(57)【要約】本発明は、生物学、遺伝学及び医学の領域に関する。特に、本発明は、前立腺癌のような癌病理の検出、特徴決定及び／又は処置の新規方法に関する。本発明は、該病理において活性な化合物の同定及びスクリーニングの方法にも関する。さらに、本発明は、前記方法を実施するために使用される化合物、遺伝子、細胞、プラスミド又は組成物に関する。より具体的には、本発明は、前述の病理における、ヒトカリクレイン２及びヒトカリクレイン３のバリアントの役割、並びに治療、診断又は実験の標的としてのそれらの使用を概説する。
2005519606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：１〜４９の配列、
ｂ）遺伝暗号の縮重に起因する配列番号：１〜４９の配列のバリアント、
ｃ）配列番号：１〜４９の配列の相補鎖、及び
ｄ）配列ａ）〜ｃ）の特定の断片：
の中から選択された配列を含む核酸。
【請求項２】
好ましくはｃＤＮＡ及びｇＤＮＡより選択されるＤＮＡ、又はＲＮＡである、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
好ましくは配列番号：５０〜１６７より選択された配列の全部又は特定の一部を含むポリペプチドより選択される、請求項１〜２のいずれか１項記載の核酸によりコードされたポリペプチド。
【請求項４】
それぞれ配列番号：５０〜１６７の配列のバリアントＫＬＫ２−ＥＨＴ００２〜ＫＬＫ２−ＥＨＴ０１１及びＰＳＡ−ＥＨＴ００１〜ＰＳＡ−ＥＨＴ０２７又はＫＬＫ２−ＥＨＴｂ〜ＫＬＫ２−ＥＨＴｌ及びＰＳＡ−ＥＨＴａ〜ＰＳＡ−ＥＨＴｕより選択されたタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜２のいずれか１項記載の核酸の選択的ハイブリダイゼーションによる検出を可能にする核酸プローブ。
【請求項６】
プローブが、請求項１〜２のいずれか１項記載の核酸の配列を含む、請求項５記載のプローブ。
【請求項７】
２０〜１０００ヌクレオチド、好ましくは５０〜８００ヌクレオチドを含む、請求項６記載のプローブ。
【請求項８】
プライマーが、請求項１〜２のいずれか１項記載の核酸の選択的増幅を可能にするプライマー。
【請求項９】
３〜５０塩基、好ましくは３〜４０塩基、より好ましくは３〜３５塩基から構成されている、請求項８記載のプライマー。
【請求項１０】
癌に関与している突然変異を含有している、ＰＳＡの特異抗原をコードする遺伝子又はＫＬＫ２をコードする遺伝子の少なくとも１つの領域に相補的である、請求項８又は９のいずれか１項記載のプライマー。
【請求項１１】
配列番号：１〜４９の配列又はそれらの相補鎖のうちの１つの少なくとも一部に相補的な、３〜５０ヌクレオチドを含む一本鎖核酸から構成されている、請求項１０記載のプライマー。
【請求項１２】
センス配列及び逆方向配列を含むプライマー対であって、該対のプライマーが、請求項１〜２のいずれか１項記載の核酸のある領域にハイブリダイズし、該核酸の少なくとも一部の増幅を可能にするものである、プライマー対。
【請求項１３】
請求項３又は４のいずれか１項タンパク質又はポリペプチドに特異的である抗体。
【請求項１４】
ポリクローナル、モノクローナル又はそれらの誘導体である、請求項１４記載の抗体。
【請求項１５】
対象における疾患又は疾患の素因を検出するための方法であって、請求項１〜２のいずれか１項記載の核酸又は請求項３もしくは４に記載のタンパク質もしくはポリペプチドの、該対象からの試料における存在を決定することを含む、方法。
【請求項１６】
決定が、配列決定、選択的ハイブリダイゼーション及び／又は増幅により達成される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
増幅が、請求項１２のプライマー対を使用することにより達成される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
−  請求項１２記載のプライマー対又は請求項５〜７のいずれか１項記載のプローブ又は請求項１３及び１４のいずれか１項記載の抗体、並びに
−  増幅、ハイブリダイゼーション又は免疫学的反応に必要な試薬、
を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の方法を実施するために使用され得るキット。
【請求項１９】
活性化合物を選択又は同定するための方法であって、請求項３記載のポリペプチドを発現している細胞とテスト化合物をインビトロ又はエキソビボ接触させること、及び該ポリペプチドの発現又は活性を調整する化合物を選択又は同定すること、を含む方法。
【請求項２０】
ポリペプチドと結合する化合物を選択することを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドの発現を調整する化合物を選択することを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
請求項１又は２記載の核酸を含有しているベクター。
【請求項２３】
請求項２２記載のベクターを含有している組換え細胞。
【請求項２４】
マトリックス上に固定化された、請求項１、２、５、６及び７のいずれか１項記載の核酸、請求項２２記載のベクター、請求項３もしくは４記載のポリペプチド又は請求項１３もしくは１４記載の抗体を含む生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、遺伝学及び医学の領域に属する。特に、本発明は、ＰＳＡ抗原（前立腺特異抗原又はＫＬＫ３）及びカリクレイン−２（ＫＬＫ２）に対応する遺伝子のオルタナティブスプライシング事象に関連した新たなヌクレオチド配列に関するものである。本発明は、生物学的試料におけるこれらの核酸又は対応するタンパク質の存在を検出するための、又はそれらの発現のレベルを決定するための方法、及びそれらの活性又は発現を調整することができる分子を選択するための方法にも関する。
【０００２】
本発明は、癌、特に前立腺癌のスクリーニング、診断、分類又はモニタリング、特に前立腺癌と良性肥大症（ＢＰＨ）の差別、及びこれらの疾患の新たな治療アプローチの開発に特に適している。
【０００３】
カリクレインとは、ウイルス前駆タンパク質の生物学的活性型への翻訳後修飾を可能にする活性を有するタンパク質群に相当する。このファミリーのある種のメンバー、即ちＰＳＡ（「前立腺特異抗原」）という名称でも既知のカリクレイン３、そしてより最近ではカリクレイン２が、前立腺癌の検出、診断及びモニタリングのため利用可能な最良のマーカーと見なされている。血中のＰＳＡ量を測定するテストの使用は、増加しつつある前立腺癌（Ｐｃａ）を有する患者の診断を行う可能性を提供する。しかしながら、ＰＳＡは非癌性の前立腺上皮細胞によっても産生されており、前立腺癌を有する患者を、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）の症状を有する患者から識別することは、しばしば困難である。血清において、ＰＳＡは、遊離の非複合体化形態、及びとりわけアルファ−アンチキモトリプシンとの複合体化形態で存在する。これらの異なる形態の測定及びそれらの比率は、ＰＣａ及びＢＰＨの鑑別診断において有益である。
【０００４】
オルタナティブスプライシングは、限定された遺伝情報から機能的多様性が生成することを可能にする、遺伝子の発現を制御するための機序である。この高度に制御された機序は、ヒト疾患の発達の際、改変され得る。従って、癌におけるスプライシング機構の脱制御は、ある種のヒト腫瘍において特異的に発現されるアイソフォーム又はバリアントの発現をもたらす場合がある。これらのアイソフォームは、疾患状態の発達又は維持において決定的な機能的役割を有するかもしれない。そのようなアイソフォームの特異的発現は、医用生成物及び／又は診断法の開発のための合理的な指向的なアプローチのための優れた事象を構成する。最近、オルタナティブスプライシングによる改変に対して感受性の遺伝子及びこれらの遺伝子内のドメインを系統的に同定するための、遺伝子発現のプロファイリングのための技術（ＤＡＴＡＳ）が開発された（ＷＯ９９／４６４０３）。
【０００５】
本発明は、ここで、前立腺組織におけるＰＳＡ遺伝子及びＫＬＫ２遺伝子のオルタナティブスプライシングに関連した新たな遺伝学的事象を記載する。本発明は、とりわけ、腫瘍性前立腺組織に関連したスプライシング改変のレパートリーの構築、並びにＰＳＡ遺伝子及びＫＬＫ２遺伝子又は対応するｍＲＮＡの構造的改変の同定に基づく。従って、本発明は、癌、特に前立腺癌の新たな治療的及び診断的アプローチを提供する。
【０００６】
より具体的には、前立腺の癌を有する患者の腫瘍又は非腫瘍エリアからの前立腺組織の試料から抽出されたＲＮＡを使用して、定性的差次的分析が実施された。この分析は、無類の利点を示す（出願ＷＯ９９／４６４０３に記載された）ＤＡＴＡＳ技術の実行のおかげで、定性的差次的スクリーニングを使用して実施された。腫瘍性及び非腫瘍性の前立腺組織からのＲＮＡ分子に対するＤＡＴＡＳ技術の適用は、ヒトカリクレイン２及びカリクレイン３（ＰＳＡ）のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの様々な断片の単離をもたらした。次いで、これらの結果は、オルタナティブスプライシングに関連した事象を明らかにする多数のｃＤＮＡを同定する可能性を提供した。
【０００７】
従って、本発明は、前立腺組織における、より具体的には癌性組織又は良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）に関連した組織における、ＫＬＫ３（ＰＳＡ）及びＫＬＫ２のアイソフォーム又はバリアントの特異的発現を起こさせることができる、いくつかの最初の分子的事象を記載する。本発明は、これらのバリアントのうちの１個又は数個の、新規の治療的及び診断的標的としての使用を正当化する、そして癌、特に前立腺癌の診断及び処置において有利に使用され得る、分子的データを提供する。
【０００８】
本発明の第一の面は、ヒトＰＳＡ及びＫＬＫ２のバリアント、特にスプライシングバリアントに関する。本発明は、これらのバリアントに対応する核酸、又はそれらが示す特異的改変に関し、コードされたタンパク質（又はポリペプチド又はタンパク質ドメイン）にも関する。
【０００９】
本願のもう１つの面は、これらのバリアントもしくは改変の生物学的試料（血液、血漿、尿、血清、唾液、生検材料又は細胞培養物等）における存在を検出するための、又はそれらのそれぞれの量もしくは割合を決定するための方法又は道具に関する。そのような道具は、特に、核酸プローブ又はプライマー、抗体又はその他の特異的リガンド、キット、デバイス、チップ等を含む。検出法は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、クロマトグラフィー及び免疫学的方法等を含み得る。これらの方法は、疾患の進行、もしくは癌、特に前立腺癌のための処置の効力の検出、特徴決定及びモニタリング、又はそのような疾患の素因の決定に、特に適している。
【００１０】
本願のもう１つの面は、記載されたバリアントに対して活性な、即ちそれらの発現又は活性を調整することができる化合物を作製するための道具及び方法に関する。これらの道具及び方法は、特に、核酸、ベクター、組換え細胞（又は、そのような細胞に由来する調製物）、結合アッセイ等を含む。本発明は、そのようにして同定又は作製された化合物、それらを含有している医薬組成物、及びそれらの治療的使用も含むものとする。
【００１１】
従って、本発明は、癌、特に前立腺癌の診断、及びそれらの治療戦略の開発に適用可能である。
【００１２】
ＫＬＫ２及びＫＬＫ３のバリアント
従って、本願の第一の面は、ＫＬＫ２及びＫＬＫ３（ＰＳＡ）のバリアント、又はこれらの遺伝子（又は対応するＲＮＡもしくはタンパク質）に影響を与える特定の遺伝学的改変に関係する。本発明のさらなる特定の目的は、これらのＰＳＡ及びＫＬＫ２のバリアントに対応する核酸、又はそれらが示す特異的改変に関し、コードされたタンパク質（又はポリペプチドもしくはタンパク質ドメイン）にも関する。
【００１３】
ＫＬＫ２遺伝子及びＫＬＫ３遺伝子の多数のアイソフォームが、先行技術において記載されている。
【００１４】
Ｋ−ＬＭは、ＫＬＫ２のイントロン１の完全な保持に対応する（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＦ３３６１０６）（Ｄａｖｉｄら（２００２））。デイヴィッド（Ｄａｖｉｄ）らは、Ｋ−ＬＭメッセンジャーＲＮＡの発現が、前立腺上皮に限定されていること、及びＫ−ＬＭタンパク質が、免疫組織化学によって分泌上皮細胞中に検出され得ることを指摘している（使用された抗体の特異性を示すデータはないにも関わらず）。Ｋ−ＬＭがヒト血清中に存在するか否かを示すデータは存在しない。Ｋ−ＬＭは、良性前立腺肥大症に対応する２つの精液試料及び組織試料において検出されるようである。内因性型のＫ−ＬＭは、前立腺細胞系に検出され得ない（アンドロゲン刺激がある場合でも、又はない場合でも）。前立腺癌を有する患者からの組織又は血清におけるＫ−ＬＭの優先的又は差次的な発現に関する結果は示されていない。
【００１５】
７８３塩基対ではなく６６９塩基対のオープンリーディングフレームに対応する、エキソン４とエキソン５との間のオルタナティブ部位を使用するＫＬＫ２バリアントが記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｓ３９３２９）（Ｒｉｅｇｍａｎら（１９９１））。
【００１６】
より長い３’ＵＴＲ領域を有する３つのバリアントが記載されている（Ｌｉｕら（１９９９））（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＦ１８８７４５−７９）。これらのバリアントのうちの１つは、野生型ＫＬＫ２と等しいオープンリーディングフレームを有し；第二のバリアントは以前に記載されたバリアント（Ｒｉｅｇｍａｎら（１９９１））のそれに対応するオープンリーディングフレームを有するであろう。これらのバリアントのうちの１つは、エキソン３とエキソン４との間に１３ヌクレオチド欠失を有し、従って、カルボキシ末端部分が９７アミノ酸短縮されたタンパク質をコードする。著者らは、ＲＴ−ＰＣＲを使用したいくつかの発現データを提示しているが、対応する１個以上のタンパク質に関する結果は示していない。
【００１７】
ＰＳＡ−ＬＭは、ＰＳＡイントロン１の完全な保持に対応する（Ｄａｖｉｄら（２００２））（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＦ３３５４７７、ＡＦ３３５４７８、ＡＪ４５９７８４）。Ｄａｖｉｄらは、ＰＳＡ−ＬＭメッセンジャーＲＮＡの発現が、前立腺上皮に限定されていること、及びＰＳＡ−ＬＭタンパク質が、免疫組織化学によって分泌上皮細胞中に検出され得ることを指摘している。良性前立腺肥大症に対応するヒト血清、精液又は組織におけるＰＳＡ−ＬＭの存在を示すデータは存在しない。内因性型のＰＳＡ−ＬＭは、前立腺細胞系に検出され得ない（アンドロゲン刺激がある場合でも、又はない場合でも）。前立腺癌を有する患者からの組織又は血清におけるＰＳＡ−ＬＭの優先的又は差次的な発現に関係している結果は存在しない。
【００１８】
エキソン３に１２９ヌクレオチド欠失を有するＰＳＡバリアントが記載されている（Ｔａｎａｋａら（２０００））。それは、ＰＳＡ−ＲＰ３（Ｈｅｕｚａｅ−Ｖｏｕｒｃ’ｈら（２００３））としても既知である。タナカ（Ｔａｎａｋａ）らは、悪性及び良性の前立腺組織における、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、このバリアントに関する定性的発現データを示している。対応するタンパク質の発現は特徴決定されていない。
【００１９】
イントロン３の完全な保持（ＰＡ４２４）及びイントロン４の最後の４４２ヌクレオチドの部分的保持（ＰＡ５２５）に対応する２つのＰＳＡバリアントが記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｍ２１８９６、Ｍ２１８９７）（Ｒｉｅｇｍａｎら（１９８８））。ＰＡ４２４は、１５６アミノ酸長の成熟タンパク質を生じ得る。最後の１６アミノ酸は、野生型ＰＳＡと異なるであろう。ＰＡ５２５は、２１４アミノ酸の成熟タンパク質を与えるであろう。最後の２８アミノ酸は、野生型ＰＳＡと異なるであろう。Ｒｉｅｇｍａｎらは、メッセンジャーＲＮＡ又はタンパク質の差次的発現に関する付加的なデータを提示していない。
【００２０】
下記のＰＡ４２４及びＰＡ５２５は、引き続いて単離されたＰＳＡ−ＲＰ１及びＰＳＡ−ＲＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＪ３１０９３７、ＡＪ３１０９３８）（Ｈｅｕｚａｅら（１９９９）；Ｈｅｕｚａｅ−Ｖｏｕｒｃ’ｈら（２００１））と極めて類似している。ＰＳＡ−ＲＰ１及びＰＳＡ−ＲＰ２のｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞系は、対応するタンパク質を発現し分泌し得るが、Ｈｅｕｚａｅらは、前立腺組織における内因性のＰＳＡ−ＲＰ１及びＰＳＡ−ＲＰ２タンパク質の発現を証明する結果を示していない。
【００２１】
別のグループ（Ｍｅｎｇら（２００２））は、ノーザンブロット及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、ＰＳＡ−ＲＰ１メッセンジャーＲＮＡ発現を特徴決定した。正常な顕微解剖組織と腫瘍性の顕微解剖組織との間に、発現の違いは観察され得なかった。正常な前立腺組織及び腫瘍性の前立腺組織の切片における特異的ＰＳＡ−ＲＰ１抗体を使用し、免疫組織化学により上皮細胞の細胞質にＰＳＡ−ＲＰ１タンパク質の発現を検出することが可能であった。
【００２２】
イントロン４の５’部分の保持に対応するＰＳＡバリアント、ＰＳＡ−ＲＰ５が、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託されている（登録番号：ＡＪ５１２３４６）。
【００２３】
エキソン３に欠失を有するＰＳＡバリアント、ＰＳＡ−ＲＰ４が、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託されている（登録番号：ＡＪ４５９７８２）。
【００２４】
本願は、ここで、ＰＳＡ遺伝子及びＫＬＫ２遺伝子の異なる型の存在、並びにそれらの病理学的状況との相関を記載する。これらのアイソフォームは、腫瘍試料から同定された。ｃＤＮＡ及びこれらのｃＤＮＡによりコードされるタンパク質／ポリペプチドの説明が、以下に示される。完全配列は、添付の配列表に提供される。本発明の特異的バリアントの主要な特徴は、実施例に記載される。
【００２５】
本発明の第一の目的は、本願に記載されたＰＳＡ及びＫＬＫ２のバリアントの配列、又はその特定の一部を含む核酸に関する。
【００２６】
本発明の別の目的は、本願において記載されたＰＳＡ及びＫＬＫ２のバリアントにおける遺伝学的改変を特徴とする核酸に関する。そのような核酸は、特に、突然変異型領域、保持されたイントロンドメイン、又は欠失により新たに作出されたジャンクションに相補的であり得る。
【００２７】
本発明の別の目的は、ＫＬＫ２−ＥＨＴ００２〜ＫＬＫ２−ＥＨＴ０１１及びＰＳＡ−ＥＨＴ００１〜ＰＳＡ−ＥＨＴ０２７又はこれらのバリアントの任意の組み合わせからのメッセンジャーＲＮＡ（又はｃＤＮＡ）に由来する配列の全部又は一部を含む核酸、並びに癌、特に前立腺癌、特にその良性型ＢＨＰの診断、検出又はモニタリングのための方法を実行するためのそれらの使用に関する。
【００２８】
本発明の別の目的は、
ａ）配列番号：１〜４９の配列；
ｂ）遺伝暗号の縮重に起因する配列番号：１〜４９の配列のバリアント；
ｃ）配列番号：１〜４９の配列の相補鎖；及び
ｄ）配列ａ）〜ｃ）の特定の断片：の中から選択された配列を含む任意の核酸にある。
【００２９】
「特定の」断片又は一部という用語は、関係しているバリアントの特徴的な断片、典型的には関係しているバリアントに特徴的な遺伝学的改変を少なくとも含有している断片をさす。従って、そのような特定の断片は、本出願人らによって証明された患者における改変事象に起因する特定の構造的特質（例えば、突然変異、新たなジャンクション、イントロンの保持、配列の欠失、終止コドン、リーディングフレームシフトに起因する新たな配列等）の存在によって野生型配列と異なっている。この特定の構造的特質は、「標的配列」という表現によっても表される。本発明に係る特定の断片は、前記定義のような標的断片を少なくとも含む。好ましい断片は、関係している配列の少なくとも５個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１２個を含む。断片は、最大５０、７５もしくは１００ヌクレオチド又はそれ以上を含み得る。
【００３０】
本発明において使用されるように、核酸は、好ましくはｃＤＮＡ及びｇＤＮＡより選択されるＤＮＡ、又はＲＮＡであり得る。それらは、合成又は半合成の核酸、ＰＣＲ断片、オリゴヌクレオチド、二本鎖又は一本鎖の領域等であり得る。核酸は、合成、組換え経路、クローニング、（１つ以上の）遺伝子組立て、突然変異誘発等によって、又はこれらの技術の組み合わせを使用することによって作製され得る。
【００３１】
核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又は無細胞転写系のいずれかにおいて、本発明のＰＳＡ又はＫＬＫ２のバリアントを作製するために使用され得る。それらは、細胞における対応するｍＲＮＡの発現又は翻訳を減少させることができるアンチセンス又は干渉性（ＲＮＡｉ）分子の作製においても使用され得る。それらは、ハイブリダイゼーション反応によって、本発明において記載されたＰＳＡ又はＫＬＫ２の突然変異型の試料における存在の特異的な同定を可能にするプローブ、特に標識されたプローブを作製するためにも使用され得る。さらに、それらは、特に疾患のスクリーニング又は診断を目標として、試料中のＰＳＡ又はＫＬＫ２のバリアント（又はそのようなバリアントの標的配列）を増幅するのに有用な核酸プライマーを作製するために使用され得る。
【００３２】
これに関して、本発明の別の目的は、典型的には選択的ハイブリダイゼーションによって、テスト核酸集団からの前記定義のような核酸の検出を可能にする核酸プローブに関する。一般に、プローブは、前記定義のような核酸の配列、又はそのような核酸の配列の（特定の）一部を含む。特定の一部は、好ましくは、本明細書に既に記載されたようなバリアントに特徴的なものであり、特に、前立腺癌に関連した改変を含有している一部である。それは、典型的には、１０〜１０００ヌクレオチド、好ましくは５０〜８００を含み、通常一本鎖である。プローブの具体例は、本明細書において既に定義されたような核酸の少なくとも１つの領域に特異的であり相補的であるオリゴヌクレオチドにより表される。オリゴヌクレオチドは、典型的には一本鎖であり、一般に１０〜１００塩基を含む。本発明に包含されるオリゴヌクレオチドの具体例は、表１に提供される。本発明のオリゴヌクレオチド及び／又は核酸プローブは、例えば放射性マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー又は発光マーカー等によって標識され得る。
【００３３】
本発明の別の目的は、本明細書において既に定義されたような核酸又はそのような核酸の（特定の）一部の（選択的）増幅を可能にする核酸プローブに関する。増幅される部分は、好ましくは、本明細書に既に記載されたバリアントのいずれかに特徴的な改変、特に前立腺癌に関連した改変を含有している。本発明に係るプライマーは、典型的には一本鎖であり、有利には３〜５０塩基、好ましくは３〜４０塩基、より好ましくは３〜３５塩基から構成される。特定のプライマーは、ＰＳＡ遺伝子もしくはＫＬＫ２遺伝子又はそれらの対応するＲＮＡの少なくとも１つの領域に相補的である。
【００３４】
好ましい実施態様は、配列番号：１〜４９の配列又はそれらの相補鎖のうちの１つの少なくとも一部に相補的な、３〜５０ヌクレオチドを含む一本鎖核酸から構成されたプライマーにある。そのような核酸プライマーの例は、実験セクションに見出され得る。
【００３５】
本発明は、センス配列及び逆方向配列を含むプライマー対（該対のプライマーは、前記定義のような核酸のある領域にハイブリダイズし、該核酸の少なくとも一部の増幅を可能にする）にも関する。
【００３６】
本発明に係る特定のプライマー対は、表２に提供される。
【００３７】
本願の別の目的は、前記定義のような核酸を含むベクターに関する。それは、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ウイルス、ファージ等であり得る。ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲ等のような、様々な市販のプラスミドが挙げられ得る。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス等が挙げられ得る。
【００３８】
本明細書において既に定義されたような核酸又はベクターを含有している組換え細胞を提供することが、本発明の別の目的である。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。原核細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌を特に挙げ得る。真核細胞としては、酵母細胞、又は哺乳動物、昆虫もしくは植物の細胞を挙げ得る。それらは、初代培養物又は細胞系であり得る。ＣＯＳ、ＣＨＯ、３Ｔ３、ＨｅＬａ等の細胞が挙げ得る。
【００３９】
本発明の別の目的は、マトリックス（支持体）上に固定化された、前記定義のような核酸を含む組成物に関する。本発明は、特に、本明細書において既に定義されたような核酸を少なくとも１つ含む、可溶型の、又はマトリックス上に固定化された、複数個の混合された核酸を含む組成物に関する。
【００４０】
本発明の別の目的は、本明細書において既に定義されたような核酸１個又は数個が固定化されているマトリックス（を含む生成物）に関する。マトリックスは、例えばナイロン、ガラス、プラスチック、金属、繊維、セラミック材料、シリカ、ポリマー等、又はその他の任意の適合性の材料のような、固体で、平坦又はそうでない、均一又はそうでないものであり得る。核酸は、好ましくは、分子がハイブリダイゼーション反応に到達可能になるような条件の下で、一方の末端で固定化される。核酸は、マトリックス上に正確に配置することができ、数回にわたり沈着させることができる。
【００４１】
特定のバリアントにおいて、１個又は数個の特定のオリゴヌクレオチドを、各オルタナティブスプライシング事象を特徴決定するために使用することができる（図９参照）。とりわけ、長型の定量を可能にする、排除されたエキソンに特異的なオリゴヌクレオチド；及び／又は長型及び短型のＲＮＡを定量するために使用し得るスプライシングに関与していない隣接エキソンのうちの１つに特異的なオリゴヌクレオチド；及び／又は使用し得るジャンクションに特異的な１個又は数個（例えば、３個）のオリゴヌクレオチド（そのうちの１個は、スプライシングの後に生成する新たな配列に特異的であり、スプライシングを受けた型の定量を可能にする）を使用することが可能である。当然、その他のオリゴヌクレオチドの組み合わせ、特に１個又は２個のオリゴヌクレオチドのみの使用が企図され得る。より具体的にジャンクションオリゴヌクレオチドに関しては、それらは、理想的にはジャンクションの中央に存在するべきであるが、ジャンクションに対してシフトしたオリゴヌクレオチドも使用し得る。有利には、ハイブリダイズする能力に干渉し得る二次構造を有していないオリゴヌクレオチドが使用されよう。一般に、作成されたオリゴの全てが均一な熱力学的プロファイル、即ちＴｍ（６５℃）及び長さ（２４又は２５マー）を有する場合、それはチップにとって好ましい。さらに、合成中、オリゴヌクレオチドは、柔軟性を促進し、マトリックスをコーティングするために使用されるポリマーとの共有結合の形成を可能にするＮＨ２−Ｃ６基の５’末への付加により修飾され得る。
【００４２】
本発明の別の目的は、本明細書において既に定義されたような組換え細胞１個又は数個が固定化又は培養されているマトリックス（を含む生成物）に関する。マトリックスは、例えばナイロン、ガラス、プラスチック、金属、繊維、セラミック材料、シリカ、ポリマー等、又はその他の任意の適合性の材料のような、固体の、平坦又はそうでない、均一又はそうでないものであり得る。細胞は、例えばマイクロタイタープレートのウェルに分配されるか、又はゲル内もしくは適当なマトリックス上に固定化される。
【００４３】
本発明は、アイソフォームＫＬＫ２−ＥＨＴ００２〜ＫＬＫ２−ＥＨＴ０１１及びＰＳＡ−ＥＨＴ００１〜ＰＳＡ−ＥＨＴ０２７又はＫＬＫ２−ＥＨＴｂ〜ＫＬＫ２−ＥＨＴｌ及びＰＳＡ−ＥＨＴａ〜ＰＳＡ−ＥＨＴｕ、特に配列番号：５０〜１６７の配列に記載されたものの全部又は一部によりコードされたペプチド及びタンパク質配列、並びに癌、特に前立腺癌、特にその良性型ＢＨＰの診断、検出又はモニタリングのための方法を実行するためのそれらの使用にも属する。
【００４４】
本願の具体的な目的は、配列番号：５０〜１６７の中から選択された配列の全部又は特定の一部を含むポリペプチドに関する。特定のポリペプチドは、遺伝子又は対応するメッセンジャーの改変によって作製された配列又はその配列の一部から構成されるか又はそれらを含む。本発明において使用されるように、「一部」という用語は、少なくとも５個、好ましくは少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも１５個の連続残基をさす。本明細書において既に説明されたように、ＰＳＡ遺伝子又はＫＬＫ２遺伝子のスプライシング改変は、新たに作出された配列（標的配列）を含有している突然変異型タンパク質の生成をもたらす。それらは、新たな配列（例えば、フレームシフト翻訳、挿入）又は新たなジャンクション等であり得る。本発明の特定のペプチドは、配列番号：５３、５６、５９、６２、６５、６７（残基１４６〜１５０）、７０、７１、７３、７６、７９、８１、９３、９５、９８、１０６、１０８、１１０、１１２、１１７、１１９（残基６６〜７０又は７４〜７９）、１２１（残基１１７〜１２１）、１２３（残基２５〜２９、５１〜５５又は１０５〜１１１）、１２６、１３１、１３３、１３４、１３５（残基６４〜６８）及び１５５の配列の全部又は特定の一部に相当するか又はそれらを含む。
【００４５】
本明細書において既に定義されたようなポリペプチド１個又は数個が固定化されているマトリックス（を含む生成物）を提供することが、本発明の別の目的である。マトリックスは、例えばナイロン、ガラス、プラスチック、金属、繊維、セラミック材料、シリカ、ポリマー等、又はその他の任意の適合性材料のような、固体で、平坦又はそうでない、均一又はそうでないものであり得る。ポリペプチドは、好ましくは、分子が、抗体のような特異的リガンドとの相互作用を含む反応に到達可能（accessible）になるような条件の下で、一方の末端で固定化されている。ポリペプチドは、マトリックス上に正確に配置され得、数回にわたり沈着させられ得る。
【００４６】
物質（核酸、ポリペプチド、抗体等のような）をマトリックス上に固定化するための技術は、文献、特に出願又は特許、欧州特許第６１９  ３２１号、ＷＯ９１／０８３０７、米国特許第４，９２５，７８５号及び英国特許第２，１９７，７２０号に記載されている。
【００４７】
特異的リガンド
本発明は、ＫＬＫ２−ＥＨＴ０１１及びＰＳＡ−ＥＨＴ００１〜０２７又はＫＬＫ２−ＥＨＴｂ〜ＫＬＫ２−ＥＨＴｌ及びＰＳＡ−ＥＨＴａ〜ＰＳＡ−ＥＨＴｕ（保持されたイントロンドメイン又は特異的に作製されたジャンクションによりコードされている）によりコードされたタンパク質に特徴的なペプチド領域に特異的な、特異的リガンド、好ましくはペプチドリガンド、特に抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）及びそれらの断片、並びに癌、特に前立腺癌の検出、診断又はモニタリングのためのそれらの使用に関する。特に、それは、ＢＰＨ型の診断、その前立腺癌からの鑑別に適している。
【００４８】
これと関連して、本発明の別の目的は、本明細書において既に定義されたようなポリペプチドと、好ましくは選択的に、結合することができる抗体に関する。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。それは、実質的に同一の抗原特異性を有する抗体の断片及び誘導体、特に抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＣＤＲ）、ヒト化抗体、多機能性抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）抗体等の形態であってもよい。抗体は、動物を免疫感作すること、及びその血清（ポリクローナル）又は脾細胞（適切な細胞系との融合によりハイブリドーマを作製するため）を収集することを含む、従来の方法を使用して、作製され得る。
【００４９】
様々な種を使用したポリクローナル抗体の作製のための方法が、既に記述されている。典型的には、抗原は、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント）と組み合わせられ、典型的には皮下注射により、動物へ投与される。反復投与が実施され得る。血液試料が収集され、免疫グロブリン又は血清が分離される。モノクローナル抗体を作製するための従来の方法は、動物を抗原で免疫感作すること、続いて、脾細胞を回収し、次いでそれを骨髄腫細胞のような不死化細胞と融合させることを含む。得られたハイブリドーマは、モノクローナル抗体を産生し、それが、個々のクローンを単離するため限界希釈によって選択され得る。Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片は、従来の技術に従い、プロテアーゼを使用した消化によって作製され得る。
【００５０】
本発明は、本明細書において既に定義されたようなポリペプチド又はその免疫原性断片を非ヒト動物へ注射すること、抗体又は抗体産生細胞を回収すること、を含む、抗体を作製する方法にも関する。好ましい抗体は、本願において記載されたＰＳＡ及びＫＬＫ２のアイソフォームに特異的であって、野生型に対しては本質的に非特異的である抗体である。
【００５１】
本発明は、前記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び該抗体を作製するためのそれらの使用に関する。
【００５２】
抗体は、毒素、標識、医用生成物又はその他の任意の治療剤のような異種断片と、共有結合的又は非共有結合的に、直接又はカップリング剤によって、カップリングさせられ得る。標識は、放射標識、酵素、蛍光剤、磁性粒子等の中から選択され得る。
【００５３】
本発明の抗体は、対象から採取された試料、典型的には哺乳動物、例えばヒトから採取された生物学的液体における、ＰＳＡ及びＫＬＫ２のアイソフォームの存在又は量を検出又は定量するためのスクリーニング剤として使用され得る。
【００５４】
本明細書において既に定義されたような抗体（又は断片もしくは誘導体）１個又は数個が固定化されているマトリックス（を含む生成物）を提供することが、本発明の別の目的である。マトリックスは、例えばナイロン、ガラス、プラスチック、金属、繊維、セラミック材料、シリカ、ポリマー等、又はその他の任意の適合性材料のような、固体の、平坦又はそうでない、均質又はそうでないものであり得る。抗体は、好ましくは、分子が、特異的抗体との相互作用を含む反応に到達可能になるような条件の下で、一方の末端で固定化される。抗体は、マトリックス上に正確に配置され得、数回にわたり沈着させられ得る。
【００５５】
検出／診断の方法
本願は、本明細書において既に定義されたような核酸、遺伝学的改変体又はタンパク質又はポリペプチドの、対象からの試料における存在を決定することを含む、対象における疾患又は疾患の素因を検出するための新たな手法を記載する。
【００５６】
決定は、配列決定、選択的ハイブリダイゼーション及び／又は増幅のような様々な技術を使用して実施され得る。タンパク質の存在を決定するために使用され得る方法は、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ等のような免疫酵素反応に基づく。改変された遺伝子又はＲＮＡの存在を決定するために使用され得る技術は、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＰＣＥ技術、ＴＭＡ（「転写介在増幅（Transcriptional Mediated Amplification）」）、ゲル移動、電気泳動、特にＤＧＧＥ（「変性濃度勾配ゲル電気泳動（denaturing gel gradient electrophoresis）」）等である。
【００５７】
増幅工程が実施される場合、それは、好ましくは、本明細書において既に定義されたようなプライマー又はプライマー対を使用して達成される。
【００５８】
本発明の具体的な目的は、癌、特に前立腺癌、特にその良性型ＢＨＰを検出するための、ＫＬＫ２−ＥＨＴ００２〜０１１及びＰＳＡ−ＥＨＴ００１〜０２７又はＫＬＫ２−ＥＨＴｂ〜ＫＬＫ２−ＥＨＴｌ及びＰＳＡ−ＥＨＴａ〜ＰＳＡ−ＥＨＴｕの遺伝子又はメッセンジャーの断片（例えば、保持されたイントロンドメイン、特異的に作製されたジャンクション、特定の突然変異等）に相補的であり特異的である核酸の使用に関する。癌検出は、特に、ＤＮＡチップを使用して、又は血液（とりわけ、血清又は精製された循環血中上皮細胞）、尿もしくは精液等のような生物学的液体に対してＰＣＲを実施することにより、達成され得る。
【００５９】
本発明は、本明細書において既に記載されたような抗体又はそれらの断片１個又は数個を含有している免疫学的テストの開発及び使用にもある。これらのアッセイは、特異的抗体を使用して個々にバリアントを検出及び／もしくは測定するため、又は適当な特異的抗体を使用してパラレルに数個のバリアントを検出及び／もしくは測定するため、又は本明細書において既に記載されたようなアイソフォーム間の、もしくは該アイソフォームとカリクレイン２及びＰＳＡのその他の記載された型との間の１個もしくは数個の比率を検出及び／もしくは測定するため、使用され得る。
【００６０】
特定の方法は、対象から採取された試料を、本明細書において既に定義されたような核酸プローブと接触させること、及びハイブリダイゼーションを証明すること、を含む。
【００６１】
別の特定の方法は、対象から採取された試料を、本明細書において既に定義されたようなプライマー又はプライマー対と接触させること、及び増幅産物を証明すること、を含む。
【００６２】
別の特定の方法は、対象から採取された試料を、本明細書において既に定義されたような抗体と接触させること、及び抗原−抗体複合体を証明すること、を含む。
【００６３】
典型的には、数個の試料を使用して、かつ／又は数個のプローブ、プライマー及び／もしくは抗体を使用して、数個のテストがパラレルに実施され得る。従って、特定の実施態様において、本発明の手法は、患者から採取された試料において、本明細書において既に記載されたようにして、パラレルに数個のバリアント又は遺伝学的改変体の存在を決定することを含む。本発明の手法は、例えば、多様な生物学的試料、特に生物学的液体（例えば、血液、血漿、尿、血清、唾液等）、組織生検材料又は細胞培養物を使用して、より一般には核酸又はタンパク質（又はポリペプチド）を含有している可能性が高い任意の試料を使用して、実施され得る。生物学的試料は、手法を容易にするため、又はそれが含有しているポリペプチドもしくは核酸をより到達可能にするため、予め処理されてもよい。試料は、精製、遠心分離、固定等されてもよいし、又は使用前に凍結もしくは保存されてもよい。
【００６４】
特定の実施態様において、本発明は、対象からの試料を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで、本明細書において既に定義されたようなプローブ、プライマー又は特異的リガンドと接触させること、及びそれぞれ改変型の存在の指標となるハイブリッド、増幅産物又は複合体の形成を決定することを含む、対象におけるＫＬＫ２又はＫＬＫ３の改変型の存在を検出するための方法に関する。
【００６５】
ｉ）本明細書において既に定義されたようなプライマー対又はプローブ又は抗体、及び
ｉｉ）増幅又はハイブリダイゼーション又は免疫学的反応に必要な試薬、
を含む、本明細書において既に定義されたような方法を実施するために使用され得るキットを提供することが、本発明の別の目的である。
【００６６】
本発明は、これらのバリアント又はそれらの断片のうちの１個又は数個を、血液（特に、血清）、尿又は精液のような試験すべき生物学的液体へ添加することにより、これらのバリアントのうちの１個又は数個の特異的パートナーを検出及び／又は測定することを可能にする方法の開発にもある。
【００６７】
活性化合物のスクリーニング
本発明の特定のＫＬＫ２及びＫＬＫ３のバリアントは、疾患を有する対象から同定され単離されたものであり、従って、癌、特に前立腺癌の処置のための特に興味深い治療標的となる。
【００６８】
これに関して、本明細書において既に定義されたようなポリペプチドの発現又は活性を調整するテスト化合物の能力を決定する工程を含む、活性化合物を選択、同定、特徴決定、最適化又は作製するための方法を提供することが、本発明の特定の目的である。
【００６９】
化合物は、より具体的には、本明細書において既に定義されたようなポリペプチドの合成（即ち、特に、対応するＲＮＡ分子の産生もしくは成熟、又はそれらの翻訳）又はそのようなポリペプチドの活性（即ち、特に、それらの成熟もしくは輸送、又は細胞内もしくは細胞外の標的との相互作用）を調整する能力に基づき選択される。
【００７０】
特定の変形実施態様において、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで、本明細書において既に定義されたようなポリペプチド又はそのようなポリペプチドをコードする核酸（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）とテスト化合物を接触させること、及び該ポリペプチド又は核酸と結合する化合物を選択すること、を含む。ポリペプチド、遺伝子又は対応するＲＮＡとの結合は、標識リガンドの置換、ゲル移動、電気泳動等のような様々な技術により測定され得る。それは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばマトリックス上に固定化されたポリペプチド又は核酸を使用して実施され得る。
【００７１】
別の特定の変形実施態様において、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで、本明細書において既に定義されたようなポリペプチドを発現している細胞とテスト化合物を接触させること、及び該ポリペプチドの発現又は活性を調整する化合物を選択又は同定すること、を含む。発現の調整は、ＲＮＡもしくはタンパク質をアッセイすることにより、又は指示系により決定され得る。
【００７２】
使用される細胞は、任意の適合性細胞、特に本明細書において既に定義されたような原核細胞又は真核細胞であり得る。典型的には、該分子を発現するよう修飾された細胞、特に組換え細胞が使用される。そのような組換え細胞は、ポリペプチドを発現する組換え核酸又はそれを含有しているベクターの導入により調製され得る。そのような組換え細胞は、本発明の具体的な目的を構成する。
【００７３】
本法は、ＰＳＡ又はＫＬＫ２の特異抗原の発現又は活性の活性化剤又は阻害剤を選択又は同定するために実施され得る。選択法は、例えば多数の候補化合物がパラレルにテストされ得るマルチウェルプレートのような様々な形式を使用して実施され得る。
【００７４】
特定の実施態様において、化合物は、記載されたバリアントの発現を阻害することができるアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸は、記載されたバリアントの特定の配列の全部又は一部を含み得る。アンチセンス配列は、とりわけ、同定されたスプライス型（例えば、標的配列）に相補的な領域を含み、それのタンパク質への翻訳を阻害し得る（又は低下させ得る）。
【００７５】
もう１つの実施態様によると、化合物は、本明細書において既に記載されたバリアントのうちの１個又は数個の発現又は活性を調整することができる、天然又は合成起源の化学化合物、特に、植物、細菌、ウイルス、動物、真核生物、合成又は半合成の起源の有機又は無機の分子である。
【００７６】
特異的な化合物、即ち野生型の発現又は活性に顕著な影響を与えることなく、バリアントの発現又は活性を調整し得るものが、好ましい。
【００７７】
このようにして同定された化合物は、前立腺癌を処置するための組成物を調製するために使用され得る。
【００７８】
本発明の別の目的は、癌、特に前立腺癌の処置を目的とした組成物を調製するための、本明細書において既に記載された１個又は数個のバリアントの発現を調整し得る、即ち刺激するか、阻害するか又は低下させることができる化合物の使用にある。
【００７９】
本発明に関して、「処置」という用語は、予防的、治癒的又は緩和的な処置、並びに患者の管理（苦痛の減少、平均余命の改善、疾患進行の遅延化）等をさす。処置は、さらに、他の活性薬剤と合わせて実施されてもよい。
【００８０】
本発明の別の目的は、１個又は数個のテスト化合物を、本発明において記載されたタンパク質を発現している細胞抽出物又は精製された形態の該タンパク質と接触させることを含む、癌性状態を処置するための組成物を調製するために使用され得る活性化合物を選択、同定又は特徴決定するための方法に関する。
【００８１】
本発明は、（ｉ）前記の方法に従い活性化合物を選択すること、及び（ｉｉ）該化合物又はその機能的アナログを、薬学的に許容される担体の存在下で準備すること、を含む、癌、特に前立腺癌を処置するための医薬を生産するための方法にも関する。機能的アナログは、典型的には、特に、活性もしくは薬物動態を改良すること、又は毒性を低下させることを目標として、化学的修飾により、同定された活性化合物から誘導された化合物である。機能的アナログは、同定された化合物の「プロドラッグ」であり得る。機能的アナログを調製するための技術、例えば分子モデリング、ＮＯ基のカップリング等は、当業者に周知である。本方法は、これに関して、選択された化合物又はその機能的アナログを合成する中間工程を含む。
【００８２】
薬学的に許容される担体又は賦形剤は、緩衝溶液、溶媒、結合剤、安定剤、乳化剤等の中から選択され得る。緩衝溶液又は希釈剤は、特に、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、乳糖、セルロース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、デンプン、粉糖及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（徐放のため）である。結合剤は、例えば、デンプン、ゼラチン、及びショ糖、グルコース、デキストロース、乳糖等のような増量溶液である。天然又は合成のゴム、特に、アルギネート、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等も使用され得る。その他の賦形剤は、例えば、セルロース及びステアリン酸マグネシウムである。例えば多糖（アラビアゴム、寒天、アルギン酸、グアーゴム及びトラガカント、キチン又はその誘導体及びセルロースエーテル）のような安定剤が、製剤中に取り込まれ得る。溶媒又は溶液は、例えば、リンゲル液、水、蒸留水、リン酸緩衝液、リン酸生理食塩水溶液及びその他の従来の液体である。
【００８３】
本発明の別の目的は、癌性細胞、特に前立腺癌性細胞の表面に局在している、本明細書において既に記載されたような１個又は数個のバリアントに特異的な細胞毒性リガンドの使用に属する。
【００８４】
本発明のその他の面及び利点は、例示的かつ非制限的なものと見なされるべきである以下の実施例を参照することにより明らかとなろう。これらの実施例は、同定されたアイソフォームが、組織及び血清においてＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で生物学的系において発現され得ることを明白に示している。
【００８５】
図及び表の説明
表１：特異的オリゴヌクレオチドの配列（配列番号：１６８〜２２０）。カラム１：オリゴヌクレオチドの名称。カラム２：オリゴヌクレオチドの配列。カラム３：特許請求の範囲に記載されたヌクレオチドの配列番号。
【００８６】
表２：ＰＳＡ及びＫＬＫ２のアイソフォームを増幅するために使用されたプライマー対。
【００８７】
表３：ヒト組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の、配列番号：１６８〜２２０のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイとのハイブリダイゼーションにより得られた蛍光シグナルの値。カラム１：オリゴヌクレオチドの名称。カラム２：配列番号。カラム３〜４：前立腺／心臓に対応する値。カラム５〜６：前立腺／腎臓に対応する値。カラム７〜８：前立腺／前立腺に対応する値。カラム９〜１０：前立腺／小腸に対応する値。記号＃Ｎ／Ａは、値がバックグラウンドノイズの２倍より低かったことを示す。
【００８８】
表４：細胞系の、配列番号：１６８〜２２０のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイとのハイブリダイゼーションにより得られた蛍光シグナルの値。カラム１：オリゴヌクレオチドの名称。カラム２：配列番号。カラム３〜４：Ｍｄａ２ｂ／ＢＴ５４９に対応する値。カラム５〜６：Ｍｄａ２／ＭＣＦ７に対応する値。カラム７〜８：Ｍｄａ２ｂ／Ｍｄａ２３１に対応する値。カラム９〜１０：Ｍｄａ２ｂ／Ｔ４７Ｄに対応する値。記号＃Ｎ／Ａは、値がバックグラウンドノイズの２倍より低かったことを示す。
【００８９】
表５：前立腺癌を有する患者からの良性組織及び腫瘍性組織の、配列番号：１６８〜２２０のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイとのハイブリダイゼーションにより得られた蛍光シグナルの値。カラム１：オリゴヌクレオチドの名称。カラム２：配列番号。カラム３〜４：患者１５０６８からの腫瘍性組織／良性組織に対応する値。カラム５〜６：患者９６４８からの腫瘍性組織／良性組織に対応する値。カラム７〜８：患者８８２７からの腫瘍性組織／良性組織に対応する値。カラム９〜１０：患者１００６３からの腫瘍性組織／良性組織に対応する値。記号＃Ｎ／Ａは、値がバックグラウンドノイズの２倍より低かったことを示す。
【００９０】
図面の簡単な説明
図１：特異的オリゴヌクレオチドの位置。長方形が付されたオリゴヌクレオチドが、スプライシング事象：イントロンの保持、エキソンの欠失、３’及び５’のクリプティック部位の使用の場合と特異的にハイブリダイズするよう設計された。
【００９１】
図２：特異的オリゴヌクレオチドの位置。５つのオリゴヌクレオチド（線が付されたもの）が、３つのエキソンを含有している長型及び２つのエキソンを含有している短型の発現を分析するために設計され得る。
【００９２】
図３：長合成型及び短合成型の標識。対応するｃＤＮＡを発現している直鎖化されたプラスミドを使用して、合成ＲＮＡが生成される。長型からのＲＮＡはシアニン３で標識され、短型からのＲＮＡはシアニン５で標識される。
【００９３】
図４：オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特異性の証明。等量で混合された短型から長型を識別するため、５つのオリゴヌクレオチドを使用した。２つの例が示される：遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂ。
【００９４】
図５：長型と短型の比率の定量的測定。長型（ｗｔ）の割合を、０、２０、４０、６０、８０及び１００％に設定した（３つの例を示す、遺伝子Ａ、Ｂ及びＣ）。
【００９５】
図６：ＰＳＡ及びＫＬＫ２のオリゴヌクレオチドマイクロアレイの特異性。ＰＳＡ特異的オリゴヌクレオチドが、シアニン３で標識されたＰＳＡアイソフォームにより明らかとなった。ＫＬＫ２特異的オリゴヌクレオチドが、シアニン５で標識されたＫＬＫ２アイソフォームにより示された。
【００９６】
図７：線状ＲＮＡ増幅の概略。
【００９７】
図８：単一の患者からの腫瘍性組織及び正常組織からのプローブを使用したＰＳＡ／ＫＬＫ２スライドのハイブリダイゼーションの例。
【００９８】
図９：対応する識別オリゴヌクレオチドにより、同一患者からの腫瘍性組織及び正常組織を分析することによる、ＰＳＡ及びＫＬＫ２のある種のアイソフォームの差次的発現の測定。カラム１：アイソフォームの性質、カラム２：対応する識別オリゴヌクレオチド、カラム３〜６：ｌｏｇ２（腫瘍性発現／正常発現の比率）。
【００９９】
図１０：対応する識別オリゴヌクレオチドにより、前立腺癌細胞系（Ｍｄａ−２ｂ及びＬＮＣａｐ）及び乳癌細胞系（Ｔ４７Ｄ）を分析することによる、ＰＳＡ及びＫＬＫ２のある種のアイソフォームのディファレンシャル発現の測定。カラム１：アイソフォームの性質、カラム２：対応する識別オリゴヌクレオチド、カラム３、４：ｌｏｇ２（前立腺癌細胞系発現／乳癌細胞系発現の比率）。前立腺癌細胞系において相対的に過剰発現していたアイソフォームが橙色で示される。乳癌細胞系において相対的に過剰発現していたアイソフォームが青色で示される。
【０１００】
図１１：対応する識別オリゴヌクレオチドにより、様々なヒト組織を分析することによる、ＰＳＡ及びＫＬＫ２のある種のアイソフォームの差次的発現の測定。カラム１：アイソフォームの性質、カラム２：対応する識別オリゴヌクレオチド、カラム３、４、５及び６：ｌｏｇ２（前立腺組織発現／心臓、腎臓、小腸及び前立腺それぞれにおける発現の比率）。前立腺組織において相対的に過剰発現していたアイソフォームが橙色で示される。他の組織において相対的に過剰発現していたアイソフォームが青色で示される。
【０１０１】
図１２：正常組織を用いてある種のアイソフォームに関して得られた蛍光シグナルを示すグラフ。
【０１０２】
図１３：３つのＰＳＡアイソフォームＡ）ＰＳＡ−ＥＨＴ００３  Ｂ）ＰＳＡ−ＥＨＴ０２３及びＣ）ＰＳＡ−ＥＨＴ０１２の特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ増幅。
【０１０３】
図１４：作製された３つのポリクローナル抗体のアノテーション。この図は、抗体ＳＥ３９６２、ＳＥ３９６３及びＳＥ４１０１に関する情報、選択されたエピトープ、合成されたペプチド、ＫＬＨコンジュゲーション及びこれらの抗体により認識される可能性が高いアイソフォームを示す。
【０１０４】
図１５：ＥＬＩＳＡを使用した３つの抗体の力価。Ａ）ＳＥ３９６２、Ｂ）ＳＥ３９６３及びＣ）ＳＥ４１０１の力価の決定。ＰＰＩ：免疫前血清。ＰＰ：最初の採集からの血清。ＧＰ：第二の採集からの血清。
【０１０５】
図１６：抗体ＥＨＴ−ＳＥ３９６２並びにＡ）低濃度の全ＰＳＡを含有している血清、Ｂ）中程度の濃度の全ＰＳＡを含有している血清及びＣ）高濃度の全ＰＳＡを含有している血清を使用したウェスタンブロットの結果。ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４及びＫＬＫ２−ＥＨＴ００６の予想分子量に対応する２本のバンドが観察される。シグナルが、増加する濃度の特異的合成エピトープ（１〜５０μg）により置換されるが、これが高用量（２５０μg）の非特異的ペプチドでは観察されないという事実により、この抗体の特異性が証明される。
【０１０６】
図１７：前立腺組織における抗体ＥＨＴ−ＳＥ３９６３を使用したウェスタンブロットの結果。ＰＳＡ−ＥＨＴ０１２の予想分子量に対応するバンドが観察される。より高分子量の他の２本のバンドも明らかとなっている。
【０１０７】
実施例
Ａ−ＰＳＡ及びＫＬＫ２のバリアントの単離
腫瘍性前立腺組織及び正常前立腺組織から抽出されたポリアデニル化（ポリＡ＋）ＲＮＡを使用して、定性的鑑別分析を実施した。ポリＡ＋ＲＮＡは、当業者に既知の技術を使用して調製した。特に、それは、チオシアン酸グアニジニウムのようなカオトロピック剤による処理、それに続く溶媒（例えば、フェノール又はクロロホルム）による全ＲＮＡの抽出を含み得た。そのような方法は、当業者に周知であり（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｌｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２（１９８７）１５６）、商業的に入手可能なキットを使用して容易に実施され得る。ポリＡ＋ＲＮＡは、当業者に既知の、商業的キットの形態で利用可能な従来の方法に従い、この全ＲＮＡより調製した。このポリＡ＋ＲＮＡを、逆転写酵素を使用した逆転写反応のための鋳型として使用した。有利には、使用される逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性を有していないべきである。これらを用いて、従来の逆転写酵素を用いた場合よりも長い相補ＤＮＡ鎖が得られた。そのようなＲＮａｓｅＨ活性を有しない逆転写酵素調製物は、商業的に入手可能である。
【０１０８】
ＤＡＴＡＳ技術に従い、ｍＲＮＡ（Ｃ）とｃＤＮＡ（Ｔ）との間のハイブリダイゼーションが、動力学の各時点について実施され、ｍＲＮＡ（Ｔ）とｃＤＮＡ（Ｃ）との間の逆のハイブリダイゼーション（reciprocal hybridization）も同様である。
【０１０９】
これらのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ異種二重鎖を、次いで、ＤＡＴＡＳ技術プロトコルに従い精製した。ＲＮａｓｅＨは非対形成ＲＮＡ配列を分解するため、相補ＤＮＡと対形成していないＲＮＡ配列を、この酵素の作用によってこれらの異種二重鎖から除去した。これらの非対形成配列は、他の点では相同なＲＮＡ分子間に存在する定性的な違いを表す。これらの定性的な違いは、ＲＮＡ分子の配列内の任意の位置、５’、３’又は配列内のいずれか、特にコーディング配列内に局在し得た。その位置によっては、これらの配列は、スプライシングによる修飾であるのみならず、転移又は欠失の結果でもあり得た。定性的な違いを表すＲＮＡ配列を、次いで、当業者に既知の技術、特にＤＡＴＡＳ技術特許に記載されたものに従い、クローニングした。これらの配列を、定性的差次的ライブラリーを構成するｃＤＮＡライブラリーへと類別した。これらのライブラリーのうちの一方は、健常な情況に特異的なエキソン及びイントロンを含有しており；他方のライブラリーは、病理学的状態に特徴的なスプライシング事象を含有していた。ヒトＫＬＫ２遺伝子及びＫＬＫ３遺伝子に由来する断片は、これらのライブラリーから得られた。４個の腫瘍性組織を混合して、腫瘍「プール」を形成させた。このＲＮＡプールをＡｍｂｉｏｎ社の「ＤＮＡフリー（ｆｒｅｅ）」キット（カタログ番号１９０６）を使用してＤＮａｓｅにより処理した。次いで、このＲＮＡ分子をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの“Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ”キット（カタログ番号４３２２１７１）に供給された逆転写酵素を使用して逆転写する。それにより作製されたｃＤＮＡを、以下のプロトコルに従い、ヒトカリクレイン２及びカリクレイン３に由来するメッセンジャーＲＮＡ分子の特異的に異なる領域を増幅するための、ＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。
【０１１０】
【表１】
2005519606.tif 000003
【０１１１】
ＰＲＣプライマーとして使用されたオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
【０１１２】
【表２】
2005519606.tif 000004
2005519606.tif 000005
【０１１３】
次いで、増幅された産物を、供給されたプロトコルに従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の“Ｔｏｐｏ”システム（カタログ番号Ｋ４６００）にクローニングした。ライゲーション産物を“Ｔｏｐ１０”コンピテント細胞に形質転換した。コロニーを、アンピシリンが補足された寒天／ＬＢ培地で同定した。これらのコロニーに存在するｃＤＮＡ分子を、以下のプロトコルに従い、プライマーＳｐ６及びＴ７を使用したＰＣＲ増幅により個々に増幅した。
【０１１４】
【表３】
2005519606.tif 000006
【０１１５】
次いで、増幅産物を、この供給元により提供されたプロトコルに従い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の“Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ”キットを使用して、配列決定のため、Ｐ１００を用いて精製した。配列決定反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのシーケンサー３１００を使用して分析した。表２は、様々なｃＤＮＡ、及び試料中のそれらを入手し増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドプライマー対を示す。
【０１１６】
Ｂ−バリアントの同定及び説明
ＫＬＫ２バリアント
ヌクレオチドの番号付けは、特に断りない限り、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１８１５７に関するものである。参照タンパク質は、シグナルペプチドを備えたＫＬＫ２である。
【０１１７】
配列ＫＬＫ２−ＥＨＴ００２〜ＫＬＫ２−ＥＨＴ０１１（配列番号：１〜７）は、オープンリーディングフレーム並びに翻訳のための開始コドン及び終止コドンを有する配列に相当した。配列ＫＬＫ２−ＥＨＴｂ〜ＫＬＫ２−ＥＨＴｌ（配列番号：８〜１５）は、翻訳のための開始コドン又は終止コドンを含む又は含まない１個、２個又は３個のリーディングフレームを有し得る発現「ＥＳＴ」配列に相当した。
【０１１８】
ＫＬＫ２−ＥＨＴ１０２（配列番号：１）：
このアイソフォームは、ｉ）イントロン２の５’部分（ｎｔ１９３５〜２０２０）の部分的保持、並びにｉｉ）エキソン３の３’部分（ｎｔ３７２８）及びエキソン４の５’部分（ｎｔ３９３７）の２個のクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）スプライス部位の使用を示した。これらの２つの事象は、コンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）スプライス部位に対応した。ＫＬＫ２−ＥＨＴ００２アイソフォームは、エキソン２の後に終止コドンを有し、従って６９番目の残基の後で短縮されたタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴ００２ｐｒｏｔａ／配列番号：５０）をコードした。５４アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴ００２ｐｒｏｔｂ／配列番号：５１が形成され得た。配列番号：１におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ１８１５７）１８２１位及び３５８１位に相当するヌクレオチドはＣ及びＡであることが分かるが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列は、これらの位置にそれぞれＴ及びＧを示した。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。いずれの変化も、翻訳されたタンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１１９】
ＫＬＫ２−ＥＨＴ００３（配列番号：２）：
このアイソフォームは、ｉ）エキソン２の完全な欠失、及びｉｉ）イントロン４の５’部分（ｎｔ４０６１〜４０９７）の保持を示した。両事象は、コンセンサススプライス部位に対応する。ＫＬＫ２−ＥＨＴ００３アイソフォームは、１５番目のトレオニン残基を超えて３４個の付加的なアミノ酸を有するタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴ００３ｐｒｏｔａ／配列番号：５２）をコードした。これらの３４アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴ００３ｐｒｏｔｂ／配列番号：５３が形成され得た。配列番号：２におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ１８１５７）３７７４位及び５４８６位に相当するヌクレオチドはＣ及びＴと見てとれるが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列は、これらの位置にそれぞれＴ及びＧを示した。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。いずれの変化も、翻訳されたタンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１２０】
ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４（配列番号：３）：
このアイソフォームは、エキソン３の完全な欠失を有した。ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４アイソフォームは、１５番目のトレオニン残基を超えて７０個の付加的なアミノ酸を有するタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４ｐｒｏｔａ／配列番号：５４）をコードした。これらの７０アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴ００３ｐｒｏｔｂ／配列番号：５５が形成され得た。最後の１６アミノ酸ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４ｐｒｏｔｃ／配列番号：５６は新しく、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含有し得る。配列番号：３におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ１８１５７）４０９７位に相当するヌクレオチドはＡと見てとれるが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列は、この位置にＧを示した。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。この変化は、翻訳されたタンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１２１】
ＫＬＫ２−ＥＨＴ００６（配列番号：４）：
このアイソフォームは、エキソン３の３’部分（ｎｔ３７２８）及びエキソン４の５’部分（ｎｔ３９３７）の２個のクリプティックスプライス部位を使用した。この事象は、コンセンサススプライス部位に対応した。ＫＬＫ２−ＥＨＴ００６アイソフォームは、１４９アミノ酸長のタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴ００６ｐｒｏｔａ／配列番号：５７）をコードした。１３４アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴ００２ｐｒｏｔｂ／配列番号：５８が形成され得た。最後の１６アミノ酸ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４ｐｒｏｔｃ／配列番号：５９は新しく、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含有し得た。配列番号：４におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ１８１５７）３６８９位に相当するヌクレオチドはＴと見てとれるが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列は、この位置にＣを示した。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。この変化は、翻訳されたタンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１２２】
ＫＬＫ２−ＥＨＴ００７（配列番号：５）：
ＫＬＫ２−ＥＨＴ００７は、イントロン４の５’部分の保持を示した。ＫＬＫ２−ＥＨＴ００７アイソフォームは、２２４アミノ酸長のタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴ００７ｐｒｏｔａ／配列番号：６０）をコードした。２０９アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴ００７ｐｒｏｔｂ／配列番号：６１が形成され得た。最後の１４アミノ酸ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４ｐｒｏｔｃ／配列番号：６２は新しく、このアイソフォームの１個以上の特異エピトープを提示しているかもしれない。
【０１２３】
ＫＬＫ２−ＥＨＴ００９（配列番号：６）：
ＫＬＫ２−ＥＨＴ００９は、ｉ）エキソン３内の配列（ｎｔ３６７１〜３７９３）の欠失、及びｉｉ）エキソン４の５’部分（ｎｔ３９３７）のクリプティックスプライス部位（コンセンサススプライス部位）の使用を示した。ＫＬＫ２−ＥＨＴ００９アイソフォームは、１２３アミノ酸のタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴ００９ｐｒｏｔａ／配列番号：６３）をコードした。１０８アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴ００９ｐｒｏｔｂ／配列番号：６４が形成され得た。最後の５アミノ酸ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４ｐｒｏｔｃ／配列番号：６５は新しく、このアイソフォームの特異的エピトープのうちの１個以上の一部を形成し得た。
【０１２４】
ＫＬＫ２−ＥＨＴ０１１（配列番号：７）：
このアイソフォームは、エキソン４の５’部分（ｎｔ４０４１）のクリプティックスプライス部位を使用した。この事象は、コンセンサススプライス部位に対応した。ＫＬＫ２−ＥＨＴ０１１アイソフォームは、１６５アミノ酸のタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴ０１１ｐｒｏｔａ／配列番号：６６）をコードした。１５０アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴ０１１ｐｒｏｔｂ／配列番号：６７が形成され得た。最後のアミノ酸位置において、フェニルアラニン残基がトリプトファン残基に交換されており、このアイソフォームの特異エピトープの一部を形成し得た。
【０１２５】
ＫＬＫ２−ＥＨＴｂ（配列番号：８）：
このアイソフォームは、イントロン１の５’部分の保持、それに続く７０１位〜１０５８位（両端を含む）の欠失を示した。ＫＬＫ２−ＥＨＴｂアイソフォームは、１５番目のトレオニン残基を超えて１０４個の付加的なアミノ酸を有するタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴｂ１、配列番号：６８）をコードした。これらの１０４アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴｂ２、配列番号：６９が形成され得た。最後の５９アミノ酸（ＫＬＫ２−ＥＨＴｂ３、配列番号：７０）は、既に記載されたアイソフォームＫ−ＬＭ（Ｄａｖｉｄら（２００２））と比較して新しい配列を表した。配列番号：８の９７位、２１４位及び２４９位のヌクレオチドはそれぞれＧ、Ｃ及びＴと見てとれるが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はそれぞれＣ、Ｔ及びＣを示した。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。突然変異９７及び２１４は、翻訳されたタンパク質の配列には影響を与えなかった。突然変異２４９は、セリン残基をフェニルアラニン残基へと変換した。Ｇｅｎｂａｎｋ参照におけるヌクレオチド１１９２〜１１９９、ＧＡＡＧＡＡＣＡが、配列番号：８においてはヌクレオチド３０３〜３０６、ＡＡＡＣに交換されていることも見てとれる。従って、ＫＬＫ２−ＥＨＴｂ１の最後の１５アミノ酸は、ＫＬＫ２−ＥＨＴｂ４、配列番号：７１を構成する１７アミノ酸を含むオープン配列に取って代わっていた。
【０１２６】
ＫＬＫ２−ＥＨＴｃ（配列番号：９）：
このアイソフォームは、イントロン１内の１１５７位のクリプティック部位を使用した。ＫＬＫ２−ＥＨＴｃアイソフォームは、１５番目のトレオニン残基を超えて６個の付加的なアミノ酸を有するタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴｃ１、配列番号：７２）をコードした。これらの６アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴｃ２、配列番号：７３が形成され得た。Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列におけるヌクレオチド１１９２〜１１９９、ＧＡＡＧＡＡＣＡが、配列番号：９においてはヌクレオチド７１〜７４、ＡＡＡＣに交換されていることが見てとれた。この変化は、終止コドンの後で起こった。
【０１２７】
ＫＬＫ２−ＥＨＴｄ（配列番号：１０）：
このアイソフォームは、イントロン１の５’部分の保持、それに続く６５７位〜１２０９位（両端を含む）の欠失を示した。ＫＬＫ２−ＥＨＴｄアイソフォームは、少なくとも４１個の付加的なアミノ酸を含むタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴｄ１、配列番号：７４）をコードした。これらの４１アミノ酸が切断され、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴｄ２、配列番号：７５が形成され得た。最後の１１個の付加的なアミノ酸（ＫＬＫ２−ＥＨＴｄ３、配列番号：７６）は、既に記載されたアイソフォームＫ−ＬＭ（Ｄａｖｉｄら（２００２））と比較して新しい配列を表した。イントロン１の継続された翻訳により予測される配列は、切断の後、８３アミノ酸のタンパク質：ＫＬＫ２−ＥＨＴｄ４、配列番号：７７を生成させた。
【０１２８】
ＫＬＫ２−ＥＨＴｅ（配列番号：１１）：
ＫＬＫ２−ＥＨＴｅは、３’末が短縮されたエキソン２及びエキソン３を含む、１４０ヌクレオチドの未知の配列を示した。ＫＬＫ２−ＥＨＴｅアイソフォームは、５２番目の位置を占めるグリシン残基を超えて１９個の付加的なアミノ酸を有するタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴｅ１、配列番号：７８）をコードした。これらの１９アミノ酸は、配列ＫＬＫ２−ＥＨＴｅ２、配列番号：７９を表した。
【０１２９】
ＫＬＫ２−ＥＨＴｆ（配列番号：１２）：
このアイソフォームは、２個のクリプティックスプライス部位（第一の部位はエキソン２の３’部分（１８７６位）、第二の部位はエキソン４（３３４９位）にある）を使用した。ＫＬＫ２−ＥＨＴｆアイソフォームは、４９位のヒスチジン残基と７０位のアスパラギンとの間の５７個の付加的なアミノ酸を有するタンパク質（ＫＬＫ２−ＥＨＴｆ１、配列番号：８０）をコードした。これらの５７アミノ酸は、ＫＬＫ２−ＥＨＴｆ２、配列番号：８１を表した。配列番号：１２の２６９位のヌクレオチドはＣと見てとれるが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はこの位置にＴを示した。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。突然変異２６９は、フェニルアラニン残基をロイシン残基へと置換した。
【０１３０】
ＫＬＫ２−ＥＨＴｊ（配列番号：１３）：
このアイソフォームは、イントロン２内の２４７３位〜３００１位の欠失を有した。ＫＬＫ２−ＥＨＴｊは、ＫＬＫ２−ＥＨＴｊ１（配列番号：８２）又はＫＬＫ２−ＥＨＴｊ２（配列番号：８３）に相当する２つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードした。
【０１３１】
ＫＬＫ２−ＥＨＴｋ（配列番号：１４）：
このアイソフォームは、２個のクリプティックスプライス部位（第一の部位はイントロン４の５０４９位、第二の部位はエキソン５の５４６９位にある）を使用した。ＫＬＫ２−ＥＨＴｋは、ＫＬＫ２−ＥＨＴｋ１（配列番号：８４）又はＫＬＫ２−ＥＨＴｋ２（配列番号：８５）に相当する２つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードした。
【０１３２】
ＫＬＫ２−ＥＨＴｌ（配列番号：１５）：
このアイソフォームは、２９９１位を占めるイントロン２内のクリプティック部位を使用する。ＫＬＫ２−ＥＨＴｋは、ＫＬＫ２−ＥＨＴｌ１（配列番号：８６）又はＫＬＫ２−ＥＨＴｌ２（配列番号：８８）に相当する２つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードした。
【０１３３】
ＰＳＡ（又はＫＬＫ３）バリアント
ヌクレオチドの番号付けは、特に断りない限り、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２７２７４に関するものである。参照タンパク質は、シグナルペプチドを備えたＰＳＡである。
【０１３４】
配列ＰＳＡ−ＥＨＴ００１〜ＰＳＡ−ＥＨＴ０２７（配列番号：１６〜３４）は、オープンリーディングフレーム並びに翻訳のための開始コドン及び終止コドンを有する配列に相当した。配列ＰＳＡ−ＥＨＴａ〜ＰＳＡ−ＥＨＴｕ（配列番号：３５〜４９）は、翻訳のための開始コドン又は終止コドンを含む又は含まない１個、２個又は３個のリーディングフレームを有し得る発現「ＥＳＴ」配列に相当した。
【０１３５】
ＰＳＡ−ＥＨＴ００１（配列番号：１６
このアイソフォームは、イントロン１の欠失断片（ｎｔ７２１〜８１１、次いで９７１〜１２７２）の保持を示した。ＰＳＡ−ＥＨＴ００１アイソフォームは、５１アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ００１ｐｒｏｔａ／配列番号：８９）をコードした。３６アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ００１ｐｒｏｔｂ／配列番号：９０が形成され得る。配列番号：１６におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）７３８位に相当するヌクレオチドはＧと見てとれるが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＴを示した。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。この変化は、トリプトファン残基をグリシン残基に置換した。
【０１３６】
ＰＳＡ−ＥＨＴ００３（配列番号：１７）：
このアイソフォームは、イントロン１の欠失断片（ｎｔ７２１〜８７４、次いで９２０〜１２７２）の保持を示した。ＰＳＡ−ＥＨＴ００３アイソフォームは、８９アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ００３ｐｒｏｔａ／配列番号：９１）をコードした。７４アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ００３ｐｒｏｔｂ／配列番号：９２が形成され得た。最後の２０アミノ酸（ＰＳＡ−ＥＨＴ００３ｐｒｏｔｃ／配列番号：９３）は、イントロン１の完全な保持を有する既に記載されたアイソフォームと比較して新しい情報を表した。
【０１３７】
ＰＳＡ−ＥＨＴ００４（配列番号：１８）：
このアイソフォームは、イントロン１内の１１４２位の３’クリプティックスプライス部位（コンセンサス部位）を使用した。ＰＳＡ−ＥＨＴ００４アイソフォームは、４７アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ００４ｐｒｏｔａ／配列番号：９４）をコードする。３２アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ００４ｐｒｏｔｂ／配列番号：９５が形成され得た。
【０１３８】
ＰＳＡ−ＥＨＴ００５（配列番号：１９）：
このアイソフォームは、イントロン１の欠失断片（ｎｔ７２１〜７９２、次いで１１４９〜１２７２）の保持を示した。ＰＳＡ−ＥＨＴ００５アイソフォームは、６８アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ００５ｐｒｏｔａ／配列番号：９６）をコードした。５３アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ００５ｐｒｏｔｂ／配列番号：９７が形成され得た。最後の２８アミノ酸（ＰＳＡ−ＥＨＴ００５ｐｒｏｔｃ／配列番号：９８）は、イントロン１の完全な保持を有する既に記載されたアイソフォームと比較して新しい情報を表した。
【０１３９】
ＰＳＡ−ＥＨＴ００７（配列番号：２０）：
このアイソフォームは、イントロン１内の６９３位に位置する５’クリプティックスプライス部位及びイントロン１内の１１４９位に位置する３’クリプティックスプライス部位を使用した。このＰＳＡ−ＥＨＴ００７アイソフォームは、２３アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ００７ｐｒｏｔａ／配列番号：９９）をコードした。
【０１４０】
ＰＳＡ−ＥＨＴ００８（配列番号：２１）：
このアイソフォームは、イントロン１内の１２０２位の３’クリプティックスプライス部位（コンセンサス部位）を使用した。このＰＳＡ−ＥＨＴ００８アイソフォームは、２７アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ００８ｐｒｏｔａ／配列番号：１００）をコードした。１２アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ００８ｐｒｏｔｂ／配列番号：１０１が形成され得た。配列番号：２１におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）６７９位に相当するヌクレオチドはＴと見てとれるが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＧを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もある。この変化は、トリプトファン残基をロイシン残基に置換した。
【０１４１】
ＰＳＡ−ＥＨＴ００９（配列番号：２２）：
このアイソフォームは、イントロン２の欠失断片（ｎｔ２１１９〜２４４７、次いで２９８８〜３２２６）の保持を示した。このＰＳＡ−ＥＨＴ００９アイソフォームは、６９アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ００９ｐｒｏｔａ／配列番号：１０２）をコードした。５４アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ００９ｐｒｏｔｂ／配列番号：１０３が形成され得る。配列番号：２２におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）１９６６位に相当するヌクレオチドはＡと見てとれるが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＧを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もある。この変化は、タンパク質の配列には影響を与えない。その他の点突然変異は終止コドンの後に同定された。
【０１４２】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０１２（配列番号：２３）：
このアイソフォームは、イントロン２の２４２６位の３’クリプティックスプライス部位（コンセンサス部位）を使用した。このＰＳＡ−ＥＨＴ０１２アイソフォームは、８３アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０１２ｐｒｏｔａ／配列番号：１０４）をコードした。６８アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ００４ｐｒｏｔｂ／配列番号：１０５が形成され得た。最後の１４アミノ酸（ＰＳＡ−ＥＨＴ０１２ｐｒｏｔｃ／配列番号：１０６）は、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高かった。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もある。いずれの変化も、翻訳されたタンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１４３】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０１３（配列番号：２４）：
このアイソフォームは、イントロン１内の１９４５位の３’クリプティックスプライス部位（コンセンサス部位）を使用した。このＰＳＡ−ＥＨＴ０１３アイソフォームは、７５アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０１３ｐｒｏｔａ／配列番号：１０７）をコードした。６０アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０１３ｐｒｏｔｂ／配列番号：１０８が形成され得た。これらの６０アミノ酸は、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高かった。
【０１４４】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０１５（配列番号：２５）：
このアイソフォームは、エキソン１内の７０３位に位置する５’クリプティックスプライス部位及びエキソン２内の２０３０位に位置する３’クリプティック部位を使用した。ＰＳＡ−ＥＨＴ０１５アイソフォームは、４１アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０１５ｐｒｏｔａ／配列番号：１０９）をコードする。最後の３０アミノ酸（ＰＳＡ−ＥＨＴ０１５ｐｒｏｔｂ／配列番号：１１０）は、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高かった。配列番号：２５におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）２０９４位に相当するヌクレオチドはＣであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＴを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。この変化は、セリン残基をプロリン残基に置換した。
【０１４５】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０１６（配列番号：２６）：
このアイソフォームは、エキソン２内の２０５３位に位置する３’クリプティックスプライス部位（コンセンサス部位）を使用した。このＰＳＡ−ＥＨＴ０１６アイソフォームは、３９アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０１６ｐｒｏｔａ／配列番号：１１１）をコードした。２４アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０１６ｐｒｏｔｂ／配列番号：１１２が形成され得た。これらの２４アミノ酸は、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高かった。
【０１４６】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０１８（配列番号：２７）：
このアイソフォームは、イントロン２の欠失断片（ｎｔ２１１９〜２５８８、次いで３１１４〜３２２６）の保持を示した。このＰＳＡ−ＥＨＴ０１８アイソフォームは、６９アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０１８ｐｒｏｔａ／配列番号：１１３）をコードした。５４アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０１８ｐｒｏｔｂ／配列番号：１１４が形成され得る。配列番号：２７におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）２５４５位に相当するヌクレオチドはＴであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＡを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。この変化は、タンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１４７】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０１９（配列番号：２８）：
このアイソフォームは、エキソン３内に位置する断片（ヌクレオチド３８２８〜３９３３）の欠失を有した。このＰＳＡ−ＥＨＴ０１９アイソフォームは、１００アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０１９ｐｒｏｔａ／配列番号：１１５）をコードした。８５アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０１９ｐｒｏｔｂ／配列番号：１１６が形成され得た。最後の６アミノ酸（ＰＳＡ−ＥＨＴ０１９ｐｒｏｔｂ／配列番号：１１７）は、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高かった。配列番号：２８におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）３７８６位及び３９４３位に相当するヌクレオチドはＴ及びＡであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はそれぞれＣ及びＣを示す。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。第一の変化は、タンパク質の配列には影響を与えなかった。第二のものは、セリン残基をアルギニン残基に置換した。
【０１４８】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０２１（配列番号：２９）：
このアイソフォームは、エキソン３内の３８８５位に位置する３’クリプティックスプライス部位（コンセンサス部位）を使用し、エキソン３の３’部分（ヌクレオチド３９０３〜４０２５）の欠失も有した。ＰＳＡ−ＥＨＴ０２１アイソフォームは、１７７アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０２１ｐｒｏｔａ／配列番号：１１８）をコードした。１６２アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０２１ｐｒｏｔｂ／配列番号：１１９が形成され得た。残基６９及び７６の周辺に作出された新たなジャンクションは、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高い。配列番号：２９におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）１９６６位に相当するヌクレオチドはＡであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＧを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。この変化は、タンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１４９】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０２２（配列番号：３０）：
このアイソフォームは、エキソン３の３’部分（ヌクレオチド３９０３〜４０２５）の欠失を有した。ＰＳＡ−ＥＨＴ０２２アイソフォームは、２２０アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０２２ｐｒｏｔａ／配列番号：１２０）をコードした。２０５アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０２２ｐｒｏｔｂ／配列番号：１２１が形成され得た。残基１１９の周辺に作出された新たなジャンクションは、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高かった。配列番号：３０におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）１９６６位に相当するヌクレオチドはＡであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＧを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。この変化は、タンパク質の配列には影響を与えなかった。ＰＳＡ−ＥＨＴ０２２（配列番号：３０）は、２００２年１０月２４日にＧｅｎｂａｎｋに寄託されたＰＳＡバリアント（登録番号：ＡＪ４５９７８２）に相当する。
【０１５０】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０２３（配列番号：３１）：
このアイソフォームは、エキソン２の断片（ヌクレオチド１９９０〜２０４０）の欠失、エキソン３内の３８８５位の３’クリプティック部位（コンセンサス部位）の使用、及びイントロン３の５’断片（ヌクレオチド４０４３〜４０６０）（コンセンサス部位）の保持を有する。このアイソフォームは、２０７アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０２３ｐｒｏｔａ／配列番号：１２２）をコードした。１９２アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０２３ｐｒｏｔｂ／配列番号：１２３が形成され得た。残基２７及び５３の周辺及び領域１０５〜１１１に作出された新たなジャンクションは、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高かった。配列番号：３１におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）２０６０位及び５７３１位に相当するヌクレオチドはＧ及びＧであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はそれぞれＴ及びＴを示す。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。第一の変化は、システイン残基をグリシン残基に置換した。第二のものは、タンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１５１】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０２５（配列番号：３２）：
このアイソフォームは、エキソン３を欠失していた。このアイソフォームは、８５アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０２５ｐｒｏｔａ／配列番号：１２４）をコードした。７０アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０２５ｐｒｏｔｂ／配列番号：１２５が形成され得た。最後の１６アミノ酸（ＰＳＡ−ＥＨＴ０２５ｐｒｏｔｃ／配列番号：１２６）は、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高かった。配列番号：３２におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）２１１８〜４１８６位及び５７９１位に相当するヌクレオチドはＧ及びＧであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はそれぞれＡＴ及びＣを示す。この違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。エキソン２の３’部位とエキソン４の５’部位の一致は、この領域におけるポリメラーゼによって導入された突然変異を示唆する。最後の変化は、タンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１５２】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０２６（配列番号：３３）：
このアイソフォームは、エキソン３内に位置する断片（ヌクレオチド３７８１〜４０２５）の欠失を有する。このＰＳＡ−ＥＨＴ０２６アイソフォームは、７８アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０２６ｐｒｏｔａ／配列番号：１２７）をコードした。６３アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０２６ｐｒｏｔｂ／配列番号：１２８が形成され得た。
【０１５３】
ＰＳＡ−ＥＨＴ０２７（配列番号：３４）：
このアイソフォームは、エキソン３の５’末の３７８０位に位置するクリプティックスプライス部位を使用し、エキソン４を欠失している。このＰＳＡ−ＥＨＴ０２７アイソフォームは、１１４アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴ０２７ｐｒｏｔａ／配列番号：１２９）をコードした。１２９アミノ酸が切断され、配列ＰＳＡ−ＥＨＴ０２７ｐｒｏｔｂ／配列番号：１３０が形成され得た。最後の６７アミノ酸（ＰＳＡ−ＥＨＴ０２７ｐｒｏｔｃ／配列番号：１３１）は、野生型ＰＳＡと比較して新しい情報を表し、従って、このアイソフォームの特異エピトープのうちの１個以上を含む可能性が高かった。配列番号：３４におけるＧｅｎｂａｎｋ（Ｍ２７２７４）１９６６位に相当するヌクレオチドはＡであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＧを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。この変化は、タンパク質の配列には影響を与えなかった。
【０１５４】
ＰＳＡ−ＥＨＴａ（配列番号：３５）：
このアイソフォームは、イントロン１の５’部分の９１ヌクレオチドの欠失、それに続く次の１５２ヌクレオチドの欠失（次いで、イントロン１に戻る）を示した。ＰＳＡ−ＥＨＴａアイソフォームは、９０アミノ酸のタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴａ１、配列番号：１３２）をコードし、その最後の７５アミノ酸が切断され得た（配列ＰＳＡ−ＥＨＴａ２、配列番号：１３３）。それは、ＰＳＡと異なる情報を表し、最後の４４アミノ酸（配列ＰＳＡ−ＥＨＴａ３、配列番号：１３４）は、既に記載されたイントロン１の完全な保持（Ｄａｖｉｄら（２００２））と比較して新しい情報を示した。最後の７４アミノ酸の２６位において、ＰがＱに置換されていた。配列番号：３５の９０位及び２３４位のヌクレオチドはＡ及びＣであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＣ及びＴを示す。２４３位及び２９３位のＧ及びＣヌクレオチドも、Ｇｅｎｂａｎｋ参照と異なっていた。しかしながら、これらの２つのヌクレオチドは、実際、発表されているゲノム配列に相当していた（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＴ＿０１１１９０）。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。従って、プロリン残基がグルタミン残基に置換され（突然変異９０）、イソロイシン残基がトレオニン残基に置換されている（突然変異２３４）。
【０１５５】
ＰＳＡ−ＥＨＴｄ（配列番号：３６）：
このアイソフォームは、エキソン２の最後の９ヌクレオチド及びエキソン３の最初の２４３ヌクレオチドの欠失を有した。このＰＳＡ−ＥＨＴｄアイソフォームは、８４アミノ酸欠失を有するタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴｄ１、配列番号：１３５）をコードした。システイン残基６６とトレオニン残基１５１との間に新たなドメインが形成されていた。
【０１５６】
ＰＳＡ−ＥＨＴｆ（配列番号：３７）：
このアイソフォームは、１０５ヌクレオチドの長さの欠失イントロン３（２４２０〜２５２６）の保持を示す。ＰＳＡ−ＥＨＴｆアイソフォームは、リジン残基で置換された６９番目のアスパラギン酸残基の後で短縮されたタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴｆ１、配列番号：１３６）をコードしていた。配列番号：３７の５６位のヌクレオチドはＧであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＡを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。この突然変異は、ヒスチジン残基をアルギニン残基に置換する。
【０１５７】
ＰＳＡ−ＥＨＴｈ（配列番号：３８）：
このアイソフォームは、イントロン４内のクリプティックスプライス部位（５４７２位）の使用に起因した。このＰＳＡ−ＥＨＴｈアイソフォームは、ＰＳＡ−ＥＨＴｈ１（配列番号：１３７）又はＰＳＡ−ＥＨＴｈ２（配列番号：１３８）に相当する２つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードしていた。配列番号：３８の７９位、１９９位及び２５８位のヌクレオチドはＣ、Ｃ及びＧであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＴ、Ｔ及びＡを示す。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。
【０１５８】
ＰＳＡ−ＥＨＴｊ（配列番号：３９）：
このアイソフォームは、イントロン４内の（５２５７位の）クリプティックスプライス部位の使用に起因した。このＰＳＡ−ＥＨＴｊアイソフォームは、ＰＳＡ−ＥＨＴｊ１（配列番号：１３９）、ＰＳＡ−ＥＨＴｊ２（配列番号：１４０）又はＰＳＡ−ＥＨＴｊ３（配列番号：１４１）に相当する３つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードしていた。
【０１５９】
ＰＳＡ−ＥＨＴｋ（配列番号：４０）：
このアイソフォームは、イントロン３の３’部分の保持、次いで短縮されたイントロン４（４３３７位〜５５１６位）の保持を示した。このアイソフォームは、ＰＳＡ−ＥＨＴｋ１（配列番号：１４２）、ＰＳＡ−ＥＨＴｋ２（配列番号：１４４）又はＰＳＡ−ＥＨＴｋ３（配列番号：１４４）に相当する３つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードしていた。
【０１６０】
ＰＳＡ−ＥＨＴｌ（配列番号：４１）：
このアイソフォームは、イントロン４内の４２７４位のクリプティック部位及びイントロン４内の４５３８位のもう１つのクリプティック部位を使用した。配列番号：４１の７９位のヌクレオチドはＣであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＴを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。ＰＳＡ−ＥＨＴｌは、ＰＳＡ−ＥＨＴｌ１（配列番号：１４５）、ＰＳＡ−ＥＨＴｌ２（配列番号：１４６）又はＰＳＡ−ＥＨＴｌ３（配列番号：１４７）に相当する３つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードしていた。ＰＳＡ−ＥＨＴｌ３において、この突然変異は、イソロイシン残基をトレオニン残基に置換した。
【０１６１】
ＰＳＡ−ＥＨＴｍ（配列番号：４２）：
このアイソフォームは、短縮されたイントロン１（１２１４〜１７５５）の保持を示した。ＰＳＡ−ＥＨＴｍは、ＰＳＡ−ＥＨＴｍ１（配列番号：１４８）、ＰＳＡ−ＥＨＴｍ２（配列番号：１４９）又はＰＳＡ−ＥＨＴｍ３（配列番号：１５０）に相当する３つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードしていた。
【０１６２】
ＰＳＡ−ＥＨＴｎ（配列番号：４３）：
このアイソフォームは、短縮されたイントロン１（１３６６〜１７３６）の保持を示した。ＰＳＡ−ＥＨＴｍは、ＰＳＡ−ＥＨＴｎ１（配列番号：１５１）、ＰＳＡ−ＥＨＴｎ２（配列番号：１５２）又はＰＳＡ−ＥＨＴｎ３（配列番号：１５３）に相当する３つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードしていた。
【０１６３】
ＰＳＡ−ＥＨＴｐ（配列番号：４４）：
このアイソフォームは、イントロン１内の（１２４０位の）クリプティックスプライス部位の使用に起因した。ＰＳＡ−ＥＨＴｐは、１５位のイソロイシン残基を超えて付加的な２７アミノ酸を有するタンパク質（ＰＳＡ−ＥＨＴｐ１、配列番号：１５４）をコードし得た。配列ＰＳＡ−ＥＨＴｐ２（配列番号：１５５）を表す、これらの２７アミノ酸は、切断後に放出され得た。
【０１６４】
ＰＳＡ−ＥＨＴｑ（配列番号：４５）：
このアイソフォームは、短縮されたイントロン２（２７４０〜３１６７位）の保持を示した。ＫＬＫ２−ＥＨＴｋは、ＫＬＫ２−ＥＨＴｑ１（配列番号：１５６）又はＫＬＫ２−ＥＨＴｑ２（配列番号：１５７）に相当する２つのリーディングフレームのうちの１つを含むタンパク質をコードしていた。
【０１６５】
ＰＳＡ−ＥＨＴｒ（配列番号：４６）：
このアイソフォームは、短縮されたイントロン２（２５８９〜３１９９位）の保持を示した。ＰＳＡ−ＥＨＴｍは、ＰＳＡ−ＥＨＴｒ１（配列番号：１５８）、ＰＳＡ−ＥＨＴｒ２（配列番号：１５９）又はＰＳＡ−ＥＨＴｒ３（配列番号：１６０）に相当する３つのリーディングフレームのうちの１つを含むタンパク質をコードしていた。
【０１６６】
ＰＳＡ−ＥＨＴｓ（配列番号：４７）：
このアイソフォームは、短縮されたイントロン４（４５１６〜４８８９位）の保持を示した。配列番号：４７の５４位、９３位及び２０１〜２０８位のヌクレオチドはＣ、Ａ及びＴＧＣＣＧＣＴＧであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＴ、Ｇ及びＡＧ−−ＧＴＧＴを示すことが分かる。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。このアイソフォームは、ＰＳＡ−ＥＨＴｓ１（配列番号：１６１）又はＰＳＡ−ＥＨＴｓ２（配列番号：１６２）に相当する２つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードしていた。ＰＳＡ−ＥＨＴｓ１における５４位の突然変異は、ロイシン残基をプロリン残基に置換した。
【０１６７】
ＰＳＡ−ＥＨＴｔ（配列番号：４８）：
このアイソフォームは、短縮されたイントロン４（４７２７〜５１１１位）の保持を示した。配列番号：４８の１３７位及び２３９位のヌクレオチドはＧ及びＡであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＡ及びＧを示す。これらの違いは、これらの位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。このアイソフォームは、ＰＳＡ−ＥＨＴｔ１（配列番号：１６３）又はＰＳＡ−ＥＨＴｔ２（配列番号：１６４）に相当する２つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードしていた。
【０１６８】
ＰＳＡ−ＥＨＴｕ（配列番号：４９）：
このアイソフォームは、イントロン４内の（５０５６位の）クリプティック部位の使用に起因した。配列番号：４９の４８位のヌクレオチドはＴであったが、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列はＣを示す。この違いは、この位置における多形の存在、又は参照された配列におけるエラーによって説明され得るが、ポリメラーゼによって誘導された突然変異の可能性もあった。ＰＳＡ−ＥＨＴｍは、ＰＳＡ−ＥＨＴｕ１（配列番号：１６５）、ＰＳＡ−ＥＨＴｕ２（配列番号：１６６）又はＰＳＡ−ＥＨＴｕ３（配列番号：１６７）に相当する３つのリーディングフレームのうちの１つを有するタンパク質をコードしていた。ＰＳＡ−ＥＨＴｕ２における突然変異４８は、アラニン残基をバリン残基に置換した。
【０１６９】
Ｃ−ジャンクションオリゴヌクレオチドのマイクロアレイを使用したＰＳＡ及びＫＬＫ２のアイソフォームの発現のバリデーション
本発明において記載されたＰＳＡ及びＫＬＫ２のバリアントの発現を、これらのバリアントと特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドのマイクロアレイを使用して確立した。配列に基づき、ＰＳＡ及びｋｌｋ２のスプライスバリアントは、異なる型の事象から生じる（図１）。
・「エキソンスキッピング」：特異的（例えば、識別）オリゴヌクレオチドを、エキソン１−エキソン３ジャンクションにより作出された配列と相補的であるよう設計した。
・イントロン保持：特異的オリゴヌクレオチドは、イントロン配列内に位置していた。
・オルタナティブ５’又は３’スプライス部位が使用される場合、識別オリゴヌクレオチドは、これらの新たなジャンクションのうちの１つと相補的である（即ち、それと対合する）よう設計された。
・オリゴヌクレオチドは、野生型のｋｌｋ２及びＰＳＡのエキソン及びジャンクションにおいても作製された。
【０１７０】
Ｃ１−ジャンクションオリゴヌクレオチドのマイクロアレイの説明
この研究は、２４及び２５マーのオリゴヌクレオチド１４９個を作製することからなっていた。それらの配列を添付書類（表１）に示す。記載されたバリアントにより作出された特異的ジャンクションからの付加的な「識別」オリゴヌクレオチド（配列番号：１６８〜配列番号：２２０）が、特許請求の範囲に記載される。
【０１７１】
各オルタナティブスプライシングを特徴決定するため、５個のオリゴヌクレオチドを使用した（図２参照）。１個のオリゴヌクレオチドは排除されるエキソンに特異的であり、長型の定量を可能にした。第二のオリゴヌクレオチドは、スプライシング事象に関与しない隣接エキソンのうちの１つに特異的であり、長型及び短型のＲＮＡの定量を可能にした。最後に、３個のオリゴヌクレオチドはジャンクションに特異的であり；そのうち１個はスプライシング後に作成される新たな配列に特異的であり、スプライシングを受けた型の定量を可能にした。当然、その他のオリゴヌクレオチドの組み合わせ、とりわけ１個又は２個のオリゴヌクレオチドのみの使用も企図され得る。オリゴヌクレオチドの設計に関して、プローブが古典的に使用されるＰＣＲ産物プローブより短い場合には、これらのプローブが、設計の基となった遺伝子ではない遺伝子に非特異的にハイブリダイズしないことをチェックする必要がある。さらに、オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズする能力に干渉する可能性のある二次構造を有していないことを保証することが不可欠である。一般に、作成されたオリゴ全てが均一な熱力学的プロファイル、即ちＴｍ（６５℃）及び長さ（２４又は２５マー）を有する場合、それはチップにとって好ましい。さらに、合成中、オリゴヌクレオチドを、５’末へのＮＨ２−Ｃ６基の付加により修飾し、柔軟性を促進し、ガラススライドをコーティングするために使用されるポリマーとの共有結合の形成を可能にすることができた。
【０１７２】
ジャンクションオリゴヌクレオチドをより特異的に解明するため、それらは、理想的にはジャンクションの中央に存在するべきであるが、ジャンクションに関してシフトしたオリゴヌクレオチドの可能性も考慮した。
【０１７３】
プライマーファインダー（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｉｎｄｅｒ）ソフトウェアを、オリゴヌクレオチドを設計するために選択した。選択した基準は、以下の通りである：
−％ＧＣ：２４マー及び３０マーの場合４０〜６０％、４０マーの場合３０〜６０％
−オリゴヌクレオチド濃度：５０nM
−塩濃度：５０mM
−「ヘアピン」二次構造又はホモダイマーを形成する傾向を有するオリゴヌクレオチドを無視
【０１７４】
まず、本発明者らの技術をバリデートするため、クローニングされたアイソフォームを取り扱った（図３参照）。長アイソフォーム及び短アイソフォームを含有しているプラスミドを直鎖化した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行った。反応培地は、蛍光色素と化学的相互作用を形成するアミノアリル−ＵＴＰを含有していた。本発明者らは、Ｃｙ３で長アイソフォームを標識し、Ｃｙ５で短アイソフォームを標識することを選択した。ＲＮＡはハイブリダイゼーションを作成し得る多数の二次構造を有するため、化学的断片化工程がプロトコルに導入されることが要求された。精製後、アイソフォームを混合し、次いでガラススライド（３Ｄ  Ｌｉｎｋ、Ｍｏｔｏｒｏｌａ又はＣｏｄｅｌｉｎｋ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にハイブリダイズさせた。
【０１７５】
図４は、異なる遺伝子に対応するクローンのうちの２個で得られた結果を示す。この実験は、本発明者らのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特異性をチェックするために実施された。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を使用してショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＲＮＡを増幅した。スライドを読み取るためのスキャナーを較正するため、外因性シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）コントロールをＲＮＡへ導入した。次いで、ショウジョウバエＲＮＡが、標的がハイブリダイズする配列を含有していないと仮定して、標識されたアイソフォーム（各アイソフォーム５ng）をショウジョウバエｃＲＮＡで希釈して、ハイブリダイゼーションの特異性をチェックすることを可能にする複雑な環境を作出した（バイオコンピューター（ｂｉｏｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ）分析）。ハイブリダイゼーション後、スライドをＣｙ３チャネル及びＣｙ５チャネルの両方で読み取った。各スポットの蛍光強度を測定し、中央値を計算することにより値を規準化した。各オリゴヌクレオチドを四つ組でスポットした。エキソン２、ジャンクション１−２及び２−３に相当するオリゴヌクレオチドを、クアントアレイ（ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ）により作成された画像上に赤色で出現する理由である、長型にのみハイブリダイズするよう設計した。ジャンクション１−３に特異的なオリゴヌクレオチドは、短型にのみハイブリダイズし、従って緑色で出現すると想像される。長アイソフォームと短アイソフォームの当モル混合物を使用したため、両画像の重ね合わせは、橙色スポットを示す。（アイソフォームを２６pgに希釈することにより、チップの感度を決定するための類似の実験を実施した）。この実験は、規準化後、共通エキソンを考慮した場合、ハイブリダイゼーションの５０％が長型によるものであったことを示している。エキソン２、ジャンクション１−２及び２−３を考慮した場合、ハイブリダイゼーションの９０〜１００％が長型によるものであった。ジャンクション１−３に関しては、ハイブリダイゼーションの７％未満が、長型によるものであった。これらの実験は、オリゴの設計及びハイブリダイゼーションの特異性をバリデートする。この高度の特異性は、アイソフォームを定量するためにこの道具を使用することを可能するために重大である。
【０１７６】
先の結果は、長アイソフォームと短アイソフォームの当モル混合物を使用して得られた。従って、次の段階の目標は、その道具が定量的であることを示すことであった（図５）。このため、本発明者らは、長型と短型を異なる蛍光色素で標識し、試料中の長型の量を２０％ずつ増加させ０〜１００％に変動させた（ｘ軸）。蛍光強度を規準化した後、共通エキソンで得られた値に基づき長型の％を測定し、それをｙ軸にプロットした。グラフに示されるように、測定された値は理論値に極めて近かった。
【０１７７】
これらの研究は、全て、スプライシングを受けたエキソン又はイントロン保持の発現を定性的にも定量的にも画定するために、オリゴアレイツールを使用することが可能であると予想され得ることを意味している。
【０１７８】
マイクロアレイを作るため、１４９個のオリゴヌクレオチド（２４及び２５マー）を設計した。これらのオリゴヌクレオチドを、１５０mMリン酸ナトリウムバッファーに２５uMの濃度で取り上げた。次いで、オリゴヌクレオチドをガラススライド（Ｃｏｄｅｌｉｎｋ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に担荷させ、そのスライドをＮａＣｌ中で加湿チャンバー内で１６時間インキュベートした。次に、未使用の反応部位を、５０mMエタノールアミン、０．１Mトリス、０．１％ＳＤＳ（ｐＨ９）の溶液を使用してブロッキングした。次いで、それらを４×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの溶液で洗浄した。標的を、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１mg/mlサケ精子ＤＮＡのバッファー中で、５０℃の温度で、１６時間ハイブリダイズさせた。次いで、増加するストリンジェンシーの洗浄条件を使用して、それらを洗浄した。
カバースリップを除去するため４×ＳＳＣ
２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃で５分間
０．２×ＳＳＣ、室温で５分間
０．１×ＳＳＣ、室温で５分間
【０１７９】
Ｃ２−オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション能の決定
ＰＳＡとｋｌｋ２を識別するために使用されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション能及び特異性をチェックした。これを達成するため、本発明者らは、シアニン５で標識されたｋｌｋ２に対応するいくつかのアイソフォーム、及びシアニン３で標識されたＰＳＡのいくつかのアイソフォームをプールした（図６）。次いで、ｃＲＮＡを単一スライド上に共ハイブリダイズさせ、それを２つのチャネルで読み取った。２つの画像を重ね合わせたところ、四つ組で適用され後に再設計された１つのオリゴを除き、ＰＳＡオリゴヌクレオチドとｋｌｋ２オリゴヌクレオチドとの間のクロスハイブリダイゼーションは存在しないことが明らかとなった。
【０１８０】
Ｃ３−患者からの腫瘍性試料及び健康試料における研究
通常不充分な生物学的材料が存在したため、本発明者らは、ＲＮＡ増幅を活用した（図７）。第一工程は、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩを使用したオリゴｄＴの存在下でのｍＲＮＡの逆転写からなっていた。鋳型として用いられたＲＮＡをＲｎａｓｅＨで分解し、第二鎖ｃＤＮＡ合成のためＤＮＡポリメラーゼＩにより使用され得るプライマーを残した。合成された断片をＤＮＡリガーゼにより組み立てた。この工程の終了後、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼにより認識される二本鎖ＤＮＡ構造が形成された。この酵素は、メッセンジャーの配列に対応する鎖を増幅し、相補配列のプローブとハイブリダイズするｃＲＮＡの分子を合成する（ｍＲＮＡセンス）。各患者について、２つの異なる蛍光色素で標識された（腫瘍性試料及び健康試料に対応する）標的８ugを単一スライド上で共ハイブリダイズさせた。蛍光強度を両チャネルで測定し、ガラススライドの蛍光を読み取るための分析ソフトウェア（ＧｅｎｅＴｒａｆｆｉｃ）の全強度法（ｇｌｏｂａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して規準化した。図８は、患者のうちの１人から得られた２つの重ね合わせられた画像を示す。分析された他の患者３人についても類似の評価がなされ得る。蛍光シグナルは高品質であり、強度は一般に１，５００より大きい。４人の患者からの腫瘍性試料及び良性試料から得られたシグナルの分析は、いくつかのアイソフォームがいくつかの患者においてディファレンシャルに発現されていることを証明した（図９）。
【０１８１】
Ｃ４−前立腺癌及び乳癌に由来する細胞系における研究
いくつかの実験において、前立腺癌細胞系及び乳癌細胞系におけるＰＳＡ及びＫＬＫ２２のアイソフォームの発現プロファイルを比較した。このため、本発明者らは、２個の前立腺癌細胞系（Ｍｄａ２ｂ及びＬｎＣＡＰ）及び４個の乳癌細胞系（Ｍｄａ２３１、Ｔ４７Ｄ、Ｍｃｆ７及びＢＴ５４９）からＲＮＡを増幅した。次いで、Ｍｄａ２ｂ系及びＬｎＣＡＰ系をシアニン３で、乳癌系をシアニン５で標識した後、各前立腺癌系を様々な乳癌系と共ハイブリダイズさせた。スライドを両チャネルで読み取り、全強度法を使用してジーントラフィック（ＧｅｎｅＴｒａｆｆｉｃ）で蛍光強度を規準化した。研究を２つのハイブリダイゼーション群（各前立腺癌細胞系に１つずつ）に分割した。次いで、単一のハイブリダイゼーション群から少なくとも１つのハイブリダイゼーションにおいて脱制御された発現を有する識別オリゴヌクレオチドのリストを同定した。本発明者らは、０．６６未満又は１．５超（即ち、−０．５８＜平均ｌｏｇ２比率＞０．５８）の計算された比率を有するオリゴを選択した。最も多数の識別オリゴヌクレオチドを含む最も顕著なディファレンシャル発現が観察されたＭｄａ２ｂ対Ｔ４７Ｄ及びＬｎＣＡＰ対Ｔ４７Ｄの分析の結果を提示することを選択した。ディファレンシャル発現は、１５個のアイソフォームで観察され、そのうち３個（即ち、ＰＳＡ−ＥＨＴ０１９、ＰＳＡ−ＥＨＴｊ及びＰＳＡ−ＥＨＴｌ）が、乳癌由来系と比較して前立腺癌由来系において過剰発現していた。他の１２個は、前立腺癌において過少発現していた（図１０）。
【０１８２】
Ｃ５−組織研究
これらの実験は、ＰＳＡアイソフォーム及びＫＬＫ２アイソフォームの組織特異的発現をチェックすることからなっていた。このため、本発明者らは、４つの組織：前立腺、心臓、腎臓及び腸を選択した。これらの４つの組織からＲＮＡを増幅し、前立腺からのシアニン３標識ｃＲＮＡを他の組織からのシアニン５標識ｃＲＮＡと共ハイブリダイズさせた。前立腺からのシアニン３標識ｃＲＮＡを、シアニン５標識前立腺ｃＲＮＡとも共ハイブリダイズさせた。スライドを両チャネルで読み取り、全強度法を使用してジーントラフィック（ＧｅｎｅＴｒａｆｆｉｃ）で蛍光強度を規準化した。次に、これらの４つのハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーション群において、少なくとも１つのハイブリダイゼーションにおいて脱制御された発現を有していた識別オリゴヌクレオチドのリストを同定した。本発明者らは、計算された比率が０．６６未満又は１．５超（即ち、−０．５８＜平均ｌｏｇ２比率＞０．５８）であるオリゴヌクレオチドを選択した。それにより、試験された健康組織（前立腺、心臓、小腸及び腎臓）に依る、いくつかのＰＳＡ及びＫＬＫ２のアイソフォームの脱制御された発現を示した。これらは、ＰＳＡ−ＥＨＴ００３、ＰＳＡ−ＥＨＴ００５、ＰＳＡ−ＥＨＴ０１３、ｋｌｋ２−ＥＨＴｂ、ｋｌｋ２−ＥＨＴｄ、ｋｌｋ２−ＥＨＴｊｋｌｋ２−ＥＨＴｆ及びｋｌｋ２−ＥＨＴｌ、ＰＳＡ−ＥＨＴ０１９及びｋｌｋ２−ＥＨＴｅであった（図１１及び１２）。
【０１８３】
Ｃ６−得られたハイブリダイゼーションシグナルの要約
表３、４及び５は、健康組織（表３）、細胞系（表４）及び前立腺癌を有する患者からの組織（表５）を使用してオリゴヌクレオチドマイクロアレイで得られたハイブリダイゼーションシグナルを示す。バックグラウンドノイズの値の２倍より大きい値が示される（有意なハイブリダイゼーションを表す）。バックグラウンドノイズの値の２倍より小さい値は、略号＃ＮＡにより表される。オリゴヌクレオチド配列番号：１８４、２１５及び２２０を除く識別オリゴヌクレオチド全てが、研究された系の少なくとも１つにおいて、有意なシグナルを生じたようである。従って、本発明において記載されたアイソフォームの発現は、このアプローチにより確認される。オリゴヌクレオチド配列番号：１８４と関連したＰＳＡ−ＥＨＴ０２３アイソフォームも、より高感度のＰＣＲアプローチを使用して検出されたことに注目すべきである（下記セクションＤ参照）。
【０１８４】
結論として、本発明において記載されたアイソフォームの大部分が、実際に、研究されたモデルのうちの１つにおいて発現しているようである。組織特異的発現及び腫瘍特異的発現も証明された。
【０１８５】
Ｄ−ＰＣＲによるＰＳＡ及びＫＬＫ２のアイソフォームの発現のバリデーション
ＰＣＲジャンクション法を使用して、いくつかのアイソフォームの存在を示した。原理は、既に記載されたオルタナティブスプライシング事象に起因する新たなジャンクションに特異的に向けられたオリゴヌクレオチドを使用したアイソフォームの特異的増幅に基づく。増幅は、各患者の前立腺からの良性エリア及び腫瘍性エリアの両方からのＲＮＡを使用して、そしてプラスミドコントロールも使用して実施される。
【０１８６】
ＰＣＲ増幅の結果は、図１３に示される。矢印は、予想サイズのバンドを示す。所望の結果は、ｗｔコントロールは陰性である、即ち野生型プラスミドを使用した場合にはアイソフォームのサイズの特異的増幅が存在しない、Ｔ（腫瘍）プール及びＮ（正常）プールにおけるアイソフォームの特異的増幅である。クローニングされたアイソフォームを有するプラスミドを、増幅のための陽性コントロールとして使用する。
【０１８７】
【表４】
2005519606.tif 000007
【０１８８】
結論として、この方法も、前立腺組織におけるいくつかのアイソフォームの存在を証明するために使用され得る。ＰＣＲは、マイクロアレイ技術より高感度であり、とりわけ、ＰＳＡ−ＥＨＴ０１２の発現を明らかにした。
【０１８９】
Ｅ−抗体作製及びタンパク質発現
いくつかのアイソフォームに特異的なポリクローナル抗体を、本発明において記載されたバリアントのうちのいくつかによりコードされたタンパク質の存在を決定するため、作製した。これらの抗体を、対応するタンパク質の発現を検出するためウェスタンブロットにおいて使用した。
【０１９０】
抗体作製及びタンパク質発現
全てのペプチド及び抗体が、ユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）（ベルギー）により作製された。図１４に記載された配列に相当するペプチド２０〜３０mgが、７０％超の純度で、Ｆｍｏｃ化学を使用して合成された。免疫応答を誘導するため、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はグルタルアルデヒドを使用して、ＫＬＨが各ペプチド５mgとコンジュゲートさせられた。２匹のウサギ（ＳＰＦニュージーランドホワイトウサギ）が、コンジュゲートしたペプチド２００mgで免疫感作された。最初の注射は、フロイント完全アジュバントを用いて実施され、その後の注射はフロイント不完全アジュバントで実施された。０、１４、２８及び５６日目の注射及び０、３８及び６６日目の血清収集を含む、標準的なプロトコルが使用された。最後の採血は８７日目に行われた。血清中の抗体力価がＥＬＩＳＡにより測定された（図１５）。抗原、合成ペプチド又はＫＬＨが、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに担荷させられた（ＰＢＳ中１００ng、４℃、１６時間）。飽和（ＢＳＡ１mg/ml、２５℃、２時間）の後、血清の段階希釈物（免疫前：ＰＰＩ、最初の採集からの血清：ＰＰ及び第二の採集からの血清：ＧＰ）を２５℃で２時間インキュベートした。ＨＲＰ／ＯＰＤ系を使用して抗体結合を示し、４９２nmにおける光学密度を測定した。選択されたエピトープについて得られた力価は、満足のゆくものであった。
【０１９１】
ウェスタンブロット分析
溶解バッファー（５０mMトリスｐＨ＝７．５、５mM  ＥＧＴＡ、１５０mM  ＮａＣｌ、１％トリトン５０mM  ＮａＦ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））を使用して、組織及び細胞系からタンパク質抽出物を調製した。抽出物をブラッドフォード法を使用して定量した。組織を使用した場合には、抽出物２０μgをポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルに担荷させた。血清を使用した場合には、非精製血清の５０分の１希釈物又は精製血清の８分の１希釈物１５μlを使用した（Ａｕｒｕｍ  ＢｉｏＲａｄキット、番号７３２−６７０１）。変性条件下での電気泳動の後、分離されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに移した。次いで、メンブレンの、特異的に作製されたポリクローナル抗体（先のセクション参照）とのインキュベーションにより、ＰＳＡ及びＫＬＫ２のバリアントを検出した。洗浄後、メンブレンを、ペルオキシダーゼＨＲＰで標識された二次抗免疫グロブリン抗体（希釈率１／５０００）と共にインキュベートした。次いで、バンドを、ＥＣＬ検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して可視化した。
【０１９２】
ＥＨＴ−ＳＥ３９６２抗体
この抗体は、ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４バリアント及びＫＬＫ２−ＥＨＴ００６バリアントに共通のエピトープから作成された。これらの２つのバリアントについて予想されるサイズは、１７kD（ＫＬＫ２−ＥＨＴ００６）及び１０kD（ＫＬＫ２−ＥＨＴ００４）であった。血清試料を使用したところ、予想サイズに移動する２つのバンドが観察され得た（図１６）。増加する用量の、選択されたエピトープに相当する合成ペプチドにより置換されたため、抗体はこれらのバンドを特異的に認識するようである（図１６Ｄ）。異なる血清試料間には不均一性が観察された。全ＰＳＡ濃度との明白な相関は観察されなかった（図１６Ａ）、Ｂ）及びＣ））
【０１９３】
ＥＨＴ−ＳＥ３９６３抗体
この抗体は、ＰＳＡ−ＥＨＴ０２１に対応するジャンクションエピトープに対して産生された（予想サイズ：２０kD）。およそ２２、２５及び４０kDの分子量を有する３つのバンドが、前立腺組織を使用して観察された（図１７）。最低分子量を有するバンドが、ＰＳＡ−ＥＨＴ０２１に対応するかもしれなかった。２５kDバンドは、ＰＳＡ−ＥＨＴ０２１に関連した２つのスプライシング事象のうちの１つを有するものとして既に記載されたバリアントに対応し得る（Ｔａｎａｋａら、２０００）。
【０１９４】
【表５】
2005519606.tif 000008
【０１９５】
【表６】
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【０１９６】
【表７】
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【０１９７】
【表８】
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【０１９８】
【表９】
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【０１９９】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】特異的オリゴヌクレオチドの位置。長方形が付されたオリゴヌクレオチドが、スプライシング事象：イントロンの保持、エキソンの欠失、３’及び５’のクリプティック部位の使用の場合と特異的にハイブリダイズするよう設計された。
【図２】特異的オリゴヌクレオチドの位置。５つのオリゴヌクレオチド（線が付されたもの）が、３つのエキソンを含有している長型及び２つのエキソンを含有している短型の発現を分析するために設計され得る。
【図３】長合成型及び短合成型の標識。対応するｃＤＮＡを発現している直鎖化されたプラスミドを使用して、合成ＲＮＡが生成される。長型からのＲＮＡはシアニン３で標識され、短型からのＲＮＡはシアニン５で標識される。
【図４】オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特異性の証明。等量で混合された短型から長型を識別するため、５つのオリゴヌクレオチドを使用した。２つの例が示される：遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂ。
【図５】長型と短型の比率の定量的測定。長型（ｗｔ）の割合を、０、２０、４０、６０、８０及び１００％に設定した（３つの例を示す、遺伝子Ａ、Ｂ及びＣ）。
【図６】ＰＳＡ及びＫＬＫ２のオリゴヌクレオチドマイクロアレイの特異性。
【図７】線状ＲＮＡ増幅の概略。
【図８】単一の患者からの腫瘍性組織及び正常組織からのプローブを使用したＰＳＡ／ＫＬＫ２スライドのハイブリダイゼーションの例。
【図９】対応する識別オリゴヌクレオチドにより、同一患者からの腫瘍性組織及び正常組織を分析することによる、ＰＳＡ及びＫＬＫ２のある種のアイソフォームの特質的な発現の測定。
【図１０】対応する識別オリゴヌクレオチドにより、前立腺癌細胞系（Ｍｄａ−２ｂ及びＬＮＣａｐ）及び乳癌細胞系（Ｔ４７Ｄ）を分析することによる、ＰＳＡ及びＫＬＫ２のある種のアイソフォームの差次的発現の測定。
【図１１】対応する識別オリゴヌクレオチドにより、様々なヒト組織を分析することによる、ＰＳＡ及びＫＬＫ２のある種のアイソフォームの特質的な発現の測定。
【図１２】正常組織を用いてある種のアイソフォームに関して得られた蛍光シグナルを示すグラフ。
【図１３】３つのＰＳＡアイソフォームＡ）ＰＳＡ−ＥＨＴ００３  Ｂ）ＰＳＡ−ＥＨＴ０２３及びＣ）ＰＳＡ−ＥＨＴ０１２の特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ増幅。
【図１４】作製された３つのポリクローナル抗体のアノテーション。
【図１５Ａ】ＥＬＩＳＡを使用した３つの抗体の力価。Ａ）ＳＥ３９６２の力価の決定。ＰＰＩ：免疫前血清。ＰＰ：最初の採集からの血清。ＧＰ：第二の採集からの血清。
【図１５Ｂ】ＥＬＩＳＡを使用した３つの抗体の力価。Ｂ）ＳＥ３９６３の力価の決定。ＰＰＩ：免疫前血清。ＰＰ：最初の採集からの血清。ＧＰ：第二の採集からの血清。
【図１５Ｃ】ＥＬＩＳＡを使用した３つの抗体の力価。Ｃ）ＳＥ４１０１の力価の決定。ＰＰＩ：免疫前血清。ＰＰ：最初の採集からの血清。ＧＰ：第二の採集からの血清。
【図１６Ａ】抗体ＥＨＴ−ＳＥ３９６２及びＡ）低濃度の全ＰＳＡを含有している血清を使用したウェスタンブロットの結果。
【図１６Ｂ】抗体ＥＨＴ−ＳＥ３９６２及びＢ）中程度の濃度の全ＰＳＡを含有している血清を使用したウェスタンブロットの結果。
【図１６Ｃ】抗体ＥＨＴ−ＳＥ３９６２及びＣ）高濃度の全ＰＳＡを含有している血清を使用したウェスタンブロットの結果。
【図１６Ｄ】抗体ＥＨＴ−ＳＥ３９６２及びＤ）特異的ペプチドと非特異的ペプチドを使用したウェスタンブロットの結果。
【図１７】前立腺組織における抗体ＥＨＴ−ＳＥ３９６３を使用したウェスタンブロットの結果。
【図１】
2005519606.tif 000033
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005519606.tif 000039
【図８】
2005519606.tif 000040
【図９】
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【図１０】
2005519606.tif 000042
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2005519606.tif 000045
【図１４】
2005519606.tif 000046
【図１５Ａ】
2005519606.tif 000047
【図１５Ｂ】
2005519606.tif 000048
【図１５Ｃ】
2005519606.tif 000049
【図１６Ａ】
2005519606.tif 000050
【図１６Ｂ】
2005519606.tif 000051
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
2005519606.tif 000053
【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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