(57)【要約】本発明は、概して、サイトカインを介した細胞活性を調節する方法およびそのために有用な物質に関する。より詳しくは、本発明は、細胞内スフィンゴシンキナーゼ依存性シグナル伝達機構を調節することにより、腫瘍壊死因子を介する細胞活性を調節する方法に関する。本発明の方法は、とりわけ、サイトカインを介した異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療および／または予防に有用である。本発明はさらに、目的のスフィンゴシンキナーゼ依存性シグナル伝達機構を調節できる物質を同定するおよび／または設計するための方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、サイトカイン誘導性の細胞活性を調節する方法。
【請求項２】
スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法。
【請求項３】
スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法。
【請求項４】
TNF誘導性の細胞活性が抗アポトーシス特性の誘導であり、調節がスフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用の抑制である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
TNF誘導性の細胞活性が炎症誘発活性の誘導であり、誘導がスフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用の抑制である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
物質がスフィンゴシンキナーゼのC末端領域に結合する、連結する、またはそうでなければ会合する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
C末端領域がアミノ酸配列PPEEにより定義される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
スフィンゴシンキナーゼがヒトスフィンゴシンキナーゼであり、C末端領域が<400>1のアミノ酸残基番号379〜382のアミノ酸配列PPEEにより定義される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、哺乳動物における、サイトカイン誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための方法。
【請求項１０】
スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、哺乳動物における、TNF誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための方法。
【請求項１１】
スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、哺乳動物における、TNF誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための方法。
【請求項１２】
TNF誘導性の細胞活性が抗アポトーシス特性の誘導であり、調節がスフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用の抑制である、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
疾患が腫瘍性疾患である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
TNF誘導性の細胞活性が炎症誘発活性の誘導であり、誘導がスフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用の抑制である、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
物質がスフィンゴシンキナーゼのC末端領域に結合する、連結する、またはそうでなければ会合する、請求項9〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
C末端領域がアミノ酸配列PPEEにより定義される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
スフィンゴシンキナーゼがヒトスフィンゴシンキナーゼであり、C末端領域が<400>1のアミノ酸残基番号379〜382のアミノ酸配列PPEEにより定義される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物がヒトである、請求項9〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物における、サイトカイン誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療のための医薬品の製造における、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節し、そしてその相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する物質の使用。
【請求項２０】
哺乳動物における、TNF誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療のための医薬品の製造における、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節し、そしてその相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する物質の使用。
【請求項２１】
哺乳動物における、TNF誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療のための医薬品の製造における、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を調節し、そしてその相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する物質の使用。
【請求項２２】
TNF誘導性の細胞活性が抗アポトーシス特性の誘導であり、調節がスフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用の抑制である、請求項19〜21のいずれか一項記載の使用。
【請求項２３】
疾患が腫瘍性疾患である、請求項22記載の使用。
【請求項２４】
TNF誘導性の細胞活性が炎症誘発活性の誘導であり、誘導がスフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用の抑制である、請求項19〜21のいずれか一項記載の使用。
【請求項２５】
物質がスフィンゴシンキナーゼのC末端領域に結合する、連結する、またはそうでなければ会合する、請求項19〜24のいずれか一項記載の使用。
【請求項２６】
C末端領域がアミノ酸配列PPEEにより定義される、請求項25記載の使用。
【請求項２７】
スフィンゴシンキナーゼがヒトスフィンゴシンキナーゼであり、C末端領域が<400>1のアミノ酸残基番号379〜382のアミノ酸配列PPEEにより定義される、請求項26記載の使用。
【請求項２８】
哺乳動物がヒトである、請求項19〜27のいずれか一項記載の使用。
【請求項２９】
請求項1〜8のいずれか一項記載の方法に従って定義される調節物質と、一つもしくは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項1〜19のいずれか一項記載の方法に従って使用される場合の、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法に従って定義される物質。
【請求項３１】
TRAFおよびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物または誘導体を含有する細胞またはその抽出物を、推定物質と接触させる段階、その相互作用に関連した発現表現型の変化を検出する段階を含む、TRAFのスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物またはその誘導体との相互作用を調節できる物質を検出するための方法。
【請求項３２】
TRAFがTRAF2である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
発現表現型の変化がアポトーシス特性の変化である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
発現表現型の変化がスフィンゴシンキナーゼの機能活性の調節である、請求項31または32記載の方法。
【請求項３５】
スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体を、推定物質と接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼのTRAF結合部位とその物質の相互相補性の程度を評価する段階を含む方法であって、その結合部位またはその誘導体と相互作用でき、そしてそのスフィンゴシンキナーゼと関連する少なくとも一つの機能活性を調節できる物質を分析する、設計するおよび／または改変するための方法。
【請求項３６】
TRAF結合部位がスフィンゴシンキナーゼのC末端領域である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
C末端領域がアミノ酸配列PPEEにより定義される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
スフィンゴシンキナーゼがヒトスフィンゴシンキナーゼであり、C末端領域が<400>1のアミノ酸残基番号379〜382のアミノ酸配列PPEEにより定義される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
請求項35〜38のいずれか一項に従って同定される物質。
【請求項４０】
請求項1〜18のいずれか一項記載の方法で使用される場合の請求項39記載の物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、サイトカインを介した細胞活性を調節する方法およびそのために有用な物質に関する。より詳しくは、本発明は、細胞内スフィンゴシンキナーゼ依存性シグナル伝達機構を調節することにより、腫瘍壊死因子を介する細胞活性を調節する方法に関する。本発明の方法は、とりわけ、サイトカインを介した異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療および／または予防に有用である。本発明はさらに、目的のスフィンゴシンキナーゼ依存性シグナル伝達機構を調節することができる物質を同定するおよび／または設計するための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書中で著者により引用される刊行物の詳細な目録は、発明の詳細な説明の末尾に収載されている。
【０００３】
本明細書における如何なる先行技術に対する参照も、先行技術がオーストラリアでの共通の一般認識の一部をなすことを認めてはおらず、また認めたと解釈すべきではなく、そのように示唆されることもない。
【０００４】
もともとはその殺腫瘍活性により定義された腫瘍壊死因子α(本明細書では「TNF」という)は、細胞増殖、アポトーシス、ならびに炎症および免疫調節応答などの、さまざまな生物および細胞での応答を誘導する多機能サイトカインである。TNFに対する異なる細胞応答は、細胞表面の受容体(p55 TNF-R1およびp75 TNF-R2)を介してシグナル伝達され、それらのアダプタータンパク質により、異なるそして別々のシグナル伝達経路が開始される。これらの別々のシグナルは、最良の例としてTNFのアポトーシスと抗アポトーシスの双方の役割などの細胞作用の拮抗に繋がり得る(Locksleyら, Cell 104, 487, 2001)。
【０００５】
細胞生存、活性化およびアポトーシスのような、腫瘍壊死因子に対する目立って異なる細胞応答は、個々の経路を介して伝達される。個々のシグナル伝達は、異なる種類のアダプタータンパク質をTNF受容体スーパーファミリー複合体に動員することにより開始されると思われている。例えば、TRADD、FADD/MORT1およびRIPを含む複合体の動員により、各種カスパーゼのさらなる動員および活性化が引き起こされ、次いで、細胞死が引き起こされる(Tartagliaら, Cell 73, 213, 1993; Chinnaiyanら, Science 274, 990, 1996)。他方、TNFにより、その受容体と、二次クラスのアダプタータンパク質である、TNFR関連因子(本明細書では「TRAF」と呼ばれる)との相互作用が誘導され、NF-κBを活性化するために、NF-κB誘導キナーゼ(NIK)のような下流シグナルが動員される(Locksleyら、2001、前記; Archら, Genes & Devel. 12, 2821, 1998)。さらに、TNF受容体へのTRADD、FADDおよびFANの動員により、酸性または中性スフィンゴミエリナーゼ(Smase)の活性化が可能となり、いくつかの細胞種においてアポトーシスシグナル伝達に関与するとされているセラミドが産生される。TNFは、スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の産生をもたらす、スフィンゴミエリン代謝経路におけるもう一つの重要な酵素である、スフィンゴシンキナーゼ(SphK)を活性化する。S1Pは、TNFが介するアポトーシスの有力なアンタゴニストの一つである。
【０００６】
TNF受容体関連因子には6つのメンバーが含まれ、これらはTRAF1〜6である。TRAF2はTRAFファミリーの原型的メンバーである。それは多くのTNF受容体と直接的または間接的に相互作用でき、これらの受容体のシグナル伝達を媒介する。TRAF2はまた、I-TRAF/TANK、RIP、NIKおよびカスパーゼ阻害因子cIAPのような多数の細胞内タンパク質とも相互作用でき、これにより転写因子NF-κB、ストレスにより活性化されるタンパク質キナーゼ(SAPKまたはJNK)および抗アポトーシスの活性化に必要なシグナルを伝達する(Hsuら, Cell 81, 495, 1995; Rotheら, Cell 83, 1243, 1995; Wangら, Science 281, 1680, 1998)。構造研究により、シグナル連結点としてのTRAF2の複雑性および融通性が明らかとされている(Parkら, Cell 101, 777, 2000)。しかし、TRAF2が、異なる生物学的機能を引き起こす、NF-κBおよびJNKのような別個の下流のシグナルを区別して活性化できるかどうか、またはこれがどのように達成され得るかについて、未だ明らかにされていない。確かに、標的遺伝子欠失、すなわちRINGフィンガードメインを含むN末端の86アミノ酸を欠損した切断型TRAF2(ΔTRAF2)により、TRAF2がJNK活性化およびNF-(B-非依存的経路)を介したTNF誘導性のアポトーシス抑制に必須であることが明らかにされた(Yehら, Immunity 7:715, 1997; Leeら, Immunity 7:703, 1997)が、この機能の正確な機構は明らかにされていない。
【０００７】
最近、TNFの多機能活性を媒介するシグナル分子として、スフィンゴ脂質が浮上してきた(Hannunら, Biochemistry 40:4893, 2001)。スフィンゴ脂質の代謝回転によるTNFシグナル伝達は、次の2つの異なる経路により例示される:スフィンゴミエリナーゼ(SMase)の活性化により生じるセラミド形成およびスフィンゴシンキナーゼ(SphK)活性化によるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の産生。セラミドを、TNF誘導性の細胞死を媒介するアポトーシス誘導因子と見なす論争(Hannun, Science 274:1855, 1996)があるにもかかわらず、S1Pは、抗アポトーシスおよび有糸分裂誘発因子であることが明らかにされている(OliveraおよびSpiegal, Nature 365:557 1993; Cuvillierら, Nature 381:800, 1996;Xiaら, J. Biol. Chem. 27434499, 1999ならびにCur. Biol. 10:1527, 2000)。
【０００８】
TNF媒介性の細胞活性を調節するシグナルは、十分には明らかにされていない。これらの細胞シグナル伝達機構の解明は、異常な細胞活性、またはそうでなければ望ましくない細胞活性であって、その細胞活性がTNF調節性のシグナル伝達機構を介して直接的または間接的に調節可能であることを特徴とする、疾患を治療することを対象とした治療および／または予防戦略の開発のために必要である。構造研究により、シグナル連結点としてのTRAF2の複雑性および融通性が明らかとされている(Parkら、2000、前記)が、TRAF2が、異なる生物学的機能を引き起こす、NF-κBおよびJNKのようなその別個の下流のシグナルを区別して活性化できるかどうか、およびその方法については未だ明らかにされていない。
【０００９】
本発明に至る研究において、本発明者らは、TRAF2と、スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の産生に関与する脂質キナーゼであるスフィンゴシンキナーゼ(SphK)との間の物理的相互作用を同定した。TRAF2とSphKの相互作用により、SphKを活性化でき、これは、TRAF2が介する、JNKではなくNF-(Bの活性化に必要である。さらに、TRAF2促進性の抗アポトーシスシグナル経路には、TNFが介するアポトーシスの間のSphK活性化が厳密には含まれていることが解明されている。従って、TNF受容体スーパーファミリーとスフィンゴ脂質シグナル経路との間の相互作用により、特に細胞活性化および細胞生存をもたらす、TRAF2が介するシグナル機構が提供される。本発明者らはさらに、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2結合モチーフを同定した。これらの細胞シグナル伝達機構および結合モチーフの同定により、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節することでTNFが介する細胞活性を調節することを対象とした方法の開発が容易となった。スフィンゴシンキナーゼ/TRAF2結合モチーフの同定により、この結合モチーフと相互作用することで、TNFが介する細胞活性を調節する物質の同定、設計および使用を対象とした方法の開発がさらに容易となった。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
続く本明細書および特許請求の範囲中で、文脈から別の意味に取らざるを得ない場合を除き、「含む（comprise）」という用語、ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」という変化形は、記述されたそのものもしくは段階、または複数の両者の群を含むが、他の如何なるものもしくは段階または複数の両者の群を排除することを意味するわけではないと理解される。
【００１１】
本明細書にて使用される「由来する」という用語は、特定のものが特定の供給源から必ずしも直接的に得られるわけではないが、その供給源から得ることができることを示すものとされる。
【００１２】
本明細書には、本明細書に参考文献の後に示したアミノ酸配列情報(プログラムPatentIn Version 3.1を用いて作製した)が含まれる。各アミノ酸配列は、配列表中で、数字表記<210>の後に記載の配列識別番号(例えば、<210>1、<210>2など)により特定されている。配列の長さ、配列の種類(タンパク質(PRT)など)および各アミノ酸配列の由来する生物は、それぞれ数字表記<211>、<212>および<213>の欄に記載の情報により示される。本明細書に記載されているアミノ酸配列は、数字表記の欄<400>の後の配列識別番号(例えば、<400>1、<400>2など)に記載の情報により特定される。
【００１３】
本発明の一つの局面により、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、サイトカイン誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００１４】
もう一つの局面において、本発明により、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの局面により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの局面により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を抑制するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞のアポトーシスを亢進させる、細胞のTNF誘導性の抗アポトーシス機能活性を抑制する方法が提供される。
【００１７】
もう一つの局面において、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を抑制するために十分な時間および条件の下で、細胞を物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞のTNF誘導性の炎症誘発活性の一つまたは複数を抑制する、細胞のTNF誘導性の炎症誘発機能活性を抑制する方法が提供される。
【００１８】
さらにもう一つの局面において、本発明により、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる(この物質は、スフィンゴシンキナーゼのC末端領域と結合する、連結する、またはそうでなければ会合する)段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、サイトカイン誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００１９】
なおもう一つのさらなる局面において、本発明により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる(この物質は、スフィンゴシンキナーゼのC末端領域と結合する、連結する、またはそうでなければ会合する)段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる局面により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる(この物質は、スフィンゴシンキナーゼのC末端領域のアミノ酸配列PPEEと、結合する、連結する、またはそうでなければ会合する)段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、哺乳動物における、サイトカイン誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための方法を対象とする。
【００２２】
なおさらに、本発明のさらなる局面により、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、哺乳動物における、TNF誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための方法が提供される。
【００２３】
もう一つの局面において、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を抑制するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、TNF誘導性の抗アポトーシス機能特性を抑制する、腫瘍性疾患の治療および／または予防のための方法が提供される。
【００２４】
さらにもう一つの局面において、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を抑制するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その哺乳動物によるTNF誘導性の炎症メディエーターの産生を抑制する、哺乳動物における炎症の治療および／または予防のための方法が提供される。
【００２５】
本発明のなおもう一つの局面は、先に定義したように、哺乳動物における、サイトカイン誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療のための医薬品の製造における、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節し、そしてその相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する物質の使用に関する。
【００２６】
なおもう一つのさらなる局面において、本発明は、これまでに定義した調節物質と、一つもしくは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤とを含む薬学的組成物を考慮する。上記の物質は活性成分と呼ばれる。
【００２７】
本発明のなおもう一つの局面は、先に定義したように、本発明の方法において用いられる場合の物質に関する。
【００２８】
本発明のもう一つの局面により、TRAFおよびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物または誘導体を含有する細胞またはその抽出物を、推定物質と接触させる段階、およびその相互作用に関連した発現表現型の変化を検出する段階を含む、TRAFのスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物またはその誘導体との相互作用を調節できる物質を検出するための方法が提供される。
【００２９】
本発明のさらなる局面により、TRAFおよびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物または誘導体を含有する細胞を、推定物質と接触させる段階、およびその相互作用に関連したアポトーシス特性の変化を検出する段階を含む、TRAFのスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物またはその誘導体との相互作用を調節できる物質を検出するための方法が提供される。
【００３０】
なおもう一つの局面において、本発明により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2結合部位またはその機能的等価物またはその誘導体を含有する細胞を、推定物質と接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物または誘導体の機能の調節と関連する発現表現型の変化を検出する段階を含む、その結合部位またはその機能的等価物またはその誘導体と結合できるかそうでなければ会合できる物質を検出するための方法が提供される。
【００３１】
なおさらに、本発明のさらなる局面は、スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体を、推定物質と接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼのTRAF結合部位とその物質の相互相補性の程度を評価する段階を含む、その結合部位またはその誘導体と相互作用でき、そしてそのスフィンゴシンキナーゼと関連する少なくとも一つの機能活性を調節できる物質を分析する、設計するおよび／または改変するための方法を対象とする。
【００３２】
関連する局面において、本発明は、先に定義される方法のいずれかを利用して同定された物質にまで及ぶと理解されるべきである。この点において、ある物質への言及は、少なくとも一つのTRAFを介する機能活性を調節する任意のタンパク質性または非タンパク質性分子への言及と理解されるべきである。
【００３３】
本明細書中で使用される1文字および3文字表記を表1に示す。
【００３４】
（表1）1文字および3文字アミノ酸の略称表記
2005502598.tif 000002
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、TRAFが介するサイトカインシグナル伝達経路におけるスフィンゴシンキナーゼの役割の解明とスフィンゴシンキナーゼ結合モチーフ(これを介してスフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用が起こる)の同定の双方に一部基づくものである。これらの決定により、異常なTNFシグナル伝達または望ましくないTNFシグナル伝達を特徴とするような疾患を治療するための治療および／または予防法の合理的な設計が可能となった。さらに、この結合モチーフと特異的に相互作用する物質の同定および／または設計が容易となり、これにより、ある程度の特異性が特許請求の範囲に記載の調節方法に導入され、TRAFを介したJNK活性化ではなく、TRAFを介したNF-κB活性化を選択的に調節する能力により副作用が減少される。
【００３６】
従って、本発明の一つの局面により、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、サイトカイン誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００３７】
「サイトカイン誘導性の細胞活性」という用語は、サイトカイン刺激の結果として細胞が遂行できる機能活性のうちのいずれか一つまたは複数を指すものとして理解されるべきである。
【００３８】
サイトカインはタンパク質ホルモンであり、本明細書で使用される「サイトカイン」という用語は、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロンまたはTNFを含むがこれらに限定されない、任意のタンパク質ホルモンまたはその誘導体、相同体、類似体、化学的等価物もしくは模倣体を指すものとして理解されるべきである。サイトカインは、TNFであることが好ましい。
【００３９】
本発明は、より詳しくは、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法を提供する。
【００４０】
「TNF」により、例えばTNF-αおよびTNF-βならびにその誘導体、相同体、類似体、化学的等価物および模倣体を含む、TNFの全ての形態を意味する。「TNF」という用語には同様に、TNF mRNAの選択的スプライシングから生じる任意のアイソフォームまたはTNFの突然変異体もしくは多型性変異体への言及も含まれると理解されるべきである。他の分子(その対象分子は、TNFまたはTNF様受容体を介したシグナル伝達の誘導により、一つまたは複数のTNFシグナル伝達事象を擬態する範囲内でTNF機能活性を示す)への言及も同様に含まれると理解されるべきである。本発明の方法は、TNFのその受容体との相互作用の結果として誘導された、細胞内シグナル伝達事象の調節による細胞活性の調節を対象としているので、TNFのTNF受容体との相互作用によるか、または天然に存在するもしくは天然に存在していない模倣体もしくは類似体のようなTNF模倣体のその対象となる受容体との相互作用により誘導されたかどうかとは関係なく、そのような細胞活性の調節に本方法を適用できる。例えば、個体に導入された場合、TNF受容体との相互作用により、好ましくないTNF様の細胞活性を誘導すると思われる、天然に存在するまたは天然に存在していないTNF模倣体(例えば、毒素または薬剤)が存在する可能性が考えられる。従って、本発明はその範囲が「TNF誘導性」であると本明細書で定義されるような細胞活性の調節にまで及ぶと理解されるべきである。
【００４１】
「TRAF」という用語は、アダプタータンパク質のうちTRAFクラスを指すものとして理解されるべきである。現在までに、このクラスにはTRAF1〜6と命名された6つの既知メンバーが存在している。「スフィンゴシンキナーゼ 」という用語は、とりわけ、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性化の際のスフィンゴシン-1-リン酸の産生に関与する分子を指すものとして理解されるべきである。
【００４２】
従って、「TRAF」および「スフィンゴシンキナーゼ 」という用語は、これらのタンパク質の全ての形態およびその誘導体、相同体、類似体、化学的等価物または模倣体を指すものとして理解されるべきである。これには例えば、目的のTRAFもしくはスフィンゴシンキナーゼのmRNAの選択的スプライシングから生じる任意のアイソフォーム、またはこれらのタンパク質の突然変異体もしくは多型性変異体が含まれる。TRAFは、TRAF2またはその誘導体、相同体、類似体、化学的等価物もしくは模倣体であることが好ましい。
【００４３】
TRAF2はTRAFファミリーの原型的メンバーである。それは多くのTNF受容体と直接的または間接的に相互作用でき、これらの受容体のシグナル伝達を媒介する。TRAF2はまた、I-TRAF/TANK、RIP、NIKおよびカスパーゼ阻害因子cIAPのような多数の細胞内タンパク質とも相互作用でき、これにより転写因子NF-κB、ストレスにより活性化されるタンパク質キナーゼ(SAPKまたはJNK)および抗アポトーシスの活性化に必要なシグナルを伝達する。構造研究により、シグナル連結点としてのTRAF2の複雑性および融通性が明らかとされている。
【００４４】
従って、より詳しくは、本発明により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００４５】
本発明を一つの理論または作用機序に限定するものではないが、TRAF2は、TNF受容体スーパーファミリーにより誘導される細胞活性化、細胞生存および抗アポトーシスを媒介する主要なアダプタータンパク質のうちの一つである。TNF受容体の関与により、それらのTRAF2との直接的または間接的な相互作用が引き起こされ、続いてJNK、NF-κBおよび抗アポトーシス経路の活性化に繋がる下流シグナルが補充される。現在までに、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との物理的相互作用により、スフィンゴシン-1-リン酸の生成がもたらされることが判明している。スフィンゴシン-1-リン酸は、細胞成長、細胞生存および細胞増殖をインビボおよびインビトロの両方で調節する二次メッセンジャーである。TRAF2のスフィンゴシンキナーゼとの相互作用は、JNKではなくNF-κBのTRAF2が介する活性化に必要であることも判明している。従って、TRAF2のスフィンゴシンキナーゼとの相互作用は、TRAF2が介するシグナル伝達経路のうちの一つ、即ちNF-κBの活性化に関与しているが、JNKを活性化する、TRAF2シグナル伝達の他の経路には関与していないと考えられる。従って、本発明がTRAF2の介するシグナル伝達の調節を対象とする限りにおいて、スフィンゴシンキナーゼ/TRAF2相互作用を調節する物質により、まず初めにTNFにより誘導され、JNKシグナル伝達経路により介されるものではなく、NF-κBにより介される細胞活性の調節のみがもたらされるような、有益なレベルの特異性が提供される。これにより、TRAF2シグナル伝達経路の両方が調節されていたならば、認められたと思われる副作用を減少させる可能性がある、有益なレベルの特異性が提供される。
【００４６】
上記に詳述したように、TNFは、細胞増殖、アポトーシス、抗アポトーシスならびに炎症および免疫調節応答を含むが、これらに限定されることはない、広範囲の細胞応答を誘導する極めて多機能なサイトカインである。本発明を一つの理論または作用機序に限定するものではないが、TRAFシグナル伝達により媒介される活性は主に、細胞活性化、抗アポトーシスおよび増殖の活性であると考えられている。さらに、本発明を一つの理論または作用機序に限定するものではないが、本発明者らにより、TRAF2には固有の触媒活性が含まれていないこと、およびタンパク質-タンパク質相互作用は、TRAF2が下流シグナルの活性化を媒介するために必須であることが明らかとなった。特に、スフィンゴシンキナーゼとTRAF2は、NF-κB活性化のような、下流のシグナル伝達事象の誘導を促進するために、スフィンゴシンキナーゼ結合モチーフを介して相互作用することが明らかとなった。スフィンゴシンキナーゼとTRAF2の「相互作用」という用語は、従って、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、共有結合または他の会合の形によるものを含むが、これらに限定されることはない、これら二分子間の相互作用の任意の形成を指すものとして理解されるべきである。
【００４７】
TRAFが介するTNF刺激と関連したスフィンゴシンキナーゼの役割およびこれら二分子間の相互作用の性質の双方の解明により、TNF誘導性の細胞活性を調節するための機構が規定される。「調節される」とは、亢進されるかまたは抑制されることを意味する。例えば、スフィンゴシンキナーゼとTRAFの相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、TRAFシグナル伝達経路により媒介される、TNF誘導性の細胞活性の発生または程度を誘発または亢進させる、例えば、細胞の増殖および/または抗アポトーシス特性を亢進させる手段が提供される。逆に、TRAFシグナル伝達経路により媒介されるTNF誘導性の細胞活性が望ましくない(例えば、望ましくない細胞増殖または細胞生存)限りにおいては、本発明の方法により、スフィンゴシンキナーゼ/TRAF相互作用の拮抗作用を介したそのような活性の抑制が容易となる。
【００４８】
「誘発させるかそうでなければ作動させる」という用語は、下記(i)、(ii)を指すものとして理解されるべきである。
【００４９】
(i)TNF様細胞活性化をもたらすために、スフィンゴシンキナーゼのTRAF、特にTRAF2との相互作用を誘発させること;または
【００５０】
(ii)最初の誘発に続いて、スフィンゴシンキナーゼ/TRAF相互作用を亢進させる、促進させるかそうでなければ作動させること。
【００５１】
逆に、スフィンゴシンキナーゼのTRAF、特にTRAF2との相互作用を「阻害するかそうでなければ拮抗する」とは、下記(i)、(ii)を指す。
【００５２】
(i)スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を防止すること(例えば、TNF刺激後の、または既知のもしくは今にも起こりそうな任意のTNF刺激がない場合の予防能として);または
【００５３】
(ii)スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの既存の相互作用を、その効果がないようにまたはその効果がより低くなるように拮抗すること(例えば、これら二分子の結合親和性を減少させること)。
【００５４】
スフィンゴシンキナーゼとTRAFとの間の相互作用の調節(亢進または抑制の意味のどちらかで)は、部分的であってもよく、または完全であってもよいと理解されるべきである。部分的な調節は、所定の細胞にて通常起こるスフィンゴシンキナーゼ/TRAF相互作用の一部のみが、本発明の方法により影響を受ける(例えば、細胞がTNF刺激を受けている時間の一部のみに、本発明の方法をその細胞に適用する、または被験細胞と接触させる物質を、細胞内スフィンゴシンキナーゼ/TRAF相互作用を満たすのに不十分な濃度で供給する)場合に起こるが、完全な調節は、全てのスフィンゴシンキナーゼ/TRAF相互作用が調節される場合に起こる。
【００５５】
対象となるTNF誘導性の細胞活性は、抗アポトーシス特性の誘導または炎症誘発活性の亢進であることが好ましい。
【００５６】
この好ましい態様により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を抑制するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞のアポトーシスを亢進させる、細胞のTNF誘導性の抗アポトーシス機能活性を抑制する方法が提供される。
【００５７】
もう一つの好ましい態様において、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を抑制するために十分な時間および条件の下で、細胞を物質と接触させる段階を含む方法であって、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞のTNF誘導性の炎症誘発活性の一つまたは複数を抑制する、細胞のTNF誘導性の炎症機能活性を抑制する方法が提供される。
【００５８】
スフィンゴシンキナーゼとTRAFとの間の相互作用の調節は、下記(i)〜(iv)を含む多くの方法のうちのいずれか一つにより達成されうるが、下記(i)〜(iv)に限定されることはない。
【００５９】
(i)シグナル伝達を目的として利用可能なTRAFまたはスフィンゴシンキナーゼの細胞内濃度を調節するために、TRAFもしくはスフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体、相同体もしくは類似体をコードする核酸分子を細胞中に導入する方法、またはスフィンゴシンキナーゼまたはTRAFのタンパク質性の形態のもの、またはその誘導体、相同体、類似体、化学的等価物もしくは模倣体を導入する方法。
【００６０】
(ii)遺伝子の転写および/または翻訳調節を調節する、タンパク質性または非タンパク質性分子を細胞に導入する方法。ここで、前記遺伝子は、TRAF遺伝子またはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子であってもよい。
【００６１】
(iii)競合阻害剤のような、TRAFとスフィンゴシンキナーゼとの間の相互作用と拮抗する、タンパク質性または非タンパク質性分子を細胞に導入する方法。
【００６２】
(iv)TRAFとスフィンゴシンキナーゼとの間の相互作用を作動させる、タンパク質性または非タンパク質性分子を細胞に導入する方法。
【００６３】
「物質」という用語は、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節する、任意のタンパク質性または非タンパク質性分子を指すものとして理解されるべきであり、これには例えば前記要点(i)〜(iv)で詳述されている分子が含まれる。対象物質を、任意のタンパク質性または非タンパク質性分子と連結させる、結合させるかまたはそうでなければ会合させてもよい。例えば、それを局部へのその標的化を可能とする分子と会合させてもよい。
【００６４】
上記のタンパク質性分子は、融合タンパク質または以下の例えば天然物スクリーニングを含む天然、組換え型または合成起源に由来してもよい。上記の非タンパク質性分子は、例えば天然物スクリーニングのような天然起源に由来してもよく、または化学合成してもよい。本発明は、スフィンゴシンキナーゼ/TRAF相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる上記のスフィンゴシンキナーゼまたはTRAFの化学類似体を考慮する。化学的アゴニストは、必ずしも上記のスフィンゴシンキナーゼまたはTRAFに由来せず、特定の構造類似性を共有してもよい。または、化学的アゴニストは、上記のスフィンゴシンキナーゼまたはTRAFの特定の物理化学的特性を特に模倣するように設計してもよい。アンタゴニストは、上記のスフィンゴシンキナーゼおよびTRAFが相互作用できないように遮断、阻害、またはそうでなければ防止することができる任意の化合物であってもよい。アンタゴニストには、上記のスフィンゴシンキナーゼまたはTRAFに対して特異的なモノクローナル抗体、または上記のスフィンゴシンキナーゼの一部、および被験細胞において遺伝子またはmRNAの転写または翻訳を防止するアンチセンス核酸が含まれる。発現の調節はまた、抗原、RNA、リボソーム、DNAザイム、RNAアプタマー、抗体、または共抑制における使用に適した分子を用いて行ってもよい。そのような分子を同定する際の使用に適したスクリーニング方法について、より詳細に後述する。
【００６５】
上記のタンパク質性または非タンパク質性分子は、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために直接または間接的に作用し得る。上記の分子がスフィンゴシンキナーゼまたはTRAF分子と会合する場合、直接的作用とする。上記の分子がスフィンゴシンキナーゼまたはTRAF以外の分子と会合し、他の分子がスフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を直接または間接的に調節する場合、間接的作用とする。従って、本発明の方法には、調節段階の経路の誘導によってスフィンゴシンキナーゼ/TRAF相互作用を調節することが包含される。
【００６６】
「誘導体」には、融合タンパク質を含む、天然、合成、または組換え起源からの断片、一部、部分、変異体、変種および模倣体が含まれる。一部または断片には、例えば、スフィンゴシンキナーゼまたはTRAFの活性部位が含まれる。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換に由来してもよい。アミノ酸挿入誘導体には、単一または複数アミノ酸の配列内挿入と共に、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合体が含まれる。挿入アミノ酸配列変種は、一つまたは複数のアミノ酸残基がタンパク質の既定の部位に導入されているものであるが、得られた産物を適切にスクリーニングすればランダム挿入も同様に可能である。欠失変種は、一つまたは複数のアミノ酸が配列から除去されることを特徴とする。置換アミノ酸変種は、配列における少なくとも一つの残基が除去されて、異なる残基がその場所に挿入されている変種である。置換アミノ酸変種の例としては、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換には、典型的に、以下の群内での置換が含まれる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。アミノ酸配列への付加には、他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質との融合体が含まれる。
【００６７】
「相同体」という用語は、処置される種以外の種に由来する核酸分子またはタンパク質を指すものとして理解されるべきである。
【００６８】
核酸またはタンパク質分子の化学的および機能的等価物は、これらの分子の任意の一つまたは複数の機能的活性を示す分子として理解されるべきであり、化学合成されるか、または天然物スクリーニングのようなスクリーニング工程を介して同定される場合のように、如何なる起源に由来してもよい。
【００６９】
誘導体には、ペプチド、ポリペプチド、または他のタンパク質性分子もしくは非タンパク質性分子と融合した完全なタンパク質の特定のエピトープまたは一部を有する断片が含まれる。
【００７０】
本明細書において考慮される類似体には、非天然アミノ酸および／またはその誘導体をペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質合成の際に組み入れる側鎖の改変、ならびにタンパク質性分子またはその類似体に対する構造の拘束を課すクロスリンク剤および他の方法の使用が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００７１】
核酸配列の誘導体は、同様に、他の核酸分子との融合体を含む、単一または複数のヌクレオチド置換、欠失、および／または付加に由来するものであってもよい。本発明の核酸分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、PCRプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の共抑制および融合における使用に適した分子が含まれる。核酸配列の誘導体にはまた、縮重変種が含まれる。
【００７２】
本発明によって考慮される側鎖の改変の例には、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化に続いてNaBH4を用いた還元によるような、アミノ基の改変；メチルアセトイミデートによるアミジン化（amidination）；無水酢酸によるアシル化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサール-5-リン酸によるリジンのピリドキシル化に続くNaBH4による還元が含まれる。
【００７３】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサールのような試薬による複素環縮合産物の形成によって改変してもよい。
【００７４】
カルボキシル基は、O-アシルイソウレア形成によるカルボジイミド活性化の後に、例えば、対応するアミドへのその後の誘導体形成によって改変してもよい。
【００７５】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；過ギ酸のシステイン酸への酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィド形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；4-塩化水銀ベンゾエート、4-塩化水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-塩化水銀-4-ニトロフェノール、および他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成；アルカリpHでのシアネートのカルバモイル化のような方法によって改変してもよい。
【００７６】
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドによる酸化、または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルフェニルによるインドール環のアルキル化によって改変してもよい。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンとのニトロ化によって3-ニトロチロシン誘導体を形成してもよい。
【００７７】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の改変は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化、またはジエチルピロカーボネートによるN-カルボエトキシル化によって行ってもよい。
【００７８】
タンパク質合成の際に非天然のアミノ酸および誘導体を組み入れる例には、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のD-異性体の使用が含まれるが、これらに限定されることはない。本明細書において考慮される非天然アミノ酸のリストを表2に示す。
【００７９】
（表2）
2005502598.tif 000003
2005502598.tif 000004
2005502598.tif 000005
【００８０】
クロスリンク剤は、例えば、n=1〜n=6の(CH2)nスペーサー基を有する二機能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなホモ二機能性クロスリンク剤、およびN-ヒドロキシスクシンイミドのようなアミノ反応部分ともう一つの基特異的反応部分とを通常含むヘテロ二機能性試薬を用いて、3D立体構造を安定化させるために用いることができる。
【００８１】
本発明の方法により処置される細胞は、エクスビボまたはインビボにあってもよいと理解されるべきである。「エクスビボ」とは、細胞を被験体の体内から切除し、その活性の調節はインビトロにて開始されることを意味する。例えば、細胞は、長期培養される非腫瘍細胞でもよく、従って、持続的にTNF誘導性の増殖を受けるように刺激され、その増殖はスフィンゴシンキナーゼ/TRAF2相互作用のアゴニストにより亢進される。本発明の好ましい局面によれば、細胞を、インビボ(例えば、結腸中)にある、悪性細胞のような腫瘍細胞としてもよく、その増殖抑制は、本発明の方法をインビボで適用し、スフィンゴシンキナーゼ/TRAF相互作用のレベルを抑制してアポトーシスを誘発することにより達成される。
【００８２】
本発明を一つの理論または作用機序に限定するものではないが、本発明者らは、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2結合モチーフを同定した。特に、現在、スフィンゴシンキナーゼのC末端残基が、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用において重要な役割を果たしていることが明らかにされている。さらにより詳しくは、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2結合モチーフは、<400>1の位置379〜382にあるアミノ酸PPEEにより定義される部位に相当することが確認されている。
【００８３】
もう一つの局面において、本発明により、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる(この物質は、スフィンゴシンキナーゼのC末端領域と結合する、連結する、またはそうでなければ会合する)段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、サイトカイン誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００８４】
より詳しくは、本発明により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる(この物質は、スフィンゴシンキナーゼのC末端領域と結合する、連結する、またはそうでなければ会合する)段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００８５】
好ましい態様において、前記C末端領域はアミノ酸配列PPEEにより定義され、そしてより詳しくは、前記PPEEモチーフは<400>1の位置番号379〜382に位置するモチーフに相当する。
【００８６】
この好ましい態様により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、細胞を有効量の物質と接触させる(この物質は、スフィンゴシンキナーゼのC末端領域のアミノ酸配列PPEEと結合する、連結する、またはそうでなければ会合する)段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、TNF誘導性の細胞活性を調節する方法が提供される。
【００８７】
さらにより詳しくは、前記配列は、<400>1の位置番号379〜382に位置する。
【００８８】
本発明のさらなる局面は、病状の治療および／または予防と関連した本発明の使用に関する。本発明を一つの理論または作用機序に限定するものではないが、サイトカイン、とりわけTNFの多機能活性が、これらの分子を、健康および疾患状態の双方の生理的過程のあらゆる局面における不可欠な機能成分としている。従って、本発明の方法により、異常なサイトカイン機能活性、またはそうでなければ望ましくないサイトカイン機能活性を調節するための価値ある手段が提供される。
【００８９】
従って、本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、哺乳動物における、サイトカイン誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための方法を対象とする。
【００９０】
より詳しくは、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることにより、その細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その細胞活性を抑制する、哺乳動物における、TNF誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療および／または予防のための方法が提供される。
【００９１】
前記TRAFは、TRAF2であることが好ましい。
【００９２】
「異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な」細胞活性という用語は、過剰に活発な細胞活性、それが望ましくないという点において不適当である生理的に正常な細胞活性、または不十分な細胞活性を指すものとして理解されるべきである。例えば、腫瘍細胞が増殖する間のTNF産生により、細胞増殖が維持されること、および抗アポトーシス特性を腫瘍細胞に与えることが明らかにされている。本発明を決して限定するわけではないが、これらの生存促進特性は、TRAF2経路を介してシグナル伝達されると考えられている。細胞が腫瘍細胞である限りにおいて、そのような活性が抑制されるのが望ましいことは明らかである。同様に、関節リウマチのような、炎症を特徴とする疾患には、炎症メディエーターの合成および分泌を引き起こす、TNF誘導性の細胞の活性化が含まれていることが知られている。そのような状況において、そのような活性を抑制することもまた、望ましい。さらにもう一つの例として、腫瘍状態の治療を目的としたTNF療法に関連する現在の制限として、TNF刺激に関連する多機能活性および複数のシグナル伝達経路に関するものがある。従って、TNF刺激により、TRADDが介するシグナル伝達機構によるアポトーシス経路の活性化が引き起こされる可能性があるが、そのような治療の副作用として、極めて深刻な炎症反応を頻繁に引き起こす、TRAFが介する炎症メディエーター産生が誘導される可能性がある。従って、本発明により、腫瘍状態におけるTNF療法を調整する手段が提供される。特に、TNFの投与を利用して腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することができるが、TRAF2/スフィンゴシンキナーゼ相互作用の同時阻害を利用して、他で誘発される可能性がある炎症メディエーターの産生を抑制することができる。さらに、TRAF2経路のTNF刺激により誘発され得る、抗アポトーシス特性の抑制が達成される。従って、本発明の方法により、TNFの傷害活性(killing activity)を促進させ、同時に好ましくない炎症反応を減少させる手段が提供される。
【００９３】
従って、一つの好ましい態様において、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を抑制するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、TNF誘導性の抗アポトーシス機能特性を抑制する、腫瘍性疾患の治療および／または予防のための方法が提供される。
【００９４】
もう一つの好ましい局面において、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2との相互作用を抑制するために十分な時間および条件の下で、有効量の物質を哺乳動物に投与する段階を含む方法であって、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することにより、その哺乳動物によるTNF誘導性の炎症メディエーターの産生を抑制する、哺乳動物における、炎症の治療および／または予防のための方法が提供される。
【００９５】
本明細書で使用される「哺乳動物」という用語には、ヒト、霊長動物、家畜動物(例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット)、伴侶動物(例えば、イヌ、ネコ)および捕らえられた野生動物(例えば、キツネ、カンガルー、シカ)が含まれる。哺乳動物は、ヒトまたは実験動物であることが好ましい。哺乳動物は、ヒトであることがさらにより好ましい。
【００９６】
「有効量」とは、少なくともある程度、所望の反応を達成するために、または治療する特定の疾患の発病を遅らせるために、または治療する特定の疾患の進行を抑制するために、または治療する特定の疾患の発病もしくは進行を完全に阻止するために必要な量を意味する。その量は、治療される個体の健康および生理的状態、治療される個体の分類群、望まれる予防の程度、組成物の処方設計、病状の評価、および他の関連する要因に応じて変化する。その量は、通常の試験により決定することができ、比較的、広範囲にわたると予測される。
【００９７】
本明細書において「治療」および「予防」という用語は、最も広い意味において考慮されるべきである。「治療」という用語は、完全に回復するまで被験者を治療することを必ずしも意味しない。同様に、「予防」は、被験者が最終的に疾患状態にならないことを必ずしも意味しない。従って、治療および予防には、特定の疾患の症状を改善すること、または特定の疾患の発症の危険性を予防またはそうでなければ減少させることが含まれる。「予防」という用語は、特定の疾患の重症度または発病を減少させると見なしてもよい。「治療」はまた、既存の疾患の重症度を減少させてもよい。
【００９８】
本発明によりさらに、癌の治療において、循環細胞毒性物質または放射線療法に哺乳動物をさらすことに合わせて物質を投与するような治療の組み合わせが考慮される。
【００９９】
調節物質の投与は、薬学的組成物の形において、如何なる都合の良い手段によって行ってもよい。薬学的組成物の調節物質は、特定の場合に依存する量を投与した場合に、治療的活性を示すことが考慮される。変更は、例えば、ヒトまたは動物、および選択する調節物質に依存する。広範囲の用量を適用してもよい。例えば、患者に応じて、調節物質約0.1 mg〜約1 mgを1日に体重1 kgあたり投与してもよい。用法は、最適な治療反応を提供するように調節してもよい。例えば、いくつかの分割用量を毎日、毎週、毎月、または他の適した時間間隔で投与してもよく、または用量は、状況の緊急性によって示されるように比例して減少させてもよい。
【０１００】
調節物質は、経口、静脈内(水溶性の場合)、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、または坐剤経路、またはインプラント(例えば、徐放性分子を用いて)によるような都合の良い様式で投与してもよい。調節物質は、酸付加塩、または例えば、亜鉛、鉄等の金属複合体のような(本出願の目的にとって塩と見なされる)、薬学的に許容される非毒性の塩の形で投与してもよい。そのような酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等である。活性成分を錠剤として投与する場合、錠剤は、トラガカント、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；アルギン酸のような崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含んでもよい。
【０１０１】
投与経路には、呼吸器内、気管内、鼻咽喉内、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、くも膜下腔内、脳内、鼻腔内、注入、経口、直腸内、IV点滴パッチ、およびインプラントが含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１０２】
これらの方法に従って、本発明に基づいて定義される物質を、一つまたは複数の他の化合物または分子と同時投与してもよい。「同時投与する」とは、同じ処方での、または同じもしくは異なる経路を介した二回の異なる処方で同時に投与すること、または同じもしくは異なる経路による逐次投与を意味する。例えば、対象物質を、その効果を促進させるためにアゴニスト物質とともに投与してもよい。「逐次」投与とは、二種類の分子の投与間の、数秒、数分、数時間または数日間の時間の相違を意味する。これらの分子は、どの順序で投与してもよい。
【０１０３】
本発明のもう一つの局面により、先に定義したように、哺乳動物における、サイトカイン誘導性の異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞活性を特徴とする疾患の治療のための医薬品の製造における、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用を調節し、そしてその相互作用を誘発させるかそうでなければ作動させることによりその細胞活性を亢進させ、その相互作用を阻害するかそうでなければ拮抗することによりその細胞活性を抑制する、物質の使用が考慮される。
【０１０４】
前記サイトカインはTNFであり、そして前記TRAFはTRAF2であることが好ましい。
【０１０５】
前記TNF誘導性の細胞活性の調節は、抗アポトーシス特性の抑制、または炎症メディエーターの産生の抑制であることがさらにより好ましい。
【０１０６】
なおもう一つのさらなる局面において、本発明により、先に定義した調節物質と、一つもしくは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤とを含む薬学的組成物が考慮される。前記物質は活性成分と呼ばれる。
【０１０７】
注射での使用に適した製剤には、滅菌水溶液(水溶性の場合)もしくは分散剤、および滅菌注射用溶液もしくは分散剤の即時調合剤のための滅菌粉末が含まれ、または局所適用に適したクリームもしくは他の剤形の形であってもよい。これは製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等)、その適した混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒体とすることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンのような被覆物を用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤（superfactant）を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって行うことができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に用いることによって行うことができる。
【０１０８】
滅菌注射用溶液は、先に列挙した他の様々な成分と共に、適当な溶媒中に必要量の活性化合物を組み入れた後、必要に応じ、濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、基礎分散媒体と先に列挙したもののうちの必要な他の成分とを含む滅菌媒体に様々な滅菌した活性成分を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えてさらなる所望の成分の粉末を、先に濾過滅菌したその溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１０９】
活性成分を適切に保護する場合、それらは、例えば、不活性希釈剤と共に、もしくは同化できる食用担体と共に経口投与してもよく、硬もしくは軟ゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、または食品に直接組み入れてもよい。経口治療的投与の場合、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウェーハ等の形で用いてもよい。そのような組成物および調製物は、活性化合物の重量で少なくとも1%を含まなければならない。組成物および調製物の割合は、当然のこととして変化してもよく、単位重量あたり約5%〜約80%であることが都合がよいと考えられる。そのような治療的に有用な組成物における活性化合物の量は、適した用量が得られるような量である。本発明に従う好ましい組成物または調製物は、経口用量単位剤形が活性化合物の約0.1μg〜2000 mgを含むように調製される。
【０１１０】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等はまた、以降に記載する成分を含んでもよい:ガム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤;リン酸二カルシウムのような賦形剤;コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等のような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤;および蔗糖、乳糖、またはサッカリンのような甘味料を加えてもよく、またはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリー着香料のような香料を加えてもよい。用量単位剤形がカプセル剤である場合、これは上記の種類の材料の他に、液体担体を含んでもよい。他の様々な材料が被覆物として存在してもよく、または用量単位の物理的な形状を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖またはその両者によって被覆してもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としての蔗糖、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料、およびチェリーまたはオレンジ香料のような着香料を含んでもよい。当然、如何なる用量単位剤形を調製するために用いられる如何なる材料も薬学的に純粋でなければならず、用いられる量において実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物(群)を、徐放性調製物および製剤に組み入れてもよい。
【０１１１】
薬学的組成物はまた、ベクターが調節物質をコードする核酸分子を有する場合に、標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターのような遺伝子分子を含んでもよい。ベクターは、例えばウイルスベクターであってもよい。
【０１１２】
本発明のさらにもう一つの局面は、本発明の方法にて使用される場合、先に定義した物質に関する。
【０１１３】
先に定義した調節物質のスクリーニングは、スフィンゴシンキナーゼおよびTRAFを含む細胞を物質に接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼ/TRAFの機能的活性の調節、または下流のスフィンゴシンキナーゼもしくはTRAFの細胞標的、例えばNF-κBの活性もしくは発現の調節に関してスクリーニングする段階を含むが、これらに限定されることはない、いくつかの適した方法のいずれか一つによって行うことができる。そのような調節の検出は、ウェスタンブロッティング法、電気泳動移動度シフトアッセイ法、および／またはスフィンゴシンキナーゼもしくはTRAF活性のレポーターの読み出し、例えばルシフェラーゼ、CAT等のような技術を利用して行うことができる。
【０１１４】
スフィンゴシンキナーゼまたはTRAFタンパク質は、試験の被験体である細胞において本来存在してもよく、またはそれらをコードする遺伝子は、試験の目的のために宿主細胞にトランスフェクトされていてもよいと理解されるべきである。さらに、天然に存在する、またはトランスフェクトされた遺伝子は、構成的に発現されてもよく、それによって、とりわけスフィンゴシンキナーゼとTRAFの相互作用性を抑制する物質のスクリーニングに有用なモデルが提供され、または、遺伝子は、ファージディスプレイ法および酵母ツーハイブリッドもしくはマルチハイブリッドスクリーニング法のような特定の刺激条件の下での活性化を必要としてもよく、それによって、とりわけスフィンゴシンキナーゼとTRAFの相互作用性を調節する物質のスクリーニングに有用なモデルが提供される。さらに、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子が細胞にトランスフェクトされる限りにおいて、その分子は、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子全体を含んでもよく、TRAF2結合部位のような遺伝子の一部だけを含んでもよい。
【０１１５】
もう一つの例において、検出の対象は、スフィンゴシンキナーゼそのものではなく、下流のスフィンゴシンキナーゼ調節標的、例えば、TRAF2またはNF-κBでありうる。さらにもう一つの例には、最小レポーターに連結されたスフィンゴシンキナーゼ結合部位が含まれる。例えば、スフィンゴシンキナーゼとTRAFの相互作用性の調節は、TNFで刺激した細胞の下流のシグナル伝達成分の調節をスクリーニングすることにより検出することができる。これは、スフィンゴシンキナーゼおよびTRAFがその活性を調節する、分子の調節を監視する系の一例である。スクリーニング系の被験体である細胞が腫瘍細胞である場合、例えば、スフィンゴシンキナーゼとTRAFの相互作用性の調節は、その細胞のアポトーシスの誘発をスクリーニングすることにより検出することができると考えられる。
【０１１６】
従って、本発明のもう一つの局面により、TRAFおよびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物または誘導体を含有する細胞またはその抽出物を、推定物質と接触させる段階、およびその相互作用に関連した発現表現型の変化を検出する段階を含む、TRAFのスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物またはその誘導体との相互作用を調節できる物質を検出するための方法が提供される。
【０１１７】
「スフィンゴシンキナーゼ 」および「TRAF」という用語は、スフィンゴシンキナーゼもしくはTRAF発現産物、またはスフィンゴシンキナーゼタンパク質のTRAF2結合領域のような、スフィンゴシンキナーゼもしくはTRAF分子の一部もしくは断片を指すものとして理解されるべきである。この点において、スフィンゴシンキナーゼまたはTRAF発現産物は、細胞中に発現される。細胞は、スフィンゴシンキナーゼまたはTRAF核酸分子をトランスフェクトされている宿主細胞であってもよく、またはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を本来含む細胞であってもよい。「その抽出物」という用語は、無細胞転写系を指すものとして理解されるべきである。
【０１１８】
「その相互作用に関連した発現表現型の変化」を検出するという用語は、スフィンゴシンキナーゼのTRAFとの相互作用の調節に関連した細胞変化の検出として理解すべきである。これらは、例えば、細胞内変化または細胞外で認めることができる変化として検出可能であってもよい。例えば、これには、下流の産物レベルまたは活性(例えば、NF-κB)の変化を検出することが含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１１９】
好ましい態様において、本発明により、TRAFおよびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物または誘導体を含有する細胞を、推定物質と接触させる段階、およびその相互作用に関連したアポトーシス特性の変化を検出する段階を含む、TRAFのスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物またはその誘導体との相互作用を調節できる物質を検出するための方法が提供される。
【０１２０】
なおもう一つの局面において、本発明により、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2結合部位またはその機能的等価物またはその誘導体を含有する細胞を、推定物質と接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物または誘導体の機能の調節と関連する発現表現型の変化を検出する段階を含む、その結合部位またはその機能的等価物またはその誘導体と結合できるかそうでなければ会合できる物質を検出するための方法が提供される。
【０１２１】
「スフィンゴシンキナーゼのTRAF2結合部位」という用語は、先に定義したように、TRAF2と相互作用するスフィンゴシンキナーゼ結合モチーフを指すものとして理解されるべきである。
【０１２２】
前述の種類の機能に基づくアッセイを利用して、TRAFとスフィンゴシンキナーゼの相互作用を調節する物質をスクリーニングすることに加えて、スフィンゴシンキナーゼのTRAF2結合モチーフの同定によりまた、推定物質またはリード化合物の対象結合部位との物理的相互作用の解析に基づき、TRAFとスフィンゴシンキナーゼの相互作用を調節する物質のスクリーニング、解析、合理的設計および/または調節が容易となる。
【０１２３】
特に、結合部位の性質および位置を理解することにより、X線結晶学のような技術による結合部位の構造に関するスフィンゴシンキナーゼの三次元構造の解析が容易となる。
【０１２４】
従って、本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体を、推定物質と接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼのTRAF結合部位とその物質の相互相補性の程度を評価する段階を含む、その結合部位またはその誘導体と相互作用でき、そしてそのスフィンゴシンキナーゼと関連する少なくとも一つの機能活性を調節できる物質を分析する、設計するおよび／または改変するための方法を対象とする。
【０１２５】
スフィンゴシンキナーゼのTRAF結合部位は、本明細書では「スフィンゴシンキナーゼ結合部位」と呼ばれる。
【０１２６】
前記スフィンゴシンキナーゼ結合部位は、<400>1の位置番号379〜382のアミノ酸配列PPEEにより定義されることが好ましい。
【０１２７】
相互相補性を評価するために推定物質と接触されるスフィンゴシンキナーゼは、組み換え技術によって産生されてもよいと理解されるべきである。しかし、対象となるスフィンゴシンキナーゼは、当業者に周知であると思われる技術およびソフトウェアを用いて、スフィンゴシンキナーゼ部位と物質の相互作用の解析を容易にする、明らかとなった結合部位の構造に基づくイメージ、例えば、電子密度図、分子モデル(棒、球棒、空間充填または表面表現モデルが含まれるが、これらに限定されることはない)または他のデジタル式もしくは非デジタル式表面表現モデルもしくはイメージの形をとってもよいとも理解されるべきである。例えば、相互作用の解析は、リガンドの結合に対するオン/オフ速度および解離定数のBiacoreリアルタイム解析(Gardsvollら, 1999; Hoyer-Hansenら, 1997; Ploug, 1998; Plougら, 1994; 1995; 1998)ならびにNMR摂動実験(Stephensら, 1992)のような技術を用いて行うことができる。
【０１２８】
対象となるスフィンゴシンキナーゼ結合部位と物質の「相互相補性の程度を評価する」という用語は、対象となるスフィンゴシンキナーゼ結合部位と関心のある物質との間の相互作用の性質および/または程度を含むが、これらに限定されることはない、関心のある任意の特性を明らかにすることを指すものとして理解されるべきである。上記に詳述したように、任意の適した技術を用いることができる。そのような技術は当業者に周知であると思われ、これと関連して用いることができる。対象となる相互作用の性質に関して、ある所定の物質の特定残基とスフィンゴシンキナーゼ結合部位の特定残基との間で起こる、相互作用の機構の種類(例えば、ペプチド結合または水素結合の形成、イオン結合、ファンデルワールス力等)および/またはそれらの相対的強度を評価することが望ましいかもしれない。関心のある物質と対象となるスフィンゴシンキナーゼ結合部位との間で起こる、相互作用の程度を評価することもまた、望ましいかもしれない。例えば、対象となる物質とスフィンゴシンキナーゼ結合部位との間の実際の相互作用部位の位置を解析することにより、スフィンゴシンキナーゼ結合部位のこの領域への物質の適合性の質、ならびにその結合相互作用の相対的強度および安定性を決定することが可能となる。例えば、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の機能を遮断することを目的とする場合、TRAF2相互作用を阻止するかまたはそうでなければ妨害する(例えば、立体的に妨害するまたは化学的もしくは静電気的に寄せつけない)ような、スフィンゴシンキナーゼ結合部位と相互作用する物質が求められると思われる。TRAFが介するスフィンゴシンキナーゼ機能の調節に関して必要とされる会合の形には、従来から理解されているように、いかなる相互作用性の化学結合機構の形成も含まれないかもしれないが、例えば、活性化分子の結合に対して立体障害をもたらすために、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の対象となる結合領域に対する物質領域が最も近くなる位置のような、非結合機構が含まれるかもしれない。相互作用が、障害の形または他の斥力の生成となって現れる場合、結合機構の従来の形のいずれかが形成されていなくても、これはそれでもなお「相互作用」の形として理解されるべきである。
【０１２９】
上記に述べたように、推定物質の相互相補性を評価するため、物理的形状でか、またはイメージとしてかどちらかで用いられるスフィンゴシンキナーゼ結合部位は、天然に存在するスフィンゴシンキナーゼ結合部位の形状であってもよく、またはそれはその誘導体、相同体、類似体、変異体、断片もしくは等価物であってもよいと、また理解されるべきである。その誘導体、相同体、類似体、変異体、断片もしくは等価物は、物理的または非物理的(例えば、イメージ)形状のどちらであってもよい。
【０１３０】
スフィンゴシンキナーゼ結合領域の決定により、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の三次元構造の決定、ならびにTRAFが介するスフィンゴシンキナーゼ機能を調節するために使用できる物質の同定および/または合理的改変および設計が容易となる。
【０１３１】
本発明の用途を決して限定するわけではないが、本発明の方法により、スフィンゴシンキナーゼ結合部位と相互作用できる物質の解析、設計および/または改変が容易となる。この点において、物質の「解析、設計および/または改変」という用語は、その最も広い意味において以下(i)〜(iii)を含むと理解されるべきである。
【０１３２】
(i)TRAFが介するスフィンゴシンキナーゼの機能活性に関して何らかの調節能を示す物質を同定するために無作為スクリーニング(例えば、日常的な高処理スクリーニング法を利用する)を行い、次いで本発明のこの局面の方法を用いて、物質の調節能の正確な性質および度合いを解析する。この点において、既存の結晶を物質に浸すかまたは同時結晶化を行うことができると思われる。次いで、例えば在来化合物(local compound)のモデル化および合成による改変を、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の突然変異形成と共に組み合せて、行うことができると思われる。活性を調節する可能性がある物質をスクリーニングする際には、標準的ファージディスプレイ法および同様にしてコンビナトリアルケミストリーを用いてもよい(Goodsonら, 1994; Terrett, 2000)。そのような相互作用研究はまた、Biacore解析およびNMR摂動実験のような技術を用いて推進することができる。そのような物質は、作動的かまたは拮抗的かのいずれかで機能するそれらの能力に関し、タンパク質性または非タンパク質性分子をランダムスクリーニングするという点で、一般によく「リード」物質と呼ばれる。さらに、例えば、結合親和性および特異性を、リード物質を改変してスフィンゴシンキナーゼ結合部位との相互作用を最大化することで促進できると思われる。そのような解析により、所定の目的に最適な物質の選別が容易になると思われる。このようにして、選別段階はインビトロデータだけでなく、物質/スフィンゴシンキナーゼ相互作用部位の、所定の目的に対するそれらの頻度、安定性および適合性に関する解析法にもまた基づいている。例えば、そのような解析により、無作為に同定された物質に関してインビトロ活性において許容可能であると思われるものが、実際には、大きな斥力を示す物質/スフィンゴシンキナーゼ部位が近位に存在することで、物質とスフィンゴシンキナーゼとの間の全体的な相互作用が脱安定化されることにより、極めて不安定な相互作用により誘導されていることが明らかになる可能性がある。これにより、その結果、インビトロ活性を同程度示すが、さらなる解析により、その物質がそのような脱安定化斥力の存在を伴わない、別の有望なリード化合物の選別が容易になると思われる。
【０１３３】
本明細書で定義される調節物質のスクリーニングは、当業者に周知であると思われる、例えば、リード化合物を同定することを目的としてタンパク質性および非タンパク質性分子を無作為にスクリーニングするために日常的に利用される、インシリコ法を含む、いくつかの適当な方法のうちのいずれか一つにより達成することができる。
【０１３４】
これらの方法により、合成、組換え、化学および天然ライブラリーを含む、タンパク質性または非タンパク質性物質のような、推定調節物質の高処理スクリーニングを行うための機構が提供される。
【０１３５】
(ii)候補物質またはリード物質(例えば、要点(i)に記載の方法に従って同定された物質)は、スフィンゴシンキナーゼとの望ましい相互作用(例えば、特異的な結合親和性)を最大化し、望ましくない相互作用(例えば、反発相互作用かそうでなければ脱安定化相互作用)を最小化するために、改変できると思われる。
【０１３６】
本明細書に定義される目的に従う候補物質またはリード物質の改変方法は、当業者に周知であると思われる。例えば、Amore(Navaza, 1994)のような分子置換プログラムをこの点に関して利用してもよい。本発明の方法によりまた、シグナル伝達活性を除去するかまたは改善するため、周知のシグナル誘発物質の突然変異形成が容易となる。
【０１３７】
(iii)適合分子を解析するおよび/または既存分子を構造的に改変することのほか、本発明の方法によりまた、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の望ましい相互作用構造特性を示す物質を理論的にモデル化すること、次いでその対象物質の合成および試験に基づいて、アゴニスト物質またはアンタゴニスト物質のような物質の合理的設計および合成が容易となる。
【０１３８】
上記用途(i)〜(iii)のうちのいずれか一つまたは複数を、特定の物質を同定する際に用いてもよいと理解されるべきである。
【０１３９】
関連する局面において、本発明は、先に定義された方法のいずれかを利用して同定された物質にまで及ぶと理解されるべきである。この点において、ある物質への言及は、少なくとも一つのTRAFを介する機能活性を調節する任意のタンパク質性または非タンパク質性分子への言及と理解されるべきである。
【０１４０】
本発明は、下記の非限定的な実施例によりさらに明確にされる。
【０１４１】
実施例1
TRAF2によるシグナル伝達におけるスフィンゴシンキナーゼの役割の同定
材料および方法
細胞、プラスミド、突然変異導入法、およびトランスフェクション法
HEK 293TはAmerican Type Culture Collectionから入手し、10%ウシ胎児血清(FCS)を添加したDMEM(GIBCO BRL社)中で維持した。ヒト臍静脈細胞(HUVEC)を単離し、記述のように維持した(Xiaら, J. Biol. Chem. 274:33143〜33147, 1999)。ヒトSphK1(SphK)cDNA(Genbankアクセッション番号AF200328)の3’末端にFLAGエピトープをタグ付けし、以前に説明されているように(Pitsonら, Biochem. J. 350 Pt. 2:429〜441, 2000)pcDNA3ベクター(Invitrogen社)にサブクローニングした。SphK変異体を作製するために、FLAGタグを付けたSphKをpALTER(PROMEGA社)部位特異的変異導入ベクターを用いてクローニングした。製造元の実験手順書に詳述されているように、一本鎖DNAを調製し、オリゴヌクレオチド位置指定変異導入法の鋳型として使用した。変異導入用オリゴヌクレオチド
2005502598.tif 000006
および
2005502598.tif 000007
を、それぞれTB1-SphKおよびTB2-SphK変異体の作製のために設計し、TB1/2-SphKに対しては組み合わせて使用した。所望の改変が組み入れられていることを検証するために、その変異体を塩基配列決定し、次いでpcDNA3ベクター中にサブクローニングした。SphKG82Dの作製は、以前の記載に従った(Pitsonら, J. Biol. Chem. 275:33945, 2000)。発現プラスミドpRK5-TRAF2-FLAGおよびpRK5-TRAF287-501-FLAGは、Dr V. Dixit(Genentech Inc., South San Francisco)から戴いた。Lipofectamine 2000 (GIBCO BRL社)を、製造元の実験手順書に従い、一過性トランスフェクションのために使用した。
【０１４２】
免疫沈降およびイムノブロットアッセイ
各10 cmディッシュのトランスフェクトされた293T細胞を、溶解用緩衝液(50 mM HEPES、150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.1% NP-40/Triton X-100、20 mM NaF、1 mM オルトバナジン酸ナトリウム、10μg/mlロイペプチンおよびアプロチニン) 1 mlで溶解した。タンパク質量を均等化した溶解物を、抗FLAG、抗HAまたは対照用マウスIgG1モノクローナル抗体(Sigma社)で、それぞれ4℃、2時間、免疫沈降した。プロテインA/Gプラス-アガロースビーズ(Santa Cruz社)とのさらなる2時間のインキュベーションにより、免疫複合体を沈降させた。アガロースビーズを、溶解用緩衝液 1 mlで2回、高塩濃度(1 M NaCl)溶解用緩衝液 1 mlで2回、および溶解用緩衝液でさらに2回、洗浄した。免疫沈降物を10% SDS-PAGEにより分離し、Hybond-Pに転写した(Amersham Pharmacia Biotech社)。続いてイムノブロッティング解析を、別記の通り行った(Xiaら、1999、前記)。イムノブロッティングアッセイに関して、抗FLAG-エピトープ抗体(M2, Kodak社)、抗HA-エピトープ抗体(Sigma社)、抗TRAF2抗体および抗I-κBα抗体(Santa Cruz社)を、それぞれ5000倍、2500倍および1000倍希釈して使用した。
【０１４３】
GST融合タンパク質結合アッセイ
ヒトSphK cDNAをGST融合タンパク質発現ベクター、pGEX-1(Amersham Pharmacia Biotech社)に読み枠が合うようにサブクローニングした。誘導GST-SphK融合タンパク質の発現および精製は、記載の通り行った(Smithら, Gene 67:31〜40, 1988)。TRAF2またはΔTRAF2を過剰発現させたHUVECまたは293T細胞の入った各T75フラスコから調製した細胞溶解物を、GST-SphKまたはGST単独の融合タンパク質を結合させたグルタチオン-セファロースビーズの1:1スラリー20μlと、4℃で2時間、インキュベートした。溶解用緩衝液で6回、徹底的に洗浄した後、共沈タンパク質のほか全溶解物を、抗TRAF2抗体を用いたイムノブロット法により解析した。
【０１４４】
細胞生存アッセイ
トランスフェクトされた293T細胞を、密度2×104細胞/ウェルで48ウェルプレートに蒔き、シクロヘキシミド(1μg/ml)の存在下または非存在下、TNF(10 ng/ml)で18時間、刺激した。以前に記述(Xiaら、1999、前記)されている通り、細胞生存率をMTT色素還元法により評価し、通常の培地中で維持された細胞に対する割合として表した。
【０１４５】
キナーゼ活性アッセイ
以前に記述(Xiaら、1999、前記)されている通り、細胞質ゾル画分を0.1% Triton X-100に溶解した5μMスフィンゴシンおよび[γ32P]ATP (1 mM, 0.5 mCi/ml)と37℃で15分間インキュベートすることにより、SphK活性を測定した。HAタグを付けたJNKを共発現させた細胞からの抗HA免疫沈降物中の免疫複合体のキナーゼアッセイにより、JNK活性を測定した。記述(Xiaら, Proc. Natl. Acad. Science. USA. 95:14196, 1998)のように、基質としてGST-c-jun (1〜79)融合タンパク質とのインキュベーションにより、免疫沈降した複合物の活性を決定した。
【０１４６】
電気泳動移動度シフトアッセイ
293T細胞に所望の発現ベクターまたは空ベクターをコトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後にTNFで刺激し、核抽出物を調製した。これらの実験においてプローブとして使用した二本鎖オリゴヌクレオチドには、E-セレクチンプロモーターにあるコンセンサスNF-κB結合部位(下線が引かれている)を含有する、
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が含まれる。記述(Xiaら、1998、前記)のように、32P標識NF-κBプローブを核タンパク質4μgとインキュベートすることにより、コンセンサスNF-κBオリゴヌクレオチドのゲル移動度シフト法を行った。特異的DNA-タンパク質複合体は、非標識NF-κBオリゴヌクレオチドを50倍モル過剰に添加することで完全に取り除かれた。
【０１４７】
レポーターアッセイ
SphK、SphKG82D、または空ベクターを過剰発現している安定的にトランスフェクトされた293細胞に、pRK5-TRAF2またはpRK5ベクターと共に、Ig-κB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド(pTK81-IgK, 200 ng/トランスフェクション)およびウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ対照用ベクター(pRL, 20 ng/トランスフェクション)をコトランスフェクトした。必要に応じて空ベクターを補うことにより、トランスフェクトされるDNAの総量を一定に保った。トランスフェクションから24時間後に細胞抽出物を調製し、レポーター遺伝子活性をデュアル・ルシフェラーゼ・アッセイ・システム(Promega社)により決定し、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性に対して標準化した。
【０１４８】
実施例2
TRAF2によるシグナル伝達におけるスフィンゴシンキナーゼの役割の同定
結果
TRAF2はSphKを活性化し、TNF誘導性のSphK活性化を媒介した
TNF誘導性のSphK活性化がTRAF2により媒介されているかどうかを決定するために、試験を行った。ヒト胎児腎臓細胞株293Tに野生型TRAF2、ドミナントネガティブTRAF2 (TRAF287-501, ΔTRAF2)、または空ベクターを一過性にトランスフェクトした。図1に示されているように、TNF誘導性のSphK活性だけでなく、それ自身の活性も促進させたTRFA2の過剰発現により、対照用のトランスフェクタントに比べSphKを2倍活性化できた。イムノブロッティングアッセイにより、TNF刺激の存在下または非存在下で、導入遺伝子の発現レベルが同等であることが示された(図1b)。さらに、TNF誘導性のSphK活性化が、N末端のRINGフィンガーが除去されているΔTRAF2により遮断された。これらのデータにより、TNF刺激に対する細胞応答に関する新規のシグナル伝達経路である、TNF誘導性のSphK活性化の媒介におけるTRAF2の役割が示唆される。
【０１４９】
TRAF2はSphKと物理的に相互作用する
TRAF2とSphKとの間の物理的相互作用の可能性について調べた。最初に、FLAGエピトープタグTRAF2またはΔTRAF2とHAエピトープタグSphKを共発現させたHEK293T細胞株における過剰発現に基づく共免疫沈降アッセイを行った。細胞溶解物を抗FLAGモノクローナル抗体で免疫沈降し、共沈降したHAタグSphKを抗HA抗体によるイムノブロットアッセイにより検出した。トランスフェクトされた細胞からの免疫沈降複合体中で、SphKはTRAF2と会合することが判明した(図2a)。逆に、抗HAエピトープ抗体を用いて免疫沈降アッセイを行うことにより、FLAGタグTRAF2またはΔTRAF2がHAタグSphKと共沈降することも判明した(データは示していない)。さらに、GST-SphK融合タンパク質を用いて会合した細胞内タンパク質を引き落とすことにより、内在性TRAF2がSphKとも相互作用できるかどうかという点について調べた。図2bに示されているように、GST-SphK融合タンパク質が、293T細胞で過剰発現させたTRAF2のみならず、ヒト内皮細胞(HUVEC)で内在性TRAF2ともまた相互作用できたことから、TRAF2のSphKとの物理的相互作用が認められた。ドミナントネガティブTRAF2(ΔTRAF2)もSphKと会合することが示された(図2)ことから、TRAF2のN末端のRINGフィンガーはその相互作用に必要ではないことが示唆される。
【０１５０】
TRAF2結合モチーフであるPPEEがTRAF2のSphKとの相互作用に重要な役割を果たしている
TNF受容体スーパーファミリーの各種メンバーにおけるTRAF2結合配列の構造に基づく配列アライメントから、主要なコンセンサスモチーフ(P/S/T/A)X(Q/E)Eおよび非主要モチーフPXQXXDが明らかとなった(Yeら, Mol Cell 4:321〜330, 1999; Yeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:8961〜8966, 2000)。SphK配列(ヒトSphK-1)の解析により、それぞれ240〜243(PLEE)および379〜382(PPEE)の位置にある二つの可能性のあるTRAF2結合モチーフが明らかとされたことから、SphKとTRAF2の相互作用の根拠となる可能性のある構造がもたらされた。これらの二つのTRAF2結合モチーフがSphKのTRAF2との結合に役割を果たしているかどうか調べるために、SphKの三つの突然変異体、TB1-SphK、TB2-SphKおよびTB1/2-SphK、を作製した。これらにおいてTRAF2結合モチーフの一番目、二番目または両方をアラニンで、即ち、それぞれPLEEをPLAAにおよびPPEEをPPAAに変異させた(図3a)。TB1-SphKではなく、TB2-SphKまたはTB1/2-SphKのどちらかを発現させることにより、SphKのTRAF2との共免疫沈降能が除去されることが確定したこと(図3b)から、二番目のTRAF2結合モチーフがこれら二つの分子の相互作用に必須であることが示唆される。TB1-SphK、TB2-SphKまたはTB1/2-SphKを強制発現させた細胞が、刺激を受けていないSphK活性を、野生型SphKをトランスフェクトした細胞で認められた同一レベルまで上昇させたこと(図4a)から、これらのSphK変異体において固有の酵素触媒活性が減退しないことが明らかとなった。ひときわ、TB1-SphKではなく、TB2-SphKの活性がTNF刺激に対して応答しなかった(図4aおよび4b)ことから、TRAF2とのその相互作用能においてだけではなく、TNF誘導性のSphK活性化を媒介する際においてもSphKのC末端TB2部位の役割の重要性が示唆された。対照的に、タンパク質キナーゼCの活性化を介するSphKの活性化因子であるホルボールエステル(PMA)(Cuvillierら、1996、前記; Xiaら、1999、前記)に対するTB2-SphKの応答は減退しなかった(図4a)ことから、TB2-SphKの欠陥がTNF特異的であることが示唆された。総合すれば、これらのデータにより、SphKが結合モチーフPPEE379-382を介してTRAF2と相互作用すること、およびこの相互作用がTNF誘導性のSphK活性化の媒介に重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０１５１】
TRAF2のSphKとの相互作用がTNF誘導性のNF-κB活性化に必要である
TRAF2がSphKと相互作用し、次いでSphKを活性化したという事実、ならびにSphKが細胞生存および活性化を調節するシグナル伝達に関与している(Cuvillierら、1996、前記; Xiaら、2000、前記)という事実から考えて、TRAF2伝達シグナルにおけるSphKの役割を確定することを試みた。IκBαの分解およびNF-κB DNA結合複合体のゲルシフトアッセイ(図4aおよび4b)により本明細書で確定されたように、TRAF2の過剰発現により、NF-κBを活性化することができた。TB2-SphKの共発現により、IκBαの分解が著しく阻害され(図5a)、TNF刺激またはTRAF2の過剰発現のどちらかにより誘導されたNF-κB DNA結合活性が減少した(図5bおよび5c)。対照的に、野生型SphKの過剰発現によりNF-κB活性が増加した(図5b)ことから、SphKのNF-κB活性化への有力な効果が示唆された。
【０１５２】
TNF誘導性のNF-κB活性化を媒介する際のSphKのTRAF2との相互作用の役割をさらに確立するため、TRAF2結合モチーフはもとのまま保持しているが、酵素触媒活性を欠いたSphKの点突然変異体(SphKG82D)(Pitsonら、2000、前記)を使用した。共免疫沈降法により確定されたように、SphKG82DによりTRAF2に対する結合能は減少せず、そしてTNF刺激に応答するSphK活性を完全に除去した(図4a)。SphKG82Dの発現により、IκBαの分解が劇的に阻害され(図5a)、用量依存的にNF-κB DNA結合活性を阻害した(図5bおよび5c)。NF-κBレポーター遺伝子アッセイにより、IκBα分解およびNF-κB DNA結合アッセイの結果が確認されたことから、TRAF2またはSphKの過剰発現によりNF-κB依存的な遺伝子活性は増加するが、TNFまたはTRAF2のNF-κB活性化への効果は、SphKG82Dの共発現により阻害されることが明らかとなった(図5d)。従って、TRAF2が介するSphK活性化がTNF誘導性のNF-κB活性化に明らかに必要である。
【０１５３】
TRAF2とSphKの相互作用によってはJNK活性化へのシグナルは伝達されない
JNKは、TNF刺激の間にTRAF2により媒介される、もう一つの十分に立証された主要なシグナル経路である(Luiら, Cell 87:565〜576, 1996; Leeら, Immunity 7:703〜713, 1997)ので、TRAF2のSphKとの相互作用がTRAF2依存的なJNK活性化を調節するか調べた。際立って、TNF刺激もTRAF2誘導性のJNK活性の過剰発現もTB2-SphKまたはSphKG82Dの発現による影響を受けなかった(図6)。さらに、野生型SphKの過剰発現によるJNK活性化への有意な効果はなかった。故に、SphKまたはNF-κBの効果とは対照的に、TNFまたはTRAF2により誘導されるJNKの活性化は、SphKとは無関係である。
【０１５４】
SphK活性化はTRAF2の抗アポトーシスシグナル伝達に関与している
TRAF2のSphKとの相互作用が、TRAF2が介する抗アポトーシスシグナル伝達経路に関与しているかどうかに関する試験を行った。ΔTRAF2の発現により、TNFによる殺傷(killing)に対する細胞感受性が増した(図7)ことから、抗アポトーシスにおけるTRAF2の役割が示唆される。ΔTRAF2の効果は、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド(CHX)の存在下でさえも、SphKの過剰発現により完全に抑制されたことから、新規タンパク質合成に非依存的なSphK活性化により促進される抗アポトーシス経路が示唆された(図7)。TRAF2の過剰発現により、CHXの存在下でTNF誘導性のアポトーシスに対する防御効果が一部もたらされるが、それはSphKとの共発現により大幅に促進された(図7, 右パネル)。対照的に、アポトーシスに対するTRAF2の防御効果は、SphKG82Dの共発現により取り除かれた(図7)。総合すれば、これらの所見により、SphK活性がTNF刺激の間のTRAF2の抗アポトーシス能を確定する上で必須であることが示唆される。
【０１５５】
当業者は、本明細書に記載の発明が、具体的に記載したもの以外にも、変更および改変の余地があることを認識すると思われる。本発明には、そのような全ての変更および改変が含まれると理解されるべきである。本発明にはまた、本明細書において個々にまたは集合的に記載または示した段階、特徴、組成物および化合物の全て、ならびに上記の段階または特徴の如何なる二つまたはそれ以上の任意のおよび全ての組み合わせが含まれる。
【０１５６】
引用文献
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【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】SphK活性化におけるTRAF2の効果の画像である。293T細胞にTRAF2、ΔTRAF2、または空の発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞をTNF(1 ng/ml)ありまたはなしで10分間刺激し、次いで細胞溶解物を調製した。(a) 細胞質分画中のSphK活性を方法の項に記載されているように測定した。データは別個に行った3回の実験の平均値(±SD)であり、各実験は2重測定とした。(b) 抗FLAG抗体を用いたイムノブロッティング法により、導入遺伝子の発現が同等であることが示された。
【図２】TRAF2とSphKの相互作用の画像である。293T細胞に表示量(μg)の発現ベクターをコトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、表示に応じてTNF(1 ng/ml)で10分間刺激し、全細胞溶解物を調製した。(a) 表示の通り、溶解物を抗FLAG抗体または対照としてマウスIgG抗体を用いて免疫沈降(IP)した。IP複合体を次いで、抗FLAG抗体(上段)または抗HA抗体(下段)を用いたイムノブロッティング法(IB)により解析した。(b) HUVECまたはトランスフェクトされた293T細胞由来の溶解物を、GST-SphK融合タンパク質(レーン7〜9)またはGSTタンパク質(レーン4〜6)とインキュベートした。GST融合タンパク質と共沈したタンパク質のほかに全溶解物(レーン1〜3)を、抗TRAF2抗体を用いたイムノブロッティング法により解析した。
【図３】SphKのTRAF2結合モチーフの部位特異的変異導入法により、SphKのTRAF2との相互作用が取り除かれることを示す画像である。(a) 野生型ヒトSphK-1(wt-SphK)中の推定上のTRAF2結合モチーフ(TB1およびTB2)、ならびにSphKの変異体、TB1-SphK、TB2-SphKおよびTB1/2-SphKの概略図。(b) 293T細胞に表示の発現ベクターをコトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞を溶解し、その溶解物を抗TRAF2抗体により免疫沈降(IP)し、次いで共沈したSphKまたはその変異体を抗FLAG抗体によるイムノブロッティング法(IB)により検出した(上パネル)。全細胞溶解物中のタンパク質の発現を下パネルに示した。
【図４】TB2-SphKおよびSphKG82DがTNF誘導性のSphK活性化を阻止することを示すグラフである。(a) 293T細胞に表示の発現ベクターをトランスフェクトし、次いでトランスフェクションから48時間後にTNF(1 ng/ml)、PMA(100 nM)またはnilで10分間刺激した後、SphK活性を決定した。データは別個に行った3回の実験の相対活性の平均値(±SD)である。(b) SphKまたはTB2-SphKをトランスフェクトした293T細胞中のSphK活性を、TNF(1 ng/ml)刺激から表示の時点で測定した。表示のデータは、2重測定で行った1つの代表実験の平均活性値である。
【図５】NF-κB活性化におけるSphKの効果の画像である。293T細胞に表示の発現ベクターをコトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞をTNF(1 ng/ml)ありまたはなしで30分間刺激した。(a) 抗-IκBα抗体を用いたウエスタンブロット法によるI-κBα分解が示されている。(b) NF-κB活性化は、方法の項に記載されているように、NF-κB DNA結合複合体のゲルシフト法により決定した。＊各反応に50倍過剰の未標識の競合オリゴヌクレオチドを添加することで、NF-κBの結合特異性が示されている。(c) SphKG82DまたはTB2-SphKの量を増加させて(1〜4μg)トランスフェクトした後、TNFで刺激した細胞において測定されたNF-κB結合複合体。(d) SphK、SphKG82D、または空ベクターを過剰発現している、安定的に遺伝子導入された293細胞に、TRAF2またはpRK5ベクターに加え、Ig-κB-lucレポータープラスミドおよび対照用のウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼベクターをコトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、細胞をTNF(1 ng/ml)で4時間刺激し、次いでレポーター遺伝子の活性を測定し、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性に対して標準化した。表示のデータは、4重測定で行った1つの代表実験の相対ルシフェラーゼ活性の平均値である。別個に行った4回の実験で、同様の結果が得られた。
【図６】JNK活性化におけるSphKの効果の画像である。293T細胞に表示量の発現ベクターをコトランスフェクトした。48時間後、細胞をTNF(1 ng/ml)ありまたはなしで30分間刺激した。JNK活性を「方法」の項に記載されているように測定した。下パネルに表示したHAイムノブロットから、HA-JNK量が同等であることが示されている。
【図７】TRAF2が介する抗アポトーシスにおけるSphKの効果を示すグラフである。表示の通り、293T細胞に SphK、SphKG82D、または空ベクターのほか、TRAF2またはΔTRAF2をコトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞をシクロヘキシミド(CHX、1μg/ml)の非存在下(左パネル)または存在下(右パネル)にてTNF(10 ng/ml)でさらに18時間刺激した。次いで、細胞生存率をMTTアッセイにより評価し、10% FCSを含有する通常の培地中で維持された細胞に対する割合として表した。表示のデータは、3重測定で行った1つの代表実験の平均(±S.A.)である。
【図８】TRAF2のSphKとの相互作用により、TNFシグナル伝達経路が二つに分岐されることを示すモデルの概略図である。TRAF2との相互作用に続くSphK活性の増加により、TNFシグナル伝達をJNKの活性化ではなくNF-κBおよび抗アポトーシスの活性化へと特異的に伝達する。
【図９】ヒトSphK(上パネル)のアミノ酸配列中のTRAF2結合モチーフ(太文字)の概略図である。左パネルは公開された構造情報(Ye, Hら, Immunity 7:715, 1997)に基づく、既知のTRAF2結合モチーフのコンセンサスを示している。下パネルはTRAF2結合モチーフを突然変異させたSphK変異体(TB1-SphKおよびTB2-SphK)の概略図である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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