(57)【要約】本明細書に記載する装置及び方法は、例えばＰＣＲ増幅又は等温増幅のような核酸反応中の蛍光偏光（ＦＰ）を検出する。多重サンプル中で、蛍光偏光を同時検出することができる。さらに、同じ反応中に、サンプル内の異なる配列を検出するために多重の異なる発蛍光団を用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
空間的に識別可能な核酸サンプルを含むサンプル・キャリヤー；該サンプル・キャリヤーの第１領域の範囲内の複数の空間的に識別可能なエリア中に位置した蛍光化合物を偏光によって同時に励起させるように設定された光源；該第１領域中の複数の該エリアの各々中の蛍光化合物からの発光を同時に検出するように設定された検出系；該サンプル・キャリヤーの温度を調節するように設定された熱制御ユニットを含む装置。
【請求項２】
熱制御ユニットが、該キャリヤーを反応過程中に周期的に加熱し、冷却するように設定される、請求項１記載の装置。
【請求項３】
サンプル・キャリヤーが検出系及び光源の一方又は両方に対して固定される、請求項１記載の装置。
【請求項４】
サンプル・キャリヤーが複数の物理的に結合したエリアを含む、請求項１記載の装置。
【請求項５】
複数のエリアの各々がサンプル・キャリヤー内でコンテナーを含む、請求項４記載の装置。
【請求項６】
検出系がさらに、第１極性の発光及び第２極性の発光を検出するように設定される、請求項１記載の装置。
【請求項７】
第１極性と第２極性とが相互にほぼ直交する、請求項６記載の装置。
【請求項８】
第１極性が光源からの偏光の極性に平行し、第２極性が光源からの偏光の極性に平行でない、請求項６記載の装置。
【請求項９】
検出系が、第１極性光と第２極性光とを同時に検出するように設定される、請求項６記載の装置。
【請求項１０】
検出系が、第１検出器及び第２検出器を含む、請求項６記載の装置。
【請求項１１】
検出系が、単独の検出器を有し、第１極性光と第２極性光とが該検出器の異なる領域上に発射される、請求項９記載の装置。
【請求項１２】
検出系がさらに、第１極性光と第２極性光とを連続的に検出するように設定される、請求項６記載の装置。
【請求項１３】
検出系が、第１極性光と第２極性光との連続的検出を可能にするように制御される偏光子を含む、請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
検出系がさらに、第１発蛍光団からの偏光を第２発蛍光団からの偏光から識別するように設定される、請求項１記載の装置。
【請求項１５】
第１領域がサンプル・キャリヤーの全ての物理的に識別可能なサンプルを含む、請求項６記載の装置。
【請求項１６】
該装置がさらに、スキャンニング・ミラーを含む、請求項１記載の装置。
【請求項１７】
スキャンニング・ミラーが、光源からの励起光を反射する、請求項１６記載の装置。
【請求項１８】
スキャンニング・ミラーが、サンプル・キャリヤーからの発光を検出器まで反射する、請求項１６記載の装置。
【請求項１９】
光源から放射される光路が、検出器への入射光路に平行である、請求項１記載の装置。
【請求項２０】
検出器が、光源と、サンプル・キャリヤーのイメージング可能な表面との間に配置される、請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
光源からサンプル・キャリヤー表面への光路又はサンプル・キャリヤーのイメージング可能な表面から検出器への光路が、該イメージング可能な表面に関して、傾斜している、請求項１記載の装置。
【請求項２２】
光源がさらに、第２領域を励起させるように設定され、検出系がさらに、該第２領域からの発光を検出するように設定される、請求項１記載の装置。
【請求項２３】
検出系が、光源からの偏光に平行な面内の光を検出するように設定される、請求項１記載の装置。
【請求項２４】
検出系及び光源が、励起と検出との間の時間的な遅延を可能にするように、シグナル連絡する、請求項１記載の装置。
【請求項２５】
各々が、発蛍光団に結合する核酸プライマーを包含する増幅試薬を含む、複数の空間的に識別可能な反応サンプル；核酸増幅のために反応サンプルの条件を制御するように設定される増幅制御ユニット；複数の反応サンプルの各々に関連した蛍光偏光を同時にモニターするように設定される蛍光偏光モニターを含む装置。
【請求項２６】
蛍光偏光モニターが偏光源と、複数の反応サンプルの各サンプルからの発光を同時にモニターすることができる検出器を含む、請求項２５記載の装置。
【請求項２７】
検出器が、所定極性の発光を同時にモニターするように設定される、請求項２６記載の装置。
【請求項２８】
検出器が、第１極性の光及び第２極性の光を連続的に検出するように設定され、第１極性の光が光源からの偏光面に平行である、請求項２７記載の装置。
【請求項２９】
第１極性と第２極性とが相互に直交する、請求項２８記載の装置。
【請求項３０】
サンプルの少なくとも幾つかが、第１発蛍光団とはスペクトル的に識別可能である第２発蛍光団に結合する第２核酸プライマーを含み、検出器が、第１発蛍光団及び第２発蛍光団からの発光を識別することができる光学フィルターを含む、請求項２５記載の装置。
【請求項３１】
空間的に識別可能な核酸サンプルと、核酸プライマーに結合する発蛍光団を含む増幅試薬とを用意すること；複数のサンプルの各サンプルを同時に増幅すること；及び該増幅中に、該複数のサンプルの各サンプルからの発蛍光団に関連した蛍光偏光情報を同時に検出することを含む方法。
【請求項３２】
該検出が、増幅中の少なくとも複数のインスタンスの蛍光偏光情報を検出することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
該増幅が熱サイクルを含み、該検出が、各サイクルに関して少なくとも１つのインスタンスの蛍光偏光情報を検出することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
各サイクルの該少なくとも１つのインスタンスが、該サイクルの所定温度におけるインスタンスである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
増幅及び検出が、複数の空間的に識別可能なサンプル中に位置する発蛍光団を偏光によって同時に励起させるように設定された光源；及び複数の空間的に識別可能なサンプルの各々中の発蛍光団からの発光を同時に検出するように設定された検出系を含む装置によって行なわれる、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
増幅がＰＣＲ増幅を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
ＰＣＲ増幅が指数関数的増殖を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ＰＣＲ増殖が線形増殖を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
検出が、発蛍光団を励起偏光で励起させ、第１所定面における発光を検出することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
第１所定面が、励起偏光面に平行である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
検出がさらに、第２所定面における発光を検出することを含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
第１所定面及び第２所定面における発光が同時に検出される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
第１所定面及び第２所定面における発光が別々の時間に検出される、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
サンプルの各々が、サンプル・キャリヤーの別々のアドレスに配置される、請求項３５記載の方法。
【請求項４５】
サンプル・キャリヤーが、増幅の間中、光源及び／又は検出系に対して固定されている、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
核酸サンプル、増幅試薬及び、二本鎖核酸に結合可能であり、一本鎖核酸に比較して二本鎖核酸に対して少なくとも１０倍の選択性を有する蛍光プローブを包含する反応混合物を用意すること；複数のサンプルの各サンプルを増幅すること；並びに該増幅中に、少なくとも複数のインスタンスにおける蛍光プローブに関連した蛍光偏光情報を検出することを含む方法。
【請求項４７】
蛍光プローブが挿入染料である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
該染料がＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ又は臭化エチジウムである、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
異なる核酸サンプルを有する複数の反応混合物を用意し、該混合物を同時に増幅し、同時に検出する、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
核酸サンプルと、第１核酸プライマーに結合した第１発蛍光団及び第２核酸プライマーに結合した第２発蛍光団を含む増幅試薬とを用意すること；該第１プライマー及び第２プライマーを用いて、サンプル中の核酸を増幅すること；並びに該増幅中の少なくとも複数のインスタンスにおいて、該発蛍光団の各々に関連した蛍光偏光情報を検出することを含む方法。
【請求項５１】
第１発蛍光団及び第２発蛍光団が識別可能な吸収スペクトル及び／又は発光スペクトルを有する、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
該検出が、第１波長における第１発蛍光団の蛍光偏光情報及び第２波長における第２発蛍光団からの蛍光偏光情報を連続的に検出することを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
第１プライマーと第２プライマーとが同じ遺伝子にハイブリダイズする、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
核酸サンプルと、第１核酸種に特異的な第１核酸プライマーに結合した第１発蛍光団及び第２核酸種に特異的な第２核酸プライマーに結合した第２発蛍光団を含む増幅試薬を用意すること；該第１プライマー及び該第２プライマーを用いて、該サンプル中の核酸を増幅すること；並びに該増幅中の少なくとも複数のインスタンスにおいて、該発蛍光団の各々に関連した蛍光偏光情報を検出することを含む方法。
【請求項５５】
検出が、第１波長における第１発蛍光団の蛍光偏光情報及び第２波長における第２発蛍光団からの蛍光偏光情報を連続的に検出することを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
第１発蛍光団及び第２発蛍光団が、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ローダミン及びＣｙ７から成る群から選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも４種類の異なる標識されたプライマーを用いて、検出する、請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
機械可読媒体の物品であって、プロセッサに、強度値を測定する工程、この場合に（ｉ）各強度値を励起偏光に対してほぼ垂直な蛍光を表す値と励起偏光に対してほぼ平行な蛍光を表す値との関数として測定する、（ｉｉ）標的核酸に対して特異的なプライマーに結合した発蛍光団からの蛍光を検出する、及び（ｉｉｉ）各強度値が核酸増幅反応中の時間的インスタンスに対応する；増幅反応の指数関数帯の範囲内の強度値から初期強度値を補外する工程；並びに標的核酸の初期濃度を推論する工程を含む方法を行なわせるインストラクションを含む物品。
【請求項５９】
推論が、標的核酸の推論された初期強度値を、既知分子濃度の基準核酸の同様に推論された初期強度値と比較して、該標的核酸の推定初期分子濃度を決定することを含む、請求項５８記載の物品。
【請求項６０】
機械可読媒体の物品であって、プロセッサに、各イメージング部位が標的核酸の増幅プライマーを包含する、複数のイメージング部位における確定極性の検出光についての情報を各マップが包含する複数のイメージ・マップを受け取る工程；及びイメージング部位の各々における伸長したプライマーの存在度を表示する値を測定する工程を含む方法を行なわせるインストラクションを含む物品。
【請求項６１】
イメージング部位の各々が、マルチ−サンプル・キャリヤー上のサンプルに対応する、請求項６０記載の物品。
【請求項６２】
複数のイメージ・マップが、反応中の種々なインスタンスにおける検出光についての情報を包含するマップを含む、請求項６０記載の物品。
【請求項６３】
イメージング部位の少なくとも１つが、既知分子濃度の基準サンプルに対応する、請求項６２記載の物品。
【請求項６４】
インストラクションがさらに、プロセッサに、基準サンプルに対応するイメージング部位の情報から、少なくとも幾つかのイメージング部位の標的核酸の初期濃度を推論させる、請求項６３記載の物品。
【請求項６５】
機械可読媒体上に記憶されたデータベースであって、（ａ）蛍光偏光評価、（ｂ）反応サンプル、（ｃ）時間的情報、並びに各蛍光偏光評価を反応サンプル及び時間的値に関係付ける関連性を表すデータを含むデータベース。
【請求項６６】
各マップが、複数のイメージング部位における確定極性の検出光についての情報を包含する、複数のイメージ・マップを含む、機械可読媒体上に記憶されたデータベースであって、各マップの検出光が発蛍光団に関係し、各マップが核酸増幅反応中の時間的インスタンスに関係するデータベース。
【請求項６７】
（１）複数の核酸増幅部位における反応条件を制御するように設定される増幅制御ユニット；及び（２）該複数部位の各部位に関係した蛍光偏光を同時にモニターするように設定された蛍光偏光モニターを含む装置；並びに該装置から、蛍光偏光についての情報を受け取って、該複数部位の各部位における核酸種の濃度と相関する初期値を推論するように設定されたプロセッサを含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
この記載は、蛍光偏光による核酸検出に関する。サンプル中の少量の特定核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて検出することができる。いわゆるリアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲ反応における核酸を反応の過程中にモニターする。リアルタイムＰＣＲは、核酸濃度の定量を補助している。
【０００２】
Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｒ．等（Biotechnology(NY)1993;11(9):1026-1030)は、反応中に存在する増幅核酸の量をモニターするために挿入染料(intercalating dye)、臭化エチジウムを用いたリアルタイムＰＣＲ法を述べている。染料が挿入されると、臭化エチジウムの蛍光が変化する。該反応中の蛍光レベルを時間に対してプロットして、出発サンプルの量の測定に用いている。高い感度と信頼度で、サンプルの定量が達成されている。しかし、核酸への臭化エチジウムの結合は、特定の標的配列に対して特異的ではなく、したがって、標的配列と非標的核酸とを区別することができない。
【０００３】
別のリアルタイムＰＣＲ手法は、標的配列に特異的なプローブ配列をモニターする５’ヌクレアーゼ・アッセイを包含する（Holland PM et al,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280; Lee LG et al,(1993)Nucl.Acids Res 21(16):3761-3766; Livak KJ et al,(1995)PCR Meth.Appl.4(6):357-362)。このアッセイにおけるプローブは、５’蛍光染料及び３’クエンチング染料を包含する。該プローブがテンプレートに結合すると、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性が、プライマーから３’クエンチング染料を切断する。次に、５’蛍光染料が、励起されると、より強力な蛍光シグナルを与える。
【０００４】
概要
１つの態様では、本発明は、サンプル・キャリヤーの第１領域内の複数の、空間的に識別可能なエリアに位置する蛍光化合物を偏光によって同時に励起させるための光源；及び該第１領域内の複数のエリアの各々中の該蛍光化合物からの発光を同時に検出するための検出系を包含する装置を特徴とする。該装置はさらに、空間的に識別可能な核酸サンプルを包含するサンプル・キャリヤーの温度を調節するため、例えば、該キャリヤーを反応過程中に周期的に加熱し、冷却するための熱制御ユニットをも包含する。
【０００５】
該検出系はさらに、反応過程中の少なくとも複数のインスタンスにおける発光を同時に検出するように設定されることができる。さらに、該検出系は、検出系及び光源の一方又は両方に対して相対的に該サンプル・キャリヤーを移動させることなく、第１領域からの発光を検出することができる。
【０００６】
該装置はさらに、サンプル・キャリヤー、例えば、複数の個別エリア(discrete area)を有するキャリヤーを包含することができる。例えば、サンプル・キャリヤー内で、複数エリアの各エリアはコンテナーを包含する。各コンテナーは、物理的に識別可能な核酸サンプルの１つを包含することができる。１実施態様では、第１領域がサンプル・キャリヤーの、物理的に識別可能な全てのサンプルを包含することができる。
【０００７】
１実施態様では、複数の個別エリアの少なくとも一部は、相互に連続している（例えば、相互から物理的に単離していない）。該複数の個別エリアの各エリアは、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡ若しくはＤＮＡポリメラーゼ）及び／又は核酸リガーゼを包含することができる。典型的なサンプルは、合成的又は生物学的サンプル、例えば、組織学的調製物、細胞、抽出物若しくは細胞、環境的サンプルを包含する。細胞サンプルの場合には、細胞を薄く塗る(spread)ことができる。
【０００８】
１実施態様では、検出系はさらに、第１極性の発光及び第２極性の発光を検出するように設定される。
第１極性と第２極性とは、相互にほぼ直交することができる。１実施態様では、第１極性と第２極性とは少なくとも３０°離れており、例えば、約４５°離れている。１実施態様では、第１極性は光源からの偏光の極性に対してほぼ平行（例えば、１０°の範囲内）である。第２極性は光源からの偏光の極性に対して平行ではない（例えば、垂直である）ことができる。検出系はさらに、少なくとも第３極性の発光を検出するように設定されることができる。
【０００９】
検出系は、第１極性光と第２極性光とを同時に検出することができる。１実施態様では、検出系は、第１検出器及び第２検出器を包含する。別の実施態様では、検出系は、単独の検出器から成り、第１極性光及び第２極性光が該検出器の異なる領域上に発射される。
【００１０】
検出系は、第１極性光と第２極性光とを連続的に検出することができる。１実施態様では、検出系は、第１極性光と第２極性光との検出を可能にするように制御される偏光子(polarizer)を包含する。
【００１１】
検出系と光源とは、例えば、発光の検出が励起に関して時間的に遅延する場合に、例えば、過渡的状態の検出を可能にするように、シグナル連絡することができる。該装置は、定常状態の検出のために設定されることもできる。
【００１２】
１実施態様では、検出系はさらに、第１発蛍光団からの偏光を少なくとも第２発蛍光団の偏光から識別するように、例えば、第１発蛍光団からの蛍光偏光と第２発蛍光団からの蛍光偏光とを検出し、識別するように設定される。該系はさらに、第３発蛍光団（例えば、５若しくは６発蛍光団より大きい発蛍光団）、例えば本明細書に記載する発蛍光団の蛍光偏光を検出する及び／又は識別することができる。
【００１３】
熱制御ユニットはさらに、サンプル・キャリヤー中のサンプル及び／又は熱源及びヒートシンク中の溶液温度を検出する熱プローブを包含することができる。１実施態様では、熱制御ユニットはさらに、サンプル・キャリヤーに熱勾配を選択的に与えるように設定される。熱制御ユニットはプロセッサによっても調節することができ、該プロセッサは、ユーザーによって、例えば、ユーザー・インタフェースから与えられるインストラクションを（直接に又は間接に）受け取ることができる。該インストラクションは、熱サイクルに関する情報を包含することができる。
【００１４】
光源は、電球(bulb)又はレーザーを包含することができる。光源は、帯域フィルター、偏光子及びディフューザーの１つ以上を包含することができる。１つ以上の光ファイバーを照射するように、光源を配置することができる。１実施態様では、該装置は、サンプル・キャリヤーの第１領域群(a first plurality of regions)を照射するように設定された１束を含めた、複数の光ファイバー束を包含し、第２光ファイバー束はサンプル・キャリヤーの第２領域群(a second plurality of regions)を設定する。第１群及び第２群の領域はオーバーラップすることができ、例えば、第１群及び第２群の領域は、同一の広がりを有することができる。例えば、第１領域群が第１インデックスによってスペースを決められた領域に相当するのに対して、第２領域群は第２インデックスでスペースを決められた領域に相当しうる。
【００１５】
１実施態様では、該装置はさらに、ビームスプリッターを包含し、該ビームスプリッターは、それぞれ、励起光をサンプル・キャリヤーに反射し、及び／又は発光を検出器に反射するように配置される。１実施態様では、該装置はさらに、スキャンニング・ミラー(scanning mirror)を包含し、スキャンニング・ミラーは、例えば、光源からの励起光を反射する、又は発光を検出器に反射するように配置される。
【００１６】
検出系は、光電子増倍管（ＰＭＴ）又は電荷結合素子(charged coupled device)（ＣＣＤ）を包含することができる。検出系は、イメージ・マップ（例えば、ピクセル化イメージ(pixilated image)を形成するイメージング系を包含することができる。
【００１７】
１実施態様では、光源から放射される光路は、検出器中への入射光路に平行である。１実施態様では、検出器が、光源と、サンプル・キャリヤーのイメージング可能な(imageable)表面との間に（又はインラインに）配置される。
【００１８】
別の実施態様では、光源からサンプル・キャリヤー表面までの光路、又はサンプル・キャリヤーのイメージング可能な表面から検出器までの光路は、該イメージング可能な表面に関して傾斜している。例えば、両光路が傾斜していることが可能である。
【００１９】
１実施態様では、光源がさらに、第２領域を励起させるように設定され、検出系がさらに、該第２領域からの発光を検出するように設定される。
別の実施態様では、本発明は、各々が、発蛍光団に結合する核酸プライマーを包含する増幅試薬を含む、複数の空間的に識別可能な反応サンプル；核酸増幅のために反応サンプルの条件を制御するように設定される増幅制御ユニット；複数の反応サンプルの各々に関連した蛍光偏光を同時にモニターするように設定される蛍光偏光モニターを包含する装置を特徴とする。該装置の実施態様は、本明細書に記載する如何なる特徴をも包含することができる。該装置は、第２サンプル群(a second plurality of samples)を包含することができる。
【００２０】
さらに他の態様では、本発明は、空間的に識別可能な(spatially distinct)核酸サンプルと、核酸プライマーに結合する発蛍光団を含む増幅試薬とを用意すること；複数のサンプルの各サンプルを同時に増幅すること；及び該増幅中に、該複数のサンプルの各サンプルからの発蛍光団に関連した蛍光偏光情報を同時に検出することを含む方法を特徴とする。各プライマーは、種々な核酸種の１つ(a different nucleic acid species)に特異的であることができる。
【００２１】
蛍光偏光情報は、少なくとも、励起光の面に平行な面における発光量に関する情報を包含する。幾つかの場合には、蛍光偏光情報は、励起光の面に平行な面における発光量に関する情報及び励起光の面に垂直な面における発光量に関する情報を包含する。蛍光偏光情報を、励起光の面に平行な面における発光量と、垂直な面における発光量の両方に関する関数である値として表現することが、便利であると考えられる。
【００２２】
該検出は、増幅中の少なくとも複数のインスタンス(at least a plurality of instances)の蛍光偏光情報を検出することを包含することができる。１実施態様では、該インスタンスは、規則的な間隔をおいており、例えば、少なくとも幾つかのサンプルの増幅が飽和相に達するまで、規則的間隔をおいている。１実施態様では、該増幅は熱サイクルを包含し、該検出は各サイクルに関して少なくとも１つのインスタンスの蛍光偏光情報を検出することを包含する。
【００２３】
１実施態様では、増幅及び検出が、本明細書に記載する装置によって、例えば、複数の空間的に識別可能なサンプル中に位置する発蛍光団を偏光によって同時に励起させるように設定された光源；及び複数の空間的に識別可能なサンプルの各々中の発蛍光団からの発光を同時に検出するように設定された検出系を包含する装置によって行なわれる。
【００２４】
指数関数的増殖方法と線形増殖方法の両方を用いることができる。１実施態様では、増殖は、ＤＮＡポリメラーゼ活性、例えば、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ活性に依存する。例えば、増殖は熱サイクル、例えばＰＣＲ増殖、例えば指数関数的又は線形増殖（例えば、第２プライマーを用いない）を包含することができる。別の実施態様では、増殖はＲＮＡポリメラーゼ活性に依存する。例えば、増殖は等温性である。さらに他の実施態様では、増殖は配列特異的開裂イベント、例えば、フラップのエンドヌクレオリティック開裂(endonucleolytic cleavage of a flap)を含む。
【００２５】
サンプル・キャリヤーの別々のアドレスに、サンプルの各々を配置することができる。例えば、サンプル・キャリヤーは、マルチウェル・プレート、プレーナー・アレー等を包含することができる。１実施態様では、該サンプル・キャリヤーは、均一に加熱されない。
【００２６】
１実施態様では、検出は、第１極性及び第２極性の発光を検出することを包含する。第１極性及び第２極性の発光は、同時に又は別々の時間に検出することができる。
該方法はさらに、本明細書に記載する他の特徴又は態様、例えば、本明細書に記載する装置の使用に関連した特徴を包含することができる。
【００２７】
別の態様では、本発明は、各混合物が核酸サンプル及び増幅試薬を包含し、該増幅試薬が第１核酸プライマーに結合した発蛍光団及び第２核酸プライマーに結合した第２発蛍光団を包含する、複数の反応混合物を包含するサンプル・キャリヤーを用意する工程；該第１及び第２プライマーを用いて、サンプルの反応混合物の各々中に存在する場合の標的核酸を増幅する工程；並びに増幅中の少なくとも複数のインスタンスにおいて、発蛍光団に関連した蛍光偏光情報を検出する工程を包含し、該増幅を通して該サンプル・キャリヤーが固定されている方法を特徴とする。１実施態様では、混合物は、プライマーにそれぞれ結合した、少なくとも第３、第４、第５及び第６発蛍光団を包含する。該発蛍光団は、それぞれ、例えば、励起又は発光チャンネル(emission channel)又は両方において、相互からスペクトル的に分割することができる。典型的な発蛍光団は、フルオレセイン（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ））、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びＣｙ７を包含する。該方法はさらに、本明細書に記載する他の特徴及び態様、例えば、本明細書に記載する装置の使用に関連した特徴を包含することができる。
【００２８】
さらに他の態様では、本発明は、核酸サンプル、増幅試薬及び、二本鎖核酸に結合可能である蛍光プローブを包含する反応混合物を用意すること；複数のサンプルの各サンプルを増幅すること；並びに該増幅中に、少なくとも複数のインスタンスにおける蛍光プローブに関連した蛍光偏光情報を検出することを含む方法を特徴とする。該蛍光プローブは、一本鎖核酸に比較して二本鎖核酸への結合に対して少なくとも１０、２０、５０、１００、２００又は４００倍の選択性を有する。１実施態様では、該蛍光プローブは挿入染料、例えば、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ又は臭化エチジウムである。１実施態様では、異なる核酸サンプルを有する、複数の反応混合物を用意し、該混合物を同時に増幅し、同時に検出する。該方法はさらに、本明細書に記載する他の特徴及び態様、例えば、本明細書に記載する装置の使用に関連した特徴を包含することができる。
【００２９】
別の態様では、本発明は、マルチプレックス核酸分析方法を特徴とする。該方法は、核酸サンプルと、第１核酸プライマーに結合した第１発蛍光団及び第２核酸プライマーに結合した第２発蛍光団を包含する増幅試薬とを用意する工程；該第１プライマー及び第２プライマーを用いて、サンプル中の核酸を増幅する工程；並びに該増幅中の少なくとも複数のインスタンスにおいて、該発蛍光団の各々に関連した蛍光偏光情報を検出する工程を包含する。
【００３０】
１実施態様では、第１発蛍光団及び第２発蛍光団は、識別可能な吸収スペクトル及び／又は発光スペクトルを有する。該発光スペクトルは、場合によっては、部分的にオーバーラップしていることも可能である。該検出は、第１波長における第１発蛍光団の蛍光偏光情報及び第２波長における第２発蛍光団からの蛍光偏光情報を連続的に検出することを包含することができる。
【００３１】
１実施態様では、第１プライマーと第２プライマーとは、異なる遺伝子にハイブリダイズする。別の実施態様では、第１プライマーと第２プライマーとは、同じ遺伝子に、例えば、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子、同じ遺伝子の異なるスプライシング変異体、又は同じ遺伝子の異なる領域にハイブリダイズする。例えば、第１プライマーと第２プライマーとは、部分的にオーバーラップすることが可能である。
【００３２】
第１プライマーと第２プライマーとは、多形性の対立遺伝子、例えば、単一ヌクレオチド多形性の対立遺伝子に差別的にハイブリダイズすることができる。１実施態様では、第１プライマーは、多形性の第１対立遺伝子にハイブリダイズする場合に、多形性の第２対立遺伝子に対するよりも不適正が少ない領域を包含する。例えば、第１プライマーの領域は、多形性の第１対立遺伝子に対して正確に相補的であり、多形性の第１対立遺伝子に対しては部分的に相補的でありうる。関連する例では、該領域は、第１対立遺伝子にハイブリダイズする場合に及びさらに第２対立遺伝子にハイブリダイズする場合にも不適正である、少なくとも１つの位置を包含する。別の例では、該領域は、第２対立遺伝子にハイブリダイズする場合に不適正位置(a mismatched position)を包含するが、第１対立遺伝子にハイブリダイズする場合には不適正位置を包含しない。該不適正位置は、プライマー内の任意の位置、例えば、プライマーの中心内、又は３’末端の４、３、２若しくは１ヌクレオチド内であることができる。１実施態様では、不適正位置は３’末端に存在する。同様に、第２プライマーは、多形性の第２対立遺伝子にハイブリダイズする場合に、多形性の第１対立遺伝子に対するよりも不適正が少ない領域を包含する。１実施態様では、第１プライマーと第２プライマーとは、同じ長さのヌクレオチド(the same length in nucleotides)を有する。該方法はさらに、本明細書に記載する他の特徴及び態様、例えば、本明細書に記載する装置の使用に関連した特徴を包含することができる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、機械可読媒体の物品であって、プロセッサに、蛍光情報、例えば蛍光偏光情報を分析する方法を行なわせるインストラクションを含む物品を特徴とする。該方法は、蛍光情報（例えば、蛍光偏光値及び／又は蛍光強度値）を受け取る工程であって、情報の各インスタンスが核酸増幅反応中の時間的インスタンスに関連している工程；該増幅反応の指数関数的領域内の強度値から初期値を補外する工程；並びに標的核酸の初期濃度を推論する工程を包含する。該方法は、基準サンプルから、例えば、特定配列組成(a given sequence composition)の既知核酸濃度のサンプルから強度値を分析することを包含することができる。１実施態様では、単一基準サンプルを用いる。
【００３４】
上記から分かるように、蛍光偏光情報は、励起偏光(polarized excitation light)に対してほぼ垂直な蛍光を表す値及び励起偏光に対して平行な値を包含することができる。該蛍光情報は、標的核酸に特異的なプライマーに結合した発蛍光団から検出することができる。該方法は、推論された初期濃度の表示又は伝送を行なうことを包含しうる。該方法はさらに、標的核酸の推論された初期濃度を、基準核酸の同様に推論された初期濃度に比較することも包含することができる。該補外は、時間的値に対して蛍光値の対数を線形補外することを包含しうる。
【００３５】
さらに他の態様では、本発明は、機械可読媒体の物品であって、プロセッサに、各イメージング部位(imaged sites)が標的核酸の増幅プライマーを包含する、複数のイメージング部位における確定極性の検出光についての情報を各マップが包含する複数のイメージ・マップを受け取る工程；及びイメージング部位の各々における伸長したプライマーの存在度を表示する値を測定する工程を含む方法を行なわせるインストラクションを含む物品を特徴とする。各イメージ・マップは、イメージング部位の各々に関して複数のピクセルを包含することができる。該イメージ・マップは、ＣＣＤからのイメージ情報、例えば、未加工又は加工(raw or processed)イメージ情報を包含することができる。イメージング部位の各々は、マルチサンプル・キャリヤー上のサンプルに対応することができる。
【００３６】
１実施態様では、該複数のイメージ・マップは、第１確定極性(first defined polarity)の検出光についての情報を包含するマップ及び第２確定極性(second defined polarity)の検出光についての情報を包含するマップを含む。例えば、第１確定極性と第２確定極性とは、相互に直交する。
【００３７】
該複数のイメージ・マップは、反応中の種々なインスタンスにおける、例えば種々な熱サイクル中に発生するインスタンスにおける検出光についての情報を包含するマップを含むことができる。
【００３８】
該方法はさらに、各部位の測定値からイメージング部位の各々に関する標的核酸の初期濃度を推論することを包含する。少なくとも２つのイメージング部位においては、標的核酸が異なることがありうる。推論された濃度は、他の情報に、例えば、特定部位における標的核酸のアイデンティティを表す情報に関連づけることができる。１実施態様では、各イメージング部位に少なくとも複数のプライマーが存在し、該複数のプライマーは、該複数の他のプライマーとは異なる発蛍光団を包含する。検出光についての情報は、該異なる発蛍光団を区別する情報を包含することができる。
【００３９】
さらに他の態様では、本発明は、機械可読媒体上に記憶されたデータベースを特徴とする。該データーベースは、（ａ）蛍光偏光評価、（ｂ）反応サンプル、（ｃ）時間的情報を表すデータと；蛍光偏光評価を、反応サンプル及び時間的値に関連づける関係とを包含する。
【００４０】
該蛍光偏光評価は、第１極性の検出光及び第２極性の検出光の評価を包含することができる。１実施態様では、第１極性と第２極性とは直交する。時間的値は、増幅反応中、例えば種々な時間サイクル中の時間に相当することができる。データはさらに、（ｄ）特定プライマーとの関係並びに他の有用な情報を表すことができる。
【００４１】
別の態様では、本発明は、各イメージ・マップが複数のイメージング部位における確定極性の検出光についての情報を包含する、複数のイメージ・マップを包含するデータベースを特徴とする、この場合、各マップの検出光は発蛍光団に関連し、各マップは核酸増幅反応中の時間的位置に関連する。１実施態様では、該マップはピクセル化され、各イメージ部位は複数のピクセルに相当する。１実施態様では、該複数は、第１確定極性の検出光についての情報を包含するマップ及び第２確定極性の検出光についての情報を包含するマップを含む。例えば、該複数のマップの各マップ値(mapped value)は、第１確定極性の検出光と第２確定極性の検出光との関数であり、該第１極性と該第２極性とは相互に直交する。１実施態様では、該複数のマップは、第１発蛍光団の蛍光偏光についての情報を包含するマップ及び第２発蛍光団の蛍光偏光についての情報を包含するマップを含む。
【００４２】
本発明はさらに、本明細書に記載する装置、及び該装置から蛍光偏光についての情報を受け取るように設定されたプロセッサを包含する系を特徴とする。例えば、該装置は、（１）複数の核酸増幅部位における反応条件を制御するように設定される増幅制御ユニット；及び（２）該複数部位の各部位に関連した蛍光偏光を同時にモニターするように設定される蛍光偏光モニターを包含する。該プロセッサは、温度を経時的に制御するインストラクションを送るように、例えば、熱サイクリングを行なうように設定することができる。送られる他のインストラクションは、蛍光偏光をモニターするためのトリガーを包含することができる。
【００４３】
検出光についての受け取られる情報は、イメージ又はイメージ・マップ、例えば、ピクセル化イメージのマップを包含することができる。１実施態様では、受け取られる情報は、特定モニターリング・イベントに関する各サンプルの総合値を包含する。
【００４４】
プロセッサは、反応条件についての情報、例えば、検出温度についての情報を、例えば、周期的又は連続的に受け取ることもできる。１実施態様では、プロセッサは、情報をまとめて（例えば、複数のモニターリング・イベント、例えば、時間的に分離したモニターリング・イベントに関して同時に(at once)）受け取る。
【００４５】
プロセッサは、核酸濃度を推論し、及び／又は推論された濃度を表示し、記憶し若しくは伝送するように設定することができる。
１実施態様では、プロセッサと装置とは、シリアル・コネクション(serial connection)によって、シグナル連絡している。別の実施態様では、プロセッサと装置とは、コンピューター・ネットワーク、例えば無線ネットワーク又はイーサネット（登録商標）によって、シグナル連絡する。１実施態様では、該系はさらに、プロセッサとシグナル連絡するサーバ(server)を包含する。
【００４６】
該特徴的な方法及び装置(the featured methods and apparati)の少なくとも１つの利点は、多重核酸サンプルにおいて核酸増幅を迅速に、場合によっては同時にモニターすることができることである。増幅反応中に、サンプルのコレクションのイメージを間隔をおいて採取することができる。該イメージのプロセシングは、初期サンプル中の標的核酸の濃度を表示することができる。迅速なイメージングは、特定の時間枠内に多くのサンプルをプロセシングすることを可能にするのみでなく、増幅プロセスにおける精度及び再現性を高めることも可能にする。同様に、特定の標的配列に対して１つの標識プライマー（それ自体が、典型的に、単一ラベル(label)のみを有するプライマー）のみを用いることが経済的である。さらに、このことは、数回の実施によって、各々が異なる標的配列に対して特異的である多重プライマーによる増幅を検出することを可能にする。
【００４７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになると思われる。本明細書に引用した、全ての特許及び参考文献は、それらの全体で、本明細書に援用される。
【００４８】
詳細な説明
蛍光偏光
本明細書に記載する装置及び方法は、例えばＰＣＲ増幅又は等温増幅のような核酸反応中の蛍光偏光（ＦＰ）の検出を可能にする。典型的に、多重サンプルでは、ＦＰが同時に検出される。
【００４９】
ＦＰ測定値(FP measurements)は、分子のサイズ又は分子量の関数である、この理由は、これらのパラメーターが溶液中の分子の回転速度に寄与するからである。詳しくは、回転速度は、サイズに逆比例して(inversely with size)変化する。発蛍光団が分子に結合する場合に、ＦＰは小さい分子と大きい分子とを回転速度によって効果的に区別することができる。大きい分子は比較的緩慢に回転するので、それらが発する蛍光の大きい成分は、励起光の面に平行な光である。したがって、幾つかのＦＰ測定値は、主として、励起光の面に平行な光（Ｆｐａｒａｌｌｅｌ）から成る。他のＦＰ測定値は、当然、さらに、励起光の面に、−典型的には垂直な−非平行な面内で発せられる光（例えば、Ｆｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）の測定値をも包含する。１つの標準的なＦＰ値は、下記比率である：
【００５０】
【化１】
2005526975.tif 000002
【００５１】
式中、Ｆは光強度の相対的な測定値（ＲＦＵ、相対的な蛍光単位）である。
ＦＰ値を与える他の関係も、有用である。
ＦＰ−ＰＣＲは、ＰＣＲプライマーに組み込まれた発蛍光団の回転速度をモニターする。標識プライマーは、少なくとも４種類の明白なサイズを有することができる：
１．伸長していず，ハイブリダイズしていない（即ち、一本鎖）；
２．伸長していないが、標的にハイブリダイズしている；
３．伸長しているが、ハイブリダイズしていない（即ち、一本鎖）；
４．伸長しており、標的にハイブリダイズしている。
【００５２】
これらの形の各々は異なる分子サイズを有し、したがって、異なるＦＰ値を有する。ＦＰ測定値（例えば、Ｆｐａｒａｌｌｅｌ及び／又はＦｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）を用いて、伸長した若しくは伸長していないプライマーの量、及び／又はハイブリダイズした若しくはハイブリダイズしていないプライマーの量を測定することができる。
【００５３】
核酸増幅反応中に、プライマーは伸長する（例えば、ポリメラーゼ又はリガーゼによって）。プライマーが長い核酸に組み入れられると、その分子量とサイズとは増加する。該長い核酸は、大きい分子の相応して緩慢な回転速度及び増大したＦＰ値を有する。したがって、ＦＰは、反応が進行するときの（例えば、反応中のインスタンスにおける）プライマーの伸長を敏感にモニターすることができる。
【００５４】
相補的核酸鎖へのプライマーのアニーリングを検出することもできる。相補的鎖にアニーリングする場合に、プライマー−補体複合体(primr-complement complex)は大きい分子の回転速度を有する、その結果、ＦＰによってそのようなものとして検出される。したがって、該プライマーがその補体にアニーリングすることができる条件下で、ＦＰは同様に、相補的鎖の濃度と伸長したプライマーの量の両方の尺度(measure)を与える。
【００５５】
実施に依存して、条件を選択して、伸長していないプライマーのハイブリダイゼーションの程度を制御することができる。例えば、プライマーのＴｍより充分に低い温度において、ＦＰ測定を行なうことができ、この場合に、生成物が存在するならば、伸長していないプライマーはアニーリングする。同様に、プライマーのＴｍより充分に高い温度においては、伸長していないプライマーはアニーリングしない。プライマーのＴｍが例えば所定値（例えば、４０〜５５℃、５０〜６０℃又は４７〜５５℃の範囲内の所定値）よりも低くなるように、プライマーを設計することもできる。ＰＣＲ増幅の例では、ＦＰ測定をサイクル当り少なくとも１回、例えば、各サイクルで同じ所定温度において、行なうことができる。
【００５６】
プライマーのアニーリング状態に拘わらず、増幅反応が進行するにつれて、多くのプライマーが伸長して、生成物中に組み入れられ、多くの生成物が製造され、その結果、サンプルの平均偏光値を高めることになる。
【００５７】
ＦＰ値は、存在する核酸生成物の量に関連づけることができる。例えば、リアルタイム検出のために各ＰＣＲサイクルにおいて、データを収集することができる。ＰＣＲ反応中の複数のＦＰ値の間の関係は、サンプルについての有用な情報を提供する。ＦＰ値対ＰＣＲサイクル（例えば、ｌｎ（ＦＰ）対ＰＣＲサイクル）のプロットを用いて、増幅前のサンプル中の標的核酸の初期濃度を補外することができる。
【００５８】
他の幾つかのリアルタイムＰＣＲ法とは異なって、ＦＰ−ＰＣＲは、単一ラベル（例えば、発蛍光団）を有する単一標識プライマーによって実施することができる。例えば、多重ラベル及び多重標識プライマーによる他の実施も、当然可能である。ＰＣＲ標的の特異性(specificity)は、配列特異的プライマーの設計によって達成され、これによって、増幅した核酸を検討するための第２プローブの必要性は無くなる。
【００５９】
さらに、多くの他の実施を用いることができる。１つの実施では、標識プライマーを同じ配列を有する非標識プライマーで希釈する。例えば、標識プライマーの非標識プライマーに対する比率は１．０未満、０．２５又は０．１であることができる。別の実施では、ＰＣＲプライマーの両方のプライマーが非標識である。伸長不能であって、生成物鎖の１つにハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドによって、生成物は検出される。
【００６０】
ＰＣＲ増幅のＦＰ分析装置
図１に関して、ＦＰ−ＰＣＲ分析の典型的な装置１０は、光学アセンブリ(optical assembly)１５及び熱サイクラー・アセンブリ(thermal cycler assembly)２０を包含する。
【００６１】
熱サイクラー・アセンブリ
図２に関して、熱サイクラー・アセンブリ２０は、伝熱ブロック(heat transfer block)２４を包含し、該伝熱ブロック上にサンプル・キャリヤー２３が配置される。伝熱ブロック２４の温度は、冷却のためには、ヒート−コールド・ソース(heat-cold source)２５及びヒート・シンク２６によって調節される。他の設計が当業者によって提供されることができる。例えば、ＰＣＲのためのＰｅｌｔｉｅｒ効果デバイスの構造が知られている。これらのデバイスは、熱電気加熱及び冷却のために固相テクノロジーを用いる。これらのデバイスは、部品を移動させることなく、作動することができ、過剰な熱を除去するために通常はファンを有する。
【００６２】
幾つかの実施態様では、伝熱ブロック２４は、空間的温度勾配を与えるように設定される。
サンプル・キャリヤー２３は複数のエリアを包含することができ、該エリアの上又は内部で、例えば、反復サンプル(replicates)又は異なるサンプルのために反応が生じうる。典型的なサンプル・キャリヤーは、マイクロタイター・プレート、１つ以上の（例えば、１列の）毛管、微小流体系(microfluidic system)（例えば、カートリッジ）等を包含する。例えば、該サンプル・キャリヤーは、例えば、９６又は３８４穴を有する標準マイクロタイター・プレートの多重穴のような、多重容器を包含することができる。別の例では、サンプル・キャリヤーは、ｉｎ  ｓｉｔｕ増幅のために組織学的サンプルを包含する、例えば、サンプル・キャリヤーは平面的なガラス面を包含する。さらに他の例では、該キャリヤーは、接触面上に１組の整列したサンプルを包含する。
【００６３】
サンプル・キャリヤー２３は、透明なシール２２によって被覆される。例えば、該シールは、例えば、可視光線又はＵＶ光線に透明であるプラスチックのような物質、例えば、均一に複屈折性である物質、例えば、ポリエステル又はポリオレフィンのような物質から構成することができる。
【００６４】
シール２２そのものは、加熱される透明な蓋(transparent heated lid)２１によって被覆される。加熱される蓋(heated lid)２１は少なくとも２つの機能を果たすことができる。１つの機能は、シールが穴の密閉を維持するように該シールに圧力を加えることである。第２機能は、例えば、サンプルから蒸発しうる液体の凝縮を防止するために、ＰＣＲ増幅中にサンプル・キャリヤー２３の頂部上の温度を維持することである。加熱される蓋２１は、例えばＢＫ７又はＦｕｓｅｄ−Ｓｉｌｉｃａのような、通常の光学物質(optical materials)から構成することができ、該加熱される蓋２１は、薄膜、透光性熱源を包含する、又は必要な温度（例えば、〜１０４℃）及び均一な温度(uniformity of temperature)（例えば、〜４℃）を与える、別なタイプの熱源に取り付けることができる。
【００６５】
再び、図１に関して、光学アセンブリ(optical assembly)１５は、光源アセンブリ４０及び検出器３０を包含する。該光源は、熱サイクラー・アセンブリ２０の表面に平行な励起光ビームを発射することができる。ビーム・スプリッター(beam splitter)５０を用いて、該励起光を励起光源(excitation source)から熱サイクラー・アセンブリ２０の上面に直接反射させることができる。
【００６６】
光源モジュール
さらに図３に関して、光源アセンブリ４０は光源４１を包含する。該光源４１からの光は、熱吸収フィルター(heat-absorbing filter)、次にレンズ４３、帯域フィルター４４、第２レンズ４５及び偏光子４６を通過する。当然、例えば、熱吸収フィルター４２のような、幾つかの要素は任意である；ここに図示していない、他の要素を包含することもできる。詳細(specifics)は、実施及び所望の性能に依存する。
【００６７】
光源４１．光源４１は、幾つかの重要な要素を有する。該光源自体が、幾つかの構造(configuration)の１つでありうる。光源４１は、レーザー、石英−タングステン・ハロゲン、Ｘｅｎｏｎ（連続又はフラッシュ）光源、水銀光源等でありうる。該光源は電球(bulb)であることができる、電球はあらゆる方向に放射し、それを効果的にするためには、光学素子(optics)を集めて、導くことを必要とする。他の光源は、光を集めて、導く設計に組み込まれた光学要素(optical componements)を有することができる。光源が非偏光性光源(non-polarized source)である場合には、光をその後、偏光させて（例えば、以下の偏光子を参照）、サンプルに達する光を供給し、１方向の線形偏光に限定する。
【００６８】
さらに、例えばレーザーのような偏光源(polarized light source)を用いることによって、線形励起偏光を得ることもできる。幾つかの実施では、広帯域波長可変レーザーが波長可変偏光源の能力(capability)を有するので、広帯域波長可変レーザーを用いることができる。
【００６９】
帯域フィルター４４．広帯域光源の場合には、例えばレンズのような、他の光学要素が、励起光のために問題の波長範囲を選択するために、帯域フィルターに通して光を導く。これらのフィルターは、通常、約２０ｎｍ(on the order of 20nm)のフル−ウィドウス−ハーフ−マックス(full-width-half-max)（ＦＷＨＭ）及び約６０〜９０％(on the order of 60−90%)のピーク伝達(peak transmission)を有する薄膜テクノロジー干渉フィルターである。
【００７０】
照明系の他の必要条件は、サンプルを横切る統一した光(uniformity of light)が均質であることである。幾つかの実施の場合のように、大きいエリアを照明すべきである場合には、均質性が重要である。しかし、均質性は、修正ファクターによって妥協され、補正されることができる。場合によっては、このアプローチが有利である。
【００７１】
ディフューザー(diffuser)（図示せず）．この均質性を得るための１つの方法は、光源を拡散することである。１実施態様では、高度の均質性及び効率を得るために、ホログラフィック型ディフューザーを用いる。ホログラフィック型及び慣用的ディフューザーの両方は、一般的には、光学的提供者(optical suppliers)から入手可能である。この場合に考慮すべきは、これらの型のディフューザーは偏光を維持しないので、これらのディフューザーを偏光子の前に用いる必要があることである。
【００７２】
レンズ４２、４４．光源アセンブリ４０内のレンズは、光をガイドし、フィルター、ディフューザー、ミラー及び他の光学要素に通して導き、サンプルに到達させる。
偏光子４６．光源アセンブリ４０内で用いられる偏光子４６は、上述したように、選択した装置に依存して、固定型又は可変型であることができる。単純な偏光子は、光学素子カタログで容易に入手可能な、薄い二色性シート物質(thin dichroic sheet materials)である。より複雑な偏光子は、液晶偏光子(LIquid-Crystal Polarizers)（ＬＣＰｓ）を包含する。これらのＬＣＰデバイスは、入射光を最初に濾過して、線形状態にするために、単純な偏光子を用いることができ、次いで、これらのデバイスは、該線形光を受動的に通過させるか、又は能動的に該光を液晶によって回転させて、対立線形状態にするために用いられる。
【００７３】
例えば、Ｇｌａｎ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ偏光子のような、大きい結晶偏光子も使用可能である。これらの偏光子は厚いカルサイト結晶デバイスであり、これらは２つの偏光を効果的に同時に、但し、異なる物理的方向に供給することができる。
【００７４】
該系が一方の偏光の方向付け(orientation)に他方の偏光に比べて有意に、予測不能な形式で影響を及ぼしてはならないと言う点で、偏光の保持は重要である。所定の又は固定した組織的バイアスを測定して、先験的に(a priori)説明することができる。しかし、これらのシグナルの一方の強度を他方に比べて有意に減じないように、これらのバイアスを最小化することができる。
【００７５】
幾つかの実施では、光源モジュールは、個別サンプル穴に識別可能な照明源を与えるために光ファイバー束を包含することができる。該光ファイバー束は、単一照明源からの光を受け取ることができる。１例では、これらの照明源は穴に照明を直接与えるのではなく、むしろ、例えばスキャンニング・ミラー(scanning mirror)及び照明路における他の光学素子を介して、該ファイバーから該穴に光を発射するイメージング系のための光源として役立つ。別の例では、各ファイバーは穴を、又はサンプル・キャリヤーの個々の領域に指定された偏光用光学要素(polarizing optical element)を直接照明する。
【００７６】
他の例では、ファイバー照明系は、９６穴プレートの分離間隔を利用して配置されたサンプル又は３８４穴プレートの分離間隔を利用して配置されたサンプルのいずれかを照明することができる。両方のファイバー束は、例えば、図１４に示すように、１列に設定される（以下をも参照のこと）。次に、９６穴方向付けに指定されたファイバーは一方の束に単離され、３８４穴に設定されたファイバーは単離され、第２束に導かれる。ファイバーはフレキシビルであるので、光源は静止した状態であることができ、適当な束は光源からの光を受け取る位置であることができる。同様に、ファイバーは静止した状態であることができ、光を適当なファイバー束に導くために、ミラーを移動させる。通常、光ファイバーは放射路に用いられない、この理由は、光ファイバーを放射路に用いると、イメージの空間的質及び偏光の質が混乱するからである。
【００７７】
図１４における実施例を参照すると、系１１０は、複数のファイバー束、例えば、２つのファイバー束１２６と１２８を包含する。一方の束は第１配置、例えば９６穴プレートに設定され、他方の束は第２位置、例えば３８４穴プレートに設定される。図１４に示すように、９６穴プレートに設定されたファイバーは束１２８中に位置付けられ、３８４穴プレートに設定されたファイバーは束１２６中に単離される。１実施態様では、ファイバーはフレキシビルであるので、光源は静止した状態であることができ、適当な束は光源１２０からの光を受け取るように位置付けられることができる。例えば、適当な束は、それが照明のためにインラインになるまで、路１２４に沿って移動されうる(be translated along the path 124)。他の実施態様では、ファイバーは静止した状態であることができ、光を適当なファイバー束に導くために、ミラー及び／又はレンズ系を移動させる。
【００７８】
図１５における関連実施例に関しては、光ファイバー１３４の単一束１３２は、光源１２０によって照明される。個々のファイバー１３４は、サンプル・キャリヤー１３０の異なる領域を照明するように分配される。
【００７９】
検出アセンブリ
再び図３を参照すると、検出器３０は、一般にカメラと呼ばれる、例えばシングルポイント検出器(a single point detector)又は検出器列(an array of detectors)のような、イメージング系３１を包含する。この検出器又はカメラは、単一電荷結合素子（ＣＣＤ）、ＣＣＤ列、光電子増倍管（ＰＭＴ）又はＰＭＴ列であることができる。固有の増幅が充分でない場合に、増強装置(intensifier)３２を用いて、該種類の検出器のためのシグナル・レベルを増幅することができる。検出器３０は、選択した特定の設定に依存して、光源アセンブリ４０と同じ光学要素の多くを有することができる。
【００８０】
偏光子３６．サンプルから発せられた光は、偏光子３６を通過する、該偏光子は該光源アセンブリの偏光子４６と同じ構成であることができる。偏光子３６は検出路において、特定の偏光の光のみが検出されるように、光を濾過する。偏光子３６，４６の相対的位置付けは重要である。偏光対比(polarization contrast)が測定されるので、偏光の平行方向及び垂直方向の両方の線形放射偏光(the linear emission polarization)を測定する必要がある。別の有用な設定では、励起偏光方向は平行位置付けと垂直位置付けとの間で切り換わることができるが、放射偏光子(emission polarizer)は一方の位置付けに留まる。さらに他の設定では、放射偏光を１方向に固定することができ、放射偏光を平行成分と垂直成分とに分離して、独立的に、したがって同時に測定することができる。さらに、例えば、総合蛍光強度を測定するために、偏光子を除去することもできる。
【００８１】
例えば、Ｇｌａｎ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ偏光子のような、大きい結晶偏光子を用いて、検出器３０において発光の２種類の異なる偏光を分析することができる。
帯域フィルター３４．これらのフィルターは、発蛍光団によって発せられる光の波長に集中する光の伝達を可能にする放射フィルター(emission filters)である。これらのフィルターは機能において、励起フィルターの機能と同じである、但し、中心波長は、発蛍光団の発光プロフィルに応じて、波長がシフトする。
【００８２】
レンズは、サンプルからの光を集めて、検出器３０内の該フィルターに通して、カメラ３１に供給するために最適化される。
励起フィルター及び放射フィルター（各々の一方が対をなす）の多重部品は、ＰＣＲ反応をモニターするために用いられる、多様な種類の発蛍光団に対して用いることができる。単独ＰＣＲ反応で多重発蛍光団を評価するために、装置にこれらの部品が装備される。
【００８３】
下記は、照明系（例えば、光源アセンブリ４０）及び検出系の３つの典型的な設定である。これらの設定の各々を用いて、多重部位（例えば、多重サンプル）を同時に又は別々に励起させ、及び／又は検出することができる。
【００８４】
１．連続的検出．この設定では、偏光が偏光の励起ビームによって所定方向でサンプルを照明するように、照明系は固定される。検出系は、少なくとも２つの方向：該励起ビームに対して平行方向及び垂直方向で連続的に発光を分析するように設計される。
【００８５】
例えば、検出器３０内の偏光子は、該２極性（垂直と平行）の検出間で切り換わるように、９０°回転されることが可能である。他の例では、２つの偏光子が用いられる。検出路において、該偏光子が光路から取り出されて、他方の偏光子が、極性を切り換えるために挿入される。
【００８６】
２．連続的励起．この設定では、光源アセンブリ４０は、偏光の少なくとも２つのビーム：その線形偏光が検出される発光の偏光方向に垂直である１ビームと、その線形偏光が該検出される発光の偏光方向に平行である他方のビームを、連続的に供給する。検出系は固定された状態で留まり、所定方向で発せられる光を検出する。検出器３０に関して述べたように、光源アセンブリ４０中の偏光子は、２種類の異なる極性の偏光を生じるために回転される又は切り換えられる。
【００８７】
１実施態様では、連続的励起と連続的検出の両方が用いられる。この実施態様の典型的な実施では、４測定値が測定され、平均される：励起光の各極性に対して２回の垂直検出測定値。
【００８８】
３．同時検出．この設定では、偏光が偏光の励起ビームによって所定方向でサンプルを照明するように、照明系は固定される。検出系は、２種類の異なる偏光方向：該励起ビームに垂直な１偏光方向と、該励起ビームの偏光方向に平行な、他方の偏光方向で発せられる光を同時に検出する。１実施態様では、検出系は２つの分離した検出器を包含し、これらの検出器は、それぞれの検出路の各々において発光を独立的に分析する。他の実施態様では、異なる偏光のビームは分割され、再結合するが、別々のビームを単離し、同定することができる一列型検出器(single array type detector)上で空間的に分離する。
【００８９】
垂直偏光と平行偏光との同時検出は、全てのサンプルが同時にイメージングされるように、又は各サンプルが個別にイメージングされるように、行なうことができる。
同時検出の１つの利点は、速さである。両方の読取りが同時になされるので、第２方向の発光を検出するための付加的な時間が不必要である。第２の利点は安定性である。両方向の偏光に対する照明は同時である。したがって、該２方向での測定値は、同量の励起光から得られる。該２測定値が２つの異なる時点で測定される場合に生じうる、照明系の偏差が回避される。
【００９０】
上記３設定の各々に関して、サンプル・キャリヤー２３上に多重サンプルを包含するエリアが同時に検出されるように、又は個々のサンプルが別々に、例えば連続的に検出されるように、検出を行なうことができる。
【００９１】
多重サンプルを包含するエリアが同時に検出されるというシナリオでは、該エリアを光源アセンブリ４０によって照明して、次に、イメージング系、例えば、イメージの異なるピクセル(different pixels of an image)に数値を割り当てるアレイ(array)を包含する系を用いて検出する。このシナリオは、とりわけ、速さという利点を有する。
【００９２】
個々のサンプルを別々に検出するというシナリオでは、スキャンニング系を用いて、選択的に照明し、及び／又は特定の個別サンプルからの発光を選択的に検出する。好ましい実施態様では、サンプル・キャリヤー２３はプロセスを通して固定される。しかし、光学素子は、異なる個々のサンプルをスキャンするように修正される。例えば、該スキャンニング系は移動可能なミラー、例えば、図５のスキャンニング・ミラー５５を包含することができる。
【００９３】
該スキャンニング系は、各サンプルに個別に又はサンプルの部分集合に照明を導くことができ、必要な照明全体を少なくし、サンプル・キャリヤー２３全体が照明された場合に照明される系の部品(parts)からの干渉を少なくする可能性を秘めると言う利点を有する。該スキャンニング系は、非常に敏感であり、大きいダイナミック・レンジを有する、例えばＰＭＴのような、シングルポイント検出器又はポイント検出器列(an array of point detectors)を用いることができる。さらに、一度に、単一サンプル又は少数のサンプルを照明することによって、照明されず、検出されないエリアの光退色(photobleaching)を回避しながら、サンプル当りの照明量を有意に高めることができる。
【００９４】
上記多様な設定の他に、検出系及び光源を過渡状態及び定常状態の検出のために設定することができる。定常状態検出のために、検出系が発光を検出する間隔(interval)中に、励起光を供給する。対照的に、過渡状態検出のためには、励起光をある時点で(at one time)供給する。時間的遅延が続いて生じ、その後に、検出系が発光を検出する。この設定では、検出系は、検出路上の帯域フィルターを通過する反射励起光の形態でのノイズを受容しない。
【００９５】
下記は、幾つかの典型的な装置１０である。
図４の実施例に関して、光源アセンブリ４０は、サンプル・キャリヤー２３の表面に平行である励起光ビームを生じる。該ビームは、該ビームをサンプル・キャリヤー２３の表面に導くためのビーム・スプリッター５０によって反射される。該ビームは、該サンプル・キャリヤー内の多重の異なるサンプルが励起光を受け取るように、表面の充分なエリアを照明する。次に、該サンプル・キャリヤー内のサンプルから発せられる蛍光が、ビーム・スプリッター５０を通過して、検出器３０に運ばれる。
【００９６】
図５の実施例に関して、光源アセンブリ４０はサンプル・キャリヤー２３の表面に平行である励起光ビームを生じる。該ビームは、該ビームをサンプル・キャリヤー２３の表面に導くスキャンニング・スポット・ミラー５５によって反射される。該ビームは、該サンプル・キャリヤー内の多重の異なるサンプルが励起光を受け取るように、表面の充分なエリアを照明する。サンプル・キャリヤーの表面上の特定のエリアを照明するためにミラーを位置付ける制御ユニットに、該ミラーを連結することができる。次に、サンプル・キャリヤー内のサンプルによって発せられる蛍光が、検出器３０に進む。
【００９７】
図６に関して、サンプル・キャリヤー２３に面するように、光源アセンブリ４０を位置付けることができる。この設定では、検出器３０は今や、サンプル・キャリヤーの表面に平行な光路に沿った発光を受け取るように位置付けられている。スキャンニング・スポット・ミラー５５は、サンプル・キャリヤー２３の表面上のエリアからの発光を検出器３０中に導く。図６の設定は、光源アセンブリ４０と検出器３０との位置が取り替えられていること以外は、図５の設定に類似する。
【００９８】
図７の実施例に関して、光源アセンブリ４０と検出器３０とは、検出すべき、サンプル・キャリヤー２３の表面上のエリアに面するように位置付けられている。図７に示すように、光源アセンブリ４０から該表面への光路と、該表面から検出器３０への光路とは両方とも傾斜している。関連実施態様では、光源アセンブリ４０又は検出器３０は、光路がサンプル・キャリヤー２３の表面に垂直になるように、配置される。しかし、このように配置されていないユニットは、該ユニットと該表面との間の光路が傾斜するように、位置付けられる。
【００９９】
図８の実施例に関して、検出器３０は、光源アセンブリ４０からサンプル・キャリヤー２３への励起光の光路内に配置される。例えば、検出器３０は、励起光ビームによって照明されるエリアの小さい領域のみを遮蔽するように位置付けられる。
【０１００】
図９の実施例に関して、２つの検出器６１、６２がビーム・スプリッティング偏光子(beam splitting polarizer)３７と共に用いられる。発光はレンズ６３によって収集されてから、ビーム・スプリッティング偏光子３７（例えば、Ｇｌａｎ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ偏光子、薄膜ビームスプリッター、又はマイクロワイヤー型ビームスプリッター(microwire type beamsplitter)）を通して導かれる。１方向に偏光した光は第１検出器６１に進む。垂直面内で偏光した光は、第２検出器６２に進む。この設定は、励起ビームに平行に偏光した光と、励起ビームに垂直に偏光した光とを同時に検出することを可能にする。上記“同時検出”設定を参照のこと。
【０１０１】
図１０の実施例に関して、励起ビームに平行に偏光した光と、励起ビームに垂直に偏光した光とを同時に検出するために、１つの検出器３０が用いられる。発光はこの場合も、レンズ６３によって収集されてから、ビーム・スプリッティング偏光子３７を通して導かれる。１方向に偏光した光は、直接、検出器３０に進む。垂直面内で偏光した光は、ミラー６４、６５、６６によって検出器３０にまで反射される。そのため、検出器３０は、サンプル・キャリヤー２３の２つのイメージ、光の各偏光に対して１つのイメージを読み取る。
【０１０２】
図１３の実施例に関して、ファイバー連結光源７０によって励起光が供給される。該光は、フィルター７２によって所望の励起波長に濾過される。ファイバー７４は、該光をライン・イルミネーター７６に導く。典型的に、該光は、光ファイバー後に、偏光子によって、スキャンニング・ミラー８２に達する前に、偏光される、但し、該ファイバーが偏光状態を維持する場合には、ファイバー前に光を偏光することができる。光ビームは、円柱レンズ７８によって集束され、スキャンニング・ミラー８２によってサンプル・キャリヤー９０に導かれる。２つの可能な光路８３、８４が示されている。これらの光路はテレセントリック・スキャン・レンズ８６を通過する、テレセントリック・スキャン・レンズ８６は該ビームを、例えば、サンプル・キャリヤー９０の領域８８上に集中させる。該領域は、例えば、マイクロタイター・プレートの１つの穴、より典型的には、穴の列、又はより一般的には、多重の異なる核酸サンプルを包含しうる任意のエリアでありうる。該エリア内の発蛍光団によって発せられる光は、スキャンニング・ミラー８２に戻って進み、ビーム・スプリッター８０によって、光を線形配列検出器９４上に集束させる円柱レンズ９２まで反射される。関連実施態様では、テレセントリック・スキャン・レンズの代わりにレンズ列が用いられる。
【０１０３】
ＦＰモニター系(system for FP monitoring)
ＦＰモニター系も、特徴付けられる。図１２の実施例に関して、該系は、ＦＰ−ＰＣＲ装置１０にシグナル連絡するコンピューター・システム５１０を包含する。コンピューター・システム５１０は、コンソール５０１、キーボード５０２等を包含する。コンピューター・システム５１０は、サーバ５０４を包含するネットワーク５０３に接続することができる。
【０１０４】
例えば、コンピューター・システム５１０はユーザーとインターフェースして、ＦＰ−ＰＣＲ手順をカスタマイズすることができる。コンピューター・システム５１０は、該手順を実行するために、装置１０にインストラクションを送ることができる。インストラクションは、例えば、熱サイクラー・アセンブリ２０及び光学アセンブリ１５を直接制御して、該手順を実行する。
【０１０５】
他の実施では、コンピューター・システム５１０は、ユーザー参加パラメーター(user-entered parameters)を装置１０に送る。装置１０搭載プロセッサ(Processor on-board the apparatus10)が、次に、熱サイクラー・アセンブリ２０及び光学アセンブリ１５を制御して、該手順を実行する。
【０１０６】
コンピューター・システム５１０はさらに、検出器３０から情報を受け取る。該情報は、検出器３０によって得られる未処理(unprocessed)イメージ、又は検出器３０によって前処理されたイメージであることができる。コンピューター・システム５１０によって実行されるソフトウェアを用いて、イメージを処理して、サンプル・キャリヤー２３中の各サンプルに関して読取り値を得ることができる。典型的にリアルタイムで得られた読取り値は記憶される。ＰＣＲ手順中にコンソール５０１に、情報を表示して、例えば、ユーザーに予備的結果を与えることができる。ＰＣＲ手順が終了した後に、記憶された情報を完全に処理して、例えば、初期サンプル中の特定核酸種の初期濃度を決定することができる。該初期濃度を決定するための１つのアルゴリズムを以下で説明する（“リアルタイム増幅アルゴリズム”参照のこと）。
【０１０７】
同様なシステムを用いて、他の核酸増幅反応、例えば等温反応をモニターすることができる。
リアルタイム増幅アルゴリズム
１態様では、本発明は、サンプルに関して（及び複数のサンプルに関して、例えば、複数の反応において、例えば多重穴プレートの各穴において、基板(substrate)上の１つ以上の位置において、１つ以上の毛管において等）標的核酸濃度を測定する方法を特徴とする。該方法は、比較するために１つ以上の基準サンプルを用いて、次に、実測値からサンプルの初期核酸濃度を補外することができる。実測値は核酸濃度に直接比例する。しかし、実測値は、例えば、蛍光偏光の例におけるＦＰ値、又は例えばその蛍光強度が核酸濃度によって変化する５’ヌクレアーゼ・プローブの場合における蛍光強度（ＦＩ）のような、核酸濃度を示す、任意の尺度(measure)であることができる。ＦＰ測定値は、式１によってＦＩに関連づけられる：
ＦＩ＝Ｆparallel  ＋  ２＊Ｆperpendicular        （１）
上記式において、Ｆparallelは、励起光の面内で偏光した光の蛍光シグナルであり、Ｆperpendicularは、励起光に垂直な面内で偏光した光の蛍光シグナルである。
【０１０８】
下記実施例によって、Ｆと濃度の絶対測定値との間の関係を説明する。Ｆは、実施に依存して、例えばＦＰ値及び／又はＦＩ値（例えば、ヌクレアーゼ・アッセイの場合）のような、濃度に直接比例する任意の値である。Ｆ値は、次のように、濃度の絶対測定値に変換される。濃度は蛍光に直接比例する。このことは、蛍光の特定の変化率に関して、濃度の変化が等しい率であることを意味する。
【０１０９】
典型的な反応に関して、ＤＮＡが、サンプル・シグナルが系のノイズ（例えば、機器及びサンプルのノイズ）を超えるような、充分な時間(a sufficient enough times)増幅されるまで、Ｆシグナルはフラットである。ひと度、該シグナルが系ノイズを該ノイズ・レベルの数倍(some multiple of the noise level)超えたならば、該曲線は指数関数的になり、該シグナルの対数（Ｉｎ（Ｆｔ））は、時間（例えば、ＰＣＲサイクル数）に対して線形になる。サンプルが飽和に達すると、この関係（Ｉｎ（Ｆｔ）対時間）はもはや線形ではない。
【０１１０】
該曲線の線形区分を同定して、次にこれを用いて、０時点（ｔ０）における縦軸を補外して、Ｉｎ（Ｆ０）を決定し、したがって、逆対数(inverse logarithm)を用いることによって、Ｆ０を決定する。この実施例では、初期蛍光（ＫＦ０）（即ち、ｔ０における蛍光）が、ｅをＩｎ（ＦＰ０）パワー(power)にまで高めることによって、ｙ軸（Ｉｎ（ＦＰ）軸）のインターセプトＩｎ（ＦＰ０）から推定される、即ち、ＫＦ０＝ＦＰ０．
次に、標的核酸の初期濃度がＦ０から、例えば、既知濃度の標準(standard)に基準(reference)を用いることによって、算出される。例えば、同じランにおける同じ機器で、未知濃度（ＵＣ０）及び既知濃度（ＫＣ０）のサンプルに関して、例えば、前記パラグラフに述べた方法を用いて、初期Ｆ０値を決定することができる。既知濃度サンプル及び未知濃度サンプルに関して、該変換は容易に行なうことができる。既知濃度サンプルの計算ｔ０蛍光（ＫＦ０）が比較基準になり、未知濃度サンプルの計算ｔ０蛍光（ＵＣ０）が未知の目的データ(unknown desired data)である。
【０１１１】
【化２】
2005526975.tif 000003
【０１１２】
式２は、次のように、再整理される：
【０１１３】
【化３】
2005526975.tif 000004
【０１１４】
蛍光と濃度との関係が明白に示されるならば、既知サンプルと未知サンプルとの濃度及び蛍光の関係は同じでなければならないと言う事実から、このことは明らかである。次の式はこの関係に該当する。
【０１１５】
ＫＦ＝α・ＫＣ  及び  ＵＦ＝α・ＵＣ          （４）
上記式において、αは比例定数である。次に、式（３）中に式（４）を用いて、かつ下付き文字を省略することによって、該式が有効であることが明らかになる。
【０１１６】
【化４】
2005526975.tif 000005
【０１１７】
これの例は、次の通りである。既知濃度のサンプル  ＫＣ０＝１０，０００をデバイスに入れ、蛍光（ＫＦ０）が２０，０００であると計算され；未知濃度のサンプルをデバイスに入れ、未知のｔ０蛍光（ＵＦ０）が５０，０００であると計算されたならば、該式から、未知サンプルの濃度（ＵＣ０）２５，０００が得られる。
【０１１８】
【化５】
2005526975.tif 000006
【０１１９】
この場合、基準サンプル（Ｋｎｏｗｎ）に関して、蛍光は、濃度の２倍の値である、そこで未知サンプルに関しては、関係が絶対的であり、αが２であるので、濃度は蛍光の値の１／２でなければならない。
【０１２０】
これらの計算は、ソフトウェアによって自動的に行なわれることができる。データを自動的に受け取って、処理するように、ソフトウェアを装置に接続することができる。ソフトウェアは、ユーザー・インストラクションを受け取って、ユーザーに質問し、例えば、サンプル・アイデンティティ、既知対照サンプルの濃度、レポート・フォーマット等を知るために、ユーザー・インターフェースを包含することができる。
【０１２１】
他の実施では、ソフトウェアは装置から独立して、例えば、デスクトップ・コンピューター又は手持ち式機器上で操作される。例えば、機器からのデータは、分析のために手動でロードする（又はエンターする）ことができる。
【０１２２】
幾つかの実施では、キャリブレーション・ツールとしてのＤＮＡの既知希釈シリーズ(a known dilution series of DNA)を分析検査することなく、上記アルゴリズムを用いることができる。さらに、該アルゴリズムは、Ｉｎ（ＦＰｔ）対時間曲線の勾配から独立しているので、異なるサンプルが異なる増幅効率を有する場合でさえも、正確な結果が得られる。
【０１２３】
上記アルゴリズムは、核酸増幅をリアルタイム・モニターするための如何なる方法にも、例えば、ＦＰモニターリング以外の方法にも適用することができる。
増幅反応
ＰＣＲ増幅のための生化学的方法は、例えば、Dieffenbach and Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Sambrook & Russell(2001)Molecular Cloning:A laboratory Manual,3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press;US Patent Nos.4,683,195 and 4,683,202,Saiki,et al.(1985)Science230,1350-1354に、一般的に記載されている。
【０１２４】
典型的なＦＰ−ＰＣＲ増幅反応は、下記成分：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、フォワード・プライマー(forward primer)、リバース・プライマー(reverse primer)、緩衝液及び塩（例えば、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ８．８）を包含する。
【０１２５】
フォワード・プライマー及びリバース・プライマーは、検出すべきである標的配列の各末端に特異的にアニーリングするように設計される。ＦＰ−ＰＣＲに関しては、該ペアの２つのプライマーの一方が発蛍光団で標識される。
【０１２６】
ＦＰ−ＰＣＲのための典型的な発蛍光団は、フルオレセイン（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ））、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びＣｙ７を包含する。
【０１２７】
１つの実施では、増幅反応成分によって混合物を調製する。該混合物のアリコートを、マイクロタイター・プレート・サンプル・キャリヤーの異なる穴に分配する。該穴の各々に異なるサンプルを加える。必要に応じて、穴の幾つかを用いて、１種類以上のサンプルの希釈シリーズを調製する。しかし、幾つかの実施態様では、正確なＦＰ検出及び適当なアルゴリズム的使用は、種々なサンプル中の初期標的配列濃度の定量測定のための希釈シリーズの必要性を予め回避する。
【０１２８】
温度サイクリング(temperature cycling)：ＦＰ−ＰＣＲのために、標準ＰＣＲサイクルを用いることができる。例えば、変性温度と、アニーリング温度と、プライマー伸長温度との間のサイクリングを用いることができる。特定の温度及び回数(times)は、特定の実施の詳細に、例えば、プライマー設計、プライマー結合部位配列、及び増幅された標的配列の長さに依存する。
【０１２９】
本明細書に記載するように、１実施態様では、伝熱ブロック２４が温度勾配(thermal gradient)を与える。したがって、例えば、アニーリング温度をサンプル・キャリヤー２３の穴の間で変えることができる。
【０１３０】
ＦＰの測定
ＦＰは、他の要因のなかでも、温度によって影響を受ける。そのため、熱サイクル中の特定の温度において、サンプル・キャリヤーからデータを得る。例えば、１つの好都合な温度は、４０〜７０℃、５５〜６５℃、３７〜４２℃又は６５〜７５℃間である。該温度は、未伸長プライマーがそれらの補体（存在する場合に）上の結合部位にアニーリングする温度でも、又は未伸長プライマーがそれらの補体にアニーリングしない温度でもありうる。
【０１３１】
ＰＣＲサイクルはまた、サイクル毎に１回のデータ収集に適した温度に、サンプル・キャリヤー温度を維持するようにプログラムすることもできる。幾つかの実施では、サーマル・プローブをサンプル・キャリヤーに取り付ける。該プローブは、該キャリヤーの穴の１つにおいて溶液中に直接挿入することができる。該プローブからの温度読取り値を用いて、ＦＰデータ収集をトリガーする(trigger)。温度の記録も記憶することができる。
【０１３２】
線形ＰＣＲ  １実施態様では、ＰＣＲ増幅は、伸長したプライマーの濃度及び時間に関して直線的である。線形ＰＣＲには、単一プライマーのみを用いる。換言すると、リバース・プライマーは用いない。各サイクル中に、形成される伸長プライマー数は、初期サンプル中に存在する標的分子数に等しいので、増幅は経時的に直線的に進行する。伸長プライマー濃度対時間のプロットの勾配を用いて、初期分子数を決定することができる。それ故、線形ＰＣＲを用いて、量が線形増幅による検出のために充分であるならば、初期サンプル中の標的分子濃度の非常に正確な尺度を得ることができる。
【０１３３】
該方法と装置とは、他の核酸増幅方法にも適応させることができる。他の幾つかの例は、下記を包含する：
例えば、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成を用いて、核酸を増幅する、転写に基づく方法（U.S.Pat.No.6,066,457;U.S.Pat.No.6,132,997;U.S.Pat.No.5,716,785;Sarkar et al.,Science(1989)244:331-34;Stofler et al.,Science(1988)239:491;U.S.Patent Nos.5,130,238;5,409,818;and 5,554,517(for NASBA)）及び
鎖置換増幅(strand displacement amplification)(SDA;U.S.Patent Nos.5,455,166 and 5,624,825);
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）。ＬＣＲに関して、小さい非標識オリゴヌクレオチドへの標識プローブのライゲーションは、ＦＰに小さい違いを生じるに過ぎないので、ライゲーションによるＦＰシグナルの変化を高めるために、該標識プローブを大きい非標識分子にライゲートすることができる；並びに
例えば、U.S.Patent Nos.5,88870 及び6,001,567に記載されているような、フラップ・エンドヌクレアーゼに基づく切断。
【０１３４】
これらの他の増幅方法の幾つかに関して、増幅は等温的であることができる。光源２０は、反応混合物（又は混合物）を増幅中に多数の間隔を置いてサンプリングすることができる。典型的に、規則的な間隔が選択される。
【０１３５】
マルチプレックス・プライマー分析
反応室の１つ以上の別々のアドレス（例えば、サンプル・キャリヤーのサンプル、例えば、マイクロタイタープレートの穴）において、１つより多い標的核酸配列を分析することができる。各標的配列に対して、異なる標識プライマーを用いる。例えば、関連する又は関連しない配列を増幅させる２種類のプライマーを、異なる発蛍光団で標識する。
【０１３６】
遺伝子の２つの対立遺伝子を検出するために、反応は、第１対立遺伝子に特異的であり、第１発蛍光団で標識された第１プライマー；第２対立遺伝子に特異的であり、第２発蛍光団で標識された第２プライマー；及び対立鎖上の、第１対立遺伝子及び第２対立遺伝子の両方に結合する第３プライマーを包含することができる。
【０１３７】
第１対立遺伝子が存在する場合には、第１プライマーと第３プライマーとが標的配列を増幅させる。第２対立遺伝子が存在する場合には、第２プライマーと第３プライマーとが標的配列を増幅させる。該対立遺伝子がＳＮＰである場合には、不適当なプライマーがハイブリダイズして、存在する対立遺伝子の合成の準備をする可能性がある。しかし、それにも拘わらず、定量的検出は、適当なプライマーによる優先的増殖(preferential amplification)を実証すると考えられる。さらに、ＳＮＰを識別する、プライマーの問題の位置(query position)を、例えば、該プライマーの３’末端に又はその近くに（例えば、該末端の１、２、３、４又は５ヌクレオチド内に）慎重に位置付けることができる。該プライマーはさらに、該プライマーのＴｍを低下させ、その感受性を高めるために、例えば、該問題の位置に隣接して又は該問題の位置の近くに意図的な不正対合(mismatches)を包含することもできる。
【０１３８】
２つの非関連標的核酸を検出するために、反応は、下記：第１核酸に特異的で、第１発蛍光団で標識された第１プライマー；第１核酸に特異的で、該核酸のセグメントが第１プライマーと共に増幅されるように、第１核酸上の部位にハイブリダイズする第２プライマー；第２核酸に特異的で、第２発蛍光団で標識された第３プライマー；及び第２核酸に特異的で、該核酸のセグメントが第３プライマーと共に増幅されるように、第２核酸上の部位にハイブリダイズする第４プライマーを包含することができる。
【０１３９】
該２つの非関連核酸は、同じ細胞によって転写される遺伝子、例えば、アクチン及びｐ５３をコードする遺伝子であることができる。他の実施例では、２つの非関連遺伝子は抗生物質耐性遺伝子及び細菌毒性を示す遺伝子であることができる。
【０１４０】
多重の異なる発蛍光団（例えば、少なくとも２、３、４、５又は６種類の異なる発蛍光団）を、マルチプレックス分析に用いることができる。６種類の典型的なセットは；（１）６−ＦＡＭ；（２）ＨＥＸ；（３）Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ；（４）Ｃｙ５；（５）Ｃｙ５．５；及び（６）下記群；Ｃｙ３、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＴＡＭＲＡ、及びＣｙ７から選択される発蛍光団を包含する。一般に、それらの発光及び／又は励起ピーク(emission and/or excitation peaks)が分離可能である発蛍光団の任意のセットを用いることができる。さらに、両方のピークは、それらが検出によって又は励起によって分離されることができる限り、分離可能である必要はない。
【０１４１】
挿入染料
蛍光標識される前に増幅プライマーを必要としない実施に挿入染料(intercalating dye)を用いることも、可能である（但し、干渉しない異なる染料による実施も可能である）。Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎは、二本鎖ＤＮＡの副溝に結合する挿入染料である。臭化エチジウムは他の例である。この染料は、溶液中で結合していない(unbound)ときに、比較的不活性であるが、ＤＮＡに結合すると、非常に鮮明(much brighter)になる。したがって、ＰＣＲ反応中にＤＮＡ量が増加すると、トップ−リード迅速蛍光モード(top-read prompt fluorescence mode)を用いる標準リアルタイムＰＣＲ機器によって検出されうるように、各新しいＰＣＲ生成物に該染料が結合するにつれて、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎのシグナルは比例して増加する。しかし、非結合染料もシグナルを発し、このシグナルは、結合染料に比べて弱いとは言え、バックグランドを越えて検出可能である。
【０１４２】
リアルタイム増幅におけるＦＰモードでのＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎモニターリングが、増幅を定量するための有用な情報を与えることを、試験が実証している。該非結合染料のシグナルは、時間が経つうちにＤＮＡに多くの染料が結合するにつれてのｍＰ値の増加を知るために対比(contrast)の検出が必要になるほど、顕著になる。この結果は、１ｓｔＰＣＲサイクルと最後（即ち、３５〜４０ｔｈ）サイクルとの間のｍＰ値の大きな変化（増加）である。
【０１４３】
したがって、挿入染料（Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎを包含する）のＦＰ曲線は、例えば、二本鎖生成物を生成するＰＣＲ若しくは等温増幅反応のような、核酸増幅反応を含めた、任意の核酸反応における生成物形成度の指標である。
【０１４４】
ソフトウェア
本発明のコンピューターに基づく態様は、デジタル電子回路で、又はコンピューター・ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアで、又はこれらの組み合わせで実施することができる。本明細書に記載したアルゴリズム及び制御方法(control procedures)は、プログラム可能なプロセッサによる実行のために、機械可読記憶デバイスに具体的に含まれる(tangibly embodied)コンピューター・プログラム製品で実施することができる；及び方法のアクション(method action)は、入力データに作用して、出力を発生することによって本発明の機能を果たすためのインストラクションのプログラムを実行するプログラム可能なプロセッサによって果たすことができる。出力は、ユーザーのための情報（例えば、推論された核酸濃度を表す、例えば、グラフィック又は数値）及び／又はＦＰ装置を制御するための指令を包含することができる。入力は、受信シグナル(receiving signals)、例えば、ＦＰ装置の検出光からの情報を表すシグナルを包含することができる。
【０１４５】
本発明は、データ記憶システム、少なくとも１つの入力デバイス及び少なくとも１つの出力デバイス（例えば、プリンター、コンソール、ＦＰ装置、又はディスク・ドライブ）からデータ及びインストラクションを受け取り、これらにデータ及びインストラクションを伝送するために連結した、少なくとも１つのプログラム可能なプロセッサを包含するプログラム可能なシステムで実行可能である、１つ以上のコンピューター・プログラムで有利に実施される。各コンピューター・プログラムは、高レベルの工程又はオブジェクト指向プログラミング言語(a high level procedural or object oriented programming language)で、又は必要な場合には、アセンブリ若しくは機械語で、実施することができ、いずれにせよ、言語は、コンパイラー言語又はインタープリッタ型言語であることができる。適当なプロセッサは、例として、一般的マイクロプロセッサ及び特殊目的マイクロプロセッサの両方を包含する。一般に、プロセッサは、読取り専用メモリー及び／又はランダム・アクセス・メモリーからインストラクション及びデータを受け取る。一般に、コンピューターは、データ・ファイルを記憶するために１つ以上の大量記憶デバイス(mass storage devices)を包含する；このようなデバイスは、例えばインターナル・ハード・ディスク及びリムーバブル・ディスクのような磁気ディスク；光磁気ディスク；及び光ディスクを包含する。コンピューター・プログラム・インストラクション及びデータを具体的に含むために適した記憶デバイスは、例として、例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ及びフラッシュ・メモリー・デバイスのような半導体メモリー・デバイス；インターナル・ハード・ディスク及びリムーバブル・ディスクのような磁気ディスク；光磁気ディスク；及びＣＤ−ＲＯＭディスクを含めた、あらゆる形式の不揮発性メモリー(non-volatile memory)を包含する。
【０１４６】
１つのこのようなタイプのコンピューターの例を図１１に示す、図１１は、本発明の装置又は方法を実施する又は遂行するために適したプログラム可能なプロセシング・システム５１０のブロック図を示す。コンピューター・システム５１０は、プロセッサ５２０、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）５２１、プログラム・メモリー５２２（例えば、書き込み可能な読み取り専用メモリー（ＲＯＭ）、例えばフラッシュＲＯＭ）、ハードディスク・ドライブ・コントローラ５２３、及びプロセッサ（ＣＰＵ）バス５２５によって連結される入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ５２４を包含する。コンピューター・システム５１０は、例えばＲＯＭで、予めプログラムすることができる；又は他のソースから（例えば、フロッピー（登録商標）・ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ又は別のコンピューターから）のプログラムをロードすることによって、プログラムする（及び再プログラムする）ことができる。
【０１４７】
ハードディスク・ドライブ・コントローラ５２３は、本発明を具体化するプログラムをを含めた、実行可能なコンピューター・プログラムを記憶するために適したハードディスク５３０、及びデータを含むストレージに接続される。Ｉ／Ｏコントローラ５２４は、Ｉ／Ｏバス５２６によってＩ／Ｏインターフェース５２７に接続される。Ｉ／Ｏインターフェース５２７は、例えばシリアル・リンク、ローカル・エリア・ネットワーク、ワイヤレス・リンク及びパラレル・リンクのような通信回路を介して、アナログ又はデジタル形式でデータを受け取って、伝送する。
【０１４８】
実行環境(execution environment)の非限定的な１例は、コンピューター・ランニングＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ４．０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）若しくは改善された(or better)又はＳｏｌａｒｉｓ２．６若しくは改善された（Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）オペレーティング・システムを包含する。ブラウザーは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒバージョン４．０若しくはより大きいもの(or greater)又はＮｅｔｓｃａｐｅ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ又はＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｏｒバージョン４．０若しくはより大きいものであることができる。データベース及び管理サーバのためのコンピューターは、２５６ＭＢメモリ及び９ＧＢ  ＳＣＳＩドライブを用いる、４００ＭＨｚ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）  ＩＩ（Ｉｎｔｅｌ）プロセッサ若しくは同等物を備えたＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ４．０を包含することができる。或いは、２５６ＭＢメモリ及び９ＧＢ  ＳＣＳＩドライブを備えたＳｏｌａｒｉｓ２．６  Ｕｌｔｒａ１０（４００Ｍｈｚ）を用いることができる。
【０１４９】
典型的な適用
増幅反応のＦＰ検出は広範に、例えば、特定の核酸の存在度を定量するために、用いることができる。典型的な適用は、サンプル中の遺伝子発現レベルの検出、サンプル中の腫瘍遺伝子の存在の検出、サンプル中の癌細胞の存在の検出、サンプル（例えば、血液サンプル若しくは法医学サンプル）中の単一ヌクレオチド多形態の検出、サンプル中の病原体の検出、サンプルの遺伝子型の決定（例えば、診断学若しくは法医学のため）及びＲＮＡスプライス検出を包含する。
【０１５０】
他の実施態様
本発明の多くの実施態様を説明してきた。それにも拘わらず、多様な改変が、本発明の要旨及び範囲から逸脱せずに、なされうることは、理解されるであろう。したがって、他の実施態様も、特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図２】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図３】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図４】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図５】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図６】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図７】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図８】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図９】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図１０】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図１１】ソフトウェアを操作するための典型的なコンピューターのブロック図である。
【図１２】典型的なシステムの概略図である。
【図１３】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図１４】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図１５】本発明の典型的な装置の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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