(57)【要約】本発明は、フレキシブルポリペプチドリンカー分子により連結されるサイトカインのリガンド結合ドメインを含むオリゴマーポリペプチド（２量体、３量体等）の提供に関する。前記リンカー分子は、ヒトまたは動物被検体へ投与される時に、生物学上活性なサイトカインの放出を調整するためのプロテアーゼに感受性の部位を任意に含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン受容体の２つより多いリガンド結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインがリンカー分子により連結され、そしてリンカー分子が少なくとも１つのタンパク質分解性切断部位を含むポリペプチド。
【請求項２】
前記切断部位が血清プロテアーゼに感受性である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記血清プロテアーゼがトロンビンである、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記切断部位がアミノ酸配列ＬＶＰＲＧＳまたはその変異体を含む、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記切断部位がアミノ酸配列ＳＧＧＧＧを含む、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記切断部位がアミノ酸配列ＰＧＩＳＧＧＧＧＧＧを含む、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記切断部位がアミノ酸配列ＬＶＰＲＧＳＰＧＩＳＧＧＧＧＧＧまたはその変異体を含む、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記切断部位が該切断部位の側面に位置するアミノ酸配列ＳＧＧＧＧまたはその変異体の少なくとも２つのコピーを含む、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが少なくとも４つのリガンド結合ドメインを含む、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが４、６、８、１０または１２個のリガンド結合ドメインを有する、請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが３、４、５、６、７、８、９または１０個のリガンド結合ドメインを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが１０個より多いリガンド結合ドメインを有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドがアンタゴニストである、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがアゴニストである、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記サイトカイン受容体リガンド結合ドメインが以下の：成長ホルモン；レプチン；エリスロポイエチン；プロラクチン；インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１；ＩＬ−１２のｐ３５サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；インターフェロン、ＩＦＮαおよびＩＦＮγからなる群から選択されるサイトカインのリガンド結合ドメインから選択される、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
結合ドメインが成長ホルモンのリガンド結合ドメインである、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１７】
結合ドメインがレプチンのリガンド結合ドメインである、請求項１６記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記リンカーが５〜５０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記リンカーが５〜３０個のアミノ酸残基を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記リンカーがペプチド、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒの少なくとも１つのコピーを含む、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記リンカーが５アミノ酸長であり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リンカーの１つのコピーからなる、請求項２０記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記リンカーが１０アミノ酸長であり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２リンカーの２つのコピーからなる、請求項２０記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記リンカーが１５アミノ酸長であり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リンカーの３つのコピーからなる、請求項２０記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記リンカーが２０アミノ酸長であり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーの４つのコピーからなる、請求項２０記載のポリペプチド。
【請求項２５】
リガンド結合ドメインのインフレーム翻訳融合物を含む融合タンパク質である、先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
化学架橋剤を含む先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記化学架橋剤が前記リガンド結合ドメインを連結するのに役立つポリペプチド。
【請求項２７】
前記化学架橋剤が、ジスクシニミジル−スベリミデート−ジヒドロクロリド、ジメチル−アジピミデート−ジヒドロクロリド、１，５，−２，４ジニトロベンゼンからなる群から選択されるホモ二機能性架橋剤を含む、請求項２６記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記化学架橋剤が、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル  ２，３−ジブロモプロピオネート、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド  ヒドロクロリド、スクシニミジル  ４−［ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレートからなる群から選択されるへテロ二機能性架橋剤を含む、請求項２６または２７記載のポリペプチド。
【請求項２９】
先行の請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項３０】
（ｉ）図４および図６に示す配列、
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列とハイブリダイズし、かつサイトカイン受容体調整活性を有する配列、および
（ｉｉｉ）前記（ｉ）および（ｉｉ）で定義の配列に対する遺伝コードの結果として縮重する配列からなる群から選択される、核酸配列を含む核酸分子。
【請求項３１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で図４または図６に示す配列にハイブリダイズする核酸分子。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加および／または置換により改変され、そして前記改変体が受容体媒介細胞シグナル伝達の阻害または活性化に関して前記ポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニスト作用を強化する、請求項３２記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ＤＮＡ分子を含むベクターであって、前記ＤＮＡ分子が請求項１〜２８、３２または３３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするベクター。
【請求項３５】
原核生物または真核生物遺伝子発現のために適用される発現ベクターである請求項３４記載のベクター。
【請求項３６】
前記ベクターがコードし、したがって前記組換えポリペプチドに前記ポリペプチドの精製を促すための分泌シグナルが提供される、請求項３４または３５記載のベクター。
【請求項３７】
（ｉ）前記ポリペプチドの製造のための条件下で、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の核酸または請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させること、および
（ｉｉ）前記細胞またはその増殖環境から前記ポリペプチドを精製すること
を含む、請求項１〜２８、３２または３３のいずれか１項に記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項３８】
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の核酸または請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換／トランスフェクトされた細胞。
【請求項３９】
医薬として、請求項１〜２８、３２または３３のいずれか１項に記載のポリペプチド、および／または請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の核酸および／または請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項４０】
請求項１〜２８、３２または３３のいずれか１項に記載のポリペプチド、および／または請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の核酸および／または請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のベクターを含む医薬組成物であって、該医薬組成物が、任意選択で、キャリア、賦形剤、および／または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項４１】
末端肥大症、巨人症、ＧＨ欠損症、ターナー症候群、腎不全、骨粗鬆症、糖尿病、癌、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧症、貧血症、自己免疫疾患および感染症、慢性関節リウマチを含む炎症性障害からなる群から選択される疾患の治療用の薬物を製造するための、請求項１〜２８、３２または３３のいずれか１項に記載のポリペプチド、および／または請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の核酸および／または請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項４２】
ヒトまたは動物被験体の治療方法であって、請求項１〜２８、３２または３３のいずれか１項に記載のポリペプチド、および／または請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の核酸および／または請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項４０に記載の医薬組成物および／または請求項４１に記載の薬物の有効量を前記被験体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインの２つより多いリガンド結合ドメインを含むポリペプチドであって、ドメインが、タンパク質分解性切断部位を任意選択で含むフレキシブルリンカーにより連結されるポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
適切な生化学反応を起こすために受容体と相互作用するリガンドは、アゴニストと知られており、生化学反応を防止する、すなわち妨害するリガンドはアンタゴニストとして知られている。例えば、限定されないが、細胞特異的成長因子はアゴニストとして作用し細胞表面に存在する受容体に結合するリガンドである。リガンド特異的な結合による受容体の活性化は、細胞内シグナル伝達カスケードの活性化を介した細胞増殖を促進し、特に、細胞周期特異的遺伝子を発現し、静止期の細胞を増殖するように活性化する。成長因子はまた、細胞分化を活性化することができる。
【０００３】
サイトカインと呼ばれる多数の成長因子群は、多種多様にわたる細胞機能に関連する。これらには、例として、免疫系の調整、エネルギー代謝の調節、ならびに成長および発達の制御が含まれるが、これらに限定されない。リンパ球によって分泌されたサイトカインを、リンホカインという（インターロイキンとしても知られる）。単球およびマクロファージによって分泌されるサイトカインをモノカインという。サイトカインはまた、内分泌腺（例えば、下垂体による成長ホルモン（ＧＨ））および脂肪細胞（例えば、レプチン）によって分泌される。サイトカインは、標的細胞上の細胞表面で発現する受容体を介してその効果を媒介する。
【０００４】
サイトカイン受容体ファミリーの受容体は、１つの膜貫通ドメインを有し、固有の酵素活性を欠く(Kishimoto et al., 1994)。サイトカインの同族受容体への結合の際、受容体ホモ二量体またはヘテロ二量体形成またはオリゴマー形成のいずれかが起こる。受容体複合体が内在化（internalise）され、Ｊａｋ／ＳｔａｔおよびＭａＰｋ経路を含む関連シグナル伝達カスケードの活性化によってシグナル伝達が起こる。内在化の後のリサイクルステップによって細胞内でさらに使用するための受容体分子が再生される。
【０００５】
ＧＨおよびＧＨＲへの結合に関して、上記の例が記載されている。この例は、例示に過ぎず限定を意図するものではないが、受容体：リガンド複合体の結合、二量体形成、および内在化によるシグナル伝達カスケードを活性化するサイトカインの例である。１つの成長ホルモン（ＧＨ）分子は２つの同一受容体分子に会合することが知られている(Cunningham et al., 1991; de Vos et al., 1992; Sundstrom et al., 1996; Clarkson et al., 1998)。これは、ＧＨ上の２つの固有の受容体結合部位および２つの受容体の細胞外ドメイン上の共通の結合ポケットによって起こる。ＧＨ分子上の部位１は、部位２よりも親和性が高く、受容体の二量体形成は、ＧＨ上の部位１への１つの受容体結合およびその後の部位２への第２の受容体の使用が連続的に起こると考えられる。
【０００６】
ＧＨＲの細胞外部分は、２つの連結したドメインとして存在し、それぞれ約１００個のアミノ酸（ＳＤ−１００）、Ｃ末端ＳＤ−１００ドメインは細胞表面付近に存在し、Ｎ末端ＳＤ−１００ドメインは最も離れて存在する。これは、ヘテロ三量体複合体ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲが形成されるホルモン結合が起こるこれら２つのドメインの高次構造の変化である。リガンドにより起動される受容体二量体形成はシグナル活性化の誘導(Cunningham et al., 1991)、Ｊａｋ２／Ｓｔａｔ５経路を含むリン酸化カスケードを誘発する(Argetsinger & Carter-Su, 1996)重要な事象であると提案される。共焦点顕微鏡および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用して、リガンド結合後にＧＨＲが非常に迅速に内在化され、この内在化およびシグナル伝達が独立した機能であることが知られている(Maamra et al., 1999)。ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲ複合体の内在化後のリサイクルステップによって細胞内でさらに使用するための受容体分子が再生される。
【０００７】
ＧＨ関連であるサイトカインの例としてはレプチンおよびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）がある。レプチン受容体およびＥＰＯ受容体は、ＧＨＲとかなりの構造相同性を共有し、シグナル伝達を誘発するために類似の二量体形成プロセスが必要である。レプチンは食欲を抑え、レプチン耐性は肥満に関係する。レプチン受容体アンタゴニストにより、神経性食欲不振症の治療方法が得られる。過剰なＥＰＯにより、二次的に低酸素症（慢性肺疾患）を発症し得る赤血球増加症または、一次性真性赤血球増加症（過剰赤血球障害）を発症する。ＥＰＯアンタゴニストにより赤血球増加症の治療方法が得られる。
【０００８】
過剰な成長ホルモンに起因する末端肥大症および巨人症の疾患は、通常、下垂体腫瘍による。現在試験中の薬物は、ＧＨＲの分子構造の最近得られた知識を使用してデザインしたペグ化(pegylated)ＧＨアンタゴニストＢ２０３６である。不運なことに、ＧＨ作用の拮抗には内因性ＧＨレベルよりも１０００倍高い非常に高レベルのＢ２０３６を必要とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、特に、動物に投与した場合に生物学的に活性なサイトカインの放出を調整するためにプロテアーゼ感受性部位を任意選択で含むフレキシブルポリペプチドリンカー分子を介して連結されるサイトカインのリガンド結合ドメインを含むオリゴマーポリペプチド（二量体、三量体等）の提供に関する。
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、サイトカイン受容体の２つより多いリガンド結合ドメインを含むポリペプチドであって、該ドメインがリンカー分子により連結される、ポリペプチドが提供される。
【００１１】
好ましくは、リンカー分子が少なくとも１つのタンパク質分解性切断部位を含む。
【００１２】
好ましくは、上記切断部位が血清プロテアーゼに感受性である。
【００１３】
好ましくは、上記切断部位がアミノ酸配列ＬＶＰＲＧＳまたはその変異体を含む。
【００１４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記切断部位がアミノ酸配列ＳＧＧＧＧまたはその機能的変異体の少なくとも１つのコピーを含む。好ましくは、上記切断部位がアミノ酸配列ＰＧＩＳＧＧＧＧＧＧを含む。
【００１５】
さらにより好ましくは、上記切断部位がアミノ酸配列ＬＶＰＲＧＳＰＧＩＳＧＧＧＧＧＧまたはその変異体を含む。
【００１６】
代替的に、上記切断部位が切断部位の側面に位置するアミノ酸配列ＳＧＧＧＧまたはその機能的変異体の少なくとも２つのコピーを含む。
【００１７】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記切断部位が血清プロテアーゼトロンビンに感受性である。
【００１８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記ポリペプチドが複数のリガンド結合ドメインを含む。好ましくは上記ポリペプチドが、３、４、５、６、７、８、９または１０個のリガンド結合ドメインを有する。好ましくは上記ポリペプチドが、１０個より多いリガンド結合ドメインを有する。
【００１９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記ポリペプチドが４、６、８、１０または１２個のリガンド結合ドメインを有する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドが少なくとも４つのリガンド結合ドメインを含む。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態において、上記ポリペプチドがアンタゴニストである。
【００２２】
本発明の代替的な好ましい実施形態において、上記ポリペプチドがアゴニストである。
【００２３】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上記リガンド結合ドメインが以下の：成長ホルモン；レプチン；エリスロポイエチン；プロラクチン；インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１；ＩＬ−１２のｐ３５サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；インターフェロン、ＩＦＮαおよびＩＦＮγからなる群から選択されるサイトカインのリガンド結合ドメインから選択される。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドが成長ホルモンのリガンド結合ドメインである。
【００２５】
単一ｈＧＨ分子は、２個のＧＨＲ分子と結合する。ｈＧＨ分子は、高親和性部位を介して一方の受容体分子と、そして低親和性部位を介して他方の受容体分子と相互作用する。ｈＧＨに連結されたｈＧＨからなる単一タンパク質鎖は、１対の受容体分子と強力に結合し得る２つの高親和性部位および２つの低親和性部位を含有する。
【００２６】
本発明の一実施形態において、リガンド結合ドメインの２つまたはそれ以上のコピーが単一ポリペプチド鎖上に発現され、そしてタンデム(tandem)またはオリゴマーサイトカインの配列は、「リガンド結合ドメイン−リンカー−リガンド結合ドメイン」で配置される。
【００２７】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記リガンド結合ドメインがレプチンの結合ドメインである。
【００２８】
好ましくは、リンカーはペプチド、
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＳｅｒＳｅｒＳｅｒ（以後、「Ｇｌｙ４Ｓｅｒ４」という）
の少なくとも１つのコピーを含む。
【００２９】
本発明の一実施形態において、リンカーが８アミノ酸長であり、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ４リンカーの１つのコピーからなる。本発明の代替的な実施形態において、リンカーが１６アミノ酸長であり、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ４リンカーの２つのコピーからなる。本発明のさらなる代替的な実施形態において、上記リンカーが２４アミノ酸長であり、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ４リンカーの３つのコピーからなる。
【００３０】
より好ましくは、リンカーは、５〜５０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。最も好ましくは、リンカーは、５〜３０個のアミノ酸残基を含む。
【００３１】
最も好ましくは、リンカーはペプチド、
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（以後、「（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）」もしくは「Ｇ４Ｓ」という）
の少なくとも１つのコピーを含む。
【００３２】
本発明の一実施形態において、リンカーが５アミノ酸長であり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リンカーの１つのコピーからなる。本発明の代替的な実施形態において、リンカーが１０アミノ酸長であり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２リンカーの２つのコピーからなる。本発明のさらなる代替的な実施形態において、上記リンカーが１５アミノ酸長であり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リンカーの３つのコピーからなる。本発明のさらなる代替的な実施形態において、上記リンカーが２０アミノ酸長であり、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーの４つのコピーからなる。
【００３３】
本発明の代替的な実施形態において、ポリペプチドが本発明によるリガンド結合ドメインのインフレーム翻訳融合物を含む融合タンパク質である。
【００３４】
代替的なリンカーを用いて、例えば化学的タンパク質架橋剤を用いて、リガンド結合ドメインを連結し得る、ということは当業者には明らかである。例えばホモ二機能性架橋剤(homo-bifunctional crosslinker)、例えばジスクシニミジル−スベリミデート−ジヒドロクロリド(disuccinimidyl-suberimidate-dihydrochloride)、ジメチル−アジピミデート−ジヒドロクロリド(dimethyl-adipimidate-dihydrochloride)、１，５，−２，４ジニトロベンゼン(1,5-2,4 dinitrobenzene)、あるいはヘテロ二機能性架橋剤(hetero-bifunctional crosslinker)、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジル  ２，３−ジブロモプロピオネート(N-hydroxysuccinimidyl 2,3-dibromopropinate)、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド  ヒドロクロリド(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)、スクシニミジル  ４−［ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート(succinimidyl 4-[n-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate)。
【００３５】
化学架橋剤のさらなる例としては、化学的改変(modified)リンカー分子および／またはリガンド結合ドメインの提供が挙げられる。例えばリンカー分子の一端がアミノ酸末端リジン残基で終結され、リガンド結合がカルボキシル末端グルタミン残基による場合には、リガンド結合ドメインはトランスグルタミナーゼでオリゴマー形成され得る。
【００３６】
本発明のさらなる態様によると、本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、上記核配分子が
ｉ）図４および図６に示す配列、
ｉｉ）上記の（ｉ）の配列とハイブリダイズし、サイトカイン受容体調整活性を有する配列、および
ｉｉｉ）上記の（ｉ）および（ｉｉ）で定義の配列に対する遺伝コードの結果として縮重する配列からなる群から選択される、核酸配列を含む。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、上記核酸は、ストリンジェントなハイブダイゼーション条件下で図４または図６に示す配列にハイブリダイズする。
【００３９】
核酸配列が既知の場合、至適ハイブリダイゼーション条件を計算することができることが当該分野で周知である。例えば、ハイブリダイゼーション条件を、ハイブリダイゼーションされる核酸のＧＣ含量によって決定することができる。Sambrookら（１９８９）「Molecular Cloning; A Laboratory Approach」を参照のこと。特定の相同性を示す核酸分子間のハイブリッド形成の達成に必要なストリンジェンシー条件の一般的な計算式は以下である。
【００４０】
【数１】
2005529583.tif 000002
【００４１】
典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、４〜６×ＳＳＰＥ（１リットルに溶解し、ｐＨを７．４に調整した２０×ＳＳＰＥは、１７５．３ｇ  ＮａＣｌ、８８．２ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、および７．４ｇ  ＥＤＴＡを含む）；５〜１０×デンハルト溶液（５ｇ  Ｆｉｃｏｌｌ（タイプ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇポリビニルピロリドン、および５ｇウシ血清アルブミン／５００ｍｌを含む５０×デンハルト溶液）；１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ／ニシンＤＮＡ；０．１〜１．０％ドデシル硫酸ナトリウム；任意選択で４０〜６０％の脱イオンホルムアミドを使用する。ハイブリダイゼーション温度は、核酸標的配列のＧＣ含量に依存して変化するが、典型的には４２℃と６５℃の間である。
【００４２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子によってコードされるポリペプチドが得られる。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、このようにしてコードされたポリペプチドを、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、または置換によって改変する。理想的には、上記改変により、受容体媒介細胞シグナル伝達の阻害または活性化に関して上記ポリペプチドの拮抗または作動効果が増強される。
【００４４】
あるいはまたは好ましくは、改変には、組換えまたは合成形態のポリペプチドの産生における改変アミノ酸の使用が含まれる。
【００４５】
改変アミノ酸には、（例としてであり、限定されない）４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ６−アセチルリジン、Ｎ６−メチルリジン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルリジン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチルリジン、シクロヘキシアラニン、Ｄ−アミノ酸、オルニチンが含まれることが当業者に明らかである。改変アミノ酸の組み込みにより、ポリペプチドに対して有利な性質を付与することができる。例えば、改変アミノ酸の組み込みによりポリペプチドのその結合部位に対する親和性を増加させることができるか、改変アミノ酸により、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増加させて、患者に投与する治療ポリペプチドの有効量を減少させることが可能である。
【００４６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の任意の先行の態様または実施形態によるＤＮＡ分子を包含するベクターが得られる。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの組換え製造手段によって上記ベクターが得られる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、上記ベクターは原核生物遺伝子発現に適応する発現ベクターである。
【００４９】
原核生物発現系は当該分野で周知であり、高レベルの構成的(constitutive)および誘導発現に適応するベクターを含む。組換えポリペプチドが細菌細胞に有毒である場合、誘導発現系は特に有利である。発現の誘導を、種々のインデューサーに反応するプロモーターによって厳密に制御される（例えば、ＩＰＴＧ誘導性）。細菌細胞を、誘導前の静止期まで増殖させることができる、それにより有毒ポリペプチドの有害性を減少させることができる。
【００５０】
さらに、一定のポリペプチドは、例えば、タンパク質の不安定性または凝集の問題により組換え製造が困難であることも当該分野で周知である。天然および組換え細菌ポリペプチドの産生を容易にする遺伝子（例えば、細菌プロテアーゼ）が変異した遺伝子改変細菌株が利用可能であることが周知である。
【００５１】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記ベクターは、真核生物遺伝子発現に適応した発現ベクターである。
【００５２】
典型的には、上記適用には、例として、細胞／組織特異的発現を媒介する転写調節配列（プロモーター配列）の提供が含まれるが、これらに限定されない。これらのプロモーター配列は、細胞／組織特異的であるか、誘導可能であるか、構成的であり得る。
【００５３】
プロモーターは当該分野で認識された用語であり、明白にする目的で、これには、例示のみで限定しない以下の特徴が含まれる。エンハンサーエレメントは、しばしば遺伝子の転写開始部位の５’末端で見出されるシス作用核酸配列である（エンハンサーを、遺伝子配列の３’末端でも見出すことができるか、イントロン配列中にも存在するので位置独立性である）。エンハンサーは、エンハンサーが連結する遺伝子の転写速度を増大させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているトランス作用転写因子（ポリペプチド）に反応性を示す。転写因子の結合／活性（David S. LatchmanによるEukaryotic Transcription Factors, Academic Press Ltd, San Diegoを参照のこと）は、例えば、中間代謝産物（例えば、グルコース、脂質）、環境エフェクター（例えば、光、熱）が包含されるが、これらに限定されない多数の環境因子(environmental cues)に反応性を示す。
【００５４】
プロモーターエレメントはまた、いわゆるＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含む。これらの配列はまた、特に、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように機能するポリペプチドに結合する。
【００５５】
適用には、真核細胞または原核宿主のいずれかでの上記ベクターの維持を容易にする選択マーカーおよび自律複製配列の提供も包含される。自律的に維持されたベクターを、エピソームベクター(episomal vector)という。
【００５６】
ベクターコード遺伝子の発現を容易にする適用には、転写終結／ポリアデニル化配列の提供が含まれる。これにはまた、２シストロンまたは多シストロン発現カセット中に配列されたベクターコード遺伝子の発現を最大にするように機能する内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の提供が包含される。
【００５７】
これらの適用は、当該分野で周知である。一般に、発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技術の発現に関する相当数の出版された文献が存在する。Sambrookら（１９８９）「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbour Laboratory、Cold Spring Harbour, NYおよびその参考文献；Marston, F（１９８７）、「DNA Cloning Techniques: A Practical Approach」、第ＩＩＩ巻、IRL Press, Oxford UK；「DNA Cloning」、F. M. Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons, Inc.（１９９４）を参照のこと。
【００５８】
本発明のなおさらなる態様では、
（ｉ）ポリペプチドの製造のための条件下で、本発明のベクターまたは核酸により形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させること、
（ｉｉ）上記細胞またはその増殖環境から上記ポリペプチドを精製することを含む、本発明によるポリペプチドの調製方法が得られる。
【００５９】
本発明の好ましい方法では、上記ベクターが、結合剤ポリペプチドの精製を容易にするために分泌シグナルをコードし、従って、上記組換えポリペプチドが得られる。
【００６０】
本発明のなおさらなる態様では、本発明によるベクターまたは核酸により形質転換またはトランスフェクトした細胞が得られる。
【００６１】
好ましくは、上記細胞が真核細胞であり、真菌；昆虫（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；両生類；植物；哺乳動物から選択される。
【００６２】
より好ましくは、上記細胞が原核細胞であり、大腸菌細胞である。
【００６３】
本発明のさらなる態様によれば、医薬として本発明によるポリペプチドの使用が提供される。好ましくは、本発明によるポリペプチドを含む医薬組成物が得られる。好ましくは、上記医薬組成物には、キャリア、賦形剤、および／または希釈剤が含まれる。
【００６４】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上記ポリペプチドが末端肥大症、巨人症、ＧＨ欠損症、ターナー症候群、腎不全、骨粗鬆症、糖尿病、癌、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧症、貧血症、自己免疫疾患および感染症、慢性関節リウマチを含む炎症性障害からなる群から選択される疾患の治療に使用するための薬物を製造するために使用する。
【００６５】
本発明はまた、有効量のポリペプチド、医薬組成物または薬物を上記被験体に投与することを含む、ヒトまたは動物被験体の治療方法を提供する。
【００６６】
本発明のポリペプチドまたは組成物は、注射を含めた任意の慣用的経路により、あるいは長時間の漸進的注入により投与され得る。投与は、例えば経口、静脈内、腹腔内、筋内、腔内(intracavity)、皮下、経皮的であり得るし、あるいはポリペプチドを分泌するよう工学処理された非病理学的(non-pathological)ＧＭＯにより送達され得る。
【００６７】
上記の方法に用いられる医薬組成物は、好ましくは滅菌性であり、患者への投与に適した重量または容量単位で所望の応答を生じるために有効量の本発明によるポリペプチドを含有する。
【００６８】
投与される場合、本発明の医薬調製物は、医薬上許容可能量で、そして医薬に許容可能な組成物中に適用される。「医薬に許容可能な」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を意味する。このような調製物は、塩、緩衝剤（例えば塩の状態の酢酸、塩の状態のクエン酸、塩の状態のホウ酸および塩の状態のリン酸）、防腐剤（例えば塩化ベンズアルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサール）、相溶性キャリアならびに任意選択でその他の治療薬を慣例的に含有し得る。
【００６９】
組成物は、所望により、医薬に許容可能なキャリアと併合され得る。「医薬に許容可能なキャリア」という用語は、本明細書中で用いる場合、ヒトへの投与に適している１つまたは複数の相溶性固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。「キャリア」という用語は、適用を促すために活性成分が併合される天然または合成の、有機または無機成分を意味する。
【００７０】
医薬組成物は、便宜上単位投薬形態で存在するのが可能であり、製薬技術分野で周知の方法のいずれかにより調製され得る。全方法が、活性作用物質を、１つまたは複数の補助成分を組成するキャリアと会合させる(association)ステップを包含する。概して組成物は、活性化合物を均一に且つ密接に液体キャリア、微粉砕固体キャリアまたはその両方と会合させ、次に必要な場合には生成物を造形することにより、調製される。
【００７１】
経口投与に適した組成物は、各々予定量の活性化合物を含有する別個の単位、例えばカプセル、錠剤、ロゼンジとして提供され得る。その他の組成物としては、水性液体または非水性液体中の懸濁液、例えばシロップ、エリキシルまたはエマルションが挙げられる。
【００７２】
非経口投与に適した組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張であるポリペプチドの滅菌水性または非水性調製物を便宜上含む。この調製物は、適切な分散または湿潤剤および沈殿防止剤を用いて、既知の方法に従って処方され得る。滅菌注射用調製物は、非毒性非経口上許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。用いられ得る許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒質として因習的に用いられる。この目的のために、任意の無刺激不揮発性油、例えば合成モノまたはジグリセリドが用いられ得る。また、脂肪酸、例えばオレイン酸が注射用物質の調製に用いられ得る。経口、皮下、静脈内、筋内等の投与に適したキャリア処方物は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出され得る。
【００７３】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による有効量の核酸またはベクターを、動物、好ましくはヒトに投与することを含む治療方法が提供される。
【００７４】
本発明の一実施形態をここで、実例のみにより、以下の図を参照しながら説明する。
【実施例】
【００７５】
材料および方法
ｐＴｒｃＨｉｓχ１Ａ１中のＧＨＲをコードする配列（図１）を、別のＧＨ遺伝子（残基１〜１９１）と置き換えて、（Ｇ４Ｓ）４リンカーで連結される２連続ＧＨ遺伝子を生成した。その結果生じた構築物（ｐＴｒｃＨｉｓχ１Ｃ１）を、大腸菌のＤＮＡ組換え欠損株である大腸菌ＳＵＲＥ細胞中で形質転換した。ヒツジ抗マウス−ＨＲＰ（Amersham）でプローブされた抗ＧＨ（１０Ａ７、マウスＩｇＧ１）を用いたウエスタンブロットにより、ＧＨ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨタンパク質を発現するクローンを同定した。（Ｇ４Ｓ）４リンカーを欠いた（ＧＨ−ＧＨ）別のＧＨ−タンデムも、同一方法を用いて構築した（ｐＴｒｃＨｉｓχ１Ｃ２）。
【００７６】
金属キレートアフィニティーカラム（Ｐｒｏｂｏｎｄ樹脂、Invitrogen）、その後イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ、Pharmacia）を用いて、細胞溶解物からＧＨタンデムタンパク質を精製した。
【００７７】
ＧＨ−タンデムタンパク質の作用を、確立されたバイオアッセイ（Ross et al., 1997）を用いて分析した。
【００７８】
レプチン遺伝子を最初はｐＨＥＡＴ；温度誘導性ベクター中にクローン化した。しかしながら大腸菌ＳＵＲＥ細胞中での発現に関しては、遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓプラスミド中でサブクローニングした。次に（Ｇ４Ｓ）４リンカーを導入し、最後に二次レプチンドメインを遺伝子に結繋して、レプチンタンデムを発現する構築物を生成した。この構築物ｐＴｒｃＨｉｓχ２Ｃ１を次に大腸菌ＳＵＲＥ細胞中に形質転換した。ウサギ中で開発され、抗ウサギ−ＨＲＰ（Sigma）でプローブされた抗レプチン抗体（Sigma）を用いてウエスタンブロットによりレプチン−タンデムの発現を立証した。
【００７９】
ＧＨ−タンデムのクローニング
ＰＣＲを用いて、制限部位（ＮｏｔＩまたはＥｃｏＲＩ）、その後のＧＨ遺伝子および次にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位からなるＤＮＡの断片を生成した。これを、関連制限酵素で消化されていたｐＴｒｃＨｉｓχ１Ａ１に結繋して、構築物χ１Ｃ１（ＧＨ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨ）およびχ１Ｃ２（ＧＨ−ＧＨ）を生成した。ＰＣＲのために用いられたプライマーを図２に示し、そして反応スキームを図３に示す。
【００８０】
ＧＨ−タンデムの精製
１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）雌鶏卵白リソチームおよび超音波処理の組合せを用いて、誘導細胞（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．８中に再懸濁）を溶解した。４０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により、不溶性物質を除去した。
【００８１】
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５％グリセロール、ｐＨ７．８で平衡させた５ｍｌＰｒｏｂｏｎｄ樹脂カラム（Invitrogen）に、清澄化細胞溶解物を適用した。次にカラムを１０カラム容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５％グリセロール、ｐＨ６．０で洗浄した。５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５％グリセロール、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．０を用いて、結合タンパク質を溶離した。
【００８２】
タンパク質を低塩緩衝液（２５ｍＭトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ８．０）に対して一晩透析し、次に遠心分離して、あらゆる粒状物質を除去した。次にタンパク質試料を、低塩緩衝液で予備平衡させておいたＭｏｎｏ−Ｑカラム（Pharmacia）上に載せた。低塩緩衝液を用いた１０カラム容積洗浄後、０Ｍ塩化ナトリウム〜１Ｍ塩化ナトリウム（２５ｍＭトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ８．０中）間の勾配を用いて、２０カラム容積以上で結合タンパク質を溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより、溶離プロフィールに関するピークを分析した。
【００８３】
次にAmicon社のＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹ-１０カラムを用いて、ＧＨ−タンデムタンパク質を（必要な場合）濃縮した。
【００８４】
クマシー染色およびウエスタンブロットの両方により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製χ１Ｃ１の純度を確証した（図８）。一旦この試料の完全性が確証されれば、χ１Ｃ１を、前に確立されたバイオアッセイ（Ross et al., 1997）に付した（図９）。
【００８５】
レプチン−タンデムのクローニング
プライマーＬｅｐ２ＴｒｃＦＯＲおよびＬｅｐ２ＴｒｃＲＥＶ（図２）を用いたＰＣＲを用いて、ｐＨＥＡＴＬｅｐｔｉｎから、（ＮｈｅＩ）−ＬＥＰＴＩＮ−（ＮｏｔＩ）−（ＸｈｏＩ）−（ＳａｌＩ）−ＳＴＯＰ−（ＥｃｏＲＩ）から成るＤＮＡ配列を生成した。ＰＣＲにより末端制限部位を導入し、内部制限部位はｐＨＥＡＴＬｅｐｔｉｎベクター中にすでに存在した。生成されたＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位間のｐＴｒｃＨｉｓχ１Ａ１に結繋して、ｐＴｒｃＨｉｓＬｅｐｔｉｎを産生した。
【００８６】
次にＰＣＲを用いて、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ制限部位が側面に位置する（Ｇ４Ｓ）４コードリンカーを生成し、用いたプライマーはＬｅｐＬｉｎｋＦＯＲおよびＬｅｐＬｉｎｋＲＥＶであった（図２）。これを、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位間でｐＴｒｃＨｉｓＬｅｐｔｉｎに結繋して、ｐＴｒｃＨｉｓＬｅｐＬｉｎｋを産生した。
【００８７】
プライマーＬｅｐ２ＦＯＲおよびＬｅｐ２ＲＥＶ（図２）を用いて、ＰＣＲにより、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ制限部位が側面に位置する二次レプチン遺伝子を生成した。これをＸｈｏＩおよびＳａｌＩ制限部位間に結繋して、レプチンタンデムｐＴｒｃＨｉｓχ２Ｃ１を発現する構築物を生成した。レプチン−タンデムのこの生成方法を、図１０に示す。
【００８８】
このプラスミドを大腸菌ＳＵＲＥ細胞中に形質転換し、発現試験を実行し、発現の可視化をウエスタンブロットにより実施した（図１１）。
【００８９】
【表１−１】
2005529583.tif 000003
【００９０】
【表１−２】
2005529583.tif 000004
【００９１】
【表１−３】
2005529583.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ｐＴｒｃＨｉｓχ１Ａ１のプラスミドマップを例示する。
【図２】タンデム構築物の合成に用いられるプライマーを例示する。
【図３】ｐＴｒｃＨｉｓχ１Ｃ１の構築のための模式図である。ｐＴｒｃＨｉｓχ１Ｃ２を同様に構築するが、しかしながら用いられるフォワードプライマーはＤｉＧＨＮｏｔＦであり、用いられる制限酵素はＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩである。
【図４】トロンビン切断性リンカーにより分離された成長ホルモンタンデムに関するＤＮＡ配列を例示する。リンカー領域をイタリック体で示し、トロンビン切断部位を太字で示す。
【図５】トロンビン切断性リンカーにより分離された成長ホルモンタンデムに関するタンパク質配列を例示する。リンカー領域をイタリック体で示し、トロンビン切断部位を太字で示す。
【図６】トロンビン切断性リンカーにより分離されたレプチンタンデムに関するＤＮＡ配列を例示する。リンカー領域をイタリック体で示し、トロンビン切断部位を太字で示す。
【図７】トロンビン切断性リンカーにより分離されたレプチンタンデムに関するタンパク質配列を例示する。リンカー領域をイタリック体で示し、トロンビン切断部位を太字で示す。切断性リンカーは、この構築物においては任意選択である。
【図８】精製ＧＨ−タンデム（χ１Ｃ１）のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロットを示す。
【図９】χ１Ｃ１に関して生じたバイオアッセイデータ、ならびに比較のための企業内(in-house)合成ＧＨおよび市販のＧＨに関するデータである。タンデムの活性は、企業内生成ＧＨに類似する。各々の場合、用いた試験タンパク質の濃度は、０ｎｇ、６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇおよび１００ｎｇであった。
【図１０】ｐＴｒｃＨｉｓχ２Ｃ１の構築を例示する模式図である。
【図１１】大腸菌ＳＵＲＥ：ｐＴｒｃＨｉｓχ２Ｃ１細胞のクローンにより発現されたタンパク質が走行するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットを示す。レプチン−タンデムの予測サイズは〜３７ｋＤａであり、かすかな帯域がこのサイズで観察される。しかしながら主要帯域はこのサイズの約半分である。これは、レプチンタンデムが発現されているが、しかしほとんどおそらくは、単一レプチンドメインに切断される、ということを示唆する。
【図１】
2005529583.tif 000006
【図２】
2005529583.tif 000007
【図３】
2005529583.tif 000008
【図４】
2005529583.tif 000009
【図５】
2005529583.tif 000010
【図６】
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【図７】
2005529583.tif 000012
【図８】
2005529583.tif 000013
【図９】
2005529583.tif 000014
【図１０】
2005529583.tif 000015
【図１１】
2005529583.tif 000016
【国際調査報告】
2005529583.tif 000017
2005529583.tif 000018
2005529583.tif 000019
2005529583.tif 000020
2005529583.tif 000021