの形状が存在する、2）同ウイルスの全てが、HBVのエンベロープとヌクレオカプシド抗原に機能的かつ構造的に対応するタンパク質を持つ、3）同ウイルスは肝臓内で複製されるが、肝外部位においても生存し得る、4）同ウイルスはRNA依存性及びDNA依存性のDNAポリメラーゼ活性の双方を持つ内因性DNAポリメラーゼを含む、5）同ウイルスのゲノムは部分的に二本鎖の環状DNA分子である、6）同ウイルスは急性肝炎及び慢性肝炎ならびに肝細胞癌に関係している、7）同ウイルスのゲノムの複製は、レトロウイルスに見られるものと同じように、RNA中間体を経由し、同ウイルス内因性のRNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を使ってDNAへ逆転写される。感染した肝細胞の細胞核において、部分的に二本鎖のDNAはDNA依存性DNAポリメラーゼによって共有結合によって閉環された環状二本鎖DNA（cccDNA）に転換する。ウイルスのDNA転写は宿主のRNAポリメラーゼによって達成され、転写開始部位が異なるが全て共通のポリアデニル化シグナルによって終結するRNAの転写産物が幾つか生成される。これらRNAのうち最長のものは、幾つかのウイルスタンパク質のための情報伝達と同時にウイルスのプレゲノムとしての役割を果たす。ウイルスタンパク質はプレゲノムRNAから翻訳され、ウイルスタンパク質とプレゲノムRNAはビリオンにパッケージされ肝細胞から分泌される。HBVのインビトロ培養は困難であるが、幾つかの細胞ではHBVのDNAの核酸を入れることに成功しており、インビトロでのHBV粒子の生成が可能となっている。
【００７３】
HBVには3つの粒子形態がある。非感染性の22nmの粒子で、球状または長い管状のもの、及び無傷の感染性B型肝炎ビリオンを示す42nmの二重殻球状粒子である。エンベロープタンパク質であるHBsAgはHBVのS遺伝子の生成物で、ビリオンの外部表面上、ならびに小さな球状及び管状の構造上に存在する。
【００７４】
S遺伝子オープンリーディングフレームの上流には、プレS遺伝子の生成物をコードするプレS1、プレS2のプレS遺伝子オープンリーディングフレームが位置し、こうした生成物はポリメラーゼ化したヒト血清アルブミンのためのHBV表面上の受容体及び肝細胞受容体のための付着部位も含まれている。42nmの無傷のビリオンは中性洗剤で崩壊し、27nmの分離したヌクレオカプシドコア粒子になりうる。そのコアはC遺伝子によってコードされた2つのヌクレカプシドタンパク質によって構成されている。C遺伝子はコア領域とプレコア領域とを定める2つの開始コドンを持っている。ヌクレカプシドコアの表面に発現する主要な抗原はコア領域によってコードされ、B型肝炎コア抗原（HBcAg）と呼ばれる。B型肝炎e抗原（HBeAg）はプレコアATGにおいて開始し、同じC遺伝子から生成される。
【００７５】
また、ヌクレカプシドコア内にはDNAポリメラーゼがパッケージされており、HBV DNAの複製と修復とを指示している。DNAポリメラーゼはHBV遺伝子のうち最大の第三のP遺伝子によってコードされている。この酵素はDNA依存性DNAポリメラーゼ活性とRNA依存性の逆転写酵素活性を合わせ持ち、またプレゲノムRNAを効率的にカプシドで包むために必要とされている。第四の遺伝子Xは、ウイルス遺伝子及び細胞遺伝子両者の転写を促進できることが示される小型で粒子とは関連のないタンパク質をコードしている。DNAポリメラーゼ遺伝子は本アッセイ法の中でターゲットとして選択されている。
【００７６】
ヒトHBV DNAポリメラーゼの増幅
ウイルスDNAは、QIAアンプ（QIAamp）血液キット（キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）を使ってHVB患者の血清検体から単離した。ネステッドPCR法を用い、野生型HBVポリメラーゼ（HBV-WT）、L528M及びM522Vの突然変異を保有しているタイプI変異体HBVタンパク質（HBV-M、HM2、及びHM5）、及びM552Iの突然変異を保有しているタイプII変異体（HM1及びHM3）をコードするHVB DNAポリメラーゼ配列を増幅した。この両突然変異は、表現型的にラミブジン耐性に関係している。
【００７７】
第一段階のPCRでは、プライマーHB10（配列番号：1）及び、プライマーHB11（配列番号：2）を用いた。第二段階では、プライマーHB3（配列番号：3）及びHB6（配列番号：4）使用した。両PCR段階における50μlの反応混合液は、10mMのTris-HCL（pH8.3）、50mMのKCL、1.5mMのMgCl2、0.2mMの各dNTP、20pMの各プライマー、及び1.25UのTaqDNAポリメラーゼ（パーキンエルマー社）を含有していた。両段階でのPCR条件は、94℃で5分間、次に94℃で30秒、55℃で1分間、72℃で3.5分間、を35回繰り返し、続いて72℃で更に5分間伸長させた。
【００７８】
2.6kbのPCRの結果、患者の検体血清からはDNAを転写するためのT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列と、効果的なRNA翻訳のためのコザックコンセンサス配列と、そして特定のHBV DNAポリメラーゼ配列とを含むDNA鋳型が生成された。
【００７９】
ポリメラーゼの発現
PCRによって生成されたDNA鋳型は、ウサギの網状赤血球の溶解系、すなわち、PCR DNA用のTNT T7クイック（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）を用いることで、セルフリー発現系において直接的にHBV DNAポリメラーゼへと転写翻訳した。HBVポリメラーゼの全長に相当する90kDaのタンパク質を、この真核生物の発現系から生成した。
【００８０】
ポリメラーゼのための機能アッセイ法
発現したHBVポリメラーゼタンパク質のDNAポリメラーゼ活性を決定するために、感受性のあるポリメラーゼアッセイ法（Roche Molecular Biochemicals，インデアナ州インデアナポリス）を用いた。図1は、B型肝炎ウイルス（HBV）の突然変異体及び野生型における、DNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を測定するものである。ここで示されたDNAポリメラーゼアッセイ法は非放射性アッセイ法を提供するものであり、新たに合成されたDNAにおけるジゴキニゲニン標識ヌクレオチド及びビオチン標識ヌクレオチドに対する酵素の能力を測定する。ビオチン標識核酸は、ストレプトアビジンで皮膜されたマイクロタイタープレートの表面に結合するため、DNAポリメラーゼ活性のパラメーターとしての合成DNAの検出は、サンドイッチELISAプロトコールに従った。ペルオキシダーゼと結合した抗ジゴキニゲニン抗体は、核酸とともにインキュベートされる。ペルオキシダー基質に加えると、ペルオキシダーゼ活性に対応して色の変化が発生するが、これはマイクロプレートELISA読み取り機で検出できる。試料の吸光度は、その試料中のDNAポリメラーゼの活性レベルと直接的な相関関係にある。そのようなアッセイ法は、例えばロシュモレキュラーバイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals）社のDNAポリメラーゼ、非放射性キット等、市販されている。図1では、HBV-WTは野生型HBVポリメラーゼを示している。HBV-Mは、表現型的にラミブジン耐性と関係しているタイプI変異体（L528M及びM552V）を含むHBVポリメラーゼを指す。PC及びNCは、それぞれ陽性対照及び陰性対照を指す。簡潔に言えば、陽性対照はポリメラーゼ緩衝液にクレノウ酵素を含んでおり、陰性対照はDNAアンプリコンのない網状赤血球溶解液を含んでいる。
【００８１】
図2は、抗ウイルス化合物ラミブジン-TPの阻害曲線と、この薬剤の濃度範囲にわたってのHBVポリメラーゼ活性に対する影響を図示する。ラミブジン-TPは0、20、40、60、80、100、200、300nMの最終濃度範囲にわたって、ポリメラーゼアッセイ中の酵素と接触するために使われた。薬剤濃度に対して、DNAポリメラーゼ活性の阻害（％）がグラフになっている。IC50を誘導するもう一つの技術は、阻害剤の濃度を対数表示にして生体活性をパーセンテージでグラフにすることであり、この場合その阻害曲線は単一結合部位アルゴリズムを用いた非線形回帰モデルによって記述される。そのようなモデルプログラムは、例えばグラフパッドソフトウェア（GraphPad Software）社（カリフォルニア州サンディエゴ）のPRISM等、当業者には周知のことである。
【００８２】
図3は、抗ウイルス化合物ラミブジン-TPの阻害曲線と、野生型HBVポリメラーゼ（HBV-WT）、タイプI変異体HBVタンパク質（HBV-M、HM2、及びHM5）、及びタイプII変異体（M552Iを示し表現型的にラミブジン耐性に関与しているHM1及びHM3）に対し、野生型HBVポリメラーゼ活性におけるこの薬剤の影響とを、濃度範囲にわたって図示している。ラミブジン-TPは、0、60、100、及び200nMの最終濃度範囲にわたってポリメラーゼアッセイ法に加えられた。薬剤濃度に対するDNAポリメラーゼ活性の阻害（％）がグラフに示されている。図1は、B型肝炎ウイルス（HBV）の突然変異体及び野生型における、DNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を測定したアッセイを図示する。本明細書に示されたDNAポリメラーゼアッセイ法は非放射性アッセイ法を提供するものであり、新たに合成されたDNA中の修飾ヌクレオチドを取り込む酵素の能力を測定する。DNAポリメラーゼ活性のパラメーターとしての合成DNAの検出は、サンドイッチELISAプロトコールに従う。試料の吸光度は、その試料中のDNAポリメラーゼ活性レベルと直接的な相関関係にある。HBV-WTは野生型HBVポリメラーゼを示している。HBV-Mは、表現型的にラミブジン耐性と関係しているタイプI変異体（L528M及びM552V）を含むHBVポリメラーゼを指す。PC及びNCは、それぞれ陽性対照及び陰性対照を指す。
【００８３】
表現型の解釈；薬剤感受性
薬剤感受性の変化は、患者の試料から得られたIC50と、野生型標準のIC50との比較から計算できる。このアッセイ法によると、野生型のIC50値と変異体タンパク質のIC50値における僅か1％から5％の相対的親和性の変化を検出可能である。IC50の変化は全て重要であるが、相対的親和性については5％から10％の変化であれば治療用化合物の臨床的有効性が明らかに低下したことを示し、50％の変化であれば有効性の実質的な低下を示し、その化合物の使用を中止すべきであることを示唆している。そして100％の変化は事実上、機能が完全に損失したことを示す。図3では、突然変異体タンパク質は約100nMのIC50を示す一方、野生型ポリメラーゼは約50nMのIC50を示しており、IC50値が半減、即ち50％減少したことになる。これは突然変異体における薬剤耐性表現型に相当する。
【００８４】
実施例2．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）
後天性免疫不全症候群（AIDS）は致命的疾病であり、通常、人類史上最も深刻な疾病の一つであると認識されている。全世界的にヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染者及びAIDS患者の数は際限も無く増加しており、その蔓延を阻止する努力の効果は限られたものであると一部では信じられている。今日ではHIVには2つの種類、即ち、HIV-1とHIV-2があることが認識されている。1994年の12月31日までに世界保健機関に報告されているAIDS患者の数は、1,025,073人である。この数は全患者数の一部に過ぎず、診断見落とし、過少申告、報告の遅延を考慮し、HIV感染者の推定値に基づくとすると、WHOは1994年末現在で世界全体では通算4.5百万以上の患者がいると推定している（Mertensら（1995）AIDS9（Suppl A），S259-S272）。北アメリカ、ヨーロッパ、サハラ以南のアフリカでHIVが流行し始めてからは、19.5百万人以上の男性、女性、そして子供達が感染したと推定されている。今日AIDS患者の数を申告している国が約190カ国に及び、この20年間でAIDSが全世界的に蔓延していることは際立った特徴の一つである。WHOによる全世界のHIV感染者の予測は、信じ難いものである。2000年の成人AIDS患者の通算総数は1千万人近いと予測されている。2000年迄にはHIVに関連した成人死者数の累計は、現在の約3百万人に対して8百万人以上と、大幅に増加することが予想されている。
【００８５】
HIV-1とHIV-2は、2つの同一RNA分子を包含する複相ゲノムを持ったエンベロープに包まれたレトロウイルスである。HIVの分子組成は、（5'）U3-R-U5-gag-pol-env-U3-R-U5（3'）である。U3、R、及びU5配列は、感染宿主においてウイルス遺伝子の発現、及び時合によっては隣接した細胞の遺伝子の発現を促進するような調節エレメントであるロングターミナルリピート（LTR）を形成する。ウイルスRNAの内部領域は、構造タンパク質をコードする：即ち、gag（p55、p17、p24、p7コアタンパク質）、pol（p10プロテアーゼ、p66及びp51逆転写酵素、及びp32インテグラーゼ）、env（gp120、gp41エンベロープ糖タンパク質）である。gagは、ウイルスプロテアーゼによって3つまたは4つの構造タンパク質に分割されるポリタンパク質前駆体をコードする。polは逆転写酵素（RT）、ならびにウイルスプロテアーゼ、及びウイルスインテグラーゼをコードする。envは、ウイルスの膜貫通型糖タンパク質及び外部糖タンパク質をコードする。gag遺伝子及びpol遺伝子はゲノムRNAとして発現する一方、env遺伝子はスプライスされたサブゲノムRNAとして発現する。env遺伝子に加えて、ウイルスの複製及び生物活動に寄与する、スプライスされたサブゲノムRNAによって生成されるHIV遺伝子が他にもある。こうした遺伝子は、ウイルス遺伝子及び他の細胞遺伝子の発現を促進するタンパク質をコードするtat、スプライスのないウイルスmRNAまたは単一スプライスのウイルスmRNAの発現を促進するタンパク質をコードするrev、ある特定の条件下においてウイルス生産を調節してるように見受けられるミリスチル化タンパク質をコードするnef、ターゲット細胞に感染するウイルス粒子の能力には影響を及ぼすが、細胞同士の接触によってウイルス発現または伝達に影響を及ぼすようには見えないタンパク質をコードするvif、ビリオン関連タンパク質をコードするvpr、ならびにウイルス粒子の細胞外への放出を促進するように見受けられるタンパク質をコードするvpuを含む。
【００８６】
AIDSは、ウイルス薬剤耐性の問題を最も良く実証する疾病である。薬剤耐性のあるHIV分離株は、ヌクレオシド及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤とに対して発見されている。AZT及び他の逆転写酵素阻害剤はウイルス複製を約90％減少させることしかできないため、AZT耐性HIV分離株が出現することは、驚くべきことではない。薬剤治療の選択的圧力が存在している状態でウイルス複製が高率であることは、薬剤耐性突然変異体の出現に対して理想的な状況を供与していることになる。感染末期段階の患者はウイルス複製が高率であり、感染初期段階の患者よりもAZT治療に伴い耐性ウイルスを早く形成する（本明細書に参考文献として組み入れられるRichmanら（1990）J AIDS 3，743-6を参照）。AZTに対する耐性の発現の初期性状は、薬剤感受性の進行的かつ段階的減少によって分かる（Larderら（1989）Science 243，1731-1734）。これは、感受性の減少に寄与する逆転写酵素のための遺伝子において多数の突然変異が見出されたことによって説明される（Larderら（1989）Science 246，1155-1158）。これらの突然変異は、低減した感受性の表現型に対して追加的に、更には相乗的に寄与した（Kellamら（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．89，1934-1938）。そのように突然変異が累積的に獲得される結果として、感受性が進行的に減少した。非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤において類似した現象が見られる（本明細書に参考文献として組み入れられるNunbergら（1991）J Virol 65，4887-4892；Sardannaら（1992）J Biol  Chem 267，17526-17530を参照）。プロテアーゼ阻害剤の研究によって、薬剤感受性が減少したHIV種が数週間以内で選択されることが発見されている（Hoら（1994）J Viro l68，2016-2020；Kaplanら（1994）Proc．Natl．Acad．Sci．91，5597-5601）。最近の研究ではプロテアーゼ阻害剤は逆転写酵素阻害剤より強力であると示されているものの、それにもかかわらず耐性が出てきている（本明細書に参考文献として組み入れられるCondraら、Id．及びReport 3rd Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections，March 1996を参照）。薬剤投与の減少、薬物間相互作用、吸収不良あるいは他の要因による生体利用度の低下によって引き起こされようと、自主的な休薬期間によるものであろうと、治療量以下の薬剤レベルではウイルス複製が活発になり、突然変異及び耐性が増加する機会が増える。
【００８７】
薬剤治療の選択圧力下では、既存の突然変異体の急増が許される。ウイルスを完全に抑制する抗ウイルス薬剤活性が存在しない状態で継続的なウイルス複製が起こるので、AZT及びHIVのプロテアーゼ阻害剤に関して記述したように、多くの突然変異が累積的に長期間にわたって獲得され得る。実際、異なる薬剤に対するウイルス突然変異体の多重耐性が観察されている（Larderら（1989）Science 243，1731-1734；Larderら（1989）Science 246，1155-1158；Condraら（1995）Nature 374，569-71）。例えばHIVの場合がそうであるように多くのウイルス感染における耐性が必然的に現れる中で、耐性ウイルス集団に対する最も効果的な治療方法を最適化する戦略を取られなければならない。薬剤耐性を形成しやすい患者は回復を困難にする状況を作り出す他の複雑な要因も持っている場合が多いため、薬剤が効果のないことを薬剤耐性によるものと決めることは困難である（Richman（1994）AIDS Res Hum Retroviruses 10，901-905）。更に、患者は異なる感受性のある様々なウイルスを合わせ持っている。
【００８８】
HIVタンパク質の単離と増幅
逆転写酵素（RT）阻害剤に対するHIV1型分離株の薬剤感受性を評価するための表現型アッセイ法が開発されている。この方法は、医師に現行の化学療法を続けるか、他の療法に変更するかどうかについての情報を与える。ウイルス負荷の監視はHIV患者の介護における日常的な局面となってきている。しかし、ウイルス負荷の数値だけでは、どの薬剤を単独で使用するか、あるいは組み合わせて使用するかという決定の基準とすることができない。併用療法は、ますます好まれる化学療法の投薬計画になってきている。薬剤を併用している人にとって薬剤の効果が表れなくなり始めた場合に、併用した薬剤のうちどの薬剤の効力が無くなったかということを確実に知ることは不可能である。現在使用可能な薬剤の数は限られているので、単純に薬剤すべてを交換することはできない。更に、もし完全に化学療法の投薬計画を切り替えると、その特定の患者に効き目のある一つまたは複数の薬剤を放棄することになり兼ねない。また特定の阻害剤に対して耐性を示するウイルスが、他の阻害剤に対して様々な程度の交差耐性を示すこともある得る。それゆえ理想的には、ある人がウイルス負荷検査を受け、ウイルス負荷の増加が検出されるたびに、本発明の薬剤感受性／耐性アッセイ法も実施すべきである。効果的な治療能力のある療法が開発されるまで、HIVの病気を管理するためには、こうした検査が必要である。
【００８９】
HIV-1の配列（分離株HXB2、参照ゲノム、9718bp）は、米国国立保健研究所の国立医学図書館にある全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）からENTREZ文書検索システムを介して得た（Genbank名：HIVHXB2CG、Genbankアクセッション番号：0/3455＜NCBI SEQ.ID No：327742）。目的の遺伝子を増幅させるように設計されたプライマーセットが開発されている。逆転写される配列が逆転写酵素または逆転写酵素及びプロテアーゼをコードするものである場合、下流のプライマーとしてはOUT3（下流）とRVP5（上流）との組み合わせが好ましく、OUT3プライマーは
2005500022.tif 000004
（配列番号：5）を含み、RVP5は
2005500022.tif 000005
（配列番号：6）を含み、Maschera，B.ら、Journal of Virology，69，5431-5436に記述されるPCR条件を用いることが好ましい。
【００９０】
Pol遺伝子及びRT遺伝子からの所望される配列は、表現型薬剤感受性を決定しようとしている患者から得られた生体物質の試料から単離する。所望される配列の単離には、様々な種類の生体物質を使用することができる。生体物質は、血漿、血清、または精液及び膣分泌液から得られたセルフリー体液より得られてもよい。特に血漿が好ましく、特に有利である。所望される配列の単離に血漿等の生体物質を使用する場合、通常最低量の血漿が使用され、約50〜500μl、特に約200μl台といった量である。あるいは、RNA安定剤を加えた全血を生体物質とすることができる。また更なる態様では生体物質は、脳組織、リンパ節、生検から得られる他の組織より選ばれた固体組織物質である。例えば、Boom，R.ら、Journal of Clinical Microbiology，28：3，495-503（1990）に記載された方法等として知られる方法により、本発明に従って、ウイルスRNAは都合良く単離できる。血漿、血清、セルフリー体液の場合は、キアゲン企業グループによって市販されているQIAアンプウイルスRNAキットを使用することもできる。
【００９１】
逆転写は、パーキンエルマー社のGeneアンプ（GeneAmp）逆転写キット等、市販されているキットを用いて実行することができる。特定の下流プライマーを用いて、患者のpol遺伝子の所望される領域を好ましく逆転写することができる。特に好ましい態様では、HIV-1特異OUT3プライマーとRNase H活性を欠いた遺伝子操作された逆転写酵素とを使用して、患者のHIV RT遺伝子及びHIVプロテアーゼ遺伝子を逆転写し、転写される全RNAが分解されることなくcDNAに変換されるようにする。このような遺伝子操作された逆転写酵素である、Expand（Expandは商標）逆転写酵素は、ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim GmbH）から入手できる。Expand逆転写酵素はRNA依存性DNAポリメラーゼである。この酵素はモロニーマウス白血病（Moloney Murine Leukemia）ウイルス逆転写酵素（M-MuLV-RT）を遺伝子操作したものである。RNase H配列内の点突然変異は、RNase Hの活性を検出可能なレベル以下まで減少する。この遺伝子操作された逆転写酵素を使用することで、完全な長さのcDNA転写産物をより多くの量得ることが可能になる。逆転写に続いて、転写されたDNAはPCR技術を用いて増幅されるが、ネステッドPCR技術を使用して逆転写産物を増幅するのが好ましい。対象の領域がRT領域の場合には、Kellam，P.及びLarder，B.A.，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，38：1，23-30（1994）に記載されているように、内部プライマー及び外部プライマーを用いて、ネステッドPCR技術が使用される。
【００９２】
HIVタンパク質の発現
PCR生成DNA鋳型は、共役網状赤血球溶解物系、すなわちPCR DNA用TNT T7クイック（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、HIV逆転写酵素及びHIVプロテアーゼへと発現させた。タンパク質の完全性の確認と同様に、タンパク質のサイズはウエスタンブロット法で確認した。
【００９３】
HIVタンパク質のための機能アッセイ法
下記に示す化合物のうち一つまたは複数の化合物とともに、このタンパク質を阻害アッセイ法に使用した。AZT、ddI（ジダノシン／Videx（Videxは商標）、ddC（ザルシタビン）、3TC（ラミブジン）、d4T（スタブジン）等のRT阻害剤、デラビルジン（U9051125（BMAP）／Rescriptor（Rescriptorは商標））、ロビリド（αAPA）、ネビラピン（B1-RG-587／Viramune（Viramuneは商標）及びチビラピン（8-Cl-TIBO（R86183））等の非ヌクレオシドRT阻害剤、ならびにサキナビル、インジナビル、及びリトナビル等のプロテアーゼ阻害剤である。これらの阻害剤は、前述したようにヌクレオシド取込アッセイ法、またはプロテアーゼ活性アッセイ法中のタンパク質試料に加えられ、1.0pMから10,000μMの濃度範囲にわたって生体活性分子に接触し、それによって野生型タンパク質及び患者由来タンパク質に関して記述したようにIC50値を生成する。
【００９４】
ホモジニアス時間分解蛍光（HTRF）アッセイ法は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）プロテアーゼのために開発された。このアッセイ法は、切れやすい結合の両側に異なる標識を持ったペプチド基質を使用し、ストレプトアビジン交差結合XL665（SA／XL665）とユーロピウムクリプテート（Eu(K)）標識抗ホスホチロシン抗体との2つの検出化合物を近接させ、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）が発生し得るようにする。HIVプロテアーゼにより二重に標識された基質を切断することにより複合体の形成を排除し、それによりFEETが減少し、酵素活性の測定が可能になる。反応の条件は、参考文献として本明細書に組み入れられるCummings RTら、Anal Biochem Apr 10；269（1）：79-93（1999）に記載されているとおりである。一次速度定数と酵素濃度とを調べると、HIVプロテアーゼの単量体と二量体との均衡のKDが示される。このFRETアッセイ法は、抗ウイルス化合物存在下のHIVプロテアーゼ酵素の阻害を測定するためにも使用された（Cummings RT参照）。
【００９５】
表現型の解釈：薬剤感受性
患者由来タンパク質と野生型タンパク質とのIC50値に相対的な差異があることは、抗ウイルス剤の効果が異なる可能性を示している。例えば、HIVに感染していると診断された患者に本発明のアッセイ法を実施するとする。その患者は、抗ウイルス剤ddIとAZTとの併用化学療法を受けている。表現型検査によると、抗ウイルス剤ddIのIC50値は野生型タンパク質に対する検査の場合は50nMで、患者の試料に対する検査の場合は47nMである。このようにIC50値がほぼ同量であることは、検査中であるHIV感染はddIに対する耐性を生成していないことを示している。対照的にAZTのIC50値は野生型タンパク質に対する検査の場合では1.0nMで、患者の試料に対する検査の場合は4.7nMである。IC50値に約5倍の差異があることは、その感染がAZTに対する耐性を生成しつつあることを示している。しかしながら、ラミブジン化合物は治療の薬剤候補であると見なされている。ラミブジンのIC50値は野生型タンパク質に対する検査では30.0nMで、患者の試料に対する検査では15nMである。IC50値に2倍の差異があることは、ラミブジンが治療剤に適していることを示している。患者の担当医あるいは同等の当業者は薬剤の相対的なIC50値を利用し、ラミブジンとAZTとが抗ウイルス剤の最適な組み合わせであり、ddIの投与を停止すべきであると決定する。
【００９６】
実施例3．C型肝炎ウイルス（HCV）
C型感染ウイルス（HCV）感染は世界各地で発生しており、認知される以前は輸血による肝炎の代表的なものであった。世界中の血液ドナーの抗HCVの血清陽性率は、0.02％から1.23％の間である。HCVはまた、血液製剤によって引き起こされる肝炎の一般的な原因である。この10年間にアメリカ国内だけで、年間150,000人の新たな感染者がいると推定されている（本明細書に参考文献として組み入れられるAlter，Infect．Agents Dis．2，155-166（1993）；Houghton 1996，in Fields Virology，第3版、pp.1035-1058）。
【００９７】
C型肝炎ウイルスは、フラビウイルス科の一種で、脂質エンベロープを持った正鎖のRNAの非セグメントRNAである。同科の他のウイルスには、ペスチウイルス属（例えば牛ウイルス性下痢ウイルス、すなわちBVDV、及び典型的な豚コレラウイルス、すなわちCSFV等）、及びフラビウイルス属（例えば黄熱病ウイルス及びデング熱ウイルス）がある。Rice，1996 in Fields Virology，第3版、pp.931-959を参照。ウイルスの分離とウイルスゲノムの配列解読によってHCV複製の分子分析及びコードされたタンパク質の機能の理解は非常に発展したものの、分子クローンからの天然HCV及び組換えHCVの効果的な細胞培養系が無いことが障害になっている。しかしながら低レベルの複製は、HCVに感染したヒトまたはチンパンジーからのウイルス感染細胞株や、HCVのcDNAクローンから誘導されたRNAをトランスフェクトした細胞株において観察されている。
【００９８】
HCVは感染した細胞内の、小胞体と緊密に関係している細胞質で複製する。入り込んだ正向RNAが放たれ、内部開始メカニズムを通じて翻訳が開始される（本明細書に参考文献として組み入れられるWangら、J．Virol．67，3338-3344（1993）及び、Tsukiyama-Koharaら、J．Virol．66，1476-1483（1992））。内部開始は、ゲノムの5'末端のシス作用性RNAエレメントによって誘導される。ある報告では、この内部リボソームエントリーサイトすなわちIRESの全体の活性は、オープンリーディングフレーム（ORF）の5'非翻訳領域（UTR）と第一の123アミノ酸に及ぶ、最初の700個のヌクレオチドに見受けられると示唆される（本明細書に参考文献として組み入れられるLu及びWimmer，PNAS93，1412，（1996））。HCVタンパク質産物のすべては、大きなポリタンパク質（分離株に依存し、3010〜3030個のアミノ酸）のタンパク質分解によって生成されるが、宿主シグナルペプチダーゼ、ウイルス自己切断メタロプロテイナーゼ、NS2、ウイルスセリンプロテアーゼNS3/4Aの3種のうち何れかのプロテアーゼによって実行される。これらの酵素の総合作用は、ウイルスゲノムRNAの複製及びパッケージングに必要とされる構造的タンパク質（C、E1、及びE2）と非構造的タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B）を生成する。NS5Bは、インプットされたゲノムRNAが負鎖の複製物（相補RNA、すなわちcRNA）へと変換される原因となるウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ（RDRP）であり、cRNAは、より正向のゲノム／メッセンジャーRNAをNS5Bにより転写するための鋳型として機能する。
【００９９】
幾つかの研究機関や研究所では、抗ウイルス剤の発見及び開発を試みている。現在のところHCVに対する効果的な唯一の療法は、αインターフェロンであり、ごく限られた感染者において肝臓及び血液中のウイルスの量（ウイルス負荷）を制御できる（参考文献として組み入れられるHoughton 1996，in Fields Virology，第3版、pp.1035-1058、Chung RTら、Proc Natl Acad Sci USA Aug 14；98（17）：9847-52（2001）を参照）。しかしながら、HCVセリンプロテアーゼNS3/4A（本明細書に参考文献として組み入れられるLoveら、Cell 87，331-342（1996）；Kimら、Cell87，343-355（1996））の分子構造が利用でき、HIV-1感染に対する治療におけるプロテアーゼ阻害剤の使用も成功しているので、間もなく他の選択肢が可能となるはずである。HCVプロテアーゼ阻害剤に加えて、HCV複製を特異的に妨げる可能性のある他の阻害剤は、例えばIRES、NS5BによってコードされるRDDP活性、またはNS3によってコードされるRNAヘリカーゼ活性、によって誘導される内部開始等のウイルス特異活性をターゲットにできる。
【０１００】
RDRPのエラー率が高い結果、RNAウイルスは特に、多くの新しい成長条件に対応することができる。この種のほとんどのポリメラーゼは、10,000個の複製されたヌクレオチドに対して一つの割合のエラー率であると推定されている。ゲノムの大きさが約9.5kbの場合ゲノムが複製されるごとに、HCVゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド部位に突然変異が生じる可能性がある。それ故、抗ウイルス剤に対して慢性的に晒される間に、薬剤耐性が強くなる可能性がある。薬剤が選択でき薬剤耐性遺伝子型のパターンが重複しなければ、HIVの場合のように、薬剤耐性HCVのための迅速かつ便利なアッセイ法によって抗ウイルス治療の成功の可能性が大きく向上するだろう。耐性関連突然変異体は、その薬剤が存在する細胞培地でウイルスを成長することによって迅速に識別でき、このアプローチはHIV-1で利用され大いに成功した。しかしながら今のところHCVの手頃な細胞培地は無い。したがってインビトロで、薬剤耐性の表現型を与えるゲノム変化の正確な性質を決定することは不可能である。それ故、既知の耐性関連突然変異に関するデーターベースが無いため、所望される耐性のアッセイ法は遺伝子型というよりもむしろ、表現型の読み取りに依存するものである。本発明では、患者の試料から得られるC型肝炎ウイルスによって発現される生体活性分子に対する、化合物の効果を評価するためのアッセイ法及びその手法を提供する。
【０１０１】
抗HCV療法でよく使われるターゲットは、宿主シグナルペプチターゼ、ウイルス自己切断メタロプロテイナーゼ、NS2、またはウイルスセリンプロテアーゼNS3/4Aを含む。これらの酵素の総合作用は、ウイルスゲノムRNAの複製及びパッケージングに必要とされる構造的タンパク質（C、E1、及びE2）と非構造的タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B）を生成する。NS5Bは、インプットされたゲノムRNA負鎖が複製物（相補RNA、すなわちcRNA）へと変換される原因となるウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ（RDRP）である。本発明の方法って、HCV生体活性分子NS5Bは、インビトロで増幅され、インビトロで発現する。増幅された核酸配列によってコードされたNS5Bタンパク質は、機能するRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）であり、ポリメラーゼ活性を阻害するとして知られる化合物の存在下または非存在下で、またはそのような性質を発見しようとしている化合物の存在下または非存在下でポリメラーゼ活性のためにアッセイ法を行うことができる。耐性表現型は、阻害化合物の存在下または非存在下で患者由来の組換えNS5Bタンパク質のRNA依存性RNAポリメラーゼ活性の変化を測定することで検出される。
【０１０２】
HCV NS5B遺伝子の増幅
患者の血液の試料から患者由来のC型肝炎ウィルスを得た。野生型HCVの配列（分離株：JPUT971017、参照ゲノムC型肝炎ウィルス、1773bp）は、米国国立保健研究所の国立医学図書館にある全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）よりENTREZ文献検索システムを介して得た（Genbankアクセッション番号：9757541）（参考文献として本明細書に組み入れられるMurakami，K.ら、Arch．Virol．146（4），729-741（2001）及びKato Nら、Proc．Natl．Acad．Sci USA，87：9524（1990）も参照のこと）。塩基7668から塩基9440でコードしたNS5B RNA依存性RNAポリメラーゼ遺伝子を増幅するように設計されたプライマーセットを作った。NS5B遺伝子用のこのようなプライマーセットとPCR増幅条件の例は、参考文献として本明細書に組み入れられるDing Jら、Chin Med J（Engl）Feb；111（2）：128-31（1998）及びHolland PVら、J Clin Microbiol.，Oct；34（10）：2372-8（1996）に挙げられている。
【０１０３】
HCVタンパク質の発現
PCRによって発生したDNA鋳型を、結合網状赤血球溶解物系であるPCR DNA用TNT T7クイック（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）を使い、インビトロで直接HCV NS5Bに転写し翻訳した。全長のHCV NS5Bタンパク質に対応する65kDaのタンパク質を、この真核発現系より産生した。HCV NS5Bの大きさと完全性はウエスタンブロット法により確認された。
【０１０４】
HCVタンパク質の機能アッセイ法
幾つかの抗ウィルス剤のNS5Bポリメラーゼを阻害する能力を調べるために、酵素が変更されたヌクレオチドを新しく合成したRNAに組み込む能力を測定するように設計されたRNAポリメラーゼアッセイ法が使われている。合成されたRNAの検出はウィルスRNA依存性RNAポリメラーゼ（RDRP）の活性用のパラメータを提供し、参考文献として組み入れられるZhong W.ら、J Virol Feb；74（4）：2017-22（2000）；Lohmann Vら、J Viral Hepat May；7（3）：167-74（2000）；Ferrari Eら、J Virol Feb；73（2）：1649-54（1999）；Ishii Kら、Hepatology Apr；29（4）：1227-35（1999）；Behrens SEら、EMBO J Jan 2；15（1）：12-22（1996）；Zhong WJら、Virol Oct；74（19）：9134-43（2000）；及びOh JWら、J Biol  Chem Jun 9；275（23）：17710-7（2000）の方法を追随している。
【０１０５】
NS5Bタンパク質は、下記に示すの化合物のうち一つまたは複数の化合物とともに阻害アッセイ法に使用した。AZT、ddI（ジダノシン／Videx(登録商標)）、ddC（ザルシタビン）、3TC（ラミブジン）、d4T（スタブジン）、リバビリン三リン酸等のウィルス阻害剤や、デラビルジン（U9051125（BMAP）／Rescriptor(登録商標)）、ロビリド（αAPA）、ネビラピン（B1-RG-587／Viramune(登録商標)）、チビラピン（8-Cl-TIBO（R86183）、及びグリオトキシン等の非ヌクレオシドRT阻害剤である。これらの阻害剤を1.0pMから10,000μMの濃度範囲でNS5Bタンパク質試料に加えることにより、この化合物、ならびに野生型NSR5Bタンパク質及び患者由来NS5Bタンパク質双方の記述にある通りのIC50値を得る（前出のZhong W.、Ishii K.、Lohmann V.を参照のこと）。
【０１０６】
表現型の解釈：薬剤感受性
ヌクレオシド化合物と非ヌクレオシド化合物のRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）活性への効果の一連の分析によって、例えばリバビリン三リン酸は野生型NS5Bタンパク質にも患者由来NS5Bタンパク質にも阻害効果がないが、ポリオウィルスにおけるポリオウィルス3D RdRp阻害剤として知られるグリオトキシンは、野生型タンパク質と患者由来タンパク質双方のHCV NS5B RdRpを投与量に依存する形で阻害するということを我々は発見した。薬剤感受性の変化は患者試料のIC50と野生型標準のIC50とを比較することによって計算できる。野生型標準のIC50値と突然変異タンパク質のIC50値との間の相対的な親和性が僅か1〜5％程変化であっても、このアッセイ法では検出可能である。親和性の変化は、将来の化学療法の投薬計画を決定するために使われる薬剤耐性表現型を示す。
【０１０７】
実施例4．ヒトサイトメガロウィルス（HCMV）
ヒトサイトメガロウィルス（HCMV）は世界中の風土病であり、感染率は季節的に変動せず一年を通じて比較的一定であると見られている。ヒトがHCMVの唯一知られる貯蔵庫であり、自然感染は直接または間接の人間同士の接触によっておこる。合衆国で生まれる乳児の0.2％から2.2％が胎内で感染する。更に8％から60％は、出産中もしくはその後母乳で授乳中の感染の結果として生後6ヶ月のうちに感染する。乳房におけるHCMV感染の再活性化の高発生率から、母乳感染が世界中のHCMV感染経路の中で最も一般的な形態であるといえる。殆どの先進国において、40％から80％の子供が思春期前に感染している。世界のその他の地域では、人口の90％から100％が幼児期に感染している。
【０１０８】
ヒトサイトメガロウィルス（HCMV）は、ヘルペスウィルス科の一員である。典型的なヘルペスビリオンは、162のカプソメアを含む長軸に沿った穴のある直径約100〜110nMの三角形二十面体キャプシドと線状二本鎖DNAとを含む核と、核を取り囲む無定形の「エンベロープ」と、表面にウィルス性糖タンパク質スパイクを含むエンベロープから成る。外被層の厚さの相違のため、ビリオンの大きさは120nmから300nmにわたる。
【０１０９】
ヘルペスウィルスには3つのサブグループがある。
1．αヘルペスウィルス：HSV、VZV。多様宿主範囲、相対的に短い生殖周期、培地での迅速な増殖、感染した細胞の効率的な破壊、感覚神経における潜伏感染を確立する能力。
2．βヘルペスウィルス：HCMV。限られた宿主範囲、長い生殖周期、培地における感染の進行は遅い。感染した細胞は拡大し、保菌細胞がただちに確立される。ウィルスは分泌線、リンパ細網細胞、腎臓その他の組織において潜伏した状態を維持する。
3．γヘルペスウィルス：EBV。極めて狭い範囲の実験的宿主範囲。リンパ芽球状細胞で複製し、いくつかのタイプの上皮細胞や繊維芽細胞での溶菌感染の原因となる。
【０１１０】
ヒトヘルペスウィルスは、以下の8つが知られている。ヒトヘルペスウィルス1（単純ヘルペスウィルス1、HSV-1）、ヒトヘルペスウィルス2（単純ヘルペスウィルス2、HSV-2）、ヒトヘルペスウィルス3（水疱痘ウィルス、VZV）、ヒトヘルペスウィルス4（エプスタイン-バーウィルス、EBV）、ヒトヘルペスウィルス5（ヒトサイトメガロウィルス）、ヒトヘルペスウィルス6、ヒトヘルペスウィルス7、及びヒトヘルペスウィルス8である。ヘルペスウィルスのゲノムは、感染細胞の核内でウィルスキャプシドから放出される時に環状またはコンカテマーと成るビリオン内の線状二本鎖（ds）DNAから成る。ヘルペスウィルスのゲノムの大きさは120から230キロ塩基対（kbp）の範囲にわたる。このゲノムの大きさは、個別のウィルスの集団内で様々である（10kdbまでの差異）。この差異は末端反復配列及び内部反復配列の存在によるものである。ヘルペスウィルスは、その全体的ゲノム編成に基づいてAからFの6つのグループに分類することができる。HSVとHCMVはグループEの部類に入り、このグループでは配列が双方の末端から逆方向に反復されて内部に並列化されており、そのゲノムは、それぞれが独自の配列から成るUL及びUSから成る、逆位反復が側面に位置するL（ロング）及びS（ショート）の2つの構成要素に分けている。これらのウィルスにおいては、双方の構成要素は互いに相対的に逆転することができ、ビリオンから抽出されたDNAは、その2つの構成要素の相対方向が異なる4つの等モル集団から成る。
【０１１１】
HCMVはβヘルペスウィルスであり、クラスEゲノムタイプの部類に入るという点で他のβヘルペスウィルス類とは異なっている。HCMVのゲノムは長さ約230kbpで、配列は完全に解読されている（EMBL Seqデータベースアクセッション番号：X17403）。自然発生するウィルスの集団において、ゲノムは4つの異性体として存在する。HCMVにおいてはHSVにおいてと同様に、L-Sジャンクションは削除することができ、それによって培養細胞におけるウィルスの成長能力に多大な影響を与えずにその4つの異性体のうちの一つにゲノムを凍結する。
【０１１２】
HCMVゲノムは、線状ゲノムの両端に定方向に不特定数存在する末端反復配列「a」と「a'」を含有する。不特定回数の「a」の反復は、L-Sジャンクションにも逆方向に存在する。これらの位置における配列「a」の数は1から10の範囲であるが、1であることが主である。HCMVにおける「a」の大きさは、700bpから900bpの範囲である。配列「a」は、切断シグナルとパッケージングシグナルを保有する。パッケージングシグナルは、pac-1及びpac-2と呼ばれ「a」内に位置する、高度に保存された2つの短配列要素である。pac-1エレメントとpac-2エレメントの双方を保有する220bpの断片は、組換えCMV構築の逆位用部位のみならず切断／パッケージ用の部位も保有するのに十分である。線状ゲノムの末端は、ゲノムの何れかの端に3'の遊離ヌクレオチド1つを残す切断事象によって生成される。このゲノムのL構成要素及びS構成要素を作る独自の配列UL及び配列USの側面に位置する「b」と「b'」（またはTRL及びIRL）及び「c」と「c'」（またはIRSとTRS）と呼ばれる大きな逆位反復によって、このゲノムはさらに特徴付けられる。
【０１１３】
HCMV複製周期は他のヘルペスウィルスと比較して相対的に遅い。ウィルスが複製するには、ウィルス遺伝子の複数のセットが連続して順序立った発現をする。これらのセットは感染後の異なった時期に発現し、感染後の転写産物が蓄積する時間に基づいたα（前初期）のセット、β1とβ2（遅延初期）のセット、及びγ1とγ2（後期）のセットを含む。DNA複製とゲノム成熟とビリオン形態形成は、各段階に必要な適切な遺伝子産物の時間的制御を通じて調整されている。遺伝子産物の発現は迅速である。後期遺伝子発現は24時間から35時間遅れる。子孫ビリオンは感染後48時間で蓄積され始め、72時間から96時間で最大レベルに達する。許容繊維芽細胞において、DNA複製は感染後14時間から16時間程の早期に検出することができる。HCMVは宿主DNA合成、RNA合成、及びタンパク質合成を刺激する。HCMVは活発に分裂する細胞においてより早く複製し、HCMV複製は宿主細胞代謝を低下させる薬剤で細胞を前処理することよって阻害される。HCMVゲノムは感染後間もなく環状になる。環はコンカテマーを生じ、ゲノムの逆位はDNAのコンカテマー形状内で起こる。サザンブロット分析に基づくと大部分の複製DNAは単位長さより大きく、末端断片を欠如している。
【０１１４】
薬剤耐性のターゲット
現在HCMVの治療のために使用されている薬剤（ガンシクロビル（GCV）、フォスカルネット、シドフォビル）は、UL97ホスホトランスフェラーゼとUL54ウィルスDNAポリメラーゼの2つのウィルス遺伝子における突然変異を選択することが知られている。長期のGCV保全治療を受けたHCMV関連の神経系の病気の患者の中枢神経系（CNS）からGCV耐性HCMVが回収されている。HCMVの耐性菌株を選択してもよく、優先的にCNSに生息する。ウィルスを脳脊髄液（CSF）から培養するのは不可能である場合が多いが、PCRを使ってHCMV DNAを増幅することは可能である。
【０１１５】
CMVの第一分離株はゆっくり複製する場合がある。また、成長率が顕著に遅い薬剤耐性を持つ臨床的分離株もある。混合ウィルス集団においては、耐性ウィルス集団は感受性の強い集団に隠されることもある。従ってウィルスの成長に依存するアッセイ結果は、信憑性に欠けることもある。血液や尿は得ることが容易なため、殆どのウィルス培養のアッセイ法には、血液か尿を使用する。しかし、これらの区分からのウィルスは、病気が発生している特定の組織（特に硝子体液及びcsf）に居るウィルスを代表しないこともある。患者由来ヘルペスウィルスの薬剤耐性をもつ変種のうち、比較的頻繁に変更されるアミノ酸残基も幾つかあるが、大部分の変種の突然変異が広範な分布であるために、迅速な遺伝子スクリーニング法が非実用的なものと成る。重要なことには、個別の遺伝子的変化に起因する薬剤感受性表現型が複雑で多様なことから、HCMVの抗ウィルス感受性のための生物学的検査は更に有益になるであろう。
【０１１６】
UL97：GCV耐性に関連した突然変異には、アミノ酸460、520、590、591、592、593、594、595、596、600、603、607、659、及び665番目が含まれる。ホスホトランスフェラーゼタンパク質には2つの機能ドメイン、1）調節ドメインをコードするアミノ末端の300個のアミノ酸と、2）触媒ドメインを定義するカルボキシ末端の400個のアミノ酸とがある。知られている薬剤耐性突然変異の全ては触媒ドメインに見られる（約1.2kbの配列）。HSVにおいて、チミジンキナーゼ遺伝子産物（TK）は細胞内でのGCVのリン酸化の原因であり、HSVにおけるGCVに対する耐性はチミジンキナーゼ遺伝子の突然変異に関連している。HCMVには、HSVチミジンキナーゼ遺伝子に対するホモログはない。HSVにおいてUL97に相同的な遺伝子（UL13）はタンパク質キナーゼである。
【０１１７】
UL54：この遺伝子における突然変異は、フォスカルネット対する耐性だけでなくGCVやその他のヌクレオシド類似体（シドフォビルを含む）に対する耐性という結果になり得る。フォスカルネット耐性に関連した突然変異にはアミノ酸700番目と715番目とが含まれる。GCV耐性に関連した突然変異にはアミノ酸301、412、501、503及び987番目が含まれる。成熟タンパク質には4つの認知されたドメインがある。1）5'-3'exoRNAseH、3'-5'エクソヌクレアーゼ、提案している触媒ドメイン、及びアクセサリータンパク質結合ドメインである。開発中の新しい治療法には、CMVプロテアーゼ（UL80）とDNA成熟酵素（「ターミナーゼ」）をターゲットにした薬剤が含まれる。参考文献として本明細書に組み入れられるMousavi-Jazi Mら、J Clin Virol Dec；23（1-2）：1-15（2001）とJabs，D.A.ら、J Infect Dis，Jan 15；183（2）：333-337（2001）を参照のこと。
【０１１８】
対象であるCMV遺伝子の増幅
HSV-6参照ゲノムヒトヘルペスウィルス6の配列を、米国国立保健研究所の国立医学図書館にある全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）からENTREZ文献検索システム（を介して得たGenbankアクセッション番号：NP/042935）（参考文献として本明細書に組み入れられるKato Nら、Proc．Natl．Acad．Sci USA，87：9524（1990）及びTeo，I.A.ら、Journal of Virology．65（9），4670-4680（1991）も参照のこと）。UL97遺伝子及びUL54遺伝子を増幅するように設計されたプライマーセットが開発された。
【０１１９】
CMVタンパク質の発現
PCRで生成したDNA鋳型を、共役網状赤血球溶解物系であるPCR DNA用TNT T7クイック（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）を使いセルフリー発現系で直接的に転写し翻訳した。タンパク質の大きさ及び完全性はウエスタンブロット法により確認された。
【０１２０】
CMVタンパク質の機能アッセイ法
移動を触媒するUL97酵素のリン酸の能力を測定するために設計されたホスファターゼアッセイ法が開発された。核酸を重合するUL54の能力を測定するために設計されたポリメラーゼアッセイ法も開発された。これらのアッセイ法を本明細書に記述する。タンパク質は、以下の化合物のうち一つ以上と共に阻害アッセイ法に使われている。AZT、ddI（ジダノシン／Videx）（Videxは商標）、ddC（ザルシタビン）、3TC（ラミブジン）、及びd4T（スタブジン）等のウィルス阻害剤、デラビルジン（U9051125（BMAP）／Rescriptor）（Rescriptorは商標）、ロビリド（αAPA）、ネビラピン（B1-RG-587／Viramune）（Viramuneは商標）、及びチビラピン（8-Cl-TIBO（R86183））等の非ヌクレオシドRT阻害剤、ならびにサキナビル、インジナビル、及びリトナビル等のプロテアーゼ阻害剤である。ヌクレオシド取り込みアッセイ法またはプロテアーゼ活性アッセイ法において前述の通り、これらの阻害剤を1.0pMから10,000μMの濃度範囲でタンパク質試料に加えることにより、野生型タンパク質及び患者由来タンパク質に対して、前記にある通りIC50値を得る。
【０１２１】
表現型の解釈：薬剤感受性
薬剤感受性の変化は患者試料のIC50と野生型標準のIC50とを比較することによって計算できる。野生型標準のIC50値と突然変異タンパク質のIC50値との間の相対的な親和性が僅か1〜5％程の変化であっても、このアッセイ法では検出可能である。IC50のどのような変化も重要であるが、相対的な親和性の5〜10％の変化は治療剤の臨床的な有効性が明らかに減少したことを示し、一方、50％の変化は有効性が実質的に減少したことを示し、この化合物の使用は中止されるべきであることが示唆される。100％の変化は治療可能性の完全な損失を事実上意味する。
【０１２２】
実施例5．自己免疫疾患
ポリ(ADP-リボシル)トランスフェラーゼ（PARP）の異形対立遺伝子とは、臨床的な全身性紅斑性狼瘡（SLE）の症状がみられる患者におけるSLEの診断の対象であり、またはSLEの症状が現れない患者におけるSLEを患う遺伝性の素因を示す（米国特許第6,280,941号参照）。ポリ(ADP-リボシル)トランスフェラーゼ（E.C．2.4.2.30）はゲノム完全性を保持する機能を果たし、ADP-リボースポリマーをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）から合成する唯一の酵素として知られ、またDNA鎖切断に反応して活性化される（W.M．Shiehら、J．Biol．Chem．273：30069-72（1998）は参考文献として本明細書に組み入れられる）。ポリ(ADP-リボシル)トランスフェラーゼ酵素はDNAポリメラーゼを物理的な連関により刺激することが示されており、またインビボでDNAポリメラーゼαと共に錯体を形成することもある(Simbulan，CMら、J．Biol．Chem．268：93-99（1993）は参考文献として本明細書に組み入れられる)。ポリ(ADP-リボシル)トランスフェラーゼの活性化には、DNA結合ドメイン（「ジンクフィンガー」）のDNA結合能力と、「活性化シグナル」を酵素の触媒ドメインに転移できるDNA結合ドメインの構造を保持する能力との両方を必要とする（Turuccoら、FEBS  Lett．399：313-16（1996）は参考文献として本明細書に組み入れられる）。
【０１２３】
ポリ(ADP-リボシル)トランスフェラーゼの重要な生理学的な機能は、特定の阻害剤（3-アミノベンズアミド、3-メトキシベンズアミド、またはアンチセンスRNA）を使用してのノックアウトマウスの研究により詳しく研究されている（Jeggo，PAら、Current Biol．8：49-5（1998）は参考文献として本明細書に組み入れられる）。ポリ(ADP-リボシル)トランスフェラーゼ活性が欠如すると、結果として顕著な自然発生的遺伝子再構成が生じたりDNA損傷に対する過敏に反応することを累積データは示しており、ゲノムの安定性を保持するためにポリ(ADP-リボシル)トランスフェラーゼが本質的な役割を果たしていることを含意している。PARPノックアウトマウスのアポトーシスには重度の異常は検出されないが、これらのマウスの脾細胞はアルキル化剤に対してより迅速なアポトーシス反応を示す。PARP発現の絶たれた細胞株はアポトーシスシグナルに対して無感覚である（Simbulan-Rosenthal CMら、J．Biol．Chem．273：13703-12（1998）は参考文献として本明細書に組み入れられる）。PARPには誘発されたアポトーシスを制御する役割があるが、おそらくは生物体内部の他の代償的な経路のため、細胞株からよりも生物体全体からの方が障害のあるアポトーシスは検出されにくい。
【０１２４】
PARPの増幅及び発現は記述したように達成される。PARP活性はp53タンパク質を結合させる能力によって検出される。この結合は共免疫沈降によって検出することができる。記述のようにSPRを用いることにより、PARPに対するある化合物の親和性を得ることができる。
【０１２５】
表現型の解釈：薬剤感受性
薬剤感受性の変化は患者試料のIC50と野生型標準のIC50とを比較することによって計算することができる。野生型標準のIC50値と突然変異タンパク質のIC50値との間の相対的な親和性が僅か1〜5％程の変化であっても、このアッセイ法では検出可能である。IC50のどのような変化も重要であるが、相対的な親和性の5〜10％の変化は治療剤の臨床的な有効性が明らかに減少したことを示し、一方、50％の変化は有効性が実質的に減少したことを示し、この化合物の使用は中止されるべきであることを示唆する。100％の変化は治療可能性の完全な損失を事実上意味する。
【０１２６】
実施例6．キノロン化合物に対する細菌の耐性
フルオロキノロンは、広域スペクトラムで細菌感染症治療に効果的な抗生物質である。フルオロキノロンの主要ターゲットは、一時的な二本鎖DNA切断によってDNAトポロジーを変えるDNAジャイレース及びトポイソメラーゼIVである。DNAジャイレースは、gyrA遺伝子及びgyrB遺伝子によってそれぞれコードされるGyrAサブユニット及びGyrBサブユニットから成る。トポイソメラーゼIVは、parC遺伝子及びparE遺伝子によってそれぞれコードされるParCサブユニット及びParEサブユニットを含有する。キノロン耐性を決定付ける領域（QRDR）は主にgyrA遺伝子とparC遺伝子であるが、この領域内での突然変異はキノロン耐性と関連している。gyrB遺伝子またはparE遺伝子のQRBR内での突然変異も、程度は少ないがキノロン耐性に影響を与えると考えられている。DNAジャイレースはグラム陰性の細菌の主要なキノロンターゲットと思われるが、トポイソメラーゼIVはグラム陽性の生物の優先ターゲットであると思われる。DNAジャイレース及び／またはトポイソメラーゼIV遺伝子の突然変異は、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）やアウレウス球菌（Staphylococcus aureus）のフルオロキノロン耐性を持つ突然変異種に頻繁に見られ、例えば、レボフロキサシンで肺炎の治療をした患者から単離された肺炎球菌のフルオロキノロン耐性培養では、フルオロキノロン耐性を与えるとして知られるparC（DNAトポイソメラーゼIV）及びgyrA（DNAジャイレース）双方における突然変異が含まれていた（参考文献として本明細書に組み入れられる、Urban Cら、J Infect Dis．2001 Sep 15；184（6）：794-8；Schmitz FJら、Antimicrob Agents Chemother．2000 Nov；44（11）：3229-31；Ince Dら、Antimicrob Agents Chemother．2000 Dec；44（12）：3344-50；Pan XSら、Antimicrob Agents Chemother．2001 Nov；45（11）：3140-7；Richardson DCら、Antimicrob Agents Chemother．2001 Jun；45（6）：1911-4；Roychoudhury Sら、Antimicrob Agents Chemother．2001 Apr；45（4）：1115-20；Barnard FMら、Antimicrob Agents Chemother．2001 Jul；45（7）：1994-2000を参照のこと）。
【０１２７】
gyrA遺伝子の増幅
フルオロキノロン耐性肺炎球菌を気管支肺炎と診断された患者の肺培養から単離した。この細菌の核酸をアルカリ溶解によりの試料から抽出した。gyrA遺伝子を増幅する為に設計したPCR用のプライマー及び増幅条件は、前記のPanらとBarnardらに示されている。
【０１２８】
タンパク質の発現
PCRによって生成したDNA鋳型を、共役網状赤血球溶解物系であるPCR DNA用TNT T7クイック（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）を使い直接的にインビトロで転写し翻訳した。DNAジャイレースAタンパク質に対応する100kDaタンパク質をこの真核発現系より生産した。このタンパク質を、Brown POら、Proc Natl Acad Sci USA 1979 Dec；76（12）：6110-9の方法に従って精製した。タンパク質の大きさ及び完全性はウエスタンブロット法により確認した。
【０１２９】
タンパク質の機能アッセイ法
フルオロキノロン耐性肺炎球菌から得られた精製された突然変異DNAジャイレースAタンパク質の機能活性を、前記のPanらとBarnardらに記述された超らせん形成阻害アッセイ法及びDNA分裂アッセイ法で野生型DNAジャイレースAタンパク質と比較した。抗生物質を濃度範囲にわたって野生型タンパク質と突然変異タンパク質双方のタンパク質に接触するように加えた。また、各抗生物質と突然変異タンパク質、突然変異タンパク質双方の親和性は、前記のRoychoudhuryらに記述される方法に従って得た。各アッセイ法で試験した抗生物質は以下の通りである。シプロフロキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、ジェミフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、リファンピン、ムピロシン、プレマフロキサシン及び幾つかの8-メトキシ-非フッ化キノロン（NFQ）。
【０１３０】
表現型の解釈：薬剤感受性
酵素阻害アッセイ法またはDNA切断アッセイ法において、突然変異酵素は野生型に比べ活性の阻害に必要なMIC（最少阻止濃度）が、スパルフロキサシンで約4倍、シプロフロキサシンで約50倍、プレマフロキサシンで32倍増加した。シプロフロキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、及びトロバフロキサシンに対するMICは、標準投薬計画について報告されている最高血清薬剤濃度を上回った。一方、NFQ、クリナフロキサシン、ジェミフロキサシン、及びモキシフロキサシンのMICは最高血清濃度を下回った。このことは、臨床的にはシプロフロキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、及びトロバフロキサシンの使用の中断と、NFQ、クリナフロキサシン、ジェミフロキサシン、及びモキシフロキサシンを使った治療の継続と、スパルフロキサシン及びプレマフロキサシンの活性における更なる変化の監視とを示唆する。
【０１３１】
結合アッセイ法において、NFQ及びクリナフロキサシンは、シプロフロキサシン、トロバフロキサシン、ガチフロキサシン、ジェミフロキサシン、及びモキシフロキサシンよりも高い親和性を野生型と突然変異双方のDNAジャイレースAターゲットに対して示した。更に、制御タンパク質及びトポイソメラーゼIVの計算された親和性パラメータと、DNAジャイレースの計算された親和性パラメータの割合は、シプロフロキサシン及びトロバフロキサシンの場合よりもNFQ、クリナフロキサシン、及びガチフロキサシンの場合の方が低かった。総合的に考慮すると双方の実験の結果は、NFQ及びクリナフロキサシンキノロンは複数の薬剤ターゲットをより良く活用でき、ターゲットタンパク質中の耐性は未だ出来ておらず、また抗細菌性の阻害は薬理学的に容認可能な投薬範囲内で達成できる、ということを当業者に示唆する。従って医師や臨床医は、フルオロキノロン耐性肺炎連鎖球菌に対し、疾病状態の改善する可能性が最も高い化学療法の手法を選択できる。
【０１３２】
実施例7．抗真菌耐性
殆どの抗真菌性の薬剤は、細胞膜ステロールの生合成の干渉もしくはステロール機能の阻止によって真菌細胞の細胞膜の完全性を乱すことを目的とした作用のメカニズムを有する。しかし、抗真菌治療の成功を妨げている一つの重要な障害は、薬剤耐性の激増、特にアゾール抗カビ剤に対しての薬剤耐性の激増である。真菌類が薬剤耐性を生じるメカニズムの重要なものとして、細胞からの細胞障害性薬剤の排出を容易にし、ひいては薬剤蓄積の減少と濃度の低下につながる押し出しポンプの過剰発現がある。真菌類によるアゾール耐性は多種の薬剤を排出する輸送体の遺伝子の過剰発現に起因しうるとの初期の観察以来、主にサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）とカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）とアスペルギルス（Aspergillus）とクリプトコッカス（Cryptococcus）に関して目覚しい発展が遂げられている。多数の内的輸送体が、個々のカンジダ・アルビカンスのプラズマ細胞膜の薬剤排出ポンプの輸送機能の分析を妨げている。Cdr1pタンパク質は、多剤耐性表現型に関係していると推測される主なポンプであり、ATP結合カセット（ABC）群の7つの主な輸送体が削除されたサッカロマイセス・セレヴィシエの突然変異体（AD1-8u（-））にあるゲノムのPDR5座から増幅できる。サッカロマイセス・セレヴィシエAD1-8u（-）は薬剤感受性表現型を示し、またアゾール抗真菌剤に過敏である（典型的な投薬量で80％の細胞が阻止されるMIC［MIC（80）s］は、フルコナゾールに対して0.625g/ml、ケトコナゾールに対して＜0.016g/ml、及びイトラコナゾールに対して＜0.016g/ml）。一方で、例えば、カンジダ・アルビカンスを過剰発現する菌株（AD1002）はフルコナゾール、ケトコナゾール、及びイトラコナゾール（それぞれ30、0.5、4g/ml）のアゾール［（MIC（80）s］に耐性があった。参考文献として本明細書に組み入れられるNakamura K，Antimicrob Agants Chemother. 2001 Dec；45（12）：3366-3374を参照のこと。その他のこのようなフルコナゾール（FCZ）へのカンジダ・アルビカンスの耐性メカニズムと関連した生物活性分子のターゲットには、14-α-ジメチラーゼ遺伝子（ERG16遺伝子）、ラノステロール14α-ジメチラーゼ遺伝子（ERG11）、排出輸送体をコードする遺伝子（MDR1及びCDR）、及び日和見的なヒト病原体であるアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）に確認される14-αステロールデメチラーゼに類似した酵素をコードするcyp51に関連した遺伝子（cyp51とcyp51B）が含まれる。増幅条件及びプライマーセットは参考文献として本明細書に組み入れられるWang Wら、Chin Med J（Engl），1999 May；112（5）：466-71、Perea Sら、Antimicrob Agents Chemother．2001 Oct；45（10）：2676-84及びMellado Eら、J  Clin Miclobiol. 2001 Jul；39（7）：2431-8に開示されており、またSt．Georgiev V.，Curr Drug Targets．2000 Nov；1（3）：261-84も併せて参照のこと。
【０１３３】
gyrA遺伝子の増幅
高いレベルのフルコナゾール耐性（64マイクログラム／ml以上のMIC）を表すカンジダ・アルビカンス菌株を口腔咽頭カンジダ症のあるヒト免疫不全ウィルス（HIV）感染患者から単離した。アゾール耐性に関係すると見られているラノステロール14α-ジメチラーゼ（ERG11）及び排出輸送体（MDR1及びCDR）をコードする遺伝子の発現レベルを、感受性のある分離株及び耐性のある分離株の一致するセット中で観察した。また、参考文献として本明細書に組み入れられるPerea Sら、Antimicrob Agents Chemother．2001 Oct；45（10）：2676-84に記述されたように、PCRによってERG11遺伝子を増幅した。
【０１３４】
タンパク質の発現
PCRによって発生したDNA鋳型を、共役網状赤血球溶解物系であるPCR DNA用TNT T7クイック（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）を使いセルフリー発現系で直接的に転写し翻訳した。ラノステロール14α-ジメチラーゼタンパク質に対応する60kDaタンパク質をこの真核発現系より生産した。タンパク質は、参考文献として本明細書に組み入れられるKalb VFら、DNA，Dec 6（6）：529-37（1987）の方法に従って精製した。精製されたタンパク質の大きさ及び完全性はウエスタンブロット法により確認された。
【０１３５】
タンパク質の機能アッセイ法
参考文献として本明細書に組み入れられるMarichal，P.ら、Microbiology（1999），145，2701-2713に記述されているように、ミクロソームをカンジダ・アルビカンスから単離した。還元されたミクロソームチトクロームP450の生成においてCO複合体を防止することにより、アゾールのタンパク質親和性の試験に用いることが可能なアッセイ法が提供される。P450の内容及びCOのP450の還元された赤血球鉄分との相互作用におけるアゾールの効果は、参考文献として本明細書に組み入れられるVanden Bossche，H.ら、Drug Dev Res，8：287-298（1986）に記述されたように計測した。このアッセイ法には、0.1nモルのチトクロームP450と100pMから100μMの範囲の抗真菌化合物であるイトラコナゾールとフルコナゾールを使用した。
【０１３６】
表現型の解釈：薬剤感受性
野生型ラノステロール14α-ジメチラーゼタンパク質に対するイトラコナゾールのIC50値は、一般的には10から50nMの間であると報告されている。突然変異タンパク質に対するIC50値の範囲は30〜75nMの間であるが、薬剤は100nMにおいては突然変異ラノステロール14α-ジメチラーゼタンパク質をほぼ完全に阻害した。突然変異菌株は、イトラコナゾールに対して過敏であると見なすことができる。フルコナゾールに関しては、更に顕著な違いが観察されている。IC50値は100倍を超える範囲にわたり、野生型タンパク質における40nMから突然変異タンパク質における4880nMの間であった。この結果は、突然変異ラノステロール14α-ジメチラーゼタンパク質においてはイトラコナゾールに対する著しい耐性は未だ発達していないということと、抗真菌性の阻害は薬理学的に容認可能な投薬範囲内で達成できるということを当業者に示唆する。従って医師または臨床医は、高いレベルのフルコナゾール耐性を示すカンジダ・アルビカンス菌株に対し、口腔咽頭カンジダ症の状態を改善する可能性が最も高い化学療法の手法を選択することができる。
【０１３７】
実施例8．VLA-4受容体のα4サブユニット
炎症とは感染または疾病に対する血管を持つ組織の反応であり、血管の内皮細胞への白血球の付着と周辺組織へ入り込むことによるものである。通常の炎症においては、侵入する生物、食菌残屑、及び死細胞を殺す為に入り込んだ白血球が有毒な仲介物を放出し、組織の修復及び免疫反応における役割を果たす。しかし、病理的な炎症においては入り込んだ白血球は過剰な反応を示すことから、深刻または致命的な損傷を起こすこともある。例えば、参考文献として組み入れられるHickey，Psychoneuroimmunology II（Academic Press 1990）を参照のこと。
【０１３８】
白血球の内皮細胞への付着は細胞表面リガンドと内皮細胞と白血球の受容体との特定の相互作用を通じて起こる（参考文献として組み入れられるSpringer、Nature 346：425-433（1990）を参照のこと）。リガンド及び受容体が何であるかは、異なった細胞亜類型、解剖学的配置、及び炎症性の刺激により様々である。VLA-4白血球細胞表面受容体は、（参考文献として組み入れられる）Hemler、欧州特許第330,506号（1989）によって始めて特定された。VLA-4は細胞表面受容体のβ1インテグリン群のひとつであり、それぞれがα鎖及びβ鎖から成る。VLA-4はα4鎖及びβ1鎖を含む。VLA-4はVCAM-1と呼ばれる内皮細胞リガンドと特異的に結合する（参考文献として組み入れられるElicesら、Cell 60：577-584（1990）を参照のこと）。VCAM-1は活性化したヒト臍静脈細胞から当初検出されたが、このリガンドは脳内皮細胞からも検出されている。共同所有の同時係属中米国特許出願第07/871,223号（参考文献として組み入れられる）を参照のこと。
【０１３９】
VLA-4のような付着分子は、ペプチド化合物及び非ペプチド化合物、バイアリールアルカン酸、4-アミノ-フェニルアラニン化合物、チオアミド誘導体、環状アミノ酸誘導体、及び複素環式化合物といった抗自己免疫化合物としての可能性のあるターゲットである。その全文が参考文献として本明細書に組み入れられる米国特許第6,306,887号、米国特許第6,291,511号、米国特許第6,291,453号、米国特許第6,288,267号、米国特許第5,998,447号、及び米国特許第6,001,809号を参照のこと。VLA-4受容体は脳内皮細胞にあるリガンドと相互作用し、そのため特に重要なターゲットとなっている。脳の炎症に起因する病気及び症状は特に深刻な結果を有する。例えば、そのような病気の一例である多発性硬化症（MS）は、深刻な障害や死につながる慢性的な経過を有する（悪化及び沈静化の有無にかかわらず）。米国だけでも推定250,000人から350,000人がこの病気の影響を受けている。
【０１４０】
VLA-4受容体に対する抗体は動物モデルを使ったインビトロ及びインビボの双方で、その抗炎症薬としての可能性を試験されている（参考文献として本明細書に組み入れられる米国特許出願第07/871,223号、及びYadnockら、Nature 356：63-66（1992）を参照のこと）。インビトロ実験では抗VLA-4抗体は白血球の脳内皮細胞への付着を防ぐということが示された。動物実験では、多発性硬化症を模して人工的に誘発された症状（実験的自己免疫脳脊髄炎）を有する動物への抗VLA-4抗体の影響の試験がなされている。この実験は、抗VLA-4抗体の投与が動物における脳の炎症と結果として起こる麻痺状態を防ぐということを示している。総合的にこれらの実験によって、抗VLA-4抗体は多発性硬化症やその他の炎症性の病気や疾患の治療において有益な可能性のある治療化合物として認識される（参考文献として本明細書に組み入れられる米国特許第5,840,299号を参照のこと）。
【０１４１】
本発明はMAb21.6結合表現型用アッセイ法に用いるVLA-4受容体のα4サブユニット発現のためのアッセイ法を提供する。結合表現型は、VLA-4受容体のα4依存相互作用を遮るためのヒト化MAb21.6の能力容量を利用する治療法の可能性を決定付ける。VLA-4受容体と内皮細胞のVCAM-1リガンドとのα4依存相互作用は多数の炎症性反応、特に中枢神経系の炎症性反応の初期の段階でおこる。急性の臨床的悪化のある中枢神経系の炎症の結果としておこる好ましくない病気や症状には、多発性硬化症（Yednockら、Nature 356, 63（1992）；Baronら、J．Exp．Med．177，57（1993））、髄膜炎、脳炎、脳梗塞、その他の脳の傷、炎症性腸疾患（Hamannら、J．Immunol．152，3238（1994））、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ（van Dinther-Janssenら、J．Immunol．147，4207（1991）；van Dinther-Janssenら、Annals Rheumatic Diseases 52，672（1993）；Elicesら、J．Clin．Invest．93，405（1994）；Postigoら、J．Clin．Invest．89，1445（1992），喘息（Mulliganら、J．Immunol．150，2407（1993）及び急性若年発症糖尿病（タイプ1）（Yangら、PNAS 90，10494（1993），Burklyら、Diabetes 43，529（1994）；Baronら、J．Clin．Invest．93，1700（1994）を含む。これらの文献の全文は参考文献として本明細書に組み入れられる。
【０１４２】
VLA-4遺伝子断片の増幅
VLA-4受容体の配列はGenbankの配列アクセッション番号：NM/000885及びXM/002572に示されている。α4サブユニットをコードするヌクレオチド配列は本明細書に記述された方法で増幅または供給される。
【０１４３】
タンパク質の発現
本明細書に記述された方法によって、VLA-4受容体のα4サブユニットが発現する。このタンパク質の完全性は、腹水症からのモノクローナル抗体MAb21.6を希釈率1：50で使用しウエスタンブロット法により確認された。抗体は天然（機能性）タンパク質サブユニットを認識するので、結合表現型を探知するもう一つの方法を提供する。
【０１４４】
タンパク質の機能アッセイ法
VLA-4受容体へのヒト化モノクローナル抗体は米国特許第5,840,299号に記述されている。VLA-4受容体のα4サブユニットへのmAbの親和性を計測するために、表面プラズモン共鳴アッセイ法ではモノクローナル抗体MAb21.6を使用した。VLA-4受容体タンパク質の精製α4サブユニット10nモルをスクシンイミドエステル結合によってBIAcore(登録商標)チップに添付し、かつBIAcore(登録商標)の使用マニュアルに記述されたようにして平衡状態にした。モノクローナル抗体MAb21.6を、10pM、25pM、50pM、75pM、100pM、250pM、500pM、750pM、1nM、2.5nM、5nM、7.5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、及び1000nM濃度のフローセルに加えた。反応の結合定数及び解離定数を受容体サブユニットとMAbとの結合定数（KD）の算出に使用した。
【０１４５】
表現型の解釈：薬剤感受性
KDはおよそ10-9であるという結果がでた。この値はMab21.6のターゲットに対する親和性が中程度に強いことを示す。このことは、MAb21.6での抗α4サブユニット治療がVLA-4受容体を阻害する方法をもたらすということを示唆する。MAb21.6をL25というα4インテグリンに対する他の抗体と比較した。L25はベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）から市販されており、α4β1インテグリンの粘着機能への良い阻害剤であると文献に報告されている。活性化α4β1インテグリンを阻止するその能力は多発性硬化症などの炎症性の病気の治療に価値を有し得る。
【０１４６】
MAb21.6とL25とのさらなる比較として、ヒトT細胞のVCAM-1への粘着を阻害する抗体の能力を、VCAM-1を増量しながら測定した。この実験では、増量されたVCAM-1で96ウェルのアッセイプレートのプラスチックウェルを皮膜し、その皮膜されたウェルに対するヒトT細胞株Jurkat（高いレベルのα4β1インテグリンを発現する）の接触及び結合の能力を計測した。この結果は、L25は低いレベルのVCAM-1が使われた場合は細胞粘着に対する良い阻害剤となるが、高いレベルのVACM-1が使われた場合は完全に効果が無くなるということを示している。それに対してMAb21.6は、存在するVCAM-1の量に関わらず細胞粘着を完全に阻害する。高い濃度のVCAM-1を阻害する能力は、炎症部位でのVCAM-1を上方制御するため、治療への使用に望ましい（参考文献として本明細書に組み入れられる米国特許第5,840,299号を参照のこと）。
【０１４７】
実施例9．チロシンキナーゼ
本発明は、チロシンキナーゼ酵素を阻害する化合物と、チロシンキナーゼを阻害する化合物を含む組成と、新血管形成、癌、腫瘍増殖、アテローム性動脈硬化、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、炎症性の疾患等の哺乳動物に見られるチロシンキナーゼ依存の病気や症状を治療する為の、チロシンキナーゼ阻害剤を使った方法とに関するものである。本発明は、その表現型を決定するためにチロシンキナーゼもしくはチロシンホスファターゼタンパク質を発現するアッセイ法及び手法を可能にするものである。
【０１４８】
キナーゼは多数の異なって細胞増殖、分化、及び情報伝達過程をタンパク質にリン酸グループを加えることによって調整する。制御されない情報伝達は、炎症、癌、アテローム性動脈硬化や乾癬などの多様な疾病に関係があるとされてきた。可逆タンパク質リン酸化反応は真核細胞の活性を制御するための主な戦略である。哺乳動物細胞において活性である10,000のタンパク質のうちリン酸化したものは1000を超えると推定されている。活性化を促進する高エネルギーのリン酸は一般にアデノシン三リン酸分子（ATP）から特定のタンパク質へタンパク質キナーゼによって移動し、タンパク質リン酸によってタンパク質から取り除かれる。リン酸化反応は細胞外情報（ホルモン、神経伝達物質、増殖因子及び分化因子など）、細胞周期チェックポイント、及び環境や栄養上のストレスに反応して起こり、大まかには分子のスイッチを入れることに例えられる。スイッチが入ると、適切なタンパク質が代謝酵素、調整タンパク質、受容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャンネル及びイオンポンプ、また転写因子を活性化する。タンパク質キナーゼの阻害剤には血管形成阻害剤、ピラゾール誘導体、サイクリンC変異型、アミノチアゾール化合物、キナゾリン化合物、ベンズイミダゾール化合物、ポリペプチドと抗体、ピラミジン誘導体、置換型2-アニロピラミジン類、及びニ環式複素環式芳香族化合物が含まれる（参考文献として本明細書にその全文が組み入れられる米国特許第6,265,403号、米国特許第6,316,466号、米国特許第6,306,648号、米国特許第6,262,096号、米国特許第6,313,129号、米国特許第6,162,804号、米国特許第6,096,308号、米国特許第6,194,186号、米国特許第6,235,741号、米国特許第6,235,746号、米国特許第6,207,669号、米国特許第6,043,045号を参照のこと）。
【０１４９】
タンパク質チロシンキナーゼPTKはターゲットタンパク質におけるチロシン残留物を特異的にリン酸化し、膜貫通型の受容体PTKと膜非貫通型の非受容体PTKに分かれることもある。膜貫通型タンパク質チロシンキナーゼは殆どの増殖因子の受容体である。増殖因子の受容体への結合は、リン酸グループのATPから受容体の選択されたチロシン側鎖や他の特定のタンパク質への移動を活性化する。受容体PTKに関連した増殖因子（GF）には、例えば、表皮増殖因子、血小板由来増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン増殖因子及びインスリン様増殖因子、神経増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、及びマクロファージコロニー刺激因子等がある。
【０１５０】
非受容体PTKには膜貫通領域が欠如しており、その代わり細胞表面にある受容体の細胞間領域と複合体を形成する。非受容体PTKを通じて機能するいくつかの受容体には、サイトカインとホルモン（増殖ホルモン及びプロラクチン）の受容体や、Tリンパ球及びBリンパ球の表面の抗原特異的受容体が含まれる。癌遺伝子のタンパク質産物及び多数の増殖因子受容体はチロシンをリン酸化するタンパク質キナーゼ活性を含む。
【０１５１】
もう一つのキナーゼの群にタンパク質キナーゼC（PKC）群がある。リン酸化反応はPKCの調整に重要な役割を果たす。これらの酵素は、リン脂質加水分解を推進する情報を変換し、ジアシルグリセロールが生産された時と、従来のイソ型に対してはCa2+濃度が増加した時に細胞膜に呼び寄せられる。これらの補助因子の結合は活性部位から自動阻害（擬似基質）ドメインを取り除く構造変化に帰するので、基質の結合及びリン酸化反応を促進する。PKC群の活性剤及び阻害剤は、前立腺上皮細胞のアポトーシスを調整する。セリン／トレオニンキナーゼのPKC群は情報変換調整細胞の増殖と分化とに関連付けられてきたが、最近では細胞死の調整にも関連するとされている（Day，M.L.ら、Cell  Growth ＆ Differ. 5：735-741（1994；Powell，C.T.ら、Cell Growth ＆ Differ．7：419-428（1996））が参考文献として本明細書に取り入られている）。大部分のPKCイソ酵素は、細胞膜リン脂質から得られた生理的活性剤ジアシルグリセロールを必要とする。更に、PKC活性は細胞膜及び／または細胞骨格成分との関連もその多数の生理作用を遂行するために必要とする。PKCはプラスとマイナス双方の細胞周期調節とアポトーシスの開始に結びついた情報変換経路の変調をする。ヒトの前立腺癌細胞株であるPC3における変化増殖因子β（TGF-β1）の変化の増殖阻害行為に関連したPKCの一例には、線虫（C．elegans）のタンパク質キナーゼK02B12がある。
【０１５２】
RNA活性タンパク質キナーゼ（PKR）は、インターフェロン処理によって誘発され、二本鎖RNAによって活性化されるセリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。PKRは自動リン酸化されると、タンパク質合成の真核生物の開始因子2（eLF-2）のαサブユニットのリン酸化を触媒する。タンパク質キナーゼ阻害剤（PKI）はヒトの癌、特に白血病の治療への使用の可能性があることを明示している（本明細書に参考文献として組み入れられるLock，R．B．Cancer Chemother．Pharmacol．39（5）：399-409（1997））。セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤の一例としては、504-アミノ酸親水性タンパク質である、Bトーラスより得られたP58PKR阻害剤（PKRI）がある。大腸菌中のヒスチジン融合タンパク質として発現されたPKRIは、PKRの自動リン酸化とeLF-2のαサブユニットのリン酸化の双方を妨げた。ウェスタンブロット法での分析によると、PKRIはウシ細胞にだけでなくヒト細胞とサル細胞とマウス細胞にも見られ、このタンパク質が高度に保存されていることを示す。タンパク質キナーゼCの阻害剤のもう一つの例に、cAMP依存タンパク質キナーゼ及びタンパク質キナーゼCの阻害剤として機能する、マウスから得られるタンパク質キナーゼ阻害剤がある。
【０１５３】
従って、新しいPKとPKIとそれらをコードするポリヌクレオチドの発見は、細胞増殖に関連した病気、特に癌や免疫反応や発育障害の診断、予防、及び治療に有用な新しい組成を提供することにより、この分野の必要性を満たすものである（本明細書に参考文献として組み入れられる米国特許第6,194,186号を参照のこと）。
【０１５４】
生体活性分子の増幅及び発現
タンパク質キナーゼとタンパク質ホスファターゼは実験の構成または臨床医療における決定に応じて選択される。本明細書に記述された方法によって、増幅と発現は成されている。
【０１５５】
表現型アッセイ法
タンパク質キナーゼとタンパク質ホスファターゼは広範に研究された分子である。キナーゼ活性やホスファターゼ活性を決定するための簡素かつ効率的な試験方法は、SigmaTECT(登録商標)タンパク質キナーゼアッセイ法や非放射性ホスファターゼアッセイシステム等があり、プロメガ社より購入できる。キナーゼ活性の測定に用いる多数のペプチド基質は、参考文献として本明細書に組み入れられるKemp，BEら、J Biol Chem 252，4888（1977）；Casinelle，JEら、Meth．Enzymol.，200 115（1991）等の科学文献にも記述されている。高純度に作られた酵素や阻害剤は多数の販売元より市販されている。これらのアッセイ法は、タンパク質キナーゼの表現型やタンパク質ホスファターゼの表現型を決定する方法を提供する。従って、表現型の情報は、これらのタンパク質の表現型の変調が可能である化合物を発見するために創薬過程において使われる。
【０１５６】
実施例10．P-糖タンパク質
細胞における多剤耐性
ある種の細胞には、薬剤耐性を生じることができるものもある。多剤耐性（MDR）を示すハムスター腫瘍細胞株、マウス腫瘍細胞株、及びヒト腫瘍細胞株が報告されている。癌の化学療法における主な問題の一つは、一部のヒト腫瘍の多数の化学療法薬に対する交差耐性である。この種の多剤耐性は、薬剤の蓄積の減少とP-糖タンパク質またはgp170としても知られる多剤耐性タンパク質の発現の増加とを伴う（「P-糖タンパク質」という用語はP-糖タンパク質とgp170の双方を表すのもとする）。P-糖タンパク質は、MDR細胞において頻繁に増幅されるMDR1遺伝子がコードする高分子量細胞膜タンパク質（Mw170〜180kDa）である。ヒトMDR1遺伝子のコード部位の完全ヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列の完全なものは、国際公開公報第87/05943号、優先日1986年3月28日及び8月1日、「Compositions and methods for clones containing DNA sequences associated with multi-drug resistance in human cells」においてRoninson I.B.により開示されている。P-糖タンパク質に特定のcDNAを分離する方法は、参考文献として本明細書に組み入れられる1986年3月3日公開の欧州特許出願公報第174,810号に記述されている。
【０１５７】
「古典的」MDR表現型はP-糖タンパク質を基盤とするが、「非古典的」MDR表現型は異なったメカニズムを基盤としており、そのうちの一部は未だ確認されていない。「MDR表現型」という用語は古典的MDR表現型と非古典的MDR表現型双方を含むものとする。「MDRマーカー」または「MDR抗原」には、MDR表現型を発現する細胞に単独でもしくは区別されて発現されたP-糖タンパク質とその他の抗原が含まれる。異なった突然変異細胞株は異なった程度の薬剤耐性を示す。MDR表現型を示す細胞株の例を単一の細胞毒化合物への耐性をはかるために選出した。これらの細胞株は、異なった化学構造及び作用のターゲットを持つ、多くは癌の治療に使われるお互いに関連性の無い細胞毒の様々なものに対する広範かつ予見し難い交差耐性も示す。この耐性は、癌細胞の増殖を遅らせたり減少させるための化学療法に使われる薬剤の有効性を妨げる。
【０１５８】
ヒト骨髄白血病細胞株K562のK562/ADMアドリアマイシン耐性を持つ変種を認識できるモノクローナル抗体は、参考文献として本明細書に組み入れられる欧州特許出願公報第214,640号A3、Tsuruo，T.、1987年5月18日公開、「Monoclonal antibody in relation to drug-resistant cancers and productions thereof」に開示されている。このモノクローナル抗体は、K562/ADM株を用いて免疫性を与えたマウスから得たマウス骨髄腫細胞と脾臓細胞の融合物から成るハイブリドーマによって作製された。
【０１５９】
Fc受容体（FcR）
Fc受容体は免疫反応に関わる多くの細胞に見られる。Fc受容体（FcR）は免疫グロブリン分子（Ig）のFc部分のための細胞表面受容体である。Fc受容体と結合できるヒトIgとして今までに確認されたのもには、IgG（FcRn、FcγRI、FcγRII、及びFcγRIII）、IgE（FcεR）、IgA（FcαR）また重合したIgM/A（FcμαR）がある。異なった種類のFcRは、例えば、肥満細胞、マクロファージ、単核白血球、好酸球、血小板、白血球、好中球、腺上皮、肝細胞、腎臓、心臓、胎盤、肺、膵臓といった種類の細胞から検出されている。参考文献として本明細書に組み入れられるHogg，N.，Immun．Today，9：185-86（1998）；Unkeless，J.C.，Ann．Rev．Imm.，6：251-87（1992），Burmeisterら、Nature．Nov 24；372（6504）：336-43（1994）及びSimister NE.，Vaccine Aug-Sep；16（14-15）：1451-5（1998）を参照のこと。FcRの構造と機能は、IgGの恒常性だけでなく、エフェクター細胞とIgを分泌するリンパ球との間の重要なリンクを提供する。
【０１６０】
ハイブリドーマ3G8は、ヒトの白血球とチンパンジーの白血球上のヒトFcγRIIIを認識するマウスIgG1 MABを分泌するマウスハイブリドーマである。例えば、MAB3G8は好中球、単核白血球、マクロファージ、及びNK細胞上のFcγRIIIを認識する。MAbとハイブリドーマ3G8は、参考文献として本明細書に組み入れられる前出のUnkelessらの文献に記述されており、Unkless，J.C.ら、J．Exp．Med.，150：580-596（1979）で初めて開示された。
【０１６１】
メラノーマ特異性MABと化学的に相互結合したMAB3G8から成る化学的に構成された二重特異性抗体は、インビトロ及びヌードのマウスの双方においてメラノーマ細胞を殺すためにFcγRIIIで武装したリンパ球を導くことができた。参考文献として、Titus，J.A.ら、J．Immunol.，139：3153（1987）は組み入れられる。更に、もう一つの化学的に構成された二重特異性抗体である抗CD3/MRK16は、MDR細胞上のP-糖タンパク質及びT-リンパ球上のCD3抗体に対して反応を示した。抗CD3/MRK16二重特異性抗体は、インビトロでMDR腫瘍細胞の溶解を誘発するということが発見されている。Van  Dijk，J.ら、Int．J．Cancer、44：738（1989）は参考文献として組み入れられる。その他のP-糖タンパク質の阻害剤には、米国特許第6,143,837号と米国特許第6,106,833号に記述されたモノクローナル抗体があり、またキナーゼC阻害剤、アントラニル酸誘導体、オリゴヌクレオチド、thrフェニルピペリジン（thrphenylpiperidine）化合物、テトラアリールエチレン化合物、そしてジアリールアルキル化合物が含まれる。これらの阻害剤化合物は参考文献として本明細書に組み入れられる米国特許第5,972,598号、米国特許第6,218,393号、米国特許第6,001,991号、米国特許第5,670,521号、米国特許第5,665,780号、米国特許第5,648,365号、米国特許第6,043,045号、及び米国特許第5,837,536号に記述されている。
【０１６２】
P-糖タンパク質の配列はGenbankの配列アクセッション番号：M14758に示されている。機能タンパク質は本明細書に記述された方法で発現する。抗P-糖タンパク質Mabへの親和性は、ELISA結合アッセイ法もしくはSPRによって決定できる。阻害化合物の存在の有無によるタンパク質の構成上の変化は、質量分析または2-D NMRによって検出できる。薬剤耐性表現型が検出されるということは、治療の可能性があることを示唆する。表現型を決定するこのようなアッセイ法の性能及びこのような表現型の解釈は、医療専門家や同等レベルの当業者の間で知られている。
【０１６３】
同等な範囲
前述された本発明の特定の態様の詳細な説明により、臨床的に関連性のある表現型用生体分子の発現及びアッセイ法の独自の手順で、患者の治療を改善し創薬過程を改善するという結果を伴ったものが説明されたということが明白にされた。本明細書において詳細な特定の態様を開示したが、これは具体例を示すことを目的とした単なる一例として開示したもので、本明細書に記述した特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。特に、特許請求の範囲に定義された本発明の精神及び適用範囲から逸脱しない範囲において、代用や変更が本発明になされてもよいと発明者は考える。例えば、アッセイ法のための生体分子の選択、化学療法薬の選択、またはアッセイ法に基づく適切な患者の治療の選択は、本明細書に記述された態様の知識を有する当業者にとって容易であると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
添付の図は本明細書に開示する発明の原理を図示するもので、単に例として意図されており、本発明の請求項の範囲を制限するためにあると解釈すべきものではない。
【図１】B型肝炎ウイルスの突然変異体（HBV-m）及び野生型（HBV-WT）双方のDNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を測定したアッセイを図示する。
【図２】抗ウイルス化合物ラミブジン-TPの阻害曲線であり、野生型HBVポリメラーゼ活性に対するこの薬剤の濃度範囲にわたっての影響を図示する。
【図３】抗ウイルス化合物ラミブジン-TPの阻害曲線であり、HBVポリメラーゼ活性に対するこの薬剤の濃度範囲にわたっての影響を、ラミブジンに高感度な表現型を持つ野生型（HBV-WT）及びラミブジンに抗性な表現型を持つ突然変異体のHBVタンパク質（HBV-M、HM1、及びHM2、HM5）に対して図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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