(57)【要約】本発明は、通常生物学的検定法および診断検定法（diagnostic assay）に関し、特に、光バイオディスクシステムを用い細胞を画像化する方法および装置に関する。詳細には、本発明は、予め定められた波長の電磁放射を吸収する染色液を光バイオディスク（optical bio-disc）と共に使用して、白血球の核の形態に基づく白血球を含む細胞の識別および定量を行う方法に関するが、実施の最良の実施形態に従って後述する特定の実施の形態に限定されるものではない。
2005502872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ディスクおよびディスクドライブを使用して検定を行う方法であって、
ディスクの表面の細胞のサンプルをディスクのチャンバに用意し、前記チャンバは捕捉剤を有する少なくとも１つの捕捉領域を備え、
前記光ディスクを光学式読み取り装置にロードし、
前記光ディスクを回転させ、
電磁放射入射ビームを前記捕捉領域に送り、
前記捕捉領域において前記ディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、
前記検出したビームを出力信号に変換し、そして
前記出力信号を分析し、それによって、前記捕捉領域において捕捉された前記細胞の個数および型に関する情報を前記出力信号から抽出するステップ
を含む方法。
【請求項２】
サンプルを収容する光ディスクおよびドライブシステムであって、
基板と、該基板に平行なキャップと、該キャップと該基板との間に画定される、捕捉領域を備えたチャンバとを備えるディスクと、
第１の細胞捕捉剤を有する第１の捕捉領域および第２の細胞捕捉剤を有する第２の捕捉領域である捕捉領域における基板上の捕捉層と、
前記ディスクの前記捕捉領域に向けて光を送る光源と、
前記ディスクの前記捕捉領域から反射した光または前記捕捉領域を透過した光を検出して、信号を供給する検出器、および
前記信号を使用して、捕捉された細胞の核を区別し、捕捉分子に結合した前記サンプル内の要素を計数するプロセッサ、
を備えるシステム。
【請求項３】
光ディスクおよびディスクドライブを使用して白血球の計数を行う方法であって、
分離勾配液を含む第１の管に血液サンプルを用意し、
前記血液サンプルを層に分離するのに十分な速度で一度に前記第１の管を回転させ、
前記分離された血液サンプルから白血球層を隔離し、
前記白血球層を再度懸濁し、それによって、白血球懸濁液を形成し、
前記白血球懸濁液のサンプルを、少なくとも１つの捕捉剤を有する少なくとも１つの捕捉領域を備えた光ディスクの表面に用意し、
前記光ディスクを光学式読み取り装置にロードし、
前記光ディスクを回転させ、
電磁放射入射ビームを捕捉領域に送り、
前記捕捉領域において前記ディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、
前記検出したビームを出力信号に変換し、そして
前記出力信号を分析し、それによって、前記捕捉領域において捕捉された前記細胞の核の形態に関する情報を該出力信号から抽出するステップ
を含む方法。
【請求項４】
前記白血球のサンプルを前記捕捉剤の近傍に送り、
前記捕捉剤の存在下で前記細胞を培養し、
前記細胞が前記捕捉剤と特異的に結合することを可能にし、
前記電磁放射ビームの波長または該波長の近くで吸収する染色液で前記細胞の核を染色するステップ
をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
特異的な型の捕捉された細胞の個数を分析するステップであって、それによって、前記サンプル内の該特異的な細胞の型の濃度を求めるステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記捕捉された細胞の核の形態を分析する前記ステップは、前記ディスクから反射した光または前記ディスクを透過した光のレベルの変化を検出することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
画像認識を使用して核の形態により細胞の型を区別し、特異的な細胞の型の細胞の個数を計数するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記画像認識は、ある型の白血球の核を別の型の白血球の核と区別することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記画像認識は、細胞染色用の色素を使用することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記色素は、バイタル色素、蛍光色素、赤外色素、および近赤外色素を含む群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイタル色素は、Ｌｅｉｓｈｍａｎ色素、アクリジンオレンジ、およびＺｙｎｏｓｔａｉｎ、を含む群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記光ディスクを回転させる前記ステップは、前記細胞が前記少なくとも１つの捕捉剤と結合する機会を有するように十分な速度で十分な時間の間、回転させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記光ディスクを回転させる前記ステップは、結合していない細胞が前記捕捉領域から除去されるように十分な速度で十分な時間の間、回転させることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記光ディスクを回転させる前記ステップは、単一の速度で行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記捕捉領域のそれぞれにおいて前記捕捉された細胞を計数し、細胞の計数を含む出力を提供するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記出力は、ＣＤ４細胞の計数およびＣＤ８細胞の計数、ならびにＣＤ８細胞に対するＣＤ４細胞の比を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項３ないし１６のいずれか１項に記載の方法に従ってクラスタ分化の計数を行うために使用される光バイオディスク。
【請求項１８】
核の形態を使用して細胞の型を区別し、分画白血球の計数を行う光検定ディスクを作成する方法であって、
基板を用意し、
活性層により前記基板を被覆し、
クロスリンカーを前記活性層の上に設け、それによって、１つまたは複数の捕捉領域を生成し、
前記クロスリンカーが前記活性層に結合することを可能にし、
過剰なクロスリンカーを前記捕捉領域から除去し、
キャップ部を前記活性層に付着させ、それによって、細胞の懸濁液と、捕捉された細胞の核を染色する色素溶液とを収容するのに適合した流路を形成するステップ
を含む方法。
【請求項１９】
試験サンプル内の白血球を分析する方法であって、
光バイオディスク内に複数の白血球をロードし、
特定の細胞表面のマーカに対する特異性を有する捕捉剤の使用により、指定された標的領域で前記白血球を捕捉し、
前記捕捉された白血球の核を色素により染色し、
入射ビーム光を前記捕捉された白血球に向けて送り、
前記入射ビーム光が、前記捕捉された白血球の前記染色された核と相互作用することを可能にし、それによって、前記核の形態に関する情報を運ぶ帰還ビーム光を形成し、
前記帰還ビーム光を検出し、
前記検出された帰還ビーム光を出力信号に変換し、
前記出力信号を分析し、それによって、前記捕捉領域で捕捉された前記細胞の前記核の形態に関する情報を抽出するステップ
を含む方法。
【請求項２０】
前記色素は、バイタル色素、バイタル核色素、核色素、ＤＮＡ色素、染色体色素、蛍光色素、赤外色素、近赤外色素、ＵＶ色素、および可視色素を含む色素の群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
特異的な型の捕捉された白血球の個数を計数するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記特異的な型の白血球は、好中球、単球、リンパ球、好酸球、および好塩基球を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１９ないし２２のいずれか１項に記載の方法に従って白血球の分析を行うために使用される光バイオディスク。
【請求項２４】
光ディスクおよびディスクドライブを使用して検定を行う方法であって、
細胞のサンプルをディスクの表面に用意し、
前記ディスクを光学式読み取り装置にロードし、
前記光ディスクを回転させ、
電磁放射入射ビームを捕捉領域に送り、
前記ディスクおよび前記ディスクの表面の細胞のサンプルと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、
前記検出したビームを出力信号に変換し、そして
前記出力信号を分析し、それによって、前記捕捉領域において捕捉された前記細胞の個数および型に関する情報を前記出力信号から抽出するステップ
を含む方法。
【請求項２５】
予め定められた波長の光を吸収する色素により前記細胞のサンプルを染色するステップ、をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記予め定められた波長は、前記電磁放射ビームの波長または該波長の近くである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記色素は、赤外線スペクトル領域内の光を吸収する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記色素は、近赤外吸収染色液である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記色素は、紫外線スペクトル領域内の光を吸収する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記色素は可視スペクトル領域内の光を吸収する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記電磁放射ビームは、前記色素の吸収波長から１０ｎｍ以内の波長を有する、請求項２６ないし３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記色素は、ＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅ３８、ＴＯ−ＰＲＯ−５−ヨウ化物、ＩＲ−７８０ヨウ化物、Ｌａｓｅｒ  Ｐｒｏ  ＩＲ、ｄｄ−００７、Ｚｙｎｏｓｔａｉｎ、インドシアニン・グリーン、銅フタロシアニン、３，３’−ジエチルチアトリカルボシアニンカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＴＴＣＩ）、３，３’−ジエチルオキサトリカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＯＴＣＩ）、３，３’−ジエチルチアジカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＴＤＣＩ）、および３，３’−ジエチルオキサジカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＯＤＣＩ）を含む群から選択される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記色素は、前記ディスクの表面の前記細胞のサンプルの予め定められたコンパートメントにラベルを付ける、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記予め定められたコンパートメントは、核、核小体、核包膜、ゴルジ体（golgi apparatus）、小胞体、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム、微小管、中心小体、リボソーム、細胞膜、および細胞壁を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞のサンプルをディスクの表面に用意する前記ステップは、該細胞のサンプルを塗り付けることにより行われ、それによって、該ディスクの表面に細胞の単層を生成する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記クロスリンカーは、細胞の表面のオリゴ糖と結合する、請求項１８に記載の光検定ディスクを作成する方法。
【請求項３７】
前記クロスリンカーは、レクチンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１８、３６、または３７のいずれか１項に従って作成された前記ディスクの使用方法であって、
白血球を含むサンプルを前記流路内に堆積させ、
前記白血球が、前記捕捉領域内で前記クロスリンカーに結合することを可能にし、
結合していない細胞を前記捕捉領域から除去し、
光学式読み取り装置内に前記ディスクをロードし、
前記捕捉領域に電磁放射入射ビームを送り、
前記ディスクおよび前記ディスクの表面の前記細胞のサンプルと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、
前記検出されたビームを出力信号に変換し、そして
前記出力信号を分析し、それによって、前記捕捉領域において捕捉された細胞の個数および型に関する情報を該出力信号から抽出すること、
を含む方法。
【請求項３９】
予め定められた波長の光を吸収する染色液により前記細胞のサンプルを染色するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記予め定められた波長は、前記電磁放射ビームの波長にあるか、または該波長の近くにある、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
この出願は、２００１年１１月２０日に出願された米国特許出願第０９／９８８，７２８号の部分継続出願である。
【０００２】
また、この出願は、２００１年９月７日に出願された米国仮出願第６０／３１８，０２６号、２００１年９月１１日に出願された米国仮出願第６０／３２２，０４０号、２００１年９月１２日に出願された米国仮出願第６０／３２２，８６３号、２００１年９月１４日に出願された米国仮出願第６０／３２２，５２７号、２００１年１０月３日に出願された米国仮出願第６０／３２６，８００号、２００２年１月３１日に出願された米国仮出願第６０／３５３，３００号、２００２年２月５日に出願された米国仮出願第６０／３５５，６４４号、２００２年２月１９日に出願された米国仮出願第６０／３５８，４７９号、および２００２年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／３６３，９４９号からの優先権の利益も主張する。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、包括的には、生物学的検定法および診断検定法（diagnostic assay）に関し、特に、生体サンプル中の血球検体を画像化する方法および装置に関する。詳細には、本発明は、予め定められた波長の電磁放射を吸収する染色液（stains）を光バイオディスク（optical bio-disc）と共に使用して、白血球の核の形態に基づく白血球の識別および定量を行う方法に関する。ただし、本発明は、実施の最良の実施形態に従って後述する特定の実施の形態に限定されるものではない。本発明は、本発明の譲受人に譲渡され、同時係属中の以下の特許出願に開示されたディスク、検定法、およびシステムのいずれとも組み合わせて有利に使用することができる。すなわち、２００１年７月３日に出願された「Clinical Diagnostic Optical Bio-Disc And Related Methods For Selection And Detection Of Lymphocytes Including Helper-Inducer/Suppressor-Cytotoxic Cells」と題する米国仮出願第６０／３０２，７５７号、２００１年７月１７日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３０６，０３５号、２００１年７月１７日に出願された「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３０５，９９３号、２００１年７月１９日に出願された「Methods for Imaging Blood Cells, Blood-Borne Parasites and Pathogens, and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３０６，５９２号、および２００１年７月２３日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３０７，２６３号である。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
【０００４】
２．関連技術の説明
血球計数スクリーニングは、正常な状態および急性病または慢性病、負傷、既知の貧血症、寄生虫症、骨髄性疾患、白血病を含むいくつかの状態に対する定型的な臨床試験であり、かつ、骨髄抑制薬による処置中の定型的な臨床試験である。また、血球計数スクリーニングは、外科的処置、輸血のベースラインを確保する定型的な試験として、または、ある状態の診断もしくは治療のツールとしての定型的な臨床試験でもある。血球計数は、患者の健康を判断するために、診断、処置、および追跡調査の期間中に使用される。血球計数単独では、人がリンパ腫であるのか、または、他の病気を有するのかを判断することはできない。しかしながら、これらの値は、すべてが正常であるかどうか、および、さらに試験が必要かどうかを判断することができる。
【０００５】
多数の研究および診断場面において、細胞の混合物から特異的な細胞を分離して、分析することが必要とされている。特に、原因が、血液、髄液、骨髄、腫瘍ホモジェネート、リンパ系組織などの可能性がある場合には、必要とされる。血液、髄液、骨髄、腫瘍組織、リンパ液などの定型的なスクリーニングは、外科的処置、輸血のベースラインを確保するために必要とされるか、または、患者の健康を判断するための診断、処置もしくは治療のツールとして必要とされる。
【０００６】
また、血球計数は、患者の健康を判断するために、診断、処置、および追跡調査の期間中も使用される。全血球計数（complete blood count）（ＣＢＣ）は、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球体積、血小板計数、および白血球計数を含む試験の集合である。血球計数は、１立方ｍｍの全血あたりの赤血球および白血球を数えあげることである。
【０００７】
白血球計数（ＷＢＣ（white blood cell count）、白血球）は、血液の標準サンプルの白血球の総数である。正常な健康人では、通常、ＷＢＣ計数は、１マイクロリットル（μｌ）あたり４０００〜１０８００個の細胞である。例えば運動、ストレス、および病気といった要因により、これらの値は影響を受ける可能性がある。ＷＢＣが高いということは、感染症、白血病、または組織の損傷を示すことがある。ＷＢＣ計数が１マイクロリットルあたり１０００個の細胞未満になると、感染症の危険が増加する。
【０００８】
白血球分画試験（leukocyte differential testing）は、白血球計数自体から得ることができる情報を越える多くの情報を収集するのに不可欠である。白血球分画計数は、疑わしい新たな感染症または熱（ＣＢＣが正常な場合であっても）、異常に関連した疾患の疑い、異常な白血球計数、疑いのある白血病、および例えば好酸球増加症、単球増加症、または好塩基球増加症といった他の異常を見極めるのに使用される。重度の白血球減少症がある場合（例えば薬物治療の副次的なものとして）には、白血球および白血球分画の試験が、繰り返し実行されることがある。処置の間、例えば化学治療または放射線治療の間、その処置が、癌細胞に加えて健康な血球を欠乏させているかどうかを判断するのに、血球計数は非常に重要である。化学治療は、血球の産生に影響を与えるので、血液中のさまざまな種類の細胞の量をチェックすることは重要である。
【０００９】
分画白血球計数は、コンピュータ化された細胞計数計測装置によって求めることができる。このような装置は、５つの主要な白血球の型の総計数および割合を求める。正常な個人では、大多数の好中球（５０〜６０％）、それに次ぐリンパ球（２０〜４０％）、次いで単球（２〜９％）が、わずかな好酸球（１〜４％）および好塩基球（０．５％〜２％）と共に存在する。
【００１０】
事後対応の反応性のまたは腫瘍性の反応のいずれかによることがある白血球の増加、および、白血球の消耗もしくは破壊または骨髄の障害に起因し得る白血球の減少により、ＷＢＣ分画計数（differential count）は、通常、異常になる。好中球減少症（好中球の損失）、リンパ球減少症（リンパ球の損失）、血球板血症（血小板の欠乏であり、命にかかわる可能性がある）のような症状は、分画白血球計数によって判断することができる。また、分画計数は、特に、血球の産生に影響を与える化学治療および放射線治療の処理の期間中の血球計数の全体像も与える。
【００１１】
リンパ球のカテゴリ内では、さらに、細胞の亜類型が存在する。例えば、リンパ球は、大きくは、Ｔ細胞（胸腺由来リンパ球）およびＢ細胞（滑液等価リンパ球（bursal-equivalent lymphocyte））に分けることができ、主として、それぞれ細胞媒介性免疫および体液性免疫を担っている。白血球内のグループを分類するのに、形態学的特徴が使用されてきたが、形態学だけでは、リンパ球の亜類型の多くの機能を区別するのに不十分であることが分かってきた。さまざまな機能を有するリンパ球を区別するために、ロゼット（rosetting）による分析、免疫蛍光顕微鏡検査による分析、酵素組織化学による分析、および特異的な細胞表面のマーカに対する最近のモノクローナル抗体による分析を含む技法が開発された。
【００１２】
Ｔ細胞は、例えばＣＤ４およびＣＤ８といった主な２つの細胞表面抗原の一方が存在することによりさらに区別されることが多い。ＣＤ４＋型細胞は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれ、抗体媒介性免疫に関与する。これらのＴ細胞は、Ｂ細胞によって提示された抗原に結合して、プラズマ細胞のクローンの発生を引き起こす。プラズマ細胞は、抗原物質に対する抗体を分泌する。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫にも不可欠である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば食作用を有するマクロファージおよび樹状細胞といった抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示された抗原に結合して、他の免疫細胞をその区域に引き付けるリンフォカインを放出すると理解されている。その結果、炎症が生じ、抗原物質を囲んで破壊しようとする細胞および分子の蓄積が生じる。
【００１３】
型ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞またはキラーＴ細胞と呼ばれる。これらのＴ細胞は、結合した細胞を破壊する分子を分泌する。感染した細胞が、他の細胞に感染できる新たなウィルスの集団を放出する前に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それら感染した細胞を破壊するので、このＣＤ８＋Ｔ細胞の分子の分泌は、ウィルス感染との闘いにおいて重要である。
【００１４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の概算ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞の比の概算は、免疫不全病を有する人間の患者の免疫の健康状態を評価するのに有用である。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ＣＤ４の細胞表面抗原に対する高い親和性を有するレトロウィルスであり、したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、このウィルスの有力な標的である。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、免疫におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の重要性の鮮明で悲劇的な実例を提供する。この病気が進行すると、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が、感染したＣＤ４＋Ｔ細胞を破壊し、かつ／または、感染したＣＤ４＋細胞がアポトーシス、すなわち細胞自殺を受けるので、ＣＤ４＋Ｔ細胞の個数は、その正常な範囲である１μｌあたり約１０００個よりも少なくなる。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の比は、予後因子として使用することができる。米国公衆衛生サービスは、すべての感染者のＣＤ４＋のレベルを３〜６カ月ごとに監視するように勧告している。
【００１５】
ＣＤ４およびＣＤ８に加えて、リンパ球の亜類型の識別に使用できる他の多くの細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５、およびＣＤ５６）が存在する。抗体技法によってこれらの細胞表面抗原を検出できることにより、診断病理学には新しい局面が加えられ、さまざまな技法が、ヘマトリンパ球（hematolymphoid）疾患（例えば、ＡＩＤＳ、白血病、およびリンパ腫）の免疫表現型（immunophenotype）の研究に利用することができる。例えば放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）といった従来のマイクロ免疫検定法（microimmuno-assay）は、同位体、酵素、または蛍光物質と特異的にそれぞれ反応する、対応した抗体または抗原の存否を検出するために、当該同位体、酵素、または蛍光物質をそれぞれ使用する。
【００１６】
血液の標準サンプル中の血小板の個数は、通常、１マイクロリットル（μｌ）あたり１３３，０００から３３３，０００である。血小板の個数が過剰であることは、血小板血症と呼ばれる。血小板計数は、事後対応の（reactive）反応または骨髄障害により、正常な血小板計数を越えることがある。事後対応の反応は、通常、出血、感染、腫瘍、および骨髄増殖性疾患が原因で引き起こされる。骨髄障害は、通常、汎血球減少症として知られている血球の損失を伴う。他方、血小板計数の減少は、免疫性血小板減少症によるものである。血小板減少症は、血小板計数が３０，０００未満になると発生する。その結果、異常な出血が発生する。計数が５０００未満になると、命にかかわると考えられる。
【００１７】
ＣＢＣは、ヘモグロビンのレベル、ヘマトクリット、全白血球、および赤血球計数を計測する市販の手動機器または市販の電子機器によって行うことができる。変形したものには、血小板計数、白血球分画計数、および細胞指数（cellular index）が含まれ得る。血液分析装置は、完全に自動化され、その結果、ＣＳＦ、胸膜液、腹水、心嚢液、および胃吸引のような体液内の細胞計数が正確になる。
【００１８】
従来の方法およびシステムと比較して、本発明者等は、細胞およびそれらの成分の画像化および分析を行う、簡単で小型化された超高感度の安価なシステムを開発した。このシステムは、光バイオディスク、関連した検出アセンブリに加えて、情報および信号の処理方法ならびにソフトウェアを使用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
［発明の概要］
本発明は、染色／ラベル付けがされていない細胞、または、染色／ラベル付けがされた細胞の画像化、識別、および定量を行うように設計されている。これに加えて、本発明の好ましい実施の形態では、細胞を、細胞の核を染色する色素を使用して染色し、それによって、細胞の細胞質と核との間のコントラストを強調してその識別を助ける。この色素には、赤外色素および蛍光色素が含まれる。また、これにより、サンプル内の正常な細胞および異常な細胞の付加情報および詳細を視覚化することが容易になる。光バイオディスクを使用した細胞の画像化に関する詳細は、２００１年１月１１日に出願された「Methods and Apparatus for Detecting Investigational Features on a Surface of an Optical Disc Assembly」と題する米国仮出願第６０／２６０，７６１号、２００１年１月１８日に出願された「Disklab Diagnostic Platform」と題する米国仮出願第６０／２６２，５３２号、２００１年２月２０日に出願された「Signal Processing Apparatus and Methods for Obtaining Signal Signatures of Investigational Features Detected on a Surface of an Optical Disc Assembly」と題する米国仮出願第６０／２７０，０９５号、および２００１年５月１８日に出願された「Signal Processing Apparatus and Methods for Obtaining Signal Signatures of Investigational Features Detected on a Surface of an Optical Disc Assembly」と題する米国仮出願第６０／２９２，１０８号に開示されている。これらのすべての出願は、参照により、その内容のすべてが本明細書に援用される。
【００２０】
試験は、バイオディスク上においてそのディスクに配置された特別な流路内の細胞を光学的に画像化する原理に基づいている。検定は、固相に取り付けられた特異的な捕捉剤（capture agent）を有するフロー流路を備えたバイオディスク内で行うことができる。
【００２１】
光バイオディスク上で行われる分画細胞計数試験は、色素を使用することにより増強された細胞の光散乱特性により、血液または他の体液内のさまざまな細胞を識別する。また、この画像化技術は、光バイオディスクを使用して、血液寄生虫および血液媒介病原体の識別も容易にする。これらの方法は、ハードウェア計数器を含むイベント計数器または細胞計数器のソフトウェアと共に上部検出器、底部検出器を使用するＣＤタイプの読み取り装置における顕微分析または細胞検出を含む。細胞の画像化および計数に使用される光ディスクシステムに関する詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された同時係属中である、２００１年１０月２４日に出願された米国仮出願第６０／３３５，１２３号、２００２年１月２８日に出願された米国仮出願第６０／３５２，６４９号、２００２年１月３０日に出願された米国仮出願第６０／３５３，７３９号、２００２年２月７日に出願された米国仮出願第６０／３５５，０９号、および２００２年２月１４日に出願された米国仮出願第６０／３５７，２３５号に開示されている。これらのすべての出願の題名は、 「Segmented Area Detector for BioDive and Methods Relating Thereto」である。これらのすべての出願は、参照により、その内容のすべてが本明細書に援用される。
【００２２】
例えば血液、脳脊髄液、唾液、尿、結腸細胞、または他の任意の生体を源とするサンプルの分析を実行する改良された方法および装置が、タイムリーでコスト効率がよく、技術的に適切な方法で提供される。特に、白血球のさまざまな型または他の細胞の型、寄生虫、病原体、および生体物質の相対的なレベルを定量化するためのより簡単で、より効率的な方法に対する要求が存在する。本発明は、この要求に応える。さらに、本発明は、血球の画像化、分画白血球計数の実行、ならびに関連する処理方法およびソフトウェアに関する。
【００２３】
本発明の一態様は、光分析ディスクと共同で検定を行って、細胞の検出および計数を行う方法および装置を提供することである。本発明のさらなる態様は、光分析ディスクと共同で検定を行って、リンパ球を検出する方法および装置を提供することである。
【００２４】
本発明の別の態様によると、光学式読み取り装置によって読み取り可能な符号化情報を有するディスク表面内またはディスク表面上にサンプルを用意することを含む方法が提供される。この情報は、読み取り装置の走査をディスクに対して制御するために使用することができる。
【００２５】
本試験または検定は、少なくとも２つの方法で実行することができる。第１の方法は、光バイオディスク上に配置された特別な流路内の血球を光学的に画像化する原理に基づくものである。約５から２０マイクロリットルの全血をディスク上に特別に設計された流路に注入する。画像は、さまざまな白血球の亜類型を識別して白血球分画計数を生成する細胞認識ソフトウェアによって分析される。第２の方法は、特異的な細胞に対する細胞特異的な抗体を使用した特異的な細胞捕捉に基づくものである。その特定の一実施の形態によると、抗体は、例えば、リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、および好酸球（ＣＤ１５）に対するものである。これらの白血球の亜類型特異的抗体を、フローチャンバを備えるバイオディスク内の固体面に組み立て／付着させる。他の実施の形態では、捕捉抗体は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５といった対象となる特異的表面マーカを有する他の細胞に対するものを対象とする。
【００２６】
ディスクを光学式読み取り装置にロードし、放射源からの電磁放射入射ビームをディスクに送る。中心軸の回りにディスクを回転させ、かつ、入射ビームを中心軸に対して半径方向に移動させることにより、このビームをディスク全体にわたって走査させる。ディスクを透過するか、または、ディスクから反射した電磁放射ビームを検出して分析し、サンプルに特徴的な情報を抽出する。
【００２７】
また、本発明の実施の形態は、チャンバを形成するために間隔をあけて配置された基板およびキャップを有するディスクも含む。例えば細胞を有する血液といった物質のサンプルをこのチャンバに用意する。ディスクを回転させると、サンプルは、捕捉領域を通過する。捕捉領域は、対象となる細胞の型の細胞表面マーカである例えばＣＤ４およびＣＤ８といった抗原に結合する抗体または他の特異的結合相手を有する捕捉層を備える。１回の試験を使用して、血液サンプル中のＣＤ４およびＣＤ８ならびに他の抗原を画像化できることが好ましい。本発明の別の態様によると、捕捉領域が位置する視界窓に光を送り、透過光または反射光を検出して捕捉された細胞の識別および計数を行うディスク読み取り装置が提供される。これらのＣＤ４計数およびＣＤ８計数、ならびにそれらの比は、例えばＡＩＤＳといった症状を監視するのに有益である。
【００２８】
試験サンプルをディスク内のチャンバに供給することが好ましい。単一のチャンバは、複数の捕捉区域を有することが好ましく、複数の捕捉区域のそれぞれは、１つまたは複数の抗体を有することができる。一実施の形態では、単一のチャンバが、各捕捉領域が異なる型の抗体を有する複数の捕捉領域を有し、制御領域としての機能を果たす捕捉領域を有することができる。これらの捕捉領域は、ディスクの１つまたは複数の半径方向に沿って並べることができる。検出方法は、その特徴の遷移を検出すること、または、視界窓を画像化し、画像認識ソフトウェアを使用して捕捉された細胞を計数することを含む。計数は、直接的なものであってもよいし、間接的なものであってもよい。直接的なものは、例えば、所望の細胞を計数することである。間接的なものは、例えば、所望の細胞および所望でない細胞の集まりを計数し、所望でない細胞を計数し、そして、減算を行って所望の細胞の計数を得ることである。捕捉領域は、抗体の１つまたは複数の層を有することができる。
【００２９】
細胞のサンプルをディスクに用意すると、ディスクを１段階または２段階以上で回転させて、細胞を捕捉領域に移動させ、次いで、結合していない細胞を捕捉領域から除去することができる。他の方法でサンプルを処理することもできる。例えば、検出用に使用される光源によってサンプルを培養または加熱することができる。マイクロフルイディクスを使用して、サンプルのディスク上での処理に望ましくなり得る染色液または他の任意の液体を加えることができる。この処理は、ディスク上の情報記憶区域の符号化情報で指定されることが好ましい。他の中間的なステップ、例えば培養を行うと共に、ドライブおよび読み取り装置を所望の速度で所望の時間の間、回転させるのに、記憶された情報を有利に使用することができる。
【００３０】
マイクロ技術は、細胞の型、寄生虫、病原体、および他の生体物質の識別を行うための臨床診断において特に有用である。本発明は、マイクロ技術を利用して、光バイオディスク上の全血中の分画白血球の計数を行う。さらに、本発明は、血球を画像化すること、分画白血球の計数を行うこと、ならびに関連した処理方法およびソフトウェアを対象とする。
【００３１】
本発明による別の試験または検定は、少なくとも２つの方法で実行することができる。第１の方法は、光バイオディスク上に配置された特別な流路内の血球を光学的に画像化する原理に基づくものである。約５から２０マイクロリットルの全血を、ディスク上に特別に設計された流路に注入する。画像は、さまざまな白血球の亜類型を識別して白血球分画計数を生成する細胞認識ソフトウェアによって分析される。第２の方法は、特異的な細胞に対する細胞特異的な抗体を使用した特異的な細胞捕捉に基づくものである。この特定の実施の形態では、抗体は、例えば、リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、および好酸球（ＣＤ１５）に対するものを対象とする。上述した関連する検定と同様に、これらの白血球の亜類型特異的抗体を、フローチャンバを備えるバイオディスク内の固体面に組み立て／付着させる。
【００３２】
バイオディスクドライブアセンブリは、ディスクの回転、ディスク上に記憶された任意の符号化情報の読み出しおよび処理、ならびにバイオディスクのフローチャンバの細胞捕捉領域の分析に使用される。バイオディスクドライブには、バイオディスクを回転させるモータと、ディスクの回転速度を制御するコントローラと、ディスクからの帰還信号を処理するプロセッサと、処理された信号を分析する分析装置とが設けられる。回転速度は、可変であり、回転の速さ、時間、および回転方向の双方に応じて厳密に回転速度を制御することができる。また、バイオディスクは、フローチャンバおよび標的領域の試験物質が、ドライブの読み取りビームによって呼びかけを受け、分析装置によって分析される前、その最中、またはその後のいずれかにおいて、当該バイオディスクに情報を書き込むことに利用することもできる。バイオディスクは、ディスクの回転を制御する符号化情報と、行われる免疫型（immunotyping）検定の型に特有の情報の処理を提供する符号化情報と、その結果をバイオドライブに関連したモニタに表示する符号化情報とを含むことができる。
【００３３】
包括的には分画細胞計数プロトコルおよび詳細には分画白血球計数プロトコルが、ＣＤフォーマット、ＣＤ−Ｒフォーマット、またはＤＶＤフォーマット、これらのフォーマットの変更版、およびそれらの代替物に対して開発される。ドライブの読み取りビームまたは呼びかけビームは、分析サンプル内のさまざまな細胞を検出し、分画細胞計数ソフトウェアにより分析を受けることができる画像を生成する。
【００３４】
これらの単調で根気のいる細胞計数検定を行うには、微視的方法または高機能な細胞計数器が不可欠である。本方法は、光バイオディスクおよび関連するアセンブリを使用する。分析チャンバ内で結合されていない（free）さまざまな白血球の亜類型の光画像、または、特異的抗体方法によって捕捉されたそれら亜類型の光画像が、細胞認識ソフトウェアプログラムによって生成され分析される。この細胞認識ソフトウェアプログラムは、血液または他の体液内のさまざまな細胞要素をそれらの光散乱特性により識別する。この帰還光は、入射ビームと対象サンプルとの光／物質相互作用後に検出される。検出された帰還光信号は処理されて、識別可能な信号シグネチャまたはデジタルＩＤを提供する。従来技術の方法は、通常、例えば細胞染色、ＲＢＣ削除、または他の根気のいるプロトコルといった準備を要するが、本方法の実施の形態は、サンプルの前処理をなんら要しないようにできる。これらの方法は、上部検出器、底部検出器、イベント計数器、もしくは細胞計数器を使用するＣＤ型読み取り装置または光ディスク読み取り装置における微視的分析または細胞検出を含む。
【００３５】
本発明の一態様によると、核色素、染色体色素、バイタル色素（vital dye）、赤外色素、および蛍光色素を使用して、細胞の細胞質と核とのコントラストを強調することができる。本発明の好ましい一実施の形態では、ＩＲＤｙｅ３８（ネブラスカ州リンカーンのLI-COR Inc.）、ＩＲ−７８０ヨウ化物（Sigma-Aldrich）、ストレプトアビジンＬａｓｅｒ  ＰｒｏおよびＴＯ−ＰＲＯ−５−ヨウ化物（オレゴン州ユージーンのMolecular Probes）、ならびにｄｄ−００７  ＩＲ色素が、細胞核のラベル付けに使用される。この染色プロセスにより、細胞の核の形状に基づく、さまざまな細胞の型の視覚化および識別が容易になる。光バイオディスクを使用した細胞の画像化に関する詳細は、２００１年５月２２日に出願された「Disc Drive Assembly For Optical Bio-Discs」と題する米国仮出願第６０／２９３，０９３号に開示されている。この出願は、参照により本明細書に援用される。
【００３６】
以下のパラグラフでは、バイオディスクの製造を対象とする本発明のある特定の好ましい実施の形態による主要な方法のステップの概要を提示する。
【００３７】
ディスクの準備：エアガンを使用して、金反射型ディスクまたは透過型ディスクをクリーニングし、あらゆる塵粒を除去する。スピンコータを使用して、ディスクをイソプロパノールで２回すすぎ洗いする。ディスク上に２％ポリスチレンをスピンコートして、非常に厚いコーティングを全体に与える。
【００３８】
化学種（chemistry）の堆積：一実施の形態は、ストレプトアビジンの３０分間の培養と、ビオチン化第１抗体の６０分間の培養と、第２捕捉抗体の３０分間の培養とを行う３つのステップの堆積プロトコルを含む。これらのすべてのステップは、堆積の間に、ストリンジェント洗浄／乾燥ステップを使用する恒湿チャンバ内で、室温で行う。
【００３９】
簡単に言うと、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１μｌの１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンを各窓上に層化して、３０分間培養する。蒸留水を使用して過剰なストレプトアビジンをすすぎ洗いし、ディスクを乾燥させる。等量のビオチン化ＩｇＧ（ＰＢＳ中の１２５μｇ／ｍｌ）とアルデヒド活性化デキストラン（２００μｇ／ｍｌ）とを結合することにより、ビオチン化ＩｇＧデキストラン複合体を調製する。デキストランアルデヒドビオチン化ＩｇＧ複合体を各捕捉窓のストレプトアビジン上に層化して、冷蔵庫で６０分間または一晩培養する。過剰な試薬をすすぎ洗いし、ディスクをスピン乾燥させる。バイオディスクスロット上の指定されたスポットに捕捉抗体を層化することにより、特定のバーコード捕捉パターンを生成する。分画計数用に、抗好中球（ＣＤ１２８またはそれ以外のもの）、抗リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ５６，およびそれ以外のもの）、抗好酸球（ＣＤ１５）、抗単球（ＣＤ１４）、抗塩基球（ＣＤ６３）、および抗血小板（ＣＤ３２およびＣＤ１５１）を、例えば、各スロットの指定されたスポットに層化する。以下の表１は、捕捉層アセンブリの捕捉パターンの変化例を一覧にしている。冷蔵庫で３０分間または一晩培養する。２５μｍ、５０μｍ、または１００μｍ（５０μｍ流路は、２５μｍチャンバに必要なサンプルの２倍の体積のサンプルを必要とする）の直線状、Ｕ字形、もしくは他の流路形式と、透明カバーディスク（上部検出器と共に使用される）または反射カバーディスク（底部検出器と共に使用される）とを使用してディスクを組み立てる。
【００４０】
【表１】
2005502872.tif 000003
【００４１】
ディスクの漏れチェックおよび望ましくない細胞の非特異的結合の遮断：血液というバイオハザード物質を分析しているので、本発明の品質管理製造態様の一部として、ディスクの漏れをチェックし、サンプルが本来の場所にある状態で、ディスクのスピン中にチャンバの漏れがないことを確かめる。各流路を、市販の遮断剤であるＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄで満たし、１時間の間、遮断することが好ましい。ディスクを５０００ｒｐｍで５分間スピンさせ、漏れおよびディスクの安定性を検査する。漏れのチェック後、ディスクを真空チャンバに２４時間入れる。真空処理後、使用するまで、チャンバをＰＢＳ緩衝水で満たすか、または、空の状態で真空パウチに入れて、冷蔵庫で保管する。
【００４２】
全血からのバフィーコート（buffy-coat）層の分離：脱線維素静脈血を遠心分離管で２５分間２８００ｒｐｍで遠心分離することによりバフィーコートを調製する。上澄みの血漿を細いピペットを用いて注意深く除去する。次いで、白血球および血小板を含んだ下にある白色層をピペットで取る。遠心分離を行わないで血液からバフィーコートを得る別の方法としては、フィブリノゲン、デキストラン、アラビアゴム、Ｆｉｃｏｌｌ、またはメチルセルロースといった沈殿増進剤を用いて血液の沈殿を可能にするものがある。Ｂｏｙｕｍ試薬（メチルセルロースおよびナトリウムメトリゾエート）が、赤血球による混入のない白血球の試料を得るのに特に適している。あるいは、正の選択もしくは負の選択、または溶血方法により、リンパ球を全血から分離することもできる。
【００４３】
ディスクでの検定−基礎技術の説明：分画白血球計数ディスク試験の好ましい一実施の形態は、（１）化学種を有する基本ディスク、（２）流路層、および（３）カバーディスクの３つの個別の構成要素を備える。
【００４４】
バフィーコートまたは全血を、好ましくはＰＢＳで希釈して、ディスクチャンバ内に注入し、チャンバの注入ポートおよび排出ポートをテープで密閉して、ディスクを所望の時間の間、好ましくは室温で培養する。第１の方法の場合、ディスク上の所与の区域（例えば１ミリメートル四方の区域）が、上部検出器および底部検出器を有する光ドライブの標準的な７８０ｎｍレーザを使用して走査される。関連した細胞認識ソフトウェアは、本譲受人によって開発され、例えば、好ましくは１ミリメートル四方に等しい取り込み画像から分画計数を与えるように自動化され、２００２年３月１２日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３６３，９４９号および２００２年８月２１日に出願された「Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same」と題する米国仮出願第６０／４０４，９２１号に開示されている。第２の方法の場合、ディスクは、標準的な７８０ｎｍレーザを使用して走査され、リンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板を含み得る捕捉領域が画像化される。本譲受人によって開発された細胞認識ソフトウェアは、次のルーチン、すなわち（ａ）ディスクを遠心分離して、結合していない過剰な細胞をスピン除去すること、（ｂ）特定の区域または特定の捕捉領域を画像化すること、および（ｃ）各捕捉領域の特異的に捕捉された細胞を計数することと、白血球の分画部分集合の個数を導き出すこととを含むデータ処理、を実行するように自動化されている。
【００４５】
この処理ステップ中、認識ソフトウェアは、各捕捉領域にわたって読み取りを行い、遭遇した細胞に印を付ける。各捕捉領域から得られたデータの処理に続いて、ソフトウェアは、１マイクロリットルの体積の血液あたりのリンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板の領域の個数を表示する。光ドライブへのディスクの挿入から、対象となる結果の表示までのプロセス全体は、約１０〜１５分を要する。
【００４６】
本発明に関連した開示は、２００１年７月２３日に出願された「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３０７，２６２号、２００１年７月２３日に出願された「Methods for Imaging Blood Cells, Blood-Borne Parasites and Pathogens, and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３０７，２６４号、２００１年７月２３日に出願された「Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymphocytes」と題する米国仮出願第６０／３０７，５６２号、および２００１年７月２４日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３０７，４８７号にも提示されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
【００４７】
以下のパラグラフでは、本発明のある特定の好ましい実施の形態によるディスクの仕様の主要な要素の概要を提示する。
【００４８】
トラック設計：本発明の好ましい一実施の形態では、ディスクは、３００ｎｍの金で被覆されたフォワードＷｏｂｂｌｅ  Ｓｅｔ  ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０である。この反射型ディスク上に、サイズ２×１ｍｍの楕円形のデータ窓をリソグラフィーによってエッチングする。「Ｕ」字型流路を使用して、高さ２５μｍのチャンバを生成する。注入ポートおよび排出ポートを備えたチャンバ全体を満たすには、約７μｌのサンプルが必要となる。４つの窓／４つの流路の形式を使用できることが好ましい。一方、反射型ディスク上には、データ窓をエッチングせずに、ディスク全体を使用することができる。
【００４９】
接着および接合：好ましい一実施の形態では、本「Ｕ字」型流体回路を備える接着層または流路層を、Ｆｒａｙｌｏｃｋ接着ＤＢＬ  ２０１  Ｒｅｖ  Ｃ  ３Ｍ９４６６１から作成する。あるいは、直線状流路を使用してチャンバを生成する。
【００５０】
カバーディスク：半径２６ｍｍにおける等距離の場所に直径０．０４０インチの４８個のサンプル注入口を有する十分に反射型の透明ディスクが、本ディスクアセンブリの特定の一実施の形態で使用される。
【００５１】
データの取り込みおよび処理：データディスクは、本譲受人の細胞認識ソフトウェアを使用して、好ましい４倍速および２．６７ＭＨｚのサンプリングレートでソフトウェアにより走査され読み取られる。
【００５２】
ソフトウェア：本発明は、処理方法ならびに関連した細胞認識および画像化のソフトウェアをさらに含む。このソフトウェアは、細胞の計数および分画細胞の計数を行い、それらの計数を表示することを対象とする。本ソフトウェアは、光ディスクドライブ読み取り装置において光バイオディスクに記憶することができるか、あるいは、安全なサーバから光学式読み取り装置によってのみアクセス可能にすることができる。このサーバは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）といったコンピュータネットワークで実施することもできるし、それ以外に、所定の契約条件のもとでインターネットを介して利用可能にすることもできる。このような分散方法は、本発明の譲受人に譲渡された、２０００年１１月８日に出願された「Interactive Method and System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Medical Information Using Specially Prepared Bio-Optical Disc, Optical Disc Drive, and Internet Connections」と題する米国仮出願第６０／２４６，８２４号、および２００１年１１月７日に出願された「Interactive System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Information and the Use Thereof」と題する関連する米国特許出願第０９／９８６，０７８号に開示され、これらの出願の双方は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００５３】
用具：本明細書で開示されるさまざまな好ましい実施の形態を実践するのに使用される用具は、ｆｏｒｗａｒｄ  ｗｏｂｂｌｅ金メタライズドフォトレジストディスク、透過型金メタライズドディスク、ピペットおよびチップ、スピンコータ、遠心分離機、回転ロータ、例えばナトリウムクエン酸塩またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）といった抗凝血剤を有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ＣＰＴ管、恒湿チャンバ、ディスクプレス、接着剤、カバーディスク、透明カバーディスク、テープまたは同等のもの、真空装置、イエローチップ、ならびに真空チャンバを含む。
【００５４】
試薬：本発明の一定の方法に従って細胞の計数を行うのに使用される試薬には、リン酸緩衝生理食塩水、イソプロピルアルコール、蒸留水、およびＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄが含まれる。
【００５５】
既知の技術の限界を克服することが、本発明の目的である。本発明のもう１つの目的は、既知の光ディスクシステムを、光バイオディスク上の全血内の分画白血球の計数を行うように適合させることである。血球を画像化して、分画白血球の計数を行うことが本発明のさらなる目的である。
【００５６】
本発明に関する技術的態様は、次の出願にも記載されている。すなわち、２００１年７月２４日に出願された「Optical Analysis Discs Including Microfluidic Circuits for Performing Cell Counts」と題する米国仮出願第６０／３０７，４８９号、２００１年７月２５日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin」と題する米国仮出願第６０／３０７，８２５号、２００１年７月２５日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents」と題する米国仮出願第６０／３０７，７６２号、２００１年７月２５日に出願された「Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs」と題する米国仮出願第６０／３０７，７６４号、２００１年７月２７日に出願された「Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３０８，２１４号、および２００１年７月２７日に出願された「Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３０８，１９７号にも記載され、これらの出願のすべては、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００５７】
本発明は、さらに、予め定められた波長の入射光を吸収する色素によって細胞の核を染色すること、および光ディスクシステムを使用してこれらの細胞を画像化し、細胞の核の形態に基づいてサンプル内のさまざまな細胞の型を識別して定量化することを対象とする。
【００５８】
次に、より詳細に、本発明は、光ディスクおよびディスクドライブを使用して検定を行う方法を対象とする。この方法は、（１）ディスクの表面上のディスクのチャンバであって、捕捉剤を有する少なくとも１つの捕捉領域を備えたチャンバに細胞のサンプルを用意するステップと、（２）このディスクを光学式読み取り装置にロードするステップと、（３）この光ディスクを回転させるステップと、（４）電磁放射入射ビームを捕捉領域に送るステップと、（５）捕捉領域においてディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出するステップと、（６）検出したビームを出力信号に変換するステップと、（７）この出力信号を分析して、捕捉領域において捕捉された細胞の個数および型に関する情報を当該出力信号から抽出するステップとを含む。
【００５９】
本発明の別の態様によると、サンプルを収容する光ディスクおよびドライブシステムが提供される。このシステムは、基板と、基板に平行なキャップと、キャップと基板との間に画定される、捕捉領域を備えたチャンバとを備えるディスクを有する。捕捉層が、捕捉領域における基板上に配置される。第１の捕捉領域は、第１の細胞捕捉剤を有し、第２の捕捉領域は、第２の細胞捕捉剤を有する。このシステムは、さらに、ディスクの捕捉領域に向けて光を送る光源と、ディスクの捕捉領域から反射した光または捕捉領域を透過した光を検出して、信号を供給する検出器と、この信号を使用して、捕捉された細胞の核を区別し、捕捉分子に結合したサンプル内の要素を計数するプロセッサとを備える。
【００６０】
本発明の別の態様によると、光ディスクおよびディスクドライブを使用して白血球の計数を行う方法が提供される。この特定の方法は、（１）分離勾配液を含む第１の管に血液サンプルを用意するステップと、（２）この血液サンプルを層に分離するのに十分な速度で一度に第１の管を回転させるステップと、（３）分離された血液サンプルから白血球層を隔離するステップとを含む。この特定の方法は、（４）白血球層を再度懸濁し、それによって、白血球懸濁液を形成すること、（５）白血球懸濁液のサンプルを、少なくとも１つの捕捉剤を有する少なくとも１つの捕捉領域を備えた光ディスクの表面に用意すること、（６）光ディスクを光学式読み取り装置にロードすること、および（７）光ディスクを回転させることを続けて行う。次いで、この方法は、（８）電磁放射入射ビームを捕捉領域に送るステップと、（９）捕捉領域においてディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出するステップと、（１０）検出したビームを出力信号に変換するステップと、（１１）出力信号を分析するステップであって、それによって、捕捉領域において捕捉された細胞の核の形態に関する情報を当該出力信号から抽出する、出力信号を分析するステップとを続けて行う。特定の一実施の形態では、この方法は、白血球のサンプルを捕捉剤の近傍に送るステップと、捕捉剤の存在下で細胞を培養するステップと、細胞が捕捉剤と特異的に結合することを可能にするステップと、電磁放射ビームの波長または該波長の近くで吸収する染色液で細胞の核を染色するステップとを追加して含むことができる。
【００６１】
上記特定の実施の形態において、この方法は、特異的な型の捕捉された細胞の個数を分析するステップであって、それによって、サンプル内の当該特異的な細胞の型の濃度を求める、特異的な型の捕捉された細胞の個数を分析するステップをさらに含む。この方法において、捕捉された細胞の核の形態を分析する上記ステップは、ディスクから反射した光またはディスクを透過した光のレベルの変化を検出することを含むことができる。また、この方法は、画像認識を使用して核の形態により細胞の型を区別し、特異的な細胞の型の細胞の個数を計数するステップも含み、例えば、白血球の核のある型が、別の型から区別される。細胞染色用の色素を使用して、画像認識を向上させることができる。これらの色素には、バイタル色素、蛍光色素、赤外色素、および近赤外色素が含まれ得る。バイタル色素は、Ｌｅｉｓｈｍａｎ色素、アクリジンオレンジ、またはＺｙｎｏｓｔａｉｎとすることができる。さらに、光ディスクを回転させる上記ステップは、細胞が少なくとも１つの捕捉剤と結合する機会を有するように十分な速度で十分な時間の間、回転させることを含むことができる。この回転させるステップは、結合していない細胞が捕捉領域から除去されるように十分な速度で十分な時間の間、回転させることをさらに含む。このステップは、単一の速度で行うこともできるし、複数の速度で行うこともできる。また、この特定の方法は、捕捉領域のそれぞれにおいて捕捉された細胞を計数し、細胞の計数を含む出力を提供するステップも含むことができる。
【００６２】
本発明のさらに別の態様によると、細胞の型を区別する核の形態に基づいて分画白血球の計数を行う光検定ディスクを作成する別の方法が提供される。この方法は、基板を設けるステップと、活性層により基板を被覆するステップと、クロスリンカーを活性層の上に設けるステップであって、それによって、１つまたは複数の捕捉領域を生成する、クロスリンカーを活性層の上に設けるステップと、クロスリンカーが活性層に結合することを可能にするステップと、過剰なクロスリンカーを捕捉領域から除去するステップと、キャップ部を活性層に付着させるステップであって、それによって、細胞の懸濁液と、捕捉された細胞の核を染色する色素溶液とを収容するのに適合した流路を形成する、キャップ部を活性層に付着させるステップとを含む。この方法で使用されるクロスリンカーは、細胞表面のオリゴサッカライドと結合することができる。このクロスリンカーは、レクチンとすることができる。
【００６３】
本発明の別の態様によると、上記方法に従って作成されたディスクの使用方法が提供される。事前に作成されたディスクのこの特定の使用方法は、白血球を含むサンプルを流路内に堆積させるステップと、白血球が、捕捉領域内でクロスリンカーに結合することを可能にするステップと、結合していない細胞を捕捉領域から除去するステップと、光学式読み取り装置内にディスクをロードするステップとを含む。事前に作成されたディスクの本使用方法は、捕捉領域に電磁放射入射ビームを送るステップと、ディスクおよびディスクの表面の細胞のサンプルと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出するステップと、検出されたビームを出力信号に変換するステップと、出力信号を分析するステップであって、それによって、捕捉領域において捕捉された細胞の個数および型に関する情報を当該出力信号から抽出する、出力信号を分析するステップとをさらに含む。この方法は、予め定められた波長の光を吸収する染色液により細胞のサンプルを染色するステップをさらに含むことができ、この予め定められた波長は、電磁放射ビームの波長または該波長の近くである。
【００６４】
現発明のさらに別の態様によると、試験サンプル内の白血球を分析するさらに別の方法が開示される。この方法は、（１）光バイオディスク内に複数の白血球をロードするステップと、（２）特定の細胞表面のマーカに対する特異性を有する捕捉剤の使用により、指定された標的領域で白血球を捕捉するステップと、（３）捕捉された白血球の核を色素により染色するステップと、（４）入射ビーム光を捕捉された白血球に向けて送るステップと、（５）入射ビーム光が、捕捉された白血球の染色された核と相互作用することを可能にするステップであって、それによって、核の形態に関する情報を運ぶ帰還ビーム光を形成する、入射ビーム光が、捕捉された白血球の前記染色された核と相互作用することを可能にするステップと、（６）帰還ビーム光を検出するステップと、（７）検出された帰還ビームを出力信号に変換するステップと、（８）出力信号を分析するステップであって、それによって、捕捉領域で捕捉された細胞の核の形態に関する情報をこの出力信号から抽出する、出力信号を分析するステップとを含む。この方法で使用される色素には、バイタル色素、バイタル核色素、核色素、ＤＮＡ色素、染色体色素、蛍光色素、赤外色素、近赤外色素、ＵＶ色素、および可視色素が含まれ得る。この特定の方法は、好中球、単球、リンパ球、好酸球、および好塩基球を含む特異的な型の捕捉された白血球の個数を計数するステップをさらに含むこともできる。また、本方法は、この方法に従って白血球の分析を行うために使用される光バイオディスクの使用も含む。
【００６５】
本発明のさらに別の態様によると、光ディスクおよびディスクドライブを使用して検定を行う方法が提供され、この方法は、ディスクの表面に細胞のサンプルを供給するステップと、光学式読み取り装置にディスクをロードするステップと、光ディスクを回転させるステップと、捕捉領域に電磁放射入射ビームを送るステップと、ディスクおよびディスクの表面の細胞のサンプルと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出するステップと、検出したビームを出力信号に変換するステップと、出力信号を分析するステップであって、それによって、捕捉領域において捕捉された細胞の個数および型に関する情報をこの出力信号から抽出する、出力信号を分析するステップとを含む。この方法は、予め定められた波長の光を吸収する色素により細胞のサンプルを染色するステップをさらに含み、この予め定められた波長は、電磁放射ビームの波長またはこの波長の近くであり、色素は、赤外線スペクトル領域内の光を吸収する。色素は、近赤外線スペクトル領域、赤外線（ＩＲ）スペクトル領域、紫外線（ＵＶ）スペクトル領域、および可視光（ＶＩＳ）スペクトル領域で光を吸収することができる。さらに、電磁放射ビームは、色素の吸収波長から１０ｎｍ以内の波長とすることができる。細胞の染色に使用される色素には、例えば、ＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅ３８、ＴＯ−ＰＲＯ−５−ヨウ化物、ＩＲ−７８０ヨウ化物、Ｌａｓｅｒ  Ｐｒｏ  ＩＲ、ｄｄ−００７、Ｚｙｎｏｓｔａｉｎ、イドシアニン・グリーン、銅フタロシアニン、３，３’−ジエチルチアトリカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＴＴＣＩ）、３，３’−ジエチルオキサトリカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＯＴＣＩ）、３，３’−ジエチルチアジカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＴＤＣＩ）、および３，３’−ジエチルオキサジカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＯＤＣＩ）が含まれ得る。これらの色素は、ディスクの表面の細胞のサンプルの予め定められたコンパートメントに特異的にラベルを付けるように設計することができ、この予め定められたコンパートメントには、核、核小体、核包膜、ゴルジ体、小胞体、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム、微小管、中心小体、リボソーム、細胞膜、および細胞壁が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、細胞のサンプルをディスクの表面に供給する上記ステップは、細胞のサンプルを塗り付けることにより行うことができ、それによって、ディスクの表面に細胞の単層が生成される。
【００６６】
上記説明した方法および装置は、１つまたは複数の利点を有することができ、これらの利点には、経験を積んだ技術者が試験を行う必要のない簡単で迅速なディスク上の処理、少ないサンプル容積、安価な用具の使用、ならびに既知の光ディスクフォーマットおよびドライブの製造の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの特徴および利点ならびに他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を添付図面の図および技術例と共に参照することにより、より良く理解される。
【００６７】
本発明のさらに別の目的は、当該目的に寄与する別の特徴および当該目的から生じる利点と共に、以下の本発明の好ましい実施の形態の説明から明らかになる。この好ましい実施の形態は、添付図面に示される。添付図面では、全体を通して、同じ参照番号は同じ構成要素を示す。
【課題を解決するための手段】
【００６８】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ディスクドライブシステム、光バイオディスク、細胞検定および関連した細胞計数方法、画像処理技法、ならびに関連したソフトウェアを対象とする。以下では、本発明のこれらの態様のそれぞれをさらに詳細に論考する。
【００６９】
本明細書に開示されるディスクドライブシステム、光バイオディスク、細胞検定および関連した細胞計数方法、画像処理技法、ならびに関連したソフトウェアに関する本発明の態様は、２００１年１１月１３日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３３８，６７９号、２００１年１１月１４日に出願された「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３３２，００１号、２００１年１１月３０日に出願された「Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３３４，１３１号、２００２年１月１７日に出願された「RBC Sieving Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」と題する米国仮出願第６０／３４９，３９２号、２００２年１月１８日に出願された「RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」と題する米国仮出願第６０／３４９，４４９号、２００２年１月３１日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３５３，３００号、２００２年２月５日に出願された「Cluster Designation Assays Performed on Optical Bio-Disc Including Equi-Radial Analysis Zones」と題する米国仮出願第６０／３５５，６４４号、２００２年２月１９日に出願された「Cluster Designation Assays Preformed on Optical Bio-Disc Including Equi-Radial Analysis Zones and Related Systems and Methods」と題する米国仮出願第６０／３５８，４７９号、２００２年３月１２日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３６３，９４９号、および２００２年８月２１日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same」と題する米国仮出願第６０／４０４，９２１号にも提示され、これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
【００７０】
＜ドライブシステムおよび関連したディスク＞
図１は、本明細書で開示される細胞計数および分画細胞計数を行うために実施される本発明による光バイオディスク１１０の斜視図である。本光バイオディスク１１０は、光ディスクドライブ１１２および表示モニタ１１４と共に示される。このタイプのディスクドライブおよびディスク分析システムに関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００１年１１月９日に出願された「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs」と題する米国特許出願第１０／００８，１５６号および２００２年１月１０日に出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題する米国特許出願第１０／０４３，６８８号に開示され、これらの両出願は、参照により本明細書に援用される。
【００７１】
図２は、光バイオディスク１１０の一実施の形態の主要な構造上の要素の分解斜視図である。図２は、本発明で使用することができる反射領域の光バイオディスク１１０（以下「反射型ディスク」という）の例である。主要な構造上の要素には、キャップ部１１６と、接着部材または流路層１１８と、基板１２０とが含まれる。キャップ部１１６は、１つまたは複数の注入ポート１２２および１つまたは複数の排出ポート１２４を備える。キャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図２の斜視図から見られるように、その底部は、反射面１４６（図４）で被覆されることが好ましい。好ましい実施の形態では、トリガマークまたはトリガマーキング１２６が、反射層１４２（図４）の表面上に備えられる。トリガマーキング１２６には、バイオディスクの３つの層すべての透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域が含まれ得る。これらの透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域は、情報により符号化される。この情報は、図１０に示すように、プロセッサ１６６にデータを送信し、次に、図６および図１０に示すように、呼びかけビームまたは入射ビーム１５２の操作機能とやり取りを行う。
【００７２】
図２に示す第２の要素は、流体回路１２８、すなわちＵ字型流路が形成された接着部材または流路層１１８である。この流体回路１２８は、膜に刻印するか、または、膜を切り取ってプラスチック薄膜を除去し、図示するような形状を形成することにより形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フロー流路１３０および帰還流路１３２を備える。図２に示す流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバ１３４を備える。２つの異なる型の混合チャンバ１３４が示されている。第１のものは、フロー流路１３０に対して対称的に形成される対称混合チャンバ１３６である。第２のものは、オフセット混合チャンバ１３８である。このオフセット混合チャンバ１３８は、図示するように、フロー流路１３０の一方の側に形成される。
【００７３】
図２に示す第３の要素は、標的領域または捕捉領域１４０を備えた基板１２０である。基板１２０は、ポリカーボネート製であることが好ましく、図４に示すように、その最上部には反射層１４２が堆積されている。標的領域１４０は、図示した形状、あるいは、任意の所望の形状に反射層１４２を除去することにより形成される。あるいは、標的領域１４０は、反射層１４２を施す前に標的領域１４０区域をマスクすることを含むマスク技法によって形成することもできる。反射層１４２は、例えばアルミニウムまたは金といった金属から形成することができる。
【００７４】
図３は、図２に示す光バイオディスク１１０の平面図であり、ディスク内に位置する流体回路１２８、標的領域１４０、およびトリガマーキング１２６が見えるように、反射層１４２が、透明で示されたキャップ部１１６上に示されている。
【００７５】
図４は、本発明の一実施の形態による反射領域型の光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。この図は、光バイオディスク１１０のさまざまな層の一部を含み、この一部は、それぞれの主要な層、基板、コーティング、または膜の部分断面図を示すために切り取られている。図４は、反射層１４２で被覆された基板１２０を示す。反射層１４２上には、活性層１４４が施される。好ましい実施の形態では、活性層１４４は、ポリスチレンから形成することができる。あるいは、ポリカーボネート、金、活性ガラス（activated glass）、変性ガラス（modified glass）、または変性ポリスチレン、例えばポリスチレン無水マレイン酸を使用することができる。さらに、ヒドロゲルを使用することができる。あるいは、この実施の形態に示すように、活性層１４４上には、プラスチック接着部材１１８を施す。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、切り取られたか、または、刻印されたＵ字型を示し、このＵ字型が流体回路１２８を生成する。本バイオディスクのこの反射領域の実施の形態の最後の主要な構造上の層は、キャップ部１１６である。キャップ部１１６は、その底部に反射面１４６を備える。反射面１４６は、アルミニウムまたは金といった金属から作成することができる。
【００７６】
次に図５を参照して、本発明による透過型の光バイオディスク１１０の主要な構造上の要素の分解斜視図を示す。この透過型の光バイオディスク１１０の主要な構造上の要素も、同様に、キャップ部１１６と、接着部材または流路部材１１８と、基板１２０の層を備える。キャップ部１１６は、１つまたは複数の注入ポート１２２および１つまたは複数の排出ポート１２４を備える。キャップ部１１６は、ポリカーボネート層から形成することができる。図６および図９に最もよく示すように、オプションのトリガマーキング１２６を、薄い半反射層１４３の表面に備えることができる。トリガマーキング１２６には、バイオディスクの３つの層すべての透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域が含まれ得る。これらの透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域は、情報により符号化される。この情報は、図１０に示すように、プロセッサ１６６にデータを送信し、次に、図６および図１０に示すように、呼びかけビーム１５２の操作機能とやり取りを行う。
【００７７】
図５に示す第２の要素は、流体回路１２８、すなわちＵ字型流路が形成された接着部材または流路層１１８である。この流体回路１２８は、膜に刻印するか、または、膜を切り取ってプラスチック薄膜を除去し、図示するような形状を形成することにより形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フロー流路１３０および帰還流路１３２を備える。図５に示す流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバ１３４を備える。２つの異なる型の混合チャンバ１３４が示されている。第１のものは、フロー流路１３０に対して対称的に形成される対称混合チャンバ１３６である。第２のものは、オフセット混合チャンバ１３８である。このオフセット混合チャンバ１３８は、図示するように、フロー流路１３０の一方の側に形成される。
【００７８】
図５に示す第３の要素は、標的領域または捕捉領域１４０を備えることができる基板１２０である。基板１２０は、ポリカーボネート製であることが好ましく、図６に示すように、その最上部には薄い半反射層１４３が堆積されている。図５および図６に示すディスク１１０の基板１２０に関連した半反射層１４３は、図２、図３、および図４に示す反射型ディスク１１０の基板１２０上の反射層１４２よりもかなり薄くなっている。この薄い半反射層１４３により、呼びかけビーム１５２の一部は、図６および図１２に示すように、透過型ディスクの構造上の層を透過することができる。薄い半反射層１４３は、例えばアルミニウムまたは金といった金属から形成することができる。
【００７９】
図６は、図５に示す光バイオディスク１１０の透過型の実施の形態の基板１２０および半反射層１４３の拡大斜視図である。薄い半反射層１４３は、例えばアルミニウムまたは金といった金属から作成することができる。好ましい実施の形態では、図５および図６に示す透過型ディスクの薄い半反射層１４３は、約１００〜３００Åの厚さであり、４００Åを越えない。この薄い半反射層１４３により、入射ビームまたは呼びかけビーム１５２の一部は、半反射層１４３を貫通して、通過することが可能になり、それによって、図１０および図１２に示す上部検出器１５８によって検出される。一方、その光の一部が反射されて、すなわち入射経路に沿って戻される。以下に示すように、表２は、金の薄膜の厚さに対する反射特性および透過特性を示している。金の薄膜層は、８００Åよりも厚くなると、完全反射となる。一方、光が金の薄膜を透過する閾値不透明度は、約４００Åである。
【００８０】
表２に加えて、図７は、金の厚さに基づく薄い半反射層１４３の反射特性および透過特性の逆の関係のグラフ表示を提供する。図７に示すグラフで使用される反射値および透過値は、絶対値である。
【００８１】
【表２】
2005502872.tif 000004
【００８２】
次に図８を参照して、図５および図６に示す透過型光バイオディスク１１０の平面図を示す。透明なキャップ部１１６は、ディスク内に位置する流体流路、トリガマーキング１２６、および標的領域１４０を見せている。
【００８３】
図９は、本発明の透過型ディスクの実施の形態による光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。このディスク１１０は、そのさまざまな層の一部が、それぞれの主要な層、基板、コーティング、または膜の部分断面図を示すために切り取られて示されている。図９は、透明なキャップ部１１６と、基板１２０上の薄い半反射層１４３と、トリガマーキング１２６とを有する透過型ディスクフォーマットを示している。この実施の形態では、トリガマーキング１２６は、キャップの上部に配置された不透明材を備える。あるいは、トリガマーキング１２６は、ディスクの薄い反射層１４３にエッチングされた透明な非反射窓、または、図１０に示すトリガ検出器１６０から到来する信号を吸収する、すなわち反射しない任意のマークによって形成することができる。また、図９は、図示した形状、あるいは、任意の所望の形状で、指定した区域をマーキングすることにより形成される標的領域１４０も示している。標的領域１４０を示すマーキングは、基板１２０上の薄い半反射層１４３または（ディスクの下の）基盤１２０の底部に作成することができる。あるいは、標的領域１４０は、標的領域１４０を除く薄い半反射層１４３全体をマスクすることを含むマスク技法によって形成することもできる。この実施の形態では、標的領域１４０は、薄い半反射層１４３上のシルクスクリーンインクによって作成することができる。図５、図８、および図９に示す透過型ディスクフォーマットでは、別の方法として、標的領域１４０の範囲を、ディスクに符号化されたアドレス情報によって画定することができる。この実施の形態では、標的領域１４０は、物理的に見分けることができる端部境界を含まない。
【００８４】
図９を続けて参照して、薄い半反射層１４３上に施された活性層１４４を示す。好ましい実施の形態では、活性層１４４は、２％のポリスチレンからなる１０〜２００μｍの厚さの層である。あるいは、ポリカーボネート、金、活性ガラス、変性ガラス、または変性ポリスチレン、例えばポリスチレン無水マレイン酸を使用することができる。さらに、ヒドロゲルを使用することができる。あるいは、この実施の形態に示すように、活性層１４４上には、プラスチック接着部材１１８が施される。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、切り取られたか、または、刻印されたＵ字型を示し、このＵ字型が流体回路１２８を生成する。
【００８５】
本バイオディスク１１０のこの透過型の実施の形態の最後の主要な構造上の層は、透明な非反射キャップ部１１６である。このキャップ部１１６は、注入ポート１２２および排出ポート１２４を備える。
【００８６】
次に図１０を参照して、光コンポーネント１４８と、入射ビームまたは呼びかけビーム１５２を生成する光源１５０と、帰還ビーム１５４と、透過ビーム１５６とを示すブロック斜視図を表示する。図４に示す反射バイオディスクの場合、帰還ビーム１５４は、光バイオディスク１１０のキャップ部１１６の反射面１４６から反射される。本光バイオディスク１１０のこの反射型の実施の形態では、帰還ビーム１５４は、底部検出器１５７によって検出され、信号要素が存在する場合には分析される。他方、透過バイオディスクフォーマットでは、透過ビーム１５６が、上部検出器１５８によって検出され、信号要素が存在する場合には分析も行われる。透過型の実施の形態では、上部検出器１５８として、光検出器を使用することができる。
【００８７】
また、図１０は、ディスク上のトリガマーキング１２６とトリガ検出器１６０とを含むハードウェアトリガメカニズムも示している。このハードウェアトリガメカニズムは、反射バイオディスク（図４）および透過バイオディスク（図９）の双方で使用される。トリガメカニズムにより、プロセッサ１６６は、呼びかけビーム１５２がそれぞれの標的領域１４０にある場合にのみデータを収集することが可能になる。さらに、透過バイオディスクシステムでは、ソフトウェアトリガも使用することができる。このソフトウェアトリガは、呼びかけビーム１５２が、それぞれの標的領域１４０の端部に当たるとすぐに、底部検出器を使用して、プロセッサ１６６に信号を送り、データを収集する。さらに、図１０は、駆動モータ１６２と、光バイオディスク１１０の回転を制御するコントローラ１６４とを示している。また、図１０は、別の場合に実施されるプロセッサ１６６および分析装置１６８を示しており、これらは、帰還ビーム１５４と、透過型光バイオディスクに関連した透過ビーム１５６とを処理する。
【００８８】
図１１に示すように、本発明による光バイオディスク１１０の反射型ディスクの実施の形態の部分断面図が表されている。図１１は、基板１２０および反射層１４２を示している。上述したように、反射層１４２は、例えば、アルミニウム、金、または他の適切な反射材といった材料から作成することができる。この実施の形態では、基板１２０の上面は滑らかになっている。また、図１１は、反射層１４２上に施される活性層１４４も示している。また、図１１に示すように、標的領域１４０は、所望の場所の反射層１４２の区域または一部を除去することによるか、あるいは、反射層１４２を施す前に所望の区域をマスクすることにより形成される。図１１にさらに示すように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４上に施される。また、図１１は、キャップ部１１６、および、当該キャップ１１６に関連した反射面１４６も示している。したがって、キャップ部１１６が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に貼付されると、それによって、フロー流路１３０が形成される。図１１に示す矢印により図示するように、入射ビーム１５２の経路は、最初、ディスク１１０の下から基板１２０の方向に向けられている。次いで、この入射ビームは、反射層１４２の近くの一点に合焦する。この合焦は、反射層１４２が存在しない場所では、標的領域１４０で起こるので、入射は、活性層１４４を通ってフロー流路１３０内に入る経路に沿って進み続ける。その後、入射ビーム１５２は、上方に進み続けてフロー流路を横切り、最終的には反射面１４６に入射する。この時点で、入射ビーム１５２は、入射経路に沿って戻され、すなわち反射されて帰還し、それによって帰還ビーム１５４を形成する。
【００８９】
図１２は、本発明によるバイオディスク１１０の透過型の実施の形態の部分断面図である。図１２は、透明キャップ部１１６と、基板１２０上の薄い半反射層１４３とを有する透過型ディスクフォーマットを示している。また、図１２は、薄い半反射層１４３上に施された活性層１４４も示している。好ましい実施の形態では、この透過型ディスクは、約１００〜３００オングストロームの厚さの例えばアルミニウムまたは金といった金属から作成された薄い半反射層１４３を有し、４００オングストロームを越えることはない。この薄い半反射層１４３により、図１０に示す光源１５０からの入射ビームまたは呼びかけビーム１５２の一部は、ディスクを貫通して上方に通過することが可能になり、上部検出器１５８によって検出される。一方、光の一部は、反射され、入射ビームと同じ経路に沿って逆方向に戻る。この配置では、帰還ビームまたは反射ビーム１５４は、半反射層１４３から反射される。したがって、このようにして、帰還ビーム１５４はフロー流路１３０に入ることはない。反射光または帰還ビーム１５４は、図１３および図１４と共に、より詳細に説明するように、半反射層１４３内または半反射層１４３上に形成される事前に記録された情報トラック上の入射ビーム１５２を追跡するために使用することができる。図１２に示すディスクの実施の形態では、物理的に画定された標的領域１４０が存在してもよいし、存在しなくてもよい。標的領域１４０は、基板１２０上の薄い半反射層１４３上に作成される直接マーキングによって生成することができる。これらのマーキングは、シルクスクリーニングまたは任意の同等の方法を使用して形成することができる。標的領域を画定するのに物理的な印が使用されない（例えば、符号化されたソフトウェアアドレス指定が利用される場合）別の実施の形態では、フロー流路１３０は、実際には、検査特徴（investigational feature）の検査が行われる限られた標的区域として使用されてもよい。
【００９０】
図１３は、本発明によるバイオディスク１１０の反射型ディスクの実施の形態のトラックを横切った断面図である。この図は、ディスクの半径およびフロー流路に沿って縦方向に描かれている。図１３は、基板１２０および反射層１４２を含む。この実施の形態では、基板１２０は一連の溝１７０を備える。これらの溝１７０は、ディスクの中心近くから外側端部に向かって伸びる螺旋形状である。溝１７０は、呼びかけビーム１５２がディスクの螺旋溝１７０に沿って追従できるように実施される。この型の溝１７０は、「ウォブル溝（ｗｏｂｂｌｅ  ｇｒｏｏｖｅ）」として知られている。波状の、または、波打つ側壁を有する底部は、溝１７０を形成する一方、高くなった、または、立ち上がった部分は、隣接する溝１７０を螺旋状に分離する。この実施の形態で溝１７０上に施された反射層１４２は、図示するように、性質上等角である。また、図１３は、反射層１４２上に施された活性層１４４も示している。図１３に示すように、標的領域１４０は、所望の場所の反射層１４２の区域または一部を除去することによるか、あるいは、反射層１４２を施す前に所望の区域をマスクすることにより形成される。図１３にさらに示すように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４上に施される。また、図１３は、キャップ部１１６、および、当該キャップ部１１６に関連した反射面１４６も示している。したがって、キャップ部１１６が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に貼付されると、それによって、フロー流路１３０が形成される。
【００９１】
図１４は、例えば図１２に示すような本発明によるバイオディスク１１０の透過型ディスクの実施の形態のトラックを横切った断面図である。この図は、ディスクの半径およびフロー流路に沿って縦方向に描かれている。図１４は、基板１２０および薄い半反射層１４３を示している。この薄い半反射層１４３により、光源１５０からの入射ビームまたは呼びかけビーム１５２は、ディスクを貫通して通過することが可能になり、上部検出器１５８によって検出される。一方、光の一部が反射され、帰還ビーム１５４の形で戻る。薄い半反射層１４３の厚さは、ディスク読み取り装置がその追跡能力を維持するのに必要とされる反射光の最小量によって決定される。この実施の形態の基板１２０は、図１３で論考した基盤と同様に、一連の溝１７０を備える。この実施の形態の溝１７０も、ディスクの中心近くから外側端部に向かって伸びる螺旋形状であることが好ましい。溝１７０は、呼びかけビーム１５２がこの螺旋に沿って追従できるように実施される。また、図１４は、薄い半反射層１４３上に施された活性層１４４も示している。図１４にさらに示すように、プラスチック接着部材または流路層１１８が、活性層１４４上に施される。また、図１４は、反射面１４６を有さないキャップ部１１６も示している。したがって、キャップ部が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に貼付されると、それによって、フロー流路１３０が形成され、入射ビーム１５２の一部は、ほぼ反射されることなく、フロー流路１３０を通過することができる。
【００９２】
図１５は、反射型ディスクの全層と、反射型ディスクの最初の反射特性とを示す図１１と同様の図である。図１６は、透過型ディスクの全層と、透過型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１２と同様の図である。これらの切断面は、溝１７０に沿って切断されたものであるので、図１５および図１６には、溝１７０は見えない。図１５および図１６は、これらの実施の形態の溝１７０に垂直に位置する狭いフロー流路１３０が存在することを示している。図１３、図１４、図１５、および図１６は、それぞれの反射型ディスクおよび透過型ディスクの全層を示している。これらの図では、入射ビーム１５２が、最初に、基板１２０と相互作用することが示されている。基板１２０は、入射ビームの経路を図示するように変更して、反射層１４２または薄い半反射層１４３上でビーム１５２の焦点が合うようにする屈折特性を有する。
【００９３】
＜細胞検定＞
血液サンプル中のＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の個体群の絶対数ならびにＣＤ４＋／ＣＤ８＋のリンパ球比を高速に求める汎用的な均質固相細胞捕捉検定法（generic homogeneous solid phase cell capture assay）が、本発明の方法を利用して実行可能である。この試験は、バイオディスクに組み込まれた小さなフロー流路内で行われる。この試験は、全血から分離された７〜１５μｌの単核球（ＭＮＣ）において、捕捉領域上の特異的な抗体により捕捉されたＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ２＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、およびＣＤ４５＋細胞の個数を求める。この試験は、ディスク上の特定の場所における局所的な細胞捕捉の原理に基づいている。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に基づく捕捉化学種を特異的な血球表面の抗原に局所的に適用することにより、いくつかの特異的な細胞捕捉領域が、ディスク上に生成される。ＭＮＣ血液（１０，０００〜３０，０００細胞／μｌ）により２５〜１００μｌのチャンバを溢れさせると、ＣＤ４抗原、ＣＤ８抗原、ＣＤ２抗原、ＣＤ３抗原、ＣＤ１９抗原、およびＣＤ４５抗原を発現する細胞が、ディスク内の捕捉領域に捕捉される。また、捕捉領域には、確定した負の制御区域も組み込まれる。
【００９４】
図１７Ａは、血液サンプルの分析を示す、イラストで表したフローチャートである。ステップ１で、４ｍｌまたは８ｍｌのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）および抗凝血剤内に血液（４〜８ｍｌ）を直接収集する。抗凝血剤としては、例えばＥＤＴＡ、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）、またはヘパリンといったものがある。本発明の別の実施の形態の等価なステップでは、抗凝血剤内の３ｍｌの血液を、例えばヒストパック（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）（登録商標）１０７７といった分離勾配液（separation gradient）１７６を含む管１７２内に、当該液の上に覆うように入れる。いずれの場合も、収集から２時間以内に血液サンプル１７４を使用することが好ましい。血液サンプル１７４が上を覆った分離勾配液１７６を含む管１７２を、水平ロータおよび回転動翼を有するバイオハザード遠心分離機内において、室温で３０分間、４００×ｇで遠心分離する。遠心分離後、単核球（ＭＮＣ）画分１８０の上にある約２ｍｍの血漿を残して、血漿層１７８を除去する（ステップ２）。ＭＮＣ層１８０を収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって洗浄する。細胞を、室温で１０分間、２５０×ｇで遠心分離することによりペレットにして、残っているあらゆる血小板を除去する。上澄み液を除去し、管をそっと軽く叩くことによって、ＭＮＣペレット１８０を再度、ＰＢＳ内に懸濁させる。この最終的なペレット１８０を、バイオディスク１１０の流路１３０の高さに応じて、１０，０００〜３０，０００細胞／μｌの細胞計数に再度懸濁する（ステップ３）。
【００９５】
バイオディスク１１０のフロー流路１３０を、７μｌのＭＮＣ懸濁液で溢れさせ、混合チャンバの注入ポート１２２および排出ポート１２４（図３および図８）を接着タブまたは他の適切な密閉部材で密閉する（ステップ４）。バイオディスク１１０を室温で１５分間培養し、その後、光ドライブ１１２の７８０ｎｍレーザを使用して走査され、捕捉フィールドが画像化される（ステップ５）。透過バイオディスク１１０を使用する場合、光ドライブ１１２は、任意選択で、捕捉フィールドを画像化するために上部検出器１５８（図１０）を備えることが理解されるべきである。ソフトウェアが、ディスクに符号化されて、以下のタスクを自動的に実行するようにドライブに指令することが好ましい。すなわち、（ａ）１つまたは複数の段階でディスクに遠心力を作用させて、結合していない過剰な細胞を除去すること、（ｂ）特定の捕捉窓を表示モニタ１１４に画像化すること、および（ｃ）データを処理することである。データの処理には、各捕捉領域に特異的に捕捉された細胞を計数すること、および、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の比または求めるようにプログラムされたいずれかの比を導出することが含まれるが、これらに限定されるものではない。他の所望の比は、本発明の別の実施の形態によって容易に提供することができる。
【００９６】
図１７Ａにさらに示すように、本発明は、光ディスクおよびディスクドライブシステムを用いてクラスタ標識（cluster designation）の計数を行う方法を対象とする。この方法は、分離勾配液を含む第１の管に血液サンプルを用意するステップと、この血液サンプルを層に分離するのに十分な時間および速度で第１の管を回転させるステップと、Ｔ細胞を含むＭＮＣ層を再度懸濁して、ＭＮＣ懸濁液を形成するステップと、少なくとも１つの捕捉剤を含んだ少なくとも１つの捕捉領域を備えるディスク表面にＭＮＣ懸濁液のサンプルを用意するステップと、このディスクを光学式読み取り装置にロードするステップと、このディスクを回転させるステップと、電磁放射入射ビームを捕捉領域に送るステップと、捕捉領域でディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出するステップと、この検出したビームを出力信号に変換するステップと、この出力信号を分析して、捕捉領域で捕捉された細胞の個数に関する情報を抽出するステップとを含む。この方法の一実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が反射されるような反射層により構築される。この方法の別の実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が光ディスクを透過するように構築される。
【００９７】
分析／処理ステップの間、ソフトウェアは、各捕捉領域の画像を全体にわたって読み取り、細胞の画像に遭遇した時にその細胞の画像に印を付ける。例えば、ソフトウェアは、捕捉されたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の個数の計数に続いて、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の細胞比を計算し、ＣＤ４＋捕捉領域、ＣＤ８＋捕捉領域、ＣＤ３＋捕捉領域、およびＣＤ４５＋捕捉領域の全血の１マイクロリットルあたりの細胞の絶対数と、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の細胞比との双方を表示する。ディスクを光ドライブに挿入してから個数および比を得るまでのプロセス全体に要する時間は、約１２分である。
【００９８】
一実施の形態では、ディスクは、符号化情報層として３００ｎｍの金で被覆されたｆｏｒｗａｒｄ  Ｗｏｂｂｌｅ  Ｓｅｔ  ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０のＣＤ−Ｒディスクである。反射型ディスク上に、サイズ２×１ｍｍの楕円形の視界窓を、既知のリソグラフィー技法によって、反射層からエッチングする。透過型ディスクの設計の中には、個別の視界窓をエッチングせずに、ディスク全体を使用できるものがある。特定の一実施の形態では、接着層は、Ｆｒａｙｌｏｃｋ接着ＤＢＬ  ２０１  Ｒｅｖ  Ｃ３Ｍ９４６６１である。そのカバーは、半径２６ｍｍにおいて等距離に配置された直径０．０４０インチの４８個のサンプル注入口を有する透明ディスクである。このデータディスクは、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋計数ソフトウェアを使用して、４倍速および２．６７ＭＨｚのサンプリングレートでソフトウェアにより走査され読み取られる。
【００９９】
図１７Ｂを参照して、本発明の一実施の形態では、厚いポリスチレン層１１８を基板１２０上に形成し、（任意選択で）ストレプトアビジン１８２の層を形成する。細胞捕捉抗体は、ビオチンを介してストレプトアビジン１８２に結び付く。これらの抗体には、捕捉抗体用の十分な個数の結合部位を生成するために、ストレプトアビジン上に被覆されたデキストラン活性化アルデヒド（Dextran-activated aldehyde）と結び付いたビオチン化抗体が含まれ得る。これは、白血球（ＷＢＣ）と強固な接合を特異的に形成できる強力な捕捉化学種を生み出す。
【０１００】
図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃは、本発明の一実施の形態で使用されるクロスリンクシステムのイラスト表現である。クロスリンクシステムには、１つまたは複数の高分子部分（macromolecular moiety）を別の高分子部分にクロスリンクする１つまたは複数のクロスリンク剤、すなわち共役剤が必要であることが理解されるべきである。クロスリンクは、２つの高分子部分間の共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよく、通常、２つの高分子のフリーラジカルが結合する時に形成され得る。クロスリンクを実現する化学修飾または共役プロセスは、ある官能基と別の官能基との反応を伴い、その結果、化学結合が形成される。反応型官能基または選択的な反応型官能基を有するバイオ共役（bioconjugate）試薬を生成することにより、標的分子の簡単で再現可能なクロスリンクまたはタグ付けの基礎が形成される（「Bioconjugate Techniques」, Greg T. Hermanson, Academic Press, San Diego, CA, (1996)）。
【０１０１】
クロスリンク剤には、同種二機能性リンカー（homobifunctional linker）、異種二機能性リンカ（heterobifunctional linker）、およびゼロレングスクロスリンカー（zero-length cross-linker）が含まれるが、これらに限定されるものではない。同種二機能性リンカは、同じ機能性の２つの反応部位を有するリンカであり、例えばグルタルアルデヒドなどがある。これらの試薬は、双方の分子上の同じ共通基と反応して共有結合することにより、あるタンパク質を別のタンパク質に結合することができる。異種二機能性共役試薬は、タンパク質および他の高分子上の２つの異なる機能標的に結合できる２つの異なる反応基を含む。例えば、クロスリンカーのある部分は、アミン反応基を含むことができる一方、別の部分は、スルフヒドリル反応基から構成することができる。その結果、クロスリンク反応を標的分子の選択部分に向けることができ、したがって、共役プロセス全体にわたってより良い制御を得ることができる。ゼロレングスクロスリンカーは、原子を追加しない化学結合を形成することにより、２つの分子の共役を仲介する。したがって、分子の１つの原子は、リンカまたはスペーサが介在することなく、第２の分子の原子に共有結合によって結び付く。当業者は、クロスリンク剤の詳細な説明を得るために、「Bioconjugate Techniques」, Greg T. Hermanson, Academic Press, San Diego, CA, (1996)を参照することができる。
【０１０２】
本発明では、クロスリンク剤をバイオディスクの表面に結合させて、標的領域内に捕捉剤を固定する。好ましいクロスリンクシステムは、ビオチン−ストレプトアビジンからなる異種二機能性群、すなわち、アビジン結合基板に結合したビオチン化捕捉剤である。図１８Ａは、ストレプトアビジン１８２のイラスト表現である。制限なく、ストレプトアビジンには、アビジン、ストレプトアビジン、およびそれらを修飾したものが含まれる。図示するように、タンパク質は４つのサブユニットを備える。これらのサブユニットのそれぞれは、ビオチン用の１つの結合部位を含む（Hermanson）。ストレプトアビジン１８２は、さまざまな化学種によって、例えばポリスチレンといったプラスチックに結合することができる。ストレプトアビジン１８２は、理想的には、バイオディスクの活性層１４４（図４および図９）に結び付き、ビオチン化検知分子（例えば抗体）に本質的に非可逆結合する。
【０１０３】
図１８Ｂは、ビオチン１８４のイラスト表現である。ビオチン（すなわち、ビタミンＨ）は、あらゆる細胞内に少量存在する、自然に発生する成長因子である。ビオチンのタンパク質アビジンおよびストレプトアビジンとの相互作用は、知られている最も強い非共有結合的親和性の１つである。ビオチン分子１８４は、そのバレリアン酸側鎖を介してタンパク質に直接結び付くこともできるし、スペーサアームおよびさまざまな反応基を生成する他の有機成分により誘導（derivitize）することもできる。アミン基、カルボン酸塩基、スルフヒドリル基、および糖質基は、ビオチン誘導体の適切な選択を通じて特異的にビオチン化の標的にすることができる（Hermanson）。図１８Ｃは、ビオチン１８４がストレプトアビジン１８２と相互作用したものからなるクロスリンクシステムのイラスト表現である。
【０１０４】
本発明の実施の形態の実施態様は、捕捉剤を利用して、本明細書に説明する検定を実行する。捕捉剤は、検体を検出するあらゆる高分子をいうことが理解されるべきである。本発明の捕捉剤には、対象となる検体に対して優先選択性を有する高分子、すなわち、対象となる検体に対して選択的な結合親和性を有する高分子が含まれる。捕捉剤には、合成核酸またはバイオ生成された核酸、および、合成タンパク質またはバイオ生成されたタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明が使用できる捕捉剤の例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応生成物、またはこれらのヌクレオチドを結合したもの（キメラ）、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、細胞膜受容体、ならびに特異的な（例えばウィルス、細胞、または他の物質の）抗原決定基、薬物、ペプチド、コファクタ、レクチン、多糖類、細胞、細胞膜、および細胞小器官と反応する抗血清が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の捕捉剤は、抗体であることが好ましい。
【０１０５】
抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、および組み換え生成された抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体は、生体内で産生することもできるし、生体外で産生することもできる。抗体の産生方法は、当業者に既知である。例えば、Antibody Production: Essential Techniques, Peter Delves (Ed.), John Wiley & Son Ltd, ISBN: 0471970107 (1997)を参照されたい。この出版物は、参照によりその全内容が本明細書に援用される。あるいは、抗体は、民間の供給源から得ることができ、例えば、ニュージャージー州０７８３６フランダースのプレサントヒル通りにあるResearch Diagnostics Inc.から得ることができる。本発明の抗体は、任意の１つの特定の種の抗体に限定されることが意図されているわけではなく、例えば、ヒト、マウス、ラット、およびヤギの抗体のすべてが、本発明によって検討される。本発明の１次抗体は、マウス内で産生された抗ヒト抗体であり、２次抗体は、ヤギ内で産生された抗マウス抗体であることが好ましい。
【０１０６】
また、任意の、または、すべての抗体の型は、細胞表面の抗原に結合するのに使用することができるので、用語「抗体」は、抗体の任意のクラスまたは任意のサブクラスをも含む。医療診断の技術における抗体の使用は、当業者に既知である。例えば、Diagnostic and Therapeutic Antibodies (Methods in Molecular Medicine), Andrew J. T. George and Catherine E. Urch (Eds.), Humana Press; ISBN: 0896037983 (2000)、および、Antibodies in Diagnosis and Therapy: Technologies, Mechanisms and Clinical Data (Studies in Chemistry Series), Siegfried Matzku and Rolf A. Stahel (Eds.), Harwood Academic Pub.; ISBN: 9057023105 (1999)を参照されたい。これらは、参照によりその全内容が本明細書に援用される。
【０１０７】
本発明の少なくともいくつかの実施の形態では、複数の捕捉剤を使用して、対象となる検体が検出される。図１８Ｄは、本発明の方法において２次捕捉剤１８６として使用されるＩｇＧクラスの抗体のイラスト表現である。本発明の２次捕捉剤には、別の捕捉剤に対する親和性を有し、対象となる検体に対する親和性を有する薬剤が含まれるが、これに限定されるものでないことが理解されるべきである。図１８Ｅは、ビオチン分子１８４に結合した２次捕捉剤ＩｇＧ１８６を示し、以下、ビオチン化ＩｇＧと呼ぶ。
【０１０８】
図１８Ｆは、１次捕捉剤１８８のイラスト表現である。本発明の１次捕捉剤１８８は、対象となる検体に対する選択的な親和性を有することが理解されるべきである。１次捕捉剤は、白血球に対する親和性を有する抗体であることが好ましい。より具体的には、これらの抗体は、リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、好酸球（ＣＤ１５）、および対象となる他の細胞表面のマーカを対象とする。図１８Ｇは、ビオチン分子１８４に結合した１次捕捉剤１８８を示す。ＣＤ４およびＣＤ８に加えて、他の多くの細胞表面の抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ５６）に対する抗体が存在し、それらを使用して、リンパ球の亜類型を識別することができる。
【０１０９】
図１８Ｈは、ＣＤ４＋Ｔ細胞１９０のイラスト表現である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば、食作用を有するマクロファージおよび樹状細胞といった抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現される特異的な抗原に結合し、他の免疫系細胞をその区域に引き付けるリンフォカインを放出する。その結果、炎症が生じ、抗原物質を囲んで破壊しようとする細胞および分子の蓄積が生じる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、その細胞表面全体にわたって多数の抗原１９２を有することが理解されるべきである。一方、図１８Ｈは、４つの抗原１９２を有するＣＤ４＋Ｔ細胞１９０を示しているが、これは例示にすぎない。
【０１１０】
図１８Ｉは、ＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のイラスト表現である。これらのＴ細胞は、結合した細胞を破壊する分子を分泌する。感染した細胞が、他の細胞に感染できる新たなウィルスの集団を放出する前に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それら感染した細胞を破壊するので、このＣＤ８＋Ｔ細胞の分子の分泌は、ウィルス感染との戦いにおいて重要である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、その細胞表面全体にわたって多数の抗原１９６を有することが理解されるべきである。一方、図１８Ｉは、４つの抗原１９６を有するＣＤ８＋Ｔ細胞１９４を示しているが、これは、例示にすぎない。
【０１１１】
図１８Ｊは、アルデヒド活性化デキストラン（aldehyde-activated dextran）の３次元マトリックス（ＤＣＨＯ）１９８に結合し、それによって、ＤＣＨＯ抗体複合体１９９を形成する２次抗体１８６を示すイラスト表現である。デキストランは、主として、Ｄグルコースの繰り返し単位がグリコシド結合によって互いにリンクしたものからなる直線的な多糖類である。デキストランは、クロスリンク剤として幅広く使用され、その性質上、多価であることから、分子は、ポリマ鎖に沿って多数の部位で結び付くことが可能になる（Hermanson）。例示に過ぎないが、図１８Ｋに示すように、デキストラン１９８に結合した抗体１８６を図示する。
【０１１２】
本発明の細胞検定に関する態様は、以下の米国仮出願にも開示されている。すなわち、２００１年７月２７日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３０８，１７６号、２００１年８月１５日に出願された「Methods for Quantitative and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells Including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３１２，２４８号、２００１年８月２０日に出願された「Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc Including Same」と題する米国仮出願第６０／３１３，５１４号、２００１年８月２０日に出願された「RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」と題する米国仮出願第６０／３１３，７１５号、２００１年８月２０日に出願された「RBC Sieving Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」と題する米国仮出願第６０／３１３，５３６号、および２００１年８月３０日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３１５，９３７号にも開示されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
【０１１３】
＜実施態様Ｉ＞
図１９Ａ〜図１９Ｄは、本発明の第１の実施態様の検体捕捉のイラスト表現である。図１９Ａおよび図１９Ｂは、ビオチン化１次抗体（図１８Ｇ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の捕捉を示している。この抗体１８８は、クロスリンク剤のストレプトアビジン１８２によって、バイオディスク１１０の活性層１４４（図４および図９）上に固定される。図１９Ｃおよび図１９Ｄは、クロスリンクシステムを有さない本発明の同じ実施態様の別の実施の形態を示している。この実施の形態では、１次抗体１８８は、バイオディスク１１０の活性層１４４上に直接固定される。
【０１１４】
図２０Ａ〜図２０Ｉは、本発明の第１の実施態様の実施の形態の構成を示す断面図である。第１の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用して、バイオディスクのフロー流路内に捕捉剤を固定する反射型ディスクの構成を伴う。図２０Ａを参照して、光バイオディスク１１０の光透過性基板１２０、反射層１４２、および活性層１４４を示す。反射層１４２の複数の部分を除去して（または堆積時に開口部を生成して）、視界窓２００を生成する。この視界窓２００を通って、光は、抗体が固定される捕捉領域１４０の場所に向かうことができる。図２０Ａは、５つのこのような捕捉領域１４０を示している。その最初のものを捕捉領域１４１として示す。活性層１４４は、ポリスチレンであることが好ましく、反射層１４２の上にスピンコートして、あるいは当技術分野において知られる方法によって堆積され、約４０〜３００ミクロンの厚さを有する滑らかな表面を形成する。次いで、ストレプトアビジン１８２を各捕捉領域１４０および１４１上に堆積させ、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２０Ｂ）。ディスク１１０を洗浄して、結合していないストレプトアビジン１８２を除去し、次いで、ディスク１１０をスピン乾燥して、ディスク１１０の表面から水分を完全に除去する（図２０Ｃ）。基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の捕捉領域１４１上に堆積させて、ビオチン化１次抗体１８８を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上に堆積させる（図２０Ｄおよび図２０Ｅ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する。結合していない抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２０Ｆ）。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる（図２０Ｇ）キャップ部１１６（図２）は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。キャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する（図２０Ｇ）。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路１３０内に注入し、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２０Ｈ）。ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間という所定の時間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を吸引して完全に除去する（図２０Ｉ）。
【０１１５】
本発明の第１の実施態様の第２の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する反射型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の窓１４１の上に堆積させ、非ビオチン化１次抗体１８８（図１８Ｆ）を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上の活性層１４４（図２０Ａ）に直接堆積させる。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養する（図２０Ｅ）。結合していない抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２０Ｆ）。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。キャップ部１１６（図２）は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。キャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する（図２０Ｇ）。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路１３０内に注入して、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２０Ｈ）。ディスクを恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を吸引して完全に除去する（図２０Ｉ）。図２１は、クロスリンクシステムを使用しない、完成した反射バイオディスク１１０の断面図を示している。
【０１１６】
本発明の第１の実施態様の第３の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用してバイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基板１２０と、視界窓２００（図２０Ａ）を有さない半反射層１４３と、活性層１４４とが、図５に示すように設けられる。ストレプトアビジン１８２、ビオチン化１次抗体１８８、基準ドット２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上述したとおりであり、図２０Ｂ〜図２０Ｈに示すとおりである。接着部材１１８をそれぞれ活性層１４４に付着させる。光透過性キャップ部１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成することができる。このキャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク１１０内にフロー流路１３０を形成する（図２０Ｇ）。図２２は、クロスリンクシステムを利用する、完成した透過バイオディスク１１０の断面図を示している。この第１の実施態様の第４の実施の形態は、当業者によって構築可能であることが理解されるべきである。この第４の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成（図２１および図２２）を伴う。
【０１１７】
＜実施態様ＩＩ＞
図２３Ａ〜図２３Ｄは、本発明の第２の実施態様の検体捕捉のイラスト表現である。図２３Ａおよび図２３Ｂは、１次抗体１８８（図１８Ｆ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の捕捉を示している。この１次抗体１８８は、クロスリンク剤のストレプトアビジン１８２によって、バイオディスク１１０の活性層１４４（図４および図９）上に固定されるビオチン化２次抗体１８６（図１８Ｅ）に結合される。図２３Ｃおよび図２３Ｄは、クロスリンクシステムを有さない本発明の同じ実施態様の別の実施の形態を示している。この実施の形態では、２次抗体１８６は、バイオディスク１１０の活性層１４４上に直接固定される。
【０１１８】
図２４Ａ〜図２４Ｌは、本発明の第２の実施態様の実施の形態の構成を示す断面図である。第１の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用して、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する反射型ディスクの構成を伴う。図２４Ａを参照して、光バイオディスク１１０の光透過性基板１２０、反射層１４２、および活性層１４４を示す。反射層１４２の複数の部分を除去して（または堆積時に開口部を生成して）、視界窓２００を生成する。この視界窓２００を通って、光は、抗体が固定される捕捉領域１４０の場所に向かうことができる。図２４Ａは、５つのこのような捕捉領域１４０を示している。その最初のものを捕捉領域１４１として示す。活性層１４４は、ポリスチレンであることが好ましく、反射層１４２の上にスピンコートして、約４０〜３００マイクロメートルの厚さを有する滑らかな表面を形成する。次いで、ストレプトアビジン１８２を各捕捉領域１４０および１４１上に堆積させ、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養する（図２４Ｂ）。ディスク１１０を洗浄して、結合していないストレプトアビジン１８２を除去し、次いで、ディスク１１０をスピン乾燥して、ディスク１１０の表面から水分を完全に除去する（図２４Ｃ）。基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の捕捉領域１４１上に堆積させて、ビオチン化２次抗体１８６を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上に堆積させる（図２４Ｄおよび図２４Ｅ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養する（図２４Ｅ）。結合していない２次抗体１８６をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２４Ｆ）。次いで、１次抗体１８８（図１８Ｆ）を各捕捉領域１４０上に堆積させる（図２４Ｇ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養する（図２４Ｈ）。結合していない１次抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２４Ｉ）。それぞれの接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。キャップ部１１６（図２）は、ポリカーボネートから同様に形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。キャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する（図２４Ｊ）。例えば、ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路１３０内に注入し、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２４Ｋ）。ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を吸引して完全に除去する（図２４Ｌ）。
【０１１９】
本発明の第２の実施態様の第２の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する反射型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の窓１４１の上に堆積させ、非ビオチン化２次抗体１８６（図１８Ｄ）を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上の活性層１４４（図２４Ａ）に直接堆積させる。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２４Ｅ）。結合していない２次抗体１８６をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２４Ｆ）。次いで、１次抗体１８８（図１８Ｆ）を各捕捉領域１４０上に堆積させる（図２４Ｇ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２４Ｈ）。結合していない１次抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２４Ｉ）。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。前の実施の形態と同様に、この実施の形態のキャップ部１１６も、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。キャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する（図２４Ｊ）。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路１３０内に注入して、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２４Ｋ）。この実施の形態では、ディスクを恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を吸引して完全に除去する（図２４Ｌ）。図２５は、クロスリンクシステムを使用しない、完成した反射バイオディスク１１０の断面図を示している。
【０１２０】
本発明の第２の実施態様の第３の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用してバイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基板１２０と、視界窓２００（図２４Ａ）を有さない半反射層１４３と、活性層１４４とが、図５に示すように設けられる。ストレプトアビジン１８２、ビオチン化２次抗体１８６、１次抗体１８８、基準ドット２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上述したとおりであり、図２４Ｂ〜図２４Ｋに示すとおりである。接着部材１１８を活性層１４４に同様に付着させる。光透過性キャップ部１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成することができる。このキャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク１１０内にフロー流路１３０を形成する（図２４Ｊ）。図２６は、クロスリンクシステムを利用する、完成した透過バイオディスク１１０の断面図を示している。この第２の実施態様の第４の実施の形態は、当業者によって構築可能であることが理解されるべきである。この第４の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成（図２１および図２２）を伴う。
【０１２１】
＜実施態様ＩＩＩ＞
図２７Ａ〜図２７Ｄは、本発明の第３の実施態様による検体捕捉のイラスト表現である。図２７Ａおよび図２７Ｂは、１次抗体１８８（図１８Ｆ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の捕捉を示している。この１次抗体１８８は、２次抗体１８６（図１８Ｄ）に結合し、２次抗体１８６は、ＤＣＨＯ１９８のストランドに結合して、図２８Ａの下に示すようなＤＣＨＯ抗体複合体１９９を形成する。ＤＣＨＯ抗体複合体１９９は、ＤＣＨＯ１９８によってクロスリンクされた１つまたは複数の抗体を含むことができる。バイオディスク１１０（図４および図９）の活性層１４４に２次抗体１８６のいくつかを結合させることを通じて、ＤＣＨＯ抗体複合体１９９を活性層１４４に固定する。図２７Ｃおよび図２７Ｄは、本発明の同じ実施態様の、２次抗体１８６を有さない別の実施の形態を示している。この実施の形態では、１次抗体１８８をＤＣＨＯに直接結合して、ＤＣＨＯ抗体複合体１９９を形成し、そして、このＤＣＨＯ抗体複合体１９９をバイオディスク１１０の活性層１４４に固定する。
【０１２２】
図２８Ａは、抗体ＤＣＨＯ複合体の調製を示すイラストの流れ図である一方、図２８Ｂ〜図２８Ｊは、本発明の第３の実施態様の一実施の形態の構成を示す複数の図である。この第３の実施態様の第１の実施の形態は、クロスリンク剤のＤＣＨＯを利用して、２つまたは３つ以上の捕捉剤をクロスリンクする反射型ディスクの構成を伴う。図２８Ａは、ＤＣＨＯ抗体複合体１９９の調製を示している。等しい濃度のＤＣＨＯ１９８および２次抗体１８６を混合して結合させ、それによって、ＤＣＨＯ抗体（２次）複合体１９９を形成する。図２８Ｂを参照して、光バイオディスク１１０の光透過性基板１２０、反射層１４２、および活性層１４４を示す。反射層１４２の複数の部分を除去して（または堆積時に開口部を生成して）、視界窓２００を生成する。この視界窓２００を通って、光は、抗体が固定される捕捉領域１４０の場所に向かうことができる。図２８Ｂは、５つのこのような捕捉領域１４０を示している。その最初のものを捕捉領域１４１として示す。活性層１４４は、ポリスチレンであることが好ましく、この活性層１４４を反射層１４２の上にスピンコートして、約４０〜３００マイクロメートルの厚さを有する滑らかな表面を形成する。この特定の実施の形態では、次いで、ＤＣＨＯ抗体複合体（２次）１９９を各捕捉領域１４０上に堆積させ、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２８Ｃ）。ディスク１１０を洗浄して、結合していないＤＣＨＯ抗体複合体（２次）１９９を除去し、次いで、ディスク１１０をスピン乾燥して、ディスク１１０の表面から水分を完全に除去する（図２８Ｄ）。基準ドット２０２を最初の捕捉領域１４１上に堆積させて、１次抗体１８８を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上に堆積させる（図２８Ｅ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２８Ｆ）。結合していない１次抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２８Ｇ）。接着部材または流路層１１８を活性層１４４に付着させる。上記実施の形態と同様に、図２に概略を示すキャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。本実施の形態では、図２８Ｈに示すように、キャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路１３０内に注入し、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する。このステップを図２８Ｉに示す。この実施の形態では、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養し、図２８Ｊに表すように、残っているあらゆる溶液を吸引して完全に除去する。
【０１２３】
本発明の製造態様によると、図２８Ａ〜図２８Ｊは、クラスタ分化の計数を行う光検定ディスクの作成方法も示している。この光検定ディスクの作成方法は、管にクロスリンカーを提供するステップと、管に捕捉剤を加えるステップと、クロスリンカーと捕捉剤とを結合（複合体の形成）させるステップと、基板を設けるステップと、活性層により基板を被覆するステップと、複合体を活性層上に堆積させるステップと、接着部材を使用して活性層にキャップ部を取り付けるステップとを含む。この実施の形態では、クロスリンカーは、アルデヒド活性化デキストランである。捕捉剤は、細胞表面の抗原と結合するためのものである。別の実施の形態では、この捕捉剤は、細胞表面の抗原に対する選択的な親和性を有する１次捕捉剤と結合するためのものである。好ましい実施の形態では、細胞表面の抗原は、ＣＤ族の抗原から独立して選択される。より好ましい実施の形態では、細胞表面の抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５からなる群から独立して選択される。
【０１２４】
本発明の第３の実施態様の第２の実施の形態は、２次抗体を使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に１次捕捉剤を固定する反射型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、等しい濃度のＤＣＨＯ１９８および１次抗体１８８を混合して結合させ、それによって、図２８Ａに表すＤＣＨＯ抗体（１次）複合体１９９を形成する。基準マークまたは検量線作成マーク２０２を最初の窓１４１上に堆積させて、ＤＣＨＯ抗体（１次）複合体１９９を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０にわたって活性層１４４（図２８Ｃ）上に堆積させる。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養し、結合していないＤＣＨＯ抗体（１次）複合体１９９をＰＢＳ洗浄により除去する。図２８Ｄに示すように、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する。接着部材または流路層１１８を、同様にして、活性層１４４に付着させる。キャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。図２８Ｈに示すように、キャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路１３０内に注入し、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２８Ｉ）。ディスクを恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養し、図２８Ｊに示すように、残っているあらゆる溶液を吸引して完全に除去する。図２９は、２次抗体を使用しない、完成した反射バイオディスク１１０の断面図を示している。
【０１２５】
本発明の第３の実施態様の第３の実施の形態は、クロスリンカーＤＣＨＯを利用してバイオディスク１１０のフロー流路１３０内の捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基板１２０と、視界窓２００（図２８Ｂ）を有さない半反射層１４３と、活性層１４４とが、図５に示すように設けられる。ＤＣＨＯ抗体（２次）複合体１９９、１次抗体１８８、基準マークまたは基準ドット２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上述したとおりであり、図２８Ｃ〜図２８Ｉに示すとおりである。接着部材または流路層１１８を活性層１４４に付着させる。光透過性キャップ部１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成することができる。このキャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク１１０内にフロー流路１３０を形成する。図３０は、ＤＣＨＯ抗体（２次）複合体１９９および１次抗体１８８を利用する、完成した透過型バイオディスク１１０の断面図を示している。この第３の実施態様の第４の実施の形態は、当業者によって構築可能であることが理解されるべきである。この第４の実施の形態は、２次抗体を使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に１次捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成（図２９および図３０）を伴う。他の実施の形態は、ストレプトアビジン１８２（図１８Ａ）およびビオチン１８４（図１８Ｂ）を使用して、１次抗体または２次抗体をバイオディスク１１０の活性層１４４に固定することを伴うことができる。固定された抗体（１次および２次の双方）は、その後、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内の捕捉剤の濃度を増加させるために、ＤＣＨＯ１９８により複合体にすることができる。
【０１２６】
＜実施態様ＩＶ＞
図３１Ａは、４つの流体回路１２８を示す光バイオディスク１１０の平面図である。各流体回路は、特異的な細胞表面マーカ用および負の制御領域用の数個の捕捉領域１４０を有する。図示するように、各流体回路は、専用化されて、具体的にはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５を対象とする捕捉領域１４０を有する。他のあらゆる所望の細胞表面の抗原のパターンまたは組み合わせ、例えば他のＣＤマーカまたは細胞表面マーカ、を使用することもできる。この特定の実施態様では、それぞれの個別の流体回路について、その捕捉領域１４０のそれぞれは、単一の共通の捕捉剤のみを有することが必要とされる。図３１Ａに示すディスクは、図３１Ｂ〜図３１Ｅ、図４４Ａ〜図４４Ｄ、図４５、および図４６において後述する細胞捕捉化学種および細胞捕捉方法と共に使用するのに特に適している。図３１Ａに表すバイオディスク１１０は、反射型ディスクであってもよいし、透過型ディスクであってもよい。
【０１２７】
次に図３１Ｂ〜図３１Ｅに移って、本発明の第４の実施態様の検体捕捉のイラスト表現を示す。図３１Ｂおよび図３１Ｃは、ＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４の２次抗体１８６による捕捉を示している。これらのＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４は、１次抗体１８８（図１８Ｆ）と事前に結合して、１次抗体細胞複合体を形成している。１次抗体１８８は、クロスリンク剤のストレプトアビジン１８２によってバイオディスク１１０（図４および図９）の活性層１４４上に固定されたビオチン化２次抗体１８６（図１８Ｅ）に結合する。図３１Ｄおよび図３１Ｅは、本発明の同じ実態態様の、クロスリンクシステムを有さない別の実施の形態を示している。この実施の形態では、２次抗体１８６は、バイオディスク１１０の活性層１４４上に直接固定される。
【０１２８】
図３２Ａ〜図３２Ｉは、本発明の第４の実施態様の一実施の形態の構成を示す断面図である。第１の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用して、バイオディスクのフロー流路内に捕捉剤を固定する反射型ディスクの構成を伴う。図３２Ａを参照して、光バイオディスク１１０の光透過性基板１２０、反射層１４２、および活性層１４４を示す。反射層１４２の複数の部分を除去して（または堆積時に開口部を生成して）、視界窓２００を生成する。この視界窓２００を通って、光は、抗体が固定される捕捉領域１４０の場所に向かうことができる。図３２Ａは、５つのこのような捕捉領域１４０を示している。その最初のものを捕捉領域１４１として示す。活性層１４４は、ポリスチレンであることが好ましく、この活性層１４４を反射層１４２の上にスピンコートして、約４０〜３００マイクロメートルの厚さを有する滑らかな表面を形成する。次いで、図３２Ｂに表すように、ストレプトアビジン１８２を各捕捉領域１４０および１４１上に堆積させて、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養する。図３２Ｃに示すように、ディスク１１０を洗浄して、結合していないストレプトアビジン１８２を除去し、次いで、ディスク１１０をスピン乾燥して、ディスク１１０の表面から水分を完全に除去する。基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の捕捉領域１４１上に堆積させて、図３２Ｄおよび図３２Ｅに示すように、ビオチン化２次抗体１８６を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上に堆積させる。次いで、この実施の形態では、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養する。このステップを図３２Ｅに示す。結合していない２次抗体１８６をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する。本方法のこのステップを図３２Ｆに表す。接着部材または流路層１１８を活性層１４４に同様に取り付ける。それぞれのキャップ部１１６（図２）は、ポリカーボネートから形成されることが好ましく、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。図３２Ｇに示すように、キャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路１３０内に注入して、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する。このステップを図３２Ｈに示す。ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養し、図３２Ｉに表すように、残っているあらゆる溶液を吸引して完全に除去する。
【０１２９】
本発明の第４の実施態様の第２の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する反射型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の窓１４１の上に堆積させ、非ビオチン化２次抗体１８６（通常図１８Ｄに示す）を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上の活性層１４４に直接堆積させる。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する。結合していない２次抗体１８６をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。キャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。キャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路１３０内に注入して、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する。ディスクを恒湿チャンバ内でおよそ３０分間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を吸引して完全に除去する。図３３は、クロスリンクシステムを使用しない、完成した反射バイオディスク１１０の断面図を示している。
【０１３０】
本発明の第４の実施態様の第３の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用してバイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基板１２０と、視界窓２００（図３２Ａ）を有さない半反射層１４３と、活性層１４４とが、図５に示すように設けられる。ストレプトアビジン１８２、ビオチン化１次抗体１８８、基準マーク２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上述したとおりであり、図３２Ｂ〜図３２Ｈに示すとおりである。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。光透過性キャップ部１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成することができる。このキャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク１１０内にフロー流路１３０を形成する（図３２Ｇ）。図３４は、クロスリンクシステムを利用する、完成した透過バイオディスク１１０の断面図を示している。この第４の実施態様の第４の実施の形態は、当業者によって構築可能であることが理解されるべきである。この第４の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に２次捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成（図３３および図３４）を伴う。
【０１３１】
＜クラスタ分化の計数−実施態様Ｉ＞
図３５Ａは、４つの流体回路１２８を示す光バイオディスク１１０の平面図である。各流体回路は、特異的な細胞表面マーカ用および負の制御領域用の数個の捕捉領域１４０を有する。図示するように、各流体回路は、専用化されて、それぞれの捕捉領域が具体的にはＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＣＤ４５を対象とする４つの捕捉領域１４０を有する。他のあらゆる所望の細胞表面の抗原のパターンまたは組み合わせ、例えば他のＣＤマーカまたは細胞表面マーカ、を使用することもできる。この特定の実施態様では、それぞれの個別の流体回路について、その捕捉領域１４０のそれぞれが、単一の共通の捕捉剤のみを有する必要があるという制限はない。これとは逆に、この実施態様では、捕捉領域は、異なる捕捉剤を有することが望ましい。これらの捕捉領域は、例えば、少なくとも２×２マトリックスを有する配列フォーマットで配置することができる。図３５Ａに示すディスクは、図３５Ｂ〜図３５Ｄ、図３６、図３７、図３８Ａ〜図３８Ｃ、図３９、図４０、図４１Ａ〜図４１Ｃ、図４２、および図４３において後述する細胞捕捉化学種および細胞捕捉方法と共に使用するのに特に適している。図３５Ａに表すバイオディスク１１０は、反射型ディスクであってもよいし、透過型ディスクであってもよい。
【０１３２】
次に図３５Ｂ〜図３５Ｄを参照して、本発明の第１の実施態様のバイオディスクを使用した、精製および洗浄を受けたＭＮＣサンプル（図１７Ａ）の分析を示す。図３５Ｂに表すように、バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、１次抗体１８８との接触を実現する。図３５Ｃに示すように、１次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２０Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、図３５Ｄの捕捉されたＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
【０１３３】
図３６は、本発明の第１の実施態様の第２の実施の形態を使用した、図３５Ｂ〜図３５Ｄと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図３５Ｂ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、１次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図３５Ｃ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２０Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図３５Ｄ）と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
【０１３４】
図３７は、本発明の第１の実施態様の第３の実施の形態を使用した、図３５Ｂ〜図３５Ｄと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図３５Ｂ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、１次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図３５Ｃ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２０Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図３５Ｄ）と相互作用し、透過ビーム１５６は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて送られる。
【０１３５】
＜クラスタ分化の計数−実施態様ＩＩ＞
次に図３８Ａ〜図３８Ｃを参照して、本発明の第２の実施態様のバイオディスクを使用した、精製および洗浄を受けたＭＮＣサンプル（図１７Ａ）の分析を示す。図３８Ａに示すように、バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、１次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する。このステップを図３８Ｂに示す。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２４Ｌ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、図３８Ｃの捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
【０１３６】
図３９は、本発明の第２の実施態様の第２の実施の形態を使用した、図３８Ａ〜図３８Ｃと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図３８Ａ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、１次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図３５８Ｂ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２４Ｌ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図３８Ｃ）と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
【０１３７】
図４０は、本発明の第２の実施態様の第３の実施の形態を使用した、図３８Ａ〜図３８Ｃと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図３８Ａ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、１次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図３８Ｂ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２４Ｌ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図３８Ｃ）と相互作用し、透過ビーム１５６は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて送られる。
【０１３８】
＜クラスタ分化の計数−実施態様ＩＩＩ＞
次に図４１Ａ〜図４１Ｃを参照して、本発明の第３の実施態様のバイオディスクを使用した、精製および洗浄を受けたＭＮＣサンプル（図１７Ａ）の分析を示す。図４１Ａに示すように、バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、１次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する。本方法のこのステップを図４１Ｂに示す。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２８Ｊ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、図４１Ｃの捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
【０１３９】
図４２は、本発明の第３の実施態様の第２の実施の形態を使用した、図４１Ａ〜図４１Ｃと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図４１Ａ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、１次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図４１Ｂ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２８Ｊ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図４１Ｃ）と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
【０１４０】
図４３は、本発明の第３の実施態様の第３の実施の形態を使用した、図４１Ａ〜図４１Ｃと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図４１Ａ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、１次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図４１Ｂ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２８Ｊ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図４１Ｃ）と相互作用し、透過ビーム１５６は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて送られる。
【０１４１】
＜クラスタ分化の計数−実施態様ＩＶ＞
次に図４４Ａ〜図４４Ｄを参照して、本発明の第４の実施態様のバイオディスクを使用した、精製および洗浄を受けたＭＮＣサンプル（図１７Ａ）の分析を示す。図４４Ａは、１次抗体Ｔ細胞複合体の調製を示すイラストの流れ図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の双方を含むＭＮＣ懸濁液を１次抗体１８８と混合して、結合させ、それによって、１次抗体Ｔ細胞複合体を形成する。当業者には明らかなように、異なる表面マーカを有する他の細胞にも、現在の実施態様を使用してタグ付けを行うことができる。図４４Ｂに示すように、バイオディスク１１０のフロー流路１３０を１次抗体Ｔ細胞複合体で溢れさせる。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、バイオディスク１１０の活性層１４４に固定された２次抗体１８８との接触を実現する。図４４Ｃに示すように、２次抗体１８６は、１次抗体Ｔ細胞複合体に対する親和性を有し、これらの複合体を捕捉する。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していない複合体が、捕捉領域１４０（図３２Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、図４４Ｄの捕捉された複合体と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
【０１４２】
図４４Ａ〜図４４Ｄは、本発明の方法の別の主要な態様も示している。図１７Ａに関連して、クラスタ分化の計数を行う別の方法を提供する。この方法は、（１）分離勾配液を含む管に血液サンプルを供給するステップと、（２）この血液サンプルを層に分離するのに十分な速度で一度にこの管を回転させるステップと、（３）Ｔ細胞を含むＭＮＣ層を再懸濁するステップであって、それによりＭＮＣ懸濁液を形成する、再懸濁するステップと、（４）このＭＮＣ懸濁液に１次抗体を加えて、１次抗体Ｔ細胞複合体を形成するステップと、（５）少なくとも１つの捕捉剤を含んだ少なくとも１つの捕捉領域を備えるディスク表面に１次抗体Ｔ細胞複合体のサンプルを供給するステップと、（６）このディスクを光学式読み取り装置にロードするステップと、（７）電磁放射入射ビームを捕捉領域に送るステップと、（８）捕捉領域でディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出するステップと、（９）この検出したビームを出力信号に変換するステップと、（１０）この出力信号を分析するステップであって、それにより捕捉領域で捕捉された細胞の個数に関する情報を抽出する、分析するステップとを含む。この方法の一実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が反射されるような反射層により構築される。この方法の別の実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が光ディスクを透過するように構築される。
【０１４３】
図４５は、本発明の第４の実施態様の第２の実施の形態を使用した、図４４Ａ〜図４４Ｄと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０を１次抗体Ｔ細胞複合体で溢れさせる（図４４Ｂ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、バイオディスク１１０の活性層１４４に固定された２次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体Ｔ細胞複合体に対し親和性を有する２次抗体１８６は、複合体を捕捉する（図４４Ｃ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していない複合体が、捕捉領域１４０（図３２Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉された複合体（図４４Ｄ）と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
【０１４４】
図４６は、本発明の第４の実施態様の第３の実施の形態を使用した、図４４Ａ〜図４４Ｄと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０を１次抗体Ｔ細胞複合体で溢れさせる（図４４Ｂ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、バイオディスク１１０の活性層１４４に固定された２次抗体１８８との接触を実現する。１次抗体Ｔ細胞に対し親和性を有する２次抗体１８６は、複合体を捕捉する（図４４Ｃ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していない複合体が、捕捉領域１４０（図３２Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉された複合体（図４４Ｄ）と相互作用し、透過ビーム１５６は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて送られる。
【０１４５】
当業者は、これらの教示に鑑みて、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、本発明の方法の１つまたは複数の実施態様の１つまたは複数の実施の形態を組み合わせることが可能であることを理解するであろう。
【０１４６】
＜細胞検出および関連するソフトウェア＞
図４７を参照して、サンプルを保持するための流体回路１２８を備えた光バイオディスク１１０を示す。また、図４７は、異なる捕捉領域または標的領域１４０および標的領域１４１を示すために拡大した流体回路４７も示している。標的領域１４１は、基準マークまたは検量線作成ドット２０２を備える。この特定の実施の形態では、５つの捕捉領域１４０が使用される。各捕捉領域は、それぞれ、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、および負の制御としてのミオグロビンを捕捉するように実施される。
【０１４７】
図４８Ａは、６つの捕捉領域１４０を備えた異なる実施の形態から得られる画像である。各捕捉領域は、それぞれ、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ１５＋細胞、ＣＤ４＋細胞、およびＣＤ８＋細胞をそれぞれ捕捉するように実施されるものと、ＣＤ＋１５細胞用の第２の捕捉領域と、ＣＤ４５＋細胞用の第２の捕捉領域である。この実施の形態では、２つのＣＤ４５捕捉領域およびＣＤ１５捕捉領域を確認制御またはチェックとして使用し、捕捉効率の結果および予想計数の結果が一致していることを検証することができる。また、図４８Ａは、ＣＤ４、ＣＤ８、および制御の拡大図によって一連の細胞表面の抗原を示している。ここに示すように、画像は、背景フィールドに対して示された複数の細胞からなる。図４８Ｂは、本発明によるバイオディスクから得られた画像と比較した実際の顕微鏡画像の制御領域、ＣＤ４捕捉領域、およびＣＤ８捕捉領域の拡大図である。図４９は、実際の顕微鏡画像と、本発明による対応するバイオディスク画像との別の比較を、より詳細に示している。図４８Ｂおよび図４９に表すように、本発明者等は、顕微鏡から得ることができる品質および解像度と比較して、バイオディスク画像が、それに等しい品質および解像度を有することに確認した。したがって、これらの画像は、本発明の装置および方法を使用して、背景に対して個々の細胞を可視化できることを実証している。検査特徴を検出する方法は、本発明の譲受人に譲渡された、共に「Signal Processing Apparatus and Methods for Obtaining Signal Signatures of Investigational Features Detected on a Surface of an Optical Disc Assembly」と題し、それぞれ、２００１年２月２日および２００１年５月１８日に出願されている米国仮出願第６０／２７０，０９５号および第６０／２９２，１０８号、ならびに本発明の譲受人に譲渡された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題し、２００２年１月１０日に出願されている米国特許出願第１０／０４３，６８８号に、より詳細に記載されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
【０１４８】
これらの細胞は、さまざまな異なる方法の１つを通じて検出することができ、例えば、エッジ検出ハードウェアまたはエッジ検出ソフトウェアを使用して、透過光または反射光の十分大きなレベルの変化を検出して計数し、したがって、遷移、ゆえに細胞を計数することを含む。以下に、より詳細に説明する別の方法は、画像認識ソフトウェアまたはパターン認識ソフトウェアを使用して、背景に対して細胞を識別するものである。画像認識は、ＷＢＣをＲＢＣと区別することができ、また、好中球、単球、好塩基球、好酸球、顆粒球、およびリンパ球をも区別することができる。
【０１４９】
１．６マイクロメートル程度離れたトラックを有する光ディスクを使用して、ディスク上の細胞または集合体を画像化することができる。例えば、白血球は、通常、少なくとも５トラック分から１２トラック分ほどの直径を有するので、その白血球の画像を得ることができる。
【０１５０】
このような画像を得るために、図２、図３、および図４に示すタイプの透過型ディスクを使用することができ（ただし、反射型ディスクも使用できる）、トリガセンサ１６０および上部検出器１５８を備えた図１０に示すタイプのディスクドライブシステムを使用することができる。トリガ検出器１５８は、透過型ディスクのトリガマーク１２６を検出し、そのマークが検出されると、データの収集および／または処理を行うコンピュータに信号を供給する。光源が、視界窓のトラックを通過すると、画像が、受信された透過光として得られる。この場合の上部検出器は、単一の検出器であってもよいし、半径方向および／または円周方向に向いた複数の検出器エレメントからなる配列であってもよい。このような検出器および検出方法は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された以下の出願に記載されている。すなわち、２０００年１１月９日に出願された「Optical Disc Drive For Bio-Optical Disc」と題する米国仮出願第６０／２４７，４６５号、２００１年５月２２日に出願された「Disc Drive Assembly For Optical Bio-Discs」と題する米国仮出願第６０／２９３，０９３号、および２００１年１１月９日に出願された「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs」と題する米国特許出願第１０／００８，１５６号に記載されている。これらの出願のそれぞれは、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０１５１】
図４８Ａ、図４８Ｂ、および図４９のような画像が得られた後、その画像データを、所望の特徴を識別するように設計された画像認識ソフトウェアによってさらに処理することができる。この画像認識ソフトウェアは、細胞を背景と区別する能力だけでなく、ある型の細胞を別の型の細胞と区別する能力を有することがさらに望ましい。
【０１５２】
次に図５０を参照して、赤血球および白血球の双方を含む検査データから得られた画像を示す。拡大図に示すように、これらの白血球および赤血球は、明らかに区別可能な特徴を有し、したがって、背景に対して検出することができ、画像認識によって互いを区別することもできる。さらに、図５９、図６０、および図６１と共に以下に論考するように、リンパ球、単球、好中球、好酸球、顆粒球、および好塩基球を含む白血球の型を、これらの細胞の核を染色することにより、互いに区別することも可能である。
【０１５３】
図５１は、多数の細胞を有するサンプルフィールドを示し、プラス記号は、細胞として識別されたそれぞれの対象物を示している。あらゆる領域または任意の個数の所望の領域について、細胞の個数が検出された後、その結果の細胞計数データは、単一のスクリーンに表示することができる。このスクリーンは、例えば図５２に示す表現といった見易い表現を提供する。図５２に示すように、具体的な細胞計数は、棒グラフと共に提供され、相対的な細胞数が明示される。ＣＤ４／ＣＤ８分析の場合、システムは、ＣＤ４／ＣＤ８比と共に、他の任意の所望の数学計算または比較も生成することができる。図５３は、画像フィールド内の細胞が、ＣＤ４計数、ＣＤ８計数、および比に変換されているところを示すプロセスの別のビューを提供し、その出力は、比が正常な範囲内にあることを示している。
【０１５４】
細胞検出および関連した処理方法に関する本発明の態様は、以下の米国仮出願にも開示されている。すなわち、２００１年８月３１日に出願された「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３１６，２７３号、２００１年９月７日に出願された「Methods for Imaging Blood cells, Blood-Borne Parasites and Pathogens, and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３１８，０２６号、２００１年９月１４日に出願された「Optical Analysis Discs Including Microfluidic Circuits for Performing Cell Counts」と題する米国仮出願第６０／３２２，５２７号、２００１年９月１１日に出願された「Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymphocytes」と題する米国仮出願第６０／３２２，０４０号、２００１年９月１２日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３２２，８６３号、および２００１年９月１７日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin, Plasma, or Poly-Lysine」と題する米国仮出願第６０／３２２，７９３号に開示されている。
【０１５５】
＜分画細胞計数方法および関連するソフトウェア＞
光ディスクデータを使用した白血球計数用の複数の方法および関連するアルゴリズムを本明細書でさらに詳細に論考する。これらの方法および関連するアルゴリズムは、白血球の計数に限定されるものではなく、任意の型の細胞物質の計数を行うことに容易に適用することができる。この細胞物質には、赤血球、白血球、ビーズ（beads）、および光学式読み取り装置によって検出できる同様の光シグネチャ（optical signature）を生成する生物および非生物の双方の他の任意の対象物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５６】
図５４〜図５８を参照して説明する本発明に関する方法およびアルゴリズムの以下の説明は、例示の目的で、白血球の計数を対象とする。いくつかを変更することにより、これらの方法およびアルゴリズムを、他の型の細胞、すなわち白血球と同様のサイズの対象物の計数に適用することができる。この細胞計数方法およびアルゴリズムのデータ評価の態様を本明細書で一般的に説明し、本発明の方法および装置の関連する背景を提供する。光バイオディスクから検査データを取り込んで処理する方法およびアルゴリズムは、一般の広い適用性を有し、本発明の譲受人に譲渡された次の米国仮出願にさらに詳細に開示されている。すなわち、２００１年５月１６日に出願された「Variable Sampling Control For Rendering Pixelation of Analysis Results In Optical Bio-Disc Assembly And Apparatus Relating Thereto」と題する米国仮出願第６０／２９１，２３３号および「Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same」と題する米国仮出願第６０／４０４，９２１号に開示されている。前者の出願は、参照により本明細書に援用され、後者の出願は、上記で援用したものである。以下の論考では、簡単な説明により、これらの方法およびアルゴリズムの基本的な方式を提示する。図１０に示すように、生物試験サンプルの属性に関する情報は、試験サンプルとの相互作用により変更または変調を受けた電磁放射ビームの形で、光バイオディスク１１０から取り出される。図２、図３、図４、図１１、図１３、および図１５と共に論考した反射型光バイオディスクの場合、帰還ビーム１５４が、生物サンプルに関する情報を運ぶ。上述したように、このような生物サンプルに関する情報は、基本的に、入射ビームが、フロー流路１３０または標的領域１４０内にあり、したがって、サンプルと接触した時にのみ、帰還ビーム１５４に含まれる。バイオディスク１１０の反射型の実施の形態では、帰還ビーム１５４は、反射層１４２内もしくは反射層１４２上に符号化された情報、または、それ以外に図１３および図１４に示すウォブル溝１７０に符号化された情報も運ぶことができる。当業者には明らかなように、対応する入射ビームが、反射層１４２と接触した時にのみ、事前に記録された情報が、標的領域を有する反射型ディスクの帰還ビーム１５４に含まれる。情報を有する反射層１４２が除去されている区域、または、それ例外に存在しない区域に、入射ビーム１５２が存在する場合、このような情報は、帰還ビーム１５４に含まれない。図５、図６、図８、図９、図１２、図１４、および図１６と共に論考した透過型光バイオディスクの場合、透過ビーム１５６が、生物サンプルに関する情報を運ぶ。
【０１５７】
図１０の参照を続けて、生物試験サンプルに関する情報は、その情報が、反射型ディスクの帰還ビーム１５４から得られようと、透過型ディスクの透過ビーム１５６から得られようと、信号処理用のプロセッサ１６６に送られる。この処理は、底部検出器１５７（反射型ディスク）または上部検出器１５８（透過型ディスク）によって検出されたアナログ信号の離散的なデジタル形式への変換を含む。
【０１５８】
次に図５４を参照して、この信号変換は、一定の時間間隔２１２でアナログ信号２１０をサンプリングすること、および、その信号の対応する瞬時アナログ振幅２１４を離散的なバイナリ整数２１６として符号化することを含む。サンプリングは、ある開始時刻２１８で開始され、ある終了時刻２２０で停止される。任意のアナログ／デジタル変換プロセスと関連した２つの共通の値は、サンプリング周波数およびビット深度である。サンプリング周波数は、サンプリングレートとも呼ばれ、単位時間当たりに取り込まれるサンプル数である。サンプリング周波数が高いほど、連続したサンプル間の時間間隔２１２は小さくなり、その結果、元のアナログ信号２１０と比べたデジタル信号２２２の忠実度は高くなる。ビット深度は、アナログ信号２１０のサンプリングされた振幅２１４を符号化するために各サンプル点で使用されるビット数である。ビット深度が大きいほど、バイナリ整数２１６は、元のアナログ振幅２１４をより良く近似することになる。本実施の形態では、サンプリングレートは、８ＭＨｚであり、ビット深度は、１つのサンプル当たり１２ビットである。これにより、０から４０９５（０から（２ｎ−１））の範囲の整数サンプルが可能になる。ここで、ｎは、ビット深度である。この組み合わせは、他の実施の形態で必要な特定の精度に適合するように変更することができる。一例であって、これに限定されるものではないが、一般に細胞よりも小さなビーズを計数する方法を含む実施の形態では、サンプリング周波数を増加させることが望ましいことがある。次いで、サンプリングされたデータは、アナログ／デジタル変換のためにプロセッサ１６６に送信される。
【０１５９】
アナログ／デジタル変換の間、レーザの経路に沿って連続したそれぞれのサンプル点２２４は、一次元配列２２６としてディスクまたはメモリに連続的に記憶される。連続したそれぞれのトラックは、独立した１次元配列を与え、この１次元配列は、画像に類似した２次元配列２２８（図５７Ａ）を生成する。
【０１６０】
図５５は、本発明の光バイオディスク１１０の斜視図であり、指定部分の拡大詳細斜視図は、捕捉された白血球２３０が、この光バイオディスクのトラック２３２を基準として位置することを示している。図示するように、入射ビーム１５２の白血球２３０との相互作用により、信号を含むビームが、反射型ディスクの帰還ビーム１５４または透過型ディスクの透過ビーム１５６のいずれかの形で生成される。
【０１６１】
図５６Ａは、図５５に示す光バイオディスク１１０のトラック２３２を基準にして位置する白血球２３０の別のグラフ表示である。図５５および図５６Ａに示すように、白血球２３０は、約４つのトラックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに及んでいる。図５６Ｂは、図５５および図５６Ａの白血球２１０から得られた一連のシグネチャトレース（signature trace）を示している。図５６Ｂに示すように、検出システムは、トラックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対応した４つのアナログ信号Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを供給する。図５６Ｂにさらに示すように、アナログ信号Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのそれぞれは、白血球２３０に関する特定の情報を運ぶ。したがって、図示するように、白血球２３０を走査することにより、区別可能で（distinct）、かつ、検出および処理が可能な乱れが入射ビームに生じる。次いで、アナログシグネチャトレース（信号）２１０は、図５７Ａおよび図５７Ｃに示すような類似したデジタル信号２２２に変換するためにプロセッサ１６６に送られる。図５７Ａおよび図５７Ｃについては、以下にさらに詳細に論考する。
【０１６２】
図５７は、図５７Ａ、図５７Ｂ、図５７Ｃ、および図５７Ｄの間の関係を示すグラフ表示である。図５７Ａ、図５７Ｂ、図５７Ｃ、および図５７Ｄは、図５６Ｂからのシグネチャトレースのデジタル信号２２２への変換のイラストによるグラフ表示である。このデジタル信号２２２は、１次元配列２２６として記憶されており、データ入力２４４用に２次元配列２２８に結合される。
【０１６３】
次に図５７Ａを特に参照して、図５５および図５６Ａに示す光バイオディスクのトラックＡおよびＢからのサンプリングされたアナログ信号２１０を示す。プロセッサ１６６は、次に、アナログ信号２１０の対応する瞬時アナログ振幅２１４を、離散的なバイナリ整数２１６として符号化する（図５４参照）。その結果の一連のデータ点が、サンプリングされたアナログ信号２１０に類似したデジタル信号２２２である。
【０１６４】
次に図５７Ｂを参照して、トラックＡおよびＢ（図５７Ａ）から得られたデジタル信号２２２は、独立した１次元メモリ配列２２６として記憶される。連続したそれぞれのトラックは、対応する１次元配列を与える。この１次元配列が、先行する１次元配列と結合されると、画像に類似した２次元配列２２８が生成される。次いで、このデジタルデータは、サンプル点２２４（図５４）からなる２次元配列２２８としてメモリまたはディスクに記憶される。サンプル点２２４は、サンプル区域内の特定の点における帰還ビーム１５４または透過ビーム１５６（図５５）の相対的な強度を表すものである。次いで、２次元配列は、図５７Ｂに表すような生のファイルまたは画像ファイル２４０の形でメモリまたはディスクに記憶される。次いで、画像ファイル２４０に記憶されたデータは、取り出されてメモリに与えられ（２４２）、図１０に示す分析装置１６８へのデータ入力２４４として使用される。
【０１６５】
図５７Ｃは、図５５および図５６Ａに示す光バイオディスクのトラックＣおよびＤからのサンプリングされたアナログ信号２１０を示している。プロセッサ１６６は、次に、アナログ信号２１０の対応する瞬時アナログ振幅２１４を、離散的なバイナリ整数２１６として符号化する（図５４）。その結果の一連のデータ点が、サンプリングされたアナログ信号２１０に類似したデジタル信号２２２である。
【０１６６】
次に図５７Ｄを参照して、トラックＣおよびＤから得られたデジタル信号２２２は、独立した１次元メモリ配列２２６として記憶される。連続したそれぞれのトラックは、対応する１次元配列を与え、この１次元配列が、先行する１次元配列と結合されると、画像に類似した２次元配列２２８が生成される。上述したように、このデジタルデータは、次に、サンプル点２２４（図５４）からなる２次元配列２２８としてメモリまたはディスクに記憶される。サンプル点２２４は、サンプル区域内の特定の点における帰還ビーム１５４または透過ビーム１５６（図５５）の相対的な強度を表すものである。次いで、２次元配列は、図５７Ｂに表すような生のファイルまたは画像ファイル２４０の形でメモリまたはディスクに記憶される。上記に示したように、画像ファイル２４０に記憶されたデータは、次に、取り出されてメモリに与えられ（２４２）、図１０の分析装置１６８へのデータ入力２４４として使用される。
【０１６７】
本発明の計算アルゴリズムおよび処理アルゴリズムは、分析装置１６８（図１０）に記憶され、入力データ２４４に適用されて、有用な出力結果２６２（図５８）を生成する。この出力結果は、表示モニタ１１４（図１０）に表示することができる。次に図５８を参照して、本発明の処理方法および計算アルゴリズムによるデータ評価の主要なステップの論理フローチャートを示す。本処理方法の最初の主要なステップは、入力データ２４４を受信することを含む。上述したように、データ評価は、０から４０９６の範囲の整数の配列から開始する。
【０１６８】
次の主要なステップ２４６は、計数を行うディスクの区域を選択することである。この区域が画定されると、次の目的は、画定した区域に含まれる全白血球を実際に計数することになる。ステップ２４６の実施態様は、ディスクの構成またはユーザの選択に依存する。一例であって、これに限定されるものではないが、図２および図５に示す例えば標的領域１４０といった窓を有するディスクを使用する本発明の実施の形態では、ソフトウェアは、その窓を認識し、分析および計数を行うためにその窓の部分をクロッピングする。好ましい一実施の形態、例えば図２に示す実施の形態では、標的領域または窓は、半円形の部分がその各端部にある１×２ｍｍの長方形の形状を有する。この実施の形態では、ソフトウェアは、それぞれの窓の内部に１×２ｍｍの標準長方形の区域をクロッピングする。この実施の形態の一態様では、読み取り装置は、連続した数個のサンプル値を取り込んで、数個の異なる窓での細胞数を比較することができる。
【０１６９】
図５、図６、図８、および図９に示すように、窓を有さない透過型ディスクを使用する本発明の実施の形態では、２つの異なる方法の一方でステップ２４６を実行することができる。固定座標を有する点を基準にしてその中心の位置を特定することによるか、または、基準マーク２０２（例えば、図２４Ｌ、図２５、および図２６を参照）を検出することによるかのいずれかで、標準長方形の位置が選択される。この基準マークは、暗い色素の点である。基準マーク２０２が使用される場合には、所望のコントラストを有する色素を、細胞の２つのクラスタに関するディスクの特定の位置１４１（例えば図２０Ｅ）に堆積させる。次いで、光ディスク読み取り装置を、それら細胞のクラスタの一方の中心にスキップするように指示し、次いで、標準長方形を、選択したクラスタの中心にする。
【０１７０】
ステップ２４６に関して上述したユーザの選択について、ユーザは、マウス選択ないしは他の方法で直接対話することにより、細胞計数を行う所望のサンプル区域の形状、例えば長方形区域を指定することができる。このソフトウェアの本実施の形態では、これは、マウスを使用して、モニタ１１４に表示される、光バイオディスク導出画像の所望の部分の上に長方形をクリックしてドラッグすることを含む。評価区域の選択方法にかかわらず、それぞれの長方形区域は、次のステップ２４８で計数を行うために評価される。
【０１７１】
図５８の３番目の主要なステップは、ステップ２４８であり、このステップは、背景の照度を一様化することを対象にする。このプロセスは、いくつかのハードウェア構成で引き起こされて起こり得る背景の一様性のばらつきを補正する。背景照度の一様化により、背景全体、すなわち細胞でない画像の部分が、ある任意の背景値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを有する平面に近づくように、各サンプル点の強度レベルが補われる。Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、多くの方法で決定することができ、例えば、標準長方形サンプル区域全体にわたって平均値をとることで決定することができるが、本実施の形態では、その値は２０００に設定される。選択した長方形サンプル区域の各点Ｐの値Ｖは、数（Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ＋（Ｖ−Ｐの近傍の平均値））に置き換えられ、必要に応じて切り捨てられて、実際の可能な範囲の値に適合される。この可能な範囲の値は、本発明の好ましい実施の形態では０から４０９５である。近傍の寸法は、細胞のサイズよりも十分大きく、かつ、標準長方形のサイズよりも十分小さくなるように選択される。
【０１７２】
図５８のフローチャートの次のステップは、正規化ステップ２５０である。正規化ステップ２５０を行う際に、平均が２０００で、標準偏差が６００となるように、１次変換が、標準長方形サンプル区域のデータを用いて実行される。必要に応じて、その値は、０から４０９６に適合するように切り捨てられる。背景照度一様化ステップ２４８に加えてこのステップ２５０により、ソフトウェアは、ハードウェアの変更および調整の影響を受けにくくなる。一例であって、これに限定されるものではないが、例えば上部検出器１５８（図５５）といった検出回路の信号利得を、結果の細胞計数に大幅な影響を与えることなく変更することができる。
【０１７３】
図５８に示すように、フィルタリングステップ２５２が次に実行される。標準長方形内のそれぞれの点Ｐに対して、ステップ２４８で示した寸法よりも小さな寸法を有するＰの近傍において、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄと十分区別可能な値を有する点の個数が算出される。これら算出された点は、画像内の細胞のサイズに近いはずである。この個数が十分大きい場合には、Ｐの値はそのままとされ、そうでない場合には、Ｐの値には、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄが割り当てられる。このフィルタリング操作は、雑音を除去するために実行され、最適な場合には、細胞のみが画像内に残る一方、背景は一様にＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに等しくなる。
【０１７４】
図５８に示すように、不良な構成要素を除去することを対象にするオプションのステップ２５４を実行することができる。例えば、散乱、気泡、埃、および他の同様のムラといった欠陥が、フィルタリングステップ２５２を通過することがある。これらの欠陥は、直接的に、または、画像のヒストグラムの分布全体に影響を与えることにより、細胞計数のエラーの原因になることがある。通常、これらの欠陥のサイズは、細胞よりも十分に大きく、次のようにしてステップ２５４で除去することができる。まず、選択した領域と同じ寸法を有する２値画像が形成される。この２値画像内の点について、元の画像の対応する点の値がＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄと等しい場合には、その点は白と定められ、そうでない場合には、黒と定められる。次に、黒の点からなる接続された構成要素が抽出される。次いで、後続する浸食および膨張を適用して、構成要素の図が調整される。最後に、定められた閾値よりも大きな構成要素が除去される。このオプションのステップの一実施の形態では、値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを有する元の画像の対応するサンプル点をこの構成要素に割り当てることにより、その構成要素が元の画像から除去される。どの構成要素が計数可能な対象を構成し、どの構成要素を除去するかを決定する閾値は、ユーザが定義した値である。また、この閾値は、計数を行う検査特徴、すなわち白血球、赤血球、または他の生体物質に応じて変化してもよい。オプションのステップ２５４の後、ステップ２４８、２５０、および２５２が繰り返されることが好ましい。
【０１７５】
図５８に示す次の主要な処理ステップは、ステップ２５６である。このステップ２５６は、明るい中心によって細胞の計数を行うことを対象とする。計数ステップ２５６は、いくつかのサブステップからなる。これらのサブステップの最初のものは、畳み込み演算を実行することを含む。この畳み込み演算サブステップでは、畳み込み映像（convoluted picture）と呼ばれる補助配列が形成される。点Ｐにおける畳み込み映像の値は、Ｐの円形の近傍でフィルタリングを行った後の映像の積分結果の値である。より正確には、特定の一実施の形態の場合、積分される関数は、ｖが２０００よりも大きい場合には、ｖ−２０００に等しい関数であり、ｖが２０００以下の場合には、０である。計数ステップ２５６で実行される次のサブステップは、ほぼ細胞のサイズと同じ半径の近傍において、畳み込み映像の極大値を検出することである。次に、互いの閉じた近傍内で同じ値を有する２重の極大値が回避される。計数ステップ２５６の最後のサブステップでは、残りの極大値が、細胞を示すものであると宣言される。
【０１７６】
いくつかのハードウェア構成では、いくつかの細胞は、明るい中心を持たないように見えることがある。これらの場合、暗い縁のみが見え、次の２つのオプションのステップ２５８および２６０が役立つ。
【０１７７】
ステップ２５８は、検出された細胞を映像から除去することを対象とする。ステップ２５８では、検出された各細胞の中心の周りの円形の領域が、値２０００で埋められ、その結果、明るい中心および暗い縁の双方を有する細胞が、２回検出されることがなくなる。
【０１７８】
ステップ２６０は、暗い縁によって細胞を追加計数することを対象とする。ステップ２５８後の画像を用いて、２つの変換が行われる。このルーチンの最初のサブステップであるサブステップ（ａ）では、各点の値ｖが、（２０００−ｖ）に置き換えられ、その結果が負である場合には、その値は、ゼロに置き換えられる。サブステップ（ｂ）では、次に、その結果の映像に対して、内部半径Ｒ１および外部半径Ｒ２のリングを用いて畳み込み演算が行われる。Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、細胞の予想される最小半径および予想される最大半径である。このリングは、サブステップ（ｄ）で、その後、上下左右にシフトされる。サブステップ（ｃ）では、４回のシフトの結果が合計される。この変換後、暗い縁の細胞の画像は、４つの花びらの花のように見える。最後に、サブステップ（ｄ）では、サブステップ（ｃ）で得られた関数の極大値が、計数ステップ２５６で使用された方法と同様に検出される。それらの極大値は、ステップ２５６で除外された細胞を示すものであると宣言される。
【０１７９】
計数ステップ２５６の後、または、計数ステップ２６０が任意選択で使用された場合には計数ステップ２６０の後の、図５８に示す最後の主要なステップが、結果出力ステップ２６２である。標準長方形内で検出された細胞の個数が、図１および図５に示すモニタ１１４に表示され、識別された各細胞は、表示された光バイオディスク導出画像上で赤の十字形により印が付けられる。
【０１８０】
図５９を参照して、赤い血球、すなわち赤血球、および、白い血球、すなわち白血球の図を示す。白血球、すなわち白い血球は、２つの主要な群に分類される。第１の群は、顆粒状白血球である。それら顆粒状の白血球は、赤色骨髄から作られ、細胞質内には、はっきりと見える顆粒を有し、葉のある核を保有する。３種類の顆粒状白血球（多形体、多形核白血球、またはＰＭＮＳとしても知られている）は、好中球（直径１０〜１２μｍ）、好酸球（直径１０〜１２μｍ）、および好塩基球（直径８〜１０μｍ）である。好中球の核は、非常に細いストランドによって接続された２つ〜６つの葉を有する。この細胞は、老化するにつれて、葉に分かれる程度が進行する。一般によく使用される染色液がこの細胞に適用されると、細かな一様に分布した青白い薄紫色の顆粒が、細胞質内に見られる。好酸球も、２葉になった核を含み、それらの葉は、細いストランドまたは厚い峡部により接続されている。その細胞質には、核を覆うこともなく、見えなくすることもない大きな一様なサイズの顆粒が詰まっている。これらの顆粒は、一般によく使用される染色液により、赤からオレンジ色に染まる。好塩基球の核も、２葉であるか、または、不規則な形状であり、多くの場合、文字Ｓの形になる。その細胞質の顆粒は、丸く、サイズが可変であり、濃い藍色に染まり、一般に核を見えなくする。
【０１８１】
白血球の第２の主要な群は、無顆粒白血球である。それら無顆粒白血球は、リンパ組織および骨髄組織（赤色骨髄）から作られ、細胞質顆粒は、それらの小さなサイズおよび染色品質の低さのために、光学顕微鏡では見ることができない。２種類の無顆粒白血球は、リンパ球（直径７〜１５μｍ）および単球（直径１４〜１９μｍ）である。リンパ球の核は、丸く、わずかにギザギザを有する。その細胞質は、核の周りにリングを形成する。単球の核は、通常、ギザギザを有するか、または、図５９、図６０、および図６１に示すように腎臓の形状を有する。
【０１８２】
本発明によると、予め定められた一定の細胞コンパートメントを、予め定められた吸収範囲を有する染色液で染色することができる。この細胞コンパートメントには、核、核小体、核包膜、ゴルジ体、小胞体、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム、微小管、中心小体、リボソーム、細胞膜、および細胞壁が含まれ得る。予め定められた波長には、ＵＶ吸収範囲、可視光吸収範囲、およびＩＲ吸収範囲が含まれ得る。これらの色素には、バイタル色素、赤外色素、近赤外色素、および蛍光色素が含まれ得る。これらの色素を使用して、異なる細胞コンパートメント間のコントラストを強調し、サンプル内のさまざまな細胞の分画および定量を可能にすることができる。例えば、白血球の核を染色すると、それらの核の形態および個数に基づいて、さまざまな白血球の型を識別して、定量化することができる。細胞および染色されたコンパートメントの検出に使用される入射ビームまたは呼びかけビームは、使用する色素の最大吸収波長から１０ｎｍ以内の波長を有することが好ましい。細胞の検出、計数、および画像認識に関する詳細は、本発明の譲受人に譲渡された同時係属中の次の米国仮出願および米国特許出願に開示されている。米国仮出願は、すべて「Bio-Disc and Bio-Drive Analyser System Including Methods Relating Thereto」と題する２００２年２月１３日に出願された米国仮出願第６０／３５６，９８２号、２００２年４月１１日に出願された米国仮出願第６０／３７２，００７号、および２００２年９月４日に出願された米国仮出願第６０／ｘｘｘ，ｘｘｘ号と、２００１年１１月９日に出願された「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs」と題する米国特許出願第１０／００８，１５６号、および２００２年１月１０日に出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題する米国特許出願第１０／０４３，６８８号である。これらの出願のすべては、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０１８３】
本発明の好ましい実施の形態の１つによると、サンプル内の細胞の核の画像を改善するために、赤外線吸収色素を使用して、細胞の核にラベルが付けられる。この赤外線吸収色素には、ＮＮ３８２、ＩＲＤｙｅ３８、ＩＲＤｙｅ４０、ＩＲＤｙｅ４１、ＩＲＤｙｅ７８、ＩＲＤｙｅ８０、ＩＲＤｙｅ７００、およびＩＲＤｙｅ８００のようなＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅ（ネブラスカ州リンカーンのLI-COR Biosciences, Inc.）、ＴＯ−ＰＲＯ−５−ヨウ化物、ＩＲ−７８０ヨウ化物、Ｌａｓｅｒ  Ｐｒｏ  ＩＲ  Ｄｙｅｓ（オレゴン州ユージーンのMolecular Probes）、ｄｄ−００７、Ｚｙｎｏｓｔａｉｎ（英国グラスゴー大学のZynocyte,）、インドシアニン・グリーン、銅フタロシアニン、３，３’−ジエチルチアトリカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＴＴＣＩ）、３，３’−ジエチルオキサトリカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＯＴＣＩ）、３，３’−ジエチルチアジカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＴＤＣＩ）、ならびに３，３’−ジエチルオキサジカルボシアニン・ヨウ化物（ＤＯＤＣＩ）の色素が含まれる。この染色プロセスにより、サンプル内の正常な細胞および正常でない細胞の付加的情報および詳細の視覚化が容易になる。他の色素を使用して、細胞のさまざまな部分を染色することもできる。本発明で使用できる他の色素の例は、ウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrich Chemical Inc.のFloyd J. Greenによる「The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes, and Indicators」、ニューヨーク州ニューヨークのPlenum Pressの「Topics in Applied Chemistry: Infrared Absorbing Dyes」, Masaru Matsuoka (Ed.)、ならびにPatonay, GおよびAntoine, M.D.著の「Near-Infrared Fluorogenic Labels: New Approach to an Old Problem」, Analytical Chemistry, Vol. 63, No. 6, March 15, 1991に記載され、列挙されている。これらの出版物のすべては、そのすべての内容が本明細書に援用される。
【０１８４】
本発明のさらに別の好ましい実施の形態では、周囲の細胞質に対する核のコントラストを増加させて、画質を改善し、さまざまな白血球の型の識別を助けるために、染色プロセスは、バイタル核染色液を含む。この核染色液には、Ｚｙｎｏｓｔａｉｎが含まれる。
【０１８５】
次に図６０を参照して、ｄｄ−００７赤外色素により染色され、本発明の光バイオディスクシステムを使用して収集された白血球の画像を示す。図示するように、細胞核は染色されて、光ディスク読み取り装置からの入射ビームに対して不透明になる。核が不透明になるのは、ｄｄ−００７色素による入射ビームの吸収によるものである。図示するように、サンプル内のさまざまな細胞の型を、それらの核の形態に基づいて容易に識別することができる。図６０で識別された細胞の拡大画像を図６１に示す。
【０１８６】
＜実験の詳細＞
本発明を図面を参照して詳細に説明してきたが、本発明の一定の例およびさらなる例示を以下に提供する。
【実施例１】
【０１８７】
図１７Ａは、サンプルの調製、バイオディスクの使用、および結果（図５２および図５３で、より詳細に示される）の提供を示す画像的フローチャートを示す。それぞれの処理工程の時間分、回転速度や他の詳細等の、以下の実施例の詳細は、図１７Ａ、図５２および図５３を参照した上記のものより詳細である。それにも関わらず、本実施例の基本的な工程は上記のものと類似である。
【０１８８】
Ａ．基板調製および化学蒸着を含むディスク製造
この実施例において、反射ディスクまたは透過ディスク基板１２０（それぞれ、図２および図５）を、エアガンを用いて清浄にして全ての塵粒を除去する。このディスクを、スピンコーターを用いてイソプロパノールで２回洗い流す。２％ポリスチレンをディスク上にスピンコートし、全体を極めて厚くコーティングする。
【０１８９】
その後、化学蒸着を行う。一実施形態は、以下の３工程の蒸着プロトコルを含む：ストレプトアビジンを３０分間培養；ビオチン化第一抗体を６０分間培養；および第二捕捉抗体を３０分間培養。第一抗体は、第二の種（例えば、マウス）のイムノグロブリンのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）に対して、第一の種（例えば、羊）において作成することができる。第二捕捉抗体は、特異的な細胞表面抗原（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８）に対して、第二の種において作成される。これらの工程は、恒湿チャンバ（humidity chamber）中において室温で、蒸着の間の洗浄および乾燥工程を用いて行われる。
【０１９０】
リン酸緩衝生理食塩水中の１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン１μｌずつを各窓上に積層し、３０分間培養する。過剰のストレプトアビジンを蒸留水を用いて洗い流し、ディスクを乾燥させる。等容量のビオチン化抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ）および活性化デキストランアルデヒド（２００μｇ／ｍｌ）を混合する。デキストランアルデヒド（ＤＣＨＯ）−ビオチン化抗マウスＩｇＧを、各取り込み窓中のストレプトアビジン上に積層し、冷蔵庫中で６０分間または一晩培養する。過剰の試薬を洗い流し、ディスクをスピン乾燥する。
【０１９１】
図４７に示すように、ヒトの細胞表面抗原に対するマウスＩｇＧ抗体を用いて、ＣＤ４（窓２）、ＣＤ８（窓３）、ＣＤ３（窓４）、ＣＤ４５（窓５）、および陰性コントロール等（窓６）等の、様々な試験のための放射状に配向した多数の観察窓があり得る。調製した基板を、冷蔵庫中で３０分間または一晩培養する。
【０１９２】
化学蒸着のパターンを以下の表３に示す。
【０１９３】
【表３】
2005502872.tif 000005
【０１９４】
Ｂ．ディスクアセンブリ
流体チャネルを作製するＵ型または「ｅ−ｒａｄ」チャネル等のスタンプアウト（stamped out）部分、およびクリアキャップ１１６（図５、上部検出器を用いた透過ディスクの使用のため）または捕捉領域全体にある反射層１４２（図２、下部検出器を用いた反射ディスクの使用のため）を有するキャップ１１６を有する、例えば、２５、５０または１００ミクロン厚であり得る接着層（図２および図５のチャネル層１１８）を用いて、ディスクを組み立てる。
【０１９５】
一実施形態において、このディスクは、エンコード情報層として３００ｎｍの金でコーティングされた、フォワードＷｏｂｂｌｅ  Ｓｅｔ  ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０  ＣＤ−Ｒディスクである。反射ディスク上には、既知のリソグラフィー技術によって、２×１６ｍｍの大きさの楕円の観察窓が反射層からエッチングされている。透過ディスクの幾つかのデザインにおいては、分かれた観察窓はエッチングされておらず、ディスク全体を使用可能である。この特殊な例においては、チャネル層は、Ｆｒａｙｌｏｃｋ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ＤＢＬ２０１  Ｒｅｖ  Ｃ  ３Ｍ９４６６１から形成される。カバーは、半径２６ｍｍで等距離にある、直径０．０４０インチの４８個のサンプル注入口を有するクリアディスクである。ＣＤ４／ＣＤ８計数ソフトウェアを用いて、ソフトウェアを４倍速かつサンプル率２．６７ＭＨｚで、データディスクをスキャンして読み込む。
【０１９６】
Ｃ．ディスク漏れチェック
血液を分析しているため、ディスクを漏れをチェックし、サンプルを有するディスクをスピンする間にその場でチャンバ漏れがないことを初めに確認することが可能である。ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄおよびＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ等のブロッキング剤を、各チャネルに充填する。ブロックは少なくとも１時間である。ディスクを５０００ｒｐｍで５分間スピンさせて漏れ試験を行い、ディスクの安定性をチェックする。漏れをチェックした後、ディスクを真空チャンバに２４時間入れる。２４時間真空化後、ディスクを真空パウチに入れ、使用まで冷蔵庫中に保存する。
【０１９７】
Ｄ．サンプルの回収、調製およびディスクへの塗布
以下の項は、概して図１７Ａに示されるサンプル処理工程に関する。単核細胞（ＭＮＣ）を、例えばBecton Dickinson CPT Vacutainerを用いて、密度勾配遠心法により精製する。血液（４〜８ｍｌ）を、４または８ｍｌのＥＤＴＡ含有CPT Vacutainer中に直接回収する。水平ローターおよび回転バケットを有するバイオハザード遠心機中で、１５００〜１８００×ｇで２５分間、室温でチューブを遠心分離する。血液は、回収の２時間以内に使用されることが好ましい。遠心分離後、ＭＮＣ層上の約２ｍｍの血漿は残し、単核細胞画分上の血漿を除去する。ＭＮＣを回収し、ＰＢＳで洗浄する。３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離することにより、細胞をペレット化する。上清を除去し、チューブを穏やかにタッピングすることによりＭＮＣを含有するペレットをＰＢＳに再懸濁する。３００×ｇで各１０分間、室温でもう一度洗浄を行い、血小板を除去する。最終的なペレットを、１０，０００細胞／μｌの細胞数に再懸濁する。１８μｌ容量のＭＮＣを、１以上の分析チャンバまたはチャネルへ導入し、ディスクを固定して１５分間室温で培養する。チャネルを密閉する。その後、ディスクドライブを用いて３０００ｒｐｍで３〜４分間ディスクをスピンさせる。４倍速かつサンプル率２．６７ＭＨｚでソフトウェアを用い、ディスクをスキャンして読み込むのが好ましい。
【０１９８】
血液サンプルを直ちに処理できない場合、ＣＰＴチューブを数回穏やかに反転させることによって最初の遠心分離後の単核細胞を血漿に再懸濁し、室温で２４時間まで保存することができる。２４時間以内に、上記のように血漿中の細胞を回収し、洗浄することができる。
【０１９９】
Ｅ．ＣＤ４／ＣＤ８検定フォーマット
この実施例における検定は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球集団の絶対数および血液サンプル中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球の比を迅速に測定するための一般的な相同固相細胞捕捉検定法（homogeneous solid phase cell capture assay）である。この試験はＣＤ−ＲＯＭに組み込まれた小さなチャンバ内で実施されるが、全血液から単離された単核細胞（ＭＮＣ）７μｌ中の、捕捉領域上の特異的な抗体によって取り込まれる、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋およびＣＤ４５＋細胞の数を測定する。この試験は、ディスク上の特異的な位置の局在細胞を取り込むという原理に基づく。特定の血液細胞表面抗原に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に基づく捕捉化学物質を局在塗布することにより、幾つかの特異的な細胞捕捉領域をディスク上に作製する。チャンバをＭＮＣ血液（３０，０００細胞／μｌ）で溢れさせると、抗原ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ４５を発現する細胞は、ディスク上の捕捉領域で取り込まれる。また、画定された陰性対照領域もバーコードに組み込まれる。
【０２００】
Ｆ．オンディスク分析
上記工程Ｄで調製されたＭＮＣ細胞（ＰＢＳ中、１８μｌ）をディスクチャンバに注入し、チャンバの出入り口を密閉する。ディスクを１５分間室温で培養した後、上部検出器を有する光学ドライブ中で７８０ｎｍのレーザを用いてスキャンし、上記のように捕捉領域を画像化する。
【０２０１】
ソフトウェアをディスク上にエンコードしてドライブに、以下の動作を自動的に行うように指示を与える：（ａ）１以上の段階でディスクを遠心分離し、過剰の非結合細胞を除去する、（ｂ）特異的な取り込み窓を画像化する、および（ｃ）それぞれの捕捉領域中の特異的に取り込まれた細胞を計数すること、およびＣＤ４／ＣＤ８の比（または比がプログラムされ、測定される）を得ることを含み、データを処理する。
【０２０２】
処理工程の間、ソフトウェアによってそれぞれの捕捉領域画像全体を読み込み、細胞に接近すると細胞に印を付ける。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の数の評価に続いて、ソフトウェアによってＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の比を算出し、全血液１μｌ当たりの、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋およびＣＤ４５＋捕捉領域中の細胞の絶対数、およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋比の両方を示す。光学ドライブへディスクを挿入してから数および比を得るまでの全処理は、約１２分かかる。
【０２０３】
Ｇ．使用試薬
ストレプトアビジン（Sigma, cat. # S-4762）：脱イオン水を添加して５ｍｇ／ｍｌ溶液とし、等分して−３０℃で保存する。使用の際は、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにＴｒｉｓ緩衝液を添加する。
陽性対照：ＣＤ４５（Sigma, Lot # 038H4892, Cat # C7556）。２〜８℃で保存する。
二次捕捉抗体：ビオチン化抗マウスＩｇＧ（ヒツジ由来、Vector laboratories, lot # L0602, Catalog # BA-9200）。保存溶液（１．５ｍｇ／ｍｌ）は蒸留水で作製される。使用ｂ−ＩｇＧ溶液：０．１ＭのＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ。２〜８℃で保存する。長期保存の場合は−３０℃で保持してもよい。
アルデヒド活性化デキストラン（Pierce, lot # 97111761, cat # 1856167）。保存溶液：ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌ、２〜８℃で保存する。
一次捕捉抗体：ＣＤ４（DAKO, cat # M0716）、ＣＤ８（DAKO, cat # M0707）、ＣＤ２（DAKO, cat # M720）、ＣＤ４５（DAKO, cat # M0701）、ＣＤ１４（DAKO, cat # M825）、およびＣＤ３（DAKO, cat # M7193）。２〜８℃で保存する。
陰性対照：マウスＩｇＧ１（DAKO, cat # X0931）。２〜８℃で保存する。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Life Technologies/GIBCO BRL, cat. # 10010-023）または等価物。室温で保存する。
イソプロピルアルコール、９０〜１００％。
【０２０４】
Ｈ．ＲＢＣ溶解プロトコル
塩化アンモニウム溶解緩衝液
１倍保存の塩化アンモニウム溶解緩衝液は、２〜８℃で保存されるべきである。０．１５５ＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムを含有する；ｐＨ７．３〜７．４、２〜８℃で保存する。使用前に室温に戻す。
【０２０５】
手順
１．各１００μｌの血液に対して２ｍｌの溶解緩衝液を添加する（この手順はバイオハザードフード中で行うのが好ましい）。
２．ボルテックスして室温で１５分間培養する。
３．バイオハザードフード中の遠心機を用いて、５００×ｇで５分間、室温で血液を遠心分離する。
４．上清を除去し、ＰＢＳ中の２％ＦＣＳまたはＦＢＳで細胞を洗浄する。細胞を遠心分離する。
５．ＷＢＣの全量を算出し、サンプル注入のためにＷＢＣの最終濃度を１０，０００細胞／μｌとする。
【実施例２】
【０２０６】
単核細胞分離手順
クエン酸ナトリウムを有するBecton and Dickinson Vacutainer CPT（BD catalog # 362760（４ｍｌの場合）、# 362761（８ｍｌの場合））細胞調製チューブを使用する。手順は、全てのバイオハザード注意に従い、バイオハザードフード中で行う。工程：
１．血液を、４または８ｍｌのＥＤＴＡ含有CPT Vacutainer中に直接回収する。血液が既に抗凝固物質中にある場合、初めにＥＤＴＡをVacutainerへ添加した後、血液サンプル６〜８ｍｌをＣＰＴチューブへ添加する。
２．水平ローターおよび回転バケットを有するバイオハザード遠心機中で、１５００〜１８００×ｇ、２５分間室温でチューブを遠心分離する。最も良い結果のために、回収の２時間以内に血液を遠心分離すべきである。しかしながら、２時間より古い血液を遠心分離すると、ＭＮＣ数が減少し、かつＲＢＣ汚染が増加し得る。
３．遠心分離後、ＭＮＣ層上の約２ｍｍの血漿を残し、血漿を除去する。白色の単核層を１５ｍｌの円錐形遠心分離チューブへ回収し、移す。
４．ＭＮＣ層へ１０〜１５ｍｌのＰＢＳを添加し、遠心分離チューブを数回反転させることによって細胞を穏やかに混合する。
５．バイオハザード遠心機中で２００×ｇで１０分間、室温で遠心分離することによって細胞を洗浄する。
６．上清を除去する。チューブを穏やかにタッピングすることによって細胞を再懸濁する。
７．１０ｍｌのＰＢＳ中でもう一度洗浄する。２００〜３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離して血小板を除去する。
８．上清を除去して５０μｌのＰＢＳにペレットを再懸濁する。
９．サンプル中の細胞数を評価する。ＣＢＣを実施する、または２μｌの細胞を１８μｌのトリパンブルーに希釈し、穏やかに混合して細胞を血球計算器で計数する。分析のために、サンプルを最終細胞数１０，０００細胞／μｌとする。
１０．細胞を直ちに処理することができない場合、最初の遠心分離(上記工程２)の後にＣＰＴチューブを数回穏やかに反転させることによって、分離された血漿中へ単核細胞を再懸濁し、室温で２４時間までの間保存する。２４時間以内に血漿中の細胞を回収し、上記のような洗浄を続ける。
【０２０７】
１μｌ当たりの全細胞数＝２５ｍ２中の細胞数×（倍）１００。
【実施例３】
【０２０８】
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を用いた全血液からのＭＮＣの単離
１ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、１ｍｌの全血液をその上に穏やかに積層した。その後、４００×ｇで３０分間、室温で遠心分離した。混合物をパスツールピペットで慎重に吸引し、不透明な界面を遠心分離したチューブへ移した。その後、１０ｍｌのＰＢＳを遠心分離チューブへ添加した。その後、溶液を２５０×ｇで１０分間遠心分離した。上清を静かに移し、細胞ペレットを１０．０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、２５０×ｇで１０分間スピンさせた。その後、ペレットを１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、２５０×ｇでスピンさせることによって、細胞をもう一度洗浄した。最終的な細胞ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。
【実施例４】
【０２０９】
ディスク調製および化学蒸着（ストレプトアビジンによる）
Ａ．基板調製および化学蒸着を含むディスク製造
この実施例では、透過ディスク基板をエアガンで清浄にして塵粒を除去した。その後、このディスクをスピンコーターに載せ、イソプロパノールの一定流で２回洗い流した。次いで、３１０ｍｌのトルエンおよび６５ｍｌのイソプロパノールに溶解させた２％ポリスチレンを有するポリスチレン溶液を、ディスク上に均一にコーティングした。
【０２１０】
ストレプトアビジン蒸着のために、ストレプトアビジン保存溶液をＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。手動のピン蒸着を用いて、約１μｌのストレプトアビジンをディスク上のそれぞれの捕捉領域に蒸着させた。ディスクを恒湿チャンバ中で３０分間培養した。その後、過剰の非結合ストレプトアビジンを脱イオン水で洗い流して捕捉領域から除去し、ディスクをスピン乾燥した。
【０２１１】
二次抗体蒸着のために、活性化デキストランアルデヒドの新たな溶液（ＰＢＳ中に２００μｇ／ｍｌ）を、等容量のＶｅｃｔｏｒ  ＩｇＧ（ＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ）と混合した。手動のスピン蒸着を用いて、ディスク上のそれぞれの捕捉領域に、約１μｌのＩｇＧ＋ＤＣＨＯ複合体を蒸着（ストレプトアビジン層の上に積層）した。ディスクを恒湿チャンバ中で６０分間培養した。過剰の抗体は脱イオン水で洗い流して除去し、ディスクをスピン乾燥した。
【０２１２】
一次抗体のために、ＤＡＫＯ  ＣＤ４を希釈してＰＢＳ中に５０μｇ／ｍｌとし、ＤＡＫＯ  ＣＤ８を希釈してＰＢＳ中に２５μｇ／ｍｌとし、ＤＡＫＯ  ＣＤ４５を希釈してＰＢＳ中に１４５μｇ／ｍｌとした。手動のピンアプリケーターを用いて、約１μｌの各一次抗体を、結合させた二次抗体の上に蒸着させた。その後、ディスクを恒湿チャンバ中で３０分間培養した。捕捉領域をＰＢＳで洗浄することにより過剰の非結合抗体を除去し、ディスクをスピン乾燥した。
【０２１３】
Ｂ．ディスクアセンブリ
使用したカバーディスクは、ディスクに付着したＦｒａｙｌｏｃｋ接着チャネル層を有する透明のディスクであった。流体回路を作製する４つのＵ型チャネルを接着剤へスタンプした。カバーを透過ディスク基板上に置いて、流体チャネルが捕捉領域全体にわたるようにした。次いで、ディスクを共に固定するために、ディスクプレスを８回通過させた。
【０２１４】
Ｃ．ディスク漏れチェック、ブロッキング
各流体チャネルにＳｔａｂｌｅＧｕａｒｄを充填し、１時間培養した。培養の間、ディスクをスピンコーター中で５分間５０００ｒｐｍでスピンさせた。スピン後、ディスクチャネルの漏れをチェックした。次いで、ＳｔａｂｌｅＧｕａｒｄをチャネルから吸引し、ディスクを真空チャンバ中、真空下で一晩置いた。翌朝、ディスクを真空パウチに入れ、４℃で保存した。
【実施例５】
【０２１５】
血液塗抹の調製
ＲＢＣ、多数のＷＢＣおよび血小板を含有する白血球層（Buffy coat）から血液５μｌを採取した。中央のカバースリップの一端に細胞を置き、その端に沿って血液を広げるために他のカバースリップの一端を血液滴の上に置いた後、均一にスライドさせて、細胞を１００％エタノール中に固定して空気乾燥させた。
【実施例６】
【０２１６】
Ｚｙｎｏｓｔａｉｎによる細胞染色
Ａ．白血球層から血液細胞２５μｌを採取し、１％エタノール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ  １００（ＰＯ４緩衝液中、５０μｌ／５ｍｌ）を用いることによって、培養温度３７℃で２５μｌの生体染料Ｚｙｎｏｓｔａｉｎによって染色し、サンプルを１０、２０および３０分で取り出した。その後、細胞をガラスカバースリップ上になすり付けた（smear）。カバースリップを光学バイオディスクに装着させ、光学バイオディスクシステムを用いてそのときの細胞の画像を撮った。
【０２１７】
Ｂ．血液細胞を白血球層から採取し、Ｚｙｎｏｓｔａｉｎと混合して染色剤に対する細胞の比が１：３および１：６となるようにし、５、１０および３０分間培養した。その後、ガラスカバースリップ上に塗抹を作製した。カバースリップを光学バイオディスクに装着した後、光学バイオディスクシステムを用いてそのときの細胞の画像を撮った。染色剤に対する細胞の比が１：６で３０分間培養した場合に、良好な細胞染色を示すことがわかった。
【０２１８】
Ｃ．全血液の５μｌを採取して、２０μｌの白血病培養細胞および１２０μｌのＺｙｎｏｓｔａｉｎと混合し、３０分間培養した。その後、ガラスカバースリップ上に塗抹を作製した。カバースリップを光学バイオディスクに装着し、光学バイオディスクシステムを用いてそのときの細胞の画像を撮った。
【実施例７】
【０２１９】
Ｔｏ−Ｐｒｏ−５ヨウ化物蛍光染料によるリンパ球培養細胞（ＫＧ１ａ）の染色
細胞培養物を５分間８００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去し、ペレットをｐＨ７．４のＰＢＳ中に再懸濁した。その後、１０μｌのＴＰ−Ｐｒｏ−５ヨウ化物および１００μｌの細胞懸濁液を混合した。その後、Ｔｏ−Ｐｒｏ−５との培養の５、１０、３０分後に、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【実施例８】
【０２２０】
ＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅ３８によるＫＧ１ａ細胞の染色
ＫＧ１ａ培養細胞を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で２回（８００ｒｐｍで１０分スピンを２回）洗浄した。洗浄した細胞を脱イオン水中の４％ＩＲＤｙｅ３８中で３０分間培養した後、ガラスカバースリップ上になすり付けた。カバースリップを光学バイオディスクに装着し、光学バイオディスクシステムを用いてそのときの細胞の画像を撮った。
【実施例９】
【０２２１】
ＩＲＤｙｅ３８およびｄｄ−００７によるＫＧ１ａ細胞の染色
培養細胞を８００ｒｐｍで５分間スピンさせ、単離されたＫＧ１ａ細胞の上清を静かに注いでｐＨ７．４のＰＢＳ中で細胞を洗浄した（２×１０分）。洗浄した細胞を２つのアリコートに分割し、脱イオン水中の４％ＩＲＤｙｅ３８またはＴｒｉｔｏｎＸ−ＰＢＳ７．４中のｄｄ−００７のいずれかと、それぞれ３０分間混合した。その後、細胞をガラスカバースリップ上になすり付けた。カバースリップを光学バイオディスクに装着し、光学バイオディスクシステムを用いてそのときの細胞の画像を撮った。ｄｄ−００７染料を用いたこの実験の結果を、図６０および図６１に示す。
【０２２２】
＜結言＞
本明細書に開示した装置、方法、およびプロセスに関する本発明の態様は、以下の出願にも提供されている。すなわち、２００１年９月２０日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents」と題する米国仮出願第６０／３２３，６８２号、２００１年９月２４日に出願された「Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs」と題する米国仮出願第６０／３２４，３３６号、２００１年１０月３日に出願された「Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３２６，８００号、２００１年１０月１０日に出願された「Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３２８，２４６号、２００１年１０月１９日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３８６，０７２号、２００１年１０月１９日に出願された「Methods for Quantitative and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells Including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３８６，０７３号、２００１年１０月２６日に出願された「Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc Including Same」と題する米国仮出願第６０／３８６，０７１号、２００１年１１月７日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３４４，９７７号、および２００１年１１月９日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin, Plasma, or Poly-Lysine」と題する米国仮出願第６０／３４９，９７５号に提供されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
【０２２３】
この明細書で言及したすべての特許、仮出願、特許出願、およびそれ以外の出版物は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０２２４】
一定の好ましい実施の形態を参照して、本発明を詳細に説明してきたが、本発明は、それらの正確な実施の形態に限定されるものでないことが理解されるべきである。逆に、本発明を実践する現在のベストモードを説明する本光バイオディスクを考慮すると、当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、多くの変更および変形が思い浮かぶであろう。したがって、本発明の範囲は、上記説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意味するものおよび均等物の範囲内に入るすべての改変、変更、および変形は、特許請求の範囲の範囲内にあるとみなされる。
【０２２５】
さらに、当業者は、定型的に実験にすぎないものを使用するだけで、本明細書で説明した本発明の特定の実施の形態に対する多くの均等物を認識するか、または、把握することができる。このような均等物も、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】本発明によるバイオディスクシステムのイラスト表現である。
【図２】本発明と共に利用される反射型バイオディスクの分解斜視図である。
【図３】図２に示すディスクの平面図である。
【図４】切り取り部分がディスクのさまざまな層を示す、図２に示すディスクの斜視図である。
【図５】本発明と共に使用される透過型バイオディスクの分解斜視図である。
【図６】切り取り部分がディスクの半反射層の機能的態様を示す、図５に示すディスクを表す斜視図である。
【図７】薄い金薄膜の厚さと透過との関係を示すグラフ表示である。
【図８】図５に示すディスクの平面図である。
【図９】切り取り部分が、図６に示す半反射層のタイプを含むディスクのさまざまな層を示す、図５に示すディスクの斜視図である。
【図１０】図１のシステムをより詳細に示すブロック斜視図表現である。
【図１１】図２、図３、および図４に示す反射型光バイオディスクに形成されたフロー流路を示す、当該反射型光バイオディスクの半径に対して垂直な部分断面図である。
【図１２】図５、図８、および図９に示す透過型光バイオディスクに形成されたフロー流路および上部検出器を示す、当該透過型光バイオディスクの半径に対して垂直な部分断面図である。
【図１３】図２、図３、および図４に示す反射型光バイオディスクに形成されたウォブル溝を示す当該反射型光バイオディスクの縦方向の部分断面図である。
【図１４】図５、図８、および図９に示す透過型光バイオディスクに形成されたウォブル溝および上部検出器を示す当該透過型光バイオディスクの縦方向の部分断面図である。
【図１５】反射型ディスクの全層と、反射型ディスクの最初の反射特性を示す図１１と同様の図である。
【図１６】透過型ディスクの全層と、透過型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１２と同様の図である。
【図１７Ａ】本発明の方法を使用する血液サンプルの分析を示す、イラストで表したフローチャートである。
【図１７Ｂ】図１７Ａに示すディスクと共に使用する白血球への抗体の付着を示すイラスト詳細図である。
【図１８】Ａはストレプトアビジンのイラスト表現である。
Ｂはビオチンのイラスト表現である。
Ｃはストレプトアビジンおよびビオチンからなるクロスリンクシステムのイラスト表現である。
Ｄは２次捕抗体のイラスト表現である。
Ｅはビオチン化２次抗体のイラスト表現である。
Ｆは１次抗体のイラスト表現である。
Ｇはビオチン化１次抗体のイラスト表現である。
Ｈは４つのＣＤ４表面抗原を示すＣＤ４＋細胞のイラスト表現である。
Ｉは４つのＣＤ８表面抗原を示すＣＤ８＋細胞のイラスト表現である。
Ｊはアルデヒド活性化デキストランに結合した２次抗体を示すイラスト表現である。
Ｋは図１８Ｊの断面のイラスト表現である。
【図１９】Ａは本発明の第１の実施態様におけるクロスリンクシステムにより基板に結合する１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
Ｂは本発明の第１の実施態様におけるクロスリンクシステムにより基板に結合する１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
Ｃは本発明の第１の実施態様における基板に直接結合する１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
Ｄは本発明の第１の実施態様における基板に直接結合する１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
【図２０Ａ】本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２０Ｂ】本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面である。
【図２０Ｃ】本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２０Ｄ】本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２０Ｅ】本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２０Ｆ】本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２０Ｇ】本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２０Ｈ】本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２０Ｉ】本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２１】図２０Ａ〜図２０Ｉに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。
【図２２】透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図２０Ａ〜図２０Ｉに利用される捕捉化学種を示す図である。
【図２３】Ａは本発明の第２の実施態様におけるクロスリンクシステムによって基板に結合する２次抗体に結合した１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
Ｂは本発明の第２の実施態様におけるクロスリンクシステムによって基板に結合する２次抗体に結合した１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
Ｃは本発明の第２の実施態様における基板に直接結合する２次抗体に結合した１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
Ｄは本発明の第２の実施態様における基板に直接結合する２次抗体に結合した１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
【図２４Ａ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｂ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｃ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｄ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｅ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｆ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｇ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｈ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｉ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｊ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｋ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２４Ｌ】本発明による１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２５】図２４Ａ〜図２４Ｌに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。
【図２６】透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図２４Ａ〜図２４Ｌに利用される捕捉化学種を示す図である。
【図２７】Ａは本発明の第２の実施態様におけるＤＣＨＯのストランドによって基板に結合する２次抗体に結合した１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
Ｂは本発明の第２の実施態様におけるＤＣＨＯのストランドによって基板に結合する２次抗体に結合した１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
Ｃは本発明の第２の実施態様におけるＤＣＨＯのストランドによって基板に直接結合する１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
Ｄは本発明の第２の実施態様におけるＤＣＨＯのストランドによって基板に直接結合する１次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。
【図２８Ａ】抗体ＤＣＨＯ複合体の調製を示すイラストによる流れ図である。
【図２８Ｂ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２８Ｃ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２８Ｄ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２８Ｅ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２８Ｆ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２８Ｇ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２８Ｈ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２８Ｉ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２８Ｊ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図２９】図２８Ｂ〜図２８Ｊに示す反射型ディスクの、２次抗体を使用しない別の実施の形態である。
【図３０】透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図２８Ｂ〜図２８Ｊに利用される捕捉化学種を示す図である。
【図３１Ａ】各流体回路が、特異的細胞表面マーカ用のいくつかの捕捉領域と負の制御領域とを有する４つの流体回路を示す光バイオディスクの平面図である。
【図３１Ｂ】本発明の第３の実施態様におけるクロスリンクシステムによって基板に結合する２次抗体による１次抗体細胞複合体の捕捉を示すイラスト表現である。
【図３１Ｃ】本発明の第３の実施態様におけるクロスリンクシステムによって基板に結合する２次抗体による１次抗体細胞複合体の捕捉を示すイラスト表現である。
【図３１Ｄ】本発明の第３の実施態様における基板に直接結合する２次抗体による１次抗体複合体の捕捉を示すイラスト表現である。
【図３１Ｅ】本発明の第３の実施態様における基板に直接結合する２次抗体による１次抗体複合体の捕捉を示すイラスト表現である。
【図３２Ａ】クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図３２Ｂ】クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図３２Ｃ】クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図３２Ｄ】クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図３２Ｅ】クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図３２Ｆ】クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図３２Ｇ】クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図３２Ｈ】クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図３２Ｉ】クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。
【図３３】図３２Ａ〜図３２Ｉに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。
【図３４】透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図３２Ａ〜図３２Ｉに利用される捕捉化学種を示す図である。
【図３５Ａ】各流体回路が、異なる細胞表面マーカ用のいくつかの捕捉領域と負の制御領域とを有する４つの流体回路を示す光バイオディスクの平面図である。
【図３５Ｂ】クロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第１の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図３５Ｃ】クロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第１の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図３５Ｄ】クロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第１の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図３６】図３５Ｂ、図３５Ｃ、および図３５Ｄに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。
【図３７】透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図３５Ｂ、図３５Ｃ、および図３５Ｄに利用される捕捉化学種を示す図である。
【図３８】Ａは１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第２の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
Ｂは１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第２の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
Ｃは１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第２の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図３９】図３８Ａ、図３８Ｂ、および図３８Ｃに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。
【図４０】透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図３８Ａ、図３８Ｂ、および図３８Ｃに利用される捕捉化学種を示す図である。
【図４１Ａ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用する血液サンプル分析方法の第３の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図４１Ｂ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用する血液サンプル分析方法の第３の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図４１Ｃ】１次抗体および２次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用する血液サンプル分析方法の第３の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図４２】図４１Ａ、図４１Ｂ、および図４１Ｃに示す反射型ディスクの、２次抗体を使用しない別の実施の形態の図である。
【図４３】透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図４１Ａ、図４１Ｂ、および図４１Ｃに利用される捕捉化学種を示す図である。
【図４４Ａ】１次抗体細胞複合体の調製を示すイラストによる流れ図である。
【図４４Ｂ】１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第４の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図４４Ｃ】１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第４の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図４４Ｄ】１次捕捉抗体および２次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第４の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。
【図４５】図４４Ｂ、図４４Ｃ、および図４４Ｄに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。
【図４６】透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図４４Ｂ、図４４Ｃ、および図４４Ｄに利用される捕捉化学種を示す図である。
【図４７】本発明の一実施の形態によるバーコード技法を示すチャンバを有する光ディスクのイラスト図である。
【図４８Ａ】本発明の一実施の形態によるバーコードフォーマットを使用する検定から得られた結果図である。
【図４８Ｂ】ＣＤ４領域、ＣＤ８領域、および制御領域の対応する顕微鏡画像およびディスク画像を示す図である。
【図４９】本発明の方法および装置から得ることができる結果を示す、対応する顕微鏡画像およびディスク画像の拡大図を示す図である。
【図５０】本発明の一実施の形態による画像認識の使用を示す図である。
【図５１】本発明の一実施の形態による画像認識の使用を示す図である。
【図５２】本発明の一実施の形態によるバーコードからの予想出力のスクリーンショットを示す図である。
【図５３】本発明の一実施の形態による捕捉された細胞から使用可能な出力への変換方法を示す図である。
【図５４】サンプリングされたアナログ信号の、１次元配列として記憶される対応するデジタル信号への変換のイラストによるグラフ表示である。
【図５５】指定部分の拡大詳細図が、入射ビームと相互作用した後の信号を含むビームを発生するバイオディスクのトラックを基準にして位置する捕捉された白血球を示す、光ディスクの斜視図である。
【図５６】Ａは本発明による光バイオディスクのトラックを基準にして位置する白血球のグラフ表示である。
Ｂは本発明による図５６Ａの白血球から得られた一連のシグネチャトレースである。
【図５７Ａ】共に取り込まれると、１次元配列として記憶されて、データ入力用の２次元配列に結合されるデジタル信号への、図５６Ｂのシグネチャトレースの変換のイラストによるグラフ表示である。
【図５７Ｂ】共に取り込まれると、１次元配列として記憶されて、データ入力用の２次元配列に結合されるデジタル信号への、図５６Ｂのシグネチャトレースの変換のイラストによるグラフ表示である。
【図５７Ｃ】共に取り込まれると、１次元配列として記憶されて、データ入力用の２次元配列に結合されるデジタル信号への、図５６Ｂのシグネチャトレースの変換のイラストによるグラフ表示である。
【図５７Ｄ】共に取り込まれると、１次元配列として記憶されて、データ入力用の２次元配列に結合されるデジタル信号への、図５６Ｂのシグネチャトレースの変換のイラストによるグラフ表示である。
【図５７Ｅ】図５７Ａ、図５７Ｂ，図５７Ｃ、および図５７Ｄの間の関係を示すグラフ表示である。
【図５８】本発明に関する処理方法および計算アルゴリズムによるデータ評価の主要なステップを示す論理フローチャートである。
【図５９】赤血球および白血球のさまざまな型を含む赤血球および白血球ならびにそれらの固有の解剖学的特徴の図である。
【図６０】光学式読み取り装置を使用して収集された、赤外色素で染色された白血球の画像である。
【図６１】図６０に示すいくつかの白血球の拡大画像である。
【図１】
2005502872.tif 000006
【図２】
2005502872.tif 000007
【図３】
2005502872.tif 000008
【図４】
2005502872.tif 000009
【図５】
2005502872.tif 000010
【図６】
2005502872.tif 000011
【図７】
2005502872.tif 000012
【図８】
2005502872.tif 000013
【図９】
2005502872.tif 000014
【図１０】
2005502872.tif 000015
【図１１】
2005502872.tif 000016
【図１２】
2005502872.tif 000017
【図１３】
2005502872.tif 000018
【図１４】
2005502872.tif 000019
【図１５】
2005502872.tif 000020
【図１６】
2005502872.tif 000021
【図１７Ａ】
2005502872.tif 000022
【図１７Ｂ】
2005502872.tif 000023
【図１８】
2005502872.tif 000024
【図１９】
2005502872.tif 000025
【図２０Ａ】
2005502872.tif 000026
【図２０Ｂ】
2005502872.tif 000027
【図２０Ｃ】
2005502872.tif 000028
【図２０Ｄ】
2005502872.tif 000029
【図２０Ｅ】
2005502872.tif 000030
【図２０Ｆ】
2005502872.tif 000031
【図２０Ｇ】
2005502872.tif 000032
【図２０Ｈ】
2005502872.tif 000033
【図２０Ｉ】
2005502872.tif 000034
【図２１】
2005502872.tif 000035
【図２２】
2005502872.tif 000036
【図２３】
2005502872.tif 000037
【図２４Ａ】
2005502872.tif 000038
【図２４Ｂ】
2005502872.tif 000039
【図２４Ｃ】
2005502872.tif 000040
【図２４Ｄ】
2005502872.tif 000041
【図２４Ｅ】
2005502872.tif 000042
【図２４Ｆ】
2005502872.tif 000043
【図２４Ｇ】
2005502872.tif 000044
【図２４Ｈ】
2005502872.tif 000045
【図２４Ｉ】
2005502872.tif 000046
【図２４Ｊ】
2005502872.tif 000047
【図２４Ｋ】
2005502872.tif 000048
【図２４Ｌ】
2005502872.tif 000049
【図２５】
2005502872.tif 000050
【図２６】
2005502872.tif 000051
【図２７】
2005502872.tif 000052
【図２８Ａ】
2005502872.tif 000053
【図２８Ｂ】
2005502872.tif 000054
【図２８Ｃ】
2005502872.tif 000055
【図２８Ｄ】
2005502872.tif 000056
【図２８Ｅ】
2005502872.tif 000057
【図２８Ｆ】
2005502872.tif 000058
【図２８Ｇ】
2005502872.tif 000059
【図２８Ｈ】
2005502872.tif 000060
【図２８Ｉ】
2005502872.tif 000061
【図２８Ｊ】
2005502872.tif 000062
【図２９】
2005502872.tif 000063
【図３０】
2005502872.tif 000064
【図３１Ａ】
2005502872.tif 000065
【図３１Ｂ】
2005502872.tif 000066
【図３１Ｃ】
2005502872.tif 000067
【図３１Ｄ】
2005502872.tif 000068
【図３１Ｅ】
2005502872.tif 000069
【図３２Ａ】
2005502872.tif 000070
【図３２Ｂ】
2005502872.tif 000071
【図３２Ｃ】
2005502872.tif 000072
【図３２Ｄ】
2005502872.tif 000073
【図３２Ｅ】
2005502872.tif 000074
【図３２Ｆ】
2005502872.tif 000075
【図３２Ｇ】
2005502872.tif 000076
【図３２Ｈ】
2005502872.tif 000077
【図３２Ｉ】
2005502872.tif 000078
【図３３】
2005502872.tif 000079
【図３４】
2005502872.tif 000080
【図３５Ａ】
2005502872.tif 000081
【図３５Ｂ】
2005502872.tif 000082
【図３５Ｃ】
2005502872.tif 000083
【図３５Ｄ】
2005502872.tif 000084
【図３６】
2005502872.tif 000085
【図３７】
2005502872.tif 000086
【図３８】
2005502872.tif 000087
【図３９】
2005502872.tif 000088
【図４０】
2005502872.tif 000089
【図４１Ａ】
2005502872.tif 000090
【図４１Ｂ】
2005502872.tif 000091
【図４１Ｃ】
2005502872.tif 000092
【図４２】
2005502872.tif 000093
【図４３】
2005502872.tif 000094
【図４４Ａ】
2005502872.tif 000095
【図４４Ｂ】
2005502872.tif 000096
【図４４Ｃ】
2005502872.tif 000097
【図４４Ｄ】
2005502872.tif 000098
【図４５】
2005502872.tif 000099
【図４６】
2005502872.tif 000100
【図４７】
2005502872.tif 000101
【図４８Ａ】
2005502872.tif 000102
【図４８Ｂ】
2005502872.tif 000103
【図４９】
2005502872.tif 000104
【図５０】
2005502872.tif 000105
【図５１】
2005502872.tif 000106
【図５２】
2005502872.tif 000107
【図５３】
2005502872.tif 000108
【図５４】
2005502872.tif 000109
【図５５】
2005502872.tif 000110
【図５６】
2005502872.tif 000111
【図５７Ａ】
2005502872.tif 000112
【図５７Ｂ】
2005502872.tif 000113
【図５７Ｃ】
2005502872.tif 000114
【図５７Ｄ】
2005502872.tif 000115
【図５７Ｅ】
2005502872.tif 000116
【図５８】
2005502872.tif 000117
【図５９】
2005502872.tif 000118
【図６０】
2005502872.tif 000119
【図６１】
2005502872.tif 000120
【国際公開パンフレット】
2005502872.tif 000121
2005502872.tif 000122
2005502872.tif 000123
2005502872.tif 000124
2005502872.tif 000125
2005502872.tif 000126
2005502872.tif 000127
2005502872.tif 000128
2005502872.tif 000129
2005502872.tif 000130
2005502872.tif 000131
2005502872.tif 000132
2005502872.tif 000133
2005502872.tif 000134
2005502872.tif 000135
2005502872.tif 000136
2005502872.tif 000137
2005502872.tif 000138
2005502872.tif 000139
2005502872.tif 000140
2005502872.tif 000141
2005502872.tif 000142
2005502872.tif 000143
2005502872.tif 000144
2005502872.tif 000145
2005502872.tif 000146
2005502872.tif 000147
2005502872.tif 000148
2005502872.tif 000149
2005502872.tif 000150
2005502872.tif 000151
2005502872.tif 000152
2005502872.tif 000153
2005502872.tif 000154
2005502872.tif 000155
2005502872.tif 000156
2005502872.tif 000157
2005502872.tif 000158
2005502872.tif 000159
2005502872.tif 000160
2005502872.tif 000161
2005502872.tif 000162
2005502872.tif 000163
2005502872.tif 000164
2005502872.tif 000165
2005502872.tif 000166
2005502872.tif 000167
2005502872.tif 000168
2005502872.tif 000169
2005502872.tif 000170
2005502872.tif 000171
2005502872.tif 000172
2005502872.tif 000173
2005502872.tif 000174
2005502872.tif 000175
2005502872.tif 000176
2005502872.tif 000177
2005502872.tif 000178
2005502872.tif 000179
2005502872.tif 000180
2005502872.tif 000181
2005502872.tif 000182
2005502872.tif 000183
2005502872.tif 000184
2005502872.tif 000185
2005502872.tif 000186
2005502872.tif 000187
2005502872.tif 000188
2005502872.tif 000189
2005502872.tif 000190
2005502872.tif 000191
2005502872.tif 000192
2005502872.tif 000193
2005502872.tif 000194
2005502872.tif 000195
2005502872.tif 000196
2005502872.tif 000197
2005502872.tif 000198
2005502872.tif 000199
2005502872.tif 000200
2005502872.tif 000201
2005502872.tif 000202
2005502872.tif 000203
2005502872.tif 000204
2005502872.tif 000205
2005502872.tif 000206
2005502872.tif 000207
2005502872.tif 000208
2005502872.tif 000209
2005502872.tif 000210
2005502872.tif 000211
2005502872.tif 000212
2005502872.tif 000213
2005502872.tif 000214
2005502872.tif 000215
2005502872.tif 000216
2005502872.tif 000217
2005502872.tif 000218
2005502872.tif 000219
2005502872.tif 000220
2005502872.tif 000221
2005502872.tif 000222
2005502872.tif 000223
2005502872.tif 000224
2005502872.tif 000225
2005502872.tif 000226
2005502872.tif 000227
2005502872.tif 000228
2005502872.tif 000229
2005502872.tif 000230
2005502872.tif 000231
2005502872.tif 000232
2005502872.tif 000233
2005502872.tif 000234
2005502872.tif 000235
2005502872.tif 000236
2005502872.tif 000237
2005502872.tif 000238
2005502872.tif 000239
2005502872.tif 000240
2005502872.tif 000241
2005502872.tif 000242
2005502872.tif 000243
2005502872.tif 000244
2005502872.tif 000245
2005502872.tif 000246
2005502872.tif 000247
2005502872.tif 000248
2005502872.tif 000249
2005502872.tif 000250
2005502872.tif 000251
2005502872.tif 000252
2005502872.tif 000253
2005502872.tif 000254
2005502872.tif 000255
2005502872.tif 000256
2005502872.tif 000257
2005502872.tif 000258
2005502872.tif 000259
2005502872.tif 000260
2005502872.tif 000261
2005502872.tif 000262
2005502872.tif 000263
2005502872.tif 000264
2005502872.tif 000265
2005502872.tif 000266
2005502872.tif 000267
2005502872.tif 000268
2005502872.tif 000269
2005502872.tif 000270
2005502872.tif 000271
2005502872.tif 000272
2005502872.tif 000273
2005502872.tif 000274
2005502872.tif 000275
2005502872.tif 000276
2005502872.tif 000277
2005502872.tif 000278
2005502872.tif 000279
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502872.tif 000280
2005502872.tif 000281
【国際調査報告】
2005502872.tif 000282
2005502872.tif 000283