(57)【要約】本発明は、哺乳動物の癌細胞増殖の選択的阻害における使用のために、メチレンテトラ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）阻害剤を提供する。これらの阻害剤は、小さい分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、オリゴヌクレオチドを形成する３重らせん、アンチＭＴＨＦＲ抗体またはそれらのフラグメント、ＭＴＨＦＲ突然変異またはＭＴＨＦＲのフラグメントでよい。本発明は、ＭＴＨＦＲの阻害剤をコード化する核酸、およびこれらの核酸を含むベクターを更に提供する。本発明は、癌細胞増殖の選択的阻害のためにＭＴＨＦＲ阻害剤を用いる方法、およびＭＴＨＦＲ阻害剤を含む薬理学的組成物をも包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする哺乳動物の癌細胞増殖を選択的に阻害する使用のための、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の阻害剤であって、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる、前記阻害剤。
【請求項２】
ＭＴＨＦＲをコード化する遺伝子と相補的な配列を含み、長さが少なくとも７個のヌクレオチド鎖の、非対立的特定アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す配列を含む、請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
リボザイムである、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項５】
ＭＴＨＦＲに結合し、阻害する抗体、または抗体フラグメントである、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項６】
小さい分子である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項７】
ペプチドである、請求項５に記載の阻害剤。
【請求項８】
突然変異ＭＴＨＦＲ、またはＭＴＨＦＲのフラグメントである、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項９】
癌細胞増殖の阻害が、制癌治療のために癌細胞を敏感にさせる、請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１０】
哺乳動物が癌である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１１】
癌が、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、神経芽細胞腫、または神経こう腫である、請求項１０に記載の阻害剤。
【請求項１２】
哺乳動物がヒトである、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１３】
請求項２、３、４、５、７または８のいずれかに記載の阻害剤をコード化する配列を含む核酸。
【請求項１４】
調整コントロール因子と動作可能なように関連がある、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
調整コントロール因子が、転写コントロール因子である、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１３、１４または１５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかに記載の阻害剤、および薬理学的に許容できるキャリア、希釈剤、補形剤を含む薬理学的組成物。
【請求項１８】
阻害剤が、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現、またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）阻害剤の、薬剤の製造のための使用。
【請求項１９】
阻害剤が、長さが少なくとも７個のヌクレオチド鎖でＭＴＨＦＲをコード化する遺伝子と相補的な配列を含む、非対立的特定アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
阻害剤が、ＭＴＨＦＲに結合して阻害する抗体、または抗体フラグメントである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
阻害剤が小さい分子である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２３】
阻害剤が突然変異ＭＴＨＦＲ、またはＭＴＨＦＲのフラグメントである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２４】
阻害剤が、制癌治療のために癌細胞を敏感にさせる、請求項１８、１９、２０、２１、２２または２３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項２５】
薬剤が付加的に制癌治療を含む、請求項１８、１９、２０、２１、２２または２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
薬剤が、哺乳動物の癌を処置、安定化、または予防する目的である、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
癌が、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、神経芽細胞腫、または神経こう腫である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
哺乳動物がヒトである、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
阻害剤が癌細胞増殖を選択的に阻害し、および阻害剤がメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）遺伝子発現、またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる、薬剤の製造のための、請求項１６に記載のベクターの使用。
【請求項３０】
阻害剤が制癌治療のために癌細胞を敏感にさせる、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
薬剤が制癌治療を付加的に含む、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
薬剤が、哺乳動物の癌を処置、安定化、または予防する目的である、請求項２９、３０または３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
癌が、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、神経芽細胞腫、または神経こう腫である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
哺乳動物がヒトである、請求項２９、３０、３１、３２または３３のいずれかに記載の使用。
【請求項３５】
ヒトのメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）を、コード化する遺伝子と相補的な配列を含み、長さが少なくとも７個のヌクレオチド鎖の、非対立的特定アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ヒトのＭＴＨＦＲ遺伝子発現を阻害する、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが癌細胞増殖を選択的に阻害する、請求項３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＭＴＨＦＲ遺伝子のエクソン５と相補的である、請求項３５または３６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す配列を含む、請求項３５、３６または３７のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート核酸である、請求項３５、３６、３７または３８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項３５、３６、３７、３８または３９のいずれかに記載の、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコード化する核酸を含むベクター。
【請求項４１】
メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の阻害剤を投与することにより、哺乳動物の癌細胞増殖を選択的に阻害する段階を含む哺乳動物の癌を処置、安定化、または予防する方法であって、阻害剤が、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現、またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる、前記方法。
【請求項４２】
哺乳動物がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の阻害剤と癌細胞が接触する段階を含む癌細胞増殖を阻害する方法であって、阻害剤が、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現、またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる、前記方法。
【請求項４４】
癌細胞増殖を選択的に阻害する、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の阻害剤を含む、請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４のいずれかに記載の使用、または、請求項４１、４２、もしくは４３のいずれかに記載の方法のためのキットであって、阻害剤が、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現、またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、癌細胞の増殖および／または転移の阻害剤の分野に関する。特に本発明は、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、および癌の治療においてのそれらの使用に関する。
【０００２】
背景
葉酸誘導体は、プリン、チミジレート、およびメチオニンの生合成の反応を含むいくつかの重要な単一炭素移動(single―carbon transfer)反応のための補酵素である。メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ；ＥＣ１．５．１．２０）は、５，１０―メチレンテトラヒドロ葉酸のＮＡＤＰＨ―関連還元を触媒して、５―メチルテトラヒドロ葉酸、ホモシステインのメチオニンへのメチル化のための補助基質に変換させる。
【０００３】
ＭＴＨＦＲの遺伝的欠損、常染色体性劣性疾患は、最も一般的な先天性葉酸代謝異常である。メチルテトラヒドロ葉酸の合成の阻害は、メチオニンの通常の濃度の低下と共に、増大したホモシステインをもたらす。ＭＴＨＦＲの深刻な欠損を有する（線維芽細胞の０〜２０％活性）患者は、可変のフェノタイプを有する。深刻なＭＴＨＦＲ欠損を有する少なくとも１人の患者が無症状であるが、発育の遅れ、精神薄弱、運動および歩行異常、末梢神経障害、発作および精神障害が、このグループで報告されてきた。深刻な型の病理学的変化は、ＣＮＳの神経伝達物質、およびメチオニン濃度の低下だけでなく、増大したホモシステインを伴う他の条件でみられる血管の変化を含む。ＭＴＨＦＲのより穏やかな欠損（３５〜５０％活性）は、冠動脈疾患を有する患者にみられる（以下参照）。遺伝子異質性は、同様に、種々の臨床的特徴、酵素活性の可変なレベル、および差異熱を考慮すれば、患者細胞の還元酵素の不活性プロフィールである。
【０００４】
豚の肝臓から単離されたＭＴＨＦＲを均一まで精製すると、７７―ｋＤａサブユニットのホモダイマーであることが分かった。豚のペプチドの部分的タンパク質分解は、空間的に異なる２つの領域：４０ｋＤａのＮ末端領域、および３７ｋＤａのＣ末端領域を明らかにした。後者の領域は、アロステリックコントロール剤Ｓ―アデノシルメチオニンのための結合部位を含有する。
【０００５】
ヒトのＭＴＨＦＲのためのｃＤＮＡは、単離、および解読され、遺伝子の突然変異は、ＭＴＨＦＲの不完全な個人に確認された(Goyette,et al.,(1994)Nat.Genet.,7:195-200)。国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ００／００４４２は、ＭＴＨＦＲ遺伝子、ＭＴＨＦＲ欠損を有する個人のＭＴＨＦＲ遺伝子の突然変異を確認する方法、および機能的ＭＴＨＦＲ遺伝子またはタンパク質の提供を含む、ＭＴＨＦＲ欠損を有する個人に対して治療する方法のための、核酸プローブを開示している。その出願は、さらに、ＭＴＨＦＲ欠損が、神経芽腫および大腸癌などの癌を含む病気、疾患、機能障害に関連するかもしれないと教示している。
【０００６】
ＰＣＴ／ＩＢ００／００４４２もまた、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現を阻害すること、またはＭＴＨＦＲタンパク質を阻害することによる、癌を有する患者の治療のための方法について主張している。しかし、そこでの教示を仮定しても、ＭＴＨＦＲ欠損と病気との立証された関係を考慮すると、特にそのような方法が癌の治療に効果的なのかどうかは、不明確なままである。ＰＣＴ／ＩＢ００／００４４２には、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲタンパク質を阻害することによる、癌を有する患者の治療がどのように実行されているのか、またはそのような阻害が癌細胞にどのような効果を与えるのか議論されてない。実際に、ＰＣＴ／ＩＢ００／００４４２は、対象のＭＴＨＦＲ活性を低下させることが有害な効果をもたらすかもしれないと教示しているように思える。
【０００７】
従って、選択的に癌細胞を標的にする方法に対する要求が残る。特に癌細胞増殖に特異的な阻害を提供する方法である。
【０００８】
この背景の情報は、出願人に既知と思われる情報を本出願と関連づける目的で提供する。許可を必ずしも意図しないし、本発明に反して先行技術を構成するいかなる先行情報も解釈されない。明細書の全体にわたって参照される刊行物は、この出願全体の参考文献により組み込まれる。
【０００９】
本発明の要約
本発明の目的は、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびそれらの使用を提供することである。本発明の特徴によると、治療を必要とする哺乳動物の癌細胞増殖の選択的阻害における使用のための、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の阻害剤を提供し、ここで阻害剤は、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる。
【００１０】
本発明のもう一つの特徴によると、そのような治療を必要とする哺乳動物の癌細胞増殖の選択的阻害における使用のための、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の阻害剤をコード化する配列を含む核酸を提供し、ここで阻害剤は、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させ、および阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、オリゴヌクレオチドを形成する３重らせん、アンチＭＴＨＦＲの抗体またはそれらのフラグメント、ＭＴＨＦＲ突然変異体、またはＭＴＨＦＲのフラグメントである。本発明のさらにもう一つの特徴によると、この核酸を含むベクターを提供する。
【００１１】
本発明のもう一つの特徴によると、治療を必要とする哺乳動物の癌細胞増殖の選択的阻害における使用のための、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の阻害剤を含む薬理学的組成物を提供し、ここで阻害剤は、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させ、薬理学的に許容できるキャリア、希釈剤、補形剤である。
【００１２】
本発明のもう一つの特徴によると、薬剤の製造のためのＭＴＨＦＲ阻害剤の使用を提供し、ここで阻害剤は、選択的に癌細胞増殖を阻害し、および阻害剤はＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる。
【００１３】
本発明のもう一つの特徴によると、そのような治療を必要とする哺乳動物の癌細胞増殖の選択的阻害における使用のための、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）の阻害剤をコード化する配列を含む核酸を含むベクターの使用を提供し、ここで阻害剤はＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させ、および阻害剤は、薬剤の製造のための、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、オリゴヌクレオチドを形成する３重らせん、アンチＭＴＨＦＲの抗体またはそれらのフラグメント、ＭＴＨＦＲ突然変異体またはＭＴＨＦＲのフラグメントであり、ここで阻害剤は、癌細胞増殖を選択的に阻害し、および阻害剤はＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる。
【００１４】
本発明のもう一つの特徴によると、長さが少なくとも７個のヌクレオチドで、ヒトのＭＴＨＦＲをコード化する遺伝子と相補的な配列を含む非対立的特定アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供し、ここでオリゴヌクレオチドは、ヒトのＭＴＨＦＲ遺伝子発現を阻害する。本発明のさらにもう一つの特徴によると、このアンチセンスオリゴヌクレオチドをコード化する配列を含むベクターを提供する。
【００１５】
本発明のもう一つの特徴によると、ＭＴＨＦＲの阻害剤を投与することによる、哺乳動物の癌細胞増殖を選択的に阻害する段階を含む、哺乳動物の癌を処置、安定化、予防する方法を提供し、ここで、阻害剤は、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる。
【００１６】
本発明のもう一つの特徴によると、ＭＴＨＦＲの阻害剤が癌細胞と接触する段階を含む、癌細胞増殖を阻害する方法を提供し、ここで阻害剤は、非癌性細胞増殖に実質的に影響を与えず、および阻害剤は、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる。
【００１７】
本発明のもう一つの特徴によると、薬剤の製造のためのＭＴＨＦＲ阻害剤の使用のためのキット、または本発明方法のためのキットを提供し、癌細胞増殖を選択的に阻害するＭＴＨＦＲの阻害剤を含み、ここで阻害剤は、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現またはＭＴＨＦＲ活性を低下させる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、ＭＴＨＦＲ活性を下方制御することにより、癌細胞の増殖を選択的に阻害する方法を提供する。本明細書において、ＭＴＨＦＲ活性を下方制御することは、ＭＴＨＦＲタンパク質の直接的な阻害、またはＭＴＨＦＲ遺伝子発現の阻害により達成することができる。
【００１９】
ＭＴＨＦＲ欠損の有害な効果に関する先行技術を考慮すると、ＭＴＨＦＲタンパク質のレベルの下方制御は、負の効果しか引き起こさないと予想される。従って、マウスの癌モデルのＭＴＨＦＲタンパク質レベルの、下方制御の特に予想外の結果は、腫瘍の数および大きさを減少させる効果であった。ここに記載されるように、癌細胞および通常の細胞の治療で、非対立的特定アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子発現が阻害されるという、この予想外の発見は、さらに以下に証明された。
【００２０】
定義
他に定義がなければ、ここで用いられるすべての技術的および科学的用語は、この発明に関する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２１】
“非対立的特定”の用語は、ここでは、少なくとも２つの異なるＭＴＨＦＲ対立遺伝子と結合できる化合物をあらわす。
ここで用いられる“特異的ハイブリダイズ”の用語は、検出可能で特異的に第二の核酸と結合する核酸の能力をあらわす。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらのフラグメントは、非特異的核酸と検出可能的に結合するかなりの量を最小化する、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、特異的に標的核酸ストランドにハイブリダイズする。技術的に既知な特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、非常にストリンジェントな条件を用いることができる（例えばAusubel,et al.,(2000)Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons,New york,NY参照）。
【００２２】
典型的に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、通常のハイブリダイゼーション工程により高度のストリンジェント下で遂行される。洗浄条件は、典型的に、約５〜３０分後に洗浄溶液を交換し、１〜３ｘＳＳＣ、０．１〜１％ＳＤＳ、５０〜７０℃である。
【００２３】
ここで用いられる、核酸配列を参照しての“対応する”の用語は、対照ポリヌクレオチド配列のすべて、または一部と同一であるポリヌクレオチド配列を意味する。対照的に、“相補的である”の用語は、対照ポリヌクレオチド配列の補完物のすべて、または一部と同一であるポリヌクレオチド配列を意味するように、ここでは用いられる。例として、“ＴＡＴＡＣ”のヌクレオチド配列は、対照配列“ＴＡＴＡＣ”に対応し、対照配列“ＧＴＡＴＡ”に相補的である。
【００２４】
以下の用語“対照配列”、“比較ウインドウ”、“配列同一”、“配列同一のパーセンテージ”、および“実質同一”は、ここでは２種またはそれ以上のポリヌクレオチドの配列関係を記述するために用いられる。“対照配列”は、配列比較のための基準として用いられる定義された配列であり、対照配列は、より長い配列の一部、例えば全長ｃＤＮＡ、または遺伝子配列のセグメントとしてであり、完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含むことができる。一般的に、対照配列は、長さが少なくとも２０個のヌクレオチド、しばしば長さが少なくとも２５個のヌクレオチドで、頻繁に長さが少なくとも５０個のヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ（１）２つのポリヌクレオチドの間で類似する配列（すなわち完全なポリヌクレオチド配列の部分）を含み、（２）さらに２つのポリヌクレオチドの間で相違している配列を含むことができるために、２種（またはそれ以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は、配列類似点の一部を特定し、比較するために、典型的に２つのポリヌクレオチドの配列を“比較ウインドウ”にわたって、比較することにより遂行される。
【００２５】
ここで用いられる“比較ウインドウ”は、少なくとも２０個の連続的なヌクレオチド位置を有する概念上のセグメントをあらわし、ここでポリヌクレオチド配列は、少なくとも２０個の連続的なヌクレオチドを有する対照配列と比較でき、比較ウインドウのポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な配置に対して、対照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれ以下の付加または欠失（すなわち格差）を含むことができる。
比較ウインドウを配置するための配列の最適な配置は、スミスおよびウオーターマンの部分的ホモロジーアルゴリズム（１９８１）Adv.Appl.Math.2:482により、ニードルマンおよびブンシュのホモロジー配置アルゴリズム（１９７０）J.Mol.Biol.48:443により、ピアースンおよびリップマンの類似方法の探求（１９８８）Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444により、これらのアルゴリズムのコンピューター化された遂行(GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,573 Science Dr.,Madison,WI)により、または検出により実行することができ、そして種々の方法により発生した最高の配置（すなわち比較ウインドウにわたってホモロジーの最も高いパーセンテージをもたらす）が選択される。
【００２６】
“配列同一”の用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較ウインドウにわたって同一であること（すなわちそれぞれのヌクレオチドに基づき）を意味する。“配列同一のパーセンテージ”の用語は、比較のウインドウにわたって、最適に配置した２つの配列を比較し、適合位置の数を出すために同一の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が双方の配列に存在する位置の数を決定し、適合位置の数を比較のウインドウ（すなわちウインドウサイズ）の位置の全体数で割り、配列同一のパーセンテージを出すために計算結果を１００で掛けることにより算出される。
【００２７】
ここで用いられる“実質同一”の用語は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでポリヌクレオチドは、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウインドウにわたって、しばしば少なくとも２５〜５０個のヌクレオチドのウインドウにわたり対照配列と比較して、少なくとも３０パーセントの配列同一、頻繁に少なくとも５０パーセント配列同一、およびより一般的に、少なくとも６０パーセントの配列同一を有する配列を含み、ここで配列同一のパーセンテージは、比較のウインドウにわたって、合計で対照配列の２０パーセントまたはそれ以下の付加または欠失を含んでもよいポリヌクレオチド配列と、対照配列を比較することにより算出される。
【００２８】
ＭＴＨＦＲ阻害剤
本発明は、哺乳動物（例えばヒト）のＭＴＨＦＲ活性を下方制御することにより、癌細胞増殖を選択的に阻害する化合物を提供する。選択的阻害の程度は、一般的に哺乳動物の癌を処置、安定化、予防するのに充分である。本明細書中、選択的阻害は、癌細胞増殖が通常の細胞増殖よりも実質的に阻害されることを意味する。本発明の特異的態様において、ＭＴＨＦＲ阻害剤で処置された通常の細胞増殖も完全に、または部分的に影響を受けない条件下で、癌細胞増殖はＭＴＨＦＲ阻害剤により阻害される。通常の細胞増殖がＭＴＨＦＲ阻害剤との接触により部分的に影響を受けるとき、癌細胞への影響と通常の細胞への影響との間の差異は、癌細胞がＭＴＨＦＲ阻害剤との接触により、優先的に阻害され、および／または死滅することである。
【００２９】
本発明による阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、生物学的に不活性なＭＴＨＦＲタンパク質またはフラグメント、ペプチド、小さい分子の阻害剤または抗体である。
【００３０】
（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド
この発明の明細書中、アンチセンス化合物を特別な核酸に“標的にする”ことは、多段階工程である。その工程は、一般的に機能を調節できる核酸配列の同定から始まる。本発明において、標的は、ＭＴＨＦＲをコード化する遺伝子である。標的工程もまた、所望の効果、すなわち遺伝子によりコード化されたタンパク質の発現の調節を生じうることを、引き起こすアンチセンス相互作用に対する、この遺伝子内の位置または場所の決定を含む。
【００３１】
一般的に、アンチセンス調節のために標的にされる遺伝子に５つの領域があり、５’非翻訳領域（５’―ＵＴＲ）、翻訳開始または出発コドン領域、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、翻訳終了または停止コドン領域、および３’非翻訳領域（３’―ＵＴＲ）である。
【００３２】
“翻訳開始コドン”および“出発コドン”の用語は、真核生物においてはどの場合も開始アミノ酸が典型的にメチオニンであるが、多くのコドン配列を包含することができる。真核生物の遺伝子は、２種またはそれ以上の代替的な出発コドンを有し、それらのうちのいずれか一つは特別な細胞型または細胞組織で、または特別な規定条件下で翻訳開始のために好ましくは用いられてもよいことが技術的に知られている。本明細書中、“出発コドン”および“翻訳開始コドン”は、生体内でそのようなコドンの配列に関わらずにＭＴＨＦＲをコード化する遺伝子から転写された、ｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するために用いられる単数または複数のコドンをあらわす。
【００３３】
真核生物の転写物は直接的に翻訳されることは技術的に既知であるが、しかし大部分の哺乳類のＯＲＦｓは、“イントロン”として知られ、翻訳される前に転写物から削除された１種またはそれ以上の配列を含有し、ＯＲＦの発現（非削除）部分は、“エクソン”としてあらわされる(Alberts et al., (1983) Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing Inc., New York, 411〜415頁)。本明細書中、イントロンおよびエクソンの双方は、アンチセンスのための標的として役立つことができる。
【００３４】
ある態様では、ＯＲＦは、生体内でのある機能的意味が原因で、アンチセンスのために標的にできる１種またはそれ以上の部位も含有することができる。部位の後者のタイプの例は、遺伝子内のステムループ（ｓｔｅｍ―ｌｏｏｐ）構造（例えば米国特許第５，５１２，４３８参照）、および非処理ｍＲＮＡ分子内にイントロン／エクソン接合部位を含む。加えて、ｍＲＮＡ分子は、アンチセンスのために標的として役立つことができる５’キャップ領域を有する。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’三リン酸塩結合を経由してｍＲＮＡの大部分の５’残基と結合するＮ７―メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、キャップと隣接する最初の５０個のヌクレオチドだけではなく、５’キャップ構造それ自体を含むとみなされる。
【００３５】
本発明によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非対立的特定的で、従って、標的にされる遺伝子の領域は保存された領域であり、すなわちＭＴＨＦＲ遺伝子の異なった対立遺伝子に配列差異がない。本発明態様の一つに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン１〜１１または他のＭＴＨＦＲエクソンの一つのすべて、または部分に標的をあわせる(Goyette et al.,(1998)Mammalian Genome 9:652-656)。関連した態様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＴＨＦＲ遺伝子のエクソン５に標的をあわせる。本発明のさらに関連した態様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＡＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＧＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を有し、ＭＴＨＦＲ遺伝子のエクソン５の７９６〜８１５ヌクレオチドと結合する。
【００３６】
本発明によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトのＭＴＨＦＲ対立遺伝子の少なくとも７０％と結合する。関連した態様には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトのＭＴＨＦＲ対立遺伝子の少なくとも８０％、または少なくとも９０％と結合する。本発明のもう一つの態様には、アンチセンス核酸は、多様な部位を含有するＭＴＨＦＲ遺伝子の領域と結合しない。
【００３７】
単数または複数の標的部位がいったん識別されると、所望の結果を与える標的と十分に相補的な（すなわち充分な強度および特異性をともなってハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドが選択される。
【００３８】
本発明によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列が二本鎖、ヘアピンを最も形成しそうになく、またはホモオリゴマー／配列の繰り返しを最も含有しそうにないＭＴＨＦＲ遺伝子と相補的な配列から選択される。オリゴヌクレオチドは、さらにＧＣクランプを含有できる。これらの性質は、市販のコンピューターソフトウエア、例えばコンピューターモデリングプログラムＯＬＩＧＯ（登録商標）Primer Analysis Software, Version 5.0 (National Biosciences, Inc.,Plymouth,MNにより記載される）を用いることで、定性的に決定することができる。
【００３９】
効果的であるためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、典型的に７個と３５０個の間である。本発明の態様の一つには、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約７個から約５０個のヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド類似体を含む。関連した態様には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５個から約２５個のヌクレオチド、もしくはヌクレオチド類似体、または約１８個から約２２個のヌクレオチド、もしくはヌクレオチド類似体を含む。
【００４０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その標的配列と１００％の同一性を有する必要はないと、技術的に理解されている。従って、本発明は、標的配列と少なくとも約７５％の同一性のある配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドだけでなく、標的配列と１００％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをも意図する。本発明の一つの態様には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約９０％同一である配列を有する。関連した態様には、標的配列と少なくとも約９５％同一である配列を有し、いくつかの塩基のギャップ、または不一致を許容している。本発明によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、もう一つのヒトの発現配列（ＥＳＴ）、またはヒトの他の繰り返しＥＳＴｓの領域の逆の補完物に５０％未満の同一性である。同一性は、例えばウィスコンシンコンピューターグループ（ＧＣＧ）ソフトウエアの大学のＢＬＡＳＴＮプログラムを用いることにより決定することができる。
【００４１】
代替的に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者には既知の標準技術を用いて決定され、標的ＭＴＨＦＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズする能力により、定義することができる（例えばハイブリダイゼーション分析）。
本発明中、“オリゴヌクレオチド”の用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、修正ＲＮＡもしくは修正ＤＮＡ、またはＲＮＡ模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）もしくはＤＮＡ模倣体のアンチセンスオリゴマー、またはポリマーをあらわす。従って、この用語は、非自然的に発生し同様に機能する部分を有するオリゴヌクレオチドだけでなく、自然発生する核酸塩基、糖、および分子内ヌクレオシド共有（骨格）結合からなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような修正または置換オリゴヌクレオチドは、促進された細胞内取り込み、標的核酸に対する促進された親和性、およびヌクレアーゼ存在下での増大した安定性などの所望の性質のために、天然型でしばしば好まれる。
【００４２】
この発明で有用な、修正または置換アンチセンス化合物の例は、修正された骨格、または非天然的に発生する分子内ヌクレオシド結合を含有するオリゴヌクレオチドを含む。本発明によると、修正された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格中にリン原子を保持するもの、および骨格中にリン原子を有さないものを含む。この明細書の目的において、および時々技術的に参照されるように、分子内ヌクレオシド骨格中のリン原子を有さない修正オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドとみなすことができる。
【００４３】
典型的な修正オリゴヌクレオチド骨格は、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、および３’―アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’アミノホスホロアミデート、ならびにアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノ（ｔｈｉｏｎｏ）ホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’―５’結合、これらの２’―５’結合アナログ、逆転した極性を有するボラノホスフェートであり、ここでヌクレオシド部位の隣接対は、３’―５’から５’―３’、または２’―５’から５’―２’で結合する。様々の塩、混合塩、およびフリーの酸型もまた含まれる。
【００４４】
リン原子を含まない典型的な修正オリゴヌクレオチド骨格は、短い鎖状アルキルまたはシクロアルキルの分子内ヌクレオシド結合、ヘテロ原子を混合したアルキル、またはシクロアルキル分子内ヌクレオシド結合、または短い鎖状ヘテロ原子性、またはヘテロ環の１種または２種以上の分子内ヌクレオシド結合により形成される。そのような骨格は、モルホリン結合（ヌクレオシドの糖部分から分かれて形成された）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケンを含有する骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；およびＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の混合成分を有する他のものである。
【００４５】
本発明はまた、糖、およびヌクレオチド部位の分子内ヌクレオシド結合の双方が、新規な基で置換されたオリゴヌクレオチド模倣体を意図する。塩基部位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために保持されている。そのようなオリゴヌクレオチド模倣体の例は、優れたハイブリダイゼーション適性を有すると示され、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である(Nielsen et al., (1991) Science, 254:1497-1500)。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミドを含有する骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置換される。核酸塩基は保持され、直接または間接的に、骨格のアミド部位のアザー窒素原子に結合する。
【００４６】
修正オリゴヌクレオチドは、１種または２種以上の置換糖部位を含有することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、２’位で以下の置換基：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの一つを有する糖を含み、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または無置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、またはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルでよい。そのような基の例は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］］２であり、ここでｎおよびｍは、１から約１０である。代替的に、オリゴヌクレオチドは、２’位で以下の置換基：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルアカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、オリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および類似の性質を有する他の置換基の一つを含むことができる。特別な例は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  ７８：４８６−５０４）、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、２’−メトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）である。
【００４７】
類似の修正は、オリゴヌクレオチドの他の位置でも、特に、３’末端ヌクレオチドの糖の３’位、または２’−５’結合オリゴヌクレオチドの３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行うことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代用としてシクロブチル部位などの模倣糖を有することができる。
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基への修正または置換基を含むことができる。ここで用いられるように、“無修正”または“天然”核酸塩基は、プリン基部のアデニン（Ａ）、およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン基部のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修正核酸塩基は、他の合成核酸塩基、ならびに５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニル（ｐｒｏｐｙｎｙｌ）ウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン５−ウラシル（疑似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザアデニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニン３−デアザアデニンなどの天然核酸塩基を含む。
【００４８】
更なる核酸塩基は、U. S. Pat. No.3,687,808; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, (1990) pp 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons; Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, Int. Ed., 30:613；およびSanghvi,Y. S.,(1993) Antisense Research and Applications, pp 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Pressに開示されるものを含む。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換基は、０．６〜１．２℃の差で、核酸の二本鎖安定性を増大させると示されている(Sanghvi, Y. S., (1993) Antisense Research and Applications, pp 276-278, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, Boca Raton)。
【００４９】
本発明に含まれるもう一つのオリゴヌクレオチド修正は、化学的にオリゴヌクレオチドの１種または２種以上の部位または共役に結合し、活性、細胞分布、オリゴヌクレオチドの細胞摂取を高める。そのような部位は、限定はしないが、コレステロール部位(Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., (1994) Bioorg. Med. Chem. Let., 4:1053-1060)、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール(Manoharan et al., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306-309; Manoharan et al., (1993) Bioorg. Med. Chem. Lett., 3:2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res., 20:533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., (1991) EMBO J., 10:1111-1118; Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259:327-330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie, 75:49-54)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ラク（ｒａｃ）−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ラク−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート(Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18:3777-3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14:969-973)、または酢酸アダマンタン(Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654)などの脂質部位、またはパルミチン部位(Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264:229-237)、またはオクタデシルアミン、またはヘキシルアミノーカルボニルーオキシコレステロール部位(Crooke et al., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:923-937)を含む。
【００５０】
当業者は、与えられるオリゴヌクレオチドの全ての部位に対して、一定に修正することは、必要でないと認識する。従って、本発明は、当該修正をオリゴヌクレオチド内の単一のオリゴヌクレオチド、または単一のヌクレオシドにより多く組み込むことを意図する。さらに本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に少なくとも一つの領域を含有し、ここでオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対して耐性が増大した、細胞摂取が増大した、および／または標的核酸に対する結合親和性増大したオリゴヌクレオチドを協議できるように修正される。オリゴヌクレオチドの付加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂することのできる酵素のための基質として役立つことができる。例として、ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡストランドを開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮａｓｅ  Ｈの活性化は、ＲＮＡターゲットの開裂をもたらし、それによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率を非常に高める。結果的に、キメラオリゴヌクレオチドを用いたとき、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、比較できる結果をより短いオリゴヌクレオチドで、しばしば得ることができる。ＲＮＡターゲットの開裂は、通常ゲル電気泳動法、および必要であるならば技術的に既知の関連した核酸ハイブリダイゼーションにより検知することができる。
【００５１】
本明細書中、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレアーゼによる分解に影響を受けやすくないように修正されるか、または代替的に、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼからのオリゴヌクレオチドを、それ自体で保護する送達媒体に置く場合には“ヌクレアーゼ耐性”である。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、およびモルホリノオリゴマーを含む。ヌクレアーゼ耐性を与えるための適切な送達媒体は、例えばリポソームを含む。
【００５２】
本発明は、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基を含有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに意図する。
本発明の一つの態様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１種または２種以上のヌクレオチド内の非結合ホスホリル酸素が、硫黄に置換されたホスホロチオエート核酸である。関連した態様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＴＨＦＲ遺伝子のエクソン５に結合する５’−ＡＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＧＴＡ−３’配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を有する、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【００５３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の通常の技術により調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems Canada Inc., Mississauga, Canadaから入手できる装置などの市販の装置を利用する固相合成を用いて、調製することができる。技術的に既知であるが、ホスホロチオエートおよびアルキル化された誘導体などの修正オリゴヌクレオチドは、容易に類似方法により調製できる。
代替的に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に発生するＭＴＨＦＲ遺伝子の酵素消化により、技術的に既知の方法で調製できる。
【００５４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、組み替えＤＮＡ技術により調製することができる。従って、本発明は、ＭＴＨＦＲ遺伝子を標的にする、１種または２種以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコード化する、核酸配列を含む発現ベクターを包含する。そのような発現ベクターによりコード化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、適切なホスト細胞に発現される。適切な発現ベクターは、技術的に既知の工程を用いて容易に構築することができる。適切なベクターは、制限はしないが、プラスミド、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄｓ）、コスミッド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡウイルスを含む。一般的に、ウイルスベクターは複製欠損であるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる。
【００５５】
当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現のための、適切なホスト細胞の選択は、選択されるベクター次第であることを理解している。ホスト細胞の例は、制限はしないが、細菌、酵母、昆虫、植物、および哺乳動物の細胞を含む。
【００５６】
当業者はまた、発現ベクターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の効率的な転写、または翻訳に必要な調整因子をさらに含むことができることを理解する。ベクターに取り込むことのできる調整因子の例は、制限はしないが、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリアデニル化シグナルなどの転写因子を含む。従って、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコード化する核酸配列に、動作可能なように結合する１種または２種以上の調整因子を含むベクターを提供する。当業者は、適切な調整因子の選択は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現のための、選択されるホスト細胞次第であること、およびそのような因子は細菌、かび、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む様々のソースに由来することを理解する。
【００５７】
本明細書中、発現ベクターは、付加的にレポーター遺伝子を含有することができる。適切なレポーター遺伝子は、制限はしないが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、発光酵素、およびβ−グルクロニダーゼを含む。レポーター遺伝子の発現ベクターへの組み込みは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの転写が、レポーター遺伝子の発現により発生するシグナルを検知することにより、モニターされることを可能とする。
【００５８】
本発明によると、発現ベクターは、技術的に既知の多様な方法の一つにより、適切なホスト細胞または組織に導入することができる。これらの方法は、例えば、安定なまたは一時的なトランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーション、および組み込みウイルスベクターの感染を含む。発現ベクターを構築する、およびこれらのベクターをホスト細胞に導入する方法は技術的に既知であり、Sambrook et al., (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., (2000) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New Yorkに一般的に記載される。
【００５９】
本発明と関連した態様に、ＭＴＨＦＲ阻害剤は、ハイブリダイズして、ＭＴＨＦＲ遺伝子の５’末端で３重らせん構造を形成し、転写を妨害するために用いることのできるオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドを形成する３重らせん構造は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関連して、上記したように調製することができる。同様に、オリゴヌクレオチドを形成する３重らせんをコード化する核酸は、上記したようにベクター内でクローニングすることができる。
【００６０】
ＭＴＨＦＲ遺伝子発現を阻害する、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを形成する３重らせんの能力は、当業者に既知の多くの技術により決定することができる。例えば、ＭＴＨＦＲｍＲＮＡのレベルは、標準ノーザンブロット分析より決定することができ、および／またはＭＴＨＦＲタンパク質のレベルは、標準ウエスタンブロット分析により決定することができる。これらの方法を行う方法は、当業者にはよく知られている（参照、例えば、Ausubel et al., (2000) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York: Coligan, et al., (2001) Current Protocols in Protein Science, Wiley & Sons, New York)。本発明の態様に、ＭＴＨＦＲタンパク質のレベルは、Christensen, et al., (1997) Arterioscler. Thromb. Vasc. Bio., 17:573-596に記載されるように、ＭＴＨＦＲ酵素活性のレベルを測定することにより、決定される。代替態様には、ＭＴＨＦＲタンパク質のレベルは、ホモシステインの細胞内レベルの結果的な増大、または５−メチルテトラヒドロ葉酸またはメチオニンの結果的な減少を測定することにより、評価することができる。
【００６１】
（ｉｉ）  リボザイム
本発明の一つの態様には、ＭＴＨＦＲ阻害剤は、ＭＴＨＦＲをコード化しているＲＮＡを特異的に標的にするリボザイムである。リボザイムは、ヌクレオチド塩基配列特異的方法で、他の分離ＲＮＡ分子を繰り返し開裂することができる酵素活性を有するＲＮＡ分子である。そのような酵素のＲＮＡ分子は、実質的にいかなるＲＮＡ転写物をも標的にすることができ、実効的開裂は、生体外で達成することができる（Kim et al., 84 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8788, 1987; Haseloff and Gerlach, 334 Nature 585, 1988; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; and Jefferies et al., 17 Nucleic Acids Research 1371, 1989.）。
【００６２】
リボザイムは、まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを裂くために作用するＲＮＡの酵素部位に極めて近接に有するリボザイムの標的ＲＮＡ結合部分を介して起こる。従って、そのリボザイムは、まず相補的塩基対を介して標的ＲＮＡを認識し、そして結合し、一旦正確な部位と結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを裂く。そのような標的ＲＮＡの戦略的開裂は、コード化されているタンパク質を直接合成することのできる能力を破壊する。リボザイムが結合して、そのＲＮＡ標的を開裂した後、もう一つの標的を探索するＲＮＡから解放されて、繰り返して新しい標的と結合し、裂くことができる。
【００６３】
ハンマーヘッドのリボザイムは、ヌクレオチド配列の少なくとも標的ＲＮＡの部分と相補的なハイブリダイズ領域、および標的ＲＮＡを裂くように適合されている触媒領域を含む。ハイブリダイズ領域は、９（９）またはそれ以上のヌクレオチドを含有する。従って、本発明のハンマーヘッドのリボザイムは、ＭＴＨＦＲをコード化する遺伝子と相補的なハイブリダイズ領域を有し、長さが少なくとも９個のヌクレオチドである。そのようなリボザイムの構造および製造は、技術的によく知られており、Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591に充分に記載されている。
【００６４】
本発明のリボザイムもまた、Tetrahymena thermophilaで自然に発生し（ＩＶＳ，またはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られる）、トーマスグーチおよび共同著作者により広範囲に記載される(Zaug, et al., 1984, Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324:429-433; 国際公開公報No. WO 88/04300 by University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216)ようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後“Cech-type ribozymes”という）を含む。グーチエンドリボヌクレアーゼは、標的ＲＮＡの開裂が起こる後に、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズする８個の塩基対活性部位を有する。
【００６５】
リボザイムと、最大リボザイム活性を生み出す基質との間に結合自由エネルギーの狭い範囲がある。そのような結合エネルギーは、基質結合アームの、ＧからＩ、およびＵからＢｒＵ置換（または同等物置換）によるリボザイムの製造により最適化することができる。このことは、実質的な標的認識配列、２つの基質結合アームの長さ、またはリボザイムの酵素の部位の変換をともなわずに、結合自由エネルギーの操作を許容する。自由エネルギー対リボザイム活性曲線の形は、各々の塩基（またはいくつかの塩基）の修正、無修正の実験からのデータを用いることにより、リボザイム／基質相互作用の大きさの変化の面倒をともなうことなく、容易に決定することができる。
【００６６】
そのような実験は、最も活性なリボザイム構造を示唆する。従って、修正塩基の使用は、最大リボザイム活性を保証する結合自由エネルギーの“微調整”を可能にする。加えて、そのような塩基、例えばＧに対するＩの置換は、非標的ＲＮＡの開裂が問題となるとき、基質特異性のより高いレベルを可能にすることができる。
【００６７】
ＭＴＨＦＲｍＲＮＡ発現を阻害する本発明のリボザイムの能力は、当業者には既知の多くの技術により決定することができる。例えば、ＭＴＨＦＲタンパク質の濃度は、標準ウエスタンブロット分析により決定することができる。この方法を行う技術は、当業者にはよく知られている（参照、例えば、Ausubel et al., (2000) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York: Coligan, et al., (2001) Current Protocols in Protein Science, Wiley & Sons, New York)。本発明の一つの態様にはChristensen, et al., (1997) Arterioscler. Thromb. Vasc. Bio., 17:573-596に記載されるように、ＭＴＨＦＲタンパク質のレベルをＭＴＨＦＲ酵素活性のレベルを測定することにより決定される。代替的態様には、ＭＴＨＦＲタンパク質のレベルは、ホモシステインの細胞の結果として生じた増大、もしくはここに記載されるように、５−メチルテトラヒドロ葉酸またはメチオニンの減少を測定することにより、評価することができる。
【００６８】
（ｉｉｉ）生物学的に不活性なＭＴＨＦＲタンパク質、またはＭＴＨＦＲタンパク質のフラグメント
本発明は、野生型タンパク質の作用を妨害し、従ってＭＴＨＦＲ活性の阻害剤として作用する、生物学的に不活性なＭＴＨＦＲタンパク質、またはＭＴＨＦＲタンパク質のフラグメントの使用を意図する。
阻害性のフラグメントの候補は、野生型ＭＴＨＦＲタンパク質から生じるフラグメントから無作為に選択することができる。候補のポリペプチドフラグメントを生じる方法は、当業者にはよく知られており、制限はしないが、自然タンパク質の酵素的、化学的または機械的開裂、そのようなフラグメントをコード化する核酸の発現などを含む。生物学的に不活性なＭＴＨＦＲタンパク質は、当業者には既知の技術の様々の方法により生成する。例えば、タンパク質をコード化する核酸の特定部位またはランダム変異技術、化学的または物理的手段によるタンパク質の不活性化による。
【００６９】
野生型ＭＴＨＦＲの活性を妨害する、生物学的不活性ＭＴＨＦＲタンパク質またはフラグメントの能力は、標準技術、例えばChristensenらにより記載される方法(1997) Arterioscler. Thromb. Vasc. Bio., 17:573-596、または競合する結合を調査することにより、決定することができる。
【００７０】
（ｉＶ）  ペプチド阻害剤
本発明はまた、ＭＴＨＦＲタンパク質に結合し、活性を阻害するポリペプチドおよびペプチドを提供する。そのようなペプチドを識別する一つの典型的な方法は、ファージディスプレイ技術による。無作為の短いペプチドのファージディスプレイライブラリは、例えばNew England Biolabsから商業的に入手可能で、“パンニング”として知られる生体外の選択工程を通じて利用される。簡単な形態では、パンニングは、標的分子で被膜されたプレート、またはビーズをともなって、ファージ提示されたペプチドのライブラリをまず培養し、最後に特異的に結合されたファージを抽出することを含む。本発明の目的のために、標的分子は、ＭＴＨＦＲタンパク質、またはそれらのフラグメントである。
【００７１】
特異的に結合するファージにより提示されたペプチドは、その後に単離され、当業者に既知の標準技術により配列される。ある場合には、単離ペプチドの結合強度は、その後に標準技術を用いてテストされる。ＭＴＨＦＲ活性を阻害するペプチドの能力はまた、ここに記載されるような技術的に既知の検定法を用いて決定することができる。
【００７２】
（ｖ）  小さい分子の阻害剤
潜在的に阻害性の化合物は、合成または天然化合物の大きなライブラリから選別される。糖類、ペプチド、および核酸を基本にした化合物の無作為で、および直接的合成のために、多数の手段が現在用いられて、技術的にはよく知られている。合成化合物のライブラリは、Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, N.J.), Brandon Associates (Merrimack, N.H.), and Microsource (New Milford, Conn.)を含む多くの会社から商業的に入手可能である。珍しい化学的なライブラリもまた、Aldrich (Milwaukee, Wis.)から入手可能である。コンビナトリアルライブラリもまた入手可能で、標準手順により用意することができる。代替的に、細菌、カビ、植物、および動物の抽出物の形態での天然化合物のライブラリは、例えばPan Laboratories (Bothell, Wash.) または MycoSearch (North Carolina)から入手可能で、容易に生産可能である。付加的に、天然でおよび合成的に造られたライブラリおよび化合物は、通常の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に修正される。
【００７３】
これらのライブラリは、ＭＴＨＦＲタンパク質の活性を阻害する能力（例えば、Christensenらにより記載された方法を用いて）、または既知の技術、例えば核酸結合検定法、ゲルシフト法、その他同種類のものによるＭＴＨＦＲ遺伝子の発現を阻害する能力に対して（例えば、Christensenらにより記載された方法を用いて）選別することができる。
【００７４】
（ｖｉ）  抗体
本発明はまた、ＭＴＨＦＲタンパク質、またはそれらのフラグメントに対して引き起こされる、ＭＴＨＦＲ活性の阻害剤としての抗体、および抗体フラグメントの使用を意図する。
【００７５】
抗体の製造のために、ヤギ、ウサギ、ネズミ、マウス、ヒト、および他のものを含む様々なホストに、ＭＴＨＦＲタンパク質を備えた、または免疫原性質を有するそれらのフラグメント、もしくはオリゴペプチドを備えた注射により、免疫性を与えることができる。ホスト種に依存して、種々のアジュバントは、限定はされないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、およびリゾレシチン、プルロニック(pluronic)、ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、およびジニトロフェノールなどの表面活性基質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの例は、BCG(bacilli Calmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumを含む。
【００７６】
ＭＴＨＦＲに対する抗体を誘発するために用いるオリゴペプチド、ペプチド、またはフラグメントは、約５個ほどのアミノ酸からなるアミノ酸配列を有することができる。本発明の一つの態様には、少なくとも約１０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列が用いられる。これらのオリゴペプチド、ペプチド、またはフラグメントは、天然に発生する小さい分子の全アミノ酸配列を含有する、天然タンパク質のアミノ酸配列の部分と同一になることができる。必要に応じて、短い長さのＭＴＨＦＲアミノ酸は、ＫＬＨなどのもう一つのタンパク質に融合することができ、キメラ分子に対する抗体をつくることができる。
【００７７】
ＭＴＨＦＲに対するモノクローナル抗体は、培養物の連続的な細胞株により、抗体分子の製造を提供する技術を用いて調製することができる。これらは、限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトのＢ−細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術を含む（参照、例えば、Kohler, G. et al. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030; and Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120)。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、精製ＭＴＨＦＲを伴って、マウスまたはネズミなどの動物を免疫することにより得ることができる。免疫にされた動物からの脾臓細胞は、その後に標準技術を用いて不滅にする。培養上清が、１００ｎｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有するＭＴＨＦＲの活性阻害を引き起こす抗体を含有する、それらの不滅化された単離細胞は、その後に、当業者に既知で精通している技術を用いることで選択され、クローニングされる。これらのクローンにより製造されたモノクローナル抗体は、その後に標準プロトコルにより単離される。
【００７８】
免疫にされた動物の脾臓細胞の不滅化は、(1980) J. Imm. Meth. 39:285-308の方法に従って、これらの細胞をＰ３Ｘ６３−Ａｇ  ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）などの骨髄腫細胞株に融合することにより実行される。当業者に既知の他の方法もまた、脾臓細胞を不滅化するために用いることができる。ＭＴＨＦＲタンパク質に対する所望の抗体を製造する不滅化細胞を検知するために、培養上清のサンプルは、ＭＴＨＦＲとの反応性に対する酵素免疫測定法(ELISA)を用いてテストされる。ＭＴＨＦＲの酵素活性を阻害する、それらの抗体を得るために、ＭＴＨＦＲに結合する抗体を製造する、クローンの培養上清は、ここに記載されるような適切な検定法を用いて、付加的にＭＴＨＦＲ活性の阻害に対する試験がなされる。培養上清がＭＴＨＦＲ活性の所望の阻害を示すクローンは膨張し、これらのクローンにより製造される抗体は、既知方法により単離される。
【００７９】
付加的に、適切な抗原特異性、および生物的活性を備えた分子を得るために、ネズミの抗体遺伝子をヒトの抗体遺伝子への挿入などの、“キメラ抗体”の製造のために発展した技術を用いることができる(Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. et al. (1984) Nature 312:604-608; and Takeda, S. et al. (1985) Nature 314:452-454)。代替的に、単鎖抗体の製造のために記載された技術を、技術的に既知の方法を用いて、ＭＴＨＦＲ特異的な単鎖抗体を製造するために適合させることができる。
【００８０】
関連した特異性を有するが、異なるイディオタイプ組成の抗体は、無作為な組み合わせの免疫グロブリンライブラリから、鎖を切り混ぜることにより生成させることができる（参照、例えば、Burton D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10134-10137)。
抗体はまた、リンパ球の個体群の生体内での製造を誘発すること、または免疫グロブリンライブラリ、もしくは文献に開示されるような(Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349:293-299)非常に特異的に結合する試薬のパネルの選別により、製造することができる。
【００８１】
ＭＴＨＦＲに対する特異的結合部位を含有する抗体フラグメントもまた生成させることができる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子のペプシン消化により製造されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより生成するＦａｂフラグメントを含む。代替的に、Ｆａｂ発現ライブラリを構築し、所望の特異性（参照、例えば、Huse, W. D. et al. (1989) Scienc,e 246:1275-1281）を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とする。
【００８２】
様々の免疫測定を、所望の特異性を有する抗体を同定するために選別する目的で用いることができる。確立された特異性を有する多クローンまたは単クローン抗体を用いる、競合結合測定法、または免疫放射定量測定法に対する多くのプロトコルが、技術的によく知られている。そのような免疫測定法は、典型的にＭＴＨＦＲとその特異的抗体との間の錯体形成の測定を含む。そのような技術の例は、ＥＬＩＳＡｓ、放射免疫測定法、（ＲＩＡｓ）、および蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を含む。代替的に、２つの非妨害ＭＴＨＦＲエピトープに反応性のある単クローン抗体を利用する、２部位の単クローンに基づく免疫測定法、または競合結合測定法を用いることができる（参照Maddox, D. E. et al. (1983) J. Exp. Med. 158:1211-1216）。これら、および他の測定法は、技術的にはよく知られている（参照、例えば、Hampton, R. et al. (1990) Serological Methods: A Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn., Section IV; Coligan, J. E. et al. (1997, and periodic supplements) Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, New York, N.Y.; Maddox, D. E. et al. (1983) J. Exp. Med. 158:1211-1216）。
【００８３】
ＭＴＨＦＲ阻害剤の選択
本発明の阻害剤を効果的にするために、それらは、適切な程度に癌細胞中のＭＴＨＦＲの活性を減少させなければならない。上記したように、阻害剤に応じてＭＴＨＦＲ活性を下方制御する程度は、多くの方法で測定することができる。例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の細胞レベルを測定すること、ＭＴＨＦＲタンパク質の活性を直接測定すること、もしくは細胞のホモシステインの増加、または細胞の５−メチルテトラ葉酸またはメチオニンの減少を測定すること、候補の阻害剤を伴う以下の処置、および候補の阻害剤が非存在下で得られる結果と比較することである。
【００８４】
典型的に、効果的な阻害剤は、ＭＴＨＦＲｍＲＮＡ、タンパク質、または酵素活性のレベル、もしくは、阻害剤非存在下での対応するレベルと比較したとき、少なくと２０％のＭＴＨＦＲ阻害剤を投与される、細胞内の５−メチルテトラヒドロ葉酸、またはメチオニンのレベルを低下させる。より典型的に、レベルは少なくとも４０％に低下、しばしば少なくとも６０％、８０％、または９０％、ときどき少なくとも９５％に低下させる。細胞内のホモシステインのレベルを、阻害剤の有効性の指標として測定するとき、このレベルは、阻害剤非存在下より少なくとも２０％大きい。より典型的に、レベルは少なくとも４０％、しばしば少なくとも６０％、８０％、または９０％増加させる。本発明はまた、細胞内のホモシステインのレベルが、阻害剤非存在下より、１００％、２００％、または５００％ほどにもなる阻害剤を提供する。
【００８５】
代替的に、阻害剤存在下でのＭＴＨＦＲｍＲＮＡ、タンパク質、酵素活性のレベルは、ＭＴＨＦＲナンセンス変異に対する同型の細胞などの、機能的ＭＴＨＦＲを発現しない対照細胞のレベルと比較することができる。この場合、そのレベルは、対照細胞のレベルの典型的に２０倍、より典型的に５倍、およびしばしば２倍以下である。
【００８６】
癌細胞に対するＭＴＨＦＲ阻害剤の効果のテスト
癌細胞の増殖を選択的に阻害する、本発明の阻害剤の能力は、阻害剤を伴って適切な癌細胞株を処置することにより、および適切な対照で処置された細胞の増殖、および／または生存を比較することにより決定することができる。阻害剤の選択性を決定するために、非形質転換細胞株は阻害剤を伴って処置することができ、同様の方法で増殖、および／または生存を観察することができる。
【００８７】
本発明のＭＴＨＦＲ阻害剤の効果をテストするための適切な癌細胞株の例は、限定はされないが、大腸癌細胞株ＳＷ４０、ＬＯＶＯ、ＣａＣＯ―２、Ｃｏｌｏ３２０、ＳＷ６２０、およびＳＷ１２２２；神経芽細胞腫細胞株ＢＥ（２）ＣおよびＳＫ―Ｎ−Ｆ１；乳癌細胞株ＭＣＦ７およびＳＫＢｒ３；および神経こう腫細胞株Ｕ８７―ｌａｃＺである。他の多くの適切な癌細胞株は、商業的に入手可能である。これらのテストに対する適切な対照は、未処置の細胞、非特異的阻害剤などの対照化合物で処置された細胞、または阻害剤で処置された非形質転換細胞を含む。
【００８８】
典型的には、ここで記載されるものなどのいかなる標準測定法を用いて測定しても、処置を切り抜ける癌細胞の存在は、最初の癌細胞の数の少なくとも２０％以下である。より典型的には、その数は、少なくとも４０％より低く、頻繁に少なくとも６０％または８０％より低く、および時々１００％より低い。本発明ＭＴＨＦＲ阻害剤は、急速に増殖しない非癌細胞に著しい影響は与えない。本発明の一つの態様には、通常の細胞の生存パーセントにしめる癌細胞の生存パーセントの比率は、通常の細胞が急速には増殖しないとき１未満である。より典型的に、この比率は０．９、０．８、０．７または０．６未満である。
【００８９】
本発明によると、阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるとき、ＭＴＨＦＲアンチセンスヌクレオチドの投与後に存在する癌細胞の数は、ＭＴＨＦＲ核酸領域の逆の補完物と７０％未満で同一であるポリヌクレオチド配列を有するコントロールオリゴヌクレオチドの投与後に、存在するガン細胞の数より少なくとも２倍小さい。より典型的に、その数は、少なくとも５倍大きく、頻繁に少なくとも１０倍、２０倍大きく、および時々５０倍大きい。
【００９０】
本発明の一つの態様に、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の効果は、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤またはコントロールオリゴヌクレオチドを、癌細胞に核酸を導入することにより決定される。細胞の最初の数は、例えば血球計算板を用いて決定され、処置を切り抜けた細胞の数は、例えば比色細胞タンパク質測定法を用いて決定される。処置を切り抜ける細胞のパーセンテージは、その後に計算することができる。関連した態様に、癌細胞増殖を減少させる場合の、アンチセンススオリゴヌクレオチド阻害剤の特異性は、線維芽細胞（すなわち非形質転換）の細胞株に核酸を導入すること、および上記したように生存細胞を決定することでのみ決定される。
【００９１】
ＭＴＨＦＲ阻害剤の投与
本発明の阻害剤は、単独で、または薬理学的組成物の形態で投与できる。従って本発明は、１種または２種以上のＭＴＨＦＲ阻害剤、および薬理学的に許容できる希釈剤、または補形薬を含む薬理学的組成物を提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドである本発明阻害剤を含む薬理学的組成物の場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレチドをコード化するベクターとして、存在することができる。同様に、タンパク性分子（すなわち、ＭＴＨＦＲフラグメント、ＭＴＨＦＲ突然変異体、ＭＴＨＦＲ特異的抗体、またはそれらのフラグメント）である本発明の阻害剤を含む薬理学的組成物である場合、その分子は、その分子をコード化する核酸として、存在することができる。関連した態様に、この核酸はベクター中に存在する。
【００９２】
本発明の阻害剤、およびその阻害剤を含む薬理学的組成物は、局所処置、全身処置のどちらが望ましいのか、および処置される範囲に依存して、多くの方法で投与することができる。投与は、局所的（眼を含み、膣および直腸送達を含む粘膜への投与）、肺、（例えば噴霧器、気管内、鼻腔内、表皮、経皮的によるパウダーまたはエアゾールの吸息、または吸入）、経口的または非経口的である。非経口的投与は、静脈内、動脈内、比下、腹膜内、または筋肉内注射、もしくは注入、または頭蓋内、例えばクモ膜下、または脳室内の投与を含む。
【００９３】
本発明の阻害剤は、単独または組み合わせて送達することができ、薬理学的に許容できる媒体と共に送達することができる。理想的に、そのような媒体は、安定性および／または送達性特性を高める。本発明はまた、阻害剤、またはリポソーム、微粒子、もしくはミクロカプセルなどの適切な媒体を用いて阻害剤を含む、薬理学的組成物の投与を提供する。本発明の様々な態様に、そのような媒体の使用は、活性成分の維持された放出を達成するのに有益である。
【００９４】
癌の処置のための個人に対しての投与のために、本発明はまた、阻害剤、またはその阻害剤を含む薬理学的組成物の、タブレット、カプセル、およびその他同種類のものなどの経口投与形態を意図する。この目的のために、阻害剤、またはその阻害剤を含む薬理学的組成物は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、スターチ、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバターなどの通常のキャリアと混合することができる。所望であるなら、希釈剤、香料添加剤、可溶剤、潤滑剤、懸濁化剤、バインダー、タブレット分解剤などもまた用いることができる。阻害剤、またはその阻害剤を含む薬理学的組成物は、他のキャリアの有無に関わらずカプセルに包むことができる。すべての場合、いかなる固体および液体組成物中の活性原料の比率は、経口投与で処置された個人に望ましい活性を与えるのに、少なくとも充分である。本発明はさらに阻害剤、またはその阻害剤を含む薬理学的組成物の非経口注射を意図しており、その場合、他の溶質、例えば、溶液を等浸透圧性にするのに十分な生理食塩水、またはグルコースを含有した無菌溶液の形態で用いられる。
【００９５】
吸息または吸飲による投与のためには、阻害剤、または阻害剤を含む薬理学的組成物を、水溶液、または部分的水溶液に製剤化することができ、その後に、エアゾールの形態で利用することができる。本発明はまた、阻害剤、または阻害剤を含む薬理学的組成物の局所的使用も意図する。この目的のために、それらは、薬理学的に許容できる媒体中で少量のパウダー、クリーム、またはローションとして、製剤化することができ、肌の部分に影響を与えるように適用される。
【００９６】
本発明はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、およびペプチド阻害剤の、阻害剤の生体内での合成を導くように設計された、遺伝的ベクター構造の形態での投与を提供する。適切なベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンティウイルス、バキュロウイルス、またはヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む。ベクター構造内で、阻害剤をコード化する核酸配列は、適切なプロモーターの支配下にある。ここに記載されるように、ベクター構造は付加的に、効率的な転写物および／または阻害剤をコード化する核酸の変換を提供する他の調因子を含有することができる。
【００９７】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコード化する核酸配列を含むベクターの調製は、ここに記載される。当業者は、本発明によるタンパク質性阻害剤に対するコード配列を含むベクターは同じ標準技術を用いて調製することができることを十分に理解する。
【００９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、またはペプチドの生体内での合成のためのそのような遺伝子ベクター構造物を構築し、投与する方法は、技術的によく知られている。例えば、Ausubel, et al., (2000) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York, N.Yを参照するとよい。細胞核内のアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入、発現、および蓄積のための効果的な方法は、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ６，２６５，１６７に記載されている。この方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが核内のセンスｍＲＮＡをハイブリダイズするのを可能とし、従ってアンチセンスオリゴヌクレオチドが処理されるのも、細胞質へ輸送されるのも防ぐ。
【００９９】
本発明阻害剤、または阻害剤を含む薬理学的組成物に対する所要服用量は、用いられる個々の組成、投与ルート、症状の重症度、および処置される個々の対照によって異なる。所要服用量は、当業者には既知の標準的臨床技術により決定することができる。処置は、化合物の適量より少ない量で一般的に開始される。その後、服用量は、状況下の最適効果に達するまで増大される。一般的に、阻害剤、または阻害剤を含む薬理学的組成物は、有害で、有毒ないかなる副作用をも引き起こさずに、効果的な結果を一般的に与える濃度で投与される。投与は、単一服用としてでもよく、または所望の場合、服用は、一日の間で適切な時間に投与する便利なサブユニットに分割することができる。
【０１００】
適用
本発明は、非癌細胞は完全に、または部分的に影響を受けない状態であるのに、癌細胞増殖を選択的に減少させるＭＴＨＦＲ阻害剤を提供する。従って、本発明阻害剤は、癌を処置、安定化、または予防するために用いることができる。本明細書中、阻害剤は、腫瘍の大きさの縮小を引き起こし、腫瘍の大きさの増大を減速または予防し、腫瘍の消失とその再発の間の病気でない生存時間を増大させ、腫瘍（例えば転移）の最初またはその後の発生を予防し、または腫瘍と関連した悪影響を減少させる細胞傷害性または細胞増殖抑制性効果を及ぼす。
【０１０１】
本発明は、ＭＴＨＦＲ阻害剤の“感作剤”としての使用をも意図しており、それは選択的に癌細胞増殖を阻害する。この場合、その阻害剤は、単独で細胞に細胞傷害性効果をもたらさないが、選択的に癌細胞増殖を制止、または減速させる。従ってその阻害剤は、癌細胞を減退させる手段を提供し、従って通常の制癌治療法からの利益を助長する。
【０１０２】
本発明の一つの態様に、１種または２種以上のＭＴＨＦＲ阻害剤が１種または２種以上の制癌治療法に投与される。１種または２種以上のＭＴＨＦＲ阻害剤は、制癌治療法での処置中、または処置後に投与される。“制癌治療法”は、癌細胞の増殖および／または転移を予防、または遅延させるいかなる化合物、組成物、または処置でもよい。そのような制癌治療法は、限定はしないが、化学療法薬治療、放射線、遺伝子療法、ホルモン触診、免疫療法、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド療法を含む。本発明の使用のための制癌治療法はまた、新規化合物、または今後発展する治療法を含むと考える。
【０１０３】
本発明によると、１種または２種以上のＭＴＨＦＲ阻害剤、または１種または２種以上のＭＴＨＦＲ阻害剤薬理学的組成物は、通常細胞は完全に、または部分的に影響を受けない状態であるのに、体外または体内の癌細胞を選択的に阻害するために用いられる。本発明の更なる態様は、１種または２種以上のＭＴＨＦＲ阻害剤、または１種または２種以上のＭＴＨＦＲ阻害剤を含む薬理学的組成物を投与することにより、癌に苦しむ哺乳動物を処置する方法を提供する。関連した態様に、ＭＴＨＦＲ阻害剤、または薬理学的組成物は、そのような治療を必要とする哺乳動物の、体外または体内の癌細胞の増殖および／または転移を、選択的に阻害するために用いられる。本発明の特別な態様に、哺乳動物は、ヒトである。
【０１０４】
本発明によると、処置、安定化、または予防することのできる癌の例は、限定はしないが、乳癌腫、大腸癌腫、結腸直腸癌腫、神経芽細胞腫、および神経こう腫を含む。ここで用いられるように、“癌”は、癌のすべてのタイプ、または哺乳動物にみられる癌腫、肉腫を含む腫瘍または悪性腫瘍をあらわす。癌の例は、脳、乳、頸部、大腸、頭頸部、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮、および髄芽細胞腫の癌である。
【０１０５】
“白血病”の用語は、血液形成臓器(bloodforming organs)の進行性で悪性の病気を広くあらわし、血液および骨髄中の白血球およびそれらの前駆体の、歪んだ拡散および発達により一般的に特徴づけられる。白血病は、臨床的に（１）病気（急性または慢性）の継続期間および特徴；（２）関与する細胞のタイプ；骨髄（骨髄性）、白血球（リンパ性）、または単球、および（３）白血性、または非白血性（亜白血性）血液中の異常細胞数の増加または非増加に基づいて、一般的に分類される。白血病は、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性全骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球性白血病(leukocythemic leukemia)、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎児白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽球性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ球白血病、リンパ肉腫細胞白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、骨髄微芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲル型白血病、プラズマ細胞白血病、骨髄腫白血病、前骨髄球性白血病、リエダー(Rieder)細胞白血病、シリング(Schilling's)白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞白血病を含む。
【０１０６】
“肉腫”の用語は、一般的に初期の結合組織のような物質で構成される腫瘍あらわし、一般的には、細線維性または同種物質に組み込まれる、密に詰まった細胞からなる。肉腫は、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫メラノ肉腫(melanosarcoma)、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー(Abemethy's)肉腫、動物性脂肪肉腫、脂肪肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル芽細胞肉腫、ブドウ状肉腫、緑色(chloroma)肉腫、絨毛癌、胎児肉腫、ウイルム(Wilms')腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、ジェンセン(Jensen's)肉腫、カポジ肉腫、クップフェル(Kupffer)細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫症、悪性間葉腫肉腫、骨膜傍肉腫、網状赤血球性肉腫、ラウス肉腫、血清のう胞肉腫(serocystic sarcoma)、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫を含む。
【０１０７】
“黒色腫”の用語は、肌および他の器官のメラノサイトシステムから生じる腫瘍を意味する。黒色腫は、例えば、末端性黒子性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン(Cloudman's)黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディングーパッセイ(Harding-Passey)黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫を含む。
【０１０８】
“癌腫”の用語は、周囲組織に浸透し転移を引き起こす傾向のある上皮細胞の悪性増殖をあらわす。典型的な癌腫は、例えば細葉細胞癌、胞状細胞癌、腺状のう胞癌腫(adenocystic carcinoma)、腺様のう胞癌、癌腫(adenomatosum)、副腎皮質の癌腫、歯槽癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞癌腫(basocellulare)、基底様癌腫、基底有きょく細胞癌腫、気管支肺胞癌腫、細気管支癌腫、気管支原生癌腫、大脳様癌腫、胆管細胞癌腫、絨毛膜癌腫、こう様(colloid)癌腫、コメド癌腫、コーパス(corpus)癌腫、篩状癌腫、鎧状癌皮膚癌腫(carcinoma cutaneum)、円筒癌腫円筒型細胞癌腫、腺管癌腫、緻密癌腫、胎児性癌腫、脳様癌腫、類表皮癌癌腫、上皮筋(epitheliale)アデノイド癌腫、外向発育癌腫、carcinoma ex ulcere、線維癌腫、
【０１０９】
ゼラチン状癌腫、ゲル状癌腫、巨細胞癌腫、巨細胞性癌腫、腺癌腫、顆粒膜細胞膜腫、ヘアーマトリックス癌腫、血液様癌腫、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、硝子質癌腫、hypemephroid癌腫乳児胎児性癌腫(infantile embryonal carcinoma)、粘膜内癌腫(carcinoma in situ)、表皮内癌腫、上皮内癌腫、Krompecher's癌腫、Kulchitzk細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状癌腫(lenticular carcinoma)、レンズ癌腫(carcinoma lenticulare)、脂肪腫性癌腫、リンパ上皮癌腫、骨髄癌腫、骨髄性癌腫、悪性黒色腫、軟癌腫（carcinoma molle)、粘液性癌腫、粘液腺癌腫(mucinous carcinoma)、粘液のう胞癌腫、粘液性類表皮癌腫、粘膜癌(carcinoma mucosum、mucous carcinoma)、粘液腫癌腫(carcinoma myxomatodes)、naspharyngeal癌腫、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫、骨様癌腫、乳頭癌腫、門脈周囲性(periportal)癌腫、前侵潤癌腫、有きょく細胞癌腫、糊状癌腫(pultaceous carcinoma)、腎臓の腎細胞癌腫、補充細胞癌腫、肉腫性癌腫(carcinoma sarcomatodes)、シュナイダー(schneiderian)癌腫、スキルス癌腫、陰のう(scroti)癌腫、シグネットリング細胞癌腫、単一癌腫(carcinoma simplex)、小細胞癌腫、solanoid癌腫、球状細胞癌腫、紡錘細胞癌腫、海綿体癌腫(carcinoma spongiosum)、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌腫、ストリング状癌腫(string carcinoma)、血管拡張性癌腫(carcinoma telangiectaticum)、毛細血管拡張性癌腫(carcinoma telangiectodes)、移行細胞癌腫、結節状癌腫（carcinoma tuberosum)、結節性癌腫(tuberous carcinoma)、ゆう状癌腫(verrucous carcinoma)、および絨毛癌腫(carcinoma villosum)を含む。
【０１１０】
付加的な癌は、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、大腸癌、悪性膵臓癌、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌状態の皮膚損傷、睾丸癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿性殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質細胞癌、前立腺癌を含む。
【０１１１】
キット
本発明は、癌の処置における使用のための、薬理学的組成物中に阻害剤を含有する治療キットを付加的に提供する。キットの内容は、凍結乾燥することができ、キットは、凍結乾燥された成分の再構成のために、適切な溶媒を付加的に含有することができる。キットのそれぞれの成分は、分離容器に包装され、そのような容器に結びつけられ、薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する行政機関により規定された形での通知となり、通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売の機関による認可をあらわす。
【０１１２】
キットの成分が１種または２種以上の液体溶液で提供される場合、その液体溶液は水溶液、例えば無菌水溶液であることがある。体内での使用のために、発現構造は、薬理学的に許容できる注入可能な組成に形成することができる。この場合、容器の方法はそれ自体で、吸入抗原、注射器、ピペット、目薬の容器、または器具のような他のものでもよく、製剤が肺などの動物の汚染された領域に適用され、動物に注入され、またはキットの他の成分に適用、および混合することができる。
【０１１３】
キットの成分はまた、乾燥、または凍結乾燥形態で提供されてもよい。試薬、または成分が乾燥形態として提供される場合、再構成は一般的に適切な溶媒の添加による。その溶媒はまた、もう一つの容器の方法で提供することができると考えられる。容器の数、または型に関係なく、本発明キットはまた、動物の体内で究極に複雑な組成が、注入／投与または配置されることの助けとなるための道具を含む、または包装することができる。そのような道具は、吸入抗原、注射器、ピペット、ペンセット、計量スプーン、目薬の容器、または医学的に認証されたいかなる送達媒体でもよい。
【０１１４】
ここに記載された本発明のより良い理解を得るために、以下の例を示す。これらの例は、ただ説明をする目的のためにある。従って、それらは本発明の権利範囲を決して限定しない。
【０１１５】
例
一般
細胞株
ヒトの線維芽細胞ＭＣＨ  ５１、ＭＣＨ  ７５およびＷＧ  １５５４は、突然変異のヒト細胞ストレイン（モントリオール小児病院、モントリオール、カナダ）の収納庫から得られた。ＷＧ１５５４は、ＭＴＨＦＲのナンセンス変異に同型である(Goyette et al, (1994) Nature Genetics, 7:175-200)。ヒトの大腸癌細胞株ＣａＣｏ−２、Ｃｏｌｏ  ３２０およびＳＷ６２０は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville MD)から得られ、ヒトの大腸癌細胞株ＳＷ１２２２は、Dr. N. Beauchemin（McGill大学、モントリオール、カナダ）から贈られた。癌腫株は、以前に報告したように(Frosst et al, (1995) Nature Genetics, 10:111-113)、ＰＣＲ増幅およびｈｉｎｆＩ消化により、ＭＴＨＦＲ変異体に対して６７７塩基対で遺伝子型を特定された。ＳＷ  １２２２およびＣａＣｏ−２は、野生型アラニン対立遺伝子（Ａ）をもつために示されるのに対して、Ｃｏｌｏ  ３２０およびＳＷ６２０は、突然変異バリン対立遺伝子（Ｖ）をもつ。２つの神経芽細胞腫、ＢＥ（２）ＣおよびＳＫ−Ｎ−Ｆ１は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。乳癌細胞株、ＭＣＦ７およびＳＫＢｒ３は、Dr. Morag Park （McGill大学、モントリオール、カナダ）から贈られた。
【０１１６】
ＭＣＦ７細胞株は、a −ＭＥＭ(Life Technologies, Rockville MD)中で培養され、ＳＫＢｒ３細胞株は、Ｄ−ＭＥＭ(Life Technologies)中で維持された。双方の株のための媒体には、１０％ウシ胎仔血清(Intergen, Purchase NY)を追加した。すべての他の細胞株は、５％ウシ胎仔血清(Intergen)および鉄が豊富な５％のウシ血清(Intergen)を追加したＭＥＭ(Life Technologies)中で培養した。
【０１１７】
すべての媒体はまた、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン(Life Technologies)、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン(Life Technologies)、０．５μｇ／ｍｌのファンギゾン試薬(Life Technologies)を追加した。すべての細胞株は、湿った３７℃の培養器の５％ＣＯ２中で、７５ｃｍ２フラスコに培養された。
【０１１８】
欠損培地
ＭＥＭ、ならびに１００ｍＭのピルビン酸ナトリウムを追加された葉酸およびメチオニンのないＭＥＭ（Ｆ−Ｍ−）は、ライフテクノロジーから得られた。メチオニンの欠損（Ｍ−）媒体のために、２．３μＭの葉酸(Sigma-Aldrich, Oakville ON)をＦ−Ｍ−媒体に加えた。すべての媒体のために、５％のウシ胎仔血清(Intergen)、鉄が豊富な５％のウシ血清(Intergen)、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン(Life Technologies)、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン(Life Technologies)、および０．５μｇ／ｍｌのファンギゾン試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。Ｍ−Ｈ＋媒体のために、０．４４ｍＭのホモシステイン(Sigma-Aldrich)および１．５μＭのビタミンＢ１２(Sigma-Aldrich)をＭ−媒体に加えた。透析血清がすべての媒体のために用いられた。
【０１１９】
欠損媒体中における細胞の生存細胞研究
細胞生存研究は、穴につき３０，０００〜５０，０００個の細胞で初める６つの穴のある組織培養皿で行われ、それぞれの条件で３回繰り返された。細胞の最初の数は、血球計で評価された。ＭＥＭでの細胞生存は、欠損媒体（Ｍ−，Ｍ−Ｈ＋）中での増殖に対する対照として用いられた。生存細胞は、フルオロレポーター比色細胞タンパク質検定キット(FluoroReporter Colorimetric Cell Protein Assay Kit)(Molecular Probes, Eugene OR)を用いて数えられた。
【０１２０】
オリゴヌクレオチド
ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞生存に与える効果を決定する検定のために、ＭＴＨＦＲのエクソン５と結合するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドＥＸ５（ホスホロチオエート５’−ＡＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＧＴＡ−３’）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６］、６つの塩基対ミスマッチを有するコントロールオリゴヌクレオチドＣＴ  ６７７（ホスホロチオエート５’−ＴＧＣＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＡＴＡＧＧＴＣ−３’）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８］、および混合配列コントロールＣＴＳＥＸ５を有するオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート５’−ＧＴＧＡＣＧＴＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧ−３’）［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７］が、標準的な固相ＤＮＡ合成工程を用いて合成された。ヒトの発現配列（ＥＳＴ）データベースのＢＬＡＳＴ調査が、ヒトの他のいかなる報告されたＥＳＴとも重要な同一性がないことを指摘したので、エクソン５のこの領域が選択された。加えて、このＭＴＨＦＲエクソンのための配列変形も報告されず、エクソン５に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、すべてのＭＴＨＦＲ対立遺伝子に結合することができると示唆している。ＣＴ６７７およびＣＴＳＥＸ５の配列はＢＬＡＳＴ調査の既知のいかなるヒト遺伝子にも相応しなかった。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれのヌクレオチドの非架橋ホスホリル酸素の一つが硫黄に置換された、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとして合成された。この修正は、体外および体内のヌクレアーゼ安定性および薬物動態を劇的に改善した。
【０１２１】
オリゴヌクレオチドのトランスフェクションおよび細胞計数
細胞は５０〜７０％の集合で６つの穴のある皿におき、完全媒体(Life Technologies)中で一晩培養した。それぞれの穴は、一度ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ(Life Technologies)で洗浄した。その細胞にその後、４００ｎＭのオリゴヌクレオチドにつき、１２μｇ／ｍｌのリポフェクチン試薬(Life Technologies)を含有する、１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ媒体をかぶせた。その媒体は、３７° Ｃ、ＡＳＯｓで５時間培養した後に．完全媒体（２−４ｍｌ）で置き換えた。オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを３日連日実行し、その後ＭＥＭ中で３日間再生させた。細胞は、フルオロレポーター比色細胞タンパク質検定キット(Molecular Probes)のＳＲＢ染色法により数えられた。それぞれの実験で処置は３回実行された。
【０１２２】
用量実験において、オリゴヌクレオチド全濃度は、コントロールオリゴヌクレオチドと共にテストオリゴヌクレオチドを追加することにより、４００ｎＭに一定に保った(Basilion et al, (1999) Molec. Pharmacol., 56:359-369)。
【０１２３】
オリゴヌクレオチド処置後のタンパク質抽出
ウエスタンブロット分析、およびＭＴＨＦＲ酵素検定のために、６Ｘ１０５  ＳＷ６２０大腸癌細胞は、１００ｍｍ組織培養ペトリ皿におかれた。オリゴヌクレオチドを細胞にトランスフェクションした後、その細胞は取り入れられ、細胞ペレットからのクルードのタンパク質抽出物が、−７０℃でペレットを凍結し、４℃で解凍することを３回行うことにより得られた。その細胞ペレットはその後、２ｕｇ／ｍｌのアプロチニン(Boehringer Mannheim, Laval, Quebec)、および２ｕｇ／ｍｌのロイペプチン(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)を含む０．１ＭのＫＰＯ４  ｐＨ６．３中で再び浮遊させた。細胞の破片は、１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離することにより除去した。タンパク質濃度は、製品使用説明書(BioRad, Mississauga ON)による、ブラッドフォード(Bradford)方法(Bradford, 1976)を用いて測定した。
【０１２４】
ＭＴＨＦＲ酵素検定
酵素活性は、クルードのタンパク質抽出物で、すでに記載したように(Christensen et al, (1997) ARTERIOSCLER. Thromb. Vasc. Biol., 17:569-573)、反対方向で測定された。タンパク質の等量（〜６０μｇ）が検定ごとに用いられた。酵素活性は、タンパク質ｍｇ／ｈごとに生成するホルムアルデヒドｎｍｏｌとしてあらわされた。
【０１２５】
ウエスタンブロット分析
タンパク質の等量（３５−６０mｇ）は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に担持された。トランスファーは、トランスファーバッファー(transfer buffer)（３９ｍＭのグリシン、４９ｍＭのトリス塩基、０．０３７％のＳＤＳ、２０％のメタノール）中、２〜３時間、７０Ｖで、ニトロセルロース（Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ膜、Amersham Pharmacia Biotech）に実行された。その膜は、ＰＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎ２０(Tween20;BioRad)中の、５％の無脂肪スキムミルクで、４℃で一晩遮られた。ＭＴＨＦＲタンパク質は、４℃で４〜６時間培養されたＰＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎ２０(Tween20;BioRad)中の、５％の無脂肪スキムミルク中、１：１０００の希釈でウサギのアンチ豚抗体を用いて、検知された。
【０１２６】
ＰＢＳ−０．５％のＴｗｅｅｎ２０で連続的に３回洗浄した後、アンチウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ共役抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が、第２の抗体として用いられた。免疫複合体は、ＥＣＬキット(Amersham Pharmacia Biotech)で、高められた化学発光により視覚化された。タンパク質の計量は、平床式スキャナで、フィルム走査法により決定された（Hewlett Packard Scan）。ＭＴＨＦＲおよびアクチンバンドエリアは計算され、ＭＴＨＦＲタンパク質レベルは、ＭＴＨＦＲ／アクチンの比としてあらわされる。
【０１２７】
統計分析
一方向のＡＮＯＶＡは、ＥＸ５で処置した後の細胞生存を分析するために、ＳＰＳＳソフトウエア、バージョン１０．０(SPSS Inc., Chicago IL)を用いて実行された。研究者のｔ−検定は、ＭＴＨＦＲ活性の差異を評価するため、およびＥＸ５アンチセンスで処置した線維芽細胞株の細胞生存データを分析するために用いられた。
【０１２８】
例１：ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクション後の、癌細胞の減少した細胞生存
以下の癌細胞株がこれらの実験で用いられる：ＳＷ６２０大腸癌(ATCC Accession No. CCL-227)、ＬＯＶＯ大腸癌(ATCC Accession No. CCL 229)、ＢＥＣ２神経芽細胞腫(ATCC Accession No. CRL 2268)、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１神経芽細胞腫(ATCC Accession No. CRL 2142)、ＭＣＦ７乳癌(ATCC Accession No. HTB 2)、ＳＫＢｒ３乳癌(ATCC Accession No. HTB 30)、およびＵ８７−ｌａｃＺ神経こう腫細胞株(Li et al., (1999) Clin. Cancer Res.5:637-642)。
【０１２９】
これらのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを伴う腫瘍細胞のトランスフェクションに先んじて、その細胞は、６つの穴のあるプレート、または１０ｃｍ組織培養皿に、５０〜６０％の集合で置かれ、３７℃および５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、その細胞はＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  減少血清媒体(Gibco, BRL)で洗浄し、ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはコントロールオリゴヌクレオチド（図３〜１１）の一つ、および１２ｕｇ／ｍｌのリポフェクチン試薬(Gibco, BRL)の、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ減少血清媒体中での指示された濃度で処置した。Ｕ８７−ｌａｃＺ神経こう腫細胞株のために、コントロールオリゴヌクレオチドＣＴ６７７は、コントロールオリゴヌクレオチドとして用いられ；他のすべての細胞株のために、混合オリゴヌクレオチドＣＴＳＥＸ５は、コントロールオリゴヌクレオチドとして用いた。
【０１３０】
オリゴヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションをしてから、３７℃および５％ＣＯ２で５時間培養した後、オリゴヌクレオチド、およびリポフェクチンを含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ減少血清媒体は、５％のＦＢＳおよび５％のウシ血清を追加したＭＥＭで置き換えられた。翌日、トランスフェクション手順を繰り返した。第２のトランスフェクションのために、細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ媒体で洗浄し、ＭＴＨＦＲアンチセンスまたはコントロールオリゴヌクレオチド、およびリポフェクチン試薬と共に、上記したように５時間培養した。その後、その媒体を、５％のＦＢＳおよび５％のウシ血清を追加したＭＥＭに置き換えた。次の日、第３のトランスフェクションを、第２のトランスフェクションに対して記載したように実行した。このトランスフェクションの後、その細胞は、その追加されたＭＥＭ媒体で２日から４日間増殖させた。その後に、組織培養皿に付着している細胞の数を、製品説明(FluoroReporter（登録商標）Colorimetric Cell Protein Assay Kit F-2961 from Molecular Probes, Eugene OR)による、比色細胞タンパク質検定キットを用いて決定した。このキットは、アニオン性キサンチン染料、スルフォダミン(sulforhadamine)Ｂを含有し、それは、穏やかな酸性条件下で塩基性アミノ酸と静電気的に安定な錯体を形成する。このタンパク質染色錯体は、ＴＣＡ固定細胞からの解放された型の除去後、分光光度法により検知された。
【０１３１】
例２：ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドの非癌細胞の細胞生存を低下させることができない能力
非癌細胞に与えるＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を決定するために、ＭＴＨＦＲのために２つのナンセンス突然変異体をもち、従って機能的なＭＴＨＦＲタンパク質をつくらない、ヒトの二倍体（ｄｉｐｌｏｉｄ）線維芽細胞株ＷＧ１５５４もまた、上記トランスフェクション検定法でテストされた(Goyette et al., (1994) Nat. Genet.7:195-200)。特に、その細胞は、ＭＴＨＦＲのエクソン５に結合するように設計された、４００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはコントロールオリゴヌクレオチドの３回のトランスフェクションの対象となり、３日間再生するのを許容された。腫瘍細胞株の以前の結果と比較して、ＭＴＨＦＲアンチセンスまたはコントロールオリゴヌクレオチドで処置された、ＷＧ１５５４細胞の間の細胞生存に違いはなかった（図１０）。この結果は、ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＴＨＦＲを発現しない非癌細胞よりも癌細胞により有害であることを示す。従って、ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを対象に投与した場合、不都合な副作用をあまり生じない。
【０１３２】
例３：ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドは、メチオニン依存性形質転換細胞の細胞生存を低下させる
３つの線維芽細胞ストレイン（図１１）、および４つの大腸癌株（図１２）は、ＭＥＭ、メチオニンのないＭＥＭ（Ｍ−）、またはホモシステインおよびビタミンＢ１２を追加したメチオニンのないＭＥＭ（Ｍ−Ｈ＋）中で増殖させた。後者の媒体は、ホモシステインおよび５−メチレンテトラヒドロ葉酸から、ビタミンＢ１２依存性メチオニンシンターゼにより触媒されての、メチオニンの新規な合成法を試験するのに役立った。５−メチレンテトラヒドロ葉酸は、ＭＴＨＦＲ反応の生成物である。７つすべての株はＭ−媒体に敏感性を示し；この媒体中での増殖は、ＭＥＭでの増殖に比較して、著しく低下した。コントロール線維芽細胞（ＭＣＨ  ５１，ＭＣＨ  ７５）は、Ｍ−Ｈ＋媒体中での通常の増殖を実質的に維持することができた。しかし、ＭＴＨＦＲのナンセンス突然変異体に同型(Goyette et al, 1994)の、線維芽細胞ストレインＷＧ  １５５４は、Ｍ−Ｈ＋媒体での増殖を復活させることができなかった。Ｍ−Ｈ＋媒体中で培養された癌株は、内生のメチオニン合成を通してわずかだけ増殖を増加させた（図１２）。細胞数は、ＭＥＭで得られた値のわずかに小さいパーセンテージ（５％−２０％）だった。２つの株（Ｃｏｌｏ  ３２０およびＳＷ６２０）は、穏やかな酵素欠陥と結びつくバリン対立遺伝子を有するが、ＭＴＨＦＲ活性に関して、これらの癌株は名声を傷つけることはない。
【０１３３】
図１３Ａは、ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドＥＸ５のＳＷ６２０癌細胞への処置後の、細胞生存の用量依存性減少（ｐ＜０．０１、一方向ＡＮＯＶＡ）を実証する。４００ｎＭの最大容量で細胞生存は、混合コントロールオリゴヌクレオチドＣＴＳＥＸ５で処置した細胞生存と比較して、約８０％減少した。
【０１３４】
ＭＴＨＦＲ発現が変化したのを確かめるために、ウエスタンブロットが、ＥＸ５  ＡＳＯの３回連続処置後の、免疫反応性ＭＴＨＦＲタンパク質を分析するために用いられた。図１３Ｂは、混合コントロールＣＴＳＥＸ５での処置と比較して、またはリポフェクチン試薬のみ（模擬トランスフェクション）の処置と比較しての、ＥＸ５処置後のＭＴＨＦＲタンパク質レベルの著しい減少を実証する。アクチンを正常化した後、コントロールオリゴで処置をしたＭＴＨＦＲタンパク質レベルは、模擬的に処置された細胞の９４％であり、ここでは、ＥＸ５の２００ｎＭおよび４００ｎＭで処置すると、模擬的に処置された細胞のそれぞれ、３９％および２５％である（３回のウエスタンブロットの平均）。
【０１３５】
例４：４００ｎＭのＥＸ５での処置後の、通常のヒトの線維芽細胞、乳癌細胞、および神経芽細胞腫瘍株の細胞生存
上記したように、ＥＸ５の４００ｎＭで処置後、２つの神経芽細胞腫瘍株（ＢＥ（２）ＣおよびＳＫ−Ｎ−Ｆ１）は、コントロールＡＳＯ処置細胞と比較して著しい減少、８０％（ｐ＜０．００１）および６５％（ｐ＜０．０１）の減少をそれぞれ示した。同様に、乳癌細胞株ＳＫＢｒ３は、細胞生存の８０％減少（ｐ＜０．０００１）を示し、ＭＣＦ７乳癌細胞株は、コントロールオリゴヌクレオチドＣＴＳＥＸ５で処置された細胞と比較して、細胞生存の９２％減少（ｐ＜０．０００１）を示した。形質転換株で得られたデータに対して、ＥＸ５の４００ｎＭで処置した通常のヒトの２つの線維芽細胞株（ＭＣＨ  ７５およびＭＣＨ  ５１）は、ＣＴＳＥＸ５で処置された細胞（ｐ＞０．０５）と比較して細胞生存に、著しい差異は示さなかった。これらの結果は、図１４に要約する。
【０１３６】
例４：腫瘍に対するＭＴＨＦＲ発現の下方制御の体内での効果
（多発性腸新生組織形成）Ｍｉｎマウスが、大腸癌のための確立されたマウスモデルである。それは、ＡＰＣ遺伝子の突然変異体、ヒトの遺伝的で散在する大腸腫瘍で変化する同じ遺伝子をもつ。これらのマウスは、数ヶ月で多発性腫瘍（３０から１００まで）を成長させる。
【０１３７】
ＡＰＣ突然変異体の一つのコピーをもつＭｉｎマウスは、ＭＴＨＦＲ遺伝子の異型接合ノックアウトを有するＭＴＨＦＲ欠損マウスと交配させた。これらの異型接合マウスは、対立遺伝子のない（Ｍｔｈｆｒ  ＋／−）一つのコピーをもち、従って、通常のマウスと比較してＭＴＨＦＲ活性の５０％を有する。
ＡＰＣ突然変異だけをもつＭｉｎマウス（ｎ＝２０）は、平均腫瘍数７５±６．６（標準誤差）を有するのに対し、ＭＴＨＦＲのない対立遺伝子だけでなくＡＰＣ突然変異を有する、Ｍｉｎマウスは、平均腫瘍数３６±２．７を有する。腫瘍数のこの違いは非常に重要である（ｐ＜０．０００１）。加えて、腫瘍の大きさは、ＭＴＨＦＲ突然変異のないＭｉｎマウス（腫瘍の７６．３％は１ｍｍより小さい）に比較して、ＭＴＨＦＲ突然変異をもつＭｉｎマウス（腫瘍の９１．９％は１ｍｍより小さい）でより小さい。
【０１３８】
従って、形質転換細胞のＭＴＨＦＲ部分的阻害は、腫瘍の減少した数、および腫瘍の減少した増殖に関連する。ＭＴＨＦＲ（Ｍｔｈｆｒ＋／−）の異型接合ノックアウトを有し、他のいかなる突然変異も有さないマウスは、外観、出生時体重、発育、および生存で、通常のマウスと同様であるので、通常細胞のＭＴＨＦＲ部分的阻害は、有害であるようにはみえない。
【０１３９】
これらの研究は、ＭＴＨＦＲ阻害が、通常細胞より急激に増殖する細胞に有害であることを示唆する。これは、概説した培養細胞の研究と合致しており、形質転換細胞は通常細胞よりメチオニンに対してより高い需要を有することを実証する。
【０１４０】
例５：ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドの研究のための生体の動物モデル
ＭＴＨＦＲ阻害剤の生体テストのために、以前記載したヌードマウスの癌モデルを用いることができる(Bufalo et al., (1996) British J. Canc. 74:387-393; Dean  et al., (1996) Cancer Res. 56:3499-3507; Hasegawa et al., (1998) Int. J. Cancer 76:812-816; Narayanan, (1994) In Vivo 8: 787-794)。簡潔に、癌細胞がｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウスの脇腹に皮下注射される。結果の腫瘍の大きさは、定期的に測定される。腫瘍体積が１００ｍｍ３〜２００ｍｍ３に達すると、ＭＴＨＦＲ阻害剤またはコントロール化合物が、腫瘍部位に皮下注射される。最初の実験に対して、２００μｇの阻害剤の用量が、１から２週間にわたって隔日に皮下注射される。この期間、腫瘍の外観、および大きさをモニターする。一組の注射が完了した後、マウスを犠牲にして、その腫瘍を更なる分析のために取り出す。
【０１４１】
阻害剤の皮下投与の効果を決定した後に、様々の用量の効果、および阻害剤の全身投与に対する投薬頻度を評価するために、静脈注射を実行することができる。この情報は、ヒトの臨床試験のための適切な投薬スケジュールを決定するために用いることができる。必要に応じて、ＭＴＨＦＲ阻害剤はまた、ラット、犬、または猿を含む他の哺乳動物の自然発生的または誘発的癌などの癌のための、他の標準的な動物モデルでもテストすることができる。
【０１４２】
従って記載した発明の態様は、多くの方法に変えることができるのは明らかである。そのような変法は、本発明の要旨および範囲からの逸脱としてみなさず、当業者に明らかであるそのような変形は、クレームの権利範囲内に含まれるものと考える。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１Ａ】ヒトのＭＴＨＦＲｃＤＮＡの入手可能な全体配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＮＯ：２）を表す。
【図１Ｂ】ヒトのＭＴＨＦＲｃＤＮＡの入手可能な全体配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＮＯ：２）を表す。
【図１Ｃ】ヒトのＭＴＨＦＲｃＤＮＡの入手可能な全体配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＮＯ：２）を表す。
【図２Ａ】ヒトのＭＴＨＦＲエクソンおよび傍らのイントロン配列を表す。大きさおよび傍らのイントロン配列と共に、ヒト遺伝子のエクソン配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３〜１３）が与えられる。ｃＤＮＡ内のエクソンの、括弧ではさんである塩基対の位置は、公開されたヒトのｃＤＮＡ塩基対番号(Goyette et al., 1994)に関する。塩基１は元のｃＤＮＡのＡＴＧから１２塩基対上流にあり、相当する塩基は、ここではアスタリスクにより示す。エクソン１は、ＡＴＧ開始部位（下線付き）を含有し、およびエクソン１１は終始コドン（下線付き）を含有する。
【図２Ｂ】ヒトのＭＴＨＦＲエクソンおよび傍らのイントロン配列を表す。大きさおよび傍らのイントロン配列と共に、ヒト遺伝子のエクソン配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３〜１３）が与えられる。ｃＤＮＡ内のエクソンの、括弧ではさんである塩基対の位置は、公開されたヒトのｃＤＮＡ塩基対番号(Goyette et al., 1994)に関する。塩基１は元のｃＤＮＡのＡＴＧから１２塩基対上流にあり、相当する塩基は、ここではアスタリスクにより示す。エクソン１は、ＡＴＧ開始部位（下線付き）を含有し、およびエクソン１１は終始コドン（下線付き）を含有する。
【図３】ＭＴＨＦＲのエクソン５に対するアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの濃度を変化させて、それぞれの回で５時間、処置を３回を行ったあとの、ＳＷ６２０大腸癌の生存パーセントを明示する。その細胞を数える前に、２日間の最終処置の後、再生するのを許容する。値は、コントロールオリゴヌクレオチドＣＴＳＥＸ５（ホスホロチオエート  ５’−ＧＴＧＡＣＧＴＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）で処置した後に生存する細胞の数と比較して、生存する細胞のパーセントとして表される。
【図４】図３に記載したように、ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置して、３日の再生期間後のＬＯＶＯ大腸癌の生存パーセントを明示する。
【図５】図３に記載したように、ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を変化させて処置して、２日間再生するのを許容した、神経芽腫細胞ＢＥＣ２の生存パーセントを明示する。
【図６】図３に記載したように、ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を変化させて処置して、４日間再生するのを許容した、神経芽腫細胞ＳＫ−Ｎ−Ｆ１の生存パーセントを明示する。
【図７】図３に記載したように、異なる濃度のＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置して、２．５日の再生期間後の、乳癌細胞ＭＣＦ７の生存パーセントを明示する。
【図８】図３に記載したように、ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を変化させて処置して、２．５日の再生期間後の、乳癌細胞ＳＫＢｒ３の生存パーセントを明示する。
【図９】図３に記載したように、ＭＴＨＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を変化させて処置して、２日の再生期間後の、神経こう腫細胞Ｕ８７−ｌａｃＺの生存パーセントを明示する。この実験のために、６つの塩基対のミスマッチＣＴ６７７（ホスホロチオエート５’−ＴＧＣＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＡＴＡＧＧＴＣ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を有するオリゴヌクレオチドが、コントロールオリゴヌクレオチドとして用いられた。
【図１０】４００ｎＭのＭＴＨＦＲアンチセンスまたはコントロールオリゴヌクレオチドで処置して、３日間再生するのを許容したＭＴＨＦＲの、ナンセンス変異に対する同型の線維芽細胞ＷＧ１５５４の生存パーセントを明示する。
【図１１】不完全な媒体中での線維芽細胞株の増殖を表す。２つの野生型線維芽細胞株（ＭＣＨ５１、ＭＣＨ７５）、およびＭＴＨＦＲのない突然変異体（ＷＧ１５５４）をＭＥＭ（■）、Ｍ−（×）、およびＭ−Ｈ＋（○）中で１２時間培養した。それぞれの細胞株の数は、３時点でＳＲＢ測定を用いて数えた。それぞれのポイントは、３回の±ＳＤの平均を表す。
【図１２】不完全な媒体中での大腸癌細胞株の増殖を表す。４つの大腸癌細胞株をＭＥＭ（■）、Ｍ−（×）、およびＭ−Ｈ＋（○）中で１２時間培養した。それぞれの大腸癌細胞株のＭＴＨＦＲ遺伝子型は、括弧内に示される。それぞれの株に対する細胞の数は、３時点でＳＲＢ測定を用いて数えた。それぞれのポイントは、３回の±ＳＤの平均を表す。
【図１３】アンチセンスオリゴヌクレオチドＥＸ５で処置した後の細胞生存およびＭＴＨＦＲタンパク質レベルを表す。（Ａ）細胞を、ＥＸ５（□）の濃度を増加させながら連続して３日間処置した。細胞もまたコントロールオリゴヌクレオチドＣＴＳＥＸ５を処置した。生存細胞の数は、ＳＲＢ染色法により決定した。ＥＸ５をトランスフェクションした後の生存細胞を、コントロールＣＴＳＥＸ５オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした後の生存細胞の％として表す。誤差の制約は、３つの実験の平均値の±ＳＥをあらわし、それぞれが３回実行した。（Ｂ）リポフェクチン(Lipofection)のみ（模擬トランスフェクション）、ＣＴＳＥＸ５の４００ｎＭ、ＥＸ５の２００ｎＭまたは４００ｎＭで３回処置した後のＭＴＨＦＲタンパク質レベルである。細胞を、３回処置後に採取し、ウエスタンブロット分析にかける。ＭＴＨＦＲタンパク質、および分子量マーカーの位置が示される。β―アクチンのタンパク質レベルもまた、サンプルへの等しい取り込みを検証するために、ウエスタンブロットにより測定された。
【図１４】通常のヒトの線維芽細胞、乳癌細胞、および神経芽細胞腫株をＥＸ５の４００ｎＭで処置した後の細胞生存の比較をあらわす。細胞は、ＥＸ５の４００ｎＭ、およびＣＴＳＥＸ５の４００ｎＭで連続して３日間処置した。生存細胞の数は、材料および方法に記載されるように、ＳＲＢ染色法により決定された。それぞれの細胞株に対して、ＥＸ５をトランスフェクションした後の細胞株は、コントロールＣＴＳＥＸ５オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした後の生存％としてあらわす。グラフのそれぞれの値は、３回の±ＳＤの平均をあらわす。
【図１Ａ】
2005500246.tif 000002
【図１Ｂ】
2005500246.tif 000003
【図１Ｃ】
2005500246.tif 000004
【図２Ａ】
2005500246.tif 000005
【図２Ｂ】
2005500246.tif 000006
【図３】
2005500246.tif 000007
【図４】
2005500246.tif 000008
【図５】
2005500246.tif 000009
【図６】
2005500246.tif 000010
【図７】
2005500246.tif 000011
【図８】
2005500246.tif 000012
【図９】
2005500246.tif 000013
【図１０】
2005500246.tif 000014
【図１１】
2005500246.tif 000015
【図１２】
2005500246.tif 000016
【図１３】
2005500246.tif 000017
【図１４】
2005500246.tif 000018
【国際公開パンフレット】
2005500246.tif 000019
2005500246.tif 000020
2005500246.tif 000021
2005500246.tif 000022
2005500246.tif 000023
2005500246.tif 000024
2005500246.tif 000025
2005500246.tif 000026
2005500246.tif 000027
2005500246.tif 000028
2005500246.tif 000029
2005500246.tif 000030
2005500246.tif 000031
2005500246.tif 000032
2005500246.tif 000033
2005500246.tif 000034
2005500246.tif 000035
2005500246.tif 000036
2005500246.tif 000037
2005500246.tif 000038
2005500246.tif 000039
2005500246.tif 000040
2005500246.tif 000041
2005500246.tif 000042
2005500246.tif 000043
2005500246.tif 000044
2005500246.tif 000045
2005500246.tif 000046
2005500246.tif 000047
2005500246.tif 000048
2005500246.tif 000049
2005500246.tif 000050
2005500246.tif 000051
2005500246.tif 000052
2005500246.tif 000053
2005500246.tif 000054
2005500246.tif 000055
2005500246.tif 000056
2005500246.tif 000057
2005500246.tif 000058
2005500246.tif 000059
2005500246.tif 000060
2005500246.tif 000061
2005500246.tif 000062
2005500246.tif 000063
2005500246.tif 000064
2005500246.tif 000065
2005500246.tif 000066
2005500246.tif 000067
2005500246.tif 000068
2005500246.tif 000069
2005500246.tif 000070
2005500246.tif 000071
2005500246.tif 000072
2005500246.tif 000073
2005500246.tif 000074
2005500246.tif 000075
2005500246.tif 000076
2005500246.tif 000077
2005500246.tif 000078
2005500246.tif 000079
2005500246.tif 000080
2005500246.tif 000081
2005500246.tif 000082
2005500246.tif 000083
2005500246.tif 000084
2005500246.tif 000085
2005500246.tif 000086
2005500246.tif 000087
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500246.tif 000088
【国際調査報告】
2005500246.tif 000089
2005500246.tif 000090
2005500246.tif 000091
2005500246.tif 000092