(57)【要約】本発明は、マーカーとしてＴＲＡＩＬ遺伝子および／または蛋白質発現を決定することによって、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、特にＩＦＮ−βに感受性であるＭＳ患者を同定し、およびＭＳ患者でのＩＦＮ療法をモニタリングする方法に関する。
2005527221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＡＩＬ発現および／またはＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度を決定することを特徴とする、多発性硬化症の治療に利用されるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）療法に対し個体を陽性応答者または非応答者として同定する方法。
【請求項２】
使用する療法が、ＩＦＮ−β療法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＲＡＩＬ発現の決定および／またはＴＲＡＩＬ蛋白質濃度の決定をＩＦＮ療法の前に行う、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＲＡＩＬ発現の決定および／またはＴＲＡＩＬ蛋白質濃度の決定を哺乳動物起源の試料によって実施する、請求項１から３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、体液、その画分、組織抽出物、および、細胞抽出物を含む群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記体液が、全血、その画分、血清、血漿、脳脊髄液、滑液、腹水浸出液、炎症浸出液、および尿を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）ＴＲＡＩＬポリペプチドまたはその部分をコードするＴＲＡＩＬ核酸の量および／または濃度を検出しかつ／または測定することによってＴＲＡＩＬ発現を決定し、かつ
（ｂ）ＴＲＡＩＬポリペプチドまたはその部分の量および／または濃度を検出しかつ／または測定することによってＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度を決定する、前記請求項１から７のいずれか１に記載の方法。
【請求項９】
液体試料に可溶なＴＲＡＩＬ蛋白質の量および／または濃度を測定することによってＴＲＡＩＬ蛋白質濃度の決定を実施する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＴＲＡＩＬポリペプチドの量および／または濃度の測定が、抗ＴＲＡＩＬ抗体を使用するイムノアッセイによって行われる、請求項８および９のいずれか１に記載の方法。
【請求項１１】
決定したＴＲＡＩＬポリペプチドの量および／または濃度を限界値と比較して陽性応答者と非応答者を判別する、請求項８から１０のいずれか１に記載の方法。
【請求項１２】
前記限界値が、少なくとも３５０±２０ｐｇ／ｍｌであり、約５８４．１ｐｇ／ｍｌが好ましい、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項４から６のいずれか１による試料中のＴＲＡＩＬｍＲＮＡの量および／または濃度を測定することによってＴＲＡＩＬ核酸の量および／または濃度を決定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、血液細胞、末梢免疫細胞、ニューロン組織、および筋組織の抽出物を含む群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＲＡＩＬｍＲＮＡの量および／または濃度の測定を、１つまたは複数のＴＲＡＩＬ特異的プローブを使用しポリメラーゼ連鎖反応を援用して実施する、請求項１３および１４のいずれか１に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＲＡＩＬｍＲＮＡの量および／または濃度を限界値と比較して陽性応答者と非応答者を判別する、請求項１３から１５のいずれか１に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＲＡＩＬ核酸の量および／または濃度が、１つまたは複数の生体活性マーカーの核酸の量および／または濃度と相関し、ならびに／あるいはＴＲＡＩＬポリペプチドの量および／または濃度が、１つまたは複数の生体活性マーカーのポリペプチドの量および／または濃度に相関する、前記請求項１から１６のいずれか１に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体活性マーカーが、ＭｘＡ蛋白質または他のＩＦＮ誘導性蛋白質を含む群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
多発性硬化症の治療に利用されるＩＦＮ療法をモニタリングするための請求項１から１８のいずれか１に記載の方法の使用。
【請求項２０】
前記ＴＲＡＩＬ遺伝子またはその部分に特異的な核酸プローブおよび／または（１つまたは複数の）プライマー、ならびに／あるいは前記ＴＲＡＩＬポリペプチドまたはその部分に特異的な抗体を含む、請求項１から１９のいずれか１に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２１】
ＥＬＩＳＡ検定に適切で前記ＴＲＡＩＬポリペプチドに特異的な少なくとも１個の抗体を含む、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＡＩＬ遺伝子および／または蛋白質の発現をマーカーとして決定することによる、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、特にＩＦＮ−βに感受性のＭＳ患者を同定する方法、およびＭＳ患者でのＩＦＮ療法をモニタリングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、世界中で約１００万人が患う最もありふれた中枢神経系（ＣＮＳ）疾患であり、若年成人で長引く重篤な障害を引き起こす。その病因は、依然として不明であるが、その病因の根底には脳および脊髄の白質内の自己分子に対抗する、Ｔ細胞が媒介する炎症過程があるという概念が有力な証拠をもって支持されている（Martin et al. 1992, Annu Rev Immunol 10: 153-187）。ＭＳ患者および健康な個人にはミエリン反応性Ｔ細胞が存在するので（Pette et al. 1990, Neurology 40: 1770-1776; Hohlfeld et al. 1995, Neurology 45 (suppl 6): S33-S38）、ＭＳの一次免疫異常には、Ｔ細胞活性化状態を高め厳格な活性化要件を弱める調節機序の異常が関与する可能性が極めて高い（Zang et al. 1994, J Exp Med 179: 973-984; Markovic-Plese et al. 2001, J Clin Invest 108: 1185-1194）。
【０００３】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）であるインターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）は、免疫調節特性を有する多面的サイトカインであり、ＭＳの治療において世界標準になっている。この薬物の応答者で有効性が十分実証されているにも関わらず、かなりの数の患者がＩＦＮ−βに応答しない。ＭＳに関して、なぜＩＦＮ−β療法が有効なのか、または有効でないのか、かつＩＦＮ−βによりＭＳの臨床経過がどのように変化するのかは依然として不明である（ＩＦＮＢ多発性硬化症研究グループ、およびブリティッシュコロンビア大学ＭＳ／ＭＲＩ分析グループ1995, Neurology 45: 1277-1285; Jacobs et al. 1996, Ann Neurol 39: 285-294、ＰＲＩＳＭＳ研究グループ 1998, Lancet 352: 1498-1504）。推定される作用機序には、Ｔ細胞の増殖抑制、多数のサイトカインの調節、並びに細胞接着、細胞遊走、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ活性への干渉による血液脳関門開放の阻止が含まれる（Rudick et al. 1996, Ann Neurol 40: 618-627; Wang et al. 2000, J Immunol 165: 548-557; Stone et al. 2000, Ann Neurol 37: 611-619）。しかし、ＭＳにおいてＩＦＮ−βがどのように働くかを理解することはマーカーの開発に不可欠である。すなわちそのマーカーがあれば個体がＩＦＮ−βに陽性の応答をするチャンスがあるか否かが予測可能になる。その予測が可能であれば、それはＩＦＮ−β療法のコストおよび患者に起こり得る副作用の面で価値があり、ＭＳ患者を治療する現在と将来の戦略の有効性が増大する。
【０００４】
したがって、ＭＳ患者でのＩＦＮ−β療法の臨床結果と相関し、個々の患者の治療応答を予測する方法において使用可能なマーカーを同定する必要がある。
【０００５】
最近、固有で特異的な免疫応答に関与し、ＭＳでＩＦＮ−βの潜在的なエフェクター標的である多数の遺伝子が同定された（Wandinger et al. 2001, Ann Neurol 50: 349-357）。ＴＮＦ／神経成長因子スーパーファミリの新規な構成員であって、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシスを誘導するリガンド（ＴＲＡＩＬ、ＡＰＯ２Ｌとも称される）（Wiley et al. 1995, Immunity 3: 673-682）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−βによって一貫して上方調節される遺伝子の１つであった。興味深いことに、ＴＲＡＩＬは内在性ＩＦＮ−βの誘導を媒介し、それによってこの療法の効果を増幅することも分かってきた（Kumar-Sinha et al. 2002, J Biol Chem 277: 575-585）。
【０００６】
最近、そのアポトーシス誘導効果（Wiley et al. 1995, Immunity 3: 673-682）とは別に、ＴＲＡＩＬがＴ細胞レベルで強力な抗炎症特性を発揮することが分かった（Song et al. 2000, J Exp Med 191: 1095-1104; Hilliard et al. 2001, J Immunol 166: 1314- 1319; Lunemann et al. 2002, J Immunol 168: 4881-4888）。ＴＲＡＩＬ受容体２による全身的な中和を行うとコラーゲン誘導関節炎および実験的な自己免疫脳脊髄炎が悪化することが自己免疫疾患動物モデルの研究によって実証され、Ｔ細胞増殖およびエフェクター機能にＴＲＡＩＬが作用することが示唆されている（Song et al. 2000, J Exp Med 191: 1095-1104; Hilliard et al. 2001, J Immunol 166: 1314-1319）。つい最近、ヒト免疫系において、Lunemann et al.（2002, J Immunol 168: 4881-4888）が、ＴＲＡＩＬはアポトーシスの誘導に失敗しても、自己反応性かつ外来抗原特異的Ｔ細胞の活性化を阻害することを示している。特に、リンパ球の活性化に極めて重要な、ストア作動性カルシウム放出によって活性化されるカルシウムチャンネルを介して、ＴＲＡＩＬはカルシウム流入を負に調節し、さらにＴ細胞抗原特異性あるいはＴヘルパー表現型とは無関係に、後続の細胞周期の進行およびサイトカインの産生を阻害する（Lunemann et al. 2002, J Immunol 168: 4881-4888）。ＴＲＡＩＬがヒトＴ細胞エフェクター機能にこのような影響を与えることから、ＴＲＡＩＬ系がＭＳの病因に役割を果たしていることが示唆され、その役割の中で活性化したミエリン特異的Ｔ細胞が炎症性脳損傷を媒介すると思われる。病気の自然な進行中、ＴＲＡＩＬはＭＳ患者の末梢免疫細胞中で増加することが判明したこと、および再発寛解型ＭＳ患者において臨床的寛解時にＴＲＡＩＬ濃度が最高であったことによってこの概念は裏付けられる（Huang et al. 2000, Neurology 55: 928-934）。
【０００７】
ヒトＴ細胞に対するその免疫制御特性の他に、ＴＲＡＩＬは、形質転換していないヒト肝細胞および脳細胞でアポトーシス型細胞死を誘導することが分かった（Jo et al. 2000, Nat Med 6: 564-657; Nitsch et al. 2000, Lancet 356: 827-828）。後者の知見は、抗炎症特性および破壊的特性の促進による、神経炎症でのＴＲＡＩＬの両刃の役割を示唆している。しかし、血液脳関門の統合性に与えるＩＦＮ−βの即時効果を考慮すると、ＭＳ治療の際にＩＦＮ−βにより誘導されたＴＲＡＩＬの上方調節には、ＣＮＳに対する直接効果よりも周辺での免疫制御機序が含まれる可能性がより高い（Stone et al. 1995, Ann Neurol 37: 611-619）。
【０００８】
現在まで、ＩＦＮ−β治療に対する患者の感受性を高い信頼度で予測することはできない。ＩＦＮ−β治療が極めて高価であり、医療システムに莫大な経済的負担を課していることを考慮すれば、患者のＩＦＮ−β療法の結果について予測ができれば望ましい。さらに、個々の患者にとって、一方で恩恵の可能性と他方で予想されるはずの副作用を比較考慮するために、そのような予測を立てることは極めて望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、個々のＭＳ患者においてＩＦＮ−β療法が成功するチャンスを予想可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＴＲＡＩＬ発現および／またはＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度を決定することを特徴とする、ＭＳの治療に利用されるＩ型ＩＦＮ療法に対して陽性応答者または陰性応答者、すなわち、非応答者として個人を同定する方法によってこの目的を解決する。
【００１１】
ＭＳの治療に利用されるＩ型ＩＦＮ療法をモニタリングするために本発明による方法を使用することによってもこの目的は解決される。
【００１２】
高用量のＩＦＮ−βに対するＭＳ患者の応答をモニタリングするために本発明による方法を使用することによってもこの目的は解決される。
【００１３】
ＩＦＮ−β治療経過中に中和抗体（ＮＡＢ）の発生および／または出現をモニタリングするために本発明による方法を使用することによってもこの目的は解決される。
【００１４】
ＴＲＡＩＬ遺伝子またはその部分に特異的な核酸プローブおよび／または１つまたは複数のプライマー、ならびに／あるいはＴＲＡＩＬポリペプチドまたはその部分に特異的な抗体を含む、本発明による方法を実施するためのキットによってこの目的はさらに解決される。別の好ましい実施形態では、本発明による方法を実施するためのキット（または医薬組成物）は、標準化ＴＲＡＩＬ蛋白質プローブ（すなわち、血清または血漿など）、ならびに１つまたは複数の抗ＴＲＡＩＬ抗体を含み、場合によっては、別の成分と混合して、および／または分離した容器で他の適当な成分と共に含まれる。そのようなキットは、とりわけ、ＥＬＩＳＡ検定、好ましくは大規模自動操作で適切に使用することができる。
【００１５】
本発明の方法は、ＩＦＮ−β療法で使用されることが好ましい。
【００１６】
本発明の方法は、ＩＦＮ療法の前にＴＲＡＩＬ発現および／またはＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度を決定するために使用することが好ましい。
【００１７】
前記方法では、試料は、哺乳動物から得ることが好ましく、ヒトから得ることがより好ましい。
【００１８】
好ましい実施形態では、試料は、体液、その画分、組織抽出物、および細胞抽出物を含む群から選択する。
【００１９】
より好ましい実施形態では、体液は、全血、血清、血漿、脳脊髄液、滑液、腹水浸出液、炎症の浸出液、および尿を含む群から選択する。
【００２０】
本発明による方法の特定の好ましい実施形態では、
（ａ）ＴＲＡＩＬポリペプチドまたはその部分をコードするＴＲＡＩＬ核酸の量および／または濃度を検出しかつ／または測定することによってＴＲＡＩＬ発現を決定し、かつ
（ｂ）ＴＲＡＩＬポリペプチドまたはその部分の量および／または濃度を検出しかつ／または測定することによってＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度を決定する。
【００２１】
本発明による方法の一実施形態では、液体試料中の可溶性ＴＲＡＩＬ（ｓＴＲＡＩＬ）蛋白質の量および／または濃度を測定することによってＴＲＡＩＬ蛋白質濃度の決定を実施する。
【００２２】
ＴＲＡＩＬポリペプチドの量および／または濃度の測定は、抗ＴＲＡＩＬ抗体を使用するイムノアッセイによって行われることが好ましい。
【００２３】
イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）が好ましいが、たとえば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはウェスタンブロットなどのブロッティング技術でもよい。
【００２４】
決定したＴＲＡＩＬポリペプチドの量および／または濃度を限界値と比較して陽性応答者と非応答者を判別するのが好ましく、その限界値は約３５０±２０ｐｇ／ｍｌである。とはいえ、より高い濃度のｓＴＲＡＩＬである約５８４．１ｐｇ／ｍｌも療法前に９０．５％の応答者および７１．４％の非応答者の臨床結果を正確に予測した。
【００２５】
あるいは、膜に結合したＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度を決定することができ、この決定は抗ＴＲＡＩＬ抗体の使用によって、たとえば、ＦＡＣＳｃａｎ分析、ＥＬＩｓｐｏｔ検定、または免疫組織化学技術で行われることが好ましい。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ核酸の量および／または濃度は、組織または細胞抽出物試料中のＴＲＡＩＬｍＲＮＡの量および／または濃度の測定によって決定することが好ましい。
【００２７】
好ましい実施形態では、前記試料には、血液細胞、末梢免疫細胞、ニューロン組織、および筋組織の抽出物を含む群から選択した抽出物が含まれ、その中でも末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）抽出物が特に好ましい。
【００２８】
ＴＲＡＩＬｍＲＮＡの量および／または濃度の測定は、１つまたは複数のＴＲＡＩＬ特異的プローブを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行うことが好ましい。
【００２９】
あるいは、ノーザンブロットなどの他の核酸定量技術を使用することができる。さらに、ＴＲＡＩＬｍＲＮＡの量および／または濃度は、固体組織または細胞試料で、たとえば、ＴＲＡＩＬ特異的プローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法によって決定することができる。
【００３０】
ＴＲＡＩＬｍＲＮＡの量および／または濃度は、限界値と比較して陽性応答者と非応答者を判別することが好ましい。前記限界値は、基準値と比較して少なくとも２倍である。
【００３１】
ＴＲＡＩＬ核酸および／またはポリペプチドの量および／または濃度は、それぞれ、ＭｘＡ蛋白質や他のＩＦＮ誘導性蛋白質など、ＩＦＮ−β療法の１つまたは複数の生体応答マーカー核酸および／またはポリペプチドの量および／または濃度に相関することが好ましい。
【００３２】
本明細書では、顕性ＭＳを患う個人は、一般的に受け入れられている判定基準に従って診断する（Poser et al. 1983, Ann Neurol 13: 227-231; McDonald et al. 2001, Ann Neurol 50: 121-127）。（拡大障害状態尺度ＥＤＳＳによって定義した、；Kurtzke 1983, Neurology 22: 1444-1452）障害状態は、臨床パラメータによって評価した。
【００３３】
本明細書では、「陽性応答者」を、ＩＦＮ−βの治療中にさらに再発することなく、ＥＤＳＳも低下しなかった患者として定義する一方で、引き続き１度または複数回再発している患者を「非応答者」として定義する。別の態様では、ＩＦＮ−β治療の陽性応答者および非応答者を臨床補助的活性マーカー、たとえば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって定義する。
【００３４】
ＴＲＡＩＬ発現および／またはＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度の決定を身体外で実施する方法として本発明の方法は理解されるものとする。
【００３５】
本明細書で使用される用語「決定」は、定性的検出および定量を意味してよい。
【００３６】
本明細書では、「抗ＴＲＡＩＬ抗体」は、ＴＲＡＩＬポリペプチドまたはその部分を目的とする抗体であり、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、二重抗体（diabodies）、およびキメラを含めてよい。
【００３７】
本明細書では、「ＴＲＡＩＬ」は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンドのことをさし、すなわち、略して「ＴＲＡＩＬ」は特異的形態特徴を伴うある種の型の細胞死であるアポトーシスを誘導することが初めに注目された分子である。ＴＮＦおよびＴＲＡＩＬは、類似の能力を持つ同じ分子ファミリに属する。その最初の発見以来、ＴＲＡＩＬ分子の他の機能が同定されてきた。本明細書で示したデータにとって重要な機能はＴ細胞作用の阻止であり、この機能は炎症を全体的に防止するので抗炎症性であると考えることができる。ＴＲＡＩＬは、Ｔ細胞数の増加（増殖、次項参照のこと）を担う細胞周期の一定の経路を阻害することによってこの効果を生み出している。
【００３８】
本明細書で使用される「T細胞増殖／細胞周期」は、Ｔ細胞数の増加をさしＴ細胞増殖と称される。この過程のために予め必要な条件は、カルシウムが主要な役割を担う活性化段階に始まり、続いて単細胞を分割して２個の細胞に導く一連の事象である。後者が生じるためには、細胞はいくつかのステップ［たとえば、Ｇ（＝間）期およびＳ（＝合成）期］からなり、いくつかの分子によって調節される、いわゆる、「細胞周期」を経なければならない。
【００３９】
「遺伝子発現プロファイリング」により、たとえば、ｃＤＮＡマイクロアレイ、すなわち、遺伝子発現の同時測定用に数百および数千の異なるプローブを含むマイクロアレイによって、特定の時間に特定の組織で発現される遺伝子のスナップ写真が得られる。
【００４０】
本明細書では、「実時間定量的ｒｔＰＣＲ」は、二重標識蛍光プローブの分解をＰＣＲ増幅に随伴してリアルタイムにモニタする方法をさす。入力標的ＲＮＡ濃度は、レポーター蛍光放出が閾値濃度を超えて増加する（ＰＣＲサイクルで測定した）時間に相関する。
【００４１】
本明細書で使用される「ＲＯＣ分析」は、一定の診断パラメータに基づき一連の判別を行って異なる２つの状態（病人、および非病人）に分ける必要があるとき、いかに正確に診断試験を実施するかの統計的定量方法をさす。その判別パラメータのあらゆる値をカットオフとして使用し対応する感受性および特異性を計算する。
【００４２】
要するに、ＴＲＡＩＬがＭＳのＩＦＮ−β療法における生体応答マーカーであるとの同定は本明細書の開示が最初である。初期のかつ持続したＴＲＡＩＬ遺伝子の誘導が、ＩＦＮ−β療法応答のマーカーであることは、その遺伝子および蛋白質の発現プロフィールと長期間治療したＭＳ患者の臨床疾患マーカーとを結びつけることによって実証されている。ＴＲＡＩＬ遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏプロフィールおよび蛋白質の発現によって、ＩＦＮ−β療法の非応答者と応答個体とをより詳細に判別することができる。さらに、患者血清中のｓＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度が高い場合には療法を開始する前でさえ治療応答のあることを予測することができた。ｓＴＲＡＩＬの血清濃度を決定するためにＥＬＩＳＡを使用して、２つの限界値、その１つの値は約３５０±２０ｐｇ／ｍｌ、高い方の値はすなわち５８４．１ｐｇ／ｍｌが観察された。したがって、これらの限界値より高い濃度では、ＩＦＮ−β療法に対して陽性の応答が予測されることが示唆されるが、低い濃度では応答しないことが指摘される。
【００４３】
次に、本発明を添付図に関する以下の実施例によってさらに説明する。本発明の範囲にどんな制限を加える意図もなく実施例は全て、例示のためにのみ提供される。引用した参照文献は全て、その全体が参照により本明細書に編入される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
実施例を説明する前に図について述べる。
【００４５】
図１は、ＩＦＮ−β−１ａ療法中のＭＳ患者６２人のＭｘＡ、ＴＲＡＩＬ、およびＣＤ９５Ｌの自発的遺伝子発現を示す。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料をＩＦＮ−β−１ａ療法開始前、ならびに療法下４週間目、２６週間目、および５２週間目に得た。全ＲＮＡを抽出し、実時間（ｒｔ）ＰＣＲによって相対的ｍＲＮＡ濃度を決定した。遺伝子発現濃度をヒポキサンチンホスホリル転移酵素（ＨＰＲＴ）の発現に対して標準化した。ＭｘＡ蛋白質遺伝子発現の誘導をＩＦＮ−β療法の生体応答マーカーとしてｉｎ  ｖｉｖｏで測定した。変化を治療前の遺伝子発現濃度と比べて示す。データを平均値±ＳＥＭとして示す。時間の影響を１群ＭＡＮＯＶＡ、各ｐ＜０．０５によって証明した。治療４週間後、２６週間後、および５２週間後の変化をＰｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定した結果を多重調節した基準と比較した（*ｐ＜０．００１）。
【００４６】
図２は、ＩＦＮ−β「初年度応答者」（ｎ＝２０）および「初年度非応答者」（ｎ＝１９）のＴＲＡＩＬ遺伝子発現の示差的な誘導を示す。非応答者とは対照的に、ＩＦＮ−β−１ａ療法によって、臨床治療に応答するＭＳ患者ではＴＲＡＩＬ遺伝子発現が初期におよび持続して上方調節される。ＭｘＡ遺伝子発現が上方調節されることから、両患者群においてＩＦＮ−β−１ａのｉｎ  ｖｉｖｏ生体有効性が実証される。ＣＤ９５Ｌは、どんな患者の部分集団においてもＩＦＮ−β療法によって顕著に調節されなかった。*ｐ＜０．０５。
【００４７】
図３は、ＩＦＮ−β治療中のＴＲＡＩＬ遺伝子発現の上方調節が、中和抗体（ＮＡＢ）の存在下で阻害されることを示している。治療１年後に、ＩＦＮ−β−１ａに対してＮＡＢが生じた患者の第３部分集団（ｎ＝２３）でＭｘＡおよびＴＲＡＩＬの自発的遺伝子発現を測定した。ＮＡＢの存在は１８ヵ月後に確認された。ＭｘＡおよびＴＲＡＩＬ遺伝子発現の初期上方調節は、中和抗体の存在下で阻害された。時間作用：１群ＭＡＮＯＶＡ、各ｐ＜０．０００１、多重調節したＰｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定（*ｐ＜０．００１）。
【００４８】
図４は、患者部分集団の基準ＴＲＡＩＬ遺伝子発現濃度を示す。遺伝子発現濃度をＨＰＲＴの発現に対して標準化した。箱ひげ図は、各群の濃度中央値（箱内水平線）、２５および７５パーセンタイル（箱の上端および下端）、および１０および９０パーセンタイル（箱の上方および下方に伸びた線）を表す。患者下位群間には有意差は認められなかった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定）。
【００４９】
図５は、健康な個体と比較した（Ａ）、およびＩＦＮ−β−１ａ療法中の（Ｂ）ＭＳ患者の可溶性ＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度を示す。実験の詳細は実施例４参照のこと。
【００５０】
図６は、ＩＦＮ−βによるＴＲＡＩＬの遺伝子転写および蛋白質発現の調節を示す。ＰＢＭＣ（ウェル当たり１０６個）を４８穴プレートにて最終容量１ｍｌで指定した時間培養した。ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）（１０ＩＵ／ｍｌ）のＩＦＮ−β−１ａ（１０および１００ＩＵ／ｍｌ）で細胞を培養した。ＴＲＡＩＬｍＲＮＡをｒｔＰＣＲによって決定した。遺伝子発現濃度を１８ＳｒＲＮＡに対して標準化した（Ａ）。細胞表面発現をフローサイトメトリーによって検出した。抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体と、それに続くフィコエリトリン（ＰＥ）標識ヤギ抗マウスモノクローナル抗体によって細胞を染色した（Ｂ）。培養上清のｓＴＲＡＩＬ蛋白質濃度をＥＬＩＳＡによって決定した（Ｃ）。２名の健康な個人で得られた結果を示す（平均値±ＳＥＭ）。
【００５１】
図７は、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現がＩＦＮ−β治療を受けた、療法応答性患者で特異的に誘導されることを示している。治療を受けた患者、未治療患者、および健康な対象の第２の独立コホートで９ヵ月間にわたって自発的遺伝子発現を測定した。患者の人口統計的特性に関しては表２を参照のこと。ＴＲＡＩＬ遺伝子発現に関する顕著な影響はＩＦＮ−β治療応答者で排他的に見受けられた。（ＭＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０２６）（Ａ）。ＭｘＡ遺伝子発現の上方調節は、治療応答者（ＭＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．００６４）および非応答者（ＭＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．０００６）でのＩＦＮ−β−１ａのｉｎ  ｖｉｖｏ生体有効性を実証している（Ｂ）。
【００５２】
図８は、「初年度応答者」対「初年度非応答者」におけるｓＴＲＡＩＬ濃度の予測される判別値を示す。治療前に応答者２９人および非応答者２０人（ＮＡＢを有する患者を含む）から得た血清を調査した（Ａ）。ＩＦＮ−β療法前の患者の血清中のｓＴＲＡＩＬ濃度により予測される治療応答についての感受性および特異性を示すＲＯＣ特性（材料および方法を参照のこと）。ＲＯＣ曲線下領域＝０．８７９、９５％信頼区間、０．７８５〜０．９７４。（Ｂ）ＮＡＢを有しない下位グループの患者のＲＯＣ分析（応答者１６人および非応答者１７人）。ＲＯＣ曲線下領域＝０．９１９、９５％信頼区間、０．８１２〜１．０２６。
【００５３】
【表１】
2005527221.tif 000003
【００５４】
【表２】
2005527221.tif 000004
【００５５】
以下の実施例は、本発明を例示し立証することを目的とする。ＩＦＮ−β療法でのＴＲＡＩＬの関与を研究するためにＭＳと確定された患者を集めた。研究は、地方倫理委員会によって承認され、各人からはインフォームドコンセントを得た。
【００５６】
ＭＳ患者は全て、再発寛解型と臨床上確定されたＭＳであった。健康な志願者は、神経免疫学研究室の職員から選択した。研究したＭＳ患者（ｎ＝６２）は、ＩＦＮ−β−１ａの臨床試験であるＭＡＳＴＥＲ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標）によるＭＳ抗体状態および療法評価）研究に継時的に参加した。その研究に適格な対象は、１８歳から５５歳の患者であって、２年を超えて再発寛解型ＭＳを患っており、過去２年間に少なくとも２回再発し、研究前６ヵ月間にどんな免疫調節治療も受けていない、治療開始前４週間に悪化していない、かつ拡大障害状態尺度（ＥＤＳＳ）（Lunemann et al. 2001, Neurology 57: 1132-1134）によって定義される障害スコアが０〜５．５である患者である。患者は全て、週１回の皮下注射によってＩＦＮ−β−１ａ（Rebif（登録商標）、Serono社、ドイツ国Unterschleisheim）、４４μｇの治療を受けた。この用量は、Ｔ２活性およびＭＲＩによって測定した疾患の負担を著しく低減することが示されており、最初の神経系統機能障害の出現後、患者が確定したＭＳへ転換（conversation）するのを遅らせることが実証されているＩＦＮ−β−１ａ濃度の２倍を表している（The Once Weekly Interferon for MS Study Group「ＭＳに向けて週１回インターフェロン研究グループ」1999, Neurology 53: 679-686; Comi et al. 2001, Lancet 357; 1576-1582）。さらに、治療開始後にＰＢＭＣのＭｘＡ遺伝子発現が明らかに著しく増強されることによって示されたように、この用量は生体に有効であることが判明した（参照：図１）。ＩＦＮ−β−１ａの適用後３日目の採血時毎に（ＥＤＳＳによって定義した）障害の状態および再発の臨床データを得た（Kurtzke 1983, Neurology 33: 1444-1452）。臨床再発とは、既存の症状の著しい悪化、または発熱はないが２４時間を超えて持続する新規な神経系欠陥の様子として定義した。この研究の目的のために、完全な継時的データのある患者しか含めなかった（ｎ＝６２）。ＩＦＮ−βで治療中、さらに再発せずＥＤＳＳも低下しなかった患者を陽性応答者（ｎ＝２０）として定義する一方で、引き続き１度または複数回再発した患者を非応答者（ｎ＝１９）として定義した。これらの患者の数人で、臨床再発を静脈内メチルプレドニゾロン用量１ｇ／日の３日間コースで治療した。しかし、全ての血液試料を治療前に得た。この研究の目的のために、陽性応答者（ｎ＝２０）および非応答者（ｎ＝１９）は無作為に選択した（表１を参照）。さらに、ＭｘＡ誘導検定によって決定した、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）に対して中和抗体（ＮＡＢ）を生じた患者（ｎ＝２３）を含めた。Ｒｅｂｉｆ（登録商標）によって誘導されたＭｘＡ濃度は記載の通りに決定した（Kracke et al. 2000, Neurology 54: 193-199）。結果をインターフェロン中和化単位（ＩＮＵ）、すなわちＲｅｂｉｆ（登録商標）１０Ｕ／ｍｌの活性を検量線によって決定した判別可能な１Ｕ／ｍｌの活性に中和する血清の力価として示す。この群内では、１７人の患者が治療応答に関する臨床判定基準を満たした。ＩＦＮ−β治療前（基準＝０週）ならびに療法下４週間目、２６週間目、および５２週間目に静脈血液試料を採取した（毎回ＩＦＮ−β適用後３日目）。治療経過中ＮＡＢを生じた患者は７８週間目まで追跡した。
【００５７】
特異性を調査し本発明者らのデータを確認するために、第２の独立コホートは、当方外来診療部門で月１回追跡したｎ＝２０の再発寛解型ＭＳ患者（表２）、および同じ間隔で血液を提供した４人の健康なドナーからなった。これらの人々のうち、１１人の患者には週３回標準用量の２２μｇのＲｅｂｉｆ（登録商標）の投与を開始した。療法開始時に現れるインフルエンザ様症状などの副作用を緩和するために、用量は徐々に増加し４週間後に総量に達した。ＭＲＩ走査（１，５Ｔスキャナ、Siemens Vision、Siemens社、ドイツ国Erlangen）は、臨床データおよび免疫学的データを伏せた熟達した研究者によって分析した。本発明者らは、治療開始前および開始後９ヵ月目に、スピンエコーＴ１強調走査（ＴＲ８４０ｍｓ、ＴＥ１４ｍｓ、マトリックス寸法１９２×２５６、視野２５６ｍｍ、５ｍｍ厚の２８枚の連続軸位断）を造影剤（Magnevist（登録商標）２０ｍｌ、ガドペンテト酸ジメグルミン［Ｇｄ］、Schering社、ドイツ国ベルリン）の有無によって測定し、かつターボスピンエコーＴ２強調走査（ＴＲ４００ｍｓ、ＴＥ１００ｍｓ、マトリックス寸法９６×１２８ｍｍ、視野２４０ｍｍ）を測定した。ＩＦＮ−β治療中、さらに再発せず、ＥＤＳＳも低下せず、Ｔ１およびＴ２の病変負荷も進行せず、Ｇｄ強化病変もない患者を「初年度応答者」として定義する一方で、引き続き１度または複数回再発した患者、またはＭＲＩが活性な患者を「初年度非応答者」として定義した。
【００５８】
フィコール密度勾配遠心法（Bio-Whittaker社、米国メリーランド州Walkersville）によってＰＢＭＣを新鮮血から単離し液体窒素で冷凍保存した。検定を実施するまで血清を−２０°Ｃで貯蔵した。臨床データ、ＭＲＩデータ、およびそれらのそれぞれの結果も伏せた独立した研究者らによって全ＲＮＡおよび蛋白質測定を実施した。研究の全部分は、地方倫理委員会によって承認され、各個人からは書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００５９】
人口統計的データは、平均値、中央値、および範囲によって記載されている。比較の根拠用に図の結果は平均値±ＳＥＭとして表す。時間に関する興味深い臨床結果の変化は、２因子設計での反復測定（因子として治療および反復）用非パラメータ多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）を使用して分析した（Brunner, E., Domhof, S., Langer, F.  Nonparametric Analysis of Longitudinal Data in Factorial Experiments「因子実験での継時的データ非パラメータ分析」J. Wiley, New York 2002）。したがって、本発明者らは、対応する応答曲線上の全点を同時に比較した。全般的試験後、本発明者らは、Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  解析（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）を実施して治療の一定の時間相互間での特異的な差、および治療と基準の間での特異的な（臨床的に重大な）差を検出した。同じ理由で、本発明者らは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定の使用によって一定の時間点に関して２つの投与群間の差も分析した。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して２群を超える群間の差を検出した（非パラメータ１元配置ＡＮＯＶＡ）。多重比較のための調整は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍによる逐次拒絶検定の手順を使用して実施した。予測される判別値をＲＯＣ分析によって算出した。感受性および特異性を考慮して最適カットオフ値を提案する。Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＳＰＳＳ（リリース１１．０．１、著作権（登録商標）SPSS Inc.11998-2001）およびStatistical Analysis System（SAS）バージョン８．２（SAS Institute Inc. 米国ノースカロライナ州Cary）を使用し統計分析を実施した。ｐ＜０．０５レベル、両側で有意性を評価した（正確）。
【実施例１】
【００６０】
全身的ＩＦＮ−β治療直後のＴＲＡＩＬ遺伝子発現の誘導
【００６１】
最初に、ＭＳ患者の全身的ＩＦＮ−β治療によってｉｎ  ｖｉｖｏでＴＲＡＩＬ遺伝子発現が誘導されるかどうかを検査した。この目的のために、ＭＳ患者（ｎ＝６２）から得たＰＢＭＣをＩＦＮ−β−１ａ療法前および療法中に調査した。
【００６２】
ＩＦＮ−β−１ａ療法の開始前、ならびに療法下４週間目、２６週間目、および５２週間目に末梢血試料を得た。フィコール密度勾配遠心法（Bio-Whittaker、米国メリーランド州Walkersville）によって新鮮血からＰＢＭＣを単離し分析まで液体窒素に冷凍保存した。
【００６３】
全ＲＮＡを抽出し相対的ｍＲＮＡ濃度を実時間（ｒｔ）ＰＣＲによって定量した。さらに、密接に関連したＴＮＦファミリ構成員ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬとも言う）も定量した。並行して、ＩＦＮ−β−１ａ療法に対するｉｎ  ｖｉｖｏ応答マーカーとしてＭｘＡ蛋白質遺伝子発現も測定した（Wandinger et al. 2001, Ann Neurol 50: 349-357）。
【００６４】
ＲＮｅａｓｙキット（Qiagen社、米国カリフォルニア州Santa Clarita）を使用し細胞から全ＲＮＡの単離を実施し、メーカー（Perkin Elmer社、米国カリフォルニア州Foster City）使用説明書に従ってＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬を使用し無作為の六量体を用いてｃＤＮＡへ逆転写した。ｒｔＰＣＲの定量は、ABI Prism（登録商標）7700 Sequence Detection System （Perkin Elmer社）（Wandinger et al. 2001, Ann Neurol 50: 349-357）で実施した。刺激状態用にヒポキサンチンホスホリル転移酵素（ＨＰＲＴ）および１８ＳｒＲＮＡを増幅し試料の標準化に利用した。増幅プロトコルは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲキットの推奨に従った。ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、ＭｘＡ、およびＨＰＲＴ転写物を検出するために、オリゴヌクレオチドを、前進および逆進プライマーには最終濃度２００ｎＭで、また以下の蛍光発生プローブには１００ｎＭで使用した。
ＴＲＡＩＬ前進：  ５'ＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴ３'、
逆進：            ５'ＴＧＡＴＧＡＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＧ３'、
プローブ：        ５'ＦＡＭ−ＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ３'；
ＣＤ９５Ｌ前進：  ５'ＡＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧ３'、
逆進：            ５'ＡＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＴ３'、
プローブ：        ５'ＦＡＭ−ＡＡＧＣＡＡＡＴＡＧＧＣＣＡＣＣＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣ−ＴＡＭＲＡ３'；
ＭｘＡ前進：      ５'ＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＴＡＴＣＡＣ３'、
逆進：            ５'ＧＡＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＡＡ３'、
プローブ：        ５'ＦＡＭ−ＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣ−ＴＡＭＲＡ３'；
ＨＰＲＴ前進：    ５'ＡＧＴＣＴＧＧＣＴＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧ３'、
逆進：            ５'ＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧＧ３'、
プローブ：        ５'ＦＡＭ−ＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＡＣＣＴＴＧＡ−ＴＡＭＲＡ３'。
【００６５】
そのプロトコルのΔΔＣＴ法によってＨＰＲＴまたは１８ＳｒＲＮＡに相対的な遺伝子発現の定量を算出した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）リボソームＲＮＡ制御試薬（Perkin Elmer社）を使用し１８ＳｒＲＮＡを増幅した。２倍以上の遺伝子発現の変化は、次の統計分析に有効であるとみなした。
【００６６】
ＳＰＳＳソフトウェア（SPSS Software GmbH社、ドイツ国ミュンヘン）を使用し統計分析を実施した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定を使用して患者群間のデータを比較した。群内の従属変数を分析するために、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号順位検定を実施した。以下に概説する実験から得られたデータを同じ統計手法を使用し評価した。人口統計的データを平均値、中央値、および範囲によって記載する。比較の根拠用に図の結果は平均値±ＳＥＭとして示す。
【００６７】
図１では、基準と比較して、ＭｘＡおよびＴＲＡＩＬの自発的遺伝子発現は、治療３週間後のＭＳ患者のＰＢＭＣで著しく上方調節され、１年間高いままであったことがわかる［時間作用は各（ｐ＜０．０５）である１群ＭＡＮＯＶＡによって証明された。Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定ではＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍにより全（正確）ｐ値＜０．００１-α／３＝０．０１６７］（図１）。それに反して、ＣＤ９５Ｌでは、ＩＦＮ−β療法中、試験した各時間点でどんな著しい調節も示されなかった。
【実施例２】
【００６８】
ＩＦＮ−β応答者および非応答者でのＴＲＡＩＬ遺伝子発現
【００６９】
ＩＦＮ−βの作用機序のためのＴＲＡＩＬ誘導の機能的な妥当性を検証するために、患者を彼らの臨床応答状態に関して特徴付けた。ＩＦＮ−β治療中、さらに再発せずＥＤＳＳも低下しなかったＮＡＢ陰性患者を陽性薬物応答者として定義する一方で、引き続き１度または複数回再発した患者を非応答者として定義した。
【００７０】
図２に例示したように、ＩＦＮ−β療法によって、臨床応答するＭＳ患者でＴＲＡＩＬ遺伝子発現の初期にかつ持続して上方調節がもたらされた（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定：ｐ＝０．００１、ｐ＝０．０２１、ｐ＝０，００２正確-Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ）。これに反して、非薬物応答者では、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現は治療６ヵ月後に一時的にしか誘導されなかった。生体応答マーカーＭｘＡは、両群で著しく上方調節され（図２Ａ）両患者群でＩＦＮ−β−１ａのｉｎ  ｖｉｖｏ生体有効性が示された。図２Ａで概説したように、非応答者では、調査した各時点で全身的ＩＦＮ−β治療に呼応してさらに高いＭｘＡ遺伝子発現濃度が示された（非パラメータＭＡＮＯＶＡｐ＜０．０００１）。群全体に関しては、ＣＤ９５Ｌは、患者部分集団ではＩＦＮ−β療法によって顕著に調節されなかった。応答者と非応答者の間では、調査した遺伝子の基準発現濃度の差は認められなかった（データを図示せず）。
【実施例３】
【００７１】
中和抗体を生じた患者でのＴＲＡＩＬ遺伝子発現
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＦＮ−βによるＭｘＡおよびＴＲＡＩＬ発現の平行した上方調節を考慮して、ＩＦＮ−βの治療進行中のＮＡＢの出現が、ＭｘＡに関して報告されているようにＴＲＡＩＬ遺伝子の発現に作用するかどうかを調査した（Deisenhammer et al. 1999, Neurology 52: 1239-1243）。したがって、１年後にＮＡＢを生じた患者の第３部分集団（ｎ＝２３）で自発的遺伝子発現を分析した。ＮＡＢの存在は１８ヵ月後に確認された（参照：表１、２）。
【００７３】
図３は、これらの対象で、ＭｘＡ遺伝子の誘導によって測定されたＩＦＮ−βの生体利用能がＮＡＢの存在下で完全に阻害されたことを実証する（系統だった時間作用は１群用非パラメータＭＡＮＯＶＡで分析（ｐ＜０．０００１）、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定での最初の２個のｐ値＜０．０００１、ｐ３＝０．５６３、ｐ４＝０．７４１正確）。並行して、ＩＦＮ−βによるＴＲＡＩＬ遺伝子発現の初期上方調節も阻害され、ＩＦＮ−βによるＴＲＡＩＬ転写の直接調節が示唆された（図３）（１群用非パラメータＭＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１）、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定では最初の２個のｐ値＜０．０００１、ｐ３＝０．８５５、ｐ４＝０．５４３正確）。ＣＤ９５Ｌの発現は、ＮＡＢの存在下で著しい変動を示さなかった（データを図示せず）。ＴＲＡＩＬの基準遺伝子発現濃度では３群の患者下位群相互間に有意差は認められなかった（図４）（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、ｐ＝０．５０２正確）。
【００７４】
興味深いことに、これらの患者の大部分は、研究時中依然として臨床応答状態のままであった。しかし、この臨床観察は、ＩＦＮ−β−１ｂの中心的試行およびＩＦＮ−β−１ａのＰＲＩＳＭＳ研究の拡大の結果と一致し、その研究では最後に、ＮＡＢの発生は、それぞれ、１８〜２４ヵ月間および２４ヵ月以降の観察期間中効力喪失の遅延が伴った（ＩＦＮＢ多発性硬化症グループおよびブリティッシュコロンビア大学ＭＳ／ＭＲＩ分析グループ、1996, Neurology 47: 889-894；ＰＲＩＳＭＳ研究グループおよびブリティッシュコロンビア大学ＭＳ／ＭＲＩ分析グループ、PRISMS-4, 2001, Neurology 56: 1628-1636）。
【実施例４】
【００７５】
ＩＦＮ−β応答者および非応答者でのＴＲＡＩＬ蛋白質の発現
【００７６】
ＴＲＡＩＬ蛋白質の発現に関してもＩＦＮ−β非応答者は応答者と異なるかという質問に対処するために、ＩＦＮ−β−１ａ療法前および療法中のｓＴＲＡＩＬ蛋白質血清濃度を異なる２種の実験設定で測定した。
【００７７】
実験用に、ＮＡＢ陰性薬物応答者（ｎ＝１２）および非応答者（ｎ＝１１）から血清を入手して調査用とし、この血清を検定実施まで−２０°Ｃで貯蔵した。メーカー（Trinova Biochem、ドイツ国Giesen）のプロトコルに従って検出限界６５ｐｇ／ｍｌであるサンドウィッチＥＬＩＳＡを使用して可溶性ＴＲＡＩＬ蛋白質を定量した。
【００７８】
ＩＦＮ−β−１ａ療法前および療法中に、本発明者らは、膜結合および可溶性ＴＲＡＩＬ（ｓＴＲＡＩＬ）蛋白質濃度を、調査のために血清を得ることができたＮＡＢ陰性薬物応答者（ｎ＝１２）および非応答者（ｎ＝１１）のＰＢＭＣ上でおよび血清で測定した。療法前には、ＭＳ患者（ｎ＝２３）は、性別および年齢が似通った健康な個人（ｎ＝２４）と比較してｓＴＲＡＩＬ濃度が低下したことが明らかになった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定、ｐ＝０．０１７正確）（図５Ａ）。患者群内では、ＩＦＮ−β治療進行中応答者と非応答者との間では、血清中ｓＴＲＡＩＬ蛋白質の蓄積で有意差があった（ＭＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００１０９）（図５Ｂ）。
【００７９】
ＩＦＮ−β−１ａ療法開始前、ならびに療法下４週間目、２６週間目、および５２週間目に、ＩＦＮ−β応答者（ｎ＝１２）および非応答者（ｎ＝１１）の血清中の可溶性ＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度を測定した。箱ひげ図は、各群中央値濃度（箱内水平線）、２５および７５パーセンタイル（箱の上端および下端）、ならびに１０および９０パーセンタイル（箱の上方および下方に伸びた線）を示す。患者群間の統計的有意差をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定によって検定した。*ｐ＜０．０５。
【００８０】
図５Ｂで実証したように、治療開始前、応答者は非応答者と比較して既に顕著に高いｓＴＲＡＩＬ基準濃度を示し（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ｐ＝０．００４正確）、ＴＲＡＩＬ発現の転写後調節の差が根底にあることを示唆した。３５０ｐｇ／ｍｌを超える、特に約５８４．１ｐｇ／ｍｌｓのＴＲＡＩＬ濃度は、ＩＦＮ−β療法への応答に明確に関連付けられた。すなわち、療法前に３５０ｐｇ／ｍｌより上回る、またはわずかに下回るｓＴＲＡＩＬ濃度によって、それぞれ、９２％の陽性応答者および７３％の非応答者の臨床結果が予想された。患者群全体では、これは正解予測率８３．６％を意味した。基準濃度と比較して、血清中のｓＴＲＡＩＬ蛋白質の蓄積は、応答者でＩＦＮ−β治療４週間後、および非応答者で著しく増大した。長期治療患者では、６ヶ月後および１２ヵ月後、ｓＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度は、非応答者と比較して陽性応答者では依然として著しく上方調節された（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ｐ（６ヵ月）＝０．０１１、ｐ（１２ヵ月）＝０．０１５正確-Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ）。
【００８１】
血清中のｓＴＲＡＩＬの他に、ＰＢＭＣ上に発現した膜結合ＴＲＡＩＬ蛋白質をフローサイトメトリーで測定した。ＩＦＮ−β−１ａ療法前および療法中にＮＡＢ陰性応答者および非応答者からＰＢＭＣを調製し、１試料につきＰＢＭＣ２×１０５個を抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（カタログ番号８０４−３２２−Ｃ１００、Alexis Corporation社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）または対照マウスＩｇＧ１（カタログ番号Ｘ０９３１、DAKO社、デンマーク国Glostrup）と共に濃度１：１００で４°Ｃで３０分間培養した。洗浄した細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）標識２次ヤギ抗マウス抗体（カタログ番号Ｒ０４８０、ＤＡＫＯ社）と共に濃度１：２０で３０分間培養した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析し、データをＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Becton-Dickinson社、米国Mountain View）を使用し処理した。値を特異的蛍光強度として表し、ヒストグラム統計によって計算し、ＴＲＡＩＬ抗体による蛍光強度から適切な対照抗体による蛍光強度を除いて百分比によって定義した。
【００８２】
ＩＦＮ−β治療中、ＰＢＭＣ上のＴＲＡＩＬ表面発現の著しい変化は患者部分集団のどれにも認められなかった（データを図示せず）。研究全体にわたって血液試料はＩＦＮ−β投与（皮下注射）後３日目に患者から回収したので、陰性の知見は膜結合ＴＲＡＩＬ発現の時間経過によって説明できる。
【実施例５】
【００８３】
ＰＢＭＣ細胞培養でのＴＲＡＩＬ遺伝子および蛋白質の発現
【００８４】
ＰＢＭＣをＩＦＮ−β−１ａの存在下ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、ＴＲＡＩＬ遺伝子転写の調節、細胞表面発現、および培養上清中の可溶性蛋白質の蓄積を比較調査した（参照図６）。
【００８５】
Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍｌ、およびペニシリン／ストレプトマイシン１００Ｕ／ｍｌ（Whittaker Bioproducts社、米国メリーランド州Gaithersburg）、ならびに５％ヒト血漿を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ギブコ社、米国ニューヨーク州Grand Island）に解凍したばかりのＰＢＭＣを再懸濁した。ＰＢＭＣ（ウェル当たり１０６細胞）を３７°Ｃ、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で培養した。明示した場合は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）またはサイトカインを以下のように培養に加えた：ＰＨＡ１μｇ／ｍｌ（Sigma-Aldrich社、ドイツ国Steinheim）、組換えヒトＩＦＮ−β−１ａ、１０ＩＵ／ｍｌおよび１００ＩＵ／ｍｌ（Rebif（登録商標）、Serono社、ドイツ国Unterschleissheim）、組換えヒトＩＬ−２、１０ＩＵ／ｍｌ（Proleukin社、ドイツ国フランクフルトEurocetus）。
【００８６】
図６Ａで実証したように、ＩＦＮ−βによるＰＢＭＣを培養すると２４時間後にＴＲＡＩＬｍＲＮＡ濃度の迅速で用量依存的上方調節と、７２時間後にそれに続く第２ピークがもたらされた。ＴＲＡＩＬ発現も同様にＩＦＮ−βによって２４時間後にＰＢＭＣ表面上に急速に誘導された（図６Ｂ）。しかし、膜結合ＴＲＡＩＬ発現は、７２時間後の基準濃度と比較してほんのわずかにしか増大しなかった。濃度１０ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−βで刺激したとき、培養上清の可溶性ＴＲＡＩＬ濃度は２４時間にわたって増加し９６時間高いままであった（図６Ｃ）。濃度１００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−βで培養すると、９６時間にわたってｓＴＲＡＩＬがさらに増加した。ＩＦＮ−βとは対照的に、ＰＨＡおよびＩＬ−２で細胞を刺激すると、ＴＲＡＩＬ遺伝子および蛋白質の発現は遅延された（図６Ａ−Ｃ）。既に報告されている知見と一致して、これらのデータはＩＦＮ−βがＴＲＡＩＬ発現の転写制御を直接調節することを示している（Kayagaki et al. 1999, J Exp Med 189:1451-1460）。
【実施例６】
【００８７】
より高い用量のＩＦＮ−βで治療した患者での示差的なＴＲＡＩＬ調節の確認
【００８８】
ＴＲＡＩＬがＩＦＮ−βの潜在的応答マーカーであるという仮説を試験するために、週３回２２μｇのＩＦＮ−β療法を開始した第２の独立した患者群でＴＲＡＩＬ発現をさらに研究した。これらの患者では、治療応答は、無症状性疾患の活性の測定としてＭＲＩ分析によって確認した。療法中、臨床判定基準の他に、応答者にはＴ１およびＴ２病変カウントで進行はなく、新規なＧｄ増大病変もないことが明らかになった。知見の確認として、治療中、ＴＲＡＩＬ遺伝子誘導の顕著な差によって応答者を非応答者と明瞭に判別することができた（系統だった時間作用は非パラメータＭＡＮＯＶＡによって分析した。ｐ＝０．０２６）（図７Ａ）。
【００８９】
標準用量で投与されたＩＦＮ−βによるＴＲＡＩＬ遺伝子誘導の影響は、これらの患者でほぼ５倍も高く、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子転写が用量依存性調節であることも実証した。生体応答マーカーＭｘＡは、応答者および非応答者で著しく上方調節された（系統だった時間作用は非パラメータ１群ＭＡＮＯＶＡで分析した。それぞれ、各ｐ＝０．００６４およびｐ＝０．０００６、正確）（図７Ｂ）。
【００９０】
ＩＦＮ−βで治療した患者を、１群の９人の未治療患者および４人の健康な個人と比較することによって、ＩＦＮ−β療法に応答する患者でＴＲＡＩＬの上方調節の特異性が強調される（図７Ａ）。未治療患者群だけでなく健康な個人においてもＭｘＡは増加した（図７Ｂ）。
【実施例７】
【００９１】
ＩＦＮ−β療法応答に関するｓＴＲＡＩＬの予測値
【００９２】
ＩＦＮ−βで治療した患者の第２群も、治療前に応答者で高いｓＴＲＡＩＬ濃度を示したので、療法応答に関するｓＴＲＡＩＬの予測される判別値を決定するために最後に全般的ＲＯＣ分析を実施した。血清を得ることができた合計４９人の治療前患者（ＮＡＢ＋患者を含む）を調査した。その後２９人は応答者および２０人は非応答者であった。療法前のｓＴＲＡＩＬ濃度が５８４．１ｐｇ／ｍｌより高いかまたは低いかによって９０．５％の応答者および７１．４％の非応答者の臨床結果が正確に予測された。ＲＯＣ分析特性（曲線下領域、０．８７９、９５％信頼区間、０．７８５〜０．９７４）を図８Ａに示す。中和抗体（ＮＡＢ）を有する患者にｓＴＲＡＩＬの治療応答を予測する能力が備わるかどうか調査するために、ＮＡＢ患者を除いた第２予測分析の形で感受性分析を実施した（図８Ｂ）。この下位グループの結果（曲線下領域、０．９１９、９５％信頼区間、０．８１２〜１．０２６）は全患者での分析に一致したので、これらの患者は予測マーカーとしてのｓＴＲＡＩＬの能力について適切な影響を持たないと推定することができる。
【００９３】
以上の説明、特許請求の範囲、および／または添付の図面で開示された特徴は、別々におよびそれらのどんな組合せでも、その多様な形で本発明を提供するための材料であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ＩＦＮ−β−１ａ療法中のＭＳ患者６２人のＭｘＡ、ＴＲＡＩＬ、およびＣＤ９５Ｌの自発的遺伝子発現を示す。
【図２】図２は、ＩＦＮ−β「初年度応答者」（ｎ＝２０）および「初年度非応答者」（ｎ＝１９）のＴＲＡＩＬ遺伝子発現の示差的な誘導を示す。
【図３】図３は、ＩＦＮ−β治療中のＴＲＡＩＬ遺伝子発現の上方調節が、中和抗体（ＮＡＢ）の存在下で阻害されることを示している。
【図４】図４は、患者部分集団の基準ＴＲＡＩＬ遺伝子発現濃度を示す。
【図５】図５は、健康な個体と比較した（Ａ）、およびＩＦＮ−β−１ａ療法中の（Ｂ）ＭＳ患者の可溶性ＴＲＡＩＬ蛋白質の濃度を示す。
【図６】図６は、ＩＦＮ−βによるＴＲＡＩＬの遺伝子転写および蛋白質発現の調節を示す。
【図７】図７は、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現がＩＦＮ−β治療を受けた、療法応答性患者で特異的に誘導されることを示している。
【図８】図８は、「初年度応答者」対「初年度非応答者」におけるｓＴＲＡＩＬ濃度の予測される判別値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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