(57)【要約】【課題】【解決手段】クモ糸タンパク質をコードする核酸類、ポリペプチド類、および、それに免疫学的に特異的な抗体類を開示する。それらの使用法もまた、提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２９番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２】
配列表の配列番号３０番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、ある核酸分子。
【請求項３】
配列表の配列番号３１番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項４】
配列表の配列番号３２番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項５】
配列表の配列番号３３番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項６】
配列表の配列番号３４番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項７】
配列表の配列番号３５番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項８】
配列表の配列番号３６番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項９】
配列表の配列番号３７番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１０】
配列表の配列番号３８番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１１】
配列表の配列番号３９番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１２】
配列表の配列番号４０番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１３】
配列表の配列番号４１番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１４】
配列表の配列番号４２番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１５】
配列表の配列番号４３番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１６】
配列表の配列番号４４番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１７】
配列表の配列番号４５番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１８】
配列表の配列番号４６番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項１９】
配列表の配列番号４７番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２０】
配列表の配列番号４８番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２１】
配列表の配列番号５０番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２２】
配列表の配列番号５１番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２３】
配列表の配列番号５２番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２４】
配列表の配列番号５３番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２５】
配列表の配列番号５４番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２６】
配列表の配列番号５５番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２７】
配列表の配列番号５６番が示すタンパク質及びその天然の対立遺伝子変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２８】
配列表の配列番号５６番とその天然の対立遺伝子変異体の、コンセンサス糸タンパク配列をコードする、核酸分子。
【請求項２９】
配列表の配列番号１〜２８番から成るグループから選択された核酸分子。
【請求項３０】
配列表の配列番号１〜２８番が示す核酸の少なくとも１つを有する、発現ベクター。
【請求項３１】
請求項３０記載の発現ベクターを有する宿主細胞。
【請求項３２】
配列表の配列番号２９番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項３３】
配列表の配列番号３０番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項３４】
配列表の配列番号３１番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項３５】
配列表の配列番号３２番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項３６】
配列表の配列番号３３番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項３７】
配列表の配列番号３４番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項３８】
配列表の配列番号３５番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項３９】
配列表の配列番号３６番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４０】
配列表の配列番号３７番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４１】
配列表の配列番号３８番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４２】
配列表の配列番号３９番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４３】
配列表の配列番号４０番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４４】
配列表の配列番号４１番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４５】
配列表の配列番号４２番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４６】
配列表の配列番号４３番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４７】
配列表の配列番号４４番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４８】
配列表の配列番号４５番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項４９】
配列表の配列番号４６番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５０】
配列表の配列番号４７番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５１】
配列表の配列番号４８番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５２】
配列表の配列番号４９番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５３】
配列表の配列番号５０番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５４】
配列表の配列番号５１番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５５】
配列表の配列番号５２番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５６】
配列表の配列番号５３番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５７】
配列表の配列番号５４番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５８】
配列表の配列番号５５番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項５９】
配列表の配列番号５６番を有する、クモ糸タンパク質。
【請求項６０】
配列表の配列番号５７番を有する、クモ糸アミノ酸コンセンサス配列。
【請求項６１】
配列表の配列番号２９〜５６から成るグループから選択されたクモ糸タンパク質。
【請求項６２】
請求項６１記載のタンパク質のうち少なくとも１つを有する糸ファイバ。
【請求項６３】
請求項６１のタンパク質のうち少なくとも２つを有する共重合ファイバ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、部分的に、米国国立科学財団（ＮＳＦ）の基金（助成金番号：ＭＣＢ−９８０６９９９）によって行われたため、米国特許法第２０２（ｃ）条に準じ、米国政府が本明細書に記載された本発明に権利を有することを、ここに認知する。
【０００２】
この発明は、分子生物学と細胞生物学の分野に関連する。具体的には、クモ糸ポリペプチド質をコードする核酸、クモ糸ポリペプチド、クモ糸ポリペプチドに特異的な抗体、およびそれらの使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
当発明が関係する到達水準をより充分に記載するために、この出願ではいくつかの刊行物を括弧に入れた番号で引用する。これらの引用文献の全リストは、明細書の最後に付けた。これらの刊行物のそれぞれの開示は、この引例により本明細書に一体化される。
【０００４】
クモの糸は、タンパク質のアミノ酸構成、タンパク質のアミノ酸構成での変異から起こる構造的特性、およびそのような変異がいかにタンパク質機能に影響するかの間の関係を調べるためのモデルシステムを有する。糸の産出は、節足動物内で複数回、進化したが、糸の使用はクモで非常に高度に発達している。クモは、多くの異なる糸タンパク質（もしくは、フィブロインタンパク質）のアレイを紡ぐ生涯の能力と、この能力に依存する程度においてユニークである。真正クモ目（Ａｒａｎｅａｅ）には３４，０００以上の記述された種がある（１）。それぞれの種は糸を利用し、いくつかの種の篩板をもたない（ｅｃｒｉｂｅｌｌａｔｅ）コガネグモ上科（Ａｒａｎｅｏｉｄｅａ）は、多岐にわたる機械的性質を有する、各仕事に特異的な糸の、多様なツールキットを有する（２）。Ａｒａｎｅｏｉｄ（コガネグモ上科のクモ類）の大瓶状糸（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ）、すなわち主な牽引糸は極めて強靭である。クモの巣の構築に用いられる、小瓶状糸（ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ）は高度な伸長力を有する。部分的に鞭状糸から成る、円網の捕獲螺旋（ｃａｐｔｕｒｅ  ｓｐｉｒａｌ）は、弾性で、壊れる前に長さが３倍になりうる（３）。これらの各ファイバは、クモ糸フィブロイン遺伝子ファミリーによってコードされる１つ以上のタンパク質から構成される（４）。Ａｒａｎｅｏｉｄのフィブロインの配列は、これらのフィブロインが４つの簡単なアミノ酸モチーフ：（？）ポリアラニン（Ａｎ）、交互に並ぶグリシンとアラニン（ＧＡ）、ＧＧＸ（Ｘはアミノ酸の小さなサブセットアミノ酸を表す）、ＧＰＧ（Ｘ）ｎの反復によって特色付けられる（５）。
【０００５】
クモは、分解したフィブロインタンパク質からファイバを引き出すが、これらは特別の組の腹部の腺に貯蔵されている。各タイプの糸は、紡糸口（ｓｐｉｎｎｅｒｅｔ）上の小さい開口部（ｓｐｉｇｏｔ）によって押し出されるまで、異なる腹部の腺によって分泌かつ貯蔵されている。牽引糸、隠れ家（ｒｅｔｒｅａｔ）、卵嚢、餌食を捕まえるわなを含む多様の目的で、クモはフィブロインタンパク質を単一で、または組み合わせて使用する。これらの特殊化された用途があるために、個々の糸は、特定の用途でその有用性を最適化する機械的性質（例えば、抗張力と柔軟性）を有するように進化したようであるらしい。
【０００６】
オオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ）のような円網性クモ類は、いくつかのタイプの糸合成腺から由来するクモ糸タンパク質を産生することが知られており、その源泉の器官にしたがって命名されている。存在することが知られるクモ糸タンパク質には、大瓶状クモタンパク質（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、小瓶状クモタンパク質（ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、および鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）、ナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）の各クモ糸タンパク質が含まれる。各器官から由来するクモ糸タンパク質は一般的に、それらの物理学的および化学的性質によって、他の合成器官から由来するクモ糸タンパク質から区別される。そのような物理学的および化学的性質によって、クモ糸は異なる使用法に適合できる。例えば、管状糸は卵嚢の外層に使用され、一方、ブドウ状糸は餌食を包むのに関与し、ナシ状糸はアッタチメントディスク（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｄｉｓｋ）として敷かれる。
【０００７】
ほとんどのクモ糸の分子的かつ構造的研究は、極めて高い抗張力を有する牽引糸に集中している（ＸｕおよびＬｅｗｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．,ＵＳＡ  ８７,７１２０−７１２４,１９９０;ＨｉｎｍａｎおよびＬｅｗｉｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.２６７,１９３２０−１９３２４,１９９２;Ｔｈｉｅｌら.,Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３４,１０８９−１０９７,１９９４;Ｓｉｍｍｏｎｓら,Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１,８４−８７,１９９６;Ｋｕｍｍｅｒｌｅｎら.,Ｍａｃｒｏｍｏｌ.２９,２９２０−２９２８,１９９６;およびＯｓａｋｉ,Ｎａｔｕｒｅ  ３８４,４１９,１９９６）。牽引糸（大瓶状腺によって産生されるので大瓶状糸（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ）としばしば呼ばれる）は、ケブラー（４×１０９Ｎｍ−２）に似た高い抗張力（５×１０９Ｎｍ−２）を有する（Ｇｏｓｌｉｎｅら、Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ  １０,３７−４３，１９８６; Ｓｔａｕｆｆｅｒら、Ｊ．Ａｒａｃｈｎｏｌ．２２,５−１１,１９９４）。この例外的な強度に加えて、牽引糸はまた、相当な弾性（約３５％）も示す（Ｇｏｓｌｉｎｅら、Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ  １０,３７−４３,１９８６）。このように、牽引糸の構造的かつ機能的分析は、強度と弾性を付与するタンパク質の特徴に関して明らかにしている。
【０００８】
糸の強度は、血漿のβシート構造に大きく起因する。そのようなタンパク質ドメインは、鱗翅目の糸（例えば、カイコ、Ｍｉｔａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ.３８,５８３−５９２,１９９４）とクモ糸（ＸｕおよびＬｅｗｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．,ＵＳＡ  ８７,７１２０−７１２４,１９９０；ＨｉｎｍａｎおよびＬｅｗｉｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７,１９３２０−１９３２４,１９９２；Ｇｏｓｌｉｎｅら、Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ  １０,３７−４３,１９８６）の両方で見つかっている。対照的に、弾性は不定形の領域に関与すると一般的に考えられている（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら、Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ,１９８２）。これらの不定形な成分のより正確な特徴は、分子の配列データによって明らかにされ得る。
【０００９】
大瓶状糸タンパク質のタンパク質配列に基づいて、βターン構造が弾性のメカニズムであるらしいと示唆されている（ＨｉｎｍａｎおよびＬｅｗｉｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．２６７,１９３２０−１９３２４，１９９２）。しかし、牽引糸は少なくとも２つの異なるタンパク質の混成物であり、これらのタンパク質が強度と中程度の弾性の両方を分け与えているために、この提案を評価することには問題がある。
【００１０】
オオジョロウグモの小瓶状糸は、物理学的性質と化学的性質の両方によって、同種の大瓶状糸から区別され得る。基本的なレベルでは、溶解した小瓶状糸のアミノ酸組成は、溶解した大瓶状糸のアミノ酸組成と異なる。大瓶状タンパク質（ｍａｊｏｒ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １（ＭａＳＰ１）、ｍａｊｏｒ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２（ＭａＳＰ２））のように、小瓶状糸を構成するタンパク質（ｍｉｎｏｒ  ｓｐｉｎｄｒｏｉｎ  １（ＭｉＳＰ１）、ｍｉｎｏｒ  ｓｐｉｎｄｒｏｉｎ  ２（ＭｉＳＰ２））は、短い配列のアミノ酸の不完全な繰り返しが大部分を占める一次構造を有する。さらに、大瓶状糸によって示される弾性と対照的に、小瓶状糸はリコイル（ｒｅｃｏｉｌ）なしで弾性を与える。小瓶状糸はちぎれる前に初期の長さの約２５％まで伸び、１００，０００ｐｓｉ（ポンド/平方インチ）の抗張力を示す。したがって小瓶状糸タンパク質は、大瓶状糸タンパク質に比較して、比較的低い抗張力と弾性を示す。
【００１１】
一方、捕獲螺旋は、鞭状腺と集合腺から由来する糸タンパク質から形成される。円網の捕獲螺旋は、餌食を捕まえ保持しなければならない構造から予想されるように、顕著な伸長能力を有する構造から成る。捕獲糸は、より低い抗張力（１×１０９Ｎｍ−２）を有するが、牽引糸より数倍の弾性（２００％以上）を有する（ＶｏｌｌｒａｔｈおよびＥｄｍｏｎｄｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０,３０５−３０７,１９８９;ＫｏｈｌｅｒおよびＶｏｌｌｒａｔｈ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ.２７１,１−１７,１９９５）。鞭状糸が該螺旋の芯繊維から成り、一方集合糸は非繊維性の水性層を提供する。このように、集合糸は弾性の捕獲螺旋の不可欠な部分であるが、伸長の能力を提供するのは、鞭状糸である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
クモによって産出される様々な糸のユニークな性質の観点において、新規なクモ糸タンパク質類の同定とそれらの化学的性質と物理的性質の特徴は、多くの利用法（応用）に対する有用性を有する、新しい有益な試薬を提供する。クモ糸タンパク質は、限定するわけではないが、強度の抗張力と弾性を含む特性を有する点でユニークである。さらに、個々のクモ糸タンパク質は、特性の異なる組み合わせを有するように進化し、その組み合わせは、タンパク質の強度と弾性の間の物理的平衡に貢献する。
【００１３】
クモ糸は、タンパク質から形成されたファイバから成る。天然のクモ糸のファイバは、２つ以上のタンパク質の混成からなり得る。一般的に、クモ糸タンパク質は、短いコンセンサス配列の間接的な反復（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔｓ）として特徴付けられ得る一次アミノ酸配列を有することが知られており、コンセンサス配列における変異は、異なる糸タンパク質に特徴的な性質の要因である。
【００１４】
糸ファイバは、糸タンパク質のコンセンサスリピートユニットに実質的に類似したアミノ酸配列を有する合成ポリペプチド、または天然または遺伝子操作された糸タンパク質、またはそれらの誘導体をコードする核酸配列から発現されたポリペプチドから作られ得る。また、クモ糸タンパク質の応用目的によって、１つのクモ糸タンパク質からまたは異なる糸タンパク質の組み合わせからファイバを形成することが望ましい場合もあり得る。それに応じて、組み合わせの比を調節することができる。
【００１５】
本発明のひとつの観点において、新規のクモ糸タンパク質をコードする核酸配列を提供する。本発明の核酸配列の一例は、配列表の配列番号１〜２８番を含む配列を有する。
【００１６】
本発明の特定の観点において、新規のＭａＳｐ１様クモ糸タンパク質をコードする、核酸配列の一例を提供する。このタイプの核酸配列の一例は、配列表の配列番号１〜７番を含む配列を有する。
【００１７】
本発明の別の観点において、新規のＭａＳｐ２様クモ糸タンパク質をコードする、核酸配列の一例を提供する。このタイプの核酸配列の一例は、配列表の配列番号８〜１６番を含む配列を有する。
【００１８】
本発明の別の実施様態では、新規の鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ：ｆｌａｇ）様クモ糸タンパク質をコードする、核酸配列の一例を提供する。このタイプの核酸配列の一例は、配列表の配列番号１７番と１８番を含む配列を有する。
【００１９】
本発明の別の実施様態では、新規のクモ糸タンパク質をコードする核酸配列を提供する。このタイプの核酸配列の一例は、配列表の配列番号１９番と２０番を含む配列を有する。
【００２０】
さらに本発明の別の観点において、非典型的な繰り返しモチーフを含む、新規のクモ糸タンパク質をコードする核酸配列を提供する。このタイプの核酸配列の一例は、配列表の配列番号２１〜２７番を含む配列を有する。
【００２１】
本発明の特定の観点において、単離された核酸配列を提供し、この核酸配列は、非典型的な繰り返しモチーフを含む、新規のクモ糸タンパク質をコードする。このタイプの核酸配列の一例は、配列表の配列番号２８番を含む配列を有する。
【００２２】
本発明の好適な実施様態では、提供された単離の核酸分子類がクモ糸タンパク質類をコードする。特定の実施様態では、本発明のクモ糸タンパク質が、配列表の配列番号２９〜５６番から成るアミノ酸配列を有する。
【００２３】
本発明の特定の観点において、新規のＭａＳｐ１様クモ糸タンパク質が、配列表の配列番号２９〜３５番から成るアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本発明の別の観点において、新規のＭａＳｐ２様クモ糸タンパク質が、配列表の配列番号３６〜４４番から成るアミノ酸配列を有する。
【００２５】
本発明の別の観点において、新規のｆｌａｇ様クモ糸タンパク質が、配列表の配列番号４５番と配列表の配列番号４６番から成るアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本発明の別の観点において、新規のクモ糸タンパク質が、配列表の配列番号４７番と配列表の配列番号４８番から成るアミノ酸配列を有する。
【００２７】
本発明の別の観点において、非典型的な繰り返しモチーフから成る、新規のクモ糸タンパク質が、配列表の配列番号４９〜５５番から成るアミノ酸配列を有する。
【００２８】
本発明の特定の観点において、非典型的な繰り返しモチーフから成る、新規のクモ糸タンパク質を提供する。このタイプのクモ糸タンパク質のアミノ酸配列の一例は、配列表の配列番号５６番を有する。
【００２９】
本発明の別の観点によると、単離された核酸分子が提供され、その核酸分子は以下のグループから選択された配列を有する。すなわち、（１）配列表の配列番号１〜２８番、（２）配列表の配列番号２９〜５６番のアミノ酸をコードする核酸から成る配列表の配列番号１〜２８番の個々の相補的な一本鎖の前もって選択された一部、または全体と特異的にハイブリダイズする配列、（３）配列表の配列番号１〜２８番の前もって選択された一部をコードする配列、（４）配列表の配列番号５６番から由来したコンセンサス配列（配列表の配列番号５７番）のアミノ酸群をコードする核酸からなる配列である。
【００３０】
そのような部分的配列は、本発明のクモ糸タンパク質の相同体を同定し、単離するためのプローブとして有用である。さらに、配列表の配列番号１〜２８番の核酸の天然の対立遺伝子変異体をコードするた短離された核酸配列もまた、本発明の範囲内にあると考えらる。天然の対立遺伝子変異体という用語は、下記に定義されている。
【００３１】
本発明の別の観点によると、上記のクモ糸タンパク質に免疫学的に特異的な抗体類を提供する。
【００３２】
本発明のさらに別の観点では、クモ糸タンパク質をコードする核酸類の少なくとも１つを含む宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、限定されるものではないが、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳細胞、および植物細胞を含む。本発明のクモ糸タンパク質をコードする核酸の１つ以上を過剰発現する宿主細胞は、多くの応用で有用な試薬を提供する。そのような応用には、限定するものではないが、少なくとも１つの糸タンパク質を有する糸ファイバの産生が含まれ、構造的性質を調節するための物質が組み込まれる。
【００３３】
天然のクモ糸タンパク質類は、不完全な繰り返し構造を有する。この繰り返し内の不完全性は、ファイバ形成の必要性よりも、この糸タンパク質遺伝子が進化した過程の結果であるようである。したがって、繰り返し内の不完全性は、タンパク質分子の凝集に続いて形成されるファイバの性質に影響しないようである。
【００３４】
したがって、本発明の別の実施様態では、遺伝子操作されたクモ糸タンパク質群をコードする核酸配列を提供し、ここで、これらのタンパク質群のそれぞれは、アミノ酸配列の直接的リピート（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）を有するポリペプチドから成る。別法として、核酸配列は、「共重合体」糸タンパク質を形成するためのいくつかの異なるアミノ酸配列を含み得る。
【００３５】
本発明のさらに別の実施様態では、核酸配列から発現されたクモ糸タンパク質を提供するが、ここでその核酸配列は、クモ糸腺（ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｇｌａｎｄ）から由来した、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または上記のすべての断片から得られる。
【００３６】
本発明の別の実施様態では、少なくとも１つのクモ糸タンパク質をコードする核酸配列の発現によって得られた糸タンパク質から作られたファイバを提供する。
【００３７】
本発明の詳細な説明
クモ糸タンパク質の物理学的特徴は、これらのフィブロインに無比の機械的性質を与えるため、種々の応用で理想的に適したクモ糸タンパク質をもたらす。したがって、ここで記載するように、新規のクモ糸タンパク質の同定は、天然および合成のクモ糸タンパク質の産生に有用な手段を提供し、これらのクモ糸タンパク質はファイバに編み込むことができ、そのようなタンパク質から成るファイバに特有の性質をもたせる。
【００３８】
本発明の好適な実施様態では、新規のクモ糸タンパク質をコードする核酸配列群は、配列表の配列番号1〜２８番から成る配列を有する。
【００３９】
特定の実施様態では、本発明のクモ糸タンパク質が、配列表の配列番号２９〜５６番から成るアミノ酸配列群を有する。
【００４０】
さらに別の実施様態では、配列表の配列番号５６番から由来するコンセンサス配列が、配列表の配列番号５７番から成るアミノ酸配列群を有する。
【００４１】
他のクモ糸タンパク質類は以前に同定されている。例えば、米国特許出願番号：５，７７３，７７１、５，９８９，８９４、５，７２８，８１０を参照。これらの開示全体は、この引用例によって本明細書に一体化される。
【００４２】
１  定義
以下の定義は本発明の理解を促進するために提供される。
【００４３】
本発明で使用された核酸に関して、用語「単離された核酸」が時々使用される。この用語は、ＤＮＡに適用された時に、それが由来する生物体の天然のゲノム中で（５’と３’の方向に）隣接する配列から分離された、ＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」はベクター（例えばプラスミドやウイルスベクター）に挿入されたＤＮＡ分子、あるいは原核細胞または真核細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。「単離された核酸分子」にはまた、ｃＤＮＡ分子を含み得る。ベクターに挿入された単離された核酸分子もまた、ここで時々、組換え核酸分子として呼ばれる。
【００４４】
ＲＮＡ分子に関して、用語「単離された核酸」は、上記のように定義されたような単離されたＤＮＡ分子によってコードされる、ＲＮＡ分子を主に指す。或いは、この用語は、天然の状態（すなわち、細胞または組織中）で会合しているＲＮＡ分子群から十分に分離されて、「実質的に純粋な」形態で存在するような、ＲＮＡ分子を指し得る。
【００４５】
一本鎖の核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、用語「特異的にハイブリダイズする」は、一般に当分野で使用されるようなあらかじめ決められた条件下で、ハイブリダイゼーションを許すような、実質的に相補的な配列をもつ２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の会合を指す（時々、「実質的に相補的な」とも呼ばれる）。特に、この用語は、オリゴヌクレオチドと、本発明の一本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子内に含まれる、実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを指し、相補的でない配列の一本鎖核酸とオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを除外する。異なる相補性をもつ一本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする好適な条件は、当分野で周知である。
【００４６】
例えば、特定の配列の相同性をもつ核酸分子群の間のハイブリダイゼーションを達成するためのストリンジェンシー条件を計算するための１つの一般的な式を下に示す（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。
【００４７】
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ[Ｎａ＋]＋０．４１×（％  Ｇ＋Ｃ）−０．６３×（％ホルムアミド）−６００／塩基対の数
【００４８】
上記の式の例証として、ＤＮＡ含量が４２％でプローブの平均の大きさが２００塩基の場合、[Ｎａ＋]＝[０．３６８]と５０％ホルムアミドを使用すると、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡに重鎖のＴｍは、相同性が１％減少するごとに１〜１．５℃下がる。したがって、約７５％以上の配列同一性を有する標的が、４２℃のハイブリダイゼーションの温度で見られるであろう。
【００４９】
本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明のプライマー類とプローブ類を指し、２つ以上の（好適には３つ以上の）リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを有する核酸分子として定義される。該オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々なファクターと該オリゴヌクレオチドの特定の用途および使用法に依存するであろう。好適なオリゴヌクレオチド類は、配列表の配列番号１〜２８番の１５〜５０の連続した塩基から成る。
【００５０】
本明細書中で用いる用語「プローブ」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を指す。これは精製された制限酵素で消化される天然のものでも、または合成で産生されたものでもよく、このプローブに相補的な配列を有する核酸にアニーリングできるか、特異的にハイブリダイズできる、プローブは一本鎖または二本鎖であり得る。該プローブの正確なサイズは、温度、プローブの源泉、および方法を含む様々なファクターに依存するであろう。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプローブは通常１５〜２５、またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少数のヌクレオチドを含むこともある。本明細書でのプローブ類は、特定の標的核酸配列の異なるストランドに相補的であるように選択される。これは、該プローブ類が、一組の前もって決定された条件下でそれぞれの標的ストランドに「特異的にハイブリダイズ」する、またはアニーリングするほどに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、該プローブの配列は該標的の正確な相補配列を反映している必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片を該プローブの５’端または３’端に付け、該プローブ配列の残りの部分を標的ストランドに相補的にすることが可能である。或いは、該プローブの配列が特異的に標的核酸とアニーリングできるに十分な相補性を該標的核酸の配列と有しているならば、非相補的な塩基群、またはより長い配列を該プローブに散在させることは可能である。
【００５１】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、オリゴヌクレオチドを指し、このオリゴヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡの何れでもよく、また一本鎖でも二本鎖でもよく、また生物学的システムから由来したものでも、制限酵素消化によって生成されたものでも、また合成で産生されたものでもよく、適当な環境下に置かれた時に、鋳型に依存した核酸合成のイニシエーターとして機能的に作動し得るようなオリゴヌクレオチドである。好適な核酸鋳型、核酸の好適なヌクレオシド三リン酸前駆体群、好適な温度とｐＨのような好適な補因子類と条件で存在すると、該プライマーはポリメラーゼまたは同様の活性の作用によってヌクレオチドが付加されることにより、３’端で伸長されて、プライマー伸長産物を生み出す。該プライマーは、特別の条件と応用の必要条件に依存して長さが変わり得る。例えば、診断の応用では該オリゴヌクレオチドプライマーの長さは通常１５〜２５、またはそれ以上である。所望の伸長産物の合成を開始するために、該プライマーは所望の鋳型に十分に相補的でなければならない。すなわち、ポリメラーゼまたは同様な酵素による合成の開始で使用されるために、ほぼ並置の位置にある該プライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な所望の鋳型ストランドとアニーリングし得るプライマーでなければならない該プライマーの配列は所望の鋳型の正確な相補性を示す必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列を、それ以外は相補的なプライマーの５’端に付けることが可能である。別法として、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在させることもでき、これは、そのプライマー配列が所望の鋳型ストランドの配列と十分な相補性を有し、伸長産物の合成のための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供できる場合に可能である。
【００５２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５、第４，８００，１９５、第４，９６５，１８８に記述されており、これらの開示全体はこの引用により本明細書に一体化される。
【００５３】
本明細書で記述されたアミノ酸残基類は、「Ｌ」異性体型であることが好ましい。しかし、該ポリペプチドの所望の性質が維持される限り、任意のL−アミノ酸の残基を「Ｄ」異性体型残基と置換することが可能である。本明細書で示されるすべてのアミノ酸残基配列は、従来の左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向に従う。
【００５４】
本出願では、アミノ酸残基は、以下の表のように３つの英字または１つの英字の略称に従って表される。
【００５５】
【表１】
2005502347.tif 000002
【００５６】
本明細書では、用語「単離されたタンパク質」または「単離され精製されたタンパク質」が時々使用される。この用語は主に、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されたタンパク質を指す。或いは、この用語は、タンパク質が天然で随伴する他のタンパク質類から十分に分離され、「実質的に純粋な」形態で存在する該タンパク質を指し得る。「単離された」は、他の化合物との人為的な混合体または人造の混合体、或いは根本的な作用と干渉しない不純物の存在で、その不純物が例えば不完全な精製、安定剤の添加、または例えば免疫原性の調製物や薬理学的に許容しうる調製物への調合のため存在する可能性のあるもの、を除外する意味はもっていない。
【００５７】
「成熟したタンパク質」または「成熟したポリペプチド」は、任意のプロセッシング事象後に該ポリペプチドの配列を有する、ポリペプチドを意味し、そのようなプロセッシング事象は該ポリペプチドの生成中に通常起こる（例えば、ポリプロテイン前駆体からのタンパク分解性プロセッシング）。成熟タンパク質の配列または境界を設計するのに、成熟なタンパク質配列の初めのアミノ酸をアミノ酸残基１と命名する。本明細書で使用されるように、成熟タンパク質に付いている任意のアミノ酸残基で、該タンパク質に天然に見られない、アミノ酸１より前に或る残基を、アミノ酸−１、−２、−３等のように命名する。組換え発現系で、メチオニン開始コドンがしばしば効率の高い翻訳の目的で利用される。本明細書で使用されるように、その結果、得られるポリペプチド内のこのメチオニン残基は、成熟タンパク質配列に関連して（−１）の位置にあることになる。
【００５８】
低分子量「ペプチド類似体」は、タンパク質の天然の類似体または或る突然変異の（突然変異した）類似体を意味し、このような類似体は該タンパク質の断片群が順列に並んだもの、あるいは不連続的に並んだものを有し、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸と置換されていることがあり、またその親タンパク質（ｐａｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）または突然変異のないタンパク質と比較した時、生物学的活性が変更されたり、増加されたり、減少されたりする。
【００５９】
「生物学的活性」の用語は、生物学的意味（すなわち、生命体内、或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの代理モデルまたは複写モデル（ｆａｃｓｉｍｉｌｅ  ｍｏｄｅｌ）内）での分子によってなされる、機能または一組の機能である。当明細書で記述されるように、クモ糸タンパク質類では、生物学的活性は物理学的性質（例えば、抗張力と弾性）によって特徴付けられる。
【００６０】
用語「実質的に純粋な」は、目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、その他）を重量で少なくとも５０〜６０％含む、調製物を指す。さらに好適には、その調製物は目的の化合物を重量で少なくとも７５％含み、最も好適には、重量で９０〜９９％含む。純粋性は、目的の化合物に適当な方法で測定する（すなわち、クロマトグラフィー法、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、ＨＰＬＣ分析、質量スペクトロメトリ、および類似な方法）。
【００６１】
用語「タグ」、「タグ配列」、または「タンパク質タグ」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドもしくはアミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質、または他の化学物質の化学的部分を指し、これが他の配列に加えられたら、特にその配列の検出や単離で、他の有用性を提供し、有益な性質を与える。したがって、例えば、伸長産物またはハイブリダイズした産物の単離を促進するためにホモポリマー核酸配列、またはキャプチャーヌクレオチド（ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に相補的な核酸配列を、プライマーまたはプローブ配列に加えることが可能である。タンパク質タグの場合には、ヒスチジン残基群（例えば、４から８の連続したヒスチジン残基）をタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに加えて、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によってタンパク質の単離を促進することが可能である。或いは、特定の抗体分子類または他の分子類と反応するエピトープ類や結合決定基を示す、アミノ酸配列、ペプチド、タンパク質、または融合パートナー（例えば、フラッグエピトープ（ｆｌａｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ）、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンタンパク質の膜貫通エピトープ、タンパク質Ａ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、マルトース結合ドメイン、チチン結合ドメイン、グルタチオンSトランスフェラーゼ、および類似物）をタンパク質類に加えて、アフィニティクロマトグラフィーや免疫親和性クロマトグラフィーのような手段によってタンパク質単離を促進することが可能である。化学的タグ部分には、ビオチンのような分子類が含まれ、これらは核酸類またはタンパク質類に加えて、アビジン試薬およびその類似体との相互作用によって単離または検出を促進し得る。訓練を受けた技術者は、多くの他のタグ部分に精通しており、また構想し得る。また多くの他のタグ部分も、この定義の範囲内にあると考えられる。
【００６２】
「ベクター」は、プラスミド、コスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージ、またはウイルスのようなレプリコンであり、他の遺伝配列または遺伝因子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）をそのようなベクターに付けて、その付着した配列または因子の複製をもたらすことが可能である。「発現ベクター」は、特定のベクターであり、宿主細胞での発現のために必要な調節領域群を有する１つの遺伝子を含む。
【００６３】
用語「機能的に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、コード配列の発現に必要な調節配列群が、該コード配列の発現に影響するように、そのＤＮＡ分子中の該コード配列に関連する適当な位置に置かれることを意味する。この同じ定義は時々、発現ベクターでのコード配列と転写制御因子（例えば、プロモーター因子、エンハンサー因子、および終結因子）との配置に適用される。この定義はまた、時々、ハイブリッド核酸分子が産生される場合に、第一の核酸分子と第二の核酸分子の核酸配列の配置にも適用される。
【００６４】
特定のヌクレオチドまたはアミノ酸を言及する時に、表現法「・・・から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、与えられた配列表の配列番号の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用された時に、この表現法はその配列自体、および該配列の基本的特徴と新規な特徴に影響を与えないような分子修飾類を含む。
【００６５】
「クローン」または「クローン細胞集団」は、１つの細胞または共通の祖先から有糸分裂によって由来する、細胞の集団である。
【００６６】
「細胞株」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで何世代にわたって安定的に成長できる、最初の細胞または細胞集団からのクローンである。
【００６７】
「免疫反応」は、機能する免疫系を有する宿主中で、ウイルス抗原のような抗原によって生じる反応を意味する。免疫反応は、免疫グロブリンまたは抗体の産生を伴う、本質的に体液性免疫反応か、或いは種々のタイプのＢリンパ球とＴリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、およびこれらに類似した細胞類を伴う、本質的に細胞性免疫反応のいずれかであり得るか、或いはその両方であり得る。免疫反応はまた、サイトカイン類、リンホカイン類、およびそれらの類似体のような種々のエフェクター分子類の産生または合成をも含む。免疫反応は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏと種々の細胞系または動物系の両方で測定され得る。そのような免疫反応は、宿主を病気から保護するのに重要であることがあり、予防と治療で使用されることがある。
【００６８】
「抗体」または「抗体分子」は、特定の抗原に結合する抗体類およびそれらの断片類を含む、任意の免疫グロブリンである。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および二重特異性抗体を含む。当明細書で使用されるように、抗体と抗体分子は、そのままの完全な免疫グロブリン分子、および免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ')２、とＦ（Ｖ）のような、当分野で知られる部分）を網羅する。
【００６９】
抗体類に関して、用語「免疫学的に特異的」は、目的のタンパク質または化合物の１つ以上のエピトープに結合するが、抗原性の生物学的分子類の混ざった集団を含むサンプルで、他の分子を実質的に認識せず、また結合しないような抗体類を指す。
【００７０】
特定の配列の核酸の、「天然の対立遺伝子変異体」、「突然変異体」、および「誘導体」は、特定の配列に密接に関連するが、天然的にまたは計画的に、配列または構造での変化を有する可能性のある核酸配列を指す。密接に関連ということは、配列の少なくとも約７５％、しばしば９０％以上のヌクレオチド群が、特定のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯを使用した核酸配列の限られた長さでマッチすることを意味する。密接に関連する核酸配列群の間のヌクレオチド配列での変化または差は、特定の核酸配列の性質で、正常な複製または重複の過程中に起こる、配列中のヌクレオチド変化を代表し得る。他の変化類を、特定の目的（例えば、核酸の調節領域でのアミノ酸コドンまたは配列を変える目的）のために配列中で特異的に設計し、誘導し得る。そのような特定の変異は、種々の突然変異生成技術を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製されたり、またはそのような変異を誘導したり選択するための特別の選択条件下に置かれた、宿主生物体中で産生され得る。そのような特異的に発生された配列変異体類は、元の配列の「突然変異体」または「誘導体」と呼ばれることもある。
【００７１】
クモ糸タンパク質の「誘導体」、またはその誘導体の断片は、該タンパク質のアミノ酸配列を変えることによって修正した（例えば、該タンパク質をコードする核酸を操作することによって、或いは該タンパク質自体を変更することによって）、ポリペプチドを意味する。天然のアミノ酸配列のそのような誘導には、１つ以上のアミノ酸の挿入、追加、又は置換を伴うことがあり、またそのような誘導によって元のクモ糸タンパク質の本質的な活性が変わることも、変わらないこともあり得る。
【００７２】
上記したように、本発明のクモ糸のポリペプチドまたはタンパク質には、クモ糸タンパク質から誘導され、クモ糸タンパク質の少なくとも１つの性質または他の特徴を保持するような、任意の類似体、断片、誘導体、、または突然変異体を含む。クモ糸タンパク質の異なる「変異体」は自然に存在する。これらの変異体は、該タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列での差によって特徴付けられる対立遺伝子群である可能性があり、或いは異なるＲＮＡプロセッシングまたは翻訳後修飾を含み得る。技能者は、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠損、追加、交換を有する変異体類を産生することが可能である。これらの変異体にはとりわけ以下が含まれ得る：（ａ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的なアミノ酸または非保存的なアミノ酸で置換されるような変異体、（ｂ）１つ以上のアミノ酸がクモ糸タンパク質に加えられたような変異体、（ｃ）１つ以上のアミノ酸が１つの置換基を含むような変異体、および（ｄ）クモ糸タンパク質またはその断片が、他のペプチドまたはポリペプチドと融合されたような変異体で、そのようなペプチドまたはポリペプチドは、例えば、融合パートナー、タンパク質タグ、または他の化学的部分であり、それがクモ糸タンパク質に有用な性質（例えば、抗体のためのエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチンの部分、他）を与え得るもの。本発明のほかのクモ糸タンパク質には、１つの種からのアミノ酸群が他の種での対応する残基群に置換された変異体を含み、この置換は保存的位置か非保存的位置のいずれかでなされる。他の実施様態では、非保存的位置でのアミノ酸群が保存的残基または非保存的残基群と置換される。これらの変異体を得る方法には、遺伝的技術（抑制、欠失、突然変異、他）、化学的技術、および酵素的技術が含まれ、これらは当業者には周知である。
【００７３】
そのような対立遺伝子変異、類似体、断片、誘導体、突然変異体、および修飾体（他の核酸プロセッシング形態と他の翻訳後形態を含む）が、クモ糸タンパク質の生物学的性質のいずれかを保持するクモ糸タンパク質の誘導体である限り、これらを本発明の範囲内に含む。
【００７４】
本明細書で使用される、用語「機能的な」は核酸配列またはアミノ酸配列がここで記載したアッセイや目的で機能的であることを意味する。
【００７５】
「ユニットリピート（ｕｎｉｔ  ｒｅｐｅａｔ）」は、短い繰り返し配列を構成する。このように、クモ糸タンパク質類の一次構造は、その大部分が、ユニットリピートの小さい変異体の連続から成ると考えられている。天然の該タンパク質類でのユニットリピート群はしばしば、互いに異なる。すなわち、該タンパク質の長さに沿って、ユニットリピートにほとんど、または全く重複がない。しかし、クモ糸タンパク質は、何回かのシングルユニットリピートの、正確な反復を有するタンパク質の一次構造において作製される。ユニットリピートの何回かの反復と、２番目のユニットリピートの何回かの反復から成る、別の合成クモ糸が合成され得る。そのような構造は、典型的なブロック共重合体に似ているであろう。いくつかの異なる配列を有するユニットリピートを組み合わせて、特定の応用に好適な性質を有する合成クモ糸タンパク質を提供することが可能である。
【００７６】
当明細書で用いる、用語「直接的リピート（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）」は、似た繰り返しをもつタンデム（頭−尾構造（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ））に位置する、繰り返しである。
【００７７】
２  クモ糸をコードする核酸分子、クモ糸タンパク質、およびそれに対する抗体の調製
Ａ  核酸分子類
本発明のポリペプチド類をコードする核酸分子類は、２つの一般的な方法によって調製され得る：（１）好適なヌクレオチド三リン酸から合成、または（２）生物学的源泉から単離両方の方法は当分野で周知のプロトコール類を使用する。クモ糸タンパク質をコードするＤＮＡ配列のような、ヌクレオチド配列情報が入手できると、オリゴヌクレオチド合成によって本発明の単離された核酸分子の調製が可能になる。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８Ａ  ＤＮＡシンセサイザーまたは同様の装置で使用されるフォスフォアミダイトによって調製され得る。その結果得られるコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は直接使用されるか、または高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法のような、当分野で知られる方法によって精製され得る。
【００７８】
クモ糸タンパク質をコードする配列のような配列群を同定するための特定のプローブは、１５と４０の間のヌクレオチドの長さであり得る。上記のプローブより長いプローブでは、クモ糸タンパク質をコードする配列内に他の連続したヌクレオチド群を含むようにする。
【００７９】
本発明に基づいて、クモ糸タンパク質をコードする配列群と適度なレベルの配列相同性を有する核酸類を、好適なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件と洗浄条件を使用して同定することが可能である。例えば、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’Ｓ液、１．０％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精巣DNA、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、および５０％までのホルムアミドから成るハイブリダイゼーション溶液を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ(１９８９)の方法に従って行い得る。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で少なくとも６時間行う。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを以下のように洗浄する：（１）２×ＳＳＣと１％ＳＤＳ中で室温で５分間、（２）２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳ中で室温で１５分間、（３）１×ＳＳＣと１％ＳＤＳ中で３７℃で３０分〜１時間、（４）１×ＳＳＣと１％ＳＤＳ中で４２〜６５℃で２時間と３０分おきに溶液を変える。
【００８０】
本明細書で記述された核酸分子には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその断片類を含み、これらは一本鎖また二本鎖であり得る。クモ糸タンパク質をコードする配列の選択された部分のように、核酸配列の少なくとも１つの配列とハイブリダイズできる配列群を有するオリゴヌクレオチド類をこのように提供する。また本発明の視野には、クモ糸タンパク質をコードする配列からのＤＮＡと、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用法が含まれると考えられたい。クモ糸タンパク質をコードする配列を特異的に増幅できるプライマー類もまた提供する。以前に述べたように、そのようなオリゴヌクレオチド類は、クモ糸タンパク質をコードする配列を検出、単離、および増幅するためにプライマーとして有用である。
【００８１】
クモ糸タンパク質遺伝子類の発現またはそれらのコードするタンパク質群の産生を阻害するために、翻訳開始部位および／またはスプライス部位に標的され得るようなアンチセンス核酸分子類もまた提供する。そのようなアンチセンス分子類は通常、１５〜３０の間のヌクレオチド長であり、クモ糸タンパク質ｍＲＮＡ分子の翻訳開始部位をしばしば含む。
【００８２】
Ｂ  タンパク質
本発明の全長クモ糸タンパク質類は、知られた方法にしたがって様々な方法で調製し得る。これらのタンパク質類は、免疫親和性精製法によって好適な源泉（例えば、形質移入された細菌や動物の培養細胞）から精製し得る。しかし、与えられた細胞タイプで常に存在し得るタンパク質のレベルが低いため、これは好適な方法ではない。クモ糸タンパク質類をコードする核酸分子類が利用できるようになると、当分野で知られるｉｎ  ｖｉｔｒｏの発現方法を用いてそれらのタンパク質の産生が可能になる。例えば、ｃＤＮＡや遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクター（例えば、ｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５）中にクローンした後、好適な無細胞翻訳系（例えば、コムギ胚芽やウサギ網状赤血球）で無細胞翻訳することが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写および翻訳系は、例えばＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）またはＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から市販されている。
【００８３】
或いは、好適な実施様態に従って、大量のクモ糸タンパク質を好適な原核生物系または真核生物系での発現によって産生し得る。例えば、配列表の配列番号１〜２８の群から選択された１つの配列を有する核酸配列のような、少なくとも１つのＤＮＡの部分またはすべてを、細菌細胞（例えば、大腸菌）での発現に適合されたプラスミドベクターに挿入することが可能である。そのようなベクターは、宿主細胞内のDNAの発現に必要な調節因子類を含み、これらの因子類を宿主細胞でそのＤＮＡの発現を許容するような仕方で配置する。発現に必要な調節因子類は、プロモーター配列、転写開始配列、およびオプションとしてエンハンサー配列を含む。
【００８４】
組換え型の原核細胞システムまたは真核細胞システムでの遺伝子発現によって産生されたクモ糸タンパク質類は、当分野で知られる方法に従って精製され得る。好適な実施様態では、市販の発現／分泌システムを使用でき、それによって組み換えられたタンパク質が発現され、その後その宿主細胞から分泌され、周囲の媒質から容易に該組換えタンパク質を精製できる。発現／分泌ベクターが使用されない場合、別のアプローチは、タンパク質が発現される原核細胞または真核細胞から由来する細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）（細胞の一体性を破壊した後の細胞の残存物）からの該タンパク質の精製を含む。そのような細胞溶解物の産生の方法は、当業者では公知である。組換えタンパク質は、親和性分離（例えば、該組換えタンパク質に特異的に結合する抗体類との免疫学的相互作用、または組換えタンパク質のＮ端またはＣ端に６〜８のヒスチジンでタグをつけた組換えタンパク質の単離のためにニッケルカラム）によって精製され得る。別法として、タグはＦＬＡＧエピトープまたはヘマグルチニンエピトープから成り得る。このような方法は、当業者によって一般的に使われている。
【００８５】
前記した方法に従って調製された、本発明の全長クモ糸タンパク質類は、標準的な方法に従って分析され得る。例えば、そのようなタンパク質類は、公知の方法に従ってアミノ酸分析にかけることができる。
【００８６】
本発明に従って産生されたタンパク質は、ポリペプチド合成の後、化学的に修飾され得る。スペーサー領域に数個のカルボン酸側鎖（アスパラギン酸またはグルタミン酸）を有することによって、そのような側鎖を有するアミノ酸群を含むような糸タンパク質類に種々の異なる化学基を付着することを容易にする。最も簡単で容易な方法は、水溶性のカルボジイミドを用いて、一級アミンを介して修飾基を付加する。もし付加される基に一級アミンがない場合は、種々の連結用試薬がそれ自体の一級アミンを介して付加され、該修飾基が利用可能な化学作用によって付加される（Ｊｅｎｎｅｓ，Ｌ．およびＳｔｕｍｐｆ,Ｗ．Ｅ.，Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、ｃｈａｐｔｅｒ  ４２、Ｐ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃｏｎｎ、ｅｄｉｔｏｒ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
【００８７】
好ましい化学修飾には、限定するものではないが、繊維芽細胞等の細胞に結合するペプチドでの誘導、抗体での誘導、および架橋された繊維が作られるような架橋剤での誘導が含まれる。当業者の技能以内で、特定の目的のための誘導試薬を選択できる。
【００８８】
クモ糸タンパク質産生の例証的方法
クモ糸タンパク質のユニークな性質の観点から、合成のクモ糸タンパク質の産生には特別の考慮が適用されるべきである。これらのタンパク質をコードするアミノ酸配列の反復の特徴のため、全長のクモ糸タンパク質またはその断片類の合成は技術的に難しくなる。全長のクモ糸分子類の産生を容易にするために、以下のプロトコールを提供する。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、直接な合成によって、またはクローン化されたＤＮＡからの発現によって、作製され得る。クローン化されたＤＮＡの発現方法は、上記に記述されており、当業者で一般的に公知である。本発明のクモ糸タンパク質類をコードするＤＮＡを発現するのに使われる発現ベクターを設計するのに、以下の考慮が推奨される。
【００９０】
まず、クモ糸タンパク質類は、その構造中で高度に反復性であるため、クローン化されたＤＮＡは、染色体外因子中で反復性配列を維持できるような宿主細胞株で増殖され発現されるべきである（例えば、ＳＵＲＥ（ＴＭ）（細胞、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。特定のアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、プロリン、およびグルタミン）が多いことは、これらのアミノ酸のためのｔＲＮＡを過剰発現する宿主細胞を使用することが有益であり得ることも示唆する。
【００９１】
別法では、本発明のタンパク質類は、高レベルの転写、エピトープタグを介して親和性による精製を可能にする融合タンパク質類を提供するベクターを用いて発現され得る。この宿主は、細菌細胞または真核細胞のいずれかであり得る。特に出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｓａｅ）のような酵母、または昆虫細胞のような真核細胞は、特に有用な真核細胞の宿主であり得る。遺伝子操作された小瓶状糸タンパク質の発現は、米国特許番号５，７５６，６７７に記述されており、これを引用することをもって本明細書の一部とする。本発明のタンパク質類を発現するのに、そのようなアプローチを使用することが可能である。
【００９２】
有用なクモ糸タンパク質、またはその断片は、（１）発現される細胞内で不溶性であってもよく、または（２）繊維が作られる正常な条件下で、不溶性の繊維に形成され得ることがあってもよい。好適には、該タンパク質は（１）と（２）の条件化で不溶性である。特に、該タンパク質またはその断片は、水、アルコール（メタノール、エタノール、他）、アセトン、および／または有機酸のような、溶媒で不溶性であり得る。そのようなクモ糸タンパク質またはその断片は、高い抗張力（例えば、０．５ｘ〜２ｘの抗張力、ここでｘは、対応する天然の糸タンパク質、または完全なタンパク質から形成された繊維の抗張力である）を有する、繊維に形成されることが可能であるはずである。クモ糸タンパク質またはその断片は、高い弾性（例えば、少なくとも１５％、より望ましくは約２５％）を有する繊維に形成されることも可能であるはずである。
【００９３】
クモ糸タンパク質の変異体類は、天然のクモ糸タンパク質または天然のタンパク質より高い抗張力および／または弾性を有する繊維に形成されることが可能である。その弾性は最大１００％増加することが可能である。変異体は、タンパク質断片の性質を有することも可能である。
【００９４】
断片または変異体は、天然のクモ糸と同じ特徴を実質的に有し得る。その天然のタンパク質は、繊維の形状にある時、特に不溶性になり、ほとんどの酵素類による分解に抵抗性となることがある。
【００９５】
組換えクモ糸タンパク質類は、細胞を溶解して、その中で発現されたクモ糸タンパク質を放出させることによって、培養から回収され得る。まず、細胞のデブリを遠心で分離をし得る。その後、デブリと上澄みから成る、透明な細胞溶解物は、クモ糸タンパク質類が不溶性で細胞デブリが溶性であるような溶媒類で繰り返し抽出され得る。上記のような、差異的な溶解性を用いる方法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）は、精製されたクモ糸タンパク質沈殿物の単離を促進するために使用され得る。これらの方法は、繰り返されるか、濾過、透析、および／またはクロマトグラフィー等の他の方法と組み合わせられて、純粋な産物を得ることが可能である。
【００９６】
クモ糸タンパク質の濃度が臨界値を越えた時に、そのクモ糸タンパク質の自然発生的な自己集合によって、溶液から繊維状の凝縮体が形成されるであろう。そのような凝集体を、Ｏ’Ｂｒｉｅｎらの方法（Ｉ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、「Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｉｌｋ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０４−１１７ページ、Ｋａｐｌａｎ，Ａｄａｍｓ，Ｆａｒｍｅｒ  ａｎｄ  Ｖｉｎｅｙ，ｅｄｓ．，ｃ．１９９４  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）に従って収集し、機械的に紡いで肉眼的な繊維にすることが可能である。
【００９７】
クモ糸タンパク質から繊維を調製するための例証的方法
上記したように、クモ糸タンパク質類は誘導されたポリアミドとして見ることが可能である。よって、可溶性のクモ糸タンパク質群から繊維を産生する方法は、典型的なポリアミド繊維（例えば、ナイロン等）を産生するのに使用される方法に似ている。
【００９８】
Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（前記）は、アデノウイルス繊維タンパク質からの繊維産生法を記述している。典型的な繊維産生法では、クモ糸タンパク質群を強度に極性の溶媒中で溶解させ得る。そのようなタンパク質溶液のタンパク質濃度は、通常５％以上であり、好適には８〜２０％であるべきである。
【００９９】
好適には、繊維は、液晶相の特徴の性質を有する溶液から紡出させる。相転移が起こり得る繊維濃度は、タンパク質のポリペプチド成分または該溶液中に存在するタンパク質群の組み合わせに依存する。しかし、相転移は該溶液の透明さと複屈折をモニタリングすることによって検知することができる。液晶相の始まりは、該溶液が半透明の外観となり、直角の偏向フィルターを通して見た時に複屈折を示す時に、検知され得る。
【０１００】
クモ糸タンパク質を溶解するために使われる溶媒は極性であるべきであり、好適には非常に極性である。そのような溶媒の例としては、ジ−ハロ酢酸（ｄｉ−ｈａｌｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄｓ）、トリ−ハロ酢酸（ｔｒｉ−ｈａｌｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄｓ）、およびハロアルコール（例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール）が挙げられる。アセトンのような共溶媒が有用な場合もある。リチウムチオシアネート、グアニジンチオシアネート、または尿素のような、カオトロピック剤の溶液も使用することが可能である。
【０１０１】
繊維形成技術では、機械的方法で拾い上げるに十分な長さが産生されるまで、繊維が開口部を通して該タンパク質溶液からメタノールにまず押し出され得る。その後、繊維はメタノール溶液を通って、そのような機械的方法で引かれ、収集され、乾燥されることが可能である。繊維を引く方法類は当業者には周知であると考えられる。例えば、５８ｋＤａの合成ＭａＳｐコンセンサスポリペプチドから成る繊維は、低分子量のナイロンを引くのに使われる方法に似た方法によって引かれた。そのような方法類は、米国特許番号５，９９４，０９９に記載されており、その全体の引用をもって当明細書の一部とする。
【０１０２】
注記として、本発明のクモ糸タンパク質類は、短いアミノ酸配列の不完全な反復が大部分を占める一次構造を有する。「ユニットリピート」は、そのような短い配列を構成する。このように、クモ糸タンパク質の一次構造は、その大部分が、ユニットリピートの小さい変異体の列から成ると考えられている。天然のタンパク質でのユニットリピートはしばしば、互いに異なる。すなわち、タンパク質の長さに沿って、ユニットリピートにほとんど、または全く重複がない。しかし、合成タンパク質の一次構造が１つのユニットリピートの、何回かの正確な反復として記述され得るような合成クモ糸を作製し得る。別の合成クモ糸類は、ユニットリピートの何回かの反復と、２番目のユニットリピートの何回かの反復として記載され得る。そのような構造は、典型的なブロック共重合体に似ているであろう。本発明はまた、いくつかの異なるクモ糸配列群（天然の変異体類またはそれらの遺伝操作された変異体類）から由来するユニットリピートから成る合成クモ糸タンパク質類の産生を含む。
【０１０３】
そのような合成のハイブリッドクモ糸タンパク質類は、それぞれ９００から２７００のアミノ酸を有し、２５から１００の繰り返し、好適には３０から９０の繰り返しを有し得る。クモ糸、その断片、その変異体は通常、断片類に関して、少なくとも約１６，０００ダルトン、好適には１６，０００から１５０，０００までのダルトン、より好適には５０，０００から１２０，０００までのダルトンの、分子量を有し、全長のタンパク質に関して、１００，０００以上で５００，０００以下のダルトン、好適には１２０，０００から３５０，０００までのダルトンの分子量を有する。
【０１０４】
Ｃ  抗体類
本発明はまた、本発明のタンパク質類に免疫特異的に結合できる抗体類を提供する。クモ糸タンパク質に対するポリクローナル抗体類は、標準的方法に従って調製され得る。好適な実施様態では、モノクローナル抗体類が調製される。モノクローナル抗体類は、本明細書で記述したクモ糸タンパク質類の種々のエピトープと免疫特異的に反応する。モノクローナル抗体類は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの一般的方法に従い、標準的プロトコールに従って調製され得る。クモ糸タンパク質と免疫特異的に相互作用する、ポリクローナル抗体類またはモノクローナル抗体類を、そのようなタンパク質類を同定し精製するために利用することが可能である。例えば、抗体類は、それらが免疫特異的に相互作用するタンパク質類の親和性分離に利用でき得る。抗体類は、タンパク質類と他の生物学的分子類の混合物を含む、サンプルからタンパク質を免疫沈降するために使用することができる。抗クモ糸タンパク質抗体類の他の使用法は、下記に記述される。
【０１０５】
３  クモ糸をコードする核酸、クモ糸タンパク質、およびそれに対する抗体の使用法
Ａ  クモ糸をコードする核酸
クモ糸タンパク質をコードする核酸は、本発明に従った種々の目的に使用されることが可能である。クモ糸タンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの断片群は、クモ糸タンパク質類をコードする遺伝子群の存在および／または発現を検出するために、プローブとして使用することが可能である。クモ糸タンパク質をコードする核酸類を、そのようなアッセイでプローブとして利用し得る方法には、限定するものではないが、（１）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション、（３）ノーザンハイブリダイゼーション、および（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような、様々な増幅反応、が含まれる。
【０１０６】
本発明のクモ糸をコードする核酸類は、他の動物からの関連遺伝子群を同定するためのプローブとしても利用し得る。当業者で周知のように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調節して、核酸プローブ類を種々の程度の相同性の相補性配列とハイブリダイゼーションさせることが可能である。クモ糸タンパク質をコードする核酸類を利用して、本発明のクモ糸タンパク質遺伝子群に種々の程度で関連する他の遺伝子群を同定し、特徴付けすることが可能である。そのような情報は、クモ糸タンパク質類に典型的な物理学的性質を有するタンパク質類をコードする核酸配列のさらなる特徴付けを可能にし、したがって、そのようなタンパク質類の構造／機能の分析を促進する。さらに、これらはクモ糸タンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の同定に使用することが可能であり（例えば、「ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｒａｐ」テクニックによって）、これによって、クモ糸タンパク質類から成るクモの巣で使われている他の成分の同定をさらに加速化するであろう。さらに、そのようなスクリーニングで同定された相互作用するタンパク質類は、合成のクモ糸タンパク質類から成る物質の産生および／または最適化に有用になり得る。クモ糸タンパク質をコードする核酸類はまた、標的クモ糸タンパク質ＤＮＡのＰＣＲ増幅に適するプライマーセットを産生するのに使用することが可能である。好適なプライマー類の選択基準は、当業者で周知である。
【０１０７】
本発明には、少なくとも１つのクモ糸タンパク質を含む宿主細胞類が含まれる。本発明で使用が予期される宿主細胞類には、限定されるものではないが、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳細胞、および植物細胞が挙げられる。クモ糸タンパク質をコードするＤＮＡ分子類は一種類だけをそのような宿主細胞に導入することが可能であり、または組み合わせて導入し、そのような発現によって与えられる細胞の表現型を評価し得る。ＤＮＡ分子類を導入する方法もまた、当業者には周知である。そのような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ他、編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ  １９９５に記述されてあり、それを開示することをもって、本明細書の一部である。
【０１０８】
上記に述べられたように、クモ糸タンパク質をコードする核酸類はまた、大量の実質的に純粋なクモ糸タンパク質、またはその選択された部分類を産生するのにも利用できる。
【０１０９】
Ｂ  タンパク質と抗体
本発明の方法によって産出された、精製されたクモ糸タンパク質、またはその断片群は、種々の異なる応用で利用されることが可能であるが、そのような応用には、限定するものではないが、ファブリックの生産、縫糸、医療用カバー（ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｏｖｅｒｉｎｇｓ）、ハイテクの衣類、ロープ、補強プラスチック、その他、強度と弾性の種々の組み合わせが必要な応用が含まれる。
【０１１０】
表２は、種々の生物学的物質と人工の物質の物理学的性質の一覧表である。
【０１１１】
【表２】
2005502347.tif 000003
【０１１２】
表２に示されるように、クモ糸は有利な物理学的性質によって特徴付けられ、そのような性質には、限られるものではないが、高い抗張力と顕著な弾性が含まれる。これらの性質は多くの応用で非常に望ましい。クモ糸は集合体でこれらの物理学的性質を有し、その集合体のためにクモ糸が無比の有用性をもつユニークなタンパク質となっていることを注記するのは重要である。例えば、クモの牽引糸は、スチールや炭素繊維より大きな抗張力（２００  ｋｓｉ）、いくつかのナイロンほど大きい弾性（３５％）、絹糸ほど低い剛性（０．６  ｍｓｉ）、および水中で超収縮（ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｒａｃｔ）する能力（長さが最大６０％まで減少）を有する。牽引糸の高い抗張力と弾性の観点から見て、牽引糸を破損するのに必要なエネルギーは、ケブラーJとスチールを含む、任意の知られる繊維を破壊するために必要なエネルギーを上回る。これらの特性は、既に知られる天然物質または人工の物質のいずれより優れている。さらに、本発明のこの新しい物質はまた、非常に軽量の物質にそのような好適な特徴の、ユニークな組み合わせを提供するであろう。
【０１１３】
前記の有益な性質の観点において、本発明で開示した該クモ糸タンパク質類を物質での成分として使用することで、優れた製品類を産生できるであろう。クモ糸が好適な溶媒中に溶解され、小さい開口部を通してクモ糸繊維を産生する時、そのような繊維はファブリック／物質に織り込まれたり、またはコンポジットのファブリック／物質に加えられ得る。例えば、クモ糸繊維類はファブリック類に織り込まれて、ファブリックの強度と弾性を調節することが可能で、異なる応用に対して最適化された、そのような修正されたファブリックから成る物質を提供する。クモ糸繊維は、ハイテク衣類、ロープ、船の帆、パラシュート、空中装置（例えば、ハンググライダ−）の翼、電気的構成部品の柔軟な取付けひも、縫合糸、および移植用の生体適合物質（例えば、人工靭帯または大動脈用テープ（ａｏｒｔｉｃ  ｂａｎｄｉｎｇ））を作製するための材料に組み入れた時に、特に有用であり得る。生物医学的応用には、手術で使用される縫合糸に、本発明の天然および／または合成のクモ糸繊維の使用が含まれ、そのような手術には、限定するものではないが、目の手術、再建手術（例えば、神経や鼓膜の再建）、血管閉鎖、腸の手術、美容外科手術、および中枢神経系手術が含まれる。天然と合成のクモ糸繊維はまた、抗生物質で飽和した縫合糸と移植材料、および骨と結合組織の再建の基質材料の生産でも有用であり得る。再建用の移植材料と基質材料は、凝縮された成長因子、分化因子、および／または細胞誘引物質で飽和されて、外来性の物質の取り込みと患者の回復を促進することが可能である。本発明のクモ糸タンパク質類と繊維類は、強度と弾性の種々の組み合わせが必要な、任意の応用に使用できる。さらに、クモ糸タンパク質類は、任意の応用でその有用性を最適化するために修正することが可能である。上記したように、クモ糸タンパク質類の配列は、フィブロインの種々の物理学的性質を変えるために修正することができ、異なるクモ糸タンパク質類とそれらの変異体を組み合わせて織り込んで、少なくとも１つのクモ糸タンパク質またはその変異体から成る繊維を産生できる。
【０１１４】
天然のクモ糸タンパク質への免疫反応に対する潜在性を評価するために計画された、予備的な研究で、天然の牽引糸をマウスとラットの筋肉内、腹腔内、または皮下に移植した。天然の牽引糸を導入した動物類は、移植の部位にかかわらず、該クモ糸タンパク質に対する免疫応答を起こさなかった。注記すべきは、クモ糸タンパク質移植物の回りの組織切片は、ポリエチレン棒が挿入された移植部位から由来する組織切片に本質的に同じであった。ポリエチレン棒は、移植以前に牽引クモ糸タンパク質が包まれる固体基質として使われたので、ポリエチレン棒のみの導入はこの実験で陰性対照として使える。上記の考察から、本発明のクモ糸タンパク質類は、脊椎動物に導入された時に、最小の免疫応答を誘導すると予期される。
【０１１５】
合成クモ糸繊維は、天然のクモ糸繊維を使用できる任意の応用で有用である。例えば、合成繊維は種々のプラスチックおよび／または樹脂と混合して、繊維で強化したプラスチックおよび／または樹脂製品を調製することが可能である。クモ糸は１８０℃まで安定であるため、クモ糸タンパク質繊維は、熱で注入されたプラスチック（ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｐｌａｓｔｉｃｓ）で、構造的補強物質として有用であろう。
【０１１６】
本発明のクモ糸タンパク質およびその誘導体は、当業者で公知の方法によて大量に産生できることは、前記の記述から明らかであろう。クモ糸タンパク質類およびその誘導体は、任意の目的の繊維に作製し得る。さらに、繊維類の混合コンポジットもまた、そのユニークな組み合わせの性質のゆえに、興味深い。そのような混合コンポジットは、それらが組み込まれることが可能な任意の物質に柔軟性と強度の特徴を与え得る。
【０１１７】
精製されたクモ糸タンパク質、またはその断片類は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生するために使用することができ、このような抗体は、細胞内でのクモ糸タンパク質（またはクモ糸タンパク質を含む複合体）の存在または蓄積のための感受性の高い検出試薬として役立ち得る。組換え技術によって、クモ糸タンパク質の一部または全体を含む融合タンパク質の発現が可能になる。該タンパク質の全長タンパク質または断片類を利用して、クモ糸タンパク質の種々のエピトープ群に特異的な１群のモノクローナル抗体を産生することができ、これらの抗体によって細胞内のクモ糸タンパク質の検出により高い感受性を提供できる。
【０１１８】
クモ糸タンパク質に免疫学的に特異的なポリクローナル抗体類とモノクローナル抗体類は、これらのタンパク質の検出と定量化をするための種々のアッセイで使用し得る。そのようなアッセイには、限定するものではないが、種々の細胞からの抽出物の（１）フローサイトメトリー分析、（２）イムノブロット分析（例えば、ドットブロット法、ウエスタンブロット法）が含まれる。さらに、抗クモ糸タンパク質抗体類は、クモ糸タンパク質と会合サブユニット類の精製に使用することができる（例えば、アフィニティカラム精製法、免疫沈降法）。
【０１１９】
前記の考察から、本発明の、クモ糸をコードする核酸類、クモ糸を発現するベクター類、クモ糸、抗クモ糸抗体類は、個別に或いは組み合わせて使用でき、その使用目的は、例えば（１）他のクモ糸タンパク質類、または同様のモチーフから成るタンパク質類をコードする核酸配列の同定、（２）異なる物理学的性質の最適化のために選択された、新規なハイブリッドのクモ糸タンパク質の産生、（３）クモ糸タンパク質類、またはその断片類や誘導体類を大量に発現、および（４）細胞および／または生物体でのクモ糸タンパク質類の発現の検出である。
【０１２０】
以下の例は本発明の実施様態を例証するために提供される。これらの例は、本発明の範囲をいかようにも限定するものではない。
【０１２１】
例１
クモ糸タンパク質類をコードするクローン類の同定
新規のクモ糸タンパク質類を同定し、フィブロインタンパク質類をコードする核酸配列の限られたデータベースを拡大するために、７つのクモ属の糸腺から由来する１１のｃＤＮＡライブラリを作製した。ｃＤＮＡデータは、２つのゲノムライブラリとＰＣＲで増幅された配列群からの情報で補われた（７）。真正クモ目の７つの科からの２８のフィブロインの部分的ｃＤＮＡまたは遺伝子配列が同定された。当明細書で記述されるように、これらのデータは、特徴付けられたフィブロイン類の系統発生学的多様性を大きく拡大する。
【０１２２】
配列データの収集方法
ｃＤＮＡライブラリは、Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ（コガネクモ科：Ａｒａｎｅｉｄａｅ）とＬａｃｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ（ヒメグモ科：Ｔｈｅｒｉｄｉｉｄａｅ）の大瓶状腺、Ａ．ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａの鞭状腺、Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓ  ｔｅｎｅｂｒｏｓｕｓ（キシダクモ科：Ｐｉｓａｕｒｉｄａｅ）の瓶状腺、Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｔｒｉｓｔｉｓ（Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｉｄａｅ科）の２組の糸腺、およびｍｙｇａｌｏｍｏｒｐｈ  Ｅｕａｇｒｕｓ  ｃｈｉｓｏｓｅｕｓ（ジョウゴグモ科：Ｄｉｐｌｕｒｉｄａｅ）の糸腺から作製された。Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓからの腺は、広範なループした導管（ｄｕｃｔ）を介して出糸突起に接続された長い尾（ｔａｉｌ）を有する、４組の細長い瓶状腺（ｓｐｉｎｄｌｙ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｇｌａｎｄ）であった。Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓからの腺は、２つの最も大きい組のアンプルの形をした腺（ａｍｐｕｌｅ−ｓｈａｐｅｄ  ｇｌａｎｄ）であった。Ｅｕａｇｒｕｓの比較的一様な糸腺類は、この種のＲＮＡ抽出のために混合された。Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ（アシナガグモ）とＡ．ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａのゲノムライブラリが構築された。１３のライブラリからのデータは、ＰＣＲで増幅された、８つのＡｒａｎｅｏｉｄからのゲノム配列によって増大された。
【０１２３】
Ｐｈｉｄｉｐｐｕｓ  ａｕｄａｘ（ハエトリグモ科：Ｓａｌｔｉｃｉｄａｅ）からの糸腺のすべては、この種のためのＲＮＡ抽出で混合された。同様に、Ｚｏｒｏｃｒａｔｅｓ種（Ｚｏｒｏｃｒａｔｉｄａｅ）からの糸腺のすべては、この種のためのＲＮＡ抽出で混合された。別のｃＤＮＡライブラリは、Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ（コガネグモ科）の、中間の紡糸口に接続されたブドウ状腺と後部の紡糸口に接続されたブドウ状腺から作製された。ブドウ状フィブロインの同一のｃＤＮＡ配列群が、両方のライブラリから単離された。
【０１２４】
７つのｃＤＮＡライブラリの構築とスクリーニングの方法を下記に示した。糸腺類は、安楽死させたクモから切開され、液体窒素に急速冷凍された。ｍＲＮＡは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（Ｄｙｎａｌ）を用いて該糸腺類から抽出された。ｃＤＮＡは、ファーストストランド合成プライマー（ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｉｍｅｒ）としてオリゴ（ｄＴ）と使い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて合成された。サイズによって分画されたｃＤＮＡ（ＣｈｒｏｍａＳｐｉｎ−１０００、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、ｐＧＥＭ−３ｚｆ(＋)（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションされ、ＳＵＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＺＥｒＯ（登録商標）−２細胞、またはＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気穿孔された。各々が約１５００の組換えコロニーの、１１のライブラリが構築され、コロニーはスクリーニングのためにナイロン膜に移した。
【０１２５】
クモ糸のｃＤＮＡクローン群は、γ３２Ｐで標識されたプローブ類である、ＣＣＷＡＹＷＣＣＮＣＣＡＴＡＴＣＣＷＣＣ（配列表の配列番号５８番）、ＣＣＷＣＣＷＧＧＷＣＣＮＮＮＷＣＣＷＣＣＷＧＧＷＣＣ（配列表の配列番号５９番）、ＣＣＷＧＧＷＣＣＴＴＧＴＴＧＷＣＣＷＧＧＷＣＣ（配列表の配列番号６０番）、ＧＣＤＧＣＤＧＣＤＧＣＤＧＣＤＧＣ（配列表の配列番号６１番）、ＣＣＷＧＣＷＣＣＷＧＣＷＣＣＷＧＣＷＣＣ（配列表の配列番号６２番）、およびＣＣＡＧＡＤＡＧＡＣＣＡＧＧＡＴＴＡＣＴ（配列表の配列番号６３番）との順次ハイブリダイゼーション（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓ）（ＱｕｉｋＨｙｂ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と大きな挿入サイズで選択されたクローン群のシークエンシングによって同定された。上記のオリゴヌクレオチド群は、発表されているクモ糸の配列に基づいて設計された（４、５、８、９を参照）。数百の陽性のクローン群は制限酵素類でスクリーニングされ、部分集団のクローン群を、標準のＭ１３シークエンシングプライマー（Ｍ１３  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いて、ゲノムプライミングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＮＥＢ）でトランスポソンを挿入することによって、シークエンシング（ＡＢＩ）した。多様な転写物が、クモ糸フィブロイン遺伝子ファミリーのメンバーとして認識されたが、この認識は、内部の反復性、非反復性のカルボキシ末端で、以前にシークエンシングされたＡｒａｎｅｏｉｄフィブロインと同様の配列、および切開された糸腺類からと発表された研究からのアミノ酸成分に関する配列の翻訳の一貫性によって行われた（Ｊ．ｐａｌｍｅｒ（１９８５）Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．１８６：１９５）。
【０１２６】
ゲノムライブラリ群は、アシナガグモ科（ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄ）であるＮｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ（λＧｅｍ−１２、Ｐｒｏｍｅｇａ）とコガネグモ科のＡｒｇｉｏｐｅ  Ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ（λＦｉｘＩＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対して構築された。ゲノムライブラリ群は、放射能標識したプローブ類のＣＣＷＣＣＷＧＧＷＣＣＮＮＮＷＣＣＷＣＣＷＧＧＷＣＣ（配列表の配列番号５９番）とＣＣＷＧＧＷＣＣＴＴＧＴＴＧＷＣＣＷＧＧＷＣＣ（配列表の配列番号６０番）でスクリーニングした。選択された糸遺伝子挿入物は、第一腕（ｔｈｅ  λ  ａｒｍｓ）から切り取られ、ｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターにサブクローンされ、上記のようにシークエンスされた。
【０１２７】
ゲノム配列は、Ａｒａｎｅｏｉｄ（Ｎ．ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｎ．ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ、Ａ．ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ、Ａ．ａｕｒａｎｔｉａ、Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ  ｋａｕａｉｅｎｓｉｓ、Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ、およびＧａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａ）から増幅された。ＭａＳｐ１に対してプライマーＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＴＡＣＧ  （配列表の配列番号６４番）、ＧＧＣＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＴＴＧＡＣＣＡＡＣＧ（配列表の配列番号６５番）、およびＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＣ（配列表の配列番号６６番）を使用し、ＭａＳｐ２に対してＣＣＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡＣＣＡＧＧＴＣ（配列表の配列番号６７番）、ＣＣＧＡＣＡＡＣＴＴＧＧＧＣＧＡＡＣＴＧＡＧ（配列表の配列番号６８番），ＣＡＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧ（配列表の配列番号６９番）、ＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣ（配列表の配列番号７０番）、ＣＣＡＡＣＣＡＷＴＴＧＣＧＣＡＴＡＣＴＧ（配列表の配列番号７１番）、ＧＣＴＴＧＡＧＴＴＡＡＡＧＡＹＴＧＡＣＣ（配列表の配列番号７２番)、およびＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＴＡＴＧ（配列表の配列番号７３番）を使用し、標準の方法（Ｇｉｂｃｏ組換えＴａｑポリメラーゼ）でＰＣＲが行われた。ＰＣＲ反応は、一般的にＤＮＡ断片群のラダーの産生が起こる。そのようなラダーは、ＰＣＲプライマー群がクモ糸遺伝子の繰り返し配列群の複数の結合部位群にアニーリングすることによって起こる。増幅された各フィブロインに対して、該ＰＣＲラダー中の最も狭いバンドを摘出し、ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使ってクローンした。各クモ糸遺伝子の２〜３のクローンが、上記のようにシークエンシングされた。１１のクモのフィブロインからの追加の配列群がＧｅｎＢａｎｋ（アクセス番号Ｍ３７１３７、Ｕ０３８４８、Ｍ９２９１３、ＡＦ０２７７３５、ＡＦＯ２７７３６、ＡＦＯ２７７３７、ＡＦ０２７９７２、ＡＦ０２７９７３、ＡＦ２１８６２３、ＡＦ２１８６２４、Ｕ２０３２８、Ｕ４７８５３、Ｕ４７８５４、Ｕ４７８５５、およびＵ４７８５６）から取られた。これらの発表済の配列群は、Ａｒａｎｅｏｉｄのオオジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ）とオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ）からである（図１）。
【０１２８】
結果
クモ（４-５、８-９）とレピドプテラン（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）（１０-１１）からの、以前に発表されたフィブロイン類のように、本発明の該配列群は、繰り返しのアラニンとグリシンの豊富なタンパク質類をコードする。各分子内で、繰り返しのアミノ酸モチーフ群は、高次のアンサンブルリピート（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｒｅｐｅａｔｓ）に組織化されている。各フィブロイン内のアンサンブルリピート群は整列されており、１つのコンセンサスアンサンブルリピートは各分子に対し作製された（１２）。Ａｒａｎｅｏｉｄでないクモ類からの糸ＤＮＡ配列（図２）は、部分的に、円網クモ類のフィブロインを構成する、重要なアミノ酸モチーフを繰り返す。ＧＡ、ＧＧＸ、およびＡｎは、キシダクモ科（ｐｉｓａｕｒｉｄ）のツリグモ（ｆｉｓｈｉｎｇ  ｓｐｉｄｅｒ）であるＤｏｌｏｍｅｄｅｓからの糸フィブロインのコンセンサス アンサンブルリピートユニットを形成する。Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓの糸タンパク質でのこれらの３つのモチーフの関連は、円網クモ類の大瓶状糸フィブロインと小瓶状糸フィブロインを反映している（図３）。ＧＡ、ＧＧＸ、およびＡｎのモチーフはまた、系統的により基本的なクモの系統（単性域類（Ｈａｐｌｏｇｙｎａｅ） および トタテグモ亜目（Ｍｙｇａｌｏｍｏｒｐｈａｅ））からのアンサンブル リピートユニット群の中に、時々まばらに分布している。Ａｎは、これらの分類からのフィブリン類、およびこれまで研究された真正クモ目のすべての系統からのフィブリン類のそれぞれで示された。（図２及び図３）トタテグモ亜目（タランチュラ類とその同類）は、三畳紀の中ごろ、２億４０００万年以上前に、クモ亜目（Ａｒａｎｅｏｍｏｒｐｈａｅ）（「真の」クモ類）から分岐し（１３、図１）、したがってＡｎモチーフはその時代以来、異なるクモ類で維持されてきた可能性がある。
【０１２９】
Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ（単性域類）とＥｕａｇｒｕｓ（トタテグモ目）のフィブロインは、内部的には繰り返しがあるが、これらの基礎的な分類からのアンサンブルリピート（図２）は、以前に記載された糸からの同様のユニット（図３）と異なる。これらの原始的なグループからのフィブロイン類のそれぞれは、セリンのストレッチを含む。Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｃＤＮＡ１は、Ａｎ、Ｓｎ、（ＧＸ）ｎ、および（ＡＱ）ｎの反復を有し、内部的に高度に繰り返し性がある。Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｃＤＮＡ３は、長い繰り返しユニットのタンデムアレイをコードする５’末端とずっと短いアンサンブルユニットの１５の繰り返しをコードする３’末端を有する、ユニークな分子構成をもつ。約３４６アミノ酸のＥｕａｇｒｕｓリピートユニットは、セリンとアラニンがリッチな配列の複雑な混合体であり、Ａｒａｎｅｏｉｄのフィブロイン類（図２）には稀なアミノ酸であるスレオニン列を含む。
【０１３０】
全体的なモジュラー構造、散在するＧＡ、ＧＧＸ、Ａｎモチーフ、および非反復的カルボキシ末端でのアミノ酸マッチ（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍａｔｃｈｅｓ）の他に、Ａｒａｎｅｏｉｄのフィブロイン類とＰｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓとＥｕａｇｒｕｓからのフィブロイン類との間の配列類似性は、ほんの限られたものである（図２と図３）。本明細書で提示されたデータは、クモ類が広い多様性をもったフィブロインを利用していることを明らかに示す。そのような多様性は、これらのクモ類が住む多様な生態系を反映している可能性がある（１、１４）。基本的な真正クモ目の新規の該フィブロインリピートが示唆するところでは、クモ糸の設計は、特に特定の配列に依存しているようではないらしいが、円網クモ類の内のフィブロインの比較はこの記述に矛盾する（図３）。
【０１３１】
発表されたデータ（４−５，８−９）と組み合わせると、これらの新しい配列群は、４つのグループのフィブロイン（１５）、すなわち 大瓶状ｓｐｉｄｒｏｉｎ１様（ＭａＳｐ１）、大瓶状ｓｐｉｄｒｏｉｎ２様（ＭａＳｐ２）、小瓶状ｓｐｉｄｒｏｉｎ（ＭａＳｐ）、鞭状糸タンパク質（Ｆｌａｇ）に関して、２つの最も基本的なクレードである無篩板の円網クモ類、コガネクモ科と「派生（ｄｅｒｉｖｅｄ）コガネグモ科」（図１）の間での比較を可能にする。これらの４つのグループのそれぞれの内での、フィブロイン間の差は、主にＡｎ、ＧＡ、ＧＧＸ、およびＧＰＧ（Ｘ）ｎのモチーフの配置と頻度での変動である（図３）。Ａｎ、ＧＡ、およびＧＧＸは、コガネグモ科と派生コガネグモ科との、両方のＭｉＳｐオーソログでのコンセンサスリピートに存在する。大瓶状フィブロイン類は、Ａｒａｎｅｏｉｄの間で同様に保存されている。ＭａＳｐ１の安定なリピートは、Ａｎ、ＧＡ、およびＧＧＸであり、ＭａＳｐ２の安定なリピートは、ＧＰＧ（Ｘ）ｎとＡｎである。これらのモチーフは、クモの巣を作るが通常の円網を紡がないようなＡｒａｎｅｏｉｄであるゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ）の大瓶状フィブロインでさえでも保持されている。長いＦｌａｇリピートは、コガネグモ上科内で多様であるが、コガネグモ科と派生コガネグモ科のリピートユニットはどちらも、主にクラスター化したＧＰＧ（Ｘ）ｎとＧＧＸのモチーフから成る（図３）。
【０１３２】
化石の証拠は、派生コガネグモ科からコガネグモ科の分岐は、白亜紀前記より以前に起こったことを示唆する（図１）。したがって、ＭａＳｐ１、ＭａＳｐ２、ＭｉＳｐ、およびＦｌａｇ内に保存されたモチーフ類は、１億２５００万年以上にわたって、おそらく淘汰を安定化することによって維持されてきた。（１６）そのような長い進化期間にわたって維持されてきたモチーフ類は、特殊化された円網糸の多様な機械的特性に重要であるようである。
【０１３３】
例２
ＭａＳｐ１様およびＭａＳｐ２様のクモ糸タンパク質類のクローン
本発明の新規のクモ糸タンパク質類の、さらなる分類と構造／機能の分析の目的のために、フィブロイン配列群は、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓの異なる類似グループに指定された。クモ糸フィブロイン類は、大部分（９０％以上）がアンサンブルリピートユニットから成る長いタンパク質であり、そのようなアンサンブルリピートユニットは内部的に繰り返しがある（４，５，８，９）。異なるフィブロインからのアンサンブルリピートユニットは長さが異なり、時には１桁ほどの差がある。この長さの変動とクモ糸タンパク質の全体的なモジュラー構造のために、分子間の残基対残基の相同性を述べることは困難である。したがって、アンサンブルリピートユニット間の全体的な類似性や差異が、まずＡｒａｎｅｏｉｄのフィブロインを４つのクラスに分類するために使われた。以下のタンパク質は、以前にＮ．ｃｌａｖｉｐｅｓで記述されたように（５，９）、ＭａＳｐ１様タイプのフィブロインに対応する。
【０１３４】
ＭａＳｐ１様グループタンパク質類は、１つのポリアラニン区間を有する、短いアンサンブルリピートによって特徴付けられた。１つのリピートの残りは、多くのＧＧＸモチーフと散在したＧＡモチーフから成る。クモ糸タンパク質のＭａＳｐ１様グループには、Ｎ． ｃｌａｖｉｐｅｓのＭａＳｐ１と、Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｕｒａｎｔｉａ（Ａ．ａｕｒａｎｔｉａ）からのゲノムＭａＳｐ１クローン（配列表の配列番号１番）、Ａ．ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａのＭａＳｐ１のｃＤＮＡ（配列表の配列番号２番）、Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ（Ｌ．ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ）のＭａＳｐ１のｃＤＮＡ（配列表の配列番号３番）、Ｎ．ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓからのゲノムＭａＳｐ１クローン（配列表の配列番号４番）、Ｎ．ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓからのゲノムＭａＳｐ１クローン（配列表の配列番号５番）、Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ  ｋａｕａｉｅｎｓｉｓ（Ｔ．ｋａｕａｉｅｎｓｉｓ）からのゲノムＭａＳｐ１クローン（配列表の配列番号６番）、およびＴ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒからのゲノムＭａＳｐ１クローン（配列表の配列番号７番）によってコードされるタンパク質類が含まれる。配列表の配列番号１〜７によってコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号２９〜３５番で提供されている。
【０１３５】
ＭａＳｐ２様グループのタンパク質類は、１つのポリアラニン区間と種々のＧＰＧ（Ｘ）ｎとＧＰモチーフから成る、短いアンサンブルリピートによって特徴付けられた。クモ糸タンパク質のＭａＳｐ２様グループには、Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓのＭａＳｐ２と、Ａ．ａｕｒａｎｔｉａからの１つのゲノムＭａＳｐ２クローン（配列表の配列番号８番）、Ａ．ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａの１つのＭａＳｐ２  ｃＤＮＡ（配列表の配列番号９番）、Ａ．  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａの１つのゲノムＭａＳｐ２クローン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０）、Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａからの１つのゲノムＭａＳｐ２クローン（配列表の配列番号１１番）、Ｌ．ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓの１つのＭａＳｐ２  ｃＤＮＡ（配列表の配列番号１２番）、Ｌ．ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓからの１つのゲノムＭａＳｐ２クローン（配列表の配列番号１３番）、Ｎ．ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓからの２つのゲノムＭａＳｐ２クローン（配列表の配列番号１４〜１５番）、およびＮ．ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓからの１つのゲノムＭａＳｐ２クローン（配列表の配列番号１６番）によってコードされるタンパク質類が含まれる。配列表の配列番号８〜１６番によってコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号３６〜４４番で提供されている。
【０１３６】
例３
鞭状様のクモ糸タンパク質類のクローン
アンサンブル リピートユニットの間の全体的な類似性と差に基づいて、以下のグループのタンパク質類は、Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓ（５，９）で以前に記述されたようなフィブロインに似た、ｆｌａｇ様タイプのフィブロインとして分類された。
【０１３７】
Ｆｌａｇ様のグループのタンパク質類は、主にクラスターのＧＧＸとＧＰＧ（Ｘ）ｎから成る長いアンサンブルリピートによって特徴付けられた。各アンサンブルリピートは、Ａｒａｎｅｏｉｄの糸に典型的でないアミノ酸類を含む、１つの「スペーサー」領域を有していた。ｆｌａｇ様グループのクモ糸タンパク質類は、Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓからのＦｌａｇとＡ．ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａのＦｌａｇ  ｃＤＮＡクローン類（配列表の配列番号１７−１８）によってコードされた２つのタンパク質を含む。配列表の配列番号１７−１８番によってコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号４５〜４６番で提供されている。
【０１３８】
例４
異なるモチーフから成るクモ糸タンパク質のクローン類
当明細書で記載される、２つの新規なクモ糸タンパク質は、Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓで以前に記述された４つのクラスのＡｒａｎｅｏｉｄフィブロインの１つに容易に指定できなかった。このグループのフィブロイン類には、異なる繰り返しモチーフから成るクモ糸タンパク質に含まれる。この特徴は、これらのフィブロイン類をコードする核酸配列が由来した種の異なる生態系を反映している可能性がある。このカテゴリーには、Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓ  ｔｅｎｅｂｒｏｓｕｓ（Ｄ．ｔｅｎｅｂｒｏｓｕｓ）のフィブロイン１  ｃＤＮＡ（配列表の配列番号１９番）とＤ．ｔｅｎｅｂｒｏｓｕｓのフィブロイン２  ｃＤＮＡ（配列表の配列番号２０番）によってコードされるタンパク質が含まれる。配列表の配列番号１９〜２０番によってコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号４７〜４８番で提供されている。
【０１３９】
例５
非典型的なモチーフから成るクモ糸タンパク質のクローン類
本発明の７つの新規なクモ糸タンパク質類は、以前に特徴付けられたＡｒａｎｅｏｉｄフィブロインで記述されたモチーフとは異なる非典型的なクモ糸モチーフ類から成る。このグループのフィブロイン類には、異なる繰り返しモチーフから成るクモ糸タンパク質に含まれる。この特徴は、これらのフィブロイン類をコードする核酸配列が由来した種の異なる生態系を反映している可能性がある。このカテゴリーには、Ｅｕａｇｒｕｓ  ｃｈｉｓｏｓｅｕｓ（Ｅ．ｃｈｉｓｏｓｅｕｓ）のフィブロイン１ ｃＤＮＡ（配列表の配列番号２１番）、Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｔｒｉｓｔｉｓ（Ｐ．ｔｒｉｓｔｉｓ）のフィブロイン１ ｃＤＮＡ（配列表の配列番号２２番）、Ｐ．ｔｒｉｓｔｉｓのフィブロイン２ｃＤＮＡ（配列表の配列番号２３番）、Ｐ．ｔｒｉｓｔｉｓのフィブロイン３  ｃＤＮＡ（配列表の配列番号２４番）、Ｐ．ｔｒｉｓｔｉｓのフィブロイン４  ｃＤＮＡ（配列表の配列番号２５番）、Ｐｈｉｄｉｐｐｕｓ  ａｕｄａｘ（Ｐ．ａｕｄａｘ）のフィブロイン１  ｃＤＮＡ（配列表の配列番号２６番）、およびＺｏｒｏｃｒａｔｅｓ種のフィブロイン１  ｃＤＮＡ（配列表の配列番号２７番）によってコードされるタンパク質類が含まれる。配列表の配列番号２１〜２７番によってコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号４９〜５５番で提供されている。
【０１４０】
例６
異なるモチーフから成るクモ糸タンパク質の１つの例証的なクローン
本発明の１つの新規なクモ糸タンパク質は、以前に特徴付けられたＡｒａｎｅｏｉｄフィブロインで記述されたモチーフとは異なる非典型的なクモ糸モチーフ類から成る。このフィブロインは、高度に異なる繰り返しモチーフ類から成り、Ａ．ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａのブドウ状フィブロイン１  ｃＤＮＡクローン（配列表の配列番号２８番）によってコードされる。配列表の配列番号２８番によってコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号５６番で提供されている。
【０１４１】
Ａ．ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａのブドウ状フィブロイン１タンパク質（配列表の配列番号５６番）の１つのコンセンサス配列リピートは、約２００のアミノ酸から成るが、これは当明細書で同定された。このコンセンサス配列リピートから成るアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号５７番で提供されている。そのようなコンセンサス配列は、幾つかの応用で有用であり、そのような応用には、限定されるものではないが、１）配列表の配列番号５７番をコードできる縮退核酸プローブ類の産生であり、そのようなプローブ類は新規のクモ糸タンパク質類をコードする核酸分子のスクリーニングと同定に使用でき、２）配列表の配列番号５７番の一部または全体に特異的な抗体類の産生であり、そのような抗体類は新規なクモ糸タンパク質類とそれらの誘導体類のスクリーニングと同定に使用でき、および３）合成クモ糸タンパク質類の設計と産生でのモジュラーユニットとしての利用、が含まれる。
【０１４２】
例７
合成クモ糸タンパク質類の設計とそれらの使用法の例証的方法
合成クモ糸タンパク質類の設計するための下記の方法は、クモ糸タンパク質類のアミノ酸構成、およびアミノ酸配列の繰り返し領域がどのようにクモ糸タンパク質類の構造的／物理学的性質に寄与するかに基づいている。
【０１４３】
一般的に、合成クモ糸タンパク質類は、一連の物理学的性質を有すると同定されたアミノ酸配列領域類の、タンデムで厳密な一連の反復からなり得る。厳密な反復は、正確に複製されたアミノ酸配列の領域から成る。別法では、合成クモ糸タンパク質類は、一連の物理学的性質を有すると同定された、タンデムで非厳密的な一連の反復からなり得る。非厳密的な反復は、アミノ酸配列の領域から成り、その中では少なくとも１つのアミノ酸配列が、基本的な非厳密的反復ユニットで変更されており、そのような変更が、基本的な非厳密的反復ユニットに特徴的な、一連の物理学的性質を変えないようなものである。
【０１４４】
強度が必要であるが弾性が全く必要でないような応用（例えば、防弾チョッキ）では、小瓶状糸の抗張力を増加するために、（ＧＡ）ｎ領域を（Ａ）ｎ領域で置換することが可能である。このような変更は抗張力を増加し得る。典型的なＭｉＳｐ１タンパク質は、１６の（ＧＡ）ユニットを有する。８つの（ＧＡ）領域を、例えば、（Ａ）領域で置換すると、抗張力を１００，０００ｐｓｉから少なくとも４００，０００ｐｓｉまで増加できるであろう。さらに、もし（Ａ）ｎ領域が（ＧＡ）ｎ領域ほど長ければ、抗張力は６００，０００ｐｓｉ以上まで増加するであろう。
【０１４５】
高い抗張力と、大瓶状糸より大きな弾性を有する繊維を作るためには、（ＧＰＧＸＸ）領域の数を、４〜５の領域（天然の大瓶状クモ糸タンパク質類に通常見つけられる（ＧＰＧＸＸ）領域の範囲）から、より大きな数の領域まで増加することが可能である。例えば、もしその数を１０〜１２の（ＧＰＧＸＸ）領域数まで増加させると、弾性は５０〜６０％まで増加するであろう。例えば、もしその数をさらに２５〜３０の領域数まで増加させると、弾性は約１００％増加するであろう。そのような繊維類は、傷部（例えば、火傷）を覆うのに使用することができ、簡単な配置と構造的支持を提供する。そのような繊維類は、衣類およびコンポジット物質での繊維類としても使用し得る。
【０１４６】
非常に弾性のある鞭状糸の抗張力は、（ＧＰＧＸＸ）ユニットのいくつかを（Ａ）ｎ領域と置換することによって増加することが可能である。鞭状糸タンパク質は、各リピートにつき平均５０の（ＧＰＧＸＸ）ユニットを含む。したがって、各リピートでの２つのユニットを（Ａ）領域で置き換えると、鞭状糸の抗張力を４倍増加して、４００，０００ｐｓｉの抗張力を達成することができる。そのような鞭状タンパク質類の使用法は、増加した弾性を有する大瓶状タンパク質で記載された使用法（上に記載）に類似する。鞭状タンパク質は別の有利性を有し、それは、該タンパク質のスペーサー領域が、抗体および／または成長因子（またはそれらの組み合わせ）のような機能分子を、鞭状タンパク質類から成るコンポジットに付加できる可能性を与える有利性である。
【０１４７】
本発明の天然クモ糸タンパク質および／または合成クモ糸タンパク質の組み合わせから織り込まれた繊維もまた、本発明に含まれる。そのようなコンポジット繊維は種々の応用で有用性があり、限定するものでないが、ファブリックの生産、縫合糸、医療用カバー（ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｏｖｅｒｉｎｇｓ）、ハイテクの衣類、ロープ、および補強プラスチックが含まれる。
【０１４８】
引用文献と注記
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９．Ｇｅｎｂａｎｋ＃  Ｍ３７１３７，Ｍ９２９１３，ＡＦ０２７７３５−ＡＦ０２７７３７，ＡＦ２１８６２１−ＡＦ２１８６２４.
１０．Ｋ．Ｍｉｔａ，Ｓ．Ｉｃｈｉｍｕｒａ，Ｔ．Ｊａｍｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ.  ３８，５８３(１９９４).
１１．Ｇｅｎｂａｎｋ＃  ＡＦ０８３３４，ＡＦ０９５２３９，ＡＦ０９５２４０.
１２．種々のフィブロイン類のＤＮＡ配列群が、アミノ酸配列に翻訳された。各フィブロインに関して、アンサンブルリピートユニット（繰り返し配列モチーフの高次集合体）は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いて、第一に計算法で、第２に手動で整列させ、コンセンサス アンサンブルリピートユニットが産生された。コンセンサス アンサンブルユニットは、各分子のリピートのアライメントの各位置で最も共通のアミノ酸（またはギャップ）として定義した。アライメント位置で互角があった場合には、Ｘはコンセンサス配列でのあいまいさを表した。
１３．Ｐ．Ｓｅｌｄｅｎ，Ｊ．Ｇａｌｌ，Ｐａｌａｅｏｎｔｏｌｏｇｙ  ３５，２１１(１９９２).
１４．Ｃ．Ｃｒａｉｇ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４２，２３１(１９９７).
１５．Ａｒａｎｅｏｉｄの糸の配列はまず、アンサンブル リピートユニットの配列特徴にしたがって、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ（５，９）での異なるフィブロインオーソログに割り当てられた。これらの割り当ては、非反復的カルボキシ末端配列、発現パターン、コガネグモ上科に関する独立の系統発生的仮説への適合性、および遺伝子重複イベント最小化の系統発生学的分析を介して査定された。
１６．Ｐ．Ｓｅｌｄｅｎ，Ｐａｌａｅｏｎｔｏｌｏｇｙ  ３３，２５７(１９９０).
１７．Ａ．Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｅ．Ｒａｙ，Ｌ．Ｊｅｌｉｎｓｋｉ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２７，５２３５(１９９４).
１８．Ｓ．Ｓｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，５６３(１９９７).
１９．Ｘ．Ｑｉｎ，Ｋ．Ｃｏｙｎｅ，Ｊ．Ｗａｉｔｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３２６２３(１９９７).
２０．Ａ．Ｔａｔｈａｍ，Ｐ．Ｓｈｅｗｒｙ，Ｂ．Ｍｉｆｌｉｎ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１７７，２０５(１９８４).
２１．Ｂ．Ｔｈｉｅｌ，Ｋ．Ｇｕｅｓｓ，Ｃ．Ｖｉｎｅｙ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４１，７０３(１９９６).
２２．Ｑ．Ｃａｏ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｂａｙｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７，６７７(１９９７).
２３．Ｊ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２，８９(１９８７).
２４．Ｌ．Ｃｈｅｎ，Ａ．ＤｅＶｒｉｅｓ，Ｃ．Ｃｈｅｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，３８１７(１９９７).
２５．Ａ．Ｓｅｉｄｅｌ，Ｏ．Ｌｉｉｖａｋ，Ｌ．Ｊｅｌｉｎｓｋｉ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３１，６７３３(１９９８).
２６．Ｂ．Ｍａｄｓｅｎ，Ｚ．Ｓｈａｏ，Ｆ．Ｖｏｌｌｒａｔｈ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．２４，３０１(１９９９).
２７．Ｇ．Ｈｏｒｍｉｇａ，Ｎ．Ｓｃｈａｒｆｆ，Ｊ．Ｃｏｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．４９，４３５(２０００).
【０１４９】
本発明の好適な実施例を上記に記載し、明確に例示したが、これらによって本発明をそのような実施例に限定するものではない。下記の請求に記載された、本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、種々の修正をすることが可能であろう。
配列表
【０１５０】
核酸配列
【０１５１】
【化１−１】
2005502347.tif 000004
【０１５２】
【化１−２】
2005502347.tif 000005
【０１５３】
【化１−３】
2005502347.tif 000006
【０１５４】
【化１−４】
2005502347.tif 000007
【０１５５】
【化１−５】
2005502347.tif 000008
【０１５６】
【化１−６】
2005502347.tif 000009
【０１５７】
【化１−７】
2005502347.tif 000010
【０１５８】
【化１−８】
2005502347.tif 000011
【０１５９】
【化１−９】
2005502347.tif 000012
【０１６０】
【化１−１０】
2005502347.tif 000013
【０１６１】
【化１−１１】
2005502347.tif 000014
【０１６２】
【化１−１２】
2005502347.tif 000015
【０１６３】
【化１−１３】
2005502347.tif 000016
【０１６４】
【化１−１４】
2005502347.tif 000017
【０１６５】
【化１−１５】
2005502347.tif 000018
【０１６６】
【化１−１６】
2005502347.tif 000019
【０１６７】
【化１−１７】
2005502347.tif 000020
【０１６８】
【化１−１８】
2005502347.tif 000021
【０１６９】
【化１−１９】
2005502347.tif 000022
【０１７０】
【化１−２０】
2005502347.tif 000023
【０１７１】
【化１−２１】
2005502347.tif 000024
【０１７２】
【化１−２２】
2005502347.tif 000025
【０１７３】
【化１−２３】
2005502347.tif 000026
【０１７４】
【化１−２４】
2005502347.tif 000027
【０１７５】
【化１−２５】
2005502347.tif 000028
【０１７６】
アミノ酸配列
【０１７７】
【化２−１】
2005502347.tif 000029
【０１７８】
【化２−２】
2005502347.tif 000030
【０１７９】
【化２−３】
2005502347.tif 000031
【０１８０】
【化２−４】
2005502347.tif 000032
【０１８１】
【化２−５】
2005502347.tif 000033
【０１８２】
【化２−６】
2005502347.tif 000034
【０１８３】
【化２−７】
2005502347.tif 000035
【０１８４】
【化２−８】
2005502347.tif 000036
【０１８５】
【化２−９】
2005502347.tif 000037
【０１８６】
【化２−１０】
2005502347.tif 000038
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、形態的証拠（１、２７）に基づいて真正クモ目の系統発生学的関係の分析を示す。以前に発表されたクモのフィブロインの配列は、白い丸でマークされた２つの属（ｇｅｎｕｓ）からのものである。ここで示すデータを含めて、フィブロインは赤の種類（Ｔａｘａ）で特徴付けられている。内部の節にある丸は、化石で補正された点を示す。これらの節（Ｍａｃｒｙｐｈａｎｔｅｓ（１６−黒丸）とＲｏｓａｍｙｇａｌｅ（１３−灰色丸））を補正する絶滅した分類が示されており、より高いレベルの分類が、系統図の右にある。Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓ、Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ、およびＥｕａｇｒｕｓは、それぞれＰｉｓａｕｒｉｄａｅ（キシダグモ）科、Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｉｄａｅ科、およびＤｉｐｌｕｒｉｄａｅ（ジョウゴグモ）科からである。
【図２】図２は、Ａｒａｎｅｏｉｄではないクモのフィブロイン群のコンセンサス アンサンブルリピートを示す。アミノ酸の１文字略号が使用され、ＧＧＸ、ＧＡ、およびＡｎのモチーフは、それぞれ緑色、茶色、および赤で示される。Ｐｌｅｃｔｅｒｕｒｙｓ  ｃＤＮＡ１とＰｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｃＤＮＡ２は、Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓの大瓶状腺から由来し、Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｃＤＮＡ３とＰｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｃＤＮＡ４は、このクモの小瓶状腺から由来した。
【図３】図３は、４つのＡｒａｎｅｏｉｄフィブロインのオーソログ群のコンセンサス アンサンブルリピートを示す。アミノ酸の１文字略号が使用され、ＧＧＸ、ＧＡ、Ａｎ、およびＧＰＧ（Ｘ）ｎのモチーフは、それぞれ緑色、茶色、赤、および青で示される。ＭｉＳｐフィブロイン類の「スペーサー」領域は、セリンリッチな配列であり、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓでは１３７アミノ酸長である（Ｇｅｎｂａｎｋ番号  ＡＦ０２７７３５）。Ｎｅｐ．ｃ．＝Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ、Ｎｅｐ．ｍ．＝Ｎ．ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｎｅｐ．ｓ．＝Ｎ． ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ、Ｔｅｔ．Ｋ．＝Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ  ｋａｕａｉｅｎｓｉｓ、Ｔｅｔ．Ｖ．＝Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｔ．ｇ．＝Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ、Ａｒｇ．ｔ．＝Ａｒｇｉｏｐｅ ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ、Ａｒｇ．ａ．＝Ａ．ａｕｒａｎｔｉａ、Ａｒａ．ｂ．＝Ａｒａｎｅｕｓ  ｂｉｃｅｎｔｅｎａｒｉｕｓ、Ａｒａ．ｄ．＝Ａ．ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ、Ｇａｓ．ｍ．＝Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａ、§ｍ＝大瓶状腺からのｃＤＮＡ、§ｆ＝鞭状腺からのｃＤＮＡ、†＝ＰＣＲ／ゲノムクローン、＊＝以前に発表された配列Ａ．ｄｉａｄｅｍａｔｕｓのフィブロイン（４）の以前の命名は括弧で示されている（ＡＤＦ１−４）。
【図１】
2005502347.tif 000039
【図２】
2005502347.tif 000040
【図３】
2005502347.tif 000041
【国際公開パンフレット】
2005502347.tif 000042
2005502347.tif 000043
2005502347.tif 000044
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2005502347.tif 000050
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2005502347.tif 000100
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2005502347.tif 000102
2005502347.tif 000103
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2005502347.tif 000109
2005502347.tif 000110
2005502347.tif 000111
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2005502347.tif 000125
2005502347.tif 000126
2005502347.tif 000127
2005502347.tif 000128
2005502347.tif 000129
2005502347.tif 000130
2005502347.tif 000131
2005502347.tif 000132
2005502347.tif 000133
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2005502347.tif 000135
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2005502347.tif 000139
2005502347.tif 000140
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502347.tif 000141
2005502347.tif 000142