(57)【要約】本発明は、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法に関する。本発明の方法は、細胞の生体エネルギー的指数を作成するため、構造タンパク質およびミトコンドリアの呼吸（それぞれ例えば、hsp 60やチトクロームオキシダーゼのサブユニットIおよびIV）に関して、ミトコンドリアの生体エネルギー的機能のタンパク質（H+-ATP合成酵素のβ-触媒サブユニットなど）の発現についての研究を使用すること、そしてグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素およびピルビン酸キナーゼMなどの細胞の解糖経路のタンパク質の発現に関連する前記ミトコンドリア生体エネルギー指数（β-ATPase／hsp60比；β-ATPase／COX I比；β-ATPase／COX IV比）を使用すること、からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法であって、癌の型が腎臓癌、結腸癌、胃癌、肺癌および乳癌である場合に、ミトコンドリアのH（+）-ATP合成酵素のサブユニットβを発現のマーカーとして使用することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
ウェスタンブロット、免疫組織化学などの免疫学的技術を使用することを特徴とする、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
癌の型が腎臓癌、結腸癌、胃癌、肺癌および乳癌である場合に、β-F1-ATPase／Hsp 60比；β-F1-ATPase／COX I比；および／またはβ-F1-ATPase／COX IV比；により表現されるミトコンドリアの生体エネルギー指数を使用することを特徴とする、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
癌の型が腎臓癌、結腸癌、胃癌、肺癌および乳癌である場合に、β-F1-ATPase／Hsp 60／GAPDH比；β-F1-ATPase／COX I／GAPDH比；および／またはβ-F1-ATPase／COX IV／GAPDH比により表現される細胞の生体エネルギー指数を使用することを特徴とする、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
癌の型が腎臓癌、結腸癌、胃癌、肺癌および乳癌である場合に、β-F1-ATPase／Hsp 60／PK比；β-F1-ATPase／COX I／PK比；β-F1-ATPase／COX IV／PK GAPDH比により表現される細胞の生体エネルギー指数を使用することを特徴とする、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための、請求項3に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の目的
本明細書の記載は、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌を検出する方法、進行を解析する方法および悪性腫瘍の予後診断を行う方法に関する発明を取り扱うものであり、その目的は、細胞による解糖の能力に関してミトコンドリアの機能的能力を研究することに基づいて、癌の検出、腫瘍進行の解析およびその予後診断することについての手法を確立することにある。
【０００２】
発明の属する分野
本発明は、特にバイオテクノロジーの分野において記載された、悪性腫瘍の検出および追跡のため、医学的および獣医学的腫瘍学における用途を有する。概念的な観点から、H（+）-ATP合成酵素のミトコンドリア複合体の触媒サブユニットβ、並びにミトコンドリアの生体エネルギー指数および細胞の生体エネルギー指数も、神経科学および心臓血管疾患の分野において有用であり、そして一般的に組織の低酸素症および／または無酸素症が関連するすべての病態並びにミトコンドリアの細胞活性の機能不全に関連するその他の病態において有用でありうる。
【０００３】
発明の背景
ミトコンドリアは、エネルギー供給の役割を果たす真核細胞のオルガネラである。H（+）-ATP合成酵素における細胞ATPの合成の最終段階における役割を果たす酵素的装置、回転型分子エンジンは、ミトコンドリア内膜に分布する[12]。近年、ミトコンドリアがヒト病態の多様な発現に明らかに関与していることから、ミトコンドリアは、生物医学に関連した研究において、重要な役割を担うようになってきた。具体的には、癌の場合、細胞下オルガネラセンサーでありそしてアポトーシスプログラムの実行者であるからである。アポトーシスは、プログラム細胞死の遺伝的プログラムであり、エネルギーを必要とする反応で、そして生物の正常な発生には必須なものである。アポトーシスプログラムにおける変化は、癌および神経変性性疾患などの特定の病態の進行に関わる [10, 11]。
【０００４】
癌細胞のエネルギー的代謝の研究は、この疾患の分子生物学的なアプローチおよびその発展のおかげで、1970年代初頭までの癌研究において、中心的な問題であったが、これまでの10年間は、科学の世界により追いやられていた話題であった。しかしながら、Otto Warburgが腫瘍細胞ではミトコンドリア機能が変異しているはずであり、そしてこの機能不全により大多数の腫瘍細胞の特徴である高い好気的解糖が説明されなければならない、という仮説をたてたのが、1930年代であった。多数の癌細胞および腫瘍の解糖の表現型が生化学的および分子的な研究から示されたのに対して、癌細胞のミトコンドリア機能の機能不全は、癌の生物学において浸透しなかった。実際、我々は、ミトコンドリアが新生物性形質転換において果たす役割ならびに細胞の形質転換状態の支持または促進において果たす役割については、未だに知らない。ただ単に、高度解糖ラット肝細胞癌の場合、動物の異常なエネルギー代謝は、ミトコンドリアの比細胞含量の減少により、説明された[6]。この具体的な場合において、肝細胞癌のミトコンドリアの表現型は、胎児肝臓のミトコンドリアの表現型と類似しており、その場合、ミトコンドリアの生物発生の具体的なプログラムにより細胞のミトコンドリア含量が限定されている、ということが記載された[1]。
【０００５】
一方、アポトーシスプログラムの実行のためには、ミトコンドリアのH（+）-ATP合成酵素の分子的構成要素が必要とされていること[7, 8]、ならびに細胞内の機能的酸化的リン酸化が必要とされていること[2, 4]が、最近示された。これらの結果から、H（+）-ATP合成酵素の発現が相対的に低い細胞および／または同一のH（+）-ATP合成酵素のボトルネックである酸化的リン酸化の機能が欠損している細胞は、アポトーシスに対してより耐性であるはずであり、そして従って、生物という文脈において、クローン性増殖を好むはずである、ということが示唆される。
【０００６】
本発明の場合において、“ウェスタンブロット”および免疫細胞化学的技術においてミトコンドリアタンパク質および解糖経路のタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を、正常組織およびその対応する腫瘍においてこれらのタンパク質の発現を定量することを目的として使用して、癌の進行および予後診断のマーカーとしてそれらを単独でまたは組み合わせて使用した。
【０００７】
このように、H（+）-ATP合成酵素（β-F1-ATPase）のミトコンドリア複合体の触媒サブユニットβが肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、および結腸腫瘍においてその発現が減少していることをはじめて示すことができたが、このことは、腫瘍細胞のミトコンドリア機能が影響を受けていることが示されることを示唆しており、Otto Warburgが前世紀初頭に述べ、現在までにヒトの癌腫において示されていなかった仮説を確認するものである。これらの結果により、乳房、肺、胃、前立腺、および子宮内膜における腺癌；肺および喉頭扁平上皮癌、メラノーマおよびリンパ腫；への外挿が可能になる。
【０００８】
肝臓癌腫において、ミトコンドリア機能の異常は、マーカーであるHsp 60や適切なミトコンドリアのDNAの場合と同様に、ミトコンドリアの構造的構成要素のより低い発現が発生するため、ミトコンドリアの生物発生の抑制により発生する（図1）。
【０００９】
対照的に、腎臓癌腫の場合（図2）および結腸癌腫の場合（図3）、H（+）-ATP合成酵素のミトコンドリア複合体の触媒サブユニットβのより低い発現が、Hsp 60の発現において顕著な変化が存在しない場合にみられ、このことはこの種の癌腫の場合、ミトコンドリアの機能的な分化の段階を決定する分子的機構に影響を与え、その結果は生体エネルギー的マーカーと構造的マーカーとのあいだの比率により、すなわち、β-F1-ATPase／Hsp 60比により、発現されることを意味している。哺乳動物の腺癌において、β-F1-ATPaseのより低い発現は、Hsp 60およびチトクロームオキシダーゼIのより高い発現と同時的に生じ、このことは、腫瘍組織におけるβ-F1-ATPase／Hsp 60比およびβ-F1-ATPase／COX I比の非常に顕著な減少を意味している。
【００１０】
肺の腺癌においては、呼吸の酵素であるチトクロームオキシダーゼIおよびIVの発現に対する、β-F1-ATPaseの相対的発現（β-F1-ATPase／COX Iおよびβ-F1-ATPase／COX IV）が、非常に減少する。
【００１１】
肺扁平上皮癌においては、Hsp 60の発現に対するβ-F1-ATPaseの相対的発現（β-F1-ATPase／Hsp 60比）が、顕著に減少する。
さらに、癌におけるβ-F1-ATPase／Hsp 60比、β-F1-ATPase／COX I比および／またはβ-F1-ATPase／COX IV比の減少が生み出されるのと同様の様式で、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）の発現の増加（図2および3）および／または解糖経路のマーカーであるピルビン酸キナーゼイソ型M（PK）の増加が生み出されることを、我々は示した。
【００１２】
この理由のため、我々は、細胞のGAPDH発現に対するβ-F1-ATPase／Hsp 60比、β-F1-ATPase／COX I比および／またはβ-F1-ATPase／COX IV比（β-F1-ATPase／Hsp 60／GAPDH比、β-F1-ATPase／COX I／GAPDH比、β-F1-ATPase／COX IV／GAPDH比）および／またはPK発現に対するβ-F1-ATPase／Hsp 60比、β-F1-ATPase／COX I比および／またはβ-F1-ATPase／COX IV比（β-F1-ATPase／Hsp 60／PK比、β-F1-ATPase／COX I／PK比、β-F1-ATPase／COX IV／PK比）のいずれかを表現する指数を有する、細胞の解糖能力を有するミトコンドリアの生体エネルギー的潜在的可能性に関連する、細胞の生体エネルギー的指数（BEC指数）を定義する。BEC指数もまた、健康な腎臓細胞（図2）、結腸細胞（図3）、乳腺、胃、および肺において観察されたものと比較して、腫瘍細胞においては減少している。
【００１３】
さらに、結腸癌腫の場合、β-F1-ATPase（図4）並びにBEC指数は、患者の生存の指標である。
【００１４】
【表１−１】
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【００１５】
【表１−２】
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【００１６】
【表１−３】
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【００１７】
発明の説明
細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法が、H（+）-ATP合成酵素のミトコンドリア複合体の触媒サブユニットβの相対的発現を、唯一のマーカーとしてまたはミトコンドリアマーカーであるHsp 60、COX IおよびCOX IVと組み合わせて（β-F1-ATPase／Hsp 60比、β-F1-ATPase／COX I比および／またはβ-F1-ATPase／COX IV比）、決定することに基づいて、悪性腫瘍を検出するための方法として構成され、そしてこの比率は、同時に細胞の解糖マーカー（GAPDH、HK、PK）の発現に対して表現される。本発明が提案する方法は、それ自体、具体的な応用分野において明らかに新規なものとして設計される。ミトコンドリアの生体エネルギー的機能が、“癌の生体エネルギー的兆候または証拠”と我々が呼ぶ場合がある一般的な癌のマーカーをもたらすことが要求されそして示されることは、はじめてのことである。
【００１８】
具体的には、本発明の対象である、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法は、マーカーとして使用するタンパク質に対する特異的抗体を使用するウェスタンブロット法および免疫組織化学などの免疫学的技術による、肝細胞癌、肝芽細胞腫およびヒト腎臓、乳腺、肺、胃および結腸の腺癌に関する以前の研究からはじめて、創作された。
【００１９】
対照としては、剖検および／または生検に由来するか、または腫瘍に隣接する非-腫瘍部分に由来する、ヒト肝臓、腎臓、乳腺、肺、胃および結腸の非-腫瘍サンプルを使用したことを、指摘しておかなければならない。
【００２０】
本発明の好ましい態様
予め確認された細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法は、癌においてその発現がより低いことを示すために、腫瘍細胞におけるβ-F1-ATPaseの相対的発現を決定する方法からなる。
【００２１】
同一サンプル中のHsp 60、COX IおよびCOX IVの発現を、同一の技術を用いて解析することにより、ミトコンドリアタンパク質をローディングすることによるかおよび／またはそれをメンブレンに転写することによるか、に関わらず、サンプルのミトコンドリアの生体エネルギー的指数（β-F1-ATPase／Hsp 60比、β-F1-ATPase／COX I比、β-F1-ATPase／COX IV比）の演算を可能にするのと同時に、使用される測定システムの内部対照がもたらされる。
【００２２】
同一サンプル中のGAPDHおよび／またはPKの発現を、同一の技術を用いて解析することにより、細胞タンパク質をローディングすることによるかおよび／またはそれをメンブレンに転写することによるか、に関わらず、細胞の生体エネルギー的指数（β-F1-ATPase／COX I／GAPDH比；β-F1-ATPase／COX IV／GAPDH比；β-F1-ATPase／Hsp 60／PK比；β-F1-ATPase／COX I／PK比；β-F1-ATPase／COX IV／PK比）の演算を可能にするのと同時に、使用される側性システムの内部対照がもたらされる。
【００２３】
仮説は、β-F1-ATPaseの発現およびミトコンドリアおよび細胞の生体エネルギー的指数（BEC指数）が両方とも、癌において減少しており、その結果、アポトーシスプログラムにネガティブな影響を与え、そして腫瘍細胞のクローン性増殖を可能にする、というものである。癌においてβ-F1-ATPase発現の阻害が生み出されるメカニズムが全く無視されても、このことは、癌においてβ-F1-ATPaseのmRNAの発現が増加している場合に、そのmRNAの発現がより低いため、当てはまらないようである。ことによると、癌におけるβ-F1-ATPaseの発現がより低いのは、対応するmRNAの翻訳をこれと細胞タンパク質との相互作用により、調節することによる。
【００２４】
ラット肝臓のH（+）-ATP合成酵素に特異的なウサギポリクローナル抗体が、いくつかの技術により、研究室において作製された。ある場合において、SDSポリアクリルアミドゲルで精製したタンパク質を使用した[3]。別の場合において、ラット肝臓β-F1-ATPaseのcDNA発現を使用し[5]、そしてその後、発現されたタンパク質を親和性技術により精製することにより、細菌中で合成されたタンパク質を免疫源として使用した。使用した残りの抗体は、商業的に入手したものである。
【００２５】
肝臓、腎臓、乳腺、胃、肺および結腸の腫瘍における代謝性マーカーの発現、並びに対応する健康組織における代謝性マーカーの発現は、ウェスタンブロット法および免疫細胞化学的技術により行った。
【００２６】
ウェスタンブロット技術によりマーカーを決定するため、厚さ17μlの同一患者の正常組織および腫瘍組織、20切片を、それぞれ、150 mMのNaCl、0.02％のアジ化（acide）ナトリウム、0.1％のSDS、1％のNonidet P-40、0.5％のデオキシコール酸ナトリウム、1μg/μlのアプロチニン、1μg/μlのアンチトリプシン、0.4 mMのEDTA、10 mMのNaF、および0.75 mMのPMSFを含有する、300μlの50 mM Tris-HCl pH 8バッファー中で、4℃にて30分間、抽出しおよび処理した。タンパク質の抽出後、サンプルを14,000 rpm、4℃にて25分間、遠心分離にかけ、そして得られた上清中のタンパク質濃度を、Bradford反応を使用して決定した。同一患者の正常組織および腫瘍組織から抽出した15〜30μgのタンパク質の分画を、10％または15％のPAGEのSDSゲル中でおこなった。その後、ゲル中での画分化タンパク質を、1時間、定電圧下で、PVDFメンブレンに転写した。タンパク質の免疫学的検出を、以下の一次抗体：抗-β-F1-ATPase（1:20,000）、抗-Hsp 60（1:2,000）、抗-COX I（1:250）、抗-COX IV（1:100）および抗-GAPDH（1:10,000）を、ペルオキシダーゼ抱合体中で1:3,000に希釈した対応する二次抗体と共に使用して、そして化学発光法を使用して、おこなった。異なるタンパク質の免疫反応性シグナルにおける強度の定量は、画像デジタル解析システムを使用して、実現された。
【００２７】
免疫組織化学的技術によりタンパク質マーカーの発現を測定するために、以前に中性ホルマリン溶液中で固定しそしてパラフィン包埋した、正常組織または病理学的組織のサンプルに対応する4〜5μm厚の切片を、一次抗体である抗-β-F1-ATPase（1:3,000）、抗-Hsp 60（1:800）または抗-GAPDH（1:1,000）と共にインキュベートした。別の免疫組織化学を発色するため、DAKO CorporationのEnvision-Plusホースラディッシュペルオキシダーゼシステムを使用して、ジアミノベンジジンに基づく検出方法を行った。その後、細胞核を強調するため、切片をヘマトキシリンを用いて染色した。細胞内に蓄積したクロモゲン強度の定量は、デジタル的に拡大されたサンプル画像（1,000×）から得られた、細胞質の単位領域（30μm2）当たりに蓄積したクロモゲン強度の濃度計解析を使用して、おこなった。
【００２８】
肝細胞癌および健康な肝臓の場合、ウェスタンブロット技術により、ミトコンドリアDNAの相対的細胞含量も測定した[9]。この目的のため、バッファー（10 mM EDTA、0.5％ SDSおよび0.8μg/μlプロテナーゼKを含有する10 mM Tris HCl pH 7.5）中でホモジナイズしたサンプルから、細胞DNAをフェノールにより抽出した。得られたDNAは、2.5倍量のエタノールおよび、0.1倍量の酢酸ナトリウム3 Mを用いて沈殿させた。DNAを、100 mM NaClおよび0.1μg/μl RNAseを含有する媒体10 mM Tris HCl pH 8.0中に再懸濁した。室温にて1時間インキュベーションした後、SDSを添加して最終濃度を0.5％とし、そしてフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール（isoamilic）（25：24：1）を用いて抽出し、そしてDNAをエタノールおよび酢酸ナトリウムを用いる沈殿を繰り返す。DNAを、制限酵素BamHIにかけ、そして0.8％アガロースゲル上で分画した。DNAフラグメントを、減圧条件下にて、4時間、10 mm水銀の分圧にて、ニトロセルロースメンブレンに転写した。80℃にて2時間、同一物をインキュベーションすることにより、メンブレンに対してDNAフラグメントを固定する。メンブレンを、β-F1-ATPaseの核遺伝子およびATPase 6-8および12 Sのミトコンドリア遺伝子について、32Pで標識したDNAゾンデ（sonde）と共にインキュベートした。ハイブリダイゼーション条件は、5×Denhardt溶液、50％ホルムアミド、0.5％ SDS、6×SSCおよび0.132 mg/mlのサケ精子DNAであった。メンブレンを、以下のプロトコル：室温にて10分間、6×SSCを用いて、65℃にて10分間、0.1 SDSを含有する2×SDSを用いて、そして65℃にて10分間、0.1 SDSを含有する1×SSCを用いて；にしたがって、洗浄した。その後、洗浄したメンブレンをオートラジオグラフィー用フィルムに-70℃にて曝露し、そして様々な遺伝子に対応する光の強度を、濃度計により定量した。
【００２９】
肝細胞癌、肝芽細胞腫および肝限局性結節性過形成のサンプルを免疫細胞化学的技術により解析することにより、正常肝臓におけるこれらのマーカーの発現と比較する場合、β-F1-ATPaseおよびHsp 60の発現が、非常に顕著に減少することが示された。具体的には、肝細胞癌におけるこれらの2種のマーカーの発現は、正常肝臓において観察された発現と比較した場合、β-F1-ATPaseについて13％、そしてHsp 60について30％であった。
【００３０】
肝細胞癌の場合において、ウェスタンブロット技術により、チューブリンの発現と比較した場合、両マーカーの発現ともにこの減少が示された。さらに、肝細胞癌においては、ミトコンドリアDNAの相対的含量は、正常肝臓のミトコンドリアDNAと比較して、約1/2〜1/3ほどの非常に低いものであることが示された。
【００３１】
この一連の結果から、肝臓癌においては、細胞のミトコンドリア生物発生（biogenesis）の抑制がもたらされることが示される。
腎臓、胃および結腸の腺癌におけるHsp 60の発現の解析からは、それぞれの非-腫瘍組織と比較して、顕著な変化は示されなかった。対照的に、β-F1-ATPase発現は、腎臓、胃、および結腸腫瘍において、顕著に減少する。特に、これら3種の組織の癌腫において、β-F1-ATPase発現の減少は、対応する正常組織において観察されたものと比較して、50％である。
【００３２】
哺乳動物腺癌において、β-F1-ATPase発現は、正常哺乳動物組織におけるこのタンパク質発現よりも、40％低い。同時に、哺乳動物腺癌において、Hsp 60の発現およびチトクロームオキシダーゼの発現は、正常哺乳動物組織において観察されたものと比較して、それぞれ700％および300％高いことが観察される。
【００３３】
肺腺癌においては、β-F1-ATPaseの相対的発現は、正常肺組織において観察されたものよりも、50％低い。さらに、肺腺癌においては、β-F1-ATPaseの発現は、正常肺組織において観察されるものと比較して300％高い発現レベルを示す呼吸酵素チトクロームオキシダーゼIおよびIVにおける発現と比較して、非常に減少している。肺扁平上皮腺癌においては、β-F1-ATPaseの相対的発現は、Hsp 60発現と比較して、非常に減少しており、β-F1-ATPase／Hsp 60比は正常肺組織において観察されたものの20％である。
【００３４】
癌におけるミトコンドリアの生体エネルギー的機能の活性がより低いことと一致して、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）の活性が、腎臓、乳腺、肺および結腸の腫瘍において、強力に増強されることが観察され、ミトコンドリアの生体エネルギー的指数（β-F1-ATPase／Hsp 60比）と、GAPDHの量により表現される細胞の解糖能力との間で、非常に顕著な反比例関係が見いだされることが、観察された。その後、それぞれの正常組織におけるGAPDH発現と比較した場合、GAPDHが、腎臓腫瘍においては600％、結腸腫瘍においては200％、乳腺腫瘍においては900％、そして肺腫瘍においては400％、増加することが示された。乳腺腫瘍および肺腫瘍におけるPKの発現は、正常乳腺組織および正常肺組織において観察されるものよりも、それぞれ、500％および250％高いものである。
【００３５】
したがって、腎臓、乳腺、胃、肺および結腸における腫瘍についてのBEC指数（β-F1-ATPase／Hsp 60／GAPDHまたはβ-F1-ATPase／Hsp 60／PK）は、それぞれの健康組織におけるものよりも、ずっと低いものである。この意味において、腎臓腫瘍においてβ-F1-ATPase／Hsp 60／GAPDH比により推定されたBEC指数は、正常腎臓において見いだされた値の10％であり、結腸腫瘍におけるものは正常結腸において見いだされた値の25％であり、胃の腫瘍におけるものは正常な胃において見いだされた値の50％であり、乳腺腺癌におけるものは正常な乳腺組織において見いだされた値の5％であり、肺腺癌におけるものは正常な肺において見いだされた値の20％であり、そして肺扁平上皮癌におけるものは正常肺において見いだされた値の10％である。胃の腺癌においてβ-F1-ATPase／Hsp 60／PK比により推定されたBEC指数は、正常な胃において見いだされた値の50％であり、乳腺腺癌におけるものは正常乳腺組織において見いだされた値の5％であり、肺腺癌におけるものは正常な肺において見いだされた値の25％であり、そして肺扁平上皮癌におけるものは正常肺において見いだされた値の30％である。
【００３６】
患者が生存することが既知である結腸直腸腫瘍における、β-F1-ATPase、Hsp 60およびGAPDHの発現の研究並びにミトコンドリアの生体エネルギー的指数（β-F1-ATPase／Hsp 60）および細胞の生体エネルギー的指数（β-F1-ATPase／Hsp 60／GAPDH）の研究は、患者の生存および予後診断により、β-F1-ATPaseの発現レベルとミトコンドリア生体エネルギー的指数および細胞生体エネルギー的指数のレベルとの間に顕著な関係が存在することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
作成された記載を完全なものとするため、そして本発明の特徴をより良く理解するための補助となることを目的として、本明細書に明細書の一部分として一連の図面を添付するが、これらは説明のためのものであり、限定することを目的としたものではない。これらは、以下の内容について記載している：
【図１】図1は、ヒト肝細胞癌におけるミトコンドリア生物発生（biogenesis）の抑制を示す。a：正常肝臓（C1-C3）におけるおよび肝細胞癌（T1-T2）における、β-F1-ATPase（β-F1）、Hsp 60およびチューブリンの発現の解析。ヒストグラムは、正常肝臓におけるチューブリンの発現（白棒）および肝細胞癌におけるチューブリンの発現（黒棒）に対する、β-F1およびHsp 60の相対的細胞含量を示す。b：正常肝臓（C1-C3）におけるおよび肝細胞癌（T1-T2）における、ミトコンドリアDNA含量（mtDNA）の解析。ヒストグラムは、正常肝臓における核遺伝子β-F1（白棒）および肝細胞癌における核遺伝子β-F1（黒棒）に対する、ミトコンドリア遺伝子12SおよびA6-8の相対的細胞含量を示す。
【図２】図2は、β-F1-ATPase（β-F1）、Hsp 60およびGAPDHの発現の解析、並びに正常腎臓上皮（白棒）および腎臓癌腫（黒棒）における、ミトコンドリアの生体エネルギー的指数（β-F1／Hsp 60）、および細胞の生体エネルギー的指数（BEC指数β-F1／Hsp 60／GAPDH）に対応する。
【図３】図3は、ミトコンドリアの生体エネルギー的指数（β-F1／Hsp 60）およびGAPDH発現の生体エネルギー的指数の分析、並びに正常結腸サンプル（白棒）および結腸癌腫（黒棒）における、細胞の生体エネルギー的指数の分析（BEC指数β-F1／Hsp 60／GAPDH）を示す。
【図４】図4は、最終的に、結腸直腸癌におけるβ-F1-ATPase発現が患者の生存と相関する場合の、Kaplan-Meier分析を示す。破線（図の上側）は、高レベルのβ-F1-ATPase発現を有する腫瘍に対応する。実線（図の下側）は、低レベルのβ-F1-ATPase発現を有する腫瘍に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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