(57)【要約】本発明は、人工角膜としての使用に適したインプラント及びその製造方法並びに使用方法を提供する。本発明による人工角膜は２相人工角膜または３相人工角膜であり得る。これらの人工角膜は、柔軟で光学的に透明な中心コア部と親水性で多孔性のスカート部とを有し、両部分は何れも生体適合性で、組織と一体化可能である。３相人工角膜はさらにコア部とスカート部との間に中間領域を有する。該人工角膜は高水準のオキュラートレランスを有し、スカート部と組織との一体化や、その表面上で上皮組織の増殖が可能である。このように生体適合性の材料を用いることによって、角膜移植に伴う疾病伝染のリスクが回避され、術後の炎症が最小限ですみ、合成角膜をホストの眼球に移植した後の組織壊死の発生頻度や重症度が低く抑えられる。
2005532094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工角膜であって、
（ａ）前側面、後側面、及び外辺部とを有する生体適合性で光学的に透明な中心コア部を含む第１相と、
（ｂ）前記中心コア部の前記外辺部を外囲しそれに共有結合された、生体適合性で親水性で多孔性のスカート部を含む第２相とを含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項２】
前記前側面の上での上皮細胞の成長を促進するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の人工角膜。
【請求項３】
前記中心コア部が、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（pHEMA）を含むことを特徴とする請求項１に記載の人工角膜。
【請求項４】
前記スカート部が、ポリマーマトリックス中に入れられたコラーゲンを含むことを特徴とする請求項１に記載の人工角膜。
【請求項５】
前記ポリマーマトリックスが、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）を含むことを特徴とする請求項４に記載の人工角膜。
【請求項６】
前記中心コア部が、コンタクトレンズ作成用の硬質の生体適合性材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の人工角膜。
【請求項７】
前記中心コア部が、ポリメチルメタクリレート（PMMA）を含むことを特徴とする請求項６に記載の人工角膜。
【請求項８】
前記中心コア部が、眼内レンズ作成用の柔軟な生体適合性材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の人工角膜。
【請求項９】
前記柔軟な生体適合性材料が、シリコーン、シリコーン化合物、及び親水性アクリル樹脂からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項８に記載の人工角膜。
【請求項１０】
成長因子、成長促進物質、成長阻害物質、ホルモン、抗生物質、接着分子からなる群から選択された生物活性物質をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の人工角膜。
【請求項１１】
人工角膜であって、
（ａ）前側面、後側面、及び外辺部とを有する生体適合性で光学的に透明な中心コア部を含む第１相と、
（ｂ）前記中心コア部の前記外辺部を外囲しそれに共有結合された、生体適合性で親水性で多孔性のスカート部を含む第２相と、
（ｃ）前記中心コア部と前記スカート部との間に配置され、前記中心コア部の外辺部に共有結合され、かつ前記スカート部に共有結合された中間領域を含む第３相とを含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項１２】
前記前側面の上での上皮細胞の成長を促進するように構成されていることを特徴とする請求項１１に記載の人工角膜。
【請求項１３】
前記中間領域が、ポリマーブラシを含むことを特徴とする請求項１１に記載の人工角膜。
【請求項１４】
前記ポリマーブラシが、リビングラジカル重合を含む方法によって重合された親水性ポリマーを含むことを特徴とする請求項１３に記載の人工角膜。
【請求項１５】
前記中心コア部が、コンタクトレンズ作成用の硬質の生体適合性材料を含むことを特徴とする請求項１１に記載の人工角膜。
【請求項１６】
前記中心コア部が、ポリメチルメタクリレート（PMMA）を含むことを特徴とする請求項１５に記載の人工角膜。
【請求項１７】
前記中心コア部が、眼内レンズ作成用の柔軟な生体適合性材料を含むことを特徴とする請求項１１に記載の人工角膜。
【請求項１８】
前記柔軟な生体適合性材料が、シリコーン、シリコーン化合物、及び親水性アクリル樹脂からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１７に記載の人工角膜。
【請求項１９】
成長因子、成長促進物質、成長阻害物質、ホルモン、抗生物質、接着分子からなる群から選択された生物活性物質をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の人工角膜。
【請求項２０】
人工角膜の生体適合性を測定する方法であって、
（ａ）動物の角膜内に人工角膜を挿入する過程と、
（ｂ）前記人工角膜への組織の一体化のレベル、前記人工角膜によって生ずる組織の壊死のレベル、前記人工角膜によって生ずる炎症のレベル、及び前記人工角膜の押出され率からなる因子群から選択された少なくとも１つの因子を測定する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
人工角膜であって、
（ａ）前側面、後側面、及び外辺部とを有する生体適合性で光学的に透明な中心コア部を含む第１相であって、前記中心コア部が、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（pHEMA）を含み、前記pHEMAの一方の面が上皮形成を促進するように化学的に改変されている、該第１相と、
（ｂ）前記中心コア部の前記外辺部を外囲しそれに共有結合された、生体適合性で親水性で多孔性のスカート部を含む第２相とを含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項２２】
上皮形成を促進する方法であって、
（ａ）表面を改変された生体適合性材料を準備する過程と、
（ｂ）前記表面を改変された生体適合性材料の一方の面に化学的に改変処理を施す過程と有し、前記化学的な改変処理が、TEMPOによる酸化及び漂白剤による酸化からなる群から選択された処理であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記表面を改変された生体適合性材料が、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（pHEMA）を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は眼疾患の治療の分野に関するものである。本発明は、特に、角膜の置換が必要な疾患に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
角膜は、眼内の内容物を保護するとともに光を屈折させて網膜上に集束させる。さまざまな条件によって角膜混濁が生じ、失明にいたることがある。このような条件としては、外傷、感染症、炎症、眼球手術、及び遺伝的体質等が挙げられる。角膜移植を受けた人は約８００万人〜１０００万人と見積もられる。現在の角膜混濁の治療法は全層角膜移植（角膜移植）であり、この場合、損傷を受けた即ち疾病状態の角膜がドナーの目から取り出された角膜に置換される。置換角膜組織は、死亡したドナーから取り出され、移植時まで保存されなければならない。その組織は死亡から１２時間以内に回収され、約７日以内に使用されなければならない。その成功率は、元の眼球の状態に左右される。後進国や発展途上国における全層角膜移植を制限しているのは主として組織の入手しやすさと費用である。
【０００３】
これらの国々では文化的・宗教的理由と、アイバンクを整備するための資源が限られていることから、角膜移植は実現できなかった。
【０００４】
角膜移植が行われている先進国においても、視力を低下させ得るようなさまざまな角膜移植の合併症が起こり得、そのようなものとしては重症の乱視、角膜移植片拒絶反応及び移植不全、緑内障、及び失明にいたるような感染症等がある。加えて、角膜の疾病は全層角膜移で治療することができないものも多く存在する。このようなものとしては、化学的熱傷、スティーヴェンズ‐ジョンソン病、トラコーマ、重症ドライアイ、及び再発性角膜移植不全等がある。
【０００５】
人工角膜は角膜組織に入手等の問題を解決するであろうが、従来技術では、人工角膜の開発にまだ成功していない。
【０００６】
人工角膜の開発における課題の一つは、中心部が光学的に透明で、周辺部が細胞との一体化が可能な生体適合性である構造を設計・製造することであり、これは実際上困難であることがわかっている。実際に実現された人工角膜は重症の合併症を伴うものであった。そのような合併症としては、例えば眼内炎（眼内感染症）、突出、緑内障（調節されない眼圧上昇）、上皮下向増殖症、ブドウ膜炎（眼内炎症）、及び組織壊死等が挙げられる。これらの合併症は人工角膜と被移植組織との間の組織接着がうまくいかないことが原因の一つに挙げられ、これによって回復不可能な失明に至ることもあり得る。
【０００７】
Chirilaらによって設計された人工角膜は、当分野における最近の成果の一つである（例えば、Chirila, T.V. "An Overview of the Development of Artificial Corneas With Porous Skirts and the Use of pHEMA for Such an Application", Biornaterials, 22, 3311-3317 (2001); Hicksら, "Development and clinical assessment of an artificial cornea", Prog Retin Eye Res., 19,149-170 (2000); Vijayasekaranら, "Cell viability and inflammatory response in hydrogel sponges implanted in the rabbit cornea", Biornaterials, 19, 2255-2267 (1998); Hicksら, "Implantation of pHEMA keratoprostheses after alkali burns in rabbit eyes", Cornea, 17, 301-308 (1998); Hicksら, "Clinical results of implantation of the Chirila keratoprosthesis in rabbits ", Br J Oplithalmol. 82, 18-25 (1998); Vijayasekaranら "Histologic evaluation during healing of hydrogel core-and-skirt keratoprostheses in the rabbit eye", Cornea, 16, 52-59 (1997); Hicksら " Keratoprosthesis: preliminary results of an artificial corneal button as a full-thickness implant in the rabbit model", Aust N Z J Oplithalmol. 24, 297-303 (1996); Crawfordら "Preliminary evaluation of hydrogel coreand-skirt keratoprosthesis in the rabbit cornea", J Refract Surg. 12, 525-529 (1996); Crawfordら "Tissue interaction with hydrogel sponges implanted in the rabbit cornea", Cornea, 12, 348-357 (1993)参照）。
【０００８】
Chirilaらによって作成された人工角膜は、１種類のポリマー、ポリ（２ヒドロキシエチルメタクリレート）（poly(2 hydroxyethyl methacrylate)）またはpHEMAから形成されるという特徴を有する。このことによって、コア部とスカート部との間の密な結合が確保される。このポリマーは生体適合性のポリマーである。
【０００９】
生体適合性の材料を用いることは、人工角膜でよくみられるような押出され（extrusion）の問題を克服するのに役立ち得る（例えば、Chirila, T.V. "An Overview of the Development of Artificial Corneas With Porous Skirts and the Use of pHENIA for Such an Application", Bioniaterials, 22, 3311-3317 (2001)参照）。
【００１０】
加えて、pHEMAは親水性であり、このためこの生物学的材料は構造内に侵入し得る。Chirilaらの人口角膜は、pHEMAをコア部とスカート部とで異なる条件で重合させることによって作成される（Chirila, T.V. "An Overview of the Development of Artificial Corneas With Porous Skirts and the Use of pHEMA for Such an Application", Biomaterials, 22, 3311-3317 (2001)）。硬質で透明なコア材料は、初期の混合物中の水を３５％とすることによって得られ、水分を４５％以上とすると海綿状の材料となる。初めに高い水分を用いてスカート部を重合させ、次に水分を低下させて硬質のコア部を重合させる。
【００１１】
別のグループは、pHEMAヒドロゲルのフリーラジカル重合において、疎水性モノマー、フェノキシエチルメタクリレート（PEM）を組み入れると、ヒドロゲルへの細胞接着及び細胞増殖のレベルが向上することを発見した（Sandemannら "Novel Materials to Enhance Keratoprosthesis Integration ", Br.J. Ophthalmol., 84, 640-644 (2000)）。pHEMAに基づく親水性が芳香族モノマーの組み入れによって変調されたことによって、細胞伸展の促進が生じ得る（Dropcovaら " A Standard Strain of Human Ocular Keratocytes", Ophthalmic Res. 31, 33-41 (1999)）。
【００１２】
過去４０乃至５０年間に開発された人工角膜はうまく機能せず、完全で回復不能な失明に至る緑内障、押出され、及び眼内炎（眼内感染症）等の重篤な合併症を伴うものであった。このようなことになる原因は、一つには、生体適合性がなく慢性の炎症や組織壊死が生じるためである。Chirilaらの人工角膜は、ある程度細胞と一体化する生体適合性を有するpHEMAからなるものである。しかし、人工角膜の材料と設計の両方について、組織との一体化のし易さを高めるための改善が必要である。従って、生体適合性を有し、被移植者の眼に入れたときに重篤な合併症が生じにくい人工角膜が求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、人工角膜としての使用に適したインプラント、及びそのようなインプラントの製造方法並びに使用方法を提供する。本発明の特徴を有する人工角膜は、透明なコア部と、構造及び／または材料が異なる相を構成する周縁部とを有する複相人工角膜を含む。或る実施態様では、中心が透明で、周縁部に親水性で多孔性のスカート部を有する２相人工角膜が提供される。別の実施態様では、中心が透明で、周縁部に親水性で多孔性のスカート部を有し、かつコア部とスカート部との間に（例えばポリマーブラシリンク領域等の）コア／スカート中間領域を有する。親水性で多孔性のスカート部は、該スカート部と組織との一体化を助け、かつ人工角膜の表面の上での上皮細胞の増殖を助けるように構成されている。コア／スカート中間領域は、人工角膜の機械的特性を向上させ、人工角膜に他の望ましい特徴を付加するように構成されている。従って、本発明の特徴を有する人工角膜は、コア／スカート構造体であり、選択に応じてコア部とスカート部との間にリンク領域としてのコア／スカート中間領域を有し、該構造体は、被移植者の移植部に縫合することが容易で、移植された角膜が通常受ける機械的応力に耐えるに十分な機械的強度を有する。
【００１４】
本発明のインプラントは、その人工角膜（移植物）表面での上皮形成のみならず細胞の内部侵入（ingrowth）を促進するように構成され、またそのような材料を有する。本発明の特徴を有するハイブリッド合成／生体分子人工角膜は、高水準のオキュラートレランス（ocular tolerance）を有し、柔軟な中心コア部と多孔性のスカート部から構成され、両部分はともに生体適合性で組織との一体化が可能である。生体適合性の材料を用いることによって、角膜移植に伴う疾病伝染のリスクが避けられ、術後の炎症が最小限ですみ、合成角膜をホストの眼球に埋め込んだ後の組織壊死の発生頻度や度合いが低下することになる。
【００１５】
本発明の特徴を有するインプラントは生体適合性の材料から作られ、透明な中心光学コア部を有する。コア部の縁は、化学的結合によってコア部にスカート部を結合するのを助ける化学的機能を付加されている。またスカート部は、コラーゲンのような生体適合性材料をコア／スカート構造体に共有結合させ得るようにも化学的に機能付加されている。この構造は、角膜実質細胞（角膜細胞）が一体化可能で、人工角膜の中心は光学的に透明な状態のまま、表面を上皮細胞が覆い細孔内部には細胞外マトリックスが作られるようにできる。抗生物質及び細胞増殖促進剤をコア／スカート構造体に塗付してもよい。これらの要素は、炎症や人工角膜の拒絶反応を少なくするのを助け、上皮の増殖や細胞の一体化を促進する。角膜実質細胞及び他の細胞のインプラント内での増殖や一体化によって、人工角膜とホストの組織被移植部との間が水密に接合され、眼内炎や押出されが防止される。細胞の増殖と一体化の度合いは、本発明の特徴を有する人工角膜において、最大限の角膜実質細胞を人工角膜と一体化させ得るような材料を使用し、材料内に一様な大きさの細孔を形成し、（コラーゲンでコーティングしたポリマー等の）生体適合性の環境を提供し、かつ細胞移動及び細胞接着を開始させ得るサイトカインやタンパク質を用いることによって高められる。また本発明は、人工角膜を作成するために用いられる組成物や材料の機能、及び人工角膜自体の機能を評価する方法も提供する。
【００１６】
本発明の特徴を有する人工角膜は、表面の生体適合性材料（例えばpHEMA）が材料の一方の側（好ましくは表側）が上皮形成と組織の一体化を促進するべく化学的に改変される形態で開発され得る。化学的方法の例としては、以下に限定されないが、TEMPO触媒酸化や漂白酸化等が挙げられる。
【００１７】
本発明の特徴を有する人工角膜インプラントは、高水準のオキュラートレランス、向上した生体適合性、高い機械的強度を有し、移植が容易で、移植された組織からの疾病伝染のリスクを回避でき、術後の炎症や感染症を従来の方法や機具と比較してうまく管理できるという利点を提供する。人工角膜がドナーからの提供角膜より有利な点として、世界中どの地域でも使用できること、術後に速やかに視力回復できること、乱視をなくすことでよりよい視力が得られること、ヒトの角膜組織保存の必要がなくなりコスト上の利点が得られること、そして特に意義深い点として、ドナーから伝染し得る感染症、例えば肝炎、梅毒、ヒト免疫不全ウイルス感染（HIV）やクロイツフェルト‐ヤコブ病（CJD）にかかるリスクをなくすことができる点が挙げられる。
【００１８】
従って、本発明の特徴を有する複数の相からなる人工角膜インプラントは、角膜の疾病により失明した何百万人の人々に視力を与えるという主要な目的を果たすとともに、数多くの利点をもたらすものである。この器具及び方法は、他の器官の人工移植物にも応用可能で、人工組織や器官に関するバイオエンジニアリング分野において有用なものである。
【００１９】
このような本発明の目的及び利点は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を参照することによりよく理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下の詳細な説明では、さまざまな細部についてある特定の形態のものが示されているが、これは例示を目的としたものであり、当業者であれば、以下に説明する実施例にさまざまな改変を加えても本発明の範囲から逸脱しないことが容易に理解されよう。従って、以下の本発明の好ましい実施形態は、特許請求の範囲に記載された発明の一般性を損なったり、範囲を限定するものとして記載されたものではない。
【００２１】
図１は、本発明の特徴を有する人工角膜１０の模式図であり、該人工角膜は、角膜インプラントとして眼球に縫合され得るコア／多孔性スカート構造物１２を備えている。コア／スカート構造物１２は、中心コア部１４とスカート部１８を有しており、両者はコア／スカート中間領域２２で結合されている。コア周縁部１６を有するコア部１４と、スカート２０周辺部を有するスカート部１８とは、コア周縁部１６とスカート周縁部２０とを相互に結合する中間領域２２にしっかりと結合されている。スカート部１８は多孔性のスカート部であるのが好ましい。このような人工角膜１０は、移植角膜の差込みに用いられる技術や他の形態の人工角膜の移植のために用いられる技術に類似した技術によって移植され得る（例えば、Trinkaus-Randall, "Cornea", Ch.35, Principles of Tissue Engineering, 2nd ed., Academic Press (2000)参照）。
【００２２】
（さまざまな種類の生体適合性材料を組み入れた）新しい種類のスカート部１８を柔軟で透明な材料を有するコア部１０に取付けるためには、現代化学の手法を用いることもできる。本発明の特徴を有する人工角膜１０の中心コア部１４は、その表面上における上皮細胞の増殖を促進するように構成されるのが好ましい。
【００２３】
また、スカート部１８は、親水性かつ多孔性で、角膜実質細胞及び血管壁の増殖を効果的に促進するように構成されるのが好ましい。本発明の特徴を有する人工角膜１０は、機械的に頑丈であり、また強固なコア／スカート中間領域２２を有している。また、本発明の特徴を有する人工角膜１０は２相構造または２相構造を有し得る。２相構造は、例えばポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（pHEMA）から作成された中心光学コア部１４と、例えばポリマーマトリクス（例えばポリテトラフルオロエチレン（PTFE））に組み合わせられたコラーゲンから作成されたスカート部１８とを有する。３相構造は、中心光学コア部１４とスカート部１８に加えて、コア／スカート中間領域２２を有する。
【００２４】
本発明の特徴を有する人工角膜１０においては、２相及び３相系の合成が用いられる。２相系の場合は、中心光学領域（コア部１４）の周囲に直接周縁部（スカート部１８）を化学的に結合する。３相系の場合は、短い水溶性ポリマーの「リンカー」ブラシを、コア部１４の外辺部上に合成し、その後ポリマーブラシ２４にスカート部１８を結合する。従って３相系では、コア周縁部１６とスカート周縁部２０との間のコア／スカート中間領域２２がポリマーブラシ２４を含む。図２はポリマーブラシを示す模式図である。２相系または２相系の何れかが選択されるかは、特定の生体適合性コア部とスカート部材料の結合のための化学反応スキームによって決まる。
【００２５】
本発明の特徴を有する人工角膜１０のヒドロゲルコア１４は、角膜の主要な構成材料である間質の代用物である。間質は、コラーゲンとスルホン化プロテオグリカンを豊富に含む細胞外マトリックスからなる。本発明の特徴を有する人工角膜１０のスカート部１８は、好ましくは、該人工角膜を眼球に固定するためにストロマ（stroma）に類似した生体適合性材料から構成される。相互に浸透し合う生体適合性ポリマーネットワークにコラーゲンを用いるのは、人工角膜を眼に固定するために有効である。移植後の剥離を防止するため、コラーゲンをコア部１４にしっかりと固着することは重要である。コラーゲンは、後述する二つの方法を含めた何らかの適切な方式で、本発明の人工角膜１０のコア部１４に固着し得る。
【００２６】
本発明による人工角膜を構成する各相は、好ましくは均質な相であるのが好ましい。例えば、透明な中心コア部１４は、好ましくは、例えばpHEMAの均質な相またはコラーゲンでコーティングしたpHEMAから構成される均質な相であり得る。スカート部１８は、例えば、PTFEマトリックス中に入れられたコラーゲンから構成された均質な相であり得る。
ポリマーブラシリンカー領域は、例えばポリエチレングリコール（PEG）の均質な相から構成され得る。
【００２７】
ヒドロゲルコア１４にコラーゲンを固着する第１の方法では、コラーゲンスカート部１８とスカート周縁部２０がコラーゲン上のアミノ基またはカルボキシル基によってコア部に直接化学的に結合されるように、コア部１４の周縁部１６が機能化され得る。コラーゲンの微小繊維自体はかなり堅いことから、ヒドロゲルコアに共有結合し得るより柔軟で生体適合性のポリマー網にコラーゲンを編み込むことによって、規則的で多孔性のスカート部を容易に形成できるようになる。このポリマー網は、pHEMAのような多孔質のヒドロゲルか、他の生体適合性ポリマー（例えば、アクリロニトリルと陰性基を有するオレフィン系不飽和コモノマーとのコポリマー等）であり得る。以上の方法によって、２相人工角膜が得られる。
【００２８】
スカート部１８をコア部１４に固着する第２の方法は、図２に示すように、中心の光学的コア部１４とスカート部材料１８との間の中間結合層として、水溶性ポリマーブラシ２４を用いることである。この方法には、強い結合面を形成するには結合が不十分であるため共有結合によってしっかりとした物理的構造が形成されなかった場合に、コラーゲンスカート部をコア部に結合する更に別の手段を提供できるという利点がある。他に有利となり得る点として、ポリマーブラシを延長して、より堅く不規則なコラーゲンマトリックスにも浸透する規則的なポリマーマトリックスを形成することができる点が挙げられる。この第２の方法によって、３相人工角膜が得られる。
【００２９】
使用され得る材料は、さまざまな生体適合性、周縁部のホストの角膜細胞への接着、機械的強度、そして臨床上の要請にこたえる必要がある。この数年間のポリマー化学の進歩によって、２種以上の異なる材料を共有結合して、強固でしっかりとした結合部を決まった手順で形成することができるようになった。一つの例として、一端が面に結合した形で溶媒（水）の中にぶら下がったポリマーを有する「ポリマーブラシ」の形成が挙げられる。この結合は、水溶性ホモポリマー（同一のモノマー単位から構成されるもの）の化学的エンドグラフト接続によって、またはジブロックコポリマー（各ブロックはホモポリマーのようなもので１箇所の接合部で結合された２つのブロックを有する。）のブロックの１つを併合させることによってなされる。水溶性ブラシの特性（その厚さや密度のプロフィールを含む）は、分子量、ポリマーのカバーする範囲、水和量、及び表面の性質によって左右される。
【００３０】
図２は、本発明による人工角膜の中心光学的コア部に結合したポリマーブラシを強調して示した模式図である。図面に示すポリマーはPEGであり、タンパク質が非特異的かつ非共有結合で表面に吸収されるのを抑制することが知られている（Kimら, "Effect of Poly(ethylene glycol) Graft Polymerization of Poly(methyl methacrylate) on Cell Adhesion", J.Cataract Refract. Surg., 27,766-774 (2001)）。ポリマーブラシは、生体適合性のスカート材料をコア部に結合するために用いることができる。
【００３１】
構造の明確な（well-defined）水溶性ポリマーは、リビングフリーラジカル重合と称する技術によって生成することができ、この技術は現在活発に研究され急速に発展しつつあるポリマー科学の一分野をなす。リビングラジカル重合は、成長鎖と逆反応するいくつかの化学種の存在下で行われる基本的には従来と同様のラジカル重合である（例えば、Hawker, "Accurate Structural Control and Block Formation in the Living Polymerization of 1,3-Dienes by Nitroxide-Mediated Procedures", Macromolecules 33, 363-370 (2000)参照）。リビングラジカル重合プロセルのケミストリの概要は、リビングラジカル重合の一般的な反応スキームを示す図３に表示されている。このような反応は、構造の明確な水溶性ポリマーを生成するのに有用である。
【００３２】
図３に示すように、反応開始後、成長ラジカル鎖（Pn-）は、モノマー（M）を付加して成長を続けるか、或いは、解重合可能な末端キャッピングする化学種（T）と反応して成長停止状態の鎖（Pn-T）を形成する。所定の時間の経過後、ほとんどのポリマー鎖は反応停止状態となり、活性な鎖の濃度は、２本の鎖が互いにぶつかって反応停止する確率が劇的に低下するような低濃度（10-6M）となっている。或る程度の反応停止は重合反応全体にわたって継続して生ずるが、結合による反応停止には通常少なくとも１本の非常に短い鎖が関与することから、重合が進行するにつれて反応停止量は徐々に減少する。適切な条件、一般的には高温の条件下で、反応停止状態の化学種が反応して、成長中のラジカル鎖とその化学種Tとを生ずる。次に解重合可能な末端形成化学種Tは、成長中の鎖への付加についてモノマーと競合する。活性の鎖と反応停止鎖との平衡状態が短時間で達成されると多分散度（polydispersity）の小さい樹脂が得られる。持続的なラジカルの効果によって、活性ラジカルの濃度が一定に保たれ、重合を許容される速度で進行させることが可能となる。安定なフリーラジカルを用いて現在調査中の水溶性ポリマーの一例として、ポリアクリロニトリルが挙げられる。
【００３３】
２相及び３相のコア／スカート型人工角膜を構築する際に、コア用として異なる材料を用いてもよい。また、細胞増殖印紙、抗生物質、及び他の生物活性物質を、分子として、若しくは埋め込まれた徐放性マイクロカプセル若しくはナノカプセルに入れてスカート部に含めることによって、必要な細胞の増殖を促進し、炎症や人工角膜の移植に対する他の望ましくない反応を抑制し得る。
【００３４】
ポリメチルメタクリレート（PMMA）は、生物学的に不活性で、透明で、加工が容易で、かつ広範囲の屈折力を有するように製造できることから、さまざまな人工角膜の設計においてコア部用の光学的に透明な材料として用いられてきた（例えば、Kirkhamら, "The Keratoprosthesis: Improved Biocompatibility Through Design and Surface Modification", Ophthalmic Surgery, 22, 455-461 (1991)参照）。しかし、組織の壊死や組織の溶解（コラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素が関与する酵素作用プロセス）は、硬質のPMMAコア部と生体組織の接合部で起こることが多く、水分の漏れや感染症の原因となる。この問題は、生体内における絶え間ない眼球の動きによって動的応力を生じやすい、PMMAの剛性が原因となることがある。人工角膜の剛性を低下させ、炎症、組織の溶解、組織の壊死、その他生じ得る問題のリスクを低下させるため、例えばシリコーンや親水性アクリル樹脂（例えば眼内レンズとして用いられるもの）のようなPMMAより柔軟な他の材料を、人工角膜のコア用に用いてもよい。
【００３５】
本発明の特徴を有する人工角膜を構成する相または複数の相は、架橋を有するもの、或いは孔を有するものとし得る。本発明の特徴を有する人工角膜に用いられる架橋材料は、長期にわたる材料の膨潤を減ずるのを助け、かつ細胞の接着や増殖を促進するのに役立ち得る種々のサイズの孔を分散した形で形成する。人工角膜を構成する材料の架橋処理は、紫外線照射への暴露、例えばグルタルアルデヒド若しくはホルムアルデヒド等の架橋剤の使用、または他の手段や方法を含む何らかの適切な手段によって行うことができる。孔を有する相は、（角膜細胞のサイズに対して）比較的小さいサイズの孔を有し、かつ孔のサイズの分布は狭いのが好ましい。孔のサイズの分布が狭い材料（例えば、孔のサイズのばらつきが概ね１０倍以内の範囲に収まる材料）が好ましく、そのような材料は孔のサイズのばらつきの分布が広い材料より一層容易に被移植者の眼に受容される人工角膜を提供する。しかし、孔のサイズのばらつきの分布が広い材料（例えば、孔径に概ね２０倍以上のばらつきがある場合）は、好ましくない。
【００３６】
本発明の特徴を有する人工角膜は、例えば成長因子、サイトカイン、抗生物質、または他の薬物やホルモンを含む生物活性物質を含むか、そのような物質でコーティングされてもよい。例えば、人工角膜をコラーゲンの層でコーティングすることによって、その機能を高め、拒絶反応の危険を減らすことができる。同様に、人工角膜は成長因子や他の生物活性材料でコーティングされてもよい。
【００３７】
人工角膜の上に角膜上皮細胞を増殖させることによって、その機能が改善し、拒絶反応のリスクが低減する。そのような上を覆う成長は、例えば成長因子、サイトカイン、抗生物質、または他の生物活性物質によって促進させることができる。人工角膜の上を覆う角膜上皮細胞の成長の誘導は、被移植者の眼への移植前、移植後、若しくはその両方のタイミングで行うことができる。
【００３８】
細胞成長因子、抗生物質、及び他の生物活性物質をスカート部材料に加えるための方法はいくつかある。１つの技法は、その細胞増殖に関与するタンパク質をコラーゲンマトリックスに結合するために、GPI（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカーへの共有結合を利用することである。成長因子のGPI分子への共有結合は、それらを細胞膜や他の基質に固定するための重要なメカニズムとして認識されている（例えば、Low, M.G., "Glycosyl-phosphatidylinositol: a Versatile Anchor for Cell Surface Proteins", The FASEB Journal, 3, 1600-1608 (1989)参照）。成長因子、抗生物質、若しくはその両方をスカート部材料に組み入れるための別の方法は、スカート部マトリックスに埋め込まれたマイクロサイズまたはナノサイズの粒子を用いる高分子ドラッグデリバリー（例えば、Fuら, "Protein Stability in Controlled Release Systems", Nature Biotechnology, 18, 24-25 (2000)参照）を利用することである。ポリマーのシェルに包入された薬物の分子は、化学的または酵素の作用によって形成される孔を通して放出され得る。また、薬物分子がポリマーに埋め込まれて、分子自体がポリマーから飛び出すか、ポリマーの分解によって分散するようにもし得る。このメカニズムはコラゲナーゼ阻害剤のデリバリーのために利用でき、例えば局所性1％のメドロキシプロゲステロンは、動物における角膜の潰瘍形成の抑制及びゼラチナーゼ及びコラゲナーゼ合成の低減に有効であり、1％テトラサイクリン溶液は強力な酵素阻害剤である。別の例として、サイモシンβ4が、特に角膜上皮細胞に対する強力な治癒因子であることが最近発見された（例えば、Malindaら, "Thymosin 04 Accelerates Wound Healing" Journal of Investigative Dermatology, 113, 364-368 (1999)参照）。従って、局所性1％のメドロキシプロゲステロン、1％テトラサイクリン溶液、サイモシンβ4及びその他の薬剤、例えば角膜移植後の合併症を低減するための術後管理で使用される他の薬剤は、本発明による人口角膜に含めるのに適している。
【００３９】
周縁のスカート部へ細胞を侵入させ、かつ移植人口角膜の表面上を上皮細胞で覆わせるべく組織一体化を促進するように構成された表面を得るため、表面科学の分野で使用される技術、例えば微細加工技術等を人口角膜に適用することができる。明確で決められた構造のスカート部とコア部との境界面を形成するために、表面科学及び微細加工技術を、化学的ストラテジーと組み合わせて利用することができる。上皮細胞の成長を促進するために、生体適合性の材料（例えばコラーゲン）を人口角膜の表面に結合するために表面を改変する他の異なる手順を利用できる。例えば、角膜表面を形成するためにDesaiら, "Nanopore Technology for Biomedical Applications", Biomedical Microdevices, 2, 11-40 (1999)に記載の技術を用いることができる。
【００４０】
中心光学的コア部の一部をマスクすることができ、かつコア部に他の材料を結合できるようにするため露出された表面を化学的に処理することができる。これを行うためには幾つかの方法がある。一般的には、処理される表面は、重合可能な界面活性剤、架橋剤、及びフリーラジカル開始剤の水性分散液に浸漬される。次にその表面を紫外線に曝露し、永久架橋表面コーティングを形成する（例えば、Valint, "Surface Coating of Polymer Objects ", 米国特許第5,135,297号参照）。コア部の表面とその外辺部の両方をこのように処理することができる。人工角膜への細菌の付着を抑制したり、或いは人工角膜への血小板の堆積を減らすために、コラーゲンでコーティングされた表面を用いて人工角膜の表面を作成してもよい（例えば、McGradyら, "Specific and Charge Interactions Mediate Collagen Recognition by Oral Lactobacilli", J.Dent.Res., 74, 649-657 (1995); Abulenciaら, "Comparitive Antiplatelet Efficacy of a Novel, Nonpeptide GPIIb/lIla. Antagonist (XV454) and Adciximab (c7E3) in Flow Models of Thrombosis", Arterioscler.  Thromb. Vasc. Biol., 21, 149-156 (2001)参照）。また、生体適合性を高め、生体内での人工角膜のトレランスを更に改善するために、異なる種類の動物のコラーゲン、及び患者のストロマからの自己由来コラーゲンを周縁スカート部において用いてもよい。
【００４１】
そのようなコラーゲンコーティングは、人工角膜の上での細胞増殖を補助する作用を高めるのに効果的である。他の処置、例えばI型コラーゲン、I型コラーゲンでコーティングしたポリ（ビニルアルコール）コポリマー、ヒドロキシエチルメタクリレート（HEMA）とメチルメタクリレートのコポリマー、及び他の化合物や混合物等で人工角膜を処置することは、人工角膜への上皮の接着を促進したり、患者におけるインプラントのトレランスを高めるのに有効な細胞成長を促進するために有効である（例えば、Kirkhamら, "The Keratoprosthesis: Improved 17/28 Biocompatibility Through Design and Surface Modification", Ophthalmic Surgery, 22, 455-461 (1991)参照）。
【００４２】
自己組織化単層モデルの表面とペプチド、タンパク質、及び細胞との相互作用は、-CF3末端、-CH3末端、-CO2CH3末端、及び-CH2OH末端の機能性を利用することによって、ある範囲の酸化状態を有するようにすることができる（例えば、Margelら, "Peptide, Protein, and Cellular Interactions With Self-Assembled Monolayer Model Surfaces" J. Biomed. Mater. Res., 27, 1463-1476 (1993)参照）。ポリマー材料の表面上のアミノ基は、酸水解によって脱保護化できる（例えば、Zhengら, "Modification of Materials Formed From Poly(L-lactic acid) to Enable Covalent Binding of Biopolymers: Application to High-Density Three-Dimensional Cell Culture in Foams With Attached Collagen" In Vitro Cell Dev. Biol. Anim., 34, 679-684 (1998)参照）。そして脱保護化されたアミノ基にコラーゲンを共有結合させ、高密度の細胞増殖が可能な表面を形成できる。このようにして、例えばポリエステル等の合成ポリマー医用生体材料上での上皮細胞成長を促進させることができる（例えば、Tjiaら, "Substrate-Absorbed Collagen and Cell Secreted Fibronectin Concertedly Induce Cell Migration on Poly(lactide-glycolide) Substrates", Biomaterials, 20, 2223-2233 (1999)参照）。現在、ポリマー表面にタンパク質を結合することで複合材料の機能に変化を与えられること、そして境界面の適切な設計によってその機能を最適化できることは十分に認められている。細菌の付着が少なく、細菌性の感染症を抑制できるポリマー医用生体材料の設計方法については、例えば、Montdargentら, "Toward New Biomaterials " Infect. Control Hosp. Epidemiol., 21, 404-410 (2000)に記載されている。
【００４３】
このような生物活性物質を人工角膜に結合するに適した改変を利用して、例えば抗生物質のような任意の所望の生物活性物質を結合し得る。本発明の特徴を有する人工角膜インプラントに組み込むのに適した抗生物質としては、ペニシリン、アンピシリン、アモキシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、アミノグリコシド、キノロン、ポリミキシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、サルファ剤、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、スルホンアミド、セフチオフル結晶の遊離酸、塩酸セフチオフル、チロシン、チルミコシン、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、トブラマイシン、ゲンタマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシン、グラミシジン、ナフチリジン、及びエリスロマイシン；テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン等のテトラサイクリン類；エンロフロキサシン、ダノフロキサシン、プリマフロキサシン（premafloxacin）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、及びシプロフロキサシン等のフルオロキノロン誘導体；スルホンアミド、スルファセタミド、スルファメチゾール、及びスルフイソキサゾール等の抗菌薬；ニトロフラゾン及びプロピオン酸ナトリウム等の他の抗菌薬；及びイドクスウリジンを含む抗ウイルス薬、及びこれらの化合物の類似体（analogs）、誘導体及び塩が挙げられる。
【００４４】
成長因子、発育因子、成長阻害物質、接着分子、サイトカイン、及びホルモンを、本発明の特徴を有する人工角膜に組み込んでもよい。本発明の特徴を有する人工角膜インプラントに組み込むに適した成長因子やサイトカインとしては、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、神経成長因子（NGF）、インシュリン様成長因子（IGF-I及びIGF-IなどのIGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、酸性線維芽細胞成長因子（AFGF）及び塩基性線維芽細胞成長因子（BFGF）等の維芽細胞成長因子（FGF）、肝細胞成長因子（HGF）、トランスフォーミング成長因子α（TGF-α）やトランスフォーミング成長因子β（TGF-β）等のトランスフォーミング成長因子（TGF）、上皮成長因子（EGF）、結合組織成長因子（CTGF）、インターロイキン、インターフェロン、プレイトロフィン（PTN）、白血病抑制因子、コロニー刺激因子１（CSF-1）、血管内皮成長因子（VEGF）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、運動神経成長因子（NWGF）、及びホルスコリン等が挙げられる。本発明の特徴を有する人工角膜インプラントに組み込むに適したホルモンとしては、エストロゲン、テストステロン、甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、プロラクチン、エリスロポエチン、及びインスリン等が挙げられる。
【００４５】
生体適合性は、術後の合併症を最小限にする、人工角膜の設計に際して重要な要素である。一般的にはポリマーである人工角膜を作成するために用いられる材料の物理的、化学的特性は、人工角膜の生体適合性を決定するために重要な因子である。例えば、ポリマーの孔径は組織の一体化について重要な要素である（例えば、Trinkaus-Randall V.ら "In vivo fiboplasia of a porous polymer in a cornea." Invest Ophthalmol Vis Sci 32,3245-51 (1991); TrinkaussRandall Vら"In vitro evaluation of fibroplasias in a porous polymer." Invest Ophthalmol Vis Sci 31,1321-6 (1990)参照）。スカート部に用いるための幾つかの異なる種類のポリマーに対して生体適合性についての動物実験が行われたが、これにはポリテトラフルオロエチレン（PTFE）（商用名Proplast（登録商標）、Gore-Tex（登録商標））や延伸ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）が含まれる。これらの材料のなかではePTFEが好適である（例えば、Legeaisら"A second generation of biointegrable keratoprosthesis. First in vivo evaluation" (abstract) Invest Ophthalmol Vis Sci 37 (suppl) 37,1450 (1996); Legeaisら, "Advances in artificial corneas" (abstract). Invest Ophthalmol Vis Sci 37 (suppl) 36,1466 (1995)参照）。
【００４６】
或いは、炭素繊維のスカート部、ポリプロピレン／ポリブチレン・コポリマーのスカート部、ポリ（２ヒドロキシエチルメタクリレート）（pHEMA）または他の材料は、良好な組織の一体化をもたらし得る（例えば、Kain "The develoment of the silicone-carbon keratoprosthesis" Refract Corneal Surg 9,209-10 (1993); TrinkausRandallら "In vitro fibroplasias of aporous polymer in the cornea" Invest Ophthalmol Vis Sci 32,3245-3251 (1991); Chirila TV, Constable IJ,, Crawford GJら: Poly(2-hydroxyethy methacrylate) spoges as implant materials: in vivo and in vitro evaluation of cellular invasion" Biomaterials 14,26-38 (1993)参照）。
【００４７】
ポリマーの性能について組織培養物を用いてin vitroで及びin vivoで試験して、ポリマーの孔への細胞の侵入のレベルを決定し、好ましいポリマー材料を決定し得る。加えて、成長因子、抗生物質、抗炎症薬（例えばメチルプレドニゾロン）等の付加物質の効果は、そのような動物モデルで評価し得る。例えば、候補の人工角膜材料を試験方法を含む、人工角膜インプラントの生体適合性の評価方法では、試験されるインプラントまたは材料を動物モデルの生体内の角膜に挿入し、炎症のレベルや押出され率（rate of extrusion）を評価し、組織の一体化、炎症、及び組織の壊死や押出され等の合併症のレベルをモニタリングする。上皮細胞の増殖や組織の一体化を促進するために、人工角膜に対して、表面に上皮の移行が可能となるようなコーティングや微細加工を施したり、成長因子や成長促進物質を含める等の追加の改変を施してもよい。そのような処理や改変の効果は、例えば炎症や細胞浸潤のレベルを評価する動物モデルを含む同じアッセイによって決定できる。また、術後の炎症のレベルは、人口角膜内に入れられ抗生物質の量によって制御する。この場合も同様に、炎症のレベルは動物モデルで評価する。
【００４８】
例えば、I型コラーゲンでコーティングしたポリ（ビニルアルコール）コポリマーは、上皮接着や増殖を促進することが知られている（例えば、Trinkauss-Randallら"Development of a biopolymeric kertoprosthetic material." Invest Ophthalmol Vis Sci 29,393-400 (1988)参照）。上皮細胞成長を助ける他のポリマーとしては、ヒドロキシエチルメタクリレート（HEMA）とメチルメタクリレート（MMA）のコポリマー等が挙げられる（例えば、Hicksら, "Keratoprosthesis: "Advancing toward a true artificial cornea." Survey of Ophthalmology 42,175-189 (1997)参照）。
【００４９】
以上、本発明について、発明の範囲の制限を意図するのではなく発明のあらゆる側面について例示することを意図して示した幾つかの実施例に基づいて説明してきた。従って、本発明は、実施形態の細部について変更して実施することが可能であり、そのような変更はこの開示内容から当業者が想到できるものである。例えば、材料の一方の側（この真s区は材料の前側）における上皮形成や組織一体化を促進するように表面を改変した生体適合性材料を作成できる。例えばpHEMAヒドロゲルの表面の改変は、様々な化学的方法によって達成できる。好ましい方法は、以下に限定されないが、pHEMAをTEMPO／漂白剤の何れかで酸化して、表面にアルデヒドを生成する方法である（TEMPO＝2,2,6,6テトラメチル-1-ピペラジニルオキシ，フリーラジカル）。これらの酸化技術は、合成pHEMAヒドロゲルのレンズ表面の改変に適用されており（例えば出願人の研究所内で合成されたものは、6%メタクリル酸、93%HEMA＝2-ヒドロキシエチルメタクリレート、及び1%EGDMA＝図４に示すようなエチレングリコールジメタクリレート、という組成のもの）、市販のものとしてはVifilcon-A（登録商標）コンタクトレンズ（American Optical製、55%水、主要構成成分：HEMA及びPVP＝ポリ（ビニルピロリドン））がある。
【００５０】
表面の改変を確実に達成するため、これらの「表面改変」ヒドロゲルレンズの両方を1-ピレンメチルアミンで処理し、図５に示すようなピレンイミン改変ヒドロゲル（pyrene-imine modified hydrogel）を生成した。よく洗浄した後、これらの化合物は紫外線の下で蛍光発光したが、これは表面が改変されたことを表している。ヒドロゲル（合成pHEMA及びVifilcon-A（登録商標））の第１アルコールからアルデヒドへの表面酸化の概略を表した図５に示すように、蛍光性1ピレンメチルアミンとともに濃縮して、ピレンイミン改変ヒドロゲルを生成した。末端アルコールを有する未反応ヒドロゲル（合成pHEMA及びVifilcon-A（登録商標））は1-ピレンメチルアミンと反応せず、従って蛍光発光しなかった。
【００５１】
これらの表面改変技法の目的は、in vivoで上皮形成を促進する傾向を有するヒドロゲルを生成することである。この目的のため、本出願人は、ウシの器官培養モデルの眼球への外科的移植について２種類の表面改変ヒドロゲルレンズ（合成pHEMA及びVifilcon-A（登録商標））を調べた。何れの場合も、表面改変ヒドロゲルがin vivoで上皮形成を促進することが確認されたが、表面を改変していないヒドロゲルにはそのような傾向は見られなかった。これらの外科用インプラントの組織学的検査によって、コラーゲンに共有結合した改変pHEMAを覆う上皮細胞層が確認された。
【００５２】
pHEMAの表面の改変を更に進めて、カルボキシル基を生成することができる。BCl3を用いた酸化的エステル切断や、KMNO4 or Ag2Oによる末端アルコールの酸化等の化学的技法を用いることもできる。これら表面への機能性付与に対する代替技術として、プラズマ堆積を利用することもできる。また、これらのカルボキシル基にコラーゲンを共有結合させて、典型的なジシクロヘキシルカルボジイミドを介する結合によってアミド結合を形成することができる。
【００５３】
上記の実施形態の変更は、特許請求の範囲によって規定される本発明の技術思想及びその均等物の範囲内に含まれるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の特徴を有する人工角膜の模式図であり、角膜インプラントとして眼球に縫合され得るコア／多孔性スカート構造物を示している。
【図２】本発明の特徴を有する人工角膜の中心光学コア部に結合されたポリマーブラシの模式図を示す。
【図３】構造の明確な水溶性ポリマーを作るのに役立つリビングラジカル重合法の反応スキームの概略を示す。
【図４】本発明の特徴を有する架橋pHEMAヒドロゲルの合成法を示す。
【図５】ヒドロゲル（合成pHEMA及びVifilcon-A（登録商標））を第１アルコールからアルデヒドに表面酸化する本発明の実施の概略説明を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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