(57)【要約】本願は、抗原と共に或いは抗原なしで用いてＢ細胞成分及びＴ細胞成分を含む免疫応答を誘導し、増強させ、或いは調節する、非コードＲＮＡモチーフに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含む、対象の抗原に対するＴ細胞応答を増強する方法。
【請求項２】
前記組成物と前記抗原とを同時投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象に二本鎖ＲＮＡを投与した後に、抗原を投与若しくは接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記二本鎖ＲＮＡがポリアデニンとポリウラシルとから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記二本鎖ＲＮＡがポリグアニンとポリシトシンとから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原に対するＴｈ１細胞の応答を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原に対するＴｃ１細胞の応答を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
非感染性抗原に対する大量域寛容を防止する方法であって、前記非感染性抗原を、ポリアデニンとポリウラシル、又はポリイノシンとポリシトシンから成る二本鎖ＲＮＡ組成物と共に投与することを含む方法。
【請求項９】
Ｂ細胞の不応答を防止する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗原がウィルスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ｄｓＲＮＡがｐＡ：ｐＵである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ポリアデニン及びポリウラシルから成るｄｓＲＮＡ配列を含む、抗原に対するＴ細胞の応答を増強するための組成物。
【請求項１３】
前記組成物が抗原を更に含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原が医薬的に許容される担体に添加されて投与される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原が免疫グロブリンに添加されて投与される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記医薬的に許容されるものがＩｇＧである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
抗原が腫瘍関連エピトープである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
抗原がウィルスである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
抗原が腫瘍関連Ｔ細胞エピトープである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２０】
ポリイノシン及びポリシトシンから成るｄｓＲＮＡ配列を含む、対象の抗原に対するＴ細胞の応答を増強するための組成物。
【請求項２１】
前記組成物が抗原を更に含む、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、免疫応答の誘導に有用なモチーフに関する。特に本願は、抗原と共に或いは抗原なしで用いて、Ｂ細胞（抗体）成分、及び必要に応じてＴ細胞成分を含む免疫応答を誘導し、増強し、或いは調節する、非コードＲＮＡ（non-coding RNA）モチーフに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルス感染には、多くの場合、正常な状態では通常出会うことの無いＲＮＡ種が関係しており、またウィルス感染によりこのようなＲＮＡ種が産生されることが多い。このようなＲＮＡは、ゲノムの断片（二本鎖ＲＮＡを有するウィルスの場合）か、複製中間体か、ステムループ構造体かのいずれかであり、ＴＬＲ３（Toll様受容体３）等の自然免疫受容体により認識され、ＩＦＮ−Ｉや他の可溶性メディエーターの産生を引き起こす。更に、ポリＩ：ポリＣ（ｐＩ：ｐＣ、或いはｐＩ：Ｃ）等、ある種のｄｓＲＮＡモチーフが、未成熟な樹状細胞をプロフェッショナルＡＰＣとして作用するステージへと活性化することが分かっている。ポリＩ：ポリＣやＩＦＮ−Ｉがタンパク抗原に対する抗体応答に影響を及ぼすことが知られているにも拘わらず、ｄｓＲＮＡ免疫調節モチーフに関して得られている情報の多くは自然免疫のモデルから得たものであり、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、その他特定の抗原受容体を欠く細胞サブセットに限定されていた。従って、二本鎖ＲＮＡや他のＲＮＡ種に関連するモチーフが、適応免疫応答に限られた影響しか及ぼさないのか、それとも強い危険シグナルとして免疫寛容を防ぎ、特定のＴ細胞の分化方向を決定する作用をするのかはこれまで示されていなかった。更に、免疫応答に対して潜在的に様々な影響力を有するＲＮＡ関連危険モチーフが多数存在するのか否かという重大な問題についても議論はなされていない。更に、非コードＲＮＡモチーフがウィルス感染の際のクラスＩ拘束性免疫応答の誘導を促進できるかどうかは明確にされておらず、最近までは、多くの場合、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の不稔感染又は増殖感染に続いて起こると考えられていた。
【０００３】
ウィルス感染の際、特定のＴリンパ球が、ＭＨＣ分子によって提示される外来エピトープと接触し、Ｂリンパ球は可溶性抗原を認識する。リンパ球の増殖や分化によって、特定のエフェクター細胞や記憶細胞から成る適応免疫応答が規定される。免疫応答の初期段階においては、自然免疫は、微生物関連モチーフを認識すると共に、損傷により誘導された内発性危険シグナルをも認識する。この危険シグナルとは、損傷後における特定リンパ球の分化方向や免疫応答の全体的プロフィールを決定するものである。危険シグナルが存在しない場合には、Ｔ細胞及びＢ細胞の応答性が低下し、特に、抗原量が中程度から高度の所で免疫寛容を生じる。このことが無害の抗原と感染に関わる「危険」な抗原とを区別する決定的メカニズムであると提唱されてきた。また、このメカニズムは、これまで抗原−受容体レパートリーのレベルのみにおいて決定されると考えられていた自己と非自己とを区別する免疫システムの戦略に新たな視点を与えている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
適応免疫応答はＴ細胞及びＢ細胞のエピトープの認識によって刺激され、自然免疫受容体を介して作用する「危険」シグナルによって形作られる。本願では、非コード二本鎖或いは一本鎖ＲＮＡに関連するモチーフが、ウィルス感染に似た免疫応答、即ち炎症促進性(pro-inflammatory)ケモカイン発現の急速な誘導、抗原提示細胞(ＡＰＣ)の増加（recruitment）及び活性化、免疫調節サイトカインの調節、Ｔｈ１細胞の分化、アイソタイプのスイッチング、クロスプライミングの刺激等、ＭＨＣクラスＩ拘束性免疫応答の誘導に関わる免疫系応答に対して基本的機能を与えるということを示す。また本願では、ＲＮＡ関連モチーフの不均一性が免疫応答プロフィールに様々な影響を及ぼすことを示す。ウィルス感染に際し特定のＲＮＡモチーフが示す能力である、寛容誘導の阻止能力と免疫防御の効果的構築能力とに基づき、このようなＲＮＡ種が強力な「危険シグナル」であることを示す。さらに本願では、選択したＲＮＡモチーフ群をアジュバントとして用いてサブユニットワクチンに対する免疫応答を最適化することを教示する。ウィルス感染の際に産生されるＲＮＡ関連モチーフが、自然免疫に短期的影響を与えるのみならず、早期応答と、抗原特異性Ｂ細胞及びＴ細胞の活性化と分化を含む後期適応段階との間を橋渡しするものであることが結論付けられる。
【０００５】
本願では、ＲＮＡの一本鎖対二本鎖の性質の違いに加えて、オリゴヌクレオチドの組成が自然免疫受容体による非コードＲＮＡモチーフの認識のための重要な決定基であることを示す。更に、不均一なＲＮＡモチーフが、適応免疫に対して強力且つ様々な影響を及ぼし、ウィルス感染の際の免疫応答の特徴の多くを媒介するするものであることを示す。最後に、新たに開示するＲＮＡモチーフが、各種感染症やガンに対して予防的或いは治療的に用いることにより防御メカニズムを効果的に作動させるものであることも示す。
【０００６】
本願は２００２年３月１５日出願の米国特許仮出願第６０／３６４，４９０号及び２００２年９月２０日出願の米国特許仮出願第６０／４１２，２１９号に基づく優先権を主張しており、これら出願を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の実施態様を含む。
【０００８】
１．抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、二本鎖ＲＮＡを含有する組成物を投与することと、前記組成物と前記抗原とを同時投与することとを含む方法。
【０００９】
２．抗原が体内に既に存在している場合に抗原に対する免疫応答を増強或いは調節する方法であって、二本鎖ＲＮＡを含有する組成物を投与することを含む方法。
【００１０】
３．ＲＮＡが非コードＲＮＡである、パラグラフ１に記載の方法。
【００１１】
４．二本鎖ＲＮＡがポリアデニン及びポリウラシルから成る、パラグラフ１又は２に記載の方法。
【００１２】
５．二本鎖ＲＮＡが、ポリグアニンとポリシトシン、及びポリイノシンとポリシトシンから成る群の一方から成る、パラグラフ１又は２に記載の方法。
【００１３】
６．二本鎖ＲＮＡがアデニンとウラシルとから成る、パラグラフ１又は２に記載の方法。
【００１４】
７．二本鎖ＲＮＡがグアニンとシトシン、又はイノシンとシトシンから成る、パラグラフ１又は２に記載の方法。
【００１５】
８．Ｔｈ１細胞及びＴｃ１細胞の応答を増強する、パラグラフ１に記載の方法。
【００１６】
９．Ｔｃ１細胞応答を誘導する、パラグラフ１に記載の方法。
【００１７】
１０．Ｂ細胞応答を増強する、パラグラフ１に記載の方法。
【００１８】
１１．前記抗原を別の抗原と同時投与する、パラグラフ１に記載の方法。
【００１９】
１２．ＣＸＣケモカイン及びＣＣケモカインを誘導する、パラグラフ１に記載の方法。
【００２０】
１３．ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、及びＩＰ−１０を誘導する、パラグラフ１２に記載の方法。
【００２１】
１４．前記組成物の前記投与が、ＣＤ１１ｂ＋単球又はＣＤ１１ｃ＋樹状細胞を増加させ活性化させることにより、Ｔ細胞及びＢ細胞の応答を増強する、パラグラフ１に記載の方法。
【００２２】
１５．二本鎖ＲＮＡ組成物が、抗原提示細胞を増加させることにより免疫応答を増強する、パラグラフ１に記載の方法。
【００２３】
１６．抗原提示細胞がプロフェッショナルＡＰＣである、パラグラフ１に記載の方法。
【００２４】
１７．二本鎖ＲＮＡ組成物がイノシンとシトシンとを含み、ＣＤ１１ｃ+樹状細胞の効果的な増加を誘導する、パラグラフ１又は２に記載の方法。
【００２５】
１８．パラグラフ１又は２に記載の方法であって、二本鎖がイノシンとシトシンとを含むＲＮＡ組成物及びアデニンとウラシルとを含むＲＮＡ組成物から成る群から選択され、該方法がＣＤ１１ｂ＋単球の効果的な増加を誘導する、パラグラフ１又は２に記載の方法。
【００２６】
１９．ＡＰＣが活性化される、パラグラフ１５に記載の方法。
【００２７】
２０．抗原が非感染性抗原であり、ＲＮＡ ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞が、ポリアデニンとポリウラシルとを含むＲＮＡ組成物によりクロスプライミングされる、パラグラフ４に記載の方法。
【００２８】
２１．ＲＮＡ組成物を粘膜投与する、パラグラフ４〜７に記載の方法。
【００２９】
２２．非感染性抗原に対する大量域寛容を阻止する方法であって、ポリアデニンとポリウラシル、若しくはポリイノシンとポリシトシンのいずれかを含む二本鎖ＲＮＡ組成物と共に前記非感染性抗原を投与することを含む方法。
【００３０】
２３．非感染性抗原を高用量で投与するか、或いは非感染性抗原が既に体内に存在している、パラグラフ２２に記載の方法。
【００３１】
２４．該用量が、寛容を生ぜしめうる（toleragenic）量の抗原である、パラグラフ２２に記載の方法。
【００３２】
２５．Ｂ細胞の不応答を防止する、パラグラフ２２に記載の方法。
【００３３】
２６．組成物や抗原を、各種担体と複合化して或いは複合化せずに、粘膜投与、呼吸器投与、静脈内投与、皮下投与、及び筋肉内投与の一により投与する、パラグラフ１、２及び２２に記載の方法。
【００３４】
２７．Ｉｇバックボーンに結合した少なくとも一の抗原ペプチドエピトープを用いて抗原提示細胞にロードすることによりＩｇ−ペプチド分子を形成し、該Ｉｇ−ペプチド分子をｄｓＲＮＡモチーフと共に生体内投与することを含み、エピトープがＭＨＣ Ｉ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、抗原との生体内での接触に続いて、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞が効果的に二次増殖する、免疫方法。
【００３５】
２８．抗原がウィルスである、パラグラフ２７に記載の方法。
【００３６】
２９．ウィルスがインフルエンザウィルスである、パラグラフ２８に記載の方法。
【００３７】
３０．ペプチド−エピトープがｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）である、パラグラフ２７に記載の方法。
【００３８】
３１．ｄｓＲＮＡがｐＡ：ｐＵである、パラグラフ２７に記載の方法。
【００３９】
３２．Ｔ細胞が細胞障害性Ｔリンパ球である、パラグラフ２７に記載の方法。
【００４０】
３３．抗原との生体内での接触に続くＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞の二次増殖が、組換え抗原を無菌生理食塩水に添加して投与しただけの場合よりも大きい、パラグラフ２７に記載の方法。
【００４１】
３４．ＩｇＧバックボーンに結合した少なくとも一の腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを用いて抗原提示細胞にロードすることによりＩｇＧ−ペプチド分子を形成し、該Ｉｇ−ペプチド分子をｄｓＲＮＡと共に生体内投与する、臨床診断後の腫瘍の制御及び処置方法。
【００４２】
３５．腫瘍関連Ｔ細胞エピトープがＭＨＣ Ｉ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体が生じる、パラグラフ３４に記載の方法。
【００４３】
３６．腫瘍関連Ｔ細胞エピトープに対する免疫応答と腫瘍拒絶を生じる、パラグラフ３４に記載の方法。
【００４４】
３７．ｄｓＲＮＡがｐＡ：ｐＵである、パラグラフ３４に記載の方法。
【００４５】
３８．Ｉｇ−Ｇペプチド複合体及びｄｓＲＮＡを抗腫瘍治療として繰り返し投与する、パラグラフ３４に記載の方法。
【００４６】
３９．腫瘍拒絶が生じると、Ｔｃ１免疫が腫瘍関連エピトープに対して生じる、パラグラフ３４及び３５に記載の方法。
【００４７】
４０．ＩｇＧ−ペプチド及びｄｓＲＮＡを投与すると、Ｔｃ２免疫が腫瘍関連エピトープに対して生じる、パラグラフ３４に記載の方法。
【００４８】
４１．同種の腫瘍関連エピトープに対する有効な記憶応答を更に誘導する、パラグラフ３４に記載の方法。
【００４９】
４２．腫瘍細胞変異体に対する継続的な免疫（continued immunity）を生じる、パラグラフ３４に記載の方法。
【００５０】
４３．抗原に対する抗体応答を増強する方法であって、ヒト又はヒト以外の哺乳類に対して該抗原を、ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ及びｐＣ：ｐＧ又はそれらの混合物から成る群より選択されるｄｓＲＮＡと共に投与することを含む方法。
【００５１】
４４．抗原に対する抗体応答を増強する方法であって、ヒト又はヒト以外の哺乳類に対して該抗原を、ｐＡ、ｐＣ、ｐＩ、ｐＵ、ｐ（Ｇ，Ｕ）、ｐ（Ｃ，Ｕ）、ｐ（Ａ，Ｃ）、ｐ（Ｉ，Ｕ）、ｐ（Ｃ，Ｉ）、ｐ（Ａ，Ｕ）、ｐ（Ａ，Ｇ）、ｐ（Ａ，Ｃ，Ｇ）、ｐ（Ａ，Ｃ，Ｕ）及びｐ（Ａ，Ｇ，Ｕ）から成る群より選択される一本鎖ＲＮＡ種の混合物と共に投与することを含む方法。
【００５２】
４５．ポリアデニン及びポリウラシルから成るｄｓＲＮＡ配列を含む、抗原に対する免疫応答を増強するための組成物。
【００５３】
４６．組成物が抗原を更に含む、パラグラフ４５に記載の組成物。
【００５４】
４７．前記抗原が既に体内に存在している、パラグラフ４５に記載の組成物。
【００５５】
４８．前記抗原が医薬的に許容される担体に添加されて投与される、パラグラフ４５に記載の組成物。
【００５６】
４９．前記抗原が免疫グロブリンに添加されて投与される、パラグラフ４５に記載の組成物。
【００５７】
５０．前記医薬的に許容されるものがＩｇＧである、パラグラフ４８に記載の組成物。
【００５８】
５１．抗原が腫瘍関連エピトープである、パラグラフ４５〜４７に記載の組成物。
【００５９】
５２．抗原がウィルスである、パラグラフ４５〜４７に記載の組成物。
【００６０】
５３．抗原が腫瘍関連Ｔ細胞エピトープである、パラグラフ５１に記載の組成物。
【００６１】
５４．ｄｓＲＮＡが前記抗原と共に投与される、パラグラフ４５〜５３に記載の組成物。
【００６２】
５５．前記ｄｓＲＮＡが前記抗原とは別途に投与される、パラグラフ４５〜５３に記載の組成物。
【００６３】
５６．ポリイノシン及びポリシステインから成るｄｓＲＮＡ配列を含む、抗原に対する免疫応答を増強するための組成物。
【００６４】
５７．組成物が抗原を更に含む、パラグラフ５６に記載の組成物。
【００６５】
５８．前記抗原が既に体内に存在している、パラグラフ５６に記載の組成物。
【００６６】
５９．前記抗原が医薬的に許容される担体に添加されて投与される、パラグラフ５６に記載の組成物。
【００６７】
６０．前記抗原が免疫グロブリンに添加されて投与される、パラグラフ５６に記載の組成物。
【００６８】
６１．前記医薬的に許容されるものがＩｇＧである、パラグラフ５９に記載の組成物。
【００６９】
６２．前記抗原が腫瘍関連エピトープである、パラグラフ５６〜５８に記載の組成物。
【００７０】
６３．前記抗原がウィルスである、パラグラフ５６〜５８に記載の組成物。
【００７１】
６４．前記抗原が腫瘍関連Ｔ細胞エピトープである、パラグラフ６２に記載の組成物。
【００７２】
６５．ｄｓＲＮＡが前記抗原と共に投与される、パラグラフ５６〜６４に記載の組成物。
【００７３】
６６．前記ｄｓＲＮＡが前記抗原とは別途に投与される、パラグラフ５６〜６４に記載の組成物。
【００７４】
６７．抗原に対する免疫応答を増強させるための医薬の製造のための二本鎖（「ｄｓＲＮＡ」）の使用であって、前記ｄｓＲＮＡを前記抗原と共に患者に投与することを含む使用。
【００７５】
６８．抗原に対する免疫応答を増強させるための医薬の製造のためのｄｓＲＮＡの使用であって、抗原が既に患者の体内に存在しているときに前記ｄｓＲＮＡを患者に投与することを含む使用。
【００７６】
６９．ｄｓＲＮＡが非コードＲＮＡである、パラグラフ６７又は６８に記載の使用。
【００７７】
７０．二本鎖ＲＮＡがポリアデニンとポリウラシルから成る、パラグラフ６７又は６８に記載の使用。
【００７８】
７１．二本鎖ＲＮＡが、ポリイノシンとポリシトシン、又はポリグアニンとポリシトシンから成る、パラグラフ６７又は６８に記載の使用。
【００７９】
７２．二本鎖ＲＮＡがアデニンとウラシルを含む、パラグラフ６７又は６８に記載の使用。
【００８０】
７３．二本鎖ＲＮＡがグアニンとシトシン、又はイノシンとシトシンを含む、パラグラフ６７又は６８に記載の使用。
【００８１】
７４．Ｔｈ１細胞及びＴｃ１細胞の応答が増強される、パラグラフ６７〜７３に記載の使用。
【００８２】
７５．抗原に対するＴｃ１細胞の応答が誘導される、パラグラフ６７〜７３に記載の使用。
【００８３】
７６．前記方法が抗原に対するＢ細胞の応答を増強する、パラグラフ６７〜７３に記載の使用。
【００８４】
７７．前記抗原が別の抗原と同時投与される、パラグラフ６７又は６８に記載の使用。
【００８５】
７８．前記方法がＣＸＣケモカイン及びＣＣケモカインを誘導する、パラグラフ６７又は６８に記載の使用。
【００８６】
７９．前記方法がＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、及びＩＰ−１０を誘導する、パラグラフ６７又は６８に記載の使用。
【００８７】
８０．前記ｄｓＲＮＡの前記投与が、ＣＤ１１ｂ＋単球又はＣＤ１１ｃ＋樹状細胞を増加させ活性化することにより、Ｔ細胞及びＢ細胞の応答を増強する、パラグラフ６７〜７１に記載の使用。
【００８８】
８１．二本鎖ＲＮＡ組成物が、抗原提示細胞を増加させることにより、免疫応答を増強する、パラグラフ６７〜７１に記載の使用。
【００８９】
８２．抗原提示細胞がプロフェッショナルＡＰＣである、パラグラフ８１に記載の使用。
【００９０】
８３．二本鎖ＲＮＡ組成物がイノシンとシトシンを含み、ＣＤ１１ｃ+樹状細胞の効果的増加を誘導する、パラグラフ７１に記載の使用。
【００９１】
８４．前記二本鎖が、イノシンとシトシンとを含むＲＮＡ組成物、及びアデニンとウラシルとを含むＲＮＡ組成物から成る群より選択され、前記方法がＣＤ１１ｂ＋単球の効果的増加を誘導する、パラグラフ６７又は６８に記載の使用。
【００９２】
８５．前記抗原が非感染性抗原であり、ＲＮＡ ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞がポリアデニンとポリウラシルを含むＲＮＡ組成物によりクロスプライミングされる、パラグラフ６７〜７０に記載の使用。
【００９３】
８６．組成物や抗原が、各種担体と複合化され或いは複合化されないで、粘膜投与、呼吸器投与、静脈内投与、皮下投与、及び筋肉内投与の一により投与される、パラグラフ６７〜７０に記載の使用。
【００９４】
８７．非感染性抗原に対する大量域寛容を防止するための医薬の製造のためのｄｓＲＮＡの使用であって、ポリアデニンとポリウラシル、若しくはポリイノシンとポリシトシンのいずれかを含む二本鎖ＲＮＡ組成物と共に前記非感染性抗原を投与することを含む使用。
【００９５】
８８．前記非感染性抗原が高用量で投与されるか、或いは既に体内に存在している、パラグラフ８７に記載の使用。
【００９６】
８９．該用量が、寛容を生ぜしめうる量の抗原である、パラグラフ８７に記載の使用。
【００９７】
９０．前記方法がＢ細胞の不応答を防止する、パラグラフ８７に記載の使用。
【００９８】
９１．Ｉｇバックボーンに結合した少なくとも一の抗原ペプチドエピトープを用いて抗原提示細胞にロードすることによりＩｇ−ペプチド分子を形成し、該Ｉｇ−ペプチド分子をｄｓＲＮＡモチーフと共に生体内投与することを含み、エピトープがＭＨＣ Ｉ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、抗原との生体内での接触に続いて、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞が効果的に二次増殖する、医薬の製造のためのｄｓＲＮＡの使用。
【００９９】
９２．抗原がウィルスである、パラグラフ９１に記載の使用。
【０１００】
９３．ウィルスがインフルエンザウィルスである、パラグラフ９１に記載の使用。
【０１０１】
９４．ペプチドエピトープがｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）である、パラグラフ９１に記載の使用。
【０１０２】
９５．ｄｓＲＮＡがｐＡ：ｐＵである、パラグラフ９１に記載の使用。
【０１０３】
９６．Ｔ細胞が細胞障害性Ｔリンパ球である、パラグラフ９１に記載の使用。
【０１０４】
９７．ＩｇＧバックボーンに結合した少なくとも一の腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを用いて抗原提示細胞にロードすることによりＩｇＧ−ペプチド分子を形成し、該Ｉｇ−ペプチド分子をｄｓＲＮＡと共に生体内投与することを含む、臨床診断後の腫瘍の制御及び処置のための医薬の製造におけるｄｓＲＮＡの使用。
【０１０５】
９８．腫瘍関連Ｔ細胞エピトープがＭＨＣ Ｉ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体を生じる、パラグラフ９７に記載の使用。
【０１０６】
９９．前記方法が腫瘍関連Ｔ細胞エピトープに対する免疫応答と腫瘍拒絶を生じる、パラグラフ９７に記載の使用。
【０１０７】
１００．ｄｓＲＮＡがｐＡ：ｐＵである、パラグラフ９７に記載の使用。
【０１０８】
１０１．Ｉｇ−Ｇペプチド複合体及びｄｓＲＮＡが抗腫瘍治療として繰り返し投与される、パラグラフ９７に記載の使用。
【０１０９】
１０２．腫瘍拒絶が生じると、Ｔｃ１免疫が腫瘍関連エピトープに対して生じる、パラグラフ９７に記載の使用。
【０１１０】
１０３．ＩｇＧ−ペプチド及びｄｓＲＮＡを投与すると、Ｔｃ２免疫が腫瘍関連エピトープに対して生じる、パラグラフ９７に記載の使用。
【０１１１】
１０４．前記方法が、同種の腫瘍関連エピトープに対する有効な記憶応答を更に誘導する、パラグラフ９７に記載の使用。
【０１１２】
１０５．前記方法が、腫瘍細胞変異体に対する継続的な免疫を生じる、パラグラフ９７に記載の使用。
【０１１３】
１０６．抗原に対する抗体応答を増強するための医薬の製造におけるｄｓＲＮＡの使用であって、ヒト又はヒト以外の哺乳類に対して前記抗原を、ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ及びｐＣ：ｐＧから成る群より選択されるｄｓＲＮＡと共に投与することを含む使用。
【０１１４】
１０７．抗原に対する抗体応答を増強するための医薬の製造におけるｄｓＲＮＡの使用であって、ヒト又はヒト以外の哺乳類に対して前記抗原を、ｐＡ、ｐＣ、ｐＩ、ｐＵ、ｐ（Ｇ，Ｕ）、ｐ（Ｃ，Ｕ）、ｐ（Ａ，Ｃ）、ｐ（Ｉ，Ｕ）、ｐ（Ｃ，Ｉ）、ｐ（Ａ，Ｕ）、ｐ（Ａ，Ｇ）、ｐ（Ａ，Ｃ，Ｇ）、ｐ（Ａ，Ｃ，Ｕ）及びｐ（Ａ，Ｇ，Ｕ）から成る群より選択される一本鎖ＲＮＡ種の混合物と共に投与することを含む使用。
【０１１５】
１０８．ポリアデニン及びポリウラシルから成るｄｓＲＮＡ配列を含む、抗原に対する免疫応答を増強するための医薬の製造におけるｄｓＲＮＡの使用。
【０１１６】
１０９．前記組成物が抗原を更に含む、パラグラフ１０８に記載の使用。
【０１１７】
１１０．前記抗原が既に体内に存在している、パラグラフ１０８に記載の使用。
【０１１８】
１１１．前記抗原が医薬的に許容される担体に添加されて投与される、パラグラフ１０８に記載の使用。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
自然免疫の潜在的な役割の理解が進んだ結果、微生物感染時における免疫応答のメカニズムが研究の主要な領域となった。自然免疫細胞は、各種細菌に関連したモチーフ、即ち「外因性」危険シグナルを識別する多種に渡る受容体を有していることが直ちに明らかとなった。このパターン認識イベントの後の自然免疫と適応免疫間の連携は、Ｔ細胞及びＢ細胞の応答性及び応答プロフィールに重要な影響を及ぼす。自然免疫は迅速ではあるが識別性に乏しい。しかしながら、自然免疫は、よりゆっくりと進展しより強力なエフェクターで構成される適応免疫を方向付ける。適応免疫は、体細胞突然変異によって獲得した広範囲に亘るレパートリーを有する。自然免疫と適応免疫とを合せて用いる多重パターン認識戦略によって、免疫識別の規範は、自己／非自己認識から危険／非危険認識へと変化した。精製タンパクの免疫原性が低いこと、微生物モチーフにより免疫メディエーターが誘導されること、及びこれらメディエーター（サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子）が適応免疫に対して有する活性の特徴付けは、全てこの概念を支持するものである。
【０１２０】
本願に開示するように、危険シグナルとしての非コードＲＮＡモチーフの役割を明確にする合理的なアプローチをとったところ、ウィルス感染の際、適応免疫を制御するにあたって前記モチーフが果たす役割の理解に直ちに結び付くものであった。更に、ワクチン接種と共にこれらＲＮＡモチーフをアジュバントとして使用することについて研究を行なった。
【０１２１】
合成ＲＮＡのライブラリーと２段階の戦略を採用し、自然免疫ではなく適応免疫に及ぼす効果を読出しとして利用した。この方法により、ＲＮＡの二本鎖の性質に加えて、オリゴヌクレオチドの組成が、この問題に関する役割を果たすことが意外にも見出された。Ａ：Ｕベースのモチーフは、Ｔｈ１免疫の作動、ＩｇＧ２ａへのアイソタイプスイッチング（図１Ａ〜１Ｃ）、クロスプライミング（図３Ａ〜３Ｅ）の各能力が、Ｉ：Ｃベースのモチーフに比べ高いことが示される。先に定義したこのＩ：Ｃモチーフは、Ｔ２細胞及びＢ細胞免疫（図１Ａ〜１Ｃ）を増強する。ｄｓＲＮＡに関連するＣ：Ｇモチーフ、或いは種々雑多なｓｓＲＮＡモチーフは、相補塩基で構成されるｓｓＲＮＡの混合物を用いない限りは、適応免疫に対し低い効果しか示さなかった。これらの結果は、機能的ＴＬＲ４の非存在下で再現されたことから、この時点でエンドトキシン認識経路と共通の経路は除外することができる。最近になって、ＴＬＲ３はｐＩ：ｐＣを認識する役割を果たすことがわかってきたが、ｐＡ：ｐＵとｐＩ：ｐＣの二種のモチーフによって誘起される免疫応答プロフィールは大きく異なるため（図１Ａ〜１Ｃ）、ｐＡ：ｐＵとの共通認識経路ではないと考えられる。それよりも、ＴＬＲ３以外のＴＬＲアイソフォーム及び／又は共受容体が、基本的（rudimentary）免疫レパートリーを連想させるプロセスによって、ヌクレオチドの同一性に基づいてＲＮＡモチーフを識別するプロセスに関係していると考えられる。反復的非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドモチーフを認識することがわかったＴＬＲ９、或いはＴＬＲのアイソフォームが、ｄｓＲＮＡ−モチーフの識別に関与している可能性もある。しかしながら最近の証拠ではＴＬＲの関与は裏付けられていない。ｄｓＲＮＡが誘導する転写因子と共刺激分子のスペクトルは、非メチル化ＣｐＧモチーフのスペクトルとが異なるのである。ｐＩ：ｐＣ及びｐＡ：ｐＵはどちらもＣＸＣケモカインを誘導するため（図３Ａ）、選択的にＴｈ２細胞に結合する能力を有するＣＣケモカイン等、他のメディエーターが、これらのモチーフによって惹起される異なるＴｈプロフィールの原因となっていると考えられる。
【０１２２】
データによれば、新規に特徴付けられたｐＡ：ｐＵ結合モチーフは、適応免疫応答の、通常はウィルス感染した後にのみに見出される多くの特徴を誘導できると結論される。タンパク抗原（ＯＶＡとｇｐ１４０）及び不活性化インフルエンザウィルスによるＴ１応答（Ｔｈ１とＴｃ１の双方）の誘導が示されている（図１〜３）。タンパク抗原に対するＭＨＣクラスＩ拘束性応答の誘導は（図３Ｄ、Ｅ）、このＲＮＡモチーフがプロセシングと提示のメカニズムに適合するレベルにまでＡＰＣを活性化するのに十分であったことを示唆しており、クロスプライミングがウィルス感染の主要なメカニズムであることを裏付ける新規な情報を示している。このことはＡＰＣの直接感染よりも、ＲＮＡ関連危険モチーフが、インフルエンザウィルス等のＲＮＡウィルスの感染の際に細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が誘導される原因であることを示唆している。免疫応答性の増強は、ＡＰＣの急速な増加と活性化によって説明できる（図３Ａ〜３Ｅ）。ｐＡ：ｐＵによって促進されるＴ１免疫の誘導はアイソタイプスイッチングを伴い、ＩｇＧ２ａ抗体の生成を生じる（図１Ｂ）。しかしながら、ｄｓＲＮＡは、ＩｇＡクラスに対するアイソタイプスイッチングは誘導できなかった。これはＴＧＦ−βの阻害と関連性があり（図示せず）、ｄｓＲＮＡ危険モチーフが、炎症促進性メディエーターの誘導及び抗炎症メディエーターの下方調節(down-regulation)によって作用することを示唆している。これらの結果は、インフルエンザ等の感染の際に、ｄｓＲＮＡモチーフが適応免疫を形成する重要な（但しこれのみに限定されるものではない）役割と一致する。
【０１２３】
強力な危険モチーフは、免疫応答性・不応答（寛容）の点で結果に影響を及ぼすはずであるので、免疫不応答がうまく特徴付けられたモデルである、ヒトＩｇＧに対する大量域寛容をｄｓＲＮＡが阻止するかどうかが検討された。ｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣの両者が、適応免疫のモジュレータであるばかりでなく、免疫寛容の強力な阻害剤であることが示された（図４Ａ〜４Ｂ）。この観察は、ｄｓＲＮＡが有する特徴パネルを豊かにし、危険モチーフのアジュバンド効果が一般に、少なくとも部分的には免疫不応答の防止によって生じている可能性を開く。最後に、Ａ及びＵ塩基は天然ＲＮＡ種に見出されるが、Ｉ（イノシン）塩基は見出されないため、データは、ウィルス感染の際の免疫応答に対する潜在的な関連性を有する前者のｄｓＲＮＡモチーフを示す。
【０１２４】
危険モチーフとしてのｐＡ：ｐＵの効力は、インフルエンザウィルスによる一次感染に対する制御能力によって示される（図４Ａ〜４Ｂ）。自然免疫及び適応免疫の迅速な可動性により説明できるこの特徴は、一次感染の際の非メチル化ＣｐＧオリゴＤＮＡモチーフの免疫防御能力を強く想起させる。これを敷衍すれば、自然免疫は異種の或いは外因的に生成された感染関連ポリヌクレオチドモチーフを認識する精巧な能力を有し、それによって適応免疫を調節すると結論される。従って、系内に抗原が存在する場合、ｄｓＲＮＡへの更なる接触は、免疫応答を簡単に、より効果的に働かせることができると考えられ、抗原のクリアランスについての直接的示唆が与えられる。
【０１２５】
ここに記述する結果に基づくと、ｄｓＲＮＡモチーフは、サブユニット、組換えワクチン或いは不活性化ワクチンと協同するアジュバントとしての理にかなった候補である。特に、ｐＡ：ｐＵは、ベクター複製がない場合に、生ワクチンの有益な特徴の内の或るものを提供しているらしく思われる。本願は、粘膜や全身に対してのワクチン接種を行うための、抗原とｄｓＲＮＡの同時処方を可能にする免疫複合体を開示する。図５Ａ〜５Ｄに示すように、これら複合体を用いる肺のワクチン接種と癌の免疫治療は、抗体、Ｔヘルパー及びクラスＩ拘束性Ｔ細胞から成る強力な免疫応答の誘導を生じる。
【０１２６】
結論として、適応免疫応答に影響を及ぼすＲＮＡモチーフを選択する合理的なアプローチを用いることにより、予期せぬ多様性と新規のＲＮＡ関連危険モチーフが定義された。適応免疫応答の体系的な検討により、選択されたＲＮＡモチーフが、自然感染を想起させる広範囲に亘る特徴を組織することが示された。最後に、本願の検討は、免疫不応答、即ち寛容を排除することによる免疫治療のみならず、粘膜或いは全身に対するワクチン接種に使用される可能性を有するこれらＲＮＡモチーフを含む新規な調剤を明確にするものである。
【０１２７】
Ａ）材料及び方法
１）抗原及び免疫調節剤
一本鎖及び二本鎖合成ＲＮＡ１８種のパネル（表１参照）をシグマ社（Sigma）から購入し、無菌ＰＢＳに溶解した。これらのＲＮＡはプールとして或いは個々に使用した。卵白アルブミン（ＯＶＡ、低エンドトキシン）はシグマ社（Ａ７６４１）から購入した。コレラ毒サブユニットＢ（ＣＴＢ）はカルビオケム（Calbiochem）（カタログ番号２２７０３９）から、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）はＤＩＦＣＯ（カタログ番号２６３８１０）から、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）はシグマ社（カタログ番号Ｉ４５０６）から購入した。コンホメーションエピトープを保ち且つ三量体化する能力を有する組換えｇｐ１４０  ＨＩＶ抗原は、停止変異（stop mutation）を導入することにより、ＩＩＩＢ株のｇｐ１６０エンベロープタンパク質から得た。この抗原は、ベルナルド・モス（Bernard Moss）博士（Ｎ．Ｉ．Ｈ．）の厚意により提供されたワクチニアウィルスベクターによってＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ）細胞内で発現し、レンチルレクチンセファロースクロマトグラフ（ファーマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって精製した。ｇｐ１４０抗原であることは、フィッツジェラルド（Fitzgerald）（カタログ番号２０−ＨＧ８１）から購入したＨＩＶエンベロープ特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析によって確認した。インフルエンザウィルス（Ａ／ＷＳＮ／３２Ｈ１Ｎ１株）はＭＤＢＫ細胞で増殖させ、上清からショ糖勾配遠心法によって精製した。ウィルスの不活性化のために、ウィルス粒子を攪拌しながら１５分間、短波長ＵＶ光に曝露した。不活性化は、許容ＭＤＣＫ細胞へのウィルス滴定により確認した。可変領域内にＩ−Ｅd−拘束性ヘマグルチニン由来ペプチドＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ（ＩｇＨＡ）［配列番号１］を有する組換えマウスＩｇＧ2ｂを得て、先に特徴付けたように精製した。
【０１２８】
【表１】
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【０１２９】
２）動物
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ及びＴＬＲ４−／−Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ雌性マウスを、ジャクソンラボラトリ（Jackson Laboratories、マサチューセッツ州バーハーバー）から購入し、アライアンス・ファーマスーティカル社（Alliance Pharmaceutical Corp.）で特定の病原体条件に収容した。Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスにおける観察結果の主要なものは、エンドトキシンに対する応答性を欠損したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいて再現された。雌性のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３３０グラム）はタコニックファーム（Taconic Farms）から購入し、同様の条件下に置いた。
【０１３０】
３）免疫感作、攻撃、及びウィルス力価の測定
マウスとラットは前述のように各々気管内点滴、噴霧投与によってプライミングし、マウスの場合は、鼻腔内に二週間の間隔で二回追加免疫を行った。大量域寛容の誘導のために、それらのマウスを静注によってプライミングした。最後に、強い免疫応答を誘導するために、マウスをＣＦＡで乳化した抗原の皮下注射により免疫感作した。プライミング、追加免疫、或いは寛容の誘導に用いた抗原の量は、ＯＶＡ−１００μｇ、ＨＩＶ  ｇｐ１４０−１０μｇ、ｈＩｇＧ−２００μｇ、ショ糖精製ＵＶ−ＷＳＮ−２０μｇであった。合成ＲＮＡは、一用量につき４０〜５０μｇの量を、抗原と共に或いは抗原なしで、ＳＣＬ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳに添加し或いは添加せずに用いた。ＣＴＢの一用量当たりの含有量は１０μｇであった。抗原は、生理食塩水に添加して導入するか、或いは処方の際にＳＣＬマトリクスと適合する不活性ビヒクルであるパーフルオロカーボン（パーフルブロン（perflubron）（未希釈なパーフルオロオクチルブロマイド）、リクイベント（Liquivent(）、アライアンス・ファーマスーティカル社）に添加して導入する（点滴或いは噴霧投与の全量は４０〜４５μＬ）。
【０１３１】
ウィルス攻撃のために、Ｃ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ４−／−Ｃ3Ｈ／ＨｅＪマウスを、メトファン麻酔下で亜致死量（ＴＣＩＤ50：１０4組織培養感染量５０％）のＷＳＮウィルス生菌に経鼻感染させた。感染５日後、マウスを殺し肺を摘出し、ホモジネートして−７０℃で保存した。ウィルス力価は、許容ＭＤＣＫ細胞による試料の段階希釈液を４８時間インキュベートし、次いでニワトリ赤血球細胞（アニマルテクノロジー社から入手）による標準血球凝集反応により測定した。終点力価は３回の測定の補間によって評価し、器官当りのＴＣＩＤ50として表した。
【０１３２】
４）免疫複合体
リン脂質を主な賦形剤として短鎖脂質複合体（「免疫複合体」）を得る技術プロセスは噴霧乾燥であった。ここではこのプロセスのより簡略化したバージョンを用いた。即ち、リン脂質を水にホモジネートし（リポソーム或いはミセルの形成のため）、賦形剤と活性剤を混合し、次いで噴霧乾燥した。詳細には、噴霧乾燥の直前に、２種の調製物ＡとＢを混合して水性組成物を調製した。調製物Ａは、０．１４ｇのジオクタノイルホスファチジルコリン（アバンティポーラーリピッズ社（Avanti Polar Lipids））を２３ｍＬの温ＤＩ水に溶解したミセル調製物を含んでいた。このリン脂質ミセル調製物に、０．０３５７ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏと０．７１４ｇｒのラクトースを溶解した。調製物Ｂは、２０ｍｇの卵白アルブミン（シグマ社）と５ｍＬのＰＢＳに溶解した４ｍｇのｐＡ：ｐＵ（エンドトキシンは含まず）とを含んでいた。フィード用混合物（２ｍＬ調製物Ａ＋調製物Ｂ）を標準Ｂ−１９１ミニ噴霧乾燥機によって次の条件で噴霧乾燥した。入口温度７０℃、出口温度４３℃、アスピレータ９０％、ポンプ２．２ｍＬ／分、窒素流量２４００Ｌ／時間。得られた複合体のＰＬ：ＯＶＡ：ｐＡｐＵ：ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ：ラクトースの重量比は１２：２０：４：３：６１であった。
【０１３３】
５）抗体及びＴ細胞応答の測定
抗体応答はＥＬＩＳＡによって測定した。即ち、ウェルを抗原（２μｇ／ｍＬのｇｐ１４０、８μｇ／ｍＬのショ糖精製ウィルス、１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ又は１０μｇ／ｍＬのＯＶＡ）でコーティングし、シーブロック（SeaBlock）（ピアース社（Pierce）、イリノイ州ロックフォード、カタログ番号３７５２７）でブロッキングした。血清と気管支肺胞洗浄液の段階希釈液は、室温で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ（シグマ社、カタログ番号Ａ７４３４）結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたアッセイを行い、基質（ｐＮＰＰ、シグマ社、カタログ番号Ｎ２７６５）を添加し、ソフトマックス（SoftMax）ソフトウェアを備えた自動ＥＬＩＳＡリーダー（モルキュラーデバイス社社（Molecular Devices）、ThermoMax）で測定した。
【０１３４】
細胞応答の測定のために、脾臓を７０ミクロンナイロンファルコンストレーナ（ベクトンディッキンソン社（Becton Dickinson）、カタログ番号３５２３５０）に付し、次いで赤血球溶解緩衝液（シグマ社、カタログ番号Ｒ７７５７）によって赤血球を溶解することにより脾臓細胞浮遊液を得た。肺組織をコラゲナーゼ（シグマ社、カタログ番号Ｃ９８９１）で消化し、次いでフィコールパーク（Ficoll-Paque）（アマシャムファルマシア社（Amersham Pharmacia）、カタログ番号１７−１４４０−０２）勾配遠心によって、肺関連脂質組織からリンパ球を単離した。Ｔ細胞応答はＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定した。９６ウェルの４５ミクロン混合セルロースエステルプレート（ミリポア社（Millipore）、カタログ番号ＭＡＨＡ  Ｓ４５１０）を、４μｇ／ｍＬのラット抗マウス抗ＩＦＮγ、抗ＩＬ−２或いは抗ＩＬ−４モノクロナール抗体（ＢＤファーミンジェン社（PharMingen）、カタログ番号５５４４３０、カタログ番号１８１６１Ｄ、カタログ番号５５４３８７）でコーティングした。１０％ＦＣＳを含む無菌生理食塩水３７℃で１時間処理しブロッキングした後、脾臓細胞浮遊液を抗原或いはペプチドと共に、又はなしで、ウェル当たり５×１０5細胞添加した。肺リンパ球の場合は、刺激の前にエフェクター細胞とマイトマイシン処理した脾臓刺激細胞とを１：１で混合した。刺激のために、段階的に量を変えた各種抗原（ＯＶＡ、ｇｐ１４０、ｈＩｇＧ、或いはショ糖精製ＷＳＮウィルス）、或いはペプチド（クラスＩＩ拘束性ＨＡ  ＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ［配列番号１］、或いはクラスＩ拘束性ＳＩＩＮＦＥＫＬ［配列番号２］と前述のＨＩＶ  Ｖ３由来Ｒ１０Ｋペプチド）を用いた。刺激から７２時間後、ビオチン化ラット抗マウスサイトカイン抗体（ＢＤファーミンジェン社）、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（バイオソース社（BioSource Int.）、カリフォルニア州カマリロ）と不溶性ＡＥＣ基質を用いたアッセイを行った。結果は多重パラメータ解析ソフトウェア（イメージプロ（Image Pro）、メディアサイバネティックス社（Media Cybernetics））を備えた自動イメージングシステム（ナビター／マイクロメイト（Navitar／Micromate））を用い測定した。
【０１３５】
６）ケモカイン遺伝子の発現の測定
前日に合成ＲＮＡで処置したマウスと対照マウスの肺におけるケモカインの発現量を、次に記述するＤＮＡアレイ技術を用い測定した。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社（Qiagen）、カリフォルニア州バレンシア）を用いて肺から単離した。このＲＮＡをＲＮａｓｅ−フリーＤＮａｓｅＩ（ストラタジーン社（Stratagene）、カリフォルニア州サンディエゴ）で処理し更に精製した。ＤＮＡアレイはスーパーアレイ社（SuperArray Inc.、メリーランド州ベサダ）のＮｏｎｒａｄ−ＧＥＡｒｒａｙキットを用い行った。即ち、ｃＤＮＡプローブをビオチン−１６−ｄＵＴＰを含有するｄＮＴＰｍｉｘと共にＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて合成した。ＧＥＡｒｒａｙ膜を６８℃で１〜２時間プリハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは、ビオチン標識ｃＤＮＡと共に膜をインキュベートすることにより行った。ハイブリダイズした膜を、２×ＳＳＣ−１％ＳＤＳで２回、０．１×ＳＳＣ−０．５％ＳＤＳで２回洗浄した。膜をアルカリホスファターゼ抱合型ストレプトアビジン（バイオソース社、カリフォルニア州カマリロ）と共に更にインキュベートし、最終的に、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光基質を用い現像した。シグナルの強度は、Ｇｅｌ−Ｐｒｏソフトウェアを備えたＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ解析システム（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリングス）によって測定した。
【０１３６】
７）フローサイトメトリー
前日に合成ＲＮＡ又は生理食塩水を用い処理をしたマウスの肺から得た細胞浮遊液を、前述のように、コラゲナーゼ消化とフィコール勾配遠心によって調製した。細胞を１％（ｖ：ｖ）マウス血清（シグマ社、カタログ番号Ｍ５９０５）と１％（ｗ：ｖ）ウシアルブミン（フラクションＶ、シグマ社、カタログ番号Ａ３０５９）を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、ＰＥ標識ラット抗マウスＣＤ１１ｂ（ファーミンジェン社、カタログ番号０１７１５Ａ）、ＰＥ標識ハムスター抗マウスＣＤ１１ｃ（ファーミンジェン社、カタログ番号０９７０５Ａ）、或いは適切なＰＥ標識アイソタイプ対照（ファーミンジェン社、カタログ番号１１１２５Ａ又は１１１８５Ａ）を、１０6個の細胞に対して１μｇの抗体となる濃度で氷上で４０分間染色した。分析はベクトンディッキンソンＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ装置によって行った。ヨウ化プロピジウムを用い、生育不能細胞をゲートアウトした。
【０１３７】
８）磁気分離及び養子免疫細胞移入
ＣＤ１１ｃ+樹状細胞等のプロフェッショナルＡＰＣを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から、ラット抗マウス抗ＣＤ１１ｃ抗体（ミルテニイバイオテック社（Miltenyi Biotech））を結合させ磁気ビーズを用いて分離した。即ち、単一細胞浮遊液を、ＭＡＣＳ緩衝液（ＢＳＡとＥＤＴＡ）に１０7細胞／ｍＬで再懸濁し、磁気ビーズと共に氷上で１５’インキュベートし、洗浄し、磁気カラムに通した。溶出前にカラムを３回洗浄し、次いで２回連続して洗浄し、５０μｇ／ｍＬのＲＮＡモチーフ又は５ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−１２（バイオソース社、カリフォルニア州カマリロ）と共に、又はなしで１００μｇ／ｍＬのＩｇＨＡで一夜インビトロパルシングした。あるいは、ラット抗マウスＣＤ４０モノクロナール抗体（ＢＤファーミンジェン社）を事前にコーティングしたウェル上で、細胞をＩｇＨＡと共に一夜インキュベートした。細胞を洗浄し、平衡無菌生理食塩水に再懸濁し、皮下注射によってナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに養子免疫細胞移入した（２．５×１０5ＡＰＣ／マウス）。前述のようにＨＡクラスＩＩ拘束性ペプチドによって刺激した後、Ｔ細胞応答を第１４日にＩＬ−２  ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定した。
【０１３８】
９）統計解析
免疫応答の大きさは、値の正規分布と等分散を仮定し、ｔ検定を用いて比較した。
【０１３９】
Ｂ．結果
１）免疫反応を調節するＲＮＡモチーフの系統的定義
ウィルス感染の際には、一過性の非通常ＲＮＡ種が生成され、「危険」シグナルとして活動する。従って、複数の多様なＲＮＡモチーフが生来の免疫細胞によって認識され、適応免疫応答を大きく調節すると仮定された。この仮定を系統的な原理から検証するために、合成一本鎖及び二本鎖ＲＮＡモチーフのライブラリーを、経気道投与タンパク抗原（ＯＶＡ）に対する特異的ＩｇＧ応答を調節する能力に関してスクリーニングした。プロセスを簡略化するために、スクリーニングを次の２ラウンドに設定した。（１）ラウンド１はＲＮＡ種のプールを用い（表１）、（２）第２ラウンドでは免疫応答に最大の影響を与えるプール内の要素を詳細に調べる。
【０１４０】
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、次の方法によりシグマ社で作成した。
ｓｓＲＮＡ：ポリヌクレオチド（ポリＡ、ポリＵ）は、ヌクレオチドとポリヌクレオチド−ホスホリラーゼを用い酵素的に調製されるが、調製プロセスには動物由来の材料は入らない。ｄｓＲＮＡ：ポリアデニル酸（ポリＡ、ｐＡ）をポリウリジル酸（ポリＵ、ｐＵ）と共にアニール。一般に、本発明のｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡはホモポリマーであり、ｄｓＲＮＡの場合は、単一の塩基或いはヌクレオチド（例えば、アデニン）が一本の鎖を一貫して形成し、その相補が他の鎖を一貫して形成する。ｓｓＲＮＡの場合、一本鎖は同一のヌクレオチドで一貫して形成される。しかしながら、混合ヌクレオチド（ｄｓＲＮＡの場合はその相補も）で形成されたｄｓＲＮＡ或いはｓｓＲＮＡ組成物の使用は、本発明の範囲内である。本発明のｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡ組成物は、塩基／ヌクレオチドであるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、及びイノシン（Ｉ）を含む。表１及び図８ＡのＲＮＡ組成物は、実施例で用いられる各種ＲＮＡ組成物を説明するものである。本発明のＲＮＡ組成物は、実施例２７で調製され精製された。
【０１４１】
本発明で用いられる各種ＲＮＡ鎖は、一般に長さが１００〜２０００の塩基対であるが、１〜２０、２０〜４０、４０〜６０、６０〜８０、８０〜１００、１〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、８００〜９００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００、１４００〜１５００、１５００〜１６００、１６００〜１７００、１７００〜１８００、１８００〜１９００、１９００〜２０００、２０００〜２１００、２１００〜２２００、２３００〜２４００、２４００〜２５００、２５００〜３０００、３０００〜４０００、４０００〜５０００、５０００〜１００００の塩基対であってもよく、また長さが１００００より長い塩基対及び／又はそれらの混合物であってもよい。
【実施例１】
【０１４２】
実施例１：標準抗原（ＯＶＡ）に対する抗体反応に及ぼすＲＮＡモチーフ各種プールの影響
各ＲＮＡプール（表１）が適応免疫に与える影響を、ＯＶＡの経気道同時免疫感作Ｃ５７Ｂ１／６マウスを用いて測定した。「材料及び方法」の章に記載のように、抗体反応は、ＩｇＧ終点力価（ｎ＝４／群）における平均±ＳＥＭとして示す。対照として、無菌ＰＢＳに添加したＯＶＡ、コレラ毒サブユニットＢ（ＣＴＢ）と組み合わせたＯＶＡ、更にＰＢＳだけのものを用いた。図１Ａに示すように、ｄｓＲＮＡに対応するプールが、抗体反応に最大の影響を与え、この特定の免疫を実質的に増強した。一方、互いに相補的な一本鎖種の混合物については、この増強は部分的なものにとどまった。
【０１４３】
これは、残基の性質とＲＮＡの二次構造の双方により、特定のＢ細胞応答に影響する「危険」モチーフとしての作用能力が決まることを示す。
【実施例２】
【０１４４】
実施例２：ＯＶＡに対する抗体反応の誘導に与える種々のｄｓＲＮＡモチーフの個別の作用
ＲＮＡプールの代わりに個々のｄｓＲＮＡを用いた以外は前記実施例と同様に「材料及び方法」の章に記載の方法で実験を行った。結果を図１Ａと同様の仕方で図１Ｂに示す。この結果は、独立した２種類の実験を体現しているものである。ＩＮＳＥＴ：ＯＶＡに対する平均ＩｇＧ２ａ力価と平均ＩｇＧ１力価の比。左から右への順序はメインパネルのものと同じである（ＰＢＳ  ＯＶＡ、ＣＴＢ  ＯＶＡ、ｐＣ：ｐＧ  ＯＶＡ、ｐＩ：ｐＣ  ＯＶＡ及びｐＡ：ｐＵ  ＯＶＡ）。この２ラウンド目のスクリーニングにおいては、図１Ｂに示すように、二本鎖ＲＮＡとして構成された２種類のモチーフ、即ちｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける特定の抗原に対するＩｇＧ応答の発現に大きな影響を与えることが示されている。エンドトキシンに対する応答性が低いＴＬＲ４−／−Ｃ3Ｈ／ＨｅＪマウスでも同様の結果が得られた（図示せず）。
【０１４５】
従って、抗体反応の大きさ及びプロフィールに影響を及ぼす能力はＲＮＡモチーフによって異なる。
【実施例３】
【０１４６】
実施例３：ＯＶＡと共に個別のｄｓＲＮＡモチーフを用いて誘導されるＴ細胞応答の大きさ及びプロフィール
ＥＬＩＳＰＯＴ分析により得られた結果は、脾臓１個当りのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４スポット形成コロニー（ＳＦＣ）の数の平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝４／群）。図１Ｃに示すように、ｐＡ：ｐＵとｐＩ：ｐＣ（４０μｇ、「材料及び方法」参照）の両方が特定のＴ細胞応答に対する増幅効果を有していた。驚くべきことに、特定の抗原に対するＴ細胞応答のプロフィールはＲＮＡ残基の性質に依存しており、これは、免疫系がＲＮＡ関連危険モチーフを区別できることを示している。Ａ残基及びＵ残基を含有するＲＮＡモチーフは、Ｉ及びＣを含有するモチーフよりも、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＩＦＮ−γ−産生Ｔｈ１細胞（図１Ｃ）の分化を方向付けることができる。この結果は、ＩｇＧアイソタイプの誘導が異なることを反映しており、Ｔｈプロフィール（図１Ｂ−ＩＮＳＥＴ）と一致している。
【０１４７】
Ｔヘルパー応答の大きさ及びプロフィールへの影響はｄｓＲＮＡモチーフ毎に異なると結論される。
【実施例４】
【０１４８】
実施例４：ウィルス抗原（ＨＩＶ組換えｇｐ１４０タンパク質）に対する抗体反応に及ぼす特定のｄｓＲＮＡモチーフの影響
図２Ａに示すように、ＨＩＶ  ｇｐ１４０（１０μｇ、「材料及び方法」参照）断片に対する抗体反応に及ぼす影響を、気道を抗原のみで感作した或いは抗原と共にｐＡ：ｐＵ（４０μｇ、「材料及び方法」参照）で感作したＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて測定した。結果はＩｇＧ終点力価（ｎ＝３／群）の平均±ＳＥＭで示す。
【０１４９】
その結果、実際に用いられる可能性のあるウィルス抗原に対する抗体反応が、新規なｄｓＲＮＡモチーフにより増強されることがわかった。
【実施例５】
【０１５０】
実施例５：全ＵＶ不活性化インフルエンザウィルス（Ａ／ＷＳＮ／３２  Ｈ１Ｎ１株（ＵＶ−ＷＳＮ））に対する抗体反応に及ぼす特定のｄｓＲＮＡモチーフの影響
実施例４に示すように、ＵＶ不活性化ＷＳＮウィルス（ＵＶ−ＷＳＮ）（２０μｇ、「材料及び方法」参照）のみによる粘膜免疫感作、或いは該ウィルスと一緒に各ｄｓＲＮＡモチーフ（５０μｇ）を用いて粘膜免疫感作を行った後、インフルエンザウィルス特異ＩｇＧ抗体を測定した。対照として、同じ株のインフルエンザウィルス（ｎ＝４／群）による感染後の抗体反応を用いた。結果は、図２ＢにＩｇＧ終点力価の平均±ＳＥＭとして示す。
【０１５１】
この結果、全不活性化微生物のウィルス抗原に対する抗体反応は、新規なｄｓＲＮＡモチーフにより増強されることがわかった。
【実施例６】
【０１５２】
実施例６：特定のｄｓＲＮＡモチーフの同時投与による、全体を不活性化したインフルエンザウィルスに対するＴ細胞応答の増強
全インフルエンザウィルスに対するＴ細胞応答を、脾臓細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定し、バックグラウンドを引いたＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−２  ＳＦＣ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）で示す。ｐＡ：ｐＵを用いた場合の抗原に対するＴ細胞応答を、抗原のみで免疫感作を行った後の応答、或いはインフルエンザウィルス感染後の応答と比較した（図２Ｃ参照）。
【０１５３】
従って、実施例４〜６に示すように、ｄｓＲＮＡが抗体反応に与える影響は、別の抗原、即ちＨＩＶエンベロープタンパク質（組換えｇｐ１４０）や全不活性化インフルエンザウィルス（図２Ａ、Ｂ）を用いて別々に確認した。実際には、ｐＡ：ｐＵは、ｐＩ：ｐＣよりも、インフルエンザウィルスに対する特定の抗体の力価を、感染により惹き起こされたのと同レベルまで回復させた（図２Ｂ）。更に、ｐＡ：ｐＵは、不活性化したウィルスでの免疫感作において、自然感染による応答レベルまでＴ細胞応答を回復させたことは重要である（図２Ｃ）。このように、各ＲＮＡモチーフは、これまで知られていない広範囲の影響をＴ細胞応答及びＢ細胞応答に与えることがわかった。
【０１５４】
２）ｄｓＲＮＡに関連するモチーフは、プロフェッショナル抗原提示細胞の増加と活性化を調節する。
ｄｓＲＮＡ関連危険モチーフ（ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ等）は自然免疫成分を介して間接的にＴ細胞応答に影響を及ぼすと仮定した。この仮説を検証するため、ＲＮＡ投与後の肺リンパ球様組織におけるケモカイン遺伝子の発現を決定した。
【実施例７】
【０１５５】
実施例７：ＲＮＡモチーフによるケモカイン遺伝子の局所的アップレギュレーション
ＲＮＡモチーフによるケモカイン遺伝子の局所的アップレギュレーションを、経気道処理の１日後、ＤＮＡアレイ技法により測定した（材料及び方法「ケモカイン遺伝子発現の測定」参照）。結果を、非処理マウスの肺組織で測定された発現レベルに対する増加倍率で示す。ｄｓＲＮＡにより惹き起こされたケモカインの発現を、ＬＰＳにより誘導されたものと比較した。Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞と選択的に結合するケモカインはそれぞれ、実線及び破線で囲って示した（図３Ａ）。
【０１５６】
ＤＮＡアレイ技法による測定の結果、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＭＣＰ−１がｐＡ：ｐＵによってもｐＩ：ｐＣによっても強く誘導されることがわかった（図３Ａ参照）。しかしながら、Ｔｈ２細胞により選択的に発現する受容体と結合できるケモカインであるＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３及びＣＣの発現を惹き起こしたのはｐＩ：ｐＣだけであった。ＬＰＳは異なるケモカインの発現を誘導した、即ちＣＸＣケモカインであるＭＩＧ及びＭＩＰ−１α、並びにＣＣケモカインであるＴＣＡ−３のアップレギュレーションを誘導した（図３Ａ参照）。この結果、事前には予測できなかったことであるが、特定のｄｓＲＮＡモチーフによって、ケモカインの複雑なプロフィールが惹き起こされた。
【実施例８】
【０１５７】
実施例８：ｄｓＲＮＡ処理マウスの肺におけるプロフェッショナルＡＰＣの増加
ｄｓＲＮＡ処理したマウスの肺におけるプロフェッショナルＡＰＣの増加を、処理１日後、ＦＡＣＳ分析により評価した。結果を、肺間質組織における全細胞数に対するＣＤｌｌｃ+細胞数及びＣＤｌｌｂ+細胞数の百分率（ｎ＝４／群）として図３Ｂに示す。ＣＤ１１ｂ+（単球）はｐＡ：ｐＵとｐＩ：ｐＣとにより増加するが、これはケモカインのアップレギュレーションと一致する（実施例７参照）。対照的に、ＣＤ１１ｃ+樹状細胞の増加を有効に誘導したのはｐＩ：ｐＣだけであった。ｄｓＲＮＡモチーフは投与部位におけるＡＰＣを増加すると結論される。
【実施例９】
【０１５８】
実施例９：ｄｓＲＮＡモチーフによるプロフェッショナルＡＰＣ（樹状細胞）の活性化
ｄｓＲＮＡモチーフによるプロフェッショナルＡＰＣの活性化を次の方法で確認した。まず、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原と共にｄｓＲＮＡを用いてＣＤ１１ｃ+細胞のパルシングを行い、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに養子移入実験を行い、Ｔ細胞応答を測定した（図３Ｃ）。対照として用いたものは、抗原パルスＡＰＣ、或いはｒＩＬ−１２と抗ＣＤ４０ｍＡｂとで共刺激した抗原付加（loaded）であった。結果は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析で見積もられる脾臓中のＩＬ−２ＳＦＣの数として図３Ｃに示す。
【０１５９】
この結果、ｄｓＲＮＡモチーフは、増加作用を有するのに加え、ＡＰＣを活性化することがわかった。
【実施例１０】
【０１６０】
実施例１０：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ｄｓＲＮＡモチーフにより刺激される、ウィルス抗原に対するＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞のクロスプライミング
ｄｓＲＮＡモチーフにより刺激されるクロスプライミング（ＡＰＣが、クラスＩ拘束性Ｔ細胞を感染なしでプライミングする能力を得る特別な状況をいう）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて検討した。マウスは、人工的に組換えを行ったＨＩＶ  ｇｐ１４０抗原（１０μｇ）と共にｐＡ：ｐＵで処理して用いた。検討は、ＭＨＣクラスＩ拘束性コグネイトペプチドを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激によるＥＬＩＳＰＯＴ分析により行った（「材料及び方法」参照）。対照として、用量を合わせたｇｐ１４０抗原を用いた。結果は、脾臓１個当りのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４ＳＦＣの数の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４／群）として図３Ｄに示す。
【０１６１】
ｄｓＲＮＡモチーフは、実際に用いられる可能性のある非感染性抗原に対するＭＨＣクラスＩ拘束性の誘導を促進すると結論される。
【実施例１１】
【０１６２】
実施例１１：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、ｄｓＲＮＡモチーフにより刺激される、ＯＶＡに対するＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞のクロスプライミング
ｄｓＲＮＡモチーフにより刺激されるクロスプライミングをＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて検討した。マウスは、全ＯＶＡと共にｐＡ：ｐＵで処理して用いた。検討はＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激によるＥＬＩＳＰＯＴ分析により行った（「材料及び方法」参照）。対照として、用量を合わせたＯＶＡ抗原又は無菌ＰＢＳを用いた。結果は、脾臓１個あたりのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４ＳＦＣの数の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４／群）として図３Ｅに示す。
【０１６３】
ｄｓＲＮＡモチーフは、実際に用いられる可能性のある非感染性抗原に対するＭＨＣクラスＩ拘束性の誘導を促進すると結論される。
【０１６４】
ｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣの粘膜投与後の肺間質細胞のＦＡＣＳ分析により、ＣＤ１１ｂ+単球が迅速に増加すること、ＣＤｌｌｃ+樹状細胞についても増加することがわかった（図３Ｂ）。また、ナイーブマウスからのＣＤ１１ｃ+ＤＣを抗原及びｐＡ：ｐＵ或いはより少ないｐＩ：ｐＣと共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートしたところ、これらは活性化されたが、これは、抗原でパルスした細胞をＢＡＬＢ／ｃレシピエントに養子移入したことにより、クラスＩＩ−拘束性Ｔ細胞免疫の増強が惹き起こされたためである（図３Ｃ）。同様の増強が抗ＣＤ４０抗体或いはＩＬ−１２と共にＡＰＣをインキュベーションした場合にも測定された。最後に、組換えＨＩＶエンベロープタンパク質（ｇｐ１４０）及びＯＶＡで粘膜予防接種を行った場合にも、ｐＡ：ｐＵは、強いＣＤ８+Ｔ細胞促進効果を有していた（図３Ｄ−Ｅ）。これは、それぞれＨＩＶエンベロープタンパク質及びＯＶＡからの特徴付けられたＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドを用いたＥＬＩＳＰＯＴ分析により示された。このように、ｄｓＲＮＡは、プロフェッショナルＡＰＣの分化を惹き起こしてＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞のクロスプライミングに適した段階へ導く能力を有する。この種の免疫応答は通常、ウィルス感染の場合にのみ起こる。決定したｄｓＲＮＡモチーフを用いれば、ベクター複製による副作用を伴う生ワクチンベクターは不要とすることができる。更に、これらデータは、ＲＮＡモチーフが自然免疫の要素に大きな影響を与える、即ちＲＮＡモチーフは適応免疫応答を調節する能力を有することを示している。
【０１６５】
３）ｄｓＲＮＡモチーフは、大量域寛容の誘導を阻害し、抗ウィルス防御免疫を誘導する。
危険分子は、無害の抗原と、感染プロセスに関連する抗原とを区別するのに関与している。高用量の場合、非感染性精製タンパク抗原は不応答即ち免疫寛容を誘導する。自己或いは無害の抗原に対して寛容を獲得する中心的な方法は「免疫無視（immunological ignorance）」或いは「免疫寛容」である。前者では、抗原は、空間的分離によりＡＰＣにアクセスできない。後者では、抗原はＡＰＣにアクセスでき、細胞内に取り込まれてプロセシングされるが、共刺激が少ない場合、エピトープが提示される。正味の結果が、Ｔ細胞のこのレベルにおける免疫不応答即ち寛容となり得る。感染や免疫攻撃の場合、「免疫無視」や「寛容」を防ぐメカニズムが存在する。このようなメカニズムは、共刺激分子や炎症性ケモカイン、炎症性サイトカインの発現の活性化を伴う、ＡＰＣの新規な移動パターンの誘導により発生する。その結果、「危険分子」が存在することによって生じた環境において、免疫系が曝されている全ての抗原に対して、無視や寛容よりもむしろ強い免疫応答が生じる。例えば、腫瘍関連抗原は、免疫エフェクターにより無視されたり寛容原性との関連において提示されることも多い。このような抗原に対する免疫受容能を回復するための手段の直接的実用化は、抗癌治療において有意義である。ｐＡ：ｐＵモチーフ及びｐＩ：ｐＣモチーフの危険シグナルとしての適格性を調べるため、ｈＩｇＧの静脈接種による寛容モデルを用いた。
【実施例１２】
【０１６６】
実施例１２：ｄｓＲＮＡモチーフはヒトＩｇＧを注射したマウスにおける大量域寛容を阻害する
まず、マウスに、標準的な寛容原性用量（２００μｇ）のｈＩｇＧのみを静注し（黒印）、或いはこれと共にｐＩ：ｐＣ或いはｐＡ：ｐＵ（４０〜５０μｇ）を静注し（白印；図４Ａ参照）、その後、免疫原性用量（５０μｇ）のｈＩｇＧをＣＦＡに乳化させたものを皮下注射し追加免疫を行った。ｈＩｇＧに対する抗体の力価を、追加免疫後、異なる時間間隔でＥＬＩＳＡにより測定した。対照として、ＣＦＡに添加したｈＩｇＧで免疫感作したマウスを用いた。最大力価（破線）を示す。結果は、終点力価の平均±ＳＥＭ（ｎ＝５／群）として図４Ａに示す。
【０１６７】
この結果、ＣＦＡ中のｈＩｇＧによる追加免疫後の抗体力価で示されるように、生理食塩水中のｈＩｇＧと共にｐＡ：ｐＵ或いはｐＩ：ｐＣを同時接種することにより、Ｂ細胞不応答の誘導が阻止されることがわかった（図４Ａ）。ｄｓＲＮＡ関連モチーフは、このプロトタイプの抗原に対し、より高い一次応答を誘導すると共に二次応答を助ける（rescue）。同様に、Ｔ細胞プロフィールの評価から、ＩＬ−４及びＩＬ−２の産生がｄｓＲＮＡの同時投与により部分的に回復したことがわかった。
【実施例１３】
【０１６８】
実施例１３：個々のｄｓＲＮＡモチーフ毎に、インフルエンザウィルス感染に対する免疫防御を高める能力が異なる。
危険モチーフは、免疫防御の防御体制を即座に高める能力を有すると仮定した。従って、ｐＡ：ｐＵとｐＩ：ｐＣが、インフルエンザウィルスの初期感染の進展にどのような影響を与えるかについて調べた。
【０１６９】
マウスを、亜致死用量のインフルエンザウィルスによる肺感染の１日前及び１日後に、呼吸器系を介してｐＩ：ｐＣ、ｐＡ：ｐＵ又は生理食塩水で処理した。５日目、肺組織のウィルス力価を概算し、器官１個あたりの全感染ユニットで示した（平均±ＳＥＭ；ｎ＝６／群；結果は、Ｃ3Ｈ／ＨｅＪ  ＴＬＲ−４−／−マウス及びコンピテントマウスにおける２種類の独立した試験のものである）。
【０１７０】
図４Ｂから、気道をＲＮＡモチーフで処理したマウスは亜致死量のインフルエンザウィルスに感染したことがわかる。感染５日後、肺のウィルス力価を定量した。同様の結果がＣ５７ＢＬ／６マウス及びＴＬＲ４−／−  Ｃ3Ｈ／ＨｅＪマウスでも得られた（図示せず）。尚、ｄｓＲＮＡは、肺のウィルス力価の有効な減少をもたらすのに効果的である。驚くべきことに、ｐＡ：ｐＵは、肺ウィルス力価の抑制においてｐＩ：ｐＣよりも非常に有効性が高く、これが更に、ｄｓＲＮＡ関連危険モチーフを区別する免疫系の能力を高める。このように、免疫記憶がない状態において、ｄｓＲＮＡモチーフは、ウィルス感染に対する有効な初期応答性を高めることができる。
【０１７１】
４）ＲＮＡ危険モチーフとの同時被包化（co-encapsulation）によるタンパク抗原に対する免疫の増強
非定式化サブユニットワクチン（一般には精製したタンパク抗原）に対する免疫応答は最小規模のものであるため、同じ微小構造に含まれるＡＰＣを抗原とｄｓＲＮＡ危険モチーフとに生体内で同時接触させ、更に良い結果が得られるかを調べた。この試験のため、プロトタイプの抗原（ＯＶＡ）をｐＡ：ｐＵ或いはｐＩ：ｐＣと組合せ調製し、賦形剤として生体適合性があり且つ免疫学的に不活性なリン脂質（ジオクタノイルホスファチジルコリン等）及び乳糖を加えて短鎖脂質複合体（「ＳＣＬ」）の形態とした（「材料及び方法」参照）。短鎖脂質複合体に調製したＯＶＡ＋ｐＡ：ｐＵ或いはｐＩ：ｐＣをＣ５７ＢＬ／６マウスの気道に投与した際の抗体反応を測定した所、この抗体反応は、生理食塩水中の非定式化抗原で免疫感作したマウス、或いはｄｓＲＮＡモチーフなしで調製しＳＣＬ複合体とした抗原で免疫感作したマウスの抗体反応に比べ非常に高かった（図５Ａ）。
【実施例１４】
【０１７２】
実施例１４：モデル抗原（ＯＶＡ）のみをロードした短鎖脂質複合体、或いはモデル抗原（ＯＶＡ）とｄｓＲＮＡモチーフとをロードした短鎖脂質複合体
短鎖リン脂質からなり、モデル抗原（ＯＶＡ）のみをロードした短鎖脂質複合体、及びモデル抗原（ＯＶＡ）とｄｓＲＮＡモチーフとをロードした短鎖脂質複合体を作成し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて試験した（図５Ａ）。抗体反応はＥＬＩＳＡで測定した。結果は、経気管免疫感作２週間後に行ったＩｇＧ終点力価の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４／群；データは独立した２種類の測定結果である）で示す。対照として、ＰＢＳ中のＯＶＡと、ＯＶＡをＣＴＢ（コレラ毒Ｂ）と組合せ調製して短鎖脂質複合体（ジオクタノイルホスファチジルコリン）としたものとを用いた。この結果、ＲＮＡモチーフの免疫特性を保存し抗原及びｄｓＲＮＡを含む分子複合体が作成され、これは実用に耐えるものであることが分かった。
【実施例１５】
【０１７３】
実施例１５：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、ｄｓＲＮＡモチーフと組合せ調製したＯＶＡによる免疫感作後の全ＯＶＡ抗原又はクラスＩ拘束性優性ＯＶＡペプチドに対する局所（肺）Ｔ細胞応答及び全身性（脾臓）Ｔ細胞応答
図５Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、全ＯＶＡ抗原又はクラスＩ拘束性優性ＯＶＡペプチドに対する局所（肺）Ｔ細胞応答及び全身性（脾臓）Ｔ細胞応答を測定した結果を示す。マウスは、ＯＶＡのみを短鎖脂質複合体（ジオクタノイルホスファチジルコリン）としたもの、或いはＯＶＡとｐＡ：ｐＵとを短鎖脂質複合体（ジオクタノイルホスファチジルコリン）としたもので免疫感作した。分析はＥＬＩＳＰＯＴにより実施し、結果はＩＦＮ−γＳＦＣ／器官（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４／群）として示した。
【０１７４】
興味深いことに、ＣＴＢは、短鎖脂質複合体組合せ調製物に対して、限られたアジュバント作用しか示さなかった。先の結果と一致しているが、Ｔ１免疫の誘導は、図５Ｂに示すようにｐＡ：ｐＵ粒子においてのみ測定され、ｐＩ：ｐＣでは測定されず、ｐＩ：ｐＣはＴ２免疫の増強を示したのみであった（図示せず）。更に、ｐＡ：ｐＵと抗原の組合せ調製物（「材料及び方法」参照）に対するＴ細胞応答により、重要な局所的成分が示された（図５Ｂ）。最後に、よく規定されたクラスＩ拘束性ＳＩＩＮＦＥＫＬ［配列番号２］ペプチドを用いると、ｐＡ：ｐＵは、ＳＣＬ複合体と協同して、クロスプライミングを促進する能力を維持することが確認された（図５Ｂ）。
【実施例１６】
【０１７５】
実施例１６：ｄｓＲＮＡモチーフを組合せ調製したモデル抗原（ＯＶＡ）をロードしたＳＣ脂質複合体の経粘膜予防接種に対するスプラーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）ラットの全身性及び局所的抗体反応
ＯＶＡとｄｓＲＮＡとを組合せ調製した脂質複合体でラットの免疫感作を行った。対照として、抗原を含まないＳＣ脂質複合体、ＯＶＡは含むがｄｓＲＮＡモチーフは含まないＳＣＬ複合体、及び用量を合わせたＯＶＡをそれぞれ生理食塩水に添加し用いた。結果を、ＥＬＩＳＡにより測定した、血清（図５Ｃ）及び３５日目の気管支肺洗浄液（図５Ｄ）に含まれるＯＶＡ特異的抗体の終点力価（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４／群）として示す。
【０１７６】
ＯＶＡとｐＡ：ｐＵ又はｐＩ：ｐＣとをロードしたＳＣＬ複合体を噴霧したスプラーグ・ドーリーラットにおいても同様の抗体反応の増強が測定された（図５Ｃ）。ｄｓＲＮＡもＯＶＡも含まないＳＣ脂質複合体を生理食塩水中に添加したものを用いた場合、力価はこれよりも低かった。粘膜抗体力価の分析（図５Ｄ）でも同様のプロフィールを示した。
【０１７７】
このように、ＲＮＡ関連危険モチーフとタンパク抗原とを新規な噴霧乾燥技法により組合せ調製したものは、ＲＮＡモチーフの免疫調節特性を保存しており、局所的にも全身的にも特定の免疫応答を実質的に増強させる。
【実施例１７】
【０１７８】
実施例１７：非複製ｄｓＲＮＡモチーフは（Ｂ細胞及びＴ細胞）適応免疫応答のマスタースイッチとして作用する
ｄｓＲＮＡ等の危険モチーフを含まない抗原は、免疫原性が弱いか、高用量の場合は免疫寛容を誘導する。しかしながら、ｄｓＲＮＡモチーフは、免疫系が抗原を認識する方法を変化させる。即ち、このようなモチーフは、弱い応答性や寛容ではなく、共存する抗原に対し強く応答するように適応（Ｔ細胞及びＢ細胞）免疫を導くと共に、免疫寛容を阻害する或いは阻止する。従って、ｄｓＲＮＡモチーフの認識による自然免疫は、Ｂ及びＴ細胞適応免疫のマスタースイッチとして作用する（図７）。
【実施例１８】
【０１７９】
実施例１８：天然のｄｓＲＮＡは、自然免疫応答と適応免疫応答を橋渡しする。実施例１８は、インフルエンザウィルス感染により産生された天然の非感染性二本鎖ＲＮＡが、タンパク抗原に対する特定の免疫応答に関し、実質的な影響を及ぼすことを示す。
【０１８０】
許容ＭＤＣＫ細胞をＷＳＮインフルエンザウィルス（１０8ＴＣＩＤ50／１×１０9細胞）に感染させ、２４時間後、細胞を回収して洗浄し、ＲＮＡ分離キット（キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）で全ＲＮＡを抽出した。更に、ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡｓｅＩ（ストラタジーン社、カリフォルニア州サンディエゴ）でＲＮＡを更に精製した。次に、Ｓ１ヌクレアーゼ（アンビオン社（Ambion、Inc.）、テキサス州オースチン）（５μ／ＲＮＡμｇ）と共に３７℃で３０分インキュベートし、サンプル中の一本鎖ＲＮＡを除去した。分解前後に、ゲル電気泳動によりＲＮＡを分析した。精製ｄｓＲＮＡには感染性がないことを、標準的なインフルエンザウィルス滴定により確認した。対照として、１０9非感染ＭＤＣＫ細胞から同様に精製し処理した材料を用いた。核酸濃度は分光測定法（Ａ260mm）により測定し、エンドトキシンがないことはリムルスアッセイにより確認した。精製ｄｓＲＮＡ及び対照のＲＮＡは、単独で、或いはｇｐ１４０組換え抗原（２５μｇのＲＮＡと２μｇの抗原を２５ｍＬの無菌ＰＢＳに加えたもの）との混合物として用いた。
【０１８１】
感染性のないことを確認した後、４０μｇのｄｓＲＮＡ又は対照ＲＮＡを４０μｇの組換えトランケート抗原（ＨＩＶエンベロープのｇｐ１４０）と混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに経鼻注入（ｎ＝３／群）により投与した。付加的な対照として、４０μｇのｇｐ１４０タンパク質を生理食塩水に添加したもので免疫感作した動物（ｎ＝３／群）を用いた。マウスへの追加免疫をプライミング２週間後に一度行った。追加免疫の２週間後、血液を採取し、血清を調製し、ｇｐ１４０に対する抗体反応をＥＬＩＳＡにより測定した。即ち、ウェルを抗原（２μｇ／ｍＬのｇｐ１４０）でコーティングし、シーブロック（ピアース社、イリノイ州ロックフォード、カタログ番号３７５２７）でブロッキングした。血清と気管支肺胞洗浄液の段階希釈液は、室温で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ（シグマ社、カタログ番号Ａ７４３４）結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたアッセイを行い、基質（ｐＮＰＰ、シグマ社、カタログ番号Ｎ２７６５）を添加し、ソフトマックスソフトウェアを備えた自動マイクロタイタープレートリーダー（モルキュラーデバイス社、ThermoMax）で測定した。
【０１８２】
図７のパネルＡは実験の一般原理を示す。図７のパネルＢは、全ＩｇＧを用いた場合の各血清希釈液のアッセイ実施後の吸収を示す。図７のパネルＢは、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１抗体アイソタイプを用いた場合の１／５０血清希釈液の吸収を示す。
【０１８３】
全体としては、図７のパネルＡ、Ｂのデータから、インフルエンザウィルスに感染したＭＤＣＫ細胞からの天然の非感染性ｄｓＲＮＡは、プロトタイプ抗原に対する適応応答を増強する効果が予想外に高いことがわかった。ＩｇＧｌ抗体反応及びＩｇＧ２ａ抗体反応も亢進したことから、強いＴヘルパー１及び２反応が誘導されたことがわかる。
【実施例１９】
【０１８４】
実施例１９：自然免疫応答に対する選択したＲＮＡモチーフの作用：異種モチーフ。この実施例は、各種合成ＲＮＡモチーフが、意外にも、タンパク抗原に対する適応特異的免疫応答に別個の作用を有することを示す。
【０１８５】
図８Ａは、合成ＲＮＡモチーフを広く含むライブラリーを示し、合成ＲＮＡモチーフは複数のプールにグループ分けされて次の２段階の力価スクリーニング工程に用いられる。
（Ａ）マウスを各ＲＮＡプールで気管内免疫感作し、経鼻注入による追加免疫を２週間毎に２回行った。抗体反応はＥＬＩＳＡにより行い（図８Ｂ）、結果はＩｇＧ終点力価の平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝４／群）。対照として、ＯＶＡを無菌ＰＢＳに添加したもの、ＯＶＡをコレラ毒サブユニットＢ（ＣＴＢ）と一緒に用いたもの、ＰＢＳのみをそれぞれ用量を合わせて用いた。即ち、ウェルを抗原（１０μｇ／ｍＬのＯＶＡ）でコーティングし、シーブロック（ピアース社、イリノイ州ロックフォード、カタログ番号３７５２７）でブロッキングした。血清と気管支肺胞洗浄液の段階希釈液は、室温で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ（シグマ社、カタログ番号Ａ７４３４）結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたアッセイを行い、基質（ｐＮＰＰ、シグマ社、カタログ番号Ｎ２７６５）を添加し、ソフトマックスソフトウェアを備えた自動マイクロタイタープレートリーダー（モルキュラーデバイス社、ThermoMax）で測定した。
【０１８６】
（Ｂ）ＯＶＡに対する抗体反応の誘導に与える各種ｄｓＲＮＡモチーフの影響：結果を図８Ｃに示す。データは独立した２種類の実験結果である。ＩＮＳＥＴ：ＯＶＡに対する平均ＩｇＧ２ａ力価とＩｇＧｌ力価の比。この実験のために、ビオチンコンジュゲート抗マウスＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体を用い、ストレプトアビジン−ＡＫＰコンジュゲートと共にインキュベートした。左右の順序は図８Ｃのメインパネルと同様である：ＰＢＳ  ＯＶＡ、ＣＴＢ  ＯＶＡ、ｐＣ：ｐＧ  ＯＶＡ、ｐＩ：ｐＣ  ＯＶＡ及びｐＡ：ｐＵ  ＯＶＡ。
【０１８７】
（Ｃ）雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＯＶＡ及びｄｓＲＮＡモチーフにより誘導されたＴ細胞応答の大きさ及びプロフィール。細胞応答の測定のために、脾臓を７０ミクロンナイロンファルコンストレーナ（ベクトンディッキンソン社、カタログ番号３５２３５０）に付し、次いで赤血球溶解緩衝液（シグマ社、カタログ番号Ｒ７７５７）によって赤血球を溶解することにより脾臓細胞浮遊液を得た。肺組織をコラゲナーゼ（シグマ社、カタログ番号Ｃ９８９１）で消化し、次いでフィコールパーク（アマシャムファルマシア社、カタログ番号１７−１４４０−０２）勾配遠心によって、肺関連脂質組織からリンパ球を単離した。Ｔ細胞応答はＥＬＩＳＰＯＴ分析によって次のように測定した。９６ウェルの４５ミクロン混合セルロースエステルプレート（ミリポア社、カタログ番号ＭＡＨＡ  Ｓ４５１０）を、４μｇ／ｍＬのラット抗マウス抗ＩＦＮγ、抗ＩＬ−２或いは抗ＩＬ−４モノクロナール抗体（ＢＤファーミンジェン社、カタログ番号５５４４３０、カタログ番号１８１６１Ｄ、カタログ番号５５４３８７）でコーティングした。１０％ＦＣＳを含む無菌生理食塩水３７℃で１時間処理しブロッキングした後、脾臓細胞浮遊液を抗原／ペプチドと共に、又はなしで、ウェル当たり５×１０5細胞添加した。刺激のために、段階的に量を変えた各種抗原（ＯＶＡ）を用いた。刺激から７２時間後、ビオチン化ラット抗マウスサイトカイン抗体（ＢＤファーミンジェン社）、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（バイオソース社、カリフォルニア州カマリロ）と不溶性ＡＥＣ基質を用いたアッセイを行った。結果は多重パラメータ解析ソフトウェア（イメージプロ、メディアサイバネティックス社）を備えた自動イメージングシステム（ナビター／マイクロメイト）を用い測定した。結果を、脾臓当りのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４スポット形成コロニー（ＳＦＣ）の数の平均±ＳＥＭとして図８Ｄに示す（ｎ＝４／群）。結果は独立した２種類の実験結果である。
【０１８８】
図８Ｂ〜Ｄに示す結果から、各合成ＲＮＡは、プロトタイプのタンパク抗原に対するＢ細胞応答及びＴ細胞応答に対し増強作用を有することがわかる。更に、各モチーフは、特定のヌクレオチドの組合せを含むが、Ｔ１対Ｔ２誘導及びその後の免疫グロブリンアイソタイプスイッチングに関し、モチーフによって異なる特定の効果を有する。
【実施例２０】
【０１８９】
実施例２０：選択された合成ＲＮＡモチーフを用いることにより、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔｃ１細胞の誘導が促進されＩＦＮ−γが産生される。
（Ａ）ｄｓＲＮＡモチーフにより刺激されるクロスプライミングをＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて検討した。マウスは、１０μｇの人工的に組み換えたＨＩＶ  ｇｐ１４０抗原とｐＡ：ｐＵとで処理（プライミング＋２回の追加免疫）して用いた。応答は、実施例１９に記載したように、Ｖ３ドメイン由来のＭＨＣクラスＩ拘束性コグネイトペプチドＲ１０Ｋによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を用いたＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した。対照として、用量を合わせたｇｐ１４０抗原を用いた。結果を、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４  ＳＦＣの数／脾臓（ｎ＝４／群）の平均±ＳＥＭとして図９Ａに示す。
【０１９０】
（Ｂ）ｄｓＲＮＡモチーフにより刺激されるクロスプライミングを、１００μｇの全ＯＶＡとｐＡ：ｐＵとで処理したＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて検討した。検討は、実施例１９に記載のように、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ［配列番号２］によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を用いたＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した。対照として、用量を合わせた、生理食塩水又は無菌ＰＢＳに添加したＯＶＡ抗原を用いた。結果を、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４  ＳＦＣの数／脾臓（ｎ＝４／群）の平均±ＳＥＭとして図９Ｂに示す。
【０１９１】
図９Ａ〜Ｂに示す結果から、大きな抗原（ポリペプチド）に含まれる様々な各種ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドに対し、選択された合成ＲＮＡモチーフがＴ細胞免疫の亢進を促進できたことがわかる。この免疫応答は、ＩＦＮ−γを産生するＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞に含まれるＴｃ１成分を含む。
【実施例２１】
【０１９２】
実施例２１は、予想外のことであるが、合成ＲＮＡモチーフによって結合する細胞受容体が異なる、即ちＲＮＡモチーフを区別する複数の受容体が存在することを示す。
【０１９３】
ＣＤ１１ｂ+  ＡＰＣへの蛍光タグ化ｐＡ：ｐＵのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結合をＦＡＣＳ分析により測定した。ＭＡＣＳ分離ＡＰＣを４℃で３０分間、１０μｇ／ｍＬのタグ化ｐＡ：ｐＵ（［ＰＡ：ｐＵ］−Ｆ）と共にインキュベートし、洗浄して分析した。これとは別の方法として、ＡＰＣをそれぞれ２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの非タグ化ｐＡ：ｐＵ、ｐＡ或いはｐＩ：ｐＣと共に１０分間プレインキュベートし、タグ化ｐＡ：ｐＵで染色してＦＡＣＳ分析を行った。染色された細胞（白い領域）、染色されていない細胞（黒い領域）のプロフィールと、染色程度の高いＡＰＣの百分率とを各パネルに示す（ｘ軸は対数）。データは、独立した２種類の測定結果を示し、各サンプルに対し１００００回測定したものである。
【０１９４】
材料：
マウスＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃ磁気分離ビーズ：ミルテニイバイオテック社、それぞれカタログ番号１３０−０４９−６０１及びカタログ番号１３０−０５２−００１；
ＵＬＹＳＩＳ核酸標識キット：アレクサ（Alexa）４８８、分子プローブ  カタログ番号Ｕ２１６５０；
ＲＮＡモチーフ：
・ｐＡ：ｐＵ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０６８）；
・ｐＩ：ｐＣ、（シグマ社、ロット番号５２Ｋ４０４７）；
・ｐＡ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０２２）；
ＦＡＣＳ緩衝液：ＰＢＳ、１％  ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム；
ＭＡＣｓ緩衝液：ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＢＳＡ；
コラゲナーゼ緩衝液：０．２２５ｍｇ  ＢＳＡ、０．００６２ｍｇ  コラゲナーゼが５０ｍＬ  ＲＰＭＩに入っているもの；
７０ｕｍ細胞ストレーナ：（ファルコン／ベクトンディッキンソン社、カタログ番号３５２３５０
【０１９５】
方法：
Ｉ  ＲＮＡモチーフの標識：
１．次のプロトコルにより、各ＲＮＡモチーフをＵＬＹＳＩＳ  Ａｌｅｘａ４８８標識でタグ化した。
【０１９６】
ＩＩ  脾臓細胞の調製：
１．Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌性、４匹）から脾臓細胞及び肺細胞を単離；
・肺細胞は、脾臓細胞とは異なり、切り刻んだ後、コラゲナーゼ緩衝液中３７℃で３０分間インキュベートしてから、次のステップに進むことを要する；
・７０ｕｍファルコン細胞ストレーナを通す；
・洗浄後、再度ＭＡＣＳ緩衝液に懸濁させる：
２．推奨プロトコルに従い、ＣＤ１１ｂ特異的又はＣＤ１１ｃ特異的ＭＡＣＳビーズで標識する；
３．次いで細胞に次の処理を行った：
・非タグ化ｐＡ、ｐＡ：ｐＵ、又はｐＩ：ｐＣ（２０ｕｇ／ｍＬ又は１００ｕｇ／ｍＬ）、室温、１０分間；
・各モチーフの染料：ｄｓＲＮＡの比に合うように、ＵＬＹＳＩＳタグ化ｐＡ及びｐＡ：ｐＵ（それぞれ１．５ｕｇ／チューブ及び１０ｕｇ／チューブ）を添加した。
混合、氷上で３０分間インキュベート。
洗浄（１回）し、ＦＡＣＳ緩衝液に再度懸濁した。
【０１９７】
ＩＩＩ  フローサイトメトリー：
フローサイトメトリー分析を行い、タグ化ＲＮＡモチーフと非タグ化ＲＮＡモチーフの競合阻害及び細胞受容体の結合を測定／比較する。
【０１９８】
図１０に示した結果から、ｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣは、異なる細胞受容体に結合することがわかる。ｐＩ：ｐＣはＴＬＲ３に結合するため、ＴＬＲ３とは異なる別の受容体がＲＮＡ認識免疫機能に関与していることがわかる。
【実施例２２】
【０１９９】
実施例２２は、選択された合成ＲＮＡモチーフが、免疫学的活性に重要な、ケモカイン遺伝子の生体内における発現を誘導することを示す。
【０２００】
ｄｓＲＮＡモチーフによるケモカイン遺伝子発現の局所的なアップレギュレーションを、経気道投与１日後に抽出した肺組織からのＲＮＡを用いたＤＮＡアレイ技法により測定した。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて肺から単離した。このＲＮＡをＲＮａｓｅ−フリーＤＮａｓｅＩ（ストラタジーン社）、カリフォルニア州サンディエゴ）で処理し更に精製した。ＤＮＡアレイはスーパーアレイ社（メリーランド州ベサダ）のＮｏｎｒａｄ−ＧＥＡｒｒａｙキットを用い行った。即ち、ｃＤＮＡプローブをビオチン−１６−ｄＵＴＰを含有するｄＮＴＰｍｉｘと共にＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて合成した。ＧＥＡｒｒａｙ膜を６８℃で１〜２時間プリハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは、ビオチン標識ｃＤＮＡと共に膜をインキュベートすることにより行った。ハイブリダイズした膜を、２×ＳＳＣ−１％ＳＤＳで２回、０．１×ＳＳＣ−０．５％ＳＤＳで２回洗浄した。膜をアルカリホスファターゼ抱合型ストレプトアビジン（バイオソース社、カリフォルニア州カマリロ）と共に更にインキュベートし、最終的に、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光基質を用い現像した。シグナルの強度は、Ｇｅｌ−Ｐｒｏソフトウェアを備えたＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ解析システム（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリングス）によって測定した。
【０２０１】
結果を、非処理マウスの肺組織で測定された発現レベルに対する遺伝子発現の増加倍率で示す（図１１）。ｄｓＲＮＡ（５０μｇのｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣ）により惹き起こされたケモカインの発現パターンを、１μｇのＬＰＳにより誘導されたパターンと比較した。Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞上の受容体と選択的に結合したケモカインを、それぞれ実線及び破線で囲った。
【０２０２】
図１１に示す結果から、ｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣは広範な種類のケモカインの発現を惹き起こし、その発現パターンはモチーフに依存し且つＬＰＳ（エンドトキシン）のパターンとは異なることがわかる。
【実施例２３】
【０２０３】
実施例２３は、選択された合成ＲＮＡモチーフは、肺ウィルスによる感染を制御できる免疫防御を高めることを示す。
【０２０４】
各ｄｓＲＮＡモチーフは、インフルエンザウィルス感染に対する免疫防御を高める能力が異なる。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを、亜致死量のインフルエンザウィルスによる肺感染の１日前及び後に、経呼吸器ルートで５０μｇのｐＩ：ｐＣ、ｐＡ：ｐＵ或いは５０μＬの生理食塩水で処理した。ウィルス攻撃のために、Ｃ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ４−／−Ｃ3Ｈ／ＨｅＪマウスを、メトファン麻酔下で亜致死量（ＴＣＩＤ50：１０4組織培養感染量５０％）のＷＳＮ（Ａ／ＷＳＮ／Ｈ１ｎ１）ウィルス生菌に経鼻感染させた。感染５日後、マウスを殺し肺を摘出し、ホモジネートして−７０℃で保存した。ウィルス力価は、許容ＭＤＣＫ細胞による試料の段階希釈液を４８時間インキュベートし、次いでニワトリ赤血球細胞（アニマルテクノロジー社から入手）による標準血球凝集反応により測定した。終点力価は３回の測定の補間によって評価し、器官当りのＴＣＩＤ50として表した（平均±ＳＥＭ；ｎ＝６／群；結果はＣ3Ｈ／ＨｅＪ  ＴＬＲ−４−／−マウス及びコンピテントマウスにおける独立した２種類の試験の結果である）。ＴＬＲ４コンピテントのＣ５７ＢＬ／６マウスでも同様の結果が得られた。
【０２０５】
図１２に示す結果から、選択された合成ＲＮＡモチーフを用いることによりインフルエンザウィルスの複製を制御できることがわかる。
【実施例２４】
【０２０６】
実施例２４は、選択された複数の合成ＲＮＡモチーフを同時投与することにより、高用量の標準抗原に対する免疫寛容が破壊されることを示す。
【０２０７】
ｄｓＲＮＡモチーフは、ヒトＩｇＧを注射したマウスにおいて大量域寛容を阻止する。まず、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を寛容原性用量である２００μｇのｈＩｇＧのみ（黒印）、或いはこれと１００μｇのｐＩ：ｐＣ又はｐＡ：ｐＵを一緒に（白印）静注し、免疫原性用量である１００μｇのｈＩｇＧのＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）乳化物を皮下注射し追加免疫を行った。ｈＩｇＧに対する抗体の力価をＥＬＩＳＡにより（コーティングに１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧを用いた以外は実施例１９と同様に）測定した。測定は、最初の注射後、各時間に行った。対照として、１００μｇのｈＩｇＧのＣＦＡ乳化物で免疫感作したマウスを用いて得た最大力価をグラフに示す（破線）。
【０２０８】
結果は、終点力価の平均±ＳＥＭとして図１３に示す（ｎ＝５／群）。ＴＬＲ４欠損（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）マウス及びＬＰＳ−応答性Ｃ３Ｈ／ＳｎＪマウスでも同様の結果が得られた。図１３に示す結果から、選択された合成ＲＮＡモチーフであるｐＩ：ｐＣ及びｐＡ：ｐＵは、大量の精製タンパク質投与に通常伴う大量域寛容を著しく阻害することがわかる。
【実施例２５】
【０２０９】
実施例２５は、選択されたＲＮＡモチーフが、ヒトＡＰＣによる各種サイトカインの産生を誘導することを示す。
【０２１０】
分化後のヒトＴＨＰ−１単球細胞を各種濃度の合成ＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ又はｐＡ）と共に２４時間インキュベートし、細胞上清を回収した。ＩＬ−１２及びＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、各培養条件に対する各サイトカインのｐｇ／ｍＬ（濃度）として図１４に示す。
【０２１１】
図１４に示す結果から、選択された合成ＲＮＡモチーフはヒト単球細胞に作用し、この作用はモチーフ（ヌクレオチド組成物）の化学構造によって不均一であることがわかる。合成ＲＮＡモチーフ全てではないが、選択された合成ＲＮＡモチーフは、ヒト単球細胞による、重要なＴ１調節サイトカインであるＩＬ−１２の産生を誘導できる。
【０２１２】
材料：
ＴＨＰ−１ヒト単球細胞系：ＡＴＣＣ、カタログ番号ＴＩＢ−２０２；
ＩＬ−１２サイトカイン：ヒトＥＬＩＳＡ、ＩＬ−１２ウルトラセンシティブ（ＵＳ）カタログ番号ＫＨＣ０１２３；
ＴＮＦアルファサイトカイン：ヒトＥＬＩＳＡ、ＴＮＦアルファ  カタログ番号ＫＨＣ３０１２；
ＲＮＡモチーフ：
・ｐＡ：ｐＵ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０６８）;
・ｐＩ：ｐＣ、（シグマ社、ロット番号５２Ｋ４０４７）;
・ｐＡ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０２２）
【０２１３】
方法：
１．ＴＨＰ−１細胞に、１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡを加え、１０％ＦＣＳを含有する培地において分化させた。
２．細胞を穏やかに洗浄し、ＦＣＳを含まない培地（ＨＬ−１）を加え、処理物（ＲＮＡモチーフ及び対照）（３〜１００μｇ／ｍＬ）を付着性（adherent）ＴＨＰ−１細胞に添加した。
３．２４時間インキュベートした後、細胞上清を回収し、ＩＬ−１２及びＴＮＦアルファの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【実施例２６】
【０２１４】
実施例２６は、２個の区別される合成ＲＮＡモチーフがヒトＴＨＰ−１単球細胞に結合するときに、互いに異なる受容体と相互作用を示すことを示す。
【０２１５】
ＴＨＰ−１細胞を、種々異なる量の非標識合成ＲＮＡと共に室温で１５分間インキュベートした。次に、タグ化したｐＡ：ｐＵを４℃で３０分かけて添加し、細胞を洗浄し、蛍光をＦＡＣＳ分析により測定した。結果を図１５Ａ及び１５Ｂに棒グラフとして示す。図１５Ａは大細胞のサブセットを、図１５Ｂは全細胞集団を示す。染色された細胞の百分率を各図に示した。
【０２１６】
図１５Ａ〜１５Ｂに示す結果から、非タグ化ｐＡ：ｐＵは、大細胞のサブセット及び全細胞集団の両方のレベルにおいてタグ化ｐＡ：ｐＵのヒトＴＨＰ−１単球細胞への結合に打勝つ（compete out）ことができるが、非タグ化ｐＩ：ｐＣは打勝つことができないことがわかる。
【０２１７】
材料：
１．ＵＬＹＳＩＳ：核酸蛍光標識（モレキュラー・プローブス社（Molecular Probes）、カタログ番号Ｕ−２１６５０）
２．ＲＮＡモチーフ：
・ｐＡ：ｐＵ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０６８）;
・ｐＩ：ｐＣ、（シグマ社、ロット番号５２Ｋ４０４７）；
３．Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌカラム：（ピアース社、カタログ番号２０３４４）
【０２１８】
方法：
Ｉ  ポリアデニル−ポリウリジル酸（ｐＡ：ｐＵ）の標識：
エンドトキシンをＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌカラムを用いて除去した後、ｐＡ：ｐＵの標識を、ＵＬＹＳＩＳ核酸標識システムを用いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８蛍光染料により行った。
概略：
・酢酸ナトリウム及びエタノールを用いて−７０℃でｐＡ：ｐＵを沈澱させた。
・ｐＡ：ｐＵを熱変性させ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８試薬により９０℃で標識した；
・反応を停止させ、標識されたｐＡ：ｐＵをエタノール沈澱させた。
【０２１９】
ＩＩ  細胞の処理：
ＴＨＰ−１細胞を２×１０6細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた；
この懸濁液（５０μＬ、５×１０4細胞）を１２×７５ｍｍチューブに入れた；
非タグ化ｐＡ：ｐＵ又はｐＩ：ｐＣを２０又は１００μｇ／ｍＬの濃度でＴＨＰ−１細胞に添加し、１５分間インキュベートした；
ＵＬＹＳＩＳ標識されたｐＡ：ｐＵを１００ｕｇ／ｍＬの濃度で３０分かけて氷上で添加した。
ＴＨＰ−１細胞を１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁させ、フローサイトメトリー分析を行って、異なる処理を施した集団間の蛍光の相対差を測定した。
【実施例２７】
【０２２０】
実施例２７は、アジュバント合成ＲＮＡを、最も有効な形式で使用するために事前にどのように調製・精製するかを示す。
【０２２１】
バルク合成ＲＮＡ材料を標準的な有機合成法により得る。その後エンドトキシンを含まない無菌生理食塩水にこの材料を溶解し、ＬＰＳ濃度が０．００５ＥＵ／μｇより低くなるまでエンドトキシン除去カラムを通す。ＬＰＳの測定は標準的なリムルスアッセイにより行う。その後、材料を一連の遠心分離にかけ、有孔率が規定されたフィルタを通して分画する（図１６参照）。
【０２２２】
有用な画分は、サイズが２０ｂｐ未満から最大１００ｂｐの合成ＲＮＡを含むものである。精製後、材料を標準的な各種アッセイ、即ち分光測光（ＯＤ２６０ｎｍ）；ゲル電気泳動；リムルスアッセイによるエンドトキシンの定量；ヒトＴＨＰ−１細胞に対する生体活性（実施例２５と同様）により測定し評価する。
【実施例２８】
【０２２３】
実施例２８は、選択された合成ＲＮＡ化合物の各画分は、意外にも、ＲＮＡのサイズによって生物学的活性が異なることを示す。
【０２２４】
分化したヒトＴＨＰ−１単球細胞を、異なる濃度の合成ＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ、実施例２７と同様に分画した）と共に２４時間インキュベートし上清を回収した。ＴＮＦ−αの濃度をバイオソースインターナショナル社（カリフォルニア州カマリロ）のキットを用いてＥＬＩＳＡにより測定した。結果を、図１７に培養条件毎にｐｇ／ｍＬ（濃度）として示す。
【０２２５】
図１７に示す結果から、選択された合成ＲＮＡ化合物の分子量が小さい程、その画分は、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞によるサイトカイン産生に関する生物学的活性が高いことが分かる。
【実施例２９】
【０２２６】
実施例２９：選択された合成ＲＮＡモチーフは、意外にも、モチーフによって抗ＲＮＡ抗体の産生に関する免疫プロフィールが異なる。
【０２２７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、腹腔及び皮下［ｉ．ｐ．＋ｓ．ｃ．］から５０μｇ＋５０μｇのｈＩｇＧ及び合成ＲＮＡ（ｐＩ：ｐＣ又はｐＡ：ｐＵ）で免疫感作し、１週間後血清サンプルを得た。対照として、生理食塩水に添加したｈＩｇＧを注射したマウスを用いた。ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ、ｐＡ及びｈＩｇＧに対する抗ｈＩｇＧ及びｄｓＲＮＡ  ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。即ち、ウェルを抗原（１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ或いは合成ＲＮＡ）でコーティングし、シーブロック（ピアース社、イリノイ州ロックフォード、カタログ番号３７５２７）でブロッキングした。血清と気管支肺胞洗浄液の段階希釈液は、室温で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ（シグマ社、カタログ番号Ａ７４３４）結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたアッセイを行い、基質（ｐＮＰＰ、シグマ社、カタログ番号Ｎ２７６５）を添加し、ソフトマックスソフトウェアを備えた自動マイクロタイタープレートリーダー（モルキュラーデバイス社、ThermoMax）で測定した。
【０２２８】
結果を、図１８に、終点力価の平均±ＳＥＭ（ｎ＝３／群）として示す。図１８に示す結果から、ｐＩ：ｐＣは、ｐＡ：ｐＵと異なり、それ自身に対する抗体反応を誘導し、別のＲＮＡモチーフに対する交叉反応性成分を有する。
【実施例３０】
【０２２９】
実施例３０：組換えＩｇＧをＡＰＣに生体内でローディングすると、付加的な条件を満たしたときのみ、Ｔｃｌ型のＭＨＣクラスＩ応答が起こる。
【０２３０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０ｕｇの選択された合成ＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ又はｐＩ：ｐＣ）と混合した５０ｕｇのｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）（図３１Ａ〜３１Ｄ参照）（ＮＰペプチドは、Ａ型インフルエンザウィルスのエピトープを保護し保存したもの）で皮下免疫感作した。対照として、ナイーブマウス又はｒｅｃＩｇＧのみで免疫感作したマウスを用いた。免疫感作３週間後、Ｔ細胞応答を次のとおりＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した：ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に添加した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ４に対しては４ｕｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮガンマに対しては８μｇ／ｍＬ、（ＢＤファーミンジェン社）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地で３７℃、１時間処理しブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０5／ウェルでＮＰ１４７−１５５ペプチドと共にインキュベートした、或いは培地のみでインキュベートしバックグラウンドを評価した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％−ＦＢＳ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に添加したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。
【０２３１】
翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を添加して開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０２３２】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社メリーランド州シルバースプリングス）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。サイトカイン産生Ｔ細胞がＮＰペプチド（ＮＰペプチドは、Ａ型インフルエンザウィルスのエピトープを保護し保存したもの）と反応する頻度を測定し、刺激に使用されたペプチドの量に対して示した。結果を、図１９に三連のデータの平均＋ＳＥＭ（ｎ＝３マウス／群）として示す。
【０２３３】
ＮＰ  ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを有する組換えＩｇＧの投与によって、Ｔｃ２免疫は起こるがＴｃ１応答は起こらない。これは、特定の共刺激プロフィールを有するクラスＩペプチド複合体が生体内で形成されたことを示唆している。図１９に示す結果から、選択された複数の合成ＲＮＡを同時に使用することにより、ＩｇＧが仲介するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープの輸送に続き、ＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマの効果的な誘導が促進されることがわかる（ｄｓＲＮＡ１はｐＡ：ｐＵであり、ｄｓＲＮＡ２はｐＩ：ｐＣである）。
【実施例３１】
【０２３４】
実施例３１：ＦｃガンマＲによるＡＰＣローディングとＲＮＡ受容体による活性化の同時操作による、ＭＨＣクラスＩペプチドの効果的形成とその結果のＴ細胞応答の指示
【０２３５】
脾臓ＡＰＣをナイーブＢＡＬＢｃマウスから単離し、１ｕｇのＮＰペプチド、又は５０μｇのｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）を単独で或いは５０μｇ／ｍＬの選択された合成ｄｓＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ）を組合せたもので、ｅｘ  ｖｉｖｏでのパルシングを一晩行った。細胞を洗浄し、５×１０6個の細胞をナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにｓ．ｃ．及びｉ．ｐ．で等量投与した。３週間後、応答を次の通りＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した：ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に添加した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮガンマに対しては８μｇ／ｍＬ、（ＢＤファーミンジェン社）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地で３７℃、１時間処理しブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０5／ウェルで３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は３μｇ／ｍＬのＮＰペプチドと共にインキュベートした、或いは培地のみでインキュベートしバックグラウンドを評価した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％−ＦＢＳ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に添加したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を添加して開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０２３６】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリングス）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、図２０に、ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激に用いたペプチド濃度に対するサイトカイン産生スポット形成コロニーの発生度合（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３マウス／群）で示す。更に、刺激に用いたペプチド濃度に対するエリア／コロニーの平均をＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−４に対してプロットした（任意単位）。
【０２３７】
図２０に示した結果から、組換えＩｇＧのＡＰＣへのｅｘ  ｖｉｖｏローディングは、ペプチド自体を使用するのに比べ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体の形成及びＴｃ応答の発生に対しより効果的であることがわかる。更に、ＩｇＧ／ＦｃガンマＲによるエピトープの輸送後、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体が単に形成された場合は、ＩＬ−４は産生するがＩＦＮガンマは産生しないＴｃ２細胞の分化が惹き起こされる。選択された合成ＲＮＡでＡＰＣを同時に処理することにより、Ｔ細胞プロフィールをＩＦＮ−ガンマ産生Ｔｃ１細胞にまで拡大することができる。
【実施例３２】
【０２３８】
実施例３２は、ＩｇＧ−ペプチドと選択された共刺激モチーフとを同時プライミングすることにより、ウィルス感染後にＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞のより効果的な二次増殖が起こることを示す。
【０２３９】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）、ｐＡ：ｐＵ、或いはｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）及びｐＡ：ｐＵ（５０ｕｇ／注射）を注射した。対照として、ナイーブマウスを用いた。処理の３週間後、マウスにＡ／ＷＳＮ／３２  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスの１０４ＴＣＩＤ５０を気道から感染させた。感染４日後、ＮＰペプチド刺激をｅｘ  ｖｉｖｏで行った後、脾臓のＴ細胞プロフィールをＥＬＩＳＰＯＴ分析により次のようにして測定した：ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランスモール、スハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に添加した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４ｕｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮガンマに対しては８μｇ／ｍＬ、（ＢＤファーミンジェン社）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地で３７℃、１時間処理しブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、２０μｇ／ｍＬのＮＰペプチドと共に又は培地のみで５×１０5／ウェルでインキュベートし、バックグラウンドを評価した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％−ＦＢＳ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に添加したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を添加して開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０２４０】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリングス）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、図２２に、サイトカイン産生コロニーを形成するＮＰ特異的ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞の発生度合（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４マウス／群）で示す。
【０２４１】
図２１に示す結果から、選択された合成ＲＮＡの同時投与を実施したとき、クラスＩ拘束性エピトープのＩｇＧ媒介輸送がクラスＩ拘束性Ｔｃ１応答のプライミングに最も効果的であることがわかる。プライミングされたこのような前駆体は、インフルエンザウィルス感染後、急速に増殖した。
【実施例３３】
【０２４２】
実施例３３は、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを認識する細胞障害性リンパ球の最も効果的なプライミングは、ＩｇＧバックボーンに挿入されたペプチドエピトープを選択されたＲＮＡモチーフと共に同時投与することにより行われるものであることを示す。
【０２４３】
前出の実施例と同様に、ＢＡＬＢｃマウスに対しｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）による免疫感作及び攻撃を行い、インフルエンザウィルス感染４日後に殺した。脾臓細胞を取り出し、ＨＬ−１培地に５００万／ｍＬで懸濁し、５Ｕ／ｍＬの組換えＩＬ−２の存在下、１０μｇ／ｍＬのＮＰ１４７−１５５ペプチドと共に５日間同時インキュベートした。４マウス／群からの脾臓細胞をプールし、フラスコ中でインキュベートした。
【０２４４】
増殖後、生残性を有する細胞をフィコール勾配遠心分離により回収し、洗浄後、種々の細胞数に分けてＶ底プレート中で５時間インキュベートした。インキュベーションは、固定数のｓｐ２０ターゲット細胞を添加して行い、ＮＰペプチド（２０μｇ／ｍＬ）は添加又は非添加で行った。プレートの遠心分離後、上清を回収し、ＬＤＨの濃度を、Ｐｒｏｍｅｇａキット（カタログ番号Ｇ１７８０）を用いて測定した。結果は、各Ｅ：Ｔ比（エフェクター対ターゲットの比）における比溶解性として示す。
【０２４５】
図２２に示す結果から、抗ウィルス細胞障害性Ｔ細胞の効果的なプライミングには、ＩｇＧにより輸送されたクラスＩ拘束性エピトープの生体内でのＡＰＣへの効果的なローディングと、選択された合成ＲＮＡモチーフ、即ちｐＡ：ｐＵによる適切な指示との両方が必要であることがわかる。
【実施例３４】
【０２４６】
実施例３４は、ウィルス性ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを有するＩｇＧと、選択された合成ＲＮＡモチーフとを一緒にワクチン投与することにより、プロトタイプウィルスによる感染攻撃に対する防御が提供されることを示す。
【０２４７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５０ｕｇのｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）及び５０ｕｇの選択された合成ＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ）を皮下注射し、免疫感作を行った。免疫感作３週間後、マウスに対し１０4ＴＣＩＤ５０の感染性ＷＳＮインフルエンザウィルスにより攻撃を行い、５日後に殺した。次の標準ＭＤＣＫ血球凝集アッセイにより肺ウィルスを肺ホモジネートに滴定した：１日目、ＭＤＣＫ細胞を９６ウェルプレートに添加し（２×１０4／ウェル／２００ｕＬ）、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。翌日、肺ホモジネートのＤＭＥＭ培地１０倍希釈液（２５μＬ）をトリプシン処理ＭＤＣＫプレート中、３連で短時間（１分）インキュベートした後、３７℃でインキュベートした。１時間後、１７５ｕＬの完全ＤＭＥＭ培地を添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ2で４８時間インキュベートした。２日後、ＭＤＣＫプレートから得た細胞培養上清と共に室温で３０分間インキュベートしたニワトリ赤血球を用いて、血球凝集阻止を行った。結果は、全肺ウィルスの平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝４マウス／群）。対照として、免疫感作を行っていないマウスを用いた。
【０２４８】
図２３に示す結果から、ウィルス性クラスＩ拘束性エピトープを有する組換えＩｇＧと一緒に、選択された合成ｄｓＲＮＡによって免疫感作を行うことにより、感染攻撃後のウィルス複製を制限できる免疫応答がプライミングされることがわかる。
【実施例３５】
【０２４９】
実施例３５：図２４に、Ｉｇ−ペプチドに基づく分子の効力をテストするために用いた腫瘍モデルを示す。
【０２５０】
Ｂａｌｂ−ｃマウス（Ｋd拘束性)を用い腫瘍モデルを確立した。通常、腫瘍細胞（１００μＬ中に１００万〜１５００万）は側腹部に注射した（上の写真の矢印参照）。原発腫瘍（注射サイトの腫瘍）は、まずその領域を触診することにより検出し、次いでカリパスで腫瘍サイズを測定することにより定量化した。一連の実験において、トランスフェクトしていない細胞、或いは安定にトランスフェクトされ異種タンパク質（Ｈ鎖のＣＤＲ３領域に異なるエピトープペプチドを発現する組換えＩｇＧ、或いは完全なＮＰタンパク質）を発現する細胞のいずれかであるマウス骨髄腫細胞系（ＳＰ２／０）を用い、マウスに腫瘍を誘導した。ＳＰ２／０細胞内の異種タンパク質の発現は、免疫適格マウスにおける各種抗腫瘍戦略のテストのための特異的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を提供した。典型的には、未処置マウスには、注射後１週間で触知可能な充実性原発腫瘍が発生し、次の４週間に亘り病的状態や死をもたらした。注射したマウスの死後剖検により、転移病変が明らかになった（図２４参照）。Ｓｐ２／０細胞は、原発腫瘍組織、同様に腫瘍を有するマウスから採取した脾臓から培養した（データは示さず）。ＳＰ２／０細胞には、ＭＨＣＩ拘束性ＮＰエピトープ（アミノ酸１４７〜１５５）等のＨ鎖のＣＤＲ３領域に導入された特定のエピトープ配列以外は全てが同一である組換えＩｇＧ発現プラスミドが安定にトランスフェクトされた。また、ＳＰ２／０細胞には、ＣＭＶプロモータの制御下、ＷＳＮウィルスのＮＰタンパク質全体のためのコード配列を含むプラスミドが安定にトランスフェクトされた。全てのトランスフェクト細胞系は、野生型ＳＰ２／０細胞の場合と同一のフレームに原発腫瘍を引き起こした。
【０２５１】
本腫瘍モデルは、Ｂａｌｂ−ｃマウスに転移腫瘍を誘導することが先に示された腺癌細胞系（４Ｔ１、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３９、Ｋd拘束性）を含むように拡張された。４Ｔ−１細胞系は、ＳＰ／０系に関する前の記述に類似していた。Ｂａｌｂ−ｃマウス側腹部への１００万〜１５００万４Ｔ−１細胞の投与は、触診可能な原発腫瘍をＳＰ２／０細胞の投与の場合と類似の時間フレームで生じ、最終的には死をもたらした。各種器官からの組織の死後採取は原発腫瘍のみならず、脾臓、肺からも４Ｔ−１が回収できることを示した（図示せず）。４Ｔ−１細胞に、前述のＮＰ−発現プラスミドを安定にトランスフェクトした。ＳＰ２／０の場合のように、４Ｔ−１細胞へのトランスフェクトは、腫瘍の増殖過程や疾患の致死率に影響を与えなかった。
【実施例３６】
【０２５２】
実施例３６は、選択された共刺激ＲＮＡモチーフと共に組換えＩｇＧ内の腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを用いた、臨床診断後の腫瘍のコントロールと処置の成功例を示す。
【０２５３】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｈ鎖（ＩｇＮＰ）のＣＤＲ３領域内にＭＨＣ  Ｉ（Ｋｄ）ＮＰエピトープペプチドを有する組換えＩｇＧを安定に発現するＳＰ２／０細胞を注射投与した（１００μＬ中１５００万）。投与後第７日、全てのマウスは触診可能な腫瘍を有し、それらのマウスを無作為に３群（共刺激モチーフ単独（ポリマーｐＡｐＵを含むｄｓＲＮＡ）、精製ＩｇＴＡＡタンパク質（ＩｇＮＰ）、これら両者）に振り分けた。処置時間は矢印で示し、各投与は図示の化合物を５０μｇ含んだ。図中、転移疾患を発現し死亡したマウスを「Ｄ」で表した。
【０２５４】
これらのデータは、治療開始時に原発腫瘍を有する全てのマウスにおいて、ｄｓＲＮＡ（共刺激モチーフ）とＩｇＴＡＡ（ＩｇＮＰ）の組合せが劇的な保護応答を生じることを示す。片方の化合物のみで処置したマウスの全ては、疾患により死亡したが、両者を用いて処置したマウスの１００％は、処置開始後３週間後も生存していた。これらのマウスは、Ｔ細胞応答の測定のために殺された時にも良好な臨床状態であった。これらのデータは、ＡＰＣへのＴＡＡの生体内ローディング（ＡＰＣのＦｃ受容体を介したＩｇＮＰの摂取によって成される）は、抗腫瘍応答の効力に関して十分ではないことを示す。ＩｇＮＰをｐＡｐＵ  ｄｓＲＮＡと組み合わせて処置したマウスにおいて示される腫瘍の拒絶と生存は、腫瘍関連抗原による腫瘍の処置が共刺激に関して重要な役割を果たすことを示している。
【０２５５】
結論として、図２５の結果は、腫瘍関連抗原のＡＰＣへの効果的な生体内ローディングと、選択された合成ＲＮＡモチーフによる同時活性化との両者を共に行うことが、腫瘍成長の効果的な制御と腫瘍拒絶の誘導のために必要且つ十分であることを示す。
【実施例３７】
【０２５６】
実施例３７：本実施例は、腫瘍細胞を亜致死量接種した場合に、腫瘍抗原に対する最適未満の応答を、ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープを共刺激モチーフと共に用いる治療によって修正できることを示す。
【０２５７】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｈ鎖のＣＤＲ３内にＷＳＮウィルス核タンパク質のＭＨＣ  Ｉ（Ｋd）エピトープ（アミノ酸１４７〜１５５）を含む組換えＩｇＧ（ＩｇＮＰ）を安定に発現するＳＰ２／０細胞を注射投与した。細胞接種物は、マウス当たり１００万細胞（１００μＬ中）であった。マウスを、注射サイトに触診可能な腫瘍が検出されるまで観察した。この時点で腫瘍を測定し、８匹のマウスには処置を施さず、６匹には精製ＩｇＴＡＡ（即ち、精製ＩｇＮＰ、２ｍｇ／ｋｇ）とｄｓＲＮＡ（ｐＡｐＵ、４ｍｇ／ｋｇ）を一週間毎に腫瘍内注入した。腫瘍は一週間毎に測定した。
【０２５８】
図２６のパネルＡは、８匹のマウスの内の６匹は、誘導された腫瘍が進行し最終的に死に到ったが、これらのマウスの内の２匹は、自発的に腫瘍を完全に拒絶したことを示す。図４１のパネルＢは、ＩｇＮＰ／ｄｓＲＮＡによる３回の一週間毎の処置（矢印で示す）が、６匹のマウスの内の４匹において腫瘍の完全な拒絶を刺激し、他のマウスでは腫瘍の大幅な軽減を刺激したことを示す。
【０２５９】
図２６の結果（パネルＡとＢ）は、腫瘍関連抗原のＡＰＣへの効果的な生体内ローディングと、選択された合成ＲＮＡによる同時活性化の両者を行うことが、腫瘍関連抗原に対する効果的な免疫応答を誘導できることを示す。
【実施例３８】
【０２６０】
実施例３８は、ＩｇＧバックボーン内の腫瘍エピトープと共刺激合成ＲＮＡとを共に用いた腫瘍を有するマウスの治療は、腫瘍浸潤リンパ球の活性状態へと回復可能であることを示す。
【０２６１】
２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０００万のＮＰ−Ｋdエピトープ発現ｓｐ２０トランスフェクトーマを注射投与した。腫瘍の発生後、一匹のマウスに、５０μｇの選択されたｄｓＲＮＡモチーフ（ｐＡｐＵ）と５０μｇの「ＩｇＮＰ」−ｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋd）とを生理食塩水に添加したものを腫瘍内に注入した。２４時間後にマウスを殺し、腫瘍を摘出し、コラゲナーゼで消化し、７０ｕｍのフィルタで濾過し、次いで生存細胞をフィルコール勾配で単離した。細胞をＴＣＲβ、ＣＤ２５、或いはアイソタイプ対照に対してｍＡｂｓで染色し、ＦＡＣＳ分析で評価した。結果を、染色された細胞の百分率と共に、ヒストグラムで示した。
【０２６２】
材料：
ＳＰ２０細胞系（ＡＴＣＣ）；
２  ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎｄ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）；
ファルコン７０ミクロンフィルタ（ベクトンディッキンソン社、カタログ番号３５２３５０）；
コラゲナーゼ（シグマ社、カタログ番号Ｃ−９８９１）;
ＢＳＡ、ｆｒａｃｔｉｏｎＶ（シグマ社、カタログ番号Ａ−４５０３）；
コラゲナーゼ緩衝液：０．２２５ｇｍ  ＢＳＡ＋０．００６２５ｇｍ（５０ｍＬ  ＲＰＭ  Ｉ中）；
フィコール−ハイパーク（Ficoll-hypaque）（１．０７７、アマシャム社、カタログ番号１７−１４４０−０２）；
ＦＡＣＳ緩衝液：１％ウシ胎児血清＋０．１％アジド（ＰＢＳ中）；
抗体：全てＢＤファーミンジェン社から；
フローサイトメータ：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）。
【０２６３】
方法：腫瘍細胞単離及びＦＡＣＳ分析
６週間前に腫瘍を前述のように誘導；
ＢＡＬＢ／ｃマウスから腫瘍を単離；
殺菌ハサミで腫瘍を切り刻み、コラゲナーゼ緩衝液１０ｍＬを添加；
３７℃で４０分間インキュベート；
腫瘍を、ＲＰＭＩで洗浄しながら３ｍＬの注射器プランジャを用い７０μｍのファルコン（Falcon）フィルタを通し５０ｍＬチューブに濾過；
１Ｘ洗浄し４ｍｌｓの温ＲＰＭＩ緩衝液に再懸濁；
等量の細胞浮遊液を用いフィコール上で層とし、室温、２０００ＲＰＭで１５分間遠心；
層を単離し、ＨＬ−１緩衝液で一回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に２×１０6／ｍＬで再懸濁し、フローサイトメトリー分析を行う；
残存細胞はＥＬＩＳＰＯＴ分析に用いた；
細胞を１２×７５ｍｍのチューブに入れ（５０μＬ／チューブ）、ＦＩＴＣ標識抗マウス抗体（２μｇ／チューブ）とマウス血清（１μＬ／チューブ）で染色：
・アイソタイプ対照；
・抗ＣＤ４０；
・抗ＣＤ８；
・抗ＣＤ４；
・抗ＣＤ２５；
・抗ＴＣＲガンマデルタ；
・抗ＴＣＲベータ；
氷上で３０分間インキュベート；
ＦＡＣＳ緩衝液で一回洗浄、３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁。
【０２６４】
図２７の結果は、腫瘍関連エピトープを有する組換え免疫グロブリンと選択された合成ｄｓＲＮＡモチーフとを共に用いて処置をすると、Ｔ細胞受容体マーカーＴＣＲβを提示する腫瘍浸潤リンパ球が、活性化マーカーＣＤ２５の発現を獲得したことを示す。
【実施例３９】
【０２６５】
実施例３９は、ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープと選択された共刺激分子とを共に用いた腫瘍を有するマウスの治療の成功は、Ｔｃ２に加えＴｃ１を含むＴｃの特定の分化パターンに関連することを示す。
【０２６６】
腫瘍関連エピトープを有する組換えＩｇと選択された合成ｄｓＲＮＡモチーフとを共に用いる実施例３７に記載の処置により腫瘍の拒絶に成功したマウスを殺し、腫瘍関連エピトープに対するＴ細胞応答を、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、モレシェイム、フランス）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に添加した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２と抗ＩＬ４に対しては４ｕｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮガンマに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社）と共に４°Ｃで一夜インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地で３７°Ｃ、一時間処理しブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計測後、各種濃度のＮＰペプチドと共に５×１０5／ウェルでインキュベートした。プレートは３７°Ｃで７２時間、５％ＣＯ２でインキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％−ＦＢＳ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）中に２μｇ／ｍＬ）と共に、４°Ｃで一夜インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を添加して開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０２６７】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリングス）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、ＩＬ−４、ＩＬ−２、及びＩＦＮ−γに対応するコロニーを形成するスポットの数（平均±ＳＥＭ）として表した。対照として、腫瘍を拒絶できなかった非処置マウスを用いた（ｎ＝４／群）。
【０２６８】
図２８の結果は、腫瘍の拒絶に成功した処置マウスは、治療性Ｉｇ上に腫瘍関連エピトープに対するＴｃ１応答をＴｃ２免疫と共に発現したことを示す。対照的に、腫瘍を拒絶できなかったマウスはＴｃ２免疫のみを示した。
【実施例４０】
【０２６９】
実施例４０は、ＩｇＧバックボーン内のＴ細胞エピトープと選択された共刺激モチーフとを共に用いた、腫瘍を有するマウスの特定の処置後の、効果的記憶応答の誘導を示す。
【０２７０】
ＮＰ−ＫdＴＡＡ発現ｓｐ２／０腫瘍を有するマウスを、実施例３７の記載のように、ＴＡＡを有する組換えＩｇと選択された合成ＲＮＡモチーフとを共に注射投与することにより処置した。腫瘍の拒絶後、マウスを１５００万のＮＰ−Ｋｄエピトープ発現ＳＰ２／０細胞を対側投与する皮下注射によって攻撃した。平行して、４匹の対照ナイーブマウスに、腫瘍形成／致死量の同タイプ細胞を同様に注入した。腫瘍の発生とサイズをモニタし、直径（ｍｍ）を攻撃からの時間に関して表した。
【０２７１】
図２９の結果は、図示の処置により有効な腫瘍の拒絶が誘導されると、その後は同種の腫瘍で攻撃してもこれに対し効果的な防御が行われ、効果的な免疫記憶が発現することを示す。
【実施例４１】
【０２７２】
実施例４１は、驚くべきことに、ＴＡＡを有するＩｇＧと共刺激物とを共に用いることによる腫瘍拒絶の誘導は、ＴＡＡを欠いた或いはＴＡＡの変異体を示す多数の腫瘍細胞変異体に対する交叉保護を生じることを示す。
【０２７３】
実施例４０の記載のような相同攻撃に対して保護されたマウスに、１５００万の腫瘍細胞（ＴＡＡを欠いた（抗原変異体なし）同種の腫瘍細胞、或いはＮＰ−Ｋdエピトープを欠いたＴＡＡの変異体を有する同種の腫瘍細胞）を用いて引き続き攻撃を行った。更に、マウスに、図３０Ａに添付の表に示される異なる型の腫瘍細胞系（４Ｔ−１腺癌）を用い対照として攻撃を行った。いずれの場合にもナイーブ対照が含まれる。
【０２７４】
腫瘍変異体による多重攻撃に対して保護されたマウスのＴ細胞免疫の状態は、ＴＡＡ（ＮＰ−Ｋｄペプチド）、ＨＡ（ＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチド）、或いは細胞溶解物から抽出したタンパク質で刺激した脾臓細胞浮遊液を用いたＥＬＩＳＰＯＴ分析で評価した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、モレシェイム、フランス）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に入れた精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２と抗ＩＬ４に対しては４ｕｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮガンマに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社）と共に、４°Ｃで一夜インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地を用い、３７°Ｃで１時間処理しブロッキングした。
【０２７５】
脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計測後、各種濃度の抗体と共に５×１０5／ウェルでインキュベートした。プレートは３７°Ｃで７２時間、５％ＣＯ２でインキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％−ＦＢＳ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）中に２μｇ／ｍＬ）と共に、４°Ｃで一夜インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を添加して開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０２７６】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリングス）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、ＩＬ−４、ＩＬ−２、及びＩＦＮ−γに対応するコロニーを形成するスポットの数（平均±ＳＥＭ）として表した。対照として、腫瘍を拒絶できなかった非処置マウスを用いた（ｎ＝４／群）。対照としてはナイーブマウスが含まれる。データは、器官当たりのサイトカイン産生細胞数（平均±ＳＥＭ）として表す（ｎ＝３／群）。
【０２７７】
図３０Ａ〜３０Ｂ（図３０Ａの表を含む）の結果は、腫瘍の拒絶を生じる図示の処置の結果として出現した免疫は、抗原変異体非存在下での攻撃に対する防御となり、サイトカイン産生細胞の全体に亘る増殖に関係付けられることを示す。このことは、提案に係る投薬計画によって増強される抗腫瘍リンパ球の、免疫療法分子によって担われているのではない腫瘍関連抗原に対するレパートリーの広がりを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２７８】
【図１】図１は、特定の抗体及びＴ細胞免疫に対する各種合成ＲＮＡモチーフの作用を示す。
【図２】図２は、特定のｄｓＲＮＡによる、ウィルス抗原に対する免疫応答の亢進を示す。
【図３】図３は、特定のｄｓＲＮＡモチーフが自然免疫及び抗原提示細胞に与える影響を示す。
【図４】図４は、特定のｄｓＲＮＡモチーフの「危険シグナル」性を示す。
【図５】図５は、選択されたｄｓＲＮＡモチーフの、強力なワクチンアジュバントとしての使用を示す。
【図６】図６は、免疫応答に対するｄｓＲＮＡモチーフの作用を示すフローチャートである。
【図７】図７は、インフルエンザ感染中に産生された天然の非感染性二本鎖ＲＮＡが、タンパク抗原に対する特異的免疫応答に実質的効果を有することを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、合成ＲＮＡモチーフの広範なライブラリーを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、各種合成ＲＮＡが、プロトタイプタンパク抗原に対するＢ細胞及びＴ細胞の応答を増強する効果を有することを示す。
【図９】図９は、自然免疫応答に対する選択されたＲＮＡモチーフの作用を示す。
【図１０】図１０は、別個のＲＮＡモチーフが抗原提示細胞上の異なる受容体に結合することを示す。
【図１１】図１１は、別個のＲＮＡモチーフがケモカインの様々な上方調節(upregulation)を誘導することを示す。
【図１２】図１２は、選択された合成ＲＮＡモチーフを使用することにより、インフルエンザウィルスの複製を制御できることを示す。
【図１３】図１３は、選択された合成ＲＮＡモチーフであるｐＩ：ｐＣ及びｐＡ：ｐＵが、精製タンパクの多量投与に通常伴う大量域寛容を著しく阻害することを示す。
【図１４】図１４は、選択された合成ＲＮＡモチーフがヒト単球細胞に作用することを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、非タグ化ｐＡ：ｐＵは、タグ化ｐＡ：ｐＵのヒトＴＨＰ−１単球細胞への結合に打勝つことができるが、非タグ化ｐＩ：ｐＣは打勝つことができないことを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、非タグ化ｐＡ：ｐＵは、タグ化ｐＡ：ｐＵのヒトＴＨＰ−１単球細胞への結合に打勝つことができるが、非タグ化ｐＩ：ｐＣは打勝つことができないことを示す。
【図１６】図１６は、ｄｓＲＮＡの精製及び分画工程を示す。
【図１７】図１７は、選択された合成ＲＮＡ化合物の分子量が小さい画分ほど、生物学的活性が高いことを示す。
【図１８】図１８は、ｐＩ：ｐＣは、ｐＡ：ｐＵと異なり、自己に対する抗体反応を誘導し、別のＲＮＡモチーフに対する交叉反応性成分を有することを示す。
【図１９】図１９は、選択された複数の合成ＲＮＡを同時に使用することにより、ＩｇＧが仲介するＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープの輸送に続いて、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの効果的な誘導が促進されることを示す。
【図２０】図２０は、組換えＩｇＧによるex vivoでのＡＰＣローディングは、ペプチド自体を使用するのに比べ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体の形成及びＴｃ応答の発生においてより効果的であることを示す。
【図２１】図２１は、選択された合成ＲＮＡを同時投与した場合に、クラスＩ拘束性Ｔｃ１応答のプライミングにおいて、クラスＩ拘束性エピトープのＩｇＧ媒介輸送が最も効果的となることを示す。
【図２２】図２２は、抗ウィルス細胞障害性Ｔ細胞の効果的なプライミングには、ＩｇＧにより輸送されたクラスＩ拘束性エピトープをＡＰＣにin vivoで効果的にローディングすることが必要であると共に、選択された合成ＲＮＡモチーフによる適切な指示も必要であることを示す。
【図２３】図２３は、ウィルス性クラスＩ拘束性エピトープを有する組換えＩｇＧ及び選択された合成ｄｓＲＮＡによって免疫感作を行うことにより、感染による攻撃後のウィルス複製を制限できる免疫応答がプライミングされることを示す。
【図２４】図２４は、Ｉｇ−ペプチドに基づく分子の効力を試験するために用いた腫瘍モデルである。
【図２５】図２５は、腫瘍関連抗原のＡＰＣへの効果的なin vivoローディングと同時に、選択された合成ＲＮＡモチーフによって活性化を行うことが、腫瘍成長の効果的な制御及び腫瘍拒絶の誘導のために必要且つ十分であることを示す。
【図２６】図２６は、腫瘍関連抗原のＡＰＣへの効果的なin vivoローディングと同時に、選択された合成ＲＮＡによって活性化を行うことによって、腫瘍関連抗原に対する効果的な免疫応答を誘導できることを示す。
【図２７】図２７は、腫瘍関連エピトープを有する組換え免疫グロブリンと選択された合成ｄｓＲＮＡモチーフとを共に用いて処理することにより、Ｔ細胞受容体マーカーＴＣＲβを提示する腫瘍浸潤リンパ球が、活性化マーカーＣＤ２５の発現を獲得したことを示す。
【図２８】図２８は、腫瘍拒絶に成功した処置マウスが、Ｔｃ２免疫を発現すると共に、治療用Ｉｇ上の腫瘍関連エピトープに対するＴｃ１応答を発現したことを示す。
【図２９】図２９は、図示の処置により有効な腫瘍拒絶が誘導されると、その後は同種の腫瘍が生じそうになっても効果的に防御されることを示し、よって効果的な免疫記憶が発現していることが分かる。
【図３０Ａ】図３０Ａは、腫瘍拒絶を生じる図示の処置の結果として出現した免疫が、抗原変異体非存在下での攻撃に対する防御となり、サイトカイン産生細胞の増殖全般に関連していることを示す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、腫瘍拒絶を生じる図示の処置の結果として出現した免疫が、抗原変異体非存在下での攻撃に対する防御となり、サイトカイン産生細胞の増殖全般に関連していることを示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、（ａ）天然ＩｇＧ（Ｌ鎖−Ｈ鎖ヘテロ二量体）、（Ｂ）ＣＤＲ（相補性決定領域）３、２、１或いはフレームワーク領域に挿入された抗原（Ａｇ）由来ペプチド、（Ｃ）抗原又は断片で置換したＶＨセグメント、及び（Ｄ）抗原又は抗原断片で置換したＶＨセグメント及びＣＨ１セグメントを示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＩｇＧペプチド及びＦｃペプチドを図示する。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、選択されたヒトＩｇＧバックボーンの特性を示す。
【図３１Ｄ】図３１Ｄは、Ｈ鎖の安定領域の配列、及び予想される構成の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【国際調査報告】
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