(57)【要約】本発明は、血管新生又は浸潤及び／又は転移の形成を阻害するための薬剤の調製における、アダマリシンのディスインテグリンドメイン又はその誘導体の全部又は一部を含む又はそれで構成されているタンパク質、アダマリシンのディスインテグリンドメインは又その誘導体の全部又は一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む又はそれで構成されている核酸分子の中から選択された活性作用物質の利用に関する。有利には、アダマリシンはメタルギジンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生又は浸潤及び／又は転移の形成を阻害するための薬剤の調製における、アダマリシンのディスインテグリンドメイン又はその誘導体の全部又は一部を含む又はそれで構成されているタンパク質、アダマリシンのディスインテグリンドメインは又その誘導体の全部又は一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む又はそれで構成されている核酸分子の中から選択された活性作用物質の利用。
【請求項２】
アダマリシンがメタルギジンであることを特徴とする請求項１に記載の利用。
【請求項３】
タンパク質が、補遺の配列表中に配列番号２として表わされているアミノ酸配列をもつメタルギジン又はその誘導体のディスインテグリンドメインの全部又は一部を含む又はそれで構成されていることを特徴とする請求項２に記載の利用。
【請求項４】
核酸分子が、補遺の配列表中に配列番号１として表わされているヌクレオチド配列をもつメタルギジンのディスインテグリンドメインの全部又は一部をコードするポリヌクレオチド配列、その相補的配列又はその誘導体を含むか又はそれで構成されていることを特徴とする請求項２に記載の利用。
【請求項５】
核酸分子がベクターであるか又は発現ベクターに接合されていることを特徴とする請求項４に記載の利用。
【請求項６】
核酸分子が、インビボでディスインテグリンドメインの全部又は一部を発現するような形で前記分子によって形質転換された細胞の中に存在することを特徴とする請求項４または５のいずれか１項に記載の利用。
【請求項７】
前記薬剤が、癌、転移プロセス、炎症性疾患、乾癬、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性症の治療及び／又は予防を目的とするものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、網膜の病的血管新生といったような数多くの病理に関与する血管新生、浸潤及び転移プロセスに貢献する事象の阻害の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ヒトの内皮細胞上に存在する分子のフラグメントの、抗血管新生、抗浸潤及び抗転移機能の実証に基づいている。本発明は、ディスインテグリンドメインの全部又は一部から成るアダマリシンフラグメントの利用に関する。より特定的には、本発明は、以下「抗血管新生メタルギジンペプチド（ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｔａｒｇｉｄｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」を略して「ＡＭＥＰ」とも呼ぶメタルギジンのディスインテグリンドメインの利用（Ｋｒａｔｚｃｈｍａｒ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９６）に関する。
【０００３】
このフラグメントは、文献中で記述されてきたその他の抗血管新生物質に比べ、以下のような独創性を有する：すなわち、
−血管新生の全ての段階すなわち内皮細胞の遊走及び増殖、マトリクスの異なる基質に対するそれらの接着、毛細管タイプの構造の形成を同時に阻害すること、及び
−内皮細胞のアポトーシスを誘発すること。
【０００４】
さらに、予期せぬことにこのフラグメントは、一方では癌性細胞の浸潤を阻害し、他方では特にインテグリンアルファｖベータ３を表面で発現する細胞の転移の形成を妨げる能力を呈する。
【０００５】
血管新生というのは、１つの刺激に応答して既存の血管の出芽によって新しい毛細血管を形成させる形態形成プロセスを意味する。インビボでの血管新生の際には、新生毛細管は毛細管又は後毛細管小静脈から発生し、動脈、小動脈、又は静脈から発生することは決してない。かくして血管新生因子は、例えばＦＧＦ２といったような血管新生の開始及び／又は維持を可能にする分子である。従って抗血管新生因子は、血管新生の単数又は複数の主要段階にねらいを定めて血管新生を阻害する分子である。
【０００６】
接着というのは、細胞外マトリクスに付着する細胞の能力から成る。この現象は、細胞の表面に存在する数多くの接着分子を介入させる。
【０００７】
細胞の遊走は、マトリクスの化合物を細胞が分解できるようにする酵素、ならびにマトリクスに対する細胞の定着を確保する接着分子を介入させる。その上、細胞骨格の動的アーキテクチャは、細胞が運動性にとって不可欠な接着及び剥離の周期を交互に行なえるようにしている。
【０００８】
増殖は、経時的な細胞分裂に関係する１つの現象である。
【０００９】
アポトーシスは、細胞死と呼ばれる複雑なプログラムに従った自らの自殺を開始する正常細胞に固有の能力から成る。アノイキスは、基質に対するその接着力の喪失の結果としてもたらされる正常細胞内で誘発されるアポトーシスの一つの形である。
【００１０】
浸潤は、隣接する要素を置換してゆくことになる解剖学的要素の１集合の過度の増殖である。
【００１１】
転移は、「初期」癌と呼ばれる予め存在した癌と関係するもののこの癌から離れたところに発生しそれと連続性をもたない癌細胞の病巣である。これらの二次病巣の拡散は、リンパ又は血液経由で起こる。
【００１２】
腫瘍の発生及びさまざまな器官内でのその拡散は、血管新生とも呼ばれる血管内及び血管周辺の血管形成によって左右される（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９８４）。血管新生プロセスのターゲティングは、新しい治療アプローチであり、癌治療における大きな変革である。かくして、数多くの抗血管新生分子が現在臨床試験中である。
【００１３】
ビタキシンは、内皮細胞の増殖の阻害ならびにプロアポトーシス効果を誘発するヒト化された抗インテグリンアルファｖベータ３抗体である（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９４；Ｈａｍｍｅｓ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９６）が、これは、それらの遊走を修正するわけではない。インテグリンアルファｖベータ３は、新生脈管の内皮細胞及び或る種の癌細胞によって優先的に発現される接着分子である。これは、特に内皮細胞の接着及び遊走を誘発するフィブリン、コラーゲン浸潤、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンといった細胞外マトリクスの或る種の化合物と相互作用する。血管新生におけるインテグリンアルファｖベータ３の主要な役割については、充分に記述されてきた（Ｅｌｉｃｅｉｒｉ及びＣｈｅｒｅｓｈの定期刊行物、２０００）。
【００１４】
マリマスタットはメタロプロティナーゼのタンパク質分解活性を遮断し、その結果、内皮細胞の遊走を阻害するが、これらの細胞の増殖に対しいかなる効果ももたない。メタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）は実際、内皮細胞の遊走にとって不可欠である細胞外マトリクスの化合物全体を分解できるようにする酵素の大きな系統群に属している。セリンプロテアーゼに属するその他の酵素も同様に、膜状表面（ｕ−ＰＡＲ）及びプラスミンに定着したそのレセプタに結合された場合のウロキナーゼタイプ（ｕＰＡ）のプラスミノーゲン活性化物質のように、細胞遊走に参与する。
【００１５】
これらの薬剤全体が、血管新生を遮断する目的をもつが、それらの作用は、多能性であるＡＭＥＰとは異なり、このプロセスの１つ又は２つの段階に制限される。かくして、ＡＭＥＰは、それが当初向けられるインテグリンアルファｖベータ３の血管形成機能全体つまり内皮細胞の増殖及び接着を遮断するだけでなく、驚くべきことに、これらの細胞の遊走の完全な阻害ならびに毛細管タイプの構造の形成の阻害をも誘発する。その細胞周期の修正とは独立したこれらの細胞に対するそのプロアポトーシス効果も又、その独創性を成している。
【００１６】
その上、予期せぬことに、ＡＭＥＰは、大きい抗浸潤能力と抗転移能力を同時に有している。
【００１７】
「ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ディスインテグリンと金属タンパク質）」を略してＡＤＡＭ又は「ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ，ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ（金属タンパク質富有、ディスインテグリン富有及びシステイン富有タンパク質）」を略してＭＤＣとも呼ばれるアダマリシンは、細胞の原形質膜の中に定着されたタンパク質の１系統群である。記述されている２９のアダマリシン全体に共通の構造は、以下のものから成る：
−そのプロテアーゼ触媒活性が亜鉛に依存しているメタロプロティナーゼドメイン、
−ディスインテグリンドメイン、及び
−システイン及びＥＧＦタイプの反復を富有するドメイン（Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９５）。
【００１８】
しかしながら、アダマリシン全体の中でわずか１０前後のものが触媒活性をもつメタロプロティナーゼドメインを有している。異なるアダマリシンの生理学的役割は、細胞接着の調節、リガンドの遊離、レセプタの活性化、細胞融合（２０００年のＰｒｉｍａｋｏｆｆ及びＭｙｌｅｓの定期刊行物）といったようにきわめて多様である。それでも、これらの分子の作用様式は未知である。
【００１９】
ＡＭＥＰは、以下の２つの側面で文献中に記述されてきたヘビのディスインテグリンと区別すべきものである：
−ヘビのディスインテグリンは血管新生の異なる段階に対して限定的な作用を及ぼす。例えばアクチン（ａｃｃｕｔｉｎｅ）（Ｙｅｈ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９８）は、マトリクスの異なる化合物に対する内皮細胞の接着を阻害しそのアポトーシスを誘発するが、一方Ｓａｌｍｏｓｉｎｅ（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９９）は、内皮細胞の接着及びＦＧＦ２によって誘発されたそれらの増殖の阻害を誘発する。
−ＡＭＥＰは同様に、ヒト由来のものであるという利点を呈し、従って、抗癌療法で必要とされる長期処置における薬剤として利用されるのを妨げている免疫原性という性質を示すヘビディスインテグリンの抗原性を有していない。
【００２０】
従って本発明は、血管新生又は浸潤及び／又は転移の形成を阻害するための薬剤の調製における、アダマリシンのディスインテグリンドメイン又はその誘導体の全部又は一部を含む又はそれで構成されているタンパク質、アダマリシンのディスインテグリンドメインは又その誘導体の全部又は一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む又はそれで構成されている核酸分子の中から選択された活性作用物質の利用を目的としている。
【００２１】
有利には、アダマリシンはメタルギジンである。従って本発明は、特にタンパク質が、補遺の配列表中に配列番号２として表わされているアミノ酸配列をもつメタルギジン又はその誘導体のディスインテグリンドメインの全部又は一部を含む又はそれで構成されているタンパク質の利用に関する。
【００２２】
ＡＭＥＰフラグメントは、このディスインテグリンドメインがインテグリンアルファｖベータ３に結合することによって血管新生中内皮細胞の同型凝集にのみ関与し得ると考えていた一部の業者が想定していたこと（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９８）とは異なり、それが腫瘍の浸潤、転移の形成及び血管新生の全ての段階すなわち内皮細胞の遊走と同時に増殖も阻害する能力を有するという点で傑出している。その上、血管新生に対するＡＭＥＰの阻害活性は、血管新生因子を全く添加しない場合でも観察される。
【００２３】
これに対して、外因性血管新生因子を利用する必要性は、抗アルファｖベータ３抗体の抗血管新生効果を立証するために見られる。この抗体は、血管新生の維持に不可欠である血管新生因子であるＦＧＦ２による誘発の後にのみ血管新生を阻害する（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９３）。内皮細胞の接着の単なる阻害物質として記述されている（Ｋｏｓｔｅｔｓｋｙ  ｅｔ  Ａｒｔｅｍｊｅｖ，２０００）ＲＧＤ配列を有するその他のぺプチドと比べたＡＭＥＰの治療上の利点は、その作用スペクトルにもある。
【００２４】
本発明は、アダマリシン、より特定的にはメタルギジンのディスインテグリンドメイン及びその誘導体に関する。かかる誘導体は、当業者が本発明の教示、より特定的には以下の実験部分で報告されているモデル及び試験から決定することのできる抗血管新生、抗浸潤及び抗転移特性を呈する機能的等価物を構成する。すなわちこれは、単数又は複数のアミノ酸の欠失、付加、抑制又は置換によって修飾された配列の切形フラグメントである。同様にこれは、化学的に修飾されたアミノ酸から成る前記誘導体に対応するフラグメントであり得、これらの修飾の目的は、これらの誘導体をより安定したものにすることにある。同様にして、本発明は、前記誘導体についてコードするポリヌクレオチド配列にも関する。
【００２５】
本発明は、従って、配列番号１として補遺の配列表に表わされている配列をもつメタルギジン又はその誘導体のディスインテグリンドメインの全部又は一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関する。このドメインのコーディング配列は、２７６個のヌクレオチド（Ｍｅｔ−４２０〜Ｇｌｕ−５１１）で構成されている。
【００２６】
前記配列は、有利にはその発現の調節配列の制御下に置かれる。かかる核酸分子は例えば以下のようなベクターである：
−移入技術の如何とは無関係に、抗血管新生フラグメントＡＭＥＰ又は誘導体についてコードする発現プラスミド、
−前記フラグメント又は誘導体と精製を容易にする（ｐＧＥＸ型プラスミド）又は組織ターゲティングを容易にするタンパク質ドメインの間の融合タンパク質についてコードする発現プラスミド、
−例えば昆虫細胞内のバキュロウイルス又は真核細胞内のプラスミドといった細菌以外の宿主生物に特異的な、前記フラグメントＡＭＥＰ又は誘導体についてコードするプラスミド又はその他のタイプの発現ベクター。
【００２７】
かかる核酸分子は、処置すべき部位のレベルでディスインテグリンドメインの全部又は一部を発現するような形で１つの個体に対し前記分子又はこの分子による形質転換を受けた細胞を投与することから成る、遺伝子療法又は細胞療法のプロトコルの中で利用可能である。
【００２８】
かかる核酸分子は同様に、本発明のタンパク質を調製するためにも有用である。かくして、ヒトのＡＭＥＰは、ＡＭＥＰについてコードするプラスミドでの形質転換を受けた真核細胞及び細菌から合成された。より厳密に言うと、細菌産生系としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ（クローンＤＨ５アルファ）が利用され、真核生物産生系としてはｔｉｂｉａ−ｃｒａｎｉａｌ筋が利用されたが、酵母又はその他のあらゆる産生系を利用することができると思われる。
【００２９】
血管新生の全ての段階（内皮細胞の遊走、増殖、接着、アポトーシス及び毛細管タイプの構造の形成）及び腫瘍浸潤及び転移形成に対するＡＭＥＰの阻害作用を明らかにすることによって、癌治療における新しい抗腫瘍薬を提供することが可能となる。実際、これまでの文献中で記述されてきた血管新生のその他の阻害物質と異なり、ＡＭＥＰは、例外的かつ多能性で固有の抗浸潤、抗転移及び抗血管新生活性を及ぼす。ＡＭＥＰは、異なる由来をもつ（巨大血管又は微小血管性、形質転換を受けた又は受けない）内皮細胞の遊走及び増殖ならびに（フィブリノーゲン、ヒートロネクチン及びフィブロネクチン上での）細胞の接着及びインビトロでの三次元モデル内の毛細管タイプの構造の形成を同時に阻害する。ＡＭＥＰのプロアポトーシス効果も同様に明らかにされているインビボでは、ＡＭＥＰは、血管の形成及び特にインテグリンアルファｖベータ３を発現する細胞の転移性拡散を阻害することによって腫瘍の成長を遮断する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
従って本発明は、癌性病理全般ならびに炎症性疾患、乾癬、アテローム性動脈硬化症黄斑変性症などのような、発病に血管新生が寄与している病気の新しい治療及び／又は予防方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
活性作用物質は、本発明に従った薬剤の中で、利用される投与様式に適合された当業者にとって既知の薬学的に受容可能なあらゆるビヒクルと結びつけられている。かくして、本発明に従った薬剤は、以下の要領で投与可能である：
−全身、局所、経口投与又はインプラントとして単独で、
−細胞又は遺伝子療法により、
−その他の活性成分と結びつけて、
−例えばナノ粒子形態といったあらゆる剤形で。
【００３２】
本発明のその他の利点及び特徴は、ＡＭＥＰの調製及びそのインビトロ及びインビボでの抗血管新生、抗浸潤及び抗転移活性に関しかつ添付図面を参照した以下の記述から明らかになることだろう。
【００３３】
以下の記述では、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９８９）；ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ第Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ＥＤ．１９８５）；Ｂ．Ｐｅｒｄａｌ，分子クローニング：実用ガイド（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．（ｅｄｓ．）分子生物学における現行プロセス、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）といったような文献において記述された従来の分子生物学の技術が利用されている。
【００３４】
かくして、核酸というのは、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合したサブユニットを含むポリキメラ化合物である。核酸には、各々１本鎖又は２本鎖でありうるポリリボ核酸（ＲＮＡ）及びポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれる。ＤＮＡは、ＣＤＮＡ（相補的）、ゲノミックＤＮＡ、合成ＤＮＡ及び半合成ＤＮＡを内含する。1つのタンパク質についてコードするヌクレオチド配列又は核酸配列は、センス配列と呼ばれる。組換え型ＤＮＡ分子というのは、分子生物学技術による操作を受けたＤＮＡ分子を意味する。
【００３５】
ＤＮＡコーディング配列というのは、適切な調節配列の制御下にあるときに、インビトロ又はインビボで１つの細胞内で転写されポリペプチドに翻訳される２本鎖ＤＮＡ配列を意味する。コーディング配列の開始は、アミノ末端５'で開始コドンにより決定され、翻訳の終りは、カルボキシ末端３'の停止コドンにより決定される。ポリアデニル化シグナル（転写の終結）が、一般に、コーディング配列の３'に位置設定されることになる。転写及び翻訳を制御する配列は、プロモータ、刺激物質といった調節ＤＮＡ配列であり、そのため、宿主細胞中のコーディング配列の発現を可能にする。
【００３６】
プロモータ配列は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼを結合させコーディング配列の転写を開始させる能力をもつＤＮＡ領域である。
【００３７】
ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列を、後にタンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡ（伝令）に転写する場合、コーディング配列は細胞内で転写及び翻訳配列の制御下にある。
【００３８】
発現プラスミドは、構造遺伝子（望ましいタンパク質に対応するＤＮＡセグメント）が間に挿入される複数の調節配列を有する染色体外円形２本鎖ＤＮＡ分子である。これは、細菌内で独立した形で複製される。
【００３９】
発現ベクターは、独立した複製起点及び誘発可能なプロモータを最低限有し、細菌内又は真核細胞内といった宿主細胞内に特異的に導入され得る分子である。このベクター内には、所望のタンパク質又はペプチドに対応するインサートと呼ばれるコーディング配列が挿入され得る。
【実施例】
【００４０】
Ｉ−方法
【００４１】
１）細胞培養
【００４２】
ＣＰＡＥ（仔牛肺動脈内皮細胞）は、Ｊ．Ｂａｄｅｔ博士（フランス、クレテイユ大学、真核細胞バイオテクノロジー研究所）によって提供されたものである。これらの細胞を、２０％のウシ胎児血清（ＳＶＦ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＵＩ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を添加したＭＥＭ培地中で培養する。以下で引用する全ての培地（「完全培地」）は、ＣＰＡＥ細胞のために利用されるものと同じ濃度のペニシリン／ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを含有している。これらは、継代１２−２０で利用される。細胞ＨＭＥＣ−１（ヒト微小血管系内皮細胞）は、ヒトの真皮の内皮細胞をＳＶ４０遺伝子及びＬａｒｇｅ  Ｔ抗原でトランスフェクションすることによってこの細胞系統を確立したＡｄｅｓ博士（疾病管理及び予防センター、Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）により提供された。ＨＭＥＣ−１細胞を、完全ＭＣＤＢ１３１培地（Ｓｉｇｍａ，ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にＳＶＦ１０％、ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍｌ（協力Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）及びヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）１μｇ／ｍｌを加えたものの中で培養する。Ｊａｆｆｅ及びその共同作業者により記述された方法に従って、ＨＵＶＥＣ細胞（ヒトの臍帯静脈内皮細胞）を、臍帯研究所で抽出した。臍帯を、コラゲナーゼＡにより０．２％に制御された消化に付す（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、２０％のＳＶＦ、ＨＥＰＥＳ７５ｍＭ、重炭酸ナトリウム３．７ｍＭ、ｐＨ７．５及びファンギゾン５μｇ／ｍｌ（ＬＩＦＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）で補足された完全培地Ｍ１９９中で一次細胞を培養する。ＨＭＶＥＣ−ｄ細胞（真皮の微小血管の内皮細胞、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅ、ベルギー）を、メーカーが供給した完全培地（ＥＧＭ−２ＭＶ）に１０％のＳＶＦを補足したものの中で継代４から６まで培養する。Ｃ５１（マウス結腸癌）細胞は、完全培地ＲＰＭＩ＋１０％のＳＶＦ中で培養される。３Ｔ３細胞（マウス腫瘍線維芽細胞）は、完全培地ＤＮＥＭ＋１０％内で培養され、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞（ヒト乳癌細胞）は癌性線維芽細胞３Ｔ３ならびに１０％のＳＶＦが添加された完全培地ＤＭＥＭを利用する。Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウス黒色腫細胞）は、ＤＭＥＭ培地＋１０％のＳＶＦ及び１．５ｇ／ｌの重炭酸ナトリウム中で培養される。
【００４３】
抗ディスインテグリン抗体は、Ｈｅｒｒａｎ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍｅ、Ｆｒａｎｃｅ）によって記述された方法に従って、ＡＭＥＰフラグメントをウサギに接種した後に得られる。このフラグメントは、１２個のアミノ酸から成り、ＲＧＤＣ配列を含有する；その分子量は、１．４ＫＤａである。
【００４４】
２）細菌系内のヒトＡＭＥＰの構築及び合成
【００４５】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＡＭＥＰの融合タンパク質で調製した。このためには、ＡＭＥＰについてコードする配列番号１の２７６個のヌクレオチド（Ｍｅｔ−４２０〜Ｇｌｕ−５１１）のｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅させた。このｃＤＮＡをＢａｍＨ１部位のレベルでプラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ中でサブクローニングした（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。ＧＳＴ−ＡＭＥＰ融合タンパク質の合成は、Ｓｍｉｔｈ及びＪｏｈｎｓｏｎ，１９８８によって記述されているようなイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１ｍＭ）により、大腸菌ＤＨ５０内で誘発された。簡単に言うと、１％のＴｒｉｔｏｎ×１００での細菌の溶解とそれに続く音波処理の後、ＧＳＴ−ディスインテグリンを、グルタチオン−アガロースを用いたアフィニティクロマトグラフィ上で精製し、還元グルタチオン（Ｓｉｇｍａ）（即時調合された最終ｐＨ７．５のもの）を含有する還元グルタチオン（５ｍＭトリス、ＨＣＬ（ｐH８．０））で溶出させた。この融合タンパク質の分子量（３６Ｋｄａ）に対応する唯一のバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した（図１ａ）
【００４６】
ｉｎｖｉｔｒｏで異なる血管新生モデル上においてＡＭＥＰに対応するペプチドの活性をテストするために、我々は、Ａｍｅｒｓｈａｍの使用説明書に従って、それ自体ＧＳＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ）にカップリングされたタンパク質である特異的プロテアーゼ「ＰｒｅＳｃｉｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ」によりＧＳＴのＡＭＥＰを分割した。
【００４７】
次に、Ｓｉｇｍａの使用説明書に従ってカラム上のグルタチオンーアガロースを利用したアフィニティクロマトグラフィによって、ＡＭＥＰを精製した。ＡＭＥＰは９１個のアミノ酸からなり、推定分子量は９．７ＫＤａである。
【００４８】
ウエスタンブロット（図１ｂ）及び高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によりＡＭＥＰの純度を分析した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ試験によって決定した（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｐｅｒｂｉｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）。
【００４９】
３）ウエスタンブロット
【００５０】
ポリアクリルアミド−ＳＤＳ１２％から成る電気泳動ゲル上に、精製されたＡＭＥＰ１００ミリグラムを被着させ、ニトロセルロース膜上に移した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ）。膜を一時間、１０％の牛乳を含むＴＢＳ緩衝液（トリス緩衝溶液：トリス１０ｍＭｐＨ７．５；ＮａＣｌ２００ｍＭ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％））で飽和させ、次に、ＡＭＥＰに対して向けられた１：１０００の希釈度のウサギポリクローナル血清（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｒａｎｃｅ）又は抗ＧＳＴ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でインキュベートした。ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で５回洗浄した後、メーカー（ＤＡＫＯ）の使用説明書に従い１：２０００の希釈度でペルオキシダーゼにカップリングされた適切な２次抗体で１時間、膜をインキュベートする。膜をすすぎ用の同じ緩衝液中で５回洗浄し、化学発光プロセスＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に従ってシグナルの検出を実施する。
【００５１】
４）フィブリノーゲン、ビトロネクチン及びフィブロネクチンへの接着
【００５２】
−第１の技術：試験中のＡＭＥＰでの内皮細胞の一時的インキュベーション
【００５３】
ＥＤＴＡ１．５ｍＭでのインキュベーションにより培養皿からＣＰＡＥを剥離させ、接着緩衝液（ＮａＣｌ１４０ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ、グルコース５ｍＭ、ＫＣｌ５．４ｍＭ、ＣａＣｌ２２ｍＭ、ＭｇＣｌ２１ｍＭ、ＭｎＣｌ２１ｍＭ、ｐＨ７．４）中で５×１０５細胞／ｍｌの割合で再懸濁させる。その後、１００μｌの細胞懸濁液を、大気温でＡＭＥＰ（５μｇ／ｍｌ）の存在下に置き、次に、負の対照としての１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）又は、５０μｌの精製フィブリノーゲン（ＰＢＳ中４０μｇ／ｍｌ；Ｋａｂｉ）、１０μｇ／ｍｌのビトロネクチン（Ｓｉｇｍａ）；３０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）又は１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と共に４℃で一晩予めインキュベートされた９６ウエル付プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｄ．Ｄｕｔｃｈｅｒ）ウエルの中に導入する。３７℃でＣＰＡＥ細胞を２０分間インキュベートした後、プレートを２００μｌの接着緩衝液２００μｌで２回洗浄し、非特異的部位を、３７℃で１時間、ＢＳＡ１％を添加したＰＢＳで飽和させる。その後、ＢＳＡ１％を含有する接着緩衝液で２回新たにプレートを洗浄する。接着していない細胞は、接着緩衝液に１％のＢＳＡを加えたもの２００μｌで３回ウエルを洗浄することによって除去される。細胞のホスファターゼ活性を測定することにより、接着した細胞を定量化することができる。簡単に言うと、０．１％のトリトン×１００を含有するｐＨ５．５の酢酸塩緩衝液中３ｍｇ／ｍｌのパラニトロフェノールホスフェート（Ｓｉｇｍａ）１００μｌをウエル内に添加し、３７℃で２時間インキュベートする。１ＮのＮａＯＨを加えて反応を停止させる。接着した細胞の数を表わすパラニトロフェノールの遊離は、ＥＬＩＳＡ読取り装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｔｗｉｎｒｅａｄｅｒ）により４０５ｎｍで吸光度を読取った後に測定される。各実験を３回ずつ実施する。
【００５４】
−第２の技術：剥離される前に５μｇ／ｍｌの最終濃度のＡＭＥＰの存在下で２４時間ＣＰＡＥ細胞を培養させる。その後のプロトコルは、ＡＭＥＰとの細胞のインキュベーションはその後全く行なわれないという詳細を除き、前述のものと同一である。
【００５５】
５）内皮細胞の遊走モデル
【００５６】
遊走モデルは、２４ウエルのプレート内で実施される。１．５％のアガロースを培地中に溶解させて、ウエル内にゲルを形成させる。このとき、アガロースシリンダの半分はウエル内に挿入される。ＣＰＡＥ細胞を、ウエルの自由なままの空間内に付加し、その集密性に至るまで培養させる。細胞が遊走できるようにするべくアガロース片を除去し、ＡＭＥＰを培地内に所望の濃度で添加する。その後、透明なミリ方眼紙を皿の下に置いて、倒立型顕微鏡の下で接眼マイクロメータを用いて細胞の遊走速度を決定した。２重に行なう実験を３回反復する。結果は、対照との関係において百分率で表わされる。
【００５７】
６）細胞増殖モデル
【００５８】
細胞は、完全培地内でウエルあたり２０，０００細胞の割合で培養される（９６ウエルのプレート；Ｇｒｅｉｎｅｒ）。２４時間後に、細胞をさらに２４時間増殖期Ｇ０／Ｇ１で誘発するべく、完全培地に対応する濃度の２分の１の濃度を含有する培地内で、細胞を培養する。その後、細胞を３０時間、ＡＭＥＰの存在下又は不在下で完全培地を用いて培養する。このとき、トリチウム化チミジン（１ウエルあたり１μＣｉ）を細胞に添加し、１８時間インキュベートする。細胞によるトリチウム化チミジンの取込みは、Ｓｋａｔｒｏｎ（Ｓｋａｔｒｏｎ、Ｌｉｅｒ、Ｎｏｒｖｅｇｅ)の利用のために記述されたプロコトルに従ってろ紙を用いて定量化され、このとき、シンチレーション液の添加後の計量により、放射能が決定される。結果は、対照との関係において百分率で表わされる。
【００５９】
７）アポトーシス及び細胞周期の分析（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の利用）、及び早発性アポトーシスの定量化（ＡｎｎｅｘｉｎｅＶの利用）
【００６０】
−Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）でのＤＮＡの特異的ウイルス染色技術
【００６１】
内皮細胞（ＣＰＡＥ）をトリプシン化し、細胞懸濁液を１・１０６細胞／ｍｌで調整する。２０μｇ／ｍｌでＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２着色剤を添加し、細胞を３分間、撹拌しながら大気温でインキュベートする。アポトーシス細胞の百分率を、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ）で分析する。その後細胞を暗所（３７℃）で３０分間インキュベートさせ、細胞周期の分析を実施する。
【００６２】
−アネキシンＶ（Ｒ及びＤ系）を用いた技術：１ｍｌの反応緩衝液（１００μｌの結合緩衝液１０×（１００ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨｐＨ７．４、１．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１８ｍＭのＣａＣｌ２）、１００μｌのヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌの初期濃度）、１０μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及び７９０μｌの脱イオン水）の中に１・１０６個の内皮細胞（ＣＰＡＥ）の沈渣を再懸濁させる。懸濁液を１５分間、暗所で室温でインキュベートする。アポトーシス細胞の百分率をフローサイトメータにより分析する。
【００６３】
８）フィブリンゲル内の２つの血管新生モデルにおける毛細管タイプの構造の形成
【００６４】
モデルの１つは、ＣＰＡＥ細胞の凝集塊を利用し、Ｐｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．１９９１よって記述された方法に従って利用される。簡単に言うと、１０，０００個のＣＰＡＥが９６ウエルプレート内で２％のアガロース上に２４時間塊集させられる。３つの凝集塊を採取し、フィブリンゲル内に取込む；精製されたフィブリノーゲン（３ｍｇ／ｍｌ；Ｋａｂｉ）が、ＭＥＭ培地に対し透析され、次に２０％のＳＶＦ、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２μＭのアプロチニン及びＡＭＥＰと所望の濃度で混合される。このとき、ヒトトロンビン（１ＵＩ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を付加してフィブリンゲルを得、その表面にアプロチニン（２μＭ）の加わった完全培地を添加し、この培地を３日毎に交換する。毛細管タイプの構造形成は、２４時間の培養以降に観察できる。これらの毛細管を、倒置型顕微鏡の下で撮影し、これらの構造の寸法を写真上で測定する。統計的分析（マン・ホイットニー方式）により、これらの構造のサイズが異なるものであるか否かを決定することができる。
【００６５】
第２のモデルは、Ｎｅｈｌ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，によって記述されている技術に従って、約１５０μｍの球を利用する。利用される細胞は、ＣＰＡＥがこのモデルにおいて利用できないかぎりにおいてＨＭＥＣ−１である。なおＨＭＥＣ−１は前述のモデル内では利用できない。ＨＭＥＣ−１細胞は、それを３７℃で４時間完全培地中で球と共にインキュベートした時点でＣｙｔｏｄｅｘ３（Ｓｉｇｍａ）球に接着する。球は、このとき、１球あたり３０個の細胞を得るような形で大量の完全培地中に再懸濁させられ、毎分３０ｒｐｍで３０分毎に５分間の撹拌を１２時間受け、その後４日間同じ速度で連続的に培養される。球の全ての表面が細胞で覆われた時点で、球は、定量化及び結果分析の方法についてと同様、先行するモデルについて記述したものと同一のフィブリンゲル中で濃縮及び取込みするような形で５分間８００ｇで遠心分離される。ＣＰＡＥを利用するモデルとは異なり、毛細管タイプの構造は、３７℃での３日間の培養後に初めて現れる。
【００６６】
９）エレクトロトランスファ用プラスミドの調製
【００６７】
ＡＭＥＰのｃＤＮＡは、ベクターｐＢｉのＥｃｏＲＶ部位でサブクローニングされる（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）。このベクターの問題の遺伝子の発現は、真核生物遺伝子  Ｔｅｔ−Ｏｎが関与する発現系の中のテトラサイクリンに応答するプロモータに依存している。ベクターＴｅｔ−Ｏｎは、トランス作用因子ｒｔＴＡ（逆テトラサイクリン転写作用因子を発現し、ベクターＴｅｔ−ｔＴＳは、「サイレンサー」ｔＴＳ（テトラサイクリン転写サイレンサー）を発現する。プラスミドの精製は、いかなる内毒素も存在しないような形で実施される（Ｍａｘｉ  ｅｎｄｏ  ｆｒｅｅ  Ｋｉｔ、Ｑｕｉａｇｅｎ）。精製されたプラスミドＤＮＡは、所望の濃度で内毒素が含まれていない状態で、無菌０．９％ＮａＣｌの中で可溶化される。
【００６８】
１０）ヌードマウス及びＣ５７Ｂｌ／６の筋肉内へのヒトＡＭＥＰについてコードする遺伝子のエレクトロトランスファ
【００６９】
２０μｇのプラスミドｐＢｉ−ＡＭＥＰ、１０μｇのプラスミドＴｅｔ−ｏｆｆ及び２０μｇのプラスミドｔｅｔ−ｏｎを３０μｌの無菌０．９％ＮａＣｌ中で可溶化させ、Ｍｉｒ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．（Ｍｉｒ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９９）によって記述されているようにペントバルビトールを腹腔内接種することで予め麻酔した生後８週間のヌードマウス又はＣ５７Ｂｌ／６の頭蓋一脛骨（ｔａｂｉａ−ｃｒａｎｉａｌ）筋の中に注入した。簡単に言うと、２枚の鋼板を収納しマウスの足に適合された電極を用いて、阻害物質Ｚの周波数で２０ｍｓの間、２００Ｖ／ｃｍの電気ショックを８回加える。電極は、電気パルサーＰＳ−１５（Ｊｏｕａｎ  ｓｔ  Ｈｅｒｂｌａｉｎ、Ｆｒａｎｃｅ）に接続されている。ＡＭＥＰの遺伝子を含まない同じプラスミドは、負の対照を構成している。
【００７０】
１１）腫瘍成長の胸腺欠損マウスモデル（細胞ＭＤＡ  ＭＢ２３１）
【００７１】
８０％の集密性まで予め培養された細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、剥離、洗浄され２０・１０６細胞／ｍｌの割合でＰＢＳ中に再懸濁させられる。上述のように予め処理された生後８週間のヌードマウスの背中に細胞懸濁液２００マイクロリットルを皮下注射する。腫瘍の２つの直径を測定することにより、数学式（２つの直径の和／２）３／０．５２に従ってその体積を計算することができる。腫瘍が１８ｍｍ３の体積に達した時点で、マウスの飲料水中にドキシサイクリン（テトラサイクリンの安定した類似体）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）を２００μｇ／ｍｌで添加し、５％のスクロースを付加して、マウスの筋肉内のＡＭＥＰの発現を誘発する。誘発後１４日間にわたり腫瘍の寸法を追跡調査する。
【００７２】
１２）腫瘍血管新生の定量化（皮下中実腫瘍の免疫組織化学及び分析）
【００７３】
腫瘍組織は、エタノール中で固定される。５μｍの切片をパラフィンで調製する。内因性ペルオキシダーゼを１０分間３％のＨ２Ｏ２で消して、免疫組織化学でこれらの切片を利用できるようにする。精製水で切片を洗浄しその後１０分間Ｏｐｔｉｍａｘ１：１０（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）血清で飽和させた後、スライドグラスを１時間、１：５０で抗ＣＤ３１ラット抗体（内皮細胞の接着分子）と共にインキュベートする。４分間Ｏｐｔｉｍａｘで２回洗浄した後、スライドグラスを、ビオチンにカップリングされた抗ラットヤギポリクローナルし、その後、Ｏｐｔｉｍａｘで４分間２回洗浄する。その後スライドグラスを１０分間ＤＡＢ色素生産基質で処理し、精製水で洗浄し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対抗染色する。全てのスライドグラスを同じ日に免疫マーキングし、対抗染色し、これにより標準化されたマーキング強度が保証される。
【００７４】
各々の動物について、ＣＤ３１でマーキングされた切片を代表する１つの組織学的標本が、Ａｘｉｏｐｈｏｔ  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡（ドイツ）、ソニー３ＣＣＤカメラ（解像度７６８×５７６画素）を用いる画像分析に付される。１００倍という倍率を選択することにより、標本全体のデジタル化が可能となる。これらには、腫瘍組織しか考慮されず、壊死及び線維素性ゾーンは除外される。各々の標本について、表面全体又は標本のサイズが過度に大きい場合には隣接する８つのフィールドがデジタル化される。画像は、Ｌｉｎｕｘに基づく特定的プログラムによって分析され、０〜２５５の定量的指標を生み出す。デジタル化されたカラー画像は、異なるグレーレベルに変換される。栗色と赤の脈管のみで構成された理論的画像が２５５という指標に対応し、一方脈管が無い画像（完全に青色のマーキング）は、指標０に結びつけられることになる。画像の各画素について、０〜２５５の間に含まれる値及びこれらの数字の平均が各画像について得られる。各動物についての最終的指標は、８つの隣接フィールドの平均値の計算の結果得られる。
【００７５】
１３）同系転移性腫瘍モデル（肺転移、細胞Ｂ１６Ｆ１０）
【００７６】
２００μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの飲料水に添加して、Ｂ１６Ｆ１０マウスの黒色腫細胞の注入の３日前にマウスの筋肉中でＡＭＥＰの発現を誘発する。これらの細胞は予め、５０％の集密性まで培養され、剥離され、洗浄され、４・１０６細胞１ｍｌの割合でＰＢＳ中に再懸濁されていた。細胞懸濁液１００マイクロリットルをマウスの眼窩後洞内に静脈内注射した。細胞移植の７日後にマウスを屠殺し、肺を採取し、双眼ルーペ下で黒色の肺転移計数を実施する。
【００７７】
ＩＩ−結果
【００７８】
１）フィブロネクチン、ビトロネクチン及びフィブリノーゲン上のＡＭＥＰによる内皮細胞の接着阻害
【００７９】
方法の中で記述された２つの接着技術は、ＲＧＤＣ配列を含む１２のアミノ酸から成る１．４ＫｄａのＡＭＥＰのフラグメント又はＡＭＥＰの存在下で実施された（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｒａｎｃｅ）。このペプチド（「１．４ＫＤａ−ペプチド」）は、ＡＭＥＰの作用様式が対照のＲＧＤペプチドと異なっているか否かを決定するために利用された。
【００８０】
内皮細胞が、接着試験を行なう前に１．４ＫＤａのペプチド（１μｇ／ｍｌ）で正確に３０分インキュベートされた場合、ビトロネクチン（４９±１．２％の阻害）及びフィブリノーゲン（５０±２．４％の阻害）上で細胞接着の強い低減が見られる。この結果は、このフラグメントが、その特定基質で内皮細胞の表面に存在するインテグリンアルファｖベータ３の相互作用を遮断するかぎりにおいて驚くべきことではない。これらの同じ条件下で、これらの基質に対する内皮細胞の接着に対するＡＭＥＰの有意な効果は、比較可能なモル濃度（１０μｇ／ｍｌ、図示せず）で全く検出されなかった。
【００８１】
これに対して、細胞が前述のものと同じモル濃度でＡＭＥＰ又は１．４ｋＤａのペプチドと共に２４時間予備インキュベートされる場合、得られる結果は逆転する。すなわち、ＡＭＥＰは、３つの基質について３０％だけビトロネクチン、フィブロネクチン及びフィブリノーゲン上での内皮細胞の接着を阻害する一方で、１．４ｋＤａのペプチドは、有意な効果を全く及ぼさない（図２）。
【００８２】
２）ＡＭＥＰによる内皮細胞遊走の阻害
【００８３】
図３は、我々の遊走モデルにおける対照（ドメイン不在：Ａ，Ｂ）に比べた、５μｇ／ｍｌ（Ｃ，Ｄ）及び１０μｇ／ｍｌ（Ｅ，Ｆ）でのＡＭＥＰの添加後の内皮細胞（ＣＰＡＥ）の様相を示している。ＡＭＥＰの存在下では、細胞のきわめて明確な形態変化が見られた：すなわち、内皮細胞は、長い偽足を形成し、細胞間の凝集力は改変され、数多くの細胞が剥離している（１０μｇ／ｍｌ）。この現象は、細胞（Ｄ，Ｆ）の遊走前端においてより一層良く見える。これらの細胞の変位速度と対するＡＭＥＰの効果は、いかなる阻害効果も誘発しない１．４ｋＤａのペプチドとは異なり、用量依存性（２〜１０μｇ／ｍｌ）であり、１０μｇ／ｍｌで細胞遊走が完全に阻害される（図４）。
【００８４】
３）細胞増殖に対するＡＭＥＰの効果
【００８５】
１２個のアミノ酸のフラグメント（利用される濃度の如何に関わらず（１〜１００μｇ／ｍｌ、図示せず）内皮細胞の増殖に対しいかなる効果ももたない１．４ｋＤａのペプチド）とは異なり、ＡＭＥＰは、２μｇ／ｍｌ以降、その増殖を強く阻害する（４０％の低減）（図５）。この効果は、５μｇ／ｍｌで最大であり、増殖阻害は６０％である（１０μｇ／ｍｌで同一の百分率）。予めウエスタンブロット（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｒａｎｃｅ）で利用された、ＡＭＥＰに対して向けられたウサギのポリクローナル血清は、これらの細胞の増殖を比較可能な形で阻害する（６５±０．１％）。
【００８６】
ＡＭＥＰの作用の特異性を分析するために、我々は、巨大血管又は微小血管の一次内皮細胞の増殖、ならびにその表面にＡＭＥＰの既知の標的の１つであるインテグリンアルファｖベータ３を有するか又は有さないものとして知られている癌細胞に対するその効果を研究した。下表１に示されている結果は、ＡＭＥＰが、その表面にインテグリンアルファｖベータ３をほとんど又は全く有していないさまざまな由来の（線維芽細胞、乳房、結腸）の癌細胞（それぞれ、ＭＤＡ  ＭＢ２３１、Ｃ５１、３Ｔ３）の増殖に対しいかなる効果ももたないのに対し、異なるタイプの内皮細胞を比較可能な形で阻害するということを示している。有利には、インテグリンアルファｖベータ３を発現する細胞の増殖に対するＡＭＥＰの大きい阻害効果が視察される。
【００８７】
【表１】
2005502638.tif 000002
【００８８】
表１は、内皮細胞及び癌細胞の増殖に対するＡＭＥＰの効果に関する。実験は、５回反復された（平均±ＳＥＭ）。表示された数字は、同じ条件下で行なわれた対照（ＡＭＥＰ無し）に対する５μｇ／ｍｌで利用されたＡＭＥＰによる取り上げられた細胞の増殖の阻害百分率を表わしている。
【００８９】
４）内皮細胞に対するＡＭＥＰのプロアポトーシス活性の立証
【００９０】
アポトーシス細胞の百分率を決定することを可能にする２つの技術が利用された。そのうちの１つの方法は、生きた細胞を保ちその結果細胞周期の異なる期を追跡調査できるようにするＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を利用している。アネキシン−Ｖを利用する技術の方は、内皮細胞の早発性アポトーシスを決定できるようにする（その表面におけるセリンホスファチシルの視覚化）。得られた結果は、比較可能なもの、つまりＡＭＥＰの存在下で３倍になったアポトーシス細胞百分率である（下表２）。これに対し、アポトーシスを誘発する分子の大部分とは異なり、ＡＭＥＰの存在下でＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて、細胞周期の修正は全く立証できなかった（図示せず）
【００９１】
【表２】
2005502638.tif 000003
【００９２】
表２は、アポトーシス状態の細胞の百分率を報告している。フラックスサイトメータでの分析が、「材料と方法」の中で記述された２つの方法に従って実証される。実験は３回実施された。平均±ＳＥＭ。
【００９３】
５）ＡＭＥＰは、フィブリンゲルでの２つの血管新生モデルにおいて毛細管タイプの構造の形成を阻害する
【００９４】
微小血管の内皮細胞は、血管新生の研究のためにより適合しており、このような理由から我々はＨＭＥＣ−１を利用した（Ｎｅｈｌｓ  ｅｔ  Ｈｅｒｒｍａｎｎ、１９９５）。これらの細胞は、球上で培養され、次にフィブリンゲル内に取込まれる（図６、対照：Ａ，Ｂ）。毛細管タイプの構造の形成に対するＡＭＥＰ（５μｇ／ｍｌ）の阻害効果は、３日間の培養後に見られ（Ｃ）、管（Ｄ）のサイズの９０％の減少を伴って１０日後に目覚しいものとなる。血管新生の異なる段階に対するＡＭＥＰの効果を決定する目的をもつこれまでの研究では、内皮細胞としてＣＰＡＥが利用されてきており、従って我々は、もう１つの血管新生モデルに対するこの分野の効果を確認したいと考えた。実際、これらの細胞は、その形態が適合されていないことから球を利用するモデル内で利用できない。ＣＰＡＥの凝集は、インビトロでの血管新生に対するＡＭＥＰの効果を研究する唯一の手段であった。毛細管タイプの構造は、フィブリンゲル内の凝集塊の取込みから２４時間後に現れる。図７は、３日間のインキュベーションの後に撮られた写真を集めている。５μｇ／ｍｌ（Ｂ）又は１０μｇ／ｍｌ（Ｃ，Ｅ）でのＡＭＥＰの添加は、対照（Ａ，Ｄ）との関係において毛細管タイプの構造の崩壊を誘発し、内皮細胞の死を導く（図示せず）。対照条件下では、６日間のインキュベーションまで構造の長さの増加が見られる（図示せず）。
【００９５】
６）ヌードマウス上でのＡＭＥＰによる腫瘍の成長及び腫瘍の血管新生の阻害
【００９６】
ヌードマウスにおけるＡＭＥＰの産生は、マウスの筋肉内でＡＭＥＰについてコードする遺伝子のエレクトロトランスファとそれに続くドキシサイクリンによるその発現の誘発の後に得られる。
【００９７】
図８に示されているように、ＡＭＥＰグループの腫瘍体積は、対照グループのものよりも明らかに小さく、処置の１４日後に阻害が７８％に達することが確認されている。類似の阻害率は、わずか７日間の処置の後に見られる。腫瘍内血管新生の定量化が、これらの同じ腫瘍の切片について実施された。表３に提示された結果は、腫瘍の成長に対するＡＭＥＰの強力な阻害効果が、５３．４％というＡＭＥＰによる処置を受けた腫瘍の内部での血管数の有意な阻害と相関関係をもつということを示している。
【００９８】
これらの結果は、ＡＭＥＰがインテグリンアルファｖベータ３を発現しない腫瘍のインビボモデルの中で強力に作用することを示している。
【００９９】
以下の表３は、ＡＭＥＰを発現するか又はしないマウスに由来する腫瘍の切片を表わす標本のコンピュータによる画像のデジタル化及び分析の後に得られる、腫瘍の血管構築の統計的指標を表わしている。
【０１００】
【表３】
2005502638.tif 000004
【０１０１】
７）同系マウス上でのＡＭＥＰによる肺転移形成の阻害
【０１０２】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの筋肉内でのＡＭＥＰの産生は、ドキシサイクリンにより誘発される。対照グループに比較して、７日間の処置の後に７４．２％という肺転移数の異例の阻害が、ＡＭＥＰでの処置を受けたマウスのグループにおいて観察される（図９，１０）。
【０１０３】
ＩＩＩ−論述
【０１０４】
血管新生プロセス中に内皮細胞が活性化され、これらの細胞は、血管新生表現型を獲得する。このとき、これらの細胞はその表面にインテグリンアルファｖベータ３及びメタルギジン（成長した血管に由来する内皮細胞上で検出不可能な分子）を有する（Ｈｅｒｒｅｎ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９７）。
【０１０５】
得られた結果全体は、ＡＭＥＰが１．４ｋＤａのペプチドにより及ぼされるものよりもさらに広い抗血管新生活性を有するということを示している。ＡＭＥＰのみならず１．４ｋＤａペプチドも又インテグリンアルファｖベータ３に対する内皮細胞の結合に関与するＲＧＤ配列を有することから、ＡＭＥＰの作用がインテグリンアルファｖベータ３の機能の遮断に制限されないということが示唆される。ＡＭＥＰは、細胞レベルでのシグナリング（インテグリンアルファｖベータ３及び／又はメタルギジンを経由しうるメッセージ）の修正に関係づけされうる固有の活性を有すると思われる。
【０１０６】
細胞の接着は、細胞遊走に介入する現象である。しかしながら、我々は、接着の阻害が内皮細胞の遊走阻害の原因となる唯一のメカニズムではないと考えている。かくして、１０μｇ／ｍｌのＡＭＥＰという濃度では阻害に対するＡＭＥＰの阻害効果は部分的でしかないものの、この同じ濃度が、内皮細胞の遊走を完全に遮断するためには充分なものである。
【０１０７】
血管新生の主要な段階に対するＡＭＥＰのこの例外的な阻害活性は、その増殖防止効果（内皮細胞の増殖阻害の６０％に至る）によって強化される。興味深いことに、ＡＭＥＰによって誘発される内皮細胞の増殖阻害は、細胞周期の検出可能な修正に結びつけられるものではない。
【０１０８】
血管新生の最終段階に際して、細胞は、脈管口径の形成を可能にするため吻合する管の形に組織される。我々は、「材料」の項で記述された２つの技術に従って、微小血管（ＨＭＥＣ−１）及び巨大血管（ＣＰＡＥ）の内皮細胞を用いてこの現象をｉｎｖｉｔｒｏで再度作り上げた。注目に値することに、毛細管タイプの構造の形成の完全な阻害が、ＡＭＥＰの存在下でＨＭＥＣ−１を用いたモデルにおいて視察される。血管新生のその他の阻害物質でこれまでに観察できたものとは異なり、ＡＭＥＰは、予め早発的に（１２時間）形成されたＣＰＡＥの管の側方崩壊を誘発する。ＣＰＡＥは、実際、ＨＭＥＣ−１に比べてはるかに高い増殖及び遊走速度を有し（図示せず）、これにより、２つの血管新生モデルに対するＡＭＥＰの効果の２元性を説明することが可能である。
【０１０９】
なお、これらの研究作業は、ＡＭＥＰによるインビボでの腫瘍血管新生の阻害が、インテグリンアルファｖベータ３を発現しないものとして知られている腫瘍上でさえ、腫瘍成長の例外的な阻害を導くということを示している。さらに、肺転移モデルにおけるＡＭＥＰの顕著な抗転移効果が明らかにされている。
【０１１０】
最後に、１０μｇ／ｍｌのＡＭＥＰでの内皮細胞の処理は、位相差顕微鏡で観察できる（培地中に浮遊する）死枯した内皮細胞の数の増加を誘発する（図３）。しかしながら、アポトーシス（なお生きている細胞について定量化可能な現象）に対するこの製品の効果は（３倍の増加）。従ってＡＭＥＰは、アノイキスの名前で最近記述された（Ｆｒｉｓｃｈ、２０００；Ｚｈｕ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，２００１）現象による細胞死の誘発に対し強力な抗血管新生効果を結びつけるという特殊性を有する。
【０１１１】
従って、ＡＭＥＰの革新的な側面は、これまでに発見されたその他の分子（内皮細胞の増殖を阻害するアンギオスタチン、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９４；Ｗｕ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９７、Ｓｉｍ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９７）又は、ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦといった血管新生因子により誘発された場合のみであるが、それらの増殖ならびにそれらの遊走を同様に阻害するエンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９７、Ｓｉｍ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，２０００；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９９９）参照）とは異なる内皮細胞の遊走及び増殖を含めた血管新生の全ての段階を阻害するその能力にある。その上、インビトロでの遊走及び血管新生に対するＡＭＥＰのそれぞれの効果、すなわち内皮細胞の移動性の完全な停止及び毛細管タイプの構造の形成の欠如には目をみはるものがある。
【０１１２】
予期せぬことに、インビトロでの記述された実験全体についての細菌における組換え型タンパク質の形で合成されたＡＭＥＰの強力な阻害効果は、哺乳動物において新たに合成されたＡＭＥＰを用いて実現されたインビボで得られた結果によって確認されている。有利には、胸腺欠損モデルの体内での腫瘍の成長に対するＡＭＥＰの阻害効果は、インビトロでの血管新生の全段階のＡＭＥＰによる阻害の直接的効果である腫瘍内血管数の減少と関係づけすべきものである。その上、黒色腫細胞を利用した肺転移の形成に対するＡＭＥＰの抗浸潤効果は、インビトロでのこれらの同じ細胞についてのＡＭＥＰの特殊な増殖防止効果に相関される。
【０１１３】
（参照文献）
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【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】以下のものを表わしている。すなわちａとして、精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの融合タンパク質（グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ−ＡＭＥＰ）の視覚化。３６Ｋｄａでクーマシーブルーでの染色の後に、唯一のバンドが目に見える。ｂとして、精製されたＡＭＥＰのウエスタンブロット。ウサギにおいて作られた抗ディスインテグリン抗血清による１０Ｋｄａでの唯一のバンドの視覚化。
【図２】フィブリノーゲン（３０μｇ／ｍｌ）、ビトロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）及びフィブロネクチン（４０μｇ／ｍｌ）に対するＣＰＡＥの接着に対するＡＭＥＰの効果を示す。細胞は、接着試験の前にＡＭＥＰ又は１４個のアミノ酸のフラグメントを用いて２４時間前処理された（「材料及び方法の中の記述」。実験は、３回同一条件で実施され、３回反復されている。結果は、対照との関係において百分率で表わされている（平均±ＳＥＭ）。
【図３】内皮細胞の形態及び遊走に対するＡＭＥＰの効果を示す。遊走前端はそれぞれ対照、５μｇ／ｍｌのＡＭＥＰ、１０μｇ／ｍｌのＡＭＥＰという条件の写真Ｂ，Ｄ，Ｅ，に表わされている（位相差顕微鏡）。
【図４】ＡＭＥＰによるＣＰＡＥの遊走の用量依存的阻害を表わす。細胞の遊走前端の位置は、３日間毎日測定される。結果は５回の実験の平均であり、対照との関係における百分率で表わされている（平均±ＳＥＭ）。
【図５】ＡＭＥＰによるＣＰＡＥの増殖の用量依存的阻害を表わす。細胞は、ＲＧＤＣ配列を含むこのドメインのフラグメント又はＡＭＥＰの存在下で４８時間培養され、１μＣｉのトリチウム化チミジンと共に１８時間インキュベートされる。このとき、取込まれた放射能が測定される。結果は５回の実験の平均であり、対照との関係における百分率で表わされている（平均±ＳＥＭ）。
【図６】ＨＭＥＣ−１を利用した毛細管タイプの構造の形成に対するＡＭＥＰの効果を示す。内皮細胞に被覆されたｃｙｔｏｄｅｘ球が、ＡＭＥＰの不在下（写真Ａ，Ｂ）又は存在下（５μｇ／ｍｌ）（写真Ｃ，Ｄ）でフィブリンゲル内に取込まれる。
【図７】対照（Ａ，Ｄ）との関係におけるＡＭＥＰ５μｇ／ｍｌ（Ｂ）又は１０μｇ／ｍｌ（Ｃ，Ｅ）の存在下でのＣＰＡＥを用いたフィブリンゲル内の毛細管形成に対するＡＭＥＰの効果を示す。
【図８】ＡＭＥＰによる腫瘍成長の阻害を示す。１本の曲線の各点は、ヌードマウス上で測定した腫瘍の体積を表わしている。提示された実験には、１４日間処置を受けた５匹の動物がＡＭＥＰグループならびに対照グループについて関与している。ヒストグラムは、各グループについて５匹のマウスの平均腫瘍体積を表わす。この図は、全く異なる３つの実験を表わしている。
【図９】黒色腫細胞を利用したＡＭＥＰによる肺転移数の阻害を示す。各点は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの肺の中で計数した転移数を表わす。提示された実験には、各グループについて１２匹の動物が関与している。ヒストグラムは、対照グループ及び処置を受けたグループにおける転移数の平均を示す。この実験は、２つの全く異なる実験を代表するものである。
【図１０】対照マウスの肺と比べたＡＭＥＰで処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスの肺の肺転移数（黒色斑）の数の阻害の写真表現を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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