(57)【要約】単糖類および二糖類および三糖類に結合した芳香性成分基を含む少なくとも１つの水溶性グリコシドをホップ球果以外のホップ植物部分から単離することが開示される。ホップ植物の葉を水性アルコールで抽出することによって製造されるグリコシド調製物は、グリコシド調製物が添加されたビールに快いブドウ風味をもたらすことが発見された。水性アルコール抽出されたホップ植物葉から製造されたグリコシド調製物のグリコシド組成は、ホップ球果から製造された同様な調製物と異なることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されたケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体を製造する方法であって、
（ａ）ホップ球果以外のホップ植物部分を水性アルコールで抽出して、極性の水溶性化合物を含有する抽出物を製造する工程、
（ｂ）抽出物中における前記の極性の水溶性化合物を濃縮する工程、および
（ｃ）前記の濃縮された抽出物におけるケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体を精製して、精製されたケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体を得る工程
を含む方法。
【請求項２】
ホップ植物部分が、葉および茎からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
ホップ植物部分が、新鮮葉、凍結葉、乾燥葉および使用済み葉からなる群から選択される葉である、請求項２の方法。
【請求項４】
ホップ植物がカスケードホップ植物である、請求項１の方法。
【請求項５】
ホップエッセンス前駆体またはフレイバラント前駆体が少なくとも１つのグリコシドを含有する、請求項１の方法。
【請求項６】
請求項１の方法によって製造される、ケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体の調製物。
【請求項７】
ホップオイル、イソ−α−酸類、ジヒドロイソ−α−酸類、テトラヒドロイソ−α−酸類およびヘキサヒドロイソ−α−酸類、ホップ球果のエッセンスおよびフレイバラント、またはホップ球果のエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体からなる群から選択される少なくとも１つのホップ画分をさらに含有するように改変された請求項６の調製物。
【請求項８】
前駆体中のグリコシドの加水分解がブドウ風味の展開と相関する、請求項６の調製物。
【請求項９】
精製工程が、
（ａ）ポリマー樹脂、活性炭、分子ふるい、シリカゲル、誘導体化シリカゲル、セルロースおよび誘導体化セルロースからなる群から選択される充填物質を有する液体クロマトグラフィーカラムに抽出物を供給し、それにより、少なくとも１つのケトルホップエッセンス前駆体またはフレイバラント前駆体が充填物質に保持される工程、
（ｂ）前記のケトルホップエッセンス前駆体またはフレイバラント前駆体を前記充填物質から溶出して、これらの化合物を含有する溶出物を得る工程、および  （ｃ）溶出物中の前記化合物を蒸発によってさらに濃縮する工程
によって達成される、請求項１の方法。
【請求項１０】
請求項６の前駆体からホップエッセンスおよびフレイバラントを調製する方法であって、アグリコン成分と糖成分との間のグリコシド結合を切断することによってグリコシドの少なくとも一部をアグリコンに変換する工程を含む方法。
【請求項１１】
変換工程が、グリコシド結合の破壊を触媒し得る酵素によって触媒される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
変換工程が、酵母およびモデル麦芽汁緩衝液の存在下での発酵によって達成される、請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記麦芽汁緩衝液が少なくとも１つの糖をさらに含有する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
変換工程が、発酵に先立って酵母および麦芽汁を含有する発酵液に前駆体を加えることによって行われる、請求項１０の方法。
【請求項１５】
請求項１０の方法によって製造される、ホップエッセンスおよびフレイバラントの調製物。
【請求項１６】
ホップオイル、イソ−α−酸類、ジヒドロイソ−α−酸類、テトラヒドロイソ−α−酸類、およびヘキサヒドロイソ−α−酸類、ホップ球果のエッセンスまたはフレイバラント、およびホップ球果のエッセンス前駆体またはフレイバラント前駆体からなる群から選択される少なくとも１つのホップ画分をさらに含有するように改変された、請求項１５の調製物。
【請求項１７】
ケトルホップ風味の飲料物を製造する方法であって、
（ａ）請求項１５の調製物を、所望するレベルの風味をもたらすために十分な量で飲料物媒質と混合する工程
を含む方法。
【請求項１８】
前記飲料物媒質が非アルコール飲料物である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記飲料物媒質が発酵可能な媒質である、請求項１７の方法。
【請求項２０】
請求項１５の調製物が発酵後に添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ケトルホップ風味の飲料物を製造する方法であって、
（ａ）請求項６の前駆体を、所望するレベルの風味をもたらすために十分な量で、発酵可能な飲料物媒質に添加する工程
を含む方法。
【請求項２２】
前記前駆体が発酵前に添加される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記媒質を発酵させる工程をさらに含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記前駆体が発酵工程の後に添加される、請求項２１の方法。
【請求項２５】
請求項１７の方法によって調製されるケトルホップ風味の飲料物。
【請求項２６】
ブドウ風味を有する、請求項２５の飲料物。
【請求項２７】
請求項２１の方法によって調製されるケトルホップ風味の飲料物。
【請求項２８】
ブドウ風味を有する、請求項２７の飲料物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
該当出願なし
【０００２】
（連邦政府により援助を受けた研究に関する記述）
該当研究なし
【０００３】
（発明の背景）
醸造において使用されるホップ類は、最終製品に、主として苦みを加え、ホップ風味（例えば、味や香り）を与える。ホップ植物の果実（球果）に由来するホップは、軟質樹脂、硬質樹脂、ホップオイル、ワックス、脂質および炭水化物から構成される。軟質樹脂はα−酸類およびβ−酸類からなる。軟質樹脂およびホップオイルの画分は、有機溶媒によって、または液体ＣＯ2もしくは超臨界ＣＯ2によって抽出可能である。従来の醸造では、α−酸類は、苦み味の原因であるイソα−酸類に変換される。ビールにおけるホップ風味の特徴をいかに最もよく説明するかに関する意見は一致していないが、ホップ風味（またはケトルホップ風味）がビールの全体的な感覚的インパクトの本質的一面であることが広く認識されている。
【０００４】
米国特許出願第08/838,217号（これは参照して本明細書の記載の一部とする）には、単糖または二糖または三糖に結合した芳香性化合物を含む水溶性グリコシドがホップまたはホップ固形物から抽出され得ることが開示された。そのようにして得られるホップグリコシドは、エッセンスおよびフレイバラントの前駆体であり、ビールに風味をつけるために使用することができる。グリコシドのグリコシド結合の加水分解はアグリコンおよび遊離糖の生成をもたらす。ビールなどの飲料物に風味をもたらすことを助けるのは、このような揮発性の芳香性化合物である。グリコシドをその構成成分のアグリコンおよび糖に変換することは、酸加水分解によって化学的に、または特異的なグリコシダーゼの作用により酵素的に、または酵母などの細胞全体の生物触媒を使用して発酵的に達成することができる。芳香性アグリコンは、発酵後、風味を与えるためにホップ未添加のビールに添加することができる。これらのケトルホップエッセンスおよびフレイバラントの使用は、醸造プロセスに対する経済性、効率、一貫性、柔軟性、簡便性および品質をもたらす。
【０００５】
ビールに風味をつけるための添加剤として使用されるフレイバラントの供給源としてのホップ球果からホップグリコシドの風味前駆体を単離することは、先行技術を上回る改善であった。しかしながら、醸造プロセスにおけるさらなる改善が引き続き求められている。
【０００６】
従来、醸造において使用されるホップ類はホップ植物の果実またはホップ球果に由来し、ホップ植物の葉および茎は捨てられている。しかしながら、醸造におけるホップ球果の使用には欠点がいくつかある。ホップ植物の球果には、過度な苦み味をビールに間接的にもたらし得るある種のホップ樹脂が含有される。ホップ樹脂の誘導体は、光にさらされたときに分解を受けやすく、その結果、そのような化合物を含むビールまたは同様な飲料物に、望ましくない風味を与える化合物が形成される。従って、ホップ樹脂を含有するビールは、時間とともに、特に、ビールが光にさらされた場合に、気が抜けやすくなるか、または望ましくない風味を発しやすくなる。
【０００７】
醸造業界では、先行技術の方法を上回る改善された効率、コスト削減および加工上の利点をもたらすか、または望ましい特性、例えば、改善された味、低下した光感受性、もしくは延びた保存安定性などを有する製造物をもたらす新しい方法を開発することが引き続き注目されている。
【０００８】
この分野で求められているものは、樹脂を実質的に含まないホップ植物部分からホップグリコシドを単離する方法である。
【０００９】
（発明の簡単な要約）
本発明者らは、ケトルホップ風味のエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体が、ホップ植物の葉および茎を含む、ホップ球果以外のホップ植物部分から、受け入れられるほどの収率で、そしてホップ樹脂を実質的に含まず単離され得ることを発見した。
【００１０】
本発明の１つの態様により、ホップの葉または茎から調製されるケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体、そしてそのような前駆体調製物の製造方法が提供される。この場合、その製造方法は、ホップ植物の葉または茎を水性アルコールで抽出して、極性の水溶性化合物を含有する抽出物を製造する工程、抽出物中における前記の極性の水溶性化合物を濃縮する工程、および前記の濃縮された抽出物におけるケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体を精製する工程を含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、ケトルホップのエッセンス調製物およびフレイバラント調製物であり、そして該ケトルホップのエッセンス調製物およびフレイバラント調製物を本発明のケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体から調製する方法である。この場合、その方法は、前記前駆体中のグリコシドの少なくとも一部のアグリコン成分と糖成分との間のグリコシド結合の加水分解を生じさせるために好適な条件のもとで前記前駆体を処理する工程を含む。
【００１２】
場合により、本発明のケトルホップエッセンス調製物およびフレイバラント調製物は、ホップオイル、イソ−α−酸類、ジヒドロイソ−α−酸類、テトラヒドロイソ−α−酸類およびヘキサヒドロイソ−α−酸類から選択される少なくとも１つのホップ画分を調製物に加えることによって改変することができる。本発明のケトルホップエッセンス調製物およびフレイバラント調製物は、ホップ球果に由来するケトルホップエッセンスおよびフレイバラントを調製物に加えることによって改変することができる。
【００１３】
本発明には、ケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体と、発酵可能な増殖培地（媒質）とを使用してケトルホップ風味の飲料物を製造する方法で、本発明のケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体を発酵前の培地に添加する工程を含む方法が含まれる。
【００１４】
本発明には、球果以外のホップ植物部分から単離されたエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体に由来するケトルホップエッセンス調製物およびフレイバラント調製物で風味づけられた飲料物、そしてそのような飲料物を製造する方法であって、所望する強さおよび特徴の風味を達成するために十分な量で調製物を飲料物に添加することを含む方法が含まれる。発酵可能な増殖培地から調製される飲料物の場合、フレイバラント調製物が、好ましくは、培地を発酵させた後に添加される。
【００１５】
場合により、本発明の飲料物は、ホップオイル、α−酸類、イソ−α−酸類、ジヒドロイソ−α−酸類、テトラヒドロイソ−α−酸類およびヘキサヒドロイソ−α−酸類、またはホップ球果に由来するフレイバラントから選択される少なくとも１つのホップ画分をさらに含むように改変されたケトルホップエッセンスおよびフレイバラントを使用して調製することができる。
【００１６】
ホップ球果以外のホップ植物部分が、ケトルホップエッセンスおよびフレイバラントを調製するために使用されることを可能にする方法を提供することは本発明の目的の１つである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、ホップ植物の葉もしくは茎から抽出されたフレイバラント前駆体で、または本発明のエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体に存在するグリコシドの少なくとも一部を加水分解および／もしくは発酵することによって調製されたケトルホップエッセンスおよびフレイバラントで風味づけられた発酵飲料物を調製する方法を提供することである。
【００１８】
ホップ植物あたりの精製されたケトルホップエッセンスおよびフレイバラントの収量が増大することは本発明の利点の１つである。
【００１９】
本発明のエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体が調製されるホップの茎および葉が、発酵飲料物の過度な苦み味、質の悪い風味、および気が抜けることの一因になり得る樹脂を本質的に全く含有しないことはさらなる利点である。
【００２０】
ケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体が、発酵飲料物を調製するための発酵前に発酵可能な飲料物媒質に添加されることはさらなる利点である。
【００２１】
ホップ植物の葉および茎を使用することによって、ホップオイルおよび樹脂を除くために使用される有機溶媒または液体／超臨界ＣＯ2でホップを抽出しなければならないことが除かれることは好都合であり、これにより、精製プロセスが簡略化される。
【００２２】
本発明の別の利点は、ホップ植物の茎および葉から単離された前駆体から調製されるホップエッセンスおよびフレイバラントが、ホップ球果に由来するホップエッセンスおよびフレイバラントによってもたらされるのとは異なる望ましい風味を、ホップエッセンスおよびフレイバラントを含む発酵飲料物にもたらし得るということである。
【００２３】
本発明の方法により、通常的には捨てられる葉および茎を使用することによってホップフレイバラント前駆体の収率が増大することはさらなる利点である。
【００２４】
本発明の他の目的、特徴および利点は、本明細書、図面および請求の範囲を検討することから明らかになるであろう。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
従来、ビール用の風味剤は、ホップ球果全体を含むホップ固形物、または二酸化炭素（液体もしくは超臨界）もしくはヘキサンなどの非極性の無機溶媒もしくは有機溶媒で抽出されたホップ球果から調製されるホップペレット、または二酸化炭素（液体もしくは超臨界）もしくはヘキサンなどの非極性の無機溶媒もしくは有機溶媒で抽出されたホップ球果から調製されるホップ抽出物を使用して調製されている。本発明は、球果以外のホップ植物部分からケトルホップエッセンスおよびフレイバラントを単離することを可能にする。
【００２６】
植物では、様々なグリコシドが特定の機能および目的のために貯蔵される。グリコシドまたは複合糖質は、単糖類（主としてグルコース）、二糖類、三糖類および／またはより長鎖の多糖類に対するグリコシド結合を有する様々な有機化合物からなる複雑な炭水化物の１つのクラスを構成する。これらの分子の有機非炭水化物成分（これはアグリコンと呼ばれる）は、グリコシド結合を破壊する生物学的反応または化学的反応によって遊離され得る。ある種のアグリコンは芳香性である可能性を有する。果実の風味特徴の多くは、芳香性成分を含むグリコシドにおけるグリコシド結合の加水分解により形成される芳香性アグリコンが存在するためである。
【００２７】
「エッセンス」により、嗅覚によって感知することができる化合物が意味され、「フレイバラント」により、その芳香および味覚によって感知することができる化合物が意味される。
【００２８】
実施例には、ケトルホップエッセンス前駆体またはフレイバラント前駆体が、ホップ植物の葉から、具体的には凍結葉または新鮮なカスケードホップ葉から、受け入れられるほどの収率で精製されることが明らかにされる。本発明の方法はまた、乾燥葉から、または「使用済み」の葉（例えば、非極性の無機溶媒または有機溶媒で以前に抽出された葉）からケトルホップエッセンス前駆体またはフレイバラント前駆体を精製するために用いられ得ることを理解しなければならない。当然のことではあるが、本発明の方法は、茎を含む、ホップ球果以外の任意のホップ植物部分を使用して実施され得ることが考えられる。任意のホップ植物種または品種が本発明の実施において使用され得ることが当然のこととして考えられるので、本発明はカスケードホップ植物に限定されない。
【００２９】
実施例に記載されるように、カスケードホップの葉から得られるエッセンスおよびフレイバラントは、非常に果実様の芳香、そしてブドウの強い芳香および風味を有する。本発明の方法を使用して、異なる様々な植物からホップエッセンスおよびフレイバラントを得ることが可能であること、そしてこれらのエッセンスおよびフレイバラントが、カスケードホップ植物から単離されたエッセンスおよびフレイバラントの風味プロフィルとは異なる風味プロフィルを有し得ることが理解されるはずである。
【００３０】
実施例では、ケトルホップエッセンス前駆体またはフレイバラント前駆体が、８０％のメタノールを含む水溶液の過剰量を使用してホップ葉から抽出された。当業者は、エタノールを含む他の低分子量アルコールが、抽出溶液におけるアルコールの様々な濃度と同様に、本発明を実施するために同等に好適であることを理解するであろう。
【００３１】
好ましくは、ホップ成分（茎、葉、または球果以外の部分）対水性アルコールの比率は１：１〜１：１００（ｗ／ｖ）である。水性アルコールが０．１％〜１００％（ｖ／ｖ）の水を含有すること、そしてアルコールがメタノールまたはエタノールであることもまた好ましい。より好ましくは、アルコールは約２０％〜約８０％（ｖ／ｖ）の範囲内である。好ましくは、濃縮工程は蒸発によって達成される。
【００３２】
精製工程は、好ましくは、（ａ）ポリマー樹脂、活性炭、分子ふるい、シリカゲル、誘導体化シリカゲル、セルロースおよび誘導体化セルロースからなる群から選択される充填物質を有する液体クロマトグラフィーカラムに抽出物を供給し、それにより、ケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体が充填物質に保持される工程、（ｂ）ケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体を充填物質から溶出して、前駆体を含有する溶出物を得る工程、および（ｃ）溶出物中の前駆体を蒸発によってさらに濃縮する工程によって達成される。
【００３３】
精製工程はまた、（ａ）ろ過、逆浸透、限外ろ過、サイズ排除、透析、電気透析および浸透からなる群から選択される膜プロセスに抽出物を供給し、それにより、ケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体が濃縮画分に保持される工程、および（ｂ）濃縮画分中の化合物を蒸発によってさらに濃縮する工程によって達成され得る。
【００３４】
好ましくは、上記の精製工程により、遊離した炭水化物および無機塩の少なくとも一部を抽出物から除去することができる。
【００３５】
本発明のエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体は、飲料物に風味をつけるために直接的または間接的に使用することができる。風味を生じさせるために、エッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体に存在するグリコシドは、エッセンスおよび風味に主に関与する芳香性化合物を生じさせるために加水分解しなければならない。エッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体は、風味が酵母の酵素による改変でもたらされるので、発酵前の発酵可能な飲料物（例えば、ビール、ワインまたはサイダー）に添加することができる。
【００３６】
好ましくは、前駆体は、飲料物に添加される前にエッセンスおよびフレイバラントに変換される。下記の実施例では、この変換は、モデル麦芽汁（糖含有または糖非含有）における酵母発酵液に前駆体を添加することによって達成された。このモデル麦芽汁における発酵により製造されたフレイバラントは、次に、発酵可能な飲料物または非発酵性飲料物のいずれかに風味をつけるために使用することができる。
【００３７】
あるいは、前駆体は、グリコシド結合の酸加水分解または酵素的加水分解によるアグリコンの放出を達成するために処理することができ、そしてそのようにして製造されたフレイバラントは、さらなる発酵を伴うか、またはさらなる発酵を伴うことなく、飲料物に風味をつけるために使用することができる。これにより、フレイバラントを非発酵飲料物（水およびソーダ水など）において使用することができる。ワインまたはビールなどの発酵飲料物にフレイバラントを発酵後に添加するという選択肢は、これらの飲料物の製造において、より大きい柔軟性を提供する。
【００３８】
ケトルホップエッセンスおよびフレイバラントをホップ未添加のビールに添加することによってビールに風味をつけたい場合には、最初に、アグリコンに対する糖成分の結合を破壊することによって、ケトルホップのエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体に存在するグリコシドの少なくとも一部をアグリコンに変換することができる。そのような変換工程は、糖成分とアグリコンとが結合するグリコシド結合を加水分解するその能力について選択される酵素で前駆体を処理することによって達成することができる。米国特許出願第08/832,217号に広範囲に議論されているように、変換はまた、酵母およびモデル麦芽汁の存在下での発酵によって、または酵母および麦芽汁の存在下での発酵によって、または酸加水分解によって、またはグリコシド結合を加水分解するための任意の他の好適な方法によって達成することができる。
【００３９】
下記の実施例により明らかにされるように、本発明のエッセンスおよびフレイバラントは、糖の存在下または非存在下におけるモデル麦芽汁での発酵液にフレイバラント前駆体を含めることによって製造することができる。より強い風味が、糖を補充しなかったモデル麦芽汁緩衝液で得られることが認められた。
【００４０】
ケトルホップ風味は、おそらくは単一の化合物のためでなはく、むしろ、芳香性物質および非芳香性物質の混合物に依存することがこの分野では認識されている。それぞれの化合物が、ビールではそれ自身の風味閾値レベルを有する。低濃度で存在する多数の風味付与化合物がケトルホップ風味の原因となるので、化学分析は非常に困難である。従って、濃縮および分画化の組合せ、官能分析および化学分析、風味付与前駆体および風味付与化合物の直接的および間接的な特徴づけが必要である。
【００４１】
化学分析を補完するために、日常的な官能分析が、単純な糖、選択されたホップ成分、酵母、無機塩および水を有する確立された発酵系におけるケトルホップ風味を特定するために使用された。実際の麦芽汁ではなく、モデル麦芽汁において単純な糖を使用することにより、系が単純化され、そして、より意味のある比較をケトルホップ風味調製物間で行うことが可能になる。
【００４２】
ホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体を単離するために、ホップ植物部分の水性アルコール抽出物が濃縮され、そして調製的な液体カラムクロマトグラフィーによって部分精製された。ポリビニル樹脂またはアンバーライトＸＡＤ−２（スチレン−ジビニルベンゼン）を充填したカラムが、抽出物を濃縮／精製するために使用された。これらの樹脂は水溶液から極性化合物を保持することができ、一方で、遊離のアグリコンまたはグリコシド分解産物などの非極性化合物を除くことができる。
【００４３】
一般に、ホップ植物部分の水性抽出部の濃縮および精製は、（１）ポリマー吸着材、例えば、Ｒｏｈｍ＆Ｈａｓｓから得られるアンバーライトＸＡＤシリーズの樹脂（ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６など）、（２）炭化水素で誘導体化されたシリカゲル（Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−１８など）、（３）活性炭、および（４）セルロースなどの物質を使用して、そして同様に、逆浸透、限外ろ過、サイズ排除およびその他などの膜プロセスを使用して達成することができる。水性アルコール抽出と上記方法のいずれかとの組合せを使用して、ホップ植物部分に存在する極性の水溶性のケトルホップエッセンス前駆体およびフレイバラント前駆体の濃度をかなり増大させることができる。上記の精製方法により、遊離の炭水化物および無機塩の少なくとも一部がホップ植物部分の水性アルコール抽出物から除去され得ることが理解される。
【００４４】
カラムに保持された極性化合物はアルコールによって溶出させることができ、そして溶出液は蒸発によって濃縮され、ＸＡＤ−２画分と呼ばれる濃縮物を得ることができる。完全に加水分解されたＸＡＤ−２画分の炭水化物組成分析を、高感度なパルス電流測定検出器（電気化学（ＥＣ）検出器）を備えたイオン交換ＨＰＬＣを用いて行うことができる。完全に加水分解されたＸＡＤ−２画分は、グルコース、そしてガラクトース、フコース、グルコサミンおよびガラクトサミンなどの微量成分、そしてアグリコンから構成され得る。このことは、ＸＡＤ−２画分は主としてグリコシドからなることを示し得る。
【００４５】
グリコシドの不揮発性（多数のＯＨ基）のために、逆相Ｃ−１８のＬＣ／エレクトロスプレーＭＳ技術を、ＸＡＤ−２画分におけるグリコシドの直接的な分析のために使用することができる。様々なグリコシド化合物をこの方法により同定することができる。
【００４６】
また、グリコシドの不揮発性（多数のＯＨ基）のために、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）誘導体化ＧＣ／ＭＳ技術を、ＸＡＤ−２画分におけるすべての完全なグリコシドを分析するために使用することができる。様々なグリコシド化合物をこの方法により同定することができる。
【００４７】
アンバーライトＸＡＤ−２（ポリビニル樹脂）に加えて、活性炭、逆相シリカゲル（Ｃ−１８、Ｃ−２、ＮＨ２）、セファデックスおよびセルロースもまた、ホップ植物部分の水性アルコール抽出物を濃縮および分画化するために使用することができる。
【００４８】
ＸＡＤ−２画分の発酵のために用いられる条件は、従来のビール発酵において使用される条件とは少し異なった。無機塩を含有するか、または無機塩およびグルコース（０．１１ｇ／ｍｌ）を含有するモデル麦芽汁緩衝液溶液が、実際の麦芽汁の代わりに使用された。これは、実際の麦芽汁の風味は複雑であるので、ホップ植物部分の抽出物の特徴づけがより困難になるからである。発酵は１５℃の好気的条件下で行われた。発酵温度は、特に重要であることは見出されなかったが、約１０℃〜約３０℃の範囲内で行うことができる。
【００４９】
モデル麦芽汁での発酵は、鋭い果実様の芳香、ブドウの快く強く甘い芳香、および強いブドウ風味または強いブドウソーダ水風味を有する、直接的で、純粋で、明白なケトルホップ風味を伴う濃縮物をもたらすことが見出された。ホップ植物の葉から調製されたＸＡＤ−２濃縮物を含むモデル麦芽汁発酵物の風味プロフィルは、ＸＡＤ−２画分を伴うことなく発酵が行われたコントロールの風味プロフィルとは異なった。この場合、コントロールでは、少しエステル様の香りとともに、ワイン様で、硫化物様で、そして酵母様であると感知される製造物がもたらされた。麦芽汁緩衝液での発酵物によってもたらされるブドウ風味は、麦芽汁緩衝液＋グルコースでの発酵においてもたらされるブドウ風味よりも強いことが報告された。
【００５０】
ホップ植物の葉から調製されたＸＡＤ−２濃縮物を含む発酵物の風味プロフィルは、ホップ球果に由来する同様に濃縮された抽出物を含む発酵物とは異なった。
【００５１】
さらなる原型となるエッセンスまたはフレイバラントを、上記のエッセンスにホップオイルを加えることによって作り出すことができる。発酵後のエッセンスおよびフレイバラントのこの異なるホップ風味原型物は、濃いホップ風味特性、または後でホップ風味がする特性、または乾いたホップ特性を有する製品を製造するために好適である。さらに、エッセンスまたはフレイバラントは、ホップ球果およびホップ球果以外のホップ植物部分から得られるエッセンスおよびフレイバラントの組合せを含むように改変することができる。
【００５２】
エッセンスおよびフレイバラントをホップ球果以外のホップ植物部分から単離することにより、ビールに風味をつけるために、単独で使用され得るか、または他のホップオイル、エッセンスもしくはフレイバラントとの組合せで使用され得る他にないフレイバラントの発見がもたらされた。これらの精製されたエッセンスおよびフレイバラントを添加することにより、１回の発酵から、他にない風味プロフィルを有する様々なビールを得るための便利な方法が発酵後にもたらされる。
【００５３】
下記の非限定的な実施例は純粋に例示であることが意図される。
【００５４】
（実施例）
ホップ葉の水分含有量の測定
凍結された新鮮なカスケードホップ葉を用いた。ホップ葉サンプルは茎を少し含有したが、主に葉材料からなった。
【００５５】
凍結された新鮮なホップ葉（ＦＨＬ）における葉材料の乾燥重量を測定するために、凍結された新鮮なホップ葉のサンプル（１２３．６ｇ）を実験室で経時的に乾燥した。サンプルの重量を定期的にモニターして、乾燥プロセスを、さらなる重量減少がほとんど生じなくなるまで続けた。約３週間後、サンプルは４１．２ｇ（すなわち、その元の湿重量のほぼ１／３）の重量になった。
【００５６】
凍結ホップ葉の抽出
凍結された新鮮なホップ葉は下記のように抽出された。
凍結された新鮮なホップ葉のサンプル（８．６ｋｇ湿重量、２．９ｋｇの乾燥ホップ葉に等しい）を、４Ｌ容量のブレンダーを使用して粉砕した。それぞれのバッチについて、ブレンダーを８０％の容量に満たし、そして約１Ｌの８０％メタノール／２０％ミリポア水の溶液を、ピューレを得るために入れた。合計で１５Ｌの８０％メタノール水溶液を、葉の粉砕および抽出のために使用した。ピューレをまとめ、抽出のために２時間撹拌しながら混合した。抽出後、混合物を、ブッフナー漏斗およびチーズクロスを使用して真空ろ過した。漏斗内の固形物を１Ｌの８０％メタノール水溶液で洗浄し、そして溶液が出なくなるまで手で押さえた。合計で５個の大きいブッフナー漏斗分の混合物を、合計で２０Ｌの８０％メタノール溶液を抽出工程および洗浄工程で使用して、ろ過し、圧縮した。ろ過された液体抽出物を、ブッフナー漏斗およびワットマン＃５４１ろ紙を使用して真空ろ過した。
【００５７】
合計で１７．０２５Ｌの葉抽出物溶液が得られた。この抽出物の５．９Ｌ部分（１ｋｇの乾燥ホップ葉からの抽出物に等しい）をＸＡＤ法によってさらに処理して、グリコシドを単離および濃縮した。簡単に記載すると、抽出物から、Ｒｏｔｏｖａｐを使用してメタノールを除き、そして濃縮された抽出物を、アンバーライトＸＡＤ−２が充填されたカラムに通し、保持された抽出物をメタノールでカラムから溶出した。溶出された画分からメタノールを除き、グリコシド画分を製造した。グリコシド画分は６００ｍｌ容量に含有された。新鮮なホップ葉のグリコシド画分の１００ｍｌ部分を凍結乾燥して、１．０８ｇの固形物を得た。
【００５８】
ＨＰＬＣグリコシルグルコース分析を、グリコシド濃度を見積もるために抽出物について行い、そして誘導体化ＧＣ／ＭＳを、グリコシド構成成分を決定するために凍結乾燥（ＦＤ）物について行った。使用された両方の方法は確立された方法である。
【００５９】
２組の発酵実験（糖含有または糖非含有）を、風味の展開を評価するために、新鮮ホップ葉の凍結乾燥されたＸＡＤ濃縮物を使用して行った。
【００６０】
糖を含有しないモデル麦芽汁緩衝液における発酵
１．新鮮ホップ葉のＸＡＤ凍結乾燥物（０．４ｍｇ／ｍｌ）、モデル麦芽汁緩衝液および酵母（１億個の細胞／ｍｌ）。
２．コントロール−モデル麦芽汁緩衝液＋酵母（１億個の細胞／ｍｌ）。
３．コントロール−緩衝液のみ
発酵反応（１〜３）を、振とうにより通気しながら１５℃で３日間行った。
【００６１】
グルコースを含有するモデル麦芽汁緩衝液における発酵
４．新鮮ホップ葉のＸＡＤ凍結乾燥物（０．４ｍｇ／ｍｌ）、グルコース（０．１１ｇ／ｍｌ）、モデル麦芽汁緩衝液、および酵母（１２００万個の細胞／ｍｌ）。
５．コントロール−グルコース（０．１１ｇ／ｍｌ）、モデル麦芽汁緩衝液、および酵母（１２００万個の細胞／ｍｌ）。
発酵反応（４〜５）を、通気しながら１５℃で７日間行った。
【００６２】
１Ｌのモデル麦芽汁緩衝液は下記の成分を１Ｌのミリポア水に含有する。
ＫＨ2ＰＯ               １．０３ｇ
ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ      ０．３１ｇ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ2Ｏ     １．４１ｇ
ＮａＣｌ                ０．１１ｇ
(ＮＨ４)2ＳＯ4          １．７９ｇ
揮発分分析のために、上記の発酵サンプルをＣ１８カートリッジ抽出法によって抽出し、ＧＣ／ＭＳＤによって分析した。
【００６３】
結果
ＨＰＬＣグリコシルグルコース分析の結果は表１に示される通りである。ガレナ（Ｇａｌｅｎａ）ホップの固形物（ホップ球果またはペレットを液体／超臨界ＣＯ２または非極性有機溶媒で抽出した後に残留する固体残渣）を使用して得られた結果を、比較のために示す。ＨＰＬＣグリコシルグルコース分析に基づいて、新鮮なホップ葉は、ホップ固形物よりもはるかに少量のグリコシドを含有した。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
表２に、カスケードＦＨＬおよびＭｔ．Ｈｏｏｄホップ固形物における選択されたグリコシドのイオン強度（ＴＦＡ誘導体化ＧＣ／ＭＳ分析の質量フラグメントピーク面積カウントによって測定される）を示す。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
グリコシドの組成がＦＨＬとホップ固形物との間で著しく異なることに留意することは興味深いことである。例えば、ベンジルアルコールグリコシドがＦＨＬには非常に大きい濃度で存在するが、オクタノールグリコシドは検出できず、そしてＴＦＡ誘導体化ＧＣ／ＭＳ分析に基づいた場合、総グリコシドの濃度は、新鮮葉の方が使用済みの球果よりも大きかった。
【００６８】
発酵サンプルの芳香評価結果
５人によって行われた芳香評価の結果を表３および表４にまとめる。
【００６９】
【表３】
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【００７０】
【表４】
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【００７１】
発酵１および発酵４は、非常に快く強く甘いブドウ芳香をもたらした。この芳香の強さは、酵母がＦＨＬ  ＸＡＤ  ＦＤを代謝するようにさせられている糖非含有サンプル（＃１）ではより強いようであった。サンプル＃４では、ホップ固形物に由来するホップグリコシドを用いて調製されるサンプルにおいて典型的に見出されるような、ＦＨＬ  ＸＡＤ  ＦＤによってもたらされる苦み味は全くなかった（サンプル＃１は味覚試験されなかった）。
【００７２】
ＦＨＬから調製された抽出物は、ホップ固形物から調製される抽出物とは著しく異なるグリコシド組成を有する。ＦＨＬまたはホップ固形物を使用する発酵製造物における重要な差異は、ＦＨＬを発酵に含むことにより、非常に強く快いブドウ芳香を有する製造物が得られるが、対照的に、そのようなブドウ芳香は、ホップ固形物を含む発酵物によって生じないということである。現在、この強いブドウ芳香の原因となる化合物は明確には明らかにされていない。
【００７３】
別の重要な知見は、ＦＨＬは、ホップ固形物に由来するグリコシドに特徴的である苦み味をもたらさないということである。
【００７４】
本発明は、例示された実施態様に限定されず、添付された請求項の範囲に含まれるようなすべての改変および変化を包含することが意図とされる。
【国際調査報告】
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