(57)【要約】本発明は、例えば、腺房細胞が、腺房細胞および肝臓細胞の特徴を示す改変細胞表現型（ＩＰ細胞）への分化転換と共に３〜４倍の増殖を受ける条件下で、細胞用培地および細胞付着表面を含む細胞培養システム中で細胞を培養することを含む、哺乳動物腺房細胞を増殖する方法に関する。本発明はまた、細胞を新規の確定された培地中で培養することを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるこれらのＩＰ細胞からインスリン産生細胞への形質転換方法にも関する。これらの方法を実施するための適切な培地、ＩＰ細胞の表現型を有するおよび／またはこれらの方法により産生される単離細胞、およびこの方法を実施するためのキットも開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腺房細胞および肝臓関連遺伝子のマーカーを発現するＩＰ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、インスリン産生細胞に形質転換する方法であって、前記ＩＰ細胞を、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレラ毒素Ｂサブユニット、デキサメタゾン、ガストリン放出ペプチド、ラミニン、Ｍｅｔ−エンケファリン、ＰＤＧＦＡＡ＋ＰＤＧＦＢＢ、ソニックヘッジホッグ、およびサブスタンスＰからなる群から選択される少なくとも１種の分化促進因子の有効量を含む細胞用培地中で、ＩＰ細胞がインスリン産生細胞へと形質転換されるように培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ＩＰ細胞は、膵臓腺房細胞の培養物から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞はヒト細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞を、１種または複数の細胞外マトリックス分子で被覆されている基質と接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞外マトリックス分子は、コラーゲンＩ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＩＶ、ビトロネクチン、および／またはフィブロネクチンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
基質は、フラスコ、ペトリ皿、プレート、ウェル、または回転ボトルの表面上にあるか、または足場の一部であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
培地は無血清であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
培地は血清を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
培地は、ＢＳＡ、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、および上皮成長因子（ＥＧＦ）を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞は、５×１０３から２０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で基質上に播種されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１の方法により生成された単離インスリン産生細胞。
【請求項１２】
哺乳類腺房細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化することにより調製されたインスリン産生細胞であって、前記インスリン産生細胞は、１６日後に表６に示したようなｅｘ  ｖｉｖｏでの発現プロファイルを有することを特徴とするインスリン産生細胞。
【請求項１３】
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレラ毒素Ｂサブユニット、デキサメタゾン、ガストリン放出ペプチド、ラミニン、Ｍｅｔ−エンケファリン、ＰＤＧＦＡＡ＋ＰＤＧＦＢＢ、ソニックヘッジホッグ、およびサブスタンスＰからなる群から選択された少なくとも１種の分化促進因子を含む無血清培地であって、前記培地は、インスリン産生細胞へのＩＰ細胞の分化を促進することを特徴とする培地。
【請求項１４】
ＤＭＥＭおよびＨａｍｓＦ１２の１：１混合物と表２に列挙した成分を含む無血清培地。
【請求項１５】
ａ）哺乳類上皮細胞の培養に適した基礎培地：
ｂ）コラーゲンＩで被覆された培養基質、および、別個にパッケージングされた、
ｃ）ＢＳＡ、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレラ毒素Ｂサブユニット、デキサメタゾン、ガストリン放出ペプチド、ラミニン、Ｍｅｔ−エンケファリン、ＰＤＧＦＡＡ＋ＰＤＧＦＢＢ、ソニックヘッジホッグ、およびサブスタンスＰ、またはこれらの成分の２種以上の組合せを、本明細書の表１に示したような完全培地中の最終濃度を生じるに適切な量で含む、無血清培地サプリメント
を含有することを特徴とするＩＰ細胞をインスリン産生細胞に分化するのに適したキット。
【請求項１６】
細胞培養基質は、細胞培養に適したフラスコ、ボトル、ペトリ皿、プレート、またはウェルの表面上に含まれることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
細胞用培地は、ＤＭＥＭとＨａｍｓ１２の１：１混合物を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＭＥＭとＨａｍｓ１２の１：１混合物を含むことを特徴とする請求項１３に記載の無血清培地。
【請求項１９】
前記分化促進因子は、表１に示したような培地中での濃度を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記分化促進因子は、表１に示したような培地中での濃度を有することを特徴とする請求項１３に記載の無血清培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、ヒト膵臓腺房細胞を、増殖および腺上皮細胞およびその後のインスリン産生細胞への分化転換を支持する条件下で培養するための、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００２年５月２８日に提出された仮出願第６０／３８４，０００号の利益を請求するものであり、この開示のその全体が本明細書に参照して取り込まれる。
【０００３】
インスリン産生細胞を臓器ドナーから取り出し、それらをインスリン依存性Ｉ型糖尿病患者に移植することの潜在的な利点は明確である。エドモントンの臨床試験では、多くの患者が、臓器ドナー源からの無傷の島を移植した後、約２年間の間、外来的なインスリンを送達せずに生存している。しかし、現在の技術では、細胞療法のために一人の糖尿病患者に移植するために十分な数の島（約１００万の島、各々約１，０００個の細胞からなる）を作製するためには、２つの臓器ドナー膵臓が必要である。したがって、糖尿病分野では、移植のためのインスリン産生細胞の新しい源の同定が強調されている。収集後および移植前の島の増殖、および、骨髄に由来するかまたは膵臓に位置する前駆細胞に由来する幹様細胞からの新しい島の生成を含む、多くの手段が試みられている。これらのアプローチにより提示された試みは、長期間の培養におよぶ島の機能の維持、および、骨髄および膵臓からのインスリン産生に利用できる幹様細胞の相対的な希少性の維持に関連している。膵臓に由来する管前駆幹様細胞は、インスリン産生細胞への分化においては骨髄由来細胞よりも効率的であることが報告されており、これは膵臓微小環境に関連した多くの分化シグナルを確実に受けるその起源部位（すなわち膵臓）を反映し得る。膵臓における最も豊富な細胞型は腺房細胞であり、これは膵臓の約８５％を構成する。腺房細胞は消化酵素の産生および分泌をつかさどり、島細胞のように、管細胞区画からの発達中に生じる。
【０００４】
腺房細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特にストレス条件下で培養した場合、ＣＫ１９、ＣＫ７、および炭酸脱水酵素（著者によりすべて管細胞のマーカーであると称されている）（例えば、Ｋｅｒｒ−Ｃｏｎｔｅ、１９９６、特許文献１参照）、Ｈａｌｌら、１９９２）の発現により決定されたように、管細胞に似た細胞型へと「分化転換」を受けることができるという報告がある。さらに、Ｂｏｕｗｅｎｓら（１９９８）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、膵管結紮のモデルにおいて、膵臓の結紮部分における腺房細胞は、管表現型をもつ細胞へと分化転換を受けることを示した。さらなる研究により、膵臓の結紮部分における管細胞のさらなる分化時にインスリン産生細胞を産生できることが示唆されている。腺房細胞はまた、一次培養物中では生存度が低いと報告されており、いくつかの培養条件では、１週間以内に少なくとも５０％の細胞が消失する。一次管細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、いくつかの培養条件下でインスリン産生細胞へと変換されることが実証されているが（例えば、Ｂｏｎｎｅｒ  Ｗｅｉｒ、２０００、特許文献２参照）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腺房細胞から生じて分化してさらに島様細胞を産生する細胞は報告されていない。
【特許文献１】国際公開第０２／２９０１０Ａ２号
【特許文献２】米国特許第６，０１１，６４７号明細書
【非特許文献１】Bonner-Weir, Sら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 7999-8004 (2000)
【非特許文献２】Bouwens, L.、Microsc. Res. Tech. 43: 332-6 (1998)
【非特許文献３】Bowens, L.ら、Diabetologia 41: 629-33 (1998)
【非特許文献４】Gmyr, V.ら、Diabetes 49: 1671-80 (2000)
【非特許文献５】Gmyr, V.ら、Cell Transplant 10: 109-21 (2001)
【非特許文献６】Gmyr, V.ら、Diabetes 49: 1671-80 (2000)
【非特許文献７】Hall, P. A.ら、J. Pathol. 166: 97-103 (1992)
【非特許文献８】Kerr-Conte, J.ら、Diabetes 45: 1108-14 (1996)
【非特許文献９】Kerr-Conte, J.ら、Transplant Proc 27: 3268 (1985)
【非特許文献１０】Pattou F.ら、Bull. Acad. Natl. Med. 184: 1887-99 (2000)
【非特許文献１１】Rao, MSら、Biochem Biophys Res Comm. 156: 131-6 (1988)
【非特許文献１２】Rooman, Ilseら、Diabetes 51: 686-90 (2002)
【非特許文献１３】Rooman, Iら、Diabetologia 43: 907-14 (2000)
【非特許文献１４】Rooman, Iら、Gastroenterology 121: 940-9 (2001)
【非特許文献１５】Trivedi, N.ら、Endocrinology 142: 2115-22 (2001)
【非特許文献１６】Tsanadis, G.ら、Histol. Histopathol. 10: 1-10 (1995)
【非特許文献１７】Wang, R. N.ら、Diabetologia 38: 1405-11 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明のシステムの開発前には、一次膵臓腺房細胞は、血清含有培地（血清の使用に伴うリスクおよび不確実性の両方から望ましくない）中、または複雑な無血清培地調合物中のいずれにおいても、インスリン産生細胞への分化は伴わずに増殖されていた。同様に、一次膵臓腺房細胞は、増殖は伴わずにインスリン産生細胞へと分化転換されており、インスリン産生表現型をもつ細胞の産生は少数であった。さらに、出発材料として腺房細胞を使用して、良好な量でインスリン産生細胞を得ることは以前には不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、豊富な膵臓腺房細胞の増殖および分化転換により、例えばインスリン産生細胞へとさらに分化できる多数の細胞を迅速に作製するための、簡単な細胞培養システムおよび方法が必要である。さらに、このような細胞を培養しインスリン産生細胞へと形質転換するための細胞培養システムおよび方法が必要である。本明細書に開示したある細胞培養システムおよび関連した方法により、インスリン産生細胞を産生することのできる少なくとも８０％の中間前駆細胞を含む増殖培養物を生じる簡単な１ステップのアプローチが可能となる。第２の細胞培養システムおよび関連した方法により、これらの中間前駆細胞または他の腺上皮細胞をさらに培養して、インスリン産生細胞を得ることが可能となる。ＩＰ細胞およびインスリン産生細胞の両方が、糖尿病などの疾患の治療のための細胞をベースとした療法に有用であろう。
【０００７】
本発明は、腺房細胞を、時間の経過と共に３〜４倍の細胞数の増加を起こし、培養の早期に（ｅｘ  ｖｉｖｏで２〜３日後）腺房および管マーカーを同時発現する細胞集団を生じながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成功裏に培養でき、その後、腺房細胞が最終的に（ｅｘ  ｖｉｖｏで約７〜８日後）いくつかの腺房関連遺伝子ならびにいくつかの肝臓関連遺伝子の発現により特徴づけられる改変表現型を獲得するための、組成物および方法を提供する。ｅｘ  ｖｉｖｏで約７〜８日後にこれらの改変された細胞により発現される遺伝子には、例えば、管性サイトケラチン（ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９）、肝臓核因子１（ＨＮＦ１）、α−１アンチトリプシン、ｐｉ−グルタチオンｓトランスフェラーゼ（ｐｉ−ＧＳＴ）、肝臓特異的（塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子、Ｔｈｙ−１、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）−α、およびＣ／ＥＢＰ−βが含まれる。これらの細胞は、あったとしてもわずかな、膵臓関連遺伝子の炭酸脱水酵素、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）、エラスターゼ、およびアミラーゼの発現を示す。遺伝子の「あったとしてもわずかな」発現とは、本明細書では、本明細書に記載したハイブリダイゼーションおよび免疫細胞化学的方法などの慣用的な方法の下では一般に遺伝子発現が検出不可能であるが、ＰＣＲをベースとした解析のような著しく感度の高い方法では検出できることを意味する。この型の改変細胞は、本明細書では、中間前駆（「ＩＰ」）細胞と称する。増殖／分化転換された腺房細胞（ＩＰ細胞）は、一般的な血清含有培地を使用して産生できるか、または、好ましい方法では、血清を用いずに、１つ以上の細胞外マトリックス分子（ＥＣＭ）を含む表面上で、１つ以上の可溶性活性因子の存在下で産生できる。ＥＣＭは、可溶性活性因子の存在下、２次元または３次元培養システムで提示することができる。
【０００８】
これらの培養物から生成されたＩＰ細胞は、一部の医学的適用に直接的に有用であると期待される。例えば、このような細胞は、糖尿病患者にインプラントした場合に、ある条件下で、インスリン産生細胞の機能を果たすようになるという証拠がある。前記細胞はまた、創薬および毒性研究にも使用できる。
【０００９】
さらに、本発明のさらなる態様によれば、ＩＰ細胞は、任意の標準的な無血清基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ：ＨａｍｓＦ１２）を、ＢＳＡと、ＥＣＭ、小分子および成長因子を含めた因子の組合せと共に含む無血清培地中でさらに培養することができる。５〜１０日間培養した後、ＩＰ細胞はさらなるステップの分化を受けることができ、プロインスリンおよびＣ−ペプチドを発現する細胞凝集物の形成は最高に達する。これらの培養物を高グルコース培地で攻撃（challenge）すると、インスリンおよびＣ−ペプチドの培地への放出が引き起こされ、これにより、これらの培養物中での機能的な島様細胞の産生が示される。
【００１０】
したがって、第１の態様において、本発明は、細胞増殖も刺激する優れた細胞付着表面、および基礎培地組成物に添加された有効量の１種または複数の可溶性活性因子、または、血清（例えばウシ胎児血清）を含む単純な培地を含む、細胞培養システムを提供する。細胞培養システムは、哺乳類上皮細胞、特にヒト上皮細胞の一次培養に特に有用である。好ましい実施形態において、細胞培養システムは、一次腺房細胞、特にヒト膵臓腺房細胞の増殖および分化転換に使用される。
【００１１】
この細胞培養システムのための細胞付着表面は、２次元（例えばプレート、フラスコ、回転ボトル、ペトリ皿、ウェルなど）および３次元（例えば足場）環境の両方を含む、細胞が付着し増殖できる任意の表面である。好ましくは、表面は、少なくとも１つの型のＥＣＭ、またはそのペプチド断片を含む。細胞は、いくつかの環境では、これらの表面から脱着し、自己支持凝集物を形成する場合もある。適切な断片は、ＥＣＭのアミノ酸配列の任意の部分と同一である３つ以上のアミノ酸残基の配列からなるペプチドを含む。このような断片は、当業者には既知である手段により容易に作製および試験できる。最も好ましくは、表面はコラーゲンＩの層である。当分野で既知の多くの他の表面、例えば、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＩＶ、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンも適している。コラーゲンＩが容易さおよび費用の点から好ましい。
【００１２】
可溶性活性因子が添加される基礎培地は、上皮細胞の増殖および分化に適した任意の細胞用培地でよい。これらには、ＤＭＥＭ、ＨａｍｓＦ１２、ＭＥＭ、Ｍ−１９９、およびＲＰＭＩが含まれるがこれに限定されない。このような培地の一般的な必要条件および多くの適切な例は、当業者には既知である。この基礎培地に、血清（例えばウシ胎児血清）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの安定化タンパク質を、有効量の可溶性活性因子と共に加える。培地は好ましくは無血清である。
【００１３】
一次膵臓腺房細胞の増殖およびＩＰ細胞への分化転換のための可溶性活性因子には、ＨＧＦ受容体アクチベーターおよびＥＧＦ受容体アクチベーターなどの増殖因子が含まれる。好ましい可溶性活性因子には、ＥＧＦおよび形質転換増殖因子−α、ＩＧＦ１、ＨＧＦ、ベータセルリン、プロラクチン、およびガストリン１の中の１つ以上が含まれる。ＨＧＦ、ＥＧＦおよび／または形質転換増殖因子−αが特に好ましい。また、ＩＧＦ１とベータセルリンの組合せも好ましい。
【００１４】
１つの特に好ましい実施形態において、基礎培地は、ＤＭＥＭとＨａｍｓＦ１２の１：１混合物を含む。基礎培地は、最終濃度が約４ｍＭとなるまでのグルタミン、インスリン（約０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（約０．５〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．００５５ｍｇ／ｍｌ）、セレニウム（約０．２５〜５．０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約０．００６７μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム）、および上皮成長因子（ＥＧＦ）（約１〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ）を添加することにより完成させる。この培地は、これ以後、膵臓細胞培地、すなわちＰＣＭと称する。この基礎培地調合物に、約２０％までのウシ胎児血清（または他の血清）、好ましくは約１０〜約１５％のウシ胎児血清、最も好ましくは約１０％または約１５％までのウシ胎児血清）を添加してもよく、あるいは、無血清培養環境を生じるために、血清の代わりに以下の成分を添加する：熱失活させたウシ血清アルブミン（０．１〜２％）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（１〜２０ｎｇ／ｍｌ）、および／または形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）（１〜１０ｎｇ／ｍｌ）。さらに、培地は、ベータセルリン（０．５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、ガストリン１（０．０５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、プロラクチン（１．０〜１０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはＩＧＦ−１（５〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含んでいてもよい。特定の調合物においては、細胞の増殖および分化転換を支持するのに効果的な調合物を得るために、これらの成分をより多くまたはより少なく加えてもよい。当業者は、成分の有効量の決定には、単なる日常的な実験しか必要ないことを認識しているだろう。
【００１５】
この付着表面および培地の使用により、望まれる表現型をもつ一次膵臓細胞の増殖および分化転換は非常に簡単になる。
【００１６】
特に好ましい実施形態において、細胞培養システムは、コラーゲンＩで被覆された組織培養表面（２次元形または３次元形で提示）と、ＢＳＡ、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、および形質転換増殖因子α（ＴＧＦＡ）を含む無血清培地との組合せである。
【００１７】
細胞培養システムにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、以前の方法に比べて、接着培養のための一次膵臓上皮細胞の優れた付着が可能となり、一方で、一次膵臓培養物の上皮成分の増殖を促進すると共に、出発材料に存在する腺房細胞からＩＰ細胞への共同性の分化転換も促進する細胞環境も作り、一方で、望ましくない線維芽細胞の出現も最小限とする。この培養システムの利点は構築しやすいこと、必要な成分が少ないこと、そして、すべての成分が容易に入手でき、必要とされる様式で容易に使用されることである。
【００１８】
本発明のこの態様の成分は、キットの形態で簡便にパッケージングすることができる。キットには、例えば、１）細胞用培地、例えばＤＭＥＭ、２）ＢＳＡ、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、ＨＧＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦＡを、完全培地で前記した濃度を生じるに適切な量で含む、無血清培地サプリメント；および、３）少なくとも１つのコラーゲンＩで被覆された基質、例えば組織培養用の容器（例えば、少なくとも１つのコラーゲン−１で被覆された組織培養表面を有する皿（１または複数））、または培養皿または他の実験用商品で使用するためのコラーゲン−１で被覆されたインサートが含まれ得る。キットはまた、場合により、組織培養皿または他の細胞培養付属物、および、上皮細胞培養および分化を行うのに必要とされる場合がある追加の試薬を含んでいてもよい。
【００１９】
足場、コラーゲンで被覆されたフラスコまたは他の容器および無血清培地からなる培養システムを、別のバイアルとしての可溶性活性因子と共にパッケージングすることができ、これは使用直前に培地に加える。活性因子の組合せを、同じ目的、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの一次膵臓腺房細胞の増殖および分化を達成するために、多種多様な基礎培地に添加することができる。このような培養システムはまた、他の細胞型、特に、肝臓、膵臓、腸、前立腺、および乳房に由来するものを含む、他の臓器および組織に由来する腺上皮細胞にも有用であろう。
【００２０】
コラーゲンＩ表面により優れた細胞付着がもたらされ（これにより初回培養中に付着する細胞数は増加し、したがって、培養効率は増強される）、一方、コラーゲンＩおよび可溶性活性因子の組合せ（例えば、ＨＧＦ、ＴＧＦＡ、およびＥＧＦ）により、時間の経過と共に連続的な細胞増殖が促進され、一次膵臓腺房細胞で以前に報告されていた数よりも細胞数は増加する。さらに、大半の細胞において、腺房細胞の増殖に、ＩＰ表現型への分化転換が伴なって生じ、この表現型は糖尿病などの疾患の処置において治療に有用な可能性のある細胞表現型である。これはコラーゲンＩ、ＨＧＦ、ＴＧＦＡおよびＥＧＦに関連した細胞内シグナル伝達経路の収束に起因して生じるようであり、相乗的な応答が生じている。
【００２１】
本発明の細胞培養システムは、以前に使用されていたシステムに比べ、予期されなかった利点を有する。コラーゲンＩ、ＩＶ、ＶＩ、ビトロネクチン、およびフィブロネクチンは細胞付着を増強すると期待された。しかし、培養の最初の１８時間の間に等価な細胞付着を引き起こした他の細胞外マトリックス分子は、ＨＧＦ／ＥＧＦ／ＴＧＦＡを含む無血清培地中で、時間の経過と共に一貫した細胞増殖を促進しなかった。細胞増殖およびＩＰ細胞への分化を達成する最も効率的かつコスト効果的な方法は、コラーゲン−Ｉ表面および減量した血清（好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％、１０％、または５％未満、最も好ましくは２％）を含む培地を利用することである。
【００２２】
本発明の別の態様は、哺乳類上皮細胞の培養法であって、前記細胞を前記の細胞培養システムに加え、それらを適切な温度および大気条件で維持することを含む。「哺乳類上皮細胞」は、サイトケラチンの発現の存在により、およびしばしば組織特異的機能（すなわち、皮膚の上皮細胞はケラチンを作り、腸の上皮細胞はムチンを作り、前立腺の上皮細胞はＰＳＡを作る）を示唆するマーカーの存在により定義される、上皮細胞表現型をもつ組織または臓器の任意の細胞を意味する。好ましい実施形態において、細胞は、一次膵臓細胞、特にヒト膵臓細胞である。哺乳類細胞に適切な温度は、通常、約３７℃の範囲であるが、細胞型に応じて幾分変化してもよい。雰囲気は通常の空気でも、または、当業者はよく知っているように、細胞の維持に適切な他の特殊なガスの混合物でもよい。膵臓腺房細胞の増殖は、培養雰囲気中の酸素圧力を２１％未満に減少することにより最大限にすることができ、一方で、ＩＰ細胞への分化転換は、酸素圧力を５％より高く増加することにより増強することができる。好ましい酸素圧力の範囲は、約５％から約２１％の間である。
【００２３】
第２の態様において、本発明はまた、前記したような中間前駆（ＩＰ）表現型に特徴的なマーカーの発現を獲得した腺上皮細胞を、インスリン産生細胞へと形質転換するための方法および組成物を提供する。「腺上皮細胞」とは、腺の成分である上皮細胞を意味する。腺は、鍵となる分子の分泌に関連した特別な機能を有する組織であり、生体中の大半の臓器は腺性機能を有し（肝臓、腸、膵臓、前立腺、乳房、下垂体、副腎、腎臓）、これによりそれらはホルモン、消化酵素、または他の生命に必須な液体を産生および放出している。内胚葉に由来する臓器（例えば肝臓、腸、膵臓）由来の腺上皮細胞は、多くの同じ遺伝子を発現する能力を含む、多くの特徴を共有している。特に好ましいのは、膵臓に由来する腺上皮細胞、例えば腺房細胞である。本明細書に使用したような「発現する」および「発現」なる語は、一般に、標準的な免疫細胞化学法により検出可能である核酸（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質遺伝子産物を意味する。
【００２４】
この態様において、本発明は、腺上皮細胞からインスリン産生細胞への形質転換を支持および促進する、細胞付着表面および培地を含む、第２の細胞培養システムを提供する。細胞付着表面は、一次膵臓腺房細胞の増殖のための付着表面と類似しており、それと同一でもよい。容器上に被覆された平坦な表面の形態で提示されていても、または、細胞培養に適合した足場または他の表面の形態で提示されていてもよい。それは、細胞を維持または細胞増殖を支持できる任意の組成物を含んでいても、またはそれで被覆されていてもよい。好ましい実施形態において、それは、少なくとも１つのＥＣＭ、例えばコラーゲンＩ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＩＶ、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンを含む。特に好ましい実施形態において、細胞付着表面はコラーゲン−Ｉである。
【００２５】
この態様において、本発明は、腺上皮細胞からインスリン産生細胞への形質転換を促進する、少なくとも１つの分化促進因子（「ＤＰＦ」）を含む、さらなる培地を提供する。腺上皮細胞からインスリン産生細胞への形質転換のためのＤＰＦは、アクチビンＡ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレラ毒素Ｂサブユニット、デキサメタゾン、ガストリン放出ペプチド、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルコース、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、インスリン、ラミニン、ＬＩＦ、Ｍｅｔ−エンケファリン、ＰＤＧＦＡＡ＋ＰＤＧＦＢＢ、プロラクチン、ソニックヘッジホッグ、サブスタンスＰ、ＴＧＦ−α、トロロクス（α−トコフェロール誘導体）、またはＶＥＧＦの１種または複数とすることができる。これらの２３個の各々のＤＰＦの培地中の好ましい濃度を表１に列挙する。いくつかの場合では１つのＤＰＦで十分であるが、好ましくは２つ以上の因子を使用する。２３種の因子のすべてを使用してもよい。
【００２６】
【表１】
2005527241.tif 000002
【００２７】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、培地は、以下の分化促進ＤＰＦの少なくとも１つ（または１０個すべて）を含む：Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレラ毒素Ｂサブユニット、デキサメタゾン、ガストリン放出ペプチド、ラミニン、Ｍｅｔ−エンケファリン、ＰＤＧＦＡＡ＋ＰＤＧＦＢＢ、ソニックヘッジホッグ、およびサブスタンスＰ。
【００２８】
好ましい実施形態において、腺上皮細胞からインスリン産生細胞への形質転換を促進する培地は、ＤＭＥＭとＨａｍｓＦ１２の１：１混合物および表２に列挙した成分からなる。この培地は時に本明細書では「培地または培地Ｇ９」と称する。
【００２９】
【表２−１】
2005527241.tif 000003
【００３０】
【表２−２】
2005527241.tif 000004
【００３１】
本発明のこの態様の成分はまた、キットの形態で簡便にパッケージングしてもよい。キットは、例えば、１）細胞用培地、例えばＤＭＥＭ、ＨａｍｓＦ１２、またはその組合せ；２）ＢＳＡおよびＤＰＦｓアクチビンＡ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレラ毒素Ｂサブユニット、デキサメタゾン、ガストリン放出ペプチド、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルコース、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、インスリン、ラミニン、ＬＩＦ、Ｍｅｔ−エンケファリン、ＰＤＧＦＡＡ＋ＰＤＧＦＢＢ、プロラクチン、ソニックヘッジホッグ、サブスタンスＰ、ＴＧＦ−α、トロロクス（α−トコフェロール誘導体）、またはＶＥＧＦ、またはこれらの成分の２つ以上の組合せを、完全培地で表１に記載した濃度を生じるのに適切な量で含む、無血清培地サプリメント；および３）少なくとも１つのコラーゲン−１で被覆された組織培養表面を有する組織培養皿（１または複数）（または培養皿または他の実験商品で使用するためのコラーゲン−１で被覆されたインサート）を含むことができる。キットはまた、場合により、組織培養皿および／または他の細胞培養付属物、ならびに、上皮細胞培養および分化を行うのに必要とされ得る追加の試薬を含むことができる。他の実施形態において、キットは、本明細書に考察した培地または培地成分のいずれかを含むことができる。
【００３２】
足場、コラーゲンで被覆されたフラスコまたは他の容器および無血清基礎培地からなる培養システムは、別のバイアルとしてのＤＰＦと共にパッケージングし得、これは使用直前に培地に添加される。ＤＰＦの組合せを、同じ目的、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの一次膵臓腺房細胞の増殖および分化を達成するために、多種多様な基礎培地に添加することができる。このような培養システムはまた、他の細胞型、特に、肝臓、膵臓、腸、前立腺、および乳房に由来するものを含む、他の腺組織に由来する他の上皮細胞にも有用であろう。
【００３３】
本発明はまた、腺上皮細胞を、前記の細胞培養システム中で培養することを含む、腺上皮細胞をインスリン産生細胞に変換する方法も提供する。この方法はさらに、培地を細胞培養物から取り除き、細胞培養物にグルコースを含む無血清培地を再度供給し、プロインスリン産生、Ｃ−ペプチド産生、またはインスリン放出を測定することを含むことができる。
【００３４】
さらに、本発明は、細胞のサブセットがＩＰ細胞に関連した少なくとも１つのマーカーを発現する（例えば、管性サイトケラチン（ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８およびＣＫ１９）、ＨＮＦ１、α−１アンチトリプシン、ｐｉ−グルタチオンｓトランスフェラーゼ（ｐｉ−ＧＳＴ）、肝臓特異的ｂＨＬＨ転写因子、Ｔｈｙ−１、Ｃ／ＥＢＰ−αおよびＣ／ＥＢＰ−βを含む、いくつかの腺房関連遺伝子ならびにいくつかの肝臓関連遺伝子を発現し、あったとしてもわずかな膵臓関連遺伝子炭酸脱水酵素、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）、エラスターゼおよびアミラーゼを発現する）ような細胞の集団に由来する、免疫検出可能なプロインスリン、インスリン、および／またはｃ−ペプチドを有する細胞質顆粒を含む、インスリン産生細胞の単離集団を提供する。
【００３５】
「単離」細胞または細胞集団とは、本明細書では、細胞または細胞集団をその元々の環境（例えば、天然である場合には天然環境）から取り出し、天然に結合している少なくとも１つの他の成分から単離または分離することを意味する。例えば、天然に生存している宿主に存在する天然細胞は単離されていないが、天然系に同時存在するいくつかまたはすべての材料から分離された同細胞は単離されている。このような細胞または細胞集団は、細胞培養物または細胞集団の一部となることができ、このような培養物または集団はその天然環境の一部ではないという点で依然として単離されている。
【００３６】
１つの好ましい実施形態において、インスリン産生細胞は、哺乳動物膵臓から得られた腺上皮細胞、例えば一次腺房細胞から得られる。
【００３７】
以下の実施例に開示したデータは、新しく単離したヒト膵臓細胞から作成されている。これらの条件での一次ヒト膵臓細胞の増殖により、種々の目的のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＰ細胞の研究に適した、および、糖尿病などの疾患の処置のための細胞療法におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの移植に適した、混合上皮ＩＰ表現型を有する培養物が生じる。これらの方法により作製されたＩＰ細胞はまた、膵臓上皮癌の研究における正常対照として、膵臓細胞生物学の研究に、および、正常膵臓上皮細胞（管性または腺房性）に対する薬物／化合物の効果を試験するために有用であり得る。さらに、細胞をさらに培養して、以下に実証したようなインスリン産生細胞を作製することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の好ましい実施形態を記載する上で、明瞭化のために専門用語を使用する。しかし、本発明は、このように選択した専門用語に限定されない。各々の専門的要素にはすべての技術的均等物が含まれており、これは同じように機能して類似の目的を達成する。ここで引用した各文献は、各々を個々に参照により取り込んだのと同様に参照により取り込まれる。
【００３９】
以下の略称を使用する：
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＢＭＰ  骨形成タンパク質
ｂＨＬＨ：塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＴＧＦβ１：形質転換成長因子β１
ＥＣＭ：細胞外マトリックス分子；構造的支持ならびに接着に関連した細胞シグナル源を提供する組織の細胞により産生される天然に存在するタンパク質。例は、コラーゲン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニンである。
ＥＧＦ：上皮成長因子
ＨａｍｓＦ１２：Ｈａｍの栄養混合物Ｆ１２
ＨＧＦ：肝細胞増殖因子
ＨＮＦ−１：肝核因子１
ＩＧＦ１：インスリン様増殖因子１
ＩＧＦ−ＩＩ：インスリン様増殖因子２
ＩＰ細胞：例えば膵臓腺房細胞または肝臓細胞などの上皮細胞から誘導される中間前駆細胞であって、誘導された細胞は、いくつかの腺房関連遺伝子、ならびに、いくつかの肝臓関連遺伝子（例えばサイトケラチン（ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８，およびＣＫ１９）、ＨＮＦ１、α−１アンチトリプシン、ｐｉ−グルタチオンｓトランスフェラーゼ（ｐｉ−ＧＳＴ）、肝臓特異的ｂＨＬＨ転写因子、Ｔｈｙ−１、Ｃ／ＥＢＰ−αおよびＣ／ＥＢＰ−βを含む）を発現し、あったとしてもわずかな膵臓関連遺伝子炭酸脱水酵素、嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）、エラスターゼおよびアミラーゼを発現する。
ＰＤＧＦ−Ａ：血小板由来増殖因子α
ＰＤＧＦ−Ｂ：血小板由来増殖因子β
ＴＧＦＡ、ＴＧＦ−α：形質転換成長因子α
【００４０】
本明細書に使用したような「培養システム」なる語は、細胞付着表面、好ましくは細胞増殖も刺激するものと、基礎培地組成物に添加された有効量の１つ以上の因子または血清（例えばウシ血清アルブミン）を含む培地とを含む、培養物中で細胞を増殖および／または分化するためのシステムを意味することを意図する。
【００４１】
本明細書で活性可溶性因子およびＤＰＦに言及する場合、「有効量」は、単独でまたは他の含まれる因子と組み合わせて、ＩＰ細胞への増殖および分化、または適宜インスリン産生細胞への増殖および分化を促進する上で効果的である量を意味する。
【実施例】
【００４２】
Ｉ．一次腺房細胞から腺上皮細胞への増殖および分化転換（培養第Ｉ相）
材料および方法：
出発材料：一次ヒト膵臓腺房細胞を、移植のための島細胞の標準的なＣＯＢＥ勾配調製物からの廃棄物として回収する（Ｌａｋｅら、１９８９）。密度勾配遠心分離後、島は、１．０６３密度と１．１０密度の間の層として存在し、残りの細胞は、密度に基づいて勾配の底に沈降したペレットとして回収される。移植センターで細胞を回収した約４８時間後に非組織培養処理ポリスチレンフラスコ中に発明者らは受け取り、ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清中に、約２００万細胞／ｍｌの密度で懸濁する。細胞数および生存度を、光学顕微鏡観察により血球計測器でトリパンブルー排除および計数により評価する。
【００４３】
出発材料の表現型評価。出発材料の調製物を、膵臓細胞を最初に収集した約２４時間後に細胞ペレットとして、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した。パラフィン切片を調製し、スライド上に置き、インスリン（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）、ＣＫ１９（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）、およびアミラーゼ（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）に対する抗体を用いて免疫細胞化学解析を行った。１試料あたり最小で３つの切片を、各マーカーを用いて評価した。すべての抗体染色を、予め希釈した市販の抗体を用いて製造業者の提言に従って実施した。ＣＫ１９では、抗原回収の目的で、ペプシン酵素（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）による３分間の処理を遮断ステップより先に実施した。簡潔には、切片を、等級（ｇｒａｄｅｄ）エタノールにより再水和し、その後、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１５分間インキュベートした。一次抗体を加える３０分前にタンパク質ブロッカー（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）を加えた。３回の５分間の洗浄後、ビオチン化二次抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）を１：１００希釈で加え、切片を３０分間室温でインキュベートした。３回の５分間の洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ−５９６コンジュゲートストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を蛍光可視化のために加えた。各スライドについて、最小で３個の２００倍像を、ＳＰＯＴカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ、ＴＸ）を具備したＮｉｋｏｎ蛍光顕微鏡を使用して撮影した。像を、像解析ソフトフェア（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ／Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を使用して定量的に評価して、インスリン陽性、ＣＫ１９＋、およびアミラーゼ＋細胞の相対的割合を決定した。インスリン＋細胞は島β細胞であり、ＣＫ１９＋細胞は一次管細胞であり、アミラーゼ＋細胞は腺房細胞である（実施例１参照）。
【００４４】
（実施例１）
細胞培養条件の特徴づけ
Ａ．無血清培地
新しく単離した一次ヒト膵臓細胞を、ＣＯＢＥ細胞分離器からペレットとして集め、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、切片化し、アミラーゼ、ＣＫ１９、およびインスリンに対する抗体を用いて解析した。像（図１Ａおよび１Ｂ）はユニバーサルイメージングシステム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で集め、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアで解析した。この細胞ペレット（図１Ｃ）は、１．０％インスリン＋細胞（島β細胞）、５．８％ＣＫ１９＋細胞（一次管細胞）、および９３．２％のアミラーゼ＋および非標識（腺房細胞および他の細胞型）から構成されていた。
【００４５】
その後、一次ヒト膵臓細胞を、１０４または１０５細胞／ｃｍ２で組織培養物で処理したポリスチレン上に、ＤＭＥＭ市販培地と１０％ウシ胎児血清中またはＰＣＭと１０％ウシ胎児血清中に播種した。複製培養物をトリプシン処理により３日間間隔で収集し、生存細胞（トリパンブルー排除により決定）を血球計で計測した。結果（図２に示す）により、本明細書に記載した（血清含有）培地調合物は、一次膵臓細胞の成長および維持には、市販の培地調合物より優れていることが実証される。図３は、細胞を６日間、基礎培地中、基礎培地とすべての可溶性活性因子［ＨＧＦ、約１〜約２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５．０ｎｇ／ｍｌ；ＴＧＦＡ、約１〜約１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２ｎｇ／ｍｌ；ベータセルリン、約０．５〜約２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ；ガストリン１、約０．０５〜約１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０６ｎｇ／ｍｌ；プロラクチン、約１．０〜約１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２．４ｎｇ／ｍｌ；およびＩＧＦ１、約５〜約１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌ］および基礎培地と１０％血清中で増殖した結果を比較する。無血清培地調合物は、培地＋血清により得られる増殖を達成／超過する。
【００４６】
細胞増殖実験は、基礎培地に、わずか３つの可溶性活性因子：ＴＧＦ、ＨＧＦ、およびＥＧＦを補充した以外は、実質的に前記と同様に繰り返した。図６Ｄは、種々の培地中で細胞を増殖した結果を比較し；図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、種々の培地条件下で増殖した細胞培養物の高倍率像を示す。
【００４７】
Ｂ．ＥＣＭ表面
一次ヒト膵臓細胞の付着は、付着した細胞の数と、コラーゲンＩ（１μｇ／ｃｍ２）、フィブロネクチン（３μｇ／ｃｍ２）、ラミニン（２μｇ／ｃｍ２）、ビトロネクチン（１μｇ／ｃｍ２）、マトリゲル（１μｇ／ｃｍ２）、ヒトＥＣＭ（１μｇ／ｃｍ２）、またはポリ−Ｄ−リジン（３μｇ／ｃｍ２）からなるＥＣＭ表面のパネル上に最初に播種した細胞の数を計測することにより評価した。１つの条件では、コラーゲンＩＶ、ラミニン、およびフィブロネクチンの混合物を使用した。ＥＣＭを前記濃度で溶液中に入れ、製造業者の提示に従って１時間室温で組織培養処理ポリスチレン表面に被覆した。その後、過剰のＥＣＭ溶液を除去し、表面を水中で２回濯いだ。細胞を播種する直前に、水を吸引し、その後、細胞をＥＣＭ表面上に、４ｍＭのグルタミン、１×ＩＴＳサプリメント（ＧＩＢＣＯ５１５００−０５６）、１０％ウシ胎児血清（失活、品質保障、ＧＩＢＣ２６１４０−０７９）、および１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ）（ＢＤ４００１）を含む、ＤＭＥＭ：ＨａｍｓＦ１２混合物（１：１）からなる増殖培地（ＰＣＭ）中１×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞を、対照として組織培養ポリスチレン表面上に播種した。１８時間後、非付着細胞を洗浄して除去し、残りの付着細胞にＰＣＭを再度供与し、７日間増殖させてその後に評価した。培養物を１０％ホルマリン中で固定し、前記したようにＣＫ１９およびアミラーゼについての抗体を用いて免疫細胞化学法にかけて、表現型組成を決定した。細胞を、ＤＡＰＩ蛍光青核染色で対比染色し、個々の細胞核を細胞計数のために可視化した。種々の条件にかけた細胞の代謝活性はＭＴＳアッセイにより決定した。生存細胞を、増殖中の生存細胞数または細胞毒性を決定するための比色法であるＭＴＳアッセイ（プロメガCell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay）を使用して測定した。この解析の結果を図７に示す。
【００４８】
（実施例２）
ＥＣＭ表面および種々の培地成分を用いてのさらなる研究
９０％を超える非島／非管細胞からなる一次膵臓細胞を、２８，９００細胞／ウェル（１０５細胞／ｃｍ２）の密度で種々の被覆表面上に撒いた。付着していない細胞を１８時間後に洗浄除去し、培養物を再供与し、８日間増殖させた。培養物をホルマリン（１０％）中で固定し、ＣＫ１９およびアミラーゼに対する抗体を用いて表現型解析にかけた。結果を図４Ａ〜Ｂに示す。コラーゲンＩ、ＩＶ、ラミニン、フィブロネクチン、およびマトリゲルが細胞付着および増殖に適した表面を提供するが、腺性上皮表現型（ＣＫ１９＋）を有する細胞集団の細胞の増加と共に腺房（アミラーゼ＋）表現型の維持は、コラーゲンＩ上で優れていた。解析した細胞の中で５０％を超える細胞がアミラーゼを発現し、解析した細胞の中で５０％を超える細胞がＣＫ１９を発現し、これは、これらの実験条件において、細胞の亜集団が両方のマーカーを発現することを示唆する。
【００４９】
組織培養処理ポリスチレン培養表面を、前記したようにコラーゲンＩで被覆した。組織培地（ＰＣＭ）は前記したように調製した。いくつかの場合では、血清を、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ベータセルリン、ＨＧＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦ−αを含む可溶性増殖因子の組合せと共に、画分Ｖ  ＢＳＡ（９９％純粋、熱で失活、シグマ）と交換した。最適な接種密度は、実施例３に実証したように、１０４ないし１０５細胞／ｃｍ２である。細胞を、ＰＣＭ中、１．５×１０６細胞／フラスコでコラーゲン被覆フラスコ（１５０ｃｍ２）上に播種した。約１８時間の付着期間後に、付着していない細胞を穏やかな吸引／濯ぎにより洗浄除去し、その後、新しい培地を再供与した。培養物を経過時間にわたって代謝アッセイ（ＭＴＴ）により、およびトリプシン処理および細胞計測によりモニタリングし、細胞数を確立した（実施例３参照）。培養期間の終了時の細胞表現型を以下のように評価した：小規模の培養物を同時に９６ウェルプレートに確立した。培養相の終了時に、単層細胞を１０％ホルマリン中で最短１時間で固定した。ホルマリンを除去し単層を濯いだ後、培養物を、ＣＫ１９、アミラーゼ、インスリン、およびビメンチン（線維芽細胞のマーカー）について前の章で記載したように免疫細胞化学法にかけた。ＣＫ１９＋細胞の相対的割合は、前記したように定量的像解析により決定した（実施例４参照）。ホルマリンを除去し単層を濯いだ後、培養物を、ＣＫ１９およびビメンチン（線維芽細胞のマーカー）について前の章で記載したように免疫細胞化学法にかけた。細胞はアミラーゼ抗体でも染色したが、培養物中での時間の経過と共に細胞によるアミラーゼなどの消化酵素の放出により陽性結果がでなかった。ＣＫ１９＋細胞の相対的割合は、前記したように定量的像解析により決定した（実施例４参照）。腺房細胞による管マーカーの獲得は、培養の２〜３日中に細胞亜集団におけるＣＫ１９およびアミラーゼの同時発現を実証することにより確認された（実施例５参照）。これらの実験のために、ＣＫ１９一次抗体をホルマリン固定細胞培養物と反応させ、その後、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて可視化した。その後、細胞を遮断ステップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋｅｒ、ＢｉｏＧｅｎｅｘ）にかけ、その後、第２の一次抗体（抗アミラーゼ）を適用した。アミラーゼの可視化は、Ａｌｅｘａ５９４コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧの適用により行われた。像を前記のように集めた。本明細書に記載の条件で７日間の培養期間の終了時に、培養物中の細胞の６５〜９０％がＣＫ１９を発現し、一方、２０％未満の細胞がビメンチンを発現する（実施例６参照）。ＣＫ１９＋細胞の相対的比率のばらつきは、おそらく、個体患者の年齢、性別、および他の独特な特徴に起因した異質性を反映している。
【００５０】
（実施例３）
細胞播種の密度
一次膵臓細胞を、組織培養処理ポリスチレン皿（６０ｍｍ）上に３つの密度で播種し、ＰＣＭを供与した。光学顕微鏡観察を毎日行った。２４時間の時点で、皿を犠牲にし、トリパンブルーで染色して生存度を評価した。結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
2005527241.tif 000005
【００５２】
（実施例４）
細胞を、コラーゲンＩ表面上で、３７℃で、２１％酸素中、２％ＢＳＡ、２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−α、１０ｎｇ／ｍlのＥＧＦ、および１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを含むＰＣＭ培地または基礎培地中で増殖させた。７日後、培養物を１０％ホルマリンで固定し、蛍光検出を含む免疫細胞化学解析にかけ、その後、自動画像収集および解析を行った。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。線維芽細胞（ビメンチン＋）画分、腺上皮細胞画分（ＣＫ１９＋）、および非標識細胞の画分（その他）は、増殖後に類似している。このことは、血清を無血清培地と交換しても、血清含有培地中で増殖させた細胞に比べて、線維芽細胞の過剰増殖を伴うことなくＣＫ１９＋細胞の画分が維持されることを示唆する。
【００５３】
（実施例５）
一次膵臓腺房細胞を、数日間、１０％ウシ胎児血清、０．０１ｍｇ／ｍｌのインスリン、０．００５５ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、０．００６７μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、４ｍｍｏｌ／リットルのグルタミンおよび抗生物質を含む、１：１比のＤＭＥＭおよびＨａｍｓＦ１２の中で培養した。２日間培養した後（ｅｘ  ｖｉｖｏで４日間）、腺房細胞によるアミラーゼの発現は、免疫細胞化学法により決定したところ依然として強い（図８Ａ、上の左のパネル、赤色染色）。ＣＫ１９の発現も明確である（図８Ｂ、下の左のパネル、緑の染色）。２つの像の重ね合わせ（図８Ｃ）により、高い比率の細胞において、アミラーゼおよびＣＫ１９の明確な共発現が実証され、このことは、アミラーゼ＋腺房細胞からアミラーゼ＋／ＣＫ１９＋の混合した腺房／管表現型（ＡＤ細胞）への活発な変換から判断して中間細胞が存在することを示している。培養物を毎日評価することにより（図９）、ＣＫ１９発現の開始は培養の２日目頃から始まり、５日目までには培養物は大半の免疫検出可能なアミラーゼ発現を失い、ＣＫ１９発現が大半となっていることが実証された。
【００５４】
（実施例６）
ＰＣＭ／コラーゲンＩ表面中で７日間増殖した後、細胞を固定し、ＣＫ１９に対する抗体で染色し、核ＤＡＰＩで対比染色した。全細胞数を自動像解析により評価し（図１０Ａの左パネル、青色で染色した細胞核）、一方、ＣＫ１９＋細胞を計測した（図１０Ｂ、右パネル、緑で染色した細胞の細胞質）。３７８個の全細胞の中で、３４２個がＣＫ１９について免疫陽性であった（９０％）。本明細書に記載の条件を使用して約７日間培養した後、腺房細胞は明確な管特徴を有し、この状態ではこれをＩＰ細胞と称する。大半の一次ヒト培養物では、約７日後の培養物中の８０％を超える細胞が、種々の組織からの管細胞と関連しているＣＫ１９のようなマーカーを発現している。
【００５５】
（実施例７）
７日間の培養物の遺伝子発現解析（ＩＰ細胞）
２つの独立的なＩＰ細胞培養物を、クロンテック８ＫＡｔｌａｓ遺伝子アレイ解析にかけた。ＩＰ細胞は、ＰＣＭおよびコラーゲンＩ表面を含む細胞培養システム中で一次腺房細胞を培養することにより得られた。単層培養物をＰＢＳで２回濯ぎ、その後、０．２５％トリプシンを用いてフラスコから脱着した。細胞を、水平遠心分離機中で１，２００ＲＰＭで３分間遠心分離することによりペレット化した。細胞ペレットを再懸濁し、２回ＰＢＳ中で洗浄し、その後、前記したように最終の遠心分離を１，２００ＲＰＭで３分間行った。上清を廃棄し、穏やかに吸引して、細胞ペレットから可能な限り多くの液体を除去し、その後、ドライアイス／エタノール浴中で迅速凍結し、慣用的な技術を使用して遺伝子発現解析を実施するＢＤクロンテックに移行するまで−８０℃で保存した。
【００５６】
標識されたＰ−３３ｃＤＮＡプローブを、Ａｔｌａｓ  Ｐｕｒｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡラベリングシステムの一部であるストレプトアビジン磁気ビーズ分離法を使用してポリＡ＋ＲＮＡを最初に増やすことにより、各試料からの３０μｇの全ＲＮＡから調製した。各試料からの標識プローブを、約１６時間、プラスチックヒト８Ｋ遺伝子アレイとハイブリダイズし、アレイを洗浄し、Ａｔｌａｓアレイプロトコルに従って画像化した。Ａｔｌａｓ  Ｉｍａｇｅ２．７ソフトウェアを使用して、アレイ格子鋳型を用いてアレイ像を配列し、強いシグナル過剰発生（strong signal bleedover）に起因する偽バックグラウンドシグナルまたは偽シグナルを排除した。その後、転写シグナルを、Ａｔｌａｓ  Ｉｍａｇｅ２．７ソフトウェアを使用してこれらの配列したアレイから抽出し、遺伝子発現の変化についてのさらなる統計学的解析を実施した。
【００５７】
一般に、ｍＲＮＡ転写を、適切なオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションによりアッセイした。いくつかの場合では、例えばＣＫ１９およびアミラーゼでは、タンパク質発現産物を、慣用的な免疫組織化学的方法を使用して測定した。選択したセットの遺伝子のこれらの細胞集団による発現の要約を表４に提示する。表４は、ＩＰ細胞で発現された遺伝子のリスト、および、一次腺房細胞および一次管細胞における発現パターンの比較を含む。「＋」として同定された遺伝子産物は発現され；「＋＋」として同定されたものは強く発現された。記号「丸にＲ」で指定された遺伝子産物は、再生膵臓で見出される。
【００５８】
【表４−１】
2005527241.tif 000006
【００５９】
【表４−２】
2005527241.tif 000007
【００６０】
ＩＩ．腺上皮細胞からインスリン産生細胞への形質転換−ＩＰ培養物の分化によるインスリン産生細胞の産生（第ＩＩ培養期）
ＩＰ培養物を利用して、血清を含まないが以下の分化促進因子の組合せを含む確定された培地調合物と合わせられた、ＩＰ細胞の付着を促進するコラーゲンＩなどの表面を含む、培養の第２期中に細胞を入れることによりインスリン産生細胞を生成することができる：アクチビンＡ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、コレラ毒素Ｂサブユニット、デキサメタゾン、ガストリン放出ペプチド、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルコース、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、インスリン、ラミニン、ＬＩＦ、Ｍｅｔ−エンケファリン、ＰＤＧＦＡＡ＋ＰＤＧＦＢＢ、プロラクチン、ソニックヘッジホッグ、サブスタンスＰ、ＴＧＦ−α、トロロクス（α−トコフェロール誘導体）、およびＶＥＧＦ。以下の例では、基礎培地は、抗生物質および０．２％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ、熱失活９９％純粋）を含む、ＨａｍｓＦ１２およびＤＭＥＭの１：１混合物からなる。１つの例では（組合せ１）、基礎培地には、コレラ毒素Ｂ、デキサメタゾン、ＧＲＰ、ＧＬＰ−１、グルコース、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、インスリン、プロラクチン、ソニックヘッジホッグ、トロロクス、ａＦＧＦ、およびｂＦＧＦが含まれていた。別の例では（組合せ２）、基礎培地には、アクチビンＡ、ＣＧＲＰ−α、ＣＮＰ、グルコース、ＧＬＰ−１、ＩＧＦ−２、インスリン、ＬＩＦ、Ｍｅｔ−エンケファリン、プロラクチン、ソニックヘッジホッグ、ａＦＧＦ、およびｖＥＧＦが含まれていた。第３の例では（組合せ３）、基礎培地には、アクチビンＡ、ＣＧＲＰ−α、コレラ毒素Ｂ、デキサメタゾン、グルコース、ＧＬＰ−１、インスリン、ＬＩＦ、ラミニン、Ｍｅｔ−エンケファリン、ＰＤＧＦＡＡ／ＢＢ、ソニックヘッジホッグ、サブスタンスＰ、ＴＧＦ−α、ａＦＧＦ、およびＶＥＧＦが含まれている。これらの培地サプリメントの濃度は表１に列挙する。
【００６１】
ＡＤ細胞を、１）産生される表面からの細胞をトリプシン処理し、新しい付着促進表面上に約５×１０４細胞／ｃｍ２で再分布することにより、または、２）培地を取り出し、ＰＢＳ中で２回洗浄して古い培地の痕跡を除去し、培養物に、分化促進因子を含む新しい培地（前記）を再供給することにより培養物に入れた。細胞を４〜１０日間３７℃で２１％酸素で培養する。５日後に、培地の半分を除去し、分化促進因子を含む等しい容量の新しい培地と交換する。
【００６２】
分化培養後のＩＰ細胞の表現型解析
前記した分化条件で培養したＩＰ細胞の形態学的評価を光学顕微鏡によりとった（以下の実施例８を参照）。これらの培養物を含む細胞の細胞表現型は、ビタミン、プロインスリン、Ｃ−ペプチド、ＭＵＣ−１、およびＣＫ１９に対するモノクローナル抗体を使用して前記のように免疫細胞化学法により評価した（以下の実施例１０参照）。簡潔には、培養物を１時間室温で１０％ホルマリンで固定し、その後、ＰＢＳで洗浄し、免疫細胞化学プロトコルにかけた（以下の実施例９を参照）。
【００６３】
分化培養後のＩＰ細胞の機能的解析
凝集した細胞クラスターがインスリンおよびＣ−ペプチドを放出する能力は、以下のように培養細胞をグルコース攻撃にかけることにより評価した。分化培地中で７〜１０日間培養しておいた細胞を３回ＰＢＳ中で洗浄し、その後、１）５ｍＭグルコースを含む基礎培地（前記）、または２）２２ｍＭグルコースを含む基礎培地を再度投入した。１８時間後、細胞コンディショニングした培地を集め、インスリンおよびＣ−ペプチド放出についてＥＬＩＳＡ解析にかけた（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＤＳＬ））。ＥＬＩＳＡは、製造業者の明細書に従って標準的な範囲アッセイ手順を使用して実施した。プレートをアッセイ中に振とう機でインキュベートし、結果をＴｅｃａｎ分光測光プレート解読機で解読した。１ウェルあたりのインスリンまたはＣ−ペプチドの全ｎｇを、５ｍＭグルコース培地および２２ｍＭグルコース培地の両方における、各培地条件について計算した（実施例１０を参照）。
【００６４】
（実施例８）
膵臓腺房細胞を、基礎培地＋ＩＴＳ＋血清（１０％）中で１週間培養し、その後、トリプシン処理し（ＥＤＴＡを含まない０．２５％トリプシンで１０分間３７℃で処理）、新しいコラーゲン−１で被覆した表面に移し、列挙した２３個すべてのＤＦＰを含む培地中に入れた。３〜５日間の期間かけて、細胞は容易に、光学顕微鏡により明確に観察可能な３次元のさやのような構造を形成した（図１１）。いくつかのより大きなさやが、培養物中で４〜６日間の後に培養表面から脱着し、トリパンブルー排除により決定したところ生存したままであった。さやのような構造は、インスリン産生細胞の凝集であると推定され、以下に記載のようにさらなる解析にかけた。
【００６５】
（実施例９）
前の実施例に記載したのと同じような様式で生成したさやのような構造を、１０％ホルマリン中で固定し、最初にＣＫ１９モノクローナル抗体を用いて、その後、前記したように、Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体を用いて免疫細胞化学解析にかけた。図１２Ａは、細胞の群を示し（ＤＡＰＩ染色核は青い）、その中のいくつかはＣＫ１９に免疫陽性である（緑染色）。図１２Ｂは、同じ細胞群を示し、その中の多くはＣ−ペプチドに陽性であり、これは、細胞内で合成されたプロインスリン分子が切断されて成熟インスリンを生じた場合に産生され；Ｃ−ペプチド染色細胞は赤く、典型的には細胞質の顆粒が染色されている。図１２Ｃは、より高倍率の重ね合わせ像を示し、これは小さな細胞のサブセットにおける、ＣＫ１９およびＣ−ペプチドの共局在を実証している。共染色細胞は、重ね合わせ像では黄色−オレンジに見える。
【００６６】
（実施例１０）
基礎培地（陰性対照）または分化促進培地の組合せ１、２、および３中で培養した細胞を、インスリンおよびＣ−ペプチドを培地へ放出する能力について評価した。さらに、漸増濃度のグルコースにより、より多くの量のインスリンおよびＣ−ペプチドの放出がもたらされるかどうかを評価し、これにより、島のような機能性が示された。最初に、細胞を、１週間、基礎培地＋ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＴＳ＋１０％ウシ胎児血清（ＰＣＭ）中で培養した。その後、細胞を、洗浄および培地交換（継代培養せず）、または洗浄、トリプシン処理／脱着、再播種、および培地交換にかけた。複製培養物に、基礎培地（無血清）、新しいＰＣＭ、または、分化促進培地の３つの組合せの１つ（すべて無血清）を再投入した。１０日後、分化培地を除去し、培養物を３回ＰＢＳで洗浄し、その後、５ｍＭグルコースまたは２２ｍＭグルコース（最終濃度）を含む無血清培地を再投入した。１８時間後、コンディショニングされた培地を集め、インスリンまたはＣ−ペプチドに対する抗体（ＤＳＬ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＥＬＩＳＡ解析にかけた。図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、それぞれ、非継代培養細胞によるインスリン放出、および、グルコース攻撃に応答したインスリン放出およびＣ−ペプチド放出を示す。いくつかの培養物がインスリンを含み、細胞は培地からインスリンを取り込むことができるので、Ｃ−ペプチドの産生は、細胞がプロインスリンの合成およびプロセシングから新規にインスリンを合成しているという重要な情報である。さらに、インスリンおよびＣ−ペプチドの産生は、グルコース濃度の増加と共に大半の場合には増加し、このことは、これらの培養物中における細胞の島のような機能を示唆する。インスリンまたはＣ−ペプチドは、ＤＰＦをまったく含まない基礎培地中ではほとんど産生されないことに注意する。
【００６７】
（実施例１１）
インスリンの量およびＤＮＡの量の両方を、酵素的脱着および継代培養を伴うまたは伴わない分化培養にかけた、ＩＰ細胞において測定した。培養は、前の章で記載したように正確に実施した。ＤＮＡを標準的なＰｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して測定し、一方、インスリンはＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。インスリンの全ｎｇを、試料中のＤＮＡの全μｇで割り、これによりインスリン：ＤＮＡの比の値を出し、存在するインスリンの量と存在する細胞数（ＤＮＡ含量を反映）の比を計算した。結果を図１４に示す。各々の分化培地組合せにおいて、インスリン：ＤＮＡの比は、基礎培地に比べて増加しており、このことから、ＤＰＦを含まずに培養した場合に比べて、ＤＰＦの存在下の方が細胞あたり、より多くのインスリンが産生されることが示唆される。さらに、インスリン：ＤＮＡ比は、グルコース攻撃時に（２２ｍＭグルコース対５ｍＭ）いくつかの条件ではわずかに増加し、このことから、細胞は、より多くの量のインスリンを放出することによりグルコースに応答することが示唆される。
【００６８】
（実施例１２）
前の方法により得られたインスリン産生細胞を、前記のように遺伝子発現解析にかけた。表５は、最も多く発現された遺伝子のリスト、クロンテックａｔｌａｓ８Ｋ遺伝子アレイにおけるその位置、および、これらの遺伝子の相対的発現（標準化後）を含む。表５は付録１として本明細書に添付する。
【００６９】
（実施例１３）
一次ヒト膵臓細胞を、コラーゲン−１表面上でＰＣＭ中に０．５×１０５細胞／ｃｍ２で播種し、７日間増殖した。インスリンを、以下のように、１日目、７日目、および１０日目に測定した：増殖培地を除去し、ウェルを３回リン酸緩衝食塩水で洗浄した。１時間３７℃で５ｍＭグルコースを含みインスリンを含まない基礎培地中でプレインキュベートした後、培地を除去し、１）５ｍＭグルコースを含む基礎培地（インスリンを含まない）、または２）２２ｍＭグルコースを含む基礎培地（インスリンを含まない）と交換した。インスリンを、細胞コンディショニング培地中で１８時間後に３７℃で測定した。７日間培養した後、ＰＣＭ培地を、１）新しいＰＣＭ、２）無血清基礎培地、３）２３のすべての分化因子を含む無血清基礎培地、４）無血清組合せ１、または５）無血清組合せ２と交換した。結果を図１５に示す。３日間分化因子に曝露した後、インスリン放出の増加が、分化因子の存在下で認められる。１日目の結果は、出発材料中における有意な数のインスリン産生細胞の存在について議論しており、一次培養物における腺房細胞からのインスリン産生細胞の新規産生を実証している。１０日間の終了時に、グルコース攻撃に応答したインスリン放出は、ＰＣＭまたは基礎培地中よりもＤＦＰ培地中の方がはるかに高く、このことは、ＤＦＰが、腺上皮細胞からインスリン産生細胞への形質転換に対して奏功するという刺激効果を確証するということが図からわかる。
【００７０】
（実施例１４）
ヒト膵臓腺房細胞を、コラーゲンＩ表面上でＰＣＭ中で１日目から７日目まで培養し、これにより、７日目にはＩＰ細胞の培養物が産生する。７日目に、ＩＰ細胞を洗浄し、ＰＣＭ培地を、表２に列挙した３０個の因子を含むＧ０９分化培地と交換した。各時点で（１、７、１０、および１４日目）、培養物を３回ＰＢＳで洗浄し、その後、培養物を、５ｍＭまたは２２ｍＭグルコースを含む、ＤＭＥＭとＨＡＭｓＦ１２の１：１混合物で攻撃することによりインスリン放出を測定した。１８時間グルコースに曝露した後、上清を集め、インスリンをＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１５ａに示す。
【００７１】
（実施例１５）
ＩＩＩ．増殖させ、ＩＰ細胞へと分化させ、その後、インスリン産生細胞へとさらに分化させる、一次ヒト腺房細胞のいくつかの時点における発現研究
３つの独立した一次ヒト膵臓腺房細胞の試料を播種し、前記のように増殖した。０日目から８日目まで、細胞は、ＰＣＭ中で１０４細胞／ｃｍ２で播種されたコラーゲンＩ表面上にあった。８日目、培地をＰＣＭから、表２に示した活性因子を有する培地と交換した。細胞に、８日目から１６日目までにＧ０９（５０％の培地を交換）を２回投入した。細胞は、培養プロセス全体を通じて表面上に留まった。培養物を最初に撒いた３日後に（活発に分化転換している腺房細胞）、撒いた８日後（ＩＰ細胞）、および撒いた１６日後（インスリン産生細胞と推定）に収集し、実施例７に記載のように、遺伝子発現解析にかけた。ｍＲＮＡ発現データは、クロンテックの１２Ｋマイクロアレイを用いて得られた。
【００７２】
簡潔には、増殖培地を培養フラスコから取り出し、溶解溶液を細胞層上でピペッティングすることにより、約２分間、トリゾールＬＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カオトロープ／フェノール試薬中で細胞を溶解した。９ｍｌの溶解溶液あたり、３ｍｌのＲＮＡｓｅ非含有水をＯａｋ  Ｒｉｄｇｅ遠心チューブ中に加えた。その後、２．４ｍｌのクロロホルムを加え、溶液を激しく１分間ボルテックスにかけた。その後、水相および有機相を、４℃での遠心分離により分離し、ＲＮＡを含む上の水相を取り出し、清潔なＰＥＴチューブに移した。ＲＮＡをイソプロパノール沈降により沈降させ、７０％エタノールで洗浄し、２００μｌのＲＮＡｓｅ非含有水中に再度溶解した。カオトロープ溶解試薬を直ちにＲＮＡに加え、ＤＮＡｓｅ消化ステップを含むキアゲンスピンカラム法を使用してさらに精製した。精製ＲＮＡは最終的に、８０μｌのＲＮＡｓｅ非含有水に溶出し、−８０℃で保存した。
【００７３】
Ａｔｌａｓ  Ｐｕｒｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡラベリングシステムの一部であるストレプトアビジン磁気ビーズ分離法を使用してポリＡ＋ＲＮＡを最初に富化することにより、各試料からの３０μｇの全ＲＮＡから標識Ｐ−３３ｃＤＮＡプローブを調製した。各試料からの標識プローブを、約１６時間、プラスチックヒト１２Ｋ遺伝子アレイとハイブリダイズさせ、アレイを洗浄し、Ａｔｌａｓアレイプロトコルに従って画像化した。Ａｔｌａｓ  ｉｍａｇｅ２．７ソフトウェアを使用して、アレイ格子鋳型を用いてアレイ像を配列し、強いシグナル過剰発生に起因する偽のバックグラウンドシグナルまたは偽シグナルを排除した。その後、転写シグナルを、Ａｔｌａｓ  Ｉｍａｇｅ２．７ソフトウェアを使用してこれらの配列したアレイから抽出し、遺伝子発現の変化についてのさらなる統計学的解析を実施した。
【００７４】
生発現データを以下のように解析した：１）我々は、３つの任意の条件／時点で発現されなかった遺伝子を除外した；２）我々は、アレイ間の差異および試料処理、ハイブリダイゼーションなどにおけるばらつきの効果を除去するために、互いに対してすべてのマイクロアレイを標準化した；３）我々は、条件／時点間の統計学的に有意な差異を示す遺伝子を同定した；そして、４）我々は、試験の設計および表現型の変化に矛盾しない様式で、その一時的パターンに基づいて遺伝子を群にまとめた。
【００７５】
表６は、上の解析により同定された遺伝子についての発現データを示す。この表は付録２として本明細書に添付する。これらの同定された遺伝子は、３日後および８日後の両方で高いレベルで発現されているか、または、その発現は、３日後から８日後まで実質的に増加していた。表はまた、１６日後におけるこれらの遺伝子の発現レベル、および、３つのすべての条件／時点における平均発現を示す。表はまた、種々の時点における発現比を示す：「Ｉ対Ａ」は、推定インスリン産生細胞（１６日後）対腺房（８日後）細胞の発現比であり；「Ｉｎｔ対Ａ」は、ＩＰ細胞（８日後）細胞対腺房細胞（３日後）の比である。
【００７６】
表６に示したデータを、それらを１７の中の１つの「クラス」に群にまとめることによりさらに解析し、その特徴を表に要約する。これらの１７クラスの特徴のグラフ表示を図１６に提示する。
【００７７】
表６の８日後の時点のデータも、これらの細胞における８日後に発現された遺伝子が、（１）肝臓および膵臓で通常発現される遺伝子；（２）膵臓関連遺伝子；（３）肝臓関連遺伝子；または（４）前駆体関連遺伝子のクラスに属するかどうかに関してグループ分けした。結果を表７に示す。
【００７８】
【表５−１】
2005527241.tif 000008
【００７９】
【表５−２】
2005527241.tif 000009
【００８０】
理解されるように、８日目にはＩＰ細胞は、膵臓腺房細胞に一致する遺伝子をもはや発現しておらず、膵管細胞に特異的な遺伝子の相補体も発現していなかった。ＩＰ細胞は、インスリン、ソマトスタチン、および膵ポリペプチドを含む、膵臓島に関連したいくつかのマーカーを低いレベルで発現しており、このことは、集団中の少なくともいくつかの細胞は、膵臓島の内分泌遺伝子を発現するのに適合していることを示唆する。
【００８１】
驚くべきことに、ＩＰ細胞はまた、いくつかの肝臓特異的転写因子（例えばＣ／ＥＢＰα、Ｃ−ＥＢＰ−β）、および、肝臓「卵」幹細胞に関連したマーカーである、低いレベルのＴｈｙ−１を含む、成熟および発達中の肝臓の他のマーカーを発現していた。このことから、分化中の細胞は単純に膵臓腺房から膵管に移行しているのではなく、肝臓特徴および膵臓特徴の両方をもつ細胞へと発達し、これらの細胞型の１つの任意の単一の遺伝子発現プロファイルにはあてはまらないことが示唆される。この実施例で産生された細胞は、銅欠乏食を供与したげっ歯類の膵臓から出現した細胞に似ている（例えばＲａｏら、１９８８参照）。このような動物の膵臓は、膵炎の急性期を通り、その後、肝臓の「ヘパチゼーション」を受ける（膵臓遺伝子よりもむしろ肝臓遺伝子を発現し始める細胞を意味する）。肝臓に似た細胞はまた、ヒト胎児膵臓でも報告されている（Ｔｓａｎａｄｉｓら、１９９５）。本発明の方法により産生された単離細胞（例えば、本発明の方法により一次腺房細胞または他の型の内胚葉細胞または前駆細胞を増殖することにより）は、卵細胞または銅欠乏食を与えたげっ歯類の膵臓から単離された細胞のような、ＩＰ細胞の特徴のいくつかを有し得る天然細胞とは区別できる。
【００８２】
これらのＩＰ細胞の特徴を有する細胞は、例えば、糖尿病の処置における治療アプローチに有用である場合がある。さらに、この実施例における細胞は膵臓に由来しているが、他の上皮組織、またはおそらくはさらには任意の内胚葉に由来する組織も、追加的な細胞の源となることができ、これは類似の表現型を有する細胞へと分化することができる。適切な組織型には、例えば、肝臓または腸が含まれる。これらのＩＰ細胞は、膵臓、肝臓、腸、および神経組織に関連した遺伝子を発現する。例えば、それらは、膵臓、肝臓、および腸の管細胞に関連した共通のマーカーである、ムチン、ＣＫ１９、およびＣＫ７を発現する。したがって、これらのＩＰ細胞に見られる遺伝子発現パターンは、インスリン産生細胞を作成する目的でこれらの各組織から誘導された細胞の予測的な目安として機能しうる。さらに、ＩＰ細胞は、適切な条件下で、膵臓島細胞だけでなく、肝細胞または任意の内胚葉由来組織も生じる。
【００８３】
一部を上で引用した以下の文献の開示は本発明に関する：
特許文献１（Ｋｅｒｒ−Ｃｏｎｔｅ）；
非特許文献１；
非特許文献２；
非特許文献３；
非特許文献４；
非特許文献５；
非特許文献６；
非特許文献７；
非特許文献８；
非特許文献９；
非特許文献１０；
非特許文献１１；
非特許文献１２；
非特許文献１３；
非特許文献１４；
非特許文献１５；
非特許文献１６；
非特許文献１７；
特許文献２（Ａｍｍｏｎ  Ｐｅｃｋ）。
【００８４】
本明細書に説明および考察した実施形態は、本発明を作成および使用する上で発明者に知られた最善の方法を単に当業者に教示するためものであり、本発明の範囲を限定するものとは捉えるべきではない。本発明の例示した実施形態は改変または変更することができ、本発明から逸脱することなく、前記の教示に照らして当業者には理解されるように、要素を加えたりまたは削除したりすることができる。それ故、特許請求の範囲およびその均等物内で、本発明は、具体的に記載した以外の方法でも実施できることを理解すべきである。
【００８５】
前記および図面に引用したすべての出願、特許および刊行物の全開示はその全体を参照することにより取り込まれる。
【００８６】
【表６−１】
2005527241.tif 000010
【００８７】
【表６−２】
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【００８８】
【表６−３】
2005527241.tif 000012
【００８９】
【表６−４】
2005527241.tif 000013
【００９０】
【表６−５】
2005527241.tif 000014
【００９１】
【表６−６】
2005527241.tif 000015
【００９２】
【表７−１】
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【００９３】
【表７−２】
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【００９４】
【表７−３】
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【００９５】
【表７−４】
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【００９６】
【表７−５】
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【００９７】
【表７−６】
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【００９８】
【表７−７】
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【００９９】
【表７−８】
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【０１００】
【表７−９】
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【０１０１】
【表７−１０】
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【０１０２】
【表７−１１】
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【０１０３】
【表７−１２】
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【０１０４】
【表７−１３】
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【０１０５】
【表７−１４】
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【０１０６】
【表７−１５】
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【０１０７】
【表７−１６】
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【０１０８】
【表７−１７】
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【０１０９】
【表７−１８】
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【０１１０】
【表７−１９】
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【０１１１】
【表７−２０】
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【０１１２】
【表７−２１】
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【０１１３】
【表７−２２】
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【０１１４】
【表７−２３】
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【０１１５】
【表７−２４】
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【０１１６】
【表７−２５】
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【０１１７】
【表７−２６】
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【０１１８】
【表７−２７】
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【０１１９】
【表７−２８】
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【０１２０】
【表７−２９】
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【０１２１】
【表７−３０】
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【０１２２】
【表７−３１】
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【０１２３】
【表７−３２】
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【０１２４】
【表７−３３】
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【０１２５】
【表７−３４】
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【０１２６】
【表７−３５】
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【０１２７】
【表７−３６】
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【０１２８】
【表７−３７】
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【０１２９】
【表７−３８】
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【０１３０】
【表７−３９】
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【０１３１】
【表７−４０】
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【０１３２】
【表７−４１】
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【０１３３】
【表７−４２】
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【０１３４】
【表７−４３】
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【０１３５】
【表７−４４】
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【０１３６】
【表７−４５】
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【０１３７】
【表７−４６】
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【０１３８】
【表７−４７】
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【０１３９】
【表７−４８】
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【０１４０】
【表７−４９】
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【０１４１】
【表７−５０】
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【０１４２】
【表７−５１】
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【０１４３】
【表７−５２】
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【０１４４】
【表７−５３】
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【０１４５】
【表７−５４】
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【０１４６】
【表７−５５】
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【０１４７】
【表７−５６】
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【０１４８】
【表７−５７】
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【０１４９】
【表７−５８】
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【０１５０】
【表７−５９】
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【０１５１】
【表７−６０】
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【０１５２】
【表７−６１】
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【０１５３】
【表７−６２】
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【０１５４】
【表７−６３】
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【０１５５】
【表７−６４】
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【０１５６】
【表７−６５】
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【０１５７】
【表７−６６】
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【０１５８】
【表７−６７】
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【０１５９】
【表７−６８】
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【０１６０】
【表７−６９】
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【０１６１】
【表７−７０】
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【０１６２】
【表７−７１】
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【０１６３】
【表７−７２】
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【０１６４】
【表７−７３】
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【０１６５】
【表７−７４】
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【０１６６】
【表７−７５】
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【０１６７】
【表７−７６】
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【０１６８】
【表７−７７】
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【０１６９】
【表７−７８】
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【０１７０】
【表７−７９】
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【０１７１】
【表７−８０】
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【０１７２】
【表７−８１】
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【０１７３】
【表７−８２】
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【０１７４】
【表７−８３】
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【０１７５】
【表７−８４】
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【０１７６】
【表７−８５】
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【０１７７】
【表７−８６】
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【０１７８】
【表７−８７】
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【０１７９】
【表７−８８】
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【０１８０】
【表７−８９】
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【０１８１】
【表７−９０】
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【０１８２】
【表７−９１】
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【０１８３】
【表７−９２】
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【０１８４】
【表７−９３】
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【０１８５】
【表７−９４】
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【０１８６】
【表７−９５】
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【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１Ａ】アミラーゼ（図１Ａ）に対する抗体で出発材料を処理した後の顕微鏡像を示す図である。
【図１Ｂ】インスリン（図１Ｂ）に対する抗体で出発材料を処理した後の顕微鏡像を示す図である。
【図１Ｃ】ＣＫ１９（図１Ｃ）に対する抗体で出発材料を処理した後の顕微鏡像を示す図である。
【図１Ｄ】新しく単離した一次ヒト膵臓細胞の細胞ペレットの組成（図１Ｄ）を示す図である。
【図２】市販の培地（血清を含む）または血清を含む記載の膵臓細胞培地（ＰＣＭ）中で増殖された一次ヒト膵臓培養物から作成した増殖曲線を示す図である。
【図３】記載の基礎培地組成物ｖｓ基礎培地＋可溶性成長因子（無血清調合）ｖｓ基礎培地＋ウシ胎児血清中の細胞増殖の比較を示す図である。
【図４Ａ】増殖後の全細胞数（図４Ａ）に対する異なる培養表面の効果を示す図である。
【図４Ｂ】増殖後の細胞表現型（図４Ｂ）に対する異なる培養表面の効果を示す図である。
【図５Ａ】すべての可溶性の活性因子を含む、血清含有（５Ａ）培地中での増殖後の細胞表現型の比較を示す図である。
【図５Ｂ】すべての可溶性の活性因子を含む、無血清（５Ｂ）培地中での増殖後の細胞表現型の比較を示す図である。
【図６】３つの可溶性活性因子であるＨＧＦ、ＥＧＦおよびＴＧＦＡを補充した無血清培地を含む、種々の条件で増殖した細胞培養物の高倍率像を示す図である。上皮形態に注意。
【図７】経過時間による代謝活性アッセイにより決定される、ＥＣＭで被覆した表面上でのＩＰ細胞の増殖の実証を示す図である。コラーゲンＩ表面を、本明細書に記載の培地調合と組み合わせた場合のより優れた増殖に注意し、マトリゲルと市販の血清を有する培地の組合せよりも優れた結果が得られている。
【図８Ａ】図８Ａ（上の左）は、２日間培養した後の腺房細胞によるアミラーゼの発現を示す（赤い染色）。
【図８Ｂ】図８Ｂ（下の左）はＣＫ１９の発現を示す（緑の染色）。
【図８Ｃ】図８Ｃは２つの像の重ね合わせを示す図であり、多くの比率の細胞で共発現がなされている（黄色）。
【図９】５日間におよぶ培養物中での一次腺房細胞の変化している表現型を示す図である。アミラーゼは赤であり、ＣＫ１９は緑である。２日後および３日後の黄色の出現に注意（アミラーゼ＋ＣＫ１９）。
【図１０】（Ａ）および（Ｂ）はコラーゲンＩで被覆された表面上での血清含有培地中で増殖した一次ヒト膵臓細胞を示す図である。像を解析して、全細胞（図１０Ａ、青い核）および全陽性細胞（図１０Ｂ、青い核が、ＣＫ１９について染色している緑により囲まれている）を決定した。
【図１１】すべてのＤＰＦ（アクチビンＡ、０．５ｎｇ／ｍｌ；酸性ＦＧＦ、２．５ｎｇ／ｍｌ；塩基性ＦＧＦ、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、０．１１μｇ／ｍｌ；カルシトニン遺伝子関連ペプチド、０．１９μｇ／ｍｌ；コレラ毒素Ｂサブユニット、１２．５ｎｇ／ｍｌ；デキサメタゾン、０．００２μｇ／ｍｌ；ガストリン放出ペプチド、０．１４３μｇ／ｍｌ；グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、０．０３３μｇ／ｍｌ；グルコース、１．０８μｇ／ｍｌ；ＩＧＦ１、０．００２５μｇ／ｍｌ；ＩＧＦ２、０．００２５μｇ／ｍｌ；インスリン、９．５μｇ／ｍｌ；ラミニン、２．２５μｇ／ｍｌ；ＬＩＦ、０．００２５μｇ／ｍｌ；Ｍｅｔ−エンケファリン、０．００３０μｇ／ｍｌ；ＰＤＧＦＡＡ＋ＰＤＧＦＢＢ（０．００５０μｇ／ｍｌ：０．００２５μｇ／ｍｌのＰＤＧＦＡＡ＋０．００２５μｇ／ｍｌのＰＤＧＦＢＢ）；プロラクチン、０．００１２μｇ／ｍｌ；ソニックヘッジホッグ、０．０２５μｇ／ｍｌ；サブスタンスＰ、５．０μｇ／ｍｌ；ＴＧＦ−α、０．００１０μｇ／ｍｌ；トロロクス（α−トコフェロール誘導体）、０．６２５μｇ／ｍｌ；およびＶＥＧＦ、０．００２５μｇ／ｍｌ）を含むコラーゲンＩ表面上で培養された膵臓腺房細胞の光学顕微鏡（２００倍）外観を示す図である。
【図１２Ａ】ＣＫ１９抗体（緑）を用いての免疫細胞化学解析を示す図である。
【図１２Ｂ】Ｃ−ペプチド抗体（赤）を用いての免疫細胞化学解析を示す図である。
【図１２Ｃ】ＣＫ１９およびＣ−ペプチド（オレンジ）の共局在を実証した重ね合わせ像を示す図である。青い部分はＤＡＰＩ染色核である。
【図１３Ａ】成長および分化プロセス中に脱着および再配置（継代培養）していないＩＰ細胞における、グルコース攻撃時のインスリン放出を示す図である。
【図１３Ｂ】実施例１０に従って継代培養しておいたＩＰ細胞における、グルコース攻撃時のインスリン放出を示す図である。
【図１３Ｃ】実施例１０に従って継代培養しておかなかったＩＰ細胞における、グルコース攻撃時のＣ−ペプチド放出を示す図である。
【図１４】実施例１１に記載のように、ＤＦＰ培地の組合せ１、２、および３で処理した継代培養および非継代培養細胞におけるインスリン／ＤＮＡの比を示す図である。
【図１５】実施例１３に記載のように、ＰＣＭおよびＤＰＦ培地中での１０日間の培養にわたる、基礎レベルグルコース（５ｍｍ）およびグルコース攻撃（２２ｍｍ）に応答したインスリン放出を示す図である。
【図１５Ａ】実施例１４に詳述したように、ＰＣＭおよびＤＭＧ９培地中での１４日間の培養にわたる、基礎レベルグルコース（５ｍｍ）およびグルコース攻撃（２２ｍｍ）に応答したインスリン放出を示す図である。
【図１６】実施例１４に詳述したように、表の最後の列に示したように、表６に示した１７クラスの遺伝子の特徴のグラフ表示である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１５Ａ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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