(57)【要約】本発明は、アスペルギルス・ニゲルから単離された新規なアミラーゼをコードする遺伝子を含む、新規に同定されたポリヌクレオチド配列に関する。本発明はこの新規な遺伝子の全長、新規なアミラーゼをコードする全長配列を含むcDNA配列、および完全長機能的タンパク質のアミノ酸配列、およびそれらの機能的等価物を特徴とする。本発明はまたこれらの酵素を工業的方法に使用する方法および真菌感染の診断方法にも関する。また、本発明のポリヌクレオチドによって形質転換された細胞および本発明のアミラーゼが遺伝的に改変されてその活性および／発現レベルが増強もしくは低下した細胞も本発明に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるポリヌクレオチドに高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る請求項１記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
糸状菌から得ることのできる、請求項１または２記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
A.ニゲルから得ることのできる、請求項３記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの機能的等価物をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの機能的等価物の少なくとも１つの機能的ドメインをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドまたはそれらの等価物。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれる単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド配列が前記ポリヌクレオチド配列を適切な宿主細胞中で発現させるために適した制御配列に機能的に連結している、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
適切な宿主細胞が糸状菌である、請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜８いずれか１項記載のポリヌクレオチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項記載のベクターを作製する方法であって、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターでトランスフォーメーションした宿主細胞を培養する工程および前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを前記宿主細胞から単離する工程を含む前記方法。
【請求項１３】
配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する単離ペプチドまたはそれらの機能的等価物。
【請求項１４】
アスペルギルス・ニゲルから得ることのできる請求項１５記載の単離ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項記載のベクターを適切な宿主細胞、例えばアスペルギルス・ニゲルにおいて発現させることによって得られる単離ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項記載のポリペプチドの機能的ドメインを含む組換えアミラーゼ。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項記載のベクターで適切な宿主細胞をトランスフォーメーションする工程、前記ポリヌクレオチドの発現が可能な条件下で前記細胞を培養する工程、および場合により、コードされるポリぺプチドを前記細胞または培地から精製する工程、を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１３〜１６のいずれか１項記載のポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１３〜１６のいずれか１項記載のポリペプチドと反応する精製抗体。
【請求項２１】
請求項１３〜１６のいずれか１項記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれか１項記載の単離ポリヌクレオチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項記載のベクターまたは請求項１３〜１５のいずれか１項記載の単離ポリペプチドまたは請求項１６または２１記載の組換えタンパク質のベーキング工程における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はアルペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)から単離された新規なアミラーゼをコードする遺伝子を含む、新たに同定されたポリヌクレオチド配列に関する。本発明は新規遺伝子の完全長ヌクレオチド配列、新規なアミラーゼの完全長コード配列を含むcDNA配列、および、完全長機能性タンパク質およびそれらの機能的等価物のアミノ酸配列を特徴とする。本発明はまた工業的方法および真菌感染の診断方法におけるこれらの酵素の使用方法に関する。また、本発明には、本発明のポリヌクレオチドによって形質転換された細胞および本発明のアミラーゼが遺伝的に改変されてその活性および／または発現が増強されている細胞が含まれる。
【０００２】
発明の背景
デンプンをグルコースに加水分解する工業的方法は無機酸または酵素触媒反応に依存している。現在、酵素の使用が好ましく改善された収率および好ましい経済性と関連した多くの利点を提供している。酵素的加水分解によりデンプン分解、反応の特異性、および精製された産物の安定性に対してより大きな制御が可能となる。より温和な反応条件には低い温度および中性付近のpHが含まれ、それにより望ましくない副反応が減少する。異臭があり着色のある化合物、特に5-ヒドロキシ-2-メチルフルフルアルデヒド、アンヒドログルコース化合物、および望ましくない塩類の生成がより少なくなる。酵素的方法は、エネルギー要求性が低く中和工程を排除することができるので望ましい。
【０００３】
アルファ-アミラーゼ（E.C.3.2.1.1）すなわちα-アミラーゼはオリゴ糖類および多糖類の1,4-アルファ-グルコシド結合のエンド加水分解を触媒する。これらはまた、1.4-アルファ-D-グルカングルカノヒドロラーゼ、タカ-アミラーゼ、エンドアミラーゼまたはグリコゲナーゼとしても知られている。アルファアミラーゼはデンプン、グリコーゲンおよび関連する多糖およびオリゴ糖にランダム様式で作用し、還元基はα-配座で遊離される。
ベータ-アミラーゼ（E.C.3.2.1.2）は多糖類中の1,4-アルファ-グルコシド結合の加水分解を触媒し、鎖の非還元末端から連続的にマルトース単位を除去する。別の名前は1,4-アルファ-D-グルカンマルトヒドロラーゼ、サッカロゲンアミラーゼ、グリコゲナーゼである。ベータアミラーゼはデンプン、グリコーゲンおよび関連する多糖およびオリゴ糖に作用して転化によりベータマルトースを生成する。
【０００４】
グルコアミラーゼ（E.C.3.2.1.3）は末端の1,4-結合したα-D-グルコース残基の鎖の非還元末端からの連続的加水分解を触媒し、β-D-グルコースを遊離する。別の名前は、グルカン1,4-α-グルコシダーゼ、1,4-α-D-グルカングルコヒドロラーゼ、アミログルコシダーゼ、γ-アミラーゼ、リソソームα-グルコシダーゼ、エクソ-1,4-α-グルコシダーゼである。この酵素の大部分の形態は、配列中の次の結合が1,4である場合に1,6-α-D-グルコシド結合を迅速に加水分解することができ、この酵素のいくつかの調製物は他の多糖における1,6-および1,3-α-D-グルコシド結合を加水分解する。
【０００５】
アミラーゼは微生物において簡便に製造することができる。微生物アミラーゼは種々の供給源から入手可能である；バチルス種はバクテリア酵素の一般的な供給源であるが、真菌酵素は一般にアスペルギルス種において製造される。
大部分の真菌アミラーゼの低い至適pHにより糖化のための簡便な酸性条件が許される。そのような条件はグルコース収率を下げるフルクトースおよび他の糖への望ましくない異性化反応を低減させる。更に、酸性条件は糖化反応容器中の夾雑微生物の増殖を抑制する。
アミラーゼは、ベーキング、醸造、コーンシロップ製造およびアルコールおよび酢発酵を含む多様な工業的用途において使用することができる。
【０００６】
麦芽化コムギ、オオムギ、バクテリアおよび真菌はベーキング処理のためのα-アミラーゼの典型的な供給源である。真菌α-アミラーゼは希釈粉末、予備包装された用量、または水に分散可能な錠剤の形態でパン生地に加えられる。この酵素はパン製造所において粉末に加えてもよく、稀だが、ミル自体に加えてもよい。麦芽化コムギおよびオオムギも、これらの穀類からの粉末がミルにて最終産物と混合される場合、アミロース分解活性の供給源として機能し得る。バクテリアα-アミラーゼの特性によりコーヒーケーキ、フルーツケーキ、ブラウニー（browny）、クッキー、スナックおよびクラッカーの製造にこれらを使用することが可能である。真菌α-アミラーゼ、通常はA.オリゼ、A.ニゲル、A.アワモリまたリゾパス(Rhizopus)種のα-アミラーゼはフラワー中のアミロース分解活性を補助するために使用される。これらの供給源からの酵素は生地の発酵可能な単糖および二糖の濃度を通常の0.5％から酵母の増殖を促進させる濃度まで上昇させることができる。添加した真菌および内在性酵素によるグルコースおよびマルトースの徐放性放出はパン製造発酵の際の酵母の代謝およびガス生成に必須の栄養素を供給する。A.オリゼα-アミラーゼはパン製造用途のためにはバチルス種からのバクテリア酵素よりも好まれることがときどきある。なぜなら、この真菌由来酵素は60〜70℃にて熱に不安定でベーキング工程で生き残らないからである。この熱不安定性は、完成品のパン塊において、柔らかい、または粘着質の中身を生じさせるであろうゲル化デンプンに対する酵素作用を防止する。バクテリアα-アミラーゼも使用でき、良好な結果を与えるが、ゴムのような食感のパンを避けるため注意深く計量しなければならない。白色パン用小麦粉は6.7〜10.5％の損傷デンプンを含むのでアミラーゼ追加は有益であり、時には必須である。添加した酵素は通常パン用小麦粉中に存在する損傷デンプン、破裂デンプン粒子をコムギβ-アミラーゼよりも効率的に分解する（Bigelis R.:Enzymes in Food processing, Nagodawithana and Reed Eds. Acad. Press Inc p121-158およびこれに引用されている文献）。
【０００７】
アミラーゼ追加は、ベーキング製品の製造過程に使用すれば、ロール、バンズおよびクラッカーの品質の改善に加えてパンの品質の他の特徴を改善することができる。パンのベーキングにおいて、真菌又はバクテリアアミラーゼによる処理はパン生地の粘性を低下させ、それにより手作業または機械による操作の容易性を改善する。酵素の計量した投与量により、パン塊の圧縮性を低下させ、より柔らかなパンが製造される。更に、そのような処理は、ゲル状デンプンの粘性を低下させ、ベーキングの際に酵素不活性化前により大きな膨張を可能とすることによりパンの体積を増加させ、酵素の不活性化は塊の体積を固定する。風味、皮の特性および焼き品質(toasting quality)に対する好ましい効果が見られる。パンの保存特性もまた変化し、味覚試験者(taste panel)が決定したところによれば、よりゆっくりと固くなりより長く維持される、より柔らかく、より圧縮可能な中身をもった製品が作られる。アミロース分解活性はパンの糖濃度を増加させることもでき、味覚上有利なより好ましい甘い製品が作られる（Bigelis R.:Enzymes in Food processing, Nagodawithana and Reed 編集. Acad. Press Inc p121-158およびこれに引用されている文献）。
【０００８】
醸造において、添加した酵素は内在性オオムギβ-アミラーゼの作用に寄与し、デンプン消化工程を補助する。このような添加酵素は、添加物と呼ばれるトウモロコシおよびコメのような非モルト穀物粒が使用される場合に特に重要である。これらの添加物穀物粒はカルボヒドラーゼが欠損しているので、真菌α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼはデンプン消化を増加させることができ、非モルト穀粒の割合を低下させ、マッシュの首尾一貫した品質を保証する。アミラーゼはオオムギのアミロースおよびアミロペクチンを可溶化させ、これらの基質をオオムギβ-アミラーゼによるさらなる分解へ曝露する。結果として、マルトースおよび小デキストリンのレベルが上昇し、最後には酵母の発酵を促進する麦芽液成分を生成する。低トランスグルコシダーゼ活性を有するアミラーゼ調製物は、この酵素の痕跡レベルがイソマルトースおよびパノース（この両者は酵母によって発酵されない。）を生成するので好ましい。醸造用途のためのアミラーゼ活性の供給源は一般にはA.ニゲルまたはA.オリゼのようなアスペルギルス種の酵素である。これらの供給源からのプロテアーゼを添加してタンパク質を可溶化してアミラーゼに協力させて酵母発酵に必須のアミノ酸を遊離させても良い（Bigelis R.:Enzymes in Food processing, Nagodawithana and Reed 編集、 Acad. Press Inc p121-158およびこれに引用されている文献）。
【０００９】
上述の工程において、組換えDNA技術により得られる酵素を使用するのが有利である。そのような組換え酵素は伝統的に精製された対応物に比べて多数の利点を有している。組換え酵素は低コスト、高収量で製造することができ、バクテリアやウイルスなどの夾雑物がなく、バクテリア毒素もなく、他の酵素活性の混入もない。
真菌におけるアミラーゼの分子クローニングが記載されている。アスペルギルス・オリゼ、A.ニゲル、A.シロウサミイィ(shirousamii)からのいくつかのアルファ-アミラーゼのDNAおよび推定されるアミノ酸配列がWirselら、Mol. Microbiol 1989, (1)3-14, Boel ら、Biochemistry 1990(29) 6244-6249、およびShibuyaら、Biosci. Biotech. Biochem. 1992(56) 174-179に与えられている。バチルス・アミロリケファシエンスのα-アミラーゼの分子クローニングはTakkinenら、J. Biol. Chem. 1983(258) 1007-1013に記載されている。
【００１０】
アミラーゼ、特に、α-アミラーゼが低コストで製造することができることは重要である。これは、生産効率の改善（より高い発現レベル）、または改善された比活性（酵素１mgあたりのより高い活性）を提供することにより達成することができる。従って、本発明の目的は改善された生産効率および／または改善された比活性を有する改善された酵素を提供することである。
αアミラーゼがパンの改良材として使用される場合、それらを他の酵素と一緒に液体調製物として供給することが好ましい。グリセロールのような酵素安定化剤は液体パン改良材の主要なコスト要因であり、従って、安定化剤の量を少なくするために、そのような調製物に使用するためのより安定なα-アミラーゼに対する需要が存在する。より安定なα-アミラーゼを提供することも本発明の目的である。
【００１１】
α-アミラーゼは、しばしばアスコルビン酸と組み合わせて使用される。アスコルビン酸は高いpHにて不安定になりやすい。一方、α-アミラーゼは低いpH値において不安定になる。２つの要求の妥協点として、そのような調製物は4.7付近のpHにて通常維持される。従って、より低い至適pHを有するおよび／または低いpH値にて（好ましくはpH4.7）、より高い安定性を有するα-アミラーゼがあることは有利であろう。本発明はそのような酵素を提供する。
アスコルビン酸は、多くの用途においてα-アミラーゼと組み合わせて使用され、そこではアスコルビン酸は例えばオキサレートのような多数のキレート物質へ変換される。オキサレートはCaイオンに結合することができ、α-アミラーゼはその安定性のためにCaイオンを必要とするので、オキサレートはこれらのα-アミラーゼ調製物に対して不安定化因子として作用する。従って、本発明の背景にあるのは、その安定性のためにCaイオン依存性の低い酵素を提供することである。
従来技術によるα-アミラーゼの別の特徴はそれらの限られた熱安定性である。真菌α-アミラーゼは約65℃で不活性化され、従って、それらはベーキング工程の初期において熱-不活性化される。また、この特性により、真菌α-アミラーゼはハグベリフォーリングナンバー法(Hagberg falling number method)（AACC, 1983,方法56-81A）およびブラベンダーアミログラフ法（Brabender amylograph method）(AACC, 1983, 方法22-1)における活性測定のために適さなくなっている。また室温より僅かに高い温度における長引いた保存はときどき酵素活性を劣化させる。従って、本発明の目的は改善された熱安定性を有するα-アミラーゼを提供することである。
【００１２】
発明の目的
本発明の目的は改善された新規なアミラーゼをコードする新規なポリヌクレオチドを提供することである。本発明の更なる目的は、改善された、天然に産生された、および組換え的に産生されたアミラーゼ、および、それらを産生する組換え株を提供することである。
また、融合ポリペプチドも本発明の一部であり、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作製および使用する方法も本発明の一部である。
【００１３】
発明の概要
本発明は、α-アミラーゼ活性および以下から選ばれる１以上の特徴を有する単離されたポリペプチドに関する：
１）配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドまたはこれらの機能的等価物。
２）配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはそれらの機能的等価物を適切な宿主、例えば、アスペルギルス・ニゲルにおいて発現させることによって得られる単離ポリペプチド。
３）（１）または（２）記載のポリペプチドの機能性ドメインを含むポリペプチド。
４）（１）、（２）または（３）のアレル変異体。
５）（１）、（２）、（３）または（４）の断片。
６）精製酵素1mgあたりの酵素活性として、または培養体積1mlあたり、または生成されたバイオマス１mgあたりの酵素活性として表された、改善された比活性および／または改善された生産効率を有するポリペプチド。
【００１４】
７）改善された安定性を有する、50％未満のグリセロール、好ましくは40％未満のグリセロール、より好ましくは30％未満のグリセロール、更に好ましくは20％未満のグリセロール、より好ましくは10％未満のグリセロールの存在下、最も好ましくはグリセロールの非存在下にて安定であるポリペプチド。
８）4.7より低いpH、好ましくはpH4.0より低いpH値、更に好ましくはpH3.5より低いpH値にて安定なポリペプチド。
９）Caイオンに対して改善された安定性を有するポリペプチド。
【００１５】
本発明のα-アミラーゼは１以上の上述の性質を有してよいことは明らかである。比活性、生産効率、安定性、至適pHおよび酸安定性を決定する方法はこの分野でよく知られている。それらは、特にWO 00/60058の材料と方法の項に見ることができる。
本発明は上記のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。
より具体的には、本発明は配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるヌクレオチド配列を有する配列に、高度にストリンジェントな条件下で優先的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列を提供する。従って、本発明は、配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるいずれかの配列に対して約40％、好ましくは約65％、より好ましくは70％、さらに好ましくは75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％相同性のある核酸を提供する。
【００１６】
より好ましい実施態様において、本発明は糸状菌、特に好ましくはA.ニゲル、から得られる上述のような単離ポリヌクレオチドを提供する。
一つの実施態様において、本発明は配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれらの機能的等価物をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
さらに好ましい実施態様において、本発明は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれらの機能的等価物の少なくとも一つの機能性ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有するアミラーゼ遺伝子が提供される。本発明の別の特徴において、本発明はポリヌクレオチド、好ましくは配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するA.ニゲルアミラーゼまたはそれらのポリペプチドの変異体または断片をコードするcDNAを提供する。好ましい実施態様において、このcDNAは配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12およびこれらの機能的等価物からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する。
さらに好ましい実施態様において、本発明は本発明のポリヌクレオチドのコード配列を含むポリヌクレオチドが提供され、それらは、好ましくは配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列である。
【００１８】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターおよび、本発明のDNAを増幅または検出するために使用できるプライマー、プローブおよび断片に関する。
更に好ましい実施態様において、本発明のポリヌクレオチドが、それにコードされるアミノ酸配列を適切な宿主、例えばA.ニゲルまたはA.オリゼ中で発現させるために適切な制御配列に機能的に連結されているベクターが提供される。本発明はまた本発明のポリヌクレオチドおよびベクターを調製するための方法を提供する。
本発明はまた、本発明の異種または同種ポリヌクレオチドを含む、組換え的に作製された宿主細胞に関する。
別の実施態様において、本発明は、本発明のアミラーゼの発現が有意に増加した組換え宿主細胞、または前記アミラーゼの活性が増大した組換え宿主細胞を提供する。
本発明の別の実施態様において、本発明の異種または同種ポリヌクレオチドを含む組換え的に作製された宿主細胞であって、本発明の機能的アミラーゼを産生することのできる前記細胞、好ましくは、本発明のアミラーゼを過剰発現できる細胞、例えば、本発明の遺伝子またはcDNAの増加したコピー数を含むアスペルギルス株が提供される。
【００１９】
さらにまた本発明の別の特徴において、精製ポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドには本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが含まれる。特に好ましいのは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれらの機能的等価物である。
本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質も本発明の範囲内である。本発明はまた本発明のポリペプチドを作製する方法も提供する。
本発明は、本明細書に記載したような工業的方法における本発明のアミラーゼの使用にも関する。
【００２０】
発明の詳細な記載
ポリヌクレオチド
本発明は配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するアルファ-アミラーゼまたはそれらの機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の配列はアスペルギルス・ニゲルから得られるゲノムクローンをシーケンシングすることによって決定された。本発明はA.ニゲルアルファアミラーゼをコードする遺伝子ならびにその完全なcDNA配列およびそのコード配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。従って、本発明は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドまたはそれらの機能的等価物に関する。
【００２１】
より具体的には、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下、好ましくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる単離ポリヌクレオチドに関する。有利には、そのようなポリヌクレオチドは糸状菌、特にアスペルギルス・ニゲルから得ることができる。より具体的には、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12からなる群、より選ばれるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれらの機能的等価物の少なくとも一つの機能的ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
【００２２】
本明細書において、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、染色体DNAから単離し得る核酸分子であって、タンパク質、例えば、A.ニゲルアミラーゼ、をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。遺伝子はコード配列、非コード配列、イントロンおよび制御配列を含み得る。さらに、遺伝子とは本明細書で定義する単離核酸分子をいう。
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるヌクレオチド配列を有する核酸分子またはこれらの機能的等価物は標準的な分子生物学的技術および本明細書で提供される配列情報を用いて単離することができる。例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11または配列番号12の核酸配列の全体または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用することにより、本発明の核酸分子は（例えば、Sambrook, J., とManiatis, T.、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されているような）標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を用いて単離することができる。
【００２３】
さらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11または配列番号12の全体または一部を包含する核酸分子は、ここに提供する配列情報に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって単離することができる。
本発明の核酸はcDNA、mRNAまたは、ゲノムDNAを鋳型として用い、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準的なPCR増幅技術によって増幅することができる。そのようにして増幅した核酸は適切なベクターにクローニングすることができ、DNA配列解析により特徴を調べることができる。
さらに、本発明のヌクレオチド配列に対応する、または本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは標準的な合成技術、たとえば、自動化DNA合成機を用いて調製することができる。
【００２４】
好ましい実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、または配列番号12に示したヌクレオチド配列を含む。配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、または配列番号12に与えた配列情報は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３，配列番号４，配列番号５および配列番号６に示したA.ニゲルアルファアミラーゼ遺伝子のコード配列に対応する。このcDNAはそれぞれ配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するA.ニゲルアルファアミラーゼをコードする配列を含む。
【００２５】
他の好ましい実施態様において、本発明の単離核酸分子は配列番号１、配列番号２、配列番号３，配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11または配列番号12に示したヌクレオチド配列の、またはこれらの配列の機能的等価物の、相補物である核酸分子を含む。
他のヌクレオチド配列に相補的である核酸分子とは、他のヌクレオチド配列に十分に相補的であり、他のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、それによって安定な二重鎖を形成することのできる核酸分子である。
本発明の一つの特徴は、本発明のポリペプチドまたは生物学的に活性な断片またはドメインのようなその機能的等価物をコードする単離核酸分子、および本発明のポリペプチドを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な核酸分子、および核酸分子の増幅または変異導入のためのPCRプライマーとして使用するために適した、そのような核酸分子の断片に関する。
【００２６】
「単離ポリヌクレオチド」または「単離核酸」とは、それが由来する生物の天然に存在するゲノム中で直接に隣接するどちらのコード配列（一つは5'末端、もう一つは3'末端）とも直接には隣接していないDNAまたはRNAをいう。従って、一つの実施態様では、単離核酸はコード領域に直接隣接する5’非コード配列（たとえばプロモーター）のいくつかまたは全部を含む。従って、この用語は、たとえば、ベクターに取り込まれた組換えDNA、自立的に複製するプラスミドまたはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノム中に取り込まれた組換えDNA、または分離した分子として（たとえば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されたcDNAまたはゲノムDNA断片）存在する組換えDNAを含む。また、この語には細胞性物質、ウイルス物質、または培地（組換えDNA技術によって生産される場合）、または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学合成される場合）を実質的に含まない、追加のポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。さらに、「単離核酸断片」は断片として天然に生じない、天然状態では見出されないであろう核酸断片である。
本明細書においては、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」はDNA分子（たとえばcDNAまたはゲノムDNA）およびRNA分子（たとえばmRNA）、およびヌクレオチド類似体を用いて作成されるDNAまたはRNAの類似物を含むべく意図されている。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖DNAが好ましい。核酸はオリゴヌクレオチド類似物または誘導体（たとえば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドはたとえば、改変塩基対形成能またはヌクレアーゼに対して増加した耐性を有する核酸を調製するために使用することができる。
【００２７】
本発明の他の実施態様により、本発明の核酸のアンチセンスである単離核酸分子が提供される。また、ここに記載した核酸分子の相補鎖も本発明の範囲内である。
ある応用例において、アミラーゼ活性のない産物を得ることが有利なことがある。そのような産物は本発明のアミラーゼ遺伝子が除去された、または、その活性が低下した微生物において作製することができる。そのような微生物は組換えDNA技術、たとえば、本発明の遺伝子の発現をノックアウトすることにより得ることができる。アミラーゼ欠損変異体は、アミラーゼの混入が望まれない凝乳酵素の製造のために有利に使用することができる。
破壊または変異導入によるアミラーゼ活性の除去の代わりに、アミラーゼ活性のダウンレギュレーションによってアミラーゼ活性の低下を達成することもできる。これは本発明の遺伝子のプロモーターまたは他の制御配列を遺伝的に改変することにより達成することができる。ここに提供した配列情報を助けとして、当業者はどのようにしてアミラーゼ活性の低下したまたは除去された変異微生物を提供するという目標に到達するかが分かるであろう。
【００２８】
シーケンシングの誤り
本明細書に提供した配列情報は、誤って同定された塩基を含めなければならないほど狭く解釈してはならない。本明細書に開示した具体的な配列は、糸状菌、特にA.ニゲルの完全な遺伝子を単離するために容易に用いることができ、次に、それを更なる配列解析に簡単にかけ、それによってシーケンシングの誤りを容易に明らかにすることができる。
別に示さない限り、ここに示すDNA分子のシーケンシングによって決定される全てのヌクレオチド配列は自動DNAシーケンサーを用いて決定されており、ここで決定されたDNA分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は上述のように決定したDNA配列の翻訳によって予想した。従って、自動化アプローチによって決定される全てのDNA配列についてこの分野で知られているように、ここで決定されたどのヌクレオチド配列もいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、シーケンシングしたDNA分子の実際のヌクレオチド配列と典型的には少なくとも約90％同一、より典型的には少なくとも約95％から少なくとも約99.9%同一である。実際の配列はこの分野で知られた手動DNAシーケンシング法を含む他の方法によってより正確に決定することができる。この分野で知られているように、実際の配列に比較して、決定したヌクレオチド配列における単一の塩基の挿入または欠失はそのヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを生じさせ、決定したヌクレオチド配列によってコードされる予想アミノ酸配列はそのシーケンシングしたDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列と、そのような挿入または欠失の位置を開始点として、完全に異なるであろう。
当業者はそのような誤って同定された塩基を明らかにすることができ、そのような誤りを修正する方法を知っている。
【００２９】
核酸断片、プローブおよびプライマー
本発明の核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11または配列番号12に示した核酸配列の一部または断片のみ、たとえば、プローブまたはプライマーとして使用できる断片または本発明のタンパク質の一部をコードする断片のみを含んでいてもよい。アルファアミラーゼ遺伝子のクローニングおよびcDNAから決定されるヌクレオチド配列は、他のアルファアミラーゼファミリーのメンバーおよび他の種の同族体を同定および／またはクローニングに使用するために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能とする。典型的には、このプローブ／プライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11または配列番号12に示したヌクレオチド配列またはそれらの機能的等価物の約12または15、好ましくは約18または20、好ましくは約22または25、より好ましくは約30、35、40、45、50、55、60、65または75またはより多くの連続的なヌクレオチドに（好ましくは高度にストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００３０】
本明細書に提示したヌクレオチド配列に基づくプローブはたとえば他の生物の同じタンパク質または相同体をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用することができる。好ましい実施態様において、プローブはさらにそれに結合した標識基を含んでもよく、たとえばその標識基は放射性同位体であっても、蛍光化合物、酵素、酵素補因子であってもよい。そのようなプローブはアルファ-アミラーゼを発現している細胞を同定するための診断キットの一部として使用することもできる。
【００３１】
同一性＆相同性
用語「相同性」または「％同一性」は本明細書において互換的に使用される。本発明の目的において、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の％同一性を決定するため、配列を最適比較のためにアラインメントする（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適アラインメントのため第１のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入することができる）ことが規定される。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基を比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置を占めるのと同じアミノ酸残基又はヌクレオチド残基によって占められる場合、その分子はその位置において同一である。２つの配列間の％同一性はそれらの配列によって共有される同一である位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝（同一である位置の数）／（位置の総数（すなわち重複する位置））ｘ１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
【００３２】
当業者は２つの配列間の相同性を決定するためのいくつかの異なるプログラムが利用可能であるという事実を知るであろう。配列の比較および２つの配列間における％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。好ましい実施態様において、２つのアミノ酸配列間の％同一性は、GCGソフトウエアパッケージに含まれるGAPプログラム（以前はhttp://www.gcg.comから入手可能で、現在はhttp://www.accelrys.comから入手可能）に含まれているNeedlemanとWunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、およびギャップ重み付け16、14、12、10、８、６、または４、および長さ重み付け１，２、３、４，５または６を用いて行うことができる。当業者は、これらの異なる全てのパラメーターは僅かに異なる結果を生じさせるであろうが、２つの配列間の全体的な％同一性は異なるアルゴリズムを用いた場合に有意には異ならないことを理解するであろう。
【００３３】
更にまた別の態様において、２つのヌクレオチド配列間の％同一性はGCGソフトウエアパッケージ中のGAPプログラム（以前はhttp://www.gcg.comから入手可能で、現在はhttp://www.accelrys.comから入手可能）を用い、NWSgapdna.CMPマトリックスおよびギャップ重み付け40、50、60、70または80および長さ重み付け１，２、３、４、５または６を用いて決定される。他の実施態様において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の％同一性はALIGNプログラム（Ver.2.0）（http://vega.igh.cnrs/fr/bin/align-guess.cgiで入手可能）に含まれているE.MeyersとW.miller(CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを用い、PAM120重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ４を用いて決定される。
本発明の核酸配列またはタンパク質配列は更に公共のデータベースに対する検索を行うため、例えば他の同族メンバーまたは関連配列を同定するために、「問い合わせ配列」として使用することができる。そのような検索はAltschulら(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム（ver2.0）を使用して行うことができる。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索をNBLASTプログラムをスコア＝100、ワード長＝12にて用いて行うことができる。本発明のタンパク質分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTタンパク質検索はXBLASTプログラムをスコア＝50、ワード長＝３で用いて行うことができる。比較目的のためギャップの入ったアライメントを得るためには、Altshchulら、(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402に記載されたようなギャップ化BLASTを用いることができる。BLASTおよびギャップ化BLASTプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）を用いる場合、それぞれのプログラムの初期パラメーターを使用することができる（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照せよ）。
【００３４】
ハイブリダイゼーション
本明細書において、用語「ハイブリダイズ」とは、互いに少なくとも約50％、少なくとも約40％、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約85％から90％、更に好ましくは少なくとも95％相同である配列が典型的には互いにハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述することを意図している。
そのようなハイブリダイゼーション条件の非限定的な好ましい例は、６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃、続いて１ｘSSC、0.1％SDS中、50℃、好ましくは55℃、好ましくは60℃、更に好ましくは65℃にて１回以上の洗浄を行う条件である。
高度にストリンジェントな条件には、例えば５ｘSSC/５ｘデンハルト溶液/0.1％SDS中、68℃におけるハイブリダイゼーション、および0.2ｘSSC/0.1％SDS中室温にての洗浄が含まれる。あるいは、洗浄は42℃で行っても良い。
【００３５】
当業者は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、および高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためにどの条件を適用すべきかを知っているであろう。そのような条件に関する追加的ガイダンスはこの分野で容易に入手可能であり、例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.;および、Ausubelら（編集）, 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.)中で得ることができる。
もちろん、ポリA配列（例えばmRNAの3'末端ポリ(A)列）のみにハイブリダイズする、または相補的なT（またはU）ストレッチのみにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ(A)列またはその相補配列を含むどの核酸分子にも（例えば、実際上どの二本鎖cDNAクローンにも）ハイブリダイズするであろうから、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドには含まれないであろう。
【００３６】
他の生物からの完全長DNAの取得
典型的なアプローチにおいて、他の生物、例えば、糸状菌、特にアスペルギルス種からのcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。
例えば、アスペルギルス株をノーザンブロット解析により相同なポリヌクレオチドに対してスクリーニングすることができる。本発明のポリヌクレオチドに相同な転写物が検出できたならば、当業者によく知られた標準的な技術を用いて適切な株から単離されたRNAからcDNAライブラリーを構築することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るプローブを用いて全ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングしてもよい。
相同な遺伝子配列は、例えば、本明細書に教示したヌクレオチド配列に基づいて設計した２つの縮退オリゴヌクレオチド集団を用いたPCRを行うことにより単離することができる。
【００３７】
反応のための鋳型は本発明のポリヌクレオチドを発現していることが知られている、またはそのように考えられる株から調製したmRNAの逆転写によって得たcDNAであってよい。PCR産物をサブクローニングし、増幅された配列が新規なアルファアミラーゼ核酸配列またはその機能的等価物を表しているか確認するためにシーケンシングすることができる。
次に、そのPCR断片を用い、種々の既知の方法を用いて完全長cDNAクローンを単離することができる。例えば、増幅した断片を標識し、バクテリオファージまたはコスミドcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。あるいは、標識断片はゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。
他の生物からの完全長cDNAを単離するためにPCR技術を用いることもできる。例えば、標準的な手順に従って適切な細胞または組織源からRNAを単離することができる。増幅された大部分の断片の5'末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを第１鎖合成のプライミングのために用いて逆転写反応をこのRNAに対して行うことができる。
得られたRNA/DNAハイブリッドは次に標準的なターミナルトランスフェラーゼ反応を用いて（例えば、グアニンで）「テーリング」することができ、このハイブリッドをRNase Hで消化し、第２鎖を（例えば、ポリ-Cプライマーで）プライミングすることができる。このように、増幅した断片の上流のcDNA配列を容易に単離することができる。有用なクローニング手順の総説については、Sambrookら（既出）およびAusubelら（既出）を参照せよ。
【００３８】
ベクター
本発明の別の側面は本発明のタンパク質またはその機能的等価物をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において、用語「ベクター」とは、それに連結されている別の核酸を運ぶことのできる核酸分子をいう。ベクターの一つの型は「プラスミド」（追加のDNA素片を連結し得る円環状の二本鎖DNAをいう）である。ベクターの別の型はウイルスベクター（追加のDNA素片はウイルスゲノム中に連結し得る）である。ある種のベクターはそれが導入される宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、バクテリア性複製起点を含むバクテリアベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は宿主細胞へ導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。更に、ある種のベクターはそれに機能的に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは本明細書において「発現ベクター」と称される。一般には、組換えDNA技術における有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書においては用語「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用することができる。しかしながら、本発明はウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、等価な機能を提供する他の形態の発現ベクターをも含むことが意図されている。
【００３９】
本発明の組換え発現ベクターは本発明の核酸を宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で含む。これは組換え発現ベクターが、発現に使用する宿主細胞に基づいて、発現させるべき核酸配列に機能的に連結した１以上の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター中で、「機能的に連結」したとは、注目するヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を（例えば、in vitro転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞へ導入される場合は宿主細胞中で）可能とするような様式で制御配列に連結していることを意味することを意図している。用語「制御配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むべく意図されている。そのような制御配列は、例えば、Goedel；Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。制御配列には、多数の型の宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指令する配列、およびある種の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指令する配列（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。当業者には、発現ベクターの設計は形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等のような要因に依存し得ることが理解されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され、それにより本明細書に記載の核酸にコードされるタンパク質またはペプチド（例えば、アルファ-アミラーゼ、変異アルファアミラーゼ、その断片、その変種およびその機能的等価物、融合タンパク質等）を生産することができる。
【００４０】
本発明の組換え発現ベクターは原核細胞または真核細胞におけるアルファアミラーゼの発現のために設計することができる。例えば、本発明のタンパク質は大腸菌のようなバクテリア細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞はさらにGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に論じられている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばT7プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼを用いてin vitroで転写および翻訳することができる。
本発明に有用な発現ベクターには、染色体由来ベクター、エピソーム性ベクター、およびウイルス由来ベクターが含まれ、例えば、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素に由来するベクター、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスに由来するベクター、および、コスミドおよびファジミドのような、プラスミドとファージの遺伝要素から由来するベクターのようなそれらの組合せに由来するベクターが含まれる。
【００４１】
DNA挿入物は適切なプロモーター、例えばいくつか例を挙げるとラムダファージPLプロモーター、大腸菌lac、trpおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、およびレトロウイルスLTRプロモーター、に機能的に連結していなければならない。他の適切なプロモーターは当業者には知られているであろう。特定の実施態様において、糸状菌におけるアミラーゼの高発現レベルを指令し得るプロモーターが好ましい。そのようなプロモーターはこの分野で既知である。発現構築物は転写開始、終結のための部位、および転写領域には翻訳のためのリボソーム結合部位を含んでいて良い。この構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの開始部に適切に配置された翻訳開始AUG、および末端に適切に配置された終結コドンを含むであろう。
【００４２】
ベクターDNAは慣用的なトランスフォーメーション技術およびトランスフェクション技術により原核細胞または真核細胞へ導入することができる。本明細書において、用語「トランスフォーメーション」および「トランスフェクション」は外来性核酸（例えばDNA）を宿主細胞に導入するためのこの技術分野で認知された種々の技術をいうべく意図されている。これらにはリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン-媒介トランスフェクション、トランスダクション、インフェクション、リポフェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞のトランスフォーメーションまたはトランスフェクションのための適切な方法はSambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology (1986)および他の手引き書に見ることができる。
【００４３】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、ごく一部の細胞のみが外来DNAをそのゲノム中に組み込み得ることが知られている。これらの組込み体を同定し選抜するために、選抜可能マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が一般には注目する遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選抜可能マーカーには、G418、ハイグロマイシン、メタトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選抜可能マーカーをコードする核酸は本発明のタンパク質をコードするベクターと同じベクター上に導入することもできるし、または、別のベクターに導入することもできる。導入した核酸で安定にトランスフェクションされた細胞は薬剤選抜により同定することができる（例えば、選抜マーカーを取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【００４４】
原核生物におけるタンパク質の発現はしばしば大腸菌において、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を指令する構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターを含むベクターで行われる。融合ベクターは、それにコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは典型的には３つの目的に役立つ：１）組換えタンパク質の発現を増加させるため、２）組換えタンパク質の溶解性を増加させるため、および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。
しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合タンパク質の精製に続いて組換えタンパク質を融合部分から分離することを可能とするために、融合部分と組換えタンパク質部分の連結部位にタンパク質分解性切断部位が導入される。そのような酵素、およびそれらの同族認識配列には、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。
【００４５】
示したように、発現ベクターは好ましくは選抜マーカを含むであろう。そのようなマーカには、真核細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン耐性、および大腸菌および他のバクテリアの培養についてテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性が含まれる。適切な宿主の代表的な例には、大腸菌、ストレプトミセスおよびサルモネラ・ティフィムリウムのようなバクテリア細胞、真菌細胞、酵母、ドロソフィラS2およびスポドプテラSf9のような昆虫細胞、CHO、COS、Bowesメラノーマ、および植物細胞が含まれる。上述の宿主細胞のための適切な培地および条件はこの分野で知られたものである。
バクテリア中で使用するための適切なベクターには以下が含まれる：Qiagenから入手可能なpQE70、pQE60およびPQE-9；Stratageneから入手可能なpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH146A；および、Pharmaciaから入手可能なptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。好ましい真核ベクターには以下が含まれる：Stratageneから入手可能pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZT1およびpSG；Pharmaciaから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL。他の適切なベクターは当業者には容易に明らかであろう。
【００４６】
本発明に使用するバクテリアプロモーターには、大腸菌lacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモーター、およびtrpプロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルスLTRのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（「RSV」）のプロモーター）、マウスメタロチオネイン-Iプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターが含まれる。
高等真核細胞による本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写はベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大することがある。エンハンサーは通常約10から300bpのcis作用性要素で、与えられた宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増大させるように作用する。エンハンサーの例には、bp100から270の複製起点の後期側に位置するSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
【００４７】
翻訳されたタンパク質のエンプラズミックレティキュラムの内腔、細胞膜周辺腔、または細胞外環境への分泌のため、適切な分泌シグナルを発現されるポリペプチドに取り込むことができる。このシグナルはそのポリペプチドに対して内在性シグナルであっても異種シグナルであってもよい。
ポリペプチドは、融合タンパク質のような修飾形態で発現されてもよく、分泌シグナルだけでなく追加的な異種機能領域を含んでいても良い。従って、例えば、追加のアミノ酸領域、特に荷電アミノ酸の領域、をポリペプチドのN-末端に付加して宿主細胞中、精製の際、または続く操作および保存における安定性および維持性を改善することができる。また、ペプチド部分をポリペプチドに付加して精製を容易にすることもできる。
【００４８】
本発明のポリペプチド
本発明は配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11または配列番号12のポリヌクレオチドを適切な宿主中で発現させることによって得られるアミノ酸配列、からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを提供する。また、上記ポリペプチドの機能的等価物を含むペプチドまたはポリペプチドも本発明に含まれる。上記ポリペプチドは総称的に用語「本発明のポリペプチド」に含まれる。
用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は（一般に認識されているように）同義語であり、各用語はペプチド結合によって結合した少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すために必要とされる文脈において互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」は本明細書では７個を越えるアミノ酸残基を含む鎖について使用する。本明細書において、全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は左から右へアミノ末端からカルボキシ末端の方向に記載される。本明細書に用いるアミノ酸の一文字表記はこの分野で一般に使用されるものであり、Sambrookら、(Molecular Cloning: A Laboratory Manual第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)に見ることができる。
【００４９】
「単離」ポリペプチドまたはタンパク質とは、その天然環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質を意図している。例えば、組換え的に作製されたポリペプチドおよび宿主細胞にて発現されたタンパク質は、何らかの適切な技術、例えばSmithとJohnson, Gene 67:31-40 (1988)において一段精製法により実質的に精製された天然または組換えペプチドとして本発明の目的について単離されたと考えられる。
本発明のアミラーゼは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、よく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収および精製することができる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を精製のために使用することができる。
本発明のポリペプチドには、天然の精製産物、化学的合成方法の産物、原核または真核宿主（例えば、バクテリア、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞）から組換え技術によって作製した産物が含まれる。組換え生産方法に用いた宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていることもされていないこともある。加えて、本発明のポリペプチドは、宿主媒介過程の結果として、ある場合には修飾開始メチオニン残基を含むこともある。
【００５０】
タンパク質断片
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片にも関する。
本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片には、このタンパク質（例えば、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17または配列番号18のアミノ酸配列）と充分に同一またはそれに由来するアミノ酸配列を含み、完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含む、対応する完全長タンパク質の少なくとも一つの生物学的活性を示すポリペプチドが含まれる。典型的には、生物学的に活性な断片はアルファアミラーゼの少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のタンパク質の生物学的に活性な断片は、例えば、長さ10、25、50、100またはそれ以上のアミノ酸長であってよい。さらに、他の生物学的に活性な、タンパク質の他の部分が除去されたタンパク質を組換え技術により調製し、本発明のポリペプチドの未変性形態の１以上の生物学的活性について評価することができる。
本発明はまた、アルファアミラーゼの上述の生物学的に活性な断片をコードする核酸断片も特徴とする。
【００５１】
融合タンパク質
本発明のタンパク質またはその機能的等価物、例えば、その生物学的に活性な部分を非-アルファ-アミラーゼポリペプチド（例えば、異種アミノ酸配列）に機能的に連結して融合タンパク質を形成させることができる。本明細書において、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は非-アルファ-アミラーゼポリペプチドに機能的に連結したアルファアミラーゼを含む。好ましい実施態様において、融合タンパク質は本発明のタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な断片を含む。ここで、用語「機能的に連結」したとは、アルファアミラーゼおよび非-アルファアミラーゼが互いにインフレームでアルファアミラーゼのN-末端またはC-末端に融合していることを意図している。
例えば、一つの実施態様において、融合タンパク質は、アルファアミラーゼ配列がGST配列のC-末端に融合したGST-融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は本発明の組換えタンパク質の精製を容易にすることができる。他の実施態様において、融合タンパク質はそのN-末端で異種シグナル配列に融合した本発明のタンパク質が含まれる。ある宿主細胞においては（例えば、動物宿主および酵母宿主）、本発明の発現および／または分泌は異種シグナル配列の使用により増加させることができる。
【００５２】
他の例において、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列を異種シグナル配列として使用することができる(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら、編集、John Wiley & Sons, 1992)。真核性シグナル配列の他の例には、メリチンおおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼ（Stratagene; La Jolla, California）の分泌配列が含まれる。更にまた別の例では、有用な原核性シグナル配列にはphoA分泌シグナル（Sambrookら、上述）およびプロテインA分泌シグナル(Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey)が含まれる。
シグナル配列は本発明のタンパク質の分泌および単離を容易にするために使用することができる。シグナル配列は典型的には、一般に１以上の切断事象において分泌の際に成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアによって特徴付けられる。そのようなシグナルペプチドは分泌経路を通過するときに成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を許すプロセッシング部位を含む。シグナル配列は、発現ベクターが導入された真核宿主からの分泌のように、タンパク質の分泌を指令し、このシグナル配列は続いてまたは同時に切断される。次に、タンパク質はこの分野で認知されている技術によって細胞外培地から容易に精製することができる。あるいは、シグナル配列は、GSTドメインのような精製を容易にする配列を用いて、注目するタンパク質に結合させることができる。従って、例えば、ポリペプチドをコードする配列をマーカー配列、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列に融合させてもよい。本発明の特徴のある好ましい態様において、マーカー配列は、例えば、商業的に入手可能な多数の中でpQEベクター（Qiagen, Inc）中に提供されるtagのようなヘキサ-ヒスチジンペプチドである。Gentzら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)中に記載されるように、例えば、ヘキサ-ヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を援助する。HAタグはインフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する、精製のための有用な別のペプチドであり、Wilsonら、例えばCell 37：767 (1984)に記載されている。
【００５３】
好ましくは、本発明のタンパク質を含むキメラタンパク質または融合タンパク質は標準的な組換えDNA技術によって作製される。例えば、種々のポリペプチドをコードするDNA断片は慣用技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端または突出末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて接着末端のフィルイン、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理および酵素的連結によって、インフレームで一緒に連結される。別の態様において、融合遺伝子は自動化DNA合成機を含む慣用技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅を２つの連続する遺伝子断片間で相補的な突出部を生じさせるアンカープライマーを用いて行い、これらの断片を続いてアニーリングさせ、再増幅させ、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 編集Ausubelら、John Wiley & Sons:1992）。さらに、既に融合部分（例えばGSTポリペプチド）をコードしている多数の発現ベクターが商業的に入手可能である。本発明の核酸は、そのような発現ベクターへ、融合部分が本発明のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させるため融合部分へインフレームで連結するようにクローニングすることができる。
【００５４】
機能的等価物
用語「機能的等価物」および「機能的変異体」は、本明細書では互換的に使用される。本明細書に記載のアルファアミラーゼをコードするDNAの機能的等価物は本明細書に規定するA.ニゲルアミラーゼの特定の機能を示すポリペプチドをコードする単離DNA断片である。本発明のポリペプチドの機能的等価物は、本明細書に規定するA.ニゲルアミラーゼの少なくとも一つの機能を示すポリペプチドである。それらの機能的等価物には生物学的に活性な断片が包含される。
機能的タンパク質等価物または機能的ポリペプチド等価物は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17または配列番号18に示した配列において１以上のアミノ酸の保存的置換のみを含んでいることも、または、非必須アミノ酸の置換、挿入または欠失を含むこともある。従って、非-必須アミノ酸は配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17または配列番号18において、その生物学的機能を実質的に変えることなく改変することのできる残基である。例えば、本発明のタンパク質間で保存されているアミノ酸残基は特に改変を受け入れがたいと予測される。さらに、本発明のタンパク質と他のアミラーゼの中で保存されているアミノ酸は改変が許容されそうもない。
【００５５】
用語「保存的置換」は類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換える置換を意味するべく意図されている。このような同族はこの分野で知られており、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を持たない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００５６】
機能的核酸等価物は典型的にはサイレント変異、またはコードされるポリペプチドの生物学的機能を改変しない変異が含まれる。従って、本発明は特定の生物学的活性について本質的でないアミノ酸残基における改変を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。そのようなタンパク質は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17または配列番号18とはアミノ酸配列において異なっているが、なお少なくとも一つの生物学的活性を維持している。一つの実施態様において、単離された核酸分子は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも約40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同またはそれ以上の相同性のある、実質的に相同なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をどのように作製するかに関するガイダンスはBowie, J.U.ら、Science 247:1306-1310(1990)に提供されており、そこでは著者らは、アミノ酸配列の変更に対する寛容性を研究するためには２つの主要なアプローチがあることを示している。第１の方法は、変異が天然の選抜によって許容されるか拒絶されるかという、進化の過程に依存している。第２のアプローチは、遺伝子操作を用いてクローニングされた遺伝子の特定の位置においてアミノ酸変更を導入し、機能が維持されている配列を選抜またはスクリーニングする。著者らが述べているように、これらの研究により、タンパク質はアミノ酸置換に対して驚くほど慣用であることが明らかになっている。著者らは更にタンパク質のある部位においてどの改変が許容されやすいかを示している。例えば、大部分の埋め込まれたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、一方、表面側側鎖の特徴は一般にあまり保存されない。その他のこのような表現型的サイレント置換はBowieら（既出）およびそこに引用される文献に記載されている。
【００５８】
配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質に相同なタンパク質をコードする単離核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるヌクレオチド配列を有するヌクレオチドコード配列に、コードするタンパク質に１以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入が導入されるように１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作製することができる。そのような変異は、部位特異的変異導入およびPCR-媒介変異導入のような標準的な技術によって導入することができる。
【００５９】
用語「機能的等価物」は本明細書において提供されるA.ニゲルアルファアミラーゼのオルソログ（orthologue,相同分子種）も包含する。A.ニゲルアルファアミラーゼのオルソログは他の株または種から単離することができ、類似または同一の生物学的活性を有するタンパク質である。そのようなオルソログは配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列に実質的に相同であるアミノ酸配列を含むとして容易に同定することができる。
本明細書において、用語「実質的に相同」とは、第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と同一または等価な（例えば類似の側鎖を有する）アミノ酸の充分な若しくは最小限の数を含み、第１および第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が共通のドメインを有することをいう。例えば、約40％、好ましくは65％、より好ましくは70％、更に好ましくは75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一性を有する共通のドメインを含むアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は本明細書では充分に同一であると定義される。
【００６０】
また、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれる配列と異なるヌクレオチド配列を有する他のアルファアミラーゼファミリーのメンバーをコードする核酸もまた本発明の範囲内である。更に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれる配列と異なるヌクレオチド配列を有する、異なる種由来のアルファアミラーゼをコードする核酸も本発明の範囲内である。
本発明のDNAの変異体（例えば、天然のアレル変異体）に対応する核酸分子および類似体は本明細書に開示した核酸に対するそれらの相同性に基づいて、標準的なハイブリダイゼーション条件に従い、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で本明細書に開示したcDNAまたはその適切な断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いて単離することができる。
本明細書に提供したA.ニゲル配列の天然に存在するアレル変異体に加えて、当業者は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるヌクレオチド配列を変異させることによって変化を導入することができ、それによってアルファアミラーゼタンパク質の機能を実質的に変更せずにアルファアミラーゼタンパク質のアミノ酸配列に変異を生じさせることができることを認識するであろう。
【００６１】
本発明の別の側面において、改善されたアルファアミラーゼが提供される。改善されたアルファアミラーゼとは少なくとも一つの生物学的活性が改善されたタンパク質である。そのようなタンパク質は、飽和変異導入のようなコード配列の全体または一部へのランダム変異導入によって得ることができ、得られた変異体は組換え的に発現させ、生物学的活性についてスクリーニングすることができる。例えば、この分野ではアミラーゼの酵素活性を測定するための標準的なアッセイが提供されており、従って、改善されたタンパク質が容易に選択できるであろう。
好ましい実施態様において、本アルファアミラーゼは配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する。他の実施態様において、本アルファアミラーゼは配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列に実質的に相同であって、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を維持しているが、天然の変異または変異導入のためにアミノ酸配列がこれらと異なっている。
【００６２】
さらなる実施態様において、本アルファアミラーゼは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群、または、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群、より選ばれるヌクレオチド配列を有する核酸に、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズし得る単離核酸断片によってコードされるアミノ酸配列を有する。
従って、本発明のアルファアミラーゼは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列に対して少なくとも40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはこれより高い相同性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を維持している単離タンパク質である。
【００６３】
本発明のタンパク質の機能的等価物はまた、例えば、変異体のコンビナトリアルライブラリー、例えば本発明のタンパク質の短縮変異体をアミラーゼ活性についてスクリーニングすることによっても同定することができる。一つの実施態様において、変異体の多様なライブラリーは核酸レベルでのコンビナトリアル変異導入によって作製することができる。変異体の多様なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、可能なタンパク質配列の縮退集合が個々のポリペプチドとして、あるいは、より大きなタンパク質融合体の集合として（例えばファージディスプレイ）発現可能となるように遺伝子配列へ酵素的に連結することによって作製することができる。縮退オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの可能な変異体のライブラリーを作製するために使用できる種々の方法が存在する。縮退オリゴヌクレオチドを合成する方法はこの分野で知られたものである（例えば、Narang(1983) Tetrahedron 39:3；Itakuraら、(1984)Annu. Rev. Biochem. 53:323；Itakuraら(1984)Science 198:1056；Ikeら、(1983) Nucleic Acid Res. 11:477）。
【００６４】
加えて、本発明のポリペプチドのコード配列の断片のライブラリーを使用して、続く変異体の選抜スクリーニングのための多様なポリペプチド集団を作製することができる。例えば、コード配列断片のライブラリーは、注目するコード配列の二本鎖PCR断片を、一分子あたり約1回だけニックが入るような条件下でヌクレアーゼで処理し、その二本鎖DNAを変性させ、DNAを復元させて異なるニック産物からのセンス／アンチセンスを含み得る二本鎖DNAを形成させ、再形成させた二本鎖の一本鎖部分をS1ヌクレアーゼで処理し、得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結することにより作製することができる。この方法により、注目するタンパク質の種々のサイズのN-末端および内部断片をコードする発現ベクターが導かれる。
点変異導入または短縮化によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および、選択した特性を有する遺伝子産物についてcDNAをスクリーニングするためのいくつかの技術がこの分野で知られている。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために最も広く用いられている、高処理解析が容易な技術にには、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、適切な細胞を得られたベクターのライブラリーでトランスフォーメーションし、所望の活性を検出することがその産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易とさせるような条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。再帰的アンサンブル変異導入(recursive ensemble mutagenesis)（REM）はライブラリー中の機能変異体の頻度を高める技術であるが、これをスクリーニングアッセイと組み合わせて本発明のタンパク質の変異体を同定することができる(ArkinとYourvan(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgraveら、(1993) Protein Engineering 6(3):327-331)。
【００６５】
当業者には、任意の集団中でアルファアミラーゼのアミノ酸配列中に変化を生じさせ得るDNA配列多型が存在することがあるのが理解されるであろう。そのような遺伝的多型は天然のアレル変異のために異なる集団からの細胞または一つの集団内で存在し得る。アレル変異体は機能的等価物も含み得る。
本発明のポリヌクレオチドの断片は機能的ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドを含み得る。そのようなポリヌクレオチドはプローブとして、またはPCR反応のためのプライマーとして機能し得る。
本発明の核酸はそれが機能的ポリペプチドをコードするか、非機能的ペプチドをコードするかに関わりなく、ハイブリダーゼーションプローブとして、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーとして使用することができる。アルファアミラーゼ活性を有しないポリペプチドをコードする本発明の核酸分子の使用には、とりわけ以下が含まれる：（１）cDNAライブラリー、例えばA.ニゲルと異なる他の生物由来のcDNAライブラリーからの、アルファアミラーゼをコードする遺伝子またはそのアレル変異体の単離；（２）Vermaら、Human Choromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)に記載されているような、アルファアミラーゼ遺伝子の正確な染色体上の位置を与えるための中期染色体展開物に対するin situハイブリダイゼーション(例えばFISH)；（３）特異的な組織および／または細胞におけるアルファアミラーゼmRNAの発現を検出するためのノーザンブロット解析および（４）任意の生物学的サンプル（例えば組織）において、アルファアミラーゼプローブにハイブリダイズし得る核酸の存在を解析するための診断ツールとして使用することができるプローブおよびプライマー。
【００６６】
また、本発明には、アルファアミラーゼ遺伝子またはcDNAの機能的等価物を得る方法が包含される。そのような方法は以下を必要とする；配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する配列の全体または一部をコードする単離核酸またはそれらの変異体を含む標識されたプローブを得ること；ライブラリー中の核酸断片へのプローブのハイブリダイゼーションを可能とし、核酸二本鎖を形成させることが可能な条件下で、標識プローブで核酸断片ライブラリーをスクリーニングすること、および、いずれかの標識二本鎖中の核酸断片から完全長遺伝子配列を調製して、アルファアミラーゼ遺伝子に関連した遺伝子を得ること。
一つの実施態様において、本発明の核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11または配列番号12に示した核酸配列またはこれらの相補配列に対して、少なくとも40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはこれより高い相同性を有する。
別の実施態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17または配列番号18に示したアミノ酸配列に対して、少なくとも40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはこれより高い相同性を有する。
【００６７】
宿主細胞
別の実施態様において、本発明は本発明に包含される核酸を含む細胞、例えば、形質転換細胞または組換え宿主細胞を特徴とする。「形質転換細胞」または「組換え細胞」は組換えDNA技術によって本発明の核酸が導入されている細胞（またはその子孫）である。原核細胞および真核細胞のどちらも含まれる（例えばバクテリア、真菌、酵母、その他、特に好ましいのは糸状菌、特にアスペルギルス・ニゲルの細胞である）。
特異的な、望ましい様式で、挿入した配列の発現を調節する、または遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする細胞を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）はタンパク質の最適な機能発揮を容易にし得る。
種々の細胞はタンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび改変について特徴的で特異的な機構を有している。発現された外来性タンパク質の所望の正しい修飾およびプロセッシングを保証するために、分子生物学および／または微生物学の分野で当業者によく知られた適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のため、一次転写物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化、リン酸化のための細胞機構を保持する真核宿主細胞を使用することができる。そのような宿主細胞はこの分野でよく知られたものである。
宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38および脈絡叢細胞株のような哺乳動物細胞株が含まれるが、これらには限定されない。
【００６８】
所望であれば、本発明のポリペプチドは安定にトランスフェクションされた細胞株によって産生することができる。哺乳動物細胞の安定トランスフェクションのために適した多数のベクターが公衆に利用可能であり、そのような細胞株を構築するための方法も公知である（例えば、Ausubelら（既出））。
【００６９】
抗体
本発明は、更に本発明のアルファアミラーゼに特異的に結合する抗体、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を特徴とする。
本明細書において、用語「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(Mab)は、インタクトな分子および、本発明のタンパク質に特異的に結合し得る（例えばFabおよびF(ab')2断片のような）抗体断片を含むことが意図されている。FabおよびF(ab')2断片はインタクトな抗体のFc断片を欠いており、循環からより迅速に消失し、インタクトな抗体よりも少ない非特異的組織結合性を有し得る（Wahlら、J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)）。従って、これらの断片が好ましい。
【００７０】
本発明の抗体は種々の方法の何れを用いて調製しても良い。例えば、本発明のアルファアミラーゼまたはその抗原性断片を発現している細胞を動物に投与してポリクローナル抗体を含む血清生産を誘導することができる。好ましい態様において、本発明のタンパク質の調製物はそれが天然の夾雑物を実質的に含まないように調製および精製される。次に、そのような調製物を動物に導入してより比活性の高いポリクローナル抗血清を作製する。最も好ましい態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（または、そのアルファアミラーゼ結合断片）である。そのようなモノクローナル抗体はハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（Kohlerら、Nature 256:495(1975)；Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)；Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp563-681 (1981)）。一般に、そのような手順は動物（好ましくはマウス）を本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を発現している細胞で免疫感作することを含む。そのようにして免疫感作したマウスの脾細胞を抽出し、適切なミエローマ細胞株と融合させる。本発明に従って、どのような適切ミエローマ細胞株を使用してもよいが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville、Marylandから入手できる親ミエローマ細胞株(SP2O)を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞はHAT培地中で選抜的に維持され、次にWandsら（Gastro-enterology 80:225-232 (1981)）に記載されたように限界希釈によってクローニングされる。次にそのような選抜を通して得られたハイブリドーマ細胞をアッセイしてアルファアミラーゼ抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定する。一般に、Ausubelら、（既出）に記載されたようにポリペプチドはKLHのような担体タンパク質に結合され、アジュバントと混合されて、宿主哺乳動物に注射される。
【００７１】
特に、注目するポリペプチドの注射によって種々の宿主動物を免疫感作することができる。適切な宿主動物の例にはウサギ、マウス、モルモット、およびラットが含まれる。免疫学的応答を増加させるため、宿主の種に依存して種々のアジュバントを使用することができ、それらにはフロイントの完全および不完全アジュバント、水酸化アルミニウムのような無機物ゲル、リゾレシチンのような表面活性化物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、BCG（カルメット-ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム・パルバム(Corinebacterium parvum)が含まれるが、これらには限定されない。ポリクローナル抗体は感作動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。
【００７２】
そのような抗体はIgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらのいずれかのサブクラスを含む、どの免疫グロブリンクラスでもあり得る。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitroまたはin vivoで培養することができる。
一旦作製されたならば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は本発明のタンパク質またはそれらの機能的等価物の特異的認識について、Ausubelら（既出）に記載されているような標準的技術を用いたウエスタンブロットまたは免疫沈降解析のような免疫アッセイにおいてテストされる。本発明のタンパク質またはそれらの機能的等価物に特異的に結合する抗体は本発明において有用である。例えば、そのような抗体は本発明のタンパク質をアスペルギルスの病原性または非病原性株において（例えば、アスペルギルス抽出物中に）検出するための免疫アッセイに使用することができる。
【００７３】
好ましくは、本発明の抗体は、荷電残基の頻度の高さのような基準により、抗原性がありそうな本発明のタンパク質の断片を用いて作製される。例えば、そのような断片は標準的なPCR技術によって作製し、次にpGEX発現ベクター（Ausubelら、既出）にクローニングすることができる。次に融合タンパク質は大腸菌にて発現され、Ausubelら（既出）に記載されているように、グルタチオンアガロースアフィニティーマトリックスを用いて精製することができる。所望であれば、各タンパク質についていくつか（例えば２つまたは３つ）の融合物を作製することができ、各融合物を少なくとも二匹のウサギに注射することができる。一連の注射（典型的には少なくとも３回のブースト注射が含まれる）によって抗血清を生じさせることができる。典型的には、本発明の組換えアルファアミラーゼまたはそれらの機能的等価物を免疫沈降させる能力について抗血清を検査する。一方、無関係のタンパク質は免疫反応の特異性の対照として作用するであろう。
【００７４】
あるいは、一本鎖抗体作製について記載された技術（米国特許第4,946,778号および第4,704,692号）を適合させて本発明のタンパク質またはそれらの機能的等価物に対する一本鎖抗体を作製することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは商業的に、例えば、Pharmaciaから入手可能である。
更に、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに使用するために特に許容される方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号、PCT公報WO 92/18619、PCT公報WO 91/17271、PCT公報WO 20791、PCT公報WO 92/20791、PCT公報WO 92/15679、PCT公報 WO 93/01288、PCT公報WO 92/01047、PCT公報WO 92/09690、PCT公報WO 90/02809、Fuchsら、(1991)Bio/Technology 9:1370-1372、Hayら、(1992)Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85、Huseら、(1989)Science 246:1275-1281、Griffithsら、（1993）EMBO J. 12:725-734に見ることができる。
【００７５】
本発明のタンパク質またはそれらの機能的等価物に特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、たとえば、本発明のタンパク質またはそれらの機能的等価物をコードする遺伝子の発現を（例えば、アスペルギルスの他の株において）検出するために使用することができる。例えば、本発明のタンパク質はアスペルギルス細胞または抽出物の通常の免疫アッセイにおいて容易に検出することができる。適切なアッセイには、ウエスタンブロット、ELISA、放射免疫アッセイ、その他が含まれるがこれらに限定されない。
「特異的に結合」するとは、抗体が特定の抗原、例えば本発明のタンパク質またはポリペプチド、を認識し結合するが、サンプル中の他の無関係の分子を実質的に認識および結合しないことを意味する。
抗体は、例えば、ポリペプチド抗原が樹脂に固定化されているアフィニティークロマトグラフィー法によって精製することができる。
【００７６】
本発明のポリペプチドに対する抗体（例えば、モノクローナル抗体）はアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準的な技術によってポリペプチドを単離するために使用することができる。さらに、そのような抗体は、ポリペプチドの発現量および発現パターンを評価するために（例えば、細胞抽出物または細胞上清中の）タンパク質を検出するために使用することができる。抗体はまた臨床試験手順の一部として細胞または組織のタンパク質レベルをモニターするため、例えば、アスペルギルス症の任意の治療レジメンの効果を決定するため若しくは診断において、診断的に使用することもできる。
抗体を検出物質と共役させることにより検出が容易になり得る。検出物質の例には種々の酵素、置換基、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例にはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、または、アセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な蛍光物質の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンが含まれ、発光物質の例にはルミノールが含まれ、生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、適切な放射性物質の例には125I、131I、35Sまたは3Hが含まれる。
【００７７】
抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープはタンパク質の表面上に位置する、例えば親水性領域に位置する領域である。本発明の疎水性プロットは親水性領域を同定するために使用することができる。
本発明のタンパク質の抗原性ペプチドは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群より選ばれるアミノ酸配列の少なくとも７個（好ましくは10、15、20または30個）の連続するアミノ酸残基を含み、このペプチドに対して生じた抗体がそのタンパク質と特異的な免疫複合体を形成するように、そのタンパク質のエピトープを含む。
抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは本発明のタンパク質の領域であって、本タンパク質の表面に位置する領域、例えば、親水性領域、疎水性領域、α領域、β領域、コイル領域、ターン領域およびフレシキブル領域である。
【００７８】
免疫アッセイ
生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドの定性的または定量的測定はこの分野で既知の方法を用いて行うことができる。抗体を基礎とする技術は生物学的サンプル中の特異的なポリペプチドレベルをアッセイするための特別な利点を与える。
それらの中で、特異的な認識は一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって与えられるが、二次検出系は蛍光、酵素、または他の共役二次抗体を利用することができる。その結果として、免疫複合体が得られる。
従って、本発明はある生物がアスペルギルスに感染しているかどうかを診断する方法を提供する。その方法は以下の工程を含む：
・アスペルギルス感染が疑われる生物から生物学的サンプルを単離すること、
・前記生物学的サンプルを本発明の抗体と反応させること、
・免疫複合体が形成されたかどうかを決定すること。
【００７９】
ウエスタンブロットまたはドット／スロットアッセイのためのタンパク質を遊離させるために、たとえば尿素および中性の変性剤で組織を抽出することもできる。この技術は体液にも適用できる。
抗体を基礎とする、本発明のタンパク質を検出するために有用な他の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、および放射免疫アッセイ（RIA）のような免疫アッセイが含まれる。たとえば、本発明に対する特異的モノクローナル抗体は本発明のタンパク質を検出および定量するための免疫吸着剤および酵素標識プローブとして使用することができる。サンプル中に存在する特定のタンパク質の量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを用いて標準調製物中に存在する量を参照することにより計算することができる。他のELISAアッセイにおいて、２つの別個の特異的なモノクローナル抗体を使用して生物学的体液中の本発明のタンパク質を検出することができる。このアッセイにおいて、抗体の一つが免疫吸着剤として使用され、他の抗体が酵素-標識プローブとして使用される。
【００８０】
上述した技術は本質的に「一段階」または「二段階」アッセイとして行うことができる。「一段階」アッセイは、本発明のタンパク質を固定化抗体と接触させ、洗浄せずに、この混合物を標識抗体と接触させることを含む。「二段階」アッセイは混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを含む。他の慣用的な方法も適しているのならば使用することができる。アッセイ系の一つの構成成分を支持体上に固定化することが通常好ましく、それによりこの系の他の構成成分がこの構成成分と接触しサンプルから容易に取り出されることが可能となる。
適切な酵素標識には、たとえば、基質と反応することにより過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ類が含まれる。オキシダーゼ標識の活性は酵素-標識抗体／基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによりアッセイすることができる。
酵素の他に他の適切な標識にはヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム(3H)、インジウム(112In)およびテクネチウム(99mTc)のような放射性同位体、およびフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、およびビオチンが含まれる。
【００８１】
テスト化合物の本発明のタンパク質への特異的結合は、たとえば、可逆的または不可逆的に本発明のタンパク質を基材上、たとえば96穴ポリスチレンマイクロタイタープレートのウエルの表面に固定化することによってin vitroで検出することができる。ポリペプチドおよび他の小分子を固定化する方法はこの分野でよく知られている。たとえば、ポリペプチドを溶液として（典型的には１〜100μlの体積中0.05〜１mg/mlの濃度で）各ウエルに加え、そのプレートを室温から37℃にて0.1時間から36時間インキュベーションすることにより、マイクロタイタープレートを本発明のタンパク質で被覆することができる。プレートに結合しなかったポリペプチドは過剰な溶液を振り落とし、次にプレートを（１回または繰り返し）水またはバッファーで洗浄することによりプレートから除去することができる。典型的には、ポリペプチドは水またはバッファー中に含まれている。次にプレートを結合ペプチドを含まないバッファーで洗浄する。プレート上の遊離のタンパク質-結合部位をブロックするため、プレートを結合ペプチドと無関係のタンパク質でブロッキングする。たとえば、Tris-HCl中2mg/mlの濃度の300μlのウシ血清アルブミン（BSA）が適している。適切な基材には所定の架橋性の化学的性質を含む基材（たとえば、Corning  Costar Corp.(Cambridge, MA)のポリスチレン、スチレン、またはポリプロピレン基材）が含まれる。所望であれば、ビーズ状粒子、たとえばアガロースビーズまたはセファロースビーズを基材として使用することができる。
【００８２】
本発明のポリペプチドへのテスト化合物の結合はこの技術で既知の種々の方法にいずれによっても検出することができる。たとえば、特異的な抗体を免疫アッセイにおいて使用することができる。所望であれば、この抗体は標識することができ（たとえば、蛍光標識または放射性同位体を用いて）、直接検出することができる（例えばWest and McMahon, J. Cell Biol. 74:264, 1977を参照せよ）。あるいは、検出のために第２の抗体（たとえば、抗-AN97抗体のFc部分に結合する標識抗体）を使用することができる。別の検出方法において、本発明のタンパク質が（たとえば、放射性同位体、蛍光団、発色団その他により）標識され、この標識が検出される。さらにまた別の方法において、本発明のタンパク質は光学的に検出できるタンパク質、たとえば（UV光の下で検出できる）緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質として生産される。別の方法において、本発明のタンパク質は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼのような検出可能な酵素活性を有する酵素に共有結合的に付加または融合させることができる。これらの酵素をコードする遺伝子は全てクローニングされており、当業者が使用するために容易に利用可能である。所望であれば、融合タンパク質は抗原を含むことができ、そのような抗原はポリクローナルまたはモノクローナル抗体により慣用的な方法を用いて検出することができる。適切な抗原には酵素（たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびガラクトシダーゼ）、および非酵素ポリペプチド（たとえば、BSAおよびグロブリンのような血清タンパク質、および、カゼインのような乳タンパク質）が含まれる。
【００８３】
エピトープ、抗原および免疫原
他の側面において、本発明は本発明のポリペプチドのエピトープ保持部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」とは、タンパク質全体が免疫原である場合に抗体応答を顕在化させるタンパク質の部分として定義される。これらの免疫原性エピトープは分子のいくつかの位置に限定されていると考えられている。一方、抗体が結合することのできるタンパク質分子の領域は「抗原性エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は抗原性エピトープの数よりも一般には少ない。たとえば、Geysen, H.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002(1984)を参照せよ。
【００８４】
抗原性エピトープを保持するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結合することのできるタンパク質部分の領域を含む）の選抜について、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたそのタンパク質と反応する抗血清を一般に誘導できることがこの分野でよく知られている。例えば、Sutcliffe, J.G.ら、Science 219:660-666(1984)を参照せよ。タンパク質反応性血清を誘起し得るペプチドはタンパク質の一次配列中に頻度高く提示されており、一組の単純な化学的規則によって特徴付けることができ、インタクトなタンパク質の免疫支配領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にもアミノ末端若しくはカルボキシル末端にも限定されない。極めて疎水性であるペプチドおよび６残基以下のペプチドは一般に模倣されたタンパク質に結合する抗体を誘導することにおいて効果的でない；より長い、可溶性のペプチド、特にプロリン残基を含むペプチドが通常効果的である。Sutcliffeら（既出）、661。例えば、このガイドラインに従って設計した、インフルエンザウイルスヘマグルチニンHA1ポリペプチド鎖の配列の75％をカバーする８〜39残基を含む20個のペプチドの内18個がHA1タンパク質またはインタクトなウイルスと反応する抗体を誘導した；そして、MuLVポリメラーゼからのペプチドの12/12および狂犬病糖タンパク質からのペプチドの18/18がそれぞれのタンパク質を沈降させる抗体を誘導した。
【００８５】
従って、本発明の抗原性エピトープ保持ペプチドおよびポリペプチドは本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を生じさせるのに有用である。従って、抗原性エピトープ保持ペプチドで免疫感作された供与体の脾臓細胞の融合によって得られるハイブリドーマは高い比率で一般に未変性タンパク質と反応する抗体を分泌する。Sutcliffeら（既出）663。抗原性エピトープ保持ペプチドまたはポリペプチドによって誘起された抗体は模倣されたタンパク質を検出するために有用であり、異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プロセッシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の運命を追跡するために使用することができる。ペプチドおよび抗-ペプチド抗体は、短いペプチド（例えば約９個のアミノ酸）であっても結合することができ、免疫沈降アッセイにおいてより長いペプチドを置換できることが示されているので、模倣されたタンパク質の種々の定性的または定量的アッセイ、例えば競合アッセイ、に使用することができる。例えば、Wilson, I.A.ら、Cell 37:767-778,777 (1984)を参照せよ。本発明の抗-ペプチド抗体は模倣されたタンパク質の精製、例えばこの分野でよく知られた方法を用いた吸着クロマトグラフィーによる精製、にも有用である。
【００８６】
上述のガイドラインに従って設計された、本発明の抗原性エピトープ保持ペプチドおよびポリペプチドは好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に含まれる少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは約15〜約30個のアミノ酸を含む。しかしながら、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより長い部分を含む、約30〜約50アミノ酸、または本発明のアミノ酸配列全体までを含むペプチドまたはポリペプチドも本発明のエピトープ保持ペプチドまたはポリペプチドと考えられ、模倣されたタンパク質と反応する抗体を誘導するために有用である。好ましくは、エピトープ保持ペプチドのアミノ酸配列は水性媒体中で実質的な溶解性を与えるために選択される（すなわち、この配列はかなり親水性の残基を含み、高度に疎水性の配列は避けるのが好ましい）；かつ、プロリン残基を含む配列が特に好ましい。
【００８７】
本発明のエピトープ保持ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を用いた組換え的手段を含む、ペプチドまたはポリペプチドを作製するためのどのような慣用的手段によって作製しても良い。例えば、組換え生産および精製の際および抗-ペプチド抗体を作製するための免疫感作の際に、短いエピトープ保持アミノ酸配列を、担体として作用する、より大きなポリペプチドに融合させることができる。
エピトープ保持ペプチドは化学合成の既知の方法を用いて合成することができる。Houghtenは、多数のペプチドを合成するための単純な方法、例えば、HA1ポリペプチドの断片の単一アミノ酸変種を表す10〜20mgの248個の異なる13残基ペプチドを合成するための方法、を記載しており、これらのペプチドは４週間足らずのうちに調製および解析（ELISA-型結合分析）された（Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985)）。この「同時複式ペプチド合成（Simultaneous Multiple Peptide Synthesis） (SMPS)」法はHoughtenらの米国特許第4,631,211号（1986）に更に記載されている。この方法では、種々のペプチドの固相合成用の個々の樹脂が別々の溶媒透過性容器に入っており、固相法に含まれる多数の同一の繰り返し工程を最適に利用することができる。
完全に手動的方法により500〜1000以上の合成を同時に行うことが可能となる。Houghtenら、既出、5134。
【００８８】
本発明のエピトープ保持ペプチドおよびポリペプチドはこの分野でよく知られた方法に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Sutcliffeら（既出）；Wilsonら（既出）；Chow,M.ら、Proc. Natl. Ada. Sci. USA 82:910-914およびBittle, F.J.ら、Gen. Virol. 66:2347-2354(1985)を参照せよ。
一般に、動物は遊離のペプチドで免疫感作することができる；しかしながら、抗-ペプチド抗体の力価はペプチドをキーホールリンペットヘモシアニンに(KHL)または破傷風菌毒素のような巨大分子担体に結合させることによってブーストさせることができる。例えば、システインを含むペプチドはマレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)のようなリンカーを用いて担体に共役させることができ、一方他のペプチドはグルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を用いて担体に共役させることができる。
【００８９】
ウサギ、ラットおよびマウスのような動物を遊離又は担体共役ペプチドで、例えば、約100μgのペプチドまたは担体タンパク質およびフロイントのアジュバントを含む乳濁液の腹腔内および／または皮内注射によって免疫感作する。検出し得る（例えば、固相表面に吸着させた遊離のペプチドを用いたELISAアッセイによる）抗-ペプチド抗体の有用な力価を生じさせるために何回かのブースター注射が、例えば約２週間の間隔をおいて必要かも知れない。免疫感作した動物の血清中の抗-ペプチド抗体の力価は、例えばこの分野でよく知られた方法に従った固相支持体上のペプチドへの吸着および選択した抗体の溶出により、抗-ペプチド抗体を選抜することにより増加させることができる。
本発明の免疫原性エピトープ保持ペプチド、すなわちタンパク質全体が免疫原である場合に抗体応答を生じさせるタンパク質の部分、はこの分野で知られた方法によって同定される。例えば、Geysenら、1984（既出）には、酵素結合免疫吸着アッセイにおいて反応させるに充分な純度の数百のペプチドを固相支持体上で迅速に同時に合成するための方法が開示されている。
【００９０】
合成されたペプチドと抗体との相互作用は支持体からそれらを外さなくても容易に検出される。このようにして、当業者によれば所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保持するペプチドを日常的に同定することができる。例えば、手足口病ウイルスのコートタンパク質中の免疫学的に重要なエピトープは、Geysenらにより、このタンパク質の全213アミノ酸配列をカバーする208個の可能な全てのヘキサペプチドの重複集合を合成することによって７アミノ酸残基の解像度で位置が特定された。次に、全ての20アミノ酸がエピトープ内の各位置で置換されたペプチドの完全な置換集合を合成し、抗体との反応について特異性を与える特定のアミノ酸を決定した。このように、本発明のエピトープ保持ペプチドのペプチド類似体はこの方法により日常的に作製することができる。Geysenらの米国特許第4,708,781号（1987）には、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保持するペプチドを同定するこの方法が更に記載されている。
さらに、Geysenの米国特許第5,194,392号(1990)には、注目する抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープの位相幾何学的等価物（すなわち、「ミモトープ」（mimotope））であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的方法が記載されている。より一般的には、Geysenの米国特許第4,433,092号（1989）には、注目する特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの場所的等価物（topographical）であるモノマーの配列を検出または決定する方法が記載されている。同様に、ペルアルキル化オリゴペプチド混合物（Peralkylated Oligopeptide Mixtures）に関するHoughten, R.A.らの米国特許第5,480,971号(1996)には、直線状C1-C7-ペルアルキル化オリゴペプチド並びにそのようなペプチドの集合およびライブラリー、および、注目する受容分子へ優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためのそのようなペプチドの集合およびライブラリーの使用方法が記載されている。このように、本発明のエピトープ保持ペプチドの非ペプチド類似体もこれらの方法により日常的に作製することが出来る。
【００９１】
工業プロセスにおけるアルファアミラーゼの使用
本発明は、本発明のタンパク質のいくつかの工業的方法または製薬的方法における使用にも関する。これらの方法で得られた長期的経験にもかかわらず、本発明のアミラーゼは現在使用されている酵素に対して多数の有意な利点を特徴とする。具体的な用途に依存するが、これらの利点には低生産コスト、基質に対する高い特異性、低い抗原性、低副反応性、適切な微生物で生産した場合の高い収率、より適切なpHおよび温度範囲、および、食品品質およびコーシャ面はもちろん最終産物のより良好な風味のような特徴が含まれる。
本発明のアミラーゼの重要な特徴は、それらが種々の応用のために理想的に適した至適pHおよび至適温度範囲の全体をカバーしていることである。例えば、多くの大量処理は、例えば微生物感染の危険性を抑えるために、50℃またはそれ以上という比較的高い処理温度による利益が得られる。本発明のいくつかのアルファアミラーゼはこの要求性を満たすが、同時に、更なる熱処理による酵素の不活性化の試みに抵抗するほど熱安定ではない。後者の特徴は残存酵素活性のない最終製品を生み出す製造手段を可能とする。同様に多くの飼料製品および食品は僅かに酸性のpH値を有しているので、酸性または中性至適pHを有するアミラーゼはそれらの処理に好ましい。本発明のアルファアミラーゼはこの要求も満たしている。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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