(57)【要約】本発明は、哺乳動物において抗原の免疫原性を増大させるための方法及び組成物に関し、該方法は、該抗原をグリコシルセラミド、好ましくはα-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）を含むアジュバント組成物と共に投与することを含む。本発明に従って、アジュバントとしてのグリコシルセラミドの使用によって、少なくとも部分的に抗原特異的Th1-型応答、特にCD8+Ｔ細胞応答が増大及び／または延長する。本発明の方法及び組成物は、種々の感染性疾患及び新生物疾患の予防及び治療に有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において抗原の免疫原性を増大させる方法であって、該動物を該抗原及び一般式１のグリコシルセラミドを含有するアジュバントで併せて免疫することを含む、上記方法。
【化１】
2005500336.tif 000019
［式中、R1、R2及びR5はＨまたは特定の単糖を示し、R3及びR6はそれぞれＨまたはＯＨを示し、R4はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し、Xは１から２３までの整数を示し、R7は以下の(a)から(g)の基：(a)-(CH2)11-CH3、(b)-(CH2)12-CH3、(c)-(CH2)13-CH3、(d)-(CH2)9-CH(CH3)2、(e)-(CH2)10-CH(CH3)2、(f)-(CH2)11-CH(CH3)2、(g)-(CH2)11-CH(CH3)-C2H5、のいずれかを示す。］
【請求項２】
上記グリコシルセラミドが、α-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）、α-グルコシルセラミド（α-GlcCer）、Galα1-6Galα1-1'Cer、Galα1-6Glcα1-1'Cer、Galα1-2Galα1-1'Cer、及びGalβ1-3Galα1-1'Cerからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記α-GalCerが(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記抗原及び上記アジュバントを同時に投与する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記抗原がマラリア特異的である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記マラリア特異的抗原が照射されたマラリア原虫スポロゾイトを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記マラリア特異的抗原が、マラリアスポロゾイト周囲（CS）タンパク質のＴ細胞エピトープを含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
上記抗原がHIV特異的である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
上記抗原が、該抗原を発現する組み換えウイルスによって提示される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
上記ウイルスが、組み換えアデノウイルス、組み換えポックスウイルス、及び組み換えシンドビスウイルスからなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
上記哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物における抗原特異的Th1-型免疫応答の持続期間を増大または延長させる方法であって、該動物に(i)抗原、及び(ii)一般式１のグリコシルセラミドを含むアジュバント、を併せて投与することを含む、上記方法。
【化２】
2005500336.tif 000020
［式中、R1、R2及びR5はＨまたは特定の単糖を示し、R3及びR6はそれぞれＨまたはＯＨを示し、R4はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し、Xは１から２３までの整数を示し、R7は以下の(a)から(g)の基：(a)-(CH2)11-CH3、(b)-(CH2)12-CH3、(c)-(CH2)13-CH3、(d)-(CH2)9-CH(CH3)2、(e)-(CH2)10-CH(CH3)2、(f)-(CH2)11-CH(CH3)2、(g)-(CH2)11-CH(CH3)--C2H5、のいずれかを示す。］
【請求項１３】
上記Th1-型免疫応答がCD8+Ｔ細胞応答である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物における疾患を治療する方法であって、該哺乳動物に抗原、及び一般式１のグリコシルセラミドを含むアジュバントを併せて投与することを含む、上記方法。
【化３】
2005500336.tif 000021
［式中、R1、R2及びR5はＨまたは特定の単糖を示し、R3及びR6はそれぞれＨまたはＯＨを示し、R4はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し、Xは１から２３までの整数を示し、R7は以下の(a)から(g)の基：(a)-(CH2)11-CH3、(b)-(CH2)12-CH3、(c)-(CH2)13-CH3、(d)-(CH2)9-CH(CH3)2、(e)-(CH2)10-CH(CH3)2、(f)-(CH2)11-CH(CH3)2、(g)-(CH2)11-CH(CH3)-C2H5、のいずれかを示す。］
【請求項１５】
上記グリコシルセラミドが、α-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）、α-グルコシルセラミド（α-GlcCer）、Galα1-6Galα1-1'Cer、Galα1-6Glcα1-1'Cer、Galα1-2Galα1-1'Cer、及びGalβ1-3Galα1-1'Cerからなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
上記α-GalCerが(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
上記疾患が感染及び癌からなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
上記感染が、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、及び真菌感染からなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
上記疾患がマラリアである、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
上記疾患がHIV感染である、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
上記哺乳動物がヒトである、請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
一般式１のグリコシルセラミド：
【化４】
2005500336.tif 000022
［式中、R1、R2及びR5はＨまたは特定の単糖を示し、R3及びR6はそれぞれＨまたはＯＨを示し、R4はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し、Xは１から２３までの整数を示し、R7は以下の(a)から(g)の基：(a)-(CH2)11-CH3、(b)-(CH2)12-CH3、(c)-(CH2)13-CH3、(d)-(CH2)9-CH(CH3)2、(e)-(CH2)10-CH(CH3)2、(f)-(CH2)11-CH(CH3)2、(g)-(CH2)11-CH(CH3)-C2H5、のいずれかを示す。］
を含む免疫原として有効な量のアジュバントを含有する医薬組成物。
【請求項２３】
上記グリコシルセラミドが、α-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）、α-グルコシルセラミド（α-GlcCer）、Galα1-6Galα1-1'Cer、Galα1-6Glcα1-1'Cer、Galα1-2Galα1-1'Cer、及びGalβ1-3Galα1-1'Cerからなる群から選択される、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
上記α-GalCerが(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールである、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
更に薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含有する、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２６】
更に免疫原として有効な量の抗原を含有する、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２２記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において抗原によって誘導される防御免疫を増大させる方法。
【請求項２８】
請求項２２記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における疾患を治療する方法。
【請求項２９】
上記疾患が感染及び癌からなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
上記感染が、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、及び真菌感染からなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
上記疾患がマラリアである、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
上記疾患がHIV感染である、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
免疫原として有効な量の抗原と、一般式１のグリコシルセラミド：
【化５】
2005500336.tif 000023
［式中、R1、R2及びR5はＨまたは特定の単糖を示し、R3及びR6はそれぞれＨまたはＯＨを示し、R4はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し、Xは１から２３までの整数を示し、R7は以下の(a)から(g)の基：(a)-(CH2)11-CH3、(b)-(CH2)12-CH3、(c)-(CH2)13-CH3、(d)-(CH2)9-CH(CH3)2、(e)-(CH2)10-CH(CH3)2、(f)-(CH2)11-CH(CH3)2、(g)-(CH2)11-CH(CH3)-C2H5、のいずれかを示す。］
を含む免疫原として有効な量のアジュバントとを含有するワクチン組成物。
【請求項３４】
上記グリコシルセラミドが、α-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）、α-グルコシルセラミド（α-GlcCer）、Galα1-6Galα1-1'Cer、Galα1-6Glcα1-1'Cer、Galα1-2Galα1-1'Cer、及びGalβ1-3Galα1-1'Cerからなる群から選択される、請求項３３記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
上記α-GalCerが(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールである、請求項３４記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
更に薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含有する、請求項３３記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
スポロゾイト段階のマラリアに対する免疫を、罹患の可能性の有る哺乳動物宿主に付与する方法であって、該宿主に
(i)第一の量の、スポロゾイト表面抗原からなる群から選択される少なくとも１種のマラリア特異的抗原、及び
(ii)第二の量の、免疫アジュバントとしてのα-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）、
を併せて投与することを含み、該アジュバントの併用投与なしに第一の量の抗原を投与した際に宿主が有し得る免疫応答と比較して、宿主による該抗原に対する免疫応答を増大または延長するのに該第一の量と該第二の量が組み合わせで有効である、上記方法。
【請求項３８】
上記α-GalCerが(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
上記抗原及び上記アジュバントを同時に投与する、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
上記マラリア特異的抗原が、マラリア原虫スポロゾイト周囲（CS）タンパク質のＴ細胞エピトープを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
上記Ｔ細胞エピトープが、YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK（配列番号１）、SYVPSAEQI（配列番号２）、(NVDPNANP)n（配列番号３）、及びEYLNKIQNSLSTEWSPCSVT（配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
上記マラリア特異的抗原が、マラリア原虫スポロゾイト周囲（CS）タンパク質のＢ細胞エピトープを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
上記Ｂ細胞エピトープがアミノ酸配列(NANP)3（配列番号１５）を有する、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
上記マラリア特異的抗原が、該抗原を発現する組み換えウイルスによって提示される、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
上記ウイルスが、組み換えアデノウイルス、組み換えポックスウイルス、及び組み換えシンドビスウイルスからなる群から選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
上記宿主がヒトである、請求項３７記載の方法。
【請求項４７】
免疫応答の上記増大または延長が、抗原特異的CD8+Ｔ細胞応答持続期間の増大または延長によって現れる、請求項３７記載の方法。
【請求項４８】
上記第一の量が、体重１kg当たり0.1μg〜100mgの範囲である、請求項３７記載の方法。
【請求項４９】
上記第二の量が、体重１kg当たり10〜100μgの範囲である、請求項３７記載の方法。
【請求項５０】
HIV抗原に対するＴ細胞応答を、罹患し得る哺乳動物宿主において増大させる方法であって、該宿主に
(i)第一の量の、Gag、Tat、Pol、Env、Nef、gp160、p18、及びgp120からなる群から選択される少なくとも１種のHIV特異的抗原、及び
(ii)第二の量の、免疫アジュバントとしてのα-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）を併せて投与することを含み、該アジュバントの併用投与なしに第一の量の抗原を投与した際に宿主が有し得る免疫応答と比較して、宿主による該抗原に対するＴ細胞応答を増大するのに該第一の量と該第二の量が組み合わせで有効である、上記方法。
【請求項５１】
上記α-GalCerが(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールである、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
上記HIV特異的抗原及び上記アジュバントを同時に投与する、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
上記アジュバントを上記抗原の１時間前に投与する、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
上記HIV特異的抗原が、Gag、Tat、Env、Pol、Nef、gp160、p18またはgp120のＴ細胞エピトープを含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
上記Ｔ細胞エピトープが、RGPGRAFVTI（配列番号５）、KAFSPEVIPMF（配列番号６）、KAFSPEVI（配列番号７）、TPQDLNMML（配列番号８）、TPQDLNTML（配列番号９）、DTINEEAAEW（配列番号１０）、KRWIILGLNK（配列番号１１）、及びQATQEVKNW（配列番号１２）、RLRPGGKKK（配列番号１３）、及びSLYNTVATL（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
上記HIV特異的抗原が、該抗原を発現する組み換えウイルスによって提示される、請求項５０記載の方法。
【請求項５７】
上記ウイルスが、組み換えアデノウイルス、組み換えポックスウイルス、及び組み換えシンドビスウイルスからなる群から選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５８】
上記宿主がヒトである、請求項５０記載の方法。
【請求項５９】
上記第一の量が、体重１kg当たり0.1μg〜100mgの範囲である、請求項５０記載の方法。
【請求項６０】
上記第二の量が、体重１kg当たり10〜100μgの範囲である、請求項５０記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも１種の抗原、及び一般式１のグリコシルセラミド：
【化６】
2005500336.tif 000024
［式中、R1、R2及びR5はＨまたは特定の単糖を示し、R3及びR6はそれぞれＨまたはＯＨを示し、R4はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し、Xは１から２３までの整数を示し、R7は以下の(a)から(g)の基：(a)-(CH2)11-CH3、(b)-(CH2)12-CH3、(c)-(CH2)13-CH3、(d)-(CH2)9-CH(CH3)2、(e)-(CH2)10-CH(CH3)2、(f)-(CH2)11-CH(CH3)2、(g)-(CH2)11-CH(CH3)-C2H5、のいずれかを示す。］
を含むアジュバントを含有するワクチン組成物の調製方法であって、該アジュバント及び該抗原を混合することを含む、上記方法。
【請求項６２】
少なくとも１種の抗原及びアジュバントを含有する医薬組成物またはワクチン組成物の調製のためのキットであって、該アジュバントが一般式１のグリコシルセラミド：
【化７】
2005500336.tif 000025
［式中、R1、R2及びR5はＨまたは特定の単糖を示し、R3及びR6はそれぞれＨまたはＯＨを示し、R4はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し、Xは１から２３までの整数を示し、R7は以下の(a)から(g)の基：(a)-(CH2)11-CH3、(b)-(CH2)12-CH3、(c)-(CH2)13-CH3、(d)-(CH2)9-CH(CH3)2、(e)-(CH2)10-CH(CH3)2、(f)-(CH2)11-CH(CH3)2、(g)-(CH2)11-CH(CH3)-C2H5、のいずれかを示す。］
を含み、該キットが、第一の容器に抗原、第二の容器にアジュバント、及び場合によって抗原及びアジュバントを混合するための、及び／または組成物を投与するための説明書を含み、場合によって該容器がパッケージに入っている、上記キット。
【請求項６３】
アジュバントが、α-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）、α-グルコシルセラミド（α-GlcCer）、Galα1-6Galα1-1'Cer、Galα1-6Glcα1-1'Cer、Galα1-2Galα1-1'Cer、及びGalβ1-3Galα1-1'Cerからなる群から選択される、請求項６２記載のキット。
【請求項６４】
上記α-GalCerが(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールである、請求項６３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法（35U.S.C.）第１１９条第（ｅ）項に基づいて、2001年7月25日に出願された米国仮出願第60/308,056号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づき優先権を主張する。
【０００２】
本発明に至る研究は、その一部が国立衛生研究所の研究資金AI-01682、AI-40656、およびAI-47840により支援された。従って、米国政府は、本発明において所定の権利を所有する。
【０００３】
本発明は、様々な感染および腫瘍抗原の免疫原性を増大させるためのアジュバントとしてのグリコシルセラミドの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
予防的もしくは治療的免疫化に従う病原体、新生物細胞、または自己反応免疫機構の首尾よい排除は、免疫化に応答して活性化され、そして好ましくは健常な組織の損傷を最小限に留めて有効な応答を装架する宿主の免疫系の能力に大きな程度で依存する。
【０００５】
ワクチンを合理的に開発するには、はじめに、防御の免疫学的相関物（疾患に対する防御を担う免疫エフェクター機構）を同定し、その後、所望の適応応答を発揮することが可能な抗原を選択することを要する。一旦、このような適切な抗原が同定されれば、それを効果的に宿主の免疫系に送達することが不可欠である。
【０００６】
有効なワクチンの開発において、免疫学的アジュバントは、抗原特異的免疫応答を促進、延長、および／または増強し、ならびに適切なタイプの応答の選択的導入を提供する極めて重要な成分としての役割を果たす。
【０００７】
新たなワクチンは、様々な新生物疾患、自己免疫疾患ならびにヒト免疫不全ウイルス（HIV）および結核を含む伝染性疾患の制御のために現在開発ならびに試験が行われている。典型的に弱毒化された生の病原体または複製しない不活化された病原体に基づく従来のワクチンとは対照的に、現代のワクチンは、合成、組換え、または高度に精製されたサブユニット抗原から成る。サブユニットワクチンは、防御的免疫化に必要な抗原のみを含むように開発され、不活化全粒子型または弱毒生ワクチンよりも安全であると考えられる。しかし、サブユニット抗原が精製され、そして弱毒または死菌ワクチンに関連する自己アジュバント化免疫調節成分を含まないことにより、しばしば、免疫原性が減弱される。
【０００８】
比較的弱い抗原の免疫原性は、通常、単独で投与した場合に免疫原性ではないが抗原に対する免疫応答を誘発、増加および／または延長する物質である「アジュバント」と抗原との同時、あるいはより一般には併せて投与することによって増強することができる。アジュバントが存在しない場合、免疫応答が減少するかもしくは発生しないこともあり、またはさらに悪い場合には宿主が抗原に対して忍容性を示すこともある。
【０００９】
アジュバントは、構造的に異種の化合物の群において見出すことができる（Guptaら、1993, Vaccine, 11:293-306）。アジュバントの古典的に認識される例としては、オイルエマルジョン（例えば、フロイントのアジュバント）、サポニン、アルミニウムまたはカルシウム塩（例えば、ミョウバン）、非イオン性ブロックポリマー型界面活性剤、リポ多糖（LPS）、マイコバクテリア、破傷風トキソイドなどが挙げられる。理論的には、より顕著な免疫学的応答を究極的にもたらす免疫学的事象のカスケードにおいて、特定の状況を支持もしくは増幅することが可能なそれぞれの分子または物質をアジュバントとして規定することができる。
【００１０】
原則として、ワクチン処方でのアジュバントの使用を介して、（１）ワクチンに適切または所望である免疫応答を指令および最適化する；（２）ワクチンの粘膜送達、即ち、ワクチンと、口内または胃または肺上皮などの粘膜表面および関連するリンパ系組織との接触を生じる投与を可能にする；（３）細胞性免疫応答を促進する；（４）高度に精製されたかまたは組換え抗原などのより弱い免疫原の免疫原性を増強する；（５）抗原の量または防御免疫を提供するのに必要な免疫化の頻度を減少する；ならびに（６）新生児、高齢、および免疫欠陥状態のワクチンレシピエントなどの免疫応答が減少または減弱した個体におけるワクチンの有効性を改善することができる。
【００１１】
それらの作用様式についてはほとんど知られていないが、現在、以下の機構のうちの１つによってアジュバントは免疫応答を増大すると考えられている：（１）抗原の生物学的または免疫学的半減期を増加すること（例えば、Lascelles, 1989, Vet. Immunol. Immunopathol., 22:15-27; Freund, 1956, Adv. Tuber. Res., 7:130-147を参照のこと）；（２）抗原提示細胞（APC）への抗原送達、ならびに例えば、ＡＰＣによる抗原−アジュバント複合体の消化後に抗原がエンドソーム膜を横切ってサイトゾルに到達することを可能にする（Kovacsovics-Bankowskiら、Science, 1995, 267:243-246）ことによって、ＡＰＣによる抗原のプロセシングおよび提示（例えば、Fazekas de St. Grothら、Immunol. Today, 19:448-454, 1998を参照のこと）を改善すること；（３）微生物構造を模倣して、生得の免疫系由来の補助細胞に局在する病原体認識受容体（ＰＲＲ）による微生物由来抗原の認識を改善すること（Janeway, 1989, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 54:1-13; Medzhitov, 1997, Cell, 91:295-298; Rook, 1993, Immunol. Today, 14:95-96）；（４）免疫応答を開始する役割を果たすストレスまたは損傷を受けた細胞由来の危険誘導性シグナルを模倣すること（例えば、Matzinger, 1994, Annu. Rev. Immunol., 12:991-209を参照のこと）；（５）免疫調節性サイトカインの産生を誘導すること（例えば、Nohria, 1994, Biotherapy, 7:261-269；Iwasakiら、1997, J. Immunol., 158:4591-4601；Maeckerら、1997, Vaccine, 15:1687-1696を参照のこと）；（６）免疫応答を免疫系の特定のサブセットに偏向させる（例えば、Ｔｈ１またはＴｈ２型応答を作製すること［以下を参照のこと］など）（Janssenら、Blood, 97:2758-2763, 2001； Yamamotoら、Scand. J. Immunol., 53:211-217, 2001； Weiner G.J., J. Leukoc. Biol., 68:455-63,2000； Lucey, Infect. Dis. Clin. North Am., 13:1-9,1999）、ならびに（７）抗原攻撃の迅速な分散を阻止すること（「デポ効果（depot effect）」）（Hoodら、Immunology、第２版、1984、Benjamin/Cummings: Menlo Park, CA；St Clairら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:9469-9474, 1999； Ahaoら、J. Pharm. Sci., 85:1261-1270, 1996； Moreinら、Vet. Immunol. Immunopathol., 54:373-384, 1996）（また、Schijns, Curr. Opin. Immunol., 12:456-463, 2000；Vogel, Clin. Infect. Dis., 30［補遺３］：S266-70, 2000；SinghおよびO’Hagan, Nature Biotechnol., 17:1075-81, 1999；CoxおよびCoulter, Vaccine, 15:248-256, 1997による再検討を参照のこと）。
【００１２】
最近の観察により、内因的に産生されるサイトカインは、従来のアジュバントによって誘発される必須伝達シグナルとして作用することが強く示唆されている。サイトカインネットワークは余りに多く存在するため、特定のアジュバントの活性の由来を１つ以上のサイトカインに特定することは困難である。免疫原性に極めて重要なサイトカインとして、催炎（１型）物質：インターフェロン（IFN）−α／β、腫瘍壊死因子（TNF）−α、インターロイキン（IL）-1、IL-6、IL-12、IL-15およびIL-18を挙げることができ、これらは抗原提示に影響を及ぼす。他のサイトカインは、ＴならびにＢ細胞のクローン性増殖および分化中のより下流で作用することができ、プロトタイプとしてIL-2、IL-4およびIFN-ガンマがある（Brewerら、1996, Eur. J. Immunol., 26:2062-2066；Smithら、1998, Immunology, 93:556-562）。INF-γおよび遅延型過敏症の誘導を介して免疫応答を増強するアジュバントはまた、補体介在性溶解および抗体依存性細胞介在性細胞障害エフェクター機構において最も活性であるIgGサブクラス（例えば、マウスにおけるIgG2aおよびヒトにおけるIgG1）の産生をも誘発する（Allison, Dev. Biol. Stand., 1998, 92:3-11； Unkeless, Annu. Rev. Immunol., 1988, 6:251-81； Phillipsら、Vaccine, 1992, 10:151-8）。
【００１３】
明らかに、いくつかのアジュバントは、１つを超える機能を実施することができる。例えば、LPSまたはトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）の抽出物などの精製された微生物成分は、抗原提示樹状細胞（ＤＣ）の数およびそれらの移動だけではなく、IL-12の産生をも迅速に増加する（Souzaら、1997, J. Exp. Med., 186:1819-1829）。
【００１４】
異なるアジュバントは、多様な作用機構を有し得るため、特定のワクチンとの使用のためのそれらの選択は、用いようとする投与経路、所望される免疫応答のタイプ（例えば、抗体介在性、細胞介在性、粘膜など）、および１次抗原の特定の不適合性に基づくことができる。
【００１５】
免疫原性を増強するためにワクチン処方にアジュバントを組み入れる利益は、これらの因子が有害な局所および／または全身反応を誘導する危険性よりも、大きくあるべきである。局所有害反応には、注入部位での局所炎症、および稀に、肉芽腫または無菌性膿瘍形成の誘導が含まれる。実験動物において観察されるアジュバントに対する全身反応には、倦怠感、発熱、アジュバント関節炎、および前部ブドウ膜炎が挙げられる（Allisonら、Mol. Immunol., 1991, 28:279-84； Watersら、Infect. Immun., 1986, 51:816-25）。そのような反応は、しばしば、アジュバントおよび抗原自体の相互反応によって生じ得、アジュバントが生成する特定の抗原に対する応答のタイプ、またはアジュバントが誘導するサイトカインのプロフィールが原因であり得る。
【００１６】
従って、フロイントの完全またはフロイントの不完全アジュバントなどの多くの強力な免疫アジュバントは毒性であり、従って、動物の研究目的のみに有用であり、ヒトのワクチン化には有用ではない。現在、アルミニウム塩およびMF59は、ヒト使用のために承認されている唯一のワクチンアジュバントである。評価中である新規のアジュバントのうち、リポ多糖誘導性MPLおよびサポニン誘導体QS-21などの免疫刺激分子が最も有望であるようであるが、それらのヒト使用のための安全性については疑問が生じている。MF59マイクロエマルジョンおよび液−粒子免疫刺激複合体（ISCOM）などの微粒状アジュバントの前臨床研究は、これらの分子がそれ自体で体液性および細胞性免疫応答の強力な誘導因子であることを示唆している。さらに、CpGオリゴヌクレオチドに関する前臨床データは、特に、それらが免疫応答を選択的に操作する能力について有望視されているようである。これらの全てのアジュバントは有望性を示しているが、より強力な新規のアジュバントを開発することにより、新規のワクチンを開発し、新規および既存の両方のワクチンを治療ならびに改善された予防薬剤として使用することを可能にすることができる。
【００１７】
最近、主流であるＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞とは異なる新規のリンパ球系統、ナチュラルキラーＴ（NKT）細胞が同定された（Araseら、1992, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:6506； Bendelacら、1997, Annu. Rev. Immunol., 15:535）。これらの細胞は、ＮＫ細胞受容体、およびマウスのVα14およびJα281遺伝子セグメントならびにヒトのVα24およびJαQ遺伝子セグメントによってコードされる半インバリアントＴ細胞受容体（TCR）の共発現を特徴とする。NKT細胞をin vivoで活性化すると、一連の細胞の活性化事象が誘導され、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および樹状細胞（ＤＣ）などの生来の細胞の活性化、Ｂ細胞およびＴ細胞などの適応細胞の活性化、共刺激分子の誘導、ならびにインターロイキン−４（IL-4）およびインターフェロン−γ（IFN-γ）などのサイトカインの急速な放出がもたらされる（Burdinら、Eur. J. Immunol. 29:2014-2025, 1999； Carnaudら、J. Immunol., 163:4647-4650, 1999； Kitamuraら、J. Exp. Med., 189:1121-1128, 1999；Kitamuraら、Cell Immunol., 199:37-42, 2000； AderemおよびUlevitch, Nature, 406:782-787, 2000）。さらに、活性化されたNKT細胞は、それ自体でFasおよびパーフォリンによって介在される (細胞)障害活性を生じさせることができる。全活性化カスケードは、NKT TCRの系合によって補充することができる。あるいは、強力なＴヘルパー細胞１型（Th1）機能は、感染させたマクロファージまたはＤＣによって放出されるインターロイキン−１２（IL-12）などのサイトカインによって選択的に誘発させることができる。これらの機能は、おそらく、自己免疫性糖尿病などの症状、確立した腫瘍の拒絶または化学的に誘導される腫瘍の予防におけるNKT細胞の重要な役割に相関すると考えられる（Yoshimotoら、1995, Science, 270:1845； Hammondら、J. Exp. Med., 187:1047-1056, 1998； Kawanoら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:5690； Lehuenら、J. Exp. Med., 188:1831-1839, 1998； Wilsonら、Nature, 391:177-181, 1998； Smythら、J. Exp. Med., 191:661-668, 2000）。最終的に、NKT細胞は、Th1-Th2偏向に影響を及ぼすそれらの能力を介して抗微生物免疫に寄与すると考えられる（Cuiら、J. Exp. Med., 190:783-792, 1999； Singhら、J. Immunol., 163:2373-2377, 1999； ShinkaiおよびLocksley, J. Exp. Med., 191:907-914, 2000）。従って、これらの細胞は、生得の免疫応答において重要なエフェクターであるとみなされる。しかし、適応免疫応答の発達におけるNKT細胞の潜在的役割については依然として不明である。
【００１８】
最近、ＮＫＴ細胞は、元は沖縄産海綿から抽出された糖脂質（Natoriら、Tetrahedron, 50:2771-2784, 1994）、またはその合成類似体KRN7000［(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4,-オクタデカントリオール］（キリンビール、医薬探索研究所（Pharmaceutical Research Laboratories）（日本、群馬県）より入手することができる）、または先に記載のように合成される（例えば、Kobayashiら、1995, Oncol. Res., 7:529-534； Kawanoら、1997, Science, 278:1626-9； Burdinら、1998, J. Immunol., 161:3271； Kitamuraら、1999, J. Exp. Med., 189:1121；米国特許第5,936,076号を参照のこと）ようなα−ガラクトシル−セラミド（α-GalCer）によりin vitroおよびin vivoの両方で活性化することができる。従って、α-GalCerは、NKT細胞によってＮＫ活性およびサイトカイン産生を刺激し、in vivoで強力な抗腫瘍活性を示すことができることが示された（Kawanoら、1997、上掲；Kawanoら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:5690； Kitamuraら、1999、上掲）。Kitamuraら（1999、上掲）は、α-GalCerの免疫刺激効果は、CD40-CD40L介在性NKT-DC相互作用によって開始されることを実証した。α-GalCerの免疫調節機能はCD1d-/-およびNKT欠損マウスの両方に存在しないため、これは、α-GalCerがMHCクラスＩ様分子CD1dによって提示されるべきであることを示す。
【００１９】
CD1は、Ｔ細胞に脂質および糖脂質抗原を提示するように発達してきたとおもわれるMHCに関連する非多型性遺伝子の保存されたファミリーであり、このような方法で、抗原認識の生来および適応両方の経路に参加する（ParkおよびBendelac, Nature, 406:788-792, 2000により再検討されており；また、Calabiら、Eur. J. Immunol., 19:285-292, 1989；PorcelliおよびModlin, Annu. Rev. Immunol., 17:297-329, 1999をも参照のこと）。それは、配列相同性に基づいて２つの群に分離することができる５つまでの異なる遺伝子（イソタイプ）を含む。CD1a、CD1b、CD1cおよびCD1eを含むグループ１はヒトには存在するが、マウスおよびラットには存在しない。CD1dを含むグループ２は、これまでのところヒトを含むすべての種において見出される。
【００２０】
CD1イソタイプは、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージおよびＢ細胞のサブセットなどの抗原提示細胞によって選択的に発現されるが、肝細胞でのCD1d発現は別として、それらは、一般に固形組織では発現されない（Porcelliら、上掲；Bendelacら、Annu. Rev. Immunol., 15:535-562, 1997）。
【００２１】
α-GalCerは、半インバリアントTCRを発現し、強力なエフェクターおよび調節機能を発揮するマウスおよびヒトのCD1d拘束性リンパ球中のリンパ球によってピコモル濃度で認識される（Kawanoら、Science, 278:1626-1629, 1997）。次いで、CD1d/α-GalCer複合体は、マウスVα14およびヒトVα24ナチュラルキラーＴ（NKT）細胞の抗原受容体によって認識される（Bendelacら、Science, 268:863-865, 1995； Bendelacら、Annu. Rev. Immunol., 15:535-562, 1997；Parkら、Eur. J. Immunol., 30:620-625, 2000）。
【００２２】
CD1dに結合することにより、α-GalCerは、in vivoおよびin vitroでマウスNKT細胞（Kawanoら、1997, Science, 278:1626-1629; Burdinら、1998, J. Immunol., 161:3271-3281）、ならびにin vitroでヒトNKT細胞（Spadaら、1998, J. Exp. Med., 188:1529-1534； Brossayら、1998, J. Exp. Med. 188:1521-1528）を活性化することが実証された。例えば、α-GalCerは、ヒトNKT細胞を活性化することによって、in vitroでNKT介在性抗腫瘍活性を表すことが示された(Kawanoら、1999, Cancer Res., 59:5102-5105)。
【００２３】
α-GalCerに加えて、（α−グリコシルセラミド［α-GlcCer］、Galα1-6Galα1-1’Cer、Galα1-6Glcα1-1’Cer、Galα1-2Galα1-1’Cer、およびGalβ1-3Galα1-1’Cerのような）糖部分のα−アノマーのコンフォメーションおよびフィトスフィンゴシンの3,4-水酸基を有する他のグリコシルセラミドは、有効性は低いものの、マウスのVα14NKT細胞の増殖を刺激することが実証されている（Kawanoら、Science, 278:1626-1629, 1997）。マウスのVα14NKT細胞ハイブリドーマによって反応性についてα-GalCer類似体の一対象群を試験することにより、Brossayら（J. Immunol., 161:5124-5128, 1998）は、２４〜２個の炭素のα-GalCerアシル鎖をほぼ完全に切断してもマウスCD1またはそのヒト相同物によって提示される糖脂質に対するマウスNKT細胞反応にはそれほど影響を及ぼさないことを見出した。
【００２４】
また、α-GalCerのin vivo投与は、CD1d拘束性機構によってNKT細胞の活性化を引き起こして強力なＮＫ活性およびサイトカイン産生（例えば、IL-4、IL-12およびIFN-γ）を誘導するだけではなく、獲得免疫に関与する免疫調節細胞の活性化を誘導することが実証されている（Nishimuraら、2000, Int. Immunol., 12:987-994）。具体的には、マクロファージおよびNKT細胞の活性化に加えて、α-GalCerのin vivo投与により、CD4+T細胞、CD8+細胞およびＢ細胞に対する初期活性化マーカーCD69の誘導が生じることが示された（Burdinら、1999, Eur. J. Immunol. 29:2014； Singhら、1999, J. Immunol. 163:2373；Kitamuraら、2000, Cell. Immunol. 199:37; Schofieldら、1999, Science 283:225;Eberlら、2000, J. Immunol., 165:4305-4311）。これらの研究は、α-GalCerが、NKT細胞によって介在される生得の免疫だけではなく、Ｂ細胞、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞およびＴ細胞障害性（Ｔｃ）細胞によって介在される適応免疫への橋渡しにも同様に重要な役割を果たし得る可能性を開く。
【００２５】
新たな腫瘍特異的抗原の同定ならびに免疫系が癌の予防および腫瘍増殖の制御に極めて重要な役割を果たすことの認識により、近年、（例えば、腫瘍の付加量を減少し、転移を制御するために）治療用癌ワクチンの開発が改めて注目されている。
【００２６】
糖脂質リガンドα-GalCerによるNKT細胞のin vivoでの系合が生来および適応免疫に一般的であるエレメントに関与する細胞活性化のカスケードならびに腫瘍特異的細胞障害性Ｔ細胞の産生を誘導することが実証された（Nishimuraら、2000、上掲）ことにより、α-GalCerの投与は、その後の免疫応答、特に腫瘍細胞に対して指令される応答の速さおよび強度だけではなく、タイプにも一般に影響を及ぼすことが示唆される。実際、Kabayashiら（1995, Oncol. Res., 7:529-534）は、合成されたα-GalCer（KRN7000）が、OK432およびレンチナンなどの生物学的応答修飾物質ならびに化学療法剤マイトマイシンＣよりもB16担癌マウスにおいて強力な抗転移活性を有することを発見した。これらの実験では、担癌マウスの６０％が１００μg/kgのKRN7000による処置で治癒した。KRN7000はまた、マウスＴリンパ腫EL-4細胞（Nakagawaら、Oncol. Res., 10:561-568, 1998）またはColon26細胞（Nakagawaら、Cancer Res., 58:1202-1207, 1998）の肝転移を有するマウスにおいて顕著な腫瘍特異的免疫を誘導することが示された。さらに、α-GalCerのマウスへの投与は、原発性黒色腫の肝転移の進展を阻害することが見出された（Kawanoら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:5690-5693）。
【００２７】
上記のデータより、本発明者らは、グリコシルセラミド誘導性ＮＫＴ細胞はまた、様々な感染に対抗するのに関与する免疫応答にも寄与し得るという仮説を導き出した。実際、本発明者らおよび共同研究者らは、最近、α-GalCerをマウスに投与すると、強力な抗マラリア活性を生じ、齧歯類のマラリア原虫Ｐ．ヨエリ（P. yoeli）およびＰ．ベルグヘイ（P. berghei）の肝実質細胞内段階の発育を阻害することを観察した（Gonzalez-Aseguinolazaら、2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:8461-8466）。しかし、CD1dまたはVα14NKT細胞のいずれかを欠くマウスにα-GalCer単独を投与すると、マラリアに対してマウスを防御することができなかったことから、α-GalCerの抗マラリア活性にはNKT細胞およびCD1dの発現の両方が必要であることが示される。さらに、α-GalCerは、IFN-γあるいはIFN-γ受容体を欠くマウスの肝臓における寄生虫の発達を阻害することができなかったことから、糖脂質の抗マラリア活性は、主にIFN-γによって仲介される。
【００２８】
α-GalCerのNKT介在性抗腫瘍および抗寄生虫活性に関するデータに照らし合わせてみると、この糖脂質は防御免疫応答の強力な誘導因子であることが提唱される（例えば、ParkおよびBendelac、上掲を参照のこと）。本発明者らは、α-GalCerおよび関連するグリコシルセラミドが抗原としてではなく、他の抗原によって誘導される防御免疫応答を増強および／または持続期間を延長することが可能なアジュバントとして用いることができるのではないかと考え、これを世界で初めて実証することによって、これらの仮説を顕著に発展させた。α-GalCer介在性NKT細胞を活性化するとマラリア感染細胞が完全に排除され、従って、適応免疫応答の発達に必要な抗原の供給源が排除されるため、このことは予想外の発見である。事実、照射されたスポロゾイトによる免疫化の２日前にα-GalCerを投与すると、スポロゾイト誘導性防御がほぼ完全に撤廃される。従って、α-GalCerをアジュバントとして使用するためには、所定の抗原に関連する投与のタイミングが極めて重要である。
【００２９】
従って、本発明は、世界で初めて、（ｉ）抗原および（ｉｉ）グリコシルセラミド、特にα-GalCerを含むアジュバントによる哺乳動物の共同免疫化（conjoint immunization）に関与する哺乳動物、とりわけヒトにおける抗原に対する免疫応答を増強および／またはその持続期間を延長するための方法ならびに組成物を提供する。
【００３０】
重要なことに、免疫応答を刺激する能力に加えて、α-GalCerは、その用量とは独立して、齧歯類およびサルにおいて毒性を誘導性ないことが実証されている（Nakagawaら、1998,Cancer Res.,58:1202-1207）。さらに、最近の研究で、マウスにおけるα-GalCer処置の直後、肝臓の酵素活性が一過的に上昇し、若干の肝損傷が示唆されることが示された（Osmanら、2000,Eur.J.Immunol.,39:1919-1928）が、現在、顕著な合併症を伴わない癌患者を処置するためにα-GalCerを使用して、ヒト治験が行われている（Giacconeら、2000,Abstract.Proc.Amer.Soc.Clin.Oncol.,19:477a）。最後に、他の多くの新たに開発されたアジュバント（下記を参照のこと）とは異なり、α-GalCerおよび関連のグリコシルセラミドは、合理的な収率および有効性で合成して生成させることができる（例えば、米国特許第5,936,076号を参照のこと）。これらの全ての因子は、グリコシルセラミドおよび特にα-GalCerを所望のアジュバント候補にする。
【００３１】
α-GalCerおよび関連のグリコシルセラミドとは対照的に、ヒトの使用のために承認されている従来のワクチン送達システムおよびアジュバント、アルミニウム塩ならびにMF59（SinghおよびO’Hagan, Nat. Biotechnol., 17:1075-1081, 1999）は、CD8+Ｔ細胞応答を誘導する能力が劣る。精製されたサポニン、免疫刺激複合体、リポソーム、CpGDNAモチーフ、および組換え弱毒化ウイルス（例えば、アデノウイルス、シンドビス（Sindbis）ウイルス、インフルエンザウイルス、およびワクシニアウイルス）などの所定の新規のアジュバントは、単独または標準的なミョウバンアジュバントとの組み合わせで与えられる同じ抗原に誘導される応答を超えて、抗原特異的細胞性免疫応答を改善することが示されている（Newmanら、J. Immunol., 1992; 148:2357-2362； Takahashiら、Nature, 1990, 344:873-875； Babuら、Vaccine, 1995, 13:1669-1676； Powersら、J. Infect. Dis., 1995, 172:1103-7； Whiteら、Vaccine, 1995, 13:1111-1122； Kriegら、Trends Microbiol., 6:23-27, 1998； Rodriguesら、J. Immunol., 158: 1268-1274, 1997； Tsujiら、J. Virol., 72:6907-6910, 1998； Liら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5214-52188, 1993）が、現在利用可能なアジュバントで、ヒトにおいて低い毒性、生産性の費用効率および免疫系を効率的に刺激する能力を兼備するものはない。
【００３２】
適応免疫応答の発達は、多くのエレメントが参加する多因子現象である。この点について、α-GalCer活性化NKT細胞は、抗原提示細胞（APC）、Ｂ細胞、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞およびＴ細胞障害性（Ｔｃ）細胞などの適応免疫応答の発達に関与する多くのエレメントの活性を含む。従って、理論的には、α-GalCerは理想的な免疫調節物質であり得る。さらなる利点は、α-GalCerは、ヒトへの使用に適切な経口、皮下、および筋肉内経路を含む異なる多くの経路を介して投与し、免疫系を活性化することができる。最終的に、α-GalCerは齧歯類およびサルにおいて毒性を誘導しないことが示されている（Nakagawaら、Cancer Res.,58:1202-1207,1998）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
従って、当該技術分野では、低い毒性および容易な利用可能性と共に有意な程度で抗原特異的免疫応答を増強および／または延長する能力を兼備する新しいアジュバントを開発することが強く要求されている。本発明は、より優れた特性を有する新規の群のアジュバントであるグリコシルセラミドを提供することによって、当該技術分野におけるこれらおよび他の必要性に取り組んでいる。そのようなアジュバントは、様々な感染ならびに癌の処置のための予防および／または治療ワクチンを改善することができる。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明の目的は、哺乳動物における抗原の免疫原性を増大するための方法であって、該抗原及び一般式Ｉ：
【化１】
2005500336.tif 000002
【００３５】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５はＨまたは特定の単糖を示し；Ｒ３およびＲ６はそれぞれＨまたはＯＨを示し；Ｒ４はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し；Ｘは１〜２３の整数を示し；Ｒ７は以下の基（ａ）〜（ｇ）：（ａ）-(CH2)11-CH3、（ｂ）-(CH2)12-CH3、（ｃ）-(CH2)13-CH3、（ｄ）-(CH2)9-CH(CH3)2、（ｅ）-(CH2)10-CH(CH3)2、（ｆ）-(CH2)11-CH(CH3)2、（ｇ）-(CH2)11-CH(CH3)-C2H5、のいずれかを示す。］
のグリコシルセラミドを含むアジュバント組成物と併せて前記抗原を投与することを含む上記方法を提供する。
【００３６】
本発明の好適なアジュバントは、α−ガラクトシルセラミド（α-GalCer）、具体的には、式２：
【化２】
2005500336.tif 000003
【００３７】
によって表される(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールを含む。
【００３８】
本発明に従えば、グリコシルセラミドをアジュバントとして使用することにより、抗原によって誘導される防御免疫の増強および／またはその持続期間の延長が生じ、抗原特異的Th1型応答、特にCD8+Ｔ細胞応答の増強および／またはその持続期間の延長の少なくとも一部に起因する。
【００３９】
本発明のグリコシルセラミド含有アジュバントは、任意の抗原、特に、感染因子または腫瘍由来の抗原との併せて投与することができる。好ましくは、アジュバントおよび抗原は同時、最も好ましくは単一の剤形で投与される。
【００４０】
さらなる実施態様では、本発明は哺乳動物における疾患を処置するための予防および／または治療方法であって、前記哺乳動物に、グリコシルセラミドを含むアジュバント組成物と共に免疫防御抗原を投与することを含む、上記方法を提供する。本明細書に記載されているように、本方法は、様々な伝染性あるいは新生物疾患を予防および／または治療するのに有用であり得る。好適な実施例では、本発明の方法は、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、および真菌感染からなる群より選択される感染を治療するために用いられる。
【００４１】
従って、特定の実施態様では、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるマラリアのスポロゾイト段階に対する免疫を付与するための方法を開示し、ここで、前記方法は、前記哺乳動物に、マラリア特異的抗原およびα-GalCerを含む免疫アジュバントを併せて投与することを含む。別の特定の実施態様では、本発明は、哺乳動物におけるHIV感染に対する免疫応答を増強する（かつAIDSを潜在的に予防および／または治療する）ための方法を開示し、ここで、前記方法は、前記哺乳動物にHIV特異的抗原およびα-GalCerを含む免疫アジュバントを併せて投与することを含む。本明細書において開示されるさらなる特定の方法は：
（ｉ）ウシ結核菌カルメット−ゲラン菌（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin）およびα-GalCerを含む免疫アジュバントを投与することによって、結核菌（M. tuberculosis）感染の予防のために、ウシ結核菌カルメット−ゲラン菌に対する免疫応答を増強すること；
（ｉｉ）ヒト黒色腫関連抗原、gp100をコードするプラスミドcDNAおよびα-GalCerを含む免疫アジュバントを投与することによって、黒色腫に対する免疫応答を増強すること；
（ｉｉｉ）免疫優性抗原、65kDaマンノタンパク質（MP65）由来のペプチドおよびα-GalCerを含む免疫アジュバントを投与することによって、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する免疫応答を増大すること、
を含むが、それらに限定されない。
【００４２】
本発明の方法に連係して、免疫原として有効な量の抗原および式１内のグリコシルセラミドから選択される免疫原として有効な量のアジュバント、ならびに必要に応じて薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む医薬組成物ならびにワクチン組成物も提供される。特定の実施態様では、本発明のアジュバントの調製のために使用されるグリコシルセラミドは、α-GalCer、具体的には、［(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオール］である。
【００４３】
本発明の組成物において有用な抗原として、様々なウイルス、細菌、真菌、寄生虫特異的、および腫瘍特異的抗原が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のウイルス抗原の非制限的な例には、gp120、gp160、p18、Tat、Gag、Pol、Env、NefなどのHIV抗原；ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質；Ｂ型肝炎ウイルス由来の表面抗原およびコア抗原が含まれる。本発明の細菌抗原の非制限的な例には、ボレリア種（Borrelia sp.）由来のOspA、OspBおよびOspC抗原が含まれる。本発明の真菌および寄生虫抗原の非制限的な例には、それぞれカンジダ・アルビカンス由来のMP65およびプラスモジウム種（Plasmodium sp.）が含まれる。本発明の腫瘍特異的抗原の非制限的な例には、黒色腫由来のMelanAおよびgp100抗原が含まれる。
【００４４】
特定の実施態様では、抗原はマラリア特異的であり、例えば、照射されたマラリア原虫のスポロゾイトあるいはＰ．ヨエリＣＳタンパク質のCD4+Ｔ細胞エピトープYNRNIVNRLLGDALNGKPEEK（配列番号１）もしくはCD8+Ｔ細胞エピトープSYVPSAEQI（配列番号２）、またはＰ．ファルシパルム（P. falciparum）ＣＳタンパク質のCD4+Ｔ細胞エピトープ(NVDPNANP)ｎ（配列番号３）、もしくはCD4+/CD8+Ｔ細胞エピトープEYLNKIQNSLSTEWSPCSVT（配列番号４）などのマラリアスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質のＴ細胞エピトープを含む合成ペプチド抗原を含む。別の好適な実施態様では、抗原はHIV特異的であり、ｐ１８タンパク質のCD8+Ｔ細胞エピトープRGPGRAFVTI（配列番号５）またはHIV-1Gag p24 CD8+Ｔ細胞エピトープ（例えば、KAFSPEVIPMF（第３０〜４０アミノ酸残基、配列番号６）、KAFSPEVI（第３０〜３７アミノ酸残基、配列番号７）、TPQDLNM(もしくはT)ML（第１８０〜１８８アミノ酸残基、配列番号８および９）、DTINEEAAEW（第２０３〜２１２アミノ酸残基、配列番号１０）、KRWIILGLNK（第２６３〜２７２アミノ酸残基、配列番号１１）、ならびにQATQEVKNW（第３０８〜３１６アミノ酸残基、配列番号１２））、またはGag pl7 CD8+Ｔ細胞エピトープ（例えば、RLRPGGKKK（第２０〜２９アミノ酸残基、配列番号１３）およびSLYNTVATL（第７７〜８５アミノ酸残基、配列番号１４））などである。
【００４５】
特定の実施態様では、抗原は、前記抗原を発現する組換えウイルスによって提示される。好ましくは、ウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えポックスウイルス、およびシンドビスウイルスからなる群より選択される。
【００４６】
本発明はまた、少なくとも１種の抗原およびグリコシルセラミド含有アジュバントを含むワクチン組成物を調製するための方法を提供し、前記方法は、アジュバントおよび抗原を混合することを含む。
【００４７】
関連する実施態様では、本発明は、少なくとも１種の抗原およびグリコシルセラミド含有アジュバントを含む医薬組成物またはワクチン組成物の調製のためのキットを提供し、前記キットは、第１の容器に抗原、第２の容器にアジュバント、ならびに必要に応じて抗原とアジュバントとを混合するための、および／または組成物の投与のための説明書を含み；そしてここで、必要に応じて、容器はパッケージに入っている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
定義
用語「アジュバント」および「免疫アジュバント」は、本発明において交換可能に使用され、宿主に単独で投与する場合には非免疫原性であるが、別の抗原と併せて投与する場合には該抗原に対する宿主の免疫原性を増大させることができる化合物または混合物を指す。
【００４９】
免疫応答のアジュバント介在性増強および／またはその持続期間の延長は、次のうちの１つ以上を含むがそれらに限定されない当該技術分野において公知である任意の方法によって評価することができる：（ｉ）抗原のみによる免疫化に応答して産生される抗体の数に対して、アジュバント／抗原併用による免疫化に応答して産生される抗体の数の増加；（ｉｉ）抗原またはアジュバントを認識するＴ細胞の数の増加；ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のＩ型サイトカインのレベルの増加。
【００５０】
本発明のアジュバントは、スフィンゴ糖脂質のクラスに属する化合物、具体的には、一般式１：
【化３】
2005500336.tif 000004
【００５１】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５はＨまたは特定の単糖を示し；Ｒ３およびＲ６はそれぞれＨまたはＯＨを示し；Ｒ４はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し；Ｘは１〜２３の整数を示し；Ｒ７は次の基（ａ）〜（ｇ）：（ａ）-(CH2)11-CH3、（ｂ）-(CH2)12-CH3、（ｃ）-(CH2)13-CH3、（ｄ）-(CH2)9-CH(CH3)2、（ｅ）-(CH2)10-CH(CH3)2、（ｆ）-(CH2)11-CH(CH3)2、（ｇ）-(CH2)11-CH(CH3)-C2H5のいずれか１つを表す。］
で表すことができるグリコシルセラミドを含む。
【００５２】
本発明の好適なアジュバントは、α−ガラクトシルセラミド（α-GalCer）、具体的には、式２：
【化４】
2005500336.tif 000005
【００５３】
によって表される(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールを含む。
【００５４】
本発明のアジュバントに有用なグリコシルセラミドの他の例として：
α −グルコシルセラミド（α-GlcCer）、具体的には、式３：
【化５】
2005500336.tif 000006
【００５５】
の(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-グルコピラノシル)-N-ヘキサコサノイル-2-アミノ-1,3,4-オクタデカントリオール、
Galα1-6Galα1-1’Cer、具体的には、式４：
【化６】
2005500336.tif 000007
【００５６】
の(2S,3S,4R)-2-アミノ-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル-(1-6)-α-D-ガラクトピラノシル)-N-ヘキサコサノイル-1,3,4-オクタデカントリオール、
Galα1-6Glcα1-1’Cer、具体的には、式５：
【化７】
2005500336.tif 000008
【００５７】
の(2S,3S,4R)-2-アミノ-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル-(1-6)-α-D-グルコピラノシル)-N-ヘキサコサノイル-1,3,4-オクタデカントリオール、
Galα1-2Galα1-1’Cer、具体的には、式６：
【化８】
2005500336.tif 000009
【００５８】
の(2S,3S,4R)-2-アミノ-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル-(1-2)-α-D-ガラクトピラノシル)-N-[(R)-2-ヒドロキシテトラコサノイル]-1,3,4-オクタデカントリオール、
Galβ1-3Galα1-1’Cer 、具体的には、式７：
【化９】
2005500336.tif 000010
【００５９】
の(2S,3S,4R)-2-アミノ-1-O-(β-D-ガラクトフラノシル-(1-4)-α-D-ガラクトピラノシル)-N-[(R)-2-ヒドロキシテトラコサノイル]-1,3,4-オクタデカントリオールが挙げられるが、これらに限定しない。
【００６０】
好ましくは、本発明のアジュバントは、ヒトにおける使用について薬学的に許容し得るものである。
【００６１】
本発明のアジュバントは、抗原を含む医薬組成物もしくはワクチン組成物の部分または個別の処方として投与することができ、抗原を含有する第２の組成物と併せて投与される。これらの組成物のいずれにおいても、グリコシルセラミドは他のアジュバントおよび／または賦形剤／担体と併用することができる。これらの他のアジュバントには、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、MF59、またはSAFなどのオイルエマルジョンおよび乳化剤を基剤とするアジュバント、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、リン酸アルミニウムまたはリン酸カルシウムなどの鉱物ゲル；コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、変異毒素（例えば、LTK63もしくはLTR72）、ウシ型弱毒結核菌ワクチン（Bacille Calmette-Guerin）（BCG）、コリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）、DNA CpGモチーフ、ムラミルジペプチド、またはモノホスホリルリピドＡなどの微生物由来のアジュバント；免疫刺激複合体（ISCOM）リポソーム、生分解性微小球、またはサポニン（例えば、QS-21）などの粒子状アジュバント；IFN-γ、IL-2、IL-12またはGM-CSFなどのサイトカイン；非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類自体（例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン［thr-MDP］、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−［１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ］−エチルアミン）、ポリホスファゼン、または合成ポリヌクレオチドなどの合成アジュバント、およびリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、炭化水素エマルジョン、またはスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanins）（KLH）などの界面活性物質が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、これらのさらなるアジュバントもヒトにおける使用について薬学的に許容し得る。
【００６２】
本発明の意味の範囲内において、用語「併せて投与」は、免疫アジュバントおよび抗原を１つの組成物において同時に、もしくは異なる組成物において同時に、または順次投与することを指すために使用される。しかし、「併せて」とみなされる順次投与では、アジュバントが抗原に対する免疫応答を増大することがなお可能である時間間隔で個別に抗原およびアジュバントが投与されなければならない。例えば、抗原がポリペプチドである場合、抗原およびアジュバントは同日、好ましくは相互の１時間以内、および最も好ましくは同時に投与される。しかし、核酸が被験体に送達され、ポリペプチド抗原が被験体の細胞で発現される場合、アジュバントは核酸投与の２４時間以内、好ましくは６時間以内に投与される。
【００６３】
本明細書で使用される用語「免疫原性」とは、抗原が体液性または細胞性免疫応答、好ましくは両方を誘発することが可能であることを意味する。免疫原性を有するものはまた抗原性をも有する。免疫原性組成物は、免疫系を有する動物に投与される場合、体液性または細胞性免疫応答、あるいは両方を誘発する組成物である。
【００６４】
用語「抗原」は、免疫系を有する宿主、動物またはヒトに（直接または例えば、DNAワクチンにおいて発現時に）導入される場合、宿主の免疫系で認識され、免疫応答を誘発することが可能な任意の因子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸、またはそれらの組合せ）を指す。本明細書において規定されるように、抗原誘導性免疫応答は、体液性または細胞性、あるいは両方であることができる。因子は、それが免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体（TCR）などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することが可能である場合、「抗原性」であると呼ばれる。本発明の意味の範囲内において、抗原は、好ましくは「表面抗原」であり、即ち、病原体の表面または感染された細胞の表面または腫瘍細胞の表面上に天然に発現される。抗原性である分子は、それ自体で免疫原性である必要はなく、即ち、アジュバントまたは担体を伴わない場合には免疫応答を誘発し得る必要はない。
【００６５】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、Ｂ細胞、もしくはＴ細胞のいずれか一方、または両方によって認識される抗原に任意の部分を指す。好ましくは、免疫グロブリン（抗体）の抗原認識部位またはＴ細胞抗原受容体（TCR）を有するそのようなエピトープの相互作用は、抗原特異的免疫応答を誘導する。Ｔ細胞は、タンパク質がより小さなペプチドに切断され、別の細胞表面に位置する「腫瘍組織適合性遺伝子複合体（MHC）」と呼ばれる複合体において提示される。MHC複合体−クラスＩおよびクラスＩＩの２つのクラスが存在し、それぞれのクラスは多くの異なる対立遺伝子から構成される。クラスＩ  MHC複合体は、事実上全ての細胞上に見出され、細胞内に産生されるタンパク質からペプチドを提示する。従って、クラスＩ  MHC複合体は、ウイルスに感染した細胞または癌遺伝子の発現の結果として癌化した細胞を死滅させるのに有用である。それらの表面上にあるCD8と呼ばれるタンパク質を有するＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（TCR）を介してMHCクラスＩ／ペプチド複合体に特異的に結合する。これにより、細胞溶解エフェクター活性がもたらされる。クラスＩＩ  MHC複合体は、抗原提示細胞（APC）上においてのみ見出され、APCによって飲食された循環性病原体由来のペプチドを提示するために使用される。CD4と呼ばれるタンパク質を有するＴ細胞は、TCRを介してMHCクラスＩＩ／ペプチド複合体に結合する。これにより、免疫応答を刺激する特定のサイトカインの合成がもたらされる。MHCクラスＩ提示を介する免疫系によって効率的に認識されるために、抗原性ポリペプチドは少なくとも８〜１０アミノ酸のエピトープを含有しなければならないが、一方、MHCクラスＩＩ提示を介する免疫系によって効率的に認識されるためには、抗原性ポリペプチドは、少なくとも１３〜２５アミノ酸のエピトープを含有しなければならない。例えば、Fundamental Immunology、第３版、W. E. Paul編、1999、Lippincott-Raven Publ.を参照のこと。
【００６６】
用語「種特異的」抗原は、特定の種のみに存在するかまたは特定の種のみから誘導される抗原を指す。従って、用語「マラリア由来」または「マラリア特異的」抗原は、マラリア原虫（前記マラリア原虫として、Ｐ．ファルシパルム（P. falciparum）、Ｐ．ビバックス（P. vivax）、Ｐ．マラリア（P. malariae）、Ｐ．オバレ（P. ovale）、Ｐ．レイヘノウイ（P. reichenowi）、Ｐ．ノウレシ（P. knowlesi）、Ｐ．シノモルギ（P. cynomolgi）、Ｐ．ブラシリアヌム（P. brasilianum）、Ｐ．ヨエリ（P. yoelii）、Ｐ．ベルグヘイ（P. berghei）、またはＰ．チャバウディ（P. chabaudi）があるがこれらに限定されない）を構成し、少なくとも５〜１０アミノ酸残基を含むいずれか１つのタンパク質から誘導される少なくとも１種のエピトープ（Ｂ細胞および／またはＴ細胞）を含む天然の（例えば、照射されたスポロゾイト）または合成（例えば、化学的に生成される多抗原ペプチド［MAP］もしくは組換え合成されたポリペプチド）抗原を指す。抗原作製のための好適なマラリア原虫タンパク質はスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質であるが、しかし、他のタンパク質、例えば、トロンボスポンジン関連付着（名称なし）タンパク質（TRAP）（またスポロゾイト表面タンパク質２（SSP2）とも呼ばれる）、LSA I、hsp70、SALSA、STARP、Hepl7、MSA、RAP-1、RAP-2なども使用することができる。
【００６７】
用語「ワクチン」は、レシピエントにおいて防御免疫を誘発するために使用することができる組成物（例えば、アデノウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターなどのタンパク質またはベクター）を指す。いくつかの個体は、強力なもしくは防御免疫応答、または場合によって、いずれの免疫応答をも有し得ないことがあるため、有効であるために、本発明のワクチンは、免疫化された集団の一部において免疫を誘発することができることに留意すべきである。このような不能性は、個体の遺伝的背景、または免疫不全症状（後天的または先天的）または免疫抑制（例えば、化学療法による治療または臓器の拒絶を防止するかもしくは自己免疫症状を抑制するための免疫抑制薬の使用）のために生じ得る。ワクチンの有効性は、動物モデルにおいて確立することができる。
【００６８】
用語「DNAワクチン」は、当該技術分野において非公式な用語であり、本明細書では、組換えベクターによって送達されるワクチンを指すために使用される。本明細書において使用される代替的およびより説明的用語は「ベクターワクチン」である（レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのいくつかの潜在的ベクターはRNAウイルスであり、かつ場合により、ベクターを介して、DNAの代わりに非ウイルス性RNAが細胞に送達されるため）。一般に、ベクターはin vivoで投与されるが、形質導入された細胞をin vivoで導入することによる、樹状細胞（ＤＣ）などの適切な抗原提示細胞のex vivo形質導入も考慮される。
【００６９】
用語「治療する」は、被験体における疾患の少なくとも１つの徴候を緩和または軽減することを意味するために本明細書において使用される。本発明の意味の範囲において、用語「治療する」はまた、検出潜伏期、即ち、感染から疾患の臨床発現までの期間を延長することも意味し得る。おそらく、疾患は、伝染性疾患（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、もしくは真菌）または悪性（例えば、肉腫、癌腫、神経膠腫、芽腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、リンパ腫、白血病、黒色腫などの固形または血液腫瘍）のいずれか一方である。
【００７０】
用語「防御する」は、被験体における疾患の発達および継続を予防もしくは治療、またはその両方を適切に行うことを意味するために本明細書において使用される。本発明の意味の範囲において、疾患は、伝染性疾患（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、もしくは真菌）および悪性（例えば、肉腫、癌腫、神経膠腫、芽腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、リンパ腫、白血病、黒色腫などの固形または血液腫瘍）から選択される群より選択される。例えば、本明細書において開示されているように、マラリア原虫由来の抗原をを含む抗マラリアワクチンを、α-GalCerを含むアジュバントと併用して予防的に投与すると、マラリアを発達する危険性にあるレシピエント被験体を防御することができる。同様に、本発明に従えば、腫瘍特異的抗原を、α-GalCerまたは式１の別のグリコシルセラミドを含むアジュバントと併せて治療的に投与すると、抗腫瘍免疫応答を増大させて、腫瘍増殖および転移の低減または腫瘍の退縮さえももたらすことができる。
【００７１】
用語「防御免疫」は、前記抗原の負荷を不活化および／または減少し、長期継続免疫（例えば、抗体の産生を介して獲得される）をもたらす宿主動物における免疫応答（能動／獲得もしくは受動／生得のいずれか一方、または両方）を指し、これは、同じまたは関連抗原の反復暴露時に疾患の発達を予防または遅延する。「防御免疫応答」は、例えば、病原体または感染された細胞の負荷を排除もしくは減少するか、または免疫された（ワクチン接種した）被験体の腫瘍負荷を減少するのに有効な体液性（抗体）免疫もしくは細胞性免疫、またはその両方を含む。本発明の意味の範囲において、防御免疫はその定義の全てを完全に満たしていなくてもよい。
【００７２】
免疫系は、２つの一般的な系、「生得の」または「自然」免疫系および「獲得」または「適応」免疫系に分類される。生得の免疫系は、はじめに、感染を制御下に保ち、適応免疫が適切な応答を発達するための時間を許容する。最近の研究により、生得の免疫系の様々な成分が、抗原特異的ＢおよびＴリンパ球を含む適応免疫系の成分を誘発ならびに増大することが示唆されている（FearonおよびLocksley、上掲； Kos, 1998, Immunol. Res., 17:303； Romagnani, 1992, Immunol. Today, 13:379； BanchereauおよびSteinman,1988, Nature, 392:245）。
【００７３】
用語「生得の免疫」または「自然免疫」は、前回の抗原との接触に影響されない生来の免疫応答を指す。マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）を含む生得の免疫系の細胞は、パターン認識受容体を介して外来性抗原を取り込み、これらの抗原のペプチドフラグメントをMHCクラスＩおよびクラスＩＩ分子と結合し、それぞれ生得のCD8+およびCD4+Ｔ細胞を刺激する（BanchereauおよびSteinman、上掲； Holmskovら、1994, Immunol. Today, 15:67； UlevitchおよびTobias, 1995, Annu. Rev. Immunol., 13:437）。特化した抗原提示細胞（APC）は、これらのＴ細胞と連絡し、それぞれ細胞性および体液性免疫に介在する生得のCD4+Ｔ細胞をＴヘルパー１（Th1）またはＴヘルパー２（Th2）リンパ球への分化をもたらす（Trinchieri, 1995, Annu. Rev. Immunol., 13:251； HowardおよびO’Garra, 1992, Immunol. Today, 13:198； Abbasら、1996, Nature, 383:787； Okamuraら、1998, Adv. Immunol., 70:281； MosmannおよびSad, 1996, Immunol. Today, 17:138； O’Garra, 1998, Immunity, 8:275）。
【００７４】
用語「獲得免疫」または「適応免疫」は、動物の生涯の間に確立され、導入される抗原に対して特異的であり、そして前記抗原と反復して遭遇することで増強された応答によって特徴付けられるる能動または受動、体液性または細胞性免疫を意味するために本明細書において使用される。適応免疫系のＴリンパ球の重要な特徴は、細胞表面上に提示されたMHC分子によって提示された病原体由来のペプチドを微小な濃度で検出するそれらの能力である。
【００７５】
本明細書において使用される用語「免疫応答を増大する」は、免疫応答を増強もしくはその持続期間を延長するか、またはその両方である。因子（例えば、アジュバント）の特性に言及する場合、用語「免疫原性を増大する［ことが可能である］」は、抗原の免疫原性を増大する能力もしくは抗原に対する免疫応答の持続期間を延長する能力、またはその両方を指す。
【００７６】
本発明の意味の範囲内の語句「免疫応答を増強する」は、所定の抗原に対する免疫反応性の規模および／または効率を増加する特性あるいはプロセスを指し、前記免疫反応性は体液性もしくは細胞性免疫のいずれか一方、またはその両方である。免疫応答は、抗原特異的免疫反応性（例えば、抗体価、Ｔ細胞産生）の任意の測定可能なパラメータが少なくとも２倍、好ましくは１０倍、最も好ましくは３０倍増加する場合に、増加すると考えられる。
【００７７】
用量または量に適用される用語「治療上有効な」は、それを必要とする動物に投与した時に所望される活性が生じるのに十分な化合物または医薬組成物またはワクチンの量を指す。アジュバントおよび抗原含有組成物またはワクチンについて本明細書において使用される用語「治療有効量／用量」は、用語「免疫原として有効な量／用量」と交換可能に使用され、動物への投与時に有効な免疫応答を産生するのに十分な化合物（例えば、抗原および／またはグリコシルセラミドを含むアジュバント）あるいは医薬組成物あるいはワクチンの量または用量を指す。
【００７８】
本発明の組成物と合わせて使用される語句「薬学的に許容し得る」は、生理学的に忍容性であり、ヒトに投与した場合、典型的に不都合な反応を生じないような組成物の分子実態および他の成分を指す。好ましくは、本明細書において使用される用語「薬学的に許容し得る」は、哺乳動物、より好ましくはヒトにおける使用について、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他に一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。
【００７９】
本発明の医薬組成物またはワクチン組成物に適用される用語「担体」は、化合物（例えば、抗原および／またはグリコシルセラミドを含むアジュバント）と共に投与される希釈剤、賦形剤、もしくはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、水またはオイルなどの滅菌液体であることができ、ピーナツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成由来のものを含む。水または水溶液、食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセリン水溶液は、特に注射溶液の担体として好適に用いられる。適切な薬学的担体については、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、E. W. Martin、第１８版に記載されている。
【００８０】
用語「天然の抗体」または「免疫グロブリン」は、通常、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖から成る約150,000ダルトンのヘテロ４量体の糖タンパク質を指す。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合で重鎖に結合する一方、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンのイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔配置された鎖内のジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一方の末端で可変ドメイン（ＶＨ）、続いて多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の末端で可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端で定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと共に整列され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと共に整列される。特定のアミノ酸残基は軽鎖および重鎖可変ドメイン間で境界面を形成すると考えられる（Clothiaら、J. Mol. Biol., 186:651-663, 1985； NovotnyおよびHaber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596, 1985）。
【００８１】
用語「抗体」または「Ａｂ」は、最も広範な意味で使用され、特に、天然の抗体だけではなく、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、ならびにそれらが所望される生物学的活性を示す限り抗体フラグメント（例えば、Fab、F(ab’)2、scFvおよびFv）も含む。
【００８２】
「サイトカイン」は、細胞内メディエーターとして別の細胞集団に作用する１つの細胞集団によって放出される１群のタンパク質の属名である。そのようなサイトカインの例には、リンフォカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンがある。サイトカインの中には、インターフェロン（IFN、特にINF-γ）、インターロイキン（IL、特にIL-1、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12）、コロニー刺激因子（CSF）、トロンボポイエチン（TPO）、エリスロポイエチン（EPO）、白血病抑制因子（LIF）、キット−リガンド（kit-ligand）、成長ホルモン（GH）、インスリン様成長因子（IGF）、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、レラキシン、濾胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、黄体形成ホルモン（LH）、造血成長因子、肝成長因子、線維芽細胞成長因子（FGF）、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子（TNF）、ミューラー阻害物質、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（VEGF）、インテグリン、神経成長因子（NGF）、血小板成長因子、トランスフォーミング成長因子（TGF）、骨誘導性因子などが含まれる。
【００８３】
本明細書において使用される用語「被験体」は、免疫系を有する動物、好ましくは、哺乳動物（例えば、マウスなどの齧歯類）を指す。特に、該用語はヒトを指す。
【００８４】
用語「約」または「およそ」は、通常、所定の値または範囲の２０％内、より好ましくは、１０％内、および最も好ましくは５％内を意味する。あるいは、特に生物学的系（例えば、免疫応答を測定する場合）では、用語「約」は、約1/10〜約10倍（即ち、違いが１桁以内）、好ましくは、所定の値の１／２〜２倍であることを意味する。
【００８５】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」は、宿主を形質転換して、導入される配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入されるビヒクルを意味する。ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。
【００８６】
本発明に従えば、当業者の範囲内で従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。そのような技術は周知であり、文献内に十分に説明されている。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York）（本明細書では「Sambrookら、1989」）； DNA Cloning: A Practical Approach第Ｉおよび第ＩＩ巻（D. N. Glover編、１９８５）； Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait編、1984）；Nucleic Acid Hybridization［B. D. HamesおよびS. J. Higgins編、（1985）］；Transcription And Translatiorz［B. D. HamesおよびS. J. Higgins編、（1984）］；Animal Cell Culture [R. I. Freshney編、（1986）］；Immobilized Cells And Enzymes［IRL出版（IRL Press），（1986）］；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular C1oning(1984);F.M.Ausubelら（編）、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.(1994)を参照のこと。
【００８７】
「核酸分子」（あるいは「核酸」）は、一本鎖形態あるいは二本鎖ヘリックスでのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン：「RNA分子」）あるいはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン：「DNA分子」）のリン酸エステルポリマー形態、あるいはホスホロチオエートおよびチオエステルなどの任意のホスホエステル類自体を指す。オリゴヌクレオチド（１００ヌクレオチド未満の構成単位を有する）またはポリヌクレオチドは、規定される用語に含まれ、二本鎖DNA-DNA、DNA-RNA、およびRNA-RNAヘリックスである。例えば、この用語には、とりわけ、線状（例えば、制限フラグメント）または環状DNA分子、プラスミド、および染色体で認められる二本鎖DNAが含まれる。特定の二本鎖DNA分子の構造の考察では、配列は、転写されない鎖のDNA（即ち、mRNAに相同な配列を有する鎖）に沿って５’〜３’の方向での配列のみを与える通常の慣例に従って本明細書では説明し得る。「組換えDNA分子」は、分子生物学的操作を経験したDNA分子である。
【００８８】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、核酸によってコードされ得るかまたは合成で調製され得るアミノ酸に基づくポリマーである。ポリペプチドは、タンパク質、タンパク質フラグメント、キメラタンパク質などであることができる。一般に、用語「タンパク質」は、細胞において内因的に発現されるポリペプチドである。一般に、特定のタンパク質または酵素をコードするDNA配列は、mRNAの対応する配列に「転写」される。次いで、mRNA配列は、タンパク質を形成するアミノ酸の配列に「翻訳」される。「アミノ酸配列」は、２アミノ酸以上の任意の鎖である。用語「ペプチド」は、通常、１００アミノ酸未満の構成単位を有する、アミノ酸に基づくポリマーについて使用されるが、用語「ポリペプチド」は、少なくとも１００個のそのような単位を有するポリマーのために使用される。しかし、本明細書においては、「ポリペプチド」は包括的な名称である。
【００８９】
グリコシルセラミドを含むアジュバントの使用
１つの局面において、本発明は、哺乳動物における抗原の免疫原性を増大するための方法であって、前記抗原を、式１のグリコシルセラミド、好ましくは、α−ガラクトシルセラミド（α-GalCer）を含むアジュバント組成物と共に併せて投与することを含む、上記方法を提供する。本発明に従えば、グリコシルセラミドをアジュバントとして使用することにより、抗原によって誘導される防御免疫の増大および／またはその持続期間の延長が生じる。例えば、本明細書において開示されているように、グリコシルセラミドと腫瘍またはウイルス抗原のＴ細胞もしくはＢ細胞エピトープに対応するペプチド、またはこれらの抗原を発現するＤＮＡ構築物とを併せて投与すると、抗原特異的免疫応答が増強される。
【００９０】
本発明のグリコシルセラミド含有アジュバントは、任意の抗原、特に伝染性因子または腫瘍由来の抗原と併せて投与することができる。
【００９１】
背景のセクションで考察したように、マウスおよびヒトの両方におけるグリコシルセラミドの免疫刺激効果は、CD1d分子の発現に依存し、NKT細胞によって介在される。実際、本発明は、α-GalCerアジュバント活性は、少なくとも一部はNKT介在性抗原特異的Th1型Ｔ細胞応答およびCD8+Ｔ細胞（またはＴｃ）応答を増強ならびに／または延長するその能力に起因する。
【００９２】
免疫療法の観点から、NKT細胞系のグリコシルセラミド介在性活性化は、次の理由から他の機構とは異なる利点を有するようである：（ａ）活性化されたNKT細胞の細胞障害性のレベルは極めて高く、広範な腫瘍細胞または感染された細胞に対して有効である；（ｂ）グリコシルセラミドによるNKT細胞の活性化は、個体間で単形態性であるCD1d分子に総合的に依存し（Porcelli, Adv. Immunol., 59:1-98, 1995）、このことはグリコシルセラミド含有アジュバントが、MHCハプロタイプに関係なく全ての患者によって利用され得ることを示す；（ｃ）ヒト患者のＤＣの抗原提示機能およびNKT活性化は、Vα14NKT細胞状態をインジケーターとして使用して、マウスにおけるin vivoアッセイにより、免疫療法の前に評価することができる。
【００９３】
本発明に従えば、式１のグリコシルセラミドを含有するアジュバントおよび抗原は、２つの個別の処方または同じ組成物の部分のいずれか一方として投与することができる。個別に投与する場合、アジュバントおよび抗原は順次または同時のいずれかで投与することができる。本明細書において開示されるように、グリコシルセラミドアジュバントと抗原との同時投与が好ましく、一般に最も効率的な免疫刺激を達成することが可能である。
【００９４】
本発明のグリコシルセラミドアジュバントは、複数の異なる抗原との併用でその免疫刺激活性を発揮するため、従って、それは予防および治療的適用の両方に有用である。従って、さらなる局面では、本発明は、哺乳動物の疾患を処置するための予防および／または治療方法であって、前記哺乳動物に抗原と式１のグリコシルセラミドを含有するアジュバントとを併せて投与することを含む上記方法を提供する。本方法は、例えば、様々な感染に対する防御および／または処置、ならびに様々な新生物疾患を治療するのに有用であり得る。
【００９５】
本発明の免疫原性増強方法は、寄生虫感染（マラリア原虫腫などによって生じる感染など）、ウイルス感染（インフルエンザウイルス、白血病ウイルス、HIVなどの免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ポックスウイルス、おたふく風邪ウイルス、サイトメガロウイルス［CMV］、エプスタイン−バールウイルスなどによって生じる感染など）、細菌感染（スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、ニューモコッカス、淋菌（Neisseria gonorrhea）、ボレリア（Borrelia）、シュードモナスなどによって生じる感染）、真菌感染（カンジダ、トリコフィトン、ピチロスポルムなどによって生じる感染）を含むがそれらに限定されない感染に対抗するために使用することができる。
【００９６】
本発明の方法はまた、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、内皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺肉腫、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、随様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫、頚部癌、精巣腫、肺癌、肺小細胞癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠癌、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭癌、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫を含むがそれらに限定されない様々な癌の治療においても有用である
本明細書においてさらに開示されるように、本発明の免疫原性増強方法の効率は、抗原およびグリコシルセラミドアジュバントが同時に投与される場合に達成される。
【００９７】
特定の実施態様では、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）のマラリアを予防および／または治療するための方法であって、ここで、前記方法は、前記哺乳動物に、マラリア特異的抗原と式１のグリコシルセラミド、好ましくはα-GalCerを含むアジュバントとを併せて投与することを含む、上記方法を開示する。下記の実施例１において開示されるように、至適用量未満の照射されたマラリア寄生虫でマウスを免疫化し、α-GalCerを同時投与すると、抗マラリア防御免疫が顕著に増大される。α-GalCerの同時投与は、抗マラリア防御免疫の防御のレベルを増加するだけではなく、その持続期間をも延長する。さらに、α-GalCerと照射された寄生虫またはペプチド（マラリアＣＳタンパク質のCD4+またはCD8+エピトープに対応する）とをマウスに注入すると、抗原特異的Ｔ細胞の数の増加がもたらされる。
【００９８】
別の特定の実施態様では、本発明は、哺乳動物におけるHIV感染に対する免疫応答を増強する（ならびにAIDSを予防および／または治療する）方法であって、ここで、前記方法は、前記哺乳動物に、HIV特異的抗原とα-GalCerアジュバントとを併せて投与することを含む、上記方法を開示する。下記の実施例２において開示されるように、HIVのp18（Ｖ３ループ）のCD8+Ｔ細胞エピトープ（RGPGRAFVTI［配列番号５］）で免疫されたマウスにα-GalCerを同時投与すると、α-GalCer処置を伴わずに免疫化されたマウスと比較して、HIV特異的CD8+Ｔ細胞応答のレベルがほぼ３倍増強される。
【００９９】
本発明の方法は、他の治療と併せて使用することができる。例えば、腫瘍特異的抗原および本発明のグリコシルセラミド含有アジュバントを使用する抗癌治療は、化学療法および／または放射線療法および／またはIL-12治療と併せて使用することができる。α−グリコシルセラミド含有アジュバントを含む抗ウイルスワクチンは、IFN-α治療と併せて使用することができる。
【０１００】
その治療的適用に加えて、本発明のグリコシルセラミドアジュバントはまた、基礎免疫学の多くの局面の研究に対する調査手段として応用してもよい。例えば、該アジュバントを使用して、NKT細胞の機能、ＤＣによる抗原提示、ならびにサイトカインおよびそれらの受容体による免疫応答の調節などの免疫機構を研究することができる。同じ抗原に対して異なるアジュバントが、様々な強度および／または持続期間の免疫応答を産生することができるため、防御免疫の要件の同定を支援し得るワクチン開発調査にも、グリコシルセラミドアジュバントを用いることができる。
【０１０１】
グリコシルセラミド含有医薬組成物およびワクチン組成物
本発明の方法と併せて、免疫学的有効量の抗原およびグリコシルセラミドを含む免疫学的有効量のアジュバント、ならびに必要に応じて、さらなる免疫刺激剤、担体または賦形剤（おそらくその全てが薬学的に許容し得る）を含む医薬組成物ならびにワクチン組成物も提供される。前記抗原およびアジュバントは、単一の組成物、または同時もしくは順次投与することができる２つの個別の組成物のいずれか一方として処方することができる。
【０１０２】
本発明のアジュバントは、スフィンゴ糖脂質のクラスに属する化合物、具体的には、一般式１：
【化１０】
2005500336.tif 000011
【０１０３】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５はＨまたは特定の単糖を示し；Ｒ３およびＲ６はそれぞれＨまたはＯＨを示し；Ｒ４はＨ、ＯＨまたは特定の単糖を示し；Ｘは１〜２３の整数を示し；Ｒ７は次の基（ａ）〜（ｇ）：（ａ）-(CH2)11-CH3、（ｂ）-(CH2)12-CH3、（ｃ）-(CH2)13-CH3、（ｄ）-(CH2)9-CH(CH3)2、（ｅ）-(CH2)10-CH(CH3)2、（ｆ）-(CH2)11-CH(CH3)2、（ｇ）-(CH2)11-CH(CH3)-C2H5のいずれか１つを表す。］
で表すことができるグリコシルセラミドを含む。
【０１０４】
本発明の好適なアジュバントは、α−ガラクトシルセラミド（α-GalCer）、具体的には、式２：
【化１１】
2005500336.tif 000012
【０１０５】
によって表される(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオールを含む。
【０１０６】
本発明のアジュバントに有用なグリコシルセラミドの他の例として：
α −グルコシルセラミド（α-GlcCer）、具体的には、式３：
【化１２】
2005500336.tif 000013
【０１０７】
の(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-グルコピラノシル)-N-ヘキサコサノイル-2-アミノ-1,3,4-オクタデカントリオール、
Galα1-6Galα1-1’Cer、具体的には、式４：
【化１３】
2005500336.tif 000014
【０１０８】
の(2S,3S,4R)-2-アミノ-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル-(1-6)-α-D-ガラクトピラノシル)-N-ヘキサコサノイル-1,3,4-オクタデカントリオール、
Galα1-6Glcα1-1’Cer、具体的には、式５：
【化１４】
2005500336.tif 000015
【０１０９】
の(2S,3S,4R)-2-アミノ-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル-(1-6)-α-D-グルコピラノシル)-N-ヘキサコサノイル-1,3,4-オクタデカントリオール、
Galα1-2Galα1-1’Cer、具体的には、式６：
【化１５】
2005500336.tif 000016
【０１１０】
の(2S,3S,4R)-2-アミノ-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル-(1-2)-α-D-ガラクトピラノシル)-N-[(R)-2-ヒドロキシテトラコサノイル]-1,3,4-オクタデカントリオール、
Galβ1-3Galα1-1’Cer 、具体的には、式７：
【化１６】
2005500336.tif 000017
【０１１１】
の(2S,3S,4R)-2-アミノ-1-O-(β-D-ガラクトフラノシル-(1-4)-α-D-ガラクトピラノシル)-N-[(R)-2-ヒドロキシテトラコサノイル]-1,3,4-オクタデカントリオール
が挙げられるが、これらに限定しない。
【０１１２】
α-GalCerアジュバント成分は、沖縄産海綿（例えば、Natoriら、Tetrahedron,50:2771-2784,1994に記載されている）から単離されるか、または合成により生成することができる（例えば、米国特許第5,936,076号；同第5,780,441号；同第5,849,716号、および同第6,071,884号；国際公開第98/29534号、および同第98/44928号；Kobayashiら、1995,Oncol.Res.,7:529-534を参照のこと）。同様に、本発明の他の関連のグリコシルセラミドアジュバントは、天然の供給源（例えば、海綿）から単離されるか、または合成により生成することができる（例えば、米国特許第5,936,076号；同第5,780,441号；同第5,849,716号、および同第6,071,884号；国際公開第98/29534号および同第98/44928号；Moritaら、J. Med. Chem., 38:2176-2187, 1995；Ｔeriyukiら、J. Med. Chem., 42:1836-1841, 1999に記載されている）。
【０１１３】
本発明の免疫原性（例えば、ワクチン）組成物に使用される抗原は、真核細胞（例えば、腫瘍、寄生虫、真菌）、細菌細胞、ウイルス粒子、またはその任意の部分から誘導することができる。免疫原性応答が指令されるべき材料が抗原性に乏しい場合、標準的な共有結合技術、例えば、いくらかの市販の試薬キットのうちの１つによって、それを、アルブミンまたはハプテンなどの担体分子にさらにコンジュゲートさせてもよい。
【０１１４】
本発明の好適な抗原の例として、（ｉ）照射されたプラスモジウム・スポロゾイトなどのマラリア特異的抗原あるいはマラリアスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の少なくとも１種のＴ細胞および／またはＢ細胞エピトープを含む合成ペプチド抗原（下記を参照のこと）；（ｉｉ）インフルエンザウイルス（例えば、表面糖タンパク質血球凝集（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）［シチメンチョウインフルエンザＨＡ型もしくはトリインフルエンザＡ型／Jalisco／95H5HA］）；免疫不全ウイルス（例えば、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）抗原、サル免疫不全ウイルス（SIV）抗原、もしくはgp120、gp160、p18抗原などのヒト免疫不全ウイルス抗原（HIV）［下記の実施例２に記載されている］）、Gagpl7/p24、Tat、Pol、Nef、およびEnv；ヘルペスウイルス（例えば、ネコヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、イヌヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV、例えば、HSVtk、gB、gD）、マレク病ウイルス、シチメンチョウのヘルペスウイルス（HVT）、もしくはサイトメガロウイルス（CMV）、またはエプスタイン−バールウイルス由来の糖タンパク質）；肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg））；パピローマウイルス；ウシ白血病ウイルス（例えば、gp51，３０エンベロープ抗原）；ネコ白血病ウイルス（FeLV）（例えば、FeLVエンベロープタンパク質、ニューカッスル病ウイルス（NDV）抗原、例えば、ＨＮまたはＦ）；ラウス関連ウイルス（RAV-1env）；伝染性気管支炎ウイルス（例えば、マトリックスおよび／またはプレプロマー（preplomer））；フラビウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス（JEV）抗原、黄熱病抗原、もしくはデング熱ウイルス抗原）；麻疹ウイルス（例えば、イヌジステンバーウイルス抗原、麻疹抗原、またはＨＡもしくはＦなどの牛疫抗原）；狂犬病ウイルス（狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）；パルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス抗原）；ポックスウイルス（例えば、欠肢症抗原、カナリアポックスウイルス抗原、もしくは家禽ポックスウイルス抗原）；トリポックスウイルス（水痘帯状疱疹抗原）；伝染性ファブリキュウス嚢疾患（例えば、VP2、VP3、またはVP4）；ハンタウイルス；おたふく風邪ウイルスから誘導されるようなウイルスタンパク質またはペプチド抗原；（ｉｉｉ）グラム陰性細菌細胞壁から単離されるリポ多糖、ならびにスタフィロコッカス特異的、ストレプトコッカス特異的、肺炎双球菌（例えば、PspA［国際公開第92/14488号を参照のこと］）淋菌（Neisseria gonorrhea）特異的ボレリア（Borrelia）特異的（例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelli）、およびボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）などのライム病に関連するボレリア（Borrelia）のOspA、OspB、OspC抗原［例えば、米国特許第5,523,089；国際公開第90/04411号、同第91/09870号、同第93/04175号、同第96/06165号、同第93/08306号；PCT/US92/08697号；Bergstromら、Mol.Microbiol.,3:479-486,1989；Johnsonら、Infect.and Immun.60:1845-1853,1992；Johnsonら、Vaccine 13:1086-1094,1995；The Sixth International Conference on Lyme Borreliosis:Progress on the Development of Lyme Disease Vaccine,Vaccine 13:133-135,1995を参照のこと］）ならびにシュードモナス特異的タンパク質またはペプチドなどの細菌抗原；（ｉｖ）���ンジダ、白癬菌、またはプチロスポルム（ptyrosporum）から単離される抗原などの真菌抗原、ならびに（ｖ）（黒色腫における）ErbB受容体、メラン（Melan）Ａ［MART1］、gp100、チロシナーゼ、TRP-1/gp75、およびTRP-2；（膀胱、頭頚部、および非小細胞癌における）MAGE-1およびMAGE-3；（頚部癌における）HPV EGおよびＥ７タンパク質；（乳、膵臓、結腸、および前立腺癌における）ムチン［MUC-1］；（前立腺癌における）前立腺特異抗原［PSA］；（結腸、乳、および消化器癌における）癌胎児性抗原［CEA］ならびにMAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE12、BAGE-1、CAGE-1,2,8、CAGE-3〜7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV、およびTRP2-INT2などの共通の腫瘍特異的抗原などの腫瘍特異的タンパク質が挙げられる。
【０１１５】
目的の抗原は、任意の動物もしくはヒト病原体または腫瘍から誘導することができるため、抗原に関する前記のリストは、例示的であることが意図される。目的の病原体由来の抗原をコードするDNAについては、例えば、米国特許第4,722,848号；同第5,174,993号；同第5,338,683号；同第5,494,807号；同第5,503,834号；同第5,505,941号；同第5,514,375号；同第5,529,780号；英国特許GB2 269 820 B号；および国際公開第92/22641号；同第93/03145号；同第94/16716号；同第96/3941号；PCT/US94/06652号が注目される。腫瘍ウイルス由来の抗原については、Molecular Biology of Tumor Viruses, RNA Tumor Viruses、第２版、Weissら、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1982も参照される。本発明の組成物において有用なさらなる抗原については、Stedman’s Medical Dictionary（第２４版、1982）も参照されたい。
【０１１６】
特定の実施態様では、本発明の組成物は、マラリア、特にＰ．ヨエリおよび主なヒトマラリア原虫の種Ｐ．ファルシパルム（P.falciparum）およびＰ．ビバックス（P.vivax）に対する防御免疫を提供する。これらの組成物は、次の成分の１つ以上を含む：（ｉ）好ましくは、多様な遺伝的背景の哺乳動物において抗マラリアＴ細胞応答誘発することが可能なＴ細胞エピトープを含む少なくとも１種のマラリア特異的ペプチド（例えば、YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK［配列番号１］もしくはSYVPSAEQI［配列番号２］Ｐ．ヨエリＣＳタンパク質のＴ細胞エピトープ［Reniaら、J. Immunol., 22:157-160, 1993； Rodriguesら、Int. Immunol., 3:579-585, 1991］または(NVDPNANP)ｎ［配列番号３］もしくはEYLNKIQNSLSTEWSPCSVT［配列番号４］Ｐ．ファルシパルム（P.falciparum）ＣＳタンパク質のＴ細胞エピトープ［Nardinら、Science 246:1603, 1989； Morenoら、Int. Immunol. 3:997, 1991； Morenoら、J. Immunol. 151:489, 1993］）；（ｉｉ）抗マラリア（即ち、中和）抗体（例えば、マラリア生物体のスポロゾイト段階に対して指令される）の産生を刺激することが可能なＢ細胞エピトープを含む少なくとも１種のマラリア特異的ペプチド（例えば、(NANP)３［配列番号１５］Ｐ．ファルシパルムＣＳタンパク質の反復領域内に位置するＢ細胞エピトープ［Nardinら、J. Exp. Med. 156:20, 1982；Nardinら、Ann. Rev. Immunol. 11:687, 1993］）。好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１種のＢ細胞エピトープおよび少なくとも１種のＴ細胞エピトープを有する。好ましくは、Ｂ細胞エピトープは、マラリアのスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質を特異的に認識して結合する抗体の産生を誘発する。あるいは、またはさらに、本発明の組成物は、例えば、Ｐ．ビバックス赤血球分泌型タンパク質−１または−２（PvESP-1またはPvESP-2)(例えば、米国特許第5,874,527号を参照のこと）、トロンボスポンジン関連付着（名称なし）タンパク質（TRAP）と呼ばれるＰ．ファルシパルムスポロゾイト表面タンパク質（またスポロゾイト表面タンパク質２（SSP2）とも呼ばれる）、LSA I、hsp70、SALSA、STARP、Hepl7、MSA、RAP-1、およびRAP-2などの他のマラリア成分から誘導され、該成分と反応するるＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含んでもよい。１つの実施態様では、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープ成分は多抗原ペプチド（MAP）に組み入れられ、高密度のエピトープを含有する合成高分子ポリペプチドを形成する。MAPの合成方法は当該技術分野において周知である（例えば、Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5409, 1988; Tam, Meth. Enzymol., 168:7, 1989を参照のこと）。
【０１１７】
本発明はまた、Ｐ．マラリアエ（P.malariae）、Ｐ．オバール（P.ovale）、Ｐ．ライヒノウ（P.reichenowi）、Ｐ．ノウレシ（P.knowlesi）、Ｐ．シノモルギ（P.cynomolgi）、Ｐ．ブラシリアヌム（P.brasilianum）、Ｐ．ベルグヘイ（P.berghei）、およびＰ．チャバウディ（P.chabaudi）を含むがこれらに限定されない他のマラリア原虫の種から誘導されるＢ細胞およびＴ細胞エピトープも包含する。これらのエピトープは、典型的に、マラリア原虫のタンパク質由来の８〜１８アミノ酸残基を含む。
【０１１８】
別の特定の実施態様では、本発明の好適な抗原は、HIV特異的である（p18タンパク質のＴ細胞エピトープRGPGRAFVTI［配列番号５］、下記の実施例２を参照のこと）。本明細書において開示されるように、上述のHIV特異的抗原および式１のグリコシルセラミド、好ましくはα-GalCerを含むアジュバントを含む組成物は、感染し易い哺乳動物宿主においてHIV抗原に対するＴ細胞応答を増強することが可能である。
【０１１９】
更に別の特定の実施態様では、本発明の抗原はインフルエンザＡ型ウイルス特異的である。本明細書において開示されるように、α-GalCerとインフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）のCD8+Ｔ細胞エピトープTYQRTRALV（配列番号１６）を発現する至適用量未満（105p.f.u.）の組換えシンドビスウイルスとを同時投与すると（Tsujiら，J.Virol.,72:6907-6910,1998）、感染し易い哺乳動物宿主においてCD8+Ｔ細胞抗インフルエンザ応答が有意に増大される。
【０１２０】
本発明の組成物の使用のためにさらなる抗原誘導性ＢおよびＴ細胞エピトープを提供するために、例えば、（ｉ）タンパク質分解酵素を使用して目的の抗原を重複ペプチドにフラグメント化し、続いて、完全長抗原によって誘発される抗体に結合し、Ｔ細胞またはＢ細胞活性を誘導する個々のペプチドの能力を試験すること（例えば、Janis Kuby,Immunology、79-80頁、W.H.Freeman,1992を参照のこと）；（ｉｉ）配列が所定の抗原のセグメントもしくは類似体（例えば、Alexanderら、1994, Immunity, 1:751-61；Hammerら、1994, J. Exp. Med., 180:2353-8を参照のこと）、あるいはそのようなセグメントに基づく構築物、あるいは担体もしくは異種抗体に結合または融合した類似体である合成ペプチドを調製し、抗原特異的抗体またはＴ細胞活性化を誘発するそのようなペプチドの能力を試験すること（例えば、in vitroおよびin vivoの両方でMHCクラスＩＩ分子と相互作用するそれらの能力を試験する［例えば、O’Sullivanら、1991,J.Immunol.,147:2663-9；Hillら、1991,J.Immunol.,147:189-197を参照のこと］）；Ｔ細胞エピトープの決定のためには、ペプチドは、MHCクラスＩ分子の溝を占有するために少なくとも８〜１０アミノ酸長であるべきであり、MHCクラスＩＩ分子の溝を占有するために少なくとも１３〜２５アミノ酸長であるべきであり、好ましくは、ペプチドはより長くあるべきである；これらのペプチドはまた、免疫応答を作製するのに十分に高い親和性および特異性で様々なクラスＩまたはクラスＩＩ  MHC分子への結合することを可能にする適切なアンカーモチーフを含有すべきである（Bocchiaら、Blood 85:2680-2684, 1995；Englehard, Ann. Rev. Immunol. 12:181, 1994を参照のこと）；（ｉｉｉ）精製されたMHC分子と会合するペプチドの配列を決定すること（例えば、Nelsonら、1997, PNAS, 94:628-33を参照のこと）；（ｉｖ）MHCクラスＩＩ分子、TCR、完全長抗原に対して惹起される抗体などに対する高親和性結合についてペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングすること（例えば、Hammerら、1992, J. Exp. Med., 176:1007-13を参照のこと）；（ｖ）異なるタンパク質配列をコンピュータ解析して、例えば、親水性ストレッチ（親水性アミノ酸残基はしばしばタンパク質の表面上に配置され、従って、抗体へのアクセスが可能である）および／または目的のタンパク質の配列とMHC分子と会合するペプチドの公開された構造とを比較することによって、高親和性TCRまたはMHCクラスＩＩ対立遺伝子特異的モチーフを同定すること（Mallios, Bioinformatics, 15:432-439, 1999； Milikら、Nat. Biotechnol., 16:753-756, 1998；Brusicら、Nuc. Acids Res, 26:368-371, 1998； Fellerおよびde la Cruz, Nature, 349:720-721, 1991）；（ｖｉ）天然の抗原−抗体複合体のＸ線結晶解析を実施すること（Janis Kuby, Immunology、８０頁、W. H. Freeman, 1992）、ならびに（ｖｉｉ）目的の抗原の様々な部分に対するモノクローナル抗体を作製し、次いで、それらの抗体がin vitroまたはin vivoで、抗原が誘導される病原体もしくは腫瘍の増殖を減弱するかどうかを確かめること（米国特許第5,019,384号および該明細書において引用される参考文献を参照のこと）のような当該技術分野において周知であるいくらかの方法のうちの１つまたは組み合わせによって、これらのエピトープを同定することができる。
【０１２１】
特定の実施態様では、本発明の抗原は、前記抗原を発現する組換えウイルスによって提示される。好ましくは、ウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えポックスウイルス、および組換えシンドビスウイルスからなる群より選択される。
【０１２２】
開示された組成物では、抗原およびグリコシルセラミドアジュバントは、免疫学的有効量にある。各特定の抗原について、至適免疫学的有効量は、実験的に決定されるべきである（所定の患者および／または治療のタイプに関する特定の特徴を考慮する）。一般に、この量は、体重１ｋｇ当たり０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲にある。本発明のグリコシルセラミドアジュバントについては、至適免疫学的有効量は、好ましくは、体重１ｋｇ当たり１０〜１００μｇの範囲にある。
【０１２３】
本発明はまた、少なくとも１種の抗原と式１のグリコシルセラミド、好ましくはα-GalCerを含むアジュバントを含むワクチン組成物を調製するための方法を提供し、前記方法は、アジュバントおよび抗原、ならびに必要に応じて、１つ以上の生理学的に許容し得る担体および／または賦形剤および／または補助物質を混合することを含む。
【０１２４】
処方および投与
本発明は、本発明の治療剤（単一の組成物または同時または順次に投与することができる２つの個別の組成物として抗原およびグリコシルセラミドアジュバント）を含有する医薬およびワクチン処方を提供し、該処方は、上記の伝染性または新生物疾患の治療および予防のために抗原特異的防御免疫応答を誘発するための投与に適切である。本発明の組成物は、１つ以上の生理学的に許容し得る担体または賦形剤を使用する任意の従来の方法で処方することができる。従って、抗原および／または式１のグリコシルセラミド、好ましくはα-GalCerを含むアジュバントは、経口、口内、鼻腔内、眼、膣、直腸、脳内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下経路を含むがそれらに限定されない経皮送達、または経粘膜投与によって、乱切（例えば、二又の針を使用して皮膚の頂部層に擦傷を作製する）、吸入（肺）もしくは通気（口または鼻のいずれかを介する）によるか、またはex vivoで抗原提示細胞に投与し、続いて、該細胞を被験体に投与することによるか、あるいは免疫化の他の任意の標準的な経路による投与のために処方することができる。
【０１２５】
好ましくは、本発明の免疫原性処方は、非経口的、即ち、静脈内（i.v.）、皮下（s.c.）、腹腔内（i.p.）、筋肉内（i.m.）、皮下（s.d.）、もしくは皮内（i.d.）投与によって、直接注入、例えば、ボーラス注入、継続輸注、または遺伝子銃（例えば、裸の（naked）ネイクドＤＮＡもしくはＲＮＡなどのベクターワクチンを被験体に投与する）を介して送達することができる。注入のための処方は、例えば、アンプルまたは多用量容器中の単位用量の形で、添加する保存剤と共に表現することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の賦形剤、懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態を取ることができ、懸濁化、安定化および／または分散化剤などの処方化剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、使用前に、安定なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水との再構築のために粉末の形態であることができる。
【０１２６】
本発明はまた、様々な粘膜ワクチン化戦略を考慮する。粘膜は、ワクチンの局所送達によって標的化することができる一方、免疫原性組成物を粘膜に送達するために様々な戦略が用いられている。例えば、特定の実施態様では、免疫原性ポリペプチドまたはベクターワクチンは、コレラ毒素Ｂまたはコレラ毒素Ａ／Ｂキメラなどのコレラ毒素との混合かまたは該コレラ毒素とのコンジュゲートもしくはキメラ融合タンパク質として投与することができる（例えば、Hajishengallis, J. Immunol., 154:4322-32, 1995； JoblingおよびHolmes, Infect Immun., 60:4915-24, 1992； LebensおよびHolmgren, Dev Biol Stand 82:215-27, 1994を参照のこと）。別の実施態様では、易熱性毒素（ＬＴ）との混合物が粘膜ワクチン化のために調製することができる。他の粘膜免疫化戦略には、免疫原をマイクロカプセルにカプセル化すること（例えば、米国特許第5,075,109号；同第5,820,883号、および同第5,853,763号を参照のこと）ならびに免疫増強膜担体を使用すること（例えば、国際公開第98/0558号を参照のこと）が含まれる。経口投与される免疫減の免疫原性は、赤血球（rbc）またはrbc膜基質（例えば、米国特許第5,643,577号を参照のこと）を使用するか、またはブルー・タング抗原（例えば、米国特許第5,690,938号を参照のこと）を使用することによって、増強することができる。標的化された免疫減の全身投与は、粘膜免疫化を生じることもできる（米国特許第5,518,725号を参照のこと）。キメラライノウイルス（例えば、米国特許第5,714,374号を参照のこと）、アデノウイルス、ワクシニアウイルスを使用するか、または核酸を特異的に標的化する（例えば、国際公開第97/05267号を参照のこと）などして、粘膜組織における発現のための遺伝子を送達するために、様々な戦略を使用することもできる。
【０１２７】
経口投与では、本発明の処方は、結合剤（例えば、予めゲル化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容し得る賦形剤と共に従来の手段によって、例えば、錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によって被覆することができる。本発明の組成物は、微小球またはマイクロカプセルに導入することができ、例えば、ポリグリコール酸／乳酸（PGLA）から形成することができる（米国特許第5,814,344号、同第5,100,669号、および同第4,849,222号、国際公開第95/11010号および同第93/07861号を参照のこと）。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、エマルジョンもしくは懸濁液の形態を取ることができるか、または使用前に水もしくは他の安定なビヒクルと再構成するための乾燥製品として存在することができる。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画した植物油）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容し得る添加物と共に従来の手段によって調製することができる。製剤はまた、適切であれば緩衝塩、薬味、着色剤および甘味剤を含有することができる。経口投与のための製剤には、有効な化合物を徐放するための適切な処方を施すことができる。
【０１２８】
吸入による投与のために、本発明の治療薬は、適切なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または適切な気体を使用することによって、加圧されたパックまたは噴霧器からのエアゾルスプレーのプレゼンテーションの形態で簡便に送達することができる。加圧されたエアゾルの場合、用量単位は、軽量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。吸入器または吸入器具の使用ための例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有して処方することができる。
【０１２９】
本発明の組成物はまた、ココアバターもしくは他のグリセリドなどの従来の座剤用基剤を含有する座剤または停留浣腸剤などの直腸組成物において処方することもできる。
【０１３０】
先に記載の処方に加えて、組成物はまた、デポ製剤として処方することもできる。そのような長期作用性処方は、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注入によって投与することができる。従って、例えば、化合物は、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容し得るオイル中のエマルジョン）またはイオン交換樹脂によるか、あるいはやや溶け難い誘導体、例えば、やや溶け難い塩として処方することができる。
【０１３１】
本明細書において開示されるように、抗原および／またはグリコシルセラミドアジュバントは、薬学的に許容可能であり、かつ有効成分に適合性である賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール、滅菌等張水性緩衝液などがある。さらに、所望であれば、製剤は、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、および／または医薬組成物もしくはワクチンの有効性を増強する免疫刺激剤（例えば、グリコシルセラミドとは別のアジュバント）などの少量の補助物質を含んでもよい。本発明の組成物の有効性を増強することができるさらなる免疫刺激剤の非制限的例には、免疫刺激性、免疫増強性、催炎性サイトカイン、リンフォカイン、もしくはケモカインまたはそれらをコードする核酸が含まれる（具体的例として、インターロイキン（IL）-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（CSF）および他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、表題「定義」のセクションにおいてさらなる免疫刺激性サイトカインを参照のこと）。これらのさらなる免疫刺激性分子は、タンパク質としてか、または該分子の発現をコードするベクターの発現によって、全身もしくは局所に送達することができる。抗原およびグリコシルセラミドアジュバントの送達についての上記の技術もさらなる免疫刺激性分子の送達のために用いることができる。
【０１３２】
本発明はまた、本発明の免疫原性処方の１つ以上の成分が充填された１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットも提供する。関連する実施態様では、本発明は、少なくとも１種の抗原およびグリコシルセラミド含有アジュバントを含む医薬組成物またはワクチン組成物の調製のためのキットを提供し、該キットは、第１の容器に抗原、および第２の容器にアジュバント、ならびに必要に応じて抗原およびアジュバントを混合するためのならびに／または組成物の投与のための説明書を含む。キットの各容器はまた、必要に応じて、１つ以上の生理学的に許容し得る担体および／または賦形剤および／または補助物質を含んでもよい。上記の容器に関連して、通知書は薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府当局によって規定された形態でなければならず、該通知書には、製造、使用または販売の当局によるヒトへの投与への承認が織り込まれている。
【０１３３】
所望であれば、組成物は、有効成分（即ち、抗原および／またはグリコシルセラミド含有アジュバント）を含有する１つ以上の単位用量形態を含有することができるパックまたはディスペンサーデバイス内に提示されていてもよい。例えば、パックは、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書を添付することができる。適応性薬学的担体中に処方される本発明の組成物を調製し、適切な容器内に配置し、そして適応症の治療のために標識することができる。
【０１３４】
有効用量および安全性評価
本発明の方法に従えば、本明細書に記載の医薬組成物およびワクチン組成物は、免疫学的有効量、好ましくは最小の毒性で患者に投与される。表題「定義」のセクションに記載のように、開示された処方物の「免疫学的有効用量」または「治療有効用量」は、処置される被験体において、有効な免疫応答を生じ、従って、前期被験体に健康上の利益がもたらされるのに十分な抗原および／またはグリコシルセラミドアジュバントの量を指す。
【０１３５】
当該技術分野において良好に確立されている方法論（例えば、生物学的評価研究センター（Center for Biological Evaluation）および食品医薬品局（Food and Drug Administration）および国立アレルギー・感染症研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases）間の共同研究における新規のアジュバントを含有するいくらかのワクチン処方の評価に関する報告［Goldenthalら、National Cooperative Vaccine Development Working Group. AIDS Res.Hum.Retroviruses,1993,9:545-9］を参照のこと）に従えば、目的の化合物および組成物の有効用量および毒性は、抗原およびグリコシルセラミド含有アジュバントの両方が免疫原性であり、ヒト臨床治験で提唱されているものと同じ経路で再現的に免疫化することができる小動物モデル（例えば、マウス）を用いて、前臨床試験において最初に決定される。具体的には、本発明の方法で使用される任意の医薬組成物またはワクチンについて、動物モデルから最初に治療有効用量を見積もり、ＩＣ５０（即ち、徴候の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度の範囲を達成することができる。次いで、動物システム由来の用量−応答曲線を使用して、ヒトにおける最初の臨床試験についての試験用量を決定する。各組成物の安全性の決定では、用量および免疫化の頻度は、臨床治験での使用について予想されるものに一致するかまたはそれらを超えるべきである。
【０１３６】
本明細書において開示されるように、本発明の組成物におけるグリコシルセラミド、抗原および他の成分の用量は、継続的または間欠的に投与される用量が特定の量を超えないことを確実にするために、試験動物の結果および患者の個々の状態を考慮して決定される。特定の用量は当然、投与手順、年齢、体重、性別、感受性、食餌、投与期間、併用した薬物、疾患の重症度などの患者または被験動物の状態によって変動する。特定の条件下での適切な用量および投与期間は、上記の項目に基づいた試験によって決定することができ、医療従事者の判断および標準的な臨床技術に従った患者の環境に従って決定すべきである。これに関連して、抗原の用量は、一般に、体重１ｋｇ当たり０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲にあり、抗原に対する免疫応答を増大するのに必要なグリコシルセラミドアジュバントの用量は、一般に、体重１ｋｇ当たり１０〜１００μｇの範囲にある。
【０１３７】
本発明のグリコシルセラミド含有免疫原性組成物の毒性および治療有効性は、実験動物の標準的な薬学手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死的用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定することによって、決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す治療薬を使用することができる一方（例えば、癌または生命が脅かされる感染の重度の形態を治療する場合）、他の組織および器官に対する潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を減少するために、特定の部位（例えば、免疫応答を介在するリンパ組織、腫瘍、または伝染性因子の複製を支持する器官）に対して免疫原性組成物を標的化する送達システムを開発するように配慮すべきである。本明細書において開示されるように（背景のセクションおよび実施例も参照のこと）、本発明のグリコシルセラミドアジュバントは、比較的低い用量（例えば、体重１ｋｇ当たり１０〜１００μｇのアジュバント）で高度に免疫刺激性であるだけではなく、低い毒性を有し、顕著な副作用を生じない。
【０１３８】
上記で指定されるように、動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための用量の範囲を処方するのに使用することができる。ヒトにおける本発明のグリコシルセラミド含有組成物の治療有効用量は、毒性がほとんどないかまたはまったく認められないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に好適にある。用量は、用いる剤形および利用する投与経路に依存して、この範囲内で変動することができる。理想的には、単回用量が使用されるべきである。
【実施例】
【０１３９】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【０１４０】
実施例１：ナチュラルキラーＴ細胞リガンドα−ガラクトシルセラミドは、マラリアワクチンによって誘導される防御免疫を増強し、その持続期間を延長する
方法
寄生虫ならびに免疫化および刺激のためのそれらの使用。（Rodriguesら、Int. Immunol., 3:579-585, 1991； Gonzalez-Aseguinolazaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:8461-8466, 2000）に記載のように、蚊の唾液腺を切開することによって、Ｐ．ヨエリ（17X NL株）スポロゾイトを入手した。免疫化のため、スポロゾイトを12,000radに暴露することによって、照射−弱毒化し、次いで、マウスの尾静脈に静脈内注入するかまたは尾の基底部に皮下注入した。防御アッセイおよびELISPOTアッセイのために、それぞれ１×１０４および１×１０５のγ-spzを使用して、マウスを免疫化した。スポロゾイト接種後３日目〜１４日目から連日採取したギムザ染色血液薄層塗抹標本の顕微鏡観察によって、寄生虫血症を決定した。完全な防御は、この期間全体で寄生虫血症が認められないと規定した。
【０１４１】
組換えウイルスによる免疫化。全Ｐ．ヨエリＣＳタンパク質、AdPyCS（Rodriguesら、J. Immunol., 158:1268-1274, 1997）を発現する至適用量未満（1×107p.f.u.）の組換えアデノウイルスを使用して、マウスを免疫化した。Ｐ．ヨエリＣＳタンパク質、SIN（Mal）のCD8+Ｔ細胞エピトープ（SYVPSAEQI［配列番号２］）を発現する組換えシンドビスウイルス、およびHIV p18タンパク質、SIN（p18）のCD8+Ｔ細胞エピトープ（RGPGRAFVTI［配列番号５］）を発現する組換えシンビスウイルスを記載の通りに構築し（Tsujiら、J. Virol., 72:6907-6910, 1998； Villacresら、Virology, 270:54-64, 2000）、1×105p.f.u.のウイルスを至適用量未満としてs.c.で接種した。
【０１４２】
マウス。BALB/cおよびB10.D2マウスは、The Jackson Laboratory（BarHarbor,ME）より購入し、動物施設において標準的な条件下で維持した。相同組換えおよび凝集キメラ技術（Cuiら、Science, 278:1623-1626, 1997；Gonzalez-Aseguinolazaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:8461-8466, 2000）によるJα281遺伝子セグメントの特異的欠失によってVα14NTK欠損マウス（Jα281-/-）を確立し、３〜４回のBALB/cマウスへの戻し交配後に使用した。１２９起源の胎性幹細胞からCD1d欠損マウス（CD1d-/-）を作製し、７〜８回のBALB/cへの戻し交配後に使用した（Mendirattaら、Immunity, 6:469-477, 1997；Gonzalez-Aseguinolazaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:8461-8466, 2000）。IFN-γ受容体欠損マウス（ＩＦＮ−γＲ−／−）を、スイス・インスティテュート・フォア・エクスペリメンタル・カンサー・リサーチ（Swiss Institute for Experimental Cancer Research）（Epalinges, Switzerland）より入手し、３回のB10.D2への戻し交配後に使用した（Rodriguesら、Parasite Immunol.,22:157-160,2000）。６〜８週齢のいずれかの性のマウスを使用した。
【０１４３】
α-GalCer。α-GalCer、［(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオール］は、キリンビール社（日本、群馬県）によって、開示された方法（Moritaら、J. Med. Chem., 38:2176-2187, 1995；Teriyukiら、J. Med. Chem., 42:1836-1841, 1999）を使用して合成された。本来の製品を０．９％NaCl溶液中０．５％ポリソルベート−２０（ニッコー・ケミカル、東京）に溶解し、使用直前にPBSで希釈した。
【０１４４】
ペプチド免疫化およびα-GalCer処置。マウスをＰ．ヨエリＣＳタンパク質のCD4+Ｔ細胞エピトープ（YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK［配列番号１］（Reniaら、J. Immunol., 22:157-160, 1993））またはCD8+Ｔ細胞エピトープ（SYVPSAEQI［配列番号２］）（Rodriguesら、Int. Immunol., 3:579-585, 1991）に対応するペプチドでマウスを免疫化した。ＣＳタンパク質のCD8+エピトープ表すペプチドを不完全フロイント（IFA）のアジュバント中に乳化する一方、ＣＳ特異的CD4+エピトープを含有するペプチドを完全フロイントのアジュバント（CFA）中に乳化した。マウスを１０ｍｇのペプチドで皮下に免疫化した。免疫化したマウスのいくつかにα-GalCerを腹腔に注入し、残りのマウスにコントロールとしてビヒクルのみを注入した。用量および投与期間は下記に示す通りである。
【０１４５】
ELISPOTアッセイによるエピトープ特異的CD4+およびCD8+Ｔ細胞の定量。ELISPOTアッセイを実施して、IFN-γまたはIL-4を産生するＣＳ特異的CD4+およびCD8+Ｔ細胞の数を決定した（Miyahiraら、J. Immunol. Methods, 181:45-54, 1995）。簡単に説明すると、９６ウェルニトロセルロース膜プレート（Millipore、 Bedford, MA）を抗マウスIFN-γモノクローナル抗体（mAb）、または抗マウスIL-4 mAbで被覆した。１晩、室温でインキュベートした後、ウェルを繰り返し洗浄し、培養培地で１時間、３７℃でブロックした。MHCクラスＩおよびＩＩ  H-2d分子の両方を発現するMHC適合性標的細胞、A20.2JB細胞リンパ腫を、Ｐ．ヨエリＣＳタンパク質のCD4+Ｔ細胞エピトープ（YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK［配列番号１］）もしくはCD8+Ｔ細胞エピトープ（SYVPSAEQI［配列番号２］）、またはHIVp18タンパク質のCD8+Ｔ細胞エピトープ（RGPGRAFVTI［配列番号５］）を示す合成ペプチドと共に、１時間、３７℃でインキュベートした。ペプチドパルス標識細胞を照射した後、細胞をELISPOTウェルに添加した。非処置細胞をネガティブコントロールとして使用した。免疫化したマウスの脾臓またはリンパ節から単離した系列希釈したリンパ球を、1.5×105標的細胞と共にELISPOTウェル中で同時培養した。IFN-γ検出用に２４時間またはIL-4検出用に４８時間３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした後、（Rodriguesら、J. Immunol., 158:1268-1274, 1997）に予め記載されているようにプレートを処置し、IFN-γおよびIL-4分泌細胞に対応するスポットの数を決定した。
【０１４６】
リアルタイムPCRによるスポロゾイト接種マウスの肝臓におけるＰ．ヨエリrRNAの定量。Ｐ．ヨエリrRNAの定量は、記載の通りに実施した（Bruna-Romeroら、Int. J. Parasitol. 31:1499-1502, 2001）。簡単に説明すると、ChomczynskiおよびSacchi（ChomczynskiおよびSacchi, Anal. Biochem., 162:156-159, 1987）の方法によって、１×１０４Ｐ．ヨエリスポロゾイトの注入４２時間後に屠殺したマウスの肝臓から全RNAを単離した。抽出したRNAの逆転写後、cDNAを作製し、ABIプリズム５７００シークエンス・ディテクション・システム（ABI Prism 5700 Sequence Detection system）（PE Biosystems, Foster City, CA；Bruna-Romeroら、Int. J. Parasitol., 31:1499-1502, 2001）を使用して、リアルタイムPCRによって、その量を分析した。ABI Prism Primer Express software（PE Biosystems、Foster City,CA）を使用し、Ｐ．ヨエリ（17X NL）18S rRNA配列（Bruna-Romeroら、Int. J. Parasitol. 31:1499-1502, 2001）使用して、以下の配列を有するプライマーおよび蛍光発生（fluorogenic）プローブを注文開発した。プライマー5’-GGGGATTGGTTTTGACGTTTTTGCG-3’（前方プライマー；配列番号１７）、および5’-AAGCATTAAATAAAGCGAATACATCCTTAT-3’（後方プライマー；配列番号１８）を、Operon Technologies Inc.（Alameda,CA）より入手した。特異的蛍光発生（fluorogenic）プローブ、PyNYU、5’-FAM-CAATTGGTTTACCTTTTGCTCTTT-TAMRA-3’（配列番号１９）は、PE Applied biosystems（Foster City,CA）から入手し、５−プロピン−２’−デオキシウリジン（turbo Taqman probe）で作製し、適切なＴｍを達成した。反応混合物は、５μｌの10×Taqman緩衝液Ａ（PE Biosystems、Foster City,CA）、３．５ｍＭ  MgCl2、２００μＭ  dNTP、０．３μＭ前方プライマー、０．３μＭ後方プライマー、５０ｎＭターボ・タックマン・プローブ（turbo Taqman probe）PyNYU、1.25U AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ、および水を含有し、５０μｌの最終反応容積とした。温度プロファイルは、９５℃で１０分間ならびに９５℃で１５秒間およびアニーリング／伸長６０℃で１分間の３５サイクルを含んだ。PCR産物は、２％アガロース−1×TAE（５０ｍＭ  トリス−酢酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ  EDTA）ゲル染色中、０．５ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムで可視化した。Gel Doc2000ゲル・ドキュメンテーション・システム（BioRad、Hercules、CA）を使用して、ゲルのデジタル画像を入手し、Quantity One software（BioRad、Hercules、CA）を使用して、デンシトメトリーにより分析した。本アッセイにおいて検出される寄生虫由来の18S cDNA分子の正確な量は、両肝サンプルから得られるＣＴ値および既知の量のプラスミド18S cDNAにより作製される標準曲線から得られる値を使用して、直線回帰分析によって決定した。
【０１４７】
ELISPOTアッセイによるα-GalCer特異的細胞の定量。IFN-γおよび／またはIL-4産生α-GalCer特異的リンパ球の相対数は、ELISPOTアッセイを使用して決定した。リンパ球は、（Rodriguesら、J. Immunol., 158:1268-1274, 1997）に記載のように、野生型およびIFN-γR欠損マウスの肝臓から単離した。100ng/mlのα-GalCerまたはビヒクルと共に、107細胞／ｍｌの細胞密度で１２時間のインキュベーション後、ウェル当たり1×106細胞から系列希釈を始めたリンパ球を対応する抗サイトカイン抗体で被覆したELISPOTウェルに配置した。２４時間、３７℃でおよび５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした後、（Rodriguesら、J. Immunol., 158:1268-1274, 1997）に記載のように、プレートを発達させた。
【０１４８】
CD1d/α-GalCer４量体を使用したフローサイトメトリー分析。（Matsudaら、J. Exp. Med., 192:741-754, 2000）に予め記載されているように、α-GalCer特異的リンパ球を、CD1d分子およびα-GalCerから成るCD1d/α-GalCer４量体複合体を使用して同定した。第１に、新たに単離した肝リンパ球をフィコエリトリン（ＰＥ）標識４量体複合体と共にインキュベートし、続いて、FITC標識抗CD3モノクローナル抗体と共に第２のインキュベーションを行った。次いで、CELLQUESTソフトウェア（Becton Dickinson）を使用するFACSカリバー（FACScalibur）装置（Becton Dickinson、 San Jose, CA）により細胞を分析した。
【０１４９】
間接免疫蛍光アッセイ（IFA）。スポロゾイトによる攻撃の直前に、免疫化されたマウスの血清を入手し、間接免疫蛍光アッセイ（IFA）においてＰ．ヨエリスポロゾイトを使用して、それらのＡｂ価を測定した。簡単に説明すると、Ｐ．ヨエリスポロゾイトをマルチスポットガラススライド上に配置し、空気乾燥した。１％BSAを含有するPBSで希釈した血清と共に１時間インキュベートした後、スライドをPBSで洗浄し、FITC標識アフィニティー精製ヤギ抗マウスＡｂ（Kirkegaard & Perry Laboratories、 Gaithersburg, MD）と共に１時間インキュベートした。次いで、スライドを洗浄し、５０％（v/v）グリセリンおよび１％（w/v）エバンス・ブルー（Evans blue）を含有するPBS内に装架し、漂白を低下させる。スポロゾイトの蛍光を生じる最も高い血清の希釈倍率をIFA価とみなした。
【０１５０】
ELISAによるＡｂイソタイプレベルの測定。スポロゾイトによる攻撃の前に、免疫化したマウスの血清を入手し、マウス・ハイブリドーマ・サブタイピング・キット（Mouse Hybridoma Subtyping Kit, Boehringer Mannheim、Mannheim, Germany）を使用して、ＣＳ特異的IgM、IgGI、IgG2a、およびIgEイソタイプを測定した。簡単に説明すると、プレートを、Ｐ．ヨエリＣＳタンパク質の１０ｍｇ／ｍｌのＢ細胞エピトープ(QGPGAP)２（Charoenvitら、J. Immunol., 146:1020-1025, 1991）で被覆し、１％BSAを含有するPBSでブロックし、免疫化および非免疫化マウス由来の血清の１：５希釈液と共に１時間、インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスIgM、IgG1a、IgG2a（Boehringer Mannheim）およびIgE（Southern Biotechnology Associates, Inc.、 Birmingham, AL）を添加し、続いて、製造者の指示に従って、基質、2,2-アジノ-ジ-[3-エチルベンゾチアゾリンスルホネート（６）]と共にインキュベートした。
【０１５１】
統計解析。スチューデントｔ検定を全ての比較に使用した。０．０１未満のＰ値のみを有意とみなした。データは、平均値±SDとして表す。
【０１５２】
結果
α-GalCerは抗マラリア防御免疫を増強する
至適用量未満の照射されたスポロゾイトによる免疫化によって誘導される抗マラリア防御免疫応答を増強するα-GalCerの能力を評価するために、BALB/cマウスを、至適用量未満（1×104）の照射されたスポロゾイト（γ-spz）で、異なる用量のγ-GalCer（０．５、１、２μｇ）と共に静脈内投与により免疫化した。２週間後、これらの異なるグループのマウスを、１×１０４生Ｐ．ヨエリスポロゾイトで攻撃し、高感度リアルタイムPCRアッセイ（Bruna Romeroら、Int. J. Parasitol. 31:1499 1502, 2001）を使用して、肝臓における寄生虫特異的ｒＲＮＡの量を決定することによって、抗マラリア防御免疫のレベルを測定した。α-GalCerの投与は、γ-spzによる免疫化によって誘発される防御免疫のレベル（肝段階発育の阻害％）を用量依存的に有意に増強した（図１Ａ）。実際、２μｇのα-GalCerを投与されたγ-spz免疫化マウスの肝臓における寄生虫負荷量は、γ-spzのみで免疫化されたマウスの肝臓における負荷量よりも１０倍少なかった。
【０１５３】
本発明者らはまた、空気乾燥Ｐ．ヨエリスポロゾイトの免疫蛍光アッセイ（IFA）を使用して、抗スポロゾイト抗体の力価、ならびにELISAを使用して、スポロゾイトの主要表面抗原であるスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質に対する抗体の力価を決定した。抗体価は、α-GalCerを投与されたか否かにかかわらず、γ-spz免疫化マウスのグループ間で同一であった（図１Ａ）。抗ＣＳ抗体の免疫グロブリンのイソタイプを決定した時、抗ＣＳ抗体のIgE、IgG1、IgG2aまたはIgMにおける有意差は、α-GalCer処置および非処置マウス間で検出されなかった。これらの結果は、抗マラリア体液性応答がα-GalCer処置の影響を受けないことを示す。
【０１５４】
次いで、１×１０４γ-spzによる静脈内免疫化の同日、２日前または２日後に、BALB/cマウスに２μｇの糖脂質を投与することによって、α-GalCerによって示されるアジュバント活性の速度論について試験した。γ-spzの同日にα-GalCerが投与された時に、最も高いレベルの抗マラリア防御免疫が誘発された（図１Ｂ）。γ-spz免疫化２日後のα-GalCerの投与は、スポロゾイト単独によって誘発される防御免疫のレベルを有意には増強しなかった。興味深いことに、γ-spz免疫化の２日前にα-GalCerを投与すると、防御免疫は全く認められなかった。２日早くα-GalCerを投与したことにより、スポロゾイトが抗原提示細胞により、プロセスされ、提示される前にスポロゾイトが排除され、そのためマラリア特異的免疫応答の導入が防止された可能性がある。本発明者らの先の研究（Gonzalez-Aseguinolazaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:8461-8466, 2000）において示したように、生スポロゾイトによる攻撃の２日前に投与されたα-GalCerは、NKT細胞およびIFN-γ依存的な様式で、肝臓中の寄生虫を完全に排除する。α-GalCerのアジュバント活性の同様な速度論は、B10.D2マウスにおいて観察された（図１Ｂ）。
【０１５５】
α-GalCerおよびマラリア抗原の同時投与はマラリア特異的Ｔ細胞応答、特にCD8+Ｔ細胞の応答を増強する
マラリアに対する防御免疫応答のα-GalCer介在性増強がγ-spz免疫化に関連する特有の現象であるか、または投与される免疫原には依存しない一般的現象であるかどうかを決定するために、全ＣＳタンパク質、AdPyCSを発現する組換えアデノウイルス（Rodriguesら、J. Immunol., 158:1268-1274, 1997）、またはＣＳタンパク質、SIN（Mal）のCD8+Ｔ細胞エピトープを発現する組換えシンドビスウイルス（Tsujiら、J. Virol., 72:6907-6910, 1998）の至適用量未満による皮下免疫化と同日に、α-GalCerをBALB/cマウスに投与した。図１Ｃおよび１Ｄに見られるように、α-GalCerは、至適用量未満の２つの異なる組換えウイルスでの免疫化によって誘導される防御免疫応答を有意に増強する。AdPyCSの場合、防御は、コントロールのほぼ１０倍増大され、SIN（Mal）の場合、α-GalCerとの同時投与後の防御は３倍増強された。
【０１５６】
ワクチンと同時投与されるα-GalCerのアジュバント活性をさらに評価するために、寄生虫血症（即ち、血中における寄生虫の存在）を、血液薄層塗抹標本の顕微鏡検査によって、連日監視した。簡単に説明すると、BALB/cマウスを、静脈内への1×104 γ-spzまたは皮下への1×107 p.f.u.のAdPyCSで免疫化した（該用量ではα-GalCer処置を伴ってもまたは伴わなくても、マラリアに対する防御を付与し得ない）。２週間後、全てのマウスを５０生存Ｐ．ヨエリスポロゾイドで攻撃し、寄生虫血症を監視することによって血液感染の発生を決定した。３０匹のα-GalCer処置、γ-spz免疫化マウスのうち２８匹が防御され、一方、ほとんどのα-GalCer非処置、γ-spz免疫化マウスはマラリア感染が成立した（表Ｉ）。同様に、AdPyCSと共にα-GalCerを投与すると、至適用量未満のウイルスによって誘導される防御効果が強力に増大された。一方、α-GalCer単独を投与すると、攻撃されたマウスを防御することができなかった。全般的に、これらの結果は、肝段階のデータを確証し（図１）、またα-GalCer投与は、γ-spzおよび組換えウイルスの両方の至適免疫化用量未満の有効性を増加し、深遠なアジュバント効果を示す。
【表１】
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【０１５７】
α-GalCerは様々なワクチンによって誘発されるＴ細胞応答を増強する
マラリア特異的Ｔ細胞応答（即ち、CD4+および／またはCD8+Ｔ細胞応答）のどの成分がα-GalCerとγ-spzとの同時注入によって増強されるを決定するために、α-GalCerを伴うかまたは伴わずに処置したγ-spz免疫化マウスにおけるこれらの免疫パラメータを比較した。この目的のために、BALB/cマウスを、1×105 γ-spzで、ビヒクル（０．５％ポリソルベート−２０、ニッコー・ケミカル、東京）またはα-GalCerのいずれか一方を伴って免疫化した。２あるいは６週間後、脾臓リンパ球を単離し、ELISPOTアッセイ（Rodriguesら、J. Immunol., 158:1268-1274, 1997）によって、ＣＳ特異的、IFN-γおよびIL-4分泌CD8+ならびにCD4+Ｔ細胞の数を決定した。図２Ａに見られるように、α-GalCer処置は、免疫２週間後にγ-spzによって誘発されるＣＳ特異的Ｔ細胞応答のレベルを顕著に増強した。具体的には、α-GalCerは、IFN-γ分泌ＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞の数を、γ-spz免疫化単独によって誘発される場合と比較しておよそ７倍増加した（図２Ａ）。さらに、IFN-γ分泌ＣＳ特異的CD4+Ｔ細胞も、程度はより低いものの有意に増加した（図２Ａ）。さらに重要なことに、α-GalCerの投与は、ＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞応答をを増強するだけではなく、応答の持続期間を延長した（図２Ａ；下記を参照のこと）。α-GalCer処置によるＴ細胞応答のそのような強力な増強は、γ-spz免疫化の２日前または２日後にα-GalCerを投与した場合には認められなかった。IL-4分泌ＣＳ特異的CD4+またはCD8+Ｔ細胞の数に差は認められなかったことから、α-GalCer処置は、本実験系では、抗原特異的Th1型応答を主に増強することが示される。BALB/cおよびB10.D2両マウスにおいて同様の結果が得られたため、α-GalCerのアジュバント効果は、これらのマウスの異なる遺伝的背景によって影響されないと結論付けることができる。
【０１５８】
α-GalCer投与は、スポロゾイト免疫化マウスのＣＳ特異的Ｔ細胞応答のレベルを強力に増大することが見出されたため、本発明者らは、α-GalCerは、ペプチド免疫化ならびに組換えウイルスによる免疫化時にもＣＳ特異的Ｔ細胞応答を増強することができるかどうかを決定した。α-GalCerを、（ｉ）ＣＳタンパク質のCD8+Ｔ細胞エピトープもしくはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープいずれか一方に対応する１０ｍｇの合成ペプチドまたは（ｉｉ）至適用量未満のAdPyCSとの皮下免疫と同時に、BALB/cマウスに投与した。１０日後、これらのグループのマウスからリンパ節細胞（ペプチド免疫化の検討のため）および脾臓細胞（ウイルス免疫化の検討のため）を入手し、IFN-γまたはIL-4を分泌するＣＳ特異的Ｔ細胞の数を、ELISPOTアッセイにより決定した。α-GalCer処置、ペプチド免疫化マウスにおいて誘発されたIFN-γを分泌するＣＳ特異的CD4+およびCD8+Ｔ細胞の両方の数は、α-GalCerを伴わないペプチド免疫化マウスにおける前記Ｔ細胞の数よりも有意に大きかった。ペプチド免疫化２日前または２日後に投与されたα-GalCerはまた、α-GalCerとペプチドとの同時投与によって増強される応答よりも低い程度ではあるものの、ＣＳ特異的Ｔ細胞応答を有意に増強することが可能であった。α-GalCer処置、AdPyCS免疫化マウスにおいて誘発されたＩＦＮ−γを分泌するＣＳ特異的CD4+およびCD8+Ｔ細胞の両方の数は、ウイルス単独で免疫化されたマウスのグループ由来のＴ細胞の数よりも１０倍大きかった（図２Ｂ）。SIN（Mal）を使用した場合にも、α-GalCerは、IFN-γを分泌するＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞の数を増加することを見出した（図２Ｃ）。
【０１５９】
本発明者らは、α-GalCerのアジュバント活性がＣＳのH-2Kd-制限化CD8+Ｔ細胞エピトープに特異的に関連する現象であるか、または非マラリアエピトープにも適用され得るかどうかについても調べた。この目的のために、BALB/cマウスを、HIVのp18タンパク質（Ｖ３ループ）のH-2Dd-制限化CD8+Ｔ細胞エピトープ（RGPGRAFVTI［配列番号５］）を発現する組換えシンドビスウイルス（Villacresら、Virology, 270:54-64, 2000）で免疫化した。α-GalCer同時投与は、SIN（p18）による免疫化によって誘導されるp18特異的IFN-γ分泌CD8+Ｔ細胞の数を４倍増加した（図２Ｃ）。これらの結果は、（ｉ）α-GalCer処置が、マウスにおいてHIV抗原に特異的なCD8+Ｔ細胞応答を増強すること、および（２）α-GalCer処置が、外来性エピトープ（即ち、抗原提示とは別）を発現する組換えシンドビスウイルスによって誘導されるCD8+Ｔ細胞応答を増強することを示す。さらに一般的には、本明細書において示されるデータは、α-GalCerでの処置による細胞性免疫応答の増強は、抗原送達システム（弱毒化病原体、ペプチドまたは組換えウイルス）およびエピトープに依存しないことを実証している。
【０１６０】
α-GalCerは、スポロゾイト免疫化によって誘発されるマラリア特異的Ｔ細胞応答および抗マラリア防御の両方の持続期間を延長する
次に、ＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞応答の持続期間を、α-GalCer処置、スポロゾイト免疫化マウス、およびα-GalCerを伴わないスポロゾイト免疫化マウスにおいて比較した。BALB/cマウスを、α-GalCerを伴うかまたは伴わずに1×105 γ-spzで免疫化し、２または４週間後、これらのマウスから脾臓細胞を入手し、ELISPOTによって、IFN-γを分泌するＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞の数を決定した。α-GalCerの投与は、ＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞応答を増強するだけではなく、この応答の持続期間も延長した（図３Ａ）。
【０１６１】
マラリアに対する防御の持続期間に対するα-GalCerのアジュバント効果を決定するために、２つの個別の実験で、血液薄層塗抹標本の顕微鏡観察を介して寄生虫血症（即ち、血液中における寄生虫の存在）を連日監視した。実験１では、２つのグループのマウス（一方はα-GalCerで処置し、他方は非処置のもの）を、1×104 γ-spz（免疫２週間後にマラリアに対する防御を付与し得ない用量）で免疫化した。２週間後、全てのマウスを５０生存Ｐ．ヨエリスポロゾイドで攻撃し、寄生虫血症を監視することによって、血中感染の発生を決定した。実験２では、２つのグループのマウス（一方はα-GalCerで処置し、他方は非処置のもの）を、1×105 γ-spz（免疫化２週間後に完全な防御を誘導するが、４週間後では誘導しない用量）で免疫化した。４週間後、これらの免疫化したマウス、ならび処置をうけていないコントロールを５０生スポロゾイドで攻撃し、上記のようにして感染経過を決定した。１０匹のα-GalCer処置、スポロゾイト免疫化マウスのうちの９匹が両方の実験で防御される一方、α-GalCer処置を受けなかったほとんどのスポロゾイト免疫化マウスはマラリア感染が成立したことを見出した（図３Ｂ）。これらの結果は、RT-PCRによって肝臓中の寄生虫負荷量を決定する研究において得られたデータを確証し、さらに、α-GalCer投与は防御免疫応答の持続期間を延長し、アジュバント効果を示す至適免疫化用量未満の照射されたスポロゾイトの有効性を増加することを実証する。
【０１６２】
α-GalCerのアジュバント活性は、CD1d分子、Vα14NKT細胞およびIFN-γを必要とする
α-GalCerは、CD1d分子に関連してNKT細胞を活性化することが明らかにされている（背景のセクションに記載の参考文献、例えば、Kawanoら、Science, 278:1626-1629, 1997を参照のこと）ため、CD1d分子を欠くマウスならびに古典的NKT細胞受容体を発現するＴ細胞を欠損するマウスを使用して、α-GalCerアジュバント活性の基礎になる細胞機構について調べた。簡単に説明すると、これらのノックアウトマウスを、野生型コントロールと共に、α-GalCer処置を伴うかまたは伴わずに、至適用量未満のγ-spz（1×104）で免疫化した。２週間後、これらの免疫化したマウス、ならびに非免疫化コントロールを生スポロゾイトで攻撃し、抗マラリア防御免疫のレベルを決定した。図４Ａに見られるように、野生型マウスにおいて、γ-spz誘導性防御免疫のレベルを増加するα-GalCerは、CD1d欠損マウス、ならびにVα14NKT細胞を欠くJα281欠損マウスにおいて防御免疫を増大することができなかった。これらの結果はα-GalCerのアジュバント活性がCD1d分子およびVα14NKT細胞の両方に依存することを示す。
【０１６３】
α-GalCerのアジュバント活性に対するCD1d分子およびVα14NKT細胞の重要性をさらに実証するために、CD1dまたはVα14NKT細胞のいずれか一方を欠損したγ-spz免疫化、α-GalCer処置または非処置マウスにおいてＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞を測定した。図４Ｂに見られるように、α-GalCerは、非処置細胞の場合と比較して、CD1d欠損マウスにおいてγ-spz免疫化によって誘導されるＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞を増加することができなかったことから、α-GalCerには、ＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞応答を増大するためにCD1dが必要であることが示される。興味深いことに、γ-spz免疫化およびα-GalCer処置、Jα281欠損マウスにおいて、ＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞の数は、非処置細胞の場合と比較して有意に増加した（図４Ｂ）。しかし、この増加は、α-GalCer処置、γ-spz免疫化野生型マウスのレベルには達せず（図４Ｂ）、抗マラリア防御免疫のレベルを増大しなかった（図４Ａ）。従って、これらの所見は、α-GalCerのアジュバント効果への介在におけるVα14NKT細胞の重要性を実証する。
【０１６４】
最後に、α-GalCerアジュバント活性の基礎になる分子機構を理解するために、IFN-γ受容体を欠くマウス（IFN-γR-/-）を、α-GalCer同時処置を伴うかまたは伴わずにγ-spzで免疫化し、１０日後、ＣＳ特異的IFN-γ分泌CD8+およびCD4+Ｔ細胞の数を、ELISPOTアッセイによって分析した。α-GalCer同時投与は、γ-spz免疫化ノックアウトマウスにおけるＣＳ特異的IFN-γ分泌CD8+およびCD4+Ｔ細胞の数を増大することができなかった（図５Ａ）。GM-CSF受容体β鎖（Satoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:7439-7444, 1999）およびFas（Miezaら、J. Immunol., 156:4035-4040, 1996）などの異なる分子を欠損するマウスも部分的にNKT細胞を欠損することが報告されている。IFN-γ受容体が存在しないことにより、NKT細胞の数の減少および機能の欠損がもたらされる可能性を排除するために、これらのIFN-γR-/-マウスにおけるNKT細胞の存在および機能を、CD1d/α-GalCer４量体染色およびELISPOTアッセイによって分析した。CD1d/α-GalCer４量体を使用するフローサイトメトリー分析は、IFN-γR-/-マウスにおける肝リンパ球間のα-GalCer特異的NKT細胞の百分率が、野生型マウスの場合と同様であることを示した（図５Ｂ）。野生型ならびにIFN-γR-/-マウスの肝臓（図５Ｃ）および脾臓においてIFN-γを分泌するα-GalCer特異的細胞の数は、同様であることから、NKT細胞集団の欠陥のためにアジュバント活性が失われる可能性が排除されている。総合的に、これらの結果は、α-GalCerのアジュバント活性がIFN-γの産生に依存することを示す。
【０１６５】
考察
本実施例は、NKT細胞リガンド、α-GalCerがアジュバントとして作用し、マラリア特異的抗原によって誘導される抗マラリア獲得免疫を調節する能力を扱っている。本明細書において開示されるように、至適用量未満の（ｉ）照射されたプラスモジウム・ヨエリ（Plasmodium yoelii）スポロゾイト、（ｉｉ）ＣＳタンパク質のCD8+Ｔ細胞エピトープもしくはCD4+Ｔ細胞エピトープのいずれか一方に対応する合成ペプチドまたは（ｉｉｉ）全ＣＳタンパク質もしくはＣＳタンパク質のCD8+Ｔ細胞エピトープを発現する組換えベクターウイルスで免疫化したマウスへのα-GalCer投与は、抗マラリア防御免疫を顕著に増大する。さらに、本実施例では、スポロゾイト免疫化４週間後でも、α-GalCer処置がより高いレベルの防御を誘発することを見出したことにより、より長期間継続する防御免疫がα-GalCerを併せて投与することによって誘発され得ることが示された。
【０１６６】
α-GalCer投与の影響を受ける主な免疫成分は、明らかにIFN-γを分泌するマラリア特異的CD8+およびCD4+Ｔ細胞である。本研究では、体液性応答ならびにTh2型応答のレベルは、α-GalCer投与によって変化しなかった。対照的に、α-GalCerの投与は、γ-spz免疫化によって誘導されるIFN-γ分泌ＣＳ特異的CD4+およびCD8+Ｔ細胞の数を、それぞれおよそ５倍および７倍増大した。さらに、ＣＳ特異的Ｔ細胞応答のレベルは、α-GalCer処置マウスにおけるγ-spz免疫化６週間後に、非処置マウスと比較してかなり高位を保持した。マラリアの肝段階に対する防御免疫は、主にCD8+Ｔ細胞ならびにCD4+Ｔ細胞によって介在され、IFN-γの産生を必要とする（Schofieldら、Nature 330:664-666, 1987；Weissら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:573-576, 1988；DoolanおよびHoffman、J. Immunol., 165:1453-1462, 2000）ため、α-GalCer処置によって抗マラリア防御が増加されその持続期間が延長されることは驚くべきことではない。
【０１６７】
α-GalCer処置マウスを、CD4+およびCD8+エピトープに対応する合成ペプチドまたはＰ．ヨエリＣＳタンパク質もしくはこのタンパク質のH-2Kd拘束性CD8+Ｔ細胞エピトープのいずれか一方を発現する組換えウイルスで免疫化した場合にもα-GalCerのアジュバント効果が観察された。これらの結果は、γ-spz免疫化によって得られるデータを確認し、さらに範囲を広げるものであり、これは、使用される免疫原のタイプ（寄生虫全体、またはペプチド、または組換えウイルス）にかかわらず、マラリア特異的CD8+およびCD4+細胞応答がα-GalCer投与によって増強されることを示す。本実施例では、HIVのH-2Dd拘束性Ｔ細胞エピトープを発現する組換えシンドビスウイルスによって誘導される免疫応答もまた増強されるため、α-GalCer投与によって増強されるCD8+Ｔ細胞応答は、使用されるCD8+Ｔ細胞エピトープに依存しないことも実証されている。
【０１６８】
α-GalCerが、γ-spz免疫化によって誘導される抗マラリア防御免疫のレベルを増大する能力には、CD1d分子およびVα14NKT細胞の両方が必要である。これらの成分がなければ、α-GalCerは、至適用量未満の免疫原によって誘発される防御を増加することができなかった。CD1d分子およびVα14NKT細胞の両方は、抗マラリア防御免疫を増大するα-GalCerの能力に必要であるが、ＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞の数の注目すべき増加がα-GalCer処置後のJα281欠損マウスにおいて検出された。このことは、Ｔ細胞応答に影響を及ぼし、このような中等度の増加を引き起こすような、これらのマウスの高い程度の遺伝的不均質性によるかもしれない。あるいは、CD1d反応性、非Vα14NKT細胞はJα281欠損マウスに存在するかもしれない。
【０１６９】
α-GalCerのアジュバント効果の正確な分子機構はまだ十分に明らかにされていないが、α-GalCerのこれらの活性がIFN-γ受容体を欠くマウスにおいて排除されるという今回に所見は、α-GalCerのアジュバント効果への介在においてIFN-γが重要であることを示している。NKTおよび／またはＮＫ細胞によって分泌されるIFN-γは、MHCクラスＩをプロセスする機構、例えば、TAP、プロテオソームサブユニットおよびクラスＩ重鎖をアップレグレートすることによって、抗原提示細胞に作用する可能性がある。あるいは、IFN-γは、抗原特異的CD8+Ｔ細胞に直接作用することによって、細胞性獲得免疫応答を増強する可能性もある。
【０１７０】
本速度論研究は、糖脂質が抗原（照射されたマラリア原虫スポロゾイト［γ-spz］、またはマラリア特異的ペプチドエピトープ［例えば、組換えウイルスによって提示される］など）と同時投与される場合にのみ、α-GalCerが最大のアジュバント効果を示し、これらの免疫原による免疫化２日前または２日後にα-GalCerを投与するとアジュバント活性が認められなくなることを実証している。CD1d/α-GalCer４量体を使用するα-GalCer投与後のNKT細胞のin vivo速度論に関する最近の研究は、マウスのNKT細胞、特に２０〜３０％のリンパ球集団を構成する肝臓におけるＮＫＴ細胞が敏速に活性化され、大量のIFN-γおよびIL-4を分泌し、刺激５時間後に迅速に消失することを示した（Matsudaら、J. Exp. Med., 192:741-754, 2000）。興味深いことに、このような急激なα-GalCer活性化NKT細胞の消失は、α-GalCerで処置した肝患者の抹消血の表現型分析によっても確認された。
【０１７１】
様々な研究者によって先に示されているように、NKT細胞の活性化は、ＮＫ細胞の活性化だけではなく、記憶CD4+およびCD8+Ｔ細胞の増殖（Eberlら、J. Immunol., 165:4305-4311, 2000）またはＴ細胞およびＢ細胞の表面上の早期活性化マーカーCD69の誘導（Nishimuraら、Int. Immunol. 12:987-994, 2000）をも引き起こすことから、Ｔ細胞およびＢ細胞応答の開始における活性化されたNKT細胞の役割が示唆される。また、異なる多くの研究者による最近の研究は、α-GalCer処置後、NKTおよびＮＫ細胞より分泌されるIFN-γを示している（Nishimuraら、Int. Immunol. 12:987-994, 2000；Carnaudら、J. Immunol., 163:4647-4650, 1999；EberlおよびMacDonald, Eur. J. Immunol., 30:985-992, 2000）。これらの研究のうちの１つでは、Ｔ細胞リンパ腫で免疫化したマウスにα-GalCerを投与すると腫瘍特異的細胞障害性Ｔ細胞の作製が増大されることが示されている（Nishimuraら、Int. Immunol. 12:987-994, 2000）。しかし、α-GalCer活性化NKT細胞が病原体または腫瘍に対する防御免疫の誘導に寄与し得るかどうかについては解明されていない。このことに関し、今回の研究は、α-GalCer活性化NKT細胞が、CD8+Ｔ細胞が主なエフェクター細胞である防御免疫の誘導において役割を果たすことを世界で初めて示している。
【０１７２】
結論として、本研究は、α-GalCerが抗原特異的防御免疫応答を増強し、および／またはその持続期間を延長するためのアジュバントとして作用することを示した。具体的には、本明細書において記載されているように、このα-GalCer介在性免疫刺激は、その少なくとも一部がα-GalCer活性化NKT細胞に起因する。内因性の哺乳動物のα-GalCerの対応物についてはまだ同定されていないが、それはまた、NKT細胞を活性化するための病因学的および炎症条件の範囲下で誘導され得ると考えられる（Miezaら、J. Immunol., 156:4035-4040, 1996； Sumidaら、J. Exp. Med., 182:1163-1168, 1995）。従って、本明細書において開示した研究は、生来および適応免疫を橋渡しすることにおけるNKT細胞の役割に関する証拠を提示し得る。
【０１７３】
α-GalCerのアジュバント活性に関する今回の所見は、明らかに、マラリアだけではなく、他の様々な細胞内微生物病原体、ならびに他の感染および腫瘍にも応用することができる。最後に、α-GalCerはマウスだけではなくヒトのNKT細胞をも刺激することができることが実証されている（Brossayら、J. Exp. Med. 188:1521-1528, 1998；Spadaら、J. Exp. Med., 188:1529-1534, 1998）ため、今回の所見は、ヒトNKT細胞の役割の理解、および新規かつより有効なヒトワクチンの開発に直接適用することができる。
【０１７４】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様によって範囲が制限されるべきではない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な変更が、上記の説明および添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０１７５】
本明細書に記載の全ての出願、刊行物、試験方法、文献およびその他の材料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１Ａ】α-GalCerが、照射されたスポロゾイトおよびマラリア原虫抗原を発現する組換えウイルスによって誘導される抗マラリア防御免疫を増大することを示す。
【０１７７】
BALB/cマウスのグループに、異なる用量のα-GalCer（０．５、１、もしくは２μｇ）またはビヒクル(-)を、Ｐ．ヨエリの照射されたスポロゾイト（γ-spz）による静脈内免疫化と共に腹腔内に同時注入した。２週間後、全てのグループのマウスを伝染性スポロゾイドで攻撃し、リアルタイムRT-PCRによって肝臓中の寄生虫rRNAの量を測定した。免疫化および非免疫化マウス由来の血清を回収し、それらの抗スポロゾイド抗体の力価をIFAによってアッセイした。
【図１Ｂ】α-GalCerが、照射されたスポロゾイトおよびマラリア原虫抗原を発現する組換えウイルスによって誘導される抗マラリア防御免疫を増大することを示す。
【０１７８】
γ-spzによるBALB/c（■）またはB10.D2（□）マウスへの免疫化の２日前（−２）、同日（０）または２日後（＋２）に単回量のα-GalCerを投与した。
【０１７９】
２週間後に全てのグループのマウスに生Ｐ．ヨエリのスポロゾイトを感染させ、Ａに記載のように肝臓中の寄生虫負荷量を決定した。結果は、５匹のマウスの平均値±SDとして表す。
【図１Ｃ】α-GalCerが、照射されたスポロゾイトおよびマラリア原虫抗原を発現する組換えウイルスによって誘導される抗マラリア防御免疫を増大することを示す。
【０１８０】
BALB/cマウスのグループを、Ｐ．ヨエリＣＳタンパク質を発現する組換えアデノウイルス、AdPyCSで皮下に、α-GalCer(+)またはビヒクル(-)のs.c.投与と共に免疫化した。
【０１８１】
２週間後に全てのグループのマウスに生Ｐ．ヨエリのスポロゾイトを感染させ、Ａに記載のように肝臓中の寄生虫負荷量を決定した。結果は、５匹のマウスの平均値±SDとして表す。
【図１Ｄ】α-GalCerが、照射されたスポロゾイトおよびマラリア原虫抗原を発現する組換えウイルスによって誘導される抗マラリア防御免疫を増大することを示す。
【０１８２】
BALB/cマウスのグループを、Ｐ．ヨエリＣＳタンパク質のCD8+Ｔ細胞エピトープを発現する組換えシンドビスウイルス、SIN（Mal）でs.c.により、α-GalCer(+)またはビヒクル(-)のs.c.投与と共に免疫化した。アスタリスク（＊）は、アンペアドｔ検定を使用した２つの値間の有意（P<0.01）差を示す。
【０１８３】
２週間後に全てのグループのマウスに生Ｐ．ヨエリのスポロゾイトを感染させ、Ａに記載のように肝臓中の寄生虫負荷量を決定した。結果は、５匹のマウスの平均値±SDとして表す。
【図２Ａ】α-GalCerが、様々なワクチンによって誘発される抗原特異的Ｔ細胞応答のレベルを増加することを示す。
【０１８４】
BALB/cマウスのグループを、γ-spzでs.c.により、同じ経路によるα-GalCerの投与を伴うかまたは伴わずに免疫化し、２または６週間後に、脾臓のリンパ球を単離し、ELISPOTアッセイによって、IFN-γを分泌するＣＳ特異的CD8+（■）およびCD4+（□）Ｔ細胞の数を決定した。
【図２Ｂ】α-GalCerが、様々なワクチンによって誘発される抗原特異的Ｔ細胞応答のレベルを増加することを示す。
【０１８５】
BALB/cマウスのグループを、Ｐ．ヨエリＣＳタンパク質を発現する組換えアデノウイルス、AdPyCSでs.c.により、α-GalCer（＋）またはビヒクル（−）のs.c.投与と共に免疫化した。２週間後、ELISPOTアッセイによって、IFN-γを分泌するＣＳ特異的CD8+（■）およびCD4+（□）Ｔ細胞の数を決定した。
【図２Ｃ】α-GalCerが、様々なワクチンによって誘発される抗原特異的Ｔ細胞応答のレベルを増加することを示す。
【０１８６】
BALB/cマウスのグループを、Ｐ．ヨエリＣＳタンパク質のCD8+Ｔ細胞エピトープを発現する組換えシンドビスウイルス、SIN（Mal）、またはHIVのp18タンパク質のCD8+Ｔ細胞エピトープを発現する組換えシンドビスウイルス、SIN（p18）でs.c.により、α-GalCer(+)またはビヒクル(-)のs.c.投与と共に免疫化した。２週間後、ELISPOTアッセイによって、IFN-γを分泌するＣＳ特異的およびp18特異的CD8+Ｔ細胞の数を決定した。データは、同様の結果を有する２つの実験のうちの１つを示し、３匹のマウスの平均値±SDとして表す。
【図３】α-GalCerがγ-spzによって誘発される抗マラリア免疫応答の持続期間を延長することを示す。
【０１８７】
Ａ．BALB/cマウスを、図２のようにγ-spzで、α-GalCer(+)またはビヒクル(-)と共に免疫化し、２〜４週間後、ELISPOTアッセイによって、脾臓においてIFN-γを分泌するＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞の数を決定した。
【０１８８】
Ｂ．α-GalCer(+)またはビヒクル(-)で処置したBALB/cマウスを、１×１０４または１×１０５のいずれかのγ-spzで免疫化し、それぞれ２または４週間後、これらのマウス＋非免疫化マウスを、５０生存Ｐ．ヨエリスポロゾイドで攻撃した。攻撃３日目〜１４日目に血液薄層塗抹標本において寄生虫血症を監視することによって、血液感染の発生を決定した。
【図４】α-GalCerのアジュバント活性にはCDd1分子およびVα14NKT細胞が必要であることを示す。
【０１８９】
Ａ．BALB/cバックグランドに対するCD1d欠損（CD1-/-）、Vα14NKT（Jα281-/-）欠損および野生型（ＷＴ）マウスのグループを、γ-spzでi.v.により、α-GalCer(+)またはビヒクル(-)のi.p.投与と共に免疫化した。２週間後、これらのマウスおよび非免疫化マウスを、生存スポロゾイドで攻撃し、図１に記載のように、肝臓中の寄生虫負荷量を測定した。
【０１９０】
Ｂ．Ａに記載のマウスの同一のグループを、γ-spzで、α-GalCer(+)またはビヒクル(-)の腹腔内注入と共に免疫化した。２週間後、ELISPOTアッセイによって、脾臓においてIFN-γを分泌するＣＳ特異的CD8+Ｔ細胞の数を決定した。アスタリスク（＊）は、アンペアドｔ検定を使用した２つの値間の有意（P<0.01）差を示す。結果は、同様の結果を有する２つの実験に反映し、５匹（Ａ）または３匹（Ｂ）のマウスの平均値±SDとして表す。
【図５Ａ】IFN-γ受容体欠損マウスではα-GalCerのアジュバント活性が得られないことを示す。
【０１９１】
B10.D2バックグランドに対するIFN-γ受容体欠損（IFN-γR-/-）および野生型（ＷＴ）マウスのグループを、γ-spzでi.v.により、α-GalCer(+)またはビヒクル(-)のi.p.投与と共に免疫化した。２週間後、脾臓のリンパ球を入手し、ELISPOTアッセイによって、IFN-γを分泌するＣＳ特異的CD8+（■）およびCD4+（□）Ｔ細胞の数を決定した。
【図５Ｂ】IFN-γ受容体欠損マウスではα-GalCerのアジュバント活性が得られないことを示す。
【０１９２】
IFN-γR-/-およびＷＴマウスから肝臓リンパ球細胞を入手し、ＰＥ−標識CD1d/α-GalCer４量体およびFITC標識抗ＣＤ３抗体で標識し、フローサイトメトリー分析によって、α-GalCer特異的Ｔ細胞の百分率を決定した。右上に示す数値は、肝臓リンパ球細胞集団のうちの二重陽性細胞の百分率を表す。
【図５Ｃ】IFN-γ受容体欠損マウスではα-GalCerのアジュバント活性が得られないことを示す。
【０１９３】
IFN-γR-/-（■）またはＷＴ（□）マウスから肝臓リンパ球を入手し、ELISPOTアッセイによって、IFN-γまたはIL-4を分泌するα-GalCer特異的細胞の数を決定した。結果は、５匹の細胞の平均値±ＳＤとして表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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