(57)【要約】本発明は、生物学の分野に関する。特に、接合エピトープ数を最少化し免疫原性を高めたワクチンを提供するように、複数のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープペプチドをコードするマルチエピトープ構築物の接合部に選択した組合せのスペーサー核酸を有する最適化されたマルチエピトープワクチンを設計するための方法およびシステムに関する。
2005502320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のエピトープ核酸を有するマルチエピトープ構築物を設計するためのコンピュータ化された方法であって、該方法が、
複数のエピトープ、接合エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入物、および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値を含む複数の入力パラメータをコンピュータシステムのメモリー中に記憶すること、
前記複数のエピトープからエピトープ対のリストを作成すること、
前記少なくとも１つのモチーフ、前記複数の挿入物、および各挿入物に対する前記少なくとも１つのエンハンスメント重み値に基づくアミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを前記各エピトープ対に対して決定すること、および
前記複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列を同定することの各ステップを含み、アミノ酸挿入物の前記少なくとも１つの最適な組合せのそれぞれ１つが２つのエピトープの接合部それぞれに挿入されて、最適化されたマルチエピトープ構築物を提供することを特徴とする方法。
【請求項２】
少なくとも１つの最適な整列を同定する前記ステップが、前記複数のエピトープの整列の順列すべてを評価する徹底的な探索を実施することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの最適な整列を同定する前記ステップが、前記複数のエピトープの整列の順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実施することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの最適な整列を同定する前記ステップが、
前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数が指定値Ｘ未満であるときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべての徹底的な探索を実施すること、および
前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数がＸより大きいかＸに等しいときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実施することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の入力パラメータが挿入物の最大数（ＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）の値をさらに含み、アミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対して決定する前記ステップが各エピトープ対に対して可能な挿入物の各組合せに対する機能値（Ｆ）を計算することを含み、組合せ内の挿入物の数が０からＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓの範囲にあり、前記機能値が、Ｊ＞０のときＦ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊ、Ｊ＝０のときＦ＝２（Ｃ＋Ｎ）なる式（式中、ＣはＣ＋１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、ＮはＮ−１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、Ｊは前記少なくとも１つのモチーフに基づくエピトープ対中での挿入物の組合せそれぞれに対して検出される接合エピトープ数に等しい）に従って計算されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数のエピトープを有するマルチエピトープ構築物を設計するためのコンピュータ化された方法であって、該方法が、
複数のエピトープ、接合エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入物、および各挿入物に対するＣ＋１エンハンスメント重み値、各挿入物に対するＮ−１エンハンスメント重み値、および挿入物の最大数（ＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）を含む複数の入力パラメータをコンピュータシステムのメモリー中に記憶すること、
前記複数のエピトープからエピトープ対のリストを作成すること、
挿入数が０からＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓの範囲にある各エピトープ対に対する挿入物の各組合せに対し、Ｊ＞０のときＦ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊ、Ｊ＝０のときＦ＝２（Ｃ＋Ｎ）なる式（式中、Ｃはフランキングアミノ酸挿入物それぞれのＣ＋１エンハンスメント重み値に等しく、ＮはＮ−１フランキングアミノ酸挿入物それぞれのＮ−１エンハンスメント重み値に等しく、Ｊは前記少なくとも１つのモチーフに基づくエピトープ対中にある挿入物の組合せそれぞれに対して検出される接合エピトープ数に等しい）を用いて機能値（Ｆ）を計算すること、
最大機能値Ｆを与える挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対して決定すること、
挿入物の最適な組合せのリストを作成すること、および
挿入物の最適な組合せの前記リストに基づいて、機能値の最大合計を与える順に整列された前記複数のエピトープを含む前記マルチエピトープ構築物の少なくとも１つの最適な順列を同定することの各ステップを含み、挿入物の前記最適な組合せのそれぞれ１つを前記マルチエピトープ構築物の２つのエピトープの接合部それぞれに挿入することを特徴とする方法。
【請求項７】
少なくとも１つの最適な順列を同定する前記ステップが、前記複数のエピトープの整列の順列すべてを評価する徹底的な探索を実施することを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの最適な順列を同定する前記ステップが、前記複数のエピトープの整列の順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実施することを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の入力パラメータが最大探索時間（ＭａｘＳｅａｒｃｈＴｉｍｅ）の値をさらに含み、前記確率的な探索が前記ＭａｘＳｅａｒｃｈＴｉｍｅ値にほぼ等しい時間実施され、前記少なくとも１つの最適な順列が機能値の最大合計を有すると評価された少なくとも１つの順列を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの最適な順列を同定する前記ステップが、
前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数が指定値Ｘ未満であるときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべての徹底的な探索を実施すること、および
前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数がＸより大きいかＸに等しいときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実施すること
を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
複数のエピトープを有するマルチエピトープ構築物を設計するためのコンピュータシステムであって、
複数のエピトープ、接合エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入物、および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値を含む複数の入力パラメータを記憶するためのメモリー、
前記メモリーから前記入力パラメータを検索し、前記複数のエピトープからエピトープ対のリストを作成し、さらに前記少なくとも１つのモチーフ、前記複数の挿入物、および各挿入物に対する前記少なくとも１つのエンハンスメント重み値に基づくアミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを前記エピトープ対の各々に対して決定し、さらに前記複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列を同定し、アミノ酸挿入物の前記最適な組合せのそれぞれ１つを２つのエピトープの接合部それぞれに挿入し、最適化されたマルチエピトープ構築物を提供するためのプロセッサ、および
前記プロセッサに接続され、前記複数のエピトープの前記少なくとも１つの最適な整列をユーザーに表示するための表示モニターを含むことを特徴とするシステム。
【請求項１２】
前記プロセッサが、前記複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列を同定するときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべてを評価する徹底的な探索を実施して少なくとも１つの最適化されたマルチエピトープ構築物を同定することを特徴とする請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記プロセッサが、前記複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列を同定するときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実施して少なくとも１つの最適化されたマルチエピトープ構築物を同定することを特徴とする請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記プロセッサが、前記複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列を同定するときに、前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数が指定値Ｘ未満であるときは、前記複数のエピトープの整列の順列すべての徹底的な探索を実施し、前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数がＸより大きいかＸに等しいときは、前記複数のエピトープの整列の順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実施することを特徴とする請求項１１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記複数の入力パラメータが挿入物の最大数（ＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）の値をさらに含み、前記プロセッサが、アミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対して決定するときに、各エピトープ対に対して可能な挿入物の各組合せに対する機能値（Ｆ）を計算し、組合せ内の挿入物の数が０からＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓの範囲にあり、前記機能値が、Ｊ＞０のときＦ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊ、Ｊ＝０のときＦ＝２（Ｃ＋Ｎ）なる式（式中、ＣはＣ＋１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、ＮはＮ−１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、Ｊは前記少なくとも１つのモチーフに基づくエピトープ対中にある挿入物の組合せそれぞれに対して検出される接合エピトープ数に等しい）に従って計算されることを特徴とする請求項１１に記載のシステム。
【請求項１６】
複数のエピトープを有する最適化されたマルチエピトープ構築物を設計するためのコンピュータシステムであって、
ユーザーが指定する複数の入力パラメータを入力するための入力装置、
複数のエピトープ、接合エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入物、各挿入物のＣ＋１エンハンスメント重み値、各挿入物のＮ−１エンハンスメント重み値、および挿入物の最大数（ＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）を含む前記複数の入力パラメータを記憶するための、入力装置に接続されたメモリー、
前記メモリーから前記入力パラメータを検索し、前記複数のエピトープからエピトープ対のリストを作成するためのプロセッサ
を含み、
前記プロセッサが、挿入物の数が０からＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓの範囲にある各エピトープ対に対する挿入物の各組合せに対し、Ｊ＞０のときＦ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊ、Ｊ＝０のときＦ＝２（Ｃ＋Ｎ）なる式（式中、Ｃはフランキングアミノ酸挿入物それぞれのＣ＋１エンハンスメント重み値に等しく、ＮはＮ−１フランキングアミノ酸挿入物それぞれのＮ−１エンハンスメント重み値に等しく、Ｊは前記少なくとも１つのモチーフに基づくエピトープ対中にある挿入の組合せそれぞれに対して検出される接合エピトープ数に等しい）を用いて機能値（Ｆ）を計算し、
前記プロセッサが、最大機能値Ｆを与える挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対してさらに決定し、挿入物の最適な組合せのリストを作成し、挿入物の最適な組合せの前記リストに基づいて、機能値の最大合計を与える順に整列された前記複数のエピトープを含む前記マルチエピトープ構築物の少なくとも１つの最適な順列を同定し、挿入物の前記最適な組合せのそれぞれ１つが、前記最適化されたマルチエピトープ構築物の２つのエピトープの接合部それぞれに挿入されたことを特徴とするシステム。
【請求項１７】
複数のエピトープを有するマルチエピトープ構築物を設計するためのコンピュータプログラムを格納するデータ記憶装置であって、コンピュータプログラムが、コンピュータシステムによって実行されるときに、
複数のエピトープ、接合エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入物、および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値を含む複数の入力パラメータをコンピュータシステムのメモリーから検索すること、
前記複数のエピトープからエピトープ対のリストを作成すること
前記少なくとも１つのモチーフ、前記複数の挿入物、および前記各挿入物に対する前記少なくとも１つのエンハンスメント重み値に基づくアミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを前記エピトープ対の各々に対して決定すること、および
前記複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列を同定することの各ステップを含むプロセスを実行し、アミノ酸挿入物の前記少なくとも１つの最適な組合せのそれぞれ１つを２つのエピトープの接合部それぞれに挿入し、最適化されたマルチエピトープ構築物を提供することを特徴とするデータ記憶装置。
【請求項１８】
前記コンピュータプログラムが実行されたときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべてを評価する徹底的な探索を実行して、前記複数のエピトープの前記少なくとも１つの最適な整列を同定することを特徴とする請求項１７に記載のデータ記憶装置。
【請求項１９】
前記コンピュータプログラムが実行されたときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実行して、前記複数のエピトープの前記少なくとも１つの最適な整列を同定することを特徴とする請求項１７に記載のデータ記憶装置。
【請求項２０】
前記コンピュータプログラムが実行されたとき、前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数が指定値Ｘ未満であるときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべてを評価する徹底的な探索を実施し、前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数がＸより大きいかＸに等しいときに、順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実施して、前記複数のエピトープの前記少なくとも１つの最適な整列を同定することを特徴とする請求項１７に記載のデータ記憶装置。
【請求項２１】
前記コンピュータプログラムが実行されたときに、前記コンピュータシステムの前記メモリーから挿入物の最大数（ＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）の値をさらに検索し、アミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対して決定する前記ステップをさらに実行し、前記ステップの実行は各エピトープ対に対して可能な挿入物の各組合せに対する機能値（Ｆ）を計算することによって構成され、組合せ内の挿入物の数が０からＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓの範囲にあり、前記機能値が、Ｊ＞０のときＦ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊ、Ｊ＝０のときＦ＝２（Ｃ＋Ｎ）なる式（式中、ＣはＣ＋１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、ＮはＮ−１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、Ｊは前記少なくとも１つのモチーフに基づくエピトープ対中にある挿入物の組合せそれぞれに対して検出される接合エピトープ数に等しい）に従って計算されることを特徴とする請求項１７に記載のデータ記憶装置。
【請求項２２】
複数のエピトープを有するマルチエピトープ構築物を設計するための装置であって、
複数のエピトープ、接合エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入物および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値を含む複数の入力パラメータをコンピュータシステムのメモリー中に記憶する手段、
前記複数のエピトープからエピトープ対のリストを作成する手段、
前記少なくとも１つのモチーフ、前記複数の挿入物、および各挿入物に対する前記少なくとも１つのエンハンスメント重み値に基づくアミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを前記エピトープ対の各々に対して決定するための手段、および
前記複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列を同定するための手段を含み、アミノ酸挿入物の前記少なくとも１つの最適な組合せのそれぞれ１つを２つのエピトープの接合部それぞれに挿入し、最適化されたマルチエピトープ構築物を提供することを特徴とする装置。
【請求項２３】
少なくとも１つの最適な整列を同定する前記手段が、前記複数のエピトープの整列の順列すべてを評価する徹底的な探索を実施するための手段を含むことを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
少なくとも１つの最適な整列を同定する前記手段が、前記複数のエピトープの整列の順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実施する手段を含むことを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２５】
少なくとも１つの最適な整列を同定する前記手段が、
前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数が指定値Ｘ未満のとき、前記複数のエピトープの整列の順列すべての徹底的な探索を実施するための手段、および
前記マルチエピトープ構築物に入れるべきエピトープの数がＸより大きいかＸに等しいときに、前記複数のエピトープの整列の順列すべてのサブセットのみを評価する確率的な探索を実施するための手段を含むことを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２６】
前記複数の入力パラメータが挿入物の最大数（ＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）の値をさらに含み、アミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対して決定するための前記手段が、各エピトープ対に対して可能な挿入物の各組合せに対する機能値（Ｆ）を計算するための手段を含み、組合せ内の挿入物の数が０からＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓの範囲にあり、前記機能値が、Ｊ＞０のときＦ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊ、Ｊ＝０のときＦ＝２（Ｃ＋Ｎ）なる式（式中、ＣはＣ＋１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、ＮはＮ−１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、Ｊは前記少なくとも１つのモチーフに基づくエピトープ対中にある挿入の組合せそれぞれに対して検出される接合エピトープ数に等しい）に従って計算されることを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２７】
２つ以上のＣＴＬエピトープ核酸を含むマルチエピトープ構築物を設計するための方法であって、該方法が、
（ｉ）ＣＴＬエピトープ核酸を分類して接合エピトープ数を最少化すること、
（ｉｉ）Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｓ、ＣおよびＴからなる群から選択されるフランキングアミノ酸残基をＣＴＬエピトープ核酸のＣ＋１位に導入すること、
（ｉｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸スペーサー残基であって、該スペーサーがＣＴＬまたはＨＴＬ接合エピトープの発生を防止するものを２つのエピトープ核酸の間に導入すること、および
（ｉｖ）最小数の接合エピトープ、最小数のアミノ酸スペーサー残基、および各ＣＴＬエピトープ核酸に対してＣ＋１位にある最大数のＫ、Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｓ、ＣまたはＴを有する１つまたは複数のマルチエピトープ構築物を選択すること
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
２つ以上のＨＴＬエピトープ核酸を含むマルチエピトープ構築物を設計するための方法であって、該方法が、
（ｉ）前記エピトープ核酸を分類して接合エピトープ数を最少化すること、
（ｉｉ）Ｇ、Ｐ、ＮまたはＡからなる群から選択され、前記核酸エピトープの間に配置されるフランキングアミノ酸残基を導入すること、および
（ｉｉｉ）ＨＴＬ接合エピトープの発生を防止する１つまたは複数のアミノ酸スペーサー残基を２つのエピトープ核酸の間に導入すること
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
既知のＨＬＡクラスＩＩ一次アンカー残基ではない残基からスペーサー残基を独立に選択することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
スペーサー残基の導入がＨＴＬエピトープの発生を防止し、さらに、スペーサーがＧ、ＰおよびＮからなる群から独立に選択される少なくとも５つのアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
スペーサーがＧＰＧＰＧであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
スペーサー残基の導入がＨＴＬエピトープの発生を防止し、さらに、スペーサーがＡおよびＧからなる群から独立に選択される少なくともｌ、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸残基であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
ＣＴＬエピトープのＣ＋１位置にフランキング残基を導入することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
フランキング残基がＫ、Ｒ、Ｎ、ＧおよびＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
フランキング残基がスペーサーアミノ酸残基に隣接することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
マルチエピトープ構築物によって含まれるＨＬＡエピトープのＣ末端に隣接するＨＬＡエピトープのＮ末端残基をＫ、Ｒ、Ｎ、ＧおよびＡからなる群から選択される残基で置換することをさらに含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
マルチエピトープ構築物の構造を予測するステップをさらに含み、該選択ステップが、細胞中に導入されたときに、マルチエピトープ構築物中に含まれるエピトープのすべてがＨＬＡプロセシング経路によって産生されるように、ＨＬＡプロセシング経路によってプロセシングを受ける１つまたは複数のマルチエピトープ構築物を選択することをさらに含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１または２７の方法により調製されることを特徴とするマルチエピトープ構築物。
【請求項３９】
複数のＣＴＬエピトープ核酸および複数のスペーサー核酸を含むマルチエピトープ構築物であって、
ＣＴＬエピトープ核酸が約８から約１１アミノ酸長のクラスＩ  ＨＬＡエピトープペプチドをコードし、
スペーサー核酸がＣＴＬエピトープ核酸の間に位置し、
スペーサー核酸が１から８の間のアミノ酸をコードし、
１つまたは複数のスペーサー核酸が、他のスペーサー核酸によってコードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードし、かつ
スペーサー核酸の各々がエピトーププロセシングを最適化し、接合エピトープを最少化する
ことを特徴とするマルチエピトープ構築物。
【請求項４０】
標的核酸をさらに含むことを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項４１】
ＨＴＬ特異的エピトープをコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項４２】
２つ以上のスペーサー核酸が、他のスペーサー核酸によってコードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項４３】
１つまたは複数のスペーサー核酸が、３つの連続したアラニン残基を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項４４】
エピトープペプチドが約９アミノ酸長であることを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項４５】
構築物が、ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ；ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ；ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ；ＧＬＳＲＹＶＡＲＬ；ＹＭＤＤＶＶＬＧＶ；ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ；ＡＬＭＰＬＹＡＣＩ；ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ；ＨＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫ；ＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫ；ＬＶＶＤＦＳＱＦＳＲ；ＮＶＳＩＰＷＴＨＫ；ＳＡＩＣＳＶＶＲＲ；ＫＶＧＮＦＴＧＬＹ；ＱＡＦＴＦＳＰＴＹＫ；ＬＰＳＤＦＦＰＳＶ；ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ；ＴＰＡＲＶＴＧＧＶＦ；ＨＰＡＡＭＰＨＬＬ；ＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹ；ＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹ；ＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹ；ＬＳＬＤＶＳＡＡＦＹ；ＳＷＰＫＦＡＶＰＮＬ；ＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦ；ＥＹＬＶＳＦＧＶＷ；ＫＹＴＳＦＰＷＬＬからなる群から選択されるクラスＩ  ＨＬＡエピトープペプチドをコードする５以上のＣＴＬエピトープ核酸を含むことを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項４６】
構築物が、ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ；ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ；ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ；ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ；ＹＭＤＤＶＶＬＧＶ；ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ；ＨＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫ；ＳＡＩＣＳＶＶＲＲ；ＱＡＦＴＦＳＰＴＹＫ；ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ；ＴＰＡＲＶＴＧＧＶＦ；ＨＰＡＡＭＰＨＬＬ；ＦＰＨＣＬＡＦＳＹＭ；ＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹ；ＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹ；ＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹ；ＬＳＬＤＶＳＡＡＦＹ；ＳＷＰＫＦＡＶＰＮＬ；ＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦ；ＥＹＬＶＳＦＧＶＷ；ＫＹＴＳＦＰＷＬＬからなる群から選択されるクラスＩ  ＨＬＡエピトープペプチドをコードする５つ以上のＣＴＬエピトープ核酸を含むことを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項４７】
構築物が、ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ；ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ；ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ；ＧＬＳＲＹＶＡＲＬ；ＹＭＤＤＶＶＬＧＶ；ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ；ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ；ＨＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫ；ＬＶＶＤＦＳＱＦＳＲ；ＮＶＳＩＰＷＴＨＫ；ＳＡＩＣＳＶＶＲＲ；ＱＡＦＴＦＳＰＴＹＫ；ＬＰＳＤＦＦＰＳＶ；ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ；ＴＰＡＲＶＴＧＧＶＦ；ＨＰＡＡＭＰＨＬＬ；ＦＰＨＣＬＡＦＳＹＭ；ＹＰＡＬＭＰＬＹＡＣＩ；ＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹ；ＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹ；ＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹ；ＡＳＦＣＧＳＰＹ；ＬＳＬＤＶＳＡＡＦＹ；ＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬ；ＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩ；ＳＷＰＫＦＡＶＰＮＬ；ＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦ；ＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦ；ＥＹＬＶＳＦＧＶＷ；ＫＹＴＳＦＰＷＬＬからなる群から選択されるクラスＩ  ＨＬＡエピトープペプチドをコードする５つ以上のＣＴＬエピトープ核酸を含むことを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項４８】
構築物が、ＶＬＡＥＡＭＳＱＶ；ＭＴＮＮＰＰＩＰＶ；ＭＡＳＤＦＮＬＰＰＶ；ＫＬＶＧＫＬＮＷＡ；ＬＶＧＰＴＰＶＮＩ；ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ；ＫＡＡＣＷＷＡＧＩ；ＫＭＩＧＧＩＧＧＦＩ；ＲＡＭＡＳＤＦＮＬ；ＴＬＮＦＰＩＳＰＩ；ＫＬＴＰＬＣＶＴＬ；ＬＬＱＬＴＶＷＧＩ；ＳＬＬＮＡＴＤＩＡＶ；ＬＴＦＧＷＣＦＫＬ；ＡＩＩＲＩＬＱＱＬ；ＲＩＬＱＱＬＬＦＩ；ＱＭＡＶＦＩＨＮＦＫ；ＫＶＹＬＡＷＶＰＡＨＫ；ＫＩＱＮＦＲＶＹＹＲ；ＡＩＦＱＳＳＭＴＫ；ＶＴＩＫＩＧＧＱＬＫ；ＴＴＬＦＣＡＳＤＡＫ；ＶＴＶＹＹＧＶＰＶＷＫ；ＱＶＰＬＲＰＭＴＹＫ；ＶＭＩＶＷＱＶＤＲ；ＱＭＶＨＱＡＩＳＰＲ；ＹＰＬＡＳＬＲＳＬＦ；ＨＰＶＨＡＧＰＩＡ；ＦＰＩＳＰＩＥＴＶ；ＩＰＹＮＰＱＳＱＧＶＶ；ＩＰＩＨＹＣＡＰＡ；ＣＰＫＶＳＦＥＰＩ；ＦＰＶＲＰＱＶＰＬ；ＶＰＬＱＬＰＰＬ；ＥＶＮＩＶＴＤＳＱＹ；ＦＲＤＹＶＤＲＦＹ；ＶＩＹＱＹＭＤＤＬＹ；ＶＴＶＬＤＶＧＤＡＹ；ＩＹＱＥＰＦＫＮＬ；ＰＹＮＴＰＶＦＡＩ；ＴＹＱＩＹＱＥＰＦ；ＹＷＱＡＴＷＩＰＥＷ；ＩＷＧＣＳＧＫＬＩ；ＲＹＬＫＤＱＱＬＬ；ＶＷＫＥＡＴＴＴＬＦ；ＩＹＥＴＹＧＤＴＷ；ＰＹＮＥＷＴＬＥＬ；ＬＬＦＮＩＬＧＧＷＶ；ＦＬＬＬＡＤＡＲＶ；ＹＬＶＡＹＱＡＴＶ；ＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶ；ＤＬＭＧＹＩＰＬＶ；ＷＭＮＲＬＩＡＦＡ；ＶＬＶＧＧＶＬＡＡ；ＨＭＷＮＦＩＳＧＩ；ＩＬＡＧＹＧＡＧＶ；ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ；ＬＬＦＬＬＬＡＤＡ；ＹＬＶＴＲＨＡＤＶ；ＫＴＳＥＲＳＱＰＲ；ＲＬＧＶＲＡＴＲＫ；ＱＬＦＴＦＳＰＲＲ；ＲＭＹＶＧＧＶＥＨＲ；ＬＩＦＣＨＳＫＫＫ；ＧＶＡＧＡＬＶＡＦＫ；ＶＡＧＡＬＶＡＦＫ；ＬＧＦＧＡＹＭＳＫ；ＬＰＧＣＳＦＳＩＦ；ＬＳＡＦＳＬＨＳＹ；ＣＴＣＧＳＳＤＬＹ；ＬＴＤＰＳＨＩＴＡ；ＬＴＣＧＦＡＤＬＭＧＹ；ＬＡＤＧＧＣＳＧＧＡＹ；ＦＷＡＫＨＭＷＮＦ；ＲＭＩＬＭＴＨＦＦ；ＶＭＧＳＳＹＧＦ；ＦＷＡＫＨＭＷＮＦＩ；ＦＭＫＡＶＣＶＥＶ；ＧＬＬＧＶＶＳＴＶ；ＩＬＳＶＳＳＦＬＦＶ；ＱＴＮＦＫＳＬＬＲ；ＧＶＳＥＮＩＦＬＫ；ＬＬＡＣＡＧＬＡＹＫ；ＴＰＹＡＧＥＰＡＰＦ；ＬＰＳＥＮＥＲＧＹ；ＫＹＫＬＡＴＳＶＬ；ＳＦＬＦＶＥＡＬＦ；ＹＦＩＬＶＮＬＬＩ；ＦＬＩＦＦＤＬＦＬＶ；ＶＬＡＧＬＬＧＶＶ；ＶＬＬＧＧＶＧＬＶＬ；ＬＡＣＡＧＬＡＹＫ；ＡＬＦＦＩＩＨＦＮＫ；ＦＩＬＶＮＬＬＩＦＨ；ＬＰＹＧＲＴＮＬ；ＦＶＥＡＬＦＱＥＹ；ＦＱＤＥＥＮＩＧＩＹ；ＦＹＦＩＬＶＮＬＬ；ＫＹＬＶＩＶＦＬＩ；ＧＬＩＭＶＬＳＦＬ；ＫＩＬＳＶＦＦＬＡ；ＶＴＣＧＮＧＩＱＶＲ；ＨＶＬＳＨＮＳＹＥＫ；ＰＳＤＧＫＣＮＬＹ；ＹＹＩＰＨＱＳＳＬ；ＫＦＩＫＳＬＦＨＩＦ；ＶＦＬＩＦＦＤＬＦＬ；ＬＦＨＩＦＤＧＤＮＥＩ；ＹＹＧＫＱＥＮＷＹＳＬ；ＬＹＩＳＦＹＦＩ；ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ；ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ；ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ；ＧＬＳＲＹＶＡＲＬ；ＹＭＤＤＶＶＬＧＶ；ＩＬＲＧＴＳＦＶＹＶ；ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ；ＡＬＭＰＬＹＡＣＩ；ＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶ；ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ；ＨＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫ；ＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫ；ＬＶＶＤＦＳＱＦＳＲ；ＮＶＳＩＰＷＴＨＫ；ＳＡＩＣＳＶＶＲＲ；ＫＶＧＮＦＴＧＬＹ；ＱＡＦＴＦＳＰＴＹＫ；ＬＰＳＤＦＦＰＳＶ；ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ；ＴＰＡＲＶＴＧＧＶＦ；ＲＭＳＲＶＴＴＦＴＶ；ＡＬＶＬＬＭＬＰＶＶ；ＬＭＩＧＴＡＡＡＶＶ；ＡＬＶＬＬＭＬＰＶ；ＧＬＭＴＡＶＹＬＶ；ＭＡＬＬＲＬＰＶ；ＲＭＦＡＡＮＬＧＶ；ＳＬＹＦＧＧＩＣＶ；ＲＬＰＬＶＬＰＡＶ；ＲＬＭＩＧＴＡＡＡ；ＦＶＶＡＬＩＰＬＶ；ＭＴＹＡＡＰＬＦＶ；ＡＭＡＬＬＲＬＰＬＶ；ＫＬＣＰＶＱＬＷＶ；ＡＴＶＧＩＭＩＧＶ；ＩＭＩＧＨＬＶＧＶ；ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ；ＫＶＡＥＩＶＨＦＬ；ＶＶＬＧＶＶＦＧＩ；ＳＭＰＰＰＧＴＲＶ；ＬＴＦＦＷＬＤＲＳＶ；ＴＬＭＳＡＭＴＮＬ；ＩＭＹＳＡＨＤＴＴＶ；ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＶ；ＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩ；ＬＬＹＳＬＶＨＮＬ；ＭＭＮＤＱＬＭＦＬ；ＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＶ；ＡＬＧＴＴＣＹＶ；ＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶ；ＬＬＬＳＩＡＬＳＶ；ＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＶ；ＦＬＲＰＲＳＬＱＣＶ；ＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＶからなる群から選択されるクラスＩ  ＨＬＡエピトープペプチドをコードする５つ以上のＣＴＬエピトープ核酸を含むことを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項４９】
ＥＰ−ＨＩＶ−１０９０、ＨＩＶ−ＣＰＴ、ＨＩＶ−ＦＴ、ＨＩＶ−ＴＣ、ＨＣＶ．１、ＨＣＶ．２、ＨＣＶ．３ｓ１、ＨＣＶ．３ｓ２、ＨＣＶ．３ｓ２（−３）、ＨＣＶ．３ｓ３、ＨＣＶ．ＰＣ３、ＨＣＶ．ＰＣ４、ＨＣＶ．２４３１（１Ｐ）、ＨＣＶ．４３１２（１Ｐ）、ＡＯＳＩ．Ｋ、ＨＢＶ．１、ＨＢＶ．２、ＰｆＣＴＬ．１、ＰｆＣＴＬ．２、ＰｆＣＴＬ．３、Ｐｆ３３、ＴＢ．１、ＢＣＬ  Ａ２  ＃９０、ＢＣＬ  Ａ２  ＃８８、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  １、ＨＢＶ−２Ａ、ＨＢＶ−２Ｂ、ＨＢＶ−２１Ａ、ＨＢＶ−２１Ｂ、ＨＢＶ−３０Ｂ、ＨＢＶ−３０Ｃ、ＨＢＶ−３０ＣＬおよび前述の任意のものとハイブリッド形成するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項５０】
ＥＰ−ＨＩＶ−１０９０、ＨＣＶ．３ｓ１、ＨＣＶ．３ｓ３、ＨＣＶ．ＰＣ３、ＨＣＶ．ＰＣ４、ＨＣＶ．２４３１（１Ｐ）、ＨＣＶ．４３１２（１Ｐ）、ＨＢＶ．２、ＰｆＣＴＬ．１、ＰｆＣＴＬ．２、ＰｆＣＴＬ．３、Ｐｆ３３、ＴＢ．１、ＢＣＬ  Ａ２  ＃９０、ＢＣＬ  Ａ２  ＃８８、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  １および前述の任意のものとハイブリッド形成するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項５１】
ＥＰ−ＨＩＶ−１０９０のヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でＥＰ−ＨＩＶ−１０９０とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項３９に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項５２】
複数のＨＴＬエピトープ核酸および複数のスペーサー核酸を含むマルチエピトープ構築物であって、
ＨＴＬエピトープ核酸が約７から約１７アミノ酸長のクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープをコードし、
スペーサー核酸がＨＴＬエピトープ核酸の間に位置し、かつ
スペーサー核酸が５つ以上のアミノ酸をコードし、スペーサー核酸の各々がエピトーププロセシングを最適化し、接合エピトープを最少化する
ことを特徴とするマルチエピトープ構築物。
【請求項５３】
スペーサー核酸が、グリシンとプロリンを交互に有するアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項５２に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項５４】
１つまたは複数のスペーサー核酸がアミノ酸ＧＰＧＰＧをコードすることを特徴とする請求項５３に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項５５】
すべてのスペーサー核酸がアミノ酸ＧＰＧＰＧをコードすることを特徴とする請求項５４に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項５６】
構築物が、ＭＧＴＳＦＶＹＶＰＳＡＬＮＰＡＤ；ＬＣＱＶＦＡＤＡＴＰＴＧＷＧＬ；ＲＨＹＬＨＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫ；ＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬＡ；ＥＳＲＬＶＶＤＦＳＱＦＳＲＧＮ；ＰＦＬＬＡＱＦＴＳＡＩＣＳＶＶ；ＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶ；ＬＨＬＹＳＨＰＩＩＬＧＦＲＫＩ；ＳＳＮＬＳＷＬＳＬＤＶＳＡＡＦ；ＬＱＳＬＴＮＬＬＳＳＮＬＳＷＬ；ＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳ；ＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩ；ＶＧＰＬＴＶＮＥＫＲＲＬＫＬＩ；ＫＱＣＦＲＫＬＰＶＮＲＰＩＤＷ；ＡＡＮＷＩＬＲＧＴＳＦＶＹＶＰ；ＫＱＡＦＴＦＳＰＴＹＫＡＦＬＣ；ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡからなる群から選択されるクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープペプチドをコードする５つ以上のＨＴＬエピトープ核酸を含むことを特徴とする請求項５２に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項５７】
構築物が、ＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹ；ＷＥＦＶＮＴＰＰＬＶＫＬＷＹＱ；ＱＫＱＩＴＫＩＱＮＦＲＶＹＹＲ；ＫＶＹＬＡＷＶＰＡＨＫＧＩＧＧ；ＧＥＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩ；ＥＫＶＹＬＡＷＶＰＡＨＫＧＩＧ；ＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱ；ＱＧＱＭＶＨＱＡＩＳＰＲＴＬＮ；ＳＰＡＩＦＱＳＳＭＴＫＩＬＥＰ；ＩＫＱＦＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹ；ＦＲＫＹＴＡＦＴＩＰＳＩＮＮＥ；ＨＳＮＷＲＡＭＡＳＤＦＮＬＰＰ；ＫＴＡＶＱＭＡＶＦＩＨＮＦＫＲ；ＹＲＫＩＬＲＱＲＫＩＤＲＬＩＤ；ＷＡＧＩＫＱＥＦＧＩＰＹＮＰＱ；ＥＶＮＩＶＴＤＳＱＹＡＬＧＩＩ；ＡＥＴＦＹＶＤＧＡＡＮＲＥＴＫ；ＧＡＶＶＩＱＤＮＳＤＩＫＶＶＰ；ＭＲＫＬＡＩＬＳＶＳＳＦＬＦＶ；ＭＮＹＹＧＫＱＥＮＷＹＳＬＫＫ；ＳＳＶＦＮＶＶＮＳＳＩＧＬＩＭ；ＲＨＮＷＶＮＨＡＶＰＬＡＭＫＬＩ；ＰＤＳＩＱＤＳＬＫＥＳＲＫＬＮ；ＫＣＮＬＹＡＤＳＡＷＥＮＶＫＮ；ＶＫＮＶＩＧＰＦＭＫＡＶＣＶＥ；ＫＹＫＩＡＧＧＩＡＧＧＬＡＬＬ；ＧＬＡＹＫＦＶＶＰＧＡＡＴＰＹ；ＫＳＫＹＫＬＡＴＳＶＬＡＧＬＬ；ＡＧＬＬＧＮＶＳＴＶＬＬＧＧＶ；ＬＬＩＦＨＩＮＧＫＩＩＫ  ＮＳＥ；ＱＴＮＦＫＳＬＬＲＮＬＧＶＳＥからなる群から選択されるクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープペプチドをコードする５つ以上のＨＴＬエピトープ核酸を含むことを特徴とする請求項５２に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項５８】
ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３のヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でＥＰ−ＨＩＶ−１０４３とハイブリッド形成する核酸を有することを特徴とする請求項５２に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項５９】
ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３  ＰＡＤＲＥ（登録商標）のヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でＥＰ−ＨＩＶ−１０４３  ＰＡＤＲＥ（登録商標）とハイブリッド形成する核酸を有することを特徴とする請求項５２に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項６０】
ＨＩＶ７５量体のヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でＨＩＶ７５量体とハイブリッド形成する核酸を有することを特徴とする請求項５２に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項６１】
ＰｆＨＴＬのヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でＰｆＨＴＬとハイブリッド形成する核酸を有することを特徴とする請求項５２に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項６２】
ＨＢＶ−ＨＴＬのヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でＨＢＶ−ＨＴＬとハイブリッド形成する核酸を有することを特徴とする請求項５２に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項６３】
１５個以上のエピトープ核酸および１０個以上のスペーサー核酸を含むマルチエピトープ構築物であって、
エピトープ核酸がクラスＩ  ＨＬＡエピトープまたはクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープをコードし、
エピトープ核酸が約７から約１７アミノ酸長のエピトープペプチドをコードし、
スペーサー核酸がエピトープ核酸の間に位置し、かつ
スペーサー核酸が、クラスＩ  ＨＬＡエピトープ核酸の間に挿入されたときに１から８の間のアミノ酸をコードし、クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープ核酸の間に挿入されたときに５以上のアミノ酸をコードすることを特徴とするマルチエピトープ構築物。
【請求項６４】
２０個以上のエピトープ核酸配列および１５個以上のスペーサー核酸配列を有することを特徴とする請求項６３に記載のマルチエピトープ構築物。
【請求項６５】
２５個以上のエピトープ核酸配列および１８個以上のスペーサー核酸配列を有することを特徴とする請求項６３に記載のマルチエピトープ構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学の分野に関する。特に、本発明は、マルチエピトープ核酸ワクチンおよび免疫原性を高めるこのようなワクチンを設計する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マルチエピトープ（「ミニ遺伝子」または「ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）」）ワクチンに関連する技術が開発されつつある。複数のエピトープに対し同時に免疫応答の誘発が達成できることがいくつかの独立した研究で確立された。たとえば、多数のＴ細胞特異性に対して応答を誘発し検出することができる。自然の状況において、Ｄｏｏｌａｎ等（非特許文献１）は、単一ドナーからのＰＢＭＣを用いて１７個もの異なる熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）エピトープに対するリコールＴ細胞応答（ｒｅｃａｌｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を同時に検出した。同様に、Ｂｅｒｔｏｎｉおよびその同僚ら（非特許文献２）は、単一ドナー中の１２個の異なるＨＢＶ由来のエピトープに対する同時ＣＴＬ応答を検出した。マルチエピトープ核酸ワクチンによる免疫に関して、複数のＴ細胞応答が誘発されたいくつかの例が報告された。たとえば、エピトープすべてが免疫原性および／または抗原性である約１０個のＭＨＣクラスＩエピトープからなるミニ遺伝子ワクチンが報告された。具体的には、９個のＥＢＶエピトープ（非特許文献３）、７個のＨＩＶエピトープ（非特許文献４）、１０個のネズミエピトープ（非特許文献５）および１０個の腫瘍由来エピトープ（非特許文献６）からなる各ミニ遺伝子ワクチンが活性であることが示された。ＨＢＶおよびＨＩＶ由来の９個の異なるＨＬＡ−Ａ２．１およびＡ１１限定エピトープ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）をコードするマルチエピトープＤＮＡプラスミドがすべてのエピトープに対してＣＴＬを誘導したことも示された（非特許文献７）。
【０００３】
したがって、複数のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ（すなわち、ＣＴＬ）エピトープを含むミニ遺伝子ワクチンを設計することができ、すべてのエピトープに対して提示および認識を得ることができる。しかし、マルチエピトープ構築物の免疫原性は、多数の変数の影響を強く受けるように思われ、そのうちいくつかはこれまで未知のものである。たとえば、同じエピトープの免疫原性（または抗原性）は、マルチエピトープワクチン構築物を最適化するための戦略を特定することが必要な状況で現れた。このような最適化は、強力な免疫応答を誘発する上で、また、最終的な臨床効力のために重要である。したがって、本発明は、多数のエピトープを含むマルチエピトープワクチンの抗原性および免疫原性を最適化する戦略、ならびにこれらの戦略に従って生成される最適化されたマルチエピトープワクチン、特にミニ遺伝子ワクチンを提供する。
【０００４】
以下の項では、ミニ遺伝子の免疫原性、エピトープのプロセシングおよびクラスＩおよびクラスＩＩの各ＭＨＣ分子と関連する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の提示に影響を及ぼし得る主な変数のいくつかを手短に概説する。
【０００５】
免疫優性
複雑な外来病原体によってコードされる何千もの可能なペプチドのうち、ＭＨＣクラスＩ抗原に結合可能な、したがってＴ細胞により認識可能なペプチド型の割合はほんのわずかである。この現象は、マルチエピトープワクチンの開発に明らかに潜在的影響を及ぼすもので、免疫優性（非特許文献８）として知られる。免疫優性にはいくつかの主要な変数が寄与している。本明細書において、本発明者らは、細胞内プロセシングの結果として適切なペプチドの生成に定性的にも定量的にも影響する変数について述べる。
【０００６】
接合エピトープ（Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ）
接合エピトープは、別の２つのエピトープが並置したために生成するエピトープと定義される。新しいエピトープは、第１のエピトープに由来するＣ末端セクションと第２のエピトープに由来するＮ末端セクションからなる。接合エピトープの生成は、以下の理由により、クラスＩおよびクラスＩＩ限定エピトープ用マルチエピトープミニ遺伝子ワクチンの設計における潜在的な問題である。第１に、ＨＬＡトランスジェニック実験動物において免疫原性が一般に試験されるヒトエピトープからなるミニ遺伝子、またはそれを含むミニ遺伝子を開発するときに、ネズミエピトープの生成は、有害な免疫優性効果を生じる恐れがある。第２に、ヒトＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に対する新しい意図しないエピトープの生成は、ワクチンのレシピエントに、標的によって誘発されるＴ細胞応答であり感染細胞または腫瘍によっては発現されない新しいＴ細胞特異性を誘発する恐れがある。これらの応答は、明らかに不適切で効果がなく、有害な免疫優性効果を生じて逆効果でさえあり得る。
【０００７】
接合エピトープの存在は、多くの異なる実験状況で実証されてきた。Ｇｅｆｔｅｒおよびその共同研究者らは、２つの異なるクラスＩＩ限定エピトープが同一線上に並置して合成された系においてその効果を最初に示した（非特許文献９）。その効果はあまりにも著しく、これら各エピトープの免疫系認識がこれらの新しい接合エピトープによって完全に「サイレント」になるほどであった（非特許文献１０）。接合エピトープを指向したヘルパーＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２限定ＨＢＶによって誘導される免疫優性ＣＴＬエピトープと普遍的な破傷風トキソイドによって誘導されるＨＴＬエピトープで構成される合成リポペプチドによる免疫処置の結果としてヒトにおいても観察された（非特許文献１１）。したがって、接合エピトープの生成は、マルチエピトープ構築物を設計する際の主要な考慮事項の１つである。
【０００８】
本発明は、この問題に取り組む方法、および接合エピトープの発生を回避するかまたは最小限に抑える方法を提供する。
【０００９】
フランキング領域
クラスＩ限定エピトープは、複雑なプロセスによって生成する（非特許文献８）。エンドプロテアーゼと、エキソプロテアーゼによる潜在的なトリミングを含むタンパク質限定加水分解には、抗原プロセシング関連トランスポーター（Ｔｒａｎｓｆｅｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（ＴＡＰ）分子により小胞体（ＥＲ）膜を通るトランスロケーションが続く。ＣＴＬ前駆体のＥＲトリミングも示されたが（非特許文献１３）、抗原性ペプチドの生成に関わる主要な細胞質ゾルプロテアーゼ複合体およびそれらの前駆体はプロテオソームである（非特許文献１２）。エピトープのＣ末端およびＮ末端に隣接する残基が、エピトープの生成効率に影響を及ぼすか否かは長年議論されてきた。
【００１０】
プロセシングされたエピトープの収率および有効性は、免疫原性を決定する主要な変数の１つとして意味づけられ、したがって、免疫応答の大きさがＭＨＣの結合したエピトープ量に直接比例し、Ｔ細胞認識によって示すことができるという点でミニ遺伝子の全体的な効力に明らかに重大な影響を及ぼす。これが事実である証拠がいくつかの研究で提示された。たとえば、エピトープ密度に本質的に比例するウイルス特異的ＣＴＬの誘導（非特許文献１４）が観察された。更に、前もってプロセシングした最適なエピトープをコードする組換えミニ遺伝子を用いて、完全長タンパク質で自然に観察されるよりも高いレベルのエピトープ発現が誘発された（非特許文献１５）。例外はいくつかあるものの（非特許文献１７）、一般にミニ遺伝子による初回抗原刺激は、抗原全体による初回抗原刺激よりも有効であることが示された（非特許文献７、１６）。
【００１１】
初期の研究では、エピトープ内の残基（非特許文献１８）が免疫原性を主に調節すると結論づけられた。他の研究も、そのほとんどは無関係な遺伝子中または同じ遺伝子であるが異なる位置へのエピトープのグラフトに基づいて同様の結論に達した（非特許文献１９、２０）。しかし、別の実験（非特許文献１８、２１）では、ＣＴＬエピトープのすぐ隣に局在する残基が、認識に直接影響を及ぼし得ることが示唆された（非特許文献２２、２３）。ミニ遺伝子ワクチンに関連して論争が再開された。Ｓｈａｓｔｒｉおよびその共同研究者ら（非特許文献２４）は、Ｔ細胞応答が、Ｎ末端フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）残基を変えても有意な影響を受けないが、単一のＣ末端フランキング残基の追加によって阻害されることを見出した。Ｃ末端フランキング残基がイソロイシン、ロイシン、システインおよびプロリンのときに最も劇的な阻害が認められた。これに対し、Ｇｉｌｅａｄｉ（非特許文献２５）は、マウスインフルエンザウイルスエピトープのＮ末端に位置する残基の作用による顕著な効果を報告した。Ｂｅｒｇｍａｎｎおよびその共同研究者らは、芳香族残基、塩基性残基およびアラニン残基がエピトープの効率的な認識を助け、一方ＧおよびＰ残基がエピトープ認識を強く阻害することを見出した（非特許文献２６）。これに対し、Ｌｉｐｐｏｌｉｓ（非特許文献２７）は、置換フランキング残基は認識をもたらさないと結論した。しかし、試験されたのは、プロテオソームの特異性に影響しそうにないかなり保存的な置換のみであった。
【００１２】
これらの効果の特異性、一般に天然のエピトープの特異性は、プロテオソームの特異性と概略相関すると考えられる。たとえば、プロテオソームの特異性は、一部トリプシン様であり（非特許文献２８）、塩基性アミノ酸の後で切断を起こす。しかし、疎水性および酸性残基のカルボキシル側の効率的な切断も可能である。これらの特異性と一致するのはＳｈｅｒｍａｎおよび共同研究者らの研究であり、彼らはｐ５３エピトープのＣ末端に続く位置でのＲからＨへの突然変異がプロテオソームによって媒介されるタンパク質のプロセシングに影響を及ぼすことを見出した（非特許文献２９）。別のいくつかの研究（非特許文献３、３０）は、フランキング領域を用いてさらに最適化できる可能性も認めているものの、最小限のエピトープを利用してミニ遺伝子を構築できること、およびこれらのフランキング配列が必要とは考えられないことを示した。
【００１３】
要するに、ＨＬＡクラスＩエピトープについては、プロセシングおよびＣＴＬエピトープの提示の際のフランキング領域の効果はまだ不明である。フランキング領域の調節効果は、ミニ遺伝子ワクチンでは系統的に解析されていない。したがって、一般にヒトクラスＩによって限定されるエピトープをコードするミニ遺伝子ワクチンを用いた解析が必要である。本発明は、このような解析を提供し、したがって、免疫原性および抗原性について最適化されたマルチエピトープワクチン構築物およびこのような構築物を設計する方法を提供する。
【００１４】
ＨＬＡクラスＩＩペプチド複合物も、ＨＬＡクラスＩプロセシングとは明確に異なる複雑な一連の現象の結果として生成する。プロセシング経路には、インバリアント鎖（Ｉｉ）との結合、その専用区画への輸送、ＩｉからＣＬＩＰへの分解、およびＨＬＡ−ＤＭによって触媒されるＣＬＩＰの除去が含まれる（総説としてたとえば、非特許文献３１、３２を参照されたい）。また、Ｉｉの分解において、一般に様々なカテプシン、特にカテプシンＳおよびＬが潜在的に極めて重要な役割を果たす非特許文献３３）。しかし、機能的なエピトープの生成の点では、このプロセスはやや選択性が低いと考えられ（非特許文献３４）、様々な大きさのペプチドがＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩに結合することができる（非特許文献３５）。可能なペプチドのほとんどまたはすべてが生成すると考えられる（非特許文献３６、３７）。したがって、フランキング領域の論点に比べ、接合エピトープの生成は、特定の実施形態においてより重要な検討事項となり得る。
【００１５】
【特許文献１】
国際公開第９４／２０１２７号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第９４／０３２０５号パンフレット
【特許文献３】
１９９９年３月１日に出願された同時係属の米国特許出願第０９／２６０，７１４号明細書
【特許文献４】
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４号
【特許文献５】
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２７７６６号
【特許文献６】
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２４８０２号
【特許文献７】
米国特許第５，７３６，１４２号明細書
【特許文献８】
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３７７８号
【特許文献９】
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１０６４６号
【特許文献１０】
米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献１１】
米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献１２】
米国特許第４，７２２，８４８号明細書
【特許文献１３】
１９９７年５月２７日に発行された米国特許第５，６３３，２３４号明細書
【特許文献１４】
１９９６年１２月３日に発行された米国特許第５，５８０，８５９号明細書
【特許文献１５】
１９９７年１２月３０日に発行された米国特許第５，７０３，０５５号明細書
【特許文献１６】
１９９７年１０月２１日に発行された米国特許第５，６７９，６４７号明細書
【非特許文献１】
Doolan等、Immunity、Vol. 7 (1): 97〜112 (1997)
【非特許文献２】
Bertoni等、J Clin Invest、Vol. 100 (3): 503〜13 (1997)
【非特許文献３】
Thomson等、Proc Natl Acad Sci USA、Vol. 92 (13): 5845〜9 (1995)
【非特許文献４】
Woodberry等、J Virol、Vol. 73 (7): 5320〜5 (1999)
【非特許文献５】
Thomson等、J Immunol、Vol. 160 (4): 1717〜23 (1998)
【非特許文献６】
Mateo等、J Immunol、Vol. 163 (7): 4058〜63 (1999)
【非特許文献７】
Ishioka等、J Immunol、Vol. 162 (7): 3915〜25 (1999)
【非特許文献８】
Yewdell等、Annu Rev Immunol、17: 51〜88 (1999)
【非特許文献９】
Perkins等、J Immunol、Vol. 146 (7): 2137〜44 (1991)
【非特許文献１０】
Wang等、Cell Immunol、Vol. 143 (2): 284〜97 (1992)
【非特許文献１１】
Livingston等、J Immunol、Vol. 159 (3): 1383〜92 (1997)
【非特許文献１２】
Niedermann等、Immunity、Vol. 2 (3): 289〜99 (1995)
【非特許文献１３】
Paz等、Immunity、Vol. 11 (2): 241〜51 (1999)
【非特許文献１４】
Wherry等、J Immunol、Vol. 163 (7): 3735〜45 (1999)
【非特許文献１５】
Anton等、J Immunol、Vol. 158 (6): 2535〜42 (1997)
【非特許文献１６】
Restifo等、J Immunol、Vol. 154 (9): 4414〜22 (1995)
【非特許文献１７】
Iwasaki等、Vaccine、Vol. 17 (15〜16): 2081〜8 (1999)
【非特許文献１８】
Hahn等、J Exp Med、Vol. 176 (5): 1335〜41 (1992)
【非特許文献１９】
Chimini等、J Exp Med、Vol. 169 (1): 297〜302 (1989)
【非特許文献２０】
Hahn等、J Exp Med、Vol. 174 (3): 733〜6 (1991)
【非特許文献２１】
Del Val等、Cell、Vol. 66 (6): 1145〜53 (1991)
【非特許文献２２】
Couillin等、J Exp Med、Vol. 180 (3): 1129〜34 (1994)
【非特許文献２３】
Bergmann等、J Virol. Vol. 68 (8): 5306〜10 (1994)
【非特許文献２４】
Shastri等、J Immunol、Vol. 155 (9): 4339〜46 (1995)
【非特許文献２５】
Gileadi等、Eur J Immunol、Vol. 29 (7): 2213〜22 (1999)
【非特許文献２６】
Bergmann等、J Immunol、Vol. 157 (8): 3242〜9 (1996)
【非特許文献２７】
Lippolis等、J Virol、Vol. 69 (5): 3134〜46 (1995)
【非特許文献２８】
Niedermann等、Immunity、Vol. 2 (3): 289〜99 (1995)
【非特許文献２９】
Theobald等、J Exp Med、Vol. 188 (6): 1017〜28 (1998)
【非特許文献３０】
Hanke等、J Gen Virol、Vol. 79 (Pt 1): 83〜90 (1998)
【非特許文献３１】
Blum等、Crit Rev Immunol、Vol. 17 (5〜6): 411〜7 (1997)
【非特許文献３２】
Arndt等、Immunol Res、Vol. 16 (3): 261〜72 (1997)
【非特許文献３３】
Nakagawa等、Immunity; Vol. 10 (2): 207〜17 (1999)
【非特許文献３４】
Chapman H.A.、Curr Opin Immunol、Vol. 10 (1): 93〜102 (1998)
【非特許文献３５】
Hunt等、Science、Vol. 256 (5065): 1817〜20 (1992)
【非特許文献３６】
Moudgil等、J Immunol、Vol. 159 (6): 2574〜9 (1997)
【非特許文献３７】
Thomson等、J Virol、Vol. 72 (3): 2246〜52 (1998)
【非特許文献３８】
Ceppellini等、Nature 339: 392、1989
【非特許文献３９】
Christnick等; Nature 352: 67、1991
【非特許文献４０】
Busch等、Int. Immunol. 2: 443、19990
【非特許文献４１】
Hill等、J. Immunol. 147: 189、1991
【非特許文献４２】
del Guercio等、J. Immunol. 154: 685、1995
【非特許文献４３】
Cerundolo等、J. Immunol. 21: 2069、1991
【非特許文献４４】
Hill等、J. Immunol. 152、2890、1994
【非特許文献４５】
Marshall等、J. Immunol. 152: 4946、1994
【非特許文献４６】
Reay等、EMBO J. 11: 2829、1992
【非特許文献４７】
Khilko等、J. Biol. Chem. 268: 15425、1993
【非特許文献４８】
Hammer等、J. Exp. Med. 180: 2353、1994
【非特許文献４９】
Ljunggren等、Nature 346: 476、1990
【非特許文献５０】
Schumacher等、Cell 62: 563、1990
【非特許文献５１】
Townsend等、Cell 62: 285、1990
【非特許文献５２】
Parker等、J. Immunol. 149: 1896、1992
【非特許文献５３】
Sercarz等、Annu. Rev. Immunol. 11: 729〜766、1993
【非特許文献５４】
Stites等、IMMUNOLOGY、8TH ED.、Lange Publishing、Los Altos、CA (1994)
【非特許文献５５】
Paul、FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY、3RD ED.、Raven Press、New York、1993
【非特許文献５６】
SmithおよびWaterman、Advances in Applied Mathematics 2: 482〜489 (1981)
【非特許文献５７】
Sette等、J. Immunol.、143: 1268〜73 (1989)
【非特許文献５８】
Tussey等、Immunity、Vol. 3 (1): 65〜77 (1995)
【非特許文献５９】
Vitiello等、J. Clin. Invest 95: 341〜349、1995
【非特許文献６０】
Vitiello等、J. Exp. Med. 173 (4)、1007〜1015、1991
【非特許文献６１】
Alberts等、Molecular Biology of the Cell (3rd ed.,1994)
【非特許文献６２】
CantorおよびSchimmel、Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)
【非特許文献６３】
Kyte & Doolittle、J. Mol. Biol. 157: 105〜132 (1982)
【非特許文献６４】
Stryer、Biochemistry (3rd ed. 1988)
【非特許文献６５】
Rammensee等、Immunogenetics、Vol. 41 (4): 178〜228 (1995)
【非特許文献６６】
Sette等、J Immunol、Vol. 153 (12): 5586〜92 (1994)
【非特許文献６７】
Wentworth等、Int Immunol、Vol. 8 (5): 651〜9 (1996)
【非特許文献６８】
Engelhard等、J Immunol、Vol. 146 (4): 1226〜32 (1991)
【非特許文献６９】
Man等、Int Immunol、Vol. 7 (4): 597〜605 (1995)
【非特許文献７０】
Shirai等、J Immunol、Vol. 154 (6): 2733〜42 (1995)
【非特許文献７１】
Ishioka等、J Immunol、Vol. 162 (7): 3915〜25 (1999)
【非特許文献７２】
Alexander等、J Immunol、Vol. 159 (10): 4753〜61 (1997)
【非特許文献７３】
Wentworth等、Eur J Immunol、Vol. 26 (1): 97〜101 (1996)
【非特許文献７４】
Rotzschke O、Falk K.、Curr Opin Immunol、Vol. 6 (1): 45〜51 (1994)
【非特許文献７５】
Maier等、Immunogenetics; Vol. 40 (4): 306〜8 (1994)
【非特許文献７６】
Shields等、Mol Immunol Vol. 35 (14〜15): 919〜28 (1998)
【非特許文献７７】
Vitiello等、Science、Vol. 250 (4986): 1423〜6 (1990)
【非特許文献７８】
Sijts等、J Immunol、Vol. 156 (2): 683〜92 (1996)
【非特許文献７９】
Demotz等、Nature、Vol. 342 (6250): 682〜4 (1989)
【非特許文献８０】
Kageyama等、J Immunol、Vol. 154 (2): 567〜76 (1995)
【非特許文献８１】
Alexander-Miller等、Proc Natl Acad Sci USA、Vol. 93 (9): 4102〜7 (1996)
【非特許文献８２】
Greenberg P.D.、Riddell S.R.、Science、Vol. 285 (5427): 546〜51 (1999)
【非特許文献８３】
Taneja V.、David C.S.、Immunol Rev、Vol. 169: 67〜79 (1999)
【非特許文献８４】
Bertoni等、J Immunol、Vol. 161 (8): 4447〜55 (1998)
【非特許文献８５】
Geluk等、J Exp Med、Vol. 177 (4): 979〜87 (1993)
【非特許文献８６】
Dzuris等、J. Immunol.、July 1999
【非特許文献８７】
Wall等、J. Immunol.、152: 4526〜36 (1994)
【非特許文献８８】
Murali-Krishna等、Immunity、Vol. 8 (2): 177〜87 (1998)
【非特許文献８９】
Ogg G.S.、McMichael A.J.、Curr Opin Immunol、Vol. 10 (4): 393〜6 (1998)
【非特許文献９０】
Ogg等、Science、Vol. 279 (5359): 2103〜6 (1998)
【非特許文献９１】
Gray等、J Immunol、Vol. 162 (3): 1780〜8 (1999)
【非特許文献９２】
Ogg等、J Virol、Vol. 73 (11): 9153〜60 (1999)
【非特許文献９３】
Kalams等、J Virol、Vol. 73 (8): 6721〜8 (1999)
【非特許文献９４】
Larsson等、AIDS、Vol. 13 (7): 767〜77 (1999)
【非特許文献９５】
Corne等、J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol、Vol. 20 (5): 442〜7 (1999)
【非特許文献９６】
Hanke等、Vaccine、Vol. 16 (4): 426〜35 (1998)
【非特許文献９７】
Threlkeld等、J Immunol、Vol. 159 (4): 1648〜57 (1997)
【非特許文献９８】
Shimizu Y、DeMars R、J Immunol、Vol. 142 (9): 3320〜8 (1989)
【非特許文献９９】
Sambrook等、Molecular Cloning、A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)
【非特許文献１００】
Kriegler、Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)
【非特許文献１０１】
Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等編、1994)
【非特許文献１０２】
Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (Gait編、1984)
【非特許文献１０３】
Kuijpers、Nucleic Acids Research 18 (17): 5197 (1994)
【非特許文献１０４】
Dueholm、J. Org Chem. 59: 5767〜5773 (1994)
【非特許文献１０５】
Methods in Molecular Biology、volume 20 (Agrawal編)
【非特許文献１０６】
Tijssen、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes、たとえば、Part I、chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" (1993)
【非特許文献１０７】
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis等編、1990)
【非特許文献１０８】
Beaucage & Caruthers、Tetrahedron Letts. 22: 1859〜1862 (1981)
【非特許文献１０９】
Van Devanter等、Nucleic Acids Res. 12: 6159〜6168 (1984)
【非特許文献１１０】
Pearson & Reanier、J. Chrom. 255: 137〜149 (1983)
【非特許文献１１１】
Copier等、J. Immunol. 157: 1017〜1027 (1996)
【非特許文献１１２】
Liljedahl等、EMBO J. 15: 4817〜4824 (1996)
【非特許文献１１３】
Bonnerot等、Immunity 3: 335〜347 (1995)
【非特許文献１１４】
Gueguen & Long、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14692〜14697 (1996)
【非特許文献１１５】
Diminsky等、Vaccine 15: 637〜647 (1997)
【非特許文献１１６】
Le Borgne等、Virology 240: 304〜315 (1998)
【非特許文献１１７】
Kuhrober等、International Immunol. 9: 1203〜1212 (1997)
【非特許文献１１８】
Weber等、Vaccine 13: 831〜834 (1995)
【非特許文献１１９】
Donnelly等、Ann. Rev. Immunol. 15: 617〜648 (1997)
【非特許文献１２０】
Gregoriadis、Liposome Technology、Vols. I to III (2nd ed. 1993)
【非特許文献１２１】
Brunner等、Immunology、Vol. 14 (2): 181〜96 (1968)
【非特許文献１２２】
Current Protocols in Immunology、Vol 1、John Wiley & Sons, Inc.、USA 1991 Chapter 3; Manual of Clinical Laboratory Immunology、Fifth edition、ASM Press、1997 Section R
【非特許文献１２３】
J. Coligan、A. Kruisbeek、D. Margulies、E. ShevachおよびW. Strober (編)、Current Protocols in Immunology、Vol 1、"Assays for T cell function: induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity" John Wiley & Sons, Inc.、USA中のWunderlick, J.、Shearer, G.およびLivingston, A.、p. 3.11.18
【非特許文献１２４】
McKinney等、J. Immunol. Meth. 237 (1〜2): 105〜117 (2000)
【非特許文献１２５】
Tetramer Core Facility: http: //www.miaid.nih.gov/reposit/tetramer/index.html
【非特許文献１２６】
Heathcote等、Hepatology、Vol. 30 (2): 531〜6 (1999)
【非特許文献１２７】
Livingston等、J Immunol、Vol. 162 (5): 3088〜95 (1999)
【非特許文献１２８】
http: //www.kazusa.or.jp/codon/
【非特許文献１２９】
Celis等、Proc Natl Acad Sci USA、Vol. 91 (6): 2105〜9 (1994)
【非特許文献１３０】
Southwood等、J Immunol、Vol. 160 (7): 3363〜73 (1998)
【非特許文献１３１】
Current Protocols in Molecular Biology、Vol 3、John Wiley & Sons, Inc. USA 1999
【非特許文献１３２】
Manstein等、Gene、Vol. 162 (1): 129〜34 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、接合エピトープの数を最小限に抑えるように、ならびにマルチエピトープワクチンの免疫原性および／または抗原性を最大にするか、または少なくとも増加させるようにマルチエピトープワクチンの効力を最適化するための方法およびシステムを提供する。特に、本発明は、複数のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープをコードするマルチエピトープ核酸構築物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一実施形態において、複数のエピトープを有するマルチエピトープ構築物を設計するためのコンピュータ化された方法は、コンピュータシステムのメモリー中に、複数のエピトープ、接合エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入物および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｗｅｉｇｈｔ  ｖａｌｕｅ）を含む複数の入力パラメータを記憶すること；複数のエピトープからエピトープ対のリストを作成すること；少なくとも１つのモチーフ、複数の挿入物および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値に基づくアミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対して決定すること；および複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を同定することの各ステップを含み、アミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せのそれぞれ１つが２つのエピトープの接合部それぞれに挿入されて、最適化されたマルチエピトープ構築物を提供する。好ましい実施形態において、少なくとも１つの最適なエピトープの整列を同定するステップは、複数のエピトープの整列のすべての順列を評価する徹底的な探索または複数のエピトープの整列のすべての順列のサブセットのみを評価する確率的な探索のいずれかを実施することによって達成することができる。
【００１８】
更なる実施形態において、本方法は、各エピトープ対に対して可能な挿入物の各組合せに対する機能値（ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）（Ｆ）を計算することによって、アミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対して決定する。この場合において、１つの組合せ内の挿入物の数は、ユーザーが入力する０から挿入物の最大数（ＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）の値までの範囲であってよく、機能値は、Ｊ＞０のときＦ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊ、Ｊ＝０のときＦ＝２（Ｃ＋Ｎ）なる式（式中、ＣはＣ＋１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、ＮはＮ−１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値に等しく、Ｊは前記少なくとも１つのモチーフに基づく１つのエピトープ対中にある挿入物の組合せそれぞれに対して検出される接合エピトープ数に等しい）に従って計算される。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、複数のエピトープを有するマルチエピトープ構築物を設計するためのコンピュータシステムは、複数のエピトープ、接合エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入物および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値のような複数の入力パラメータを記憶するためのメモリー；メモリーから入力パラメータを検索し、複数のエピトープからエピトープ対のリストを作成するためのプロセッサを含み、プロセッサは、さらに、少なくとも１つのモチーフ、複数の挿入物および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値に基づいてアミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対して決定する。プロセッサは、さらに、複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列を同定する。この場合において、アミノ酸挿入物の最適な組合せのそれぞれ１つが２つのエピトープの接合部それぞれに挿入されて、最適化されたマルチエピトープ構築物、および複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列をユーザーに表示するための、プロセッサに接続された表示モニターが提供される。
【００２０】
更なる実施形態において、本発明は、複数のエピトープを有するマルチエピトープ構築物を設計するためのコンピュータプログラムを格納するためのデータ記憶装置を提供する。このコンピュータプログラムは、コンピュータシステムにより実行されたときに、以下のプロセスを実行する。該プロセスは、コンピュータシステムのメモリーから、たとえば、複数のエピトープ、接合エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入物および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値を含めた複数の入力パラメータを検索すること；複数のエピトープからエピトープ対のリストを作成すること；少なくとも１つのモチーフ、複数の挿入物および各挿入物に対する少なくとも１つのエンハンスメント重み値に基づくアミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対に対して決定すること；および複数のエピトープの少なくとも１つの最適な整列を同定することの各ステップを含み、アミノ酸挿入物の少なくとも１つの最適な組合せのそれぞれ１つが２つのエピトープの接合部それぞれに挿入され、最適化されたマルチエピトープ構築物を提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、複数のエピトープを含むマルチエピトープ構築物を設計するための方法およびシステムを提供する。本方法は、（ｉ）複数のエピトープを分類して接合エピトープの数を最小限に抑えること、（ｉｉ）エピトープのＣ＋１位にフランキングアミノ酸残基を導入してマルチエピトープ構築物中に含ませること、（ｉｉｉ）マルチエピトープ構築物の２つのエピトープ間に接合エピトープの生成を防止する１つまたは複数のアミノ酸スペーサー残基を導入すること、および（ｉｖ）各エピトープに対してＣ＋１位に最小数の接合エピトープ、最小数のアミノ酸スペーサー残基および最大数のフランキングアミノ酸残基を有する１つまたは複数のマルチエピトープ構築物を選択することの各ステップを含む。いくつかの実施形態において、スペーサー残基は、ＨＬＡクラスＩＩの一次アンカー残基であることが知られていない残基から、独立に選択される。特定の実施形態では、スペーサー残基を導入することによって、ＨＴＬエピトープの生成が防止される。このようなスペーサーは、Ｇ、ＰおよびＮからなる群から独立に選択される少なくとも５つのアミノ酸残基を含むことが多い。いくつかの実施形態では、スペーサーはＧＰＧＰＧである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、スペーサー残基を導入することによってＣＴＬエピトープの生成が防止される。スペーサーは、ＡおよびＧからなる群から独立に選択される１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸残基である。フランキング残基は、ＣＴＬエピトープのＣ＋１位に導入され、Ｋ、Ｒ、Ｎ、ＧおよびＡからなる群から選択されることが多い。いくつかの実施形態では、フランキング残基はスペーサー配列に隣接している。本発明の方法は、マルチエピトープ構築物内の隣接エピトープのＣ末端に隣接しているエピトープのＮ末端残基を、Ｋ、Ｒ、Ｎ、ＧおよびＡからなる群から選択される残基で置換することも含むことができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、マルチエピトープ構築物の構造を予測することのステップも含むことができ、さらに、最大限の構造を有する１または複数の構築物、すなわち、ＨＬＡプロセシング経路によってプロセシングされて構築物に含まれるエピトープのすべてを産生する１つまたは複数の構築物を選択することのステップも含むことができる。いくつかの実施形態において、マルチエピトープ構築物は、図９に並べたＥＰ−ＨＩＶ−１０９０、ＨＩＶ−ＣＰＴまたはＨＩＶ−ＴＣをコードする。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、マルチエピトープ構築物を最適化するシステムは、プロセッサ（たとえば、中央処理装置）およびプロセッサによって実行される命令およびプロセッサで操作すべき（すなわち、処理すべき）データを記憶するための、プロセッサに接続された少なくとも１つのメモリーを備えるコンピュータシステムを含む。コンピュータシステムは、さらに、プロセッサに接続された入力装置（たとえば、キーボード）およびユーザーが所望のパラメータを入力でき、プロセッサが情報にアクセスできるようにするための少なくとも１つのメモリーを含む。プロセッサは、単一のＣＰＵまたは複数の異なるプロセシング装置／単一の集積回路チップ上に集積された回路とすることができる。あるいは、プロセッサは、直接のワイヤ／コンダクタ接続またはデータバスのいずれかを介して相互に選択的に接続された別個のプロセシング装置／回路の集まりとすることができる。同様に、少なくとも１つのメモリーは、１つの巨大メモリー装置（たとえば、ＥＰＲＯＭ）あるいはデータおよび／またはプログラム情報（すなわち、プロセッサによって実行される命令）を選択的に記憶するための相互に選択的に接続された複数の別個のメモリー装置（たとえば、ＥＥＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＲＡＭ、ＤＲＡＭ、ＳＤＲＡＭ、Ｆｌａｓｈなど）の集まりとすることができる。当業者であれば所望のコンピュータシステムアーキテクチャーを実行して、本明細書に開示する操作および機能を実施することが容易にできる。
【００２５】
一実施形態において、コンピュータシステムは、情報、命令、画像、グラフィックスなどを表示するための表示モニターを含む。コンピュータシステムは、キーボードを介してユーザーの入力を受ける。これらのユーザー入力パラメータは、たとえば、挿入物（すなわち、フランキング残基およびスペーサー残基）の数、処理すべきペプチド、各アミノ酸に対するＣ＋１およびＮ−１各加重値（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ  ｖａｌｕｅｓ）および接合エピトープを探索するために使用するモチーフを含むことができる。これらの入力値／パラメータに基づいて、コンピュータシステムは、各ペプチド対に対する接合エピトープ数を自動的に決定し、フランキング残基と各ペプチド対の接合部に挿入することができるスペーサーとの各組合せに対する「エンハンスメント」値も計算する「接合アナライザー（Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）」ソフトウエアプログラムを実行する。次いで、接合アナライザープログラムの結果を、「最適な」組合せまたは完全なペプチドセットの連結を決定する徹底的または確率的な探索プログラムのいずれかに用いて、最小数の接合エピトープおよび最大の機能（たとえば、免疫原性）値を有するマルチエピトープポリペプチドまたは核酸を作製する。
【００２６】
一実施形態において、コンピュータシステムで処理すべきペプチド数が１４未満であれば、ポリペプチドを構成するすべてのペプチド順列を調べて「最良の」または「最適な」機能値を有する順列を見つける徹底的な探索プログラムをコンピュータシステムで実行する。一実施形態において、Ｊが０より大きいとき（Ｃｅ＋Ｎｅ）／Ｊ、Ｊが０に等しいとき２×（Ｃｅ＋Ｎｅ）（式中、ＣｅはペプチドのＣ＋１位のアミノ酸のエンハンスメント「重み」値、ＮｅはペプチドのＮ−１位のアミノ酸のエンハンスメント「重み」値、およびＪはマルチエピトープ核酸配列によってコードされるポリペプチド中に含まれる接合エピトープの数である）なる式を用いて機能値を計算する。したがって、この機能値を最大にすることは、最小数の接合エピトープおよびフランキング残基に対して最大のエンハンスメント重み値を有するペプチド対を同定することになる。処理すべきペプチド数が１４以上である場合、コンピュータシステムは、「モンテカルロ」法を用いて順列スペースの多数の領域を調べて、最適な（たとえば、最大の機能値を有する）ペプチド配列の最良の推定値を見つける確率的な探索プログラムを実行する。
【００２７】
さらなる実施形態において、コンピュータシステムは、徹底的または確率的な探索プログラムの出力結果を設定または限定するパラメータ値をユーザーが入力できるようにする。たとえば、ユーザーは、同じ機能値を有する結果の最大数（「ＭａｘＤｕｐｌｉｃａｔｅＦｕｎｃｔｉｏｎＶａｌｕｅ＝Ｘ」）を入力して探索の結果生成する順列数を限定することができる。探索プログラムが同じ機能値を与える多数の配列を見つけることが可能であるので、多数の等価な解で出力ファイルが満杯になるのを防ぐことが望ましい。この限界に達すると、より大きなすなわち「より良い」機能値が見出されるまでそれ以上の結果は報告されない。別の例として、ユーザーは、確率的な探索プロセス中の精査（ｐｒｏｂｅ）当たりの「ヒット」の最大数を入力することもできる。このパラメータは、確率的な探索プログラムが単一の精査であまりにも多数の出力を生成するのを防止する。好ましい一実施形態において、単一の精査で調べられる順列数は、いくつかの因子、すなわち、入力テキストファイル中の各精査に対して設定される時間、コンピュータの速度、ならびに「ＭａｘＨｉｔｓＰｅｒＰｒｏｂｅ」および「ＭａｘＤｕｐｌｉｃａｔｅＦｕｎｃｔｉｏｎＶａｌｕｅｓ」の各パラメータ値によって限定される。解析用に順列を作成し選択するために使用されるアルゴリズムは、多数のコンピュータ科学教本に見られる周知の再帰的アルゴリズムに従うことができる。たとえば、３個から同時に３個を取る６つの順列は以下の配列、すなわち、ＡＢＣ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、ＢＣＡ、ＣＢＡ、ＣＡＢで作成されることになる。入力パラメータの更なる例として、ユーザーは、確率的な探索の実行方法、たとえば、無作為、統計的または他の方法、各精査に許容される最大時間（たとえば、５分）、および実行する精査数を入力することができる。
【００２８】
上述の方法および以下に記載する方法により設計されるマルチエピトープ構築物も本明細書では開示される。マルチエピトープ構築物には、エピトープ核酸のサブセット間のスペーサー核酸またはエピトープ核酸のすべてが含まれる。１つまたは複数のスペーサー核酸は、他のスペーサー核酸によってコードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードして、エピトープのプロセシングを最適化し、接合エピトープの存在を最小限に抑えることができる。
【００２９】
定義
本明細書で開示する発明の好ましい実施形態のいくつかを当業者が理解できるようにするために以下の定義を与える。しかし、これらの定義は例示的なものにすぎず、特許請求の範囲に定める本発明の範囲を限定するために使用するのでは決してないことを理解されたい。当業者は、以下の定義をわずかに改変し、そのように改変された定義を利用して本明細書で開示する本発明を理解し実行することができる。当業者に明白なそのような改変は、以下に定める特許請求の範囲に適用することができ、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００３０】
この開示を通して、「結合データ」結果を、しばしば「ＩＣ50」として表す。ＩＣ50は、結合アッセイにおいて、基準ペプチドの結合の５０％の阻害が観測されるペプチド濃度である。アッセイを実施する諸条件（すなわち、限定ＨＬＡタンパク質および標識ペプチド濃度）を与えると、これらの値からＫD値が見積もられる。結合を決定するためのアッセイは、詳細に記載されている（特許文献１、２）。アッセイの諸条件が変われば、使用する個々の試薬（たとえば、ＨＬＡ調製物など）に応じてＩＣ50値は変わることがあり、しばしば劇的に変わり得ることに留意されたい。たとえば、ＨＬＡ分子の濃度が過剰であると、所与のリガンドの見掛け上測定されたＩＣ50が増加する。別法では、結合は、基準ペプチドに対して表される。個々のアッセイの感度がより高くまたはより低くなるにつれ、試験ペプチドのＩＣ50は幾分変化し得るが、基準ペプチドに対する結合は有意には変化しない。たとえば、基準ペプチドのＩＣ50が１０倍に増加するような条件下でのアッセイ試験では、試験ペプチドのＩＣ50値も約１０倍になる。したがって、ペプチドが、良い、中程度の、弱いまたはネガティブなバインダーかどうかの評価は、不明瞭さを避けるため、一般に、標準ペプチドのＩＣ50と比較したそのＩＣ50に基づく。結合は、生細胞（非特許文献３８〜４２）、洗剤溶解物を使用した細胞を含まないシステム（例えば、非特許文献４３）、固定された精製ＭＨＣ（例えば、非特許文献４４、４５）、ＥＬＩＳＡシステム（例えば、非特許文献４６）、表面プラズモン共鳴（例えば、非特許文献４７）、高流量可溶相アッセイ（ｈｉｇｈ  ｆｌｕｘ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｈａｓｅ  ａｓｓａｙｓ）（非特許文献４８）およびクラスＩ  ＭＨＣ安定化またはアセンブリーの測定（例えば、非特許文献４９〜５２）を用いたアッセイシステムを含めた他のアッセイシステムを用いても決定することができる。
【００３１】
エピトープ中の「カルボキシル末端」または「カルボキシル末端位」の残基位置の名称は、ペプチドのカルボキシル末端に最も近いエピトープ末端の残基位置を指し、以下に定義する従来の命名法を用いて呼称される。「Ｃ＋１」はエピトープＣ末端残基の直後の残基または位置を指し、すなわち、エピトープＣ末端の側面に位置する残基を指す。マルチエピトープ構築物のカルボキシル末端にあるエピトープの「カルボキシル末端位」はポリペプチドのカルボキシル末端に実際に対応してもしなくてもよい。好ましい実施形態において、最適化されたマルチエピトープ構築物に使用されるエピトープは、モチーフを有するエピトープであり、エピトープのカルボキシル末端は、特定のモチーフに対応する一次アンカー残基に関して定義される。
【００３２】
エピトープ中の「アミノ末端」または「アミノ末端位」の残基位置の名称は、ペプチドのアミノ末端に最も近いエピトープ末端の残基位置を指し、以下に定義する従来の命名法を用いて呼称される。「Ｎ−１」はエピトープのアミノ末端（位置番号１）でエピトープに隣接する残基または位置を指す。マルチエピトープ構築物のアミノ末端にあるエピトープの「アミノ末端位」はポリペプチドのアミノ末端に実際に対応してもしなくてもよい。好ましい実施形態において、最適化されたマルチエピトープ構築物に使用されるエピトープは、モチーフを有するエピトープであり、エピトープのアミノ末端は、特定のモチーフに対応する一次アンカー残基に関して定義される。
【００３３】
「コンピュータ」または「コンピュータシステム」は、一般には、プロセッサ；たとえば、ハードドライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなどの少なくとも１つの情報記憶／検索装置；たとえば、キーボード、マウス、タッチスクリーンまたはマイクロホンなどの少なくとも１つの入力装置；および表示構造を含む。また、コンピュータは、遠隔ユーザーがネットワークを介してコンピュータと情報交換でき、本明細書に開示するマルチエピトープ構築物の最適化機能を実施できるようなネットワークと通信する通信チャンネルを含むことができる。このようなコンピュータは、上述に記載したものよりも多いまたは少ないものを含むことができる。ネットワークは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）またはワールドワイドウェッブ（たとえば、インターネット）などのグローバルネットワークとすることができる。
【００３４】
本明細書で使用する「構築物」は、一般に、天然には発生しない組成物を示す。構築物は、合成技術、たとえば、組換えＤＮＡ調製およびＤＮＡ発現または核酸もしくはアミノ酸の化学合成技術によって作製することができる。構築物は、得られるものがその形では天然に見られないように、ある材料を別の材料に付加または合併させても作製することができる。「マルチエピトープ構築物」は、「ミニ遺伝子」または「マルチエピトープ核酸ワクチン」という用語と互いに交換して使用することができ、免疫システムにおいて機能する分子、好ましくはクラスＩ  ＨＬＡおよびＴ細胞受容体またはクラスＩＩ  ＨＬＡおよびＴ細胞受容体に結合できる任意の長さのペプチドエピトープをコードする複数のエピトープ核酸が含まれる。マルチエピトープ構築物中のすべてのエピトープ核酸は、クラスＩ  ＨＬＡエピトープまたはクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープをコードすることができる。クラスＩ  ＨＬＡをコードするエピトープ核酸はＣＴＬエピトープ核酸と称し、クラスＩＩ  ＨＬＡをコードするエピトープ核酸はＨＴＬエピトープ核酸と称する。いくつかのマルチエピトープ構築物は、クラスＩ  ＨＬＡエピトープをコードするマルチエピトープ核酸のサブセットおよびクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープをコードするマルチエピトープ核酸の別のサブセットを有することができる。ＣＴＬエピトープ核酸は、好ましくは約８から１３アミノ酸長、より好ましくは約８から約１１アミノ酸長、最も好ましくは約９アミノ酸長のエピトープペプチドをコードする。ＨＴＬエピトープ核酸は、約７から約２３、好ましくは約７から約１７、より好ましくは約１１から約１５、最も好ましくは約１３アミノ酸長のエピトープペプチドをコードすることができる。本明細書に記載するマルチエピトープ構築物は、好ましくは５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上のエピトープ核酸を含む。マルチエピトープ構築物中のエピトープ核酸のすべては、１つの生物体に由来することができ（たとえば、あらゆるエピトープ核酸のヌクレオチド配列はＨＩＶ系中に存在することができる）、あるいはマルチエピトープ構築物は、２つ以上の異なる生物体中に存在するエピトープ核酸（たとえば、ＨＩＶからのいくつかのエピトープとＨＣＶからのいくつかのエピトープ）を含むことができる。「ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）」という用語は、本明細書では特定のマルチエピトープ構築物を称するのに使用する。以下に記述するように、マルチエピトープ構築物中の１つまたは複数のエピトープ核酸には、スペーサー核酸が側面に位置していてもよい。
【００３５】
「マルチエピトープワクチン」は「ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）ワクチン」と同義であり、複数のエピトープを含むワクチンである。
【００３６】
「交差反応性結合」とは、２個以上のＨＬＡ分子がペプチドに結合することを示し、同義語は「縮重結合」である。
【００３７】
「潜在性エピトープ（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、単離したペプチドによる免疫処置によって応答が誘発されるが、エピトープを含む完全な全タンパク質が抗原として使用されるとき、応答はインビトロで交差反応性ではない。
【００３８】
「優性エピトープ（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、未変性の全抗原による免疫化によって免疫応答を誘発するエピトープである（例えば、非特許文献５３参照）。このような応答は、単離したペプチドエピトープとインビトロで交差反応性である。
【００３９】
「エピトープ」は、特定のアミノ酸配列に関しては、特定の免疫グロブリンによる認識に関与する１組のアミノ酸残基、またはＴ細胞に関連しては、Ｔ細胞受容体タンパク質および／または主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）受容体による認識に必要なアミノ酸残基である。インビトロまたはインビボでの免疫システムを設定する際に、エピトープは、１次、２次および３次のペプチド構造、電荷のような分子の集合的な特徴であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体またはＨＬＡ分子によって認識される部位を共に形成する。この開示を通して、エピトープとペプチドを区別なく使用することが多い。しかし、本発明のエピトープよりも大きく、それを含む単離または精製されたタンパク質またはペプチド分子は、依然として本発明の範囲内にあることを理解すべきである。
【００４０】
「フランキング残基」は、エピトープの次に位置する残基である。フランキング残基は、エピトープのＮ末端またはＣ末端に隣接する位置に導入または挿入することができる。
【００４１】
「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」は、ペプチドがＨＬＡ分子に結合してＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発するような対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフ（ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆ）を含むペプチドである。したがって、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し、その後抗原（この抗原から免疫原性ペプチドが誘導される）に対して細胞障害性Ｔ細胞応答またはヘルパーＴ細胞応答を誘発することができる。
【００４２】
「ヘテロクリティック（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ）アナログ」は、本明細書では、所与の投与に対する応答の増大によって、または同じ応答を達成するのに要する量の低下によって測定される特異的Ｔ細胞に対する効力の大きなペプチドとして定義される。ヘテロクリティックアナログの利点として、エピトープがより強力で（同じ効果を達成するのに要する量がより少なくなるので）より経済的になり得ることが挙げられる。また、修飾されたエピトープは、抗原特異的Ｔ細胞無応答性（Ｔ細胞寛容性）を克服するかもしれない。
【００４３】
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（たとえば、非特許文献５４参照）。
【００４４】
本明細書で使用する「ＨＬＡスーパータイプまたはＨＬＡファミリー」は、共有するペプチド結合特異性に基づいて分類される複数のＨＬＡ分子セットを示す。特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに対して同様の結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、このようなＨＬＡスーパータイプに分類される。ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、ＨＬＡファミリーおよびＨＬＡｘｘ様分子（ｘｘは具体的なＨＬＡタイプを示す）という用語は同義語である。
【００４５】
本明細書で使用する、ＨＬＡクラスＩ分子に対する「高親和性」は、ＩＣ50またはＫD値が５０ｎＭ以下の結合として定義され、ＨＬＡクラスＩ分子に対する「中程度の親和性」はＩＣ50またはＫD値が約５０から約５００ｎＭの結合として定義される。ＨＬＡクラスＩＩ分子への結合に対する「高親和性」は、ＩＣ50またはＫD値が１００ｎＭ以下の結合として定義され、ＨＬＡクラスＩＩ分子への結合に対する「中程度の親和性」はＩＣ50またはＫD値が約１００から約１０００ｎＭの結合として定義される。
【００４６】
「ＩＣ50」は、結合アッセイにおいて、基準ペプチドの結合の５０％の阻害が認められるペプチド濃度である。アッセイを実施する諸条件（すなわち、限定ＨＬＡタンパク質および標識ペプチド濃度）に応じて、これらの値からＫD値を見積もることができる。
【００４７】
２つ以上のペプチド配列において「同一の」または百分率が「同一」とは、比較枠にわたり比較して最も一致するように配列したときに、手動整列および目視検査による配列比較アルゴリズムで測定して、同じまたは特定の百分率の同じアミノ酸残基を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００４８】
マルチエピトープ構築物中の特定の位置、たとえば、エピトープのＣ末端にＣ末端側で隣接してアミノ酸残基を「導入すること」とは、所望の残基が特定の位置に、たとえば、エピトープに隣接するように、または有害な残基がエピトープのＣ末端に隣接しないように複数のエピトープを配置することを包含する。この用語は、アミノ酸残基、好ましくは好ましいまたは中程度のアミノ酸残基を特定の位置に挿入することも含む。アミノ酸残基は、１つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することによって配列中に導入することもできる。このような置換は、類推原理（たとえば、特許文献３、４参照）に従って行われることが好ましい。
【００４９】
「単離された」または「生物学的に純粋な」という句は、その自然の状態で見られる材料に通常付随する組成物を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。したがって、本発明に従って単離されたペプチドは、好ましくは、それらのｉｎ  ｓｉｔｕ環境で通常ペプチドに付随する材料を含まない。
【００５０】
「連結（ｌｉｎｋ）」または「接続（ｊｏｉｎ）」とは、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合および静電結合を含む（ただしこれらだけに限定されない）、ペプチドを機能的に結合するための当分野で既知の任意の方法を指す。
【００５１】
「主要組織適合複合体」または「ＭＨＣ」は、生理学的免疫応答を担う細胞相互作用を制御するのにある役割を果たす遺伝子のクラスターである。ヒトにおいては、ＭＨＣ複合体はＨＬＡ複合体としても知られる。ＭＨＣおよびＨＬＡ複合体の詳細な記述は、たとえば、非特許文献５５を参照されたい。
【００５２】
本明細書で使用する、「ペプチドの中間」とは、アミノ末端でもカルボキシル末端でもないペプチドの位置を指す。
【００５３】
本明細書で使用する「最小数の接合エピトープ」とは、無作為選択基準により作成されるよりも少ないいくつかの接合エピトープを指す。
【００５４】
「モチーフ」という用語は、規定の長さのペプチド、通常、クラスＩ  ＨＬＡモチーフでは約８から約１３アミノ酸およびクラスＩＩ  ＨＬＡモチーフでは約６から約２５アミノ酸のペプチド中の残基パターンを指し、これは特定のＨＬＡ分子によって認識される。ペプチドモチーフは、典型的には、各ヒトＨＬＡ対立遺伝子がコードする各タンパク質で異なり、第１および二次アンカー残基のパターンが異なる。
【００５５】
「ネガティブ結合残基」または「有害な残基」は、ペプチドエピトープ中の特定の位置（典型的には、一次アンカー位置ではない）に存在する場合、ペプチドの対応するＨＬＡ分子に対するペプチドの結合親和性を低下させるアミノ酸である。
【００５６】
「最適化」とは、エピトープを分類して接合エピトープの発生を最小限に抑え、エピトープのＣ末端またはＮ末端の側面に位置するフランキング残基を挿入し、スペーサー残基を挿入して接合エピトープの発生をさらに防止し、またはフランキング残基を提供することによって少なくとも１つのエピトープ対を有するマルチエピトープ構築物の免疫原性または抗原性を増加させることを指す。最適化されたマルチエピトープ構築物の免疫原性または抗原性の増加は、最適化パラメータに基づいて構築されていないマルチエピトープ構築物に対して測定され、当業者に既知のアッセイ、たとえば、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫原性の評価、ＥＬＩＳＰＯＴ、インターフェロン−ガンマ放出アッセイ、四量体染色、クロミウム放出アッセイおよび樹状細胞上の提示などを用いる。
【００５７】
「ペプチド」という用語は、本明細書では「オリゴペプチド」と区別なく用いられ、一般に隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボキシル基のペプチド結合によって互いに結合された一連の残基、一般にＬ−アミノ酸を表す。本発明のＣＴＬを誘導する好ましいペプチドは、１３残基長以下であり、一般に約８から約１１残基、好ましくは９または１０残基からなる。ＨＴＬを誘導する好ましいオリゴペプチドは、約５０残基長未満であり、一般に約６から約３０残基、より一般的には約１２から２５、しばしば約１５から２０残基からなる。
【００５８】
「ＰａｎＤＲ結合ペプチドまたはＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチド」は、１を超えるＨＬＡクラスＩＩ  ＤＲ分子を結合する分子ファミリーの一メンバーである。分子のＰＡＤＲＥ（登録商標）ファミリーを規定するパターンは、ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフのようなものと考えることができる。ＰＡＤＲＥ（登録商標）は、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、インビトロおよびインビボでヒトヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答を刺激する。
【００５９】
「薬剤的に許容される」とは、一般に無毒、不活性および／または生理的に適合した組成を指す。
【００６０】
「ＨＬＡクラスＩプロセシング経路に供する」とは、マルチエピトープ構築物が、ＨＬＡクラスＩプロセシング経路によって大いにプロセシングを受けるように細胞に導入されることを意味する。典型的には、マルチエピトープ構築物は、マルチエピトープ構築物をコードする発現ベクターを用いて細胞に導入される。エピトープのクラスＩＩプロセシング経路への進入機序は不明であるが、このようなマルチエピトープ構築物がコードするＨＬＡクラスＩＩエピトープはやはりクラスＩＩ分子上に提示される。
【００６１】
「一次アンカー残基」または「一次ＭＨＣアンカー」は、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子の接点を提供すると理解されるペプチド配列に沿った特定の位置にあるアミノ酸である。規定長のペプチド内の１個から３個、通常２個の一次アンカー残基は一般に免疫原性ペプチドに対する「モチーフ」を規定する。これらの残基は、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｏｖｅｓ）に、それらの側鎖が結合溝の特定のポケットに埋められ密着して入ると理解される。一実施形態において、たとえば、ＨＬＡクラスＩエピトープの一次アンカー残基は、本発明に従い９残基ペプチドエピトープの（アミノ末端の位置から）２位の位置、およびカルボキシル末端位にある。各モチーフおよびスーパーモチーフに対する一次アンカー位置は、たとえば、特許文献４、５の表ＩおよびＩＩＩに記載されている。ほとんどのクラスＩＩエピトープのアンカーにおいて動作し得る好ましいアミノ酸は、１位のＭおよびＦおよび６位のＶ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、ＡおよびＣからなる。クラスＩＩエピトープのほとんどでこれらの位置を占有できる許容されるアミノ酸は、１位のＬ、Ｉ、Ｖ、ＷおよびＹおよび６位のＰ、ＬおよびＩからなる。クラスＩＩエピトープの１位および６位におけるこれらのアミノ酸の有無によって、ＨＬＡ−ＤＲ１、４、７スーパーモチーフが規定される。ＨＬＡ−ＤＲ３結合モチーフは、１位がＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＹおよびＡ、４位がＤ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴ、６位がＫ、ＲおよびＨの群から選択される好ましいアミノ酸によって規定される。他のアミノ酸は、おそらくこれらの位置でも許容されるが、好ましくはない。
【００６２】
また、これらの一次アンカー位置における特定の残基の有無を変えることによってアナログペプチドを生成させることができる。このようなアナログを使用して特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を調節する。
【００６３】
様々なＨＬＡ分子において、異なるペプチドが同じＴ細胞クローンによって認識される場合「無差別認識」が起こる。無差別認識または結合は交差反応性結合と同義である。
【００６４】
「保護免疫応答」または「治療免疫応答」は、病原体または腫瘍抗原から誘導される抗原に対するＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答であり、疾患症状、副作用、または進行を何らかの方法で防止または少なくとも部分的に抑止する。免疫応答には、ヘルパーＴ細胞の刺激によって促進される抗体応答も含めることができる。
【００６５】
「残基」という用語は、アミド結合または擬似アミド結合によってペプチドまたはタンパク質中に組み込まれるアミノ酸または擬似アミノ酸を指す。
【００６６】
「二次アンカー残基」は、ペプチドの一次アンカー位置以外の位置でペプチド結合に影響を及ぼし得るアミノ酸である。二次アンカー残基は、ある位置でランダムなアミノ酸分布によって予想されるよりもかなり多い頻度で結合ペプチド中に存在する。二次アンカー残基は、「二次アンカー位置」に存在するとされる。二次アンカー残基は、高いもしくは中程度の親和性の結合ペプチドまたは高いもしくは中程度の親和性の結合に関連する残基中により多く存在する残基として特定することができる。たとえば、アナログペプチドは、これらの二次アンカー位置にある特定の残基の有無を変えることによって生成させることができる。このようなアナログを用いて、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を細かく調節する。「固定ペプチド」という用語をアナログペプチドを称するのに使用することもある。
【００６７】
「エピトープを分類する」とは、マルチエピトープ構築物におけるエピトープの順序を決定または設計することを指す。
【００６８】
「スペーサー」とは、接合エピトープの発生を防止し、および／またはプロセシングの効率を高めるためにマルチエピトープ構築物中の２つのエピトープ間に挿入される配列を指す。マルチエピトープ構築物は、１つまたは複数のスペーサー核酸を含むことができる。スペーサー核酸は構築物中の各エピトープ核酸の側面に位置することができ、スペーサー核酸対エピトープ核酸の比は、約２対１０、約５対１０、約６対１０、約７対１０、約８対１０または約９対１０とすることができ、約８対１０の比はいくつかの構築物に対して有利な結果を生むように決定されている。
【００６９】
スペーサー核酸は、１つまたは複数のアミノ酸をコードすることができる。マルチエピトープ構築物中のクラスＩ  ＨＬＡエピトープの側面に位置するスペーサー核酸は、好ましくは１から約８アミノ酸長である。マルチエピトープ構築物中のクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープに隣接するスペーサー核酸は、好ましくは５よりも大きく、６、７以上のアミノ酸長、より好ましくは５または６アミノ酸長である。
【００７０】
構築物中のスペーサー数、スペーサー中のアミノ酸数およびスペーサーのアミノ酸組成は、エピトーププロセシングを最適化するようにおよび／または接合エピトープを最少化するように選択することができる。スペーサーは、エピトーププロセシングと接合モチーフを同時に最適化することによって選択することが好ましい。エピトーププロセシングを最適化するために適切なアミノ酸を本明細書に記載する。また、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＨＬＡに対して、構築物中の接合エピトープ数を最少化するのに適切なアミノ酸スペーシングを本明細書に記載する。たとえば、クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープの側面に位置するスペーサーは、一次アンカー残基として一般には知られていないＧ、Ｐおよび／またはＮ残基を含むことが好ましい（たとえば、特許文献４参照）。クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープの側面に位置する特に好ましいスペーサーには、ＧとＰが交互になった残基、たとえば、（ＧＰ）n、（ＰＧ）n、（ＧＰ）nＧ、（ＰＧ）nＰなど（ｎは１から１０の整数、好ましくは２または約２であり、そのようなスペーサーの具体的な例はＧＰＧＰＧである）が含まれる。好ましいスペーサー、特にクラスＩ  ＨＬＡエピトープに対する好ましいスペーサーは、１、２、３個以上の連続したアラニン（Ａ）残基を含む（たとえば、３個の連続したアラニン残基を含むスペーサーを示した図２３Ａを参照されたい）。
【００７１】
いくつかのマルチエピトープ構築物では、各スペーサー核酸が同じアミノ酸配列をコードすることで十分である。同じアミノ酸配列をコードする２つのスペーサー核酸を含むマルチエピトープ構築物では、これらのスペーサーをコードするスペーサー核酸は、同じかまたは異なるヌクレオチド配列を有することができる。この場合、異なるヌクレオチド配列は、マルチエピトープ構築物が細胞に挿入されるときに、意図しない組換え現象が起こる可能性を低下させることが好ましい。
【００７２】
別のマルチエピトープ構築物では、１つまたは複数のスペーサー核酸は異なるアミノ酸配列をコードすることができる。スペーサー核酸の多くがマルチエピトープ構築物中の同じアミノ酸配列をコードすることができる一方で、１、２、３、４、５個以上のスペーサー核酸が異なるアミノ酸配列をコードすることができ、マルチエピトープ構築物中のスペーサー核酸すべてが、異なるアミノ酸配列をコードすることが可能である。本明細書に記載するように、スペーサー配列がエピトーププロセシングを最大にし、および／または接合エピトープを最小限に抑えるかどうかを決定することによって、スペーサー核酸が側面に位置するエピトープ核酸に対してスペーサー核酸を最適化することができる。
【００７３】
マルチエピトープ構築物は、１つの構築物中のスペーサーがエピトーププロセシングを最適化できるかどうかまたは別の構築物よりも接合エピトープを最少化できるかどうかによって互いに区別することができ、さらに、好ましくは、構築物は、１つの構築物が別の構築物よりもエピトーププロセシングおよび接合エピトープに対して同時に最適化される場合に区別することが可能である。エピトーププロセシングおよび接合モチーフに対して構築物が最適化されたかどうかを決定するコンピュータ支援方法ならびにインビトロおよびインビボでの実験室法を本明細書に記載する。
【００７４】
「亜優性（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープ」は、このエピトープを含む全抗原による免疫化についてはほとんどまたはまったく応答を誘起しないが、単離したエピトープによる免疫化ではそれに対する応答を得ることができるエピトープであり、この応答は、（潜在エピトープの場合とは異なり）全タンパク質を用いてインビトロまたはインビボで応答を復活させたときに検出される。
【００７５】
「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるＨＬＡ分子が共有する結合特異性を提供するペプチドに対するアミノ酸配列である。スーパーモチーフを有するペプチドは、２つ以上のＨＬＡ抗原によって（本明細書で定義される）高親和性または中程度の親和性で認識されることが好ましい。
【００７６】
「合成ペプチド」は、天然には存在しないが、化学合成、組換えＤＮＡ技術などの方法を用いて合成されるペプチドである。
【００７７】
「ＴＣＲコンタクト残基」または「Ｔ細胞受容体コンタクト残基」は、Ｔ細胞受容体により結合されると考えられるエピトープ中のアミノ酸残基である。これらは、本明細書では何れの一次ＭＨＣアンカーとしても定義されていない。Ｔ細胞受容体コンタクト残基は、野生型ペプチドで誘導されるＴ細胞認識に対して、試験したアナログすべてがＴ細胞認識を誘導するペプチド中の位置／複数の位置として定義される。
【００７８】
本明細書で使用する「相同」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度を指す。核酸が別の核酸と同じヌクレオチド配列を有するとき、「同一（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という語が「相同」という語に置き換わることができる。配列の相同性および配列の同一性は、高ストリンジェンシーおよび／または低ストリンジェンシー下でのハイブリダイゼーション試験によっても決定することができ、本明細書で開示するのは低ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー下でマルチエピトープ構築物にハイブリダイズする核酸である。また、配列の相同性および配列の同一性は、当分野で既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いて配列を解析することによって決定することができる。このような方法は、本明細書で開示するマルチエピトープ構築物に核酸が同一または相同であるかどうかを評価するのに使用される。本発明の一部は、本明細書に開示するマルチエピトープ構築物のヌクレオチド配列に８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上同一なヌクレオチド配列に関する。
【００７９】
本明細書で使用する「ストリンジェント条件」という用語は、ヌクレオチド配列と開示したマルチエピトープ構築物のヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能にする諸条件を指す。適切なストリンジェント条件は、たとえば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション各溶液中の塩またはホルムアミドの濃度やハイブリダイゼーション温度によって規定することができ、当分野では周知である。特に、塩濃度を低下させ、ホルムアミド濃度を増加させ、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによってストリンジェンシーを上げることができる。たとえば、高ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションは、約３７℃から４２℃の約５０％ホルムアミド中で起こりうる。特に、ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳおよびせん断され変性されたサケ精子ＤＮＡ２００μｇ／ｍｌ中４２℃、または５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸および変性せん断サケ精子ＤＮＡ２０μｇ／ｍｌを含む溶液中４２℃の高ストリンジェンシー条件下で起こり、次いで０．１×ＳＳＣ中約６５℃でフィルターを洗浄する。ハイブリダイゼーションは、約３５％から２５％のホルムアミド中約３０℃から３５℃のストリンジェンシーを下げた条件下で行うことができる。たとえば、低下させたストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳおよびせん断変性サケ精子ＤＮＡ２００μｇ／ｍｌ中３５℃とすることができる。特定のレベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、対象とする核酸のプリン対ピリミジンの比を計算し、それに応じて温度を調節することによってさらに狭めることができる。上記範囲と条件が変動することは当分野では周知である。
【００８０】
ハイブリダイゼーション試験を利用して配列の同一性または配列の相同性を評価することに加え、既知のコンピュータプログラムを使用して特定の核酸が本明細書に開示するマルチエピトープ構築物と相同かどうかを決定することができる。このようなプログラムの例は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１）であり、他の配列整列プログラムも当分野で既知であり、２つ以上のヌクレオチド配列が相同かどうかを決定するのに利用することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、非特許文献５６の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて２つの配列間の相同の最良のセグメントを見つける。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の任意の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、たとえば、基準配列に対して９５％同一かどうかを決定するときに、基準ヌクレオチド配列の全長にわたって同一性百分率が計算され、基準配列中のヌクレオチド総数の５％までの相同性の相違が許容されるように各パラメータを設定することができる。
【００８１】
ペプチド化合物を記述するのに使用する命名法では、通例に従い各アミノ酸残基のアミノ基が左（Ｎ末端）およびカルボキシル基が右（Ｃ末端）にある。エピトープ中のアミノ酸残基位置を呼称するときには、アミノからカルボキシル方向へ番号が付けられ、エピトープまたはそれが一部となり得るエピトープのペプチドまたはタンパク質のアミノ末端に最も近い位置が１位である。本発明で選択した具体的な実施形態を示す式では、アミノ末端基およびカルボキシル末端基を具体的には示していないが、別段の指定がない限り生理的ｐＨ値で想定される形である。アミノ酸の構造式では、各残基は一般に標準の３文字または１文字の名称で表される。アミノ酸残基のＬ体は、大文字の単一文字または３文字記号の大文字の第１文字で表され、Ｄ体を含むこれらのアミノ酸のＤ体は、小文字の単一文字または小文字３文字の記号で表される。グリシンは、不斉炭素原子を含まず単に「Ｇｌｙ」またはＧと称する。アミノ酸の記号を以下に示す。
【００８２】
【表１】
2005502320.tif 000003
【００８３】
アミノ酸の「化学特性」を、芳香族（Ｆ、Ｗ、Ｙ）、脂肪族疎水性（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ）、低極性（Ｓ、Ｔ、Ｃ）、高極性（Ｑ、Ｎ）、酸性（Ｄ、Ｅ）、塩基性（Ｒ、Ｈ、Ｋ）、プロリン、アラニンおよびグリシンで定義する。
【００８４】
本明細書で使用する頭字語は以下の通りである。
ＡＰＣ：            抗原提示細胞
ＣＤ３：            ＰａｎＴ細胞マーカー
ＣＤ４：            ヘルパーＴリンパ球マーカー
ＣＤ８：            細胞障害性Ｔリンパ球マーカー
ＣＥＡ：            癌胎児抗原
ＣＦＡ：            完全フロイントアジュバント
ＣＴＬ：            細胞障害性Ｔリンパ球
ＤＣ：              樹状細胞。ＤＣは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来のモデルペプチドに特異的なＣＴＬ系（ＣＴＬ  ｌｉｎｅｓ）からのサイトカイン放出を刺激することによって強力な抗原提示細胞として機能した。ＨＢＶペプチドエピトープと共にエクスビボで間欠投与されるＤＣをを用いたインビトロ実験では、未処置マウスにインビトロで送達された後、ＣＴＬ免疫応答が刺激された。
ＤＭＳＯ：          ジメチルスルホキシド
ＥＬＩＳＡ：        酵素結合免疫吸着検定法
Ｅ：Ｔ：            エフェクター：標的比
ＦＣＳ：            ウシ胎児血清
Ｇ−ＣＳＦ：        顆粒球コロニー刺激因子
ＧＭ−ＣＳＦ：      顆粒球マクロファージ（単球）コロニー刺激因子
ＨＢＶ：            Ｂ型肝炎ウイルス
ＨＥＲ２／Ｎｅｕ：  ｃ−ｅｒｂＢ−２
ＨＬＡ：            ヒト白血球抗原
ＨＬＡ−ＤＲ：      ヒト白血球抗原クラスＩＩ
ＨＰＬＣ：          高速液体クロマトグラフィ
ＨＴＣ：            ヘルパーＴ細胞
ＨＴＬ：            ヘルパーＴリンパ球
ＩＤ：              同一性
ＩＦＡ：            不完全フロイントアジュバント
ＩＦＮγ：          インターフェロンガンマ
ＩＬ−４：          インターロイキン４サイトカイン
ＩＶ：              静脈内
ＬＵ30%：          １００：１（Ｅ：Ｔ）比で３０％溶解を達成するのに要する
細胞障害活性
ＭＡｂ：            モノクローナル抗体
ＭＡＧＥ：          メラノーマ抗原
ＭＬＲ：            混合リンパ球反応
ＭＮＣ：            単核細胞
ＰＢ：              末梢血
ＰＢＭＣ：          末梢血単核球細胞
ＳＣ：              皮下
Ｓ．Ｅ．Ｍ．：      平均値の標準誤差
ＱＤ：              １日１回投与
ＴＡＡ：            腫瘍関連抗原
ＴＣＲ：            Ｔ細胞受容体
ＴＮＦ：            腫瘍壊死因子
ＷＢＣ：            白血球
【００８５】
本出願は、１９９３年３月５日に出願され現在は放棄されている０８／０２７，１４６号の一部継続出願である、１９９３年６月４日に出願され現在は放棄されている０８／０７３，２０５号の一部継続出願である、１９９３年１１月２９日に出願され現在は放棄されている０８／１５９，１８４号の一部継続出願である、１９９４年３月４日に出願された米国出願番号第０８／２０５，７１３号の一部継続出願である、１９９８年１１月１０日に出願された米国出願番号第０９／１８９，７０２号に関連していると考えられる。本出願は、現在は放棄されている米国出願番号第６０／０１３，１１３号の利益を請求している、米国出願番号第０８／８１５，３９６号の一部継続出願である、米国出願番号第０９／２２６，７７５号にも関係している。さらに、本出願は、放棄された米国出願番号第０８／５８９，１０８号の一部継続出願である、米国出願番号第０９／０１７，７３５号；米国出願番号第０８／７５３，６２２号、米国出願番号第０８／８２２，３８２号、放棄された米国出願番号第６０／０１３，９８０号、米国出願番号第０８／４５４，０３３号、米国出願番号第０９／１１６，４２４号および米国出願番号第０８／３４９，１７７号に関係している。本出願は、米国出願番号第０９／０１７，５２４号、米国出願番号第０８／８２１，７３９号、放棄された米国出願番号第６０／０１３，８３３号、米国出願番号第０８／７５８，４０９号、米国出願番号第０８／５８９，１０７号、米国出願番号第０８／４５１，９１３号、米国出願番号第０８／１８６，２６６号、米国出願番号第０９／１１６，０６１号、および放棄された米国出願番号第０７／９２６，６６６号の一部継続出願である、放棄された米国出願番号第０８／０２７，７４６号の一部継続出願である、放棄された米国出願番号第０８／１０３，３９６号の一部継続出願である、米国出願番号第０８／１５９，３３９号の一部継続出願である、米国出願番号第０８／３４７，６１０号にも関係している。本出願は、米国出願番号第０９／０１７，７４３号、米国出願番号第０８／７５３，６１５号；米国出願番号第０８／５９０，２９８号、米国出願番号第０９／１１５，４００号および放棄された米国出願番号第０８／２７８，６３４号の一部継続出願である、米国出願番号第０８／３４４，８２４号の一部継続出願である、米国出願番号第０８／４５２，８４３号にも関連していると考えられる。本出願は、米国仮出願番号第６０／０８７，１９２号、および放棄された米国出願番号第６０／０３６，７１３号および放棄された米国出願番号第６０／０３７，４３２号の一部継続出願である、米国出願番号第０９／００９，９５３号にも関係していると考えられる。また、本出願は、米国出願番号第０９／０９８，５８４号および米国出願番号第０９／２３９，０４３号にも関係している。本出願はおそらく、２０００年５月３０日に出願された同時継続中の米国出願番号第０９／５８３，２００号、１９９９年３月１日に出願された米国出願番号第０９／２６０，７１４号および２０００年１０月６日に出願された米国仮出願「Ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ  Ａｎａｌｏｇｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、代理人整理番号０１���６２３−０１５８１０ＵＳにも関連していると考えられる。上記出願のすべてを参照により本明細書に組み込む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８６】
以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。図面を通して同一の要素を同一の符号で参照する。本発明は、最適化された免疫原性を有するマルチエピトープワクチンを設計する方法およびシステムに関する。好ましい実施形態において、ワクチンはＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを含む。本発明によるワクチンは、特定の民族に偏らない人種に有効に適用でき、異なるウイルスまたは他の抗原性単離物のなかで保存されているエピトープに焦点を合わせることが好ましい。本明細書に開示する方法およびシステムにより、ワクチンは応答の大きさおよび幅に関して最適化され、最も簡単なエピトープ構成を可能にすることができる。最後に、ヒトのマルチエピトープワクチンの免疫原性を評価する一般的な方法を提供する。
【００８７】
本発明の方法は、本明細書で明らかにする原理に基づいてマルチエピトープ構築物を設計することを含む。一実施態様において、本発明は、単一のプロモーターマルチエピトープ構築物を用いて、特異的なＣＴＬおよびＨＴＬ各エピトープに対する各応答を同時に誘発する。このような構築物は、多数の、好ましくは１０を超える、しばしば２０を超え、２５、３０、２５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０以上の異なるエピトープを含むことができる。
【００８８】
好ましい一実施形態において、以下の機能および／または解析を実施することによって、コンピュータシステムは１つまたは複数の最適なマルチエピトープ構築物を同定する。
（ｉ）マルチエピトープ構築物に組み込むべきエピトープを分類して、形成される接合エピトープの数を最少化する順番を提供する。この分類操作を図１１および１２を参照して以下により詳細に考察する。エピトープを順位付けるのに２番目に検討すべき事項として、エピトープのＮ末端にあるＣＴＬ免疫原性を高める残基を別のＣＴＬエピトープのＣ末端に並置するようにエピトープを配置することが好ましい。
（ｉｉ）免疫原性を高めるフランキング残基を、エピトープのフランキング位置（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）に挿入することができる。特定の実施形態では、ＣＴＬエピトープのＣ＋１位にフランキング残基を挿入する。
（ｉｉｉ）エピトープ間にスペーサー配列を挿入して接合エピトープが発生するのを防止することができる。特定の実施形態において、スペーサー配列は免疫原生を高める残基を、この残基がＣＴＬエピトープのＣ末端の側面に位置するように、リンカーのＮ末端に含むこともできる。
【００８９】
ＨＴＬ接合エピトープを防止する特定の実施形態では、既知の任意のＨＬＡクラスＩＩアンカー残基に対応しないアミノ酸残基で構成されるスペーサーを使用する。たとえば、ＧとＰが交互の残基（ＧＰスペーサー）を２つのＨＴＬエピトープ間に入れる。
【００９０】
本発明の別の実施態様は（上記検討事項（ｉｉ））、エピトープの側面の位置、たとえば、エピトープのＣ末端に隣接する位置で特定のアミノ酸残基を導入または置換し、それによって、その部位に導入または置換された特定の残基を含まない構築物、すなわち、最適化されていないマルチエピトープ構築物よりも抗原性および免疫原性が高いマルチエピトープ構築物を生成させる。マルチエピトープ構築物を最適化する方法は、フランキング残基、好ましくはＫ、Ｎ、Ｇ、ＲまたはＡを、エピトープのＣ＋１位、すなわち、エピトープのＣ末端に隣接する位置に導入するステップを含む。別の実施形態では、免疫原性の低下に寄与する残基、すなわち、負に帯電した残基、たとえば、Ｄ、脂肪族残基（Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ）または芳香族非トリトファン残基を置換する。適したフランキング残基を与えるように適切なエピトープを配置することによって、または特定の残基を挿入することによって、フランキング残基を導入することができる。
【００９１】
背景技術の項で述べたように、最高１０個のエピトープをコードするマルチエピトープ構築物（ミニ遺伝子）を使用して、いくつかの異なるエピトープに対する応答を誘発した。実験的なマルチエピトープ構築物ｐＭｉｎ．１に関係するデータが発表された（非特許文献７）。本明細書は、対象とする無数の疾患の徴候を扱う、最適化された免疫原性を有するマルチエピトープ構築物を設計し評価するためのパラメータを開示する。
【００９２】
いくつかの研究に基づいて設計パラメータを特定した。マルチエピトープ構築物の予備評価では、各２０から２５個の異なるＣＴＬエピトープを導入した３つの異なるマルチエピトープ構築物に関するデータを提供する（図１）。１個の構築物は、ＨＩＶによって誘導されるエピトープに基づき（ＨＩＶ−１）、他の２個は、ＨＣＶによって誘導されるエピトープが組み込まれている（それぞれＨＣＶ１およびＨＣＶ２）。Ａ２またはＡ１１  ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいてこれらの異なるマルチエピトープ構築物の免疫原性を測定した（Ａ１、Ａ２４およびＢ７限定エピトープは評価しなかった）。
【００９３】
すなわち、単一のｉ．ｍ．ＤＮＡワクチン注射から１１日後、６日間のインビトロでの単一の再刺激後に、ＣＴＬ活性（本明細書に記載するクロミウム放出またはｉｎ  ｓｉｔｕでのＩＦＮ産生）を測定するアッセイを利用して、８から１４個の異なる代表的なエピトープに対する応答を評価した。ＨＩＶ−１、ＨＣＶ１およびＨＣＶ２それぞれの場合において、試験したエピトープの６／８（７５％）、１０／１４（７２％）および１３／１４（９３％）で、エピトープ特異的ＣＴＬの初回抗原刺激を実証することができた。したがって、多数のエピトープに対してＣＴＬ応答を同時に初回抗原刺激可能なマルチエピトープ構築物を容易に設計することができる。しかし、エピトープに対するＣＴＬ初回抗原刺激が検出されないものもあり、考察した３６例のうちのいくつかでは応答が稀でありまたは少なくとも３桁（１０００倍）以上大きく変動したことは重要視すべきである。これらの結果から、マルチエピトープ構築物をより慎重に解析し、最適化する必要があることが強く示唆された。
【００９４】
特定のエピトープに対する最適以下の初回抗原刺激性能が、マルチエピトープ構築物のサイズに関係する可能性も検討した。実際、発表された報告のほとんどは最高１０個のエピトープからなるマルチエピトープ構築物について述べられており、２０エピトープの構築物を報告している数少ない例では、わずか２つまたは３つのエピトープに対する活性しか測定されていない。この可能性に取り組むために、各々１０個のエピトープを含み、ＨＩＶ−１  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）の半分に相当する２つのより小さなＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）（ＨＩＶ−１．１およびＨＩＶ−１．２）を合成し試験した。４個の代表的なエピトープに対する応答を測定した。
【００９５】
【表２】
2005502320.tif 000004
【００９６】
より小さなＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）によって誘発される応答は、２０エピトープ構築物によって誘発される応答と同等か、どちらかといえば小さいことが判明した（表１）。したがって、ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）サイズに関係する因子は、特定のエピトープに対して観測された最適以下の初回抗原刺激の説明にはなりそうになく、したがって本明細書に開示する他のパラメータを用いて有効なマルチエピトープ構築物を設計する。
【００９７】
接合モチーフの最少化
マルチエピトープ構築物の設計における検討事項の１つは、エピトープを互いに隣接して配置したときに接合エピトープが意図せずに生成することである。マルチエピトープ構築物におけるこのようなエピトープの存在は、性能に有意な影響を及ぼし得る。この望ましくない効果に対する防御戦略を、マルチエピトープワクチンの開発に適用するために本明細書に開示する。接合エピトープは、エピトープを分類して接合エピトープ数が最少になる順番を特定することによってまず最少化できる。このような分類操作はコンピュータを用いて、または、必要であれば、マルチエピトープ構築物中に含まれるエピトープ数に応じて目視により実施することができる。
【００９８】
たとえば、パターンを見つけるコンピュータプログラム、たとえば、ＰｒｏＶＵＥ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｂｅａｃｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．が作製したＰａｎｏｒａｍａを、本発明の一実施形態に従って使用することができる。特定のマルチエピトープ構築物を設計するのに極めて多数の様々なエピトープの整列を考慮することができる。コンピュータプログラムは、考慮する特定のエピトープセットおよびモチーフを有する接合エピトープがあるかどうかを評価するためにスキャンすべきこれらのモチーフを入力として受け取る。たとえば、プログラムは、マルチエピトープ構築物の作製をシミュレートすることができ、発見的（ｅｕｒｉｓｔｉｃ）計算アルゴリズムでは、エピトープ対を調べて接合モチーフの発生を回避または最少化することができる。このプログラムは、たとえば、毎秒６×１０5（百万の約半分）のマルチエピトープ構築物の構成を評価できる。
【００９９】
前段落に記載したコンピュータプログラムを用いて１０エピトープ構築物を完全に解析するには、１０の階乗≒３．６×１０6の組合せを調べる必要があり、６秒で完了することができる。１４エピトープ構築物を、２、３日で完全に解析することができる。したがって、考慮する構築物がより大きくなるにつれ解析時間は極めて急速に増加する。しかし、完全な解析が常に必要なわけではなく、任意の所望の時間プログラムを走らせることができる。いずれの場合でも、本発明のコンピュータシステムは、最小数の接合エピトープを有する少なくとも１つの構成を同定し提供する。
【０１００】
この種の手法による結果の例を表２に示す。２日間のコンピュータ解析の結果として、２５個のエピトープを組み込んだＨＣＶ１  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）中に含まれる同じエピトープの異なる１０個の無作為分類における接合モチーフ数をこの表に示す。最適化されていない分類では、２５から３８個、平均３１個の多数のＡ２、Ａ１１およびＫｂモチーフが見出された。これに比べＨＣＶ  １  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）の分類ではこのような接合モチーフはわずか２つしか存在しない。結論として、コンピュータプログラムを利用して、マルチエピトープ構築物中に存在する接合モチーフの数を効果的に最少化することができる。
【０１０１】
【表３】
2005502320.tif 000005
【０１０２】
クラスＩＩ接合エピトープの除去およびインビボでのクラスＩＩ限定応答試験
接合エピトープを除去する別の要素として、並置したときに接合エピトープを生成する２つのエピトープ間にスペーサー配列を挿入することができる。
【０１０３】
一実施形態において、ＨＴＬエピトープに対する接合エピトープの問題を正すために、スペーサー、たとえば５アミノ酸長のスペーサーを２つのエピトープ間に挿入する。このようなスペーサーに組み込まれたアミノ酸残基は、ＨＬＡクラスＩＩ結合モチーフのいずれに対しても一次アンカー残基として知られていないアミノ酸残基であることが好ましい。このような残基にはＧ、ＰおよびＮが含まれる。好ましい実施形態では、配列がＧＰＧＰＧのスペーサーを２つのエピトープ間に挿入する。以前の研究から、クラスＩＩ結合相互作用を中断するのにＧＰスペーサーが特に有効であることが示されている（非特許文献５７）。既知のヒトクラスＩＩ結合モチーフおよびマウスＩＡb（ＨＬＡトランスジェニックマウスによって発現されるクラスＩＩ）すべてが、４残基離隔して位置する主要なアンカー位置にＧもＰも受け容れない。この手法は、クラスＩＩ限定エピトープが接合エピトープとして形成されないことを事実上保証するものである。
【０１０４】
この設計の検討を有効にする例において、本発明者らは、ＨＩＶ誘導ＨＴＬエピトープを組み込んだポリペプチドを合成した。これらのエピトープは、広範な交差反応性のＨＬＡ  ＤＲ結合エピトープである。次いで、これらのエピトープがネズミＩＡbクラスＩＩ分子にも効率的に結合することを確認した。図２ａに、検討した２つの異なる合成ポリペプチドを例示する図を示す。
【０１０５】
第１の構築物は、直線状に配列された４個の異なるエピトープを取り込み、一方、第２の構築物はＧＰＧＰＧスペーサーを取り込む。３個の潜在的な接合エピトープに相当する合成ペプチドも合成した。
【０１０６】
ＩＡb陽性マウス中の様々なエピトープに対して増殖性反応を示すかどうかこれらの異なる構築物２ｎＭの初回抗原刺激能力を試験し、等モル量の同じペプチドのプール（各ペプチド３μｇ）によって誘発される応答と比較した。具体的には、３匹のマウスのグループにＣＦＡエマルジョンで希釈したペプチドを注射し、注射から１１日後にそれらのリンパ節細胞をその後３日間インビトロで培養し、培養の最後の２４時間にチミジン取り込みを測定した。それらの高い親和性ＩＡb結合能力に基づいて予想されるように、４個のエピトープすべてが良好な増殖性反応を誘発することが判明した（図２ｂ）。これらのペプチドをプールして注射すると、刺激指数（ＳＩ）値は４．９から１７．９の範囲に認められた。しかし、同じエピトープを組み込んだ線形ポリペプチドを試験すると、Ｐｏｌ  ３３５に対する応答が消失した。これは、Ｇａｇ  １７１とＰｏ１  ３３５にまたがる接合エピトープに対する応答の出現を伴った。ＧＰＧＰＧスペーサーを使用すると、おそらくは接合エピトープが破壊されＰｏｌ  ３３５応答が回復することにより、この問題は解消した。認められた応答は、単離したペプチドのプールで認められた応答と同様の大きさであった。
【０１０７】
これらの結果は、複数のＨＩＶで誘導されたクラスＩＩエピトープに対する応答を同時に誘発できることを示し、ＨＴＬエピトープ候補を取り込んだ様々な構築物の免疫原性を検討するために、ＩＡb／ＤＲ交差反応性がどのように利用できるかも説明する。結局、適切なスペーサーは、これを使用しないと効果的なワクチン免疫原性を妨害するクラスＩＩ接合エピトープを効果的に破壊するのに使用できることをこれらの結果は示している。
【０１０８】
クラスＩ限定応答の場合、天然に存在する接合エピトープおよびその結果起こるエピトープ特異的応答の阻害の一例がＭｃＭｉｃｈａｅｌおよび共同研究者らによって示された（非特許文献５８）。クラスＩに対する接合エピトープの問題に対処するために、同様の解析を行うことができる。たとえば、特定のコンピュータプログラムを使用して、選択したネズミモチーフならびに最も一般的なヒトクラスＩ  ＨＬＡ  ＡおよびＢモチーフをスクリーニングすることによって、可能なクラスＩ限定接合エピトープを同定する。
【０１０９】
スペーサー配列を同様に使用して、ＣＴＬ接合エピトープを防止することもできる。ＡやＧなどの極めて小さな残基は、好ましいスペーサー残基であることが多い。Ｇは、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの好ましい一次アンカー残基（例えば特許文献６参照）としても比較的稀に見られる。これらのスペーサーは、長さを変えることができ、たとえば、スペーサー配列は一般に１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸残基長とすることができ、これより長いときもある。マルチエピトープ構築物を作製する際の物理的制約のために、長さはより短い方が好ましいことが多い。
【０１１０】
ＣＴＬマルチエピトープ構築物の免疫原性に関するフランキング領域の影響
マルチエピトープ構築物を設計する際に検討すべき別の因子は、ＣＴＬエピトープのＣ末端の側面の位置に免疫原性に有利な残基を挿入することである。
【０１１１】
免疫原性を高める残基、したがって、マルチエピトープ構築物に挿入して免疫原性を最適化する残基を同定する研究を本明細書で開示する。
【０１１２】
エピトープが発現される分子環境は、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいてそのエピトープに特異的なＣＴＬの初回抗原刺激の頻度および／または大きさに劇的な影響を及ぼすことが多い。表３にその２つの例を示す。
【０１１３】
【表４】
2005502320.tif 000006
【０１１４】
ｐＭｉｎ５  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）において発現されたＨＢＶ  Ｃｏｒｅ  １８エピトープの免疫原性は、大きさがｐＭｉｎ  １  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）の場合に認められるものの約１／２００である。同様に、ＨＣＶ１  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）において発現されるＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  １３２エピトープの免疫原性はほんのわずかであり、実施された異なる１２の独立したＣＴＬ実験／培養のうちわずか２つでしか有意なＴ細胞初回抗原刺激が確認されなかった。これら２つの陽性実験は、約１００ＳＵのＩＦＮγの応答を生じた。しかし、同じエピトープがＨＣＶ２  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）において発現されたときは、１７／１８の例で陽性反応が認められ、平均の大きさは約５倍高かった。
【０１１５】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−ＦＴの免疫原性
ＨＩＶマルチエピトープＤＮＡワクチンＨＩＶ−ＦＴ（図３ａ）は、２０個のＨＩＶ由来ＣＴＬエピトープをコードする。これら２０個のエピトープのうち、８個はＨＬＡ−Ａ*０２０１、９個はＨＬＡ−Ａ*１１０１、３個はＨＬＡ−Ｂ*０７０２によって限定される。すべてのエピトープがそれらの該当する限定エレメント（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に高い親和性または中程度の親和性で結合した。ＨＬＡ−Ａ*０２０１限定エピトープのすべてが、精製ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子に、ほぼ同じ親和性で結合し、ＩＣ50値は１９〜１９２ｎＭの範囲であった（図３ａ）。ＨＩＶ−ＦＴに含まれるように選択されたＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープは、ＨＩＶ−１感染個体に認識され、ＩＦＡと共に乳化し、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスを初回抗原刺激するのに利用したとき、ＣＴＬ応答を復活させるための初回抗原刺激に極めて有効でもあった。この構築物は、複数のエピトープをそれらの間にスペーサー配列を介在させずに順次コードするように設計されており、コンセンサスＩｇκシグナル配列がこの構築物の５'端に融合して、コードされた抗原が小胞体中に輸送されるのを促進した（非特許文献７）。
【０１１６】
ＨＩＶ−ＦＴが復活ＣＴＬ応答をインビボで初回抗原刺激できるかどうかを、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスの筋肉内免疫処置によって評価した。ＨＩＶ−ＦＴプラスミドＤＮＡ１００μｇで免疫した動物から採取したひ細胞を、ＨＩＶ−ＦＴ中にコードされた各ＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープで刺激し、培養６日後のペプチド特異的ＣＴＬ活性を分析した。ＨＩＶ−ＦＴ中の３個のエピトープに対する代表的なＣＴＬ応答を図４ａに示す。様々な実験からの結果をより便利に編集するために、各ひ細胞培養物に対する細胞障害百分率を細胞溶解単位で表した（非特許文献５９）。ＨＩＶ−ＦＴ中にコードされた８個のＨＬＡ−Ａ*０２０１限定エピトープのうち、Ｐｏｌ  ４９８、Ｅｎｖ  １３４、Ｐｏｌ  ４４８、Ｖｐｒ  ６２、Ｎｅｆ  ２２１およびＧａｇ  ２７１をＤＮＡ免疫処置後にＣＴＬ応答に対して初回抗原刺激した（図４ｂ）。ＣＴＬ応答の大きさは、Ｐｏ１  ４９８に対する約５０ＬＵ程度の高さから、Ｎｅｆ  ２２１およびＧａｇ  ２７１に対する４ＬＵ程度まで１０倍以上変わった。同様に、復活ＣＴＬ応答の頻度はエピトープ間で変わり、Ｐｏｌ  ４９８エピトープが実験の９４％で応答を誘発した一方で、Ｇａｇ  ２７１に対するＣＴＬ応答は実験のわずか３１％でしか検出されなかった。結論として、いずれのスペーサーアミノ酸なしにエピトープを順次コードするＨＩＶ−ＦＴによるＤＮＡ免疫処置は、解析したエピトープの大多数に対して復活ＣＴＬ応答を誘発した。しかし、応答の大きさおよび頻度はエピトープ間で大きく変動した。
【０１１７】
トランスフェクションした細胞系におけるエピトープ免疫原性とＨＩＶ−ＦＴエピトープ提示レベルとの間の相関
次に、ＨＩＶ−ＦＴ中のＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの免疫原性の差を評価した。特異なＭＨＣ結合親和性は、エピトープのすべてがＨＬＡ−Ａ*０２０１に高い親和性で結合したので除外することができた（図３ａ）。また、ＩＦＡ中で乳化し最適に前処理したペプチドでＨＬＡトランスジェニックマウスを免疫した後、エピトープすべてが同等のＣＴＬ応答を示したことから、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスにおけるＴＣＲ特異性の適切なレパートリーの欠如は除外することができた。Ｔ細胞認識に対して提示される各エピトープの相対量の変化は、エピトープの免疫原性の差に原因がある可能性がある。
【０１１８】
これを試験するため、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子を発現するヒトＴ細胞系のジャーカット細胞（非特許文献６０）をエピソームベクター中で発現されたＨＩＶ−ＦＴでトランスフェクションした。ヒトとマウスのプロセシング能力の潜在的な差に関連し得る任意の可能な人為産物を排除するために使用するため、ヒト細胞系を選択した。このトランスフェクションされた細胞系は、ヒトＭＨＣ提示をヒト抗原プロセシング能力と調和させ、ヒトに使用するＣＴＬエピトープ系ＤＮＡワクチンのその後の開発を支援するものである。
【０１１９】
ペプチド特異的ＣＴＬ系は、ＨＩＶ−ＦＴ中にコードされているＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープのうち４個のトランスフェクションされた標的、即ちＰｏｌ  ４９８、Ｅｎｖ  １３４、Ｐｏｌ  ４４８およびＮｅｆ  ２２１で提示を検出した。これらのエピトープのそれぞれが生成され提示されるレベルを定量化するために、トランスフェクションしていない標的および可変量の各エピトープまたはペプチドと共に様々なエピトープに特異的なＣＴＬ系をインキュベートした。これらのＣＴＬ用量応答曲線を標準曲線として利用して、ＨＩＶ−ＦＴをトランスフェクションした標的細胞に応答して観測されるのと同じレベルのＩＦＮγ分泌を誘発するペプチド濃度を決定した。この値を「ペプチド同等用量（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｄｏｓｅ）」と称し、トランスフェクション細胞上で提示されるエピトープの相対的な尺度とする。
【０１２０】
表４は、ＨＩＶ−ＦＴ中にコードされる８個のＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープに対するこの解析の知見を要約したものである。ペプチド同等用量は、Ｎｅｆ  ２２１の高い３３．３ｎｇ／ｍｌからエピトープＧａｇ  ２７１、Ｇａｇ  ３８６およびＰｏｌ  ７７４の０．４ｎｇ／ｍｌ未満のペプチド同等量まで変動した。これらの結果を累積すると、ＨＩＶ−ＦＴをトランスフェクションしたヒト細胞系では、異なるＨＬＡ−Ａ*０２０１限定エピトープの提示レベルにおいて少なくとも１００倍の変動が存在することが示される。抗原性アッセイにおいて検出可能レベルで提示されたエピトープすべてが、インビボでも免疫原性であった。免疫原性であるが抗原性ではない唯一のエピトープはＧａｇ  ２７１であった。この場合、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫｂトランスジェニックマウスのＨＩＶ−ＦＴによる免疫化は、試験培養物の１／３未満の弱いＣＴＬ応答を誘発した。抗原性解析に対して感度限界以下で提示された他の２つのエピトープＧａｇ  ３８６およびＰｏｌ  ７７４は非免疫原性であった。結論として、これらの結果は、ＨＩＶ−ＦＴ免疫化によって誘発されるＣＴＬ応答の不均一性が、少なくとも部分的には最適以下のエピトープ提示に起因することを示唆している。
【０１２１】
【表５】
2005502320.tif 000007
【０１２２】
フランキングアミノ酸は、ワクチン接種後のＣＴＬエピトープのインビボでの免疫原性に影響を及ぼす
本明細書に記載するように、個々のＣＴＬエピトープの側面に位置する特定のアミノ酸は、タンパク質分解的な切断に対する抗原の感受性を変えることによって、エピトープがプロセシングを受ける効率に影響を及ぼすか、またはそれを促進する１つの因子となる。エピトープ免疫原性に対するフランキングアミノ酸の影響を調べるために、配列を中断することなく最小限のＣＴＬエピトープをコードするいくつかの無関係な実験的マルチエピトープＤＮＡ構築物で免疫したＨＬＡ−Ａ*０２０１、−Ａ*１１０１および−Ｂ*０７０１トランスジェニックマウスから免疫原性データを得た。９４個の異なるエピトープ／フランキング残基の組合せを表わすデータベースを編集して、エピトープ免疫原性に関し、すぐ側面に位置するアミノ酸の可能な影響を決定した。所与のエピトープとフランキングアミノ酸の組合せは、重複性により解析が人為的に歪められるのを防止するために１つしか含めなかった。ＨＬＡトランスジェニックにおけるエピトープ免疫原性は、測定した培養物の少なくとも３０％で１００ＳＵまたは２０ＬＵを超えれば最適とみなした。ＣＴＬ応答は、４つのカテゴリー、すなわち（＋＋＋）、優−２００ＬＵまたは１０００ＳＵを超える；（＋＋）、良−２０〜２００ＬＵまたは１００〜１０００ＳＵ；（＋）、中間−２から２０ＬＵまたは１０から１００ＳＵ；および（＋／−）、弱またはネガティブ−２ＬＵまたは１０ＳＵ未満の１つに通常採点される。最適と最適以下の各応答数は、フランキング位置のアミノ酸の化学的タイプに基づいて分類され、差の有意性はカイ二乗検定を用いて決定した。
【０１２３】
この解析から、エピトープのアミノ末端にあるアミノ酸のタイプと免疫原性にはなんの関連性も見出されなかった。しかし、カルボキシル末端フランキング残基、Ｃ＋１残基の有意な効果が確認された。正に帯電したアミノ酸、ＫまたはＲは、最適なＣＴＬ応答を最も高頻度、すなわち６８％の頻度で伴った（図５）。Ｃ＋１残基におけるアミノ酸ＮおよびＱの存在も、検査例の５５．５％で強いＣＴＬ応答を伴った；Ｃ＋１位においてＮがエピトープの側面に位置する場合、エピトープは３／４の例で最適なＣＴＬ応答を誘発した。一般に、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＳなどの小さな残基は、解析可能な組合せの５４％で強い応答を誘発する中程度のＣＴＬ応答を促進した。逆に、芳香族および脂肪族アミノ酸が側面に位置したエピトープは、検査例のそれぞれわずか３６％および１７％でしかインビボで最適な応答を誘発しなかった。負に帯電した残基Ｄは、最適以下のＣＴＬ応答を生じた。エピトープ免疫原性に対するＣ＋１アミノ酸の影響は、カイ二乗検定を用いて統計的に有意であることが判明した（Ｐ＜０．０３）。Ｃ＋１位よりも遠位のＣ末端残基に対して同様の解析を行ったときには、エピトープ免疫原性に対する有意な影響は認められなかった。
【０１２４】
エピトープ免疫原性に対するＣ１残基の効果の直接評価
Ｃ＋１フランキング位置における好ましいタイプと有害なタイプの各アミノ酸の効果を直接評価するために、ＨＢＶ．１およびＨＢＶ．２（図３ｂ）と称する２つのマルチエピトープ構築物を評価した。ＨＩＶ−ＦＴと同様、これらのＨＢＶ構築物は、スペーサーを介在せずに順次エピトープをコードする。実際、ＨＢＶ．１およびＨＢＶ．２は、すでに特性の決定された実験的マルチエピトープ構築物ｐＭｉｎ１（非特許文献７）においてＨＩＶ−１エピトープを類似のＨＢＶ由来のエピトープで置換することによって生成された。
【０１２５】
ＨＢＶ．１の場合、高い免疫原性ＨＢＶ  Ｃｏｒｅ  １８エピトープの直後のＨＩＶ−１エピトープがＨＢＶ  Ｐｏｌ  ５６２エピトープで置換された。これによりＣ＋１残基がＫからＦに変わった。第２の構築物ＨＢＶ．２は、追加のエピトープＨＢＶ  Ｐｏｌ  ６２９がＨＢＶ  Ｃｏｒｅ  １８とＰｏｌ  ５６２の各エピトープ間に挿入されて生成された。すなわち、Ｃ＋１アミノ酸をＫ残基で置換する変化である。これらの異なる状況下に存在するＣｏｒｅ  １８エピトープの免疫原性を、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋbトランスジェニックマウスで評価すると、Ｃｏｒｅ  １８エピトープは、ＨＢＶ．１では事実上非免疫原性であるがＨＢＶ．２では強い免疫原性であると判定された（図６ａ）。このエピトープのインビボでの免疫原性の低下は、本発明者らの以前の解析から予測されたものであった。
【０１２６】
ＣＴＬエピトープ免疫原性に対するＣ＋１フランキングアミノ酸の効果をさらに試験するために、Ｃｏｒｅ  １８エピトープに対してＣ＋１の位置に単一のアミノ酸を挿入することによってＨＢＶ．１とは異なる１組の構築物（図３ｂ）を評価した。Ｃ＋１位でＷ、ＹまたはＬが側面に位置したときにはＣｏｒｅ  １８エピトープに対するＣＴＬ応答はほとんどまたはまったく観測されなかった（図６ｂ）。これに対し、単一のＫ残基を挿入すると、Ｃｏｒｅ  １８に対するＣＴＬ応答が劇的に増加した。この応答は、エピトープのＮ末端にＫを含むエピトープであるＰｏｌ  ６２９がＣｏｒｅ  １８エピトープの側面に位置しているＨＢＶ．２で観測される応答に匹敵した。Ｃｏｒｅ  １８ＣＴＬ応答の亢進は、Ｒ、Ｃ、ＮまたはＧを挿入しても認められた。これらの挿入の効果は特異的であり、これらの構築物内にある他のエピトープの免疫原性はＣＴＬ応答に有意な変化を示さなかった（データ示さず）。結論として、これらのデータは、Ｃ＋１アミノ酸がエピトープの免疫原性に劇的な影響を及ぼすことができることを示している。
【０１２７】
ＣＴＬエピトープ免疫原性の変動は存在量と相関する
異なるＣ＋１残基を伴うＣｏｒｅ  １８の免疫原性の変動が、タンパク質分解的な切断に対する特異な感受性の結果であるならば、エピトープ提示レベルの大きな差を、異なる構築物で検出できるはずである。これを試験するため、トランスジェニックマウスで発現されるのと同じＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子を発現するジャーカット細胞にＨＢＶ．１またはＨＢＶ．１Ｋのいずれかを発現するエピソームベクターをトランスフェクションした。Ｃ＋１位にＫがあるとき、同じ位置にＦが存在するのに比べてＣｏｒｅ  １８エピトープが＞１０5高いレベルで提示された（図７）。Ｐｏｌ  ４５５の提示は１０倍未満しか変動しないことから、このＣｏｒｅ  １８の提示の差を標的細胞系間の遺伝子発現の差に帰することはできそうにない。これらのデータは、マルチエピトープＤＮＡワクチンにおいてＣ＋１位のアミノ酸がエピトープ提示の効率に影響を及ぼすことができるという際立った効果を実証している。したがって、これらのデータは、エピトープ提示レベルに影響を及ぼすという設計検討事項を通して、ＤＮＡワクチンにおけるＣＴＬエピトープの免疫原性を最適化できることを示している。この効果は抗原が転写され翻訳された後に発揮されるので、このタイプの最適化は、ウイルスベクター、当業者に既知の他の発現ベクターなど他の方式により送達されたエピトープ系のワクチンに適用可能である。
【０１２８】
要約すると、フランキング残基では、Ａ、Ｃ、Ｇなどの極めて小さな残基、またはＱ、Ｗ、Ｋ、Ｒなどの大きな残基が一般に良好なまたは優れた応答に関連していることが判明した。マルチエピトープ構築物中の停止コドンのためにＣ＋１残基が存在しないこと、あるいはＳ、Ｔなどの中間サイズの残基が存在することは、より中間的な応答パターンと関連付けられた。最後に、負に帯電した残基Ｄ、脂肪族（Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ）または芳香族非トリプトファン残基（Ｙ、Ｆ）の場合、比較的弱い応答が観察された。これらの結果は、エピトープのＣ末端の側面に位置する特定の残基が応答の頻度および大きさに劇的な影響を及ぼすことができることを示している。Ｃ＋１位置のフランキング残基は、スペーサー配列と組み合わせて導入することもできる。すなわち、免疫原性に有利な残基、好ましくは、Ｋ、Ｒ、Ｎ、ＡまたはＧが、スペーサーのフランキング残基として含まれる。
【０１２９】
マルチエピトープ構築物の分類および最適化
本発明を用いてマルチエピトープ構築物を開発するために、マルチエピトープ構築物中に含まれるエピトープを、本明細書で規定するパラメータを用いて分類し最適化する。分類および最適化はコンピュータを用いて、またはより少ない数のエピトープに対してはコンピュータを用いないで実施することができる。
【０１３０】
コンピュータ化された最適化を、一般に以下のように実施することができる。以下は、同定し最適化するコンピュータ化されたシステムの例を提供するものであり、たとえば、最小数の接合エピトープおよび最大数のフランキング残基、エピトープ組合せを与える。図１０は、本発明の一実施形態に従い、マルチエピトープ構築物の最適化を実施するためのコンピュータシステム１００を示したものである。コンピュータシステム１００は、処理回路、たとえば、中央処理装置（ＣＰＵ）、メモリー、たとえば、ハードディスクドライブ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、キャッシュおよび今日のコンピュータに一般に見られる他のコンポーネント、装置および回路（図示せず）を含む従来タイプのコンピュータとすることができる。好ましい一実施形態において、コンピュータシステム１００は、他のコンポーネントおよび装置の中でも、毎秒６００，０００から７００，０００の順列を探索可能なＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｇ３  ３３３ＭＨｚプロセッサ、６ギガビット（ＧＢ）ハードドライブ、９６メガビットＲＡＭおよび５１２キロビット（ＫＢ）キャッシュメモリーを含む。コンピュータシステム１００はさらにテキスト、グラフィックス、および他の情報をユーザーに表示するためのモニター１０２、およびユーザーがデータ、コマンドおよび他の情報をコンピュータシステム１００に入力できるようにするキーボード１０４を含む。
【０１３１】
図１０に示すように、一実施形態において、コンピュータシステム１００は、１つまたは複数の遠隔コンピュータ１５０とコンピュータネットワーク１６０を介して通信することができ、遠隔地の登録ユーザーが遠隔コンピュータ１５０にログオンし所定のパスワードまたはユーザーＩＤを入力することによって本明細書に記載する接合解析およびマルチエピトープ構築物の最適化操作を実行することができる。コンピュータネットワーク１６０は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）またはワールドワイドウェッブ（すなわち、インターネット）とすることができる。これらのタイプのネットワークは当分野で周知であり、したがって、これらのネットワークおよびそれらの通信プロトコルに関しては本明細書では考察しない。
【０１３２】
好ましい一実施形態において、コンピュータシステム１００はソフトウエアプログラム、たとえば、オブジェクトコードを、コンピュータシステム１００のハードドライブメモリー中に格納する。このオブジェクトコードは、本明細書に記載の機能を実施するためのＣＰＵによって実行される。ソフトウエアプログラムの１つのコンポーネントまたはモジュールは、マルチエピトープ核酸構築物によってコードされるポリペプチドのペプチド接合部の接合エピトープを解析し同定し、ならびにこれらの接合部でスペーサーおよびフランキング残基の組合せを評価する機能を実行する。このソフトウエアモジュールは、本明細書では「接合アナライザー（Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）」モジュールまたはプログラムと称する。好ましい一実施形態において、接合アナライザーは、下記の他の基準、データおよび操作パラメータに従い、ユーザーにより入力されたペプチドを解析し処理する。
【０１３３】
図１１Ａ〜Ｂ（以下、図１１）に、本発明の一実施形態に従い、ユーザー入力データおよび接合アナライザープログラムが使用するパラメータを含む例示的な入力テキストファイル２００を示す。図１１に示すように、様々なタイプの入力データがプログラムに与えられる。第１に、ユーザーは１組のプロセシング用ペプチドまたはエピトープ２０２を入力する。各アミノ酸がＣ＋１およびＮ−１位に出現するときには、ユーザーは各アミノ酸に対する１組の重み２０４もテキストファイルに入力する。一実施形態において、重み値は、各アミノ酸をポリペプチドのＣ＋１またはＮ−１位に配置するときに、各アミノ酸の免疫原性または抗原性「エンハンスメント」効果を反映する実験結果の統計解析または経験的解析によって決定される。しかし、各アミノ酸に対する重み値の割当は、重み値の決定に使用する所望の基準に応じて、当業者に明らかなインビトロおよびインビボでの研究を含めて多数の方法により行うことができる。このような実験または研究のいくつかの例を以下にさらに詳細に記述する。
【０１３４】
好ましい一実施形態において、異なるエピトープ／フランキング残基の組合せを含むデータベースは、エピトープの免疫原性に基づいて階層化され、最適と最適以下の応答数を分類してアミノ酸をランク付けし、エンハンスメント重み値を割り当てる。テキストファイルは、接合エピトープを検出するのに用いる１組のモチーフ２０６も含んでいる。好ましい一実施形態において、ユーザーは、各ペプチド対間に挿入されてスペーサーおよび／またはフランキング残基として機能するアミノ酸（スペーサーおよびフランキング）の最大数（ＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）２０８を入力することもできる。プログラムの操作を制御する他のパラメータ、値またはコマンド（本明細書ではこれらをまとめて「パラメータ」と称する）、たとえば、「ＯｕｔｐｕｔＴｏＳｃｒｅｅｎ（Ｙ／Ｎ）」２１０、「ＯｕｔｐｕｔＴｏＦｉｌｅ（Ｙ／Ｎ）」２１２、妥当な結果として許容される最低機能値（「ＭｉｎｉｍｕｍＡｃｃｅｐｔｅｄ」）２１４、同じ機能値を有する結果の最大数（「ＭａｘＤｕｐｌｉｃａｔｅＦｕｎｃｔｉｏｎＶａｌｕｅ」）２１６、探索に許容される最大時間（分）（「ＳｅａｒｃｈＴｉｍｅ」）２１８、徹底的な探索が必要かどうか（「Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ＝Ｙ／Ｎ」）２２０、確率的な探索の精査の数（「ＮｕｍＳｔｏｃｈａｓｔｉｃＰｒｏｂｅｓ」）２２２、確率的な探索中に１回の精査当たりに許容される最大ヒット数（「ＭａｘＨｉｔｓＰｅｒＰｒｏｂｅ」）２２４、および各精査の開始を無作為とすべきか、またはそれ以外にすべきかどうか（「ＲａｎｄｏｍＰｒｏｂｅＳｔａｒｔ（Ｙ／Ｎ）」）２２６なども入力することができる。これらのパラメータは、説明の目的のみに用意したものである。当業者には明らかなように、プログラムの操作および出力形式を制御する他のパラメータも入力することができる。
【０１３５】
テキストファイル２００中のモチーフ２０６は、接合エピトープを同定するための「マスク」または構造モデルを提供する。たとえば、図１１に示す第１のモチーフ２０６、ＸＸＸＸ（ＦＹ）ＸＸ（ＬＩＭＶ）は、８アミノ酸長のエピトープを規定する。値「Ｘ」は、任意のアミノ酸がエピトープのその位置に存在し得ることを示す。値「（ＦＹ）」は、Ｆアミノ酸またはＹアミノ酸のいずれかがエピトープの５番目の位置に存在し得ることを示す。同様に、「（ＬＩＭＶ）」は、列挙したアミノ酸Ｌ、Ｉ、ＭまたはＶのいずれか１つが、エピトープの８番目の位置に存在し得ることを示す。したがって、２つのペプチドの接合部にまたがる８つのアミノ酸配列が上記モチーフ基準を満たすならば、それは接合エピトープとして同定される。
【０１３６】
図１２に、接合アナライザープログラムの一実施形態のフローチャートを示す。ステップ３０１で、プログラムは、接合解析操作を実行するためのユーザー入力および命令を受ける。好ましい一実施形態において、プログラムは、入力パラメータ２０２〜２２６を入力するために図１１に示す入力テキストファイル２００を使用する。当分野で周知のとおり、そのようなテキストファイルを、たとえば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（商標）スプレッドシートファイルまたは文書から引き出して、その操作のための所望の入力パラメータ（たとえば、エピトープ、モチーフ、フランキング残基重み値、最大ヒット数、最大探索時間など）を指定する。ステップ３０３では、接合アナライザープログラムは、エピトープ対すべてのリストを作成する。たとえば、ユーザーが１０個のエピトープを入力すれば、全部で９０（１０×９）個のエピトープ（ペプチド）対が存在することになる。次に、ステップ３０５では、ペプチドまたはエピトープの各対に対して、プログラムは、最小接合エピトープ数および／またはＣ＋１およびＮ−１のスペーシング残基の寄与による最大効果をもたらす挿入セットを決定する。これを決定するために、プログラムは、各ペプチド対に対して可能なスペーサーの組合せそれぞれに対して機能値を計算する。ここで、スペーサー数は０からＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ２０８（図１１）の範囲とすることができ、任意の既知または前もって指定したアミノ酸配列を検討することができる。好ましい一実施形態では、以下の式、すなわちＦ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊを用いて機能値を計算する。式中、ＣはエピトープのＣ＋１位に位置するフランキングアミノ酸に対するエンハンスメント重み値、ＮはエピトープのＮ−１位に位置するフランキングアミノ酸に対するエンハンスメント重み値、およびＪは存在する接合エピトープの数である。複数のモチーフがペプチド対の１つの接合部で適合し得るので、Ｊは１よりも大きい数とすることができる。Ｊ＝０のとき、Ｆ＝２（Ｃ＋Ｎ）である。この第２の式が選択されたのは、機能値Ｆが、固定値（Ｃ＋Ｎ）に対して、Ｊが２から１に変化したときに２倍になり、Ｊが１から０に変化したとき再び２倍になるはずだからである。しかし、上記式は例示にすぎず、ペプチド対を評価する他の式をいつでも容易にプログラムに追加できることを理解されたい。所望の重点または評価基準に応じた上記式の修飾または変更は、当業者には容易に明らかなはずである。ステップ３０７では、プログラムは、各ペプチド対および各ペプチド対に対する最大機能値に対して最適な挿入（スペーシングおよび／またはフランキング残基）の組合せを出力する。好ましい一実施形態においては、このプログラムからの出力は、最大機能結果を与える挿入物を列記した出力テキストファイルとしてステップ３０７で各ペプチド対に対して作成される。
【０１３７】
図１３Ａ〜Ｄ（以下、図１３）に、最大機能値を有するスペーサーの組合せを各ペプチド対に対して記載する例示的な出力テキストファイル４００を示す。図１３に示す例では、Ａ〜Ｋと標識した１１個のペプチド２０２（図１１）を処理し、モチーフ２０６を用いて接合エピトープを検出し、各可能なフランキング残基に対するエンハンスメント重み値２０４を使用し、ＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ２０８を４に設定した。接合アナライザープログラムの操作およびフォーマットを制御する他のパラメータを、パラメータ設定４０２に示すように設定した。便宜上、好ましい一実施形態において、これらの入力パラメータは出力テキストファイル４００で繰り返される。出力テキストファイル４００は、ステップ３０５（図１２）の結果を含む出力表４０４を含む。出力表４０４の第１列（Ｃｏｌ．１）は、対の第１のペプチドを示す。出力表の第２列（Ｃｏｌ．２）に、スペーサーとＣ＋１フランキングアミノ酸の両方として機能する第１のアミノ酸挿入物を記載する。第３列に、第２のスペーサーアミノ酸を記載する。第４列に、第３のスペーサーアミノ酸を記載する。第５列に、第６列に記載する対の第２のペプチドに対するＮ−１フランキングアミノ酸でもある第４のスペーサーアミノ酸を記載する。第７列に、第２列のＣ＋１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値を記載する。第８列に、第６列に記載するＮ−１フランキングアミノ酸のエンハンスメント重み値４１２を記載する。第９列に、Ｃ＋１とＮ−１のエンハンスメント重み値の合計を記載する。第１０列に、ペプチド対中に見出される接合エピトープ数を記載し、第１１列に、上記式に基づくペプチド対に対する最大機能値を記載する。たとえば、出力表４０４の第１行は、ペプチドＶＬＡＥＡＭＳＱＶ−ＩＬＫＥＰＶＨＧＶに対応するペプチド対Ａ−Ｂの場合、３つのアミノ酸の組合せであるスペーサーＣＡＬは、すべての接合エピトープを除去し８．８０の最大機能値を与えた。しかし、他の出力オプションも本発明に従って実行できることを理解されたい。たとえば、出力表４０４は、ユーザーが望む詳細および／または解析のレベルに応じて、各ペプチド対に対する上位３２の結果を示し、または、評価した順にすべての可能な挿入に対するあらゆる結果を示し、または、モチーフ探索プロセスをたどって大きな出力ファイルを作成することができる。
【０１３８】
好ましい実施形態では、出力表４０４に含まれる情報を用いて「徹底的なＪ探索」または「確率的なＪ探索」のいずれかを実施して、最適なスペーサーの組合せを含めて１１個のペプチドすべてを連結したポリペプチド構築物を同定する。たとえば、１１個のペプチドの場合、１０個の接合部が存在するはずである。したがって、１０個の接合部すべてを考慮した機能値の最大の合計を与える順列が、マルチエピトープ構築物の「最適な」順列として同定される。一実施形態において、ユーザーの便宜のために、出力テキストファイル４００は、ペプチド／エピトープ２０２、使用した重み値２０４、使用したモチーフ２０６およびＭａｘＩｎｓｅｒｔｉｏｎ値  ２０８および図１１の入力テキストファイル２００に入力する他のパラメータ設定４０２の元のリストも含むことになる。
【０１３９】
「徹底的なＪ探索」は、ペプチドの順列すべてを調べ、最大機能合計を有する順列を選択する。しかし、順列の階乗の性質から、処理すべきペプチドの数が増加するにつれ、徹底的なＪ探索を完了するのに要する時間はほぼ指数的に増加する。たとえば、標準のＭａｃｉｎｔｏｓｈ  ３３３ＭＨｚコンピュータを用いて、１３個のペプチドに対して推定される実行時間は約２．９時間であり、１４個のペプチドに対しては約４０時間である。「確率的なＪ探索」は、順列空間全体ではなく、順列配列の多数の範囲を探索するように設計されており、見出した最良の機能合計を報告する。その時点での最大機能合計に合うかまたはそれを超える順列のみを報告することによって、順列配列のより広い範囲を探索することが可能である。この技術は、２０個ものペプチドで成功を収めている。２０個のペプチドの徹底的な探索を実行する時間は、１．３×１０５年の桁である。
【０１４０】
再び図１２を参照すると、ステップ３０９では、出力テキストファイル４００から可能なポリペプチド順列の徹底的な探索と確率的な探索のいずれを実行すべきかをプログラムが決定する。好ましい一実施形態において、ステップ３０９での決定はユーザーが行う。ユーザーは、探索が入力パラメータＥｘｈａｕｓｔｉｖｅ（Ｙ／Ｎ）２２０（図１１）によって指定される徹底的と確率的のどちらであるかを入力する。他の実施形態において、プログラムは、処理すべきペプチドの数によって確率的探索か徹底的探索のいずれかを自動的に選択することができる。たとえば、１４個未満のエピトープが含まれるのであれば、徹底的な探索ルーチンがプログラムによって自動的に選択される。徹底的な探索プログラムは、マルチエピトープ構築物を構成するエピトープの順列すべてを調べて、エピトープ対すべてに対して最適化機能値の合計に対する最良の値を有する順列を見出す。すべてを調べるので「最良の」順列が確実に見出される。マルチエピトープ構築物中に１４個以上のエピトープが含まれるのであれば、確率的な探索を用いる。好ましい一実施形態において、確率的な探索は、当業者には既知のモンテカルロ法を用いて順列空間の多数の領域を調べて最適なペプチド配列の最良の推定値を見出す。しかし、確率的に探索する他の方法も本発明に従って実施することができる。たとえば、確率的な各精査に対する開始順列を無作為に選ぶのではなく、ユーザーが入力する異なるペプチドの１つで始まる順列で各精査が始まるようにプログラムは要求することができる。たとえば、ちょうど３個のペプチドＡ、ＢおよびＣが存在する場合、３回の精査は、たとえば、ＡＢＣ、ＢＡＣおよびＣＢＡで開始される。この方法は、可能な順列にかなり一様に適用することができる。
【０１４１】
確率的な探索が選択された場合、次にステップ３１１で、精査を開始することによってプログラムは確率的な探索を始める。次に、ステップ３１３で、精査当たりの最大探索時間が経過したかどうかをプログラムは判定する。最大探索時間に達していない場合、次にステップ３１５で、１回の精査が精査当たりの最大「ヒット」数に到達したかまたはそれを超えたかどうかをプログラムは判定する。一実施形態において、順列の機能値合計が、前に解析した１つまたは複数の順列に対してすでに登録されている最大機能合計と同じかそれよりも大きいときに精査のヒットが登録される。精査当たりの最大ヒット数に達していない場合、ステップ３１７で、その回の確率的な精査は次の順列または順列セットを評価し、プロセスはステップ３１３に戻る。ステップ３１５で、精査当たりの最大ヒット数に到達したかそれを超えたと判定された場合には、プログラムはステップ３１９に進み、最大精査数がすでに実行されたかどうかを判定する。また、ステップ３１３で、精査当たりの最大時間限界に到達したかそれを超えたと判定された場合には、プログラムはステップ３１９に進んで最大精査数が完了したかどうかを判定する。ステップ３１９で、最大精査数に達していないと判定された場合、プログラムはステップ３１１に戻り新しい探索の精査を開始する。ステップ３１９で最大精査数が実行されたと判定された場合、プログラムはステップ３２３に進み、その時までに同定された最適な順列の最良のセットを出力する。この「最良のセット」は、たとえば、最大の機能合計を有する順列のみから、あるいは上位３つの大きな機能合計を有する順列からなることができ、あるいはユーザーが望む他の任意の出力基準とすることができる。
【０１４２】
好ましい一実施形態において、精査は精査当たりの指定された最大ヒット数を得ると、その精査に対する未使用時間を残りの精査で割って残りの各精査に何時間割り当てるべきかを決定する。換言すると、精査があまりにも多数のヒットを見出したために早く終了した場合、残りの精査にはより多くの時間が割り当てられる。このような機能は、コンピュータプログラム作成の熟練者には容易に実施できるものである。
【０１４３】
ステップ３０９で徹底的な探索が選択された場合、ステップ３２１で徹底的な探索が開始されて、上記の通りすべての順列が解析される。徹底的な解析が完了すると、プログラムはステップ３２３に進み、見出された最適な順列の「最良のセット」を出力する。上述したように、この「最良のセット」は、最大合計機能値、または上位３つの最大合計機能値を有する順列、またはユーザーが指定する任意所望の基準に合致する順列（たとえば、最大機能値を有する上位３０個の順列）を含むことができる。
【０１４４】
上で考察した決定ステップまたは判定ステップ（たとえば、ステップ３１３、３１５および３１９）の各々では、定期的な間隔（たとえば、５秒毎）で問い合せを行うようにプログラムを設定することができ、あるいは、指定数（たとえば、５）の順列を解析した後またはすべての順列を解析した後に問い合わせを行うようにプログラムを設定することができる。これらの操作プロトコルおよびタイミングプロトコルのいずれでも当業者が実行し、調節することは容易である。
【０１４５】
プログラム出力から、最良のエピトープ配列のリストが得られる。多数の順列が同じ評価機能値を有するので、そのいくつかは最適な配列を選択する際に他の因子を検討できるように作成される。上述のコンピュータ化された技術を用いて生成されるマルチエピトープ構築物の例を図９に示す。本発明の方法およびシステムによって実行される例示的なプロセスフローは先に示されている。当業者には容易に明らかなように、電荷分布、疎水性／親水性領域解析、折畳み構造予測などの他の因子も評価関数に組み込んで、マルチエピトープ構築物をさらに最適化することができる。また、すでに最適化されたマルチエピトープ構築物を追加の１回または複数回の同じまたは類似したプロセスを通して処理することによって、マルチエピトープ構築物をさらに最適化することができる。続く処理ラウンドでは、第１ラウンドの最適化に用いたパラメータと比較して１つまたは複数のパラメータを変更することができる。２ラウンドで最適化されたマルチエピトープ構築物の例は、ＨＢＶ−３０ＣＬ構築物である。
【０１４６】
マルチエピトープ構築物は、検討すべき各構築物の構造を決定することによって最適化することもできる。ポリペプチド構造などの巨大分子の構造は、様々なレベルの構成要素（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）で記述することができる。この構成要素の一般的な考察は、たとえば、非特許文献６１、６２を参照されたい。「一次構造」は個々のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」はポリペプチド内の局所的に順序づけられた三次元構造を指す。これらの構造は一般にドメインとして知られる。ドメインは、ポリペプチドの小単位を形成するポリペプチド部分である。典型的なドメインは、一続きのβシートおよびαヘリックスのようなより小さな構成要素の部分からなる。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立した三次ユニットの非共有結合によって形成される三次元構造を指す。
【０１４７】
電荷分布、疎水性／親水性領域解析または折り畳み構造予測のような構造の予測は、当業者には既知の配列解析プログラムを用いて実施することができ、たとえば、疎水性および親水性ドメインを同定することができる（例えば非特許文献６３、６４参照。ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ．に見られるプログラムなどいくつかのインターネットベースの配列解析プログラムも参照されたい）。
【０１４８】
マルチエピトープ構築物の三次元構造モデルも作製することができる。これは、一般に、解析すべきアミノ酸配列をコンピュータシステムに入力することによって実施される。アミノ酸配列は、タンパク質の１次配列またはサブ配列を表し、タンパク質の構造情報をコードしている。次いで、タンパク質の三次元構造モデルを、当業者に既知のソフトウエアを用いて、コンピュータシステムの相互作用によって作成する。
【０１４９】
アミノ酸配列は、対象とするタンパク質の二次、三次および四次構造を形成するのに必要な情報をコードする一次構造である。ソフトウエアは、１次配列がコードする特定のパラメータを調べて構造モデルを作製する。これらのパラメータは、「エネルギー項」と称し、静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接触可能表面および水素結合を主に含む。第２のエネルギー項は、ファンデルワールスポテンシャルを含む。生体分子は、累積型でエネルギー項が最小になる構造を形成する。したがって、コンピュータプログラムは、一次構造すなわちアミノ酸配列によってコードされるこれらの項を用いて、二次構造モデルを作製する。次いで、二次構造によってコードされるタンパク質の三次構造は、二次構造のエネルギー項に基づいて形成される。ユーザーは、タンパク質が膜結合型か溶解型か、体内におけるその位置およびその細胞の位置、たとえば、細胞質、表面または核のゆな追加の変数を入力することができる。これらの変数は、二次構造のエネルギー項と共に用いられて三次構造モデルを形成する。三次構造のモデル化においては、コンピュータプログラムは、二次構造の疎水面は疎水面と、親水面は親水面と一致させる。次いで、ＨＬＡプロセシング装置に最も容易にアクセス可能なこれらのマルチエピトープ構築物が選択される。
【０１５０】
マルチエピトープワクチンの免疫原性の評価
マルチエピトープ構築物の開発は、ＭＨＣとのペプチド結合が種特異的なので、無類の難題である。異なる種からの異なるタイプのＭＨＣは、異なるペプチドセットと結合する傾向がある（非特許文献６５）。その結果、ヒトエピトープからなる構築物を通常の実験動物で試験することは不可能である。この制限を克服する代替方法が一般に利用可能である。それらには、１）非ヒトＭＨＣ限定エピトープを組み込んだ類似の構築物を試験すること、２）非ヒトＭＨＣ限定コントロールエピトープへの依存、３）ヒトと非ヒトＭＨＣの交差反応性への依存、４）ＨＬＡトランスジェニック動物の使用、および５）ヒト細胞を用いたインビボの抗原性アッセイなどが含まれる。以下は、抗原性および免疫原性を解析するための技術開発の簡明な概説である。
【０１５１】
クラスＩ  ＨＬＡ遺伝子導入
エピトープの同定（非特許文献６６〜７０）およびワクチン開発（非特許文献７１）のためにＨＬＡトランスジェニックマウスを利用することが確立されている。発表された報告のほとんどは、ＨＬＡ  Ａ２．１／Ｋbマウスの使用を検討したが、Ｂ*２７およびＢ*３５０１マウスも利用可能であることに留意すべきである。さらに、ＨＬＡ  Ａ*１１／Ｋbマウス（非特許文献７２）およびＨＬＡ  Ｂ７／ＫbおよびＨＬＡ  Ａ１／Ｋbマウスも作製された。
【０１５２】
３８個の異なる可能なエピトープのデータを解析して、Ａ２．１／ＫbトランスジェニックマウスのＡ２．１限定ＣＴＬレパートリーとＡ２．１＋ヒトの重複レベルを決定した（非特許文献７３）。ヒトとマウスの両方で、約５００ｎＭのＭＨＣペプチド結合親和性しきい値は、インビボでＣＴＬ応答を誘発するペプチドの能力と相関する。インビボでのヒトデータとインビボでのマウスデータの間の高レベルの一致が、強く結合したペプチドの８５％、中程度のバインダーの５８％および弱い／ネガティブバインダーの８３％で観測された。同様な結果は、ＨＬＡ  Ａ１１およびＨＬＡ  Ｂ７トランスジェニックマウスでも観測された（非特許文献７２）。したがって、トランスジェニックマウスのＴ細胞受容体レパートリーとヒトＣＴＬの間に存在する広範な重複のために、トランスジェニックマウスは、本明細書に記載のマルチエピトープ構築物の免疫原性を評価するのに役立つ。
【０１５３】
ＨＬＡ  Ａ１１マウスに関する限り、ＴＡＰ輸送の異なる特異性は、ＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスを免疫原性評価に使用するのを妨げない。ネズミとヒトのＴＡＰはどちらも、疎水性末端を有するペプチドを効率的に輸送するものの、ヒトＴＡＰのみが、Ａ３、Ａ１１およびＡ３スーパータイプの他のメンバーにより結合されるペプチドのような正に帯電したＣ末端を有するペプチドを効率的に輸送すると報告された。この関係はＡ２、Ａ１またはＢ７には当てはまらない。というのは、ネズミとヒトの両方のＴＡＰは、Ａ２、Ｂ７またはＡ１が結合したペプチドを同等に輸送することができるはずだからである。この解釈と一致して、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ（非特許文献６０）およびＲｏｔｚｓｃｈｋｅ（非特許文献７４）は、マウスとヒトの各細胞でプロセシングが類似していることを示唆したが、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ（非特許文献７４）は、ヒト細胞に対してネズミ細胞では異なること、即ち両方ともＨＬＡ  Ａ３分子を発現する点で異なることを示唆した。しかし、ＨＬＡ  Ａ１１トランスジェニック体を使用して、インビボのＴおよびＢ細胞上でＨＬＡ分子の発現が観察され、報告されたネズミＴＡＰの好ましくない特異性は、Ａ１１／Ｋb分子のインビボでの安定化および輸送を妨害しないことが示唆された（非特許文献７２）。これらのデータは、荷電Ｃ末端を有するペプチドがＡ１１分子をトランスフェクションしたネズミ細胞から溶出し得るという以前の観察と一致する（非特許文献７５）。ＨＬＡ  Ａ１１マウスにおいて、インフルエンザなどの複合体抗原に対する応答および、最も重要なのは、マルチエピトープ構築物によってコードされるＡ１１限定エピトープに対する応答（た非特許文献７１）も検出された。したがって、ＴＡＰの問題は、トランスジェニックマウスでは軽微な問題と考えられる。
【０１５４】
ＨＬＡトランスジェニックマウスの使用に関連し得る別の問題は、ＨＬＡ発現および結合特異性に対して起こり得るβ２ミクログロブリンの影響である。ヒトβ２は、ヒトとマウスの両方のＭＨＣに、マウスβ２ミクログロブリンよりも高い親和性および安定性で結合することは周知である（非特許文献７６）。ＭＨＣ重鎖とβ２のより安定な複合体がＭＨＣクラスＩの外因性装填（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｏａｄｉｎｇ）を容易にすることも周知である（非特許文献７７）。本発明者らは、ＨＬＡ／Ｋbとヒトβ２のダブルトランスジェニックマウスを作製することによってこの変数の潜在的効果を調べた。ヒトβ２の発現は、ＨＬＡ  Ｂ７／Ｋbマウスの場合に有益であり、ＨＬＡ  Ａ１トランスジェニックマウスの場合に良好な発現レベルを達成するのに絶対必要であった。したがって、本発明者らはＨＬＡ／Ｋbとβ２のダブルトランスジェニックマウスを一時的にも定期的にも繁殖させ利用した。したがって、ＨＬＡトランスジェニックマウスを用いて、４つの主要なＨＬＡ特異性（すなわち、Ａ２、Ａ１１、Ｂ７およびＡ１）のＨＬＡ限定認識をモデル化することができ、他のＨＬＡ特異性用トランスジェニックマウスを、免疫原性の評価に適したモデルとして開発することができる。
【０１５５】
クラスＩエピトープの抗原性試験
いくつかの独立の系統の実験から、細胞表面のクラスＩ／ペプチド複合体の密度が、Ｔ細胞の初回抗原刺激レベルと相関し得ることが示されている。したがって、エピトープがＡＰＣ表面に生成し提示されるレベルを測定することで、ヒト細胞におけるマルチエピトープ核酸ワクチンのインビトロでの効力を間接的に評価する手段が提供される。ＨＬＡクラスＩトランスジェニックマウスの使用を補完するものとして、この手法はヒト細胞におけるプロセシングを調べる利点を有する（非特許文献７１）。
【０１５６】
プロセシングを受けたペプチドを実験的に定量化可能ないくつかの手法が利用可能である。ＡＰＣ表面から溶出するペプチド量を測定することによって、細胞表面のペプチド量を定量化することができる（非特許文献７８、７９）。あるいは、感染またはトランスフェクションした標的細胞によって誘発される溶解量またはリンホカイン放出量を測定し、次いで等価な溶解レベルまたはリンホカイン放出レベルを得るのに必要なペプチド濃度を決定することによってペプチド−ＭＨＣ複合体数を推定することができる（非特許文献８０）。
【０１５７】
同様の手法を用いて、マルチエピトープ核酸をトランスフェクションした細胞系におけるエピトープの提示も測定した。具体的には、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて免疫原性であるマルチエピトープ構築物も、同じ構築物をトランスフェクションしたヒト細胞によって最適なエピトープにプロセシングされる。トランスジェニックマウスで観察される応答の大きさは、トランスフェクションしたヒト標的細胞で観察された抗原性と相関する（非特許文献７１）。
【０１５８】
抗原性アッセイを用いて、エピトープの順序またはフランキング残基が異なるいくつかの関係する構築物をＡＰＣにトランスフェクションすることができ、エピトープ提示に対する上述の変数の影響を評価することができる。これは比較的多数の異なる構築物を評価することが必要な場合に好ましい試験システムになり得る。これは多数のエピトープ特異的ＣＴＬを必要とするが、高い感受性のＣＴＬ系を生成し（非特許文献８１）それらを増殖して数を増やすことも可能な手順（非特許文献８２）が、この潜在的問題に対処するために開発された。
【０１５９】
トランスフェクションのために選択した細胞が、インビボでのＡＰＣ機能を実行する細胞を反映しない場合、誤解を招きかねない結果が得られる可能性があることも留意すべきである。Ｂ細胞系譜の細胞は、「専門的」ＡＰＣとして知られ、一般にトランスフェクションレシピエントとして使用される。このタイプのトランスフェクションＢ細胞を使用することは、この分野では容認された操作となっている。また、より詳細に本明細書に記載するように、トランスフェクションされたヒトＢ細胞を利用したインビトロデータとＨＬＡトランスジェニックマウスを利用したインビボの結果との良好な相関がすでに注目されている。
【０１６０】
ＨＴＬ応答の測定
好ましい実施形態では、ワクチン構築物が最適化されてクラスＩＩ限定免疫応答を誘発する。クラスＩＩエピトープを含めてマルチエピトープ構築物を評価する一方法は、ＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスを使用することである。いくつかのグループがＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスを作製しその特徴を明らかにした（非特許文献８３）。
【０１６１】
特定のヒトＭＨＣ分子と実験動物が発現する特定のＭＨＣ分子との交差反応性に依拠する代替法も存在する。Ｂｅｒｔｏｎｉおよびその同僚ら（非特許文献８４）は、特定のＨＬＡクラスＩスーパータイプとチンパンジによって発現される特定のＰＡＴＲ分子との間で評価可能な交差反応性を実証できることを述べた。クラスＩＩ（非特許文献８５）およびクラスＩ（非特許文献８６）の分子レベルでのヒトとマカクの交差反応性も記述された。最後に、ヒトＨＬＡ  Ｂ７スーパータイプによって認識されるモチーフは、ネズミクラスＩ  Ｌdによって認識されるモチーフ（非特許文献６５）と本質的に同じであることも留意されたい。マウスにおいてＨＬＡ  ＤＲ限定エピトープを試験することに関連して、ＤＲ１とＩＡbのモチーフには類似性が存在することがＷａｌｌ等（非特許文献８７）によって示された。本発明者らは、本発明者らのトランスジェニックマウスを定期的に繁殖させて、この偶然の類似性を利用した。また、本発明者らは、本発明者らのペプチドのほとんどがＩＡbに結合し、その結果、これらのマウスをＣＴＬおよびＨＴＬ免疫原性の試験に使用したことも示した。
【０１６２】
臨床試料からの免疫応答の測定および定量化
ワクチン性能を評価する重大な要素は、インビボでの免疫応答誘発能力を評価することである。免疫原ならびに一般的な復活抗原に対するＣＴＬおよびＨＴＬ応答の解析は、一般的に使用され当分野では既知である。使用されるアッセイには、クロミウム放出、リンホカイン分泌、リンパ球増殖アッセイが含まれる。
【０１６３】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色、四量体染色などのより感度の高い技術が当分野で利用可能になった。これらのより新しい方法は、一般的なＣＴＬおよびＨＴＬアッセイよりも１０倍から１００倍感度が高いと推定される（非特許文献８８）。小れは、従来の方法が、インビトロで増殖することができ、実際に、メモリーＴ細胞区画の一部分のみの代表とすることができるＴ細胞のサブセットのみを測定するためである（非特許文献８９）。具体的には、これらの技術を使用して、ＨＩＶの例で以前の技術ならば検出不可能であった患者からの抗原特異的ＣＴＬ応答が測定された（非特許文献９０〜９５）。
【０１６４】
ほとんど例外なく、新たに単離した細胞の直接の活動を従来のアッセイで実証することは困難であった（非特許文献８９）。しかし、感度が向上したより新しい技術により、感染したヒトまたは実験動物から新たに単離した細胞からの応答を研究者が検出することが可能になった（非特許文献８８、８９）。インビトロでの再刺激ステップによらないこれらの高感度アッセイが利用できることによって、自然感染および癌におけるＣＴＬ機能の研究が大いに促進された。これに対し、実験的ワクチンの有効性を判定する基準として利用されるアッセイは、通常、１つまたは複数のインビトロでの再刺激ステップと共に実施される（非特許文献８９）。実際、ほとんど例外なく（非特許文献９６）、新たに単離したクラスＩ限定ＣＤ８＋Ｔ細胞で、ＣＴＬ応答を誘発するように設計した実験的ワクチンによる免疫化に対する応答を実証することは困難である。ＥＬＩＳＰＯＴ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＩＦＮγＥＬＩＳＡなどの高感度アッセイは、再刺激ステップと組み合わせて使用して最大の感度を達成した。ＭＨＣ四量体も、この目的に使用される。
【０１６５】
ＭＨＣ四量体は、１９９６年にＡｌｔｍａｎおよびその同僚によって始めて記述された。彼らは、ＣＴＬエピトープを含むＨＩＶ特異的ペプチドと共に折り畳まれ、蛍光マーカーでタグ付けされた四量体中に、一緒に複合体化された可溶性ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子を作製した。これらを用いて、このエピトープを認識するＨＩＶ感染個体由来のＴ細胞集団を標識した（非特許文献８９）。次いで、これらの細胞をフローサイトメトリーによって定量化し、このエピトープに特異的なＴ細胞の頻度測定が可能になった。この技術は、ＨＩＶ研究ならびに他の感染症で極めて一般的になった（非特許文献８９〜９３）。しかし、四量体法が、定義されたＨＬＡ／ペプチドの組合せに依拠している点で、ＨＬＡ多型性がこの技術の一般的な適用を制限する可能性がある。しかし、ＨＩＶ誘導ペプチドを含めて種々のペプチドが、Ａ２、Ａ３およびＢ７スーパータイプの異なるメンバーにおいてペプチド特異的ＣＴＬ系によって認識されることが示された（非特許文献２、９７）。まとめるとこれらの知見は、所与のＭＨＣ／ペプチドの組合せに対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、同じスーパータイプからの異なるＭＨＣ分子によって提示される同じペプチドに対して検出可能な親和性を有することを示している。
【０１６６】
予防薬ワクチンの効力が持続性メモリー応答（ｍｅｍｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の誘発と主に相関する状況において、再刺激アッセイは、ワクチンが誘発する免疫応答をモニターするのに最も適切で感度の高い測定法になり得る。これに対し、治療用ワクチンの場合、作用と免疫学的に相関する主なものは、一次アッセイによって最も適切に測定されるエフェクターＴ細胞機能の誘導であろう。したがって、高感度アッセイを使用することによって、ワクチン効力を免疫学的にモニターするのに最も適した試験戦略が可能になる。
【０１６７】
トランスフェクションされたヒトＡＰＣにおけるマルチエピトープ構築物の免疫原性
ヒト細胞におけるエピトープのプロセシングおよび提示を評価するために抗原性アッセイを実施した。ヒト標的細胞にマルチエピトープ核酸ワクチンを効率的にトランスフェクションするエピソームベクターを用いて、このような解析を実施した。
【０１６８】
たとえば、２２１  Ａ２Ｋb標的細胞にＨＩＶ−１  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）ワクチンをトランスフェクションした。２２１  Ａ２Ｋb標的細胞は、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて発現されるＡ２Ｋb遺伝子を発現するが、内在性のクラスＩを発現しない（非特許文献９８）。ＨＬＡトランスジェニックマウスに由来し、様々なＨＩＶ誘導ＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬ系に対する抗原を提示するこれらの能力につて、これらのトランスフェクション細胞を試験した。異なるＣＴＬ系の抗原感受性の差を補正するために、トランスフェクションしていない細胞をＡＰＣとして用いて、ペプチド投与量の滴定を並行して行った。代表的なデータを図８に示す。ＨＩＶ  Ｐｏｌ  ４９８特異的ＣＴＬの場合、トランスフェクション標的細胞は、ＩＦＮγ３７８ｐｇ／ｍｌの放出を誘発した。ペプチドの用量反応の調査から、外来の添加ペプチド４８ｎｇ／ｍｌがほぼ同じレベルのＩＦＮγ放出を達成するのに必要なことが明らかである。これらの結果は、外来の添加ペプチド４８ｎｇ／ｍｌに相当する比較的多量のＰｏｌ  ４９８エピトープがトランスフェクション細胞によって提示されることを示している。
【０１６９】
【表６】
2005502320.tif 000008
【０１７０】
比較すると、２５ｐｇ／ｍｌ未満のＩＦＮγがＧａｇ  ２７１エピトープに特異的なＣＴＬを利用して検出された。トランスフェクションしていない標的細胞によるコントロールのペプチド滴定からは０．２ｐｇ／ｍｌの「ペプチド当量」（ＰＥ）しか検出できなかったので、この陰性結果を、利用した特定のＣＴＬ系の感受性の低さに帰することができないことが明らかになった。したがって、Ｇａｇ  ２７１エピトープは、ＨＩＶ−１トランスフェクション標的細胞において効率的にプロセシングも提示もされていないと考えられる。プロセシング効率のおおよその定量として「ペプチド当量」値を利用することによって、Ｐｏｌ  ４９８エピトープよりも少なくとも２００倍少ないＧａｇ  ２７１がトランスフェクション標的によって提示されると推定することができる。
【０１７１】
ＨＩＶ−ＦＴに含まれる４個の異なるエピトープに対する様々な独立した測定の結果を表５に集めた。ＨＩＶ−ＦＴトランスフェクション細胞から生成される各エピトープの量は、Ｐｏｌ  ４９８の３０．５ＰＥからＧａｇ  ２７１の０．２ＰＥ未満の低さにまでわたった。２つのエピトープＥｎｖ  １３４およびＮｅｆ  ２２１は、それぞれ６．１および２．１ＰＥの中間的な値であった。
【０１７２】
次に、これらの結果を、ＨＩＶ−ＦＴ構築物による免疫後に各エピトープで観測されたインビボでの免疫原性の値と相関付けた。Ｐｏｌ  ４９８エピトープは予想通り免疫原性も最も高かった。インビボで中間的な免疫原性が認められたＥｎｖ  １３４およびＮｅｆ  ２２１エピトープは、インビトロでもトランスフェクションされたヒト細胞により中程度の効率でプロセシングを受けた。最後に、インビトロで検出可能なプロセシングが認められなかったＧａｇ  ２７１は、インビボの免疫原性も頻度、大きさ共に最適以下であった。
【０１７３】
これらのデータは、いくつかの重要な意味を含んでいる。第１に、これらは、所与の構築物に含まれる異なるエピトープが特異な効率でプロセシングを受け提示され得ることを示唆している。第２に、これらのデータは、プロセシングを受けて生成したエピトープの量に免疫原性が比例することを示唆している。最後に、これらの結果は、ヒト用に向けられたマルチエピトープワクチンを最適化するためにトランスジェニックマウスを使用することに重要な確証を与えるものである。
【０１７４】
ＩＩＩ．マルチエピトープ構築物の調製
マルチエピトープ構築物中に含まれるエピトープは、ＰＣＴ出願（特許文献４または５）に記載されているように、典型的には、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ結合モチーフを有する。マルチエピトープ構築物は、たとえば、非特許文献７に記載される方法に従って調製することができる。
【０１７５】
マルチエピトープ構築物中に存在するＨＬＡクラスＩＩまたはクラスＩの複数のエピトープは、同じ抗原からでも異なる抗原からでも誘導することができる。たとえば、マルチエピトープ構築物は、同じウイルスの異なる２つの抗原または異なるウイルスの異なる２つの抗原から誘導される１つまたは複数のＨＬＡエピトープを含むことができる。マルチエピトープ構築物に含まれるエピトープは、たとえば、ＨＬＡ対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むエピトープを選択するためのコンピュータを用いることによって、当業者により選択されうる。本発明のマルチエピトープ構築物は、１つまたは複数の広範な交差反応性結合、または汎用のＨＬＡクラスＩＩエピトープ、たとえば、（特許文献７に記載された）ＰＡＤＲＥ（登録商標）（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはＰＡＤＲＥ（登録商標）ファミリー分子をコードすることもできる。
【０１７６】
汎用ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、他のＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩエピトープと都合良く結合して、所与の抗原に応答して活性化される細胞の数を増加させ、ＨＬＡ反応性対立遺伝子の集団に対してより広範に適用することができる。したがって、本発明のマルチエピトープ構築物は、抗原特異的ＨＬＡエピトープ、汎用ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、あるいは特異的ＨＬＡエピトープと少なくとも１つの汎用ＨＬＡクラスＩＩエピトープとの組合せを含むことができる。
【０１７７】
ＨＬＡクラスＩエピトープは、一般に、約８から約１３アミノ酸長、特に８、９、１０または１１アミノ酸長である。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、一般に、約６から２５アミノ酸長、特に約１３から２１アミノ酸長である。ＨＬＡクラスＩまたはＩＩエピトープは、対象とする任意所望の抗原から誘導することができる。対象とする抗原は、ウイルス抗原、表面受容体、腫瘍抗原、腫瘍遺伝子、酵素または任意の病原体、免疫応答が望まれる細胞または分子などとすることができる。エピトープは、１個または複数のＨＬＡ対立遺伝子を結合するその能力に基づいて選択することができる。天然に存在する配列のアナログであるエピトープも本明細書に記載するマルチエピトープ構築物に入れることができる。このようなアナログペプチドは、たとえば、特許文献３、４および８に記載されている。
【０１７８】
エピトープの配置およびエピトープ間のスペーサーを最適化するための本明細書に記載する方法が与えられれば、当業者は本明細書に記載のマルチエピトープ構築物中に任意のＨＬＡエピトープを入れることができる。図２、３、９、１７および１８Ａ〜１８Ｎは例示的な構築物を示し、構築物中のエピトープは図１９Ａ〜１９Ｅに列挙されている。例示的な構築物は、図２０Ｂ、２０Ｄ、２０Ｅおよび２０Ｆ（エピトープを図２０Ａに記載する）；図２１Ｂ、２１Ｄおよび２１Ｅ（エピトープを図２１Ａに記載する）；図２２Ｂ、２２Ｄおよび２２Ｅ（エピトープを２２Ａに記載する）；図２３Ｃ；ならびに図２４Ｂおよび２４Ｃ（エピトープを図２４Ａに記載する）にも記載されている。マルチエピトープ構築物は、図１９Ａ〜１９Ｅ、２０Ａ、２１Ａ、２２Ａおよび２４Ａに記載した５以上または６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５または３０以上のエピトープを含むことができる。これらのエピトープの任意の組合せを含むマルチエピトープ構築物は、本明細書に記載の手順を用いて最適化することができ、スペーサーも同様に最適化することができる。
【０１７９】
マルチエピトープ構築物は、当分野で周知の方法論を用いて作製することができる。たとえば、マルチエピトープ構築物を含むポリペプチドを合成し連結することができる。通常は組換えＤＮＡ技術を用いてマルチエピトープ構築物を構築する。
【０１８０】
ＩＶ．発現ベクター、およびマルチエピトープ構築物の構築
本発明のマルチエピトープ構築物は、マルチエピトープポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターとして一般に提供される。このような発現ベクターの構築は、たとえば、特許文献９に記載されている。発現ベクターは、抗原が発現され適切なＨＬＡ分子を標的とするように、生物体の適切な細胞中で核酸をコードする転写単位を発現することが可能な少なくとも１つのプロモーターエレメントを含む。たとえば、ヒトに投与する場合、ヒト細胞中で機能するプロモーターエレメントが発現ベクター中に組み込まれている。
【０１８１】
好ましい実施形態において、本発明は、組換え遺伝学の分野で普通の技術を利用する。この発明で使用する一般的な方法を開示する基本的なテキストには、たとえば、非特許文献９９〜１０６が含まれる。
【０１８２】
エピトープをコードする核酸は、標準技術に従い構築物中に組み立てられる。一般に、マルチエピトープポリペプチドをコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅技術を用いて単離されるか、または化学的に合成される。組換えクローニング技術も、適宜使用することができる。所望のエピトープを（ＰＣＲにより構築物を組み立てるとき）増幅するかまたは（合成オリゴヌクレオチドを用いて構築物を組み立てるとき）コードするオリゴヌクレオチド配列を選択する。
【０１８３】
プライマーを用いた増幅技術は、一般に、最適エピトープをコードする配列をＤＮＡまたはＲＮＡから増幅し単離するのに使用される（特許文献１０、１１、非特許文献１０７）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの方法を用いて、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからエピトープ核酸配列を直接増幅することができる。制限エンドヌクレアーゼ部位をプライマーに組み込むことができる。ＰＣＲ反応によって増幅されたマルチエピトープ構築物を、アガロースゲルから精製し、適切なベクター中にクローン化することができる。
【０１８４】
合成オリゴヌクレオチドを用いてマルチエピトープ構築物を構築することもできる。この方法は、遺伝子のセンス鎖とナンセンス鎖の両方を表現する、一連の重複するオリゴヌクレオチドを用いて実施される。次いで、これらのＤＮＡ断片をアニールし、連結し、クローン化する。市販されていないオリゴヌクレオチドは、自動合成装置（非特許文献１０９）を用いて、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（非特許文献１０８）によって最初に記述された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動法またはアニオン交換ＨＰＬＣ（非特許文献１１０）のいずれかによる。
【０１８５】
マルチエピトープ構築物のエピトープは、一般に、転写を指令する強力なプロモーター、ならびに、エンハンサー、ポリアデニル化部位のような他の制御配列を含む発現ベクター中にサブクローン化される。適切なプロモーターは当分野で周知であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等およびＡｕｓｕｂｅｌ等に記載されている。哺乳動物細胞用真核生物発現システムは当分野で周知であり市販されている。このようなプロモーターエレメントには、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０が含まれる。
【０１８６】
発現ベクターは、一般に、転写単位すなわち宿主細胞中でのマルチエピトープ構築物の発現に必要な追加のエレメントをすべて含む発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、マルチエピトープ構築物に作動可能に連結されたプロモーターおよび転写物の効率的ポリアデニレーションに必要なシグナルを含む。カセットの追加のエレメントは、エンハンサー、および、機能的なスプライスドナーおよびアクセプター部位を含むイントロンを含むことができる。
【０１８７】
発現カセットは、プロモーター配列に加えて、構造遺伝子の下流にあり、効率的なターミネーションをもたらす転写ターミネーション領域を含むこともできる。ターミネーション領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子からでも異なる遺伝子からでも得ることができる。
【０１８８】
遺伝情報を細胞中に輸送するのに使用する特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞の発現に使用される従来のベクターはどれでも使用することができる。真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、一般に、真核生物発現ベクター、たとえば、ＳＶ４０ベクター、ＣＭＶベクター、乳頭腫ウイルスベクターおよびエプスタインバーウイルスから誘導されるベクターに使用される。
【０１８９】
本発明のマルチエピトープ構築物は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、細菌ベクターを含めて様々なベクターから発現させることができる。ウイルス発現ベクターの例は、ワクシニア、鶏痘などの弱毒ウイルス宿主である。この手法の例として、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてワクシニアウイルスを用いる。腫瘍を有する宿主中に導入すると、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主のＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発する。免疫化プロトコルに有用なワクシニアベクターおよび方法は、たとえば特許文献１２に記載されている。
【０１９０】
治療投与または免疫化に有用な他の多種多様なベクター、たとえば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ））、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、解毒炭そ毒素ベクターなどのような非ウイルスベクターは当業者には明白である。
【０１９１】
マルチエピトープ構築物の免疫原性および抗原性は、本明細書に記載の通りに評価される。
【０１９２】
標的配列
本発明の発現ベクターは、ＭＨＣ標的配列に作動可能に連結された１つまたは複数のＭＨＣエピトープをコードすることができ、本明細書では「標的核酸」または「標的配列」と称する。ＭＨＣ標的配列を使用すると、ＭＨＣ分子アセンブリー部位にペプチドエピトープを誘導し細胞表面に輸送することによって、抗原に対する免疫応答が抗原単体を送達するよりも亢進され、それによってＴ細胞に結合しそれを活性化するのに役立つＭＨＣ分子−ペプチドエピトープ複合体の数が増加する。
【０１９３】
ＭＨＣクラスＩ標的配列、たとえば、ＭＨＣクラスＩエピトープペプチドをサイトゾル経路または小胞体に導く配列（非特許文献６５）を本発明に使用することができる。たとえば、サイトゾル経路は、細胞内部で発現される内在性抗原をプロセシングする。特定の理論に拘泥するものではないが、サイトゾルタンパク質は、プロテアソームのエンドペプチダーゼの働きによって少なくとも部分的に分解され、その後ＴＡＰ分子（プロセシング関連トランスポーター）によって小胞体に輸送されると考えられる。小胞体では、この抗原はＭＨＣクラスＩ分子に結合する。小胞体シグナル配列は、サイトゾルプロセシング経路を迂回し、内在性抗原を直接小胞体に導き、そこでペプチド断片へのタンパク質分解が起こる。このようなＭＨＣクラスＩ標的配列は当分野で周知であり、たとえば、Ｉｇκ、組織プラスミノゲンアクチベーター、インシュリンなどからのシグナル配列が含まれる。好ましいシグナルペプチドはヒトＩｇκ鎖配列である。小胞体シグナル配列は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープをＭＨＣクラスＩ分子アセンブリー部位である小胞体に導くのにも使用することができる。ＭＨＣクラスＩＩ標的配列、たとえば、ペプチドをエンドサイトーシス経路に導く標的配列も本発明で使用することができる。これらの標的配列は、一般に、細胞外抗原を誘導してエンドサイトーシス経路に入り、その結果、抗原はリソソーム区画へ移され、そこでタンパク質分解によって抗原は抗原ペプチドに切断されＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。外来性抗原の通常のプロセシングと同様に、ＭＨＣクラスＩＩエピトープをエンドサイトーシス経路のエンドソームに誘導し、および／または引き続いてリソソーム（ここで、ＭＨＣクラスＩＩエピトープがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができる）に誘導する配列が、ＭＨＣクラスＩＩ標的配列である。たとえば、本発明に有用なＭＨＣクラスＩＩ標的配列グループは、リソソーム標的配列であり、ポリペプチドをリソソームに局在化させる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、一般に、リソソーム中のエンドサイトーシスによって取り込まれた抗原のタンパク質分解プロセシングから誘導される抗原ペプチドに結合するので、リソソーム標的配列はＭＨＣクラスＩＩ標的配列として機能することができる。リソソーム標的配列は、当分野で周知であり、Ａｕｇｕｓｔ等（特許文献１３。参照によりこれを本明細書に援用する）によって記述されたリソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２中に見出される配列などがある。
【０１９４】
リソソーム標的配列を含む他のリソソームタンパク質には、ＨＬＡ−ＤＭが含まれる。ＨＬＡ−ＤＭは、抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するのを促進する際に機能するエンドソーム／リソソームタンパク質である。ＨＬＡ−ＤＭはリソソームにあるので、これはＭＨＣクラスＩＩ分子標的配列として機能することができるリソソーム標的配列を有する（非特許文献１１１。参照によりこれを本明細書に援用する）。
【０１９５】
常在性のリソソームタンパク質ＨＬＡ−ＤＯも、リソソーム標的配列として機能することができる。タンパク質をリソソームに導く特異的Ｔｙｒ含有モチーフをコードする上述の常在性リソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１およびＨＬＡ−ＤＭに対し、ＨＬＡ−ＤＯはＨＬＡ−ＤＭを伴ってリソソームに導かれる（非特許文献１１２。参照によりこれを本明細書に援用する）。したがって、ＨＬＡ−ＤＭと結合し、その結果ＨＬＡ−ＤＯをリソソームに移すＨＬＡ−ＤＯ配列は、ＡＭＣクラスＩＩ標的配列として使用することができる。同様に、ＨＬＡ−ＤＯのネズミ相同配列であるＨ２−ＤＯは、ＭＨＣクラスＩＩ標的配列を導くのに使用することができる。ＭＨＣクラスＩＩエピトープを、ＨＬＡ−ＤＯまたはＨ２−ＤＯと融合してリソソームに導くことができる。
【０１９６】
別の例では、Ｂ細胞受容体サブユニットＩｇ−αおよびＩｇ−βの細胞質ドメインは、抗原の内在化を仲介し、例えば特許文献１１３に開示されるように抗原提示の効率を向上させる。したがって、Ｉｇ−αおよびＩｇ−βタンパク質の細胞質ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープをエンドサイトーシス経路に導いてプロセシングしＭＨＣクラスＩＩ分子へ結合させるＭＨＣクラスＩＩ標的配列として機能することができる。
【０１９７】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープをエンドサイトーシス経路に導くＭＨＣクラスＩＩ標的配列の別の例は、ポリペプチドを分泌するように指令する配列であり、ポリペプチドはエンドソーム経路に入ることができる。ポリペプチドの分泌を誘導するこれらのＭＨＣクラスＩＩ標的配列は、外来性細胞外抗原がプロセシングを受けて、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドになる通常の経路を模倣したものである。ポリペプチドを小胞体を経由して導き最終的に分泌させる働きをする任意のシグナル配列は、分泌ポリペプチドがエンドソーム／リソソーム経路に入り、切断されてＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるペプチドになることができる限りは、ＭＨＣクラスＩＩ標的配列として機能することができる。
【０１９８】
別の例では、Ｉｉタンパク質は、小胞体中のＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、そこで、小胞体中に存在するペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するのを防止する働きをする。したがって、ＭＨＣクラスＩＩエピトープがＩｉタンパク質に融合することによって、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは小胞体およびＭＨＣクラスＩＩ分子に導かれる。たとえば、Ｉｉタンパク質のＣＬＩＰ配列を取り除いてＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩエピトープ配列で置換することができ、その結果ＭＨＣクラスＩＩエピトープは小胞体に導かれて、そこで、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。
【０１９９】
いくつかのケースでは、抗原自体がＭＨＣクラスＩＩまたはＩ標的配列として働き、汎用ＭＨＣクラスＩＩエピトープに融合して免疫応答を刺激することができる。細胞質ウイルス抗原は一般にプロセシングを受けてＭＨＣクラスＩ分子との複合体として提示されるが、インフルエンザ基質タンパク質などの長寿命細胞質タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ分子プロセシング経路に入ることができる（非特許文献１１４）。したがって、長寿命細胞質タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ標的配列として機能することができる。たとえば、汎用ＭＨＣクラスＭＨＣクラスＩＩエピトープに融合したインフルエンザ基質タンパク質をコードする発現ベクターを、都合よく使用してインフルエンザ抗原および汎用ＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩエピトープをＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ経路に導き、インフルエンザに対する免疫応答を刺激することができる。
【０２００】
ＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ標的配列として機能する抗原の別の例は、自然に粒子を形成するポリペプチドである。このポリペプチドは、それらを産生する細胞から分泌され、自然に粒子を形成する。粒子は受容体仲介エンドサイトーシスなどのエンドサイトーシスによって抗原提示細胞中に取り込まれ、またはファゴサイトーシスによって飲み込まれる。粒子は、エンドソーム／リソソーム経路に入った後、タンパク質分解によって切断され抗原ペプチドになる。
【０２０１】
自然に粒子を形成するこのようなポリペプチドの１つは、例えば非特許文献１１５および１１６に開示されるようなＨＢＶ表面抗原（ＨＢＶ−Ｓ）である。自然に粒子を形成する別のポリペプチドは、例えば非特許文献１１７に開示されるようなＨＢＶコア抗原である。自然に粒子を形成するさらに別のポリペプチドは、非特許文献１１８に開示されような酵母Ｔｙタンパク質である。たとえば、汎用ＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩエピトープに融合したＨＢＶ−Ｓ抗原を含む発現ベクターを好都合に使用して、ＨＢＶ−Ｓ抗原および汎用ＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩエピトープをＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ経路に導き、ＨＢＶに対する免疫応答を刺激することができる。
【０２０２】
インビボでの投与
本発明は、本発明の発現ベクターを個体に投与することによって、免疫応答を刺激するための方法も提供する。本発明の発現ベクターはＭＨＣエピトープをＭＨＣ分子に導き、したがって発現ベクターがコードする抗原によって活性化されるＣＴＬおよびＨＴＬの数が増加するので、本発明の発現ベクターを投与して免疫応答を刺激することは有利である。
【０２０３】
まず、本発明の発現ベクターをマウスでスクリーニングして、所望の免疫応答を刺激するのに最適な活性を有する発現ベクターを決定する。したがって、最初の試験を、可能な場合には、ＭＨＣ標的配列のマウス遺伝子を用いて実施する。本発明の発現ベクターの活性を決定する方法は、当分野で周知であり、たとえば、以下の実施例ＩＩおよびＩＩＩに記載したＴ細胞活性を測定するための3Ｈ−チミジンの取り込みおよびＣＴＬ活性を測定するための51Ｃｒの放出が含まれる。実施例ＩＶに記載したのと類似の実験を実施して、免疫応答を刺激する活性を有する発現ベクターを決定する。活性を有する発現ベクターを、さらにヒトで試験する。コードされたマウス配列に対して、有害である可能性のある免疫応答を回避するため、ＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ標的配列がヒト遺伝子から誘導されるように、活性を有する発現ベクターを修飾する。たとえば、様々なＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ標的配列を含む遺伝子のヒト相同配列の類似領域を本発明の発現ベクター中に置換する。下記実施例Ｉに記載する発現ベクターなどのヒトＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ標的配列を含む発現ベクターが、ヒトにおいて免疫応答を刺激する活性があるかどうか試験する。
【０２０４】
本発明は、薬剤的に許容される担体および本発明の発現ベクターを含む薬剤組成物にも関する。薬剤的に許容される担体は、当分野で周知であり、生理緩衝食塩水、アルコール／水性溶液、あるいはグリコール、グリセロール、オリーブオイルのようなオイルまたは注射可能な有機エステルのような他の溶媒またはビヒクルを含む、水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。
【０２０５】
薬剤的に許容される担体は、たとえば、発現ベクターを安定化し、発現ベクターの吸収を増大させる働きをする生理学的に許容される化合物を含むことができる。このような生理学的に許容される化合物には、たとえば、グルコース、スクロース、デキストランのような炭水化物、アスコルビン酸、グルタチオンのような酸化防止剤、キレート剤、低分子量ポリペプチド、抗菌剤、不活性ガスまたは他の安定剤または賦形剤などである。さらに、発現ベクターは、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物のような他の化合物と複合体を形成することができる。発現ベクターは、たとえば、ワクチン銃（ｖａｃｃｉｎｅ  ｇｕｎ）を用いて個体に投与できる粒子またはビーズに複合化することもできる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含めて薬剤的に許容される担体の選択は、たとえば、発現ベクターの投与経路によって決まることを知っている。
【０２０６】
本発明は、本発明の発現ベクターを含む薬剤組成物を投与して免疫応答を刺激する方法にも関する。発現ベクターは、たとえば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ等（非特許文献１１９）、Ｆｅｌｇｎｅｒ他（特許文献１４）、Ｆｅｌｇｎｅｒ（特許文献１５）およびＣａｒｓｏｎ他（特許文献１６）に記載された当分野で周知の方法によって投与される。一実施形態では、マルチエピトープ構築物を裸の核酸として投与する。
【０２０７】
本発明の発現ベクターを含む薬剤組成物は、たとえば、経口、腟内、直腸、または、静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、腹腔内、槽内のような非経口を含めて様々な経路によって、あるいは、たとえば、皮膚貼付薬または経皮イオントフォレーシスにより皮膚を通してそれぞれ受動吸収または促進吸収することによって、患者に投与して免疫応答を刺激することができる。また、この組成物は、注射、挿管または局所で投与することができ、そのうち後者は受動で、たとえば、軟膏または粉末を直接適用することができ、または能動で、たとえば、スプレー式点鼻薬または吸入剤を用いることができる。発現ベクターは、局所スプレーとして投与することもでき、この場合、組成の１成分は適切な噴霧剤である。薬剤組成物は、所望であれば、特許文献１５、非特許文献１２０に記載されるように、リポソーム、ミクロスフェアまたは他のポリマーマトリックス中に入れることもできる。リポソームは、たとえば、リン脂質または他の脂質からなり、比較的簡単に作製され、投与され、無毒で生理学的に許容される代謝可能な担体である。
【０２０８】
本発明の発現ベクターは、特許文献１４および１５に記載されるように、動物の身体組織の間質空間に送達することができる。本発明の発現ベクターを、皮内および皮下注射ならびに経皮投与を含めて筋肉へ投与することは、特に有効な投与方法である。イオントフォレーシスなどによる経皮投与も、本発明の発現ベクターを筋肉に送達させる有効な方法である。本発明の発現ベクターの表皮投与も利用することができる。表皮投与には、表皮の最外層を機械的または化学的に刺激して刺激薬に対する免疫応答を刺激することが含まれる（特許文献１６）。
【０２０９】
本発明の発現ベクターを投与して免疫応答を刺激する他の有効な方法には、特許文献１６に記載されるような粘膜投与が含まれる。粘膜投与の場合、最も有効な投与方法には、発現ベクターおよび薬剤組成物を含有する適切なエアロゾルの鼻腔内投与が含まれる。坐薬および局所製剤も、生殖、膣および眼球の各部位の粘膜組織に発現ベクターを送達するのに有効である。また、発現ベクターを、粒子に複合化してワクチン銃によって投与することができる。
【０２１０】
投与すべき用量は、投与方法によって決まり、一般に約０．１μｇから約２００μｇの間である。たとえば、投与量を約０．０５μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、特に約０．００５〜５ｍｇ／ｋｇとすることができる。有効投与量は、たとえば、発現ベクター投与後の免疫応答を測定することによって決定することができる。たとえば、発現ベクターによってコードされるＭＨＣクラスＩＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩエピトープに特異的な抗体の産生は、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイを含めた当分野で周知の方法によって測定することができる。また、Ｔヘルパー細胞またはＣＴＬ応答の活性は、たとえば、Ｔ細胞活性を測定するための3Ｈ−チミジンの取り込み、およびＣＴＬ活性を測定するための51Ｃｒの放出を含めて、当分野で周知の方法によって測定することができる（下記実施例ＩＩおよびＩＩＩ参照）。
【０２１１】
本発明の発現ベクターを含む薬剤組成物は、予防または治療の目的で哺乳動物、特にヒトに投与することができる。本発明の発現ベクターを用いて治療または予防できる疾患の例には、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶおよびＣＭＶによる感染、ならびに前立腺癌、腎癌、子宮頚癌、リンパ腫、尖圭コンジローマおよび後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が含まれる。
【０２１２】
治療に適用するには、癌、自己免疫疾患またはウイルス感染にすでに罹っている個体に本発明の発現ベクターを投与する。汎用ＭＨＣクラスＩＩエピトープのすべてを発現している個体を含めて、個体の潜伏期または急性期にある個体は、本発明の発現ベクターを、適宜個別にまたは他の治療と組み合わせて治療することができる。
【０２１３】
治療および予防に適用する場合には、本発明の発現ベクターを含む薬剤組成物を、抗原に対して有効な免疫応答を誘発し疾患の徴候または症状を寛解させるのに十分な量で患者に投与する。疾患の徴候または症状を寛解させるのに十分な発現ベクターの投与量を治療有効量と称する。治療有効量を実現するのに十分な発現ベクター量は、本発明の発現ベクターを含む薬剤組成、投与方法、治療する疾患の状態および重症度、患者の体重および全般的な健康状態、および処方医師の判断によって決まる。
【実施例】
【０２１４】
以下の例は、特許請求の範囲に記載された発明を限定するためではなく、例示のために提供するものである。本明細書に記載する実施例および実施形態は例示の目的のためだけにあり、それに合わせて様々な修飾または変更が当業者に示唆されるが、それらは本願の精神と範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものと理解されたい。
【０２１５】
実施例１〜９は、マルチエピトープ構築物の免疫原性および抗原性を評価するためのアッセイの例を提供する。
【０２１６】
（実施例１）
抗原性アッセイ
ＤＮＡ、ペプチド／ＩＦＡまたはリポペプチドで初回抗原刺激したトランスジェニックマウスのひ細胞から高親和性ペプチド特異的ＣＴＬ系を生成させることができる。簡潔に述べると、トランスジェニックマウスから採取したひ細胞をペプチド０．１μｇ／ｍｌおよびＬＰＳ芽細胞で刺激する。初回刺激から１０日後およびその後毎週、ペプチド０．１μｇ／ｍｌと共にＬＰＳ芽細胞を１時間間欠投与して細胞を再刺激する。再刺激から５日後に上述したｉｎ  ｓｉｔｕ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡでＣＴＬ系を評価する。あるいは、たとえば、標的病原体に感染した患者または標的疾患、たとえば、癌に罹った患者から誘導されるＣＴＬ系を使用することができる。トランスジェニックマウスまたは患者のいずれからも入手不可能な特異的ＣＴＬ系を当技術分野の専門技術を利用して正常なドナーのＰＢＭＣから生成させる。
【０２１７】
これらのアッセイに使用すべき標的細胞は、トランスジェニックマウスから誘導されるＣＴＬ系に対するＡ２．１／Ｋb、Ａ１１／Ｋb、Ａ１／ＫbまたはＢ７／Ｋbをトランスフェクションしたジャーカット細胞または．２２１細胞である。これらの細胞系すべてが現在入手可能である（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ヒトＣＴＬ系の場合、適切なヒトＨＬＡ対立遺伝子をトランスフェクションした．２２１細胞を利用する。本発明者らは、Ａ２およびＡ１をトランスフェクションした．２２１細胞を現在所有しており、Ａ１１、Ａ２４およびＢ７の各トランスフェクション体を作製している。別の実施形態において、標的細胞に関して予期せぬ問題が生じた場合、ＬＰＳ芽細胞およびＥＢＶで形質転換された系をそれぞれネズミおよびヒトＣＴＬ系に対して利用する。
【０２１８】
抗原性をアッセイするために、連続して希釈したＣＴＬを１０5個の標的細胞と１から１０-6μｇ／ｍｌの複数のペプチド濃度でインキュベートする。また、対象とするマルチエピトープ構築物を含むエピソームベクターをトランスフェクションした標的細胞ともＣＴＬをインキュベートする。エピソームベクターは当分野で既知である。
【０２１９】
マルチエピトープ核酸をトランスフェクションしたＡＰＣ中で自然のプロセシングによって生成されるペプチドの相対量を以下のように定量する。ＣＴＬ系がトランスフェクション標的細胞を認識して生成するＩＦＮγの量を記録する。同量のＩＦＮγを生成させるのに必要な合成ペプチド量を、同じＣＴＬ系を既知濃度のペプチドと共に並行してインキュベートしたとき作成される標準曲線から内挿する。
【０２２０】
（実施例２）
マウス、免疫化および細胞培養物
この試験に使用するＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋb（非特許文献６０）およびＡ１１／Ｋb（非特許文献７２）トランスジェニックマウスの誘導についてはすでに記述されている。ＨＬＡ  Ｂ７  Ｋbトランスジェニックマウスは、社内で入手可能である（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ＨＬＡ  ＤＲ２、ＤＲ３およびＤＲ４トランスジェニックマウスは、Ｃ．Ｄａｖｉｄ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ）から得られる。非トランスジェニックＨ−２bマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたは他の業者から購入する。免疫化を、たとえば、非特許文献７に記載のとおりに実施した。細胞すべてを、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン４ｍＭ、２−ＭＥ５０μＭ、ピルビン酸ナトリウム０．５ｍＭ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよびペニシリン１００Ｕ／ｍｌを補充したＨＥＰＥＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなる培地で増殖させた。
【０２２１】
ＨＬＡトランスジェニックマウスおよび抗原性アッセイを、ＣＴＬ応答を試験し最適化するために使用する。ＨＬＡ−ＤＲとＩＡbの自然交差反応性もＨＴＬ応答を試験するために利用することができる。この評価によって、マルチエピトープ構築物の抗原性および免疫原性が評価される。
【０２２２】
（実施例３）
増殖アッセイ
ＨＴＬエピトープの免疫応答誘導能力を評価するために、増殖アッセイのようなアッセイを実施することが多い。たとえば、マウスＣＤ４  Ｔリンパ球は、ひ臓の単細胞懸濁物からＤｙｎａＢｅａｄｓ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）（Ｄｙｎａｌ）を用いて免疫磁気により単離される。手短に述べると、２×１０7個のひ細胞を５．６×１０7個の磁気ビーズと共に４℃で４０分間インキュベートし、次いで３回洗浄する。磁気ビーズをＤｅｔａｃｈａＢｅａｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４（Ｄｙｎａｌ）を用いて引き離す。単離したＣＤ４  Ｔリンパ球（２×１０5細胞／ウェル）を５×１０5個の照射された（３５００ｒａｄ）同系ひ細胞と共に平底９６ウェルマイクロタイタープレート中で３組培養する。精製したペプチドを、最終濃度２０、１、０．０５および０μｇ／ｍｌでウェルに添加し、細胞を合計４日間培養する。回収する約１４時間前に、3Ｈ−チミジン（ＩＣＮ）１μＣｉを各ウェルに添加する。ウェルを、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いてＵｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｂプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）上に回収する。ＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）マイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて液体シンチレーションカウンティングにより3Ｈ−チミジン取りこみ量を測定する。
【０２２３】
（実施例４）
51クロミウム放出アッセイ
ＣＴＬ活性を測定するこのアッセイは当分野で周知である。このアッセイは、51Ｃｒ標識標的集団から放出される51Ｃｒの百分率を測定することによってＴ細胞集団の溶解活性を定量する（非特許文献１２１）。クロミウム放出アッセイから導出されるデータは、通常、ＣＴＬ頻度／１０6細胞（限界希釈法、ＬＤＡ（非特許文献１２２））として、またはこれより煩雑でないバルクＣＴＬ活性の定量評価（細胞溶解単位、ＬＵアッセイ）によって表される。ＬＵアッセイでは、51Ｃｒ放出アッセイで作成される標準Ｅ：Ｔ比対細胞障害性百分率のデータ曲線を、１０6エフェクター細胞当たりの細胞溶解単位（ＬＵ）に変換する。１ＬＵは、標的細胞の３０％を溶解するのに必要な溶解活性として定義される（非特許文献１２３）。ＬＵを計算することによって、応答を定量化することが可能になり、したがって異なる実験値を容易に比較することができる。
【０２２４】
（実施例５）
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＩＦＮγＥＬＩＳＡ
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＩＦＮγＥＬＩＳＡアッセイが開発され、新たに単離したひ細胞とペプチドで再刺激したひ細胞（非特許文献１２４）ＩＦＮの両方に対して最適化された。このアッセイは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを基にするが、可溶色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）を利用して、ハイスループット分析に容易に適用できるようになっている。１次および再刺激アッセイの両方で、この技術は、これら他のアッセイでは検出不可能な応答がｉｎ  ｓｉｔｕ  ＥＬＩＳＡで観測されるという点で、従来の上清のＥＬＩＳＡまたは51Ｃｒ放出アッセイのいずれよりも感度が高い。１個の細胞当たりを基準にして、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＥＬＩＳＡの感度は約１ＩＦＮγ分泌細胞／１０4培養細胞である。
【０２２５】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを抗ＩＦＮγ（ラット抗マウスＩＦＮαＭＡｂ、クローンＲ４−６Ａ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で終夜４℃で被覆し、次いでＰＢＳ中の１０％ＦＢＳで室温で２時間ブロックする。連続希釈した初代ひ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）またはＣＴＬを、ペプチドおよび１０5ジャーカットＡ２．１／Ｋb細胞／ウェルと共に３７℃５％ＣＯ2で２０時間培養する。翌日、細胞を洗浄除去し、分泌されたＩＦＮγを検出するためのビオチン化α−ＩＦＮγ（ラット抗マウスＩＦＮγｍＡｂ、クローンＸＭＧ１．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、ウェル中に分泌されたＩＦＮγを検出する。ＨＲＰが結合したストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）（Ｚｙｍｅｄ）およびＴＭＢ（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を製造者の指示に従って使用して発色させる。Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ  ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４５０ｎｍで吸光度を読む。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＩＦＮγＥＬＩＳＡのデータを、特定のペプチドに応答してＩＦＮγ１００ｐｇを分泌する細胞の数に基づき、ペプチド非存在下でのＩＦＮのバックグラウンド量に対して補正された、分泌単位（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｕｎｉｔｓ）で評価する。
【０２２６】
（実施例６）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、誘導されて特異的リンホカイン、通常はＩＦＮγを産生し放出する個々の細胞の能力を測定することによって、所与のペプチドに特異的なＴ細胞の頻度を定量する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの感度が高くなったことで、感染ヒトまたは実験動物から新たに単離した細胞からの応答を研究者が検出できるようになった（非特許文献８８、９０）。ＩＦＮγＥＬＩＳＡにおいて上述したように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを最終ステップまで実施する。ただし、ＨＲＰ−ストレプアビジンの代わりにＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａ、１：５００希釈）を用いる。基質５−ＢＣＩＰ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて製造者の指示に従って発色させる。位相差顕微鏡を用いてスポットを数える。あるいは、Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを利用してスポットを数える。この場合、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を使用する。
【０２２７】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、免疫応答を定量するのに常に利用される。スポットは手作業で数えることができるが、好ましくは、スポットを認識し数えるように特別に設計されたソフトウエアを備えた顕微鏡ベースのシステムであるＺｅｉｓｓのＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを使用する。
【０２２８】
（実施例７）
四量体染色
四量体染色は、ペプチドエピトープと、クラスＩ抗原と、エピトープ特異的Ｔ細胞受容体との相互作用に基づいてエピトープ特異的ヒトＣＤ８+Ｔリンパ球を検出するフローサイトメトリー技術である。このアッセイは、新たに単離した血液試料中のエピトープ特異的ヒトＣＤ８+Ｔリンパ球を迅速に定量することができる。ＨＩＶペプチド／ＨＬＡの様々な組合せに対するＭＨＣ四量体は、たとえば、ＮＩＨリポジトリ（非特許文献１２５）から得られる。エピトープ特異的細胞を標識するために、体積１００μｌ中１×１０6個のＰＢＭＣを、適切な四量体５μｇ／ｍｌならびにヒトＣＤ３およびＣＤ８を認識するモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡまたはＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡを含めた商用供給源から様々な蛍光色素複合体が入手可能である）と共に暗所で４０分間インキュベートする。細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した後、ＦＡＣｓａｎまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて分析する。試料データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて解析する。
【０２２９】
（実施例８）
臨床試料のアッセイ
患者またはボランティアからの凍結ＰＢＭＣ試料中の特異的ＣＤ８+ＣＴＬ活性を評価するために様々なアッセイを使用することができる。ＥＬＩＳＰＯＴ、クロミウム放出、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＩＦＮγ放出、増殖アッセイおよび四量体アッセイすべてが、様々な実験モデル、たとえば、ネズミおよび／または霊長類起源の実験モデルからの応答を評価するのに有用である。
【０２３０】
これらのアッセイのネズミ用の実験方法を先に記載したが、これらはヒトの系にも適合し（非特許文献１１、１２６、１２７）、当業者が認めるようにさらに適合させることができる。アッセイを完了するのに必要な凍結されたＰＢＭＣ試料の量の計算は、実施例１４にもより詳細に記載する。
【０２３１】
（実施例９）
トランスジェニック動物
体積１０〜１００μｌ中最高１００μｇの用量のＤＮＡまたはペプチドを前けい骨筋内に筋肉内投与して、または尾部つけ根に皮下投与して、トランスジェニックマウス（ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋb  Ｈ２b、ＨＬＡ−Ａ１１／Ｋb、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｋb）を免疫する。ＤＮＡは生理食塩水に、ペプチドはＩＦＡに希釈して処方する。１１〜２１日後、動物をＣＯ2窒息を用いて屠殺し、そのひ臓を摘出し、ＣＴＬ機能をインビトロで決定するための細胞源として使用する。一般に、１実験グループ当たり３〜６匹のマウスを使用する。また、ＣＴＬ培養物の再刺激のためのＡＰＣ源として非免疫マウスのひ臓を使用する。８〜１２週齢のオスとメスを使用する。
【０２３２】
（実施例１０）
複数のＣＴＬおよびＨＴＬエピトープに対する応答の同時誘導の実証
ＣＴＬエピトープ鎖（ｓｔｒｉｎｇ）の構築および試験
この実施例では、複数のＣＴＬおよびＨＴＬエピトープを試験する例を提供する。たとえば、単一のプロモーターの制御下にある１０〜１２個の異なるＣＴＬエピトープを含むエピトープ鎖を合成し、標準プラスミドｐｃＤＮＡ  ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に組み込む。これらの構築物は、標準シグナル配列および汎用ＨＴＬエピトープＰＡＤＲＥ（登録商標）を含んでいる。各エピトープセットを、集団をバランス良く網羅するように選択する。試験および最適化を容易にするために、トランスジェニックマウスにおいて免疫原性であり、および／またはヒトにおいて抗原性であることが示されたエピトープのバランスの取れた集合体（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を含めてある。
【０２３３】
本明細書に記載するコンピュータプログラムを使用してクラスＩ接合モチーフを最少化するように、これらのＣＴＬエピトープの特定の順番を選択する。順番の最適化に関して最善を尽くしても、本発明による構築物中に潜在的接合エピトープがまだ存在する場合、それに対応するペプチドを合成して、ＨＬＡトランスジェニックマウス中のそのようなエピトープに対するＣＴＬ応答をモニターする。一般に、接合モチーフの最少化は順調で適切である。しかし、接合エピトープに対する応答が検出される場合、以前の項で考察したタンパク質分解切断の予想優先度に適合するＫ、ＡＫ、ＫＡ、ＫＫまたはＡのような１から２残基の短いスペーサーを用いてこれらの接合エピトープを破壊する。
【０２３４】
最適化した構築物の最終的使途はヒトワクチンであるので、最適化したヒトコドンを利用する。しかし、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおける最適化プロセスを促進するために、可能なときはいつでも、マウスにとっても最適なヒトコドンを選択するように配慮する。ヒトおよびネズミコドンの使用頻度は極めて類似している。たとえば、非特許文献１２８のコドン使用頻度データベースを参照されたい。
【０２３５】
様々なマルチエピトープ核酸ワクチン構築物をトランスフェクションしたヒト細胞を、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおけるインビボ試験と並行して行う抗原性アッセイに使用することができる。コドン使用頻度の違いによるマルチエピトープ核酸ワクチンの効力差は、これら２つの異なるアッセイシステムの利用度によって対処される。
【０２３６】
一般に、プラスミド構築物の抗原性と免疫原性の試験は並行して行われる。トランスジェニックマウスにおけるインビボ試験は、Ａ２、Ａ１１およびＢ７  ＨＬＡトランスジェニックマウスに対して実施される。本発明者らの実験室において十分に確立されている手順に従い、心臓毒で前処置したマウスに各プラスミド１００μｇを筋肉内注射し、１１日後に応答を評価する（非特許文献７）。アッセイには、新たに単離した細胞のＥＬＩＳＰＯＴ、ならびに再刺激した細胞培養物のインターフェロンガンマ放出および細胞障害性クロミウム放出アッセイなどがある。上述の技術すべてが当分野で十分に確立されている。これらのＨＬＡタイプに対してトランスジェニックマウスの巨大コロニーが「社内で」すでに樹立されているので、エピトープに対する応答の同時測定は問題にならない。複数の読取りアッセイ（ｒｅａｄｏｕｔ  ａｓｓａｙｓ）では、４から６匹のマウスグループが、６から１０個の異なるエピトープに対する応答を測定するのに適している。ＨＬＡ  Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＨＬＡ  Ａ２限定ＨＩＶ誘導エピトープの試験は一般に行われている。しかし、問題が生じた場合は、ヒトＡＰＣを用いた抗原性試験を代替戦略として使用することができ、あるいは、それを使用してトランスジェニックマウス試験を補完することができる。
【０２３７】
トランスジェニック動物における免疫原性と抗原性の相関を拡張するために、本明細書に報告する試験で述べたように、抗原性試験を利用して、高親和性ＣＴＬ系がすでに社内で利用可能であるＰｏｌ  ４９８、Ｅｎｖ  １３４、Ｎｅｆ  ２２１、Ｇａｇ  ２７１のようなエピトープに対する応答を評価する。追加の適切なＣＴＬ系を生成させるために、本明細書に記載し本発明者らの研究室で常に利用されているように、アジュバント中に乳化したペプチドまたはリポペプチドによるＨＬＡトランスジェニックマウスの直接免疫化を利用して抗原性アッセイに使用する系を生成させる。
【０２３８】
抗原性アッセイは、インビボでの最適化実験が不可能なエピトープに対する１次読取りとしても使用される。これらのエピトープには、Ａ２４およびおそらくＡ１限定エピトープ、ならびにＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて非免疫原性である任意のエピトープが含まれる。このようないずれの場合でも、本発明者らは病原体に曝された個体から生成されるヒトＣＴＬ系を使用する。あるいは、本発明者らは、インビトロでのＣＴＬ誘導のために、ＧＭＣＳＦ／ＩＬ４によって誘導される樹状細胞および末梢血リンパ球を用いてＣＴＬ系を生成させる（非特許文献１２９）。
【０２３９】
マルチエピトープ構築物をコードするエピソームベクターを作製し、適切なヒト細胞系にトランスフェクションして標的細胞を生成させた。たとえば、ヒトＴ細胞系ジャーカットを使用することができるが、リンパ芽球腫細胞系も首尾よく利用することができた。ヒト起源のＣＴＬ系を利用する実験の場合、特性が十分明らかなＨＬＡ適合、同型接合、ＥＢＶ細胞系が、精製ＭＨＣ源および標的細胞として通常使用され、マルチエピトープ核酸トランスフェクションのレシピエントとして使用される。ＨＬＡトランスジェニックマウスから誘導されるＣＴＬ系を利用する実験の場合、適合ＨＬＡ／Ｋbキメラ構築物でトランスフェクションされたクラスＩネガティブな、ＥＢＶで形質転換された、突然変異細胞系．２２１のコレクション（非特許文献９８）がマルチエピトープ核酸トランスフェクションのレシピエントとして使用される。このような細胞は、ＣＴＬ系に対するペプチド抗原を効果的に提示する（非特許文献１２９）。
【０２４０】
ＨＴＬエピトープ鎖の構築および試験
単一のプロモーターの制御下にある３〜２０個の異なるＨＴＬエピトープを含むエピトープ鎖を合成し、標準プラスミドｐｃＤＮＡ  ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に組み込む。試験および最適化を容易にするため、ＩＡbマウスにおいて免疫原性であることがすでに知られているエピトープのバランスの取れた提示が提供されるように、所与の構築物に対する各エピトープセットを選択する。また、接合部に対応するペプチドすべてを合成し、ＩＡbへの結合について、さらに最も重要なことには、世界で最も一般的なＤＲ対立遺伝子（非特許文献１３０）を代表する１４個の異なるＤＲ分子のパネルへの結合について試験する。したがって、対象とする抗原向けではないＨＴＬエピトープは、これらのプラスミド中では生成しない。しかし、良好なＤＲ結合潜在能力（したがって、インビボでの潜在的ＤＲ限定免疫原性）を有する接合領域が検出された場合には、ＧＰＧＰＧなどのスペーサーを導入してこれらを除去する。構築物すべてにおいて、本明細書に記載するように、クラスＩ接合モチーフの数も最少化される。
【０２４１】
ＨＬＡ  ＤＲトランスジェニックマウスおよび／またはＨ２ｂハプロタイプのマウスを用いて実験的ワクチンプラスミドの免疫原性を試験する。増殖および／またはサイトカイン産生を測定する（ＩＬ５、ＩＦＮγ）。典型的な手順では、心臓毒で前処置したマウスに各プラスミド１００μｇを筋肉内注射し、１１日後に応答を評価する（非特許文献７）。
【０２４２】
ＣＴＬエピトープとＨＴＬエピトープの相互作用の試験
上述の作業により、解析可能なエピトープすべてに対する同時応答／抗原性を実証するために利用されるエピトープの小さな機能性ブロックが生じる。これらのブロックは、次の実施例に記載するさらなる最適化の対象となる。これらの同じ構築物を用いて、免疫優性を評価する。具体的には、ＣＴＬエピトープ構築物すべてを一緒に混合し、あるいはＨＴＬエピトープ構築物すべてを一緒に混合する。次いで、構築物のプールから得られる結果を、同じ構築物を別々に注射して得られる結果と比較する。
【０２４３】
これらの構築物は、ＣＴＬエピトープへの応答に対するＨＴＬエピトープの効果を決定するのにも使用される。具体的には、プラスミドを含むＨＴＬおよびＣＴＬをプールし、マウスに注射し、選択したエピトープに対するＣＴＬおよびＨＴＬの各応答を本明細書に記載のとおりに測定する。たとえば標的抗原から誘導されるＨＴＬエピトープの存在が、ＣＴＬエピトープ構築物中にｐａｎ  ＤＲ結合エピトープ、たとえば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）またはＰＡＤＲＥ（登録商標）ファミリー分子を含むプラスミドを用いて達成される応答のレベルを超えて、ＣＴＬ応答を増大するかどうかが、しばしば決定される。典型的には、ＰＡＤＲＥ（登録商標）が標的抗原で誘導されるＨＴＬエピトープに対する応答を阻害または増大させるかどうか、あるいは逆に、対象とする抗原から誘導されたＨＴＬエピトープがＰＡＤＲＥ（登録商標）に対する応答を阻害または増大させるかどうかも決定される。
【０２４４】
この方法論を用いて、多数のエピトープに対して応答することが可能になる。構築物のプーリングがいくつかのより弱いエピトープに対する応答を阻害する可能性がある。この場合、最適化後にプーリング実験を繰り返す。
【０２４５】
（実施例１１）
ＣＴＬおよびＨＴＬマルチエピトープ構築物の最適化
この実施例では、実施例１０に記載したＣＴＬおよびＨＴＬ各構築物の最適化について述べる。抗原性および免疫原性に対するフランキング残基の潜在的影響も、最適化ミニ遺伝子構築物において評価する。これらの試験には、効果的なプロセシングを促進するように設計したフランキング残基（これに対する類義語は「スペーサー」である）を含有することが含まれる。
【０２４６】
このような解析を以下のように実施することができる。第１に、実施例１０に記載したＣＴＬマルチエピトープ構築物の試験結果を、エピトープのＮ末端およびＣ末端の側面に位置する３残基での特異的残基の存在と活性との間の傾向および相関について解析する。最適以下のＣＴＬ初回抗原刺激を示すエピトープ（これらは、応答の大きさに関して最適以下である）は、フランキング領域最適化の対象である。１０〜１２個の異なるＣＴＬエピトープをコードするＣＴＬマルチエピトープ核酸ワクチンの各々に対して、最適化された構成を有する「第２世代の」マルチエピトープ核酸ワクチンが生成する。
【０２４７】
一実施形態において、第１の最適化設計は、最適以下の性能に関連するエピトープすべてに対して、Ｃ＋１位にアラニン（Ａ）またはリシン（Ｋ）残基のいずれかを導入することである。第２の最適化設計は、抗原性に関連する標的抗原、たとえば、ＨＩＶにおいて天然に存在する残基をＣ＋１位に導入することである。
【０２４８】
選択したエピトープに対して、追加の修飾も導入する。具体的には、他の残基スペーサーをエピトープＣ末端およびＮ末端に導入する効果も検討する。実施例１０に記載したマルチエピトープ核酸ワクチンの解析結果に応じて、検討する残基には、たとえば、Ｇ、Ｑ、Ｗ、ＳおよびＴをさらに含めることができる。接合エピトープがこれらの修飾によって生成する場合、本明細書に記載するように、接合エピトープを除去する別のエピトープの順序を合理的に設計する。第２世代構築物すべてを、本明細書に記載するように、抗原性および免疫原性について試験する。
【０２４９】
これらの修飾の結果、マルチエピトープ構築物の特異的な修飾に対応する活性の変動が特定される。全体的な有益効果を有する特定の修飾が見出される。これを確認するために、追加のマルチエピトープ核酸ワクチンであって、エピトープすべて（許容される抗原性および免疫原性を示したエピトープも）が同じ修飾を受けているものを生成させ試験する。いくつかの例では、活性の増加がいくつかのエピトープで記録されるが、その他では記録されない。即ち、特定の修飾が、あるエピトープの活性を増加させ、他のエピトープの活性を減少させることはより望ましくない。このような場合、追加のマルチエピトープ核酸ワクチンを設計し試験して、有害であるか、または効果のないことが証明された修飾を除きつつ、有益な修飾を維持する。
【０２５０】
これらのマルチエピトープ核酸ワクチンは、ａ）予想される接合エピトープが最小限しか存在しないように、かつｂ）前のマルチエピトープ核酸ワクチンでは機能しなかったエピトープが今回はより有効な状況になるように設計される。
【０２５１】
ＨＴＬマルチエピトープ構築物の場合、「第１世代」構築物から得られるデータを、接合エピトープ、構築物内のエピトープ位置およびスペーサー、たとえばＧＰＧＰＧスペーサーへの近接度に関する傾向について調べる。特異的な傾向が検出された場合、これらの傾向に基づいて第２世代構築物を設計する。あるいは、最適以下の活性を生じるマルチエピトープ構築物の場合、ＩｉおよびＬＡＭＰに基づく戦略のような他の標的戦略の潜在的有効性を再評価し、ターゲティングなしおよび簡単なリーダー配列ターゲティングと比較する。
【０２５２】
この項に記載するＣＴＬまたはＨＴＬマルチエピトープ構築物のいずれかの活性に大きな変動が検出されたときには、これらの結果は、構築物の活性に影響を及ぼすコンフォーメーションまたは「長距離」効果のような作用と一致する。これらの変数は、現在の分子および細胞生物学技術によって解析することができる。たとえば、様々なマルチエピトープ構築物をトランスフェクションした細胞系は、ノーザン分析またはプライマー伸張アッセイ（非特許文献１３１）によってｍＲＮＡ発現レベルおよび安定性を解析することができる。
【０２５３】
マルチエピトープ核酸ワクチンすべてにおいて、ＭＹＣ／ｈｉｓのような抗体タグも含めることができる。このタグによって、タンパク質発現レベルの試験が可能になる。ＭＹＣ／ｈｉｓタグ（非特許文献１３２）を入れることによって、発現産物の安定性をパルスチェイス実験により決定することもできる。次いで、これらのアッセイの結果を、抗原性および免疫原性の実験結果と比較することができる。傾向および一般的な規則、ならびに試験した様々な変数間の相関の存在についてこの結果を詳細に検討する。
【０２５４】
（実施例１２）
選択したエピトープを効果的に送達可能な最も簡単なプラスミドの構成の決定
実施例１１および１２に記載した実験を、マルチエピトープ核酸ワクチン設計に関する変数を扱うように設計する。理想的には、ヒトに使用できるベクターをプログラム全体を通して使用するが、ワクチンエピトープの最適化試験用に１つのＤＮＡワクチンプラスミドを使用し、次いで、ヒトの使用に適切なベクターに切り換えることができる。実際のベクター選定は、いくつかの変数に依存する。たとえば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）のような信頼のおける供給源を通した、ヒトの使用に適切なベクターの利用可能性が１つの因子である。
【０２５５】
この実施例では、最適化した構築物を連結してより大きなエピトープブロックを形成する。構築物すべてを、好ましくは、ＣＴＬマルチエピトープ構築物の場合、ＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチドおよびリーダー配列ターゲティングを組み込むように設計する。具体的には、１０〜１２個のＣＴＬエピトープ構築物２対を連結して、２０〜２４個のＣＴＬエピトープ構築物を２つ作製する。エピトープの連結が、より小さい構築物と比較して最適以下の（減少した）活性を与える場合、代わりの組合せおよび連結順序を検討する。次いで、最適な活性をもたらす２０〜２４個のＣＴＬエピトープ構築物からなる特定の対を連結し、得られるＣＴＬエピトープすべてを含む構築物の活性を評価する。再度、２つまでの別の配置を検討する。この構築物のサイズが比較的大きいので、標的配列の特異的効果が確認される。というのは、リーダー配列ターゲティングは小さな構築物でより効果的であり、一方、大きな構築物は、ユビキチンシグナルによる最も効果的な標的になり得るからである。具体的には、特異的標的配列のない一構築物を作製し、ユビキチン分子の付加による分解の標的となる構築物と比較する。
【０２５６】
同様の戦略をＨＴＬに対しても使用する。３〜５個のＨＴＬエピトープ構築物２対を連結して７〜９個のＨＴＬエピトープ構築物を２つ作製する。今回も、これらのエピトープの連結が、最適以下の（減少した）活性を与える場合、代わりの組合せおよび連結順序を検討する。最適な活性をもたらす７〜９個のＣＴＬエピトープ構築物からなる特定の対を連結し、得られるＨＴＬエピトープすべてを含む構築物の活性を評価する。再度、２つまでの別の配置を検討する。
【０２５７】
これらの結果に基づいて、１パネルの、たとえば、ＨＩＶエピトープを効果的に送達可能な最適化されたプラスミドの構成を、臨床試験評価用に選択する。対象とする（感染または疾患に関連する）任意の抗原由来のエピトープを単独でも組み合わせても使用できることは当然である。この構成は、１つまたは複数のＨＴＬエピトープ構築物および１つまたは複数のＣＴＬエピトープ構築物を必要とする。エピトープすべてを効果的に送達することが可能な１つの長いＣＴＬおよび１つの長いＨＴＬエピトープ構築物の組合せは、ワクチンの臨床開発をさらに簡単にするので最も好ましい。同時注入したときに２つの構築物間で望ましくない相互作用が認められる場合、同じ動物に異なるプラスミドを、注射して、ただし異なる注射部位または異なる時点に注射して調べる。あるいは、所望のエピトープすべてをコードする単一のＣＴＬ構築物およびＨＴＬ構築物が同定されない場合、さらなる開発のために構築物のプールを検討する。
【０２５８】
（実施例１３）
マルチエピトープワクチンによる免疫化後の、ＣＤ８＋リンパ球応答の誘導の評価およびキャラクタリゼーション
主にＥＬＩＳＰＯＴ法によりＣＤ８＋リンパ球応答を測定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、当分野で既知であり、本発明者らの研究室で普通に使用されている。本明細書に記載する自動化されたＺｅｉｓｓ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダーも使用する。ＣＤ８＋応答を測定するのに利用するアッセイは、主に、新たに単離した細胞について、およびペプチドを用いてインビトロで再刺激した細胞についてのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。また、特定の例では、クロミウム放出アッセイを利用する。その結果は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで観測された結果と相関があった。選択したペプチド／ＭＨＣの組合せに対する四量体染色も実施した。
【０２５９】
臨床アッセイを開発し検証した。この作業のタイミングは、臨床ワクチンＥｐｉＧｅｎｅ（商標）の選定後で、かつ臨床試験に登録された個体から採取した実際の試料が利用できる前の時期にあたった。ＣＴＬ評価のためのアッセイは、当分野での経験、たとえば、実験的ＨＢＶワクチンＴｈｅｒａｄｉｇｍ（非特許文献１１、１２６、１２７）の第Ｉ相および第ＩＩ相治験においてＣＴＬ評価用アッセイを確立した経験に基づいて確立することができる。具体的には、正常な対象および、たとえば、ワクチン接種をしていないボランティアから誘導される、フィコールで精製したＰＢＭＣを使用することができる。前述したように、本発明に従って他の抗原性標的も使用することができる。
【０２６０】
（実施例１４）
最適化されたマルチエピトープＤＮＡベースワクチン構築物の設計
接合エピトープ形成の最少化とＣ＋１プロセシング効率の最適化を同時に行う上述のコンピュータ支援方法を利用して最適化構築物を設計した。以下のモチーフ、すなわち、ネズミＫb（ＸＸＸＸ（ＦＹ）Ｘ2-3（ＬＩＭＶ））、Ｄb（ＸＸＸＸＮＸ2-3ＬＩＭＶ））、ヒトＡ２（Ｘ（ＬＭ）Ｘ6-7Ｖ）、ヒトＡ３／Ａ１１（Ｘ（ＬＩＭＶ）Ｘ6-7（ＫＲＹ））およびヒトＢ７（ＸＰＸ6-7（ＬＩＭＶＦ））を接合の最少化に利用した。Ｃ＋１傾向値（ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ  ｖａｌｕｅｓ）を図６に示すデータから計算し、以下のようになった。Ｋ＝２．２；Ｎ＝２；Ｇ＝１．８；Ｔ＝１．５；Ａ、Ｆ、Ｓ＝１．３３；Ｗ、Ｑ＝１．２；Ｒ＝１．７；Ｍ、Ｙ＝１；Ｉ＝０．８６；Ｌ＝０．７６；Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｅ、Ｐ＝０。４個までのアミノ酸の挿入が許容された。この手順および本明細書に記載する他の手順によって設計される構築物の例を図１８に示す。これらの構築物のいくつかの特性をインビトロおよびインビボでの免疫原性試験により明らかにし、以下に説明する。図１９に、マルチエピトープ構築物中の特定の核酸配列によってコードされるアミノ酸エピトープ配列を列挙する。
【０２６１】
（実施例１５）
マルチエピトープＣＴＬ構築物の免疫原性試験およびフランキングアミノ酸の影響
様々なマルチエピトープ構築物の免疫原性試験にＨＬＡトランスジェニックマウスを使用した。１グループのマウスを、前けい骨筋の両側に１０μＭ心臓毒５０μｌを注射して前処置し、４または５日後、ＰＢＳに希釈したＤＮＡ構築物１００μｇを同じ筋肉に投与した。別のグループでは、ＣＦＡ中に乳化したペプチド（ペプチドは、ＤＮＡ注射グループのマウスに投与したＤＮＡ構築物内のエピトープに対応する）を各マウスに注射した。免疫化後１１から１４日目に、ＤＮＡを接種した動物およびペプチドを接種した動物からひ細胞を回収し、ＣＴＬ活性を、標準51Ｃｒ放出アッセイ、ペプチドエピトープ特異的再刺激を用いない精製ＣＤ８＋Ｔリンパ球によるγ−ＩＦＮ産生を測定するＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびペプチドエピトープによるインビトロでのエピトープ特異的再刺激ステップを含むｉｎ  ｓｉｔｕ  ＥＬＩＳＡを含めたいくつかのアッセイの１つで測定した。ペプチドエピトープでの刺激に関して、ＥＰ−ＨＩＶ−１０９０構築物によって誘導されるＣＴＬ活性の例を図１４Ａに、ペプチドエピトープでの刺激に関して、ＰｆＣＴＬ．１、ＰｆＣＴＬ．２およびＰＦＣＴＬ．３構築物によって誘導されるＣＴＬ活性を図１４Ｂに示す。
【０２６２】
Ｃ＋１フランキング位置における異なるアミノ酸の効果を、ＨＢＶ．１構築物中のＣｏｒｅ  １８エピトープに対してＣ＋１位に異なるアミノ酸を挿入することによって直接評価した。免疫原性データは、Ｗ、ＹまたはＬがＣ＋１位の側面に位置すると、Ｃｏｒｅ  １８エピトープの免疫原性が低下することを明確に示している（図６ｂ）。これに対し、単一のＫ残基を挿入すると、Ｃｏｒｅ  １８に対するＣＴＬ応答が劇的に増加した。Ｃ＋１位置でＲ、Ｃ、ＮまたはＧを用いることによってＣＴＬ応答の増大も認められた。これらのデータは、Ｃ＋１プロセシングの最適化によって、マルチエピトープ構築物の設計を改善できることを明確に示している。
【０２６３】
（実施例１６）
マルチエピトープＨＴＬ構築物の免疫原性試験およびスペーサー配列の影響
ＨＴＬエピトープを分離し、それによって接合エピトープを破壊するＧＰＧＰＧからなる汎用スペーサーを開発した。このスペーサー設計の背後にある論理は、ＧもＰも、ＨＴＬペプチドエピトープのコア領域中の１および６位の第１のアンカーとして、任意の既知のネズミまたはヒトＭＨＣクラスＩＭＨＣクラスＩＩ分子によって使用されないことである。このスペーサーにより導入される５アミノ酸のギャップによって、隣接するエピトープが分離され、２つのエピトープのアミノ酸は、１および６位におけるアンカーとして物理的に働くことができない。１つは３個のスペーサーを有し、それ以外はスペーサーがなく、マウスＩＡbに結合することが知られている４個のＨＩＶ−１エピトープからなる合成ペプチドを用いて、ＧＰＧＰＧスペーサーの有用性を試験した。ＨＩＶ７５量体は３個のＧＰＧＰＧスペーサーを有する構築物であり、ＨＩＶ６０量体は３個のスペーサーを欠く構築物であった。ＣＦＡで希釈したペプチドによるＣＢ６Ｆ１マウスの免疫化によって、スペーサーの非存在下で４個のうち３個のエピトープに対するＨＴＬ応答が誘導されたが、スペーサーが存在するときにはエピトープすべてが免疫原性であった（図１５）。この事実は、スペーサーがマルチエピトープ構築物の性能を改善できることを示している。
【０２６４】
Ｈ２bxdマウスにＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）構築物を筋肉内投与して免疫化することにより、マルチエピトープＨＴＬ  ＤＮＡベースの構築物がインビボでＨＴＬ応答を誘導する能力を評価した。ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）構築物を図１８に示す。そして、ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）とＥＰ−ＨＩＶ−１０４３の違いは、前者がＣ末端ＧＰＧＰＧスペーサーとその後に続くＰＡＤＲＥ配列ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡを有することである。免疫化から１１日後に、追加免疫を投与せず、ひ臓からＣＤ４  Ｔ細胞を精製し、ペプチド特異的ＨＴＬ応答を１次γ−ＩＦＮ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定した。ＨＩＶエピトープをコードする構築物によって誘導されるＨＴＬ活性の例を図１６に示す。全体的に見て、マルチエピトープＨＩＶ  ＨＴＬ構築物を用いたＤＮＡ免疫化によって誘導されるＨＴＬ応答は、ペプチド免疫化によって誘導される応答とほぼ等しいかそれよりも大きかった。
【０２６５】
したがって、上述したように、本発明は、ポリペプチド接合部を自動的に解析し、接合エピトープを除去または減数し、マルチエピトープ構築物の効力を最適化するスペーサーの組合せを特定するための新規な方法およびシステムを提供する。当業者は、単に日常的な実験法を用いて、本明細書に記載する発明の具体的な実施形態の多数の等価物を理解し、または確認することができる。これらの等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２６６】
【図１】２０から２５個のそれぞれ異なるＣＴＬエピトープが組み込まれた３つの異なるマルチエピトープ構築物に関するデータを示す図である。
【図２】図２ａは、２つの異なる合成ポリペプチドを示す図であり、第１の構築物は直線上に同時に合成された（ｃｏｓｙｎｔｈｅｔｉｚｅｄ）４つの異なるエピトープが組み込まれ、第２の構築物はＧＰＧＰＧスペーサーが組み込まれている。図２ｂは、これらの異なる構築物２ｎＭのＩＡbポジティブマウス中の様々なエピトープへの増殖性反応に対する初回抗原刺激能力を示すグラフであり、同量の同じペプチドのプール（各ペプチド３μｇ）によって誘導される応答と比較したものである。
【図３】マルチエピトープＤＮＡ構築物の構造を示す図である。ＨＬＡの限定を各エピトープ上に示す。Ａ*０２０１エピトープは太字で書かれている。ＨＬＡ結合親和性（ＩＣ50ｎＭ）を各エピトープの下に示す。（ａ）コードされたエピトープの順番を示すＨＩＶ−ＦＴの概略図。（ｂ）ＨＢＶ特異的構築物の概略図。Ｃｏｒｅ  １８に対するＣ＋１アミノ酸を矢印で示す。Ｃｏｒｅ  １８のＣ1位に単一のアミノ酸挿入物を含むＨＢＶ特異的構築物をＨＢＶ．１Ｘとして示す。
【図４】ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−ＦＴ中のＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの免疫原性を示すグラフである。（ａ）エピトープＰｏｌ  ４９８（丸）、Ｖｐｒ  ６２（三角）、Ｇａｇ  ３８６（正方形）に対する代表的ＣＴＬ応答。各ペプチドの存在下（塗りつぶした記号）または非存在下（白抜きの記号）でのジャーカット−ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb標的細胞に対する51Ｃｒ放出アッセイで細胞障害性を分析した。（ｂ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−ＦＴの免疫原性のＣＴＬ応答の概要。横棒は陽性培養物の幾何平均ＣＴＬ応答を示す。陽性ＣＴＬ培養物の頻度も示す。
【図５】エピトープ免疫原性に対するＣ＋１アミノ酸の影響を示すグラフである。９４通りのエピトープ／Ｃ＋１アミノ酸の組合せを表す多様なマルチエピトープ構築物からのＣＴＬ応答を取り入れたデータベースを分析して、特定の組合せが最適なＣＴＬ応答を伴う例の頻度（％）を決定した。測定した培養物の少なくとも３０％において１００ＳＵまたは２０ＬＵよりも大きい場合にＣＴＬ応答を最適と見なした。所与のエピトープ／Ｃ＋１アミノ酸の組合せが観測された回数も示す。
【図６】ＨＢＶ特異的構築物に対するＣＴＬ応答を示すグラフである。（ａ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスのＤＮＡ免疫化後のＣｏｒｅ  １８エピトープに対するＣＴＬ応答。（ｂ）Ｃｏｒｅ  １８のＣ＋１位の単一アミノ酸挿入物で変わる構築物によるＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＫbトランスジェニックマウスのＤＮＡ免疫化後のＨＢＶ  Ｃｏｒｅ  １８に対するＣＴＬ応答。
【図７】ＨＢＶ．１（陰影の付いた棒）およびＨＢＶ．１Ｋ（斜線の入った棒）の各トランスフェクション細胞系におけるＨＢＶ  Ｃｏｒｅ  １８提示レベルを示すグラフである。エピトープの提示を、ペプチド特異的ＣＴＬ系を用いて定量化した。ＨＢＶ  Ｐｏｌ  ４５５の提示を比較のために示す。
【図８】ＨＩＶ−ＦＴ  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）をトランスフェクションした２２１Ａ２Ｋb標的細胞のデータを示すグラフである。ＨＬＡトランスジェニックマウス由来のＣＴＬ系に対して、これらのトランスフェクション細胞のエピトープ提示能力を評価した。これらのトランスフェクション細胞は、様々なＨＩＶ誘導ＣＴＬエピトープに特異的である。異なるＣＴＬ系の抗原感受性の相違を補正するために、トランスフェクションしなかった細胞をＡＰＣとして用いて、ペプチド投与量の滴定を並行して行った。
【図９】本発明の方法を用いて最適化されたＨＩＶマルチエピトープ構築物を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態によるマルチエピトープ構築物の自動最適化を実施するためのコンピュータシステムを示す図である。
【図１１Ａ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの実行に用いるユーザー入力パラメータを含む例示的な入力テキストファイルを示す表である。
【図１１Ｂ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの実行に用いるユーザー入力パラメータを含む例示的な入力テキストファイルを示す表である。
【図１２】本発明の一実施形態による最適マルチエピトープ構築物を同定するためのソフトウエアプログラムのフローチャートを示す図である。
【図１３Ａ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの出力結果を含む例示的な出力テキストファイルを示す表である。
【図１３Ｂ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの出力結果を含む例示的な出力テキストファイルを示す表である。
【図１３Ｃ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの出力結果を含む例示的な出力テキストファイルを示す表である。
【図１３Ｄ】本発明の一実施形態による接合アナライザープログラムの出力結果を含む例示的な出力テキストファイルを示す表である。
【図１４Ａ】ＥＰ−ＨＩＶ−９０によって誘導される、ＩＦＡ中の個々のペプチドに対するＣＴＬ応答を示すグラフである。
【図１４Ｂ】個々のペプチドに対するＰｆＣＴＬ．１．、ＰｆＣＴＬ．２およびＰｆＣＴＬ．３によって誘導されるＣＴＬ応答を示すグラフである。
【図１５】個々のエピトープへのＨＴＬ応答に対するクラスＩＩエピトープ構築物ＨＩＶ７５量体およびＨＩＶ６０量体中のＧＰＧＰＧスペーサーの効果を示すグラフである。
【図１６】ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）構築物中に存在する個々のエピトープに対するＨＴＬ応答を示すグラフである。
【図１７】ＨＩＶ７５量体、ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３およびＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）中に存在するエピトープを示す概略図である。
【図１８Ａ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｂ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｃ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｄ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｅ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｆ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｇ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｈ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｉ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｊ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｋ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｌ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｍ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１８Ｎ】特定のマルチエピトープ構築物のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図１９Ａ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｂ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｃ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｄ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｅ】特定のマルチエピトープ構築物中に存在するエピトープのアミノ酸配列を示す。
【図２０Ａ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂを構築するのに使用したＨＢＶ  ＣＴＬエピトープを示す。
【図２０Ｂ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂのエピトープの順番を示す。図２０Ｂでは、ＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂ中のシグナル配列は、Ｉｇκコンセンサスシグナル配列である。ただし、他のシグナル配列も利用できる。
【図２０Ｃ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂの、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３／１１トランスジェニックマウスで誘導される免疫応答を示す。
【図２０Ｄ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂのうち、ＨＢＶ−２のアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２０Ｅ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂのうち、ＨＢＶ−２Ａのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２０Ｆ】関係する３つのＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２ＡおよびＨＢＶ−２Ｂのうち、ＨＢＶ−２Ｂのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２１Ａ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂを構築するのに使用したＨＢＶ  ＣＴＬエピトープを示す。
【図２１Ｂ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂのエピトープの順番を示す図である。
【図２１Ｃ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂの、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３／１１トランスジェニックマウスにおいて誘導された免疫応答を示すグラフである。
【図２１Ｄ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂのうち、ＨＢＶ−２１Ａのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２１Ｅ】２つの２１ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−２１ＡおよびＨＢＶ−２１Ｂのうち、ＨＢＶ−２１Ｂのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２２Ａ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃを構築するのに使用したＨＢＶ  ＣＴＬエピトープを示す。
【図２２Ｂ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃのエピトープの順番を示す図である。
【図２２Ｃ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃの、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３／１１トランスジェニックマウスにおいて誘導された免疫応答を示すグラフである。
【図２２Ｄ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃのうち、ＨＢＶ−３０Ｂのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２２Ｅ】２つの３０ＣＴＬエピトープＥｐｉＧｅｎｅｓ（商標）であるＨＢＶ−３０ＢおよびＨＢＶ−３０Ｃのうち、ＨＢＶ−３０Ｃのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２３Ａ】ＨＢＶ−３０Ｃ  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）において２つのＨＬＡ  Ａ２限定ＣＴＬエピトープに隣接するスペーサーになされた修飾を示す図である。プロセシングおよびその後の提示の効率が増加するように、したがって、エピトープの免疫原性が増加するように修飾を設計した。ＨＢＶ−３０ＣのＣｏｒｅ  １８エピトープの側面に位置するリシン（Ｋ）スペーサーを修飾して３個のアラニン残基（ＡＡＡ）を入れたＨＢＶ−３０ＣＬとした。また、ＨＢＶ−３０Ｃのｅｎｖ  １８３エピトープの側面に位置する１個のアスパラギン（Ｎ）スペーサーを修飾して３個のアラニン残基（ＡＡＡ）を入れたＨＢＶ−３０ＣＬとした。
【図２３Ｂ】２つのＨＬＡ  Ａ２限定ＣＴＬエピトープの側面に位置するスペーサーが修飾されたＨＢＶ−３０Ｃ  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）の、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３／１１トランスジェニックマウスを用いて測定した免疫原性を示すグラフである。
【図２３Ｃ】２つのＨＬＡ  Ａ２限定ＣＴＬエピトープの側面に位置するスペーサーが修飾されたＨＢＶ−３０Ｃ  ＥｐｉＧｅｎｅ（商標）のアミノ酸および核酸配列を示す。
【図２４Ａ】ＧＰＧＰＧアミノ酸スペーサーによって分離されたＨＴＬエピトープを含むマルチエピトープワクチンを構築するのに使用したＨＴＬエピトープおよび選択されたＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に対するそれらの結合親和性を示す
【図２４Ｂ】ＧＰＧＰＧアミノ酸スペーサーによって分離されたＨＴＬエピトープを含むマルチエピトープワクチンを構築するのに使用したＨＴＬエピトープの図である。
【図２４Ｃ】ＧＰＧＰＧアミノ酸スペーサーによって分離されたＨＴＬエピトープを含むマルチエピトープワクチンの核酸配列およびその核酸によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１８Ｊ】
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【図１８Ｋ】
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【図１８Ｌ】
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【図１８Ｍ】
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【図１８Ｎ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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