(57)【要約】個体群における多型マーカーの同定方法が提供される。この方法は、個体群の第１の試料を遺伝子型的に特徴づけし、遺伝子型の特徴づけに基づいて第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し、それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し、そしてそれぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の第２の試料を遺伝子型決定し、それにより個体群における多型マーカーを同定することを含む。バクテリア個体群における多型マーカーの同定方法も提供される。この方法は、個体群の第１の試料を表現型的に特徴づけし、遺伝子型の特徴づけに基づいて第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し、それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し、そしてそれぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の第２の試料を遺伝子型決定し、それにより個体群における多型マーカーを同定することを含む。また、それぞれ同じ数および位置のビットを含み且つそれぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列を設け、ビット列の関連性を示す−選択可能な要素を含む−グラフ図を作成し、第１の選択可能な要素を選択し、第２の選択可能な要素を選択し、そして第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはその逆であるビットを同定することを含む、複数のビット列の中の独特のビットを同定するための方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体群の１個もしくはそれより多くの個体を含む第１の試料を遺伝子型的に特徴づけし；
遺伝子型の特徴づけに基づいて第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し：
それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し；そして
それぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の１個もしくはそれより多くのメンバーを含む第２の試料を遺伝子型決定し、
それにより個体群における多型マーカーを同定する
ことを含んでなる、個体群における多型マーカーを同定するための方法。
【請求項２】
個体群がバクテリア個体群である、請求項１の方法。
【請求項３】
バクテリア個体群がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラクツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテレジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｅｄｉｔｉｓ）およびサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）よりなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
個体群の１個もしくはそれより多くの個体を含む第１の試料を遺伝子型的に特徴づけし；
遺伝子型の特徴づけに基づいて第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し：
それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し；そして
それぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の１個もしくはそれより多くのメンバーを含む第２の試料を遺伝子型決定し、
それによりバクテリア個体群における多型マーカーを同定する
ことを含んでなる、バクテリア個体群における多型マーカーを同定するための方法。
【請求項５】
バクテリア個体群がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラクツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテレジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｅｄｉｔｉｓ）およびサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）よりなる群から選択される、請求項４の方法。
【請求項６】
それぞれ同じ数および位置のビットを含み、それぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列を設け；
ビット列の関連性を示す選択可能な要素を含むグラフ図を作成し；
第１の選択可能な要素を選択し；
第２の選択可能な要素を選択し；そして
第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはｒｕｓｔ選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在であり且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在するビットを同定する
ことを含んでなる、複数のビット列の中の独特のビットを同定するための方法。
【請求項７】
ビット列中の対応する位置におけるビット値の共通性によりビット列の関連性を決定する、請求項６の方法。
【請求項８】
グラフ図がデンドログラムであり且つ選択可能な要素が葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す、請求項６の方法。
【請求項９】
グラフ図がデンドログラムであり且つ選択可能な要素が葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す、請求項７の方法。
【請求項１０】
それぞれ同じ数および位置のビットを含み、それぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列を設けるために構成されたロジック；
ビット列の関連性を示す選択可能な要素を含むグラフ図を作成するために構成されたロジック；
第１の選択可能な要素を選択するために構成されたロジック；
第２の選択可能な要素を選択するために構成されたロジック；
第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはｒｕｓｔ選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在であり且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在するビットを同定するために構成されたロジック
を含んでなる、複数のビット列の中の独特のビットを同定するためのソフトウェアを有するコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１１】
ビット列中の対応する位置におけるビット値の共通性によりビット列の関連性を決定する、請求項１０のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１２】
グラフ図がデンドログラムであり且つ選択可能な要素が葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す、請求項１０のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１３】
グラフ図がデンドログラムであり且つ選択可能な要素が葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す、請求項１１のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１４】
それぞれのビット列が生物のゲノムを示しそしてそれぞれのビットがゲノムのオリゴヌクレオチドセグメントから作成されるマイクロアレイの１個の領域を示す請求項６の方法。
【請求項１５】
第２の試料の遺伝子型決定が、
第２の試料のそれぞれのメンバーに関するビット列を作成し、それぞれのビットはメンバーに関するゲノムのオリゴヌクレオチドセグメントから作成されるマイクロアレイの１個の領域を示し且つそれぞれのビットはマイクロアレイのそれぞれの領域上に付着したオリゴヌクレオチドセグメントのハイブリッド形成の程度に依存して０または１の値を有し、
ビット列の関連性を示す選択可能な要素を含むグラフ図を作成し；
第１の選択可能な要素を選択し；
第２の選択可能な要素を選択し；そして
第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはｒｕｓｔ選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在であり且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在するビットを同定する
ことを含む請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的に個体群および分子遺伝子学の分野に関する。特に、それは個体群における多型マーカーを同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
一般原則として、種の分類学的分類は、遺伝的に類似しており且つ生殖的に交わることができる生物に一般的に指定されている。バクテリアは無性生物なので、種は一般に個体群を指し、それは遺伝的および生化学的類似性を共有する。バクテリアの種は類似性を共有するにもかかわらず、任意の種の種々の個体群を比較すると、有意な多様性が観察されうる。例えば、腸管バクテリアであるエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は約１７０種の血清型からなる。
【０００３】
臨床的または産業的微生物学者の最も重要な仕事の１つは、試料中にもし存在するならどの微生物が存在するかを明確に決定することである。幾つかの普通に知られており且つ簡単な方法を用い、微生物学者は一般に未知の微生物の種を比較的迅速に推定することができる。しかしながら、試料中に存在する微生物の亜種または実際の系統の決定は、多くの場合に遺伝子的または生化学的分析の複雑な方法を必要とする。これはもちろんより高い経費およびより遅い所要時間に言い換えられる。
【０００４】
試料中に存在する単なる種ではなくてバクテリアの特定の系統の決定は、食品産業にとって特に重要である。例えばＥ．コリの約１７０の系統の中でそれらの約３０だけが人間にとって病原性である。系統または亜種の病原的能力に依存して、加工業者は多くの場合に明確な系統もしくは亜種分類の決定に時間および努力を投じるより、種で汚染されたバッチを破棄することを選びうる。これは、それが実際に病原性であるかどうかを決定するために実際の系統を推定することに伴う前記の経費の故である。そのような「破棄」に伴う明らかな問題は、それもそれに伴う経費、すなわち収入源の損失を有することである。従って、試料中にバクテリアのどの系統が存在しうるかを迅速に同定する何らかの方法があることが望ましい。バクテリアの系統の迅速な同定のための診断手段の開発のために、問題となる系統およびあまり問題とならない系統に特徴的な遺伝子マーカーを同定するのがまず必要である。
【０００５】
系統−レベルの分類の実際の適用の他に、より安全な食物環境を作るために、バクテリアの個体群の遺伝子的特徴の理解も重要である。遺伝子取得、欠失および突然変異によるゲノムの改変は、食物連鎖中への新しい伝達経路および食物生産環境において課される選択圧と共に、食物由来の病原体の進化および発生を駆動する要素である。かくしていかにして病原性および腐敗性生物が食物供給に入るのか、いかにして病原性生物の種々の個体群が食物生産環境における選択圧により影響されるのか、およびいかにしてこれがある主の個体群に毒性、腐敗性および／または伝達性の向上を与える特性に関連するのかを理解するための新しい方法が創案されることがますます重要になる。無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）；増幅制限酵素断片長多型性（ＡＦＬＰ）、オクタマーに基づくゲノム走査（ＯＧＢＳ）および多座配列決定（ｍｕｌｔｉ−ｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を含む幾つかの分子遺伝学的方法が、個体群についての高分解能情報を与えるために開発された。これらの方法のそれぞれは、それらが１回の実験でゲノムの限られた範囲しか含まれないこと、および従って、特に緊密に関連する系統の場合に、含まれるゲノム範囲を広げるために複数の目的で行なわれなければならないことに悩まされている。本発明は、１回の実験でゲノム全体の包含を可能にすることにより並びに関連する個体群に特異的な遺伝子セグメントの決定により、この制限を克服する。
【０００６】
食物産業にとって特に興味ある別のバクテリアはリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。リステリア・モノサイトゲネス系統の数種の血清型が食物中および環境中で見出されているが、ほとんど（＞９５％）の人間感染症は３種の血清型である１／２ａ、１／２ｂおよび４ｂだけにより引き起こされる。これらの系統は２種の主要遺伝子群に属し、それらの１つは血清型１／２ａを含むが１／２ｂおよび４ｂは別の群に属する。ほとんどの分子遺伝学および免疫学研究は、１／２ａ（系統１０４０３ｓ、ＥＧＤ、ＮＣＴＣ７９７３マック（Ｍａｃｋ））および１／２ｃ（系統ＬＯ２８）を含む第１の遺伝子群からの系統を使用した。別の群を示す系統は大部分が分子遺伝学研究から省かれてきた。しかしながら、この群からの系統、特に血清型４ｂの系統、は食物産業および公衆衛生にとって最も意義がありうる。
【０００７】
血清型４ｂの系統は、散発的感染症の相当な部分（約４０％）だけでなく、ロスアンジェルスにおける１９８５年のハリスコチーズ（Ｊａｌｉｓｃｏ  ｃｈｅｅｓｅ）大発生および汚染されたホットドッグに由来する米国における最近の数州にまたがる大発生を含む研究されたリステリア病の共通原因大発生のほとんど全ても引き起こす。Ｌ．モノサイトゲネス単離体の種々の下位個体群の中で迅速に区別するための独特のＤＮＡ配列情報を決定するための比較的迅速な、簡単なそして安価な方法に関する要望がある。そのような試験は疫学研究および危険性評価研究に必要な高性能分析にとって重要である。
【０００８】
リステリア・モノサイトゲネスは、髄膜炎、敗血症、および胎児死亡の範囲にわたる生命を脅かす感染症を引き起こしうる至るところにあるグラム陽性生物である。リストリア病の発生率は低いが、特に妊娠中の女性および免疫が弱体化した人間では、関連する病的状態が極めて高くなりうる（非特許文献１）。Ｌ．モノサイトゲネスはその強固な生理学的特性に関して良く知られておりそして冷蔵温度において、低いｐＨ、および／または高い浸透率の条件下で成長しうるわずかな病原性バクテリアの１種である（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。
【０００９】
Ｌモノストゲネスは数種のタイプの培養された細胞中で成長可能でありそして細胞内で成長し且つ宿主細胞の細胞骨格成分の使用により隣接する宿主細胞に拡大することが可能である（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。Ｌモノサイトゲネス中の毒性の遺伝的分析が、宿主細胞侵襲中に起きる一連の事象に直接寄与する数個の遺伝子座を同定した（非特許文献１２、非特許文献１３で論評された）。これらの毒性遺伝子はアドヘシン類（ａｄｈｅｓｉｎｓ）、細胞分解毒素、アクチン重合性蛋白質およびホスホリパーゼ類を包含し、それらはそれぞれ宿主細胞侵入、液胞漏出、複製、および隣接宿主細胞への拡大において機能する。
【００１０】
例えば温度および炭水化物の如き数種のシグナルが毒性遺伝子の調節を抑制するようであり（非特許文献１４、非特許文献１５）、そして最近の証明はこれらが毒性遺伝子の発現を支配する別個の経路であることを示唆している（非特許文献１６）。かくして、ＰｒｆＡと称する毒性遺伝子調節剤は、毒性遺伝子の転写と宿主中への侵入を合図しうる種々の信号とを結びつけることができる。
【００１１】
Ｌモノサイトゲネス系統は体細胞（数字で示される）および鞭毛（文字で示される）抗原における血清型の差異を示す（非特許文献１７）。Ｌモノサイトゲネスの１３種の血清型が食物中および環境中で見出されているが（非特許文献１８）、最も臨床的な単離体は３種の血清型である１／２ａ、１／２ｂおよび４ｂだけであり（非特許文献１９）、これらの血清型が人間にとって特に有毒でありうるかまたは感染症の伝達および定着に関して必要な障害をより良好に持続させうることを示唆している。
【００１２】
Ｌ．モノサイトゲネス系統の中の遺伝的関係を試験するために数種の研究が行なわれた。最も有意なものの１つは多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）を用いた初期の研究であり、それが２つの顕著な遺伝系統の中の分類された４５種の電気泳動型（（ＥＴ−対立遺伝子または蛋白質同形体の組み合わせ）を同定した（非特許文献２０）。多分、この研究からの比較的顕著な結果の１つは、大発生から単離された系統のほぼ全てが２種のＥＴだけから構成されていたという発見であり、これらのクローンが人間にとって高度に有毒でありうることを示唆している。流行する系統の密集化とは対照的に、散発的な症例から単離される系統は多種のＥＴの中に分散されていた。
【００１３】
ＭＬＥＥの他に、パルスフィールドゲル電気泳動法（非特許文献２１）、リボタイピング（非特許文献２２）、毒性遺伝子のＲＦＬＰ分析（非特許文献２３）、並びに毒性遺伝子のＤＮＡ配列分析（非特許文献２４、非特許文献２５）を用いる研究者もＬ．モノサイトゲネス系統の２つの顕著な系統の存在を示した。ＲＦＬＰ分析およびリボタイピングと一緒の毒性関連遺伝子の種々の組み合わせの多座配列分析を用いた最近の研究（非特許文献２６、非特許文献２７）は独立してＬモノサイトゲネスの第３の系統の存在を示した。これらの方法により示された遺伝的関係は、流行性系統が系統Ｉであると確認され、散発的系統が系統ＩおよびＩＩで見出されたが、系統ＩＩＩは人間の臨床単離体を欠いていたことを示した（非特許文献２８）。実際に、この遺伝的特徴がこれらの著者をして系統ＩＩＩ系統がほとんど動物の病原体でありそしてリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の新種として指定すべきであると提唱せしめた（非特許文献２９）。同時に、遺伝分析の数種の手段を使用したこれらの研究は、毒性すなわち感染症を定着させるために必要な障害の持続を容易にする生理学的特徴がＬモノサイトゲネスの系統の中で均一に分布されていないという見解を強く支持している。数種のバクテリア病原体の研究は、実際に、毒性遺伝子の対立遺伝子の独特な組み合わせにより示される高度に有毒な下位個体群のクローン増殖が一般に疾病の拡大増加に関連することを示した（例えば非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２参照）。最近、Ｅ．コリＯ１５７：Ｈ７の明らかなクローン個体群の中でも異なる下位個体群が米国で存在しそして独特な生態を有するようであることが示された（非特許文献３３）。従って、毒性能力における変動の現象は病原性微生物の一般的特徴であるようである。
【００１４】
Ｌ．モノサイトゲネス下位個体群の毒性特徴における差異を説明しうる互いに排他的でない幾つかの可能性がある。最も簡単な説明の１つは、より有毒と推定される下位個体群は系統を宿主細胞および組織にさらに良好に浸透可能にさせる毒性遺伝子の対立遺伝子の特定の組み合わせを有するというものである。別の病原体種では、毒性遺伝子の対立遺伝子の組み合わせがある種のクローンの増加および拡大において重要な役割を演ずるようである。第２に、ある種の系統が毒性に寄与するかまたは毒性遺伝子発現の独特なパターンを有する別の遺伝子を有することが可能である。ＰｒｆＡ活性の調節における系統特異的な変動が種々のＬ．モノサイトゲネス系統におけるｐｒｆＡ−依存性遺伝子発現に対する炭素源の効果に関して最近示された（非特許文献３４、非特許文献３５）。最後に、系統間の生理学的差異が、ある種の系統を感染を定着させるために必要な障害をより良好に耐えることができるようにする特徴を与えることも可能である。
【非特許文献１】ゲリン（Ｇｅｌｌｉｎ）およびブルーム（Ｂｒｏｏｍｅ）、１９８９
【非特許文献２】ファーバー（Ｆａｒｂｅｒ）およびブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、１９９０
【非特許文献３】ファーバー（Ｆａｒｂｅｒ）およびプテルキン（Ｐｔｅｒｋｉｎ）、１９９１
【非特許文献４】クロル（Ｋｒｏｌｌ）およびパチェット（Ｐａｔｃｈｅｔｔ）、１９９２
【非特許文献５】ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９９２
【非特許文献６】ウィルキンズ（Ｗｉｌｋｉｎｓ）他、１９７２
【非特許文献７】クロル（Ｋｒｏｌｌ）およびパチェット（Ｐａｔｃｈｅｔｔ）、１９９２
【非特許文献８】ガリアード（Ｇａｌｌｉａｒｄ）他、１９８７
【非特許文献９】ポートノイ（Ｐｏｒｔｎｏｙ）他、１９８８
【非特許文献１０】チルネイ（Ｔｉｌｎｅｙ）およびポートノイ（Ｐｏｒｔｎｏｙ）、１９８９
【非特許文献１１】ムニエル（Ｍｏｕｎｉｅｒ）他、１９９０
【非特許文献１２】ポートノイ（Ｐｏｒｔｎｏｙ）他、１９９２
【非特許文献１３】シーハン（Ｓｈｅｅｈａｎ）他、１９９４
【非特許文献１４】ライマイステル−ワヒテル（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗａｃｈｔｅｒ）他、１９９２、
【非特許文献１５】パーク（Ｐａｒｋ）およびクロル（Ｋｒｏｌｌ）、１９９３
【非特許文献１６】レンゾニ（Ｒｅｎｚｏｎｉ）他、１９９７
【非特許文献１７】シーリンゲル（Ｓｅｅｌｉｎｇｅｒ）およびヘーネ（Ｈｏｅｈｎｅ）、１９７９
【非特許文献１８】ファーバー（Ｆａｒｂｅｒ）およびプテルキン（Ｐｔｅｒｋｉｎ）、１９９１
【非特許文献１９】シュチャット（Ｓｃｈｕｃｈａｔ）他、１９９１
【非特許文献２０】ピファレッチ（Ｐｉｆｆａｒｅｔｔｉ）他、１９８９
【非特許文献２１】ブロッシュ（Ｂｒｏｓｃｈ）他、１９９４
【非特許文献２２】グレーヴェス（Ｇｒａｖｅｓ）他、１９９４
【非特許文献２３】ヴィネス（Ｖｉｎｅｓ）他、１９９２
【非特許文献２４】グテクンスト（Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔ）他、１９９２
【非特許文献２５】ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）他、１９９１
【非特許文献２６】ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）他、１９９５
【非特許文献２７】ウィードマン（Ｗｉｅｄｍａｎｎ）他、１９９７
【非特許文献２８】ウィードマン（Ｗｉｅｄｍａｎｎ）他、１９９７
【非特許文献２９】ウィードマン（Ｗｉｅｄｍａｎｎ）他、１９９７
【非特許文献３０】カラオリス（Ｋａｒａｏｌｉｓ）他、１９９５
【非特許文献３１】ムッセイ（Ｍｕｓｓｅｉ）およびクラウス（Ｋｒａｕｓｅ）、１９９８
【非特許文献３２】ムッサー（Ｍｕｓｓｅｒ）、１９９６
【非特許文献３３】キム（Ｋｉｍ）他、１９９９
【非特許文献３４】ブレーム（Ｂｒｅｈｍ）他、１９９９
【非特許文献３５】ヒューレット（Ｈｕｉｌｅｔｔ）他、１９９９
【発明の開示】
【００１５】
概要
個体群の第１の試料を遺伝子型的に特徴づけし、この特徴づけに基づいて第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し、それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し、それぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の第２の試料を遺伝子型決定し、個体群における多型マーカーを同定し、そしてマーカーを選別して当該個体群のこれらの特徴を同定することを含んでなる、個体群における多型マーカーを同定するための方法が提供される。１つの態様では、個体群はバクテリア個体群である。バクテリア個体群はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラクツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテレジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｅｄｉｔｉｓ）およびサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）よりなる群から選択される。
【００１６】
個体群の第１の試料を遺伝子型的に特徴づけし、この特徴づけに基づいて第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し、それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し、それぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の第２の試料を遺伝子型決定し、個体群における多型マーカーを同定し、そしてマーカーを選別して当該個体群のこれらの特徴を同定することを含んでなる、バクテリア個体群における多型マーカーを同定するための方法も提供される。１つの態様では、バクテリア個体群はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラクツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテレジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｅｄｉｔｉｓ）およびサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）よりなる群から選択される。
【００１７】
それぞれ同じ数および位置のビットを含みそしてそれぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列を設け、ビット列の関連性を示す−選択可能な要素を含む−グラフ図を作成し、第１の選択可能な要素を選択し、第２の選択可能な要素を選択し、そして第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはその逆であるビットを同定することを含む、複数のビット列の中の独特のビットを同定するための方法も提供される。１つの態様では、ビット列の関連性はビット列中の対応する位置におけるビット値の共通性により決定される。この方法およびこの方法の態様の両者において、グラフ図はデンドログラムであることができ且つそして選択可能な要素は葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す。
【００１８】
それぞれ同じ数および位置のビットを含み、それぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列を設けるために構成されたロジック、ビット列の関連性を示す選択可能な要素を含むグラフ図を作成するために構成されたロジック、第１の選択可能な要素を選択するために構成されたロジック、第２の選択可能な要素を選択するために構成されたロジック、およびｒｕｓｔ選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはｒｕｓｔ選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在であり且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在するビットを同定するために構成されたロジックを含む、複数のビット列の中の独特のビットを同定するためのソフトウェアを有するコンピューター読み取り可能な媒体も提供される。１つの態様では、ビット列の関連性はビット列中の対応する位置におけるビット値の共通性により決定される。この方法およびこの方法の態様の両者において、グラフ図はデンドログラムであることができ且つ選択可能な要素は葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す。
【００１９】
本発明の他のシステム、方法、特徴および利点は以下の図面および詳細な記述の検討で当業者には明らかであろうしまたは明らかになるであろう。そのようなさらなるシステム、方法、特徴および利点はこの記述に含まれ、本発明の範囲内にあり、そして添付されている特許請求の範囲により保護されることが意図される。
【００２０】
図面中の構成部分は必ずしも一定の基準で評価される必要はなく、その代わり本発明の原則の説明で強調される。
好ましい態様の詳細な記述
ここに記載されている本発明は単なる説明だけであることを理解すべきである。ここに示された態様のいずれも限定用ではない。添付されている特許請求の範囲により規定されている本発明の範囲から逸脱せずに改変および応用を行ないうることは当業者に明らかになるであろう。
【００２１】
本発明は、個体群の中の多型マーカーの同定方法を提供する。
【００２２】
ここで使用される「個体群」は同一種に属する２種もしくはそれより多くの生物を指すことを意図する。個体群の「試料」は個体群全体またはそのいずれかの部分を包含しうる。
【００２３】
ここで使用される「マーカー」は試料の中で１つの個体またはメンバーを別の個体またはメンバーと区別しうる特徴をさすことを意図する。
【００２４】
本発明の方法は、個体群の第１の試料を遺伝子型的に特徴づけし、遺伝子型的特徴づけに基づいてｒｕｓｔ試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し、それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し、それぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の第２の試料を遺伝子型決定し、個体群における多型マーカーを同定し、そして当該個体群のこれらの特徴を同定するためのマーカーを選別する段階を含む。
【００２５】
典型的には、マイクロアレイは少なくとも約１００／ｃｍ2、そして好ましくは約１０００／ｃｍ2、の別個の領域の密度を有する固体担体の表面上に形成された領域の一次または二次元列である。そのようなマイクロアレイ中の領域は約１０−２５０μｍの範囲内の典型的寸法、例えば直径、を有し、そしてほぼ同じ距離だけ列の中の別の領域から離されている。例えばシリカ処理ガラススライドの如き固体担体上への合成オリゴヌクレオチド類、ＰＣＲ生成物または他の形態の遺伝物質の組の付着により、ＤＮＡマイクロアレイを作成することができる。
【００２６】
当該生物のゲノムの寸法、固体担体の寸法および別個の領域を離している距離に依存して、全ゲノムが存在するようにＤＮＡマイクロアレイを作成することができる。全ゲノムから誘導されるＰＣＲ生成物を含有する全ゲノムマイクロアレイは２種の一般的方法により作成される。第１に、当該生物のゲノム配列が入手可能である場合には、個別オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせをゲノム中のそれぞれのコード化領域に関して設計して、独立する反応におけるそれぞれの遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を可能にする。増幅生成物を次に使用してマイクロアレイを作成する。ゲノム配列が入手可能でない場合には、「ショットガン」方法が使用される。この方法では、セグメントをクローニング部位に隣接する共通プライミング部位を含有するベクターの中にクローニングすることによりゲノムＤＮＡのライブラリーが構成される。ライブラリーからのそれぞれのクローンを次に独立して増幅させそしてアンプリコンを使用してマイクロアレイを作成する。固体担体上へのオリゴヌクレオチド類の付着または「印刷」は例えば自動化されたアレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）によるような当該技術で既知である数種の方法のいずれかにより行なうことができる。固体担体上にオリゴヌクレオチド類を付着させるため使用される方法に関係なく、使用者は指定された領域におけるオリゴヌクレオチド類を追跡してその元のクローンに戻すことが可能でなければならない。
【００２７】
本発明の方法は、好ましい態様では、バクテリア個体群を包含する生存生物の個体群における多型遺伝子マーカーの同定および選別に有用である。代表的なバクテリア個体群はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラクツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテレジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｅｄｉｔｉｓ）およびサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）を包含する。
第１の試料の遺伝子型の特徴づけ
個体群の第１の試料はいずれかの適当な方法を用いて遺伝子型的に同定することができる。有用な方法は全ゲノムマイクロアレイ、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅制限酵素断片長多型性（ＡＦＬＰ）、多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）、オクタマーに基づくゲノム走査（ＯＢＧＳ）、および多座配列分類（ＭＬＳＴ）を包含するが、それらに限定されない。本発明における遺伝子型の特徴づけのためには、全ゲノムマイクロアレイを使用することが好ましい。これは、第１の試料の標本からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成しそして次にこの標本のマイクロアレイを参照として用いて第１の試料中に存在する１種もしくは複数の個体を遺伝子型決定することにより、行なわれる。
【００２８】
好ましくは、遺伝子型決定段階は個体毎に行なわれる。遺伝子型決定されるそれぞれの個体に関して、標本および個体の両者からの予め決められた等量のゲノムＤＮＡに蛍光色素で標識付けし、そして次にマイクロアレイに対してハイブリッド形成する。配列の相補性により、標本からのＤＮＡはマイクロアレイのそれぞれの領域に存在するオリゴヌクレオチド類の全てに対してハイブリッド形成するであろう。そうゆうわけで、標本のＤＮＡおよび個体のＤＮＡの標識付け中に異なる標識が使用される。
【００２９】
ハイブリッド形成後に、マイクロアレイのそれぞれの領域に対する標本および個体からの標識付けされたＤＮＡのハイブリッド形成により記録された蛍光強度が多色マイクロアレイスキャナーにより測定されそして画像分析および統計学的分析ソフトウェアによりバイナリ要素または整数に変換される。画像分析ソフトウェアは、スプレッドシートファイル中に、マイクロアレイの領域の全てを表す蛍光強度のアウトプットを作成する。統計学的分析用には、マイクロアレイ領域に対する個体のＤＮＡのハイブリッド形成のパターンを示すビット列を作成するために二進変換を使用することが好ましい。二進変換は、異なる色素チャネル上のそれぞれの領域のハイブリッド形成強度を比較することにより、行なわれる。個体のＤＮＡがハイブリッド形成セグメントを含有する場合には、標本のＤＮＡ対個体のＤＮＡのハイブリッド形成強度の比は０であるかまたは０に近い。個体のＤＮＡがセグメントを欠いている場合またはセグメントが実質的に変更されている場合には、比ははるかに高い。好ましくは、ハイブリッド形成強度の比が平均値より上の＜２の標準偏差である場合には１のバイナリビットがこの領域に指定されそしてハイブリッド形成強度の比が平均より上の＞２の標準偏差である場合には０のバイナリビットがこの領域に指定されるような比のしきい値が使用されるが、これらの数を逆転させうることは当業者には容易に明らかになるであろう。生じたアウトプットファイルはテキスト形式にされるが、それをスプレッドシート形式にすることもできる。アウトプットファイルは変換されたバイナリ要素または正規化された比を含有することができる。統計学的分析ソフトウェア、好ましくはＰＥＲＬに基づくもの、はそれぞれの個体に関するそれぞれのアウトプットファイルからのデータを複合ファイルにまとめ、そして比の平均値および中央値のセンタリング（ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）によるデータの正規化により統計学的分析を行なう。複合ファイルが作成されたら、第１の試料中に存在する個体の遺伝的関連性に関する決定を行なう。そのような決定は、好ましくは第１の試料からのそれぞれの個体に対応するビット列を含有する複合ファイルを、１個もしくはそれより多くのクラスタリングアリゴリズムを含む別個のコンピュータープログラムの中に加えることにより、行なわれる。好ましくは、クラスタリングプログラムは近隣接合およびブートストラップアリゴリズムの両者を含む。クラスタリングプログラムはデンドログラムがｒｕｓｔ試料中のそれぞれの個体から構成されるようにするために向けられている。そのようなデンドログラムは、それぞれの個体間の相対的遺伝子距離並びに個体の中の遺伝子型的に関連する群または集団の存在を示す。クラスタリングはアレイからのバイナリまたは整数測定のいずれかで行えることは当業者に明らかになるであろう。
遺伝子型の特徴づけに基づく第１の試料の１つもしくはそれより多くの個体の選択
ｒｕｓｔ試料が遺伝子型的に特徴づけされたら、第１の試料中に存在する１つもしくはそれより多くの個体が遺伝子型の特徴づけに基づき選択される。選択は、選択されたそれぞれの個体が試料群または集団の別の個体の間でほとんどの特性を共有するように、行なわれる。
第１の試料から選択されるそれぞれの個体からのマイクロアレイの作成
ｒｕｓｔ試料の１個もしくはそれより多くの個体が選択されたら、全ゲノムマイクロアレイがそれぞれから製造される。
第２の試料の遺伝子型決定
全ゲノムマイクロアレイが第１の試料から選択されたそれぞれの個体から製造されたら、個体群の第２の試料がそれぞれ選択された個体のマイクロアレイを参照として用いて遺伝子型決定される。好ましくは、これはメンバー毎に行なわれる。遺伝子型決定される第２の試料のそれぞれのメンバーに関して、選択された１個もしくは複数の個体およびメンバーのそれぞれからの予め決められた量のゲノムＤＮＡが蛍光色素で標識付けされ、そして次にそれぞれの１個もしくは複数のマイクロアレイに対してハイブリッド形成される。配列の相補性により、選択される個体からのＤＮＡはそれぞれのマイクロアレイのそれぞれの領域の中に存在するオリゴヌクレオチド類の全てに対してハイブリッド形成するであろう。そうゆうわけで、選択される個体のＤＮＡおよびメンバーのＤＮＡの標識付け中に異なる蛍光色素が使用される。
【００３０】
ハイブリッド形成後に、マイクロアレイのそれぞれの領域に対する標本およびメンバーからの標識付けされたＤＮＡのハイブリッド形成により記録された蛍光強度が多色マイクロアレイスキャナーにより測定されそして画像分析および統計学的分析ソフトウェアによりバイナリ要素または整数に変換される。画像分析ソフトウェアは、スプレッドシートファイル中に、マイクロアレイの領域の全てを表す蛍光強度のアウトプットを作成する。統計学的分析用には、マイクロアレイ領域に対するメンバーのＤＮＡのハイブリッド形成のパターンを示すビット列を作成するために二進変換を使用することが好ましい。二進変換は、異なる色素チャネル上のそれぞれの領域のハイブリッド形成強度を比較することにより、行なわれる。メンバーのＤＮＡがハイブリッド形成セグメントを含有する場合には、選択される個体のＤＮＡおよびメンバーのＤＮＡのハイブリッド形成強度の比は０であるかまたは０に近い。メンバーのＤＮＡがセグメントを欠いている場合またはセグメントが実質的に変更されている場合には、比ははるかに高い。好ましくはハイブリッド形成強度の比が平均値より上の＜２の標準偏差である場合には１のバイナリビットがその領域に指定されそしてハイブリッド形成強度の比が平均値より上の＞２の標準偏差である場合には０のバイナリビットがその領域に指定されるような比のしきい値が使用される。生じたアウトプットファイルはテキスト形式にされるが、それをスプレッドシート形式にすることもできる。アウトプットファイルは変換されたバイナリ要素または正規化された比を含有することができる。統計学的分析ソフトウェア、好ましくはＰＥＲＬに基づくもの、はそれぞれのメンバーに関するそれぞれのアウトプットファイルからのデータを複合ファイルにまとめ、そして比の平均値および中位値のセンタリングによるデータの正規化により統計学的分析を行なう。複合ファイルが作成されたら、第２の試料中に存在するメンバーの遺伝的関連性に関する決定を行なう。そのような決定は、好ましくは第２の試料からのそれぞれのメンバーに対応するビット列を含有する複合ファイルを、１個もしくはそれより多くのクラスタリングアリゴリズムを含む別個のコンピュータープログラムの中に加えることにより、行なわれる。好ましくは、クラスタリングプログラムは近隣接合およびブートストラップアリゴリズムの両者を含む。クラスタリングプログラムは複合ファイルに含まれたデータを選別しそして群にしながら、それぞれのビットに対応するマイクロアレイ領域の同定に関する情報を保存する。クラスタリングプログラムはデンドログラムが第２の試料のそれぞれのメンバーから構成されるようにするために向けられている。そのようなデンドログラムは、それぞれのメンバーの中の相対的遺伝子距離並びにメンバーの中の遺伝的に関連する群または集団の存在を示す。系統発生もデンドログラムから推論できる。クラスタリングはアレイからのバイナリまたは整数測定のいずれかで行いうることは当業者に明らかになるであろう。
【００３１】
第２の試料のメンバーが遺伝的に関連のある群またはクラスターにまとめられたら、クラスタリングプログラムは２つのそのような群またはクラスターを選択するように向けられる。クラスタリングプログラムは次に、１つの群またはクラスターに存在し且つ別のものには不在である特定のマイクロアレイ領域に対応するマーカーを同定するために向けられる。このプログラムは１つの群またはクラスターの少なくとも１つのメンバー中に存在し且つ第２の群またはクラスターの全てのメンバー中に不在であるマーカーを同定するためにも向けられる。それぞれのビットに対応するマイクロアレイ領域に関する情報は選別およびグループ化工程中に保存されるため、マイクロアレイ領域は容易に同定されてこれらのタイプのマーカーを示すことができる。これらの特定領域は次に元のマイクロアレイ蛍光スキャン上で同定されうる。
【００３２】
バクテリア個体群中における多型マーカーの同定方法も提供される。本発明の方法は、個体群の第１の試料を遺伝子型的に特徴づけし、遺伝子型の特徴づけに基づいて第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し、それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し、そしてそれぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の第２の試料を遺伝子型決定し、それにより個体群における多型マーカーを同定することを含む。代表的なバクテリア個体群はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラクツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテレジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｅｄｉｔｉｓ）およびサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）よりなる群から選択される。
【００３３】
典型的には、マイクロアレイは少なくとも約１００／ｃｍ2、そして好ましくは約１０００／ｃｍ2、別個の領域の密度を有する固体担体の表面上に形成された領域の一次または二次元列である。そのようなマイクロアレイ中の領域は約１０−２５０μｍの範囲内の典型的寸法、例えば直径、を有し、そしてほぼ同じ距離だけ列の中の別の領域から離されている。例えばシリカ処理ガラススライドの如き固体担体上への合成オリゴヌクレオチド類、ＰＣＲ生成物または他の形態の遺伝物質の組の付着により、ＤＮＡマイクロアレイを作成することができる。
【００３４】
当該生物のゲノムの寸法、固体担体の寸法、および別個の領域を離している距離に依存して、全ゲノムが存在するようにＤＮＡマイクロアレイを作成することができる。全ゲノムから誘導されるＰＣＲ生成物を含有する全ゲノムマイクロアレイは２種の一般的方法により作成される。第１に、当該生物のゲノム配列が入手可能である場合には、個別のオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせをゲノム中のそれぞれのコード化領域に関して設計して、独立する反応におけるそれぞれの遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を可能にする。増幅生成物を次に使用してマイクロアレイを作成する。ゲノム配列が入手可能でない場合には、「ショットガン」方法が使用される。この方法では、セグメントをクローニング部位に隣接する共通プライミング部位を含有するベクターの中にクローニングすることによりゲノムＤＮＡのライブラリーが構成される。ライブラリーからのそれぞれのクローンを次に独立して増幅させそしてアンプリコンを使用してマイクロアレイを作成する。固体担体上へのオリゴヌクレオチド類の付着または「印刷」は例えば自動化されたアレイヤーによるような当該技術で既知である数種の方法のいずれかにより行なうことができる。固体担体上にオリゴヌクレオチド類を付着させるため使用される方法に関係なく、使用者は指定された領域におけるオリゴヌクレオチド類を追跡してその元のクローンに戻すことが可能でなければならない。
第１の試料の遺伝子型の特徴づけ
バクテリア個体群を遺伝子型的に特徴づけするための、血清型決定、毒素製造、胞子形成効率、発酵特徴、例えば食物発酵、および食物感覚特徴の損失または変性に関連する酵素の製造に基づく試料の特徴づけを包含するが、それらに限定されない数種の許容可能な方法がある。
遺伝子型の特徴づけに基づく第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体の選択
第１の試料が遺伝子型的に特徴づけされたら、ｒｕｓｔ試料中に存在する１個もしくはそれより多くの個体が遺伝子型の特徴づけに基づき選択される。選択は、選択されたそれぞれの個体が試料の中の別の個体間でほとんどの特性を共有するように、行なわれる。
第１の試料から選択されるそれぞれの個体からのマイクロアレイの作成
ｒｕｓｔ試料の１個もしくはそれより多くの個体が選択されたら、全ゲノムマイクロアレイがそれぞれから製造される。
第２の試料の遺伝子型決定
全ゲノムマイクロアレイが第１の試料から選択されたそれぞれの個体から製造されたら、個体群の第２の試料がそれぞれ選択された個体のマイクロアレイを参照として用いて遺伝子型決定される。好ましくは、これはメンバー毎に行なわれる。遺伝子型決定される第２の試料のそれぞれのメンバーに関して、選択された１個もしくは複数の個体およびメンバーのそれぞれからの予め決められた量のゲノムＤＮＡが蛍光色素で標識付けされ、そして次にそれぞれの１個もしくは複数のマイクロアレイに対してハイブリッド形成される。配列の相補性により、選択される個体からのＤＮＡはそれぞれのマイクロアレイのそれぞれの領域中に存在するオリゴヌクレオチド類の全てに対してハイブリッド形成するであろう。そうゆうわけで、選択される個体のＤＮＡおよびメンバーのＤＮＡの標識付け中に異なる蛍光色素が使用される。
【００３５】
ハイブリッド形成後に、それぞれのマイクロアレイのそれぞれの領域に対する選択された個体およびメンバーからの標識付けされたＤＮＡのハイブリッド形成により記録された蛍光強度が多色マイクロアレイスキャナーにより測定されそして画像分析および統計学的分析ソフトウェアによりバイナリ要素または整数に変換される。画像分析ソフトウェアは、スプレッドシートファイル中に、マイクロアレイの領域の全てを表す蛍光強度のアウトプットを作成する。統計学的分析用には、マイクロアレイ領域に対するメンバーのＤＮＡのハイブリッド形成のパターンを示すビット列を作成するために二進変換を使用することが好ましい。二進変換は、異なる色素チャネル上のそれぞれの領域のハイブリッド形成強度を比較することにより、行なわれる。メンバーのＤＮＡがハイブリッド形成セグメントを含有する場合には、選択される個体のＤＮＡおよびメンバーのＤＮＡのハイブリッド形成強度の比は０であるかまたは０に近い。メンバーのＤＮＡがセグメントを欠いている場合またはセグメントが実質的に変更されている場合には、比ははるかに高い。好ましくはハイブリッド形成強度の比が平均より上の＜２の標準偏差である場合には１のバイナリビットがその領域に指定されそしてハイブリッド形成強度の比が平均より上の＞２の標準偏差である場合には０のバイナリビットがその領域に指定されるような比のしきい値が使用される。生じたアウトプットファイルはテキスト形式にされるが、それをスプレッドシート形式にすることもできる。アウトプットファイルは変換されたバイナリ要素または正規化された比を含有することができる。統計学的分析ソフトウェア、好ましくはＰＥＲＬに基づくもの、はそれぞれのメンバーに関するそれぞれのアウトプットファイルからのデータを複合ファイルにまとめ、そして比の平均値および中央値のセンタリングによるデータの正規化により統計学的分析を行なう。複合ファイルが作成されたら、第２の試料中に存在するメンバーの遺伝的関連性に関する決定を行なう。そのような決定は、好ましくは第２の試料からのそれぞれのメンバーに対応するビット列を含有する複合ファイルを、１個もしくはそれより多くのクラスタリングアリゴリズムを含む別個のコンピュータープログラムの中に加えることにより、行なわれる。好ましくは、クラスタリングプログラムは近隣接合およびブートストラップアリゴリズムの両者を含む。クラスタリングプログラムは複合ファイルに含まれたデータを選別しそして群にしながら、それぞれのビットに対応するマイクロアレイ領域の同定に関する情報を保存する。クラスタリングプログラムはデンドログラムが第２の試料のそれぞれのメンバーから構成されるようにするために向けられている。そのようなデンドログラムは、それぞれのメンバーの中の相対的遺伝子距離並びにメンバーの中の遺伝的に関連する群またはクラスターの存在を示す。系統発生もデンドログラムから推論できる。クラスタリングはアレイからのバイナリまたは整数測定のいずれかで行いうることは当業者に明らかになるであろう。
【００３６】
第２の試料のメンバーが遺伝的に関連のある群またはクラスターにまとめられたら、クラスタリングプログラムは２つのそのような群またはクラスターを選択するように向けられる。クラスタリングプログラムは次に、１つの群またはクラスターに存在し且つ別のものには不在である特定のマイクロアレイ領域に対応するマーカーを同定するために向けられる。このプログラムは１つの群またはクラスターの少なくとも１つのメンバー中に存在し且つ第２の群またはクラスターの全てのメンバー中に不在であるマーカーを同定するために向けることもできる。それぞれのビットに対応するマイクロアレイ領域に関する情報は選別およびグループ化工程中に保存されるため、マイクロアレイ領域は容易に同定されてこれらのタイプのマーカーを示す。これらの特定領域を次に元のマイクロアレイ蛍光スキャン上で同定することができる。
【００３７】
それぞれ同じ数および位置のビットを含み且つそれぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列を設け、ビット列の関連性を示す−選択可能な要素を含む−グラフ図を作成し、第１の選択可能な要素を選択し、第２の選択可能な要素を選択し、そして第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはその逆であるビットを同定することを含む、複数のビット列の中の独特のビットを同定するための方法も提供される。幾つかの態様では、それぞれのビット列が生物のゲノムを示しそしてそれぞれのビットがゲノムのオリゴヌクレオチドセグメントから作成されるマイクロアレイのその領域を示す。これも幾つかの態様では、ビット列の関連性はビット列中の対応する位置におけるビット値の共通性により決定される。好ましい態様では、グラフ図はデンドログラムであり且つ選択可能な要素は葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す。
【００３８】
図１および２に表示されているように、それぞれ同じ数および位置のビットを含み、それぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列１０２を設けるために構成されたロジック、ビット列１０４の関連性を示す選択可能な要素を含むグラフ図を作成するために構成されたロジック、第１の選択可能な要素１０６を選択するために構成されたロジック、第２の選択可能な要素１０８を選択するために構成されたロジック、および第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素１１０により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いは第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在であり且つ第２の選択可能な要素１１２により示されるそれぞれのビット列中に存在するビットを同定するために構成されたロジックを含む、複数のビット列の中の独特のビットを同定するためのソフトウェア１００を有するコンピューター読み取り可能な媒体も提供される。１つの態様では、ビット列の関連性はビット列中の対応する位置におけるビット値の共通性により決定される。好ましい態様では、グラフ図はデンドログラム２００であることができ且つ選択可能な要素は葉２０２および節２０４であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す。
【００３９】
ソフトウェア１００は、命令実行システム、装置、もしくは機器、例えばコンピューターをベースにしたシステム、プロセッサーを含有するシステム、または命令実行システム、装置、もしくは機器からの命令を選択的に取り出しそして命令を実行することができる別のシステムにより、またはそれらと関連して使用するためのいずれのコンピューター読み取り可能な媒体またはコンピューター保有媒体中に一体化することができる。この文書の概念では、「コンピューター読み取り可能な媒体」は、命令実行システム、装置、もしくは機器によりまたはそれらと関連して使用するためのプログラムを含有し、貯蔵し、伝達し、伝播し、または移送することができるいずれかの手段である。コンピューター読み取り可能な媒体は、例えば、電子、磁気、光学、電磁気、赤外、もしくは半導体のシステム、装置、機器、または伝播媒体でありうるが、それらに限定されない。コンピューター読み取り可能な媒体のさらに具体的な例（非網羅的リスト）は下記のものを包含するであろう：１つもしくはそれより多くの線を有する電気連結（電子）、携帯式コンピューターディスケット（磁気）、ＲＡＭ（電子）、読み取り専用記憶装置「ＲＯＭ」（電子）、消去可能なプログラム可能な読み取り専用記憶装置（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリー）（電子）、光ファイバー（光学）、および携帯式コンパクトディスク読み取り専用記憶装置「ＣＤＲＯＭ」（光学）。
【００４０】
ソフトウェア１００は少なくとも１つのコンピューター−読み取り可能な信号を有する媒体（例えばインターネット、磁気貯蔵媒体、例えばフロッピーディスク、または光学貯蔵場所、例えばコンパクトディスク（ＣＤ／ＤＶＤ）、生物学的、または原子データ貯蔵媒体）中に一体化することができる。さらに別の例示実施では、コンピューター読み取り可能な信号を有する媒体は不同受容装置を含んでなるかまたはそれと連結されたネットワーク、例えば、１つもしくはそれより多くの電話ネットワーク、局部領域ネットワーク、インターネット、および無線ネットワーク、上に伝達される変調された搬送信号を含んでなることができる。そのような態様の例は、いずれかの数のプログラミング言語に書かれたかまたはそれを用いて説明される一連のコンピューター命令である。ソフトウェア１００は例えば紙または別の媒体の光学走査により電子的にキャプチャーされ、次にコンパイルされ、翻訳されまたは必要なら適当な方法で別の方法で処理され、そして次にコンピューターメモリーに貯蔵されるため、コンピューター読み取り可能な媒体はソフトウェア１００が印刷された紙または別の適当な媒体であることもできることに注目すること。
診断プローブおよびアッセイ
特定の群またはクラスターに特異的な多型マーカーが本発明の方法により同定されたら、マイクロアレイ領域情報を使用して元のショットガンライブラリー中にクローンを配置することができる。元のクローンが配置されたら、ＤＮＡをそこから抽出し、そしてサザンブロット中のプローブとして使用して特定ＤＮＡセグメントの存在もしくは不在またはその中の変化を確認することができる。特異的マーカーの存在または不在がサザンブロット法により確認されたら、クローン挿入部を配列決定し、そしてそのマーカーもしくは複数のマーカーを含有する生物の同定のためのアッセイにおける診断プローブとして使用することができる。
【００４１】
以下の実施例は本発明をさらに説明するためでありそしてそれの限定ではない。
【実施例】
【００４２】
Ｌモノサイトゲネス１０４０３Ｓショットガンマイクロアレイの作成
リステリア・モノサイトゲネス単離体中のゲノム多様性を同定するためのアレイに基づく方法の可能性を示すために、ショットガンＤＮＡマイクロアレイを系統１０４０３Ｓから作成した。これは、Ｌ．モノサイトゲネス１０４０３ＳＤＮＡライブラリーからの４，３５０個のＰＣＲ増幅インサートをシリカ処理ガラススライド上に二重に印刷することにより行なわれた。可能なかぎり忠実なライブラリーを製造するため、高圧空気を用いてゲノムＤＮＡを１．５キロ塩基の平均寸法に切断するトポ（ＴＯＰＯ）(R)ショットガンライブラリー作成キット（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア）を用いて、ライブラリーを作成した。切断されたＤＮＡフラグメントを次にクレノウおよびＴ４−ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化し、引き続き脱リン酸化してライブラリー中の非隣接フラグメントの連結反応を防止した。脱リン酸化されたＤＮＡフラグメントを次にｐＴｏｐｏベクターの中にクローン化した。個々のコロニーを直ちに９６穴プレートに移した。独立クローンから増幅したインサートをアガロースゲル電気泳動により分析し、精製しそしてアレーに印刷した。インサートの平均寸法は１．５キロベースであった。従って、このマイクロアレイは１０４０３Ｓゲノムの範囲において約１．５倍の冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を与えた。
遺伝子型決定における参照アレイとしての１０４０３Ｓゲノムマイクロアレイの使用
ゲノム多様性を同定するためのショットガンアレイに基づくゲノム比較を示すために、ショットガンアレイを最初に参照アレイとして使用して疫学的に特徴づけされた系統の組を遺伝子型決定した。これらのパイロット研究用に、臨床的および環境的（食物）試料の両方から由来するＬ．モノサイトゲネス系統を使用した。ＤＮＡをそれぞれの系統から抽出しそして２μｇをランダムプライマー反応で使用した。反応は５０μｌ量でギブコ／ＢＲＬバイオプライム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  ＢＩＯＰＲＩＭＥ）(R)ＤＮＡ標識付けキット（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド）を用いて行なわれた。それぞれの実験で、１０４０３ｓＤＮＡの独立アリコートをＣＹ３色素で標識付けされたヌクレオチドを用いてランダムプライミングし、そして試験系統をＣＹ５色素標識ヌクレオチドを用いてランダムプライミングした。標識付け後に、標識付けされた生成物をミクロン３０フィルター（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））を用いて濃縮した。ＣＹ３およびＣＹ５標識付け反応からの全ての濃縮された生成物を次に１００μｇの酵母ｔＲＮＡおよび４００μｇの鮭精子ＤＮＡを含有する３０μｌのハイブリッド形成緩衝液の中に混入し、アレイ上に積層し、そしてカバースリップで覆った。ハイブリッド形成反応を次に個別のハイブリッド形成チャンバーに入れそして３時間にわたり６５℃でインキュベートした。ハイブリッド形成体を次にそれぞれ５分間にわたり１ＸＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳ、０．１ＸＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳ、そして最後に０．１ＸＳＣＣの中で洗浄した。アレイ領域の蛍光強度をＧＳＩルノミックス・スカナラＹ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ  ＳＣＡＮＡＲＲＡ  Ｙ）(R)３０００マルチカラーマイクロアレイスキャナーを用いて測定した。
【００４３】
系統の関連性を試験するために、８，７００個の異なるアレー領域のそれぞれにおけるＣＹ３標識１０４０３ＳプローブおよびＣＹ５標識試験ＤＮＡプローブのハイブリッド形成により記録されたハイブリッド形成強度をバイナリ要素に変換した。これは、ＣＹ３およびＣＹ５チャネル上のそれぞれのスポットのハイブリッド形成強度をスキャンアライズ（ＳｃａｎＡｌｙｚｅ）を用いて比較することにより、行なわれた。この画像分析ソフトウェアは、蛍光のバックグラウンドを引いた比を作成するための数種の方法を与えそしてデータをテキストファイルとしてアウトプットする。
【００４４】
スキャンアライズファイルからのバックグラウンドを引いた比とアドレスの複合ファイルを作成したフォーマットオール（ＦｏｒｍａｔＡＬＬ）ソフトウェアは、それぞれ個別の参照試験系統対に対応するそれぞれのカラムの平均値および中央値をセンタリングすることによりデータの正規化も行った。このソフトウェアは次に、式：
Ｘ＞２標準偏差＝二進法０
Ｘ＜２標準偏差＝二進法１
に基づき正規化された比をバイナリに変換した。
【００４５】
アウトプットファイルを次にＰ．Ａ．Ｕ．Ｐ．（フィロジェネティック・アナリシス・ユージング・パルシモニー（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ））４．０およびマークファインド（ＭａｒｋＦｉｎｄ）におけるクラスター解析のためにフォーマットオールでフォーマット化した。隣接結合およびブートストラップのようなクラスタリングアリゴリズムを含むソフトプログラムであるＰ．Ａ．Ｕ．Ｐ．４．０およびマークファインドの両者におけるクラスター分析が個体群における多型マーカーの同定および選別を可能にする。マークファインド中のマーカー選別がそれぞれのクレード中に不在の数個の遺伝子座を明らかにした（表１）。
表１
クレード                          全てのメンバー中に不在の遺伝子座の数
Ａ                              ２０
Ｂ                              ７５
Ｃ                              ４２
Ｄ                              ６７
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は複数のビット列の中の独特のビット列を同定するためのソフトウェアの操作を説明するフローチャートである。
【図２】図２は複数のビット列の中の独特のビットを同定するためのソフトウェアにより作成されたデンドログラムの説明である。
【図１】
2005526952.tif 000002
【図２】
2005526952.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月27日(2003.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体群の１個もしくはそれより多くの個体を含む第１の試料を遺伝子型的に特徴づけし；
遺伝子型の特徴づけに基づいて第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し：
それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し；そして
それぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の１個もしくはそれより多くのメンバーを含む第２の試料を遺伝子型決定し、
それにより個体群における多型マーカーを同定する
ことを含んでなる、個体群における多型マーカーを同定するための方法。
【請求項２】
個体群がバクテリア個体群である、請求項１の方法。
【請求項３】
バクテリア個体群がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラクツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテレジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｅｄｉｔｉｓ）およびサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）よりなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
個体群の１個もしくはそれより多くの個体を含む第１の試料を遺伝子型的に特徴づけし；
遺伝子型の特徴づけに基づいて第１の試料の１個もしくはそれより多くの個体を選択し：
それぞれの選択された個体からのゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイを作成し；そして
それぞれの作成されたマイクロアレイを参照として用いて、個体群の１個もしくはそれより多くのメンバーを含む第２の試料を遺伝子型決定し、
それによりバクテリア個体群における多型マーカーを同定する
ことを含んでなる、バクテリア個体群における多型マーカーを同定するための方法。
【請求項５】
バクテリア個体群がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラクツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテレジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｅｄｉｔｉｓ）およびサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）よりなる群から選択される、請求項４の方法。
【請求項６】
それぞれ同じ数および位置のビットを含み、それぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列を設け；
ビット列の関連性を示す選択可能な要素を含むグラフ図を作成し；
第１の選択可能な要素を選択し；
第２の選択可能な要素を選択し；そして
第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはｒｕｓｔ選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在であり且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在するビットを同定する
ことを含んでなる、複数のビット列の中の独特のビットを同定するための方法。
【請求項７】
ビット列中の対応する位置におけるビット値の共通性によりビット列の関連性を決定する、請求項６の方法。
【請求項８】
グラフ図がデンドログラムであり且つ選択可能な要素が葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す、請求項６の方法。
【請求項９】
グラフ図がデンドログラムであり且つ選択可能な要素が葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す、請求項７の方法。
【請求項１０】
それぞれ同じ数および位置のビットを含み、それぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列を設けるために構成されたロジック；
ビット列の関連性を示す選択可能な要素を含むグラフ図を作成するために構成されたロジック；
第１の選択可能な要素を選択するために構成されたロジック；
第２の選択可能な要素を選択するために構成されたロジック；
第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはｒｕｓｔ選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在であり且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在するビットを同定するために構成されたロジック
を含んでなる、複数のビット列の中の独特のビットを同定するためのソフトウェアを有するコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１１】
ビット列中の対応する位置におけるビット値の共通性によりビット列の関連性を決定する、請求項１０のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１２】
グラフ図がデンドログラムであり且つ選択可能な要素が葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す、請求項１０のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１３】
グラフ図がデンドログラムであり且つ選択可能な要素が葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す、請求項１１のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１４】
それぞれのビット列が生物のゲノムを示しそしてそれぞれのビットがゲノムのオリゴヌクレオチドセグメントから作成されるマイクロアレイの１個の領域を示す請求項６の方法。
【請求項１５】
第２の試料の遺伝子型決定が、
第２の試料のそれぞれのメンバーに関するビット列を作成し、それぞれのビットはメンバーに関するゲノムのオリゴヌクレオチドセグメントから作成されるマイクロアレイの１個の領域を示し且つそれぞれのビットはマイクロアレイのそれぞれの領域上に付着したオリゴヌクレオチドセグメントのハイブリッド形成の程度に依存して０または１の値を有し、
ビット列の関連性を示す選択可能な要素を含むグラフ図を作成し；
第１の選択可能な要素を選択し；
第２の選択可能な要素を選択し；そして
第１の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在のビット或いはｒｕｓｔ選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に不在であり且つ第２の選択可能な要素により示されるそれぞれのビット列中に存在するビットを同定する
ことを含む請求項１の方法。
【請求項１６】
個体群からの複数の個体を含む第１の試料を特徴づけし；
典型的ゲノムＤＮＡマイクロアレイを設け；
第１の試料から個体を選択し；
典型的マイクロアレイに選択された個体のゲノムＤＮＡをハイブリダイズさせ；
選択された個体のゲノムＤＮＡと典型的マイクロアレイの間のハイブリッド形成のセグメントを決定し；
それぞれのハイブリッド形成されたセグメントのハイブリッド形成強度比を計算し；
それぞれの強度比を数値要素に転換し；
数値要素よりなるデータをまとめ、そして
データを分析して個体群中に存在するハイブリッド形成のパターンを同定する
段階を含んでなる、個体群における多型マーカーを同定するための方法。
【請求項１７】
典型的マイクロアレイが個体群における個体からのゲノムＤＮＡから作成される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
第１の試料から個体を選択する段階が、同じ個体群の他の個体の中でほとんどの特徴を共有する個体の選択を含む、請求項１６の方法。
【請求項１９】
第１の試料中の個体のそれぞれからのゲノムＤＮＡを典型的マイクロアレイに対してハイブリダイズさせて第１の試料からの個体の遺伝的関連性を決定する段階をさらに含んでなる、請求項１６の方法。
【請求項２０】
同じ個体群からの複数の選択された個体を含む第２の試料を特徴づけし、
第２の試料中の個体のそれぞれからのゲノムＤＮＡを典型的マイクロアレイに対してハイブリダイズさせて個体群における個体の遺伝的関連性を決定する
段階をさらに含んでなる、請求項１６の方法。
【請求項２１】
第１および第２の試料の少なくとも１つが遺伝子型により特徴づけされ、そして第１および第２の試料から選択される個体の少なくとも１つが遺伝子型の特徴づけに基づいて選択される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
第１および第２の試料の少なくとも１つが遺伝子型により特徴づけされ、そして第１および第２の試料から選択される個体の少なくとも１つが遺伝子型の特徴づけに基づいて選択される、請求項２０の方法。
【請求項２３】
それぞれの選択される個体のゲノムＤＮＡが蛍光色素を用いて標識付けされる段階をさらに含んでなる、請求項１８の方法。
【請求項２４】
それぞれの選択される個体のゲノムＤＮＡが異なる蛍光色素を用いて標識付けされる、請求項２３の方法。
【請求項２５】
それぞれのセグメントのハイブリッド形成強度を測定する段階がハイブリッド形成されたセグメントの蛍光強度の測定を含む、請求項２３の方法。
【請求項２６】
数値要素が整数である、請求項１６の方法。
【請求項２７】
変換段階が二進変換を含み、そして数値要素が０または１ビットよりなる二進法数字である、請求項１６の方法。
【請求項２８】
データをまとめる段階が試料中の選択される個体に対応するバイナリビットの列を生成する、請求項２７の方法。
【請求項２９】
試料中のそれぞれの個体に関するビット列を複合ファイルの中に収集する段階をさらに含む、請求項２８の方法。
【請求項３０】
分析段階がハイブリッド形成強度比のそれぞれの平均値および中央値のセンタリングによりデータを正規化することをさらに含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】
それぞれのビット列に関するグラフ図を作成する段階をさらに含む、請求項２９の方法。
【請求項３２】
個体群がバクテリア個体群である、請求項１６の方法。
【請求項３３】
バクテリア個体群がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス・ラクツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｕｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテレジチス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｅｄｉｔｉｓ）およびサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）よりなる群から選択される、請求項３２の方法。
【請求項３４】
それぞれの列が個体群の中の個体を示し且つそれぞれ同じ数および位置のビットを含み、
それぞれのビットが０または１の値を有する複数のビット列を設け；
ビット列の関連性を示す選択可能な要素を含むグラフ図を作成し；
第１の選択可能な要素を選択し；
第２の選択可能な要素を選択し；そして
第１の選択可能な要素を表すそれぞれのビット列中に存在し且つ第２の選択可能な要素を表すそれぞれのビット列中に不在のビット或いは第１の選択可能な要素を表すそれぞれのビット列中に不在であり且つ第２の選択可能な要素を表すそれぞれのビット列中に存在するビットを同定する
段階を含む、複数の個体を含んでなるバクテリア個体群における多型マーカーを同定するための方法。
【請求項３５】
ビット列中の対応する位置におけるビット値の共通性によりビット列の関連性を決定する、請求項３４の方法。
【請求項３６】
グラフ図がデンドログラムであり且つ選択可能な要素が葉および節であり、それぞれの葉は１個のビット列を示し、そしてそれぞれの節は２個もしくはそれより多くのビット列を示す、請求項３４の方法。
【国際調査報告】
2005526952.tif 000004
2005526952.tif 000005