(57)【要約】本発明は、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）またはＣ１ｑを含む溶液の濃度を測定するために、および、ＣＲＰまたはＣ１ｑと、それらに結合する成分との相互作用、特にＣＲＰとＣ１ｑとの相互作用に影響を与える物質を同定するために、ＣＲＰまたはＣ１ｑと、ＣＲＰまたはＣ１ｑに結合する成分との相互作用を測定するためのＨＴＳ可能な方法および試験システムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直接的に、または、１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰに結合する２種の成分の結合現象の測定方法であって、以下の工程：
（ａ）初めに、ＣＲＰ含有溶液を導入すること、
（ｂ）少なくとも１種のドナー成分、または、少なくとも１種のドナー成分を含む成分群を、上記ＣＲＰ含有溶液に加えること［該ドナー成分は、光源により励起した後、シグナルを放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を含む成分であり、該ドナー成分は、直接的に、または、該成分群からの１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰに結合することができる］、
（ｃ）少なくとも１種のアクセプター成分、または、少なくとも１種のアクセプター成分を含む成分群を、上記ＣＲＰ含有溶液に加えること［該アクセプター成分は、（ｂ）に記載の化合物または化合物群によって放出されたシグナルを受信および電磁放射の形態で放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）を含む成分であり、該アクセプター成分は、直接的に、または、該成分群の１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰに結合することができる］、
（ｄ）（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を光源によって励起すること、
（ｅ）上記結合現象を検出するために、（ｃ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）によって放出された電磁放射を検出すること、
を含む、上記方法。
【請求項２】
直接的に、または、１またはそれ以上の成分を介してＣ１ｑに結合する２種の成分の結合現象の測定方法であって、以下の工程：
（ａ）初めに、Ｃ１ｑ含有溶液を導入すること、
（ｂ）少なくとも１種のドナー成分、または、少なくとも１種のドナー成分を含む成分群を、上記Ｃ１ｑ含有溶液に加えること［該ドナー成分は、光源により励起した後、シグナルを放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を含む成分であり、該ドナー成分は、直接的に、または、該成分群からの１またはそれ以上の成分を介してＣ１ｑに結合することができる］、
（ｃ）少なくとも１種のアクセプター成分、または、少なくとも１種のアクセプター成分を含む成分群を、上記Ｃ１ｑ含有溶液に加えること［該アクセプター成分は、（ｂ）に記載の化合物または化合物群によって放出されたシグナルを受信および電磁放射の形態で放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）を含む成分であり、該アクセプター成分は、直接的に、または、該成分群の１またはそれ以上の成分を介してＣ１ｑに結合することができる］、
（ｄ）（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を光源によって励起すること、
（ｅ）上記結合現象を検出するために、（ｃ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）によって放出された電磁放射を検出すること、
を含む、上記方法。
【請求項３】
電磁放射は蛍光放射である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｄ）に記載の光源は、レーザーまたはランプである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
（ｅ）に記載の検出は、光電子増倍管を用いて行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
（ｂ）および／または（ｃ）に記載の成分群の成分は、空間的に連続してＣＲＰに、または互いに結合することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｂ）および／または（ｃ）に記載の成分群の成分は、空間的に連続してＣ１ｑに、または互いに結合することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
成分はポリペプチドであるか、または、ポリペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
成分の少なくとも１種は、抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
成分の少なくとも１種は、ＣＲＰの天然の結合パートナーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＲＰの天然の結合パートナーは、Ｃ１ｑである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１（ａ）または請求項１（ｂ）に記載の成分群は、Ｃ１ｑ、および、抗Ｃ１ｑ抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
成分の少なくとも１種は、Ｃ１ｑの天然の結合パートナーである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
天然の結合パートナーは、ＣＲＰである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項２（ａ）または請求項２（ｂ）に記載の成分群は、ＣＲＰおよび抗ＣＲＰ抗体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シグナルは、（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）から、（ｃ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）へエミッションレスエネルギー伝達によって伝達される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
エミッションレスエネルギー伝達は、蛍光共鳴エネルギー移動である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
シグナルは、一重項酸素を介して伝達される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１（ｂ）または請求項２（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）は、レーザーによる励起の後、三重項酸素を一重項酸素に変換することができる化合物を含み、請求項１（ｂ）または請求項２（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）は、一重項酸素によって励起可能な少なくとも１種の第一の化合物、ならびに、一重項酸素によって励起可能な該化合物によって吸収されたエネルギーをエミッションレス方式で吸収し、蛍光放射の形態で放出することができる少なくとも１種の第二の化合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ドナー群および／またはアクセプター群は、粒子上に局在している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
粒子の平均直径は約２００ｎｍである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
未知のＣＲＰ含量を有するＣＲＰ含有溶液の濃度を測定するのに用いられる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
未知のＣ１ｑ含量を有するＣ１ｑ含有溶液の濃度を測定するのに用いられる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
溶液は、血清、血漿、または、生理学的緩衝液または水で希釈した血清もしくは血漿である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
生物の炎症の状態、および／または、心停止および／または卒中のリスクを測定するための診断方法である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ワンステップ法として行うことができるＨＴＳ可能な均一方法である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
試験物質が、ＣＲＰとＣＲＰ結合成分との結合現象に影響を与えるかどうかを観察するために、工程（ａ）および／または工程（ｂ）および／または工程（ｃ）および／または工程（ｄ）の前に、少なくとも１種の試験物質を加える追加の工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
試験物質が、Ｃ１ｑとＣ１ｑ結合成分との結合現象に影響を与えるかどうかを観察するために、工程（ａ）および／または工程（ｂ）および／または工程（ｃ）および／または工程（ｄ）の前に、少なくとも１種の試験物質を加える追加の工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
調節、阻害または活性化する方式で結合現象に作用する物質を測定するのに用いられる、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＲＰと、ＣＲＰへ結合する成分との結合現象を測定するためのＨＴＳ可能な診断分析システムであって、以下の成分：
（Ａ）少なくとも１種のドナー成分、または、少なくとも１種のドナー成分を含む成分群［該ドナー成分は、光源により励起した後、シグナルを放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を含む成分であり、該ドナー成分は、直接的に、または、該成分群からの１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰに結合することができる］、
（Ｂ）少なくとも１種のアクセプター成分、または、少なくとも１種のアクセプター成分を含む成分群［該アクセプター成分は、（Ａ）に記載の化合物または化合物群によって放出されたシグナルを受信および電磁放射の形態で放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）を含む成分であり、該アクセプター成分は、直接的に、または、該成分群の１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰに結合することができる］
を含む上記診断分析システム。
【請求項３２】
Ｃ１ｑとＣ１ｑへ結合する成分との結合現象を測定するためのＨＴＳ可能な診断分析システムであって、以下の成分：
（Ａ）少なくとも１種のドナー成分、または、少なくとも１種のドナー成分を含む成分群［該ドナー成分は、光源により励起した後、シグナルを放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を含む成分であり、該ドナー成分は、直接的に、または、該成分群からの１またはそれ以上の成分を介してＣ１ｑに結合するこ
とすることができる］、
（Ｂ）少なくとも１種のアクセプター成分、または、少なくとも１種のアクセプター成分を含む成分群［該アクセプター成分は、（Ａ）に記載の化合物または化合物群によって放出されたシグナルを受信および電磁放射の形態で放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）を含む成分であり、該アクセプター成分は、直接的に、または、該成分群の１またはそれ以上の成分を介してＣ１ｑに結合することができる］
を含む上記診断分析システム。
【請求項３３】
以下の追加の成分：
（Ｃ）血清もしくは血漿、または、生理学的緩衝液もしくは水で希釈した血清もしくは血漿、
（Ｄ）（Ａ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を励起するための光源、
（Ｅ）（Ｂ）に記載の放出された電磁放射を検出するための検出システム
を含む、請求項３１または３２に記載のＨＴＳ可能な分析システム。
【請求項３４】
ＣＲＰとＣＲＰへ結合する成分との相互作用に、調節する方式で作用する活性物質を測定するためのＨＴＳ可能な分析システムであって、以下の成分：
（Ａ′）少なくとも１種のドナー成分、または、少なくとも１種のドナー成分を含む成分群［該ドナー成分は、光源により励起した後、シグナルを放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を含む成分であり、該ドナー成分は、直接的に、または、該成分群からの１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰに結合することができる］、
（Ｂ′）少なくとも１種のアクセプター成分、または、少なくとも１種のアクセプター成分を含む成分群［該アクセプター成分は、（Ａ′）に記載の化合物または化合物群によって放出されたシグナルを受信および電磁放射の形態で放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）を含む成分であり、該アクセプター成分は、直接的に、または、該成分群の１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰに結合することができる］、
（Ｃ′）少なくとも１種の試験化合物
を含む上記分析システム。
【請求項３５】
Ｃ１ｑとＣ１ｑへ結合する成分との相互作用に、調節する方式で作用する活性物質を測定するためのＨＴＳ可能な分析システムであって、以下の成分：
（Ａ′）少なくとも１種のドナー成分、または、少なくとも１種のドナー成分を含む成分群［該ドナー成分は、光源により励起した後、シグナルを放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を含む成分であり、該ドナー成分は、直接的に、または、該成分群からの１またはそれ以上の成分を介してＣ１ｑに結合することすることができる］、
（Ｂ′）少なくとも１種のアクセプター成分、または、少なくとも１種のアクセプター成分を含む成分群［該アクセプター成分は、（Ａ′）に記載の化合物または化合物群によって放出されたシグナルを受信および電磁放射の形態で放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）を含む成分であり、該アクセプター成分は、直接的に、または、該成分群の１またはそれ以上の成分を介してＣ１ｑに結合することができる］、
（Ｃ′）少なくとも１種の試験化合物
を含む上記分析システム。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載のＨＴＳ可能な分析システムであって、以下の追加の成分
：
（Ｄ′）（Ａ′）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を励起するための光源、
（Ｅ′）（Ｂ′）に記載の放出された電磁放射を検出するための検出システム
を含む上記分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）およびＣ１ｑを含む溶液の濃度をそれぞれ測定するため、および、ＣＲＰおよびＣ１ｑと、それぞれそれらに結合する成分との相互作用に影響を与える物質を測定するために、ＣＲＰおよびＣ１ｑと、それぞれＣＲＰおよびＣ１ｑへ結合する成分との相互作用を測定するためのＨＴＳ可能な方法および分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、急性期血漿タンパク質であり、感染または組織損傷の後にその血清濃度は迅速かつ著しく増加する（Ｖｏｌａｎａｋｉｓ（２００１年），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８，１８９〜１９７）。ＣＲＰは、Ｃａ2+イオンの存在下でホスホコリン（ＰＣｈ）に結合する。ＰＣｈは、病原微生物の多糖類、および、損傷した細胞や壊死細胞の細胞膜において極めて普遍的に存在する。ＰＣｈに結合したＣＲＰは、タンパク質Ｃ１ｑへ結合することにより、古典的な補体カスケードを活性化することができる。
【０００３】
補体は、免疫系の一構成成分であり、主に抗体が介在する免疫防御に関与する。補体の３つの生理学的な機能は、細菌感染に対する防御、先天性と後天性免疫との連結、および、免疫複合体とアポトーシス細胞の除去である。古典的な補体カスケード、代替補体カスケード、および、マンノース−レクチン補体カスケードは、区別される（Ｗａｌｐｏｒｔ（２００１年），Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４４，１０５８〜１０６６）。古典的な補体カスケードは、細菌細胞を溶解させ、まずＣ１ｑと、細胞表面へ結合する抗体またはＰＣｈ結合ＣＲＰとの連結を開始させる。
【０００４】
Ｃ−反応性タンパク質は、先進工業国において最も一般的な死亡原因である冠状動脈性心疾患に関するマーカーとして、さらに予測値として用いられる（ＲｉｆａｉおよびＲｉｄｋｅｒ（２００１年），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，４０３〜４１１）。
【０００５】
新しい研究によれば（Ｊｉａｌａｌ等（２００１年），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３，１９３３〜１９３５）、ＣＲＰレベルを低下させること、または、ＣＲＰが介在するエフェクターの機能（例えばＣ１ｑへ結合することによる補体活性化）をブロックすることが、冠状動脈性心疾患の予防と治療に有用であると推測されている。
【０００６】
それゆえに、まず、簡単な方法でＣＲＰおよび／またはＣ１ｑの血漿濃度を測定し、次に、ＣＲＰおよび／またはＣ１ｑとその他の成分との相互作用、特にＣＲＰとＣ１ｑとの相互作用に、調節する方式（すなわち活性化または阻害する方式）で作用する物質を同定することができる、方法を提供することが望ましい。
【０００７】
ＣＲＰとＣ１ｑとの結合を測定する方法は、例えば、Ｊｉａｎｇ等（１９９１年），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６，２３２４〜２３３０、および、Ａｇｒａｗａｌ等（２００１年），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，３９９８〜４００４で説明されている。いずれの文献もＥＬＩＳＡ法を利用している。これらはいずれも、極めて時間と材料を浪費する、多段階式の不均一方法である。従って、これらの方法を実行するためには、反応物質の１つは常に、予め固相に固定されている必要がある。その上、多数の洗浄工程が必要である。
【０００８】
Ｌｅｂｄｕｅ等（１９９８年），Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３５，７４５〜７５３では、ＣＲＰの免疫比濁検出方法が説明されている。この目的のために、サンプルをポリスチレン粒子にローディングした抗ＣＲＰ抗体と共にインキュベートしている。前記方法は、比濁計が必要である点と、この方法を実行するために比較的大量のサンプルを用いなければならない点において重大な不利益がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえに、本発明の目的は、ＣＲＰまたはＣ１ｑの血漿濃度を簡単な方法で測定、さらに、ＣＲＰまたはＣ１ｑとその他の成分との相互作用、特にＣ１ｑとＣＲＰとの相互作用に調節、活性化または阻害する方式で作用する物質を同定することができる方法を提供することであり、前記方法は、以前に説明された方法に比べて、感度が高く、費用効果が高く、材料を節約することができ、より簡便および／または迅速に行われる点で、先行技術に比べて有利に優れている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的は、直接的に、または、１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰまたはＣ１ｑに結合する２種の成分の結合現象の測定方法によって達成され、本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）初めに、ＣＲＰまたはＣ１ｑ含有溶液を導入すること、
（ｂ）少なくとも１種のドナー成分、または、少なくとも１種のドナー成分を含む成分群を、前記ＣＲＰまたはＣ１ｑ含有溶液に加えること［前記ドナー成分は、光源により励起した後、シグナルを放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を含む成分であり、前記ドナー成分は、直接的に、または、前記成分群からの１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰまたはＣ１ｑに結合することができる］、
（ｃ）少なくとも１種のアクセプター成分、または、少なくとも１種のアクセプター成分を含む成分群を、前記ＣＲＰまたはＣ１ｑ含有溶液に加えること［前記アクセプター成分は、（ｂ）に記載の化合物または化合物群によって放出されたシグナルを受信および電磁放射の形態で放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）を含む成分であり、前記アクセプター成分は、直接的に、または、前記成分群の１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰまたはＣ１ｑに結合することができる］、
（ｄ）（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を光源によって励起すること、
（ｅ）前記結合現象を検出するために、（ｃ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）によって放出された電磁放射を検出すること。
【００１１】
本発明において、（ｃ）に記載の放出された電磁放射は、好ましくは蛍光放射である。（ｄ）に記載の光源は、例えばレーザーまたはランプ、例えばヘリウムまたはハロゲンランプでもよい。（ｅ）に記載の電磁放射は、例えば光電子増倍管を用いて検出してもよい。
【００１２】
好ましくは、本発明で用いられ得る成分は、ポリペプチドであるか、または、ポリペプチドを含む。本発明の特に好ましい実施形態において、少なくとも１種の前記成分は抗体であり、この抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
【００１３】
成分群が用いられる場合、前記成分は、好ましくは、空間的に連続して、ＣＲＰもしくはＣ１ｑに、または、互いに結合することができる。前記結合は、結合カスケードの形態で起こり、その例としては、抗体（一次抗体、二次抗体など）の連続的な結合が挙げられる。本発明において、（ｂ）および（ｃ）に記載のＣＲＰまたはＣ１ｑに直接結合する成分は、いずれの場合においても、好ましくは、ＣＲＰまたはＣ１ｑの特定の結合領域、ま
たは、特定のエピトープに結合する成分であり、（ｂ）に記載の前記ＣＲＰまたはＣ１ｑ結合成分は、（ｃ）に記載のＣＲＰまたはＣ１ｑ結合成分とは異なる結合部位へ結合する。
【００１４】
その他の本発明の方法の好ましい実施形態において、ＣＲＰまたはＣ１ｑに直接結合する成分の一方は、ＣＲＰまたはＣ１ｑの天然に存在する結合パートナーであり、ＣＲＰの場合、このようなパートナーとして特に好ましくはＣ１ｑであり、逆もまた同様である。従って、前記ドナーまたはアクセプター成分が、ＣＲＰまたはＣ１ｑに直接結合する場合、前記ドナーまたはアクセプター成分のいずれかは、ドナー群またはアクセプター群を含むＣ１ｑまたはＣＲＰのいずれかである。従って、結合カスケードを形成することができる成分群を用いる場合、Ｃ１ｑまたはＣＲＰは、ＣＲＰまたはＣ１ｑへ結合する第一の成分であり、これを介して、前記ドナーまたはアクセプター成分のいずれかを、ＣＲＰまたはＣ１ｑに結合させることができる。前記成分群の残りの成分は、特に好ましくは抗体分子である。
【００１５】
従って、例えば、初めにＣＲＰ含有溶液を導入する場合、この実施形態において好ましくは、前記ドナーまたはアクセプター成分のいずれかそれ自体がＣ１ｑを含むか、または、前記ドナーまたはアクセプター成分は、Ｃ１ｑを介してＣＲＰに結合する。この場合、前記ドナーまたはアクセプター成分は、抗Ｃ１ｑ抗体、または、前記抗Ｃ１ｑ抗体へ結合することができる二次抗体を含んでもよい。従って、いずれの場合においても、その他の成分（アクセプターまたはドナー成分）は、抗ＣＲＰ抗体、または、前記抗ＣＲＰ抗体へ結合することができる抗体、または、後者に対して向けられた三次抗体を含む。
【００１６】
好ましい実施形態において、（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）および／または（ｃ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）は、粒子上に局在し、前記粒子の平均直径は、好ましくは１５０〜２５０ｎｍであり、特に好ましくは約２００ｎｍである。従って、この場合、前記ドナーまたはアクセプター成分は、前記粒子を含み、前記粒子は、高分子材料製のものが可能である。
【００１７】
本発明の方法は、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）可能な方法であり、本方法は、ワンステップ法の形態で均一に実施することができる。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、「ミックス・アンド・メジャー（ｍｉｘ
ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅ）」原理に従って実行され、それにより顕著に時間を節約でき、高い精度の測定データを得ることができる。
【００１９】
本発明の方法により、ＣＲＰのＣ１ｑへの結合を測定することができ、それにより、以前に説明されてきた不均一方法を用いた場合に必要とされた時間の１０％未満の時間で、前記結合に影響を与える物質、および、測定しようとする複合体媒体中のＣＲＰまたはＣ１ｑの濃度を同定することができる。
【００２０】
この新規の方法の特筆すべき特徴は、反応物質を固相に固定する必要がないため、溶液中の２種のタンパク質間の結合をモニターすることが可能なことである。その上、生物学的な源から得られたタンパク質を直接測定することができ、例えば蛍光団を結合させることによりＣＲＰまたはＣ１ｑを改変する必要がない。それゆえに、本方法は、タンパク質をその自然な状態で分析処理することができるという特定の利点を有し、従って、タンパク質を固定および／または改変する際に生じ得る変性のリスクをなくすことができる。
【００２１】
本発明の方法のその他の利点は、本発明の方法のサンプルの量を従来の方法に比べてかなり低減できることである。従って、１０μｌ未満の量を用いることが可能であり、従っ
て、材料コストを最小化することができる。その上、ＣＲＰまたはＣ１ｑ濃度が１ｎＭ未満、さらには１００ｐＭ未満の、かなり希釈した溶液を用いることができる。それに加えて、本方法は、極めて高感度である。その上、以上の観察によれば、これは、ＣＲＰがＣ１ｑに結合することによる補体活性化に影響を与える物質のハイスループットスクリーニングを可能にした最初の方法である。
【００２２】
好ましい本発明の方法の実施形態において、前記シグナルは、（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）から、（ｃ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）へ、一重項酸素を介して伝達される。
【００２３】
この場合、前記ドナー群は、好ましくは、レーザーによる励起の後三重項酸素を一重項酸素に変換できる化合物を含み、および、前記アクセプター群は、一重項酸素によって励起可能な少なくとも１種の第一の化合物、ならびに、一重項酸素によって励起可能な群によって吸収されたエネルギーを、エミッションレス方式で吸収すること、および、蛍光放射の形態で放出することができる第二の化合物を含む。
【００２４】
形成された一重項酸素は、前記ドナー群から前記アクセプター群へ拡散し、そこに存在する化学発光物質と反応することができる。このプロセスで放出されたエネルギーは、蛍光団に伝達され、最終的に、前記エネルギーを蛍光放射の形態で放出し、これは、光電子増倍管を用いて検出することができる。検出可能なシグナルに関する前提条件は、水溶液中では、一重項酸素は不安定であり減衰するため、ドナーおよびアクセプタービーズが空間的に近接していることである。それゆえに、この方法で用いられ得る結合成分は、結合現象が起こる場合に、ドナー群とアクセプター群との距離が好ましくは２００ｎｍ未満になるように選択され、なぜなら、それより長い距離だと、一重項酸素の減衰時間のために一重項酸素による効果的なエネルギー伝達が不可能なためである。
【００２５】
この実施形態において特に好ましくは、ドナー群およびアクセプター群が粒子上に局在しており、前記粒子の平均直径は、好ましくは１５０〜２５０ｎｍであり、特に好ましくは約２００ｎｍであることである。この場合、前記粒子の好ましい使用形態は、ドナー群含有粒子の最終濃度が１〜４０μｇ／ｍｌであり、アクセプター群含有粒子の最終濃度が１〜８０μｇ／ｍｌであることである。前記粒子の結合能は、例えば、粒子１μｇ／ｍｌあたり約０.１ｎＭ〜１ｎＭであり得る。
【００２６】
特に好ましくは、本方法において、パーキン−エルマーライフサイエンス社製のアルファ−スクリーン（Ａｌｐｈａ−Ｓｃｒｅｅｎ）−ビーズを粒子として用いることである。この実施形態において、前記ドナー群は、レーザーを波長６８０ｎｍで放射することによって励起され、アクセプター群により放出された放射は、波長５２０〜６００ｎｍで検出可能である。
【００２７】
従って、この場合、本方法は、初めにドナー群およびアクセプター群を含有するドナービーズおよびアクセプタービーズを導入するような方法で行うことができる。次に、それ自体、または、さらなる成分を介するかのいずれかによってＣＲＰまたはＣ１ｑに結合することができる成分は、前記ドナーおよびアクセプタービーズに結合する。すでに上述したように、これら成分は、Ｃ１ｑもしくはＣＲＰのいずれか、または、抗ＣＲＰもしくは抗Ｃ１ｑ抗体、もしくは、前記抗ＣＲＰまたは抗Ｃ１ｑ抗体に対して向けられた二次抗体であり得る。
【００２８】
さらに好ましい本発明の方法の実施形態において、前記シグナルは、（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）から、（ｃ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）に、エミッションレスエネルギー伝達を介し
て、特に好ましくは蛍光共鳴エネルギー移動を介して伝達される。
【００２９】
この場合、本方法は、以下のようにして行うことができる；例えば、（ｂ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）は、ユーロピウム塩含有化合物を含み、および、（ｃ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群（アクセプター群）は、アロフィコシアニンを含んでもよい（Ｇｒｅｐｉｎ等（２０００年），Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ５，２１２）。あるいは、前記ドナー群およびアクセプター群は、エミッションレスエネルギー伝達に適した色素であってもよい。その上、エミッションレスエネルギー伝達、特に蛍光共鳴エネルギー移動に適した当業者既知の全ての化合物を用いることができる（例えば、Ｐｏｐｅ等（１９９９年），Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，３５０を参照）。
【００３０】
この実施形態において、好ましくは、結合の後のドナー群およびアクセプター群の距離が１０ｎｍ未満になるように用いられる結合成分を選択することであり、なぜなら、それより長い距離だと、効果的なエミッションレスエネルギー伝達が不可能なためである。
【００３１】
本発明に係る好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＣＲＰまたはＣ１ｑ含量が未知のＣＲＰまたはＣ１ｑ含有溶液の濃度を測定するのに用いられ、前記溶液は、好ましくは、血漿もしくは血清、または、適切な生理学的緩衝液または水で希釈した血漿もしくは血清である。前記方法は、例えば、診断目的で、特に生物の炎症の状態、および／または、心停止および／または卒中のリスクを測定するために用いることができる。
【００３２】
それゆえに、本発明は同様に、ＣＲＰまたはＣ１ｑと、ＣＲＰまたはＣ１ｑへ結合する成分との結合現象を測定するためのＨＴＳ可能な診断分析システムに関し、本システムは、以下の成分を含む：
（Ａ）少なくとも１種のドナー成分、または、少なくとも１種のドナー成分を含む成分群［前記ドナー成分は、光源により励起した後、シグナルを放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を含む成分であり、前記ドナー成分は、直接的に、または、前記成分群からの１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰまたはＣ１ｑに結合することができる］、
（Ｂ）少なくとも１種のアクセプター成分、または、少なくとも１種のアクセプター成分を含む成分群［前記アクセプター成分は、（Ａ）に記載の化合物または化合物群により放出されたシグナルを受信および電磁放射の形態で放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群を含む成分であり、および、前記アクセプター成分は、直接的に、または、前記成分群の１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰまたはＣ１ｑに結合することができる］。
【００３３】
この場合、ＨＴＳ可能な分析システムは、好ましくは、以下の追加の成分を含む：
（Ｃ）血清もしくは血漿、または、生理学的緩衝液または水で希釈した血液、
（Ｄ）（Ａ）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群を励起するための光源、
（Ｅ）（Ｂ）に記載の放出された電磁放射を検出するための検出システム。
【００３４】
その他の本発明の方法の好ましい実施形態において、試験物質が、結合現象に影響を与えるかどうかを観察するするために、工程（ａ）および／または工程（ｂ）および／または工程（ｃ）および／または工程（ｄ）の前に、少なくとも１種の試験物質を添加する。この方法において、ＣＲＰまたはＣ１ｑとバインダーとの相互作用、特にＣＲＰとＣ１ｑとの相互作用に調節、阻害または活性化する方式で作用する物質を測定することが可能である。この実施形態は、好ましくは、望ましい特性を有する物質を測定するために、ＨＴＳ方法で試験物質のライブラリーをスクリーニングすることを含む。
【００３５】
それゆえに、本発明は同様に、ＣＲＰまたはＣ１ｑと、ＣＲＰまたはＣ１ｑへ結合する成分との相互作用に調節する方式で作用する活性物質を測定するための、ＨＴＳ可能な分析システムに関し、本システムは、以下の成分を含む：
（Ａ′）少なくとも１種のドナー成分、または、少なくとも１種のドナー成分を含む成分群［前記ドナー成分は、光源により励起した後、シグナルを放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群（ドナー群）を含む成分であり、前記ドナー成分は、直接的に、または、前記成分群からの１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰまたはＣ１ｑに結合することができる］、
（Ｂ′）少なくとも１種のアクセプター成分、または、少なくとも１種のアクセプター成分を含む成分群［前記アクセプター成分は、（Ａ′）に記載の化合物または化合物群により放出されたシグナルを受信および電磁放射の形態で放出することができる少なくとも１種の化合物または化合物群を含む成分であり、および、前記アクセプター成分は、直接的に、または、前記成分群の１またはそれ以上の成分を介してＣＲＰまたはＣ１ｑに結合することができる］、
（Ｃ′）少なくとも１種の試験化合物。
【００３６】
この場合、前記ＨＴＳ可能な分析システムは、好ましくは以下の追加の成分を含む：
（Ｄ′）（Ａ′）に記載の少なくとも１種の化合物または化合物群を励起するための光源、
（Ｅ′）（Ｂ′）に記載の放出された電磁放射を検出するための検出システム、
（Ｆ′）ＣＲＰまたはＣ１ｑ含有溶液。
【００３７】
この場合、本発明のＨＴＳ可能な分析システムは、好ましくは、上述の本発明の方法を行うために用いられる。それゆえに、分析システムの要素および成分の特定の実施形態は、本発明の方法で用いられる上述の特定の実施形態に相当する。
【００３８】
図１は、実施例で説明された方法を図式的に示したものである。ここで、用いられるドナー成分は抗Ｃ１ｑ抗体であり、ドナー群は粒子上に局在しており、前記抗Ｃ１ｑ抗体に結合する。この場合、ドナー成分は、Ｃ１ｑを介してＣＲＰに結合可能である。この場合、アクセプター成分は、抗ウサギ二次抗体であり、アクセプター群は粒子上に局在しており、前記抗ウサギ二次抗体に結合する。この場合、アクセプター成分は、ウサギ由来抗ＣＲＰ抗体を介してＣＲＰに結合することができる。
【実施例】
【００３９】
典型的な実施形態：ＣＲＰのＣ１ｑへの結合を測定するための結合分析
この実験は、パッカード・バイオサイエンス社製のアルファ−スクリーン検出キットを用いて行われており、このキットは、ドナーおよびアクセプタービーズを含み、前記ドナービーズは、所定の波長で励起した後、三重項酸素を一重項酸素に変換することができる化合物を含み、前記アクセプタービーズは、一重項酸素によって励起可能な化合物、さらに、励起される化合物からエネルギーを、エミッションレスエネルギー伝達の形態で受信すること、次に、蛍光放射の形態で放出することができる化合物を含む。ここで上記化合物は、いずれの場合も、ヒドロゲルマトリックスに埋め込まれた。用いられたビーズは、製造元により、ドナービーズはストレプトアビジンで、アクセプタービーズは抗ウサギ抗体で予めプレコーティングされていた。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
反応緩衝液の製造
アルファ−スクリーン−システムでは、以下の反応緩衝液が用いられた：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.２）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭホスホリルコリン、０.１％ＢＳＡ。トリス−ＮａＣｌ緩衝液のストック溶液を、トリス−ＨＣｌ（３.１５ｇ）とＮａＣｌ（８.７７ｇ）をＨ2Ｏに溶解させ、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７.２に調節し、次に、Ｈ2Ｏを加えて１Ｌにすることによって製造した。この緩衝液を室温で保存した。反応緩衝液を、ＣａＣｌ2（３６.７ｍｇ）、ホスホリルコリン（１２.９ｍｇ）およびＢＳＡ（５０ｍｇ）をトリス−ＮａＣｌ緩衝液（５０ｍｌ）に加えることにより製造した。
【００４２】
抗Ｃ１ｑ抗体のビオチン化
抗Ｃ１ｑ抗体がストレプトアビジン被覆ドナービーズに結合できるようにするために、
抗Ｃ１ｑ抗体をまずビオチン化する必要がある。この目的のために、抗Ｃ１ｑポリクローナル血清（１００μｌ）をＰＢＳ（２００ｍｌ）に対して、室温で１時間、２回透析した。１.５ｍＭスルホ−ＮＨＳ溶液（ミリＱ水溶液）（２０μｌ）を添加した後、この溶液を室温で３０分間静置し、次に、過量のビオチン化試薬を除去するためにＰＢＳに対して２回透析した。
【００４３】
分析方法
初めにドナービーズ／抗ＣＲＰ溶液（２μｌ）を導入し、次に、Ｃ１ｑ（２μｌ）、ＣＲＰ（２μｌ）およびアクセプタービーズ／抗ＣＲＰ（２μｌ）を加えることによって分析を行った。それにより、以下の最終濃度が得られた：ＣＲＰ：１ｎＭ；Ｃ１ｑ：１０ｎＭ；抗ＣＲＰ：７.３ｎＭ；抗Ｃ１ｑ：１：１５００；ドナービーズ：２０μｇ／ｍｌ；アクセプタービーズ：４０μｇ／ｍｌ。ネガティブコントロールにおいて、反応緩衝液の代わりに、ＣＲＰ溶液、Ｃ１ｑ溶液、または、これら溶液の両方を用いた。室温で２時間インキュベートした後、アルファクエスト（ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ）リーダーでデータを読み込んだ。
【００４４】
結果
ＣＲＰ濃度１ｎＭ、Ｃ１ｑ濃度１０ｎＭで放出された放射の測定された強度は以下の通りであった（光電子増倍管のカウントを列挙する）：
ＣＲＰ非存在、および、Ｃ１ｑ非存在の場合：９５２
ＣＲＰ存在、および、Ｃ１ｑ非存在：１２５５
ＣＲＰ非存在、および、Ｃ１ｑ存在：１１１４
ＣＲＰ存在、および、Ｃ１ｑ存在：８０３７６。
【００４５】
以上より、Ｃ１ｑ含有溶液とＣＲＰ含有溶液を合わせた際に、ネガティブコントロールは、強いシグナルは観察されたが、ポジティブな結果は示さないことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】実施例で説明された方法を図式的に示したものである。
【図１】
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【国際調査報告】
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