(57)【要約】本発明は、キトサンの調製方法を提供し、この方法は、粒子状キチンを、少なくとも３６時間の期間、水溶液で膨潤させ、その後、結果物である膨潤した粒子状キチンを、高温でアルカリ溶液と反応させて、脱アセチル化を生じさせることを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子状キチンを、３０℃以下の温度で、少なくとも３６時間、水性溶液で膨潤させ、その後、結果物である膨潤した粒子状キチンを、高温でアルカリ溶液と反応させて、脱アセチル化を生じさせることを含む、キトサンの調製方法。
【請求項２】
キチンに圧力および／または照射を適用し、その膨潤を促進する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
粒子状キチンを、３０℃以下の温度で、膨潤を促進するために圧力または照射を適用して、水性溶液で膨潤させ、その後、結果物である膨潤した粒子状キチンを、高温でアルカリ溶液と反応させて、脱アセチル化を生じさせることを含む、キトサンの調製方法。
【請求項４】
膨潤を、少なくとも２４時間生じさせる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
膨潤を、粒子状の非晶質キチンを与えるのに十分な期間生じさせる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
膨潤を、アルカリ水溶液において生じさせる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記粒子状キチンを、少なくとも１０Nのアルカリ溶液において膨潤させる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記粒子状キチンを、少なくとも１０Mの水酸化ナトリウム水溶液で膨潤させる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記粒子状キチンを、少なくとも１８Mの水酸化ナトリウム水溶液で膨潤させる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記粒子状キチンを、４８〜７５時間に渡り膨潤させる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子状キチンを、４５〜１２０℃の温度で脱アセチル化する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
粒子状キチンが、α−キチンである請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
キトサン生成物が、０．２〜０．７のＦAを有する請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
脱アセチル化の生成物を洗浄し、随意で乾燥することによって、キトサン生成物を回収する請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ａ）３０℃よりも低い温度で、１０Ｍより高い濃縮アルカリ液で、最低限３６時間、キチンを拡張膨潤（extended swelling）させる工程、
ｂ）所定の時間、温度を４５℃以上に上昇させることによって、膨潤したキチンを脱アセチル化する工程、および、
ｃ）（ｂ）工程の脱アセチル化キチンを、洗浄液が中性となるまで水で洗浄し、随意、キトサン生成物を乾燥し、粉砕することにより、キトサンを単離する工程、を含む請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
粒子状の非晶質キチンを、高温で、アルカリ水溶液と反応させることを含む、キトサンの調製方法。
【請求項１７】
粒子状キチンを、３０℃以下の温度で、６５〜１０００時間、アルカリ溶液で膨潤させ、その後、反応混合物からキトサンを抽出することを含む、キトサンの調製方法。
【請求項１８】
キトサン生成物が、後に、化学的または物理的に改質される請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記キトサン生成物が、キトサン塩に変化させられる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
キトサン生成物が、後に、医薬品、獣医学的製品、食品または化粧品に調製される請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法によって製造されたキトサン生成物。
【請求項２２】
０．４５〜０．７のアセチル化度を有するキトサンであって、１２ＭのＨＣｌで、４０℃で９時間の酸性加水分解において、モノマーおよびオリゴマーの混合物が得られ、前記混合物は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体および六量体に対応する累進的に小さくなるピークのパターンを示さないものである、キトサン。
【請求項２３】
請求項２１または２２のいずれかに記載のキトサンを含む、科学技術的製品、農産物、食品、ニュートラシューティカル製品、医薬品、生物医薬品、獣医学的製品または化粧品。
【請求項２４】
科学技術的製品、農産物、食品、ニュートラシューティカル製品、医薬品、生物医薬品、獣医学的製品または化粧品の調製のための、請求項２１または２２のいずれかに記載のキトサンの使用。
【請求項２５】
非晶質キチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キトサンの調製方法、並びに、それにより製造される新規のキトサン製品およびその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
キチンは、無脊椎動物の外骨格や菌類に存在する、式（Ｃ8Ｈ13Ｎ5）nで表される天然の含窒素ムコ多糖類である。詳しくは、エビ、カニ、テナガエビおよびロブスターなどの甲殻類の外骨格の主成分である。更に詳しくは、キチンは、ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンである。すなわち、キチンは、（１→４）結合した、２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース（ＧｌｃＮａｃ；Ａユニット）からなる。キチンの物理的構造は高次であるが、最多の形態はα−キチンであり、これは、甲殻類食品産業からの廃物として入手可能である。α−キチンにおいて鎖は逆平行であり、広範囲で水素結合している。別の形態はβ−キチンであり、これは、例えば、イカLoligoの甲および珪藻Thalassiosira fluviatilisの棘状突起から単離可能である。β−キチンにおいて鎖は平行であり、α−キチンと比較して水素結合は少ない。
【０００３】
キチンは、酸性ｐH値であっても水に不溶であり、大部分の有機溶媒に不溶である。このことが、それを用いた応用を制限している。
【０００４】
キチンのN−アセチル基は分離し、キトサンとして知られる生成物を生成し得る。キトサンは、例えば、医薬品および化粧品の組成物、充填剤、吸収剤、キャリアおよび担体として、多くの用途が知られている。
【０００５】
キトサンは、種々の相対存在量およびシーケンスで、（１→４）結合した、Ａユニット、および、２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコースのユニット（ＧｌｃＮ；Ｄユニット）からなる水溶性多糖類の系統である。
【０００６】
ここで、キチンとキトサンとの間の区別は、希酸性溶液におけるキチンの不溶性と、同希酸性溶液におけるキトサンの可溶性に基づいている（ロバーツ（Roberts）, G.A.F., “Chitin Chemistry” (1991年),6-7頁を参照）。
【０００７】
ロバーツ（前出）の第６頁にある完全水溶性キトサンの定義は、キトサンは、一般に、Ｄユニットの遊離アミノ基がプロトン付加されたときにのみ水溶性となるということに関連している。このようなプロトン付加は、制御された量の酸、例えば酢酸の添加によって、達成することができる。しかしながら、キトサンは、酸の添加なしに水溶性とし得るような、種々の塩形態、すなわち、Ｄユニットのプロトン付加アミノ基と、負電荷を帯びた対イオン（例えば、蟻酸イオン、酢酸イオン、塩化物イオンまたはその他の陰イオン）とを備えた形態で調製可能である。このようなキトサン塩調製のための操作は、文献に記載されている（例えば、ドラジェット（Draget）等, Biomaterials 13:635-638頁(1992年)、ヴァラム（Varum）等,Carbohydrate Polymers 28:187-193頁(1995年)、US-A-5,599,916を参照されたい。）。
【０００８】
キトサンの特性を表す一つのパラメータは、ＤユニットよりはむしろＡユニットである糖ユニットの相対割合、ＦAである。
【０００９】
キトサンの構造を表すため、次のような、ＡおよびＤユニットの組成が異なる３種の異なるキトサンの化学構造の図式的表現が与えられる；
DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD
完全にN−脱アセチル化されたキトサン分子の部分（ＦA＝０．００）
DDDADDADDDDDAADDADDDDDADADDDDAADDDDADDDD
部分的にN−脱アセチル化されたキトサン分子の部分（ＦA＝０．２５）
DAAADDADDDDAAAADADDADDADDDDADAAAADDAADAA
部分的にN−脱アセチル化されたキトサン分子の部分（ＦA＝０．５０）
キトサンのような二成分ヘテロ多糖類においては、分子の化学構造は、化学組成（すなわち、ＦA）の理解だけでは、完全には特性を表すことができない。化学構造を完全に表すためには、２つのモノマーの鎖に沿ったシーケンスと、その鎖における分布を知ることが必要である。２つのモノマー単位の鎖に沿ったシーケンスを表す一つの方法は、２つのモノマー単位の隣接頻度を測定し、統計的モデルから得られる値と比較することである。ＮＭＲ研究により、同種および異種の両方で調製された水溶性キトサンが、鎖に沿ってアセチル化ユニットおよび脱アセチル化ユニットのランダムな分布を有することが示されている（ヴァラム等,Carbohydr. Res. 211:17-23頁(1991年)、および217:19-27頁(1991年)参照）。
【００１０】
親水性プロトン付加アミノ基を有するモノマー残基、および、疎水性アセチル基を有する別のモノマー残基の相対量は変化し得るものであるが、この２つのモノマーの存在は、溶液、ゲルおよび固相におけるキトサンの物理的特性、並びに、他の分子、細胞およびその他の生物学的および非生物学的物質との相互作用に影響を及ぼす。しかしながら、キトサンの商業的使用が、長い間、アセチル化ユニットの割合が低い（ＦA＜０．１５）キトサン試料に限定されている理由の一つには、他のキトサンを大規模に調製するための安価な方法がなかったこと、そして、高いＦAを有するキトサンの機能的特性の詳細な理解に限界があることが挙げられる。
【００１１】
キチンからのキトサンの生成においては、脱アセチル化に加えて解重合も生じ、キトサンは、広範囲のアセチル化度および広範囲の分子量で生成され得ることに注意すべきである。しかしながら、一般に、商業的に入射可能なキトサンについて残る一つの問題は、生理学的ｐＨ値において不溶性であるということである。
【００１２】
キチンからのキトサンの生成は、一般に、均一反応または不均一反応のいずれかとして実施される。均一反応においては、キチンはアルカリ中に懸濁され、懸濁液が氷で冷却されてキチンが溶液に導かれる；不均一反応においては、粒子状キチンが温アルカリ溶液、一般には水酸化ナトリウム中に分散される。均一反応の場合、得られるキトサンのＦAは、一般に０．３〜０．７である。不均一反応の場合、得られるキトサンのＦAは、一般に０〜０．１５の範囲である。異なる脱アセチル化度を有するキトサンが必要とされるときには、キトサンを再アセチル化する必要がある。均一反応の場合、残存するＮ−アセチル基は、一般に、キトサン生成物のポリマー骨格に沿ってランダムに位置している。不均一反応の場合、しばしば、ポリマー骨格に沿ったアセチル基の分布がほぼランダムである、酸に可溶な成分とともに、少量の不溶性キトサン様物質が生成物中に存在する。
【００１３】
脱アセチル化操作の先行技術の記述は、US-A-4195175；ヴァラム等,”Advances in chitin chemistry”127-136頁, C.J.Brine編,1992年；オットー（Ottoy）等, Carbohydrate Polymers 29:17-24(1996)；サンナン（Sannnan）等, Macromol.Chem.176:1191-1195(1975)；サンナン等, Macromol.Chem.177:3589-3600(1976)；クリタ（Kurita）等, Chemistry Letters 1597-1598(1989)；CA-A-2101079にみることができる。
【００１４】
幾つかの応用においては、最近、より高い割合のアセチル化キトサンにおいて、増強された性能が認められている（スミドスロッド（Smidsrod）等, 1-11頁,”Chitin and Chitosan - Citin and Chitosan in Life Science”; T.Uragami等編, Kodansha Scientific, Japan(2001)(ISDN 4-906464-13-0)参照）。重要なことは、中性のｐH値における溶解度の増大、制御可能なリゾチームによる分解率、疎水性表面（例えば、脂肪粒子および細胞表面）との強い相互作用とそれによって得られる増強された脂肪結合特性および凝集、水中油型乳濁液に及ぼす増強された不安定化作用、および、多くのコスメティック、ニュートラシューティカルおよび生物医学的応用における拡大された有用性である。
【００１５】
また、最近、より高度にアセチル化されたキトサンは、細菌細胞をより効果的に凝集させることが示されている（スミドスロッド等, Biomacromolecules 2:126-133頁(2001年)）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、より高度にアセチル化されたキトサンを調製するための既知の操作は、これを工業生産への規模拡大に対して不適切なものとするような、不都合を有している。
【００１７】
すなわち、例えば、膨潤なしの不均一系の脱アセチル化プロセスに対しては、水溶性のキトサンから未反応のキチンを分離するため、酸によって生成物を抽出する必要があり、これは、高度にアセチル化されたキトサン生成物の収量を減少させることに加えて、水の除去を含む。
【００１８】
高度に脱アセチル化されたキトサンの再アセチル化は、脱アセチル化工程に加えて、キトサンの可溶化、無水酢酸およびメタノールなどの有機化学種の使用、および最終生成物の単離を含む。
【００１９】
均一系の脱アセチル化操作は、氷の添加によるキチンの可溶化、および溶液からのキトサンの単離を含む。更に、キチン溶液が過度に高い粘度を有することを避けるため、反応媒体において、大量の水性アルカリ液（aqueous lye）が必要である。この均一系の脱アセチル化操作は、故に、不均一系の脱アセチル化操作に比べて、製品がより高価となる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
驚くべきことに、我々は、ここに、不均一系の脱アセチル化反応において、キチンが、まず、長期低温アルカリ膨潤段階に曝されれば、キトサン生成物が、ポリマー鎖に沿ったＮ−アセチル基の分布がよりランダムで、所望に応じて低くまたは高くすることが可能な脱アセチル化度で、所望であれば従来の生成物よりも低くすることが可能な解重合度で、且つ、所望であれば生理学的ｐＨにおいて増強された水溶性を有するものとして得られることを見出した。
【００２１】
よって、本発明の一つの側面はキトサンの調製方法の提供し、この方法は、粒子状キチンを、３０℃以下の温度で、少なくとも３６時間、水性溶液、好ましくはアルカリ水溶液で膨潤させ、その後、結果物である膨潤した粒子状キチンを、高温でアルカリ溶液と反応させて、脱アセチル化を生じさせて、例えば、所定の所望のＦA値で、所望であれば完全に水溶性のキトサンを得ることを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の方法で用いられるキチンは、好ましくは、無脊椎動物の外骨格から、例えば、脱タンパク質および鉱物質除去によって抽出されたキチンである。すなわち、キチンは、好ましくはα−キチンである。特に好ましくは、このキチンは、甲殻類の外骨格、特に、エビ、オキアミ、ロブスターまたはカニの外骨格および二枚貝の殻から抽出される。エビという語は、ここでは、スカンピなどと同種のものだけでなく、テナガエビ（prawn）およびエビ（shrimp）の両方を示すものとして使用される。ロブスターという語は、ここでは、ロブスターと、クレイフィッシュおよびラングスティーニなどと同種のものの両方を示すものとして使用される。北極地方のテナガエビ（パンダラスボレアリス（Pandalus borealis））の外骨格が、特に好ましい。このような甲殻類の外骨格は、食品製造産業の廃物として入手可能である。しかしながら、出発物質として使用されるキチンは、好ましくは甲殻類の殻（例えば、エビ、二枚貝、オキアミ、カニおよびロブスターの殻）から単離されるが、他のキチン源、例えばイカの甲および珪藻などの原料からのβ−キチンも、本発明の方法において使用可能である。更に、γ−キチンなどの他のキチンも使用可能である。キチン出発物質は、未加工、または、例えば、随意で乾燥され、更に機械的および／または化学的に改質された、前処理した形態であってもよい。しかしながら、キチンは、例えば５〜１０００μｍ、特に５０〜５００μｍの粒径最頻値を有する、フレークまたは粉末状であることが好ましい。このような粉末は、望ましくは、粒径が実質的に均一である。
【００２３】
粒子状キチンを、水性溶液、好ましくはアルカリ溶液、例えば、少なくとも１０Ｎのアルカリ溶液、および／または、キチンの結晶構造を乱すことが可能な溶解した電解質／塩を含む溶液中において、膨潤させる。溶液は、好ましくは極性またはプロトン性を有し、例えば、水、アルコール（例えばメタノール）、ジメチルスホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドまたはアセトニトリルである。アルカリ水溶液は、その環境に対する影響が低くなるように使用されることが、特に好ましい。使用されるアルカリは、キチンを脱アセチル化し得るあらゆるアルカリであり得るが、好ましくは無機アルカリであり、特に、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、例えば水酸化カリウム、特に水酸化ナトリウムである。すなわち、アルカリは、いわゆる強塩基であることが好ましい。アルカリ液（灰汁）が、特に好ましく使用される。アルカリ溶液は、１０ＭＮａＯＨ、更に好ましくは１５Ｍ ＮａＯＨと等しいか、またはそれよりも大きいｐＨを有することが望ましい。一般に、少なくとも１５Ｍ水酸化ナトリウム、特に、少なくとも１８Ｍ水酸化ナトリウムが使用され、例えば１５〜２５Ｍ、より好ましくは１８〜２２Ｍである。アルカリ溶液は、一般に、粒子状キチンに対する重量比１００：１〜１：１、好ましくは５０：１〜４：１、更に好ましくは３０：１〜８：１で使用される。
【００２４】
一つの好ましい実施形態においては、キチンを、キチンが溶解し得る有機溶媒を含む液体と接触させる。液体は、共溶媒として水を含んでいてもよく、水は、膨潤した非晶質粒子として溶解キチンを沈殿させるために、キチン液体混合物に添加されてもよい。このような液体は、アルカリであることが望ましいが、キチンの結晶構造を乱し得るその他の溶解成分、例えば電解質／塩を含んでいてもよい。これに使用し得るような液体の一つは、塩化カルシウムのメタノール系水性溶液である。
【００２５】
本発明の方法の膨潤段階が、３０℃以下の温度、例えば−６〜３０℃、より好ましくは０〜３０℃、更に１５〜２５℃、特に２０℃以下の温度で実施されることが好ましい。従来の均一系のキチン脱アセチル化反応においては、氷温度に冷却されることによってキチンが溶液とされるが、本発明の方法において、膨潤は５℃以下の温度で生じ、これはキチンが溶解する前に終了し、高温でアルカリ脱アセチル化に曝される物質は、粒子状の溶解していない膨潤したキチンである。
【００２６】
膨潤段階は、好ましくは、少なくとも４８時間（例えば４８〜７５時間）、より好ましくは、少なくとも５４時間、特に６０〜１２０時間、更には６５〜７５時間実施する。膨潤期間が延長されるほど、後の脱アセチル化において生成される、酸に可溶なキトサンの収率が増大するが、７５時間を超えると、更なる収率の増大は小さい。一般に、β−キチンに必要な膨潤時間は、α−キチンに必要な時間よりも短い。
【００２７】
キチンの膨潤は、膨潤中にキチンを、例えば、湿気を含んだキチンを粉砕若しくは押出すこと、または、マイクロ波若しくは超音波照射によって、圧力または照射に曝すことによって加速することができる。これは、キチンからキトサンへの転換の新しい側面であり、すなわち、本発明の更に別の側面は、粒子状キチンを、３０℃以下の温度で、膨潤を促進するために圧力または照射を適用して、水性溶液（好ましくはアルカリ溶液）で膨潤させ、その後、結果物である膨潤した粒子状キチンを、高温でアルカリ溶液と反応させて、脱アセチル化を生じさせることを含む、キトサンの調製方法を提供する。
【００２８】
望ましくは、膨潤時間は、キチンが膨潤した非晶質キチンとなる、すなわち、キチンが結晶領域から実質的に自由となるのに十分な時間となるように選択される。これは、Ｘ線回折によって実験的に確認することができる。一般に、キチンは、キチンが蒸留水中で有する体積の少なくとも１．４倍、好ましくは少なくとも１．５倍の体積に膨潤すると、膨潤した非晶質状態となる。
【００２９】
非晶質キチンのアルカリ脱アセチル化は、それ自体が新規であり、本発明の更なる側面を構成する。本発明のこの側面によれば、好ましくはアルカリ溶液で膨潤させた、粒子状の非晶質キチンを、高温、例えば３０℃以上、好ましくは４０℃以上で、アルカリ水溶液と反応させることを含む、キトサンの調製方法が提供される。この方法に用いられる非晶質キチンは、ここに記載したような膨潤によって、または、溶解したキチンの沈殿によって、生成させることができる。
【００３０】
膨潤に続き、膨潤したキチンは、膨潤段階で用いられた温度よりも高温、例えば少なくとも５℃高い温度、好ましくは２５℃高い温度で、アルカリ脱アセチル化に曝される。一般に、脱アセチル化段階における温度は、少なくとも４０℃であり、溶液の沸点まで（例えば１３０℃まで）、好ましくは少なくとも４５℃、例えば４５〜１２０℃、より好ましくは５０〜７０℃、特に５５〜６５℃の範囲である。温度の上昇による効果は、所望の脱アセチル化度を生成させるのに要する時間の減少である。本発明の方法は、好ましくは、所定のＦA値を有するキトサンが得られるように実施され、方法は、通常、所定の時間、上昇した脱アセチル化温度に曝すことを含む。一般に、脱アセチル化反応は、３０分から１０時間、好ましくは４５分から４時間、実施される。
【００３１】
脱アセチル化段階において用いられるアルカリ溶液は、随意、更なるアルカリが添加、または、過剰のアルカリが除去された、膨潤段階において用いられる溶液と同様のものであり得る。または、膨潤したキチンを回収し、新たなアルカリ溶液に接触させてもよい。このような更なる、または新たなアルカリ溶液は、膨潤段階において前述したものであってもよい。簡便性および経済的理由から、脱アセチル化段階は、一般に、随意、更にアルカリ溶液を添加した、膨潤段階と同じアルカリ溶液を用いて実施される。
【００３２】
脱アセチル化は、好ましくは、０．２〜０．７、特に０．４５〜０．６のＦAを有するキトサン生成物が得られるように生じさせることが好ましい。
【００３３】
脱アセチル化に続き、キトサン生成物は、例えば、従来のキトサン製造方法におけるのと同様に、一般に洗浄され、随意で乾燥され、粉砕される。所望であれば、酸性抽出および沈殿によって残留キチンから分離することができ、これもまた、従来のキトサン製造方法におけるのと同様に実施できる。
【００３４】
キトサン生成物の洗浄は、一般的に、温水（例えば３０〜７０℃）で実施され、洗浄溶液が中性ｐＨに達するまで続けられる。冷水での洗浄は、ゲル形成が生じるおそれがあるため、一般には避けるべきである。
【００３５】
すなわち、本発明の一つの好ましい実施形態においては、方法は、膨潤と、その後の脱アセチル化によって、所定のアセチル化アミノ基率（ＦA）を有する、完全に水溶性のキトサンを製造するための方法であって、
ａ）３０℃よりも低い温度で、１０Ｍより高い濃縮アルカリ液で、最低限３６時間、キチンを拡張膨潤させる工程、
ｂ）所定の時間、温度を４５℃以上に上昇させることによって、膨潤したキチンを脱アセチル化する工程、および、
ｃ）（ｂ）工程の脱アセチル化キチンを、洗浄液が中性となるまで水で洗浄し、随意、キトサン生成物を乾燥し、粉砕することにより、キトサンを単離する工程を含むことを特徴とする。
【００３６】
本発明の方法と、先行技術に記載された不均一系操作との主な相違点は、拡張膨潤の実施である。本発明の方法と、先行技術に記載された均一系操作との相違は、完全に明確であり、次の事項の回避を含む：
ａ）粘度に起因して、濃縮において結果として生じる制限を伴った、キチンの可溶化
ｂ）（アセチル化ユニットの割合が高い、または低い）キトサン生成物の沈殿
生成物の単離のための沈殿段階がないこととともに、脱アセチル化における操作体積が相当に減少することは、先行技術の均一系の脱アセチル化操作と比較した、本発明の方法の明らかな利点であり、このことが、方法を産業的に実施可能とする。
【００３７】
前述した不均一系の脱アセチル化プロセスに関して、本発明の本質的な特有の特徴は、完全に水溶性の生成物を生成することが可能であり、水溶性キトサンから未反応のキチンを分離するために酸で生成物を抽出する必要がないということである。
【００３８】
ここで使用されるような「完全に水溶性のキトサン」は、完全に溶解することが可能であり、例えば、１％ｗ／ｖ酢酸中に１％ｗ／ｖキトサン溶液として、希酸性溶液において９７重量％以上が溶解する、キトサンを意味する。
【００３９】
特定のアルカリ溶液について、所望の脱アセチル化度を有するキトサンを生成するのに要する、膨潤および脱アセチル化段階の温度および継続時間は、普通の実験によって決定することができる。２０ＭＮａＯＨを用いた例によれば、２０℃で６６〜１００時間の、パンダラス ボレアリス由来のα−キトサンの膨潤と、これに続く、５０℃で３時間、または６０℃で１時間の脱アセチル化によって、約０．５のＦAを有するキトサンが得られる。
【００４０】
よって、本発明の方法は、通常、所定温度で所定時間の膨潤と、これに続く、所定温度で所定時間の脱アセチル化によって、所望のＦAのキトサンを生成することを含む。または、しかしながら、時間および温度は、例えばサンプリングおよび試験によって、反応媒体の特性の監視を含むフィードバック制御システムにおいて調節してもよい。
【００４１】
また、驚くべきことに、我々は、アルカリ溶液膨潤が、相当に長い期間、例えば６５時間以上実施されると、高温での後処理がなくても、キチン脱アセチル化が生じることを見出した。脱アセチル化度は、膨潤が延長された時間に依存し、６５〜１０００時間、好ましくは７０〜４００時間、より好ましくは１００〜３００時間、この方法で膨潤したキチンから、有用なキトサン生成物が回収できる。これは、本発明の更なる側面を構成する。本発明のこの側面によれば、粒子状キチンを、３０℃以下の温度で、６５〜１０００時間、アルカリ溶液で膨潤させ、その後、反応混合物からキトサンを抽出することを含む、キトサンの調製方法が提供される。
【００４２】
低温膨潤は、キチンを、非晶質領域によって分離された結晶領域を含む自然状態から、キチンが実質的に全体的に非晶質である状態に転換する。例えば、１０〜２５Ｎアルカリ溶液（例えば２０ＭＮａＯＨ）において、１０〜２５℃で、この転換には、通常、３６〜８０時間かかる。このプロセスは、キチンの膨潤を監視すること、またはＸ線解析によって注視することができる。膨潤が終了すると、脱アセチル化が始まる。通常、膨潤が終了すると、ＦAが約０．５に達するのに約９０時間、約０．３に達するのに約２５０時間、０．０５に達するのに約６００時間かかる。したがって、このプロセスは、アルカリ処理のｐＨ、温度および継続時間を選択することによって、簡単に、所望の脱アセチル化度に達するように実施することができる。本プロセスの中間体として生成される実質的に非晶質のキチンは、それ自体が新規であり、本発明の更なる側面を構成する。本発明のこの側面によれば、非晶質（すなわち、非結晶性）のキチン、特に膨潤した非晶質キチンが提供される。本発明の更なる側面によれば、非晶質キチンを、高温で、アルカリ水溶液と反応させることを含む、キトサンの調製方法が提供される。
【００４３】
このようにして本発明の方法を用いて生成された、中間領域の脱アセチル化度を有するキトサンは、生理学的ｐＨまたはこれに近いｐＨにおいて増強された水溶性を有し、本発明の更なる側面を構成する。このようなキトサンは、濃酸での加水分解による生成物のサイズ排除クロマトグラフィーによって、従来の方法によって生成されたキトサンと区別することが可能である。これを、添付図面の図１および２に示し、図１は、均一系脱アセチル化によって生成したキトサンの酸性加水分解生成物のサイズ排除クロマトグラフであり、図２は、本発明の方法によって生成したキトサンの酸性加水分解生成物のサイズ排除クロマトグラフである。このように、先行技術の生成物については、単量体、二量体、三量体などに対応するピークの大きさが、累進的に増大している。対して、本発明による生成物は、ブロック状（blockwise）のパターンを示す。すなわち、本発明の更なる側面によれば、０．４５〜０．７のアセチル化度を有するキトサンであって、１２ＭのＨＣｌで、４０℃で９時間の酸性加水分解において、モノマーおよびオリゴマーの混合物が得られ、前記混合物は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体および六量体に対応する累進的に小さくなるピークのパターンを示さないものであるキトサンが提供される。
【００４４】
本発明の方法によって生成されるキトサンは、生成された状態で用いられてもよく、また、更なる化学的または物理的改質、例えば、解重合、脱アセチル化、アセチル化、塩形成またはその他の化学的誘導体化、粉砕、ゲル化、溶液化、分留、酸抽出などに曝されてもよい。キトサンの誘導体化の代表例は、科学文献および特許文献に広く記載されている。例えば従来の手法による、塩への変換は、好ましい生成後処理である。
【００４５】
キトサン生成物または改質生成物は、キトサンについて以前より提案されているあらゆる用途分野、例えば、科学技術的製品、農産物、食品（人の食品および動物の飼料および食品添加物を含む。）、ニュートラシューティカル製品、医薬品、生物医薬品、獣医学的製品または化粧品の調製において、使用可能である。しかしながら、特に、医薬的または獣医学的組成物、食品または化粧品添加物として好適である。
【００４６】
すなわち、本発明の更なる側面によれば、科学技術的製品、農産物、食品、ニュートラシューティカル製品、医薬品、生物医薬品、獣医学的製品または化粧品の調製のための、本発明の方法のキトサンの使用が提供される。本発明の更なる側面によれば、本発明の方法のキトサン生成物を含む、科学技術的製品、農産物、食品、ニュートラシューティカル製品、医薬品、生物医薬品、獣医学的製品または化粧品が提供される。
【００４７】
ここで、参照した刊行物を、参考として組み入れる。
【００４８】
以下の、非限定的な実施例を参照して、本発明を更に詳説する。
【実施例１】
【００４９】
膨潤時間の相関的要素としての、アセチル化ユニットの割合が約０．５である酸溶性キトサンの調製
原料物質として、北極エビ（arctic shrimp）の殻から単離され、プリメックス イングレジエンツ  エーエスエー（Primex Ingredients ASA）（ハウグサンド（Haugesund）、ノルウェー）から入手可能なキチンを用いた。操作は、次のようにして実施した。
【００５０】
１．  微粉砕キチン（ハンマーミルで１ミリメートル以下の粒子に粉砕されている。）２．５ｇを、４３ｍｌの２０ＭＮａＯＨに添加した。そして、キチンを、２０℃で、０〜９５時間膨潤させた。
【００５１】
２．  膨潤したキチンを、膨潤で使用した水酸化ナトリウムで、６０℃で１時間、脱アセチル化した。
【００５２】
３．  分散液を焼結ガラスに移し、温水（５０〜８０℃）で中性ｐＨとなるまで洗浄した。
【００５３】
４．  前出のオットー（Ottoy）等の記載のように、キトサンを乾燥し、測量し、酸溶性キトサンの含有量を求めるために分析した。更に、プロトンＮＭＲ分光法によって、酸溶性分の化学組成（ＦA）を測定した。前出のドラジェット（Draget）等の記載のように、ｐＨ４．５、イオン強度０．１Ｍで、酸溶性分の固有粘度を測定した。結果を、下記表１に示す。
【００５４】
【表１】
2005500410.tif 000003
このように、収率（酸溶性分％として測定した。）は、膨潤させない場合の４２％から、６６時間膨潤させた場合の９８％まで、増大した。
【実施例２】
【００５５】
アセチル化ユニットの割合（ＦA）が高い完全水溶性キトサンの生成
実施例1と同様のキチンを用いて、実施例１に記載のようにして、２０℃で６６時間膨潤させた。
【００５６】
膨潤したキチンを、５０℃で脱アセチル化させ、脱アセチル化時間は１〜７時間で変化させた。酸溶性キトサンの含有量（すなわち、１％ｗ／ｖ酢酸中における。）、酸溶性分のＦA、および酸溶性分の固有粘度を測定した。結果を、下記表２に示す。
【００５７】
【表２】
2005500410.tif 000004
このように、キトサンの化学組成（ＦA）は、脱アセチル化の時間によって制御することができ、脱アセチル化の時間が、約０．５以下のＦAを得るのに十分であると、生成物は実質的に完全水溶性である。
【００５８】
脱アセチル化温度を６０℃に上昇させ、脱アセチル化時間を１,２および３時間として、実験を繰り返した。酸溶性キトサンの含有量、酸溶性分のＦA、および酸溶性分の固有粘度を測定した。結果を、下記表３に示す。
【００５９】
【表３】
2005500410.tif 000005
このように、５０℃で必要とされる３時間に対し、１時間の脱アセチル化時間で、高いアセチル化度（ＦA＝０．５１）を有する完全水溶性のキトサンが得られる。
【実施例３】
【００６０】
低い脱アセチル化度を有する完全水溶性キトサンの生成
キトサンの工業生産のため、プリメックス イングレジエンツ（フィンスネス（Finnsnes）、ノルウェー）によって供給されるようなキチンフレークを、出発物質として選択した。使用したキチンは、１〜２ｃｍ2までの面積と、２０〜２００μｍで変化するフレーク厚みを有するフレーク状粒子であった。キチンフレークの乾燥物量は２０重量％であり、水相は、ＮａＯＨ（水溶液）成分のため、ｐＨ１２であった。
【００６１】
操作は、次のようにして実施した：
１．  キチンフレークを、キチン：ＮａＯＨ水溶液の比を１：８として、２２℃で、５０％（ｗ／ｗ）ＮａＯＨ水溶液に添加し、５０％（ｗ／ｗ）以下のアルカリ濃度で、２２〜２７℃（キチンを添加する際に上昇させた温度）で、７０時間膨潤させた。
【００６２】
２．  膨潤したキチンを、同様のアルカリで、６０℃で１時間、脱アセチル化した。
【００６３】
３．  分散液を濾過器に移し、温水（５０〜８０℃）で中性ｐＨとなるまで洗浄した。
【００６４】
４．  キトサンを乾燥し、Ｈ1−ＮＭＲ分光法によって、酸溶性分のＦAを測定した。前出のドラジェット（Draget）等の記載のように、ｐＨ４．５、イオン強度０．１Ｍで、酸溶性分の固有粘度を測定した。結果を、下記表４に示す。
【００６５】
【表４】
2005500410.tif 000006
【実施例４】
【００６６】
高い脱アセチル化度を有する完全水溶性キトサンの生成
キトサンフレーク出発物質は、実施例１で使用したものと同様である。
【００６７】
１．  キチンフレークを、キチン：ＮａＯＨ水溶液の比を１：８として、２２℃で、５０％（ｗ／ｗ）ＮａＯＨ水溶液に添加した。アルカリを圧搾して、キチン：ＮａＯＨ水溶液の比を１：４とした。
【００６８】
２．  キチン／アルカリ塊を９１時間膨潤させた。
【００６９】
３．  得られた分散液を濾過器に移し、温水（５０〜８０℃）で中性ｐＨとなるまで洗浄した。
【００７０】
４．  キトサンを乾燥し、Ｈ1−ＮＭＲ分光法によって、酸溶性分のＦAを測定した。前出のドラジェット（Draget）等の記載のように、ｐＨ４．５、イオン強度０．１Ｍで、酸溶性分の固有粘度を測定した。結果を、下記表５に示す。
【００７１】
【表５】
2005500410.tif 000007
【実施例５】
【００７２】
低い脱アセチル化度を有する完全水溶性キトサンの生成
本実施例は、本発明の方法が、従来の方法を用いて生成されたものに匹敵するキトサンを生成し得ることを示すものである。
【００７３】
キチン（実施例１で用いたものと同様）を、実施例１と同様に、２０℃で６６時間膨潤させる。膨潤したキチンと、膨潤していないキチンとを、７０，９０および１２０℃で、２０ＭＮａＯＨ（実施例１と同様）で脱アセチル化した。結果を、下記表６〜８に示す。
【００７４】
【表６】
2005500410.tif 000008
【００７５】
【表７】
2005500410.tif 000009
【００７６】
【表８】
2005500410.tif 000010
【実施例６】
【００７７】
加水分解物のサイズ排除クロマトグラフィー
サンナン（Sannan）等、Macromol. Chem. 177:3589-3600頁(1976年)の均一系脱アセチル化方法によって生成されたＦA ０．４３のキトサンと、実施例１〜４の方法に従って生成されたＦA ０．４６のキトサンとを、１２Ｍ ＨＣｌで、４０℃で６〜１１時間加水分解した。そして、加水分解物を、（トンメラアス(Tommeraas)等、Carbohydrate Res. 333:137-144頁(2001年)に記載のように）サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。結果は、図１および図２に示され、単糖から六糖フラグメントに対応するピークの範囲に渡り、ピーク高さにおいて、明らかに異なるパターンを示している。１，２，３，４，５および６を付したピークは、それぞれ、単糖から六糖フラグメントに対応する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、均一系脱アセチル化によって生成したキトサンの酸性加水分解物のサイズ排除クロマトグラフである。
【図２】図２は、本発明の方法によって生成したキトサンの酸性加水分解生成物のサイズ排除クロマトグラフである。
【図１】
2005500410.tif 000011
【図２】
2005500410.tif 000012
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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