(57)【要約】天然または組換え非ヒトプロテアーゼのＤＮＡ配列から得られたプロテアーゼ変異体含む新規な酵素変異体を開示する。変異体プロテアーゼは、通常、天然または組換えプロテアーゼをエンコードする前駆体ＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの変異により得られ、前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列中に多数のアミノ酸残基の置換を生じる。当該変異体プロテアーゼは前駆体プロテアーゼの性質と異なり、例えば変化した洗浄能力を有する。置換アミノ酸残基は、バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの２７、４５、１７０、１８１、２５１及び２７１に対応する。バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの１、１４、４９、６１、８７、１００、１０２、１１８、１２８、２０４及び２５８から選択される位置に少なくとも１の別の置換を含む別の変異体も記載する。
2005519592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電アミノ酸残基位置に１以上の変異を含み、前駆体プロテアーゼと同じ正味静電荷を有することを特徴とする、前駆体プロテアーゼのプロテアーゼ変異体。
【請求項２】
前記荷電アミノ酸残基位置がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからなる群より選択される、請求項１のプロテアーゼ変異体。
【請求項３】
前記変異体が、配列番号２に示すバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの２７、４５、１７０、１８１、２５１及び２７１からなる群より選択される残基位置に等しい１以上の残基位置での置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１のプロテアーゼ変異体。
【請求項４】
前記変異体が２７、４５、１７０、１８１、２５１及び２７１に対応する１以上の位置での置換を含み、Ｋ２７Ｔ、Ｒ４５Ｎ、Ｒ１７０Ｓ、Ｄ１８１Ｎ、Ｋ２５１Ｇ及びＥ２７１Ｔから選択される置換である、請求項３のプロテアーゼ変異体。
【請求項５】
さらに、配列番号２に示すバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの１、１４、４９、６１、８７、１００、１０２、１１８、１２８、２０４及び２５８に対応する１以上の位置での別の置換を含む、請求項３のプロテアーゼ変異体。
【請求項６】
変異体がＲ４５Ｎ−Ｇ１１８Ｅ−Ｅ２７１Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｐ１４Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｎ２０４Ｒ、Ｄ１８１Ｎ−Ｇ１１８Ｄ、Ｒ４５Ｎ−Ｇ２５８Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ａ１Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｇ６１Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｎ２０４Ｒ、Ｋ２５１Ｇ−Ｓ８７Ｋ、Ｒ１７０Ｓ−Ｓ２１６Ｒ、Ｅ２７１Ｔ−Ｇ１００Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｇ１０２Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｓ１２８Ｅ、Ｋ２７Ｔ−Ｇ１００Ｅ、Ｒ１７０Ｓ−Ｇ１００Ｒ、Ｅ２７１Ｔ−Ｓ４９Ｅ、及びＥ２７１Ｔ−Ｓ１２８Ｅの組み合わせから選択される、請求項５のプロテアーゼ変異体。
【請求項７】
請求項２のプロテアーゼ変異体をエンコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７のＤＮＡをエンコードする発現ベクター。
【請求項９】
請求項８の発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
【請求項１０】
請求項２のプロテアーゼ変異体を含んだ洗浄組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
セリンプロテアーゼはカルボニル・ヒドロラーゼの下位集団である。これらは広範囲の特異性及び生物学的機能を有する酵素の種々の分類を含む。Ｓｔｒｏｕｄ，Ｒ．Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．，１３１：７４−８８。それらの機能的多様性にもかかわらず、セリンプロテアーゼの触媒機構は、１）ズブチリシン及び２）哺乳類キモトリプシン関連及び同種細菌性セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン及びＳ．ｇｒｅｓｉｕｓトリプシン）の少なくとも２つの遺伝学的にはっきり区別できる酵素のファミリーに近かった。セリンプロテアーゼのこれら２つのファミリーは非常に類似した触媒作用機構を示す。Ｋｒａｕｔ，Ｊ．（１９７７）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４６：３３１−３５８。さらに、一次構造は関連しないが、これら２つの酵素ファミリーの三次構造はセリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸塩からなるアミノ酸の保存された触媒３残基を結集させる。
【０００２】
ズブチリシンは、種々のバチルス種及びその他の微生物から大量に分泌されるセリンプロテアーゼ（ａｐｐｒｏｘ．ＭＷ（分子量）２７，５００）である。ズブチリシンのタンパク質配列はバチルスの少なくとも９つの異なる種から決定された。Ｍａｒｋｌａｎｄ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３６４：１５３７−１５４０。バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・リケニホルミス、及びバチルス・レンタスのいくつかの天然変異体から得られるズブチリシンの三次元結晶構造が報告されている。これらの研究はズブチリシンが哺乳類セリンプロテアーゼに通常関連しないが、類似の活性部位構造を有することを示す。共有結合ペプチド阻害因子を含んだズブチリシンのＸ線結晶構造（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７２）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１：２４３９−２４４９）または生成複合物（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１：１０９７−１１０３）も活性部位及びズブチリシンの推定上の基質が結合する分子の溝（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｌｅｆｔ）についての情報を提供した。さらに、多くの動的及び化学的修正のズブチリシンについての研究が報告されており、（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ｂ．（１９７６）、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４１：２３７−２９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ，Ｆ．Ｓ．Ｉｄ．）及びズブチリシンの残基２２２のメチオニンの側鎖が過酸化水素によりメチオニン−スルホキシドに変換される少なくとも１の報告（Ｓｔａｕｆｆｅｒ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９６５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４：５３３３−５３３８）及び広範囲の部位特異性突然変異が実行された（Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｌｌ（１９８８）ＴＩＢＳ  １３：２９１−２９７）。
【０００３】
発明の概要
本発明の１の側面は、分子の電荷分布をその配向及び相、表面、その他の分子及び領域との相互作用に影響を与えるために変化させることである。
【０００４】
前駆体または親酵素の酵素変異体は、荷電アミノ酸残基位置での１以上の変異を含む変異体、前駆体酵素と同じ正味静電荷及び／または前駆体酵素と同じ等電点を有することを特徴とする変異体を目的とする。
【０００５】
本発明の他の側面において、前駆体プロテアーゼのプロテアーゼ変異体をここで目的とし、荷電アミノ酸残基位置で１以上の変異を含む変異体、前駆体プロテアーゼと同じ正味静電荷または等電点を有することを特徴とする変異体を目的とする。荷電アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、チロシン及びアルギニンである。残基位置はここに同定するバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの位置５、７、２３、２６、２８−３１、３４、４７、６３、６５、６６、６９、７０、７３、８２−８５、８８、９０、９２、９３、１０５、１１３、１２５、１３８、１３９、１４８−１５１、１７６、１７８、１７９、１９３、１９６、２００、２０１、２０２、２０７、２１９、２２０、２２３、２２９、２３３、２５０、２６６、２６７、及び２７３に等しい残基位置である。また、残基位置はバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの位置２３、３９、４１、４５、６７、９４、１３６、１７０、１８１、２４７、２５１及び／または２７１に等しい残基位置である。さらに別の側面は、当該プロテアーゼ変異体をエンコードするＤＮＡ配列及び当該変異体ＤＮＡ配列を含んだ発現ベクターを提供することである。
【０００６】
前駆体プロテアーゼのプロテアーゼ変異体は、荷電アミノ酸残基位置で１以上の変異を含む前記変異体、前記前駆体プロテアーゼと同じ正味静電荷を有することを特徴とする前記変異体である。請求項１のプロテアーゼ変異体は、前記荷電アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びアルギニンからなる群より選択される。プロテアーゼ変異体は配列番号２に示すバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの２７、４５、１７０、１８１、２５１及び２７１からなる群より選択される残基位置に等しい１以上の残基位置での置換を有するアミノ酸配列を含む。プロテアーゼ変異体は２７、４５、１７０、１８１、２５１及び２７１に対応する１以上の位置での置換を含み、Ｋ２７Ｔ、Ｒ４５Ｎ、Ｒ１７０Ｓ、Ｄ１８１Ｎ、Ｋ２５１Ｇ及びＥ２７１Ｔから選択される置換である。
【０００７】
プロテアーゼ変異体は配列番号２に示すバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンの１、１４、４９、６１、８７、１００、１０２、１１８、１２８、２０４及び２５８に対応する１以上の位置での別の置換をさらに含むことができる。変異体はＲ４５Ｎ−Ｇ１１８Ｅ−Ｅ２７１Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｐ１４Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｎ２０４Ｒ、Ｄ１８１Ｎ−Ｇ１１８Ｄ、Ｒ４５Ｎ−Ｇ２５８Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ａ１Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｇ６１Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｎ２０４Ｒ、Ｋ２５１Ｇ−Ｓ８７Ｋ、Ｒ１７０Ｓ−Ｓ２１６Ｒ、Ｅ２７１Ｔ−Ｇ１００Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｇ１０２Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｓ１２８Ｅ、Ｋ２７Ｔ−Ｇ１００Ｅ、Ｒ１７０Ｓ−Ｇ１００Ｒ、Ｅ２７１Ｔ−Ｓ４９Ｅ、及びＥ２７１Ｔ−Ｓ１２８Ｅの組み合わせから選択できる。
【０００８】
さらに、本発明のその他の側面は、このようなベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供することである。
【０００９】
さらに、本発明のプロテアーゼ変異体を含んだ洗浄組成物を提供する。
【００１０】
発明の詳細な説明
プロテアーゼは、一般的にタンパク質またはペプチドのペプチド結合を切断する働きを有するカルボニルヒドロラーゼである。ここで用いる“プロテアーゼ”は天然プロテアーゼまたは組換え型プロテアーゼを意味する。天然プロテアーゼはα−アミノアシルペプチド・ヒロドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシル−プロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼを含む。セリン、メタロ、チオール及び酸プロテアーゼが挙げられ、及びエンド及びエキソ−プロテアーゼが挙げられる。
【００１１】
本発明は、変異体のアミノ酸配列が得られる前駆体カルボニルヒドロラーゼと比較して異なるタンパク質分解活性、安定性、基質特異性、ｐＨプロファイル及び／または性能特徴を有する非天然型カルボニルヒドロラーゼ変異体（プロテアーゼ変異体）である、プロテアーゼ酵素を含む。特に、当該プロテアーゼ変異体は天然には見られないアミノ酸配列を有し、異なるアミノ酸を含む前駆体プロテアーゼの多数のアミノ酸残基の置換により得られる。前駆体プロテアーゼは天然プロテアーゼまたは組換え型プロテアーゼである。
【００１２】
本発明で有用なプロテアーゼ変異体は、指定のアミノ酸残基位置で１９の天然Ｌ−アミノ酸のいずれかの置換を含む。当該置換は任意の前駆体ズブチリシンにおいて作られる（原核生物、真核生物、哺乳類、等）。この出願の全体にわたって、種々のアミノ酸を一般的な１及び３文字記号を用いて言及する。当該記号はＤａｌｅ，Ｍ．Ｗ．（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（細菌の分子遺伝学），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｂに特定されている。
【００１３】
本発明で有用なプロテアーゼ変異体は好ましくはバチルス・ズブチリシンから得られる。より好ましくは、プロテアーゼ変異体はバチルス・レンタスズブチリシン及び／またはズブチリシン３０９から得られる。
【００１４】
ズブチリシンは、一般的にタンパク質またはペプチドのペプチド結合を切断する働きを有する細菌性または真菌プロテアーゼである。ここで用いる“ズブチリシン”は、天然または組み換え型ズブチリシンを意味する。一連の天然ズブチリシンは種々の微生物種により生成され、よく分泌されることが知られる。この一連のメンバーのアミノ酸配列は完全に相同ではない。しかしながら、この一連のズブチリシンは同じまたは類似のタイプのタンパク質分解活性を示す。セリンプロテアーゼのこの分類は、触媒３残基を特徴付ける共通のアミノ酸配列を共有し、セリンプロテアーゼのキモトリプシン関連分類と区別している。ズブチリシン及びキモトリプシン関連セリンプロテアーゼの両方は、アスパラギン酸塩、ヒスチジン及びセリンを含む触媒３残基を有する。ズブチリシン関連プロテアーゼにおいて、これらのアミノ酸の相対順序は、アミノからカルボキシ末端へ読取って、アスパラギン酸塩−ヒスチジン−セリンである。キモトリプシン関連プロテアーゼにおいて、相対順序は、しかしながら、ヒスチジン−アスパラギン酸塩−セリンである。従って、ここでズブチリシンは、ズブチリシン関連プロテアーゼの触媒３残基を有するセリンプロテアーゼをいう。例として、限定されないが、図３で特定されるズブチリシンを含む。一般的に、及び本発明の目的において、プロテアーゼ中のアミノ酸の番号は、図１に表される成熟バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシン配列に割当てた数に対応する。
【００１５】
“組換え型ズブチリシン”または“組換え型プロテアーゼ”は、ズブチリシンまたはプロテアーゼをエンコードするＤＮＡ配列が修飾され、天然アミノ酸配列における１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入をエンコードする変異（または突然変異）ＤＮＡ配列を生成するズブチリシンまたはプロテアーゼをいう。当該変異を生成する適当な方法は、米国特許ＲＥ３４，６０６号、米国特許第５，２０４，０１５号及び米国特許第５，１８５，２５８号、米国特許第５，７００，６７６号、米国特許第５，８０１，０３８号及び米国特許第５，７６３，２５７号に開示されるものを含み、ここに組込まれる。
【００１６】
“非ヒトズブチリシン”及びそれらをエンコードするＤＮＡは多くの原核及び真核生物から得られる。原核生物の適当な例は、大腸菌またはシュードモナスなどのグラム陰性生物及びミクロコッカスまたはバチルスなどのグラム陽性細菌を含む。ズブチリシン及びそれらの遺伝子が得られる真核生物の例としては、サッカロマイセス・セレヴィシエなどの酵母、アスペルギルス種などの真菌を含む。
【００１７】
“酵素変異体”は“前駆体酵素”のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有する。前駆体酵素プロテアーゼは天然酵素及び組換え酵素を含む。本発明者が意図する酵素は、限定されないが、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼを含む。本発明者が意図する具体的な酵素は、限定されないが、アミラーゼ、ラッカーゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ及びパーミアーゼを含む。酵素変異体のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入により前駆体酵素アミノ酸配列から“得られる”。当該変異は前駆体酵素それ自体の操作というよりもむしろ、前駆体酵素のアミノ酸配列をエンコードする“前駆体酵素ＤＮＡ配列”の変異である。前駆体ＤＮＡ配列をそのように操作する適当な方法はここに開示する方法及び当業者に公知の方法を含む。プロテアーゼに関するいかなる引用または議論はその他の酵素、例えば、上で特定した一部の酵素に適用可能であることを当然である。
【００１８】
“プロテアーゼ変異体”は、“前駆体プロテアーゼ”のアミノ酸配列から得られるアミノ酸配列を有する。前駆体プロテアーゼは天然プロテアーゼ及び組換え型プロテアーゼを含む。プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入により前駆体プロテアーゼアミノ酸配列から“得られる”。当該変異は前駆体プロテアーゼ酵素それ自体の操作というよりもむしろ、前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列をエンコードする“前駆体ＤＮＡ配列”の変異である。前駆体ＤＮＡ配列の当該操作の適当な方法は、ここに開示する方法を含み、及び当業者に公知の方法を含む（例えば、ＥＰ０  ３２８２９９、ＷＯ８９／０６２７９及びここに既に引用した米国特許及び出願を参照）。
【００１９】
“荷電アミノ酸”は潜在的にイオン性であり、電荷が変化し、特定のｐＨまたはｐＨ範囲で帯電するアミノ酸として定義する。これらのアミノ酸は、例えば、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸及びいくつかの極性アミノ酸を含む。酸性アミノ酸はｐＨ６．０で負に帯電したアミノ酸であり、例えばアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）及び／またはグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。塩基性アミノ酸はｐＨ６．０で正に帯電したアミノ酸であり、例えばリジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、及び／またはヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）である。
【００２０】
“非荷電アミノ酸”は潜在的にイオン性でないアミノ酸として定義する。これらのアミノ酸は、限定されないが、非荷電非極性アミノ酸、及び／または非荷電極性アミノ酸を含む。非荷電非極性アミノ酸は、限定されないが、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、及び／またはメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）を含む。非荷電極性アミノ酸は、限定されないが、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）及び／またはグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）を含む。
【００２１】
“正味静電荷（Ｎｅｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃｈａｒｇｅ）”は所定のｐＨまたはｐＨ範囲での変異体または前駆体酵素またはプロテアーゼの静電荷の合計として定義される。典型的なｐＨはｐＨ６．０である。
【００２２】
“等電点”（ｐｌ０）は、タンパク質またはタンパク質複合体、例えばプロテアーゼまたはプロテアーゼ複合体（任意で金属またはその他のイオンを付随するもの）が中性であるｐＨ値として定義するものであり、すなわち、複合体の静電荷の合計（正味静電荷＝ＮＥＣ）はゼロである。この合計において、個々の静電荷の正または負の性質の対価は考慮しなければならない。
【００２３】
“同じ等電点（ｐｌ０）”はｐＨ単位の明確な範囲内であるｐｌ０として定義される。例えば、ｐＨ単位の明確な範囲はその他のｐｌ０と比較するｐｌ０の１ｐＨ単位以下であり、０．２５〜０．７５の間、例えば、０．５ｐＨ単位であり、好ましくは０．０１〜０．５ｐＨ単位内であり、例えば０．１ｐＨ単位、及びより好ましくは０．００１〜０．０５ｐＨ単位内、例えば、０．０１ｐＨ単位である。同じ等電点は所定のｐＨまたは所定のｐＨ範囲で決定できる。
【００２４】
“同一の静電荷”は、 “Ｚ”または前駆体プロテアーゼ中に存在する電荷と同じ数のプロテアーゼ変異体中の特定荷電残基を維持するものとして定義される。荷電残基の数は同じであるが、特定アミノ酸残基は、正味の静電荷が所定のｐＨで前駆体プロテアーゼと同じである限りは、プロテアーゼ変異体の外側周辺のその他の位置に置換できる。
【００２５】
“同じ正味静電荷”は、“Ｚ”またはプロテアーゼ変異体の静電荷の合計の明確な範囲内のプロテアーゼ前駆体の静電荷の合計を維持するものとして定義される。同じ合計静電荷の維持は明確なｐＨ範囲にわたって明確な範囲の電荷単位内で正味静電荷を維持することを意味する。プロテアーゼ前駆体と同じ正味静電荷を有するプロテアーゼ変異体は前駆体プロテアーゼの明確な数の電荷単位内の正味静電荷を有する。例えば、同じ正味静電荷を有するプロテアーゼ変異体は１ｐＨ単位以下であり、前駆体プロテアーゼ正味静電荷の０．２５〜０．７５電荷単位内であり、例えば、０．５単位である。さらに、より好ましくは、同じ正味静電荷を有するプロテアーゼ変異体は前駆体プロテアーゼ正味静電荷の０．０５〜０．２５単位内であり、例えば、０．１単位である。さらに、より好ましくは、同じ正味静電荷を有するプロテアーゼ変異体は前駆体プロテアーゼ正味静電荷の０．００１〜０．０５単位内であり、例えば、０．０１単位である。電荷単位は提供する（酸）または受け取る（塩基）プロトンの数として定義できる。個々のアミノ酸の静電荷は所定のｐＨ、例えば、６．０または７．０で受け取るまたは提供するプロトンの数を決定することにより通常確定できる。Ｚ値もこの出願内で後述する式により決定できる。
【００２６】
変異体または前駆体プロテアーゼの“合計電荷量”はそれぞれのプロテアーゼの静電荷の合計数として定義される。同じ正味静電荷を有するプロテアーゼ変異体は前駆体プロテアーゼと異なる合計電荷量を有することができる。
【００２７】
当業者により認識されるように、等電点は、問題の酵素中の種々の荷電残基のｐＫ値を用いる平衡対価を用いることにより適宜計算でき、それから、ここに明示的に引用する欧州特許第０９４５５０２号及びその実施例に記載されるように、酵素分子のＮＥＣがゼロに等しいｐＨ値の繰り返しにより見つけられる。
【００２８】
この計算の１つの問題点は荷電残基のｐＫ値がその環境に依存し、その結果変動するということである。しかしながら、実際の値と関係ない特定の近似ｐＫ値を荷電残基に割り当てることにより非常に良い結果が得られるようになる。また、部分的に環境を考慮に入れることでより高度な計算を行うことが可能になる。
【００２９】
また、ｐｌ０は等電点電気泳動法または酵素を含んだ溶液を滴定することにより実験的に決定できる。さらに、荷電残基の種々のｐＫ値は滴定により実験的に決定できる。
【００３０】
本発明の別の側面において、ｐｌ０についての上述の観測はさらに、前駆体プロテアーゼ中のアミノ酸の欠失、置換または挿入される位置及びアミノ酸を決定または選択する方法に利用し、変異体プロテアーゼの正味静電荷または等電点が、同じｐＨ値または明確なｐＨ範囲で計算される前駆体プロテアーゼのＮＥＣまたはｐｌ０と同じになるようにする。
【００３１】
本発明でカバーされるこの原則を表す他の方法は、前記前駆体プロテアーゼまたは酵素中のアミノ酸の欠失、置換または挿入される位置及びアミノ酸が１の方法で選択されるものであり、それにより電荷または合計電荷量（＝ＴＣＣ）の合計数及び／または最終的な変異体プロテアーゼまたは酵素のＮＥＣがプロテアーゼまたは酵素の最適洗浄能力に関する明確なｐＨまたはｐＨ範囲で変化しない等電点を有する変異体プロテアーゼまたは酵素を提供するように一定を維持し、最適ｐＨは洗浄溶液のｐＨにできるだけ接近させるべきであり、前記変異体プロテアーゼは使用するためのものである。
【００３２】
上に示すように、酵素などの巨大分子のｐｌ０は該分子のＮＥＣがゼロであるｐＨとして計算する。該手順は欧州特許０  ９４５  ５０２に記載の実施例で説明されているが、該原則をここにより詳細に記載する。
【００３３】
ｐＫ値は各潜在性の荷電アミノ酸残基に割り当てる。それから、荷電または非荷電形（荷電／非荷電、Ｃ／Ｕ（ｉ））の所定のｐＨのアミノ酸残基の存在比を式Ｉａ及びＩｂを用いて負及び正電荷の両方について計算する。
【００３４】
Ｃ／Ｕ（ｉ）＝１０（ｐｈ−ｐＫｉ）（負電荷）（Ｉａ）
Ｃ／Ｕ（ｉ）＝１０（ｐＫｉ−ｐｈ）（正電荷）（Ｉｂ）
上述の式に従うと、ｐＨがｐＫｉと等しい場合、Ｃ／Ｕ（ｉ）は１である。
【００３５】
相対電荷、Ｑｒ（ｉ）または各荷電残基に割り当てた電荷寄与（ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、式ＩＩａ及びＩＩｂを用いて計算する。  
Ｑｒ（ｉ）＝Ｃ／Ｕ（ｉ）／（１＋Ｃ／Ｕ（ｉ））（負電荷）（ＩＩａ）
Ｑｒ（ｉ）＝−Ｃ／Ｕ（ｉ）／（１＋Ｃ／Ｕ（ｉ））（正電荷）（ＩＩｂ）
【００３６】
荷電残基から得られる全ての電荷寄与の合計がゼロである場合のｐＨ値は、繰り返しにより、または十分に濃いｐＨ−電荷合計表（ｓｕｍ  ｔａｂｌｅ）により見出すことができる。
【００３７】
正味静電荷Ｚを決定する他の方法は、基（Ｒまたはアミノ基など）が陽イオン性の酸の形態を有する場合、αが部分正電荷を表すということは当業者が理解することである：
【数１】
2005519592.tif 000003
【００３８】
一方、カルボキシルなどの基は、中性の酸の形態及び陰イオン性の共役塩基を含み、αは非荷電部分を表す。そして、部分電荷は：
【数２】
2005519592.tif 000004
【００３９】
種々の大半のプロテアーゼまたは酵素の性質はＮＥＣ及び／またはプロテアーゼまたは酵素分子の等電点に依存することが留意される。例えば、プロテアーゼまたは酵素溶解性、安定性、複数の相媒体中の位相分布及び／または表面電荷は分子のＮＥＣ及び／または等電点の変化により影響を受ける性質である。驚くべきことに、改善されたプロテアーゼの特徴は同じ等電点または同じ正味静電荷を維持しながら達成できた。特定の理論に縛られることは望まないが、問題のタンパク質、酵素またはプロテアーゼの大部分の性質を維持するが、分子の相互作用の運動、例えば基質、表面または培地に関する変化の分布または分子の配向を修飾することが望ましい状況があると考えられる。
【００４０】
本発明の１の側面において、プロテアーゼ変異体及び前駆体プロテアーゼは同一の正味静電荷または同一の等電点を有する。同一の正味静電荷は同一静電荷を有することにより、または前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列への追加の修飾による追加の変異位置から生じる電荷変化を相殺することにより維持できる。これらの追加の変異は、限定されないが、追加残基に対して反対の電荷を有する残基を置換または挿入することを含む（追加の塩基性残基を相殺するために追加の酸性残基を加える）。従って、プロテアーゼ変異体中の荷電残基の数は、例えば、荷電残基の数がプロテアーゼ前駆体におけるものよりも多い場合、プロテアーゼ前駆体のものと異なると考えられる。追加の荷電残基を相殺するために、相当する反対の荷電アミノ酸置換を同じ正味静電荷を維持するために作ることができる。さらに、プロテアーゼまたは酵素変異体中の荷電残基の数は、それが他の非荷電残基に相当する反対の荷電アミノ酸欠失または置換であって、荷電残基が非荷電残基を欠失または置換する場合、プロテアーゼまたは酵素前駆体中の荷電残基の数より少ない。
【００４１】
本発明の１の側面は、ＮＥＣまたはｐｌ０が同一の場合、例えばプロテアーゼ変異体及び前駆体プロテアーゼの合計電荷量が同じ場合、または前駆体プロテアーゼ中の荷電残基が同じ数で維持される場合である。荷電アミノ酸が同一のＮＥＣまたはｐｌ０を維持するために再配置される場合、少なくとも１のこれらの荷電アミノ酸が前駆体プロテアーゼの残基位置から異なる残基位置に置換される。プロテアーゼ前駆体中の特定の荷電アミノ酸、バチルス・レンタス（ＧＧ３６） 中の“Ｘ”リジン、が特定数ある場合、それから変異体プロテアーゼは同じ数だが前駆体プロテアーゼと比較して異なる位置のリジン残基、すなわち、“Ｘ”を保有する。従って、例えば、Ｋ２７は異なる残基で置換でき、相当するＫは他の位置、好ましくは表面位置で置換される。１の実施態様において、荷電残基、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンまたはアルギニンは異なる位置に置換できる。同一の静電荷を維持するために、荷電残基により置換される特定前駆体残基、例えば位置２７からのＫ残基、は位置２７で置換できる。例えば、Ｒ４５Ｎ−Ｎ２０４Ｒは同一の静電荷を維持するために置換された同一の残基位置を有する。さらに、荷電残基により置換された特定の前駆体残基が非荷電残基である場合、その他の非荷電残基は荷電残基をもともと有する位置に置換できる。例えば、Ｒ１７０Ｓ−Ａ１Ｒの組み合わせはアラニンをアルギニンで置換し、アルギンをセリンで置換する。もちろん、複数の変異を作る場合、任意の置換残基がその他の任意の残基中に置換でき、各々のアミノ酸が同じ数で維持される限り変異される。静電荷は、プロテアーゼ変異体及び前駆体プロテアーゼが同じｐＨで測定される限り、任意の所定ｐＨで測定できる。
【００４２】
本発明の他の側面において、分子の同じ正味静電荷は、前駆体プロテアーゼに対する変異から生じる正味静電荷の変化を相殺することにより維持する。例えば、当該変異を達成する１の方法は、別の反対の荷電アミノ酸残基の挿入または置換や、異なるが類似に帯電したアミノ酸残基の欠失である。例えば、プロテアーゼ変異体中に前駆体プロテアーゼ中よりも多くの酸性アミノ酸が存在する場合、変異体は追加の塩基性アミノ酸を含む。例えば、プロテアーゼ変異体中に前駆体プロテアーゼよりも多くの特定の酸性アミノ酸、例えば、グルタミン酸が存在する場合、当該変異を相殺するために、対応する数のアスパラギン酸残基を欠失または非荷電アミノ酸で置換できる。例えば、前駆体プロテアーゼ中に特定の数の荷電アミノ酸が存在する場合、本発明者は、変異体プロテアーゼのアミノ酸の数の増加または減少とともに荷電アミノ酸の数の変化を相殺するアミノ酸の対応する増加または減少を意図する。  従って、上述の通り、追加の正電荷残基は、対応する数の負電荷アミノ酸を追加することにより、または対応する数のその他の正電荷アミノ酸を非電荷残基またはそれらの組み合わせで置換することにより相殺できる。より少ない数の正電荷残基は対応する数の負電荷アミノ酸を欠失させることにより、対応する数の負電荷アミノ酸またはそれらの組み合わせを対応する数の非電荷残基で置換することにより相殺できる。
【００４３】
１の実施態様において、第１のアミノ酸位置で非荷電残基により置換される同じ荷電のアミノ酸残基は、荷電残基を置換する同じ非荷電アミノ酸が存在する、第２のアミノ酸位置に置換される。非荷電残基は荷電アミノ酸の元の位置で置換でき、一方、置換荷電アミノ酸は非荷電アミノ酸の位置を置換できる。例えば、Ｒ４５Ｎ−Ｎ２０４Ｒは荷電アミノ酸、アルギニンに関する非荷電アミノ酸、アルパラギンの置換を反映する。荷電アミノ酸を置換した同じ非荷電アミノ酸は荷電アミノ酸が再挿入される位置に存在する必要はない。例えば、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、及び／またはトレオニン（ＴｈｒまたはＴ）の群より選択される非荷電アミノ酸は荷電アミノ酸位置に置換でき、一方荷電アミノ酸残基は上述の群のその他でもとから占められているアミノ酸位置に置換される。例えば、変異体Ｅ２７１Ｔ−Ｇ１００Ｅにおいて、２７１位置のグルタミン酸アミノ酸はトレオニンアミノ酸で置換され、一方、１００位置のグリシン残基はグルタミン酸アミノ酸で置換される。同様に、同一の荷電アミノ酸は最初から非荷電の位置、例えば、Ｋ２７Ｔ−Ｇ１００Ｅに置換される必要はない。荷電アミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ）はこの点において有用である。
【００４４】
本発明の他の側面において、プロテアーゼ変異体ＮＥＣは、０．５荷電単位（Ｚ）の範囲以下、前駆体プロテアーゼＮＥＣの範囲から０〜１４のｐＨの範囲以上と様々である。
【００４５】
さらに本発明の他の側面において、プロテアーゼ変異体ＮＥＣは、１電荷単位の範囲以下、前駆体プロテアーゼＮＥＣの範囲から明確なｐＨ範囲以上で変化する。明確なｐＨ範囲は例えば、所望のプロテアーゼまたは酵素環境に関して最適または所望のｐＨとして当業界で認識される２ｐＨ単位内、またはｐＨ４単位の範囲内である。
【００４６】
本発明の他の側面において、前駆体プロテアーゼ内で見られる電荷残基の変異は、同じまたは同一の正味静電荷を維持しながら、増加した有益な洗浄特性を示すプロテアーゼ変異体を生じることができることが確認された。
【００４７】
本発明のさらに別の側面において、前駆体プロテアーゼ内で見られる電荷残基の変異は、明確なｐＨで、明確なｐＨ範囲を超えて、例えば、４ｐＨ単位の範囲を超えて、または０．００１〜１４のｐＨ範囲を超えて、同じまたは同一の正味静電荷を維持しながら、増加した有益な洗浄特性を示すプロテアーゼ変異体を生じることができることが確認された。
【００４８】
本発明者が変異を目的とする典型的なアミノ酸残基は、例えば、リジン、アルギニン、及び／またはヒスチジンなどの塩基性アミノ酸；例えばアスパラギン酸及び／またはグルタミン酸などの酸性アミノ酸；及び／またはそうでなければ例えばチロシンなどの極性Ｒ基を含む。
【００４９】
他の側面において、本発明の変異体プロテアーゼは前記前駆体プロテアーゼと比較して、同じ数の正電荷アミノ酸残基、前駆体プロテアーゼ中の同一のアミノ酸及び同じ電荷を有する異なるアミノ酸の両方、及び前駆体プロテアーゼ中の同じ数の負電荷アミノ酸残基；または、バチルス・アミロリケファシエンス（ＢＰＮ’）の位置５、７、２２、２３、２４、２６、２８−３１、３４、４５、４７、６３、６５、６６、６９、７０、７３、８２−８５、８８、９０、９２、９３、９７、１０２、１０５、１１３、１２５、１２７、１３８、１３９、１４８−１５１、１６９、１７０、１７６、１７８、１７９、１９３、１９６、２００、２０１、２０２、２０７、２１９、２２０、２２３、２２９、２３３、２５０、２６６、２６７及び２７３の１以上の任意の位置での対応アミノ酸残基間で変異を有するが、プロテアーゼ変異体の正味静電荷及び／または等電点が前駆体プロテアーゼと同じになるように、より多いまたは少ない正電荷アミノ酸残基及び対応するより多いまたは少ない負電荷アミノ酸残基を有する。１の実施態様において、２７、４５、１３６、１７０、１８１、２４７、２５１及び／または２７１の１以上の位置での対応アミノ酸残基間での変異は荷電残基位置の非荷電残基での置換を含む。これらの残基位置は、これらのバチルス・レンタス野生型における対応位置がこれらの位置の荷電アミノ酸残基を有するので、重要である。例えば、バチルス・レンタスズブチリシン（配列番号６）の２７、３８、４０、４４、６５、９２、１３４、１６４、１７５、２４１、２４５及び／または２６５の残基位置はそれぞれバチルス・アミロリケファシエンス（配列番号２）の２７、３９、４１、４５、６７、９４、１３６、１７０、１８１、２４７、２５１及び／または２７１に対応する。
【００５０】
他の側面において、本発明の変異体プロテアーゼは前記前駆体プロテアーゼと比較して、同じ数の正電荷アミノ酸残基、前駆体プロテアーゼ中の同一のアミノ酸及び同じ電荷を有する異なるアミノ酸の両方、及び前駆体プロテアーゼ中の同じ数の負電荷アミノ酸残基；または、バチルス・アミロリケファシエンス（ＢＰＮ’）の位置２７、３９、４１、４５、６７、９４、１３６、１７０、１８１、１９７、２４７、２４９、２５１及び／または２７１の１以上の任意の位置での対応アミノ酸残基間で変異を有するが、プロテアーゼ変異体の正味静電荷及び／または等電点が前駆体プロテアーゼと同じになるように、より多いまたは少ない正電荷アミノ酸残基及び対応するより多いまたは少ない負電荷アミノ酸残基を有する。本発明者が意図する具体的な置換は、バチルス・アミロリケファシエンスのＫ２７Ａ、Ｋ２７Ｃ、Ｋ２７Ｅ、Ｋ２７Ｑ、Ｋ２７Ｇ、Ｋ２７H、Ｋ２７Ｉ、Ｋ２７Ｌ、Ｋ２７Ｍ、Ｋ２７Ｆ、Ｋ２７Ｐ、Ｋ２７Ｓ、Ｋ２７Ｔ、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２７Y、Ｈ３９Ａ、Ｈ３９Ｒ、Ｈ３９Ｄ、Ｈ３９Ｎ、Ｈ３９Ｃ、Ｈ３９Ｅ、Ｈ３９Ｑ、Ｈ３９Ｇ、Ｈ３９Ｈ、Ｈ３９Ｉ、Ｈ３９Ｌ、Ｈ３９Ｋ、Ｈ３９Ｍ、Ｈ３９Ｆ、Ｈ３９Ｐ、Ｈ３９Ｔ、Ｈ３９Ｗ、Ｈ３９Ｙ、Ｈ３９Ｖ、Ｄ４１Ａ、Ｄ４１Ｒ、Ｄ４１Ｃ、Ｄ４１Ｅ、Ｄ４１Ｑ、Ｄ４１Ｇ、Ｄ４１Ｈ、Ｄ４１Ｉ、Ｄ４１Ｌ、Ｄ４１Ｋ、Ｄ４１Ｍ、Ｄ４１Ｆ、Ｄ４１Ｐ、Ｄ４１Ｓ、Ｄ４１Ｔ、Ｄ４１Ｗ、Ｄ４１Ｙ、Ｄ４１Ｖ、Ｒ４５Ａ、Ｒ４５Ｒ、Ｒ４５Ｄ、Ｒ４５Ｎ、Ｒ４５Ｃ、Ｒ４５Ｅ、Ｒ４５Ｃ、Ｒ４５Ｅ、Ｒ４５Ｑ、Ｒ４５Ｇ、Ｒ４５Ｈ、Ｒ４５Ｉ、Ｒ４５Ｌ、Ｒ４５Ｋ、Ｒ４５Ｍ、Ｒ４５Ｆ、Ｒ４５Ｐ、Ｒ４５Ｓ、Ｒ４５Ｔ、Ｒ４５Ｗ、Ｒ４５Ｙ、Ｒ４５Ｖ、Ｈ６７Ａ、Ｈ６７Ｒ、Ｈ６７Ｄ、Ｈ６７Ｎ、Ｈ６７Ｃ、Ｈ６７Ｅ、Ｈ６７Ｑ、Ｈ６７Ｇ、Ｈ６７Ｈ、Ｈ６７Ｉ、Ｈ６７Ｌ、Ｈ６７Ｋ、Ｈ６７Ｍ、Ｈ６７Ｆ、Ｈ６７Ｐ、Ｈ６７Ｓ、Ｈ６７Ｔ、Ｈ６７Ｗ、Ｈ６７Ｙ、Ｈ６７Ｖ、Ｋ９４Ａ、Ｋ９４Ｒ、Ｋ９４Ｄ、Ｋ９４Ｎ、Ｋ９４Ｃ、Ｋ９４Ｅ、Ｋ９４Ｑ、Ｋ９４Ｇ、Ｋ９４Ｈ、Ｋ９４Ｉ、Ｋ９４Ｌ、Ｋ９４Ｋ、Ｋ９４Ｍ、Ｋ９４Ｆ、Ｋ９４Ｐ、Ｋ９４Ｓ、Ｋ９４Ｔ、Ｋ９４Ｗ、Ｋ９４Ｙ、Ｋ９４Ｖ、Ｅ１３６Ａ、Ｅ１３６Ｄ、Ｅ１３６Ｎ、Ｅ１３６Ｃ、Ｅ１３６Ｅ、Ｅ１３６Ｇ、Ｅ１３６Ｈ、Ｅ１３６Ｉ、Ｅ１３６Ｌ、Ｅ１３６Ｋ、Ｅ１３６Ｍ、Ｅ１３６Ｆ、Ｅ１３６Ｐ、Ｅ１３６Ｓ、Ｅ１３６Ｔ、Ｅ１３６Ｗ、Ｅ１３６Ｙ、Ｅ１３６Ｖ、Ｒ１７０Ａ、Ｒ１７０Ｒ、Ｒ１７０Ｄ、Ｒ１７０Ｎ、Ｒ１７０Ｃ、Ｒ１７０Ｅ、Ｒ１７０Ｑ、Ｒ１７０Ｇ、Ｒ１７０Ｈ、Ｒ１７０Ｉ、Ｒ１７０Ｌ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｍ、Ｒ１７０Ｆ、Ｒ１７０Ｐ、Ｒ１７０Ｓ、Ｒ１７０Ｔ、Ｒ１７０Ｗ、Ｒ１７０Ｙ、Ｒ１７０Ｖ、Ｄ１８１Ａ、Ｄ１８１Ｒ、Ｄ１８１Ｄ、Ｄ１８１Ｎ、Ｄ１８１Ｃ、Ｄ１８１Ｅ、Ｄ１８１Ｑ、Ｄ１８１Ｇ、Ｄ１８１Ｈ、Ｄ１８１Ｉ、Ｄ１８１Ｌ、Ｄ１８１Ｋ、Ｄ１８１Ｍ、Ｄ１８１Ｆ、Ｄ１８１Ｐ、Ｄ１８１Ｓ、Ｄ１８１Ｔ、Ｄ１８１Ｗ、Ｄ１８１Ｙ、Ｄ１８１Ｖ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｒ、Ｄ１９７Ｄ、Ｄ１９７Ｎ、Ｄ１９７Ｃ、Ｄ１９７Ｅ、Ｄ１９７Ｑ、Ｄ１９７Ｇ、Ｄ１９７Ｈ、Ｄ１９７Ｉ、Ｄ１９７Ｌ、Ｄ１９７Ｋ、Ｄ１９７Ｍ、Ｄ１９７Ｆ、Ｄ１９７���、Ｄ１９７Ｓ、Ｄ１９７Ｔ、Ｄ１９７Ｗ、Ｄ１９７Ｙ、Ｄ１９７Ｖ、Ｒ２４７Ａ、Ｒ２４７Ｒ、Ｒ２４７Ｄ、Ｒ２４７Ｎ、Ｒ２４７Ｃ、Ｒ２４７Ｅ、Ｒ２４７Ｑ、Ｒ２４７Ｇ、Ｒ２４７Ｈ、Ｒ２４７Ｉ、Ｒ２４７Ｌ、Ｒ２４７Ｋ、Ｒ２４７Ｍ、Ｒ２４７Ｆ、Ｒ２４７Ｐ、Ｒ２４７Ｓ、Ｒ２４７Ｔ、Ｒ２４７Ｗ、Ｒ２４７Ｙ、Ｒ２４７Ｖ、Ｈ２４９Ａ、Ｈ２４９Ｒ、Ｈ２４９Ｄ、Ｈ２４９Ｎ、Ｈ２４９Ｃ、Ｈ２４９Ｅ、Ｈ２４９Ｑ、Ｈ２４９Ｇ、Ｈ２４９Ｈ、Ｈ２４９Ｉ、Ｈ２４９Ｋ、Ｈ２４９Ｍ、Ｈ２４９０Ｆ、Ｈ２４９Ｐ、Ｈ２４９Ｓ、Ｈ２４９Ｔ、Ｈ２４９Ｗ、Ｈ２４９Ｖ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｑ、Ｋ２５１Ｇ、Ｋ２５１Ｈ、Ｋ２５１Ｉ、Ｋ２５１Ｌ、Ｋ２５１Ｋ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｐ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｗ、Ｋ２５１Ｙ、Ｋ２５１Ｖ、Ｅ２７１Ａ、Ｅ２７１Ｒ、Ｅ２７１Ｄ、Ｅ２７１Ｎ、Ｅ２７１Ｃ、Ｅ２７１Ｅ、Ｅ２７１Ｈ、Ｅ２７１Ｉ、Ｅ２７１Ｌ、Ｅ２７１Ｋ、Ｅ２７１Ｍ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｐ、Ｅ２７１Ｓ、Ｅ２７１Ｔ、Ｅ２７１Ｗ、Ｅ２７１Ｙ、及び／またはＥ２７１Ｖを含む。正電荷残基のそれ自身の置換による数の増加は、特定の洗浄環境において特定の変異体の効果の増加を生じると同時に、対応する反対の電荷変化は異なる洗浄環境において効果の増加を生じることができることに気付いた。例えば、負電荷変異は低イオン強度洗浄環境で有利な特徴を与え、正電荷変異は高イオン強度洗浄環境で有利な特徴を与えることが予想される。同じ正味静電荷または等電点を維持しながら正の増加及び負の増加の両方を含む変異体は、前駆体プロテアーゼの性能と比較して、両方の環境において改善された特徴を示すプロテアーゼ分子を生じることが予想される。
【００５１】
これらの置換は好ましくはバチルス・レンタス（組み換え体または天然型）ズブチリシン内で作られるが、該置換は任意のバチルス・プロテアーゼ内、例えばバチルス・アミロリケファシエンス及び／またはズブチリシン３０９内で作ることができる。
【００５２】
本発明の１の側面は、１、２−４、６、９−１２、１９、１４、１５、１７−２０、２５、２７、３６−３８、４０、４４、４９、５１、５２、５４−６１、６８、７１、７５、７６、８７、８９、９１、９７、１００−１０２、１０４、１０８、１１１、１１２、１１５、１１７、１１８、１２０−１２３、１２８、１２９、１３１、１３３、１３４、１３６、１３７、１４０、１４３−１４６、１５９、１６４、１６５、１６７、１７０、１７１、１７３、１７５、１８０、１８２−１８７、１９１、１９２、１９４、１９５、２０４、２０６、２０９−２１２、２１６、２１８、２２２、２２４、２２６、２３４−２４５、２５２、２５５、２５７−２６３、２６５、２６８、２６９及び２７４からなる群より位置付けられるまたは選択される残基に対応する１以上の残基位置において、さらに少なくとも１の別の置換アミノ酸を含むプロテアーゼ変異体を含む。本発明者によって意図される具体的な置換は、バチルス・アミロリケファシエンスまたはバチルス・レンタスのＩ１２２Ａ、Ｙ１９５Ｅ、Ｍ２２２Ａ、Ｍ２２２Ｓ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ａ１９４Ｐ、Ｄ３６、Ｎ７６Ｄ、Ｈ１２０Ｄ、Ｇ１９５Ｅ及びＫ２３５Ｎに等しい残基を含み、該変異体はバチルス・ズブチリシンから得られる。
【００５３】
特に重要なのは、これらの位置の変異体が荷電アミノ酸置換とともに増加した洗浄能力を示す点である。これらの位置を含み、及び最初から荷電アミノ酸を有する変異体の組み合わせは
重要である。本発明者が意図する典型的な組み合わせはＫ２７Ｔ−Ｇ１００Ｅ、Ｒ４５Ｎ−Ａ１Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｐ１４Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｇ６１Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｓ１２８Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｎ２０４Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｓ２１６Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｇ２５８Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ａ１Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｐ１４Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｓ４９Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｇ６１Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｇ１００Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｓ１２８Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｎ２０４Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｓ２１６Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｇ２５８Ｒ、Ｄ１８１Ｎ−Ｇ１１８Ｄ、Ｄ１８１Ｎ−Ｇ２５８Ｄ、Ｋ２５１Ｇ−Ｓ８７Ｋ、Ｅ２７１Ｔ−Ｓ４９Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｔ６６Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｇ１００Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｇ１０２Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｓ１２８Ｅ、Ｒ４５Ｎ−Ｇ１１８Ｅ−Ｅ２７１Ｒ、Ｓ４９Ｒ−Ｇ１０２Ｅ−Ｒ１７０Ｓ−Ｅ２７１Ｔ及びＰ１４Ｒ−Ｒ４５Ｎ−Ｒ１７０Ｓ−Ｇ２５８Ｒを含む。これらの変異を有するプロテアーゼ変異体が作ることができることは当業者に当然理解され、米国特許第５，７４１，６９４号、第６，１９０，９００号、及び第６，１９７，５６７号に記載され、明示的にここに引用する。さらに、これらの変異は仮出願番号第６０／４２３，０８７（２００２年１１月１日に出願；Ｎｅｅｌａｍ  ＡｍｉｎとＶｏｌｋｅｒ  Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）に記載される直接的なバチルス形質転換法を用いても行うことができる。１の実施態様において、変異は融合ＰＣＲ技術を用いて行った（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，ＡＶ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１９９２年７月５日（５）：４１３−２０）。同時にこの日に提出された、仮出願番号＿／＿＿＿＿＿（Ｃｈｒｉｓ  Ｌｅｅｆｌａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．）。
【００５４】
本発明のさらに別の側面において、バチルス・アミロリケファシエンスの２１、２２、２４、３２、３３、３６、５０、６４、６７、７７、８７、９４、９５、９６、９７、１０４、１０７、１１０、１２４、１２３、１２６、１２７、１２８、１２９、１３５、１５２、１５５、１５７、１５６、１６６、１６９、１７０、１７１、１７２、１８９、１９７、２０４、２１３、２１４、２１５、２１７、２２２または２７４からなる群より位置付けられる１以上の同等残基においてさらに少なくとも１の別の置換アミノ酸を有するプロテアーゼ変異体を含む。本発明者により意図される具体的な残基は以下を含む：Ｋ２７Ｒ、Ｍ５０Ｆ、Ｎ７６Ｄ、Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ｖ１０４Ｙ、Ｉ１２２Ａ、Ｎ１２３Ｓ、Ｍ１２４Ｌ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ２１７Ｌ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、Ｎ２４８Ｄ、Ｎ２５２Ｋ、Ｔ２７４Ａ、及びＭ２２２Ｓ。プロテアーゼ変異体、３つの位置の変異をエンコードする組換えＤＮＡ、及び／またはこれらの変異を作る方法は米国特許ＲＥ３４，６０６号；第５，９７２，６８２号；第５，１８５，２５８号；第５，３１０，６７５号；第５，３１６，９４１号；第５，８０１，０３８号；第５，９７２，６８２号；第５，９５５，３４０号及び第５，７００，６７６号に記載されており、明示的にここに引用する。
【００５５】
これらのアミノ酸位置番号は図１で表された成熟バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンに割当てた番号をいう。本発明は、しかしながら、この特定のズブチリシンの変異に限定されず、バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの特定の同定残基に“等しい”位置でのアミノ酸残基を含む前駆体プロテアーゼまで広がる。本発明の好ましい実施態様において、前駆体プロテアーゼはバチルス・レンタスズブチリシン（配列番号６）であり、置換は上述の位置に対応するバチルス・レンタスにおける同等のアミノ酸残基位置に作られる。
【００５６】
前駆体プロテアーゼの残基（アミノ酸）位置は、それがバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの特定残基またはその一部と相同（すなわち、一次または三次構造の位置が一致する）または類似している場合、バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの残基に等しい（すなわち、結合、反応または化学的に相互作用するための同じまたは類似の機能的能力を有する）。
【００５７】
一次構造の相同性を確立するために、前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列はバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシン一次配列、及び特に配列が公知なズブチリシンにおいて不変な公知の残基の組と直接比較する。例えば、ここで図２はバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシン及びバチルス・レンタスズブチリシン間での保存残基を示す。保存残基を並べ、配列を維持するために必要な挿入及び欠失を考慮した後（すなわち、任意の欠失及び挿入により保存残基が除去されるのを防ぐ）、バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの一次配列中の特定のアミノ酸に等しい残基を明確にする。保存残基の配列は、好ましくは当該配列の１００％保存されるべきである。しかしながら、保存残基の９８％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７５％以上、５０％以上、または少なくとも４５％以上の配列も同等残基を明確にするために十分である。触媒３残基、Ａｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存は維持されるべきである。Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７１９−７３７は多数のセリンプロテアーゼの配列を示す。Ｓｉｅｚｅｎらはサブチラーゼ（ｓｕｂｔｉｌａｓｅｓ）またはズブチリシン様セリンプロテアーゼの分類に言及している。
【００５８】
例えば、図３において、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ズブチリス、バチルス・リケニホルミス（カールスベルゲンシス）及びバチルス・レンタス由来のズブチリシンのアミノ酸配列はアミノ酸配列間に最大値の相同性を与えるように配列する。これらの配列の比較は各配列に含まれる多数の保存残基があることを示す。これらの保存残基（ＢＰＮ’とバチルス・レンタス間）は図２に同定される。
【００５９】
これらの保存残基は、従って、ここでの好ましいプロテアーゼ前駆体酵素である、バチルス・レンタス（ＰＣＴ公報ＷＯ８９／０６２７９、１９８９年７月１３日に公開）由来ズブチリシン、または好ましいバチルス・レンタスズブチリシンと相同性の高い、ＰＢ９２（ＥＰ０  ３２８２９９）として言及されるズブチリシンなどのその他のズブチリシンにおいてバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの対応する同等なアミノ酸残基を特定するために使用できる。特定のこれらズブチリシンのアミノ酸配列は、保存残基の最大相同性を得るために、バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの配列と一緒に図３Ａ及び３Ｂに配列する。図に示すように、バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンと比較して、バチルス・レンタスの配列中に多数の欠失がある。従って、例えば、その他のズブチリシンにおけるバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシン中のＶａｌ１６５の同等アミノ酸はバチルス・レンタス及びバチルス・リケニホルミスのイソロイシンである。
【００６０】
また、“同等残基（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）”は三次構造がＸ線結晶学により決定された前駆体プロテアーゼの三次構造のレベルでの相同性を決定することにより特定できる。同等残基は前駆体プロテアーゼの特定アミノ酸残基の２以上の主鎖原子の原子座標の残基として特定し、バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシン（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣ及びＯ上のＯ）は配列後０．１３ｎｍ内であり、好ましくは０．１ｎｍである。最適モデルを方向付け、バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンに対して問題になっているプロテアーゼの水素でないタンパク質原子の原子座標の最大重複を与えるように位置付けた後、配列が達成される。最適モデルは、最も高い可能な解答での実験的回折データの最も低いＲ因子を与える結晶学モデルである。
【００６１】
【数３】
2005519592.tif 000005
【００６２】
バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの特定残基に機能的に類似する同等残基は、タンパク質構造を変化、修飾または寄与するような構造、基質結合またはバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの特定残基を特定または起因するような触媒作用に適合できる前駆体プロテアーゼのアミノ酸として特定される。さらに、これらは、所定の残基の主鎖原子は占める相同性位置に基づいて同等の基準を満たさないが、残基の少なくとも２の側鎖原子の原子座標はバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍにある範囲において類似位置を占める前駆体プロテアーゼ（三次構造をＸ線結晶学により得た）の残基である。バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの３次元構造の座標はＥＰＯ公報第０  ２５１４４６（対応特許、米国特許第５，１８２，２０４号、開示の内容をここに引用する）に示され、三次元構造のレベルで同等残基を決定するための上述の概要として用いることができる。
【００６３】
置換に関して同定されたいくつかの残基は保存残基であり、一方その他のものは保存残基ではない。保存されていない残基の場合、１以上のアミノ酸の置換は天然に見られるアミノ酸配列と一致しないアミノ酸配列を有する変異体を生成する置換に限定される。保存残基の場合、このような置換は天然配列を生じないはずである。本発明のプロテアーゼ変異体はプロテアーゼ変異体の成熟型及び当該プロテアーゼ変異体のプロ及びプレプロ型を含む。プレプロ型は、プロテアーゼ変異体の発現、分泌及び変異を促進するので、好ましい構造である。
【００６４】
“プロ配列”は、除去された時、“成熟”型プロテアーゼを生じる、成熟型プロテアーゼのＮ末端部分に結合するアミノ酸配列をいう。多くのタンパク質分解酵素は、翻訳プロ酵素生成物として天然に見られ、翻訳後処理がない場合、この方法で発現する。その他のプロテアーゼ・プロ配列が使用できるが、プロテアーゼ変異体を生成する好ましいプロ配列はバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンズブチリシンの推定上のプロ配列である。
【００６５】
“シグナル配列”または“プレ配列”は、プロテアーゼのＮ末端部分または成熟またはプロ型プロテアーゼの分泌に関与するプロプロテアーゼのＮ末端部分に結合するアミノ酸の任意の配列をいう。シグナル配列のこの定義は機能上のものであり、天然の条件下でプロテアーゼの分泌の実行に関与するプロテアーゼ遺伝子のＮ末端部分によりエンコードされるすべてのそれらのアミノ酸配列を含むことを意味する。本発明はここに定義するプロテアーゼ変異体の分泌を達成するために当該配列を利用する。１の可能なシグナル配列はバチルス・レンタス（ＡＴＣＣ２１５３６）由来のズブチリシンのシグナル配列の残余と融合したバチルス・ズブチリスズブチリシン由来のシグナル配列の最初の７つのアミノ酸残基を含む。
【００６６】
“プレプロ”型プロテアーゼ変異体はプロテアーゼのアミノ末端に作動可能に連結するプロ配列、及びプロ配列のアミノ末端に作動可能に連結する“プレ”または“シグナル”配列を有するプロテアーゼの成熟型からなる。
【００６７】
“発現ベクター”は、適当な宿主中に前記ＤＮＡの発現をもたらすことができる適当な制御配列に作動可能に連結するＤＮＡ配列を含んだＤＮＡ構築体をいう。当該制御配列は転写を達成するためのプロモーター、当該転写を制御するための任意的なオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をエンコードする配列、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含む。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単純なゲノム挿入である。一旦、適当な宿主に形質転換されると、ベクターは複製でき、宿主ゲノムに独立的に機能し、または場合によっては、ゲノム自身に溶け込む。本願明細書において、“プラスミド”及び“ベクター”は、プラスミドが現在ベクターの最も一般的に使用されている形態であるので、時には交換可能に用いる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たし、当業界で公知の発現ベクターのその他の形態を含むことも意図するものである。
【００６８】
本発明で用いられる“宿主細胞”は一般に、米国特許ＲＥ３４，６０６号及び／または５，４４１，８８２号に開示された方法により好ましくは操作される原核または真核宿主であり、酵素的に活性なエンドプロテアーゼを分泌できないようにさせる。プロテアーゼを発現するために有用な宿主細胞は、酵素的に活性な中性プロテアーゼ及びアルカリ性プロテアーゼ（ズブチリシン）が不足しているバチルス株ＢＧ２０３６である。株ＢＧ２０３６の構築は米国特許第５，２６４，３６６号に詳細が記載されている。プロテアーゼを発現するためのその他の宿主細胞はバチルス・ズブチリスＩ１６８（米国特許ＲＥ３４，６０６号；米国特許第５，２６４，３６６号；及び第５，４４１，８８２号に記載されている。これらの開示の内容をここに引用する）及びバチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス等などの任意の適当なバチルス株を含む。特に有用な宿主細胞はバチルス株ＢＧ２８６４である。株ＢＧ２８６４の構築はＤ．Ｎａｋｉ、Ｃ．Ｐａｅｃｈ、Ｇ．Ｇａｎｓｈａｗ、Ｖ．Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９８）４９：２９０−２９４に詳細が記載されている。
【００６９】
宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトする。当該形質転換宿主細胞はプロテアーゼ変異体をエンコードするベクターを複製し、または所望のプロテアーゼ変異体を発現することができる。ベクターがプレまたはプレプロ型のプロテアーゼ変異体をエンコードする場合、当該変異体は、発現されたとき、一般的に宿主細胞から宿主細胞培地に分泌される。
【００７０】
“作動可能に連結する”は、２つのＤＮＡ領域間の関係について言及する場合、単にお互いが機能的に関連することを意味する。例えば、プレ配列は、それがシグナル配列として機能する場合、ペプチドに作動可能に連結し、シグナル配列の切断に最も関係すると思われるタンパク質の成熟型の分泌に関与する。プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結し、リボソーム結合部位はそれが翻訳を可能にするように位置する場合、コード配列に作動可能に連結する。
【００７１】
天然前駆体プロテアーゼをエンコードする遺伝子は当業者に公知の一般的な方法に従って得られる。該方法は通常、目的のプロテアーゼの領域をエンコードする推定配列を有する標識プローブを合成する工程、プロテアーゼを発現する微生物からゲノムライブラリーを調製する工程、及びプローブへのハイブリダイゼーションにより目的の遺伝子に関するライブラリーをスクリーニングする工程を含む。陽性のハイブリダイズしたクローンはそれから、地図を作り、配列する。
【００７２】
クローンされたプロテアーゼはそれからプロテアーゼを発現するために宿主細胞に形質転換して用いる。プロテアーゼ遺伝子はそれから、高コピー数プラスミド中に連結される。プラスミド複製、問題の遺伝子に作動可能に連結したプロモーター（認識される場合、遺伝子自身の相同プロモーターとして提供される、すなわち、宿主により転写される）、外来のまたはプロテアーゼ遺伝子の内生停止領域により提供された転写停止及びポリアデニル化領域（特定の真核宿主細胞のプロテアーゼ遺伝子から宿主により転写されたｍＲＮＡの安定に必要）、及び望ましくは、抗生物質含有培地での成長によりプラスミド感染宿主細胞の培養管理が維持できる抗生物質抵抗性遺伝子などの選択遺伝子に必要な公知の要素を含むという意味で、このプラスミドは宿主中で複製する。高コピー数プラスミドも宿主の複製起源を含み、それにより、多数のプラスミドが染色体の制限なしに細胞質中で生成することが可能となる。しかしながら、複数のプロテアーゼのコピーを宿主ゲノム内に組込むことは本発明の範囲内である。このことは特に相同組換えの影響を受けやすい原核及び真核生物により促進される。
【００７３】
遺伝子は天然バチルス・レンタス遺伝子である。もしくは、天然または変異前駆体プロテアーゼをエンコードする合成遺伝子が生成できる。この方法において、前駆体プロテアーゼのＤＮＡ及び／またはアミノ酸配列を決定する。複数の重複合成一本鎖ＤＮＡ断片はその後合成し、ハイブリダイゼーション及び連結により前駆体プロテアーゼをエンコードする合成ＤＮＡを生成する。合成遺伝子構築の例は米国特許第５，２０４，０１５号の実施例３に示されており、その開示の内容はここに引用する。
【００７４】
天然または合成前駆体プロテアーゼ遺伝子を一旦クローンすると、多数の修飾が天然前駆体プロテアーゼの合成を超えて遺伝子の使用を高めるために行われる。当該修飾は、米国特許ＲＥ３４，６０６号；第５，７４１，６９４号；第６，１９０，９００号；第６，１９７，５６７号；第５，９７２，６８２号；第５，１８５，２５８号；第５，７００，６７６号及びＥＰＯ公報第０  ２５１４４６号に開示される組換えプロテアーゼの生成及びここに記載するプロテアーゼ変異体の生成を含む。
【００７５】
以下のカセット式変異誘発法は本発明のプロテアーゼ変異体の構築を促進するために使用できるが、その他の方法も使用できる。まず、プロテアーゼをエンコードする天然遺伝子を得て、全体または一部の配列を決定する。それから、エンコードされる酵素において１以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を作ることが望ましいポイントに関して配列をスキャンする。このポイントのフランキング配列を、発現した場合種々の変異をエンコードする、オリゴヌクレオチドプールを有する遺伝子の短い断片を置換する制限部位の存在に関して評価する。当該制限部位は、好ましくは遺伝子断片の置換を促進するようなプロテアーゼ遺伝子内の固有部位である。しかしながら、制限消化により生じた遺伝子断片が適当な配列内で再構築されるとすれば、プロテアーゼ遺伝子内の過度に冗長でない任意の都合のよい制限部位が使用できる。制限部位が選択点から都合のよい距離内（１０〜１５ヌクレオチド）の位置に存在しない場合、当該部位はリーディング・フレームまたはエンコードされるアミノ酸が最終的な構造で変化しない方法で遺伝子内の置換ヌクレオチドにより生じる。配列を変化させて所望の配列に合わせる遺伝子の変異は、公知の方法に従ってＭ１３プライマー伸長法により達成される。適当なフランキング領域を位置付け、２つの都合のよい制限部位配列に達するために必要な変化を評価する課題は遺伝コードの冗長さ、遺伝子の制限酵素地図及び多数の異なる制限酵素によりルーチン化される。都合のよいフランキング制限部位が利用できる場合、上述の方法は部位を含まないフランキング領域とのみ関連して使用される必要があることを留意すべきである。
【００７６】
一旦、天然ＤＮＡまたは合成ＤＮＡがクローンされると、変異する位置のフランキング制限部位は同種の制限酵素を用いて消化され、多数のエンド末端−相補オリゴヌクレオチドカセットは該遺伝子内に連結される。全てのオリゴヌクレオチドは同じ制限部位を有するように合成でき、制限部位を作るために合成リンカーは必要でないので、突然変異生成はこの方法により単純化される。
【００７７】
適当な宿主の形質転換で発現される変異体プロテアーゼは、所望の特性、例えば改善された洗浄能力、基質特異性、酸化安定性、ｐＨ活性プロファイル等を示す単離または回収された酵素についてスクリーニングできる。
【００７８】
ここで用いる、タンパク質分解活性は活性酵素ミリグラム当たりのペプチド結合の加水分解の速度として定義される。タンパク質分解活性を測定するための多くの公知の手順が存在する（Ｋ．Ｍ．Ｋａｌｉｓｚ，“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（細菌プロテイナーゼ），”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａ．Ｆｉｅｃｈｔｅｒ編集、１９８８）。タンパク質分解活性を測定するその他の典型的な方法は、選択基質の変換を所定の基質濃度に加えたプロテアーゼの吸収の変化を測定することにより間接的に測定する種々の分光学的分析を含む。典型的な基質はジメチルカゼイン、Ｎ−スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe ｐNa及びケラチンを含む（米国特許出願番号第６０／３４４，７０２を参照）。
【００７９】
修飾タンパク質分解活性に加え、または修飾タンパク質分解活性に代えて、本発明の変異体酵素は、Ｋｍ、ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／Ｋｍ比及び／または修飾された基質特異性及び／または修飾されたｐＨ活性プロファイルなどのその他の修飾された性質を有することができる。これらの酵素は、例えば、ペプチドの調製において、または洗濯用などの加水分解プロセスのために存在すると予想される特定基質に合わせることができる。
【００８０】
基質特異性の変化は前駆体酵素と変異体間のｋｃａｔ／Ｋｍ比の違いとして定義できる。ｋｃａｔ／Ｋｍ比は触媒効果の指標である。増加または減少したｋｃａｔ／Ｋｍ比を有する原核生物カルボニルヒドロラーゼを実施例に記載する。一般的に、本目的はより大きい（数の上で大きい）所定の基質のｋｃａｔ／Ｋｍ比を有する変異体を安全なものにし、それにより酵素を使用して標的基質上でより効果的に作用できるようにすることである。１の基質に関するｋｃａｔ／Ｋｍ比の増加は他の基質に関するｋｃａｔ／Ｋｍ比の減少により達成できる。これは基質特異性の移動であり、このような移動を示す変異体は、前駆体が望ましくないところでの実用性を有し、例えば、基質混合物中の特定基質の望ましくない加水分解を防ぐ。
【００８１】
ｋｃａｔ及びＫｍは公知の手順に従って測定でき、または米国特許第５，４４１，８８２号の実施例１８の記載に従って測定できる。
【００８２】
さらに、酸化安定性は、実施例に記載されるプロテアーゼ変異体により達成できる目的である。該安定性は種々の用途に応じて高めたり減少させたりすることができる。高められた安定性は１以上のメチオニン、トリプトファン、システインまたはリジン残基を欠失することにより達成でき、任意でメチオニン、トリプトファン、システインまたはリジンでないその他のアミノ酸残基を置換することにより達成できる。その逆の置換は減少された酸化安定性を生じる。置換残基はアラニルであってもよいが、中性残基も適している。
【００８３】
さらに、安定性、例えば耐熱性は、実施例に記載されるプロテアーゼ変異体により達成できる目的である。安定性は種々の用途に望ましいように高めたり減少させたりできる。高められた安定性は本願明細書で同定された１以上の残基の置換により達成でき、任意でそのうち１つが同じでない他のアミノ酸残基を置換することにより達成できる。耐熱性は所定の温度において長時間にわたって酵素活性を維持する。改善された耐熱性は、前駆体プロテアーゼと比較して変異体の大量の酵素活性の保全を伴う。例えば、所定の温度、通常は測定する操作温度での前駆体と比較した変異体の酵素活性レベルの増加である。
【００８４】
ここに記載するプロテアーゼ変異体は特定の洗浄条件下で改善された洗浄能力を示す。例えば、プロテアーゼ変異体は、当業界で公知（例えば、ＷＯ９９／３４０１１（“Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ａｓｓａｙｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｐｒｅｆｆｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（好ましい酵素および／または好ましい洗剤組成物についての改良された分析方法）．”））の種々の分析法で測定した性能により示されるように、例えば温度、水の硬度及び／または洗剤濃度の異なる洗浄条件下、異なる洗浄能力を示す。
【００８５】
バチルス・ズブチリシンまたはそのプレ、プレプロ及びプロ型の場合、先に述べた位置での変異は上述の特徴が変化した変異体、または酵素の処理が変化した変異体を生成する。これらのアミノ酸位置番号は図１に見られるようにバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンに割り当てられたものであることに留意されたい。所定の位置からのＮ末端方向の欠失または挿入は、関連アミノ酸位置を移動させ、残基がその最初のまたは野生型の数字の位置ではなくなることが当然に理解される。また、対立遺伝子の違い及び種々の原核生物種間のばらつきは位置移動を生じ、当該ズブチリシンの位置１６９がグリシンで占められなくなる。このような場合、グリシンの新しい位置は指定グリシン＋１６９と等しく、指定グリシン＋１６９内に包含されると考えられる。グリシン＋１６９の新しい位置は図１のグリシン＋１６９と相同な領域に関して問題のズブチリシンをスキャニングすることにより容易に同定される。
【００８６】
１以上、通常は約１０までの、アミノ酸残基が変異する。しかしながら、商慣行はさておき、作られる変異の数に限定はない。
【００８７】
本酵素は塩として得られる。タンパク質の電離状態は、溶液内の場合、または調製される溶液内の場合、固形の場合、周囲環境のｐＨに依存することは明らかである。酸性タンパク質は例えば、アンモニウム、ナトリウムまたはカリウム塩として通常調製され、塩基性タンパク質は塩化物、硫酸塩またはリン酸塩として調製される。従って、本出願は指定した種々のプロテアーゼの電気的に中性及び塩形態の両方を含み、プロテアーゼの語は電離状態を問わない、有機構造骨格をいう。
【００８８】
プロテアーゼ変異体は特に食品加工及び洗浄技術に有用である。プロテアーゼ変異体及び前駆体プロテアーゼを含むカルボニルヒドロラーゼは、ここに記載するように発酵により生成し、適切な技術により回収する。例えば、Ｋ．Ａｎｓｔｒｕｐ，１９７４、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、編集、Ｂ．Ｓｐｅｎｃｅｒ、ｐｐ．２３−４６を参照されたい。
【００８９】
本発明の１の側面において、本発明の目的は、少なくとも１の洗剤剤形において、及び／または少なくとも１組の洗浄条件下において、前駆体プロテアーゼと比較して変化した、好ましくは改善された洗浄能力を有する変異体プロテアーゼを安定させることである。産業プロセス、特に洗濯業での使用のため、それらはそれ自体公知の方法に従って洗剤またはその他の界面活性剤と一緒に処方される。後者の場合、酵素はタンパク質分解酵素の分野で公知の洗剤、ビルダー、漂白剤、及び／蛍光白色化剤と混合される。適当な洗剤は直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエトキシレート硫酸塩、硫酸化直鎖アルコールまたはエトキシレート直鎖アルコールが挙げられる。該組成物は顆粒状または液状で処方できる。例えば、米国特許第３，６２３，９５７号；第４，４０４，１２８号；第４，３８１，２４７号；第４，４０４，１１５号；第４，３１８，８１８号；第４，２６１，８６８号；第４，２４２，２１９号；第４，１４２，９９９号；第４，１１１，８５５号；第４，０１１，１６９号；第４，０９０，９７３号；第３，９８５，６８６号；第３，７９０，４８２号；第３，７４９，６７１号；第３，５６０，３９２号；第３，５５８，４９８号；及び第３，５５７，００２号を参照されたい。
【００９０】
種々の洗浄条件が存在し、種々の洗剤剤形、洗浄水量、洗浄水温度、及びプロテアーゼ変異体が曝される洗浄時間の長さなどである。例えば、異なる分野で使用される洗剤剤形は洗浄水中存在するそれらの関連成分を異なる濃度で有する。例えば、ヨーロッパの洗剤は通常、洗浄水中、約３０００−８０００ｐｐｍの洗剤成分を有するが、一方、日本の潜在は通常、洗浄水中８００以下、例えば、６６７ｐｐｍの洗剤成分を有する。北米において、特にアメリカでは、洗剤は通常、洗浄水中、約８００〜２０００、例えば９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在する。
【００９１】
低洗剤濃度系は約８００ｐｐｍ以下の洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤を含む。日本の洗剤は通常、約６６７ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在するので、低洗剤濃度系と考えられる。
【００９２】
中洗剤濃度は約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤を含む。北米の洗剤は通常、約９７５ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在するので、中洗剤濃度系と考えられる。ブラジルは約１５００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する。
【００９３】
高洗剤濃度系は約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は通常、約３０００〜８０００ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に含むので、高洗剤濃度系と考えられる。
【００９４】
中南米の洗剤は通常、高泡立ちリン酸塩ビルダー洗剤であり、中南米で使用される洗剤の範囲は、洗浄水中の洗剤成分が１５００ｐｐｍ〜６０００ｐｐｍの範囲であるので、中及び高洗剤濃度の両方になる。上述の通り、ブラジルは通常、洗浄水中に約１５００ｐｐｍの洗剤成分を有する。しかしながら、その他の中南米の国に限定されない、その他の高泡立ちリン酸塩ビルダー洗剤の地は、約６０００ｐｐｍ以下の洗剤成分が洗浄水中に存在する高洗剤濃度系を有する。
【００９５】
上述に照らして、一般的な洗浄溶液中の洗剤組成物の濃度は世界中で約８００ｐｐｍ以下の洗剤組成物（“低洗剤濃度地”）、例えば、日本の約６６７ｐｐｍ、から約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍ（“中洗剤濃度地”）、例えば、アメリカの約９７５ｐｐｍ及びブラジルの約１５００ｐｐｍ、及び約２０００ｐｐｍ以下（“高洗剤濃度地”）、例えば、ヨーロッパの約４５００ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍ及び高泡立ちリン酸塩ビルダー地の約６０００ｐｐｍまで様々であることがわかる。
【００９６】
一般的な洗剤溶液の濃度は実験的に決定する。例えば、米国において、一般的な洗濯機は洗浄溶液の約６４．４Ｌの体積を入れることができる。従って、洗浄溶液約６２．７９ｇの洗剤組成物内で約９７５ｐｐｍの洗剤濃度を得るためには、６４．４Ｌの洗浄溶液を加えなければならない。この量は、洗剤と一緒に備えられる計量カップを用いて消費者により洗浄水中で測定される一般的な量である。
【００９７】
さらに別の例として、異なる場所では異なる洗浄温度を用いている。日本の洗浄水の温度は一般にヨーロッパで用いる温度よりも低い。例えば、ヨーロッパにおける洗浄水の温度は通常、約３０〜５０℃であり、一般的には約４０℃である。北米及び／または日本における洗浄水の温度は通常、ヨーロッパの洗浄水よりも低く、例えば約１０〜３０℃であり、一般的に約２０℃である。
【００９８】
さらに、別の例として、異なる場所では、異なる水硬度を用いる。水硬度は一般的に合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋のガロン当たりのグレインとして記載される。硬度は水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量を測定したものである。アメリカのほとんどの水は硬水であるが、硬度の程度は様々である。中程度の硬水（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬水（１２１〜１８１ｐｐｍ）は６０〜１８１ｐｐｍの硬度ミネラルを含む（米国ガロン当たりのグレインに変換したｐｐｍは、ｐｐｍ数÷１７．１＝ガロン当たりのグレインである）。
【００９９】
【表１】
2005519592.tif 000006
【０１００】
ヨーロッパの水の硬度は一般に、１０〜２０ガロン／グレイン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋であり、例えば、約１５ガロン／グレイン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋である。北米の水の硬度は一般に、日本の水の硬度より高いが、ヨーロッパの水の硬度より低い。例えば、３〜１０グレイン、３〜８グレインまたは約６グレインである。日本の水の硬度は一般に北米の水の硬度より低く、通常４未満、例えば、３グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋である。
【０１０１】
従って、本発明の１の側面は少なくとも１組の洗浄条件において改善された洗浄能力を示すプロテアーゼ変異体を含む。本発明の他の側面は１以上の洗浄条件、例えば、ヨーロッパ、日本または北米条件において、改善された洗浄能力を示すプロテアーゼ変異体を含む。
【０１０２】
該変異体プロテアーゼを用いて得られたスクリーニング結果に基づいて、バチルスズブチリシンにおける言及した変異及びバチルス・レンタスにおけるそれらの同等物はタンパク質分解活性、性能及び／またはこれらの酵素の安定性及び当該変異体酵素の洗浄または洗剤性能に重要である。
【０１０３】
本発明の多くのプロテアーゼ変異体は種々の洗剤組成物またはシャンプーまたはローションなどのパーソナルケア製剤を処方するのに有用である。本発明のプロテアーゼ変異体を含む組成物において有用な多数の公知の化合物は適当な界面活性剤である。これらは、Ｂａｒｒｙ  Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎの米国特許第４，４０４，１２８号及びＪｉｒｉ  Ｆｌｏｒａ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，２６１，８６８号に記載されるような、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性イオン界面活性剤を含む。適当な洗剤処方は米国特許第５，２０４，０１５号（すでにここに引用している）の実施例７に記載されている。当該技術は洗浄組成物として用いることができる種々の剤形でよく知られている。一般的な洗浄組成物に加えて、本発明のプロテアーゼ変異体は、天然または野生型プロテアーゼが使用される任意の目的に使用できることが容易に理解される。従って、これらの変異体は使用でき、例えば、固形または液体石けん用途、食器洗い用製剤、コンタクトレンズ洗浄液または製品、ペプチド加水分解、廃棄物処理、織物用途、タンパク質生成における融合−分解酵素としてである。本発明の変異体は洗剤組成物において高められた性能を有する（前駆体と比較して）。ここで用いるように、洗剤における高められた性能は、標準洗浄サイクル後の通常の評価により測定した、草または血液などのしみに敏感な特定酵素の洗浄の増加として定義する。
【０１０４】
本発明のプロテアーゼは、約０．０１〜約５重量％（好ましくは０．１重量％〜０．５重量％）でｐＨが６．５〜１２．０の公知の粉末及び液体洗剤中に処方できる。これらの洗剤洗浄組成物は、公知のプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはエンドグリコシダーゼなどその他の酵素並びにビルダー及び安定剤を含むこともできる。
【０１０５】
本発明のプロテアーゼの従来の洗浄組成物への添加は、いかなる特別な使用の限定をも生じない。すなわち、該洗剤に適切ないかなる温度及びｐＨも、該ｐＨが上述の範囲内である限り、及び該温度が記載したプロテアーゼの変性温度以下である限り、本発明の組成物に適している。さらに、本発明のプロテアーゼは洗剤なしに洗浄組成物中で使用でき、この場合もやはり、単独またはビルダー及び安定剤との組み合わせにおいて使用できる。
【０１０６】
また、本発明は本発明のプロテアーゼ変異体を含む洗浄組成物に関する。洗浄組成物は一般的に洗浄組成物に使用される添加物をさらに含むことができる。これらは、限定されないが、漂白剤、界面活性剤、ビルダー、酵素及び漂白触媒から選択できる。組成物に含めることが適当な添加剤については当業者にとって明らかである。ここに与えるリストは完全なものではなく、適当な添加剤の例としてのみ理解させるべきである。酵素と適合性のある添加剤及びその他の成分のみ、例えば界面活性剤のみを組成物中に用いることも当業者には容易に理解されることである。
【０１０７】
存在する場合、洗浄組成物に存在する添加剤の量は約０．０１％〜約９９．９％、好ましくは約１％〜約９５％、より好ましくは約１％〜約８０％である。
【０１０８】
本発明の変異体プロテアーゼは、例えば、米国特許第５，６１２，０５５号；米国特許第５，３１４，６９２号；及び米国特許第５，１４７，６４２号に記載されるような動物飼料添加物の一部として、動物飼料中に含めることもできる。
【０１０９】
本発明の１の側面は、本発明の変異体プロテアーゼを含む織物処理のための組成物である。該組成物は、ＲＤ２１６，０３４号；欧州特許１３４，２６７号；米国特許第４，５３３，３５９号；及び欧州特許第３４４，２５９号などの公報に記載されているような例えば絹またはウールを処理するために使用できる。
【０１１０】
以下は実施例により表すものであり、請求の範囲を限定するものとして解釈されない。
【０１１１】
ここに引用する全ての刊行物及び特許はその全体をここに組み込むものとする。
【０１１２】
実施例１
多数のプロテアーゼ変異体が生成でき、当業界に公知の方法を用いて精製できる。変異はバチルス・アミロリケファシエンス（ＢＰＮ’）ズブチリシンまたはバチルス・レンタスＧＧ３６ズブチリシンにおいて作ることができる。変異体は以下から選択できる：バチルス・アミロリケファシエンスのＫ２７Ａ、Ｋ２７Ｃ、Ｋ２７Ｅ、Ｋ２７Ｑ、Ｋ２７Ｇ、Ｋ２７H、Ｋ２７Ｉ、Ｋ２７Ｌ、Ｋ２７Ｍ、Ｋ２７Ｆ、Ｋ２７Ｐ、Ｋ２７Ｓ、Ｋ２７Ｔ、Ｋ２７Ｗ、Ｋ２７Y、Ｈ３９Ａ、Ｈ３９Ｒ、Ｈ３９Ｄ、Ｈ３９Ｎ、Ｈ３９Ｃ、Ｈ３９Ｅ、Ｈ３９Ｑ、Ｈ３９Ｇ、Ｈ３９Ｉ、Ｈ３９Ｌ、Ｈ３９Ｋ、Ｈ３９Ｍ、Ｈ３９Ｆ、Ｈ３９Ｐ、Ｈ３９Ｔ、Ｈ３９Ｗ、Ｈ３９Ｙ、Ｈ３９Ｖ、Ｄ４１Ａ、Ｄ４１Ｒ、Ｄ４１Ｃ、Ｄ４１Ｅ、Ｄ４１Ｑ、Ｄ４１Ｇ、Ｄ４１Ｈ、Ｄ４１Ｉ、Ｄ４１Ｌ、Ｄ４１Ｋ、Ｄ４１Ｍ、Ｄ４１Ｆ、Ｄ４１Ｐ、Ｄ４１Ｓ、Ｄ４１Ｔ、Ｄ４１Ｗ、Ｄ４１Ｙ、Ｄ４１Ｖ、Ｒ４５Ａ、Ｒ４５Ｒ、Ｒ４５Ｄ、Ｒ４５Ｎ、Ｒ４５Ｃ、Ｒ４５Ｅ、Ｒ４５Ｃ、Ｒ４５Ｅ、Ｒ４５Ｑ、Ｒ４５Ｇ、Ｒ４５Ｈ、Ｒ４５Ｉ、Ｒ４５Ｌ、Ｒ４５Ｋ、Ｒ４５Ｍ、Ｒ４５Ｆ、Ｒ４５Ｐ、Ｒ４５Ｓ、Ｒ４５Ｔ、Ｒ４５Ｗ、Ｒ４５Ｙ、Ｒ４５Ｖ、Ｈ６７Ａ、Ｈ６７Ｒ、Ｈ６７Ｄ、Ｈ６７Ｎ、Ｈ６７Ｃ、Ｈ６７Ｅ、Ｈ６７Ｑ、Ｈ６７Ｇ、Ｈ６７Ｉ、Ｈ６７Ｌ、Ｈ６７Ｋ、Ｈ６７Ｍ、Ｈ６７Ｆ、Ｈ６７Ｐ、Ｈ６７Ｓ、Ｈ６７Ｔ、Ｈ６７Ｗ、Ｈ６７Ｙ、Ｈ６７Ｖ、Ｋ９４Ａ、Ｋ９４Ｒ、Ｋ９４Ｄ、Ｋ９４Ｎ、Ｋ９４Ｃ、Ｋ９４Ｅ、Ｋ９４Ｑ、Ｋ９４Ｇ、Ｋ９４Ｈ、Ｋ９４Ｉ、Ｋ９４Ｌ、Ｋ９４Ｍ、Ｋ９４Ｆ、Ｋ９４Ｐ、Ｋ９４Ｓ、Ｋ９４Ｔ、Ｋ９４Ｗ、Ｋ９４Ｙ、Ｋ９４Ｖ、Ｅ１３６Ａ、Ｅ１３６Ｄ、Ｅ１３６Ｎ、Ｅ１３６Ｃ、Ｅ１３６Ｇ、Ｅ１３６Ｈ、Ｅ１３６Ｉ、Ｅ１３６Ｌ、Ｅ１３６Ｋ、Ｅ１３６Ｍ、Ｅ１３６Ｆ、Ｅ１３６Ｐ、Ｅ１３６Ｓ、Ｅ１３６Ｔ、Ｅ１３６Ｗ、Ｅ１３６Ｙ、Ｅ１３６Ｖ、Ｒ１７０Ａ、Ｒ１７０Ｄ、Ｒ１７０Ｎ、Ｒ１７０Ｃ、Ｒ１７０Ｅ、Ｒ１７０Ｑ、Ｒ１７０Ｇ、Ｒ１７０Ｈ、Ｒ１７０Ｉ、Ｒ１７０Ｌ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｍ、Ｒ１７０Ｆ、Ｒ１７０Ｐ、Ｒ１７０Ｓ、Ｒ１７０Ｔ、Ｒ１７０Ｗ、Ｒ１７０Ｙ、Ｒ１７０Ｖ、Ｄ１８１Ａ、Ｄ１８１Ｒ、Ｄ１８１Ｎ、Ｄ１８１Ｃ、Ｄ１８１Ｅ、Ｄ１８１Ｑ、Ｄ１８１Ｇ、Ｄ１８１Ｈ、Ｄ１８１Ｉ、Ｄ１８１Ｌ、Ｄ１８１Ｋ、Ｄ１８１Ｍ、Ｄ１８１Ｆ、Ｄ１８１Ｐ、Ｄ１８１Ｓ、Ｄ１８１Ｔ、Ｄ１８１Ｗ、Ｄ１８１Ｙ、Ｄ１８１Ｖ、Ｄ１９７Ａ、Ｄ１９７Ｒ、Ｄ１９７Ｎ、Ｄ１９７Ｃ、Ｄ１９７Ｅ、Ｄ１９７Ｑ、Ｄ１９７Ｇ、Ｄ１９７Ｈ、Ｄ１９７Ｉ、Ｄ１９７Ｌ、Ｄ１９７Ｋ、Ｄ１９７Ｍ、Ｄ１９７Ｆ、Ｄ１９７Ｐ、Ｄ１９７Ｓ、Ｄ１９７Ｔ、Ｄ１９７Ｗ、Ｄ１９７Ｙ、Ｄ１９７Ｖ、Ｒ２４７Ａ、Ｒ２４７Ｄ、Ｒ２４７Ｎ、Ｒ２４７Ｃ、Ｒ２４７Ｅ、Ｒ２４７Ｑ、Ｒ２４７Ｇ、Ｒ２４７Ｈ、Ｒ２４７Ｉ、Ｒ２４７Ｌ、Ｒ２４７Ｋ、Ｒ２４７Ｍ、Ｒ２４７Ｆ、Ｒ２４７Ｐ、Ｒ２４７Ｓ、Ｒ２４７Ｔ、Ｒ２４７Ｗ、Ｒ２４７Ｙ、Ｒ２４７Ｖ、Ｈ２４９Ａ、Ｈ２４９Ｒ、Ｈ２４９Ｄ、Ｈ２４９Ｎ、Ｈ２４９Ｃ、Ｈ２４９Ｅ、Ｈ２４９Ｑ、Ｈ２４９Ｇ、Ｈ２４９Ｉ、Ｈ２４９Ｋ、Ｈ２４９Ｍ、Ｈ２４９Ｆ、Ｈ２４９Ｐ、Ｈ２４９Ｓ、Ｈ２４９Ｔ、Ｈ２４９Ｗ、Ｈ２４９Ｖ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｃ���Ｋ２５１Ｑ、Ｋ２５１Ｇ、Ｋ２５１Ｈ、Ｋ２５１Ｉ、Ｋ２５１Ｌ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｐ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｗ、Ｋ２５１Ｙ、Ｋ２５１Ｖ、Ｅ２７１Ａ、Ｅ２７１Ｒ、Ｅ２７１Ｄ、Ｅ２７１Ｎ、Ｅ２７１Ｃ、Ｅ２７１Ｈ、Ｅ２７１Ｉ、Ｅ２７１Ｌ、Ｅ２７１Ｋ、Ｅ２７１Ｍ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｐ、Ｅ２７１Ｓ、Ｅ２７１Ｔ、Ｅ２７１Ｗ、Ｅ２７１Ｙ、及び／またはＥ２７１Ｖ。
【０１１３】
実施例２
多数のプロテアーゼ変異体は公知の方法を用いて生成及び精製できる。変異はバチルス・アミロリケファシエンス（ＢＰＮ’）ズブチリシンまたはバチルス・レンタスＧＧ３６ズブチリシンにおいて作ることができる。変異体は以下の位置に対応するアミノ酸の挿入、欠失または置換で作ることができる：バチルス・アミロリケファシエンス（ＢＰＮ’）の５、７、２３、２６、２８−３１、３４、４７、６３、６５、６６、６９、７０、７３、８２−８５、８８、９０、９２、９３、１０５、１１３、１２５、１３８、１３９、１４８−１５１、１７６、１７８、１７９、１９３、１９６、２００、２０１、２０２、２０７、２１９、２２０、２２３、２２９、２３３、２５０、２６６、２６７、及び２７３。
【０１１４】
実施例３
実施例１及び／または２で生成した多数のプロテアーゼ変異体は、米国特許出願番号６０／０６８，７９６、“Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｓｓａｙｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ／ｏｒ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（好ましい酵素及び／または好ましい洗剤組成物の改善された分析方法）”に記載されている、マイクロスウォッチ（ｍｉｃｒｏｓｗａｔｃｈ）分析法を用いて２種類の洗剤及び洗浄条件における性能を試験する。
【０１１５】
変異体プロテアーゼは種々の洗剤を分析及び試験される。例えば、可能な洗剤は、０．６７ｇ／ｌろ過アリエール・ウルトラ（Ａｒｉｅｌ  Ｕｌｔｒａ）（プロクター＆ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国）、溶液中３グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含み、２０℃で各ウェル中０．３ｐｐｍ酵素が使用される。他の典型的な洗剤は、３．３８ｇ／ｌろ過アリエールＦｕｔｕｒ（プロクター＆ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国）、溶液中１５グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含み、４０℃で各ウェル中０．３ｐｐｍ酵素が使用される。野生型と比較して高い相対値は改善された洗剤効果を示す。
【０１１６】
実施例４
実施例１及び２で記載するように分析できる変異体プロテアーゼはその他の異なる洗剤においても分析できる。実施例２と同じ性能試験を以下の洗剤を用いて記載変異体プロテアーゼについて行うことができる：第１の洗剤は、０．６７ｇ／ｌろ過アリエール・ウルトラ（プロクター＆ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国）であり、溶液中３グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含み、及び２０℃で各ウェル中０．３ｐｐｍ酵素を使用した。第２の洗剤は、３．３８ｇ／ｌろ過アリエールＦｕｔｕｒ（プロクター＆ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国）、であり、溶液中１５グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含み、及び４０℃で各ウェル中０．３ｐｐｍ酵素を使用できる。第３の洗剤は、３．５ｇ／ｌＨＳＰ１洗剤（プロクター＆ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国）であり、溶液中８グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含み、及び２０℃で各ウェル中０．３ｐｐｍ酵素を使用できる。第４の洗剤は、１．５ｍｌ／ｌ  Ｔｉｄｅ洗剤（プロクター＆ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国）であり、溶液中３グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含み、及び２０℃で各ウェル中０．３ｐｐｍの酵素を使用できる。
【０１１７】
実施例５
多数のプロテアーゼ変異体を生成し、当業界で公知の方法を用いて精製した。全ての変異はバチルス・レンタスＧＧ３６ズブチリシン中に作った。変異体を表３に示す。
【０１１８】
ＧＧ３６飽和部位ライブラリー及び部位特異性変異体を構築するために、３つのＰＣＲ反応を行った。２つのＰＣＲ反応はＧＧ３６に目的の変異コドンを導入するためのものであり、融合ＰＣＲは所望の変異を含む発現ベクターを構築するためのものである。
【０１１９】
目的のＧＧ３６コドンはＢＰＮ’の番号に従って番号を付ける（図１Ａ−Ｃ及び３Ａ−Ｂに記載した）。
【０１２０】
飽和部位ライブラリー構築について：
突然変異生成の方法は領域−特異性変異方法（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）に基づいて行い、変異するコドンの配列に対応し、そのコドンでのヌクレオチドのランダムな結合を保証する具体的に作成された３ＤＮＡ配列ＮＮＳ（（Ａ、Ｃ、ＴまたはＧ）、（Ａ、Ｃ、ＴまたはＧ）、（ＣまたはＧ））を取り囲む３０〜４０ヌクレオチド長のフォワード及びリバース相補オリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて特定ＤＮＡコドン中に全ての可能な変異を一度に作成した。
【０１２１】
部位特異性変異体構築について：
フォワード及びリバース変異プライマーは両側の相同配列の１５以下塩基を含むプライマーの中間に３つの所望の変異を含む。これらの変異は目的のコドンをカバーし、所望のアミノ酸に特異的であり、意図的に合成される。
【０１２２】
ライブラリー及び変異体を構築するために使用する第２のプライマーセットはｐＶＳ０８  Ａｐａｌ消化部位及びそのフランキングヌクレオチド配列を一緒に含む。
【０１２３】
Ａｐａｌプライマー：
フォワードＡｐａｌプライマー：
【化１】
2005519592.tif 000007
リバースＡｐａｌプライマー：
【化２】
2005519592.tif 000008
【０１２４】
ＧＧ３６分子の変異導入はＩｎｖｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州、米国）Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ・ハイファイ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）（Ｃａｔ．ｎｏ．１１３０４−１０２）とｐＶＳ０８テンプレートＤＮＡ及びフォワード変異プライマー及び反応１のリバースＡｐａｌプライマーまたはリバース変異プライマー及び反応２のフォワードＡｐａｌプライマーを一緒に用いて行った。
【０１２５】
所望の変異を含む発現ベクターの構築は、反応１及び２の両方のＰＣＲ断片、フォワード及びリバースＡｐａｌプライマー及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ・ハイファイ（Ｃａｔ．ｎｏ．１１３０４−１０２）を用いて融合ＰＣＲにより達成した。
【０１２６】
全てのＰＣＲは、サイクル数を除いて（３０の代わりに２０）、ポリメラーゼと一緒に提供されるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ手順に従って行った。２つの別個のＰＣＲ反応はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ・ハイファイ（Ｃａｔ．ｎｏ．１１３０４−１０２）を用いて行う。増幅線形５．６Ｋｂ断片を精製し（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、Ｃａｔ．ｎｏ．２８１０６）、Ａｐａｌ制限酵素を用いて消化し、融合断片の両側に付着端を生成した：
-  ３５μＬ精製ＤＮＡ断片
-  ４μＬ  Ｒｅａｃｔ（登録商標）４バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）
-  １μＬ  Ａｐａｌ、１０単位／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｔ．ｎｏ．１５４４０−０１９）
反応条件：１時間、３０℃
【０１２７】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｐｎｌを用いて追加の消化をｐＶＳ０８テンプレートＤＮＡを除去するために行った。
-  ４０μＬ  Ａｐａｌ消化ＤＮＡ断片
-  １μＬ  Ｄｐｎｌ、４単位／μＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｔ．ｎｏ．１５２４２−０１９）
反応条件：１６〜２０時間、３７℃
【０１２８】
２回消化及び精製断片の結合は所望の変異を含む新しい環状ＤＮＡを生じ、コンピテントバチルス・ズブチリスに直接形質転換した：
-  ３０μＬのＡｐａｌ及びＤｐｎｌ消化ＤＮＡ断片
-  ８μＬ  Ｔ４リガーゼ・バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｔ．ｎｏ．４６３００−０１８）
-  １μＬ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、１単位／μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｔ．ｎｏ．１５２２４−０１７）
反応条件：１６〜２０時間、１６℃
【０１２９】
結合混合物を、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ及びＳｐｉｚｉｚｅｎ（１９６１）の方法を用いてバチルス・ズブチリスＢＧ２８６４（Ｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）に形質転換し、クロラムフェニコール耐性及びプロテアーゼ活性に関して選択した。
【０１３０】
タンパク質生成の方法
炭素源（グルコース及びマルトデキシトリン、１０．５及び１７．５ｇ／ｌ）、窒素源（尿、素、３．６ｇ／ｌ）及びリン酸塩（０．５ｇ／ｌ）及び硫酸塩（０．５ｇ／ｌ）などの必須養分を含み、及びさらに微量元素（Ｆｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｃｏ、１〜４ｍｇ／ｍｌ）を補足したＭｏｐｓ培地（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４）中で１〜５０μＬのグリセロール培養物を植菌する。培地はＭＯＰＳ／トリシン混合物を用いて中和し、７〜８のｐＨを生じる。培養物を１〜５日、３７℃／２２０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ  ＩＩ）で培養する。
【０１３１】
参考文献：
Protein engineering of the high-alkaline serine protease PB92 from Bacillus alcalophilus: functional and structural consequences of mutation at the S4 substrate binfing pocket. （バチルスａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ由来の高アルカリ性セリンプロテアーゼＰＢ９２のタンパク質工学：Ｓ４基質結合ポケットでの変異の機能的及び構造的結果。）
Teplyakov AV、van der Laan JM、Lammers AA、Kelders H、Kalk  KH、Misset O、Mulleners LJ、Dijkstra BW
Protein Eng.1992 Jul;5(5): 413-20.
Selection of a subtilisin-hyperproducing Bachillus in a highly structured environment （高度構造環境におけるズブチリシン−過剰生成バチルスの選択）
D.Naki、C.Paech、G.Ganshaw、V.Schellenberger.Appl Microbiol Biotechnol (1998) 49: 290-294.
Requirements for transformation in Bacillus subtilis （バチルス・ズブチリスにおける形質転換の必要条件）
Anagnostopoulos、C. and Spizizen、J. in J. Bacteriol. 81、741-746 (1961).
Culture Medium for Enterobacteria （腸内細菌の培養基）
Frederick C. Neidhardt、Philip L. Bloch and David F. Smith in Journal of Bacteriology、Sept 1974. p736-747 Vol. 119. No. 3.
【０１３２】
【表２】
2005519592.tif 000009
【０１３３】
実施例６
実施例１で生成した多数のプロテアーゼ変異体を、米国特許出願番号０９／５５４，９９２（ＷＯ９９／３４０１１）、“Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｓｓａｙｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ／ｏｒ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（好ましい酵素及び／または好ましい洗剤組成物の改善された分析方法）”に記載されているマイクロスウォッチ（ｍｉｃｒｏｓｗａｔｃｈ）分析法を用いて２種類の洗剤及び洗浄条件における性能を試験した。
【０１３４】
表４は分析した変異体プロテアーゼ及び２つの異なる洗剤で試験した結果を記載する。Ａ欄及びＣ欄は、分析材料はＭＴＰ中の形質転換株の成長により生成した。Ｂ欄及びＤ欄は、分析材料は振とうフラスコ（２５０ｍｌ）中の形質転換株の成長により生成した。Ａ欄及びＢ欄は、洗剤が７．６ｇ／ｌろ過アリエール・レギュラー（プロクター＆ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国）であり、溶液中１５グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含み、及び４０℃で各ウェル中０．５ｐｐｍの酵素を使用した（ヨーロッパ条件）。Ｃ欄及びＤ欄は、洗剤が０．６７ｇ／ｌろ過Ｔｉｄｅ  Ｏｐａｌ（プロクター＆ギャンブル、シンシナティ、オハイオ州、米国）であり、溶液中３グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度を含み、及び２０℃で各ウェル中０．５ｐｐｍの酵素を使用した（日本条件）。性能指数を次の式で計算した：
変異体の洗浄性能  ÷  ＧＧ３６の洗浄性能（野生型）
４つの性能値を平均し、表２で示す値に達した。
【０１３５】
【表３】
2005519592.tif 000010
【０１３６】
【表４】
2005519592.tif 000011
【０１３７】
上述の分析の結果として、いくつかの変異体はＧＧ３６野生型プロテアーゼの性能指数よりも大きな性能指数を示した。例えば、変異体Ｒ４５Ｎ−Ｇ１１８Ｅ−Ｅ２７１Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｐ１４Ｒ、Ｒ４５Ｎ−Ｎ２０４Ｒ、Ｄ１８１Ｎ−Ｇ１１８Ｄ、及びＲ４５Ｎ−Ｇ２５８Ｒは、ヨーロッパ条件下（１５グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度、４０℃、０．５ｐｐｍ）、マイクロスウォッチ分析において（ＷＯ９９／３４０１１）、それぞれ１．７５、１．２８、１．２８、１．２４、及び１．２３の性能指数を示した（表４）。変異体Ｒ１７０Ｓ−Ａ１Ｐ、Ｒ１７０Ｓ−Ｇ６１Ｒ、Ｒ１７０Ｓ−Ｎ２０４Ｒ、Ｋ２５１Ｇ−Ｓ８７Ｋ、及びＲ１７０Ｓ−Ｓ２１６Ｒは、それぞれ２．０９、２．０３、１．７９、１．５４、１．４７、１．３９及び１．２１の性能指数を示した（表５）。変異体Ｅ２７１Ｔ−Ｇ１００Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｇ１０２Ｅ、Ｅ２７１Ｔ−Ｓ１２８Ｅ、Ｋ２７Ｔ−Ｇ１００Ｅ、Ｒ１７０Ｓ−Ｇ１００Ｒ、及びＥ２７１Ｔ−Ｓ４９Ｅは、日本条件下（３グレイン／ガロン合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋硬度、２０℃、０．５ｐｐｍ）、マイクロスウォッチ９６マイクロタイター・ウェルプレート（ＷＯ９９／３４０１１）分析において、それぞれ３．２２、１．８５、２．３３、２．０４、１．７９及び１．４３の性能指数を示した（表５）。変異体Ｋ２５１Ｇ−Ｓ８７Ｋ、Ｒ１７０Ｓ−Ａ１Ｒ、及びＥ２７１Ｔ−Ｓ１２８Ｅは、それぞれ、２．０６、１．５５、及び１．２０の性能指数を示した（表５）。変異体Ｋ２５１Ｇ−Ｓ８７Ｋ、及びＲ１７０Ｓ−Ａ１Ｒは、日本及びヨーロッパ条件の両方の下、１．００以上の性能指数を示した。
【０１３８】
本発明は種々の具体的な実施態様との関連において議論及び例示したが、適用性及び開示の範囲を限定するものとして解釈されるものではなく、前述に説明した特徴及び請求の範囲の全ての組み合わせ及びサブコンビネーションにまで及ぶものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１Ａ】バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンのＤＮＡ配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）並びにこの遺伝子の制限地図の一部を示す。
【図１Ｂ−１】バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンのＤＮＡ配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）並びにこの遺伝子の制限地図の一部を示す。
【図１Ｂ−２】バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンのＤＮＡ配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）並びにこの遺伝子の制限地図の一部を示す。
【図１Ｂ−３】バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンのＤＮＡ配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）並びにこの遺伝子の制限地図の一部を示す。
【図２】バチルス・アミロリケファシエンス（ＢＰＮ）’及びバチルス・レンタス（野生型）から得たズブチリシン間の保存アミノ酸残基を示す。
【図３Ａ】図３Ａと３Ｂは、４つのズブチリシンのアミノ酸配列を表す。一番上の行はバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシン（ズブチリシンＢＰＮ’と呼ぶ時もある）から得たズブチリシンのアミノ酸配列を表す（配列番号３）。２行目はバチルス・ズブチリスから得たズブチリシンのアミノ酸配列を表す（配列番号４）。３行目はバチルス・リケニホルミスから得たズブチリシンのアミノ酸配列を表す（配列番号５）。４行目はバチルス・レンタス（ＰＣＴ  ＷＯ８９／０６２７６でズブチリシン３０９とも呼ばれている）から得たズブチリシンのアミノ酸配列を表す（配列番号６）。記号＊はズブチリシンＢＰＮ’と比較して特定のアミノ酸残基がないことを示す。
【図３Ｂ】図３Ａと３Ｂは、４つのズブチリシンのアミノ酸配列を表す。一番上の行はバチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシン（ズブチリシンＢＰＮ’と呼ぶ時もある）から得たズブチリシンのアミノ酸配列を表す（配列番号３）。２行目はバチルス・ズブチリスから得たズブチリシンのアミノ酸配列を表す（配列番号４）。３行目はバチルス・リケニホルミスから得たズブチリシンのアミノ酸配列を表す（配列番号５）。４行目はバチルス・レンタス（ＰＣＴ  ＷＯ８９／０６２７６でズブチリシン３０９とも呼ばれている）から得たズブチリシンのアミノ酸配列を表す（配列番号６）。記号＊はズブチリシンＢＰＮ’と比較して特定のアミノ酸残基がないことを示す。
【図４】ｐＶＳ０８バチルス・ズブチリス発現ベクターを示す。
【図５】フォワードＡｐａIプライマー、リバースＡｐａＩプライマー、リバース変異プライマー及びフォワード変異プライマーの方向を示す。
【図１Ａ】
2005519592.tif 000012
【図１Ｂ−１】
2005519592.tif 000013
【図１Ｂ−２】
2005519592.tif 000014
【図１Ｂ−３】
2005519592.tif 000015
【図２】
2005519592.tif 000016
【図３Ａ】
2005519592.tif 000017
【図３Ｂ】
2005519592.tif 000018
【図４】
2005519592.tif 000019
【図５】
2005519592.tif 000020
【国際調査報告】
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