(57)【要約】本発明は、新規化学化合物、それらを発見する方法、およびそれらの治療的用途に関する。特に、本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体、ならびに、プログラム細胞死プロセスの誤調節、自己免疫、炎症、および過増殖などに関連した多くの状態を治療するための治療的物質としてベンゾジアゼピン誘導体を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞死を調節する方法であり、以下の段階を含む方法：
a. i. ミトコンドリアを有する標的細胞
ii. オリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合する物質
を提供する段階；および
b. 該物質がオリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合して該細胞内のスーパーオキシドレベルを増加または細胞ATPレベルを変化させるような条件下で、該細胞を該物質に曝露する段階。
【請求項２】
標的細胞がインビトロ細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
標的細胞がインビボ細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
標的細胞がエクスビボ細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
標的細胞が癌細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
標的細胞が、B細胞、T細胞、および顆粒球からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
物質がベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
物質がBZ-432を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
曝露段階が、標的細胞の細胞死の増加をもたらす、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
細胞における増殖を阻害する方法であり、以下の段階を含む方法：
a. i. ミトコンドリアを有する標的の増殖細胞
ii. ミトコンドリアATP合成酵素複合体に結合する物質
を提供する段階；および
b. 該物質がミトコンドリアATP合成酵素複合体に結合して該細胞内のスーパーオキシドレベルを増加または細胞ATPレベルを変化するような条件下で、該細胞を該物質へ曝露する段階。
【請求項１１】
物質がオリゴマイシン感受性付与タンパク質へ結合する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
標的細胞がインビトロ細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
標的細胞がインビボ細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
標的細胞がエクスビボ細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
標的細胞が癌細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
標的細胞が、B細胞、T細胞、および顆粒球からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
標的細胞が増殖細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
物質がベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１９】
物質がBZ-432を含む、請求項10記載の方法。
【請求項２０】
a. 物質に曝露された対象の細胞内のスーパーオキシドを増加または細胞ATPレベルを変化させるのに十分な用量の、オリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合する物質；および
b. 細胞死の開始により改善される状態を治療するための該物質の使用に関する説明書を備える、薬学的組成物。
【請求項２１】
物質がベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体を含む、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
物質がBZ-432を含む、請求項20記載の組成物。
【請求項２３】
状態が癌である、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
状態が、増殖性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
状態が、移植片対宿主病および移植拒絶反応からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
a. 物質に曝露された対象の細胞内のスーパーオキシドを増加または細胞ATPレベルを変化させるのに十分な用量の、ミトコンドリアATP合成酵素複合体に結合する物質；および
b. 自己免疫疾患、増殖性疾患、または癌を治療するための該物質の使用に関する説明書
を備える、薬学的組成物。
【請求項２７】
物質がベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体を含む、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
物質がBZ-432を含む、請求項26記載の組成物。
【請求項２９】
増殖性疾患、自己免疫疾患、または癌を治療するのに有用な物質を同定する方法であり、以下の段階を含む方法：
a. i. ミトコンドリアATP合成酵素複合体、
ii. ベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体、および
iii. 候補物質
を提供する段階；
b. ミトコンドリアATP合成酵素複合体を、ベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体および候補物質へ曝露する段階；ならびに
c. ベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体および候補物質の、ミトコンドリアATP合成酵素複合体への結合を比較する段階。
【請求項３０】
比較段階が、ミトコンドリアATP合成酵素複合体を含有する細胞における細胞死、成長速度、または細胞数を観察する段階を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
比較段階が、ミトコンドリアATP合成酵素複合体を含有する細胞におけるスーパーオキシドレベルを測定する段階を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
比較段階が、ベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体および候補物質の、ミトコンドリアATP合成酵素複合体に対する結合親和性を測定する段階を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
比較段階が、候補物質のオリゴマイシン感受性付与タンパク質への結合を検出する段階を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
薬学的物質を同定する方法であり、以下の段階を含む方法：
a. スーパーオキシドフリーラジカルを生成するか、細胞死を開始するか、または細胞増殖を変化させるように、ミトコンドリアATP合成酵素複合体に結合する物質を提供する段階；
b. 該物質を化学的に修飾して、候補薬学的物質のライブラリーを作成する段階；および
c. 該物質と比較した、スーパーオキシドフリーラジカルを生成する能力、細胞死を開始する能力、または細胞増殖を変化させる能力の増大に基づいて、候補物質ライブラリーの1つまたは複数の個別のメンバーを選択する段階。
【請求項３５】
組織または動物における毒性に関してライブラリーの1つまたは複数の個別のメンバーを試験する段階を更に含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
ライブラリーの1つまたは複数の個別のメンバーを、市販品としての承認のために政府機関へ提出する段階を更に含む、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
選択的に細胞死を誘導する物質または活性化細胞の成長もしくは増殖を阻害する物質をスクリーニングする方法であり、以下の段階を含む方法：
a. i. 少なくとも1種の未活性化細胞を含む第一の細胞試料
ii. 少なくとも1種の未活性化細胞を含む第二の細胞試料
iii. 少なくとも1種の未活性化細胞を含む第三の細胞試料
iv. 有効量の活性化物質
v. 有効量の候補物質
vi. 有効な比および量の活性化物質および候補物質
を提供する段階；
b. 第一の細胞試料を、該有効量の活性化物質と接触させる段階；
c. 第二の細胞試料を、該有効量の候補物質と接触させる段階；
d. 第三の細胞試料を、該有効な比および量の活性化物質および候補物質と接触させる段階；
e. 第三の細胞試料中の細胞死のレベルまたは細胞数を、第一の細胞試料中および第二の細胞試料中の細胞死のレベルまたは細胞数と比較する段階；ならびに
f. 第三の細胞試料中の細胞死または成長阻害の量を、第一の細胞試料中および第二の細胞試料中の細胞死または成長阻害のレベルと比較する段階。
【請求項３８】
d. 第三の細胞試料中の細胞死または成長阻害のレベルが、第一の細胞試料中および第二の細胞試料中の細胞死を上回る場合に、第三の試料に接触した候補物質を選択する段階を更に含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
第一、第二、および第三の試料が、B細胞、T細胞、顆粒球、または癌細胞を含有する、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
接触がインビトロにおいて起こる、請求項37記載の方法。
【請求項４１】
接触がインビボにおいて起こる、請求項37記載の方法。
【請求項４２】
活性化物質が、T細胞リガンド、BAFFリガンド、TNF、Fasリガンド(FasL)、Toll受容体、APRIL受容体、CD40リガンド、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、ステロイド、B細胞リガンド、γ線照射、UV照射、細胞ストレスを増大させる物質もしくは条件、ならびに細胞表面受容体を特異的に認識および結合する抗体からなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項４３】
抗体が、抗CD4、抗CD8、抗CD20、抗BAFF、抗TNF、抗CD40、抗CD3、抗CD28、抗B220、抗Toll受容体、抗APRIL受容体、抗B細胞受容体、および抗T細胞受容体からなる群より選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ミトコンドリア透過性遷移の前に、活性化された標的細胞を、該活性化された標的細胞におけるスーパーオキシド形成を阻害する有効量の物質と接触することにより、活性化された標的細胞における誘導された細胞死を阻害する方法。
【請求項４５】
活性化された標的細胞がインビトロで存在する、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
活性化された標的細胞がインビボで存在する、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
物質がミトコンドリアATP合成酵素に結合する、請求項44記載の方法。
【請求項４８】
物質がオリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合する、請求項44記載の方法。
【請求項４９】
物質がベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体を含む、請求項44記載の方法。
【請求項５０】
選択的に細胞死を誘導する物質または活性化細胞の成長もしくは増殖を阻害する物質をスクリーニングする方法であり、以下の段階を含む方法：
a. i. 少なくとも1種の未活性化細胞を含む第一の細胞試料
ii. 少なくとも1種の未活性化細胞を含む第二の細胞試料
iii. 候補物質
を提供する段階；
b. 第一の細胞試料を、候補物質と接触させる段階；ならびに
c. 第一および第二の細胞中の、細胞内スーパーオキシド濃度を比較する段階。
【請求項５１】
d. 第一の細胞試料中の細胞内スーパーオキシド濃度が、第二の細胞試料中を上回る場合に、第一の細胞試料に接触した候補物質を選択する段階を更に含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
e. i. 処理された未活性化細胞においてスーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質
ii. 少なくとも1種の未活性化細胞を含む第三の細胞試料
iii. 少なくとも1種の未活性化細胞を含む第四の細胞試料
を提供する段階；
f. 第三の細胞試料を、該スーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質で処理する段階；
g. 第四の細胞試料を、該スーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質および選択された候補物質で処理する段階；ならびに
h. 処理した第四の細胞試料中のスーパーオキシドレベルが、処理した第三の細胞試料と比べて高いかどうかを判定することにより、該スーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質と共に、候補物質がスーパーオキシドレベルを相乗的に増大させるかどうかを同定する段階
を更に含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
スーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質、および、請求項52記載の同定された候補物質を含有する、薬学的カクテル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年1月22日に出願された米国特許出願第09/767,283号の一部継続出願であり、これは2000年11月8日に出願された米国特許出願第09/700,101号の継続出願であり、これは2000年4月27日に出願されたPCT US00/11599号の国内登録(entry)であり、これは1999年4月30日に出願された米国特許仮出願第60/131,761号の、1999年11月15日に出願された米国特許仮出願第60/165,511号の、および2000年3月24日に出願された米国特許仮出願第60/191,855号の優先権を主張するものである。本出願は更に、2001年8月15日に出願された米国特許仮出願第60/312,560号の、2001年8月20日に出願された米国特許仮出願第60/313,689号の、および2002年7月18日に出願された米国特許仮出願速達番号(Express Mail)EV092300423号の優先権を主張するものである。前述の各出願は、その全体が具体的に本明細書に参照として組入れられている。
【０００２】
本発明は、NIH助成金GM46831およびAI47450により一部支援された。米国政府は、本発明に権利を有する。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は、新規化学化合物、それらの発見法、およびそれらの治療的用途に関する。特に本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体、ならびにプログラムされた細胞死、自己免疫、炎症および過増殖などの過程の誤調節に関連した多くの状態を治療するために、ベンゾジアゼピン誘導体を治療的物質として使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
多細胞生物は、細胞数の精密な制御を行っている。細胞増殖と細胞死の間の平衡は、このホメオスタシスを実現している。細胞死は、ネクローシスを介して、またはアポトーシスとして知られている細胞自死型を通して、ほぼ全ての種類の脊椎動物細胞において生じる。アポトーシスは、共通の遺伝的にプログラムされた死の機構に携わる、様々な細胞外および細胞内シグナルにより引き金を引かれる。
【０００５】
多細胞生物は、損傷されたまたは不必要な細胞に、その生物の利益のためにそれらを破壊することを指示するために、アポトーシスを使用する。従って、アポトーシス過程の制御は、例えば、脳内の神経シナプスの形成と同じような、余剰な相互連結(interconnecting)組織のアポトーシスによる制御された除去を必要とする胎児の指およびつま先の発生のように、通常の発生にとって非常に重要である。同様に制御されたアポトーシスは、月経開始時の子宮の内層(子宮内膜)の剥脱(sloughing)にも寄与している。アポトーシスは、組織造形(sculpting)および正常細胞維持において重要な役割を果たしている一方で、これは生物の良好な生存を脅かす細胞および侵略者(例えばウイルス)に対する第一の防御でもある。
【０００６】
多くの疾患が、細胞死の過程の調節不良に関連していることは驚くことではない。異常なアポトーシス調節と、様々な新生物疾患、自己免疫疾患およびウイルス疾患の病因(pathenogenicity)の間の因果関係の実験モデルが確立された。例えば、細胞媒介性免疫応答において、エフェクター細胞(例えば、細胞傷害性Tリンパ球「CTL」)は、感染した細胞がアポトーシスを受けるのを誘導することにより、ウイルス感染した細胞を破壊する。この生物は引き続き、最早エフェクター細胞が必要でなくなった時点で、エフェクター細胞を破壊するためにアポトーシス過程に頼る。自己免疫は、通常アポトーシスを誘導するCTLにより、互いにおよびそれら自身でさえ、妨害される。この過程の欠損は、エリテマトーデスおよび慢性関節リウマチのような様々な自己免疫疾患に関連している。
【０００７】
多細胞生物は、損傷された核酸(例えばDNA)を伴う細胞に、癌性となる前にそれら自身を破壊することを指示するためにも、アポトーシスを使用する。一部の癌を引き起こすウイルスは、正常なアポトーシス過程を中止するように感染した(形質転換された)細胞を再プログラムすることにより、この防御手段(safeguard)を突破する。例えば、いくつかのヒトパピローマウイルス(HPV)は、p53アポトーシスプロモーターを失活するタンパク質(E6)を産生することにより形質転換された細胞のアポトーシス除去を抑制することにより、子宮頚癌を引き起こすことに関連している。同様に単核細胞症およびバーキットリンパ腫の原因物質であるエプスタインバーウイルス(EBV)は、感染した細胞を、異常な細胞の通常のアポトーシス除去を妨害するようなタンパク質を産生するように再プログラムし、その結果癌細胞の増殖およびその生物全体への拡散をもたらす。
【０００８】
更に他のウイルスは、癌発生を直接もたらすことはせずに、細胞のアポトーシス機構を破壊的に操作する。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染した個体における免疫系の破壊は感染CD4+ T細胞(100,000個中約1個)が、非感染姉妹細胞にアポトーシスを受けることを指示することを通じて進行すると考えられる。
【０００９】
非ウイルス手段により生じる一部の癌も、アポトーシスによる破壊を回避するための機構を生じている。例えば、骨髄腫細胞は、Apaf-1をコードしている遺伝子の発現を阻害することにより、アポトーシスを回避する。別の癌細胞、特に肺癌および結腸癌の細胞は、異常な細胞のCTLが媒介したクリアランスの開始を阻害する可溶性デコイ分子を高レベル分泌する。アポトーシス機構の誤調節は、様々な変性状態および血管疾患にも関連している。
【００１０】
アポトーシス過程およびその細胞機構の制御された調節は、多細胞生物の生存にとって死活に関わることは明らかである。典型的には、アポトーシス発生を被ることを指示された細胞において生じる生化学的変化は、一連の進行で生じる。しかし先に示したように、アポトーシス調節の欠損は、生物において重篤な有害作用を引き起こしうる。
【００１１】
異常な細胞(例えば、癌細胞)においてアポトーシス機構の調節を制御および回復する様々な試みがある。例えば、異常な細胞が増殖する前にこれらを破壊するための細胞毒性物質を開発するために、多くの研究が行われている。細胞毒性物質はそれ自身、ヒトおよび動物の両方の健康にとって広範な利用性があり、かつほぼ全ての型の癌および過増殖性自己免疫障害、例えばエリテマトーデスおよび慢性関節リウマチなどを治療する最初の指針を示している。
【００１２】
臨床用途において多くの細胞毒性物質は、DNAを損傷することにより、それらの作用を発揮する(例えば、シスプラチン(シス-ジアミノジクロプラタニム(cis-diaminodichroplatanim)(II))はDNAに架橋結合するのに対し、ブレオマイシンは鎖切断を誘導する)。この核損傷は、p53システムのような細胞因子が認められるならば、損傷された細胞の死滅につながるアポトーシスカスケードを開始させる。
【００１３】
しかし、現存する細胞毒性化学療法剤には、重篤な欠点がある。例えば多くの公知の細胞毒性物質は、健康な細胞と罹患した細胞の間の差別をほとんど示さない。この特異性欠如は、有効性を制限しかつ/または早期死亡をもたらすような重度の副作用を生じることが多い。更に多くの現存する細胞毒性物質の長期間投与は、更なる投与の有効性を低下させるかまたは無効とする抵抗性遺伝子(例えば、bcl-2ファミリーまたは多剤耐性(MDR)タンパク質)の発現をもたらす。一部の細胞毒性物質は、p53および関連タンパク質に突然変異を誘発する。これらの考察に基づいて、理想的な細胞毒性薬物は、罹患した細胞のみを殺傷し、化学療法抵抗性となりにくいものでなければならない。
【００１４】
罹患した細胞を選択的に殺傷するひとつの戦略とは、罹患した細胞において発現される分子を選択的に認識する薬物の開発である。従って効果的細胞毒性化学療法剤は、疾患の指標となる分子を認識し、かつ(例えば、直接的または間接的のどちらかで)罹患した細胞の死滅を誘導するであろう。一部の型の癌細胞上のマーカーは、治療的抗体および小分子で同定されかつ標的化されているが、ほとんどの癌において、診断的および治療的探索のための独自の特性は分かっていない。更に狼瘡のような疾患について、創薬のための特異的分子標的は同定されていない。
【００１５】
アポトーシス過程の誤調節を特徴とする疾患および状態(例えば、ウイルス感染、過増殖性自己免疫疾患、慢性炎症状態、および癌)に罹患した対象におけるこれらの過程を調節するための改善された組成物および方法が必要とされている。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
本発明は、新規化学化合物、それらを発見する方法、およびそれらの治療的用途に関する。特に本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体、ならびにプログラムされた細胞死の過程の誤調節、自己免疫、炎症、および過増殖などの多くの状態を治療するための治療的物質としてベンゾジアゼピン誘導体を使用する方法を提供する。
【００１７】
例えば本発明は、ミトコンドリアを有する標的細胞およびオリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合する物質を提供する段階；ならびに、細胞においてスーパーオキシドレベルを増加するかまたはATPレベルを変化させるように、この物質がオリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合する条件下で、該細胞を該物質へ曝露する段階を含む、細胞死を調節する方法を提供する。いくつかの態様において、標的細胞はインビトロ細胞である。別の態様において、標的細胞はインビボ細胞である。より更なる態様において、標的細胞はエクスビボ細胞である。
【００１８】
本発明は、多くの標的細胞が、本発明の方法および組成物に適していることを企図しており、例えば、標的細胞は、癌細胞、B細胞、T細胞、および顆粒球を含むが、これらに限定されるわけではない。本発明の方法における使用に好ましい物質は、本明細書において明らかにされたベンゾジアゼピンおよびベンゾジオンの誘導体である。しかし本発明は、本明細書において明らかにされたベンゾジアゼピンおよびベンゾジオンの誘導体に限定されることは意図されていない。実際、一部の追加の態様において、ミトコンドリアATP合成酵素複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)部分に結合し、ならびに過増殖性疾患、自己免疫疾患、炎症疾患、移植片対宿主病、移植拒絶反応、癌などを含むが、これらに限定されるわけではない多くの状態の1種または複数の任意の治療に有用である任意の物質が、本発明の方法において有用である。本発明は、ミトコンドリアATP合成酵素のOSCP部分に結合する物質に限定されない。本明細書に説明されたように、本発明の方法において有用である多くの非限定的機構および治療的物質が提供される。
【００１９】
特に好ましい態様において、本発明の方法は、(例えば、治療的に有用な)有効量のBZ-432を患者に提供する。当業者は、使用することができる多くの製剤(例えば、錠剤、散剤、軟膏剤、クリーム剤、経口懸濁剤、注射剤用製剤など)を理解するであろう。当業者は、投薬の考察、ならびに薬学的組成物の患者への投与時に採用されなければならない規制および管理の措置を熟知している。好ましい態様において、企図された患者は、哺乳類を含むが、これらに限定されるわけではない。特に好ましい態様において、本発明の方法および組成物は、ヒトへの投与に関し、かつこれについて最適化される。
【００２０】
本発明は更に、標的細胞における細胞死を増大するための組成物(例えばベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体)および方法(例えば投与)を提供する。
【００２１】
本発明は、ミトコンドリアを有する増殖する標的細胞、およびミトコンドリアATP合成酵素複合体に結合する物質を提供する段階；ならびに、この物質がミトコンドリアATP合成酵素複合体に結合し、その細胞内のスーパーオキシドレベルを増加するかまたはATPレベルを変化させる条件下で、この細胞を物質に曝露する段階を含む、細胞の増殖を阻害するための組成物(例えばベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体)および方法(例えば投与)も提供する。
【００２２】
一部の本発明の態様において、企図された本発明の物質は、処理された細胞/組織におけるスーパーオキシドレベルを増大するように、オリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合する。これらの態様の一部において、標的細胞は、増殖する細胞である。特に好ましい態様において、治療的レベルのBz-423が患者へ投与される。
【００２３】
より更なる態様において、本発明は、物質が曝露された対象の細胞内のスーパーオキシドを増加または細胞ATPレベルを変化させるのに十分な用量の、オリゴマイシン感受性付与タンパク質に結合する物質；および、状態(例えば、癌、増殖性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病、移植片拒絶反応など)を治療するためのこの物質の使用に関する指示書を備える、薬学的組成物を提供する。
【００２４】
本発明は、より更なる態様において、その物質に曝露された患者の細胞においてスーパーオキシドを増加するかまたはATPレベルを変化するのに十分な用量の、ミトコンドリアATP合成酵素複合体に結合する物質(例えば、ベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体)；および、自己免疫疾患、増殖性疾患、または癌を治療するためのこの物質の使用に関する説明書を備える、薬学的組成物を提供する。これらの態様の一部において、好ましい物質はBz-432を含む。
【００２５】
本発明の追加の態様は、以下の段階を含む、増殖性疾患、自己免疫疾患、または癌を治療するために有用な物質を同定する方法を提供する：ミトコンドリアATP合成酵素複合体、ベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体、候補物質を提供する段階；ミトコンドリアATP合成酵素複合体を、ベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体および候補物質に曝露する段階；ならびに、ベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体および候補物質の、ミトコンドリアATP合成酵素複合体への結合を比較する段階。本発明の方法は、観察される方策により限定される。例えば、いくつかの態様において、比較段階は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体を含む細胞において細胞死、成長速度、または細胞数を観察する段階を含む。別の態様において、比較段階は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体を含む細胞においてスーパーオキシドレベルを測定する段階を含む。より更なる態様において、比較段階は、ベンゾジアゼピンまたはベンゾジオン誘導体および候補物質の、ミトコンドリアATP合成酵素複合体への結合親和性を測定する段階を含む。あるいは、その他の態様として、候補物質のオリゴマイシン感受性付与タンパク質への結合を検出する段階を含む比較段階が考えられる。
【００２６】
スーパーオキシドフリーラジカルを生成するか、ATPレベルを変化させるか、細胞死を開始するか、または細胞増殖を変化させるように、ミトコンドリアATP合成酵素複合体に結合する物質を提供する段階；候補薬学的物質のライブラリーを作成するために、この物質を化学的に修飾する段階；ならびに、その物質と比べ、スーパーオキシドフリーラジカルを生成するか、細胞死を開始するか、または細胞増殖を変化させるそれら能力の増大に基づいて、候補物質ライブラリーの1つまたは複数の個別のメンバーを選択する段階を含む、薬学的物質を同定する方法も提供される。加えていくつかの態様において、更に、ライブラリーの1つまたは複数の個別のメンバーを、組織または動物における毒性について試験する段階を含む。
【００２７】
本明細書に明らかにされた治療的方法は、追加的に、市販品として承認されるために、ライブラリーの1つまたは複数の個別のメンバーを、政府機関(例えば米国食品医薬品局)へ提出する段階を含んでもよい。
【００２８】
更に別の本発明の態様は、以下の段階を含む、選択的に細胞死を誘導する物質または活性化（activated）細胞の成長もしくは増殖を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する：少なくとも1種の未活性化細胞を含む有効量の第一の細胞試料、少なくとも1種の未活性化細胞を含む有効量の第二の細胞試料、少なくとも1種の未活性化細胞を含む有効量の第三の細胞試料、有効量の活性化物質、有効量の候補物質、有効な比および量のこの活性化物質および候補物質を提供する段階；第一の細胞試料を、有効量の活性化物質と接触させる段階；第二の細胞試料を、有効量の候補物質と接触させる段階；第三の細胞試料を、有効比および量の活性化物質および該候補物質と接触させる段階；第三の細胞試料中の細胞死のレベルまたは細胞数を、第一の細胞試料中および第二の細胞試料中の細胞死のレベルまたは細胞数と比較する段階；ならびに、第三の細胞試料中の細胞死または成長阻害の量を、第一の細胞試料中および第二の細胞試料中の細胞死または成長阻害の量と比較する段階。これらの態様の一部は任意で、第三の細胞試料中で細胞死または成長阻害のレベルが、第一の細胞試料中および第二の細胞試料中の細胞死を上回る場合に、第三の試料に接触した候補物質を選択する段階を更に含む。これらの態様における使用に適した試料は、B細胞、T細胞、顆粒球、または癌細胞などである。
【００２９】
本発明の方法での使用に適した活性化物質は、T細胞リガンド、BAFFリガンド、TNF、Fasリガンド(FasL)、Tollリガンド、APRIL、CD40リガンド、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、ステロイド、B細胞リガンド、γ線照射、UV照射、細胞ストレスを増大させる物質もしくは条件、ならびに細胞表面受容体を特異的に認識および結合する抗体(例えば、抗CD4、抗CD8、抗CD20、抗BAFF、抗TNF、抗CD40、抗CD3、抗CD28、抗B220、抗Toll受容体、抗APRIL受容体、抗B細胞受容体、抗T細胞受容体など)を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００３０】
本発明の追加の態様は、活性化された標的細胞を、ミトコンドリアの透過性遷移の前に、該活性化された標的細胞におけるスーパーオキシド形成を阻害する物質(例えば、タクロリマスなど)の有効量と接触することにより、活性化された標的細胞(例えば、インビトロまたはインビボ活性化された標的細胞)において誘導された細胞死を阻害する方法も提供する。
【００３１】
本発明のいくつかの他の態様は、以下の段階を含む、選択的に細胞死を誘導する物質または活性化細胞の成長もしくは増殖を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する：少なくとも1種の未活性化細胞を含む第一の細胞試料、少なくとも1種の未活性化細胞を含む第二の細胞試料、候補物質を提供する段階；第一の細胞試料を、候補物質と接触させる段階；ならびに、第一および第二の細胞中の、細胞内スーパーオキシド濃度を比較する段階。これらの方法の一部は、第一の細胞試料中の細胞内スーパーオキシド濃度が、第二の細胞試料中を上回る場合に、第一の試料に接触した候補物質を選択する追加段階を更に含む。より更なる態様において、本発明はこれらの方法において更に、以下の追加段階を提供する：処理された未活性化細胞においてスーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質、少なくとも1種の未活性化細胞を含む第三の細胞試料、少なくとも1種の未活性化細胞を含む第四の細胞試料を提供する段階；第三の細胞試料を、該スーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質で処理する段階；第四の細胞試料を、該スーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質および該選択された候補物質で処理する段階；ならびに、処理した第四の細胞試料中のスーパーオキシドレベルが、処理した第三の細胞試料と比べて高いかどうかを判定することにより、該スーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質と共に、候補物質がスーパーオキシドレベルを相乗的に増大させるかどうかを同定する段階。更に別の態様において、本発明は、スーパーオキシドレベルを増加させることが公知である物質および同定された候補物質を含有する、薬学的カクテルを提供する。
【００３２】
定義
本発明の理解を促進するために、多くの用語および語句を以下に定義する。
【００３３】
本明細書において使用される「ベンゾジアゼピン」という用語は、フェニル環に融合した7員の非芳香族系環状複素環であり、ここで7員環は環状複素環の一部として2個の窒素原子を有するものを意味する。一部の局面において、この2個の窒素原子は、下記一般構造において示されるように、1位および4位にある。
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【００３４】
ベンゾジアゼピンは、1個のケト基(典型的には2位)、または各々2位および5位で2個のケト基で置換することができる。ベンゾジアゼピンが2位および5位に各々1個ずつ2個のケト基を有する場合、これはベンゾジアゼピン-2,5-ジオンと称される。最も一般的には、ベンゾジアゼピンは更に、6員のフェニル環もしくは7員の環状複素環のどちらかまたは両方の環上で様々な置換基により置換される。
【００３５】
本明細書において、使用される「置換された脂肪族」という用語は、少なくとも1個の脂肪族水素原子が、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換された低級脂肪族、または環(アリール、置換されたアリール、脂環式、または置換された脂環式など)で置換されている、10個未満の炭素を有するアルカンを意味する。このような例は、1-クロロエチルなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００３６】
本明細書において使用される「置換されたアリール」という用語は、芳香環、または少なくとも1個は芳香族である3個以下の融合環からなる融合芳香環システムであり、ここで環の炭素上の少なくとも1個の水素原子が、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換された低級脂肪族、または環(アリール、置換されたアリール、脂環式、または置換された脂環式など)で置換されているものを意味する。このような例は、ヒドロキシフェニルなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００３７】
本明細書において使用される「脂環式」という用語は、8個未満の炭素を有するシクロアルカンまたは3個以下の融合した脂環式環からなる融合環システムを意味する。このような例は、デカリンなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００３８】
本明細書において使用される「置換された脂環式」という用語は、少なくとも1個の脂肪族水素原子が、ハロゲン、ニトロ、チオ、アミノ、ヒドロキシ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換された低級脂肪族、または(アリール、置換されたアリール、脂環式、または置換された脂環式)環で置換されている、8個未満の炭素を有するシクロアルカンまたは3個以下の融合環からなる融合環システムを意味する。このような例は、1-クロロデカリルなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００３９】
本明細書において使用される「複素環」という用語は、少なくとも1個の環炭素原子が酸素、窒素または硫黄により置換されている、8個未満の炭素を有するシクロアルカンおよび/またはアリール環システム、または3個以下の融合環からなる融合環システムを意味する。このような例は、モルホリノなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４０】
本明細書において使用される「置換された複素環」という用語は、少なくとも1個の環炭素原子が酸素、窒素または硫黄により置換され、ならびに少なくとも1個の脂肪族水素原子は、ハロゲン、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換された低級脂肪族、または環(アリール、置換されたアリール、脂環式、または置換された脂環式)で置換されている、8個未満の炭素を有するシクロアルカンおよび/またはアリール環システム、または3個以下の融合環からなる融合環システムを意味する。このような例は、2-クロロピラニルを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４１】
本明細書において使用される「リンカー」という用語は、ふたつの異なる構造部分を連結している連続した最大8個の原子からなりかつこれを含む鎖を意味し、ここでそのような原子は、例えば炭素、窒素、酸素または硫黄である。エチレングリコールは、ひとつの限定的でない例である。
【００４２】
本明細書において使用される「アミノ置換された低級アルキル」という用語は、1個の脂肪族水素原子がアミノ基で置換されているような、最大8個の炭素原子からなりかつこれを含むアルキル単位を意味する。このような例は、エチルアミノなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４３】
本明細書において使用される「ハロゲン置換された低級アルキル」という用語は、1個の脂肪族水素原子がハロゲンで置換えられているような、最大8個の炭素原子からなりかつこれを含むアルキル鎖を意味する。このような例は、クロロエチルなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４４】
本明細書において使用される「アセチルアミノ」という用語は、アセチル化された第一級または第二級アミノを意味する。このような例は、アセトアミドなどを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４５】
本明細書において使用される用語である化合物の「誘導体」とは、化学修飾が、化合物の官能基でまたは芳香環上のどちらかに生じるような、化学的に修飾された化合物を意味する。本発明の非限定的な例である1,4-ベンゾジアゼピン誘導体は、この化合物の利用可能な窒素のどちらかに、N-アセチル基、N-メチル基、N-ヒドロキシ基を含んでもよい。追加の誘導体は、フェニル環上にトリフルオロメチル基を有するものを含んでもよい。
【００４６】
本明細書において使用される「対象」という用語は、本発明の方法で処理される生物を意味する。このような生物は、哺乳類(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど)を含むが、これらに限定されるわけではなく、ヒトが最も好ましい。本発明に関連する「対象」という用語は一般に、アポトーシス過程の調節不良により特徴付けられる状態の治療(例えば、ベンゾジアゼピン化合物の、および任意に1種または複数の他の物質の投与)を受けるであろうまたは受けている個体を意味する。
【００４７】
本明細書において使用される「診断された」という用語は、疾患のその徴候および症状(例えば、従来の療法に対する抵抗性)、または遺伝解析、病理分析、組織学的分析などによる認識を意味する。
【００４８】
本明細書において使用される「抗癌剤」という用語または「通常の抗癌剤」とは、癌の治療において使用される任意の化学療法用化合物、放射線療法、または外科的介入を意味する。
【００４９】
本明細書において使用される「インビトロ」という用語は、人工的環境および人工的環境内において起こる過程または反応を意味する。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物からなることができるが、これらに限定されるわけではない。「インビボ」という用語は、天然の環境(例えば、動物または細胞)ならびに天然の環境内において起こる過程または反応を意味する。
【００５０】
本明細書において使用される「宿主細胞」という用語は、インビトロまたはインビボに配置された、任意の真核細胞または原核細胞(例えば、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、および昆虫細胞)を意味する。
【００５１】
本明細書において使用される「細胞培養物」という用語は、任意のインビトロ細胞培養物を意味する。この用語に含まれるのは、連続する細胞株(例えば、不死化表現型を持つ)、初代細胞培養物、有限増殖細胞株(例えば、形質転換されない細胞)、ならびに卵母細胞および胚を含むインビトロにおいて維持された他の細胞集団である。
【００５２】
好ましい態様において、本発明の組成物および方法の「標的細胞」とは、リンパ系細胞または癌細胞を意味する段階を含むが、これらに限定されるわけではない。リンパ系細胞は、B細胞、T細胞、および顆粒球を含む。顆粒球は、好酸球およびマクロファージを含む。いくつかの態様において、標的細胞は、患者生検標本から得られた連続培養された細胞または連続培養されない細胞である。
【００５３】
癌細胞は、腫瘍細胞、新生物細胞、悪性細胞、転移性細胞、および過形成性細胞を含む。新生物細胞は、良性または悪性であり得る。新生物細胞が浸潤または転移しない場合は、これらは良性である。悪性細胞は、浸潤および/または転移することができるものである。過形成は、構造または機能の重大な変更を伴わない、組織または臓器内の細胞の病的蓄積である。
【００５４】
ひとつの具体的態様において、標的細胞は、病的成長または増殖を示す。本明細書において使用される「病的に増殖するまたは成長する細胞」という用語は、正常な成長の通常の制限によっては支配されないような、動物において増殖する細胞の局在化された集団を意味する。
【００５５】
本明細書において使用される「未活性化標的細胞」という用語は、G0相である細胞または刺激が適用されない細胞のどちらかを意味する。
【００５６】
本明細書において使用される「活性化された標的リンパ系細胞」という用語は、シグナル伝達カスケードを引き起こすように、適当な刺激によりプライミングされたリンパ系細胞、あるいは、G0相でないリンパ系細胞を意味する。活性化されたリンパ系細胞は、増殖し、活性化が誘導した細胞死を受けるか、もしくは1つまたは複数の細胞毒、サイトカイン、ならびに細胞型を特徴づける他の関連した膜会合タンパク質(例えば、CD8+またはCD4+)を産生することができる。これらは、特定の抗原をその表面に提示している標的細胞を認識および結合し、引き続きそのエフェクター分子を放出することも可能である。
【００５７】
本明細書において使用される「活性化された癌細胞」という用語は、シグナル伝達を引き起こすように、適当な刺激によりプライミングされた癌細胞を意味する。活性化された癌細胞は、G0相であっても無くてもよい。
【００５８】
活性化物質は、標的細胞との相互作用時に、シグナル伝達カスケードをもたらす刺激である。活性化刺激の例は、小分子、放射エネルギー、および細胞活性化する細胞表面受容体に結合する分子を含むが、これらに限定されるわけではない。活性化刺激により誘導された反応は、とりわけ、細胞内Ca2+、スーパーオキシド、またはヒドロキシルラジカルレベル；キナーゼもしくはホスファターゼのような酵素の活性；または、細胞のエネルギー状態により、特徴付けることができる。
【００５９】
ひとつの局面において、活性化物質は、細胞表面活性化受容体に結合する物質である。これらは、T細胞受容体リガンド、B細胞活性化因子(「BAFF」)、TNF、Fasリガンド(FasL)、CD40リガンド、増殖誘導リガンド(「APRIL」)、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、アミノ酸(すなわちグルタミン酸)、ステロイド、B細胞受容体リガンド、γ線照射、UV照射、細胞ストレスを増強する物質もしくは条件、または細胞表面活性化受容体を特異的に認識および結合する抗体(例えば、抗CD4、抗CD8、抗CD20、抗TACI、抗BCMA、抗TNF受容体、抗CD40、抗CD3、抗CD28、抗B220、抗CD38、抗CD19、および抗CD21)からなる群より選択することができる。BCMAはB細胞成熟抗原受容体であり、かつTACIは膜貫通アクチベーターおよびCAML相互作用子である(J.A. Grossら、Nature、404:995-999[2000]；X. Laabiら、EMBO J.、11:3897-3904[1992])。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはそれらの混合物を含む。
【００６０】
T細胞リガンドの例は、MHC分子に結合するペプチド、ペプチドMHC複合体、またはT細胞受容体の成分を認識する抗体を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６１】
B細胞リガンドの例は、B細胞受容体の成分に結合するまたは認識する分子または抗体を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６２】
細胞表面活性化受容体に結合する試薬の例は、これらの受容体のまたはそれらに対して生じた抗体(例えば、抗CD20)の天然のリガンドを含むが、これらに限定されるわけではない。RITUXIN(Genentech社、サンフランシスコ、CA)は、市販の抗CD20キメラモノクローナル抗体である。
【００６３】
細胞ストレスを増強する物質または条件の例は、熱、照射、酸化ストレス、または増殖因子離脱(withdrawal)などを含む。増殖因子の例は、血清、IL-2、血小板由来増殖因子(「PDGF」)などを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６４】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、有益なまたは望ましい結果を作用するのに十分な化合物(例えば、ベンゾジアゼピン)の量を意味する。有効量は、1回または複数回の投与、塗布または用量で投与されうり、かつ特定の製剤または投与経路に限定されることが必ずしも意図されるわけではない。
【００６５】
本明細書において使用される「細胞死の過程の調節不良」という用語は、ネクローシスまたはアポトーシスのどちらかにより細胞死を受ける細胞の能力(例えば、素因)の異常を意味する。細胞死の調節不良は、例えば、自己免疫障害(例えば全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、重症筋無力症、シェーングレン症候群など)、慢性炎症状態(例えば、乾癬、喘息およびクローン病)、過増殖性障害(例えば、腫瘍、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫など)、ウイルス感染症(例えば、ヘルペス、パピローマ、HIV)、ならびに変形性関節症およびアテローム動脈硬化症などのその他の状態のような、様々な状態に関連するかまたは状態により誘導される。
【００６６】
調節不良がウイルス感染症により誘導されるまたはこれに関連する場合に、調節不良が生じるまたは観察される時点で、このウイルス感染症が検出可能であってもなくてもよいことに注目されたい。すなわち、ウイルスが誘導した調節不良は、ウイルス感染症の症状が消失した後であっても生じ得る。
【００６７】
本明細書において使用される「過増殖性障害」という用語は、動物において増殖している細胞の局在化された集団が、正常な成長の通常の制限により支配されないような状態を意味する。過増殖性障害の例は、腫瘍、新生物、リンパ腫などを含む。新生物は、浸潤または転移を受けない場合は良性、およびこれらのどちらかを受ける場合は悪性と称される。転移性細胞または組織とは、細胞が、近傍の体構造を浸潤し、かつ破壊することを意味する。過形成は、構造または機能に重大な変化を伴わない、組織または臓器における細胞数の増加に関与している細胞増殖の形である。化生は、ある種の完全に分化した細胞が、別種の分化した細胞と置き換わるような制御された細胞成長の形である。化生は、上皮細胞または結合組織細胞において生じることができる。典型的化生は、若干無秩序な上皮化生に関連している。
【００６８】
活性化されたリンパ系細胞の病的成長は、自己免疫障害または慢性炎症状態を引き起こすことが多い。本明細書において使用される「自己免疫障害」という用語は、生物が生物自身の分子、細胞もしくは組織を認識する抗体または免疫細胞を産生する状態を意味する。自己免疫障害の非限定的な例は、慢性関節リウマチ、シェーングレン症候群、移植片対宿主病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス(「SLE」)などを含む。
【００６９】
本明細書において使用される「慢性炎症状態」という用語は、生物の免疫細胞が活性化された状態を意味する。このような状態は、病的続発症を伴う難治性の炎症反応を特徴とする。この状態は、単核細胞の浸潤、線維芽細胞および細血管の増殖、増大した結合組織、ならびに組織破壊により特徴付けられる。慢性炎症疾患の例は、クローン病、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、多発性硬化症、および喘息を含むが、これらに限定されるわけではない。慢性関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患も、慢性炎症状態をもたらすことがある。
【００７０】
本明細書において使用される「同時投与」という用語は、少なくとも2種の物質(例えば、ベンゾジアゼピン類)または療法の対象への投与を意味する。いくつかの態様において、2種またはそれよりも多い物質/療法の同時投与は、同時進行される。別の態様において、第一の物質/療法の後、第二の物質/療法が投与される。当業者は、使用される様々な物質/療法の投与の製剤および/または経路を変動できることを理解している。同時投与に適した用量は、当業者により容易に決定することができる。いくつかの態様において、物質/療法が同時投与される場合、各々の物質/療法は、それらの単独投与に適したものよりも低い用量で投与される。従って同時投与は、物質/療法の同時投与が有害であることが推定される(例えば毒性)物質の必要量を低下させるような態様に特に望ましい。
【００７１】
本明細書において使用される「毒性」という用語は、毒物投与前の同じ細胞または組織と比べ、細胞または組織にとって不利なまたは有害な作用を意味する。
【００７２】
本明細書において使用される「薬学的組成物」という用語は、特にインビボ、インビボまたはエクスビボにおける診断的または治療的用途に適した組成物を作成する、活性物質の、不活性または活性の担体との組合せを意味する。
【００７３】
本明細書において使用される「薬学的に許容できる担体」という用語は、リン酸緩衝された生理食塩水、水、乳剤(例えば、水中油型または油中水型乳剤)、ならびに様々な種類の湿潤剤のような、任意の標準的薬学的担体を意味する。これらの組成物は、安定剤および保存剤も含むことができる。担体の例は、安定剤およびアジュバントがある(例えば、Martin、Remington's Pharmaceutical Sciences、第15版、Mack Publ社、イーストン、PA [1975]参照)。
【００７４】
本明細書において使用される「薬学的に許容できる塩」という用語は、対象への投与時に、本発明の化合物またはそれらの活性代謝産物もしくは残基を提供する段階が可能である本発明の化合物の薬学的に許容できる塩(例えば、酸または塩基)を意味する。当業者に公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導することができる。酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、ホスホン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを含むが、これらに限定されるわけではない。それら自身は薬学的に許容できないシュウ酸のようなその他の酸は、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容できる酸付加塩を得る中間体として有用な塩の調製に使用することができる。
【００７５】
塩基の例は、アルカリ金属(例えば、ナトリウム)の水酸化物、アルカリ土類金属(例えば、マグネシウム)の水酸化物、アンモニアおよび式NW4+の化合物(式中、WはC1-4アルキルである)などを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００７６】
塩の例は、下記を含むが、これらに限定されるわけではない：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩(flucoheptanoate)、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩など。その他の塩の例は、Na+、NH4+、およびNW4+(Wは、C1-4アルキル基である)などのような適当なカチオンに複合された、本発明の化合物の化合物アニオンを含む。
【００７７】
治療的用途に関して、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容できるものと考えられる。しかし、薬学的に許容できない酸および塩基の塩は、例えば、薬学的に許容できる化合物の調製または精製における使用を認めることができる。
【００７８】
本明細書において使用される「固相支持体」という用語または「固形支持体」とは、当業者が入手できおよび公知の多くの支持体を意味する最も広範な意味において使用される。固相支持体は、シリカゲル、樹脂、誘導体化されたプラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルなどを含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書において使用される「固形支持体」という用語も、合成抗原を提示しているマトリックス、細胞、リポソームなどを含む。適当な固相支持体は、望ましい最終用途および様々なプロトコールに関する適性に基づいて選択することができる。例えば、ペプチド合成に関して、固相支持体は、ポリスチレン(例えば、Bachem社、Peninsula Laboratories社などから入手できるPAM樹脂)、POLYHIPE樹脂(Aminotech社、カナダから入手)、ポリアミド樹脂(Peninsula Laboratories社から入手)、ポリエチレングリコールとグラフト重合したポリスチレン樹脂(TENTAGEL、Rapp Polymere社、チュービンゲン、ドイツ)またはポリジメチルアクリルアミド樹脂(Milligen/Biosearch社(カリフォルニア)から入手)のような樹脂を意味する。
【００７９】
本明細書において使用される「病原体」という用語は、宿主に病態(例えば、感染症、癌など)を引き起こす生物学的物質を意味する。「病原体」とは、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、プリオン、および寄生生物を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８０】
「細菌」という用語は、原生動物界の全ての門を含む、全ての原核生物を意味する。この用語は、マイコプラズマ、クラミジア、アクチノミセス、ストレプトマイセス、およびリケッチアを含む細菌であると見なされる全ての微生物を包含することが意図されている。球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストなどを含む細菌の全ての形が、この定義の中に含まれる。グラム陰性またはグラム陽性である原核生物も、この用語に含まれる。「グラム陰性」および「グラム陽性」とは、当技術分野において周知のグラム染色法による染色パターンを意味する(例えば、FinegoldおよびMartin、Diagnostic Microbiology、第6版、CV Mosby、セントルイス、13-15頁[1982]参照)。「グラム陽性菌」とは、グラム染色において使用される一次色素(primary dye)を保持する細菌であり、顕微鏡下で暗青色から紫色に染色された細胞を生じる。「グラム陰性菌」とは、グラム染色において使用される一次色素を保持しないが、対比染色される細菌である。従ってグラム陰性菌は赤色に見える。
【００８１】
本明細書において使用される「微生物」という用語は、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、および寄生生物を含むがこれらに限定されるわけではない、微生物の任意の種または型を意味する。これに含まれる多くの微生物が対象に対して病原性でありうることが、本発明により考えられる。
【００８２】
本明細書において使用される「真菌」という用語は、二相性糸状菌を含む、糸状菌および酵母のような真核生物を意味する。
【００８３】
本明細書において使用される「ウイルス」という用語は、ある種の例外はあるが、光学顕微鏡では認められず、独立した代謝を欠いており、かつ生存宿主細胞内においてのみ複製することができるような、微小な感染性物質を意味する。個々の粒子(すなわちビリオン)は、典型的には、核酸およびタンパク質の殻または外皮からなり；一部のビリオンは、脂質含有膜も有する。「ウイルス」という用語は、動物、植物、ファージおよび他のウイルスを含む、全てのウイルス型を包含している。
【００８４】
本明細書において使用される「試料」という用語は、その最も広範な意味で使用される。アポトーシス機能の調節不良を特徴とする状態を示すことが疑われる試料は、細胞、組織または液体、細胞から単離された染色体(例えば中期染色体の塗沫(spread))、(溶液中の、またはサザンブロット分析用のような固形支持体へ結合した)ゲノムDNA、(溶液中の、またはノーザンブロット分析用のような固形支持体へ結合した)RNA、(溶液中の、または固形支持体へ結合した)cDNAなどを含み得る。タンパク質を含むことが疑われる試料は、細胞、組織の一部、1種または複数のタンパク質を含有する抽出液などを含むことができる。
【００８５】
本明細書において使用される「精製された」という用語または「精製する」とは、試料中の望ましくない成分を除去することを意味する。本明細書において使用される「実質的に精製された」という用語は、それらが通常会合された他の成分を、少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、かつ最も好ましくは90％またはそれよりも多く含まない分子を意味する。
【００８６】
本明細書において使用される「抗原結合タンパク質」という用語は、特異抗原に結合するタンパク質を意味する。「抗原結合タンパク質」とは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖およびヒト化された抗体を含む免疫グロブリン、Fab断片、F(ab')2断片、およびFab発現ライブラリーを含むが、これらに限定されるわけではない。ポリクローナル抗体の作成に関して、当技術分野において公知の様々な方法が使用される。抗体産生に関して、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むがこれらに限定されるわけではない様々な宿主動物を、望ましいエピトープに対応するペプチドの注射により免疫処理することができる。好ましい態様において、このペプチドは、免疫原性担体(例えば、ジフテリア毒、ウシ血清アルブミン(BSA)、またはキーホールリンペットヘモシアニン[KLH])に複合されている。フロイント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような界面活性剤表面、プルロニックポリマー、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(カルメット-ゲラン桿菌)および座瘡菌(Corynebacterium parvum)のような可能性のあるヒトアジュバントの使用を含むがこれらに限定されるわけではない、様々なアジュバントを用い、宿主種に応じて免疫応答を増強する。
【００８７】
モノクローナル抗体の調製に関して、培養物中の連続細胞株により抗体分子産生を提供する任意の技術を使用することができる(例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NYを参照)。これらは、当初KohlerおよびMilsteinにより開発されたハイブリドーマ技術(KohlerおよびMilstein、Nature、256:495-497[1975])に加え、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(例えば、Kozborら、Immunol. Today、4:72[1983]参照)、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibody and Cancer Therapy、Alan R. Liss社、77-96頁[1985]参照)を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８８】
本発明に従い、単鎖抗体の作成について説明された方法(米国特許第4,946,778号；本明細書に参照として組入れられている)を、望ましい特異的単鎖抗体を作成するために適合させることができる。追加の本発明の態様は、望ましい特異性を伴うモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な識別を可能にするために、Fab発現ライブラリーの構築に関する当技術分野において公知の技術を使用する(Huseら、Science、246:1275-1281[1989])。
【００８９】
抗体分子のイディオタイプ(抗原結合領域)を含む抗体断片は、公知の技術により作成される。例えば、このような断片は以下を含むが、これらに限定されるわけではない：抗体分子のペプシン消化により作成することができるF(ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド橋の還元により作成することができるFab'断片、ならびに抗体分子のパパインおよび還元剤の処理により作成することができるFab断片。
【００９０】
抗原結合タンパク質をコードしている遺伝子を、当技術分野において公知の方法により単離することができる。抗体産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野において公知の技術(例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線検定、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(例えばコロイド状金、酵素または放射性同位元素標識の使用)、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ、ヘマグルチニン化アッセイなど)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなど)などにより実現することができる。
【００９１】
本明細書において使用される「免疫グロブリン」という用語または「抗体」とは、特異抗原に結合するタンパク質を意味する。免疫グロブリンは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化抗体、Fab断片、F(ab')2断片、ならびにクラスIgG、IgA、IgM、IgD、IgEの免疫グロブリン、および分泌免疫グロブリン(sIg)を含むが、これらに限定されるわけではない。免疫グロブリンは一般に、二つの同一重鎖および二つの軽鎖を有する。しかし「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、単鎖抗体および2本鎖抗体も包含している。
【００９２】
本明細書において使用される「エピトープ」という用語は、特定の免疫グロブリンとの接触を生じる抗原の部分を意味する。タンパク質またはタンパク質断片が宿主動物の免疫処理に使用される場合、タンパク質の多くの領域は、このタンパク質の所定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を引き起こすことができ；これらの領域または構造は、「抗原決定基」と称される。抗原決定基は、抗体に結合するために、完全な抗原(すなわち、免疫応答を誘起するために使用される「免疫原」)と競合し得る。
【００９３】
抗体およびタンパク質またはペプチドの相互作用に関して使用される「特異的結合」という用語または「特異的に結合する」とは、その相互作用が、タンパク質上の特定の構造(すなわち、抗原決定基またはエピトープ)によって決まることを意味し；別の言い方をすると、その抗体は、一般的タンパク質よりもむしろ特異的タンパク質構造を認識しかつ結合する。例えば、抗体がエピトープ「A」について特異的である場合、標識された「A」およびその抗体を含有する反応液中にエピトープA(または遊離、未標識のA)を含むタンパク質が存在することは、その抗体に結合した標識されたAの量を減少するであろう。
【００９４】
本明細書において使用される「非特異的結合」という用語および「バックグラウンド結合」とは、抗体およびタンパク質またはペプチドの相互作用に関して使用される場合、特定の構造の存在によって左右されない相互作用(すなわち、抗体は、エピトープのような特定の構造よりもむしろ一般的タンパク質に結合する)を意味する。
【００９５】
本明細書において使用される「変調する」という用語は、化合物(例えば、ベンゾジアゼピン化合物)の活性が、細胞成長、増殖、アポトーシスなどを含むがこれらに限定されるわけではない、細胞機能の様相に対し作用する(例えば、促進または抑制する)ことを意味する。
【００９６】
本明細書において使用される「結合に競合する」という用語は、第二の分子(例えば、第二のベンゾジアゼピン誘導体またはミトコンドリアATP合成酵素のオリゴマイシン感受性付与タンパク質と結合する別の分子など)と同じ基質(例えば、ミトコンドリアATP合成酵素のオリゴマイシン感受性付与タンパク質)に結合する活性を持つ第一の分子(例えば、第一のベンゾジアゼピン誘導体)に関して使用される。第一の分子による結合の効率(例えば、速度論または熱力学)は、第二の分子に結合する基質の効率と同じ、またはより大きい、またはより少ないことができる。例えば、基質への結合に関する平衡結合定数(KD)は、これら2種の分子について異なり得る。
【００９７】
本明細書において使用される「ベンゾジアゼピン化合物の対象への投与に関する説明書」という用語およびそれらの文法的同等物は、細胞または組織におけるアポトーシス過程の調節不良を特徴とする状態の治療のためのキットに備えられた組成物を使用するための説明書を含む。この用語は同じく、自己免疫障害(例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、重症筋無力症、シェーングレン症候群など)、慢性炎症状態(例えば、乾癬、喘息およびクローン病)、過増殖性障害(例えば、腫瘍、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫など)、ウイルス感染症(例えば、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、HIV)、ならびに変形性関節症およびアテローム動脈硬化症のような他の状態などを治療するためのキットに備えられた組成物の使用に関する説明書を特に意味する。
【００９８】
いくつかの態様において、これらの説明書は更に、21 CFR 201項(以下参照)に準拠しそのキットに含まれた組成物の推奨量または常用量に関する陳述を含む。本方法および組成物に適用可能なラベリングおよび説明書の必要事項に関する追加情報は、米国食品医薬品局(FDA)のインターネット上のウェブページにおいて入手することができる。
【００９９】
いくつかの態様において、説明書は更に、体外診断用医薬品のラベリングに、FDAに要求される、意図された用法に関する陳述を含む。FDAは、体外診断用医薬品を医療用具として分類し、かつそれらが510(k)の手続きにより承認されることを要求している。510(k)に基づく承認申請に必要な情報は以下を含む：1)製品の商標名または登録商標、共通名または一般名、および分類名を含む、体外診断用医薬品の名称；2)製品の意図された用途；3)該当しうる、510(k)申請を提出する所有権者または運営者(operator)の確定された登録番号；米国食品・医薬品・化粧品法第513節に従い、当該体外診断用医薬品が属するクラスがわかっているならば、その適当なパネル、もしくは、所有権者または運営者が、当該製品がそのような項目に分類されないと判断するならば、その体外診断用医薬品がそのように分類されないという決定とその決定の基となる事項に関する供述書；4)体外診断用医薬品およびその意図された用法、ならびに用法に関する指示を説明するのに十分な提唱されたラベル、ラベリングおよび広告（利用可能であるならば、写真または技術図面が添付される）；5)当該製品が、米国において市販されている他の同型の体外診断用医薬品と類似しているおよび/または異なることを示す供述書、その供述書を裏付ける添付データ；6)実質的に同等であるという決定の基となった安全性および有効性データに関する510(k)要約；または、実質的に同等であるというFDA見解を裏付ける510(k)安全性および有効性に関する情報は、書面による請求後30日以内に誰もが入手できることに関する供述書；7)申請者は、自分たちの最良の知識において、市販前通知に提出された全てのデータおよび情報が真実かつ正確であり、かついかなる事実も省略していないと考える旨の供述書；8)FDAが実質的に同等であると決定する上で必要な体外診断用医薬品に関するあらゆる追加情報。追加情報は、米国食品医薬品局(FDA)のインターネット上のウェブページで入手できる。
【０１００】
「被験化合物」という用語は、体の機能の疾患、疾病、病気、または障害の治療または予防、さもなければ試料の生理的状態もしくは細胞状態(例えば、細胞または組織におけるアポトーシス調節不良のレベル)の変更に使用することができる、薬学的、薬物などの任意の化学実体を意味する。被験化合物は、公知のおよび可能性のある治療的化合物の両方を含む。被験化合物は、本発明のスクリーニング法を用いることにより、治療的であると決定することができる。「公知の治療的化合物」とは、そのような治療または予防において有効であることが示された(例えば、動物実験またはヒトへ投与する前臨床試験により)治療的化合物を意味する。好ましい態様において、「被験化合物」とは、細胞におけるアポトーシスを変調する物質である。
【０１０１】
本明細書において使用される「第三者」という用語は、アポトーシス過程の調節不良により特徴付けられる状態を治療するためのベンゾジアゼピン化合物の投与に関して考えられる被験化合物の販売、保管、配送、または小売りに従事した実体を意味する。
【０１０２】
発明の一般的説明
薬物の種類として、ベンゾジアゼピン化合物は、多くの疾患の治療に有効な医薬品であることが広範に試験されかつ報告されている。例えば、米国特許第4,076,823号、第4,110,337号、第4,495,101号、第4,751,223号および第5,776,946号は、各々その全体が本明細書に参照として組入れられているが、これらは、ある種のベンゾジアゼピン化合物が鎮痛薬および抗炎症薬として有効であることを開示している。同様に米国特許第5,324,726号および米国特許第5,597,915号は、各々その全体が本明細書に参照として組入れられているが、これらはある種のベンゾジアゼピン化合物が、コレシストキニンおよびガストリンのアンタゴニストであり、その結果ある種の胃腸障害の治療に有用であることを開示している。
【０１０３】
別のベンゾジアゼピン化合物は、とりわけ心筋性虚血、敗血症性ショック症候群のような、ヒト好中球エラスターゼが媒介した状態の治療において、ヒト好中球エラスターゼのインヒビターとして試験されている(例えば、米国特許第5,861,380号参照、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。その全体が本明細書に参照として組入れられている米国特許第5,041,438号は、ある種のベンゾジアゼピン化合物が、抗レトロウイルス薬として有用であることを開示している。
【０１０４】
注目されるベンゾジアゼピン化合物が描かれているにもかかわらず、下記の説明らから、本発明は、細胞死に関連した過程の調節不良を特徴とする様々な疾患の治療において有用である新規ベンゾジアゼピン化合物、およびこれらの化合物の使用法を提供する段階が明らかになるであろう。
【０１０５】
実験モデルは、アポトーシスまたはネクローシスを調節する機構の混乱と、様々な新生物疾患、自己免疫疾患およびウイルス性疾患の病因の間の因果関係を確率する(C.B. Thompson、Science、267:1456-1462[1995])。良く定義された例は、リンパ腫発生に対する、bcl-2の異常な高レベルの発現の作用である。bcl-2癌遺伝子は、多くのB細胞濾胞性リンパ腫に存在するt(14:18)染色体転座の折点に位置した遺伝要素として当初として同定された(S.J. Korsmeyer、Blood、359:554-556[1992])。この発見以降、bcl-2遺伝子産物は、様々な刺激により誘導されたアポトーシスを阻害し、かつその癌原性の可能性は、アポトーシスを狂わせるその能力から生じることが報告されている(C.L. Sentmanら、Cell、67:878-888[1994]；および、T.J. McDonnell S.J.およびKorsmeyer、Nature、349:254-256[1991])。
【０１０６】
アポトーシスの失敗または低下は、ヒト自己免疫性リンパ増殖症候群の発症に加えこの疾患のマウスモデルに関連していることが報告されている。MRL-lprまたはgldマウスは、リンパ腺腫、巨脾腫、腎炎および関節炎を発症することに加え、大量の自己抗体を産生する(P.L. Cohen、およびR.A. Eisenberg、Annul. Rev. Immunol.、9:243-269[1991])。
【０１０７】
MRL-lprマウスは、各々、FASおよびFasリガンドをコードしている遺伝子に機能喪失変異を持っている(M. Adachiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:1756-1760[1993])；T. Takakashiら、Cell、76:969-976[1994])。偏在性に発現された細胞表面受容体であるFASは、通常Fasリガンドとの結合時にアポトーシス反応をもたらす(N. Itohら、Cell、66:233-243[1991])。これらの機能喪失変異を有するマウスにおいて、FASシグナル伝達の破壊は、T細胞を、アポトーシスによる末梢欠損(peripheral deletion)に対し抵抗性とする(H. Russellら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA、90:4409-4413)。これらの細胞の不適切な生存は、リンパ系組織の新生物様成長および高レベルの自己抗体産生により証明されたT細胞およびB細胞の病原性の蓄積をもたらす。ヒトにおいて、自己免疫性リンパ増殖症候群は、リンパ腺腫、巨脾腫、自己抗体および自己免疫の徴候を含む、マウス表現型との類似性を共有している。同様に本疾患の患者は、FAS遺伝子において突然変異を保持することが報告されている(S. Nagata、J. Hum. Genet.、43:2-8[1998]参照)。
【０１０８】
ベンゾジアゼピン化合物は、中枢神経系(CNS)のベンゾジアゼピン受容体に結合し、その結果、不安および癲癇を含む様々なCNS障害の治療に使用されることがわかっている。末梢ベンゾジアゼピン受容体も同定されており、この受容体は、偶然にもCNSにも存在し得た。ベンゾジアゼピンおよび関連構造は、組織培養物において増殖された形質転換細胞の治療において有用なアポトーシス促進特性および細胞傷害特性を有する。このクラスの物質の癌および他の新生物疾患に対する治療的可能性がある。神経芽細胞腫および卵巣癌のふたつの具体例が示されている。
【０１０９】
神経芽細胞腫は、小児において認められる最も一般的な頭部外の固形腫瘍である。化学療法、放射線療法および手術を含む最新の治療は、転移性神経芽細胞腫の死亡率を有意に低下させていない。本疾患の小児生存率を改善する新規療法が必要とされている。一部の本発明の態様は、これらの腫瘍の成長を遅延する組成物および方法を提供する。
【０１１０】
同様に、卵巣癌は、標準の化学療法剤に対する患者により示された化学療法抵抗性のために治療が困難である。治療の失敗は、通常化学療法抵抗性細胞の出現に起因している。一部の本発明の態様は、化学療法抵抗性の癌細胞(例えば卵巣癌細胞)を殺傷するベンゾジアゼピン化合物を提供する。
【０１１１】
発明の詳細な説明
本発明は、新規化学化合物、それらの発見法、およびそれらの治療的用途に関する。特に本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体、およびプログラムされた細胞死、自己免疫、炎症および過増殖などの誤調節に関連した多くの状態を治療するためのベンゾジアゼピン誘導体の治療的物質としての使用法を提供する。加えて本発明は、病的な状態の下で、プログラムされた細胞死、自己免疫、炎症、および過増殖などの過程を調節する組成物および方法を提供する。
【０１１２】
本発明の組成物および方法の例は、より詳細に下記項目で説明されている：I.細胞死のベンゾジアゼピン誘導体モジュレーター；II.細胞成長および増殖を変調するベンゾジアゼピン誘導体モジュレーター；III.例証的ベンゾジアゼピン誘導体の合成；IV.薬学的組成物、製剤、ならびに例証的投与経路および投与量の考察；V.ミトコンドリアATP合成酵素(ミトコンドリアF0F1 ATPase)活性モジュレーター；および、VI. 薬物スクリーニング。
【０１１３】
本発明の実践には、特に示さない限り、通常の有機化学、薬学、分子生物学(組換え技術を含む)、細胞生物学、生化学、および免疫学の技術を使用し、これらは当技術分野の技術範囲内である。このような技術は、文献において十分説明されており、例えば「Molecular cloning: a laboratory manual」第2版(Sambrookら、1989)；「Oligonucleotide synthesis」(M.J. Gait編、1984年)；「Animal Cell Culture」(R.I. Freshney編、1987年)；「Methods in enzymology」シリーズ(Academic Press社)；「Handbook of experimental immunology」(D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編)；「Gene transfer vectors for mammalian Cells」(J.M. MillerおよびM.P. Calos編、1987年)；「Current protocols in molecular biology」(F.M. Ausubelら編、1987年、定期的に改訂)；「PCR: the polymerase chain reaction」(Mullisら編、1994年)；および、「Current protocols in immunology」(J.E. Coliganら編、1991年)がある。
【０１１４】
I. 細胞死のベンゾジアゼピン誘導体モジュレーター
一部の本発明の態様において、ベンゾジアゼピン化合物は下記構造
2005502652.tif 000003
またはその鏡像異性体(式中、R1は、脂肪族またはアリールであり；R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-HC(=O)-R5、または水素結合形成に参画する部分であり(ここで、R5は、アリール、複素環、-R6-NH-C(=O)-R7または-R6-C(=O)-NH-R7である(ここで、R6は、1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールまたは複素環である))；ならびに、R3およびR4の各々は、独立して水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換されたアミノ、アシルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8個の炭素および1〜20個の水素を有する脂肪族基、アリールまたはヘテロアリールである)；または、それらの薬学的に許容できる塩、プロドラッグまたは誘導体である。
【０１１５】
細胞死は、ネクローシス、アポトーシスまたはFAS経路の調節により誘導することができる。細胞死の過程の調節不良に関連した状態は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シェーングレン症候群、移植片対宿主病、および重症筋無力症のような、自己免疫疾患；乾癬、喘息、およびクローン病のような、慢性炎症状態；B細胞またはT細胞リンパ腫のような、過増殖性障害；ならびに、変形性関節症およびアテローム動脈硬化症のような、他の状態。細胞死の調節不良に関連したウイルス感染症により誘導される状態を治療するために、ベンゾジアゼピン化合物を使用する方法も提供される。加えて一部の局面において、本発明のベンゾジアゼピンを用いウイルス感染症を治療する方法が提供される。
【０１１６】
1種または複数の追加物質を、本発明のベンゾジアゼピンと共に同時投与する方法が提供され、ここでこのような追加物質は、新生物治療薬、免疫抑制薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬または放射線照射を含む。
【０１１７】
本発明の方法および組成物により実現されるべき細胞死は、自己免疫性または自己免疫障害による罹患した組織；炎症性または炎症に罹患した組織；過増殖性組織；ウイルス感染した組織；アテローム動脈硬化症または変形性関節症の組織内に存在する、1種または複数の細胞が関与している。
【０１１８】
対象において細胞死の過程の調節不良に関連した状態を治療するのに有用な物質を同定するためのアッセイおよび診断法も提供され、ここでは細胞死を誘導する可能性のある候補物質が、調節不良とされた細胞とベンゾジアゼピン化合物の接触により、アッセイされる。このアッセイは、適当な細胞または組織を、好ましくは低血清中に維持する段階を含む。
【０１１９】
更に、対象における細胞死の過程の調節不良に関連した状態を治療するための医薬品を調製する方法も示され、ここでこの状態、罹患した細胞または組織およびベンゾジアゼピン化合物は先に説明されている。本発明は更に、新規の下記構造を有する1,4-ベンゾジアゼピン化合物
2005502652.tif 000004
またはその鏡像異性体(式中、R1は、脂肪族またはアリールであり；R2は、-NHC(=O)-R5であり(ここで、R5は、アリール、複素環、-R6-NH-C(=O)-R7または-R6-C(=O)-NH-R7である(ここで、R6は、1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールまたは複素環である))；ならびに、R3およびR4の各々は、独立して水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換されたアミノ、アシルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8個の炭素および1〜20個の水素を有する脂肪族基、アリールまたは複素環である)；または、それらの薬学的に許容できる塩、プロドラッグまたは誘導体も提供する。
【０１２０】
例証的標的疾患および疾患標的を同定する方法が、以下に示される。
【０１２１】
A. 標的疾患および状態
本発明は、いくつかの態様において、それらが、対象の細胞または組織における正常な細胞死の過程(例えば、ネクローシスおよび/またはアポトーシス)の調節不良の結果として生じることに関連している状態を治療する方法を提供する。例証のみを目的として、このような状態は、自己免疫障害(例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーングレン症候群および重症筋無力症)；過増殖性障害(例えば、B細胞またはT細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、慢性リンパ球性白血病、乳癌、前立腺癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、骨髄腫、卵巣癌、脳癌、頭部および頸部の癌、肝癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、および子宮頚癌)；慢性炎症性状態(例えば、乾癬、喘息、またはクローン病)；変形性関節症およびアテローム動脈硬化症のような、他の状態；ならびに、DNAおよび/またはRNAウイルス感染（ここでウイルスは、ヘルペスウイルス、パピローマウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス(HIV)を含むがこれらに限定されるわけではない）により誘導された他の状態を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１２２】
これらの障害は、本明細書に説明されたベンゾジアゼピン化合物を有効量投与することにより治療される。様々なベンゾジアゼピン化合物が、以下により詳細に説明されている。好ましい態様において、これらの化合物は、それら自身治療的に有効であり、かつ大量投与される場合に、毒性をほとんどまたは全く有さない。更に以下に説明されているような、一部の追加の態様において、これらの化合物の他の物質との同時投与は、予想外の相乗的治療上の恩恵を提供する。同時投与の方法において、特許請求された化合物は、対象へ投与されるべき量を減少することにより、公知の治療的物質の有害な副作用を軽減することにおいても有用である。
【０１２３】
本明細書に説明された化合物による治療からの恩恵である状態は、細胞死の過程の調節不良の共通の病因を共有することが明らかである。正常なアポトーシスはいくつかの経路を介して生じ、各経路は複数の段階を有する。本明細書に説明された組成物および方法は、機能不全が生じる経路または経路の段階とは無関係に、調節不良のアポトーシスの治療において有用である。いくつかの態様において、これらの状態は、FASアポトーシス経路の調節不良により引き起こされる。
【０１２４】
同様にこれらの化合物は、機能不全が生じる経路または経路の段階とは関わりなく調節不良のネクローシスの治療においても有用である。
【０１２５】
細胞死の過程の調節不良は、多くの状態に関連している。新生物において、例えば、正常な細胞死が阻害され、細胞は過増殖性成長するようになる。この過程の異常な機能は、自己免疫障害、ウイルス感染症、ウイルス感染症に誘導された状態、神経変性疾患などを含む、重篤な病理も生じ得る。本発明は、これらおよび他の状態を治療する方法も提供する。本発明は、特定の機構にも、投与される物質の作用の理解にも限定されるわけではないが、本明細書に説明された化合物は、この過程が不調である場合は細胞死を誘導または促進すると考えられる。しかし本発明の化合物は、アポトーシス過程の欠損により引き起こされたのではない状態の治療にも有用である。例えば、ある種のウイルス感染症において、アポトーシスの欠損は存在しないが、細胞死はネクローシスの誘導により促進される。
【０１２６】
治療される状態は、一般に対象における症状の存在に注目することにより、または対象の細胞内の表現型もしくは遺伝子型の変化、特にアポトーシスまたはネクローシスを受ける細胞の不能に注目することにより決定される。細胞の新生物状態に関連した表現型の変化(例えば、インビボの腫瘍原性の能力に関連したインビトロ特徴のセット)は、より丸い細胞形態、より失われた下層の接着、接触阻害の喪失、足場依存性の喪失、プロテアーゼの放出、増大した糖輸送、減少した血清要求、致死性抗原の発現などを含む(例えば、Luriaら、GENERAL VIROLOGY、第3版、436-446頁[1978]、John Wiley & Sons社、ニューヨーク参照)。
【０１２７】
いくつかの態様において、細胞または組織の治療は、治療される障害の原因(主因または遠因)である細胞または組織における細胞死(ここで細胞死はアポトーシスまたはネクローシスのどちらかである)を誘導することを意味する。例えば、過増殖性障害において、この方法は、新生物細胞のような、過増殖性細胞のアポトーシスを誘導することにより、障害を治療するであろう。この態様において、腫瘍サイズまたは腫瘍負荷の減少は、本方法の目的に合致していることを確定するひとつの手段である。別の局面において、治療は、自己免疫障害および慢性炎症状態におけるような、免疫機能の回復または免疫不全の調節を包含している。更なる態様において、治療は、特定の疾患に関連した症状(例えば、癌またはHIV感染症における悪液質、または関節炎における炎症)の緩和を包含している。より更なる態様において、本発明の化合物および方法の治療的用途に加え予防的用途が意図されている。
【０１２８】
いくつかの態様において、治療される状態が自己免疫疾患である場合、本明細書に開示された方法の使用は自己抗体産生を低下させ、これは炎症および組織破壊の低下につながる。従って、治療される細胞は、それ自身自己免疫原である細胞または自己免疫反応により遠位で冒された細胞であることができ、ここでそのような細胞またはそのような細胞を含む組織における細胞死を誘導することが望ましい。同様に、炎症状態を治療する場合、治療される細胞は、炎症細胞それ自身であるかまたは炎症により遠位で冒された細胞であることができ、ここでそのような細胞またはそのような細胞を含む組織における細胞死を誘導し、その結果炎症を軽減することが望ましい。
【０１２９】
更なる態様において、治療される細胞は、ウイルス感染した細胞または先に感染している細胞もしくは組織である。いくつかの態様において、治療の成功は、細胞死を誘導し、その結果ウイルス力価を低下させる。この結果は、ウイルスの力価をアッセイするかまたは細胞数の減少に注目することにより容易に決定される。場合によっては、非常に早期に生じるウイルス感染症は、はるかに遅れた時点での細胞死の破壊を引き起こすことができるので、とりわけ治療時にウイルスの残渣またはウイルス感染症の他の徴候を有さない細胞において細胞死を誘導するために望ましいことが注目されるべきである。
【０１３０】
細胞死は、本明細書および当技術分野において説明されたようにアッセイすることができる。好ましい態様において、細胞株は、密度に左右される制約を伴わない指数増殖に到達するのに適当な期間、適当な細胞培養条件下(例えば、気体(CO2)、温度および培地)で維持される。細胞数または生存度は、トリパンブルー排除/血球計数、またはMTT色素転換アッセイのような標準技術を用いて測定される。あるいは細胞は、アポトーシスまたはネクローシスの異常に関連した遺伝子または遺伝子産物の発現について分析される。
【０１３１】
別の本発明の態様において、本発明の化合物は、細胞死を誘導するそれらの効能とは無関係の抗ウイルス活性を有する。ウイルスの複製および/または伝播を阻害するひとつの局面または方法は、ウイルスを、有効量の1種または複数の本発明の化合物および/または組成物と接触させる段階を含む。この接触は、ウイルスの複製および/または伝播を阻害するのに適した条件下で行われる。更なる態様において、これらの方法は、細胞または組織と、有効量の先に定義されたような化合物および/または組成物を接触させることにより、細胞または組織中においてウイルスの感染および/または伝播を防止する段階を含む。この接触は、ウイルスの感染および/または伝播が阻害されるのに適した条件下で行われる。
【０１３２】
ウイルスの複製および増殖を阻害および低下させることにより、ウイルスの感染力も阻害および低下されること、ならびに宿主細胞は、関連した病理も治療される追加の恩恵により、ウイルス感染が適宜処理されることが考えられる。
【０１３３】
本発明の方法において企図されるウイルスは、RNAおよび/またはDNAウイルスを含むが、これらに限定されるわけではない。単なる例として、このようなウイルスは、ヘルペス、非ヘルペスおよびレトロウイルス起源である。ヒト病原性ヘルペスウイルス科の主な例は、単純ヘルペスウイルス(HSV)1、2およびオナガザルヘルペスウイルス1(B-ウイルス)；水痘-帯状疱疹ウイルス；エプスタイン-バーウイルス(EBV)；リンホクリプトウイルス；ヒトヘルペスウイルス6-8(HHV6-S)；カポジ関連ヘルペスウイルス(KHV)；シミアンヘルペスウイルス、およびヒトサイトメガロウイルス(HCMV)がある(例えば、J.E. Gallantら、J. Infect. Dis.、166:1223-1227[1992]参照)。
【０１３４】
ヘルペスウイルス起源の動物病原体は、とりわけ、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ウシ乳頭炎ウイルス、ウシ白血病ウイルス(BLV)およびオナガザルヘルペスウイルス(B-ウイルス)を含む。
【０１３５】
非ヘルペス起源のヒトウイルスは、インフルエンザウイルスA、BおよびC；パラインフルエンザウイルス-1、2、3および4；アデノウイルス；レオウイルス；RS(respiratory syncytial)ウイルス；リノウイルス；コクサッキーウイルス；エコーウイルス；麻疹ウイルス；B型およびC型肝炎ウイルス(HBVおよびHCV)；ならびに、パポーバウイルスを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１３６】
非ヘルペス起源の動物ウイルスは、仮性狂犬病ウイルス(PRV、ブタ)、ウマ鼻肺炎ウイルス、馬媾疹ウイルス(水痘ウイルス)；リンホクリプトウイルス；マレク病ウイルス、ウシヘルペスウイルス-1(BHV-1)、ヘルペスウイルス仮性狂犬病ウイルス(PRV)を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１３７】
本発明の化合物および組成物により治療できることが考えられるレトロウイルス起源のウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1型および2型ならびにヒトリンパ球向性1および2ウイルス(HTLV-IおよびII)を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１３８】
B. 可能性のある治療的物質を同定する方法
本明細書において、アポトーシスまたはネクローシス性経路の調節不良に関連した状態を治療する可能性のある物質を同定するためのアッセイも提供される。いくつかの態様において、これらの方法は、調節不良とされた細胞、すなわち障害に冒された細胞(例えば、状態が過増殖である場合の腫瘍細胞)または状態が慢性炎症状態または自己免疫障害である免疫細胞(好中球、好塩基球、好酸球、単球またはリンパ球)の、可能性のある治療的物質との接触を含む。更なる本発明の局面において、対照細胞は更に、ベンゾジアゼピン化合物の存在または非存在下でアッセイされる。このベンゾジアゼピン化合物は、本明細書に説明された1,4-ベンゾジアゼピン化合物であることができる。対照細胞と比較した細胞死も、注目されかつ比較される。可能性のある治療的物質を同定するために、適当なアッセイ条件(例えば、インキュベーション時間、温度、培養維持培地など)が使用され、当業者はこれらを容易に決定することができる。血清は、例えばGibco BRL社(ゲティスバーグ、NM)のウシ胎仔血清のように、業者から市販されている。これらの細胞は、被験物質と共に、被験物質がアポトーシス過程および/またはネクローシスを冒すのに十分な時間、培養される。適当なインキュベーション期間の後、細胞死は、例えば、MTT色素トリパン排除のような、任意の公知手段によりアッセイされる。新規の細胞毒性物質は、対照細胞の細胞死に対する、調節不良とされた細胞の死を誘導するそれらの能力により同定される。
【０１３９】
本発明者らは、細胞が低血清条件において維持される間に、細胞毒性は大きく増悪され、かつインキュベーション時間は約2時間またはそれ未満に短縮されることを発見した。より高い血清レベルを使用する標準のインキュベーション条件下では、必要なインキュベーション時間は数時間であることが多く、場合によっては24時間またはそれ以上に達するので、これは、全く予想外の結果である。本明細書において使用される「低血清」という用語は、約10容量％から、約0.1容量％までまたはそれと等しいもしくはそれ未満を含有する培養培地を意味する。この範囲内で、濃度は自在であることが理解されなければならず、本出願人は、この範囲内で増分が約0.1％である可能な部分範囲、例えば、約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、... 1.0％、...1.5％、.. .2.0％、...2.5％、...3.0％、...3.5％、...5％などのいずれかまたはそれ未満から、約9.9％、および約10％(容量％)までの血清を企図している。
【０１４０】
従って、いくつかの態様において、本発明のベンゾジアゼピンは、先に定義されたように、低血清でアポトーシスを誘導する。
【０１４１】
更なる態様において、本発明の組成物は更に、それらが中枢ベンゾジアゼピン受容体に結合することができないか、または末梢ベンゾジアゼピン受容体に低親和性で結合することができない能力により、特徴決定および同定されている。しかし、特に好ましい態様において、本発明の組成物および方法は、中枢または末梢の任意のベンゾジアゼピン受容体を標的(例えば、選択的結合)としない。これらの化合物は、当技術分野において周知の方法を使用することにより同定することができる。
【０１４２】
例えば、末梢ベンゾジアゼピン受容体に対するベンゾジアゼピン化合物の結合親和性は、H. Schoemakerらの論文(J. Phann. Exp Ther.、225:61-69(1983))；およびA. Dobleらの論文(Brain Res. Bull.、18:49(1987))に説明されたような、良く確立された方法により決定することができる。
【０１４３】
簡単に述べるとこの方法は、ベンゾジアゼピン化合物の効能を、1-(2-クロロフェニル)-N-メチル-N-(-1,メチルプロピル)-3-イソキノリンカルボキシアミド(PK11195)のような周知の高親和性結合物質のそれと比較する段階を含み、ここで競合結合アッセイにおいて末梢ベンゾジアゼピン受容体から、PK511195と置き換わるベンゾジアゼピン化合物の能力が調べられる。
【０１４４】
前記アッセイ法のいずれかにおいて、ベンゾジアゼピン化合物を検出可能なように標識することができる。適当な検出可能標識は、同位元素、発色団、発蛍光団、磁気粒子、高親和性結合パートナー(例えば、ストレプトアビジン/ビオチン)、および抗体などを含むが、これらに限定されるわけではない。標識する同位元素の例は、ベンゾジアゼピン分子上の1つまたは複数の原子の安定したまたは放射性の同位元素である。
【０１４５】
検出可能な標識を導入する方法およびその標識を検出する方法は、当技術分野において周知である。例えば、放射性同位元素標識は、電子スピン共鳴法を含む、特別な機器を用いて検出することができる。安定した同位元素は、質量分析または磁気共鳴分析を用いて検出することができる。蛍光標識は、蛍光分光計を用いて検出することができる。これらの機器は市販されており、それらの操作は当技術分野の通常の技術の範囲内である。
【０１４６】
アッセイおよび診断法において使用することができるベンゾジアゼピン化合物は、以下により詳細に説明されている。多くの一般的および具体的態様を含む、本明細書に説明された化合物は全て、このアッセイおよび診断法において使用することができることは理解されなければならない。
【０１４７】
II. 細胞成長および増殖のベンゾジアゼピン誘導体モジュレーター
多くの細胞毒性物質の選択性は限定されており、かつ一般に罹患した細胞と健康な細胞の、薬物が誘導した細胞損傷に耐えおよび修復する差次的能力に頼っている。しかし、疾患特異的標的を発揮する細胞毒性療法の開発には、難問が残っている。多くの疾患について、適当な標的は同定されておらず、かつ標的が存在するような場合(P. HuangおよびA. Oliff、Trends Cell. Biol.、11:343-248[2001])に、それらの機能をブロックすることが疾患を制御することが公知である程度がバリデーションされているものはかなり少ない(D.W. Nicholson、Nature、407:810-816[2000])。
【０１４８】
多様性を指向した(Diversity-oriented)合成および表現型スクリーニング(時には「化学的遺伝」と称される)は、生体活性化合物を同定する頑強な方法として進歩している(S.L. Schreiber、Science、287:1964-1969[2000])。これらの方法において、標的への親和性よりもむしろ機能に基づいて直接リード化合物を同定するために、分子アレイが合成されかつスクリーニングされる。本発明の好ましい態様は、細胞毒性物質を罹患した細胞へ治療的に標的化する組成物および方法を提供する。
【０１４９】
ひとつの態様において、本発明は、対象における全身性エリテマトーデス(SLE)治療的処理のための選択的組成物および方法を提供する。SLEは、自己抗原を認識する抗体スペクトルを特徴としている。自己抗体は、末梢寛容を回避しているB細胞の産物である。自己抗体抗原免疫複合体は、心臓、脳、肺および腎の組織に沈着し、組織破壊を引き起こし、ならびに補体を活性化しかつ炎症細胞を動員することにより、臓器機能を損なう。腎臓は重要な標的であり；全SLE患者の少なくとも40％が、腎の関与を有し、かつ狼瘡は、10年にわたり28％の死亡率に関連している。
【０１５０】
狼瘡の治療に有効な薬物は、免疫抑制リンパ球毒性物質を含む。免疫抑制剤は有効であるにもかかわらず、これは狼瘡に関連した死の有意な部分を占めている重度の副作用を誘導することが多い。疾患が生じるリンパ球に対するより大きい特異性を伴う物質は、SLEおよび関連障害の治療を明らかに前進するであろう。しかし、疾患を引き起こす自己反応性B細胞の集団を正確に同定することは依然可能ではない。従って、疾患が生じる細胞のみを標的とする特別な療法は存在していない。その欠点にもかかわらず、リンパ球毒性は、新規療法を選択するための妥当な基礎を提供する。
【０１５１】
本発明は、最初に対応する未活性化標的細胞(例えば、活性化刺激に曝露されていない細胞)を、変動する量の候補物質ならびに細胞の個別の試料を、緩衝液またはそれらの同等物の同等に変動する量と接触すること、ならびに未活性化細胞内のミトコンドリア透過性遷移(「MPT」)の前にスーパーオキシドの細胞内濃度を増大するこれらの候補物質を選択することにより、活性化細胞を選択的に殺傷するか、または活性化された標的細胞の細胞成長もしくは増殖を阻害する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。本明細書において使用される「MPT前の細胞内スーパーオキシドの増加」という用語は、候補物質により誘導された、緩衝液単独で処理した細胞と比較して統計学的に有意な(p≦0.05)増加である。細胞において細胞内スーパーオキシドを測定するいくつかの方法が、当技術分野において公知である。ひとつの方法は、L. Benovらの論文に説明されたように(Free Radic. Biol. Med.、25:826-831(1998))、ヒドロエチジウムを使用する。細胞におけるMPTを測定するいくつかの方法は、当技術分野において公知である。ひとつの方法は、Zanzamiら(1995)により説明されたような色素DIOC6(3)およびJC-1を利用する。
【０１５２】
MPTの前に未活性化標的細胞において増大したスーパーオキシド濃度をもたらす物質は、マイクロモル量のFK506またはMnTBAP(またはそれらの同等物)の存在下で、細胞と接触され、かつこれらの細胞は、処理後のスーパーオキシドレベルについてアッセイされる。これらの「インヒビター」は、候補化合物の前にまたは同時に、細胞に添加することができる。FK506スクリーニングは、それらの50％有効濃度(EC50)で、阻害されたスーパーオキシド濃度(約75％阻害)の変化を有する物質を同定し、これにより、FK506は、カルシニューリン経路を阻害することにより、単独では作用しない(R. Ziniら、Life Sciences、63(5):357-368[1998])。MnTBAPスクリーニングは、マンガン(III)meso-テトラキス(4-安息香酸)ポルフィリン(「MnTBAP」)のマイクロモル量で、阻害された(＞50％阻害まで)スーパーオキシド濃度の変化を有する物質を同定する。好ましい態様において、候補物質が：1)MPT前に未活性化細胞においてスーパーオキシド濃度を増大した後；および、2)未活性化細胞においてスーパーオキシド濃度の増加が、FK506またはMnTBAP(または同等物)により阻害もしくは低下された後にのみ、候補物質は、第三のスクリーニング段階のために選択される。スクリーニングの第二および第三の両段階は、同じくMPT前の細胞内スーパーオキシド濃度を増加することが、当技術分野において公知のものから、好ましい特性を有する化合物を識別する(例えば、D.A Fennellら、Br. J. of Cancer、84(1O):1397-1404[2001]参照)。
【０１５３】
その後これらの物質は、更に未活性化細胞に対する活性化物質単独および候補物質と一緒にした作用を上回る程度、活性化された対応標的細胞の成長または増殖を阻害する能力(例えば、細胞数への影響)、それらの死を誘導する能力についてスクリーニングされる。
【０１５４】
個別の態様において、スクリーニングは、最初に未活性化標的を選択することにより行われ、これは培養された細胞または組織生検から得たものであることができる。化合物または物質の0.01nMから100mMへの連続希釈を、試験のために行う。連続希釈物は、培養培地と混合することにより、細胞と接触される。未活性化標的細胞におけるスーパーオキシドレベルおよびMPTが、各希釈物について測定され、かつ各エンドポイントについてのEC50が決定される。代わりの局面において、被験細胞は、候補物質または化合物を接触する前に、インヒビターの連続希釈物(前述)を与えられ、次にスーパーオキシドレベルが測定される。阻害アッセイは、化合物のスーパーオキシド産生がFK506またはMnTBAPまたはそれらの同等物により阻害される化合物を、その物質のEC50でスクリーニングする。その後FK506およびMnTBAP(またはそれらの同等物)により阻害される候補物質は、次に未活性化標的細胞に個別に接触されるような、候補物質細胞の連続希釈(0.01nMから100mM)および標的の活性化物質(適量)により、対応する活性化された標的細胞に対してアッセイされる。未活性化細胞に対する活性化物質単独および候補化合物を一緒にした作用を上回る程度、活性化細胞を成長または増殖を阻害するかもしくは殺傷する物質は、本発明の化合物である。
【０１５５】
これらの候補物質は、これを活性化された標的細胞の成長または増殖を選択的に阻害するか、もしくは殺傷する能力を有し、その結果、対象における関連のある標的細胞型の病的成長に関連した状態または疾患を治療する療法にとって有用である。これらの物質は、対象における活性化された標的細胞の病的成長の存在に関連した症状を改善するためにも有用である。
【０１５６】
このスクリーニングで同定された物質または化合物は、下記一般構造
2005502652.tif 000005
またはそれらの鏡像異性体を有する(式中、R1は、脂肪族、アリール、置換された脂肪族、および置換されたアリールからなる群より選択され、かつR2は、置換された脂肪族、置換されたアリール、脂環式、置換された脂環式、複素環、および置換された複素環、NH2、NHC(=O)-R5、、および水素結合形成に参加する任意の置換基からなる群より選択される)。R5は、アリール、複素環、および-R6-NH-C(=O)-R7からなる群より選択され、ここでR6は、1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールおよび複素環からなる群より選択される。R3およびR4の各々は、同じまたは異なることができ、ならびに水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、チオ、ニトロ、低級アルキル置換されたアミノ、低級アルキル置換されたハロ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8個の炭素を有する脂肪族、アリール、置換されたアリール、脂環式、置換された脂環式または複素環、ケトン、アルデヒド、エステルおよびアミドからなる群より選択される。ひとつの局面において：R1はHであり、R4はハロゲンであり、R3はヒドロキシルまたはハロゲンであり、かつR2は、芳香族または複素環である。特に示さない限りは、全ての置換基は、置換されてもされなくても良い。このような化合物の薬学的に許容できる塩は更に本発明により提供される。
【０１５７】
前記スクリーニングにより同定された化合物のより具体的な例は、
2005502652.tif 000006
(式中、R2は、下記群からなる群より選択される
2005502652.tif 000007
)、およびジメチルフェニル(全て異性体)、およびジトリフルオロメチル(全て異性体)、および
2005502652.tif 000008
の構造を有する。
【０１５８】
本発明は更に、下記化合物Bz-423も提供する。
2005502652.tif 000009
【０１５９】
Bz-423は、C-3への疎水性置換基の存在により、臨床用途がベンゾジアゼピンとは異なる。この置換は、末梢ベンゾジアゼピン受容体(「PBR」)への結合を減弱し(Kd約1μM)、かつ中枢ベンゾジアゼピン受容体への結合を妨害するため、Bz-423は鎮静剤ではない。
【０１６０】
前述の注記された3種の特性を有する物質または化合物は、本発明の物質の例である。本発明の化合物は、このスクリーニングにより同定され、動物モデルにおいて確認される。更に本発明により、このスクリーニングにより同定された物質が提供される。
【０１６１】
出願人らは、このスクリーニングを望ましい特性を有する小分子にも使用したが、本発明は、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドのような、このスクリーニングを用いて同定される他の治療様式も包含しており、その結果これは「物質」という用語内であることが意図されている。
【０１６２】
本発明は更に、標的細胞を、有効量の本発明の物質と接触することにより、活性化された標的細胞の細胞成長または増殖を選択的に殺傷および/または阻害する方法も提供する。更に、標的細胞を、有効量の活性化物質および有効量の本発明の物質と接触することにより、活性化された状態または未活性化状態のどちらかの標的細胞の細胞死を選択的に誘導する方法も提供される。
【０１６３】
本発明により、標的細胞を、細胞のミトコンドリア透過性遷移の前に標的細胞におけるスーパーオキシドの形成を阻害する物質、例えばFK506またはその同等物の有効量と接触することにより、標的細胞の細胞死を阻害する方法も提供される。これらの方法は、各々、アルツハイマーおよび虚血性再灌流損傷、例えば神経系支配(neuromotor)の問題など、ならびに卒中のような、神経変性疾患の症状を改善する。
【０１６４】
本発明の前述の方法は、インビボまたはインビボにおいて実践することができる。インビボにおいて実践される場合、この方法は、本発明のスクリーニングにより同定された物質の生物学的有効性を確認するために都合の良い動物モデルを提供する。
【０１６５】
更に有効量の本発明の物質を対象へ投与することによる、そのような療法が必要な対象における、活性化された標的細胞の病理を選択的に阻害する方法が提供される。有効量の本発明の物質の投与は、病的に成長する活性化された標的細胞に関連した症状の改善、または対象におけるそれらの存在に関連した疾患の治療にも役立つ。適当な対象は、非ホジキンリンパ腫患者、慢性リンパ球性白血病患者、皮膚T細胞白血病患者、自己免疫障害を伴う患者、または癌患者(固形腫瘍、リンパ腫、白血病)を含むが、これらに限定されるわけではない。これらの方法において使用するための治療的化合物は、本明細書に説明された化合物に加え、PCT/US00/00578号に提示されたものを含む。
【０１６６】
そのような療法を必要とする対象において未活性化標的細胞の病的成長を選択的に阻害する方法が、更に本発明において提供される。標的細胞を選択的に活性化する有効量の物質および本発明の有効量の物質が、対象へ投与される。本発明の物質の投与は、同時または逐次であることができる。
【０１６７】
本発明のひとつの態様において、Bz-423は、インビボにおいてリンパ系細胞の死を誘導するその能力に基づいて1,4-ベンゾジアゼピンライブラリーから選択される。Bz-423の他のベンゾジアゼピンおよび末梢ベンゾジアゼピン受容体リガンドとの比較は、Bz-423が独自の細胞毒性を有することを明らかにしている(図1)。NZB/Wリンパ球に対するBz-423の活性はB細胞に濃縮され、その結果治療は、T細胞よりもB細胞を2倍多く殺傷する。いくつかの態様において、Bz-423の可能性のあるインビボリンパ球毒性は、自己免疫NZB/Wおよび健常BALB/cマウスへのBz-423(60mg/kg/日を7日間)の投与により試験した。処理後、細胞死の証拠について脾臓リンパ球を分析した。NZB/Wマウスにおいて、リンパ球生存度は減少し、かつB細胞アポトーシスは増加した(表1)。表1は、7日後の、脾細胞生存度(PI)および系統特異的アポトーシス(TUNEL)を示している。対照的に、Bz-423は、生存度を低下せず、またBALB/c脾リンパ球のアポトーシスも増加しなかった。従って、Bz-423は、自己免疫マウス由来のB細胞に特異的に作用する。
【０１６８】
【表１】
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【０１６９】
自己免疫B細胞に対する所定の選択的作用があると仮定して、Bz-423が自己免疫腎炎の進行に影響を及ぼすかどうかを判定するために、更なる試験を行った。例えば、雌NZB/Wマウスに、Bz-423(60mg/kg)またはビヒクルを、6.5ヵ月齢〜9.5ヵ月齢の間、隔日投与した。対照マウスは、全ての細胞要素の膨張および場合によってはワイヤ-ループ病変形成を伴う、びまん性増殖性糸球体腎炎を発症し、平均組織病理学的スコア3+を生じた(図2A)。対照的に、Bz-423を投与したマウスは、平均スコア1+のより軽度の腎炎性の変化を有した(p＝0.002)(図2B)。Bz-423処理されたマウスも、より少ない糸球体IgGを有した(図2Cおよび図2D)(IgG、p＝0.002；C3、p＝0.034)。屠殺時に、対照マウスの83％は、処理群の27％と比べ、異常に高いBUNレベル(≧30mg/dL)を有した(カイ二乗：p＝0.001)。腎炎の組織学的スコアとタンパク尿(＞100mg/dL；p＝0.001)または上昇したBUN(p＝0.039)の間の強力な相関が、確定された。凝集において、これらの測定値は、いくつかの態様において対照と比較して処理された動物においてより少ない疾患を示している。
【０１７０】
より更なる態様において、GC B細胞の病的膨張により特徴付けられる疾患に関連したリンパ系過形成を伴うNZB/Wマウスを、更なる試験に使用した。フローサイトメトリー測定は、Bz-423は、脾臓におけるB細胞画分を減少し(49％±3、対、対照の58％±3；p＝0.05)、T細胞の画分表示では統計学的変化を伴わなかった。免疫組織化学的染色は、この減少は、GC B細胞に対する特異的作用に由来すること明らかにした(図2Eおよび図2F)。Bz-423で処理したマウスは、対照マウスと比べより少ないGCを有し(10mm2当り17±5、対、10±7、p＝0.01)、かつこれらの薬物群中のGC存在量は、対照動物に存在するものよりも、ほぼ50％小さかった(p＝0.01)。更に、Bz-423処理された動物は、主にGCに濃縮された、増大したTUNEL陽性B細胞(約3+、対、1+、p＝0.038)を有した(図2Gおよび2H)。この知見は、いくつかの態様において、GCサイズおよび数の減少は、このコンパートメント内のアポトーシスから生じたことを示している。
【０１７１】
GC B細胞は、発生および生存にB細胞受容体(BCR)刺激を必要とするが、これはそれらを他の成熟細胞から識別する属性である。BCR刺激による活性化が促進するかどうかを、処理した動物におけるGCの選択的減少について説明するために、Bz-423による殺傷を調べた。この仮説を試験するために、受容体架橋の程度が異なるBCR刺激のふたつのモデルを使用した。最初にRamos細胞を、可溶性抗IgM Fab2で処理し、それ自身はアポトーシスを誘導するには不充分である中等度のBCRシグナルを提供した。Ramos細胞は、GC細胞に特徴的な表面マーカーを提示し、成熟B細胞に特徴的なBCRライゲーションに対する反応を示し、ならびにほとんど自然発生的死を伴わずに培養物中で生存するので、ここではRamos細胞を使用した。単独では死滅の誘導に失敗する可溶性抗IgM Fab2は、Bz-423に対する感受性がある(図3A)。実際活性化されたRamos細胞のBz-423による処理は、相乗的な超付加的(supra-additive)死滅反応をもたらす。CD40に対する刺激性抗体、抗IgM活性化が誘導した細胞死(AICD)を排除するシグナルは、Bz-423単独に対する保護を提供せず、またはBz-423に対する抗IgM増感も提供しない(図3B)。
【０１７２】
第二のBCR刺激の活性化モデルにおいて、初代NZB/W B細胞を、BCRおよびFc受容体とを過度に架橋し、ならびに正常な免疫B細胞におけるAICDを誘起する、不死化した全抗IgMと共にインキュベーションした。先の報告と一致するように、NZB/W B細胞は、正常な免疫B細胞と比べ、架橋している受容体により誘導されたアポトーシスに対して抵抗性がある。それにもかかわらず、Bz-423存在下における抗IgMによる刺激は、NZB/W細胞を殺傷する。CD40の共刺激は、BALB/c細胞におけるAICDをブロックする一方で、Bz-423単独に対する保護はほとんどないか、または相乗的条件において死滅する。これらの結果は、受容体架橋の程度には関わりなく、いくつかの態様において活性化細胞はBz-423に対してより感受性があることを示している。
【０１７３】
BCR刺激された未活性化Ramos細胞におけるアポトーシスに関連したシグナルおよびマーカーを比較した。形態に関して、活性化細胞および未活性化細胞の両方の処理は、細胞質空胞化(vaculization)、核凝縮、および形質膜水疱化(blebbing)をもたらす(図4C)。
【０１７４】
B細胞において機能するアポトーシス促進シグナルに対する増感された死の依存性も試験した。1,2-ビス(2-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸(BAPTA)による細胞外カルシウムのキレート化は、非感受性の死を最小に低下させたと同時に、増感された細胞を実質的に保護した(各々、7％、対、71％阻害)。BAPTAの作用は、刺激後1時間添加した場合であっても保護的であるので、これは、急速BCRが誘導したカルシウム流入を鈍化する能力には関係していない。カスパーゼ活性のz-VADによる阻害(未活性化：31％、対、活性化：86％)、シクロスポリン(CsA)によるミトコンドリア透過性遷移(MPT)(未活性化：9％、対、活性化：54％)、およびシクロヘキサミドによるタンパク質合成(未活性化：19％、対、活性化：64％)のみが、増感された細胞を保護した。カルシニューリン阻害(FK506 10nMによる)は、いずれの条件でも保護的でなかった。酸化防止剤ビタミンEおよびスーパーオキシド(O2-)特異的MnTBAPは各々、活性化細胞および未活性化細胞を同程度保護し(〜80％)、これはO2-は、Bz-423が誘導するシグナル伝達において必須事象であることを示唆している。これらの実験は、高濃度のBz-423が、細胞をこれらの他のアポトーシスメディエーターとは関わりなく殺傷する、スーパーオキシドを発生することを示している。
【０１７５】
O2-の選択的インジケーターであるヒドロエチジウムを使用し、活性化細胞および未活性化細胞におけるO2-を測定した。O2-は、未活性化細胞および活性化細胞の両方において、Bz-423への曝露の1時間以内に増加し(図4A)、これはMPTに先行している。MnTBAPおよびビタミンEは、O2-レベルを低下させたが、z-VAD、BAPTAおよびCsAは低下させなかった。O2-の量は、Bz-423濃度の増加に伴い増大し、ならびにBCR刺激非存在下では、24時間で測定した細胞死と相関している。しかし所定のBz-423濃度に関して、BCR刺激は、未活性化細胞と比べO2-を増加させない(図4A〜図4C)。従って、細胞死におけるスーパーオキシドの役割は、活性化細胞において異なる。BCR活性化細胞は、BCR架橋が細胞を、O2-、遺伝子発現、カスパーゼ、およびミトコンドリア依存性過程の発生に対して増感する機構により、低濃度のBz-423によって殺傷される。
【０１７６】
これらの結果は、一部の好ましい態様において、BCR反応の要素が、B細胞を低濃度のBz-423により殺傷され易くすることを明らかにしている。従って、好ましい態様において、低濃度のBz-423のBCR活性化されたB細胞に対する選択的毒性は、この化合物が、BCR刺激に対するそれらの独自の依存性に基づいて、膨張されたGC集団を標的とするための機構を提供する。この機構の理解は本発明の実践には必要ではなく、本発明はこれに限定されるわけではないが、超付加的死滅反応をもたらす、中等度または頑強なBCR架橋のどちらかに呼応して作用することにより、Bz-423は、永続的なGCおよび自己反応性B細胞を支持するために提唱されたふたつの病因機構のどちらかを補償することが考えられる。従って、自己免疫病理進行を支持する同じ刺激は、一部の罹患した細胞に関する選択的治療の標的を提供する。ヒトSLEにおいて、更に、過活性化されたB細胞も、疾患の重要な決定基として関係しており、かつ同様にBCRが生じた反応に左右される。
【０１７７】
好ましい態様において、ベンゾジアゼピンは、コンビナトリアル合成に適合し易く(B.A. Buninら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、91:4708-4712[1994]参照)、ある種の条件下では、いくつかのベンゾジアゼピンは細胞生存に影響を及ぼす(A. Beurdeley-Thomasら、J. Neurooncol.、46:45-56[2000])ので、これが選択される。同じく、ベンゾジアゼピンは、DNAを損傷しないか、もしくはヌクレオチド代謝を妨害しないので、細胞毒性ベンゾジアゼピンは独自の作用様式を有する可能性がある。
【０１７８】
先に説明されたように、本発明のいくつかの好ましい態様は、Bz-423(図5A)を、強力なリード化合物として同定した。Bz-423は、抗不安薬特性を伴うベンゾジアゼピンとは異なり、中枢ベンゾジアゼピン受容体に結合しない。本発明のある種の態様により、形質転換されたRamos B細胞のBz-423と一緒のインキュベーションは、速やかにO2-を発生し、この反応性酸素種(ROS)は、上流シグナルとして機能し、アポトーシスの死の過程を開始することが示されている。この機構の理解は本発明の実践には必要ではなく、本発明はこれに限定されるわけではないが、O2-反応は、Bz-423とミトコンドリア内の標的、恐らくミトコンドリア呼吸鎖(MRC)の間の相互作用から生じることが考えられる。Ramos細胞は、胚中心(GC)のB細胞生理の局面をモデル化している(C.T. Gregoryら、J. Immunol.、139:313-318[1987])ので、本発明は、Bz-423は、インビボにおいてGCに対する活性を有することを企図している。いくつかの態様において、GC B細胞の異常な生存および拡大が疾患を引き起こす(J.P. Portanovaら、Mol. Immunol.、32:117-135[1987]；および、M.J. Shlomchikら、Nat. Rev. Immunol.、1:147-153[2001]参照)ような、狼瘡の(NZB×NZW)F1 (NZB/W)モデルを用い、Bz-423の活性が示されている。好ましい態様において、Bz-423は、GC過形成を特異的に制御し、(NZB×NZW)F1 (NZB/W)マウスモデルにおけるその後糸球体腎炎の発生を制御する。従って本発明は、B細胞アポトーシスにおけるO2-の新規役割を企図し、かつBz-423を、SLEおよび関連障害を管理するための選択的細胞毒性分子の発生のための、新規リード化合物として同定している。
【０１７９】
アポトーシスの後期に付随する高レベルのROSは巨大分子を損傷するが、生理的濃度では、細胞内シグナル伝達経路の範囲を調節する(T. Finkel、J. Leukoc. Biol.、65:337-340[1999])。一部のアポトーシス刺激(例えば、セラミド[C. Garcia-Ruizら、J. Biol. Chem.、272:11369-11377(1997)参照])、デキサメタゾン(J.F. Torres-Rocaら、J. Immunol.、165:4822-4830[2000]参照)、またはTNFα(H. Albrechtら、FEBS Lett.、351:45-48[1994]参照)は、カスパーゼ活性化のような下流エフェクター機構を開始する手段として、それらの死反応の初期にROSを誘導する。同様に、本発明は、Bz-423のミトコンドリアとの相互作用により誘導された初期のO2-反応は、Bリンパ球におけるアポトーシスプログラムをシグナル伝達することを示している。いくつかのB細胞特異性シグナル伝達経路はROSに反応し、そのように携わった場合は、アポトーシスを開始する。例えば、ブルトンのチロシンキナーゼのROSによる活性化(S. Qinら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、97:7118-7123[2000]参照)は、ホスホリパーゼCgのリン酸化を生じ(M. TakataおよびT. Kurosaki、J. Exp. Med.、184:31-40[1996]参照)、これはCa2+依存性のアポトーシスにつながり得る。これおよび関連したROS依存型過程は、B細胞のBz-423に対する易感受性に寄与することがある。
【０１８０】
本発明は、様々な方法で細胞内O2-を増加する多くの小分子を提供し、これはオキシゲナーゼからのO2-の放出、単独の電子還元、酸化物還元酵素の阻害、およびMRC活性の破壊を含むが、これらに限定されるわけではない(A.G. Sirakiら、Free Radic. Biol. Med.、32:2-10[2002]参照)。
【０１８１】
従来の化学療法は、間接的にミトコンドリア機能に障害を与える。しかし本発明のいくつかの態様において、MRCまたはMPT孔（pore）を直接標的とすることが考えられる。インビボにおけるBz-423反応、O2-生成および減少したB細胞生存の重要な要素は、NZB/Wマウスにおいて、Bz-423投与後に認められる。狼瘡のNZB/Wモデルにおいて、病原性自己抗体は、GCから出現するクラススイッチされた活性化B細胞の産物である(J.P. Portanovaら、Mol. Immunol.、32:117-135[1987]；M.J. Shlomchikら、Nat. Rev. Immunol.、1:147-153[2001]；および、Y. Munakataら、Eur. J. Immunol.、28:1435-1444[1998])。ある好ましい態様において、Bz-423は、12週間の投与後、GCの数およびサイズを劇的に低下させ、残留するGCにおけるアポトーシスを増加した。更に、他の脾リンパ球集団においては、減少は有意ではなく、リンパ球減少症の証拠、もしくはサイトカインの変化は検出されなかった(未発表データ)。従って本発明によると、このB細胞集団は、SLE介入の重要な標的であることが考えられる(例えば、M.J. Shlomchikら、前掲参照)。
【０１８２】
正常マウスにおいて生存およびアポトーシス閾値となったGC B細胞は、c-FLIPならびにBCR、CD40、CD80、およびFasを介したシグナル伝達により厳密に調節される(M.V. Eijkら、Trends Immunol.、22:677-682[2001]；および、V.K. Tsiagbeら、Crit. Rev. Immunol.、16:381-421[1996])。この機構の理解は本発明の実践には必要ではなく、本発明はこれに限定されるわけではないが、NZB/W GC B細胞の寿命は、CD81のような共刺激分子増大した発現、FcgRIIB1のようなインヒビトリー受容体のダウンレギュレーション(例えば、Y. Jiangら、Int. Immunol.、11:1685-1691[1999]参照)、および永久的BCR刺激に対する低反応性(例えば、欠陥のある活性化が誘導したB細胞死)(例えば、Y. Kozonoら、J. Immunol.、156:4498-4503[1999]参照)に結びつけられることが考えられる。これに関して、本発明は、BCR刺激は、B細胞を細胞毒性物質に対して増感することにも注目している(例えば、C.E. Linら、Exp. Cell. Res.、244:1-13[1998]参照)。従っていくつかの態様において、受容体ライゲーションが、Bz-423の選択性に寄与することが考えられる。例えば、抗IgMがB細胞をBz-423に対して増感することを示す研究がある。BCR増感の基礎となる分子は、完全には分かっていないが、架橋しているBCRは、それ自身細胞内ROSを上昇すること(例えば、W. Fangら、J. Immunol.、155:66-75[1995]参照)、ならびに狼瘡患者由来のリンパ球は、正常細胞にくらべ、還元されたグルタチオンの貯蔵が減少しかつROSが増大したこと(例えば、P. Gergely Jr.ら、Arthritis Rheum.、46:175-190[2002]参照)は公知である。従って、NZB/W GC B細胞の脆弱性は、一部、Bz-423が誘導したO2-および内因性に発生したROSの相加作用の結果であり、その結果全ての供給源からのラジカルは、これらのリンパ球の限られた還元電位を圧倒するように組み合わされ、アポトーシスを駆動する。
【０１８３】
Bz-423は、O2-依存した様式で細胞死機構に携わるアポトーシス促進分子である。本発明は、ベンゾジアゼピンに関する新規の構造-機能の関係を提供し、SLEの管理に価値がある新規分子標的および薬学的機構を指摘している。
【０１８４】
本発明によると、更にBz-423は、Ramos B細胞を、用量依存的様式で殺傷することが考えられる(図5B)。Bz-423の活性は、ミトコンドリア膜に位置した18KDaの膜貫通タンパク質である末梢ベンゾジアゼピン受容体(PBR)のリガンドと比較したが、その理由は一部のPBRリガンドは、ミトコンドリアからのデスシグナルを変調すると考えられているからである(例えば、A. Beurdeley-Thomasら、J. Neurooncol.、46:45-56[2000]参照)。1-(2-クロロフェニル)-N-メチル-N-(1-メチルプロピル)-3-イソキノリンカルボキシアミド(PK11195)および4'-クロロジアゼパムの両方とも、PBRに密に結合する(各々、KD＝0.3および30nM；しかし、細胞毒性のみはBz-423のED50の10倍を上回る。PBRへの競合アッセイにより、[3H]-PK11195結合を50％低下させるためには、1000倍過剰なBz-423が必要であり、かつ細胞の過剰なPK11195(＞20μM)とのプレ-インキュベーションは、Bz-423活性を阻害しないことを明らかにした。これらのデータは、Bz-423による細胞殺傷は、PBRへの結合からは生じないことを示している。Bz-423をジアゼパムから識別する要素である、ナフチル基(DNAP)またはフェノールヒドロキシル基(DOH)のどちらかを欠いていることは、細胞毒性活性を劇的に低下させるので(図5B)、Bz-423の活性は、その特異的構造に左右される。Bz-423が誘導した細胞毒性は、細胞収縮、核凝縮、細胞質液胞化、膜水疱化、およびDNA断片化(低二倍体DNA；図5Cおよび図5D)により特徴付けられ、アポトーシスと一致している。Bz-423殺傷におけるカスパーゼの役割を探索するために、細胞を、不可逆的カスパーゼインヒビターであるz-VADと共にプレインキュベーションした。z-VADは、DNA断片化により測定したBz-423媒介性アポトーシスを完全に妨害した。z-VADおよびBz-423で処理した細胞の5％未満が、低二倍体DNAを有したのに対し、Bz-423単独で処理した細胞は69％であった(図5D)。しかし、カスパーゼ活性の阻害は、細胞死に対して保護的でなく；細胞の形態は、z-VADを含有する培養物において、Bz-423が依然として細胞の＞80％を殺傷することを明らかにしている(図5C参照)。同様の結果が、他のアポトーシス刺激についても報告されており、カスパーゼ活性の阻止は、DNA断片化を妨害するが全般的細胞死は阻害しない(A.S. Belzacqら、Cancer Res.、61:1260-1264[2001])。
【０１８５】
更に別の態様において、ステート3（state 3）呼吸を支援する条件下での単離されたミトコンドリアの実験において、全細胞に類似したO2反応を明らかにしている。ミトコンドリアは、ADP非存在下でエネルギーが供給されるステート4ではBz-423に反応しない。この機構の理解は本発明の実践には必要ではなく、本発明はこれに限定されるわけではないが、ステート3から4への遷移において、プロトン駆動力(motive force)は、1個の電子還元反応において(例えばユビキノール)においてコンピテントな中間体が、半減期を延長するのに十分な程高くなり、かつこれらの条件は、複合体IIIでのO2のO2-への還元にとって好ましいと考えられる(V.P. Skulachev、Mol. Aspects Med.、20:139-184[1999]参照)。従って、いくつかの態様において、Bz-423が、ステート3から4への転換を誘導することにより、O2-生成することは可能である。複合体Vに結合するマクロライド系天然産物であるオリゴマイシンは、Bz-423同様に、ステート3から4への遷移を誘導し、かつO2-生成する。これらの類似性は、複合体Vも、Bz-423の分子標的であることを示している。複合体Vは、大きい複数のタンパク質の集成体であり、多くの異なる経路において小分子により阻害され得る。しかし、いくつかの態様において、オリゴマイシンとの類似性は、Bz-423は、F1ドメインに存在するオリゴマイシン感受性付与タンパク質を含む、複合体Vの要素に結合することにより、複合体VのATPase活性を阻害することがあることも示唆することが考えられる。
【０１８６】
追加の態様において、Bz-423が携わった死の機構を更に特徴付けるために、細胞内ROS、ΔΨm、シトクロムc放出、カスパーゼ活性化、およびDNA断片化を、経時的に測定した。好ましい態様において、本発明は、B細胞アポトーシスに先に関連づけられたエンドポイントを使用した(例えば、T. Doiら、Int. Immunol.、11:933-941[1999]参照)。Bz-423への曝露後に検出された第一の事象は、特異的にO2-と反応するレドックス感受性物質の、DHEで染色する細胞画分における増加である(平均蛍光強度の用量依存的増加も認められた；図6A)。O2-レベルは、1時間で初期に最大となった後は漸減し、その後4時間連続処理した後再び増加する(図6B)。この2峰性のパターンは、O2-を制限する細胞機構を指摘し、かつ「初期」および「後期」のO2-最大値は、異なるプロセスから生じることを示唆している。ΔΨmの崩壊は、ミトコンドリアの選択的電位差測定プローブであるDiOC6(3)を用いて検出した(N. Zamzamiら、J. Exp. Med.、182:367-377[1995])。勾配の変化は、初期O2-反応後に始まり、5時間までに細胞の＞90％で観察される。ミトコンドリアからのシトクロムc放出は、アポプトソーム形成およびカスパーゼ活性化を可能にする重要な段階である(P. Liら、Cell、91:479-489[1997])が、これは細胞質ゾル画分のイムノブロッティングにより試験した。ビヒクルで処理した細胞における量を上回る細胞質ゾルシトクロムcのレベルが、5時間まで検出される(挿入図、図6B)。この放出は、ΔΨmの破壊と同時に起こり、共にこれらの結果は、ミトコンドリア透過性遷移(MPT)孔の開口と一致する。実際O2-の後期増加は、ΔΨm崩壊およびシトクロムc放出を正確になぞっており、このことはこれらの過程から生じるO2-の第二の上昇を示唆している(例えば、C.M. Luetjensら、J. Neurosci.、20:5715-5723[2000]参照)。pan-カスパーゼ感受性蛍光基質FAM-VAD-フルオロメチルケトンの処理により測定されるカスパーゼ活性化は、勾配変化をなぞっているのに対し、低二倍体DNAの出現は、カスパーゼ活性化に関してわずかに遅れる(図6B)。この機構の理解は本発明の実践には必要ではなく、本発明はこれに限定されるわけではないが、Bz-423は、ミトコンドリア依存性のアポトーシス経路を誘導することが考えられる。
【０１８７】
本発明のいくつかの態様において、Bz-423は、ミトコンドリアを直接標的化すると考えられる。初期のO2-は、カスパーゼ活性化、ΔΨm崩壊およびDNA断片化に先行するので、このROSが調節の役割を有することは可能である。非貪食細胞において、レドックス酵素は、MRCと共に、ROSの主要供給源である(例えば、T. Finkel、J. Leukoc. Biol.、65:337-340[1999]参照)。従っていくつかの態様において、本発明は、これらのシステムのインヒビターが、それらのBz-423誘導されたO2-(1時間)を調節する能力についてアッセイされ、この反応の基礎が決定される(表2)。これらの試薬の中で、MRCの複合体IVに主に作用するNaN3(E. Fosslien、Ann. Clin. Lab. Sci.、31:25-67[2001])、および複合体IIIでのO2-生成を阻止するマイクロモル量のFK-506(R. Ziniら、Life Sci.、63:357-368[1998])のみが、Bz-423を変調する。MRCの成分を阻害する他の物質(例えば、ロテノン、ミクソチアゾール、テノイルトリフルオロアセトン(thenoylirifluoroacetone)、アンチマイシンA、スチグマテリン、およびオリゴマイシン)は、フラビン酵素インヒビターであるジフェニレンヨードニウムと共に、Ramos細胞においてそれらが独立して有意なROSを生成することよりも情報は少ない。まとめるとこれらの知見は、ミトコンドリアが、Bz-423誘導されたO2-の供給源であること、およびMRCの成分は、この反応に関与していることを示唆している。FK506による阻害は、カルシニューリンまたはFK506結合タンパク質のどちらかとの結合から生じるが、これらのタンパク質に密に結合する天然生成物(例えば、各々、ラパマイシンおよびシクロスポリンA)は、Bz-423 O2-反応を減弱しない(表2)。表2は、ROSインヒビターのBz-423活性に対する作用を示している。
【０１８８】
【表２】
2005502652.tif 000011
A.データは、Bz-423単独の反応に対し正規化されている。
【０１８９】
この機構の理解は本発明の実践には必要ではなく、本発明はこれに限定されるわけではないが、Bz-423がO2-生成する方法は、ミトコンドリア内のタンパク質またはO2-生成するようにミトコンドリアをシグナル伝達する別のコンパートメントの標的への結合に関連していることが考えられる。これらの代替物の間を識別するために、単離されたラット肝ミトコンドリアを、Bz-423の存在下または非存在下におけるROS産生についてアッセイした。ROSは、Espostiにより先に説明されたような、DCFH-DAのDCFへの酸化をモニタリングすることにより検出した(M.D. Esposti、Methods Cell. Biol.、65:75-96[2001]参照)。このアッセイにおいて、DCF生成速度は、約15分間のずれの後に増加し、この間に、ミトコンドリア内の内因性に還元する同等物は消費され、かつこのプローブ上の酢酸エステル部分は加水分解され、レドックス活性種であるDCFHを生じる。ステート3呼吸(コハク酸エステル＋ADP)を支持する好気的条件下で、複合体III内のユビキノール-シトクロムcレダクターゼを阻害することによりO2-生成するアンチマイシンA、およびBz-423の両方が、ROS生成速度を、溶媒対照と比べほぼ2倍増加する(Esposti、前掲参照)(図7A)。ミトコンドリアの膨潤は認められず、Bz-423はMPT孔を直接標的としないことが示されている(A.S. Belzacqら、Cancer Res.、61:1260-1264[2001])(図7B)。Bz-423とアンチマイシンAのいずれも、細胞下S15画分(細胞質ゾルおよびミクロソーム；図7C)において実質的ROSを生成せず、ならびにBz-423は、ミトコンドリアがステート4(コハク酸エステル＋オリゴマイシン)にあっても、ROSを刺激しないが、アンチマイシンAはこれらの条件下で活性化される(図7D)。まとめると、これらの実験は、ミトコンドリアは、Bz-423の分子標的を含み、かつステート3呼吸は、O2-反応を必要とすることを明らかにしている。
【０１９０】
全細胞における観察にミトコンドリアについて得られたデータを関連させるために、単離したミトコンドリアを、DHEおよびDIOC6(3)で探索した。ステート3および4の両方において、ミトコンドリアはDIOC6(3)で明るい蛍光を発し、これはΔΨmが無傷であることを示している(図7E)。Bz-423の添加は、測定経過にわたり、DIOC6(3)シグナルを変化させず、このことは、ΔΨmが崩壊されていないことを示している。対照的に、プロトノホアCCCPはΔΨmを破壊し、これは緑色蛍光を消滅する。内因性O2-によるDHE酸化は、ミトコンドリア内で赤色蛍光を発生する。Bz-423は、ステート4において対照に勝るO2-を誘導することはない。しかしDHE蛍光は、ステート3呼吸に好ましい緩衝液中でミトコンドリアをBz-423と共にインキュベーションした後には顕著に増大され、これは上昇したO2-レベルを反映している。まとめると、これらの実験は、DCFアッセイの結果を確認し、ミトコンドリア内のROS反応が、全細胞において認められるものと一致することを明らかにし、かつ初期O2-はミトコンドリア膜を隔てた勾配の崩壊からは生じないという仮説を裏付ける証拠を提供している(図6B参照)。
【０１９１】
いくつかの態様において、本発明により、Bz-423誘導されたアポトーシスは、初期O2-反応に左右されることが考えられる。O2-がBz-423誘導されたアポトーシスに必要であるかどうかを判定するために、本発明のいくつかの態様は、アポトーシス過程のROSに対する依存性を調べた。Bz-423誘導されたO2-の形成を阻害するFK506で予め処理した細胞は、カスパーゼ活性化、ミトコンドリアの脱分極、DNA断片化、および細胞死を有意に阻害する(図8A)。更に細胞をBz-423と共に、初期O2-反応が最大になる時点(図6B参照)でまで、約1時間インキュベーションした後、FK506を添加したところ、細胞死に対する保護の有意な減少を提供した(図8B)。ROSを捕捉する酸化防止剤であるビタミンE、またはO2-ジスムターゼ擬態であるMnTBAPと共にプレ-インキュベーションする細胞は、各々、同じくこれらのエンドポイントを減弱する(図8A)。MnTBAPは、Bz-423が携わったダウンストリームエフェクターの影響する時点での作用が若干少なく、その理由はO2-不均化はH2O2を生じ、これも同じエフェクターの引き金をひくからである(T. Ohseら、J. Inor. Biochem.、85:201-208[2001])(図8A)。これらのデータは、Bz-423による細胞殺傷はO2-に左右されることを明らかにしている。
【０１９２】
より更なる本発明の態様は、ROSを誘導し、かつ初代Bリンパ球をインビボにおいて殺傷するBz-423の使用法を提供する。狼瘡のNZB/Wモデルにおいて、脾GC B細胞は過剰に活性化され、かつ病的に拡大される。このコンパートメント内の体細胞の高突然変異(hypermutation)は、抗DNA抗体および他の自己抗体を産生し、そのサブセットは病原性であり、かつ糸球体腎炎の発生に寄与している(例えば、J.P. Portanovaら、Mol. Immunol.、32:117-135[1987]；Y. Munakataら、Eur. J. Immunol.、28:1435-1444[1998]；および、A.N. TheofilopoulosおよびF.J. Dixon、Adv. Immunol.、37:269-390[1985]参照)。Ramos細胞挙動は、GC B細胞の多くの反応の類例であるので(C.T. Gregoryら、J. Immunol.、139:313-318[1987]参照)、本発明の好ましい態様では、Bz-423は、恐らく治療上有用であるNZB/Wマウスにおいて活性を有することが考えられる。Bz-423のNZB/Wリンパ球に対する作用を特徴付けるために、マウスに、単回投与でBz-423(60mg/kg；n＝4)またはビヒクル(n＝4)のどちらかを投与し、2時間後に屠殺した。この用量は、注射後1時間で、約5μMのピーク血清レベルを提供し、これはインビトロのEC50とほぼ同じである(図5B参照)。Bz-423は、脾において、対照に比べ頑強なROS生成を誘導する。これらの知見に基づいて、マウスモデルにおいてBz-423がリンパ球毒性であるかどうかを判定するために、これを7日間投与(60mg/kg/日)した。細胞の動員または増殖が脾細胞集団を有意に変化させないように、短い時間枠を選択した。屠殺後のフローサイトメトリー分析は、Bz-423処理された動物におけるリンパ球生存度を低下させたこと(81±1、対、85±1；P＝0.006)、およびB細胞アポトーシスは対照に比べ増加された(32±2、対、25±2；p＝0.02)ことを示した。生存度の低下は比較的小さく、その理由は初期アポトーシス細胞は、インビボにおいて細網内皮系により迅速にクリアランスされるからである(N. Zamzamiら、J. Exp. Med.、182:367-377[1995])。T細胞アポトーシス頻度の増加は認められない(対照および処理の両方について12±4；P＝0.3)。
【０１９３】
Bz-423は、NZB/Wマウスにおいてリンパ増殖性および自己免疫疾患を軽減する。ある態様において、Bz-423が、NZB/Wマウスにおける疾患の進行を変化させるかどうかを判定するために、追加試験を行った。これらの試験のエンドポイントは、各々、GC B細胞過形成、糸球体腎炎、および自己抗体力価の測定であった。ひとつのプロトコールにおいて、6.5ヵ月齢〜9.5ヵ月齢の雌NZB/Wマウスに、Bz-423(60mg/kg/隔日；n＝25)またはビヒクル(DMSO水溶液；n＝20)を投与した。この時間枠は、疾患の組織学的発症後に始まり、重度の腎炎が通常観察される時点まで継続する(例えば、A.N. TheofilopoulosおよびF.J. Dixon、Adv. Immunol.、37:269-390[1985]参照)。NZB/Wマウスにおける疾患に関連したGC過形成は、正常な脾構造を歪める白脾髄の拡大につながる。全ての処理動物および対照動物からの脾切片を分析し、Bz-423を与えられたマウスにおける白脾髄の減少が明らかになった(1〜2+、対、3〜4+；P＝0.018)。Bz-423投与マウスは、対照と比べ、40％少ないGCを有し(10mm2につき10±2、対、17±1；P＝0.009)、ならびに処理したマウスにおけるGCは、対照よりも40％小さかった(20±2、対、35±5×103mm2；P＝0.013)。更にBz-423処理された動物由来の脾は、対照よりも多い、GC内TUNEL陽性B細胞(約3+、対、1+；P＝0.038)を有し、TUNEL染色のこのような差異は、脾の他の領域では認められなかった。これらの観察は、GCの減少は、このコンパートメント内のアポトーシス増加から生じることを示唆している。いくつかの態様において、脾細胞集団における変化は、フローサイトメトリーによっても調べた。この試験終了時に、B細胞に対する特異的作用が認められ(Bz-423：59±3、対照：67±2％；P＝0.03)、T細胞に対する作用は測定できず(Bz-423：16±2、対照：17±2％；P＝0.5)、これは、組織化学的知見と一致している。
【０１９４】
組織学に基づいて、対照の60％(20匹中12匹)は重度の腎炎(≧2+)を有したのに対し、Bz-423処理されたマウスのわずか16％(25匹中4匹)しか疾患を有さなかった(c2：P＝0.003)。対照動物における疾患は、全細胞要素の拡大および場合によってはワイヤ-ループ病変形成を伴う、びまん性増殖性糸球体腎炎により特徴付けられ、これは平均組織病理学的スコア3+に一致している。対照的に、Bz-423マウスは、より軽度の変化(1+；P＝0.002)およびより少ないIgGの糸球体沈着(Bz-423について1+、対、対照について3+；P＝0.002)を有する。本試験の終了時に、対照の83％が、異常に高いBUN(≧30mg/dL)を有したのに対し、処理群27％であった(c2：P＝0.001)。同様の傾向が、タンパク尿についても認められた：対照の49％は、有意なタンパク尿(＞100mg/dL)を有したのに対し、Bz-423処理されたマウスは18％であった(c2：P＝0.1)。まとめると、これらのデータは、Bz-423投与されたマウスは、対照よりもより少ない疾患を有することを示している。
【０１９５】
NZB/Wマウスのアザチオプリンおよびメチルプレドニソロンのようなリンパ球毒性薬による処理は、総血清の抗DNAレベルを有意に変化させることなく、腎炎を軽減することができる(例えば、M.C. GelfandおよびA.D. Steinberg、Arthritis Rheum.、15:247-255[1972]参照)。同様に、抗DNAおよびIgG力価を、本試験終了後に測定し、両群間に有意差は認められなかった(例えば、Bz-423抗dsDNA：789±145、対照：733±198U/mL；P＝0.5；Bz-423 IgG：6.7±0.8、対照：5.5±1.0mg/mL；P＝0.3)。自己抗体はいくつかのB細胞亜型により生成されるが、Bz-423は、病原性自己抗体部位発生部位であるGCを減少する。
【０１９６】
III. 例証的ベンゾジアゼピン誘導体の合成
本発明の化合物は、ベンゾジアゼピン化合物である。一部の局面において、ベンゾジアゼピン化合物は、下記構造
2005502652.tif 000012
またはその鏡像異性体を有し(式中、R1は、脂肪族またはアリールであり；R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、、または水素結合形成に参加する残基であり；ここでR5は、アリール、複素環、および-R6-NH-C(=O)-R7または-R6-C(=O)-NH-R7であり、ここでR6は、1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールまたは複素環であり、R3およびR4の各々は、独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8個の炭素および1〜20個の水素を有する脂肪族基、アリールまたは複素環である。）；または、それらの薬学的に許容できる塩、プロドラッグもしくは誘導体である。
【０１９７】
前記構造において、R1は、1〜20個の炭素および1〜20個の水素のヒドロカルビル基である。好ましくはR1は、1〜15個の炭素を有し、より好ましくは1〜12個の炭素を有する。好ましくはR1は、1〜12個の水素を有し、より好ましくは1〜10個の水素を有する。従ってR1は、脂肪族基またはアリール基である。
【０１９８】
「脂肪族」という用語は、通常アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環式として公知の基を表わす。本明細書において使用される「アリール」という用語は、フェニル環のような1個の芳香環、または互いに結合された(例えばビスフェニル)または互いに融合された(例えば、ナフタレンまたはアントラセン)2個もしくはそれよりも多い芳香環を表わす。アリール基は任意に、低級脂肪族基(例えば、C1-C4アルキル、アルケニル、アルキニル、またはC3-C6脂環式)により置換することができる。加えて、脂肪族基およびアリール基は更に、-NH2、-NHCOCH3、-OH、低級アルコキシ(C1-C4)、ハロ(-F、-Cl、-Brまたは-I)のような、1つまたは複数の官能基により置換することができる。R1は第一に非極性部分であることが好ましい。
【０１９９】
前記構造において、R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、または水素結合に参加する部分であることができ、ここでR5は、アリール、複素環、R6-NH-C(=0)-R7または-R6-C(=O)-NH-R7であり、ここでR6は、1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールまたは複素環である。「脂肪族」および「アリール」という用語は、先に定義されている。
【０２００】
本明細書において使用される「水素結合に参加する部分」という用語は、プロトンを受容または供給することができ、これにより水素結合を形成する基を表わす。
【０２０１】
水素結合に参加する部分のいくつかの特に非限定的な例は、当技術分野において周知である、フルオロ、酸素含有基および窒素含有基を含む。水素結合に参加する酸素含有基のいくつかの例は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級カルボニル、低級カルボキシル、低級エーテル、およびフェノール基を含む。本明細書において使用される修飾語「低級」とは、各酸素含有官能基が結合している低級脂肪族基(C1-C4)を意味する。
【０２０２】
従って例えば、「低級カルボニル」という用語は、特に、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒドを意味する。
【０２０３】
水素結合形成に参加する窒素含有基のいくつかの非限定的な例は、アミノ基およびアミド基を含む。加えて、酸素および窒素の両原子を含む基も水素結合形成に参加することができる。このような基の例は、ニトロ基、N-ヒドロキシ基および亜硝酸(nitrous)基を含む。
【０２０４】
本発明において水素結合受容体は、芳香環のπ電子であることも可能である。しかし本発明の水素結合参加者は、ホウ素のような金属原子を含むそのような基は含まない。更に本発明の実践の範囲内で形成された水素結合は、「二水素結合」として知られている2個の水素の間に形成されたものは含まない(このような二水素結合の更なる説明については、R.H. Crabtree、Science、282:2000-2001[1998]参照)。
【０２０５】
「複素環」という用語は、例えば、1つまたは複数のヘテロ原子を含む3〜6員の芳香族または非芳香族の環を表わす。ヘテロ原子は、同じまたは互いに異なることができる。好ましくは、このようなヘテロ原子の少なくとも1個は窒素である。この環状複素環に存在することができる他のヘテロ原子は、酸素および硫黄を含む。
【０２０６】
芳香族および非芳香族の環状複素環は、当技術分野において周知である。いくつかの限定されない芳香族環状複素環の例は、ピリジン、ピリミジン、インドール、プリン、キノリンおよびイソキノリンを含む。限定されない非芳香族複素環化合物の例は、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロリジンおよびピラゾリジンを含む。酸素含有環状複素環の例は、フラン、オキシラン、2H-ピラン、4H-ピラン、2H-クロメンおよびベンゾフランを含むが、これらに限定されるわけではない。硫黄含有環状複素環の例は、チオフェン、ベンゾチオフェン、およびパラチアジンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２０７】
窒素含有環の例は、ピロール、ピロリジン、ピラゾール、ピラゾリジン、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピリジン、ピペリジン、ピラジン、ピペラジン、ピリミジン、インドール、プリン、ベンズイミダゾール、キノリン、イソキノリン、トリアゾール、およびトリアジンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２０８】
2個の異なるヘテロ原子を含む環状複素環の例は、フェノチアジン、モルホリン、パラチアジン、オキサジン、オキサゾール、チアジン、およびチアゾールを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２０９】
この環状複素環は任意で、脂肪族、ニトロ、アセチル(すなわち、-C(=O)-CH3)、またはアリール基から選択された1つまたは複数の基により更に置換される。
【０２１０】
R3およびR4の各々は、独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、または置換されたアミノ(例えば低級アルキル置換されたアミノ、またはアセチルアミノもしくはヒドロキシアミノ)、または1〜8個の炭素および1〜20個の水素を有する脂肪族基であることができる。R3およびR4の各々が脂肪族基である場合、これは更に、前述のようなヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノまたは置換されたアミノ基のような1つまたは複数の官能基により置換することができる。「脂肪族」という用語は先に定義されたものである。あるいはR3およびR4の各々は、水素であることができる。
【０２１１】
多くの1,4-ベンゾジアゼピンが、tile C3位で環状複素環に導入されるキラリティーのために、光学異性体として存在することは周知である。光学異性体は、文献において時には、L異性体またはD異性体として説明されることがある。あるいはこれらの異性体は、R対掌体およびS対掌体(enantiomorph)とも称される。簡便化のために、これらの異性体は、対掌体または鏡像異性体と称する。本明細書において説明される1,4-ベンゾジアゼピン化合物は、それらの鏡像異性体型に加え、ラセミ混合物も含む。従って本明細書において「ベンゾジアゼピンまたはそれらの鏡像異性体」の使用は、全ての対掌体に加えそれらのラセミ混合物を含む、説明されたまたは示されたベンゾジアゼピンを意味する。
【０２１２】
前記説明より、多くの具体例は、前記一般式で表わされることは明らかである。従ってひとつの例において、R1は脂肪族であり、R2は脂肪族であるのに対し、別の例においては、R1はアリールであり、かつR2は水素結合形成に参加する部分である。あるいは、R1は脂肪族であり、かつR2は-NHC(=O)R5であるかまたは水素結合に参加する部分であることができ、ここでR5は、アリール、複素環、-R6-NH-C(=O)-R7または-R6-C(=O)-NH-R7であり、ここでR6は1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリール、または複素環である。各置換基の位置での特定の基の選択から生じる多種多様な亜組合せが可能であり、このような組合せは全て本発明の範囲内である。
【０２１３】
更に本開示を通じて与えられた数値の範囲は、その範囲内のあらゆる可能な部分範囲が考えられる融通性のある範囲として構成されることは理解されるべきである。例えば、1個〜10個の炭素の範囲を有する基の説明は、部分範囲、例えば、1個〜3個、1個〜5個、1個〜8個、または2個〜3個、2個〜5個、2個〜8個、3個〜4個、3個〜5個、3個〜7個、3個〜9個、3個〜10個などの炭素を有する基も企図している。従って、1個〜10個の範囲は、多くの可能性のある部分範囲が明確に企図されている範囲の外側境界を表わすこととが理解されるべきである。別の状況における企図される範囲の追加例で、このような範囲がその中に同様の部分範囲を含むようなものを本開示を通じて認めることができる。
【０２１４】
本発明のベンゾジアゼピン化合物の一部の具体例は以下を含む。
2005502652.tif 000013
2005502652.tif 000014
2005502652.tif 000015
【０２１５】
まとめると、多数のベンゾジアゼピン化合物が本明細書において示されている。これらのベンゾジアゼピン化合物の1種または複数を、本明細書の他所に説明されたような、細胞死に関連した様々な調節不良障害を治療するために使用することができる。前述のベンゾジアゼピンは、薬物スクリーニングアッセイおよび他の診断法においても使用することができる。
【０２１６】
IV. 薬学的組成物、製剤、ならびに例証的投与経路および投与量の考察
様々な考えられる医薬品および薬学的組成物の例証的態様を、以下に提供する。
【０２１７】
A. 医薬品調製のための化合物としてのベンゾジアゼピン誘導体
本発明のベンゾジアゼピン化合物は、細胞死の調節不良、異常な細胞成長および過増殖に関連した様々な状態を治療する医薬品の調製において有用である。
【０２１８】
さらに、これらの化合物は、ベンゾジアゼピンの有効性が公知であるまたは推定されるような他の障害を治療する医薬品の調製にも有用である。このような障害は、神経障害(例えば、てんかん)または神経筋障害を含むが、これらに限定されるわけではない。化合物の医薬品を調製する方法および技術は、当技術分野において周知である。薬学的製剤および送達経路の例を、以下に説明する。
【０２１９】
当業者は、多くの具体的態様を含む、本明細書に説明された化合物の1種または複数が、標準の製薬手法を適用することにより調製されることを理解するであろう。このような医薬品は、薬学の技術分野において周知である送達法を用い、対象へ送達することができる。
【０２２０】
B. 薬学的組成物および製剤の例
本発明のいくつかの態様において、これらの組成物は、単独で投与される一方で、一部の別の態様においては、これらの組成物は、少なくとも1種の先に定義したような活性成分/物質(例えば、ベンゾジアゼピン誘導体)を、固形支持体と共に、あるいは1種または複数の薬学的に許容できる担体および任意に他の治療的物質共に含有する薬学的製剤において存在することが好ましい。各担体は、その製剤の他の成分と相溶性があり、対象にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。
【０２２１】
考えられる製剤は、経口、経直腸、鼻腔内、局所(経皮、頬腔内、および舌下を含む)、膣内、非経口(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む)および肺内投与に適したものを含む。いくつかの態様において、製剤は、単位剤形で都合良く提供され、薬局の技術分野内で公知の方法により調製される。このような方法は、活性成分を、1種または複数の補助成分を構成している担体と共に会合させる段階を含む。一般にこれらの製剤は、活性成分を、液体担体もしくは細かく粉砕された固形担体または両方と均一かつ密接に会合(例えば、混合)させ、次に必要であるならば製品に成形することにより調製される。
【０２２２】
経口投与に適した本発明の製剤は、各々は好ましくは、予め定められた量の活性成分を含有する、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤として；散剤または顆粒剤として；水性もしくは非水性液体の液剤または懸濁剤として；または、水中油型液体乳剤もしくは油中水型液体乳剤としてなど、個別の単位として存在することができる。別の態様において、活性成分は、巨丸剤、舐剤またはパスタ剤などとして存在する。
【０２２３】
いくつかの態様において、錠剤は、少なくとも1種の活性成分および任意に1種または複数の補助物質/担体を含有し、これは各物質の圧縮または成形により作製される。好ましい態様において、圧縮錠剤は、粉末または顆粒のような自在流れ型の活性成分を、任意に結合剤(例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えば、繊維素(starch)グリコール酸ナトリウム、架橋したポビドン、架橋したカルボキシメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤または分散剤と混合し、適当な機械で圧縮することにより調製される。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤により含水した粉末とした化合物(例えば、活性成分)の混合物を適当な機械で成形することにより作製される。錠剤は、任意に被覆してもまたは切り込み線をいれても良く、ならびに例えば望ましい放出プロファイルを提供するために変動する割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いることにより、活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化しても良い。錠剤は任意に、胃ではなく腸管の一部で放出するために、腸溶性コーティングを提供する段階もできる。
【０２２４】
口腔内局所投与に適した製剤は、通常ショ糖およびアカシアガムまたはトラガカントガムである矯味矯臭基剤中に活性成分を含有するトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシアガムのような不活性基剤中に活性成分を含有する口内錠；ならびに、適当な液体担体中に活性成分を含有する含嗽剤を含む。
【０２２５】
本発明の局所投与のための薬学的組成物は、任意に、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、散剤、液剤、パスタ剤、ゲル剤、噴霧剤、エアロゾルまたは油剤として製剤化される。代替的態様において、局所製剤は、活性成分、および任意に1種または複数の賦形剤または希釈剤が含浸された絆創膏もしくは接着性硬膏のような、貼付剤または包帯を含む。好ましい態様において、局所製剤は、皮膚または他の罹患部位を通じた活性物質の吸収または浸透を増強する化合物を含有する。このような皮膚浸透増強剤の例は、ジメチルスルホキシド(DMSO)および関連した類似体を含む。
【０２２６】
望ましいならば、クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも約30質量％の多価アルコール、すなわち、2個またはそれよりも多いヒドロキシル基を有するアルコール、例えばプロピレングリコール、ブタン-1,3-ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコールならびにそれらの混合物を含む。
【０２２７】
いくつかの態様において、本発明の油相乳剤は、公知の方法で、公知の成分により構成される。この相は典型的には、単独の乳化剤(さもなければ公知のエマルゲン(emulgent))を含み、いくつかの態様においては、この相のために更に、少なくとも1種の乳化剤の脂肪もしくは油分または脂肪および油分の両方との混合物を含有することが望ましい。
【０２２８】
好ましくは、親水性乳化剤は、安定剤として作用するように、親油性乳化剤と共に含まれる。いくつかの態様においては、油分および脂肪の両方を含むことも好ましい。まとめると、乳化剤は、安定剤を伴うまたは伴わずに、いわゆる乳化ワックスを製造し、このワックスは、油分および/または脂肪と共に、クリーム製剤において油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を作製する。
【０２２９】
本発明の製剤における使用に適したエマルゲンおよび乳剤安定剤は、Tween 60、Span 80、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリルおよびラウリル硫酸ナトリウムがある。
【０２３０】
薬学的乳剤製剤において使用されるほとんどの油分中の活性化合物/物質の溶解度は非常に低い可能性が高いため、製剤のための適当な油分および脂肪の選択は、望ましい特性(例えば、化粧料的特性)の達成に基づいている。従ってクリーム剤は、チューブまたは他の容器から流れ出ることを避けるのに適した粘稠度を伴う、油っぽくなく、非汚染性でかつ洗浄可能な製品が好ましい。直鎖または分枝鎖の、一塩基性または二塩基性のアルキルエステル、例えばジ-イソアジピン酸エステル、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸2-エチルヘキシル、またはCrodamol CAPとして公知の分枝鎖エステルの配合物を使用することができ、後の三種が好ましいエステルである。これらは、必要とされる特性に応じて、単独で、または組合わせて使用することができる。あるいは、白色軟パラフィンおよび/もしくは流動パラフィンまたは他の鉱油のような高い融点の脂質を使用することができる。
【０２３１】
眼への局所投与に適した製剤も、活性成分が、適当な担体、特にその物質の水性溶媒中に溶解または懸濁された点眼剤を含む。
【０２３２】
経直腸投与のための製剤は、例えばココアバターまたはサリチル酸のような適当な基剤を伴う坐剤として存在することができる。
【０２３３】
膣内投与に適した製剤は、該物質に加え、当技術分野において適していることが公知である担体を含有する、ペッサリー、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、泡剤またはスプレー剤として存在することができる。
【０２３４】
担体が固形である鼻腔内投与に適した製剤は、鼻から吸い込む、すなわち鼻の傍に持ち上げられた粉末の容器から鼻道を通って迅速吸入(例えば強制)する方法で投与される、例えば約20μm〜約500μmの範囲の粒子サイズを有する、粗末を含む。別の担体が液体である投与に適した製剤は、鼻腔用噴霧剤、液滴、またはネブライザーによるエアロゾルを含むが、これらに限定されるわけではなく、該物質の水性または油性溶液を含む。
【０２３５】
非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および処方を意図されたレシピエントの血液と等張とする溶質液を含有することができる、水性および非水性の等張の滅菌した注射液；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含有することができる、水性および非水性の滅菌懸濁剤、ならびに化合物を血液成分または1つまたは複数の臓器を標的化するようにデザインされているリポソームまたは他の微粒子システムを含む。いくつかの態様において、これらの製剤は、例えば、アンプルおよびバイアルのような、単回投与または反復投与のための密封容器中に存在/製剤化され、ならびに使用直前に、例えば注射用水のような滅菌液体担体の添加のみを必要とする、凍結し乾燥した(凍結乾燥)状態で保存されてもよい。即時調合注射液および懸濁液を、先に説明したような滅菌散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。
【０２３６】
好ましい単位剤形製剤は、物質の、本明細書において先に言及されたような、一日量または単位、分割日量(daily subdose)、またはそれらの適当な画分を含有するものである。
【０２３７】
本発明の製剤は、先に特に言及した成分に加え、問題の製剤の型に関して当技術分野において都合の良い他の物質を含有することができることは理解されるべきであり、例えば経口投与に適したものは、甘味剤、増粘剤および香味剤のような更なる物質を含むことができる。本発明の物質、組成物および方法は、他の適当な組成物および療法と組合わせることができることも意図されている。更に別の製剤は任意に、食品添加剤(適当な甘味剤、香料、着色料など)、植物栄養剤(phytonutrient)(例えば、亜麻仁油)、鉱物(例えば、Ca、Fe、Kなど)、ビタミン、および他の許容できる組成物(例えば、複合リノレイン酸)、増量剤、および安定剤などを含む。
【０２３８】
C. 例証的投与経路および投与量の考察
例えば、リポソーム封入、微粒子、マイクロカプセル、受容体媒介したエンドサイトーシスなどの、様々な送達システムが知られており、本発明の治療的物質(例えば、ベンゾジアゼピン誘導体)を投与するために使用することができる。送達法は、動脈内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、および経口経路を含むが、これらに限定されるわけではない。特定の態様において、本発明の薬学的組成物が治療が必要な領域に局所的に投与されることが望ましいことがあり；これは、例えば手術時の局所輸注、注射またはカテーテル法により達成されるが、これらに限定されない。
【０２３９】
本明細書においてそれらの意図された目的に関して有効であると確定された物質は、標的細胞の病的成長およびこれに関連した状態に易罹患性または発症のリスクのある対象または個体へ投与することができる。物質がマウス、ラットまたはヒト患者のような対象へ投与される場合、この物質は、薬学的に許容できる担体に添加することができ、ならびに全身的または局所的に対象へ投与することができる。有益に治療され得る患者を決定するために、組織試料を患者から採取し、その細胞を、該物質に対する感受性についてアッセイする。
【０２４０】
治療的量は、経験的に決定され、これは治療される病理、治療される対象ならびに物質の有効性および毒性により変更される。動物に送達される場合、この物質の有効性を更に確認する方法が有用である。動物モデルの一例は、MLR/MpJ-lpr/lpr(「MLR-lpr」)(Jackson Laboratories、バーハーバー、MEから入手可能)である。MLR-lprマウスは、全身性自己免疫疾患を発症する。あるいは他の動物モデルは、例えば、ヌードマウスに本明細書に定義された過増殖性細胞、癌細胞または標的細胞を約105〜約109個、皮下接種することにより、腫瘍成長を誘導することにより発症することができる。腫瘍が確立された時点で、本明細書に説明された化合物が、例えば腫瘍周辺への皮下注射により投与される。腫瘍サイズの縮小を決定するための腫瘍の測定は、1週間に2回、ベニエルキャリパー(venier caliper)を用いて行われる。他の動物モデルも、適宜使用することができる。前述の疾患および状態に関するそのような動物モデルは、当技術分野において周知である。
【０２４１】
いくつかの態様において、インビボ投与は、1回投与、治療過程を通じ連続的または間欠的に実行される。投与の最も有効な手段および用量を決定する方法は、当業者に周知であり、かつ療法に使用される組成物、療法の目的、治療される標的細胞、および治療される対象に応じて変動する。単回または反復投与は、担当医により選択された投与量レベルおよびパターンにより実行される。
【０２４２】
これらの物質の適当な用量剤形および投与法は、当業者により容易に決定される。好ましくは、これらの化合物は、約0.01mg/kg〜約200mg/kg、より好ましくは約0.1mg/kg〜約100mg/kg、更により好ましくは約0.5mg/kg〜約50mg/kgで投与される。本明細書に説明された化合物は、別の物質(例えば、増感する物質)と共に同時投与される場合、その有効量は、該物質が単独で使用される場合よりも少なくてよいことがある。
【０２４３】
薬学的組成物は、経口、鼻腔内、非経口または吸入療法により投与することができ、ならびに錠剤、トローチ剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、アンプル、坐剤またはエアロゾルの形をとることができる。これらは更に、水性または非水性希釈剤中の活性成分の懸濁剤、液剤、および乳剤、シロップ剤、顆粒剤または散剤の形をとることもできる。薬学的組成物は、本発明の物質に加え、他の薬学的活性化合物または複数の本発明の化合物を含有することもできる。
【０２４４】
より具体的に述べると、活性成分とも称される本発明の物質は、経口、経直腸、鼻腔内、局所(経皮、エアロゾル、頬腔内および舌下を含むが、これらに限定されるわけではない)、経膣、非経口(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含むが、これらに限定されるわけではない)および肺内を含むが、これらに限定されるわけではないどちらか適当な経路により、療法のために投与することができる。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに治療される疾患により変動することも理解される。
【０２４５】
理想的には、この物質は、罹患部位で活性化合物の最高濃度を達成するように投与されなければならない。これは、例えば、任意に、生理食塩水内の物質の静脈内注射、または活性成分を含有する、例えば、錠剤、カプセル剤またはシロップ剤などの経口投与により達成される。
【０２４６】
この物質の望ましい血液レベルは、罹患組織内で活性成分の治療的量を提供するための連続輸注により維持してもよい。機能的組合せの使用は、各個別の治療的化合物または薬物が単独で使用される場合に必要とされる量よりも、各抗ウイルス剤成分のより低い総用量を必要とする治療的組合せを提供し、これにより副作用を軽減することが考えられる。
【０２４７】
D. 例証的同時投与経路および投与の考察
本発明は、本明細書において説明された化合物の1種または複数の追加の活性物質との同時投与に関連する方法も含む。実際、本発明の化合物を同時投与することにより、先行技術の療法および/または薬学的組成物を増強する方法を提供する段階は本発明の更なる局面である。同時投与法において、これらの物質は、これらの物質は、同時または逐次に投与することができる。ひとつの態様において、本明細書に説明された化合物は、他の活性物質の前に投与される。薬学的製剤および投与様式は、先に説明されたうちの任意のものであることができる。加えて、2種またはそれよりも多い同時投与された化学物質、生物学的物質または照射は、異なる様式または異なる処方で各々投与することができる。
【０２４８】
同時投与される1種または複数の物質は、治療される状態の種類に応じて決まる。例えば、治療される状態が癌である場合、追加の物質は、化学療法薬または放射線であることができる。治療される状態が自己免疫障害である場合、追加の物質は、免疫抑制剤または抗炎症剤であることができる。治療される状態が慢性炎症である場合、追加の物質は、抗炎症剤であることができる。抗癌剤、免疫抑制剤、抗炎症剤のような同時投与され、ならびに当技術分野において周知の任意の物質であることができる追加物質は、臨床用途において現在使用されているものを含むが、これらに限定されるわけではない。放射線療法の適当な種類および線量の決定も、当技術分野の技術範囲内であるか、または比較的容易に決定することができる。
【０２４９】
異常なアポトーシスに関連した様々な状態の治療は、一般に、下記のふたつの主要な要因により制限される：(1)薬物耐性の発生、および(2)公知の治療的物質の毒性。ある種の癌において、例えば、化学療法および放射線療法に対する抵抗性は、アポトーシスの阻害に関連していることが示されている。一部の治療的物質は、非特異的リンパ球毒性、腎毒性および骨髄毒性を含む、有害な副作用を有する。
【０２５０】
本明細書に説明された方法は、これらの問題点の両方に対処している。薬剤耐性は、用量増大が治療的恩恵を実現するために必要な場合に、本明細書に説明された化合物を、公知の物質と共に同時投与することにより克服される。本明細書に説明された化合物は、公知の物質に対して標的細胞を増感するように見え、従って治療的恩恵を実現するためにより少ないこれらの物質が必要とされる。
【０２５１】
特許請求された化合物の増感機能は、公知の療法の毒性作用に関連した問題点にも対処している。公知の物質が毒性である場合に、全ての症例において、特に薬物耐性が必要量を増大した症例において、投与される用量を制限することが望ましい。特許請求された化合物が公知の物質と同時投与される場合、これらは必要量を減少し、このことは次に有害な作用を軽減する。更に特許請求された化合物はそれ自身は大用量で有効かつ無毒の両方であるので、これらの化合物の割合が公知の毒性治療薬よりも多い同時投与は、毒性作用を最小化する一方で、所望の作用を実現するであろう。
【０２５２】
V. ミトコンドリアATP合成酵素(ミトコンドリアF0F1 ATPase)活性モジュレーター
特に好ましい態様において、本発明の組成物(例えば、ベンゾジアゼピン誘導体)は、罹患した細胞または組織におけるミトコンドリアATP合成酵素(ミトコンドリアF0F1 ATPaseと称される)複合体の活性を変調(例えば、阻害または促進)することにより、多くの状態(例えば、細胞または組織中のネクローシスおよび/またはアポトーシス過程の調節不良により特徴付けられる疾患、異常な細胞成長および/または過増殖により特徴付けられる疾患、など)のうち任意の1種または複数に罹患した患者へ、治療的恩恵を提供する。特に好ましい態様において、本発明の組成物は、この多サブユニットタンパク質複合体の特異的サブユニットに結合することにより、ミトコンドリアATP合成酵素複合体の活性を阻害する。本発明は、特定の機構に限定されず、投与される物質の作用を理解するものでもないが、いくつかの態様において、本発明の組成物は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)部分に結合する。その上更に、本発明の組成物がOSCPに結合する場合、最初の作用は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体の全般的阻害であること、および結合の下流の結果は、ATPレベルの変化および活性酸素種(例えば、O2-)の生成であることが考えられる。更に他の好ましい態様において、本発明は特定の機構に限定されず、投与される物質の作用を理解するものでもないが、フリーラジカル生成は、最終的に細胞殺傷をもたらすことが考えられる。更に別の態様において、本発明は特定の機構に限定されず、投与される物質の作用を理解するものでもないが、本発明の組成物および方法を使用するミトコンドリアATP合成酵素複合体の阻害は、細胞増殖の治療に有用な阻害を提供する段階が考えられる。
【０２５３】
従って本発明において具体化された好ましい方法は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)部分に結合することにより、罹患した細胞または組織におけるミトコンドリアATP合成酵素複合体の活性を変調(例えば、阻害または促進)する本発明の化合物を提供する段階により、患者へ治療的恩恵を提供する。重要なことは、OSCPそれ自身は活性を有さないことである。
【０２５４】
従って広範な意味のひとつにおいて、本発明の好ましい態様は、細胞または組織におけるネクローシスおよび/もしくはアポトーシス過程の調節不良により特徴付けられる多くの疾患、または異常な細胞成長および/もしくは過増殖により特徴付けられる疾患などは、それらのオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)成分に結合する段階を含むが、これらに限定されるわけではないものにより、ミトコンドリアATP合成酵素複合体の活性を変調することにより治療することができることの発見に関する。しかし本発明は、本明細書に明白に説明された組成物および方法の実践に限定されることは意図されていない。実際当業者は、本明細書には十分には言及されていない多くの追加の化合物(例えば、非ベンゾジアゼピン誘導体)は、ミトコンドリアATP合成酵素の活性を変調する本明細書において明らかにされた方法における使用に適していることを理解するであろう。
【０２５５】
従って本発明は、現在当技術分野において公知の、または今後開発されるかなりの多数の適当な化合物が、任意に本発明の方法における用途を認め得ることを特に企図している。例えば、オリゴマイシン、オサマイシン、シトバリシン(cytovaricin)、アポプトリジン(apoptolidin)、バフィロマイシン、およびジシクロヘキシルカルボジイミド(DCCD)などを含むが、これらに限定されるわけではない化合物は、本発明の方法における用途を認める。しかし本発明は、先に特定された方法または化合物に限定されることを意図するものではない。ひとつの態様において、本発明の方法において有用である可能性のある化合物は、科学文献に説明された適当なものから選択しても良い(例えば、K.B. WallaceおよびA.A. Starkov、Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.、40:353-388[2000]；A.R. Solomonら、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、97(26):14766-14771[2000]参照)。
【０２５６】
いくつかの態様において、本発明の方法において有用である可能性のある化合物は、米国立癌研究所(NCI-60)の癌細胞株に対して、有効性についてスクリーニングされる(例えば、A. Monksら、J. Natl. Cancer Inst.、83:757-766[1991]；および、K.D. Paullら、J. Natl. Cancer Inst.、81:1088-1092[1989]参照)。スクリーニング(例えば、自己免疫疾患モデルなど)に適した追加のスクリーニングは、当技術分野の技術範囲である。
【０２５７】
ひとつの局面において、例証的化合物または他の適当な化合物の誘導体(例えば、薬学的に許容できる塩、類似体、立体異性体など)も、本発明の方法において有用であるものとして企図されている。
【０２５８】
薬学的化合物および製剤を調製する当業者は、本明細書において説明された方法において使用するために任意の化合物を選択する場合に、適性の考察は、特定の化合物の毒性、安全性、有効性、利用可能性、および経費を含むが、これらに限定されるわけではないことを理解するであろう。
【０２５９】
VI. 薬物スクリーニング
本発明の好ましい態様において、本発明の化合物、および他の可能性のある有用な化合物は、ミトコンドリアATP合成酵素複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)部分へのそれらの結合親和性について、スクリーニングされる。特に好ましい態様において、化合物は、組換えOSCPタンパク質へのそれらの結合親和性を測定する段階により、本発明の方法における使用のために選択される。薬物および他の小分子の受容体への結合親和性を測定するための多くの適当なスクリーニングは、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、結合親和性スクリーニングは、インビトロシステムにおいて行われる。別の態様において、これらのスクリーニングは、インビボまたはエクスビボシステムにおいて行われる。いくつかの態様において、本発明の化合物の投与後の細胞内ATPレベルの測定は、この方法の有効性の指標を提供し、好ましい本発明の態様は、細胞内ATPレベルの定量を必要としない。
【０２６０】
追加の態様は、本発明の特定の企図された方法および化合物の有効性を測定するための、細胞および/または組織のスーパーオキシドレベル(例えば、細胞内)の測定に関する。これに関して当業者は、細胞および/または組織におけるスーパーオキシドレベル測定に有用な多くのアッセイおよび方法を理解しかつ提供する段階ができる。
【０２６１】
いくつかの態様において、構造に基づいた仮想スクリーニング法が、本発明の化合物のOSCPとの結合親和性を推定するために企図されている。
【０２６２】
ベンゾジアゼピンまたは他の化合物のOSCPへの結合速度または親和性を測定する段階ができる任意の適当なアッセイを利用することができる。例は、表面プラズマ共鳴(SPR)および放射性免疫沈降アッセイ(Lowmanら、J. Biol. Chem.、266:10982[1991])を含むが、これらに限定されるわけではない。表面プラスモン共鳴技術は、金、銀、クロムまたはアルミニウムのような伝導性金属の薄層フィルムで被覆された表面が関連しており、ここで表面プラスモンと称される電磁波は、表面プラスモン共鳴角と称される特定の角度で金属ガラス境界面の光の入射ビームにより誘導することができる。捕獲された巨大分子の結合後の溶液と金属表面の間の界面領域の反射率の変化は、SPR角度の変化を引き起こし、これは直接測定する段階ができるか、もしくは金属表面の下側から反射した光の量の変化を引き起こす。このような変化は、SPR装置表面に結合している分子の質量および他の光学特性に直接関連することができる。このような原理に基づいたいくつかのバイオセンサーシステムが明らかにされている(例えば、国際公開公報第90/05305号参照)。いくつかの市販されているSPRバイオセンサー(例えば、BiaCore社、ウプスラ、スウェーデン)がある。
【０２６３】
いくつかの態様において、ベンゾジアゼピン化合物は、ミトコンドリアATP合成酵素活性を変調するそれらの能力について、細胞培養物またはインビボ(例えば、非ヒトまたはヒト哺乳類)においてスクリーニングされる。細胞増殖アッセイ(例えばPromega社、マジソン、WIおよびStratagene社、ラホヤ、CAから市販されている)および細胞に基づく二量体化アッセイを含むが、これらに限定されるわけではないどちらか適当なアッセイを利用することができる(例えば、Fuhら、Science、256:1677[1992]；Colosiら、J. Biol. Chem.、268:12617[1993]参照)。本発明における使用が認められる追加のアッセイ様式は、細胞ATPレベル、および細胞スーパーオキシドレベルを測定するためのアッセイを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０２６４】
本発明は更に、望ましい特性(例えば、結合親和性、活性など)を増大するため、または望ましくない特性(例えば、非特異的反応性、毒性など)を最小化するために、本発明の組成物を修飾および誘導体化する方法も提供する。化学誘導体化の原理は、良く理解されている。いくつかの態様において、親化合物から誘導された子供化合物のライブラリー作成のために、反復デザイン法および化学合成法が使用される。別の態様において、慣例的実験により結果を確認する前に、コンピュータ(in silico)においてリガンド-受容体相互作用を推定およびモデル化するために、理論的デザイン法が使用される。
【０２６５】
実施例
下記実施例は、本発明のある好ましい態様を明らかにしかつ更に例証するために提供されており、それらの範囲を限定するために構成されるものではない。
【０２６６】
実施例1
化合物の調製
ベンゾジアゼピン化合物は、固相または可溶性相(soluble phase)のどちらかのコンビナトリアル合成法に加え、良く確立された技術の個別の基本を用いて調製される(例えば、C.J. Boojamraら、J. Org. Chem.、62:1240-1256[1996])；B.A. Buninら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91:4708-4712[1994]；S.Y. Stevensら、J. Am. Chem. Soc.、118:10650-10651[1996]；E.M. Gordonら、J. Med. Chem.、37:51385-1401[1994]；および、米国特許第4,110,337号および第4,076,823号を参照し、これらはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。例証のために、下記の一般的方法を提供する。
【０２６７】
1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン化合物の調製
様々な1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン誘導体を非常に高い全体収率で調製するために改良された固相合成法が、文献において報告されている(例えば、BuninおよびEllman、J. Am. Chem. Soc.、114:10997-10998[1992]参照)。これらの改良された方法を用い、1,4-ベンゾジアゼピン-2-オンが、3種の個別の成分：2-アミノベンゾフェノン、α-アミノ酸、および(任意に)アルキル化剤から、固形支持体上で構築される。
【０２６８】
好ましい2-アミノベンゾフェノンは、置換された2-アミノベンゾフェノン、例えば、ハロ置換された、ヒドロキシ置換された、およびハロヒドロキシ置換された2-アミノベンゾフェノン、例えば4-ハロ-4'-ヒドロキシ-2-アミノベンゾフェノンを含む。好ましい置換された2-アミノベンゾフェノンは、4-クロロ-4'-ヒドロキシ-2-アミノベンゾフェノンである。好ましいα-アミノ酸は、20種の一般的天然α-アミノ酸に加え、α-アミノ酸を模倣している構造、例えばホモフェニルアラニン、ホモチロシンおよびチロキシンを含む。
【０２６９】
アルキル化剤は、活性化されたおよび未活性化された求電子試薬両方を含み、その多種多様なものが当技術分野において周知である。好ましいアルキル化剤は、活性化された求電子試薬p-ブロモベンジルブロミドおよびブロモ酢酸t-ブチルを含む。
【０２７０】
このような合成の第一段階において、2-アミノベンゾフェノン誘導体が、ポリスチレン固形支持体のような固形支持体に、周知の方法を用い、かつ市販の[4-(ヒドロキシメチル)フェノキシ]酢酸のような酸で切断可能なリンカーを利用し、ヒドロキシまたはカルボン酸官能基のどちらかを介して結合し、支持された2-アミノベンゾフェノンを得る(例えば、SheppardおよびWilliams、Intl. J. Peptide Protein Res.、20:451-454[1982])。アミノベンゾフェノンの2-アミノ基は、好ましくは連結試薬との反応の前に、例えば、FMOC-Cl(クロロギ酸9-フルオレニルメチル)との反応により、保護され、保護されたアミノ基2'-NHFMOCを得る。
【０２７１】
第二段階において、保護された2-アミノ基は脱保護され(例えば、-NHFMOC基は、ジメチルホルムアミド(DMF)中におけるピペリジン処理により脱保護される)、脱保護された2-アミノベンゾフェノンは、次にα-アミノ酸(そのアミノ基はそれ自身、例えば-NHFMOC基として、保護されている)へのアミド連結を介して連結され、中間体を生じる。一般的固相ペプチド合成において使用される標準の活性化法(例えば、カルボジイミドおよびヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェニル活性化エステルの使用)を使用し、カップリングを促進する。しかし好ましい活性化法は、酸捕捉剤4-メチル-2,6-ジ-tert-ブチルピリジンの存在下での、2-アミノベンゾフェノンの、α-N-FMOC-アミノ酸フッ化物の塩化メチレン溶液による処理を使用し、アミド連結を介した完全なカップリングを得る。この好ましいカップリング法は、非反応性アミノベンゾフェノン誘導体であっても有効であることは分かっており、4-クロロおよび3-カルボキシの両不活性置換基を有する誘導体の本質的に完全なカップリングを得る。
【０２７２】
第三の段階において、保護されたアミノ基(アミノ酸に由来する)は最初に脱保護され(例えば、-NHFMOCは、DMF中のピペリジンにより-NH2に転換することができる)、脱保護されたBz-423は、酸、例えばDMF中の5％酢酸で、60℃で処理し、支持された1,4-ベンゾジアゼピン誘導体を得る。この方法を用い、大きく異なる立体特性および電子特性を伴う様々な2-アミノベンゾフェノン誘導体の完全な環化が報告されている。
【０２７３】
任意の第四の段階において、1,4-ベンゾジアゼピン誘導体は、適当なアルキル化剤および塩基によりアルキル化され、支持された完全に誘導体化された1,4-ベンゾジアゼピンを得る。標準のアルキル化法、例えばLDA(リチウムジイソプロピルアミド)またはNaHのような過剰な強塩基を使用する；しかしこのような方法は、望ましくない他の酸性官能基の脱プロトン化および過剰なアルキル化を生じることがある。ベンゾジアゼピン誘導体(例えば、エステルおよびカルバメート官能基を伴うもの)の過剰なアルキル化を妨害することができる好ましい塩基は、アニリド官能基を完全に脱プロトン化するのに十分な塩基であるが、アミド、カルバメートまたはエステル官能基を脱プロトン化するのに十分な塩基ではない。このような塩基の例は、リチウム化された5-(フェニルメチル)-2-オキサキソリジノンであり、これはテトラヒドロフラン(THF)中-78℃で1,4-ベンゾジアゼピンと反応される。脱プロトン化された後、前述のような適当なアルキル化剤を添加する。
【０２７４】
最終段階において、十分に誘導体化された1,4-ベンゾジアゼピンが、固形支持体から切断される。これは、例えば、適当な酸、例えばトリフルオロ酢酸、水およびジメチルスルフィドの混合物(容量比85:5:10)へ曝すことにより、実現される(酸不安定な保護基の同時除去と共に)。あるいは、前記ベンゾジアゼピンは、可溶性相で調製される。この合成法は、Gordonらの論文(J. Med. Chem.、37:1386-1401[1994])に説明されており、これは本明細書に参照として組入れられている。簡単に述べると、この方法は、適宜置換された2-アミノベンゾフェノンイミンによるアミノ酸樹脂のトランス-イミド化による、樹脂結合したイミンの生成を含む。これらのイミンは環化され、前述の固相合成における手法に類似した手法によりつながれる。前記方法を用いて調製されたベンゾジアゼピンの一般的純度は、約90％またはそれよりも高い。
【０２７５】
1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンの調製
1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンの固相合成のための一般的方法は、C.J. Boojamraらの論文(J. Org. Chem.、62:1240-1256[1996])に詳細に報告されている。この方法は、本発明の化合物を調製するために使用される。
【０２７６】
Merrifield樹脂、例えば(クロロメチル)ポリスチレンは、4-ヒドロキシ-2,6-ジメトキシベンズアルデヒドナトリウムによるアルキル化により誘導体化され、樹脂結合したアルデヒドを提供する。α-アミノエステルは次に、1％酢酸のDMF溶液中のNaBH(OAc)3を使用する還元的アミノ化により、誘導体化された支持体に結合される。この還元的アミノ化は、樹脂結合した第二級アミンの形成を生じる。
【０２７７】
第二級アミンは、多種多様な保護されないアントラニル酸によりアシル化され、樹脂結合した3級アミドを生じる。アシル化は、カルボジイミドおよび第三級アミンの塩酸塩の存在下でカップリング反応を行うことにより実現される。ひとつの良好なカップリング剤は、1-エチル-8-[8-(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩である。この反応は、典型的には、無水1-メチル-2-ピロリジノンの存在下で行われる。このカップリング手法は典型的には完全なアシル化を確認するために、再度繰り返される。
【０２７８】
アシル誘導体の環化は、ベンゾジアゼピンの環状複素環の窒素上の1位の置換基の同時導入のためにハロゲン化アルキルと反応することを介し、アニリドアニオンの形成による、塩基触媒によるラクタム化により実現される。アセトアニリドのリチウム塩は、この反応を触媒する良好な塩基である。従って、DMF/THF(1:1)中でアセトアニリドリチウムと30時間反応し、引き続き適当なアルキル化剤と反応したBz-423は、完全に誘導体化された支持体結合したベンゾジアゼピンを提供する。これらの化合物は、TFA/DMS/H2O(90:5:5)を用い、良好な収率および高い純度で、支持体から切断される。
【０２７９】
本発明において使用されるα-アミノエステル出発材料、アルキル化剤、およびアントラニル酸誘導体の例のいくつかは、C.J. Boojamraらの論文(J. Org. Chem.、62:1240-1256[1996]、前掲、1246)に列記されている。追加の試薬は容易に決定され、かつ市販されているか、もしくは本発明において開示された新規置換基に到達するよう、当業者により容易に調製されるかのどちらかである。
【０２８０】
例えば、Boojamraの論文(前掲)から、以下のことがわかる：アルキル化剤は、R1置換基を提供する；α-アミノエステル出発材料は、R2置換基を提供し、アントラニル酸は、R4置換基を提供する。これらの適宜置換されている出発材料を使用することにより、所望の1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンに到達する。R3置換基は、α-アミノエステル出発材料のアミンの適当な置換により得られる。立体的密集が問題となる場合は、R3置換基は、1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンが単離された後、通常の方法で結合される。
【０２８１】
実施例2
キラリティー
本発明のベンゾジアゼピンの多くは、立体中心がα-アミノ酸およびそのエステル出発材料により導入されるキラリティーのために、光学異性体として存在することは認められるはずである。前述の一般的手法は、α-アミノ酸またはエステル出発材料のキラリティーを保存する。多くの場合において、このように保存されたキラリティーが望ましい。しかし、α-アミノ酸またはエステル出発材料の望ましい光学異性体が入手できないかもしくは高価である場合、対応する光学異性体に分離されるラセミ混合物が作成され、望ましいベンゾジアゼピン鏡像異性体が単離される。
【０２８２】
例えば2,5-ジオン化合物の場合、Boojamra(前掲)は、鏡像異性体として純粋なα-アミノエステル出発材料の塩酸塩の、0.3当量のi-Pr2EtNおよび樹脂結合したアルデヒドとの6時間の予備平衡化、その後のNaBH(OAc)3の添加により、完全なラセミ化が実現されることを明らかにしている。前述の合成法の残りは、同じままである。必要ならば、更に1,4-ベンゾジアゼピン-2-ジオン化合物の場合と同様の段階が使用される。
【０２８３】
個々のベンゾジアゼピンを調製する方法は、当技術分野において周知である(例えば、米国特許第3,415,814号；第3,384,635号；および、第3,261,828号を参照し、これらは本明細書に参照として組入れられている)。任意の前述の方法において、適宜置換された出発材料を選択することにより、本発明のベンゾジアゼピンが、比較的容易に調製される。
【０２８４】
実施例3
試薬
Bz-423は、前述のように合成した。FK506は、Fujisawa(大阪、日本)から入手した。N-ベンゾイルカルボニル-Val-Ala-Asp-フルオロメチルケトン(z-VAD)は、Enzyme Systems社(リバーモア、CA)から得た。ジヒドロエチジウム(DHE)および3,3'-ヨウ化ジヘキシルオキサカルボシアニン(DiOC6(3))は、Molecular Probes社(ユージーン、OR)から得た。FAM-VAD-fmkは、Intergen社(パーチェス、NJ)から得た。マンガン(III)meso-テトラキス(4-安息香酸)ポルフィリン(MnTBAP)は、Alexis Biochemicals社(サンディエゴ、CA)から購入した。ベンゾジアゼピンは、説明されたように合成した(B.A. Buninら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、91:4708-4712[1994]参照)。他の試薬は、Sigma社(セントルイス、MO)から得た。
【０２８５】
実施例4
動物および薬物送達
雌NZB/Wマウス(Jackson Labs社、バーハーバー、ME)を、処理群および対照群に無作為に分配した。腹腔内注射により、対照マウスは、ビヒクル(50μL DMSO水溶液)を受取り、処理マウスは、ビヒクルに溶解したBz-423(60mg/kg)を与えられた。末梢血を、尾静脈から入手し、血清を調製した。脾および腎の試料は、10％緩衝化ホルマリンまたはOCT中の凍結のどちらかにより保存した。各動物からの追加の脾切片を、単独の細胞懸濁液の調製のために保存した。
【０２８６】
実施例5
初代脾細胞、細胞株、および培養条件
初代脾細胞は、6ヵ月齢のマウスから、赤血球の等張溶解を伴う、脾の機械的破壊により得た。B細胞が豊富な画分を、CD4、CD8aおよびCD11b被覆されたマイクロビーズ(Miltenyi Biotec社、オーバーン、CA)による磁気セルソーターを用いる陰性選択により調製した。Ramos株は、ATCC(モナシス、GA)から購入した。細胞を、10％熱失活ウシ胎仔血清(FBS)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)およびL-グルタミン(290μg/ml)を添加したRPMI中で維持した。初代細胞のための培地は、2-メルカプトエタノール(50μM)も含有した。全てのインビボ試験は、0.5％DMSOおよび2％FBSで行った。インビトロ実験は、2％FBS含有培地において行った。有機化合物は、0.5％DMSO含有培地に溶解した。
【０２８７】
実施例6
組織学
ホルマリン固定した腎切片を、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色し、糸球体の免疫複合体の沈着を、FITC複合したヤギ抗マウスIgG(Southern Biotechnology社、バーミンガム、AL)で染色した凍結した組織を用いる直接免疫蛍光により検出した。切片を、腎炎およびIgG沈着について0〜4+スケールを用い盲検様式で解析した。リンパ系過形成の程度は、H&Eで染色した脾切片を用い、0〜4+スケールでスコア化した。B細胞を同定するために、切片を、ビオチン化した抗B220(Pharmingen社；1μg/mL)で、その後ストレプトアビジン-Alexa 594(Molecular Probes社；5μg/mL)で染色した。凍結した脾切片を、TUNEL陽性細胞について、インサイチュー細胞死検出キット(Roche社)を用いて分析し、0〜4+スケールを用いて評価した。
【０２８８】
実施例7
TUNEL染色
凍結した脾切片を、インサイチュー細胞死検出キット(Roche Molecular Biochemicals社、インディアナポリス、IN)を用いて分析した。切片は盲検により評価し、TUNEL陽性染色の量に基づいてスコアリングした(0〜4+)。B細胞は、ビオチン化された抗B220(Pharmingen社、サンディエゴ、CA；1μg/mL、1時間、22℃)で、引き続きストレプトアビジン-Alexa 594(Molecular Probes社、ユージーン、OR；5μg/mL、1時間、22℃)で染色することにより同定した。
【０２８９】
実施例8
処理した動物由来の脾のフローサイトメトリー分析
表面マーカーを、蛍光複合した抗Thy 1.2(Pharmingen社、1μg/mL)および/または抗B220(Pharmingen社、1μg/mL)で検出した(15分間、4℃)。外膜ホスファチジルセリンを検出するために、細胞を、FITC複合したアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム(PI)と共に、製造業者(Roche Molecular Biochemicals社)の指示に従いインキュベーションした。フローサイトメトリーによるTUNEL陽性細胞の検出には、APO-BRDUキット(Pharmingen社)を使用した。スーパーオキシドおよびMPTは、細胞を10μMジヒドロエチジウムおよび2μM 3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド(DIOC6(3))(Molecular Probes社)と共に、30分間27℃でインキュベーションすることにより評価した。ヨウ化プロピジウムを用い、生存度およびDNA含量を決定した。試料は、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社、サンディエゴ、CA)で分析した。
【０２９０】
実施例9
B細胞刺激
Ramos細胞を、可溶性ヤギFab2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology Associates社、1μg/ml)および/または精製した抗ヒトCD40(Pharmingen社、クローン5C3、2.5μg/ml)で活性化した。マウスB細胞を、培養ウェルに固定したアフィニティー精製したヤギ抗マウスIgM(ICN社、オーロラ、OH；20μg/ml)および/または可溶性精製した抗マウスCD40(Pharmingen社、クローンHM40-3、2.5μg/ml)で活性化した。LPSは10μg/mlで使用した。Bz-423は、刺激を加えた直後に、培養物へ添加した。インヒビターは、Bz-423の30分前に添加した。
【０２９１】
実施例10
統計解析
統計解析を、SPSSソフトウェアパッケージを用いて行った。統計学的有意性は、Mann-Whitney U検定を用いて評価し、変量間の相関関係は、二元ANOVAにより評価した。報告した全てのp値は片側であり、データは平均±SEMで表わした。
【０２９２】
実施例11
細胞死および低二倍体DNAの検出
細胞生存度は、ヨウ化プロピジウム(PI、1μg/mL)染色により評価した。PI蛍光は、FACScaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社、サンディエゴ、CA)を用いて測定した。低二倍体DNAの測定は、DNA標識液(0.2％Tritonおよび10μg/mL RNAse Aを含有するPBS中のPI 50μg/mL)中で、細胞を4℃で一晩インキュベーションした後に行った。このデータは、総計(aggregate)以外は、CellQuestソフトウェアを用いて解析した。
【０２９３】
実施例12
O2-、ΔΨmおよびカスパーゼ活性化の検出
O2-を検出するために、細胞を、DHE(10μM)と共に、30分間37℃でインキュベーションし、エチジウム蛍光を測定するフローサイトメトリーにより分析した。ミトコンドリア膜を隔てた電位(ΔΨm)のフロー分析は、細胞をDiOC6(3)(20nM)で37℃で15分間標識することにより行った。ΔΨm崩壊に関する陽性対照は、カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP、50μM)を用いて確立した。カスパーゼ活性化アッセイは、FAM-VAD-フルオロメチルケトンで行った。この基質の処理は、フローサイトメトリーで評価した。
【０２９４】
実施例13
細胞下画分およびシトクロムc検出
Ramos細胞(250×106細胞/試料)を、Bz-423(10μM)またはビヒクルで1〜5時間処理した。細胞をペレット化し、緩衝液(68mMショ糖、220mMマンニトール、10mM HEPES-NaOH、pH7.4、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、10μg/mLロイペプチン、10μg/mLアプロチニン、1mM PMSF)中に再懸濁させ、氷上で10分間インキュベーションし、ホモジナイズした。ホモジネートを、4℃で5分間(800g)2回遠心し、核およびデブリをペレット化し、ならびに4℃で15分間(16,000g)遠心し、ミトコンドリアをペレット化した。上清を濃縮し、12％SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、Hybond ECL膜(Amersham社、ピスカタウェイ、NJ)に転写した。ブロック後(5％乾燥ミルクおよび0.1％Tweenを含有するPBS)、この膜を、抗シトクロムcモノクローナル抗体(Pharmingen社、サンディエゴ、CA；2μg/mL)で、引き続き抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼで複合した二次抗体(Amersham社)でプロービングし、化学発光により検出した。
【０２９５】
実施例14
単離されたミトコンドリアにおけるROS生成
雄のLong Evansラットを一晩絶食し、断頭により屠殺した。肝試料を、氷冷した緩衝液A(250mMショ糖、10mM Tris、0.1mM EGTA、pH7.4)中でホモジナイズし、核および細胞デブリをペレット化した(10分間、830g、4℃)。ミトコンドリアを、遠心(10分間、15,OOOg、4℃)により収集し、上清をS15画分として収集した。ミトコンドリアペレットを、緩衝液B(250mMショ糖、10mM Tris、pH7.4)で3回洗浄し、緩衝液Bで20mg/mL〜30mg/mLになるよう再懸濁した。ミトコンドリアは、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸(DCFH-DA、1μM)を含有する緩衝液C(200mMショ糖、10mM Tris、pH7.4、1mM KH2PO4、10μM EGTA、2.5μMロテノン、5mMコハク酸)で希釈した(0.5mg/mL)。ステート3測定に関して、ADP(2mM)を緩衝液中に含有し、Bz-423添加の前に、ミトコンドリアを2分間チャージさせた(charge)。ステート4を誘導するために、オリゴマイシン(10μM)を、緩衝液Cに添加した。DCFHの2',7'-ジクロロフルオレセイン(DCF)への酸化を、37℃で、蛍光分光計(λex：503nm；λem：522nm)でモニタリングした。O2-およびΔΨmに対する作用を検出するために、ミトコンドリアを、DHE(5μM)またはDIOC6(3)(20 nM)を含有する、ビヒクル、Bz-423、またはCCCPを伴う、緩衝液C中で、37℃で15分間インキュベーションし、アリコートを蛍光顕微鏡による分析のために取り出した。
【０２９６】
実施例15
脾細胞のフローサイトメトリー分析
脾細胞を、機械的破壊により調製し、赤血球を等張溶解により除去した。細胞を、蛍光複合した抗Thy 1.2(Pharmingen社；1μg/mL)および/または抗B220(Pharmingen社；1μg/mL)で、4℃で15分間染色した。外膜ホスファチジルセリンを検出するために、細胞を、FITC複合したアネキシンVおよびPI(Roche Molecular Biochemicals社、インディアナポリス、IN；1μg/mL)と共にインキュベーションした。
【０２９７】
実施例16
ROSのインビボ決定
脾臓を、Bz-423またはビヒクルで処理した4ヵ月齢のNZB/Wマウスから摘出し、OCT中で凍結させた。ROS産生は、E.D. Kerverらにより説明されたように、3,3,9-ジアミノベンジジンマンガン(II)を用いて測定した(E.D. Kerverら、Histochem. J.、29:229-237[1997]参照)。
【０２９８】
実施例17
IgG力価、BUN、およびタンパク尿
抗DNAおよびIgG力価を、P.C. Swansonらにより説明されたように、ELISAにより決定した(P.C. Swansonら、Biochemistry、35:1624-1633[1996]参照)。血清BUNは、ミシガン大学病院(University of Michigan Hospital)の臨床検査室で測定した。タンパク尿は、ChemStrip 6(Boehringer Mannheim社)を用いモニタリングした。
【０２９９】
実施例18
ベンゾジアゼピン試験
一般的方法
細胞調製：
細胞株を、完全培地(ペニシリン、ストレプトマイシン、およびL-グルタミン酸を添加した10％ウシ胎仔血清を含有するRPMIまたはDMEM)において、37℃、5％CO2下で培養した。活性アッセイのために、対数増殖相の細胞を取り出し、濃度を100,000〜300,000個/mLの間に希釈した。一部の細胞を完全培地に維持し、その間に同一アリコートを、遠心により血清減量した培地(ペニシリン、ストレプトマイシン、およびL-グルタミン酸を添加した0.2％ウシ胎仔血清を含有するRPMIまたはDMEM)と交換した。
【０３００】
活性アッセイ：
完全培地および血清減量した培地の両方の細胞の100μLアリコートを96ウェルプレートに分注し、10,000〜30,000個細胞/ウェルとした。その後化合物を、濃度1nM〜20μMで、このプレート中の適当なウェルに添加した(各50×ストック液2μL)。その後細胞を、37℃、5％CO2下で一晩培養した。相対細胞数/細胞生存度を、標準の技術(トリパンブルー排除/血球計、MTT色素転換アッセイ)を用いて測定した。
【０３０１】
実施例18.1：細胞死誘導能
アポトーシスを誘導するいくつかの個別の代表的化合物を先に示した。これらの中で最も強力なBz-423類を、Bz-423として同定し、これを以下に示した。
【０３０２】
前述の材料および方法を用い、様々な細胞における細胞死を誘導するために、Bz-423を用いた。表3は、前述のような血清減量した培地におけるBz-423との18時間培養した後の細胞生存度を示している。
【０３０３】
【表３】
2005502652.tif 000016
(値が低ければ低いほど、死滅量は多くなる)、Nd＝測定せず
【０３０４】
実施例18.2
MRL/MpJ-lpr/lpr(MRL-lpr)マウスは、ヒトSLEのような自己免疫疾患に類似した血清学的および組織学的徴候を発症している。これらのマウスは、自己免疫表現型が出現するまで、近交系の一連の交雑育種により発生した(A.N. TheofilopoulosおよびF.J. Dixon、Adv. Immunol.、37:269-390[1985])。MRL-lprマウスは、全身性自己免疫疾患の自然発症により特徴付けられる。この疾患は、いくつかの生理的位置において顕在化し、かつ様々なヒト疾患に類似している。例えば、これらのマウスにおける腎損傷は、ヒトSLEにおけるような、抗DNAの高い血清力価に関連している。これらは、びらん性関節症および唾液腺のリンパ球浸潤も発症しており、これらは各々、ヒトの疾患慢性関節リウマチ(RA)およびシェーングレン病に類似している(Theofilopoulos、前掲)。
【０３０５】
一般に、MRL-lprマウスは、lpr遺伝子座の突然変異のために、アポトーシスに際だった欠損を有する(K. Sakataら、Clin. Immunol. Immunopathol.、87:1-7[1998])。この欠損は、活性化されたリンパ球のアポトーシスシグナル伝達において重要である、Fas受容体遺伝子の突然変異に結びつけられている(R. Watanabe-Fukunagaら、Nature、356:314-317[1992])。結果的にこれらのマウスは、際だったリンパ球増殖を示し、リンパ節および脾の大規模な腫脹(enlargement)をもたらす。肉眼で見て、これらのマウスは、膨潤した足蹠および紅斑性の皮膚病巣を示している。組織学的に、糸球体腎炎、関節炎、および唾液腺の炎症浸潤が顕著である。
【０３０６】
方法
マウス：
6週齢の雌MRL-lprマウスを、Jackson Laboratories社(バーハーバー、ME)より購入した。これらの動物は、処理試験開始前に1週間、それらの環境に馴化させた。マウスは、気候制御した特定の病原体を含まない環境に、12時間の明暗サイクルで、餌および水は自在摂取させ、飼育した。1週間に1度、体重を測定しかつタンパク尿を比色反応を用いて試験した(Boehringer Mannheim ChemStrip 6)。
【０３０７】
処理様式：
マウスは、無作為化に3群に分けた：PBS(50μL、隔日)を与える対照、DMSOを与える対照(50μL、隔日)、およびBz-423を含むDMSO 50μLを与えるマウス(20匹のマウスについて60mg/kg、隔日、腹腔内、および10匹のマウスについて30mg/kg、隔日、腹腔内)。腹腔内注射は、1日おきの投与スケジュールで、30G針およびガラス製シリンジ(Hamilton)で与えた。処理は、(PBSおよびDMSOを与える)対照マウスについては7週齢で、処理マウスについては8週齢または9週齢で開始した。試験の終了時に、尾出血により採血した。マウスを、引き続きメトファン吸入により麻酔をかけ、腋窩切開による放血により屠殺した。その後試料臓器を組織学的分析のために摘出した。
【０３０８】
統計解析：
統計学的有意性の解析は、コンピュータプログラムSPSSを用いて行った。特に記さない限りは、Mann-Whitney U検定(片側)を用い、p値(確率値)＞5％を、有意であるとみなした。
【０３０９】
結果
疾患進行：
MRL-lprマウスが、ヒト自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス(SLE)において認められるものに非常に類似した腎疾患を発症することは、公知である。本疾患の特徴は、腎機能の喪失および腎不全に起因した最終的な死の転帰を迎える糸球体腎炎である。腎疾患の発症に関するマーカーは、尿中に存在するタンパク質量である。腎機能は悪化するので、糸球体濾過機構は不全となり、タンパク尿が増大する。ヒト疾患の周期性とは異なり、狼瘡のマウス型は進行性であり；従って、一旦マウスが腎炎を発症しかつタンパク尿が確認されたならば、本疾患は死亡するまで進行する。このことから、タンパク尿測定値を、MRL-lprマウスにおける腎疾患の進行を辿るために使用することができる。
【０３１０】
本発明者らの試験における疾患発症を、タンパク尿の毎週測定により追跡した。どちらか所定のマウスが、2週以上の連続する週にタンパク尿値＞2+(＞100mg/dL)である場合、これは狼瘡を有すると決定した。この判定基準に合致するマウスは、2+未満のタンパク尿の低下は認められなかった。更に、＞2+タンパク尿の死亡マウスは、非常に顕著な糸球体腎炎を有し、かつ＜2+値の死亡マウスは健康な腎を有し、死因はこの自己免疫疾患とは無関係であった。
【０３１１】
図9は、60mg/kg、隔日で処理したマウスの疾患進行分析を提供している。同様のデータが、30mg/kg隔日投与スケジュールで得られた。図9に認められるように、Bz-423で処理したマウスは、対照マウスと比べ、狼瘡様疾患の開始が有意に遅延し、かつ有効に治療した(p＝0.0043)。これらのデータは、処理した動物のBUN値が正常であるのに対し、ビヒクル単独を与えられた動物は腎性窮迫であったという観察により裏付けられた。
【０３１２】
実験的診断：
動物からの血液を、白血球(WBC)総数の変化に加え、亜型の差次的出現について分析した。Bz-423(60mg/kg)を与えられたマウスは、ヘマトクリット値、血小板数、およびWBCについて、ビヒクル単独を与えられたマウスとほぼ同じ値を有した(表4)。
【０３１３】
【表４】
2005502652.tif 000017
HCT、ヘマトクリット(％)；PLAT、血小板(K/μL)；WBC、白血球(K/μL)；POLYS、多形核細胞(％)；LYMPHS、リンパ球(％)；MONO、単球(％)；EOS、好酸球；BASO、好塩基球(％)。
【０３１４】
自己抗体：
いくつかの自己抗原に対する抗体力価を決定するために、全てのマウスからの血清試料を分析した(表5)。これらの抗体は、総血清ポリクローナル抗体であった。試験終了時に、Bz-423を与えられたマウスは、ssDNA(p＝0.019)、ヒストン(p＝0.0056)、およびLa抗原(p＝0.0265)に対する有意に低い抗体力価を示した。抗dsDNA力価は、処理マウスにおいてより低いが、対照動物のものと統計学的差はなかった(p＝0.082)。これら2群のマウス間でRo抗原に対する抗体の差異もなかった；しかし、実際の吸光度測定値は、これらのELISAに関するものは非常に低く、アッセイ感度により差異は遮蔽されたかもしれない。抗dsDNA力価は、両群において数匹の動物においてのみ認められ、これらの群間の差異に関する結論は出されていない。これらの抗Smの知見は、10％のMRL-lprマウスだけがSm抗原に対する抗体について陽性であると考えられることを報告した文献(Murphy, E.D. (1981)、データはリンパ球増殖性lprについてのみ)および他のマウス狼瘡の単遺伝子座モデルと一致した(Immunologic Defects in Laboratory Animals (E.M. GershwinおよびB. Merchant編)；第2巻、143-173頁(Plenum、ニューヨーク)参照)。自己抗体レベルで観察された差異が、非常に高い総IgG濃度のバックグラウンドにおいて認められ、これは対照群および処理群の間で統計学的に異ならなかった(p＝0.3312)。
【０３１５】
【表５】
2005502652.tif 000018
*力価は、本報告の時点で得られなかった。抗ヒストンレベルは、1/400希釈の血清におけるOD405値として報告された。
【０３１６】
関節組織学：
狼瘡症候群に加え、NIRL-lprマウスは、組織学的および血清学的の両方で、ヒト慢性関節リウマチに類似したネクローシス性(nerosive)関節症を自然発生的に発症する。これらのマウスにおける関節症病巣は、滑膜および関節周囲の結合組織の炎症性変化により特徴付けられ、血清中の循環リウマチ因子の存在を伴うことが多い。この関節症の過程は進行性であり、かつ軽度滑膜炎からネクローシス性関節症まで、いくつかの異なる病期を経て進行し、これは最終的には瘢痕化した関節につながり得る。組織学的に、5ヵ月齢のMRL-lprマウスの大半は、滑膜細胞増殖、関節軟骨および肋軟骨下の骨の破壊、炎症細胞による滑膜支質への浸潤、関節周囲の炎症(血管炎、筋炎、腱炎、神経周膜炎)、滲出液、パンヌス形成、および表皮フィブリン様結節を明らかにしている(L. Hangら、J. Exp. Med.、155:1690-1701[1982]；W.J. KoopmanおよびS. Gay、Scand. J. Rheumatology. 別冊、75:284-289[1988])。
【０３１７】
全てのBz-423で処理したマウスの前足を、関節炎および滑膜炎の徴候について調べた。(ビヒクル単独を与えられた)対照マウスは、場合によっては乳頭、絨毛構造の形成を伴う滑膜の顕著な肥厚を特徴とする、重度の滑膜炎を有した。典型的には、滑膜の病理は、滑膜細胞増殖および炎症細胞による滑膜支質の浸潤の結果であった。対照マウスの実質的割合において、疾患の過程は、パンヌス形成および関節表面のびらん(関節軟骨および肋軟骨下の骨の両方)を伴っていた。対照的に、処理マウスは、より軽度の滑膜炎に加え、より少ないびらんおよび限定されたパンヌス形成を有することが認められた(表6)。Bz-423を与えられた動物における本疾患の特徴は、浸潤性がはるかに低く、滑膜細胞増殖および炎症浸潤が少なかった。更に興味深いことに、処理マウスは、関節周囲の炎症がより少なかった。これらの知見をまとめると、Bz-423は、典型的にはMPL-lprマウスの関節を破壊する関節疾患の進行を緩和することを示唆している。
【０３１８】
【表６】
2005502652.tif 000019
*P値は、クロス集計およびカイ二乗検定により決定した。
【０３１９】
遅延型過敏症(DTH)：
Bz-423で処理したマウス(60mg/kg)は、対照マウスと比べ、TNBSに対するDTH反応において差異は示さなかった(図10C)。重要なのは、いずれの群の動物も、抗原チャレンジ後に、有意な足蹠腫脹を示さなかったことである。この現象は過去に報告されており、高齢のMRL-lprマウス(＞10週)は、DTH反応の非存在により証明されるような、刺激に対するインビボ T細胞反応を消滅したことが予想された(例えば、H. Okuyamaら、Clin. Exp. Immunol.、63:87-94[1986]；C.F. Scottら、J. Immunol.、132:633[1984]参照)。しかし、T細胞の抑制は、DTH反応の救済を生じることができる(H. Okuyamaら、Intl. Arch. Allergy Appl. Immunol.、1588:394[1989]参照)。このような救済は、本試験の処理プロトコールでは認められなかった。これらのデータは、Bz-423はT細胞機能を変化させないことを示唆している。図10A〜図10Cは、足蹠腫脹実験の結果を示している。
【０３２０】
免疫細胞機能：
刺激されたおよび刺激されないT細胞およびB細胞の両方を用いるチミジン取込みアッセイを行い、Bz-423がインビトロにおけるリンパ増殖に影響を及ぼすかどうかを判定した。ほぼ濃度10μMで、リンパ球増殖への作用は認められなかった。
【０３２１】
実施例18.3：リンパ毒性物質としてのBz-423
方法
動物および実験デザイン：
雌NZB/Wマウス(Jackson Labs社)を、ミシガン大学獣医学実験施設(Unit for Laboratory Animal Medicine)により運営された特定の病原体のいない環境が制御された部屋で、12時間明暗サイクルで飼育し、餌および水は自在摂取させた。マウスを、無作為に処理群および対照群に分配した。全てのマウスには、ガラス製マイクロリットル用シリンジおよび30G針を伴うHamilton反復ディスペンサーを用いる腹腔内注射により、投与した。対照マウスは、ビヒクル(50μL DMSO水溶液)を受取り、処理マウスはビヒクルに溶解したBz-423を与えられた。1週間に1度、動物の体重を測定し、その後の投与スケジュールを調節した。
【０３２２】
血液/組織採取：
全血球算定数カウントのための末梢血を全てのマウスの尾静脈から入手し、血清を収集した。血液は最初室温で1時間、その後4℃で一晩凝血させた。血清を、遠心により、形成された血餅から分離した(6分間、16,000×g)。脾切片を、単細胞懸濁液を調製するために、無菌的に採取した。以下の臓器試料は、10％緩衝化ホルマリン中で保存した：心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓、小腸、生殖系、唾液腺、胸腺、腸間膜および腋窩リンパ節、および皮膚。追加の腎および脾切片を、OCTにおいて瞬間凍結し保存した。骨髄塗沫は、各大腿から調製した。
【０３２３】
組織学：
全ての組織学的決定は、盲検様式で病理学者が行った。ホルマリン固定した切片を切断し、標準プロトコールを用い、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色した(L.G. Luna、「Manual of Histological Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology」、McGraw-Hill社、ニューヨーク(1960))。腎の免疫複合体沈着は、FITC複合したヤギ抗マウスIgG(Southern Biotechnology Associates社、バーミンガム、AL)およびC3(Cappel-Organon Teknika社、ダーハム、NC)で染色した凍結切片を用い、直接免疫蛍光により評価した。リンパ系過形成の程度は、0〜4+スケールでスコア化した。
【０３２４】
TUNEL染色：
凍結脾切片(厚さ4μm)を、インサイチュー細胞死検出キット(Roche Molecular Biochemicals社)を製造業者のプロトコールに従い使用し、DNA鎖破壊についてアッセイした。切片は、0〜4+スケールを用いて分析した。切片を盲検評価し、TUNEL陽性染色の量に基づいてスコアリングした。
【０３２５】
リンパ球集団の蛍光分析：
培地中の脾臓から剥がし、その後、溶解緩衝等張液で赤血球を除去することにより、単細胞懸濁液を調製した(A.M. Kruisbeek、「Current Protocols in Immunology」J.E. Coliganら編、3.1.2-3.1.5頁、John Wiley & Sons社、[1997])。106個の細胞を、4℃で、蛍光複合した抗Thy 1.2(Pharmingen社、クローン：53-2.1、1μg/mL)および/または抗B220(Pharmingen社、クローン：RA3-6B2、1g/mL)で、15分間染色した。外膜ホスファチジルセリンを検出するために染色した試料において、その後細胞を、FITC複合したアネキシンVおよびPIと共に、製造業者のプロトコールに従いインキュベーションした(Roche Molecular Biochemicals社)。細胞は、Coulter ELITEフローサイトメーターで分析した。各試料について、少なくとも10,000事象が計数された。
【０３２６】
血清抗DNA：
先に説明されたように、直接ELISAにより、力価を決定した(P.C. Swansonら、J. Clin. Invest.、97:1748-1760[1996])。IgG抗DNAの検出は、アルカリホスファターゼ複合したヤギ抗マウスIgG(H鎖のみ)二次抗体(1/1000希釈、SIGMA社)を使用した。吸光度読み値を力価に変換するために、操作しなかった8ヵ月齢の雌 NZB/Wからプールした血清を参照として用い、これを独断的に値1000U/mLとした。
【０３２７】
血清免疫グロブリン：
濃度は、ELISA捕獲により決定した。ヤギ抗マウスIg(Southern Biotechnology Associates社)を、PBS中に10pg/mLとなるよう希釈し、Immulon IIマイクロタイタープレート上に4℃で一晩被覆した。さもなければ、ELISAを、先に説明されたように行った。吸光度を濃度に変換するために、先に定量したマウス免疫グロブリン参照血清(ICN Biomedicals社、アウロラ、OH)を用い検量線を作成した。
【０３２８】
血液尿素窒素(BUN)および全血球算定(CBC)：
血清BUN測定を、ミシガン大学病院の臨床病理検査室により行った。CBC分析は、ミシガン大学獣医学実験施設の診断検査室で行った。Hemavet 15 ORにより自動的に決定された数を、血流の肉眼試験により確認した。
【０３２９】
血清1,4-ベンゾジアゼピンレベル：
Bz-423を注射したマウスからの血清試料を、アセトン(5×容量、-20℃、10分間)で沈殿させた。遠心後(16,000×g、10分間)、Bz-423を含有する上清を真空濃縮し、その後10％アセトニトリル水溶液から100％アセトニトリルまでの段階勾配を流し、Sep-pak C18カラム(Waters社)を用いて任意の残余のタンパク質から抽出した。有機画分で溶離する物質を、真空濃縮し、その後Phenomenex C18カラムを用いる逆相BPLCで分析した。ピーク面積は、Shimadzu積分器を用いて決定し、検量線に対し照会した。
【０３３０】
統計解析：
統計解析は、SPSSソフトウェアパッケージを用いて行った。組織学的および臨床データに関しては、Mann-Whitney U検定およびカイ二乗検定を用いた。スチューデントt-検定を、フローサイトメトリーデータに使用した。相関はANOVAにより評価した。
【０３３１】
実施例18.4
マウスにおける神経芽細胞腫をモデル化するために、マウスを、ヒト神経芽細胞腫細胞株SKNASで形質転換し、これらの細胞に神経芽細胞腫に関連したヒト癌遺伝子N-mycの過剰発現を引き起こした。得られた細胞株は、D2と称した。これらの細胞は、T細胞欠損無胸腺マウスへ異種移植した場合に、腫瘍を形成し；従って、ヒト神経芽細胞腫の関連動物モデルを提供した。
【０３３２】
D2細胞のインビトロ試験を、それらのベンゾジアゼピンに対する感受性を決定するために行った。D2細胞を、96ウェル組織培養プレートに、培養培地(DMEM、10容量％熱失活ウシ胎仔血清(FBS)、100μ/mlペニシリン、100μ/mlストレプトマイシン、290μ/mlグルタミン酸)中、密度10,000細胞/ウェルで播種し、一晩培養した(37℃、5％CO2)。引き続き、培養培地を、1％FBSを含有する培地と交換した。溶媒対照(ジメチルスルホキシド(DMSO)；最終濃度1容量％)またはベンゾジアゼピンの濃度2.5μM〜20μMを添加した。18時間後、細胞生存度を、本出願において先に説明したような、MTTアッセイを用いて決定した。図11は、ベンゾジアゼピンが、用量反応様式で、D2細胞を殺傷することを示している。
【０３３３】
ベンゾジアゼピンの神経芽細胞腫の腫瘍成長に対する作用を試験するために、1×107個のD2細胞を、8匹の6週齢のnu/nu雌マウス(Jackson Labs社)の各々に、大腿筋に無菌的に接種した。腫瘍細胞接種後最初の1週間に、4匹のマウスにDMSOを(20μ、毎日腹腔に注射)投与し、4匹のマウスにはベンゾジアゼピン(20μl DMSOに溶解した2.5mg、毎日腹腔に注射)を投与した。マウスを、腫瘍発生について定期的に評価し、一旦存在したならば、原発性腫瘍のサイズを隔日で測定した。表7は、腫瘍形成したマウスにおけるベンゾジアゼピン処理で、腫瘍成長率が有意に縮小したことを示している。
【０３３４】
【表７】
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nu/nuマウスにおけるベンゾジアゼピン投与は、神経芽細胞腫の腫瘍成長を遅らせる(p＜0.02)。
【０３３５】
具体的には、対照マウスの腫瘍は、平均4日間で容積が5-倍以上増大したのに対し、 ベンゾジアゼピン処理した動物においては同じサイズまで腫瘍が増大するのには12日間を要した(p＜0.02)。これらの知見は、ベンゾジアゼピンは、マウスモデルにおいて、ヒト悪性疾患の治療することができるという特許請求を裏付けている。更に、ベンゾジアゼピンは、インビトロおよびインビボの両方において、ヒト神経芽細胞腫に対する比活性を有する。
【０３３６】
実施例18.5
別の実験系において、本発明者らは、ベンゾジアゼピンが、さもなければ存在する標準の化学療法剤に対して抵抗性であるような腫瘍細胞を殺傷することができるかどうかを判定することを調べた。
【０３３７】
卵巣癌は、通常治療の失敗が化学療法抵抗性細胞の出現に起因するような化学抵抗性の問題点を研究するための優れたモデルを提供する。A2780ヒト卵巣癌細胞株は、野生型p53を含み；低レベルのbcl-2およびbcl-XL生存因子を発現し；かつ、卵巣癌の治療のための標準の化学療法剤である、シスプラチン(H)二塩化ジアミン(CDDP)による治療に対する感受性があることがわかっている。これらの細胞は、過剰発現した場合に化学療法抵抗性の発生に関連づけられる生存因子である、ヒトbcl-XLをコードしている発現ベクターによりトランスフェクションされる。これらのトランスフェクションした細胞は2B1と称し、空のベクターでトランスフェクションした対照は、単にベクターと称した。SKOV3と称される第三の卵巣癌細胞株も得た。この細胞株は、下記のように特徴付けられる：1. 野生型p53発現の欠損；2. 内因性bcl-XLの高レベル発現；および、3. CDDPの細胞毒性作用に対する相対的抵抗性。
【０３３８】
これらの細胞株は各々、RPNII、10％FBS、100U/mlペニシリン、100μ/mlストレプトマイシン、290μ/mlグルタミン酸で構成された完全培地において、標準の組織培養条件を用いて維持した。各細胞型は、24ウェルの組織培養プレート上の一連の個別のウェルに、1ウェルにつき50,000個細胞となるよう播種した。播種のおよそ24時間後、2％FBSのみで作成した同じ培養培地を含むように、培地を交換した。この時点で、対照溶媒(DMSO、1容量％)、漸増濃度のBz-423(4μM〜20μM)、または漸増濃度のCDDP(6.7〜66.7μM)のどちらかを、細胞へ添加した。24時間培養後、各ウェルに存在する全ての細胞を、トリプシン-EDTAを用いて除去し、ヨウ化プロピジウム(最終濃度1μ/ml)と混合した。20分間インキュベーションした後、細胞を、フローサイトメトリー(Coulter FACS Calibur)により分析し、ヨウ化プロピジウムを取込んだ細胞の画分として測定した形質膜完全性に基づいて細胞死を決定した。実験は、CDDPに対する化学感受性および抵抗(A2780およびベクター感受性；2B1およびSKOV3抵抗性)の推定されるパターンが観察されたことを明らかにした。図12は、ベンゾジアゼピンが、CDDP抵抗性とは関係なく、これらの各型を殺傷することを明らかにしている。更にベンゾジアゼピンは、標準の化学療法に抵抗性である卵巣癌細胞を殺傷する。更にベンゾジアゼピンは、高レベルの生存因子(bcl-XL)を発現している腫瘍細胞に加え、p53発現を欠損しているものを殺傷する。
【０３３９】
上記明細書において言及された刊行物および特許は全て、本明細書に参照として組入れられている。本発明は、特定の好ましい態様に関連して説明されているが、特許請求された本発明は、このような特定の態様に過度に限定されないことは理解されなければならない。実際、当業者には明らかであるような本発明を実施するための説明された様式の様々な変更は、添付の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０３４０】
【図１】Bz-423(10μM)を他のベンゾジアゼピン受容体リガンドと同じ濃度で比較した、インビボ処理後(24時間)ヨウ化プロピジウム(「PI」)透過性で測定した(NZB×NZW)F1 (「NZB/W」)脾細胞の細胞死を示す。対照＝培地、Bz＝Bz-423、Naph＝1-ナフトール、Cz＝クロナゼパム、Dz＝ジアゼパム、Cl-Dz＝4'-クロロジアゼパム、PK＝PK11195。
【図２】図2Aから図2Hは、Bz-423が、NZB/Wマウスにおける自己免疫型腎炎および脾過形成を減少させることを示している。ヘマトキシリン-エオシン(「H&E」)(図2Aおよび図2B)またはIgG沈着の免疫蛍光染色(図2Cおよび図2D)により同定した、投与後12週目の、対照(図2Aおよび図2C)および処理動物(図2Bおよび図2D)における腎組織病理(400×)を示している。対照(図2E)および処理マウス(図2F)由来の脾切片を、抗B220で染色した。対照(図2G)および処理(図2H)脾切片(凍結)からの胚中心(「GC」)を、B220(バックグラウンド)および断片化したDNA(白点)の同時検出のために染色した。
【図３】図3Aおよび図3Bは、Bz-423が誘導したアポトーシスに対する活性化および共刺激の作用を示す。データは、24時間でのPI陽性細胞の割合(％)として表わした。図3Aは、刺激(可溶性抗IgM)を伴うまたは伴わないBz-423に対するRamos細胞の用量反応を示す。図3Bは、示された刺激および4μM Bz-423の存在下における、初代B細胞の比殺傷を示す。白色バー＝抗IgM、黒色バー＝Bz-423、および灰色バー＝抗IgM＋Bz-423。
【図４】図4Aから図4Cは、Bz-423が、B細胞受容体(「BCR」)活性化細胞においてアポトーシスシグナルとして機能するスーパーオキシドを増加することを示している。Ramos細胞は、抗IgM単独で(対照、点線)または所与の濃度のBz-423(実線)で処理した。挿入(Insert)は、ビタミンEの作用を示している。(図4A)Bz-423による処理の1時間後のスーパーオキシドレベル。(図4B)24時間後のPI染色は、アポトーシスに一致する低二倍体DNA含量を示している。(図4C)干渉顕微鏡(Interference contrast microscopy)(400×)は、Bz-423で処理されたBCR活性化細胞および未活性化細胞の同様のアポトーシス出現を示している。
【図５】図5Aから図5Dは、Bz-423の特性を示している。(図5A)Bz-423および不活性同族体の構造。(図5B)Bz-423、4'-クロロジアゼパム(4-ClDz)、PK11195、ΔNAP、およびΔOHの、PI透過性により決定した24時間時点でのRamos細胞生存率に対する作用。(図5C)干渉顕微鏡(400×)により決定した、ビヒクル、Bz-423(10μM)、またはBz-423(10μM)＋z-VAD(100μM)で24時間処理した細胞の形態。(図5D)図5Cの処理後、細胞をフローサイトメトリーにより分析し、DNA含量を決定した。パネルA〜Dは、5回を上回る個別の測定の代表である。
【図６】図6Aおよび図6Bは、Bz-423が誘導したアポトーシスのメディエーターを示す。(図6A)Ramos細胞を、ビヒクルまたはBz-423と共に1時間インキュベーションした。蛍光強度は、5μMおよび10μM Bz-423(各々、緑色および赤色ヒストグラム)で、対照(影付きヒストグラム)よりも上昇した。(図6B)Bz-423(10μM)処理時にRamos細胞において検出された経時的変化。データは、時間を適合化した（time-matched）ビヒクル対照に相対的な所与の反応による細胞の割合(％)として表わした。この時間枠では、ビヒクルで処理した細胞では変化が認められなかった。挿入図-シトクロムc放出。レーン1-精製したシトクロムc(20ng)；レーン2-ビヒクルとのインキュベーションの5時間後に単離した細胞質ゾル画分；レーン3および4-各々、Bz-423と1時間および5時間インキュベーションした後に単離した細胞質ゾル画分。パネルAおよびBは、5回を上回る個別の測定のデータを表わしている。
【図７】図7Aから7Eは、Bz-423が、単離されたミトコンドリアにおいてROSを生成することを示している。ラット肝ミトコンドリアを、DCFH-DAおよび望ましい物質と共にインキュベーションし、蛍光強度をモニタリングした。これらの測定は、2つ組で行い、4種のミトコンドリア調製物において反復した(図7A)。データは、ステート3呼吸で得た。誘導相後(1200秒〜1500秒)の後の各曲線の勾配は、アンチマイシンA(0.5μM)、Bz-423(10μM)、およびビヒクルについて、各々、 2.1、1.5、1.1(×10-3±15％)である。勾配が大きくなればなるほど、より高レベルのROS産生と相関している。(図7B)ステート3緩衝液中のミトコンドリアの膨潤。Ca2+(400μM)のみがMPT孔を引き起こし、その結果膨潤をもたらす。(図7C)S15画分を用い、ステート3呼吸において得られたデータ。(図7D)ステート4呼吸においてミトコンドリアで得られたデータ。(図7E)ステート3および4において、DHE(赤色)またはDIOC6(3)(緑色)で染色したミトコンドリアの代表的鏡検(630×)。
【図８】図8Aおよび図8Bは、ROSの調節により、ミトコンドリア機能が保存されかつBz-423誘導殺傷が阻害されることを示している。(図8A)FK506(1μM、青色)、ビタミンE(100μM、赤色)、MnTBAP(100μM、緑色)、またはインヒビターなし(黒色)のどちらかとのRamos細胞の30分間のプレインキュベーション後、Bz-423(10μM)を培養物に添加した。白色バーは、ビヒクル単独で処理した対照試料を示した。フローサイトメトリーを用い、DHE蛍光(O2-)を1時間の時点で、カスパーゼ活性化を5時間の時点で、ΔΨm(DIOC6(3))を5時間の時点で、ならびにPI透過性および低二倍体DNAを24時間の時点で測定した。(図8B)Bz-423の添加に対する各時点でのFK506添加の細胞生存度に対する作用。パネルAおよびBの結果は、＞5の個別の測定値を表わしている。
【図９】本明細書に説明した方法に従い処理したMRL-lprマウス(実線)に関する疾患進行分析を、対照(点線)と比較し示している。疾患を伴わない動物の割合(％)(y軸)を、経時的に(x軸)プロットした。
【図１０】図1OA〜図10Cは、本発明に説明した方法に従い処理したMRL-lprマウスにおける足蹠膨潤(図10A)を対照(図10B)と比較して示している。図10Cは、図による解析である。
【図１１】D2神経芽細胞腫細胞をインビトロにおいて殺傷するための、ベンゾジアゼピン使用の有効性を示す棒グラフである。
【図１２】卵巣癌細胞が、インビトロにおけるベンゾジアゼピン適用により殺傷されることを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502652.tif 000158
【国際調査報告】
2005502652.tif 000159