(57)【要約】４０番台の保存カチオン性配列内に二塩基性部位を含有する、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βなどのＣ−Ｃケモカインの経口有効性が、二塩基性部位内の残基の少なくとも１つを非保存的に置換することにより改善された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口投与によって自己免疫性および炎症性疾患、並びに細菌およびウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物を製造するためのＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、および対応する野生型（ＷＴ）分子と少なくとも９０％の相同性を有するそれらの突然変異タンパク質の中から選択された、４０番台の二塩基性部位に少なくとも１つの非保存性突然変異を含む変異体Ｃ−Ｃケモカインの使用。
【請求項２】
前記突然変異タンパク質が、対応するＷＴ分子と９５％〜９９％の相同性を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記変異体が４０番台の二塩基性部位の位置の少なくとも１つに、アラニンまたはグルタミン酸を含有する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記突然変異タンパク質が配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、および９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記突然変異タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記自己免疫性疾患が多発性硬化症である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性および炎症性疾患、並びに細菌およびウイルス感染症を治療するまたは予防するためのＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βなどのケモカインの突然変異タンパク質の経口投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、寸法が小さい（７０〜１３０個のアミノ酸）分泌炎症性タンパク質であり、主に細胞の指向性移行と活性化、特に血液からこれらの細胞の動員を必要とする組織部位への血球の血管外遊走に関与する（バジオリーニ（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ）Ｍら、１９９７；ロッシ（Ｒｏｓｓｉ）Ｄおよびズロトニク（Ｚｌｏｔｎｉｋ）Ａ、２０００；フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）ＥＪおよびロリス（Ｌｏｌｉｓ）Ｅ、２００２）。通常、ケモカインは、外傷、炎症、またはその他の組織変質部位においてパラ分泌または自己分泌様式で産生され、細胞タイプ特異的移行と活性化をトリガーする。
【０００３】
配列中の保存システインの数と位置次第で、ケモカインはＣ、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｘ−Ｃ、およびＣ−Ｘ3−Ｃケモカインに分類される。これらの各系統群内で、ケモカインは、配列全体の配列相同性および／または特異的活性に従ってさらに分類される。インターロイキン−８（ＩＬ−８）などの多くのＣ−Ｘ−Ｃケモカインは、好中球に対して走化性であるのに対し、Ｃ−Ｃケモカインは、単球、リンパ球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、および樹状細胞をはじめとする種々の白血球上で活性である。
【０００４】
一連のヘプタヘリカルＧタンパク結合膜受容体は、それらの状態および／またはタイプ次第で、受容体の特異的組み合わせを示すターゲット細胞上で、ケモカインにそれらの生物活性を発揮させる結合パートナーである。これらの各分子をＣ−ＣケモカインにはＣＣＬ１、ＣＣＬ２など、Ｃ−Ｃケモカイン受容体にはＣＣＲ１、ＣＣＲ２などの累加数をはじめとする系統名に結びつけるために、初めはそれらを発見した科学者によって非常に不均一な様式で命名されたケモカインリガンドおよび受容体のための統一命名法が提唱されている。
【０００５】
ケモカインの生理学的効果は、同時発生の相互作用の複雑な統合システムから帰結する。受容体は重なるリガンド特異性を有することが多いので、単一受容体が異なるケモカインに結合でき、並びに単一ケモカインが異なる受容体に結合できる。
【０００６】
ケモカインを治療薬として使用することには潜在的欠点（凝集、乱交雑結合する傾向）があるにもかかわらず、これらの分子は、細胞、特に白血球の過剰な動員と活性化を防止する目的で、特に特異的ケモカインおよびそれらの受容体を阻害／拮抗することで、炎症性および自己免疫性疾患、癌、および細菌またはウイルス感染症に関連した種々の適応症のために、このような過程に結びついた病的状態において治療的介入の可能性を提供する（バジオリーニ（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ）Ｍ、２００１；ゴデザート（Ｇｏｄｅｓｓａｒｔ）Ｎおよびクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ＳＬ、２００１；プラウドフット（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ）Ａら、２０００）。
【０００７】
特にケモカインのＮ末端領域は受容体結合に関与し、Ｎ末端領域プロセシングは、ケモカインを活性化、またはケモカインを完全に不活性化できる。合成Ｃ−Ｃケモカインのアミノ末端変異体は、天然形態の阻害剤または拮抗剤としてのそれらの活性について試験されている。８または９個までのＮ末端アミノ酸を欠損しているＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳは単球上で不活性であり、ケモカイン効果の拮抗的活性が必要な疾患の治療および／または診断において受容体拮抗剤として有用である（ゴング（Ｇｏｎｇ）ＪＨら、１９９５；ゴング（Ｇｏｎｇ）ＪＨら、１９９６；国際公開第９９／１６８７７号パンフレット）。あるいは、メチオニンによるＲＡＮＴＥＳの延長から、本物に対する拮抗剤として挙動するＭｅｔ−ＲＡＮＴＥＳと称される分子のほぼ完全な活性化が帰結する（プラウドフット（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ）ＡＥら、１９９６）。
【０００８】
ＲＡＮＴＥＳおよびＣＣケモカインの化学遊走活性全般は、主に特異的細胞膜受容体と関連して研究されているものの、ＲＡＮＴＥＳは、プロテオグリカン（ＰＧ）と称されるいくつかのタンパク質に翻訳後に付加される、高度に可変性の分枝鎖糖類であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とも相互作用できる。このようなタンパク質は、単離ＧＡＧもまた存在できる細胞膜上、細胞外マトリックス中、および血流中に存在する。
【０００９】
ＧＡＧとの相互作用は、多くの細胞情報伝達可溶性分子（インターロイキン、成長因子）に共通する特徴である。ＰＧまたは単離ＧＡＧは、おそらくはこの分子を細胞外環境でのタンパク質分解から保護する目的で、可溶性分子と複合体を形成できる。またＧＡＧが、特異的受容体に対する細胞情報伝達分子の正確な提示、そして最終的にターゲット細胞活性化の調節も助けるかも知れないことが提唱されている。
【００１０】
ケモカインの場合、炎症部位における固定化勾配への集中、そしてひいては細胞受容体およびそれらの活性化状態との相互作用は、異なる形態のＧＡＧによって調節されるように見える（フーゲワーフ（Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ）ＡＪら、１９９７）。したがってこのような相互作用の調節は、炎症およびその他の疾患における治療的なアプローチを表すかもしれないことが提唱されている（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ＭＫおよびウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）ＴＮ、１９９９）。
【００１１】
ＧＡＧ−ＲＡＮＴＥＳ相互作用の構造的要求条件および機能的効果については、様々なモデルで研究されている。ＲＡＮＴＥＳは、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、またはＭＩＰ−１αなどのその他のケモカインよりも高い親和性と特異性で、ＧＡＧをヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）上にミクロモル濃度で結合する。このような相互作用は、単に静電気でなく、ＧＡＧの長さとＮ−およびＯ−硫酸化のようなその他のパラメータに左右されるようである（クシャート（Ｋｕｓｃｈｅｒｔ）ＧＳら、１９９９）。ＧＡＧ欠損細胞系はケモカインになおも結合できるが、細胞表面ＧＡＧの存在は、それらが低濃度である場合に、受容体上におけるそれらの活性を際だって高める（アリ（Ａｌｉ）Ｓら、２０００）。
【００１２】
ＲＡＮＴＥＳは、ＭＩＰ−１α（コープマン（Ｋｏｏｐｍａｎｎ）Ｗおよびクランゲル（Ｋｒａｎｇｅｌ）ＭＳ、１９９７）およびＭＩＰ−１β（コープマン（Ｋｏｏｐｍａｎｎ）Ｗら、１９９９）などのその他のケモカインでは保存される残基４４〜４７で、残基によってその他の塩基性残基（ＲＫＮＲ）から隔てられる二塩基性部位からなるカチオン性の配列を含有する。このカチオン性の配列内で単一突然変異含有するヒトＲＡＮＴＥＳ変異体は、ＨＩＶ感染症および炎症性またはアレルギー疾患の治療において潜在的治療用途を有するＲＡＮＴＥＳ拮抗剤として開示されている（国際公開第９９／３３９８９号パンフレット）。特に４４、４５、および４７位の３個の残基がアラニンで置換されたＲＡＮＴＥＳの三重変異体は、ＧＡＧ−結合能を失い、多発性硬化症および／またはその他の脱髄性疾患の治療において有用である（国際公開第０２／２８４１９号パンフレット）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
市販の製剤になったいくつかのペプチドおよびタンパク質は、経口有効性を欠いているので、常に非経口的経路によって投与されている。注射は、概して医師または医療専門家によって行われ、患者は治療を受けるために外科または病院を定期的に訪問することが期待される。生じる不快感に加えて、このタイプの適用にかかる時間は、特に治療が数ヶ月にわたる場合、患者の不満足なコンプライアンスをもたらすことが多い。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
４０番台の保存二塩基性部位のＣ−Ｃケモカイン変異体を経口投与すると、それらの治療活性がより長時間発揮できることが意外にも分かった。したがってこの特異的塩基性部位を単に突然変異させることによって、ケモカインベースの治療タンパク質の経口投与が改善されるようであり、したがって患者による自己投与を可能にし、ひいては患者の協力とコンプライアンスを改善する。その他の利点は、以下の記述から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の主要な目的は、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、および対応する野生型（ＷＴ）分子と少なくとも９０％の相同性を有するそれらの突然変異タンパク質の中から選択された変異体Ｃ−Ｃケモカインを使用して、経口投与によって自己免疫性および炎症性疾患、並びに細菌およびウイルス感染症を治療または予防するための医薬組成物を製造することであり、前記変異体は４０番台の二塩基性部位に少なくとも１個の非保存性突然変異を含む。いくつかのＣ−Ｃケモカインに共通するこの二塩基性部位を含有する４０番台のカチオン性配列は、国際公開第０２／２８４１９号パンフレット（特に図１参照）で明白に同定されている。
【００１６】
Ｃ−Ｃケモカインを経口的に投与する可能性は想起されているが（米国特許第６，２１４，５４０号明細書；米国特許第５，９６５，６９７号明細書）、得られるケモカインの生体利用効率が、ＧＡＧ結合に関与する４０番台の保存二塩基性部位の排除によって改善される、という証拠は文献にはない。
【００１７】
したがってＣ−Ｃケモカインベースの治療的タンパク質の経口投与は、特異的二塩基性部位を単に突然変異させることで有利に提供でき、慢性炎症性および自己免疫性疾患の１つなどの長期療法の場合に、このような治療的タンパク質の使用をより許容可能なものとする。経口投与のその他の利点は、注射の場合に観察できる局所性炎症、膿瘻形成、および神経障害などの可能な副作用に起因する合併症の率が大幅に低いことである。
【００１８】
経口的に生体利用可能であることが示されている４０番台の保存二塩基性部位のＣ−Ｃケモカイン変異体は、特にＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、並びに対応する野生型（ＷＴ）分子と少なくとも９０％の相同性を有し、好ましくは９５〜９９％の相同性を有するそれらの突然変異タンパク質の１つである。この定義は、Ｎ−／Ｃ−末端領域（例えばＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、またはＮ−末端で１または２個のアミノ酸の欠損または延長を有する突然変異タンパク質）レベルで修飾および／または短縮された、これらのタンパク質の突然変異タンパク質を含む。
【００１９】
これらの突然変異タンパク質のいくつかの例としては、ＧＡＧ結合領域に関連した４０番台の保存二塩基性部位のＷＴ分子に関して、少なくとも１つの非保存性突然変異を含む全ての突然変異タンパク質が挙げられ、この突然変異を通じて低下したＧＡＧ結合活性を有し得る。確かにこれらの突然変異タンパク質は、本発明によれば好ましいものである。
【００２０】
「低下したＧＡＧ結合活性」という表現は、本発明の変異体がＧＡＧに結合するより低い能力を有することを意味し、すなわち対応する野生型分子に対して、これらの各変異体のより低い割合が（硫酸ヘパリンなどの）ＧＡＧに結合する。
【００２１】
より好ましいのは、野生型分子の４４および４５位の少なくとも１個の塩基性アミノ酸が、その他のアミノ酸によって置換されたヒトＲＡＮＴＥＳの変異体である。追加的な非保存性置換は４７位で提供でき、その他の塩基性残基がＲＡＮＴＥＳのＧＡＧ結合領域を形成する。このような残基は、小型脂肪族，非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、あるいは反対の極性（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）を有する残基で置換できる。アラニンおよびグルタミン酸が好ましいものである。
【００２２】
本発明の定義に含まれる突然変異タンパク質のいくつかの例は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、および９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むものである。より好ましくはこれらの突然変異したＣ−Ｃケモカインは、配列番号：１、５、および９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
したがって本発明の主要な目的は、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、並びに対応する野生型（ＷＴ）分子と少なくとも９０％の相同性を有するそれらの突然変異タンパク質を使用して、経口投与によって、自己免疫性および炎症性疾患、並びに細菌およびウイルス感染症を治療するまたは予防するための医薬組成物を製造することである。このような疾患の制限を意図しない例は、次のとおりである。関節炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎，肝臓／皮膚／肺線維症、アレルギーまたは過敏症疾患、皮膚炎、遅延タイプ過敏症またはＤＴＨとも称されるタイプＩＶ過敏症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン疾患、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、敗血性ショック、ＨＩＶ感染症、移植、対宿主性移植片疾患（ＧＶＨＤ）。
【００２４】
上で定義されたようなケモカイン変異体は、非相同的配列を有する融合タンパク質に含めることができ、ケモカイン変異体の活性を顕著に損なうことなく追加的特性が提供され得る。このような追加的特性の例は、より容易な精製手順、体液中でのより長期の半減期または細胞外局在性である。後者の特徴は、これらのペプチドの単離および精製が促進されるだけでなく、ケモカインが自然に相互作用もする空間にケモカイン変異体を局在化させるので、上の定義に含まれる融合またはキメラタンパク質の特定群を定義するために特に重要である。
【００２５】
本発明のケモカイン変異体を含む融合タンパク質に包含することができる追加的なタンパク質配列は、膜結合タンパク質、膜結合タンパク質の細胞外領域、免疫グロブリン定常部、多量体化領域、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、移出シグナル含有タンパク質の中から選択できる。あるいは、非相同的配列は親和性による精製に有用であることができる（ロウ（Ｌｏｗｅ）ＣＲら、２００１）。
【００２６】
ケモカイン変異体と融合させる１つ以上のこれらの配列の選択は、前記作用物質の特定用途に応じたものである。一般的手順として、これらの融合タンパク質は、普通の遺伝子工学技術を使用してそれらをコードする核酸断片を産生し、原核または真核ホスト細胞を修飾するために使用されるウイルスまたはプラスミド起源のレプリカ可能ベクター内でクローニングし、エピソームまたは非／相同的統合ベクター、並びに形質転換−、感染症−、または形質移入ベースの科学技術を使用することにより製造できる。これらのベクターは、原核または真核ホスト細胞内で、融合タンパク質が、前記細胞と恒常的に活性または誘発性であるように選択される、それら自身の転写開始／終結制御配列のコントロールの下で発現できるようにしなくてはならない。このような細胞内で大幅に富化された細胞系は、次に単離して安定した細胞系を提供できる。
【００２７】
ケモカイン変異体は、所望の使用法および／または製造法によれば好ましいかもしれない、例えば活性分画、前駆体、塩、または誘導体としての別の形態であることができる。
【００２８】
「分画」という用語は、単独での、あるいは例えば糖またはホスフェートの残基、または元のポリペプチドまたはペプチドの凝集などの関連分子またはそれに結合した残基と組み合わせた、化合物自体のあらゆるポリペプチド鎖断片を指す。このような分子は、例えばペプチドの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）化学誘導体化（アセチル化またはカルボキシル化）、ペプチドの合成およびプロセシング中、またはさらなるプロセシング段階で、ペプチドのリン酸化パターンの修飾（ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン残基の導入）、または（例えば哺乳類グリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響する酵素にペプチドを曝露することで）グリコシル化の修飾によって生成されるものなど、常態では一次配列を変更しないその他の修飾からも帰結することができる。
【００２９】
「前駆体」は、細胞または身体への投与前後の代謝および酵素プロセスによって本発明の化合物に転換できる化合物である。
【００３０】
「塩」という用語は、ここではカルボキシル基の塩と、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはそれらの類似物のアミノ基の酸付加塩との双方を指す。カルボキシル基の塩は当該技術分野で既知の手段によって形成されても良く、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩などの無機塩、および例えばトリエタノールアミンなどのアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどを用いて形成される有機塩基を含む塩などが挙げられる。例えば酸付加塩としては、例えば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩、および例えば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。これらのいずれの塩も本発明のペプチドおよびポリペプチドまたはそれらの類似物と大幅に類似した活性を有するべきである。
【００３１】
「誘導体」という用語は、ここでは既知の方法に従って、アミノ酸部分の側鎖上、またはＮ−／またはＣ−末端基上に存在する官能基から調製できる誘導体を指すために使用される。このような誘導体としては、例えばカルボキシル基と、遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離水酸基のＯ−アシル誘導体とのエステルまたは脂肪族アミドが挙げられ、例えばアルカノイル−またはアロイル−基などのアシル基を用いて形成される。
【００３２】
あるいは、例えば技術分野で既知の分子および方法を使用して、ケモカイン変異体の抱合体または複合体を生成して、ポリエチレングリコールおよびその他の天然または合成ポリマーなどによって、それらのデリバリを改善できる（ピライ（Ｐｉｌｌａｉ）Ｏおよびパンチャグヌラ（Ｐａｎｃｈａｇｎｕｌａ）Ｒ、２００１）。
【００３３】
ケモカイン変異体およびそれらを含有する融合タンパク質は、それが形質転換した原核または真核ホスト細胞内でケモカイン変異体のための核酸コード化を発現させる、ウイルスまたはプラスミド起源のベクターを使用して、組換えＤＮＡベースの技術によって調製できる。
【００３４】
ケモカイン変異体をコードするＤＮＡ配列は、適切なベクターに挿入してライゲートできる。ひとたび形成すると、発現ベクターは適切なホスト細胞に導入され、それは次にベクターを発現して所望のタンパク質を生成する。
【００３５】
ここで述べられるような本発明のあらゆる組換えタンパク質の発現は、適した発現ベクターを使用して、真核細胞内（例えば酵母、昆虫または哺乳類細胞）または原核細胞で達成できる。当該技術分野で既知の任意の方法が使用できる。
【００３６】
例えば当該技術分野で周知の技術によって、上記方法のいずれかによって得られたタンパク質をコードするためのＤＮＡ分子が、適切に構築された発現ベクターに挿入される。二重鎖ｃＤＮＡは、ホモポリマーテーリングによって、または合成ＤＮＡリンカーまたはＤＮＡ二重鎖の同じ所で切る（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）ライゲーション技術の使用を伴う制限リンキングによってプラスミドベクターに連結され、ＤＮＡリガーゼが使用されてＤＮＡ分子が結合され、望ましくない結合はアルカリホスファターゼでの処理によって回避される。
【００３７】
所望のタンパク質を発現できるようにするため、発現ベクターは、タンパク質の遺伝子発現および生成を可能にするように、所望のタンパク質をコードするＤＮＡに連結した転写および翻訳制御情報を含有する特異的ヌクレオチド配列も含むべきである。まず遺伝子が転写されるためには、それはポリメラーゼが結合するＲＮＡポリメラーゼが認識できるプロモーターによって先行されなくてはならず、それによって転写過程が開始される。このような種々のプロモーターが使用されており、異なる効率で働く（強弱のプロモーター）。
【００３８】
真核ホストでは、ホストの性質次第で異なる転写および翻訳制御配列を用いても良い。それらは、制御シグナルが高レベルの発現を有する特定の遺伝子に結びついた、アデノウイルス、ウシパピローマウィルス、シミアンウイルスなどのウイルス起源に由来しても良い。例はヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。遺伝子の発現が調節できるように、抑制および活性化を可能にする転写開始制御シグナルを選択しても良い。
【００３９】
ケモカイン変異体をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、所望の遺伝子配列をホスト細胞内に組み込むことができる作動可能に連結された転写および翻訳制御シグナルを有するベクターに挿入される。ベクターの導入後、ホスト細胞はベクター含有細胞について選択される選択培地で増殖される。クローンされた遺伝子配列の発現は、所望のタンパク質の生成をもたらす。
【００４０】
導入されたＤＮＡによって安定に形質転換された細胞は、発現ベクターを含有するホスト細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することで選択できる。マーカーは、栄養素要求株ホストに光合成、例えば抗生物質または銅などの重金属の殺生剤抵抗性を提供しても良い。選択できるマーカー遺伝子は、発現するＤＮＡ遺伝子配列に直接連結でき、あるいは同時形質移入によって同一細胞に導入できる。
【００４１】
ベクターの追加的要素もまた、本発明のタンパク質の最適な生成を得るため、特にベクターを含有しない受容細胞からベクターを含有する受容細胞を認識し選択できる容易さ、特定のホストで所望されるベクターのコピー数、そしてベクターを異なる種のホスト細胞間で「シャトル」できることが望ましいかどうかについて、プラスミドまたはウイルスベクターを含有する特定の細胞を選択するために有用であるかもしれない。
【００４２】
ひとたび構築物を含有するベクターまたはＤＮＡ配列に発現の準備ができると、形質転換、形質移入、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入などの種々の適切な手段のいずれかによって、ＤＮＡ構築物を適したホスト細胞に導入しても良い。
【００４３】
ホスト細胞は、原核または真核どちらであっても良い。タンパク質分子に正確な折りたたみ、または正確な部位のグリコシル化をはじめとする翻訳後修飾を提供することから、好ましいのは例えばヒト、サル、マウス、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞のような真核ホストである。また酵母細胞は、グリコシル化をはじめとする翻訳後ペプチド修飾を実行できる。酵母中で所望のタンパク質を生成するために使用できる、強力なプロモーター配列およびプラスミドの多数のコピーを用いる、いくつかの組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母は、クローンされた哺乳類遺伝子生成物上のリーダー配列を認識して、リーダー配列（すなわちプレペプチド）を有するペプチドを分泌する。
【００４４】
ＲＡＮＴＥＳ変異体を調製する方法の具体的記述は、国際公開第０２／２８４１９号パンフレットおよびＥＰ０１０００７６１．５号明細書（どちらの出願も実施例のセクションで、ここで述べるあらゆる突然変異タンパク質の組換え調製の完全かつ具体的方法を報告している）にある。突然変異タンパク質ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの調製は、文献で開示されている（コープマン（Ｋｏｏｐｍａｎｎ）Ｗおよびクランゲル（Ｋｒａｎｇｅｌ）ＭＳ．、１９９７；ローレンス（Ｌａｕｒｅｎｃｅ）ＪＳら、２００１）。さらに多数のレビュー（マクライズ（Ｍａｋｒｉｄｅｓ）ＳＣ、１９９９）、およびオックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）発行の「実際的アプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」シリーズ中の表題「ＤＮＡクローニング２：発現システム（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」１９９５；「ＤＮＡクローニング４：哺乳類システム（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ４：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」１９９６；「タンパク質発現（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」１９９９；「タンパク質精製技術（Ｐｔｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」２００１などの書籍が、ベクターおよび原核または真核ホスト細胞を使用した組換えタンパク質のクローン化および製造方法に関する教示を提供する。
【００４５】
あるいは、固相合成および液相合成などの化学合成技術によって、ケモカイン変異体、およびそれらを含有する融合タンパク質が調製できる。短かければ完全な合成ケモカインが生成できる（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）Ａら、１９９６）。例えば固相合成として、合成するペプチドのＣ−末端に対応するアミノ酸が有機溶剤に不溶性の支持体に結合され、反応の交互の反復によって、それらのアミノ基および側鎖官能基が適した保護基で保護されるアミノ酸が、Ｃ−末端からＮ−末端の順で１つずつ縮合され、樹脂またはペプチドのアミノ基の保護基に結合したアミノ酸が放出され、かくしてペプチド鎖はこの様式で延長する。
【００４６】
固相合成法は、ｔＢｏｃ方およびＦｍｏｃ法によって、使用される保護基のタイプに応じて大まかに分類される。典型的に使用される保護基としては、アミノ基のためのｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、およびＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）、グアニジノ基のためのＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、そして水酸基のためのｔＢｕ（ｔ−ブチル）が挙げられる。所望のペプチドの合成後、それを脱保護反応させて固体支持体から切断する。このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法のためにはフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸、Ｆｍｏｃ法のためにはＴＦＡを用いて実施しても良い。
【００４７】
組換えＤＮＡまたは化学合成科学技術によって得られるケモカイン変異体に、最終的に１つ以上の精製ステップを施す。精製は、この目的のために知られるあらゆる方法、すなわち抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを伴うあらゆる従来の手順によって実施できる。例えばＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）が使用できる。溶出は、一般にタンパク質精製のために用いられる水−アセトニトリルベースの溶剤を使用して実施できる。
【００４８】
したがって本発明の別の目的は、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、および対応する野生型（ＷＴ）分子と少なくとも９０％の相同性を有するそれらの突然変異タンパク質の中から選択される変異体Ｃ−Ｃケモカインの有効量を投与することにより、上述の疾患のいずれかを治療または予防する方法であり、前記変異体は、薬剤的に許容可能な賦形剤と共に、４０番台の二塩基性部位に少なくとも１個の非保存性突然変異を含む。
【００４９】
本発明の別の実施態様は、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、および対応する野生型（ＷＴ）分子と少なくとも９０％の相同性有するそれらの突然変異タンパク質の中から選択される変異体Ｃ−Ｃケモカインの有効量を経口的に投与することで、ＭＳおよび／またはその他の脱髄性疾患を治療する方法であり、前記変異体は、薬剤的に許容可能な賦形剤と共に、４０番台の二塩基性部位に少なくとも１個の非保存性突然変異を含む。
【００５０】
本発明のケモカインは、疾患を治療、寛解、または予防する用量で、単独で、または１つ以上のケモカインが適切なキャリアまたは薬剤的に許容可能な賦形剤に混合される医薬組成物中で、それを必要とする患者に投与できる。
【００５１】
医薬組成物は、ケモカインに加えてその他の活性成分を含んでも良く、あるいは同一疾患を治療、寛解、または予防できるその他の活性成分による治療と、ケモカインによる治療とを組み合わせても良い。
【００５２】
「治療的に効果的」用量とは、さらに症状の寛解をもたらす十分な化合物の量を指す。本出願の化合物の処方および投与技術は、「レミントンの医学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（ペンシルバニア州イーストンのマーク・パブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．））の最新版にある。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣丸製造、磨砕、乳化、封入、閉じ込めまたは凍結乾燥処理の手段によって、それ自体が既知である様式で製造しても良い。
【００５４】
このようにして本発明に従って使用するための医薬組成物は、賦形剤と、薬剤的に使用できる製剤への活性分子の加工を容易にする助剤とを含む、１つ以上の生理学的に許容可能なキャリアを使用して、従来の様式で調合しても良い。
【００５５】
例えば経口投与のために、活性化合物を薬剤的に技術分野で周知の許容可能なキャリアと組み合わせて、活性成分が容易に配合できる。このようなキャリアは、治療される患者による経口摂取のために、本発明の化合物が、錠剤、丸薬、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして配合できるようにする。経口使用のための医薬調製は固形賦形剤によって得ることができ、任意に得られる混合物を粉砕し、所望ならば適切な助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣丸コアを得る。適切な賦形剤は、特に乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールをはじめとする糖と、例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤などの充填材である。所望するならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、あるいはアルギン酸や、アルギン酸ナトリウムのようなそれらの塩などの崩壊剤を添加しても良い。
【００５６】
糖衣丸コアは、適切なコーティングと共に提供される。この目的のために、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールジェル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶剤または溶剤混合物を含有しても良い、濃縮された糖溶液を使用しても良い。識別のために、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣丸コーティングに染料または顔料を添加しても良い。
【００５７】
経口的に使用できる医薬製剤としては、ゼラチンからできた押し込み型カプセル、並びにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とからできた柔軟な密封カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、乳糖などの充填材、澱粉などのバインダー、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、そして任意に安定剤とのアドミクスチャ中に活性成分を含有できる。柔軟カプセル内では、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁される。さらに安定剤を添加しても良い。経口投与のための全ての処方は、このような投与に適切な投薬量であるべきである。
【００５８】
本発明で使用するのに適した医薬組成物としては、その意図された目的を達成するために、活性成分を有効量で含有する組成物が挙げられる。より具体的には治療的有効量とは、治療を受ける対象の既存の症状の進展を防止する、あるいは緩和するのに効果的な量を意味する。有効量の判定は、特にここで提供される詳細な開示に照らして十分に当業者の能力内である。正確な処方および投薬量は、個々の医師によって患者の状態に鑑みて選択できる。例えばフィンゲル（Ｆｉｎｇｌ）ら、１９７５の「治療の薬学的基礎（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」第１章を参照されたい。
【００５９】
好ましくは上で定義されたような本発明のケモカインの投薬量は、１日当たり約１０μｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは１日当たり０．０５〜１０ｍｇの間である。さらに年齢、性別、および患者の健康状態、並びに投与されているその他の同時発生の治療もまた治療のケモカインの有効投薬量に影響する。したがってこれらの要因に基づいて、使用される投薬量および投与計画の調節および洗練を決めなくてははならず、実験的に求める必要があるかもしれない。しかしこのような判定は、ルーチンの実験以上のものを必要としない。
【００６０】
複数の投薬単位（カプセルまたは錠剤またはそれらの組み合わせなど）の投与によって必要な有効量が達成できるので、各投薬形態の個々の用量に含有される活性成分の単位含量が、必ずしもそれ自体有効量を構成しなくても良いことが理解されるであろう。有効投薬量の投与が、単一用量形態または複数投薬量形態であっても良く、それは腸溶コーティングおよび／または劣化性マトリックスまたはレザバーなどの徐放機構で提供されても良い。
【００６１】
組成物は所望するならば、活性成分を含有する１つ以上の単位投薬形態を含有しても良い、パックまたはディスペンサー装置中に提供しても良い。例えばパックは、ブリスター包装などのように金属またはプラスチックフォイルを含んでも良い。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための使用説明書が添付されても良い。
【００６２】
適合性の医薬キャリア中に配合される本発明の化合物を含む組成物を調製して、適切な容器に入れ、適応症の治療について標識しても良い。ラベルに示される適切な容態は、疾患または障害、あるいはこのような疾患または障害に関連した症状のいずれかを寛解させるのに、本発明の化合物の投与が所望される障害または疾患の治療を含んでも良い。
【００６３】
「経口」投与は経口、腸内または胃内投与を含む。さらに上記の有効性を高める処理において共力剤を結合できる。
【００６４】
ここに引用した参考文献は、引用参考文献に存在するあらゆるデータ、表、図、およびテキストを含めて、その内容全体を本願明細書に引用したものとする。さらにここに引用した参考文献内の引用された参考文献の全内容は、その内容全体を本願明細書に引用したものとする。既知の方法ステップ、従来の方法ステップ、既知の方法または従来の方法に関する言及は、本発明の態様、記述または実施態様が、関連性のある技術で開示され、教示されまたは提案されることを認めるものでは決してない。
【００６５】
本出願で開示される方法および生成物の特徴を理解すれば、先行技術を見直すことで追加的ステップの必要性および種類は容易に推論できる。以下は、範囲を制限することなく、本発明を例証することをことを意図した実施例である。表１は、配列一覧表とテキスト全体にわたり報告される配列の同定を明らかにする。
【実施例】
【００６６】
方法
薬物動態（ＰＫ）研究
８〜１２週齡のメスＢａｌｂ／ｃマウスに、経口（Ｐ．Ｏ．；経口胃管栄養法）で、５ｍｇ／ｋｇのヒトＲＡＮＴＥＳまたはＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）を投薬した。血液を様々な時点で試料採取し（１群当たりマウスｎ＝３匹）、血清を採取して、内在性のマウスＲＡＮＴＥＳでなくヒトＲＡＮＴＥＳまたはヒトＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）を検出するように設定された、ポリクローナル抗ヒトＲＡＮＴＥＳ抗体対（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ２０５８１Ｄ／２０５８２Ｄ）を使用して、ＥＬＩＳＡによって変異体ケモカインのＰＫプロフィールを得た。
【００６７】
腹膜細胞化学走性
８〜１２週齡のメスＢａｌｂ／ｃマウスに、２００μｌのビヒクル対照（ＮａＣｌ）と共に、野生型（ＷＴ）またはケモカイン変異体を４時間Ｐ．Ｏ．（経口胃管栄養法による経口投与）または３０分Ｉ．Ｐ．（腹腔内）で、あらかじめ投薬した。ｔ＝０でマウスに、２００μｌのビヒクル対照（ＮａＣｌ）、ＷＴまたは変異体ケモカインをＩ．Ｐ．投薬した。１８時間後にマウスを屠殺し腹膜洗浄を実施して、血球計算器を使用して採取した全細胞を計えた。
【００６８】
統計分析
腹膜洗浄からの全総細胞数を群の平均と共に、個々の数として表した。グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ）からのボンフェローニ事後検定付き一方向ＡＮＯＶＡ（バージョン３．０；プリズムソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ））を使用して、統計的有意性を計算した。このようにして計算されたｐ＜０．０５の値は、タンパク質または投薬によって提供される効果における統計学的有意差を示す（図中に*で表す）。
【００６９】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）
体重１８〜２２ｇの８週齡のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＢＲメスマウスに、０．２５ｍｇの結核菌を含有するフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ、マイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））中の２００μｇのミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質３３〜３５（ＭＯＧ35〜55）ペプチド（ネオシステム）を含有する、０．１ｍｌのエマルジョンを注射して免疫付与した（日数＝０；首の後ろに皮下注射）。皮下注射前に、マウスは尾静脈に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した３００ｎｇの百日咳毒素（リスト・バイオロジカル・ラブ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂ．））の２００μｌの静脈内注射を受けた。２日目に、実験動物にＰＢＳ中３００ｎｇの百日咳毒素の２回目の腹腔内注射をした。この手順により、ほぼ８〜１０日目に始まって、尾から生じて前肢にまで進行性に上昇する進行性麻痺の発現がもたらされた。
【００７０】
この研究には、全てＣＦＡ中のＭＯＧ35〜55ペプチドと百日咳毒素とで免疫付与された１０匹の実験動物の５つの群が関与し、それらは次のように処置された。
群１：Ｉ．Ｐ．経路でビヒクル（２００μｌＰＢＳ）を単独で投薬された陽性対照群。
群２：Ｐ．Ｏ．経路でビヒクル（２００μｌＰＢＳ）を単独で投薬された陽性対照群。
群３：１０μｇ／マウスのＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）を含む２００μｌ／マウスのＰＢＳをＩ．Ｐ．投薬。
群４：１００μｇ／マウスのＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）を含む２００μｌ／マウスのＰＢＳをｐ．ｏ．投薬。
群５：２０，０００Ｕ／マウスのマウス組換えインターフェロンβ（ＩＦＮβ）を含む２００μｌ／マウスのＰＢＳをＳ．Ｃ．（皮下）投薬。
【００７１】
治療は各実験動物に対して実験７日目（通常の疾患発生のほぼ３日前）に開始して、連続的に２１日間継続した。次に実験動物を実験２８日目に屠殺した。
【００７２】
５日目から開始して、以下の臨床スコアによって実験動物を麻痺の存在について個別に検査した。
０＝疾患の徴候なし
０．５＝部分的尾麻痺
１＝尾麻痺
１．５＝尾麻痺＋部分的片側性後肢麻痺
２＝尾麻痺＋後肢脱力または部分的後肢麻痺
２．５＝尾麻痺＋部分的後肢麻痺（骨盤の低下）
３＝尾麻痺＋完全な後肢麻痺
３．５＝尾麻痺＋完全な後肢麻痺＋失禁
４＝尾麻痺＋後肢麻痺＋前肢の脱力または部分的麻痺
５＝瀕死または死亡
【００７３】
結果
Ｐ．Ｏ．投与に続く血清中ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）の検出
経口投与に続いて血清中にＲＡＮＴＥＳ（配列番号：１０）およびＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）（配列番号：１）の双方が検出された。特にＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）が、用量１００μｇ／マウスでＰ．Ｏ．投与した場合、Ｐ．Ｏ．投与（表２；ｎｄ＝検出されず）の４時間後、ＥＬＩＳＡによって実験動物の血清中に５．８６ｎｇ／ｍｌ血清のピークレベルで検出された。このピークは明らかに、３０分でピークが得られたその他の投与系（血管内のまたは腹腔内）に比べると遅延している。
【００７４】
ＲＡＮＴＥＳ誘発腹膜細胞動員におけるＣ−Ｃケモカイン変異体の経口投与
マウスにあらかじめＲＡＮＴＥＳをＩ．Ｐ．投薬し、腹膜細胞の収率をベースラインとの比較でおよそ２倍に増大させた。ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）は、腹腔内に投与すると細胞を動員できないが、腹腔内にも投与すればＲＡＮＴＥＳの拮抗剤として活性である（図２Ａ）。変異体ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）およびＲＡＮＴＥＳ（Ｋ４５Ｅ）（配列番号：５）を経口的（図２Ｂおよび２Ｃ）に投与した場合、ＲＡＮＴＥＳ誘発動員の用量依存性阻害も観察された。
【００７５】
ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）を腹腔内（図２Ａ）または経口的に（図２Ｂ）投与した場合の経時変化は、ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）を経口的に投与すると、ＲＡＮＴＥＳの２４時間前まで細胞動員を阻害するのに有効であったことを示す。これは腹腔内投与と比べると長時間である。したがって二塩基性部位の突然変異は、ケモカインの生物学的利用能を改善する。
【００７６】
対応するＲＡＮＴＥＳ変異体について示されるように、ＭＩＰ−１β（Ｋ４５ＡＲ４６ＡＫ４８Ａ）（配列番号：９）は、０．０１５ｍｇ／ｋｇ程度の低用量でＭＩＰ−１β−誘発細胞動員を効果的に阻害する（図３）。
【００７７】
マウスＥＡＥモデルにおけるＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）の経口−対−腹腔内有効性
ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）は、経口的に投与すると多発性硬化症のマウスＥＡＥモデルにおいて有益な効果を示す。タンパク質は、１００μｇ／マウス／日のＰ．Ｏ．投与で、基準治療（組換えマウスＩＦＮ−β）よりも良い有効性を実証した。実験中に達した最大臨床スコアの平均値も低下した（図４）。これらの結果は、マウスにおいてＭＯＧでの免疫付与後に慢性ＥＡＥの臨床徴候を減少させるという、ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）の経口投与の明らかな有益な効果を示す。したがってＭＳなどの慢性脱髄性疾患において、治療また予防のためにＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）を経口的に投与できる。
【００７８】
Ｃ−Ｃケモカイン中の４０番台の二塩基性部位の非保存性置換はタンパク質変異体を提供し、それは経口的に投与すると、ケモカイン関連疾患モデルにおいてそれらの効果がより長時間発揮されるので、低下したＧＡＧ結合特性および拮抗剤特性を超えて、活性の具体的プロフィールが示される。
【００７９】
野生型、および本発明に従って経口利用能が改善できる突然変異したＣ−Ｃケモカインの実施例を配列番号：１０、１１、１２、１３、１４、および１５として列挙する。本発明に従って使用できる突然変異した配列の実施例は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、および９（表１）として列挙する。
【００８０】
【表１】
2005529099.tif 000002
【００８１】
【表２】
2005529099.tif 000003
【００８２】
参考文献
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ゴング（Ｇｏｎｇ）ＪＨおよびクラーク−ルイス（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ）Ｉ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８１：６３１−６４０、１９９５
ゴング（Ｇｏｎｇ）ＪＨら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１：１０５２１〜７、１９９６
フーゲワーフ（Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ）ＡＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：１３５７０〜８、１９９７
コープマン（Ｋｏｏｐｍａｎｎ）Ｗおよびクランゲル（Ｋｒａｎｇｅｌ）ＭＳ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７２：１０１０３〜９、１９９７
コープマン（Ｋｏｏｐｍａｎｎ）Ｗら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６３：２１２０〜７、１９９９
クシャート（Ｋｕｓｃｈｅｒｔ）ＧＳら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：１２９５９〜６８、１９９９
ローレンス（Ｌａｕｒｅｎｃｅ）ＪＳら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：４９９０〜４９９９、２００１
ロウ（Ｌｏｗｅ）ＣＲら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４９（１−３）：５６１−７４，２００１
プラウドフット（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ）ＡＥら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１：２５９９〜６０３、１９９６
プラウドフット（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ）Ａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１７７：２４６〜５６、２０００
ロッシ（Ｒｏｓｓｉ）Ｄおよびズロトニク（Ｚｌｏｔｎｉｋ）Ａ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８：２１７〜４２、２０００
シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ＭＫおよびウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）ＴＮ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、３：４０７〜１７、１９９９
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ＲＡＮＴＥＳ誘発腹膜細胞動員に対する阻害効果を示す、４０番台の保存二塩基性部位で突然変異したＲＡＮＴＥＳ変異体の供与反応曲線。ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）はＩ．Ｐ．（図１Ａ）またはＰ．Ｏ．（図１Ｂ）投与される。ＲＡＮＴＥＳ（Ｋ４５Ｅ）はＰ．Ｏ．投与される（図１Ｃ）。統計的に有意な効果をもたらす用量には*印を付けた。
【図２】４０番台の保存二塩基性部位で突然変異したＲＡＮＴＥＳ変異体のＲＡＮＴＥＳ誘発腹膜細胞動員に対する阻害効果の経時変化。ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）はＩ．Ｐ．（図２Ａ）またはＰ．Ｏ．（図２Ｂ）投与される。統計的に有意な効果をもたらす用量には*印を付けた。
【図３】４０番台の保存二塩基性部位で突然変異したＭＩＰ−１β変異体であるＭＩＰ−１β（Ｋ４５ＡＲ４６ＡＫ４８Ａ）を経口投与（Ｐ．Ｏ．）した場合のＭＩＰ−１β誘発腹膜細胞動員に対する阻害効果。統計的に有意な効果をもたらす用量には*印を付けた。
【図４】マウスＥＡＥマウスモデルにおいて対照およびＩＦＮβと比較した、ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ４４ＡＫ４５ＡＲ４７Ａ）のＰ．Ｏ．またはＩ．Ｐ．投与の臨床スコアに対する効果。
【図１】
2005529099.tif 000004
【図２】
2005529099.tif 000005
【図３】
2005529099.tif 000006
【図４】
2005529099.tif 000007
【配列表】
2005529099000001.app
【国際調査報告】
2005529099.tif 000008
2005529099.tif 000009
2005529099.tif 000010
2005529099.tif 000011
2005529099.tif 000012