(57)【要約】ＤＨＣＰ（４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン）は大腸菌に対して抗菌活性を有することが以前に示されている。ＤＨＣＰに応答しての大腸菌の包括的転写パターンをＤＮＡマイクロアレイによって分析した。ＤＨＣＰが大腸菌において広範な効果を有し、一般代謝ならびに細胞膜の合成および機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子に影響を及ぼすことがここに示される。さらに、種々のストレスに応答するｒｐｏＳおよびＲｐｏＳに調節される遺伝子がアップレギュレートされる。ＤＨＣＰはまた、種間クオラムセンシングに関与するオートインデューサーであるＡＩ−２を阻害すること示され、クオラム調節されるプロセス（例えば、ビルレンス、運動性および外膜機能）を構成する遺伝子はＤＨＣＰ処理によってダウンレギュレートされる。さらに、大腸菌中の別経路において作用する既知のクオラムセンシング遺伝子であるｃｙｓＫは、ＤＨＣＰに応答してかなり増加する。これらの結果は、ＤＨＣＰが大腸菌中の異なるクオラムセンシング回路のスイッチのオン／オフを調節することを示唆する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する微生物中で遺伝子を調節する方法：
遺伝子を調節しようとする微生物を４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）と接触させる工程；および
微生物中で遺伝子を調節する工程、ここで遺伝子は、リボソームタンパク質をコードする遺伝子、ストレスに応答する遺伝子、膜合成および膜機能に関与する遺伝子、一般代謝に関与する遺伝子、多様な機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、および未知の機能のタンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択される。
【請求項２】
遺伝子が表１〜７に列挙する遺伝子およびそれらのホモログからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子がクオラムセンシングプロセスに関与する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
遺伝子が種間オートインデューサーＡＩ−２の活性の阻害の結果として調節される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
遺伝子がクオラムセンシング回路のスイッチのオン／オフの結果として調節される、請求項３記載の方法。
【請求項６】
ＤＨＣＰを有効成分として含有する、請求項１記載の方法による微生物中での遺伝子調節用組成物。
【請求項７】
請求項１記載の方法による微生物中での遺伝子調節用組成物の製造におけるＤＨＣＰの使用。
【請求項８】
以下の工程を包含する生理活性物質のスクリーニング方法：
（ａ）候補物質の存在下および非存在下で微生物をインキュベートする工程；
（ｂ）候補物質の存在下および非存在下での微生物中での遺伝子の発現レベルを決定する工程、ここで遺伝子はその発現レベルがＤＨＣＰによる影響を受ける遺伝子である；
（ｃ）候補物質の存在下での発現レベルが、候補物質の非存在下での発現レベルに比較して有意に増強または低下される場合に、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに有意に影響を及ぼす生理活性物質として候補物質を同定する工程。
【請求項９】
遺伝子が表１〜７に列挙する遺伝子およびそれらのホモログからなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子の発現レベルが、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量に基づいて決定される、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子の発現レベルが、ＤＮＡマイクロアレイを使用したハイブリダイゼーションによって決定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項８記載の方法によって得られる生理活性物質。
【請求項１３】
以下の工程を包含する微生物中での組換えポリペプチドの生産を増強する方法：
（ｉ）ＤＨＣＰの存在下で微生物を培養して、組換えポリペプチドの発現および生産を増強する工程；および
（ｉｉ）培養物から生産された組換えポリペプチドを回収する工程。
【請求項１４】
ＤＨＣＰを有効成分として使用する、種間クオラムセンシングインデューサーの活性の阻害方法。
【請求項１５】
インデューサーがＡＩ−２である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＤＨＣＰを含有する、クオラムセンシング調節用組成物。
【請求項１７】
ｃｙｓＫの発現を調節する、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
ＤＨＣＰを含有する、クオラムセンシング回路のスイッチのオン／オフ用組成物。
【請求項１９】
ＤＨＣＰを含有する、種間クオラムセンシングインデューサーの活性阻害用組成物。
【請求項２０】
インデューサーがオートインデューサーＡＩ−２である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
ＤＨＣＰを含有する、ストレスに応答する遺伝子の発現調節用組成物。
【請求項２２】
ＤＨＣＰを含有する、クオラムセンシングの調節遺伝子の発現調節用組成物。
【請求項２３】
ＤＨＣＰを含有する、表１〜７に列挙する遺伝子からなる群より選択される遺伝子の発現調節用組成物。
【請求項２４】
ＤＨＣＰを含有する、組換えタンパク質の分泌促進用組成物。
【請求項２５】
ＤＨＣＰを含有する、ホメオスタシス維持用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細菌における遺伝子発現およびクオラムセンシング（quorum-sensing）の調節。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの抗生物質が種々の細菌に対して利用可能である；しかし、近年、多剤耐性細菌の出現が主要な懸念となっている。このことは、より新しくより有効な抗菌性化合物の探索への動機付けとなっている。以前に、本発明者らの研究室は、種々のグラム陰性およびグラム陽性細菌（例えば、大腸菌（E. coli）、サルモネラ（Salmonella）、バチルス（Bacillus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）など）に対する抗菌活性を有する１つのそのような化合物４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）を報告した。ＤＨＣＰは、ウロン酸またはその誘導体の加熱処理によって調製される（Koyama et al., 1999）。ＤＨＣＰは、煎った、または焙った野菜、果物、穀物、キノコ、海藻、皮質または軟骨からも生産される。ＤＨＣＰは、ガンに対する治療または予防剤、さらに防腐剤、歯磨き、化粧品および入浴剤における抗菌剤としての潜在的適用を有することが示されている（Koyama et al., 1999）。ＤＨＣＰが微生物によっても合成される可能性がある。Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）をＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の生合成においてメチル供与体として使用すると、いくつかのＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼがメチル基をＳＡＭからその基質に転移させ、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）を生成し、次いでこれは酵素Ｐｆｓを介して分解されて、Ｓ−リボシルホモシステイン（ＳＲＨ）が生成される。最後にこれはホモシステインおよび４，５−ジヒドロキシ−２，３−ペンタンジオンに変換される（Miller et al., 1968およびSchauder et al., 2001）。構造に基づくと、ＤＨＣＰが後者から形成される可能性がある。
【０００３】
ＤＨＣＰの毒性に対するマルチコピーサプレッサーが大腸菌ゲノムライブラリーから単離された。このサプレッサーをコードする遺伝子はｄｅｐと称し、この遺伝子によってコードされる推定のタンパク質はＤｅｐと称する。Ｄｅｐタンパク質は、クロラムフェニコール、ビシクロマイシンおよびテトラサイクリンを含むいくつかの抗生物質に対する耐性を与える既知の排出（efflux）タンパク質に対する高い相同性を示した。しかし、これは試験したいずれの抗生物質に対しても交差耐性を与えなかった（Phadtare et al., 2001）。ＤＨＣＰの正確な作用機構は知られていない。
【０００４】
近年、ＤＨＣＰは大腸菌におけるクオラムセンシングに関する研究においても重要となっている（Schauder et al., 2001）。多くの細菌は、増殖期に関連して低分子量シグナリングフェロモンを分泌することによって特定の遺伝子の発現を制御する能力を有している。このプロセスはクオラムセンシングと称する。クオラムセンシングによって制御される生理学的プロセスは、多様な種の細菌において生じ、生物発光、抗生物質合成、病原性、タンパク質分泌、莢膜エキソポリサッカライド合成、バイオフィルム形成および運動性を含む（概説についてはMiller et al., 2001; Schauder et al., 2001およびWhitehead et al., 2001を参照のこと）。細胞密度の制御がその顕著な特徴の１つであり、そのような応答を生じる多くの化合物が抗菌活性を有するので、クオラムセンシングの研究は特に重要である。グラム陰性生物発光海洋細菌であるビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）は、２つの異なるオートインデューサーＡＩ−１およびＡＩ−２に応答して光生成を調節する。ＡＩ−１はホモセリンラクトンであり、種内情報伝達に使用される。ＡＩ−２は種間情報伝達に使用され、その構造は知られていない。ＡＩ−２はＳＡＭから生成され、生合成経路およびその生合成における生化学的中間体は大腸菌、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）、Ｖ．ハーベイ、Ｖ．コレレ（V. cholerae）およびエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）において同一である。いくつかの化合物がＡＩ−２の候補としてスクリーニングされ、ＤＨＣＰはその１つであった。しかし、ＤＨＣＰはスクリーニングアッセイにおいて活性を示さず、従ってＡＩ−２の可能な候補としては除外された（Schauder et al., 2001）。
【０００５】
本明細書におけるいずれもの文献の引用は、本願のいずれの請求項の特許性に対しても、その文献が関連する先行技術であるかまたは重要であると考慮されるとの認定として意図されるものではない。いずれもの文献の内容または日付に関する記載は、出願時に出願人に利用可能な情報に基づいており、その記載の正確さに関する認定を構成するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細菌における遺伝子発現およびクオラムセンシングの調節を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、遺伝子を調節しようとする微生物を４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）と接触させ、それによって微生物中で遺伝子を調節することによる微生物中で遺伝子を調節する方法を提供する。調節しようとする遺伝子は、ストレスに応答する遺伝子、膜合成および膜機能に関与する遺伝子、多様な機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、および未知の機能のタンパク質をコードする遺伝子を包含する。そのような調節しようとする遺伝子の非限定的な例としては、下記表１〜７に列挙する遺伝子およびそれらのホモログが挙げられる。好ましくは、遺伝子は、例えばクオラムセンシング回路のスイッチのオン／オフまたは種間オートインデューサーＡＩ−２の活性の結果として、クオラムセンシングプロセスに関与する。
【０００８】
また、本発明は、その発現レベルがＤＨＣＰによる影響も受ける遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす生理活性物質のスクリーニング方法、およびこの方法によって得られる生理活性物質を提供する。この方法は、候補物質の存在下および非存在下で微生物をインキュベートする工程、および次いで候補物質の存在下および非存在下での微生物中での遺伝子の発現レベルを決定する工程（ここで遺伝子はその発現レベルがＤＨＣＰによる影響を受ける遺伝子である）を包含する。候補物質は、候補物質の存在下での発現レベルが、候補物質の非存在下での発現レベルに比較して有意に増強または低下される場合に、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに有意に影響を及ぼす生理活性物質として同定される。このスクリーニング方法において使用する遺伝子の非限定的な例としては、下記表１〜７に列挙する遺伝子およびそれらのホモログが挙げられる。好ましい実施態様として、遺伝子の発現レベルは、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量に基づいて、またはＤＮＡマイクロアレイを使用したハイブリダイゼーションによって決定される。
【０００９】
本発明の別の局面は、ＤＨＣＰの存在下で微生物を培養して、組換えポリペプチドの発現および生産を増強する工程、および次いで培養物から生産された組換えポリペプチドを回収する工程を包含する微生物中での組換えポリペプチドの生産を増強する方法に関する。
【００１０】
本発明のさらなる局面は、ＤＨＣＰを有効成分として使用する、種間クオラムセンシングインデューサー（例えば、インデューサーＡＩ−２）の活性の阻害方法に関する。
【００１１】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法による微生物中での遺伝子調節用組成物の製造におけるＤＨＣＰの使用、およびＤＨＣＰを有効成分として含有する、微生物中での遺伝子調節用；クオラムセンシング（例えば、ｃｙｓＫの発現）調節用；クオラムセンシング回路のスイッチのオン／オフ用；種間クオラムセンシングインデューサー（例えば、ＡＩ−２）の活性阻害用；ストレスに応答する遺伝子の発現調節用；クオラムセンシングの調節遺伝子の発現調節用；組換えタンパク質の分泌促進用；表１〜７に列挙する遺伝子から選択される遺伝子の発現調節用；またはホメオスタシス維持用組成物に関する。
【発明の効果】
【００１２】
細菌における遺伝子発現およびクオラムセンシングの調節が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は以下の実施例を参照してより容易に理解される。実施例は例示のために提供するのであって、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例１】
【００１４】
本発明者らは、ＤＨＣＰに応答しての大腸菌の包括的転写パターンをＤＮＡマイクロアレイによって分析して、（ｉ）ＤＨＣＰの抗菌活性の発現を調べ、（ｉｉ）ＤＨＣＰが大腸菌のクオラムセンシング経路に関与する可能性を調べた。本発明者らによって得られた結果は、（ｉ）ＤＨＣＰが大腸菌において広範な効果を有し、一般代謝ならびに膜の合成および機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子に影響を及ぼすこと、および（ｉｉ）クオラム調節されるプロセス（例えば、ビルレンス、運動性および外膜機能）を構成する遺伝子はＤＨＣＰ処理の影響を受けることを示した。ｓａｐＦ（Lopez-Solanilla et al., 1998）、ｐｏｔＡおよびｐｏｔＢ（DeLisa et al., 2001）のようなビルレンスに関連する遺伝子の発現レベルはＤＨＣＰで処理した細胞において減少した。大腸菌のｓａｐＦ遺伝子はＶ．フィシェリ（V. fischeri）のｓａｐＦに相同であり、後者はＬｕｘＲ−ＡＩ複合体によって増強されることが示されており、ｓａｐＦはＶ．フィシェリの生物発光において役割を果たしていることが示唆された（Chen et al., 2000）。さらに、大腸菌中の別経路において作用する既知のクオラムセンシング遺伝子であるｃｙｓＫは（Baca-DeLancey et al., 1999）、ＤＨＣＰに応答してかなり増加する。本実施例に示す結果は、ＤＨＣＰが大腸菌中の異なるクオラムセンシング回路のスイッチのオン／オフを調節することを示唆する。
【００１５】
材料および方法
細菌株
大腸菌野生株ＪＭ８３［Ｆ−ａｒａΔ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｒｐｓＬ（ｓｔｒｒ）］（Yanisch-Perron et al., 1985）をルリア・ブロス（ＬＢ）中で増殖させた。Ｖ．ハーベイＢＢ１５２およびＢＢ１７０株はＢｏｎｎｉｅ  Ｂａｓｓｌｅｒ博士（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）より提供を受けた。これらの株を以前に記載のようにＡＢ培地中で増殖させた（Surette et al., 1999）。
【００１６】
ＲＮＡ単離
ＬＢ培地中で一晩増殖させた大腸菌細胞を新たなＬＢ培地中に希釈した。増殖がクレット単位（Klett unit）５０に達した後、ＤＨＣＰを添加し（２５０μＭ）、増殖をさらにモニターした。増殖がクレット単位９０〜１００に達した後、以前に記載のように同じ濃度のＤＨＣＰを含有する培地中に１０倍希釈した（Phadtare et al., 2001）。合計８時間のＤＨＣＰとのインキュベーションの後に細胞を採集した。コントロール細胞を同様にＤＨＣＰなしで増殖させ、ＤＨＣＰ処理細胞の最終ＯＤ６００に匹敵するＯＤ６００で採集した。全ＲＮＡを以前に記載のホットフェノール法によって抽出した（Sarmientos et al., 1983）。これをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によってさらに精製し、次いでＤＮａｓｅＩで処理し、続いてフェノールクロロホルム処理およびエタノール沈殿を行った。これを２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。ＲＮＡの純度をアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【００１７】
ＤＮＡマイクロアレイ分析
ｍＲＮＡをＣｙ３−ｄＵＴＰおよびＣｙ５−ｄＵＴＰ（Amersham Pharmacia）で標識した。Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒ  ｐｄ（Ｎ）６（Amersham Pharmacia）をプライマーとして使用し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＨＩＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １（Takara Shuzo, Co. Ltd., Japan）ＤＮＡマイクロアレイを使用した。これは大腸菌Ｋ−１２  Ｗ３１１０の全ＯＲＦに対応する。
【００１８】
プライマー伸長
それぞれのｍＲＮＡの検出に使用したプライマーは以下のとおりである：プライマー７５００７７、５’−ＴＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＴＴＣＧＡＡＡＴ−３’（配列番号１）（これはｏｓｍＹの１５番目から８番目のコドンの配列に対応する（Yim et al., 1992））；プライマー７５００７８、５’−ＡＴＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＴＧＡ−３’（配列番号２）（これはｄｐｓの１６番目から９番目のコドンの配列に対応する（Altuvia et al., 1994））；プライマー９７９７４７、５’−ＣＡＧＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＴＣＡＴＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号３）（これはｒｐｏＳの６番目のコドンからの領域に対応する（Takayanagi et al., 1994））；プライマー９５６６６０、５’−ＡＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＴＣ−３’（配列番号４）（これはｋａｔＧの１３番目から６番目のコドンの領域に対応する（Triggs-Raine et al., 1998））；プライマー３９６９８０５、５’−ＣＡＧＧＣＧＡＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号５）（これはｃｙｓＫの２０番目から１３番目のコドンの領域に対応する（Byrne et al., 1988））；プライマー３９６９８０６、５’−ＧＴＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＣＡＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号６）（これはｔｅｈＡの１３番目から６番目のコドンの領域に対応する（Walter et al., 1991））；プライマー３９６９８０７、５’ＧＡＴＴＡＡＴＡＴＣＡＧＡＣＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧ−３’（配列番号７）（これはｚｉｐＡの１０番目から３番目のコドンの領域に対応する（Hale et al., 1997））；およびプライマー７０１８、５’−ＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡ−３’（配列番号８）（これはｏｍｐＦの１番目のコドンからを包含する領域を含む（登録番号Ｊ０１６５５、Ｍ１０３１１およびＭ１０３１２））。プライマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Gibco BRL）を使用することによって［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Du-Pont-New England Nuclear）で標識した。プライマー伸長を５μｇのＲＮＡを用いて４２℃で１時間最終反応容量１０μｌで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール、３２Ｐ標識プライマー０．４ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各０．５ｍＭ、ＲＮａｓｅインヒビター（Boehringer Mannheim）１０Ｕおよび逆転写酵素（Boehringer Mannheim）６．２５Ｕを用いて実施した。産物を変性条件下６％ポリアクリルアミドゲルで分析した。プライマー伸長産物の定量は直接放射能測定によって実施した。
【００１９】
ＡＩ−２アッセイ
Ｖ．ハーベイレポーター株（ＢＢ１７０）を使用するＡＩ−２アッセイをSurette and Basslerによって記載されたように実施した（Surette et al., 1999）。Ｖ．ハーベイＢＢ１５２株由来の無細胞培養液をポジティブコントロールとして使用した。無菌ＡＢ培地をネガティブコントロールとして使用した。簡潔に記載すると、Ｖ．ハーベイＢＢ１７０株を一晩通気しながら３０℃でＡＢ培地中で増殖させ、次いで細胞を新たな培地で１：５０００希釈した。希釈した培養物（９０μｌ）を、１０μｌのＡＢ培地またはＶ．ハーベイＢＢ１５２／ＤＨＣＰ（１００−２５０μＭ）の無細胞培養液を含有するアッセイ混合物に添加した。ＡＩ−２による光生成に対するＤＨＣＰの効果を確認するために、最大発光に達した後にこれを反応混合物に添加した。光生成を液体シンチレーションカウンターを用いてモニターした。
【００２０】
結果
以前、本発明者らの研究室は、大腸菌ＪＭ８３の増殖がＤＨＣＰ（２５０μＭ）の存在下で３時間のインキュベーションの後に激しく損なわれ、細胞が５時間後に増殖を停止したことを示した（Phadtare et al., 2001）。本研究の主な目的は、ＤＨＣＰ処理によって引き起こされるｍＲＮＡ量の有意な増減を示す大腸菌ＯＲＦを全て同定することであった。使用したコントロール（未処理）およびＤＨＣＰ処理細胞の細胞密度は同じであった；従って、マイクロアレイにおいて見られた変化は細胞密度の差異によっては実質的に影響されなかった。それぞれの細胞から単離したＲＮＡを使用して、ＤＮＡアレイのハイブリダイゼーション用のプローブを生成させ、本実施例の材料および方法に記載のようにしてデータを定量化した。対応するスポットのｌｏｇ表現比率の算出によって、２つの増殖条件下での大腸菌遺伝子の各々についての相対的転写物レベルの対での比較が可能となった。その発現レベルがｌｏｇ比率で少なくとも４異なる遺伝子のみを考慮した。いくつかの場合で、同じオペロンまたはカテゴリーに属する遺伝子を、ｌｏｇ比率が３または３より少し少ない係数のみで異なった場合でも考慮した。値０より高いｌｏｇ比率は誘導を示し、値０より低いｌｏｇ比率はＤＨＣＰ処理による抑制を示す。ＤＮＡマイクロアレイ分析によって見られた結果を、有意に影響を受けた遺伝子のいくつかに対応するオリゴヌクレオチドを使用したプライマー伸長によって確認した。結果を図１に示し、表１にまとめる。両方の方法の結果は互いに一致する。
【００２１】
【表１】
2005519616.tif 000002
【００２２】
本発明者らの研究室は、多数の応答遺伝子が以下の広範な機能的カテゴリーを構成することを観察した：（ｉ）リボソームタンパク質をコードする遺伝子、（ｉｉ）ストレス応答の包括的レギュレーターＲｐｏＳおよびＲｐｏＳに調節されるタンパク質をコードする遺伝子、（ｉｉｉ）膜の合成および機能（例えば、輸送）に関与する遺伝子、（ｉｖ）一般代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子、（ｖ）種々の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、ならびに（ｖｉ）仮定のタンパク質および未知の機能またはクラスのタンパク質をコードする遺伝子。
【００２３】
リボソームタンパク質をコードする遺伝子はＤＨＣＰ処理の影響を受ける
本実験に選択したＤＨＣＰの濃度によって増殖が激しく損なわれたので、増殖阻害自体に起因する有意な二次的効果が予想され、これは必ずしもＤＨＣＰの作用部位を反映しない。より遅い増殖速度の発現の１つは、細胞の翻訳機構が影響を受けていることであり、これはリボソームタンパク質のより低いレベルによって明らかとなる。表２からわかるように、リボソームＬタンパク質をコードする遺伝子の大部分はレベルの低下を示したが、大部分の場合において効果は激しくはない（２〜３倍）。
【００２４】
【表２】
2005519616.tif 000003
【００２５】
膜関連機能に対するＤＨＣＰの効果
次に、異なるクラスの遺伝子に対するＤＨＣＰの効果を検討した。表３からわかるように、細胞膜に関連するタンパク質をコードする４０個の遺伝子が有意に影響を受けた。優勢に、細胞輸送系、特に鉄（ｆｅｃＡ、ｆｅｃＢ、ｆｅｃＣ、ｆｅｃＤ、ｆｅｐＡおよびｆｅｐＣ）ならびにスペルミジン／プトレッシン（ｐｏｔＡ、ｐｏｔＢ、ｐｏｔＣおよびｐｏｔＤ）の輸送に関与するものが影響を受けた。外膜タンパク質（Ｏｍｐ）をコードする遺伝子も減少した（５〜１５倍）。モーター作用に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ｍｏｔＡ、ｍｏｔＢおよびｃｈｅＡ）は４〜６倍減少した。興味深いことに、亜鉛輸送ＡＴＰａｓｅをコードするａｔｚＮは１１倍増加した。最も顕著な差異（４７倍増加）はＣｒｅＤをコードするｃｒｅＤの場合に見られた。ＣｒｅＤの正確な機能は知られていないので（Avison et al., 2001）、この観察の生理学的意義を判断することは困難である。１つの興味深い点は、ｃｒｅＤが、ｃｒｅレギュロンの第１のメンバーであり、推定の包括的レギュレーターであるＣｒｅＢＣによって調節されていることである（Avision et al., 2001）。ＣｒｅＢＣによって調節される別の遺伝子はｔａｌＡであり（Avision et al., 2001）、これもまた本研究において７．６倍増加した（表６）。ｔａｌＡはグリセルアルデヒド−３−リン酸のペントースリン酸経路への動員に関与する酵素をコードする。その産物にいかなる機能も割り当てられていないｙｉｄＳおよびｙｉｅＩなどの他のＣｒｅＢＣに調節される遺伝子もまた４倍増加した（表７）。しかし、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｒａｄＣ、ｍａｌＥおよびｔｒｇＢなどのＣｒｅＢＣによって調節されることが知られているその他の遺伝子はＤＨＣＰによって誘導されなかった。事実、ａｃｋＡは３．６倍減少した（表５）。いくつかのさらなる因子がこれらの遺伝子の発現調節に関与しているかもしれない。
【００２６】
亜テルル酸塩に対する耐性を与えるタンパク質をコードするｔｅｈＡのレベルの５倍の増加は意義深いと思われる。亜テルル酸塩はいくつかのグラム陰性細菌において毒性を引き起こし、この毒性の正確な機構は知られていないが、それが酸化ストレスを引き起こし、種々のタンパク質において硫黄に取って代わり得、それらを非機能性にすることが示されている（Garberg et al., 1999およびSummers et al., 1977）。ｔｅｈＡの過剰発現はまた、多剤耐性ポンプによって推論されるのと同様に、テトラフェニルアルソニウムＣＩ、臭化エチジウム、クリスタルバイオレットおよびプロフラビンなどの化合物に対する耐性を与える（Turner et al., 1997）。
【００２７】
【表３】
2005519616.tif 000004
【００２８】
ＤＨＣＰはＲｐｏＳおよびＲｐｏＳによって調節されるタンパク質を誘導する
ＲｐｏＳは包括的ストレス応答レギュレーターであり、大腸菌中のクオラムセンシングに関与することも知られている（Hengge-Aronis, 2000およびSitnikov et al., 1996）。次に、ｒｐｏＳレベルに対するＤＨＣＰの効果を検討し、ｒｐｏＳがＤＨＣＰでの処理後に４倍誘導されることを見出した。酸化および浸透圧ストレスによって誘導されるタンパク質Ｄｐｓをコードする遺伝子ｄｐｓ（Altuvia et al., 1994およびMartinez et al., 1997）は１３倍誘導された（表４）。それぞれＲｐｏＳに調節されるストレスタンパク質ＯｓｍＹおよびＫａｔＧをコードするｏｓｍＹおよびｋａｔＧなどの他の遺伝子（Hengge-Aronis, 2000およびYim et al., 1994）もまた有意に誘導された。興味深いことに、ストレス応答に関与しないその他のＲｐｏＳに調節されるタンパク質のいくつかをコードする遺伝子もまた、おそらくより高レベルのＲｐｏＳ自体の発現として、誘導された。その例としては、ｈｄｅＢ、ｏｔｓＡ、ｐｏｘＢおよびｗｒｂＡが挙げられる（表４）。
【００２９】
【表４】
2005519616.tif 000005
【００３０】
一般代謝に関与する遺伝子に対するＤＨＣＰの効果
いかにしてＤＨＣＰ処理が細胞の一般代謝に影響を及ぼすかを次に検討した。膜に対する効果と同様に、ＤＨＣＰ処理は細胞の一般代謝に関与するいくつかのプロセスに影響を及ぼし、これらのいくつかはおそらく処理の二次的効果であった。４４個の遺伝子が、ＤＨＣＰ処理後に有意に異なる発現レベルを示した（表５）。最も顕著な遺伝子は、システイン合成に関与するタンパク質をコードするものであった。顕著な増加が、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＤ、ｃｙｓＨ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＮ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＱ、ｃｙｓＵ、およびｃｙｓＷなどのＣｙｓの合成に関与するレギュロンに属する遺伝子において観察された（３〜２０倍）。これらの中で、ｃｙｓＫが２０倍の最大増加を示した。興味深いことに、このレギュロンに属しないｃｙｓＧおよびｃｙｓＳはＤＨＣＰ処理による影響を受けなかった。ＤＨＣＰ処理によって誘導された他のオペロンに属する遺伝子は、それぞれガラクトースおよびモリブデン代謝に関与するｇａｌオペロンおよびｍｏａオペロンに属するものであった。一方、Ｅｎｔオペロンに属する遺伝子は減少した。ｆｒｕ（ｆｒｕＢおよびｆｒｕＫ）系もまた激しく阻害された（それぞれ８倍および３３倍）。
【００３１】
【表５】
2005519616.tif 000006
【００３２】
ＤＨＣＰは多様な機能を有するいくつかのタンパク質に影響を及ぼす
表６は、ＤＨＣＰ処理後に有意なレベルの誘導または阻害を示す３５個の遺伝子を列挙する。興味深いことに、ｔｅｈＡと同様に（表３）、亜テルル酸塩耐性に関与するＴｅｈＢをコードするｔｅｈＢが５倍誘導された。酸化ストレスに応答する、それぞれアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼ、バクテリオフェリチンおよびＳｏｘＳタンパク質をコードするａｈｐＦ、ｂｆｒおよびｓｏｘＳ（Agnez-Lima et al., 2001; Cha et al., 1995およびChen et al., 1999）もまた約４倍誘導された。ＭｄａＢ（薬物活性モジュレーター）をコードする遺伝子（ｍｄａＢ）もまた１０倍誘導された。ＭｄａＢの過剰産生は２つのトポイソメラーゼインヒビター、アドリアマイシンおよびエトポシドに対する耐性を損ない、おそらくトポイソメラーゼＩＶ活性を調節することによって作用する（Chatterjee et al., 1995）。しかし、本研究において、トポイソメラーゼＩＶの２つのサブユニットをコードする遺伝子ｐａｒＣおよびｐａｒＥのレベルはＤＨＣＰ処理に際して変化しなかった。多抗生物質耐性タンパク質ＭａｒＡをコードする遺伝子ｍａｒＡもまた５倍誘導された。グルタレドキシンタンパク質をコードする遺伝子ｎｒｄＨおよびｎｄｒＩもまたＤＨＣＰによって有意に誘導された。興味深いことに、ｓａｐ（抗菌性ペプチドに対する感受性（sensitivity to antimicrobial peptides））オペロン遺伝子などのビルレンスに関与する遺伝子がＤＨＣＰ処理によって阻害された。
【００３３】
表７は、いかなる機能も割り当てられていないタンパク質をコードする、ＤＨＣＰに応答する遺伝子を列挙する。
【００３４】
【表６】
2005519616.tif 000007
【００３５】
【表７】
2005519616.tif 000008
【００３６】
ＤＨＣＰはＡＩ−２の活性を阻害する
本研究において、Suretter and Basslerによって設計されたＡＩ−２アッセイ（Surette et al., 1999）を使用した。Ｖ．ハーベイＢＢ１７０レポーター株はクオラムセンシング表現型センサー１−、センサー２＋を有する。これはｌｕｘ発現をシグナリングシステム２ディテクターを介して誘導する。Ｖ．ハーベイＢＢ１５２株から調製した無細胞培養液（システム２オートインデューサーを含有する）１０％を添加すると、レポーター株において発光発現が刺激される。ＤＨＣＰは種間クオラムセンシングに関与するオートインデューサーＡＩ−２の候補と考えられていたが、ＤＨＣＰがこの活性を有しないことが報告された（Schauder et al., 2001）。本発明者らの研究室は、ＤＨＣＰがＡＩ−２の活性を阻害するかどうかを検討した。図２Ａからわかるように、以前の報告と一致して（Schauder et al., 2001）、Ｖ．ハーベイＢＢ１５２株から単離したＡＩ−２は発光を示したが（レーン２）、ＤＨＣＰはＡＩ−２活性を示さなかった（レーン３）。無菌ＡＢ培地をネガティブコントロールとして使用した（レーン１）。ＤＨＣＰ（２５０μＭ、ＤＮＡマイクロアレイ分析に使用したのと同じ濃度）をアッセイに添加し、その直後にＡＩ−２含有無細胞抽出物を添加した場合、ＡＩ−２活性は完全に阻害された（レーン４）。ＡＩ−２が約１０μＭの濃度で最大発光を生じることが報告されている（Schauder et al., 2001）。本アッセイにおいて使用したＤＨＣＰ濃度はＡＩ−２濃度を上回っていたことに留意すべきである。最大発光がＡＩ−２によって生じた後にＤＨＣＰを添加した場合にＤＨＣＰがＡＩ−２活性を阻害できるかどうかも試験した。図２Ｂからわかるように、ＤＨＣＰを２５０μＭの濃度で添加した場合（黒丸）、ＡＩ−２活性は８分以内に０に減少した。１００μＭの濃度で添加した場合（白四角）、ＡＩ−２活性は４０分後に０に減少した。ＤＨＣＰ添加なしの対応するコントロール活性は（白三角）、完全に安定であった。本発明者らは、ＤＨＣＰが効率的にＡＩ−２の活性を阻害すると結論付けた。
【００３７】
考察
ＤＨＣＰで処理した大腸菌細胞のＤＮＡアレイ分析の結果は、２つの見地から興味深い：データはＤＨＣＰが広範な影響を引き起こし、大腸菌の複雑なクオラムセンシングネットワークに関与することを示す。
【００３８】
ＤＨＣＰの抗菌活性
本研究は、ＤＨＣＰが大腸菌において包括的な効果を有し、一般代謝ならびに膜の合成および機能に関与するタンパク質をコードする多数の遺伝子に影響を及ぼすことを示す。興味深いことに、酸化および浸透圧ストレスに応答するいくつかの遺伝子がアップレギュレートされた。さらに、亜テルル酸塩に対する耐性を与えるｔｅｈＡ、ｔｅｈＢおよびｃｙｓＫが有意にアップレギュレートされた。亜テルル酸塩に対する耐性の機序およびその毒性の機構は研究者にとって大いに興味深いものではあるが完全には理解されていない。以下のことが示されている：（ｉ）ｃｙｓＫは大腸菌において亜テルル酸塩耐性を媒介する；（ｉｉ）ＴｅｈＡおよびＴｅｈＢは亜テルル酸塩に対する耐性を与える；これらのタンパク質中のＣｙｓ残基は亜テルル酸塩への結合に関与し、ＴｅｈＢは亜テルル酸塩への結合のためにＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）を必要とする。これは亜テルル酸塩に対する耐性の媒介においてこれらの化合物の両方に結合することができる二量体であり、（ｉｉｉ）亜テルル酸塩は酸化ストレスを生じ、種々のタンパク質において硫黄に取って代わり得、それらを非機能性にする（Syllick-Brenzinger et al., 2000; Garberg et al., 1999; Summers et al., 1977およびVasquez et al., 2001）。本研究において、ｃｙｓＫ、ｔｅｈＡおよびｔｅｈＢに加えて、酸化ストレスに応答するＡｈｐＦ、Ｄｐｓ、ＫａｔＧ、ＳｏｘＳおよびＢｆｒなどのタンパク質をコードする遺伝子がアップレギュレートされた。このことは、ＤＨＣＰが細胞内でストレスを生じ得ることを示唆し、その発現は、本研究において観察されたいくつかの二次的効果において明らかである。
【００３９】
ＤＨＣＰのクオラムセンシングへの関与
グラム陰性細菌において、クオラムセンシングには代表的に、その合成が「ＬｕｘＩ」オートインデューサーシンターゼおよび同族「ＬｕｘＲ」オートインデューサー結合／転写アクチベータタンパク質に依存する、アシル化ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）オートインデューサーが関与する。ＬｕｘＲタンパク質によるＨＳＬインデューサーの結合の結果、特異的標的遺伝子の転写活性化が生じる。生物発光に関与するＬｕｘＩ−ＬｕｘＲシグナリングカスケードはＶ．フィシェリにおいて最初に同定された（Hastings et al., 1977およびNealson et al., 1979）。この海洋グラム陰性細菌は、このクオラムセンシング回路でルシフェラーゼの発現を調節する。一方、Ｖ．ハーベイにおいては、それぞれ種内および種間情報伝達のための２つのオートインデューサーＡＩ−１およびＡＩ−２が同定された（概説については、Schauder et al., 2001を参照のこと）。ＡＩ−２はホモセリンラクトンであり、ＡＩ−２の正確な構造は知られていない。近年、ＡＩ−２がおそらくフラノシルボレートジエステルであることが提唱されている（Chen et al., 2002）。Shauder et alはＤＨＣＰのクオラムセンシング活性を検討し、それがＡＩ−２機能を有しないことを見出した（Schauder et al., 2001）。興味深いことに、本研究において、ＤＨＣＰが事実ＡＩ−２の活性を阻害することが示されている。さらに、ＤＨＣＰはＡＩ−２の合成に関与する生合成経路によって生成されるかもしれない。このことは、ＤＨＣＰがＡＩ−２機能の調節に関与し、それで大腸菌におけるＡＩ−２に基づくクオラムセンシングを調節するかもしれないという魅力的な可能性をもたらす。
【００４０】
近年、ＡＩ−２に応答しての大腸菌の包括的転写パターンのＤＮＡマイクロアレイ分析が研究された（DeLisa et al., 2001）。いくつかの観察は以下を含む：（ｉ）ＭｏｔＡおよびＭｏｔＢのような運動性に関与するタンパク質をコードする遺伝子が３倍増加し、（ｉｉ）スペルミジン／プトレッシン輸送に関与するタンパク質をコードするｐｏｔＡＢＣＤ遺伝子が３〜５倍増加した。これらのタンパク質はビルレンスに関与することが知られている植物中のａｔｔオペロンによってコードされるタンパク質に対する相同性を示し（Matthysse et al., 1996）、（ｉｉｉ）ＯｍｐＡおよびＯｍｐＦをコードする遺伝子がそれぞれ３．２倍および５．１倍増加した。ＯｍｐＡはおそらくパスツレラ・ヘモリティカ（Pasturella haemolytica）のビルレンスに関与しており（Mahasreshti et al., 1997）、（ｉｖ）ｃｙｓＫおよびｒｐｏＳがそれぞれ３倍および１．２倍増加した。興味深いことに、ＤＨＣＰ処理では、ｃｙｓＫおよびｒｐｏＳに対して以外で逆の効果が見られた（表４および５）。これは、レポーターアッセイにおいてＤＨＣＰがＡＩ−２活性を阻害したという事実と一致する。ｃｙｓＫが大腸菌中のクオラムセンシング別経路においてＡＩ−２に類似しないシグナルによって誘導されることも示されている。ＡＩ−２とは異なり、このシグナルは大腸菌ＤＨ５α株によってグルコースに依存せず定常期に産生される（Baca-DeLancey et al., 1999）。しかし、ａｓｔＤ、ｔｎａＢおよびｇａｂＴのようなおそらくこのシグナルによって誘導される遺伝子はＤＨＣＰによって誘導されなかった。インドールがシグナルとして作用し、ｃｙｓＫは誘導するがｇａｂＴは誘導しないことも示された。このことは、異なるクオラムセンシング経路の関与を示唆する（Wang et al., 2001）。本発明の結果はこれに類似しているかもしれない。ＡＩ−２の影響を受けた遺伝子のいくつかのレベルがＤＨＣＰ処理に際して変化しなかったことに留意することも重要である。ｒｆａ、ｗｚｂまたはｈｈａのような遺伝子はＤＨＣＰ処理によって有意には変化しなかったが、ＡＩ−２での処理に際しては変化を示した。この効果の正確な理由は不明であるが、これらの遺伝子がＡＩ−２に加えて他の因子によって調節されており、単なるＡＩ−２活性の阻害はそれらのダウンレギュレーションを導かない可能性がある。近年、Ｓ．チフィムリウムのＡＩ−２が、その取り込みにおいて機能するＡＢＣトランスポーターの発現を制御することが報告された。このオペロンの機能は不明であるが、リボソーム輸送オペロン（Ｒｂｓ）に対する有意な類似性を有しており、ＡＢＣトランスポーター複合体をコードすると予測されている。これはｌｓｒオペロンと命名された（Taga et al., 2001）。このオペロンはＡＩ−２の包括的効果のＤＮＡアレイ分析（DeLisa et al., 2001）および本研究においても示されていないが、興味深いことに、ＡＩ−２はＡＢＣトランスポーター系をコードする別のオペロン、すなわちｐｏｔオペロンを誘導した（DeLisa et al., 2001）。本発明者らの研究と一致して、ＤＨＣＰ処理はこのオペロンの有意な阻害を生じた（表３）。このことは、ＡＩ−２が他のＡＢＣ輸送系の調節にも関与し得ることを示唆し、ＤＨＣＰによるその阻害はこれらのオペロンの少なくともいくつ��の結果的な阻害において反映されている。
【００４１】
ｓａｐオペロン（ｓａｐＡ〜ｓａｐＦ）はエルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）のビルレンスに関与することが示されている（Lopez-Solanilla et al., 1998）。Ｖ．フィシェリのｓａｐオペロンがＬｕｘＲ−ＡＩ複合体によって調節されることが報告されており、従って生物発光において役割を果たすと推測された（Chen et al., 2000）。Ｖ．フィシェリのＳａｐタンパク質は大腸菌のＳａｐタンパク質と相同である。ＤＨＣＰはｓａｐ遺伝子を阻害した（表６）。このことは、レポーターアッセイにおける生物発光の阻害と一致する。特異的調節領域様配列Ｒ＆Ｒ＊が、Ｖ．フィシェリのｓａｐおよびｌｕｘレギュロン内に存在する。ＬｕｘＲ−ＡＩはこの領域に結合して、それぞれの遺伝子発現を調節する（Chen et al., 2000）。ＤＨＣＰがＬｕｘＲ−ＡＩ複合体のＲ＆Ｒ＊配列への結合に干渉し、それでレポーターアッセイにおけるルシフェラーゼオペロンまたは大腸菌のｓａｐオペロンのような遺伝子の転写を阻害し得るという可能性がある。ＤＨＣＰがＡＩ−２が関与するクオラムセンシングの１つの経路をオフにし、ｃｙｓＫの誘導が関与する別経路をオンにし得ると推測することは魅力的である。近年、ＡＩ−２活性が、大腸菌の低および高細胞密度培養物の両方で、いくつかのプラスミドにコードされる遺伝子の誘導後に有意に減少することが示された。ＡＩ−２レベルは各タンパク質産物の蓄積レベルに直線的に関連した（DeLisa et al., 2001）。このことは、クオラムセンシング経路を、組換え産物収量を改善するために設計される至適化ストラテジーのための潜在的な標的とする。ＡＩ−２活性のＤＨＣＰによる阻害は、この見地において興味深いとされる可能性がある。
【００４２】
結論として、ＤＨＣＰは大腸菌において広範な効果を有する。それは、ビルレンスおよび運動性のようなクオラムセンシングプロセスに関与する遺伝子のいくつかを阻害し、クオラムセンシングオートインデューサーの１つの活性自体を阻害する。一方、クオラムセンシング別経路に関与することが知られているｃｙｓＫのような特定の遺伝子が大いに誘導され、このことはＤＨＣＰが大腸菌の異なるクオラムセンシング経路のスイッチのオン／オフを調節しているかもしれないことを示唆する。
【００４３】
本発明を十分に記載したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく過度の実験なしに、本発明が広範囲の等価なパラメーター、濃度及び条件内で実施可能であることを当業者は理解する。
【００４４】
本発明をその特定の実施態様に関して記載したが、さらなる改変が可能であることが理解される。本願は、添付の請求の範囲に記載のように、本発明が関連する技術分野内で公知であるかまたは通常の慣習内に入り、そして本明細書上記の本質的特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含めて、一般に本発明の原理に従う本発明のいずれもの変形、用途、または適用を包含することが意図される。
【００４５】
刊行論文または要旨、公開または対応米国または外国特許出願、発行米国または外国特許、あるいはいずれものその他の参考文献を含む本明細書中で引用する全ての参考文献は、引用文献中に示される全てのデータ、表、図、および本文を含めて、全体を出典明示で援用する。さらに、本明細書中に引用する参考文献内で引用される参考文献の内容全体も、全体を出典明示で援用する。
【００４６】
公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法または従来の方法に対する言及は、いかにしても、本発明のいずれかの局面、記載または実施態様が関連分野において開示、教示または示唆されることを認めるものではない。
【００４７】
特定の実施態様の上記記載は、当該分野の知見（本明細書において引用する参考文献の内容を含む）を適用することによって、その特定の実施態様を、過度の実験なしに、本発明の一般的な観念から逸脱することなしに、他者が種々の適用のために容易に改変およびまたは適応できるように十分に本発明の一般的な性質を示す。それゆえ、そのような適応および改変は、本明細書中に示す教示および手引きに基づいて、開示する実施態様の等価物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書中の用語は説明目的のためのものであり、限定を目的とするものではなく、その結果、本明細書中の用語は本明細書に示す教示および手引きを当業者の知見と組み合わせて考慮して当業者によって解釈されるべきであることを理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
細菌における遺伝子発現およびクオラムセンシングの調節が提供される。
【００４９】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ｍＲＮＡのレベルに対するＤＨＣＰの効果を示すゲルである。実施例１の材料および方法に記載のホットフェノール法によって全ＲＮＡを抽出し、プライマー伸長分析をｏｓｍＹ、ｄｐｓ、ｒｐｏＳ、ｋａｔＧ、ｃｙｓＫ、ｔｅｈＡ、ｚｉｐＡおよびｏｍｐＦに対応するオリゴヌクレオチドを用いて実施した。各々の場合のレーン１および２は、それぞれコントロール（未処理）およびＤＨＣＰ処理細胞から単離したｍＲＮＡを表す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＤＨＣＰがＡＩ−２活性を阻害することを示すグラフである。実施例１の材料および方法に記載のようにＡＩ−２活性アッセイを実施した。Ｖ．ハーベイＢＢ１５２を用いて見られる発光を１００％とし、他の活性を相対的％として表現した。図２Ａにおいて、レーンは以下のとおりである：無菌ＡＢ培地、レーン１；Ｖ．ハーベイＢＢ１５２培養液、レーン２；ＤＨＣＰ（２５０μＭ）、レーン３；ＤＨＣＰ（２５０μＭ）＋Ｖ．ハーベイＢＢ１５２培養液、レーン４。図２Ｂにおいて、ＤＨＣＰを反応混合物に、最大発光がＡＩ−２によって生じた後に、２５０μＭ（黒丸）および１００μＭ（白四角）の濃度で添加した。対応する、ＤＨＣＰ添加なしのＡＩ−２のコントロール活性も示す（白三角）。光生成を種々の時点で液体シンチレーションカウンターを用いてモニターした。
【配列表】
2005519616.tif 000009
2005519616.tif 000010
【図１】
2005519616.tif 000011
【図２】
2005519616.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月10日(2004.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005519616000001.app
【国際調査報告】
2005519616.tif 000013