(57)【要約】本発明は、ＳＥＲＲＳ活性ポリマービーズ群、標的分子群の検出用のＳＥＲＲＳ活性ポリマービーズ群の製造方法および標的分子群の検出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子の識別に使用する表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）活性ビーズであって、ポリマー・シェル内にカプセル化された凝集金属コロイドおよび少なくとも一つのＳＥＲＲＳ活性染料を含むＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項２】
凝集コロイドおよびＳＥＲＲＳ活性染料をカプセル化したビーズを形成することが可能な連鎖成長メカニズムおよび段階的成長メカニズムを介して重合するモノマーを含む広範な種類のモノマーおよび架橋剤からポリマー・シェルが形成される請求項１に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項３】
前記ポリマー・シェルまたはシェル群が次のいずれかおよびそれらの誘導体から形成される請求項１または２に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ：
アクリル酸およびその誘導体類（例えば、２−ブロモアクリル酸、アクリロイルクロライド、Ｎ−アクリロイルチロシン、Ｎ−アクリロイルピロリジノン）、アクリル酸エステル類（例えば、アクリル酸アルキルエステル類、アクリル酸アリルエステル類、アクリル酸ヒドロキシプロピルエステル）、メタクリル酸およびその誘導体類（例えば、イタコン酸、２−（トリフルオロメチル）プロペン酸）、メタクリル酸エステル類（例えば、メタクリル酸メチルエステル、メタクリル酸ヒドロキシエチルエステル、メタクリル酸３−スルホプロピルエステルナトリウム塩）、スチレン類（例えば、（２、３、および４）−アミノスチレン、スチレン−４−スルホン酸、３−ニトロスチレン）、ビニル類（例えば、ビニルクロロホルメート、４−ビニル安息香酸、４−ビニルベンズアルデヒド、ビニルイミダゾール、４−ビニルフェノール、４−ビニルアミン、アクロレイン）、ビニルピリジン類（例えば、（２、３、および４）−ビニルピリジン、３−ブテン１，２−ジオール）、ボロン酸類（例えば、４−ビニルボロン酸）、スルホン酸類（例えば、４−ビニルスルホン酸）、金属キレーター類（例えば、スチレンイミノ二酢酸）、アクリルアミド類およびその誘導体類（例えば、Ｎ−メチルアクリルアミド）、メタクリルアミド類およびその誘導体類（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド）、アルケン類（例えば、４−ペンテン酸、３−クロロ−１−フェニル−１−プロペン）、無水（メタ）アクリル酸およびその誘導体類（例えば、無水メタクリル酸）、シリコン含有モノマー類（例えば、（３−メタクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、テトラメチルジシロキサン）、ポリエン類（例えば、イソプレン、３−ヒドロキシ−３，７，１１−トリメチル−１，６，１０−ドデカトリエン）、アジド類（例えば、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸）、チオール類（例えば、アリルメルカプタン）。
【請求項４】
前記ポリマー・シェル（群）がアクリル酸エステル末端を有するか、または不飽和の、ウレタン類、炭酸エステル類およびエポキシ類、またはシリコン−ベースモノマー類から形成される請求項１または２に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項５】
前記ポリマー・シェル（群）が、ジ−、トリ−、テトラ−、およびペンタ−官能性アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、アクリルアミド類、ビニル類、アリル類、およびスチレン類のような対象ポリマー化合物に堅さを与える架橋剤を含む先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項６】
凝集金属コロイドが、銀、金、銅または金属合金コロイド表面を含む先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項７】
凝集金属コロイドが、露出金属または金属表面に金属酸化物層を含む先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項８】
凝集金属コロイドが、その収着（吸収吸着）容量を増強するクエン酸塩またはポリリジンもしくはポリフェノールポリマーの有機被覆を含む先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項９】
凝集金属コロイドが、凝集金属コロイド粒子または粒子群の形態である先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項１０】
凝集金属コロイド粒子群が約４〜５０ｎｍ、または約２５〜３６ｎｍの断面を有する請求項９に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項１１】
ＳＥＲＲＳ活性ビーズが１μｍより小さい断面を有する先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項１２】
ＳＥＲＲＳ活性ビーズが、多数のＳＥＲＲＳ活性ナノ粒子群を含み、前記ＳＥＲＲＳ活性ナノ粒子群が凝集金属コロイドおよびそれに吸収されたＳＥＲＲＳ活性染料または染料群を含んでいて、前記ナノ粒子群の各々が実質的に同一のＳＥＲＲＳ信号を発生するか、または異なった染料群または染料の組合せ群を備え区別することができるＳＥＲＲＳ信号群を発生する先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項１３】
最も外側のポリマー・シェルが、さらにカルボン酸類、カルボン酸類の活性エステル類、アルコール類、アミン類、エポキサイド類、クロロメチルスチリール基類、ビニル基類、チオール基類、マレイミドおよびサクシンイミドのいずれかから選ばれる官能基を含むか、またはさらに連結基もしくは連結基群によって誘導化されていて、標的分子群が反応してビーズ（群）の表面に結合するかまたは一部が反応してビーズ（群）の表面（その部分に前記標的分子が結合できる）に結合する、先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項１４】
ビーズ群が、蛋白および抗体検出のための標識技術として使用される先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項１５】
分子刷込法（molecular imprinting methods）が適用されて、鋳型手法によりポリマー・シェルに特異的な分子認識特性を付与する先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項１６】
ＳＥＲＲＳ活性ビーズに磁気性を与える、ポリマービーズ内にカプセル化された磁気性粒子または粒子群をさらに含む先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項１７】
各ビーズが見分けることができるＳＥＲＲＳ信号を含み、その見分けることができるＳＥＲＲＳ信号がＳＥＲＲＳ活性染料群および／または各ビーズ内の染料群の相対濃度を変えることにより得られる先行するいずれかの請求項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ。
【請求項１８】
次の工程を含むＳＥＲＲＳ活性ビーズ群の調製方法：
１）吸収されたＳＥＲＲＳ活性染料を含む凝集金属コロイドを形成する工程；
２）適当な溶媒中で凝集金属コロイドとモノマーを混合する工程；および
３）凝集金属コロイドをカプセル化するポリマービーズ群を形成するようモノマーを重合する工程。
【請求項１９】
次の工程を含むＳＥＲＲＳ活性ビーズ群の調製方法：
ａ）適当な溶媒中にモノマーを供給する工程；
ｂ）ポリマービーズ群を形成するようモノマーを重合する工程；
ｃ）ポリマービーズ群を含む溶液に凝集金属コロイドを加える工程；および
ｄ）凝集金属コロイドの取り込みが起こり、ポリマービーズ群によってカプセル化されるよう溶液を加熱する工程。
【請求項２０】
ポリマービーズ群をさらに反応させて、ビーズの外側表面に官能性または連結性の基群が付加し、それによって分子をビーズに付着させる請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料中の標的分子を検出する次の工程を含む方法：
ａ）特異的に識別できるＳＥＲＲＳ信号を持つようにビーズを生成させ、その表面を修飾してそこに前記標的分子を結合させることができる部分を付けるようにした請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ（群）を供給する工程；
ｂ）前記ビーズ（群）を前記試料と接触させ、試料中の前記標的分子を前記ビーズ（群）と結合させる工程；および
ｃ）前記標的分子に結合したビーズまたはビーズ群から得られる特異的に識別できるＳＥＲＲＳ信号を検出する前記標的分子を検出する工程。
【請求項２２】
標的分子が、抗体、抗原、受容体、リガンド、またはＤＮＡ分子のような核酸分子である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的分子を結合させることができる部分が、それぞれ抗原、抗体、リガンド、受容体または相補的な核酸である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ビーズ（群）が磁気性であり、ビーズ（群）が工程ｂ）後に容易に分離され、および／または濃縮されるものである請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
試料中の特異的核酸を検出する次の工程を含む方法：
ａ）特異的に識別できるＳＥＲＲＳ信号を持つようにビーズを生成させ、その表面を修飾し、そこに前記標的分子を結合させることができる部分を付けるようにし、前記部分が標的核酸と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＳＥＲＲＳ活性ビーズ（群）を供給する工程；
ｂ）前記ビーズ（群）を試料と接触させ、試料中の前記標的核酸を前記ビーズ（群）と結合させる工程；
ｃ）前記標的結合ビーズをさらにラベルされた核酸と接触させ、前記さらにラベルされた核酸をそこに特異的にハイブリダイズする工程；
ｄ）所望により、増幅反応を遂行し、さらに所望により増幅反応が成功しているか否かを検出する工程；
ｅ）前記ラベルされハイブリダイズした核酸結合ビーズを前記ラベルされた部分を結合できる表面と接触させる工程；および
ｆ）前記基質に結合した前記ビーズ群から得られる特異的に識別できるＳＥＲＲＳ信号を検出する前記標的分子の検出工程。
【請求項２６】
除去されるべき工程ｂ、ｃおよび／またはｅの未結合試薬類を除去する１または２以上の洗浄工程をさらに含む請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＥＲＲＳ活性ポリマービーズ群および標的分子検出方法ならびに標的分子の検出に使用するそれらの生産方法の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代分子生物学における最近の開発は、同時にその場で起こる非常に多数の生物検体の認識の必要性に注目している。それらの分野の中で要求があるものとして、ＤＮＡ検出、蛋白質科学、細胞および抗体認識ならびに創薬がある。
【０００３】
ＳＥＲＲＳ以外の検出技術を使用し粒子群を含む関連の技術は、“量子点（quantum dots）”の利用と金粒子群の関与によって達成することができる表面プラズモン共鳴の変化の利用とを含む。量子点は、よく知られた色素、カドミウムスルフィド／セレニドのナノスケール粒子群から成り、これらは生物検体が付くように修飾することができる。この技術の有利な点は、単一の粒子が単一の分子と比較して強い放射を与えその粒子群の性質がセレニドに対するスルフィドの割合を変更することによって広範囲の放射周波数を得ることができるようなものであるということである。
【０００４】
表面プラズモン共鳴法では、Storhoff, J.J., Elghanian, R., Mucic, R.C., Mirkin, C.A., Letsinger, R.L., J. Am. Chem. Soc 1998, 120, 1959-1964（非特許文献１）に述べられているように、その表面が特異的なオリゴヌクレオチドで修飾された２個の金ナノ粒子を使用している。両粒子は検体である特異的なＤＮＡ鎖を認識しハイブリダイズする。これは、それらの金粒子を極めて近接させ、表面プラズモン共鳴の周波数の変化を検出する。しかしながら、そのような技術は、望まれるような総合された、多重化、強固性および単純性（simplicity）を提供しない。
【０００５】
【非特許文献１】Storhoff, J.J., Elghanian, R., Mucic, R.C., Mirkin, C.A., Letsinger, R.L., J. Am. Chem. Soc 1998, 120, 1959-1964．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＳＥＲＲＳによれば、選択的な標識（labelling）化学が提供でき、要求されている新しいタイプの分析法（assays)を開発することができる。それは蛍光に等しいかまたはこれよりよい感度を持つが、有利さの鍵となるのはラベルとして用いる各ＳＥＲＲＳ染料がある特有の指紋を与え、分離ぜずに染料混合物中で認識できるということである。現在ＳＥＲＲＳ用に具体的に設計された染料が約５０あり、そのいずれもが特有のスペクトルを与える。この潜在的な能力を利用する有効な方法が知られているけれども、その開発は２つの問題によって制限されている。第一に、染料被覆銀粒子群と、標識化する分析試薬または他の試薬との間に反応の可能性があること、第二に、安定した強度を有するＳＥＲＲＳを得るためには銀粒子群間の凝集を特異的な割合に維持し再生することが好ましいことである。すなわち、分析中に操作のバランスがすぐに崩れてしまうことである。
【０００７】
本発明の目的の一つは、前述の不利な点の少なくとも一つを除くこと、および／または軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
大まかに言えば、本発明は、ＳＥＲＲＳ活性染料をポリマー被覆内にカプセル化することができ、その染料に安定性を付与し、ＳＥＲＲＳ活性染料を環境から保護し、そして２以上のＳＥＲＲＳ信号を検出することができるように２以上の染料をカプセル化できるという本発明者らによる知見に基づいている。
【０００９】
したがって、本発明は、第一の態様において、標的分子の同定（identification）に使用する表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）活性ビーズであって、ポリマー・シェル内にカプセル化された凝集金属コロイド及び少なくとも一つのＳＥＲＲＳ活性染料を含むＳＥＲＲＳ活性ビーズを提供する。
【００１０】
ＳＥＲＲＳとは表面増強共鳴ラマン散乱を言う。ＳＥＲＲＳについては既に記載がある。例えば、Rodger, C.H., Smith, W.E., Dent, G., Edmonson, M., J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1996, 5, 791、およびそこに記載されている背景情報に関する文献を参照されたい。驚くべきことに、銀表面上では広範囲に及ぶ蛍光消光メカニズムが存在する。このことは、殆ど全ての染料が、蛍光によって可能となるより一層広範囲でかつ単純な誘導化学（derivatisation chemistry）を利用できるＳＥＲＲＳを与えることを意味する。さらに、ＳＥＲＲＳ活性粒子群によって提供される染料の特異的な機能強化は、分析対象物を含む生物学的試料および工業的試料で通常観測されるバックグランド・シグナルから染料を同定するのに充分なものである。これにより、分析物の同定を成功させる前に多くの手法で必要とされた複雑で時間がかかる分離操作が不要となる。
【００１１】
本明細書におけるＳＥＲＲＳの用語は限定的に解釈されるべきでなく、本発明は表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）に対しても適用されるが、ＳＥＲＲＳが好ましい。
【００１２】
驚くべきことに、ポリマー被覆内にＳＥＲＲＳ活性金属ナノ粒子群およびＳＥＲＲＳ活性染料をカプセル化することにより、ＳＥＲＲＳ信号が妨げられずに容易に検出されることが見出された。さらに、状況によってはビーズ群から１０ｍまでの距離でＳＥＲＲＳ信号を検出することができる。
【００１３】
ポリマー・シェルは、凝集コロイドおよびＳＥＲＲＳ活性染料をカプセル化したビーズを形成することが可能な連鎖成長メカニズムおよび段階的成長メカニズムにより重合するモノマーを含む広範な種類のモノマーおよび架橋剤から形成される。凝集コロイドの一部もビーズ（群）表面に付着し、そして／または埋め込んでもよい。ポリマー・シェルは二層以上を含んでよい。例えば、表面に凝集したコロイドを含むビーズ群が形成されてもよい。次いで、任意の金属コロイドを加えて、ビーズ作成工程を経てそのようなビーズ群を復帰させることが可能である。このやり方で、ビーズ表面に金属コロイド粒子群を含まない追加のポリマーの被覆または層が創出される。それにもかかわらず、ある場合には、ビーズ表面に金属を有することが望ましいが、これは、金属コロイドを使用して、または金属被覆によって、または金属をビーズ表面にリソグラフィー的に堆積させて達成される。また、表面に金属を含むビーズ群の有利な点は、追加的に内部でラベル（標識化）されているビーズの表面でＳＥＲＲＳ検出が実行できることである。
【００１４】
好ましいモノマーの種類および特異的モノマーは、限定されないが、次の種類のものおよびそれらの誘導体が挙げられる：アクリル酸およびその誘導体類（例えば、２−ブロモアクリル酸、アクリロイルクロライド、Ｎ−アクリロイルチロシン、Ｎ−アクリロイルピロリジノン）、アクリル酸エステル類（例えば、アクリル酸アルキルエステル類、アクリル酸アリルエステル類、アクリル酸ヒドロキシプロピルエステル）、メタクリル酸およびその誘導体類（例えば、イタコン酸、２−（トリフルオロメチル）プロペン酸）、メタクリル酸エステル類（例えば、メタクリル酸メチルエステル、メタクリル酸ヒドロキシエチルエステル、メタクリル酸３−スルホプロピルエステルナトリウム塩）、スチレン類（例えば、（２、３、および４）−アミノスチレン、スチレン−４−スルホン酸、３−ニトロスチレン）、ビニル類（例えば、ビニルクロロホルメート、４−ビニル安息香酸、４−ビニルベンズアルデヒド、ビニルイミダゾール、４−ビニルフェノール、４−ビニルアミン、アクロレイン）、ビニルピリジン類（例えば、（２、３、および４）−ビニルピリジン、３−ブテン１，２−ジオール）、ボロン酸類（例えば、４−ビニルボロン酸）、スルホン酸類（例えば、４−ビニルスルホン酸）、金属キレーター類（例えば、スチレンイミノ二酢酸）、アクリルアミド類およびその誘導体類（例えば、Ｎ−メチルアクリルアミド）、メタクリルアミド類およびその誘導体類（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド）、アルケン類（例えば、４−ペンテン酸、３−クロロ−１−フェニル−１−プロペン）、無水（メタ）アクリル酸およびその誘導体類（例えば、無水メタクリル酸）、シリコン含有モノマー類（例えば、（３−メタクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、テトラメチルジシロキサン）、ポリエン類（例えば、イソプレン、３−ヒドロキシ−３，７，１１−トリメチル−１，６，１０−ドデカトリエン）、アジド類（例えば、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸）、チオール類（例えば、アリルメルカプタン）。
本発明では、また、アクリル酸エステル末端を有するかまたは不飽和の、ウレタン類、炭酸エステル類およびエポキシ類、またはシリコン−ベースモノマー類を使用することができる。対象ポリマー化合物に堅さを与える架橋剤が当業者に知られており、その例として、ジ−、トリ−、テトラ−、およびペンタ−官能性アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、アクリルアミド類、ビニル類、アリル類、およびスチレン類が挙げられるがこれらに限られない。
【００１５】
銀、金または銅−コロイド表面、特に銀が本発明で使用するのにとりわけ好ましい。しかしながら、金属合金も使用することができる。
【００１６】
表面は、露出金属を含んでよいし、または金属表面に金属酸化物層を含んでもよい。その吸収吸着容量（sorptive capacity）を増やすめにクエン酸塩またはポリリジンもしくはポリフェノール等適当なポリマーである有機の被覆を含んでもよい。ポリマー上には共有結合で結合する染料を含むことができる。
【００１７】
コロイド粒子群は、好ましくは、均一でかつ所望の大きさと形状となるように、および自己凝集しないで可能な限り安定となるように制御した方法で凝集させる。そのような非凝集的コロイドを調製する方法は既に知られている。例えば、クエン酸塩などの還元剤で金属塩（例えば、硝酸銀）を還元して安定な微結晶懸濁液を形成する方法が挙げられる（P. C. Lee & D. Meisel, J. Phys, Chem. (1982), 86, P.3.391）。次に、この懸濁液の“ストック（stock）”を使用の直前に凝集させる。好適な凝集剤としては、酸類（例えばＨＮＯ3 またはアスコルビン酸）、ポリアミン（例えば、ポリリジン、スペルミン、スペルミジン、１，４−ジアミノピペラジン、ジエチレントリアミン、アミノエチル−１，３−プロパンジアミン、トリエチレンテトラミンおよびテトラエチレンペンタミン）およびＣｌ-，Ｉ-，Ｎａ+，Ｍｇ2+のような無機活性イオンが挙げられる。工程中の制御を強化するためには、使用する全装置を念入りに洗浄し、高品質の試薬を用いるべきである。
【００１８】
コロイド粒子群は、ＳＥＲＲＳ効果を起こす限り任意の大きさとすることができる。一般には、金属の種類に依るが、断面が約４〜５０ｎｍ、好ましくは２５〜３６ｎｍである。
【００１９】
本発明のビーズ群は極めて小さく、典型的には直径が１μｍ未満である。好ましくは、ビーズ群は断面が約１０ｎｍから１ｍｍであり、より好ましくは、約１０ｎｍから１μｍであるが、カプセル化する染料で被覆されたコロイド粒子群より小さくないものであることは明白である。
【００２０】
本発明のビーズ群は、多数のＳＥＲＲＳ活性ナノ粒子群（凝集金属コロイドおよび吸収されたＳＥＲＲＳ活性染料または染料群を含む）を含有してもよく、その各粒子群は同一に標識化されていてもよいし、または多重化能力を増大させるために異なって標識化されていてもよい。すなわち、単一のビーズは１または２以上のＳＥＲＲＳ活性染料群を含んでよい。仮に２以上の染料がビーズ内に組込まれている場合には、得られるＳＥＲＲＳ信号は、使用した種々の染料から得られる信号の組合せとなり、ビーズ内の染料群および／または染料群の相対濃度を変更することにより、識別できるＳＥＲＲＳ信号を有するビーズ群の“ライブラリー(library) ”が形成される。
【００２１】
ビーズ群の形成における銀ナノ粒子群のポリマーによる作用は、粒子群のサイズを減少することである。これにより、ビーズ化学上の追加的な制御と、広範囲のサイズが形成できる手段とがもたらされる。このように、一旦ポリマーが形成されると、ＳＥＲＲＳビーズの構造（arrangement）は、選択された凝集状態が維持されるような状態に固定される。さらに、ポリマーは銀ナノ粒子群を環境から保護する。
【００２２】
これらのビーズ群に用いられるポリマーは、さらに官能基類（例えば、カルボン酸類、カルボン酸類の活性エステル類、アルコール類、アミン類、エポキサイド類、クロロメチルスチリール基類、ビニル基類、チオール基類、マレイミドおよびサクシンイミド）を含んでよく、または標的分子群が反応して、粒子群の表面に結合するような連結基または連結基群によってさらに誘導化されていてもよい。これらの基の利点は、それらが共有結合または非共有結合で分子に結合する基点として働き、特異的な捕捉または分析を可能とすることである。ここで連結基とは、１以上またはそれ以上の標的分子と１またはそれ以上のＳＥＲＲＳ活性粒子群との間の付着を促進させる任意の基を言う。付着には、任意の結合が含まれ、特に限定されないが、例えば共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力結合、または機械的結合が挙げられる。
【００２３】
他の態様において、本発明は次の工程を有するＳＥＲＲＳ活性ビーズ群の調製方法が提供される：
１）吸収されたＳＥＲＲＳ活性染料を含む凝集金属コロイドを形成する工程；
２）適当な溶媒中で凝集金属コロイドとモノマーを混合する工程；および
３）凝集金属コロイドをカプセル化するポリマービーズ群を形成するようモノマーを重合する工程。
【００２４】
他の手段としては、ビーズ群を、吸収されたＳＥＲＲＳ活性染料を含む凝集コロイドを形成させずに作ってもよい。ビーズ群を、次いで加熱（例えば８０℃に）して、多孔性とし、それに吸収されたＳＥＲＲＳ活性染料を含む凝集コロイドを取得することができる。ビーズ群を冷却することにより、コロイド粒子群がビーズ内に捕捉される。染料／コロイドは温度を上げ、ビーズ群を適当な緩衝液中に浸すことにより除去することができる。
【００２５】
ポリマービーズ群を、さらにビーズの外側表面に官能性基または連結基群を付加するように反応させ、分子がビーズに付着するようにしてもよい。
【００２６】
適当な標的分子の例としては、核酸類、抗体類のような蛋白類、アルデヒド類、チオール類、アミン類、爆薬類、濫用薬物類、治療剤類、代謝物質類および環境汚染物質類が挙げられる。しかしながら、ビーズは非常にサイズが小さいので、例えばセキュリティ−・マーカーとして、単独で利用することもできる。従って、ビーズ群は、例えばエアゾルスプレー、ペイント、インク等の中に含有されるように表面を塗布してもよい。ビーズ類は一般に裸眼では見えないが、特異的なＳＥＲＲＳ信号を検出できるように特定のＳＥＲＲＳ活性染料またはその組合せが装填される。これは、特に模倣（couterfeiting）の防止／最小化のために応用できる。
【００２７】
ＤＮＡ配列のような適当な生物種をポリマー表面に付けることで、分析／標識（ラベル）化の操作が実行される。このようにして、分析工程とＳＥＲＲＳ工程が分離され、両者を最適化することができる。
【００２８】
本発明のビーズ群は、標識化技術として、より広い適用可能性を有する。例えば、蛋白および抗体の両者の検出に使用することができる。蛋白の場合の最も簡単な例は、対をなす蛋白の一方をＳＥＲＲＳ活性表面に付け、他方の蛋白に蛍光の標識を付けることである。対をなす複合体の場合は、ビーズは蛍光およびラマン散乱の両方を示し、対をなす分離体の場合は、ラマンスペクトルのみがビーズ上に検出される。蛍光とラマン散乱を共に同時に供給できるように改造された分光計が存在する。
【００２９】
さらに、ビーズ群は、例えば使用時の分離を助けるように適応させることができる。ビーズ群は、その表面に明確に、例えば標的を認識しかつビオチン基を含むＤＮＡ分子をビーズ群の表面を誘導化することにより付着させて、ストレプトアビジン（streptavidin）表面上に運ぶことができる。他の手段として／追加的手段として、ビーズ群は、例えば重量ベースで粒子の分離を許容する材料を秤量し添加したビーズ群の表面内および／または表面上に磁性種を組み入れることによって磁化することができる。磁性ビーズ群は、次いで小磁石を用い、例えば粒子群を濃縮して分光計のビーム内に運ばれる。
【００３０】
適当な磁性種は、ビーズ内に組込まれる磁性ナノ粒子群の形態である。そのような磁性ナノ粒子群は、ナノ粒子の形態で、鉄、磁鉄鉱、フェライト類ならびにニッケルおよびコバルト等の他の金属類の化合物などの任意の磁性材料を含む。
【００３１】
磁性ナノ粒子群の組入れは、前記磁性ナノ粒子群を含む溶液をコロイド／染料混合物と混合することにより達成され、ついでＳＥＲＲＳ活性ビーズを形成する。形成されたビーズ群は、その後先述のようにして機能が付与される。
【００３２】
抗体の場合には、蛍光体で標識化した抗原をＳＥＲＲＳ活性ビーズ上に固定した抗体に添加する競合代替分析法が持つ不確定性が除去される非常に簡単な分析を展開することができる。ビーズ群を遠心分離または磁場により溶液から除去する時に、蛍光体を有するビーズ群に発信させ、ラマンコードを読み取り、どの標識が置換されているかを決定することができる。他の方法として、ビーズ群がサンドイッチ分析法において特異的標識として使用され、抗原がプレートまたは磁性ビーズのような表面の抗体上に捕捉され、ＳＥＲＲＳで標識化された抗体で被覆された粒子が捕捉された抗原にくっつくことによって表面に付着する。抗原は、また最初に標識化された粒子上で抗体により捕捉してもよい。蛋白質の認識は、同様に、二つの蛋白質の各々に一つのビーズを付けるか、または一つの蛋白質に一つのビーズを付け、他の蛋白質に蛍光体のような他の標識を付けることによって検査される。
【００３３】
本発明のさらに他の態様として、分子刷込法（molecular imprinting methods）を適用して、テンプレート法（templating approaches）（例えば、ＷＯ００／４１７２３参照）により、ポリマー・シェルに対し特異的分子認識性を与えることができる。この一般的なアプローチは、原理的に、ポリマー・シェルに親和力を与え、臨床、食物、法医学および環境関連の検体（analytes）を含む一連の検体に適用することができる。
【００３４】
ＳＥＲＲＳスペクトルを得る方法は通常のものでよい。しかしながら、下記のものが分光器測定に利用される：
【００３５】
代表例として、本発明の方法は、可視スペクトルすなわち約３８０ｎｍ〜７８０ｎｍ、特に４００ｎｍ〜６５０ｎｍの間（実際に選ばれる周波数は、一般に、各ケースで使用される染料に依存する−可視スペクトルの赤領域の周波数は、全体として、より優れた表面増強効果を生じる傾向がある。）に周波数を有するレーザーの入射光を使用して実行される。しかしながら、他の周波数、例えば紫外（すなわち、２００ｎｍ〜４００ｎｍ）または近赤外領域（７００ｎｍ〜１１００ｎｍ）の周波数を使用することも可能である。このように、ＳＥＲＲＳ検出は約２００ｎｍ〜１１００ｎｍの間で実施される。
【００３６】
適当な周波数および強度を有する適当な光源の選択および必要な場合に行う調整は、特にＳＥＲＲＳ文献を入手し参照できる当業者の十分に能力内の事項である。ＳＥＲＲＳを使用し、高感度の検出を達成するためには、染料の極大吸収またはそれに近い周波数を持つ干渉性光源（a coherent light source）が必要である。より低い感度が必要な場合には、光源は干渉性である必要も高強度である必要もなく、ランプ（lamps）をモノクロメーター回折格子またはプリズムと組み合わせて使用し、適当な励起周波数が選択される。
【００３７】
ＳＥＲＲＳ信号を収集するのに適当な機器がいくつかあり、波長選択性ミラー、散乱光検出用のホログラフィー光素子、および光ファイバー導波管が挙げられる。ＳＥＲＲＳ信号の強度は、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）、シリコン光ダイオード、または信号のカスケード増幅用に単一または直列に配設された光電子増倍管（photomultiplier）を使用して測定することができる。光子計数電子機器が高感度検出のために使用できる。検出器の選択は、主に特定の分析を行うために必要な検出感度を考慮して行われる。
【００３８】
本発明の方法は、ある波長領域に亘って全ＳＥＲＲＳスペクトルを得るか、または一つのピークを選択しそのピークの波長でのみ走査するか（すなわち、ラマンのイメージング（imaging））して実行されることに注目されたい。また、反射光を除去するフィルターのみ使用して、レイリー散乱等および光ダイオードのような検出器を使用して全ラマン散乱を検出することもできる。
【００３９】
ＳＥＲＲＳスペクトルを得るための、および／または分析するための装置は、殆ど確実にコンピュータのようなデータ処理装置を含んでいる。
【００４０】
ラマン信号は、強度が異なる一連の不連続スペクトル線からなる。周波数および相対強度は検出されるＳＥＲＲＳ活性染料に特異的であり、従ってラマン信号はその染料の指紋”である。ＳＥＲＲＳ分析計が染料混合物を選択的に検出するために使用される場合には、同定のためには“指紋”スペクトルを検出することが必要である。
【００４１】
ＳＥＲＲＳ信号が適当な検出器によって取り込まれると、その周波数および強度データは、通常、分析用のコンピュータに通される。指紋ラマンスペクトルを評価用スペクトルと比較して検出されたラマン活性化合物を同定するか、または測定された周波数の信号強度を使用して検出されたラマン活性化合物の量を計算する。
【００４２】
検体の多重標識用のＳＥＲＲＳ活性粒子群を含むポリマー粒子群の開発についての要約を述べる。コロイド粒子群を染料で標識化し予備凝集し、ポリマー中に固定して、ＳＥＲＲＳ効果を永久的にスイッチ・オンし、分析事項は、別途例えば検出すべき分子をポリマー表面に共有結合で連結することにより実行される。主な利点は、粒子群が非常に強く安定したＳＥＲＲＳを与えることである。特定の粒子の簡単で感度のよい同定用として、懸濁液中で莫大な多重化標識能力があるが、これは他のいかなる技術にも負けないものであり、ＳＥＲＲＳ活性ナノ凝集体は環境から保護される。また、ＤＮＡ配列またはペプチドのような特定の標的検体の同定および定量が複合体混合物中超低濃度の状態にある、その場所で可能である。
【００４３】
本発明の他の態様では、試料中の標的分子を検出する下記の工程を含む方法が提供される：
ａ）特異的に同定できるＳＥＲＲＳ信号を持つようにビーズを生成させ、その表面を修飾してそこに前記標的分子を結合させることができる部分を付けるようにした本発明によるＳＥＲＲＳ活性ビーズ（群）を供給する工程；
ｂ）前記ビーズ（群）を前記試料と接触させ、試料中の前記標的分子を前記ビーズ（群）と結合させる工程；および
ｃ）前記標的分子に結合したビーズまたはビーズ群から得られる特異的に同定できるＳＥＲＲＳ信号を検出する前記標的分子を検出する工程。
【００４４】
典型的には、標的分子は抗体または抗原であり、その場合、ＳＥＲＲＳ活性ビーズはそのビーズ表面に対応する抗原または抗体が付くように修飾される。通常のサンドイッチ分析法を採用して、試料中に存在する特定の蛋白質に結合させるために第一の抗体を表面に付ける。ビーズは、これも前記蛋白に特異的である第二の抗体を含むように誘導化される。蛋白が試料中にあると、それは２つの抗体間に効果的にサンドイッチ状に挟まれて、ビーズ上で第二の抗体に付いたＳＥＲＲＳによって検出することができる。受容体またはリガンドの一方がビーズ表面に固定された受容体／リガンド複合体のように自然に会合している他の分子群もまた検出される。
【００４５】
好ましい実施態様では、本方法は試料中の特定の核酸配列を検出するために用いられる。この場合、ビーズは、ビーズ表面に付いた特定の核酸配列を含む核酸分子に特異的にハイブリダイズできる分子を持つように修飾される。特異的にハイブリダイズ可能な分子は、簡単にハイブリダイズとその後の検出が可能となるのに十分な長さを有するものである。別の場合として、標的核酸分子に特異的にハイブリダイズ可能な分子は、比較的短い分子、すなわち約５０ヌクレオチド未満、例えば長さが２５ヌクレオチド未満であって、前記核酸分子にハイブリダイズされ、そこから鎖が伸長するプライマーとして機能するよう設計される。この方法では、ビーズ表面に付ける分子は、３’末端で結合と鎖伸長開始が可能となるように、一般に５’末端を介して結合される。
典型例としては、プライマーが結合したビーズから、一定の距離、例えば１００ヌクレオチドから２０００ヌクレオチドの距離で標的核酸分子に結合するように設計された他のプライマーも利用される。これにより、当業者によく知られた、適当なＤＮＡポリメラーゼおよび必要なｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオチドトリリン酸）を使用し、標的核酸配列が組み込まれた二重鎖分子が生成する。
【００４６】
実際には、増幅反応、例えばＰＣＲを実行して検出すべき標的核酸量を効果的に増強することができる。また、特定の表面に結合できる部分を含むように適当な手段によって他のプライマーも修飾される。例えば、プライマーは、任意の増幅産物がストレプトアビジンで被覆された表面に結合できるように、プライマーの５’末端にビオチン分子を含んでよい。この方法で、１末端で表面に結合でき、フリーの末端で容易に検出できるＳＥＲＲＳ活性ビーズが組み込まれた増幅産物を生成させることができる。
【００４７】
特定の異なったＳＥＲＲＳ信号を持つＳＥＲＲＳ活性ビーズ群を生成させ得る能力により、多数の異なる標識でラベルされ、各々が異なる固定化された結合部（例えばオリゴヌクレオチド）を持つビーズ群を用いる多重化反応として当技術分野で知られている反応を行うことが可能である。オリゴヌクレオチドの場合には、一つずつが、例えば、相補的結合が３’末端で生じる時にのみ鎖伸長を起こさせる３’末端の特異的な配列を組み込むことにより核酸分子中の特定の多形を同定するように設計される。すなわち、３’末端のヌクレオチドが標的にハイブリダイズしない時には、鎖伸長が起こることはできない。増幅産物を生成するように設計された他のプライマーを使用する増幅反応を実行することにより、標的核酸分子中に存在する多形を容易に検出することができる。
【００４８】
増幅反応を行う場合には、Ｓｙｂｒグリーンのような染料が増幅産物が得られたことを示す初期インジケーターとして使用される。この産物は、その後ＳＥＲＲＳ検出を実行することにより同定することができる。このオプションである工程は、増幅産物を生成させることが確認されている反応のみがその後ＳＥＲＲＳ検出により分析されるように利用することができる。
【００４９】
要約すると、本発明の鍵となる利点は以下の通りである。
１）感度：
個々のビーズは、数百万個までのＳＥＲＲＳ活性染料標識を収容可能な別個の感知単位である。利用できる銀表面全体を染料標識できっちりと包むことができる。例えば蛍光性を有する２つの標識の密接を妨げる分子内消光メカニズムはＳＥＲＲＳに適合しない。したがって、１個のビーズについての信号が、低濃度で、非常に強く、迅速に検出される。
２）強固性：ＳＥＲＲＳからの最大信号を得るために必須の凝集工程は、ビーズの形成中に行われる。したがって、ビーズを前もって調整して、長寿命で、不変で、かつ生物学的事象による影響を受けない信号を形成するポリマーによって環境から保護される。さらに、特異的検体を見出すのに用いられる感知性種はポリマー表面に共有結合で付けられる。
３）多重検出性：ビーズ群は、多数のコロイド性懸濁液の各々の中に種類の異なる染料混合物を使用することにより、および２以上の懸濁液の凝集コロイドと染料とを特定のビーズに加えることにより、“書かれた（witten)”多数のコードを含むように製造される。これにより得られるＳＥＲＲＳの鋭いピーク群により、分離せずにビーズ群混合物中の各々のビーズの型を認識することができる。ＳＥＲＲＳ活性表面に強く付着する発色団は全て使用できることから、蛍光の利用に比べてより簡単で、かつよい広範囲の染料化学が可能である。例えば、アゾ等の染料からのＳＥＲＲＳ信号群のパターンは、発色団の周囲の置換に対する感度が非常によく、蛍光の場合と比較してより容易に多重標識を創ることができる。
【００５０】
また、ビーズ群が金属を含むために、有意の質量がビーズに供給される。この重量も、ビーズ群を利用する検出および／または分離技術で使用される。例えば、図２のように、認識されるＤＮＡ断片が、石英微量天秤はかりのストレプトアビジンを被覆したプレート表面上に捕捉され、質量変化が検出される。ビーズが重いことが、通常の方法に比べて、この質量変化を扱い易くし、石英はかりの感度増加が検出できる。重量変化を検出した後に、その原因である特定粒子が重量変化により検出できる。
【００５１】
本発明の実施例を図面を参照しながらここでさらに詳しく述べる。
【実施例】
【００５２】
実施例１
［コロイドの調製］
LeeおよびMeiselの方法によりクエン酸塩還元コロイドを調製した（Rodger, C., Smith, W.E., Dent, G., Edmonson, M., J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1996, 5, 716; Munro, C. H., Smith, W. E., Garner, M., Clarkson, J. and White, P. C., Langmuir, 1995, 11, 3712）。全てのガラス器具は王水（３：１，塩酸：硝酸）を使用して充分に洗浄し、次いで水で充分にすすぎ、蒸留水で洗浄した。硝酸銀（９０ｍｇ）を４０℃の温度でで蒸留水（５００ｍＬ）に溶かした。次いで、ブンゼンバーナーを使用して溶液をすばやく加熱し９８℃とした。この時点でクエン酸３ナトリウム塩の１％溶液１０ｍＬを加えた。次いで、９０分間９８℃の温度に一定に維持されるように注意深く温度を制御した。一定温度に保った後コロイド懸濁液を冷却し、そのＵＶ吸収スペクトルを測定した。以下に詳細を述べる実施例では、４０３〜４１０ｎｍの範囲内に最大ＵＶ吸収を持つコロイドを使用した。
【００５３】
１２ｍＬのクエン酸塩還元コロイド（λmax ４０６ｎｍ）を含む１２本の管（チューブ）を3000rpmで２０分間遠心分離機にかけて、重合で使用するペレット状の銀を調製した。各管の上澄液を除去し、残留した銀を１本の管に濃縮した。次いで、濃縮したペレットを超音波を使用してアセトニトリル中に再懸濁させ、その後3000rpmで４０分間遠心分離した。上澄液をもう一度除去し、生じたペレットを超音波を使用してアセトニトリル（５ｍＬ）中に再懸濁させ、この懸濁液を重合に組み入れた。
【００５４】
クエン酸塩還元コロイドを含む１２本の管に１５０μＬのＡＢＴＤＭＯＰＡ（４（５’−アゾベンゾトリアゾイル）−３，５−ジメトキシフェニルアミン）の１×１０-6Ｍ溶液を加えた以外は、上記と全く同じ方法で染料を装填した試料を調製した。
【００５５】
［ビーズの合成］
コントロールポリマーはコロイドを含まないが、ブランクポリマーはコロイドを含み染料を含まない。染料装填ポリマーはコロイドおよび染料を含む。
【００５６】
３つの重合（コントロール、ブランクおよび染料装填）を３つの別個の５０ｍＬ壁厚ガラス管中で行った。コントロールポリマー用の反応容器にアセトニトリル（２５ｍＬ）、ジビニルベンゼン８０（0.5ｇ）およびアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（0.005ｇ）を充填し、ブランクポリマー用の反応容器にアセトニトリル（２０ｍＬ）、染料を含まないコロイド懸濁アセトニトリル液（５ｍＬ）、ジビニルベンゼン８０（0.5ｇ）およびＡＩＢＮ（0.005ｇ）を充填し、そして染料装填ポリマー用の反応容器にアセトニトリル（２０ｍＬ）、染料装填コロイド懸濁アセトニトリル液（５ｍＬ）、ジビニルベンゼン８０（0.5ｇ）およびＡＩＢＮ（0.005ｇ）を充填した。各反応容器を振盪し、モノマーおよびＡＩＢＮを溶解させ氷水浴で約１０分間冷却し、次いで酸素を含まない窒素ガスを散布して溶存酸素を除去した。次いで、各管を密封し、偏平ローラー（low-profile roller）上２で６０℃にて４時間加熱し重合させた。重合後、ポリマービーズをメンブランフィルター（0.2μｍ）でろ過して単離し、数倍容の新アセトニトリルで洗浄し、次いで４０℃で真空乾燥した。
【００５７】
［ビーズの修飾］
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（５００ｍｇ）をＭＥＳ（２５ｍＬ）に含有する0.1Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ4.5）をポリマービーズに加え、２５℃で２時間培養してアミン表面活性種を形成した。図１に上述のようにして調製したビーズ（１）を示す。ビーズ（１）は、凝集コロイドおよびＳＥＲＲＳ活性染料ビーズ群（５）をカプセル化しているポリマー・シェル（３）で形成される。ポリマー・シェル（３）の表面は、アミノ表面活性種群（７）を持つように官能化され、ＤＮＡと反応させることができる。ビーズ１ｇ当たりオリゴ（oligo）３μｇを含むりん酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ7.2）２５ｍＬを活性ビーズ群に加え、２５℃で一夜反応させた。遠心分離によってビーズ群を溶液から除去し、準備してあったりん酸緩衝液（ＰＨ7.2）に再懸濁させた。
【００５８】
上述のようにして調製したビーズ群（１）を使用する簡単な例（図２参照）では、オリゴヌクレオチド（１２）がＤＮＡの特定の配列を認識するように設計されている。標的配列（１４）がＤＮＡ抽出物中に存在するときは、それはオリゴヌクレオチド（１２）とハイブリダイズして、ビーズ（１０）により捕捉される。例えば、ビオチン基（１８）を含む第二のオリゴヌクレオチド（１６）もハイブリダイズして、その系がストレプトアビジン（streptavidin）板またはビーズ（２０）上に発現する（落とされる）。この分析法は、粒子（１０）とビオチン化された配列（１６）の両方とハイブリダイズした標的配列（１４）を特異的に認識する。別の場合として、磁性粒子群をビーズに加えると、磁性粒子群とハイブリダイズした標的とがビオチン工程無しで適当な表面に落とされる。両方の方法において、組み込まれていないプローブ（probe）を除去するため種々の方法を使用することができる。最初の方法では、過剰のビオチンをストレプトアビジン板に加えても標識は落とされず、したがってそれは厳密に除去する必要が無い障害である。しかしながら、標識で創られた複合体のサイズが分離を容易とし、どちらの方法でもフローセルシステムまたは短いクロマトグラフィー工程を使用して、組み込まれていないプローブを除去することができる。他の場合としては、磁気を有するように被覆したストレプトアビジンビーズ群を使用して溶液から複合体を引き寄せることにより磁気的分離を行うことができる。
【００５９】
実施例２
次いで、１２本の遠心分離管を使用してさらに一組のペレット状の銀を調製した。ブランクビーズ群は、１管につきコロイド9.6ｍＬおよび水2.4ｍＬを含んでいた。染料被覆ビーズ群は、１管につき染料2.4ｍＬ（１×１０-6Ｍ）およびコロイド9.6ｍＬを含んでいた。
【００６０】
染料を加えた後全ての管を一夜放置し、４０分間遠心分離した。ペレットをアセトニトリル１０ｍＬ中に再懸濁させ、さらに４０分間再遠心分離した（超音波処理せず）。
【００６１】
次いで、ペレットをさらに５ｍＬのアセトニトリル中に再懸濁させ、ポリマー反応混合物に加える前に２分間超音波処理した。
【００６２】
次いで、ジビニルベンゼン0.5ｇおよびＡＩＢＮ0.005ｇを総容量２５ｍＬのアセトニトリル（５ｍＬのコロイドを含む）中に溶解させた。試料群をＮ2を用いて１０分間脱気した。次いで、試料群を３７℃のローラー上に置き、６０℃に加熱し２４時間重合させた。
【００６３】
次いで、試料群を孔径0.2ｍｍのろ紙を通してろ過し、アセトニトリルで洗浄し、真空乾燥機中で乾燥した。
【００６４】
次いで、少量のビーズ群（すなわち、コントロール、ブランク及び染料含有ビーズ）を約１ｍＬのアセトニトリル中に分散させ、超音波処理し、顕微鏡スライド上に滴下し乾燥させた。次いで、図３および４に示されるスペクトルを、Renishaw微小プローブ（microprobe）ラマン分光計、ｘ２０対物レンズ、１００％パワー（約８ｍＷ）ｌｓ，ｌａ  システム１００で記録した。
【００６５】
図３は、（ａ）として同定されるコントロールビーズ群のラマン（Raman）、および（ｂ）として同定されるブランクビーズ群のＳＥＲＲＳを示す。
【００６６】
図４は、ビーズ試料を含む染料中の染料のＳＥＲＲＳを示す。
【００６７】
［ＳＥＭ像］
次いで、超音波を使用してＰＶＡの溶液中に少量のビーズ群を懸濁させた。次いで、ビズ群を乾燥し小さなガラスディスク中に入れ、分析前真空下で乾燥し貯蔵した。次いで、５ｋＶの電子線を使用したCameca  ＳＸ１００電子マイクロプローブ・マイクロアナライザーで図５のＳＥＭ像を記録した。大きなビーズは約1.5μｍであり、小さなビーズは約 0.5μｍである。
【００６８】
［ＰＶＡ中の染料混合物］
図６および図７は、ＰＶＡ安定基質中の２つの混合物の２つの試料のラマンスペクトルである。
【００６９】
図６は、（ａ）ＡＢＴ  ＤＭＯＰＡ（ＧＭｌ９）、（ｂ）８ＨＱＰＫ、および（ｃ）両染料の割合が１：１０である混合物のＳＥＲＲＳスペクトルを示す。Renishaw顕微鏡システム、５１４，５ｓ，ｌａ，１００％パワー（約３ｍＷ），×５対物レンズでスペクトルを採集した。
【００７０】
図６中、２つの染料（ａ）ＡＢＴ  ＤＭＯＰＡおよび（ｂ）８ＨＱＰＫの各々のメインピークを混合物（ｃ）のスペクトル中で明確に同定することができる。標識化されたピーク（i-v）、（vii）および（viii）は全て８ＨＱＰＫ染料（すなわち、１−［４−（８−ヒドロキシ−キノリン−５イルアゾ）−フェニル］−エタノン）から生じ、一方標識化されたピーク（ix）はＡＢＴ  ＤＭＯＰＡ染料からのものである。混合物スペクトル（ｃ）中の約１３６０ｃｍ-1にあるピークは、両方の染料からのその位置にあるピークの組合せである。このピークの強度は、スペクトルの他のピークと比較して相対的に増加している。
【００７１】
図７は、（ａ）８ＨＱＰＫ、（ｂ）ベンゾトリアゾールロダミンＢ、および（ｃ）両染料の割合が３：１である混合物のＳＥＲＲＳスペクトルを示す。Renishaw顕微鏡システム、５１４ｎｍ，５ｓ，３ａ，１００％パワー（約３ｍＷ），×５対物レンズで採集した。図７中、２つの染料（ａ）８ＨＱＰＫおよび（ｂ）ＢＴＲＢの各々のメインピークを混合物（ｃ）のスペクトル中で明確に同定することができる。標識されたピーク（1-viii）は全て８ＨＱＰＫ染料（すなわち、ベンゾトリアゾールロダミンＢ−｛９−［４−（ベンゾトリアゾール−５−イルスルファモイル）−２−メチル−フェニル］−６−ジエチルアミノ−キサンテン−３イリデン｝ジエチル−アモニウム）から生じ、一方標識されたピーク（ix）はＢＴＲＢ染料からのものである。
【００７２】
実施例３−磁性ビーズ群の使用
［ビーズの調製］
磁性ナノ粒子群の溶液５０ｍＬを、実施例１と同様の染料混合物で処理した銀コロイド５０ｍＬに加えた。次いで、ナノ粒子群の混合物を遠心分離し、実施例１と同様にビーズ工程を実行した。次いで、ビーズを実施例１と同様にオリゴヌクレオチドで官能化した。
【００７３】
［方法（ａ）］
この方法は、粒子群の磁気的性質を用いる分離と精製を組み合わせたものである。
【００７４】
ビオチン片とビーズを標的ＤＮＡに対しハイブリダイズさせた実施例２の分析で意図したＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物試料を使用して、電磁石の小さく平らなチップをＰＣＲ産物を十分に含むマイクロ滴定プレート内に導入した。磁石にスイッチを入れ、全ての磁性粒子群を集めた。次いで磁石を溶液から除去し、第二のウェル（well）に浸漬してそれを洗浄し、次いで実施例２と同様ストレプトアビジン被覆域と共に第三のウェルに浸漬した。第三のウェル中で電磁石のスイッチを切り、ビーズ群を解放した。ビーズ群をストレプトアビジン域に付着させた２分後に、磁石に再びスイッチを入れた。これにより付着していない全てのビーズ群が除去された。
【００７５】
この方法で、最初のウェル中に残留した組込まれていない全てのビオチンプライマーおよび標的断片に付着していない全てのビーズ群が最初の段階で除去され、標的断片に付着していないビオチンで標識化されたＤＮＡが第二段階で除去された。第二段階後ウェルの底部に残ったビーズ群に実施例２と同様に信号を送り、ＳＥＲＲＳコードを使用してビーズおよび従って標的ＤＮＡが同定された。
【００７６】
［方法（ｂ）］
この方法は、標識化されない銀粒子群を持つ磁性粒子群のみを含む誘導化されたビーズ（誘導ビーズ）使用時の選択性の利点を説明するものである。市販の誘導ビーズも使用することができる。
【００７７】
銀ナノ粒子群を加えないこと以外は実施例１に述べたようにして１バッチのビーズ群を調製し、特定のオリゴヌクレオチド配列を使用して特定の標的ＤＮＡを認識するように誘導化した。ＰＣＲ混合物には、銀標識群がビーズ内に組込まれているが、磁性粒子群を含まない他のビーズ群も組込まれた。それらは、同じ標的ＤＮＡの異なった領域を認識するよう設計された第二のオリゴヌクレオチド配列を含んでいる。ＰＣＲに続いて、電磁石をウェルに加えスイッチを入れる。磁性ビーズ群含む試料だけがそのチップに付着する。次いで、そのチップにラマンマイクロプローブ下で信号が送られた。標識化されたビーズ群を含むチップのみが観測された。この方法は、全てのビーズ群を顕微鏡送信容量の中に濃縮するという理由で有効である。これは感度を増大させる。この方法は、二重ハイブリダイゼーション（混成）を含むという理由で信頼性および選択性がある。
【００７８】
［方法（ｃ）］
この方法は、ラマン（Raman）および蛍光を磁性ビーズ群と組み合わせた使用を説明するものである。
【００７９】
Ｓｙｂｒグリーン（green）をＤＮＡに加えた実施例４のＰＣＲ混合物を使用して、電磁石をＰＣＲ混合物に浸漬した。電磁石にスイッチを入れ、磁性粒子群を除去した。次いでラマン顕微鏡下でこの混合物に直接信号を送った。ＣＣＤ検出器の分離技術で蛍光およびラマン信号が検出されるように周波数を選んだ。この方法は、感度がビーズを即時に検出できる小さな領域で採集することにより創り出されるという理由で有効である。Ｓｙｂｒグリーンからの蛍光は、通常のＰＣＲ機内でさえもハイブリダイゼーションを検出し、迅速な１段階同定分析用の配列（array）から単一のウェルを選択できる。
【００８０】
実施例４−ＤＮＡ検出用ＳＥＲＲＳビーズ群の使用
この実施例では、ＳＥＲＲＳビーズ群が特定のＤＮＡ配列の検出のための標識として使用される。その構成は、ＳＥＲＲＳビーズ群の高感度および多重化の増大した容量を示すＰＣＲ分析に基づいている。最初の蛍光スクリーン（screen）は、応答信号を生じたチューブまたはウェルを知らせることができる。このホットウェル群はＳＥＲＲＳによって検査され、ハイブリダイズしている実際のＤＮＡ配列または配列群が決定される。
【００８１】
修飾ビーズ群は、実施例１に従ってビーズの外側表面を修飾するように調製され、３’末端がビーズの外表面から離れた方向にオリゴヌクレオチドを固定される。これは、例えば、合成中にオリゴヌクレオチドの５’末端に基を付けて、５’末端の基がビーズ表面に付着するようにビーズ表面を修飾することにより容易に達成できる。
【００８２】
図８ａは、そのようなビーズ５０を図式化して示すものであり、多数の同一のオリゴヌクレオチド５４がビーズ５０の表面に付着して、ビーズ５０内に見られる染料で標識化されたコロイド粒子群５２に基づいて特定のＳＥＲＲＳの特徴（signature）を示す。
【００８３】
［標的のＰＣＲ増幅］
ＰＣＲは、試料から二本鎖ＤＮＡの特定の断片を増幅するために用いられる。これは、対立遺伝子に特異的な遺伝子型解析用オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲに存在する特異性を利用する。最初に、プライマー配列を選び特定の疾患に見られるもっとも普通の突然変異の変異状態を検出することができる。ＤＮＡ試料の遺伝子型を分析するために、多重化増幅無反応性変異システム（multiplexed amplification refractory mutation）ＡＲＭＳ）で、２つのフォワードプライマーが１つのリバースプライマーと共に使用される。フォワードプライマーが、特定のプライマー用の標識として作用する異なったＳＥＲＲＳビーズ群上に５’−末端リンカー（linker）を介して固定化される。リバースプライマーは、５’−末端にビオチンのタグを付される。ＰＣＲの進行と共に、生成物はＳＥＲＲＳビーズから離れたアンプリコン（amplicon）の末端に組込まれたビオチンを持つＳＥＲＲＳビーズ上に構築される。別の場合として、ＳＥＲＲＳビーズ群上でＰＣＲを実行することが課題の場合は、標的の通常のＰＣＲを行い、続いてＳＥＲＲＳビーズ群を導入することが可能である。
【００８４】
例えば、５重反応（pentaplex reaction）の場合は、５つの異なるプライマーを５つの異なるＳＥＲＲＳビーズ群上に固定し、すべてのビーズ群を試料と共に混合してＰＣＲを実行することができる。
【００８５】
図８ｂは、ＰＣＲ反応に続いて得られた標識された産物６０を示す。ＳＥＲＲＳビーズ（図８ａ参照）に付いたプライマーとビオチン化されたプライマー６２とを使用する増幅により、ＳＥＲＲＳ反応性ビーズを組込んだオチン化された産物を生ずる。
【００８６】
［ＰＣＲの初期スクリーニング（オプショナル）］
ＰＣＲの成功は、例えば、二本鎖ＤＮＡの量の増加に伴うＳｙｂｒグリーン（図８ｃ，６４参照）の蛍光の増加によって判断することができる。ＰＣＲ終了時の解離曲線を用いて、ＰＣＲ産物の存在とプライマーダイマーの不存在を確認する。このように、もし増幅があれば蛍光がそれを示す。ＰＣＲ時の蛍光の増加を測定するためにＱＰＣＲ計器を使用することができるが、チューブを迅速に分析するために通常のプレートリーダーもＰＣＲ後に使用できる。テンプレートコントロールとナンセンスＤＮＡを持つビーズ群との無いコントロールチューブが適当と考えられ使用することができる。
【００８７】
［ＳＥＲＲＳビーズ群の表面への固定］
蛍光が増大したチューブがＰＣＲ産物を持つものとして、オプションで一旦同定されると、内容物がストレプトアビジン被覆スライド（図８ｄの６６参照）上にスポットされる。これは、スライド表面のＳＥＲＲＳビーズ群によりビオチン化されたＰＣＲ産物を固定する。ビオチン化されたプライマーも固定される（しかし、特異的に検出できるＳＥＲＲＳ信号を持たない）が、他の全ては一連の洗浄で除去される（これには、蛍光を発しＳＥＲＲＳ信号と干渉する、挿入されたＳｙｂｒグリーンを含む）。このようにして、ここに一連のＳＥＲＲＳビーズ群として、ＳＥＲＲＳによる信号送信の準備ができたスライド表面上に固定される。
【００８８】
［固定化されたビーズ群のＳＥＲＲＳ分析］
ＳＥＲＲＳスペクトルが固定化されたＳＥＲＲＳビーズ群上で取られ、ＰＣＲ産物を生成させるために使用された実際のプライマー配列が同定される。分離せずに混合物の成分を同定することができるＳＥＲＲＳの能力により、多重、例えば５重の特定のチューブからのＳＥＲＲＳビーズ群を眼によっても同定に使用できるが、統計学でも、多重化の程度を増大させる目的で非専門家がこれを確認することができる。
【００８９】
典型例では、構成全体は、標準のＱＰＣＲ実験時間、すなわち解離曲線を使用する場合は約１５０分、またはサイクルを標準ＰＣＲサイクラーで使用する場合は約６０分より多くの時間はかからない。ＰＣＲのセットアップは、ビーズ群上のプライマーの有効濃度および最終容量をスプレッドシート（spread sheet）に打ち込み、他の全ての値を自動的に表示させるように準備することができる。この方法は、ＰＣＲのセットアップを非常に簡単にし、計算のシステム的エラーを減らす。ＰＣＲの終了後、ストリップチューブの内容物を、読み取りプレート中に、またはロボット操作で同様に読み取るプレートためのマイクロタイタープレート中に、ピペットで秤りとる必要がある。他の手段としては、オプションとしてストレプトアビジンスライド上へ直接ピペットで秤りとることもある。
【００９０】
長い２重鎖ＤＮＡ断片にＳＥＲＲＳビーズを組込む増幅に対立するものとして線形伸長（linear extension）を使用することができる。蛍光検出はこれをピックアップしそうにないが、ＳＥＲＲＳビーズ群は、ＤＮＡの１片でも数百万でも、存在する酵素的伸長に関する情報を提供する。
【００９１】
実施例５−ビオチン−ストレプトアビジン結合親和力を利用するＳＥＲＲＳビーズＤＮＡ結合分析
ＳＥＲＲＳビーズ群結合分析の一例をここに示す。本例では、１１０塩基長配列の突然変異体濾胞性肺腺維症（Cystic Fibrosis）遺伝子を分析する。
【００９２】
アゾ染料で標識化した、ＳＥＲＲＳビーズの活性表面を、突然変異体濾胞性肺腺維症遺伝子上に見出されたＤＮＡ配列に対し相補的な、短いオリゴヌクレオチドプローブで誘導した。突然変異体ＣＦ鎖を、相補的プローブを合成した配列の反対側の末端でビオチン基に連結した。ＳＥＲＲＳ−ＤＮＡプローブがＣＦ−ビオチン配列にハイブリダイズされ、ストレプトアビジンプレート上に固定された。
【００９３】
［方法］
ＳＥＲＲＳビーズ群を、先に概要を記載した方法で、ジビニルベンゼン８０およびメタクリル酸を用いて合成した。ビーズ群の表面が多数のカルボン酸基で覆われた。これらの活性酸基を使用してオリゴヌクレオチドおよび他の分子をビーズ表面に付けた。
【００９４】
［ＤＮＡ配列］
迅速処理（Expedite）ＤＮＡ合成機を使用して２つの配列を合成した。
アミンリンカーＸを含む配列Ａ：
配列Ａ：−Ｘ−ＧＴＡＴＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴ（配列番号１）
ビオチンＢを含む配列Ｂ：
配列Ｂ：−Ｂ−ＧＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＡＧＡ（配列番号２）
【００９５】
（Ｘはアミノヘキサメチレンであり、Ｘを固相合成および精製後に、炭素鎖の末端に一級アミン基を持つオリゴヌクレオチドを製造するために添加する。）
【００９６】
配列Ａ（４００μＬ，0.6ｍｇ／ｍＬ）を精製し、これを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ，３７ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド（２４ｍｇ）を含有する0.1Ｍ  ＰＢＳ（７５０μＬ）緩衝液およびアセトニトリル（１００μＬ）を用いて、ＳＥＲＲＳ活性ビーズ群（７０ｍｇ）に結合させた。
【００９７】
配列Ｂ（0.5μＭ）を、そのＣＦ補体およびリバースプライマーと共にＰＣＲ増幅反応で使用した。産物を精製し、これを追加の配列Ｂと共にオリゴ誘導されたビーズ群に加え、９５℃で１０分間加熱した。
【００９８】
ついで、１００μＬの分散液をストレプトアビジンプレート上に点在させ、湿気のある室内に３時間放置した。ＤＮＡ誘導されたビーズ群をコントロールとして使用した。プレートを１％ＳＤＳ溶液、水、およびアセトニトリルで洗浄した。ビーズ群を乾燥し、ラマン光分光法により検査した。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】本発明によるＳＥＲＲＳ活性ビーズを示す。
【図２】本発明によるＳＥＲＲＳ活性ビーズの使用可能性を示す。
【図３】実施例２におけるコントロール粒子群のラマンスペクトルおよびブランクのビーズ群のＳＥＲＲＳを示す。
【図４】染料で被覆したビーズ試料中の染料のＳＥＲＲＳを示す。
【図５】染料被覆ビーズ群のＳＥＭ像であり、測定バーの長さは１０μｍ、ビーズ群の平均直径は約０．８μｍである。
【図６】ABT DMOPA、8HQPKおよび両染料の１：１０混合物のＳＥＲＲＳスペクトルを示す。
【図７】８ＨＱＰＫ、ベンゾトリアゾール  ロダミン  Ｂおよび両染料の３：１混合物のＳＥＲＲＳスペクトルを示す。
【図８】本発明によるＳＥＲＲＳ活性ビーズが増幅反応を使用してどのように特定の核酸配列を同定するために使用されるかを示す説明図である。
【符号の説明】
【０１００】
１  ビーズ
３  ポリマー・シェル
５  凝集コロイドおよびＳＥＲＲＳ活性染料ビーズ群
７  ＤＮＡと反応させることができるアミノ表面活性種群
１０  ビーズ
１２  オリゴヌクレオチド
１４  標的配列
１６  ビオチン化された配列
１８  ビオチン基
２０  ストレプトアビジン板またはビーズ
５０  ビーズ
５２  染料ラベルされたコロイド粒子群
５４  オリゴヌクレオチド
６０  ラベルされた産物
６２  プライマーおよびビオチン化されたプライマー
６４  Ｓｙｂｒグリーン
６６  ストレプトアビジン被覆スライド
【図１】
2005533246.tif 000002
【図２】
2005533246.tif 000003
【図３】
2005533246.tif 000004
【図４】
2005533246.tif 000005
【図５】
2005533246.tif 000006
【図６】
2005533246.tif 000007
【図７】
2005533246.tif 000008
【図８】
2005533246.tif 000009
【配列表】
2005533246000001.app
【国際調査報告】
2005533246.tif 000010
2005533246.tif 000011
2005533246.tif 000012
2005533246.tif 000013