(57)【要約】  本発明は、固有の生理学的性質を有する抗CD22モノクローナル抗体を使用した治療方法に関する。特に、本発明は、天然型ヒトCD22(hCD22)の最初の２つのIg様ドメイン、または最初の２つのIg様ドメイン内のエピトープに特異的に結合する有効量のブロッキング抗CD22モノクローナル抗体を投与することによりＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞悪性腫瘍と診断されたヒト患者を治療する方法であって、
(１)配列番号１の天然型ヒトCD22(hCD22)の最初の２つのIg様ドメイン、または最初の２つのIg様ドメイン内のエピトープに結合する有効量のブロッキング抗CD22モノクローナル抗体を、該ヒト患者に投与すること、および(２)該治療に対する該悪性腫瘍の反応をモニタリングすること、を含む方法。
【請求項２】
前記抗体は、HB22-7(HB11347)、HB22-23(HB11349)、HB22-33、HB22-5、HB22-13、およびHB22-196からなる群より選択される抗体と本質的に同じエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体は、HB22-7(HB11347)、HB22-23(HB11349)、およびHB22-33からなる群より選択される抗体と本質的に同じエピトープに結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体は、HB22-7と本質的に同じエピトープに結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体は、HB22-33と本質的に同じエピトープに結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体は、CD22とそのリガンドとの結合を少なくとも約70％ブロックする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体は、CD22とそのリガンドとの結合を少なくとも約80％ブロックする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が局所的なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、および前リンパ球性白血病のＢ細胞亜型からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療は、悪性腫瘍Ｂ細胞のその他の治療を伴わない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療は、放射線療法を伴わない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療は、化学療法を伴わない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療は、放射免疫療法(RIT)、または併用放射免疫療法(CMRIT)を伴わない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体を単独で使用する治療は、該抗体と放射免疫療法との併用治療と比べて、Rajiリンパ腫異種移植モデルの治癒率の改善をもたらすものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体を単独で使用する治療は、該抗体と放射免疫療法との併用治療と比べて、Rajiリンパ腫異種移植モデルの生存率が高まる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体を単独で使用する治療は、該抗体と放射免疫療法との併用治療と比べて、Rajiリンパ腫異種移植モデルの腫瘍容積の減少をもたらす、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体は、完全抗体のフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2およびFvフラグメント、二重特異性抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体は、さらなる抗原特異性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体は、二重特異性抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体は、CD22の別のエピトープにさらに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体はキメラである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体はヒト化である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体は静脈内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体は、週ごとに、静脈内点滴により投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
固型Ｂ細胞腫瘍の縮小を追跡することにより、前記治療に対する反応をモニタリングする、請求項６に記載の方法。
【請求項２８】
前記縮小が、磁気共鳴画像法(MRI)によりモニタリングされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が、配列番号９(HB22-5 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；または配列番号13(HB22-3 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98；または配列番号19(HB22-196 VH配列)のアミノ酸1〜100の配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVH配列を含む重鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；または配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98の配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVH配列を有する重鎖を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が、配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；および配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98からなる群より選択されるVH配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、配列番号21(HB22-5Vκ配列)；または配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；または配列番号25(HB22-13 Vκ配列)；または配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；または配列番号29(HB22-33 Vκ配列)；または配列番号31(HB22-196 Vκ配列)、のアミノ酸配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVκ配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；または配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；または配列番号29(HB22-33 Vκ配列)のアミノ酸配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVκ配列を含む軽鎖を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；および配列番号29(HB22-33 Vκ配列)のアミノ酸配列からなる群より選択されるVκ配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が、配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97と配列番号23(HB22-7 Vκ配列)のアミノ酸配列；配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100と配列番号27(HB22-23 Vκ配列)のアミノ酸配列；ならびに配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98と配列番号29(HB22-33 Vκ配列)のアミノ酸配列からなる群より選択されるVHとVκ配列とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体はキメラである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体はヒト化である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体はヒトである、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固有の生理学的性質を有する特定の抗CD22モノクローナル抗体の治療的用途に関する。特に、本発明は、固有のアポトーシス誘発性(pro-apoptotic)性質を有するブロッキング抗CD22抗体で、リンパ腫および白血病等のＢ細胞悪性腫瘍、ならびに自己免疫疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
CD22は、ほぼ全てのＢリンパ球およびほとんどのＢ細胞リンパ腫上に見とめられる膜グリコリンタンパク質(glycophosphoprotein)である。CD22の架橋は、CD22チロシンリン酸化を誘発し、ストレス活性化タンパク質キナーゼ(SAPK)経路を活性化するエフェクタータンパク質の複合体をアセンブルする。CD22架橋により、一次Ｂ細胞において可能性のある同時刺激シグナル、および新生物Ｂ細胞においてアポトーシス誘発性シグナルが得られる。構造的に、CD22は、単一アミノ末端ＶセットIgドメインおよび６つのC-2セットIgドメインからなる７つの細胞外Igドメインを有する、免疫グロブリン(Ig)遺伝子スーパーファミリーの「シアロ付着因子(sialoadhesin)」サブクラスのメンバーである。Wilsonら, J.Exp. Med. 173:137-146 (1991)；Engelら, J. Exp. Med. 181:1581-1586 (1995)；およびTorresら, J. Immunol. 149:2641-2649 (1992)。CD22は、生理学的に関連する部位にシグナリングエフェクター分子を補充することにより、Ｂリンパ球抗原受容体(BCR)シグナリングを正または負に調節する重要なリンパ球特異的シグナル形質導入分子である。Tedderら, Annu. Rev. Immunol. 15:481-504 (1997)；Satoら, Immunology 10:287-297 (1998)。
【０００３】
抗CD22抗体は、例えば、米国特許第5,484,892号；同第6,183,744号；同第6,187,287号；同第6,254,868号、およびTuscanoら, Blood 94(4):1382-92 (1999)で説明されている。非ホジキンリンパ腫の治療において、抗CD22抗体を含むモノクローナル抗体を使用することは、例えば、Rennerら, Leukemia 11(Suppl. 2):S55-9 (1997)に概説されている。ヒト化抗CD22抗体であるLymphoCideTM(empatuzumab, Immunomedics, Inc.)は、不活性および侵襲性形態の非ホジキンリンパ腫の治療について第III期臨床治験にある。この抗体のイットリウム90標識化バージョンは、同じ兆候について現在第Ｉ期臨床治験にある。
【０００４】
最近の癌治療の進歩にも関わらず、Ｂ細胞亜型の非ホジキンリンパ腫等のＢ細胞悪性腫瘍、および慢性リンパ性白血球は、癌に関連する死亡の主な引き金である。従って、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のためのさらに改善された治療計画の必要性が高い。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、特定のブロッキング抗CD22モノクローナル抗体の固有の性質を利用して、ヒト患者のＢ細胞悪性腫瘍を治療するための改善された臨床アプローチに関する。
【０００６】
一態様では、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍と診断されたヒト患者の治療方法に関し、該方法は、(１)配列番号１の天然型ヒトCD22(hCD22)の最初の２つのIg様ドメインまたは最初の２つのIg様ドメインと会合したエピトープに特異的に結合する有効量のブロッキング抗CD22モノクローナル抗体を患者に投与すること、および(２)治療に対する悪性腫瘍の反応をモニタリングすることを含む。
【０００７】
特定の実施形態では、使用する抗体は、HB22-7(HB11347)、HB22-23(HB11349)、HB22-33、HB22-5、HB22-13およびHB22-196、好ましくはHB22-7、HB22-23またはHB22-33、より好ましくはHB22-7またはHB22-33からなる群より選択される抗体と本質的に同じエピトープに結合する。
【０００８】
さらなる実施形態では、抗体は、CD22がそのリガンドに結合するのを、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％ブロックする。
【０００９】
別の実施形態では、抗体は、配列番号９(HB22-5 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；または配列番号13(HB22-13 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98；または配列番号19(HB22-196 VH配列)のアミノ酸1〜100、の配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVH配列を含む重鎖を含む。
【００１０】
さらに別の実施形態では、抗体は、配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；または配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98、の配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVH配列を含む重鎖を含む。
【００１１】
さらに別の実施形態では、抗体は、配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；または配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100の配列；および配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98からなる群より選択されるVH配列を含む。
【００１２】
異なる実施形態では、抗体は、配列番号21(HB22-5Vκ配列)；または配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；または配列番号25(HB22-13 Vκ配列)；または配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；または配列番号29(HB22-33 Vκ配列)；または配列番号31(HB22-196 Vκ配列)、のアミノ酸配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVκ配列を含む軽鎖を含む。
【００１３】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；または配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；または配列番号29(HB22-33 Vκ配列)、のアミノ酸配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVκ配列を含む軽鎖を含む。
【００１４】
さらなる実施形態では、抗体は、配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；および配列番号29(HB22-33 Vκ配列)、のアミノ酸配列からなる群より選択されるVκ配列を含む。
【００１５】
好適な実施形態では、抗体は、配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97および配列番号23(HB22-7 Vκ配列)のアミノ酸配列；配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100および配列番号27(HB22-23 Vκ配列)のアミノ酸配列；ならびに配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98および配列番号29(HB22-33 Vκ配列)のアミノ酸配列、からなる群より選択されるVHおよびVκ配列を含む。
【００１６】
異なる態様では、本発明は、上記議論した抗体重鎖または軽鎖可変領域のいずれかをコードする核酸、またはその一部に関する。
【００１７】
目的とする症状は、局所化Ｂ細胞悪性腫瘍を含む(ただし、これに限定されない)、あらゆる種類のＢ細胞悪性腫瘍であり得る。Ｂ細胞悪性腫瘍の典型的な代表例は、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、および前リンパ球性白血病のＢ細胞亜型のものである。
【００１８】
本発明の治療方法は、悪性Ｂ細胞のそれ以上の治療(放射線療法、化学療法、併用放射免疫療法(CMRIT)等を含む)を伴わないで行うことができる。本発明の治療方法は、典型的に、未治療の場合、同抗体と放射免疫療法との併用治療の場合、または放射免疫療法のみの場合と比べて、治癒率の改善および/または生存率の上昇および/または腫瘍容積の優れた減少を提供する。
【００１９】
抗体は、完全抗体、または例えばFab、Fab'、F(ab')2およびFvフラグメントを含む抗体フラグメント、二重特異性抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体であり得る。従って、抗体は、追加の抗原特異性を有し得る(例えば、二重特異性抗体であり得る)。二重特異性抗体は、例えば、CD22に対する別のエピトープにさらに結合し得る。さらに、二重特異性抗体は、CD19、CD20、CD52、CD3、CD28、またはHLA-DR10(Lym-1)等の他の抗原；またはFc受容体(例えばCD16、CD64およびCD89)に対する結合特異性を有し得る。
【００２０】
抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはヒト抗体であり得る。
【００２１】
抗体の投与は、静脈内点滴の繰返しによる静脈内(i.v.)投与等、あらゆる従来の経路で実施され得る。
【００２２】
治療に対する反応は、例えば、磁気共鳴画像化(MRI)による固型腫瘍の縮小のモニタリングを含む当業者に周知の方法によりモニタリングし得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
好適な実施形態の詳細な説明
Ａ．定義
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される用語と同じ意味を持つ。
【００２４】
当業者には、本明細書に記載するものと同様または等価の、本発明を実施する上で使用され得る多くの方法および材料が明らかであろう。実際、本発明は、記載する方法および材料に決して限定されない。本発明の目的のために、以下の用語を定義する。
【００２５】
「免疫グロブリン」(Ig)という用語は、血清のグロブリンタンパク質の免疫性授与部分、および自然には生じないが同じ機能的特徴を有するその他の糖タンパク質を指すために使用する。「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、特に「抗体」(Ab)を含む。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体、および抗原特異性を欠くその他の抗体様分子の両方を含む。天然型免疫グロブリンは、形質細胞と呼ばれる分化Ｂ細胞により分泌され、抗原特異性を持たない免疫グロブリンは、リンパ系により低レベルで、そして骨髄腫により高レベルで生成される。本明細書で使用する「免疫グロブリン」、「Ig」という用語、およびそれらの文法上の変形語は、(上記定義した)抗体、および抗原特異性を持たないIg分子を含むように使用する。
【００２６】
天然型免疫グロブリンは、通常、２つの同一軽鎖(Ｌ)および２つの同一重鎖(Ｈ)からなる、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。軽鎖はそれぞれ、１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結しており、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖によりジスルフィド結合の数は異なる。重鎖および軽鎖はまた、それぞれ、規則的に間隔をあけられた鎖内ジスルフィド架橋を有する。重鎖はそれぞれ、一端において、可変ドメイン(VH)とそれに後続するいくつかの定常ドメインを有する。軽鎖はそれぞれ、一端において可変ドメイン(VL)を有し、他端において定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインを重鎖の第１の定常ドメインとアラインさせ、軽鎖可変ドメインを重鎖の可変ドメインとアラインさせる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの接合部分を形成すると考えられている。
【００２７】
血清において見とめられる主要Igアイソタイプ(クラス)、および対応するIg重鎖(括弧内に示す)を以下に一覧する：
IgG(γ鎖)：血清中の一次Ig、抗原に反応して生じる主要な抗体、この抗体は胎盤を通る；
IgE(ε鎖)：このIgは、マスト細胞および好塩基球に固く結合し、抗原に追加的に結合する場合には、ヒスタミンおよび即時過敏反応の他の仲介物質の放出を生じ；花粉症、喘息および過敏症を含むアレルギー反応において主要な役割を果たし；寄生動物に対する防御的役割を果たしうる；
IgA(α鎖)：このIgは、唾液、涙、粘液および初乳等の外部分泌物中に存在する；
IgM(μ鎖)：抗原に対する反応において最初に誘発されるIg；その後生成される他の抗体アイソタイプよりも親和性が典型的に低く、典型的に五量体である；
IgD(δ鎖)：このIgは、臍帯血中で比較的高濃度で見とめられ、抗原に対する初期細胞受容体であり得、主要リンパ球細胞表面分子である。
【００２８】
本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、特に、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体が挙げられるがこれに限定されない)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および所望の生物学的活性を示せば抗体フラグメントを含む。
【００２９】
「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部、概して抗原結合ドメインまたは可変(Ｖ)ドメイン、を含む。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab'、F(ab')2およびFvフラグメント；二重特異性抗体；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の(すなわち、集合を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る可能性のある天然型突然変異以外については同一である)抗体の集合から得た抗体を指す。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に方向付けられ、高度に特異的である。さらに、異なる決定基(エピトープ)に方向付けられた異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体はそれぞれ、抗原上の単一の決定基に方向付けられる。
【００３１】
本明細書のモノクローナル抗体は、特に、「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、および所望の生物学的活性を示せばそのような抗体のフラグメントを含む(米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)；Oiら, Biotechnologies 4(3):214-221 (1986)；およびLiuら, Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:3439-43 (1987))。
【００３２】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」または「CDR移植」形態は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類等の非ヒト種(ドナー抗体)由来の超可変領域残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基も、対応する非ヒト残基により置き換えられている(いわゆる「逆突然変異」)。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中に見とめられない残基を含んで、親和性等の抗体特性がさらに改善されるように改変され得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てまたは実質的に全ての超可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てまたは実質的に全てのFRがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部(典型的にヒト免疫グロブリンのもの)も含む。更なる詳細については、Jonesら, Nature 321:522-525 (1986)；およびReichmannら, Nature 332:323-329 (1988)を参照のこと。
【００３３】
「一本鎖Fv」または「sFv」抗体フラグメントは、１本のポリペプチド鎖中に存在する、抗体のVHおよびVLドメインを含む。一般的に、Fvポリペプチドは、抗原結合のために望ましい構造をsFvに形成させる、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。sFvの概要については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, RosenburgおよびMoore編 Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)に掲載のPluckthunを参照のこと。
【００３４】
「二重特異性抗体」という用語は、同じポリペプチド鎖(VH-VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に連結した重鎖可変ドメイン(VH)を含む、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントを指す。同じ鎖上の２つのドメインを対合させるには短すぎるリンカーを使用することで、ドメインを強制的に、別の鎖の相補ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製する。二重特異性抗体は、例えば、EP 404,097；WO 93/11161；およびHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)により詳細に記載されている。
【００３５】
本出願を通じて使用する「線状抗体」という表現は、Zapataら Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載の抗体を指す。簡単に言うと、これらの抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムなFdセグメントの対(VH-CH1-VH-CH1)を含む。線状抗体は、二重特異的であっても、または単一特異的であってもよい。
【００３６】
IgG、IgE、IgA、IgMおよびIgDアイソタイプの抗体は、重鎖の定常領域が異なるにも関わらず、同じ可変領域(すなわち、同じ抗原結合空隙)を有し得る。免疫グロブリン(例えば、抗体)の定常領域は、抗体と抗原との結合に直接関与していないが、抗体依存型細胞毒性(ADCC)における抗体の関与等、様々なエフェクター機能を示す。
【００３７】
主な抗体アイソタイプ(クラス)の一部は、さらにサブクラスに分けられる。IgGは４つの公知のサブクラス(すなわち、IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、およびIgG4(γ4))を有し、IgAは、２つの公知のサブクラス(IgA1(α1)およびIgA2(α2))を有する。
【００３８】
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の(モノクローナルまたはポリクローナル)抗体に対する結合部位を指すために使用する。
【００３９】
天然型配列ヒトCD22のアミノ酸配列内のドメイン１および/もしくは２に結合する抗体、または本明細書に具体的に開示するモノクローナル抗体(HB22-7、HB22-23およびHB22-33等)に結合される本質的に同じエピトープに結合する抗体は、「エピトープマッピング」により同定され得る。抗体-抗原複合体の結晶構造を解明すること、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチド利用型アッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴決定するための多くの方法が、当該分野で知られている(例えば、HarlowおよびLane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999の第11章に記載されている)。遺伝子断片発現アッセイによれば、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ランダムにまたは特定の遺伝子構築により断片化され、タンパク質の発現された断片とテストする抗体との反応性を測定する。遺伝子断片は、例えば、PCRにより生成されて、放射活性アミノ酸の存在下で、in vitroでタンパク質に転写および翻訳され得る。その後、抗体と放射活性標識化タンパク質断片との結合を、免疫沈降およびゲル電気泳動により測定する。特定のエピトープも、ファージ粒子の表面上に提示されるランダムペプチド配列の大規模なライブラリー(ファージライブラリー)を使用することにより、同定され得る。あるいはまた、重複するペプチド断片の定義されたライブラリーを、単純な結合アッセイにおいて、テスト抗体との結合についてテストできる。後者のアプローチは、約5〜15アミノ酸の直線エピトープを定義するのに適している。
【００４０】
抗体および参照抗体の２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、該抗体は、該参照抗体と「実質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが、同一または立体的に重複しているエピトープに結合するか否かを決定するのに最も幅広く使用されている迅速な方法は、標識化抗原または標識化抗体のいずれかを使用して、多数ある異なる形式で構成され得る競合アッセイ(例えば、競合ELISAアッセイ)である。通常、抗原が、96ウェルプレート上に固定化され、標識化抗体の結合をブロックする非標識化抗体の能力を、放射活性または酵素標識を使用して測定する。
【００４１】
本明細書で使用するアミノ酸またはアミノ酸残基という用語は、変異体に関して以下にさらに記載するような天然型Ｌアミノ酸またはＤアミノ酸を指す。一般的に使用されているアミノ酸の１文字および３文字略語を本明細書で使用する(Bruce Albersら, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (第３版 1994))。
【００４２】
「配列同一性」は、配列をアラインし、必要であれば、保存的置換は配列同一性の一部であると考慮せずに、最大配列同一性％を得るために、ギャップを挿入した後の、天然型ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中アミノ酸残基の％と定義する。配列同一性％値は、Altschulら(1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res., 25:3389-3402に定義されるようなNCBI BLAST2.0ソフトウェアにより生成される。パラメータは、ミスマッチのペナルティー(−１に設定)以外は、デフォルト値に設定される。
【００４３】
本明細書で使用する「治療」とは、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能または検出不可能に関わらず、症状の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の安定した(すなわち、悪化しない)状態、疾患進行の遅延または減速、疾患症状の改善または軽減、および(部分的または完全な)回復が挙げられるがこれらに限定されない。「治療」とは、治療を受けない場合に予測される生存率と比べて延長した生存率も意味する。「治療」とは、障害の発達を予防すること、または病変を変えることを意図して実施する介入である。従って、「治療」とは、治療的処置、および予防または防止処置の両方を指す。治療を必要とするものとしては、既に障害を持つもの、および障害を予防するものが挙げられる。Ｂ細胞悪性腫瘍については、本治療により、悪性腫瘍細胞の数が低下する；腫瘍容積が減少する；周囲器官(例えば、軟組織または骨)への侵入を含む、悪性腫瘍細胞の広がりが阻止(減速または停止)される；転移が阻止(減速または停止)される；腫瘍成長が阻止される；Ｂ細胞悪性腫瘍に付随する症状から解放される；死亡率が低下する；生活の質が改善される；等する。本明細書の抗体での治療は、細胞増殖抑制および/または細胞毒性の効果を生じ得る。
【００４４】
「Ｂ細胞悪性腫瘍」およびその文法上の変形語は、典型的にはリンパ系組織(骨髄またはリンパ節等)中で生じるが、非リンパ系組織(甲状腺、胃腸管、唾液腺および結膜等)でも生じ得る、Ｂ細胞の悪性腫瘍または新生物を指すように、最も広い意味で使用される。本発明の治療方法は、特に、CD22陽性Ｂ細胞悪性腫瘍に関し、Ｂ細胞亜型の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、および前リンパ球性白血病が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
Ｂ．詳細な説明
１．抗体
HB22-7、HB22-23、HB22-33、HB22-5、HB22-13、およびHB22-196と称されるブロッキング抗CD22モノクローナル抗体が知られており、米国特許第5,484,892号、Tuscanoら, Eur. J. Immunol. 26:1246 (1996)、およびTuscanoら, Blood 94(4), 1382-1392 (1999)に開示されている。HB22-7およびHB22-23は、American Type Culture Collection (ATCC), 12302 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852から、それぞれ、受託番号HB22347およびHB11349として入手可能である。これらの抗体の調製は、以下の実施例１にも記載している。CD22のエピトープマッピングにより、これらのブロッキングモノクローナル抗体が、ヒトCD22の最初の２つのIg様ドメイン、または最初の２つのIg様ドメインと会合するエピトープに結合することが示された(米国特許第5,484,892号およびTedderら, Annu. Rev. Immunol. 15:481-504 (1997))。抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列も、本出願において開示している。
【００４６】
本発明は、Ｂ細胞型非ホジキンリンパ腫(NHL)の異種移植モデルにおいて得られた結果に基づき、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療におけるHB22-7、HB22-23、HB22-33、HB22-5、HB22-13およびHB22-196の全体的な特徴を有するブロッキング抗CD22抗体の予想外に優れた特性に基づく。
【００４７】
抗CD22モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法(KoehlerおよびMilstein, Nature 256:495-497 (1975))；ならびにGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, (Academic Press, 1986))、または例えば米国特許第4,816,567号およびWoodら, Nature 314:446-9 (1985)に開示されている組換え技術等の当該分野で公知の任意の標準的方法により作製され得る。
【００４８】
免疫化の際に、内因性免疫グロブリン生成の不在下でヒト抗体のレパートリーを生成可能なトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することも可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞変異型マウスにおける抗体重鎖接合領域(JH)遺伝子のホモ接合欠失により、内因性抗体生成が完全に阻害されることが説明されている。このような生殖細胞変異型マウスにおけるヒト生殖細胞免疫グロブリン遺伝子アレイの移動(transfer)は、抗原感作(antigen challenge)の際にヒト抗体の生成をもたらす。例えば、Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362, 255-258 (1993)を参照のこと。
【００４９】
Mendezら(Nature Genetics 15:146-156 (1997))は、技術をさらに改善し、抗原で感作すると高親和性完全ヒト抗体を生成する「異種マウス(Xenomouse)II」と称するトランスジェニックマウスの系統を作製した。これは、メガ塩基(megabase)ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座を、マウスに生殖細胞取込みさせて、上述したように、内因性JHセグメントに欠失を生じさせることにより達成された。異種マウスIIは、約66のVH遺伝子、完全なDHおよびHJ領域、ならびに３つの異なる定常領域(μ、δおよびχ)を含む1,020kbのヒト重鎖遺伝子座を含み、32のVκ遺伝子、JκセグメントおよびCκ遺伝子を含む800 kbのヒトκ遺伝子座も含む。これらのマウスにおいて生成される抗体は、遺伝子再配列、アセンブリおよびレパートリーを含むあらゆる点でヒトにおいて見とめられるものに酷似している。マウス遺伝子座における遺伝子再配列を抑制する内因性JHセグメントにおける欠失により、ヒト抗体が内因性抗体よりも優先的に発現される。
【００５０】
あるいはまた、ファージ提示技術(McCaffertyら, Nature 348, 552-553 (1990))を使用して、非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体フラグメントをin vitroで生成できる。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、M13またはfd等の繊維状バクテリオファージの主要または主要でない(minor)コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体フラグメントとして提示される。繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むために、抗体の機能特性に基づく選択により、同じくそれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。従って、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージ提示は、様々な形式で実施できる；これらの概要については、例えば、Johnson, Kevin S.およびChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの由来源をファージ提示のために使用できる。Clacksonら, Nature 352, 624-628 (1991)は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダム組合せライブラリーから、様々なアレイの抗オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーを構築し、様々なアレイの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)、またはGriffithら, EMBO J. 12, 725-734 (1993)により記載される技術に本質的に従って単離できる。自然の免疫反応では、抗体遺伝子は、高い率で突然変異を蓄積する(体細胞超変異)。導入される変化の一部は、高い親和性を授与し、高親和性表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞は、その後の抗原感作の間に優先的に複製および分化される。この自然のプロセスは、「鎖シャッフリング(chain shuffling)」として知られる技術(Marksら Bio/Technol. 10, 779-783 [1992])を採用することにより、模倣できる。この方法では、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を非免疫化ドナーから得たＶドメイン遺伝子の天然型変異体のレパートリー(レパートリー)に順次置き換えることにより、ファージ提示により得られる「一次」ヒト抗体の親和性を改善できる。この技術により、nM範囲内に親和性を有する抗体および抗体フラグメントが生成される。非常に大きいファージ抗体レパートリーを作製する戦略は、Waterhouseら, Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)に記載されている。
【００５１】
モノクローナル抗体の生成に関する更なる情報については、Goding, J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 第３版, Academic Press, Inc., London, San Diego, 1996；LiddellおよびWeeks：Antibody Technology: A Comprehensive Overview, Bios Scientific Publishers: Oxford, UK, 1995；BreitlingおよびDubel: Recombinant Antibodies, John Wiley and Sons, New York, 1999；ならびにPhage Display: A Laboratory Manual, Barbasら編, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2001も参照のこと。
【００５２】
抗体フラグメントの作製のために、様々な技術が開発されている。従来、これらのフラグメントは無傷抗体のタンパク質分解性消化を介して誘導される(例えば、Morimotoら, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)、およびBrennanら, Science 229:81 (1985)を参照のこと)。しかし、本発明により、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞により直接生成できる。例えば、Fab'-SHフラグメントを、大腸菌から直接回収し、化学的に共役させてF(ab')2フラグメントを形成させる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167 (1992))。別の実施形態では、ロイシンジッパーGCN4を使用してF(ab')2を形成して、F(ab')2分子のアセンブリを促す。別のアプローチによれば、Fv、FabまたはF(ab')2フラグメントが、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの生成のためのその他の技術は、当業者に明らかであろう。
【００５３】
２つの共有結合した抗体からなるヘテロ共役(heteroconjugate)抗体も、本発明の範囲内にある。このような抗体は、例えば、免疫系細胞に望ましくない細胞を標的させること(米国特許第4,676,980号)、およびHIV感染を治療すること(PCT出願公報WO 91/00360および同WO 92/200373)が示唆されてきた。ヘテロ共役抗体は、周知の市販の架橋剤を使用して、任意の都合のよい架橋法を使用して作製され得る。
【００５４】
げっ歯類、ヒトまたはヒト化に関わらず、本発明の抗体は、更なる抗原特異性を有して二重抗体を形成し得る。第２の結合特異性は、例えば、更なるＢ細胞抗原(CD19、CD20、CD52およびＢ細胞上で発現されるその他のCD抗原等)、特に標的化Ｂ細胞悪性腫瘍に付随する抗原を標的とし得る。例えば、CD20は、90％を上回る非ホジキンリンパ腫において発現されることが知られている。抗CD20抗体(Rituxan(登録商標), IDEC Pharmaceuticals)は、非ホジキンリンパ腫を治療するために臨床的に使用されている。CAMPATH-1H(抗CD52w)は、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するために開発された別の抗体である。CD20またはCD52抗原に対する結合特異性を含む二重特異性抗体が、特に、本明細書の範囲内に含まれる。本発明の二重特異性抗体が結合できる別のＢ細胞抗原は、非ホジキンリンパ腫の公知マーカーであるHLA-DR10(Lym-1)である。二重特異性抗体は、腫瘍局所化を増強するため、ならびに腫瘍特異的免疫反応を強化および/または増強するために生成され得る。その他の抗原標的の例としては、CD3、CD28およびFc受容体(CD16、CD64およびCD89)が挙げられる。二重特異性抗体は、細胞毒性を増強し、その結果、緩和速度および生存率を改善すると予想される。
【００５５】
HB22-7、HB22-23、HB22-33、HB22-5、BH22-13および/またはHB22-196と本質的に同じエピトープに結合する抗体は、エピトープマッピングにより同定され得る。２つの異なる抗体が同じエピトープを認識するか否かを判断する最も簡単な方法は、競合結合アッセイである。この方法は、抗体が、互いの抗原への結合を妨害できるかを判断し、立体配座エピトープおよび線状エピトープの両方に有効である。競合結合アッセイは、標識化抗原または標識化抗体のいずれかを使用して、多数の異なる形式で構成され得る。このアッセイの最も一般的なバージョンでは、抗原が、96ウェルプレート上に固定化される。次いで、標識化抗体が抗原に結合するのをブロックする非標識化抗体の能力を、放射活性または酵素標識を使用して測定する。更なる詳細については、例えば、 Wagenerら, J. Immunol., 130:2308-2315 (1983)；Wagenerら, J. Immunol. Methods, 68:269-274 (1984)；Kurokiら, Cancer Res. 50:4872-4879 (1990)；Kurokiら, Immunol. Invest. 21:523-538 (1992)；Kurokiら, Hybridoma 11:391-407 (1992)、およびUsing Antibodies：A Laboratory Manual, Ed HarlowおよびDavid Lane編, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, New York, 1999, pp. 386-389を参照のこと。
【００５６】
あるいはまた、またはさらに、エピトープマッピングは、ランダムなまたは特定の遺伝子構築のいずれかによる抗体が結合する抗原の断片化に基づく技術を使用し、抗体から得られる断片の反応性を決定することにより、実施できる。断片化は、例えばPCR技術、その後の放射活性アミノ酸の存在下におけるin vitroでのタンパク質に転写および翻訳により、核酸レベルで実施してもよい。更なる詳細については、例えば、HarlowおよびLane(前掲、pp.390-392)を参照のこと。
【００５７】
エピトープマッピングの別の方法によれば、タンパク質抗原の小さい線状セグメントにそれぞれ対応する重複ペプチドのセットを合成し、固相上にアレイ化させる。次いで、ペプチドのパネルを、テスト抗体でプロービングし、酵素標識化二次抗体を使用して結合した抗体を検出する。(HarlowおよびLane、前掲、pp.393-396)。
【００５８】
エピトープマッピングの分野で周知の更なる方法は、ランダムな合成またはファージ提示ペプチドライブラリーからの抗体選択である。ファージ提示ライブラリーは、ペプチドコードオリゴヌクレオチドの複合混合物を、f1型ssDNAファージの主要でないコートタンパク質遺伝子のアミノ末端に入れてクローニングすることにより構築する。このようなファージ提示ライブラリーは、例えば、New England Biolabsから市販されている。ライブラリーをストックとして増幅させ、個々のクローンの複数コピーを代表するのに十分なアリコートを、目的の抗体と混合させる。抗体結合ファージを、「バイオパンニング(biopanning)」と呼ばれる手順により回収し、結合しなかったファージを除去する。結合したファージを溶出し、細菌を感染させるために使用し、選択したストックを増幅させる。最終的に選択したストックの個々のプラークを成長させ、例えばELISAにより特定の抗体反応性についてチェックし、挿入部位周囲のDNAを配列決定する。抗体が結合するペプチドをコードする配列の分析により、抗体の特異性が定義される。更なる詳細については、例えば、SmithおよびScott, Methods Enzymol. 217:228-257 (1993)、ならびにHarlowおよびLane(前掲), pp. 397-398を参照のこと。
【００５９】
非ヒト(げっ歯類)抗体をさらに改変して、ヒト臨床用途により適するようにできる。キメラ抗体を、ヒト定常ドメイン遺伝子セグメントにスプライシングした所望の特異性を有するマウス可変領域遺伝子セグメントで作製する(例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)。
【００６０】
抗体をヒト療法に使用する場合の抗原性の問題を回避するために、非ヒト(げっ歯類)抗体をヒト化してもよい。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト由来源に由来する１つ以上のアミノ酸残基を挿入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基とよく呼ばれ、典型的に「インポート」可変ドメインから得られる。ヒト化は、Winterおよび共同研究者ら(Jonesら, Nature 321:522-525(1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、ヒト抗体の対応する配列を、げっ歯類CDRまたはCDR配列に置き換えることにより、本質的に実施され得る。抗体ヒト化の比較的単純な性質にも関わらず、げっ歯類CDRをヒトフレームワーク(FR)へ単純に移植することにより、元のげっ歯類モノクローナル抗体の結合親和性および特異性が必ず再構成されるとは限らない。ヒト化抗体の特性は、例えば、ヒトフレームワークに入れたげっ歯類抗体由来の残基を置換させること(逆突然変異)を含む適切な設計により改善できる。このような逆突然変異の位置は、配列および構造分析、または可変領域の三次元モデルの分析により決定され得る。さらに、ファージ提示ライブラリーを使用して、抗体配列内の選択した位置のアミノ酸を変化させることができる。ヒト化抗体の性質は、ヒトフレームワークの選択によっても影響を受け得る。初期実験では、げっ歯類モノクローナル抗体に対する配列同一性とは無関係に、よく特徴決定されたヒトモノクローナル抗体の限定されたサブセットを使用した(いわゆる固定フレームワークアプローチ)。さらに最近では、一部のグループが、げっ歯類可変領域に対して高いアミノ酸配列同一性を有する可変領域を使用している(相同性マッチングまたはベストフィット(best-fit)法)。別のアプローチによれば、コンセンサスまたは生殖細胞配列を使用するか、または各軽鎖もしくは重鎖可変領域中のフレームワーク配列の断片をいくつかの異なるヒトモノクローナル抗体から選択する。
【００６１】
上記議論した技術のいずれかにより調製したかまたは入手した抗体のアミノ酸変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗CD22-DNAに導入するか、例えばペプチド合成により調製され得る。アミノ酸変化により、グリコシル化部位の数または位置の変化等、ヒト化または変異型抗CD22抗体の翻訳後プロセシングも変化し得る。
【００６２】
抗体は、定常領域内の保存された位置においてグリコシル化される(JefferisおよびLund, Chem, Immunol.65:111-128 (1997)；WrightおよびMorrison, TibTECH 15:26-32 (1997))。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能(Boydら, Mol. Immunol. 32:1311-1318 (1996)；WittweおよびHoward, Biochem. 29:4175-4180 (1990))、ならびに立体構造に影響を及ぼし得る糖タンパク質の部分と糖タンパク質の提示される(presented)三次元表面との分子内相互作用(JefferisおよびLund, 前掲；WyssおよびWagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416 (1996))に影響を及ぼす。オリゴ糖類はまた、特定の認識構造に基づいて、所与の糖タンパク質に特定の分子を標的とするようにも作用し得る。例えば、ガラクトシル化IgGでは、オリゴ糖部分がCH2内スペース(inter-CH2 space)から「フリップ(flip)」し、末端Ｎアセチルグルコサミン残基がマンノース結合タンパク質に結合可能になることが報告されている(Malhotraら, Nature Med. 1:237-243 (1995))。グリコペプチダーゼによる、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で生成されるCAMPATH-1H(ヒトリンパ球のCDw52抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルIgG1抗体)からのオリゴ糖の除去により、補体仲介型溶解(CMCL)の完全な減少が生じ(Boydら, Mol. Immunol. 32:1311-1318 (1996))、ノイラミニターゼを使用したシアル酸の選択的な除去ではCMCLは無くならなかった。抗体のグリコシル化が、抗体依存型細胞毒性(ADCC)に影響を及ぼすことも報告されている。特に、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)のテトラサイクリンで調節された発現、両断GIcNAcのグリコシルトランスフェラーゼ触媒形成を有するCHO細胞は、ADCC活性を改善したことが報告されている(Umanaら, Mature Biotech. 17:176-180 (1999))。
【００６３】
抗体のグリコシル化変異体は、基礎を成すヌクレオチド配列中のグリコシル化部位を改変することにより調製され得る。さらに、抗体のグリコシル化は、基礎を成すヌクレオチド配列を変えることなく変えることもできる。グリコシル化は、抗体を発現させるために使用する宿主細胞に大きく依存する。可能性のある治療薬として組換え糖タンパク質(例えば、抗体)の発現のために使用する細胞型は、滅多に天然型細胞であることはないため、抗体のグリコシル化パターンの有意な変化が予想される(例えば、Hseら, J. Biol. Chem. 272:9062-9070 (1997)を参照のこと)。選択した宿主細胞に加えて、抗体の組換え生成の間のグリコシル化に影響を及ぼす因子としては、成長モード、培地の処方、培養密度、酸化、pH、精製スキーム等が挙げられる。オリゴ糖生成に関与する特定の酵素を導入または過剰発現させることを含めて、特定の宿主生物中で得られるグリコシル化パターンを変えるための様々な方法が提案されている(米国特許第5,047,335号；同第5,510,261号；および同第5,278,299号)。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化を、例えば、エンドグリコシダーゼＨ(Endo H)を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、遺伝子操作(例えば、特定の種類の多糖類をプロセシング不可能に)され得る。上記および同様の技術は当該分野で周知である。
【００６４】
本発明の抗体は、抗体指令型酵素プロドラッグ療法(ADEPT)によっても使用され得る。ADEPTは、腫瘍抗原を標的とするモノクローナル抗体の特異性を利用して、触媒酵素に、癌細胞の表面を標的化させる技術である。ここで、酵素は、プロドラッグ形態の抗癌薬(例えば、ペプチジル化学療法薬、WO81/01145を参照)を活性化させて、完全活性形態にする役目を果たす。例えば、WO 88/07378および米国特許第4,975,278号を参照のこと。
【００６５】
本発明の方法において有用な酵素としては、リン酸含有プロドラッグを遊離型薬物(free drugs)に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸含有プロドラッグを遊離型薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性5-フルオロシトシンを抗癌薬である5-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離型薬物に変換するのに有用な、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン(カテプシンＢおよびＬ等)等のプロテアーゼ；D-アミノ酸置換基を含むプロドラッグを遊離型薬物に変換するのに有用なD-アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離型薬物に変換するのに有用な、β-ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ等の炭水化物切断酵素；β-ラクタムで誘導体化された薬剤を遊離型薬物に変換するのに有用なβ-ラクタマーゼ；ならびにアミン窒素においてフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基でそれぞれ誘導体化された薬剤を遊離型薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ等のペニシリンアミダーゼ、が挙げられるがこれらに限定されない。あるいはまた、当該分野において「アブザイム」としても知られる酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離型活性薬剤に変換できる(例えば、Massey, Nature 328:457-458 (1987)を参照のこと)。本明細書に記載するように、抗体-アブザイムコンジュゲートを調製して、アブザイムを腫瘍細胞集合に送達できる。
【００６６】
本明細書に記載する抗体の免疫コンジュゲートも、本発明によりはっきりと包含される。免疫コンジュゲートは、化学療法剤、毒素またはラジオアイソトープ等の細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む。
【００６７】
具体的には、細胞毒性ラジオアイソトープにコンジュゲートさせて、放射線療法に標的部位を特異的に標的化させること(放射免疫治療)で、本発明の抗CD22抗体の効力を更に増強させることができる。適切なラジオアイソトープとしては、例えば、I131およびY90(両方とも臨床的な実践で使用されている)が挙げられる。その他の適切なラジオアイソトープとしては、In111、Cu67、I131、As211、Bi212、Bi213およびRe186が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
免疫コンジュゲートの生成において有用な化学療法剤としては、例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン(cytoxin)、タキソイド、例えば、パクリタキセル(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、およびドキセタキセル(Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rnace)、トキソテル(toxoter)、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド(ifosfamide)、マイトマイシンＣ、ミトザントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン(vinorelbine)、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン(carminomycin)、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(esperamicin)(米国特許第4,675,187号を参照)、5-FU、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、VP-16、クロラムブシル、メルファラン、およびその他の関連するナイトロジェン・マスタードが挙げられる。
【００６９】
本明細書の免疫コンジュゲートに使用される毒素としては、例えば、ジフテリアＡ鎖、外毒素、リシンＡ鎖、イノマイシン(enomycin)、およびトリコテセン(tricothecene)が挙げられる。特に、抗体-メイタンシノイド(maytansinoid)、および抗体-カリケマイシン(calichemicin)コンジュゲートが挙げられる。メイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートは、例えば、米国特許第5,208,020号、同第5,416,020号、および欧州特許EP 0 425 235号に開示されている。Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)も参照のこと。抗体-カリケマイシンコンジュゲートは、例えば、米国特許第5,712,374号；同第5,714,586号；同第5,739,116号；同第5,767,285号；同第5,770,701号；同第5,770,710号；同第5,773,001号；および同第5,877,296号に開示されている。
【００７０】
抗体と細胞毒性薬とのコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオン酸塩(SPDP)、イミノチオレン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(アジピン酸ジメチルHCl等)、活性エステル(スベリン酸ジスクシンイミジル(disuccinimidyl suberate))、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアナート(トルエン(tolyene)2,6-ジイソシアネート等)、およびビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等)等の様々な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素を、Vitettaら, Science, 238:1098 (1987)に記載されるように調製できる。炭素-14-標識化1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドと抗体とをコンジュゲートさせるためのキレート剤の一例である。WO94/11026を参照のこと。
【００７１】
抗CD22抗体の共有結合修飾も本発明の範囲内にある。これらは、適切であれば、化学合成、または抗体の酵素的もしくは化学的切断により実施され得る。抗体の他の種類の共有結合修飾は、抗体の標的化アミノ酸残基と、選択された側鎖またはＮ-もしくはＣ-末端残基と反応可能な有機誘導体化剤とを反応させることにより、分子に導入される。抗体の好ましい種類の共有結合修飾は、当該分野で周知の手法により、抗体を、様々な非タンパク質性高分子(例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン)のひとつと連結させることを含む。
【００７２】
２．医薬製剤および治療方法
Ｂ細胞型非ホジキンリンパ腫とは、悪性(癌性)Ｂ細胞リンパ球を原因とする大きいグループ(29を超える種類)のリンパ腫を含む用語であり、知られている種類のリンパ腫の大きなサブセットを占める。Ｂ細胞は、そのライフサイクルにおいて、複雑な細胞内シグナリングプロセスに応じて多くの変化を経ることが知られており、Ｂ細胞のライフサイクルの異なる段階において異なる種類のＢ細胞悪性腫瘍が生じ得ることがはっきりとしている。幹細胞段階では、急性リンパ球性白血病(ALL)またはリンパ芽球性リンパ腫/白血病が典型的に発達し得る。前駆Ｂ細胞は、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫/白血病を発達し得る。未熟Ｂ細胞の典型的な悪性腫瘍としては、非核切れ込み小細胞リンパ腫、および場合によりバーキット/非バーキットリンパ腫が挙げられる。抗原暴露前のＢ細胞は、典型的に、慢性リンパ球性白血病(CLL)または小リンパ球性リンパ腫を発達し、抗原暴露後は、典型的に、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫および免疫芽球性リンパ腫が見とめられる。侵攻性(成長が速い)および無痛性(indolent)(成長の遅い)リンパ腫を区別して、成長率によりＢ細胞リンパ腫を特徴付ける分類系もある。例えば、バーキット/非バーキットリンパ腫およびLCLリンパ腫は侵攻性グループに属し、無痛性リンパ腫としては、濾胞中心細胞リンパ腫(FCCL)、濾胞大細胞リンパ腫、および濾胞性核切れ込み小細胞リンパ腫が挙げられる。
【００７３】
非ホジキンリンパ腫も、発達段階により特徴付けられる。段階Ｉ：１つのリンパ節領域でのみ、またはリンパ節外の１つの領域もしくは器官のみで癌が見とめられる。ステージII：(１)横隔膜(呼吸を助ける肺下にある薄い筋肉)の同じ側にある２つ以上のリンパ節領域で癌が見とめられるか、または(２)リンパ節外の１つの領域もしくは器官およびその周辺のリンパ節においてのみ癌が見とめられるか、または(３)横隔膜の同じ側にある他のリンパ節領域も癌にかかっているかもしれない。段階III：横隔膜の両側のリンパ節領域において癌が見とめられる。リンパ節領域付近の領域もしくは器官、および/または脾臓に広がっているかもしれない。段階IV：(１)リンパ系の外にある１つ以上の器官に広がっている；これらの器官付近のリンパ節において癌細胞が見とめられても見とめられなくてもよいか、または(２)リンパ系の外の１つの器官にのみ癌が広がるが、その器官から遠く離れているリンパ節が関与している。
【００７４】
非ホジキンリンパ腫を含むＢ細胞悪性腫瘍の現行の治療オプションは、悪性腫瘍の種類および段階に依存する。典型的な治療計画としては、放射線療法(外部ビーム療法とも呼ばれる)、化学療法、免疫療法、およびこれらのアプローチの併用が挙げられる。有望なアプローチの１つは放射免疫療法(RIT)である。外部ビーム療法によれば、身体の限られた領域が照射される。化学療法では、治療は全身性であり、正常細胞に有害な影響を及ぼし、重度な毒性副作用を生じることが多い。標的化RITは、Ｂ細胞特異的抗体が、腫瘍の部位に毒性物質を送達するアプローチである。Ｂ細胞NHLを患う患者におけるRITの治療能力は、CD20、CD19、CD22およびHLA-DR10(Lym-1)を含む異なる標的を使用して示されてきた。より最近では、併用療法(CMT)が、固型腫瘍の治療のための技術として頻度が高まっており、薬剤による癌細胞の放射線感受性増強(radiosensitization)、および化学療法の直接的な細胞毒性影響を含む。NHLを治療するための最も一般的な化学療法計画は、シクロホスファミド-ヒドロキシドキソルビシン-オンコビン(ビンクリスチン)-プレドニゾン(CHOP)併用療法である。侵攻性であるが初期のNHLのランダムな調査では、CHOP単独での治療と比べて、CHOPおよび区域照射で優れた結果が示された。その有望性に関わらず、外部ビーム照射が関与する治療の欠点は、NHLがほとんど場合に広く広がっているのに対して、外部ビーム照射が、身体の限られた領域にしか高い線量で送達されないことである。従って、CMTは、局所的に進行した悪性腫瘍に対して臨床的に有用であることが分かっている。
【００７５】
別の現行アプローチは、NHLに対する全身照射の特定の送達(例えば、90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1)を、追加の化学療法剤による全身照射感受性増強効果と組み合わせた併用放射免疫療法(CMRIT)である。CMRITでは、照射が連続的に送達されるため、低酸素な癌細胞は、治療の過程において、再度酸素を取り込むか、細胞サイクルの放射感受性G2/m期を経て、治癒の可能性をより高くし得る。さらに、CMRITは、第１にLym-1によるNHLの特異的標的化により、第２にタイミングにより特異性を提供する。これにより、増感剤が、RITにより標的化される部位においてのみ潜在的に相乗効果を与えて、従って、効力を最大化し、かつ毒性を最小化する。これまでのいくつかの異種移植研究から、RITの後に放射線合成機(Taxol)に24〜48時間かけることで、相乗効果が改善したことが実証されている。
【００７６】
CMRITは、NHLの治療のための最も有利な治療アプローチであると現在考えられているが、本発明の抗体は、単独で、よく許容されているRajiおよびRamosリンパ腫異種移植モデルにおいてテストした場合、腫瘍容量減少、治癒率および全体的な生存率の点において優れた結果を生じることが実証されている。
【００７７】
本明細書に記載する抗CD22抗体は、典型的に、全ての薬剤師に周知の医薬製剤の形態で投与される。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, (第15版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1975))、特に、Blaug, Seymourによる第87章を参照のこと。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、無水吸収基質、水中油型または油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。典型的な投薬形態は、静脈内(i.v.)経路による投与に適した滅菌かつ等張性の水性溶液である。医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、幅広く(すなわち、重量が、約0.1％未満から、通常、少なくとも約2％〜最大20％〜50％以上であり)、選択した特定の投与モードに応じて、液量、粘性等により主に選択される。
【００７８】
本発明の組成物は、リポソームを介しても投与され得る。リポソームとしては、エマルジョン、発砲体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層(lamellar layer)等が挙げられる。これらの剤形では、送達する本発明の組成物は、リポソームの一部として、単独で、または所望の標的に結合する分子(抗体等)もしくはその他の治療的あるいは免疫原性組成物と共に取り込まれる。本明細書で使用するリポソームは、中性および負に荷電されたリン脂質ならびにステロール(コレステロール等)を一般的に含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般的に、例えば、血流中のリポソームの大きさ、酸不安定性、およびリポソームの安定性を考慮することにより導かれる。リポソームを調製するための様々な方法が利用可能であり、例えば、Szokaら Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)、米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、および同第5,019,369号に記載されている。
【００７９】
本発明の抗体は、単独で、または他の治療計画(化学療法、放射免疫療法(RIT)、化学療法および外部ビーム照射(併用療法、CMT)、併用放射免疫療法(CMRIT)、または単独のもしくは組合せられたサイトカイン等)と組み合わせられて投与され得る。従って、本発明の抗CD22抗体は、非ホジキンリンパ腫を治療するための最も一般的な化学療法計画であるCHOP(シクロホスファミド-ヒドロキシドキソルビシン-オンコビン(ビンクリスチン)-プレドニゾロン)と組み合わせられ得る。さらに、本明細書の抗CD22抗体は、抗CD19、抗CD20および他の抗CD22抗体を含む他の抗体(LymphoCideTM(Immunomedics, Inc.)またはLymphoCide Y-90等)と組み合わせて投与され得る。例えば、Steinら, Drugs of the Future 18:997-1004 (1993)；Behrら, Clinical Cancer Research 5:3304s-33314s, 1999(suppl.)；Juweidら, Cancer Res. 55:5899s-5907s, 1995；Behrら, Tumor Targeting 3:32-40 (1998)、および米国特許第6,183,744号、同第6,187,287号、および同第6,254,868号を参照のこと。
【００８０】
本発明により治療する患者は、悪性Ｂ細胞上でCD22を発現される。CD22抗原の存在は、免疫組織化学、FACS、標識化(例えば、放射標識化)抗-CD22抗体での結合アッセイ等の標準的な技術により確認できる。
【００８１】
好ましい投与経路は、一定の期間にわたるボーラスまたは持続点滴を介したものである(例えば、週に１度か２度の持続またはボーラス点滴)。別の好ましい経路は、皮下注射である。投薬量は、標的とするＢ細胞悪性腫瘍の性質、形態、および段階、患者の性別、年齢、状態、これまでの治療経歴、他に使用している抗癌治療(例えば、放射能、化学療法、免疫療法等が挙げられる)、ならびに当業者に典型的に考えられる他の要因に応じる。例えば、非ホジキンリンパ腫患者は、本明細書に記載の抗CD22抗体を、約50〜約1500 mg/m2/週、具体的には約100〜約1000mg/m2/週、より具体的には約150〜約500 mg/m2/週で受けられ得る。
【００８２】
患者は、抗CD22抗体を使用して、腫瘍退化(例えば、固型腫瘍の場合には腫瘍の大きさ)、循環Ｂ細胞の表現型、または生検組織の表現型をモニタリングする等、標準的な技術によりモニタリングされ得る。
【００８３】
本発明は、ヒト治療に言及して議論してきたが、本発明の抗体は、獣医学においても使用され得ることが理解されよう。例えば、ネコ悪性リンパ腫は、飼い猫に起こることが多く、ヒト非ホジキンリンパ腫と似た特徴を示す(Bertoneら, Am. J. Epidemiol. 156:268-73 (2002))。同様に、イヌは、様々なリンパ腫を発達することが知られている。従って、本明細書の抗体を使用して、ネコおよびイヌ悪性リンパ腫を治療できる。投薬量、および投与経路は、治療する動物種に応じ、それらの決定は十分に獣医の技術範囲内にある。
【００８４】
本発明の更なる詳細を、以下の限定しない実施例に記載する。
【００８５】
実施例
実施例で言及する市販の試薬は、特に示さない限り製造元の指示書に従って使用した。以下の実施例に開示する生成に加えて、モノクローナル抗体HB22-7(ATCC受託番号HB11349)を作製するハイブリドーマは、American Type Culture Collection, Rockville, MDから得ることができる。
【００８６】
実施例１
抗CD22モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体(mAb)、HB22-7(IgG2b)、HB22-23(IgG2a)、HB22-33(IgM)、HB22-5(IgG2a)、HB22-13(IgG2a)、HB22-22(IgA)、およびHB22-196を、Engelら, J Immunol 15:4710 (1993)、および米国特許第5,484,892号の方法に従って作製した。Tuscanoら, Blood 94:1382-1392 (1999)も参照のこと。しかし、他の方法を使用してもよい。簡単に言うと、HB22 mAbを、完全長CD22 cDNAで安定してトランスフェクトさせたマウス前Ｂ細胞系統300.19を免疫原として使用したハイブリドーマ技術により作製した。より具体的には、NS-1骨髄腫細胞と、完全長CD22cDNAで安定してトランスフェクトしたマウス前Ｂ細胞系300.19で３回免疫化したBalb/cマウス由来の脾臓細胞とを融合させて、CD22と反応する33のmAbを作製した。CD22cDNAでトランスフェクトされたマウスＬ細胞とは反応するが、非トランスフェクト細胞とは反応しないmAbを作製するハイブリドーマを、２回クローニングし、上清または腹水を生成するために使用した。マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定キット(Amersham, Arlington Heights, III)を使用して、mAbアイソタイプを決定した。Affi-GelプロテインA MAPS IIキット(Bio-Rad, Richmond, Calif.)を使用してIgGmAbを精製した。腹水のオイグロブリン分画を含むHB22-33 mAb(IgM)を、蒸留水に対する大々的な透析により沈降させ、SDS-PAGE分析により本質的に純粋なmAbであることが示された。米国特許第5,484,892号の表IIに開示するように、mAbであるHB22-7、HB22-22、HB22-23およびHB22-33は、Daudi、RajiおよびJurkat細胞とCD22トランスフェクトCOS細胞との結合を完全にブロックした(80〜100％)。mAbであるHB22-5、HB22-13、HB22-24、およびHB22-28は、付着を部分的にブロックした(20〜80％)。
【００８７】
リガンド結合を仲介するCD22上の領域を、「ワークショップ(Workshop)」CD22ブロッキングmAb、ならびにCD22上の５つの異なるエピトープ(エピトープＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ)を識別するmAbのパネルを使用したmAb交差阻害調査により特徴決定した(Schwartz-Albiezら, "The carbohydrate moiety of the CD22 antigen can be modulated by inhibitors of the glycosylation pathway")。ワークショップmAbの結合特異性は、図３に図示している。Leukocyte Typing IVに掲載のWhite Cell Differentiation Antigens, Knappら編, Oxford University Press, Oxford, p. 65 (1989)。本明細書のモノクローナル抗体のうちの３つ、HB22-7、HB22-22およびHB22-23が、CD22上の非常に近いまたは同じエピトープに結合することが分かった。これらおよびその他のブロッキング抗体のエピトープマッピングの結果は、Tedderら, Annu. Rev. Immunol. 15:481-504 (1997)に開示されている。治療として提案されている他の抗CD22抗体とは異なり、本発明のブロッキング抗体は、hCD22アミノ酸配列の最初の２つのIg様ドメイン内のエピトープに結合する。
【００８８】
実施例２
RajiおよびRamosリンパ腫異種移植治験
本実施例は、個々のRajiおよびRamosリンパ腫異種移植治験から得た結果を説明する。ヌードマウス異種移植片は、前臨床評価のための重要なツールである。リンパ腫細胞系であるRajiおよびRamosを利用した、ヒト非ホジキンリンパ腫(NHL)異種移植片を担持するヌードマウスは、NHLの治療の効力を評価するのに有益であることが分かっている。(Buchsbaumら, Cancer Res. 52(23):6476-6481 (1992)、およびFlavellら, Cancer Res. 57:4824-4829 (1997))
材料および方法
試薬．キャリアを含まない90Y(Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA)および111In(Nordion, Kanata, Ontario, Canada)を、希釈HCl中の塩化物として購入した。Lym-1(Tecniclone, Inc Tustin, CA)は、ヒトバーキットリンパ腫細胞核で免疫化されたマウスにおいて生成されるIgG2a mAbである。Lym-1は、悪性腫瘍Ｂ細胞上の細胞表面31-35 kD抗原を認識し、80％を上回るヒトＢ細胞NHLと反応する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、95％を上回る純度の単量体IgGを必要とする事項(specifications)に従って、Lym-1純度を評価した。先に記載されているように(O'Donnellら, Cancer. Biother. Radiopharm. 13:251-361 (1998))、90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1を調製した。HPLC、TLCおよび酢酸セルロース電気泳動による評価により、凝集内容物が５％未満で放射化学的純度が98％の90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1が調製されたことが明らかになった。
【００８９】
先に記載されているように(Tuscanoら, Blood 94:1382-1392 (1999))、プロテインAセファロースFast Flowカラム(Pharmacia)を使用して、抗CD22 mAb、HB22-7を調製した。HB22-7純度は、HPLCおよびフローサイトメトリーで測定し、純度が＞95％であることが分かった。生理学的性質を、アポトーシス誘導のフローサイトメトリー利用型分析(Apo-Tag, Pharmacia)により決定し、先に公開されている結果(Tuscanoら、前掲)と一致することが分かった。ActiClean ETOXカラム(Sterogene)を使用して内毒素除去を達成し、最終的に測定された内毒素レベルは＜0.15内毒素ユニット(EU)/mg mAb(Bio Whitaker)であった。Lym-1およびHB22-7 mAbは、マウス、ウイルス、マイコプラズマ、真菌および細菌汚染、ならびに内毒素、発熱物質およびDNA内容物、ならびに動物における全般的に安全なテストについて、MAP(マウス抗体生成)ガイドラインと合致した。
【００９０】
細胞系およびスキャッチャード分析．American Type Culture Collection (ATCC, Gathersberg, MD)から、RajiおよびRamosバーキットリンパ腫細胞系を購入した。両方の細胞系を、先に記載されているように(Tuscanoら、前掲)、HB22-7 mAbを利用したフローサイトメリー法により、CD22発現について染色した。細胞系は、10％ウシ胎仔血清を0.5×106細胞/mlで補充したRPMI 1640中に維持させた。RajiおよびRamos細胞を使用したスキャッチャード分析は、先に記載されるように実施した(Scatchard, G., Ann. of NY Acad Sci. 51:660 (1947))。簡単に言うと、HB22-7を、クロラミンＴ方法により125Iで標識化した(比活性は1.1μCi/μg)。順次希釈した非標識化HB22-7を利用して、競合結合アッセイを実施した。
【００９１】
マウス調査．７〜９週齢のメス胸腺欠損BALB/c nu/nuマウス(Harlan Sprague-Dawley)を、University of California, Davis動物ケアガイドラインに従い、通常食餌を自由に与え、病原体の無い条件下で維持させた。１つのケージにつき５匹のマウスをハウジングした。対数増殖期にRajiまたはRamos細胞を収穫した；2.5〜5.0×106細胞を、各マウスの腹部の両側に皮下注射した。腫瘍が28〜328 mm3になった移植の３週間後に調査を開始した。グループは、未処置、125μCiのRITのみ、1.4 mgのHB22-7のみ、またはRITおよびHB22-の組合せ(HB22-7を、RITの24時間前、RITと同時、もしくはRITの24時間後に投与)で構成した。周囲照射を最小限にするために、90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1での処置の後、１週間は毎日、その後は週に２回、床(bedding)を変えた。
【００９２】
抗腫瘍(tumoricidal)効果．半楕円体(hemiellipsoids)の公式(DeNardoら, Clin. Cancer Res. 3:71-79 (1997))に記載されるように、腫瘍容積を計算した。最初の腫瘍容積は、処置前日の容積と規定した。各グループについて、測定日に毎回、平均腫瘍容積を計算した；完全に退化した腫瘍は容量が０であるとした。腫瘍反応は以下のように分類した：Ｃ、治癒(腫瘍が消え、84日間の調査の終了時に再成長しなかった)；ＣＲ、完全退化(腫瘍は少なくとも７日間消えたが、その後再成長した)；ＰＲ、部分的退化(腫瘍容積が少なくとも７日間50％以上減少したが、その後再成長した)。
【００９３】
統計的分析．Kruskall Walis順位和テストを使用し、反応を「無し」、「PR」、[CR]および「治癒」として順位付けて、処置グループ間の反応の差を評価した。Kruskall Walisテストを使用して生存時間も評価した。腫瘍容積は、３つの時点で比較した：すなわち、１月目(26〜9日目)；２月目(54〜57日目)；および調査終了時(84日目)。腫瘍に関連した原因により動物を屠殺した場合、最後の容量を繰り越して、その後の時点の分析において使用した。分散分析を使用して、処置グループ間の差をテストした。p値は、両側名目(nominal)p値を表す。統計的に有意に異なることが分かったグループのサブセット内においてのみテストすることにより、多重比較を防ぐ。
【００９４】
結果
スキャッチャード分析
スキャッチャード分析を利用して、HB22-7の結合親和性、およびRamosおよびRaji細胞上のCD22受容体の数をア評価した。最大結合％(Bmax)、解離定数(Ka)、および細胞あたりの結合抗体数について細胞をアッセイした。表１に示す結果は、２つの実験の平均である。
【表１】
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【００９５】
スキャッチャード分析(表１)は、Raji細胞対Ramos細胞についてそれぞれ、細胞あたりに結合したHB22-7抗体の数およびBmaxがほぼ2.5倍増加したことを示し、Kaが２倍増加したことを示した。
【００９６】
全身オートラジオグラフィー
HB22-7特異的腫瘍ターゲッティングを評価するために、111In-2IT-BAD-抗-CD22(HB22-7)を注射した腫瘍担持ヌードマウスの全身オートラジオグラフィーを実施した。先に記載されるように(DeNardoら, Cancer 3:71-79 (1997))、注射の48時間後、マウスを屠殺し、切断し、オートラジオグラフィーにかけた(図２)。オートラジオグラフィーにより、Raji腫瘍化マウスにおける集中的な腫瘍局所化、およびRamos腫瘍化マウスにおける中度の局所化が明らかになった。このターゲッティング調査は、Rajiと比較して、Ramos細胞に対するHB22-7の結合がより少ないことを示したスキャッチャード分析と一致する。しかし、Ramos腫瘍の迅速な成長、および中心壊死と思われるものも、Ramosのターゲッティングが明らかに劣ることの原因であり得る。
【００９７】
RITおよびCMRITの効力
初期治験(081500)では、125μCiの90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1を単独で、またはHB22-7(1.4 mg)との組合せで、RITの24時間前、RITと同時、またはRITの24時間後に添加して利用した(図３)。本治験では、RITのみで処置したグループ(９匹のマウス)以外は、１グループにつき５匹のマウス、および５匹の未処置対照とした(マウスの頭数は表２に示す)。
【表２】
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【００９８】
90Y-2IT-BAD-Lym-1での同様のRaji異種移植調査から予測されるように、RITのみの場合は、21日目までに最大平均腫瘍容積減少が生じ、その後腫瘍容積が増加した。90Y-2IT-BAD-Lym-1(RIT)およびHB22-7(CMRIT)で処置した異種移植片は、より大きくより持続した平均腫瘍容積減少を示し、これは、HB22-7がRITと同時に、およびRITの24時間後に投与された場合に最大であった。驚くべきことに、単独で投与されたHB22-7は、２〜３週間目に平均腫瘍容積の安定化を生じ、その後緩やかで持続した腫瘍容積減少を生じた。
【００９９】
いくつかの追加の複製治験を実施し、高度に再現可能な結果を得た(表２)。全ての治験から得たデータを編纂し、画像的に比較した場合、最初の調査と大きく一致した結果を示した(図４)。初期腫瘍容積減少は、同じく、RITと同時にまたはRITの24時間後にHB22-7が投与された場合に21日目ごろに最大であった。HB22-7のみで処置したマウスでも、処置の２週間後に始まる腫瘍成長の安定化、その後の緩やかな持続性の腫瘍容積減少が、全ての後続治験において繰り返された。分散分析を使用して、30日目の処置グループを全て検査した場合、差が非常に有意であった(p<0.001)。60日目の全ての処置グループの容積減少の分析では、有意な差は見とめられなかったが(p=0.39)、84日目における差異は同じく有意であった(p=0.0003)。画像的に見とめられた結果は、RIT/CMRITグループにおける容積減少の差が高度に再現可能であること、ならびにHB22-7単独の場合および未処置対照の場合と異なることは示したが、RITのみの処置グループ(CMRITを含む)の場合との全ての評価時点(30、60および84日目)における容積減少の比較では、有意な差は示さなかった(p＞0.5)。追加のCMRIT治験を、HB22-7をRITの48時間後および72時間後に投与して実施した。RITとHB22-7との投与の間隔が開いても、HB22-7がRITと同時およびRITの24時間後に投与された治験と比べて、腫瘍容積減少は改善されなかった(データは図示せず)。
【０１００】
反応および治癒率は、腫瘍容積に対する治療効果と一致していた(図５)。90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1のみでの処置では、48％PR、13％CR、および13％の治癒率が得られた。CMRITグループでは、全体的な反応速度は、HB22-7およびRITが同時に投与された場合に最大となり、45％PR、15％CRおよび25％の治癒が得られた。しかし、CMRITグループにおいては、RITの24時間後にHB22-7が投与された場合に治癒率が最大(39％)であり、これは、未処置の場合(29％)、RITのみの場合(13％)、24時間前の場合(10％)、および同時の場合(25％)の処置グループにおいて見とめられた治癒率に有利に匹敵した。Kruskal Walisテストを使用して、全ての処置グループにおいて(治癒はCRよりも上位、CRはPRよりも上位として順位付けして)反応の程度を検査した場合、差異は統計的に有意であった(p=0.01)。未処置対照に対する個々の比較は、RITのみの場合(p=0.06)およびRITの24時間前にHB22-7を投与する場合(p=0.16)以外は、全て統計的に有意であった(p<0.05)。積極的処置グループ(RITのみ、CMRIT、およびHB22-7)のみを比較した場合には有意な差は無かったが(p=0.18)、同時および24時間後にHB22-7で処置したCMRITグループは、最良な観察反応パターンを有していた。興味深いことに、HB22-7のみで処置したグループは、最も高い治癒率を有し(47％)、これは、未処置対照と比べて有意な改善である(p<0.05)。
【０１０１】
腫瘍容積退化および治癒率は、同様パターンの生存率に反映された。84日間の調査期間の終了時には、38および42％の未処置およびRITのみのグループがそれぞれ生存していた(図６)。CMRIT処置グループでは、HB22-7が、RITと同時にまたはRITの24時間後に投与された場合にそれぞれ、生存率が67および50％に上昇した。Kruskal Walisを使用した生存率分析は、全てのグループの比較について有意であった(p<0.05)。反応速度分析と同様に、RITグループにおける生存率の比較は、有意な差(p=0.41)を明らかにしただけではなく、RITと同時またはRITの24時間後にHB22-7を投与した場合に一貫して見とめられるこれらのグループにおける最良の生存率を明らかにした。
【０１０２】
最良の全体生存率である76％は、HB22-7のみで処置したグループにおいて見とめられ、未処置対照と比較した場合に有意な差があった(p=0.02)。
【０１０３】
毒性
血球数およびマウス体重によりそれぞれ、血液および非血液毒性を評価した(図７ａ〜ｃ)。RIT処置グループにおけるWBCおよび血小板の底値はそれぞれ、14〜20および10〜14日目であった。WBCおよび血小板復帰はそれぞれ、処置後28および21日後であった。WBCおよび血小板の底値は、150μCiの90Y-2IT-BAD-Lym-1を利用した先の調査における観察と一致していた。RITの血液毒性は、HB22-7の同時投与により変化しなかった。HB22-7のみで処置したマウスにおいては、血液毒性は検出されなかった。全ての処置グループにおける単核細胞計数の分析から、HB22-7がRIT仲介型単核細胞底値に対して影響がないことが明らかになった(データは図示せず)。非血液毒性はマウス体重の変化により評価し、全ての処置グループにおいて等しいことが分かった(図８)。いずれの処置グループにおいても毒性による死亡はなかった。
【０１０４】
90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1薬物動態学
HB22-7を有するかまたは持たないRaji腫瘍化マウスにおける90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1の血液および全身クリアランスは同様であった(図９)。血液生物学的T1/2αは、RITのみの場合には1.4時間であり、24時間前、同時および24時間後のグループの場合にはそれぞれ2.2、2.4および2.0時間であった。血液生物学的T1/2βは、RITのみのグループの場合には127時間であり、24時間前、同時および24時間後のグループの場合にはそれぞれ133、87および103時間であった。全身T1/2は、RITの場合には246時間であり、24時間前、同時および24時間後のグループの場合にはそれぞれ207、207および196時間であった。HB22-7をRITに添加しても、90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1の薬物動態は変化しなかった。
【０１０５】
議論
Raji異種移植調査は、抗CD22 mAb(HB22-7)が、アポトーシスを増強するためにRITと組み合わされた場合に追加的なもしくは相乗作用的な影響を生成するか否か、および/または低線量率の照射によりDNAダメージが誘導されるか否かを判断するように設計した。Raji異種移植ヌードマウスモデルは、90Y-2IT-BAD-Lym-1 RITのみを使用した場合のRITの毒性およびRITの効力を評価する際に有用であることが分かった(O'Donnellら, Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals 13:351-361 (1998))。この前臨床モデルにおける反応は、ヒト臨床治験における有意な効力に反映された(O'Donnellら, Anticancer Res. 20:3647-55 (2000)；O'Donnellら, J. Nucl. Med. 40:216 (1999)(Abstract))。
【０１０６】
本実施例に記載した調査では、90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1(125μCi)への抗CD22 mAb HB22-7の添加により、毒性を全く変えることなくRITの効力が増強した。150および200μCiの90Y-2IT-BAD-Lym-1での先のRaji異種移植調査では、本調査において見とめられた反応および治癒率に匹敵する反応および治癒率が生成された(O'Donnellら、前掲)。2IT-BADリンカーでのこれらの先の調査に基づき125μCi用量の90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1を選択した。2IT-BADでの先の調査では200μCi用量において最大の効力が示されたが、125μCiを選択したのは、HB22-7がRITに対して相乗作用的または追加的であり、低い用量によりこれらの効果のより良い評価が得られるという仮説に基づいている。本実施例の調査では、リンパ腫異種移植モデルにおいてこれまで検査されていない新規リンカー(DOTA-ペプチド)を利用した。DOTA-ペプチドリンカーは、結合していない放射性医薬品の肝臓分解が増強されて、より都合の良い生物分布が得られるように設計した。腫瘍特異的摂取は、本調査において詳細には評価しなかったが、125μCiの90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1のみの場合に見とめられた毒性プロファイルは許容可能であり、処置に関連した死亡も無く、白血球および血小板の底値は予測可能であった。
【０１０７】
アポトーシス誘発およびシグナリング効果を示すin vitro調査に基づいてHB22-7を選択した(Tuscanoら, Blood 94:1382-1392 (1999))。利用したHB22-7の治療用量は、経験的なものであるが、アポトーシスをin vitroで誘発するのに有効であることが示された量に基づき、これをマウスモデルに外挿した。さらに、HB22-7の用量を公式化する際には、ヒト臨床治験において使用される等量(ヒト対マウスの体表面積の差について調整した量)のRituximab(登録商標)を考慮した。Rituximab(登録商標)の最適用量は現時点で定義されていないとはいえ、これがリンパ腫の治療に対して効力が示された唯一の入手可能なネイキッドmAbであるという事実に基づき、Rituximab(登録商標)用量への近似化を利用した。
【０１０８】
HB22-7のみ、RITおよびHB22-7の組合せの効力、ならびに３つの異なる配列組合せの効果を評価するように調査を設計した。90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1のみの場合に見とめられた腫瘍容積減少は、タイミング、大きさ、および反応持続期間の点で、90Y-2IT-BAD-Lym-1での先の調査と一致していた(O'Donnelら, 1998、前掲)。RITのみの場合には、治療の14日後に腫瘍容積に約50％の減少が生じた。最大容積減少のおよその時点(21〜30日目)において評価する場合、HB22-7をRITに添加することで、配列特異的に、反応の大きさが有意に増強した。RITと同時にまたはRITの24時間後に投与された場合に、HB22-7の添加は最も有効であると思われる。容積減少の特徴的なパターンは高度に再現可能であった。個々の複製治験により、腫瘍容積減少の同様のパターンおよび大きさが示された。腫瘍容積の改善された減少は、優れた反応速度および生存率に反映された。RITのみの場合には13％CRおよび13％治癒率が得られ、HB22-7を添加した場合には、RITと同時に投与した際には治癒率が25％まで上昇し、HB22-7をRITの24時間後に投与した際には39％まで上昇した。
【０１０９】
第２のモノクローナル抗体をRITと組み合わせたのはこれが最初であり、毒性を上昇させること無く効力を増強するよく定義された生理学的性質を有するモノクローナル抗体または他の剤に利用性がある可能性を示す。
【０１１０】
驚くべきことに、HB22-7のみで処置したマウスは、他の全ての処置グループと比較して、目覚しい腫瘍容積減少、ならびに優れた治癒率および生存率を示した。同じく、いくつかの個々の治験が、初期腫瘍容積安定化が持続し、腫瘍容積減少が処置の約14日後に開始するという、高度に一致する結果を生じた。これは、いずれの処置グループにおいても見とめられる最良治癒率および全体生存率に反映した。
【０１１１】
結果的に、本発明の抗体は、単独で投与された場合、現在NHLの治療のために最も進化した治療アプローチであると考えられているCMRITを含む他の治療計画と比べて、腫瘍容積減少、治癒率および全体生存率の点で優れた結果を提供することが実証された。
【０１１２】
実施例３
抗CD22抗体の配列分析
VHおよび軽鎖遺伝子利用
RNeasyミニキット(Qiagen Chatsworth, CA)を使用して、1〜10×105ハイブリドーマ細胞から、細胞質RNAを抽出した。まずオリゴ-dTプライマー(dT18)およびSuperscriptキット(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)を使用して、細胞質RNAから鎖cDNAを合成した。１μlのcDNA溶液を、VH遺伝子のPCR増幅用の鋳型として使用した。10 mM Tris-HCl(pH 8.3)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、200μM dNTP(Perkin Elmer, Foster City, CA)、50 pmolの各プライマー、および5UのTaqポリメラーゼ(ISC Bioexpress, Kaysville, UT)からなる100μl容量の反応混合液中でPCR反応を実施した。増幅は、30サイクル(94℃にて１分間、58℃にて１分間、72℃にて１分間；サーモサイクラー(Perkin Elmer))で行った。先に記載された(Kantorら, J. Immunol. 158:1175-86 (1996))無差別なセンス5'VHプライマー(Ms VHE: 5' GGG AAT TCG AGG TGC AGC TGC AGG AGT CTG G 3'；配列番号２)、およびCμコード領域(プライマーCμ-in：5' GAG GGG GAC ATT TGG GAA GGA CTG 3'；配列番号３)またはCγ領域(プライマーCγ1：5' GAG TTC CAG GTC ACT GTC ACT GGC 3'；配列番号４)に相補的なアンチセンスプライマーを使用して、VH遺伝子を増幅した。
【０１１３】
センスVκプライマー[5' ATG GGC (AT)TC AAG ATG GAG TCA CA(GT) (AT)(CT)(CT) C(AT)G G 3'；配列番号５]、およびCλアンチセンスプライマー(5' ACT GGA TGG TGG GAA GAT G 3'；配列番号６)を使用して、軽鎖cDNAを増幅した。
【０１１４】
異なるセンスVκプライマー(5' ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG 3'；配列番号７)を使用して、HB22-33軽鎖配列を増幅した。
【０１１５】
増幅したPCR生成物を、QIAquickゲル精製キット(Qiagen)を使用してアガロースゲルから精製し、AmpliTaq DNAポリメラーゼ、および初期PCR増幅と同じプライマーで、Perkin Elmer Dye Terminator配列決定システムを使用して増幅した後に、ABI 377 PRISM DNAシーケンサーを使用して両方向に直接配列決定した。VHおよび軽鎖領域を全て、センスおよびアンチセンスDNA鎖の両方について完全に配列決定した。
【０１１６】
抗CD22モノクローナル抗体HB22-5、HB22-7、HB22-13、HB22-23、HB22-33およびHB22-196についての、VHおよびVκアミノ酸配列のアライメントはそれぞれ、図１０および１７に示す。図１１〜１６は、ハイブリドーマHB22-5(配列番号８および９)、HB22-7(配列番号10および11)；HB22-13(配列番号12および13)；HB22-23(配列番号14および15)；HB22-33(配列番号16および17)；ならびにHB22-196(配列番号18および19)から得た抗CD22 Abについての重鎖VH-D-JH接合配列のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。図１８〜２３は、ハイブリドーマHB22-5(配列番号20および21)；HB22-7(配列番号22および23)；HB22-13(配列番号24および25)；HB22-23(配列番号26および27)；HB22-33(配列番号28および29)；ならびにHB22-196(配列番号30および31)から得た抗CD22 Abについてのκ軽鎖V-J定常領域接合配列についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】Ig様ドメイン(ドメイン1〜7)の境界を示した、ヒトCD22(hCD22)のアミノ酸配列を示す。
【図２】111In-2IT-BAD-抗CD22(HB22-7)を注射したRajiおよびRamos腫瘍担持ヌードマウスの全身オートラジオグラフィー。注射して48時間後にマウスを屠殺し、オートラジオグラフィーにかけた。上部画像は、Raji腫瘍化マウス、下部画像はRamos腫瘍化マウスである。
【図３】未処置の、または125 uCi 90Y-DOTA-ペプチド-Lym-1(RIT)単独、抗CD22単独(HB22-7)、もしくは治験081500におけるRITおよびHB22-7(CMRIT)の３つの異なる配列で処置した、Raji異種移植マウスにおける腫瘍容積の時間的評価。腫瘍容積は、週に３回評価した。各処置グループについてマウスの頭数は表にした(表２)。
【図４】全ての個々の異種移植治験において見とめられた腫瘍容積の総括的な分析。治験は、図２に示すように実施した。各治験についてのマウスの頭数は表にした(表２)。
【図５】図２に示すように処置したRaji異種移植マウスについての反応および治癒率。腫瘍反応は以下の通りに分類した：Ｃ、治癒(腫瘍が消え、84日間の調査の終了時まで再成長しなかった)；ＣＲ、完全退化(regression)(腫瘍は少なくとも７日間消えたが、その後再成長した)；ＰＲ、部分的退化(腫瘍容積が少なくとも７日間50％以上減少したが、その後再成長した)。データは、全ての個々の治験の結果を表す。
【図６】図２に示すように処置したRaji異種移植マウスについて、全体的な生存率を評価した。腫瘍量(tumor burden)が2000 mgを超えた場合に、または84日間の治験の終了時に、マウスを安楽死させた。データは、全ての個々の治験の結果を表す。
【図７】図２に示すように処置したRaji異種移植マウスにおける白血球(WBC)(図７ｂ)、赤血球(RBC)(図７ｃ)および血小板計数(図７ａ)を週に２回測定することにより、血液学的毒性を評価した。RITのみの場合と比較すると、CMRITグループに血液学的毒性の差は無かった。さらに、HB22-7のみで処置されたマウスでは血液学的毒性は見とめられなかった。
【図８】図２に示すように処置したRaji異種移植マウスの体重を週に２回測定することにより、非血液学的毒性を評価した。５つ全ての異種移植治験における治療グループのいずれにおいても有意な体重の差はなかった。
【図９】RITでの治療開始後５日間の毎日、全身(WB)および血液中の放射活性を測定することにより、RITクリアランスを評価した。結果は、90YのT1/2に基づく遅延について調節した後に報告した。CMRIT処置グループのいずれにおいても有意なRITクリアランスの差はなかった。
【図１０】リガンド結合をブロックする抗CD22抗体(Ab)のVHアミノ酸配列分析。各Abについての、アミノ酸番号付け、およびコード配列の由来源の特定は、Kabatら(Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Government Printing Office, Bethesda, MD, 1991)の慣例によるものであり、ここでアミノ酸1〜94位、CDR1および2、ならびにFR1、2および3は、VH遺伝子にコードされる。5'PCRプライマーと重複する配列は図示していない。点は、類似アミノ酸配列のアライメントを最大化するために配列に挿入されたギャップを示す。配列中のギャップは、明確化のために、VH、DおよびJセグメントの間に導入した。図示した配列のランク順は、HB22-5配列に対する関連性に基づいた。
【図１１】ハイブリドーマHB22-5(配列番号８および９)から得た抗CD22 Abについての重鎖VH-D-JH接合配列のヌクレオチド配列およびコードアミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は二重下線で示している。Ｄ領域配列は下線で示している。
【図１２】ハイブリドーマHB22-7(配列番号10および11)から得た抗CD22 Abについての重鎖VH-D-JH接合配列のヌクレオチド配列およびコードアミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は二重下線で示している。Ｄ領域配列は下線で示している。
【図１３】ハイブリドーマHB22-13(配列番号12および13)から得た抗CD22 Abについての重鎖VH-D-JH接合配列のヌクレオチド配列およびコードアミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は二重下線で示している。Ｄ領域配列は下線で示している。
【図１４】ハイブリドーマHB22-23(配列番号14および15)から得た抗CD22 Abについての重鎖VH-D-JH接合配列のヌクレオチド配列およびコードアミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は二重下線で示している。Ｄ領域配列は下線で示している。
【図１５】ハイブリドーマHB22-33(配列番号16および17)から得た抗CD22 Abについての重鎖VH-D-JH接合配列のヌクレオチド配列およびコードアミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は二重下線で示している。Ｄ領域配列は下線で示している。
【図１６】ハイブリドーマHB22-196(配列番号18および19)から得た抗CD22 Abについての重鎖VH-D-JH接合配列のヌクレオチド配列およびコードアミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は二重下線で示している。Ｄ領域配列は下線で示している。
【図１７】リガンド結合をブロックする抗CD22 Abの軽鎖Vκアミノ酸配列分析。各Abについての、アミノ酸番号付け、およびコード配列の由来源の特定は、Kabatら(前掲)の慣例によるものである。予測したシグナル配列切断部位に続くアミノ酸を１と番号付けた。点は、類似アミノ酸配列のアライメントを最大化するために配列に挿入されたギャップを示す。明確化のために、配列中のギャップをVκ、Jセグメント、およびκ定常領域(二重下線)配列の間に導入した。
【図１８】ハイブリドーマHB22-5(配列番号20および21)から得た抗CD22 Abについてのκ軽鎖V-J定常領域接合配列についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は、二重下線で示している。
【図１９】ハイブリドーマHB22-7(配列番号22および23)から得た抗CD22 Abについてのκ軽鎖V-J定常領域接合配列についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は、二重下線で示している。
【図２０】ハイブリドーマHB22-13(配列番号24および25)から得た抗CD22 Abについてのκ軽鎖V-J定常領域接合配列についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は、二重下線で示している。
【図２１】ハイブリドーマHB22-23(配列番号26および27)から得た抗CD22 Abについてのκ軽鎖V-J定常領域接合配列についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は、二重下線で示している。
【図２２】ハイブリドーマHB22-33(配列番号28および29)から得た抗CD22 Abについてのκ軽鎖V-J定常領域接合配列についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は、二重下線で示している。
【図２３】ハイブリドーマHB22-196(配列番号30および31)から得た抗CD22 Abについてのκ軽鎖V-J定常領域接合配列についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。5'PCRプライマーと重複する配列は、二重下線で示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月22日(2004.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の天然型ヒトCD22(hCD22)の最初の２つのIg様ドメインまたは最初の２つのIg様ドメイン内のエピトープに結合可能なブロッキング抗CD22モノクローナル抗体の、Ｂ細胞悪性腫瘍と診断されたヒト患者を治療するための医薬品を製造するための使用。
【請求項２】
前記抗体は、HB22-7(HB11347)、HB22-23(HB11349)、HB22-33、HB22-5、HB22-13、およびHB22-196からなる群より選択される抗体と本質的に同じエピトープに結合する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記抗体は、HB22-7(HB11347)、HB22-23(HB11349)、およびHB22-33からなる群より選択される抗体と本質的に同じエピトープに結合する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記抗体は、HB22-7と本質的に同じエピトープに結合する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記抗体は、HB22-33と本質的に同じエピトープに結合する、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記抗体は、CD22とそのリガンドとの結合を少なくとも約70％ブロックする、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記抗体は、CD22とそのリガンドとの結合を少なくとも約80％ブロックする、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が局所的なものである、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、および前リンパ球性白血病のＢ細胞亜型からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬品は、悪性腫瘍Ｂ細胞のその他の治療を伴わない治療への使用に適したものである、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬品は、放射線療法を伴わない治療への使用に適したものである、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬品は、化学療法を伴わない治療への使用に適したものである、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
前記医薬品は、放射免疫療法(RIT)、または併用放射免疫療法(CMRIT)を伴わない治療への使用に適したものである、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬品は、前記抗体を単独で使用する治療への使用に適しており、該医薬品により、該抗体と放射免疫療法との併用治療と比べて、Rajiリンパ腫異種移植モデルの治癒率が改善されることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬品は、前記抗体を単独で使用する治療への使用に適しており、該医薬品により、該抗体と放射免疫療法との併用治療と比べて、Rajiリンパ腫異種移植モデルの生存率が向上することを特徴とする前記抗体を単独で使用する治療への使用に適したものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬品は、前記抗体を単独で使用する治療への使用に適しており、該医薬品により、該抗体と放射免疫療法との併用治療と比べて、Rajiリンパ腫異種移植モデルの腫瘍容積の減少がもたらされることを特徴とする前記抗体を単独で使用する治療への使用に適したものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗体は、完全抗体のフラグメントである、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
前記抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2およびFvフラグメント、二重特異性抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体からなる群より選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記抗体は、さらなる抗原特異性を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項２０】
前記抗体は、二重特異性抗体である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記抗体は、CD22の別のエピトープにさらに結合する、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記抗体はキメラである、請求項１に記載の使用。
【請求項２３】
前記抗体はヒト化である、請求項１に記載の使用。
【請求項２４】
前記抗体はヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項２５】
前記抗体を含む医薬品は、静脈内投与されるものである、請求項１に記載の使用。
【請求項２６】
前記抗体を含む医薬品は、週ごとに、静脈内点滴により投与されるものである、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
固型Ｂ細胞腫瘍の縮小を追跡することにより、前記治療に対する反応をモニタリングすることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項２８】
前記縮小が、磁気共鳴画像法(MRI)によりモニタリングされる、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記抗体が、配列番号９(HB22-5 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；または配列番号13(HB22-3 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98；または配列番号19(HB22-196 VH配列)のアミノ酸1〜100の配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVH配列を含む重鎖を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３０】
前記抗体が、配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；または配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98の配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVH配列を含む重鎖を含む、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記抗体が、配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；および配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98からなる群より選択されるVH配列を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記抗体が、配列番号21(HB22-5Vκ配列)；または配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；または配列番号25(HB22-13 Vκ配列)；または配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；または配列番号29(HB22-33 Vκ配列)；または配列番号31(HB22-196 Vκ配列)のアミノ酸配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVκ配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３３】
前記抗体が、配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；または配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；または配列番号29(HB22-33 Vκ配列)のアミノ酸配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVκ配列を含む軽鎖を含む、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記抗体が、配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；および配列番号29(HB22-33 Vκ配列)のアミノ酸配列からなる群より選択されるVκ配列を含む、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記抗体が、配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97と配列番号23(HB22-7 Vκ配列)のアミノ酸配列；配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100と配列番号27(HB22-23 Vκ配列)のアミノ酸配列；ならびに配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98と配列番号29(HB22-33 Vκ配列)のアミノ酸配列からなる群より選択されるVHとVκ配列とを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３６】
前記抗体はキメラである、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記抗体はヒト化である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３８】
前記抗体はヒトである、請求項３５に記載の使用。
【請求項３９】
配列番号１の天然型ヒトCD22(hCD22)の最初の２つのIg様ドメインまたは最初の２つのIg様ドメイン内のエピトープに結合可能なブロッキング抗CD22モノクローナル抗体の、医薬品を製造するための使用。
【請求項４０】
配列番号９(HB22-5 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；または配列番号13(HB22-13 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；または配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98；または配列番号19(HB22-196 VH配列)のアミノ酸1〜100の配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVH配列を含む抗体重鎖可変領域をコードする核酸を含む、単離された核酸分子。
【請求項４１】
配列番号21(HB22-5Vκ配列)；または配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；または配列番号25(HB22-13 Vκ配列)；または配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；または配列番号29(HB22-33 Vκ配列)；または配列番号31(HB22-196 Vκ配列)のアミノ酸配列と少なくとも約95％の配列同一性を有するVκ配列を含む抗体軽鎖可変領域をコードする核酸を含む、単離された核酸分子。
【請求項４２】
配列番号11(HB22-7 VH配列)のアミノ酸1〜97；配列番号15(HB22-23 VH配列)のアミノ酸1〜100；および配列番号17(HB22-33 VH配列)のアミノ酸1〜98からなる群より選択されたVH配列をコードする核酸を含む、単離された核酸分子。
【請求項４３】
配列番号23(HB22-7 Vκ配列)；配列番号27(HB22-23 Vκ配列)；および配列番号29(HB22-33 Vκ配列)のアミノ酸配列からなる群より選択されたVκ配列をコードする核酸を含む、単離された核酸分子。
【国際調査報告】
2005526044.tif 000038
2005526044.tif 000039