(57)【要約】病原体、ワクチンまたは細胞性応答を誘発する任意の他の部分である作用物質に対する最近の曝露を個体において診断する方法であって、個体のT細胞が、作用物質由来の1つまたは複数のペプチドエピトープよりも大きな範囲で、少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ該作用物質由来のタンパク質を認識するかどうかをインビトロで測定することを含み、より大きな範囲のタンパク質の認識が、個体が最近作用物質に曝されたことを示す方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体、ワクチンまたは細胞性応答を誘発する任意の他の部分である作用物質に対する最近の曝露を個体において診断する方法であって、個体のT細胞が、作用物質由来の1つまたは複数のペプチドエピトープよりも大きな範囲で、少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ該作用物質由来のタンパク質を認識するかどうかをインビトロで測定することを含み、より大きな範囲のタンパク質の認識が、個体が最近作用物質に曝されたことを示す方法。
【請求項２】
個体のT細胞が、作用物質由来の1つまたは複数のペプチドエピトープに対するよりも少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ作用物質由来のタンパク質に対して、より大きな反応を示すかどうかを測定することを含み、より大きな反応が、個体が最近作用物質に曝されたことを示す、請求項1記載の方法。
【請求項３】
T細胞がタンパク質を認識するかどうかを測定することが、該タンパク質を認識するT細胞により認識されるタンパク質の類似体に対するT細胞の反応を測定することにより行われ、該類似体が少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ、請求項1記載の方法。
【請求項４】
T細胞がペプチドエピトープを認識するかどうかを測定することが、該ペプチドエピトープを認識するT細胞により認識されるペプチドエピトープの類似体に対するT細胞の反応を測定することにより行われる、請求項1または3記載の方法。
【請求項５】
以下の段階を含む、上記請求項のいずれか一項記載の方法：
(i)個体由来のT細胞の第一集団を(a)作用物質由来の1つもしくは複数のペプチドエピトープ、または(b)該ペプチドを認識するT細胞により認識される該ペプチドの類似体と接触させる段階、およびペプチドまたは類似体に対するT細胞の反応を測定する段階、ならびに
(ii)個体由来のT細胞の第二集団を(a)作用物質由来のタンパク質、または(b)該タンパク質を認識するT細胞により認識される該タンパク質の類似体と接触させる段階であって、該タンパク質または該類似体が少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ段階、および該タンパク質または該類似体に対するT細胞の反応を測定する段階。
【請求項６】
ペプチドエピトープまたはその類似体に対するT細胞の反応が実質的にない場合に、個体が最近作用物質に曝されたとして診断される、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
タンパク質またはそれの類似体が、少なくともペプチドエピトープまたはそれの類似体のアミノ酸配列を含む、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ペプチドエピトープまたはペプチドエピトープの類似体が、8個〜29個のアミノ酸の長さをもつ、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
T細胞が少なくとも4つのペプチドエピトープまたはそれらの類似体のプールを認識するかどうかを測定する、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質由来の可能性のあるエピトープのすべてを全体として表すペプチドエピトープおよび/または類似体のプールが使用される、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質またはタンパク質の類似体に対するT細胞の反応の検出の間、タンパク質をプロセシングしかつそれをT細胞へ提示することができる抗原提示細胞が存在する、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
病原体が細胞内病原体であるか、またはワクチンが細胞内病原体に対するものである、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
病原体が、HPV、HIV、SIV、HCV、クラミジア(Chlamydia)種、HBV、EBV、CMV、VZV、HSV、レジオネラ(Legionella)、チフス菌(S. typhi)、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、レーシュマニア(Leishmaniasis)、ライ菌(M. leprae)、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、トキソプラズマ(Toxoplasma)種、ブルセラ(Brucella)種、クリプトコッカス(Cryptococcus)種、カンジダ(Candida)種もしくはアスペルギルス(Aspergillus)種であるか；またはワクチンがこれらの病原体のいずれかに対するものである、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
病原体がヒト型結核菌(M. tuberculosis)であるか、またはワクチンがヒト型結核菌に対するものである、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質および/またはエピトープペプチドがESAT-6またはCFP10由来である、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
以下のペプチドエピトープ
2005532546.tif 000008
または
該ペプチドエピトープを認識するT細胞により認識されるその類似体
の1つまたは複数から選択される、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
ペプチドエピトープもしくはその類似体の認識、またはタンパク質もしくはその類似体の認識が、T細胞由来のサイトカインの分泌を検出することにより測定される、上記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
サイトカインがIFN-γである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
サイトカインが、サイトカインに特異的な固定化された抗体に結合され、その後、抗体/サイトカイン複合体の存在を検出することによりサイトカインが検出される、請求項17または18記載の方法。
【請求項２０】
病原体、ワクチンまたは細胞性応答を誘発する任意の他の部分である作用物質に対する最近の曝露を個体において診断する方法であって、個体のT細胞が、作用物質由来のペプチドエピトープよりも大きな範囲で、少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ該作用物質由来のタンパク質を認識するかどうかをインビボで測定することを含み、より大きな範囲のタンパク質の認識が、個体が最近作用物質に曝されたことを示す方法。
【請求項２１】
請求項2〜19のいずれか一項記載の方法を用いて行われる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
作用物質に対する最近の曝露を個体において診断する方法における使用のための診断手段の製造における、病原体、ワクチンもしくは細胞性応答を誘発する任意の他の部分である作用物質由来の少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつタンパク質および/または作用物質由来の1つもしくは複数のペプチドエピトープの使用であって、該方法が、個体のT細胞がペプチドエピトープよりも大きな範囲でタンパク質を認識するかどうかを測定することを含み、より大きな範囲のタンパク質の認識が、個体が最近作用物質に曝されたことを示す使用。
【請求項２３】
作用物質に対する最近の曝露を個体において診断する方法における別々、同時または逐次の使用のための、病原体、ワクチンまたは細胞性応答を誘発する任意の他の部分である作用物質由来であり、少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつタンパク質および/または作用物質由来の1つもしくは複数のペプチドエピトープを含む生成物であって、該方法が、個体のT細胞がペプチドエピトープよりも大きな範囲でタンパク質を認識するかどうかを測定することを含み、より大きな範囲のタンパク質の認識が、個体が最近作用物質に曝されたことを示す生成物。
【請求項２４】
上記請求項のいずれか一項記載の方法により最近病原体に曝されたとして診断された個体に対して、病原体により引き起こされた状態を予防または治療する生成物を投与することを含む、個体を治療する方法。
【請求項２５】
請求項1〜21のいずれか一項記載の方法により最近病原体に曝されたとして診断された個体の治療のための薬物の製造における、病原体により引き起こされた状態を予防または治療する生成物の使用。
【請求項２６】
病原体がヒト型結核菌であり、および/または作用物質がリファンピシン、イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、パラ-アミノ-サリチル酸、カナマイシン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、チアセタゾンもしくはフルオロキノロン、またはそのような作用物質の類似体である、請求項24もしくは25記載の方法または使用。
【請求項２７】
(i)エピトープペプチドまたはその類似体、および(ii)タンパク質またはその類似体、ならびに任意で、T細胞が(i)および(ii)を認識するかどうかを検出するための手段を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法を行うためのキット。
【請求項２８】
請求項24〜26のいずれか一項に記載される作用物質も含む、請求項27記載のキット。
【請求項２９】
病原体による感染を除去した個体を診断する方法であって、個体のT細胞が、病原体への曝露後の第一およびその後の第二の時点において病原体由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識し、かつ第二の時点では認識しないという測定結果が、個体が感染を除去したことを示す方法。
【請求項３０】
病原体への曝露後に活性疾患へ進行する可能性がより高い個体を診断する方法であって、個体のT細胞が病原体への曝露後の第一およびその後の第二の時点において病原体由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識しないが、第二の時点では抗原を認識するという測定結果が、個体が活性疾患へ進行する可能性がより高いことを示す方法。
【請求項３１】
ワクチンまたは細胞性応答を誘発する部分への曝露後に、ワクチンまたは部分に対してより弱い応答を開始する個体を診断する方法であって、個体のT細胞が曝露後の第一およびその後の第二の時点においてワクチンまたは部分由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識しないが、第二の時点では抗原を認識するという測定結果が、個体がワクチンまたは部分に対してより弱い応答を開始していることを示す方法。
【請求項３２】
個体に投与されたワクチンの効果を試験する方法であって、個体のT細胞が病原体への曝露後の第一およびその後の第二の時点において病原体由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識し、かつ第二の時点では認識しないという測定結果が、ワクチン抗原が除去されて、持続していないことを示す方法。
【請求項３３】
第一の時点および第二の時点が約12週間の間隔である、請求項29〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
第一の時点が曝露後約2〜16週間目であり、および/または第二の時点が曝露後約18〜48週間目である、請求項29〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
測定が、個体のT細胞が病原体、ワクチンまたは部分由来の抗原を認識する/ワクチンまたは部分由来の抗原に反応するかどうかを検出することにより行われる、請求項29〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
抗原が、少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ病原体、ワクチンもしくは部分由来のタンパク質であるか、または病原体、ワクチンもしくは部分由来のペプチドエピトープであり、該タンパク質または該ペプチドエピトープが上記請求項のいずれか一項に記載されるとおりである、請求項29〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
測定が、抗原の類似体に対するT細胞の反応を検出することにより行われ、任意で、抗原の類似体が上記請求項のいずれか一項に記載される類似体である、請求項29〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
測定が、個体由来のT細胞の集団を抗原または該抗原の類似体とインビトロまたはインビボで接触させ、該抗原または該類似体に対するT細胞の反応を測定することにより行われる、請求項29〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
抗原または類似体に対するT細胞の反応が実質的にない場合に、決定を陰性と考える、請求項29〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
測定が、T細胞が少なくとも4つのペプチドエピトープまたはそれらの類似体のプールを認識するかどうかを検出することを含む、請求項29〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
測定の間、抗原または類似体をプロセシングしかつそれをT細胞へ提示することができる抗原提示細胞が存在する、請求項29〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
病原体が細胞内病原体であるか、またはワクチンが細胞内病原体に対するものである、請求項29〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
病原体が、HPV、HIV、SIV、HCV、クラミジア種、HBV、EBV、CMV、VZV、HSV、レジオネラ、チフス菌、熱帯熱マラリア原虫、レーシュマニア、ライ菌、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、トキソプラズマ種、ブルセラ種、クリプトコッカス種、カンジダ種もしくはアスペルギルス種であるか；またはワクチンがこれらの病原体のいずれかに対するものである、請求項29〜42ののいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
病原体がヒト型結核菌であるか、またはワクチンがヒト型結核菌に対するものである、請求項29〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
抗原または類似体の認識が、T細胞由来のサイトカインの分泌を検出することにより測定される、請求項29〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
サイトカインがIFN-γである、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
サイトカインが、サイトカインに特異的な固定化された抗体に結合され、その後、抗体/サイトカイン複合体の存在を検出することによりサイトカインが検出される、請求項45または46記載の方法。
【請求項４８】
請求項30〜47ののいずれか一項記載の方法により病原体に感染しているとして診断された個体に対して、病原体により引き起こされた状態を予防または治療する生成物を投与することを含む、個体を治療する方法。
【請求項４９】
病原体がヒト型結核菌であり、および/または作用物質がリファンピシン、イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、パラ-アミノ-サリチル酸、カナマイシン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、チアセタゾンもしくはフルオロキノロン、またはそのような作用物質の類似体である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
インビボで行われる請求項29〜47のいずれか一項記載の方法における使用のための診断手段の製造における、請求項29〜47のいずれか一項に記載される抗原または類似体の使用。
【請求項５１】
抗原または類似体、および任意で、T細胞が抗原または類似体を認識するかどうかを検出するための手段も含む、請求項29〜47のいずれか一項記載の方法を行うためのキット。
【請求項５２】
請求項48または49に記載される作用物質も含む、請求項51記載のキット。
【請求項５３】
免疫抑制療法中または開始しようとしている個体において活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性を診断する方法であって、個体のT細胞がミコバクテリア抗原を認識するかどうかを検出することを含み、T細胞によるミコバクテリア抗原の認識が活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性を示す方法。
【請求項５４】
免疫抑制療法中の個体において活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性をモニターする方法であって、個体のT細胞がミコバクテリア抗原を認識するかどうかを検出することを含み、T細胞によるミコバクテリア抗原の認識が活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性を示す方法。
【請求項５５】
免疫抑制療法が、抗TNF-α抗体、メトトレキセート、アザチオプリン、コルチコステロイドまたはミコフェノール酸モフェチルの投与を含む、請求項53または54記載の方法。
【請求項５６】
抗体がインフリキシマブである、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
T細胞認識が上記請求項のいずれか一項に記載される方法を用いて行われる、請求項53〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
個体のT細胞がミコバクテリア抗原またはミコバクテリア抗原の類似体を認識する/ミコバクテリア抗原またはミコバクテリア抗原の類似体に反応するかどうかをインビトロで測定することを含む、請求項53〜57のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
個体由来のT細胞の集団を(a)ミコバクテリアの1つもしくは複数のペプチドエピトープ、または(b)該ペプチドを認識するT細胞により認識される該ペプチドの類似体と接触させること、およびペプチドまたは類似体に対するT細胞の反応を測定することを含む、請求項53〜58のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
ペプチドエピトープ、またはペプチドエピトープの類似体が8〜100個のアミノ酸の長さをもつ、請求項53〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
T細胞が少なくとも4つのペプチドエピトープまたはそれらの類似体のプールを認識するかどうかを測定する、請求項53〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
ペプチドまたはペプチドの類似体に対するT細胞の反応の検出の間、ペプチドまたは類似体をプロセシングしかつそれをT細胞へ提示することができる抗原提示細胞が存在する、請求項53〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
ミコバクテリア抗原がヒト型結核菌のものである、請求項53〜62のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
ミコバクテリア抗原がESAT-6またはCFP10である、請求項53〜63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
以下のペプチドエピトープ
2005532546.tif 000009
または
該ペプチドエピトープを認識するT細胞により認識されるその類似体
の1つまたは複数から選択される1つまたは複数のペプチドのT細胞による認識を測定する、請求項53〜64のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
T細胞認識が、T細胞由来のサイトカインの分泌を検出することにより測定される、請求項53〜65のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
サイトカインがIFN-γである、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
サイトカインが、サイトカインに特異的な固定化された抗体に結合され、その後、抗体/サイトカイン複合体の存在を検出することによりサイトカインが検出される、請求項66または67記載の方法。
【請求項６９】
請求項53〜68ののいずれか一項記載の方法により活性結核疾患または潜在性ミコバクテリア感染に対して感受性であると診断された個体に対して、該疾患または感染を予防または治療する生成物を投与することを含む、個体を治療する方法。
【請求項７０】
生成物が、リファンピシン、イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、パラ-アミノ-サリチル酸、カナマイシン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、チアセタゾンもしくはフルオロキノロン、またはそのような生成物の類似体である、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
ミコバクテリア抗原またはその類似体、および任意で、T細胞がミコバクテリア抗原または類似体を認識するかどうかを検出するための手段を含む、請求項53〜68のいずれか一項記載の方法を行うためのキット。
【請求項７２】
ミコバクテリア抗原またはその類似体が、長さが8〜100個のアミノ酸であるペプチドエピトープを含む、請求項70記載のキット。
【請求項７３】
請求項69または70に記載される生成物も含む、請求項71または72記載のキット。
【請求項７４】
ミコバクテリア疾患の如何なる症状ももたない個体において、活性ミコバクテリア疾患の発症または活性ミコバクテリア疾患の発症に対する感受性を検出する方法であって、個体がミコバクテリア抗原を認識するT細胞のレベルを増加したかどうかを測定することによって、ミコバクテリア疾患の発症、または個体が活性ミコバクテリア疾患の発症に対して感受性であるかどうかを決定することを含む方法。
【請求項７５】
個体におけるT細胞のレベルが、前の時点と比較して少なくとも5倍高いかどうかを測定することを含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
個体におけるT細胞のレベルが、前の時点と比較して100万個の末梢血単核細胞あたり少なくとも100個高いかどうかを測定することを含む、請求項74または75記載の方法。
【請求項７７】
第一の時点において個体におけるミコバクテリア抗原特異的T細胞の基礎レベルを測定すること、およびその後の第二の時点において個体におけるT細胞のレベルが増加したかどうかを測定することを含む、請求項74〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
第一および第二の時点が約3〜24ヶ月間の間隔である、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
T細胞のレベルが、ミコバクテリア抗原またはミコバクテリア抗原の類似体に対するT細胞の認識/反応をインビトロで測定することにより検出される、請求項74〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
個体由来のT細胞の集団を(a)ミコバクテリアの1つもしくは複数のペプチドエピトープ、または(b)ペプチドを認識するT細胞により認識されるペプチドの類似体と接触させること、および該ペプチドまたは該類似体に対するT細胞の反応を測定することを含む、請求項74〜79のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
ペプチドエピトープまたはペプチドエピトープの類似体が8〜100個のアミノ酸の長さをもつ、請求項74〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
少なくとも4つのペプチドエピトープまたはそれらの類似体のプールに対するT細胞の反応を測定する、請求項74〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
ペプチドまたはペプチドの類似体に対するT細胞の反応の検出の間、ペプチドまたは類似体をプロセシングしかつそれをT細胞へ提示することができる抗原提示細胞が存在する、請求項74〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
ミコバクテリア抗原がヒト型結核菌のものである、請求項74〜83のいずれか一項記載の方法。
【請求項８５】
ミコバクテリア抗原がESAT-6またはCFP10である、請求項74〜84のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
以下のペプチドエピトープ
2005532546.tif 000010
または
該ペプチドエピトープを認識するT細胞により認識されるその類似体
の1つまたは複数から選択される1つまたは複数のペプチドのT細胞による認識を測定する、請求項74〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
T細胞認識が、T細胞由来のサイトカインの分泌を検出することにより測定される、請求項74〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
サイトカインがIFN-γである、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
サイトカインが、サイトカインに特異的な固定化された抗体に結合され、その後、抗体/サイトカイン複合体の存在を検出することによりサイトカインが検出される、請求項87または88記載の方法。
【請求項９０】
請求項74〜89ののいずれか一項記載の方法により活性結核疾患または潜在性ミコバクテリア感染に対して感受性であると診断された個体に対して、該疾患または感染を予防または治療する生成物を投与することを含む、個体を治療する方法。
【請求項９１】
生成物が、リファンピシン、イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、パラ-アミノ-サリチル酸、カナマイシン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、チアセタゾンもしくはフルオロキノロン、またはそのような生成物の類似体である、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
ミコバクテリア抗原またはその類似体、および任意で、T細胞がミコバクテリア抗原または類似体を認識するかどうかを検出するための手段を含む、請求項74〜91のいずれか一項記載の方法を行うためのキット。
【請求項９３】
ミコバクテリア抗原またはその類似体が、長さが8〜100個のアミノ酸であるペプチドエピトープを含む、請求項92記載のキット。
【請求項９４】
請求項90または91に記載される生成物も含む、請求項92または93記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、個体の感染状態を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
病原体による感染は、個体において疾患症状を引き起こす場合もあるし、引き起こさない場合もある。治療的生成物は、病原体による感染を治療するために有効であるが、これらの生成物の長期の使用は有害である可能性がある。それゆえに、治療的生成物の使用を疾患症状を発生する可能性がより高い個体へターゲットすることが望ましい。このようにターゲットする治療はまた、より費用に対して効果が高いものと思われる。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
疾患症状を発生していない長期間感染した個体は、最近曝された個体より疾患症状を発生する可能性がより少ない。例えば、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)への曝露後、個体は、曝露後の最初の1〜2年間中に疾患症状を伴った活性結核へ進行する約10％の危険性をもつ。活性結核が最初の1〜2年間以内に現れないならば、活性結核への進行の残りの危険性は、個体の残っている寿命を通して5％である。それゆえに、最近感染した個体を予防的治療としてターゲットすることは、それらが疾患へ進行する高い確率をもつため、望ましい。
【０００４】
個体のいくつかの群は、活性結核を発生するより高い危険性をもつが、例えば、幼い子供(5歳未満)、生まれたての乳児(1歳未満)、HIV感染をもつ、またはプレドニゾロンのようなコルチコステロイド(典型的には、経口コルチコステロイド)もしくはインフリキシマブ(infliximab)のようなTNF-αに対する抗体(典型的には、モノクローナルおよび/またはヒト化の)のような免疫抑制性薬物療法中の個体である。そのような個体において病原体への最近の曝露を診断することは、よりいっそう重要である。
【０００５】
本発明者らは、細胞内病原体に最近曝された個体由来のT細胞は、病原体由来のタンパク質全体に反応するが、病原体由来のペプチドエピトープに反応しない、または実質的により少ない反応を示すことを見出した。これは、細胞性T細胞免疫応答が最近の感染によりほんの今初回抗原刺激を受けた(誘導された)ばかりである場合、エピトープ特異性の微調整および異なるT細胞集団のクローン増殖がまだ進行中であるため、T細胞がそれらの同族のリガンドに対してより低い親和性をもつためであると考えられる。T細胞応答アッセイ法において、タンパク質全体が、抗原提示細胞(APC)による取り込みおよびプロセシング、続いて、APC表面におけるMHC分子と関連して最適なペプチドエピトープの提示後、T細胞へ提示されるため、比較的低い親和性の細胞でさえも、これらの最適の自然にプロセシングされかつ提示されたエピトープを認識するものである。
【０００６】
対照的に、病原体由来の短い複数のペプチドエピトープは、それらが全体として、タンパク質抗原の全配列を表している場合でさえも、通常では最適なエピトープではなく、単に、それらの配列内に最適なエピトープ配列を含む傾向があるにすぎない。それゆえに、これらのペプチドの認識は、最適なエピトープに対してのより高い親和性をもつT細胞が存在することが必要とされる。そのようなT細胞は、T細胞レパートリーがより成熟し、かつ焦点を合わせられた場合の感染の後期過程に現れるだけで、最近曝された個体に存在しないと考えられる。
【０００７】
従って、本発明は、病原体、ワクチンまたは細胞性免疫応答を引き起こす部分である作用物質に対する最近の曝露を個体において診断する方法を提供し、この方法は、個体のT細胞が、作用物質由来のペプチドエピトープよりも大きな範囲で、少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ作用物質由来のタンパク質を認識するかどうかをインビトロまたはインビボで測定することを含み、より大きな範囲のタンパク質の認識は、個体が作用物質に最近曝されたことを示す。
【０００８】
好ましくは、方法において、病原体はヒト型結核菌であり、ペプチドエピトープおよび/またはタンパク質は、ESAT-6またはCFP10由来である。
【０００９】
本発明者らはまた、T細胞検出(エキソビボELISPOT)に基づく技術を用いて、病原体に曝された個体由来のT細胞は、曝露から3ヶ月目において病原体由来の抗原に反応したが、曝露から6ヶ月目においてもはや抗原に反応しないことを示した。エフェクターT細胞の存在が病原体による感染の存在を示すとすれば、これは、これらの個体が、最初は検出されていた感染を除去したことを示す。感染および感染のクリアランスの間のT細胞応答の動態のこの解明は、自然に感染を除去する個体を治療することを避けるためにその後の時点において試験する必要を示す。
【００１０】
従って、本発明は、個体のT細胞が、病原体への曝露後の第一の時点およびその後の第二の時点において病原体由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識し、かつ第二の時点では認識しないという測定結果は個体が感染を除去したことを示す、病原体による感染を除去した個体を診断する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明者らは、T細胞が曝露から3ヶ月目において反応しなかったが、曝露から6ヶ月目において反応した個体を同定した。これらの個体は、感染に対してより遅くより弱い応答を開始している。それゆえに、それらは、感染を制御することができる可能性がより低く、活性疾患へ進行する可能性がより高い。それゆえに、治療として個体のこの群をターゲットすることが望ましい。
【００１２】
従って、本発明は、個体のT細胞が病原体への曝露後第一の時点およびその後の第二の時点において病原体由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識しないが、第二の時点では抗原を認識するという測定結果は、個体が活性疾患へ進行する可能性がより高いことを示す、病原体への曝露後、活性疾患へ進行する可能性がより高い個体を診断する方法を提供する。
【００１３】
その発見はまた、ワクチンまたは細胞性応答を誘導する部分への曝露後にワクチンまたは部分に対してより弱い応答を開始する個体を診断する方法であって、個体のT細胞が、曝露後の第一の時点およびその後の第二の時点においてワクチンまたは部分由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識しないが、第二の時点では抗原を認識するという測定結果を、個体がワクチンまたは部分に対してより弱い応答を開始していることを示す方法において用いることができる。
【００１４】
本発明者らはまた、免疫抑制療法中の、または免疫抑制療法を開始しようとしている個体において、本明細書に記載されるT細胞検出アッセイ法を用いることにより、潜在性ミコバクテリア感染の検出において利点を示した。
【００１５】
従って、本発明は、免疫抑制療法中または開始しようとしている個体において活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性を診断する方法であって、個体のT細胞がミコバクテリア抗原を認識するかどうかを検出することを含み、T細胞によるミコバクテリア抗原の認識が活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性を示す方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、免疫抑制療法中の個体において活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性をモニターする方法であって、個体のT細胞がミコバクテリア抗原を認識するかどうかを検出することを含み、T細胞によるミコバクテリア抗原の認識が活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性を示す方法を提供する。
【００１７】
本発明者らは、ミコバクテリア抗原に特異的なエフェクターT細胞が、活性症候性ミコバクテリア感染の発症の前に著しく増加することを示した。このように、エフェクターT細胞におけるこの増加を、無症候性の潜在的に感染した個体における疾患への進行、または進行に対する感受性の予知するものとして用いることができる。
【００１８】
従って、本発明は、ミコバクテリア疾患の如何なる症状ももたない個体において活性ミコバクテリア疾患の発症に対する感受性を検出する方法であって、個体がミコバクテリア抗原を認識するT細胞のレベルを増加させたかどうかを測定することによって、個体が活性ミコバクテリア疾患の発症に対して感受性であるかどうかを決定することを含む方法を提供する。これは、医者が、潜在性ミコバクテリア感染をもつ無症候性個体において放射線医学および他の調査を開始すること、および症状の発症の前に早期に活性疾患を診断かつ治療することを可能にする。症状が生じる前までもの、そのような早期治療は、かなりの罹病率および死亡率を、特に(限定されるものではないが)多剤耐性結核をもつ人々にとって、防ぐものと思われる。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の異なる局面は以下で考察される。本発明の一つの局面(具体的には最近の曝露を診断する方法)に関連して以下で考察される特定のT細胞検出技術が本発明の他の局面において用いられうることは、理解されるべきである。このように、最近の曝露を診断する方法のために与えられている、検出方法に用いられるペプチドエピトープ/タンパク質の型および数(それらの長さ、起源、配列および類似体を含む)、T細胞の反応が検出される(状態の変化を含む)様式、用いられるT細胞試料の型、そのような試料が処理されうる方法、アッセイ法におけるT細胞の形、ならびにT細胞検出が行われる特定の様式の記載もまた、本発明の他の局面に関連している。
【００２０】
同様に、最近の曝露を診断する方法に関連して考察されている、試験される個体の型および個体が感染している可能性があるミコバクテリアの型は、本発明の他の局面に適用可能である。
【００２１】
最近の曝露を診断する方法
本発明の方法は、個体のT細胞が、作用物質由来のペプチドエピトープより大きな範囲で作用物質由来のタンパク質(少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ)を認識するかどうかを測定することを含む。これは、タンパク質およびペプチドエピトープか、またはこれらのいずれかの類似体(以下で考察される)のいずれかに対するT細胞の反応を検出することにより行うことができる。病原体由来の「タンパク質」または「ペプチドエピトープ」への本明細書での言及はまた、文脈が別に要求しない限り、これらの分子の類似体を含むものであることが理解される。
【００２２】
その方法は、一般的に、好ましくはヒトであるが、動物(典型的には、関連する病原体を自然にまたは人工的に感染させることが可能な動物)でありうる個体由来の試料において行われる。このように、個体は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタまたは齧歯類、例えばマウスもしくはラットのような哺乳動物でありうる。個体は、病原体への(自然の)曝露の危険にさらされうる、例えば、個体は、病原体が発生する地域に住みうる。個体は、典型的には社会経済的理由のために、感染する増加した危険性をもちうるか、または病原体に対する遺伝的もしくは後天性の素因をもちうる。一つの態様において、曝露は、自然の曝露ではない(すなわち、それは人工的曝露である)、例えば、動物モデルの病原体への意図的な曝露である。もう一つの態様において、曝露は、宿主(ヒトを含む)が住む地域における病原体の非自然的(典型的には意図的)放出に対する。
【００２３】
病原体は、細胞外病原体でありうるが、好ましくは細胞内病原体であり、一般的には、天然に存在する病原体(人工的に改変されていない)である。病原体は、典型的には、本明細書に挙げられている特定の種の宿主のいずれかを感染させることができる。それは、HPV、HIV、HCV、クラミジア(Chlamydia)種、HBV、EBV、CMV、VZV、HSV、レジオネラ(Legionella)、チフス菌(S. typhi)、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、レーシュマニア(Leishmaniasis)、ライ菌(M. leprae)、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、トキソプラズマ(Toxoplasma)種、ブルセラ(Brucella)種、クリプトコッカス(Cryptococcus)種、カンジダ(Candida)種もしくはアスペルギルス(Aspergillus)種のような、ウイルス、細菌または真菌であってもよい。
【００２４】
好ましい態様において、病原体はミコバクテリアである。ミコバクテリアは、典型的には、ESAT-6またはCFP10を発現させ、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)であってもよい。ミコバクテリアは、M. マリヌム(M. marinum)またはM. カンサシー(M. kansasii)であってもよい。臨床的症状のパターンを、これらの2つの微生物とヒト型結核菌の間を識別するために用いることができる。ミコバクテリアは、ウシ型結核菌（M. bovis）(ウシに感染するが、ヒトならびにアナグマおよびサルのような他の種にも感染することができる)であってもよい。
【００２５】
作用物質がワクチンである場合、ワクチンは、本明細書に挙げられている任意の病原体由来の抗原を含みうる(からの保護を与えうる)。本明細書に挙げられている作用物質の型のいずれも個体において細胞性応答、典型的にはT細胞および/またはNK細胞応答を誘導することができる。
【００２６】
病原体のタンパク質および/またはペプチドエピトープは、本明細書に挙げられている任意の病原体でありうるが、好ましくはミコバクテリアのものである。一つの態様において、タンパク質は、特定の病原体タンパク質であるか、または特定の病原体タンパク質に由来の配列を含むが、ペプチドエピトープは、その病原体とは異なるタンパク質由来である。しかし、好ましくは、ペプチドエピトープは、そのタンパク質内のエピトープである、すなわち、そのタンパク質は、ペプチドエピトープの配列を含む。ペプチドエピトープは、一般的に、それの配列内に、最適なエピトープを含み、典型的には、最適なエピトープ配列のN末端またはC末端において1個または複数のアミノ酸に隣接されている。
【００２７】
タンパク質は、膜タンパク質、細胞質タンパク質(病原体またはそれが感染させた細胞の細胞質に存在する)、分泌タンパク質(病原体から、および/または感染した細胞からの)、酵素、構造タンパク質または制御タンパク質でありうる。タンパク質は、典型的には、作用物質の乾燥質量の少なくとも30％または50％のような、少なくとも10％を含むものであってよい。タンパク質は、それの天然型においておよび/または方法に用いられる場合、少なくとも10個もしくは15個のような少なくとも5個の、CD4および/またはCD8T細胞エピトープを含む。
【００２８】
ペプチドエピトープは、典型的には、挙げられている任意の病原体タンパク質の断片である。ヒト型結核菌の場合、ペプチドエピトープは、ESAT-6およびCFP-10由来の下に示されるペプチドのいずれかであってもよい。
【００２９】
ESAT-6由来のペプチド：
2005532546.tif 000002
CFP-10由来のペプチド：
2005532546.tif 000003
【００３０】
ペプチドエピトープは、典型的には、12個〜25個のアミノ酸のような少なくとも8個〜29個のアミノ酸の長さをもつ。タンパク質は、典型的には、長さが50個〜300個、または80個〜200個のような、少なくとも30個〜400個のアミノ酸の長さをもつ。タンパク質は、天然に存在するタンパク質全体と同じもの、またはその断片でありうる。一つの態様において、それは、融合タンパク質（例えば非病原体タンパク質配列との融合タンパク質）の形をとりうる。一般的に、タンパク質は、少なくとも8個、例えば少なくとも12個、18個、25個または30個のアミノ酸長である病原体配列(病原体のタンパク質由来の配列)を含む。
【００３１】
本発明の方法は、任意の適する技術を用いて行うことができる。異なる技術は以下で考察され、T細胞の反応を検出する、または抗原特異的T細胞を定量する技術を含む。これらの技術は、T細胞から分泌された物質の「スポット」の検出(ELISPOTのような)、T細胞の分別(計数)(例えば、細胞内染色またはFACSを用いる)、MHC四量体の使用(例えば、分別技術における)、またはELISA技術に基づくことができる。
【００３２】
本発明の方法は、一般的に、病原体由来の1つもしくは複数のタンパク質および1つもしくは複数の(より小さい)ペプチドエピトープに対する、個体におけるT細胞からの応答の異なるレベルならびに/または異なる頻度の検出に基づく。反応するT細胞は、タンパク質またはペプチドエピトープにおけるアミノ酸配列に特異的であり/タンパク質またはペプチドエピトープにおけるアミノ酸配列に結合する。本方法において分析されるT細胞は、CD4および/もしくはCD8 T細胞、γδT細胞、またはCD1限定型T細胞でありうる。T細胞は、病原体由来のタンパク質に対してインビボであらかじめ感作されている。
【００３３】
本発明の方法は、タンパク質/ペプチドエピトープに対するT細胞反応を検出する技術を用いて行うことができる。多くのそのような技術において、個体のT細胞がタンパク質またはペプチドエピトープに反応するかどうかは、容易に明らかであり、このように、個体は、それらのT細胞がタンパク質に反応し、かつペプチドエピトープに反応しない場合に、最近曝されたとして診断される。適する閾値は当業者により決定することができる。一つの態様において、任意の閾値は陽性および陰性の応答を決定するために用いられる。
【００３４】
典型的には、方法は、100万個の末梢血単核細胞(PBMC)あたり少なくとも約20個の頻度で存在する反応性T細胞が検出できる(陽性結果)、および好ましくは、100万個のPBMCあたり約19個またはそれ未満の頻度で存在する反応性T細胞(陰性結果)と識別できる様式において行われる。
【００３５】
このように、個体は、典型的には、それらが、100万個のPBMCあたり少なくとも20個の頻度でタンパク質を認識することができるT細胞を有することを見出される場合で、かつそれらが、ペプチドエピトープを認識する、100万個のPBMCあたり19個未満である場合に、病原体に最近曝されているとして選択されると考えられる。陽性および陰性結果がこれらの特定の閾値とは異なる閾値を用いて定義されうることは、理解される。
【００３６】
好ましい態様において、T細胞は以下の段階により検出される：
(i)個体由来のT細胞の第一集団を病原体由来の1つまたは複数のペプチドエピトープ(そのペプチドを認識するT細胞により認識されるペプチドの類似体を含む)とインビトロまたはインビボで接触させる段階、およびペプチドエピトープに対するT細胞の反応を測定する段階、ならびに
(ii)個体由来のT細胞の第二集団を病原体由来のタンパク質(そのタンパク質を認識するT細胞により認識されるタンパク質の類似体を含む)とインビトロまたはインビボで接触させる段階であって、タンパク質が少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつ段階、およびタンパク質に対するT細胞の反応を測定する段階。
【００３７】
T細胞が、タンパク質またはペプチドエピトープに反応する/タンパク質またはペプチドエピトープを認識するかどうかの測定は、タンパク質またはペプチドエピトープの存在においてT細胞の状態における変化を検出することにより行うことができる。状態における変化は、一般的に、T細胞受容体がタンパク質(それがプロセシングされた後の)またはペプチドエピトープを結合した後、T細胞の抗原特異的機能的活性により引き起こされる。一般的に、T細胞受容体を結合する場合、プロセシングされたタンパク質またはペプチドは、典型的には抗原提示細胞(APC)の表面上に存在する、MHCクラスIまたはII分子に結合している。
【００３８】
T細胞の状態における変化は、サイトカイン、特にIFN-γ、IL-2またはTNF-αのようなT細胞からの物質の分泌の開始または増加であってよい。IFN-γ分泌の測定は、特に好ましい。一つの態様において、2個、3個、4〜10個またはそれ以上のサイトカインのような、1個より多いサイトカインが検出される。細胞内変化を、例えば、細胞内染色技術、典型的には細胞内サイトカイン染色(例えば、本明細書に挙げられているサイトカインのいずれかについて)を用いることにより検出することができる。染色は、例えばFACS技術を用いた細胞分別技術を用いて、検出できる。
【００３９】
物質を、典型的には、それが特異的な結合剤に結合させ、その後、特異的結合剤/物質の複合体の存在を測定することにより検出することができる。特異的結合剤は、典型的には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のような抗体である。サイトカインに対する抗体は市販されているか、または標準的技術を用いて作製することができる。
【００４０】
典型的には、特異的結合剤は、固体支持体上に固定化される。支持体は、ウェル(典型的にはアッセイプレートにおける)であってもよく、またはマイクロスフィアであってもよい。一つの態様において、この薬剤を結合した後、物質はそれを分泌したT細胞の付近に留まっているため、これは、応答しているT細胞の実際の数が測定されることを可能にする。このように、物質/薬剤の複合体の「スポット」を、支持体上に形成することができ、各スポットは物質を分泌しているT細胞を表している。スポットを定量すること(および典型的には対照に対して比較すること)は、ペプチドの認識の測定を可能にする。
【００４１】
物質が結合された後、固体支持体を、任意で、薬剤に特異的には結合していない材料を除去するために洗浄することができる。薬剤/物質の複合体は、複合体を結合する第二の結合剤を用いることにより検出できる。典型的には、第二の薬剤は、第一の薬剤を結合する部位とは異なる部位において物質を結合する。第二の薬剤は、好ましくは抗体であり、検出可能な標識により直接的にまたは間接的に標識される。
【００４２】
このように、第二の薬剤を、典型的には検出可能な標識により直接的にまたは間接的に標識される第三の薬剤により検出することができる。例えば、第二の薬剤は、ビオチン部分を含んでもよく、ストレプトアビジン部分および検出可能な標識として典型的にはアルカリホスファターゼを含む第三の薬剤による検出を可能にする。
【００４３】
一つの態様において、用いられる検出系は、国際公開公報第98/23960号に記載されるエキソビボELISPOTアッセイ法である。そのアッセイ法において、T細胞から分泌されたIFN-γは、固体支持体上に固定化されている第一IFN-γ特異的抗体により結合される。結合されたIFN-γは、その後、検出可能な標識で標識されている第二のIFN-γ特異的抗体を用いて検出される。他の検出可能な標識を用いることができる。
【００４４】
もう一つの態様において、検出は、サイトカインに特異的な抗体でコーティングされたマイクロスフィアを用いて行われるサイトカインの多重分析を用いて行われる。検出抗体(マイクロスフィア上の抗体に結合したサイトカインに結合する)を用いることができる。そのような検出抗体を、例えば、蛍光標識で標識することができる。検出技術は、Luminex多重サイトカイン検出系に基づいてもよい。
【００４５】
典型的には、方法に用いられるT細胞は、血液試料として個体から採取されるが、T細胞を含む身体試料の他の型を用いることができる。試料を直接的にアッセイへ添加してもよく、または最初に処理してもよい。典型的には、処理は、例えば水または緩衝液での、試料の希釈を含むことができる。典型的には、試料は、1.5倍から100倍まで、例えば2〜50倍または5〜10倍に希釈される。
【００４６】
処理は、試料の成分の分離を含みうる。典型的には、単核細胞(MC)が試料から分離される。MCは、T細胞およびAPCを含むものである。このように、本方法において、分離されたMCに存在するAPCは、T細胞へペプチドを提示することができる。もう一つの態様において、CD4 T細胞だけのような、T細胞だけを試料から精製することができる。PBMC、MCおよびT細胞を、Lalvaniら、(1997) J. Exp. Med. 186、p859-865に記載されるものなどの、当技術分野において公知の技術を用いて試料から分離することができる。
【００４７】
血液試料の場合、赤血球は、試料から除去されうる(血清および他の細胞を残すため)。
【００４８】
一つの態様において、検出されるT細胞は、処理されていないまたは希釈された試料の形をとる。T細胞は、好ましくは、直接的にエキソビボである、すなわち、それらは方法に用いられる前に培養されない。T細胞は、典型的には、新鮮に単離されたT細胞(新鮮に単離されたMCまたはPBMCの形をとっているような)である。
【００４９】
典型的に方法に存在するAPCは、T細胞と同じ個体由来、または異なる個体由来でありうる。APCは、天然に存在するAPCまたは人工的なAPCでありうる。APCは、T細胞へペプチドを提示することができる細胞である。それは、典型的には、B細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。それは、典型的には、T細胞と同じ試料から分離され、典型的には、T細胞と共精製される。このように、APCは、MCまたはPBMCに存在しうる。APCは、典型的には、新鮮に単離されたエキソビボの細胞または培養された細胞である。それは、短期のまたは不死化した細胞系のような、細胞系の形をとってもよい。APCは、それの表面上に空のMHCクラスIまたはII分子を発現させることができる。
【００５０】
本方法の一つの態様において、病原体由来の1個より多いタンパク質(典型的には、少なくとも2個、5個、10個またはそれ以上の異なるタンパク質)および/または病原体由来の1個より多いペプチドエピトープ(典型的には、少なくとも2個、5個、10個またはそれ以上の異なるペプチドエピトープ)を用いることができる。このように、例えば、T細胞を、試験することが意図されているすべてのタンパク質またはペプチドエピトープ(すなわち、タンパク質またはペプチドのプール)を含むアッセイに置くことができる。または、T細胞は分けられ、それぞれが試験することが意図されているタンパク質もしくはペプチドの1個または複数個を含む別々のアッセイへ置かれてもよい。
【００５１】
一つの態様において、タンパク質またはペプチドエピトープは、T細胞の非存在下においてAPCへ提供される。その後、APCは、典型的にはそれの表面上にプロセシングされたタンパク質またはペプチドエピトープを提示するようにさせておいた後に、T細胞へ提供される。提示されるペプチドは、APCの内側に取り上げられて、提示された可能性があり、またはAPCの内側に入ることなく単に表面上へ取り上げられる可能性がある。
【００５２】
タンパク質またはペプチドエピトープがT細胞と接触する持続時間は、認識を測定するために用いられる方法に依存して変わるものである。典型的には、104個〜107個、好ましくは1x105個〜5x105個のPBMCが各アッセイに添加される。ペプチドは、典型的には、10-1 μg/mlから103 μg/mlまで、好ましくは0.5〜50 μg/mlまたは1〜10 μg/mlの濃度でアッセイに用いられる。
【００５３】
典型的には、T細胞がタンパク質またはペプチドとインキュベートされる時間の長さは、4時間から72時間まで、好ましくは6〜48時間、8〜24時間または10〜16時間である。エキソビボのPBMCを用いる場合、0.3x106個のPBMCを、10 μg/mlのペプチドにおいて、12時間、37℃でインキュベートしてもよい。
【００５４】
方法は、全血Quantiferonシステム(例えば、Cellestisから入手可能である)のようなELISA法に基づくことができる。
【００５５】
一つの態様において、そのタンパク質および/またはペプチドエピトープの代わりとして、そのタンパク質またはペプチドを認識するT細胞により認識される類似体が用いられる。このように、そのような類似体を、日常的手段により同定することができ、関連するT細胞により認識されるそれらの能力を、本明細書に挙げられている任意の適する技術を用いて試験することができる。タンパク質については、そのような認識は、もちろん、APCによるそのタンパク質および/または類似体のプロセシングならびに提示の後であると考えられる。
【００５６】
類似体は、一般的に、そのタンパク質および/またはペプチドに類似した結合性質をもつものであり、従って、典型的には、同じMHC分子に結合する。類似体は、そのタンパク質またはペプチドに特異的な抗体に結合することができ、従って、そのタンパク質またはペプチドのそのような抗体への結合を阻害することができる。
【００５７】
類似体は、典型的には、タンパク質またはペプチドである。それは、等価な本来のタンパク質またはペプチドと相同性をもちうる。もう一つのペプチドと相同であるペプチドとは、典型的には、例えば、少なくとも8個、好ましくは少なくとも15個、例として少なくとも40個、60個もしくは100個またはそれ以上、の連続したアミノ酸の領域に対して、少なくとも70％、そのペプチドに相同であり、好ましくは少なくとも80％または90％、およびより好ましくは少なくとも95％、97％または99％相同である。類似体は、典型的には、例えば、相同性について言及されている前記の領域の長さのいずれかに対して、12個未満のような、1個、2個、6個未満の突然変異(それぞれは、置換(例えば、保存的置換)、欠失または挿入)により、そのタンパク質またはペプチドと異なる。
【００５８】
タンパク質相同性を測定する方法は、当技術分野においてよく知られており、本関係においては、相同性がアミノ酸同一性を基礎として計算される(時々、「ハードな相同性」と呼ばれる)ことは、当業者に理解されるものと思われる。例えば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために用いられうるBESTFITプログラムを提供する(例えば、それのデフォルト設定において用いられる)(Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Research 12、p387-395)。
【００５９】
タンパク質またはペプチドである類似体は、典型的には、上記のタンパク質もしくはペプチドについて上記の任意のアミノ酸の長さを持ち、および/または融合タンパク質の一部でありうる。典型的には、MHC分子を結合することに寄与しているまたはT細胞受容体による認識の原因である本来のタンパク質またはペプチドにおけるアミノ酸に等しい位置での類似体におけるアミノ酸は、同じであるか、または保存的変化である。
【００６０】
保存的置換は、以下の表に定義される。第二列の同じ区画内、および好ましくは第三列の同じ行内のアミノ酸は互いに置換されてもよい：
2005532546.tif 000004
【００６１】
典型的には、タンパク質またはペプチドの類似体は、自然の翻訳後修飾または人工的修飾でありうる、1つまたは複数の修飾を含む。修飾は、アミノ基、アセチル基、ヒドロキシ基またはハロゲン(例えば、フッ素)基または炭水化物の基などの化学的部分を供給しうる(典型的には、例えばC-H結合などの水素の置換により)。典型的には、修飾はN末端またはC末端上に存在する。
【００６２】
類似体は、1個または複数の非天然のアミノ酸、例えば、天然のアミノ酸とは異なる側鎖を有するアミノ酸を含む。一般的には、非天然のアミノ酸は、N末端および/またはC末端を有するものである。非天然のアミノ酸は、L-アミノ酸またはD-アミノ酸でありうる。類似体は、典型的には、本来のタンパク質もしくはペプチドに実質的に類似している形、大きさ、柔軟性または電子の配置をもつ。それは、典型的には、本来のタンパク質またはペプチドの誘導体である。
【００６３】
類似体は、典型的には、コンピューター手段により設計され、その後、当技術分野において公知の方法を用いて合成される。または、類似体は、化合物のライブラリーから選択されてもよい。ライブラリーは、コンビナトリアルライブラリー、またはファージディスプレイライブラリーのようなディスプレイライブラリーでありうる。化合物のライブラリーは、本来のペプチドが結合するMHC分子のような、MHCクラスIまたはII分子に結合している形をとってディスプレイライブラリーに発現されうる。類似体は、一般的に、本来のタンパク質またはペプチドの結合特性を模倣するそれらの能力に基づいてライブラリーから選択される。このように、それらは、本来のタンパク質もしくはペプチドを認識するT細胞受容体または抗体を結合する能力に基づいて選択されてもよい。
【００６４】
一つの態様において、T細胞は、物質に対するそれらの応答に基づくのではなく、特異的な結合剤を結合するそれらの能力に基づいて検出される。典型的には、この薬剤は、本明細書に挙げられているタンパク質、ペプチドエピトープもしくは類似体のいずれかであり、または本明細書に挙げられているタンパク質、ペプチドエピトープもしくは類似体を含む。薬剤は標識されうる(例えば、本明細書に挙げられている検出可能な標識のいずれかを用いて)。特異的な結合剤は、MHC分子を含んでもよく、好ましくはMHC四量体-ペプチド複合体である。
【００６５】
本明細書で考察されているペプチドまたは類似体は、自動化合成機の使用によるなどの、標準的合成化学技術を用いて作製されうる。それらは、より長いポリペプチド（例えば融合タンパク質）から作製されうるが、そのポリペプチドは典型的にはそのペプチドの配列を含んでおり、例えばプロテアーゼを用いるようなポリペプチドを加水分解することにより、またはポリペプチドを物理的に切断することにより、ポリペプチドから得ることができる。タンパク質は組換えで発現されてもよい。
【００６６】
方法がインビボで行われる場合、タンパク質、ペプチドエピトープおよび/または類似体を、任意の適する手段により、かつ任意の適する用量で、例えば、以下の治療的生成物について考察されている経路によるまたは用量での形をとって、投与することができる。皮膚への投与が好ましい。
【００６７】
本発明はまた、診断方法により最近病原体に曝されたとして診断された個体に対して、病原体により引き起こされた状態を予防または治療する生成物を投与することを含む、個体を治療する方法を提供する。このように、本発明は、本発明の方法により最近病原体に曝されたとして診断された個体の治療のための薬物の製造における生成物の使用を提供する。典型的には、非毒性の有効量の治療剤が投与される。
【００６８】
ヒト型結核菌の場合、治療剤は、リファンピシン、イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、パラ-アミノ-サリチル酸、カナマイシン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、チアセタゾン、またはフルオロキノロン(例えば、シプロフロキサシン)でありうる。
【００６９】
生成物は、薬剤および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の形をとってもよい。適する担体および希釈剤は、等張性食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水を含む。典型的には、生成物は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮的、皮内、経口、鼻腔内、吸入(肺への)、腟内、または直腸内の投与により投与される。
【００７０】
生成物の用量は、様々なパラメーターにより、特に、特定の薬剤；治療される患者の年齢、体重および状態；投与経路；ならびに必要とされる療法により、決定することができる。医師は、任意の特定の患者に必要とされる投与経路および用量を決定することができるものと思われる。しかし、適する用量は、生成物の10 μgから10 gまで、例えば、100 μgから1 gまででありうる。
【００７１】
2つの時点において試験することを含むワクチンの診断または試験の方法
本発明者らはまた、病原体に曝された個体由来のT細胞は、曝露から3ヶ月目に病原体由来の抗原に反応したが、曝露から6ヶ月目にはもはや抗原に反応しなかったことをT細胞検出(エキソビボELISPOT)に基づく技術を用いて示した。エフェクターT細胞の存在が病原体による感染の存在を示すとすれば、これは、これらの個体が最初に検出されていた感染を除去したことを示す。感染および感染のクリアランスの間のT細胞応答の動態のこの解明は、自然に感染を除去する個体を治療することを避けるために、後の時点において試験する必要を示している。
【００７２】
従って、本発明は、病原体による感染を除去した個体を診断する方法であって、個体のT細胞が、病原体への曝露後の第一およびその後の第二の時点において病原体由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識し、かつ第二の時点では認識しないという測定結果は、個体が感染を除去したことを示す方法を提供する。
【００７３】
感染は、個体の免疫応答により自然に除去されてもよいが、感染を治療する生成物の使用によっても薬理学的に除去されることができる。
【００７４】
さらに、本発明者らは、T細胞が曝露から3ヶ月目に反応しなかったが、曝露から6ヶ月目に反応した個体を同定した。これらの個体は、感染に対するより遅くより弱い応答を開始している。それゆえに、それらは、感染を制御することができる可能性がより少なく、活性疾患へ進行する可能性がより高い。それゆえに、治療として個体のこの群をターゲットすることが望ましい。
【００７５】
従って、本発明は、病原体への曝露後に活性疾患へ進行する可能性がより高い個体を診断する方法であって、個体のT細胞が、病原体への曝露後、第一およびその後の第二の時点において病原体由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識しないが、第二の時点では抗原を認識するという測定結果は、個体が活性疾患へ進行する可能性がより高いことを示す方法を提供する。
【００７６】
その発見はまた、ワクチンまたは細胞性応答を誘導する部分に対してワクチンまたは部分への曝露後より弱い応答を開始する個体を診断する方法であって、個体のT細胞が、曝露後の第一およびその後の第二の時点においてワクチンまたは部分由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識しないが、第二の時点では抗原を認識するという測定結果を、個体がワクチンまたは部分に対してより弱い応答を開始していることを示す方法において用いることができる。
【００７７】
さらに、後の時点において試験することも、ワクチンの効果を試験するために用いることができる。従って、本発明は、個体に投与されたワクチンの効果を試験する方法であって、個体のT細胞が、病原体への曝露後の第一およびその後の第二の時点において病原体由来の抗原を認識するかどうかを測定することを含み、T細胞が第一の時点では抗原を認識し、かつ第二の時点では認識しないという測定結果は、ワクチン抗原が除去されて、持続していないことを示す方法を提供する。
【００７８】
ワクチンの効果が低いことが見出される(すなわち、除去されつつある)場合、個体は、ワクチンの追加のもしくは増加された用量を受け取るか、または代替のワクチンでワクチン接種される必要がありうる。このように、同じワクチンを、個体へ再び、任意では増加された用量で、投与してもよい。または、異なるワクチンを投与することができる(例えば、異なる抗原/タンパク質を含む)。
【００７９】
上記の方法において、第一の時点および第二の時点は、典型的には、約4〜12週間のような、約2〜16週間の間隔である。第一の時点は、曝露後約8〜16週間目(好ましくは、約12週間目)であってよく、および/または第二の時点は、曝露後約18〜48週間目(好ましくは、約24週間目)であってもよい。
【００８０】
診断される個体は、本明細書に挙げられている個体のいずれかでありうるが、好ましくはヒトである。T細胞認識の測定は、本明細書に開示されている任意の適する方法のような、任意の適する方法を用いて行うことができる。抗原は、T細胞(本明細書に挙げられている任意の型のT細胞のような)により認識される任意の抗原であってよく、従って、本明細書に挙げられているタンパク質またはペプチドエピトープのいずれかであってよい。任意の型または特定の、本明細書に挙げられている類似体のような、抗原の類似体を測定に用いることができる。
【００８１】
典型的には、病原体は、本明細書に挙げられている任意の病原体などの細胞内病原体であり、例えば、HPV、HIV、SIV、HCV、クラミジア種、HBV、EBV、CMV、VZV、HSV、レジオネラ、チフス菌、熱帯熱マラリア原虫、レーシュマニア、ライ菌、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、トキソプラズマ種、ブルセラ種、クリプトコッカス種、カンジダ種またはアスペルギルス種である。好ましくは、病原体はヒト型結核菌である。
【００８２】
前記のように、抗原または類似体の認識は、任意の適する方法を用いて測定されることができる、好ましくは、IFN-γのような、T細胞からのサイトカインの分泌を検出することにより測定される。
【００８３】
2つの時点においてT細胞認識を測定することを含む上記の方法を、活性疾患へ進行する高い可能性をもつ個体を診断するために用いることができる。本発明は、このように診断された個体を治療する方法であって、病原体により引き起こされた状態を予防または治療する生成物を個体に投与することを含む方法を提供する。
【００８４】
好ましくは、病原体は、ヒト型結核菌であり、および/または物質は、リファンピシン、イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、パラ-アミノ-サリチル酸、カナマイシン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、チアセタゾンもしくはフルオロキノロン、またはそのような物質の類似体である。
【００８５】
本発明者らはまた、ミコバクテリア抗原全体でのみ試験の結果が陽性と出て、かつペプチドでは陰性であった個体を同定したが、その後、その後の時点では陰性(抗原およびペプチドについて)であった。このように、抗原のみに対するT細胞応答は、個体が感染を除去するであろうことを予言している。これは、最近曝されているが、感染を除去した個体を同定するために、本発明の第一局面(タンパク質およびペプチドで試験すること)および本発明の第二局面(2つの時点において試験すること)を組み合わせることが有利であることを示している。
【００８６】
このように、一つの態様において、本発明は、最近ミコバクテリアに曝されたことがあり、ミコバクテリアにより引き起こされた感染を除去した可能性が高い個体を診断する方法であって、その方法が、(i)個体のT細胞が、作用物質由来の1つまたは複数のペプチドエピトープよりも大きな範囲で、少なくとも30個のアミノ酸の長さをもつその作用物質由来のタンパク質を認識するかどうかをインビトロで測定する段階であって、より大きな範囲のタンパク質の認識は、個体が最近作用物質に曝されたことを示す段階；および(ii)個体のT細胞が、その後の第二の時点においてミコバクテリア由来の抗原を認識するかどうかを測定する段階を含み、(i)におけるより大きな範囲のタンパク質の認識、およびT細胞が第二の時点では抗原を認識しないという測定結果は、個体が最近ミコバクテリアに曝されたが、ミコバクテリアによる感染を除去したことを示す方法を提供する。
【００８７】
免疫抑制療法の前または間に診断またはモニターする方法
本発明者らは、免疫抑制療法中の個体において、潜在性ミコバクテリア感染の検出、およびそれによる活性結核に対する感受性の検出が、本明細書に記載されているT細胞に基づくアッセイ法を用いて測定されうることを実現した。
【００８８】
従って、本発明は、免疫抑制療法中または免疫抑制療法を開始しようとしている個体において活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性を診断する方法であって、個体のT細胞がミコバクテリア抗原を認識するかどうかを検出することを含み、T細胞によるミコバクテリア抗原の認識が活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性を示す方法を提供する。
【００８９】
さらに、本発明は、免疫抑制療法中の個体において活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性をモニターする方法であって、個体のT細胞がミコバクテリア抗原を認識するかどうかを検出することを含み、T細胞によるミコバクテリア抗原の認識が活性結核疾患および潜在性ミコバクテリア感染に対する感受性を示す方法を提供する。
【００９０】
診断またはモニターされる個体は、本明細書に挙げられている任意の型の個体でもありうるが、好ましくはヒトである。
【００９１】
これらの方法における免疫抑制療法は、抗TNF-α剤の投与を含んでもよい。そのような作用物質は、一般的に、TNF-αの作用を阻止する。一つの態様において、抗TNF-α剤は、TNF-αに結合する。または、抗TNF-α剤は、TNF-α受容体において作用することができ、一つの態様においてTNF-α受容体を結合する。好ましい態様において、抗TNF-α剤は、TNF-αに結合する抗体もしくは抗体の断片であるか、またはTNF-αに結合する抗体もしくは抗体の断片を含む。そのような作用物質は、ヒトもしくはマウスの抗体、またはヒト抗体配列を含むキメラ抗体でありうる。好ましい態様において、抗体は、ヒト-マウスのキメラ抗体である。より好ましい態様において、抗体は、インフリキシマブ(infliximab)(レミケード(remicade))またはヒューミラ(humira)である。抗TNF-α剤は、TNF-α受容体またはそのような受容体の断片、例えばエタネルセプト(etanercept)であってもよく、またはTNF-α受容体またはそのような受容体の断片、例えばエタネルセプトを含む。
【００９２】
免疫抑制療法は、抗-メトトレキセート、アザチオプリン、コルチコステロイドまたはミコフェノール酸モフェチルの投与免疫抑制療法を含みうる。個体は、追加として、サイクロスポリンまたはタクロリムスのようなクラシネウリン阻害剤を服用している場合もある。個体は、免疫抑制を誘導することができるメトトレキセート、アザチオプリン、コルチコステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、サイクロスポリンまたはタクロリムスの機能的類似体を服用している場合もある。
【００９３】
T細胞認識のその測定は、本明細書に開示されている任意の適する方法のような、任意の適する方法を用いて行うことができる。ミコバクテリアは、本明細書に挙げられている任意のミコバクテリアでありうるが、好ましくは、ヒト型結核菌である。抗原は、T細胞(本明細書に挙げられている任意の型のT細胞のような)により認識される任意の抗原であってよく、従って、本明細書に挙げられているタンパク質またはペプチドエピトープのいずれかでありうる。任意の型または特定の、本明細書に挙げられている類似体のような、抗原の類似体を測定に用いることができる。
【００９４】
ミコバクテリア疾患/感染に対する感受性を診断する/モニターする上記の方法を行うためのキットに加え、ミコバクテリア疾患/感染に対して感受性であると同定された個体を治療する方法もまた提供されている。
【００９５】
ミコバクテリア疾患の発症に対する感受性を検出する方法
本発明は、ミコバクテリア疾患の如何なる症状ももたない個体において活性ミコバクテリア疾患の発症に対する感受性を検出する方法であって、個体がミコバクテリア抗原を認識するT細胞のレベルを増加させたかどうかを測定し、それにより個体が活性ミコバクテリア疾患の発症に対して感受性であるかどうかを決定することを含む、方法を提供する。
【００９６】
検査される個体は、本明細書に挙げられている個体の型のいずれかでありうるが、好ましくはヒトである。T細胞レベルの測定は、本明細書に開示されている任意の適する方法のような、任意の適する方法を用いて行うことができる。ミコバクテリアは、本明細書に挙げられている任意のミコバクテリアでありうるが、好ましくは、ヒト型結核菌である。抗原は、T細胞(本明細書に挙げられている任意の型のT細胞のような)により認識される任意のミコバクテリア抗原であってよく、従って、本明細書に挙げられているタンパク質またはペプチドエピトープのいずれかでありうる。本明細書に挙げられている類似体の型のいずれか、または特定の類似体のような抗原の類似体を、測定に用いることができる。
【００９７】
個体は、個体におけるミコバクテリア抗原特異的T細胞のレベル(頻度)が、同じ個体における前の時点(一般的に、個体がまた、潜在的に感染して、かつ無症候性であった前の時点)においてよりも、少なくとも8倍または少なくとも10倍高いような、少なくとも5倍高い場合、疾患の発症に対して感受性であると選択されてもよい。このように、そのようなT細胞のレベルにおける増加は、100万個あたり少なくとも100個、100万個あたり少なくとも150個または100万個あたり少なくとも200個のような、100万個の末梢血単核細胞あたり少なくとも約80個の増加であってもよい。
【００９８】
この一つの態様において、T細胞レベルは、少なくとも2点において測定される。上記のT細胞のレベルにおける増加の測定(本明細書では第二の時点における測定として定義されている)の前である第一の時点は、第二の時点から、約8〜52週間または15〜30週間のような、約3〜104週間の間隔であってもよい。
【００９９】
疾患の発症に対して感受性であるとその方法により同定された個体に、抗ミコバクテリア剤の投与のような適切な治療を与えることができる。疾患の発症に対して感受性であるとその方法により同定された個体を、放射線医学の調査のような活性ミコバクテリア疾患についての他の診断検査で検査するために選択することができる(その後、活性疾患についての適切な治療を与えることができる)。
【０１００】
その方法を行うためのキットに加え、ミコバクテリア疾患の発症に対して感受性であると同定された個体を治療する方法もまた提供される。
【０１０１】
ESAT-6の配列：
2005532546.tif 000005
CFP-10の配列：
2005532546.tif 000006
【０１０２】
本発明は、以下の実施例により例証される。
【０１０３】
実施例1
方法
エキソビボELISPOTアッセイ法
ELISPOTアッセイ法は、静脈穿刺後2〜4時間目に行われた。試料は処理され、個人的識別名またはTST結果に関係なく、2人の科学者によりスコア化された。末梢血単核細胞(PBMC)は、標準的密度遠心分離によりヘパリン処置された血液から分離され、RPMIにおいて洗浄された。PBMCは、顕微鏡下で自動化細胞カウンターにおいてカウントされ、完全培地(R10)に再懸濁され、キャッチャー抗IFN-γモノクローナル抗体(mAb)(Mabtech、ストックホルム、スウェーデン)であらかじめコーティングされかつR10であらかじめブロックされたELISPOTプレートにウェルあたり2.5 x 105個の細胞で蒔かれた。
【０１０４】
二連のウェルは、抗原無し(陰性対照)、フィトヘマグルチニン(陽性対照)(ICN Biomedicals、OH、USA)、組換えESAT-6(rESAT-6)、またはESAT-6およびCFP10由来の12個の異なるペプチドプールの1つを含んだ。アッセイを37℃、5％CO2で一晩インキュベートし、翌朝、プレートをリン酸緩衝食塩水0.05％ ツイーン20(Sigma、MO、USA)で洗浄し、アルカリホスファターゼにあらかじめ結合したディテクター抗IFN-γmAb(Mabtech)と90分間インキュベートし、再洗浄およびBCIP/NBTPLUS色素生産性基質(Moss Inc、MD、USA)との15分間のインキュベーションにより発色させた。プレートは、水道水中での洗浄後、空気乾燥させた。
【０１０５】
アッセイは、自動化ELISPOTカウンターにおいてすべての試料について同じ設定でスコア化された。検査ウェルは、陰性対照ウェルの平均値より、平均として少なくとも5個のスポット形成細胞(SFC)を多く含み、かつさらに、この数が陰性対照ウェルの平均値の少なくとも2倍である場合に、陽性として評価された。ペプチドプールについては、各アレイがペプチドの完全なセットを含む場合の両方のアレイにおけるプールに対する応答として定義された。ESAT-6由来ペプチドのプール、CFP10由来ペプチドのプール、またはrESAT-6に対する陽性応答は、陽性ELISPOTアッセイと考えられた。
【０１０６】
ペプチド
前に記載されているように、ESAT-6分子の長さに渡る17個のペプチドおよびCFP10分子の長さに渡る18個のペプチドを購入した(Research Genetics、AL、USA)。各ペプチドは長さが15個のアミノ酸であり、10個の残基だけその隣接したペプチドと重複した；純度は>70％であった。ペプチドは、各ペプチドが4連で試験されるように、各アレイが対比させる組み合わせにおいて2つの分子由来のすべての35個のペプチドを含むそれぞれ6プールの2アレイを含む12プールへと配置された。
【０１０７】
結果
最近(11週間前)のヒト型結核菌への曝露(およびそれゆえに感染の危険性)をもつイタリアの病院からの124人の個体を上記のELISPOTアッセイ法を用いて検査した。ESAT-6およびCFP-10の両方についてのペプチドのプールならびに抗原全体を用いる場合、ツベルクリン皮膚検査によりわずか10人(8％)だけが陽性であることが見出されたが、ELISPOTを用いて34人(27％)が陽性であることが見出され、ELISPOTが曝露後、より早く感染を検出することを示した。124人の個体のうち、35人がヘルスケアワーカー(HCW)であり、そのうちのいく人かは以前、遠い過去においてヒト型結核菌に曝されたことがある可能性があり、かつ89人は母親およびその母親の生後11週間の乳児であり、そのうち、乳児は以前に曝されたことがある可能性はなく、および母親はごく少数で以前に曝されたことがある可能性があった。ELISPOTに反応した18人のHCWのうち、11人(61％)が抗原全体のみに反応した。反応した16人の母親および乳児のうち、14人(87.5％)がペプチドのプールに対してより大きな程度で抗原全体に反応した。この場合、16人の母親および乳児は、抗原全体に対してのみ反応し、かつペプチドのプールに対して反応しなかった。
【０１０８】
対照的に、UK中等学校でのヒト型結核菌大発生における545人の子供の研究において、子供はELISPOTによる検査の4〜12ヶ月前にヒト型結核菌に曝されたのであるが、133人の子供がESAT-6全体またはESAT-6由来のペプチドに反応し、これらのうち13人(9.8％)だけがESAT-6全体のみに反応した(イタリアの研究における61％および87.5％という上記の数字と比較して)。これは、UK学校における子供は、イタリアの研究における個体よりずっと早くに曝されたという事実を反映している。それゆえに、ペプチドに対するより高い抗原全体に対する反応の検出を、病原体への最近の曝露を検出するために用いることができる。
【０１０９】
実施例2
ヒト型結核菌曝露後3ヶ月目および6ヶ月目における2時点での検査(2検査ELISPOT形式)の結果
T細胞認識に基づくアッセイ法(エキソビボELISPOT)をT細胞レベルにおける初期感染の動態を研究するために用いた(症状に基づく感染/疾患指標と対比して)。エフェクターT細胞の個体における検出可能な存在は、宿主が現在、病原体により感染させられていることを示すと考えられている。
【０１１０】
供与者は、上記のイタリアの病院の研究からの108人の母親および乳児であった。3ヶ月目でELISPOTアッセイ法において検査結果が陰性と出た61人の供与者が、6ヶ月目で再び検査結果が陰性と出たことを見出した。さらに、3ヶ月目で検査結果が陽性と出た15人の供与者もまた、6ヶ月目で検査結果が陽性と出た。しかし、3ヶ月目で検査結果が陰性と出た13人の供与者は、6ヶ月目で検査結果が陽性と出て、3ヶ月目で検査結果が陽性と出た19人の供与者は、6ヶ月目で検査結果が陰性と出た。したがって、曝露後の2時点における個体のT細胞をアッセイすることの使用により、個体の2つの重要な群が同定された。
【０１１１】
第一に、検査結果が第一の時点で陽性と出て、かつ第二の時点で陰性と出た19人の供与者は、最初に感染したが、その後、感染を除去した個体である。これらの個体は治療を必要としない。これは、T細胞に基づく感染の診断を用いる場合、最初の陽性検査結果の後に次の第二の時点を検査することの重要性を例証している。興味深いことに、これらの供与者のすべての19人は、抗原で検査結果が陽性と出ただけで、ペプチドでは出なかったが、個体が、検査結果がタンパク質抗原を用いるELISPOTアッセイ法において陽性と出て、同時にペプチドを用いるELISPOTにおいて陰性と出るならば、個体は、感染を除去する可能性がより高い可能性がある。これは、治療を必要とする可能性が高いかどうかを決定するためにそのような個体を同定すること(および、恐らくその後の時点においてそれらを検査すること)の重要性を示すものである。
【０１１２】
第二に、検査結果が第一の時点で陰性と出て、かつ第二の時点で陽性と出た13人の供与者は、より遅い(より弱い)T細胞応答を開始していた個体である。より弱い応答をもつそのような個体は、感染を制御することができず、かつこのゆえに活性疾患に発展する可能性がより高い。このように、T細胞に基づく2時点診断検査を、活性疾患へ進行する可能性がより高い個体を同定するために用いることができる。明らかに、これらの個体を治療としてターゲットすることが望ましい。この発見はまた、ワクチンに対して、または細胞性応答を誘導する他の部分に対してより遅い応答を開始する個体を同定するために用いることができる。
【０１１３】
実施例3
免疫抑制された個体における潜在性ミコバクテリア感染の早期診断
インターフェロン-ガンマについてのエキソビボ酵素結合免疫スポットアッセイ法(ELISPOT)は、ヒト型結核菌により発現されるが、ウシ型結核菌BCGには存在しない抗原に特異的であるT細胞を検出する。最近の結核(TB)接触者において、そのアッセイ法が、TSTより、有意により密接にヒト型結核菌曝露と相関しており、TSTとは違って、BCGワクチン接種状態と無関係である。このように、ヒト型結核菌感染を検出することについて、TSTより高い感度および特異性をもつように思われる。これは、困難かつ共通した臨床的問題：免疫抑制療法における最近のTB接触者の評価、へのこのアッセイ法の最初の臨床的適用である。
【０１１４】
24歳の女性のモルドヴァからの不法滞在者が、イタリア、モデナのモデナの大学病院(University Hospital of Modena)で健康な乳児を出産した。彼女は、弱くかつしつこく咳をし続けることが注目されていたが、胸部X線撮影を、出産後1週間目まで遅せた。肺のX線写真および高解像度コンピューター断層撮影(HRCT)は、活性肺TBを強く示唆しており、推測される診断を告げた時、彼女は完全な病歴を提供した。彼女の熱および咳は4ヶ月間続いていたが、不法滞在者としての彼女の身分についての心配が、彼女がより早く医学的応対処置を求めるのを止めさせてしまったことが、その時明らかになった。モルドヴァで10年前、彼女は、約2ヶ月間、2つの特定されない経口薬物で肺結核について治療されていた。3つの喀痰試料は、チール-ネールゼン(ZN)染色において抗酸性桿菌について強陽性(3+)であったが、HIV血清学は陰性であった。標準的4薬物抗TB治療が開始された。3週間後、喀痰検体は、イソニアジドおよびリファンピンに耐性であるヒト型結核菌複合体を増殖した。それゆえに、治療は、5薬物療法(ピラジナミド、モキシフロキサシン、エタンブトール、ストレプトマイシンおよびクロファジミン)へ切り替えられ、結果として、前進的な臨床的改善を生じた。彼女の症状の持続期間より、彼女が4ヶ月間、ずっと感染性であったことが示唆された；それゆえに、彼女の近い接触者の調査が優先事項であった。
【０１１５】
最も高度に曝された接触者は、彼女の41歳の夫であった。彼は、不活性クローン病についてアザチオプリン(150 mg/日)の維持量で長期間免疫抑制療法中であった。彼は、ともかく症状はなく、身体検査は正常であった。彼のアザチオプリン治療を考慮して、全血球計算および特異な白血球計算を行い、両方とも正常であった。近い所帯接触者として、夫は、多剤耐性(MDR)ヒト型結核菌での感染の高危険性にあるとみなされた；感染したならば、彼は、彼の免疫抑制療法のために、活性MDR TBへの進行の高危険性にさらされることになったであろう。しかし、TSTの限界は、彼の管理にいくつかの深刻な障壁をもたらした。特に、TSTはしばしば、免疫抑制薬物療法中の、HIV感染症をもつ、またはある特定の慢性疾患(例えば、慢性腎不全)をもつ個体、すなわち、まさに、活性結核への進行の最高の危険性にある人々において、偽陰性となる(わずかな感度)。MDRヒト型結核菌での感染の早期同定は、活性な症候性MDR TBは高死亡率をもつため、特に重要である。それゆえに、夫は、TSTに加えてELISPOTによる検査を受けるように勧められた。
【０１１６】
TSTは、5 IUのタンパク質精製誘導体(PPD)(Biocine、Chiron Italy)を用いるマントゥー方法により投与された。皮膚の硬結の横径は、接種後72時間目に定規で測定されかつ記録され、陽性基準についてのカットオフとして5 mmを用いた。TST投与後すぐに、静脈血試料を採取し、ヒト型結核菌複合体に高特異的な抗原を用いて、前に記載されているようにELISPOTアッセイ法を行った。用いられる抗原は、組換え初期分泌抗原性標的-6(ESAT-6)、組換え培養濾液タンパク質10(CFP10)、およびこれらの抗原由来ペプチドプールであった。
【０１１７】
TST硬結は4 mmであり、よって陰性であると考えられたが、ELISPOT検査結果は陽性であった。陽性ELISPOT結果のために、夫は胸部X線撮影およびHRCTを受けた。胸部X線撮影は、右肺の上部帯の末梢において弱く画定された非特異的な陰影を示し、胸部HRCTは、数個の小さな硬化の病巣を示し、1個はごく初期の空洞形成をもっていた。気管支肺胞洗浄(BAL)を含む光ファイバー気管支鏡検査法を右上部葉の前区において行った。洗浄液により、ZN染色において抗酸性桿菌が明らかにされ、それゆえに、患者は、MDR-TBの推定的診断に基づいて、彼の妻と同じ5つの抗TB薬物を処方された。ヒト型結核菌複合体が5週間後、BAL液培養物から単離された。薬剤耐性パターンは妻の単離物と同じであり、IS6110制限断片長多型分析を用いる分子染色分類(DNAフィンガープリント法)より、彼の単離物が彼の妻の単離物と同一であることが示された。
【０１１８】
最近のTB接触者の評価におけるこの新規なT細胞に基づく検査の臨床的適用は、結果として、陰性の皮膚検査結果をもつ無症候性の人において潜在性の活性肺MDR TBの早期診断および迅速な治療をもたらした。夫に対して直接的恩恵であることに加えて、早期診断は、共同体においてのこのMDRヒト型結核菌株の二次伝染を防いだ。ELISPOTアッセイ法が、TSTができなかったところにおいて、初期の潜在性MDR TBの存在を検出することができたかの理由は、ELISPOTアッセイ法が、医師の診断によって免疫抑制された個体における偽陰性の結果にTSTよりなりにくいためでありうる。多くかつ増加している数の患者が、穏やかから中程度までの免疫抑制を引き起こす薬物療法中であり、本明細書に報告されている場合のように、多数は、損なわれた遅延型過敏応答および偽陰性TSTをもつ。さらに、それはしばしば、まさに、TBの重篤かつ播種性型へと進行する可能性がより高い免疫抑制された患者である。無症候性ヒト型結核菌感染についてスクリーニングすることは、抗TNF-アルファ剤(例えば、インフリキシマブ)での治療についての候補者である自己免疫および炎症性疾患をもつ患者において特に重大な意味をもつ。この強力な新しいクラスの薬剤の重要な有害作用は、潜伏的に感染した個体におけるTBの再活性化であるが、これらの患者においてTSTにより潜伏性ヒト型結核菌感染を診断することは、たいていがすでに免疫抑制剤を常用しているため、特に困難である。
【０１１９】
本発明者らは、この新規なT細胞に基づく検査が、症状の不在下、かつ陰性のTSTの設定において、初期の活性MDR TBを検出したことを示した。本発明者らの報告は、初めて、ヒト型結核菌感染についての血液検査の臨床的利用を実証し、臨床的成果を改善するためのELISPOTの可能性を示している。これらの結果に基づいて、ELISPOTは、現在、MDR TBの院内大発生を防ぐのを助けるためにこの報告に記載された源の患者の病院での全ての接触者をスクリーニングするために用いられている。
【０１２０】
実施例4
インフリキシマブ治療を開始しようとしている免疫抑制薬物療法中の慢性関節リウマチをもつ患者の調査
Th1サイトカイン腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)は、免疫および炎症において鍵となるサイトカインである。TNFを中和するモノクローナル抗体およびそれの受容体を遮断する薬物は、他の薬物療法に対して抗療性である慢性自己免疫疾患の治療のための重要な新しいクラスの薬物である。そのような状態には、慢性関節リウマチ(RA)およびクローン病(CD)および強直性脊椎炎(AS)が含まれ、これらの薬物が臨床的適用を見出している状態のリストは増加しており、現在、血清反応陰性の脊椎関節症および類肉腫症が含まれる。臨床試験に入る最初の抗TNF剤は、インフリキシマブ、ヒト化抗TNFモノクローナル抗体であった。このように、臨床的効果に加えて有害作用があるとすれば、本発明者らが最も多い経験を持っているこの薬剤に関してである。
【０１２１】
インフリキシマブは、安全かつ耐容性がよく、主な有害事象は、潜伏性結核(TB)感染(LTBI)の再活性化である。LTBIをもつ人々の90％は、健康な一生のままであり；10％のみが活性TBを発生する。しかし、インフリキシマブ治療は、この危険性を何倍にも増加させ、インフリキシマブを開始するLTBIをもつ多くの患者は、治療を開始してから17週間以内に活性TBを発生する。再活性化TBは、6ヶ月間、抗TB予防的治療(イソニアジド予防的治療)を受けることにより防止されることができる。それゆえに、インフリキシマブを処方する医者は、治療を開始する前にLTBIについて患者をスクリーニングするように製造会社により忠告される。
【０１２２】
実際にLTBIをもっている人を同定することは困難である。最近まで、LTBIを診断するための唯一の方法が、100年続いたツベルクリン皮膚検査(TST)であった。TSTは、低特異性(主に、ウシ型結核菌BCGおよび環境的ミコバクテリアとの交差反応性による)および低感度(実際、LTBIの診断についての判断基準がない)を含む、いくつかの主要な欠点をもつ。インフリキシマブ治療を開始することを望んでいる医者が直面している主な問題は、例えば、以下のものである：
・偽陰性のTST結果(現存する免疫抑制療法またはむしろ標的疾患自身により引き起こされる)。偽陰性の結果は、本当にLTBIをもつ患者が見落とされ、インフリキシマブを開始し、その後、再活性化TBを発生するということになる。
・偽陽性のTST結果(前のBCGワクチン接種により引き起こされる)。偽陽性の結果は、インフリキシマブを必要としている多数の患者が、実際にはLTBIをもっていないのであるが、TBを再活性化することのないように、誤って治療を与えられないということになる。ヨーロッパおよび世界の全住民の大部分がBCGワクチン接種されるため、これは共通の問題である。
【０１２３】
ELISPOTアッセイ法は、インフリキシマブ治療を開始しようとしている10人の慢性関節リウマチ患者を検査するために用いられた。すでに免疫抑制療法(メトトレキセート、アザチオプリン、コルチコステロイドを含む)中であるにもかかわらず、これらの患者は、ELISPOTアッセイ法における陽性対照抗原に対する容易に検出可能なIFN-γ分泌T細胞を依然として有していた。これらの患者の1人は、所帯のTB曝露の過去があった。彼女は、TB感染についてELISPOTにより陽性であったが、TSTによっては陰性であった。それゆえにこの個体のLTBIは、TSTだけが用いられていたならば見落とされていたであろうが、ELISPOTにより検出された。さらに、インフリキシマブを開始した後10週間目、彼女はELISPOT陽性のままであり、ELISPOTが、患者がTNF遮断療法を開始した後でさえもLTBIを検出するために用いられうることを示した。
【０１２４】
実施例5
結核疾患の発症を予知するものとしてのエフェクターT細胞頻度の調査
ELISPOTアッセイ法は、無症候性潜在性結核感染から活性結核へ進行した患者においてエフェクターT細胞頻度における変化を調べるために用いられた。研究の開始後8ヶ月目において症状の発生が起き、10ヶ月目において疾患の治療が開始された。疾患の診断は、ミコバクテリアの培養により確認された。結果は以下に示される。
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SFU-スポット形成単位
【０１２５】
上記のデータは、疾患症状の発生(8ヶ月目)の前に(6ヶ月目)、エフェクターT細胞頻度において著しい増加があることを示している。エフェクターT細胞における増加は、おそらく、桿菌の負荷量における増加(すなわち、抗原負荷量における増加)を反映している。桿菌における増加がエフェクターT細胞における増加を導くが、それは、8ヶ月時点まで、症状を引き起こすのに十分な組織病態を引き起こしていない。それゆえに、エフェクターT細胞の検出(例えば、ELISPOTを用いる)を、活性結核の発症を予知するものとして用いることができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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