(57)【要約】本発明は、生物学的に活性なタンパク質の、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰ、またはこのようなＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰを含む組成物（処方物も含む）に関する。より具体的には、単独での使用のためかあるいは乾燥組成物またはスラリー組成物中での、高濃度である生物学的に活性なタンパク質の、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶ＳＰＰの産生のための方法、および安定化したＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの調製のための方法が提供される。本発明はまた、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰを使用する生物学的に活性なタンパク質の安定化、貯蔵および送達のための方法に関する。本発明はさらに、生物医学的用途のための、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰあるいはこれらを含む組成物または処方物を使用する方法に関する。
2005500304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
球状タンパク質粒子。
【請求項２】
球状ナノクリスタル複合粒子である、請求項１に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項３】
前記タンパク質が、抗体または該抗体の単鎖Ｆｖフラグメントである、請求項１、または２に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項４】
直径にして約０．０４ミクロンから約３００ミクロンの範囲の粒径を有している、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項５】
直径にして約０．０４ミクロンから約２００ミクロンの範囲の粒径を有している、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項６】
直径にして約０．０４ミクロンから約１００ミクロンの範囲の粒径を有している、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項７】
直径にして約０．０４ミクロンから約１０ミクロンの範囲の粒径を有している、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項８】
直径にして約０．０４ミクロンから約５ミクロンの範囲の粒径を有している、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項９】
直径にして約０．０４ミクロンから約１ミクロンの範囲の粒径を有している、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項１０】
直径にして約４０ナノメートルから約９９９ナノメートルの範囲の粒径を有している、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項１１】
直径にして約４０ナノメートルから約４９９ナノメートルの範囲の粒径を有している、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項１２】
直径にして約２５０ミクロンを超えて約３００ミクロンまでの範囲の粒径を有している、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項１３】
直径にして約１μｍ〜約３００μｍであり、かつ約４０ｎｍ〜約９９９ｎｍの直径を有してるタンパク質ナノクリスタルを含む、請求項２に記載の球状ナノクリスタル複合粒子。
【請求項１４】
直径にして約１μｍ〜約３００μｍであり、かつ約４０ｎｍ〜約４９９ｎｍの直径を有してるタンパク質ナノクリスタルを含む、請求項２に記載の球状ナノクリスタル複合粒子。
【請求項１５】
請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子であって、ここで、前記タンパク質が該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物のコンフォメーションと同じであるコンフォメーションを有しており、これは、該ネイティブの可溶性である対応物に特異的に結合する、モノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡによって示される、球状タンパク質粒子。
【請求項１６】
請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子であって、ここで、前記タンパク質が該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物のβシート構造要素から約２０％未満異なるβシート構造要素を有しており、かつ該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物のαへリックス構造要素から約２０％未満異なるαへリックス構造要素を有しており、これは、ＦＴＩＲまたは円二色性（ＣＤ）分光法によって示される、球状タンパク質粒子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の球状タンパク質粒子であって、ここで、前記タンパク質が該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物のβシート構造要素から約２０％未満異なるβシート構造要素を有しており、これは、ＦＴＩＲによって示されるような、該ネイティブタンパク質の可溶性である対応物と比較する相関スペクトルによって示される、球状タンパク質粒子。
【請求項１８】
請求項１６に記載の球状タンパク質粒子であって、ここで、前記タンパク質が、同一条件で保存の後にそのネイティブの可溶性物と比較して、約４℃〜約５０℃で、４日から１８０日間の保存の後にそのαへリックス構造要素の約２０％未満を失っている、球状タンパク質粒子。
【請求項１９】
請求項１６項に記載の球状タンパク質粒子であって、ここで、該タンパク質は、該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物のβシート構造要素から約２０％未満で異なるβシート構造要素を有しており、かつ該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物のαへリックス構造要素の約２０％未満を失っており、これは、円二色性（ＣＤ）分光法によって示される、球状タンパク質粒子。
【請求項２０】
請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子であって、ここで、前記タンパク質が生物学的に活性なコンフォメーションを有しており、これは、そのネイティブで可溶性である対応物の生物学的活性と溶解している球状タンパク質粒子のタンパク質成分の生物学的活性とを比較することによって示される、球状タンパク質粒子。
【請求項２１】
前記タンパク質成分が、該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物の約１００％の生物学的活性を有する、請求項２０に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項２２】
前記タンパク質成分が、該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物の約９０％の生物学的活性を有する、請求項２０に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項２３】
前記タンパク質成分が、該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物の約８０％の生物学的活性を有する、請求項２０に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項２４】
前記タンパク質成分が、該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物の約７０％の生物学的活性を有する、請求項２０に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項２５】
前記タンパク質成分が、該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物の約６０％の生物学的活性を有する、請求項２０に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項２６】
前記タンパク質成分が、該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物の約５０％の生物学的活性を有する、請求項２０に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項２７】
前記抗体または前記抗体フラグメントが、該タンパク質のネイティブの可溶性である対応物の約５０％を超えて約１００％までの生物学的活性を有し、これは生物免疫アッセイによって決定付けられる、請求項３に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項２８】
前記生物免疫アッセイが直接的細胞傷害性生物免疫アッセイである、請求項２７に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項２９】
前記生物免疫アッセイが補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）生物免疫アッセイである、請求項２７に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項３０】
前記生物免疫アッセイが抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）生物免疫アッセイである、請求項２７に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項３１】
前記抗体が治療用抗体である、請求項３に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項３２】
請求項３に記載の球状タンパク質粒子であって、前記抗体が、以下：
ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、および血清ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）抗体ならびにサブクラスのＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体およびＩｇＧ４抗体、ＩｇＭ１抗体およびＩｇＭ２抗体、ならびにＩｇＡ１抗体およびＩｇＡ２抗体からなる群より選択される、球状タンパク質粒子。
【請求項３３】
前記抗体が該抗体の可溶性対応物よりもインビボでの長い半減期を有している、請求項３に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項３４】
前記抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項３に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項３５】
前記抗体がＲｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、およびＥｔａｎｅｒｃｅｐｔからなる群より選択される、請求項３に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項３６】
前記抗体が、Ａｂｃｉｘｉｍａｂ、Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ、Ｍｕｒｕｍｏｎａｂ−ＣＤ３、Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ、ＤａｃｌｉｚｕｍａｂおよびＺｅｖａｌｉｎからなる群より選択される、請求項３に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項３７】
請求項３に記載の球状タンパク質粒子であって、前記抗体が、以下：
心臓血管疾患を処置するための抗体、呼吸系疾患を処置するための抗体、組織移植拒絶反応を処置するための抗体、臓器移植拒絶反応を処置するための抗体、癌を処置するための抗体、炎症疾患を処置するための抗体、および放射線免疫療法において使用される抗体
からなる群より選択される、球状タンパク質粒子。
【請求項３８】
標識されている、請求項１、２または３のいずれかに記載の球状タンパク質粒子。
【請求項３９】
請求項３８に記載の球状タンパク質粒子であって、
以下：
放射性標識、酵素標識、毒素、磁気試薬、および薬物結合体、
から選択される標識で標識される、球状タンパク質粒子。
【請求項４０】
請求項３に記載の球状タンパク質粒子であって、前記抗体が以下：
抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＢＶ抗体、抗ＨＡＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプター抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＨＳＶ抗体、および抗ＥＢＶ抗体からなる群より選択される、球状タンパク質粒子。
【請求項４１】
乾燥した球状タンパク質粒子である、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項４２】
キャリアを含まない薬学的制御放出球状タンパク質粒子である、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の球状タンパク質粒子。
【請求項４３】
請求項１または２の記載の球状タンパク質粒子であって、前記タンパク質は、以下：
酵素、タンパク質性ホルモン、ウイルス、ウイルスタンパク質、抗体、抗体フラグメント、レセプターおよびペプチド
からなる群より選択される、球状タンパク質粒子。
【請求項４４】
請求項３に記載の球状タンパク質粒子であって、前記抗体が以下：
キメラ抗体、ヒト化抗体、非グリコシル化抗体、二特異性抗体、ヒト抗体およびマウス抗体
からなる群より選択される、球状タンパク質粒子。
【請求項４５】
球状核酸粒子。
【請求項４６】
前記核酸が哺乳動物の予防接種に使用される、請求項４５に記載の球状核酸粒子。
【請求項４７】
前記核酸が遺伝子である、請求項４５に記載の球状核酸粒子。
【請求項４８】
組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）請求項１、２または３のいずれかに記載の球状タンパク質粒子、および
（ｂ）少なくとも１つの成分
を含む、組成物。
【請求項４９】
前記タンパク質を放出し得る、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
約１ｍｇ／ｍｌを超える球状タンパク質粒子濃度を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
約１０ｍｇ／ｍｌを超える球状タンパク質粒子濃度を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
約２０ｍｇ／ｍｌを超える球状タンパク質粒子濃度を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５３】
約５０ｍｇ／ｍｌを超える球状タンパク質粒子濃度を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５４】
約１００ｍｇ／ｍｌを超える球状タンパク質粒子濃度を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５５】
約１２０ｍｇ／ｍｌを超える球状タンパク質粒子濃度を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５６】
約２００ｍｇ／ｍｌを超える球状タンパク質粒子濃度を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５７】
約４００ｍｇ／ｍｌを超える球状タンパク質粒子濃度を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５８】
前記成分がポリマー性キャリアである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ポリマー性キャリアが生分解性ポリマーまたは生体適合性ポリマーである、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
請求項５８に記載の組成物であって、前記ポリマー性キャリアが以下：
ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）すなわちＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギネート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴサッカリド、グリカミノグリカン、硫酸化ポリサッカリド、それらのブレンドならびにそれらのコポリマー
からなる群のうちの１以上から選択されたポリマーである、組成物。
【請求項６１】
前記ポリマー性キャリアがポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ポリマー性キャリアがポリ（ビニルアルコール）で乳化されている、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ポリマー性キャリアがコポリマーである、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６４】
前記成分がアルブミンである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６５】
前記タンパク質がインタクトな抗体または該抗体の単鎖Ｆｖフラグメントである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６６】
前記抗体が治療用抗体である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６７】
請求項４８の記載の組成物であって、前記成分が、以下：
スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコール
からなる群より選択される、組成物。
【請求項６８】
哺乳動物を処置するための方法であって、該方法は、以下：
請求項１、２、または３のいずれかに記載の球状タンパク質粒子を含む有効量の溶液または有効量の請求項４８に記載の組成物を該哺乳動物に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項６９】
前記有効量が治療的有効量または薬学的有効量である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記有効量が診断的有効量である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記球状タンパク質粒子または前記組成物が、以下：
経口投与、筋内投与、静脈内投与、肺吸入投与、非経口投与、経皮投与、エアロゾル送達投与、無針注射投与ならびに皮下注射投与および皮下無針注射投与
からなる群より選択される経路によって投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
請求項６８に記載の方法であって、前記溶液は、前記球状タンパク質粒子の懸濁物または前記組成物の懸濁物を含み、ここで、溶液中の該タンパク質の濃度は少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌである、方法。
【請求項７３】
請求項６８に記載の方法であって、前記溶液は、前記球状タンパク質粒子の懸濁物または前記組成物の懸濁物を含み、ここで、溶液中の該タンパク質の濃度は少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌである、方法。
【請求項７４】
請求項６８に記載の方法であって、前記溶液は、前記球状タンパク質粒子の懸濁物または前記組成物の懸濁物を含み、ここで、溶液中の該タンパク質の濃度は少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌである、方法。
【請求項７５】
請求項６８に記載の方法であって、前記溶液は、前記球状タンパク質粒子の懸濁物または前記組成物の懸濁物を含み、ここで、溶液中の該タンパク質の濃度は少なくとも約２００ｍｇ／ｍｌである、方法。
【請求項７６】
請求項６８に記載の方法であって、前記溶液は、前記球状タンパク質粒子の懸濁物または前記組成物の懸濁物を含み、ここで、溶液中の該タンパク質の濃度は少なくとも約４００ｍｇ／ｍｌである、方法。
【請求項７７】
タンパク質のアフィニティーマトリックス精製のための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）請求項３に記載の抗体または抗体フラグメントを含む球状タンパク質粒子と結合緩衝液とを混合して球状タンパク質粒子／緩衝液混合物を形成する工程であって、ここで、該抗体または該抗体フラグメントは精製されるタンパク質に対する親和性を有する、工程；
（ｂ）該精製されるタンパク質を含むタンパク質溶液を該球状タンパク質粒子／緩衝液混合物に添加して、タンパク質溶液／球状タンパク質粒子／緩衝液混合物を形成する工程；
（ｃ）該抗体または該抗体フラグメントへの該タンパク質の結合を可能にするのに十分な時間および温度で、該タンパク質溶液／球状タンパク質粒子／緩衝液混合物をインキュベートする工程；
（ｄ）洗浄緩衝液で該混合物を洗浄する工程；および
（ｅ）溶出緩衝液で該タンパク質を溶出する工程
を包含する、方法。
【請求項７８】
サンプル中の抗原のインビトロ検出のための診断キットであって、該キットは、以下：
（ａ）請求項３に記載の抗体または抗体フラグメントを含む球状タンパク質粒子であって、該抗体または該抗体フラグメントは、該抗原に特異的に結合し得る、抗体または抗体フラグメント；および
（ｂ）該サンプル中の任意の抗原に対する該抗体または該抗体フラグメントの結合を検出するための１以上の試薬；
を備える、キット。
【請求項７９】
前記抗原がウイルス抗原である、請求項７８に記載の診断キット。
【請求項８０】
請求項７９に記載の診断キットであって、前記ウイルス抗原は以下：
ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、インフルエンザウイルス抗原、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ−１）抗原、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）抗原、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、水痘−帯状疱疹ウイルス抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、ライノウイルス抗原、アデノウイルス抗原、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ポリオウイルス抗原、コクサッキーウイルス抗原、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）抗原
からなる群より選択される、診断キット。
【請求項８１】
前記抗体または前記抗体フラグメントが標識されている、請求項７８に記載の診断キット。
【請求項８２】
サンプル中の抗原の存在を検出するためのインビトロ診断方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項３に記載の抗体または抗体フラグメントが該サンプル中の任意の抗原に結合することを可能にする条件下で、該抗体または該抗体フラグメントを含む球状タンパク質粒子と該サンプルを接触する工程であって、ここで、該抗体または該抗体フラグメントは、該抗原に特異的に結合し得る、工程；および
（ｂ）該サンプル中の任意の抗原に対する該抗体または抗体フラグメントの結合を検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項８３】
前記抗原がウイルス抗原である、請求項８２に記載の診断方法。
【請求項８４】
請求項８３に記載の診断方法であって、前記ウイルス抗原は、以下：
ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、インフルエンザウイルス抗原、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ−１）抗原、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）抗原、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、水痘−帯状疱疹ウイルス抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、ライノウイルス抗原、アデノウイルス抗原、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ポリオウイルス抗原、コクサッキーウイルス抗原、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）抗原
からなる群より選択される、診断方法。
【請求項８５】
前記抗体または前記抗体フラグメントが標識されている、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
サンプル中の抗体のインビトロ検出のための診断キットであって、該キットは、以下：
（ａ）請求項１または２に記載の球状タンパク質粒子であって、前記タンパク質は該抗体に特異的に結合し得る抗原である、球状タンパク質粒子；および
（ｂ）該サンプル中の任意の抗体に対する該抗原の結合を検出するための１以上の試薬
を備える、キット。
【請求項８７】
前記抗体がウイルス抗原に特異的結合する抗体である、請求項８６に記載の診断キット。
【請求項８８】
請求項８７に記載の診断キットであって、前記ウイルス抗原が、以下：
ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、インフルエンザウイルス抗原、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ−１）抗原、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）抗原、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、水痘−帯状疱疹ウイルス抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、ライノウイルス抗原、アデノウイルス抗原、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ポリオウイルス抗原、コクサッキーウイルス抗原、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）抗原
からなる群より選択される、診断キット。
【請求項８９】
前記抗原が標識されている、請求項８６に記載の診断キット。
【請求項９０】
サンプル中の抗体の存在を検出するためのインビトロ診断方法であって、該方法は、以下：
（ａ）前記抗原が該サンプル中の任意の抗体に結合することを可能にする条件下で、請求項１または２に記載の球状タンパク質粒子と該サンプルを接触する工程であって、ここで、前記タンパク質は、該抗体に特異的に結合し得る抗原である、工程；および
（ｂ）該サンプル中の任意の抗体に対する該抗原の結合を検出する工程；
を包含する、診断方法。
【請求項９１】
前記抗体が、ウイルス抗原に特異的に結合する抗体である、請求項９０に記載の診断方法。
【請求項９２】
請求項９１に記載の診断方法であって、前記ウイルス抗原が、以下：
ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、インフルエンザウイルス抗原、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ−１）抗原、単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）抗原、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、水痘−帯状疱疹ウイルス抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、ライノウイルス抗原、アデノウイルス抗原、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、ポリオウイルス抗原、コクサッキーウイルス抗原、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）抗原
からなる群より選択される、診断方法。
【請求項９３】
前記抗原が標識されている、請求項９０に記載の診断方法。
【請求項９４】
哺乳動物中の抗原の存在を検出するためのインビボ診断方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）請求項３に記載の抗体または抗体フラグメントが該サンプル中の任意の抗原に結合することを可能にする条件下で、該抗体または抗体フラグメントを含む診断的有効量の球状タンパク質を該哺乳動物に投与する工程であって、ここで、該抗体または抗体フラグメントは該抗原に特異的に結合し得る、工程；および
（ｂ）該サンプル中の任意の抗原に対する該抗体または抗体フラグメントの結合を検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項９５】
前記抗体または前記抗体フラグメントが標識されている、請求項９４に記載の診断方法。
【請求項９６】
サンプル中の抗体の存在を検出するためのインビボ診断方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該抗原が該サンプル中の任意の抗体に結合することを可能にする条件下で、診断的有効量の請求項１または２のいずれかに記載の球状タンパク質粒子とを該哺乳動物に投与する工程であって、ここで、該タンパク質は、該抗体に特異的に結合し得る抗原である、工程；および
（ｂ）該サンプル中の任意の抗体に対する該抗原の結合を検出する工程；
を包含する、診断方法。
【請求項９７】
前記抗原が標識されている、請求項９６に記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、球状タンパク質粒子（「ＳＰＰ」）、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰ、それらを生成するための方法ならびにそれらを使用するための方法および組成物（処方物を含む）に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明はさらに、ヒトおよび動物への生物学的送達のためのＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰの使用方法に関する。より具体的には、本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰを使用して、生物学的に活性な薬学的タンパク質の送達のための代替の投薬／送達形態（例えば、エアロゾル、針なし（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ）注射）を提供し得る。
【０００３】
本発明はさらに、生物医学的適用のためのＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子あるいは結晶性ＳＰＰ、またはこれらを含有する組成物（処方物を含む）（より詳細には、高濃度のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの組成物（処方物を含む）を含む）の使用する方法に関し、これらは、被験体が必要とする時間および場所で、被験体に小さい体積で多量のタンパク質を送達するのに有用である。本発明の１つの実施形態に従って、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、被験体が必要とする時間および場所で、被験体に生物学的に活性なタンパク質をゆっくりと放出し得るキャリアを含まない送達系として使用される。本発明の代替の実施形態に従って、薬学的成分または賦形剤を、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに添加し、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを含有する組成物を作製し得る。本発明に従う組成物の１つの実施形態は、処方物である。処方物は、生体適合性ポリマーキャリアにカプセル化されるＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを含む。別の実施形態において、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰならびにそれらを含む組成物および処方物は、生物医学的適用（治療用タンパク質およびワクチンの送達を含む）のために使用される。
【０００４】
ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの安定化した組成物（処方物を含む）を調製する方法、および生物医学的適用（治療用タンパク質およびワクチンの送達を含む）のための、このようなＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの使用方法もまた提供される。
【０００５】
タンパク質が植物、山羊乳、牛乳、細胞培養物、組織培養物および卵において発現する場合、このようなタンパク質の複合混合物由来の目的の所望のタンパク質を抽出するために、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰを使用する方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００６】
（発明の背景）
タンパク質薬物は、それらの非常に乏しいバイオアベイラビリティーのために、一般的に、非経口的投与（すなわち、注射または注入）のために処方される。タンパク質薬物の非経口的投与は、通常、医者、またはある場合、病院への訪問を必要とする。結果として、タンパク質薬物の非経口的投与を必要とする患者に対する医療は、しばしば費用が高く、そして時間がかかる。さらに、患者のコンプライアンスは、しばしば問題であり、特に長期の処置を必要とする患者のコンプライアンスは問題である。
【０００７】
この問題に対処するために、針なし注射技術（例えば、針なし皮下投与）ならびに代替の薬物投薬および送達の方法および形態（例えば、乾燥パウダー吸入、皮膚エレクトロポレーションおよび徐放性薬物または制御放出薬物）が利用される。
【０００８】
針なし注射技術ならびに代替の薬物投薬および送達の方法および形態における使用のために、タンパク質薬物は、必要な安定性を達成するために、固体粒子として製造されなければならない。多くの適用のために、使用されるべきタンパク質粒子は、十分に定義された制限された大きさおよび形態学を有さなければならない。例えば、吸入を介するタンパク質薬物の送達のために、作用の主要な部位（肺胞）に到達される場合、吸入されるべきタンパク質粒子の直径は、約２〜３ミクロンでなければならない。多数の方法（噴霧乾燥、凍結乾燥およびジェットミルが挙げられる）が、ミクロンサイズのタンパク質粒子を調製するために利用される。これらの方法は、典型的に熱および機械的応力によってタンパク質を変性するので、これらの方法は問題である。従って、タンパク質の生物学的活性を失うことなく、ミクロンサイズまたはナノメーターサイズのタンパク質粒子を調製する代替の方法が必要である。本発明に従うＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、この問題ならびに以下に議論される問題を解決する。
【０００９】
Ｒｕｔｈら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ５６：５２４−２８（２０００）（「Ｒｕｔｈ」）は、結晶化のハングドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）方法を使用して作製されたα−Ｌ−イズロニダーゼ半結晶性スフェルライトに関する。ｐＨ３．０〜８．５で結晶化溶液がカルシウム塩および亜鉛塩の存在下で使用された場合、α−Ｌ−イズロニダーゼスフェルライトが、形成した。しかし、スフェルライトを形成するプロセスの間、α−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質の部分的変性または展開におそらく起因して、α−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質は配座変化を起こした。本発明の方法は、配座のあらゆる変化または生物学的活性の損失を生じることを避ける。
【００１０】
米国特許番号６，０６３，９１０（’９１０特許）は、超臨界流体沈殿によるタンパク質微粒子の調製方法に関する。この方法は、本発明によって克服される多数の欠点を有する。’９１０特許に開示される方法は、９０％有機溶媒中への目的のタンパク質の懸濁を必要とし、これは、多数のタンパク質に対して適切ではない。従って、’９１０特許に開示される方法は、本発明の方法とは異なり、沈殿物の粒子を生じ、いくつかの実施形態において、本質的には、結晶性であるＳＰＰを生じ得る。さらに、’９１０特許の方法から得られる粒子は、５ミクロン未満の直径を有するが、本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、直径が約０．０４〜約２００ミクロンおよびおそらくより大きな範囲にある粒子を形成する。
【００１１】
タンパク質粒子を調製するさらなる方法はまた、例えば、Ｂｕｓｔａｍｉ  Ｒ．Ｔ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：１３６０−６６（２０００）（「Ｂｕｓｔａｍｉ」）に開示される。Ｂｕｓｔａｍｉは、高圧改変二酸化炭素を使用するタンパク質の球状微粒子を形成する方法を言及する。Ｂｕｓｔａｍｉの方法を使用して形成された粒子は、たった約０．１〜０．５ミクロンの直径であるが、本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを生成する方法は、直径が約０．０４〜約３００ミクロンの範囲である粒子をもたらす。さらに、Ｂｕｓｔａｍｉにおいて、微粒子中に形成されたタンパク質は、結果としてそれらの生物学的活性の６０％（組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼ（ｒｈＤＮａｓｅ）に対して）までを損失した。本発明の方法を使用して、生物学的活性の損失は、予想されない。最後に、Ｂｕｓｔａｍｉの方法は、明らかにタンパク質凝集を誘導するが、本発明の方法は誘導しない。
【００１２】
原則として、乾燥のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰはまた、凍結乾燥によって調製され得る。例えば、Ｍｏｒｉｔａ  Ｔ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：１３６７−７３（２０００）（「Ｍｏｒｉｔａ」）を参照のこと。Ｍｏｒｉｔａは、タンパク質−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）水性混合物の凍結乾燥によって球状の微細なタンパク質微粒子を形成する方法を言及する。Ｍｏｒｉｔａの方法は、相分離（本明細書中の方法とは異なる）、続く凍結乾燥に依存して、２〜３ミクロンの直径を有する球を得る。本発明の方法は、遠心分離、濾過または凍結乾燥によって単離され得る異なる粒子の形態をもたらす。また、本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、直径が約０．０４〜約３００ミクロンの範囲である粒子を形成する。さらに、Ｍｏｒｉｔａに開示される方法は、以前の工程に使用されたＰＥＧを除去するために、さらなる有機溶媒（例えば、塩化メチレン）（上記のように、多数のタンパク質に対して適切でない）を必要とする。さらに、本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、これらの形態に使用される母液外および他の溶媒（例えば、水性イソプロピルアルコール）への移動に対して適切である。また、Ｍｏｒｉｔａに開示される方法は、ＰＥＧの使用を必要とし、これは使用されるタンパク質を安定化してもよいし、安定化しなくてもよい。対照的に、本発明の方法は、ＰＥＧ以外の試薬の使用を可能にし、このＰＥＧは目的のタンパク質をより安定化し得る。例えば、本発明の方法は、一般的にタンパク質を安定化し、そしてＭｏｒｉｔａの開示される方法において使用され得ない硫酸アンモニウムを使用し得る。
【００１３】
Ｍｏｒｉｔａの方法の別の限定は、開示される技術が材料の急速な冷却に関し、そして安定な生成物を凍結することのみに適用され得ることである。水溶液を始めに、−４０℃〜−５０℃の間に凍結する。次いで、この氷を減圧下で除去する。氷形成は、通常タンパク質結晶格子にとって破壊的であり、タンパク質分子を不安定化し、そして時々アモルファス沈殿の形成を導く。本発明の方法は、この問題を避ける。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、上記の障害を克服する。
【００１５】
より詳細には、本発明は、直径が約０．５〜約５０ミクロンの範囲、より好ましくは直径が約０．０４〜約３００ミクロンのサイズの範囲である、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰを作製する、単純で、効率的で、高収率の方法に関する。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰは、タンパク質の下流プロセッシング、目的のタンパク質の抽出および凝集体の除去を可能にするバッチにおいて、作製され得る。緩衝剤（例えば、グリシン、酢酸ナトリウム、リン酸塩、クエン酸塩、Ｔｉｒｓ、ホウ酸塩およびタンパク質結晶化試薬（例えば、硫酸アンモニウムのような沈殿剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧモノメチルエーテル、ギ酸ナトリウムおよび時々他の添加剤（例えば、プロピレングリコールまたはエチレングリコール））は、本発明に従うＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰの首尾よい形成に対して重要であると考えられる。これらの試薬は、ゆっくりと添加され、沈殿剤の濃度の非常に漸進的な増加をもたらす。透析は、この目的に特に適しているが、制御された様式における直接的な添加はまた、本発明に従うＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰを生じる。
【００１６】
本発明の方法において、試薬がタンパク質溶液に直接適用される場合、即時の沈殿を引き起こす傾向がある試薬（例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧモノメチルエーテル（ＰＥＧ  ＭＭＥ）およびギ酸ナトリム）は、代わりに、透析によって時間をかけてゆっくりと平衡化される。本質的に、目的のタンパク質を含む、より濃縮されていない溶液で平衡化する場合、より濃縮された結晶化緩衝液は、透析膜を通してゆっくりと通過される。時間をかけてこのプロセスは、目的のタンパク質の効率的な濃度を生じ、それによってＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰの形成をもたらすゆっくりとした沈殿を引き起こす。
【００１７】
このプロセスの重要な要素は、タンパク質が、特定のレベルでｐＨを支持し得る緩衝液（例えば、ｐＨ５．５の酢酸ナトリウム）中に存在することである。さらに、特定の添加剤（例えば、ポリエリレングリコール）は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰの首尾よい形成のために重要であると考えられる。本発明の方法は、広範囲の分子量（ＭＷ）、等電点（ｐＩ）および純度を有する広範囲のタンパク質に適用可能である。本方法に適切なタンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体および抗体フラグメント、糖タンパク質、酵素、タンパク質ホルモン、ウイルスおよびウイルスタンパク質、レセプター、診断用タンパク質およびペプチド。本発明の方法は、約４．０〜約１０．０で変化するｐＩを有する、多数のモノクローナル抗体および密にグリコシル化された糖タンパク質に対しての、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰの生産を可能にする。本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰは、非常に安定性であり、そして希釈緩衝液系においてもなお完全に溶解性を維持したままである。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、方法に関し、この方法によって、例えば、タンパク質が細胞（特に、細菌、卵、山羊乳および牛乳、植物、細胞培養物および組織培養物などを含む）において発現される場合、特定のタンパク質が複合タンパク質混合物から精製され得る。
【００１９】
さらなる実施形態は、凝集したタンパク質および凝集していないタンパク質を含有する溶液から凝集したタンパク質を除去する方法に関する。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、架橋されたおよび／またはカプセル化されたＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰを包含する。
【００２１】
本発明はまた、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを含有する、生物学的に活性なタンパク質または組成物（処方物を含む）のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに関する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される本発明をより十分に理解するために、以下の詳細な説明を記載する。この説明において、以下の用語を用いる：
非晶質固体−−タンパク質の非結晶性固体形態であって、時折、非晶質沈殿物と称される。これは、結晶性固体状態に特徴的な分子格子構造を有さない。
【００２３】
抗体−−身体中の異種分子の存在に応答して、脊椎動物の免疫系のいわゆる液性アームにより生成する約ＭＷ１５０ｋＤの糖タンパク質。抗体は、微生物（例えば、寄生生物、細菌およびウイルス）による感染の予防および回復のために必須である。抗体は、侵入した微生物およびその産物上の、抗原（またはエピトープ）と呼ばれるタンパク質（または時折、他の有機分子（ポリサッカリド、糖タンパク質、脂質または核酸を含む））構造を、非常に特異的な様式で認識しそして結合することによって、その機能を発揮する。抗体は、抗体上の超可変ドメイン（抗原結合部位と呼ばれる）とエピトープ自体との間の非常に特異的な相互作用によって、それらの標的抗原に結合する。抗原に結合すると、抗体は、感染している微生物の中和、破壊および除去に寄与する免疫系の多くのエフェクター系の１つ以上を活性化する。
【００２４】
抗体はまた、疾患状態に関与する細胞標的との特異的結合、続くその中和によって、癌、炎症、心臓血管疾患および移植拒絶の処置のために使用される。例えば、モノクローナル抗体のインフリキシマブは、腫瘍壊死因子に結合し、細胞表面レセプターとのその相互作用をブロックすることによって、その炎症における役割を中和する；一方、リツキシマブは、悪性Ｂリンパ球の細胞表面ＣＤ２０抗原に結合することによって、この悪性Ｂリンパ球を標的化する。
【００２５】
ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいは本発明に従うこれらを含む組成物（処方物を含む）に組み込まれ得る、特異的抗体の例としては、とりわけ、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＢＶ抗体、抗ＨＡＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプター抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＨＳＶ抗体および抗ＥＢＶ抗体が挙げられる。
【００２６】
１つの抗体分子は、互いに共有結合した２つの同一の重鎖（各々、約ＭＷ５０ｋＤ）、および２つの同一の軽鎖（各々、約ＭＷ２５ｋＤ）（各々が、これらの重鎖の一方に共有結合している）から構成される構造を有する。これら４つの鎖は、標準的な「Ｙ」モチーフに配置される。「Ｙ」の底の「脚」は、Ｆｃ領域（この「ｃ」は、「結晶性」を表す）と呼ばれ、そして抗体を細胞膜内に固定するため、そしてまたマクロファージ細胞に結合しそして補体を活性化するために使用される。「Ｙ」の上部の２つの「アーム」は、Ｆａｂ領域（この「ａｂ」は、「抗原結合（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）」を表す）と呼ばれる。各Ｆａｂ領域は、定常領域（Ｆａｂ領域とＦｃ領域の接合部において）、および可変領域（これは「Ｙ」の先端部まで延びる）を含む。各可変領域は、「Ｙ」の各先端部において、同一の抗原結合部位（「超可変」領域と呼ばれる、この可変領域内の領域）を含む。従って、各Ｆａｂ領域は、１つの抗原結合部位を有し、従って、この完全抗体分子は、２つの結合部位を有する（すなわち、「二重特異性」である）。天然に存在する抗体上の２つの抗原結合部位は、互いに同一であり、従って、この抗体は、１つの抗原に対して特異的である（すなわち、「単一特異性」である）。現在まで、抗体分子の多数の分子フラグメントが、単離されている。これらは、天然には存在しないが、１つ以上の完全抗体分子から操作される。これらのフラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント（酵素パパインでの消化により、完全抗体から単離される単一のＦａｂ）、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント（酵素ペプシンでこの抗体を消化することにより生成する、互いに共有結合した２つのＦａｂ）が挙げられる。Ｆａｂフラグメントは、単一特異性であり、一方、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、二重特異性である。最近多くの操作された抗体フラグメントが、紹介されている。これには、二重鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）フラグメントおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント（両方の場合で、この「ｖ」は、「可変」を表す）が挙げられる。ｄｓＦｖフラグメントは、Ｆａｂフラグメント−定常領域から構成される（すなわち、互いに共有結合した重鎖および軽鎖の可変領域のみから構成される）。ｓｃＦｖフラグメントは、ペプチドリンカーを介して、軽鎖可変領域に結合した重鎖の可変領域から構成される、単一のポリペプチド鎖である。古典的に、ｄｓＦＶおよびｓｃＦｖの両方は、一価（従って、単一特異性）である。しかし、２つのｄｓＦｖフラグメントまたは２つのｓｃＦｖフラグメントは、それ自体が連結して、二重特異性フラグメント（これは、定常領域を有さないＦ（ａｂ’）２フラグメントと類似している）を形成し得る。さらに、２つのｄｓＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントを異なる抗原結合部位（すなわち、異なる特異性）に連結して、二重特異性フラグメントを形成することが可能である。このようなフラグメントを、研究手段または治療用試薬もしくは診断用試薬のいずれかとして使用し得る。
【００２７】
ヒトにおいて、５種類の抗体（免疫グロブリンとも呼ばれる）：ＩｇＧ、ｉｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥがあり、これらの各々は、その固有の特性および機能を有する。ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥは、全て、１つの抗体分子から構成され、一方、ＩｇＡは、このような分子の１つ、２つまたは３つから構成され、そしてＩｇＭは、５つの抗体分子から構成される。さらに、ヒトにおいて、ＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、およびＩｇＭおよびＩｇＡの各々の２つのサブクラス（それぞれ、１および２）が存在する。例えば、モノクローナル抗体のリツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）は、ＩｇＧ１抗体である。
【００２８】
天然に存在する抗体は、単一の種由来であるが、操作された抗体および抗体フラグメントは、１種より多い動物由来であり得る（すなわち、キメラであり得る）。現在まで、マウス／ヒトキメラ抗体が、作製されているが、他の種の組合せが可能である。キメラ抗体は、さらに２つのサブタイプ：キメラおよびヒト化、に分類されている。キメラのマウス／ヒト抗体は、それぞれ、約７５％のヒトアミノ酸配列および約２５％のマウスアミノ酸配列を含む。ヒト配列は、その抗体の定常領域を表し、一方、マウス配列は、その抗体の可変領域を表す（従って、抗原結合部位を含む）。このようなキメラを使用するための原理は、マウス抗体の抗原特異性を保持するが、マウス抗体の免疫原性を減少させることであり（マウス抗体は、マウス以外の種において、このマウス抗体に対する免疫応答を起こす）、従って、ヒトの治療においてこのキメラを用い得る。キメラ抗体はまた、異なるヒト抗体由来のＣＤＲ領域を含む抗体を含む。
【００２９】
あるいは、キメラ抗体は、ある抗体由来のフレームワーク領域、および別の抗体由来のＣＤＲ領域を含む。キメラ抗体はまた、少なくとも２種の異なるヒト抗体由来のＣＤＲ領域を含む抗体を含む。ヒト化抗体は、約９０％（またはそれ以上）のヒトアミノ酸配列を含む。存在するマウス配列のみが、超可変領域についての配列（これは、その可変領域に含まれる実際の抗原結合部位である）である。ヒト化抗体は、キメラ抗体と比較して、最小のマウス免疫原性を有する。
【００３０】
操作された抗体および抗体フラグメントとしてはまた、とりわけ、非グリコシル化抗体および抗体フラグメントが挙げられる。
【００３１】
一般に、２つのタイプの抗体が存在し、これらはその特異性（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）により区別され得る。ポリクローナル抗体は、血液の免疫グロブリン画分として見出される抗体であり、本質的に、個体が曝された異なる抗原に特異的な多くの異なるタイプの抗体のポリクローナル混合物である（すなわち、これらは、抗体を産生する細胞であるＢリンパ球（またはＢ細胞）の多くの異なるクローン由来である）。
【００３２】
モノクローナル抗体は、単一の特異性の抗体である（すなわち、これらはＢリンパ球（Ｂ細胞）の単一のクローン由来である）。これらの抗体は、その標的抗原に対する精巧な特異性を有し、そしてまたは大量で（すなわち高力価で）産生され得る。これらは、特定の抗原（例えば、癌抗原）に対するマーカーとして、診断剤として（例えば、ＨＩＶ−１のようなウイルスを検出するためのアッセイにおいて）、および治療剤として、有用である。インタクトなモノクローナル抗体は、２つの完全な重鎖および２つの完全な軽鎖を含む古典的な分子構造を有する抗体である。これは、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃフラグメント、ｄｓＦｖフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントと区別される。
【００３３】
従来的に、モノクローナル抗体は、抗体産生Ｂ細胞を不死化ハイブリドーマ細胞と融合して、細胞培養物中でモノクローナル抗体を連続的に産生するＢ細胞ハイブリドーマを生成することにより作製されている。しかし、現在、モノクローナル抗体は、遺伝子改変動物（例えば、ウシおよびヤギ（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｒａｓｇｅｎｉｃｓ）、ブタおよびウサギ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＰＰＬ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ニワトリ（Ｔｒａｎｘｅｎｏｇｅｎ））において、ならびに植物（例えば、タバコおよびトウモロコシ（Ｅｐｉｃｙｔｅ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｅｒｉｓｔｅｍ  Ｃｒｏｐｔｅｃｈ、他）において、インビトロで大量生産され得る。例えば、多量のモノクローナル抗体は、ヤギの乳汁（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｒａｓｇｅｎｉｃｓ）において見出され得る。全てのこのような供給源由来の抗体は、本発明に従って、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰを調製するために使用され得る。さらに、トランスジェニック体の結果として、マウスは、ヒトＢ細胞ゲノム全体（これはヒト抗体をコードする）を含みそして発現するように改変されている。従って、このようなトランスジェニックマウス（Ａｂｇｅｎｉｘ）は、本発明に従うヒト抗体の供給源である。グリコシル化が、この抗体を産生する動物に特異的であることに注意すべきである。例えば、このことは、ヒト以外の供給源由来のヒト抗体が、微妙に異なるグリコシル化特性を有することを意味する。従って、本発明において有用なインタクトな抗体または単鎖Ｆｖフラグメントは、改変されたグリコシル化を示し得るか、または脱グリコシル化され得る。本発明に従って作製され得る、抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子および結晶性抗体ＳＰＰはまた、誘導体化抗体を含む。このような抗体としては、ポリエチレングリコール、あるいは少なくとも１つの糖部分または少なくとも１つのメチル基もしくはエチル基で誘導体化された抗体が挙げられる。
【００３４】
臨床的に適切な抗体はまた、これらの抗体が使用される治療領域に従って分類され得る。このような抗体としては、例えば、癌（例えば、膵臓癌）、炎症疾患（例えば、自己免疫疾患、関節炎）、心血管疾患（例えば、発作）、感染疾患（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）、呼吸疾患（例えば、喘息）、組織移植拒絶および器官移植拒絶を処置するための抗体が挙げられる。このような抗体はまた、放射線免疫療法のための抗体も含む。本発明に従って結晶化され得る抗体としては、例えば、Ａｂｃｉｘｉｍａｂ、Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ、Ｍｕｒｕｍｏｎａｂ−ＣＤ３、Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ、Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ、ＥｔａｎｅｒｃｅｐｔおよびＺｅｖａｌｉｎが挙げられる。
【００３５】
抗体活性放出速度−単位時間当たり溶解したインタクトな抗体の量。単位時間当たり溶解した単鎖Ｆｖ抗体フラグメントの量は、「単鎖Ｆｖ抗体フラグメント放出速度」である。
【００３６】
抗体ＳＰＰ−抗体もしくは抗体の組み合わせの、ゆっくりとした制御された沈殿によって形成される、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶性ＳＰＰ。抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子または結晶性抗体ＳＰＰは、任意の他の薬学的または診断的二受容可能な第二の成分と合わされて、組成物を形成し得る。あるいは、抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子または結晶性抗体ＳＰＰは、ポリマー性キャリア内にカプセル化されて、被覆された粒子（組成物の１実施形態である処方物）を形成し得る。
【００３７】
あるいは、抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子もしくは結晶性抗体ＳＰＰ、またはその組成物もしくは処方物は、抗体フラグメント（とりわけ、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント）から形成され得る。
【００３８】
抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子または結晶性抗体ＳＰＰは、球状形態を有し、そして直径約０．０４ミクロン〜約３００ミクロンの範囲のサイズを有する。
【００３９】
抗原−抗体によって特異的に認識される任意の物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）または物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）。抗原は、代表的に、細胞または侵入する微生物の表面上に見出されるタンパク質の小さい断片（ペプチド）である。抗体は、４アミノ酸長ほどの小さい抗原を特異的に認識し得ると考えられ、そしてたった１つのアミノ酸の置換が、その特定の抗原の抗体認識を破壊し得る。
【００４０】
抗原性−その抗原に対して以前に惹起された抗体により結合される、抗原の能力。抗原は、その抗原に対して標的化された抗体によって結合され得る場合に、その抗原性コンフォメーションにあるといわれる。これは、免疫原性（これは、そのネイティブのコンフォメーションで抗原を提示している微生物を次に中和する抗体の産生を誘発する、抗原の能力である）とは異なる。
【００４１】
抗イディオタイプ抗体−他の抗体の抗原結合部位に対する特異性を有する抗体。抗イディオタイプ抗体は、以下の様式で産生される：抗原は、その抗原に特異的な抗体（Ａｂ−１またはイディオタイプと称される）の産生を誘発する。次いで、これらの抗体（イディオタイプ）は、それ自体免疫原として使用されて、Ａｂ−１に特異的な第二世代の抗体を誘発する。これらの第二世代の抗体（Ａｂ−２）は、抗イディオタイプ抗体（すなわち、抗イディオタイプ）と称され、そしてＡｂ−１を産生するために最初に使用された抗原を模倣するかまたはこの抗原に密接に関連するかのいずれかである。このような反応は、抗原性刺激に応答してインビボでも天然に生じ、そしてこれらの抗体−抗体相互作用によって、免疫系は、本質的にそれ自体と相互作用し得る。この能力を利用することによって、抗イディオタイプ抗体が、特定の感染を予防するため、そして数種の癌ならびに種々の免疫疾患および自己免疫疾患を処置するために使用され得ることが想定される。
【００４２】
抗体半減期−インビボの抗体についての、所定量の抗体がその最初の濃度の５０％にまで減少する時間。ＩｇＧは、代表的に、約２１日間の半減期を有する（しかし、ＩｇＧ３は、たった７日間の半減期を有する）が、一方でＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥは、それぞれ、１０日間、６日間、３日間および２日間の代表的な半減期を有する。所定量の単鎖Ｆｖ抗体フラグメントが、その最初の濃度の５０％にまで減少する時間は、「単鎖Ｆｖ抗体フラグメント半減期」である。
【００４３】
抗体負荷−乾燥組成物の重量に対する抗体の重量％として計算されるような、抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子または結晶性抗体ＳＰＰの組成物（処方物を含む）の抗体含量。抗体負荷の代表的な範囲は、約１％〜約８０％である。乾燥組成物の重量に対するフラグメントの重量％として計算されるような、Ｆｖ抗体フラグメントＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合Ｆｖ抗体フラグメント粒子または結晶性Ｆｖ抗体フラグメントＳＰＰの、組成物（処方物を含む）の単鎖Ｆｖ抗体フラグメント含量は、「単鎖Ｆｖ抗体フラグメント負荷」である。
【００４４】
抗体放出−以下の要因のうち１つ以上によって制御されるような、ポリマー性キャリアからの活性タンパク質の放出：（１）ポリマーマトリックスの分解；（２）ポリマーマトリックス内の結晶溶解速度；（３）ポリマーマトリックスを介した溶解タンパク質の拡散；（４）タンパク質負荷；および（５）抗体結晶／ポリマーマトリックス中への生物学的媒体の拡散。
【００４５】
生体適合性ポリマー−非抗原性（アジュバントとして使用されない場合）、非発癌性、非毒性であり、さもなければ生きている生物と本質的に非適合性ではない、ポリマー。例としては、以下が挙げられる：ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）（例えば、ポリ（乳酸）すなわちＰＬＡ、ポリ（ラクチック−ｃｏ−グリコール酸）すなわちＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｒｙａｔｅ））、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ジオキサン））；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（有機）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギネート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン（ｇｌｙｃａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、硫酸化多糖、これらのブレンドおよびコポリマー。
【００４６】
生分解性ポリマー−加水分解または可溶化によって分解するポリマー。分解は、不均一（粒子表面にで主に生じる）もしくは均一（ポリマーマトリックス全体での均一な分解）、またはこのようなプロセスの組み合わせであり得る。
【００４７】
抗体の生物学的活性の決定のためのバイオイムノアッセイ−抗体の生物学的活性（とりわけ、直接的細胞傷害性、補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を含む）を決定するために使用され得る、任意のイムノアッセイ。実施例１５〜１８および図９および図１０を参照のこと。
【００４８】
生物学的高分子−タンパク質、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）のような生物学的ポリマー。本出願の目的について、生物学的高分子は、高分子とも称される。
【００４９】
補体−免疫の主なエフェクター機構の１つを形成する、約２０種の酵素、プロ酵素および他のタンパク質についての集合的な用語。それ自体は非抗原特異的であるが、補体系は、高度に特異的な抗体媒介性の免疫応答の最終的なエフェクター機構である。
【００５０】
組成物−規定された比率で維持された異なる成分の混合物。ＳＰＰ組成物、球状ナノクリスタル複合粒子組成物、または結晶性ＳＰＰ組成物は、１種以上の薬学的もしくは診断的に受容可能な成分もしくは賦形剤（糖および生体適合性ポリマーを含む）と組み合わせた、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶性ＳＰＰを含む。組成物の１実施形態は、処方物であり、これは、本発明に従うＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶性ＳＰＰであり、ポリマー性キャリア内にカプセル化されて、被覆された粒子を形成している（すなわち、少なくとも１つの成分が、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶性ＳＰＰに添加された、組成物）。賦形剤の例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎの共同出版）に記載される。「除染のための処方物」とは、以下からなる群より選択される処方物である：化学廃棄物、除草剤、殺虫剤、農薬および環境危険の除染のための処方物。
【００５１】
制御された溶解−制御された様式での、タンパク質（とりわけ、インタクトな抗体または単鎖Ｆｖ抗体フラグメントを含む）のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰの溶解、またはこのようなＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰを含む組成物もしくは処方物の溶解。溶解は、以下からなる群より選択される因子によって、制御される：上記ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰの表面積；上記ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰのサイズ；上記ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰの形状；ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰの組成物もしくは処方物の、賦形剤成分の濃度；賦形剤成分の数および性質；賦形剤成分の分子量；ポリマー性キャリアの性質；ならびにこれらの組み合わせ。
【００５２】
コポリマー−１種以上のモノマー種から形成されるポリマー。
【００５３】
結晶−結晶、例えば、結晶性ＳＰＰまたはナノクリスタル（球状ナノクリスタル複合粒子を形成する単一のナノクリスタルまたはナノクリスタルの凝集体）は、物質の固体状態の１形態であり、第二の形態（非晶性固体状態（これは、本質的に、組織化されていない固体として存在する））とは別個である。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体のようなタンパク質）または分子アセンブリ（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な三次元アレイである。結晶は、非対称単位と称される構築ブロック（これは、結晶化される物質からなる）（これは、三次元で反復される単位格子へと、十分規定された対称性に従って配置される）の格子アレイである。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．およびＤｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，第二版，ｐｐ．１−１６，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと。
【００５４】
診断的有効量−いくらかの期間にわたってそれが投与される生きた生物において、微生物による感染を診断するために有効な、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰ、またはこれらの組成物もしくは処方物の量。
【００５５】
ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの乾燥−Ｎ２、空気もしくは不活性気体での乾燥、減圧オーブン乾燥、凍結乾燥、揮発性有機溶媒での洗浄およびその後の溶媒のエバポレーション、またはヒュームフードにおけるエバポレーションを含む手段による、水、有機溶媒または液体ポリマーの除去。代表的には、乾燥は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰが、自由に流動する粉末となる場合に達成される。乾燥は、湿ったＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ上に、気体の流れを通過させることによって実施され得る。この気体は、以下からなる群より選択され得る：窒素、アルゴン、ヘリウム、二酸化炭素、空気またはこれらの組み合わせ。
【００５６】
有効量−いくらかの期間にわたってそれが投与される被験体もしくは領域を、処置、免疫、ブースト、保護、修復または解毒するのに有効な、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰ、またはこれらの組成物もしくは処方物の量。
【００５７】
乳化剤−ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰと溶液との間の界面張力を低減する、界面活性剤。あるいは、乳化剤は、ポリマー被覆されたＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰと溶液との間の界面張力を低減する。
【００５８】
糖タンパク質−糖質に共有結合したタンパク質またはペプチド。この糖質は、モノマーであっても、オリゴ糖から構成されてもよい。
【００５９】
ホモポリマー−単一のモノマー種から形成されるポリマー。
【００６０】
免疫療法タンパク質−腫瘍細胞、ウイルスもしくは細菌に対する保護免疫を誘導する活性、またはこの腫瘍細胞、ウイルスもしくは細菌を減少または排除するように、免疫系を刺激する活性を有する場合、タンパク質は免疫療法的である。
【００６１】
不溶性形態および安定形態−水性溶媒、有機溶媒または水性−有機性溶媒混合物中で不溶性であり、そしてＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰのタンパク質の成分の不溶性形態よりもより高い安定性を示す、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの形態。任意の実施形態において、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、不溶性形態で活性であり得る。そして１実施形態において、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、不溶性形態で活性であり得、次いで一旦その機能が完了すると、溶解するか、または除去もしくは消化される。
【００６２】
標識−ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰへの標識の取り込み。標識は、放射性標識、酵素標識、毒素、磁性因子または薬物結合体からなる群より選択され得る。
【００６３】
液体ポリマー−水性溶媒および有機溶媒の非存在下での、純粋な液相の合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【００６４】
高分子−タンパク質分子、糖タンパク質分子、ペプチド分子、治療タンパク質分子、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子。
【００６５】
投与方法−ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰ、またはこれらを含む組成物もしくは処方物は、種々の投与様式に適切であり得る。これらとしては、経口投与および非経口投与が挙げられる。非経口投与の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：皮下、静脈内、経皮、筋内、肺吸入、病変内、局所的投与、針なし注射、皮下注射、針なし皮下投与またはエアロゾル送達。
【００６６】
母液−高分子（例えば、タンパク質、核酸）のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを作製するために使用される、調製緩衝液。
【００６７】
有機溶媒−液体ポリマーおよびその混合物を含む、非水性起源の任意の溶媒。本発明に適切な有機溶媒としては、以下が挙げられる：アセトン、メチルアルコール、メチルイソブチルケトン、クロロホルム、１−プロパノール、イソプロパノール、２−プロパノール、アセトニトリル、１−ブタノール、２−ブタノール、エチルアルコール、シクロヘキサン、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジクロロエタン、ヘキサン、イソオクタン、塩化メチレン、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、トルエン、四塩化炭素またはこれらの組み合わせ。
【００６８】
ペプチド−小さい〜中間の分子量、通常３〜３５アミノ酸残基であり、そしてしばしばより大きいタンパク質のフラグメントを示すが、必ずしもそうではない、ポリペプチド。
【００６９】
薬学的有効量−いくらかの期間にわたってそれが投与される生きた生物においてある状態を処置するために有効な、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰ、またはこれらの組成物もしくは処方物の量。
【００７０】
予防的有効量−いくらかの期間にわたってそれが投与される個体において感染を予防するために有効な、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰ、またはこれらの組成物もしくは処方物の量。
【００７１】
成分−薬学的成分または賦形剤を含む、任意の成分または賦形剤。賦形剤としては、例えば、以下が挙げられる：
（酸性化剤）
酢酸、氷酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、希塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、希リン酸、硫酸、酒石酸。
【００７２】
（エアロゾル噴霧体）
ブタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、イソブタン、プロパン、トリクロロモノフルオロメタン
（空気置換）
二酸化炭素、窒素
（アルコール変性剤）
安息香酸デナトニウム、メチルイソブチルケトン、スクロースオクトアセテート（ｏｃｔａｃｅｔａｔｅ）
（アルカリ化剤）
強アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トロラミン
（抗ケーキング剤）  （流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）を参照のこと）
（消泡剤）
ジメチコーン、シメチコン
（抗菌保存剤）
塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム溶液、塩化ベンゼルトニウム（ｂｅｎｚｅｌｔｈｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール、チモール
（抗酸化剤）
アスコルビン酸、アスコルビル酸パルミテート（ａｃｏｒｂｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄（ｓｕｆｕｒ  ｄｉｏｘｉｄｅ）、トコフェロール、トコフェロール賦形剤
（緩衝化剤）
酢酸、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、クエン酸カリウム、メタリン酸カリウム、一塩基のリン酸カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム溶液、二塩基のリン酸ナトリウム、一塩基のリン酸ナトリウム
（カプセル潤滑剤）
（錠剤およびカプセル潤滑剤を参照のこと）
（キレート剤）
エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸および塩、エデト酸
（コーティング化剤）
カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ゼラチン、製薬グレイズ、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニルフタレート、セラック、ショ糖、二酸化チタン、カルナバワックス、微結晶性ワックス（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｗａｘ）、ゼイン
（着色剤）
キャラメル、赤、黄色、黒またはブレンド、酸化鉄
（錯化剤）
エチレンジアミン四酢酸および塩（ＥＤＴＡ）、エデト酸、ゲンチシン酸エタノールアミド（ｅｔｈａｎｏｌｍａｉｄｅ）、硫酸オキシキノリン（ｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）
（乾燥剤）
塩化カルシウム、硫酸カルシウム、二酸化シリコン
（乳化剤および／または可溶化剤）
アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン（添加剤）、モノステアリン酸グリセリン、ラノリンアルコール、レシチン、モノグリセリドおよびジグリセリド、モノエタノールアミン（添加剤）、オレイン酸  （添加剤）、オレイルアルコール（安定化剤）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシル３５ヒマシ油（ｃａｓｔｅｒ  ｏｉｌ）、ポリオキシル４０硬化ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル（ｃｅｔｏｓｔｅａｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシル４０ステアレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、ソルビタン（ｓｏｒｉｔａｎ）モノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ステアリン酸、トロラミン、乳化蝋
（濾過助剤）
粉末セルロース、精製ケイソウ土（ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ  ｅａｒｔｈ）
（風味剤および芳香剤）
アネトール、ベンズアルデヒド、エチルバニリン、メントール、メチルサリチラート、グルタミン酸一ナトリウム、橙花油、ペパーミント、ペパーミント油、ペパーミントスピリット（ｓｐｉｒｉｔ）、ローズ油、強ローズ水（ｓｔｒｏｎｇｅｒ  ｒｏｓｅ  ｗａｔｅｒ）、チモール、トルーバルサムチンクチャー、バニラ、バニラチンクチャー、バニリン
（流動促進剤および／または抗ケーキング剤）
ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、タルク
（湿潤剤）
グリセリン、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール
（軟膏基剤）
ラノリン、無水ラノリン、親水軟膏、白色軟膏、黄色軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ペトロラタム、親水ペトロラタム、白色ペトロラタム、ローズ水軟膏、スクアレン
（可塑剤）
ヒマシ油、ジアセチル化モノグリセリド、ジエチルフタレート、グリセリン、モノアセチル化モノグリセリドおよびジアセチル化モノグリセリド、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチン、クエン酸トリエチル
（ポリマー膜）
酢酸セルロース
（溶媒）
アセトン、アルコール、希釈アルコール、アミレン水和物、ベンジルベンゾエート、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチル、グリセリン、ヘキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルアルコール、塩化メチレン、メチルイソブチルケトン、鉱油、ピーナッツ油、ポリエチレングリコール、プロピレンカルボネート、プロピレングリコール、ゴマ油、注射用水、注射用滅菌水、灌流用滅菌水、精製水
（吸収剤）
粉末セルロース、チャーコウル、精製ケイソウ土
（二酸化炭素吸収剤）
バリウムヒドロキシライム（ｂａｒｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｌｉｍｅ）、ソーダ石灰
（硬化剤）
硬化ヒマシ油、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエーテルワックス、固い脂肪（ｈａｒｄ  ｆａｔ）、パラフィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化蝋、白色ワックス、黄色ワックス
（座剤基剤）
カカオバター、固い脂肪、ポリエチレングリコール
（懸濁剤および／または増粘剤）
アカシア、寒天、アルギン酸、モノステアレートアンモニウム、ベントナイト、精製ベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー９３４ｐ、カルボキシメチルセルロース  カルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）ナトリウム１２、カラゲニン、微結晶性ナトリウムセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアールガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレン酸化物、ポリビニルアルコール、ポビドン、プロピレングリコールアルギネート、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、ナトリウムアルギネート、トラガカント、キサンタンガム
（甘味剤）
アスパラテーム、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）、デキストロース、賦形剤デキストロース、フルクトース、マンニトール、サッカリン、カルシウムサッカリン、ナトリウムサッカリン、ソルビトール、溶液ソルビトール、ショ糖、圧縮性糖、粉砂糖、シロップ
（錠剤結合剤）
アカシア、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、グアールガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリエチレン酸化物、ポビドン、予めゼラチン化したデンプン、シロップ
（錠剤および／またはカプセル希釈剤）
炭酸カルシウム、二塩基のリン酸カルシウム、三塩基のリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、粉末セルロース、デキストレート、デキストリン、デキストロース  賦形剤、フルクトース、カオリン、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、予めゼラチン化したデンプン、ショ糖、圧縮性糖、粉砂糖
（錠剤崩壊剤（ｔａｂｌｅ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ））
アルギン酸、微結晶性セルロース、クロスカルメローゼ（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、クロスポビドン（ｃｏｒｓｐｏｖｉｄｏｎｅ）、ポルアクリリン（ｐｏｌａｃｒｉｌｉｎ）カリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン、予めゼラチン化したデンプン
（錠剤および／またはカプセル化潤滑剤）
ステアリン酸カルシウム、グリセリルベヘナート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈｅｎａｔｅ）、ステアリン酸マグネシウム、軽油、ポリエチレングリコール、ナトリウムステアリルフマレート（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔｅａｒｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ）、ステアリン酸、精製ステアリン酸、タルク、硬化植物油、ステアリン酸亜鉛
（張度剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ））
デキストロース、グリセリン、マンニトール、塩化カリウム、塩化ナトリウム
（ビヒクル：風味付けおよび／または甘味付け）
芳香エリキシル、化合物ベンズアルデヒドエリキシル、イソ−アルコールエリキシル、ペパーミント水、ソルビトール溶液、シロップ、トルーバルサムシロップ
（ビヒクル：油性）
アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチル酸イソプロピル、イソプロピルパルミテート、鉱油、軽油、ミリスチル（ｍｙｒｉｓｔｙｌ）アルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、ピーナッツ油、杏仁油、ゴマ油、大豆油、スクアレン
（ビヒクル：固形キャリア）
糖スフィア
（ビヒクル：無菌）
注射用静菌性水、注射用静菌性塩化ナトリウム
増粘剤（懸濁剤を参照のこと）
撥水剤（Ｗａｔｅｒ  ｒｅｐｅｌｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）
シクロメチコーン（ｃｙｃｌｏｍｅｔｈｉｃｏｎｅ）、ジメチコーン、シメチコン
（湿潤剤および／または可溶化剤）
塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドキュセートナトリウム、ノノキシノール９、ノノキシノール１０、オクトキシノール９、ポリキサマー、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０、硬化ヒマシ油、ポリオキシル５０ステアレート、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０、セトステアリルエーテル、ポリオキシル４０ステアレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート（ｍｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、チロキサポール
好ましい成分または賦形剤としては、以下の塩が挙げられる：
１）アミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリン）、２）炭水化物、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボース）、および３）二糖（例えば、ラクトース、トレハロース、マルトース、ショ糖）および４）多糖（例えば、マルトデキストリン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）、デキストラン、デンプン、グリコーゲン）、および５）アラビトール（例えば、マンニトール、キシリトール、ラクチトール（ｌａｃｔｉｔｏｌ）、ソルビトール）、６）グルクロン酸、ガラクツロン酸、７）シクロデキストリン（例えば、メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ならびに同様に８）無機塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、ホウ酸炭酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム、ならびに９）有機塩類（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩）、１０）乳化剤または可溶化剤（アカシア、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリン、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポリキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレート、および他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体のような）、１１）増粘剤（寒天、アルギン酸およびその塩、グアールガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレン酸化物、セルロースおよびその塩の誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、チロキサポールのような）。賦形剤または成分のさらに好ましい群としては、以下が挙げられる：ショ糖、トレハロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、イノシトール、（酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸のような）ナトリウムおよびカリウムの塩、グリシン、アルギニン、ポリエチレン酸化物、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン。
【００７３】
（ポリマー）
高分子は、小さな単純な化学単位の繰り返しによって構築される。この繰り返し単位は、相互連絡ネットワークを形成するために直線または分枝であり得る。この繰り返し単位は、通常、このモノマーに等価かまたはほぼ等価である。
【００７４】
（ポリマーキャリア）
ＳＰＰタンパク質成分の送達（生物学的送達を含む）のための、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）または結晶ＳＰＰのカプセル化に使用されたこのようなポリマーとしては、生物適合性ポリマーおよび生分解性ポリマーが挙げられる。ポリマーキャリアは、単一のポリマー型であり得るか、またはポリマー型の混合物からなり得る。ポリマーキャリアとして有用なポリマーとしては、例えば、以下が挙げられる：ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）（例えば、ポリ（乳酸）もしくはＰＬＡ、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））もしくはＰＬＧＡ、ポリ（Ｂ−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ジオキサノン））；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレインアルキル（ｍａｌｅｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅａｌｋｙｌ）ビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール）、アルブミン、天然ポリペプチドおよび合成ポリペプチド、アルギネート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン（ｇｌｙｃａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、硫酸化多糖、修飾したデンプン（例えば、アミロースデンプン、アミロペクチンデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、メタクリレートデンプン、および他のデンプン、ならびにタンパク質ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰをカプセル化し得る慣習的な材料。
【００７５】
（タンパク質）
炭素、水素、酸素、窒素および通常、硫酸を含む複合体高ポリマーであり、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸鎖からなる。タンパク質の分子量の範囲は、１０００ダルトンのペプチドから６００〜１０００キロダルトンの糖タンパク質を含む。
【００７６】
（タンパク質送達系）
タンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰ、あるいはそれらの組成物または処方物の１つ以上を、生物学的存在（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）に対して投与するための方法または手段。
【００７７】
（予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ）有効量）
ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰ、あるいはそれらの組成物または処方物の、生存する生物における微生物による感染を防ぐのに有効な量。これは、ある期間にわたって投与される。
【００７８】
（放射標識）
ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰへの放射標識の組み込み。放射標識の半減期が短い場合（１３１Ｉまたは９０Ｙのように）、この放射標識はまた、治療剤（例えば、癌に対する放射免疫療法において使用される）となり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当業者に公知であり、使用され得る。標識の例としては、以下の放射性同位体または放射線核種が挙げられるが、これらに限定されない：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉおよび１３１Ｉ。
【００７９】
（再構成）
ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰ、あるいはそれらの組成物または処方物の、適切な緩衝剤または薬学的賦形剤または成分中における分解。
【００８０】
（貯蔵安定性の欠如）
特定の条件下でインキュベートした時間にわたる、可溶性タンパク質相対物との比較としての、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのタンパク質成分の比活性および／または二次構造または三次構造の変化の欠如。
【００８１】
（球状タンパク質粒子（ＳＰＰ））
天然の粗い球状であり、そして遠心分離および濾過のような方法によって単離され得る形態を有する別個のタンパク質粒子。ＳＰＰまたは結晶ＳＰＰの１実施形態は、いわゆる「球状ナノクリスタル複合粒子（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」である。球状ナノクリスタル複合粒子は、直径約１〜約３００マイクロメートル（μｍ）の全体の直径を有するタンパク質粒子である。球状ナノ粒子複合粒子は、約４０〜約９９９ナノメートル（ｎｍ）の直径を有する、「ナノクリスタル」と言われるタンパク質結晶を含む。これらのタンパク質ナノクリスタルは、巨大な球状ナノクリスタル複合粒子の全体にわたって不均質にアレンジされ得るか、または層状の殻構造においてアレンジされ得る。さらに、このナノクリスタルは、孔および直径（ａｃｒｏｓｓ）（端から端まで）約１ｎｍ〜約１００ｎｍの開口部を備えるチャネルを形成するような方法において、球状ナノクリスタル複合粒子内でアレンジされ得る。
【００８２】
（結晶性球状タンパク質粒子（ＳＰＰ））
タンパク質が結晶性形態であるか、天然の結晶性であるＳＰＰ。約４０ｎｍ〜約９９９ｎｍの範囲の直径を有する結晶ＳＰＰは、「ナノクリスタル」ＳＰＰである。
【００８３】
（安定性の欠如）
特定の条件下での溶液中での時間にわたる、可溶性タンパク質相対物との比較としての、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのタンパク質成分の比活性および／または二次構造または三次構造の変化の欠如。
【００８４】
（安定性）
凝集を防ぐプロセス。賦形剤または成分を有するＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの組成物または処方物を調製することによる、可溶性タンパク質相対物との比較としての、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのタンパク質成分の比活性および／または二次構造または三次構造の変化の欠如。
【００８５】
（治療用ＳＰＰ、治療用球状ナノクリスタル複合粒子または治療用結晶ＳＰＰ）
上記のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰは、組成物もしくは処方物、または薬学的組成物もしくは薬学的処方物において、生存する生物に投与される。
【００８６】
（ワクチンＳＰＰまたはワクチン球状ナノクリスタル複合粒子またはワクチン結晶性ＳＰＰ）
ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、病原因子（例えば、ウイルス、寄生生物、細菌または腫瘍細胞）由来の抗原のタンパク質成分。このようなワクチンＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰのタンパク質活性は、病原因子または腫瘍に特異的な保護免疫応答の誘導である。
【００８７】
（本発明の方法に従うＳＰＰの処方物）
本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、沈殿剤濃度の非常に漸増的な増加を生じるような、タンパク質結晶化剤／沈殿剤のゆっくりとした添加によって作製され得る。透析は、このようなゆっくりとした変化を生じるために使用され得る。しかし、制御された様式での直接添加は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰもまた生じ得る方法である。透析において、目的の高分子（例えば、酵素、抗体、ホルモン）は、低イオン強度溶液中に存在する。高分子溶液は、半透膜区画を生じる膜またはそれを有する容器中に包まれる。透析の間、透析膜は、低分子およびイオンの通過を選択的に可能にするが、孔の大きさによって、より大きな高分子の通過を妨げる。タンパク質を含む容器または透析チューブは、所望の、ｐＨ、イオン強度、リガンド濃度などの特性を有する、より大きな容積の液体中に沈められる。タンパク質溶液は、所望の特徴および成分を徐々に獲得する。透析は、本発明の好ましい方法である。
【００８８】
あるいは、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、制御された様式での沈殿剤／緩衝液の直接添加によって生成され得る（実施例６を参照のこと）。
【００８９】
（生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはこれらを含む組成物または処方物の産生）
（透析方法：）
透析は、タンパク質溶液の成分および飽和度を改変する方法である。高分子（例えば、酵素、抗体またはホルモン）溶液は、半透膜区画を生じる膜またはそれを有する容器中に囲われる。膜は、低分子およびイオンの通過を選択的に可能にするが、孔の大きさによって、より大きな高分子の通過を妨げる。タンパク質を含む容器または透析チューブは、所望の、ｐＨ、イオン強度、リガンド濃度などの特性を有する、より大きな容積の液体中に沈められる。タンパク質溶液は、所望の特徴および成分を徐々に獲得する。
【００９０】
（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用する透析）
Ａ．この透析方法は、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒと呼ばれるデバイスを使用する（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，カタログ番号６９５７０）。本明細書中で使用されるＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒは、１０ｋＤに分子量カットオフ点を有する。
【００９１】
Ｂ．手順：
１．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒユニットを取り、一晩蒸留水中に浸す。
【００９２】
２．別のチューブ（例えば、小さなＣｅｎｔｒｉｃｏｎデバイス（Ａｍｉｃｏｎ、カタログ番号４２０８）の下部分）を取り、３．８〜３．９ｍｌの、例えば、２．０５Ｍ  硫酸アンモニウム（室温での飽和硫酸アンモニウムが４．１Ｍ溶液であると仮定して計算された）、０．１Ｍ  緩衝液（酢酸、リン酸、Ｔｒｉｓ）、および１．５％  プロピレングリコールで満たす。
試薬を以下の順に添加する：１）水、２）緩衝液、３）プロピレングリコール、および４）飽和硫酸アンモニウム。
【００９３】
３．３．５ｍｍ×３．５ｍｍの攪拌子を、デバイスの下部分に配置する。この攪拌子が、中央で着実に（壁にくっつかない）かき回していることを確実にする。
【００９４】
４．ほぼ１０〜２０ｍｇ／ｍｌに等しいタンパク質濃度の１５０〜４１０μｌの所望のタンパク質溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒに入れる。緩衝液／プロピレングリコール／硫酸アンモニウム溶液のレベルの１ｍｍまたは２ｍｍ下であるように、膜を浸す。
【００９５】
５．エバポレーションを防止するように堅く、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒに蓋をする。適当な温度で、適当な時間透析する。
【００９６】
６．透析後、ＨＰＬＣおよび顕微鏡検査を使用して、透析の結果を確認し、上清のタンパク質含量を、２８０ｎｍの光学密度での吸光度を測定することによって決定する。適切な場合はいつでもであるが、沈渣の上の液体の層が消えたすぐ後に、確認し回収する。このことは、以下の理由で重大である：
ａ）タンパク質がその上で凝集する場合、この凝集物は、まず球体を形成し、上清にモノマーとして所望のタンパク質を残す。この場合、上清が、回収され、別の膜に移され、球体を形成するまで透析を進行させる。
ｂ）抗体が、清浄化非トランスジェニックミルク中でスパイクされる場合、このミルクタンパク質は、最後に球体を形成する傾向があり、従って、所望のタンパク質の効率的な分画を達成するために正確な時間で、透析を停止することは重要である。
【００９７】
（非透析方法：）
本発明に従う、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを産生するさらなる方法は、透析を包含しない。代わりに、沈殿性試薬（例えば、硫酸アンモニウム）を、漸増的にゆっくりと添加し、それによって、逐次的様式で、タンパク質溶液の濃度を増加し得る。タンパク質溶液混合物は、各々の濃度で１時間、平衡化される。サンプルを、顕微鏡検査によって周期的に分析し、球体形成を決定する。上清中に残存するタンパク質含量、収量、タンパク質の量を、２８０ｎｍの光学密度（ＯＤ）での分光学およびＨＰＬＣによって測定する。
【００９８】
（ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰの組成物または処方物の調製：）
本発明の１つの実施形態に従って、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはこれらを含む組成物または処方物は、以下のプロセスによって調製される。
【００９９】
まず、目的の生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰが、生成される。次に、糖、糖アルコール、増粘剤、湿潤剤、可溶化剤、緩衝液塩、乳化剤、抗菌剤、抗酸化剤、およびコーティング剤から選択される賦形剤または成分が、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ処方物に直接添加される。賦形剤濃度は、代表的に、約０．０１〜３０％Ｗ／Ｗの間であり、もっとも好ましくは、約０．１〜１０％の間である。成分濃度は、約０．０１〜９０％の間である。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ濃度は、約０．０１〜９９％の間である。
【０１００】
次いで、処方物緩衝液は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰから、濾過または濃縮のいずれかによって除去される。続いて、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、室温または約−２０℃〜約２５℃との間の温度のいずれかで、必要に応じて、１つ以上の有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、または酢酸エチル）の約５０〜約１００％の溶液で、洗浄される。
【０１０１】
次いで、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの上を、窒素、空気、または希ガスのいずれかの流れを通過させることによって乾燥される。あるいは、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、空気乾燥、スプレー乾燥、凍結乾燥または真空乾燥によって乾燥される。乾燥は、最終生成物の水分含有量が、約１０重量％未満になり、最も好ましくは約５％未満になるまで、洗浄後、少なくとも約１時間〜最大で約７２時間実施される。最後に、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの微粉化（大きさを減少すること）は、所望される場合、実施され得る。
【０１０２】
本発明の１つの実施形態に従うと、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはこれらを含む組成物または処方物を調製する場合、促進剤（例えば、界面活性剤）は、調製の間に添加されない。賦形剤または成分は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰが、約１〜１０％Ｗ／Ｗの間の濃度で、あるいは約０．１〜２５％Ｗ／Ｗの間の濃度で、あるいは約０．１〜５０％Ｗ／Ｗの間の濃度で調製された後、調製緩衝液に添加される。賦形剤または成分は、約０．１〜３時間、調製緩衝液中で、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰとインキュベートされ、あるいはインキュベーションは、０．１〜１２時間実施され、あるいはインキュベーションは、０．１〜２４時間実施される。
【０１０３】
本発明の別の実施形態において、成分または賦形剤は、調製緩衝液以外の溶液に溶解され、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、調製緩衝液から取り除かれ、賦形剤溶液または成分溶液中に懸濁される。成分濃度または賦形剤濃度およびインキュベーション時間は、上記されるものと同じである。
【０１０４】
本発明の別の実施形態に従って、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰのタンパク質成分は、以下の１つ以外のタンパク質である：α−Ｌ−イズロニダーゼまたはリゾチームまたはアルブミンまたはインシュリンまたはヒト（ｒｈ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）またはカタラーゼ。
【０１０５】
本発明の別の実施形態に従うと、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰのタンパク質成分は、以下の全て以外のタンパク質である：α−Ｌ−イズロニダーゼ、リゾチーム、アルブミン、インシュリン、ヒト（ｒｈ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）およびカタラーゼ。
【０１０６】
（本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに対する使用）
本発明は、有利には、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはこれらを含む組成物または処方物を提供する。周囲温度または極限温度での貯蔵条件下で、純粋かつ安定である、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを産生することが望ましい。このようなＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、治療薬またはワクチンの用量処方物のために特に有利な形態を構成する。本発明はまた、固体粒子または非水性溶媒中に分散された粒子のいずれかとして、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの貯蔵のための組成物または処方物を提供する。さらに、本発明は、単一の生物学的に活性なタンパク質の混合物の貯蔵、または互いに相互作用し得るか、もしくはし得ないタンパク質の混合物の貯蔵、に適用され得る。
【０１０７】
また、固体の、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ調製物は、容易に再構成され、非常に高いタンパク質濃度を有する、すぐに使用できる非経口組成物および処方物を生成する。このようなタンパク質の濃度は、処方物が皮下投与に指向される場合、特に有用であると考えられる。皮下投与について、約１．５ｍｌ以下の注射体積が、許容される。従って、毎週、約１ｍｇ／ｋｇで投薬されるタンパク質について、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が必要とされ、約１００〜２００ｍｇ／ｍｌが好ましい。最も好ましい実施形態は、約４００ｍｇ／ｍｌまでのタンパク質濃度を有する、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの組成物または処方物である。これらの濃度は、凝集体問題に起因して、液体処方物中で達成されることは困難である。これらは、本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰおよびこれらの組成物または処方物において容易に達成され得る。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明は、抗体のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを生成するための方法を提供し、この抗体としては、モノクローナル抗体、および、また抗体の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントが挙げられ、種々の生物医学的適用において、このようなＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを使用する。このようなｓｃＦｖフラグメントは、抗体重鎖の可変領域を、抗体軽鎖の可変領域に、リンカーペプチドを使用して連結することによって構築される。これらの小さな大きさに起因して、ｓｃＦｖフラグメントは、インタクトな抗体よりも容易に組織に貫通し得、従って、特定の適応症に関する有益な治療適用を有し得る。
【０１０９】
本発明は、全ての免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、および血清ＩｇＡ（ｓＩｇＡ））およびサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ならびに全ての免疫グロブリンクラスおよびサブクラス由来のｓｃＦｖフラグメントの、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを含む。
【０１１０】
別の実施形態において、本発明は、生物学的に活性な、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを、貯蔵に適切にするための方法を提供する。
【０１１１】
本発明のさらに別の実施形態において、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの水性調製物は、第１の溶媒を除去し、残存するＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの固体を、第２の有機溶媒を使用して洗浄して水を除去し、その後の非水性溶媒のエバポレーションによって固体にされる。
【０１１２】
生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの非水性調製物は、非経口的投与（例えば、皮下的送達および筋内的送達を含む）に特に有用であり、一方、処方物の固体組成物は、肺投与に理想的に適している。当業者に理解されるように、肺送達は、他の投与経路によって送達されることが困難である生体高分子に特に有用である。
【０１１３】
別の実施形態において、本発明に従う、単鎖抗体フラグメントの、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ（インタクトな抗体を含む）および単鎖抗体フラグメントの、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、診断法および診断キットに有用である。例えば、このようなＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、患者または別の標本由来のサンプル中の、標的抗原または抗体の存在を診断するためのキットにおいて使用され得る。このようなキットは、容器を含み、必要に応じて、使用のための指示書を含み得る。キット中のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、検出可能な標識で標識され得る。サンプル（例えば、血液サンプル、腫瘍サンプル、細胞サンプル、または組織サンプル）中の標的抗原または抗体を検出するための方法は、サンプルを、本発明に従うタンパク質またはインタクトな抗体もしくは単鎖抗体フラグメントの、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰと混合し、サンプルが、タンパク質、抗体またはフラグメントに結合するかどうかを決定することによって実施され得る。このような方法において使用される、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、検出可能な標識で標識され得る。
【０１１４】
あるいは、本発明に従う、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子またはタンパク質の結晶ＳＰＰ（例えば、インタクトな抗体または単鎖抗体フラグメント）は、クロマトグラフィーおよび精製方法（例えば、アフィニティクロマトグラフィー）において有用である。例えば、タンパク質のアフィニティマトリクス精製は、以下：
（ａ）結合緩衝液ＳＰＰ、インタクトな抗体もしくはＳＰＰの球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、単鎖Ｆｖ抗体フラグメントの球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰと混合する工程であって、ここでそのような抗体または抗体フラグメントは、精製されるタンパク質に対する親和性を有する、工程；
（ｂ）この結晶／緩衝液混合物に、精製されるタンパク質を含むタンパク質溶液を添加する工程；
（ｃ）この混合物全体を、抗体または抗体フラグメントへのこのタンパク質の結合を可能にするのに十分な時間および温度で、インキュベートする工程；
（ｄ）混合物を、洗浄緩衝液で洗浄する工程；ならびに
（ｅ）タンパク質を、抽出緩衝液を用いて抽出する工程、
により実施され得る。
【０１１５】
（投与および生物学的送達）
現在までのところ、治療的タンパク質（例えば、インタクトな抗体）は、一般的に、これらに特徴的な、わずかな経口のバイオアベイラビリティーおよび短い結晶の持続時間に起因して、頻繁な注射または注入により投与されている。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶ＳＰＰ、およびこれらを含む組成物または処方物（これらは、生物学的に活性なタンパク質のマイクロ粒子ベースの持続性放出系を含む）は、有利に、改善された患者のコンプライアンスおよび簡便さ、より安定な血中レベルおよび潜在的な容量の減少を可能にする。このことによりなされる、徐放性能力および定常放出能力は、活性タンパク質のより効率的な送達に起因して、減少された投与量を可能にする。有意な経費の削減が、本明細書中に記載されるＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、結晶ＳＰＰおよび組成物または処方物を用いることにより達成され得る。
【０１１６】
本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰおよび組成物または処方物は、ネイティブの生物学的に活性なタンパク質の生物学的に活性な二次構造および三次構造の保存を増強する。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのタンパク質成分の生物学的活性およびコンフォメーションが、多数の方法（とりわけ以下の方法）を用いて、測定され得、そしてそのネイティブの、可溶性対応物と比較され得る。
【０１１７】
（１．二次構造を測定するためのフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法）
ＦＴＩＲ分光法は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのタンパク質成分の二次構造の特徴を測定し、そしてそれをそのネイティブの可溶性対応物の二次構造の特徴と比較するための有用な方法である。より詳細には、ＦＴＩＲ分光法は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰ由来のタンパク質のαへリックスまたはβシート成分を測定し得、そしてそれを、そのネイティブの可溶性対応物のαへリックスまたはβシート成分と比較し得る。実施例１３を参照のこと。
【０１１８】
（２．三次構造を測定するためのフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法）
ＦＴＩＲ分光法はまた、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのタンパク質成分の三次構造の特徴を測定し、そしてそれをそのネイティブの可溶性対応物の三次構造の特徴と比較するのに有用である。実施例４６を参照のこと。
【０１１９】
（３．円二色性（ＣＤ）分光法）
ＣＤ分光法は、分子構造の特徴の迅速決定のための有用な方法である。ＣＤ分光法は、タンパク質の二次構造（とりわけ、アッセイされるタンパク質のβシート成分、αへリックス成分、βターン成分およびランダムコイル成分）の特徴付けを可能にする。ＣＤスペクトルは、核酸の構造（とりわけ、その核酸分子がＡ型（Ａ−ＤＮＡまたはＡ−ＲＮＡ）、Ｂ型（Ｂ−ＤＮＡ）またはＺ型（Ｚ−ＤＮＡ）のいずれかである）の型の特徴付けをさらに可能にする。この様式において、溶解したＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰまたは球状核酸粒子、球状ナノクリスタル核酸粒子または結晶球状核酸粒子由来のタンパク質または核酸の二次構造が、それらの可溶性対応物と比較され得る。実施例４４を参照のこと。
【０１２０】
（４．モノクローナル抗体の、その抗原への特異的結合を測定するためのＥＬＩＳＡ）
酵素連結免疫吸着剤アッセイが、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰ由来のタンパク質の抗原性コンフォメーションを、そのネイティブの可溶性対応物の抗原性コンフォメーションと比較するために、そのネイティブの可溶性対応物に特異的に結合するモノクローナル抗体を使用することによって用いられ得る。実施例４５を参照のこと。
【０１２１】
（５．抗体の生物学的活性を決定するためのバイオイムノアッセイ）
あるいは、抗体ＳＰＰ、抗体球状ナノクリスタル複合粒子または抗体結晶ＳＰＰのタンパク質成分の生物学的活性が、バイオイムノアッセイによって決定され得る。バイオイムノアッセイは、抗体の生物学的活性を測定するために有用である。抗体の生物学的活性を測定するためのバイオイムノアッセイとしては、とりわけ、下記の直接的細胞傷害、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が挙げられる。これらのアッセイは、抗体ＳＰＰ、抗体球状ナノクリスタル複合粒子または抗体結晶ＳＰＰの由来抗体の残余の生物学的活性を、これらの可溶性抗体の対応物の残余の生物学的活性と比較するのに有用である。この様式において、抗体由来のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの作製、短期または長期にわたる保存、乾燥、ならびにＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶ＳＰＰの組成物または処方物の形成および引き続くその溶解の効果が、決定され得、そして問題の抗体の可溶性対応物と比較され得る。
【０１２２】
その抗原保有標的細胞上の抗体の細胞傷害が、３つのアッセイ（例えば、直接的細胞傷害、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））により特徴付けられ得る。Ｒｉｔｕｘａｎについての標的細胞は、それらの表面上のＣＤ−２０抗原を過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）する細胞であり、それらの細胞としては、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、ＪＯＫ１、およびＷＴ１００が挙げられる。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎに特異的な抗原は、ＨＥＲ２（ヒト表皮増殖因子レセプター２タンパク質）であり、これは、ヒト胸部腺癌細胞株（ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４、およびＭＣＦ／ＨＥＲ２を含む）において過剰発現される。
【０１２３】
本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰならびにそれらの組成物および処方物は、活性タンパク質を、被験体に対してそれらが必要とされる場所および時間に叙放し得るレザバを作製する。次いで、生物学的に活性なタンパク質が、特定のカプセル化技術、ポリマー処方物、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの大きさ、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの可溶性、ならびに用いられる任意の賦形剤の存在および性質により規定される期間にわたり、制御された様式で放出される。本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰならびにそれらの組成物および処方物は、生物学的に活性なタンパク質の非経口投与のための希釈剤を用いて再構築され得る。
【０１２４】
本発明に従う組成物の１つの実施形態は、処方物である。本発明に従うポリマー送達キャリア中に生物学的に活性なタンパク質ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰを含む処方物はまた、ワクチン、医薬、個人医療用（ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃａｒｅ）の処方物もしくは処方物、獣医学的処方物もしくは組成物、または経口酵素補充において用いられる任意の従来のキャリアまたはアジュバントを含み得る。これらのキャリアおよびアジュバントとしては、例えば、フロイントアジュバント、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、緩衝物質（例えば、ホスフェート）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、塩化水素、亜鉛塩、コロイドシリカ、マグネシウム、トリシリケート、セルロースベース物質およびポリエチレングリコールが挙げられる。局所形態およびゲルベースの形態のためのアジュバントとしては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびウッドワックスアルコール（ｗｏｏｄ  ｗａｘ  ａｌｃｏｈｏｌ）が挙げられ得る。
【０１２５】
本発明の１つの実施形態に従って、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰ（インタクトな抗体または単鎖Ｆｖ抗体フラグメントを含む）は、放出制御投与（薬学的放出制御投与およびキャリアを含まない薬学敵放出制御投与）を含む）のための用いられる任意の従来の物質と組み合わせられ得る。そのような物質としては、例えば、コーティング、シェル、およびフィルム（例えば、腸溶コーティングおよびポリマーコーティングおよびフィルム）が挙げられる。
【０１２６】
組成物（ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰを含む処方物を含む）は、ヒト、動物、または植物に、本発明に従う所望の送達部位で送達され得る。そのような送達としては、非経口投与、（例えば、皮下注射、静脈注射、または筋肉内注射を含む）、もしくはデバイス（例えば、移植可能なデバイス）の使用が挙げられ得るか、または、他の送達システム（例えば、経口投与、経肺投与、吸入、経皮投与、針無しの注射および針無しの皮下投与）が挙げられ得る。
【０１２７】
本発明の１つの実施形態において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰは、約０．０４μｍ〜約３００μｍの間の直径を有する。本発明の別の実施形態において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰは、約０．０４μｍ〜約２００μｍの間の直径を有する。本発明の別の実施形態において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰは、約０．０４μｍ〜約１００μｍの間の直径を有する。本発明の別の実施形態において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰは、約０．０４μｍ〜約１０μｍの間の直径を有する。本発明の最も好ましい実施形態において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰは、約０．０４μｍ〜約５μｍの間の直径を有する。本発明の別の実施形態において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰは、約０．０４μｍ〜約１μｍの間の直径を有する。本発明の別の実施形態において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰは、約０．０４μｍ〜約９９９ｎｍの間の直径を有する。本発明の別の実施形態において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰは、約０．０４μｍ〜約４９９ｎｍの間の直径を有する。
【０１２８】
本発明に従う球状ナノクリスタル複合粒子の好ましい実施形態において、この粒子は、直径約１μｍ〜約３００μｍであり、そして約４０ｎｍ〜約９９９ｎｍの直径を有するタンパク質ナノクリスタルを含む。本発明に従うナノクリスタル複合粒子の最も好ましい実施形態は、この球状ナノクリスタル複合粒子が、直径、約１μｍ〜約３００μｍであり、そして約４０ｎｍ〜約４９９ｎｍの直径を有するタンパク質ナノクリスタルを含むことである。
【０１２９】
本発明の１つの実施形態において、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰを含む組成物（処方物を含む）は、溶液中で約１ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を有する。あるいは、本発明の組成物（処方物を含む）は、溶液中で約１０ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を有する。あるいは、本発明の組成物（処方物を含む）は、溶液中で約２０ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を有する。あるいは、本発明の組成物（処方物を含む）は、溶液中で約５０ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を有する。あるいは、本発明の組成物（処方物を含む）は、溶液中で約１００ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を有する。あるいは、本発明の組成物（処方物を含む）は、溶液中で約１２０ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を有する。あるいは、本発明の組成物（処方物を含む）は、溶液中で約２００ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を有する。あるいは、本発明の組成物（処方物を含む）は、溶液中で約４００ｍｇ／ｍｌより高いタンパク質濃度を有する。
【０１３０】
本発明に従い、任意の個体（ヒト、動物および植物を含む）が、薬学的有効量の生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそのようなＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰを含む組成物もしくは処方物を用いて、幾分かの期間にわたりそれらが投与される個体における状態を処置するのに十分な期間にわたり、薬学的に受容可能な様式で処置され得る。あるいは、個体は、幾分かの期間にわたり予防有効量の生物学的に活性なＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそのようなＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰを含む組成物もしくは処方物が投与される個体における状態を予防するために有効である、それらの粒子または組成物もしくは処方物を受容し得る。
【０１３１】
生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそれらを含む組成物もしくは処方物が、単独でか、薬学的な、個人医療用もしくは獣医学的な調製物の一部としてか、個人的医療用もしくは獣医学的な調製物としてか、または予防的調製物の一部として、アジュバンドと共にか、またはそれを伴わずに投与され得る。これらは、非経口経路または経口経路により投与され得る。例えば、これらは、経口経路、経腸経路、経鼻腔経路、経耳経路、経肛門経路、経皮（ｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）経路、経眼経路、経静脈経路、筋肉内経路、経大動脈経路、経腹膜経路、経粘膜経路、舌下経路、皮下経路、経皮経路または経頭蓋経路により投与され得る。薬学的、個人医療用または獣医学的な適用のいずれかにおいて、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそれらの組成物もしくは処方物は、任意の上皮表面に局所投与され得る。そのような上皮表面としては、口腔表面、眼の表面、耳の表面、肛門表面、および鼻腔表面が挙げられ、これらは、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそれらの組成物もしくは処方物の適用により、処置、保護、修復または解毒され得る。
【０１３２】
生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそれらを含む組成物もしくは処方物を含む薬学的、獣医学的、または予防的な組成物または処方物はまた、錠剤、リポソーム、顆粒剤、球体、微粒子、微小球体、エアロゾルおよびカプセル剤からなる群より選択され得る。
【０１３３】
本発明に従うそのような使用、および他の使用において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそれらを含む組成物もしくは処方物は、錠剤へと処方され得る。そのような錠剤は、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそれらを含む組成物もしくは処方物の貯蔵のための、液体を含まず、粉塵を含まない形態から構成され、それらは、容易に扱われ、そして受容可能なレベルの活性または能力を維持する。
【０１３４】
あるいは、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそれらを含む組成物もしくは処方物は、反応性の組成物または処方物を提供するための投与のために利用される種々の従来の形態で用いられ得る。これらとしては、例えば、固体、半固体および液体（例えば、液体状溶液または懸濁液）、スラリー、ゲル、クリーム、香油、エマルジョン、ローション、散剤、スプレー剤、フォーム、ペースト、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、香油および滴下剤の投薬形態が挙げられる。
【０１３５】
生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶ＳＰＰ、またはそれらを含む組成物もしくは処方物はまた、薬学的、個人医療用の組成物もしくは処方物または獣医学的な組成物もしくは処方物において使用される、任意の従来のキャリアまたはアジュバントを含み得る。これらのキャリアおよびアジュバントとしては、例えば、フロイントアジュバント、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、緩衝物質（例えば、ホスフェート）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、マグネシウム、トリシリケート、セルロースベース物質およびポリエチレングリコールが挙げられる。局所形態およびゲルベースの形態のためのアジュバントとしては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびウッドワックスアルコール（ｗｏｏｄ  ｗａｘ  ａｌｃｏｈｏｌ）が挙げられ得る。
【０１３６】
生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物の投与および投薬レジメンの最も有効な様式は、所望の効果、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの投与の結果、もしあれば以前の治療、個体の健康状態または状態（ｃｏｎｄｔｉｏｎ）自体の状態（ｓｔａｔｕｓ）および生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物に対する応答、ならびに処置する医師または臨床家の判断に依存する。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物は、一度にまたは一連の処置にわたって、医薬品、免疫療法、または獣医学的な組成物または処方物に受容可能な任意の投薬形態で投与され得る。
【０１３７】
生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物の量（単一投薬を提供する）は、投与の特定の様式、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらの組成物または処方物の特定のタイプ、ならびに用量レベルまたは投薬頻度に依存して変化する。代表的な調製物は、約０．０１％と約９９％の間、好ましくは、約１％と約５０％の間の生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ（ｗ／ｗ）を含む。あるいは、調製物は、約０．０１％と約８０％の間のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、好ましくは、約１％と約５０％との間の生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ（ｗ／ｗ）を含む。
【０１３８】
個体の状態の改善において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物の維持用量が、必要に応じて投与され得る。引き続いて、投与の投薬量または頻度、あるいはその両方が、症状の関数として、改善された状態が保持されるレベルまで減少され得る。状態が所望のレベルに軽減した場合、処置は、やめるべきである。しかし、個体が、その状態または症状の任意の再発において、長期の基準で、断続的な処置を必要とし得る。
【０１３９】
本発明はまた、徐放性の方法論（例えば、シリコーンベースのリングまたはロッド（これは、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物を予め装填され、従って、送達のための移植片として作用し得る））を利用し得る。この技術の目的は、週または月の期間にわたって、タンパク質の一定レベルを血流に提供することである。このような移植片は、皮内に挿入され得、そして必要な場合に、安全に取り出され、そして置換され得る。
【０１４０】
本発明に従う他の組成物または処方物は、抗原性タンパク質、アジュバント、および必要に応じてカプセル化ポリマーのＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを含むワクチン組成物または処方物を含む。本発明の１つの実施形態において、インタクトな抗イディオタイプ抗体自体は、免疫原であり、従って、目的は、インタクトな抗体のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物が、抗イディオタイプが模倣するかまたは密接に関連する抗原に対する応答を誘発することである。従って、抗イディオタイプ抗体は、癌および自己免疫疾患（例えば、アレルギー）ならびにＢ型肝炎ウイルスのようなウイルスに対するある型のワクチンまたは治療法として作用し得る。
【０１４１】
このような組成物または処方物の１つの実施形態は、３つ以上の異なる放出プロフィールを有するミクロスフェアを含む単一ワクチン注射を含む。この方法において、タンパク質抗原、または抗原に類似して作用する抗イディオタイプ抗体のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、持続する免疫性を形成するのに十分な持続時間にわたって放出され得る。この組成物または処方物によって、複数の抗原ブーストが、単一単位形態で可能であり得る。このような系の１つの利点は、抗原性タンパク質、または抗原に類似して作用する抗イディオタイプ抗体のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを使用することによって、抗原のネイティブな３次元構造が維持され、そしてそれらのネイティブな形態で免疫系に提示されることである。
【０１４２】
一旦、免疫系がプライムされると、アジュバント効果についてあまり必要でなくても良い。従って、ゆっくり分解する接種物において、あまり免疫原性でないアジュバントが含まれ得、おそらく、組成物または処方物の最もゆっくり分解するミクロスフェアにおいては必要とされなくても良い。この方法において、遠隔領域における患者集団は、感染性疾患に対する保護を提供するために、複数回処置されなければならないという必要がない。タンパク質抗原、または抗原のように作用する抗イディオタイプ抗体の生物学的送達分野の当業者は、このテーマについて多くの変更が実施可能であることを理解する。
【０１４３】
本発明の別の利点は、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物が、凍結乾燥によって乾燥され得ることである（実施例２６、方法３を参照のこと）。凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）または凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）によって、水が組成物または処方物から分離され得る。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物は、最初に凍結され、次いで、高真空に置かれる。真空において、結晶性Ｈ２Ｏは昇華し、強固に結合した水のみを含む、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらの組成物または処方物をインタクトなままで残す。このような処理は、さらに、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらの組成物または処方物を安定化し、そして代表的に遭遇する周囲温度において、より簡単な貯蔵および輸送を可能にする。
【０１４４】
本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰはまた、噴霧乾燥され得る（実施例２６、方法６を参照のこと）。噴霧乾燥によって、水が、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらの組成物または処方物から分離され得る。これは、溶液、エマルジョン、およびポンプ輸送可能懸濁液のような液体フィードストックから、粉末、顆粒または凝集塊のいずれかの形態で乾燥固体を連続製造するために特に適する。噴霧乾燥は、液体フィードストックの液滴の噴霧への微粒化、および乾燥チャンバにおけるこの液滴と熱空気との接触を包含する。噴霧は、ローターリー（ホイール）またはノズル噴霧器のいずれかによって製造される。液滴からの水分のエバポレーションおよび乾燥粒子の形成は、制御された温度および気流条件下で進行する。比較的高い温度が、噴霧乾燥操作に必要である。しかし、生成物に対する熱損傷は、一般的に、ほんのわずかである。なぜなら、臨界乾燥時間の間にエバポレーションの冷却効果があり、そして引き続く、乾燥物質の高温への曝露の時間が、非常に短くあり得るからである。粉末は、乾燥チャンバから連続的に排出される。操作条件および乾燥機の設計は、生成物の乾燥特徴および粉末の仕様に従って選択される。噴霧乾燥は、粒子サイズ分布、残留水分含有量、バルク密度および粒子形状に関して、最終生成物が正確な品質基準に従う理想的なプロセスである。
【０１４５】
この特徴は、治療タンパク質およびタンパク質ワクチン（抗イディオタイプ抗体を含む）に特に望ましく、これは、単回用量滅菌容器（「アンプル」）あるいは任意の所望の増量の単回用量に、スラリーとして組成物または処方物中で、分配され得る。次いで、分配されたスラリーまたは組成物または処方物を含むアンプルは、滅菌条件下でキャップされ、バッチ凍結され、そして凍結乾燥され得る。このような滅菌容器は、世界中に輸送され得、そして周囲温度で貯蔵され得る。このようなシステムは、世界の遠隔部分および未開発部分に滅菌ワクチンおよび治療タンパク質を提供するために有用である。使用の点で、アンプルは、選択された滅菌溶媒または滅菌緩衝液で再水和され、そして分配される。このような調製物について、最小の冷蔵が必要とされるかまたは冷蔵が必要でない。
【０１４６】
本発明のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰはまた、窒素乾燥（実施例２６、方法１を参照のこと）、空気乾燥（実施例２６、方法５）、有機溶媒の添加後の空気乾燥（実施例２６、方法４）、または真空オーブン乾燥（実施例２６、方法２を参照のこと）され得る。
【０１４７】
本発明の別の実施形態において、本発明に従う生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、さらなる安定性のために架橋され得る。これによって、ｐＨ極限の領域（例えば、ヒトおよび動物の胃腸管）における、このようなＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはそれらを含む組成物または処方物の使用が可能である。例えば、生物学的に活性なタンパク質またはワクチンのＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ（例えば、モノクローナル抗体または抗イディオタイプ抗体のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ）は、以下を含むがこれらに限定されない種々の架橋剤のうちの１つを使用して架橋され得る：ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート．ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ビスマレイミド−ヘキサン（ＢＭＨ）、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、ジメチルスベルイミデート（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）．２ＨＣｌ（ＤＭＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスルホスクシンイミジルタータレート（Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ）、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクインイミジル−４−アジドベンゾエート（Ｓｕｌｆｏ−ＨＳＡＢ）、スルホスクシンイミジル−６−［ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）、ビス−［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびグルタルアルデヒド（ＧＡ）。
【０１４８】
本発明のさらなる実施形態において、タンパク質（例えば、インタクトな抗体または抗体のｓｃＦｖフラグメント）のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、抗体放射線療法において使用されるように、放射標識され得る。このような治療において、例えば、放射標識された抗癌抗体またはｓｃＦｖフラグメントを含むＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、またはそれらを含む組成物または処方物は、本発明に従って、癌の部位に送達され得る。送達後、放出された抗体またはｓｃＦｖフラグメントは、その標的癌抗原に結合し、そして放射性同位体を癌性細胞または腫瘍に直接送達する。抗体の放出は、本発明に従って、時間を調節され得る。理論的に、有用な放射標識としては、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ。しかし、実質的に、放射線療法におけるインビボの使用は、放射標識を、１３１Ｉ、９０Ｙ、または短い半減期によって規定される任意の他の放射標識に制限する。例えば、モノクローナル抗体Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、非ホジキンリンパ腫を有する患者において、放射免疫療法で使用されるために、９０イットリウム（９０Ｙ）で標識されている。この化合物は、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））として市販される。
【０１４９】
（ポリマー性キャリアにおける生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰのカプセル化）
本発明の１つの実施形態に従って、処方物は、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰが少なくとも１つのポリマー性キャリア中にカプセル化されて、ポリマー性キャリアのマトリクス内にカプセル化によってミクロスフェアを形成し、それらのネイティブかつ生物学的に活性な三次構造を保存する。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、異なる生物学的環境に送達するためまたは特定の機能をもたらすために適切な独特の性質を有する種々の生体適合性および／または生分解性ポリマーを使用してカプセル化され得る。溶解速度および従って、活性タンパク質の送達の速度は、特定のカプセル化技術、ポリマー組成物、ポリマー架橋、ポリマー厚さ（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、ポリマー溶解性、および抗体結晶形状によって決定される。
【０１５０】
カプセル化される、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、有機溶媒中に溶解されるポリマー性キャリア中に懸濁される。ポリマー溶液は、溶液に添加された後に、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを完全にコーティングするように十分に濃縮されなければならない。このような量は、約０．０２〜約２０の間、好ましくは、約０．１〜約２の間のポリマーに対するＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの重量比を提供する量である。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、約０．５分〜約３０分の間、好ましくは、約１分〜約３分の間、溶液中でポリマーと接触される。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、それらがポリマーとの接触によってコーティングされる場合、懸濁を維持すべきであり、凝集させるべきではない
その接触の後、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、コーティングされ、そして発生期の（ｎａｓｃｅｎｔ）ミクロスフェアと呼ばれる。発生期のミクロスフェアは、コーティングが行われる間、サイズを増加する。本発明の好ましい実施形態において、懸濁された、コーティングされたＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいは発生期のミクロスフェアは、ポリマー性キャリアおよび有機溶媒とともに、乳化剤として公知の界面活性剤を含むより大きな容積の水溶液に移される。水溶液において、懸濁された発生期のミクロスフェアは、水相に浸され、ここで、有機溶媒は、ポリマーからエバポレートされるかまたは拡散される。最終的に、ポリマーが、もはや可溶性でなく、そしてＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰをカプセル化して、処方物を形成する沈殿相を形成する点に達する。このプロセスのこの局面は、ポリマー性キャリアまたはポリマーの硬化と呼ばれる。乳化剤は、このプロセスの硬化相の間、システムにおいて種々の物質相の間の界面張力を減少させるのに役立つ。あるいは、コーティングポリマーは、いくらか固有の表面活性を有する場合、別の表面活性剤の添加のために必要でなくても良い。
【０１５１】
本発明に従う、生物学的に活性なタンパク質のカプセル化したＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを調製するために有用な乳化剤としては、ポリ（ビニルアルコール）（本明細書中において例示される）、界面活性剤、およびポリマーコーティングされたＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰと溶液との間の表面張力を減少させ得る他の表面活性剤が挙げられる。
【０１５２】
本発明の好ましい実施形態において、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの結晶化度は、カプセル化処理の間、維持される。結晶化度は、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰが可溶性でない有機溶媒を使用することによって、コーティングプロセスの間、維持される。引き続いて、一旦、コーティングされた球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰが、水性溶媒に移され、ポリマー性キャリアが迅速に硬化し、そして先の工程における球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの十分なコーティングが、結晶性物質の溶解を防ぐ。
【０１５３】
ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰをコーティングするためにポリマー性キャリアとして使用されるポリマーは、ホモポリマーまたはコポリマーのいずれかであり得る。ミクロスフェアの加水分解速度は、個々のポリマー種の加水分解速度によって大部分が決定される。一般的に、加水分解の速度は、以下のように減少する：ポリカルボネート＞ポリエステル＞ポリウレタン＞ポリオルトエステル＞ポリアミド。生分解性および生体適合性ポリマーの総説について、Ｗ．Ｒ．ＧｏｍｂｏｔｚおよびＤ．Ｋ．Ｐｅｔｔｉｔ、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６巻、３３２〜３５１頁（１９９５）を参照のこと。
【０１５４】
本発明の好ましい実施形態において、ポリマー性キャリアは、単一のポリマー型（例えば、ＰＬＧＡ）を含む。次に好ましい実施形態において、ポリマー性キャリアは、ポリマーの混合物（例えば、５０％  ＰＬＧＡおよび５０％アルブミン）であり得る。
【０１５５】
本発明に従って、生物学的に活性なタンパク質のカプセル化されたＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを調製するために、ポリマー性キャリアとして有用な他のポリマーとしては、以下が挙げられる：ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）（例えば、ポリ（乳酸）またはＰＬＡ）、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチレート）（ｂ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｒｙａｔｅ）、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ジオキサン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、アルブミン、アルギネート、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびその誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸多糖類、これらのブレンドおよびコポリマーからなる群より選択される生体適合性／生分解性ポリマー。他の有用なポリマーは、Ｊ．ＨｅｌｌｅｒおよびＲ．Ｗ．Ｂａｌａｒ，「Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９８０）；Ｋ．Ｏ．Ｒ．Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｈ．Ｍ．ＢｏｓｓｌｅｒおよびＤ．Ｋ．Ｄｒｅｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｍｏｎｏｇ、第５巻、１１１〜１９頁（１９７９）；Ｅ．Ｍ．Ｒａｍａｄａｎ，Ａ．Ｅｌ−ＨｅｌｗおよびＹ．Ｅｌ−Ｓａｉｄ，Ｊｏｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、第５巻、１２５頁（１９８８）に記載される。好ましいポリマーは、使用されるＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの特定のタンパク質成分、およびカプセル化されるＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの意図される使用に依存する。あるいは、溶媒エバポレーション技術は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰをカプセル化するために使用され得る（Ｄ．Ｂａｂａｙ，Ａ．ＨｏｆｆｍａｎｎおよびＳ．Ｂｅｎｉｔａ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第９巻、４８２〜４８８頁（１９８８）を参照のこと）。
【０１５６】
本発明の好ましい実施形態において、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰが、ポリマー（例えば、ポリ乳酸−コ−グリコール酸）を用いて本明細書中に示されるような二重エマルジョン法を使用して、少なくとも１つのポリマー性キャリアにカプセル化される。本発明の最も好ましい実施形態において、ポリマーは、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（「ＰＬＧＡ」）である。ＰＬＧＡは、乳酸（「Ｌ」）およびグリコール酸（「Ｇ」）とのポリ縮合反応によって調製されるコポリマーである。種々の割合のＬおよびＧを使用して、ＰＬＧＡポリマーの結晶性および疎水性を調節し得る。ポリマーのより高い結晶性は、より遅い溶解を生じる。２０〜７０％のＧ含量を有するＰＬＧＡポリマーは、非晶質性固体である傾向があるが、より高いレベルのＧまたはＬのいずれかは、よいポリマー結晶性を生じる。Ｄ．Ｋ．ＧｉｌｄｉｎｇおよびＡ．Ｍ．Ｒｅｅｄ，”Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｓｕｒｇｅｒｙ−ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｏｌｉｃ）／ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）  ｈｏｍｏ  ａｎｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：１．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１４５９−１４６４（１９８１）を参照のこと。ＰＬＧＡは、水への曝露後にエステル結合の加水分解によって分解して、乳酸およびグリコール酸の非毒性のモノマーを生じる。
【０１５７】
本発明の別の実施形態は、二重壁のポリマー被覆ミクロスフェアを含む。二重壁のポリマー被覆ミクロスフェアは、塩化メチレン、またはポリマーを溶解し得る他の溶媒中に、２つの別々のポリマー溶液を調製することによって生成され得る。生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰが、これらの溶液のうちの１つに添加され、そして分散される。ここで、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、第１のポリマーで被覆される。次いで、第１のポリマーに被覆されたＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを含む溶液は、第２のポリマー溶液と合わせられる。［Ｐｅｋａｒｅｋ，Ｋ．Ｊ．；Ｊａｃｏｂ，Ｊ．Ｓ．およびＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ，Ｅ．Ｄｏｕｂｌｅ−ｗａｌｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３６７，２５８−２６０（１９９４年１月２０日）を参照のこと］。結果として、第２のポリマーは、結晶をカプセル化する第１のポリマーをカプセル化する。典型的には、この溶液は、次いで表面活性剤または乳化剤を含む多量の水溶液中に滴下される。この水溶液において、溶媒を、２つのポリマー溶液から蒸発させ、そしてポリマーを沈殿させる。
【０１５８】
本発明に従う組成物は、生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、および少なくとも１つの成分を含む。本発明に従う処方物は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに添加される少なくとも１つの成分がポリマーである組成物である。
【０１５９】
本発明に従う生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、二次構造について特徴付けられ得る。より詳細には、このような生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰは、約０．８〜１．０の間のフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルによって決定される可溶性タンパク質対照物のスペクトルと比較した相関スペクトルによって示されるような、β−シートまたはα−ヘリックス構造含量によって特徴付けられ得る。約０．８未満の相関係数は、その二次構造含量がネイティブな生物学的に活性なタンパク質と比較して約２０％を超えて変化した程度にまで変性したタンパク質サンプルを示す。このことは、タンパク質の凝集および沈降を生じても、単に生物学的活性の喪失を生じてもよい。
【０１６０】
約０．８と１．０との間にある相関係数は、そのタンパク質サンプルがそのネイティブで可溶性の対照物の二次構造含量と約８０％〜約１００％同一である二次構造含量を有することを示す。
【０１６１】
ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはこれらを含む組成物または処方物は、約４℃〜約５０℃で約４日間〜約１８０日間の貯蔵の後に、そのタンパク質のα−ヘリックス構造含量を２０％未満喪失することによって特徴付けられ得、ここで、このタンパク質の可溶性形態は、ＦＴＩＲによって測定した場合、５０℃で６時間の貯蔵の後にそのα−ヘリックス構造含量を５０％より多く喪失する。あるいは、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ、あるいはこれらを含む組成物または処方物は、５０℃で４日間の貯蔵の後にタンパク質のα−ヘリックス構造含量を２０％未満喪失することによって特徴付けられ、ここで、このタンパク質の可溶性形態は、ＦＴＩＲによって測定した場合、５０℃で６時間の貯蔵の後にそのα−ヘリックス構造含量を５０％より多く喪失する。
【０１６２】
あるいは、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰ、ならびにこれらを含む組成物または処方物は、５０℃で貯蔵した場合、Ｔ１／２によって測定した場合、５０℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも少なくとも１２０倍高い貯蔵寿命によって特徴付けられ得る。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰ、ならびにこれらを含む組成物または処方物は、５０℃で貯蔵した場合、Ｔ１／２によって測定した場合、５０℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも少なくとも６０倍高い貯蔵寿命によって代替的に特徴付けられ得る。あるいは、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰ、ならびにこれらを含む組成物または処方物は、５０℃で貯蔵した場合、Ｔ１／２によって測定した場合、５０℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも少なくとも３０倍高い貯蔵寿命によって特徴付けられ得る。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰ、ならびにこれらを含む組成物または処方物は、５０℃で貯蔵した場合、Ｔ１／２によって測定した場合、５０℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも少なくとも１０倍高い貯蔵寿命によって代替的に特徴付けられ得る。あるいは、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰ、ならびにこれらを含む組成物または処方物は、５０℃で貯蔵した場合、Ｔ１／２によって測定した場合、５０℃の溶液中でのこのタンパク質の可溶性形態よりも高い貯蔵寿命によって特徴付けられ得る。
【０１６３】
あるいは、抗体を含むＳＰＰ、結晶性ＳＰＰまたは球状ナノクリスタル複合粒子の生物学的活性は、バイオイムノアッセイによって決定され得る。抗体の生物学的活性を測定するためのバイオイムノアッセイとしては、とりわけ以下に記載されるような、直接の細胞傷害性、補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）、および抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が挙げられる。これらのアッセイは、抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性抗体ＳＰＰ由来の抗体の残存生物学的活性をこれらの可溶性抗体対照物と比較するために有用である。この方法において、抗体からＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを作製する効果、短期または長期の貯蔵、乾燥、および形成、ならびにその後のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子および結晶性ＳＰＰの組成物または処方物の溶解が、決定され得、そして問題の抗体の可溶性対照物と比較され得る。
【０１６４】
その抗原を保有する標的細胞に対する抗体の細胞傷害性は、３つのアッセイ（例えば、直接の細胞傷害性、補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）、および抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ））によって特徴付けられ得る。Ｒｉｔｕｘａｎについての標的細胞は、ＣＤ−２０抗原をそれらの表面上に過剰発現する細胞であり、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、ＪＯＫ１およびＷＴ１００が挙げられる。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎについての特異的抗原は、ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子レセプター２タンパク質）であり、これは、ヒト胸部腺癌細胞株（ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４およびＭＣＦ／ＨＥＲ２が挙げられる）において過剰発現される。
【０１６５】
好ましくは、抗体を含むＳＰＰ、結晶性ＳＰＰまたは球状ナノクリスタル複合粒子の溶解に由来するタンパク質抗体成分は、その可溶性抗体対照物の約５０％の生物学的活性を有する。より好ましくは、抗体を含むＳＰＰ、結晶性ＳＰＰまたは球状ナノクリスタル複合粒子の溶解に由来するタンパク質抗体成分は、その可溶性抗体対照物の約６０％の生物学的活性を有する。より好ましくは、抗体を含むＳＰＰ、結晶性ＳＰＰまたは球状ナノクリスタル複合粒子の溶解に由来するタンパク質抗体成分は、その可溶性抗体対照物の約７０％の生物学的活性を有する。より好ましくは、抗体を含むＳＰＰ、結晶性ＳＰＰまたは球状ナノクリスタル複合粒子の溶解に由来するタンパク質抗体成分は、その可溶性抗体対照物の約８０％の生物学的活性を有する。より好ましくは、抗体を含むＳＰＰ、結晶性ＳＰＰまたは球状ナノクリスタル複合粒子の溶解に由来するタンパク質抗体成分は、その可溶性抗体対照物の約９０％の生物学的活性を有する。最も好ましくは、抗体を含むＳＰＰ、結晶性ＳＰＰまたは球状ナノクリスタル複合粒子の溶解に由来するタンパク質抗体成分は、その可溶性抗体対照物の約１００％の生物学的活性を有する。
【０１６６】
（球状の核酸粒子）
本発明の別の実施形態において、本明細書中に開示される方法は、核酸の球状粒子（すなわち、球状の核酸粒子（「ＳＮＡＰ」））を形成するために有用である。ＳＮＡＰは、ワクチン抗原としてＤＮＡワクチンの開発に有用であり得る。ＳＮＡＰはまた、遺伝子治療ストラテジーにおける遺伝子の送達に有用であり得る。
【０１６７】
（生物学的に活性なタンパク質の、カプセル化したＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの安定性）
当業者は、タンパク質の安定性は、タンパク質の放出を制御するポリマー微粒子送達系の首尾よい処方に対する最も重要な障壁の１つであることを理解する。ポリマーキャリア中にカプセル化された生物学的に活性なタンパク質のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰのタンパク質安定性は、３つの別々の段階で調べられ得る：ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの組成物または処方物の製造；得られたＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの組成物または処方物からのタンパク質の放出；および、このタンパク質放出の後のインビボでの安定性。可溶性タンパク質または非晶質タンパク質を含む微粒子またはミクロスフェアの調製の間、有機溶媒および凍結乾燥の使用は、タンパク質安定性に対して特に有害である。続いて、放出されたタンパク質は、水分誘導性凝集に感受性であり、よって恒久的不活性化を生じる。
【０１６８】
本発明に従ってＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの組成物または処方物を調製する間に高いタンパク質安定性を獲得するために、個々の生物学的に活性なタンパク質分子の可動性（ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの使用を介して達成し得る結果）を制限することが、必要である。
【０１６９】
（処方物を作製するときのＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの形態、結晶性および安定性の維持）
本発明に従ってタンパク質処方物を調製するためのタンパク質供給源としてＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを使用するために、透析手順の間に使用される母液の外でのＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの溶解の問題は、克服されなければならなかった。処方物の生成において使用されるＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの形態および／または結晶性および／または安定性を維持するために、いくつかのアプローチが使用され得る：
１．本発明に従ってＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの生成に使用される多くの化合物は、ポリマー処理条件と両立可能であり、それ故、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの処方物を作製する際に含まれ得る。これらとしては、とりわけ、塩、有機溶媒、金属およびＰＥＧが挙げられる。
２．乾燥したＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ：調製用緩衝液（すなわち、母液）は、濾過によって除去され得、そして残存「ペースト」は、減圧下で空気によって、水混和性有機溶媒で洗浄することによって、および／または凍結乾燥もしくはスプレー乾燥によって、乾燥され得る。
３．ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰのサイズは、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの処方物を調製する過程において操作および制御され得る。従って、ある範囲のサイズが利用可能であり、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの処方物を使用して被験体にタンパク質を送達する場合、それぞれのサイズが、異なる溶解動力学、その後の異なる徐放性プロフィールを付与する。
【０１７０】
（抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子または結晶性抗体ＳＰＰを処方する間の抗体凝集物の除去）
凝集は、抗体調製においてしばしば遭遇する重大な問題であり、そしてこのような抗体調製物を受ける患者において有害な効果を生じ得る。本発明の別の実施形態において、抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子または結晶性抗体ＳＰＰを処方するプロセスは、抗体調製の間に形成し得る抗体凝集物を除去する（実施例１３を参照のこと）。
【実施例】
【０１７１】
本発明がよりよく理解され得るために、以下の実施例が記載される。これらの実施例は、例示のみの目的のためであって、任意の様式において本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【０１７２】
（実施例１）
（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂの球状タンパク質粒子の調製）
Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂは、ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）として市販されるマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体は、慢性関節リウマチおよびクローン病を処置するために広範に使用されている。Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂは、ＴＮＦα抗原に結合するキメラＩｇＧ１κ免疫グロブリンである。これは、マウス軽鎖可変領域配列およびマウス重鎖可変領域配列ならびにヒト定常領域配列から構成される。Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ抗体は、１４９ｋＤのおよその分子量（ＭＷｔ）を有する。
【０１７３】
（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰ調製物）
（材料：）
Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ抗体（各バイアルは、１００ｍｇ  Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、５００ｍｇ  スクロース、０．５ｍｇ  ポリソルベート８０、２．２ｍｇ  一塩基性リン酸ナトリウムおよび６．１ｍｇ  二塩基性リン酸ナトリウムを含む）は、１０ｍｌの水（ｐＨ約７．２）中で再構成した（濃度は、１０ｍｇ／ｍｌに等しい）。
【０１７４】
（手順：）
Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰを、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，カタログ番号６９５７０）を以下のように使用して形成した：
［Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用する透析：］
Ａ．本実施例で使用されるＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒは、１０ｋＤに分子量カットオフ点を有した。
Ｂ．手順：
１．Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ膜単位を、蒸留水中に一晩浸した。
２．小さなＣｅｎｔｒｉｃｏｎチューブ（Ａｍｉｃｏｎ，カタログ番号４２０８）の下部分を、３．８〜３．９ｍｌの適切な緩衝液（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ用、以下を参照のこと）で充たした。
３．３．５ｍｍ×３．５ｍｍの磁気攪拌バーを使用して、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎデバイスの下部分中の溶液を攪拌した。
４．１５０〜４１０μｌの所望のタンパク質溶液（本実施例については、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（約１０〜２０ｍｇ／ｍｌに等しいタンパク質濃度）を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ装置に加えた。緩衝溶液のレベルの１ｍｍまたは２ｍｍ下になるように、適切な膜ユニットを、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ装置に置き、そしてキャップを、蒸発を防ぐように十分堅くＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒユニット上に置いた。
５．次いで、緩衝液／タンパク質混合物を適切な温度で適切な時間の間透析した。
６．透析後、ＨＰＬＣおよび顕微鏡検査を使用して、ＳＰＰの存在または非存在を決定し、上清のタンパク質含量を、２８０ｎｍの光学濃度（ＯＤ２８０）で吸光度を測定することによって決定した。ＳＰＰを、適切な時点で回収した。
［Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰの処方：］
Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂの１０ｍｇ／ｍｌ溶液１５０μｌを、２．１Ｍ  硫酸アンモニウム、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）、１％  プロピレングリコールから構成される３．９ｍｌの溶液に対して透析した。（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒにおいて）１０，０００ＭＷカットオフ透析膜を使用した。混合物を、室温で２８時間透析した。次いで、このタンパク質溶液を、２．４２Ｍ  硫酸アンモニウム、１％  プロピレングリコール、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）からなる８００μｌの溶液中で２回洗浄し、遠心分離し、そして約２００μｌの同一の溶液中に再懸濁した。
【０１７５】
（結果：）
Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰは、２８時間後に形成した。図１Ａを参照のこと。
【０１７６】
（実施例２）
（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの球状タンパク質粒子の調製）
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、ＲｉｔｕｘａｎＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）として市販されるマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体は、非ホジキンリンパ腫を処置するために広範に使用されている。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、正常および悪性のＢリンパ球表面上のＣＤ２０抗原に結合するキメラＩｇＧ１κ免疫グロブリンである。これは、マウス軽鎖可変領域配列およびマウス重鎖可変領域配列ならびにヒト定常領域配列から構成される。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体は、１４５ｋＤのおよその分子量（ＭＷｔ）を有する。
【０１７７】
（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ調製物）
（材料：）
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体（９．０ｍｇ／ｍｌ  塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍｌ  無水クエン酸ナトリウム、０．７ｍｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０および滅菌水（ｐＨ６．５）中１０ｍｇ／ｍｌで、４℃にて使用するまで貯蔵した）
（手順：）
Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂについて上記した方法（実施例１）に従って、１０，０００ＭＷカットオフＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用して、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰを形成した。
【０１７８】
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの５〜１０ｍｇ／ｍｌ溶液１００μｌを、２．１Ｍ硫酸アンモニウムと０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）と１％プロピレングリコールとからなる溶液３．９ｍｌに対して透析した。１０，０００ＭＷカットオフ透析膜を使用した。その混合物を、室温にて２８時間透析した。その後、そのタンパク質溶液を、２．４２Ｍ硫酸アンモニウムと、１％プロピレングリコールと０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）とからなる溶液８００μｌ中で２回洗浄し、遠心分離し、そして同じ溶液約２００μｌ中に再懸濁した。
【０１７９】
（結果）
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰが、２８時間後に形成した。図１Ｂを参照のこと。
【０１８０】
（実施例３  Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの球状タンパク質粒子の調製）
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂは、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）として市販されている、モノクローナル抗体である。
【０１８１】
（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰ調製）
（材料）
１ｍｌ水（２２ｍｇ／ｍｌ）（ｐＨ６）中に再構成した、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ抗体（２２ｍｇのＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂと、１ｍｇのＬ−ヒスチジンＨＣｌと、０．６４ｍｇのＬ−ヒスチジンと、４０ｍｇトレハロース二水和物と、０．１８ｍｇポリソルベート２０とを含む、凍結乾燥粉末として入手可能）。
【０１８２】
（手順）
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰを、実施例１について上記した方法に従って１０，０００  ＭＷカットオフＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用して、形成した。
【０１８３】
１００μｌのＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ溶液（２２ｍｇ／ｍｌのＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を、２．１Ｍ硫酸アンモニウムと０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）と１％プロピレングリコールとからなる溶液３．９ｍｌに対して透析した。１０，０００ＭＷカットオフ透析膜を使用した。その混合物を、室温にて２８時間透析した。その後、そのタンパク質溶液を、２．４２Ｍ硫酸アンモニウムと、１％プロピレングリコールと０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）とからなる溶液８００μｌ中で２回洗浄し、遠心分離し、そして同じ溶液約２００μｌ中に再懸濁した。
【０１８４】
（結果）
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰが、２８時間後に形成した。図１Ｃを参照のこと。
【０１８５】
（実施例４  Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔの球状タンパク質粒子の調製）
Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔは、ＥｎｂｒｅｌＴＭ（Ｉｍｍｕｎｅｘ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）として入手可能な、モノクローナル抗体である。
【０１８６】
（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  ＳＰＰ調製）
（材料）
Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ抗体（４０ｍｇマンニトールと、１０ｍｇスクロースと、１．２ｍｇトロメタミンとを含む溶液中）。
【０１８７】
（手順）
Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  ＳＰＰを、実施例１について上記した方法に従って１０，０００  ＭＷカットオフＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用して、形成した。２５ｍｇ／ｍｌのＥｔａｎｅｒｃｅｐｔ溶液（４０ｍｇマンニトールと、１０ｍｇスクロースと、１．２ｍｇトロメタミンとを含む）の２００μｌアリコートを、２．３１Ｍ硫酸アンモニウムと０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）と１％プロピレングリコールとからなる溶液３．９ｍｌに対して透析した。１０，０００ＭＷカットオフ透析膜を使用した。その混合物を、４℃にて２８時間透析した。その後、そのタンパク質溶液を、２．６２Ｍ硫酸アンモニウムと、１％プロピレングリコールと０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）とからなる溶液８００μｌ中で２回洗浄し、遠心分離し、そして同じ溶液約２００μｌ中に再懸濁した。
【０１８８】
（結果）
Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  ＳＰＰが、２８時間後に形成した。
【０１８９】
（実施例５  Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔの球状タンパク質粒子の調製、番号２）
（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  ＳＰＰ調製、方法２）
（材料）
Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  ＳＰＰを、実施例１について上記した方法に従って１０，０００  ＭＷカットオフＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用して、形成した。Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ抗体（４０ｍｇマンニトールと、１０ｍｇスクロースと、１．２ｍｇトロメタミンとを含む溶液中）。
【０１９０】
（手順）
２５ｍｇ／ｍｌのＥｔａｎｅｒｃｅｐｔ溶液２５μｌを、６Ｍ蟻酸ナトリウム（ｐＨ７．５）からなる溶液３．９ｍｌに対して透析した。１０，０００ＭＷカットオフ透析膜を使用した。その混合物を、４℃にて２８時間透析した。その後、そのタンパク質溶液を、６．５Ｍ硫酸アンモニウムからなる溶液８００μｌ中で２回洗浄し、遠心分離し、そして同じ溶液約１００μｌ中に再懸濁した。
【０１９１】
（結果）
Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  ＳＰＰが、２８時間後に形成した。
【０１９２】
（実施例６  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの球状タンパク質粒子の調製、番号２：非透析法）
（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ調製）
（材料）
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体（９．０ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウムと、７．３５ｍｇ／ｍｌクエン酸ナトリウム無水物と、０．７ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０と滅菌水（ｐＨ６．５）との中に、１０ｍｇ／ｍｌにて、使用するまで４℃で保存した）。
【０１９３】
（手順）
４Ｍ硫酸アンモニウムのアリコートを、１０ｍｇ／ｍｌのＲｉｔｕｘｉｍａｂ溶液２００μｌに添加し、濃度を段階的に０．２Ｍずつゆっくり増加させ、０．５Ｍから始めて２．２Ｍまで増加させた。その混合物を、各濃度にて１時間平衡化させた。サンプルを顕微鏡によって定期的に分析して、球状形成を測定した。タンパク質含量、収率、および上清中に残ったタンパク質の量を、光学密度（ＯＤ）２８０ｎｍの分光光度計およびＨＰＬＣによって測定した。
【０１９４】
（結果）
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰが形成した。
【０１９５】
（実施例７  アルブミンＳＰＰの調製）
アルブミンＳＰＰを、蒸気拡散懸滴物から得た。
【０１９６】
（方法）
アルブミンの（水中）２００ｍｇ／ｍｌストック溶液のアリコートを、０．０５Ｍリン酸二水素カリウム（ｐＨ５．５）と２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００との溶液と１：１の比で混合し、プラスチックカバーガラス上に配置した。０．０５Ｍリン酸二水素カリウム（ｐＨ５．５）と２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ８０００とを含むレザバ溶液１ｍｌを、２４ウェルＬｉｎｂｒｏプレート（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）のウェル（レザバ）中に配置した。その後、そのカバーガラスを、Ｌｉｎｂｒｏプレートのウェル（レザバ）の上に反転させ、そして真空グリースで密封した。その後、懸滴溶液を、レザバ溶液とゆっくり平衡化させた。
【０１９７】
（結果）
アルブミンＳＰＰが、この懸滴において一晩で形成した。
【０１９８】
（実施例８  ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する球状タンパク質粒子、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの調製）
この実施例は、種々のタンパク質（特に、酵素（例えば、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ）、タンパク質ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、ウイルス、ウイルスタンパク質、抗体（例えば、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、抗体フラグメント、レセプター、およびペプチド（例えば、カルシトニン）が挙げられる）のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰを調製する方法を示す。
【０１９９】
（手順）
分子量２０００〜８０００の４０％  ＰＥＧのアリコートを、２００μｌのタンパク質溶液（溶液１ｍｌあたり５〜２０ｍｇタンパク質）に添加し、濃度を、４％  ＰＥＧから開始して１％ずつ段階的にゆっくり増加させ、１６．５％  ＰＥＧまで段階的に増加させる。この混合物を、各濃度にて１時間平衡化させる。サンプルを、顕微鏡により定期的に分析して、球状形成を測定する。その上清中のタンパク質含量、収量、および残っているタンパク質の量を、光学密度（ＯＤ）２８０ｎｍの分光光度計およびＨＰＬＣによって測定する。
【０２００】
（実施例９  ＰＥＧ−モノメチルエーテル（ＰＥＧ−ＭＥ）を使用する球状タンパク質粒子、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの調製）
この実施例は、種々のタンパク質（特に、酵素（例えば、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ）、タンパク質ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、ウイルス、ウイルスタンパク質、抗体（例えば、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、抗体フラグメント、レセプター、およびペプチド（例えば、カルシトニン）が挙げられる）のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰを調製する方法を示す。
【０２０１】
（手順）
分子量３３５０の４０％  ＰＥＧモノメチルエーテル（ＰＥＧ−ＭＥ）のアリコートを、２００μｌのタンパク質溶液（溶液１ｍｌあたり５〜２０ｍｇタンパク質）に添加し、濃度を、４％  ＰＥＧを超えて１２％  ＰＥＧまで１％ずつ段階的にゆっくり増加させる。この混合物を、各濃度にて１時間平衡化させる。サンプルを、顕微鏡により定期的に分析して、球状形成を測定する。その上清中のタンパク質含量、収量、および残っているタンパク質の量を、光学密度（ＯＤ）２８０ｎｍの分光光度計およびＨＰＬＣによって測定する。
【０２０２】
（実施例１０）
上記に例示したＳＰＰ調製法、球状ナノクリスタル複合粒子調製法、または結晶ＳＰＰ調製法を、硫酸アンモニウム以外、ギ酸ナトリウム以外、ＰＥＧ以外、およびＰＥＧ−ＭＥ以外の緩衝液（特に、硫酸リチウムおよびＭＰＤが挙げられる）を使用して実行し得る。
【０２０３】
（実施例１１  ＳＰＰの調製による乳汁タンパク質からのＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、およびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂの選択的分画／精製）
この実施例は、ＳＰＰの調製によってＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ、ＲｉｔｕｘｉｍａｂおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂを分画／精製する方法を包含する。この方法は、他の多数のタンパク質（特に、酵素（例えば、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ）、タンパク質ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、ウイルス、ウイルスタンパク質、抗体、抗体フラグメント、レセプター、およびペプチド（例えば、カルシトニン）が挙げられる）を精製するために使用し得る。
【０２０４】
（材料）
生乳を、地方牧場（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂｒｏｏｋ  Ｆａｒｍ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＭＡ）から購入し、４℃にて保存した。
【０２０５】
（手順）
１００ｍｌの乳汁アリコートを、２つの５０ｍｌ遠心管に移し（各５０ｍｌ）、４℃にて９５００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって脱脂肪した。そのクリーム層に、鋭利なピペットチップを使用して穿刺し、その脱脂乳を、清浄なチューブにそのチューブの開口部を通してデカントした。その後、その脱脂乳を再遠心分離（４℃にて９５００ｒｐｍで１５分間）してすべての残留脂肪を除去した。その後、等容量の２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによって、その脱脂乳を清澄化した。その乳状の外観が清浄になった。これは、ミセル状構造および凝集物の破壊を示す。その後、ＥＤＴＡ清澄化脱脂乳の各々５０ｍｌのアリコートを、４℃にて、１リットルのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析して、ＥＤＴＡを除去した。その後、その透析後の溶液を、１０，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、その後、０．２μｍフィルターを通過させ、そしてタンパク質濃度についてアッセイした。その乳汁は、最終タンパク質濃度約７ｍｇ／ｍｌを有した。その後、その清澄化した乳汁の３つのアリコートを、等容量のストックＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ溶液、ストックＲｉｔｕｘｉｍａｂ溶液、またはストックＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ溶液でスパイクして、最終濃度約５〜１２ｍｇ／ｍｌタンパク質にした。清澄化した乳汁にスパイクしたそのＩｎｆｌｉｘｉｍａｂタンパク質、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂタンパク質、およびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂタンパク質の精製を、以下のように実施した。
【０２０６】
２００μｌのタンパク質／清澄化乳汁溶液を、１．８Ｍ硫酸アンモニウムと、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）と、０．５％プロピレングリコールとからなる緩衝液３．９ｍｌに対して、４℃にて１８時間、１０，０００ＭＷカットオフを有する透析膜を使用して透析した。その後、１８時間後に、そのタンパク質溶液を、１．８Ｍ硫酸アンモニウムと０．５％プロピレングリコールと０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）とを含む溶液８００μｌ中で２回洗浄し、遠心分離し、同じ溶液約２００μｌ中に再懸濁した。
【０２０７】
（結果）
Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、およびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂを、上記乳汁タンパク質から分画／精製した。図８を参照のこと。
【０２０８】
ＳＰＰを使用することに加えて、この実施例による方法を使用して、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの調製によってタンパク質を分画／精製し得る。
【０２０９】
（実施例１２）
上記に例示したＳＰＰ調製条件、球状ナノクリスタル複合粒子調製条件、または結晶ＳＰＰ調製条件は、臨床的に関連する任意のタンパク質にとって有用である。臨床的に関連するタンパク質は、使用されるべき治療領域によって分類し得る。そのようなタンパク質としては、市販のタンパク質が挙げられるがそれらに限定されず、そのような市販のタンパク質は、以下を包含するがこれらに限定されない、抗体を包含する：
（１）Ａｂｃｉｘｉｍａｂ（ＲｅｏＰｒｏＴＭ）：（抗ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩａレセプター；心血管疾患の処置用），（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、
（２）Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ（ＳｙｎａｇｉｓＴＭ）：（ＲＳＶにおける抗Ｆタンパク質；呼吸疾患）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）により製造））、
（３）Ｍｕｒｕｍｏｎａｂ−ＣＤ３（ＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅＴＭ）：（抗ＣＤ３抗体；組織移植拒絶用）（ＯｒｔｈｏＢｉｏｔｅｃｈ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）、
（４）Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ（ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭ）：（癌）（Ｗｙｅｔｈ  Ｌａｂｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）、
（５）Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ（ＳｉｍｕｌｅｃｔＴＭ）：（抗ＣＤ２５抗体；組織移植拒絶用）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、
（６）Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ（ＺｅｎａｐａｘＴＭ）：（抗ＣＤ２５抗体；組織移植拒絶用）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、
（７）Ｚｅｖａｌｉｎ：（癌についての放射免疫療法）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、
（８）ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭ：（抗ＣＤ３３抗体）。
【０２１０】
（実施例１３  抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子または結晶抗体ＳＰＰの形成の間の抗体凝集物の除去）
この実施例は、抗体調製物から抗体凝集物を除去するための方法を示す。ＳＰＰを形成するために使用される沈殿物（特に、硫酸アンモニウム、ギ酸塩、およびＰＥＧを含む）はまた、より低濃度でタンパク質凝集物を除去するために役立つ。
【０２１１】
（手順）
凝集物を含む抗体溶液（１０ｍｇ／ｍｌ抗体）を得る。サイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質凝集の程度を決定する。増加分において、２Ｍ硫酸アンモニウム、４０％ＰＥＧ（問題となるタンパク質に依存して、６．５％  ＰＥＧまでの最終濃度にする）、または８Ｍギ酸塩（問題となるタンパク質に依存して、最終濃度約０．９Ｍにする）のいずれかのストック溶液を添加する。凝集したタンパク質は、最初に析出する。非凝集タンパク質は、溶液中に残る。ペレットと溶液との間のタンパク質分配を、ＨＰＬＣによって追跡する。
【０２１２】
（実施例１４  ＦＴＩＲによる二次構造特徴決定）
以下の方法は、タンパク質の二次構造を測定するために特に有用である。詳細には、以下の方法を、アッセイされるタンパク質のβ−シート含量またはα−ヘリックス含量を測定するために使用し得る。このようにして、母液中に維持されるＳＰＰ、母液中に維持される球状ナノクリスタル複合粒子または母液中に維持される結晶ＳＰＰのタンパク質成分の二次構造、あるいは溶存するＳＰＰ、溶存する球状ナノクリスタル複合粒子または溶存する結晶ＳＰＰに由来するタンパク質の二次構造を、そのネイティブの可溶性対応物と比較し得る。このようにして、ネイティブの生物学的に活性なタンパク質に対する、例えば、１）ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰを形成する効果、２）短期保存または長期保存の効果、および３）ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの組成物もしくは処方物を生成することの効果を、決定し得る。
【０２１３】
相関係数を、Ｎｉｃｏｌｅｔから得られるタンパク質分析ソフトウェアを使用して計算する。このタンパク質分析ソフトウェアは、以前に保存された参照スペクトルとそのタンパク質スペクトルとの間の相関係数の決定を容易に可能にする（Ｇａｒｌａｎｄ，Ｂ．，ＦＴ−ＩＲ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｄｒｉｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ｎｉｃｏｌｅｔアプリケーションノート番号ＡＮ９４７９）。ネイティブの水性タンパク質の二次導関数スペクトルを、参照スペクトルとして使用する。乾燥ＳＰＰ、乾燥球状ナノクリスタル複合粒子または乾燥結晶ＳＰＰ、および凍結乾燥固体タンパク質を、サンプルとして使用し得る。それらのタンパク質は、相関係数が１に近づくにつれ、漸増的に類似する二次立体構造を有する。相関係数０．８未満によって、変性が示される。相関係数０．８未満は、１）増加したネイティブタンパク質のβ−シート含量もしくは減少したネイティブタンパク質のβ−シート含量、または２）ネイティブタンパク質のα−ヘリックス含量が、減少のみしている（すなわち、タンパク質のβ−シート含量は、変性の際に増加または減少し得るが、タンパク質のα−ヘリックス含量は、変性の際に常に減少する）ことを示す。従って、相関係数０．８未満は、アッセイされているタンパク質のネイティブの生物学的に活性な形態と比較した、そのタンパク質の変性に起因する二次構造の変化を示す。
【０２１４】
相関係数０．８〜１．０は、アッセイされているタンパク質の二次構造（すなわち、β−シート含量および／またはα−ヘリックス含量）が、そのタンパク質のネイティブの生物学的に活性な形態の二次構造と、約８０％から約１００％同一であることを意味する。
【０２１５】
（手順）
実施例３の方法に従って生成したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰ、実施例１の方法に従って生成したＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰ、および実施例２の方法に従って生成したＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰの各々の母液中で懸濁状態で維持される二次構造を、そのネイティブの可溶性対応物の二次構造と比較した。そのネイティブの可溶性抗体の懸濁状態のＳＰＰのフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルを、Ｄｏｎｇら［Ｄｏｎｇ，Ａ．，Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｂ．，Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｗ．Ｓ．，Ｂｈａｔ，Ｋ．Ｓ．およびＣｏｅ，Ｊ．Ｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２；３１：９３６４〜９３７０；Ｄｏｎｇ，Ａ．，Ｐｒｅｓｔｒｅｌｓｋｉ，Ｓ．Ｊ．，Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．およびＣａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９５；８４：４１５〜４２４．］により記載されるようなＮｉｃｏｌｅｔモデル５５０  Ｍａｇｎａシリーズ分光光度計にて収集した。その後、懸濁状態にあるＳＰＰのＦＴＩＲスペクトルを、それぞれのネイティブの可溶性対応物のＦＴＩＲスペクトルと比較した。
【０２１６】
その相関係数を、Ｎｉｃｏｌｅｔから得られるタンパク質分析ソフトウェアを使用して計算した。このタンパク質分析ソフトウェアは、以前に保存した参照スペクトルとそのタンパク質スペクトルとの間の相関係数の決定を容易に可能にする（Ｇａｒｌａｎｄ，Ｂ．，ＦＴ−ＩＲ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｄｒｉｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．，Ｎｉｃｏｌｅｔアプリケーションノート番号ＡＮ  ９４７９）。
【０２１７】
（母液中の懸濁状態に維持された）１ｍｌあたり約１０ｍｇ  ＳＰＰであるそのＳＰＰ溶液各々の１ｍｌのＦＴＩＲスペクトルを、減衰反射法（ＡＴＲ）を使用して分析した。そのスペクトルを収集し、その後、アミドＩ領域（１６００〜１７００ｃｍ−１）下の二次導関数および曲線適合プログラムを使用して、二次構造の個々の成分の相対面積を決定するために、Ｇｒａｍｓ  ３２（Ｇａｌａｃｔｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を使用して処理した。
【０２１８】
（結果）
ネイティブの可溶性Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂと比較して、０．８より大きい相関係数を、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰについて得た。これは、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰを形成するプロセスが、インタクトな抗体の完全性を損なうものでもそのネイティブ構造を２０％より大きく変化させるものでもなかったことを示す。これは、図２に示されるほぼ同一のスペクトルによって実証される。
【０２１９】
ネイティブの可溶性Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂと比較して、０．８より大きい相関係数を、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰについて得た。これは、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰを形成するプロセスが、インタクトな抗体の完全性を損なうものでもそのネイティブ構造を２０％より大きく変化させるものでもなかったことを示す。これは、図３に示されるほぼ同一のスペクトルによって実証される。
【０２２０】
ネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと比較して、０．８より大きい相関係数を、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰについて得た。これは、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰを形成するプロセスが、インタクトな抗体の完全性を損なうものでもそのネイティブ構造を２０％より大きく変化させるものでもなかったことを示す。これは、図４に示されるほぼ同一のスペクトルによって実証される。
【０２２１】
この実施例に従うＦＴＩＲ分析は、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのタンパク質成分として存在するすべてのタンパク質の二次構造を決定するために使用し得、ここで、そのＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶ＳＰＰは、その母液中に維持されている。この実施例に従うＦＴＩＲ分析は、溶存ＳＰＰ、溶存球状ナノクリスタル複合粒子または溶存結晶ＳＰＰから得られるすべてのタンパク質のため、あるいは乾燥して固体サンプルにされたＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのために、使用し得る。その固体サンプルのために、懸濁状態にあるタンパク質、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶ＳＰＰのために使用される減衰反射法（ＡＴＲ）の代わりに、拡散反射法を使用する。固体サンプルのために、そのタンパク質を、３５０ｍｇのＫＢｒ粉末を用いて軽く粉砕し、そして拡散反射アクセサリーのために使用する小さいカップ中に充填する。
【０２２２】
（実施例１５  抗体の生物学的活性の決定のためのバイオイムノアッセイ）
抗体の生物学的活性を、いわゆるバイオイムノアッセイによって特徴付けおよび測定し得、このバイオイムノアッセイとしては、特に、下記の３つのバイオイムノアッセイが挙げられる。これらのアッセイは、抗体ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合抗体粒子、または結晶抗体ＳＰＰに由来する抗体の残留する生物学的活性を、その可溶性抗体対応物と比較するために有用である。このようにして、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶ＳＰＰを抗体から生成する効果と、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、および結晶ＳＰＰの組成物もしくは処方物を短期保存もしくは長期保存し、乾燥し、そして形成し、その後溶解する効果を、決定し得、そして問題となる抗体の可溶性対応物と比較し得る。
【０２２３】
その抗原保有標的細胞に対する抗体の細胞傷害性を、これらのアッセイ（例えば、直接的細胞傷害性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））によって特徴付け得る。Ｒｉｔｕｘａｎのとっての標的細胞は、表面上にＣＤ−２０抗原を過剰発現する細胞であり、この細胞としては、Ｒａｊｉ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、ＪＯＫ１細胞およびＷＴ１００細胞が挙げられる。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎについての特異的抗原は、ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子レセプター２タンパク質）であり、このＨＥＲ２は、ヒト乳腺癌細胞株（ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４、およびＭＣＦ／ＨＥＲ２が挙げられる）において過剰発現される。
【０２２４】
（実施例１６  溶存したＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ由来のＲｉｔｕｘｉｍａｂをネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと比較する、直接的細胞傷害性バイオイムノアッセイ）
（直接的細胞傷害）
直接的細胞傷害は、その名前が暗示するように、標的細胞を種々の濃度の抗体と同時インキュベートすることによって、その標的細胞に対する抗体の固有の毒性効果を測定する。細胞生存を、抗体との同時インキュベーションの後に計数する。
【０２２５】
（手順）
１）ＲＡＪＩリンパ腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ８６から得た）を、増殖培地中で培養し、そして同じ増殖培地中に最終濃度０．５×１０５細胞／ｍｌまで希釈した。
【０２２６】
２）５０００細胞（１００μｌ）を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに移す。
【０２２７】
３）別の９６ウェルプレートにおいて、実施例１８によって溶存Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ（実施例２の方法により生成した）から得たＲｉｔｕｘｉｍａｂ、およびネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂを、細胞培養培地中で連続希釈した。
【０２２８】
４）その希釈した抗体溶液の１００μｌアリコートを、その細を含むアッセイプレートの各ウェルに移した。これによって、１ウェルあたり２００μｌの抗体／細胞溶液の最終アッセイ溶液を得た。抗体を含まずに細胞を含むウェル（１００μｌの増殖培地単独）を、コントロールとして使用した（「細胞のみ」コントロール）。そのプレートを、３７℃において３日間インキュベートした。
【０２２９】
５）３日間後、２０μｌのＰｒｏｍｅｇａ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを、各ウェルに添加した。
【０２３０】
６）その後、４９０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を、３７℃にて読み取った。溶存Ｒｉｔｕｘｉｍａｂまたはそのネイティブの可溶性対応物を含むウェル中の４９０ｎｍでの吸光度を、「細胞のみ」コントロールと比較した。「細胞のみ」コントロールと比較した吸光度の減少は、ＲＡＪＩリンパ腫細胞増殖阻害の指標であった。溶存Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰから得たＲｉｔｕｘｉｍａｂがＲＡＪＩリンパ腫細胞増殖を阻害する能力を、ネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの能力と比較した。
【０２３１】
（結果）
実施例１８によって溶存Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰから得たＲｉｔｕｘｉｍａｂは、ＲＡＪＩリンパ腫細胞の直接的細胞傷害を誘導した。これは、同じ条件下でアッセイしたネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ対応物に匹敵した。図９を参照のこと。
【０２３２】
（実施例１７  溶存したＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ由来のＲｉｔｕｘｉｍａｂをネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと比較する、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）バイオイムノアッセイ）
（補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ））
補体依存性細胞傷害反応は、抗体がその細胞表面抗原に結合する場合に生じ、それによって、補体系（細胞を溶解し局所的炎症反応を誘発する、一連の相互作用タンパク質）を活性化することによって標的細胞破壊を誘導する。
【０２３３】
（手順）
１）ＲＡＪＩリンパ腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ８６から得た）を、増殖培地中で培養し、そして同じ増殖培地中に最終濃度０．５×１０５細胞／ｍｌまで希釈した。
【０２３４】
２）５０００細胞（１００μｌ）を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに移し、実施例１９により溶存Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ（実施例２の方法により生成した）から得たＲｉｔｕｘｉｍａｂ（２５μｇ／細胞培養培地１ｍｌ）、またはネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（２５μｇ／細胞培養培地１ｍｌ）のいずれかと、種々の濃度のヒト血清との存在下で、培養した。抗体を含まずに細胞を含むウェルを、コントロールとして使用した（「細胞のみ」コントロール）。そのプレートを、３７℃において３日間インキュベートした。
【０２３５】
３）３日間のインキュベーション期間の後、生存するＲＡＪＩリンパ腫細胞の数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６−Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｌｉｇｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｐｒｏｍｅｇａ製品番号Ｇ３５８０）を使用して、各ウェルにおいて計数した。実施例１８に従って溶存Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰから得たＲｉｔｕｘｉｍａｂを含むウェル中の生細胞の数を、ネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂを含むウェル中の生細胞の数および抗体を含まない細胞（「細胞のみ」コントロール」）を含むウェル中の生細胞の数と、比較した。
【０２３６】
（結果）
図１０を参照のこと。
【０２３７】
（実施例１８  抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）バイオイムノアッセイ）
（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））
ＣＤＣと類似して、ＡＤＣＣは、モノクローナル抗体の細胞傷害を担う主要な機構のうちの１つである。ＣＤＣとは対照的に、ＡＤＣＣにより引き起こされる標的細胞破壊は、抗体がその標的細胞上の特異的抗原に結合した後に、免疫細胞を動員することによって開始される。この免疫細胞は、腫瘍細胞を特異的に攻撃する。このＡＤＣＣアッセイは、まず、ウェル／プレートに固定量の標的細胞（腫瘍細胞）を播種すること、その後、抗体およびエフェクター免疫細胞（通常は、単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））とともに同時インキュベートすることによって、行う。その細胞生存を、同時インキュベーションの最後に測定する。コントロール（標的細胞＋抗体のみ）の存在下と比較して、エフェクター免疫細胞の存在下では、細胞死は、有意に増加する。
【０２３８】
（手順）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常血液ドナーの軟膜から調製する。その軟膜を、まず、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈する。そして、Ｂｏｙｕｍら（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．補遺９７，７７〜８９（１９６８））の方法に従うＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって、ＰＢＭＣを調製する。その細胞を、熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と１０％ジメチルスルホキシドとを含む培地中に懸濁し、その後、等分にし、さらに使用するまで液体窒素中に凍結保存する。ＰＢＭＣを融解し、同じ培地中で３回洗浄し、ＰＢＳ中で１回洗浄し、２μＭの赤メンブレン色素ＰＫＨ−２６（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）とともに４分間インキュベートする。その反応チューブを、室温にてわずかに攪拌する。
【０２３９】
リンパ腫細胞株（例えば、ＲＡＪＩおよびＤＵＡＤＩ（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、プラスチックの２５ｃｍ２培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｓｏｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、１２．５ｍｌ培地中に対数増殖状態にて維持する。その細胞を採集し、ＰＢＳ中で洗浄し、２μＭのＰＫＨ−２（緑色蛍光）とともに１０分間インキュベートする。ＦＣＳを添加することによって染色を停止し、標識細胞を、培地で３回洗浄する。細胞の計数を実施して、この染色プロセスを生存した生細胞数を測定する。細胞計数は、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバー中でトリパンブルー染色を使用して実施する。均質な細胞標識を、ＵＶ蛍光顕微鏡によって確認する。リンパ腫細胞およびＰＢＭＣを、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中に播種する。次いで、選択した抗体を、新鮮なヒト血清（補体供給源として）およびサイトカインとともに添加する。その後、そのプレートを、加湿雰囲気中にて、３７℃および５％  ＣＯ２にて３日間インキュベートする。インキュベーションの後、そのプレートを、ＰＢＳ中で洗浄する。この洗浄工程の後、温ＥＤＴＡを（最終濃度０．０２％まで）補充しトリプシンを（最終濃度０．０５％まで）補充した、ＰＢＳを５０μｌ、各ウェルに添加する。１０分間のインキュベーションの後、そのプレートを、プレート振盪器において１分間攪拌する。４５％のＦＣＳを含むＰＢＳの２００μｌアリコートを、添加し（トリプシン活性をブロックし）、ヨウ化プロピジウム（１２．５μｇ／ｍｌ）を、死細胞の標識のために添加し、そしてＦＩＴＣ標識慢性リンパ球白血病リンパ球（１５０，０００細胞／ｍｌ（すなわち、２００μｌあたり３０，０００細胞））を、細胞数測定のための標準物として添加する。すべてのサンプル分析を、同一のゲートおよび機器設定を使用するＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）フローサイトメーターにおけるフローサイトメトリーによって、実施する。各ウェル中の生腫瘍細胞数を、以下の式：
生腫瘍細胞＝３０，０００×（事象（腫瘍細胞ゲート））／事象（標準細胞ゲート））
を使用して計算する。ここで、３０，０００とは、各ウェルに添加する標準細胞の数である。
【０２４０】
（実施例１９  可溶性タンパク質サンプル調製）
そのネイティブな可溶性対応物との比較のために、実施例１〜９において生成するＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのタンパク質成分を、３７℃の０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中に最終濃度約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌまでＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰを溶解（再懸濁）することによって、調製する。
【０２４１】
（実施例２０  ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰの安定性）
実施例２および３に従って調製したＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰまたはＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰの安定性を、そのネイティブの可溶性対応タンパク質の安定性と比較した。
【０２４２】
図５は、同じ期間４℃にて保存した、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰとネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂとの安定性の比較を示す。このＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰは、実施例１９における方法に従って溶解させた。この分析は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって実施した。その結果は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰが、保存中には分解しなかったことを示す。
【０２４３】
図７は、実施例３および実施例２に従ってそれぞれ生成したＴｒａｓｔｕｍａｂ  ＳＰＰおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰを、ネイティブの可溶性Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂおよびネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと同じ条件下で同じ時間４℃で保存した場合の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの図である。保存した後、ネイティブの可溶性Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂおよびネイティブの可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、ならびに溶存Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰおよび溶存Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ（実施例１９に従って溶解した）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して電気泳動した。図７は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰが、そのネイティブの可溶性対応物と同じ条件下で保存した場合に安定であることを、示す。
【０２４４】
本発明に従うどのＳＰＰ，球状ナノクリスタル複合粒子、もしくは結晶ＳＰＰ、またはそれらの組成物もしくは処方物の安定性も、この実施例の方法を使用して、それらのネイティブの可溶性対応物に対して試験し得る。
【０２４５】
（実施例２１）
（賦形剤としてポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を使用する、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの処方）
乾燥および貯蔵の間、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの安定性を増強するために、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを賦形剤と共に処方し得る。ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを以下のように０．１％のポリエチレンオキシド水溶液を使用して処方し得る。このＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを、スウィングバケット回転子を備えつけたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒベンチトップ遠心機で１０００ｒｐｍで遠心分離することによって、調製緩衝液から分離し得る。次に、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを、０．１％のポリエチレンオキシド中に３時間懸濁し（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、次いで、遠心分離によって分離する。
【０２４６】
（実施例２２）
（賦形剤としてスクロースを使用する、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの処方）
この実施例において、スクロース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、賦形剤として、調製緩衝液中のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに添加する。十分なスクロースをＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに添加し、１０％（ｗ／ｖ）の最終スクロース濃度に達する。次いで、得られた懸濁液を室温で３時間タンブリングする。スクロースでの処理後、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを、実施例２１に記載するように、遠心分離によって液体から分離する。
【０２４７】
（実施例２３）
（賦形剤としてトレハロースを使用する、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの処方）
スクロースの代わりにトレハロース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えて、調製緩衝液中の最終濃度を１０％（ｗ／ｖ）にすることにより、実施例２２のとおりにＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを処方しする。次いで、得られた懸濁液を室温で３時間タンブリングし、実施例２１に記載したように、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを遠心分離によって液体から分離する。
【０２４８】
（実施例２４）
（賦形剤としてメトキシポリエチレングリコール（ＭＯＰＥＧ）を使用する、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの処方）
スクロースの代わりにメトキシポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えて、調製緩衝液中の最終濃度を１０％（ｗ／ｖ）にし、そして実施例２１に記載されるように３時間の遠心分離後に分離することによって、実施例２２のとおりにＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを処方する。
【０２４９】
（実施例２５）
（非経口注入に特に適切な安定なＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰの作製）
実施例２および３それぞれの方法に従うＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰの作製に使用する高い硫酸アンモニウム含量（２．１Ｍ）の濾過液は、ＳＰＰがヒトまたは別の動物に非経口注入を介して送達することを意図される場合には不利である。以下の方法を使用して動物（とりわけ、ヒトを含む）への非経口送達を意図するＳＰＰ溶液の硫酸アンモニウム含量を減少させた。
【０２５０】
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰを、実施例２および３それぞれに従って作製した。濾過液を、室温での２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ溶液およびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰ溶液から除去した。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰを、１６％のＰＥＧ１５００、９％のエタノール、４．５％のグリコフロール（ｇｌｙｃｏｆｕｒｏｌ）、４．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、および０．０９Ｍのトレハロースからなる溶液中に再懸濁した。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰを、１６％のＰＥＧ１５００、９％のエタノール、４．５％のグリコフロール（ｇｌｙｃｏｆｕｒｏｌ）、４．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、０．０９Ｍのトレハロースおよび４．５％のプロピレングリコールからなる溶液中に再懸濁した。遠心分離工程を２度繰り返し、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰを最終濃度（溶液中のタンパク質）が１０ｍｇ／ｍｌである同一の各溶液に再懸濁した。
【０２５１】
（結果：）
この実施例に従って作製されるＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ溶液およびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰ溶液、ならびにこれらの可溶性対応物を２６℃で２週間貯蔵した。１週目および２週目に、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰの安定性が、それらの天然の安定性、可溶性対応物の安定性と同等であることが見出された。図１６を参照のこと。
【０２５２】
（実施例２６）
（ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰ、またはそれらの組成物もしくは処方物を乾燥する方法）
方法１．室温でのＮ２気体乾燥：ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰおよびそれらの組成物もしくは処方物を、５０ｍｌのＦｉｓｈｅｒブランドの使い捨て遠心分離チューブ（ポリプロピレン）中にスウィングバケット回転子を備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒベンチトップ遠心機で、１０００ｒｐｍでの遠心分離によって賦形剤を含有する調製緩衝液から分離する。次いで、このＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを、約１０ｐｓｉの圧力で窒素流をチューブに一晩流すことによって乾燥させる。
【０２５３】
方法２．真空炉乾燥：ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰおよびそれらの組成物もしくは処方物を、５０ｍｌのＦｉｓｈｅｒブランドの使い捨てポリプロピレン遠心分離チューブ中にスウィングバケット回転子を備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒベンチトップ遠心機中で、１０００ｒｐｍでの遠心分離を使用して、調製緩衝液／賦形剤溶液からまず分離する。次いで、湿潤のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを、室温で２５ｍｍの水銀圧（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で真空炉中に配置し、少なくとも１２時間乾燥させる。
【０２５４】
方法３．凍結乾燥：ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰまたはそれらの組成物および処方物を、５０ｍｌのＦｉｓｈｅｒブランドの使い捨てポリプロピレン遠心分離チューブ中にスウィングバケット回転子を備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒベンチトップ遠心機中で、１０００ｒｐｍでの遠心分離を使用して、調製緩衝液／賦形剤溶液からまず分離する。次いで、湿潤ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを、不十分に閉じたバイアル中でＶｉｒｔｉｓ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ２４を使用して、凍結乾燥させる。凍結工程の間に、棚温度を−４０℃まで徐々に下げる。この温度を１６時間維持する。次いで、２次乾燥をさらに８時間実施し得る。
【０２５５】
方法４．有機溶媒乾燥および空気乾燥：ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰまたはそれらの組成物および処方物を、５０ｍｌのＦｉｓｈｅｒブランドの使い捨てポリプロピレン遠心分離チューブ中にスウィングバケット回転子を備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒベンチトップ遠心機中で、１０００ｒｐｍでの遠心分離を使用して、濾過液／賦形剤溶液からまず分離する。次いで、このＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰをエタノールまたはイソプロパノールまたは酢酸エチルまたは他の適切な溶媒のような有機溶媒中に懸濁し、遠心分離する。次いで、この上清をデカントし、ＳＰＰを換気フード中、室温で、約３０分間〜約２日間（ＳＰＰサンプルのサイズに依存する）、ＳＰＰが完全に乾燥するまで、空気乾燥させるかまたは穏やかな窒素流下で乾燥させる。
【０２５６】
方法５．室温での空気乾燥：ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰまたはそれらの組成物および処方物を、５０ｍｌのＦｉｓｈｅｒブランドの使い捨て遠心分離チューブ（ポリプロピレン）中にスウィングバケット回転子を備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒベンチトップ遠心機中で、１０００ｒｐｍでの遠心分離によって、賦形剤を含む調製緩衝液から分離する。続いて、このＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを換気フード中で２日間空気乾燥させる。
【０２５７】
方法６．噴霧乾燥：ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子もしくは結晶性ＳＰＰまたはそれらの組成物および処方物を、Ｂｕｃｈｉ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｂ−１９１を使用して噴霧乾燥する。３０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを噴霧乾燥に使用する。
【０２５８】
（実施例２７）
（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰの乾燥）：
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ結晶を、実施例６の方法に従って作製し、そして実施例２６の方法４に従って乾燥する。
【０２５９】
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰの乾燥：
濾過液中にＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰを１．５ｍｇ含有する溶液を、室温で１０分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、この濾過液をＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰから除去し、そしてＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰを、７０％の２−プロパノール（イソプロパノール）中の６％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（界面活性剤）（ＢＡＳＦ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの贈り物）に再懸濁した。次いで、この溶液を、溶媒が除去され得るまで（室温で１０分間）１０００ｒｐｍで遠心分離した。溶媒を除去し、そしてＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰを２５％のプロピレングリコール／７５％の２−プロパノールの溶液中に再懸濁した。次いで、この溶媒を１０００ｒｐｍでの遠心分離（室温で１０分間）によってこの溶液から除去し、そしてＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰを１００％の２−プロパノール中に再懸濁した。次いで、２−プロパノールを１０００ｒｐｍでの遠心分離（室温で１０分間）によってこの溶液から除去した。次いで、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰを穏やかな窒素流中で乾燥させた。このサンプルサイズは小さい（１．５ｍｇ）ので、ＳＰＰは、４５分後に完全に乾燥した。
【０２６０】
（実施例２８）
（ジメチル３，３’−ジチオビスイソプロピオンイミダート．ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）架橋）
ジメチル３，３’−ジチオビスイソプロピオンイミダート  ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）溶液を、２７．９ｍｇのＤＴＢＰを６０ｍｌの水中に溶解することによって調製する。次いで、この溶液の４０ｍｌのアリコートをＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに加える（１０ｍＭの塩化カルシウムと２０％のＭＰＤを含有する、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１．５ｍｌ中に２１ｍｇ）。タンブリングをしながら２４時間、周囲温度で架橋を実施する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭの塩化カルシウムおよび２０％のＭＰＤを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁する。追加量のＤＴＢＰ（２０ｍｌ）を加え、架橋をさらに２４時間続ける。架橋を、１回あたり１ｍｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび２０％ＭＰＤを含有）で５回、過剰な試薬を洗浄することによって終結する。
【０２６１】
（実施例２９）
（ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）架橋）
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）溶液を、６０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に３６ｍｇのＤＳＰを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌのアリコートをＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに加える（１０ｍＭの塩化カルシウムと２０％のＭＰＤを含有する、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１．５ｍｌ中に２１ｍｇ）。タンブリングをしながら２４時間、周囲温度で架橋を実施する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭの塩化カルシウムおよび２０％のＭＰＤを単有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁する。追加量のＤＴＢＰ（２０ｍｌ）を加え、架橋をさらに２４時間続ける。架橋を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび２０％ＭＰＤを含有）で（各回１ｍｌの緩衝液で５回）、過剰な試薬を洗浄することによって終結する。
【０２６２】
（実施例３０）
（ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）架橋）
ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）溶液を、４０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に１２ｍｇのＢＭＨを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌのアリコートをＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに加える（１０ｍＭの塩化カルシウムと２０％のＭＰＤを含有する、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１．５ｍｌ中に２１ｍｇ）。タンブリングをしながら２４時間、周囲温度で架橋を実施する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭの塩化カルシウムおよび２０％のＭＰＤを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁する。追加量のＢＭＨ（２０ｍｌ）を加え、架橋をさらに２４時間続ける。架橋を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび２０％ＭＰＤを含有）で、過剰な試薬を洗浄する（１ｍｌの緩衝液で５回）ことによって終結する。
【０２６３】
（実施例３１）
（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ）架橋）
ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ）溶液を、５０ｍｌの水中に２９ｍｇのＢＳを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌのアリコートをＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに加える（１０ｍＭの塩化カルシウムと２０％のＭＰＤを含有する、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１．５ｍｌ中に２１ｍｇ）。タンブリングをしながら２４時間、周囲温度で架橋を実施する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭの塩化カルシウムおよび２０％のＭＰＤを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁する。追加量のＢＳ（２０ｍｌ）を加え、架橋をさらに２４時間続ける。架橋を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび２０％ＭＰＤを含有）で、過剰な試薬を洗浄する（１ｍｌの緩衝液で５回）ことによって終結する。
【０２６４】
（実施例３２）
（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）架橋）
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）溶液を、４０ｍｌのアセトン中に１０ｍｇのＤＦＤＮＢを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍのアリコートをＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに加える（１０ｍＭの塩化カルシウムと２０％のＭＰＤを含有する、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１．５ｍｌ中に２１ｍｇ）。タンブリングをしながら２４時間、周囲温度で架橋を実施する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭの塩化カルシウムおよび２０％のＭＰＤを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁する。追加量のＤＦＤＮＢ（２０ｍｌ）を加え、架橋をさらに２４時間続ける。架橋を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび２０％ＭＰＤを含有）で、過剰な試薬を洗浄する（１ｍｌの緩衝液で５回）ことによって終結する。
【０２６５】
（実施例３３  ジメチルスベルイミデート２ＨＣｌ（ＤＭＳ）の架橋：）
ジメチルスベルイミデート２ＨＣｌ（ＤＭＳ）溶液を、４０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に３３ｍｇのＤＭＳを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌアリコートを、ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ（１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に２１ｍｇ）に添加する。架橋を、２４時間回転させながら実行する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁する。さらなる量のＤＭＳ（２０ｍｌ）を添加し、架橋をさらに２４時間継続する。この架橋反応を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）を用いて過剰な試薬を洗い落とすこと（１ｍｌの緩衝液で５回）によって終結する。
【０２６６】
（実施例３４  ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）の架橋：）
ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）溶液を、５０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に１７ｍｇのＤＳＧを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌアリコートを、ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ（１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に２１ｍｇ）に添加する。架橋を、周囲温度で２４時間回転させながら実行する。その後、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁する。さらなる量のＤＳＧ（２０ｍｌ）を添加し、架橋をさらに２４時間継続する。この架橋を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）を用いて過剰な試薬を洗い落とすこと（１ｍｌの緩衝液で５回）によって終結する。
【０２６７】
（実施例３５  ジスルホスクシンイミジルタートレート（Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ）の架橋：）
ジスルホスクシンイミジルタートレート（Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ）溶液を、５０ｍｌの水中に２７ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＤＳＴを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌアリコートを、ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ（１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に２１ｍｇ）に添加する。架橋を、周囲温度で２４時間回転させながら実行する。その後、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁する。さらなる量のＳｕｌｆｏ−ＤＳＴ（２０ｍｌ）を添加し、架橋をさらに２４時間継続する。この架橋を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）を用いて過剰な試薬を洗い落とすこと（１ｍｌの緩衝液で５回）によって終結する。
【０２６８】
（実施例３６  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）の架橋：）
１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）溶液を、１ｍｌの水中に１０ｍｇのＥＤＣを溶解させることによって調製する。この溶液の２００ｍｌアリコートおよび５ｍｇの固体Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを、ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ（１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に２１ｍｇ）に添加する。架橋を、周囲温度で２４時間回転させながら実行する。２４時間後、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中に懸濁する。さらなる量のＥＤＣおよびＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ（２００ｍｌおよび５ｍｇ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）を添加し、架橋をさらに２４時間継続する。この架橋を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）を用いて過剰な試薬を洗い落とすこと（１ｍｌの緩衝液で５回）によって終結する。
【０２６９】
（実施例３７  エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ）の架橋：）
エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ）溶液を、４０ｍｌの水中に３３ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＥＧＳを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌアリコートを、ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ（１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に２１ｍｇ）に添加する。架橋を、周囲温度で２４時間回転させながら実行する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁する。さらなる量のＳｕｌｆｏ−ＥＧＳ（２０ｍｌ）を添加し、架橋をさらに２４時間継続する。この架橋を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）を用いて過剰な試薬を洗い落とすこと（１ｍｌの緩衝液で５回）によって終結する。
【０２７０】
（実施例３８  Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）の架橋：）
Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）溶液を、５０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２３ｍｇのＧＭＢＳを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌアリコートを、ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ（１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に２１ｍｇ）に添加する。架橋を、周囲温度で２４時間回転させながら実行する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁する。さらなる量のＧＭＢＳ（２０ｍｌ）を添加し、架橋をさらに２４時間継続する。この架橋反応を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）を用いて過剰な試薬を洗い落とすこと（１ｍｌの緩衝液で５回）によって終結する。
【０２７１】
（実施例３９  Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（Ｓｕｌｆｏ−ＨＳＡＢ）の架橋：）
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（Ｓｕｌｆｏ−ＨＳＡＢ）溶液を、４０ｍｌの水中に５ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＨＳＡＢを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌアリコートを、ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ（１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に２１ｍｇ）に添加する。架橋を、周囲温度で２４時間回転させながら実行する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に懸濁し、そして第２の架橋を、２５４ｎｍのＵＶ光を使用して（ＵＶランプをサンプルから２．５ｃｍ離しておくことによって）、周囲温度で１０分間振盪しながら実行する。１０分後、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。この架橋を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）を用いて過剰な試薬を洗い落とすこと（１ｍｌの緩衝液で５回）によって終結する。
【０２７２】
（実施例４０  スルホスクシンイミジル−６−［ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）の架橋：）
スルホスクシンイミジル−６−［ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）溶液を、６０ｍｌの水中に１２ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴを溶解させることによって調製する。この溶液の４０ｍｌアリコートを、ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ（１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に２１ｍｇ）に添加する。架橋を、周囲温度で２４時間回転させながら実行する。次いで、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、ペレットを１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁する。さらなる量のＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（２０ｍｌ）を添加し、架橋をさらに２４時間継続する。この架橋を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）を用いて過剰な試薬を洗い落とすこと（１ｍｌの緩衝液で５回）によって終結する。
【０２７３】
（実施例４１  ビス−［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）の架橋：）
ビス−［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）溶液を、４０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に３ｍｇのＢＡＳＥＤを溶解することによって調製する。この溶液の４０ｍｌアリコートを、ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ（１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中に２１ｍｇ）に添加する。架橋を、３６５ｎｍのＵＶ光を使用して（ＵＶランプをサンプルから２．５ｃｍ離しておくことによって）、周囲温度で３０分間振盪しながら実行する。３０分後、このスラリーを３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を廃棄する。この架橋を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）を用いて過剰な試薬を洗い落とすこと（１ｍｌの緩衝液で５回）によって終結する。
【０２７４】
（実施例４２  グルタルアルデヒドの架橋：）
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ（実施例２の方法に従って調製された）を、最終架橋剤濃度０．１％に未処理のニートグルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって架橋した。架橋を１時間進行させたままにした。このＳＰＰまたは結晶ＳＰＰを低速遠心分離によって取り出し、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。
【０２７５】
（実施例４３  可逆性架橋剤−ジスルフィド架橋化ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰ）
ＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰを、以下の架橋剤のうちの１つを使用して架橋し得る：
１）  ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデートＨＣｌ−（ＤＴＢＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ）
２）  ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）−（ＤＳＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ）。
【０２７６】
架橋を、１．５ｍｌ微量遠心チューブ（ＵＳＡ／Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で、５００ｍｌの緩衝液（１０ｍＭ  酢酸カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５））中に２５０ｍｌのＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰの溶液（２１ｍｇ）を入れることによって実行する。１つの架橋剤を、各チューブに以下のように添加した：Ａ）ＤＴＢＰ（６０ｍＭ）（２７．９ｍｇのＤＴＢＰを６０ｍｌの水中に溶解し、そして２０ｍｌのこの溶液を添加する）；およびＢ）ＤＳＰ（１４．８４ｍＭ）（３６ｍｇのＤＳＰを１２０ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解し、そして１０ｍｌのこの溶液を添加する）。
【０２７７】
このチューブを、周囲温度（２４℃〜２６℃）で、全てのサンプルが３２ｍＭ  ＮａＯＨ中で不溶性であること（２日間）（１５０ｍｌのＮａＯＨ中で５０ｍｌのサンプルを使用する）が決定されるまで回転させる。架橋されてないサンプルは、同濃度で３２ｍＭ  ＮａＯＨ中に容易に溶解する。架橋を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離すること、ならびに上清を廃棄し、そして１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）の添加によって停止させ、そして洗浄手順を３回繰り返す。
【０２７８】
（実施例４４  ジスルフィド結合を含む、架橋されたＳＰＰまたはＳＰＰ結晶の溶解）
２００ｍＭ  システイン溶液を、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中に２４２ｍｇのシステインを溶解することによって調製する。架橋されたＳＰＰ、球状ナノクリスタルコンポジット粒子、または結晶ＳＰＰの２００ｍｌのサンプルを取り、そして３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を廃棄する。このペレットを、Ｔｒｉｓ緩衝液を含む２００ｍＭ  システイン中に溶解する。別の２００ｍｌの架橋されたサンプルを取り、そして３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を廃棄する。次いで、このペレットをシステインを含まない２００ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液中に懸濁する。全てのサンプルを３７℃で１時間インキュンベートし、そして３２ｍＭ  ＮａＯＨ中の溶解についてモニタリングする（直接の視覚的観察および顕微鏡観察）。
【０２７９】
３７℃で１時間インキュベーション後、このＤＴＢＰサンプルは、システイン存在下では完全に可溶性であり、そしてシステイン非存在下では不溶性である。このＤＳＰサンプルは、システイン存在下でほとんど溶解性がなく、そしてシステイン非存在下では不溶性である。
【０２８０】
（実施例４５）
（架橋化ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの３７℃でのｐＨ溶解度の特徴づけ）
ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミダート．ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、ジメチルスベルイミダート．２ＨＣｌ（ＤＭＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスルホスクシンイミジルタータレート（スルホ−ＤＳＴ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、エチレングリコビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（スルホ−ＥＧＳ）、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）、スルホスクシンイミジル−６−［ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）、ビス−［４−ｂ−（アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）またはグルタルアルデヒド（ＧＡ）で架橋された種々のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの溶解度を、この方法を使用して研究し得る。
【０２８１】
１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で、非架橋のＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰおよび架橋されたＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰ調製物（２．８ｍｇタンパク質に相当）を、３０００ｒｐｍで５分間微量遠心し、そしてその上清の液体を除去する。２つのｐＨを試験する：ａ）ｐＨ７．４およびｂ）ｐＨ２．０。
【０２８２】
ｐＨ７．４について、２００ｍｌアリコートのＰＢＳ緩衝液（０．０１Ｍ  リン酸、０．００２７Ｍ塩化カリウム、０．１３７Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を、各サンプルに添加し、タンパク質の濃度を１４ｍｇ／ｍｌにする。これらのサンプルを、３７℃で２４時間インキュベートする。
【０２８３】
ｐＨ２．０について、２００ｍｌアリコートのグリシンＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．０）を、各サンプルに添加し、タンパク質の濃度を１４ｍｇ／ｍｌにする。これらのサンプルを、３７℃で５時間インキュベートする。最初に、これらのサンプルを、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび２０％ＭＰＤを含む１０ｍＭグリシンＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．０）で、タンブルリングしながら２５℃で一晩処理し、次いでグリシンＨＣｌ緩衝液のみで続行する。
【０２８４】
２４時間／５時間後、サンプルを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによる解離について、サンプルを研究し、そしてこの上清を、０．２２ｍｍフィルターに通す。２ｍｌのアリコートを取り、それを７９８ｍｌの脱イオン水中に入れることによって、このタンパク質を推算する。２００ｍｌアリコートのＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ試薬を、このサンプルに添加し、次いで、このサンプルを周囲温度で５分間インキュベートし、そして５９５ｎｍ波長で測定する（Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法によるＢｉｏ−Ｒａｄマイクロプロテインアッセイ）。標準として、Ｐｉｅｒｃｅからのウシ血清アルブミンを、約０〜２０ｍｇタンパク質の範囲内で使用する。
【０２８５】
（実施例４６）
（ＦＴＩＲによる三次構造の特徴づけ）
以下の方法は、アッセイされるタンパク質の三次構造を測定するために有用である。この方法において、溶解しているＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰに由来のタンパク質の三次構造を、それらのネイティブの可溶性対応物と比較し得る。この方法において、ネイティブの生物学的活性タンパク質に対する、例えば、１）ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰを形成すること、２）短期保存または長期保存、および３）ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰの組成物または処方物を作製すること、の効果を決定し得る。
【０２８６】
Ｄｏｎｇらに記載されるように、フーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）スペクトルを、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ｍｏｄｅｌ  ５５０  Ｍａｇｎａシリーズ分光光度計で収集する［Ｄｏｎｇ，Ａ．，Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｂ．，Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｗ．Ｓ．，Ｂｈａｔ，Ｋ．Ｓ．およびＣｏｅ，Ｊ．Ｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２；３１：９３６４−９３７０；Ｄｏｎｇ，Ａ．Ｐｒｅｓｔｒｅｌｓｋｉ，Ｓ．Ｊ．，Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．およびＣａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９５；８４：４１５−４２４］。
【０２８７】
固体サンプルについて、１〜２ｍｇのタンパク質を、３５０ｍｇのＫＢｒ粉末と共に軽く粉砕し、拡散反射率付属物のために使用される小さいカップに詰める。
【０２８８】
あるいは、溶液分析について、拡散反射法のかわりに、減衰全反射法（ＡＴＲ）を使用する。
【０２８９】
このスペクトルを収集し、次いでＧｒａｍｓ３２（Ｇａｌａｃｔｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅから）を使用して処理し、二次構造の個々の成分の相対領域の決定には、アミドＩ領域（１６００〜１７００ｃｍ−１）のもとで、二階微分および曲線当てはめ（ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔｔｉｎｇ）プログラムを使用する。
【０２９０】
Ｎｉｃｏｌｅｔからのタンパク質分析ソフトウェアを使用して、相関係数が算出される。このソフトウェアは、予め保存された参照スペクトルと現在のタンパク質スペクトルとの間の相関係数の決定を容易に可能にする（Ｇａｒｌａｎｄ，Ｂ，ＦＴ−ＩＲ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｄｒｉｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｎｉｃｏｌｅｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｔｅ  ＃  ＡＮ  ９４７９）。ネイティブの水溶性タンパク質の二階微分スペクトルを参照スペクトルとして使用し、そして乾燥したＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶性ＳＰＰおよび凍結乾燥した固体タンパク質を、サンプルとして使用し得る。相関係数が１に近づくにつれて、タンパク質はますます類似した三次立体配座構造を有する。変性は、０．８より小さい相関係数によって示される。これは、１）ネイティブタンパク質のβ−シート含量が、増加しているか、または減少しているかのいずれかであるか、あるいは２）ネイティブタンパク質のα−ヘリックス含量が減少しているのみであることを示す（すなわち、タンパク質のβ−シート含量は、変性の際に増加または減少し得るが、一方、タンパク質のα−ヘリックス含量は、変性の際には常に減少する）。従って、０．８より小さい相関係数は、このタンパク質のネイティブの生物学的活性形態に対して、アッセイされるタンパク質が変性していることに起因する三次構造の変化を示す。
【０２９１】
（実施例４７）
（円二色性分光法による二次構造の特徴づけ）
円二色性（ＣＤ）は、分子の光学特徴であり、これは、分子構造の不斉特性を反映する。ＣＤ分光法は、ＣＤを測定するための方法であり、そして分子の構造的特性の迅速な決定に有用である。ＣＤスペクトルは、タンパク質の二次構造（アッセイされるタンパク質のβ−シート含量、α−ヘリックス含量、β−ターン含量およびランダムコイル含量を含む）の特徴づけを可能にする。ＣＤスペクトルは、核酸の構造の型の特徴づけ（とりわけ、核酸分子がＡ型（Ａ−ＤＮＡまたはＡ−ＲＮＡ）、Ｂ型（Ｂ−ＤＮＡ）あるいはＺ型（Ｚ−ＤＮＡ）のいずれであるか、を含む）をさらに可能にする。この方法において、溶解しているＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、結晶性ＳＰＰあるいは球状核酸粒子もしくは球状ナノクリスタル複合核酸粒子または結晶性球状核酸粒子に由来するタンパク質または核酸の二次構造を、それらの可溶性の対応物と比較し得る。この方法において、ネイティブの生物学的活性タンパク質に対する、例えば、１）ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶性ＳＰＰあるいは球状核酸粒子もしくは球状ナノクリスタル複合核酸粒子または結晶性球状核酸粒子を形成すること、２）短期保存または長期保存、および３）ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子、または結晶性ＳＰＰあるいは球状核酸粒子または球状ナノクリスタル複合核酸粒子、結晶性球状核酸粒子の組成物または処方物を作製すること、の効果を決定し得る。
【０２９２】
円二色性（ＣＤ）は、光学活性な物質が、左側円偏光または右側円偏光のどちらを優先的に吸収するかを示す。ＣＤは、タンパク質およびペプチドの二次構造の特徴（αヘリックス、βシート、ターンおよびコイルを含む）を規定し得る。ＣＤ分光法は、以下のものをモニタリングするために使用されている：１）二次構造、２）立体配置変化、３）環境の影響、４）タンパク質の折りたたみおよび変性、ならびに５）動力学。
【０２９３】
（方法：）
Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰを、各々、実施例１〜３の方法に従って作製した。Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰを、実施例１９の方法に従って溶解した。溶解したＳＰＰから得た抗体の二次構造を、Ｊａｓｃｏ−８１０旋光分散計を用いて決定し、そして対応する市販の可溶性タンパク質と比較した。このタンパク質ＳＰＰサンプルを、脱イオン水で溶解および希釈し、終濃度を０．１７〜０．３３ｍｇ／ｍｌとした。標準的な０．１ｃｍパス長キュベット（２００μｌサンプルサイズ）を用いて、２６０〜１９５ｎｍ（ナノメートルでの波長）のスペクトルを得た。３セット全てのサンプル（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ＳＰＰの溶解ＳＰＰと可溶性タンパク質の両方）について、スペクトルは、溶解ＳＰＰのスペクトルと可溶性タンパク質サンプルのスペクトルとの間の有意な差異を示さなかった。
【０２９４】
結果：図１１、図１２および図１３を参照のこと。
【０２９５】
（実施例４８）
（ＥＬＩＳＡによるコンフォメーション特徴付け）
ＥＬＩＳＡは、モノクローナル抗体がタンパク質の特定のエピトープを認識しそして結合する能力を測定する。モノクローナル抗体は、主に、エピトープの全体的なコンフォメーションおよびエピトープを構成するアミノ酸の部分的なコンフォメーションに結合する。ネイティブタンパク質が変性した場合、またはそのコンフォメーションがある程度変化した場合、モノクローナル抗体は、もはやエピトープを認識できず、結合できない。従って、ネイティブの、可溶性の、ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰのタンパク質成分の対照物に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いることによって、ＥＬＩＳＡは、溶解ＳＰＰ、球状ナノクリスタル複合粒子または結晶ＳＰＰ由来のタンパク質の抗原構造と、そのネイティブの可溶性対照物抗原構造とを比較するのに役立つ。
【０２９６】
（方法）
（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＥＬＩＳＡのためのプロトコル）
Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）を、５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）（５０ｍＭカーボネート緩衝液（ｐＨ９．６）中の１０μｇ／ｍｌの濃度）でコーティングした。このプレートを、４℃で一晩コーティングした。
【０２９７】
次の日、この抗ヒト抗体を、プレートから吸引して除き、その後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（ＴＢＳＴ）でトリス緩衝化生理食塩水で３回洗浄した。
【０２９８】
次いで、これらのプレートを、プレートの各ウェルに２００μｌのブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ中の再構築された３％  脱脂乾燥乳）を添加してブロックした。これらのプレートを、室温（２１〜２５℃）で２時間、暗所にてインキュベートした。
【０２９９】
プレートをブロッキングしている間、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂサンプル（溶解Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰ（実施例３の方法に従って作成し、実施例１９の方法に従って溶解した）か、またはネイティブの可溶性Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂのいずれかから得られるＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰ）を最終濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）まで希釈緩衝液（ブロッキング緩衝液  ＋  １％  正常マウス血清）中に希釈し、毎回１：１の希釈を続けて６回行った。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂサンプルの最終濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／ｍｌ、０．６２５ｎｇ／ｍｌ、０．３１２５ｎｇ／ｍｌおよび０．１５６２５ｎｇ／ｍｌであった。
【０３００】
これらのプレートを２時間ブロックした後、２００μｌ／ウェルのＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、適切に希釈したサンプル（１００μｌ）を、プレートの適切なウェルに添加した。ブロッキング緩衝液のみを含む（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂなし）ウェルを、コントロールとして用いた。次いで、このプレートを、室温（２１〜２５℃）で１時間、暗所にてインキュベートした。
【０３０１】
インキュベーション期間の後、このプレートを２００μｌ／ウェルのＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合Ｆｃ特異的抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、プレートの各ウェルに添加した。次いでこれらのプレートを、室温（２１〜２５℃）で１時間、暗室にてインキュベートした。
【０３０２】
インキュベーション期間の後、これらのプレートを２００μｌ／ウェルのＴＢＳＴで３回洗浄した。次いで、１００μｌの基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下）を各ウェルに添加した。次いでこれらのプレートを、室温（２１〜２５℃）で３０分間、暗室にてインキュベートし、発色させた。次いでこの呈色反応を、１００μｌの１Ｎ（規定）硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を各ウェルに添加して停止した。各ウェル中の溶液の最適濃度（ＯＤ）を、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を備えた分子デバイス「ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ｐｌｕｓ」自動プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）の波長で測定した。各ウェルについて測定したＯＤ４５０は、ウェルをコーティングしている抗ヒト抗体に結合するＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂの量に正比例した。
【０３０３】
（結果）
溶解Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰから得たＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂは、そのネイティブの可溶性対照物と同じコンフォメーションを有し、ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂＳＰＰを形成するプロセスは、ネイティブＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ抗体のコンフォメーションを変化させないことを立証した。図１４を参照のこと。
【０３０４】
（実施例４９）
（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ動物モデル）
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂは、乳癌の処置に用いられ得る［Ｐｉｅｔｒａｓ  Ｒ．Ｊ．，Ｐｏｅｎ  Ｊ．Ｃ．，Ｇａｌｌａｒｄｏ，Ｄ．，Ｗｏｎｇｖｉｐａｔ  Ｐ．Ｎ．，Ｌｅｅ  Ｈ．Ｊ．およびＳｌａｍｏｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．５９，１３４７〜５５頁（１９９９）；Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．，Ｎｏｒｔｏｎ  Ｌ．，Ａｌｂａｎｅｌｌ  Ｊ．，Ｋｉｍ  Ｙ．Ｍ．，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｃｈ，ｖｏｌ．５８，２８２５〜３１頁（１９９８）］。
【０３０５】
（手順）
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰを、実施例３の方法に従って作成した。
【０３０６】
（ヌード・マウスにおける腫瘍形成の手順）
ヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ３細胞またはヒト乳癌ＢＴ−４７４細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ））を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  グルタミン、および１％  ペニシリン  Ｇ／ストレプトマイシン／菌食性溶液を加えたＢＲＭＩ１６４０培地中で培養した。数細胞世代後、ヒト乳癌細胞を、３月齢メス胸腺欠損マウスの後肢大腿に皮下接種（ｓ．ｃ．）（５×１０７細胞／動物）した。
【０３０７】
接種の前に、マウスを、１０〜１４日間、生分解性キャリア結合体中の１７β−エストラジオール（ペレット当り１．７ｍｇのエストラジオール）を皮下に与えてプライミングし、エストロゲン依存性乳癌細胞の成長を促進した。腫瘍瘤塊を、その大きさ（ｍｍ）で測定することにより、モニターした。各処置群には、５〜６動物が含まれる。これらの動物を、各処置の開始時点での体重および腫瘍瘤塊サイズに関して、ランダムに選択した。１つのセットのサイズにおいて、腫瘍が２０〜３０ｍｍ３より大きく成長したとき、または第２のセットのサイズが３５０ｍｍ３より大きく成長したときに、抗体処置を開始した。組換ヒト（ｒｈｕ）Ｍａｂ  ＨＥＲ−２抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）ＳＰＰ（懸濁状態）または「非ＳＰＰ」結晶（これもまた懸濁状態）を、動物の体重１ｋｇあたり１０ｍｇの用量で、１日に３回の投薬形態で、４日間隔で（１２日にわたって）皮下投与した。コントロールの注射は、ヒトＩｇＧ１（３０ｍｇ／ｋｇ）の注射であり、これもまた、同じ投与プロトコルを用いて皮下投与した。次いでマウスを、病理学実験のために屠殺した。
【０３０８】
（結果）
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（非ＳＰＰ）結晶の両方とも、生理食塩水（細胞送達ビヒクルとして用いられた）または非特異的ＩｇＧからなるコントロールと比較した場合、マウスへのＢＴ４７４細胞の注射によって形成された腫瘍の大部分または全てを除去し、ヒト乳癌についてのマウス動物モデルにおいてＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰが有効であることを明らかに示した。ヒト乳癌に対するＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰの使用の有効性を、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ結晶の使用の有効性と比較したときの結果を示した、図６を参照のこと。
【０３０９】
上記の動物実験は、本発明による他の抗体ＳＰＰ、抗体球状ナノクリスタル複合粒子および結晶抗体ＳＰＰ（とくに、ＩｎｆｌｉｘｉｍａｂおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂが挙げられる）に対して適応する。
【０３１０】
（実施例５０）
（ネイティブ（可溶性）および溶解したＲｉｔｕｘｉｍａｂおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂのオリゴ糖プロファイル）
オリゴ糖プロファイルを実施し、ネイティブの、可溶性Ｒｉｔｕｘｉｍａｂおよび可溶性Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂと、（溶解したＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰから得られたＲｉｔｕｘｉｍａｂ（実施例２の方法に従って作製した）および溶解したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰから得られたＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（実施例３の方法に従って作製した）との炭水化物組成を比較した。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰを、実施例１９の方法に従って溶解した。
【０３１１】
（手順）
オリゴ糖プロファイルを、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのキャピラリー電気泳動により実施し、続いてＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅ−ＣＡＰキットを用いて、炭水化物の標識および分析を行った。
【０３１２】
Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ（それぞれ、実施例２および実施例３由来）を、洗浄し、溶解し、そしてｄｄＨ２Ｏで透析し、（製造業者によって供給される）可溶性ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂサンプルおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂサンプルを、ｄｄＨ２Ｏで透析した。各サンプルの２００μｇのアリコートを、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再構成した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、（２−メルカプトエタノール）（β−ＭＥ）、およびＮＰ−４０（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）を添加し、Ｎ−結合オリゴ糖切断を改善した。引き続き、ＰＮＧａｓｅ（アスパラギン結合オリゴ糖を切断する酵素）を、各サンプルに添加し、そしてそれらのサンプルを、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、タンパク質を、３倍量の冷却エタノールで沈殿させ、サンプルをスピンし、そして上清（オリゴ糖を含む）を回収しそして凍結乾燥した。オリゴ糖サンプルを、再構成し、そしてＮａＢＨ３ＣＮ（ＡＰＴＳ処理後の再構成による標識試薬と炭水化物との間のイミン結合を減少させる還元剤である、シアノボロヒドリドナトリウム）存在下で、３７℃で一晩、１−アミノピレン−３，６，  ８−トリスホネート（ＡＰＴＳ）を用いて蛍光標識した。これらのサンプルを、一晩インキュベートし、水中に希釈し、そしてレーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）検出器を用いたＰ／ＡＣＥ  ＭＤＱキャピラリー電気泳動装置で読み取った。キャピラリーは、ｅ−ＣＡＰ炭化水素分析キットを備えたＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒにより提供される、Ｎ−ＣＨＯコーティングキャピラリーを用いた。
【０３１３】
（結果）
これらの結果は、溶解抗体ＳＰＰから得た抗体は、それらのネイティブの、可溶性対照物と同じ炭化水素含有量を有することを示し、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰの形成プロセスは、ネイティブのＲｉｔｕｘｉｍａｂ抗体およびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ抗体の炭水化物含有量を変化させないことを実証した。図１５を参照のこと。
【０３１４】
（実施例５１）
（透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察したＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ）
透過電子顕微鏡法：
実施例２の方法に従って作製したＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰサンプルを、エポキシ樹脂に包埋し、固めた。このＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰ試料をミクロトーム切断し、そして炭素電子顕微鏡グリッド上に置いた。高倍率ＴＥＭ画像を、６０ｋＶでのＰｈｉｌｌｉｐｓ  ＣＭ１０透過電子顕微鏡操作を用いて得た。
（結果）
電子顕微鏡は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰの層状殻構造を示した。この電子顕微鏡写真はまた、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰの結晶領域における４ｎｍ格子空間を示した。
【０３１５】
（実施例５２）
（走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察したＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰ）
走査電子顕微鏡法：
それぞれ実施例２および実施例３の方法に従って作製した、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰまたはＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰのサンプルを、新たに準備した炭素コーティングした金支持グリッド上に置いた。過剰量の緩衝液を、濾紙を用いて除いた。固形物を、減圧下にて、パラジウム／金でコーティングした。コーティングした試料を、ＥＴＥＣ自動走査電子顕微鏡を用いて分析した。
【０３１６】
（実施例５３）
（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰおよびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰの電子回析）
電子回析法：
電子回析像を、長さ６４０ｍｍのカメラで、６０Ｋｖで、４にセットしたスポットサイズにて録画した。
【０３１７】
（結果）
電子ビームを、実施例２および３の方法に従って作製したＲｉｔｕｘｉｍａｂ  ＳＰＰまたはＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ＳＰＰに焦点を合わせたときに得られた回析パターンは、それぞれ、分析したＳＰＰの領域における結晶の存在を示す。対照的に、電子ビームを、ＴＥＭサンプルグリッド上のホルムバール支持ポリマーからなる非結晶個体に焦点を合わせたとき、非結晶物質を示す回析パターンは得られなかった。
【０３１８】
発明者らが、本発明の多数の実施形態を記載してきた一方で、本発明の生成物およびプロセスを利用する他の実施形態を提供するために、基本的な実験を変化させ得ることが明らかである。したがって、本発明の範囲は、実施例により表される特定の実施形態ではなく、添付した特許請求の範囲によって規定されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０３１９】
【図１】図１は、記載されるようにして調製された、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）ＳＰＰの形態を示す。Ａ：インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）ＳＰＰ（実施例１を参照のこと）；Ｂ：リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）ＳＰＰ（実施例２を参照のこと）；Ｃ：トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）ＳＰＰ（実施例３を参照のこと）。
【図２】図２は、母液に懸濁したトラスツズマブ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）抗体ＳＰＰのフーリエ変換赤外線スペクトル（ＦＴＩＲ）と、ネイティブの可溶性トラスツズマブ対応物のＦＴＩＲとの間の比較を示す。ＳＰＰのトラスツズマブ成分は、そのネイティブの可溶性対応物とほぼ同じ二次構造を有し、このことは、トラスツズマブＳＰＰの形成プロセスが、インタクトな抗体の完全性を損なうことも、その元の構造を変化させることもなかったことを示す。実施例１４を参照のこと。
【図３】図３は、母液に懸濁したインフリキシマブ（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）抗体ＳＰＰのフーリエ変換赤外線スペクトル（ＦＴＩＲ）と、ネイティブの可溶性インフリキシマブ対応物のＦＴＩＲとの間の比較を示す。このＳＰＰのインフリキシマブ成分は、そのネイティブの可溶性対応物とほぼ同じ二次構造を有し、このことは、インフリキシマブＳＰＰの形成プロセスが、インタクトな抗体の完全性を損なうことも、その元の構造を変化させることもなかったことを示す。実施例１４を参照のこと。
【図４】図４は、母液に懸濁したリツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）抗体ＳＰＰのフーリエ変換赤外線スペクトル（ＦＴＩＲ）と、ネイティブの可溶性リツキシマブ対応物のＦＴＩＲとの間の比較を示す。このＳＰＰのリツキシマブ成分は、そのネイティブの可溶性対応物とほぼ同じ二次構造を有し、このことは、リツキシマブＳＰＰの形成プロセスが、インタクトな抗体の完全性を損なうことも、その元の構造を変化させることもなかったことを示す。実施例１４を参照のこと。
【図５】図５は、４°センチグレードにおける、ネイティブの可溶性リツキシマブの安定性と比較した、溶解したリツキシマブＳＰＰから得られたリツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）の安定性の分析の結果を示す。実施例２０を参照のこと。
【図６】図６は、ヒト乳癌のマウスモデルを処置するためにトラスツズマブＳＰＰを使用することの有効性と、トラスツズマブ結晶を使用することの有効性とを比較するプロットである。ネイティブの可溶性非特異的ＩｇＧを、コントロールとして使用した。実施例４９を参照のこと。
【図７】図７は、溶解したＳＰＰから得られたリツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）およびトラスツズマブ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）の安定性と、それらのネイティブの可溶性リツキシマブおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ対応物とを比較する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。実施例２０を参照のこと。
【図８】図８は、ＳＰＰの調製による乳汁タンパク質からの、インフリキシマブ（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）、リツキシマブ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ）およびトラスツズマブ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）の選択的分画化／精製を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。実施例１１を参照のこと。
【図９】図９は、実施例１９に従って、溶解リツキシマブＳＰＰ（実施例２の方法に従って作製）から得られたリツキシマブが、ＲＡＪＩリンパ腫細胞の直接的細胞傷害性を引き起こしたことを示すプロットであり、これは同じ条件下でアッセイされたそのネイティブの可溶性リツキシマブ対応物の直接的細胞傷害性に匹敵した。実施例１６を参照のこと。
【図１０】図１０は、実施例１９に従って、溶解リツキシマブＳＰＰ（実施例２の方法に従って作製）から得られたリツキシマブが、ＲＡＪＩリンパ腫細胞の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を引き起こしたことを示すプロットであり、これは同じ条件下でアッセイされたそのネイティブの可溶性リツキシマブ対応物のＣＤＣに匹敵した。実施例１７を参照のこと。
【図１１】図１１は、トラスツズマブのＣＤスペクトルである。実施例４７を参照のこと。
【図１２】図１２は、リツキシマブのＣＤスペクトルである。実施例４７を参照のこと。
【図１３】図１３は、インフリキシマブのＣＤスペクトルである。実施例４７を参照のこと。
【図１４】図１４は、溶解ＳＰＰから得られたトラスツズマブが抗ヒト抗体に結合する能力と、その可溶性対応物（ネイティブの可溶性トラスツズマブ）のその能力とを比較する、ＥＬＩＳＡの結果を示すプロットである。この結果は、トラスツズマブＳＰＰの形成プロセスが、ネイティブのトラスツズマブ抗体のコンフォメーションを変更しなかったことを実証する。実施例４８を参照のこと。
【図１５】図１５は、溶解ＳＰＰから得られた、リツキシマブ（上側のプロフィール）およびトラスツズマブ（下側のプロフィール）の糖成分と、そのネイティブの可溶性対応物とを比較する糖プロフィールである。この結果は、溶解抗体ＳＰＰから得られた抗体が、そのネイティブの可溶性対応物と同じ糖含量を有することを示し、このことは、リツキシマブＳＰＰおよびトラスツズマブＳＰＰの形成プロセスが、ネイティブのリツキシマブ抗体およびトラスツズマブ抗体の糖含量を変更しなかったことを実証する。実施例５０を参照のこと。
【図１６】図１６は、実施例２５に従って、溶液中に再懸濁したリツキシマブＳＰＰおよびトラスツズマブＳＰＰの安定性と、そのネイティブの可溶性対応物の安定性とを比較する、プロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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