(57)【要約】試料中のアスペルギルスの検出のための新規な技術を開示する。これらの技術は、PCR増幅および/またはアスペルギルスITS1 rDNA配列の検出、ならびにアスペルギルスのITS1-V1、ITS-V2、ITS-V3、ITS-V4およびITS-V5核酸配列における差異を検出することによるアスペルギルスの特定の種の同定に関する。ITS1 rDNA配列の高可変性領域は、例えば、アスペルギルス・クラバタス、アスペルギルス・グラヌロサス、アスペルギルス・シドウィ、アスペルギルス・フラビペス、アスペルギルス・レストリクタス、アスペルギルス・ベルシコロル、アスペルギルス・ウェンティ、およびアスペルギルス・ケバリエリを識別するのに特に有用である。特定の態様において、配列の差異はまた、アスペルギルス・グラヌロサスCBS 119.5A、アスペルギルス・グラヌロサス菌株NRRL 1932、アスペルギルス・シドウィ菌株NRRL 250、アスペルギルス・シドウィ菌株NRRL 4768、アスペルギルス・シドウィ菌株CUH1、アスペルギルス・シドウィ菌株CUH2、アスペルギルス・シドウィ菌株CUH7、およびアスペルギルス・シドウィ菌株CUH8のような特定の種の変異株を識別することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルスのITS1-V1、ITS-V2、ITS-V3、ITS-V4およびITS-V5核酸配列の2つまたはそれ以上における差異を検出する工程を含む、互いからアスペルギルスの種を識別する方法。
【請求項２】
差異の検出工程が、ITS1-V1、ITS-V2、ITS-V3、ITS-V4およびITS-V5核酸配列の3つまたはそれ以上における差異を検出する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
差異の検出工程が、ITS1-V1、ITS-V2、ITS-V3、ITS-V4およびITS-V5核酸配列のすべてにおける差異を検出する工程を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
差異の検出工程が、2つまたはそれ以上の核酸配列を配列決定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
配列決定工程が、核酸配列を配列決定する前に配列を増幅する工程を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
アスペルギルス・グラヌロサス、ウスタス、シドウィ、ベルシコロルおよびニドゥランスを識別する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
アスペルギルス・クラバタス、フラビペス、レストリクタス、ウェンティおよびケバリエリを識別する工程をさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
種の識別工程が、以下(a)〜(c)のITS1-V1、ITS-V2、ITS-V3、ITS-V4およびITS-V5配列を同定する工程を含む、請求項1記載の方法：
(a)アスペルギルス・クラバタスを同定するための配列番号：1またはその縮重変異体；
(b)アスペルギルス・グラヌロサスを同定するための配列番号：2、配列番号：3またはそれらの縮重変異体；
(c)アスペルギルス・シドウィを同定するための配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9またはそれらの縮重変異体。
【請求項９】
アスペルギルスの種の識別工程が、アスペルギルス種内部転写スペーサー1領域を増幅する工程、および増幅された領域の配列を決定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
アスペルギルスの種の識別工程が、種の菌株を識別する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
種の菌株の識別工程が、アスペルギルス・グラヌロサス CBS 119.5AおよびNRRL 250、アスペルギルス・シドウィ NRRL、CUH1、CUH2、CUH7、およびCUH8を識別する工程を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
種の識別工程が、以下(a)〜(c)のITS1-V1、ITS-V2、ITS-V3、ITS-V4およびITS-V5ヌクレオチド配列を同定する工程を含む、請求項1記載の方法：
(a)A. フラビペスを同定するための配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12またはそれらの縮重変異体；
(b)A. レストリクタスを同定するための配列番号：13、配列番号：14またはそれらの縮重変異体；
(c)A. ベルシコロルを同定するための配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18またはそれらの縮重変異体；
(d)A. ウェンティを同定するための配列番号：19またはその縮重変異体；
(e)A. ケバリエリを同定するための配列番号：20、配列番号：21またはそれらの縮重変異体。
【請求項１３】
(a)が配列番号：1と少なくとも75％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、(b)が配列番号：2または配列番号：3と少なくとも75％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、および(c)が配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8または配列番号：9と少なくとも75％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
(a)が配列番号：1と少なくとも85％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、(b)が配列番号：2または配列番号：3と少なくとも85％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、および(c)が配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8または配列番号：9と少なくとも85％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
(a)が配列番号：1と少なくとも95％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、(b)が配列番号：2または配列番号：3と少なくとも95％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、および(c)が配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8または配列番号：9と少なくとも95％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１６】
(a)が配列番号：1を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１７】
(b)が配列番号：2または配列番号：3を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１８】
(c)が配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8または配列番号：9を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１９】
(a)が配列番号：10、11または12を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２０】
(b)が配列番号：13または14を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２１】
(c)が配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17または配列番号：18を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２２】
(d)が配列番号：19を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２３】
(e)が配列番号：20または配列番号：21を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２４】
増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅する工程を含む、請求項5記載の方法。
【請求項２５】
差異の検出工程が、核酸プローブで核酸配列における差異を検出する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
以下の工程を含む、生物学的試料においてアスペルギルス種の存在を検出する方法：
以下の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)または(h)の1つまたは複数の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、アスペルギルス種内部転写スペーサー1領域を増幅する工程：
(a)配列番号：1；
(b)配列番号：2または3；
(c)配列番号：4、5、6、7、8または9；
(d)配列番号：10、11または12；
(e)配列番号：13または14；
(f)配列番号：15、16、17または18；
(g)配列番号：19；
(h)配列番号：20または21；ならびに、
(a)の核酸配列がアスペルギルス・クラバタスを同定し、(b)がアスペルギルス・グラヌロサスを同定し、(c)がアスペルギルス・シドウィを同定し、(d)がアスペルギルス・フラビペスを同定し、(e)がアスペルギルス・レストリクタスを同定し、(f)がアスペルギルス・ベルシコロルを同定し、(g)がアスペルギルス・ウェンティを同定し、および(h)がアスペルギルス・ケバリエリを同定する、内部転写スペーサー1領域を配列決定する工程。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：1の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・クラバタスを同定する、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：2または3の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・グラヌロサスを同定する、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：4、5、6、7、8または9の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・シドウィを同定する、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：10、11または12の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・フラビペスを同定する、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：13または14の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・レストリクタスを同定する、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：15、16、17または18の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・ベルシコロルを同定する、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：19の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・ウェンティを同定する、請求項26記載の方法。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号：20および21の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・ケバリエリを同定する、請求項26記載の方法。
【請求項３５】
(a)配列番号：2が菌株アスペルギルス・グラヌロサスCBS 119.5Aを同定し、および配列番号：3がアスペルギルス・グラヌロサス菌株NRRL 1932を同定する；
(b)配列番号：4がアスペルギルス・シドウィ菌株NRRL 250を同定し、配列番号：5がアスペルギルス・シドウィ菌株NRRL 4768を同定し、配列番号：6がアスペルギルス・シドウィ菌株CUH1を同定し、配列番号：7がアスペルギルス・シドウィ菌株CUH2を同定し、配列番号：8がアスペルギルス・シドウィ菌株CUH7を同定し、および配列番号：9がアスペルギルス・シドウィ菌株CUH8を同定する、
アスペルギルス種の存在を検出する工程が、種の菌株の存在を検出する工程をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項３６】
(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)および(g)の少なくとも5つの少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むプライマーを用いてアスペルギルス種内部転写スペーサー1領域を増幅する工程を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３７】
(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)および(g)のすべての少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むプライマーを用いてアスペルギルス種内部転写スペーサー1領域を増幅する工程を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３８】
ヌクレオチド配列がアスペルギルス属のメンバーをフラビペス、レストリクタス、ベルシコロルまたはウェンティ種のメンバーとして同定する、以下(a)〜(d)に示されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子：
(a)配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12もしくはそれらの縮重変異体；
(b)配列番号：13、配列番号：14もしくはそれらの縮重変異体；
(c)配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18もしくはそれらの縮重変異体；または
(d)配列番号：19もしくはその縮重変異体。
【請求項３９】
以下(a)〜(d)に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項38記載の単離された核酸分子：
(a)配列番号：10、配列番号：11もしくは配列番号：12；
(b)配列番号：13もしくは配列番号：14；
(c)配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17もしくは配列番号：18；または
(d)配列番号：19。
【請求項４０】
核酸分子が(a)、(b)、(c)または(d)に示されるヌクレオチド配列から本質的になる、請求項38記載の単離された核酸分子。
【請求項４１】
縮重変異体が、それが縮重変異体であるところのヌクレオチド配列と少なくとも75％の配列同一性を有する、請求項38記載の単離された核酸分子。
【請求項４２】
縮重変異体が、それが縮重変異体であるところのヌクレオチド配列と少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項38記載の単離された核酸分子。
【請求項４３】
縮重変異体が、それが縮重変異体であるところのヌクレオチド配列と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項38記載の単離された核酸分子。
【請求項４４】
核酸分子が、以下(a)〜(d)に示されるヌクレオチド配列と100％の配列同一性を有する配列からなる、請求項38記載の単離された核酸分子：
(a)配列番号：10、配列番号：11もしくは配列番号：12；
(b)配列番号：13もしくは配列番号：14；
(c)配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18；または
(d)配列番号：19。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、2002年5月17日に出願された米国仮特許出願第60/381,463号の恩典を主張するものである。
【０００２】
分野
本発明は、アスペルギルス(Aspergillus)の検出および種同定のための方法、および具体的には、アスペルギルス種もしくは種の菌株を同定または検出するための内部転写スペーサー1(internal transcribed spacer 1：ITS1)核酸配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
衰弱した内科および外科の患者の管理および治療における進歩は、不運にも、病原性および日和見性真菌による生命を危うくする感染の数における増加を伴った(McNeilら、Clin. Infect. Dis. 33:641-647、2001)。エイズ(AIDS)、癌の化学療法および高用量の副腎皮質ステロイド治療は、すべて、免疫無防備状態の個人の数の増加の一因となっている。環境中に見出され、本来、低毒性であるとみなされていた、アスペルギルス種のような腐生性繊維状真菌での日和見感染を多くの免疫無防備状態の患者は発現する(Latge、Clin. Microbiol. Rev. 12:310-350、1999)。これらの感染は、免疫無防備状態の患者において、しばしば、劇症かつ致死的である。例えば、肺および脳のアスペルギルス症は、十分に処置された場合でさえも、それぞれ、86％および99％の死亡率をもつ(Denning、Clin. Infect. Dis. 23:608-614、1996)。
【０００４】
新規の特異的な抗真菌薬および治療法の出現は、アスペルギルス症の管理の見込みを向上させた。しかしながら、診断は困難なままであり、適切な抗真菌治療の早期の開始が、免疫無防備状態の患者における死亡率を低下させるにおいて重要である(Einseleら、J. Clin. Microbiol. 35:1353-1360、1997)。このゆえに、迅速な診断的アッセイ法が、治療成果を向上させるために必要とされている。
【０００５】
アスペルギルスは、入院して治療される全身性真菌感染を引き起こす一次病原体の一つである。それは、通常、臓器移植、急性白血病および火傷を被った患者を冒し、すぐに診断されない場合には、急速に致死的でありうる。土壌、空気および水に存在する150種を超えるアスペルギルスがあり、このゆえに、アスペルギルスの重要な種の正確な検出は、しばしば、複雑かつ困難である。
【０００６】
真菌感染の診断は、典型的には、培養における感染している生物体の単離により、血清学的アッセイ法により、または組織の組織病理学的検査を通して、なされうる(Hamilton、Med. Mycol. 36:351-364、1998)。培養におけるアスペルギルス種の単離は、十分な増殖および発生する胞子形成のために数日間を必要としなければならず、適切な薬物療法を遅らせ、陽性培養は、本当の侵入または感染よりむしろ、良性のコロニー形成を示しうる(de Repentigny、Clin. Infect. Dis. 14:S11-22、1992)。組織切片において組織病理学的に研究する場合、様々なアスペルギルス種の類似性は、明確な種同定を困難にさせうる。
【０００７】
または、血清学的検査は、真菌感染を診断するために用いられうるが、ほとんどのそのような検査は、確信的診断のための望ましい感度および/または特異性を欠いている。循環している真菌の抗原を検出するたった一つの血清試料における血清学的検査は、決定的でない可能性があり、侵襲性アスペルギルス症について危険にさらされているのが最も高い免疫無防備状態の患者集団における抗体産生は、しばしば、変わりやすく、信頼できない診断的指標である(MorrisonおよびLindsley、Fungal Pathogenesis: Principles and Practice、Marcel Dekker, Inc.、667-716、2001)。
【０００８】
現行の血清学的アッセイ法は、アスペルギルスを種レベルまで同定せず、かつ時間も費用も両方かかる。さらに、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)は、侵襲性アスペルギルス症を治療するために最も一般に処方される薬物であるアンフォテリシンBに耐性であることが示された。アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)は、イトラコナゾールへの耐性を発現することが報告された。このように、臨床的アスペルギルス感染の治療のための適切な薬物の選択における援助を促進するために、アスペルギルスを種レベルまで同定する迅速な検査についての必要性が残っている。真菌の種同定はまた、例えば、その環境に曝されている免疫無防備状態の人に対して、発病させる可能性がある環境において生物体を検出するために重要でありうる。
【０００９】
PCRに基づく検出方法は、感染を診断する迅速な技術として有望であるが、カンジダ(Candida)種およびアスペルギルス種由来のDNAの同定に用いられてきた。しかしながら、これらの検査の大部分は、属特異的のみであり、多くの臨床的および環境的に重要なアスペルギルス種を特異的に同定することはできない。
【００１０】
参照として組み入れられている米国特許第6,372,430号に開示されているように、固有の内部転写配列2(ITS2)コード領域は、アスペルギルス(A. フラバス(A. flavus)、A. フミガーツス、A. ニガー(A. niger)、A. テレウス、およびA. ニドゥランス(A. nidulans))のいくつかの異なる種についての核酸プローブを開発するために用いられた。
【発明の開示】
【００１１】
概要
真菌の種同定への新規の方法が本明細書に開示されている。一つの態様において、方法は、真菌のリボソームDNAのITS1がこれらの種に渡ってあまり保存されていないという発見を利用している。本発明者らは、アスペルギルスの異なる種が、過去において種同定のために用いられていたrDNA ITS2よりも、rDNA ITS1核酸配列のより高度に非保存的な領域を有することを見出した。この驚くべき発見は、ITS1におけるこれらの配列の差異を利用することにより、アスペルギルスの異なる種を検出する、より特異的な方法の開発を可能にした。この方法で検出されうる特定のアスペルギルス種は、限定されるものではないが、A. クラバタス(A. clavatus)、A. グラヌロサス(A. granulosus)、A. シドウィ(A. sydowii)、A. フラビペス(A. flavipes)、A. レストリクタス(A. restrictus)、A. ベルシコロル(A. versicolor)、A. ウェンティ(A. wentii)、A. ケバリエリ(A. chevalieri)、およびA. ウスタス(A. ustus)、またはこれらの種の任意の組み合わせもしくはサブセット(A. グラヌロサス、A. クラバタスおよびA. シドウィのような)を含む。
【００１２】
本明細書に開示された若干数の配列は、新規な配列である。特定の態様において、単離された核酸分子は、配列番号：1(A. クラバタス由来)、配列番号：2および配列番号：3(A. グラヌロサス由来)、ならびに配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8および配列番号：9(A. シドウィ由来)、または配列番号：1(A. クラバタス由来)、配列番号：2および配列番号：3(A. グラヌロサス由来)、ならびに配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8および配列番号：9(A. シドウィ由来)のヌクレオチド配列と少なくとも75％(例えば、少なくとも85％または少なくとも95％)配列同一性をもつヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、クラバタス、グラヌロサスまたはシドウィ種のようなアスペルギルス属のメンバー由来である。
【００１３】
もう一つの態様において、単離された核酸分子は、配列番号：10、11もしくは12(A. フラビペス由来)もしくはそれらの縮重変異体、配列番号：13もしくは14(A. レストリクタス由来)もしくはそれらの縮重変異体、配列番号：15、16、17もしくは18(A. ベルシコロル由来)もしくはそれらの縮重変異体、または配列番号：19(A. ウェンティ由来)もしくはその縮重変異体として示されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、フラビペス、レストリクタス、ベルシコロルまたはウェンティ種のようなアスペルギルス属のメンバー由来を同定する。
【００１４】
さらにもう一つの態様において、単離された核酸分子は、配列番号：1に示される核酸配列と少なくとも75％(例えば、少なくとも85％または少なくとも95％)配列同一性をもつヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチド、配列番号：2または3に示される核酸配列と少なくとも75％(例えば、少なくとも85％または少なくとも95％)配列同一性をもつヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチド、および配列番号：4、5、6、7、8または9に示される核酸配列と少なくとも75％(例えば、少なくとも85％または少なくとも95％)配列同一性をもつヌクレオチド配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドからなる群より選択される核酸配列を含む。
【００１５】
一つの態様において、単離された核酸分子は、配列番号：10、11もしくは12またはそれらの縮重変異体に示される核酸配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチド、配列番号：13もしくは14またはそれらの縮重変異体に示される核酸配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチド、および配列番号：15、16、17もしくは18またはそれらの縮重変異体に示される核酸配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
さらなる態様において、方法は、例えば、真菌のrRNAのITS1領域における差異を検出することにより一つの種を別のものから識別することにより、生物学的試料においてアスペルギルス種の存在を検出することについて開示されている。ITS1領域は、これらの異なる種に渡って特に不十分に保存されていることが、現在見出されたゆえに、この領域における配列の差異の検出は、異なる種を同定することへの特に感度が高く、かつ特異的な方法である。特定の例において、方法は、アスペルギルスのITS1-V1、ITS-V2、ITS-V3、ITS-V4およびITS-V5核酸配列の2つまたはそれ以上(例えば、少なくとも3つまたはすべての5つ)における差異を検出することを含む。差異は、例えば、2つまたはそれ以上の核酸配列を配列決定すること、またはそれらの配列に特異的な核酸プローブを用いることにより、検出されうる。標的配列は、識別核酸配列を検出する前に増幅されうる。
【００１７】
特定の開示された態様において、本方法は、アスペルギルス・グラヌロサス、ウスタス、シドウィ、ベルシコロルおよびニドゥランスを識別する、およびさらに、アスペルギルス・クラバタス、フラビペス、レストリクタス、ウェンティおよびケバリエリを識別するために用いられうる。
【００１８】
種を識別する配列の例は、以下のものである：
(a)アスペルギルス・クラバタスを同定するための配列番号：1またはその縮重変異体；
(b)アスペルギルス・グラヌロサスを同定するための配列番号：2、配列番号：3またはそれらの縮重変異体；
(c)アスペルギルス・シドウィを同定するための配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、またはそれらの縮重変異体。
【００１９】
ITS1 V1〜V5領域の可変性は、種の菌株間の区別さえも可能にする。例えば、アスペルギルス・グラヌロサスCBS 119.5AとNRRL 250とを識別すること、およびアスペルギルス・シドウィNRRLと、CUH1と、CUH2と、CUH7と、CUH8とを識別することが可能である。
【００２０】
ITS1-V1、ITS-V2、ITS-V3、ITS-V4およびITS-V5ヌクレオチド配列を識別することにより種を区別する配列の他の例は、以下のものである：
(a)A. フラビペスを同定するための配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12またはそれらの縮重変異体；
(b)A. レストリクタスを同定するための配列番号：13、配列番号：14またはそれらの縮重変異体；
(c)A. ベルシコロルを同定するための配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18またはそれらの縮重変異体；
(d)A. ウェンティを同定するための配列番号：19またはそれらの縮重変異体；
(e)A. ケバリエリを同定するための配列番号：20、配列番号：21またはそれらの縮重変異体。
【００２１】
特定の例において、方法は、配列番号：1と少なくとも75％(例えば、少なくとも85％または少なくとも95％)配列同一性をもつヌクレオチド配列、配列番号：2および3と少なくとも75％(例えば、少なくとも85％または少なくとも95％)配列同一性をもつヌクレオチド配列、ならびに/または配列番号：4〜9と少なくとも75％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する領域を含むアスペルギルス種ITS1領域を増幅すること、およびITS1領域を配列決定し、それにより、アスペルギルス種の存在を決定することを含む。または、方法は、配列番号：1、配列番号：2および3、ならびに/または配列番号：4〜9からなる群より選択されるアスペルギルス種ITS1領域を増幅すること、およびITS1領域を配列決定し、それによりアスペルギルス種の存在を決定することを含む。
【００２２】
もう一つの態様において、方法は、配列番号：10、11および12またはそれらの縮重変異体、配列番配列番号：13および14またはそれらの縮重変異体、配列番号：15〜18またはそれらの縮重変異体、配列番号：19またはその縮重変異体、ならびに配列番号：20および21またはそれらの縮重変異体からなる群より選択されるアスペルギルス種ITS1領域を増幅すること、およびITS1領域を配列決定し、それによりアスペルギルス種の存在を決定することにより、生物学的試料においてアスペルギルス種の存在を検出することについて開示されている。
【００２３】
さらなる態様において、方法は、配列番号：1、配列番号：2および3、配列番号：4、5、6、7、8および9、配列番号：10、11および12、配列番号：13および14、配列番号：15、16、17および18、配列番号：19、ならびに配列番号：20および21からなる群より選択されるITS1領域の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いてアスペルギルス種ITS1領域を増幅し、かつITS1領域を配列決定し、それにより、アスペルギルス種の存在を決定することにより、生物学的試料においてアスペルギルス種の存在を検出することについて開示されている。
【００２４】
なおさらなる態様において、方法は、ユニバーサル真菌プライマーITS5(配列番号：28)、ITS1(配列番号：31)、ITS2(配列番号：29)、およびITS4(配列番号：30)を用いてアスペルギルス種ITS1領域を増幅し、続いて、配列番号：1、配列番号：2および3、配列番号：4、5、6、7、8および9、配列番号：10、11および12、配列番号：13および14、配列番号：15、16、17、18、配列番号：19、ならびに配列番号：20および21からなる群より選択されるITS1領域の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイゼーションし、アスペルギルス種の存在を示すハイブリダイゼーションを検出することにより、生物学的試料においてアスペルギルス種の存在を検出することについて開示されている。
【００２５】
これらの方法を行うためのキットもまた開示されている。
【００２６】
これらをはじめとする態様は、本明細書の詳細な説明に開示されている。開示された方法の他の特徴および利点は、以下の開示された態様の詳細な説明および添付された特許請求の範囲の検討から明らかになるものと思われる。
【００２７】
詳細な説明
I. 用語の説明
他に断りがない限り、技術用語は、通常の用法に従って用いられる。分子生物学における一般用語の定義は、Oxford University Pressにより出版されたBenjamin Lewin、Genes VII、1999；Blackwell Science Ltd.により出版された、Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、1994；およびVCH Publishers, Inc.に出版された、Robert A. Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、1995に見出されうる。
【００２８】
本明細書に用いられる場合、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」は、文脈が明らかに他に指示しない限り、単数および複数の両方を指す。同様に、単語「または(or)」は、文脈が明らかに他に指示しない限り、「および(and)」を含むことを意図される。また、本明細書に用いられる場合、用語「含む(comprises)」は、「含む(includes)」を意味する。このゆえに、「AまたはBを含むこと(comprising A or B)」とは、A、B、またはAおよびBを含むこと(including A, B, or A and B)を意味する。さらに、材料、方法および実施例は、例証となるのみであり、制限することを意図するものではない。
【００２９】
本発明の様々な態様の検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する。
【００３０】
増幅：核酸分子(例えば、DNAまたはRNA分子)の増幅は、試料における核酸分子のコピー数を増加させる技術の使用を指す。増幅の例は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であり、試料における核酸鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下において、試料が、オリゴヌクレオチドプライマーの1対と接触させられる。プライマーは、核酸のコピー数を増幅するために、適する条件下で伸長し、鋳型から分離され、再アニーリングされ、伸長し、および分離される。増幅産物は、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションもしくはライゲーション、および/または標準的技術を用いる核酸配列決定により特徴付けされうる。
【００３１】
PCR法は、特定の態様において改変されうる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応-酵素免疫測定法(PCR-EIA)法が、真菌の増幅および区別のために用いられうる。PCR-EIA法は、Elieら、J. Clin. Microbiol. 36:3260-3265、1998に記載されており、特定の態様に適合するように改変されうる。
【００３２】
増幅の他の例は、米国特許第5,744,311号に開示される鎖置換増幅(strand displacement amplification)；米国特許第6,033,881号に開示される転写無し等温増幅(transcription-free isothermal amplification)；国際公開公報第90/01069号に開示される修復連鎖反応増幅(repair chain reaction amplification)；EP-A-320,308号に開示されるリガーゼ連鎖反応増幅(ligase chain reaction amplification)；第5,427,930号に開示されるギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅(gap filling ligase chain reaction amplification)；および米国特許第6,025,134号に開示されるNASBA RNA転写無し増幅(NASBA RNA transcription-free amplification)を含む。
【００３３】
動物：生きている多細胞の脊椎のあるまたは無脊椎の生物体、例えば、哺乳動物およびトリを含むカテゴリー。哺乳動物という用語は、ヒトおよび非ヒトの両方の哺乳動物を含む。同様に、用語「対象」は、ヒトおよび獣医学的対象の両方を含む。
【００３４】
cDNA(相補DNA)：内部の非コードセグメント(イントロン)および転写制御配列を欠く1片のDNA。cDNAはまた、対応するRNA分子において翻訳調節を担う非翻訳領域(UTR)を含む場合がある。cDNAは、細胞から抽出されたメッセンジャーRNAから逆転写により実験室において合成される。
【００３５】
縮重変異体：プローブまたはプライマーの「縮重変異体」は、変化した核酸配列を有するが、十分な特異性をもって標的配列に結合する(且つ真菌標的を同定または増幅する)それらの能力を保持している配列を含む。いくつかの特定の例において、わずか約1個、約2個、約5個もしくは約10個未満の核酸だけ変化している、またはプローブもしくはプライマーが、本来の配列と少なくとも80％、85％、90％もしくは95％配列同一性を保持している。縮重変異体はまた、追加の配列が付加されたが、プローブもしくはプライマーの顕著な特異性をなお保持しているプローブまたはプライマー配列を含む。
【００３６】
アスペルギルスITS1配列の「縮重変異体」または「軽微変異体」は、変化した核酸配列を有するが、特定のアスペルギルス種を同定するそれらの能力を保持している配列を含む。いくつかの特定の例において、1個、2個、5個または10個未満の核酸が変化している。
【００３７】
真菌：菌類界に属する、生きている単細胞および多細胞生物。たいていの種は、葉緑素の欠損およびキチン質の細胞壁の存在により特徴付けられ、いくつかの真菌は、多核性でありうる。一つの態様において、真菌はアスペルギルス種である。アスペルギルスの代表的な、非限定の例は、A. ケバリエリ、A. クラバタス、A. フラビペス、A. グラヌロサス、A. レストリクタス、A. シドウィ、A. ウスタス、A. ベルシコロルおよびA. ウェンティのような以下の表1に列挙される種を含む。
【００３８】
相同体：もう一つのヌクレオチド配列と共通の祖先を共有するヌクレオチド配列；相同体は、その祖先の配列を有する種が2つの種へと分裂する場合、分岐する。
【００３９】
単離された：「単離された」微生物(真菌など)は、実質的に、異なる型、菌株または種の微生物から離れて分離または精製されている。例えば、アスペルギルス・クラバタスのコロニーは、「単離された」アスペルギルス・クラバタスとみなされるものとする。微生物は、段階希釈および培養を含む、様々な技術により単離されうる。
【００４０】
「単離された」生物学的構成要素(核酸分子またはタンパク質など)は、実質的に、その構成要素が天然で存在している生物体の細胞における他の生物学的構成要素から離れて分離または精製されている。用語「単離された」とは、絶対的な純粋であることを必要としない。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的精製方法により精製された核酸およびタンパク質を含む。その用語はまた、宿主細胞における組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、加えて、化学的に合成された核酸を含む。
【００４１】
ITS1：真菌のrDNAの一番目の内部転写スペーサー配列。真菌のrDNA領域の図である図1に示されるように、ITS1配列は、18Sと5.8Sのコード配列の間に位置する。ITS1領域は、調べた種に依存して、約142ヌクレオチド長から約187ヌクレオチド長まで変わる。一つの態様において、ITS1配列におけるヌクレオチドは、18Sコード配列の下流の一番目のヌクレオチドで始まり、5.8Sコード配列に先立ってすぐの最後のヌクレオチドで終わって数えられることができる。
【００４２】
ITS1の高頻度可変領域は、図2に関して以下のように定義される：ITS1-V1、8位〜30位(12〜21ヌクレオチド長)；ITS1-V2、50位〜67位(13〜14ヌクレオチド長)；ITS1-V3、81位〜141位(12〜54ヌクレオチド長)；ITS1-V4、151位〜181位(23〜28ヌクレオチド長)；およびITS1-V5、192位〜215位(17〜21ヌクレオチド長)。A. ニガーのITS1-V3(54ヌクレオチド)と比較して、著しく短い対応する配列は、A. ケバリエリ(12ヌクレオチド)、A. グラヌロサス(21ヌクレオチド)、A. ウスタス(21〜30ヌクレオチド)、A. シドウィ(22ヌクレオチド)、A. ベルシコロル(22ヌクレオチド)、およびA. ニドゥランス(21〜22ヌクレオチド)について見出される。
【００４３】
オリゴヌクレオチド：長さが5個〜100個のヌクレオチド塩基の直鎖状ポリヌクレオチド配列。
【００４４】
実施可能に連結された：核酸またはタンパク質のような第一分子が、その第一分子が第二分子との機能的関係において配置されている場合、第二分子と実施可能に連結されている。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、核酸コード配列と実施可能に連結されている。さらに、イントロンは、スプライシングの機能についてエキソンと実施可能に連結されている。一般的に、実施可能に連結されたヌクレオチド配列は、近接し、かつ同じリーディングフレームにおいて、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場所である。
【００４５】
ORF(open reading frame：オープンリーディングフレーム)：少しの内部終止コドンもない、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット(コドン)。これらの配列は、通常、ペプチドへ翻訳可能である。
【００４６】
プローブおよびプライマー：核酸プローブおよびプライマーを、本発明において提供される核酸分子に基づいて容易に調製することができ、それゆえに、開示された配列に対する実質的な有用性を提供する。プローブは、鋳型核酸にハイブリダイズすることができ、検出可能な標識またはレポーター分子がプローブに付着されうる。典型的な標識は、放射性同位元素、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光または蛍光剤、ハプテンおよび酵素を含む。標識化のための方法、および様々な目的について適切な標識の選択における手引きは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001；およびAusubelら(編)、Short Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、1999に考察されている。
【００４７】
プライマーは、短い核酸分子、例えば、DNAオリゴヌクレオチド15ヌクレオチド長またはそれ以上、である。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションにより相補性標的DNA鎖とアニーリングされて、プライマーと標的DNA鎖の間のハイブリッドを形成することができ、プライマーを、DNAポリメラーゼ酵素により標的DNA鎖に沿って伸長することができる。プライマー対を、例えば、PCRまたは他の核酸増幅法による、核酸配列の増幅のために用いることができる。
【００４８】
プローブおよびプライマーを調製および使用するための方法は、例えば、Sambrookら；Ausubelら(編)；およびInnisら、PCR Applications, Protocols for Functional Genomics、Academic Press, Inc.、1999に記載されている。PCRプライマー対は、例えば、Primer3、Whitehead Institute for Biomedical Research、ケンブリッジ、MAのようなその目的のために意図されたコンピュータープログラムを用いることにより、既知の配列から引き出されうる；プログラムはWhitehead Instituiteのウェブサイトを通してアクセス可能である。
【００４９】
特定のプローブまたはプライマーの特異性は、それの長さと共に増加する。このように、一つの非限定的な例として、A. クラバタスITS1配列の15個の連続したヌクレオチドを含むプライマーは、10個のヌクレオチドのみの対応するプライマーより高い特異性をもって、A. クラバタスのゲノムDNAライブラリー内に含まれるファミリー由来の別のITS1相同体のような標的配列にアニーリングする。このように、より高い特異性を得るために、A. クラバタスITS1配列の20個、25個、30個、35個、40個、50個、75個、100個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーが、選択されうる。本開示は、このように、真菌のITS1配列の特定された長さを含む単離された核酸分子(プローブおよびプライマー)を含む。そのような分子は、ITS1配列の少なくとも10個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、75個、または100個の連続したヌクレオチドを含むことができ、ITS1配列の任意の領域から得られることができる。
【００５０】
本明細書に開示されるプローブまたはプライマーのいずれもまた、最大限の長さをもつことができ、例えば、15、25、25、40、50、75または100ヌクレオチド長未満である。
【００５１】
組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有する、または2つの別に分離された配列のセグメントの人工的組み合わせにより作製される配列を有するものである。この人工的組み合わせは、化学合成により、またはより一般には、核酸の単離されたセグメントの人工的操作、例えば、遺伝子工学技術により、達成されうる。
【００５２】
試料：動物、植物または環境から得られる試料を含む。「環境試料」は、室内もしくは室外の環境内の無生命の物体または貯蔵所から得られる試料を含み、限定されるものではないが、土壌、水、塵および空気の試料を含む。
【００５３】
生物学的試料：植物または動物対象から得られる試料。本明細書に用いられる場合、生物学的試料は、対象における真菌感染の検出に有用なすべての臨床的試料を含み、限定されるものではないが、血液、血液の派生物および画分(血清のような)；固定されていない、凍結されている、またはホルマリンもしくはパラフィンに固定されている組織を含む、生検を実施されるまたは外科的に取り除かれた組織；涙；乳；皮膚切屑；表面洗液；尿；痰；脳脊髄液；前立腺液；膿；骨髄吸引液；気管支肺胞洗浄(BAL)；および唾液のような、細胞、組織、ならびに体液を含む。特定の態様において、生物学的試料は、血液、血清、脳脊髄液、BAL、膿、または皮膚病変のような、動物対象から得られる。
【００５４】
配列同一性：2つの核酸配列間の類似性は、配列間の類似性という用語で表現される、さもなければ、配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、しばしば、同一性、類似性または相同性の割合(％)によって測られる；より高いパーセンテージの同一性は、配列類似性のより高い程度を示す。真菌のITS1配列の相同体は、標準的方法を用いて整列した場合、配列同一性の比較的高い程度をもつものである。
【００５５】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)、Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410、1990は、配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxに関しての使用のために、国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター(National Center for Biotechnology Information)を含むいくつかの情報源から利用可能である。それは、NCBIウェブサイトを通してアクセスされうる。このプログラムを用いて配列同一性を決定する方法の説明もまた、ウェブサイト上で入手可能である。
【００５６】
全配列より少ないものが配列同一性について比較されることになっている場合、相同体は、典型的には、10個〜20個のアミノ酸の短い領域に関して少なくとも75％の配列同一性を有するものであり、参照配列とのそれらの類似性に依存して、少なくとも85％、または少なくとも90％もしくは95％の配列同一性をもちうる。そのような短い領域に関して配列同一性を決定するための方法は、NCBIウェブサイト上に記載されている。
【００５７】
これらの配列同一性範囲は、手引きのためのみ提供される；提供される範囲の外側になる強く有意な相同体が得られうることは全面的に可能である。
【００５８】
2つの核酸分子が密接に関係していることの代替の指標は、2つの分子がストリンジェントな条件下において互いにハイブリダイズすることである。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境パラメーター下において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおいて、特定の配列についての熱融解点(Tm)より約5℃〜20℃低いように選択される。Tmは、標的配列の50％が完全に適合したプローブにハイブリダイズする温度(規定のイオン強度およびpH下における)である。核酸ハイブリダイゼーションについての条件およびストリンジェンシーの計算は、Sambrookら；およびTijssen、Hybridization With Nucleic Acid Probe, PartI: Theory and Nucleic Acid Preparation、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、Elsevier Science Ltd.、1993に見出されうる。ストリンジェントな条件下において真菌のITS1配列にハイブリダイズする核酸分子は、典型的には、50℃での2x SSCの洗浄条件下において、全ITS1配列かまたはITS1配列の選択された部分のいずれかに基づくプローブにハイブリダイズするものである。
【００５９】
形質転換された：形質転換された細胞とは、核酸が分子生物学的技術により導入された細胞である。用語「形質転換」は、核酸分子がそのような細胞へ導入されうるすべての技術を含み、ウイルスベクターでのトランスフェクション、プラスミドベクターでの形質転換、ならびにエレクトロポレーション法、リポフェクションおよびパーティクルガン加速による裸のDNAの導入を含む。
【００６０】
ベクター：宿主細胞へ導入されるような核酸分子であり、それにより形質転換された宿主細胞を生じる。ベクターは、複製起点のような、宿主細胞においてそれが複製するのを可能にする核酸配列を含みうる。ベクターはまた、1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝要素を含みうる。
【００６１】
本開示は、互いから、および他の環境的、臨床的または医学的に重要な真菌から、アスペルギルスの種を区別するための簡単、迅速および有用な方法を提供する。
【００６２】
本方法は、アスペルギルスのいくつかの臨床的に重要な種のITS1ヌクレオチド配列を供給することにより可能になる。真菌のDNAは、ユニバーサル真菌プライマー(例えば、ユニバーサルプライマーITS1、ITS2、ITS3、ITS4またはITS5)のようなプライマーを用いて増幅されうる。アスペルギルスの異なる種は、その後、これらの種間および種の異なる配列型(シークバー：sequevar)間におけるITS1配列の差異を利用することにより区別される。例えば、増幅された真菌のDNAは、高速シーケンサーにおいて配列決定されうるため、異なるアスペルギルス種間の配列の差異が、配列が得られたアスペルギルスの特定の種に結びつけられる。
【００６３】
いくつかのアスペルギルス種のITS1配列は以前に知られていたが、本明細書に開示された多くの他のものの配列は、異なるアスペルギルス種を互いから識別するために以前には入手できなかった新規な配列である。本開示において主張されている配列の、これらの配列への任意の改変も加えての、配列(および相補体)を、いくつかの現行の方法体系、ならびにこの技術の将来の改良および変更に基づく真菌の同定のためのアッセイ法に利用することができる。これらの技術は、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、重合、脱重合、配列決定、化学的分解、酵素的消化、電気泳動、クロマトグラフィーおよび増幅に基づくアッセイ法を含む。
【００６４】
臨床的に重要なアスペルギルス種およびそれらの配列型の27個の異なるITS1配列(配列番号：1〜27)に加えて、本明細書に開示されている核酸の差異による種または配列型同定の前にアスペルギルス核酸を増幅するために用いられうるいくつかのユニバーサル真菌プライマーの配列(配列番号：28〜32)も提供される。
【００６５】
一本鎖DNA配列の特定化が、種または菌株の差異を検出するための、相補DNA配列、およびその2つの等価のRNA配列の有用性を含むことを当業者は認識しているものと思われる。さらになお、核酸を構成する部分(糖または骨格など)のいずれかの改変を組み入れた配列は、配列の機能的等価物である。これらの配列(またはそれらの部分配列)は、それ自身、プローブまたはプライマーとして役立つ。
【００６６】
II. アスペルギルス配列
開示は、アスペルギルス種由来の単離されたITS1核酸分子を提供し、アスペルギルスの検出および種同定のために用いられうる。開示は、A. クラバタス、A. グラヌロサス、A. シドウィ、A. フラビペス、A. レストリクタス、A. ベルシコロル、A. ウェンティ、A. ケバリエリ、およびA. ウスタス由来の単離されたITS1核酸分子を含む。特異的な核酸分子は以下のものを含む：
A. クラバタス(菌株ATCC 9192)：
2005529594.tif 000002
A. グラヌロサス(菌株CBS 119.5A)：
2005529594.tif 000003
A. グラヌロサス(菌株NRRL 1932)：
2005529594.tif 000004
A. シドウィ(菌株NRRL 250)：
2005529594.tif 000005
A. シドウィ(菌株NRRL 4768)：
2005529594.tif 000006
A. シドウィ(菌株CUH1)：
2005529594.tif 000007
A. シドウィ(菌株CUH2)：
2005529594.tif 000008
A. シドウィ(菌株CUH7)：
2005529594.tif 000009
A. シドウィ(菌株CUH8)：
2005529594.tif 000010
A. フラビペス(菌株ATCC 11013)：
2005529594.tif 000011
A. フラビペス(菌株ATCC 16805)：
2005529594.tif 000012
A. フラビペス(菌株ATCC 24487)：
2005529594.tif 000013
A. レストリクタス(菌株NRRL 148)：
2005529594.tif 000014
A. レストリクタス(菌株NRRL 151)：
2005529594.tif 000015
A. ベルシコロル(菌株ATCC 10072)：
2005529594.tif 000016
A. ベルシコロル(菌株NRRL 238)：
2005529594.tif 000017
A. ベルシコロル(菌株NRRL 239)：
2005529594.tif 000018
A. ベルシコロル(菌株CUH3)：
2005529594.tif 000019
A. ウェンティ(菌株3650)：
2005529594.tif 000020
A. ケバリエリ(菌株ATCC 16443)：
2005529594.tif 000021
A. ケバリエリ(菌株ATCC 24546)：
2005529594.tif 000022
A. ウスタス(菌株ATCC 14417)：
2005529594.tif 000023
A. ウスタス(菌株ATCC 16801)：
2005529594.tif 000024
A. ウスタス(菌株NRRL 275)：
2005529594.tif 000025
A. ウスタス(菌株NRRL 5077)：
2005529594.tif 000026
A. ウスタス(菌株CUH4)：
2005529594.tif 000027
A. ウスタス(菌株CUH5)：
2005529594.tif 000028
【００６７】
さらに、開示は、A. クラバタス(配列番号：1)、A. グラヌロサス(配列番号：2および3)、およびA. シドウィ(配列番号：4〜9)由来の単離されたITS1配列と少なくとも75％(例えば、少なくとも85％、95％または98％)配列同一性をもつ核酸配列(本明細書で定義されるように、相補的配列および対応するRNA配列も含む)を含む。開示はまた、A. フラビペス(配列番号：10〜12)、A. レストリクタス(配列番号：13および14)、およびA. ベルシコロル(配列番号：15〜18)、またはそれらの縮重変異体由来の単離されたITS1核酸配列を含む。そのような配列は、標的配列の検出もしくは増幅のためのプローブまたはプライマーとして用いられうる。
【００６８】
A. クラバタス(配列番号：1)、A. グラヌロサス(配列番号：2および3)、およびA. シドウィ(配列番号：4〜9)由来の単離されたITS1配列と少なくとも75％(例えば、少なくとも85％、95％または98％)配列同一性をもつ任意の核酸配列を含む、本明細書に開示されているアスペルギルスITS1配列由来の少なくとも約10個の連続したヌクレオチドまたは少なくとも約15個、20個もしくは25個の連続したヌクレオチドを含む単離されたオリゴヌクレオチド(本明細書で定義されるように、相補的配列および対応するRNA配列も含む)もまた開示されている。単離されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも10個の連続したヌクレオチド、または長さが15個、20個もしくは25個の連続したヌクレオチド、またはそれより長くてもよい。一つの態様において、オリゴヌクレオチドは、A. フラビペス(配列番号：10〜12)、A. レストリクタス(配列番号：13および14)、およびA. ベルシコロル(配列番号：15〜18)、またはそれらの縮重変異体由来である。これらのオリゴヌクレオチドは、効果的なDNAハイブリダイゼーションプローブまたは増幅に有用なプライマーとして使用されうる。そのようなプローブおよびプライマーは、アスペルギルスの検出および種分化において特に有用である。
【００６９】
いくつかの態様において、本明細書に開示されているプローブまたはプライマーのいずれもまた、最大限の長さであり、例えば、15、25、25、40、50、75、100、または150ヌクレオチド長未満である。
【００７０】
配列番号：22〜27に示されるA. ウスタス由来の単離されたITS1核酸配列もまた本明細書に開示されている。
【００７１】
本明細書に開示されている単離された核酸配列のいずれも、開示された配列からなりうるもしくは本質的になりうる、または開示された配列の15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、または80個の連続したヌクレオチドの最大限の長さをもつ核酸分子を含みうる。開示されている連続したヌクレオチドはまた、他の関連のない配列へどちらの末端でも連結されうる。
【００７２】
III. アスペルギルスITS1配列を検出する方法
試料内のアスペルギルスの存在は、本明細書に記載されるITS1配列を用いて検出されうる。アスペルギルスDNAは、これらのITS1配列を用いて、直接的に検出されうる、またはそのDNAが生じたアスペルギルス種の検出および同定の前に増幅されうる。一つの態様において、試料におけるアスペルギルスの種は、配列分析により決定される。本明細書に記載される方法は、実験室および臨床的設定においてのような、診断的および予後的適用を含む、アスペルギルスの検出が望ましいところにおいて任意の目的のために用いられうる。
【００７３】
一つの態様において、検出方法は、対象となる試料において、アスペルギルスITS1配列を核酸増幅法で増幅する工程を含む。一つの特定の態様において、増幅はPCRにより、方法は、ITS1配列由来の2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、続いて、アスペルギルス種の同定のための配列分析を行う。一つの特定の、非限定的な例において、PCRが、増幅のために利用される。
【００７４】
適当な試料は、ヒトまたは獣医学的対象から得られる臨床的試料、例えば、血液もしくは血液画分(例えば、血清)、痰、唾液、口部のもしくは洗液、皮膚切屑、生検を実施する組織(例えば、気管支鏡検査法試料)、気管支肺胞洗浄(BAL)洗液、脳脊髄液、または前立腺液を含む、任意の通常の環境的または生物学的試料を含む。そのような試料の取得についての標準的技術は入手可能である(Schlugerら、J. Exp. Med. 176:1327-1333、1992；Bigbyら、Am Rev. Respir. Dis. 133:515-518、1986；Kovacsら、NEJM 318:589-593、1988；およびOgnibeneら、Am. Rev. Respir. Dis. 129:929-932、1984を参照)。試料は、直接的に使用されうる、または、溶剤、保存剤、緩衝剤または他の化合物もしくは物質を添加することによるような処理をされうる。
【００７５】
一つの態様において、核酸は試料から単離される。DNAまたはRNAは、標準的方法を用いて抽出されうる。例えば、迅速なDNA調製は、市販のキット(例えば、Qiagen Tissue Kit、Qiagen, Inc.、バレンシア、CAを用いて行われうる。DNA調製技術は、核酸増幅を利用しやすい、かつ受け入れられるヌクレオチド調製物を生じるように選択されうる。
【００７６】
一つの特定の、非限定的な例において、ユニバーサル真菌プライマーITS5(配列番号：28)、ITS2(配列番号：29)およびITS4(配列番号：30)(図1を参照)は、A. クラバタス(配列番号：1)、A. グラヌロサス(配列番号：2および3)、およびA. シドウィ(配列番号：4〜9)由来の同定された配列、または75％、85％、90％もしくは95％同一性の配列を増幅するために用いられ、続いて、アスペルギルス種の存在を決定するために配列分析が行われる。もう一つの特定の、非限定的な例において、同じユニバーサルプライマーが、A. フラビペス(配列番号：10〜12)、A. レストリクタス(配列番号：13および14)、A. ベルシコロル(配列番号：15〜18)、A. ウェンティ(配列番号：19)、およびA. ケバリエリ(配列番号：20および21)、またはそれらの縮重変異体由来の同定された配列を増幅するために用いられ、続いて、アスペルギルス種の存在を決定するために配列分析が行われる。
【００７７】
追加の特定の、非限定的な例において、アスペルギルスITS1領域は、A. クラバタス(配列番号：1)、A. グラヌロサス(配列番号：2および3)、A. シドウィ(配列番号：4〜9)、A. フラビペス(配列番号：10〜12)、A. レストリクタス(配列番号：13および14)、A. ベルシコロル(配列番号：15〜18)、A. ウェンティ(配列番号：19)、およびA. ケバリエリ(配列番号：20および21)由来の単離されたITS1配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され、続いて、アスペルギルス種の存在を決定するために配列の区別(例えば、配列分析)が行われる。配列分析は、例えば、増幅されたITS1領域の配列を得ること、または増幅されたITS1領域内の特異的同定配列を同定するプローブを用いることを含みうる。特定の態様において、プローブまたはプライマーは、以下の配列の、少なくとも18個の連続したヌクレオチドのような、少なくとも15個の連続したヌクレオチド、例えば、15個〜18個の連続したヌクレオチドを含む：
2005529594.tif 000029
【００７８】
さらなる特定の、非限定的な例において、アスペルギルスITS1領域は、ユニバーサル真菌プライマーITS5(配列番号：28)、ITS1(配列番号：31)、ITS2(配列番号：29)、およびITS4(配列番号：30)を用いて増幅され、続いて、アスペルギルス種の存在を決定するために配列番号：1、配列番号：2もしくは3、配列番号：4、5、6、7、8もしくは9、配列番号：10、11もしくは12、配列番号：13もしくは14、配列番号：15、16、17もしくは18、配列番号：19、または配列番号：20および21のITS1領域の少なくとも15個の連続したヌクレオチド(例えば、15〜18ヌクレオチド)を含むオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションが行われる。特定の態様において、プローブは、上記に列挙されたプローブ配列の、少なくとも18個の連続したヌクレオチドのような、少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。
【００７９】
IV. キット
本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドプライマーは、アスペルギルスの検出用のキットの形態で供給されうる。そのようなキットにおいて、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、1つまたは複数の容器において供給される。オリゴヌクレオチドプライマーは、水溶液に懸濁されて、または凍結乾燥された粉末として、供給されうる。オリゴヌクレオチドが供給される容器は、供給形状（例えば、ミクロチューブ、アンプル、またはビン）を保つことができる任意の通常の容器でありうる。いくつかの適用において、プライマー対は、典型的には使い捨ての、チューブまたは同等の容器の個々において、あらかじめ測定された一回使用の量で供給されうる。そのような準備をして、アスペルギルス核酸の存在について検査される試料は、個々のチューブに添加され、増幅が直接的に行われ、続いて、配列分析が行われうる。
【００８０】
いくつかの態様において、キットはまた、DNA試料調製試薬、適切な緩衝剤(例えば、ポリメラーゼ緩衝剤)、塩(例えば、塩化マグネシウム)、およびデオキシリボヌクレオチド(dNTP)を含む、PCR増幅反応を行うために必要な試薬を含みうる。PCR反応用の1つまたは複数の対照配列もまたキットにおいて供給されうる。
【００８１】
一つの態様において、キットは、使用説明書と共に供給される。一つの特定の、非限定的な例において、使用説明書は、書面にした使用説明書である。もう一つのそのような例において、使用説明書は、ビデオカセットまたはCDに含まれる。使用説明書は、例えば、本明細書に開示されているITS1配列を用いて、核酸配列を増幅し、その後、アスペルギルスの種(および/または菌株)を区別するためのプライマーの使い方をユーザーに説明しうる。一つの特定の非限定的な例において、使用説明書は、異なるアスペルギルスを示す配列の差異を検出するために増幅された核酸を配列決定することをユーザーに指導する。または、プローブは、各種または菌株に関連している異なる配列を検出するために用いられうる。
【００８２】
実施例
以下の実施例は、特定の態様の詳細な特徴を例証するために提供されるが、特許請求の範囲は、例証されたそれらの特徴に限定されるべきではない。
【００８３】
実施例1
材料および方法
真菌DNAの単離
アスペルギルス単離物を、それらの純粋性を確立する、形態学的および他の伝統的特徴に基づいて種を同定する、かつDNA抽出のために真菌の増殖を生じるために、Czapek-Dox寒天(Difco Laboratories、デトロイト、MI)上で、25℃および37℃で、10〜14日間、増殖した。
【００８４】
1つの寒天プレートの表面からこすりとられた真菌のバイオマスを、あらかじめ冷却された(-20℃)滅菌した陶磁器の乳鉢へ移し、液体窒素で表面を覆い、乳棒でゆっくり微粉へとすりつぶした。粉末を、リボヌクレアーゼ(Sigma Chemical Co.、セントルイス、MO)を含む2 mlのG-2緩衝液(ゲノムDNA緩衝液セット(Genomic DNA buffer set)、Qiagen, Inc.)に懸濁し、Oak Ridge遠心分離管(Nalge Nunc International、ロチェスター、NY)へ移した。45 μlのプロテイナーゼK溶液(Roche Molecular Biochemicals、インディアナポリス、IN)の添加後、懸濁液を55℃で2時間、断続的撹拌でインキュベートした。粗抽出物を22,870 x gで10分間、遠心分離し、上清をFalconチューブ(Becton Dickinson、フランクリンレイク、NJ)へ移し、短時間、ボルテックス混合した。その後、DNAを製造会社の使用説明書に従い、Genomic-tip 20/Gカラム(Qiagen, Inc.)を用いて精製した。溶出されたDNAに2.5 μlのグリコーゲン溶液(Gentra Systems、ミネアポリス、MN)を追加し、標準的方法(Sambrookら参照)により沈澱させ、60 μlのDNA再水和緩衝液(PureGeneキット、Gentra Systems)に再懸濁した。
【００８５】
生物学的試料からのアスペルギルスDNAの抽出
1 mlの生物学的試料を、室温で30分間、振盪機上で1 mlの溶解溶液(1 N NaOH、0.2 M クエン酸ナトリウム、0.4 M N-アセチルシステイン)と共にインキュベートした。その後、試料を微量遠心管において12,000 rpmで10分間、遠心分離した。上清を除去し、2 mlの溶解溶液を添加し、ペレットを、30秒間ボルテックスすることにより再懸濁した。試料を再び、微量遠心管において12,000 rpmで10分間、遠心分離した。上清を除去し、ペレットを、2 mlの20 mM トリス-HCl(pH 8.3)において再懸濁し、続いて、微量遠心管において12,000 rpmで10分間、遠心分離した。上清を除去し、300 μlのソルビトール緩衝液(1 M ソルビトール、100 mM EDTA)、10 μlのβ-メルカプトエタノール、および200ユニットのザイモリエイス(zymolyase)を添加し、ペレットを、数回、短時間、ボルテックスすることにより再懸濁した。混合物を振盪機上で、35℃で1.5時間、インキュベートし、続いて、微量遠心管において6,000 rpmで15分間、遠心分離した。上清を除去し、ペレットを2 mlのソルビトール緩衝液に再懸濁した。試料を再び、微量遠心管において6,000 rpmで15分間、遠心分離した。上清を除去し、ペレットを180 μlのATL溶解緩衝液(Qiagen, Inc.)に再懸濁した。20 μlのプロテイナーゼK溶液(Qiagen, Inc.)の添加後、試料を振盪機上で、55℃で1.5時間、インキュベートした。その後、試料を微量遠心管において8,000 rpmで20分間、遠心分離した。上清を除去し、ペレットを、200 μlの20 mM トリス-HCl(pH 8.3)に再懸濁し、続いて、水浴で40分間、煮沸した。その後、DNAを、製造会社の使用説明書に従い、QIAamp DNAカラム(Qiagen, Inc.)を用いて精製した。
【００８６】
プライマーおよびプローブの調製
すべてのプライマーおよびプローブは、394または迅速自動化DNA合成機(PE Applied Biosystems、フォスターシティー、CA)を用いるβ-シアノエチルホスホラミダイト化学により合成された。
【００８７】
真菌rDNAの5.8S領域に位置するユニバーサルの真菌の配列であり、ITS5およびITS2、またはITS5およびITS4のプライマーにより増幅される領域内に含まれるITS3は、合成の間に、ジメトキシトリチル-ビオチン-炭素-6-ホスホラミダイトを取り込むことにより5'末端においてビオチン化された。その後、このビオチン化プローブ(ITS3-B)を逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。
【００８８】
ジゴキシゲニン標識プローブは、5'Amino-Modifier C6(Glen Research、スターリング、VA)を用いて5'末端アミン基をもつように合成され、0.1 M 炭酸ナトリウム緩衝液、pH 9.0中の10倍モル過剰量のジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Roche)と混合され、周囲温度で一晩、インキュベートされた。その後、ジゴキシゲニン標識プローブを逆相高圧液体クロマトグラフィー、Beckerら、J. Chromatogr. 326:293-299、1985により精製した。
【００８９】
rDNA内部転写スペーサー1のPCR増幅
PCR反応混合物は、50 mM KClを含む10 mM トリス-HCl緩衝液、pH 8.0(Roche)、1.5 mM MgCl2(Roche)、0.2 mM dNTP(Roche)および1.25 U Taqポリメラーゼ(Roche)からなった。プライマーITS5およびITS2、またはITS5およびITS4を各20 pMの最終濃度まで添加した。鋳型DNAを、50 μl 反応混合物あたり1 ngの最終濃度において添加した。各実験について、少なくとも1つの反応チューブは、陰性対照として、鋳型DNAの代わりに水を入れた。増幅をGeneAmp PCR System 9700(PE Applied Biosystems)において行った。鋳型DNAの最初の変性は、95℃で5分間、加熱することにより達成された。これに続いて、95℃で30秒間、58℃で30秒間、および72℃で1分間の30サイクルで行った。最終伸長段階は、72℃で5分間行った。適切な対照を含み、PCR汚染予防措置は、Fujitaら、J. Clin. Microbiol. 33:962-967、1995に従った。
【００９０】
配列分析
プライマー対ITS5およびITS2、ITS5およびITS4、ITS1およびITS2、またはITS1およびITS4のいずれかで生じたPCR産物を、製造会社の使用説明書に従い、QIAquick PCR精製キット(Qiagen, Inc.)を用いて精製した。精製された産物を、PCR増幅のために最初に用いたのと同じプライマー、およびBigDye Termination Cycle Sequencing Ready Reactionキット(PE Applied Biosystems)を製造会社により推奨されているように用いて、両方の鎖について配列決定した。GeneAmp PCR System 9700におけるサイクル配列決定は、96℃で5分間の最初の変性、続いて、96℃で10秒間、50℃で5秒間、および60℃で4分間の30サイクルからなる。配列決定産物をDye-Ex Spinキット(Qiagen, Inc.)を用いて精製し、減圧遠心機において乾燥させ、ホルムアミドに再懸濁した。配列決定産物を、製造会社の使用説明書に従って、自動化キャピラリーDNAシーケンサー(ABI Prism 310 Genetic Analyzer、PE Applied Biosystems)において分析した。GenBank検索および比較配列解析は、BLAST検索ツール、Genetics Computer Groupソフトウェアパッケージ(University of Wisconsin、マディソン)、およびClustal Wアラインメントプログラム(Thompsonら、Nucleic Acids Research 22:4673-4680、1994)により援助された。
【００９１】
実施例2
アスペルギルスITS1共通配列の比較解析
142ヌクレオチド長(A. ケバリエリ)から187ヌクレオチド長(A. クラバタス)までの範囲の合計46個のITS1共通配列を編集した(表1)。全体的にみて、長さおよび配列において有意な種間の可変性をもつ5つの領域が認識された(図2)。これらの高可変性領域は、以下のように限定された：ITS1-V1、8位〜30位(12〜21ヌクレオチド長)；ITS1-V2、50位〜67位(13〜14ヌクレオチド長)；ITS1-V3、81位〜141位(12〜54ヌクレオチド長)；ITS1-V4、151位〜181位(23〜28ヌクレオチド長)；およびITS1-V5、192位〜215位(17〜21ヌクレオチド長)。A. ニガーのITS1-V3配列(54ヌクレオチド)と比較して、著しくより短い対応する配列が、A. ケバリエリ(12ヌクレオチド)、A. グラヌロサス(21ヌクレオチド)、A. ウスタス(21〜30ヌクレオチド)、A. シドウィ(22ヌクレオチド)、A. ベルシコロル(22ヌクレオチド)、およびA. ニドゥランス(21〜22ヌクレオチド)について見出された。通常、種間の多様性は、非常に多様なA. ウスタス配列を除いて、≦5ヌクレオチドであり、主として、ITS1-V3領域に存在した。それらは、ITS1-V1、-V3、-V4および-V5内の合計33地点において互いに異なり、それらにより、185位、202位〜204位および215位において特徴的なヌクレオチドをもつA. ウスタスITS1配列の2つの主要な型を明らかにした。
【００９２】
ITS1配列多様性は、A. ニドゥランスと密接に関連した種の間の比較(表2)から推定されるように、本明細書に開示されているアスペルギルス種の識別を可能にした。≦77.3％、≦80.5％、≦95.4％、および≦96.7％の配列類似性は、A. グラヌロサス、A. ウスタス、A. シドウィ、およびA. ベルシコロルとの比較におけるA. ニドゥランスについて、それぞれ、決定された。A. ウスタスと比較したA. グラヌロサスは、中位の類似性(≦94.2％)を示したが、A. ベルシコロルと比較したA. シドウィについて、≦98.1％の高い値という結果となった。同じアルゴリズムを用いて、99.3％、100％、≧89.0％、98.7％、および99.4％の種間の類似性は、A. ニドゥランス、A. グラヌロサス、A. ウスタス、A. シドウィ、およびA. ベルシコロルを表す菌株について、それぞれ、見出された。A. ウスタスについての種間の類似性の広い範囲(≧89.0〜99.4％)は、明らかに、上記のように、調査された種間の非常に多様なITS1配列の存在を反映した。
【００９３】
種の区別を、ITS1の5つの高可変性領域における配列の差異を比較または検出することにより、特に効率的に行うことができる。これらの高可変性領域は、図2に示されるITS1アラインメント配列の残基8位〜31位、50位〜67位、81位〜141位、151位〜181位、および192位〜215位に対応し、図2において、点は、A. ニガーI配列と比較して同一のヌクレオチドを表し、ダッシュは、アラインメントギャップを示す。例えば、A. ニガーI配列の第一の高可変性領域は、配列C-GGG-----TCCTTTGG-----Gを含む；第二の高可変性領域は、配列TCTA--TTGT-ACCC--Tを含む；第三の高可変性領域は、配列-GCCCGCCGCTTGTC----GGCCGCCGGGGGGGCGCCTCT--GCCCCCCGGGCCCGTGCCCを含む；第四の高可変性領域は、配列CCCAACAC--GAACACTGT--CTGAAAGCG-を含む；および第五の高可変性領域は、配列GTT--GATTGAAT-GCAA-TCA-Gを含む。
【００９４】
（表１）本明細書に開示されるアスペルギルス菌株の供給源および特徴付け
2005529594.tif 000030
2005529594.tif 000031
a  ATCC、American Type Culture Collection、マナッサス、バージニア；CBS、Centraalbureau voor Schimmelcultures、ユトレヒト、オランダ；CDC、Centers for Disease Control and Prevention、アトランタ、ジョージア；NRRL、Agricultural Research Service (ARS) Culture Collection、ピオリア、イリノイス。
b  配列分析により決定されたヌクレオチドの数。
c  J. H. Shin博士、Department of Clinical Pathology, Chonnam University Medical School、光州、韓国の好意により提供された臨床的単離物。
d  A. フラバスとしてATCCに寄託されている。
【００９５】
（表２）A. ニドゥランスおよび密接に関連した種に関するITS1配列類似性
2005529594.tif 000032
a  図2への説明文において列挙されている菌株。
b  類似性は、GAPアルゴリズム(GCG)を用いて、図2に示されているような完全ITS1配列について決定された。
【００９６】
実施例3
ポリメラーゼ連鎖反応-酵素免疫測定法(EIA)
PCR産物の酵素免疫測定法(EIA)の同定は、Elieら、J. Clin. Microbiol. 36:3260-3265、1998およびFujitaら、J. Clin. Microbiol. 33:962-967、1995に記載されているように、軽微な改変をもって行われる。
【００９７】
簡単には、10 μlの加熱変性された(95℃で5分間)PCR産物を含むチューブを氷上に置き、10 ngのITS3-Bおよび10 ngのジゴキシゲニン標識プローブを含む200 μlのハイブリダイゼーション緩衝液(4X SSC、pH 7.0、0.02 M HEPES、0.002 M EDTA、0.15％ ツイーン20)を添加した。試料を混合し、37℃で1時間、インキュベートした。100 μlの混合物を、ストレプトアビジンコーティングされた(Roche)、96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルへ二連で添加し、〜350 rpmでのマイクロタイタープレート振盪機(Labline Instruments、メルローズパーク、IL)上で1時間、周囲温度でインキュベートした。マイクロタイタープレートを、ウェルあたり西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体(150 U/ml、Roche)の1:1000希釈の100 μlを添加する前に、0.05％ ツイーン20(PBST)を含む0.01 M リン酸緩衝食塩水、pH 7.2で6回、洗浄した。プレートを、振盪しながら、周囲温度で1時間、インキュベートし、その後、PBSTで6回、洗浄する。その後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)-H2O2基質(Kirkegaard and Perry、ゲーサーズバーグ、MD)をウェルへ添加し、呈色反応を、周囲温度で15分間発色させて行う。各ウェルの光学密度は、UVMaxマイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices、サニーヴェール、CA)において650 nmの波長で直ちに読まれる。二連のウェルの光学密度を平均し、試験DNAを入れているウェルの光学密度値をPCR水対照の光学密度で割ることにより計算されるEIA指数(EI)へ変換する。PCR産物のEIA同定の例は、表3に示されている。
【００９８】
スチューデントのt検定を、相同的および非相同的DNAへのプローブハイブリダイゼーションの平均EI間の差を判定するために用いる。差は、Pの値が0.05より小さいまたは等しい場合、有意とみなされる。
【００９９】
（表３）EIAにおいてPCR産物とのハイブリダイゼーションにより分析されるDNAプローブの種特異性
2005529594.tif 000033
【０１００】
実施例4
DNA配列に基づいたアスペルギルス種の同定
この実施例は、どのようにしてDNAに基づいた配列同定がアスペルギルスの異なる種を同定するために用いられうるかを例証する。生物学的試料を感染した対象から得て、真菌をアスペルギルスの増殖に適した条件下で培養し、続いて、実施例1において真菌DNAの単離に記載されているように真菌DNAの単離を行う。または、真菌DNAは、実施例1において生物学的試料からのアスペルギルスDNAの抽出に記載されているように、生物学的試料から直接的に抽出することができる。混合物に存在する真菌DNAを増幅するために、ユニバーサルプライマー対ITS5およびITS2、ITS5およびITS4、ITS1およびITS2、またはITS1およびITS4を反応混合物へ添加し、続いて、実施例1に記載されているように配列分析を行う。
【０１０１】
一つの態様において、ユニバーサルプライマー対を用いる試料に存在する真菌DNAの全般的な増幅後、ITS1の高可変性領域由来の特異的プライマーを用いてこの領域由来のDNAを増幅し、そのDNAをDNA配列分析にかける。特定の態様において、プライマーは、上で示されているプライマー配列(III. アスペルギルスITS1配列を検出する方法)の、少なくとも18個の連続したヌクレオチドのような、少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。この配列情報は、本明細書に開示されている真菌DNA配列(配列番号：1〜27)と比較され、配列適合は、アスペルギルス種の同定を確証させる。
【０１０２】
さらにもう一つの態様において、ユニバーサルプライマー対を用いる試料に存在する真菌DNAの全般的な増幅を省略し、ITS1の高可変性領域由来の特異的プライマーを用いてこの領域由来のDNAを増幅し、そのDNAをDNA配列分析にかける。特定の態様において、プライマーは、上で示されているプライマー配列(III. アスペルギルスITS1配列を検出する方法)の、少なくとも18個の連続したヌクレオチドのような、少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。この配列情報は、本明細書に開示されている真菌DNA配列(配列番号：1〜27)と比較され、配列適合は、アスペルギルス種の同定を確証させる。
【０１０３】
この技術は、培養プレート上において、臨床的検体において、食物、医薬品において、および環境または他の試料において、アスペルギルスの単一種を迅速かつ高い信頼性をもって同定するのに有用である。
【０１０４】
実施例5
ITSまたはD1/D2領域による所定の種間の塩基対の差異
この実施例における情報は、本発明者らが、ITS2領域と比較してITS1領域におけるアスペルギルス種間に実質的多様性があることを見出したことを例証する。このより高い多様性は、DNA配列情報がより優れた種の同定を提供することを可能にする。例えば、ITS1領域においてA. ウスタスとA. ニドゥランスの間に約48個の塩基対の差異があるが、ITS2領域においてはこれらの種間にたった6個の塩基対の差異しかない。
【０１０５】
以下の表4は、アスペルギルス種の同定について情報を与えるITS1領域の驚くべき優れた能力を例示する。
【０１０６】
（表４）ITSまたはD1/D2領域による所定の種間の塩基対の差異
2005529594.tif 000034
【０１０７】
前記の実施例は、例証としてのみ提供される。本明細書に記載されているヌクレオチド配列および方法における多数の変化が、アスペルギルスITS1配列の増幅についてのオリゴヌクレオチドプライマーを作製かつ使用するために、ならびにアスペルギルスの検出および種同定におけるそれらの使用のために用いられうることを当業者は認識しているものと思われる。本発明者らは、特許請求の範囲の範囲および精神に含まれるすべてのそのような改変および変化を主張する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】真菌rDNAの図である。ITS5およびITS1増幅プライマーについてのハイブリダイゼーション部位は、系統学的に保存された18S領域に示され、ITS2およびITS3増幅プライマーについてのハイブリダイゼーション部位は、系統学的に保存された5.8S領域に示され、かつITS4増幅プライマーについてのハイブリダイゼーション部位は、系統学的に保存された28S領域に示される。矢印は、増幅の方向を示す。
【図２】代表的なアスペルギルス種および菌株のITS1配列のアラインメントである。点は、A. ニガーI配列と比較して同一のヌクレオチドを表す；ダッシュは、アラインメントギャップを示す。整列させた配列は、それらの系統学的関係(SamsonおよびPitt(編)、Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus Classification、Harwood Academic Publishers、2000)による水平な線により分けられており、以下の菌株を示す：A. ニガー I(ATCC 1015、ATCC 64028)、A. ニガー II(ATCC 16404)、A. フラバス(ATCC 11497、ATCC 34896、ATCC 44310、ATCC 64025)、A. パラシチクス(ATCC 56775)、A. タマリー(ATCC 64841)、A. フラビペス I(ATCC 11013)、A. フラビペス II(ATCC 16805)、A. フラビペス III(ATCC 24487)、A. カンジダス(NRRL 303、NRRL 312)、A. テレウス(ATCC 1012、ATCC 10029、ATCC 7860)、A. ケバリエリ(ATCC 16443、ATCC 24546)、A. レストリクタス(NRRL 148、NRRL 151)、A. フミガーツス(ATCC 16903、CDC 2570)、A. グラヌロサス(CBS 119.5A、NRRL 1932)、A. ウスタス I(ATCC 14417)、A. ウスタス II(ATCC 16801)、A. ウスタス III(CUH4)、A. ウスタス IV(NRRL 275)、A. ウスタス V(NRRL 5077、CUH5)、A. シドウィ I(NRRL 250、NRRL 4768、CUH1、CUH2、CUH8)、A. シドウィ II(CUH7)、A. ベルシコロル I(ATCC 10072、NRRL 238、NRRL 239))、A. ベルシコロル II(CUH3)、A. ニドゥランス I(ATCC 16855、ATCC 64027)、およびA. ニドゥランス II(CDC 040487)。
【配列表フリーテキスト】
【０１０９】
添付の配列表に列挙される核酸配列は、37 C.F.R. 1.822に定義されるように、ヌクレオチド塩基についての標準的文字略語を用いて示されている。各核酸配列の1つの鎖のみが示されているが、相補鎖および両方の鎖の対応するRNA配列が、示されている鎖への任意の関連により含まれるものと理解されている。
配列番号：1は、A. クラバタス(菌株ATCC 9192)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：2は、A. グラヌロサス(菌株CBS 119.5A)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：3は、A. グラヌロサス(菌株NRRL 1932)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：4は、A. シドウィ(菌株NRRL 250)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：5は、A. シドウィ(菌株NRRL 4768)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：6は、A. シドウィ(菌株CUH1)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：7は、A. シドウィ(菌株CUH2)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：8は、A. シドウィ(菌株CUH7)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：9は、A. シドウィ(菌株CUH8)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：10は、A. フラビペス(菌株ATCC 11013)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：11は、A. フラビペス(菌株ATCC 16805)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：12は、A. フラビペス(菌株ATCC 24487)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：13は、A. レストリクタス(菌株NRRL 148)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：14は、A. レストリクタス(菌株NRRL 151)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：15は、A. ベルシコロル(菌株ATCC 10072)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：16は、A. ベルシコロル(菌株NRRL 238)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：17は、A. ベルシコロル(菌株NRRL 239)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：18は、A. ベルシコロル(菌株CUH3)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：19は、A. ウェンティ(菌株3650)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：20は、A. ケバリエリ(菌株ATCC 16443)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：21は、A. ケバリエリ(菌株ATCC 24546)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：22は、A. ウスタス(菌株ATCC 14417)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：23は、A. ウスタス(菌株ATCC 16801)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：24は、A. ウスタス(菌株NRRL 275)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：25は、A. ウスタス(菌株NRRL 5077)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：26は、A. ウスタス(菌株CUH4)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：27は、A. ウスタス(菌株CUH5)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号：28は、真菌ユニバーサルフォワードプライマーITS5の核酸配列を示す。
配列番号：29は、真菌ユニバーサルリバースプライマーITS2の核酸配列を示す。
配列番号：30は、真菌ユニバーサルリバースプライマーITS4の核酸配列を示す。
配列番号：31は、真菌ユニバーサルフォワードプライマーITS1の核酸配列を示す。
配列番号：32は、真菌ユニバーサルフォワードプライマーITS3の核酸配列を示す。
配列番号：33は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：34は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：35は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：36は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：37は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：38は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：39は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：40は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：41は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：42は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：43は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：44は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：45は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：46は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：47は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：48は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：49は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：50は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：51は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：52は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：53は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：54は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：55は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：56は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：57は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：58は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：59は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：60は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：61は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：62は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：63は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：64は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：65は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：66は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号：67は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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