(57)【要約】本発明は金属イオン結合活性を示すタンパク質を提供する。このタンパク質はマガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）から容易に抽出することが可能で、バイオレメディエーション用組成物、食品、栄養補助食品などに配合することができる。これは約２０ｋＤａの分子量を有し、以下の（ａ）ＴＡＲＮＥＡＮＶＮＩＹＬＨＬＳＤＤＥＤＳＮＹＥＮＳ（Ｎ末端）（配列番号１）（ｂ）ＥＰＮＡＦＭＰＧＮＬＨＨＲＶ（配列番号２）（ｃ）ＥＨＧＸＤＴＩＧＥＬ（配列番号３）の１つまたは複数を含むアミノ酸配列を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約３１ｋＤａの分子量を有し、以下の配列：
（ａ）ＴＡＸＮＥＡＮＶＮＩＹＬＨＬＳＤＤＥＤＳＮＹＥＮＳ（Ｎ末端）（配列番号１）、
（ｂ）ＥＰＮＡＦＭＰＧＮＬＨＨＲＶ（配列番号２）、
（ｃ）ＥＨＧＸＤＴＩＧＥＬ（配列番号３）、
の１つまたは複数を含むアミノ酸配列を有する、単離されたタンパク質またはその活性な断片。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質またはその活性な断片。
【請求項３】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）の血リンパから得ることができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で３１ｋＤａの見掛け分子量を有する、単離されたタンパク質またはその活性な断片。
【請求項４】
マイクロシークエンシングによる測定で約２０ｋＤａの見掛け分子量を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質または断片。
【請求項５】
金属イオン結合剤としての活性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質または断片。
【請求項６】
２価の結合剤としての活性を有する、請求項５に記載のタンパク質または断片。
【請求項７】
請求項５または６に記載のタンパク質または断片の機能的に等価な変種であるタンパク質。
【請求項８】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）以外のシェルフィッシュから得ることができ、請求項４または５に記載のタンパク質または断片の機能的に等価な変種であるタンパク質。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質または断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号５のヌクレオチド配列である、請求項９に記載のポリヌクレオチドまたはその変種。
【請求項１１】
配列番号６のヌクレオチド配列であるポリヌクレオチドまたはその変種。
【請求項１２】
配列番号７のヌクレオチド配列であるポリヌクレオチドまたはその変種。
【請求項１３】
請求項９から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項９から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを発現する宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質または断片を含む組成物。
【請求項１６】
医薬である請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
食品である請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
栄養補助食品である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質または断片が、栄養上重要な少なくとも１つの金属イオンと会合するか結合している、請求項１８に記載の栄養補助食品。
【請求項２０】
前記金属イオンが２価の金属陽イオンである、請求項１９に記載の栄養補助食品。
【請求項２１】
前記２価の金属陽イオンがカルシウム、マグネシウム、セレンまたは亜鉛である、請求項２０に記載の栄養補助食品。
【請求項２２】
バイオレメディエーション剤である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）血リンパまたは抽出物を含む物質を遠心分離し、沈殿したタンパク質を回収するステップを含む、請求項３に記載のタンパク質の取得方法。
【請求項２４】
前記遠心分離ステップが超遠心分離である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記超遠心分離が約２５０，０００ｇで約４０分実行するものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）から血リンパを抽出する予備ステップを含む、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
シェルフィッシュから得ることができる銅／亜鉛ジスムターゼ誘導自己凝集性タンパク質、または機能的に等価な変種またはその断片である金属分に富んだタンパク質。
【請求項２８】
ヒスチジンに富んだ請求項２７に記載の金属分に富んだタンパク質。
【請求項２９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質である、請求項２７または２８に記載の金属分に富んだタンパク質。
【請求項３０】
金属分に富んだタンパク質または断片である、請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質または断片。
【請求項３１】
請求項２７から３０のいずれか一項に記載の金属分に富んだタンパク質または断片を含むシェルフィッシュ抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質およびそれを含む組成物に関する。より詳細には、金属陽イオン結合特性を備えたタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
シェルフィッシュ（ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ：貝類などの殻を有する水生動物）などの水生生物は海洋環境中の広範囲の汚染物質に対処する必要がある。汚染による問題のうち主たるものの１つは、特に産業活動が行われている地域での金属汚染である。たとえば、ムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ）は、その環境からカドミウムを取り込み、次いで、このカドミウムは循環系によって腎臓に輸送されそこに蓄積されることが示されている（ネアおよびロビンソン（Ｎａｉｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）、２００１）。ムラサキイガイの体内には、カドミウムと結合能力を有する多数のタンパク質サブユニットが存在する（ロビンソン他（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ）、１９９７）。これらのうちの１つは、ヒスチジンに富むタンパク質で、各サブユニットが金属イオンとの結合能力を有する。このようなタンパク質は、シェルフィッシュから分離精製されれば、多数のバイオレメディエーション（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）用途に有用である。
【０００３】
しかし、ムラサキイガイ（ｍｕｓｓｅｌ）からこれらのタンパク質を得るのは困難である。純粋または比較的純粋なタンパク質調製品を得るためには、シェルフィッシュ全体からの抽出に、原料ホモジェネートから始めて相当量の精製が必要になる。あるいは、比較的純粋な調製品をムラサキイガイの血リンパ（ｈａｅｍｏｌｙｍｐｈ）から直接得ることもできるが、これはたとえば、内転筋からの液体抽出を必要とする手間の掛かる方法である（ＷＯ  ００／３９１６５）。これらの方法のいずれも精製タンパク質の大規模製造には適さない。
【０００４】
本出願人はパシフィック  オイスター（マガキ：Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）から、金属陽イオン結合特性を示す新規なタンパク質を識別し、同定した。このタンパク質は、カキから、十分な量をわずかな処理だけで比較的純粋な状態で容易に得ることができる。本発明は広くこのタンパク質（カボルチン（ｃａｖｏｒｔｉｎ））を対象とするものである。
（発明の開示）
したがって、第１の態様では、本発明はマガキ（クラッソストレア  ギガス：Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）から得ることができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で３１ｋＤａの見掛け分子量を有し、金属結合特性を有するタンパク質またはその活性な断片を提供する。
【０００５】
好都合なことに、このタンパク質はマガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）の血リンパから得ることができる。
【０００６】
好ましくは、タンパク質は自己凝集性タンパク質である。
【０００７】
別の態様では、本発明は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で３１ｋＤａの見掛け分子量を有し、以下の配列：
（ａ）ＴＡＸＮＥＡＮＶＮＩＹＬＨＬＳＤＤＥＤＳＮＹＥＮＳ（Ｎ末端）（配列番号１）
（ｂ）ＥＰＮＡＦＭＰＧＮＬＨＨＲＶ（配列番号２）
（ｃ）ＥＨＧＸＤＴＩＧＥＬ（配列番号３）
の１つまたは複数を含むアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質またはその活性な断片を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、以下のアミノ酸配列：
ＴＡＸＮＥＡＮＶＮＩＹＬＨＬＳＤＤＥＤＳＮＹＥＮＳＭＨＹＡＱＣＥＭＥＰＮＡＦＭＰＧＮＬＨＨＲＶＨＧＳＩＥＭＨＱＲＧＤＧＰＬＥＭＳＦＣＬＳＧＦＮＶＳＥＤＦＡＤＨＮＨＧＬＱＩＨＥＹＧＤＭＥＨＧＣＤＴＩＧＥＬＹＨＮＥＨＡＰＮＨＤＮＰＧＤＬＧＤＬＨＤＤＤＨＧＮＶＤＡＴＲＴＦＤＷＬＴＩＧＨＴＤＧＩＬＧＲＳＬＡＩＬＱＧＤＨＴＳＨＴＡＶＩＡＣＣＶＩＧＲＳＨＡＨ（配列番号４）
を含む単離されたタンパク質、またはその活性な断片を提供する。
【０００９】
望ましくは、前記タンパク質または断片は、金属イオン結合剤、特に２価陽イオン結合剤としての活性を有する。
【００１０】
１つの実施形態では、前記タンパク質または断片は金属分に富む。
【００１１】
本発明は、上に定義されるようなタンパク質または断片の機能的に等価な変種（変異体）であるタンパク質をさらに提供する。
【００１２】
本発明はまた、マガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）以外のシェルフィッシュから得ることができ、上に定義されるようなタンパク質または断片の機能的に等価な変種（変異体）であるタンパク質を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、金属分に富んだ、シェルフィッシュから得ることができる銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）由来自己凝集性タンパク質またはその機能的に等価な変種（変異体）またはその断片を提供する。
【００１４】
本発明の金属分に富んだタンパク質またはその断片を含むシェルフィッシュ抽出物も提供される。
【００１５】
別の態様では、本発明は、上に定義されるようなタンパク質または断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列を含み得る：
【００１７】
【化１】
2005502316.tif 000002
（３’−ポリＡ末端）（配列番号５）またはその変種（変異体）。
【００１８】
さらに、本発明は、上に定義されるようなポリヌクレオチドを含むベクターまたは構成体を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、上に定義されるようなタンパク質または断片を含む組成物を提供する。
【００２０】
組成物は、医薬品、食品、栄養補助食品（随意に食餌用重要な少なくとも１種の２価陽イオンと会合するか結合したタンパク質を含んでもよい）またはバイオレメディエーション剤となし得る。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）の血リンパまたは抽出物を含む材料を遠心分離するステップおよび沈殿したタンパク質を回収するステップを含む上に定義されるタンパク質の取得方法を提供する。
【００２２】
本発明は上に定義される発明を広く含むが、本発明は以下に具体例を記載する実施形態をも含む。特に添付図面を参照することにより、本発明についてのよりよい理解が得られるであろう。
（発明についての記載）
上に広く概説したように、１つの態様では、本発明は新規なタンパク質を提供する。
【００２３】
本発明のタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により計算して３１ｋＤａの見掛け分子量を有する。タンパク質は、下記：
（ａ）ＴＡＸＮＥＡＮＶＮＩＹＬＨＬＳＤＤＥＤＳＮＹＥＮＳ（Ｎ−末端）（配列番号１）、
（ｂ）ＥＰＮＡＦＭＰＧＮＬＨＨＲＶ（配列番号２）、
（ｃ）ＥＨＧＸＤＴＩＧＥＬ（配列番号３）、
の１個または複数のアミノ酸配列またはその活性な断片を含む。
【００２４】
配列（ａ）において、「Ｘ」は、「Ｓ」または「Ｒ」残基のいずれかを表わし、同じものを含む、得られたタンパク質中の配列の変種（変異）を反映している。配列（ｃ）において、「Ｘ」は、マイクロシークエンシングから推測された「Ｃ」残基を表わす。
【００２５】
本発明の特定の１つのタンパク質は、当初、マガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）からの抽出物として同定された。したがってそれは、マガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）、特にその血リンパから抽出によって直接得ることができる。
【００２６】
このタンパク質は、配列番号４および／または図２に示されるおよび配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
このタンパク質のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡを配列決定して推測されるアミノ酸による分子量は、１９３５７  Ｄａである。この配列にはグリコシル化（ｇｌｙｓｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）サイトの可能性があると見られるものが１個（図２の印刷で枠で囲った配列ＮＶＳ）ある。これは、天然分子では、炭水和物残基（グリコシル基単位）からなるポリマーがおそらくアスパラギン（Ｎ）に結合するであろうことを意味する。この質量の追加で２ｋＤａ程度の追加的な分子量が加わるが、これにより、予測される分子量と実際の分子量との間に変動があることが幾分か説明される。
【００２８】
本発明のタンパク質（ここではカボルチンともいう）は、その天然のアミノ酸配列全体を含んでもよいが、あるいはその一部が生物学的活性を残す断片（活性断片）を構成するならば、そのような一部の配列だけを含むものでもよい。このような活性は、通常、金属イオン結合剤、特に２価陽イオン結合剤であるが、この活性に限定されるものではない。
【００２９】
本発明はまた、その範囲内に、配列番号４および配列番号７と機能的に等価なタンパク質の変種（変異体）を含む。これは、マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）以外のシェルフィッシュから得ることができ、配列番号４および配列番号７のタンパク質または断片と機能的に等価な変種（変異体）であるタンパク質またはその断片を含み得る。
【００３０】
「機能的に等価な変種（変異体）」という用語は、実質的に等価な機能性を保持しつつタンパク質のアミノ酸を変えることが可能であることを認めるものである。たとえば、タンパク質は、等価なペプチドが免疫学的に交差反応し得て、本来のタンパク質と同一の機能を少なくとも実質的に持っている場合、特定の機能について別のタンパク質の機能的等価物と考えられる。タンパク質アナログの生物学的活性（たとえば、金属イオン結合能力）は、本発明のタンパク質の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％である。
【００３１】
機能的に等価なタンパク質は本来のタンパク質と同一の大きさである必要はない。等価物はたとえばタンパク質の断片、別のタンパク質または担体とのタンパク質の融合体、または追加的なアミノ酸を備えた断片の融合体でもよい。活性断片は、完全長タンパク質の１個または複数のアミノ酸残基の除去によって得ることもできる。配列中のアミノ酸を慣用の技術を使用して等価なアミノ酸に置換してもよい。通常、等価と見られるアミノ酸のグループは次のとおりである。
【００３２】
（ａ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
（ｂ）Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
（ｃ）Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
（ｄ）Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ；および
（ｅ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
ポリペプチド配列は配列（ａｌｉｇｎ）されていてもよく、特定の領域における同一アミノ酸のパーセンテージは、一般に利用可能なコンピュータアルゴリズムを使用して、他の配列に対して決定することができる。ポリペプチド配列の類似性はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して検討することができる。ＢＬＡＳＴＰソフトウェアは、ＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサーバ（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／から入手可能である。ＢＬＡＳＴＰを含むＢＬＡＳＴファミリーアルゴリズムの使用については、ＮＣＢＩのウェブサイトでＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）に、また、アルツール，スティーヴンＦ．他（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース探索プログラムの新世代」（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２３なる刊行物に記載されている。相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）に関しては、ポリペプチドは好ましくは、配列番号４のタンパク質と少なくとも約７０％の相同性、より好ましくは少なくとも約８０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。
【００３３】
本発明のポリペプチドはまた、カボルチン（配列番号４）に対して少なくとも５５％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、好ましくは少なくとも約６０％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性を備えたアミノ酸配列を有する同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド、ならびに配列番号４のタンパク質に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を有するそのようなポリペプチドを含む。
【００３４】
本発明のタンパク質は、その活性な断片および他の変種（変異体）とともに、遺伝子組換え手段または合成手段によって生成することができる（すなわち、単一のまたは融合したポリペプチド）。約１００個未満のアミノ酸、一般に約５０個未満のアミノ酸を有する合成ポリペプチドは、当業者によく知られた技術によって生成することができる。このようなペプチドは、たとえば、成長しているアミノ酸鎖にアミノ酸を逐次加えて行くメリーフィールド（Ｍｅｒｒｙｆｉｅｌｄ）固相合成法などの商業的に利用可能な固相技術のいずれかを用いて合成することができる（Ｍｅｒｒｙｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  ８５：２１４６−２１４９（１９６３）参照）。ペプチドの自動合成装置は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）／アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）などの供給元から市販されており、メーカー指示書によって操作することができる。
【００３５】
本発明のタンパク質、またはその断片もしくは変種（変異体）は、タンパク質をコードするポリヌクレオチド（通常ＤＮＡ）配列を発現ベクターに挿入し適当なホスト中でタンパク質を発現させる遺伝子組換えによって生産することもできる。当業者に知られたさまざまな発現ベクターのうちのいずれも使用できる。発現は、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換されたかトランスフェクトされた、任意の適当な宿主細胞中で実現できる。適当な宿主細胞は、原核生物、酵母およびより高度な真核細胞を含む。好ましくは、使用する宿主細胞は、大腸菌、酵母、ＣＯＳもしくはＣＨＯなどの哺乳類の細胞系、またはＳＦ９などの昆虫細胞系であり、バキュロウイルス発現ベクターを使用する。この方法で発現されるＤＮＡ配列は天然に存在するタンパク質、天然に存在するタンパク質の断片またはその変種（変異体）をコードするものでよい。
【００３６】
タンパク質または断片をコードするＤＮＡ配列は、タンパク質の部分的なアミノ酸配列に由来する変性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＤＮＡ配列を求めて、マガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）の適当なｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより得ることができる。適当な変性オリゴヌクレオチドは標準的技術によって設計、合成することができ、スクーニングはたとえば、マニアティス他「分子クローニング―実験室マニュアル」、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー（ニューヨーク州）（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ（１９８９））に記載されるようにして行うことができる。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリから核酸プローブを単離するために、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を使用できる。次いで、単離されたプローブを使用してライブラリスクリーニングを行えばよい。
【００３７】
タンパク質の変種（変異体）は、オリゴヌクレオチド誘導（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）部位特異的突然変異生成などの標準的な突然変異生成技術を使用して調製してもよい。
【００３８】
本発明の特定のポリヌクレオチドは次のヌクレオチド配列を含む：
【００３９】
【化２】
2005502316.tif 000003
（配列番号６）
別のポリヌクレオチドは以下の配列：
【００４０】
【化３】
2005502316.tif 000004
（３’ポリＡ末端）（配列番号５）を含み、ここでＴＡＧは停止コドンでありＡＡＴＡＡＡはポリアデニル化シグナルである。ＡＡＡＡＡＡは３’ポリＡ尾部の始まりである。
【００４１】
上記のポリヌクレオチド配列の変種（変異体）または相同体も、本発明の一部となり得る。ポリヌクレオチド配列は配列（ａｌｉｇｎ）されていてもよく、特定の領域における同一ヌクレオチドのパーセンテージは、一般に利用可能なコンピュータアルゴリズムを使用して、他の配列に対して決定することができる。ポリヌクレオチド配列の類似性を整列化し識別するための典型的な２つのアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮとＦＡＳＴＡのアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴＮソフトウェアはＮＣＢＩ匿名ＦＴＰサーバ（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／から入手できる。ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．４［２月−２４−１９９８］（ドキュメンテーションに記載されたデフォルトパラメータにセットされアルゴリズムとともに配布されている）］が、本発明による変種（変異体）の決定で使用するのには好ましい。ＢＬＡＳＴＮを含むＢＬＡＳＴアルゴリズムファミリーの使用については、ＮＣＢＩのウェブサイトでＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）、およびアルツール，スティーヴンＦ．他（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース探索プログラムの新世代」（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）なる刊行物に記載されている。コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡは、バージョン２．０ｕ４（ドキュメンテーションに記載されたデフォルトパラメータにセットされてアルゴリズムとともに配布されている）］が、ｆｔｐサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ．ｐｕｂ／ｆａｓｔａ／でインターネット上、入手可能であり、本発明による変種（変異体）の決定で使用するのには好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用については、Ｗ．Ｒ．ピアソンおよびＤ．Ｊ．リップマン「生物学的配列分析のための改善されたツール」（Ｗ  Ｒ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８）およびＷ．Ｒ．ピアソン「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡによる迅速かつ高感度な配列比較」（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦＡＳＴＰ  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ」）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３：６３−９８（１９９０）に記載されている。
【００４２】
本発明はまた、本発明の上記ポリヌクレオチド配列（配列番号６および配列番号７）のいずれかに対して少なくとも約５５％の同一性、好ましくは少なくとも約６０％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性を備えたポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子またはポリヌクレオチド、ならびに少なくとも約９５％同一の核酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００４３】
上記のように識別された配列はすべて、本願では「変種（変異体）」としての資格を得る。
【００４４】
変種（変異体）ポリヌクレオチド配列は、一般に、上記ポリヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本願において「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ溶液であらかじめ洗浄；６５℃、６×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳで一夜ハイブリダイズ；その後、各々１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃で３０分の洗浄を２回、さらに０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃で３０分の洗浄を２回行うことを指す。このようなハイブリダイズ可能な配列は、マガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）以外の採取源（シェルフィッシュなどの）から得た等価なタンパク質をコードするものを含む。
【００４５】
本発明のタンパク質を生産するためには上記の合成または遺伝子組換法を採ることができるが、単離によってマガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）からタンパク質を得ることも実施可能である（また、現時点では好ましい）。これは、タンパク質がマガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）の血リンパの主たるタンパク質であり、しかもタンパク質が自己凝集性であるという出願人の発見を反映している。したがって、カキ自体から直接に商業的に有意な量を分離することができる。たとえば、血リンパミリリットルあたりおよそ１ｍｇのタンパク質を得ることができる。血リンパは、カキの殻を開き、当初の液体を捨て、その後の液をカキから適当な容器に排出させて集めるだけで得ることができる。この方法で、各カキから６ｍｌまでの血リンパを集めることができる。
【００４６】
いったん得られれば、本発明のタンパク質は必要に応じ容易に精製される。これは一般に遠心分離を含むであろうが、ここで、タンパク質が自己凝集性であるという点が重要である。もっとも、他の精製法（たとえば、クロマトグラフィー）を用いることもできる。
【００４７】
さらに、もし望ましければ、当技術分野において標準的な方法を用いて追加的な精製ステップを採ってもよい。これらの方法により、タンパク質の高純度調製品を提供することが完全に可能になる。好ましくは、タンパク質調製品は、少なくとも約５０重量％のタンパク質、好ましくは少なくとも約８０重量％、好ましくは少なくとも約９０重量％、より好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含む。
【００４８】
別の実施形態では、本発明で使用されるタンパク質はシェルフィッシュ抽出物の形で提供される。抽出物は、シェルフィッシュの全体を殻とともにまたは殻なしで、水性媒体中において液状にし、さらに必要に応じて乾燥および粉体化ステップを行うだけで生産できる。このような抽出物の調製に有用な方法はジョーンズ他（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９６年）に開示されている。
【００４９】
本出願人は予想外にも、カボルチン、その等価物、または関連する自己凝集性シェルフィッシュタンパク質および抽出物が、タンパク質の１分子あたり金属１分子より多い追加的な金属分子を「担持（ｌｏａｄ）」し得ることを見出した。より具体的には、出願人は、カボルチンはタンパク質の１分子あたり約１２個までの金属分子を結合できることを測定した。結合された金属のうちの金属分子４〜６個がカボルチンにしっかりと結合されている。
【００５０】
これに対し、自然状態でのカボルチンは、鉄をわずかに結合する程度で大体４〜６分子のタンパク質に対し１分子の鉄が結合するのみである。
【００５１】
したがって、本願において「金属分に富む」という用語は、タンパク質１分子あたり金属１分子以上を担持する本発明抽出物または関連タンパク質を指す。
【００５２】
好ましい自己凝集性シェルフィッシュタンパク質はヒスチジンに富む。
【００５３】
金属分濃縮には、精製したタンパク質を必要としないことは注目されるべきである。
【００５４】
本願では、タンパク質または抽出物の金属分濃縮は、対象とする金属をタンパク質または抽出物を含む溶液に加えるだけで達成できる。金属は、塩のかたちで、または当業者に知られている他の適当なかたちで添加するのが便利でよい。添加された金属イオンは、タンパク質分子に結合し、シェルフィッシュに見られる天然レベルを超えてタンパク質の金属含有量を増加させる。
【００５５】
タンパク質及び抽出物への添加に適した金属には、鉛、砒素、水銀、マグネシウム、カドミウム、亜鉛、カルシウム、セレン、及び鉄が含まれる。一般的に、２価の陽イオンのような金属イオンの形で金属が添加される。鉄以外の金属が添加される場合、所望の１種の金属または２種以上の金属の添加の前に、すでに存在する金属を除くストリッピングままたは部分的ストリッピング処理（例えば、ｐＨ変化）を行うことができる。
【００５６】
タンパク質、その活性な断片またはその組合せは、いったん得られれば、組成物に処方することができる。組成物は、たとえば農業用組成物、医薬として用いられる治療用組成物あるいは栄養補給（ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）食品となり得るし、あるいは健康増進または食餌用の栄養補助食品ともなり得る。これらの目的のためには、一般に、タンパク質は純粋か、実質的に純粋な形であることが好ましい。ここでも、そのような組成物を処方するのに標準的方法（たとえば、レミントン薬学第１８版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９０）参照）を採ることができる。
【００５７】
１つの実施形態では、組成物は本発明のタンパク質または抽出物、および担体、希釈剤または賦形剤を含む栄養補給食品である。適当な担体、希釈剤および賦形剤は当技術分野で知られており、水、食塩水、砂糖水、油などを含む。保存剤、バッファー、安定化剤など（これらもすべては当技術分野においてよく知られている）を含んでもよい。
【００５８】
好ましい実施形態では、タンパク質および組成物は、たとえば土壌および溶液の陽イオン回収および／またはバイオレメディエーションを促進する金属イオン結合剤に使用することができる。同様に、タンパク質および組成物は、あらかじめ選択された金属イオンとともに処方して食物および栄養補助食品産業で使用することができる。
【００５９】
またさらに、組成物はタンパク質および／またはその活性な断片を含む食品とすることもできる。これは、あらかじめ調理済みの食品にタンパク質を加えたり、あるいは食品の製造プロセスの１ステップにタンパク質を組み入れることにより得られる。
【００６０】
以下、実験セクションに本発明をより詳細に説明するが、これらは例示を目的とするためのみに記載される。
【実施例】
【００６１】
セクション１
Ａ．材料および方法
Ａ．１  シェルフィッシュ：（パシフィック  オイスター：マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ））は小売店あるいは商用カキ養殖場から得た。
【００６２】
Ａ．２  抽出物：マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）からの血漿タンパク質は、カキを開き、中にある当初の液体を捨て、次いで、漏斗内にカキを置き、その後に出てくる液体を集め、液体の血リンパをビーカーに排水させることにより得た。低速度遠心分離で血球を除き、上清（血漿；細胞を含まない血リンパ）を高速遠心分離（たとえば、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）６０Ｔｉローターで５０，０００ｒｐｍ、６０〜８０分間）して、カボルチンのみまたはこれを主成分とするペレットを生じさせる。ｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸ナトリウムまたはトリス塩酸その他の適当なバッファーなどのバッファー中に再懸濁させ、カボルチンの高濃縮液を生産した。さらなる精製ステップとしてはＣｓＣｌ等密度平衡遠心分離、制御孔ガラスビーズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣシステムの使用を挙げることができる。
【００６３】
Ａ．３  ポリアクリルアミドゲル電気泳動：１０％ポリアクリルアミドゲル（８×１０ｃｍ；厚さ１ｍｍ）はメーカーの指示によって準備したストック溶液（４０％アクリルアミド／ビス溶液３７．５：１、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、アメリカ）を使用して配置した。；市販の１２％のゲル（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、アメリカ）も使用した。試料（１０μｌ）をレーンに置き、ゲルは、ブロムフェノールブルーマーカーがゲルの底に達するまで標準のトリス／グリシン／ＳＤＳバッファー（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社（カタログ１６１−０７３２））を使用して、１６０Ｖで泳動を実施した。ゲルは、ＢＭファーストステインクーマシー（Ｆａｓｔ  Ｓｔａｉｎ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）（登録商標）（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）で染色し、メーカーの指示により、脱染色した。
【００６４】
Ａ．４  等密度勾配（Ｉｓｏｐｙｃｎｉｃ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）：ＣｓＣｌ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）溶液は０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーを用い、ｐＨ７．２となるように調製し、０．２２μｍ薄膜（アクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）、ゲルマンサイエンシーズ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アメリカ）によってろ過し清澄にした。スコッティ（Ｓｃｏｔｔｉ）（１９８５）に記載されるようにして、２段階勾配（試料を含む上層１．２５ｇ／ｃｃ、および１．４５ｇ／ｃｃの下層）を調製しベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）７０Ｔｉローターで３０，０００ｒｐｍ、２０℃でおよそ１７時間遠心分離した。得られた勾配は、勾配中に小径チューブを挿入しゆっくり内容物を汲み出すことにより分画した。ＵＶ吸光度は、Ｕｖｉｃｏｒｄ分光光度計（ＬＫＢ  Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ（スウェーデン））を通過させることによりモニターするか、回収した画分をＵＶ分光測光法によってモニタリングした。画分を回収し、アッベ（Ａｂｂｅ）屈折計（ベリンガムアンドスタンリー（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ）、英国）を使用して屈折率を、また、スコッティ（Ｓｃｏｔｔｉ）（１９８５）の方法による回帰方程式を使用して密度を測定した。
【００６５】
Ａ．５多孔性ガラスクロマトグラフィー：制御孔ガラスビーズ（ＣＰＧ  ２４０−８０（シグマ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、アメリカ）を供給元指示によって処理した。１ｃｍ×１００ｃｍカラム（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、アメリカ））を調製した。試料（１〜２ｍｌ）をカラムに入れ、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．２で溶出し、ユヴィコード（Ｕｖｉｃｏｒｄ）分光光度計に通し、画分は等間隔で集めた。
【００６６】
Ａ．６タンパク質濃度の推定：濃度は、レイン（Ｌａｙｎｅ）（１９５７）の方法によるＵＶ吸収によって基礎方程式：ｍｇ／ｍｌタンパク質＝１．５５＊Ａ２８０−０．７６＊Ａ２６０を使用して求めた。高純度の凍結乾燥カボルチンを秤量し、既知体積の水またはバッファー中に再溶解した。レインの方程式と実際の濃度の関係は適当な要因を含めることにより修正した。カボルチンの濃度は、プログラム（ｗｗｗ．ｕｐ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｗａｂｉｍを介して入手可能）により推測されるアミノ酸配列から測定した消滅係数を使用しても求めることができた（０．１％（ｍｇ／ｍｌ）の吸収、システインを考慮して０．６４０）。この値は、直接に秤量しレインの方程式を使用して求めた値に近かった。あるいは、濃度は、上記のカボルチンの既知濃度に対して吸光度値を標準化して、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、アメリカ）により供給されるタンパク質分析試薬を供給元の指示に従って使用して５９５ｎｍの波長で分光測光法で測定しても求められる。
【００６７】
Ａ．７  高速液体クロマトグラフィー：分析用３００ÅＶｙｄａｃ  Ｃ−１８  ３００カラム、（２５ｃｍ×４．６ｍｍ（内径））をＨＰ  １０５０  ＴｉシリーズＨＰＬＣ（ヒューレットパッカード（アメリカ））に取り付け、逆相ＨＰＬＣを行った。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水中における試料１０μｌを０．１％のＴＥＡを含む水０〜１００％アセトニトリル（ｖ／ｖ）勾配で６０分かけて溶出し２１８ｎｍで記録した。
【００６８】
Ａ．８遺伝子配列決定方法
ＯＺ２と呼ばれる１組の非特異的プライマーを、成熟カボルチンのＣＮＢｒ開裂に続いて断片をマイクロシークエンシングすることにより得られたカボルチンの内部配列（ＭＥＰＮＡＦＭＰＧＮＬ）に基づいて、開始配列を決定するためにＧｉｂｃｏ−ＢＲＬによって合成した。一般式は次のとおりである：
ＡＴＧＣＣＮＡＡＹＧＣＮＴＴＹＡＴＧＣＣＮＧＧＮＡＡ。
【００６９】
ここで、Ｙはピリミジン塩基を表わし、Ｎは４つのヌクレオチド塩基のうちのいずれか１つを表わす。配列決定はＯＺ２およびオリゴｄＴに基づく「下流端鎖（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ）」（＝「逆行鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）」）プライマーを最初に使用して、ｃＤＮＡからＰＣＲ産物を生産することで行われた。これを、トリスベースのバッファー中、標準条件下に１％のアガロースゲル上で電気泳動にかけた。臭化エチジウム染色後に観察されたおよそ５５０本の塩基対バンドを切り出して、大腸菌ベクター中にクローン化し、肉汁培地中での培養によって増幅した。このカボルチンに基づく挿入断片の配列決定は、「ＢｉｇＤｙｅ」プリズム法（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、アメリカ）を使用し、その指示書によって、ダイターミネーション（ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）サイクルによる配列決定によって行った。生成物はＡＢＩ  ３７７自動シークエンサー上で分割した。
【００７０】
これにより下記の配列が得られた：
【００７１】
【化４】
2005502316.tif 000005
（配列番号５）
Ａ９：金属結合
材料および方法
容量１ｍｌのハイトラップ（Ｈｉ  Ｔｒａｐ（登録商標））キレート形成性アフィニティカラム（アマシャムファーマシアバイテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、英国）をメーカーの指示によって調製した。いくつかの金属塩類（無水塩化第二銅；塩化第一コバルト６水和物；塩化ニッケル６水和物；塩化亜鉛）１００ｍＭ水溶液５００ｍｌをカラムに充填し、次いで、バッファー（０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２。５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む）で洗浄し平衡させた。超遠心分離を数サイクル行って精製したカボルチンを、このバッファー中に懸濁し、およそ１ｍｇをシリンジを使用してカラムにゆっくり加えた。
【００７２】
カボルチンの銅への結合を測定するために、カラムを最初バッファー５ｍｌで、次いで２００ｍＭイミダゾールを含むバッファー５ｍｌで洗浄した。ニッケルおよび亜鉛をチャージしたカラムで、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム塩で溶離バッファー中のイミダゾールを置換した。画分の吸光度をパイユニカム（Ｐｙｅ  Ｕｎｉｃａｍ）ＳＰ１８００分光光度計を用いて、２８０ｎｍでモニターした。コバルトチャージカラムについては、２００ｍＭイミダゾール、５００ｍＭイミダゾールおよび５０ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム塩を含むバッファーを使用して溶離を行った。
【００７３】
溶離バッファーはすべてｐＨ７．２に調節した。
【００７４】
Ａ．１０  タンパク質結合鉄の分析：カボルチンの鉄含有量の測定のための高感度分析を使用した（デービス、ＭＤ、カウフマン、Ｓおよびミルスチエン  Ｄａｖｉｓ，ＭＤ、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｉｅｎ，Ｓ．（１９８６）Ａ）酵素結合鉄測定用の修正フェロジン法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ−ｂｏｕｎｄ  ｉｒｏｎ）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３、３９−４５）。超純水に溶かした硫酸第一鉄アンモニウム塩を標準として使用した。鉄ナノモル対５６２ｎｍ吸光度の標準線形プロットは、ブランク並びに、鉄の９９ナノモル（ｎｍｏｌ）から２ナノモル（ｎｍｏｌ）まで及び、各実験について測定した。より多量の試料タンパク質材料の分析を可能にするために濃メタンスルホン酸（１５．４Ｍ）を用いた。
【００７５】
Ａ．１１鉄に対するシェルフィッシュタンパク質の結合能力の測定：硫酸第一鉄アンモニウム塩６水和物を既知濃度で超純水に溶かした。精製カボルチン溶液にさまざまな比率で一定分量を加えた（「鉄担持」）。過剰（未結合）鉄は、ゲルろ過カラム（ＢｉｏＲａｄマイクロＢｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｐ−６カラムカタログ＃７３２−６２２２）を通して遠心分離によって除いた。カラムには７０μｌまでの試料を担持し、メーカーの指示に従って処理し、上記のように鉄含有量を求めるため、ろ液を分析した。タンパク質に対する鉄（「結合鉄」）のモル比は、上記方法に基づく存在タンパク質モル測定により計算した。鉄のタンパク質への結合の強さを検討するために、鉄を担持したカボルチン、ＥＤＴＡに対し鉄過剰でＥＤＴＡ二ナトリウムで処理した。次いで、ＥＤＴＡおよび未結合鉄をＢｉｏＳｐｉｎ  Ｐ−６カラムを使用するか、または水または適当なバッファーに対する徹底的な透析によって除いた。
【００７６】
Ｂ．結果
ＣｓＣｌ等密度勾配中でのカキ血漿の遠心分離後に光散乱バンドが観察された。このバンドの密度は１．３７〜１．３８ｇ／ｃｃと推定された。
【００７７】
ＣＰＧ  ２４０−８０カラム上で、半精製した抽出物の、またはＣｓＣｌ中でバンドを示す試料のクロマトグラフィーにより、溶離剤として低モル濃度リン酸塩またはトリスバッファー（通常１００ｍＭバッファー）を使用すると、大多数のカボルチンが排除体積中に溶出することが示された。対照的に、より大きな分子量のタンパク質（ウシ血清アルブミン（６８ｋＤａ））は、カラムマトリックスに含まれていた。したがって、カボルチンは凝集して大きな粒子状構造をとるようである。ＨＰＬＣでは、ＣＰＧクロマトグラフィーによって得られたマガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）由来カボルチンが、高純度である（図３を参照）ことを確認した。
【００７８】
カボルチンの収率は血リンパ平均約１ｍｇ／ｍｌであり、これは、殻を開き、当初の液体を廃棄し、後の液体を集めることにより、カキから直接得た。血リンパを低速（≒１０００ｇ）で遠心分離して血球を除き、生じる上清を超遠心分離によって処理し（たとえば、４０分、２５０，０００ｇ）、０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファーで溶出するＣＰＧクロマトグラフィー（ｐＨ７．２）、またはリン酸塩バッファー中でのＣｓＣｌ等密度バンド形成を行った。血リンパは、最も優勢なポリペプチド種であるカボルチンを約１ｍｇ／ｍｌ（１個のカキあたり血リンパの平均≒５〜６ｍｌ）を含んでいた（図１および図３を参照）。
【００７９】
精製カボルチンからの化学的および酵素的によって生成した、Ｎ−末端領域および内部断片のマイクロシークエンシングを行い、以下の開裂断片配列を生成した：
（ａ）ＴＡＸＮＥＡＮＶＮＩＹＬＨＬＳＤＤＥＤＳＮＹＥＮＳ（Ｎ−末端）
（ｂ）ＥＰＮＡＦＭＰＧＮＬＨＨＲＶ
（ｃ）ＥＨＧＸＤＴＩＧＥＬ：
各アミノ酸に対する配列用コードは以下のとおりである。
【００８０】
Ａ    アラニン
Ｃ    シスチン
Ｄ    アスパラギン酸
Ｅ    グルタミン酸
Ｆ    フェニルアラニン
Ｇ    グリシン
Ｈ    ヒスチジン
Ｉ    イソロイシン
Ｋ    リジン
Ｌ    ロイシン
Ｍ    メチオニン
Ｎ    アスパラギン
Ｐ    プロリン
Ｑ    グルタミン
Ｒ    アルギニン
Ｓ    セリン
Ｔ    トレオニン
Ｖ    バリン
Ｗ    トリプトファン
Ｙ    チロシン
上記の（ａ）〜（ｃ）の各断片は、より大きな下記のカボルチンアミノ酸配列の一部である：
ＴＡＸＮＥＡＮＶＮＩＹＬＨＬＳＤＤＥＤＳＮＹＥＮＳＭＨＹＡＱＣＥＭＥＰＮＡＦＭＰＧＮＬＨＨＲＶＨＧＳＩＥＭＨＱＲＧＤＧＰＬＥＭＳＦＣＬＳＧＦＮＶＳＥＤＦＡＤＨＮＨＧＬＱＩＨＥＹＧＤＭＥＨＧＣＤＴＩＧＥＬＹＨＮＥＨＡＰＮＨＤＮＰＧＤＬＧＤＬＨＤＤＤＨＧＮＶＤＡＴＲＴＦＤＷＬＴＩＧＨＴＤＧＩＬＧＲＳＬＡＩＬＱＧＤＨＴＳＨＴＡＶＩＡＣＣＶＩＧＲＳＨＡＨ（配列番号４）。
【００８１】
天然状態におけるカボルチンおよびペルニン（ｐｅｒｎｉｎ）の鉄への結合
シェルフィッシュタンパク質に結合した鉄の量はデービスらの方法（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）。その内容は言及により本願に組み入れられる）を分光光度法に使用して推定した。カボルチンは上に論じた抽出方法によって得た。カキタンパク質（カボルチン）についての結合比は、カボルチン４．５分子あたり鉄１原子と推定された。
【００８２】
【表１】
2005502316.tif 000006
金属の結合
ハイトラップ（Ｈｉ  Ｔｒａｐ（登録商標））キレート形成性アフィニティカラムからの結果は、カボルチンが、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルに結合していることを示した。バッファー５ｍｌでのカラム洗浄後、溶離液中には（バックグラウンド以上の）ＵＶ吸収物質は検出されなかった。しかし、銅に対するイミダゾール、または亜鉛およびニッケルに対するＥＤＴＡ（イミダゾールバッファーはこれらに対しては試みられなかった）を含むバッファーを使用した溶離液では最初の２ｍｌで全ＵＶ吸収物質（タンパク質）が溶出した。コバルト充填カラムについては、２００ｍＭイミダゾールでカボルチンは溶出しなかったが、５００ｍＭイミダゾールでは４０％のタンパク質が溶出し、ＥＤＴＡ含有バッファーで残りのタンパク質が溶出した。
【００８３】
鉄担持
鉄分析は高感度で、鉄１〜２ナノモルを容易に検出できる（図５）。各実験について、硫酸第一鉄アンモニウム塩１００ｍＭ溶液を適当に希釈し、ペルニンまたはカボルチンに結合する鉄の量を測定するための参照基準として、回帰方程式（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）（「傾向線（ｔｒｅｎｄｌｉｎｅ）」）が計算された。
【００８４】
血リンパの中のカボルチンは、自然状態では鉄への結合は低レベルである（スコット他（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１）。カキ血漿中のカボルチン濃度はおよそ１ｍｇ／ｍｌである。これらの評価は、血リンパ中に観察されるタンパク質量に基づいており、シェルフィッシュ中に存在するカボルチンのわずかな部分のみが鉄に結合していることを示す。
【００８５】
【表２】
2005502316.tif 000007
シェルフィッシュタンパク質は、カボルチンの溶液に、たとえば、硫酸第一鉄アンモニウム（塩）を加えることにより、鉄を担持することができる。結果（表３）は、カボルチンの各分子が鉄の１０または１１までの分子を結合可能であり、おそらく４〜６分子がしっかりと結合されることを示す。
【００８６】
【表３】
2005502316.tif 000008
基本的な方法は、材料および方法欄に記載したとおりであり、ＢｉｏＳｐｉｎ  Ｐ−６を用いている。鉄（硫酸第一鉄アンモニウム塩６水和物の溶液）は、２０：１（つまり、鉄に対して２０倍過剰）の分子比でカボルチン（１０ナノモル）の溶液に加えた。続いて、ＥＤＴＡ処理のために、１対１．９（ＥＤＴＡ：鉄）の比でＥＤＴＡを加えることにより、鉄担持カボルチンを処理した。訂正した吸光係数（ｒｅｆ  ０２−００１および訂正されたスプレッドシート）によるカボルチン濃度の推定、新しい推定濃度＝３５．４５−（これらは秤量されたカボルチン実験データｒｅｆ  ０２−００１に関連する）−前のカボルチン濃度推定値＝３２ｍｇ／ｍｌであり、１本のチューブあたり「１０ナノモル」が用いられ、したがって、カボルチンの新ナノモルはチューブあたり１１．１４７８０ナノモルである；「ｎ．ｄ．」は試料中に鉄が検出されないことを意味する。
【００８７】
鉄担持には精製タンパク質が必要とされないことが注意されるべきである。カボルチンはたとえばジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）の方法（１９９６）によって提供される全体のムラサキイガイの天然のままの水抽出物に硫酸第一鉄アンモニウム塩を加えることにより鉄担持させることができる。
【００８８】
考察
本発明は、マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）から得ることができる新規なタンパク質を提供する。タンパク質はより大きな粒子に自己凝集可能なようであり、この性質のために、通常観察されるタンパク質と比較して、比較的高い値の沈殿が得られる。このタンパク質はカキ全体の抽出物に見出され、血リンパの中の優勢なタンパク質であるように思われる。タンパク質の分子量は、ｃＤＮＡ配列から推測される分子量はおよそ２０ｋＤａであるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより３１ｋＤａであると推測される。その凝集能力のために、このタンパク質は短時間（たとえば２５０，０００ｇで４０分）の超遠心分離で沈殿させることができるが、モノマーのタンパク質ではそうはならないであろう。血リンパ１ミリリットルは、平均して、カボルチンを約１ｍｇもたらす。血リンパは開いたカキから血リンパを排出させることにより容易に得られ、６ｍｌまで得られる。得られた血リンパは、高濃度のカボルチンを含むだけでなく汚染物質をまったく含まないため、カボルチンの精製は簡単である。カボルチンの高純度調製品を得るためには、超遠心分離に続いてＣｓＣｌなどの適当な密度勾配媒体中の等密度バンド形成を行うことができる。
【００８９】
銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼに進化的に関連づけられる配列のカボルチンは、凝集して生理学的ｐＨおよび浸透圧で安定な統一体（ｅｎｔｉｔｙ）を形成する多量体ユニットとなる。カボルチンは、以前Ｃｕ++やＺｎ++などの陽イオンと結合する能力を有した。金属と配位結合する重要な配位子（主にヒスチジン残基）のうちの幾分かが、活性部位で失われており、そのため、このタンパク質はＳＯＤとしては不活性であるが、その代わり、このタンパク質は鉄結合が自然状態においてあるレベルで存在する。もっとも、この鉄飽和レベルはカボルチン分子集団全体の約３％にすぎない。
【００９０】
カボルチンは自然状態において鉄と結合する。しかし、自然状態における鉄とカボルチンの比率は１未満（表１）であるので、すべての分子が鉄との結合を有するわけではない。カボルチンはまた、鉄と結合する能力に加え、他の金属イオン、たとえば、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルとの結合能力も有する。
【００９１】
上に示すように、カボルチンは、著しい量の金属と結合して金属分に富んだタンパク質および抽出物を生産する能力を持っている。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の好ましいタンパク質、カボルチンは多くの有用性を有する。
【００９３】
マガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）から、抽出物として、タンパク質それ自身として、または金属分に富んだ形で得られるカボルチンタンパク質は、医薬品として価値を有し得る。特にシェルフィッシュタンパク質が本来的に食餌の栄養補助食品として価値を有する場合は、さらに、自然な治療剤または健康栄養補助食品として有用であろう。カボルチンは、カキ血リンパから高濃度の自然な生成物として容易に得られる。高純度調製品を得るためには、遠心分離（または任意の他の適当な方法）により血球を除去し、これに続いて、超遠心分離（カボルチンは容易に沈殿する凝集体を形成するため）、ＣｓＣｌなどの適当な媒体中で再懸濁および等密度バンド形成によって続いた、カボルチンを保持する適当な薄膜による排除ろ過、または適当な孔隙率の制御孔ガラスビーズなどの媒体によるクロマトグラフィーのいずれかによるだけでよい。結果はカボルチンの高純度調製品である。
【００９４】
同様に、金属分に富むタンパク質の取得は、対象とする金属を加え、好ましくは抽出物のタンパク質を含む溶液を形成することにより達成される。
【００９５】
マガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）は、生産、処理または精製に関わるわずかなコストまたは労力だけで、大量のタンパク質カボルチンを自然に生産する。
【００９６】
アフィニティカラムクロマトグラフィーによって実証されるように、カボルチン分子は鉄以外の金属イオン（たとえば、銅、亜鉛、コバルト、ニッケル）を受理することができるので、このタンパク質は選択された金属イオンのバイオレメデーション剤としても潜在的な用途を有する。
【００９７】
食品への適用については、結合イオンが、たとえばカルシウム、マグネシウム、セレンまたは亜鉛などの無毒な陽イオンであることが最も普通に意図されると理解されるであろう。
【００９８】
金属イオン、特に２価金属陽イオン結合能力は、さらにバイオレメディエーションおよび／または陽イオン回復方法におけるタンパク質の用途を生じさせる。Ｐｂ++、Ａｓ++、Ｈｇ++、Ｃｄ++などの金属イオンまたは２価陽イオンが、液体、溶液または固体媒体などの媒体中に存在して汚染物質となる場合がある。たとえば、水や土壌試料である。溶液または試料を、陽イオンが抽出されるように、タンパク質が結合される基質に通すことができる。
【００９９】
当業者は、上記の記載が例示のみを目的として提供されたもので、本発明はこれらに限定されないことを理解するであろう。
引用文献
【０１００】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】自己凝集性タンパク質の１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図（レーン１はタンパク質分子量標準（分子量はｋＤＡ単位）であり、レーン２はカキタンパク質であるカボルチン）である。
【図２】ｃＤＮＡから得られたヌクレオチド塩基配列から、およびＣＮＢｒ開裂断片の直接マイクロシークエンシングから推測されるカボルチンのアミノ酸配列を示す図（影を付けた部分は、成熟カボルチン分子（Ｎ−末端）のマイクロシークエンシングにより、またはＣＮＢｒ開裂に続けて断片をマイクロシークエンシングすることにより得られたアミノ酸配列を表わす。下線部分は、ポリアデニル化シグナルと思われる部分を示す。マイクロシークエンシングによって得られた「Ｒ」アミノ酸残基の代わりに「Ｓ」残基が推測される点で、Ｎ−末端マイクロシークエンシングは、推測された配列と異なる；これは、イタリック体で示す最初の太字「Ｘ」によって示される。これらの２つのアミノ酸に対するコドンはＡＧＹ（Ｓに対応）とＡＧＲ（Ｒに対応）である。枠で囲んだ配列ＮＶＳはグリコシル化サイトの可能性がある。イタリック体で示す２番目の太字「Ｘ」は、マイクロシークエンシングから推測された「Ｃ」残基を表わす）である。
【図３】マガキ（Ｃ．ｇｉｇａｓ）の細胞を含まない血リンパのＨＰＬＣ溶離プロフィールを示す（測定は２１８ｎｍで行った。単一のピークはカキタンパク質、カボルチンを表わす）。
【図４】細胞を含まない血リンパの高速遠心分離を行い、得られた沈殿をバッファー中に再懸濁させて精製したカボルチンの紫外線吸光度を示すグラフ（血漿中のカボルチン濃度は、上記の濃度から本来の血漿体積を外挿することにより推定した。ウシ血清アルブミンの標準濃度から得られた値を参照することによって、カキ血リンパ中のカボルチン濃度はｍｌあたり１．１７ミリグラムであると推定された）。
【図５】材料および方法欄に記載したように推測した鉄の溶液の鉄含有量（ナノモル）を示すグラフである（傾向線方程式は、波長５６２ｎｍでの吸光度を、硫酸第一鉄アンモニウム塩の一連の稀釈液中に存在する鉄濃度に関連づける。カボルチンに結合した鉄の含有量は、各実験から同様のプロットを参照することにより推定した）。
【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月12日(2003.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
天然状態におけるカボルチンの鉄への結合
シェルフィッシュタンパク質に結合した鉄の量はデービスらの方法（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）。その内容は言及により本願に組み入れられる）を分光光度法に使用して推定した。カボルチンは上に論じた抽出方法によって得た。カキタンパク質（カボルチン）についての結合比は、カボルチン４．５分子あたり鉄１原子と推定された。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
鉄担持
鉄分析は高感度で、鉄１〜２ナノモルを容易に検出できる（図５）。各実験について、硫酸第一鉄アンモニウム塩１００ｍＭ溶液を適当に希釈し、カボルチンに結合する鉄の量を測定するための参照基準として、回帰方程式（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）（「傾向線（ｔｒｅｎｄｌｉｎｅ）」）が計算された。




【手続補正書】
【提出日】平成15年5月15日(2003.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約３１ｋＤａの分子量を有し、以下の配列：
（ａ）ＴＡＸＮＥＡＮＶＮＩＹＬＨＬＳＤＤＥＤＳＮＹＥＮＳ（Ｎ末端）（配列番号１）、
（ｂ）ＥＰＮＡＦＭＰＧＮＬＨＨＲＶ（配列番号２）、
（ｃ）ＥＨＧＸＤＴＩＧＥＬ（配列番号３）、
の１つまたは複数を含むアミノ酸配列を有する、単離されたタンパク質またはその活性な断片。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質またはその活性な断片。
【請求項３】
マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）の血リンパから得られた請求項１または２に記載の単離されたタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から推定される約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質または断片。
【請求項５】
金属イオン結合剤としての活性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質または断片。
【請求項６】
２価金属イオン結合剤としての活性を有する、請求項５に記載のタンパク質または断片。
【請求項７】
請求項５または６に記載のタンパク質または断片の機能的に等価な変種であるタンパク質であり、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有する変種。
【請求項８】
請求項５または６に記載のタンパク質または断片の機能的に等価な変種であるタンパク質であり、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の同一性を有する変種。
【請求項９】
請求項５または６に記載のタンパク質または断片の機能的に等価な変種であるタンパク質であり、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％の同一性を有する変種。
【請求項１０】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）以外のシェルフィッシュから得ることができ、請求項５または６に記載のタンパク質または断片の機能的に等価な変種であり、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一性を有する変種。
【請求項１１】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）以外のシェルフィッシュから得ることができ、請求項５または６に記載のタンパク質または断片の機能的に等価な変種であり、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一性を有する変種。
【請求項１２】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）以外のシェルフィッシュから得ることができ、請求項５または６に記載のタンパク質または断片の機能的に等価な変種であり、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一性を有する変種。
【請求項１３】
クラッソストレア  ギガス以外のシェルフィッシュから得られた請求項１０〜１２のいずれかに記載にタンパク質。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質または断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号５のヌクレオチド配列またはその変種を有する請求項１４に記載のポリヌクレオチドまたはその変種。
【請求項１６】
配列番号６のヌクレオチド配列またはその変種を有するポリヌクレオチドまたはその変種。
【請求項１７】
配列番号７のアミノ酸配列またはその変種をコードするポリヌクレオチドまたはその変種。
【請求項１８】
請求項１４から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１９】
請求項１４から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを発現する宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質または断片を含む組成物。
【請求項２１】
医薬である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
食品である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
栄養補助食品である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記タンパク質または断片が、栄養上重要な少なくとも１つの金属イオンと会合するか結合している、請求項２３に記載の栄養補助食品。
【請求項２５】
前記金属イオンが２価の金属陽イオンである、請求項２４に記載の栄養補助食品。
【請求項２６】
前記２価の金属陽イオンがカルシウム、マグネシウム、セレンまたは亜鉛である、請求項２５に記載の栄養補助食品。
【請求項２７】
バイオレメディエーション剤である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２８】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）血リンパまたは抽出物を含む物質を遠心分離し、沈殿したタンパク質を回収するステップを含む、請求項３に記載のタンパク質の取得方法。
【請求項２９】
前記遠心分離ステップが超遠心分離である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記超遠心分離が約２５０，０００ｇで約４０分実行するものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）から血リンパを抽出する予備ステップを含む、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
シェルフィッシュから得ることができる銅／亜鉛ジスムターゼ誘導自己凝集性タンパク質、または機能的に等価な変種またはその断片である金属分に富んだタンパク質。
【請求項３３】
シェルフィッシュから得られた請求項３２に記載の金属分に富んだタンパク質。
【請求項３４】
ヒスチジンに富んだ請求項３２または３３に記載の金属分に富んだタンパク質。
【請求項３５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の金属分に富んだタンパク質。
【請求項３６】
クラッソストレア  ギガス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）から得られたものである請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の金属分に富んだタンパク質。
【請求項３７】
金属分に富んだタンパク質または断片である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質または断片。
【請求項３８】
請求項３２から３７のいずれか一項に記載の金属分に富んだタンパク質または断片を含むシェルフィッシュ抽出物。
【請求項３９】
金属が鉄である請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の金属分に富んだタンパク質。
【請求項４０】
金属が鉄である請求項３７に記載の金属分に富んだタンパク質または断片。
【請求項４１】
金属が鉄である請求項３８に記載の金属分に富んだタンパク質または断片を含むシェルフィッシュ抽出物。
【国際調査報告】
2005502316.tif 000048
2005502316.tif 000049