(57)【要約】本発明は、試料中に存在する微生物を検出するための方法に関し、これは、培養培地に試料を接種する段階を含む。培養培地は好ましくは、標的微生物の存在下で発色団を放出する色素原、または蛍光発生体を含み、かつ培養培地は、色付き底面を有する容器中に存在する。色付き底面と単離されたコロニーとのコントラストにより、検出が容易になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、試料中に存在する微生物を検出する方法：
a)標的微生物に適した培養培地を調製する段階；
b)色付き底部を有する容器に、該培地を流し込む段階；
c)a)由来の固形培養培地に試料または試料由来の接種物を接種して、インキュベーションする段階；および
d)容器底部の色と単離されたコロニーとの間のコントラストを用いて、該培養培地における該微生物の存在を検出する段階。
【請求項２】
培養培地が、標的生物の存在下でフルオロフォアを放出する蛍光発生剤を含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
培養培地が、色素形成剤由来の発色団の酵素的放出による標的微生物の検出に適した色素形成剤を含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項４】
容器が、不透明の色付き底部を有することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
容器が、透明の色付き底部を有することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
容器が、青色、赤色、黄色、黒色、または不透明白色から選択される色の底部を有することを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
培養培地中に存在する色素形成剤に対する微生物特異的な酵素の作用による加水分解により、発色団が放出されることを特徴とする、請求項3から6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
色素形成剤が、糖の代謝に関連する酵素基質より選択され、かつ特に以下からなる群より選択されることを特徴とする、請求項7記載の方法：
β-グルコシダーゼ基質、β-ガラクトシダーゼ基質、およびβ-グルクロニダーゼ基質。
【請求項９】
発色団が、インドキシル、ハロインドキシル（ブロモインドキシル、クロロインドキシル、フルオロインドキシル、ヨードインドキシル、ジクロロインドキシル、クロロブロモインドキシル、トリクロロインドキシル）、メチルインドキシル、およびヒドロキシキノリン誘導体からなる群より選択され、特に以下の誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項3から8のいずれか一項記載の方法：
6-クロロインドキシル、5-ブロモインドキシル、3-ブロモインドキシル、6-フルオロインドキシル、5-ヨードインドキシル、4,6-ジクロロインドキシル、6,7-ジクロロインドキシル、5-ブロモ-4-クロロインドキシル、5-ブロモ-6-クロロインドキシル、4,6,7-トリクロロインドキシル、N-メチルインドキシル、または8-ヒドロキシキノリン。
【請求項１０】
培養培地がまた、検索される微生物に選択的な因子も含むことを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
標的微生物がカンジダ種であることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
標的微生物がブドウ球菌種であり、かつ容器が、不透明の、好ましくは不透明白色の色付き底部を有することを特徴とする、請求項1から4および7から10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
標的微生物がビブリオ種であることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
標的微生物が、大腸菌型を含む種であり、かつ特に腸管出血性細菌の大腸菌であることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
色付き底部を有する容器および培養培地の組合せからなる、微生物を検出するためのキットであって、単離されたコロニーの色との有用なコントラストを示すように容器の色が選択される、キット。
【請求項１６】
培養培地が、標的微生物の存在下でフルオロフォアを放出する蛍光発生剤を含むことを特徴とする、請求項15記載のキット。
【請求項１７】
培養培地が、標的微生物の存在下で発色団を放出する色素形成剤を含むことを特徴とする、請求項15記載のキットであって、放出された発色団の色との有用なコントラストを示すように容器の色が選択される、キット。
【請求項１８】
微生物の増殖に適した培養培地が流し込まれる支持体としての、色付き底部を有する容器の使用であって、容器底部の色により該微生物のコロニーとのコントラストが可能になる、使用。
【請求項１９】
培養培地が、標的微生物の存在下でフルオロフォアを放出する蛍光発生剤を含むことを特徴とする、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
培養培地が、微生物株中に存在する特異的酵素の作用後に発色団を放出する色素形成剤を含むことを特徴とする、請求項18記載の使用であって、放出された発色団の色との有用なコントラストを示すように容器の色が選択される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する微生物を検出する方法に関し、ここで、培養培地に試料が接種され、培養培地は好ましくは、標的微生物の存在下で発色団を放出する色素形成剤（chromogenic agent）、または蛍光発生剤（fluorogenic agent）を含み、培養培地は、色付き（colored）底部を有する容器中に存在し、検出は、容器の色付き底部と単離されたコロニーとのコントラスト（contrast）により容易になる。
【背景技術】
【０００２】
生物学的試料もしくは食品試料の中、または病院環境中に存在する微生物の迅速検出は、汚染した場合に得られる測定値をできる限り迅速に定義するために必須である。
【０００３】
また同様に、適切な消毒を実施するのを可能にするためには、様々な汚染を区別できることも重要であると考えられる。
【０００４】
迅速かつ特異的な、PCRなどの方法が存在するが、これらはサーモサイクラー（thermocycler）等の装置の使用を必要とし、かつ病院環境中では必ずしも使用可能ではない。さらにこの方法は、被験試料の調製を必要とする可能性があり、実施するのが必ずしも容易ではない。
【０００５】
適切な培地における汚染微生物の培養に基づく方法、および、微生物特異的な酵素の作用後に発色団を放出する色素形成剤の添加による微生物の同定に基づく方法が、記載されている。
【０００６】
このように、国際公開公報第00/53799号、同第00/46345号、同第97/39103号、同第95/04156号、および同第94/09152号の特許出願により、ブドウ球菌、嫌気細菌もしくは腸管出血性大腸菌型（enterohemorrhagic coliform）、サルモネラ菌、または、カンジダ菌などその他の微生物を同定するための培養培地が記載されている。
【０００７】
しかし、使用される培地は概して比較的透明である。十分なコントラストが欠けているため、放出された発色団の色を明確に決定するのは難しいことが分かる場合がある。したがって、国際公開公報第95/04156号の特許出願に記載されたC培地の使用により、様々なカンジダ酵母を良好に区別することが可能になったが、得られる色は淡く、これは一部の利用者にとって問題となりうる。
【０００８】
同様に、国際公開公報第00/46345号の出願に記載された、ブドウ球菌を同定するための方法には、例えば乳白剤などの造影剤を培養培地に添加することが必要でありうる。
【０００９】
また、例えばChromagar社（パリ、フランス）から販売されているRambach Agarなどのサルモネラ菌検出用培地に関しても、コントラストのこのような必要性が感じられる。
【００１０】
フェニルグルクロニドの助けによって、特に大腸菌検出用の培地を不透明にするために、カオリンの添加が特に提唱されている。しかし、この種の成分の添加により、培地の製造コスト増大に加えて、検出培地の工業的製造に関する多くの問題が生じる可能性があることが判明している（特に沈殿）。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、単離されたコロニーと培養培地との間にコントラストが観察されないことにより生じる問題、特に培養培地中に色素形成剤が存在する結果としてこれらコロニーが着色される場合の問題に対応することを提唱する。
【００１２】
したがって本発明は、以下の段階を含む、試料中に存在する微生物を検出するための方法に関する：
a)標的微生物に適した培養培地を調製する段階；
b)色付き底部を有する容器に、上記培地を流し込む段階；
c)a)由来の固形培養培地に試料または試料由来の接種物を接種して、インキュベーションする段階；および
d)容器底部の色と単離されたコロニーとの間のコントラストを用いて、上記培養培地における上記微生物の存在を検出する段階。
【００１３】
特に好ましい態様において、本発明は、微生物に適した培養培地中に存在する色素形成剤からの発色団の酵素的放出により、試料中に存在する微生物を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法に関する：
a)標的微生物の検出に適した色素形成剤を含む、適切な培養培地を調製する段階；
b)色付き底部を有する容器に、上記培地を流し込む段階；
c)a)由来の固形培養培地に試料または試料由来の接種物を接種して、インキュベーションする段階；および
d)放出された発色団に起因する色に対する容器底部の色に関連したコントラストを用いて、上記培養培地における上記試料中に存在する微生物の存在を検出する段階。
【００１４】
別の態様において、培養培地は、色を付与する製品（例えば、McConkey Agar等）を含む。
【００１５】
別の態様において、培養培地は、標的微生物の存在下でフルオロフォアを放出する蛍光発生剤を含む。例えばガラクトシドに結合した4-メチルウンベリフェリル（4-methylumbelliferyl）をフルオロフォアとして、特に用いることができる（4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシド）。
【００１６】
好ましい態様において、本発明による容器は円形であり、特に、直径が40mm〜210mmの範囲のペトリ皿である。好ましくは、本発明による容器の直径は、47mm、55mm、90mm、100mm、または200mmに等しい。
【００１７】
本発明の好ましい態様において、容器の表面は、単離されたコロニーが増殖できるような容器に含まれる培養培地を接種することが可能なものである。したがって、本発明による容器の表面積は、好ましくは約15cm2〜17cm2を上回る。
【００１８】
本発明のある態様において、容器は不透明の色付き底部を有する。別の態様において、容器は透明の色付き底部を有する。好ましくは、容器は、青色、赤色、黄色、黒色、または不透明白色から選択される色の底部を有する。
【００１９】
本発明のある態様において、培養培地中に存在する色素形成剤に対する微生物特異的な酵素の作用による加水分解によって、発色団またはその他の色付き産物が放出される。また、上記色素形成剤は、糖の代謝に関連する酵素基質より選択され、特に以下からなる群より選択される：
β-グルコシダーゼ基質、β-ガラクトシダーゼ基質、およびβ-グルクロニダーゼ基質、ならびにホスファターゼ基質。
【００２０】
好ましくは、発色団は、インドキシル、ハロインドキシル（ブロモインドキシル、クロロインドキシル、フルオロインドキシル、ヨードインドキシル、ジクロロインドキシル、クロロブロモインドキシル、トリクロロインドキシル）、メチルインドキシル、およびヒドロキシキノリン誘導体からなる群より選択され、特に以下の誘導体からなる群より選択される：
6-クロロインドキシル、5-ブロモインドキシル、3-ブロモインドキシル、6-フルオロインドキシル、5-ヨードインドキシル、4,6-ジクロロインドキシル、6,7-ジクロロインドキシル、5-ブロモ-4-クロロインドキシル、5-ブロモ-6-クロロインドキシル、4,6,7-トリクロロインドキシル、N-メチルインドキシル、または8-ヒドロキシキノリン。
【００２１】
検索対象でない微生物の増殖の制限を可能にするためには、検索対象の微生物に選択的な因子もまた培養培地に含めることが有利である。
【００２２】
特定の態様において、培養培地はまた、高濃度のショ糖またはグルコースも含む。
【００２３】
本発明の方法は、標的微生物がカンジダ種である場合に、特に国際公開公報第95/04156号記載のクロムアガー（Chromagar）カンジダを用いて、有利に行われる。ここで、不透明または透明の色付き容器が用いられるが、色は、最も検索対象となっている酵母の性質に依存する。
【００２４】
本発明の方法はまた、標的微生物がブドウ球菌種である場合に特に適しており、ここで容器は、不透明の、好ましくは不透明白色の色付き底部を有するように、好ましく選択される。
【００２５】
標的微生物がビブリオ種である場合、大腸菌型を含む種である場合、および特に腸管出血性細菌の大腸菌である場合に本方法を行うこともまた、可能である。
【００２６】
得られる培地の性質によって微生物の色を定義するために、特に国際公開公報第00/53799号、同第00/46345号、同第97/39103号、同第95/04156号、および同第94/09152号の特許出願の開示が使用される。これら特許出願および対応する登録特許の開示、特に実施例の開示は、本特許出願に参照として組み入れられる。
【００２７】
本発明はまた、色付き底部を有する容器と、標的微生物の存在下で発色団を放出する色素形成剤を好ましく含む培養培地との組合せからなる、微生物を検出するためのキットに関する。
【００２８】
本発明の主題はまた、微生物株中に存在する特異的酵素の作用後に発色団を放出する色素形成剤を好ましく含む培養培地が流し込まれる支持体としての、色付き底部を有する容器の使用である。
【００２９】
使用される容器（一般にペトリ皿）の色は、微生物のコロニーまたは使用される色素原（chromogen）との有用なコントラストを示すように、有利に選択される。有用なコントラストとは、皿の底部に対してコロニーの色を区別する助けとなるコントラストとして定義される。したがって、培養培地が色素原を含まない場合、コロニーは全体的に淡い色になり、かつ容器の底部はやや暗く（dark）なる。
【００３０】
皿の底部の色はまた、放出される発色団の色によっても選択される。したがって、青色色素原である5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシルは吸光度が615nmであり、赤色の皿を使用した（約515nm）場合に容易に区別されうる。藤色、赤色、または紫色のコロニーを産生する色素原に関しては、波長が遠くなるような色の皿、例えば黄色の皿が使用される。淡い色のコロニーが得られる場合、暗い色の、および/または不透明の皿が使用される。
2005511091.tif 000002
【００３１】
ここで、本発明を実施するのに使用されうる発色団は、以下の一般式を有し、かつ、酵素基質に結合した色素形成剤の酸化により得られる。これら発色団は不溶性であり、色付き沈殿の形成を誘導する。グリコシダーゼの作用後だけでなく、ホスファターゼの作用後にも発色団が得られることに留意されたい。
【００３２】
色素形成剤の一覧は、米国特許第6,130,057号から得ることができ、これは、参照として本出願に組み入れられる。
【００３３】
本発明の文脈において使用されうる発色団の式：
2005511091.tif 000003
【００３４】
本発明による方法およびキットのもう一つの利点とは、特定の薬剤を含む皿の容易な同定の可能性である。実際、微生物の反応および発色団の放出の前は、色素形成剤を含む培地は無色である。したがって、色付きの皿への培地の封入が、配置および、関心対象の培地の容易な発見のために有用であることが判明しており、皿の色は、培地中の色素原および微生物の存在下で予想される色にしたがって選択されかつこれに相関する。
【国際調査報告】
2005511091.tif 000004
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