(57)【要約】任意の所望の用途において用いられる高度に標識された直鎖ポリマー分子を構築する方法、およびこのような構造の直鎖ポリマー分子。上記ポリマー分子は、互いに結合してさらに伸張された鎖を形成する多数の１種以上のモノマーオリゴヌクレオチド単位から構築される核酸である。各ポリマー内には、標識部分と結合するかまたは結合するように設計された少なくとも１種のモノマー単位が提供され、標識目的に設計された多数の繰り返し配列を有するポリマーが提供され、その結果、かなりの多様性を有する非常に有効なシグナルを有する分子が得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標識モノマーを含むオリゴヌクレオチドの集団を提供する工程（ここで、前記標識モノマーは、５’−ＡＢ−３’の構造を有するオリゴヌクレオチドであり、ＡＢはＡが少なくとも１つのヌクレオチドに対応し、Ｂが少なくとも１つのヌクレオチドに対応するようなヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列ＡＢにおいて少なくとも１つのヌクレオチドに標識が組み込まれているか、または標識が結合しており；前記標識モノマーは５プライムホスフェートを含むか、または５プライムリン酸化することができ、前記標識モノマーはさらに３プライムヒドロキシルを含むかまたは３プライムヒドロキシルを受け取ることができる）と、
（ｂ）標識分子として使用されるポリマーを合成する工程（ここにおいて、前記ポリマーは前記標識モノマーから合成されるポリマーであり、前記ポリマーは前記オリゴヌクレオチドの配列を含み、前記オリゴヌクレオチドの前記配列は前記配列ＡＢの繰り返しを含む）とを含む、方法。
【請求項２】
前記ポリマーが前記オリゴヌクレオチドの連結により合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマーが前記オリゴヌクレオチドの酵素連結により合成される直鎖ポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識モノマーが標識されたモノマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記標識モノマーが標識されたモノマーであり、前記の標識されたモノマーが蛍光色素を用いて標識されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記標識モノマーが標識結合モノマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記集団がさらに非標識モノマーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記集団が標識分子の少なくとも２つの小集団を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記集団が標識分子の少なくとも３つの小集団を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドを前記直鎖ポリマーの５プライム末端に付加する工程をさらに含み、前記オリゴヌクレオチドがターゲティングオリゴヌクレオチドとして作用するように付加される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドを前記直鎖ポリマーの３プライム末端に付加する工程をさらに含み、前記オリゴヌクレオチドがターゲティングオリゴヌクレオチドとして作用するように付加される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーを送達デバイスに取り付ける工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により製造される生成物。
【請求項１４】
（ａ）標識モノマーを含むオリゴヌクレオチドの第１の集団を提供する工程（ここで、前記標識モノマーは、５’−ＡＢ−３’の構造を有するオリゴヌクレオチドであり、ＡＢはＡが少なくとも１つのヌクレオチドに対応し、Ｂが少なくとも１つのヌクレオチドに対応するようなヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列ＡＢにおいて少なくとも１つのヌクレオチドに標識が組み込まれているか、または標識が結合しており；前記標識モノマーは５プライムホスフェートを含むか、または５プライムリン酸化することができ、前記標識モノマーはさらに３プライムヒドロキシルを含むかまたは３プライムヒドロキシルを受け取ることができる）と、
（ｂ）オリゴヌクレオチドの第２の集団を提供する工程（ここで、前記第２の集団は架橋オリゴヌクレオチドを含み、前記架橋オリゴヌクレオチドは前記標識モノマーに相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであり、それぞれの架橋オリゴヌクレオチドの配列は、前記架橋オリゴヌクレオチドそれぞれが前記標識モノマーの少なくとも２つと結合できるようになっている）と、
（ｃ）前記第１の集団および前記第２の集団を混合して、前記架橋ヌクレオチドを前記標識モノマーと結合させ、前記標識モノマーを、前記第１の集団の前記オリゴヌクレオチドの前記標識モノマーの連結に適した配置に配列させる工程と、
（ｄ）前記第１の集団の前記オリゴヌクレオチドを連結して標識分子として用いられるポリマーを形成する工程（前記ポリマーは前記標識モノマーから合成される直鎖ポリマーであり、前記直鎖ポリマーは前記オリゴヌクレオチドの配列を含み、前記オリゴヌクレオチドの前記配列は前記配列ＡＢの繰り返しを含む）とを含む、方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが前記オリゴヌクレオチドの連結により合成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーが前記オリゴヌクレオチドの酵素連結により合成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識モノマーが標識されたモノマーである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識モノマーが標識されたモノマーであり、前記標識されたモノマーが蛍光色素を用いて標識される、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標識モノマーが標識結合モノマーである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記集団がさらに非標識モノマーを含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記集団が標識分子の少なくとも２つの小集団を含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記集団が標識分子の少なくとも３つの小集団を含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドを前記直鎖ポリマーの５プライム末端に付加する工程をさらに含む、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドを前記直鎖ポリマーの３プライム末端に付加する工程をさらに含み
、前記オリゴヌクレオチドがターゲティングオリゴヌクレオチドとして作用するように付加される、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドがターゲティングオリゴヌクレオチドとして作用するように付加される、請求項２３〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリマーを送達デバイスに取り付ける工程をさらに含む、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法により製造される生成物。
【請求項２８】
（ａ）標識モノマーを含むオリゴヌクレオチドの第１の集団を提供する工程（ここで、前記標識モノマーは、５’−ＡＢ−３’の構造を有するオリゴヌクレオチドであり、ＡＢはＡが少なくとも１つのヌクレオチドに対応し、Ｂが少なくとも１つのヌクレオチドに対応するようなヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列ＡＢにおいて少なくとも１つのヌクレオチドに標識が組み込まれているか、または標識が結合しており；前記標識モノマーは５プライムホスフェートを含むか、または５プライムリン酸化することができ、前記標識モノマーはさらに３プライムヒドロキシルを含むかまたは３プライムヒドロキシルを受け取ることができる）と、
（ｂ）オリゴヌクレオチドの第２の集団を提供する工程（ここで、前記第２の集団は架橋オリゴヌクレオチドを含み、前記架橋オリゴヌクレオチドは前記標識モノマーに相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであり、それぞれの架橋オリゴヌクレオチドの配列は、前記架橋オリゴヌクレオチドそれぞれが前記標識モノマーの少なくとも２つと結合できるようになっている）と、
（ｃ）前記第１の集団および前記第２の集団を混合して、前記架橋ヌクレオチドを前記標識モノマーと結合させ、前記標識モノマーを、前記第１の集団の前記オリゴヌクレオチドの前記標識モノマーの連結に適した配置に配列させる工程と、
（ｄ）前記第１の集団の前記オリゴヌクレオチドを連結して標識分子として用いられるポリマーを形成する工程（前記ポリマーは前記標識モノマーから合成される直鎖ポリマーであり、前記直鎖ポリマーは前記オリゴヌクレオチドの配列を含み、前記オリゴヌクレオチドの前記配列は前記配列ＡＢの繰り返しを含む）と、
（ｅ）終結オリゴヌクレオチドを前記直鎖ポリマーの少なくとも一端に付加する工程とを含む、方法。
【請求項２９】
前記ポリマーが前記オリゴヌクレオチドの連結により合成される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリマーが前記オリゴヌクレオチドの酵素連結により合成される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記標識モノマーが標識されたモノマーである、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記標識モノマーが標識されたモノマーであり、前記の標識されたモノマーが蛍光色素を用いて標識される、請求項２８〜３１のいずれか１項つに記載の方法。
【請求項３３】
前記標識モノマーが標識結合モノマーである、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記集団がさらに非標識モノマーを含む、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項３５】
前記集団が標識分子の少なくとも２つの小集団を含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記集団が標識分子の少なくとも３つの小集団を含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドを前記直鎖ポリマーの５プライム末端に付加する工程をさらに含む、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドを前記直鎖ポリマーの３プライム末端に付加する工程をさらに含み、前記オリゴヌクレオチドがターゲティングオリゴヌクレオチドとして作用するように付加される、請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドがターゲティングオリゴヌクレオチドとして作用するように付加される、請求項３７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリマーを送達デバイスに取り付ける工程をさらに含む、請求項２８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法により製造される生成物。
【請求項４２】
前記第１の集団の前記標識モノマーが、前記第１の集団の前記オリゴヌクレオチドを連結する工程において所望のレベルの効率を提供する長さを有するようなものである、請求項１４〜２６または２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
（ａ）（１）標識モノマー（前記標識モノマーは連結可能なオリゴヌクレオチドであり、前記連結可能なオリゴヌクレオチドは標識分子として用いるための直鎖ポリマーの合成において用いられるモノマーとして作用するものである）と、
（２）架橋オリゴヌクレオチド（前記架橋オリゴヌクレオチドは前記標識モノマーに相補的な核酸配列を有し、それぞれの架橋オリゴヌクレオチドの配列は、前記架橋オリゴヌクレオチドがそれぞれ前記標識モノマーの少なくとも２つと結合できるようになっている）とを備える試薬のキットを提供することを含む、方法。
【請求項４４】
前記キットがさらにリガーゼを備える、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記キットがさらにＡＴＰを備える、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記キットがさらに連結緩衝液を備える、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記キットがさらにリガーゼ、ＡＴＰおよび連結緩衝液を備える、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２００３年６月１２日に出願された米国仮出願番号６０／３８８１９６（その全体は本発明の一部として参照される）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明はポリマー標識分子の合成および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸をベースとするおよび他の合成の樹状構造、炭化水素ポリマー、タンパク質および他の種類の分子を含む複数の標識または標識部分の結合部位を含有する分子は当該分野において公知である。これらの複数の標識された分子は水素結合塩基対結合（核酸分子）、抗体−抗原相互作用、ビオチン−アビジン結合および他の一般的なシステムの使用により一次または二次標的と結合する。
【０００４】
典型的には、核酸プローブ分子は、標識されたオリゴヌクレオチド、直接標識されたｃＤＮＡまたはＲＮＡ「ランオフ（ｒｕｎｏｆｆ）」分子、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡプローブまたは類似の物質からなる。標識されたオリゴヌクレオチドプローブは容易に入手可能であり、有効な反応を提供するが、一般にオリゴヌクレオチドはプローブあたり１つしか標識部分を含まず、感受性は低い。
【０００５】
直接標識されたｃＤＮＡまたはＲＮＡ「ランオフ」プローブ分子はオリゴヌクレオチドプローブよりも著しく大きく、酵素プロセスまたは類似のプロセスの間に取り込まれた標識を、１分子当たり複数含有する。プローブあたりの標識の数はさまざまで、プローブの長さ、塩基組成および組み込みの手順（酵素の種類および濃度、標識濃度、組み込み効率など）によって変わる。ハイブリダイゼーション効率は相補的な塩基の対合と物理的に妨害する嵩高い標識分子の存在によっても影響を受ける。さらに、望ましくないプローブ分子は、選択された標的分子中へ標識部分を取り込ませることについて特異性が低い酵素により標識されることが多い。
【０００６】
直接的な標識の取り込みおよび関連技術の信頼性が低い性質により、ハイブリダイゼーションの正常なプロセスを妨害しない標的分析物に複数の標識を送達する標識生成物を提供する必要がある。さらに、費用効果が高く、再現可能であり、大規模生産が可能である製造プロセスを用いて製造できる生成物が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、所望の用途において使用するためのポリマー標識分子を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、複数の標識部分を含有するポリマーオリゴヌクレオチド標識分子を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、多数の繰り返し配列を含有するオリゴヌクレオチド分子を提供することであり、各繰り返し配列は、少なくとも１つの標識部分を含有するか、または少なくとも１つの標識部分と結合するように設計されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にしたがって、これらに限定されるわけではないが、検定、診断試験、試薬キットなどの生化学、分子生物学、医学、または環境的な目的を含む所望の用途において用いられる高度に標識されたポリマー分子が提供される。好ましい具体例において、ポリマー分子は、一緒に結合して伸張された鎖を形成する多数の１種以上のモノマーオリゴヌクレオチド単位から構築される核酸である。これらのモノマーは、後述のように、互いに反応して、長く伸張させることができるポリマー鎖を形成することができる。ポリマーは、標識分子としての働きをする、言い換えれば検出可能なシグナルを生成する分子としての働きをするように提供される。従って、本発明の方法に対してさらに、多数の標識部分を有する非常に有効な標識としての働きをする長く伸張させることができるポリマーの、迅速で効率的で費用有効性の合成法が提供される。
【００１１】
各ポリマーの中には、標識モノマーとしての働きをする少なくとも１種のモノマー単位が提供される。好ましくは、標識モノマーは適切に設計されたオリゴヌクレオチドである。標識モノマーという用語は、「標識されたモノマー」および「標識結合モノマー」の両方を包含する。標識されたモノマーは、その中に１以上の標識部分を含むように設計されたモノマーを包含する。標識結合モノマーは、１以上の適切な標識部分と結合するかまたは標識部分を有するように設計されたモノマーを包含し、またそれ自体が標識を取り込むかまたは標識と結合する他の分子と結合できるモノマーも包含する。
【００１２】
本発明に対してさらに、その中に標識モノマーの単位を含むオリゴヌクレオチドの集団の繰り返しおよび連続したカップリングにより、任意の所望の長さおよびシグナル強度を有するポリマー鎖を合成することができる。これらのポリマー鎖は従って以下に記載されるように非常に多数の標識を送達するように簡単かつ有効に合成することができ、様々な潜在的用途において用いられるかなりの汎用性を有する非常に有効なシグナルを有する分子を提供する。
【００１３】
従って、本発明の様々な好ましい態様において、標識分子として使用されるポリマー核酸分子が提供され、該ポリマー核酸は、１種以上の合成または天然のオリゴヌクレオチドモノマーを含む集団から合成される。該集団内で、標識モノマー（標識されたモノマーまたは標識結合モノマーに関わらず）および非標識モノマー（標識部分が組み込まれていないかまたは標識部分には結合しないモノマー）の任意の所望の混合物を提供することができる。
【００１４】
これらのモノマーを任意の所望の方法で本発明に従って結合させ、ポリマー構造を形成することができる。さらに好ましい態様において、連結法を用いてモノマーを重合させて長い鎖にすることができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドの第２の集団を第１の集団と共に用いて、モノマー単位の連結の効率が促進される。この第２の集団は、最終ポリマーに、さらなる標識（例えば、第２のポリマー鎖）を提供するため、および／または任意の所望の程度の第２の鎖構造を提供するために用いることができる。
【００１５】
さらに好ましい別のまたはさらなる態様において、このオリゴヌクレオチドの第２の集団は、モノマーが自己会合して伸張されたポリマー鎖になるのを促進するために用いられる。これらはさらにこれらのモノマー間の連結の効率を増大させる働きもする。この態様のオリゴヌクレオチドは、「架橋オリゴヌクレオチド」としても知られ、第１の集団におけるモノマーの５プライムおよび３プライムセグメントに相補的であり、それぞれの架橋オリゴヌクレオチドは好ましくは少なくとも２つのモノマーの部分と結合し、これらを互いに隣接させて一方のモノマーの５プライム末端が他方のモノマーの３プライム末端に隣接するように配置すると、これら２つのモノマーが例えば連結により結合できる。例えば、架橋オリゴヌクレオチドは一方のモノマーの末端と他方の開始部分にハイブリダイズすることができ、これら２つのモノマーを互いに「架橋」する働きをする。このように、架
橋オリゴヌクレオチドをリガーゼの存在下で所望の標識モノマーと（および任意の他の所望のモノマーと）混合すると、高度に標識されたポリマー鎖が迅速に自己会合する。
【００１６】
さらなる好ましい態様において、ポリマーを目的の別の分子（分析物分子、プローブなど野いずれであるかには関わらず）に結合させるためにポリマーにおいて１種以上のターゲティング（ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ）オリゴヌクレオチドが提供される。このようなターゲティングオリゴヌクレオチドは、目的の所望の分子（標的）を認識し、これと結合するために提供される配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１７】
例えば、１以上のモノマーはそれ自体ターゲティングオリゴヌクレオチドとしての働きをするように設計することができる。したがって、ポリマーの合成のための集団内に、ターゲティングヌクレオチドのみとして、またはターゲティングヌクレオチドとしても、また標識モノマーとしても働く特定のモノマーを提供できる。
【００１８】
さらなるまたは他の態様において、モノマーでないが（すなわち、両方向にポリマー鎖を成長させるために使用されるものでない）オリゴヌクレオチドを終結させる１以上のオリゴヌクレオチド、すなわちポリマー鎖の最末端の一端または両端に結合することを意図されるオリゴヌクレオチドを提供することができる。これらの末端オリゴヌクレオチドはこれら自体がターゲティングモノマーを使用することに加えて、またはその代わりに、ターゲティングオリゴヌクレオチドとして働く。
【００１９】
さらに好ましくは、ポリマーは直鎖であるように設計される。従って、所望の標識およびターゲティング特性を有する伸張されたポリマー鎖を製造することができ、これらの特性は、標識されたモノマー、標識結合モノマー、非標識モノマーおよび／またはターゲティング配列（ターゲティングモノマーおよび／またはターゲティングオリゴヌクレオチドの形態のターゲティング配列であるかには関わらず）の反応混合物の組成により決定される。
【００２０】
本発明のさらなる目的および利点は、本明細書に記載された詳細な開示に関連して明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に従って、目的の任意の所望の状況において標識送達分子として使用される新規ポリマー構造が提供される。本発明の方法の好ましい態様によると、ポリマー分子は、核酸オリゴヌクレオチド分子の第１の集団を用いて合成される核酸分子であり、オリゴヌクレオチド分子の第１の集団は本明細書中でモノマーと称する。第１の集団のこれらのモノマーは、任意の所望の方法により伸張された鎖を形成するために結合される。好ましくは、結合は自己会合により、この自己会合はさらに好ましくは簡単で再現可能な酵素反応におけるモノマーの共有結合により行われる。好ましい態様において、ポリマー核酸は好ましくは直鎖である。
【００２２】
図１にさらに示すように、本発明の一連の態様に従って、オリゴヌクレオチドモノマーの第１の集団が提供され、上記モノマーはポリマー核酸構造を作るための個々の「ビルディングブロック」としての働きをする。このようなオリゴヌクレオチドモノマーは、２以上のヌクレオチドを含む分子である（これらの分子は天然に存在するものであるかまたは人工的に作られたもののいずれであってもよい）。本発明によると、オリゴヌクレオチドの長さおよびその構造は変わり得、モノマーの具体的なデザインはその意図される用途に適応させられる。例えば、天然に存在するヌクレオチドおよび／または合成ヌクレオチドは、モノマーのそれぞれを構築するために使用できる。天然に存在するヌクレオチドの例としては、例えばデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが挙げられ、一方、
合成ヌクレオチドの例としては、ロックト核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）等の構造が挙げられる。本発明に適したオリゴヌクレオチドは、合成による、クローニングによるなどにはかかわらず、任意の所望の手段により得ることができる。本発明に従って使用できる当該分野において多くの公知の技術が、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８（両方とも本発明の一部として参照される）に記載されている。
【００２３】
オリゴヌクレオチドモノマーの第１の集団内で、その中に「標識モノマー」、すなわち検出可能なシグナルを生成できる１以上の標識部分を含むように合成されたモノマー（標識されたモノマー）または所望の標識部分と結合できるモノマー（標識結合モノマー）の少なくとも１つの小集団が提供される。１、２、３、４、５、１０、２０、５０など、所望の数の標識モノマーの小集団を提供できる。上記第１の集団はさらに、必要に応じて、非標識モノマー（標識部分が組み込まれていないかまたは結合しないモノマー）の１以上の小集団を含むことができる。
【００２４】
第１の集団のオリゴヌクレオチドモノマーの重合が行われる場合、第１の集団における任意の標識モノマーを含むこれらのモノマーは互いに結合して、標識部分を含有するかまたはこれと結合するように設計された多数の繰り返し配列を含有するポリマー分子が生成する。各標識モノマーにおいて１以上の標識部分または標識部分結合配列を提供できる。数百または数千の標識モノマーを有する鎖を容易に作ることができるので、結果として得られる最終ポリマー分子は非常に高度に標識されたシグナル分子または様々な用途に適切なシグナル結合分子である。
【００２５】
その中に標識モノマーの単位を含むオリゴヌクレオチドの集団を繰り返し、連続してカップリングすることにより、合成されるポリマー鎖は任意の所望の長さおよびシグナル強度にすることができる。本発明の方法を用いて、これらのポリマー鎖は、非常に多数の標識を送達するために容易かつ有効に合成され、かなりの多様性を有する非常に有効なシグナルを分子保有している分子が提供される。
【００２６】
本発明の様々な好ましい態様において、標識分子として用いられるこのポリマー核酸分子は、第１の集団における少なくとも１種の合成または天然のオリゴヌクレオチドモノマーを含む集団から合成される。さらに詳細には、第１の集団内で、標識モノマー（標識されたモノマーまたは標識結合モノマー）および非標識モノマー（標識部分が組み込まれていないかまたは結合しないモノマー）の任意の所望の混合物を提供できる。
【００２７】
例えば、一連の態様において、少なくとも１種の標識モノマーを含む集団が提供され、ここにおいて上記標識モノマーは構造５’−ＡＢ−３’のオリゴヌクレオチドであり、ＡＢは、Ａが少なくとも１つのヌクレオチドに対応し、Ｂが少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに対応するような核酸であり、上記ヌクレオチド配列ＡＢにおける少なくとも１つのヌクレオチドは標識を取り込むか、またはこれに結合した標識を有し、上記標識モノマーは５プライムホスフェートを含むか、または５プライムリン酸化することができ、上記標識モノマーはさらに３プライムヒドロキシルを含むか、または３プライムヒドロキシルを受け取ることができる。
【００２８】
本発明のさらなる態様において、集団は少なくとも１種の標識モノマーを含み、上記標識モノマーは構造５’−ＡＬＢ−３’を含む標識されたモノマーであり、上記のように、Ａは少なくとも１つのヌクレオチドであり、５プライムホスフェートを含有するか、また
は５プライムリン酸化でき、Ｂは３プライムヒドロキシルを含有するか、または３プライムヒドロキシルを受け取ることができる少なくとも１つのヌクレオチドである。ＡおよびＢは任意のタイプのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列であり、Ｌは標識が組み込まれているか、またはこれに結合した標識（すなわち、検出可能なシグナルを生成する部分）を有する少なくとも１つのヌクレオチドである。
【００２９】
多数の標識されたモノマーおよび／または標識結合モノマーをその中に有する非常に伸張させられた鎖を生成するために標識結合および／または標識モノマーの重合を行うことができる。従って、用いられる集団は、完全に標識結合標識モノマーからなるか、または全体が標識されたモノマーからなる。
【００３０】
あるいは、１種以上の標識結合モノマー、および／または１種以上の標識されたモノマー、および／または１種以上の非標識モノマーの第１の集団においていくつかの混合物を用いることができる。例えば、一態様において、モノマーの集団は、構造５’−ＡＢ−３’の第１のモノマーおよび構造５’−ＣＤ−３’の第２のモノマーを含む少なくとも２つの異なる種類のモノマーを初期集団中に含み得る。Ａ（およびＣ）はそれぞれ少なくとも１ヌクレオチドの長さであり、それぞれは５プライムホスフェートを含有するか、または５プライムリン酸化することができ、ＢおよびＤはそれぞれ、３プライムヒドロキシル末端を含有するか、またはこれに結合したヒドロキシル基を有することができる少なくとも１ヌクレオチドの長さである。これらの態様において、第１のモノマーまたは第２のモノマーの何れか、あるいは両方は標識モノマーである。言い換えると、Ａおよび／またはＢおよび／またはＣおよび／またはＤは標識を取り込むかまたはこれに標識を結合できる。さらに、これらの具体例の第１の組において、配列Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは全部同一の配列であるわけではなく、したがってこれらの配列の少なくとも１つは他と異なっている。さらなる態様において、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは全部異なる配列である。
【００３１】
もう１つ別のこのような例において、構造５’−ＡＬ1Ｂ−３’および５’−ＣＬ2Ｄ−３’（式中、Ａは少なくとも１つのヌクレオチドであり、５プライムホスフェートを含有するか、または５プライムリン酸化することができ、Ｂは３プライムヒドロキシルを含有するか、またはヒドロキシル基が結合している少なくとも１つのヌクレオチドであり、ＡおよびＢは任意の種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列であり、Ｌ1およびＬ2はそれぞれ標識が組み込まれているかまたは標識が結合している少なくとも１つのヌクレオチドであり、Ｌ1およびＬ2は同一または異なる配列であってよく、同一または異なる標識を含み得る）を有する少なくとも２種のモノマーを第１の集団において提供できる。これらの態様の第１の組において、配列Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは全て同一の配列であるわけではなく、これらの配列の少なくとも１つは他と異なる。さらなる態様において、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは全部異なる配列である。
【００３２】
同様に、多くの他の構造の１種、２種またはそれ以上のモノマーを本発明に従って利用できる。好ましい一態様において、モノマーの均一な集団が提供される。すなわち、オリゴヌクレオチドの第１の集団は、単一配列全部の標識モノマーを含む。集団内のモノマーの全てはこの態様において標識モノマーであるので、ポリマー鎖の各モノマーは送達されるシグナルを最大にするために標識を取り込むかまたは標識と結合できる。あるいは、ポリマー核酸の特定の組成は目的の用途の必要性に応じて調整することができ、上記のように２種以上のモノマーの集団が用いられる。
【００３３】
本発明に従って任意の種類の標識を使用できるが、慣例の当該分野において公知の標識法が好適である。「標識」という用語は、本発明においては広義において用いられ、直接あるいはシグナル産生系の１以上の追加のメンバーとの相互作用によるかの何れかで検出可能なシグナルを提供できる物質を意味する。例えば、蛍光標識、化学発光標識、酵素標
識、および無機標識を含む多くの標識を本発明に従って用いることができる。標識は、好ましくは様々なシグナルを提供せず、そのかわりに一定期間にわたって一定の、再現可能なシグナルを提供するものである。
【００３４】
直接検出可能な標識としては、これらに限定されるわけではないが、蛍光検出、発色検出、および化学発光検出、または放射標識により検出可能な標識が挙げられる。例としては、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィン、およびその誘導体、クマリン（例えばヒドロキシクマリン）、ＢＯＤＩＰＹ，シアニン色素（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手）、アレキサ色素（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手）、蛍光色素ホスホルアミダイトなどの蛍光標識；３２Ｓ、３２Ｐ、３Ｈなどの放射性同位元素が挙げられる。あるいは、発色性基質を用いて検出されるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼなどのマーカー酵素を使用できる。たとえばＡＰの場合、検出は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートまたはニトロブルーテトラゾリウム塩を用いて行うことができる。あるいは、蛍光共鳴エネルギー転移も、Ｃａｒｄｕｌｌｏ，Ｎｏｎｒａｄｉａｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、“Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”、Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ４１４−４２３（全体として本発明の一部として参照される）に記載されているようにして測定できる。コロイド状金粒子またはフェリチンなどの無機標識を用いることができる。コロイド状金粒子の検出は、Ｖａｎ  ｄｅ  ＰｌａｓおよびＬｅｕｎｉｓｓｅｎ，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｇｏｌｄ  ａｓ  ａ  Ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ
Ｕｌｔｒａ−Ｓｍａｌｌ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，“Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”、Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ１１６−１２６（全体として本発明の一部として参照される）に記載されている。
【００３５】
シグナル産生系の１以上の追加のメンバーとの相互作用により検出可能なシグナルを提供する標識の例は、相補的結合対メンバーと特異的に結合する捕捉部位を包含し、ここにおいて相補的結合対メンバーは、直接検出可能な標識部分、例えば上記のような蛍光部分を含む。例えば、ビオチンをレセプターとしてのアビジンまたはストレプトアビジンとの結合リガンドとして使用できる。５（６）−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＦＬＵＯＳ）、７−アミノ−４−メチル−クマリン−３−酢酸−Ｎ’−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＡＭＣＡ、活性化）およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）から入手可能）などの１以上の標識をアビジンまたはストレプトアビジンと接合させることができる。タンパク質を蛍光標識で蛍光標識する方法、および蛍光標識を検出する方法は、Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ．，Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”，Ｇ．Ｈｏｗａｒｄ編、ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．１９９３、ｐｐ３９−６８（全体として本発明の一部として参照される）に記載されている。例えば、ストレプトアビジン−金、ストレプトアビジン−フルオロクロム、ストレプトアビジン−ＡＭＣＡ、ストレプトアビジン−フルオレセイン、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＴＰＥ）、ストレプトアビジン−スルホローダミン１０１、アビジン−ＦＩＴＣおよびアビジン−テキサスレッド（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．から商業的に入手可能）を含む様々な商業的に入手可能な標識されたストレプトアビジンおよびアビジン分子も利用可能である。
【００３６】
本発明の好ましい態様において、集団の標識されたモノマーは蛍光色素を用いて標識される。好ましくは、シアニン色素、例えばＣｙ３またはＣｙ５が利用されるが、他の好適な蛍光色素も同様に用いることができる。このような蛍光標識されたモノマーの好ましい供給源の１つは、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。しかしながら、このような蛍光標識されたモノマーは、必要に応じて、他の供給源から得ることができるか、あるいは当該分野において周知の方法を用いて合成できる。
【００３７】
同様に、標識されたポリマーを生成するためのサブユニットまたはビルディングブロックとしての働きをする任意の所望の配列を個々のモノマーについて用いることができる。本発明に関連して特に有用であることが判明しているいくつかの好ましい合成配列が開発されており、以下の実施例においてさらに議論する。これらの新規配列はすべて、二次構造が限定されているかまたは全くなく、Ｇｅｎｂａｎｋにおける典型的なＢＬＡＳＴ検索の結果に基づいて全て非生物的なものであると考えられる。
【００３８】
本発明のポリマーは好ましくは個々のモノマーサブユニットを互いにカップリングさせることにより生成される。このカップリングは任意の所望のプロセスにより達成できるが、好ましくは所望の長さのポリマー構造を産生するためのモノマー単位の連結を用いた自己会合プロセスにより行われる。あるいは、ポリマーの合成は適切に設計された鋳型に対してポリメラーゼを用いて、あるいは公知の増幅法を用いた直鎖ポリマーのサンプルの増幅によるなどして達成できる。
【００３９】
ポリマー構造の好ましい生成法を図１に示す。図に示すように、個々のオリゴヌクレオチドモノマーの第１の集団を所望の長さのポリマーを形成するように連結する方法が提供される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの例を例示の目的で図示したが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ（ロックト核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）などの配列に関係なく任意の核酸を用いることができるので、このような図は制限を意味するものではないが、あるオリゴヌクレオチド（例えばＰＮＡ）は酵素連結以外の結合技術を必要とし、これは好ましい態様である。
【００４０】
オリゴヌクレオチドであるモノマー単位の自己会合は以下にさらに記載するように本発明の好ましい態様である。しかしながら別の態様において、アミノ酸、抗体−抗原タイプの相互作用により産生される連結されたタンパク質配列などの他の標識されたモノマー単位を用いることができる。一旦モノマーの集団が提供されると、これらのモノマーはカップリングして伸張されたポリマー鎖を形成する。モノマー単位を集合させて共有または非共有手段によりポリマー構造にする当該分野において公知の任意の所望の手段を本発明の原理にしたがって用いることができる。たとえば、オリゴヌクレオチドモノマーを分子生物学の公知の技術を用いて会合させて、伸張された核酸鎖にすることができる。あるいは、標識されたアミノ酸分子を会合させてタンパク質の適切な鎖にすることができる。
【００４１】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドモノマーは酵素または化学的によらず連結を用いて会合させられる。好ましくは、酵素連結が用いられる。オリゴヌクレオチド対の酵素連結の技術は、当該分野において一般的であり、隣接するオリゴヌクレオチドを結合して連続したオリゴヌクレオチド鎖を形成するリガーゼと呼ばれる周知の酵素を用いる。このような方法は一般に、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（全体として本発明の一部として参照される）に記載されている。代表的な十分に特徴づけられた適切なリガーゼとしては、これらに限定されないが、Ｔ４リガーゼ、Ｔ７リガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ
、Ｔａｑリガーゼ、ならびに大腸菌のＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼが挙げられる。
【００４２】
公知のように、酵素連結反応は一般に、特定の反応のために適切なレベルに溶液のｐＨが維持されている緩衝溶液中で行われる。温度などの他のパラメーターも公知のように同様に調節することができる。同様に、連結は、リン酸塩転移剤、例えばＡＴＰ、スルフヒドリル試薬（ＤＴＴおよび２−メルカプトエタノールを含む）、および二価のカチオン、例えばＭｇ＋２塩などの、反応を促進する添加物の存在下で行うことができる。同様に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの薬剤以外を使用することが、連結の促進に有用であり、および／または２００ｍＭまでのＮａＣｌを含めることも連結の促進に有用である。本発明と組み合わせて用いるために設計された以下に開示される新規の合成配列を使用する場合、このような配列は特に、二次構造を最小にするように設計されている。しかしながら、他の配列を使用すると、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質をオリゴヌクレオチド連結反応に添加して鋳型鎖の任意の二次構造をゆるめ、したがって、相補オリゴヌクレオチドを結合・連結させ、反応効率を向上させることができる。例えば、大腸菌の一本鎖結合タンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．またはＡｍｅｒｓｈａｍ／ＵＳＢ）および／またはＴ４  Ｇｅｎｅ３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）を使用できる。
【００４３】
必要に応じて、リガーゼは熱安定性リガーゼであってよく、この場合において温度循環技術が可能である。熱安定性リガーゼを用いた温度循環は、例えばポリメラーゼ連鎖反応と類似しているが、オリゴマーおよびリガーゼをｄＮＴＰおよびポリメラーゼのかわりに使用する方法で核酸を増幅する方法を含む様々な用途において有用である。酵素連結の代替法として、化学連結も本発明に従って用いることができる。例えば、Ｋ．Ｄ．Ｊａｍｅｓ，Ａ．Ｄ．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４５９５６０５、（１９９７）；Ｎ−シアノイミダゾール；Ｔ．Ｌｉ、Ｋ．Ｃ．Ｎｉｃａｌａｏｕ、Ｎａｔｕｒｅ、３６９、２１８−２２１（１９９４）；ＥＤＡＣ：Ｄ．Ｓｉｅｖｅｒｓ、Ｇ．Ｖｏｎ  Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ、３６９、２２１−２２４（１９９４）参照（これらは全て全体として本発明の一部として参照される）。例えば、化学連結を酵素によっては連結できない合成オリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。
【００４４】
連結は、平滑末端を有するか、または突出を有するオリゴヌクレオチドの対に関して行うことができ、後者が好ましい。場合によっては、特定のリガーゼに対して最小数のヌクレオチド塩基が提供されなければならない。（例えば、Ｃ．Ｅ．ＰｒｉｔｃｈａｒｄおよびＥ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３４０３−３４０７（１９７７）（適当な有効性を得るための約６〜８塩基の最小長さについて議論し、全体として本発明の一部として参照される）参照）。本発明に従って、連結は、１または２塩基またはそれ以上であろうとなかろうと、特定のリガーゼによって隣接するオリゴヌクレオチドに結合する任意の数の塩基を用いて行われる。しかしながら、中程度の効率を得るためには、一般的には、各オリゴヌクレオチドに関して少なくとも４塩基が好ましい。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いる例の好ましい態様において、最適効率を得るためには、少なくとも７塩基が好ましい。
【００４５】
従って、各モノマーの好ましい長さまたは長さの範囲は、問題になるリガーゼの最適な機能に必要なヌクレオチドの数により影響を受けるであろう。したがって、オリゴヌクレオチドモノマーの一部（または好ましくは全部）は特定のリガーゼと組み合わせて所望のレベルの効率を提供するサイズに構築できる。同様に、望ましい標識の種類は必要とされるモノマーの最小長さに影響を及ぼし、またモノマーごとの可能な標識の最大数に影響する。例えば、標識間隔は：１）非常に近接している場合に自己消滅を示す蛍光色素；２）
かさ高く、立体的に妨害される他の標識デバイスを引きつける結合部分（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニン）３）立体または基質処理の原因のために適当な間隔を必要とするシグナルを生成させるために用いられる酵素などを含む多くの種類の標識部分の適切な機能に重要であることが多い。したがって、シアニン色素などの蛍光色素を使用する場合、Ｃｙ５はシグナルの消滅を回避するためには、標識間に約６ヌクレオチドの間隔を必要とし、Ｃｙ３は９塩基の間隔を必要とする。一方、放射標識は、通常、必要な間隔は最小であるかまたは必要としない。
【００４６】
従って、本発明の好ましい態様の１つにおいて、１５ｍｅｒ（マー）のまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドモノマーが好ましい。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで最適に連結させるためには少なくとも６〜７塩基（好ましくは７）が必要なので、最低１５オリゴヌクレオチドの長さを使用することにより、それぞれの側に最低７塩基が提供される。さらに好ましい態様において、モノマーの中間はＣｙ５またはＣｙ３などの蛍光色素である。従って、１４個の塩基が色素の間に提供され、これは消滅効果を回避するために十分である以上のものである。しかしながらこれらのパラメーターは、１つの好ましい態様の単なる例である。オリゴヌクレオチドの長さはもちろん、一般的には、使用されるリガーゼ、使用される標識、１つのモノマーあたりに含まれる標識の数（例えば、各モノマーごとに１つの標識、または２〜５個の標識、または６〜１０、１０〜２０、２１〜１００個など）等の要因に応じて、所望の状況に適合させて設計することができる。
【００４７】
さらに好ましい態様によると、反応混合物は相補的「架橋分子」の形態のオリゴヌクレオチドの第２の集団を含む。これらの架橋分子のそれぞれは、第１の集団の２以上のモノマーを結合し、配列させるために用いられ、架橋分子はその後の連結のための「スカフォード」としての働きをする。さらに、各相補的架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのモノマーを橋渡しをして連結するだけでなく、これらのモノマー間の連結部位の何れかの側に二本鎖部分を提供し、この二本鎖セグメントは、例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ対ＤＮＡの連結により行われるものなど、ある種のリガーゼ反応に必要な条件である。
【００４８】
図１の好ましい態様において示されるように、第２の集団におけるオリゴヌクレオチド架橋分子のそれぞれは、第１の集団からの２つのモノマーをこれらの２つのモノマーに連結させ、これらの間の連結部位を橋渡しするような方法でハイブリダイズする。例えば、相補的な架橋分子はそれぞれ、各モノマーの開始部分に相補的な核酸の第１の配列を伴って、さらには、各モノマーの末端に相補的な第２のセグメントを伴って提供され、これにより連結の意図される側を渡って２つのモノマーが「架橋」される。
【００４９】
別の態様において、架橋オリゴヌクレオチドが必要に応じて、２以上のモノマーを架橋するために提供される。例えば、３、４、５またはそれ以上のモノマーが集められた長い架橋分子を用いることができる。これらの態様において、「架橋」分子は、架橋分子の両端でモノマーに重なるだけであり、１以上のモノマーが重ならずに架橋分子と（例えば中央で）ハイブリダイズする。同様に、架橋分子の両端でハイブリダイズするモノマーでさえも（１つの架橋あたり２個以上のモノマーを用いるかどうかにかかわらず）、平滑末端の連結を行うことができるので突出している必要がない。しかしながら、両端で突出を使用することにより、一般的にはさらに効率よく連結できると考えられるので、好ましい。
【００５０】
第１の集団が連結される複数の種類のモノマーを含む場合において、これらの異なる種類のモノマーは架橋分子の１つの集団によりそれらを整列させるために好ましくは全て５’末端および３’末端に同じ配列を有する。あるいは、複数の種類のモノマーが第１の集団に存在する場合に複数の架橋分子を用いることができる。
【００５１】
架橋モノマーもポリマーに第２の鎖を提供する。この第２の鎖は、必要に応じて、連続であっても、不連続であってもよい。例えば、架橋分子は、２つのモノマーを一緒に架橋する場合（架橋分子もリガーゼにより連結される）互いに隣接するように十分長いか、または架橋分子は二本鎖および一本鎖セグメントの両方を有するポリマーを産生する隣接するモノマー間で第２の鎖上にギャップがあるようにモノマーよりも短くてもよい。
【００５２】
ある用途においては、二本鎖の最終ポリマーが好ましく、この場合、架橋オリゴヌクレオチドは互いに連結されるために十分な長さであり、最終の二本鎖分子はこの用途において使用するためにそのままの状態である。他の用途においては一本鎖の最終ポリマーが好ましく、この場合において二本鎖は分離することができるか、あるいは一方の鎖を、公知の方法を用いて分解することができる。さらに別の態様において、最終ポリマーは一本鎖および二本鎖セグメントの両方を有し、一本鎖セグメントが隣接しない架橋分子間に間隔をおいて位置する。
【００５３】
様々な態様において、架橋分子は単に、モノマーの対を一緒に架橋してその自己会合を促進するために用いることができる。しかしながらさらに別の態様において、架橋分子はそれ自体標識を含むか、またはその上に標識を有するように設計される。例えば、架橋オリゴヌクレオチドは上記第１の集団のモノマーと類似したモノマーであってもよい。この態様において、第２の集団のオリゴヌクレオチドは第１の集団に関して記載したのと同じ方法でその中に標識ヌクレオチドを含む。従って、第１および第２の集団がいずれも標識モノマーを含む場合、これらの２つの集団は互いに両方を架橋し、かつ両鎖上に標識を有するポリマーを生成する働きをする。
【００５４】
本発明によると、本発明の方法により合成されるポリマー分子は、標識部分を含有する少なくとも２つの合成オリゴヌクレオチド分子を含有する。しかしながら、さらに好ましくは少なくとも５、ｌ０、２０、５０、１００、５００、１０００、または数千、またはそれ以上のモノマーを有するポリマーを本発明に従って容易に合成することができる。従って、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、または数千、またはそれ以上の標識部分を含有するポリマーを容易に生成させることができる。
【００５５】
一般に、本明細書において記載するモノマーを連結する好ましい方法を用いたポリマー核酸の合成により、様々な長さのポリマーの集団が生成する。モノマーが全て標識されている場合、これらのポリマーの長さは、ポリマー分子中に含まれる標識部分の数に対応する。例えば、図２ａはポリマー分子の一連の合成から得られる実験結果を示し、架橋分子のオリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる比でのポリマーの大きさの変化を示す。図に示される好ましい態様において、実験に用いた１５マーのオリゴヌクレオチドは、８番目の塩基上でＣｙ３蛍光色素部分で標識され、塩基マーカーはレーン１に示され、モノマーとして用いられる１５マーのオリゴヌクレオチドに対して異なる割合の１４マーの架橋オリゴヌクレオチドは、レーン３から１０に示される。レーン３および７は１：１の割合の架橋分子とオリゴヌクレオチドを用いて産生されるポリマーの大きさの違いを示し、レーン４および８は２：１の割合の架橋分子とオリゴヌクレオチドの使用を示し、レーン５および９は３：１の割合の架橋分子とオリゴヌクレオチドを示し、レーン６および１０は４：１の割合の架橋分子とオリゴヌクレオチドを示す。
【００５６】
所定の用途に関して、検定の必要性などに基づき、反応速度論などの要因の観点から、さらに短いかまたは長い直鎖ポリマーが望ましい。産生される上記直鎖ポリマー分子の所望の長さはしたがって、反応条件を調節することによりおよび所望の長さの分子を精製することにより調整することができる。
【００５７】
長いか短いかに関わらず、これらのポリメラーゼは標識分子で極度に充填されている。
さらに、これらの高度に標識された分子は、放射活性を使用することなく、または放射性廃棄物を生成することなく産生することができる。さらに、本発明は、これらの高度に標識されたポリマー核酸の合成が、モノマーとしての働きをする少なくとも１種の連結可能なオリゴヌクレオチド、相補的架橋オリゴヌクレオチド、適切なリガーゼ（例えばＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ）、連結緩衝液、およびＡＴＰの単純な混合物を用いて容易に達成されるという特筆すべき利点を提供する。さらに、反応は一般的には、数分から数時間で完了する。連結産物の平均の長さを決定することが望ましい場合には、反応物の条件および濃度を変更することができる。
【００５８】
本発明に従って、本発明の直鎖ポリマーを産生する好適な試薬を個別にまたはキットで提供できる。例えば、好適なオリゴヌクレオチドモノマーおよび／または相補的架橋オリゴヌクレオチドを、直鎖ポリマーを産生するキットで、あるいは個々の試薬として提供できる。このようなキットはさらに、リガーゼ、ＡＴＰ、連結緩衝液、終結オリゴヌクレオチドなどの本明細書中で開示された任意の他の所望の試薬を含み得る。
【００５９】
さらに本発明に従って、ポリマー標識分子を任意の所望の手段によりさらに別の分子と結合させることができる。好ましい態様において、ポリマー標識分子はポリマーの３プライムまたは５プライム末端のいずれか、あるいはこれらの末端の両方にターゲティング構造を引き付けることにより標的化ができるようになる。このようなターゲティング構造は、平滑末端または突出連結、３プライム末端の末端ｄ−トランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）での塩基伸張、および他の公知のプロセスを含む様々な反応により結合させることができる。あるいは、１以上のモノマーそれ自体を、直接または間接的にさらに別の分子、またはさらに別の分子と結合した部分に結合させることができる。
【００６０】
標的化の目的のために、終結オリゴヌクレオチドを使用することの説明として、図３ａ、３ｂおよび３ｃは、３プライムおよび／または５プライムターゲティングまたは捕捉オリゴヌクレオチド分子の、標準的な突出ＤＮＡ対ＤＮＡ連結反応によるポリマー分子との結合を説明する。例えば図３に示すように、ターゲティングオリゴヌクレオチドを連結によりオリゴヌクレオチドの３プライムおよび／または５プライム末端と結合させることができる。終結ターゲティングオリゴヌクレオチドは連結によるモノマーの重合前、重合の、または重合完了後に付加することができ、その結果、ターゲティングオリゴヌクレオチドが成長するポリマー鎖とさらに連結される。
【００６１】
このターゲティングオリゴヌクレオチドは好ましくは第２の分子上の配列に相補的であるように選択され、相補鎖のハイブリダイゼーションによりポリマーの捕捉が可能になる。例えば、ターゲティングオリゴヌクレオチドは分析物分子、デンドリマー、本発明のさらに別のポリマーオリゴヌクレオチドなどの上の配列と相補的であり得る。第２の分子上のこの配列は、標識されたポリマーを捕捉するために用いられ、従って本発明においては「捕捉配列」と称される。
【００６２】
しかしながら、ターゲティングまたは終結オリゴヌクレオチド配列（すなわち、標識されたモノマーとは異なるもの）を同時ポリマー連結反応に添加することは、連結反応の部分的阻害剤としての働きをし、その結果、産生されるポリマーの平均サイズが小さくなる。阻害は添加されるターゲティングヌクレオチドの濃度に依存することが判明している。従って、ターゲティングオリゴヌクレオチドがポリマーを終結させるために添加される場合、この終結オリゴヌクレオチドの濃度を、ターゲティングオリゴヌクレオチドを含有する標識されたポリマー分子の大きさおよび収量を最大にする濃度に限定することが望ましい。定義のために、本明細書においては、終結オリゴヌクレオチドという用語は、ポリマーの５プライムまたは３プライム末端に付加されたモノマー単位以外の任意のオリゴヌクレオチドを意味する。このような終結オリゴヌクレオチドは重合反応前、重合反応の間に
同時に、またはその後に付加することができる。図３ａは、ポリマー分子の５プライムおよび３プライム末端の両方にターゲティングヌクレオチドが付加される態様を示す。
【００６３】
図３ｂに示すように、本発明の別の態様において、ターゲティングオリゴヌクレオチドはポリマーの一方の末端にのみ添加される。例えば、ターゲティングオリゴヌクレオチドは図に示すように３プライム末端にのみ結合させることができる。図３ｂの態様において、架橋オリゴヌクレオチド、標識されたオリゴヌクレオチド（モノマー）および終結オリゴヌクレオチドは適切なリガーゼ（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼなど）とともに、反応混合物に全部同時に添加できる。あるいは、終結オリゴヌクレオチドは連結前または後に添加できる。終結オリゴヌクレオチドは、ポリマーの３プライム末端に架橋オリゴヌクレオチドの突出末端に相補的な５プライム末端（配列Ａ）を含む。
【００６４】
しかしながら、終結オリゴヌクレオチドはさらに、架橋オリゴヌクレオチドに相補的ではなく、これとハイブリダイズしない３プライム末端（配列Ｘ）を伴って提供される。終結オリゴヌクレオチドの３プライム末端が架橋オリゴヌクレオチドとハイブリダイズできないので、その結果、終結オリゴヌクレオチドの架橋オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズがポリマー分子の３プライム末端では起こらず、重合はこの末端で停止する。その後モノマー単位が互いに連結し、モノマーが３プライム末端で終結オリゴヌクレオチドと連結すると、その結果、ポリマー分子の５プライム末端でモノマー配列を有し、ポリマー分子の３プライム末端に終結オリゴヌクレオチド配列を有するポリマーが得られる。
【００６５】
終結（停止）オリゴヌクレオチドを図３ｃに示すようにポリマー分子の５’末端のみにハイブリダイズさせるために同じ原理を用いることができる。このような態様において、架橋オリゴヌクレオチドに対する非相補配列（配列Ｙ）が終結オリゴヌクレオチドの５プライム末端に提供され、架橋分子に対する相補配列（配列Ｂ）は終結オリゴヌクレオチド（停止オリゴヌクレオチドとも言う）の３プライム末端に提供される。したがって、モノマー単位を添加すると、成長している分子の５プライム末端が停止し、重合が５プライム末端で停止する。
【００６６】
同様に、２つの異なる種類の終結オリゴヌクレオチドを用いることができる。図３ｂおよび３ｃに関してすでに記載したような両タイプのオリゴヌクレオチドを用いることにより、１種の終結オリゴヌクレオチドをポリマーの５プライム末端に、他のものをポリマーの３プライム末端にハイブリダイズさせることができる。
【００６７】
一旦ポリマーが形成されると、標識の大きさ、数および他のパラメーターに基づいてポリマー分子の異なる集団を精製するために様々な方法を用いることができる。典型的には、分子のより小さなフラクションを排除するためにサイズ排除樹脂を用いることができる。連続または不連続勾配は最大から最小までの分子を含有するフラクションを集めるために有用である。ポリアクリルアミドゲル精製、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティービーズ、または他の一般的な手動または自動化システムは様々な大きさの分子を分離するためにも有用である。機能的に、本発明の異なる大きさのポリマー分子を異なる用途に用いることができる。例えば、より小さな分子は、標識されたポリマーを接近しにくい構造に対してハイブリダイズさせることが必要であるある種のインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにより好適であり、一方、さらに多くの標識を有するさらに長いポリマーはシグナルの良好な増幅のためのマイクロアレイ上での使用にさらに好適である。
【００６８】
標識されたポリマー分子は、核酸、タンパク質およびペプチド、炭水化物、脂質などを含む標的分子の検出において潜在的有用性を有する。典型的な検定用途としては、蛍光および化学発光マイクロアレイおよびマクロアレイ、蛍光および酵素標識を利用するインサ
イチュハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡおよびハイブリダイゼーションアッセイ、および他の用途が挙げられる。
【００６９】
本発明の様々な態様において、本発明のポリマーは１以上のモノマー単位、および／または終結オリゴヌクレオチド、および／または１以上のモノマーまたは終結オリゴヌクレオチドの何れかの上の部分を介してさらに別の分子に結合する。一連の好ましい態様において、例えば終結オリゴヌクレオチドは別の核酸上の相補配列とハイブリダイズし、上記相補配列は終結オリゴヌクレオチドおよびポリマーを「捕捉」するために用いられる。相補配列は、本明細書においては「捕捉配列」とも称する。例えば図４ａおよび４ｂは核酸プローブにポリマーを結合させるための間接および直接法をそれぞれ表し、図４ａの第１の例は捕捉配列の架橋により行われ、図４ｂの第２の例はプローブにポリマーを直接カップリングさせることによる。
【００７０】
例えば図４ａにおいて、ポリマーは、一端に分析物分子上の捕捉配列に相補的である終結オリゴヌクレオチドを伴って提供される。分析物分子は、目的の任意の所望の分子である。好ましい態様において、分析物はｃＤＮＡ分子である。例えば捕捉配列を逆転写プロセスにおいて用いられるプライマーの一部として提供することにより、捕捉配列を含むｃＤＮＡ分子を合成することができる。このような態様のさらなる詳細は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／０７４７７（２００１年３月８日提出）（国際公開番号ＷＯ０１／０６６５５５）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／０１／２２８１８（２００１年７月１９日提出）（国際公開番号ＷＯ０２／０６５１１）、およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９５８９（２００１年９月２０日提出）（国際公開番号ＷＯ０２／０３３１２５）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５０２２（２００２年２月２０日提出）（国際公開番号ＷＯ０３／０１２１４７）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／２７７９９（２００２年９月３日提出）（国際公開番号ＷＯ０３／０２０９０２）（これらは全て全体として本発明の一部として参照される）に開示されている。相補的な終結オリゴヌクレオチドに対して分析物分子の捕捉配列をハイブリダイズすることにより、標識されたポリマーを捕捉し、その結果分析物核酸を標識する。これらの分析物核酸を公知の配列のプローブ、例えばマイクロアレイ、または膜、またはインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）などの固体表面に固定化されたプローブにハイブリダイズさせることができる。
【００７１】
あるいは、ポリマーを分析物分子にハイブリダイズさせるかわりに、図４ｂに示すように核酸を標識するために、ポリマーを分析物核酸に直接共有結合させることができる。この共有結合は、分析物核酸をプローブ、例えばマイクロアレイ、または膜、またはインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）などの固体表面に固定化されたプローブにハイブリダイズさせる前または後に行うことができる。
【００７２】
ポリマー標識分子は、送達デバイス、すなわち、多くのポリマーを集め、多数のポリマーを標的に送達する物質に結合される標識部分としても有用である。このような送達デバイスは、従ってシグナル増幅分子、すなわちそれ自体複数の標識分子を保持することができる、および／またはターゲティングシステム、すなわち所望の標的に結合させるためのシステムとして作用できる分子として作用できる。
【００７３】
したがって、シグナル増幅分子が本発明の複数のポリマーを有する場合、それ自体シグナル増幅分子（すなわち、ポリマー）を有するシグナル増幅分子が提供され、その結果、非常に有効なシグナル分子が提供される。これは、シグナル増幅が、第３のシグナル増幅を有する第２のシグナル増幅分子を有するような複合体を形成するなどに、有用なだけ必要に応じた回数を、同様に複数回繰り返すことができる。しかしながら、任意のこのようなデザインは、好ましくは最終複合体の反応速度論を考慮すべきである。
【００７４】
様々な送達デバイスまたはシグナル増幅分子を本発明に従って用いることができる。好ましい態様において、送達デバイスまたはシグナル増幅分子はデンドリマーである（核酸または他の成分（例えば、プラスチックなど）のデンドリマーのいずれであるかを問わない）。最も一般的には、デンドリマーは、二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の複数の相互に結合させた天然または合成のモノマーサブユニットからなる複雑で高度に分岐した分子の形態の樹状核酸分子である。このような樹状核酸分子は、Ｎｉｌｓｅｎら、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１８７，２７３−２８４（１９９７）；Ｓｔｅａｒｓら、Ａ．Ｎｏｖｅｌ，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３；９３−９９（２０００）；および様々な米国特許、例えば米国特許第５１７５２７０号；第５４８４９０４号；第５４８７９７３号；第６０７２０４３号；第６１１０６８７号；および第６１１７６３１号に記載されている。これらの刊行物はすべて全体として本発明の一部として参照される。
【００７５】
デンドリマーは、表面上に２種の一本鎖ハイブリダイゼーション「アーム」を含み、これは２つの重要な官能基を結合させるために用いられる。１つのデンドリマー分子は、表面上に少なくとも１００の各種アームを有する。１種のアームは、例えば特定のターゲティング分子と結合させて標的特異性を形成するために用いることができ、他のものは本発明のポリマー標識分子などの標識またはマーカーを結合させるために用いられる。デンドリマーの標的および標識特異性を決定する分子は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド接合体の何れかとして結合される。簡単なＤＮＡ標識、ハイブリダイゼーション、および連結反応を用いて、デンドリマー分子は高度に標識された標的特異性プローブとして作用するように構成することができる。
【００７６】
例えば、本発明の標識された直鎖ポリマーは、デンドリマーの１種のアームとハイブリダイズすることができ、標的配列は捕捉配列を用いてデンドリマーのもう一方の種類のアームとハイブリダイズすることができる。このような態様は、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／０７４７７（２００１年３月８日提出）（国際公開番号ＷＯ０１／０６６５５５）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／０１／２２８１８（２００１年７月１９日提出）（国際公開番号ＷＯ０２／０６５１１）、およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９５８９（２００１年９月２０日提出）（国際公開番号ＷＯ０２／０３３１２５）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５０２２（２００２年２月２０日提出）（国際公開番号ＷＯ０３／０１２１４７）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／２７７９９（２００２年９月３日提出）（国際公開番号ＷＯ０３／０２０９０２）（これらは全て全体として本発明の一部として参照される）に開示されている。したがって、本発明のポリマー核酸はデンドリマーアームに結合されるとこれらの出願に記載されているシグナル分子として使用できる。あるいは、標識された直鎖ポリマーはデンドリマーの両種類のアームに結合させることができ、図５に示すようにシグナル強度がさらに向上する。様々なさらなる態様および発明もこれらのＰＣＴ出願に開示されており、これらはいずれも本出願の発明と組み合わせて使用できるか、または本発明を使用するために変更できる。
【００７７】
デンドリマー送達デバイスの組み立ての概略図を図５ａおよび５ｂのさらなる態様において示す。例えば図５ａにおいて示すように、本発明のポリマーは樹状分子のアームに結合させることができる。ポリマーはデンドリマーの１種以上のアームに、例えばポリマー上の終結オリゴヌクレオチドを相補配列を含有するデンドリマーアームにハイブリダイゼーションさせることにより結合させることができる。架橋可能な配列を有する終結させることができるオリゴヌクレオチドを用いることにより、デンドリマーアームとハイブリダイズする終結オリゴヌクレオチドをデンドリマーアームと架橋させ、デンドリマーにポリマーを共有結合させることができる。当該分野において公知の任意の好適な架橋剤を本発
明に従って用いることができる。
【００７８】
好ましくは、ソラレンなどの架橋剤を用いることができ、これは光活性化の際にＤＮＡ鎖を架橋できる能力を有する直鎖フロクマリンである。例えば、Ｇｌａｓｓ、米国特許第４８２６９６７号参照（全体として本発明の一部として参照される）。あるいは、光活性化可能な化合物、例えばクマリンまたはクマリン類似体のフェニル環をＤ−リボースまたはＤ−２−デオキシリボース分子の１位に連結させることにより調製されるヌクレオチド類似体などを使用できる。例えば、Ｓａｂａ、米国特許第５０８２９３４号を参照のこと（全体として本発明の一部として参照される）。クマリン環系の３および４位間の二重結合は、このヌクレオシド類似体を含有するプローブがハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられる場合に相補鎖のヌクレオシドを共有結合する光活性化が可能な基である。他の架橋剤も同様に本発明に従って使用できる。
【００７９】
図５ａに示すように直鎖ポリマーの末端のデンドリマーアームへのハイブリダイゼーションおよび架橋の代わりに、直鎖ポリマーは一端に連結可能な終結配列を伴って提供されてもよい。
【００８０】
さらに、図５ａおよび５ｂの方法によると、２つの直鎖ポリマーを使用できる。図に示すように、第１の標識された直鎖ポリマーを一種のデンドリマーアームに結合させることができ、シグナル化の目的に使用される。第２の直鎖ポリマーも提供され、第２のタイプのデンドリマーアームにポリマーの一端を結合させる。この直鎖ポリマーの第２の末端上にターゲティング配列を有する終結オリゴヌクレオチドが提供される。
【００８１】
一旦結合されていない物質が精製されると（すなわち、ポリマーが結合しているデンドリマーのみが残り、遊離のポリマーまたは遊離の終結オリゴヌクレオチドまたは望ましくない混入物質を含まない）、直鎖ポリマーをプローブとハイブリダイズさせるためにターゲティング配列を使用できる。従って、プローブがマイクロアレイ上、ブロット上にあるかどうかにかかわらず、あるいはインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）などの他の方法が用いられるかどうかにかかわらず、直鎖ポリマーがその多くのアームに結合した全デンドリマー複合体全体をプローブにハイブリダイズさせる。第２の直鎖ポリマーはターゲティング配列だけでなく、標識をも含むので、シグナル強度は１種のアーム上にだけ標識を使用するよりもさらに向上する。
【００８２】
さらに別の態様では、直鎖ポリマーを、両方の種のデンドリマーアームに結合するように作成することができる。ここでは、いずれの直鎖ポリマーにも、ポリマーの第２の末端にターゲティング配列が含まれる。したがって、この態様では、デンドリマーの両方のアームが標識され、さらにプローブにハイブリダイゼーションするためのターゲティング配列が含まれて、プローブ−標的感度および特異性がなおさらに高められる。
【００８３】
さらに別の送達デバイスは、１以上の直鎖標識ポリマー分子を結合できる部分を含む酵素により合成されるかまたは化学的に産生される核酸分子を含む。これは、例えば以下のものを含むが、これに限定されるわけではない。
【００８４】
（１）直鎖ポリマー分子を結合できる部分を含むヌクレオチドを使用してＲＮＡ鋳型からの逆転写酵素反応により合成されるＤＮＡ分子。この例は、スクシンイミジルエステル、スルフヒドリルまたは同等の匹敵する架橋可能な部分を含有する直鎖ポリマー末端を化学的に結合できる第一級アミンで標識されたヌクレオチドを含む。
【００８５】
（２）ＤＮＡポリメラーゼの使用により酵素的に合成される架橋可能な部分（上記の通り）を含有するＤＮＡ分子。この例には、ＰＣＲ増幅されたか、または同様にして産生さ
れた分子を包含する。
【００８６】
あるいは、（３）ＲＮＡポリメラーゼの使用により酵素的に合成される架橋可能な部分（上記の通り）を含有するＲＮＡ分子。この例は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡプロモーター配列を含有するＤＮＡ鋳型から産生されるＲＮＡランオフ転写物および適切なＲＮＡポリメラーゼ酵素を包含する。
【００８７】
さらに、本発明はマイクロアレイと組み合わせて特に有用であるが、他のアッセイシステムにも適用可能である。多くの異なるマイクロアレイ構造およびその製法は当業者には周知であり、例えば、その１つが、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，８３，１９９９（その内容は全体として本発明の一部として参照される）に記載されている。一般に、マイクロアレイは核酸分析に有用な高速技術であり、空間的に分布し、ガラス板、シリコンまたはナイロン膜などの実質的に平面的な基体に安定して結合している複数の異なる核酸または遺伝子プローブ（すなわち、ポリヌクレオチド）を含む。したがって、基体に小さなスポット（例えば直径が数ミクロン）の格子線をコーティングし、各スポット（すなわち特徴）にはＤＮＡまたはヌクレオチドの短い配列の数百万のコピーを含ませる。コンピューターで基体上の各配列の位置を常に追跡する。標識された標的分子をその後これらのプローブに適用し、アレイを洗浄して、ハイブリダイズしなかった標的分子を除去する。次いで、アレイ上の特定の位置での標識された分子の存在をその位置でのプローブの既知の配列と対応させることができる。このようなマイクロアレイが開発され、遺伝子多様性または突然変異の存在について（すなわち、遺伝子型特定）、または遺伝子発現のパターンについてサンプルを分析するなどの一連の用途において使用され、短時間で行われる等価な数千回の「試験管」実験を行うことが可能になる。例えば、マイクロアレイアッセイは、本発明の図４または５の方法などを用いて行うことができる。
（実施例）
本発明のさらなる態様は以下の実施例と組み合わせて明らかになる。実施例は本発明の様々な好ましい態様を説明することを意図するものであって、本明細書において議論したり、添付の請求の範囲に記載されているような本発明の範囲を制限するものではないと理解される。
実施例１：
蛍光色素で標識された複数の標識されたポリマーの合成
複数の蛍光色素標識を含有する繰り返しポリマーＤＮＡ分子の合成を、重合成分として以下の１５マーの合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（標準的なアミダイト化学法により合成）を用いることにより行った：
５’−ｐｈｏｓ−ＡＣｇ  ｇｇＴ  ＣＣ（ＳＥ−Ｃｙ３）  ＡＴＡ  ＴＣＴ  Ｔ−３’（配列番号１）。
【００８８】
オリゴヌクレオチドの５プライム末端を化学的に（または酵素により）リン酸化し、オリゴの８番目の塩基は第一級アミンを含有するシトシン残基（Ｃ）であり、これを次にオリゴヌクレオチド合成後（かつ重合前）に蛍光色素（この実施例においてはシアニン色素Ｃｙ３）を含有しているスクシンイミダルエステルで標準的な化学縮合反応において標識する。このオリゴヌクレオチドを「ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３」と称する。
【００８９】
ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３の７個の５プライムヌクレオチドと７個の３プライムヌクレオチドを橋渡しできる架橋オリゴヌクレレオチドを、標準的なアミダイトオリゴヌクレオチド合成化学を用いて合成した。架橋オリゴヌクレオチドは以下の配列を有していた：
５’−ｇＡＣ  ＣＣｇ  ＴＡＡ  ｇＡＴ  ＡＴ−３’（配列番号２）。
【００９０】
このオリゴは「ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅ」と称し、図７に示すＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。
【００９１】
図７に示すように、複数のＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドが、ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅ架橋オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることにより末端と末端が一列に並ぶように配置している。（この実施例および他の実施例においてグアニンを意味するために小文字のｇを使用する慣例は、読者がグアニン残基を大文字Ｃで示されるシトシンとより容易に区別できるようにするだけのものである）。
【００９２】
隣接するＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３分子間の共有結合は、隣接する３プライムＤＮＡ末端および５プライム（リン酸化）ＤＮＡ末端を、二価カチオンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を含有する低塩緩衝液の存在下で連結するＴ４  ＤＮＡリガーゼの酵素作用により作られる。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いる場合、酵素連結は、連結部位の何れかの側に二本鎖配列があることを条件とし、連結部位の何れかの側の少なくとも３つの塩基対が最小の連結に必要であり、連結部位の何れかの側に最高７個の塩基対が最適な連結効率に必要である。典型的な連結反応を以下に記載する：
Ａ．以下の成分を、ヌクレアーゼを含まないポリプロピレン製微量遠心管中で混合する：
１０７．１ｕｌ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
２８０．０ｕＬ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅオリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  １０×連結緩衝液（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１２４３２９２）、６６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣＬ２、５０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭ  ＡＴＰを含む
５１２．９ｕＬ  ヌクレアーゼを含まない水
合計容量  １０００．０ｕＬ
Ｂ．内容物を１３０００ＲＰＭで微量遠心管中で遠心分離して、全ての液体を試験管の底部に集める。
【００９３】
Ｃ．４２℃で１５分間インキュベートする。
【００９４】
Ｄ．室温に冷却する。
【００９５】
Ｅ．１００ｕＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する（１Ｕ／ｕＬ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号４８１２２０）。ピペッターで穏やかに混合する。
【００９６】
Ｆ．４〜２０℃で３０〜７２０分間（またはそれ以上）インキュベートする。２０℃より低い温度でさらにインキュベートすると、若干より有効な連結が生じ、その結果、幾分長く連結した連結産物が得られる。
【００９７】
Ｇ．２７．５ｕＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（水溶液）を添加することにより反応を停止する。
【００９８】
Ｈ．Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０ミクロ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて製造業者の説明書に従って容量を約１００ｕＬに濃縮する。
【００９９】
上記プロセスの典型的な結果は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の変性により示されるように、均一でない大きさの範囲を有する、単一のオリゴヌクレオチドから誘導された連結されたＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３ポリマー分子が得られる（例えば、図２ａ参照）。特定の大きさの範囲の精製は、変性５０％ホルムアミド／変動するシュークロース濃度勾配を用いてサイズによりポリマー種を分類することにより行われる。勾配は
、Ｊ５型Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｆｏｒｍｅｒ（Ｊｕｌｅ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）を用いて、勾配の上部が約１０％スクロースであり、勾配の底部が約５０％シュークロースになり、濃度が上部から底部へほぼ直線的に増大するように、５ｍＬポリアロマー超遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎカタログ番号３２８８７４）中に導入される。５０〜１００ｕＬの連結後に濃縮されたＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３不均一ポリマーを導入された勾配の上にロードし、勾配をＢｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｌ−７０Ｋ超遠心機で１５時間４５０００ＲＰＭ（１．２Ｅ１２のオメガスクエアＴ）でＳｗ６０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて遠心分離する。遠心分離後、勾配管の底部に穴をあけ、勾配溶液を下から上に回収し、採集管あたり２〜５滴のフラクションを集める。フラクションをＰＡＧＥにより分析し、特定のフラクションについて大きさの範囲により特徴づける（図２ｂ）。平均の大きさを１５（ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチド１分子当たりの残基の数）で割ることにより、各フラクションについて蛍光体の数を計算する。標準的な２６０ｎｍ分光測定から得られる体積濃度当たりの質量を計算し、次いでＳｐｅｘＦｌｕｏｒｏＭａｘ３分光蛍光計（Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ−Ｈｏｒｉｂａ  Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）で既知量の質量の特定の蛍光を測定することにより、質量に対する蛍光体の比の経験的測定を行う。それぞれ５４２ｎｍおよび５７０ｎｍの励起／発光波長（ラマン水励起／発光ピークを避けるためにＣｙ３について誘導）についてＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３ポリマーの特異的蛍光測定を行う。任意の特定のフラクションについての１分子あたりの機能的Ｃｙ３蛍光体の平均数を、異なる量の１つの蛍光体標識されたオリゴヌクレオチドの独立して測定された蛍光の検量線を使用することにより計算する。
実施例２
同時連結プロセスにおいて標識されたＤＮＡに対して３プライム末端または５プライムを連結することができる非ポリマーオリゴヌクレオチドを用いた複数の標識されたＤＮＡポリマーの合成
オリゴヌクレオチド配列の第２の集団を標識されたポリマーの一端または両端に終結オリゴヌクレオチドとして作用するように付加すると、ポリマー分子の所望の配列との特異的ハイブリダイゼーションまたは結合が可能になる。上記のように相補的な終結配列にハイブリダイズさせるために捕捉配列として相補配列を用いることができる。これらの構築物の使用は、様々なハイブリダイゼーションプラットホーム（ブロット、マイクロアレイ、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）等を含む）中の核酸分子の直接一時ターゲティングを包含する。あるいは、またはさらに、標識されたポリマーは、標識されたポリマーを標識されたポリマーと結合した終結配列に相補的な配列とハイブリダイズさせることにより第１のターゲティング分子の二次（または三次）標識を提供することができる。一次標識送達デバイスは、ＤＮＡデンドリマー、プラスチックまたは磁気ビーズ、相補配列を含むポリマー分子などを含む。
【０１００】
終結配列（標識されたポリマーとは異なる配列を含む）を同時ポリマー連結反応に添加することは、連結反応の部分的阻害剤としての働きをし、その結果、終結オリゴヌクレオチドの濃度に依存してポリマーの平均サイズが小さくなる。従って、終結オリゴヌクレオチドの濃度を、終結オリゴヌクレオチドを含有する標識されたポリマー分子の大きさおよび収量が最大になるような濃度に限定することが望ましい。
【０１０１】
この終結反応は、架橋オリゴヌクレオチドＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅの７個の３プライムまたは５プライムヌクレオチドに相補的な配列を含有する任意の適切な配列の終結オリゴヌクレオチドを添加する以外は、実施例１の連結反応と同様である。
【０１０２】
この実施例において、配列：
５’−ｐｈｏｓ−ＡＣｇ  ｇｇＴ  Ｃｇｇ  Ｃｇｇ  ｇＡＣ  ＡｇＡ  ＡｇＡ  ＣｇＣ  ｇＣＡ  ｇＴｇ  ＡｇＴ  Ｃｇｇ  ＣＣ−３’（配列番号３）を有するオリゴヌクレオチドＲｐｔＣａｐ０１−５’ｌｉｇを、ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドにそ
の５プライム末端を介して連結するか、または配列：
５’−ｇｇＣ  ｇｇｇ  ＡＣＡ  ｇＡＡ  ｇＡＣ  ｇＣｇ  ＣＡｇ  ＴｇＡ  ｇＴＣ  ｇｇＣ  ＣＡＴ  ＡＴＣ  ＴＴ−３’（配列番号４）
を有する終結オリゴヌクレオチドＲｐｔＣａｐ０１−３’ｌｉｇをＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドにその３プライム末端を介して連結する。これらの終結オリゴヌクレオチドは、ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅ架橋オリゴヌクレオチドに相補的な７ヌクレオチドの５プライムおよび３プライム末端（それぞれ）を含有する。この実施例における終結オリゴは、例えば、終結したポリマーを逆転写酵素反応においてＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために用いられるプライマー上に見いだされる相補的な捕捉配列にハイブリダイズさせることによる、結果として得られる終結したＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３ポリマーのターゲティングに有用である。ＲＮＡからの逆転写の間に捕捉配列をｃＤＮＡに組み入れること、および捕捉配列およびその相補鎖の使用は、例えばＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／０７４７７（２００１年３月８日提出）（国際公開番号ＷＯ０１／０６６５５５）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／２２８１８（２００１年７月１９日提出）（国際公開番号ＷＯ０２／０６５１１）およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９５８９（２００１年９月２０日提出）（国際公開番号ＷＯ０２／０３３１２５）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５０２２（２００２年２月２０日提出）（国際公開番号ＷＯ０３／０１２１４７）、およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／２７７９９（２００２年９月３日提出）（国際公開番号ＷＯ０３／０２０９２０）（これらは全て全体として本発明の一部として参照される）においてさらに議論されている。
【０１０３】
ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドの３プライムおよび５プライム末端（それぞれ）と連結できる終結分子は、適切な遊離の末端上での連結により、さらなるＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドを連結し続けることにより、ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドの反対の末端をブロックせず、これにより、ポリマーのブロックされていない末端に連結されたＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３標識オリゴヌクレオチドの合成が可能になる。連結反応は次のようにして行われる：
Ａ．以下の成分を、ヌクレアーゼを含まないポリプロピレン製微量遠心管中で混合する：
１０７．１ｕｌ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
２８０．０ｕＬ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅオリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
２７．１ｕＬ  ＲｐｔＣａｐ０１−５’ｌｉｇまたはＲｐｔＣａｐ０１−３’ｌｉｇオリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  １０×連結緩衝液（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１２４３２９２）、
４８５．８ｕＬ  ヌクレアーゼを含まない水
合計容量  １０００．０ｕＬ
Ｂ．内容物を１３０００ＲＰＭで微量遠心管中で遠心分離して、全ての液体を試験管の底部に集める。
【０１０４】
Ｃ．４２℃で１５分間インキュベートする。
【０１０５】
Ｄ．室温に冷却する。
【０１０６】
Ｅ．１００ｕＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する（１Ｕ／ｕＬ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号４８１２２０）。ピペッターで穏やかに混合する。
【０１０７】
Ｆ．４〜２０℃で３０〜７２０分間（またはそれ以上）インキュベートする。２０℃より低い温度でさらにインキュベートすると、若干より有効な連結が生じ、その結果、幾分
長く連結した連結産物が得られる。
【０１０８】
Ｇ．２７．５ｕＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（水溶液）を添加することにより反応を停止する。
【０１０９】
Ｈ．Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０ミクロ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて製造業者の説明書に従って容量を約１００ｕＬに濃縮する。
【０１１０】
連結により得られる不均質なポリマー種の精製は、変性勾配精製による（例えば、実施例１参照）。
実施例３
非同時プライミング前連結プロセスにおいて複数の標識されたポリマーに対して３プライム末端または５プライム末端を連結することができる非ポリマー配列特異的オリゴヌクレオチドを用いた多標識ポリマーの合成
実施例２においてすでに記載したように、終結オリゴが過剰に用いられるならば、終結オリゴを複数の標識されたポリマーに同時に連結すると、効率が悪い。連結効率を向上させる方法の代替法は、重合オリゴヌクレオチドの一端にだけハイブリダイズするが、他の末端にはハイブリダイズしない架橋オリゴの使用を必要とし、他の末端は終結オリゴヌクレオチドのみに特異的に結合するように設計され、これにより終結オリゴヌクレオチドを１つの重合オリゴヌクレオチドのみに特異的に連結させることが可能になる。この特異的連結反応は、ハイブリッド終結および重合オリゴヌクレオチド分子の集団を形成する初期「プライミング」反応として行われ、これはその後の実施例１に記載されるような重合反応のために準備される。
【０１１１】
この実施例において、配列：
５’−ｐｈｏｓ−ｇＣＴ  ＴＴＴ  Ｔｇｇ  Ｃｇｇ  ｇＡＣ  ＡｇＡ  ＡｇＡ  ＣｇＣ  ｇＣＡ  ｇＴｇ  ＡｇＴ  Ｃｇｇ  ＣＣ−３’（配列番号５）
を有するオリゴヌクレオチドＲｐｔＣａｐ０１−７ＢＯ−５’ｌｉｇを、その５プライム末端を介してＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３に連結するか、架橋オリゴヌクレオチドＲｐｔＢｒ７ＢＯ−３’：
５’−ＡＡ  ＡＡＡ  ＣｇＡ  ＡｇＡ  ＴＡＴ−３’（配列番号６）
の使用により連結するか、あるいは配列：
５’−ｇｇＣ  ｇｇｇ  ＡＣＡ  ｇＡＡ  ｇＡＣ  ｇＣｇ  ＣＡｇ  ＴｇＡ  ｇＴＣ  ｇｇＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  Ｃｇ−３’（配列番号７）
を有する終結オリゴヌクレオチドＲｐｔＣａｐ０１−７ＢＯ−３’ｌｉｇを、ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドに対してその３プライム末端を介して、架橋オリゴヌクレオチドＲｐｔＢｒ７ＢＯ−５’：
５’−ｇＡＣ  ＣＣｇ  ＴｇｃＡＡ  ＡＡＡ−３’（配列番号８）
を使用して連結する。
【０１１２】
プライミング連結の方法を以下に説明する：
Ａ．以下の成分を、ヌクレアーゼを含まないポリプロピレン製微量遠心管中で混合する：
１００．０ｕｌ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  ＲｐｔＢｒ７ＢＯ−３’またはＲｐｔＢｒ７ＢＯ−５’Ｂｒｉｄｇｅオリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  ＲｐｔＣａｐ０１−７ＢＯ−５’ｌｉｇまたはＲｐｔＣａｐ０１−７ＢＯ−３’ｌｉｇオリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  １０×連結緩衝液（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１２４３２９２）、
６００．０ｕＬ  ヌクレアーゼを含まない水
合計容量  １０００．０ｕＬ
Ｂ．内容物を１３０００ＲＰＭで微量遠心管中で遠心分離して、全ての液体を試験管の底部に集める。
【０１１３】
Ｃ．４２℃で１５分間インキュベートする。
【０１１４】
Ｄ．室温に冷却する。
【０１１５】
Ｅ．１００ｕＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する（１Ｕ／ｕＬ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号４８１２２０）。ピペッターで穏やかに混合する。
【０１１６】
Ｆ．２０〜２５℃で３０分間インキュベートする。
【０１１７】
Ｇ．ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３非特異的重合を続けるために上記反応物に以下の試薬を添加する：
１１００．０ｕｌ  上記から得られるプライミング連結反応物
２５．０ｕＬ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチド  ２．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１５０．０ｕＬ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅ架橋オリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
２５．０ｕＬ  １０×連結緩衝液（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１２４３２９２）、
２５．０ｕＬ  ヌクレアーゼを含まない水
合計容量  １３２５．０ｕＬ
Ｈ．２０〜２５℃で３０分間インキュベートする。
【０１１８】
Ｉ．工程Ｇをさらに５回繰り返す。
【０１１９】
Ｊ．６１．３５ｕＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（水溶液）の添加により反応を停止させる。
【０１２０】
Ｋ．Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０ミクロ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて製造業者の説明書に従って容量を約１００ｕＬに濃縮する。
【０１２１】
連結の結果得られる不均質なポリマー種の精製は、変性勾配精製による（実施例１参照）。
実施例４
樹状構造上に直接重合させることによる蛍光ポリマーでのＤＮＡデンドリマーの標識
シグナル増幅分子、例えばＤＮＡデンドリマーの多量の蛍光または他の標識での標識により、別の方法で現行の標識技術により達成できるよりも高いシグナル強度が得られる。これは、まずシグナルオリゴヌクレオチド（さらに重合できる）を樹状構造（プライミングオリゴヌクレオチド）の３プライムまたは５プライム末端に連結し、続いて同一または異なる追加のポリマー分子を「プライミングオリゴヌクレオチド」に環状または非環状連結することにより達成される。この方法は、ＤＮＡデンドリマーを、樹状構造の遊離の末端（「枝」または「アーム」）から伸びる本発明のポリマー多標識ＤＮＡ鎖で標識する。ターゲティングオリゴヌクレオチドをＵＶ架橋またはポリマーオリゴヌクレオチドの連結前または連結後の連結によりデンドリマー「アーム」に結合させることができるか、あるいはターゲティングオリゴヌクレオチドをこれらの構造をデンドリマー「アーム」に連結した後、ポリマー多標識鎖の遠位末端に結合させることもできる。
【０１２２】
典型的な反応は、以下のオリゴヌクレオチドの使用を含む：
５’−ｐｈｏｓ−ＡＣｇ  ｇｇＴ  ＣＣ（ＳＥ−Ｃｙ３）  ＡＴＡ  ＴＣＴ  Ｔ−３’（配列番号１）。
【０１２３】
すでに「ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３」として記載したポリマー標識オリゴヌクレオチド：
５’−ｇＡＣ  ＣＣｇ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＣＴＡ  ＣｇＡ  ｇ−３’（配列番号９）
ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドの５プライム末端、およびデンドリマー「アーム」の３プライム末端にハイブリダイズするために必要な「ｃ（−）ＲｐｔＬｉｇ５プライム」と呼ばれる「架橋」オリゴヌクレオチド。「ｃ（−）ＲｐｔＬｉｇ５プライム」オリゴヌクレオチドは、ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３の５プライムリン酸化末端およびデンドリマーアームの３プライム末端と整列し、デンドリマーアームと１つだけのＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドの間で連結が起こる。
【０１２４】
５’−ＴＣＡ  ＣＡＴ  ＡＣｇ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ｇＡＴ  ＡＴ−３’（配列番号１０）
ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドの３プライム末端とデンドリマー「アーム」の５プライム末端のハイブリダイズに必要な「ａ（−）ＲｐｔＬｉｇ３プライム」と呼ばれる「架橋」オリゴヌクレオチド。「ａ（−）ＲｐｔＬｉｇ３プライム」オリゴヌクレオチドは、ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３の３プライム末端およびデンドリマーアームの５プライム末端と整列し、デンドリマーアームと１つだけのＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチド間に連結が起こる。
【０１２５】
「ａ（−）ＲｐｔＬｉｇ３プライム」および「ｃ（−）ＲｐｔＬｉｇ５プライム」は同じデンドリマーに対して使用すると、１つのアームの３プライム末端から同じデンドリマー上の別の種類の隣接するアームの５プライム末端にポリマーが「ループ」連結する場合があるので、使用すべきでないことに注意しなければならない。
【０１２６】
５’−ｇＡＣ  ＣＣｇ  ＴＡＡ  ｇＡＴ  ＡＴ−３’（配列番号２）
ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチドの重合に必要な「ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅ」架橋オリゴヌクレオチドも必要である（上記）。
【０１２７】
典型的な連結反応を以下に記載する：
Ａ．初期「プライミング」連結のために、以下の成分を、ヌクレアーゼを含まないポリプロピレン製微量遠心管中で混合する：
１００．０ｕｌ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  「ａ（−）ＲｐｔＬｉｇ３プライム」架橋オリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）または「ｃ（−）ＲｐｔＬｉｇ５プライム」架橋オリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）（両方を同時には添加しない）
２０．０ｕＬ  ４層＋コアデンドリマー  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  １０×連結緩衝液（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１２４３２９２）、
６８０．０ｕＬ  ヌクレアーゼを含まない水
合計容量  １０００．０ｕＬ
Ｂ．内容物を１３０００ＲＰＭで微量遠心管中で遠心分離して、全ての液体を試験管の底部に集める。
【０１２８】
Ｃ．４２℃で１５分間インキュベートする。
【０１２９】
Ｄ．室温に冷却する。
【０１３０】
Ｅ．１００ｕＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する（１Ｕ／ｕＬ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号４８１２２０）。ピペッターで穏やかに混合する。
【０１３１】
Ｆ．４〜２０℃で３０〜６０分間（またはそれ以上）インキュベートする。
【０１３２】
Ｇ．以下の重合連結に進む：
デンドリマーアームごとに１つのＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３で前プライムされたデンドリマーへのＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３の重合：
Ｈ．デンドリマーアームごとに１つのＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３で前プライムされたＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３の重合を続けるために、ヌクレアーゼを含まないポリプロピレン製微量遠心管中で以下の成分を合わせる：
１０００．０ｕＬ  上記から得られるプライムされたデンドリマー−ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３連結反応物
５０．０ｕＬ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３オリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１３０．０ｕＬ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅオリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
２０．０ｕＬ  １０×連結緩衝液（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１２４３２９２）、
合計容量  １２００．０ｕＬ
Ｉ．微量遠心分離機中１３０００ＲＰＭで内容物を遠心分離して、全ての液体を管の底部に集める。
【０１３３】
Ｊ．４２℃で１５分間インキュベートする。
【０１３４】
Ｋ．室温に冷却する。
【０１３５】
Ｌ．２０ｕＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／ｕＬ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号４８１２２０）を添加する。ピペッターで穏やかに混合する。
【０１３６】
Ｍ．４〜２０℃で３０〜６０分間（またはそれ以上）インキュベートする。
【０１３７】
Ｎ．工程Ｈ〜Ｍを３〜６回さらに繰り返し、追加のサイクルにおいて重合成分を反応に添加する。（さらなるサイクルを、同様に、さらなる長さの重合を達成するために望ましい回数だけ加えることができる。）あるいは、重合連結反応の「サイクリング」の間またはその前に標準的な分離技術（磁気ビーズ、アフィニティーまたはサイズ排除クロマトグラフィー、膜濾過など）の使用によりデンドリマー分子を連結していない反応物質から分離することができる。
【０１３８】
Ｏ．全反応容量の４０分の１量の０．５ＭのＮａＯＨを添加することによって反応を停止させる。
【０１３９】
Ｐ．製造業者の説明書に従ってＭｉｃｒｏｎ  ＹＭ−３０ミクロ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて容量を約１００ｕＬに濃縮する。
【０１４０】
典型的には、この方法の結果、１から数百または数千の標識されたポリマーオリゴヌクレオチドがデンドリマーの「アーム」のそれぞれに連結される。
実施例５
樹状構造に非特異的なあらかじめ形成されたポリマーを連結することによる蛍光ポリマーでのＤＮＡデンドリマーの標識
あらかじめ形成されたポリマー分子でのＤＮＡデンドリマーの標識は、非ポリマー標識
オリゴヌクレオチドを使用するのではなく、多標識ポリマー分子を使用する以外は上記実施例のプライミング反応と同様にして行う。上記実施例４よりも簡単で、迅速な方法を用いるこの方法は、実施例１に記載するようにあらかじめ連結されたポリマーの供給を必要とする。長いあらかじめ形成された多標識ポリマーを、デンドリマーの「アーム」および多標識ポリマーの適切な末端に同時にハイブリダイズする架橋オリゴヌクレオチドの使用によりＤＮＡデンドリマーの「アーム」に直接連結させる。
【０１４１】
典型的な連結反応を以下に記載する：
Ａ．初期「プライミング」連結のために、以下の成分を、ヌクレアーゼを含まないポリプロピレン製微量遠心管中で混合する：
１００．０ｕｌ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３あらかじめ形成された多標識ポリマー、平均サイズ１００〜１０００ヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  「ａ（−）ＲｐｔＬｉｇ３プライム」架橋オリゴヌクレオチド１．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）または「ｃ（−）ＲｐｔＬｉｇ５プライム」架橋オリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）（両方を同時には添加しない）
２０．０ｕＬ  ４層＋コアデンドリマー  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  １０×連結緩衝液（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１２４３２９２）、
６８０．０ｕＬ  ヌクレアーゼを含まない水
合計容量  １０００．０ｕＬ
Ｂ．内容物を１３０００ＲＰＭで微量遠心管中で遠心分離して、全ての液体を試験管の底部に集める。
【０１４２】
Ｃ．４２℃で１５分間インキュベートする。
【０１４３】
Ｄ．室温に冷却する。
【０１４４】
Ｅ．１００ｕＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する（１Ｕ／ｕＬ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号４８１２２０）。ピペッターで穏やかに混合する。
【０１４５】
Ｆ．４〜２０℃で６０〜２４０分間（またはそれ以上）インキュベートする。
【０１４６】
Ｇ．全反応容量の４０ｕＬの０．５ＭのＮａＯＨ（水溶液）を添加することによって反応を停止させる。
【０１４７】
Ｈ．製造業者の説明書に従ってＭｉｃｒｏｎ  ＹＭ−３０ミクロ濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて容量を約１００ｕＬに濃縮する。
【０１４８】
Ｉ．確立された方法に従って低分子種からデンドリマー分子を精製する。
【０１４９】
典型的には、この方法の結果、５から数百または数千の標識されたポリマーオリゴヌクレオチドとデンドリマー「アーム」のそれぞれの間で連結される。
【０１５０】
「ａ（−）ＲｐｔＬｉｇ３プライム」および「ｃ（−）ＲｐｔＬｉｇ５プライム」は同じデンドリマーに関して使用すると、ポリマーが１つのアームから隣接するアームに「ループ」連結する場合があるので、使用すべきでないことに注意しなければならない。
実施例６
樹状構造への配列特異的終結前形成ポリマーの連結による蛍光ポリマーでのＤＮＡデンドリマーの標識
配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて終結させたあらかじめ形成されたポリマー分子でのＤＮＡデンドリマーの標識は、相補ＤＮＡ分子にハイブリダイズできる非ポリマー終
結配列を含有する多標識ポリマー分子を使用する以外は上記実施例のプライミング反応と同様にして行われる。この方法は、デンドリマーアームにポリマー分子を架橋するために、多標識ポリマー上の非ポリマー終結配列に相補的である架橋オリゴヌクレオチドを使用しなければならない以外は、上記実施例５と同様である。機能およびデザインにおいて「ａ（−）ＲｐｔＬｉｇ３プライム」または「ｃ（−）ＲｐｔＬｉｇ５プライム」と類似している架橋が必要であり、多標識ポリマー上の終結配列の適切な７ヌクレオチドと相補的である「ａ（−）ＲｐｔＬｉｇ３プライム」に関しては種々の７塩基の３プライム末端配列、あるいは「ｃ（−）ＲｐｔＬｉｇ５プライム」に関しては７塩基の５プライム末端配列を有する。あるいは、連結反応は実施例５の手順と同様にして行われる。
実施例７
樹状構造への配列特異的終結前形成ポリマーのＵＶ架橋による蛍光ポリマーでのＤＮＡデンドリマーの標識
配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて終結させたあらかじめ形成されたポリマー分子でのＤＮＡデンドリマーの標識はまた、紫外線光（ＵＶ）活性化インターカレーターの使用による相補的なＤＮＡ配列の架橋によっても行うことができる。ＤＮＡのハイブリダイズした二本鎖領域を不可逆的に共有結合させるために、４，５，８−トリメチルソラレンなどの化合物が慣例的に用いられる。
【０１５１】
デンドリマー「アーム」上またはこれに結合した配列に相補的な終結配列の使用により、デンドリマーの枝または「アーム」にあらかじめ形成された多標識ポリマーを架橋させると、多標識ポリマー分子がデンドリマーに共有結合する。
【０１５２】
典型的な架橋反応は次の通りである：
Ａ．ＵＶ透過性である微量遠心管中で混合する：
１００．０ｕｌ  デンドリマー「アーム」に相補的である適切なオリゴヌクレオチドで終結されたＲｐｔＬｉｇＭｉｄＣｙ３前形成多標識ポリマー、平均サイズ１００〜１０００ヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
２０．０ｕＬ  ４層＋コアデンドリマー  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
２０．０ｕＬ  ０．５Ｍ  ＮａＣｌ（水溶液）
７５．０ｕＬ  ４，５，８−トリメチルソラレンで飽和させたエタノール、室温（２０〜２５℃）
２８５．０ｕＬ  ヌクレアーゼを含まない水
合計容量  ５００．０ｕＬ
Ｂ．７５℃で１０分間インキュベートする。
【０１５３】
Ｃ．ゆっくりと３５〜４２℃に冷却させる。
【０１５４】
Ｄ．１０００〜１００００ｕＪｏｕｌｅ（マイクロジュール）のＵＶ−Ａ紫外線光に露光させる。
【０１５５】
Ｅ．４，５，８−トリメチルソラレンの添加とＵＶ−Ａへの露光を繰り返す。
【０１５６】
Ｆ．確立された方法に従って、低分子種からデンドリマー分子を精製する。
実施例９
二次標識核酸分子をハイブリダイズできる複数の配列を含有するポリマーの合成
二次蛍光色素標識された分子に相補的である複数の捕捉配列を含有する繰り返し重合ＤＮＡ分子の合成は、重合成分として４６マーの合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（標準的なアミダイト化学法により合成される）を用いることにより容易に行われる：
５’−ｐｈｏｓ−ＡＣｇ  ｇｇＴ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＣＴＡ  ＣＣｇ  ＴＣＴ  Ｔｇｇ
ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＣｇＡ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  Ｔ−３’（配列番号１１
）
（ここで、オリゴヌクレオチドの５プライム末端は化学的に（または酵素により）リン酸化される）。このオリゴヌクレオチドを「ａ（−）ＲｐｔＬｉｇ」と称する。
【０１５７】
さらに、次の配列を用いて、標準的なアミダイトオリゴヌクレオチド合成化学を利用して、ａ（−）ＲｐｔＬｉｇの７個の５プライムヌクレオチドと７個の３プライムヌクレオチドを橋渡しできる架橋オリゴヌクレオチドを合成した：
５’−ｇＡＣ  ＣＣｇ  ＴＡＡ  ｇＡＴ  ＡＴ−３’（配列番号２）。
【０１５８】
典型的な連結反応を以下に記載する：
Ａ．以下の成分を、ヌクレアーゼを含まないポリプロピレン製微量遠心管中で混合する：
３２１．３ｕｌ  ａ（−）ＲｐｔＬｉｇオリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
２８０．０ｕＬ  ＲｐｔＬｉｇＭｉｄＢｒｉｄｇｅオリゴヌクレオチド  １．０ｕｇｍｓ／ｕＬ（水溶液）
１００．０ｕＬ  １０×連結緩衝液（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１２４３２９２）、
２９８．７ｕＬ  ヌクレアーゼを含まない水
合計容量  １０００．０ｕＬ
Ｂ．内容物を１３０００ＲＰＭで微量遠心分離機中で遠心分離して、全ての液体を試験管の底部に集める。
【０１５９】
Ｃ．４２℃で１５分間インキュベートする。
【０１６０】
Ｄ．室温に冷却する。
【０１６１】
Ｅ．１００ｕＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する（１Ｕ／ｕＬ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号４８１２２０）。ピペッターで穏やかに混合する。
【０１６２】
Ｆ．４〜２０℃で３０〜７２０分間（またはそれ以上）インキュベートする。２０℃より低い温度でさらにインキュベートすると、若干より有効な連結が生じ、その結果幾分長く連結した連結産物が得られる。
【０１６３】
Ｇ．２７．５ｕＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（水溶液）を添加することにより反応を停止させる。
【０１６４】
Ｈ．製造業者の説明書に従ってＭｉｃｒｏｎ  ＹＭ−３０ミクロ濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて容量を約１００ｕＬに濃縮する。
【０１６５】
上記プロセスの典型的な結果、不均一なサイズの範囲を有する、単一のオリゴヌクレオチドから誘導される連結されたａ（−）ＲｐｔＬｉｇポリマー分子が得られる。特定のサイズ範囲のポリマーの精製は、実施例１においてすでに記載されているようにして行われる。
【０１６６】
繰り返しポリマー分子はまた、実施例２または３で使用したプロセスと同じプロセスにおいて、終結オリゴヌクレオチドで標識することもできる。次いで、ａ（−）ＲｐｔＬｉｇの繰り返しを含む終結させたポリマーまたは終結していないポリマーを、以下のようなＣｙ３蛍光色素で５プライム末端上が標識された相補配列を含有しているａ（−）ＲｐｔＬｉｇ配列にハイブリダイズすることができる多標識オリゴヌクレオチドを送達する為のデバイスとして、検出アッセイで使用することができる：
５’−Ｃｙ３−ｇＡｇ  ＴＣｇ  ＴＡＴ  ｇＴｇ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＡｇＡ  Ｃｇｇ  ＴＡｇ  Ｔｇｇ  Ａ−３’（配列番号１２）。
【０１６７】
本発明を記載してきたが、上記での議論が本発明の単なる例および好ましい態様を開示し記載しているにすぎないことが理解される。当業者であれば、このような議論から、そして添付の図面および実施例から、様々な変化、変更、及びバリエーションを特許請求の範囲において定義される本発明の精神と範囲から逸脱することなく実施することができることを容易に理解する。同様に、当業者であれば、現在及び将来の知見を適用することにより、本発明の使用と同等のものを採用できる。なお、特異的な態様に関して本発明を記載してきたが、この記載は限定を意味するものではなく、本出願は、本明細書中で開示される発明の全てのこのような態様、変更、およびバリエーションをカバーするものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】本発明の好ましい態様に関する標識されたポリマー核酸の合成を示す概略図である。
【図２ａ】ゲル電気泳動を用いて分析した、本発明のポリマー分子の一連の合成の実験結果を示すものである。個々のレーンは１４マーの架橋オリゴヌクレオチドの１５マーの標識されたポリマーオリゴヌクレオチドに対する種々の化学量論比でのポリマーサイズの変化を示す。
【図２ｂ】本発明の直鎖ポリマー分子の精製の結果を示すものである。
【図３ａ】本発明のさらなる態様の標識されたポリマー核酸（ポリマー）を示す概略図であり、ここにおいて、ポリマーは５プライムおよび／または３プライム末端でターゲティングオリゴヌクレオチドを含む。
【図３ｂ】本発明のさらなる態様の標識されたポリマー核酸の合成法を示す概略図であり、ここにおいてポリマーは３プライム末端に位置する終結ターゲティングオリゴヌクレオチドを含む。
【図３ｃ】本発明のさらなる態様の標識されたポリマー核酸の合成法を示す概略図であり、ここにおいてポリマーは５プライム末端に位置する終結ターゲティングオリゴヌクレオチドを含む。
【図４ａ】核酸分析物上に提供された捕捉配列にハイブリダイズする本発明の標識されたポリマー核酸を使用することにより分析物核酸を検出するための方法を示す概略図である。
【図４ｂ】本発明の標識されたポリマー核酸に共有結合する分析物核酸を検出するための方法を示す概略図である。
【図５ａ】樹状核酸の側鎖にハイブリダイズし、架橋したポリマー核酸の使用を示す概略図である。
【図５ｂ】樹状核酸の側鎖に連結したポリマー核酸の使用を示す概略図である。
【図６】架橋オリゴヌクレオチドが本発明の直鎖ポリマーの合成において使用されるさらなる態様を示す概略図である。図に示すように、架橋オリゴヌクレオチドは、該架橋オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド配列を第１の集団のオリゴヌクレオチドの相補的ヌクレオチド配列（例えば、標識モノマー）に結合させることにより標識モノマーを整列させ、第１の集団のこれらのオリゴヌクレオチドの末端を連結に適した配置にする。これらの標識モノマーを連結のための位置に配置し、上記標識モノマーの末端が連結のための位置になる配置にするために、２つ以上の標識モノマー（図において示したのは６個）と結合する架橋オリゴヌクレオチドが用いられる態様を示す。
【図７】架橋オリゴヌクレオチドが本発明の直鎖ポリマーの合成において使用されるさらなる態様を示す概略図である。図に示すように、架橋オリゴヌクレオチドは、該架橋オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド配列を第１の集団のオリゴヌクレオチドの相補的ヌクレオチド配列（例えば、標識モノマー）に結合させることにより標識モノマーを整列させ、第１の集団のこれらのオリゴヌクレオチドの末端を連結に適した配置にする。各架橋オリゴヌクレオチドが２つの標識モノマーと結合する架橋オリゴヌクレオチドの配列を示す。この図は、２つの架橋オリゴヌクレオチドが３つの標識モノマーと結合してこれらの標識モノマーを整列させることを示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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