(57)【要約】  ゼブラフィッシュなどの魚を提供し、さらにこれをサプレッサーのスクリーニングまたは他のスクリーニングに使用することにより、遺伝子組み換えにより提供される、魚の視覚に影響を及ぼす第2遺伝子もしくは魚の視覚に影響を及ぼす処置の活性または効果に影響を及ぼす遺伝子あるいは試験物質を同定する。モデル魚の視覚を変異型または処理済み魚の視覚と比較することで、治療用途を持つ遺伝子および試験物質を同定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第2遺伝子が魚に与える活性もしくは効果または処置が魚に与える活性もしくは効果に影響を及ぼす物質あるいは遺伝子（ここでは「第1遺伝子」と記す）についてスクリーニングする方法であって、以下：
スクリーニング用のモデル魚として、（i）第2遺伝子のトランスジェニック魚であって、ただし該第2遺伝子が眼球特異的プロモーターの調節制御下にあり、かつ魚の眼球における該第2遺伝子の発現が該魚の視覚に影響を及ぼす魚、または（ii）処置を施した魚であって、ただし該処置が該魚の視覚に影響を及ぼす魚、を提供すること；
前記モデル魚を変異させて変異魚を提供すること、または前記モデル魚を試験物質で処理して処理済み魚を提供すること；
変異魚または処理済み魚の視覚をモデル魚の視覚と比較して、モデル魚と比べてその視覚が変更されている変異魚または処理済み魚を同定すること；
前記工程によって、前記第2遺伝子の活性もしくは効果または前記処置の活性もしくは効果に影響を及ぼす試験物質を同定することにより、あるいはモデル魚とその視覚が変更されている変異魚との間の遺伝的差異を同定することにより、前記第2遺伝子の活性もしくは効果または前記処置の活性もしくは効果に影響を及ぼす第1遺伝子を同定すること；
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記第2遺伝子のトランスジェニックモデル魚を変異させて変異魚を提供し、さらにこの第2遺伝子の活性または効果に影響を及ぼす第1遺伝子を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第2遺伝子のトランスジェニックモデル魚を試験物質で処理して処理済み魚を提供し、さらにこの第2遺伝子の活性または効果に影響を及ぼす試験物質を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記処置を施したモデル魚を変異させて変異魚を提供し、さらにこの処置の活性および効果に影響を及ぼす第1遺伝子を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記処置を施したモデル魚を試験物質で処理して処理済み魚を提供し、さらにこの処置の活性または効果に影響を及ぼす試験物質を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記第2遺伝子の活性または効果を減少させる第1遺伝子を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記第2遺伝子が疾患遺伝子である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第2遺伝子の活性もしくは効果を増強または増大させる第1遺伝子を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記第2遺伝子もしくは前記処置の活性または効果を減少させる試験物質を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記第2遺伝子が疾患遺伝子である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記第2遺伝子もしくは前記処置の活性または効果を増強する試験物質を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記眼球特異的プロモーターが誘導性である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記眼球特異的プロモーターが、ath5、オプシン、ロドプシン、ノクツルニン（nocturnin）、PAX6もしくはBrn3のプロモーター、または特定の光伝達カスケードプロモーターからなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記第2遺伝子が疾患遺伝子であり、かつヒトSMN、末端切断型SMN、野生型もしくは変異型ハンチンチン、野生型もしくは変異型SOD-1、TNFα、野生型もしくは変異型αシヌクレイン、野生型もしくは変異型ロドプシン、野生型もしくは変異型ELOVL4または野生型もしくは変異型プレセニリン-1もしくは-2からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
第2遺伝子のサプレッサー遺伝子である第1遺伝子を同定し、さらに請求項１記載の工程を実施することに加えて、該サプレッサー遺伝子または該サプレッサー遺伝子によりコードされる遺伝子産物を少なくとも1種の追加的成分を含む組成物中に提供することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の工程を実施することに加えて、前記サプレッサー遺伝子または前記サプレッサー遺伝子によりコードされる遺伝子産物を、試験物質が該サプレッサー遺伝子または該サプレッサー遺伝子によりコードされる遺伝子産物の活性に影響を及ぼすその能力について分析するためのスクリーニング系に提供することをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５および１６記載の工程を実施することに加えて、前記サプレッサー遺伝子または前記サプレッサー遺伝子によりコードされる遺伝子産物の活性に影響を及ぼす試験物質を少なくとも1種の追加的成分を含む組成物中に提供することをさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記第2遺伝子もしくは前記処置の活性または効果に影響を及ぼす試験物質を同定し、さらに請求項１記載の工程を実施することに加えて、該試験物質を少なくとも1種の追加的成分を含む組成物中に提供することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記魚がゼブラフィッシュ、フグおよび金魚からなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記魚がゼブラフィッシュである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
魚の眼球における疾患遺伝子の発現が該魚の視覚に影響を及ぼす、眼球特異的プロモーターの調節制御下にある該疾患遺伝子についてトランスジェニックである魚。
【請求項２２】
前記眼球特異的プロモーターが誘導性である、請求項２１記載の魚。
【請求項２３】
前記眼球特異的プロモーターがath5、オプシン、ロドプシン、ノクツルニン、PAX6もしくはBrn3のプロモーター、または特定の光伝達カスケードプロモーターからなる群より選択される、請求項２２記載の魚。
【請求項２４】
前記疾患遺伝子がヒトSMN、末端切断型SMN、野生型もしくは変異型ハンチンチン、野生型もしくは変異型SOD-1、TNFα、野生型もしくは変異型αシヌクレイン、野生型もしくは変異型ロドプシン、野生型もしくは変異型ELOVL4または野生型もしくは変異型プレセニリン-1もしくは-2からなる群より選択される、請求項２１〜２３のいずれか1項に記載の魚。
【請求項２５】
前記魚がゼブラフィッシュ、フグおよび金魚からなる群より選択される、請求項２１〜２４のいずれか1項に記載の魚。
【請求項２６】
前記魚がゼブラフィッシュである、請求項２５記載の魚。
【請求項２７】
第2遺伝子の活性または効果に影響を及ぼす第1遺伝子を同定するためのスクリーニングにおける、請求項２１〜２６のいずれか1項に記載の魚の使用。
【請求項２８】
前記第1遺伝子が前記第2遺伝子の活性または効果のサプレッサー遺伝子であり、かつこの第2遺伝子が疾患遺伝子である、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
第2遺伝子もしくは魚の処置の活性または効果に影響を及ぼす試験物質を同定するためのスクリーニングにおける、請求項２１〜２６のいずれか1項に記載の魚の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患モデルの作製、ならびに例えば疾患、疾患の治療、薬剤標的の同定と使用に関わる遺伝子や物質を同定および調査するためのアッセイにおける該疾患モデルの使用に関する。特に本発明は、ゼブラフィッシュなどの魚における疾患モデルの作製およびその使用に関する。本発明はさらに、魚、例えばゼブラフィッシュの疾患モデルの遺伝子サプレッサースクリーニングにおける使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、多数の疾患についてその原因となる遺伝子が知られている。多くの場合、これらの疾患用の動物モデルが作製されている。かかるモデルの大部分は、ラットやマウスなどの哺乳動物、またはショウジョウバエ（Drosophila）などの無脊椎動物である。哺乳動物モデルを利用することの利点は、それらがヒトと非常に似通っているということであり、また無脊椎動物を利用することにより、高度な遺伝学的解析を実施して疾患に関与する遺伝子を同定する機会が得られる。
【０００３】
疾患発現性遺伝子を同定することは、疾患機序の解明を進める際に有用であるが、それが必ずしも治療法に結び付く訳では無い。スクリーニングを実施することにより既存の疾患を治すための遺伝子を同定しうるモデル系を得ることは、非常に有用であろう。この前記スクリーニングが脊椎動物またはin vivoで実施されるのならば、該モデル系は特にヒトの疾患にとりわけ関連するであろう。
【０００４】
ゼブラフィッシュは、哺乳動物と無脊椎動物のモデル系の多くの利点を併せ持つ生物である。ゼブラフィッシュは脊椎動物であるため、ショウジョウバエや他の無脊椎動物よりもヒト疾患モデルとして適しているが、他の脊椎動物モデルとは違って遺伝子スクリーニングを実施する際に使用することができる。
【０００５】
ゼブラフィッシュの成熟期間は2〜3ヶ月と短く、また非常に多産であるため、1組の成魚から1週間当たりに100〜200匹の稚魚を得ることができる。胚と成魚はいずれも小さく、安価でまた維持が容易であるため、高い拡張性を秘めている。例えば化学的突然変異誘発法(Solnica-Krezel et al., Genetics 1994, 136(4): 1401-20)を用いて、ランダム突然変異をゼブラフィッシュゲノム内に導入することができる。また、外来遺伝子を担持するトランスジェニック魚を作り出すこともできる。異種Ikarosタンパク質を発現するゼブラフィッシュを利用して、造血障害およびリンパ増殖性疾患のモデルが作製されている（国際公開第01/40273号）。
【０００６】
国際公開第99/42606号は血管新生作用または細胞死作用または毒性作用について物質をスクリーニングする方法に関し、該方法は該物質を硬骨魚［例えばゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアント・レリオ(Giant rerio )またはフグ］に投与すること、および該硬骨魚において、該硬骨魚の少なくとも1つの組織または器官における血管新生作用または細胞死作用や毒性作用に及ぼす影響を示唆する応答を検出すること、を含む。
【０００７】
国際公開第01/12667号は、眼球内でマーカーを発現させる導入遺伝子の使用について記載している。ここで使用する生物は魚であってもよい。該文献では、マーカー発現用の遺伝子構築物を導入して、光受容性の細胞または器官において該マーカーを視覚的に検出できるようにすること、および光受容性の細胞または器官において該マーカーを視覚的に検出することにより遺伝子導入について選択すること、を含む方法によりトランスジェニック動物（魚でもよいと記載されている）を作製することを提案している。
【０００８】
国際公開第01/51604号(Exelixis)は、腫瘍遺伝子や発癌遺伝子などの感受性遺伝子を、これらの遺伝子の発現が致死的とならない非ヒト動物（仮説上、並外れた可能性を秘めるものとしてゼブラフィッシュが記載されている）の細胞に提供することに関する。変異または他の処理による変化を検出し、これを比較することが提案されている。その目的は「相互作用遺伝子(interactor genes)」の同定であって、該遺伝子に変異が生じると（前記感受性遺伝子の影響を受けた）標的組織が特異的に死滅するか、またはそのサイズが減少する。
【０００９】
Kennedy et al. J Biol Chem (2001) 276, 14037-14043は、ゼブラフィッシュ眼球内でのゼブラフィッシュのロドプシン・プロモーター制御下に置かれたGFPなどのマーカー遺伝子の発現に注目している。
【００１０】
国際公開第98/56902号には、ゼブラフィッシュを含むトランスジェニック魚の使用、および変異を有する系統を含む魚系統の交配方法について開示しており、その目的は魚の遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子を同定することである。  
ゼブラフィッシュ以外に、フグ、金魚、メダカおよびジャイアント・レリオなどの他の魚も操作、変異および研究を行うことが容易であり、また本明細書中に開示した本発明の態様および実施形態で使用することは容易である。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、基礎疾患の見本というだけでなく、さらにスクリーニングにも使用しうる魚（例えばゼブラフィッシュ）疾患モデルを提供する。都合の良いことに、本発明は、本発明を用いなければ障害や疾患のために魚が生存または繁殖できなくなるような場合にも研究およびスクリーニングを行うことができる。本発明は様々な疾患および障害のいずれにも概ね適用可能であり、その一連の実施例は本明細書中に具体的に記載してある。
【００１２】
本発明は、変異が生じた場合に疾患遺伝子の活性または効果、ひいては疾患表現型を変更する遺伝子をスクリーニングおよび同定する方法に使用するための手段、具体的にはゼブラフィッシュなどのトランスジェニック魚を提供する。その変異が最初の疾患遺伝子の活性または効果に影響を及ぼす二次的遺伝子を、サプレッサー遺伝子と呼ぶ。このサプレッサー遺伝子は、疾患を治療する際に薬剤の標的となる。
【００１３】
本発明の好適な実施形態では、遺伝子、特に疾患遺伝子を魚、例えばゼブラフィッシュに眼球特異的なプロモーターの調節制御下で導入する。従って、通常であれば動物に死、生存能力および／または生殖能力の欠如をもたらすような疾患遺伝子を導入する遺伝的改変を行うことにより、死、生存能力および／または生殖能力の欠如を回避することができる。スクリーニングを目的とする場合に非常に都合の良いことに、変異が生じたかまたは遺伝的に改変された被験生物を生殖齢まで成長させて、同様の遺伝的変更を有する新たな子孫を得ることができる。
【００１４】
他の実施形態では、トランスジェニックモデル魚を試験物質で処理し、この魚の視覚を評価することで導入遺伝子の活性もしくは効果に影響を及ぼしうる試験物質についてスクリーニングしてもよいし、さらに／または該魚を変異させて、該導入遺伝子が視覚に与える活性または効果に影響を及ぼす遺伝子を同定してもよい。同様に、ある物質、例えば2,5ヘキサンデジオン(arch toxicol 1998: 72: 597-600)、N-3-ピリジルメチル-N'-p-ニトロフェニルウレア (Br J Ophthalmol 1988 78:584-90)などの視覚に影響を及ぼす物質による処置、または光などによる物理的処置により、モデル魚を作製してもよい。尚、光誘導変性については、これもまた以前に記載されている(J Neuobiol 2000 44: 289-307)。その後、かかる処置により得られたモデル魚を、該処置の効果に影響を及ぼす遺伝子および／または該処置の効果に影響を及ぼす試験物質についてのスクリーニングに使用してもよい。遺伝子または処理の効果を、モデルの視覚と処理済みおよび／または変異が生じた魚の視覚とを比較することにより評価してもよい。
【００１５】
ある1態様では、本発明は、第2遺伝子が魚に与える活性もしくは効果または処置が魚に与える活性もしくは効果に影響を及ぼす物質あるいは遺伝子（ここでは「第1遺伝子」と記す）についてスクリーニングする方法であって、以下：
スクリーニング用のモデル魚として、（i）第2遺伝子についてトランスジェニックである魚（ただし該第2遺伝子は眼球特異的プロモーターの調節制御下にあり、かつ魚の眼球における該第2遺伝子の発現は該魚の視覚に影響を及ぼすものとする）、または（ii）処置を施した魚（ただし該処置は該魚の視覚に影響を及ぼすものとする）、を提供すること；
前記モデル魚を変異させて変異魚を提供すること、または前記モデル魚を試験物質で処理して処理済み魚を提供すること；
前記の変異魚または処理済み魚の視覚をモデル魚の視覚と比較して、モデル魚と比べてその視覚が変更されている変異魚または処理済み魚を同定すること；
前記工程により、前記第2遺伝子の活性もしくは効果または前記処置の活性もしくは効果に影響を及ぼす試験物質を同定すること、あるいはモデル魚とその視覚が変更されている変異魚との間の遺伝的差異を同定することにより、前記第2遺伝子の活性もしくは効果または前記処置の活性もしくは効果に影響を及ぼす第1遺伝子を同定すること；
を含む、上記方法を提供する。
【００１６】
前記方法は、前記第2遺伝子のトランスジェニックモデル魚を変異させて変異魚を提供し、さらにこの第2遺伝子の活性または効果に影響を及ぼす第1遺伝子を同定することを含んでいてもよい。
【００１７】
前記方法は、前記第2遺伝子のトランスジェニックモデル魚を試験物質で処理して処理済み魚を提供し、さらにこの第2遺伝子の活性または効果に影響を及ぼす試験物質を同定することを含んでいてもよい。
【００１８】
前記方法は、前記処置を施したモデル魚を変異させて変異魚を提供し、さらにこの処置の活性または効果に影響を及ぼす第1遺伝子を同定することを含んでいてもよい。
【００１９】
前記方法は、前記処置を施したモデル魚を試験物質で処理して処理済み魚を提供し、さらにこの処置の活性または効果に影響を及ぼす試験物質を同定することを含んでいてもよい。
【００２０】
前記方法は、前記第2遺伝子の活性または効果を減少させる第1遺伝子を同定することを含んでいてもよい。
【００２１】
前記第2遺伝子は疾患遺伝子であってもよい。
【００２２】
前記方法は、前記第2遺伝子の活性もしくは効果を増強または増大させる第1遺伝子を同定することを含んでいてもよい。
【００２３】
前記方法は、前記第2遺伝子もしくは前記処置の活性または効果を減少させる試験物質を同定することを含んでいてもよい。
【００２４】
前記第2遺伝子は疾患遺伝子であってもよい。
【００２５】
前記方法は、前記第2遺伝子もしくは前記処置の活性または効果を増強する試験物質を同定することを含んでいてもよい。
【００２６】
数多くの方法により、魚を物質で処理することができる。魚を試験物質に接触させてもよいし、試験物質を魚の体表面に軽く押し付けたり擦り付けたりしても、または魚の体内に注入してもよい。試験物質を魚が泳いでいる水に加えてもよい。異なる試験物質を96ウェルプレートなどのマルチウェルプレートの各ウェルに加え、有益または有害な効果を示す試験物質を同定してもよい。試験物質に曝露した各ウェルに１匹または数匹の魚を入れてもよい。試験物質を、疾患表現型の発現前に、疾患表現型の発現と同時に、または疾患表現型の発現後に加えてもよい。同一の試験物質を異なるウェルに異なる濃度で加えてもよい。例えば、試験物質1を、ウェルA1には濃度1mMで、ウェルA2には濃度100μMで、ウェルA3には濃度10μMで、ウェルA4には濃度1μMで、さらにウェルA5には濃度0.1μMで加えてもよい。さらにまた、試験物質2をウェルB1 等に加えてもよい。この試験物質の一群は、公知の薬剤であっても、または新規化学物質であってもよい。
【００２７】
さらに、複数の試験物質を組み合わせて加えてもよい。例えば、ウェルA2は試験物質1と2を、ウェルA3は試験物質1と3を、ウェルB2は試験物質2と3を含有していてもよい。あるいは、全てのウェルが試験物質Xを含み、その各々のウェルがさらに別の試験物質の一群を含有していてもよい。
【００２８】
他の選択肢として、ペトリ皿または水槽に入れた魚集団を使用し、例えば1種以上の試験物質またはそれらの組み合わせを水中に加えることにより同時に処理してもよい。
【００２９】
LOPAC ライブラリー（Sigma）などの薬物様化合物の多種ライブラリー、またはChembridge PHARMACOphore多種コンビナトリアルライブラリーを使用してもよい。イオンチャネルライブラリーやGタンパク質ライブラリーなどの、特定の標的クラスを対象とする他の標的化ライブラリーを使用してもよい。光伝達カスケードが典型的なGタンパク質カスケードである場合、後者のライブラリーは特に視覚との関わりが深い。
【００３０】
以下の薬剤は、併用すると幾らかの相乗効果を示す薬剤の具体例である：バルプロ酸ナトリウム、エトスクシミド、フェニトイン、カルバマゼピン、ラモトリジン、ガバペンチン、フェノバルビトン、ジアゼパム、クロバザム、チアガビンおよびレベテリカテム（levetericatem）。これらの薬剤および／または他の薬剤もしくは試験物質について、考えられる全ての組み合わせを挙げて、その相乗効果について試験してもよい。適切な投与量は0.1μM〜10mMと様々であるが、評価を行う際に妥当な出発濃度は100μMである。この試験により有益な効果が見出されることがある。例えばジアゼパムの場合、濃度35μMで単独療法に用いると治療効果を発揮する。
【００３１】
本発明の1態様では、眼球特異的プロモーターの調節制御下にある疾患遺伝子のトランスジェニック魚（例えばゼブラフィッシュ、フグ、金魚、メダカまたはジャイアント・レリオ）[ただしこの魚の眼球における該疾患遺伝子の発現は該魚の視覚に影響を及ぼすものとする]を提供する。
【００３２】
眼球特異的な発現を制御するために使用するプロモーターは、魚系統の確立および／またはスクリーニングを容易にするような、誘導性のものであってもよい。
【００３３】
本発明で使用する眼球特異的プロモーターは、眼球を通る光子の通過、光子エネルギーの生物学的シグナルへの変換、および該シグナルの脳内視覚中枢への伝達からなる過程のうちの1つ以上に関与する眼球構成要素または組織における疾患遺伝子の発現を提供する。従って、本発明で使用するプロモーターは、以下の組織および細胞のうちのいずれか１ヶ所以上で機能するものであってよい：結膜、角膜、房水、硝子体液、水晶体、網膜、視神経、任意の網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、神経節細胞、グリア細胞、水平細胞、双極細胞およびアマクリン細胞。
【００３４】
適切な眼球特異的プロモーターについては本明細書中の他の箇所にて開示および検討するが、それら各々は本発明の個々の実施形態で使用するのに好適なプロモーターの具体例に過ぎず、当業者であればその他のプロモーターも利用可能である。
【００３５】
特定の実施形態では、疾患遺伝子が発現されると、その疾患表現型が優性となって現れる。本発明は、その遺伝子をその天然のプロモーターではなく眼球特異的プロモーターの制御下に置くことにより、死を回避することを含む。この場合、本疾患は眼球のみで発現するため、魚は盲目となるか、または少なくとも野生型のものと比べてその視力もしくは視覚機能が損なわれる。視覚障害を持つ魚および盲目の魚は生存可能であり、また繁殖も可能である。
【００３６】
代替法は、誘導性であるため自由自在にそのスイッチを切ったり入れたりすることができるプロモーターの制御下に当該遺伝子を配置することを含む。この場合、魚が死ぬ前に疾病過程を停止させることができる。
【００３７】
本発明の実施形態で使用する疾患遺伝子は、ゼブラフィッシュなどの魚で（好適な実施形態では魚の眼球構成要素内で）発現された場合に組織または細胞機能の異常な発達、機能不全または変性を生じる任意の野生型または変異型の遺伝子であってよく、この場合、該遺伝子が眼球構成要素内で発現されると（先に記載したように）眼球の組織または細胞の異常な発達、機能不全または変性を引き起こし、結果として魚の視覚機能を冒す。幾つかの実施形態では、眼球構成要素内で疾患遺伝子が発現されると視覚系の一部に発達不全または変性が生じる。他の実施形態では、眼球構成要素内で疾患遺伝子が発現されると視覚系に機能障害が生じる。
【００３８】
本発明のある好適な実施形態では、A53T変異を担持するヒトαシヌクレインをゼブラフィッシュなどの魚の網膜神経節細胞内で発現させて、それにより該神経節細胞を変性させる。その結果、視覚情報の脳への伝達が妨げられ、そのため魚の視覚機能が悪影響を受ける。αシヌクレインが網膜神経節細胞内で発現されている魚は、正常なものに比べて視覚試験の成績が悪い。
【００３９】
別の好適な実施形態では、P347S変異を担持するヒト・ロドプシンをゼブラフィッシュなどの魚の視細胞内で発現させて、該視細胞を変性させる。その結果、光子は網膜により検出されなくなり、このため視覚試験で確認されるように、魚の視覚が損なわれる。
【００４０】
個々の好適な実施形態では、優性に作用する（dominant-acting）疾患遺伝子は、野生型または変異型のいずれかであるハンチンチン、αシヌクレイン、プレセニリン-1、プレセニリン-2、TMF、SMNおよびロドプシンからなる群より選択される。
【００４１】
これらの遺伝子のアクセッション番号および参考文献は以下の通りであるが、これらは全て参照により本明細書中に組み込まれるものとする：
ハンチンチン：野生型ヒト遺伝子のアクセッション番号OMIM 143100；Huntington's Disease Collaborative Research Group, Cell 72: 971-983, 1993. PubMed ID：8458085, Marsh et al. Hum Mol Genet 2000;9(1):13-25；
αシヌクレイン：野生型ヒト遺伝子のアクセッション番号XM003494；Spillantini et al. Nature 1997;388(6645):839-40：
プレセニリン-1：野生型ヒト遺伝子のアクセッション番号AH004968；Sherrington et al. Nature 375 (6534), 754-760 (1995)；
プレセニリン-2：野生型ヒト遺伝子のアクセッション番号NM_000447；Levy-Lahad et al. Science 269 (5226), 973-977 (1995), Levy-Lahad  et al. Science 269 (5226), 970-973 (1995), Rogaev et al. Nature 376 (6543), 775-778 (1995), Levy-Lahad et al. Genomics 34 (2), 198-204 (1996)；
TNF：野生型ヒト遺伝子のアクセッション番号XM_055614；Bitsch et al. Glia. 2000 Feb 15;29(4):366-75, Liu  et al. Nat Med. 1998 Jan;4(1):78-83, Probert et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 21;92(24):11294-8；
SOD-1：野生型ヒト遺伝子のアクセッション番号AY049787；Rosen et al. Nature 1993;362(6415):59-62, Parkes et al. Nat Genet 1998;19(2):171-4；
SMN：野生型ヒト遺伝子のアクセッション番号XM_041493；Pellizzoni et al. Cell 1998, 95(5):615-24, Miguel-Aliaga  et al. FEBS Lett 2000;486(2):99-102；
ロドプシン：野生型ヒト遺伝子のアクセッション番号U49742；Kaushal et al. Biochemistry 1994;33(20):6121-8, Li et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93(24):14176-81, Colley et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92(7):3070-4。
【００４２】
遺伝子のコード配列は、ath5、オプシン、ロドプシンまたは眼球の組織もしくは細胞内で該配列を発現させるその他のプロモーターの制御下に置いても（またはこれに機能しうる形で連結しても）よい。例えば、以下の文献を参照されたい： Mani et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(39): 36557-65 (ロドプシン)、Knox et al. (1998) FEBS Lett. 423(2): 117-21、Kennedy et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17): 14037-43、Quiambao et al. Vis. Neurosci. (1997) 14(4): 617-25およびKido et al. (1996) Curr. Eye Res. 15(8): 833-44 (オプシン)。
【００４３】
遺伝子のコード配列は、熱ショックプロモーター、またはテトラサイクリンもしくはホルモン誘導系から選択されるプロモーターなどの誘導プロモーターの制御下に置いてもよい。
【００４４】
本発明は、本明細書中に開示したように、ゼブラフィッシュなどの魚の細胞を改変するための核酸操作を提供する。本発明に従って魚で発現される疾患遺伝子の核酸は、細胞の染色体内に組み込まれる。組み込みは、当分野で利用可能な技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列を含有させることにより促進することができる。この疾患遺伝子は魚にとって異種のもの、例えばゼブラフィッシュにとって異種のもの（例えばヒトなどの哺乳動物）であってもよく、また野生型または任意の対立遺伝子変異型または突然変異型であってもよい。該疾患遺伝子は、例えばゼブラフィッシュや他の魚の遺伝子の余分なコピーを提供する野生型もしくは変異疾患型などの変異型のゼブラフィッシュ遺伝子または他の魚の遺伝子であってもよい。
【００４５】
本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列は、本明細書中に含まれる情報と参考文献および当分野で公知の技術（例えば、Sambrook and Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001、およびAusubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992、またはその増補版を参照されたい）をもとに、当業者が容易に調製しうる。ゼブラフィッシュの維持、突然変異誘発、形質転換およびマッピングについては、Detrich et al. (1998) The Zebrafish: Biology.  Methods in Cell Biology. Volume 59、およびDetrich et al. (1998) The Zebrafish: Genetics and Genomics.  Methods in Cell Biology. Volume 60を参照されたい。
【００４６】
核酸に機能しうる形で連結された1つ以上の調節配列を持つ構築物中に所望のコード配列を組み込んでその発現を制御することもできる。必要に応じて、適切な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含んでいてもよい。
【００４７】
所望のパターン（例えば網膜限定）で発現されることが知られている遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー活性に関わる領域を、該遺伝子の翻訳開始コドン上流に伸びる配列をレポーター遺伝子に連結することにより単離してもよい。推定上のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域が欠失した構築物を作製し、該構築物をトランスジェニック魚、例えばトランスジェニック・ゼブラフィッシュ、フグ、金魚、メダカまたはジャイアント・レリオ（Giant rerio）における組織特異的遺伝子発現について試験する。
【００４８】
選択マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことにより、前記遺伝子構築物がゲノム内に挿入されているクローンの選択を容易にしてもよい。蛍光マーカーを使用する場合は、胚を蛍光解剖顕微鏡の下で選別する。胚、またはそれらを成長させて得た魚を、導入遺伝子により生じた異常の存在についてスクリーニングしてもよい。別のアプローチでは、胚を集めた後にゲノムDNAを抽出し、このゲノムDNAをPCRおよび／または制限酵素消化により解析してもよい。陽性クローンを増やして、魚になるまで育ててもよい。その後、これらの魚を交配して生殖細胞内に１コピーの前記遺伝子構築物を担持する魚を作製してもよい。これらのヘテロ接合性魚をさらに交配して、前記遺伝子をヘテロ接合的に担持する魚を作製してもよい。
【００４９】
さらに別の態様では、核酸構築物を導入することを含む方法であって、所望の疾患遺伝子のコード配列が魚（例えばゼブラフィッシュ）の胚細胞内で眼球特異的プロモーターの制御下に配置される方法を提供する。DNAを初期胚細胞内に直接in vivo注入してもよい。胚幹細胞培養物の確立と併せて、一般に「形質転換」と呼ばれているがこれに限定されない他の方法を使用してもよく、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン法、電気穿孔法、リポソーム媒介型トランスフェクションおよびレトロウイルスや他のウイルスを利用した形質導入を用いるなど当分野で利用しうる任意の方法から選択してもよい。当分野で周知のように、抗生物質耐性遺伝子または感受性遺伝子などのマーカー遺伝子を、目的の核酸を含有するクローンを同定する際に使用してもよい。
【００５０】
ある特定の実施形態では、魚、例えばゼブラフィッシュに導入しようとする疾患遺伝子のコード配列をath5プロモーターの調節制御下に置く。ath5はショウジョウバエ塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子Atonalのゼブラフィッシュ眼球特異的オーソログであり、網膜神経節細胞内で特異的に発現される（Kay et al. Neuron. 2001 Jun;30(3):725-36）。別の実施形態では、疾患遺伝子のプロモーターをオプシン・プロモーター（Kennedy et al., (2001) J. Biol. Chem. 276(17): 14037-43）またはロドプシン・プロモーターで置き換える。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書中に開示し、また後述で検討するスクリーニングに使用する際に有用なゼブラフィッシュなどの魚を作製する方法を提供する。該方法は、疾患遺伝子のコード配列が魚、例えばゼブラフィッシュの眼球特異的プロモーターであるプロモーターに機能しうる形で連結されている遺伝子構築物を提供すること、該遺伝子構築物を魚、例えばゼブラフィッシュの胚に導入すること、該遺伝子構築物を該魚の胚のゲノム内に組み込ませるかあるいは組み込まれるようにすること、および該魚の胚を成長させて生存可能な魚を得ること、を含んでいてもよい。
【００５２】
生存可能でかつ繁殖可能な魚、例えばゼブラフィッシュを1匹以上の他の魚と交配することにより、眼球特異的プロモーターに機能しうる形で連結され、かつその調節制御下にある疾患遺伝子を含む遺伝子構築物のトランスジェニック魚、例えばゼブラフィッシュの系統を確立してもよい。かかる魚、例えばゼブラフィッシュの系統は、本明細書中に開示したサプレッサー遺伝子のスクリーニングにおいて有用である。
【００５３】
疾患遺伝子を魚の胚、例えばゼブラフィッシュの胚に導入するため、当業者が利用しうる技術を用いて遺伝子構築物を作製する。該構築物は、制限消化によりベクターから切り出し、そして例えば1×TE（pH8.0）で溶出し、さらにテトラメチル-ローダミンデキストラン（0.125％）などのマーカー色素を含有する50〜100μg／mL KClを用いて使用濃度まで希釈することによりゲル精製してもよい。典型的には、この溶液1〜3nLを1細胞期のゼブラフィッシュの胚に注入してもよい。数千個の胚に注入してもよい。
【００５４】
注入済みの胚を成長させた後、これらを互いに、または非トランスジェニックの野生型魚と交配する。導入遺伝子の次世代への伝達は、通常は2〜90％の率のモザイクとなる。通常は100匹以上の子孫について解析を行い、その親となった魚が導入遺伝子を担持しているかどうかを確認する。
【００５５】
注入した胚を育てて、後述にてさらに検討する改変型視機性(optikinetic)アッセイおよび視運動性（optomotor）アッセイにより一定時間おきに（例えば2日毎に）視覚機能を評価してもよい。
【００５６】
視覚障害を示す魚を飼育して、これを野生型魚と交配してもよい。親とその子孫とを比較し、子孫を同様に視覚機能不全について評価してもよい。視覚機能不全を呈する、すなわち組み込んだ疾患遺伝子構築物が生殖細胞を介して伝達されたと思われる子孫を選択的に交配することができる。これら子孫のうちの何匹かを、さらに詳細な解析のために（例えば盲目の性質を確認するために）犠牲にすることもありうる。この解析には、導入した遺伝子に対するセンスおよびアンチセンスプローブを用いたin situハイブリダイゼーション研究により神経節細胞層における前記構築物の発現について調べること、プラスチック切片などを用いた解剖学的評価により神経節細胞層の変性を調べること、およびターミナルデオキシウリジンヌクレオチド末端標識法（TUNEL）により神経節細胞層におけるアポトーシス性細胞死について調べること、が含まれていてもよい。
【００５７】
適切な特徴を呈する魚が得られた血統を、その後数世代維持してもよい。こうして維持することにより、後にこの新規変異系統を本発明のさらに別の態様に従って2次サプレッサースクリーニングに供することができる。
【００５８】
本発明の別の態様では、本明細書中に開示したように、ゼブラフィッシュ、フグ、金魚、メダカまたはジャイアント・レリオ（Giant rerio）などのトランスジェニック魚の細胞を、かかる魚に由来しかつ任意で標準技術を用いて不死化した単離細胞または細胞系として提供する。
【００５９】
本発明の態様および実施形態で使用する疾患遺伝子配列などの遺伝子（例えばゼブラフィッシュにとって異種であるなど、その魚にとって異種のもの）として野生型遺伝子を用いてもよく、あるいは突然変異型、変異型または誘導体配列を使用してもよい。その配列は、所与の配列において1個以上のヌクレオチドからなる付加、挿入、欠失および置換が1つ以上生じたことによる変化のために、野生型と異なっていてもよい。ヌクレオチド配列の変化は、遺伝コードにより決定されるタンパク質レベルのアミノ酸変化を生じるものであっても、そうでなくてもよい。
【００６０】
新規薬剤の同定につながるような薬学研究が、リード化合物を発見する前だけでなくその後でさえ膨大な数の候補物質のスクリーニングを必要とすることは、良く知られている。このことが薬学研究を非常に高価で時間のかかるものにしている一因となっている。こうしたスクリーニング手順のアシスト手段は、商業的にかなり重要な意味を持ち、また有用である。障害または疾病を治療または予防する際に有用だと考えられる物質をスクリーニングするためのかかる手段は、ゼブラフィッシュなどの本発明の魚により提供される。本発明を用いて同定されたサプレッサー遺伝子および該サプレッサー遺伝子の活性に影響を及ぼす物質は、疾病との闘いにおける進歩を示すものである。何故なら、それらはin vivoで使用する治療法を設計および検討するための基礎を提供するだけでなく、治療の活性または効果に影響を及ぼしうる試験物質、ならびに魚における疾患遺伝子の発現の活性または効果に影響を及ぼす物質を提供するからである。
【００６１】
さらに別の様々な態様では、本発明はスクリーニング方法およびアッセイ方法および手段、ならびにそれらにより同定される物質に関する。
【００６２】
本発明者らは、ゼブラフィッシュなどの魚が2次サプレッサースクリーニングにおいて有用であることに気が付いた。2次サプレッサースクリーニングは、1つ以上の変異をゲノムに導入すること、および1次変異による効果の打ち消しまたは抑制についてスクリーニングまたは選別することを必要とする。
【００６３】
その原理は、仮想遺伝子B（その正常機能は魚の大きさを制御することである）を一例として用いて説明することができる。この遺伝子が過剰活性を示すように変異している場合、より大きな魚が得られるだろう。ここでもう1つの仮説遺伝子S（その正常機能は細胞を小さくすることである）について考えてみる。この遺伝子が変異している場合、細胞はより大きくなるだろう。従って、既に変異型B遺伝子を担持している細胞内のS遺伝子に変異を導入すると、これら2つの遺伝子は互いに打ち消し合い、正常な大きさの細胞が得られるだろう。変異型S遺伝子は変異型B遺伝子の表現型を抑制するのである。
【００６４】
しかし、遺伝子Bが優性疾患遺伝子である場合には問題が生じる。何故なら、それが魚を生存不能にするものである場合、魚はすぐ死ぬかまたは繁殖できなくなってしまい、遺伝子Bに変異を有する成魚を得られないからである。
【００６５】
本発明は、疾患遺伝子の発現を眼球に限定し、該遺伝子を眼球特異的プロモーターの制御下に置くことにより、前記問題の解決策を提供する。この限定発現の結果、疾患過程はこれら特定の細胞に限定される。この場合の魚は生存可能であり、成魚まで育てて繁殖させることができるため、2次サプレッサースクリーニングに使用することができる。
【００６６】
さらに、本発明は、疾患活動性の存在および疾患活動性の程度についての正確で段階的、かつ迅速なスクリーニング方法を提供する。網膜の変性は盲目を引き起こし、またこうした盲目および視覚機能の障害について、本発明のゼブラフィッシュなどの魚においてアッセイすることは簡単である。
【００６７】
本発明で提供する魚、例えばゼブラフィッシュは、疾患遺伝子の活性または効果を低減するサプレッサー遺伝子のスクリーニングに役立つ。本発明のさらに別の態様では、魚、例えばゼブラフィッシュ、フグ、金魚、メダカまたはジャイアント・レリオ（Giant rerio）のかかるスクリーニングにおける用途が提供される。
【００６８】
さらなる態様では、本発明は、疾患遺伝子の活性または効果を減少させるサプレッサー遺伝子をスクリーニングする方法であって、以下：
スクリーニング用モデル魚として、眼球特異的プロモーターの制御下にある疾患遺伝子のトランスジェニック魚、例えばゼブラフィッシュ（ただし魚の眼球における該疾患遺伝子の発現が該魚の視覚に影響を及ぼす）を提供すること；
前記モデル魚を変異させて変異魚を提供すること；
変異魚の視覚をモデル魚の視覚と比較して、モデル魚と比較してその視覚が変更されている全ての変異魚を同定すること；
モデル魚と、その視覚が変更されている変異魚との間の遺伝的差異を同定し、それにより前記疾患遺伝子の活性または効果を減少させるサプレッサー遺伝子を同定すること；  
を含む、上記方法を提供する。
【００６９】
既に記載したように、本発明の好適な実施形態では、その種々の態様においてゼブラフィッシュを使用する。
【００７０】
眼球内で前記疾患遺伝子が発現された結果生じた視覚障害により明らかとなる疾患発現性または表現型変更性の変異を担持するゼブラフィッシュなどの魚を、第2遺伝子に生じる変異のために視覚障害を示さなくなるか（この変異型第2遺伝子は該疾患遺伝子の活性を抑制する）、または同程度の視覚障害を示さなくなるということに基づいて同定してもよい。
【００７１】
ゼブラフィッシュなどの魚の視覚機能は、例えば以下の方法のうちの1つを用いて評価してもよい：
(1)  ゼブラフィッシュは背景に溶け込むためにその体色を変化させる。暗い環境ではこの魚はより黒くなり、明るい環境ではより明るくなる。盲目の魚は自分達が暗い場所にいると判断するため黒くなる。これにより、非常に迅速な視覚スクリーニングが提供される。すなわち、黒い魚は盲目である（Neuhauss）。
【００７２】
(2)  ゼブラフィッシュや他の魚の視機性反応は、それらの目の前で縞模様（stripes）を通過させることにより評価することができる。ヒト被験者の場合、その結果生じる反射性眼球運動が抑制されることはない。すなわち、ゼブラフィッシュなどの魚の目の前で縞模様を通過させてその視機性反応の有無を評価することにより、視覚機能についての別のアッセイを提供する。関連のある視覚アッセイで視運動反応を用いる。刺激を徐々に高度化することにより、ゼブラフィッシュなどの魚の視覚機能を詳細かつ段階的に評価することができる（Orger）。さらに、この評価方法を用いれば、多数の魚について短時間で試験することができる。
【００７３】
移動回折格子（moving grating）、または動画、例えば画面上にコンピューターアニメ表示として示されたものにより、ゼブラフィッシュ幼生の先天的な視運動挙動が引き出される。つまり、幼魚は知覚した動作方向に向かって泳ぐ（Orger et al. Nat Neurosci 2000 Nov 3(11):1128-33）。ゼブラフィッシュ幼生は、孵化してすぐ生得的に動的刺激に応答し始める。これは、本明細書中に開示した本発明のスクリーニングにとって都合が良い。何故なら、変異がモデルゼブラフィッシュに及ぼす効果を迅速に測定できるからである。他の魚も同様の反応を示す。
【００７４】
ゼブラフィッシュの視覚機能はそれらの体色または体色における色素沈着を検討することにより測定してもよく、その変化は、先で論じたように、盲目の指標となる。視覚機能は、例えば魚の目の前を通過させた縞模様パターンに対する応答を観察することにより測定してもよい。好適な実施形態では、盲目であると予想される黒色の魚および視覚機能を有すると予想される明るい体色の魚をそれらの体色に基づいて分けた後、視覚機能の程度または範囲を視覚アッセイにより測定する。
【００７５】
ゼブラフィッシュなどの魚の視覚機能を分析する際には、バックグラウンドの色素沈着の変化、視覚性驚愕反応、視機性眼球反応および／または視運動性反応の観察を行ってもよい。通常、最後の2反応は共に、あるパターン（例えば横縞模様）を通過させることを含む。視機性アッセイでは、魚を3%のメチルセルロースで固定し、その目の前でパターンを通過させる。視運動性アッセイでは、魚を1つ以上の長くて狭い水路内で自由に泳がせておいて、この水路に沿ってパターンを通過させる。魚は知覚した縞模様の移動方向に向かって泳ぐため水路の一端に集まるが、それらの魚が盲目である場合は、無秩序に散らばったままである。
【００７６】
典型的な強刺激は、全視野を埋め尽くす100％コントラストの方形波および4Hzにて動く幅36度の縞模様である。視野限界はOrgerら（上掲）により確認されているが、部分的に盲目の魚の場合、この限界はさらに狭い。視覚機能不全の程度は、パターンのコントラストおよび／または縞模様の幅を魚が反応しなくなるまで少なくすることにより決定することができる。視覚機能不全の他の側面を、縞模様の色や他のパターンを変更することにより分析してもよい。
【００７７】
前記パターンは視野を横切って動く縞模様であっても、波線であってもよい。例えばOrgerら（上掲）が記載したように、他の非フーリエまたは2次刺激を使用してもよい。
【００７８】
こうして、本発明の実施形態では、魚において眼球特異的プロモーターの制御下で発現される疾患遺伝子のトランスジェニック魚、例えばゼブラフィッシュを数世代維持してもよい。このように維持することで、この系統を2次サプレッサースクリーニングに使用することが可能となり、また該スクリーニングによって該系統のゲノム内に2次変異がランダムに導入される。今や疾患発現性変異と潜在的な抑制性2次変異との両方を担持するようになった魚の視覚機能を、改変視運動性または視機性アッセイにより評価してもよい。最初の被験変異体よりも視覚機能が良好な魚は、最初の疾患発現性変異の効果を抑制する2次変異を担持する魚の候補であると考えられる。この2次変異型遺伝子およびそのタンパク質産物は、最初の変異により生じた疾患を治療する際の治療標的となる。
【００７９】
眼球特異的プロモーターの制御下にある疾患遺伝子に関してトランスジェニックであり、かつ該疾患遺伝子が魚の視覚機能に及ぼす活性または効果を減少させるサプレッサー遺伝子内に変異を有する変異型ゼブラフィッシュなどの変異魚は、それ自体が該サプレッサー遺伝子の抑制効果をモジュレートするかまたは該効果に影響を及ぼす、好ましくは該効果を増強するかまたは増大させる試験物質についてのさらなるアッセイにおいて有用である。明らかに、ある遺伝子内のある変異が第2遺伝子の活性を増強するかまたは増大させることが確認された場合には、同じ事が言える。
【００８０】
無論、当業者であれば、任意の適切な対照実験を考案し、試験アッセイで得られた結果と比較することができるだろう。
【００８１】
当業者であれば、1次変異型系統に2次変異を導入するために数多くの手法を利用することができる。かかる方法には、導入遺伝子を担持する雌魚をホモ接合性となるまで繁殖させて、その後これらの雌を、エチルニトロソウレア（ENU）に曝露したF0の雄から得たF1またはF2世代の雄と交配することが含まれる。van Eedenら(Methods Cell Biol 1999 60)により記載された突然変異誘発手順を用いると、典型的には1遺伝子座当たり0.9〜3.3×10-3という確率で突然変異体が生じる。3mM ENUで6回処理した後に繁殖力のある雄を20〜30匹得るには、健康で繁殖力のある雄が始めに100匹必要だと考えられる。
【００８２】
突然変異誘発は以下のようにして実施してもよい：
エチルニトロソウレア（ENU）を酢酸に溶かして最終濃度を10mM（pH6.0、238nmにおける光学密度により決定［吸光係数＝5830／M／cm］）とし、次いでこれを10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.6）で希釈して3.0mMの使用濃度とする。受精した子孫を確実に提供する雄魚をENU溶液中に1時間入れておく。その後、この雄魚を、水槽の水を2回交換しながら、各1時間ずつ洗浄した後、水槽に戻す。この突然変異誘発手順を1週間隔で６回繰り返す。
【００８３】
誘発される変異の頻度は、実施した突然変異誘発手順の回数に正確に比例する。このため、1ゲノム当たりに望む変異の数に合わせて手順の回数を変更することができる。
【００８４】
実際の突然変異誘発手順の場合は、暗所で実施して魚に与えるストレスを最小限に抑えると一番良い。
【００８５】
突然変異を誘発した魚から得られる最初の子孫はモザイクである。このため、最後の突然変異誘発手順を行った後、突然変異を誘発した魚を1週間隔で３回交配する。その後得られる子孫は、全ての変異がその精原幹細胞中に生じているだろうから、モザイクではないだろう。
【００８６】
他の有用な突然変異誘発手段としては、γ−またはX線媒介型突然変異誘発、およびレトロウイルス媒介型挿入性突然変異誘発が挙げられる。
【００８７】
致死という問題を克服し、優性に作用する疾患変異を2次サプレッサースクリーニングに供することを可能にする代替法は、変異遺伝子を熱ショックプロモーター、テトラサイクリン誘導系(Clontech)またはホルモン誘導プロモーターなどの誘導プロモーターの制御下に置くことを含む。
【００８８】
前記テトラサイクリン誘導系(Clontech)は2つの異なる構築物に依存している。tet-onプラスミドは、単純ヘルペスウイルスのVP16活性化ドメイン（AD）に連結された変異型tet-リプレッサータンパク質rTetRからなるテトラサイクリン制御性トランスアクチベーターrtTAを発現する。このrtTAタンパク質は、2つ目のプラスミドのテトラサイクリン応答配列（TRE）部分に結合してこれを活性化する。活性化TREはCMVサイレントプロモーターと共に機能して目的とする遺伝子の発現を促す。この系で重要となるのは、rtTAトランスアクチベーターがテトラサイクリン（またはその類似体であるドキシサイクリン）の存在下でのみTRE応答配列に結合するということである。テトラサイクリン非存在下では結合は起こらず、該応答配列は「オフ」となり、またタンパク質発現量は最小となるため、毒性タンパク質ですら効果的にそのスイッチを切ったり入れたりすることができる(Harkin et al Cell 1999 97:575-86; Lee et al PNAS 1988 95:11371-6)。
【００８９】
前記テトラサイクリン誘導系は既に哺乳動物で使用されており、マウス肺におけるインターロイキン11の調節された過剰発現を提供している(Ray et al 1997 J Cline Inv 100: 2501-)。子宮内でドキシサイクリン処理した胚、または仔マウスもしくは成体に対する明らかな毒性は観察されなかった。ドキシサイクリン非存在下では、IL-11の濃度は50pg／mL未満であった。ドキシサイクリン誘導によりその濃度は上昇し、0.3ng／mLを上回った。ドキシサイクリンを飲料水から取り除くと、IL-11の濃度は24時間以内に80％以上も減少した。この応答配列を改変して、より厳しい制御を行うことが可能である。
【００９０】
さらなる変更は、前記TRE応答配列の双方向性プロモーターへの連結を伴う。この連結により、標的遺伝子が発現される際には必ずeGFPも発現されるようになる。このため、遺伝子の保持および活性化について容易に可視化できるマーカーが提供される。
【００９１】
従って、2次サプレッサースクリーニングのシナリオでは、変異遺伝子を、誘導系（例えばテトラサイクリン誘導系）の制御下で、魚、例えばゼブラフィッシュに導入する。誘導物質（例えばテトラサイクリン）の添加により該遺伝子のスイッチを入れ、さらに該遺伝子を発現している魚をさらなる研究のために選択する。次いで、該遺伝子のスイッチを切り、該魚をその後数世代にわたって飼育することにより、2次サプレッサースクリーニングの一環としてさらに別の変異を導入することができる。
【００９２】
従って、さらに別の態様では、本発明は疾患遺伝子の活性または効果を減少させるサプレッサー遺伝子をスクリーニングする方法であって、以下：
遺伝子構築物に関してトランスジェニックであるスクリーニング用モデル魚としてゼブラフィッシュなどの魚を提供すること（ただし、魚にとって致死的であるかまたは魚を生存不能もしくは繁殖不能にする疾患遺伝子のコード配列は、誘導プロモーターの制御下に提供され、また該モデル魚は該誘導プロモーターが誘導および／または抑制されない条件下で作製され、かつ飼育されるものとする）；
前記モデル魚を変異させて変異魚を提供し、さらに前記誘導プロモーターを誘導および／または抑制解除することにより前記疾患遺伝子をモデル魚において発現させること；
前記疾患遺伝子が発現されている変異魚の生存能力および／または繁殖能力を測定し、同疾患遺伝子が発現されているモデル魚と比較すること；  
モデル魚と、生存能力および／または繁殖能力が変更されている変異魚との間の遺伝的差異を同定し、それにより前記疾患遺伝子の活性または効果を減少させるサプレッサー遺伝子を同定すること；
を含む、上記方法を提供する。
【００９３】
抑制が生じた系統の魚は、少なくとも2つの変異を有すると思われる。すなわち、前記疾患遺伝子を導入した結果生じた疾患発現性／表現型誘導性変異と、疾患／表現型抑制性または抑圧性変異である。
【００９４】
さらに注目すべきは、サプレッサー変異および遺伝子を同定する代わりに、本発明をそのいずれかの態様および実施形態で使用することにより、最初の表現型の重症度を増強または増大させる変異および遺伝子を同定することができるということである。このことを利用すれば、特定の疾患経路に関与する別の遺伝子を同定することができる。
【００９５】
同様に、例えば遺伝子が眼球内で発現される導入遺伝子であり、かつ該導入遺伝子または処理が魚の視覚に影響を与えるものである場合には、本発明を利用して魚における該遺伝子または魚の該処理の活性または効果に影響を及ぼす試験物質を同定してもよい。
【００９６】
本発明の態様または実施形態に従うスクリーニングまたはアッセイ方法は、疾患遺伝子の活性または効果を減少させるサプレッサー遺伝子を同定することを含んでいてもよい。
【００９７】
本発明の態様または実施形態に従うスクリーニングまたはアッセイ方法は、第2遺伝子の活性もしくは効果を増強または増大させる遺伝子、あるいは第2遺伝子の活性または効果に（かかる活性もしくは効果を軽減または低減するか、あるいは増強または増大させるような）影響を及ぼす試験物質を同定することを含んでいてもよい。
【００９８】
第2遺伝子の活性または効果に影響を及ぼす遺伝子（例えばサプレッサー遺伝子）を同定した後、この遺伝子（別の種、例えばヒトのホモログを含む）または該遺伝子によりコードされる遺伝子産物をクローニングしても、または他の方法を用いて単離または精製形態にて提供してもよく、また少なくとも1種の追加成分を含む組成物として提供してもよい。
【００９９】
遺伝子、例えばサプレッサー遺伝子（別の種、例えばヒトに存在するホモログを含む）または該遺伝子（例えばサプレッサー遺伝子）によりコードされる遺伝子産物を、試験物質が該遺伝子または該遺伝子によりコードされる遺伝子産物の活性に影響を及ぼすその能力について分析するためのスクリーニング系に使用してもよい。
【０１００】
遺伝子、例えばサプレッサー遺伝子、または該遺伝子によりコードされる遺伝子産物の活性に影響を及ぼす試験物質を、少なくとも1種の追加成分を含む組成物中に提供してもよい。
【０１０１】
目的の疾患遺伝子に対するサプレッサー遺伝子、または第2遺伝子の活性もしくは効果に影響を及ぼす他の遺伝子を同定した後、このサプレッサー遺伝子もしくは他の遺伝子および／または該遺伝子によりコードされる遺伝子産物を、潜在的な治療薬を同定する際の標的または治療薬そのものとして使用してもよい。また、その抑制効果や他の効果の性質をさらに調べてもよい。
【０１０２】
前記のサプレッサー遺伝子、または第2遺伝子の活性もしくは効果に影響を及ぼす他の遺伝子は、新規遺伝子であっても、あるいは関連する疾患遺伝子の活性もしくは効果に影響を及ぼすかまたはこれを抑制する機能を持つことが今まで知られていなかった公知遺伝子であってもよい。この遺伝子は、活性に影響を及ぼすかまたはこれを抑制する機能を持つことが既に公知であるか、あるいはそう予想されている遺伝子であってもよく、この場合には、魚アッセイで得られた結果は既存の証拠を裏付けるものとなる。特に、抑制効果または他の効果がin vivoで生じるという事実は、この遺伝子または該遺伝子によりコードされる遺伝子産物もしくはその断片、または該遺伝子もしくは該遺伝子産物の作用経路内に存在する成分を薬剤標的として使用することについての信頼性を高める。さらなる研究および用途のために、例えばクローニングもしくはスクリーニング技術を用いて入手可能なものであれば、別の種から得たホモログを使用してもよい。
【０１０３】
原因となる変異、例えば抑制性変異を、当分野で利用可能なマッピング技術を用いて同定してもよい（例えば、Detrich H.W., Zon L.I.and Westerfield M. (1998) The Zebrafish: Genetics and Genomics.  Methods in Cell Biology. Volume 60, pg 182-192を参照されたい）。
【０１０４】
すなわち、関連する変異、例えば抑制性変異の位置を特定する際には、この変異の遺伝子座をマーカーの位置（該マーカーの位置は公知である）と比較しながらマッピングする。DNAマーカーとしては、短いDNA配列、クローン化遺伝子または他の変異がある。現在ゼブラフィッシュで使用するのに最も良い方法では、全ゲノムを高密度で網羅している単純配列長多型（SSLP）を用いる。この方法を用いれば、0.5cM以下の距離にマッピングすることが可能であり、この位置から染色体ウォークを開始し、さらに1本鎖高次構造多型を用いてさらなるマッピングを行っても、または候補遺伝子を直接選択してもよい。
【０１０５】
SSLPを利用したマッピング
ここで使用するマーカーは2塩基（CA）リピートに隣接する2つのプライマーからなる。これらはゼブラフィッシュ系統間でその長さが非常に異なり、また多型性である。SSLPマッピングには以下の工程が含まれる：
1．交配地図（map cross）を作製し、変異体保持体を同定し、この変異体と兄弟（sibling）子孫とを別々に用意する工程、
2．変異体と兄弟子孫の両方からゲノムDNAを単離する工程、
3．変異体と兄弟子孫の両方から得たプールDNAを用いてゲノム走査を行うことにより連鎖群を決定する工程、
4．単独の胚のDNAを用いて存在しうる連鎖を確認する工程、
5．密接に連鎖するマーカーを探す工程、
6．マーカーと変異との間の組換え数を決定することにより、遺伝地図上における変異の位置を決定する工程。
【０１０６】
ゲノムDNAの単離
DNAを単独の胚から抽出するため、100％メタノールで固定した胚をペトリ皿に注ぐ。この皿にメタノールをさらに加えて胚を覆う。次に、胚をピペットで96ウェルプレートに移す（1ウェルにつき1個の胚）。その後、ピペットを用いて胚の周囲のメタノールを出来る限り取り除く。残ったメタノールは、その後PCRブロックセット上で70℃にて15分間かけて蒸発させる。250μLのプロテイナーゼK(17mg／mL, Merck)と2.25mLの1×TEとの混合物のうちの25μLを各ウェルに加える。その後、PCRプレートをHybaidフィルムで覆い、PCR装置内で55℃にて240分間加熱した後、75℃で10分間インキュベートしてプロテイナーゼKを不活性化する。こうして得られたプレートは、必要になるまで-20℃で保存することができる。
【０１０７】
ゲノム走査
48個の単独試料各々から10μLを採取することによりプールDNAを調製し、その後これを希釈して最終濃度を50ng／μLとする。マーカー用のプライマーを、それと同一のマーカーを用いて解析された変異体および兄弟由来の試料が後にアガロースゲル上で互いに隣り合って泳動されるように、マスタープライマー96ウェルプレート上に並べる。PCRプレート用に選択されるマーカーは、有用な多型を示し、かつ全ゲノムにわたって均等に散らばるマーカーである。
【０１０８】
その後、96ウェル形式にてPCR反応を行う。各ウェルには14.28μLのPCRミックス、各0.16μLの20μMフォワードおよびリバースプライマー、0.4μLの5U／μL Taqポリメラーゼならびに5.0μLの鋳型DNAが含まれている。最初の変性を94℃で3分とし、その後94℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリングおよび72℃で1分の1次伸長を１サイクルとして35サイクル行うPCRを実施する。この反応を、72℃で5分の最終伸長を行うことにより終了させる。
【０１０９】
PCRミックス：
0.2mM dATP
0.2mM dCTP
0.2mM dGTP
0.2mM dTTP
（PCR緩衝液中）
PCR緩衝液 (10×)：
100mM Tris-HCl, pH 8.3
500mM KCl
15mM MgCl2
0.1％ (w/v) ゼラチン
単独の胚についてのPCR
上記同様にPCR反応を設定し、実施するが、ここでは単独の胚のDNAを鋳型として用いる。
【０１１０】
得られたPCR産物を、1×TBE中200Vにて80分間かけて2％アガロースゲル上で泳動することにより、遺伝子多型について評価する。
【０１１１】
SSCPを利用したマッピング
ここでは一本鎖DNAを使用する。各鎖はそれぞれ熱力学的に好適な立体構造を持つものとする。単一のヌクレオチド置換により、移動パターンの違いを非変性ゲル上で検出しうる程度までその立体構造を改変することもできる。これにより、変異に密接に連鎖する非SSLPマーカーを解析することができる。
【０１１２】
マーカーを増幅するために使用したプロトコルは、SSLPマッピング用のものと同じである。PCR産物を沈殿させるため、2容量の予冷した100％エタノールと0.1容量の3M 酢酸ナトリウムを該PCR産物に加え、十分にボルテックスし、-20℃で少なくとも20分間インキュベートした後に、冷却した遠心分離機で13000rpmにて25分間遠心分離する。上清を捨て、DNAペレットを空気乾燥させた後、8μLのddH2O中に再懸濁する。5.4μLのPCR産物に0.6μLの変性溶液と2.4μLのローディングバッファをを加え、軽く混合した後、85℃で10分間インキュベートする。その後、この試料を氷上で急速冷却する。次に、各試料6〜8μLを未変性プレキャストアクリルアミドゲル(CleanGel SSCP, ETC Elektrophorese-Technik)上に載せ、製造業者の使用説明書に従って15℃にて200Vで泳動する。
【０１１３】
変性溶液：
10mM EDTA
500mM NaOH
ローディングバッファ：
2％  ブロモフェノールブルー
2％  キシレンシアノール
（ホルムアミド中）
次に、銀染色キット(PlusOne DNA Silver Staining Kit, Pharmacia)を使用し、製造業者の使用説明書に従って前記のゲルを染色する。
【０１１４】
これらの方法により、候補遺伝子を十分選択できるほど近くに変異をマッピングする。その後、変異体および野生型魚の両方においてこの遺伝子の配列決定を行うことにより変異を同定する。
【０１１５】
サプレッサーまたは第2遺伝子の活性もしくは効果に影響を及ぼす他の遺伝子がタンパク質をコードしている場合、該タンパク質は第2遺伝子（例えば疾患遺伝子）もしくはその遺伝子産物と相互作用または結合する可能性がある。従って、例えば新規のタンパク質間結合対が同定されれば、それはすなわち、該結合を候補治療薬を同定する際の標的としてモジュレートしたり該結合に影響を及ぼしたりする可能性があることを意味している。
【０１１６】
遺伝子産物同士の相互作用または結合についてさらに研究するか、またはこれを該結合または該相互作用に影響を及ぼしうる物質をさらに同定するためのアッセイ法で利用する場合、適当な手法、例えばラジオイムノアッセイ、免疫共沈、シンチレーション近接アッセイ、ELISA法、および例えばGAL4転写因子中の2つの結合ドメインまたはLexA/VP60系を用いるツーハイブリッドアッセイ（例えばFields and Song, 1989, Nature 340; 245-246を参照されたい）を含む技術を当分野で利用することができる。
【０１１７】
サプレッサーまたは他の遺伝子中のさらなる変異を利用して、サプレッサー機能が増強されているかまたは別の形で変更されている変異体を同定してもよい。
【０１１８】
従って、野生型または変異型（最初のスクリーニングで同定される変異形態であっても、そこからさらに変異した形態であってもよい）のサプレッサー遺伝子もしくは他の遺伝子、または該遺伝子によりコードされる遺伝子産物を、治療用組成物に使用してもよい。
【０１１９】
従って、さらに様々な態様において、本発明は、目的とする疾患遺伝子もしくは目的とする疾患遺伝子の抑制に影響を及ぼすことが見出されたサプレッサー遺伝子または他の遺伝子またはその遺伝子産物または物質を含む医薬組成物、医薬品、薬剤あるいは他の組成物、かかる物質の薬物療法における使用、かかる物質を例えば病状を治療（予防的な処置を含む）するために患者へ投与することを含む方法、例えば増殖性疾患を治療するなどの目的で投与するための組成物、医薬品または薬剤の製造におけるかかる物質の使用、ならびにかかる物質を製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体、および任意で他の成分と混合することを含む医薬組成物の作製方法を提供する。
【０１２０】
本発明の薬物療法で使用する物質が何であれ、投与は好ましくは、個々人に有益な効果をもたらすのに十分な量である「予防上有効な量」または「治療上有効な量」（場合によっては、予防も治療とみなすこともある）で行う。実際の投与量および投与速度とその経時変化は、治療しようとする疾患の性質と重症度によって決まる。治療の指示、例えば投与量の決定などについては、一般開業医や他の医師がその裁量の範囲内である。
【０１２１】
本発明の医薬組成物、および本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分の他に、製薬上許容しうる賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当業者に周知の他の材料を含んでいてもよい。こうした材料としては無毒のものを使用すべきであり、また活性成分の効能を妨げるものであってはならない。担体または他の材料の正確な種類は投与経路により決定されるが、該経路は経口であっても、または例えば皮膚や皮下、もしくは静脈内への注射によるものであってもよい。  
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液状形態とすることができる。錠剤はゼラチンやアジュバントなどの固形担体を含んでいてもよい。液状の医薬組成物は一般に水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油などの液状担体を含む。生理学的食塩溶液、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含んでいてもよい。
【０１２２】
静脈内、皮膚または皮下注射、または罹患部位への注入の場合、活性成分を、発熱物質を含まずかつ適切なpH、等張性および安定性を示す、非経口的に許容しうる水溶液形態とする。当分野で関連する技能を有する者であれば、例えば生食注射、リンガー液、乳酸加リンガー液などの等張ビヒクルを用いて適切な溶液を十分に調製することができる。必要であれば、保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤および／または他の添加物を含んでいてもよい。
【０１２３】
上記技術およびプロトコルの具体例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980中に見出すことができる。
【０１２４】
ウイルスベクターなどのベクターは、多様で異なる標的細胞中に核酸を導入するために当分野で以前から使用されている。典型的には、ベクターを標的細胞に曝露して十分な割合の細胞についてトランスフェクションを行うことにより、所望のペプチドの発現に由来する有用な治療または予防効果を提供する。トランスフェクトした核酸を各標的細胞のゲノム内に永久的に組み込むことで長期持続効果を提供することができるが、そうでない場合には、この治療を定期的に繰り返さなくてはならないだろう。
【０１２５】
様々なベクター、例えばウイルスベクターおよびプラスミドベクターは共に、当分野で公知である（米国特許第5,252,479号および国際公開第93/07282号を参照されたい）。特に、数多くのウイルスが遺伝子導入ベクターとして使用されており、これにはSV40などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、HSVとEBVを含むヘルペスウイルス、およびレトロウイルスが含まれる。先行技術における遺伝子治療プロトコルの多くは、無機能化したマウス・レトロウイルスを使用している。
【０１２６】
遺伝子治療でのウイルスベクターの使用に代わる方法としては、細胞内へ核酸を導入するための他の公知の方法として、マイクロインジェクション、リポソームを介した導入および受容体介在型DNA導入、さらには単純投与による裸DNAやRNAの投与（例えばプラスミドなどの核酸の筋肉等への注入）がある。
【０１２７】
こうした手法を上手く利用した特定の疾患モデルについて記載する。これら特定の実施例は実例として提供されているのであって、本発明を限定するものではない。
【０１２８】
本明細書中のいずれかの箇所に記載された全ての文献は、参照により本発明に組み込まれるものとする。
【実施例１】
【０１２９】
パーキンソン病
人口100人につき1人がパーキンソン病を発症する。パーキンソン病多発家系のうちの0.5％は、そのα-シヌクレイン遺伝子内に病原性突然変異を含んでいる(Polymeropolous et al 1996)。それが家族性や非家族性パーキンソン病の主な危険因子と考えられている訳では無いが、パーキンソン病の発症機序に関する有用な一般モデルを提供している。野生型αシヌクレインの神経細胞内過剰発現により、新皮質、海馬および黒質における封入体の進行性の蓄積、およびこれに伴ってドーパミン作動性神経末端の喪失および運動障害が生じること(Masliah et al 2000)、またαシヌクレインは特発性パーキンソン病発症患者のレビー小体内に存在する (Spillantini et al Nature 1997)ことから、野生型αシヌクレインの蓄積はパーキンソン病の発症機序に関与している可能性があると結論付けることができる。実際、パーキンソン病、多系統萎縮症（MSA）およびレビー小体痴呆（LBD）全てを包括する用語として、シヌクレイン症という概念が広まってきている（MSAとはパーキンソン病様患者の約10％に下される診断所見であり、またレビー小体痴呆はアルツハイマー病の次に多い痴呆原因として認識されつつある）。
【０１３０】
本発明の実施形態では、変異型αシヌクレインのコード配列を眼球特異的プロモーターに連結し、得られた構築物をゼブラフィッシュのゲノム内に導入する。特定の実施例では、変異型ヒトαシヌクレインをゼブラフィッシュのath5プロモーターに連結する。この構築物をゼブラフィッシュの胚に導入し、得られた魚の視覚を調べることにより、αシヌクレインが眼球内で発現されている魚を同定する。その後、これらの魚を2次サプレッサースクリーニングに使用するために選別する。
【実施例２】
【０１３１】
ハンチントン病
ハンチントン病とは、人口100,000人当たり4〜7人が発症する不治の痴呆性疾患である。遺伝子診断を用いれば、罹患患者をその症状が現れるずっと前に特定することができるが、その治療方法は未だ存在しない。
【０１３２】
ハンチントン病は、ハンチンチン遺伝子内の拡張されたCAG反復配列と、その結果生じたタンパク質内の拡張ポリグルタミン鎖に起因する。これと同様の機構が、今日までに記載されている他のトリプレットリピート病（SCA1〜8、ケネディ病すなわちX連鎖性球脊髄性筋萎縮病およびDRPLAすなわち歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）でも認められる。全てのトリプレットリピート病の発症機序は類似していると考えられている。実際、拡張されたポリグルタミンペプチドそれ自体が細胞死と神経の変性をもたらす(Marsh et al HMG 2000 9 13-25)。このタンパク質の残りの部分が、該ポリグルタミンリピートが本来持つ毒性を変更し、特定の細胞群をより耐性または感受性にしていると考えられている(Marsh et al 2000)。 
本発明の1実施形態では、変異型のヒトまたはゼブラフィッシュ・ハンチンチン遺伝子をath5プロモーターなどのゼブラフィッシュ眼球特異的プロモーターに連結し、その後ath5-プロモーター-変異型ハンチンチン・ゼブラフィッシュ系統を作製することにより、2次サプレッサースクリーニングに使用しうるハンチントン病のゼブラフィッシュモデルを作り出す。このため、これらの魚は、ハンチントン病を軽減する遺伝子を同定するための2次サプレッサースクリーニングにおいて有用である。
【実施例３】
【０１３３】
脊髄性筋萎縮症
脊髄性筋萎縮症（SMA）は、新生児6000人につき1人の割合で発症する、嚢胞性繊維症に次いで多く見られる常染色体劣性疾患である。該疾患は脊髄における前角細胞の変性と、その後に生じる全筋肉の萎縮および脱力に起因する。筋萎縮の進行度と重症度は多岐にわたり、軽症であれば成人に達するまで生き延びることもある。残念なことに、呼吸不全による幼児期の死亡が最も多い。現在利用可能なSMAの治療方法は無く、また臨床試験においても見付かっていない。
【０１３４】
病変が前角細胞に限定されているとはいえ、その原因遺伝子SMN1、すなわち運動ニューロン生存遺伝子は体中で広範囲にわたって発現される。SMNタンパク質は、細胞質における核内低分子リボ核タンパク質（snRNP）の会合に関与することで、部分的にRNAスプライシングに関わっている(Pellizzoni et al Cell 1999 96 1167)。SMNの研究者達が直面しているパラドックスは、全ての細胞にとって必須だと思われる工程に関与するタンパク質が、何故その変異形態では前角細胞に対してのみ有害なのかということである。
【０１３５】
本発明の実施形態は、ヒトSMNをath5プロモーターなどのゼブラフィッシュ眼球特異的プロモーターに連結し、その後ath5-プロモーター-変異型SMNゼブラフィッシュ系統を作製することにより、2次サプレッサースクリーニングに使用しうるゼブラフィッシュのSMAモデルを作り出すことを含む。これらの魚は、SMAを軽減する遺伝子を同定するための2次サプレッサースクリーニングにおいて有用である。ハエにおいて野生型ヒトSMNを過剰発現させると、ドミナントネガティブな表現型でSMN表現型を示すことが知られている (Miguel-Aliaga et al FEBS Letters 2000  486  99-102)。
【実施例４】
【０１３６】
運動ニューロン疾患
運動ニューロン疾患（MND）は、運動ニューロン、前角細胞または皮質脊髄路がそのいずれかの組み合わせで徐々に消失することで全筋肉が数年かけて徐々に萎縮していき、そのうち車椅子に束縛された患者は話すことも飲み込むことも、最後には呼吸することもできなくなるという、破滅的な神経変性症である。この疾患は、人口1000人につき1人が発症する。症例のうちの10％は家族性であり、さらにその20％はCu／Znスーパーオキシドジムスターゼ（SOD-1）遺伝子(Rosen et al 1993)の変異を原因とする。フリーラジカル捕捉におけるSOD-1の役割から、興奮毒性機構がMND発症機序において重要であり得るということが示唆された。このことは、運動ニューロンの培養と非SOD-1 MND患者についての研究との両方で得られた知見により裏付けられている(例えば、Rothstein et al 1992 and 5; Aoki et al 1998; Rothstein and Kuncl 1995)。ショウジョウバエの場合、SOD-1変異によりこのハエの寿命は縮まるが、正常なヒトSOD-1の過剰発現によりこの変異表現型は救済され、また該ヒトSOD-1が運動ニューロンでのみ過剰発現された場合でも野生型ハエの寿命を延長する(Parkes et al Nat Gen 1998 19  171-4)。
【０１３７】
本発明のさらに別の実施形態は、変異型ヒトまたはゼブラフィッシュのSOD-1をath5プロモーターなどのゼブラフィッシュ眼球特異的プロモーターに連結し、その後ath5-プロモーター-変異型ハンチンチン・ゼブラフィッシュ系統を作製すること含む、2次サプレッサースクリーニングに使用しうるMNDのゼブラフィッシュモデルの作製を提供する。その後、2次サプレッサースクリーニングにこの魚を用いてMNDを軽減する遺伝子を同定してもよい。
【実施例５】
【０１３８】
多発性硬化症
この慢性的な身障状態は、人口100人につき1人が発症する。βIFNなどによる現行の免疫調節療法は、一部の患者に対してごくわずかな効果を示すのみである。さらに、かかる療法は皮下に投与する必要がある上、副作用が出ることも多い。
【０１３９】
TNFαの過剰発現は、マウスの実験モデル系でその有効性が立証されている (Probert et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(24): 11294-8)。TNFα遺伝子をath5プロモーターなどのゼブラフィッシュ眼球特異的プロモーターに連結し、その後ath5-プロモーター-TNFαゼブラフィッシュ系統を作製することにより、 2次サプレッサースクリーニングに使用しうるMSのゼブラフィッシュモデルを本発明の1実施形態として作り出すことができる。これらの魚を2次サプレッサースクリーニングに用いれば、MSを軽減する遺伝子を同定することができる。神経節細胞は、その軸索がMSに共通する病巣である視神経を生じるという点で網膜に特有であるため、このモデルはとりわけ有用である。かかるモデルでは、TNFα遺伝子が他のいずれの網膜細胞種で過剰発現されても決して機能しない。このことは、有髄組織からなる中枢神経系路を生じる神経節細胞に特有の性質があって初めて可能となる。このため、ゼブラフィッシュにおいて疾患が発症すると、視神経の脱髄が起こって盲目となり、さらに容易に評価しうるMS表現型を呈する。
【国際調査報告】
2005511052.tif 000002
2005511052.tif 000003
2005511052.tif 000004
2005511052.tif 000005