(57)【要約】本発明は、合成ＲＮＡ、より具体的には、組織因子（ＴＦ）の発現を調節できる短い干渉（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ならびに、合成ｓｉＲＮＡを含む医薬製剤およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１９のヌクレオチドを含む、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡであることを特徴とし、組織因子（ＴＦ）コード核酸配列またはその断片に特異的な短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）分子（ｓｉＲＮＡ）であって、以下からなる群から選択されるｓｉＲＮＡ分子：
（ａ）配列番号１〜配列番号８に示される核酸配列を有するｓｉＲＮＡ分子、
（ｂ）（ａ）のｓｉＲＮＡ分子と約９０％相同である配列を有するｓｉＲＮＡ分子、
（ｃ）配列番号１〜配列番号８の５’または３’末端方向のいずれかに７ヌクレオチドまで移動している標的部位を有する配列を含むｓｉＲＮＡ分子、
（ｄ）（ｃ）のｓｉＲＮＡ分子と約９０％相同である配列を有するｓｉＲＮＡ分子、および
（ｅ）配列中の１個以上の２’−ＯＨヒドロキシル基へのＣ１〜Ｃ３−アルキル、Ｃ１〜Ｃ３−アルケニルまたはＣ１〜Ｃ３−アルキリル基の導入によって、および／またはリン酸ジエステル結合をホスホロチオ酸結合で置換することによって修飾されている、（ａ）〜（ｄ）の核酸配列を有するｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
二本鎖であることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡが２１〜２５ヌクレオチド長、好ましくは２１ヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡが配列番号１〜配列番号８によって特定されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項５】
ＴＦまたはその断片が脊椎動物起源、好ましくは哺乳類起源、より好ましくはヒト起源のものである、請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡの切断を誘導することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡが配列番号１または配列番号２によって特定されることを特徴とする、請求項６に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項８】
ｓｉＲＮＡが配列番号１〜配列番号８に示される野生型に対して修飾されていることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項９】
ｓｉＲＮＡが配列番号１０〜３１に示される配列であることを特徴とする、請求項８に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項１０】
配列が、配列中の１個以上の２’−ＯＨヒドロキシル基へのＣ１〜Ｃ３−アルキル、Ｃ１〜Ｃ３−アルケニルまたはＣ１〜Ｃ３−アルキリル基の導入によって修飾されていることを特徴とする、請求項８に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡが配列番号９、１０または１１に示される配列であることを特徴とする、請求項８に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項１２】
配列が、リン酸ジエステル結合をチオホスホジエステル結合で置換することによって修飾されていることを特徴とする、請求項８に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項１３】
ｓｉＲＮＡが配列番号２４、２８または２９に示される配列であることを特徴とする、請求項１２に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項１４】
ｓｉＲＮＡが配列番号２９に示される配列であることを特徴とする、請求項１２に記載のＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の、１種以上の短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）分子（ｓｉＲＮＡ）を含むことを特徴とする、医薬製剤。
【請求項１６】
配列番号１および配列番号２を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
配列番号配列番号９、１０または１１を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
配列番号２４、２８または２９、好ましくは配列番号２９を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
例えば、希釈剤、潤滑剤、結合剤、担体分解手段、吸着手段、着色剤、甘味料および／または香味剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項２０】
アジュバントおよび／または他の治療用成分を含むことを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項２１】
例えば、非経口的に（例えば、皮下、静脈内、筋内または腹腔内注射または注入による）、経口で、経鼻で、頬側に、直腸に、膣に、および／または吸入もしくはガス注入によって投与することができることを特徴とする、請求項１５〜２０のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項２２】
従来の非毒性の製薬上許容される担体、アジュバントおよび／または賦形剤を含む投与製剤で、例えば、注入溶液または懸濁液、エアロゾル、カプセル剤、錠剤、丸剤、スプレー、座剤などとして製剤されることを特徴とする、請求項１５〜２１のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項２３】
一用量で、単回または複数回用量で、または徐放性製剤によって投与されることを特徴とする、請求項１５〜２２のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項２４】
単独でまたは他の医薬とともに投与されることを特徴とする、請求項１５〜２３のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項２５】
脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトにおける、望ましくない血液凝固の治療、予防および／または阻害に適した医薬製剤を調製するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の１種以上の短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）分子（ｓｉＲＮＡ）の使用。
【請求項２６】
医薬製剤を、例えば、非経口的に（例えば、皮下、静脈内、筋内または腹腔内注射または注入による）、経口で、経鼻で、頬側に、直腸に、膣に、および／または吸入もしくはガス注入によって投与できる、請求項１４に記載の使用。
【請求項２７】
望ましくない血液凝固の治療、予防および／または阻害に適した前記医薬製剤を、そのような処置が必要な動物またはヒトに投与することを特徴とする、請求項１５〜２４のいずれかに記載の医薬製剤の使用方法。
【請求項２８】
投与経路が、例えば、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋内または腹腔内注射または注入による）、経口、経鼻、頬側に、直腸に、膣に、および／または吸入もしくはガス注入によってであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成ＲＮＡ、より具体的には、組織因子（ＴＦ）の発現を調節できる短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）、ならびに合成ｓｉＲＮＡを含む医薬製剤およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
望ましくない遺伝子発現を抑制するメカニズムは、正常な細胞機能にとって重要であり、ＲＮＡ抑制は、種々の生物での独立した研究からこの１０年の間に融合された新しい研究分野である。相同ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列間の相互作用が、遺伝子を抑制し、ＤＮＡメチル化を誘導できることはかなり以前から知られていた（１）。１９８８年のＣ．エレガンスにおけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の発見により、遺伝子抑制の誘発物として二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が注意を集め、今では、植物における多数の遺伝子抑制作用がｄｓＲＮＡによって媒介されていることが知られている（１）。
【０００３】
ＲＮＡｉは、通常、細胞質においてｄｓＲＮＡが相同ｍＲＮＡの分解の誘因となる、転写後遺伝子抑制（ＰＴＧＳ）現象として記載されている（１）。しかしながら、核ｄｓＲＮＡが、相同ＤＮＡ配列の後成的修飾および転写レベルでの抑制を導く経路に入る可能性は軽視されるべきではない。また、ＲＮＡ抑制の核での側面は、主に植物で研究されてきたが、類似のＲＮＡを標的とするＤＮＡまたはクロマチン修飾が、同様に他の生物で起こる可能性があることが示唆される。
【０００４】
動物におけるＲＮＡｉと植物におけるＰＴＧＳという関連現象は、高度に保存された同じメカニズムによって生じ、このことは、古い起源を示唆する（１）。基本的なプロセスは、相同メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の認識および標的とされる切断を導く、短い単位（短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）；ｓｉＲＮＡと呼ばれる）へと加工されるｄｓＲＮＡと関係している。（プロセシング後に）ＲＮＡｉ／ＰＴＧＳを誘発するｄｓＲＮＡは、多くの様式で核または細胞質で生じ得る。
【０００５】
ｄｓＲＮＡの、次いでｍＲＮＡを分解するｓｉＲＮＡへの加工は、２段階のＲＮＡ分解プロセスである。第１段階は、ｄｓＲＮＡを２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）長のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ、すなわち、ｓｉＲＮＡへと加工するｄｓＲＮＡエンドヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＩＩＩ様；ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ様）活性と関係している。ショウジョウバエでは、このＲＮａｓｅ  ＩＩＩ型タンパク質はダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれている。第２のステップでは、生じた複数のアンチセンスｓｉＲＮＡが結合し、ＲＮＡ誘導型抑制複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる種々のリボヌクレアーゼ複合体のガイドとして働き、これが相同一本鎖ｍＲＮＡを切断する。ＲＩＳＣは、ｍＲＮＡをアンチセンスｓｉＲＮＡと対合した領域のほぼ中央で切断し、その後ｍＲＮＡはさらに分解される。
【０００６】
種々の供給源由来のｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉ／ＰＴＧＳを導く加工経路に入ることができる。さらに、最近の研究はまた、ｄｓＲＮＡ切断については１つ以上の経路があり、機能的に同等でないこともある別の種類のｓｉＲＮＡを生じる場合があることも示唆する。
【０００７】
ＲＮＡ抑制（細胞質および核において、遺伝子発現の種々のレベルで活性である）は、転位因子およびウイルス（その多くは複製の際にｄｓＲＮＡを生じる）などの異種の配列の増殖に立ち向かうために進化したと思われる。しかしながら、ＲＮＡｉ／ＰＴＧＳは、離れた部位で抑制を誘導する可動性のシグナルを生じるので、タンパク質合成および／または機能を停止させるために、哺乳類細胞における治療ツールとしてｓｉＲＮＡを直接注入するという可能性が考慮されるべきである。
【０００８】
今までのところ、ｓｉＲＮＡ配列中の突然変異または化学的修飾の一般的な作用については、ほとんど知られていない。Ｂｏｕｔｌａら（１４）は、ショウジョウバエで、ｍＲＮＡ標的配列に対して、中央に位置する単一のミスマッチを含む突然変異したｓｉＲＮＡが実質的な活性を保持することを報告した。対照的に、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（１５）は、試験管内ショウジョウバエ胚溶解物検定法において、単一のミスマッチが活性に対して有害であることを見出した。本願では、本発明者らは、いくつかの因子、中でも、ｓｉＲＮＡ標的位置、ｓｉＲＮＡ濃度、ｍＲＮＡ濃度、ｍＲＮＡ生成およびｓｉＲＮＡ固有の切断活性、ミスマッチ突然変異によって徐々に減少し得る活性が最終結果に影響を及ぼす動的プロセスとして、生体内でのＲＮＡｉプロセスを描くことによって、これら２つの相反する結果を調整しようと試みた。
【０００９】
いくつかの他の結果も報告されている。例えば、Ｊａｃｑｕｅら（１６）は、ＨＩＶのＬＴＲをターゲッティングするｓｉＲＮＡにおける単一のミスマッチにより、活性の一部だけが失われたが、ＨＩＶのＶＩＦをターゲティングする別のｓｉＲＮＡは活性をほとんど全く失わなかったことを見出している。しかしながら、４種の突然変異により活性が完全に消失した。活性が完全に消失する他の例は、それぞれ５、６および７種の突然変異を用いて、Ｇｉｔｌｉｎら（１７）、Ｋｌａｈｒｅら（１８）およびＧａｒｒｕｓら（１９）によっても見られている。Ｂｏｕｔｌａおよび本発明者ら自身のグループ（１４、１５）によって用いられた中枢の二重突然変異は、活性の大きな喪失をもたらしたが、これはＹｕら（２０）およびＷｉｌｄａら（２１）（後者は１７塩基対しかないｓｉＲＮＡを用いた）についても同様であった。本発明者らの極めて活性な末端メチル化ｓｉＲＮＡを考慮して興味深いことは、２’−ＯＨが完全にメチル化されたｓｉＲＮＡが不活性であるというＴｕｓｃｈｌの報告である。
【００１０】
さらに、単一の突然変異による活性の消失について２つの公開された報告が存在する。しかしながら、そのうちの一方、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２２）による研究は、Ｄｉｃｅｒの作用によってｓｉＲＮＡが生じると仮定される短いヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）を用いるものである（２３）。このｓｈＲＮＡ構築物は、ｓｈＲＮＡの推定上２番目のヌクレオチドの単一の突然変異によってか、または推定上９番目のヌクレオチドの単一のミスマッチによってのいずれかで不活性化された。他方、Ｇｉｔｌｉｎら（１７）は、ゲノムＲＮＡの標的部位に単一の突然変異を含むｓｉＲＮＡ耐性ポリオウイルス株を単離することによって、双方ともセンス鎖の５’末端から数えてｓｉＲＮＡの６番目のヌクレオチドまたは９番目のヌクレオチドのいずれかにおける、より強力な単一突然変異不活性化の事例を論じた。すべてを考慮すると、異なるｓｉＲＮＡは、異なる程度に不活性化されると思われる。
【００１１】
従来、核酸の化学的修飾は、特に、一本鎖核酸配列をヌクレアーゼ分解から保護し、そのようにして半減期のより長い配列を得るために用いられてきた。例えば、ＷＯ９１／１５４９９には、アンチセンスプローブとして有用な２’Ｏ−アルキルオリゴヌクレオチドが開示されている。また、２−Ｏ−メチル化は、ハンマーヘッド型リボザイムを安定化させるために用いられてきた（４）。しかしながら、ｓｉＲＮＡの化学的修飾の作用についてはほとんど知られていない。さらに、５’末端ヌクレオチドの２’ヒドロキシルにおける大きな置換基の存在は、ｓｉＲＮＡの活性に必要であるとわかっているｓｉＲＮＡの適切なリン酸化を妨害する可能性がある（２４）。
【００１２】
したがって、個体群中の種々のｓｉＲＮＡの固有の異なる活性は、異なるｓｉＲＮＡが、異なる方法での化学的または突然変異によるｓｉＲＮＡ修飾によって影響を受けることを意味する。
【００１３】
組織因子（ＴＦ）は、血液凝固の最も強力な誘因であり（２）、アテローム硬化性プラークの破裂の際に動脈血栓症を引き起こすきっかけとなる。また、癌細胞における高含量のＴＦは、癌性血管形成および転移傾向と相関しているという十分な証拠もある。さらに、ＴＦは敗血性播種性血管内血液凝固症候群（例えば、髄膜炎菌性敗血症）の場合には中心的な病原として重要なものである。したがって、ＴＦを調節または抑制する方法には大きな価値がある。
【００１４】
特許出願ＷＯ０１／７５１６４（Ａ２）には、ｄｓＲＮＡが２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）長のＲＮＡセグメントにプロセシングされることを証明するために用いられているショウジョウバエの試験管内検査システムが開示されており、これでは、これらの２１〜２３ｎｔ断片は、ＲＮＡ分解の特異的媒介物質である。Ｃａｐｌｅｎら（２８）はＣＡＴ遺伝子およびＣ．エレガンスのｕｎｃ−２２遺伝子に対して向けられる合成ｓｉＲＮＡが、それぞれ脊椎動物および無脊椎動物系で発現を減少させたことを報告している。しかしながら、ＷＯ０１／７５１６４もＣａｐｌｅｎら（２８）も、哺乳類においてＴＦの発現を直接調節できるｓｉＲＮＡに関しては何ら開示していない。ＪａｎｏｗｓｋｙおよびＳｃｈｗｅｎｚｅｒ（２６）は、特に、ハンマーヘッド型リボザイム構築物とｈＴＦに対して向けられたオリゴヌクレオチド促進物（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）とを用いて実例をあげて、オリゴヌクレオチド促進物によるハンマーヘッド型リボザイムの活性化を報告している。しかしながら、ＪａｎｏｗｓｋｙおよびＳｃｈｗｅｎｚｅｒ（２６）によって用いられたような、ハンマーヘッド型リボザイムおよびオリゴヌクレオチド促進物を用いて遺伝子発現を阻害するメカニズムは、ｓｉＲＮＡがＴＦコード遺伝子などのいずれかの遺伝子の発現を阻害するメカニズムとは明らかに異なる。
【００１５】
抗体に関する以前の研究は別として、臨床上有用なＴＦの直接の阻害因子は得られておらず、遺伝子発現レベルでうまく調節することもできていない。植物におけるトランス遺伝子の抑制に関する研究は、遺伝子発現を抑制するためのかなり一般的な機会をもたらし、ｄｓＲＮＡは、例えば、植物、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）およびショウジョウバエでは、遺伝子抑制のための日常的に用いられるツールとしてすでに確立されている（３）。しかしながら、ｄｓＲＮＡは、作用が特定されていないために哺乳類細胞では使用できない。さらに、すべての遺伝子発現が、例えば、オリゴヌクレオチド（合成鎖）、リボザイムまたはｓｉＲＮＡ分子の使用によって、ほぼ抑制され得るとしても、特定の遺伝子の抑制においてｓｉＲＮＡとして活性であるｓｉＲＮＡを合成するために用いられるべきであるｍＲＮＡ配列の、どの部分がここでひどく位置依存的であるのかを正確に見出すことは極めて困難である。この特徴は、同一遺伝子の異なる配列に対して向けられたｓｉＲＮＡ配列が、異常な特徴は示さずに、全く異なる効率を示したという結果であったＨａｒｂｏｒｔｈら（３１）によって報告された結果によってさらに支持される。さらに、ｍＲＮＡ標的上の部位は、リボザイムにとって接近しやすさも異なり得る（４）ので、ほとんどまたはまったく毒性のない、ＴＦに対して実際に有効なリボザイム同定しようとする試みは、まだ成功していない。したがって、哺乳類においてＲＮＡｉを利用しようとする本試みが、遺伝子治療における新規発展をもたらし得ること（５）、およびｓｉＲＮＡが哺乳類ＴＦの特異的抑制におけるツールを提供し得ることが望まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本発明の目的は、ＲＩＳＣとともに、哺乳類においてＴＦの発現を直接調節できるｓｉＲＮＡを提供することである。これらの目的は、開示される特許請求の範囲を特徴とする本発明によって達成された。一般に、本発明は、二本鎖または一本鎖であり、少なくとも２１〜２５ヌクレオチドを含み、ＴＦの遺伝子発現を調節できる、ｓｉＲＮＡ分子に関する。
【００１７】
ｓｉＲＮＡとは、配列特異的ＲＮＡ分解の誘発において重要な中間体として機能するとわかっている約２１〜２５ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。本発明者らは、ｓｉＲＮＡおよび凝固誘発因子ＴＦを用いた研究で、ｓｉＲＮＡがＲＮａｓｅ  ＩＩＩ様ＲＮＡｉ阻害因子Ｄｉｃｅｒを回避し、エフェクターヌクレアーゼＲＩＳＣを直接チャージでき、その結果ＴＦ  ｍＲＮＡが分解されることを示している。本発明によれば、同一の標的に対する異なるｓｉＲＮＡは効率が異なることが示されており、したがって、ｓｉＲＮＡをＴＦ  ｍＲＮＡの種々の部分に対して合成し、その後、これはＲＩＳＣと結合し、次いで、ＴＦ  ｍＲＮＡの特異的分解／抑制が導かれる。
【００１８】
また、本発明のｓｉＲＮＡは、本発明のｓｉＲＮＡ分子の野生型配列と比べて１つまたは２つの塩基対合突然変異を含み得る、すわなち、修飾された配列は、本発明の野生型ｓｉＲＮＡ分子と約９０％相同である。
【００１９】
本発明はまた、本発明の野生型ｓｉＲＮＡと比べて化学的に修飾された、すなわち、２’−ＯＨ位への低級アルキル、例えば、メチルの導入による、または配列へのホスホロチオエート架橋の導入により修飾されたｓｉＲＮＡ分子を開示する。
【００２０】
本発明は、ｓｉＲＮＡ抑制は比較的安定であるが、経時的に低下すること、および単一のｓｉＲＮＡトランスフェクション後５日（１２０時間）の期間にわたって、ＴＦ凝固活性は５〜１０倍低下するが、残存し得ることをさらに開示する。したがって、本発明はまた、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬製剤、ならびに医薬製剤の使用に関する。本発明者らの知見によれば、本発明は、哺乳類細胞における複雑な生理学的系の根底にある遺伝子発現のｓｉＲＮＡ抑制をはじめて開示する。観察された位置的作用は、効率的なｓｉＲＮＡの探索をより骨の折れるものにするが、同定されれば、効率的なｓｉＲＮＡは、これからのインビボ検査にとってさらに大きな展望を示す。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
より具体的には、本発明は、少なくとも１９のヌクレオチドを含む二本鎖または一本鎖ｓｉＲＮＡであることを特徴とし、組織因子（ＴＦ）コード核酸配列またはその断片に向けられ、以下からなる群から選択される短い干渉ＲＮＡ分子（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）を開示する：
（ａ）配列番号１〜配列番号８に示される核酸配列を有するｓｉＲＮＡ分子、
（ｂ）（ａ）のｓｉＲＮＡ分子と約９０％相同である配列を有するｓｉＲＮＡ分子、
（ｃ）配列番号１〜配列番号８の５’または３’末端方向のいずれかに７ヌクレオチドまで移動している標的部位を有する配列を含むｓｉＲＮＡ分子、
（ｄ）（ｃ）のｓｉＲＮＡ分子と約９０％相同である配列を有するｓｉＲＮＡ分子、および
（ｅ）配列中の１個以上の２’−ＯＨヒドロキシル基へのＣ１〜Ｃ３−アルキル、Ｃ１〜Ｃ３−アルケニルまたはＣ１〜Ｃ３−アルキリル基の導入によって、および／またはリン酸ジエステル結合をホスホロチオ酸結合で置換することによって修飾されている、（ａ）〜（ｄ）の核酸配列を有するｓｉＲＮＡ。
【００２２】
一態様によれば、本発明のｓｉＲＮＡは二本鎖であることが好ましい。もう１つの態様によれば、本発明のｓｉＲＮＡは２１〜２５ヌクレオチド長、より好ましくは２１ヌクレオチド長であり、さらにより好ましくは、配列番号１〜配列番号８で特定される。
【００２３】
本発明のさらにもう１つの態様によれば、ｓｉＲＮＡは、脊椎動物起源、好ましくは哺乳類起源、より好ましくはヒト起源であるＴＦまたはその断片を対象とする。
【００２４】
さらに、本発明のｓｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断を誘導することが好ましく、この事象は配列番号１または配列番号２によって特定されることがより好ましい。
【００２５】
さらに、もう１つの態様によれば、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１〜配列番号８に示されるｓｉＲＮＡ分子と約９０％相同である配列を含むこと、またはｓｉＲＮＡが１個以上の２’−ＯＨヒドロキシル基にＣ１〜Ｃ３−アルキル、Ｃ１〜Ｃ３−アルケニルもしくはＣ１〜Ｃ３−アルキリル基が導入されている配列番号１配列〜配列番号８に示される配列を含むことが好ましい。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号９〜配列番号１１に示される配列を有する。
【００２６】
さらに、もう１つの態様によれば、本発明のｓｉＲＮＡ分子が、リン酸ジエステル結合がチオホスホジエステル結合で置換されている配列番号１〜配列番号８に示される配列を含むことが好ましい。修飾された配列が、配列番号２４、２８または２９の配列であることが好ましく、より好ましくは配列番号２９である。
【００２７】
さらにもう１つの態様によれば、本発明はまた、望ましくない血液凝固を治療、予防または阻害する方法に関し、これでは、本発明の１種以上のｓｉＲＮＡを含む医薬製剤を、そのような治療が必要な動物またはヒトに投与する。本発明の製剤は、配列番号１〜８のうちの１種以上を含むことが好ましく、配列番号１および／または配列番号２を含むことがより好ましい。
【００２８】
さらにもう１つの態様では、本発明は、本発明の１種以上のｓｉＲＮＡを含む医薬製剤に関する。本製剤は、配列番号１または２に示されるｓｉＲＮＡを含むことが好ましい。本発明の製剤が、配列番号９、１０、１１、２４、２８または２９に示される配列のうち１種以上を含むことも好ましく、配列番号２９を含むことががより好ましい。本発明の製剤はさらに、例えば、希釈剤、潤滑剤、結合剤、担体、分解手段、吸着手段、着色剤、甘味料および／または香味剤を含む。本製剤が、アジュバントおよび／または他の治療用成分を含むことも好都合である。
【００２９】
さらに、さらにもう１つの態様では、本製剤は、例えば、非経口的に（例えば、皮下、静脈内、筋内または腹腔内注射または注入による）、経口で、経鼻で、頬側に、直腸に、膣に、および／または吸入もしくはガス注入によって投与できる。本製剤は、従来の非毒性の製薬上許容される担体、アジュバントおよび／または賦形剤を含む投与製剤で、例えば、注入溶液または懸濁液、エアロゾル、カプセル剤、錠剤、丸剤、スプレー、座剤などとして製剤することがより好ましい。本発明の製剤は、一用量で、分割用量で、または徐放性装置によって、好ましくは、単独でまたは他の医薬とともに投与できることが好ましい。
【００３０】
さらに、本発明はまた、脊椎動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくはヒトにおける、望ましくない血液凝固の治療、予防および／または阻害に適した医薬製剤を調製するための、１種以上の本発明のｓｉＲＮＡの使用に関する。本発明の使用にしたがって調製した製剤は、例えば、非経口で（例えば、皮下、静脈内、筋内または腹腔内注射または注入による）、経口で、経鼻で、頬側に、直腸に、膣に、および／または吸入もしくはガス注入によって）投与できることが好ましい。
【００３１】
最後に、本発明はまた、本発明の医薬製剤の使用方法を開示し、これでは、望ましくない血液凝固の治療、予防および／または阻害に適した前記医薬製剤を、そのような処置が必要な動物またはヒトに投与する。本発明の方法にしたがう投与経路としては、例えば、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋内または腹腔内注射または注入による）、経口、経鼻、頬側に、直腸に、膣に、および／または吸入もしくはガス注入による経路がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明を以下、図および実施例を参照してより詳細に記載する。
【００３３】
ヒトＴＦ（ｈＴＦ）の抑制を得るためのｓｉＲＮＡを提供するために、２１ヌクレオチドのＲＮＡを、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（ＰｈａｒｍａｃｉａおよびＡＢＩ）を用いて化学合成した。脱保護し、脱シリル化した合成オリゴリボヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣで精製した。リボヌクレオチドを、５００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５に溶かした１０μＭで、煮沸し、水槽で徐々に冷却することによってアニーリングさせた。アニーリングの成功は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。各々、ヒトＴＦ（受託番号Ｍ１６５５３）ｍＲＮＡ内の部位をターゲッティングするｓｉＲＮＡ種を、２つのヌクレオチドデオキシチミジン３’オーバーハングを持たせて設計し、前記のＧｅｎｂａｎｋエントリーの番号付けを用い、センス鎖の最初のヌクレオチドの位置にしたがって名づけた（図１ａ）。本発明にしたがって、ｈＴＦ  ｍＲＮＡに対する１３種のｓｉＲＮＡ（６）を合成した（図１ａ）。これらのうち８種（最初の８種）のｓｉＲＮＡを、それぞれ、配列番号１〜配列番号８と命名し、ｈＴＦ遺伝子上で選択された部位のいくつかは、本発明者らの先に記載したリボザイム検定法（４）で、２つの最も接近しやすいもの（配列番号１および２）および２つの最も接近しにくいもの（配列番号３および４）であった。本発明は、配列番号１〜配列番号８の合成ｓｉＲＮＡに関する。
【００３４】
突然変異が全ｓｉＲＮＡ内で等しく許容されたかどうかを調べるために、本発明のｓｉＲＮＡを、より体系的に位置づけた。ｓｉＲＮＡの二本鎖安定性に影響を及ぼすことを避けるために、以下の実施例５で記載するように、ＧＣ対のみを、対の逆位による突然変異の標的とした。
【００３５】
さらに、ヒト細胞におけるｓｉＲＮＡの作用は一過性であり、通常、細胞培養物中では２、３日で消滅する（ＮＯ  ２００２  ０６１２，２９，３０）。有効な抑制期間を延長する能力は、ｓｉＲＮＡの治療薬としての最終的な使用にとっては極めて重要であろう。したがって、本発明者らは、種々の化学修飾を、量を徐々に増加して、ｓｉＲＮＡの両端に導入することによって、活性を損なうことなくｓｉＲＮＡの細胞内安定性を高めることを目指した。本発明者らはこれまでに、ハンマーヘッド型リボザイムを安定化させるために、リン酸塩架橋ならびにメチル化およびアリル化の形の２’−Ｏ−修飾を使用しており（４）、ｓｉＲＮＡの安定化に対する同様の戦略の可能性を調べることとした。
【００３６】
二重ルシフェラーゼ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）に用いるためのヒトＴＦのレポーター構築物を、ホタルルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子とフレーム単位でクローニングされたＴＦのコード領域を用いて設計し、融合構築物ＴＦ−ＬＵＣ（受託番号ＡＦ４１６９８９）を得た。融合構築物の番号付けは、ＴＦのｇｅｎｂａｎｋエントリーのものおよびＬＵＣのｐＧＬ３エンハンサープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を指す。ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ；示していない）をコードする、プラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｒｌｕｃ（受託番号ＡＦ４１６９９０）を内部対照として用いた。構築物内に含まれるＴＦおよびＬＵＣ  ｃＤＮＡの領域を図１ｂに示す。二重ルシフェラーゼ系は、レポーター系であり、これを用いてｓｉＲＮＡによって分解されるＴＦ  ｍＲＮＡがどの程度であるかを検出する。
【００３７】
ＨｅＬａ、Ｃｏｓ−１および２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加した、ダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）で維持した。ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴは、２．５ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子および２５μｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物を添加した、血清を含まないケラチノサイト培地で培養した。すべての細胞株は、サブコンフルエンスで定期的に継代した。実験の前日に、ＤＭＥＭ中で培養した細胞をトリプシン処理し、完全培地に再懸濁し、その後、プレーティングした。ＨａＣａＴ細胞は、剥離するまでトリプシン処理した。次いで、トリプシン阻害剤を加え、細胞を４００ｘｇで５分間遠心分離し、その後、添加した培地に再懸濁し、プレーティングした。１または２日後に細胞をトランスフェクトした。
【００３８】
リポフェクタミン媒介性一過性同時トランスフェクションを、１２ウェルプレートで、基本的に（４）に記載したとおりに、０．４０μｇ／ｍｌのプラスミド（０．３８μｇ／ｍｌのレポーターおよび２０ｎｇ／ｍｌの対照）および通常は３０ｎＭのｓｉＲＮＡ（０．４３μｇ／ｍｌ）を用いて３連で実施した。ルシフェラーゼ活性レベルは、トランスフェクションの２４時間後に２５μｌの細胞溶解物で二重ルシフェラーゼ検出法（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。まず、１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、続いて、回収時点の前に、レポーターおよび内部対照プラスミドを用いてトランスフェクトすることによって、連続トランスフェクションを実施した。
【００３９】
ノーザン解析用に、６ウェルプレートに入れたＨａＣａＴ細胞を、血清を含まない培地で、１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。リポフェクタミン２０００（商標）を、より高いトランスフェクション効率のために用いた。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡを、ダイナビーズ（Ｄｙｎａ−ｂｅａｄｓ）オリゴ（ｄＴ）２５（Ｄｙｎａｌ）を用いてトランスフェクションの２４時間後に単離した。単離したｍＲＮＡを１．３％アガロース／ホルムアルデヒド（０．８Ｍ）ゲルで１６〜１８時間断片化し、ナイロン膜（Ｍａｇｎａ−Ｃｈａｒｇｅ、Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）上にブロットした。膜を、ランダムプライムされたＴＦ（ｃＤＮＡ中の位置６１〜１２１７）およびＧＡＰＤＨ（１．２ｋｂ）ｃＤＮＡプローブを用い、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂハイブリダイゼーションバッファー（Ｓｉｇｍａ）中で、製造業者によって推奨されるとおりにハイブリダイズさせた。
【００４０】
ＴＦ活性測定用には、ＨａＣａＴ細胞単層を、氷冷バルビタール緩衝生理食塩水（ＢＢＳ）ｐＨ７．４（ＢＢＳ、３ｍＭ  バルビタールナトリウム、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）で３回洗浄し、ＢＢＳにすくい入れた。活性は、回収し、均一化した直後、２個体のドナー由来の混合した、正常なクエン酸血小板の乏しい血漿および１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて１段階の凝固検出法で測定した。活性を標準物質に関連付けた（６、７）。１ユニット（Ｕ）ＴＦは、ＴＦ  ＥＬＩＳＡで測定される１．５ｎｇのＴＦに相当する（６、７）。活性は、ＢｉｏＲａｄ  ＤＣ検出法によって測定される、細胞ホモジネート中のタンパク質含量に基準化された。
【００４１】
ＴＦ抗原を、Ｉｍｕｂｉｎｄ  Ｔｉｓｓｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，  Ｇｒｒｅｎｗｉｃｈ，  ＣＴ，  ＵＳＡ）を用いて定量化した。このＥＬＩＳＡは、ＴＦアポタンパク質、ＴＦおよびＴＦ：凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）複合体を認識する。サンプルを３７℃で解凍させ、均一化した。各ホモジネートのアリコート（１００μｌ）を、１％  ＢＳＡおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。次いで、このサンプルをＥＬＩＳＡウェルに加え、製造業者による手順を続けた。抗原レベルを、細胞ホモジネート中の全タンパク質含量に対して基準化した。
【００４２】
種々の突然変異ｓｉＲＮＡのすべてを、本発明の野生型ｓｉＲＮＡ配列について先に記載したとおりに、リポフェクタミン２０００媒介性トランスフェクションの２４時間後に、ＨａＣａＴ細胞における内因性ＴＦ  ｍＲＮＡの減少について解析した。
【００４３】
本発明のｓｉＲＮＡは、哺乳類ＴＦを抑制し、それによって望ましくない血液凝固を防ぐために使用できる。したがって、本発明はまた、医薬製剤の技術分野で十分に公知の技術に一致して、望ましくない血液凝固の治療、予防および／または阻害に適した医薬製剤を調製するための本発明のｓｉＲＮＡの使用に関する。したがって、本発明の製剤は、１種以上の本発明のｓｉＲＮＡ、当技術分野ではすべて公知の、希釈剤、潤滑剤、結合剤、担体分解および／または吸着手段、着色剤、甘味料興味剤などを含むことができる。さらに、本製剤はまた、アジュバントおよび／または他の治療用成分を含むことができ、単独でまたは他の医薬とともに投与することができる。
【００４４】
本発明の医薬製剤は、例えば、非経口的に（例えば、滅菌溶液または懸濁液の、皮下、静脈内、筋内または腹腔内注射または注入によって）、経口的に（例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、懸濁液または溶液の形で）、経鼻で（例えば、溶液／スプレーの形で）、頬側で、直腸に（例えば、座剤の形で）、膣に（例えば、座剤の形で）、吸入もしくはガス注入によって（例えば、エアロゾルまたは溶液／スプレーの形で）、埋込式リザーバーによって、またはいずれかの他の適した投与経路によって、従来の非毒性の製薬上許容される担体、アジュバントおよび／または賦形剤を含有する投与製剤で投与できる。本医薬製剤はさらに、一用量で、分割用量でまたは徐放性装置を介して投与できる。
【００４５】
本発明を、実施例として以下に記載する。実施例は、本発明の好ましい実施形態を表すが、それらは本発明の範囲を制限するものと考えられるべきではない。
【００４６】
ヒトＴＦの抑制をもたらすｓｉＲＮＡを得るために、配列番号１〜配列番号８の２１ヌクレオチドのＲＮＡを、ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（ＰｈａｒｍａｃｉａおよびＡＢＩ）を用いて化学合成した。脱保護し、脱シリル化した合成オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣで精製した。リボヌクレオチドを、５００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５に溶かした１０μＭで、煮沸し、水浴中で徐々に冷却することによってアニーリングさせた。アニーリングの成功は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。各々、ヒトＴＦ（受託番号Ｍ１６５５３）ｍＲＮＡ内の部位をターゲティングするｓｉＲＮＡ種を、２つのヌクレオチドデオキシチミジン３’オーバーハング持たせて設計し、前記のＧｅｎｂａｎｋエントリーの番号付けを用い、センス鎖の最初のヌクレオチドの位置にしたがって名づけた（図１ａ）。
【００４７】
要するに、哺乳類細胞において、標的ＴＦ  ｍＲＮＡ配列の特定の部分配列に対して相補的であるよう合成された二本鎖ｓｉＲＮＡは、この特異的ｍＲＮＡの分解を誘導することが証明される（実施例１参照）。この作用は、ＴＦ  ｍＲＮＡの２、３部位のみが、対応するｓｉＲＮＡに高度に感受性であったように、下等生物におけるデータに反して、高度に配列依存的であった。実施例２からわかるように、ＴＦ  ｍＲＮＡの減少は、ＴＦタンパク質および凝固活性の著しい減少をもたらし、これは本発明者らの知見によれば、毒性の副作用を伴わない、ＴＦに対する再現性のあるそのような作用の初めての証明である。今日、ＲＮＡタンパク質複合体の推定３次元構造に関して入手可能な現行情報に基づいて、感受性のある標的配列を選択することは可能ではない。しかしながら、本発明によれば、ＴＦ  ｍＲＮＡに対して良好な感受性のある２つの位置が提供される。
【００４８】
また、本発明者らの最良のｓｉＲＮＡ候補ｈＴＦ１６７ｉの広範な突然変異および化学修飾が十分に許容されることも証明される。化学修飾は、５’末端へのアリル修飾によっては幾分かの活性の喪失、およびより長いチオホスフェートによってはいくらかの予想された毒性を示したが、２’−ＯＨ−メチル化末端を有するｓｉＲＮＡは、強力な活性と経時変化実験における寿命の延長の双方ともを示した。
【実施例１】
【００４９】
ｈＴＦ−ＬＵＣおよびｈＴＦ  ｓｉＲＮＡを用いて一過性に同時トランスフェクトした細胞におけるｈＴＦ  ｓｉＲＮＡ効力の解析（すなわち、同時トランスフェクション検出法におけるｓｉＲＮＡ（ｓ）によるＲＮＡｉの解析）
ＴＦ  ｓｉＲＮＡ効力の最初の解析は、ｈＴＦ−ＬＵＣ（図１ｂ）およびｈＴＦ  ｓｉＲＮＡ（図１ａ）を用いて一過性に同時トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞で、二重ルシフェラーゼ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。ＬＵＣ対Ｒｌｕｃ発現の比を、代表的な無関係なｓｉＲＮＡであるプロテインセリンキナーゼ３１４ｉ（ＰＳＫ３１４ｉ）を用いてトランスフェクトした細胞におけるレベルに対して基準化した。
【００５０】
ｓｉＲＮＡは、最良の候補、ｈＴＦ１６７ｉおよびｈＴＦ３７２ｉを用いた同時トランスフェクション検出法において、強力で、特異的な作用を有しており、ＨｅＬａ細胞では１０〜１５％のルシフェラーゼ活性しか残らなかった（図１ｃ）。さらにまた、ｈＴＦ５６２ｉが中程度の作用しか示さず、ｈＴＦ４７８ｉが極めて低い活性を有していたように、位置的な作用が見られた。このパターンはまた、２９３、ＣＯＳ−１およびＨａＣａＴ細胞でも、種々の合成バッチ由来のｓｉＲＮＡを用いて、種々の濃度で（ｓｉＲＮＡは、同時トランスフェクション検出法において１〜１００ｎＭの濃度範囲にわたって同程度の阻害を引き起こした、データは示していない）、見られた（図１ｃ）。
【００５１】
ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞をレポータープラスミドでトランスフェクトした細胞とともに同時培養することでは、ＨｅＬａ細胞において、およびＨａＣａＴ細胞の接触阻害された増殖の双方において、細胞間のｓｉＲＮＡ移動は、他の研究者によってはこれまでに培地媒介性移動が報告されていた（８）にもかかわらず、全く示されなかった（データは示していない）。
【実施例２】
【００５２】
コドンレベル分解能でのｓｉＲＮＡ位置依存性の検討
高分解能で最良のｓｉＲＮＡ（すなわち、ｈＴＦ１６７ｉ）の標的部位の周囲の領域の接触性を検討し、標的部位が３ｎｔずつｈＴＦ１６７ｉの両側に移動し、その各々が２１ｎｔのうち１８を隣りものと共有するｓｉＲＮＡ（ｈＴＦ１５８ｉ、ｈＴＦ１６１ｉ、ｈＴＦ１６４ｉ、ｈＴＦ１７０ｉ、ｈＴＦ１７３ｉおよびｈＴＦ１７６ｉ）を合成した（図１ｃ参照）。驚くべきことに、これらｓｉＲＮＡ間の最小配列および位置の相違にもかかわらず、それらは広範な活性を示すことが判明した（図２）。ｈＴＦ１６７ｉの完全活性から離れる段階的な変化があり、これは上流のｓｉＲＮＡに関してより明らかであった。２種のｓｉＲＮＡ  ｈＴＦ１５８ｉおよびｈＴＦ１６１ｉは、それぞれ、ｈＴＦ１６７ｉから９および６ヌクレオチドしか移動していなかったが、その活性は大幅に消失していた。これらの結果は、局所性因子が位置作用を引き起こしたことを示唆する。
【実施例３】
【００５３】
内因性ｍＲＮＡに対するｈＴＦ  ｓｉＲＮＡ効力の解析
基質としてレポーター遺伝子の強制的な発現の使用を含む同時トランスフェクション検出法の結果は、解釈が難しい場合がある。したがって、ｓｉＲＮＡの作用はまた、ＴＦを常時発現するＨａＣａＴ細胞中の内因性ｍＲＮＡ標的で測定した（図３ａ）。２種の最良のＴＦ  ｓｉＲＮＡ、ｈＴＦ１６７ｉおよびｈＴＦ３７２ｉは、基準化したＴＦ  ｍＲＮＡがそれぞれ１０％および２６％に減少したようにこの検出法でも強力な活性を示した（図３ａ）。興味深いことに、ＲＮＡｉをベースとしたｍＲＮＡの切断検出法は、それまで哺乳類系では失敗していたが（９）、その大きさが標的配列の一次切断と一致する切断産物が、減少した主なバンドの下に明らかに見られた。したがって、本発明はまた、哺乳類細胞においてｍＲＮＡを切断できるｓｉＲＮＡに関する。さらに、観察された作用は、ＲＩＳＣは哺乳類でも活性であり得ることを示唆する。同時トランスフェクション検出法では、第３の最良のｓｉＲＮＡであるｈＴＦ２５６ｉも、ＴＦ  ｍＲＮＡレベルの大幅な低下をもたらした（５７％の残存する発現、データは示していない）。残りのＴＦ  ｓｉＲＮＡは、ノーザン検出法によって測定されるような活性は示さず（図３ｂ）、また、化学的に修飾されたリボザイムを用いたトランスフェクションがＴＦ  ｍＲＮＡを３倍誘導し得るように（データは示していない）、興味のある点である、ＴＦ発現も刺激しなかった。したがって、この無関係なｓｉＲＮＡの相対的不活性（すわなち、（非特異的）作用を有するｓｉＲＮＡ）により、ｓｉＲＮＡベースの薬物の見込みがさらに増強される。
【００５４】
ＨａＣａＴ細胞における凝固活性は、ｈＴＦ１６７ｉおよびｈＴＦ３７２ｉを用いてトランスフェクトした細胞では、偽トランスフェクトした細胞と比較してそれぞれ５倍および２倍低下した（図３ｂおよび図５ｂ）。ｓｉＲＮＡの全細胞性ＴＦタンパク質に対する作用も測定し（図３ｂ）、概ね、凝固促進活性に対して認められた作用よりも大きな阻害作用が証明された。したがって、本発明により、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ  ｈＴＦ１６７ｉおよびｈＴＦ３７２ｉは、複雑な生理学的系において特異性および効力を示すこと、および、同一標的ｍＲＮＡに対して他のｓｉＲＮＡ分子は基本的に不活性であるように、位置的作用を証明したと結論する。新規の一連のＴＦ  ｓｉＲＮＡのデータはこの結論を支持し（データは示していない）、特定のｓｉＲＮＡのこの不活性はｍＲＮＡ折り畳み構造または貫通できないタンパク質被覆による切断部位の封鎖によるものである可能性がある（１０）。
【実施例４】
【００５５】
ｓｉＲＮＡ抑制の経時変化および持続の解析
ｍＲＮＡ抑制の経時変化を測定し、トランスフェクションの開始後４、８、２４および４８時間後に回収した細胞のノーザン解析により、２４時間後の最大ｓｉＲＮＡ抑制が示された（図５ａ）。ｈＴＦ１６７ｉはｍＲＮＡレベルを、各時点でｈＴＦ１７３ｉよりも低下させたように、見かけの減少率には相違があると思われる。同様の観察結果は、誘導した突然変異（Ｍ１およびＭ２）が阻害活性の減少をもたらした修飾型のｈＴＦ１６７ｉにも見られた。アンチセンス鎖中の突然変異は、対応するセンス鎖中の突然変異よりも明らかな作用を有していた。ｓｉＲＮＡ誘導性標的分解は不完全であった（最も効率的なｓｉＲＮＡを用いても、標的ｍＲＮＡの約１０％というレベルが残存した）という事実は、保護されたコンパートメント中、例えば、スプライセオソーム中、または他の核部位中にｍＲＮＡの画分が存在することによるものである可能性がある。しかしながら、前記のデータおよび比較実験のデータを考慮すると、転写と、時間のかかるプロセスである分解の間で動力学的に決定されるバランスである可能性が高い。
【００５６】
植物（１１）および線虫（１２、１３）における実験により、特定のｓｉＲＮＡ遺伝子が誘導される表現型の遺伝力に関係している系の存在が示唆された。哺乳類細胞株におけるそのような伝播物の存在を調べるために、極めて低い細胞密度でトランスフェクトしたＨａＣａＴ細胞においてｓｉＲＮＡ抑制の持続を測定した。レポーター構築物の連続トランスフェクションに基づいた実験では、トランスフェクションの３日後と５日後の間に発現が徐々に回復し、内因性ＴＦ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ作用の時間依存性は同様であった（図５ｂ）。偽トランスフェクトした対照細胞におけるＴＦ  ｍＲＮＡのレベルは、実験の間徐々に低下し、ここで現れたものは発現の細胞増殖依存性ダウンレギュレーションである。興味深いことに、トランスフェクトした細胞では、凝固促進活性は対照レベルまでの回復をほとんど示さなかった（図５ｂ、柱）。ｈＴＦ３７２ｉを用いても、ならびにｈＴＦ１６７ｉ、ｈＴＦ３７２ｉおよびｈＴＦ５６２ｉの組合せを用いても、同様の知見が得られた（データは示していない）。
【実施例５】
【００５７】
ｓｉＲＮＡ配列への塩基対合突然変異の導入の作用の解析
先に記載したように、突然変異が全ｓｉＲＮＡ内で等しく許容されたかどうかを調べるために本発明のｓｉＲＮＡをより体系的に位置づけた。全部で８種の異なる新規単一突然変異ｓｉＲＮＡを設計し、突然変異の位置（センス鎖の５’から出発する）にしたがって名づけた（ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４、ｓ７、ｓ１１、ｓ１３、ｓ１６、すなわち、配列番号９〜１７）。先に記載した中央の単一突然変異Ｍ１（実施例４）をこの解析に含め、ｓ１０と名前を付け直した。すべてのｓｉＲＮＡを、変性ＰＡＧＥ（１５％）によって増殖性アニーリングについて解析した。
【００５８】
種々の突然変異体ｓｉＲＮＡのすべてを、先に記載したとおりに、リポフェクタミン２０００媒介性トランスフェクションの２４時間後に、ＨａＣａＴ細胞における内因性ＴＦ  ｍＲＮＡの減少について解析した。データのまとめを図７に示す。陽性対照としての、野生型ｓｉＲＮＡおよび突然変異体ｓ１０は、ＴＦ  ｍＲＮＡを、予想し、先に報告したように約１０％および２０％残存レベルまで減少させた。その他の突然変異体の活性は、ｓｉＲＮＡに沿ったその位置に応じて３つの異なる群に分けられた。ｓｉＲＮＡの５’最末端の突然変異（ｓ１〜ｓ３）は極めて良好に許容され、野生型と本質的に同等の活性を示した。さらに内側の、ｓｉＲＮＡのほぼ中央までに位置する突然変異体（ｓ４、ｓ７、ｓ１０、Ｓ１１）はその活性がわずかに損なわれており、その結果、ｍＲＮＡの減少は２５〜３０％残存レベルまでであった。しかしながら、ｓｉＲＮＡの３’側半分の両突然変異体は大幅に低下した活性を示した。このことにより、ｓｉＲＮＡ中の突然変異の許容における傾向が示唆された。１つのさらなる位置（ｓ７、ｓ１１、ｓ１３、ｓ１６）とともに中央位置（ｓ１０）が突然変異されている、いくつかの二重突然変異体の活性も解析した。その活性の順位がその変異体位置の単一突然変異体の活性のものと酷似していたように、突然変異許容における傾向はまた、これらの二重突然変異ついても明らかであった。この知見は、突然変異体の活性の差は、ｓｉＲＮＡの配列に沿った標的ミスマッチの許容における内因的傾向によるものであるという提案を強化するものである。そのような傾向の理由は、切断のために標的ｍＲＮＡを「測定する」ためにＲＩＳＣ複合体によって主に用いられる、ｓｉＲＮＡ中の提案される支配領域の存在と関連している可能性がある（１５）。
【実施例６】
【００５９】
ｓｉＲＮＡ配列の化学修飾の作用
各々、ｓｉＲＮＡ鎖の５’および３’最末端に１つの修飾を含む一連のｓｉＲＮＡ（Ｐ１＋１、Ｍ１＋１、Ａ１＋１、すなわち、それぞれ、配列番号２２、２６および３０）をまず合成した。化学合成したｓｉＲＮＡの５’末端は、生体内で活性であるためにはリン酸化されなくてはならないので、修飾に対してより感受性である可能性がある（２４）。したがって、本発明者らは、また、種々の種類の修飾にとって寛容性であると知られている（１０、１５、２５）、非塩基対合３’オーバーハングのみに２つの修飾を含むｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡＰ０＋２、Ｍ０＋２およびＡ０＋２、すなわち、それぞれ、配列番号２３、２７および３１、図６参照）を含めた。トランスフェクトしたＨａＣａＴ細胞のノーザン解析により、両末端のアリル化を含むｓｉＲＮＡを除いて、すべての修飾されたｓｉＲＮＡの本質的に減少していない活性が証明された（図８）。３’末端のみのアリル修飾は活性に影響を全く及ぼさなかった。５’末端ヌクレオチドの２’−ヒドロキシルにおける大きな置換基の存在が、Ｎｙｋａｎｅｎら（２４）によって必要であると示されたｓｉＲＮＡの適切なリン酸化を妨害する可能性がある。
【００６０】
本発明者らは、次いで、これらの突然変異のうちのどれがｓｉＲＮＡ媒介性抑制の持続性を増加させるのに十分であるかどうかを知ろうとした。内因性ＴＦ  ｍＲＮＡは、ｈＴＦ１６７を標的とする野生型ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクション後３〜５日で徐々に回復する。ＨａＣａＴ細胞を、活性な、化学修飾されたｓｉＲＮＡを用いて平行してトランスフェクトすることでは、本発明者らはトランスフェクション後３日および５日の抑制活性において有意な相違を証明できなかった（データは示していない）。したがって、本発明者らが導入した中央での修飾は、完全な最初の活性を示したが、生体内でｓｉＲＮＡを実質的に安定化させるのに明らかに十分ではなかった。
【００６１】
本発明者らの最初の中央での修飾後の依然として損なわれていないｓｉＲＮＡの活性を持ちながら、３’末端の４つと組合せて、両側に２つまたは５’末端に２つのいずれかを含むよう修飾度を広げた。最初のシリーズの、アリル化型を用いたあまり見込みのない結果とこれらの修飾に伴う高い費用のため、次のシリーズにはホスホロチオエート修飾およびメチル化に限定することとした。新規のｓｉＲＮＡセットを、ＨａＣａＴ細胞へのトランスフェクションの２４時間後の初期活性について同様に解析した。修飾されたｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした細胞では、基準化された発現レベルが、野生型を用いてトランスフェクトした細胞における１１％と比べて１６〜１８％残存レベルでわずかに上がった。最も大規模にホスホロチオエート化されたｓｉＲＮＡは、細胞にとって毒性であることが判明し、偽トランスフェクトした細胞と比較して約７０％の細胞死をもたらした（対照ｍＲＮＡ  ＧＡＰＤＨの発現レベルとして測定して）。これらの複雑な問題によって、このｓｉＲＮＡ種はさらなる解析には含めなかった。残りのｓｉＲＮＡ種を、１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡの単一トランスフェクションの５日後のＴＦ  ｍＲＮＡ発現を解析することによって抑制の持続性の増加について評価した。この時点では、野生型ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした細胞におけるＴＦ発現は、ほぼ完全に回復していた（偽トランスフェクトした細胞と比較して８０％の残存発現）（図９ａ）。しかしながら、最も広範囲に修飾したｓｉＲＮＡ（Ｍ２＋４、配列番号２９）を用いてトランスクフェクトした細胞では、強力な抑制が依然として明らかであった（３２％の残存発現）。あまり広範囲でなく修飾したｓｉＲＮＡ種（Ｐ２＋２、Ｍ２＋２、それぞれ、配列番号２４および配列番号２８）は、Ｍｅ２＋４よりも効果的ではなかったが、一貫して、トランスフェクションの５日後に野生型よりも低いＴＦ発現をもたらした（５５〜６０％）。経時変化実験により、野生型ｓｉＲＮＡは、抑制が相対的に損なわれていないトランスフェクション後３日では、依然として最も効果的であるが、抑制がその後かなり速い速度で低下することが証明された（図９ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ｓｉＲＮＡ、レポーター構築物およびトランス遺伝子発現のＲＮＡｉ；ａ）ヒトＴＦ（Ｇｅｎｂａｎｋエントリー受託番号Ｍ１６５５３）ｍＲＮＡ内の８部位をターゲティングするｓｉＲＮＡ種のセンス鎖（上部）およびアンチセンス鎖（下部）を示す。ｂ）ヒトＴＦのルシフェラーゼレポーター構築物およびｃ）同時トランスフェクション検出法におけるｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ（各々３連の３以上の独立した実験の平均、±標準偏差が示されている）。
【図２】ＨａＣａＴ細胞における標準的な同時トランスフェクション検出法におけるｓｉＲＮＡの効力。ｈＴＦ１６７ｉ  ｓｉＲＮＡの種々の合成バッチは同様の効率を示した。結果は、各々３連の、少なくとも３回の実験の平均である。
【図３】ｓｉＲＮＡは、内因性ＴＦ発現の低下を媒介した；ａ）ｈＴＦ１６７ｉおよびｈＴＦ３７２ｉは、トランスフェクトした細胞においてｍＲＮＡの切断を誘導した。ＨａＣａＴ細胞のｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）、対照としてＧＡＤＰＨを用いたトランスフェクションの後、ＴＦ  ｍＲＮＡのノーザン解析を実施した。矢印は、ｓｉＲＮＡの作用によって生じる切断断片を示す。ｂ）定常状態ｍＲＮＡレベル（黒色棒）、凝血促進活性（ドットの棒）およびＴＦタンパク質（抗原）発現（斜線の棒）に対するｓｉＲＮＡの作用の測定値は、ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡ、ＴＦ抗原レベルおよび凝血促進活性を低下させることを示す。凝血促進活性および抗原の測定のために、細胞を、７〜８時間の半減期のＴＦタンパク質に対応するようｓｉトランスフェクションの４８時間後に回収した。データは３連のうち代表的な実験のものである。
【図４】ｈＴＦ１６７ｉの用量−応答曲線。
【図５】ｓｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉの時間依存性；ａ）ｓｉＲＮＡに突然変異（Ｍ１およびＭ２は、それぞれ、１つまたは２つの突然変異を指す）が導入されると、阻害活性は低下する。細胞を１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、４、８、２４および４８時間（それぞれ、黒色棒、線を引いた棒、黒いドットのある白色棒、斜線の棒）でｍＲＮＡ単離のために回収した。発現レベルを、すべての時点で、ＧＡＤＰＨに対して基準化し、偽トランスフェクトした細胞に対して標準化した。ｂ）ｍＲＮＡレベルに対する阻害作用の減衰の経時変化（菱形）、レポーター遺伝子活性（白色三角形）および凝血促進活性（黒色棒）。
【図６】ｓｉＲＮＡ修飾。（Ａ）突然変異型および野生型のｓｉＲＮＡ  ｈＴＦ１６７ｉ。野生型（ｗｔ）ｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列はヒト組織因子（受託番号Ｍ１６５５３）の１６７〜１８７位に相当する。単一（ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４、ｓ７、ｓ１０、ｓ１１、ｓ１３、ｓ１６）および二重突然変異（ｄｓ７／１０、ｄｓ１０／１１、ｄｓ１０／１３、ｄｓ１０／１６）はすべて、センス鎖の５’末端から数えた、突然変異の位置にしたがって名づけられている。すべての突然変異（太字）は野生型に対するＧＣ逆位である。（Ｂ）ｓｉＲＮＡ  ｈＴＦ１６７ｉの化学的修飾型。非修飾リボヌクレオチドは小文字である。ホスホロチオエート架橋がアスタリスク（＊）で示されており、２’−Ｏ−メチル化および２’−Ｏ−アリル化リボヌクレオチドは、それぞれ、通常の大文字および下線を引いた太字の大文字である。
【図７】突然変異体の、内因性ｈＴＦ  ｍＲＮＡに対する活性。ＨａＣａＴ細胞を、トランスフェクションの２４時間後、ｍＲＮＡ単離のために回収した。ＴＦ発現をＧＡＰＤＨのものに対して基準化した。偽トランスフェクトした細胞における基準化した発現を１００％とした。データは少なくとも３つの独立した実験の平均＋標準偏差である。
【図８】化学的に修飾されたｓｉＲＮＡの、内因性ＴＦ  ｍＲＮＡに対する活性。実験を実施し、図７に記載したように解析した。
【図９】化学的に修飾されたｓｉＲＮＡによるＴＦ抑制の持続。Ａ）１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの５日後の特異的ＴＦ発現。Ｂ）ＴＦ  ｍＲＮＡ抑制の経時変化。１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡの単一トランスフェクションの１〜３〜５日後に回収した細胞。培地は２日毎に置換した。
【参照文献】
【００６３】
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【配列表】
2005532038.tif 000002
2005532038.tif 000003
2005532038.tif 000004
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【図１】
2005532038.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005532038.tif 000014
【図６】
2005532038.tif 000015
【図７】
2005532038.tif 000016
【図８】
2005532038.tif 000017
【図９】
2005532038.tif 000018
【国際調査報告】
2005532038.tif 000019
2005532038.tif 000020
2005532038.tif 000021
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