(57)【要約】本発明は、間葉性幹細胞の事前の培養拡大を伴わない、組織修復または組織形成のための間葉性幹細胞を単離および移植する方法に関する。特に、本発明は、間葉性幹細胞の事前の培養拡大を伴わない、骨の形成を修復または誘導するための、骨髄から間葉性幹細胞を単離する方法に関する。さらに、本発明は単離された培養拡大されていないヒト成人間葉性幹細胞集団に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞を得る方法であって：
ヒト細胞集団を、そのヒト細胞集団に含まれる間葉性幹細胞で発現する表面分子に結合する抗体と接触させ、その結果、細胞−抗体複合体を形成させるようにする工程；
前記間葉性幹細胞を回収する工程；
前記回収された間葉性幹細胞を、著しい細胞拡大を防止する条件のもとで維持し、それにより、培養拡大されていない間葉性幹細胞を得る工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記ヒト細胞集団が未分画骨髄、未分画ヒト血液、未分画ヒト皮膚、未分画ヒト骨膜、未分画筋肉または未分画ヒト脂肪を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記回収された間葉性幹細胞が間葉性組織系譜の分化細胞にさらに分化し得る請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記間葉性組織系譜が骨、軟骨、脂肪、腱、靭帯、筋肉または骨髄間質である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記間葉性組織系譜が腎臓組織、肝臓組織、脾臓組織またはニューロン組織である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が少なくとも１つのヒトＣＤ１０５抗原と相互作用する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が少なくとも１つのヒトＣＤ２９またはＣＤ４４抗原と相互作用する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がカラム、プラスチック、アレイまたは磁気ビーズに担持される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記間葉性幹細胞が目的とするタンパク質を発現させるためにさらに遺伝子操作される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的とするタンパク質が細胞成長、形態形成、分化、または組織構築およびそれらの組合せのために必要な高分子である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞成長、形態形成、分化および／または組織構築およびそれらの組合せのために必要な前記高分子が骨形態形成タンパク質、骨形態形成様タンパク質、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮増殖因子、Ａｎｇ−１、ＰＩＧＦおよびそれらの組合せである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
対象に投与される医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法であって、培養拡大されていない間葉性幹細胞を請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって得る使用方法。
【請求項１３】
対象における組織修復を刺激または増強するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法であって、培養拡大されていない間葉性幹細胞を請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって得る使用方法。
【請求項１４】
対象における組織形成を刺激または増強するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法であって、培養拡大されていない間葉性幹細胞を請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって得る使用方法。
【請求項１５】
対象における骨体積、骨性状または骨強度を維持または増大するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法であって、培養拡大されていない間葉性幹細胞を請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって得る使用方法。
【請求項１６】
単離された培養拡大されていないヒト成人間葉性幹細胞。
【請求項１７】
前記間葉性幹細胞がＣＤ１０５、ＣＤ２９および／またはＣＤ４４の細胞表面抗原を発現する請求項１６に記載の間葉性幹細胞。
【請求項１８】
ＣＤ１０５を発現する前記間葉性幹細胞の少なくとも５０％がＣＤ２９および／またはＣＤ４４の細胞表面抗原を発現する請求項１６に記載の間葉性幹細胞。
【請求項１９】
ＣＤ１０５を発現する前記間葉性幹細胞の２５％未満がＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３４および／またはＣＤ３１の細胞表面抗原を発現する請求項１６に記載の間葉性幹細胞。
【請求項２０】
前記間葉性幹細胞が間葉性組織系譜の細胞にさらに分化し得る請求項１６に記載の間葉性幹細胞。
【請求項２１】
前記間葉性組織系譜が骨、軟骨、脂肪、腱、靭帯、筋肉または骨髄間質である請求項２０に記載の間葉性幹細胞。
【請求項２２】
前記間葉性幹細胞が目的とする少なくとも一つのタンパク質を発現させるために操作される請求項１６に記載の間葉性幹細胞。
【請求項２３】
前記目的とするタンパク質が細胞成長、形態形成、分化、組織構築またはそれらの組合せのために必要な高分子である請求項２２に記載の間葉性幹細胞。
【請求項２４】
細胞成長、形態形成、分化および／または組織構築のために必要な前記高分子が骨形態形成タンパク質、骨形態形成様タンパク質、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮増殖因子、Ａｎｇ−１、ＰＩＧＦまたはそれらの組合せである請求項２３に記載の間葉性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉性幹細胞を培養拡大する工程を伴わない、組織修復または組織形成のための間葉性幹細胞を単離および移植する方法に関する。別の実施形態において、本発明は、間葉性幹細胞を培養拡大する工程を伴わない、骨の形成を修復または誘導するための骨髄由来の間葉性幹細胞を単離および移植する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉性幹細胞（ＭＳＣ）は、骨格の修復における細胞治療および細胞媒介遺伝子治療のための最も有望な道具の１つであると見なされている。ＭＳＣは、骨（Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ他、１９９２）、軟骨（Ｍａｃｋａｙ他、１９９８；Ｙｏｏ他、１９９８）、脂肪（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９６）、腱（Ｙｏｕｎｇ他、１９９８）、筋肉および間質（Ｃａｐｌａｎ他（２００１）により総説される）を含む様々な系譜に分化する潜在的能力を有することが示されていた。成人におけるＭＳＣの知られている主な供給源は、造血系系譜の細胞、内皮細胞および間葉性幹細胞（これらは骨髄間質系の一部である）を含むいくつかの細胞タイプを含有する骨髄区画である（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９）。
【０００３】
いくつかのプロトコルが、最近、骨形成性の細胞に分化する細胞として、また、ＢＭＰ−２などの治療遺伝子産物を送達するビヒクルとして、培養で拡大されたヒトＭＳＣを利用して大きな骨欠陥の再生および充填を可能にするために確立された（Ｔｕｒｇｅｍａｎ他、２００１）。ＢＭＰ−２との組合せにおいて、ｈＭＳＣは全層癒着不能骨欠陥を治癒することができることが最近示された（Ｔｕｒｇｅｍａｎ他、２００１）。また、最近の研究では、ヒトＭＳＣは、レトロウイルスベクターによって形質導入することができ、かつ、インビボ移植後において治療遺伝子の安定な発現を維持することができることが示された（Ｌｅｅ他、２００１）。これらの研究では、ＭＳＣは骨髄から単離され、培養で拡大され、場合により遺伝子操作され、インビボに移植された。培養拡大の段階は極めて費用がかかり、また、時間もかかり、そして、多くの場合、細胞はその多型潜在性を失い、所望される目的を達成できない場合がある。対照的に、培養されていない、新たに単離されたヒトＭＳＣの使用を記載する研究はほとんどなかった。Ｈｏｒｗｉｔｚ他（１９９９）は、処理されていない骨髄同種移植片に存在するヒトＭＳＣが生着して骨芽細胞の分化および更新のための幹細胞リザーバーを提供し得ることを示した。ｈＭＳＣ濃縮集団の単離では、効率的かつ再現可能な単離方法が要求される。ＭＳＣの単離に関する方法は、選択されたロットのウシ胎児血清を使用することによる細胞のプラスチック接着性の増強（Ｋａｄｉｙａｌａ他、１９９７；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９）、ＳＴＲＯ−１表面分子の存在に基づく免疫磁気単離（ＧｒｏｎｔｈｏｓおよびＳｉｍｍｏｎｓ、１９９５）を含めても、ほとんど記載されていなかった。これら２つの方法は、他の研究室によって再現することが非常に難しく、どの研究においても、培養拡大の前の細胞の分化能を明らかにすることは行われていなかった。Ｍａｊｕｍｄａｒ他（２０００）は、ヒトＢＭ吸引物から得られた細胞が抗ＣＤ１０５（エンドグリン）抗体によって単離され、培養拡大の後で軟骨形成性の細胞に分化し、ＭＳＣとは識別可能な免疫表現型を示したことを明らかにした。このことは、これらのＣＤ１０５＋の細胞は骨形成性のＭＳＣ集団を含有することを示唆している。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、組織修復または組織形成のための医薬品を調製する際に使用される培養拡大されていない間葉性幹細胞を単離する方法に関する。
【０００５】
単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞を得る方法は下記の工程を含む：ヒト細胞集団を、そのヒト細胞集団に含まれる間葉性幹細胞で発現する表面分子に結合する抗体と接触させ、その結果、細胞−抗体複合体を形成させるようにする工程；間葉性幹細胞を回収する工程；回収された間葉性幹細胞を、著しい細胞拡大を防止する条件のもとで維持し、それにより、培養拡大されていない間葉性幹細胞を得る工程。別の実施形態では、ヒト細胞集団を含むサンプルが、本明細書中上記で記載されたように、細胞−抗体複合体を形成させる前に混合サンプルが得られるように濃縮増殖培地と接触させられる。
【０００６】
別の実施形態において、対象に投与される医薬品を調製するための、単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法が提供され、この場合、培養拡大されていない間葉性幹細胞は、ヒト細胞集団を含むサンプルを得ること；サンプルを、間葉性幹細胞で発現する表面分子に結合する抗体と接触させ、その結果、細胞−抗体複合体を形成させるようにすること；間葉性幹細胞を回収し、それにより、培養拡大されていない間葉性幹細胞を得ることによって単離される。別の実施形態では、ヒト細胞集団を含むサンプルが、本明細書中上記で記載されたように、細胞−抗体複合体を形成させる前に混合サンプルが得られるように濃縮増殖培地と接触させられる。
【０００７】
別の実施形態において、対象における組織修復を刺激または増強するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法が提供され、この場合、培養拡大されていない間葉性幹細胞は、ヒト細胞集団を含むサンプルを得ること；サンプルを、間葉性幹細胞で発現する表面分子に結合する抗体と接触させ、その結果、細胞−抗体複合体を形成させるようにすること；間葉性幹細胞を回収し、それにより、培養拡大されていない間葉性幹細胞を得ることによって単離される。別の実施形態では、ヒト細胞集団を含むサンプルが、本明細書中上記で記載されたように、細胞−抗体複合体を形成させる前に混合サンプルが得られるように濃縮増殖培地と接触させられる。
【０００８】
別の実施形態において、対象における組織形成を刺激または増強するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法が提供され、この場合、培養拡大されていない間葉性幹細胞は、ヒト細胞集団を含むサンプルを得ること；サンプルを、間葉性幹細胞で発現する表面分子に結合する抗体と接触させ、その結果、細胞−抗体複合体を形成させるようにすること；間葉性幹細胞を回収し、それにより、培養拡大されていない間葉性幹細胞を得ることによって単離される。別の実施形態では、ヒト細胞集団を含むサンプルが、本明細書中上記で記載されたように、細胞−抗体複合体を形成させる前に混合サンプルが得られるように濃縮増殖培地と接触させられる。
【０００９】
別の実施形態において、対象における骨体積、骨性状または骨強度を維持または増大するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法が提供され、この場合、培養拡大されていない間葉性幹細胞は、ヒト細胞集団を含むサンプルを得ること；サンプルを、間葉性幹細胞で発現する表面分子に結合する抗体と接触させ、その結果、細胞−抗体複合体を形成させるようにすること；間葉性幹細胞を回収し、それにより、培養拡大されていない間葉性幹細胞を得ることによって単離される。別の実施形態では、ヒト細胞集団を含むサンプルが、本明細書中上記で記載されたように、細胞−抗体複合体を形成させる前に混合サンプルが得られるように濃縮増殖培地と接触させられる。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、単離された培養拡大されていないヒト成人間葉性幹細胞を提供する。１つの実施形態において、単離された培養拡大されていないヒト成人間葉性幹細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ２９および／またはＣＤ４４の細胞表面抗原を発現する。
【００１１】
図面の簡単な記述
図１は骨髄由来の単核細胞の免疫表現型を示す。単核細胞（ＭＮＣ）を密度勾配での分離によって新鮮なヒトＢＭから得た。１×１０６個の細胞を含むアリコートを、示されたマウス抗ヒト抗体で染色した。四連での細胞の割合（％）が測定された。
【００１２】
図２はＣＤ１０５マイクロビーズを用いて得られる拡大されたｈＭＳＣの骨形成性系譜へのインビトロでの分化を示す。Ａ：細胞溶解物におけるアルカリホスファターゼ活性が、骨形成性補充物の添加後の１週間目、２週間目および３週間目でアッセイされた。活性は、総細胞タンパク質（マイクログラム単位）に対して正規化された１分あたりのｐ−ニトロフェノールの放出として評価された。Ｂ：細胞溶解物において測定されたカルシウム沈着（これはカルシウム−クレゾールフタレインコンプレクソン複合体の形成として評価され、サンプル中のカルシウム濃度に正比例する５７５ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表される）。骨形成性補充物の非存在下で培養された細胞（−Ｓｕｐｐｌ．）と比較して、骨形成性補充物とともに培養された細胞（＋Ｓｕｐｐｌ．）における有意な増大（＊Ｐ＜０．０５）に留意すること。棒は、３つの個々のウエルから得られた平均（±ＳＥＭ）のＡＬＰ（Ａ）またはカルシウム沈着（Ｂ）を表している。
【００１３】
図３は培養拡大されたＣＤ１０５＋細胞の形態学分析およびフローサイトメトリー分析を示す。細胞を、ＣＤ１０５に対するマイクロビーズ結合抗体を使用して骨髄から単離し、培地に入れ、示されたように培養状態で維持した。１０日間培養されたＣＤ１０５＋細胞の顕微鏡写真（Ａ、Ｘ４０）および全体的なＢＭ−ＭＮＣの顕微鏡写真（Ｂ、Ｘ４０）。Ｃ：培養拡大された（３回〜５回の継代）ＣＤ１０５＋細胞の表面分子の発現。
【００１４】
図４は新鮮なＢＭ由来ＣＤ１０５＋細胞のインビボ骨形成能を示す。直径５ｍｍの円形状欠陥が６週齢〜８週齢のオスＣＤ−１ヌードマウスの橈骨に作製された。培養されていない新鮮なＢＭ由来ＣＤ１０５＋細胞（ＣＤ１０５マイクロビーズによって単離）をコラーゲンスポンジに載せ、欠陥部位に移植した。移植後２０日目に、マウスを屠殺し、頭蓋冠を他の軟組織から切除し、Ｘ線写真、および新しい骨形成の証拠のための組織学的分析によって分析した。Ａ、Ｂ：ＢＭ−ＣＤ１０５＋細胞が移植された頭蓋冠試料のＸ線写真（Ａ）およびＢＭ−ＣＤ１０５−細胞が移植された頭蓋冠試料のＸ線写真（Ｂ）。ＢＭ−ＣＤ１０５＋細胞が移植された欠陥部における放射線不透明領域に留意すること（Ａ、二重矢印）。Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ：ＢＭ−ＣＤ１０５＋細胞が移植された頭蓋冠試料の顕微鏡写真（Ｃ、Ｄ）およびＢＭ−ＣＤ１０５−細胞が移植された頭蓋冠試料の顕微鏡写真（Ｅ、Ｆ）。ＢＭ−ＣＤ１０５＋細胞が移植された試料における欠陥部の周縁部での新しく形成された骨に留意すること（矢印）。
【００１５】
図５は異所性部位に移植された培養されていないｈＭＳＣの生着および分化を示す。培養されていないｈＭＳＣ（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）によって単離）を蛍光性細胞トレーサー（ＤｉＩ）で標識し、ｒｈＢＭＰとともに埋め込んだ。移植後２週間目に、インプラントを取り出し、固定し、ＯＣＴに包埋した。Ａ＆Ｂ：これらのインプラントの切片のＨ＆Ｅ染色により、新しく形成された軟骨および骨（矢先）が主にインプラントの周辺部で明らかにされた（原倍率：Ａ：１０Ｘ、Ｂ：４０Ｘ）。軟骨細胞の形態学を有するＤｉＩ標識された細胞（Ｄ１、矢印）、および骨芽細胞の形態学を有するＤｉＩ標識された細胞（Ｄ２、二重矢印）もまた明らかであった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、間葉性幹細胞の培養拡大を伴わない、組織修復または組織形成のための間葉性幹細胞を単離および移植する方法に関する。１つの実施形態において、本発明は、間葉性幹細胞の事前の培養拡大を伴わない、骨の形成を修復または誘導するための、骨髄から間葉性幹細胞を単離する方法に関する。
【００１７】
組織は、１つの実施形態では軟骨であり、または、別の実施形態では骨であり、または、別の実施形態では靱帯組織である。別の実施形態において、組織は、修復を必要としている任意の哺乳動物組織であり、例えば、間葉性幹細胞がそのような修復において役割を果たしているニューロン組織、横紋筋、心筋、脾臓、肝臓または腎臓などである。
【００１８】
間葉性幹細胞（ＭＳＣ）は、複製することができ、しかしながら、未分化の細胞としてその状態を維持することができ、その一方で、骨、軟骨、脂肪、腱、筋肉および骨髄間質を含む特定の間葉系組織系譜に分化する潜在的能力を有する多能性の細胞である。本明細書中で使用される場合、本発明の用語「ＭＳＣ」または用語「間葉性幹細胞」は、限定されないが、胚性ＭＳＣ、成人ＭＳＣまたは臍帯血幹細胞を含む。
【００１９】
本発明は、１つの実施形態では組織修復において使用される医薬品、または、別の実施形態では組織形成において使用される医薬品、または、別の実施形態では骨修復において使用される医薬品へのその配合に先立つ細胞の培養拡大を伴うことなく、単離された間葉性幹細胞を使用するための、簡便かつ効率的で、時間のかからない基盤を提供する。
【００２０】
本発明は、別の実施形態において、目的とする任意の部位に投与される医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていないＭＳＣ細胞の使用を提供する。
【００２１】
用語「医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていないＭＳＣ細胞の使用」は、本明細書中上記では、その単離後すぐのＭＳＣ細胞の使用、または、培養での細胞拡大の工程を避けながら、その単離後の０〜１２時間での、単離されたＭＳＣ細胞の使用を示す。すなわち、細胞は、その使用の前に、培養でのその増殖を著しく妨げる条件のもとで保たれる。用語「培養でのその増殖を著しく妨げる」および用語「回収された間葉性幹細胞を、著しい細胞拡大を妨げる状態のもとで維持する」により、細胞増殖が、培養条件、または、培養状態で存在する時間の長さ、または、回収された間葉性幹細胞が保たれる環境条件の反映として、大幅に低下していることを理解しなければならない。
【００２２】
１つの実施形態において、細胞は、２４時間を超えない短い期間、培養される。１つの実施形態において、細胞は１時間〜２４時間の間で培養される。別の実施形態では、本発明の任意の方法または適用のためのその使用の前に、細胞は１時間〜５時間の間で培養され、または、別の実施形態では５時間〜１０時間の間で培養され、または、別の実施形態では１０時間〜１５時間の間で培養され、または、別の実施形態では１５時間〜２０時間の間で培養され、または、別の実施形態では２０時間〜２４時間の間で培養される。細胞が培養時に拡大を受けない限り、２４時間未満である任意の期間が本発明の一部であると見なされることになることを理解しなければならない。
【００２３】
１つの実施形態において、細胞は、培養の前に、目的とするタンパク質を発現させるために操作される。別の実施形態では、操作された細胞が、直接、本明細書中に列挙される方法および／または適用のために利用される。
【００２４】
本明細書中に開示された方法によって単離されたＭＳＣは培養拡大されておらず、従って、長期間の細胞培養手法において使用されるプラスチックまたはポリマーとの接触状態にはならず、長期にわたる培養期間にさらされた細胞については一般的な出来事であるストレス状態または感染による損傷を受けない。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明の方法によって単離されたＭＳＣは、本明細書中に列挙される適用のために利用されることになるが、単離後すぐに利用される。別の実施形態において、細胞は、その使用に先立って、一時的に（すなわち、本明細書中上記で議論されたように２４時間未満）培養される。別の実施形態において、細胞は、単離後、凍結することができ、かつ、細胞の機能、多能性または生存性を根本的に損なわない任意の期間にわたって貯蔵することができる。凍結された細胞は、その後、本明細書中に列挙される方法および適用のために解凍し、使用することができる。
【００２６】
用語「間葉性幹細胞」または用語「ＭＳＣ」は、最終分化していない細胞で、限りなく分裂して、いずれかの幹細胞である細胞を生じさせることができる細胞、または、不可逆的に分化して、新しいタイプの細胞を生じさせる細胞について交換可能に使用される。本発明の間葉性幹細胞および始原細胞が異なる供給源組織から単離され得ることに留意することは重要である。１つの実施形態において、供給源組織は皮膚であり、または、別の実施形態では骨髄であり、または、別の実施形態では筋肉であり、または、別の実施形態では脂肪であり、または、別の実施形態では肝臓である。さらに、幹細胞の性質を有するか、または分化可塑性を示す任意の細胞タイプ、例えば、限定されないが、骨髄、筋肉、脾臓または任意の他の組織の供給源から得られる細胞。骨髄細胞を、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨または他の髄質空間から得ることができる。ヒト間葉性幹細胞の他の供給源には、限定されないが、胚卵黄嚢、胎盤、脂肪、臍帯、胎児皮膚および思春期皮膚、筋肉組織ならびに血液が含まれる。
【００２７】
１つの実施形態において、単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞を得る方法が提供され、この場合、細胞は、細胞表面のエピトープに結合する抗体の使用による陽性選択によって得られる。この方法は下記の工程を含む：ヒト細胞集団を含むサンプルを得る工程；サンプルを、表面分子に結合する抗体と接触させ、その結果、細胞−抗体複合体を形成させるようにする工程；間葉性幹細胞を回収し、それにより、単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞を得る工程。抗体は、実施例１に示されるように、ＣＤ１０５を認識することができ、または、間葉性幹細胞の表面分子（例えば、ＣＤ４４およびＣＤ２９など）に結合する他の抗体でもあり得る。抗体は、カラム、プラスチック、アレイまたは磁気ビーズに担持することができる。
【００２８】
抗原−抗体複合体が形成されたとき、抗原−抗体複合体は、例えば、カラムによって、抗体に結合していない他の部分集団から分離される。抗体が磁気ビーズによって担持されている場合、磁気カラムを使用することができる。
【００２９】
細胞を抗体から回収する工程は、当業者に知られている好適な緩衝液を用いた洗浄によって行われる。別の実施形態では、単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞を負の選択により得る方法が提供される。この方法は下記の工程を含む：ヒト細胞集団を含むサンプルを得る工程；濃縮増殖培地をサンプルに与え、その結果、混合サンプルを得るようにする工程；間葉性幹細胞が得られるように、混合サンプルを分離する工程；間葉性幹細胞を回収し、それにより、単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞をサンプルから得る工程。濃縮増殖培地は、例えば、限定されないが、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）間葉濃縮カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＢＣ、カナダ）であり得る。間葉性幹細胞が得られるように、混合サンプルを分離する工程は、この分野では知られており、例えば、限定されないが、遠心分離機の使用によって行われる。別の実施形態において、細胞は、サンプルに存在する他の部分集団の表面に指向される抗体の使用による負の選択に供することができる。例えば、米国特許第５９６５４３６号に示されるように、骨髄サンプルを、巨核球を抗体分取により他の造血細胞から除くための負の選択に供することができ、その後、間葉性幹細胞の部分集団が得られる。培養拡大を伴わない間葉性幹細胞選択を用いる任意の方法は、陽性選択または負の選択のいずれによっても、本発明の一部であると見なされることを理解しなければならない。
【００３０】
別の実施形態において、懸濁物中に存在する非生存性の特定の部分集団の細胞を選択的に不活性化して採取し、その一方で、他の所望される部分集団に悪影響を及ぼさないために電場を利用することによって、米国特許第６０４３０６６号に従って分離することができる。この方法によれば、細胞は、特徴的なエレクトロポレーション閾値における固有的な差異または誘導された差異に基づいて選択され得る；そのような差異は、例えば、細胞サイズおよび／または臨界的な誘電的膜破壊電圧の違いに依存し得る。
【００３１】
単離された細胞におけるＭＳＣの存在は、特有のモノクローナル抗体を用いて同定される特異的な細胞表面マーカーによって確認することができる（例えば、米国特許第５４８６３５９号を参照のこと）。
【００３２】
実施例１では、細胞が、負の選択によるだけでなく、ＣＤ１０５抗体を用いて陽性選択および単離されたとき、ＣＤ１０５＋の細胞が、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ２９（β１インテグリン）およびＣＤ４４（ヒアルロン酸）の表面マーカーについて陽性に染色されることが見出されたことが明らかにされた。単離された細胞は、造血系マーカーのＣＤ１４（マクロファージマーカー）およびＣＤ４５（白血球共通抗原）について陰性に染色されることが見出された。これらの結果から、本明細書中に示される方法に従って単離された細胞はＭＳＣであったことが明らかにされた。さらに、示されるように、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸およびデキサメタゾンの存在下で培養された細胞におけるカルシウム沈着およびＡＬＰ活性を測定するアッセイでは、骨芽細胞へのＣＤ１０５＋ＭＳＣの分化が明らかにされ、従って、これらの単離されたＭＳＣは、間葉性幹細胞だけに特徴的な表面抗原を発現し、分化することなく培養で再生することができ、また、インビトロ（実施例２）またはインビボで損傷を受けた組織部位に置かれたとき（実施例３）のいずれかで誘導されたとき、特定の間葉系系譜に分化することができる。
【００３３】
ヒトＭＳＣは、通常、（比較的若い患者における１００００個の細胞に約１個から、初老患者における２００００００個に１個もの少数にまで）年齢とともに非常に減少する極めてわずかな量で骨髄に存在するが、本発明は、事前の培養拡大を伴わない、対象に投与される単離された細胞を得るための方法を提供する。
【００３４】
培養されていないＣＤ１０５＋の細胞が、限界サイズの非治癒性頭骨欠損を受けたヌードマウスに移植されたとき（実施例３）、新しい骨の形成が明らかであった。これらの結果から、培養拡大されていない骨髄由来のＣＤ１０５＋の細胞は、骨修復のために使用され得る骨形成性の細胞であることが明らかにされた。さらに、多能性の細胞として、培養拡大されていないＭＳＣは、組織修復、造血系再構築のための細胞治療などの他の適用、そして、再生医療で利用される任意の種類の手法において利用することができる。
【００３５】
別の実施形態において、対象に投与される医薬品を調製する際の、本明細書中に記載される方法により得られる単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法が提供される。
【００３６】
医薬品は、通常、必要な緩衝剤を加えることによって、注射剤および／または移植片および／またはデバイスとして、局所的、全身的または局部的な使用のために配合される。細胞は、適切な緩衝液に懸濁されたとき、培養拡大されていない細胞の組成物／培養物として示される。投与のために配合されたとき、本発明において使用される培養拡大されていない細胞は、当然のことではあるが、パイロジェンを含まない生理学的に許容され得る形態である。さらに、培養拡大されていない細胞は、組織損傷部位への送達のために粘性形態で注入することができる。局所投与は、創傷治癒および組織修復のために好適であり得る。１つの実施形態において、治療的に有用な薬剤もまた、場合により、上記で記載されたような細胞組成物に含めることができ、または、他の実施形態では、代替的または付加的に、本発明の方法における組成物と同時または連続して投与することができる。
【００３７】
別の実施形態において、本発明の組成物は、縫合または移植片の治癒能力を増強または促進するために、腱／靱帯の傷害に対する現在利用可能な処置、例えば、縫合（例えば、バイクリル（ｖｉｃｒｙｌ）縫合または外科的なガット縫合（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．））などと、または、腱／靱帯の同種移植片もしくは自家移植片と一緒に使用することができる。
【００３８】
キャリア物質の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外見および境界特性に基づく。培養拡大されていない細胞の組成物／培養物の特定の適用では、適切な配合が規定される。別の実施形態において、培養拡大されていない細胞はマトリックスと混合することができる。培養拡大されていない細胞の組成物／培養物のための潜在的なマトリックスは生分解性であり、かつ、化学的に定義され得る。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分から構成される。他の潜在的なマトリックスは非生分解性であり、かつ、化学的に定義される。好ましいマトリックスには、スポンジを含むコラーゲン系のマトリックス、例えば、Ｈｅｌｉｓｔａｔ．ＲＴＭ．（Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、Ｎ．Ｊ．）など、または、注射可能な形態のコラーゲン、ならびに、例えば、ヒアルロン酸由来の封鎖剤（これは生分解性であり得る）が含まれる。生分解性の物質（例えば、セルロースフィルムまたは外科用メッシュなど）もまた、マトリックスとして役立ち得る。そのような物質は傷害部位に縫合することができ、または、腱／靱帯の周りを包むことができる。キャリアの別の好ましいクラスはポリマーマトリックスであり、この場合、本発明の細胞は、ポリ乳酸のポリマー、ポリグリコール酸のポリマー、および、乳酸とグリコール酸との共重合体と混合することができる。これらのマトリックスは、スポンジの形態にすることができ、または、多孔性粒子の形態にすることができ、そしてまた、封鎖剤を含むことができる。好適なポリマーマトリックスが、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９３／０００５０に記載されている。
【００３９】
別の実施形態において、対象における組織修復を刺激または増強するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法が提供され、この場合、培養拡大されていない間葉性幹細胞は、本明細書中に記載される方法によって得られる。１つの実施形態において、間葉性幹細胞は（２４時間未満の）短い期間にわたって培養される。別の実施形態において、細胞は、対象へのその投与に先立ってトランンスフェクションまたは形質導入される。別の実施形態において、この方法は、結合組織に対する損傷を修復するために利用され、または、別の実施形態では非結合組織に対する損傷を修復するために利用される。
【００４０】
別の実施形態において、対象における組織形成を刺激または増強するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法が提供され、この場合、培養拡大されていない間葉性幹細胞は、本明細書中に記載される方法によって得られる。
【００４１】
用語「組織」には、１つの実施形態では結合組織が含まれ、別の実施形態では非結合組織が含まれる。
【００４２】
用語「結合組織」は、本明細書中上記では、骨、軟骨、靱帯、皮膚、脂肪、腱、筋肉、半月、ならびに、哺乳動物の組織および間質のすき間の盤状組織が含まれる。
【００４３】
別の実施形態において、本発明の培養拡大されていない細胞の組成物／培養物は、他の治療的に有用な薬剤を含むことができ、例えば、サイトカイン、ケモカイン、白血球阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、遊走阻害因子、ＭＰ５２、増殖因子（これには、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）および繊維芽細胞増殖因子−４（ＦＧＦ−４）が含まれる）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、またはそれらの組合せなど（これらに限定されない）を含むことができる。これらの薬剤のいくつかはまた、本発明の組成物において使用することができる。そのような組成物は、腱、靱帯および骨が、連続した解剖学的位置で同時に形成される胚接合部の欠陥を処置するために有用であり得るし、また、骨への腱の結合部位において組織を再生するために有用であり得る。本発明の組成物はまた、創傷治癒において、例えば、皮膚の治癒および関連した組織修復などにおいて使用され得ることが意図される。創傷のタイプには、火傷、切傷および潰瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
別の実施形態において、少なくとも１つの他の薬剤、例えば、造血を促進する薬剤などを加えることができ、例えば、造血に関与するサイトカインなどを加えることができる。いくつかの非限定的な例には、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、インターフェロン、またはそれらの組合せがある。
【００４５】
別の実施形態において、全身性タンパク質の送達を促進する薬剤、例えば、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、成長ホルモンなどを、移植後、植え付けられた間葉性幹細胞の骨髄への取り込みに従う対象に与えることができる。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「形成を誘導する」は、ヒト、家畜、飼い慣らされた動物、または任意の他の動物種において、加齢、遺伝的もしくは感染性の疾患、事故、または何らかの他の原因によって引き起こされ得るような組織の状態、変性、減耗または損傷を改善するような、組織の更新または再生における使用を示す。別の実施形態において、組織形成が、商業的目的または何らかの他の目的のための増大した成長を達成するための、家畜、飼い慣らされた動物、または任意の他の動物種における組織発達のために要求される。別の実施形態において、組織形成が、形成手術において、例えば、安定化した形状を得るための顔面再構築（これに限定されない）において要求される。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「組織修復を増強する」または用語「修復する」は、組織の傷害、引き裂き、奇形または欠損の治癒および／または再生、ならびに、組織損傷を防止する際の予防的使用を示す。
【００４８】
別の実施形態において、本発明は、エストロゲンの減少から生じる骨粗鬆症、女性において閉経または卵巣摘出によって生じ得る骨粗鬆症を処置および防止するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用方法を提供する。促進された骨再吸収を防止し、かつ、骨体積、骨性状および骨強度の低下を阻害するための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用もまた、本発明によって提供される。本発明のこれらの方法に従って、炎症組織からの抽出物を有効成分として含有する医薬組成物が、骨体積、骨性状および骨強度を維持または増大させるために使用され得る。小柱結合性および小柱非結合性を、本発明の医薬組成物を用いて健康なレベルで維持することができる。骨粗鬆症およびその症状（例えば、低下した骨体積、骨性状および骨強度、低下した小柱結合性、ならびに増大した小柱非結合性など）を、その必要性のある患者に医薬的に効果的な量の抽出物を投与することによって処置または防止することができる。
【００４９】
従って、対象における骨体積、骨性状または骨強度を維持または増大させるための医薬品を調製する際の単離された培養拡大されていない間葉性幹細胞の使用を含む、対象における骨体積、骨性状または骨強度を維持または増大させるための方法が提供され、この場合、培養拡大されていない間葉性幹細胞は、本明細書中に記載される方法によって得られる。
【００５０】
培養拡大されていない間葉性幹細胞を利用する任意の組成物または医薬品の製造は本発明の一部であると見なされることになることを理解しなければならない。
【００５１】
本発明の組成物／医薬品／培養物は下記の適用において利用することができる：（１）急性の傷害、異常な遺伝子発現または後天的な疾患によって損傷を受けた間葉系組織を再生させるために；（２）骨髄の一部を取り出し、その間葉性幹細胞を単離し、損傷した組織を、ＭＳＣを損傷した組織部位に送達するために好適な生体適合性キャリアと組み合わせられた培養されていないＭＳＣで処置することによって、損傷した間葉系組織を修復するために；（３）様々な間葉系組織を産生させるために；（４）ＭＳＣの自己再生および拘束された間葉系系譜への分化に関係する増殖因子を検出および評価するために；（５）特定の間葉系系譜へのＭＳＣの拘束および分化を調節する阻害因子を検出および評価するために；（６）間葉系細胞系譜を発達させるために、また、間葉系組織の発達に関連した因子についてアッセイするために。ＭＳＣは、ＭＳＣが構成的に発現および分泌する多くの重要なサイトカインおよび増殖因子によって示されるように、骨髄環境において非常に重要な役割を有しており、また、造血を支援する能力を有している（Ｍａｊｕｍｄａｒ他、２０００）。（７）商業的目的または何らかの他の目的のための増大した成長を達成するための、家畜、飼い慣らされた動物、または任意の他の動物種における骨格の発達を刺激するために；そして、（８）ヒト、家畜、飼い慣らされた動物、または任意の他の動物種における骨、軟骨、または任意の他の組織の新生物または過形成を処置するために。
【００５２】
これらの理由から、ＭＳＣが造血再構築のために非常に重要であることは明白である。培養されていないＭＳＣを造血移植片との組合せで使用することができる。
【００５３】
別の実施形態において、細胞は、必要性のある対象への適用に先立って、目的とするタンパク質を発現させるために遺伝子操作することができる。目的とするタンパク質は、細胞成長、形態形成、分化、組織構築、またはそれらの組合せのために必要な任意の高分子である。これらは、例えば、骨形態形成タンパク質、骨形態形成様タンパク質、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮増殖因子、造血に関係したサイトカイン、全身的送達のための因子（例えば、ＧＨ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子など）、またはそれらの組合せである。
【００５４】
用語「目的とするタンパク質を発現させるために操作された細胞」は、本明細書中上記では、細胞成長、形態形成、分化、組織構築、またはそれらの組合せのために必要な何らかの高分子を発現させるために、分子生物学的技術によって、例えば、組換えＤＮＡ技術によって改変されている細胞または組織として定義される。別の実施形態において、細胞は、細胞成長、形態形成、分化、組織構築、またはそれらの組合せのために必要な何らかの高分子の増大した量を産生させるためにそのように改変される。用語「増大した量」は、本明細書中上記では、通常の場合に産生される量よりも少なくとも１０倍多いことを示す。
【００５５】
用語「目的とするタンパク質を発現させるために細胞を遺伝子操作する」工程は、目的とするタンパク質をコードする核酸を用いた細胞のトランスフェクションまたは形質導入によって行われる。
【００５６】
用語「トランスフェクション」または用語「トランスフェクションされた細胞」は、ＤＮＡが、トランスフェクションの方法によって、すなわち、プラスミドまたはリポソームの使用によってゲノムに組み込まれている細胞を示す。
【００５７】
用語「形質導入」または用語「形質導入された細胞」は、例えば、ファージまたはレトロウイルスによるウイルスＤＮＡ移入を示す。目的とするタンパク質をコードする核酸は、ベクター分子によっても同様に導入することができ、従って、本発明のさらなる実施形態を表す。
【００５８】
ベクター分子は、目的とする生成物をコードする遺伝子が安定的に発現され得るように標的細胞または組織の内部に送達および維持され得る任意の分子であり得る。１つの実施形態において、本発明において利用されるベクターはウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターまたは非ウイルスＤＮＡプラスミドである。１つの局面によれば、この方法は、生成物をコードする遺伝子を哺乳動物組織の細胞に治療的使用または予防的使用のために導入することを含む。ウイルスベクターは、本発明の方法において使用される場合、（ａ）レトロウイルスベクター（例えば、ＭＦＧまたはｐＬＪなど）；（ｂ）アデノ関連ウイルス；（ｃ）アデノウイルス；および（ｄ）ヘルペスウイルス（これには、単純ヘルペス１または単純ヘルペス２が含まれるが、これらに限定されない）、または（ｅ）レンチウイルスからなる群から選択することができる。あるいは、非ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡプラスミドベクターなど）を使用することができる。利用された送達方法にかかわらず、送達されたとき、標的化された細胞または組織の内部における安定な保持が可能である当業者に知られているＤＮＡプラスミドベクターはどれも、本発明の範囲内である。生成物をコードする遺伝子を標的細胞に導入するための非ウイルス手段もまた本発明の範囲内である。そのような非ウイルス手段は、（ａ）少なくとも１つのリポソーム、（ｂ）Ｃａ３（ＰＯ４）２、（ｃ）エレクトロポレーション、（ｄ）ＤＥＡＥ−デキストラン、および（ｅ）ネイキッドＤＮＡの注入からなる群から選択することができる。
【００５９】
用語「核酸」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および適する場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）またはそれらの模倣体などを示す。この用語はまた、均等物として、ヌクレオチドアナログから作製されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、ならびに、記載されている実施形態に対して適用可能として、一本鎖（センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを包含することを理解しなければならない。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合のヌクレオシド間（骨格）連結から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような修飾オリゴヌクレオチドまたは置換オリゴヌクレオチドは、多くの場合、望ましい性質（例えば、増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された親和性、および、ヌクレアーゼの存在下での増大した安定性など）のために、天然の形態よりも好ましい。
【００６０】
処置の投与量は、治療効果を得るために投与される細胞の量であるが、培養されていない細胞の組成物の作用を変化させる様々な要因によって、例えば、形成されることが所望される腱または靱帯の量、腱または靱帯の損傷部位、損傷を受けた腱または靱帯の状態、創傷の大きさ、損傷組織のタイプ、患者の年齢、性別および食事、何らかの感染の重篤度、投与時間、ならびに他の臨床的要因などによって影響を受ける。投与量は、再構成において使用されるマトリックスのタイプ、および、組成物におけるさらなるタンパク質のタイプによって変化し得る。他の既知の増殖因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）など）を最終的な組成物に添加することもまた、投薬量に影響を及ぼし得る。進行を、腱／靱帯様の組織形成、あるいは、腱または靱帯の成長および／または修復を定期的に評価することによってモニターすることができる。進行は、この分野で公知の様々な方法によって、例えば、Ｘ線撮影（ＣＴ）、超音波、ＭＲＩ、関節鏡検査および組織形態学的測定によってモニターすることができる。
【００６１】
別の実施形態において、本発明は、培養拡大されていないヒト成人間葉性幹細胞を提供する。細胞は、本明細書中に開示される方法によって単離され、上記の適用のいずれかにおいて利用することができる。
【００６２】
１つの実施形態において、間葉性幹細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ２９および／またはＣＤ４４の細胞表面抗原を発現する。別の実施形態では、ＣＤ１０５を発現する間葉性幹細胞の少なくとも５０％、または、別の実施形態ではその少なくとも５５％、または、別の実施形態ではその少なくとも６０％、または、別の実施形態ではその少なくとも６５％、または、別の実施形態ではその少なくとも７０％、または、別の実施形態ではその少なくとも７５％、または、別の実施形態ではその少なくとも８０％、または、別の実施形態ではその少なくとも８５％、または、別の実施形態ではその少なくとも９０％、または、別の実施形態ではその少なくとも９５％、または、別の実施形態ではその約９５％〜１００％がＣＤ２９および／またはＣＤ４４の細胞表面抗原を発現する。
【００６３】
別の実施形態において、ＣＤ１０５を発現する間葉性幹細胞の２５％未満が、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３４および／またはＣＤ３１の細胞表面抗原を発現する。別の実施形態では、ＣＤ１０５を発現する間葉性幹細胞の２０％未満、または、別の実施形態ではその１５％未満、または、別の実施形態ではその１０％未満、または、別の実施形態ではその７％未満、または、別の実施形態ではその５％未満、または、別の実施形態ではその０〜５％が、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３４および／またはＣＤ３１の細胞表面抗原を発現する。
【００６４】
間葉性幹細胞は間葉系組織系譜の細胞へのさらなる分化が可能であることを理解しなければならない。本明細書中上記で議論されたように、間葉性組織系譜は、骨、軟骨、脂肪、腱、靱帯、筋肉または骨髄間質を構成し得る。
【００６５】
別の実施形態において、本発明の細胞は、目的とする少なくとも１つのタンパク質を発現させるために操作することができる。この場合、目的とするタンパク質は、細胞成長、形態形成、分化、組織構築、またはそれらの組合せのために必要な高分子を含むことができ、そのそれぞれが本発明の別個の実施形態を表す。
【００６６】
別の実施形態において、細胞成長、形態形成、分化および／または組織構築のために必要な高分子は、骨形態形成タンパク質、骨形態形成様タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮増殖因子、Ａｎｇ−１、ＰＩＧＦ、またはそれらの組合せである。
【実施例】
【００６７】
実験手順
ｈＭＳＣ濃縮細胞集団の単離：
１）ＢＭ−ＣＤ１０５＋細胞の免疫磁気単離：
ヒト骨髄（ＢＭ）を、矯正整形外科手術を受けた患者から得られたヘパリン処理の小柱骨サンプルから回収した（これはＨａｄａｓｓａｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（エルサレム、イスラエル）のＨｅｌｓｉｎｋｉ委員会により承認された）。ＢＭ含有の小柱骨サンプルをＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）でフラッシュ洗浄した。単核細胞を単離するために、全ＢＭをリンパ球分離培地（ＬＳＭ、ＩＣＮ−Ｃａｐｐｅｌ  Ｉｎｃ．、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ、米国）に重層し、９００ｇで３０分間、室温で、中断することなく遠心分離した。
【００６８】
単核細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）緩衝液（０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で２回洗浄して、計数し、１０７細胞／８０ｕｌの濃度でＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、１．５ｍｌの試験チューブに移した。これに直接コンジュゲート化したマウス抗ヒトＣＤ１０５抗体−マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）を加え、暗所において４℃で４５分間〜５０分間、回転器に載せた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、製造者の推奨法に従って磁気カラムでＭＳ＋を分離した。カラムを通過した細胞をＣＤ１０５−の細胞と見なした。ＣＤ１０５＋の細胞を回収するために、カラムを磁石から除き、細胞をＭＡＣＳ緩衝液でフラッシュ洗浄した。その後、ＣＤ１０５−の細胞およびＣＤ１０５＋の細胞を、さらなる使用のために遠心分離によって回収した。
【００６９】
２）ＢＭ−ｈＭＳＣの濃縮：
完全増殖培地を用いて小柱骨サンプルからフラッシュ洗浄されたヒトＢＭ細胞のアリコートを、１ｍｌのＢＭあたり５０ｕｌのカクテルでＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）間葉濃縮カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＢＣ、カナダ）と混合し、室温で２０分間インキュベーションした。その後、ＢＭ濃縮カクテル混合物を、２％のＦＣＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳの２容量で希釈し、ＬＳＭに重層して、９００ｇで３０分間、室温で、中断することなく遠心分離した。
【００７０】
境界部から集められた単核細胞を間葉性幹細胞濃縮集団と見なして、さらなる使用のためにＰＢＳで洗浄し、計数した。
【００７１】
細胞培養：
ＣＤ１０５＋集団またはＭＳＣ濃縮集団のいずれかを、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００ユニット／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）が補充されたＤＭＥＭで再懸濁して、増殖面積１ｃｍ２あたり１００００細胞〜１５０００細胞の密度で、５％のＣＯ２を含む空気において３７℃で組織培養ディッシュに置床した。培地を、７２時間後、次いで３日後〜４日後に交換した。１４日目〜１６日目に、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡと５分間〜１０分間インキュベーションすることによって剥離させた。その後、細胞を、拡大のために１ｃｍ２あたり５０００細胞〜６０００細胞の密度で再び置床した。細胞は、９０％のコンフルエンスに達したときに述べられたように継代培養され、そして、アッセイのために使用されたか、または、さらなる使用のために、８５％完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）、５％ＢＳＡおよび１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）において液体窒素中で保存された。
【００７２】
フローサイトメトリー
アリコート（０．５〜１．５×１０６細胞）の新鮮なヒト骨髄単核細胞または培養拡大されたｈＭＳＣを細胞表面分子の分析のために使用した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）をＰＢＳ中に含有するＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、蛍光色素がコンジュゲート化されたマウス抗ヒトＣＤ１０５モノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウス抗ヒトＣＤ４４、マウス抗ヒトＣＤ２９、マウス抗ヒトＣＤ１４、マウス抗ヒトＣＤ３４、マウス抗ヒトＣＤ４５の各モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ）を用いて製造者の推奨法に従って染色し、また、マウスモノクローナルイソ型抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）を使用して、非特異的な蛍光を測定した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁して、ＦＡＣｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｅｃｋｉｎｓｏｎ）、ならびにデータ収集および分析のためのＣｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウエアによってヒトの示された抗原の発現について分析した。
【００７３】
インビトロ分化アッセイ
ｈＭＳＣの骨形成性分化をインビトロで誘導するために、ＣＤ１０５マイクロビーズまたはＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）濃縮カクテルのいずれかによって単離された骨髄由来ｈＭＳＣを、０．０５ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸および０．１μＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）からなる骨形成性補充物を含有するＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにおいて３０００細胞／ｃｍ２の密度で置床した。骨形成性補充物を含まないＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを用いて成長させられた細胞を陰性コントロールとして使用した。補充物を添加した１週間後、２週間後および３週間後に、細胞を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００および１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するアルカリ緩衝液溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）（アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイの場合）、または０．５ＮのＨＣｌ溶液（カルシウム沈着アッセイの場合）で溶解した。ＡＬＰアッセイの場合、溶解液を、基質としてのｐ−ニトロフェニルホスファートとともに、０．７５Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを含有するアッセイ緩衝液（ｐＨ１０．３）と３７℃で１０分間インキュベーションした。カルシウム沈着アッセイの場合、細胞溶解物を、穏やかに振とうしながら４℃で２４時間インキュベーションした。その後、サンプルを、カルシウムキット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を使用してカルシウム含有量についてアッセイした。タンパク質含有量を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して測定した。
【００７４】
異所性部位におけるＢＭ−ｈＭＳＣ移植：
ＣＤ１０５マイクロビーズまたはＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）カクテルのいずれかによって単離されたＢＭ−ｈＭＳＣを、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＤｉＩ細胞標識溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて直ちに標識した。標識化は、細胞を無血清ＤＭＥＭに１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、１５μｌ／ｍｌのＶｙｂｒａｎｔ  ＤｉＩ溶液と混合し、暗所にて、振とう機において３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベーションすることによって行われた。ＤｉＩ標識された培養されていない細胞（インプラントあたり１〜１．５×１０６細胞）を５μｇの組換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ２）と混合し、コラーゲンスポンジ（Ｄｕｒａｇｅｎ）に載せ、６週齢〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。インプラントを移植後の２週間目および４週間目に取り出した。
【００７５】
頭骨欠陥部への移植：
頭骨欠陥アッセイのために、本発明者らはオスのＣＤ−１ヌードマウスを使用した。マウスをケタミン−キシラジン混合物で麻酔し、頭皮を頭骨まで切開し、直径５ｍｍの全層の円形状頭骨欠陥にした。この欠陥は、治癒しない限界サイズの欠陥であり（Ｋｒｅｂｓｂａｃｈ他、１９９８）、硬膜への侵入を最小限に抑えながら、歯科用バーの使用によって頭骨の頂上に作製された。マウスを３つの群に分け、そして、欠陥部とぴったり合うように切られたコラーゲンスポンジ（Ｄｕｒａｇｅｎ）をマトリックスとして使用した。頭皮をナイロン縫合糸の使用によって閉じた。３週間目に、マウスを屠殺し、頭骨試料を軟組織から切除して、４％ホルマリンで固定し、脱灰迅速溶液によって脱灰し、パラフィン包埋した。新しい骨の形成を評価するために、５ミクロン〜７ミクロンの切片を調製し、Ｈ＆Ｅによって染色した。
【００７６】
実験結果
（実施例１）
ｈＭＳＣの単離およびフローサイトメトリー：
ヒト骨髄（ＢＭ）におけるＣＤ１０５＋の細胞集団を特徴づけるために、ヒトＢＭ由来の単核細胞を、ＣＤ１０５抗原および他の造血マーカーの同時発現について分析した。新しく分離されたヒトＢＭ単核細胞のマーカーＦＡＣＳ分析では、ＣＤ１０５が、ＣＤ１０５細胞においてより大きな割合（約４０％、図１Ｃ）で同時発現しているＣＤ４５を除いて、低いレベルで他の造血マーカーと同時発現していることが明らかにされた。しかしながら、より重要なことは、ＣＤ１０５＋の細胞におけるＣＤ１４（単球マーカー）の発現が最小限に抑えられていたことであった。このことは、マクロファージ、すなわち、プラスチックに対して最大の接着性を有する骨髄由来の造血細胞集団は、単離されたＣＤ１０５＋細胞集団を構成していなかったことを示している（図１Ｅ）。
【００７７】
ＣＤ１０５＋の細胞がＣＤ１０５マイクロビーズによってヒトＢＭ単核細胞から単離され、その後、拡大のために置床された。繊維化細胞様細胞のコロニーが、最初に置床した後の７日〜１０日のうちに現れ、これは形態学的に均質な集団であり、これに対して、全ＢＭ単核細胞（ＣＤ１０５マイクロビーズによる分離を伴わない）は、繊維芽細胞様細胞およびマクロファージ様細胞からなる細胞の混合集団であった（図２Ａおよび図２Ｂ）。この方法によって単離された培養拡大後のｈＭＳＣ（３代〜６代の継代培養）のマーカーＦＡＣＳ分析では、ＣＤ１０５、ＣＤ２９およびＣＤ４４について陽性であり、ＣＤ１４およびＣＤ４５について陰性である細胞が明らかにされた（図２Ｃ）。
【００７８】
（実施例２）
インビトロでの骨形成性の分化：
ＣＤ１０５＋細胞のインビトロ骨形成能を明らかにするために、ＣＤ１０５＋の細胞を、拡大（３代〜５代の継代培養）の後、骨形成性系譜の細胞への間葉性幹細胞の分化を誘導する条件（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９）のもとで培養した。アルカリホスファターゼ活性の著しい増大が、３週間の分化期間中、（補充物を伴わない）非誘導のＭＳＣと比較して、（補充物を伴う）誘導されたｈＭＳＣでは明白であった（図３Ａ）。カルシウム沈着（これは５７５ｎｍにおけるＯＤとして表される）の継続した著しい増大が、分化期間中に観測された（１週間、２週間および３週間、図３Ｂ）。
【００７９】
（実施例３）
培養拡大されていないＣＤ１０５＋ｈＭＳＣは軟骨および骨をインビボで形成する：
ＣＤ１０５マクロビーズ分離によって単離された、新しく分離された培養拡大されていないｈＭＳＣを、そのインビボでの骨形成能を明らかにするために、ＣＤ−１ヌードマウスに誘導された頭骨欠陥部に移植した。新しい骨の形成が、処理され、Ｈ＆Ｅで染色された切片で観測され、これに対して、新しく形成された骨の証拠は、ＣＤ１０５−の細胞を含有するコラーゲン挿入体（図４）またはコラーゲン挿入体単独（データは示されず）が移植された同様な傷害のマウスでは観測されなかった。
【００８０】
培養拡大されていないｈＭＳＣのインビボでの骨形成性分化もまた、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの細胞の埋め込みによって明らかにされた。ＤｉＩで標識された培養拡大されていないｈＭＳＣ（１〜１．５×１０６細胞）をｒｈＢＭＰ２と混合し、足場として役立つコラーゲンスポンジ（Ｄｕｒａｇｅｎ）に載せて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮膚の下に移植した。軟骨および骨の形成が、移植後２週間目に、取り出されたインプラントにおいて検出された（図５Ａおよび図５Ｂ）。培養拡大されていないｈＭＳＣが、新しく形成された軟骨および骨の組織において共焦点顕微鏡観察によって確認された。ＤｉＩ標識された軟骨細胞（図５Ｃ）および骨芽細胞（図５Ｄ）がインプラントの内部に検出された。
【００８１】
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【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１Ａ】骨髄由来の単核細胞の免疫表現型を示す。
【図１Ｂ】骨髄由来の単核細胞の免疫表現型を示す。
【図１Ｃ】骨髄由来の単核細胞の免疫表現型を示す。
【図１Ｄ】骨髄由来の単核細胞の免疫表現型を示す。
【図１Ｅ】骨髄由来の単核細胞の免疫表現型を示す。
【図２Ａ】ＣＤ１０５マイクロビーズを用いて得られる拡大されたｈＭＳＣの骨形成性系譜へのインビトロでの分化を示す。
【図２Ｂ】ＣＤ１０５マイクロビーズを用いて得られる拡大されたｈＭＳＣの骨形成性系譜へのインビトロでの分化を示す。
【図２Ｃ】ＣＤ１０５マイクロビーズを用いて得られる拡大されたｈＭＳＣの骨形成性系譜へのインビトロでの分化を示す。
【図３Ａ】培養拡大されたＣＤ１０５＋細胞の形態学分析およびフローサイトメトリー分析を示す。
【図３Ｂ】培養拡大されたＣＤ１０５＋細胞の形態学分析およびフローサイトメトリー分析を示す。
【図４Ａ−Ｆ】新鮮なＢＭ由来ＣＤ１０５＋細胞のインビボ骨形成能を示す。
【図５Ａ】異所性部位に移植された培養されていないｈＭＳＣの生着および分化を示す。
【図５Ｂ−Ｄ】異所性部位に移植された培養されていないｈＭＳＣの生着および分化を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４Ａ−Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−Ｄ】
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【国際調査報告】
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