(57)【要約】本発明は、皮膚に生じる少なくとも一種または数種の微生物を検出するための、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むキットに関し、かつ本発明のキットを用いる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚に生じる少なくとも一種または数種の微生物に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、微生物を検出するためのキット。
【請求項２】
微生物が、スタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオニバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ベイヨネラ属、マラセチア属、またはスポロミュサ分類群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
微生物を、インサイチュ・ハイブリダイゼーションにより検出する、より好ましくは蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーションにより検出することを特徴とする、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
キットが、プロピオニバクテリウム・アクネス種に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
キットがさらに、少なくとも一種または数種のスタフィロコッカスに対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
キットが、少なくとも一種または数種のマラセチアに対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが、特に、オリゴヌクレオチドと共有結合している検出可能なマーカーを担持していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
検出可能なマーカーが、
ａ）蛍光マーカー、
ｂ）化学発光マーカー、
ｃ）放射性マーカー,
ｄ）酵素活性な基、
ｅ）ハプテン、
ｆ）ハイブリダイゼーションにより検出可能な核酸、
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
酵素マーカーが、ペルオキシダーゼ、好ましくはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、およびホスファターゼ、好ましくはアルカリ・ホスファターゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ｉ）配列番号：０１〜３０に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％のヌクレオチドが、ｉ）のオリゴヌクレオチドと一致するオリゴヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）のいずれかに記載の１つのオリゴヌクレオチドに由来し、１つまたはそれ以上のヌクレオチドがその配列から欠失されているか、または伸長されているオリゴヌクレオチド、および
ｉｖ）ストリンジェントな条件下でｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
ｉ）ａ）配列番号：０１〜０３に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるスタフィロコッカス属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｉｉ）ａ）配列番号：０４〜０６および２７〜２９に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるペプトストレプトコッカス属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｉｉｉ）ａ）配列番号：０７〜１２および１９〜２６に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるコリネバクテリウム属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｉｖ）ａ）配列番号：１３〜１５に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるベイヨネラ属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｖ）ａ）配列番号：１６および１７に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるプロピオニバクテリウム・アクネス属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｖｉ）ａ）配列番号：１８に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるマラセチア属の菌類を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｖｉｉ）ａ）配列番号：３０に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるスポロミュサ分類群由来の微生物を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
を含む請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
キットが、１つまたはそれ以上の標識したオリゴヌクレオチドに加えて、少なくとも１つ、好ましくは１つまたはそれ以上の標識していないオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
キットがさらに、オリゴヌクレオチドを含まない少なくとも１つのハイブリダイゼーション溶液を含むことを特徴とする、請求項１〜１２に記載のキット。
【請求項１４】
キットがさらに、少なくとも１つの適切な洗浄液または該洗浄液の濃縮液を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
キットがさらに、少なくとも１つの適切な透過処理液を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
キットがさらに、少なくとも１つの適切な固定液を含むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】
キットがさらに、少なくとも１つの適切なポジティブコントロール溶液を含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
キットがさらに、少なくとも１つの適切なネガティブコントロール溶液を含むことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
キットがさらに、包埋液を含むことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
皮膚に生じる微生物、より詳細にはスタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオニバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ベイヨネラ属、マラセチア属および／またはスポロミュサ分類群を請求項１〜１９のいずれかに記載のキットを用いたインサイチュ・ハイブリダイゼーションにより検出する方法であって、次の工程：
ａ）皮膚の試料を採取し、
ｂ）採取した試料に存在する微生物を固定し、
ｃ）固定化した微生物を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組合せと一緒にインキュベートし、ハイブリダイゼーションを誘導し、
ｄ）ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを除去し、そして
ｅ）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした微生物を検出し、場合により定量する
を含むことを特徴とする、微生物を検出する方法。
【請求項２１】
工程ａ）にて試料を皮膚表面から採取することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｉ）好ましくはエタノール、アセトンおよびエタノール／酢酸混合液からなる群から選択される変性試薬、
ｉｉ）好ましくはホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される架橋試薬、または
ｉｉｉ）熱固定処理
により固定を行うことを特徴とする、請求項２０または２１に記載の方法。 
【請求項２３】
固定後、微生物を担体に固定化することを特徴とする、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ハイブリダイゼーションの前に、微生物を透過性にすることを特徴とする、請求項２０〜２３に記載の方法。
【請求項２５】
透過性化を、好ましくはリゾチーム、リソスタフィン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼおよびムタノリシンからなる群から選択される細胞壁溶解酵素を用いた部分分解により行うことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
皮膚上の微生物を検出および／または定量するために、請求項１〜１９のいずれかに記載のキットを使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、皮膚に生じる少なくとも一種または数種の微生物に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む微生物を検出するためのキットに関し、かつ本発明のキットを用いる方法に関する。
【０００２】
ヒトの皮膚は、例えば約２m２の面積を有し、微生物が生息する最も広いヒト組織の１つである。進化の過程において、宿主とその寄生微生物は密接な関係を有しながら発達した。微生物は、様々な分泌腺を介して皮膚から供される栄養物を代謝している。結果として生じる皮膚表面の酸性化が、病原微生物のコロニー化を防いでいる。
【０００３】
しかしながら、微生物の代謝活性は望まない効果も有しうる。例えば、体臭およびふけの形成、ならびに様々な皮膚疾患の進行が、微生物の活性によって起こり得る。
【０００４】
原理上、皮膚微生物叢（フローラ）に属するすべての微生物を、皮膚から単離することができる。Priceによれば、２つの異なる群が存在する（Price, P.B.：The bacteriology of the normal skin：A new quantitative test applied to a study of the bacterial flora and the disinfectant action of mechanical cleansing.  J. Infect. Dis., 63:301-318, 1938に記載）。
【０００５】
ａ）常在フローラ（Resident flora）：ヒト皮膚上で増殖することの可能な微生物、または皮膚試料の分析において、常時多数または高い割合で発見され得る微生物。上述の特性は、これらの常在微生物が皮膚に強く係留されている（付着している）ことに起因することが記載されている。
【０００６】
ｂ）一過性フローラ（Transient flora）：ヒト皮膚上で増殖することのできない微生物、または皮膚試料の分析において、不定期に、かつ少数／低い割合でしか発見されない微生物。理論的には、これらの微生物は自由であり、すなわち皮膚の構成成分に付着していない。
【０００７】
より詳しい知識に基づくと、上述の常在皮膚フローラはすべて、原則、新しい医薬品または化粧品の活性成分を探索する観点から重要である。さらに、様々な微生物間の相互作用が、健康な皮膚とその疾患の関係の幅広い理解をもたらすことが可能であり、かつより良い活性成分、処置または医薬品の開発を促進する。化粧品産物、例えば消臭剤、クリームなどによる関連皮膚微生物の選択的影響もまた、皮膚のミクロな生態系の構造および機能の十分な知識を前提としている。
【０００８】
従来、微生物の検出は主に、血清学的または顕微鏡的に行われていた。その方法は、少数の微生物を直接検出するためには感度が十分ではない。従って、従来は微生物を増加させる培養工程を前段に行い検出していた。この方法の１つの不利点は、いくつかの微生物は利用可能な栄養媒体上で全く増加せず、よってそれらを検出することができないことである。現在、すべての細菌のうちたった０．１〜１４％のみが培養可能であることを、様々な環境試料の分析が示す。特に、培養−依存的な方法は、複雑な生物群集の組成物の分析に不適当であることが明らかである。なぜならば、選択した培養条件に依存して、特にこれらの培養条件によく合う微生物の増殖が促進され、結果として、開始試料中の存在比率が大きく変化してしまうためである。これらの集団数の変動のため、微生物の定量分析は全体として不可能である。この方法のもう１つの不利点は、既知のいくつかの培養方法がとても面倒であることと、それらの結果が多くの場合不安定であることである。これは、偽陽性および偽陰性の分析結果を両方とも生じることとなる。
【０００９】
上述の培養の不利点を鑑み、微生物検出の現代的な方法はすべて、共通の目標を有している：それは、培養の必要性を排除することにより培養の不利点を回避することを目指している。
【００１０】
微生物を検出する現代的な方法の例としては、ＤＮＡベースまたはＲＮＡベース（ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸、ＲＮＡ＝リボ核酸）のハイブリダイゼーションあるいは増幅方法がある。ハイブリダイゼーションとは、具体的には２つの一本鎖の相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの２重らせん（double helix）を形成することと理解されている。ハイブリダイゼーションは特に、２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子間と、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子間の両方で起こりうる。標的配列がもう一方の配列と十分に相補的である場合にのみ、様々な分子がハイブリダイズする。
【００１１】
検出するための相補的な標的配列を固定化することも可能であり、それはいわゆるＤＮＡチップ上にて行われることが多い。実用新案番号DE 20,110,013は、口腔疾患、特に膜炎の診断および処置のための担体（ＤＮＡチップ）などをクレームしている。口腔内フローラに発生する細菌またはウイルスの既知の基準（参照）配列と相補的なオリゴヌクレオチドを、この担体上に固定化することができる。前記相補性に基づいて、この遺伝子チップに用いられるオリゴヌクレオチドを、任意の条件下で対応する基準（参照）配列とハイブリダイズすること可能である。この担体の不利点は、微生物が培養により増幅されなければならないか、あるいは存在する試料からの遺伝子情報がハイブリダイゼーション前にチップ上で増幅されなければならないことである。従って、試料に元々存在する微生物を定量することはどちらも不可能である。
【００１２】
既知の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある。ＰＣＲにて、特定の微生物ゲノムに特有の断片を特異的なプライマーを用いて増幅する。プライマーがその標的部位を見つけると、その遺伝物質の断片を１００万倍も増幅することになる。その後の分析、例えばアガロース・ゲルを用いたＤＮＡ断片の単離にて、定性的評価を行うことができる。最も簡単な場合には、これは、用いたプライマーの標的部位が分析試料中に存在したという情報を供する。その他の情報はなにも供され得ない。これらの標的部位は、生存している細菌および死んだ細菌の両方、あるいはネイキッドＤＮＡ（naked ＤＮＡ）に由来し得る。この段階では、区別をすることはできない。さらに、分析試料中に存在する様々な物質が、ＤＮＡ増幅酵素、taq−ポリメラーゼの阻害を誘導しうる。これは、一般的に偽陰性結果の原因となる。さらに発展したＰＣＲ技術が定量的ＰＣＲであり、それは存在する微生物の量と増幅したＤＮＡの量の相関関係を確立すること目的としている。ＰＣＲの利点としては、その高い特異性と必要な時間の短さが含まれる。主な不利点は、その高い細菌混入（contamination）の受けやすさと、その結果生じる偽陽性の結果であり、上述の生存細胞および死亡細胞、またはニーキッドＤＮＡ（naked ＤＮＡ）の区別が不可能であること、および最終的に偽陰性の危険性が阻害物質の存在に起因して生じることである。
【００１３】
蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いたインサイチュ・ハイブリダイゼーション（in situ hybridization）法は、９０年代の初めに開発され、多くの環境試料にて成功裏に用いられている（Amann et al.（1990）, J. Bacteriol. 172, 762）。その方法は、「FISH」（蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション）と呼称され、どんな細胞にも生じるリボソーム・リボ核酸（ＲＮＡ）が高い保存性と可変性の配列、すなわち属または同じ種でさえ特有の配列を有しているという事実を利用している。相補的オリゴヌクレオチドを、これらの配列ドメインに対して作製することができ、さらに検出可能なマーカーを一緒に作製することができる。これらのいわゆる核酸プローブを用いて、微生物種、属または群を、試料中にて高い特異性で直接的に同定することが可能であり、必要であれば、可視化または定量することもできる。この方法は、生物群集の実際のインサイチュ条件を歪曲無しの表示を呈する唯一の方法である。現在までに、培養されておらず、かつ記載もされていない微生物が同定されている。
【００１４】
FISHにて、細胞内に浸透したプローブが分析サンプル中に存在する。開発されたプローブに対する微生物の種、属または群が分析試料中に存在している場合、微生物細胞中のプローブはその標的配列と結合しており、プローブの標識を介して細胞を検出することができる。
微生物を同定するためのさらに上述した方法（培養、ＰＣＲ）を凌ぐＦＩＳＨ技術の利点は、多数かつ多様である。
【００１５】
第一に、伝統的な培養により検出することが不可能な多数の微生物を、プローブを用いて検出することができる。試料の細菌集団のたった１５％が培養により可視化され得るが、ＦＩＳＨ技術は多くの試料中に検出される全細菌集団を１００％まで可視化することが可能である。第二に、ＦＩＳＨ技術により培養よりもはるかに迅速に微生物を検出することができる。培養による微生物の同定に数日を要するとしても、ＦＩＳＨ技術により、たとえ種レベルであっても、サンプリングから微生物の同定までを数時間のみで行うことが可能である。第三に、培養培地と異なり、プローブをその特異性にてほぼ自由に選択することができる。個々の種を、属全体または微生物群全体として適切なプローブで検出することができる。第四に、微生物種または全体の微生物集団を、試料そのもの中にて正確に定量することができる。第五に、試料中の多様な微生物集団を可視化することができる。
【００１６】
ＰＣＲとは対照的に、ＦＩＳＨは生存している微生物のみを確実に検出する。ＰＣＲで得られるネイキッドＤＮＡ（naked ＤＮＡ）または死んだ微生物による偽陽性の結果が、ＦＩＳＨでは起こらない。さらに、阻害物質の存在による偽陰性の結果も、細菌混入のために生じる偽陽性の結果と同様に除かれる。
【００１７】
従って、ＦＩＳＨ技術は、試料中における微生物を直接的に検出するための、迅速かつ高い特異性の両方を有するすぐれた手段である。培養法とは対照的に、直接的であり、さらに試料中に存在する微生物を定量することも可能である。
【００１８】
故に、本発明で取り扱う問題は、特にヒトと接触する微生物または微生物群を、これらの微生物を迅速かつ任意に試料中にて定量することができ、さらに個々の種または微生物種の群を、他の微生物の同時存在にもかかわらず安全に検出することができるような方法にて検出することを可能にした。
【００１９】
上述の問題は、皮膚に生じる少なくとも一種または数種の微生物に対する数なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、微生物を検出するためのキットにより解決され、本発明のキットを用いる方法の提供により解決された。
【００２０】
本発明にて、「皮膚」とは、ヒトの皮膚および／または動物の皮膚あるいは粘膜、ならびに皮膚付着物（髪、毛包、爪、分泌腺）であると理解される。
【００２１】
本発明にて、用語「微生物群」とは、同じ属に属するか、非常によく似たｒＲＮＡを有するかどちらかの、少なくとも２つの種の微生物を含むと解される。例えば、本発明の微生物群は、１つの属のすべての種を含むことも可能である。
【００２２】
本発明によれば、微生物群を探索すること、例えばそれらの発生または他のパラメーターにより探し出すこともまた望ましい。この例として、皮膚に存在する１つの属（例えばコリネバクテリウム属（Corynebacterium）の多くの種またはすべての種を、この属(この場合は、コリネバクテリウム属)から選択された１群の種と判断することもできる。
【００２３】
本発明のキットまたは装置一式は、１つの特定の種に対するオリゴヌクレオチド、一種に対するいくつかのオリゴヌクレオチド、数種の微生物に対する１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドと、２つまたはそれ以上の微生物群に対するいくつかのオリゴヌクレオチドを共に含むことができる。故に、例えばコリネバクテリウム属の任意の群に対する１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、例えばプロピオニバクテリウム・アクネス属（Propionibacterium acnes）を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを、１つのキットに含ませることができる。
【００２４】
特に好ましい態様にて、１つの属のすべての微生物を検出するために、１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドあるいはそれらの組合せを本発明のキットに用いることができる。これは、今まで培養することが困難または不可能であり、あるいはそのような試料中にて検出することができなかったある属の種でさえ、今や検出することができるという利点を有する。例えば、マラセチア属に対する特定のオリゴヌクレオチドを用いることで、試料中のこの真菌のすべての種を検出することができる。
【００２５】
本発明のキットに含まれるオリゴヌクレオチドは、上記の微生物のたった一種に対して特に選択されてもよい。このようにして、その皮膚における存在が特定の疾患との関係で議論されているような特有の性質を有す微生物種を有利に検出することができる。そのような特異的なプローブを用い、同属の他の種および「配列類似」の微生物に加えて、それらが検出され得る。このことは、例えば、他のプロピオニバクテリア（propionibacteria）を含む試料中にて、プロピオニバクテリウム・アクネスに特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、P．アクネスを正確かつ特異的に検出することができるため、アクネス属の調査に重要である。
【００２６】
本発明にて、本発明のキットまたは装置一式は、例えば溶液中（例えば、緩衝溶液）または混合物（例えば、凍結乾燥状態）中に少なくとも１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む。さらに、前記オリゴヌクレオチド類は、互いに一緒に存在しても良く、分かれて存在しても良い（例えば、異なる容器中に）。
【００２７】
前記オリゴヌクレオチドは、検出される微生物の染色体ＤＮＡまたはエピソームＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡまたはｒＲＮＡにも相補的であり得る。検出される微生物中にて１回以上の繰り返し（repetition frequency）中に存在するドメインに相補的なオリゴヌクレオチドを選択することが有利である。検出される配列は、１細胞につき５００〜１００，０００回存在することが好ましく、具体的に好ましい態様にては、１，０００〜５０，０００回である。このため、ｒＲＮＡを標的部位として用いることが好ましく、なぜならば細胞中にリボソームは、それぞれの活性な細胞にてタンパク質生合成部位として数千倍存在するからである。
【００２８】
本発明にて、オリゴヌクレオチドは一般的に、１２〜１，０００ヌクレオチド、好ましくは１２〜１００ヌクレオチドであり、より好ましくは１２〜５０ヌクレオチドであり、最も好ましくは１６〜２５ヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであってよい。
【００２９】
前記オリゴヌクレオチドは、適当な相補配列が、検出される微生物中に存在するかどうかにより選択される。前記配列は、一方では検出する微生物に特異的であり、他方では浸透オリゴヌクレオチドに実質的に接近可能である、すなわち例えばリボソームタンパク質またはrＲＮＡの２次構造により覆われて（マスクされて）いないものが適している。
【００３０】
特定の配列を選択することにより、微生物種、微生物属または微生物群を検出することが可能となる。１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの場合、配列の相補性は１００％なくてはならない。１５ヌクレオチド以上を含むオリゴヌクレオチドの場合、１〜数個の誤対合部位を含んでもよい。
【００３１】
１つの具体的な態様にて、本発明のキットは皮膚に生息するミクロフローラを検出するためのオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。
他の利点は、検出される微生物を定量することができることである。こうして、まず、上述した微生物の皮膚ミクロフローラの絶対的かつ相対的な量の割合に関する知識を、得ることができる。このことにより、医療または美容処置の結果、およびすべてのその効果を処置前、処置中ならびに処置後に測定することを可能にする。この点に関するもう一つの利点は、本発明の工程が生存細胞のみを検出することである。
【００３２】
１つの具体的な好ましい態様にて、微生物がスタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、コリネバクテリウム属、ベイヨネラ属（Veillonella）、マラセチア属またはスポロミュサ分類群（Sporomusa taxon）から選択される。
【００３３】
これまで、皮膚のミクロフローラは既知の培養方法によってのみ調べられてきた。上述したそれらの方法の欠点のために、培養可能な細菌または菌類しか検出することができなかった。そのような種の例としては、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）、スタフィロコッカス・エピダルミジス（S. epidermidis）、スタフィロコッカス・コーニイ（S. cohnii）、スタフィロコッカス・ヘモリチクス（S. haemolyticus）、スタフィロコッカス・ホミニス（S. hominis）、スタフィロコッカス・キャピチス（S. capitis）、スタフィロコッカス・ワーネリ（S. warneri）、スタフィロコッカス・サイウリ（S. sciuri）、スタフィロコッカス・スクレイフェリ（S. schleiferi）、スタフィロコッカス・インターメディウス（S. intermedius）、ベイヨネラ種、プロピオニバクテリウム・アクネス、マラセチア・スロフィエ(Malassezia sloffiae)、マラセチア・パチデルマチス（M. pachydermatis）、マラセチア・フルフル（M. furfur）、コリネバクテリウム・ミヌティシマム属（Corynebacterium minutissimum）、コリネバクテリウム・アミコラタム属（C. amycolatum）、コリネバクテリウム・ストリアタム（C. striatumおよびコリネバクテリウム・セロシス（C. xerosis）が含まれる。
【００３４】
本発明のオリゴヌクレオチドを添加することにより、上述のこれらのおよび他の属の種を定性的のみならず、定量的に検出することができる。この定量情報は、とりわけ活性成分の試験または皮膚疾患の早期診断に有用である。
【００３５】
さらに、特に配列番号：１９〜３０と同じまたは類似の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む本発明のキットを用いることで、同じ属に属したとしても、その属のある種と同時に他の微生物種を検出することが可能となる。
既述のように、皮膚に生じる微生物種のさらに十分な知識が、新しい活性原理の探索においてとりわけ重要である。
【００３６】
本発明の１つの具体的な態様にて、微生物の検出をインサイチュ・ハイブリダイゼーションにより行い、より好ましくは蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization）により行う。蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーションによる微生物の分析の利点、すなわち培養工程の削除および微生物の定量化の可能性、はすでに詳細に記載した。
【００３７】
ＦＩＳＨ技術による様々な微生物集団の定量化もまた、利点がある。決定した細胞数から、その後、とりわけ、異なる微生物の集団の相互作用についての結論を引出し、例えば治療目的またはその他の手段に関してそれらを検討することが可能である。特に、いくつかの異なる微生物集団または種を、一度にかつ同時に検出することができるように、様々なマーカーを異なるオリゴヌクレオチドに結合することができる。例えば、いくつかのオリゴヌクレオチドを含む１つのキットを、様々な種または種の群に対して用いることが有利である。
【００３８】
具体的な好ましい態様にて、本発明のキットは、プロピオニバクテリウム・アクネス種に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
既述のように、プロピオニバクテリウム・アクネスを検出するためのキットは、解明すべきにきびの臨床像において、皮膚の他の微生物に対する有効性および有害性について試験すべき新規な抗にきび剤、および開発すべき新しい治療または早期検出法の連結を可能とする。
【００３９】
さらに、プロピオニバクテリウム・アクネス種に対するヌクレオチドの他に、本発明のキットは、他の微生物群または種に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドも含むことができる。
にきび皮膚はしばしば、他の微生物（特に、スタフィロコッカス属またはストレプトコッカス属の微生物）による二次感染を示す。そのような二次感染の早期の識別は、処置の点で非常に価値があり、例えば早期処置により極めて弱い感染形状にすることが可能である。
【００４０】
具体的な好ましい態様にて、本発明のキットおよび装置一式は、プロピオニバクテリウム・アクネス種に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、およびスタフィロコッカス種に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
もう１つの具体的な好ましい態様にて、本発明のキットは、少なくとも一種または数種のマラセチアに対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００４１】
酵母マラセチアは、特に皮膚の剥離、例えば頭皮の剥離への関与が推測されている。この点に関する新しい知見は、本発明のキットにより、キットを用いたふけの有無についてボランティアを試験し、その結果を比較することにより与えられ得る。臨床の試料を、本発明のキットを用いてマラセチアについて試験することもできる。
【００４２】
１つの具体的な態様にて、オリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカー（好ましくは、蛍光マーカー）を担持しており、より好ましくは、それはオリゴヌクレオチドと共有結合している。オリゴヌクレオチドと標的配列の完全なハイブリダイゼーションの検出可能性は、微生物の同定および任意の定量化のための前段要件である。より具体的には、これは多くの場合、オリゴヌクレオチドに対する検出可能なマーカーの共有結合により達成される。用いられる検出可能なマーカーは、蛍光群であることが多く、例えばCy-2、Cy-3またはCy-5（Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USＡ）、FITC（フルオレセイン・イソチオシアネート）、CT（5,(6)-カルボキシテトラメチルローダミン-N-ヒドロキシスクシニミド・エステル（Molecular Probes Inc., Eugene, USＡ））、TRITC（テトラメチルローダミン-5,6-イソチオシアネート（Molecular Probes Inc., see abovｅ））またはFLUOS（5,(6)-カルボキシフルオレセイン-N-ヒドロキシスクシニイミド・エステル（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）である。または、化学発光性の基または放射活性マーカー、例えば、35S、32P、33P、125Jを用いることができる。しかし、オリゴヌクレオチドと酵素的活性分子、例えばアルカリ・ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼまたはグルコース・オキシダーゼのカップリングにより検出能を達成することもできる。これらの酵素それぞれに多数の既知の発色体があり、それらは天然基質の代わりに反応し、着色または蛍光産物を供することができる。そのような発色体の例を、以下の表１に一覧とする。
【表１】
2005532818.tif 000002
【００４３】
最後に、ハイブリダイゼーションに適したもう１つの核酸配列が、その５’末端または３’末端に存在するように、オリゴヌクレオチドを設計することができる。この核酸配列も同様に、約１５〜１，０００ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドを含む。この第二の核酸領域は、上述した方法の１つにより検出可能なオリゴヌクレオチドにより順に認識され得る。
【００４４】
もう一つの可能性は、検出可能なオリゴヌクレオチドとハプテンの連結（カップリング）であって、ハプテンはそれを認識する抗体と順次接触し得る。ジゴキシゲニンを、そのようなハプテンの例として記載することができる。記載した以外の他の例は、専門家によく知られている。
【００４５】
さらに具体的には、酵素マーカーは、ペルオキシダーゼ、好ましくはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、およびホスファターゼ、好ましくはアルカリ・ホスファターゼからなる群から選択される。
【００４６】
好ましい態様にて、キットは、以下： 
ｉ）配列番号：０１〜３０に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％のヌクレオチドが、ｉ）のオリゴヌクレオチドと一致するオリゴヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）のいずれかに記載の１つのオリゴヌクレオチドに由来し、１つまたはそれ以上のヌクレオチドがその配列から欠失されているか、または伸長されているオリゴヌクレオチド、および
ｉｖ）ストリンジェントな条件下でｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００４７】
配列番号：０１〜１８に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、およびそれと少なくとも80％のヌクレオチド、好ましくは少なくとも84％のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも90％のヌクレオチド、最も好ましくは95％のヌクレオチドが一致するオリゴヌクレオチドに加えて、本発明は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドが伸長または欠失されている、上述のオリゴヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドも包含する。
【００４８】
さらに、配列番号：１９〜３０に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、およびそれと少なくとも77％のヌクレオチド、好ましくは少なくとも83％のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも88％のヌクレオチド、最も好ましくは94％のヌクレオチドが一致するオリゴヌクレオチドに加えて、本発明は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドが伸長または欠失されている、上述のオリゴヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドも包含する。
【００４９】
より好適には１〜４０ヌクレオチド、好ましくは１〜２５ヌクレオチド、より好適には１〜１５ヌクレオチドを、上述のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に付着することも可能である。
本発明により、１〜７ヌクレオチド、好ましくは１〜５ヌクレオチド、より好ましくは１〜３ヌクレオチド、例えば該配列由来の１または２ヌクレオチドを欠失した上述のオリゴヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドを用いることもできる。
【００５０】
１つの具体的な利点は、相応に（対応させて）選択したオリゴヌクレオチドの高い特異性である。よって、属の個々の種が高い特異性で検出され得る場合、微生物の任意の属または群を特異的に検出することができる。
【００５１】
本発明のキットまたは装置一式は、皮膚に生じる微生物の迅速かつ効率的な検出に用いることができ、より好適にはＦＩＳＨ法を用いることができる。オリゴヌクレオチド配列を、他の方法、例えば遺伝子チップ上に固定化するプローブとして用いることもできる。
【００５２】
１つの具体的な態様にて、本発明のキットは、
ｉ）ａ）配列番号：０１〜０３に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように対応するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように対応するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるスタフィロコッカス属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｉｉ）ａ）配列番号：０４〜０６および２７〜２９に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるペプトストレプトコッカス属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｉｉｉ）ａ）配列番号：０７〜１２および１９〜２６に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるコリネバクテリウム属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｉｖ）ａ）配列番号：１３〜１５に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるベイヨネラ属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｖ）ａ）配列番号：１６および１７に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるプロピオニバクテリウム・アクネス種の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｖｉ）ａ）配列番号：１８に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるマラセチア属の菌類を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｖｉｉ）ａ）配列番号：３０に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるスポロミュサ分類群由来の微生物を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
を含む。
【００５３】
本発明のキットは、特に、スタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオニバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ベイヨネラ属、マラセチア属および／またはスポロミュサ分類群の微生物を特異的に検出することに適している。
【００５４】
従って、グループｉ）〜ｖｉｉ）由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの以下の組合せは、本発明のキットとして使用することが可能である。このことは、例えば、グループｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）またはｖｉｉ）の１つ由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを選択することを意味する。
【００５５】
グループｉ）由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドとグループｉｉ）由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの組合せ、および同様にグループｉ）とｉｉｉ）、ｉ）とｉｖ）、ｉ）とｖ）、ｉ）とｖｉ）、およびｉ）とｖｉｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｉ）とｉｖ）、ｉｉ）とｖ）、ｉｉ）とｖｉ）、およびｉｉ）とｖｉｉ）、ｉｉｉ）とｉｖ）、ｉｉｉ）とｖ）、ｉｉｉ）とｖｉ）、およびｉｉｉ）とｖｉｉ）、ｉｖ）とｖ）、ｉｖ）とｖｉ）、ｉｖ）とｖｉｉ）、ｖ）とｖｉ）、ｖ）とｖｉｉ）、およびｖｉ）とｖｉｉ）由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの組合せを、本発明に包含する。
【００５６】
グループｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの組合せ、ならびに同様にｉ）とｉｉ）およびｉｖ）；ｉ）とｉｉ）およびｖ）；ｉ）とｉｉ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉ）およびｖｉｉ）、ｉ）とｉｉｉ）およびｉｖ）；ｉ）とｉｉｉ）およびｖ）；ｉ）とｉｉｉ）およびｖｉ）、ｉ）とｉｉｉ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｖ）およびｖ）；ｉ）とｉｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｖ）およびｖｉｉ）、ｉ）とｖ）およびｖｉ）、ｉ）とｖ）およびｖｉｉ）；ｉｉ）とｉｉｉ）およびｉｖ）；ｉｉ）とｉｉｉ）およびｖ）；ｉｉ）とｉｉｉ）およびｖｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）およびｖｉｉ）；ｉｉ）とｉｖ）およびｖ）；ｉｉ）とｉｖ）およびｖｉ）、ｉｉ）とｉｖ）およびｖｉｉ）；ｉｉ）とｖ）およびｖｉ）、ｉｉ）とｖ）およびｖｉｉ）；ｉｉｉ）とｉｖ）およびｖ）；ｉｉｉ）とｉｖ）およびｖｉ）、ｉｉｉ）とｉｖ）およびｖｉｉ）；ｉｉｉ）とｖ）およびｖｉ）、ｉｉｉ）とｖ）およびｖｉｉ）、ならびに ｉｖ）とｖ）およびｖｉ）、ｉｖ）とｖ）およびｖｉｉ）、ｉｖ）とｖｉ）およびｖｉｉ）、ｖ）とｖｉ）およびｖｉｉ）由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの組合せもまた、本発明に用いることができる。
【００５７】
４つのグループ、すなわち、グループｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）およびｉｖ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）およびｖ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｖ）およびｖ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｖ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｖ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖ）；ｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｉｉ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉｉ）、ｖ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｖ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｖ）、ｖ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）；ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖ）；ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖｉ）；ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖｉｉ）；ｉｉ）とｉｉｉ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉｉ）とｉｉｉ）、ｖ）およびｖｉｉ）、またはｉｉｉ）とｉｖ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉｉｉ）とｉｖ）、ｖ）およびｖｉｉ）、ｉｉｉ）とｉｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）それぞれから選択される１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの組合せもまた、本発明に包含される。
【００５８】
５つのグループ、すなわち、ｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）、ｖ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）およびｖｉｉｉ）；とｉｉ）、ｉｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）；ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）およびｖｉｉ）由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの組合せもまた、本発明に包含される。
【００５９】
６つのグループ、すなわち、ｉとｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）およびｖｉ）；ｉ）とｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）およびｖｉｉ）；ｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）；ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの組合せ、ならびに７つすべてのグループ由来の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの組合せもまた、本発明に包含される。
【００６０】
従って、本発明のキットは、微生物種または微生物群を検出するために適している。例えば、この目的のためにｉ）のオリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上が、スタフィロコッカスの任意の種を検出するために選択される。
【００６１】
さらに一方で、上述した様々な属の微生物の種および／または群の検出を、適切なキットの組合せ（記載した可能性のある組合せ）によりもう一つと同時におよび／または一緒に行うことができることが有利である。例えば、オリゴヌクレオチドの適切な組合せを用いて、スタフィロコッカス属の微生物の検出（ ｉ）のオリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上を選択することによる）を、コリネバクテリウム属の微生物の検出（ ｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上を選択することによる）と同時に、および／または一緒に行うことができる。様々な組合せにより、本キットを個々に特定の要件に合うように構成することができる。
【００６２】
より具体的には、本発明のキットは、スタフィロコッカス属の微生物を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドであり、rＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドおよび配列番号：０１〜０３に示す配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。
【００６３】
記載したオリゴヌクレオチドはそれぞれ、以下のスタフィロコッカス属の種の少なくとも１つを検出する：スタフィロコッカス・アウレウス属（S. aureus）、スタフィロコッカス・エピダルミジス（S. epidermidis）、スタフィロコッカス・サッカロリティクス（S. saccharolyticus）、スタフィロコッカス・カプラエ（S. caprae）、スタフィロコッカス・キャピチス（S. capitis）、スタフィロコッカス・ワーネリ（S. warneri）、スタフィロコッカス・パステューリ（S. pasteuri）、スタフィロコッカス・アーレッテ（S. arlettae）、スタフィロコッカス・ガリナルム（S. gallinarum）、スタフィロコッカス・コーニイ（S. cohnii）、スタフィロコッカス・サッシヌス（S. succinus）、スタフィロコッカス・クルーシイ（S. kloosii）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（S. saprophyticus）、スタフィロコッカス・エクロラム（S. equorum）、スタフィロコッカス・キシロシス（S. xylosus）、スタフィロコッカス・ヘモリチクス（S. haemolyticus）、スタフィロコッカス・ホミニス（S. hominis）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（S. lugdunensis）、スタフィロコッカス・クロモゲネス（S. chromogenes）、スタフィロコッカス・アウリクラリス（S. auricularis）、スタフィロコッカス・スクレイフェリ（S. schleiferi）、スタフィロコッカス・サイウリ（S. sciuri）、スタフィロコッカス・レンタス（S. lentus）、スタフィロコッカス・ビトゥルス（S. vitulus）、スタフィロコッカス・プルベリ（S. pulveri）、スタフィロコッカス・フェリス属（S. felis）、スタフィロコッカス・ハイカス（S. hyicus）、スタフィロコッカス・ピスシファーメンタス（S. piscifermentans）、スタフィロコッカス・カルノシス（S. carnosus）、スタフィロコッカス・シムランス（S. simulans）、スタフィロコッカス・インターメディウス（S. intermedius）、スタフィロコッカス・デルフィニ（S. delphini）、スタフィロコッカス・ムスカ（S. muscae）およびスタフィロコッカス・コンディメンチ（S. condimenti）。
【００６４】
類似のｒＲＮＡ配列を有するが、スタフィロコッカス属に属さない微生物は、これらのオリゴヌクレオチドにより検出されないことが好都合である：パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・マイコデス（Bacillus mycoides）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、ブルクホリデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バクテロイド・ユニホルミス（Bacteroides uniformis）およびペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）。これは、特有の利点であり、プローブの高い特異性を示す。
【００６５】
配列番号：０２に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、スタフィロコッカス属の微生物、より好適にはスタフィロコッカス・インターメディウス（S. intermedius）、スタフィロコッカス・デルフィニ（S. delphini）、スタフィロコッカス・ムスカ（S. muscae）、スタフィロコッカス・コンディメンチ（S. condimenti）、スタフィロコッカス・ピスシファーメンタス（S. piscifermentans）、スタフィロコッカス・カルノシス（S. carnosus）、スタフィロコッカス・スクレイフェリ（S. schleiferi）、スタフィロコッカス・フェリス（S. felis）およびスタフィロコッカス・シムランス（S. simulans）、好ましくはスタフィロコッカス・インターメディウス（S. intermedius）およびスタフィロコッカス・スクレイフェリ（S. schleiferi）を検出するために適している。
【００６６】
配列番号：０１〜０２に示す配列を有する本発明のキット中のオリゴヌクレオチドの組合せは、特に好ましい。この組合せは、少なくとも以下のスタフィロコッカス属の一種を検出する：スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピダルミジス（S. epidermidis）、スタフィロコッカス・カプラエ（S. caprae）、スタフィロコッカス・キャピチス（S. capitis）、スタフィロコッカス・ワーネリ（S. warneri）、スタフィロコッカス・パステューリ（S. pasteuri）、スタフィロコッカス・アーレッテ（S. arlettae）、スタフィロコッカス・ガリナルム（S. gallinarum）、スタフィロコッカス・コーニイ（S. cohnii）、スタフィロコッカス・サッシヌス（S. succinus）、スタフィロコッカス・クルーシイ（S. kloosii）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（S. saprophyticus）、スタフィロコッカス・エクロラム（S. equorum）、スタフィロコッカス・キシロシス（S. xylosus）、スタフィロコッカス・ヘモリチクス（S. haemolyticus）、スタフィロコッカス・ホミニス（S. hominis）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（S. lugdunensis）、スタフィロコッカス・クロモゲネス（S. chromogenes）、スタフィロコッカス・アウリクラリス（S. auricularis）、スタフィロコッカス・スクレイフェリ（S. schleiferi）、スタフィロコッカス・サイウリ（S. sciuri）、スタフィロコッカス・レンタス（S. lentus）, スタフィロコッカス・ビトゥルス（S. vitulus）、スタフィロコッカス・プルベリ（S. pulveri）、スタフィロコッカス・インターメディウス（S. intermedius）、スタフィロコッカス・デルフィニ（S. delphini）、スタフィロコッカス・フェリス（S. felis）、スタフィロコッカス・ムスカ（S. muscae）、スタフィロコッカス・コンディメンチ（S. condimenti）、スタフィロコッカス・ピスシファーメンタス（S. piscifermentans）、スタフィロコッカス・カルモサス（S. carnosus）およびスタフィロコッカス・シムランス（S. simulans）。
【００６７】
より具体的には、本発明のキットは、ペプトストレプトコッカス属を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドであり、ｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドおよび配列番号：０４〜０６と２７〜２９に示す配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。
【００６８】
最新の知見によれば、「ペプトストレプトコッカス属」という属名で知られる細菌は、より具体的にはアネロコッカス属（Anaerococcus）、ペプトニフィルス属（Peptoniphilus）およびフィネゴルリア属（Finegoldia）といった様々なサブグループに配属することができる。
【００６９】
記載したオリゴヌクレオチドはそれぞれ、総称して「ペプトストレプトコッカス」として知られている以下のアネロコッカス属（Anaerococcus）、ペプトニフィルス属（Peptoniphilus）およびフィネゴルリア属（Finegoldia）種の少なくとも一つを検出する：ペプトニフィルス・アサッカロリティクス（P. assaccharolyticus）、ペプトニフィルス・ラクリマリス（P. lacrimalis）、ペプトニフィルス・ハレイ（P. hareii）、フィネゴルリア・マグナス（F. magnus）、アネロコッカス・テトラジウス（A. tetradius）、アネロコッカス・ヒドロジェナリス（A. hydrogenalis）、アネロコッカス・ラクトリティクス（A. lactolyticus）、アネロコッカス・オクトビウス（A. octavius）およびアネロコッカス・バジマリス（A. vaginalis）を検出する。
【００７０】
配列番号：０４〜０６に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが、特に好ましい。これらのオリゴヌクレオチドはそれぞれ、以下のペプトストレプトコッカス（Peptostreptococci）の一種、より具体的にはアネロコッカス属（Anaerococcus）の一種を少なくとも検出する：アネロコッカス・ヒドロジェナリス（Anaerococcus hydrogenalis）、アネロコッカス・ラクトリティクス（A. lactolyticus）、アネロコッカス・オクトビウス（A. octavius）、アネロコッカス・プレボッチ（A. prevotii）、アネロコッカス・テトラジウス（Anaerococcus tetradius）およびアネロコッカス・バジナリス（A. vaginalis）。
【００７１】
以下に記載したペプトストレプトコッカス属種および類似のｒＲＮＡ配列を有するが、ペプトストレプトコッカス属に属さない他の微生物、特に具体的にはアネロコッカス属（Anaerococcus）が、検出されないことが都合良い：ペプトニフィルス・ラクリマリス（Peptoniphilus lacrimalis）、ペプトストレプトコッカス・アネロビルス（Peptostreptococcus anaerobius）、フィネゴルリア・マグナス（Finegoldia magnus）およびルミノコッカス・プロダクツ（Ruminococcus productus）、ブレビバクテリウム・エピダーミジス（Brevibacterium epidermidis）、アビオトロファ・エレガンス（Abiotropha elegans）およびクロストリジウム・ハスチホルム（Clostridium hastiforme）。
【００７２】
具体的な好ましい態様にて、本発明のキットは、配列番号：０４に示す配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、「ペプトストレプトコッカス」の属名で知られる微生物の少なくとも以下の種を検出する：アネロコッカス・ヒドロジェナリス（Anaerococcus hydrogenalis）、アネロコッカス・ラクトリティクス（A. lactolyticus）、アネロコッカス・オクトビウス（A. octavius）、アネロコッカス・プレボッチ（A. prevotii）およびアネロコッカス・バジナリス（A. vaginalis）。
【００７３】
より具体的には、本発明のキットはさらに、ペプトストレプトコッカス属の微生物を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドであり、ｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドおよび配列番号：２７〜２９に示す配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。
【００７４】
以下に記載のペプトストレプトコッカス属の一種、および類似のｒＲＮＡ配列を有するが、ペプトストレプトコッシ（Peptostreptococci）に属さない他の微生物は、検出されないことが都合良い：ミクロモナス・ミクロス（Micromonas micros）、ヘルココッカス・クンジ（Helcococcus kunzii）、ヘルココッカス・オビス（Helcococcus ovis）。
【００７５】
配列番号：２７および２８に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが、特に好ましい。これらのオリゴヌクレオチドは、以下のペプトニフィルス属（Peptoniphilus）の少なくとも一種を検出する：ペプトニフィルス・アサッカロリティクス（Peptoniphilus assaccharolyticus）、ペプトニフィルス・ハレイ（P. hareii）、ペプトニフィルス・インドリクス（P. indolicus）（より具体的には、ATCC 29427株および近親関係の株、すなわち非常に類似のrRNＡを有する株）およびペプトニフィルス・ラクリマリス（P. lacrimalis）。
【００７６】
類似のｒＲＮＡを有する以下の種は、これらのオリゴヌクレオチドにより検出されない：シュードモナス・サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）、バリオボラックス・パラドクサス（Variovorax paradoxus）、フィネゴルリア・マグナ（Finegoldia magna）、スタフィロコッカス・エピダルミジス、プロピオニバクテリウム・アクネス、ミクロモナス・ミクロス（Micromonas micros）、ギャリコラ・バラネセ（Gallicola baranese）、アトポビウム・パルブラム（Atopobium parvulum）、ベイヨネラ・ディスパル、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ならびにアネロコッカス属（Anaerococcus）およびコリネバクテリウム属の一種。
【００７７】
配列番号：28に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、特にペプトニフィルス・ラクリマリス（Peptoniphilus lacrimalis）種の微生物を検出する。
配列番号：29に示す配列を有するオリゴヌクレオチドもまた、特に好ましい。総称して「ペプトストレプトコッシ（Peptostreptococci）」として知られている微生物由来の、このオリゴヌクレオチドは、少なくともフィネゴルリア・マグナ（Finegoldia magna）を検出し、rＲＮＡがこの種と非常によく似ている微生物も検出する。一方、以下の微生物は同時に検出されない：アネロコッカス・ヒドロジェナリス（Anaerococcus hydrogenalis）、ペプトストレプトコッカス・アネロビルス（Peptostreptococcus anaerobius）、ペプトニフィルス・ラクリマリス（Peptoniphilus lacrimalis）、スタフィロコッカス・エピダルミジス、Halocella cellulosilytica、プロピオニバクテリウム・アクネス、ミクロモナス・ミクロス（Micromonas micros）、ベイヨネラ・ディスパル、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ならびにAnaerococcus属、コリネバクテリウム属およびPeptoniphilus属の他の一種。
【００７８】
より具体的には、本発明のキットは、コリネバクテリウム属の微生物を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドであり、rＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドおよび配列番号：０７〜１２に示す配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。
【００７９】
記載したオリゴヌクレオチドはそれぞれ、以下のコリネバクテリウム属の少なくとも一種を検出する：コリネバクテリウム・グルラミカム（C. glutamicum）、コリネバクテリウム・リポフィロフラバム（C. lipophiloflavum）、コリネバクテリウム・グルクロノリチカム（C. glucuronolyticum）、コリネバクテリウム・マクジニレイ（C. macginleyi）、コリネバクテリウム・アコレンス（C. accolensi）、コリネバクテリウム・ファスチジオサム（C. fastidiosum）、コリネバクテリウム・セグメントサム（C. segmentosum）、コリネバクテリウム・アンモニアジェネス（C. ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ミヌティシマム（C. minutissimum）、コリネバクテリウム・フラベッセンス（C. flavescens）、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）、コリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）、コリネバクテリウム・シュードジェニタリウム（C. pseudogenitalium）、コリネバクテリウム・ジェニタリウム（C. genitalium）、コリネバクテリウム・ムコファシエンス（C. mucofaciens）、コリネバクテリウム・オーリス（C. auris）、コリネバクテリウム・マイセトイデス（C. mycetoides）、コリネバクテリウム・シスチテジス（C. cystitidis）、コリネバクテリウム・ピロスム（C. pilosum）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（C. pseudotuberculosis）、コリネバクテリウム・アルセランス（C. ulcerans）、コリネバクテリウム・ジフテリア（C. diphteriae）、コリネバクテリウム・ビタルメン（C. vitarumen）、コリネバクテリウム・クッシェリ（コリネバクテリウム・クッシェリ（C. kutscheri））、コリネバクテリウム・ジェニタリウム（C. genitalium）、コリネバクテリウム・アルゲントランテン（C. argentoratens）、コリネバクテリウム・カルネ（C. callunae）、コリネバクテリウム・ボービス（C. bovis）、コリネバクテリウム・バリアビリス（C. variabilis）、コリネバクテリウム・アミコラタム（C. amycolatum）、コリネバクテリウム・ツベルカロステリカム（C.tuberculostearicum）、コリネバクテリウム・セロシス（C. xerosis）、コリネバクテリウム・マトルコッチ（C. matruchotii）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（C. jeikeium）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（C. efficiens）、コリネバクテリウム・ソムセニイ（C. thomsenii）、コリネバクテリウム・ニグリカンス（C. nigricans）、コリネバクテリウム・オーリスカニス（C. auriscanis）、コリネバクテリウム・モーレパーケンス（C. mooreparkense）、コリネバクテリウム・カゼイ（C. casei）、コリネバクテリウム・カンポリーセンシシ（C. camporealensis）、コリネバクテリウム・サンドスバセンス（C. sundsvallense）、コリネバクテリウム・マスチジス（C. mastidis）、コリネバクテリウム・イミタンス（C. imitans）、コリネバクテリウム・リエジェリイ（C. riegelii）、コリネバクテリウム・アスペルム（C. asperum）、コリネバクテリウム・フレニイ（C. freneyi）、コリネバクテリウム・ストリアタム（C. striatum）、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）およびコリネバクテリウム・シムランス（C. simulans）。
【００８０】
類似のｒＲＮＡ配列を有するが、コリネバクテリウム属に属さない以下の微生物は、これらのオリゴヌクレオチドにより検出されないことが都合良い：クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ユーバクテリウム・モニリホルム（Eubacterium moniliforme）およびフソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）。以下の皮膚ミクロフローラに属する細菌もまた、検出されない：ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、ミクロコッカス・バリアンス（Micrococcus varians）、ミクロコッカス・ライエ（Micrococcus lyae）、アシネトバクター・カルコアセチスク（Acinetobacter calcoaceticus）およびストレプトコッカス・ポジェンス（streptococcus pyogenes）。これは、重要な利点であり、プローブの高い特異性を示している。
【００８１】
配列番号：１０に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、コリネバクテリウム・ストリアタム種（C. striatum）および／またはコリネバクテリウム・セロシス種（C. xerosis）のコリネバクテリアを検出するために特に好ましい。
さらに、配列番号：１１に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、コリネバクテリウム・ジェイケイウム種（C. jeikeium）のコリネバクテリアを検出するために用いられる。
【００８２】
具体的な好ましい態様にて、本発明のキットは、配列番号：０７、０８、１０および１１に示す配列を有するオリゴヌクレオチドの組合せを含む。この組合せは、コリネバクテリウム属の少なくとも以下の種を検出する：コリネバクテリウム・グルラミカム（C. glutamicum）、コリネバクテリウム・リポフィロフラバム（C. lipophiloflavum）、コリネバクテリウム・グルクロノリチカム（C. glucuronolyticum）、コリネバクテリウム・マクジニレイ（C. macginleyi）、コリネバクテリウム・アコレンス（C. accolensi）、コリネバクテリウム・ファスチジオサム、コリネバクテリウム・セグメントサム（C. segmentosum）、コリネバクテリウム・アンモニアジェネス（C. ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ミヌティシマム（C. minutissimum）、コリネバクテリウム・フラベッセンス（C. flavescens）、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）、コリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）、コリネバクテリウム・シュードジェニタリウム（C. pseudogenitalium）、コリネバクテリウム・ジェニタリウム（C. genitalium）、コリネバクテリウム・ムコファシエンス（C. mucofaciens）、コリネバクテリウム・オーリス（C. auris）、コリネバクテリウム・マイセトイデス（C. mycetoides）、コリネバクテリウム・シスチテジス（C. cystitidis）、コリネバクテリウム・ピロスム（C. pilosum）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（C. pseudotuberculosis）、コリネバクテリウム・アルセランス（C. ulcerans）、コリネバクテリウム・ジフテリア（C. diphteriae）、コリネバクテリウム・カンポリーセンシシ（C. camporealensis）、コリネバクテリウム・ビタルメン（C. vitarumen）、コリネバクテリウム・クッシェリ（C. kutscheri）、コリネバクテリウム・アルゲントランテン（C. argentoratens）、コリネバクテリウム・カルネ（C. callunae）、コリネバクテリウム・ボービス（C. bovis）、コリネバクテリウム・レナル （C. renale）、コリネバクテリウム・リエジェリイ（C. riegelii）、C. コリネバクテリウム・バリアビリス（C. variabilis）、コリネバクテリウム・アミコラタム（C. amycolatum）、コリネバクテリウム・ツベルカロステリカム、コリネバクテリウム・セロシス（C. xerosis）、コリネバクテリウム・マトルコッチ（C. matruchotii）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（C. jeikeium）。
【００８３】
１つの具体的な態様にて、本発明のキットはさらに、コリネバクテリウム属の微生物を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドであり、ｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドおよび配列番号：１９〜２６に示す配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。
【００８４】
記載したオリゴヌクレオチドはそれぞれ、以下のコリネバクテリウム属の少なくとも一種を検出する：コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）、コリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）、コリネバクテリウム・ジェニタリウム、コリネバクテリウム・ムチファシエンス（C. mucifaciens）、コリネバクテリウム・アミコラタム（C. amycolatum）、コリネバクテリウム・ツベルカロステリカムおよびコリネバクテリウム・リエジェリイ（C. riegelii）。これらのオリゴヌクレオチドは、コリネバクテリウム属の一種と非常に近親の関係にある１つまたはそれ以上の群を特異的に検出することに適している。
【００８５】
類似のｒＲＮＡ配列を有する以下の微生物は、これらのオリゴヌクレオチドにより検出されないことが都合良い：クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ユーバクテリウム・ユーリ（Eubacterium yurii）およびフソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）。皮膚ミクロフローラに属する以下の細菌もまた、検出されない：ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、ミクロコッカス・バリアンス（Micrococcus varians）、ミクロコッカス・ライエ（Micrococcus lyae）、アシネトバクター・カルコアセチスク（Acinetobacter calcoaceticus）およびストレプトコッカス・ポジェンス（streptococcus pyogenes）。これは、重要な利点であり、プローブの高い特異性を示している。
【００８６】
具体的な好ましい態様にて、配列番号：１９に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、コリネバクテリウム属由来の微生物のグループを検出するために用いられる。コリネバクテリウム属は、コリネバクテリウム・ツベルカロステリカム（より具体的には、ATCC 35692）またはCDC G5840（Acc. No. X80498）という名称の株の周囲のグループ、および非常によく似たｒＲＮＡを有する微生物、すなわちその微生物と非常に近親の関係の微生物またはそのｒＲＮＡが、記載したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする部分にて記載した微生物のｒＲＮＡと類似および／または完全に一致しているあるいはほとんど一致している（すなわち、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは１つから３つのヌクレオチドの違いを有する）微生物により形成されている。 
【００８７】
このプローブは、コリネバクテリウム・ツベルカロステリカムを検出することに都合良く、以下の非常によく似たrＲＮＡを有するコリネバクテリウム属の一種は、より遠縁の関係のコリネバクテリウム属の一種であり検出されない：コリネバクテリウム・ミヌティシマム（C. minutissimum）、コリネバクテリウム・ジフテリア（C. diphteriae）、コリネバクテリウム・ストリアタム（C. striatum）、コリネバクテリウム・セロシス（C. xerosis ）、コリネバクテリウム・ファスチジオサム、コリネバクテリウム・カンポリーセンシシ（C. camporealensis）、コリネバクテリウム・アコレンス（C. accolensi）、コリネバクテリウム・シュウドジェニタリウムおよびコリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（C. jeikeium）、コリネバクテリウム・デュラム （C. durume）、コリネバクテリウム・ムチファシエンス、コリネバクテリウム・レナル（C. renale）、コリネバクテリウム・リエジェリイ（C. riegelii）、コリネバクテリウム・グルラミカム（C. glutamicum）、コリネバクテリウム・リポフィロフラバム（C. lipophiloflavum）、コリネバクテリウム・グルクロノリチカム（C. glucuronolyticum）、コリネバクテリウム・アンモニアジェネス（C. ammoniagenes）、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（C. pseudotuberculosis）、コリネバクテリウム・クッシェリ（C. kutscheri）、コリネバクテリウム・カルネ（C. callunae）およびコリネバクテリウム・ウレアリチカム （C. urealyticum）。
【００８８】
配列番号：２０に示す配列を有するプローブは、コリネバクテリウム・アミコラタム属（C. amycolatum）および近親の関係の種を特異的に検出するために、特に好ましい。このプローブは、コリネバクテリウム・アミコラタムおよび非常によく似たｒＲＮＡを有し、記載したオリゴヌクレオチドとｒＲＮＡハイブリダイジングする部分にて誤対合はほとんどなく、好ましくは誤対合のないコリネバクテリウム属の一種を検出することに都合良いが、以下のより遠縁の関係のコリネバクテリウム属の一種は検出しない：コリネバクテリウム・アスペルム、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（C. jeikeium）、コリネバクテリウム・ボービス（C. bovis）、コリネバクテリウム・フレニイ（C. freneyi）、コリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）、コリネバクテリウム・デュラム（C. durume）、コリネバクテリウム・マトルコッチ（C. matruchotii）、コリネバクテリウム・ムチファシエンス、コリネバクテリウム・レナル（C. renale）、コリネバクテリウム・グルラミカム（C. glutamicum）およびコリネバクテリウム・セロシス（C. xerosis ）、およびさらにコリネバクテリウム・リポフィロフラバム（C. lipophiloflavum）、コリネバクテリウム・グルクロノリチカム（C. glucuronolyticum）、コリネバクテリウム・ミヌティシマム（C. minutissimum）、コリネバクテリウム・アンモニアジェネス（C. ammoniagenes）、コリネバクテリウム・カンポリーセンシシ（C. camporealensis）、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（C. pseudotuberculosis）、コリネバクテリウム・リエジェリイ（C. riegelii）、コリネバクテリウム・クッシェリ（C. kutscheri）、コリネバクテリウム・カルネ（C. callunae）およびコリネバクテリウム・ウレアリチカム（C. urealyticum）。
【００８９】
配列番号：２１に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、微生物の任意の種、より具体的にはコリネバクテリウム属を検出するために特に好ましく、それは配列番号：３１に示す16 S rＲＮＡの部分配列と少なくとも60％のヌクレオチド、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％のヌクレオチドの相同性を有する。
【００９０】
このプローブは、上述のコリネバクテリウム属の一種を有利に検出するが、以下のより遠縁の関係のコリネバクテリウム属の種は検出しない：コリネバクテリウム・ジェニタリウム、コリネバクテリウム・ムチファシエンス、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）、コリネバクテリウム・グルクロノリチカム（C. glucuronolyticum）、コリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）、コリネバクテリウム・シュードジェニタリウムおよびコリネバクテリウム・リポフィロフラバム（C. lipophiloflavum）、およびさらにコリネバクテリウム・アミコラタム（C. amycolatum）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（C. jeikeium）、コリネバクテリウム・デュラム（C. durume）、コリネバクテリウム・レナル（C. renale）、コリネバクテリウム・ストリアータム（C. striatum）、コリネバクテリウム・グルラミカム（C. glutamicum）、コリネバクテリウム・アコレンス（C. accolensi）、コリネバクテリウム・セロシス（C. xerosis ）、コリネバクテリウム・ミヌティシマム（C. minutissimum）、コリネバクテリウム・カンポリーセンシシ（C. camporealensis）、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（C. pseudotuberculosis）、コリネバクテリウム・クッシェリ（C. kutscheri）、コリネバクテリウム・カルネ（C. callunae）およびコリネバクテリウム・ウレアリチカム（C. urealyticum）。
【００９１】
配列番号：２３に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、コリネバクテリウム・アフェメンタンス種（C. afermentans）のコリネバクテリウムを検出するために特に好ましい。
このプローブは、コリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）および非常によく似たrＲＮＡを有するコリネバクテリウム属の一種を検出することに都合良いが、以下のより遠縁の関係のコリネバクテリウム属の種は検出しない：コリネバクテリウム・ジェニタリウム（C. genitalium）、コリネバクテリウム・ムチファシエンス、コリネバクテリウム・アンモニアジェネス（C. ammoniagenes）、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）、コリネバクテリウム・グルクロノリチカム（C. glucuronolyticum）、コリネバクテリウム・リエジェリイ（C. riegelii）、コリネバクテリウム・ソムセニイ、コリネバクテリウム・シュードジェニタリウム（C. pseudogenitalium）およびコリネバクテリウム・リポフィロフラバム（C. lipophiloflavum）、およびさらにコリネバクテリウム・アミコラタム（C. amycolatum）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（C. jeikeium）、コリネバクテリウム・デュラム （C. durume）、コリネバクテリウム・レナル（C. renale）、コリネバクテリウム・ストリアタム（C. striatum）、コリネバクテリウム・グルラミカム（C. glutamicum）、コリネバクテリウム・アコレンス（C. accolensi）、コリネバクテリウム・セロシス（C. xerosis）、コリネバクテリウム・ミヌティシマム（C. minutissimum）、コリネバクテリウム・カンポリーセンシシ（C. camporealensis）、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（C. pseudotuberculosis）、コリネバクテリウム・クッシェリ（C. kutscheri）、コリネバクテリウム・カルネ（C. callunae）およびコリネバクテリウム・ウレアリチカム（C. urealyticum）。
【００９２】
配列番号：２５に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、コリネバクテリウム・アフェメンタンス種（C. afermentans）、コリネバクテリウム・ムチファシエンス種、コリネバクテリウム・コレイエ種（C. coyleiae）および／または「コリネバクテリウム・ジェニタリウム」のコリネバクテリアを検出するために特に好ましい。
このプローブは、コリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）、コリネバクテリウム・ムチファシエンス、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）および「コリネバクテリウム・ジェニタリウム（C. genitalium）」ならびに非常によく似たrＲＮＡを有するコリネバクテリウム属の一種を有利に検出するが、以下のより遠縁の関係のコリネバクテリウム属の一種は検出しない：コリネバクテリウム・セロシス（C. xerosis）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（C. jeikeium）、コリネバクテリウム・ウレアリチカム（C. urealyticum）、コリネバクテリウム・アミコラタム属（C. amycolatum）、コリネバクテリウム・グルラミカム（C. glutamicum）、コリネバクテリウム・ストリアタム（C. striatum）、コリネバクテリウム・アコレンス（C. accolensi）、コリネバクテリウム・レナル（C. renale）、コリネバクテリウム・アンモニアジェネス（C. ammoniagenes）およびコリネバクテリウム・クッシェリ（C. kutscheri）、およびさらにコリネバクテリウム・グルクロノリチカム（C. glucuronolyticum）、コリネバクテリウム・カンポリーセンシシ（C. camporealensis）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（C. pseudotuberculosis）、コリネバクテリウム・デュラム（C. durume）、コリネバクテリウム・ミヌティシマム（C. minutissimum）、コリネバクテリウム・リポフィロフラバム（C. lipophiloflavum）、コリネバクテリウム・カルネ（C. callunae）およびコリネバクテリウム・ソムセニイ。
【００９３】
さらに、このオリゴヌクレオチドは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）に属さず、非常によく似たｒＲＮＡを有する以下の微生物も検出しない：ナノムレア・ファスチジオサ（Nanomurea fastidiosa）、ミクロモノスポラ・エキノスポラ（Micromonospora echinospora）、アビオトロファ・エレガンス（Abiotropha elegans）およびアルカノバクテリウム・ピオゲネス（Arcanobacterium pyogenes）。
【００９４】
配列番号：２６に示す配列を有するプローブは、コリネバクテリウム・リエゲリ（C. riegelli）を特異的に検出するために特に好ましい。
【００９５】
具体的な態様にて、本発明のキットは、ベイヨネラ属の微生物を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドであり、ｒＲＮＡと相補的なプローブおよび配列番号：１３〜１５に示す配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブを含む。
【００９６】
記載したオリゴヌクレオチドはそれぞれ、以下のベイヨネラ属の少なくとも一種を検出する：ベイヨネラ・ディスパル（V. dispar）、ベイヨネラ・パーバラ（V. parvula）およびベイヨネラ・アティピカ（V. atypica）。ベイヨネラ属は、系統樹にて大部分が単離されているため、非標的微生物は検出されないことが都合良い。
【００９７】
具体的に好ましい態様にて、本発明のキットは、配列番号：１３〜１４に示す配列を有するオリゴヌクレオチドの組合せを含む。この組合せは、以下のベイヨネラ属の少なくとも一種を検出する：ベイヨネラ・ディスパル（V. dispar）、ベイヨネラ・パーバラ（V. parvula）およびベイヨネラ・アティピカ（V. atypica）。
【００９８】
より具体的には、本発明のキットは、プロピオニバクテリウム・アクネス種の微生物を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドであり、rＲＮＡに相補的なプローブおよび配列番号：１６〜１７に示す配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるプローブを含む。
【００９９】
記載したオリゴヌクレオチドはそれぞれ、プロピオニバクテリウム・アクネス種を特異的に検出する。
具体的に好ましいキットは、配列番号：１６に示す配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１００】
類似のｒＲＮＡ配列を有するがプロピオニバクテリウム・アクネス種に属さない微生物は、検出されないことが都合良い：プロピオニバクテリウム・プロピオニクス（P. propionicus）、プロピオニバクテリウム・グラニュローサ（P. granulosum）、プロピオニバクテリウム・アビダム（P. avidum）、プロピオニバクテリウム・フレウデンレイッチイ（P. freudenreichii）、プロピオニバクテリウム・トエニ（P. thoeni）、プロピオニバクテリウム・リンフォフィルス（P. lymphophilus）、コリネバクテリウム・ミヌティシマム（C. minutissimum）、サッカロモノスポラ・ビリディス（Saccharomonospora viridis）、ノカルディオデス種（Nocardiodes）、プロピオニフェラクス・イノキュア（Propioniferax innocua）、ゴードニア・スプッチ（Gordonia sputi）およびアツカノバクテリウム（Arcanobacterium）。
【０１０１】
もう１つの具体的な態様にて、本発明のキットは、マラセチア属の微生物を特異的に検出するオリゴヌクレオチドであり、ｒＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドおよび配列番号：１８に示す配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【０１０２】
記載したオリゴヌクレオチドは、以下のマラセチア属の少なくとも一種を検出する：マラセチア・スロフィエ、マラセチア・パチデルマチス（M. pachydermatis）、マラセチア・フルフル（M. furfur）。
類似のＲＮＡ配列を有するが、マラセチア属に属さない以下の微生物は、検出されないことが都合良い：カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）およびカンジダ・クルセイ（Candida krucei）。
【０１０３】
配列番号：３０に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、スポロミュサ分類群の任意の微生物、好ましくはスポロミュサ分類群のサブグループおよび記載した微生物と非常によく似たｒＲＮＡを有する微生物から形成されるファスコラルクトバクテリウム属（Phascolarctobacterium）およびアシダミノコッカス属（Acidaminococcus）の微生物を検出するために特に好ましい。
【０１０４】
記載したオリゴヌクレオチドは、少なくともアシダミノコッカス・フェルメンタンス種（Acidaminococcus fermentans）、ファスコラルクトバクテリウム・フェウム種（Phascolarctobacterium faecium）および非常によく似たＲＮＡを有する近親の関係の微生物を検出するが、以下の微生物は検出しない：ベイヨネラ種、ハロバチルス・ハロフィルス（Halobacillus halophilus）、スポロムサ・パウチボランス（Sporomusa paucivorans）、マクロコッカス・カセオリチクス（Macrococcus caseolyticus）、アネロムサ・アシダミノフィラ（Anaeromusa acidaminophila）、ハロセラ・セルロシリチカ（Halocella cellulosilytica）、ペプトストレプトコッカス・アネロビルス（Peptostreptococcus anaerobius）、スクシクラスチカム・ルミニス（Succiniclasticum ruminis）およびスクシニスピラ・モビリス（Succinispira mobilis）。
【０１０５】
１つの具体的な好ましい態様にて、本発明のキットは、標識したオリゴヌクレオチドだけでなく、標識していないオリゴヌクレオチドも含み、微生物の検出に用いられ得る。標識していないオリゴヌクレオチドおよび標識したオリゴヌクレオチドの両方を含む試料のインキュベーションは、プローブの特異性を増大するために用いられることが好ましい。例えば、近親の関係の微生物種を、検出される微生物種と近親の関係にある検出されない微生物種に対する１つのオリゴヌクレオチドを用いて識別することができ、そのオリゴヌクレオチドは、選択された条件下で標識したプローブよりもｒＲＮＡの標的配列を有する検出されない微生物とよりハイブリダイズする。標識していないプローブが、標識したプローブよりも検出されない微生物のｒＲＮＡとよりハイブリダイズし、標識したプローブと検出されない微生物のｒＲＮＡの結合のために、標識していないオリゴヌクレオチド（competitor）の使用によって偽陽性結果が防止される。任意の微生物種または微生物群の特異的な検出がこうして可能となり、とりわけ非常によく似たｒＲＮＡ配列を有する近親の関係である種の存在においても可能である。
【０１０６】
例えば、本発明にて、配列番号：２２のオリゴヌクレオチドと一緒に配列番号：２１のオリゴヌクレオチドを用いることが適当である。この場合、配列番号：２１に示すオリゴヌクレオチドは標識されており、配列番号：２２に示すオリゴヌクレオチドは標識されていないことが好ましい。故に、16 S ｒＲＮＡ配列が配列番号：３１に示す配列を含む微生物種は検出され得るが、同時にコリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）を検出されなくすることが容易である（実施例の分析結果を参照のこと）。
【０１０７】
本発明にて、配列番号：２３と２４を共に有するオリゴヌクレオチドを用いることも、適当であろう。配列番号：２３を有するオリゴヌクレオチドは、コリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）を検出するためのプローブとして標識して用いられ、配列番号：２４のオリゴヌクレオチドは、配列番号：３１に示す配列を含む16 S rＲＮＡ配列の微生物種の非常によく似た標的配列を覆い隠している。
【０１０８】
さらに、配列番号：２６のオリゴヌクレオチドは、配列番号：２５のオリゴヌクレオチドと一緒に標識していない競合物質として用いることができる。この方法にて、系統樹にて互いに近親の以下のコリネバクテリウム属の一種は、検出することができる：コリネバクテリウム・アフェメンタンス（C. afermentans）、コリネバクテリウム・ジェニタリウム（C. genitalium）、コリネバクテリウム・ムチファシエンス、コリネバクテリウム・コレイエ（C. coyleiae）が、非常によく似たrＲＮＡ配列を有し、同時に検出されるコリネバクテリウム種のコリネバクテリウム・リエジェリイ（C. riegelii）は検出されない。
【０１０９】
本発明の具体的な好ましい態様にて、キットはさらに他の微生物種、群または属を検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１０】
配列番号：１９〜３０の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドに加えて、１つのキットは、スタフィロコッカス属、ベイヨネラ属、マラセチア属および／またはプロピオニバクテリウム属の一種を検出するために１つまたはそれ以上の他のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。様々な皮膚関連微生物を、１つの試料にて同時にまたは「並行して」、より好ましくは一回の工程にて検出することができることが都合良い。さらに、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、特に配列番号：１〜１８のオリゴヌクレオチドが、特に適している。
【０１１１】
例えば、配列番号：１９〜３０の配列を有する１つまたはそれ以上あるいはすべてのオリゴヌクレオチドを添加したキットは、検出されるより多くの群の微生物を検出することを可能にする１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含むことが、特に好ましい。
例えば、実際にまず、１つまたはそれ以上のプローブを用いてコリネバクテリウム属の微生物を含む試料を同定し、その後、コリネバクテリウム属の個々の微生物種または群に特異的な陽性試料を調べることが可能である。
【０１１２】
好ましいオリゴヌクレオチドが、コリネバクテリウム属の多くの異なる種を検出するため、好ましくはコリネバクテリウム属の皮膚関連種を検出するために用いられ、好ましくは組合せて用いられ、それらは配列番号：７〜１２に示す配列を有するオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号：７、８、１０および１１であり、特に配列番号：７、８、１０および１１のオリゴヌクレオチドは同時に用いられる場合が好ましい。最後に、上述した配列番号：１９〜２６のオリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上を、コリネバクテリウム属の所望の微生物の一種に依存してキットに添加しても良い。
【０１１３】
配列プロトコールの配列を、以下の表２に示す。
【表２】
2005532818.tif 000003
【０１１４】
本発明のキットは、重要な構成成分として（特にインサイチュ・ハイブリダイゼーション法にて用いられる場合に）検出される微生物に特異的なオリゴヌクレオチドを含む特定のハイブリダイゼーション溶液を含むことが可能である。さらに、オリゴヌクレオチドを含まない相当するハイブリダイゼーション溶液、および相当する洗浄溶液または相当する洗浄溶液の濃縮液を含んでいて良い。さらに、任意に酵素溶液、固定液、および任意に包埋液を含んでいて良い。陽性コントロールおよび陰性コントロールを同時に行うためのハイブリダイゼーション溶液（例えば、非ハイブリダイジング・オリゴヌクレオチドの添加の有無）は、任意に存在して良い。
【０１１５】
本発明の方法は、以下の工程を含む：
ａ）皮膚の試料を採取し、
ｂ）採取した試料に存在する微生物を固定し、
ｃ）固定化した微生物を少なくとも１つのオリゴヌクレオチド一緒にインキュベートし、ハイブリダイゼーションを誘導し、
ｄ）ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを除去し、そして
ｅ）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした微生物を検出し、場合により定量する。
【０１１６】
本発明にて、微生物の「固定」とは、微生物細胞壁がオリゴヌクレオチドに対して透過性になるように処置されることと解される。通常、エタノールを固定に用いる。細胞壁が、以下のこれらの手段のオリゴヌクレオチドにより透過性にされ得ない場合、同様の結果を導くのに十分な他の手段が専門家に知られている。これらには、例えば、メタノール、アルコールの混合液、希釈したパラホルムアルデヒド溶液または希ホルムアルデヒド溶液などが含まれる。
【０１１７】
本発明によれば、特に固定した細胞を「ハイブリダイゼーション」のために蛍光標識したオリゴヌクレオチドとインキュベートする。これらの標識したオリゴヌクレオチドは、任意に細胞壁を透過した後、オリゴヌクレオチドに相同的な標的配列にそれ自身が結合することができる。その結合は、相補的な核酸フラグメント間に水素結合を構築することであると解される。
【０１１８】
本発明のキットのオリゴヌクレオチドは、本発明の方法における適切なハイブリダイゼーション溶液と一緒に用いられる。この溶液の適切な構成成分は、専門家によく知られている。相当する溶液は、例えば、0％〜80％の濃度のホルムアミド、好ましくは0％〜45％の濃度のホルムアミド、より好ましくは20％〜40％の濃度のホルムアミドを含み、かつ例えば、0.1 mol／l〜1.5 mol／lの塩濃度、好ましくは0.5 mol／l〜1.0 mol／lの塩濃度（塩としては、NaClが好ましい）、より好ましくは0.9 mol／lの塩濃度を有する。さらに、洗浄剤（一般的には、ＳＤＳ）は、一般に0.001％〜0.2％の濃度、好ましくは0.005％〜0.1％の濃度、より好ましくは0.01％の濃度である。適切な緩衝物質（例えば、Tris-HCl、クエン酸ナトリウム、HEPES、PIPESなど）は、溶液をバッファリングしており、典型的に0.01 mol／l〜0.1 mol／lの濃度、好ましくは0.01 mol／l〜0.05 mol／lの濃度、より好ましくは0.02 mol／lの濃度である。ハイブリダイゼーション溶液のｐＨは、一般に6.0〜9.0の間であり、好ましくは7.0〜8.0の間、より好ましくは約8.0である。
【０１１９】
他の添加物としては、例えばハイブリダイゼーション反応における非特異的結合を防ぐためのサケ精子ＤＮＡまたはブロッキング試薬、あるいはハイブリダイゼーション反応を加速させるためのポリエチレン・グリコール、ポリビニル・ピロリドンまたは硫酸デキストランをも含んで用いることができる。さらに、すべての生存微生物および／または試料中に存在する微生物のＤＮＡを着色するために、物質（例えば、DAPI、4', 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩）を添加することもできる。相当する添加剤は、専門家によく知られており、既知の典型的な濃度で添加することができる。
【０１２０】
ハイブリダイゼーション溶液中のオリゴヌクレオチドの濃度は、その標識の性質および標的構造物の数により決定される。迅速かつ効率的なハイブリダイゼーションを供するために、オリゴヌクレオチドの数を標的物質の数よりも桁違いに多くしなければならない。しかし、過剰量の蛍光標識したオリゴヌクレオチドが、バックグラウンドの蛍光の増大を導くことを念頭に置くことが重要である。従って、オリゴヌクレオチドの濃度は、0.5〜500 ng／μlの範囲であるべきである。本発明の方法の好ましい濃度は、１μlのハイブリダイゼーション溶液に対して、用いた個々のオリゴヌクレオチドが1〜10 ngである。用いたハイブリダイゼーション溶液の量は、8μl〜100mlの間であり、本発明の好ましい態様にて10μl〜1,000μlの間であり、具体的に好ましい態様にて20μl〜40μlの間である。
【０１２１】
ハイブリダイゼーションの継続時間は、通常10分〜12時間の間であり、好ましくは約1.5時間である。ハイブリダイゼーション温度は、44℃〜48℃の間が好ましく、より好ましくは46℃である。ハイブリダイゼーション温度、およびハイブリダイゼーション溶液中における塩ならびに洗浄剤の濃度といったパラメーターは、オリゴヌクレオチド、より好ましくは検出する細胞内の標的配列に対するそのオリゴヌクレオチドの長さおよび相補性の程度に依存して最適化することができる。この点に関し専門家は、相関性の予測に精通している。
【０１２２】
ハイブリダイゼーションの完了時に、ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドおよび余剰のオリゴヌクレオチドを従来的な洗浄溶液を用いて通常通りに、除去または洗い流す必要がある。所望であれば、この洗浄溶液は、洗浄剤、例えばＳＤＳなどを0.001〜0.1％、好ましくは0.01％の濃度で含み、Tris-HClまたは適切な緩衝物質を0.001〜0.1 mol／lの濃度で、好ましくは0.02 mol／lの濃度で含み、ｐＨは6.0〜9.0の範囲であり、好ましくは約8.0である。洗浄剤は存在しても良いが、必須ではない。さらに、洗浄溶液は通常、（必要な厳密度に依存して）0.003 mol／l〜0.9 mol／lの濃度、好ましくは0.01 mol／l〜0.9 mol／lの濃度でNaClを含む。0.07 mol／lの濃度のNaClが、特に好ましい。0.05 mol／l〜0.22 mol／lの濃度のNaClは、配列番号：１９〜３０のオリゴヌクレオチドを用いて行い得る特異的な検出のハイブリダイゼーションに特に適当である。さらに、洗浄溶液は、好ましくは0.005 mol／lの濃度でEDTAを含むことが可能である。洗浄溶液は、適当な量で専門家に知られている保存料を含むことができる。
【０１２３】
結合していないオリゴヌクレオチドを、通常44℃〜52℃、好ましくは44℃〜50℃、より好ましくは44℃〜48℃の温度で、10〜40分間、好ましくは15分間、「洗い流し」を行う。
【０１２４】
用いたオリゴヌクレオチドの標識の性質に依存して、最終評価を光学顕微鏡、epifluorescence顕微鏡、化学照度計（chemoluminometer）、蛍光光度計などを用いて行うことができる。
本発明の方法の利点は、多種多様である。
【０１２５】
具体的な利点としては、この検出工程の速さである。従来の培養が、検出に最高７日までを要するのに対し、本発明の工程を利用後３時間で結果が得られる。これは初めて、用いた処置の効果および望まない効果の添付の診断用対照を供する。この点に関するもう１つの利点としては、本発明の方法が、記載したすべての微生物を同時に検出することを可能にし、サンプル採取から評価までのすべての工程を１度に行うことができるための時間的な利点がある。
【０１２６】
もう１つの主な利点は、これらの医学的および美容的に関連のある皮膚フローラの微生物を、ここに初めて同時に検出することが可能であることである。故に、オリゴヌクレオチドに対する異なるマーカーを用いて、すべての、いくつかのまたは個々の微生物群または種を、お互いに区別して同時にかつ明確に検出することができる。さらに、これらの微生物群または種の集団比率およびそれらの相互作用を、こうして初めて分析することができる。これは、医学的および／または美容的に関連ある皮膚の問題を明確に診断すること、かつ選択的に処置することの可能性を初めて開示する。皮膚のミクロフローラ全体における医学的治療または美容的処置の効果を測定することも、ここに初めて可能である。故に、処置のあらゆる効果および望まない効果を早期に認識し、さらなる処置にて増幅あるいは抑制することができる。
【０１２７】
さらに、従来の検出方法により検出することができなかった皮膚フローラの微生物を、本発明のキットを用いて本工程にてここに初めて検出することができる。
微生物の様々な群を、オリゴヌクレオチドの特異性または用いたオリゴヌクレオチドにより検出することができる。一方では微生物の大集団、もう一方では比較的小集団の、近親関係の群および一様な個々の種を、近親の関係の微生物種と同じく、他と同時に特異的に検出することができる。
【０１２８】
さらに、本発明の方法により、（陽性シグナルの場合に）系統樹に未知の微生物種を組込むことができ、または特定のプローブを用いたハイブリダイゼーション方法による生化学的な検出を基に配属の確認を行うことが可能となる。
【０１２９】
本発明の方法の好ましい態様にて、本方法の工程ａ）にて皮膚表面から試料を採取する。ボランティアから皮膚試料を採取し、皮膚表面からの微生物の剥離を促すことを目的として、皮膚を洗浄液に接触する。生理的に安全な洗浄剤、例えばトゥイーン（Tween）またはトライトン（Triton）を総重量に対し約0.01〜1％の濃度で用いることが好ましい。ｐＨは5〜10、好ましくは7〜9の範囲、例えば8が好都合である。
【０１３０】
微生物のよりよい剥離を達成するために、皮膚の表面を掻爬用器具で削る。適切な掻爬用器具は、様々な直径、例えば0.05〜1.5ｃｍ、様々な材料、例えばガラス、金属またはプラスチックの棒である。同じ材料の円形のスパチュラも適している。直径0.4〜0.8ｃｍのガラスの棒またはプラスチック・スパチュラを用いることが好ましい。ガラスピペットのマウスピース、例えば5ｍｌ ガラスピペットも、都合良く用いることができる。微生物の改善した剥離のために皮膚の表面に比較的丸い棒を用いることが特に適当である。
【０１３１】
粗い表面のプラスチック・スパチュラ、例えばガラス−ファイバー−強化ポリアミドのサンプリング用スパチュラ（Merck, Art. No. 231J2412、二重スパチュラ、長さ180 mm）は、特に適している。綿棒で擦り、比較的粘性の媒体で軽く叩くことによりサンプリングし、または接着膜（例えば、商業的に利用可能な家庭用接着テープ）で皮膚サンプリングすることもまた、本発明の目的に適当である。これらの方法を用いて、例えば、適切な緩衝溶液で洗い流すことにより微生物を入手することが可能である。他の方法としては、接着テープ自体上でも行うことができる。
【０１３２】
本発明のもう１つの好ましい態様にて、ｉ）エタノール、アセトンおよびエタノール／酢酸混合液からなる群から選択される好ましい変性試薬、ｉｉ）ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される好ましい架橋試薬、またはｉｉｉ）熱固定、により固定を行うことができる。
１つの好ましい態様にて、固定後、微生物を担体上に固定化することができる。
具体的に好ましい態様にて、微生物の固定した細胞を、本発明の方法の工程ｃ）前に透過性にすることができる。
【０１３３】
本発明にて、「透過性にする」とは、細胞を酵素的に処理することと解される。この処理は、菌類およびグラム陽性細菌の細胞壁をオリゴヌクレオチドに対し透過性にする。この処理のために適切な酵素、その適切な濃度および適切な溶媒が、専門家に知られている。本発明の方法は、もちろんグラム陰性細菌の分析にも適している；その時、透過性にするための酵素的処理は、適宜適合され、あるいは完全になくてもよい。
【０１３４】
ハイブリダイゼーション前に透過性にした細胞は、オリゴヌクレオチドを細胞内に透過することは可能であるが、リボソームおよびそのｒＲＮＡを細胞から除くことはできないという利点を有する。全細胞ハイブリダイゼーションのこの技術の主な利点は、細菌の形態が原型のまま残り、これらの原型の細菌をインサイチュウ（in situ）、すなわちそれらの自然な環境にて検出することができることである。従って、細菌の定量のみでなく、様々な細菌群のつながりも検出することができる。
【０１３５】
最も具体的な好ましい態様にて、透過性にすることは、細胞壁溶解酵素（cell-wall-lytic enzyme）、好ましくはリゾチーム（lysozyme）、リソスタフィン（lysostaphin）、プロテイナーゼＫ（proteinase K）、プロナーゼ（pronase）およびムタノリシン（mutanolysin）からなる群から望ましく選択される酵素を用いた部分分解により行うことができる。
【０１３６】
さらに、具体的な好まし態様にて、本発明は、陽性対照として適切なオリゴヌクレオチドを供する。このオリゴヌクレオチドは、分析した試料中に存在する多くの、任意にはすべての細菌または原核生物を検出することを特徴とする。例えば、オリゴヌクレオチド EUB338（細菌）は、Amann et al.（1990）に記載されており、オリゴヌクレオチド EUK（原核生物）は、この方法に適している。このような陽性対照を、適用した方法が適切に行われるかどうかをモニターするために用いることができる。しかし、とりわけ、測定された全体としての細菌集団内に特異的に検出される微生物の割合を決定することが可能である。
【０１３７】
本発明はまた、皮膚上の微生物を検出および／または定量するためのキットの使用に関する。故に、キットの使用、より具体的には本発明の方法におけるキットの使用は、活性物質の探索、皮膚ミクロフローラの分析、および活性物質を含む化粧品の効果試験にて有用である。ヒト皮膚および動物皮膚の直接的な分析、またはそれらから採取した試料における分析は両方とも、他の微生物の高いバックグラウンドに対してさえ、本発明のキットを用いて効率的に行うことができる。
【０１３８】
以下の実施例は、例示の目的で記載されており、いかなる場合にも本発明を制限するものではない。
【０１３９】
［実施例］
皮膚菌の微生物の検出
サンプリング
サンプリングは洗浄剤による洗浄法により行った（P. Williamson, A.M. Kligman（1965）, J. Invest. Derm., Vol. 45, No. 6）。
手順：
1.  両端が開いているプラスチック・シリンダーを、調査する皮膚表面上にその損傷のない末端を押さえつけ、1.5 mlの洗浄溶液（0.523 KH2PO4 g／liter、16.73 K2HPO4 g／liter、8.50 NaCl g／liter、10.00 トゥイーン 80 g／literおよび1.00 トリプトン g／literを含む、pH 8.0の生理的トゥイーン緩衝溶液）を充填した。
2.  上述の掻爬用器具の１つを用いて、処理する範囲を、その6×横および6×縦を軽い圧力で擦った。
3.  吸引下で液体を除いた後、その手順を繰り返した。
【０１４０】
２つの液体を混合した。２つの混合した液体試料の一部を、次のオリゴヌクレオチドを用いた検出に用いた；他の一部を、試料中に存在する微生物の培養による同時の検出に用いた（対照として用いるための）。
洗浄溶液の調製には、無菌水（例えば、ミリポア水）を用いなければならない。
【０１４１】
固定処理
その後、１容量の純エタノールを、採取した試料に添加し、次に遠心した（室温、8,000 r.p.m、５分）。上清の液体を廃棄し、ペレットを１容量の1×PBS溶液中にて洗浄した。最後に、ペレットを1／10容量の固定溶液（50％ エタノール）に再懸濁し、さらに用いるまで−20℃で保存した。
細胞懸濁液のアリコートを、顕微鏡用スライドに塗布し、乾燥した（46℃、30分。または十分に乾燥するまで）。その後、細胞を、もう１つの固定溶液（純エタノール）を塗布することにより十分に脱水状態にし、乾燥した（46℃、3分。または十分に乾燥するまで）。
【０１４２】
透過処理（透過性化）
その後、適当な容量の適当な酵素溶液を塗布し、試料をインキュベートした（室温で、１５分）。この工程を、他の適当な酵素溶液で任意に繰り返した。
透過処理液（透過性化液）を蒸留水で取り除き、試料を再び十分に乾燥した（十分に乾燥するまで４６℃でインキュベーション）。その後、細胞を、固定液（純エタノール）を塗布することにより十分に再脱水し、乾燥した（46℃、3分。または十分に乾燥するまで）。
【０１４３】
ハイブリダイゼーション
その後、検出する微生物に特異的な上述のオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション溶液を固定し、完全に消化し脱水した細胞に適用した。その後、スライドを、ハイブリダイゼーション溶液で湿らせたチャンバー内に置いた（46℃で90分間、ヌクレオチドなしで）。
【０１４４】
洗浄
その後、顕微鏡用スライドを、洗浄溶液を充満したチャンバー内に置き、インキュベートした（46℃、15分）。
その後、スライドを、蒸留水を充満したチャンバーに短期間浸し側面位から空気乾燥した（46℃、30分。または十分に乾燥するまで）。
【０１４５】
検出
その後、標本ホルダーを適切な包埋媒質中に包埋した。その後、試料を、蛍光顕微鏡を用いて分析した。
【０１４６】
分析結果
1.  上述のサンプリング方法を用いて、混合皮膚の女性ボランティアの前額部から微生物試料を採取した（typized by a cosmetician and confirmed by sebometer measurements）。
蛍光シグナルを計測し、結果を全細胞数と比較することにより、プロピオニ細菌の非常に高い割合を測定した（＞90％）。スタフィロコッカスの低い割合を、発見した（＜１０％）。コリネ細菌は発見されなかった。
【０１４７】
2.   微生物試料を、上述のサンプリング方法により他の女性ボランティアの皮膚から採取した。
微生物の16 S ｒＲＮＡ遺伝子を、試料の一部から単離した。その後の配列決定が、配列が新規の配列であるが、コリネバクテリウム属に属しうる微生物であることを示した。この配列は、開発されたこの微生物を検出できる相当するプローブ（配列番号：２１）に基づき、配列プロトコール中の配列番号：３１を示した。
【０１４８】
試料の他の部分を、皮膚関連コリネ細菌を検出するために、前述の細菌特異的プローブEUBおよび混合プローブ（配列番号：０７〜１１）とハイブリダイズした。
蛍光シグナルを計測し、結果を細菌特異的プローブにより測定した全細胞数と比較することにより、コリネ細菌の高割合を測定した（約73％）。
【０１４９】
配列番号：２１の標識したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたこの試料のコリネ細菌の低い割合（約５％）を、同時に競合物質として標識していない配列番号：２２のオリゴヌクレオチドを用いて、蛍光シグナルを計測し、結果を前述の検出したコリネ細菌数と比較して測定した。
【配列表】
2005532818.tif 000004
2005532818.tif 000005
2005532818.tif 000006
2005532818.tif 000007
2005532818.tif 000008
2005532818.tif 000009
2005532818.tif 000010
2005532818.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月18日(2005.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005532818000001.app
【国際調査報告】
2005532818.tif 000012
2005532818.tif 000013
2005532818.tif 000014
2005532818.tif 000015
2005532818.tif 000016
2005532818.tif 000017
2005532818.tif 000018
2005532818.tif 000019
2005532818.tif 000020
2005532818.tif 000021