(57)【要約】本発明は、ａ）生物学的バリアーの中にまたはそれを通して送達される少なくとも１つの化合物；ｂ）少なくとも４つのβ−ホモリジン残基、とりわけ４〜２５個のβ−ホモリジン残基を含んでなる送達促進トランスポーター；ｃ）所望により成分ａ）とｂ）との間にリンカー；およびｄ）所望により標識ユニット；を含んでなるコンジュゲート；かかるコンジュゲートの塩；当該コンジュゲートを含んでなる医薬組成物；生物学的バリアーの中にまたはそれを通して化合物を送達する方法、バリアーを当該コンジュゲートと接触させることを含んでなる方法；および一定のコンジュゲートの製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生物学的バリアーの中にまたはそれを通して送達される少なくとも１つの化合物（ＣＡＲＧＯ）；ｂ）少なくとも４つのβ−ホモリジン残基を含んでなる送達促進トランスポーター（ＳＨＵＴＴＬＥ）；ｃ）所望により成分ａ）とｂ）との間にリンカー（ＬＩＮＫＥＲ）；およびｄ）所望により標識ユニット（Ａ）；
を含んでなるコンジュゲートまたはその塩。
【請求項２】
構造（Ｉ）〜（Ｖ）、
【表１】
2005526023.tif 000023
〔式中、ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２であり、そしてＲ、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはアルキルを表す。〕
の群から選択される構造を有する、請求項１に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項３】
４〜２５個のβ−ホモリジン残基を含む送達促進トランスポーターを含んでなる、請求項１または２に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項４】
５〜１０個のβ−ホモリジン残基を含む送達促進トランスポーターを含んでなる、請求項１または２に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項５】
Ａがビオチニル、フルオレセイン−５−イルおよびフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−
〔式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。〕
から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項６】
ＣＡＲＧＯがオリゴヌクレオチド、ペプチドおよびタンパク質からなる群から選択される生体分子である、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項７】
ＣＡＲＧＯが抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項８】
ＣＡＲＧＯが薬理活性化合物である、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項９】
ＣＡＲＧＯが診断用イメージング剤または造影剤である、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項１０】
式Ｖ
【化１】
2005526023.tif 000024
〔式中、
Ａはオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、診断用イメージング剤または造影剤、Ｈ、ビオチニル、フルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−またはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；
Ｒ''は天然アミノ酸の側鎖を表し；
ｘは０、１または２であり；
ｎは４〜１０の整数であり；
ｍは０〜１０の整数であり；
ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２［式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはアルキルである。］を表し、そして
Ｒ'は天然アミノ酸の側鎖または部分式Ｖａ
【化２】
2005526023.tif 000025
［式中、
ｔは１から１０まで（１０を含む）の整数であり、
ｑは１から１５まで（１５を含む）の整数であり、そして
Ｒ４は天然アミノ酸の側鎖であり、かつ、Ｒ５は水素であるか、または
Ｒ４およびＲ５は一体となって−（ＣＨ２）３−を表す。］
の基を表す。〕
により表される、請求項１に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項１１】
式Ｖ〔式中、
ＡはＨ、ビオチニルまたはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；
Ｒ''はＨまたはＣＨ２ＯＨを表し；
ｘは０、１または２であり；
ｎは５、６、７または８であり；
ｍは０または１であり；そして
ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２［式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはアルキルである。］を表し、そして
Ｒ'は天然アミノ酸の側鎖または部分式Ｖａ
［式中、
ｐは１から１０まで（１０を含む）の整数であり、
ｑは１から１５まで（１５を含む）の整数であり、そして
Ｒ４は天然アミノ酸の側鎖であり、かつ、Ｒ５は水素であるか、または
Ｒ４およびＲ５は一体となって−（ＣＨ２）３−を表す。］
で示される基を表す。〕
で示される、請求項１０に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項１２】
少なくとも１つの医薬上許容される担体とともに、請求項１〜９のいずれかに記載のコンジュゲートを含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
ヒトまたは動物の処置方法において使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載のコンジュゲートまたはかかるコンジュゲートの医薬上許容される塩。
【請求項１４】
生物学的バリアーの中にまたはそれを通して化合物（ＣＡＲＧＯ）を送達する方法であって、該バリアーを、請求項１〜９のいずれかに記載のコンジュゲートと接触させることを含んでなる方法。
【請求項１５】
生物学的バリアーが皮膚または血液脳関門である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
式Ｖ〔式中、
Ａはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−またはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し、ＹはＮＨ２であり、そして他の記号および基は式Ｖのコンジュゲートについて請求項１０において定義した意味を有する。〕
で示されるコンジュゲートの製造方法であって、式ＶＩ
【化３】
2005526023.tif 000026
〔式中、Ａ'はＨ、またはＨ２Ｎ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；樹脂は、ペプチド結合の加水分解をもたらさない反応条件下で加水分解され得る結合で窒素原子に結合し；そして他の記号および基は式Ｖのコンジュゲートについて請求項１０において定義された意味を有する。〕
で示されるペプチドを、イソチオシアナート フルオレセインと最初に反応させ、その後、樹脂から切り離し、
式ＶＩで示される出発化合物は、また、必要ならば、保護された形態、および／または塩の形態の官能基を有して存在してもよく、ただし塩の形態の反応があり得るものとし；
式Ｖのコンジュゲートの保護誘導体中の任意の保護基を除去し；
そして、所望により、式Ｖの遊離のコンジュゲートを塩に変換し、式Ｖのコンジュゲートの入手可能な塩を遊離のコンジュゲートまたは他の塩に変換し、そして／または式Ｖのコンジュゲートの異性体の混合物を個々の異性体に分離することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、コンジュゲートおよび生物学的バリアーの中におよびそれを通して薬物および他の化合物の送達を促進する方法を提供する。
【０００２】
オリゴヌクレオチド、抗体、機能性ペプチドまたはタンパク質のような生体分子の実際の適用は、一般に、細胞へのかかる生体分子の輸送の欠如およびそれらの薬理学的標的の到達における非能率により阻害される。それらのサイズおよび親水性性質のため、たいていの生体分子は、容易には生物学的バリアー、たとえば生体膜の脂質二重層を通過しない。驚くべきことに、今回、少なくとも４つのβ−ホモリジンユニットを含んでなるβ−ホモリジンポリマーが生物学的バリアーを通過でき、そして生物学的バリアーの中にまたはそれを通してかかるポリマーに結合した化合物を送達できることが見出された。
【０００３】
それ故、本発明は、ａ）生物学的バリアーの中にまたはそれを通して送達される少なくとも１つの化合物（ＣＡＲＧＯ）；ｂ）少なくとも４つのβ−ホモリジン残基を含んでなる送達促進トランスポーター（ＳＨＵＴＴＬＥ）；ｃ）所望により成分ａ）とｂ）との間にリンカー（ＬＩＮＫＥＲ）；およびｄ）所望により標識ユニット（Ａ）を含んでなるコンジュゲート（ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ）；およびそれらの塩に関する。
【０００４】
有利には、β−ホモリジンポリマーは酵素的加水分解を受けない。さらに、α−ホモリジンポリマーとは対照的に、β−ホモリジンポリマーは毒性でないことが知られている。これらの特性により、β−ホモリジンポリマーは、温血動物の膜および細胞への薬理活性化合物の輸送の促進のためのＳＨＵＴＴＬＥとしての使用に適している。それ故、ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳは、治療的、予防的および診断的適用を見出す。ＳＨＵＴＴＬＥは、皮膚もしくは他の上皮組織の１もしくはそれ以上の層の中におよびそれを通して、または血液脳関門のような内皮組織をそれを通して診断用または生物学的活性剤を運ぶことができる。さらに、かかるコンジュゲートは、たとえば、細胞および細胞培養物への巨大分子（macromolecule）の輸送を促進および可視化するためにインビトロアッセイおよび試験において使用され得る。
【０００５】
本発明の好適な実施態様において、ＣＯＮＪＵＧＡＴＥは、構造（Ｉ）〜（ＩＶ）、
【表１】
2005526023.tif 000002
〔式中、ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２［式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはアルキルである。］を表す。〕
の群から選択される構造を有する。かかる式（Ｉ）〜（ＩＶ）のコンジュゲートにおいて、Ａは、ビオチニル、フルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−およびフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−〔式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。〕から選択される標識ユニットを表し得る。
【０００６】
ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ、およびとりわけ構造（Ｉ）〜（ＩＶ）のものは、当分野において既知の方法により製造され得る。適当な製造方法は、たとえば、R. Eritjaにより、"Synthesis of Oligonucleotide-Peptide Conjugates and Nucleopeptides"、"Solid-Phase Synthesis", Ed. S.A. Kates and F. Albericio, 2000, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Ch. 12, pp. 529 to 548において、およびP. Lloyd-Williams, F. AlbericioおよびE. Giraltにより、"Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, Boca Raton, 1997、特にCh. 4.4, pp. 175 207、ならびにそれらの中で、それぞれ引用されている刊行物において記載されている。特に、カルバメート、エステル、チオエーテル、ジスルフィドおよびヒドラゾン結合は、一般に形成しやすく、そしてたいていの適用に適している。
【０００７】
ＣＡＲＧＯは、オリゴヌクレオチド、たとえば、一本鎖または二本鎖標的のアンチセンス配列、ペプチド、タンパク質および抗体からなる群から選択される生体分子であり得る。本発明の１つの実施態様において、ＣＡＲＧＯは薬理活性化合物または診断用イメージング剤もしくは造影剤である。かかるＣＡＲＧＯには、抗ヒスタミン剤、グルココルチコイド、レチノイド、アロマターゼインヒビターのような細胞毒性薬、抗エストロゲン剤、トポイソメラーゼＩインヒビター、トポイソメラーゼＩＩインヒビター、微小管活性化剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、プラチナ化合物、プロテインキナーゼ活性を減少させる化合物、抗血管新生化合物、ゴナドレリンアゴニスト、抗アンドロゲン剤、ビスホスホナートおよびトラスツズマブ（trastuzumab）、ならびにシクロスポリン、タクロリムスまたはラパマイシンのような免疫抑制剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０００８】
本明細書において使用される「送達促進（delivery-enhancing）」なる語は、生物学的バリアーの中へのおよび／またはそれを横切るＣＡＲＧＯの送達量および／または速度の増加に関する。
【０００９】
特に、本発明は、式Ｖ
【化１】
2005526023.tif 000003
〔式中、
Ａはオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、診断用イメージング剤または造影剤、Ｈ、ビオチニル、フルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−またはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；
Ｒ''は天然アミノ酸（natural amino acid）の側鎖を表し；
ｘは０、１または２であり；
ｎは４〜１０の整数であり；
ｍは０〜１０の整数であり；
ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２［式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはアルキルである。］を表し、そして
Ｒ'は標準アミノ酸の側鎖または部分式Ｖａ
【化２】
2005526023.tif 000004
［式中、
ｔは１から１０まで（１０を含む）の整数であり、
ｑは１から１５まで（１５を含む）の整数であり、そして
Ｒ４は標準アミノ酸の側鎖であり、かつ、Ｒ５は水素であるか、または
Ｒ４およびＲ５は一体となって−（ＣＨ２）３−を表す。］
の基を表す。〕
により表されるコンジュゲート；またはその塩を提供する。
【００１０】
好ましくは、かかる式Ｖのコンジュゲートにおいて、
ＡはＨ、ビオチニルまたはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；
Ｒ''はＨまたはＣＨ２ＯＨを表し；
ｘは０、１または２であり；
ｎは５、６、７または８であり；
ｍは０または１であり；そして
ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２［式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはアルキルである。］を表し、そして
Ｒ'は標準アミノ酸の側鎖または部分式Ｖａの基を表す。
【００１１】
好ましくは、式Ｖのコンジュゲートにおいて、β−ホモリジンユニットは、Ｌ−立体配置を有し、すなわち該構造は好ましくは以下のとおりである。
【化３】
2005526023.tif 000005
【００１２】
本明細書において前記および後記した一般用語は、好ましくは、本開示の文脈の範囲内で、特記しない限り以下の意味を有する。
【００１３】
「低級」なる接頭語は、最大７まで（７を含む）、とりわけ最大４まで（４を含む）の炭素原子を有する基を示し、当該基は直鎖または単一もしくは複数の分枝を有する分枝鎖である。
【００１４】
コンジュゲート、塩などについて複数形が使用される場合、これは単数のコンジュゲート、塩なども意味すると解釈される。任意の不斉炭素原子は、（Ｒ）−、（Ｓ）−または（Ｒ,Ｓ）−立体配置、好ましくは（Ｒ）−または（Ｓ）−立体配置で存在し得る。かくして、コンジュゲートは、異性体の混合物または純粋な異性体として、好ましくはエナンチオピュア（enantiomer-pure）ジアステレオマーとして存在し得る。本発明は、また、本明細書に記載のコンジュゲートの可能性のある互変異性体に関する。
【００１５】
好適な実施態様において、アルキルは、最大１２までの炭素原子を有し、そしてとりわけ低級アルキルである。
【００１６】
低級アルキルは、好ましくは１（１を含む）から７まで（７を含む）、好ましくは１（１を含む）から４まで（４を含む）のアルキルであり、そして直鎖または分枝鎖である；好ましくは、低級アルキルは、ブチル、たとえばｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、プロピル、たとえばｎ−プロピルまたはイソプロピル、エチルまたは好ましくはメチルである。
【００１７】
ＣＡＲＧＯが非治療目的で使用される場合、Ａは、好ましくはビオチニル、フルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−またはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］である。
【００１８】
好ましくは、ＳＨＵＴＴＬＥは、４〜２５個、好ましくは５〜１０個のβ−ホモリジン残基を含んでなり、すなわちｎは４〜２５、好ましくは５〜１０である。さらに好ましくは、ｎは５、６、７または８である。
【００１９】
ｍは、好ましくは０〜５の整数、とりわけ０または１である。
【００２０】
Ｒ'は、好ましくは−（ＣＨ２）ｋ−ＳＨ〔式中、ｋは０〜１０、好ましくは０〜４の整数、たとえば１である。〕である。
【００２１】
Ｙは、好ましくはＮＲ１Ｒ２であり、そしてＲ１およびＲ２は、好ましくはＨである。
【００２２】
ｔは、好ましくは１〜５の整数、たとえば１、２、３、４または５である。
【００２３】
ｑは、好ましくは１〜１２の整数、たとえば８である。
【００２４】
本明細書において使用されるように「天然アミノ酸」なる語は、特に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを意味する。好ましくは、「天然アミノ酸」なる語は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンおよびＬ−ヒスチジンである。
【００２５】
非医薬目的のために、医薬上許容されない塩、たとえばピクリン酸塩または過塩素酸塩を用いることも可能である。治療的使用のために、（医薬調製物の形態で適用される場合は）医薬上許容される塩または遊離化合物のみが使用され、したがってこれらが好適である。本発明の１つの実施態様において、コンジュゲートは、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩またはトリフルオロメタンスルホン酸塩の形態で使用される。
【００２６】
Ａがフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−またはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し、そしてＹはＮＨ２である式Ｖのコンジュゲートは、本発明の新規コンジュゲートのために従来適用されたことはないが、自体公知の方法、とりわけ式ＶＩ
【化４】
2005526023.tif 000006
〔式中、Ａ'はＨ、またはＨ２Ｎ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；樹脂は、ペプチド結合の加水分解をもたらさない反応条件下で加水分解され得る結合で窒素原子に結合し；そして他の記号および基は式Ｖのコンジュゲートについて上で定義された意味を有する。〕
で示されるペプチドを、イソチオシアナート フルオレセインと、適当な溶媒、好ましくはＮ−メチル−２−ピロリドン中適当な塩基、たとえばジイソプロピルエチルアミンの存在下で０℃〜５０℃の温度、たとえば室温にて、６〜３６時間、たとえば１８、２１または２４時間最初に反応させ、そしてその後、０℃〜５０℃の温度、たとえば室温にてトリフルオロ酢酸および水の混合物で１５〜３６０分、たとえば１２０分間処理することにより樹脂から切り離し、
式ＶＩで示される出発化合物は、また、必要ならば、保護された形態、および／または塩の形態の官能基を有して存在してもよく、ただし塩の形態の反応があり得るものとし；
式Ｖのコンジュゲートの保護誘導体中の任意の保護基を除去し；
そして、所望により、式Ｖの遊離のコンジュゲートを塩に変換し、式Ｖのコンジュゲートの入手可能な塩を遊離のコンジュゲートまたは他の塩に変換し、そして／または式Ｖのコンジュゲートの異性体の混合物を個々の異性体に分離することを特徴とする方法により製造され得る。
【００２７】
ＹがＮＨ２を表す得られた式Ｖのコンジュゲートは、さらに、自体公知の方法（たとえば"Solid-Phase Synthesis", Ed. S.A. Kates and F. Albericio, 2000, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, または "Chemical Approaches to the Synthesis of peptides and proteins", CRC Press, Boca Raton, 1997参照）により、さらに、ＹがＯＲまたはＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２の基は、互いに独立して、水素またはアルキルである。）を表す式Ｖのコンジュゲートに変換され得る。
【００２８】
保護基について。
１またはそれ以上の他の官能基、たとえばカルボキシ、ヒドロキシ、アミノまたはメルカプトが、それらが反応に関与すべきでないために式Ｖのコンジュゲートにおいて保護されているかまたは保護されている必要があるならば、これらは、ペプチド化合物、およびセファロスポリンおよびペニシリン、ならびに核酸誘導体および糖の合成において通常使用されるような基である。
【００２９】
保護基は、前駆体中に既に存在し得、そして望まない二次反応、たとえばアシル化、エーテル化、エステル化、酸化、加溶媒分解および同様の反応に関する官能基を保護すべきである。保護基は、それ自体容易に、すなわち不所望の二次反応なしに、典型的には加溶媒分解、還元、光分解または酵素活性、たとえば生理的条件に類似した条件下で除去され、そしてそれらは最終生成物中に存在しないことが特徴である。専門家であれば、どの保護基が前記および後記の反応に適しているかを知っているか、または容易に確立することができる。
【００３０】
かかる保護基によるかかる官能基の保護、保護基自体、およびそれらの除去反応は、たとえば標準的参考資料、たとえばJ. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973において、T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York 1981において、"The Peptides"; Volume 3 (editors：E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981において、"Methoden der organischen Chemie" (有機化学の方法), Houben Weyl, 4th edition, Volume 15/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974において、H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosaeuren, Peptide, Proteine" (アミノ酸、ペプチド、タンパク質), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982において、およびJochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate：Monosaccharide und Derivate" (炭水化物、モノサッカライドおよび誘導体の化学), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974において記載されている。
【００３１】
付加的製造工程について。
式Ｖのコンジュゲートの塩は、自体公知の方法で製造され得る。かくして、式Ｖのコンジュゲートの酸付加塩は、酸または適当なアニオン交換試薬での処理により得られ得る。
【００３２】
塩は、通常、たとえば、適当な塩基性物質、たとえばアルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属重炭酸塩、またはアルカリ金属水酸化物、典型的には炭酸カリウムまたは水酸化ナトリウムでの処理により、遊離のコンジュゲートに変換され得る。
【００３３】
一般的製造条件について。
本明細書に記載されたすべての製造工程は、既知の反応条件、好ましくは特に記載された条件下で、溶媒または希釈剤（好ましくはたとえば、使用された試薬に不活性なものおよびこれらを溶解できるもの）の不存在下または通常存在下で、触媒、縮合剤または中和剤、たとえばイオン交換剤、典型的にはカチオン交換剤、たとえばＨ＋形態のものの不存在下または存在下で、反応および／または反応剤の種類に依存して、低温、常温、高温、たとえば−１００℃〜約１９０℃、好ましくは約−８０℃〜約１５０℃、たとえば−８０〜−６０℃、室温、−２０〜４０℃の範囲でまたは使用された溶媒の沸点にて、大気圧下または密閉容器中で、適当な場合には加圧下にて、および／または不活性雰囲気、たとえばアルゴンまたは窒素下で行われ得る。
【００３４】
出発化合物および中間体が塩形成基を有する場合、これらのすべてにおいて塩が存在し得る。塩は、また、かかる化合物の反応中に存在し得る。ただし、このことによって反応が妨害されないものとする。
【００３５】
製法の記載において特記しない限り、当該反応に適している選択され得る溶媒としては、たとえば水、エステル、典型的には低級アルキル−低級アルカノエート、たとえば酢酸ジエチル、エーテル、典型的には脂肪族エーテル、たとえばジエチルエーテル、または環状エーテル、たとえばテトラヒドロフラン、液体芳香族炭化水素、典型的にはベンゼンまたはトルエン、アルコール、典型的にはメタノール、エタノールまたは１−もしくは２−プロパノール、ニトリル、典型的にはアセトニトリル、ハロゲン化炭化水素、典型的にはジクロロメタン、酸アミド、典型的にはジメチルホルムアミド、塩基、典型的には複素環窒素塩基、たとえばピリジン、カルボン酸、典型的には低級アルカンカルボン酸、たとえば酢酸、カルボン酸無水物、典型的には低級アルカン酸無水物、たとえば無水酢酸、環状、直鎖または分枝鎖炭化水素、典型的にはシクロヘキサン、ヘキサン、またはイソペンタン、あるいはこれらの溶媒の混合物、たとえば水溶液が挙げられる。かかる溶媒の混合物は、また、処理（processing）、たとえばクロマトグラフィーまたは分配（distribution）においても使用され得る。
【００３６】
好適な実施態様において、式Ｖのコンジュゲートは、実施例に記載された製法および製造工程にしたがってまたはそれらと同様にして製造される。
【００３７】
出発物質について。
新規出発物質および／または中間体、ならびにそれらの製造方法は、同様に、本発明の主題である。好適な実施態様において、好適な化合物を得ることが可能となるようにかかる出発物質が使用され、そして反応条件が選択される。
【００３８】
式ＶＩで示される出発物質は既知であり、当分野において既知の方法と同様にまたはそれらにしたがって合成され得る。
【００３９】
たとえば、ｍが０である式ＶＩの化合物は、カップリング生成物（ＩＸ）
【化５】
2005526023.tif 000007
〔式中、ＰＧ１は保護基、好ましくはフルオレン−９−イル−メトキシカルボニルであり、そしてＰＧ２は保護基、好ましくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。〕
を提供するために、保護された形態（ＶＩＩ）のアミノ酸β−ホモリジン
【化６】
2005526023.tif 000008
〔式中、ＰＧ１は保護基、好ましくはフルオレン−９−イル−メトキシカルボニルであり、そしてＰＧ２は保護基、好ましくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。〕
を、ペプチド結合の加水分解をもたらさない条件下で加水分解され得る結合により側鎖に共有結合的に結合した少なくとも１つの第二級アミンを含んでなる側鎖を有する樹脂（ＶＩＩＩ）
【化７】
2005526023.tif 000009
と、適当な溶媒、好ましくはＮ−メチル−２−ピロリドン中で適当な塩基、たとえばジイソプロピルエチルアミンの存在下にて、０℃〜５０℃の温度、たとえば室温にて、６０〜１８０分、たとえば９０分間、１〜５当量の縮合剤、たとえばＯ−（１,２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピリジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、Ｎ−［（ジメチルアミノ）１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウム ヘキサフルオロホスフェート Ｎ−オキシドまたはテトラメチルフルオロホルムアミジニウム ヘキサフルオロホスフェートの存在下で、最初にカップリングすることにより製造され得る。
【００４０】
第二の工程において、保護基ＰＧ１を、カップリング生成物（ＩＸ）から適当な条件下ではずすと、式（Ｘ）
【化８】
2005526023.tif 000010
〔式中、ＰＧ２は保護基、好ましくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。〕
で示される化合物を提供する。
【００４１】
かかる式（Ｘ）の化合物に対して、最初に、β−ホモリジンユニットを、β−ホモリジンユニット（ＶＩＩ）と樹脂（ＶＩＩＩ）との間のカップリング反応について記載したのと同一または類似の反応条件下で上記のように保護形態（ＶＩＩ）のさらなるβ−ホモリジンユニットを加えること、および第二にカップリング生成物から適当な反応条件下で保護基ＰＧ１をはずすことの反応順序を繰り返すことにより段階的に加え、最終的に式（ＸＩ）
【化９】
2005526023.tif 000011
〔式中、ＰＧ２は保護基、好ましくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。〕
で示される化合物を提供する。
【００４２】
式（ＶＩ）の化合物においてｘが０でなければ、かかる式（ＸＩ）の化合物に対して、式（ＸＩＩ）
【化１０】
2005526023.tif 000012
〔式中、ＰＧ１は保護基、好ましくはフルオレン−９−イル−メトキシカルボニルであり、そしてＲ''は式Ｖの化合物について与えた意味を有する。〕
の保護されたアミノ酸を、最初に、β−ホモリジンユニット（ＶＩＩ）と樹脂（ＶＩＩＩ）との間のカップリング反応について記載したのと同一または類似の反応条件下で式（ＸＩＩ）の保護アミノ酸を加えること、および、第二に、カップリング生成物から適当な反応条件下で保護基ＰＧ１をはずすことの反応順序を繰り返すことにより段階的に加え、最終的に、式（ＸＩＩＩ）
【化１１】
2005526023.tif 000013
〔式中、Ａ'は水素であり、ＰＧ２は保護基、好ましくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルであり、そしてｘおよびｎは式Ｖの化合物について上で与えた意味を有する。〕
の化合物を提供する。
【００４３】
式ＶＩの化合物において、Ａ'がＨ２Ｎ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−〔式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。〕を表す場合、式（ＸＩＩＩ）の化合物を、さらに、式（ＸＩＶ）
【化１２】
2005526023.tif 000014
〔式中、ＰＧ１は保護基、好ましくはフルオレン−９−イル−メトキシカルボニルであり、そしてＤ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。〕
で示される、ＰＧ１−保護酸と、最初に、β−ホモリジンユニット（ＶＩＩ）と樹脂（ＶＩＩＩ）との間のカップリング反応について記載されたのと同一または類似の反応条件下で式（ＸＩＶ）のＰＧ１−保護酸を添加し、そして第二にカップリング生成物から適当な反応条件下で保護基ＰＧ１をはずす反応順序により反応させると、ｍが０である式（ＶＩ）
【化１３】
2005526023.tif 000015
〔式中、Ａ'がＨまたはＨ２Ｎ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；そして他の記号および基は式Ｖのコンジュゲートについて上で定義された意味を有する。〕
を得る。
【００４４】
式（ＶＩ）の化合物においてｍが０でない場合、ＰＧ１が保護基、好ましくはフルオレン−９−イル−メトキシカルボニルであり、そしてＲ''が式Ｖの化合物について与えられた意味を有する式（ＸＩＩ）の保護アミノ酸を、最初に、β−ホモリジンユニット（ＶＩＩ）と樹脂（ＶＩＩＩ）との間のカップリング反応について記載したのと同一または類似の反応条件下で式（ＸＩＩ）の保護アミノ酸を加えること、および、第二に、カップリング生成物から適当な反応条件下で保護基ＰＧ１をはずすことの反応順序を繰り返すことにより段階的に式（ＶＩＩＩ）の樹脂に加えると、カップリング生成物（ＸＶＩ）
【化１４】
2005526023.tif 000016
〔式中、Ｒ'およびｍは式Ｖの化合物について上で与えた意味を有する。〕
の化合物を得、そして式（ＶＩＩＩ）の樹脂の代わりに上に記載した反応順序のための出発物質としてかかるカップリング生成物（ＸＶＩ）を使用する。
【００４５】
Ａがオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、診断用イメージング剤もしくは造影剤、またはビオチニルを表す式Ｖのコンジュゲートは、Ａ'がＨを表し、そして他の記号および基は式Ｖのコンジュゲートについて上で定義した意味を有する式ＶＩの化合物から出発し、当分野において自体公知の反応（たとえば、P. Lloyd-Williams, F. Albericio and E. Giralt in "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, Boca Raton, 1997, たとえばCh. 4.4, pp. 175-207、およびその中で引用されている刊行物参照）を適用することにより得られ得る。特に、Ａがビオチニルを表す式Ｖのコンジュゲートは、Ａ'がＨを表し、そして他の記号および基は式Ｖのコンジュゲートについて上で定義した意味を有する式ＶＩの化合物を、ビオチン（ＸＶＩ）
【化１５】
2005526023.tif 000017
と、β−ホモリジンユニット（ＶＩＩ）と樹脂（ＶＩＩＩ）との間のカップリング反応について記載したのと同一または類似の反応条件下で反応させることにより製造され得る。
【００４６】
先に記載した方法は、Ｒ'が天然アミノ酸の側鎖を表す式Ｖの化合物を提供する。Ｒ'が部分式Ｖａ
【化１６】
2005526023.tif 000018
［式中、
ｔは１から１０まで（１０を含む）の整数であり、
ｑは１から１５まで（１５を含む）の整数であり、そして
Ｒ４は天然アミノ酸の側鎖であり、かつ、Ｒ５は水素であるか、または
Ｒ４およびＲ５は一体となって−（ＣＨ２）３−を表す。］
の基を表す式Ｖの化合物を得るために、
上で記載された方法により導入されたＲ'の残りの１つは、−ＣＨ２−ＳＨを表さなければならない、すなわち、アミノ酸 システインが少なくとも１回樹脂に結合したペプチドに添加されなければならない。−ＣＨ２−ＳＨを表す少なくとも１つの残りのＲ'を含んでなる式Ｖのかかる化合物に、"Solid-Phase Synthesis", Ed. S.A. Kates and F. Albericio, 2000, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Ch. 12の５３５頁から５３７頁に、R. Eritjaにより記載された方法、または類似の方法が適用され得る。
【００４７】
出発物質の製造において、反応に関与しない存在する官能基は、必要ならば、保護されるべきである。好適な保護基、それらの導入およびそれらの除去は、「保護基」または実施例に記載されている。
【００４８】
残りのすべての出発物質は、既知であるか、既知の方法にしたがって製造可能であるか、または商品として入手可能である；それらは、実施例において記載された方法を用いて製造され得る。
【００４９】
治療的適用において、コンジュゲートの用量は、使用されるＣＡＲＧＯ、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および病状；処置されるべき病状の重度；投与の経路ならびに患者の腎および肝機能を含むさまざまな要因に依存する。通常の技術を有する医師、臨床医学者または獣医であれば、病状の進行の予防、阻止または抑止に必要とされる薬物の有効量を容易に決定および処方し得る。毒性を伴わずに効力を生じる範囲内の薬物濃度の達成における最適な精度は、標的部位への薬物の利用能の速度論に基づいた摂取法（regimen）を必要とする。これは、薬物の分布、平衡および排出の研究を必然的に伴う。
【００５０】
本発明は、また、局所、経腸、たとえば経口または経直腸、あるいは非経腸投与に適し、そして無機または有機固体または液体であり得る医薬上許容される担体とともに、有効量、とりわけ下記の疾患の１つの処置において有効量のＣＯＮＪＵＧＡＴＥを含んでなる医薬組成物に関する。経口投与のために、とりわけ希釈剤、たとえばラクトース、デキストロース、マンニトール、および／またはグリセロール、および／または滑沢剤および／またはポリエチレングリコールとともに活性成分を含んでなる錠剤またはゼラチンカプセルが使用される。錠剤は、また、結合剤、たとえばケイ酸アルミニウムマグネシウム、スターチ、たとえばコーン、コムギまたはコメデンプン、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン、ならびに、所望により崩壊剤、たとえばスターチ、寒天、アルギン酸またはその塩、たとえばアルギン酸ナトリウム、および／または発泡性混合物、または吸着剤、着色剤、香料および甘味剤を含み得る。
【００５１】
また、非経腸的に投与可能な形態または注入溶液の形態の薬理学的に活性な本発明のコンジュゲートを使用することも可能である。該医薬組成物は、滅菌され得、そして／または賦形剤、たとえば保存剤、安定剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節のための塩および／または緩衝剤を含み得る。所望により他の薬理学活性物質を含んでいてもよい当該医薬組成物は、自体公知の方法で、たとえば慣用的な混合、造粒、糖衣錠化、溶解または凍結乾燥プロセスにより製造され、約１％〜９５％、とりわけ約１％〜約２０％の活性成分（複数も可）を含んでなる。
【００５２】
さらに、本発明は、医薬担体とともに細胞毒性ＣＡＲＧＯまたはコンジュゲートの医薬上許容される塩を含むコンジュゲートの抗腫瘍有効量を含んでなる、ヒトを含む温血動物における腫瘍の処置のための医薬組成物に関する。
【００５３】
本発明の別の態様は、ヒトまたは動物の処置方法における、ならびに感染性疾患、たとえばＨＩＶ感染、癲癇、不安、疼痛、精神病、統合失調症（schizophrenia）、片頭痛、うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、関節炎（たとえば骨関節炎およびリウマチ様関節炎）、組織潰瘍形成（たとえば角膜、下腿潰瘍（foot ulcerations）、表皮性および胃潰瘍）、創傷治癒の異常、歯周疾患、骨疾患（たとえばページェット病および骨粗鬆症）、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、高血糖、高インスリン血症、高脂血症、インスリン抵抗性、グルコース代謝障害、肥満、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、白内障、糖尿病性ネフロパシー、糸球体硬化症、糖尿病性ニューロパシー、勃起障害、月経前症候群、多嚢胞性卵巣症候群、血管再狭窄、冠状動脈性心臓病、高血圧、狭心症、心筋梗塞、卒中、皮膚および結合組織異常、代謝性アシドーシス、耐糖能異常の状態、同種移植片拒絶、アレルギー性疾患、喘息および特に、液性（たとえば、白血病）および固形腫瘍疾患のような増殖性疾患の処置用医薬の製造におけるＣＯＮＪＵＧＡＴＥまたは医薬上許容されるその塩の使用に関する。
【００５４】
「固形腫瘍疾患（solid tumor disease）」なる語は、とりわけ卵巣癌、乳癌、甲状腺癌、結腸および一般に胃腸管の癌、子宮頸癌（cervix cancer）、肺癌、たとえば小細胞肺癌および非小細胞肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺の癌、メラノーマ、またはカポジ肉腫を意味し、そしてまた、特に、腫瘍転移にも関する。
【００５５】
さらに、本発明は、生物学的バリアー、たとえば皮膚または血液脳関門の中にまたはそれを通してＣＡＲＧＯを送達する方法であって、該バリアーを、ＣＯＮＪＵＧＡＴＥと接触させることを含んでなる方法を提供する。
【００５６】
下記の実施例は、本発明の範囲を制限することなく本発明を実証する。
【００５７】
温度はセルシウス氏度（℃）で測定される。特記しない限り、反応は室温で行う。
【００５８】
【表２】
2005526023.tif 000019
【００５９】
分析用ＨＰＬＣ
グラジエント１、ＭｅＣＮ／０.０９％ ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ／０.１％ ＴＦＡ  １:４９から１：０を７分かけて直線勾配グラジエントおよび１：０を３分；流速２.０ｍＬ／分、２１５ｎｍで検出；ＳＭＴ Ｃ１８カラム（２５０×４.６ｍｍ；５μｍ、１００Å）。グラジエント２、ＭｅＣＮ／０.０９％ ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ／０.１％ ＴＦＡ  １：４９から３：２を１０分かけて直線勾配グラジエント；流速２.０ｍＬ／分、２１５ｎｍで検出；ＳＭＴ Ｃ１８カラム（２５０×４.６ｍｍ；５μｍ、１００Å）。グラジエント３、ＭｅＣＮ／０.０９％ ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ／０.１％ ＴＦＡ  １：４９から３：２を２.５分かけて直線勾配グラジエント；流速４ｍＬ／分；２１５ｎｍで検出；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｓｐｅｅｄ ＲＯＤ Ｃ１８カラム（５０×４.６ ｍｍ）。
【００６０】
実施例１：Ｎ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）７−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
【００６１】
標的であるβ−ペプチドは、４−（２',４'−ジメトキシル−フェニル−アミノメチル）−フェノキシ樹脂（ｆ＝0.53 mmol/g; NovaBiochem, Laeufelfingen, Switzerland）上で、Ｆｍｏｃストラテジーおよび当分野で既知のプロトコール（E. Atherton and R.C. Sheppard, in Rickwoood, D. and Hames, B.D. (Eds) Solid phase peptide synthesis, a practical approach, Oxford University Press, Oxford, 1990）を用いて手動で合成される。
【００６２】
ステップ１.６からの完全なβ−ペプチド樹脂を脱保護し、そしてトリフルオロ酢酸／水（９５：５、ｖ／ｖ）での室温２時間の処理により開裂させる。開裂反応からの濾液をジイソプロピルエーテル−石油エーテル（１：１、ｖ／ｖ、０℃）中で沈澱させ、そして沈殿物を濾過により回収する。粗製化合物を、０.１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル−水グラジエントで溶出したＣ１８カラム（Ｍｅｒｃｋ、ＬＩＣＨＲＯＰＲＥＰ ＲＰ−１８、１５−２５μｍのビーズ直径、Ｃ１８−誘導シリカゲルに基づく逆相カラム材料、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＦＲＧ；カラム長４６ｃｍ、直径３.６ｃｍ；流速５３.３ｍＬ／分；２１５ｎｍで検出）を用いる逆相中圧液体クロマトグラフィーにより精製する。精製した化合物の質量分析（飛行時間型マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）により、予想値（陰イオンモード）の０.１％以内の分子量１５４６．９（計算値１５４６.０）が得られる。標題の化合物の純度は、逆相分析用ＨＰＬＣにより証明される：ｔＲ＝５.１３分に単一のピーク（グラジエント１）。
【００６３】
ステップ１.１：
Ｎβ−Ｆｍｏｃ−Ｎω−Ｂｏｃ−Ｌ−β−ホモリジン（２当量；Fluka, Buchs, Switzerland）を、ジイソプロピルエチルアミン（２.２当量）の存在下でＯ−（１,２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピリジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（２.０当量）とカップリングさせる。カップリングは、最初にＦｍｏｃ−β−ホモリジン誘導体、塩基および縮合剤をＮ−メチル−２−ピロリドンに溶かし、次いで、プレアクチベーション（preactivation）のために３分間待ち、混合物を樹脂に添加し、そして最後に室温にて少なくとも９０分間振盪することにより達成される。必要ならば、第二のカップリングが、ジイソプロピルエチルアミン（６当量）の存在下で縮合剤としてＮ−［（ジメチルアミノ）１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウム ヘキサフルオロホスフェート Ｎ−オキシド（２.０当量）またはテトラメチルフルオロホルムアミジニウム ヘキサフルオロホスフェート（２.０当量）を用いることにより達成される。
【００６４】
ステップ１.２：
アミノカップリングステップの後、キャッピング手順を、欠失配列の形成を予防するために無水酢酸：ピリジン：ジメチルアセトアミド（１：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）で行う。
【００６５】
ステップ１.３：
Ｆｍｏｃ保護基を、ピペリジン／ジメチルアセトアミド（１：４、ｖ／ｖ；８×２分）でステップ１.２の生成物からはずし、続いてイソプロパノール（３×１分）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（３×２分）、イソプロパノール（３×１分）、およびＮ−メチル−２−ピロリドン（３×２分）で洗浄する。
【００６６】
ステップ１.４：
ステップ１.１〜１.３を６回繰り返して、７個のβ−ホモリジンユニットを含んでなる上記の樹脂に結合したペプチドを得る。
【００６７】
ステップ１.５：
Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３,６−ジオキサオクタン酸（Neosystem, Strasbourg, France）を、ステップ１.１でＦｍｏｃ−β−リジン誘導体について記載したようにカップリングし、Ｆｍｏｃ保護基をステップ１.３で記載したようにはずす。
【００６８】
ステップ１.６：
５−イソチオシアナート フルオレセイン（ＦＩＴＣ、"異性体Ｉ"、３当量；Fluka, Buchs, Switzerland）を、ジイソプロピルエチルアミン（６当量）の存在下でＮ−末端アミノ基に組み込む。ビルディングブロックおよび塩基をＮ−メチル−２−ピロリドン中に溶かし、混合物を樹脂に添加し、そして室温にて２１時間振盪することにより、カップリングが達成される。
【００６９】
実施例２：Ｎ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）５−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
標題の化合物を、実施例１と同様にして得る。標題の化合物：質量分析（陰イオンモード）＝１２６１.７（計算値１２６１.６）、ｔＲ＝４.９６分（グラジエント１）。
【００７０】
実施例３：Ｎ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）６−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
標題の化合物を、実施例１と同様にして得る。標題の化合物：質量分析（陰イオンモード）＝１４０３.９（計算値１４０３.８）、ｔＲ＝５.１６分（グラジエント１）。
【００７１】
実施例４：Ｎ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）８−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
標題の化合物を、実施例１と同様にして得る。標題の化合物：質量分析（陰イオンモード）＝１６８７.３（計算値１６８８.２）、ｔＲ＝５.１３分（グラジエント１）。
【００７２】
実施例５：ビオチン−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（β−ホモリジン）６−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
標題の化合物を、実施例１と同様にして得る。Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨおよび（＋）−ビオチン（Fluka, Buchs, Switzerland）を、実施例１において記載したようにカップリングする。標題の化合物：質量分析（陽イオンモード）＝１２４１.８（計算値１２４１.７）、ｔＲ＝５.５４分（グラジエント２）。
【００７３】
実施例６：ビオチン−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（β−ホモリジン）７−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
標題の化合物を、実施例１と同様にして得る。Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨおよび（＋）−ビオチン（Fluka, Buchs, Switzerland）を、実施例１において記載したようにカップリングする。標題の化合物：質量分析（陽イオンモード）＝１３８３.４（計算値１３８３.９）、ｔＲ＝５.６２分（グラジエント２）。
【００７４】
実施例７：ビオチン−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（β−ホモリジン）８−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
標題の化合物を、実施例１と同様にして得る。Ｎａ−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｎａ−Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨおよび（＋）−ビオチン（Fluka, Buchs, Switzerland）を、実施例１において記載したようにカップリングする。標題の化合物：質量分析（陽イオンモード）＝１５２６.３（計算値１５２６.１）、ｔＲ＝５.６５分（グラジエント２）。
【００７５】
実施例８：Ｎ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）６−Ｃｙｓ−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
標題のペプチドを、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ９０５０自動ペプチド合成機（連続フロー式；Millipore, Bedford, MA, USA）で、Ｃ−末端カルボキサミドを確立するためにＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（F. Albericio et al., J.Org.Chem., 55 (1990) 3730-3743参照）で開始し、そしてフルオレニルメトキシカルボニル化学（E. Atherton and R.C. Sheppard, in Rickwoood, D. and Hames, B.D. (Eds) Solid phase peptide synthesis, a practical approach, Oxford University Press, Oxford, 1990参照）に基づくプロトコールを用いて、実施例１に記載された方法と同様に合成する。Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（３当量）を、３０分の最小反応時間内（9050 Plus PepSynthesizer User's Guide, Millipore Corporation, Bedford, MA, 1992参照）で２,４,５−トリクロロフェニルエステル（シングルカップリング）を用いて組み込む。必要なＮβ−Ｆｍｏｃ−Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌ−ｂ−ホモリジン（３当量；Fluka, Buchs, Switzerland）を、ジイソプロピルエチルアミン（６.０当量）の存在下で、Ｏ−（１,２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピリジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（３.０当量）とカップリングする。Ｎ−末端フルオレセイン基を実施例１において記載したように組み込む。完全なβ−ペプチド樹脂を脱保護し、そしてトリフルオロ酢酸／水（９５：５、ｖ／ｖ）での室温３時間の処理により開裂させる。開裂反応からの濾液をジイソプロピルエーテル−石油エーテル（１：１、ｖ／ｖ、０℃）中で沈澱させ、そして沈殿物を濾過により回収する。粗製化合物を、実施例１において記載したように逆相中圧液体クロマトグラフィーにより精製する。
標題の化合物：質量分析（陰イオンモード）＝１５０６.７（計算値１５０６.９）、ｔＲ＝１.７５分（グラジエント３）。
【００７６】
実施例９：Ｎ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）７−Ｃｙｓ−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
標題の化合物を、実施例８において記載したように製造する。標題の化合物：質量分析（陰イオンモード）＝１６４８.１（計算値１６４９.１）、ｔＲ＝１.７４分（グラジエント３）。
【００７７】
実施例１０：Ｎ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）８−Ｃｙｓ−ＮＨ２ ＴＦＡ塩
標題の化合物を、実施例８において記載したように製造する。標題の化合物：質量分析（陰イオンモード）＝１７９１.１（計算値１７９１.３）、ｔＲ＝１.７２分（グラジエント３）。
【００７８】
実施例１１：
【化１７】
2005526023.tif 000020
式中、ＡＳはＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を意味し、そしてｎは６である。
【００７９】
７０.０ｍｇのＮ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）６−Ｃｙｓ−ＮＨ２（実施例８）および４３.３ｍｇの４−マレイミド−ブチリル−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（ステップ１１.１）を、０.４６ｍｌの水／アセトニトリル（３：１ ｖ／ｖ）に溶かす。反応混合物を、室温にて２時間および４５℃にて４１時間撹拌し、そして逆相中圧液体クロマトグラフィーにより精製する。
標題の化合物：質量分析（陽イオンモード）＝２５８９.３（計算値２５８９.３）、ｔＲ＝１.８８分（グラジエント３）。
【００８０】
ステップ１１.１：４−マレイミド−ブチリル−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
標題の化合物を、実施例８において記載したようにＭｉｌｌｉｇｅｎ ９０５０自動ペプチド合成機（連続フロー式；Millipore, Bedford, MA, USA）で合成する。必要なＦｍｏｃアミノ酸（３当量）を、３０分の最小反応時間内でそれらの２,４,５−トリクロロフェニルエステルを用いてカップリングする。側鎖を、下記の基で保護する：リジンのためにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルおよびアルギニンのために２,２,５,７,８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニル。４−マレイミド酪酸（３当量；Buchs, Switzerland）を、ジイソプロピルエチルアミン（６.０当量）の存在下でＯ−（１,２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピリジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（３.０当量）とともにカップリングする。固体支持体からの開裂および標題の化合物の精製は、実施例８において記載されたように行われる。標題の化合物：質量分析（陰イオンモード）＝１０７９.３（計算値１０７９.３）、ｔＲ＝１.４６分（グラジエント３）。
【００８１】
実施例１２：
【化１８】
2005526023.tif 000021
式中、ＡＳはＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を意味し、そしてｎは７である。
【００８２】
標題の化合物は、実施例１１と同様にして、Ｎ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）７−Ｃｙｓ−ＮＨ２（実施例９）を用いて得られる。標題の化合物：質量分析（陽イオンモード）＝２７３１.０（計算値２７３１.５）、ｔＲ＝１.８７分（グラジエント３）。
【００８３】
実施例１３
【化１９】
2005526023.tif 000022
式中、ＡＳはＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を意味し、そしてｎは８である。
【００８４】
標題の化合物は、実施例１１と同様にして、Ｎ−（フルオレセイン−５−イル）−チオウレイド−Ｎ'−Ａｄｏａ−（β−ホモリジン）８−Ｃｙｓ−ＮＨ２（実施例１０）を用いて得られる。標題の化合物：質量分析（陽イオンモード）＝２８７２.７（計算値２８７３.７）、ｔＲ＝１.８６分（グラジエント３）。
【００８５】
実施例１４：ＤＵ１４５およびＨＣＴ１５細胞におけるＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳの細胞内送達および核内蓄積の評価
【００８６】
ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳを、ＰＢＳ／Ｏ中の１０ｍＭストック溶液に希釈する。ＦＩＴＣを、ＤＭＳＯ中に溶かす。指数関数的に増殖しているＤＵ１４５およびＨＣＴ１５細胞を、実施例１、２、３および４の逓増濃度（０.１、１および１０μＭ）のＦＩＴＣ−標識ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳで１８時間処理する。コントロールとして、細胞のさらなるアリコートを、同じ濃度のフルオレセインでインキュベートする。細胞を回収し、固定し、そして標準的手順にしたがって顕微鏡スライドにのせる。１００μｇ／ｍｌのＲＮＡｓ Ａでの処理後に、スライドを、０.２μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する５０％グリセロール／ＰＢＳ溶液で覆う。
【００８７】
染色細胞の蛍光発光を、ＬＳＣを用いて測定する。スライドを、５ｍＷおよび４８８ｎｍラインにて２０×対物およびアルゴンイオンレーザー操作を用いて走査する。最小限５０００個の細胞を調べる。限界パラメーター（contouring parameter）はＰＩの長波長赤色蛍光シグナルであり、そして最小限１００ピクセル領域の閾値が使用される。赤色および緑色の蛍光を、別々の光電子倍増管により集める。ＦＩＴＣ標識化合物の相対核内蓄積を算定するために、バックグラウンドゲート（background gate）を、フルオレセイン単独で処置されたコントロール細胞の限界領域内の緑色蛍光強度の値を用いて定義する。
【００８８】
得られた結果は、明確に、コントロールのフルオレセインとは対照的に、試験されたすべてのＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳが、該試験において使用されたそれらの濃度に比例して細胞内、とりわけ細胞核内に蓄積していることを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月6日(2004.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生物学的バリアーの中にまたはそれを通して送達される少なくとも１つの化合物（ＣＡＲＧＯ）；ｂ）少なくとも４つのβ−ホモリジン残基を含んでなるβ−ホモリジンポリマーを含む送達促進トランスポーター（ＳＨＵＴＴＬＥ）；ｃ）所望により成分ａ）とｂ）との間にリンカー（ＬＩＮＫＥＲ）；およびｄ）所望により標識ユニット（Ａ）；
を含んでなるコンジュゲートまたはその塩。
【請求項２】
構造（Ｉ）〜（Ｖ）、
【表１】
2005526023.tif 000027
〔式中、ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２であり、そしてＲ、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはアルキルを表す。〕
の群から選択される構造を有する、請求項１に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項３】
４〜２５個のβ−ホモリジン残基を含む送達促進トランスポーターを含んでなる、請求項１または２に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項４】
５〜１０個のβ−ホモリジン残基を含む送達促進トランスポーターを含んでなる、請求項１または２に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項５】
Ａがビオチニル、フルオレセイン−５−イルおよびフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−
〔式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。〕
から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項６】
ＣＡＲＧＯがオリゴヌクレオチド、ペプチドおよびタンパク質からなる群から選択される生体分子である、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項７】
ＣＡＲＧＯが抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項８】
ＣＡＲＧＯが薬理活性化合物である、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項９】
ＣＡＲＧＯが診断用イメージング剤または造影剤である、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項１０】
式Ｖ
【化１】
2005526023.tif 000028
〔式中、
Ａはオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、診断用イメージング剤または造影剤、Ｈ、ビオチニル、フルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−またはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；
Ｒ''は天然アミノ酸の側鎖を表し；
ｘは０、１または２であり；
ｎは４〜１０の整数であり；
ｍは０〜１０の整数であり；
ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２［式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはアルキルである。］を表し、そして
Ｒ'は天然アミノ酸の側鎖または部分式Ｖａ
【化２】
2005526023.tif 000029
［式中、
ｔは１から１０まで（１０を含む）の整数であり、
ｑは１から１５まで（１５を含む）の整数であり、そして
Ｒ４は天然アミノ酸の側鎖であり、かつ、Ｒ５は水素であるか、または
Ｒ４およびＲ５は一体となって−（ＣＨ２）３−を表す。］
の基を表す。〕
により表される、請求項１に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項１１】
式Ｖ〔式中、
ＡはＨ、ビオチニルまたはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；
Ｒ''はＨまたはＣＨ２ＯＨを表し；
ｘは０、１または２であり；
ｎは５、６、７または８であり；
ｍは０または１であり；そして
ＹはＯＲまたはＮＲ１Ｒ２［式中、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素またはアルキルである。］を表し、そして
Ｒ'は天然アミノ酸の側鎖または部分式Ｖａ
［式中、
ｐは１から１０まで（１０を含む）の整数であり、
ｑは１から１５まで（１５を含む）の整数であり、そして
Ｒ４は天然アミノ酸の側鎖であり、かつ、Ｒ５は水素であるか、または
Ｒ４およびＲ５は一体となって−（ＣＨ２）３−を表す。］
で示される基を表す。〕
で示される、請求項１０に記載のコンジュゲート；またはその塩。
【請求項１２】
少なくとも１つの医薬上許容される担体とともに、請求項１〜９のいずれかに記載のコンジュゲートを含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
ヒトまたは動物の処置方法において使用するための、請求項１〜９のいずれかに記載のコンジュゲートまたはかかるコンジュゲートの医薬上許容される塩。
【請求項１４】
生物学的バリアーの中にまたはそれを通して化合物（ＣＡＲＧＯ）を送達する方法であって、該バリアーを、請求項１〜９のいずれかに記載のコンジュゲートと接触させることを含んでなる方法。
【請求項１５】
生物学的バリアーが皮膚または血液脳関門である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
式Ｖ〔式中、
Ａはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−またはフルオレセイン−５−イル−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし、２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し、ＹはＮＨ２であり、そして他の記号および基は式Ｖのコンジュゲートについて請求項１０において定義した意味を有する。〕
で示されるコンジュゲートの製造方法であって、式ＶＩ
【化３】
2005526023.tif 000030
〔式中、Ａ'はＨ、またはＨ２Ｎ−ＣＨ２−Ｄｒ−Ｅｕ−Ｇｐ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−［式中、Ｄ、ＥおよびＧは、互いに独立して、ＣＨ２、ＯまたはＮＨから選択され、ただし２つのヘテロ原子が互いに結合することはないものとし、そしてｐ、ｒおよびｕは、互いに独立して、０〜１０の整数である。］を表し；樹脂は、ペプチド結合の加水分解をもたらさない反応条件下で加水分解され得る結合で窒素原子に結合し；そして他の記号および基は式Ｖのコンジュゲートについて請求項１０において定義された意味を有する。〕
で示されるペプチドを、イソチオシアナート フルオレセインと最初に反応させ、その後、樹脂から切り離し、
式ＶＩで示される出発化合物は、また、必要ならば、保護された形態、および／または塩の形態の官能基を有して存在してもよく、ただし塩の形態の反応があり得るものとし；
式Ｖのコンジュゲートの保護誘導体中の任意の保護基を除去し；
そして、所望により、式Ｖの遊離のコンジュゲートを塩に変換し、式Ｖのコンジュゲートの入手可能な塩を遊離のコンジュゲートまたは他の塩に変換し、そして／または式Ｖのコンジュゲートの異性体の混合物を個々の異性体に分離することを含んでなる方法。
【国際調査報告】
2005526023.tif 000031
2005526023.tif 000032
2005526023.tif 000033
2005526023.tif 000034