(57)【要約】  本発明は、高い治療係数を有するサイトカイン融合タンパク質、およびこのような融合タンパク質の治療係数を高めるための方法を提供する。本発明の融合タンパク質は、細胞上で発現される複数の型のサイトカイン受容体と結合することができ、複数の細胞型と結合することもできる。さらに、本発明の融合タンパク質は、患者の身体中において、対応する天然に存在するサイトカインより長い循環半減期を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異ＩＬ−２部分と融合した非ＩＬ−２部分を含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、高親和性受容体を発現する細胞に対して参照タンパク質より高い選択性を示し、前記参照タンパク質が、非突然変異ＩＬ−２部分と融合した非ＩＬ−２部分を含み、かつ
前記選択性が、ＩＬ−２Ｒβγ受容体を発現する細胞の活性化に対するＩＬ−２Ｒαβγ受容体を発現する細胞の活性化の比として測定される、融合タンパク質。
【請求項２】
突然変異ＩＬ−２部分が、アミノ酸置換、アミノ酸欠失およびアミノ酸改変からなる群から選択されるアミノ酸の突然変異を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記選択性が、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置８８においてＮからＲにアミノ酸が置換された突然変異ヒトＩＬ−２部分と融合した、非ＩＬ−２部分を含む参照融合タンパク質の、約0.1％と約100％の間にある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記選択性が、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置８８においてＮからＲにアミノ酸が置換された突然変異ヒトＩＬ−２部分と融合した、非ＩＬ−２部分を含む参照融合タンパク質の、約0.1％と約30％の間にある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記選択性が、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置８８においてＮからＲにアミノ酸が置換された突然変異ヒトＩＬ−２部分と融合した、非ＩＬ−２部分を含む参照融合タンパク質の、約１％と約20％の間にある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記選択性が、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置８８においてＮからＲにアミノ酸が置換された突然変異ヒトＩＬ−２部分と融合した、非ＩＬ−２部分を含む参照融合タンパク質の、約２％と約10％の間にある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＩＬ−２Ｒαβγ受容体を発現する細胞が、ＣＴＬＬ−２、Ｋｉｔ２２５および成熟Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＩＬ−２Ｒβγ受容体を発現する細胞が、ＴＦ−１β細胞およびＮＫ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質が成熟ヒトＩＬ−２タンパク質より長い血清中半減期を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記非ＩＬ−２部分がアルブミンである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記非ＩＬ−２部分が抗体ドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
抗体ドメインがＫＳ−１／４、ｄＩ−ＫＳ、ｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)、ｈｕＫＳ、ｈｕＫＳ(ＮからＱ)、ＮＨＳ７６(γ２ｈ)、ＮＨＳ(γ４ｈ)ＮＨＳ７６(γ２ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)、ＮＨＳ７６(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)、および１４．１８からなる群から選択される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記突然変異が、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体との前記タンパク質の親和性に対する、ＩＬ−２Ｒβγ受容体との融合タンパク質の親和性に対して差異的効果を有する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
差異的効果が２倍を超え、以下の式：
【化１】
2005511707.tif 000006
として定義される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
差異的効果が約５倍と約10倍の間である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
差異的効果が約10倍と約1000倍の間である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
突然変異ＩＬ−２部分がアミノ酸置換Ｎ８８ＲまたはＤ２０Ｔを含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置８８においてＮがＲに変化したアミノ酸の置換を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置８５においてＬがＴに、位置８６においてＩがＴに変化したアミノ酸の置換をさらに含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記融合タンパク質が、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置２０においてＤがＴに変化したアミノ酸の置換を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記突然変異ＩＬ−２部分が、Ｋ８、Ｑ１３、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｈ７９、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｉ９２およびＥ９５からなる群から選択されるアミノ酸位置に、突然変異を有する成熟ヒトＩＬ−２タンパク質を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記突然変異ＩＬ−２部分が、Ｌ２５、Ｎ３１、Ｌ４０、Ｍ４６、Ｋ４８、Ｋ４９、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｖ１１５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｉ１２２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０およびＴ１３１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、突然変異を有する成熟ヒトＩＬ−２タンパク質を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
アミノ酸置換がＮ８８Ｒである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
アミノ酸置換がＤ２０Ｔである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
アミノ酸置換がＱ１２６Ｄである、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
１個または複数個の前記アミノ酸置換が、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体との前記タンパク質の親和性に対する、ＩＬ−２Ｒβγ受容体との前記融合タンパク質の親和性に対して差異的効果を有する、請求項２１または２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
差異的効果が２倍を超え、以下の式：
【化２】
2005511707.tif 000007
として定義される、請求項２１または２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
ＩＬ−２部分および非ＩＬ−２部分を含む融合タンパク質であって、前記非ＩＬ−２部分が、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体との前記融合タンパク質の親和性に対する、ＩＬ−２Ｒβγ受容体との前記融合タンパク質の親和性に対して差異的効果を有する突然変異を含む、融合タンパク質。
【請求項２９】
前記差異的効果が約５倍と約１０倍の間である、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
前記差異的効果が約１０倍と約１０００倍の間である、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
前記非ＩＬ−２部分が抗体ドメインを含む、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
前記抗体ドメインがＩｇＧガンマ１ドメイン、ＩｇＧガンマ２ドメインまたはＩｇＧガンマ４ドメインを含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
前記突然変異が前記抗体ドメイン中にある、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
前記突然変異が配列番号１中のＮを異なるアミノ酸に変える、請求項３３に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記ＮがＱに変わっている、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
前記突然変異が配列番号２中のＦＮをＡＱに変える、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
配列番号３５および配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
前記抗体ドメインがＩｇＧガンマ１ドメイン、ＩｇＧガンマ２ドメインまたはＩｇＧガンマ４ドメインを含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記抗体ドメインが突然変異を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記突然変異が配列番号１中のＮを異なるアミノ酸に変える、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
前記ＮがＱに変わっている、請求項４０に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
前記突然変異が配列番号２中のＦＮをＡＱに変える、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
融合タンパク質が、配列番号３５および配列番号３６のアミノ酸配列を含む２つのペプチドの二量体である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
治療用融合タンパク質を改良するための方法であって、前記融合タンパク質が細胞表面上の異なる受容体に結合する２つ以上のタンパク質ドメインを含み、
ｉ．前記異なる受容体に特異的な２つ以上のin vitroアッセイで前記融合タンパク質の活性を試験すること、
ｉｉ．突然変異によって、あるいは化学的または生化学的改変によって、前記融合タンパク質を改変すること、
ｉｉｉ．前記改変型融合タンパク質を前記２つ以上のアッセイで試験すること、
ｉｖ．前記非改変型融合タンパク質と比べて、前記アッセイにおいてその活性が差異的に影響を受ける改変型融合タンパク質を同定すること、
ｖ．動物中において前記同定した改変型融合タンパク質の活性を試験すること
を含む方法。
【請求項４５】
前記融合タンパク質の前記改変が、融合タンパク質内の一部分と前記部分に対する受容体との相互作用に影響を与える、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記受容体が１つまたは複数の前記in vitroアッセイにおいて存在する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記in vitroアッセイが細胞系アッセイである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記アッセイがＩＬ−２ＲαβγまたはＩＬ−２Ｒβγ、あるいはこの両方を発現する細胞を使用する、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、参照によりその開示全体を本明細書に組み込んだ、2001年12月４日に出願されたU.S.S.N.60／337,113、および2002年４月12日に出願されたU.S.S.N.60／371,966の、優先権および特典を請求するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概して、サイトカインを含む融合タンパク質、およびこのような融合タンパク質の治療効果を高めるための方法に関する。より詳細には本発明は、対応する天然に存在するサイトカインより長い循環半減期を患者の身体中で示し、改善された治療性を有する、サイトカイン融合タンパク質に関する。特に本発明は、改善された治療特性を有するＩＬ２融合タンパク質に関する。
【０００３】
（背景技術）
インターロイキン−２(ＩＬ−２)は、免疫系に作用して主に細胞仲介の免疫応答を生み出す、強力なサイトカインである。適切な条件下では、抗原部位の近辺において高濃度で、ＩＬ−２が局所的に生成されて、抗原に対する免疫応答を生み出すために必要な同時刺激シグナルが与えられる。Ｔ細胞の増殖および分化におけるその役割のために、ＩＬ−２は、腫瘍を治療するための免疫療法の手法における、候補となっている。Ｔ細胞を刺激することに加えて、ＩＬ−２がＢ細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー細胞(ＬＡＫ)、単球、マクロファージおよび樹状細胞を刺激することも示されてきている。
【０００４】
ＩＬ−２は、転移性腎臓癌腫および転移性メラノーマを治療するための承認された治療剤であるが、熱、悪心、血管外漏出および低血圧症を含めた、重度の毒性副作用のために、その使用は制限される。ＩＬ−２投与によって観察されるさまざまな毒性効果の中で、最も望ましくない、ＩＬ−２療法を実質的に阻害すると考えられている１つの毒性効果は、血管外漏出症(ＶＬＳ)およびそれと関連する合併症である。
【０００５】
したがって、ＩＬ−２タンパク質の治療上の有用性をさらに高めることが、当分野では依然として必要である。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分の突然変異を同定して、患者に投与するときのそのタンパク質の最大有効量に対するタンパク質の最大耐量を高めることに、部分的に基づくものである。好ましい融合タンパク質は、異なる相互作用によって、患者の身体中の同じ細胞で発現される複数の受容体種に結合することができる。好ましいサイトカイン融合タンパク質は、複数の型のサイトカイン受容体複合体、複数の細胞型に結合することができるサイトカインを含む。本発明は有用な性質を有する特定のサイトカイン融合タンパク質の変異体を同定するための方法も提供する。
【０００７】
本発明は、突然変異ＩＬ−２部分と融合した非ＩＬ−２部分を含む融合タンパク質を提供し、この融合タンパク質は、非突然変異ＩＬ−２部分と融合した非ＩＬ−２部分を含む参照タンパク質より高い選択性を示し、その選択性は、ＩＬ−２Ｒβγ受容体を発現する細胞の活性化に対する、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体発現細胞の活性化の比として測定される。
【０００８】
融合タンパク質の突然変異ＩＬ−２部分は、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の、１個または複数個のアミノ酸の突然変異を含む。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＩＬ−２部分中の１個または複数個のアミノ酸位置における、アミノ酸置換を含む。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＩＬ−２部分中の１個または複数個のアミノ酸位置における欠失を含む。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質のＩＬ−２部分中の、１個または複数個のアミノ酸の改変を含む。
【０００９】
本発明の融合タンパク質の突然変異によって、参照融合タンパク質に対する融合タンパク質の選択性が変わり、その選択性は、ＩＬ−２Ｒβγ受容体発現細胞の活性化に対する、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体発現細胞の活性化の比として測定される。融合タンパク質の突然変異によって、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体との融合タンパク質の親和性に対する、ＩＬ−２Ｒβγ受容体との融合タンパク質の親和性に、差異的効果(differential effect)がもたらされる可能性もある。好ましい突然変異または変化によって、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体発現細胞の融合タンパク質の活性化に対する、ＩＬ−２Ｒβγ受容体発現細胞の融合タンパク質の活性化が低下する。
【００１０】
本発明の好ましい融合タンパク質は一般に、約２倍を超える差異的効果を示す。一態様では、成長がＩＬ−２に依存する細胞または細胞系の増殖応答によって、差異的効果を測定する。融合タンパク質に対するこの応答は、ED50値として表され、用量反応曲線のプロッティング、および50％の最大応答をもたらすタンパク質濃度の決定から、この値が得られる。参照融合タンパク質のED50値の比に対する、ＩＬ−２Ｒβγ受容体発現細胞、本発明の融合タンパク質のＩＬ−２Ｒαβγ受容体発現細胞に関して得られるED50値の比によって、融合タンパク質の差異的効果の指標が与えられる。
【００１１】
非突然変異ＩＬ−２部分と融合した融合タンパク質と同じ非ＩＬ−２部分を含む参照融合タンパク質に対する、本発明の融合タンパク質の選択性を測定することができる。好ましい実施形態では、前記した本発明の融合タンパク質に関して測定される差異的効果は、約５倍と約10倍の間である。本発明の融合タンパク質によって示される差異的効果は、約10倍と約1000倍の間であることが好ましい。
【００１２】
他の好ましい実施形態では、融合タンパク質の選択性を、位置88においてアスパラギンからアルギニンに変わっている(Ｎ88Ｒ)アミノ酸が置換された成熟ヒトＩＬ−２を含むＩＬ−２部分と融合した、融合タンパク質と同じ非ＩＬ−２部分を含む参照融合タンパク質の選択性と比較する。改善された治療係数を有する本発明の融合タンパク質は、Ｎ88Ｒのアミノ酸が置換された参照融合タンパク質の約0.1％と約100％の間の選択性ではなく、Ｎ88Ｒの選択性に近い選択性を有する融合タンパク質を含む。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＩＬ−２部分のＮ88Ｒのアミノ酸が置換された参照融合タンパク質の約0.1％と約30％の間の選択性である、選択性を有する。本発明の融合タンパク質は、約１％と約20％の間の選択性である、ＩＬ−２部分のＮ88Ｒのアミノ酸が置換された参照融合タンパク質の選択性を有する融合タンパク質も含む。本発明の融合タンパク質の選択性は、約２％と約10％の間の選択性である、成熟ヒトＩＬ−２部分のＮ88Ｒのアミノ酸置換を含む参照融合タンパク質の選択性であってもよい。
【００１３】
本発明の融合タンパク質は、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の血清中半減期より長い、血清中半減期を有する。本発明の融合タンパク質の長い血清中半減期は、融合タンパク質の非ＩＬ−２部分に原因がある可能性がある。たとえば、一実施形態では、本発明の融合タンパク質の非ＩＬ−２部分は、アルブミンである。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質の非ＩＬ−２部分は、たとえばＫＳ−１／４抗体ドメインの変異体、ＮＨＳ76抗体ドメインの変異体、および14.18抗体ドメインの変異体を含む、抗体ドメインである。抗体ドメインは、さまざまな他の抗体、たとえばさまざまな腫瘍およびウイルス抗原に対する抗体から選択することもできる。
【００１４】
好ましい実施形態では、前記した本発明の融合タンパク質に関して測定される差異的効果は、約５倍と約10倍の間である。本発明の融合タンパク質によって示される差異的効果は、約10倍と約1000倍の間であることが好ましい。
【００１５】
約２倍を超える差異的効果をもたらす本発明の融合タンパク質の、ＩＬ−２部分のアミノ酸を突然変異させることは有用である。ＩＬ−２部分の異なるアミノ酸の突然変異によって、約２倍を超える、約５倍と約10倍の間、あるいは好ましくは約10倍と約1000倍の間の差異的効果がもたらされる。好ましい実施形態では、アミノ酸の突然変異は、成熟ヒトＩＬ−２部分の位置20に対応するアスパラギン酸のトレオニンへ(D20T)の置換である。他の好ましい実施形態では、アミノ酸の突然変異は、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置88におけるアスパラギンのアルギニンへの置換(Ｎ88Ｒ)である。本発明の融合タンパク質は、複数のアミノ酸位置での突然変異を含むこともできる。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置88でアスパラギンがアルギニンに、位置85でロイシンがトレオニンに、および位置86でイソロイシンがトレオニンに変わる、アミノ酸の置換を含む。
【００１６】
ＩＬ−２部分のいくつかの位置でのアミノ酸の突然変異は、約２倍を超える差異的効果をもたらす。成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の位置Ｋ８、Ｑ１３、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｈ７９、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｉ９２、およびＥ９５に対応するアミノ酸を、突然変異させることは有用である。突然変異させることができる他の有用なアミノ酸位置は、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質のＬ２５、Ｎ３１、Ｌ４０、Ｍ４６、Ｋ４８、Ｋ４９、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｖ１１５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｉ１２２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０およびＴ１３１である。本発明の融合タンパク質中で突然変異させる好ましいアミノ酸位置には、Ｄ２０、Ｎ８８およびＱ１２６がある。
【００１７】
一実施形態では、前に列挙した好ましい位置の１個または複数個のアミノ酸を、融合タンパク質中において突然変異させる。好ましい実施形態では、位置88のアミノ酸アスパラギンをアルギニンに置換する(Ｎ88Ｒ)。他の好ましい実施形態では、位置20のアミノ酸アスパラギン酸をトレオニン(Ｄ20Ｔ)に置換する。他の好ましい実施形態では、位置126のグルタミンをアスパラギン酸(Ｑ126Ｄ)に置換する。さまざまなアミノ酸の置換によって、ＩＬ−２Ｒβγ受容体保持細胞に対しての、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体保持細胞に関する本発明の融合タンパク質の活性の選択性がもたらされ、それがＩＬ−２Ｒαβγ受容体との融合タンパク質の親和性に対する、ＩＬ−２Ｒβγ受容体との融合タンパク質の親和性に反映される。
【００１８】
前記した１個または複数個のアミノ酸位置における突然変異を有する融合タンパク質は、約２倍を超える差異的効果を有する。差異的効果は約５倍と約10倍の間であることが好ましく、約10倍と約1000倍の間であることがより好ましい。
【００１９】
ＩＬ−２部分のアミノ酸を突然変異させることに加えて、非ＩＬ−２部分のアミノ酸を突然変異させることもできる。好ましい実施形態では、非ＩＬ−２部分は抗体ドメインである。抗体ドメインは、さまざまな異なる免疫グロブリン(Ｉｇ)抗体、好ましくは、たとえばＩｇＧガンマ１、ＩｇＧガンマ２およびＩｇＧガンマ４抗体ドメインを含むＩｇＧ抗体、またはこれらの抗体ドメインの任意の組合せから選択することができる。本明細書で使用するように、用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、(i)完全な抗体(たとえば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)、(ii)たとえばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、(Ｆａｂ')2フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体結合部位、ｓＦｖを含むその抗原結合部分、(iii)二重特異性抗体およびその抗原結合部分、および(iv)多重特異性抗体およびその抗原結合部分を意味すると理解される。本発明のタンパク質中では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも１つの免疫グロブリン定常重鎖領域、たとえば免疫グロブリン定常重鎖２(ＣＨ２)ドメイン、免疫グロブリン定常重鎖３(ＣＨ３)ドメイン、Ｆｃ領域を生成させるために使用する免疫グロブリンの型に応じて、場合によっては免疫グロブリン定常重鎖４(ＣＨ４)ドメイン、または前述したものの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン定常重鎖１(ＣＨ１)ドメインが欠けている可能性がある。免疫グロブリンＦｃ領域は、任意の免疫グロブリンクラス、たとえばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭをベースとするものであってよいが、ＩｇＧをベースとする免疫グロブリンＦｃ領域が好ましい。本発明の融合タンパク質中に含まれる抗体部分はヒトのものであることが好ましいが、ネズミ抗体、または任意の他の哺乳動物または非哺乳動物の免疫グロブリンに由来するものであってよい。本発明の融合タンパク質中に使用されるＦｃ領域を、分子の特異的な適用例に適合させることができることが企図される。一実施形態では、Ｆｃ領域は免疫グロブリンγ１イソ型またはその変異体に由来する。他の実施形態では、Ｆｃ領域は免疫グロブリンγ２イソ型またはその変異体に由来する。他の実施形態では、Ｆｃ領域は免疫グロブリンγ３イソ型またはその変異体に由来するものであってよい。Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域そのもの以外の、異なる免疫グロブリンイソ型に由来するヒンジ領域を含むことができる。たとえば、Ｆｃ領域は免疫グロブリンγ２イソ型に由来するものであってよく、免疫グロブリンγ１イソ型またはその変異体に由来するヒンジ領域を含んでよい。本発明の他の好ましい実施形態では、Ｆｃ領域は免疫グロブリンγ４イソ型に由来する。改変されて免疫グロブリンγ１イソ型またはその変異体に由来するヒンジ領域を含む、免疫グロブリンγ４イソ型が特に好ましい。
【００２０】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｉｇ部分の突然変異を含む。有用な突然変異は、ＮがＱに変わっているＩｇＧガンマ１配列ＱＹＮＳＴＹＲ(配列番号１)の突然変異であり；特に有用な突然変異は、ジペプチドモチーフＦＮがＡＱに変わっている、ガンマ２または４配列ＱＦＮＳＴ(配列番号２)の突然変異である。
【００２１】
本発明は、さまざまな本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築体も特徴とする。本発明の融合タンパク質は、癌、ウイルス感染および免疫障害を治療するために特に有用である。
【００２２】
本明細書で開示する本発明の、これらの目的および他の目的、ならびに利点および特徴は、以下の記載事項、図面、および特許請求の範囲からより明らかになるであろう。
【００２３】
（図面の簡単な説明）
図１はサイトカインと、サイトカインの本来の結合性を変える第２のタンパク質部分の、融合を示す図である。図１Ａは、二量体分子としてのＩＬ−２との融合相手、たとえば抗体またはＦｃ含有融合タンパク質のＦｃ部分などを示し、したがってＩＬ−２の２分子が、融合タンパク質のＩＬ−２部分がその受容体と相互作用すると、細胞表面に移動する。図１Ｂは、同じ効果を生み出す第２の機構を示す。
【００２４】
図２は融合タンパク質免疫サイトカインｈｕＫＳ-ＩＬ２(三角形によって表す)、および２つの変異体、ｈｕＫＳ-ａｌａ-ＩＬ２(丸によって表す)およびｈｕＫＳ-ａｌａ-ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)(星印によって表す)の、典型的な薬物動態の概略を示す図である。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＩＬ−２融合タンパク質、特にＩＬ−２免疫サイトカインの治療係数を高めるための、方法および組成物を提供する。本発明によれば、治療分子の治療係数は、分子の最大耐量をその分子の最大有効量で割った比の測定値である。本発明は、遊離ＩＬ−２と比較して著しく長い循環半減期を示す、ＩＬ−２免疫サイトカインの改良型変異体を含む。本発明は、本発明の融合タンパク質によるさまざまなエフェクター機能を保持する細胞の、低い活性化によって表される選択的ＩＬ−２応答を示す、ＩＬ−２融合タンパク質、特にＩＬ−２免疫サイトカインも提供し、この応答はＩＬ−２の毒性効果の主要な原因である。さらに本発明は、改善された活性を有するＩＬ−２融合タンパク質を提供する。本発明のＩＬ−２融合タンパク質は、異なるＩＬ−２受容体とのＩＬ−２融合タンパク質の相対的親和性を変え、ＩＬ−２融合タンパク質の変化した生物学的性質をもたらす、１個または複数個のアミノ酸位置における変化を含む。本発明は、ＩＬ−２療法と関連がある任意の毒性を低下させるか、あるいは最小限にするために有用である。任意の所与のＩＬ−２毒性、ＶＬＳなどの根底にある機構に関係なく、毒性は部分的には、ＩＬ−２は静脈内に投与され、したがって身体全体中で作用するが、特定の部位におけるＩＬ−２効果が望ましいという事実から生じるものである。この問題は、ＩＬ−２の全身投与には、局所投与で必要とされる量よりもはるかに多量が必要であり、したがってこのことが、低用量では見られないと思われる毒性を助長する可能性があるという事実によって悪化する。本発明は、低い毒性を有するＩＬ−２融合タンパク質を提供する。本発明は、低い毒性を有するＩＬ−２融合タンパク質を作製するための方法も提供する。
【００２６】
一般に本発明は、非ＩＬ−２部分と融合したＩＬ−２部分を含む融合タンパク質に有用である。本発明によれば、非ＩＬ−２部分は、合成または天然タンパク質、またはその一部分または変異体(種変異体、対立遺伝子変異体および突然変異した変異体を含む)であってよい。好ましい非ＩＬ−２部分は、Ｆｃおよびアルブミン部分を含む。本発明によれば、ＩＬ−２部分は、少なくとも１つのＩＬ−２活性または機能を保持している、天然ＩＬ−２分子、またはその一部分または変異体(種変異体、対立遺伝子変異体および突然変異した変異体を含む)であってよい(ＩＬ−２部分は、本発明に従い改変されて異なるＩＬ−２受容体結合親和性を有する、ＩＬ−２であってよい)。
【００２７】
本発明によれば細胞は、２つの形で存在する特異的な細胞表面受容体(ＩＬ−２Ｒ)によってＩＬ−２に応答する。高親和性受容体はα、βおよびγサブユニットからなるヘテロ二量体であり；中親和性受容体はβおよびγサブユニットからなるヘテロ二量体である。これら２つの形のＩＬ−２Ｒに関するＩＬ−２の結合定数は、２桁異なる。受容体の細胞質側のシグナル変換は、βγ複合体中の相互作用によって仲介される。異なる細胞型が、さまざまな量でα、βおよびγサブユニットを発現する。たとえば、活性化Ｔ細胞はこれらのサブユニットすべてを発現して、高親和性ＩＬ−２Ｒαβγを形成し、一方で成熟した休止期Ｔ細胞およびＮＫ細胞はβおよびγサブユニットを発現して、中親和性ＩＬ−２Ｒβγを与える。したがって細胞は、刺激するためには異なるレベルのＩＬ−２への露出を必要とし、逆に、特定の細胞状況でＩＬ−２活性を調節することによって、免疫応答の性質を調節することができる。
【００２８】
本発明の方法および組成物は、ＩＬ−２を有する免疫サイトカインなどのＩＬ−２融合タンパク質の状況において特に有用である。本発明によれば、ＩＬ−２を有する免疫サイトカインは、ＩＬ−２を腫瘍の微環境に直接向けることによって、ＩＬ−２療法の有効性を著しく増大させることが示されてきている合成分子である。免疫サイトカインは、抗体部分およびサイトカイン部分、ＩＬ−２部分などからなる融合タンパク質である。本発明によれば抗体部分は、抗原特異的結合親和性などの生物学的機能を有する、完全な抗体または免疫グロブリン、またはその一部分または変異体(種変異体、対立遺伝子変異体および突然変異した変異体を含む)であってよい。同様に、本発明のサイトカイン部分は、少なくともいくつかのサイトカイン活性を保持している、天然のサイトカイン、またはその一部分または変異体(種変異体、対立遺伝子変異体および突然変異した変異体を含む)であってよい。免疫サイトカインの療法の利点は容易に明らかである。たとえば、免疫サイトカインの抗体部分は腫瘍特異的エピトープを認識し、免疫サイトカイン分子を腫瘍部位に向かわせる。したがって、高濃度のＩＬ−２を腫瘍の微環境に送達させることができ、これによって、遊離ＩＬ−２に関して必要とされると思われる用量よりはるかに低用量の免疫サイトカインを使用して、前述したさまざまな免疫エフェクター細胞の活性化および増殖がもたらされる。さらに、遊離ＩＬ−２と比較して、増大した免疫サイトカインの循環半減期が、免疫サイトカインの有効性に貢献する。そして最後に、抗体の本来のエフェクター機能も、たとえばＦｃγＲIII保持ＮＫ細胞において抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を活性化させることによって、利用することができる。
【００２９】
ＩＬ−２免疫サイトカインは、遊離ＩＬ−２より高い有効性を有する。しかしながら、ＩＬ−２免疫サイトカインのいくつかの特徴が、ＩＬ−２分子の潜在的副作用を悪化させる可能性がある。血流中での遊離ＩＬ−２より著しく長いＩＬ−２免疫サイトカインの循環半減期のために、融合タンパク質分子のＩＬ−２または他の部分が、血管系中に一般的に存在する成分を活性化させる確率が高まる。同じ懸念が、Ｆｃまたはアルブミンなどの他の部分と融合したＩＬ−２を含む他の融合タンパク質に当てはまり、循環におけるＩＬ−２の長い半減期をもたらす。
【００３０】
本発明は、このような融合タンパク質の非改変形と比較して低い毒性を有する、完全な抗体、または抗体の一部分、またはアルブミンと融合したＩＬ−２などの、改変型ＩＬ−２融合タンパク質を提供する。本発明は、ＩＬ−２および／または非ＩＬ−２部分中に１個または複数個の改変がある、融合タンパク質も提供し、この改変によって、βおよびγＩＬ−２受容体サブユニット発現細胞と比較した、α、βおよびγＩＬ−２受容体サブユニット発現細胞中の融合タンパク質の相対的活性が変わる。本発明は、このような融合タンパク質の非改変形と比較して、ＩＬ−２受容体のα、βまたはγサブユニットに対して改変された親和性を示す、改変型ＩＬ−２含有融合タンパク質も提供する。
【００３１】
いくつかのＩＬ−２含有抗体融合タンパク質は、遊離ＩＬ−２に関して量的に改変されているが、治療用途には質的に最適でないＩＬ−２活性を示す。本発明は、ＩＬ−２または抗体、あるいは両方の部分が、所与の用途に関するＩＬ−２活性を質的に改善するために改変されている、改変形の抗体−ＩＬ２融合タンパク質を提供する。
【００３２】
本発明は、疾患を治療するための改変型融合タンパク質を設計する際に特に有用な、改変の型を決定するための戦略も提供する。
【００３３】
図１は、それによって融合タンパク質が、融合タンパク質中のある部分の受容体結合性が変わるように細胞表面に結合することができる、考えられる機構を示す。たとえば、図１Ａは、二量体分子としてのＩＬ−２との融合相手を示す。これによって、第２のＩＬ−２分子が、たとえばオフレート(off-rate)を低下させることによってその受容体と相互作用する確率が高まり、純粋な結合の増大がもたらされる。図１Ｂは、同じ効果を生み出す第２の機構を示す。ＩＬ−２の受容体および融合タンパク質のＩＬ−２融合相手の受容体(たとえば、Ｉｇ部分のＦｃ部のＦｃ受容体)保持細胞では、融合相手の受容体(たとえば、Ｆｃ受容体)は融合タンパク質とかみ合い、ＩＬ−２受容体と結合する確率がここで高くなっている細胞表面に融合タンパク質を結合させる。
【００３４】
ｈｕＫＳ−ＩＬ２という名称の、抗体−サイトカイン融合タンパク質の第I／II相試験が近年終了した。ｈｕＫＳ−ＩＬ２は、サイトカイン、インターロイキン−２と融合したＫＳ−１／４抗体からなる融合タンパク質である。ＫＳ−１／４は腫瘍細胞表面の抗原ＥｐＣＡＭ(上皮細胞接着分子)を認識し、腫瘍部位にＩＬ−２を濃縮させる効果を有する。この試験の行程中、治療に対する患者の応答を測定した。療法に対する有意な応答を示した１人の患者は、臨床的な部分的応答、次に疾患の安定化、および鎮痛剤の使用の減少を経験した。この患者は、失敗に終わった事前の標準的治療を既に受けていた。この患者の寿命は、このような治療の不在下で予想された寿命より大幅に延びた。
【００３５】
驚くことに、事前の化学療法の結果として、この患者のＴ細胞群はほぼ除去されていた。この患者は、試験における他のすべての患者より、はるかに少ないＴ細胞数を有していた。ＩＬ−２がＴ細胞を活性化させることが知られており、たとえば、腫瘍細胞に対するＣＤ８(＋)Ｔ細胞の細胞毒性を高めることが知られていることを考慮すると、明らかにＴ細胞を欠いているこの患者の強い応答は、特に予想外であった。この観察によって、ＩＬ−２部分が改変された細胞特異性を示すことができる、新規な抗体−ＩＬ−２融合タンパク質のさらなる研究が促され、ＩＬ−２融合タンパク質の治療係数の改善がもたらされた。
【００３６】
ＩＬ−２の結晶構造、関連サイトカインとの配列比較、および部位特異的突然変異導入法の研究から、異なるＩＬ−２受容体サブユニットと接触しているＩＬ−２中のアミノ酸、およびそれらの生物活性に対する影響の解明において、多くの進展がなされてきている。たとえば、哺乳動物種全体のＩＬ−２中に保たれているＤ20残基は、ＩＬ−２受容体のβサブユニットを結合させるための重要な残基であり、この位置でのさまざまな置換には異なる効果がある。たとえば、変異体ＩＬ−２(Ｄ20Ｋ)は、任意のＩＬ−２Ｒ複合体と結合することができず一般に不活性であり、一方で変異体ＩＬ−２(Ｄ20Ｅ)またはＩＬ２(Ｄ20Ｔ)は、それらの生物活性を保持している。アミノ酸位置Ｒ38およびＦ42はαサブユニットを結合させるために重要であり、一方でこれらの部位における突然変異によって、ＩＬ−２と高親和性受容体ＩＬ−２Ｒαβγの相互作用が低下し、それは中親和性受容体ＩＬ−２Ｒβγと依然として結合しており、したがってある程度の生物活性が保持されている。Ｎ88は、βサブユニットとの相互作用の仲介と関連がある他の残基であり、一方ＩＬ−２(Ｎ88Ｒ)変異体は、中親和性受容体との大幅に低い親和性を有し、高親和性受容体とのその親和性はほぼ変わらない。したがってＩＬ−２のＮ88Ｒ突然変異体は、依然としてＴ細胞を活性化させることができる。
【００３７】
異なる受容体との本発明の融合タンパク質の結合親和性は、たとえばラジオイムノアッセイを含めた、当分野で知られているいくつかの方法によって決定することができる。
【００３８】
したがって、受容体サブユニットの１つと接触している特定のアミノ酸を突然変異させることによって、あるいはアミノ酸残基の組合せを変えることにより、ＩＬ−２の構造を混乱させて、ＩＬ−２が他のＩＬ−２受容体複合体と比較して、１つのＩＬ−２受容体複合体に対して高い親和性を示すことが考えられる。結果として分子は、１つの細胞型において他の細胞型より高い活性を示す。本発明に従って、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質の状況でＩＬ−２の構造を操作して、所望の効果を得ることができる。さらに、いくつかの場合、Ｉｇ−ＩＬ２変異体融合タンパク質は、対応する遊離ＩＬ−２突然変異タンパク質と比較して、異なる生物学的特性を有する。
【００３９】
本発明に従って、融合タンパク質中のＩＬ−２部分を操作して、それによってＩＬ−２受容体サブユニット(α、βまたはγ)の１つまたは複数に対する改変された親和性が示され、融合タンパク質の生物活性の全体的な低下がもたらされることも考えられる。このような変異体はＩＬ−２応答細胞を活性化させることができるが、遊離ＩＬ−２より高濃度を必要とする。したがって、ＩＬ−２融合タンパク質が、たとえば標的部分の近くの所望の標的部位に濃縮されるとき、これらの変異体は改善された治療係数を有する。
【００４０】
ＩＬ−２Ｒのα受容体サブユニットは、結合機能を果たしているようである：この低親和性受容体はＩＬ−２と結合し、ＩＬ−２を細胞表面付近に保ち、その結果、細胞表面ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγ受容体サブユニットの近辺の有効濃度が増大する。さらに、ＩＬ−２受容体のαサブユニットおよびβγサブユニットは、高親和性ＩＬ−２Ｒ複合体を生み出す。本発明は、ＩＬ−２融合タンパク質が、細胞表面上の受容体との多数の異なる相互作用と関わることができるという認識に、部分的に基づくものである。たとえば、抗体部分を含む融合タンパク質の場合、抗体部分そのものが、融合タンパク質と細胞表面の結合を助長することができ、さらにＩＬ−２が、融合タンパク質中に多数のコピーで存在することができる。結果としてＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒのβおよびγサブユニットのみ発現細胞に結合することができ、このような細胞を活性化させる高い能力を有する。
【００４１】
たとえば、ＩＬ−２と融合した二量体免疫グロブリン(Ｉｇ)はＩＬ−２の２つのコピーを有し、したがって、１つのＩＬ−２部分とその受容体の結合によって、同じ細胞表面上で第２のＩＬ−２部分と受容体分子が相互作用する確率が高まる。図１Ａ中の図は、細胞表面上でのＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質の考えられる立体配置を表す。本発明は、ＩＬ−２部分が改変されてＩＬ−２Ｒβγ受容体との結合性が低下している、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質を提供する。
【００４２】
それによってＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質が、いくつかの免疫細胞の表面との改変された結合性を有することができる第２の機構は、細胞表面上のＦｃ受容体がＩｇ部分のＦｃ部と結合することができ、したがってＩＬ−２とＦｃ受容体およびＩＬ−２受容体の両方を保持する細胞の表面を結合させることができるということである(図1B)。このような細胞には、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージがある。本発明は、Ｉｇ部分が改変されてＦｃ受容体との結合性が低下している、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質を提供する。本発明は、Ｉｇ部分およびＩＬ２部分が前に記載した性質の改変を取り込んでいる、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質をさらに提供する。
【００４３】
Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質を、ＩＬ−２受容体サブユニットを有する細胞と人工的に結合させることができるという見通しに基づくと、結合部分が改変されている変異体融合タンパク質を設計することが可能である。たとえば、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質のＦｃ受容体結合性を変えることは有用である。これはたとえば、Ｆｃ部分中の知られているアミノ酸接触部位を突然変異させること、またはＮ末端連結グリコシル化部位を除去すること、あるいはタンパク質の突然変異または酵素による消化によって行うことができる。
【００４４】
同様に、本発明によれば、ＩＬ−２受容体サブユニットとの結合に対して影響がある、ＩＬ−２部分中の突然変異を導入することは有用である。特に、ＩＬ−２受容体のβサブユニットと接触している、ＩＬ−２中のアミノ酸を突然変異させることは有用である。特に有用な型の突然変異は、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒβの間の結合エネルギーを低下させるが、この相互作用を立体的に妨害することはない突然変異である。たとえば、接触アミノ酸の短い側鎖を有するアミノ酸への突然変異が、特に有用である。このような突然変異の影響は、ＩＬ−２受容体のβ−γ形とのＩＬ−２の親和性を重度に低下させること、およびこれらの受容体によって仲介されるシグナル経路の活性化を低下させることであるが、ＩＬ−２受容体のα−β−γ形との結合、またはこのようなＩＬ−２受容体保持細胞中でＩＬ−２によって誘導される活性に対する影響はほとんど、あるいはまったくない。本発明の好ましい実施形態では、突然変異によってＩＬ−２受容体のβ−γ形との親和性が低下するが、親和性がなくなることはない。
【００４５】
同様に、ＩＬ−２受容体のαサブユニットと相互作用するＩＬ−２表面上のアミノ酸に突然変異を導入することは有用である。特に有用な型の突然変異は、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒαの間の結合エネルギーを低下させるが、この相互作用を立体的に妨害することはない突然変異である。たとえば、接触アミノ酸の短い側鎖を有するアミノ酸への突然変異が、特に有用である。このような突然変異の影響は、ＩＬ−２受容体のα−β−γ形とのＩＬ−２の親和性を重度に低下させることであるが、ＩＬ−２受容体のβ−γ形との結合に対する影響はほとんど、あるいはまったくない。本発明の好ましい実施形態では、突然変異によってＩＬ−２受容体のα−β−γ形との親和性が低下するが、親和性がなくなることはない。
【００４６】
同様に、ＩＬ−２受容体のγサブユニットと相互作用するＩＬ−２表面上のアミノ酸に突然変異を導入することも有用である。前の例と同様に、特に有用な型の突然変異は、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒγの間の結合エネルギーを低下させるが、この相互作用を立体的に妨害することはない。たとえば、接触アミノ酸の短い側鎖を有するアミノ酸への突然変異が、特に有用である。このような突然変異の影響は、ＩＬ−２受容体のβ−γ形とのＩＬ−２の親和性を有意に低下させることであるが、ＩＬ−２受容体のα−β−γ形との結合に対する影響はほとんど、あるいはまったくない。本発明の好ましい実施形態では、突然変異によってＩＬ−２受容体のβ−γ形との親和性が低下するが、親和性がなくなることはない。
【００４７】
ＩＬ−２受容体サブユニットの異なる表面と相互作用するアミノ酸の、突然変異の組合せをＩＬ−２に導入することも有用である。それぞれの突然変異は独立に、ＩＬ−２とＩＬ−２受容体のα−β−γまたはβ−γ形との結合に対して影響を与える可能性はほとんど、あるいはまったくないが、突然変異の組合せによって、ＩＬ−２とその受容体との親和性またはＩＬ−２の生物活性の、望ましい低下を得ることができる。
【００４８】
本発明によれば、ＩＬ−２の他の部分の突然変異は、ＩＬ−２とＩＬ−２受容体のβ−γ形またはα−β−γ形との相互作用の変化に間接的に貢献し、したがって調節された活性を有するＩＬ−２分子をもたらす。たとえば、突然変異によって分子の立体配置をわずかに変えることができ、その結合性を変えることができる。
【００４９】
本発明によれば、ＩＬ−２部分とＩＬ−２受容体複合体の結合を調節するＩＬ−２部分の突然変異、および抗体部分の突然変異を含む、融合タンパク質を生成させることも有用である。Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質と特定のＦｃ受容体の相互作用を改変することが望まれる場合、これらの融合タンパク質が特に有用である可能性がある。
【００５０】
遊離ＩＬ−２部分は、ＩＬ−２部分がＩｇなどの他のタンパク質部分と融合するときとは、ＩＬ−２Ｒ複合体に関して異なる結合性を示す可能性がある。このことが起こる１つの考えられる機構は、前に示している。他の考えられる機構は、ＩＬ−２が免疫サイトカインの状況において立体的に、すなわち立体配置が制約され、個々の制約がＩＬ−２部分と異なるＩＬ−２受容体複合体の結合性に反映されることである。したがって、この制約を調節する改変を融合タンパク質に導入することが有用である。たとえば、非ＩＬ−２部分を変えることは、ＩＬ−２の活性の調節において有用である。
【００５１】
特定のＩＬ−２融合タンパク質、Ｆｃまたはアルブミンを含むＩｇ−ＩＬ２融合またはＩＬ−２融合タンパク質などの有用性を、ヒト疾患の治療などの特定の用途に関して、適切な細胞または動物モデルにおいて試験する。可能なときは、動物モデルにおいて試験することが好ましい。なぜなら、このような試験は、ヒト疾患における免疫系の非常に複雑な性質と非常に関係があるからである。たとえば、ある細胞の特定のバランスは、癌などの当該の疾患、または細菌、ウイルス、または寄生虫による感染と戦うために最適である可能性がある。たとえば、比較的高レベルのＴ細胞活性は、ある腫瘍型に対しては有用である可能性があるが、一方で比較的高レベルのＮＫ細胞活性は、異なる腫瘍型に対しては有用である可能性がある。
【００５２】
本発明の他の特徴は、毒性が高い、ＩＬ−２融合タンパク質変異体、たとえばＦｃまたはアルブミンを含むＩｇ−ＩＬ２融合体またはＩＬ−２融合体などである。たとえば、突然変異体Ｄ20Ｔを含むＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質は、位置20にＤを有する対応するＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質と比較して、マウスなどの動物中では低い毒性を示す。他の例では、突然変異体Ｎ８８Ｒまたは突然変異体Ｌ８５Ｔ、Ｉ８６Ｔ、Ｎ８８Ｒの組合せをＩＬ−２部分中に含むＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質は、位置88にＮを有する対応するＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質と比較して、マウスなどの動物中では低い毒性を示す。さらに、突然変異体Ｄ20Ｔまたは突然変異体Ｎ88ＲをＩＬ−２部分中に含む抗体−ＩＬ２融合タンパク質は、抗体の抗原標的を発現する腫瘍を治療するためにこれを使用すると、対応する親抗体−ＩＬ２融合タンパク質に匹敵する効力を示す。
【００５３】
Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質のＤ20Ｔ変異体の性質は、遊離ＩＬ−２タンパク質中のＤ20Ｔ変異体の報告されている性質と照らしてみると、非常に驚くべきものである。詳細には、遊離ＩＬ−２タンパク質中のＤ20Ｔ突然変異体は、ＩＬ−２Ｒαβγ保持細胞またはＩＬ２Ｒ−βγ保持細胞に対するその活性において、野生型ＩＬ−２タンパク質と比べて差異を示さない(Shanafelt他、PCT WO99／60128)。しかしながら、Ｄ20Ｔ突然変異体を含むＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質は、ＩＬ２Ｒ−βγ保持細胞の活性化においては非常に低い効力を有するが、ＩＬ−２Ｒαβγ保持細胞の活性化においてはほぼ正常の効力を有する。
【００５４】
したがって、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質のＩＬ−２部分中のいくつかのアミノ酸の突然変異によって、低い毒性がもたらされるが、一方さまざまな疾患の治療における融合タンパク質の効力に対してはほとんど影響がない。たとえば、ＩＬ−２融合タンパク質変異体とその受容体との親和性を変えることができる程度は、どのくらい上手く特定の融合タンパク質がその目的とする標的部位に濃縮するかの関数である。ＩＬ−２部分中の１個または複数個の以下のアミノ酸：Ｌｙｓ８、Ｇｌｎ１３、Ｇｌｕ１５、Ｈｉｓ１６、Ｌｅｕ１９、Ａｓｐ２０、Ｇｌｎ２２、Ｍｅｔ２３、Ａｓｎ２６、Ａｒｇ３８、Ｐｈｅ４２、Ｌｙｓ４３、Ｔｈｒ５１、Ｈｉｓ７９、Ｌｅｕ８０、Ａｒｇ８１、Ａｓｐ８４、Ａｓｎ８８、Ｖａｌ９１、Ｉｌｅ９２、およびＧｌｕ９５を突然変異させることが特に有用である。ＩＬ−２部分中の１個または複数個の以下のアミノ酸：Ｌｅｕ２５、Ａｓｎ３１、Ｌｅｕ４０、Ｍｅｔ４６、Ｌｙｓ４８、Ｌｙｓ４９、Ａｓｐｌ０９、Ｇｌｕ１１０、Ａｌａ１１２、Ｔｈｒ１１３、Ｖａｌ１１５、Ｇｌｕ１１６、Ａｓｎ１１９、Ａｒｇ１２０、Ｉｌｅ１２２、Ｔｈｒ１２３、Ｇｌｎ１２６、Ｓｅｒ１２７、Ｓｅｒ１３０、およびＴｈｒ１３１を突然変異させることも有用である。
【００５５】
本発明は、ＩＬ−２と融合したＩｇ部分のいくつかの形、たとえば抗体−ＩＬ２融合体、ｈｕＫＳ−ＩＬ２またはｄＩ−ＮＨＳ７６−ＩＬ２などを開示するものであり、ＩＬ−２と融合したＩｇ部分が変わることによって、融合タンパク質とＩＬ−２Ｒ複合体の結合性に影響を与える。これらの変化は、重鎖のアミノ酸配列中のアミノ酸の置換、または化学的改変であってよい。有用なアミノ酸の置換には、融合タンパク質のグリコシル化に影響を与える置換、またはＦｃ受容体との相互作用に直接影響を与える置換がある。特に有用な置換は、ＩｇＧ重鎖の位置Ｎ297(ＥＵ名)において通常見られるグリコシル化を阻害する置換であってよい。化学的および生化学的改変には、分子のＰＥＧ化、またはＮ末端連結グリコシル鎖を除去するためのＮ−グリカナーゼによる処理を含む。理論に縛られることを望まずに、たとえば抗体分子の硬さを変えることによる、分子の抗体部分の特異的な変化は、ＩＬ−２の立体配置に影響を与える可能性があると想定することができる。ｈｕＫＳ−ＩＬ２の場合、これらの改変によって、細胞系バイオアッセイにおいてＴ細胞に対する高い選択性をここで示す、ＫＳ−ＩＬ２分子をもたらすことができる。
【００５６】
抗体−ＩＬ２融合タンパク質に関しては、他の望ましい性質を分子に与えるＩｇ部分を選択することが、有用であることが多い。たとえば、ガンマ１サブクラスのＩｇＧ部分が、ＡＤＣＣなどの免疫学的エフェクター機能を保つために好ましい。あるいは、ガンマ２またはガンマ４サブクラスのＩｇＧ部分が、たとえばＦｃＲ受容体の相互作用を低下させるために好ましい可能性がある。サブクラスのガンマ２またはガンマ４のＩｇＧ部分を使用するときは、ガンマ１由来のヒンジ領域を含むことが特に好ましい。
【００５７】
Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質の突然変異および化学的または生化学的改変を、異なる有用な性質を有する他の突然変異、いくつかのＦｃ領域のＣ末端におけるリシンのアラニンまたは他の疎水性残基への突然変異などと組み合わせて使用することが、有用であることが多い。たとえば、本発明の改変を抗体融合タンパク質ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２またはｄＩ−ＮＨＳ(76)−ａｌａ−ＩＬ２に施すことが、特に有用である。潜在的Ｔ細胞エピトープを除去する他の突然変異を、分子に導入することも好ましい。これらの突然変異は、分子の所望の性質を実質的に変えないことが特に好ましい。
【００５８】
本発明は、ＩＬ−２と融合したＩｇ部分のいくつかの形、たとえば抗体−ＩＬ２融合体、たとえばｈｕＫＳ−ＩＬ２などをさらに開示するものであり、ＩＬ−２、たとえばＩＬ２(Ｄ20Ｔ)またはＩＬ２(Ｎ88Ｒ)のアミノ酸配列の特異的改変が、融合タンパク質とＩＬ−２Ｒ複合体の結合性を変える。成熟ヒトＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３で示される。結合性の変化は、細胞系バイオアッセイにおけるＴ細胞に対する高い選択性に反映される。特定の突然変異が、Ｔ細胞に対する高い選択性の程度に影響を与える。さらに、これらの変化によって融合分子、たとえばｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)またはｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)が生成し、たとえばｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２をマウスの全身に投与するときより、毒性のある副作用は少ない。さらに、これらの変化によって融合タンパク質、たとえばｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)がもたらされ、これはいくつかのマウス腫瘍モデルの腫瘍療法において、正常なｈｕＫＳ−ＩＬ２またはｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２と少なくとも同程度有効である。
【００５９】
腫瘍を取り除くために必要とされる免疫応答は多様であり、腫瘍型によっても異なるので、低い毒性を有する分子を使用するとき、分子から機能を完全に取り除くことは、望ましくない可能性がある。たとえば、結腸癌の肺転移が誘導されたマウスモデルでは、ｈｕＫＳ−１Ｌ２が、ＮＫ細胞を必要としないＴ細胞仲介の機構によって、癌を効果的に治療することが示されたが、一方で神経芽細胞腫のマウスモデルでは、ｈｕＫＳ−ＩＬ２による腫瘍の除去は、Ｔ細胞ではなくＮＫ細胞を必要とすることが示された。したがって、選択性概略をより適切に調節して、ＮＫ仲介の応答をさらに可能にすることができる、いくつかの例が存在する。本発明の一実施形態では、より望ましい手法は、分子の選択性概略をわずかに変えて、多数の受容体型に関する応答が、最も好ましくは分子が濃縮される部位で、さらに得られるようにすることである。たとえば、本発明は、対応する非改変型Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質と比較して、ＩＬ−２Ｒβγと比較したＩＬ−２Ｒαβγに関する選択性が、２〜10倍、10〜100倍、100〜1000倍、あるいは1000倍より高い、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質の変形を提供する。
【００６０】
本発明の他の目的は、癌または感染性疾患を治療するための、低い毒性を有するＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質の最適な使用を提供することである。改変された選択性によって低い血管毒性がもたらされる可能性があるが、融合タンパク質の用量を増大させることによって、治療係数の最適な増大をもたらすことはできない。たとえば、これらの用量の増大によって、免疫応答を調節する負の調節機構の誘導がもたらされる可能性がある。したがって、低毒性Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質とこのような影響を減らす物質を組み合わせた、治療様式を使用することが有用である可能性がある。
【００６１】
１つの近年同定された細胞免疫応答の強力な阻害剤は、高親和性ＩＬ−２Ｒを発現する、あるクラスのＣＤ４+ＣＤ25+調節Ｔ細胞である(概要に関しては、Maloy and Powrie、(2001)Nature Immunol.2：816を参照)。本発明によれば、高用量の低毒性Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質によって、これらの細胞をさらに活性化させることができる。刺激によってこれらの細胞は、その細胞表面上のＣＴＬＡ−４を上方制御し、免疫細胞上の細胞表面分子Ｂ７−１およびＢ７−２を結び付け、したがって強力な負のシグナルを誘導する(Takahashi他、(2000) J. Exp：Med. 192：303)。したがって、これらのプロセスの阻害剤が、本発明の融合タンパク質を用いる併用療法において有用であると思われる。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４およびその影響を中和する抗体を使用することができる。他の実施形態では、可溶性Ｂ７受容体およびそれらの融合タンパク質(たとえば、Ｂ７−Ｉｇ)などの、類似の活性を有する他のタンパク質を使用することができる。他の実施形態は、これらの調節Ｔ細胞そのものを殺傷または阻害する抗体、たとえば抗ＣＤ４および抗ＣＤ25などの使用を含む。好ましい実施形態では、その後者を同時にではなく順次に投与する。
【００６２】
本発明によれば、他の有用な機構は、シクロ−オキシゲナーゼ２(ＣＯＸ−２)の過剰刺激に関するものであり、これによって、免疫応答を阻害することが知られている(PCT US99／08376を参照)プロスタグラジンが生成される。したがって、他の実施形態は、低毒性Ｉｇ−ＩＬ２分子とインドメタシンなどのＣＯＸ−２阻害剤、あるいはより具体的な阻害剤セレコキシブ(Pfizer)およびロフェコキシブ(Merck＆Co)の使用を組み合わせたものである。低毒性Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質の用量の増大によって、さらに他の免疫機構を活性化させることができ、併用療法を考案してこれらの機構について述べることができることは理解される。さらに、in vivoにおいて免疫増強効果がある、低用量のいくつかの細胞毒性薬剤、たとえばシクロホスファミドなどは、併用療法に含ませるための有用な治療剤である可能性がある。
【００６３】
アルブミンの融合体が、長い血清中半減期を有する治療用融合タンパク質を生成させる目的で、開発されてきている。たとえば、Yeh他(Yeh P他、Proc Natl Acad Sci USA.[1992]89：1904〜8)は、対応するＣＤ４部分単独よりはるかに長い血清中半減期を有する、アルブミン−ＣＤ４融合タンパク質を構築した。
【００６４】
アルブミンとＩＬ−２、エリトロポイエチン、インターフェロンα、および他のリガンドの融合体を構築することが有用である。これらの融合タンパク質は、対応するリガンド単独より長い血清中半減期を有する。このような融合体は、標準的遺伝子工学およびタンパク質発現技法を使用して、Ｎ〜Ｃ末端方向にリガンド−アルブミン融合体またはアルブミン−リガンド融合体として、構築することができる。あるいは、アルブミンとリガンドを化学的結合によって結び付けることができる。
【００６５】
しかしながら、アルブミン−リガンド融合タンパク質は、しばしば望ましくない性質を有する。理論に縛られることを望まずに、なぜアルブミン−リガンド融合タンパク質が望ましくない性質を有する可能性があるのかという１つの理由は、血管内皮細胞上にアルブミンの受容体が存在するという事実である(Tiruppathi他、Proc Natl Acad Sci USA.[1996]93：250〜4)。結果として、リガンドの血管内皮細胞に対する影響が増大する可能性がある。
【００６６】
たとえば、アルブミン−ＩＬ２融合タンパク質は長い血清中半減期を有するが、さらなる血管外漏出も引き起こす。理論に縛られることを望まずに、血管系中のＩＬ−２仲介型応答の活性化が、融合タンパク質と血管系の内皮細胞上に存在するアルブミン受容体の結合のために、増大することが示される。アルブミン−ＩＬ２融合タンパク質と、アルブミンおよびＩＬ−２用の受容体保持細胞の結合は、Ｉｇ−リガンド融合タンパク質と細胞表面の結合を増大させるための、図１ｂに示す機構と類似の機構によって増大する。
【００６７】
アルブミン−ＩＬ２によって引き起こされる血管外漏出を減らすために、ＩＬ−２Ｒαβγ受容体とのＩＬ−２の親和性を特異的に低下させる突然変異を、ＩＬ−２部分に導入することが有用である。たとえば、アルブミン−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)またはアルブミン−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)融合タンパク質が構築され、これがマウスなどの動物の疾患モデルに関して、低い毒性および高い治療係数を有することがその後見出される。
【００６８】
本発明の分子は、悪性腫瘍および腫瘍を治療するため、特に固形腫瘍を治療するために有用である。本発明に従って治療することができる腫瘍の例は、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、肝臓癌、膀胱、頭部および首部癌だけには限られないが、これらに存在する上皮起源の腫瘍である。同様に、本発明によれば、メラノーマ、小細胞肺癌腫、軟質組織肉腫、および神経芽細胞腫などだけには限られないが、神経外胚葉起源の悪性腫瘍および腫瘍は、治療するのに適した候補である。
【００６９】
本発明によれば、治療剤を腫瘍部位または悪性腫瘍または転移の部位に向けることは有用である。腫瘍または悪性腫瘍細胞によって優先的に提示される抗原を対象とする抗体を含む、Ｉｇ−融合タンパク質は特に有用である。たとえば、ＥｐＣＡＭ(例えばＫＳ１／４)、または胚フィブロネクチン(例えばＢＣ１)、またはＣＥＡ、またはクロマチン複合体(例えばＮＨＳ76)、またはＧＤ２(例えば14.18)、またはＣＤ19、またはＣＤ20、またはＣＤ52、またはＨＥＲ２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂＢ−２、またはＭＵＣ１、またはＰＳＭＡに関する特異性を有する、抗体部分を含む融合タンパク質が特に有用である。さらに、さまざまなウイルス抗原を対象とする抗体が特に有用である。
【００７０】
（実施例）
[実施例１]
ＩＬ２コード配列中または抗体コード配列中のコドンが置換された、Ｉｇ−ＩＬ２融合遺伝子の構築：
免疫サイトカイン用の発現ベクターは、Gillies他、(1998)J.Immunol.160：6195〜6203中に記載された。ヌクレオチド配列のいくつかの改変によって、コード配列をヒトγ−１遺伝子の３’端に加えることが可能になった。重鎖をコードするヒトγ−１遺伝子では、翻訳停止コドンの280ｂｐ上流に位置するＸｍａＩ制限部位が、サイレント突然変異(TCCからTCA)を導入することによって破壊された。他のサイレント突然変異(TCTからTCC)を、重鎖のＣ末端リシンの３残基上流のＳｅｒコドンに導入して、新しいＸｍａＩ部位を含む、配列TCC CCG GGT AAA(配列番号４)を作製した[Lo他、(1998)Protein Engineering 11：495〜500]。
【００７１】
ＩＬ−２ ｃＤＮＡを化学合成によって構築し、これは新しい特有のPvuII制限部位を含む[Gillies他、(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. 89：1428〜1432]。発現ベクター中のＸｍａＩおよびPvuII部位は特有であり、それらは、以下のものを含めた、抗体−ＩＬ２変異体の構築を容易にした。
【００７２】
１)ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２の構築は、以前に記載されている(たとえば、WO01／58957)。生成するタンパク質は、Ｉｇ重鎖の定常領域と成熟ｈｕＩＬ−２の間の接合部にアミノ酸置換を含む。この接合部は通常、配列ＳＰＧＫ−ＡＰＴ(配列番号５)を有し、その中で−ＳＰＧＫ−は重鎖のＣ末端であり、−ＡＰＴ−は成熟ＩＬ−２タンパク質のＮ末端である。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２では、ＫからＡの置換が導入され(位置Ｋ[−1]と呼ぶ)、接合部はここで配列ＳＰＧＡ−ＡＰＴ(配列番号：６)を有する。結果として、このタンパク質の血清中半減期が改善される(実施例５を参照。
【００７３】
２)ｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２。このＫＳ−ＩＬ２融合タンパク質は、ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２中に置換を含み、潜在的Ｔ細胞エピトープが除去されている型の融合タンパク質を生成させる(同時係属特許出願U.S.S.N.10／112,582および10／138,727中に記載されており、その開示の全容は本明細書に参照によって組み込んである)。
【００７４】
本発明の融合タンパク質のＩｇ部分の定常領域は、通常は可変領域と結合している定常領域、またはＩｇ部分を有し、異なるサブクラスのＩｇＧ分子または異なる種由来の可変および定常領域を含む融合タンパク質をもたらす、異なる定常領域から選択することができる。たとえば、ＩｇＧのガンマ４定常領域(配列番号７)を、ガンマ１定常領域(配列番号８)の代わりに使用することができる。この変更には、ガンマ４鎖がより長い血清中半減期をもたらすことができるという利点がある。したがって、ＩｇＧガンマ２定常領域(配列番号９)も、ＩｇＧガンマ１定常領域(配列番号８)の代わりに使用することができる。さらに、ＩｇＧガンマ１由来のヒンジ領域(配列番号10)で、ＩｇＧガンマ２(配列番号11)またはＩｇＧガンマ４定常領域(配列番号12)中に通常存在するヒンジ領域を置換することができる。融合タンパク質Ｉｇ要素は、ＩｇＧがＦｃγＲI、ＦｃγＲIIまたはＦｃγＲIIIの少なくとも１つと低い結合親和性を有するように、定常領域中に突然変異体を含んでもよい。本発明の融合タンパク質は、ＩｇＧ定常領域中に突然変異体を含んで、潜在的グリコシル化部位およびＴ細胞エピトープを除去することができる。たとえば、さまざまな定常領域は、潜在的Ｔ細胞エピトープを除去するために、定常領域のＣ末端部分に変化を含んでよい。たとえば、ＩｇＧ分子のさまざまな定常領域のＣ末端部分中の潜在的Ｔ細胞エピトープは、ＩｇＧガンマ１およびＩｇＧガンマ２定常領域のアミノ酸配列ＫＳＬＳＬＳＰＧＫ(配列番号13)、およびＩｇＧガンマ４定常領域のアミノ酸配列ＫＳＬＳＬＳＬＧＫ(配列番号14)を、アミノ酸配列ＫＳＡＴＡＴＰＧＡ(配列番号15)に変えることによって除去される。
【００７５】
３)ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)。このｈｕＫＳ−ＩＬ２変異体は、Ｉｇ重鎖の定常領域と成熟ｈｕＩＬ−２の間の接合部に、前に記載したものと同じアミノ酸置換(Ｋ[−１]Ａ、ＡＡＡからＧＣＣへのコドンの変更によって作製したもの)を含み、さらにこのｈｕＫＳ−ＩＬ２変異体は、Ｒ側の成熟ｈｕＩＬ−２の配列中の位置Ｎ88に置換(ａＡＴからａＧＧへのコドンの変更によって作製したもの)を含む。サイレント突然変異(アミノ酸位置Ｇ98、コドンをｇｇＡｔｃｃからｇｇＣｔｃｃに変えた)を導入することによって、他の変化をｈｕＩＬ−２のヌクレオチド配列に導入して、Ｂａｍ ＨＩの既存の制限部位を除去した。
【００７６】
ＰＣＲ系突然変異誘発戦略を、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)の構築において使用した。成熟ｈｕＩＬ２のコード配列に広がる２つの重複ＰＣＲ断片を、ｈｕＩＬ２をBluescriptベクター(Stratagene)中で鋳型として使用して生成させた。上流ＰＣＲ断片は、これらの突然変異をセンスおよびアンチセンスプライマーにそれぞれ取り込むことによって、Ｋ[−１]ＡおよびＮ88Ｒをコードするヌクレオチド変化体を含んでいた。これらの変化体は、プライマー配列中に下線を引いたヌクレオチドによって示す。センスプライマー配列は：５'ＣＣＣＣＧＧＧＴＧＣＣＧＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡ３'(配列番号16)；であり、アンチセンスプライマー配列は：５'ＡｇＣＣＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＡＴＴＡＣＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＡＡＧＴＣＣＣＴＡＧＧＴ３'(配列番号17)であった。下線を引いたここではアルファベットの小文字で示したヌクレオチドは、Ｂａｍ ＨＩ部位を破壊する変化を表す。第２の下流ＰＣＲ断片は、上流ＰＣＲ断片との20ヌクレオチド重複領域、および残りのＩＬ２配列を含んでいた。この反応において使用したセンスプライマーは、５’ＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧｃＴＣＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴ(配列番号18)であった。ここでも、下線を引いたここではアルファベットの小文字で示したヌクレオチドは、Ｂａｍ ＨＩ部位を破壊するサイレント突然変異を示す。使用したアンチセンスプライマーは、pBluescriptベクター中の配列にアニールする、標準的なＭ13逆プライマーであった。これらの重複ＰＣＲ断片を、配列番号16のプライマーおよびＭ13逆プライマーを用いる反応において使用して、最終的なＰＣＲ産物を生成させ、これをその後ＴＡベクター(Invitrogen)に挿入した。
【００７７】
挿入断片の配列を確認し、改変型ＩＬ２配列(プラスミドＴＡ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)由来)を含む442ｂｐのＸｍａI／Ｘｈｏ Ｉ断片を使用して、親免疫サイトカイン発現プラスミド(ｈｕＫＳ−ＩＬ２をコードする)中の野生型ｈｕＩＬ−２配列を置換した。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)をコードする生成した免疫サイトカイン発現プラスミドを、制限地図の作製および塩基配列決定によって確認した。
【００７８】
４)ｈｕＫＳ Ｍ１−ＩＬ２(ＴＴＳＲ(配列番号19))。免疫サイトカイン変異体ｈｕＫＳ Ｍ１−ＩＬ２を、標準的な組み換えＤＮＡ技法(および、その開示の全容が本明細書に参照によって組み込んである、たとえば同時係属特許出願U.S.S.N.10／112,582中に記載された技法)によって構築した。それは融合タンパク質の抗体−ＩＬ−２接合部領域中に多数のアミノ酸置換を含み、これによって潜在的Ｔ細胞エピトープが除去され、免疫性原の低いタンパク質が生じる。配列はＫＳＬＳＬＳＰＧＡ−ＡＰＴ(配列番号20)から、ＫＳＡＴＡＴＰＧＡ−ＡＰＴ(配列番号21)に変わり(ダッシュはＩｇ／ＩＬ−２接合部位を示し、置換されたアミノ酸には下線を引く)、「Ｍ１」として示される。この変異体にさらに組み込まれているのは、免疫サイトカインの血清中半減期を増大させることが示されてきている、接合部前の最後のアミノ酸におけるＫからＡへの変化である。
【００７９】
ｈｕＫＳ Ｍ１−ＩＬ２(ＴＴＳＲ)は、免疫サイトカインのＩＬ−２部分に位置する他のアミノ酸置換を含む。前記したＮ88Ｒの置換によって作製される潜在的Ｔ細胞エピトープを除去するために、天然ｈｕＩＬ−２の−ＤＬＩＳＮＩ−(配列番号22)から−ＤＴＴＳＲＩ−(配列番号23)に配列を変化させる。
【００８０】
ＰＣＲ系突然変異誘発手法を使用して、突然変異体をセンスプライマーに組み込むことによって、変化をｈｕＩＬ−２遺伝子のヌクレオチド配列に導入した。配列ＴＴｘＲを、それぞれＡＣＣ、ＡＣＣおよびＡＧＧのコドン変化によって作製した。ｈｕ ＩＬ−２配列の３'端を含む突然変異型197ｂｐのＰＣＲ断片は、配列５'ＡＣＴＴＡＡＧＡＣＣＴＡＧＧＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴ３'(配列番号24)のセンスプライマー、および配列５'ＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣ３'(配列番号25)のアンチセンスプライマーを使用して、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)をコードする鋳型である免疫サイトカイン発現プラスミドから生成させた。このＰＣＲ断片をＴＡベクターにクローニングし、配列を確認した。完全なＩＬ−２配列を再び生成させるために、この断片をAf１ II／Xho Ｉ制限消化部位として、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)をコードする免疫サイトカイン発現プラスミドから得た２ｋｂのHind III／Af１ II断片に連結させて、Hind III／Xho Ｉ制限型pBluescriptベクターに挿入した。次いで突然変異型ＩＬ−２遺伝子を、三方向の連結でＫＳ Ｍ１−ＩＬ２をコードする免疫サイトカイン発現プラスミドの、本来のｈｕＩＬ−２配列の代わりに交換した。
【００８１】
５)ｈｕＫＳ(ＮからＱ)−ＩＬ２。ｈｕＫＳ(ＮからＱ)−ＩＬ２をコードする免疫サイトカイン発現プラスミドを、標準的な組み換えＤＮＡ技法を使用して構築した。ｈｕＫＳ(ＮからＱ)−ＩＬ２は抗体Ｆｃガンマ１定常領域のＣＨ２ドメインにアミノ酸置換を含み、これによってＮ末端連結グリコシル化を不要にする。アミノ酸配列をＱＹＮＳＴＹＲ(配列番号１)からＱＹＱＳＴＹＲ(配列番号26)に変え、置換されたアミノ酸は下線で示した。同様に、アミノ酸配列をＱＦＮＳＴ(配列番号２)からＱＡＱＳＴ(配列番号27)に変える突然変異を含み、ガンマ２およびガンマ４定常領域を含む融合タンパク質を構築し、これによってさらに潜在的Ｔ細胞エピトープが除去される。
【００８２】
[実施例２]
改変された受容体特異性をもたらす、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質の化学的または酵素的改変：
この実施例は、ＰＥＧ化ｈｕＫＳ−ＩＬ２または脱グリコシル化ｈｕＫＳ−ＩＬ２、およびこれらの変異体を生成させるために使用する、免疫サイトカインの生化学的操作を記載する。同じ方法を、他のＩＬ−２融合タンパク質、免疫サイトカイン14.18−ＩＬ２またはアルブミン−サイトカイン融合体などに適用することができる。これらの変異体を後の実施例で使用して、細胞系バイオアッセイにおけるさまざまな細胞系の増殖応答(表１)、または分子の薬物動態学的性質に対するそれらの影響を調べた。
【００８３】
ｈｕＫＳ−ＩＬ２のＰＥＧ化。ＰＥＧ(20,000)を、タンパク質上に存在するアミン基を介して、タンパク質に共有結合させた。この目的のために、スクシンイミド連結基を含む反応性のあるＰＥＧの誘導体(ｍＰＥＧ−プロピオン酸スクシンイミジル、以下では「ＳＰＡ−ＰＥＧ」と呼ぶ)を使用した。ｈｕＫＳ−ＩＬ２は、50mMのリン酸ナトリウム(ｐＨ7.5)、0.05％のTween80から構成されるアミン遊離バッファー中で充分に透析し、濃縮した。過剰なＳＰＡ−ＰＥＧをｈｕＫＳ−ＩＬ２と、５：１または10：１のモル比で合わせた。使用直前に、脱イオン水に溶かした５ｍＭのＳＰＡ−ＰＥＧストック溶液を作製した。適切な体積のＳＰＡ−ＰＥＧ溶液をｈｕＫＳ−ＩＬ２と合わせ、その反応混合物を振とう台上で30〜40分間室温においてインキュベートした。５〜10モル過剰のグリシンを加えて反応を停止させ、反応生成物をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。50mMのＨＥＰＥＳおよび150mMのＮａＣｌ中で平衡状態にしたSuperdex 200カラムに、反応サンプルを充填し、ＰＥＧ化タンパク質を含む溶出画分を集めて濃縮した。
【００８４】
ｈｕＫＳ−ＩＬ２のＮ−グリカナーゼ(glycanase)処理。ｈｕＫＳ−ＩＬ２(1.5mg)を、30ｍＵのＰＮＧａｓｅＦ(New England Biolabs)と共に、37℃で一晩インキュベートした。反応生成物は、ProteinA−Sepharoseカラムに通すことによって精製し、結合したｈｕＫＳ−ＩＬ２をｐＨ３で溶出した。溶出物を中和し、スピンカラム中のＰＢＳおよび0.05％ Tween80のバッファーに濃縮した。ｈｕＫＳ−ＩＬ２の脱グリコシル化を、サイズ排除クロマトグラフィーによって尿素ゲル上で確認した。
【００８５】
[実施例３]
Ｉｇ−ＩＬ２およびＩｇ−ＩＬ２変異体の発現および精製
ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)に関してここに記載した一般的手順は、突然変異サイトカインとのＩｇ−融合体を含めた、広くさまざまなＩｇ−サイトカイン融合タンパク質に使用することができる。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)を発現する、安定的にトランスフェクトされたクローンを得るために、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)をコードする免疫サイトカイン発現プラスミドのＤＮＡを、エレクトロポレーションによってマウスのミエローマＮＳ／０細胞に導入した。ＮＳ／０細胞は、10％の熱失活したウシ胎児血清；２ｍＭのグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補ったダルベッコの改変イーグル培地中で増殖させた。約５×１０6個の細胞をＰＢＳで１回洗浄し、0.5mlのＰＢＳ中に再懸濁させた。次いで10μｇの線状プラスミドＤＮＡを、Gene Pulser Cuvette(0.4cm電極ギャップ、BioRad)中において氷上で10分間、細胞と共にインキュベートした。エレクトロポレーションは、0.25Ｖおよび500μＦに設定したGene Pulser(BioRad、Hercules、CA)を使用して行った。細胞を氷上で10分間回復させ、その後細胞を成長培地に再懸濁させ、２枚の96ウエルプレート上に平板培養した。安定的にトランスフェクトされたクローンを、100ｎＭのメトトレキサート(ＭＴＸ)の存在下での増殖によって選択し、これを成長培地にトランスフェクションの２日後に加えた。これらの細胞に３日毎に２〜３回より多く栄養を与え、ＭＴＸ耐性クローンが２〜３週間で出現した。クローンからの上澄みを抗Fc ELISAによってアッセイして、高生産者を同定した。高生産クローンを単離し、100ｎＭのＭＴＸを含む成長培地で増殖させた。
【００８６】
免疫サイトカインを、プロテインＡ親和性カラムクロマトグラフィーによって組織培養物の上清から精製した。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)については、組み換えプロテインＡ(ｒＰＡ)アガロースカラムを、10倍体積の流通用バッファー、たとえば100ｍＭのアルギニン、５ｍＭのクエン酸(塩)、0.01％のTween 80 ｐＨ 5.6などを用いて予め平衡状態にし、カラムにｈｕＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)を含む濾過した細胞培養物の上清を16 ml／分で、約40 mg／mlのｒＰＡ樹脂に結合するように充填した。カラムを同じバッファーで充分に洗浄し、最後に免疫サイトカインをｐＨ ３の50ｍＭのグリシン中に溶出させた。ピーク画分を回収し、１ＮのＮａＯＨを用いてpHを中性に調節した。
【００８７】
[実施例４]
バイオアッセイにおけるＩｇ−ＩＬ２変異体の活性
細胞系バイオアッセイ用に、増殖がＩＬ−２に依存する細胞系を使用し、Ｉｇ−融合タンパク質、たとえばｈｕＫＳ−ＩＬ２およびｈｕＫＳ−ＩＬ２変異体の活性を、これらの細胞の増殖によって評価した。たとえば、ＣＴＬＬ−２(ATCC＃ TIB−214；Matesanz and Alcina、1996)、およびＴＦ−Ｉβ(Famer他、[1995] Blood 86：4568〜4578)を使用して、Ｔ細胞応答およびＮＫ細胞様応答をそれぞれ追跡した。ＣＴＬＬ−２は、高親和性ＩＬ−２Ｒαβγを発現するネズミのＴリンパ芽球細胞系であり、ＴＦ−１βは、中親和性ＩＬ−２Ｒβγを発現する未熟な前駆体赤血球細胞由来のヒト細胞系である。これらのアッセイ用の他の有用な細胞系は、たとえばヒト成体のＴ細胞リンパ球Kit−225(Ｋ６)(Uchida他、(1987)Blood70：1069〜1072)由来の細胞系である。細胞系ＴＦ−１βと対にすると、融合タンパク質の活性が、同じ哺乳動物種の受容体保持細胞系の対において評価される。これらのアッセイを、ヒトＰＢＭＣ(末梢血単核球細胞)由来の細胞群に関して行って、ＩＬ−２Ｒβγ保持ＮＫ細胞を単離すること、あるいはＩＬ−２Ｒαβγを発現する活性化Ｔ細胞を生成させることもできる。ｈｕ ＰＢＭＣからこれらの細胞群を単離するための技法は、当業者には知られている。たとえば、Ｔ細胞、ＰＨＡ芽細胞は、ＰＢＭＣを３日間、10マイクログラム／mlのフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ−Ｐ；Ｌ9017、Sigma、St.Louis)中でインキュベートすることによって得られる。休止期のＮＫ細胞は、たとえばヒト細胞用のＮＫ細胞単離キット(Miltenyi Biotec、Auburn、CA)を使用する、陰性選択プロトコルによって一般的に得られる。これらの融合タンパク質の活性とマウス腫瘍モデルから得られる結果を関連付けるために、１つまたは他のＩＬ−２受容体複合体を発現するマウスから得られた細胞群に、これらのアッセイを行うことも有用である。たとえばＮＫ細胞群は、SPINSEP(商標)ネズミＮＫ細胞濃縮キット(Stemcell Technologies Inc、Vancouver、BC、Canada)を使用して、組み換え欠損(SCID)Ｂａｌｂ／Ｃマウスの脾臓から得ることができる。任意のこれらの濃縮群の純度は、ＦＡＣＳ分析によって評価することができる。
【００８８】
簡潔には、洗浄した細胞を、96ウエルのマイクロタイタープレート中に10,000細胞／ウエルの密度で平板培養し、たとえば精製ｈｕＫＳＩＬ２またはｈｕＫＳ−ＩＬ２変異体を補った細胞用培地中でインキュベートした。さらに、R＆D Systems(Minneapolis、MN)から得た野生型ｈｕＩＬ−２タンパク質を、標準としてアッセイした。加えたタンパク質は、約1000倍の濃度範囲、0.45 ｎｇ／ｍｌと420 ｎｇ／ｍｌの間で希釈系として調製した(ＩＬ２のモル当量に関して標準化した)。32時間後、0.3μＣｉの[メチル-３Ｈ]チミジン(Dupont-NEN-027)をそれぞれのウエルに加え、細胞をさらに16時間インキュベートした。次いで細胞を採取し、ガラスフィルタ上で溶解させた。ＤＮＡに取り込まれた３Ｈ−チミジンを、シンチレーション計数器で測定した。
【００８９】
細胞増殖に関するそれぞれのｈｕＫＳ−ＩＬ２タンパク質変異体のED50値を、用量応答曲線をプロットし、50％の応答をもたらしたタンパク質濃度を同定することから得た。応答の選択性は、ED50値の比、たとえばED50[ＴＦ１−β]／ED50[ＣＴＬＬ−２]として表した。したがって、大きなED50比によって、比較的多量のタンパク質が、ＣＴＬＬ−２細胞応答と比較してＴＦ１−β細胞応答を誘導するために必要とされたことが示された。ｈｕＫＳ−ＩＬ２変異体のED50値の比を、遊離ｈｕＩＬ−２および親ｈｕＫＳ−１Ｌ２タンパク質と比較した。この標準値が差異的効果の指標である。参照タンパク質に関して得られた値より大きな値によって、ＣＴＬＬ−２細胞に対する選択性の変化が示された。いくつかの場合、同種に由来する細胞系に関するED50比を得て、その結果ＩＬ−２活性が、受容体との相互作用における種間の相違によって、追加的に影響を受けないことが好ましい可能性がある。以下の実施例はネズミＣＴＬＬ−２およびヒトＴＦ−１β細胞を使用して、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質と遊離ＩＬ−２のED50比を計算するものであり、これらの実験の代表的な結果は表１に示す。
【００９０】
【表１】
2005511707.tif 000002
【００９１】
この実施例では、遊離ＩＬ−２に関して得られたED50比(0.81)と比較して、約５倍低いED50比がｈｕＫＳ−１Ｌ２に関して得られた(0.17)。これによって、融合タンパク質はその選択性概略が変わったことが示され、ＴＦ−１β細胞に対する高い選択性が示された。異なる抗体／ＩＬ−２の組合せ、14.18−ＩＬ２も、ＩＬ−２単独よりＴＦ１−βに対する選択性が高く(0.07のED50比)、この効果は抗体−ＩＬ２融合タンパク質中に含まれる特定の抗体に限られず、ネズミの高親和性受容体保持細胞に対するヒトＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質の、ｈｕＩＬ−２と比べて低い活性は、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質の一般的な特徴を反映する可能性があることが示された。
【００９２】
他の変異体は、ＣＴＬＬ−２細胞応答が有利であるような改変ED50比を有していた。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)に関して、ED50比が2000を超えた劇的な効果が見られ、中親和性受容体によってこれらの細胞中で仲介されるＴＦ−１β細胞の増殖が、ほとんど検出できなかったことが示された。したがって、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)はＩＬ−２Ｒαβγ保持細胞のシグナリングを活性化させたが、それがＩＬ−２Ｒβγ保持細胞を有意に活性化させることはなかった。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)の活性は、ネズミＩＬ−２Ｒβγ複合体を発現する精製ネズミＮＫ細胞においてアッセイすることができるとも思われ；遊離ヒトＩＬ２(Ｎ88Ｒ)タンパク質に関して報告されたこととは対照的に、これによって、マウスのＴおよびＮＫ細胞を調べると(Wetzel他、ASCO 2001 Meeting Abstractを参照)、選択性が実質的に失われ、マウスＮＫ細胞中のｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)のED50値が、ＴＦ−１β細胞に関して観察された値と同等であったことが示された。
【００９３】
ＣＴＬＬ−２細胞に対する応答の選択性のわずかな変化を、Ｉｇ−ＩＬ２変異体において観察し、融合タンパク質の抗体部分のグリコシル化に影響を与える変化を伴った。詳細には、抗体のＦｃ部分中のグリコシル化部位が欠けたＫＳ(ＮからＱ)−ＩＬ２は、ｈｕＫＳ−ＩＬ２と比べてED50比の３倍の増大を示し(0.72)、一方Ｎ−グリカナーゼ処理したｈｕＫＳ−ＩＬ２は、ｈｕＫＳ−ＩＬ２と比べて２倍の増大(0.45のED50比)を示した。同様に、Ｎ−グリカナーゼ処理した異なる抗体分子と融合したＩＬ−２は、同様の結果をもたらした；たとえば、Ｎ−グリカナーゼ処理した14.18−ＩＬ２は、未処理14.18−ＩＬ２と比較して、ED50比の３倍の増大を与えた。これらの結果によって、分子そのものの抗体部分中のいくつかの変化が、抗体部分と融合するＩＬ−２分子の結合および活性の性質に影響を与えることが示された。
【００９４】
融合タンパク質のＰＥＧ化も、その選択性概略を変えた。ここでも、ＣＴＬＬ−２の刺激活性に対する変化を観察した。ｈｕＫＳ−ＩＬ２に関しては、ＰＥＧ化変異体は、ＣＴＬＬ−２細胞に有利な選択性の９倍の増大をもたらし(1.99のED50比)、14.18−ＩＬ２に関しては、20倍の増大がＰＥＧ化によって誘導された(1.34のED50比)。
【００９５】
いくつかの場合、所与のタンパク質に関する選択性のこれらの変化が、表２に示した代表的な結果において示されるように、アッセイで使用した細胞型の個々の組合せを反映する可能性もある。たとえば、ＫＳ−ＩＬ２、ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２およびＩＬ−２を、ヒトＩＬ−２Ｒαβγ保持細胞系キット225をネズミＣＴＬＬ−２の代わりに使用して比較すると、選択性の変化のパターンは保たれなかった。特にキット225細胞に関しては、これら３つのタンパク質は、ほぼ同じ活性を示した。しかしながら大抵の場合、ＴＦ−１β細胞とキット−225細胞の間のＩｇ−ＩＬ２変異体の選択的応答の傾向は、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質のＦｃ部分の脱グリコシル化の影響を含めた、ＴＦ−１β細胞およびＣＴＬＬ−２細胞に関して確立されている傾向と類似していることが見出された(以下の表２および実施例10中の代表的な結果を参照)。
【００９６】
【表２】
2005511707.tif 000003
【００９７】
さらに、キット−225細胞は、ＩＬ−２およびＩＬ２融合タンパク質およびそれらの変異体に対して、ＣＴＬＬ−２細胞よりも感受性があったことが見出された。たとえば、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２のED50値は、キット−225細胞では0.08、ＣＴＬＬ−２細胞では5.0であり、ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)に関しては、それはキット−225細胞では0.13であり、ＣＴＬＬ−２細胞では３であり、これらのアッセイにおけるキット−225細胞の感受性の約10〜50倍の増大が示された。したがって、所与のタンパク質に関するED50比の値は、使用する細胞型の個々の組合せに依存する。
【００９８】
[実施例５]
改変された受容体結合性を有するＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態
ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)の薬物動態(PK)概略を、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２およびｈｕＫＳ−ＩＬ２の概略と比較した。それぞれのタンパク質に関して、３匹の６〜８週齢マウスを使用した。ＰＢＳに125μｇ／ｍｌに希釈した25μｇの融合タンパク質を、マウスの尾部静脈に注射し、50μｌの血液サンプルを、注射直後(０時間)、および注射後0.5、１、２、４、８、および24時間で、眼後出血によって得た。血液サンプルをヘパリンコーティングチューブ中に回収して血液凝固を防止し、後細胞の原形質の上清中の免疫サイトカインのレベルを、ELISAアッセイで測定した。薬物動態の研究のために使用したELISAアッセイの手順は、以前に記載された(WO01／58957)。このアッセイによって、完全な免疫サイトカインの存在を測定した。原形質由来の免疫サイトカインの捕獲は、ＥｐＣＡＭコーティングプレート上で行い、その検出はＩＬ−２を対象とするHRP結合抗体を用いて行った。接合部においてＫがＡに置換されたｈｕＫＳ−ＩＬ２変異体、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２は、ｈｕＫＳ−ＩＬ２と比較して、循環半減期が劇的に改善されていたことは、以前に示されている(WO01／58957)。実際、ｈｕＫＳ−ａ１ａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)の循環半減期が同様に改善されたことが見出され、分子のＩＬ−２部分中のＮ88Ｒの改変は、薬物動態に対して実質的な影響がなかったことが示される。代表的な実験の結果は図２に示す。図２は、血清中に存在する免疫サイトカインの濃度(静脈内投与の直後に存在した出発濃度に対する、血清中に残っていたタンパク質の濃度のパーセンテージとして表した)の、24時間の時間行程を示す。タンパク質濃度はELISAアッセイにおいて決定し、そのアッセイでは、免疫サイトカインをその抗体部分によって捕獲し、そのサイトカイン部分によって検出する。Ｘ軸＝時間単位で表した時間ｔ；Ｙ軸＝log(残りのタンパク質濃度の％)。
【００９９】
[実施例６]
哺乳動物において改変された受容体結合性を有するＩＬ−２融合タンパク質の毒性
マウス中のＫＳ−ＩＬ２変異体ｈｕＫＳ−ＩＬ２、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２、およびｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)の相対的毒性を調べた。実施例５に示したように、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２およびｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)は、ｈｕＫＳ−ＩＬ２と比較すると大幅に高いＰＫを有する。それにもかかわらず比較目的で、ＰＫが異なるにもかかわらず、異なる分子に関して同一の投与スケジュールを使用した。長い血清中半減期は治療の有効性を高める可能性があるが、それが高い毒性をもたらす可能性もある。さらにこの実施例は、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２はｈｕＫＳ−ＩＬ２と比較して高い毒性を有していたが(長い循環半減期のために)、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)は長い循環半減期にもかかわらず、ｈｕＫＳ−ＩＬ２と比較して低い毒性を有していたことを示す。
【０１００】
Ｂａｌｂ／Ｃマウス(実験条件当たり３匹の動物)に、５日間続けて３つのタンパク質の１つを、１日１回静脈内注射した。融合タンパク質を200μｌのＰＢＳに希釈し、以下の用量で投与した：ｈｕＫＳ−ＩＬ２およびｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２は、マウス１匹当たり25、50、または75μｇ、およびｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88R)は、マウス１匹当たり50、75、または100μｇ。対照群にはＰＢＳの静脈内注射を与えた。マウスの生存を１日１回観察し、マウスの生存に対する影響を調べた。すべての用量のｈｕＫＳ−ＩＬ２を投与したマウスは生存した。しかしながらｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２は、さらに毒性であった。マウスは25μｇの用量のｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２には耐えたが、50μｇの用量では第６日に３匹のマウスすべてが死んでしまい、75μｇの用量では２匹のマウスが第4.5日に死んでしまい、第３のマウスは第５日に死んだ。他方でｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)は、100μｇを含めたすべての用量で充分に耐性があった。実際、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)を、マウス１匹当たり200μｇの用量でも投与し、マウスは生存した。したがって、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)は、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２よりも著しく毒性が低かった。
【０１０１】
ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２を用いた処置の行程中に死んだマウスを切開し、それらの器官を調べた。肺、脾臓、肝臓、胃、および腎臓を含めたすべての器官が大きく膨張し、広範囲の血管外漏出が示された。変異体ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)で処置した動物の器官も調べた。マウスは前記したように処置し、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)処置した動物からの器官重量は、特に肺および肝臓に関して、対照動物の重量と概して類似していたことが見出された。理論に縛られることを望まずに、脾臓の重量の増大は、血管外漏出ではなく、このヒトタンパク質に対する抗体の免疫応答によって引き起こされる細胞性の増大によるものであると考えられる。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)によって、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２よりも重度の低い血管外漏出が生じると推測される。表３は、対照マウスの器官と比べた器官重量の倍増率に関する、近似値の例を与える：
【０１０２】
【表３】
2005511707.tif 000004
【０１０３】
その免疫系構成に知られている改変がなされた、さまざまなマウス系統背景の影響を、これらのＩｇ−ＩＬ２融合タンパク質の毒性に関して評価した。マウス系統ＤＢＡ／２、Ｂａｌｂ／Ｃ、Ｂ６.ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃscid／ＳｚＪ(SCID)、ベージュ、およびＳＣＩＤ／ベージュを使用した。融合タンパク質は、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２に関してはマウス１匹当たり25μｇおよび50μｇの用量で、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)に関してはマウス１匹当たり200μｇの用量で前述のように投与し、マウスの生存および重量を２週間にわたり調べた。
【０１０４】
ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２の場合、大部分のマウス系統によって、前に報告したＢａｌｂ／Ｃマウスで見られた結果と類似の結果が与えられた：50μｇの用量は動物の死を第５日にもたらし、一方低用量では動物は生存し、それらの重量はその最初の重量にほぼ回復したが、擬似治療した対照動物の体重増加には至らなかった。興味深いことに、機能的ＮＫ細胞を欠いたベージュマウスは、50μｇの高用量にうまく耐えることができ；２匹の動物は第９日までに死んだが、１匹は、最初に大量の重量を失ったが(第７日までに約25％)、回復し、第15日までに、擬似治療した動物および低用量で治療した動物の身体重量を得た。ＤＢＡ／２マウスはｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２に対してより感受性があり；低用量でさえ、ＤＢＡ／２動物は第５日および第９日に死んだ。
【０１０５】
ｈｕＫＳ−ａ１ａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)に関しては、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質に対するＤＢＡ／２マウスの高い感受性も明らかであった：第８日までに、すべての動物が死んでしまい、半分の用量(100μｇ)においてさえ、動物は第９日までに死んだ。ここでも、融合タンパク質はベージュマウス中で最も耐性があり、一方ＳＣＩＤ／ベージュマウスは大量の重量を失った(第10日まで、擬似治療した対照の約80％が安定状態のままであった)。
【０１０６】
[実施例７]
哺乳動物のさまざまな腫瘍の治療における、改変された受容体結合性を有するＩｇ−ＩＬ−２融合タンパク質の有効性
ａ)Ｂａｌｂ／Ｃマウス中のＣＴ26／ＫＳＡ皮下腫瘍の処置。ヒトＫＳ抗原(ＫＳＡ)をコードする遺伝子を形質導入した、ＣＴ26結腸癌細胞を使用して、皮下腫瘍を誘導した。２×１０6個の生細胞を、100μｌのＰＢＳに懸濁させ、６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの背部に皮下注射した。腫瘍の大きさが100〜200ｍｍ3に達したとき、８匹のマウスの群に３つの治療条件の１つを施した：５日連続して、200μｌのＰＢＳに希釈した15μｇのｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２またはｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)を静脈内注射し、あるいはＰＢＳのみを投与した。50日間、週に２回腫瘍体積を測定することによって、疾患の進行を評価した。対照動物では、腫瘍体積は安定して増大し、ほぼ第32日の殺傷時に、約3500〜6000ｍｍ3の大きさに達した。対照的に、２つの実験群の腫瘍体積は、第50日までほぼ一定のままであり、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)が、腫瘍増殖の防止においてｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２と同じくらい有効であったことが示された。
【０１０７】
ｂ)Ｃ57ＢＬ／６マウス中のＬＬＣ／ＫＳＡ皮下腫瘍の処置。第２の腫瘍モデルでは、ＫＳ抗原をコードする遺伝子を形質導入したLewis肺癌細胞を使用して、皮下腫瘍を誘導した。ＥｐＣＡＭを発現する１×１０6個の生命力のあるＬＬＣ細胞を、100μｌのＰＢＳに懸濁させ、６〜８週齢のＣ57ＢＬ／６マウスの背部に皮下注射した。腫瘍の大きさが100〜150ｍｍ3に達したとき、８匹のマウスの群を前述のように治療および評価した。ただし、投与する用量は注射１回当たり20μｇに増やした。対照動物では、腫瘍体積は急速に増大し、20日以内に6500ｍｍ3を超え；２つの実験条件に関する腫瘍の増殖は同じ程度で遅れ、同じ期間で4000ｍｍ3に達し、同じ用量でｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２およびｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)を用いた治療の間に、有効性に違いがなかったことが再度示された。
【０１０８】
ｃ)Ｂ６.ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃscid／ＳｚＪマウス中のＬＬＣ／ＫＳＡ皮下腫瘍の処置。本発明の融合タンパク質は、成熟Ｔ細胞以外の細胞に対しても有効である可能性がある。たとえば、１つの実験では、本発明の融合タンパク質によって、成熟Ｔ細胞を欠いたマウスでも腫瘍増殖の遅れがもたらされた。これらの結果によって、本発明の融合タンパク質は、たとえば免疫不全患者の腫瘍の治療において、有用である可能性があることが示唆される。
【０１０９】
ＬＬＣ／ＫＳＡ皮下腫瘍モデルを、そのＴ細胞およびＢ細胞仲介の免疫応答が不全状態であった、11週齢のＢ６.ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃscid／ＳｚＪマウスにおいて評価した。前記したのと同じ治療プロトコルを続けた。対照動物の腫瘍は、15日以内に3500ｍｍ3まで急速に増大した。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２およびｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)は、同じ期間で腫瘍の増殖をその大きさの半分未満に遅らせる際に同様に有効であった。さらに、完全な免疫系を有するＣ57ＢＬ／６マウスと、Ｔ細胞およびＢ細胞を欠いたＢ６.ＣＢ17−Ｐｒｋｄｃscid／ＳｚＪマウスの間の腫瘍増殖率の違いは、最小限であった。
【０１１０】
さらに、ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２によって、完全な免疫系を有するマウスと、機能的Ｔ細胞を欠いたマウスにおいて同様に充分な腫瘍の治療がもたらされたという事実によって、この腫瘍モデルでは、免疫応答が非Ｔ細胞仲介型機構によって調節されたことが示された。したがって、治療用分子中にさまざまエフェクター細胞により免疫応答を刺激するためのオプション(option)を保つことが重要である。いずれのマウス系統においてもＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２と同程度有効であった、ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)の場合、Ｔ細胞と無関係に作用するエフェクター細胞の活性が、明らかに保たれていた。
【０１１１】
ｄ)Ｃ57ＢＬ／６マウスの肺へのＬＬＣ／ＫＳＡ転移の処置。ＬＬＣ／ＫＳＡ細胞を、肺転移モデルにおいても使用した。１×１０6個の生細胞を、200μｌのＰＢＳに懸濁させ、６〜８週齢のＣ57ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。第４日に、８匹のマウスの群に以下の治療条件の１つを施した：５日連続して、200μｌのＰＢＳ、または200μｌのＰＢＳに希釈した20μｇのＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２またはＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)をマウスに静脈内注射した。動物は27日頃に殺傷し、肺を切開しブアン液に固定した。肺中の転移の程度は、転移物によって覆われた表面積のパーセンテージを記録すること、および肺重量によって評価した。
【０１１２】
対照群の肺は96％を超えるその表面積が転移物によって覆われており、肺重量が正常な肺の約５倍増大していた(0.75g)。対照的に、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２で処置したマウスの肺は、転移物で最小限に覆われており(5.6％)、ｈｕＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)で処置したマウスの肺は、転移物をほとんど含んでいなかった(0％)。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２およびｈｕＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)で処置した動物の肺は、正常な重量であった。したがって、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)は、動物の生存に影響を与えると思われる閾値より数倍低い用量で、肺転移の処置においてｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２と同程度有効であることが証明された。
【０１１３】
[実施例８]
併用療法におけるＫＳ−１Ｌ２変異体
低毒性ＫＳ−ＩＬ２変異体、たとえばｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)などを、腫瘍を治療するための第２の免疫調節物質と共に投与することの効果を、実施例７ｂに記載したマウスの皮下腫瘍モデルＬＬＣ／ＫＳＡを使用して調べた。
【０１１４】
ａ)ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２変異体およびシクロホスファミド。併用療法のために、シクロホスファミドを第０日に75ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に投与し、この時点では腫瘍は平均90ｍｍ3であり、次に融合タンパク質を５日間の間(第１日から第５日まで)１日１回投与した。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)は、20μｇまたは100μｇの用量で投与した。対照条件は擬似治療動物、および20μｇの用量のｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２のみ、または20μｇまたは100μｇの用量のｈｕＫＳ−ａｌａ−１Ｌ２(Ｎ88Ｒ)のみで処置した動物を含んでいた。擬似処置した動物の腫瘍は、第19日までに約5000ｍｍ3に進行し、一方ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２で処置したマウスの腫瘍は約2200ｍｍ3であり、20μｇまたは100μｇのｈｕＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)で処置したマウスの腫瘍は、それぞれ約2600ｍｍ3および1700ｍｍ3であった。シクロホスファミドの同時投与によって、20μｇの用量のｈｕＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)で1700ｍｍ3の腫瘍、および高用量で1250ｍｍ3の腫瘍がもたらされ、これらはｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２のみで処置したものより著しく小さかった。
【０１１５】
ｂ)ｈｕＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２変異体およびインドメタシン。併用療法のために、インドメタシンを35μｇ／マウス／１日の用量で経口投与し、さらに融合タンパク質を５日間の間(第１日から第５日まで)１日１回投与した。腫瘍は最初は平均90ｍｍ3であった。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)は20μｇの用量で投与した。対照条件は擬似治療動物、および20μｇの用量のｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２のみ、または20μｇの用量のｈｕＫＳ−ａｌａ−１Ｌ２(Ｎ88Ｒ)のみで処置した動物を含んでいた。擬似治療した動物の腫瘍は、第19日までに約5000ｍｍ3に進行し、一方ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２で処置したマウスの腫瘍は約2200ｍｍ3であり、20μｇのｈｕＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)で処置したマウスの腫瘍は、それぞれ約2600ｍｍ3および1700ｍｍ3であった。インドメタシンの同時投与によって、20μｇの用量のｈｕＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)で850ｍｍ3への腫瘍の大きさの減少がもたらされ、これはｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２のみによる治療によって得られた腫瘍より著しく小さい腫瘍であった。
【０１１６】
[実施例９]
改善された治療係数を有するＫＳ−１Ｌ２変異体
ＩＬ−２配列中の特定の位置における突然変異によって、ＫＳ−ＩＬ２変異体を構築した。たとえば、ＩＬ−２受容体のαサブユニットと結びつく可能性がある位置に、置換を行う。適切な残基は、たとえばｈｕＩＬ−２の成熟配列中のＦ42である。このアミノ酸の芳香族環構造は、ＩＬ−２中の局所の立体配置を安定化させると考えられており(Mott他、JMB 1995、247：979)、免疫サイトカインのこの位置での、たとえばＹ、ＡまたはＫとの置換によって、ＩＬ−２受容体親和性および生物活性が徐々に低下した分子がもたらされることが見出されている。これらの分子を動物において試験し、非改変形の免疫サイトカインと比較すると、腫瘍の処置における治療係数の増大が得られることが見出されている。有効である他の置換は、位置Ｒ38およびＫ43における置換である。
【０１１７】
免疫サイトカインのＩＬ−２部分中の他の置換は、βサブユニットと結びつく可能性がある領域内の、たとえば成熟ｈｕＩＬ−２の位置Ｅ15またはＬ19における置換である。これらの残基が免疫サイトカインにおいてたとえばＡまたはＲに突然変異すると、変異体免疫サイトカインは、非改変形の免疫サイトカインと比較して、ＩＬ−２受容体のβサブユニットと低い親和性を有することが見出されている。Ｒへの置換に関する影響はＡへの置換に関する影響より深刻であり、これはＲの側鎖の大きさと関連がある可能性があることが一般に見出されている。これらの分子を動物において試験し、非改変形の免疫サイトカインと比較すると、腫瘍の治療における治療係数の増大が得られることが見出されている。他の置換が位置Ｄ84およびＶ91に導入され、治療係数の増大において有効であることも示されている。
【０１１８】
ＩＬ−２受容体のγサブユニットと結びつく分子の領域に影響を与える可能性がある、免疫サイトカインのＩＬ−２部分中の置換を、成熟ｈｕＩＬ−２の位置Ｎ119に導入する。さらに微妙な免疫サイトカイン変異体を、Ａへの突然変異によって作製し、さらに破壊的な突然変異体を、Ｒへの突然変異によって作製する。これらの変異体の影響を、腫瘍を有する動物において試験し、これらの変異体免疫サイトカインは、非改変形の免疫サイトカインと比較すると、改善された治療係数を有することが見出されている。
【０１１９】
ＩＬ−２免疫サイトカインにおいて、特に分子の多重突然変異を生み出すことにより、治療係数の増大が得られることも見出されており、免疫サイトカインにおける点突然変異によって、非常にわずかな、あるいは無視できる程度の治療係数の増大が示される。たとえば、組合せＦ42ＡとＬ19Ａ、またはＬ19ＡとＮ119Ａを含む免疫サイトカインは、いずれかの免疫サイトカイン変異体単独より有効であることが見出されている。多重突然変異に関する適用例に関しては、アミノ酸側鎖の大きさを減少させる突然変異を使用することが特に有用である。免疫サイトカインのＩＬ−２部分に導入される他の置換は、成熟ｈｕＩＬ−２のＴ51の置換である。Ａへの突然変異によって治療係数の改善が示されるわけではないが、Ｐへの突然変異によって、腫瘍の処置において非改変形の免疫サイトカインと比較して、改善された治療係数を有する免疫サイトカインが生み出される。
【０１２０】
[実施例10]
Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質変異体ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)、およびその誘導体
成熟ｈｕＩＬ−２の位置20におけるアスパラギン酸からトレオニンへの置換を含む、Ｉｇ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)をベースとする変異体を作製した。これらの変異体は、Ｉｇドメイン中、Ｆｃ部分または抗体標的ドメイン中などに追加的な置換を含む。これらの分子をコードするＤＮＡ構築体を作製するために、当業者が精通している、構築体特異的プライマーを用いて突然変異を導入するＰＣＲ手法、および適切なクローニング戦略を使用し、実施例１に記載した手順にほぼ従った。
【０１２１】
ａ)ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)。突然変異体Ｄ20Ｔを導入するために、プライマーセット５'ＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴ−３'(下線のヌクレオチドは置換されたコドンを示す)(配列番号28)、およびプライマーＴ３(５'ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ−３')(配列番号29)を用いる、ＰＣＲ突然変異誘発手法を使用し、ＤＮＡ断片をｐＢＳプラスミド上の野生型ｈｕＩＬ−２ ＤＮＡから増幅し、ＴＡベクター(Invitrogen)に挿入してＴＡ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)を生成させた。突然変異誘発は塩基配列決定によって確認した。ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２中の元のＩＬ−２配列を置換するために、ＴＡ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)からの385ｂｐのＰｖｕII／ＸｈｏＩ断片を、親免疫サイトカインプラスミドに三重の連結反応でクローニングした。融合タンパク質を発現させ、これをほぼ実施例３に記載したように精製した。ｈｕ−ＫＳの重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号30および31で示す。
【０１２２】
同じＰＣＲ誘導断片を異なるプラスミド骨格に取り込ませて、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)の他の変異体を作製した。
【０１２３】
ｂ)ｄＩ−ＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)。潜在的Ｔ細胞エピトープが除去され改変された型のＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２は、以前に記載した。融合タンパク質を発現させ、これをほぼ実施例３に記載したように精製した。ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体と融合したｄＩ−ＫＳ抗体の重鎖に対応するアミノ酸配列を、それぞれｄＩ−ＫＳの重鎖および軽鎖可変領域に対応する、配列番号32、配列番号33および34で示す。
【０１２４】
ｃ)脱グリコシル化ｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)。Ｎ−グリカナーゼを使用する酵素による脱グリコシル化を、ほぼ実施例２に記載したようにタンパク質ｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)に行った。
【０１２５】
ｄ)ｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)。このＩＬ−２(Ｄ20Ｔ)融合タンパク質のＩｇ部分は、ＩｇＧγ４サブクラス(配列番号７)の定常領域由来のものであり、これはさらにＩｇＧγ１ヒンジ(配列番号10)の特徴を保っていた。さらに、潜在的Ｔ細胞エピトープを除去する突然変異を導入した。さらに、この融合タンパク質は、アスパラギンからグルタミンへの置換を含み、これによってＦｃ中のＮ−グリコシル化部位が除去される(実施例４を参照)。フェニルアラニンからアラニンへの同時の置換によって、潜在的Ｔ細胞エピトープが除去される。融合タンパク質を発現させ、これをほぼ実施例３に記載したように精製した。
【０１２６】
ｅ)ｄＩ−ＮＨＳ７６(γ２ｈ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)。このＩＬ−２(Ｄ20Ｔ)融合タンパク質のＩｇ部分は、ＩｇＧγ２サブクラスの定常領域由来のものであり、これはさらにＩｇＧγ１ヒンジの特徴を保っていた。ＮＨＳ76では、Ｉｇの可変領域はＤＮＡ−ヒストン複合体中に含まれるエピトープを対象とするものであり、腫瘍の壊死中心を特異的に認識する(Williams他、PCT WO 00／01822)。さらに、軽鎖の可変領域の潜在的Ｔ細胞エピトープを除去する、突然変異を導入した。この残基、ロイシン104は、ＣＤＲ３ Ｖ−Ｊ接合部に存在し、バリンに置換された。融合タンパク質を発現させ、これをほぼ実施例３に記載したように精製した。
【０１２７】
ｆ)ｄＩ−ＮＨＳ76(γ２ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)。実施例10ｅのタンパク質をベースとするこのタンパク質は、Ｆｃ中のＮ末端連結グリコシル化および潜在的Ｔ細胞エピトープを排除する、実施例10ｄに記載するような、突然変異をさらに含む。融合タンパク質を発現させ、これをほぼ実施例３に記載したように精製した。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号35で示す、ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体と融合したＮＨＳ76(γ２ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)分子の重鎖配列、および配列番号36に対応する軽鎖の可変領域および定常領域配列を含む。しかしながら、配列番号35の重鎖領域は、任意のＩｇＧ軽鎖可変領域または定常領域と組み合わせて使用することができる。
【０１２８】
ｇ)ｄＩ−ＮＨＳ76(γ４ｈ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)。このタンパク質は、実施例10ｅに記載するタンパク質と類似しているが、γ２ＩｇＧサブクラスではなくγ４由来の重鎖を含む。融合タンパク質を発現させ、これをほぼ実施例３に記載したように精製した。
【０１２９】
ｈ)ｄＩ−ＮＨＳ76(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)。実施例10ｇのタンパク質をベースとするこのタンパク質は、Ｆｃ中のＮ末端連結グリコシル化および潜在的Ｔ細胞エピトープを排除する、実施例10ｄに記載するような、突然変異をさらに含む。融合タンパク質を発現させ、これをほぼ実施例３に記載したように精製した。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号37で示す、ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体と融合したｄＩ−ＮＨＳ76(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)分子の重鎖配列、および配列番号36に対応する軽鎖の可変領域および定常領域配列を含む。しかしながら、配列番号37の重鎖領域は、任意のＩｇＧ軽鎖可変領域または定常領域と組み合わせて使用することができる。
【０１３０】
本発明の融合タンパク質のＩｇ部分は、異なる種に由来するＩｇＧ分子のドメインを含む組合せを含めた、任意のサブクラスのＩｇＧ由来の重鎖の定常領域のドメインを含むことができる。したがって、本発明の融合タンパク質は、任意のサブクラスのＩｇＧ由来のヒンジ領域、たとえばＩｇＧガンマ１(配列番号10)、ガンマ２(配列番号11)またはガンマ４(配列番号12)由来のヒンジ領域を含むことができる。
【０１３１】
バイオアッセイにおけるＩｇ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体の活性：Ｉｇ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)融合タンパク質を、細胞がＩＬ−２に依存して増殖する能力を測定するバイオアッセイにおいて試験し、これをED50値として表した(実施例４を参照)。これらのアッセイは、ネズミＣＴＬＬ−２細胞またはヒトKit−225細胞(ＩＬ−２Ｒαβγを発現する)、およびヒトＴＦ−１β細胞または単離したネズミＮＫ細胞(ＩＬ−２Ｒβγを発現する)に行った。
【０１３２】
たとえば、ある代表的な実験において、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２と比較して、ＩＬ−２Ｒαβγ保持細胞ＣＴＬＬ−２におけるｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)のED50値は変わらず、一方ＩＬ−２Ｒβγ保持細胞ＴＦ−１βでは、それは約900倍大きかったことが見出された。したがって実施例４で定義したED50比は約150であり、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２と比較して、ＩＬ−２Ｒαβγ保持ＣＴＬＬ−２細胞に対する約750倍の選択性の変化が明らかになった。この細胞系の対のｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)に関して見られる、(ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２と比べた)約20,000倍の選択性の変化と比較して、ｄｉ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)の選択性は約10〜20倍低下しており、ＩＬ−２Ｒβγ発現細胞から得られる測定可能な増殖応答が反映された。この傾向は、ヒトKit 225細胞を使用したときも明らかであった。ＫＳ抗体を含む他のＩｇ融合タンパク質に関して見出されたように、抗体部分の脱グリコシル化は、ＩＬ−２Ｒβγ発現細胞における融合タンパク質の活性の低下に対してわずかではあるが、一貫した影響を与えた。
【０１３３】
ＩＬ−２依存性の細胞増殖も、異なる抗体部分を含むＩｇ−ＩＬ(Ｄ20Ｔ)変異体において測定した。ｄＩ−ＮＨＳ76(γ２)−ａｌａ−ＩＬ２と比較して、ＩＬ−２Ｒαβγ保持細胞Kit−225におけるｄＩ−ＮＨＳ76(γ２)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)のED50値は３倍増大し、一方ＩＬ−２Ｒβγ保持細胞ＴＦ−１βでは、それは約230倍増大したことが見出された。350という生じたED50比は、ｄＩ−ＫＳ(γ４)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)に関して見られたものと同じ範囲であり、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)より少なくとも10倍選択性が低かった。代表的な結果を表４に示す。
【０１３４】
【表４】
2005511707.tif 000005
【０１３５】
Ｉｇ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体の薬物動態：Ｉｇ−ＩＬ２変異体と細胞表面Ｆｃ受容体の相互作用を評価するために、Ｉｇ−ＩＬ２融合タンパク質とＦｃγＲ受容体の結合を、Ｕ937細胞を使用して細胞系ELISAでアッセイした。融合タンパク質(ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２、ｄＩ−ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２、ｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)、およびｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ))を、100μｇ／ｍｌ〜780ｎｇ／ｍｌの範囲で２倍に希釈し、細胞と共にインキュベートし、ＦＩＴＣ−複合抗ヒトＩｇＧＦｃＡｂＦ(ａｂ')2を使用して結合を検出した(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)。これらの細胞に関するｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２およびｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２の半値結合の濃度は、約５μｇ／ｍｌであり、さらに興味深いことに、ｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)タンパク質に関して２倍増大した。Ｉｇ部分(ｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ))のグリコシル化を妨げる突然変異の導入によって、このタンパク質とＵ973細胞の結合が５〜10倍低下したが、結合が完全に無くなったわけではなかった。
【０１３６】
マウスにおけるＩｇ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体の薬物動態学的性質を、ほぼ実施例５に記載したように調べた。驚くことに、ｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２と比較すると、ｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)の半減期は著しく低下した。ＰＫプロファイルの分析によって、この影響はα期中に特に著しく：一方50％のｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２が１時間後に依然として入手可能であり、わずか約５％のｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)が依然として存在したことが示された。これらのタンパク質のＰＫプロファイルのβ期の勾配は同等であった。ｄＩ−ＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)に関して見られたほぼ同一なＰＫプロファイルは、融合タンパク質ｄＩ−ＮＨＳ７６(γ２ｈ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)に関して得られ、これはＩｇＧのサブクラスγ２を含み、このＩｇＧは最小限のＦｃＲ結合親和性を通常示す。したがって、ＩＬ(Ｄ20Ｔ)タンパク質部分の融合タンパク質に対する影響は、抗体ｄＩ−ＫＳに限られなかった。
【０１３７】
Ｉｇ融合タンパク質の脱グリコシル化は一般に、ＰＫプロファイルのα期を増大させる効果があることが観察された。したがって、ｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)の酵素による脱グリコシル化の、ＰＫプロファイルに対する影響を調べた。実際、α期のＰＫプロファイルは、ｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２に関して観察されたものにほぼ回復した。融合タンパク質ｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)中と同様に、グリコシル化が突然変異誘発によって無くなると、同じ効果が得られた。したがって、ＰＫプロファイルに対する影響は、低下したＦｃＲの結合性によるものである可能性がある。
【０１３８】
Ｉｇ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体の毒性：Ｉｇ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)の毒性を、実施例６に記載したように、Ｂａｌｂ／Ｃマウス中のｄｉ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２の毒性と比較した。
【０１３９】
２つの融合タンパク質は、マウス中において同等の血清中半減期を有していた。ｄＩ−(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)は、100μｇ／マウス、200μｇ／マウスまたは400μｇ／マウスのいずれかの用量で１日５回投与し、一方ｄＩ−ＫＳ−ａＩａ−ＩＬ２は、40μｇ／マウスの用量で１日５回投与した。ｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)の400μｇ／マウスという用量でもマウスは生存し、一方、10分の１の用量のｄｉ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２を与えた対照マウスは、第６日までに死んだことが見出された。ｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)で治療したマウスの身体重量はわずかに影響を受け、第７日に最初の重量97％まで一時的に低下した。耐性用量の10倍を超える差異は、治療係数の大幅な改善を示す可能性がある。
【０１４０】
腫瘍の治療に関するＩｇ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体の有効性：Ｉｇ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)変異体の有効性を、実施例７ａに記載したように、ＣＴ26／ＫＳＡ細胞由来の皮下腫瘍を有するＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて評価した。
【０１４１】
融合タンパク質ｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)を、15μｇ／マウスおよび30μｇ／マウスの用量で投与した。腫瘍は126ｍｍ3の平均の大きさで始まり、第28日までに1800ｍｍ3と5000ｍｍ3の間の大きさに達した。15μｇ／マウスのｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２で処置したマウスの腫瘍は、355ｍｍ3の平均の大きさまで増殖したが、一方15μｇ／マウスのｄＩ−ＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)で処置したマウスの腫瘍は、2250ｍｍ3の平均の大きさに達した。これは、分子の低いＰＫによるものである可能性が最も高かった。15μｇ／マウスの低用量でｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)処置したマウスの腫瘍は、ある程度、1450ｍｍ3の平均の大きさまで増殖したが；しかしながら、一方30μｇ／マウスの用量では、腫瘍は950ｍｍ3の平均の大きさに達し、有意なことに、半分を超えるマウスで、腫瘍は測定できるほどは増殖しなかった。したがって、高用量では、ｄＩ−ＫＳ(γ４ｈ)(ＦＮ＞ＡＱ)−ａｌａ−ＩＬ２(Ｄ20Ｔ)は、腫瘍増殖の阻害に対して有意な影響があった。実際、この実験で使用した用量は、この分子の最大耐性用量より少なくとも12倍低く、したがってこの分子は、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２より改善された治療係数を有する可能性があり、対照的に最大耐性用量の３分の１〜２分の１で投与された。
【０１４２】
[実施例11]
異なるＩＬ−２受容体との、野生型および突然変異ＩＬ−２融合タンパク質の相対的親和性
ＩＬ−２Ｒαβγ受容体と比べたＩＬ−２Ｒβγ受容体との、本発明のさまざまな融合タンパク質の差異的親和性は、ラジオイムノアッセイなどのアッセイによって測定することができる。等しい数のＩＬ−２Ｒαβγ受容体発現細胞、またはＩＬ−２Ｒβγ受容体発現細胞を、プラスチックプレートの上に平板培養する。等しい数のＩＬ−２Ｒαβγ受容体発現細胞、またはＩＬ−２Ｒβγ受容体発現細胞を加えた、等量の野生型または突然変異ＩＬ２融合タンパク質に、希釈系を行い、標準曲線を得る。非結合融合タンパク質を洗浄除去し、それぞれの細胞型と結合した融合タンパク質の量を、放射標識リガンドによって検出する。Ｆｃ−ＩＬ−２融合タンパク質の場合、リガンドは、ＩｇＧのＦｃ部分と結合する、ブドウ球菌のプロテインＡなどの分子であってよい。リガンドは、特定のサブクラスのＩｇＧ分子の一部分を認識する他の抗体、たとえばＩｇＧガンマ１、ＩｇＧガンマ２またはＩｇＧガンマ４定常領域に対する抗体であってもよい。非結合融合リガンドを洗浄除去し、野生型ＩＬ２融合タンパク質と結合したＩＬ−２Ｒαβγ発現細胞；突然変異ＩＬ２融合タンパク質と結合したＩＬ−２Ｒαβγ発現細胞；野生型ＩＬ２融合タンパク質と結合したＩＬ−２Ｒβγ発現細胞、または突然変異融合タンパク質と結合したＩＬ−２Ｒβγ発現細胞のいずれかを含むプレートの放射活性を、ガンマ線測定装置上で測定する。結合アッセイから得られたデータを標準化して、細胞および細胞上で発現された受容体の数を計算する。
【０１４３】
他のアッセイでは、融合タンパク質そのものを、当分野でよく知られているさまざまな技法を使用して、放射活性によって、あるいは非放射活性的に標識することができる。標識リガンドに関する前に記載したアッセイと同様に、野生型または突然変異標識融合タンパク質を、等しい数の平板培養細胞に加え、標識された融合タンパク質の量を測定する。
【０１４４】
特定の受容体との融合タンパク質の結合親和性を、前記した結合リガンドまたは結合融合タンパク質の濃度と、非結合リガンドまたは非結合融合タンパク質の生成物の濃度、およびそれぞれの反応に加えた融合タンパク質の全体濃度の比によって測定する。野生型ＩＬ２融合タンパク質と比較すると、ＩＬ−２部分中のいくつかの突然変異によって、ＩＬ−２Ｒβγ受容体およびＩＬ−２Ｒαβγ受容体との、融合タンパク質の相対的親和性が変わる。
【０１４５】
（等価形態）
本発明は、本発明の精神またはその本質的な特徴から逸脱せずに、他の特定の形で実施することができる。したがって前述の実施形態は、本明細書に記載した本発明を制限するものではなく、すべての点で例示的なものであるとみなすべきである。したがって本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価性の意味および範囲内に入るすべての変形が、本発明の範囲に含まれると考えられる。
【０１４６】
本明細書で参照したすべての特許、特許出願、および科学文献刊行物は、参照によってその全容を組み込んである。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】サイトカインと、サイトカインの本来の結合性を変える第２のタンパク質部分の、融合を示す図である。図１Ａは、二量体分子としてのＩＬ−２との融合相手、たとえば抗体またはＦｃ含有融合タンパク質のＦｃ部分などを示し、したがってＩＬ−２の２分子が、融合タンパク質のＩＬ−２部分がその受容体と相互作用すると、細胞表面に移動する。図１Ｂは、同じ効果を生み出す第２の機構を示す。
【図２】融合タンパク質免疫サイトカインｈｕＫＳ−ＩＬ２(三角形によって表す)、および２つの変異体、ｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(丸によって表す)およびｈｕＫＳ−ａｌａ−ＩＬ２(Ｎ88Ｒ)(星印によって表す)の、典型的な薬物動態の概略を示す図である。
【図１】
2005511707.tif 000008
【図２】
2005511707.tif 000009
【配列表】
2005511707000001.app
【国際調査報告】
2005511707.tif 000010
2005511707.tif 000011