(57)【要約】本発明は、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ−１を発現する哺乳類幹細胞の単離方法、ならびにその組成物に向けられる。本発明は、種々の症状を治療するための、ＶＥＧＦＲ−１を発現するこのような単離哺乳類幹細胞の使用方法であって、種々の症状を治療するために造血、血管形成、および／または血管新生、は筋形成および神経形成を誘導することを包含し得る方法にも向けられる。最後に本発明は、幹細胞の増殖および／または分化および動員、即ちモトゲネシスmotogenesisを刺激するために、ＶＥＧＦＲ−１に結合し、活性化しまたは刺激する分子、例えばＰｌＧＦを用いる治療方法に向けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類幹細胞の単離方法であって、以下の：
細胞の集団を提供し、
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子と前記細胞の集団を接触させ、そして
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子に結合した細胞を単離する
ことを包含する方法。
【請求項２】
細胞の集団が、胎児肝臓、臍帯血、卵黄嚢、成熟脊髄、骨髄または成体末梢血試料から単離される請求項１または２記載の方法。
【請求項３】
細胞の集団が中枢神経系から単離される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子が抗体である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子がリガンドである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
リガンドがＰｌＧＦである請求項５記載の方法。
【請求項７】
１つまたはそれ以上の陽性選択マーカーと細胞を接触させ、そして１つまたはそれ以上の陽性選択マーカーに結合した細胞を単離することをさらに包含する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
陽性選択マーカーがＣＤ３４またはＡＣ１３３である請求項７記載の方法。
【請求項９】
１つまたはそれ以上の陰性選択マーカーと細胞を接触させ、そして１つまたはそれ以上の陰性選択マーカーに結合しない細胞を単離することをさらに包含する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
陰性選択マーカーがＣＤ３８またはＬｉｎである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
単離される細胞がヒト幹細胞である請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ヒト幹細胞が造血幹細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ヒト幹細胞が内皮、筋肉または神経幹細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子を含む組成物。
【請求項１５】
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子が抗体である請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子がリガンドである請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
リガンドがＰｌＧＦである請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
ＶＥＧＦＲ−１を発現する細胞を含む組成物であって、ＶＥＧＦＲ−１を発現する細胞が請求項１〜１３のいずれかに記載の方法を用いて単離している組成物。
【請求項１９】
哺乳類の治療方法であって、請求項１４〜１８のいずれかに記載の組成物を哺乳類に投与することを包含する方法。
【請求項２０】
治療が、造血、血管形成、および／または血管新生、あるいは筋形成および／または神経形成の誘導を包含する請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
治療が、投与領域への幹細胞の動員を包含する請求項１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
治療が、増殖し、または分化するための幹細胞の刺激を包含する請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
治療が、膵島細胞を再構成し、または損傷ニューロンを再生するために有用である請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
心臓または末梢性虚血を治療するために有用である請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体−１（ＦＬＴ−１）としても既知である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦＲ）受容体を発現する哺乳類幹細胞を単離し、動員する方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自己再生および分化の両方を受ける能力を有する独特の細胞集団である。哺乳類胚において、血管芽細胞（hemangioblast）は、血管芽細胞（angioblast）の前駆体および全能性または多能性造血幹細胞である、と考えられる。血管芽細胞（angioblast）およびその他の胚性全能性および／または多能性幹細胞は、出生後内皮細胞、筋肉細胞および神経細胞の前駆体であると考えられる。
【０００３】
哺乳類造血系は、さらに原始的な系列から成熟する赤血球（erythrocytes)（red blood cells）および白血球を含む(例えば米国特許第5,747,651号および第5,912,133号参照)（Dexter and Spooncer, Ann. Rev. Cell Biol., 3: 423-441(1987)を参照）。
【０００４】
赤血球は、赤芽球バースト形成単位と呼ばれる原始細胞に起因し、その直接の子孫は赤芽球コロニー形成単位と呼ばれる。白血球は、リンパおよび骨髄系の成熟細胞を含有する。リンパ球としては、Ｂリンパ球およびＴリンパ球が挙げられ、ともに初期始原細胞に起因する（Dexter and Spooncer）。骨髄系は、顆粒球、血小板、単球、マクロファージおよび巨核球を含めた多数の細胞を包含する。顆粒球は、さらに好中球、好酸球、好塩基球および肥満細胞に分けられる。成熟造血細胞の各々は、特定機能のために特殊化される。
【０００５】
胚における初期血管系の発達は、互いとの接着および原始内皮前駆体細胞、例えば血管芽細胞（angioblast）のモデリングから起こる、と一般に考えられる。この過程は一般に、血管形成として知られている。
【０００６】
新生血管の出生後の発達は、先在血管の成熟内皮細胞の増殖、移動およびリモデリングから起こる、と一般に考えられる。この過程は一般に、血管新生として既知である。
【０００７】
１つまたはそれ以上の全能性幹細胞は、一連の分化段階を経て、漸増的系列制限先祖細胞を生じる。例えばある細胞型の全能性幹細胞、例えば造血幹細胞、内皮幹細胞、筋幹細胞または神経幹細胞は、in vivoでその細胞型のすべての細胞を再構成し得る。さらなる成熟幹細胞は限定増殖能力を有し、そして一般的に、1つまたは2つのみの系列をin vitroまたはin vivoで生じ得る。
【０００８】
幹細胞ベースの両方は、広範な種々の用途を有する。例えば造血、血管形成および／または血管新生、筋形成および神経形成の幹細胞誘導は、種々の症状を治療するために用いられ得る。したがって幹細胞を用いて、限定数の細胞型の破壊および／または機能不全に起因する疾患、例えば真正糖尿病（この場合、膵島細胞が選択的に破壊されている）またはパーキンソン病（脳の特定領域内のドーパミン作動性ニューロンの破壊に起因する）を治療し得る。その他の用途としては、例えば末梢性虚血、鎌状赤血球貧血、サラセミア、筋ジストロフィー、アルツハイマー病、外傷性脊髄損傷、プルキンエ細胞変性、肝不全、心虚血、デュシェンヌ筋ジストロフィーおよび骨形成不全の治療、ならびに化学療法または放射線治療との組合せが挙げられる。ヒト幹細胞ベースの戦略は、臓器移植における使用のための、豊富な、更新可能なそして容易に入手可能な供給源からの細胞または組織の非限定性供給を生じるためにも用いられ得る。さらに安定遺伝子修飾に関するそれらの許容性によって、幹細胞は、宿主免疫応答を免れるかまたは抑制するよう遺伝子工学処理され得る。さらに幹細胞は、基礎研究、例えば発生生物学に関連した研究において種々の用途を有する。
【０００９】
幹細胞ベースの両方は種々の疾患を首尾よく治療する大きな見込みを保持するが、しかし多数の障害物が依然として存在する。このような障害物のひとつは、幹細胞の精製集団の単離を包含する。この点で、幹細胞の精製集団を得るために、種々の表面マーカーを用いるよう努力がなされてきた。例えばＣＤ３４＋造血幹細胞の精製集団は、米国特許第5,035,994号および米国特許第5,130,144号においてCivinにより記載された。ＣＤ３４＋、クラスＩＩ  ＨＬＡ＋およびＴｈｙ−１＋デある造血幹細胞のさらに高度に精製された集団は、米国特許第5,061,620号においてTsukamoto等により記載された。Tsukamotoの特許はさらに、幹細胞が、さらなる成熟系列委託(Ｌｉｎ＋)細胞の特徴を示すある種のマーカーを欠くと説明する。このようなマーカーとしては、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３３が挙げられる。これらのマーカーを欠く細胞は、系列陰性(Ｌｉｎ−)であるといわれる。
【００１０】
さらに、増殖因子が哺乳類幹細胞の開発および操作において重要な役割を演じる、ということが既知である。これらの増殖因子の役割は複雑である。例えば造血は増殖因子の非存在下で確立され得るが、但し、骨髄支質が培地に付加される。
【００１１】
造血増殖因子は、広範な活性を示す。例えばエリスロポエチンは、成熟赤血球系始原細胞のみの増殖を促すと考えられる。ＩＬ−３は、初期幹細胞の、ならびに多数の始原細胞、例えば顆粒球／マクロファージ、好酸球、巨核球、赤血球および肥満細胞系列に制限されるものの増殖および発達を促すと考えられる。その受容体がＷ遺伝子座の産物である別の造血増殖因子は、受容体タンパク質チロシンキナーゼ(ｐＴＫ)のクラスの一成員である(例えばAnderson et al., Cell, 63(1): 235-43(1990); Huang et al., Cell, 63(1): 225-33(1990); Zsebo et al., Cell, 63(1): 213-24(1990); Zsebo et al., Cell, 63(1): 195-201(1990); Flanagan & Leder, Cell, 63(1): 195-94(1990); Copeland et al., Cell, 63(1): 175-85(1990); Williams et al., Cell, 63(1): 164-74(1990)参照)。種々の名称で、例えば幹細胞因子(ＳＣＦ)および肥満細胞増殖因子(ＭＧＦ)と呼ばれるｃ−ｋｉｔに関するリガンドは、初期造血幹細胞、ならびにマウスにおける赤血球系および肥満細胞系列に制限される細胞の発達に不可欠である、と考えられる(同上)。
【００１２】
これらのタンパク質チロシンキナーゼ(ｐＴＫ)は幹細胞増殖因子に対する細胞受容体としても重要な役割を演じる、ということが次第に明らかになりつつある。ｐＴＫファミリーは、触媒ドメインにいくつかの保存アミノ酸領域を有する(例えばHanks et al., Science, 241: 42-52 9(1988); Wilks, PNAS USA, 86: 1603-1607(1989)参照)。タンパク質チロシンキナーゼのその他の特定の例としては、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)受容体が挙げられる。2つのこのような受容体、即ちShibuya et al., Oncogene, 5: 519-524(1990)によりシーケンシングされた、ＶＥＧＦＲ−１とも呼ばれるｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ＦＬＴ−１）、ならびにWO 92/14248（1992年2月20日提出）およびTerman et al., Oncogene, 6: 1677-1683(1991)に記載され、そしてMatthews et al., PNAS USA, 88: 9026-9030(1991)によりシーケンシングされた、ＶＥＧＦＲ−２としても既知であるキナーゼ挿入ドメイン含有受容体／胎児肝臓キナーゼが存在する。
【００１３】
ＶＥＧＦＲ−２はＶＥＧＦＲに関する主要シグナル伝達物質であって、内皮細胞増殖、移動、分化、管形成、血管透過性の増大および血管完全性の維持を生じる、と一般に考えられる。ＶＥＧＦＲ−１は、はなはだ弱いキナーゼ活性を保有し、ＶＥＧＦにより刺激された場合に、有糸分裂応答を生じることが出来ないが、しかしそれは、ＶＥＧＦＲ−２より約１０倍高い親和性を有するＶＥＧＦに結合する。ＶＥＧＦＲ−１は、単球およびマクロファージのＶＥＧＦおよび胎盤増殖因子(ＰｌＧＦ)誘導性移動、ならびに組織因子の産生にも結びつけられた。
【００１４】
ＶＥＧＦ相同体ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦＲ−１の天然特異的リガンドでもある。二量体分泌因子であるＰｌＧＦは、絨毛性細胞栄養芽層、合胞栄養芽層および絨毛外栄養芽細胞により大量に産生され、ＶＥＧＦとの密接なアミノ酸相同性を有する。ヒトにおいては、3つのアイソフォーム、即ちＰｌＧＦ−１、ＰｌＧＦ−２およびＰｌＧＦ−３が存在する。ＰｌＧＦ−欠損マウスを用いた試験は、この増殖因子は血管新生それ自体に関与しないが、しかしむしろ病理学的状況中のＶＥＧＦの血管新生性および透過性作用を特異的に調整する、ということを実証する。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ−１を発現する哺乳類幹細胞の単離方法を提供する。ＶＥＧＦＲ−１を発現する単離哺乳類幹細胞の組成物も提供される。単離細胞は、好ましくは造血幹細胞、内皮幹細胞、筋幹細胞および神経幹細胞を包含するが、これらは好ましくはヒト幹細胞である。好ましい実施態様では、本発明は、幹細胞に関してさらに陽性的におよび／または陰性的に選択する方法、ならびにその組成物を提供する。種々の症状を治療するためのＶＥＧＦＲ−１を発現するこのような単離哺乳類幹細胞の使用方法であって、種々の症状を治療するために造血、血管形成、および／または血管新生、筋形成および神経形成を誘導することを包含し得る方法も提供される。最後に本発明は、ＶＥＧＦＲ−１を結合し、そして活性化するかまたは刺激する分子、特にリガンド（その好ましい例はＰｌＧＦである）を用いた治療方法を提供する。このような分子は、幹細胞の増殖および／または分化および動員、即ちモトゲネシス（motogenesis）を刺激し、次にこれが用いられて種々の症状を治療し得る。
【００１６】
この技法は、多数の幹細胞の末梢循環への動員も可能にする。末梢循環中の幹細胞の濃化集団は、遺伝子療法または骨髄移植のために用いられ得るＶＥＧＦＲ−１を発現する多数の幹細胞の単離を促す。さらにこれらの幹細胞は、虚血性心筋に対して機能を回復し、膵島細胞を採光性し、あるいは損傷ニューロンを再生するために、直接的にまたは静脈内で用いられ得る。
【００１７】
本発明は、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ−１を発現する哺乳類幹細胞の単離方法、ならびにそれに関連した組成物を提供する。これらの本発明の方法は、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子と細胞の集団を結合させ、そしてその分子と結合する細胞を単離することを包含する。好ましくは本発明の方法は、幹細胞に関するさらなる陽性的および／または陰性的選択を包含する。ＶＥＧＦＲ−１を発現するこれらの単離哺乳類幹細胞は、好ましくはさらに陽性および／または陰性的に選択され、次に、種々の症状を治療するために哺乳類に投与され得るが、これは、症状を治療するために造血、血管形成、および／または血管新生、筋形成および神経形成を誘導することを包含し得る。
【００１８】
本発明のＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子は、抗体、リガンド、ペプチド、ＤＮＡ、小分子または任意のその他の適切な分子であり得る。有益であるためには、抗体、リガンド、ペプチド、ＤＮＡまたは小分子は、ＶＥＧＦＲ−１を特異的に結合しなければならない。
【００１９】
本発明の一実施態様では、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子は抗体であり、これは、モノクローナル抗体、抗体の機能性断片、キメラ化抗体、ヒト化抗体または全ヒト抗体であり得る。本発明の情況に適している抗体は、受容体の細胞外部分と特異的に結合する。本明細書中で用いる場合、別記しない限りまたは本文から明らかである場合を除いて、抗体のドメイン、領域および断片は、当業界で周知であるような標準的定義と一致する(例えばAbbas et al., Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA(1991)参照)。
【００２０】
本発明の抗体は、好ましくはモノクローナルである。本発明の特に好ましい抗体は、クローン６．１２と呼ばれ、これは、可溶性および細胞表面発現ＶＥＧＦＲ−１と結合するマウスモノクローナル抗体(ＭＡｂ)である。クローン６．１２を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−3344として寄託されている。本発明のその他の抗体は、寄託されている、そして公的に利用可能であるハイブリドーマにより産生される。このようなハイブリドーマとしては、国際出願WO 98/22616に、ならびにオーストラリア国受理出願AU 1998 50666 B2および国際出願WO 99/59636に、およびカナダ国出願CA 2328893に開示されたハイブリドーマＫＭ1730（ＦＥＲＭ  Ｂ−5697として寄託）、ＫＭ1731（ＦＥＲＭ  ＢＰ−5718として寄託）、ＫＭ1732（ＦＥＲＭ  ＢＰ−5698として寄託）、ＫＭ1748（ＦＥＲＭ  ＢＰ−5699として寄託）、ＫＭ1750（ＦＥＲＭ  ＢＰ−5700として寄託）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＫＤＲおよびＶＥＧＦＲ−１に向けられる2つの異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である二特異的抗体(ＢｓＡｂｓ)が既知である(例えば米国特許第09/865,198号（Zhu）；第60/301,299号（Zhu）参照)。
【００２１】
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子は、抗体の断片でもあり得る。本発明に有用な抗体の断片は、全抗体の場合と同一の結合特性を有するか、あるいはそれと適合性である結合特性を有する。このような断片は、一方または両方のＦａｂ断片またはＦ（ａｂ‘）2断片を含有し得る。このような断片は、一本鎖断片可変部抗体、即ちｓｃＦｖ、ダイボディまたはその他の抗体断片も含有し得る。好ましくは抗体断片は、全抗体のすべての相補性決定領域を含有駿河、しかしこのような領域のすべてより少ないものを含有する断片も機能性であり得る。
【００２２】
抗体断片が短すぎて免疫原性でない場合、それは担体分子と接合され得る。このような適切な担体分子としては、カギアナカサガイヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンが挙げられる。接合は、当業界で既知の方法により実行され得る。
【００２３】
本発明の抗体は、それに関する結合特性が、直接突然変異、親和性成熟の方法、ファージ表示または鎖シャッフリングにより改良されたものも包含する。親和性および特異性は、ＣＤＲを突然変異化し、そして所望の特性を有する抗原結合部位に関してスクリーニングすることにより、修飾または改良され得る（例えばYang et al., J. Mol. Bio., 254: 392-403(1995)参照）。ＣＤＲは、種々の方法で突然変異化される。一方法は、ほかの点では同一である抗原結合部位の集団において、12のアミノ酸すべてが特定位置に見出されるよう、個々の残基または残基の組合せを無作為化することである。あるいは突然変異は、誤りがちなＰＣＲ法により、一連のＣＤＲ残基全体で誘導される（例えばHawkins et al., J. Mol. Bio., 226: 889-896(1992)参照）。重鎖および軽鎖可変部遺伝子を含有するファージ表示ベクターは、大腸菌E. coliの突然変異体株中で増殖される（例えばLow et al., J. Mol. Bio., 250:） 359-368(1996)参照）。突然変異誘発のこれらの方法は、当業者に既知の多数の方法の例証である。
【００２４】
特異的抗体結合ドメインは、ファージ表示ライブラリーから得られるが、この場合、ヒト重鎖および軽鎖可変ドメインは糸状ファージの表面に表示される（例えばMcCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Aujame et al., Human Antibodies, 8: 155-168 (1997)参照）。可変ドメインの組合せは、典型的にはＦａｂｓまたはｓｃＦｓの形態で糸状ファージ上に表示される。ライブラリーは、所望の抗原結合特性を有する可変ドメインの組合せを保有するファージに関してスクリーニングされる。好ましい可変ドメイン組合せは、選択抗原に関して高親和性を表示し、そして他の関連抗原に対する交差反応性をほとんど示さない。抗体断片の非常に大きいレパートリーをスクリーニングすることにより（例えばGriffiths et al., EMBO J., 13, 3245-3260 (1994)参照）、良好な多様度の高親和性ＭＡｂが単離され、多くが、所望の抗原に対する亜ナノモル親和性を有すると予測される。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体、抗体の機能性断片、キメラ化抗体またはヒト化抗体は、当業界で周知の多数の技法のいずれかを用いて調製され得る。これらの方法としては、KohlerとMilstein（Nature, 256: 494-497(1975)）により記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77-96(1985)）、ならびにトリオーマ技法が挙げられるが、これらに限定されない。抗体産生方法の概観に関しては、Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988を参照されたい。
【００２６】
抗体の断片は、全抗体を切断することにより、または断片をコードするＤＮＡを発現することにより産生され得る。抗体の断片は、Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983)に、ならびにParham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983)に記載された方法によっても調製され得る。
【００２７】
抗体分子または断片は、既知の技法により、例えば免疫吸着またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフィー法あるいはそれらの組合せなどにより、精製され得る。
【００２８】
適切な発現系のベクター中への当該分子をコードするＤＮＡのクローニングも、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子を産生し得る。例えば哺乳類細胞中にヒト軽鎖またはヒト重鎖のいずれかを発現するよう設計されたＨＣＭＶベクターは、本発明の抗体を発現するために利用され得る（例えば米国特許第5,840,299号；Hum. Antibod. Hybridomas, 2: 124-134 (1991)参照）。このようなベクターは、哺乳類細胞および大腸菌E. coli中で機能性である構築物、例えばヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、複製起点および選択可能マーカーの高レベルの転写のためのプロモーターおよびエンハンサーを含有し得る。
【００２９】
ベクターの形質転換および本発明のＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子の発現のための好ましい宿主細胞は、哺乳類細胞、例えばＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにリンパ系起源の細胞株、例えばリンパ腫、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞である。その他の真核生物宿主、例えば酵母は、代替的に用いられ得る。
【００３０】
さらに代替的には、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子をコードするＤＮＡは、ウイルス、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスから得られるベクター中にクローン化され得る。遺伝子発現は、誘導性または非誘導性調節配列により制御される。ベクタークローニングのさらに詳細な説明は後述される。
【００３１】
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子がペプチドまたはＤＮＡである実施態様では、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子は、代替的に、当業界で既知であるような標準固相(または溶液相)ペプチド合成法を用いて調製され得る。さらにＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成器具を用いて合成され、そして標準組換え生産系を用いて組換え的に産生され得る。固相ペプチド合成を用いる生産は、非遺伝子コードペプチドが含まれるべきである場合に、必要とされる。ペプチドまたはＤＮＡがＶＥＧＦＲ−１を特異的に結合する場合には、任意の適切なペプチドまたはＤＮＡが本発明の情況に用いられ得る。
【００３２】
あるいはＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子は、小分子であり得る。小分子としては、例えば脂質、および多糖のポリマー、ならびにそれらの誘導体、例えばリポ多糖が挙げられる。さらにまたＶＥＧＦＲ−１に結合する任意の適切な小分子は、本発明の情況に用いられ得る。
【００３３】
本発明の一局面では、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子は、付加的アミノ酸残基、例えばペプチドタグに融合されて、単離または精製を促し得る。
【００３４】
ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子を用いて幹細胞が単離される前または後に、幹細胞は、ＶＥＧＦＲ−１幹細胞に関して前記された方法を用いたさらに何階かの単離により、さらに濃化され、即ち精製され得る。例えば幹細胞は、幹細胞に特徴的な１つまたはそれ以上のマーカー（陽性選択マーカー）に関する陽性選択により単離され得る。このようなマーカーとしては、例えばＣＤ３４およびＡＣ１３３が挙げられる。幹細胞は、成熟細胞に特徴的な１つまたはそれ以上のマーカー、例えばＣＤ３８（陰性選択マーカー）に関する陰性選択によっても、さらに単離され得る。
【００３５】
したがって、さらなる実施態様において、本発明の方法は、１つまたはそれ以上の陽性選択マーカーに哺乳類細胞を結合し、そしてマーカーに結合されていない細胞からマーカーに結合された細胞を単離することをさらに包含する。
【００３６】
陽性選択マーカーの一例では、幹細胞は、Yin等によりBlood 90, 5002-5112 (1997)に、そしてMiraglia等によりBlood 90, 5013-5021 (1997)に記載されたＡＣ１３３抗体を用いても単離され得る。ＡＣ１３３抗原は、幹細胞上に発現されるが、しかし成熟細胞では発現されない。ＡＣ１３３抗体は、Yin等（上記）にしたがって調製され得るし、あるいはMiltenyi Biotecから購入され得る。
【００３７】
これらの方法を用いて、幹細胞を特異的に結合するマーカーを含有しない細胞を除去し、即ち、陰性選択により成熟細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を除去し得る、と理解されるべきである。成熟細胞に特徴的なマーカーとしては、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４１ａ、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６９およびグリコフォリンＡが挙げられる。前記のように、これらのマーカーのいくつかまたは全部を欠く細胞は、Ｌｉｎ−と呼ばれる。
【００３８】
したがって本発明の好ましい方法は、任意に付加的に、１つまたはそれ以上の陰性選択マーカーに哺乳類幹細胞を結合し、そしてマーカーに結合された細胞からマーカーに結合されていない細胞を単離することを包含する。この場合、陰性選択マーカーに結合されていない細胞は、幹細胞を含有し、当該するものである。陰性選択は、陽性選択の前または後に用いられ得る。幹細胞は、陽性選択により、または陽性および陰性選択の両方を合わせたもの(任意の順序で実施され得る)により、精製／濃化され得る。
【００３９】
付加的マーカー(単数または複数)の存在または非存在に基づいた単離／精製の方法は、1つのマーカーの使用に限定されない。即ち、１つまたはそれ以上の付加的陽性および／または陰性選択マーカーを用いた方法が、幹細胞集団に関して濃化するために必要な場合と同様に何回も、反復され得る。
【００４０】
陽性および陰性選択マーカーは、抗体、リガンド、ペプチド、ＤＮＡ、小分子または任意のその他の適切な分子(前記のように)であり得る。好ましくは陽性選択マーカーは、ＡＣ１３３、ＣＤ３４および抗アンギオポエチン−１（Ｔｉｅ−２）と特異的に結合し、さらに好ましくは陰性選択マーカーは、ＬｉｎおよびＣＤ３８を特異的に結合する。このようなマーカーの産生方法は当業界で既知であり、多くが市販されている（例えば米国特許第5,130,144号；米国特許第5,061,620号；米国特許第5,035,994号参照）。したがって本発明の好ましい細胞は、ＶＥＧＦＲ−１、ＣＤ３４、ＡＣ１３３を特異的に結合し、そしてＬｉｎおよびＣＤ３８を特異的に結合しない(ＶＥＧＦＲ−１＋ＣＤ３４＋ＡＣ１３３＋Ｌｉｎ−ＣＤ３８−)。
【００４１】
本発明の情況では、任意の適切な細胞が単離され得るが、但し、細胞はＶＥＧＦＲ−１を発現する。好ましくは細胞は、ヒト幹細胞である。幹細胞は、１つまたはそれ以上の組織型を生じ得る細胞を説明するために本明細書中で用いられる用語である。全能性幹細胞は、完全機能性生物体を、ならびに身体のすべての細胞型を生じ得る細胞である。多分化能性幹細胞は、事実上任意の組織型を生じ得るが、しかし機能する生物体を生じない。多能性幹細胞は、より分化した細胞であり(即ちそれらの考え得る系列は低形成性であり、より確定されている)、したがって、限定数の細胞を生じ得るに過ぎない。幹細胞は、二能性細胞、一能性細胞または始原細胞でもあり得る。
【００４２】
本発明の哺乳類幹細胞は、細胞が全能性、多分化能性、多能性、二能性、一能性等であるか否かにかかわらず、細胞のこれらの異なる型の全てを包含する。
【００４３】
本発明の細胞の集団に関しては、多数の考え得る供給源が存在する。胚性幹細胞は、胚盤胞(極初期の胚)の内部細胞塊に由来する。胚性生殖細胞は、発生の多少後期の胎児組織から(生殖腺隆起と呼ばれる領域から)収集される。成体幹細胞は、成熟細胞から得られる。成体幹細胞の例としては、部分的肝切除後に増殖する肝臓細胞(肝細胞)、致死的照射または化学療法後に血液を再構成し得る造血細胞、損傷骨格筋を修復する衛星細胞、創傷治癒に参与するケラチノサイト前駆体、ならびに脳修復に関与する神経細胞が挙げられる。損傷を修復するほかに、幹細胞は、進行中の組織ホメオスタシスにおいて、例えば一生を通しての血液および皮膚の維持において、重要な役割を演じる。
【００４４】
好ましくは、単離哺乳類幹細胞が由来する細胞の供給源集団は、細胞の任意の天然または非天然混合物であり得る。したがって細胞の集団は、胚哺乳類から、または出生後哺乳類から、例えば胎児肝臓、臍帯血、哺乳類の卵黄嚢、成熟脊髄、骨髄または成体末梢血試料からであり得る。細胞は、中枢神経系、例えば髄膜からでもあり得る。
【００４５】
好ましくは本発明の単離幹細胞は造血幹細胞(ＨＳＣ)であるが、しかし本発明の単離幹細胞は、内皮幹細胞、筋幹細胞および神経幹細胞でもあり得る。筋細胞は、例えば骨格筋細胞、心筋細胞および平滑筋細胞(この例としては、例えば血管の筋細胞および消化管の筋細胞が挙げられる)であり得る。
【００４６】
細胞の集団の適切な供給源は、当業界で既知の方法により、哺乳類ドナーから採取され得る。例えば細胞は、造血性微小環境から採取され得る。さらに、好ましくは動員(即ち漸増された)された循環末梢血が、患者から取り出され得る。あるいは骨髄は、自系移植片を施されている哺乳類、例えばヒト患者から採取され得る。
【００４７】
得られた細胞の集団は次に、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子あるいは陽性および／または陰性選択マーカーと摂食されるかまたはそれらに曝露される。ＶＥＧＦＲ−１またはマーカーを発現する細胞は、分子と結合して、当該細胞の分離および単離を可能にする。細胞が分子またはマーカーをインターナライズしない場合、それは、当業界で既知の方法により細胞から分離され得る。例えば抗体は、低ｐＨを有する溶液への短時間曝露により、あるいはプロテアーゼ、例えば基もトリプシンを用いて、細胞から分離され得る。ＶＥＧＦＲ−１を発現する単離細胞が幹細胞に関して陽性および／または陰性的に濃化される好ましい実施態様では、ＶＥＧＦＲ−１を発現する細胞の単離は、細胞の陽性および／または陰性選択の前、同時に、または後に成し遂げられ得ると当業者は認識する、と理解されるべきである。
【００４８】
当該哺乳類幹細胞の集団を単離するために用いられる分子またはマーカーは、同定および分離を促進する標識と接合するのが有益である。このような標識の例としては、磁気ビーズ；アビジンまたはストレプトアビジンに対するその親和性により同定または分離され得るビオチン；蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により同定および／または分離され得る蛍光色素等が挙げられる。
【００４９】
細胞を過度に害さない限り、任意の技法が単離のために用いられ得る。多数のこのような方法が当業界で既知である。好ましい実施態様では、標識化結合分子またはマーカーは所望の細胞に結合され、そして標識の存在を検出する機械的セルソーターが標識化細胞を分離する。好ましい機械的セルソーターは、市販されているＦＡＣＳ機である（一般的にOrfao & Ruiz-Arguelles, Clin. Biochem., 29(1): 5-9(1996)参照）。
【００５０】
代替的実施態様では、細胞は、磁気ビーズによる磁気分離、固体支持体、例えばニトロセルロース、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜、磁気ビーズおよびプラスチックペトリ皿への付着を用いて単離され得る。これらの方法のためのインキュベーションの的確な条件および継続時間は、当業界で周知のように、用いられる系に特異的ないくつかの因子によっている。
【００５１】
前記の方法の特に好ましい変法では、血液はドナーの循環末梢血から直接採取される。血液は、固相結合分子またはマーカー、例えばＶＥＧＦＲ−１に対する抗体を含有するカラムを通して連続的に濾し出されて、所望の細胞、例えば造血幹細胞、内皮幹細胞、筋幹細胞および神経幹細胞を捕捉する。血球除去血液は、当業界で既知の方法により、例えば血液泳動hemaphoresisにより、直ちにドナーの循環系に戻される。十分な数の幹細胞がカラムに結合するまで、血液はこの方法で処理される。所望の細胞は次に、当業界で既知の方法によりカラムから単離される。この方法は、極大容積の血液からまばらな末梢血幹細胞が採取されるようにして、経費がかかり且つ痛みを伴う骨髄の採取、ならびに麻酔薬、鎮痛薬、輸血および感染に関連した危険性を無くす。
【００５２】
代替的に、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する分子あるいは陽性または陰性選択マーカーは、磁場により取り囲まれたカラム上の望ましくない細胞の捕獲のために、磁気コロイドに結合され得る。この系は一般に、StemCell Technologies Inc., Vancouver, British Columbia, Canadaを介して入手可能である。収集のためにカラムを通って流れる残りの細胞は、分子が向けられる細胞表面タンパク質を発現しない細胞で濃化される。
【００５３】
本発明の別の局面では、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合するリガンド、好ましくはＰｌＧＦが提供される。任意のリガンド、例えばペプチド、抗体、ＤＮＡ、小分子または任意の適切な分子が、本発明の状況で用いられ得るが、但し、リガンドはＶＥＧＦＲ−１を活性化する。適切なタンパク質、抗体、ＤＮＡおよび小分子の選択、ならびに産生の方法は、前に記載されている。
【００５４】
リガンドの突然変異体も、本発明に用いられ得る。当業界で既知の技法にしたがって当業者は容易に作製し得る、と理解されるべきである。
【００５５】
本発明は、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合し、そして活性化する分子、例えばリガンド、好ましくはＰｌＧＦを用いて、幹細胞の増殖および／または分化の刺激、ならびにin vivoおよびin vitroでの幹細胞の動員（motogenesis）を引き起こす治療方法も提供する。これらの方法を利用して、例えば末梢血への、そして造血器官、例えば骨髄、肝臓または脾臓への幹細胞の動員を誘導し、ならびに損傷ニューロンを再生し得る。
【００５６】
活性化は、本発明の情況に置いては、ＶＥＧＦＲ−１シグナル伝達が増大されることを意味する。ＶＥＧＦＲ−１は二量体化ならびにチロシンリン酸化による細胞内シグナルの伝達により機能するので、受容体リン酸化の測定方法(当業界で周知であり、例としては、例えばモノクローナル抗体または放射性標識によるホスホチロシンの測定が挙げられる)を用いて活性化を確定し得る。
【００５７】
本発明は、ＶＥＧＦＲ−１を発現する細胞またはＶＥＧＦＲ−１を特異的に結合する分子を含む組成物も包含する。好ましくは本発明の組成物は、ＶＥＧＦＲ−１を発現する幹細胞を、さらに好ましくは陽性および／または陰性選択により濃化された幹細胞を含む。別の好ましい実施態様では、本発明の組成物は、ＶＥＧＦＲ−１リガンドＰｌＧＦを含む。一局面において、ＶＥＧＦＲ−１に特異的なリガンドは、リガンドをコードする遺伝子を含有するベクターとして存在する。
【００５８】
細胞に外生遺伝子を移入するのに適した任意のベクターが、本発明の方法の範囲内に含まれる。好ましくはベクターは、ウイルスベクターである。本発明の方法にしたがって用いられるウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはその他の適切なベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。
【００５９】
このようなアデノウイルスベクターは、in vivoでウイルスが複製する必要がある遺伝因子、例えばアデノウイルスベクターが一般的に複製無能とみなされるＥ１領域が除去された、修飾ヒトアデノウイルスベクター、例えばＡｄ２またはＡｄ５であり得る。ＶＥＧＦＲ−１を特異的に結合するリガンドをコードする遺伝子を含有する発現カセットは次に、アデノウイルスゲノム中に挿入され得る。
【００６０】
当業者は、ベクターの核酸配列中に発現カセットを組入れ得る。ウイルスベクター中に発現カセットを組入れる方法は、当業界で周知であり（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989)参照）、その例としては、直接クローニング、リコンビナーゼ、例えばｆｌｐリコンビナーゼまたはｃｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼ系を用いた部位特異的組換え（Kilby et al. Trends in Genetics, 9: 413-21 (1993)で再検討されている）、相同組換え、ならびに組換えベクターを構築するためのその他の適切な方法が挙げられる。
【００６１】
ウイルスベクターのほかに、標的細胞の感染時に発現を可能にする任意の非ウイルスベクター、例えばプラスミドが、本発明の方法に用いられ得る。
【００６２】
本発明の組成物は、予防または治療の目的のために哺乳類に用いられる場合、製薬上許容可能な担体を付加的に含む組成物の形態で投与される、と理解される。
【００６３】
適切な製薬上許容可能な担体としては、例えば水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそれらの組合せのうちの１つまたはそれ以上が挙げられる。製薬上許容可能な担体はさらに、少量の補助物質、例えば湿潤剤、または乳化剤、防腐剤または緩衝剤を含み得るが、これらは結合タンパク質の保存寿命または有効性を強化する。注射用の組成物は、当業界で周知のように、哺乳類に投与後に活性成分の迅速、持続性または遅延放出を提供するよう処方され得る。
【００６４】
本発明の組成物は、種々の形態であり得る。これらの例としては、例えば固体、半固体および液体投薬形態、例えば錠剤、ピル、粉末、液体の溶液、分散液または懸濁液、リポソーム、座薬、注射用および注入用溶液が挙げられる。好ましい形態は、投与の意図された方式および治療用途によっている。
【００６５】
このような組成物は、製薬業界で周知の方法で調製される。組成物の製造に際して、活性成分は通常は、担体と混合される科、または担体により希釈されるか、および／または例えばカプセル、サッシェ、紙またはその他の容器の形態であり得る担体内に封入される。担体が希釈剤として役立つ場合、それは固体、半固体または液体物質であり得るが、これは活性成分のためのビヒクル、賦形剤または媒質として作用する。したがって組成物は、錠剤、ロゼンジ、サッシェ、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、エーロゾル(固体としてまたは液体媒質中)、例えば10重量％までの活性化合物を含有する軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、注射溶液、懸濁液、滅菌包装粉末の形態で、ならびに局所パッチとしての形態であり得る。
【００６６】
本発明の組成物は、種々の症状の予防的および／または治療的処置のために哺乳類に投与され得る。症状の処置は、造血、血管形成、および／または血管新生、あるいは筋形成および／または神経形成の誘導を包含し得る。さらに処置は、投与の領域への幹細胞の動員、ならびに増殖および／または分化のための幹細胞の刺激を包含する。
【００６７】
本発明の組成物の投与から利益を受ける哺乳類の同定は、十分に当業者の能力および知識の範囲内である。臨床当業者は、個体が任意の適切な症状に罹患しているか否かを、例えば臨床試験、身体検査および医学／家族歴の使用により、容易に確定し得る。
【００６８】
本発明の方法を用いて治療され得る多数の症状が存在する。例えば哺乳類は、遺伝性疾患、例えば鎌状赤血球貧血またはサラセミア、あるいは好ましくは組織または器官(単数または複数)の自系移植片のレセプト、もしくは組織または器官(単数または複数)の同系または異系移植片のレセプトを要する障害を有し得る。哺乳類は、化学療法または放射線療法を受けたことがあるかまたは目下受けている可能性があり、その症状は全て、哺乳類の血液を枯渇させるかまたは損なう。さらに、造血を必要とする哺乳類は、出血を蒙ったことがある科、または治癒を要する創傷を治療したことがない。創傷は、急性創傷、例えば熱傷ならびに堅いおよび／または鋭利な物体との接触により引き起こされるもの、例えば外科手術、例えば心臓血管性手術、心臓血管性血管形成術、頚動脈血管形成術および冠動脈血管形成術からの回復であり得る。創傷は、慢性創傷でもあり得るが、この例としては、潰瘍、例えば血管潰瘍および糖尿病性潰瘍が挙げられる。
【００６９】
血管形成の誘導は、心臓または末梢(即ち四肢)血管形成の増大に特に有効である。したがって本方法は、心臓および末梢性虚血を治療するのに特に有効である。
【００７０】
幹細胞は、新しい細胞および組織を要する部位にも動員され得る。例えば造血幹細胞は、サイトカイン、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ(ｃ−ｋｉｔリガンド)およびｂＦＧＦ、ケモカイン、例えばＳＤＦ−１，またはインターロイキン、例えばインターロイキン１および８により、循環末梢血中に動員(即ち漸増)され得る。哺乳類が損傷を受けるかまたは受けさせられる場合、  幹細胞は哺乳類の循環末梢血にも動員され得る。
【００７１】
末梢循環への多数の幹細胞の動員はまた、ＶＥＧＦＲ−１を発現する多数の幹細胞の単離を促すが、これは、本明細書中に記載された方法を用いて成し遂げられ得る。これらの単離幹細胞は次に、本明細書中で考察されている治療的処置のために、ならびに骨髄移植および再構成のために用いられ得る。さらにこれらの幹細胞は、虚血性心筋に対して機能を回復し、膵島細胞を再構成し、あるいは損傷ニューロンを再生するために、直接的または静脈内に用いられ得る。
【００７２】
本発明の組成物は任意の哺乳類に投与され得る、と理解されるべきである。特に本組成物は、ヒトに投与され得る。さらに、組成物がＶＥＧＦＲ−１を発現する細胞を含む実施態様では、細胞は、細胞が投与される哺乳類に対して自系、同系または異系であり得る。好ましくはしかしながら細胞は、細胞が投与される哺乳類に対して自系である。
【００７３】
本発明の別の局面では、本発明の組成物は化学的にまたは生合成的に１つまたはそれ以上の治療薬に結合され得る。本発明の組成物はさらにまた、当業界で既知の多数のものの治療の任意のその他の方法と組合せて投与され、それらの例は、当業界で慣用的に既知である。
【００７４】
本発明はさらに、標的またはレポーター部分が連結され、それにより哺乳類における治療の領域に対して本発明の組成物を特異的に標的化する本発明の組成物を意図する。
【００７５】
治療的用途において、組成物は、症状を治癒するかまたは部分的に阻止するのに十分な量で、すでに症状を蒙っている患者に投与される。これを成し遂げるのに適切な量は、「治療的有効用量」と定義される。この使用のために有効な量は、疾患の重症度および哺乳類自身の免疫系の全身状態によっている。投与スケジュールは、疾患状態および哺乳類の状態に伴っても変化し、典型的には1回ボーラス投薬または連続注入から、多数回投与／日(例えば4〜6時間毎)の範囲である科、または熟練者によりまたは哺乳類の状態により示されるような範囲である。
【００７６】
予防的用途においては、本発明の組成物を含有する組成物は、症状の作用を少なくとも部分的に防止するのに十分な量で、目下症状に罹患していない哺乳類に投与される。このような量も、「治療的有効用量」であると定義される。この使用に際して、さらにまた的確な量は、哺乳類の健康状態、および全身レベルの免疫、ならびに前に記載されている投与スケジュールによっている。
【００７７】
本発明の目的のために、組成物は、種々の経路により、例えば経口、静脈内、腹腔内、皮下、脳脊髄内、皮下、くも膜下腔内、皮内、吸入または局所的投与によっても投与され得る。
【００７８】
成長および分化因子、微小環境、例えば近隣細胞との接触、細胞外基質、ならびに局所環境はすべて、細胞の表現型および機能を確定するに際して一役を演じる（例えばHay, Collagen and other matrix glycoproteins in embryogenesis. In Cell Biology of Extracellular Matrix, E.D. Hay, ed. (New York: Plenum Press), 419-462 (1991); Studer et al., J. Neurosci., 20: 7377-83 (2000)参照）。特に成長および分化因子は、増殖し、機能的成熟形態への細胞型の分化を促すよう細胞を刺激する分子である。
【００７９】
本発明のいくつかの実施態様において、成長および分化因子は、本発明の組成物と組合せて投与され得る、と当業者は認識する。例えば成長および分化因子は、特定の方法で増殖し、分化するよう投与細胞を指図するために、ＶＥＧＦＲ−１を発現する細胞と組合せて投与され得る。代替的実施態様では、成長および分化因子は、ＶＥＧＦＲ−１を特異的に結合するリガンド、例えばＰｌＧＦと組合せて投与され、したがって投与の部位に細胞を動員する。成長および分化因子は、投与の前、同時に、または後に投与され得る、と当業者は認識する。さらに、成長および／または分化因子の投与は、反復され得る。さらなる実施態様では、成長および／または分化因子は、ＶＥＧＦＲ−１を発現する細胞に提供され得るが、一方、細胞は本発明の単離方法の前、同時に、または後に培養中に維持される。
【００８０】
成長および／または増殖因子は、例えばＳＣＦ(ｃ−ｋｉｔリガンド)、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ−３リガンドまたはトロンボポエチン単独またはＰｌＧＦまたはＶＥＧＦＲとの組合せであり得ると予見されるが、これらは幹細胞の増殖および展開を促す。
【００８１】
本発明の別の局面では、本発明の単離細胞は哺乳類中に当該ＤＮＡを含み得る。
【００８２】
当該ＤＮＡは、当業界で既知の、そして例えば米国特許第5,674,722号（Mulligan等）に記載された方法により、単離細胞中に導入され得る。あるいはＤＮＡは、ウイルス、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルス由来のベクター中にクローンかされ得る。遺伝子発現は、誘導性または非誘導性調節配列により制御され得る。
【００８３】
一般に当該ＤＮＡは、所定の条件において、根本的タンパク質欠乏を補正または補償するか、あるいは代替的に、特定遺伝子を下向き調節し得るか、またはそのコード産物の陰性作用を中和し得る遺伝子である。さらに治療用遺伝子は、例えば癌の治療において、細胞殺害を媒介する遺伝子であり得る。あるいは当該ＤＮＡは、当該タンパク質をコードし得る。
【００８４】
本発明の情況における当該タンパク質のいくつかの例としては、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＩＩＩ因子、フォンビルブラント因子、インスリン、組織プラスミノーゲン活性剤、いずれかのインターロイキン、あるいは任意のその他の成長または分化因子が挙げられるが、これらの特定例は、前に記載されている。好ましくは当該タンパク質はＰｌＧＦであって、これはＤＮＡによりコードされる。
【００８５】
本明細書中に開示された本発明の原則における変更が当業者によりなされ得る、と理解され、予測されるべきであり、このような修正は本発明の範囲内に含まれるものであると意図される。
【００８６】
以下の実施例は本発明をさらに例証するが、しかしいかなる点においても本発明の範囲を限定するものではない。慣用的方法、例えばベクターおよびプラスミドの構築に用いられる方法、このようなベクターおよびプラスミド中へのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、宿主細胞中へのプラスミドの導入、ならびに遺伝子および遺伝子産物のその発現および確定の詳細な説明は、多数の出版物、例えばSambrook et al.(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressから得られる。Rafii et al., Nature Med., Vol. 8, No. 8(August 2002)も参照されたい。本明細書中に記述された参考文献は、それらの記載内容が参照により本明細書中に含まれる。
【００８７】
実施例
抗ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂクローン６．１２
クローン６．１２は、可溶性および細胞表面発現ＶＥＧＦＲ−１と結合するマウスモノクローナル抗体(ＭＡｂ)である。それを、標準技法を用いて、ＭＡｂ６．１２のＶLおよびＶHドメインを含むＳｃＦｖ６．１２から産生した。クローン６．１２を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−3344として寄託されている。
抗ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂＭＦ−１
【００８８】
ラット抗ＶＥＧＦＲ−１モノクローナル抗体を標準ハイブリドーマ技法により開発した。完全フロイントアジュバントと混合した100 μgのＶＥＧＦＲ−１Ｆｃ（定常部）組換えタンパク質（R & D Systems, Minneapolis, MN）を用いて、8週齢ラットを腹腔内（i.p.）に初回抗原刺激した。次に、不完全フロイントアジュバントと混合した同一タンパク質を用いた融合の前に、ラットを3回、追加免疫した。
【００８９】
骨髄腫細胞Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３を免疫感作ラットからの脾臓細胞および骨髄細胞と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を生成した。ＥＬＩＳＡベースの結合および遮断検定において、ＶＥＧＦＲ−１アルカリ性ホスファターゼ(ＡＰ)組換えタンパク質を用いて、抗ＶＥＧＦＲ−１特異的クローンを選択した。陽性クローンを限定希釈によりサブクローニングした。
【００９０】
無血清培地中での連続給餌発酵により、ハイブリドーマから抗ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂを得た。ガンマ結合タンパク質Ｇ−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、無血清連続培地からＭＡｂを精製した。ピロゲントプラスPyrogent plus（登録商標）カブトガニアメーバ細胞溶解物キット（Bio Whittaker, Walkersville, MD）を用いて、in vivo試験に用いたＭＡｂを検定した。動物試験に用いた抗体調製物はすべて、≦1.25 EU/mlの内毒素を含有した。組換えＶＥＧＦＲ−１ＡＰタンパク質免疫感作ウサギから抗ＶＥＧＦＲ−１ポリクローナル抗体を生成し、ガンマ結合タンパク質Ｇカラム（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）により精製した。
【００９１】
ＥＬＩＳＡベースの結合および遮断検定ならびに親和性に関するＢＩＡｃｏｒｅ分析において、抗ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂの免疫化学的特性を特性表示した。50 ng／ウエルのＶＥＧＦＲ−１ＡＰまたはＶＥＧＦＲ−２ＡＰタンパク質を用いて、4℃で一夜、96ウエル微小滴定プレート（Falcon Flexible plate, Becton Dickinson, Bedford, MA）をコーティングすることにより、結合検定を実施した。5％ウシ血清、0.05％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水(遮断緩衝液)200 μlを付加し、室温(ＲＴ)で2時間インキュベートすることにより、ウエルを遮断した。次にウエルを洗浄（5x）し、遮断緩衝液中に希釈した50 μlで種々の濃度のＭＡｂを用いて、ＲＴで1時間インキュベートした。ウエルを再び洗浄（5x）し、50 μlのヤギ抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（BioSource International, Camarillo, CA）を用いて、ＲＴで1時間インキュベートした。ウエルを最後の1時間洗浄（5x）し、次に50 μlの３，３’，５，５‘−テトラ−メチルベンジジン(ＴＭＢ)基質（Kirkegaard and Perry Lab Inc., Gaithersburg, MD）を用いて、ＲＴで15分間インキュベートした。50 μlの1 Mリン酸（Ｈ3ＰＯ4）により反応を停止し、微小滴定プレート読取器で450 nmでウエルを読取った。
【００９２】
ＶＥＧＦＲ−１／ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦ遮断検定のために、100 ｎｇのＶＥＧＦまたはＰｌＧＦ（R & D Systems, Minneapolis, MN）を用いて、4℃で一夜、ウエルをコーティングした。前記と同様にウエルを遮断し、次に種々の濃度のＭＡｂを用いて1時間予備インキュベートしておいたＶＥＧＦＲ−１ＡＰ100 ｎｇを用いて、ＲＴで１時間、インキュベートした。ウエルを洗浄し、ｐ−ニトロフェニルホスフェート(ＰＮＰＰ、Sigma St Louis, MO)を用いてインキュベートした。ＲＴで30分間発色させて、次に微小滴定プレート読取器450 nmで読取った。
【００９３】
BIAcoreバイオセンサー（Pharmacia Biosensor）を用いて、抗ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂのＶＥＧＦＲ−１との結合動態を確定した。ＶＥＧＦＲ−１Ｆｃ融合タンパク質をセンサーチップ上に固定し、3.125 nM〜50 nMの範囲の濃度でＭＡｂを注入した。書く濃度でセンサーグラムを得て、プログラムBIA Evaluation 2.0を用いて評価して、Ｋｄ阿智に関する速度定数kon/koffの比率を確定した。
アデノウイルスベクター
【００９４】
ＡｄＰｌＧＦは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要即時／初期プロモーター／エンハンサーにより駆動されるヒトＰｌＧＦｃＤＮＡを含有するＥ１ａ領域中に発現カセットを有するアデノウイルス５型（Ａｄ５）由来Ｅ１ａ−、Ｅ３−欠損（Ｅ１ａ−Ｅ３−Ｅ４＋）アデノウイルスベクターである。
【００９５】
対照ベクターＡｄＮｕｌｌは、発現カセット中に導入遺伝子を有さない同一のアデノウイルスベクターである。
【００９６】
実施例１
本実施例は、幹細胞におけるＶＥＧＦＲ−１の発現を調べる。特に、標準技法を用いて、ヒトまたはマウスＶＥＧＦＲ−１を選択的に結合する中和および非中和ＭＡｂを生成した。ヒト胎児肝臓（ＦＬ）（妊娠15〜16週）および臍帯血（ＣＢ）を胎児から得た。標準免疫磁気技法（ＭＡＣＳ；Miltenyi Biotech）を用いて、ＦＬおよびＣＢからＣＤ３４+細胞を単離した。フローサイトメトリー分析は、45〜55％の回収率を有する純度85〜95％のＣＤ３４+分画を示した。ＣＤ３４+細胞（1 x 105ＦＬまたはＣＢ）を、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）接合ＭＡｂ；ヒトＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ３８−ＰＥ（Beckton Dickinson）、ＣＤ１５−ＰＥ（Immunotech）、ＡＣ１３３−ＰＥ（Miltenyi Biotech）、ＣＤ１４−ＰＥ（PharMingen）、ＶＥＧＦＲ−１−ＦＩＴＣ（クローン６．１２；ImClone Systems）を用いて、4℃で30分間インキュベートした。Coulter Eliteフローサイトメーターを用いて、二色フローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
【００９７】
ＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインに対するＦＩＴＣ標識化ＭＡｂを用いて、ヒトＦＬおよびＣＢ由来ＣＤ３４+およびＡＣ１３３+細胞の6.0±0.5％（Ｎ＝4）および4.3±0.3％（Ｎ＝6）においてＶＥＧＦＲ−１が発現される、ということをわれわれは見出した。約85％のＶＥＧＦＲ−１陽性細胞がＣＤ１５およびＣＤ１４陰性であったが、これは、これらの細胞が成熟ＣＤ１５またはＣＤ１４骨髄性細胞でない、ということを示す。
【００９８】
実施例２
本実施例は、ＶＥＧＦＲ−１+細胞の幹細胞能力を調べる。特に、ＶＥＧＦＲ−１+細胞の幹細胞能力を、非肥満性糖尿病患者(ＮＯＤ)−重症複合型免疫欠損(ＳＣＩＤ)マウス再集団化細胞を含むin vivo再集団化検定で評価した。
【００９９】
この目的のために、新たに単離されたヒトＣＢ  ＣＤ３４+、精製ＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ−１+およびＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ−１-細胞を亜致死的（3.5 Gy）照射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中に移植した。要するに、ヒトＣＤ３４+単核球(ＭＣ)をＣＢから単離し、ビオチニル化抗ＶＥＧＦＲ−１Ａｂ（ImClone Systems）を用いてインキュベートした。メーカーの使用説明書にしたがって、免疫磁気分離（Miltenyi Biotech）を用いて、ＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ−１+ＭＣを分離した。蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合抗ＶＥＧＦＲ−１抗体（クローン６．１２；ImClone Systems）を用いてフローサイトメトリーにより、ＶＥＧＦＲ−１+ＭＣ調製物の純度を査定し、85〜95％であることが判明した。マイクロアイソレーター中に保持したバイオクリーン条件下で、免疫無防備状態ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Jackson laboratory）を取り扱った。移植片レシピエント（8週齢）を、約0.90 Gy／分の線量で137Ｃｓγ線源から照射される3.5 Gyの照射量で処置した。尾静脈注射によるIscove変法のダルベッコ培地(ＩＭＤＭ)(Sigma)0.3 ml容積中の4 x 104〜2 x 105ヒトＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ−１+細胞の移植は、照射の６時間以内に引き続き実施した。移植後6〜8週目にマウスを屠殺し、骨髄単核球(ＢＭＭＣ)を大腿から採取した。
【０１００】
移植の6週間後に、ヒト由来ＣＤ４５+造血細胞の数を、フローサイトメトリーによりＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスＢＭで定量した。ヒトＭＣのパーセンテージを確定するために、各試料(105ＭＣ)を抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣおよび抗マウスＣＤ４５−ＰＥ（PharMingen）で染色した。次に、Coulter Eliteフローサイトメーターを用いて、二色フローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
【０１０１】
ヒトＮＯＤ／ＳＣＩＤ再集団化細胞の移植を支持するためには、104ＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ−１+細胞という少数の移植で十分であった。これらのデータは、ＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ−１+細胞が幹細胞能力を有する細胞の集団を含有する、ということを示唆する。
【０１０２】
実施例３
本実施例は、ネズミ幹細胞中のＶＥＧＦＲ−１の発現を調べる。ＶＥＧＦＲ−１がネズミ幹細胞中でも発現されるか否かを査定するために、マウスのコホートを５−フルオロウラシル(５ＦＵ)で処理して、非循環造血幹細胞(ＨＳＣ)を濃化させた。要するに、マウスを亜致死用量の５ＦＵ（300 mg/kg）で処置して、迅速循環始原細胞および前駆体のアポトーシスを生じさせたが、しかし幹細胞能力を大部分は有する非循環静止細胞は生き長らえる。この後、Ｇ0幹細胞の迅速再活性化およびリンパ造血細胞の再構成を実施した。次に、Coulter Eliteフローサイトメーターを用いて、二色フローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
【０１０３】
フローサイトメトリー分析は、5.0±0.3％（Ｎ＝6）の５ＦＵ−前処理ＢＡＬＢ／ｃＢＭＭＣがＶＥＧＦＲ−１+を発現したことを示した。ＶＥＧＦＲ−１+集団内では、35.7±0.7％がＳｃａ−１+であり、一方、31.4±0.3％がｃ−ｋｉｔ陽性であった。
【０１０４】
実施例４
本実施例は、幹細胞の低減に、特に骨髄の破壊に関連した症状の治療を調べる。ＶＥＧＦＲ−１+ＢＡＬＢ／ｃマウスＢＭＭＣのＢＭ−再集団化能力を確定するために、５ＦＵ前処理ＢＡＬＢ／ｃＢＭＭＣ(前記)から得られた種々の細胞用量のＶＥＧＦＲ−１+細胞の精製集団を、致死的照射（9 Gy）同系マウスに移植した。
【０１０５】
骨髄細胞採取の2日前に、15匹のＢＡＬＢ／ｃドナーマウスに５ＦＵ（150 mg/kg）を静注した。全実験において、頚部切断によりドナーマウスを殺害し、無菌状態で大腿骨および脛骨を取り出した。20％ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)を含有する冷ＩＭＤＭ（GIBCO-BRL Life Technologies）3 mlで大腿骨および脛骨を洗い流して、ＢＭＭＣを得た。メーカーの使用説明書にしたがって、免疫磁気分離(Miltenyi Biotech)を用いて、ネズミＶＥＧＦＲ−１+ＢＭＭＣを分離した。蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合抗ＶＥＧＦＲ−１抗体（クローンＭＦ−１；ImClone Systems）を用いてフローサイトメトリーにより、ＶＥＧＦＲ−１+ＢＭＭＣ調製物の純度を査定し、88〜95％であることが判明した。分離ＶＥＧＦＲ−１+およびＶＥＧＦＲ−１―細胞（104）をＦＩＴＣまたはＰＥ接合ＭＡｂ；Ｓａｃ−１（Ｌｙ６Ａ／Ｅ）−ＰＥ、ネズミｃ−ｋｉｔ−ＰＥ、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ、ＣＤ４５−ＰＥ（PharMingen）を用いて、4℃で30分間インキュベートした。Coulter EliteＦＣＭを用いて、二色フローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
【０１０６】
レシピエントＢＡＬＢ／ｃ（各群8匹）を、致死的照射（9 Gy）し、照射後0日目に、連続細胞用量（105、103、102および10）のＶＥＧＦＲ−１+およびＶＥＧＦＲ−１―ＢＭＭＣを静注した。１５０日目を超える日数毎日、生存をモニタリングした。
【０１０７】
結果を図１に示すが、これは、時間(日)の一関数としてのマウスの生存率(％)のグラフである。種々の用量のＶＥＧＦＲ−１―細胞を移植されたマウスはすべて14日以内に死亡したが、一方、102、103および105ＶＥＧＦＲ−１+ＢＭＭＣを移植されたマウスのそれぞれ38％、63％および100％が、150日以上にわたって生存した(図１)。致死的照射同系マウスへの５ＦＵ−前処理ＢＡＬＢ／ｃＢＭＭＣから得られた精製ＢＭＣ  ＶＥＧＦＲ−２+(Ｆｌｋ−１)細胞は105という多数の移植でさえ、致死的照射マウスを救命できなかった。顕著であるのは、103および105ＶＥＧＦＲ−２-(陰性)ＢＭＭＣを移植されたマウスの42％および75％が、150日以上も生存したことである。
【０１０８】
実施例５
本実施例は、幹細胞に、特に骨髄の破壊に関連した症状の治療を調べる。ＶＥＧＦＲ−１+細胞の長期ＢＭ−再集団化能力を査定するために、５ＦＵ前処理Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２．ＢＭＭＣから得られたＢＭＭＣ  ＶＥＧＦＲ−１+Ｓｃａ−１+細胞を、致死的照射Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１マウス（Ｎ＝6）中に移植した。
【０１０９】
同系ＢＭ細胞移植系のＶＥＧＦＲ−１+および／またはＳｃａ−１+５ＦＵ処理ＢＭ細胞を用いて、長期再構築能力を査定した。2日後に５ＦＵ処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｌｙ５．２マウスからＢＭＭＣを採取後、MoFloフローサイトメーター／セルソーターを用いて、ＶＥＧＦＲ−１+/-およびＳｃａ−１+/-ＢＭＭＣを分離した。ＶＥＧＦＲ−１+またはＶＥＧＦＲ−１―ＢＭＭＣ（103）を致死的照射（9 Gy）Ｃ５７ＢＬ／６Ｌｙ５．１マウス(各線量群8匹)中に移入した。移植の4ヵ月後に、末梢血単核球(ＰＢＭＣ)を後眼窩叢から採取し、ＦＩＴＣおよびＰＥ接合ＭＡｂ；Ｌｙ５．２−ＦＩＴＣ、ネズミＣＤ１１ｂ−ＰＥ、Ｂ２２０−ＰＥ、Ｇｒ−１−ＰＥ、Ｔｈｙ−１−ＰＥ(PharMingen)で染色した。Coulter Eliteフローサイトメーターを用いて、二色フローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
【０１１０】
105という低量のＶＥＧＦＲ−１+Ｓｃａ−１+およびＶＥＧＦＲ−１+Ｓｃａ−１―ＢＢＭＣの移植は、致死的照射マウスを救命した。結果を図１に示すが、これは、時間(日)の一関数としてのマウスの生存率(％)のグラフである。さらに、移植後4ヶ月で、発現された末梢血中の骨髄およびリンパ系列細胞の約85％がドナー(Ｌｙ５．２)起源のものであった。
【０１１１】
実施例６
本発明は、幹細胞の産生におけるＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の役割を調べる。造血の再構築におけるＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２発現の機能的役割を検査するために、ＢＭが亜致死用量の５ＦＵ（300 mg/kg）により抑制されたモデルを利用した。このモデルでは、５ＦＵによるマウスの処置は、迅速循環始原細胞および前駆体のアポトーシスを生じるが、一方、幹細胞能力を大部分は有する非循環静止細胞は生き長らえる。この後、Ｇ0幹細胞の迅速再活性化を実施して、リンパ造血細胞の再構築を4週間以内に生じた。
【０１１２】
５ＦＵ誘導性骨髄抑制および回復中の造血の再構築を媒介するに際してのＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達の意義を査定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスのコホートを５ＦＵ処理後に、ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２に対して中和ＭＡｂで処理した。ＭＡｂは、標準技法を用いて調製した。最初に2〜3日間隔で、その後1週間ベースで、後眼窩叢を毛管ピペット（Unopette, Fisher Scientific）で採取した。全白血球を次に、Neubauer血球計（Fisher Scientific）を用いて計数し、クリスタルバイオレットで染色した。
【０１１３】
ＩｇＧで処理したマウス(対照マウス)およびＶＥＧＦＲ−２ＭＡｂ処理マウスにおいて、白血球数は、５ＦＵ投与後２週間以内にベースラインレベルに回復した。しかしながら抗ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂ処置群のマウスの白血球数は回復できず、56％が3週間以内に死亡した。結果を図３に示すが、これは、時間(日)の一関数としてのマウスの生存率(％)のグラフである。さらに、処置および非処置マウスの組織学的分析は、ＢＭ細胞性が、ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂ処置群において、５ＦＵ処理後10および20日に有意に低減されることを実証した。
【０１１４】
実施例７
本実施例は、化学療法誘導性ＢＭ幹細胞抑制を改善するに際してのＰｌＧＦ増大の役割を調べる。ＢＭ抑制作因、例えば５ＦＵおよびカルボプラチン／放射線で処置したマウスのコホートを、ＰｌＧＦを発現するアデノウイルスベクター(ＡｄＰｌＧＦ、前記)を用いておよび用いずに、平行して処置した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５ＦＵ（300 mg/kg）またはカルボプラチン（1.2 mg）の1回静注プラス全身照射(ＴＢＩ；5 Gy)を施した。
【０１１５】
ＡｄＰｌＧＦを投与したマウスは、好中球減少症の程度および持続時間の、対照マウスより有意の低減を示したことは顕著であった。ＰｌＧＦの血漿中増大は、標準用量の組換え顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)と同様好中球減少症を救った。結果を図４および５に示すが、これは、５ＦＵ(図４)またはカルボプラチン＋ＴＢＩ(図５)による処置後の時間の一関数としてのマウスにおけるＷＢＣ数のグラフである。
【０１１６】
したがって本実施例は、ＶＥＧＦＲ−１を結合するリガンドであるＰｌＧＦが、化学療法誘導性骨髄幹細胞抑制後に好中球減少症の程度および継続期間を改善する、ということを実証する。
【０１１７】
実施例８
本発明は、幹細胞、特にＨＳＣの運動原性motogenic能力に及ぼすＶＥＧＦＲ−１の作用を調べる。ＶＥＧＦＲ−１+ＣＤ３４+細胞の移動を誘導するＰｌＧＦおよびＶＥＧＦの能力を、移行Boyden Chamber中で調べた。
【０１１８】
前記のトランスウエル移動技法の修正バージョンを用いた。要するに、ＬＣアリコート（100 μl）を8 μm孔トランスウエル挿入物に付加し、25 μgの増殖因子欠失マトリゲルMatrigel（Beckton and Dickinson）で被覆し、24ウエルプレートのウエル中に入れた。下部区画は、無血清ＲＰＭＩを含有した（100 ng/mlのＰｌＧＦまたは50 ng/mlのＶＥＧＦまたは100 ng/mlの支質由来因子−１(ＳＤＦ−１)（R & D System）を含む場合もある）。移動を遮断するために、各条件を別個のアリコートで調製し、抗ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂ(クローン６．１２；ImClone Inc., 1 μg／条件)とともにインキュベートした。移動は、37℃および5％ＣＯ2で14〜18時間、実行した。移動細胞を下部区画から収集し、8000 rpmで回転沈降させて、血球計を用いて計数した。生細胞だけが、トリパンブルー排除により確定した場合、定量化において考慮された。実験を３回反復して実行し、結果を、ＰｌＧＦに応答して移動した細胞の数として示す。
【０１１９】
移動抑制試験のために、新たに単離したヒトＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を無血清ＲＰＭＩ中に再懸濁し、106細胞／mlのストックを調製した。ＣＤ３４＋細胞を、指示通りにＰｌＧＦを含有する6ウエルトランスウエルプレートの上部小室中で40 μg/mlのＭＡｂを用いてＶＥＧＦＲ−１に対して予備インキュベートした。ＣＢ由来ＣＤ３４+細胞を次に、トランスウエルプレートの上部移行小室に入れた。
【０１２０】
ＰｌＧＦおよびＶＥＧＦは、上部小室への付加ＣＤ３４+細胞の17.0±1.0％および12.7±0.9％の移動を誘導した。ＶＥＧＦＲ−１に対する中和ＭＡｂは、細胞の8.0±1.2％および8.5±1.0％の移動を阻害した。結果を図６に示すが、これは、ＰｌＧＦ、ＰｌＧＦ＋抗ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂ（６．１２）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ＋抗−ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂまたはＳＤＦ−１の投与後の移動細胞の数（x 103細胞）のグラフである。
【０１２１】
これらのデータは、ＶＥＧＦＲ−１／ＰｌＧＦシグナル伝達経路、即ちＶＥＧＦＲ−１とそのリガンドとの相互作用が、ＣＤ３４+幹細胞の移動のための強力な媒介物である、ということを示唆する。
【０１２２】
実施例９
本実施例は、幹細胞の移動を媒介するＶＥＧＦＲ−１リガンドＰｌＧＦの能力を調べる。
【０１２３】
一実験において、生理学的モデルにおけるＨＳＣの移動を媒介するＰｌＧＦの能力を評価するために、ＡｄＰｌＧＦをマウスに注射することにより、ＰｌＧＦ血漿レベルを増大した。最初に2〜3日間隔で、その後1週間ベースで、後眼窩血液を毛管ピペット（Unopette, Fisher Scientific）で採取した。全白血球および顆粒球(多形核白血球)を、Neubauer血球計（Fisher Scientific）を用いて計数した。各マウスからの血液スメアの検査により差分白血球数を得て、ライト−ギムザ染色（計数された細胞200 細胞／スメア）で染色した。血漿試料を採取し、−80℃で保存して、後に、ヒトＰｌＧＦに関してイムノアッセイにより査定した。ＰｌＧＦの血漿濃度を、感受性ＥＬＩＳＡ(R & D Systems)を用いて測定した。ＰＢＭＣ（104〜105）を、ＦＩＴＣまたはＰＥ接合ＭＡｂ；ネズミＣＤ１１ｂ−ＰＥ、Ｓｃａ−１−ＰＥ(PharMingen)、ＶＥＧＦＲ−１−ＦＩＴＣ(クローンＭＦ−１；ImClone Systems)を用いて、4℃で30分間インキュベートした。次に、Coulter Eliteフローサイトメーターを用いて、二色フローサイトメトリーにより、細胞を分析した。
【０１２４】
ＡｄＰｌＧＦの静脈内投与は、注射後24時間でピークＰｌＧＦ血漿レベル（9.5±0.7 ng/ml）を生じ、21日目に処理前レベルに戻った。ＡｄＰｌＧＦ処置マウスは、3日目に、単球系列を含めてＷＢＣの前記ベースラインを上回る2倍増を示し、注射後4週までにＡｄＮｕｌｌ処置対照マウスのレベルに戻った。
【０１２５】
別の実験では、眼窩叢からＰＢＭＣを採取し、Lympholyte-M（Cederlane）を用いた不連続勾配での遠心分離後に単離した。ＭＣ(105細胞)を、35 mm懸濁液培養皿中の、30％ＦＣＳ、1％Ｌ−グルタミン、2.5％ヘミン、0.05 mM５−ＭＥ、ＩＬ−３（50 ng/ml）、ｃ−ｋｉｔリガンド（20 ng/ml）およびエリスロポエチン（2 U/ml）を含有する0.8％メチルセルロース1 ml中で3回反復してプレート化した。7日目に、倍率40倍の倒立顕微鏡を用いて、採点を実施した。ＡｄＰｌＧＦ処置マウスから得られるＰＢＭＣからの細胞を、コロニー検定において植えつけて、4つのＣＦＵ型：ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＭおよびＣＦＵ−Ｍｉｘを採点した。
【０１２６】
ＶＥＧＦＲ−１リガンドＰｌＧＦは、注射マウスの末梢血への造血始原細胞の動員を誘導した。
【０１２７】
付加的実験において、脾臓コロニー(ＣＦＵ−Ｓ)を形成し得る幹細胞能力を有するＰｌＧＦ動因性ＶＥＧＦＲ−１Ｓｃａ−１細胞の数も、致死的（9 Gy）照射同系マウスにＰｌＧＦ動員ＰＢＭＣを注射することにより、測定した。各データ点に関して、137Ｃｓγ線源から9 Gyを3匹のレシピエントマウスに照射して、内因性脾臓コロニーの産生を防止した。照射完了後数時間以内に、照射ＢＡＬＢ／ｃマウス(各群3匹)に、1 x 105ＰＢＭＣを尾静脈を通して静注した。12日後に頚部切断によりマウスを屠殺し、それらの脾臓を取り出して、ブワン溶液中に固定した。次に、肉眼的脾臓コロニー数を採点した。
【０１２８】
ＡｄＰｌＧＦの投与は、処置3日目までに末梢血へのＣＦＵ−Ｓの動員の20倍増を誘導した。結果を図７Ａ〜Ｄに示すが、これは、１日目（図７Ａ）、3日目（図７Ｂ）、10日目（図７Ｃ）および14日目（図７Ｄ）に種々の対照と比較した場合のＰｌＧＦ投与後のコロニー数のグラフである。
【０１２９】
最後に、致死的照射同系マウスへのＡｄＰｌＧＦ動員ＰＢＭＣの移植により、ＢＭ−再集団化能力を有する動員多分化能性造血細胞の数も確定した。アデノウイルスベクター投与後、赤血球を取り出すためにリンパ球−Ｍを用いて5日目にＢＡＬＢ／ｃマウス(各群9匹)からの末梢血を収集した。レシピエントＢＡＬＢ／ｃマウス(各群6匹)に致死的照射（9 Gy）し、照射後0日目に連続細胞用量（5 x 104、1 x 105、5 x 105および1 x 106）ＰＢＭＣを静注した。
【０１３０】
ＡｄＰｌＧＦの注入は、致死的照射マウスを移植し、救命し得るＨＳＣの動員を生じたが、しかしＡｄＮｕｌｌは生じなかった。結果を図８に示すが、これは、アデノウイルスベクター投与後の日数の一関数としてのＣＦＵ−Ｓコロニー数のグラフである。
【０１３１】
これらのデータは、幹細胞、即ちＨＳＣに及ぼすＶＥＧＦＲ−１の活性化が、ＨＳＣの生存または増殖というよりむしろ、運動源性motogenic能力を調節する、ということを示唆する。
【０１３２】
実施例１０
本実施例は、ＶＥＧＦＲ−１がＢＭ造血に影響を及ぼすメカニズムを調べる。
【０１３３】
一実施態様において、５ＦＵ処置後のＨＳＣの循環能力を遮断するＶＥＧＦＲ−１に対する中和ＭＡｂの能力を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスにはすべて、尾静脈から５ＦＵ（300 mg/kg）を静注した。0日目から2日間隔で、各群8匹の５ＦＵ処置マウスに、800 μgの抗ＶＥＧＦＲ−１（クローンＭＦ−１、ImClone Systems）またはヒトＩｇＧを腹腔内注射した。2〜3日間隔で30日間、白血球数をモニタリングし、各群少なくとも2匹のマウスを、各時点で頚部切断により屠殺した。各群のマウスからＢＭＭＣを採取し、冷エタノール（4℃）中で1時間固定した。次に細胞を室温（）で5分間、ＲＮアーゼ（Sigma）で処理し、ヨウ化プロピジウム（Molecular Probes）で染色した。フローサイトメトリー分析により、ＤＮＡ含量を確定した。各分析は、少なくとも2回実行した。
【０１３４】
抗ＶＥＧＦＲ−１ＭＡｂを投与された５ＦＵ処置マウスは、ＢＭ中の循環Ｓｃａ−１の証拠を示さなかった(図５)。これらのデータは、ＶＥＧＦＲ−１活性化が造血を促し得るという一メカニズムがＨＳＣの循環の誘導によるものである、という仮説を記述する。
【０１３５】
別の実験では、基質金属タンパク質(ＭＭＰ)−９の活性かを評価した。ＰｌＧＦまたはＶＥＧＦまたはＳＤＦ１を含有する(または含有しない)無血清培地中での一夜インキュベーション後、ヒトＣＤ３４+細胞培養からの上清を収集し、前に記載された（Huang et al., Biochem Biophys Res Commun, 264: 133-8 (1999)）ようなゼラチン分解性酵素電気泳動により、それらのＭＭＰ−９活性を測定した。要するに、細胞培養上清をゼラチン−アガロースビーズで処理して、ゼラチナーゼを濃縮し、1％ゼラチンを含有するＳＤＳ−Ｐａｇｅ−アクリルアミドゲルにより処理した。その後、2.5％トリトン−Ｘ−100中で室温（ＲＴ）で1時間、ゲルをインキュベートし、蒸留水（ＤＷ）中ですすいで、低塩コラゲナーゼ緩衝液（50 mMトリス−ｐＨ7.6、0.2 MＮａＣｌ、5 mMＣａＣｌ2および0.2％v/vＢｒｉｊ−35）中に、37℃で18時間入れた。10 mLの0.2％クーマシーブルー溶液および190 mLのデステインdestain(ＤＷ、メタノールおよび氷酢酸、6:3:1）で、ＲＴで30分〜1時間ゲルを染色後、ゼラチン分解活性の帯域を可視化した。各実験に関して、1 X 106細胞からの上清を収集し、各実験を3回反復実行した。Adobe Photoshop 4.0ソフトウエア適用およびUmax Astraスキャナーを用いてゲルを走査し、NIH Image 1.58を用いてゼラチン分解性帯域の強度を査定した。全ＷＢＣも確定した。
【０１３６】
ＰｌＧＦの増大は、ヒトＣＤ３４+細胞におけるＭＭＰ−９の誘導を生じる。結果を図９に示すが、これは、ＳＤＦ−１、ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦの投与後のゼラチン分解性帯域の濃度計測定強度のグラフである。逆に言えば、ＰｌＧＦの増大は、ＭＭＰ−欠損マウスにおいてはＨＳＣを動員できない。ＭＭＰ−９は、ＨＳＣの循環に必要であり、そして活性化は、細胞周期へのＨＳＣの進入を促す可溶性キット−リガンドの放出を引き起こす。
【０１３７】
全体として本実施例は、特にそのリガンドＰｌＧＦによるＶＥＧＦＲ−１活性化は、幹細胞、例えばＭＭＰ−９活性化に関与するＨＳＣの循環を促す重要な経路の一つである、ということを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】種々の濃度（105、103、102および10）のＶＥＧＦＲ−１陽性細胞またはＶＥＧＦＲ−１陰性細胞（105）の投与後の致死的照射マウスの時間（日）の一関数としての生存率（％）のグラフである。
【０１３９】
【図２】ＶＥＧＦＲ−１陽性および／またはＳｃａ−１陽性細胞の投与後の致死的照射マウスの時間（日）の一関数としての生存率（％）のグラフである。
【０１４０】
【図３】ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２に対する中和モノクローナル抗体の投与後の亜致死用量の５フルオロウラシル（５ＦＵ）で処置したマウスの時間（日）の一関数としての生存率（％）のグラフである。
【０１４１】
【図４】ＰｌＧＦを発現するアデノウイルスベクターの投与後の亜致死用量の５ＦＵで処置したマウスにおける時間（日）の一関数としての白血球（ＷＢＣ）（μl）の数のグラフである。
【０１４２】
【図５】ＰｌＧＦを発現するアデノウイルスベクターの投与後のカルボプラチン＋全身照射(ＴＢＩ)で処置したマウスにおける時間（日）の一関数としてのＷＢＣ（μl）の数のグラフである。
【０１４３】
【図６】ＰｌＧＦ、ＰｌＧＦおよびＶＥＧＦＲ−１に対するモノクローナル抗体、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−１に対するモノクローナル抗体、またはＳＤＦ−１の投与後の移行ボイデンチェンバーBoyden Chambers中での移動細胞数（ｘ103細胞）のグラフである。
【０１４４】
【図７Ａ−Ｄ】１日目（図７Ａ）、3日目（図７Ｂ）、10日目（図７Ｃ）および14日目（図７Ｄ）にＰｌＧＦ投与後の致死的照射同系マウスの末梢血中のコロニー数のグラフである。
【０１４５】
【図８】ＰｌＧＦをコードするアデノウイルスベクターが投与された後の時間（日）の一関数としての致死的照射マウスにおけるＣＦＵ−Ｓコロニー数のグラフである。
【０１４６】
【図９】ＳＤＦ−１、ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦの投与後の培養幹細胞における基質金属タンパク質に特異的なゼラチン分解性帯域の濃度計測定強度のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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