(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾された生体分子を提供する。本発明はそれら修飾生体分子を含むアレイまたは「バイオチップ」も提供する。さらに、それらの組成物を製造および使用する方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾された生体分子を含む修飾生体分子。
【請求項２】
環状エーテルがエポキシド基を含む化合物である、請求項1の修飾生体分子。
【請求項３】
エポキシドがエチレンオキシドである、請求項2の修飾生体分子。
【請求項４】
環状エーテルがオキシラン基である、請求項1の修飾生体分子。
【請求項５】
環状エーテルが芳香族炭化水素エポキシド基を含む化合物である、請求項1の修飾生体分子。
【請求項６】
Ｒ１基が生体分子と反応する、請求項1の修飾生体分子。
【請求項７】
Ｒ１基が生体分子に共有結合される、請求項6の修飾生体分子。
【請求項８】
生体分子がポリペプチド、ペプチドまたはペプチドミメティックを含む、請求項1の修飾生体分子。
【請求項９】
生体分子が多糖またはその類似体もしくはミメティックを含む、請求項1の修飾生体分子。
【請求項１０】
生体分子が脂質またはその類似体もしくはミメティックを含む、請求項1の修飾生体分子。
【請求項１１】
生体分子が小分子を含む、請求項1の修飾生体分子。
【請求項１２】
生体分子が核酸またはその類似体もしくはミメティックを含む、請求項1の修飾生体分子。
【請求項１３】
核酸がDNAまたはRNAを含む、請求項12の修飾生体分子。
【請求項１４】
核酸がＲ１基とその5'末端で反応する、請求項12の修飾生体分子。
【請求項１５】
核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項12の修飾生体分子。
【請求項１６】
核酸がテロメア構造を含む、請求項12の修飾生体分子。
【請求項１７】
核酸がクロマチン構造を含む、請求項12の修飾生体分子。
【請求項１８】
環状エーテルがエポキシド基であり、アルコキシシランが−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３、−Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３、−Ｓｉ（ＯＣＨ３）Ｈ２、−Ｓｉ（ＯＣＨ３）（ＣＨ３）２または−Ｓｉ（ＯＣＨ）３）２ＣＨ３である、請求項1の修飾生体分子。
【請求項１９】
環状エーテルがエポキシド基であり、化合物が3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＳ）である、請求項1の修飾生体分子。
【請求項２０】
Ｒ１アミノ基が1級アミノ基を含む、請求項1の修飾生体分子。
【請求項２１】
Ｒ１基がアミノ基であり、アルコキシシランが、−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３、−Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３、および
【化１】
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［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は−Ｈ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３および−ＯＣ２Ｈ３からなる群より選択され、ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも1つは−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ３であるものとする］
からなる群より選択される、請求項1の修飾生体分子。
【請求項２２】
Ｒ１がアミノ基であり、化合物が3-アミノプロピルトリエトキシシランである、請求項１の修飾生体分子。
【請求項２３】
ある表面に共有結合している配列された複数の生体分子を含む製造品であって、
前記表面への取り付けに先だって、前記生体分子は式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２
［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾され、前記表面に取り付けられた修飾生体分子は前記表面に共有結合しており、
各生体分子は前記表面の少なくとも1つの不連続な既知の位置に取り付けられて実質的に同一な生体分子のクラスターを形成する製造品。
【請求項２４】
前記表面がガラスである、請求項23の製造品。
【請求項２５】
表面が雲母または石英である、請求項23の製造品。
【請求項２６】
表面が金属酸化物表面である、請求項23の製造品。
【請求項２７】
金属酸化物表面がアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、チタニア（ＴｉＯ２）、ＳｎＯ２、ＲｕＯ２、またはＰｔＯ２からなる群より選択される、請求項26の製造品。
【請求項２８】
表面がポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびナイロンからなる群より選択される、請求項23の製造品。
【請求項２９】
修飾生体分子がＲ２基を介して表面に共有結合される、請求項23の製造品。
【請求項３０】
生体分子がヒトに由来する、請求項23の製造品。
【請求項３１】
生体分子がマウスに由来する、請求項23の製造品。
【請求項３２】
生体分子が核酸またはその類似体もしくはミメティックを含む、請求項23の製造品。
【請求項３３】
核酸がDNAまたはRNAを含む、請求項32の製造品。
【請求項３４】
核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項32の製造品。
【請求項３５】
生体分子がポリペプチド、ペプチドまたはペプチドミメティックを含む、請求項23の製造品。
【請求項３６】
生体分子が多糖またはその類似体もしくはミメティックを含む、請求項23の製造品。
【請求項３７】
生体分子が脂質またはその類似体もしくはミメティックを含む、請求項23の製造品。
【請求項３８】
生体分子が小分子を含む、請求項23の製造品。
【請求項３９】
核酸がＲ１基とその5'末端で反応する、請求項32の製造品。
【請求項４０】
核酸が複数のゲノム核酸断片を含む、請求項32の製造品。
【請求項４１】
ゲノム核酸が正常細胞に由来する、請求項40の製造品。
【請求項４２】
ゲノム核酸が染色体欠損または染色体異常を持つと疑われる細胞に由来する、請求項40の製造品。
【請求項４３】
染色体欠損または染色体異常を持つと疑われる細胞が腫瘍細胞である、請求項42の製造品。
【請求項４４】
ゲノム核酸の断片がさらにクローニング媒体を含む、請求項40の製造品。
【請求項４５】
クローニング媒体が細菌人工染色体（BAC）を含む、請求項44の製造品。
【請求項４６】
クローニング媒体がプラスミド、コスミド、バクテリオファージP1由来ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）または哺乳類人工染色体（MAC）を含む、請求項44の製造品。
【請求項４７】
核酸が複数のCpGアイランドタグを含む、請求項32の製造品。
【請求項４８】
ゲノム核酸の断片が少なくとも1つの実質的に完全な染色体に相当する配列、またはある染色体の少なくとも1つの限定されたセクションに相当する配列を含む、請求項40の製造品。
【請求項４９】
各ゲノム核酸断片が染色体上の既知の位置にマップされている、請求項40の製造品。
【請求項５０】
ゲノム核酸断片が約1.2メガ塩基以下のサイズを持つ、請求項40の製造品。
【請求項５１】
ゲノム核酸断片が約1.0メガ塩基以下のサイズである、請求項50の製造品。
【請求項５２】
各クラスターが、ある生体分子の約10〜約200個の実質的に同一なコピーからなる、請求項23の製造品。
【請求項５３】
表面が1平方センチメートルあたり約400個未満のクラスターからなる、請求項23の製造品。
【請求項５４】
各クラスターの直径が約50ミクロン以下である、請求項23の製造品。
【請求項５５】
各クラスターの直径が約25ミクロン以下である、請求項54の製造品。
【請求項５６】
染色体の限定されたサブセクションまたは実質的に完全な染色体に相当するクローン化されたゲノム核酸断片のアレイを含む製造品であって、
表面への取り付けに先立って、前記クローン化断片は式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２
［式中、Ｒ１はエポキシド基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記エポキシド基と前記アルコキシシラン基とを連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾され、修飾クローン化断片は前記表面に共有結合され、
各アレイ結合型クローン化断片は、ある染色体上の既知の位置にマップされている製造品。
【請求項５７】
請求項23に記載の製造品と印刷物とを含み、前記印刷物には核酸の試料をアレイ結合型核酸にハイブリダイズさせることに関する指示が含まれているキット。
【請求項５８】
(a)ある表面に共有結合している配列された複数の生体分子を含む製造品であって、表面への取り付けに先だって、前記生体分子は式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２
［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Xは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾され、取り付けられた修飾生体分子は前記表面に共有結合しており、
各生体分子は前記表面の少なくとも1つの不連続な既知の位置に取り付けられて、同一な生体分子のクラスターを形成する製造品を用意すること、
（b）生体分子の試料を用意すること、
（c）ステップ（b）の試料中の分子がアレイ結合型生体分子に特異的に結合することを許容するような条件下で、ステップ（b）の試料をステップ（a）に記載したアレイ結合型生体分子と接触させること、
（d）アレイ結合型生体分子に対するステップ（b）の試料中の分子の特異的結合に関してスクリーニングすることにより、特異的結合パートナーを同定すること、
を含む、特異的結合パートナーを同定する方法。
【請求項５９】
ステップ（c）の接触とステップ（d）のスクリーニングとの間に少なくとも1回の洗浄ステップをさらに含む、請求項58の方法。
【請求項６０】
以下のステップを含む、核酸試料の分子プロファイルを作成する方法：
（a）生体分子のアレイを含む製造品であって、表面への取り付けに先だって、前記生体分子は式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基と前記アルコキシシラン基とを連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾され、修飾生体分子は前記表面に共有結合される製造品を用意するステップ、
（b）核酸を含む試料を用意するステップ、および
（c）試料核酸がアレイ結合型生体分子に結合することができるような条件下で、前記核酸をステップ（a）に記載のアレイ結合型生体分子と接触させ、アレイ結合型生体分子に対する試料核酸の結合を検出することにより、試料核酸の分子プロファイルを作成するステップ。
【請求項６１】
アレイ結合型生体分子が核酸を含む、請求項60の方法。
【請求項６２】
結合がアレイ結合型核酸への試料核酸のハイブリダイゼーションを含む、請求項61の方法。
【請求項６３】
アレイ結合型核酸がゲノムDNAに由来する、請求項61の方法。
【請求項６４】
アレイ結合型核酸が、少なくとも1つの染色体のセクションまたは少なくとも1つの実質的に完全な染色体に相当する、請求項61の方法。
【請求項６５】
染色体がヒト染色体である、請求項64の方法。
【請求項６６】
アレイ結合型核酸がある染色体の既知の位置にマップされている、請求項64の方法。
【請求項６７】
分子プロファイルが比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）である、請求項61の方法。
【請求項６８】
分子プロファイルがゲノムDNA増幅、ゲノムDNA欠失またはゲノムDNA挿入の検出を含む、請求項61の方法。
【請求項６９】
分子プロファイルが点突然変異の検出を含む、請求項61の方法。
【請求項７０】
分子プロファイルが一塩基多型（SNP）の同定である、請求項61の方法。
【請求項７１】
点突然変異の検出がプライマー伸長アッセイを含む、請求項69の方法。
【請求項７２】
アレイ結合型核酸がCpGアイランドタグであり、分子プロファイルがディファレンシャルメチル化ハイブリダイゼーション（differential methylation hybiridization：DMH）である、請求項61の方法。
【請求項７３】
試料核酸が少なくとも1つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化されたゲノムDNAを含み、分子プロファイルがゲノムの超メチル化領域の検出およびマッピングを含む、請求項72の方法。
【請求項７４】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがNotI、SmaI、SacII、EagI、MspI、HpaIIおよびBssHIIからなる群より選択される、請求項73の方法。
【請求項７５】
分子プロファイルがゲノムの転写活性領域の検出を含む、請求項61の方法。
【請求項７６】
核酸の試料が核ラン・オフアッセイに由来する、請求項75の方法。
【請求項７７】
分子プロファイルがクロマチン構造の解析を含む、請求項61の方法。
【請求項７８】
アレイ結合型生体分子がクロマチン構造を含む、請求項61の方法。
【請求項７９】
分子プロファイルがテロメア構造の解析を含む、請求項61の方法。
【請求項８０】
テロメア構造の分子プロファイルがテロメア短縮またはテロメア付加の解析を含む、請求項79の方法。
【請求項８１】
アレイ結合型生体分子がテロメア構造を含む、請求項61の方法。
【請求項８２】
（a）生体分子を用意すること、
（b）式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物を用意すること、および
（c）前記生体分子を前記化合物と反応させることにより、前記生体分子を前記化合物で修飾すること
を含む、修飾生体分子の製造方法。
【請求項８３】
ある表面に共有結合している配列された複数の生体分子を含む製造品の製造方法であって、
（a）生体分子を用意すること、
（b）式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物を用意すること、
（c）ヒドロキシル基を含む表面を用意すること、
（d）前記生体分子を前記化合物と反応させることにより、前記生体分子を前記化合物で修飾すること、および
（e）複数の修飾生体分子を前記表面上に不連続なクラスターとして付着させることを含み、
修飾生体分子は前記表面の少なくとも1つの不連続な既知の位置に取り付けられて、実質的に同一な生体分子のクラスターを形成し、アレイは複数のクラスターを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばゲノムワイドな遺伝子マッピングおよび遺伝子発現研究、タンパク質相互作用研究、ペプチド相互作用研究ならびに小分子とより大きな高分子との相互作用などの領域において、結合させた分子（例えば核酸）試料に対して科学的な研究または日常的な試験を行う目的で、生体分子（例えば核酸）を固体支持体に固定化するための技術に関係する、密接に関連する化合物のファミリー、装置および方法をクレームする。
【背景技術】
【０００２】
生化学技術のかなりの部分は、核酸、特にデオキシリボ核酸、すなわちDNAが関わる研究に向けられている。DNAは水溶性化合物であり、溶解した状態で（すなわち水性溶液中に）放置すると、加水分解などによって分解すると思われる。明らかにこれはDNAが関わる研究が失敗する原因となるので、DNAが関わる研究を正確かつ確実に行うには、DNAの完全性を確保するための方法または装置が必要である。DNAの研究を容易にするには、多くの場合、滑らかなガラス製シートなどの固体表面にDNAを不動化または固定化することが望ましい。この方法で所定の位置に固定されたDNAは容易に取り扱う（すなわち他の物質と反応させる）ことができる。DNAを長い鎖であると考えると、DNAの固定化とは、鎖の残りの部分が無改変であって、その研究に応じてさらなる反応を自由に受けることができるように、鎖の一端を固体支持体に固定することを意味する。実際、これはDNAが関わる研究を行うために広く使用されている方法である。
【０００３】
固体支持体へのDNAの固定化に伴う大きな問題は、おそらく、如何にして（固体支持体に実際に結合する比較的小さな部分を除いて）DNAを変化させずにそれを行うかという、まさにその点であるだろう。これは極めて難しい問題である。なぜなら、どのような固体支持体を使用するにせよ、それらは本質的に不活性でなければならないからである。すなわち、固体支持体は、単にDNAを固体支持体上に固定化するための反応以外には、DNAと反応してはならない。ガラスは安価でありかつ高度に不活性であるので、特に適切な固体支持体である。現在、一般に行われている確立された慣行では、固体支持体（例えばガラス表面）を、その表面にDNAの一端を結合させることができるように、まずプライミングまたは誘導体化しなければならない。これを行うための技術は数多く存在する。
【０００４】
残念なことに、本来不活性であるガラス表面を誘導体することにより、DNAが関わる研究の結果を混乱させることにもなりかねない問題を生じる。問題の一つは、ガラス表面を誘導体化することにより、正味の正の静電荷がガラス表面上に生じることである。DNAは（正味の）負電荷を持っているので、他のDNA（または研究中に後から使用されるが、意図的にはガラス表面に不動化されないDNA）がガラス表面に（非特異的静電引力によって）固着しがちである。つまり、多くの場合、DNAの（二本鎖ではなく）一本鎖であるDNA「プローブ」を、固体支持体に不動化されたDNA一本鎖のアレイと接触させる。プローブは既知のヌクレオチド配列を持ち、ある特定の一本鎖DNAはその相補鎖に優先的に結合するので、プローブが反応する特定の固定化鎖により、それまで未知であった固定化鎖のヌクレオチド配列が明らかになる。しかし、このタイプの簡単な実験（プローブ研究）でも、誘導体化された（したがって静電的に帯電している）ガラス表面へのプローブの静電的固着によって、著しい混乱が起こる。例えば、プローブはその存在を普通の放射線検出器によって検出することができるように放射標識されることが多い。したがって、検出器が明示するガラス表面上のプローブの位置により、（予めわかっていて指定されている）ガラス表面上のその特定位置にある固定化DNA鎖の化学的アイデンティティまたは配列が明らかになる。しかし、放射線検出器は、固体支持体に不動化されたDNA相補鎖に化学的に結合しているプローブと、ガラス表面に単に静電的に固着しているに過ぎない（DNA鎖には結合していない）プローブとを識別することができない。
【０００５】
第2に、誘導体化された表面は「スプレディング（spreading）」と呼ばれる結果を招く。スプレディングは固体支持体表面が誘導体化によって親水性になるために起こる。その結果、DNA（固体支持体上に固定化しようとするもの）を固体支持体の表面と接触させると、DNAは不連続な「スポット」にとどまるのではなくて、一面に広がってしまう。しかし、化学者は、放射性プローブがどのスポットに検出されるかによって、プローブがどの固定化DNAと反応したかを推論することになるので、DNAは、理想的には、不連続なスポットにとどまるべきである。スプレディングはアレイ密度（すなわち一つの固体支持体上に配置することができる異なる核酸試料の数）に大きな制約を加える。したがって、スプレディングを縮小し、よってアレイ密度を増加させるための何らかの手段が、大いに望ましい。
【０００６】
核酸試料を受け止めるためのガラス表面を調製する目的で極めてよく使用される物質の一つはポリ-L-リジンである。例えば、DeRisi (1996) 14 Nature Genetics 457、Shalon (1996) 6 Genome Res. 639、およびSchena (1995) 270 Science 467などを参照されたい。他のタイプの誘導体化済みガラス支持体も市販されている（例えばシアリル化顕微鏡スライド）。例えば、Schena (1996) 93 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10614を参照されたい。
【０００７】
他にも数多くの表面コーティング剤が開示されている。例えば米国特許第5,630,932号にはトンネル顕微鏡に使用されるプローブ（白金）チップ用のコーティング剤が開示されており、表面をコーティングするための数多くの手段（特にＳｉ（ＯＣＨ3）ＣＨ2Ｉ）が開示されている。米国特許第5,610,287号には、支持体に核酸を非共有結合させるために塩または陽イオン性洗剤で固体支持体をコーティングすることが開示されている。米国特許第5,024,933号には、天然イガイ接着タンパク質の単離物による固体支持体のコーティングが開示されている。米国特許第4,937,188号には、酵素の基質として作用する分子鎖を介して酵素を固体支持体に共有結合することが開示されている。米国特許第4,818,681号には、ヌクレオシドの複素環部分を介して固体支持体をヌクレオシドリン酸塩でコーティングすることが開示されており、この場合、核酸は、酵素的カップリングによって固体支持体に固定化される。米国特許第4,806,631号には、ナイロン表面上のアミノ基を部分的に加溶媒分解すること（例えばアルキル化基で処理すること）によるナイロン固体支持体の活性化が開示されている。
【０００８】
この問題に対するもう一つのアプローチには、固体支持体と、固定化しようとする核酸との両方を誘導体化することが含まれる。例えば米国特許第5,641,630号には、ある複合体化剤で固体支持体をコーティングする処理であって、その複合体化剤はもう1つの複合体化剤に結合し、当該もう1つの複合体化剤には、結合させようとする核酸が同様に結合するという系が開示されている。米国特許第5,554,744号には、固体支持体をジイソプロピルカルボジイミドおよび酸触媒ならびにスクシニル化ヌクレオシドと接触させてヌクレオシドを固定化することが開示されている。米国特許第5,514,785号には、固体支持体を好ましくは1級および2級アミンでコーティングした後、塩化シアヌルを使って核酸の活性化を行うことが開示されている。米国特許第5,215,882号には、固定化しようとする核酸を1級アミンまたはその等価物で修飾した後、その修飾核酸を還元剤の存在下で固体支持体（この支持体は遊離のアルデヒド基を含んではならない）と反応させることが開示されている。
【０００９】
最後に、核酸を固体支持体材料に固定化する問題に対する第3のアプローチには、新規な固体支持体を作り出すことが含まれる。例えば米国特許第5,055,429号、同第5,008,220号、同第4,963,436号、同第4,826,790号および同第4,826,789号には、アルミノケイ酸塩材料でできた固体支持体材料が開示されている。
【００１０】
核酸試料を不動化する前にガラス表面（全体）を誘導体化することには上述のような短所があるので、固体支持体への核酸試料の直接合成を伴う方法が、いくつか開発されている。例えばHacia (1996) 14 Nature Genetics 441 (1996)、Lockhart (1996) 14 Nature Biotechnology 1675 (1996)、Maskos (1992) 20 Nucleic Acids Res. 1679 (1992)などを参照されたい。
【００１１】
繰り返すと、現在、生化学技術分野で支配的な見解は、固体表面に核酸を効果的に固定化するには、固体支持体をまず誘導体化するか、または化学的に不安定にする必要があり、そうした後に核酸を固体支持体と反応させることができるというものである。また、エポキシドは突然変異原であることが知られている。すなわちエポキシドは核酸、特にDNAに、損傷を与えることが知られている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、生体分子を固体支持体に不動化するための組成物および方法を提供する。任意の生体分子を修飾して、無修飾の固体支持体に不動化することができることを実証する。ある分子の結合親和性を適当な修飾によって増大させるために、その分子をまず修飾することの意義は、当業者には理解されるだろう。したがって、この修飾分子を無修飾の固体表面に固定化して、さまざまな具体的用途にとって完全に機能的な分子のアレイを作製することができる。
【００１３】
一態様として、本発明は、無修飾ガラス表面または非誘導体化ガラス表面に容易に接着するように修飾されている任意の生体分子、例えばDNA、より一般的には核酸を提供する。特に本発明の一態様では、エポキシド修飾核酸、特にDNAが、無修飾固体支持体に容易に不動化される。
【００１４】
本発明は、式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２
［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］
を有する化合物との反応によって修飾された生体分子を含む修飾生体分子を提供する。一態様として、Ｒ１環状エーテルは、エポキシド基を含む化合物、例えばエチレンオキシドまたはその等価物である。別の態様では、環状エーテルは、オキシラン基もしくはその等価物、または芳香族炭化水素エポキシド基を含む化合物である。
【００１５】
一態様として、修飾生体分子がＲ１基を介して上記化合物に連結されるように、Ｒ１は生体分子と反応する。生体分子に対するＲ１基の連結または会合は、Ｒ１基が生体分子に対して共有結合または非共有結合するようなものであることができる。
【００１６】
別の態様として、生体分子は、核酸（例えばオリゴヌクレオチド）、脂質、多糖、ポリペプチド（例えばペプチド）、またはその類似体もしくはミメティック、またはそれらの組み合わせを含む。核酸は、DNA（例えばゲノムDNAまたはcDNA）、RNA（例えばmRNA、rRNAなど）、またはその類似体もしくはミメティック、またはそれらの組み合わせを含むことができる。核酸はさらにテロメア構造またはクロマチン構造を含むこともできる。
【００１７】
一態様として、核酸は、Ｒ１基によって上記化合物に取り付けられる。すなわち核酸はＲ１基とその5'末端で反応する。
【００１８】
一態様として、環状エーテルはエポキシド基であり、アルコキシシランは−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３、−Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３、−Ｓｉ（ＯＣＨ３）Ｈ２、−Ｓｉ（ＯＣＨ３）（ＣＨ３）２または−Ｓｉ（ＯＣＨ３）２ＣＨ３である。一態様として、環状エーテルはエポキシド基であり、化合物は3-グリシドキシプロピルトリメトキシシランである。
【００１９】
一態様として、Ｒ１基は1級アミノ基である。一態様として、Ｒ１基はアミノ基であり、アルコキシシランは、−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３、−Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３、および
【００２０】
【化１】
2005500023.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は−Ｈ、−ＣＨ３および−ＯＣ２Ｈ３からなる群より選択される。ただし、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも1つは−ＯＣＨ３または−ＯＣ２Ｈ３であるものとする］
からなる群より選択される。
【００２１】
一態様として、Ｒ１基はアミノ基であり、上記化合物は3-アミノプロピルトリエトキシシランである。
【００２２】
本発明は、ある表面に共有結合している配列された複数の生体分子を含む製造品であって、表面への取り付けに先だって、前記生体分子は式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾され、前記表面に取り付けられた修飾生体分子は前記表面に共有結合しており、各生体分子は前記表面の少なくとも1つの不連続な既知の位置に取り付けられて実質的に同一な生体分子のクラスターを形成する製造品を提供する。本製造品の別の態様では、表面がガラス、雲母、石英、または金属酸化物表面である。金属酸化物表面は、アルミナ（Ａｌ2Ｏ3）、チタニア（ＴｉＯ2）、ＳｎＯ2、ＲｕＯ2、もしくはＰｔＯ2、またはその等価物であることができる。製造品の表面はポリスレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはナイロンを含むことができる。
【００２３】
一態様として、修飾生体分子は、Ｒ２基を介して表面に共有結合される。
【００２４】
製造品の一態様として、生体分子は核酸、脂質、ポリペプチド、多糖、またはその類似体もしくはミメティック、またはそれらの組み合わせを含むことができる。別の態様では、生体分子は、ウイルス、細菌、酵母、植物、昆虫、哺乳動物、例えばヒトまたはマウスなどに由来する。生体分子は核酸またはその類似体もしくはミメティックを含むことができる。核酸はDNA、RNA、またはその類似体もしくはミメティック、またはそれらの組み合わせを含むことができる。核酸はオリゴヌクレオチドであることができる。
【００２５】
製造品の一態様として、核酸はＲ１基とその5'末端で反応する。
【００２６】
一態様として、製造品上に固定化される核酸は、複数のゲノム核酸断片を含むことができる。生体分子、例えばゲノム核酸またはRNAは、正常細胞または異常細胞、例えば染色体欠損または染色体異常を持つと疑われる細胞、例えばガン細胞または腫瘍細胞に由来することができる。別の態様では、ゲノムDNAが、ウイルス、細菌、酵母、植物、昆虫、哺乳動物、例えばヒトまたはマウスなどに由来する。
【００２７】
製造品の一態様として、核酸の断片、例えばゲノム核酸の断片は、さらにクローニング媒体を含む。クローニング媒体は細菌人工染色体（BAC）を含むことができる。別の態様では、クローニング媒体はプラスミド、コスミド、バクテリオファージP1由来ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）または哺乳類人工染色体（MAC）を含む。
【００２８】
製造品の一態様として、核酸は複数のCpGアイランドタグを含む。
【００２９】
製造品の一態様として、ゲノム核酸の断片は、少なくとも1つの実質的に完全な染色体に相当する配列、またはある染色体の少なくとも1つの限定されたセクションに相当する配列を含む。一態様として、各ゲノム核酸断片は、ある染色体上の既知の位置にマップされている。別の態様では、核酸、例えばゲノム核酸断片は、約1.5メガ塩基以下、約1.2メガ塩基以下、約1.0メガ塩基以下、約0.75メガ塩基以下のサイズを持つ。
【００３０】
製造品の別の態様では、実質的に同一な生体分子の各クラスターが、ある生体分子の約5〜約400個または約10〜約200個または約50〜100個の実質的に同一なコピーからなる。表面は、1平方センチメートルあたり約800、約600、約500、約400、約300、約200または約100個未満のクラスターからなることができる。
【００３１】
製造品の別の態様では、実質的に同一な生体分子の各クラスターの直径が、約100ミクロン、約50ミクロン、約25ミクロン、約15ミクロンまたは約10ミクロン以下である。
【００３２】
本発明は、染色体の限定されたサブセクションまたは実質的に完全な染色体に相当するクローン化されたゲノム核酸断片のアレイを含む製造品（例えばアレイまたはバイオチップ）であって、表面への取り付けに先立って、前記クローン化断片は式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１はエポキシド基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記エポキシド基と前記アルコキシシラン基とを連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾され、修飾クローン化断片は前記表面に共有結合され、各アレイ結合型クローン化断片はある染色体上の既知の位置にマップされている製造品を提供する。
【００３３】
本発明は、本明細書に記載する本発明の製造品と印刷物とを含むキットであって、前記印刷物には核酸の試料をアレイ結合型核酸にハイブリダイズさせることに関する指示が含まれているキットを提供する。
【００３４】
本発明は、（a）ある表面に共有結合している配列された複数の生体分子を含む製造品であって、表面への取り付けに先だって、前記生体分子は式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾され、取り付けられた修飾生体分子は前記表面に共有結合しており、各生体分子は前記表面の少なくとも1つの不連続な既知の位置に取り付けられて、同一な生体分子のクラスターを形成する製造品を用意すること、（b）生体分子の試料を用意すること、（c）ステップ（b）の試料中の分子がアレイ結合型生体分子に特異的に結合することを許容するような条件下で、ステップ（b）の試料をステップ（a）に記載したアレイ結合型生体分子と接触させること、（d）アレイ結合型生体分子に対するステップ（b）の試料中の分子の特異的結合に関してスクリーニングすることにより、特異的結合パートナーを同定することを含む、特異的結合パートナーを同定する方法を提供する。一態様として、本方法はさらに、ステップ（c）の接触とステップ（d）のスクリーニングとの間に少なくとも1回の洗浄ステップを含む。
【００３５】
本発明は、以下のステップを含む、核酸試料の分子プロファイルを作成する方法を提供する：（a）生体分子のアレイを含む製造品であって、表面への取り付けに先だって、前記生体分子は式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基と前記アルコキシシラン基とを連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾され、修飾生体分子は前記表面に共有結合される製造品を用意するステップ、（b）核酸を含む試料を用意するステップ、および（c）試料核酸がアレイ結合型生体分子に結合することができるような条件下で、前記核酸をステップ（a）に記載のアレイ結合型生体分子と接触させ、アレイ結合型生体分子に対する試料核酸の結合を検出することにより、試料核酸の分子プロファイルを作成するステップ。
【００３６】
この方法の一態様として、アレイ結合型生体分子は、核酸、例えばゲノムDNAに相当するもしくはゲノムDNAに由来するDNA、またはメッセージなどを含む。結合は、アレイ結合型核酸への試料核酸のハイブリダイゼーションを含むことができる。アレイ結合型核酸は、少なくとも1つの染色体のセクションまたは少なくとも1つの実質的に完全な染色体に相当することができる。染色体はウイルス、細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳類（例えばヒトもしくはマウス）の染色体であることができる。一態様として、アレイ結合型核酸は、ある染色体上の既知の位置にマップされている。
【００３７】
この方法の一態様として、分子プロファイルは比較ゲノムハイブリダイゼーション（comparative genomic hybridization：CGH）である。分子プロファイルは、ゲノムDNA増幅、ゲノムDNA欠失またはゲノムDNA挿入の検出を含むことができる。分子プロファイルは点突然変異の検出を含むことができる。
【００３８】
この方法の一態様として、分子プロファイルは、単一のまたは複数の点突然変異の同定、例えば一塩基多型（SNP）の同定である。この方法の一態様として、点突然変異の検出は、プライマー伸長アッセイの使用を、さらに含むことができる。
【００３９】
この方法の一態様として、本発明の修飾核酸またはアレイ結合型核酸は、1つまたは複数個のCpGアイランドタグを含む。一態様として、分子プロファイルは、ディファレンシャルメチル化ハイブリダイゼーション（differential methylation hybiridization：DMH）反応によって作成される。試料核酸は、少なくとも1つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化されたゲノムDNAを含むことができ、分子プロファイルはゲノムの超メチル化領域の検出およびマッピングを含む。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、NotI、SmaI、SacII、EagI、MspI、HpaIIおよびBssHIIからなる群より選択されることができる。
【００４０】
この方法の一態様として、分子プロファイルは、ゲノムの転写活性領域の検出を含む。一態様として、核酸の試料は、核ラン・オフアッセイに由来することができる。この場合、この試料は本発明の方法で修飾することができ、一態様として、これらの修飾核酸は本発明に記載するアレイ上に固定化される。
【００４１】
この方法の一態様として、分子プロファイルはクロマチン構造の解析を含む。本発明の修飾核酸またはアレイ結合型生体分子は、クロマチン構造を含むことができる。
【００４２】
この方法の一態様として、分子プロファイルはテロメア構造の解析を含む。テロメア構造の分子プロファイルは、テロメア短縮またはテロメア付加の解析を含むことができる。本発明の修飾核酸またはアレイ結合型生体分子（例えば核酸）は、1つまたは複数のテロメア構造を含むことができる。
【００４３】
本発明は、修飾生体分子の製造方法であって、（a）生体分子を用意すること、（b）式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物を用意すること、および（c）前記生体分子を前記化合物と反応させることにより、前記生体分子を前記化合物で修飾することを含む方法を提供する。
【００４４】
本発明は、ある表面に共有結合している配列された複数の生体分子を含む製造品（例えばアレイまたはバイオチップ）の製造方法であって、（a）生体分子を用意すること、（b）式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物を用意すること、（c）ヒドロキシル基を含む表面を用意すること、（d）前記生体分子を前記化合物と反応させることにより、前記生体分子を前記化合物で修飾すること、および（e）複数の修飾生体分子を前記表面上に不連続なクラスターとして付着させることを含み、修飾生体分子は前記表面の少なくとも1つの不連続な既知の位置に取り付けられて、少なくとも1つの実質的に同一な生体分子のクラスターを形成する（アレイは少なくとも2つ（複数）のクラスターを含む）方法を提供する。
【００４５】
製造品の作製方法の一態様として、生体分子（例えば核酸）の修飾に使用される化合物は、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシランである。一態様として、生体分子は核酸分子であり、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシランとの反応は塩基性pHで行われ、それにより、修飾核酸が生成する。この反応では、pHは約pH9.5を超えることができる。3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン修飾核酸は、ほぼ中性pHで、非誘導体化ガラス表面に付着させることができる。
【００４６】
製造品の作製方法のもう一つの態様として、生体分子（例えば核酸）の修飾に使用される化合物は、3-アミノプロピルトリエトキシシランである。一態様として、生体分子は核酸であり、3-アミノプロピルトリエトキシシランとの反応はほぼ中性pHで行われる。この反応は硫酸水素ナトリウムまたはその等価物の存在下で行うことができる。この修飾核酸は非誘導体化ガラス表面に付着させることができる。
【００４７】
本発明の修飾生体分子、例えば修飾核酸などは、固体表面に接着して、その後の生化学的研究を可能にする。したがって本発明の一態様として、修飾核酸などの修飾生体分子は、2つの重要な官能基を含む部分（すなわち環状エーテル基およびアルコキシシラン基）に共有結合された生体分子（例えば核酸）を含む。本発明の他の態様によれば、上述の修飾生体分子（例えば核酸）を製造する方法がクレームされる。
【００４８】
もう一つの態様として、本発明は、ガラスまたは他の不活性表面を含む高密度マイクロアレイを提供する。このアレイまたは「バイオチップ」は、数多くの著しく不連続な修飾生体分子（例えばDNA）試料スポットまたは「クラスター」を、表面上にプリントすることによって作製することができる。
【００４９】
もう一つの態様として、本発明は、生体分子（例えば核酸）とハロゲン化シランまたはその等価物とから製造される修飾生体分子（例えば核酸）を提供する。
【００５０】
もう一つの態様として、本発明は、生体分子（例えば核酸）を臭素化された部分と反応させた後、アミノ化シランと反応させることによって製造される修飾核酸を提供する。
【００５１】
もう一つの態様として、本発明は、上述の高密度マイクロアレイのプリンティングを可能にする装置を提供する。
【００５２】
もう一つの態様として、本発明は、試料密度および検出感度を最適化するために固体表面の静電特性を調整することを可能にする修飾シランを提供する。
【００５３】
本発明は先行技術に対して数多くの利点を持っている。これらの利点の多くは、固体表面（これは普通のガラスであってよい）が著しく化学的に不活性な状態を保つという事実に由来する。したがって、上述した、プローブ（または他の反応物）がガラスに固着する問題および「スプレディング」の問題は、完全に排除される。最終的には、例えば、最新の誘導体化固体支持体と比較して検出感度が著しく高くなるなどの結果が得られる。
【００５４】
また、固体支持体に固定化される生体分子（例えば核酸）は容易に誘導体化される。本発明のエポキシド誘導体の反応は実行が簡単であり、穏かな条件で起こり、反応速度は速く、平衡は著しく有利である。さらに、本発明のエポキシド修飾生体分子（例えば核酸）は本質的に永続的に安定であるので、それらを製造（誘導体化）して、後で使用する（非誘導体化表面との反応を行う）ために貯蔵しておくことができる。
【００５５】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細を、添付の図面に記載し、以下に説明する。本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【００５６】
本明細書に引用する刊行物、GenBankアクセッション番号（配列）、ATCC寄託物、特許および特許出願はいずれも、あらゆる目的で、参照により明示的に本明細書に組み込まれるものとする。
【００５７】
図面は必ずしも一定の縮尺では描かれていない。簡潔明瞭になるように、本発明の特徴の一部が拡大して描かれたり、模式的に描かれたりしている。さまざまな図面中の類似する符号は類似する要素を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
本発明は、ポリペプチドおよび核酸などの修飾生体分子、およびこれらの修飾生体分子がアレイ表面に固定化されているアレイを含む製造品を提供する。本発明は、これらの組成物を製造および使用する方法も提供する。
【００５９】
本発明の一態様は、固定化しようとする生体分子（例えば核酸）の化学修飾である。この化学修飾核酸は、ガラス表面などの固体支持体と反応させて、生体分子（例えば核酸）を固定化した状態にすることが容易である。重ねて言うが、これは、核酸そのものの修飾ではなく固体支持体の修飾を教示する先行技術とは、正反対である。
【００６０】
本発明の修飾生体分子（例えば核酸）は、反応性官能基（例えばヒドロキシル基）を持つさまざまな固体表面に容易に接着する。そのような固体表面としては、例えば石英ガラス、雲母、アルミナ（Ａｌ2Ｏ3）、チタニア（ＴｉＯ2）、ＳｎＯ2、ＲｕＯ2、ＰｔＯ2、プラスチック、例えばポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびナイロンなどのポリマー材料、ならびに数多くの半導体表面、例えば数多くの他の金属酸化物表面およびその等価物などが挙げられるが、これらに限るわけではない。
【００６１】
ある一群の態様では、本発明の化学修飾生体分子（例えば核酸）は、2つの重要な官能基、すなわち環状エーテルとアルコキシシラン基とを持つ化合物を使って、そのように修飾される。生体分子（例えば核酸）は環状エーテルと反応し、新たに修飾された生体分子（例えば核酸）を本来不活性な表面（例えばガラス）と接触させると、アルコキシシラン基がヒドロキシル含有（例えばヒドロキシル誘導体化）表面、例えばガラス表面上のＳｉ−ＯＨ基と反応する。
【００６２】
もう一つの態様群では、本発明の化学修飾生体分子（例えば核酸）は、2つの重要な官能基、すなわちアミノ基とアルコキシシラン基とを持つ化合物を使って、そのように修飾される。生体分子（例えば核酸）はアミノ基と反応し、新たに修飾された生体分子（例えば核酸）を本来不活性な（例えばガラス）表面と接触させると、アルコキシシラン基がヒドロキシル含有（例えばヒドロキシル誘導体化）表面、例えばガラス表面上のＳｉ−ＯＨ基と反応する。
【００６３】
さらにもう一つの異なる態様群では、生体分子（例えば核酸）は、ハロゲン化シラン化合物との反応によって修飾される。
【００６４】
もう一つの態様群では、生体分子（例えば核酸）は、アミン含有シランと臭素化核酸との最終反応を含む2段階プロセスによって誘導体化される。
【００６５】
別の態様は、本発明の他の態様の修飾生体分子（例えば核酸）を利用して、高密度マイクロアレイを製造し、最適化することに向けられる。
【００６６】
さらなる態様には、任意の生体分子または生体分子の組み合わせを含む組成物ならびにその製造および使用方法が含まれる。核酸、例えばDNAまたはRNAが、本発明の方法によって修飾し本発明の方法で使用することができる数多くの生体組成物（例えば生体ポリマー）の一つに過ぎないことは、当業者には理解される。ポリマーとは、既製の単位がつなぎ合わされている分子、例えば限られた多様性を持ちうるモノマーまたは組成物が通常は同じ機序によって互いに連結されている分子を指す。例えばセルロースは単純な糖のポリマーまたは多糖である。代表的な生体分子には、例えばDNA、RNA、タンパク質、ペプチド、脂質、糖、多糖、ならびにそれらのミメティックおよび類似体などがあるが、これらに限るわけではない。したがって、本発明の修飾核酸と同様に、ポリマーを含む任意の生体分子（自然界に見いだされる構造または合成構造を持つものを含む）を本発明の方法によって修飾し、固体表面に不動化することができることは、当業者には理解される。
【００６７】
本発明のもう一つの態様は、生体分子の修飾である。修飾の一タイプは、化学的架橋である。二官能性「架橋」試薬が2つの反応性基を持ち、それゆえに2つの標的基を共有結合的に架橋する手段となることは、当技術分野ではよく知られている。化学架橋試薬中の反応性基は、通例、例えばスクシンイミジルエステル、マレイミドおよびヨードアセトアミドなどの官能基の種類に属する。二官能性架橋試薬は、ホモ二官能性架橋試薬、ヘテロ二官能性架橋試薬およびゼロ長（zero length）二官能性架橋試薬に分類することができる。ホモ二官能性架橋試薬の場合は反応性基が同一である。これらの試薬は類似する官能基、例えば2つのチオール、2つのアミン、2つの酸、または2つのアルコールなどをカップリングし、主として分子内架橋の形成に使用される。ヘテロ二官能性架橋試薬の場合は反応性基が異なる化学的性質を持ち、異なった官能基間での架橋の形成を可能にする。「ゼロ長」架橋試薬は、2つの基の間に化学結合を形成させるが、それ自体は生成物には組み込まれない。例えば水溶性カルボジイミド（EDAC）は、カルボン酸をアミンにカップリングするために使用される。
【００６８】
従来からある二官能性架橋試薬の他に、解離速度が極めて遅い2分子間の非共有結合相互作用も、架橋としての機能を果たすことができる。例えば、リン脂質の反応性誘導体は、抗体または酵素をリポソームまたは細胞膜に連結するために使用することができる。ビオチン化試薬およびハプテン化試薬も、ヘテロ二官能性架橋試薬であると考えることができる。なぜなら、これらは化学反応性基と共に、それぞれアビジンまたは抗ハプテン抗体に高い親和性で結合するビオチンまたはハプテン部分も含むからである。
【００６９】
化学的架橋試薬に対して、光反応性架橋試薬も利用することもができる。一般的スキームでは、光反応性基と共に化学反応性基も含む光反応性架橋試薬を使用する。これらの架橋剤はまず1つの分子と化学的に反応させた後、その修飾分子を第2の分子にUV照射を使ってカップリングする。化学基および光反応性基の反応特性に依存して、これらの架橋剤は、類似する官能基または類似しない官能基をカップリングするために使用することができる。
【００７０】
別の態様は、本発明の修飾分子を利用して高密度マイクロアレイを製造し、最適化することに向けられる。
【００７１】
定義
別段の定義を設けない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されている意味を持つ。本明細書で使用する場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、それぞれに与えられた意味を持つ。
【００７２】
本明細書で使用する「核酸」という用語は、一本鎖型または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチド（DNA）またはリボヌクレオチド（RNA）を指す。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。この用語は、DNA部分にホスホジエステル結合を介して結合された2'-O-アルキル置換基を持つRNA部分を含む混合オリゴヌクレオチドを包含する。例えば米国特許第5,013,830号を参照されたい。この用語は、合成主鎖を持つ核酸様構造も包含する。本発明が提供するDNA主鎖類似体には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミダイト、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、3'-チオアセタール、メチレン(メチルイミノ)、3'-N-カルバメート、モルホリノ、カルバメート、およびペプチド核酸（PNA）が含まれる。F. Eckstein編「Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach」IRL Press at Oxford University Press (1991)、BasergaおよびDenhardt編「Antisense Strategies」Annals of the New York Academy of Sciences, 第600巻 (NYAS 1992)、Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923-1937、「Antisense Research and Applications」(1993, CRC Press)を参照されたい。PNAはN-(2-アミノエチル)グリシン単位などの非イオン性主鎖を持つ。ホスホロチオエート結合は、例えば米国特許第6,031,092号、同第6,001,982号、同第5,684,148号などに記載されている。また、WO 97/03211、WO 96/39154、Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197も参照されたい。この用語が包含する他の合成主鎖には、メチルホスホネート結合または交互に起こるメチルホスホネート結合とホスホジエステル結合（例えば米国特許第5,962,674号、Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698を参照されたい）およびベンジルホスホネート結合（例えば米国特許第5,532,226号、Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156）が含まれる。核酸という用語は、遺伝子、DNA、RNA、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブおよび増幅産物という用語と可換的に使用される。
【００７３】
「ポリペプチド」「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本発明の組成物を包含し、本発明の組成物には、以下に詳述するように、当該変異体が由来するポリペプチドと実質的に一致する構造および活性を持つ「類似体」または「保存的変異体」および「ミメティック」または「ペプチドミメティック」も包含される。
【００７４】
「小分子」という用語は、有機分子または合成分子などの任意の合成小分子、例えばコンビナトリアルケミストリーの技法によって作製されたものなどを意味する。これらの小分子は、例えばGilmanら編「Organic Syntheses Collective Volumes」（John Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク）、Venuti (1989) Pharm Res.6:867-873などの科学文献および特許文献に詳述されているさまざまな手順および技法を使って合成することができる。小分子の合成は、本発明に関係する他のすべての手順と同様に、当技術分野で知られている任意の方法またはプロトコールと組み合わせて実施することができる。例えば、コンビナトリアル化合物ライブラリーの作製およびスクリーニングはよく知られている。例えば米国特許第6,096,496号、同第6,075,166号、同第6,054,047号、同第6,004,617号、同第5,985,356号、同第5,980,839号、同第5,917,185号、同第5,767,238号を参照されたい。
【００７５】
本明細書で使用する「アレイ」もしくは「マイクロアレイ」または「バイオチップ」もしくは「チップ」という用語は、複数の固定化標的要素を含み、各標的要素が、以下に詳述するように、固体表面に固定化された生体分子（例えば核酸分子または抗体などのポリペプチド）を含む「クラスター」または「バイオサイト（biosite）」または限定された区域を含んでいる製造品、装置である。
【００７６】
本明細書で使用する「核酸標的の試料」または「核酸の試料」という用語は、別の核酸もしくはポリペプチドまたはその組み合わせ（例えば固定化プローブ）へのハイブリダイゼーションに適した形態（例えば可溶性水溶液）をとっている、DNAもしくはRNAを含む試料、または天然の供給源から単離されたDNAもしくはRNAの核酸見本を指す。核酸は単離、クローニング、または増幅することができ、例えば実質的にゲノム全体から、またはある特定染色体の実質的に全部または一部から、または選択された配列（例えば特定のプロモーター、遺伝子、増幅断片、制限断片、cDNAなど）から得られるゲノムDNA、mRNAまたはcDNAであってよい。核酸試料は特定の細胞または組織から抽出することができる。核酸試料の調製に原材料として使用される細胞または組織試料は、典型的には、ゲノム核酸の塩基置換、増幅、欠失および/または転座と関係する遺伝子欠損または遺伝子関連疾患もしくは状態（例えば癌）を持つと疑われる患者から採取される。細胞および組織試料を単離する方法は当業者にはよく知られており、例えば吸引、組織薄切、針生検などがあるが、これらに限るわけではない。試料は、組織学的目的で採取された凍結切片またはパラフィン切片組織切片を含む、患者から得られる試料である「臨床試料」であることが多いだろう。試料は、細胞培養物から得られる（細胞）上清または細胞そのもの、組織培養によって得られる細胞、および染色体異常の検出またはアンプリコンコピー数の決定が望まれるような他の媒体から得ることもできる。場合により、核酸は、ハイブリダイゼーションに先立ち、PCRなどの標準的技術を使って増幅してもよい。別の態様では、標的核酸は標識されていなくてもよいし、プローブ（例えばアレイ上に固定化されたオリゴヌクレオチドまたはクローン）へのその結合を検出することができるように（例えば本明細書に説明するようなに）標識されていてもよい。プローブは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅産物の収集物、実質的にある染色体の全体もしくは染色体断片、または実質的にあるゲノムの全体（例えばBAC、PAC、YACなどのクローンの収集物として）の1つまたは複数の特定（前もって選択しておいた）部分に由来する核酸の供給源から製造することができ、全体としてその供給源を表現することができる（下記参照）。プローブまたはゲノム核酸試料は、何らかの方法で、例えば繰返し核酸のブロッキングもしくは除去、または選択した核酸の濃縮などによって加工してもよい。
【００７７】
核酸の作製と操作
本発明は、修飾核酸、および修飾核酸組成物を含むアレイを含む製造品、ならびにこれらのアレイの作製および使用方法を提供する。核酸は、式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾される。アレイ上の修飾核酸または固定化核酸は、染色体の限定された一部もしくは全体またはゲノム全体を含むゲノムDNAを表現することができる。いくつかの態様において、本発明のアレイおよび方法は、アレイ上でのCGH反応（例えば米国特許第5,830,645号および同第5,976,790号を参照されたい）を含む比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）反応に使用される（下記参照）。本発明は、科学文献および特許文献に詳述されている技術上知られる任意の方法またはプロトコールまたは装置と組み合わせて実施することができる。
【００７８】
一般技術
本発明を実施するために使用される核酸は、RNAであれ、cDNAであれ、ゲノムDNAであれ、ベクターであれ、ウイルスであれ、またはそのハイブリッドであれ、さまざまな供給源から単離し、遺伝子操作し、増幅し、および/または組換え的に発現/産生させることができる（組換えポリペプチドは本発明に従って修飾し、またはアレイに固定化することができる）。細菌、哺乳類、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含む任意の組換え発現系を使用することができる。
【００７９】
もう一つの選択肢として、これらの核酸は、例えばCarruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661、Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444、Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380、Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896、Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90、Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109、Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859、米国特許第4,458,066号などに記載の周知の化学合成技術により、インビトロで合成することもできる。その場合、二本鎖DNA断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で両方の鎖をアニールすることによって、またはDNAポリメラーゼをプライマー配列と共に使用して相補鎖を加えることによって得ることができる。
【００８０】
核酸を操作する技術、例えばサブクローニング、プローブのラベリング（例えばクレノウポリメラーゼを用いるランダムプライマーラベリング、ニックトランスレーション、増幅）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献および特許文献に詳述されている。例えば、Sambrook編「MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL」第2版, 第1〜3巻, コールドスプリングハーバー研究所（1989）、Ausubel編「CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」（John Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク, 1997）、Tijssen編「LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES. Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation」Elsevier, ニューヨーク（1993）などを参照されたい。
【００８１】
本発明の組成物および方法で使用される核酸を取得し操作するもう一つの有用な手段は、ゲノム試料からクローニングすること、そして必要であれば、例えばゲノムクローンもしくはcDNAクローンまたは全ゲノムDNAの他の供給源から単離されたインサートをスクリーニングし、再クローニングすることである。本発明の方法および組成物で使用されるゲノム核酸の供給源としては、例えば哺乳類人工染色体（例えばAscenzioni (1997) Cancer Lett. 118:135-142、米国特許第5,721,118号、同第6,025,155号参照）（ヒト人工染色体を含む；例えばWarburton (1997) Nature 386:553-555、Roush (1997) Science 276:38-39、Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335参照）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、P1人工染色体（例えばWoon (1998) Genomics 50:306-316、Boren (1996) Genome Res. 6:1123-1130参照）、PACS（バクテリオファージP1由来ベクター、例えばIoannou (1994) Nature Genet. 6:84-89、Reid (1997) Genomics 43:366-375、Nothwang (1997) Genomics 41:370-378、Kern (1997) Biotechniques 23:120-124参照）、コスミド、プラスミドまたはcDNAなどに含まれる、またはもっぱらそれらから構成される、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーが挙げられる。
【００８２】
核酸の増幅
オリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅を使って、本発明の組成物および方法に使用される核酸を生成させたり、アレイにハイブリダイズした試験試料または対照試料を検出またはそのレベルを測定したりすることができる。当業者は、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択し、設計することができる。増幅方法も当技術分野ではよく知られており、例えばポリメラーゼ連鎖反応PCR（Innis編「PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS」Academic Press, ニューヨーク（1990）およびInnis編「PCR STRATEGIES」（1995）, Academic Press, Inc., ニューヨーク）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えばWu (1989) Genomics 4:560、Landegren (1988) Science 241:1077、Barringer (1990) Gene 89:117参照）、転写増幅（transcriptional amplification）（例えばKwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173参照）および3SR（self-sustained sequence replication）（例えばGuatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874参照）、Ｑβレプリカーゼ増幅（例えばSmith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491参照）、自動Ｑβレプリカーゼ増幅アッセイ（例えばBurg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271参照）、および他のRNAポリメラーゼによる技術（例えばNASBA, Cangene（オンタリオ州ミシソーガ）などが挙げられる。Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316、Sambrook、Ausubel、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号、Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564も参照されたい。
【００８３】
ポリペプチド
本発明は修飾ポリペプチド、ならびにポリペプチド、ペプチドおよびペプチドミメティックが固定化されているアレイを含む製造品に関する。ポリペプチドは、式：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２［式中、Ｒ１は環状エーテル基またはアミノ基であり、Ｒ２はアルコキシシラン基であり、Ｘは前記環状エーテル基または前記アミノ基を前記アルコキシシラン基に連結するのに化学的に適した部分である］を有する化合物との反応によって修飾される。上述のように、本発明を実施するために使用される「ポリペプチド」「タンパク質」および「ペプチド」という用語には本発明の組成物が含まれ、本発明の組成物には「類似体」または「保存的類似体」および「ミメティック」または「ペプチドミメティック」も含まれる。「ミメティック」および「ペプチドミメティック」という用語は、合成化学化合物を指す。ミメティックはもっぱらアミノ酸の合成非天然類似体から構成されるか、または一部が天然ペプチドアミノ酸であり、かつ一部がアミノ酸の非天然類似体であるキメラ分子であることができる。ミメティックは、任意の量の天然アミノ酸保存的置換を、そのような置換が当該ミメティックの構造および/または活性を実質的に変化させない限り、含むこともできる。ポリペプチドミメティック組成物は、典型的には次の3つの構造群から選択される非天然構造成分の任意の組み合わせを含むことができる：a）天然アミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結基、b）天然アミノ酸残基に代わる非天然残基、またはc）二次構造模倣（すなわち二次構造、例えばβターン、γターン、βシート、αヘリックスコンフォメーションなどを誘導または安定化すること）を誘導する残基。ポリペプチドは、その残基の全部または一部が天然のペプチド結合以外の化学的手段によってつながれている場合に、ミメティックであると特徴づけることができる。個々のペプチドミメティック残基は、ペプチド結合、他の化学結合またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）またはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）などによってつなぎ合わせることができる。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）連結の代替になりうる連結基には、例えばケトメチレン（例：−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−の代わりに−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−）、アミノメチレン（ＣＨ2−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ2−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ2−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ4−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステルなどがある（例えばSpatola (1983)「Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins」第7巻の267〜357ページ「Peptide Backbone Modifications」Marcell Dekker, ニューヨーク参照）。ポリペプチドは、天然アミノ酸残基の代わりにすべてのまたは一部の非天然残基を含むことによって、ミメティックであると特徴づけることもできる。非天然残基は科学文献および特許文献に詳述されている。例えばGilmanら「Organic Syntheses Collective Volumes」（前掲）などの科学文献および特許文献に詳述されているさまざまな手順および技法を使って個々の合成残基およびミメティックを組み込んだポリペプチドを合成できることは、���業者には理解されるだろう。ミメティックを組み込んだポリペプチドは、例えば米国特許第5,422,426号に記載されている固相合成法を使って作製することもできる。ペプチドおよびペプチドミメティックは、コンビナトリアル技法を使って合成することもできる。ペプチドおよびペプチドミメティックライブラリーの作製にはさまざまな技術がよく知られており、例えばマルチピン法、ティーバック法およびスプリット-カップル-ミックス法などがある。例えばal-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223、Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119、Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27、Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234などを参照されたい。修飾ポリペプチドおよびペプチドは、さらに、化学修飾法によって製造することができる。例えば、Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444、Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380、Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896を参照されたい。これらのペプチドは、当技術分野で周知の化学的方法を使って、その全部または一部を合成することもできる（例えばCaruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223、Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232、Banga, A.K.「Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems」 (1995) Technomic Publishing Co., ペンシルべニア州ランカスターなどを参照されたい）。ペプチド合成はさまざまな固相技術を使って行うことができ（例えばRoberge (1995) Science 269:202、Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13参照）、自動合成を使用してもよい。
【００８４】
アレイまたは「バイオチップ」
本発明は、本発明の修飾生体分子（本発明の修飾核酸および修飾ポリペプチドを含む）を含む「アレイ」もしくは「マイクロアレイ」または「バイオチップ」もしくは「チップ」を提供する。アレイは一般に、アレイの表面上に限定された「クラスター」または「バイオサイト」として固定化されている複数の標的要素であり、各標的要素は、試料への会合（特異的結合またはハイブリダイゼーション）に備えて固体表面に固定化された1つまたは複数の生体分子（例えば核酸またはポリヌクレオチド）を含んでいる。固定化核酸は、特定のメッセージから得られる配列（例えばcDNAライブラリー）またはヒトゲノムを含む遺伝子から得られる配列（ゲノムライブラリー）を含むことができる。他の標的要素は、基準配列などを含むことができる。アレイ上の生体分子は、固体表面にさまざまなサイズおよびさまざまな密度で配置することができる。1つのクラスター中の生体分子の密度およびアレイ上のクラスターの数は、例えばラベル、固体支持体の性質、その他のいくつかの因子に依存することになる。各クラスター/バイオサイトは、実質的に同じ生体分子（例えば核酸またはポリペプチド）を含んでもよいし、生体分子の混合物（例えば長さおよび/または配列の異なる核酸）を含んでもよい。したがって、例えば、クラスター/バイオサイトは、2コピー以上のDNAのクローン化断片を含んでもよく、各コピーは異なる長さの断片に分割してもよい。本発明の修飾生体分子を固定化する表面としては、後述するようにニトロセルロース、ガラス、石英、融解石英、プラスチックなどを挙げることができる。本発明の組成物および方法には、例えば米国特許第6,197,503号、同第6,174,684号、同第6,156,501号、同第6,093,370号、同第6,087,112号、同第6,087,103号、同第6,087,102号、同第6,083,697号、同第6,080,585号、同第6,054,270号、同第6,048,695号、同第6,045,996号、同第6,022,963号、同第6,013,440号、同第5,959,098号、同第5,856,174号、同第5,843,655号、同第5,837,832号、同第5,770,456号、同第5,723,320号、同第5,700,637号、同第5,695,940号、同第5,556,752号、同第5,143,854号などに記載されているアレイの設計ならびに関連する成分および方法の全部または一部を組み込むことができる。例えば、WO 99/51773、WO 99/09217、WO 97/46313、WO 96/17958、WO 89/10977なども参照されたい。また例えば、Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174、Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092、Kern (1997) Biotechniques 23:120-124、Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20: 399-407、Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21: 25-32、Epstein (2000) Current Opinion in Biotech. 11:36-41、Mendoza (1999) Biotechniques 27:778-788、Lueking (1999) Anal. Biochem. 270:103-111、Davies (1999) Biotechniques 27:1258-1261なども参照されたい。
【００８５】
基材表面
アレイを含む本発明の製造品は、剛性、半剛性または可撓性材料の基材表面を持つことができる。基材表面は平坦または平面状であるか、ウェル、盛り上がった領域、エッチングされた溝、小孔、ビーズ、フィラメントなどの形状をとることができる。基材は、「捕捉プローブ（capture probe）」を直接または間接的に結合させることが可能な任意の材料であることができる。例えば、適切な材料としては、紙、ガラス（例えば米国特許第5,843,767号）、セラミックス、石英または他の結晶性基材（例えばヒ化ガリウム）、金属、メタロイド、ポラクリロイルモルフォリド（polacryloylmorpholide）、種々のプラスチックおよびプラスチックコポリマー、Nylon（商標）、Teflon（商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4-メチルブテン)、ポリスチレン、ポリスチレン/ラテックス、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、レーヨン、ナイロン、ポリ(酪酸ブチル)、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）（例えば米国特許第6,024,872号参照）、シリコーン（例えば米国特許第6,096,817号参照）、ポリホルムアルデヒド（例えば米国特許第4,355,153号および同第4,652,613号参照）、セルロース（例えば米国特許第5,068,269号参照）、酢酸セルロース（例えば米国特許第6,048,457号参照）、ニトロセルロース、種々の膜およびゲル（例えば、シリカエアロゲル、例えば米国特許第5,795,557号）、常磁性または超常磁性微粒子（例えば米国特許第5,939,261号）などを挙げることができるが、これらに限るわけではない。反応性官能基は、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基などであることができる。シラン（例えば、モノ-およびジ-ヒドロキシアルキルシラン、アミノアルキルトリアルコキシシラン、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシランなど）は、アミン官能基との反応に、ヒドロキシル官能基を提供することができる。
【００８６】
試料核酸の分子プロファイルの作成
本発明は、核酸試料（例えばゲノムDNAまたはcDNAライブラリーの試料）の分子プロファイルを作成するための組成物および方法を提供する。本発明は、製造品、およびアレイ結合型核酸を核酸含有試料と接触させ、アレイに対する試料核酸の結合を検出し、それによって試料核酸の分子プロファイルを作成するための製造品および方法を提供する。本発明の他の態様として、分子プロファイルは、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）反応；ゲノムDNA増幅、ゲノムDNA欠失、またはゲノムDNA挿入の検出；点突然変異の検出、例えば一塩基多型（SNP）の同定；アレイ結合型核酸がCpGアイランドタグであるディファレンシャルメチル化ハイブリダイゼーション（DMH）；あるゲノムの転写活性領域の検出（例えば核ラン・オフアッセイを用いる）；クロマチン構造の解析、およびテロメア構造の解析（テロメア短縮またはテロメア付加など）であることができる。これらの手順はすべて当技術分野では周知であり、任意の分子生物学的手順または解析を、本発明の修飾生体分子またはアレイを使って行うことができる。
【００８７】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）
一態様として、本発明のアレイおよび方法は、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）反応に使用される。CGHは、量的変化（すなわちコピー数の増加または減少）を起こしているゲノム中の領域を検出するために使用することができる分子細胞遺伝学的アプローチである。腫瘍細胞のゲノムを解析することにより、増加および/または減少欠失を起こしている、1つまたは複数の異常な領域を検出することができる。cDNAアレイを使って何百もの遺伝子のディファレンシャルな発現を解析し、よって正常組織および患部組織における遺伝子発現の特徴づけを容易にすることができる。本発明の方法およびアレイを用いた比較ゲノムハイブリダイゼーションによる核酸試料の分子プロファイルの作成は、当技術分野で知られている方法および組成物を使って実施することができる。例えば米国特許第6,197,501号、同第6,159,685号、同第5,976,790号、同第5,965,362号、同第5,856,097号、同第5,830,645号、同第5,721,098号、同第5,665,549号、同第5,635,351号、およびDiago (2001) American J. of Pathol. May;158(5):1623-1631、Theillet (2001) Bull. Cancer 88:261-268、Werner (2001) Pharmacogenomics 2:25-36、Jain (2000) Pharmacogenomics 1:289-307などを参照されたい。
【００８８】
一塩基多型（SNP）の検出
ある態様では、本発明のアレイおよび方法は、一塩基多型（SNP）などの点突然変異を検出するために使用される。アレイは、数多くの個体を何千ものSNPマーカーを使って研究する薬理ゲノミクスのハイスループット遺伝子タイピングアプローチに使用することができる。SNPマッピングにより、複合疾患遺伝子の局在化が急速に進んだ。比較的小さい連鎖不平衡領域における、ある疾患に関係する複数SNPの検出により、その疾患に関する連鎖領域を狭めることができ、感受性遺伝子の同定は、疾患プロセスの機序のよりよい理解を可能にし、新しいより有効な医薬の発見を容易にすることになる。本発明の方法およびアレイを用いたSNPの解析および検出による核酸試料の分子プロファイルの作成は、当技術分野で知られている方法および組成物を使って実施することができる。例えば米国特許第6,221,592号、第6,110,709号、第6,074,831号、第6,015,888号、およびKwok (2000) Pharmacogenomics 1:95-100、Riley (2000) Pharmacogenomics 1:39-47、Kokoris (2000) Mol. Diagn. 5:329-340、Shi (2001) Clin. Chem. 47:164-172、Fan (2000) Genome Res. 10:853-860、Ianonne (2000) Cytometry 39:131-140、Cai (2000) Genomics. 66:135-143、Chen (2000) Genome Res. 10:549-557、Syvanen (1999) Hum. Mutat. 13:1-10、Pastinen (1997) Genome Res. 7:606-614などを参照されたい。
【００８９】
ディファレンシャルメチル化ハイブリダイゼーション（DMH）
本発明のアレイおよび方法は、例えばCpGアイランド解析などを含むディファレンシャルメチル化ハイブリダイゼーション（DMH）に使用される。一態様として、アレイに結合した核酸は、CpGアイランドタグを含む。一態様として、本発明の方法およびアレイは、ゲノムの超メチル化または低メチル化領域を同定し、解析し、マッピングするために使用される。一態様として、試料核酸は、少なくとも1つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化されたゲノムDNAを含むことができ、分子プロファイルはゲノムの超メチル化（または低メチル化）領域の検出およびマッピングを含む。メチル化感受性制限酵素エンドヌクレアーゼまたはそれと等価なエンドヌクレアーゼ酵素は、例えばNotI、SmaI、SacII、EagI、MspI、HpaII、Sau3AIおよびBssHIIなどを含めて、どれでも使用することができる。本発明の一態様では、メチル化感受性酵素とそのメチル化非感受性イソシゾマーの両方を使用する。例えばRobinson (2000) Chromosome Res. 8:635-643には、メチル化感受性酵素HpaIIとそのメチル化非感受性イソシゾマーMspIの使用が記載されている。Windhofer (2000) Curr. Genet. 37:194-199には、メチル化感受性エンドヌクレアーゼSau3AIおよびメチル化非感受性エンドヌクレアーゼNdeIIによるゲノムDNAの消化が記載されている。また例えば、Muller (2001) J. Biol. Chem. 276:14271-14278、Memisoglu (2000) J. Bacteriol. 182:2104-2112、Roth (2000) Biol. Chem. 381:269-272なども参照されたい。
【００９０】
DNAのメチル化、CpGジヌクレオチドの場合であれば、シトシンへのメチル基の共有結合的付加は、哺乳類ゲノムに対して重大な作用を持つ。これらの作用には、転写因子結合の阻害またはメチル結合タンパク質とそれに伴うクロマチン再構築因子の動員による転写抑制、X染色体の不活性化、刷込みおよび寄生DNA配列の抑制が含まれる。DNAのメチル化はまた、適切な胚発生、DNA修復、およびゲノムの安定性にも不可欠である。例えば、DNAの脱メチル化が染色体の安定性に及ぼす影響は、配列特異的クロマチン構造によって調整される（本発明はクロマチン構造を含む修飾生体分子およびアレイも提供する）（例えばVilain (2000) Cytogenet. Cell. Genet. 90:93-101参照）。
【００９１】
腫瘍細胞では正常なメチル化パターンがしばしば乱され、領域特異的超メチル化を伴う全体的な低メチル化を示す。これらの超メチル化事象が腫瘍抑制遺伝子のプロモーター内で起こると、それらは遺伝子をサイレンシングし、欠失または突然変異によく似た形で細胞の成長に有利に働く。例えばRb腫瘍抑制経路はしばしば、p16INK4A遺伝子のメチル化依存的なサイレンシングおよびプロテオソームサブユニットによるRb分解の刺激によって破壊される（例えばBuendia (2000) Semin. Cancer Biol. 10:185-200）。したがって、DNAメチル化の異常の反転は、これらの遺伝子の腫瘍抑制機能を回復し、癌治療の新しいアプローチになりうる（例えばSantini (2001) Ann. Intern. Med. 3;134(7):573-586参照）。選択された遺伝子のDNAメチル化による転写サイレンシングは、ヒト胃腸悪性腫瘍の発生および進行に重要な役割を果たす（例えばToyota (2000) J. Gastroenterol. 35:727-734参照）。本発明の方法およびアレイを用いたディファレンシャルメチル化およびCpGアイランドの解析による核酸試料の分子プロファイルの作成は、当技術分野で知られる方法を使って実施することができる。米国特許第6,214,556号、同第6,180,344号、同第5,851,762号、ならびにW00127317、W09928498、WO0044934およびW01999DE03747 19991119も参照されたい。
【００９２】
テロメア構造の解析
本発明のアレイおよび方法は、テロメア短縮またはテロメア付加などのテロメア構造の解析に使用される。特殊化した核タンパク質構造であるテロメアの維持は、染色体の安定性にとって不可欠である。染色体末端でテロメアの新たな合成が起こらなければ、細胞分裂が進むにつれて染色体が短くなる。テロメアの長さが臨界的に短くなると、これは、ついには、複製老化またはアポトーシスを誘発する。ヒト細胞におけるテロメラーゼ活性の調節は癌の発生に重要な役割を果たしている（テロメラーゼは直線状真核染色体のテロメア末端を合成する酵素である）。テロメラーゼは、正常なヒト体細胞の大部分では強く抑制されているが、細胞の不死化中および癌では活性化状態になる。したがって、テロメラーゼアッセイは癌の検出および診断に役立つ（例えばHahn (2001) Ann Med 33: 123-129; Meyerson (2000) J. Clin. Oncol. 18:2626-2634、Meyerson (1998) Toxicol. Lett. 102-103:41-5参照）。本発明のアレイ型テロメア構造を使用すれば、テロメラーゼの生物学の理解が促進され、臨床に関係するテロメラーゼに基づく治療法につながるだろう。本発明の方法およびアレイを用いたテロメア構造の解析による核酸試料の分子プロファイルの作成は、当技術分野で知られる方法および組成物を使って実施することができる。例えば米国特許第6,221,590号、同第6,221,584号、同第6,022,709号、同第6,007,989号、同第6,004,939号、同第5,972,605号、同第5,871,926号、同第5,834,193号、同第5,830,644号、同第5,695,932号、同第5,645,986号を参照されたい。
【００９３】
クロマチン構造の解析
本発明のアレイおよび方法は、クロマチン凝縮、クロマチン脱凝縮、ヒストンリン酸化、ヒストンアシル化などを含むクロマチン構造の解析に使用される（例えばGuo (2000) Cancer Res. 60:5667-5672、Mahlknecht (2000) Mol. Med. 6:623-644参照）。一部の癌ではクロマチン構造の再構築が起こる（例えばGiamarchi (2000) Adv. Exp. Med. Biol. 480:155-161参照）。クロマチン構造は、DNAを基質として利用する核プロセス、例えば核内で起こる転写、複製、DNA修復、およびDNA編成などに影響を及ぼす。クロマチン構造解析は妊性評価に役立つ。例えば脱凝縮したクロマチンを持つ精子は不妊である。無処置の癌を持つ患者におけるDNAの損傷は、精子クロマチン構造アッセイを使って測定することができる（例えばKobayashi (2001) Fertil. Steril. 75:469-475）。本発明の方法およびアレイを用いたクロマチン構造の解析による核酸試料の分子プロファイルの作成は、当技術分野で知られている方法および組成物を使って実施することができる。例えば米国特許第6,204,064号、同第6,187,749号、同第6,097,485号、同第5,972,608号、同第5,919,621号、同第5,470,709号、およびDreyer (2000) Anal. Cell Pathol. 20:141-150、Hong (2001) Acta Cytol. 45:163-168、Evenson (1991) Reprod. Toxicol. 5:115-125などを参照されたい。
【００９４】
核ラン・オフアッセイ
本発明のアッセイおよび方法は、核酸の転写活性領域、例えばゲノムの転写活性領域の検出および解析に使用される。一態様として、核酸の試料は核ラン・オフアッセイに由来し、本発明の組成物と方法によって検出および解析することができる。もう一つの態様では、核ラン・オフ試料が本発明の方法によって修飾される。一態様として、これらの修飾核酸は本明細書に記載のアレイに固定化される。
【００９５】
本発明の方法およびアレイを用いて核ラン・オフアッセイなどの方法によって行われる核酸の転写活性領域の検出および解析による核酸試料の分子プロファイルの作成は、当技術分野でよく知られる方法および組成物を使って実施することができる。例えば米国特許第6,200,960号、同第6,184,032号、同第6,175,060号、同第6,159,751号、同第6,022,694号、同第5,994,523号、およびDelany (2001) Methods Mol. Biol. 151:321-333、Srivastava (1998) Methods Mol. Biol. 86:201-207、Greene (1994) J. Biochem. Biophys. Methods 29:179-187、Srivastava (1994) Methods Mol. Biol. 31: 281-288を参照されたい。
【００９６】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書に記載する発明にさまざまな置換および変更を加えうることは、当業者には明白だろう。本明細書に記載する実施例および諸態様は例示を目的とするに過ぎず、それらに照らして、さまざまな変更または改変が当業者に示唆されること、そしてそれらが本願の精神および範囲ならびに本願特許請求の範囲に包含されることは、いうまでもない。
【００９７】
実施例
以下の実施例は本願発明を例示するために記載するものであって、本願発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００９８】
3-グリシドキシプロピルトリメトキシシランを用いる修飾核酸の製造
以下の実施例では、本発明の修飾核酸の一態様の製造および使用を説明する。化学修飾の目的は、非誘導体化固体表面に核酸を容易に不動化することができるようにすることである。この実施例では、核酸（好ましくはDNA）を3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（GPTS）との反応により、図1に従って修飾する。GPTSは、実際に、ガラス表面を誘導体化し、誘導体化されたそのガラス表面に（無修飾の）DNA試料を接触させて、そこに固定化する目的で、以前から使用されている。しかし、ここではGPTSの使用目的が反対であり、DNAを修飾した後、修飾されたDNAを非誘導体化ガラス表面に取り付けることは、今までに開示されたことも、示唆されたこともない。さらに、GPTSは、エポキシド基を含むので、インビボでDNAを損傷することが知られている。これらの理由から、DNAを誘導体化するためにGPTSを使用することは、先行技術では実際のところ推奨されない。
【００９９】
概説すると、固体支持体への核酸の不動化は、本質的に2つのステップからなる。第1ステップでは、核酸がGPTS分子のエポキシ末端と反応し、第2ステップでは、ガラス表面がGPTS修飾核酸の他端またはGPTS修飾核酸のシラン末端と反応し、それにより、非誘導体化ガラス表面に核酸が不動化される。反応全体は迅速であり、有利な平衡を特徴とし、極めて穏かな条件下で、最少量の安価な試薬を使って行われる。この反応の各ステップを実行する方法が数多く存在することは極めて明白であるが、好ましい方法をこの実施例と以降の実施例に示す。
【０１００】
図1に示すように、環状または環エーテルとアルコキシシラン（この場合はそれぞれエチレンオキシドとトリメチルオキシシラン）を持つ化学化合物は、2つの化合物末端を含み、それら2つの末端は4炭素のエーテル結合によってつながれている。図示する化合物は3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、すなわちGPTSである。第1ステップでは、塩基性pH、好ましくは9.5より高いpHでDNAをGPTSと反応させて、修飾DNAを形成させる。次に、その修飾DNAを非誘導体化ガラス（または他のシラノール含有）表面と中性pHで反応させ、よってDNAをガラス表面上に固定化する。この第1ステップでは、環エーテル反応基がDNAと反応する。重ねて言うが、環エーテルは、GPTSの場合にようにエチレンオキシドである必要はない。ただし、反応性が比較的低いエーテル官能基の反応性を増大させるために小さい環であることが好ましい。
【０１０１】
誘導体化DNAをもたらす第1反応は、おそらくはDNAのリボース環の炭素5が関与する開環反応である。この誘導体化DNAは並はずれて安定であり、実際に使用するまで長期間にわたって貯蔵しておくことができる。誘導体化DNAをガラス表面上に固定化する第2反応は単純な置換反応であり、ガラス表面にSi-O-Si結合が生成し、GPTS分子からアルコキシ基の1つが除去される。
【実施例２】
【０１０２】
3-アミノプロピルトリエトキシシランを使った修飾核酸の製造
以下の実施例では本発明の修飾核酸のもう1つの態様の製造および使用を説明する。化学修飾の目的は、非誘導体化固体表面に核酸を容易に不動化することができるようにすることである。この実施例では、核酸（好ましくはDNA）を3-アミノプロピルトリメトキシシランとの反応により、図2に従って修飾する。実施例1と同様に、固体支持体への核酸の不動化は、本質的に2つのステップからなる。第1ステップでは、核酸が3-アミノプロピルトリメトキシシラン分子のアミノ末端と反応し、第2ステップでは、ガラス表面が3-アミノプロピルトリメトキシシラン修飾核酸の他端またはシラン末端と反応し、それにより、非誘導体化ガラス表面上に核酸が不動化される。
【０１０３】
実施例1と同様に、反応全体は迅速であり、有利な平衡を特徴とし、極めて穏かな条件下で、最少量の安価な試薬を使って行われる。この反応の各ステップを実行する方法が数多く存在することは極めて明白であるが、好ましい方法をこの実施例と以下の実施例に示す。
【０１０４】
図2に示すように、アミノ基とアルコキシシラン（この場合はそれぞれNH2とトリエチルオキシシラン）を持つ化学化合物は、2つの化合物末端を含み、それら2つの末端はプロピル結合によってつながれている。図示する化合物は3-アミノプロピルトリエトキシシランである。第1ステップでは、中性pHで亜硫酸水素ナトリウムまたはその等価物の存在下に、DNAを3-アミノプロピルトリエトキシシランと反応させる。
【０１０５】
誘導体化DNAをもたらす第1反応は、核酸上のシトシン残基のアミノ基転移反応である。誘導体化DNAをガラス表面上に固定化する第2反応は、実施例1と同様に、単純な置換反応である。これにより、ガラス表面ではSi-O-Si結合が生成し、GPTS分子からアルコキシ基の1つが除去される。
【実施例３】
【０１０６】
修飾核酸を用いた高密度マイクロアレイの製造
以下の実施例では本発明の高密度マイクロアレイの製造を説明する。
【０１０７】
実施例1および2に記載したような本発明の修飾核酸を製造したら、それらをさまざまな方法で利用して、例えば高密度アレイを製造することができる。重ねて言うが、これらの修飾核酸（特にDNA）は、修飾DNAを非誘導体化表面と接触させるだけでガラス表面上に固定化することができる。その意義は、なかんずく、スプレディング（固定化しようとするDNAの所望の位置からの移動）および非特異的なプローブの固着（表面上に正味の正の静電荷を生成し、それが負に帯電したDNAを誘引するという、ガラス表面の誘導体化によるもの）が本質的に排除されるということである。
【０１０８】
これらの利点から、著しく望ましい並はずれて高密度マイクロアレイの作製が可能になる。例えば、スプレディングが排除され、プローブの固着が効果的に排除されるので、それぞれが顕微鏡的サイズであってすべてが単一のガラス表面上に固定化されている事実上何千もの被験DNA試料を、一つの小さいガラス表面に含めることができる。実際、あるガラス表面上におかれた50ミクロン未満の小さい多数の単一試料スポットからなるマイクロアレイを構築することができる。
【０１０９】
このタイプの多数のDNA試料からなる高密度マイクロアレイは、本発明でも容易に構築することができる。修飾DNAは実際の使用よりもかなり前に（例えば実施例1および2に従って）製造することができる。これらの化学修飾DNA試料は、無改変のガラスシート上に例えば格子状にすぐに「刻印」することができる「DNAチップ」に似ている。図3は、本発明のDNAチップを使って、そのような高密度マイクロアレイを製造するための装置の一態様を表している。好ましい一態様として、装置は、複数の安価な市販のキャピラリーマイクロピペット（好ましくは10cmマイクロピペットであるが、他のサイズでももちろん構わない）から作製される。図3に示すように、各10cmマイクロピペットを引っ張って、その一端を細くする。それらを六方最密アレイに配置し、四角い枠で束ねる。マイクロピペットを互いにのり付けして、枠内に安定した単位を形成させることができる。先細端（図3B）を切り落とし、光学的に平坦になるまで磨く。
【０１１０】
マイクロアレイを製造するために、装置のマイクロピペットに合うように調整されたウェルを持っていて（本発明に従って化学修飾された）被験DNA試料を含んでいるマルチウェル容器に、装置の先端を浸漬する。先端をウェルと接触させると、単なる毛細管作用により、特定のウェルに対応するマイクロピペット中に、少量の各DNA試料が投入される。スポットのサイズは、先細端のサイズによって、注意深く制御することができる。この装置および本発明のDNAチップを使用すれば、何千もの試料を狭い領域に同時に、かつ高価なロボットを必要とせずに、配列することができる。実際、本発明の方法（DNAチップおよびピペット装置を含む）は、高速スポッティングロボットを用いる方法よりもさらに効率がいいことが証明されている。最後に、本発明の化合物、方法および装置は、市販用の包装済みキットへの組み込みが容易である。
【０１１１】
本発明の高密度マイクロアレイは、上記従来技術の項に開示したような従来技術のマイクロアレイシステムにも容易に組み込むことができる。例えば、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）、およびガラス基材上にDNA試料のマイクロアレイを作製し、複合蛍光標識プローブとのハイブリダイゼーションによってプロービングし、ハイブリダイゼーションを表す蛍光シグナルをレーザー走査顕微鏡を使って検出するShalon (1996) 6 Genome Res. 639 (1996)に記載の方法（この文献にはDNA試料を解析するためのマイクロアレイシステムが記載されている）。同様に、Sargentら（米国特許第5,601,982号）には、走査トンネル顕微鏡法による核酸の走査を含むポリヌクレオチドの配列を決定するための方法および機器が開示されている。
【０１１２】
本発明が核酸のみの使用に限定されないことは、当業者には理解されるだろう。他の生体分子、例えばDNA、RNA、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドおよび多糖などの生体高分子も、二官能性シラン化合物または他の架橋試薬など、本発明の方法を使って直接活性化して、固体表面に固定化された生体分子（例えば生体高分子）を得ることができる。本発明は、配列（すなわち固定化）しようとする標的分子をまず修飾して、それらがそのプロービング（例えばハイブリダイゼーション）能力を失うことなく固体表面への結合親和性を獲得するようにする。修飾は独立したプロセスなので、事実上任意の生体分子を修飾し、配列（固定化）することができる。したがって、本発明が核酸に限定されず、さまざまな生体分子にも使用できることは、当業者には理解される。
【実施例４】
【０１１３】
修飾核酸の製造
以下の実施例では、核酸の修飾を説明することにより、本発明の修飾生体分子製造方法を実証するものである。
【０１１４】
ハロゲン化シランの使用：この実施例では、本発明の修飾核酸のもう一つの形態を説明する。重ねて言うが、本明細書に開示しクレームする化学修飾の目的は、非誘導体化固体表面（例えば普通の石英ガラス）に核酸を容易に不動化することができるようにすることである。図4では、無修飾核酸をほぼ中性pHで適切なシラン化合物と反応させることによって、本発明の修飾核酸を製造する。図4の「Ｘ」は、任意のハライド、好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＩを指すことができ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は同じであっても異なってもよく、−ＯＣＨ3および−ＯＣ2Ｈ5が含まれる。特に好ましい態様では、図4の矢印の左側に描いたハロゲン化シランが、8-ブロモオクチルトリクロロシラン、8-ブロモオクチルトリメトキシシラン、4-クロロブチルメチルジクロロシラン、および3-ヨードプロピルトリメトキシシランである。
【０１１５】
図4に示す変換は次のように行った。ハロゲン化シランをジメチルホルムアミド（DMF）に約30mMの濃度で溶解した。次に、3mg〜10mgの核酸を、100mlの0.01Mリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解した。次に、1〜3mgの30mMハロゲン化シランを加え、その溶液をよく混合し、約37℃で約3時間反応させた（別法として、室温で一晩反応させることもできる）。反応後、所望の生成物（修飾核酸）をエタノール沈殿によって精製し、その修飾核酸を水に溶解する。
【実施例５】
【０１１６】
アレイの作製ならびにスポット（クラスター）の密度およびサイズの制御
以下の実施例は、本発明のアレイまたは「バイオチップ」を製造する方法の代表例を実証するものである。
【０１１７】
本願の全体を通して述べるように、本発明の利点の一つは、研究者が核酸研究を行うために並はずれて高密度なマイクロアレイを製造できるようになるということである。この実施例は、本発明の高密度マイクロアレイの製造を開示した実施例3との関係でもっともよく理解される。この実施例では、本発明に従って、固体支持体上の個々の核酸「スポット」または「クラスター」のサイズおよび密度を制御するための、強化された方法を開示する。
【０１１８】
小さい「スポット」または「クラスター」サイズは、高密度マイクロアレイとの関係で、より高い試料密度（すなわち単位面積あたりの試料数の増加）およびより優れた検出感度（シグナルが拡散しないため）をもたらす。従来の固体支持体系では、当業者は難しいジレンマに直面する。普通のきれいな石英ガラス表面（本明細書に記載する実験で使用されるタイプのもの）は極めて親水性である。したがって、ガラス表面上に置くと、核酸試料は当然広がる傾向を示す。重ねて言うが、これは望ましくない。スプレディングを緩和するために、当業者は、例えば表面を疎水性剤で前処理するか、または単に表面を脱水することなどにより、表面をより疎水的にするための処置を施すことができる。当然、これらの選択肢はどちらも、シラン修飾核酸に対するガラス表面の反応性を下げることになる。
【０１１９】
この実施例で議論する本発明の一群の態様では、当業者は、このジレンマを免れる。より具体的には、本発明のもう一つのタイプのシランを使用することにより、スプレディングは排除することができ、しかも修飾核酸に対する表面の反応性を維持しておくことができる。例えば、加水分解後のこれらのシランの極めて一般的な態様の一つは、疎水性基で連結されたＳｉ（ＯＨ）3を、各末端に含む。図6参照。さまざまな疎水性リンカーをどれでも使用することができる。特に好ましい態様には、1,6-ビストリクロロシリルヘキサン、1,8-ビストリクロロシリルオクタン、1,6-ビストリメトキシシリルヘキサン、および1,4-ビストリメトキシシリルエチルベンゼンなどがある。したがって、本発明のこれらの態様では、シランの一端が表面に接着し、他端が修飾生体分子（例えば核酸）に対する反応性を保つ。疎水性リンカーは表面に疎水性を付与する。したがって、表面の静電特性（疎水性対親水性）を容易に調整する方法は、当業者にはすぐにわかる。例えば疎水性を制御するためにリンカーの鎖長を調節することができる。また表面の反応性は、表面と接触させるシランの量を調節することによって制御することができる。
【０１２０】
本発明のこの態様に従って固体支持体を製造するために、換気フードの中で、ガラス表面を3M HCl中で約2時間ゆっくり煮沸することによって洗浄した。次に、表面を脱イオン水ですすいだ後、使用準備が整うまで、0.1M HCl中に保存した。使用準備が整ったら、表面を再蒸留脱イオン水ですすいで、残存している酸を除去した後、無水エタノール中ですすいだ。次にその表面を直ちに、0.0005％〜0.002％の本発明のこの態様の二官能性シランを含むエタノール溶液に移した。次に、その表面を室温で約48時間処理した。次に、表面をエタノールですすぎ、風乾した。最後に、使用準備が整うまで、ガラス表面を無塵環境に保存した。
【実施例６】
【０１２１】
アミン含有シラン化合物を使った修飾核酸の製造
以下の実施例では、本発明の修飾核酸のもう一つの形態を説明する。この態様群では、手つかずの核酸をアミン含有シランと反応させることによって修飾核酸を製造する。アミン含有シランによる核酸の誘導体化は、次の2つのステップから構成される：(1)核酸のハロゲン化（または図示するようにブロモ化）（図5A、5B）、および（2）ハロゲン化核酸の誘導体化（図5C）。図5A、5Bに示すように、反応は穏かなpH条件でN-ブロモスクシンイミドの存在下に行うことができる。これらの反応変数のいずれかを変化させることで、当業生化学者は、反応速度を制御することができる。また、図5A、5Bに示すように、反応は通常、pHに依存してグアニン塩基またはシトシン塩基で起こる。すなわち、中性〜弱塩基性pHはグアニン残基での反応に有利であり、より塩基性のpHはシトシン残基での反応に有利である。
【０１２２】
核酸がDNAであるかRNAであるかに応じて、わずかに異なる反応プロトコールを使用することが好ましい。DNAの場合は、5mgのDNAを100mlの0.1M NaHCO3に溶解して、pHを約9.5にした。この溶液を氷上で約5分間保った。同時に、濃度約10mMの新鮮なN-ブロモスクシンイミド溶液を調製し、これも氷上で冷却した。次に、1mlのN-ブロモスクシンイミド溶液をDNA溶液に加えた。次にその溶液を激しく（渦を巻くように）撹拌した。次に反応を氷上で約15分間進行させた。次に、pH約9.5〜約12の0.5Mアミノシラン溶液10mlを臭素活性化DNA溶液に加え、この新しい混合物を65℃で約2時間反応させた。最後に、シラン修飾DNAを当技術分野で周知の方法によって精製した。好ましくはエタノール沈殿またはそれと等価な手順によって精製する。
【０１２３】
RNAには、似ているがわずかに異なるプロトコールを使用した。5mgのRNAを100mlの0.1Mリン酸緩衝液に溶解してpHを約7.5にした。この溶液を氷上で約5分間保った。同時に、濃度約10mMの新鮮なN-ブロモスクシンイミド溶液を調製し、これも氷上で冷却した。次に、1mlのN-ブロモスクシンイミド溶液をDNA溶液に加え、次にその溶液を激しく（渦が巻くように）撹拌した。次に反応を氷上で約15分間進行させた。次に、pH約8.0の1Mアミノシラン溶液10mlを臭素活性化DNA溶液に加え、この新しい混合物を45℃で約2時間反応させた。最後に、シラン修飾DNAを当技術分野で周知の方法によって精製した。好ましくはエタノール沈殿またはそれと等価な手順によって精製する。
【０１２４】
これらの態様では、以下のシランをこれらの理由から利用することができる。
【０１２５】
【化２】
2005500023.tif 000004
［Ｒは−ＣＨ３または−Ｃ２Ｈ５であることができる；
Ｒ１はＨ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＯＣＨ３、または−ＯＣ２Ｈ５であることができる；
Ｒ２はＨ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＯＣＨ３、または−ＯＣ２Ｈ５であることができる］。
【０１２６】
さらに、加水分解後に以下の形態を取る他のアミノシラン化合物はいずれも有用である。
【０１２７】
【化３】
2005500023.tif 000005
【実施例７】
【０１２８】
3-グリシドキシプロピルトリメトキシシランを用いた修飾生体分子（生体高分子）の製造
この実施例では、二官能性シラン化合物を使って生体分子（例えば核酸）を修飾する方法を説明する。
【０１２９】
化学修飾の目的は、非誘導体化固体表面に試料（生体分子）を容易に不動化することができるようにすることである。この実施例では、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（GPTS）との反応によって生体高分子を修飾する。
【０１３０】
概説すると、固体表面上への生体高分子の不動化は、本質的には2つのステップからなる。第1ステップでは、生体高分子がGPTS分子のエポキシ末端と反応し、第2ステップでは、ガラス表面がGPTS修飾生体高分子の他端またはGPTS修飾生体高分子のシラン末端と反応し、それにより、非誘導体化ガラス表面上に生体高分子が不動化される。
【０１３１】
本発明にさまざまな二官能性架橋試薬を使用できることは当業者には理解される（上記参照）。架橋試薬およびそれらの使用に必要な条件は当技術分野ではよく知られているので、当業者は、本願が提供する情報を補外し、特別な架橋試薬および条件を利用して、特別な修飾生体高分子を得ることができるだろう。
【実施例８】
【０１３２】
修飾小分子の製造
この実施例では、生体高分子とはいえない生体分子を修飾する方法を説明する。上述のように、本発明の組成物および方法には、任意の生体分子を組み込むことができる。これらの非生体高分子はまず、エポキシドシラン活性化生体高分子、例えば実施例7に従って活性化された生体高分子に架橋される。典型的には小分子であるこれら非生体高分子の架橋は、分子のサイズと安定性を増加させる。非生体高分子が活性化生体高分子（例えばポリエチレングリコール（PEG）またはDNA）に架橋されたら、適切な条件での直接的な付着および硬化によって、これらの架橋分子を固体表面上に固定化することができる。
【実施例９】
【０１３３】
タンパク質およびポリペプチド（例えば抗体）、多糖ならびに脂質などのアミン含有生体高分子のシラン化
この実施例では、アミン含有生体分子をシラン化によって修飾する方法を説明する。そのような生体分子には、アミン基を含む核酸の他に、ペプチドおよびポリペプチド（例えば抗体）、脂質ならびに多糖が含まれる。アミン基を含む核酸には、例えば、米国特許第6,127,533号に記載されているアミノオキシ部分を含むヌクレオチド組成物などが含まれる。
【０１３４】
生体高分子は効果的にシラン化され、ガラス表面上に配列される。まず、生体高分子を2-イミノチオラン（一般に「トラウト（Traut's）試薬」と呼ばれる）またはN-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート（SATA）もしくはスクシンイミジルアセチルチオプロピオネート（SATP）で処理して、活性スルフヒドリル官能基を導入する。活性化された生体高分子を、穏かな条件下で既述のようなエポキシドシラン化合物と反応させることによってシラン化する。典型的な反応を図7に示す。この例ではSATPと−Ｓｉ（ＯＣＨ3）3を含むエポキシシランを使用している。
【０１３５】
抗体はさまざまな方法によってシラン化される。そのような方法の一つは、まず、50mM NaClおよび10mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.3）に約1〜3mg/mlの濃度で抗体を溶解することである。次に、100mM SATAまたはSATP/DMSO溶液5mlを1mlの抗体溶液に加え、室温（RT）で一晩反応させる。次に、100mMの1Mヒドロキシルアミン塩酸塩を加え、RTで1時間反応させる。RT活性化の後、10mMの0.2M 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（エポキシドシラン）を加え、RTで約5時間反応させる。すべての反応が完了したら、Sephadex G25カラムまたはそれに相当するものでゲル濾過することにより、抗体を精製する。修飾抗体を直接付着によってガラス表面に固定する。
【０１３６】
本明細書に挙げた特許、刊行物はすべて本発明が属する技術分野の当業者の水準を示している。本明細書に記載した特許、刊行物はすべて、それぞれ個々の刊行物が参照により本明細書に組み込まれることを個別に明示した場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
本発明が、固有のならびに上述の目的、目標および利点を達成するのによく適していることは、当業者にはすぐに理解されるだろう。化学修飾核酸、それらの固体支持体へのとりつけ、ならびに本明細書に記載の順序、方法、手順、アッセイ、分子、装置および具体的化合物は、現時点における、本発明の好ましい態様を表し、代表例ではあるが、本発明の範囲を限定しようとするものではない。当業者であれば本発明の精神に包含され特許請求の範囲に定義される上記態様の変更態様および他の用途も思いつくだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】核酸（この場合はDNA）と3-グリシドキシプロピルトリメトキシシランとのカップリング反応、および続いて行われる新たに修飾されたDNAと固体支持体（この場合はガラス表面）との反応を表す図。最終反応生成物である固定化DNAを一番下に示す。
【図２】核酸（この場合はDNA）と3-アミノプロピルトリエトキシシランとのカップリング反応、および続いて行われる新たに修飾されたDNAと固体支持体（この場合はガラス表面）との反応を表す図。最終反応生成物である固定化DNAを一番下に示す。
【図３】高密度マイクロアレイを作製するための装置を表す図。上面図（図3A）と側面図（図3B）の両方を示す。
【図４】ハロゲン含有シラン化合物のアルキル化による核酸のシラン化を表す図。
【図５Ａ】アミン含有シラン化合物を使った核酸のシラン化の第1ステップを表す図。この場合、中性pHおよび弱塩基性pHでは、反応はグアニン塩基で優先的に起こる。
【図５Ｂ】アミン含有シラン化合物を使った核酸のシラン化の第1ステップを表す図。この場合、より塩基性のpHでは、反応はシトシン塩基で優先的に起こる。
【図５Ｃ】アミン含有シラン化合物を使った核酸のシラン化の第2および最終ステップを表す図。
【図６】疎水性リンカーによるシランリンカーを示す本発明の一態様の概略図。
【図７】実施例9に詳述するように、アセチルチオプロピオン酸スクシンイミジル（SATP）の使用を含む方法によって、生体分子、ポリペプチドを修飾または「活性化」して、活性スルフヒドリル官能基を導入する代表的反応の概略図。
【図１】
2005500023.tif 000007
【図２】
2005500023.tif 000008
【図３】
2005500023.tif 000009
【図４】
2005500023.tif 000010
【図５Ａ】
2005500023.tif 000011
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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