(57)【要約】本発明は、機能性ＩＬ−６分子および機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を含む融合タンパク質に関する。本発明は、融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質の産生方法、ならびに感染性疾患そして炎症性および免疫学的障害の治療における融合タンパク質の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性ＩＬ−６分子および機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を含む融合タンパク質であって、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＰ−１０のうちの１つまたはそれ以上の発現を増大するタンパク質。
【請求項２】
前記機能性ＩＬ−６分子および前記機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子はリンカーにより一緒に連結される請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記リンカーは配列ＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥを含む請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記機能性ＩＬ−６分子は図３の残基２９〜２１２またはその機能的に等価な相同体を含む請求項１ないし３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記機能性ＩＬ−６分子は図３の配列またはその機能的に等価なものを含む請求項１ないし４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子は図４の残基１１３〜３６４またはその機能的に等価な相同体を含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子は図４の配列またはその機能的に等価なものを含む請求項１ないし６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
１つまたはそれ以上の機能性ＩＬ−６分子および１つまたはそれ以上の機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を含む請求項１ないし７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
１つの機能性ＩＬ−６分子および１つの機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を含む請求項１ないし７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの発現を増大する請求項１ないし９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＰ−１０の発現を増大する請求項１ないし９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ＭＩＰ−α、ＭＩＰ−βまたはＲＡＮＴＥＳの発現を少なくとも５倍増大する請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１５】
前記核酸分子の発現を得るためにプロモーターおよびその他の調節配列を含む請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５記載のベクターで形質転換される宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の産生方法であって、適切な宿主細胞中で請求項１３記載の核酸分子を発現すること、および前記タンパク質を単離
することを包含する融合タンパク質の生産方法。
【請求項１８】
請求項１４または請求項１５記載のベクターで宿主細胞を形質転換すること、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質の産生のための適切な条件下で宿主細胞を培養すること、および前記融合タンパク質を単離することを包含する請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを特定するスクリーニング方法であって、候補分子が前記融合タンパク質の機能に影響を及ぼすか否かを確定するために前記候補分子を試験することを包含する方法。
【請求項２０】
ｇｐ１３０と結合し、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質とＨ−ＩＬ−６の両方の作用を阻害する請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質の阻害形態。
【請求項２１】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質により引き起こされるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現を阻害し、Ｈ−ＩＬ−６により引き起こされるＭＣＰ−１の発現を阻害する請求項２０記載の融合タンパク質の阻害形態。
【請求項２２】
ｇｐ１３０と結合し、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質の作用を阻害する請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質の阻害形態であって、Ｈ−ＩＬ−６ではない融合タンパク質の阻害形態。
【請求項２３】
細胞系中のシグナル伝達経路の調整方法における請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項２０もしくは請求項２１記載の阻害形態の使用。
【請求項２４】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項１４または１５記載の発現ベクターの請求項１３記載の核酸分子、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項２６】
治療に用いるための請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１２記載の核酸または請求項１４もしくは請求項１５記載の発現ベクター。
【請求項２７】
免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、感染性疾患、炎症性障害または免疫学的障害の予防もしくは治療のための薬剤の製造における、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１３記載の核酸または請求項１４もしくは請求項１５記載の発現ベクターの使用。
【請求項２８】
免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、感染性疾患の治療または予防における、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１３記載の核酸または請求項１４もしくは請求項１５記載の発現ベクターの使用。
【請求項２９】
感染性疾患の治療または予防の方法であって、免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の有効用量の融合タンパク質、請求項１３記載の核酸または請求項１４もしくは請求項１５記載の発現ベクターをこのような治療を必要とする個体に投与することを包含する方法。
【請求項３０】
前記感染性疾患はＨＩＶのＭ栄養株により引き起こされるＡＩＤＳである請求項２７もしくは請求項２８記載の使用または請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記感染性疾患は細菌性腹膜炎である請求項２７もしくは請求項２８記載の使用または請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
高レベルのＩＬ−６に関連した免疫学的障害の予防または治療のための薬剤の製造における請求項２０ないし２２のいずれか１項に記載の融合タンパク質の阻害形態の使用。
【請求項３３】
前記免疫学的障害が関節リウマチである請求項２８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性ＩＬ−６分子および機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を含む融合タンパク質に関する。本発明は、融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質の生産方法、ならびに感染性疾患そして炎症性および免疫学的障害の治療における融合タンパク質の使用にも関する。
【０００２】
インターロイキン−６(ＩＬ−６)は、増殖／分化、造血ならびに免疫応答の調節を含めた種々の細胞事象を調節するのに関与する主要炎症性サイトカインである。これらの過程の活性化は、ある種の細胞の表面に見出される特異的受容体(ＩＬ−６Ｒ)とのＩＬ−６の結合により調節される。ＩＬ−６Ｒの存在は少数の細胞型にのみ限定されるため、ＩＬ−６自体の活性は制限される。しかしながら、可溶性形態のＩＬ−６Ｒ(ｓＩＬ６Ｒ)との結合は、ＩＬ−６の生物学的活性を調整し得る。ｓＩＬ−６Ｒは種々の体液中で同定されており、多数の疾患において増加する。ｓＩＬ−６ＲはＩＬ−６を結合し、正常ではＩＬ−６単独には応答しない細胞型の活性化を促し得る。したがって、ｓＩＬ−６Ｒ放出の制御はＩＬ−６活性の調節における重要な過程である。
【０００３】
可溶性サイトカイン受容体は、典型的にはタンパク質分解性切断(ＰＣ)または示差的ｍＲＮＡスプライシング(ＤＳ)により生成される。ｓＩＬ−６Ｒの場合、両メカニズムが利用されて、本明細書中でＰＣ−ｓＩＬ−６ＲおよびＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒと呼ばれる２つのアイソフォームが結果として生成される。両形態は構造的に関連しているが、その近位ＣＯＯＨ末端尾での１０個の特有のアミノ酸の付加により、ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲはＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒの形態とは区別される。その結果として、ｓＩＬ−６Ｒの２つの別個の形態はこの可溶性受容体の全体的特性を制御する。
【０００４】
上記のように、インターロイキン−６(ＩＬ−６)に割り当てられる生物学的活性の多くは、ｓＩＬ−６Ｒを結合するその能力により媒介される（Jones et al., FASEB. J. 15, 43-58, 2001）。実際、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体の形成は、細胞の増殖、分化および炎症性事象の調節を含めた種々の細胞性応答を刺激することが示されている。これらの過程の活性化は、全てのＩＬ−６関連サイトカインに関する全般的シグナル伝達サブユニットとして作用する普遍的に発現される膜結合ｇｐ１３０の刺激複合体の相互作用により達成される（Heinrich et al., Eur. J. Biochem. 236, 837-842, 1998）。その結果、ｓＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−６複合体は、ｇｐ１３０を発現するが、ＩＬ−６自体に対して本来応答しない細胞型のアゴニストとして作用する。コグネイトＩＬ−６Ｒの細胞性発現が肝細胞および白血球亜集団に主として限定されるとすると、ｓＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６に対して応答性である細胞型の範囲を広げる能力を有する。
【０００５】
多数の臨床状態におけるｓＩＬ−６Ｒレベル増大の確認は、この可溶性受容体が局所性および全身性ＩＬ−６媒介性応答の両方を調節する可能性を強調する（Jones et al., 2001(上記)）。その結果、ＩＬ−６自体により制御される細胞事象がｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体により媒介されるものと区別されることが不可欠である。この問題点にとって重要なのは、ｓＩＬ−６Ｒ放出がどのようにｉｎ  ｖｉｖｏで調節されるかを確かめる必要性であった。しかしながら、ｓＩＬ−６Ｒレベルを制御するメカニズムを理解しようとすると、２つのアイソフォームＰＣ−ｓＩＬ−６ＲまたはＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの存在により混乱を生じる。両形態は構造的に関連するが、示差的にスプライシングされた変異体は、スプライシング過程の結果として導入される新規の近位ＣＯＯＨ末端配列（ＧＳＲＲＲＧＳＣＧＬ）によりシェッドアイソフォームと区別され得る（Horiuchi et al., Immunology 95, 360-369, 1998）。今日までのところ、ｓＩＬ−６Ｒの活性を制御するために２つのアイソフォームが存在する理由は明らかでない。
【０００６】
ＰＣ−およびＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒはそれぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓＩＬ−６Ｒの全体的特性を調和させ得るため、個々の細胞事象を引き出すそれらの能力も評価しながら、炎症性事象の進行中のそれらの時間的関係を考察することが不可欠である。種々の疾患状態からの臨床試料の検査により、各アイソフォームの放出が示差的に調節され、個体の年齢、研究される疾患状態および疾患進行の段階に応じることがこれまでに確証されてきた（Jones et al., 2001(上記), Horiuchi et al., 1998(上記)およびMuller-Newen et al., Eur. J. Biochem. 236, 837-842, 1996）。
【０００７】
ここ４〜５年で、細胞表面タンパク質ＣＤ４、ならびにＣＸＣＲ４（ＨＩＶのＴ栄養株に関して）およびＣＣＲ５（ＨＩＶのＭ栄養株に関して）として同定された２つの別個の補助受容体の１つを利用することにより、ＨＩＶが細胞に進入することが示された。これらの補助受容体の本来の機能は、ケモカイン受容体として作用することであり、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳはすべて、ＣＣＲ５と結合する。実際、これらのケモカインの循環レベルの有意の上昇を示すＨＩＶ患者は、より低レベルのＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳを有する個体より十分発達した（blown）ＡＩＤＳを発症する可能性は低い。３つのケモカインのすべて、ならびにＨＩＶのＭ栄養株はＣＣＲ５を結合するため、高レベルのＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳはＣＣＲ５結合に関してウイルスと競合し、ＨＩＶ進入を有効に抑制する。その結果として、ケモカインに有利にこの競合の平衡を再調整し得る任意の因子は、ＨＩＶ療法として有用であり得る。
【０００８】
Fischer他（Nat. Biotechnol., 15, 142-5, 1997）には、リンカーによりＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒに連結されたＩＬ−６を含む融合タンパク質は初期造血前駆体の強力な刺激剤であることが示されている。融合タンパク質は、ハイパーＩＬ−６(Ｈ−ＩＬ−６)と当業者に呼ばれている。Ｈ−ＩＬ−６の使用は、Jostock et al.,（J. Immunol. Methods, 223, 171-183, 1999）、Kollet他（Blood, 94, 923-931, 1999）およびChebath他（Eur. Cytokine. Netw., 8, 359-65, 1997）に記載されている。ＷＯ  ００／０１７３１号およびＷＯ  ９９／０２５５２号では、ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒに連結されたＩＬ−６を含む融合タンパク質が開示されている。
【０００９】
米国特許ＵＳ−Ａ−５，９１９，７６３号では、Ｈ−ＩＬ−６は、肝臓およびその機能の再生を促すことにより肝臓損傷の治療に用いられてきたと述べられている。
【００１０】
従来技術文書で、ＩＬ−６およびＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒを含むタンパク質を開示または示唆するものはない。
【００１１】
本発明は、機能性ＩＬ−６分子および機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を含む融合タンパク質であって、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＰ−１０のうちの１つまたはそれ以上の発現を増大するタンパク質を提供する。
【００１２】
ＭＩＰ−１αは、ＣＣＬ３とも呼ばれ、ＭＩＰ−１βは、ＣＣＬ４とも呼ばれ、ＲＡＮＴＥＳはＣＣＬＳとも呼ばれ、そしてＩＰ−１０はＣＸＣＬ１０とも呼ばれる。
【００１３】
本発明は、機能性ＩＬ−６分子および機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を含む融合タンパク質が１つまたはそれ以上のＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＰ−１０の発現増大を生じるという予期せぬ知見に基づいている。機能性ＩＬ−６分子およびＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ機能性分子(即ちＨ−ＩＬ−６)を含む融合タンパク質は、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現増大を生じない。したがって、本発明の融合タンパク質は、その機能においてＨ−ＩＬ−６とは実質的に異なる。本発明の融合タンパク質およびＨ−ＩＬ−６はともにＭＣＰ−１の発現を増大することが見出されているが、本発明の融合タンパク質のみは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＰ−１０のうちの１つまたはそれ以上の発現を増大する。本発明の融合タンパク質は、その他のケモカイン、例えばＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）またはＩＴＡＣ（ＣＸＣＬ１１）の発現も増大する。
【００１４】
「機能性ＩＬ−６分子」という用語は、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現を増大するためにＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒとの組み合わせにおいて機能する任意のＩＬ−６分子を指す。候補分子が機能性ＩＬ−６分子であるか否かを決定するために、候補分子は、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現の増大が認められるか否かを決定するためにＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒとの組み合わせで試験され得る。このような機能を確定するための適切な方法は、本明細書中の実施例１に記載されている。好ましくは機能性ＩＬ−６分子は、図３の残基２９〜２１２、あるいはその機能性相同体を含む。機能性ＩＬ−６分子が図３に示された配列またはその機能性相同体を含むことがさらに好ましい。「機能性相同体」という用語は、機能性ＩＬ−６分子の活性を保有し、好ましくは少なくとも６０％の配列相同性を有するタンパク質を指す。相同性は、好ましくはＢＬＡＳＴ解析を用いて確定される。相同体は図３の残基２９〜２１２との少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％の配列相同性を有することがさらに好ましい。好ましくはこのような機能性相同体は、図３の残基２９〜２１２とは約１〜１０アミノ酸が異なっている。
【００１５】
任意のアミノ酸変化が保存性であることがさらに好ましい。保存性変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーからの１つで１つのアミノ酸を置換するものである。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの、およびグルタミン酸に代わるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離置換、あるいは構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置換はタンパク質の生物学的活性に大きな影響を及ぼさないと予測するのは理にかなっている。タンパク質中の他のアミノ酸とのジスルフィド結合を形成し得るアミノ酸の数を増大する突然変異は、タンパク質の安定性を増大するために特に好ましい。タンパク質の機能を増大するその他の突然変異も作製され得る。
【００１６】
「機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子」という用語は、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現を増大するためにＩＬ−６との組み合わせにおいて機能する任意のＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を指す。候補分子が機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子であるか否かを決定するために、候補分子は、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０における増大が認められるか否かを決定するためのＩＬ−６との組み合わせで試験され得る。このような機能を確定するための適切な方法は、本明細書中の実施例１に記載されている。好ましくは機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子は、図４の残基１１３〜３６４、あるいはその機能相同体を含む。機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子が図４に示された配列またはその機能相同体を含むことがさらに好ましい。
【００１７】
「その機能相同体」という用語は、相同体が機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの活性を保持しなければならないこと、および配列の相同性が図４に示された配列の残基１１３〜３６４に対して判定されるべきものであることを除いて、上記と同様である。
【００１８】
図４中のＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子のＣ末端の１０個のアミノ酸はＤＳ−ｓＩＬ−６ＲおよびＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ間の主な差異であるので、Ｃ末端の１０個のアミノ酸または機能的に等価の配列が機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子中に存在することが不可欠である。機能的に等価の配列としては、ＩＬ−６と組み合わせた場合に、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現のレベルをＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子が増大するのを可能にする配列が挙げられる。例えばＣ末端の１０個のアミノ酸は、上記のように保存的アミノ酸変化により修飾され得る。さらに、図４に示された配列を有するＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を用いた場合に達成される上記のＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ機能性分子の機能を増大する(すなわちＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現のレベルを増大する)修飾がなされ得る。適切な修飾は、Ｃ末端の１０個のアミノ酸中のアルギニンの一続きの長さを増大することを包含し得る。その他の適切な修飾は、無作為アミノ酸置換、特にアラニン置換、ならびにＣ末端の１０個のアミノ酸の切断であり得る。このような修飾は、本明細書中に記載された方法を用いて試験され得る。特にＲＴ−ＰＣＲは、ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲをコードするｃＤＮＡを生成した。このｃＤＮＡ分子は、ＧＳＲＲＲＧＳＣＧＬ配列またはＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの任意のその他の配列を修飾するための鋳型として用いられ得る。この配列を基礎にしたオリゴヌクレオチドプライマーは、近位ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ配列内に新規のコドンを導入するためのＰＣＲアプローチに用いられ得る。これは、発現されるとＤＳ−ｓＩＬ−６ＲＣＯＯＨ末端の連続切断ならびにＰＣ−ｓＩＬ−６ＲへのＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ配列の段階的変換を生じるｃＤＮＡ断片の生成を可能にする。突然変異誘発キット(Stratagene)に向けられるクイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）ＴＭ部位も、ＧＳＲＲＲＧＳＣＧＬ配列内の個々の残基を修飾するために用いられて、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ活性の媒介を担うアミノ酸を指摘し得る。すべての変異体がシーケンシングされ、適切なベクター、例えばＳＦ９細胞中でのバキュロウイルス発現のためのｐＶＬ１３９３（Horiuchi, 1998(上記)）およびＣＯＳ−７細胞中での一過性／安定発現のためのｐｃＤＮＡ−３（Elson et al., 2000, Nature Neuroscience, 3: 867-872）中でクローン化される。ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの機能を増大するその他の突然変異も作製され得る。
【００１９】
受容体機能性を保証するために、そして各ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ突然変異体の結合動態を評価するために、表面プラズモン共鳴技法が、ＣＭ５カルボキシメチルデキストランのようなマトリックスに固定されたＩＬ−６または可溶性ｇｐ１３０(ｓｇｐ１３０)(例えば１０ｍｇ／ｍｌコーティングストック中)とともに用いられ得る。示差的ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ活性を引き出すための重要な残基を同定するために、ヒト腹膜中皮細胞(ＨＰＭＣ)によるケモカイン発現（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＰ−１０）がＥＬＩＳＡを用いてモニタリングされる（Hurst et al., Immunity, 14, 705-714, 2001）。ルシフェラーゼレポーターアッセイも、下記の材料と方法に記載するように、修飾がＤＳ−ｓＩＬ−６ＲによるＲＡＮＴＥＳプロモーターの活性化を中断させるか否かを確定するために用いられ得る。
【００２０】
機能性ＩＬ−６分子および機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子は、リンカーを介して一緒に連結され得るか、あるいは共有結合により互いに直接結合され得る。適切なフレキシブルリンカーは、当業者に既知である。好ましくはフレキシブルリンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥを有する。あるいはリンカーは、ロイシンジッパーの形態であり得る。
【００２１】
機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子に機能性ＩＬ−６分子を直接結合する方法は、ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒに直接融合されたＩＬ−６を含む融合タンパク質が開示されている国際特許出願ＷＯ  ００／０１７３１における以下の教示の結果から容易に確定され得る。
【００２２】
本発明の融合タンパク質は、１つより多い機能性ＩＬ−６分子および１つより多い機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を含み得る。ＩＬ−６分子対ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子の比は１：１でなければならないというわけではないが、好ましくは１：１である。好ましくは本発明の融合タンパク質は、１つの機能性ＩＬ−６分子および１つの機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子を含む。
【００２３】
本発明の融合タンパク質は、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも１５倍、最も好ましくは少なくとも２５倍、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現を増大することが特に好ましい。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現の増大は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定され得る。好ましくは増大は、適切な細胞系で、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長されたヒト腹膜中皮細胞(ＨＰＭＣ)で測定される。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０における増大を測定するための適切な方法は、本明細書中に開示されている。
【００２４】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は図５に示された配列を有する。図５に示された融合タンパク質は、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグ(下線を施されている)を有するフレキシブルリンカーにより一緒に連結された機能性ＩＬ−６分子および機能性ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ分子をコードする。ｃ−ｍｙｃタグは、融合タンパク質の精製を手助けするために用いられ、特に融合タンパク質がスクリーニングまたは医学的情況で用いられる場合には、好ましくは本発明の融合タンパク質の一部でない。
【００２５】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００２６】
本発明の核酸は、当業界で既知の方法により得られる。例えば天然に存在する配列は、適切な細胞系からのゲノムクローニングまたはｃＤＮＡクローニングにより、あるいはヒトまたはマウスのような生物体の組織に直接由来するＤＮＡまたはｃＤＮＡから得られる。あるいは配列は、標準合成方法、例えばホスホアミダイト法を用いて合成され得る。
【００２７】
多数の技法が、合成またはクローニング手法により得られる核酸配列を変えるために用いられ得る。このような技法は、当業者に既知である。例えば部位特異的突然変異誘発またはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発およびＰＣＲ技法は、ＤＮＡ配列を変更するために用いられ得る。このような技法は当業者には既知であり、当業者に既知の膨大な文献本体に記載されている。
【００２８】
本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクターも提供する。発現ベクターは、種々の異なる生物体、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌および例えば酵母のような真核微生物における核酸の発現に関して既知である。このような発現ベクターはすべて当業者に既知であり、核酸配列を発現するための発現ベクターの使用は、当業者に既知の標準技法である。好ましくは発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。
【００２９】
好ましくは本発明の発現ベクターは、プロモーターおよび本発明の核酸分子を含む。ベクターは、本発明の融合タンパク質を産生させる。ベクターは、核酸分子の発現を得るのに必要とされる任意のその他の調節配列を含むことがさらに好ましい。
【００３０】
本発明の核酸分子は、適切な宿主細胞において細胞内に発現され得る。プロモーター配列は本発明の核酸分子に直接連結され得るが、この場合、コードタンパク質のＮ末端のアミノ酸は、開始ＡＴＧコドンによりコードされるメチオニンである。
【００３１】
あるいは、本発明の核酸分子によりコードされる融合タンパク質は、本発明の核酸分子にリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を連結することにより、適切な宿主細胞から分泌され得る。コードタンパク質は、リーダー配列断片ならびに本発明の核酸分子によりコードされる融合タンパク質を含む。リーダー配列は、細胞からの融合タンパク質の分泌を引き起こす。好ましくは、リーダー配列と本発明の核酸分子によりコードされる融合タンパク質との間にプロセシング部位が存在して、リーダー配列を酵素的または化学的に切断させる。このようなリーダー配列の一例は、アデノウイルストリパライト（triparite）リーダーである。
【００３２】
好ましくは、本発明のベクターは、本発明の核酸分子の望ましい発現を得るために必要なプロモーターおよびその他の調節配列を含む。
【００３３】
本発明はまた、本発明のベクターで形質転換される宿主細胞を提供する。
【００３４】
「形質転換」という用語は、挿入のために用いられる方法、例えば直接取り込み、形質導入、ｆ−交配または電気穿孔とは関係なく、宿主細胞中への外生核酸分子の挿入を指す。外生核酸は非組込みベクター（エピソーム）として得られるか、あるいは宿主ゲノム中に組み込まれ得る。
【００３５】
好ましくは宿主細胞は真核生物細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＨＰＭＣ、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎(ＢＫＨ)細胞、肝臓起源の細胞、例えばＨｅｐＧ２細胞、ならびに骨髄腫またはハイブリドーマ細胞系である。あるいは宿主細胞は、原核生物細胞、例えば大腸菌である。
【００３６】
本発明はさらに、本発明の融合タンパク質の産生方法であって、本発明のベクターで宿主細胞をトランスフェクトすること、およびトランスフェクトした宿主細胞を適切な条件下で培養することであって、それにより核酸分子の発現および本発明の融合タンパク質の産生を引き起こす、培養することを包含する方法を提供する。次に、融合タンパク質は標準技法を用いて、融合タンパク質が分泌されるか否かに応じて、トランスフェクトした細胞から、または細胞成長培地から収集され得る。
【００３７】
本発明は、本発明の融合タンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストを同定するスクリーニング方法も提供する。スクリーニング方法は好ましくは、候補分子の存在が本発明の融合タンパク質の機能に影響を及ぼすか否かを確定するために候補分子を試験することを包含する。例えば候補分子は、ケモカイン、例えばＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の産生を増大または低減し得るか、あるいは融合タンパク質により影響されるケモカインの範囲を変更し得る。
【００３８】
候補分子は、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーまたは天然生成物ミックスから単離され得る。候補分子は、天然または修飾基質、リガンド、酵素、受容体、抗体分子、あるいは構造的または機能的模倣物であり得る。適切なスクリーニング技法の概説に関しては、Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1(2):Chapter 5, (1991)を参照されたい。
【００３９】
本発明は、本発明の融合タンパク質の阻害形態であって、ｇｐ１３０と結合し、本発明の融合タンパク質およびＨ−ＩＬ−６の両方の作用を阻害する阻害形態にも関する。好ましくは本発明の融合タンパク質の阻害形態は、本発明の融合タンパク質により引き起こされるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０の発現を阻害し、Ｈ−ＩＬ−６により引き起こされるＭＣＰ−１の発現を阻害する。このような阻害形態は、機能性相同体の生成に関して上記されたように本発明の融合タンパク質を突然変異させることにより生成され得る。さらに阻害形態の機能は、機能性相同体の試験に関して上記されたような同一の方法を用いて確定され得る。融合タンパク質の阻害形態は、好ましくは本発明の融合タンパク質およびＨ−ＩＬ−６の作用を妨げるかまたは実質的に低減する(すなわち少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％)。好ましくは本発明の融合タンパク質の阻害形態は、本発明の融合タンパク質の作用を阻害するだけであって、この場合、融合タンパク質の阻害形態はＨ−ＩＬ−６ではない。
【００４０】
本発明は、細胞系中のシグナル伝達経路の調整方法における本発明の融合タンパク質または融合タンパク質の阻害形態の使用も提供する。細胞系におけるシグナル伝達の調整により、シグナル伝達経路に関する情報が得られ、これが、標的化され得る経路の他の部分の同定をもたらして、所望の結果を達成し得る。細胞系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系、例えば細胞培養、またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞系、例えば生物体であり得る。
【００４１】
本発明はまた、薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは賦形剤とともに、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸または本発明の発現ベクターを含む薬学的組成物を提供する。
【００４２】
適切な薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは賦形剤は以下で論考される。
【００４３】
本発明はまた、治療に用いるための本発明の融合タンパク質、本発明の核酸あるいは本発明の発現ベクターを提供する。
【００４４】
本発明はまた、感染性疾患、炎症性障害もしくは免疫学的障害の治療または予防のための薬剤の製造における、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸あるいは本発明の発現ベクターの使用を提供する。
【００４５】
本発明はまた、免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、感染性疾患、炎症性障害もしくは免疫学的障害の治療または予防における、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸あるいは本発明の発現ベクターの使用を提供する。
【００４６】
本発明はまた、感染性疾患、炎症性障害もしくは免疫学的障害の治療または予防方法であって、免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、有効用量の本発明の融合タンパク質、本発明の核酸あるいは本発明の発現ベクターをこのような治療を必要とする個体に投与することを包含する方法を提供する。
【００４７】
感染性疾患は、感染作用因子がＣＣＲ５受容体を用いて結合する任意の疾患であり得る。感染性疾患はＨＩＶのＭ栄養株により引き起こされるＡＩＤＳであることが特に好ましい。
【００４８】
融合タンパク質は、ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＲＡＮＴＥＳまたはＩＰ−１０、ならびにその他のケモカインのレベルを増大するので、融合タンパク質が炎症性応答を増大または回復させ得るのと同様に、免疫応答を増大または回復させるのが望ましい場合、融合タンパク質は炎症性障害の治療または予防に用途を有すると考えられ得る。適切な炎症性障害としては、細菌性腹膜炎およびクローン病が挙げられる。本発明の融合タンパク質は特に、細菌性腹膜炎の治療に有用である(実施例７参照)。本発明の融合タンパク質は、免疫学的障害、例えば自己免疫疾患の治療または予防にも用いられ得る。
【００４９】
本発明は、高レベルのＩＬ−６に関連した免疫学的障害、例えば関節リウマチの治療または予防における本発明による融合タンパク質の阻害形態の使用も提供する。
【００５０】
本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物のいずれか一つ(すなわち本発明の融合タンパク質、本発明の核酸分子または本発明の発現ベクター)を、任意の薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは賦形剤とともに含む。本発明の薬学的組成物中に用いられ得る薬学的に許容可能な担体、アジュバントおよび賦形剤としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝剤物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明の薬学的組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、または埋没レザーバによって投与され得る。好ましくは薬学的組成物は、経口的にまたは注射により投与される。本発明の薬学的組成物は、任意の慣用的非毒性の薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは賦形剤を含有し得る。非経口的という用語は、本明細書中で用いられる場合、皮下、皮内、静脈内、筋内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技法を包含する。
【００５２】
薬学的組成物は、滅菌注射用製剤の形態、例えば滅菌注射用水性または油性懸濁液であり得る。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤（例えばＴｗｅｅｎ８０など）および沈殿防止剤を用いて、当業界で既知の技法にしたがって配合され得る。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液でもあり得る。用いられ得る許容可能な賦形剤および溶媒としては、マンニトール、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌性不揮発性油は、溶媒または懸濁媒質として慣用的に用いられる。この目的のために、任意の無刺激性不揮発性油、例えば合成モノまたはジグリセリドが用いられ得る。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、天然の薬学的に許容可能な油、例えばオリーブ油またはヒマシ油と同様に、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンで、注射液の製剤中で有用である。これらの油溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばＰｈ．Ｈｅｌｖまたは同様のアルコールも含有し得る。
【００５３】
本発明の薬学的組成物は、任意の経口的に許容可能な投薬形態で、例えばカプセル、錠剤および水性懸濁液および溶液(これらに限定されない)で、経口的に投与され得る。経口的使用のための錠剤の場合、一般的に用いられる担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも典型的に添加される。カプセル形態での経口投与のためには、有用な希釈剤としてはラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液が経口的に投与される場合、活性成分は、乳化剤および沈殿防止剤と組み合わせられる。所望により、ある種の甘味剤および／または風味剤および／または着色剤が添加され得る。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は、経鼻エーロゾルまたは吸入により投与され得る。このような組成物は、薬学的配合物の業界で既知の技法により調製され、ベンジルアルコールまたはその他の適切な防腐剤、生物学的利用能を強化するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当業界で既知のその他の可溶化剤または分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【００５５】
ここで、以下の図面を参照しながら、下記の実施例において本発明を例証する。
【実施例】
【００５６】
材料および方法
試薬
バキュロウイルス発現ｓＩＬ−６Ｒアイソフォームを、上記のようにして得た（Horicuhi et al., Immunology 95, 360-369, 1994）。モノクローナル抗ＩＬ−６および抗ｓＩＬ−６Ｒ（それぞれｍＡｂ−２２６およびｍＡｂ−２２７）は、R & D systemsから購入した。抗ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ(ｍＡｂ−２Ｆ３)を、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの特有のＣＯＯＨ末端配列に対して産生した（Horiuchi et al.,(上記)）。
【００５７】
ヒト腹膜中皮細胞の単離および培養
待機腹腔手術を受けている同意患者からの大網組織の連続トリプシン（０．１％ｗ／ｖトリプシン：０．０２％ｗ／ｖＥＤＴＡ）消化により、ヒト腹膜中皮細胞(ＨＰＭＣ)を単離した（Topley et al., American. J. Pathology, 142, 1876-1886, 1993）。湿潤５％ＣＯ２大気中で３７℃で、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５μｇ／ｍｌのインスリンおよび０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（Life TechnologiesまたはSigma）を含有するアール緩衝化１９９培地中で、細胞を培養した。実験前に、ＨＰＭＣ単層を成長させ、血清の非存在下で停止させた。これらの条件下で、ＨＰＭＣは９６時間もの間、生育可能および静止状態のままであった（Topley et al., 1993(上記)）。血清の非存在下で、第二継代より古くない細胞で、刺激を実施した。
【００５８】
炎症媒介物質濃度の確定
サンドイッチＥＬＩＳＡ技法を用いて、炎症媒介物質濃度を定量化した。対応抗体対ＯｐｔＥＩＡキット（Pharmingen, Becton-Dickinson）を用いて、ヒトＭＣＰ−１レベルを確定した。適切な対応抗体対(ｍＡｂ６７８／ＮＡＦ２７８)（R & D Systems）を用いてヒトＲＡＮＴＥＳを定量化し、一方、アマーシャムバイオトラック（Amersham BIOTRAK）ＥＬＩＳＡキットを用いてヒトＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびエオタキシンを解析した。
【００５９】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
既知の転写因子結合モチーフ内に完全プロモーター配列または突然変異を保有するルシフェラーゼ連結ＲＡＮＴＥＳプロモーター構築物を、長崎大学のH. Moriuchi教授から入手した（Moriuchi et al., J. Immunol. 159, 5441-5449, 1997）。簡潔には、１０％ＦＣＳを含有するＭ１９９培地中で、ＨＰＭＣ（１ｘ１０４細胞／６ウエルマイクロタイタープレート）を、それらが６０〜７０％の集密に達するまで培養した。単層を洗浄し、個々のルシフェラーゼ連結プロモーター構築物(０．５〜１．０μｇ)で一晩、細胞をトランスフェクトした。標準リン酸カルシウム沈殿技法を用いて、一過性トランスフェクションを実施した（Graham and van de Eb, Virology, 52, 456-458, 1973）。一旦ＨＰＭＣを回収したら、実施例４に示したように、細胞を２４時間刺激した。細胞溶解物を調製し、市販のルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を用いて発光測定によりルシフェラーゼ活性を確定した。
【００６０】
核抽出物の調製
ＤＮＡ結合タンパク質の抽出のために、迅速技法を用いてＨＰＭＣから核抽出物を調製した。簡潔には、氷冷ＰＢＳ(ｐＨ７．４)中に細胞を収集し、遠心分離によりペレット化した。冷緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ(ｐＨ７．９)、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）中に細胞を再懸濁し、氷上でさらに２０分間インキュベートした。遠心分離により細胞砕片をペレット化し、必要になるまで上清を−８０℃で保存した。
【００６１】
電気泳動移動度シフトアッセイ(ＥＭＳＡ)およびスーパーシフト
前に記載されたように、ＥＭＳＡを実施した（Zhang et al., J. Biol. Chem. 272, 30607-30609, 1997）。ＮＦ−ｋＢ（５’−ＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣ−３’＆５’−ＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡ−３’）、ＳＴＡＴ−３（ＳＩＥ−ｍ６７  ５’ＣＧＡＣＡＴＴＴＣＣＣＧＴＡＡＡＴＣＧ−３’＆５’−ＣＧＡＣＧＡＴＴＴＡＣＧＧＧＡＡＡＴＧ−３’）およびＣ／ＥＢＰ（５’ＧＡＣＧＴＣＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＡＡ−３’＆５’−ＴＡＴＴＡＡＧＡＴＴＧＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣＧ−３’）結合に関するコンセンサスモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを、ＥＭＳＡで用いるためにアニーリングした。これらの二本鎖断片を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて［α３２Ｐ］−ｄＴＴＰで放射能標識した。核抽出物を標識コンセンサス配列とともにインキュベートし、６％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によりＤＮＡタンパク質相互作用を解明した。
【００６２】
実施例１
ＣＣＲ５−リガンドの示差的誘導
ヒト腹膜中皮細胞を４８時間成長を停止させた後、種々の濃度（０−５０ｎｇ／ｍｌ）のＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ(●)またはＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ(○)を１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６と組み合わせて用いて刺激した。一晩インキュベートした後、無細胞上清を収集し、特異的ＥＬＩＳＡを用いてケモカイン産生を測定した。値は、４つの個々の実験からの平均±ＳＥＭを表す。データは、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒが、ＩＬ−６の存在下で、ＣＣＬ３(ＭＩＰ−１α)、ＣＣＬ４(ＭＩＰ−１β)、ＣＣＬ５(ＲＡＮＴＥＳ)およびＣＸＣＬ１０(ＩＰ−１０)の発現を誘導し、一方、ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒは影響を及ぼさないことを示す(図６参照)。ＣＣＬ２(ＭＣＰ−１)およびＣＣＬ１１(エオタキシン)の誘導を、それぞれ陽性および陰性対照として示す。
【００６３】
実施例２
ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ媒介性ケモカイン放出の阻害
３０ｎｇ／ｍｌのＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒを１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６と組み合わせて用いて、成長停止ヒト腹膜中皮細胞を刺激した(２４時間)。ＥＬＩＳＡを用いて、ＣＣＬ２およびＣＣＬ５の放出を定量化した。図７Ａは、ヒト腹膜中皮細胞を処理前に４８時間成長停止したことを示す。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６＋２０ｎｇ／ｍｌのＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの存在下（中黒記号）または非存在下（中白記号）で、種々のモノクローナル抗体（０−５０μｇ／ｍｌ）を用いて細胞を処理した。ＭＡｂ２０６（抗ＩＬ−６）で処理した細胞を、中黒正方形として示す。ＭＡｂ２２７（抗可溶性ＩＬ−６）で処理した細胞を、中黒円形として示す。（ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒのカルボキシ末端に対する）ＭＡｂ２Ｆ３で処理した細胞を、中黒菱形として示す。馴化培地を２４時間後に収集し、ＥＬＩＳＡを用いてＣＣＬ２／ＭＣＰ−１およびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳレベルを定量化した。値は、４つの個々の実験からの平均±ＳＥＭを表す。
【００６４】
図７Ｂは、ＰＣ−ｓＩＬ−６ＲによるＲＡＮＴＥＳ産生の特異的遮断を示す。漸増濃度のＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ(０〜５０ｎｇ／ｍｌ)の存在下で、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ媒介性ＲＡＮＴＥＳ放出をモニタリングした(●)。ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６に応答するＲＡＮＴＥＳの分泌を、対照として示す(○)。値は、４つの個々の実験からの平均±ＳＥＭを表す。他の実験では、可溶性ｇｐ１３０、ハイパー−ＩＬ−６の封入により、ＲＡＮＴＥＳ放出を遮断した。
【００６５】
実施例３
ケモカイン誘導に関する時間経過
１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６の存在下で、５０ｎｇ／ｍｌのＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ(●)またはＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ(○)で成長停止ＨＰＭＣを刺激した。比較のために、非刺激細胞を示す(中白矩形)。設定時間間隔で無細胞上清を収集し、ＣＣＬ２(ＭＣＰ−１)およびＣＣＬ５(ＲＡＮＴＥＳ)の放出を測定した。値は、４つの個々の実験からの平均±ＳＥＭを表す。データは、ＣＣＬ２産生がｓＩＬ−６Ｒによる３〜４時間の刺激後に検出可能であるが、ＣＣＬ５のＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ媒介性放出は、初期刺激後１５時間まで観察されないことを示す(図８参照)。これらの所見は、ＣＣＬ５の発現の調節がＣＣＬ２の場合と異なることを示唆する。
【００６６】
実施例４
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
１．４ｋｂのＲＡＮＴＥＳプロモーター断片(ＲＡＮＴＥＳ−１．４)を含有するルシフェラーゼレポーター構築物または既知の転写因子コンセンサス配列内の種々の突然変異（△ＮＦ−ｋＢ、△ＳＴＡＴおよび△ＮＦ−ＩＬ−６）（Moriuchi et al., 1997 (上記)）を、ヒト腹膜中皮細胞中に一過性にトランスフェクトした。回収後、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６単独または５０ｎｇ／ｍｌのＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ(ＰＣ)またはＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ(ＤＳ)との組み合わせを用いて、細胞を刺激した。２４時間刺激した後、ルシフェラーゼ活性をモニタリングした。対照としてイオノマイシンを用いて△ＮＦ−ＩＬ−６構築物の活性を確証したが、イオノマイシンはルシフェラーゼ活性のおよそ４０倍の増大を誘導した(データは示されていない)。値は、個々の一次中皮細胞単離物を用いて実施した実験から得られた誘導の倍数を表し、平均±ＳＥＭ(ｎ＝４)を示す(図９参照)。これらのデータは、ＮＦ−ＩＬ−６の崩壊がルシフェラーゼ活性のＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ媒介性誘導を大幅に遮断したが、一方、ＰＣ−ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６単独は対照レベルを上回る構築物のいずれかによる増大を示さなかったことを示す。
【００６７】
実施例５
ＥＭＳＡ解析
１０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−βまたは１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を５０ｎｇ／ｍｌのＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ(ＰＣ)またはＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ(ＤＳ)と組み合わせて用いて、３０分間刺激したＨＰＭＣから核抽出物を単離した。ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ−３(ＳＩＥ  ｍ６７)およびＣ／ＥＢＰ(ＮＦ−ＩＬ−６)に関するコンセンサス配列を放射能標識し、核抽出物とともにインキュベートした。電気泳動による６％ポリアクリルアミドゲル上での分離によりタンパク質−ＤＮＡ相互作用を解析し、オートラジオグラフィーによりバンドを可視化した(図１０参照)。ＮＦ−κＢおよびＳＴＡＴ−３の活性化を対照として用いた。これらの初期実験は、ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲがＣ／ＥＢＰコンセンサス配列との結合強化を誘導することを重視する。このコンセンサスオリゴヌクレオチドは個々のＣ／ＥＢＰファミリー成員が区別されるようできないため、特異的抗体を用いる競合ＥＭＳＡおよびスーパーシフトアプローチを一般的に用いて、ＮＦ−ＩＬ−６α(Ｃ／ＥＢＰβ)またはＮＦ−ＩＬ−６β(Ｃ／ＥＢＰδ)の関与を確証する。
【００６８】
実施例６
ハイパーＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの発現および機能的特性化
無血清条件下でｐｃＤＮＡ−３(モック（Mock）)またはｐｃＤＮＡ−３／ハイパーＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ(ハイパーＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ)を用いて、ＣＯＳ−７細胞を一過性にトランスフェクトした。３７℃で２４時間インキュベートした後、馴化培地を収集し、特異的ＥＬＩＳＡを用いてヒトＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒの濃度を定量化した(図１１Ａ参照)。この馴化培地をさらに、血清不足ヒト滑膜繊維芽細胞に添加した。３７℃で２４時間インキュベートした後、馴化培地を収集し、特異的ＥＬＩＳＡを用いてヒトＣＣＬ２／ＭＣＰ−１およびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの濃度を定量化した(図９Ｂ参照)。値は、単一実験からの平均±ＳＤを表す。
【００６９】
実施例７
炎症能力
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）から調製された無細胞上清(ＳＥＳと呼ばれる)を用いて、野生型およびＩＬ−６欠損(ＩＬ−６ -/-)マウスの両方における腹膜炎症モデルの特性化を、本発明者等は以前報告した（Hurst et al., Immunity, 14, 705-714, 2001）。このモデルを用いて、ＩＬ−６ -/-マウスにおけるＤＳ−およびＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒの炎症能力を調べた。マウスに滅菌ＰＢＳ(対照)、１００ｎｇ／マウスのＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒおよび２５ｎｇ／マウスのヒトＩＬ−６(ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ)、１００ｎｇ／マウスのＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒおよび２５ｎｇ／マウスのヒトＩＬ−６(ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ)、ＳＥＳ単独(ＳＥＳ)あるいはＤＳ−ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６またはＰＣ−ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６と組み合わせて(それぞれＳＥＳ＋ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲまたはＳＥＳ＋ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ)、腹腔内投与した。３時間刺激した後、腹腔を洗浄し、炎症パラメーターを確定した。ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒに関して前に報告されたように（Hurst et al., Immunity, 14, 705-714, 2001）、両アイソフォームは、ＳＥＳへの曝露後、好中球の浸潤を阻害した(図１２Ａ参照)。ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳのレベルを洗浄液中でも測定し、それはＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ＋ＩＬ−６の作用により優先的に誘導されることが判明した本発明者等のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータと一致した(図１２Ｂ参照)。値は、平均±ＳＥＭを表す(ｎ＝３〜４匹の動物／条件＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．００１)。
【００７０】
実施例８
野生型(ＩＬ−６＋／＋)およびＩＬ−６欠損(ＩＬ−６−／−)マウスにおけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の発現
ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒによる受容体ＣＣＲ５(ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５)およびＣＸＣＲ３(ＣＸＣＬ１０)に特異的なケモカインの選択的誘導は、このアイソフォームが炎症の部位にＴリンパ球および単球を誘引するのに重要であり得ることを示唆する。これを試験するために、腹膜炎症の最近特性化されたモデルを用いて、ＩＬ−６＋／＋およびＩＬ−６−／−マウスにおけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０（ＣＲＧ−２、ＩＰ−１０のネズミ相同体）の一過性発現を確定した。このモデルは、腹膜透析患者が通常遭遇する細菌性腹膜炎エピソードに非常によく似ており、表皮ブドウ球菌から得られる無細菌細胞上清(ＳＥＳと呼ばれる)の腹腔内投与に基づいている（Hurst et al., 2001）。図１３Ａに示したように、ＳＥＳ曝露ＩＬ−６−／−マウスにおいて観察されたＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０発現に関するプロフィールは、ＩＬ−６＋／＋マウスにおいて遭遇するものとはかなり変更されていた。可溶性ｇｐ１３０(ｓｇｐ１３０)によるＩＬ−６＋／＋マウスにおけるｓＩＬ−６Ｒ活性の遮断は、ＳＥＳ処理ＩＬ−６＋／＋マウスで観察されるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０放出のプロフィールを、ＩＬ−６−／−マウスにおいて観察されるものに変換するため、発現のこれらの修飾パターンは、ｓＩＬ−６Ｒシグナル伝達の結果であった(図１３Ｂ)。
【００７１】
実施例９
ＩＬ−６−／−マウスにおけるＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ活性の機能的特性化
ＩＬ−６−／−マウスにおけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０放出の修飾パターンが白血球漸増に直接影響を及ぼすか否かを調べるために、ＩＬ−６＋／＋およびＩＬ−６−／−マウスをＳＥＳで曝露し、ネズミＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３に対する抗体を用いて腹腔から洗浄した細胞にＦＡＣＳ染色を施した(図１４)。ＳＥＳによるＩＬ−６＋／＋マウスの処理は、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３を保有する細胞型における増大を誘導したが、しかしながらこの浸潤はＳＥＳ処理ＩＬ−６−／−マウスにおいては減損された(図１４)。ＣＣＲ５＋／ＣＸＣＲ３＋細胞の浸潤は、ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６の存在下でＳＥＳで曝露しておいたＩＬ−６−／−マウスでも評価した(図１５Ａ)。ケモカインデータにより予測されるように、ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲによるＩＬ−６シグナル伝達の再構築は、ＣＣＲ５＋／ＣＸＣＲ３＋陽性細胞の流入をＩＬ−６＋／＋マウスにおいて遭遇するレベルに回復させた。これらの白血球の漸増増大はＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒに特異的であり、ｓｇｐ１３０により遮断された(図１５Ａ)。抗ＣＤ３および抗ＣＣＲ５で二重標識された細胞集団に関して、同様のデータを得た(図１５Ｂ)。これらの応答はＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒに特異的であり、ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒによって誘導されなかった(図１５ＡおよびＢ)。すべての場合に、ＩＬ−６−／−マウスへのＳＥＳの投与は、腹腔に補充された白血球の総数における有意の増大を誘導した(図１５Ｂ)。その結果として、ＩＬ−６はＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ結合によりＣＸＣＲ３およびＣＣＲ５を発現する白血球の誘引に影響を及ぼすと思われ、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの生物学的特性がＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒの場合と明らかに異なっていることに重点を置く。
【００７２】
インターロイキン−６(ＩＬ−６)は、炎症誘発性作用および抗炎症作用の両方を有すると記載されている。その防御特性に関しては、ＩＬ−６は、炎症誘発性サイトカイン発現を遮断するその能力により、そしてＩＬ−１受容体アンタゴニストおよび可溶性ｐ５５ＴＮＦα−受容体の放出を促進することにより、炎症性応答の程度を調整すると考えられる（Schindler et al., Blood 75, 40-44, 1990; Tilg et al., Blood, 83, 113-118, 1994およびXing et al., J. Clin. Invest. 101, 311-320, 1998）。インターロイキン−６は、感染または炎症の部位での好中球の蓄積がその作用により抑制されるため、白血球漸増にも影響を及ぼし得る（Ulich et al., Am. Pathol. 138, 1097-1102, 1991; Barton et al., Infect. Immunol. 61, 1496-1500, 1993およびXing et al., J. Clin. Invest. 101, 311-320, 1998）。実際、内毒素エーロゾルへのＩＬ６欠損（ＩＬ６−／−）マウスの曝露は、野生型（ＩＬ−６＋／＋）動物より極めて多数の気管支肺胞洗浄液中の好中球を生じる（Xing et al., J. Clin. Invest. 101, 311-320, 1998）。
【００７３】
ＩＬ−６媒介性応答の主要な調節は、コグネイトＩＬ−６受容体(ＩＬ−６Ｒ)の発現を欠く細胞型におけるＩＬ−６応答性を可能にするリガンド−受容体複合体を形成する可溶性ＩＬ６受容体(ｓＩＬ−６Ｒ)の存在である（Jones et al., FASEB. J. 15, 43-58, 2001）。この[ｓＩＬ６Ｒ／ＩＬ６]複合体は、サイトカインのＩＬ−６ファミリーに関して普遍的に発現されるシグナル伝達要素ｇｐ１３０との相互作用により普通はＩＬ−６に応答しない細胞を活性化する能力を有する（Jones et al., FASEB. J. 15, 43-58, 2001）。ｓＩＬ−６Ｒがある種のケモカイン(ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３)および接着分子(ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１)の発現を誘導し得るというのは、このメカニズムによる（Romano et al., Immunity 6, 315-325, 1997; Modur et al., J. Clin. Invest. 100, 2752-2756, 1997およびKlouche et al., J. Immunol. 163, 4583-4589, 2000）。近年、ｓＩＬ−６Ｒ放出は炎症の消散における重要な媒介物として作用し、感染の急性かつ優勢な好中球段階とより持続性の単核球流入との間の移行を支持することを本発明者等は提唱した。その結果として、ｓＩＬ−６Ｒ媒介性シグナル伝達は、白血球漸増に及ぼすＩＬ−６の上記の作用に寄与し得る。
【００７４】
本出願は、ＰＣ−ｓＩＬ−６ＲおよびＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒがある種のＣＣ−ケモカインの発現を調節することを示す。両形態はＭＣＰ−１発現を活性化することが判明したが、ＣＣＲ５リガンドＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの放出を引き出し得たのはＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒだけであった。これは、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒが単核球(Ｔリンパ球および単球)漸増および活性化において顕著な役割を務め得ることを意味する（Moser & Loetscher, 2001）。実際、ＣＣＲ５は、通常ある種の炎症性疾患に関連するＴｈ１細胞性応答に関するマーカーである（Qin et al., J. Clin. Invest. 101: 746-754, 1998; Sallusto et al., J. Exp. Med. 187: 875-883, 1998）。ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲによるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの特異的アップレギュレーションは、このｓＩＬ−６Ｒアイソフォームがこれらの部位へのこのＴ細胞サブセットのホーミングの制御に関与し得ることを示唆する。しかしながら、ＩＬ−６がＴ細胞に作用して、Ｔｈ１細胞へのそれらの分化を阻害することが近年報告された（Diehl et al., Immunity 13, 805-815, 2000）。この点で、ｓＩＬ−６Ｒは可溶性ｇｐ１３０の阻害能力を強化する拮抗性分子として作用することが示唆されている（Mueller-Newen et al., Eur. J. Biochem. 236, 837-842, 1998）ため、Ｔ細胞からのＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの放出（Horiuchi et al., Immunology 95, 360-369, 1994）は、Ｔｈ１分極の制御における別の役割も務め得る。したがって、任意の遊離ＩＬ−６を片付けることにより、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６がＴ細胞サブセットに直接作用し、それらの表現型に影響を及ぼすのを防止し得る。
【００７５】
今までのところ、ＮＦ−ＩＬ−６のＩＬ−６媒介性活性化により制御される炎症性事象についてはほとんどわかっていない。概してＩＬ−６は、転写因子のＳＴＡＴ−３およびＮＦ−ＩＬ−６ファミリーの活性化により２組の遺伝子を活性化すると考えられる。したがって急性期応答の場合、ＮＦ−ＩＬ−６はクラス１急性期タンパク質(例えば、Ｃ反応性タンパク質および血清アミロイド)の発現を調節することが報告されており、一方、クラス２急性期遺伝子、例えばフィブリノーゲンはＳＴＡＴ−３により制御される（Zhang et al., J. Biol. Chem. 272, 30607-30609. 1997）。ここに提示された証拠は明らかに、ｓＩＬ−６Ｒの両アイソフォームはＳＴＡＴ−３を活性化し得るが、ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲはＮＦ−ＩＬ−６トランス活性化を調節する特有の能力を保有することを示す。ＲＡＮＴＥＳの発現を、そしておそらくはＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの発現を調整すると考えられるのは、ＮＦＩＬ−６のこの示差的活性化である。この点で、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β発現の時間依存性解析は、ＭＣＰ−１が、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの場合よりかなり早期に誘導されることを明示した。ＣＣ−ケモカイン発現のこの見かけの示差的制御は、ｓＩＬ−６ＲアイソフォームによるＳＴＡＴ−３およびＮＦ−ＩＬ−６トランス活性化の個々の調節に起因し得る。
【００７６】
臨床試料の解析は、ｓＩＬ−６Ｒレベルが、示差的ｍＲＮＡスプライシングおよびタンパク質分解性（分断性）切断の両方により疾患進行中に独立して制御されることをすでに示している（Horiuchi et al., Immunology, 95, 360-369, 1998およびJones et al., FASEB. J. 15, 43-58, 2001）。したがってＤＳ−ｓＩＬ−６ＲおよびＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒは、独立してこの可溶性サイトカイン受容体の全体的特性に寄与し得る。顕性臨床的腹膜炎を有する連続的携行式腹膜透析(ＣＡＰＤ)中の患者から得られた腹膜流出液中のｓＩＬ−６Ｒに関する発現プロフィールを、近年本発明者等は解析した。これらの試料の解析により、総ｓＩＬ−６Ｒレベルは感染後最初の２４〜４８時間以内に上昇したが、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ濃度は炎症の３日目に大幅に増大しただけであったことが示された。これは、疾患の後期段階中のＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒに関する役割を暗示する。臨床的腹膜炎試料の解析により、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの発現が、１日目にピークに達し、３日目にはベースラインに戻るＭＣＰ−１の場合(データは示されていない)より、感染経過中のより後期（４日目）に起こることが分かった。実際、ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲによるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの特異的誘導は、これらのケモカインが炎症過程の後期に発現されるということを意味するだけでなく、それらの作用がＭＣＰ−１のようなその他のＣＣケモカインの場合とは異なることを意味する。この点で、すべてのＣＣＲ５−リガンドが樹状細胞によるＩＬ−１２産生を活性化し得るということが示されているが、一方、ＭＣＰ−１〜４はγ−ＩＦＮ活性化単核球によるＩＬ−１２産生を抑制することが報告されている（Aliberti et al., Nature Immunol. 1, 83-87, 2000; Braun et al., J. Immunol, 164, 3009-3017, 2000）。したがって、ｓＩＬ−６ＲアイソフォームによるＣＣケモカインの示差的発現は、異なる単核球亜集団の漸増に寄与するだけでなく、炎症の消散に関与するその他の媒介物質の発現プロフィールにも影響し得る。
【００７７】
３つのケモカインすべて、ならびにＨＩＶのＭ栄養株はＣＣＲ５を結合するので、高レベルのＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳがＣＣＲ５結合に関してウイルスと競合し、ＨＩＶ進入を有効に抑制する。したがってケモカインを支持してこの競合の平衡を矯正し得る任意の因子が、ＨＩＶ療法として有用であり得る。したがって本発明の融合タンパク質の使用は、感染性作用因子がＣＣＲ５に、特にＨＩＶのＭ栄養株に結合する任意の疾患の治療に有用である。
【００７８】
本明細書中に参照された科学文献、特許および特許出願はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中に援用される。
【００７９】
本発明は単に例示として記載されたものであって、詳細の修正は添付の特許請求の範囲で定義されるような本発明の範囲内でなされ得る、と理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】Ｈ−ＩＬ−６の概略図を示す。
【図２】膜ボード形態、ＤＳ−ｓＩＬ−６ＲおよびＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒを含めた完全ＩＬ−６Ｒタンパク質配列を示す。推定膜貫通ドメインに下線を付す。
【図３】配列ＩＬ−６を示す。
【図４】配列ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒを示す。
【図５】フレキシブルリンカーによりＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ（ハイパーＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ）に連結されたＩＬ−６の配列を示す(この場合、リンカーおよびＣＯＯＨ末端ｃ−ｍｙｃタグ配列に下線を付す)。
【図６】ヒトＩＬ−６と組み合わせたＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ(●)またはＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ(○)によるＣＣＲ５リガンドの示差的誘導を示す。
【図７】(Ａ)種々のモノクローナル抗体および(Ｂ)ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒを用いたＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ媒介性ケモカイン放出の阻害を示す。
【図８】ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ(●)およびＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ(○)によるケモカイン誘導に関する時間経過を示す。
【図９】ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。
【図１０】ＥＭＳＡ解析の結果を示す。
【図１１】ハイパーＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの発現および機能的特性化を示す。(Ａ)は産生された媒介物質のレベル(グラフの上左手角参照)を示し、(Ｂ)は産生されたＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳのレベルを示す。
【図１２】ＰＣ−ｓＩＬ−６Ｒ、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ、ＳＥＳ、ＳＥＳ＋ＰＣ−ｓＩＬ−６ＲおよびＳＥＳ＋ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒの炎症性能力を示す。
【図１３】ＩＬ−６＋／＋およびＩＬ−６−／−マウスにおけるＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の発現を示すが、この場合、(Ａ)野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＩＬ−６＋／＋）およびＩＬ−６−／−マウスにはＳＥＳまたはＰＢＳを腹腔内投与し、指示間隔で腹腔を洗浄し；（Ｂ）ＩＬ−６＋／＋マウスにはＰＢＳ、１５０ｎｇ／マウスのｓｇｐ１３０単独、ＳＥＳまたは１５０ｎｇ／マウスのｓｇｐ１３０と組み合わせたＳＥＳを投与した。指示時間間隔で、腹腔を洗浄した。両方の場合において、ＥＬＩＳＡを用いて、洗浄液中の、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０レベルを定量化した。値は平均±ＳＥＭ(ｎ＝マウス６匹／条件)として表す。
【図１４】ＩＬ−６＋／＋およびＩＬ−６−／−マウスにおけるＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３を発現する細胞の漸増を示すが、この場合、ＩＬ−６＋／＋およびＩＬ−６−／−マウスにはＰＢＳ(対照)またはＳＥＳを投与した。１２時間後、腹腔を洗浄し、回収細胞をＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３に関して抗体で二重標識し、ＦＡＣＳにより解析した。対照抗体による自己蛍光により四分円を設定し、各条件に関する代表的散乱プロットと一緒に、上右セグメント中にある細胞のパーセンテージを提示する(マウス４〜６匹／実験条件からの平均±ＳＥＭ)。値は、各条件に関してマウス４〜６匹からの平均(％)±ＳＥＭを表す。
【図１５Ａ】ＩＬ−６＋／＋およびＩＬ−６−／−マウスにおけるＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３を発現する細胞の漸増を示す。ＩＬ−６−／−マウスを、ＳＥＳの存在下または非存在下で、ＤＳ−ｓＩＬ−６Ｒ(２５ｎｇ／マウス)およびＩＬ−６ (２０ｎｇ／マウス)(ＤＳ／ＩＬ−６)の組み合わせで処理した。可溶性ｇｐ１３０(１５０ｎｇ／マウス)も指示通りに含まれた。対照抗体による自己蛍光により四分円を設定し、各条件に関する代表的散乱プロットと一緒に、上右セグメント中にある細胞のパーセンテージを提示する(マウス４〜６匹／実験条件からの平均±ＳＥＭ)。
【図１５Ｂ】回収細胞のパーセンテージをＣＣＲ５およびＣＤ３に関して抗体で二重標識した(上グラフ)。値は、各条件に関してマウス４〜６匹からの平均(％)±ＳＥＭを表す。各実験条件に関する総白血球流入(下グラフ)。値は、各条件に関してマウス４〜６匹からの平均(％)±ＳＥＭを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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