(57)【要約】アビジンおよびストレプトアビジンの二量体（ジアビジン）が記載され、ここでリンカーはスベレートであり、それはアビジンの様々な官能基（−ＮＨ２または−ＣＯＯＨ）に結合する。アビジンと比較して、ジアビジンは、支持体上のヒトテネイシン、ビオチン化抗テネイシンモノクローナル抗体（Ｍａｂ−Ｂ）、アビジン／ジアビジン、およびビオチン−３Ｈを用いたインビトロプレ標的化試験に用いた場合、標的上の標識化ビオチンの量を上昇させる能力を示す。かかるジアビジンの、三段階プレ標的化放射免疫療法に基づく癌の診断および抗癌治療における使用も記載される。
2005529081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スベレートによって−ＮＨ２基を介して２分子のアビジンが結合しているアビジン二量体。
【請求項２】
分子量３４００のポリエチレングリコールによって−ＣＯＯＨ基を介して２分子のアビジンが結合しているアビジン二量体。
【請求項３】
アビジンがストレプトアビジンである請求項１または２の二量体。
【請求項４】
請求項１−３のいずれかの二量体を含む医薬組成物および／または診断組成物。
【請求項５】
非経口投与または局所投与されうる請求項４の組成物。
【請求項６】
請求項１−３のいずれかの二量体の医薬および診断手段の調製のための使用。
【請求項７】
請求項１−３のいずれかの二量体の病的状態の器官または組織の診断または治療に有用な医薬の調製のための使用。
【請求項８】
請求項１−３のいずれかの二量体の腫瘍の治療または診断に有用な医薬または診断手段の調製のための使用。
【請求項９】
請求項１−３のいずれかの二量体のインビトロでの抗体を用いたプレ標的化方法における使用。
【請求項１０】
請求項１−３のいずれかの二量体の抗体を用いるプレ標的化方法を使用する疾患の治療に有用な医薬の調製のための使用。
【請求項１１】
該疾患が腫瘍である請求項１０の使用。
【請求項１２】
該抗体が抗テネイシン抗体である請求項１０の使用。
【請求項１３】
該抗テネイシン抗体がモノクローナル抗体である請求項１２の使用。
【請求項１４】
該医薬が三段階プレ標的化技術による腫瘍の診断および治療に有用なキットの一部である請求項１０の使用。
【請求項１５】
該キットが放射性医薬品を含む請求項１４の使用。
【請求項１６】
キットの少なくとも１つの成分が請求項１または請求項２の二量体を含むことを特徴とする腫瘍の放射線治療または診断用キット。
【請求項１７】
プレ標的化技術に用いる請求項１６のキット。
【請求項１８】
該プレ標的化技術が三段階プレ標的化技術である請求項１７のキット。
【請求項１９】
ビオチン化抗テネイシン抗体を含む請求項１６、１７または１８のいずれかのキット。
【請求項２０】
該抗体がモノクローナル抗体である請求項１９のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載する本発明は、腫瘍の診断および治療、特にいわゆる三段階プレ標的化(pretargeting)方法において有用なアビジン誘導体に関する。
【０００２】
本明細書に記載する本発明は、ヒトおよび動物の診断および治療における使用、特に、腫瘍などの病的状態の診断および治療に有用な改変アビジンに関する。
【０００３】
本明細書に記載する本発明は、医薬および診断手段の調製の技術分野に関し、医薬分野での工業用途に好適な化合物、その調製方法、その使用方法およびそれを含む組成物を提供する。
【０００４】
本明細書に記載する本発明は、診断薬および治療薬において、画像取得技術として、そして病的状態の器官および組織の治療に有用な化合物、組成物および方法を提供する。
【０００５】
特に、これに限定されるわけではないが、本発明は放射性医薬品による腫瘍治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００６】
腫瘍治療は主に腫瘍細胞を殺傷するための物質を使用することによって行われている。これは細胞毒性物質を用いることにより達成されるが、細胞毒性物質はその効果を完全に発揮するには腫瘍細胞に侵入する必要がある。あるいは細胞を殺傷するに十分なエネルギーを有する放射による腫瘍細胞の治療によっても達成される。両方の場合において、周囲の健康な細胞に損傷を与えることを避けるために標的細胞にできるだけ選択的に物質を送達しなければならないという問題がある。放射性医薬品、即ち放射性部分を有する物質を用いる場合、活性部分（即ち、放射性部分）を、放射性核種が体内または腫瘍周囲の健康な細胞に拡散しないように選択的に腫瘍標的に送達しなければならないという問題が特に指摘される。
【０００７】
腫瘍の検出および治療の１つの特に有効な方法が欧州特許第０４９６０７４号に記載されている。この特許のプロトコールは脳腫瘍のいわゆるプレ標的化抗体ガイド（Guided)放射免疫療法(PAGRIT）に適用されている。この方法において、ビオチン化抗テネイシンモノクローナル抗体（Ｍａｂ−Ｂ）の後にアビジンがヒト対象に注射され、腫瘍に結合していない遊離のＭａｂ−Ｂと複合体を形成することによって遊離のＭａｂ−Ｂが血流から除去され、かかる複合体は肝臓により効率的に除去される（除去効果）。ストレプトアビジンの注入はアビジンと比べて良好な腫瘍のアビジン化を達成するために行われる。アビジンの血中耐久性はストレプトアビジンと比べて非常に短い。
【０００８】
該システムは陽性の臨床応答を示したが(Cremonesi、M. et al.、1999; Paganelli、G. et al.、1999; Paganelli、G. et al.、2001)、１つの主な限定要因はストレプトアビジンによる強い免疫応答にある(Paganelli、G. et al.、1997)。かかる２つの障害、即ちストレプトアビジンの高い免疫原性およびアビジンの迅速なクリアランスを克服するために、アビジンにポリオキシエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を共有結合させることによって化学的に改変されたアビジンが用いられてきた。その誘導体化のレベルは様々な分子量の直鎖状または分枝状のＰＥＧの使用によって変動する。予備的研究により、ＰＥＧによるアビジンの機能化（以下ＰＥＧ化と称する）の程度が上昇するにつれ、アビジンの血漿半減期が長くなり、免疫原性が低減され、腫瘍に関する物質の特異的体内分布が向上することが示された。
【０００９】
アビジン−ＰＥＧのＭａｂ−Ｂビオチンへの結合能はＰＥＧ化によって低下する結果、誘導体の強度が低減してしまうことになる(Chinol、M. et al.、1998)。
【００１０】
この問題に対する解決が国際特許出願第ＷＯ９４／２３７５９号（出願人Immunomedics）によって提案されており、好ましくは５，０００Ｄａ以上の高分子量分子（デキストラン、タンパク質およびポリカルボン酸など）の化学的誘導体化に基づくアビジンマルチポリマーが記載されている。しかし、５つの多量体のいずれについてもその特許においてはプレ標的化またはその他の方法における作用強度の点に関しては十分に特徴づけられていない。
【００１１】
本明細書に記載する本発明で示されているように、上記国際特許出願第ＷＯ９４／２３７５９９号により提供される多量体化（二量体化も含む）の一般概念では、三段階プレ標的化方法の適用において必要な要求を満たすことができる一般的なアビジン多量体を当業者が見いだすに完全かつ十分な教示がなされていない。実際、種々の二官能性クロスリンカーを用いて得られる種々のジアビジンは、遊離のビオチンに対する結合能力は同様に有しているものの、三段階プレ標的化にてインビトロでアッセイした場合のその能力が、場合によっては完全に無効であることが判明している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記観察により、アビジンの多量体化によっては自動的に有用な機能的産物を得ることはできず、プレ標的化に好適な能力の高い分子の選択のために生物学的特徴付けが必要であることが示された。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の概要）
このたび、アビジンのアミノおよび／またはカルボキシ基と結合することができる二官能性リンカーによって２分子のアビジンを結合させることにより、ＰＡＧＲＩＴとして知られる腫瘍治療方法での使用の要求を満たす２種類のアビジン二量体が得られることを見いだした。かかるリンカーはジスクシニミジルスベレート(suberate)（これにより得られる二量体を以下ジアビジン１と称する）および分子量３４００のＰＥＧジアミン（これにより得られる二量体を以下ジアビジン２と称する）から選択される。
【００１４】
したがって、本明細書に記載する本発明の目的は、２分子のアビジンがスベレートによって−ＮＨ２基を介して結合しているアビジン二量体および２分子のアビジンが分子量３４００のポリエチレングリコールによって−ＣＯＯＨ基を介して結合しているアビジン二量体である。
【００１５】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は上記ジアビジンを含む医薬組成物および／または診断組成物である。
【００１６】
本発明の別の目的は、病的状態の器官および組織のための医薬または診断薬として、特に腫瘍の治療または診断に有用な医薬の調製のためのジアビジンの使用である。
【００１７】
これらおよびその他の本発明の目的は実施例によって以下により詳細に説明される。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明においては、アビジンとはアビジンおよびストレプトアビジンの両方を意味するが、本発明の特定の態様としてストレプトアビジンを用いる場合は、そのことを特に言及する。
【００１９】
ジアビジン１はアビジンと活性エステルとしてＮ−ヒドロキシスクシニミジル（ＮＨＳエステル）を有するジスクシニミジルスベレート（ＤＳＳ）を反応させることにより調製した。ＤＤＳは、アビジンの−ＮＨ２基との結合において反応性のホモ二官能性クロスリンカーである。
【００２０】
ジアビジン２およびジアビジン３（陰性対照）をそれぞれホモ二官能性クロスリンカーとして分子量３４００のＰＥＧジアミン（ＰＥＧ（ＮＨ２）２）および分子量３４００のポリエチレングリコール−ジスクシニミジルプロピオン酸［ＰＥＧ（ＳＰＡ）２］を用いて作成した。
【００２１】
アビジンと比べてストレプトアビジンは循環系からゆっくりと除かれるため、ジストレプトアビジンが本発明の特に好ましい態様である。半減期がより長いということは、アビジンの効力を最大限に増加させるのに重要である。ストレプトアビジンのクロスリンキングのプロトコールはジアビジン１産生に用いたものと同様であった。
【００２２】
本明細書に記載する本発明による医薬組成物または診断組成物は、本明細書に記載するジアビジンの少なくとも１つを含む。ジアビジンは好適な媒体および／または賦形剤との混合物とされよう。媒体および／または賦形剤は薬学で通常用いられているものであり、例えば”Remington’s Pharmaceutical Sciences Handbook”最新版に記載されているものが挙げられる。本発明による組成物は有効量のジアビジンを含むものである。
【００２３】
医薬組成物の好適な例は、非経口および局所投与可能なものである。この目的に好適な医薬組成物は、溶液、懸濁液、または使用時に再構成される凍結乾燥された形態のものである。
【００２４】
本発明によるジアビジンの使用は、抗体によるプレ標的化として知られる技術による、病的状態の組織（例えば腫瘍）の診断または治療のための医薬または診断手段の調製として特に好適であり、インビトロプレ標的化技術にも好適である。例示的な１つの態様において、プレ標的化技術はビオチン化抗テネイシン抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて行われる。
【００２５】
本発明の工業用途に好適な形態は、診断または治療用、特に腫瘍の放射線治療用のキットである。かかるキットは例えば、欧州特許第０４９６０７４号、Paganelli、Chinol et al.の研究（ European Journal of Nuclear Medicament Vol. 26、No 4; April 1999; 348-357）、米国特許第５９６８４０５号および関連する文献に記載されている。
【００２６】
本明細書に記載する本発明のさらなる目的は、特に、例えば、プレ標的化方法、好ましくは三段階プレ標的化方法などの、放射能による腫瘍の治療または診断用キットであり、該キットの少なくとも１つの成分がジアビジンを含むことを特徴とする。該キットにおいて、１つの好適なビオチン化抗体は抗テネイシン抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２７】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００２８】
ジアビジン１
１ｍｌのアビジン溶液（ＰＢＳ中３００μＭ、ｐＨ７．４）を、２５μｌのＤＳＳ(Pierce)（ＤＭＳＯ中２５ｍＭ）と混合した（アビジン：ＤＳＳ比：１：２）。混合物を０℃で２時間インキュベートした後、反応を５０μｌのＴｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ８．０）でブロックした。上記反応比の選択は１：１から１：１０の比を用いた予備的試験に基づいて行った。
【００２９】
反応スキームは以下の通りである：
【化１】
2005529081.tif 000003
【実施例２】
【００３０】
ジアビジン２
１ｍｌのアビジン（ＰＢＳ中４５０μＭ、ｐＨ７．４）を、１２０μｌのＰＥＧ（ＮＨ２）２(Shearwater Corp.)（Ｈ２Ｏ中９ｍＭ）および５０μｌの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド−ＨＣｌ（ＥＤＡＣ）（ＤＭＳＯ中２６０ｍＭ）（アビジン：ＰＥＧ比：およそ１：２．５）と混合し、２時間室温で反応させた。この期間の最後に５０μｌのＴｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加し、混合物をゲルろ過にかけた。反応ｐＨ４．０から８．０で１：１から１：１０の範囲でアビジン：ＰＥＧ比について調べた。Sims et al.、1980に記載の方法を用いて精製したジアビジン２最終産物のＰＥＧ：アビジン比の値は０．９であった。簡単に説明すると、ジアビジン２を水中３００μＭに希釈し、２５０μｌのＨＣｌ（１Ｎ）中５％のＢａＣｌ２を１ｍｌの容積に添加し、２５０μｌの溶液を１．２７ｇのＩ２を１００ｍｌのＫＩ２％に混合することによって調製した。混合物を１５分間インキュベートし、吸光度を５３５ｎｍにて測定した。検量線をＰＥＧ（ＮＨ２）２について得た。
【００３１】
ジアビジン２の反応スキームは以下の通りである：
【化２】
2005529081.tif 000004
【実施例３】
【００３２】
ジアビジン３
１ｍｌのアビジン（ＰＢＳ中１５０μＭ、ｐＨ７．４）を、２０μｌのＰＥＧジスクシニミジル−プロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ−ＳＰＡ）（Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）（アビジン：ＰＥＧ比：１：３．５）と混合し、０℃で２時間反応させた。この反応比は１：２から１：１０の範囲の比について行った予備的試験に基づいて選択した。精製した二量体のＰＥＧ：アビジン比の値は上記のSims et al.によって開発された方法を用いて測定したところ、３：１であった。
【００３３】
反応スキームは以下の通りである:
【化３】
2005529081.tif 000005
【００３４】
実施例１、２および３に記載の３つの反応によって得られたジアビジンの収率はおよそ２０−３０％であった。反応において３種のリンカーの量を増加させると、アビジンオリゴマーの最終収量も高くなり（三量体など、示さず）、その結果クロマトグラフィーによる分離が困難となった。反応混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００−１０／３０ゲルろ過カラムで分析し、生成物の精製はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００−１６／６０カラムにて行った。ジアビジン１、２および３の反応混合物のクロマトグラフィープロフィールをそれぞれ図１ａ、ｂおよびｃに示す。一連の標準タンパク質の分子量（較正）をそれぞれの溶出時間において示す。カラムの較正は図１ｄに示す：デキストランブルー（Ｖｏ）、フェリチン（４４４ＫＤａ）、アルドラーゼ（１５８ＫＤａ）、アルブミン（６７ＫＤａ）、およびリボヌクレアーゼ（１４ＫＤａ）を用いた。
【００３５】
精製したアビジン二量体を図１ｅ、ｆおよびｇに示す。サンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００−１０／１５でＰＢＳ中で流速０．５ｍｌ／分（ａ−ｄ）および１ｍｌ／分（ｅ−ｇ）にてＪａｓｃｏＨＰＬＣシステム（２８０ｎｍ分光光度計に連結）を用いて分離した。
【実施例４】
【００３６】
ジストレプトアビジン
１ｍｌのストレプトアビジン（ＰＢＳ中３００μＭ、ｐｈ７．４）を２５μＬのＤＳＳ（ＤＭＳＯ中２５ｍＭ）と、ストレプトアビジン：ＤＳＳ比１：２で混合し、０℃で２時間インキュベートした後、反応を５０μＬのＴＲＩＳ（１Ｍ、ｐＨ８．０）でクエンチした。全部で４つの反応条件についてストレプトアビジン：ＤＳＳの範囲１：１から１：１０の比にて試験した。本発明者らは上記の比、１：２を選択した。
【００３７】
反応スキームは上述の実施例に記載したものと同様とした。
【００３８】
反応の最後のクロスリンキング混合物のジストレプトアビジンについてのクロマトグラフィープロフィールを図５ａに示す。精製したジストレプトアビジンを図５ｂに、ストレプトアビジンを５ｃに示す。サンプルはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００−１０／１５カラムでＰＢＳ中流速１ｍｌ／分でＪａｓｃｏＨＰＬＣシステム（２８０ｎｍの吸光度を測定する分光光度計に連結）で分析した。
【００３９】
ジアビジンのビオチンへの結合能力の測定
アビジンとジアビジンのビオチンに結合する能力を比較するため、ＨＡＢＡ（４−ヒドロキシ−アゾベンゼン−２’−カルボン酸）法を用いた。アビジンおよびジアビジンはすべて０．１Ｍホスフェート、０．４ｍＭＨＡＢＡ、ｐＨ７．０中３μＭの６７ＫＤａアビジン単量体に対応する濃度とした。次ぎにホスフェートに溶解したビオチンを終濃度０から２０μＭの範囲で添加し、吸光度を５００ｎｍにて測定した。
【００４０】
ビオチンへの結合能力は、結合しているＨＡＢＡの５０％を置換するのに必要なビオチン濃度として評価した。
【００４１】
およそ５μＭのビオチンにより、アビジンおよび３種のジアビジンについて５０％のＨＡＢＡを置換することができた（図２）。このことから、ジアビジンはクロスリンキング後も結合部位の総数を維持していることが推測される。ジアビジンのビオチン結合特性はアビジンと匹敵するものであった。
【００４２】
インビトロプレ標的化アッセイ
ビオチン化抗テネイシンモノクローナル抗体（Ｍａｂ−Ｂ）を介するテネイシンに対する放射標識化ビオチンの結合量を増加させるジアビジンの能力を調べるため、図３に模式的に示すインビトロプレ標的化アッセイを用いた。
【００４３】
簡単に説明すると、９６−ウェルプレートに０．５μｇ／ウェルのヒトテネイシン（Ｔｎ−Ｃ）を４℃で１６時間吸着させた。ＰＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０での３回の洗浄後、ウェルに残っている吸着部位をＰＢＳ２％、ＢＳＡ２％および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１時間室温でブロッキングした。２種類のビオチン化抗テネイシンモノクローナル抗体（ＳＴ２１４６またはＳＴ２０７７）をウェル中で２時間、飽和濃度である１０μｇ／ｍｌにてインキュベートした。上記のように洗浄した後、アビジンまたはジアビジンをウェル中で二連で様々な濃度にてインキュベートした。最後に、飽和量の５ｐｍｏｌのビオチン−３Ｈ（１．６ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）を各ウェル中で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートの読みをβ−カウンターで得た。図４に示すように、使用した２種類のＭＡｂについて、ジアビジン１およびジアビジン２ではアビジンと比べて結合したビオチン量が多かった；ジアビジン３はＭＡｂＳＴ２１４６については増加を示さず、ＭＡｂＳＴ２０７７との結合能力については減少を示した。
【００４４】
アビジンと比較して、濃度２．５μｇ／ｍｌのジアビジン２はＭａｂＳＴ２０７７を介してのビオチン−３Ｈ結合量が２．１倍増加していた（３回の実験の平均）。ジアビジン１については増加は１．６倍であった（６回の実験の平均）。一方、ジアビジン３についてはアビジン単量体と比較して結合能力は低かった（９０％）。
【００４５】
これらの実験から、リンカーの長さとジアビジン二量体に含まれる結合部位の両方が、ビオチン化抗体を介するプレ標的化における二量体の活性に影響を及ぼすことが結論される。
【００４６】
ジストレプトアビジンは図６に示すように、インビトロでストレプトアビジンより強力であることが判明した。
【００４７】
マイクロタイター９６ウェルプレートを０．５μｇ／ウェルのヒトＴｎＣで４℃で１６時間被覆し、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０によって非特異的結合をブロッキングした。ビオチン化抗−ＴｎＣ抗体ＳＴ２１４６を濃度１０μｇ／ｍｌにて２時間添加した。ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、その後ストレプトアビジンまたはジストレプトアビジンを示された濃度にて添加した。最後に、５ｐｍｏｌの３Ｈ−ビオチン（１．６ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）を添加し、ウェルを２時間インキュベートし、洗浄してβ−カウンターでカウントした。
【００４８】
図６に示すように、ジストレプトアビジンはストレプトアビジンと比較して放射標識化ビオチンの結合を上昇させる。
【００４９】
（参考文献）
Chinol M., Casalini P., Maggiolo M., Canevari S., Omodeo E.S., Caliceti P., Veronese F.M., Cremonesi M., Chiolerio F., Nardone E., Siccardi A.G., Paganelli G. Biochemical modifications of avidin improve pharmacokinetics and biodistribution, and reduce immunogenicity. British Journal of Cancer 78(2): 189-197, 1998.
Cremonesi M., Ferrari M., Chinol M., Stabin M. G., Grana C., Prisco G., Robertson C., Tosi G., Paganelli G. Three-step radioimmunotherapy with yttrium-90 biotin: dosimetry and pharmacokinetics in cancer patients. Eur J Nucl Med 26(2):110-120, 1999.
Paganelli G., Chinol M., Maggiolo M., Sidoli A., Corti A., Baroni S., Siccardi AG. The three-step pretargeting approach reduces the human anti-mouse antibody response in patients submitted to radioimmunoscintigraphy and radioimmunotherapy. Eur J Nucl Med 24:350-351, 1997.
Paganelli G., Grana C., Chinol M., Cremonesi M., De Cicco C., De Braud F., Robertson C., Zurrida S., Casadio C., Zoboli S., Siccardi A. G., Veronesi U. Antibody-guided three step therapy for high grade glioma with yttrium-90 biotin. Eur J Nucl Med 26(4):348-357, 1999.
Paganelli G., Bartolomei M., Ferrari M., Cremonesi M., Broggi G., Maira G., Sturiale C., Grana C., Prisco G., Gatti M., Caliceti P., Chinol M. Pre-targeted locoregional radioimmunotherapy with 90Y-biotin in glioma patients: Phase I study and preliminary therapeutic results. Cancer Biother & Radiopharm 16(3):227-235, 2001.
Sims G.E.S. and Snape T.J. A method for estimation of polyethylene glycol in plasma protein fractions. Anal Biochem 107:60-63, 1980.
【図面の簡単な説明】
【００５０】
（原文に記載無し）
【図１】
2005529081.tif 000006
【図２】
2005529081.tif 000007
【図３】
2005529081.tif 000008
【図４】
2005529081.tif 000009
【図５】
2005529081.tif 000010
【図６】
2005529081.tif 000011
【国際調査報告】
2005529081.tif 000012
2005529081.tif 000013
2005529081.tif 000014
2005529081.tif 000015