(57)【要約】本発明は新規の組成物および個体の免疫調節方法を提供する。免疫調節は、３〜６量体免疫調節性オリゴヌクレオチドを含む免疫調節性ポリヌクレオチド／マイクロキャリヤー（ＩＭＯ／ＭＣ）複合体の投与によって達成される。ＩＭＯ／ＭＣ複合体は、共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。また、ＭＣの中に包み込まれた３〜６量体ＩＭＯを含む免疫調節性組成物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロキャリヤー（ＭＣ）およびヌクレオチド３〜６個の長さの免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）（ただし、当該ＩＭＯは５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′からなる群から選ばれる配列を有しない。）の複合体を含む免疫調節性組成物。
【請求項２】
前記ＩＭＯが式５′−Ｘ１ＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０〜４個のヌクレオチドであり、そしてＸ２は０〜４個のヌクレオチドである。）に従う配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＩＭＯが式５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′または５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０〜２個のヌクレオチドであり、かつ、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドである。）に従う配列を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＩＭＯがヌクレオチド６個の長さである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＩＭＯがヌクレオチド５個の長さである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＩＭＯがヌクレオチド４個の長さである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＩＭＯがヌクレオチド３個の長さである、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＩＭＯは少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＩＭＯが少なくとも１つの修飾シトシンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記マイクロキャリヤーが固相マイクロキャリヤーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記マイクロキャリヤーが生分解性の重合体粒子である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記マイクロキャリヤーが生分解性のポリエステル粒子である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記マイクロキャリヤーがポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンおよびマロン酸ポリメチリデンからなる群から選ばれる重合体を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記マイクロキャリヤーが陽イオン基を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記マイクロキャリヤーが無機粒子を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記マイクロキャリヤーが無機の結晶性物質を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記マイクロキャリヤーがヒドロキシアパタイトおよびリン酸カルシウムからなる群から選ばれる物質を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記マイクロキャリヤーが１０ｎｍ〜１０μｍの大きさである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記マイクロキャリヤーが２５ｎｍ〜５μｍの大きさである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
抗原をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗原が前記ＭＣとＩＭＯの複合体に結合している、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗原が前記ＭＣとＩＭＯの複合体に非共有結合で結合している、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記抗原が前記ＭＣとＩＭＯの複合体に共有結合で結合している、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗原が前記ＭＣとＩＭＯの複合体のＭＣに共有結合で結合している、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗原が前記ＭＣとＩＭＯの複合体のＩＭＯに共有結合で結合している、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗原が前記ＭＣとＩＭＯの複合体に結合していない、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が抗原を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記複合体がヌクレオチド６個を超える長さのオリゴヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
マイクロキャリヤー（ＭＣ）およびヌクレオチド３〜６個の長さの免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）（ただし、ＩＭＯは５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′からなる群から選ばれる配列を有しない。）の複合体、ならびに薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬品組成物。
【請求項３０】
個体の免疫応答を調節するために有効な量のマイクロキャリヤー（ＭＣ）と免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）の複合体を当該個体に投与することを含む当該個体の免疫応答を調節する方法であって、上記ＩＭＯはヌクレオチド３〜６個の長さであり、かつ上記ＩＭＯは５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′からなる群から選ばれる配列を有しない、前記方法。
【請求項３１】
前記個体がＴｈ２型免疫応答に関連した疾患を患っている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｔｈ２型免疫応答に関連した疾患がアレルギーおよびアレルギー誘発喘息からなる群から選ばれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記個体がワクチンを受ける、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記個体が治療ワクチンを受ける、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療ワクチンがアレルギーエピトープ、ミコバクテリアエピトープおよび腫瘍関連エピトープからなる群から選ばれるエピトープを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記個体が予防ワクチンを受ける、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記個体が感染因子への曝露の危険性がある、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記個体が癌を発病する危険性がある、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記個体が癌を患っている、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記個体が感染症を患っている、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記複合体がヌクレオチド６個を超える長さのオリゴヌクレオチドを含まない、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
個体のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を増加させるために有効な量のマイクロキャリヤー（ＭＣ）と免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）の複合体を当該個体に投与することを含む当該個体のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を増加させる方法であって、上記ＩＭＯがヌクレオチド３〜６個の長さであり、かつ上記ＩＭＯが５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′からなる群から選ばれる配列を有しない、前記方法。
【請求項４３】
前記個体が、特発性肺線維症、強皮症、皮膚の放射線誘発線維症、肝線維症および腎線維症からなる群から選ばれる疾患を患っている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
個体のインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）を増加させるために有効な量のマイクロキャリヤー（ＭＣ）と免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）の複合体を当該個体に投与することを含む当該個体のインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）を増加させる方法であって、上記ＩＭＯがヌクレオチド３〜６個の長さであり、かつ上記ＩＭＯが５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′からなる群から選ばれる配列を有しない、前記方法。
【請求項４５】
前記個体がウイルス感染および癌からなる群から選ばれる疾患を患っている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルス感染がインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスおよび乳頭腫ウイルスからなる群から選ばれるウイルスによる感染である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
個体の感染症の症状を改善するために有効な量のマイクロキャリヤー（ＭＣ）と免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）の複合体を個体に投与することからなる当該個体の感染症の１つまたはそれ以上の症状を改善する方法であって、上記ＩＭＯがヌクレオチド３〜６個の長さであり、かつ上記ＩＭＯが５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′からなる群から選ばれる配列を有しない、前記方法。
【請求項４８】
前記感染症が細胞性病原体によって引き起こされる感染症である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記感染症がミコバクテリア症、マラリア、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、住血吸虫症および肝吸虫症からなる群から選ばれる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
個体のＩｇＥ値を低減するために有効な量のマイクロキャリヤー（ＭＣ）と免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）の複合体を当該個体に投与することを含むＩｇＥ関連疾患がある個体のＩｇＥ値の低減方法であって、上記ＩＭＯがヌクレオチド３〜６個の長さであり、かつ上記ＩＭＯが５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′からなる群から選ばれる配列を有しない、前記方法。
【請求項５１】
マイクロキャリヤー（ＭＣ）と、ヌクレオチド３〜６個の長さの免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）（ただし、当該ＩＭＯは５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′からなる群から選ばれる配列を有しない。）との複合体を含む、個体の免疫調節用キット。
【請求項５２】
個体を免疫調節するために前記複合体の投与のための使用説明書をさらに含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記使用説明書がＴｈ２型免疫応答に関連した疾患を患っている個体の免疫調節に関するものである、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記疾患がアレルギーおよびアレルギー誘発喘息からなる群から選ばれる、請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
前記使用説明書がワクチンを受ける個体の免疫調節に関するものである、請求項５２に記載のキット。
【請求項５６】
前記ワクチンが治療ワクチンである、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記ワクチンが予防ワクチンである、請求項５５に記載のキット。
【請求項５８】
前記使用説明書が癌を患っている個体の免疫調節に関するものである、請求項５２に記載のキット。
【請求項５９】
前記使用説明書が感染症を患っている個体の免疫調節に関するものである、請求項５２に記載のキット。
【請求項６０】
前記使用説明書が、感染因子への曝露の危険性がある個体の免疫調節に関するものである、請求項５２に記載のキット。
【請求項６１】
前記使用説明書が、癌の危険性がある個体の免疫調節に関するものである、請求項５２に記載のキット。
【請求項６２】
マイクロキャリヤー（ＭＣ）の中に包み込まれたヌクレオチド３〜６個の長さの免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）を含む免疫調節性組成物。
【請求項６３】
個体の免疫応答を調節するために有効な量のマイクロキャリヤー（ＭＣ）の中に包み込まれたヌクレオチド３〜６個の長さの免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）を当該個体に投与することを含む当該個体の免疫応答を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）を含む免疫調節性組成物およびその使用方法に関する。特に、本発明は、ミクロ粒子に結合した、ヌクレオチド３〜６個の長さのＩＭＯを含む免疫調節性組成物に関する。本発明はまた、免疫応答の少なくとも１面を調節するための、ＩＭＯ／マイクロキャリヤー複合体の投与にも関する。
【背景技術】
【０００２】
感染またはその他の抗原攻撃に対して生じる免疫応答の型は、通常、応答に関与するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞のサブセットによって識別することができる。Ｔｈ１サブセットは遅延型過敏症や細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化のような古典的細胞媒介機能の責任を負うが、Ｔｈ２サブセットはＢ細胞活性化のヘルパーとしてより効果的に機能する。抗原に対する免疫応答の型は、通常、抗原に対して応答する細胞によって産生されたサイトカインによって影響を受ける。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞によって分泌されるサイトカインの違いは、これらの２つのサブセットの異なる生物学的機能を反映すると信じられている。例えば、Romagnani (2000) Ann. Allergy Asthma Immunol. 85:9-18を参照。
【０００３】
Ｔｈ１サブセットは、ＣＴＬを活性化するＩＬ−２やＩＦＮ−γを分泌するので、ウイルス感染症、細胞内病原体および腫瘍細胞に対して応答するのに特に適するかもしれない。ＩＬ−４およびＩＬ−５はＩｇＥ産生および好酸球活性化をそれぞれ誘発することが知られているので、Ｔｈ２サブセットは自由生育細菌および寄生虫に対して応答するのにより適するかもしれないし、アレルギー反応を仲介するかもしれない。一般に、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は別個の型のサイトカインを分泌するので、１つの型の応答は、他の型の応答の活性を緩和することができる。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスのシフトは、例えばアレルギー応答を、またはその代わりに増加したＣＴＬ応答をもたらす場合がある。
【０００４】
結核およびマラリアのような多くの感染症については、Ｔｈ２型応答は感染に対する防御値がほとんどない。潜在的に伝染性の完全なウイルス粒子の使用を避ける、標的抗原および他の現在使用されている抗原物質から誘導された小さなペプチドを用いる、提案されたワクチンは、必ずしも治療効果を達成するのに必要な免疫応答を誘発するとは限らない。治療上有効なヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンの不足は、この欠損の不運な例である。タンパク質を主成分としたワクチンは、典型的には、中和抗体の高い力価によって特徴づけられるが有意な細胞性免疫がない、Ｔｈ２型免疫応答を誘発する。
【０００５】
さらに、ある型の抗体応答は、ある適応には不適当であり、最も顕著にはＩｇＥ抗体応答がアナフィラキシーショックをもたらす場合があるアレルギーには不適当である。通常、アレルギー応答はまたＴｈ２型免疫応答に関与している。アレルギー性喘息の応答を含むアレルギー応答は、アレルゲン暴露の数秒から数分以内に起こり、細胞の脱顆粒によって特徴づけられる初期応答、および４〜２４時間後に起こり、アレルゲン暴露の部位への好酸球の浸潤によって特徴づけられる後期応答によって特徴づけられる。特に、アレルギー応答の初期に、アレルゲンは、好塩基性細胞および肥満細胞の上にＩｇＥ抗体を架橋し、それは次には脱顆粒の引き金となり、それに続いて、肥満細胞および好塩基性細胞からのヒスタミンおよびその他の炎症の伝達物質の放出の引き金となる。後期応答の間に、好酸球はアレルゲン暴露の部位（そこで組織損傷および機能不全が生じる）へ浸潤する。
【０００６】
アレルギー疾患の抗原免疫療法は、少量だが徐々に増加する量の抗原の皮下注射を含む。そのような免疫療法は、ＩｇＥ媒介アナフィラキシーを誘発する危険性を示し、アレルギー性後期応答のサイトカインを媒介とした事象を有効にアドレスしない。今までのところ、この手法はほんの限られた成功しかもたらしていない。
【０００７】
一般に免疫刺激配列すなわち「ＩＳＳ」として知られている、あるＤＮＡ塩基配列の投与は、Ｔｈ１関連サイトカインの分泌によって示されるようなＴｈ１型偏りを持った免疫応答を誘発する。抗原と共に免疫刺激ポリヌクレオチドの投与は、投与された抗原に対してＴｈ１型免疫応答をもたらす。Roman et al. (1997) Nature Med. 3:849-854。例えば、食塩水中のまたはアジュバントミョウバン中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を皮内に注射されたマウスは、特異的なＩｇＧ１およびＩｇＥ抗体、ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌するがＩＦＮ−γを分泌しないＣＤ４＋細胞を産生することによって応答した。これは、そのＴ細胞が主にＴｈ２サブセットのものであったことを示す。しかしながら、β−ＧａｌをコードしＩＳＳを含む（食塩水中の）プラスミドＤＮＡを皮内に（または尖叉皮膚引っ掻き塗布具で）注射されたマウスは、ＩｇＧ２ａ抗体ならびにＩＦＮ−γを分泌するがＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌しないＣＤ４＋細胞を産生することによって応答した。これは、そのＴ細胞が主にＴｈ１サブセットのものであったことを示す。さらに、プラスミドＤＮＡを注射されたマウスによる特異的なＩｇＥの産生は、６６〜７５％減少した。Raz et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5141-5145。一般に、裸のＤＮＡ免疫処置に対する応答は、抗原に刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞による、ＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＩＦＮ−γの産生によって特徴づけられ、それはＴｈ１型応答を示す。これは、減少したＩｇＥ産生によって示されるように、アレルギーおよび喘息の治療において特に重要である。免疫刺激ポリヌクレオチドがＴｈ１型免疫応答を刺激する能力は、細菌抗原、ウイルス抗原およびアレルゲンで実証されている（例えば、国際公開第９８／５５４９５号パンフレット参照。）。
【０００８】
メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、免疫刺激活性を持つことが見いだされた。ＩＳＳオリゴヌクレオチドは、５′−プリン，プリン，シトシン，グアニン，ピリミジン，ピリミジン−３′（５′−ＲＲＣＧＹＹ−３′）のコア六量体配列を含むと記述されてきた。多くの開示は塩基が６個以上の長さのＩＳＳオリゴヌクレオチドに言及している（例えば、国際公開第９７／２８２５９号パンフレット、国際公開第９８／１６２４７号パンフレットおよび国際公開第９９／１１２７５号パンフレット）が、他の報告はＩＳＳが免疫刺激効果を持つためにはヌクレオチドが少なくとも８〜１０個の長さでなければならないと述べている（例えば、Krieg et al. (1995) Nature 374:546-49、および国際公開第０１／５１５００号パンフレット参照。）。国際公開第９６／０２５５５号パンフレットは、最も有効なＩＳＳオリゴヌクレオチドはより大きなオリゴヌクレオチド内に５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′または５′−ＧＡＣＧＴＣ−３′のいずれかを含むと述べている。より最近、国際公開第９８／５２９６２号パンフレットは、３つの六量体オリゴヌクレオチド、５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′および５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′を記述しており、それらは免疫刺激効果を持つと述べている。Ｌｉａｎｇら（J. Clin. Invest. 98:1119-29, 1996）は、モチーフ（ＴＣＧ）ｎ（ここでｎ≧３）はヒト細胞の最小の刺激因子であることを開示している。
【０００９】
ミクロ粒子（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ）に結合したＩＳＳ含有２７塩基オリゴヌクレオチドが、溶液中の同一のオリゴヌクレオチドと同じくらい試験管内の免疫刺激に有効であることがこれまでに示されている（Ｌｉａｎｇら、同書）。金、ラテックスおよび磁性粒子に結合したＩＳＳ含有オリゴヌクレオチドについては、異なる結果が報告されており、これらの物質との複合体は、ＩＳＳ含有オリゴヌクレオチドに応答して増殖する７ＴＤ１細胞の増殖の刺激に活性ではなかった（Manzel et al. (1999) Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9:459-464）。
【００１０】
ＩＳＳについて記述している他の論文には次のものがある。Krieg et al. (1989) J. Immunol. 143:2448-2451、Tokunaga et al. (1992) Microbiol. Immunol. 36:55-66、Kataoka et al. (1992) Jpn. J. Cancer Res. 83:244-247、Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076、Mojcik et al. (1993) Clin. Immuno. and Immunopathol. 67:130-136、Branda et al. (1993) Biochem. Pharmacol. 45:2037-2043、Pisetsky et al. (1994) Life Sci. 54(2):101-107、Yamamoto et al. (1994a) Antisense Research and Development. 4:119-122、Yamamoto et al.(1994b) Jpn. J. Cancer Res. 85:775-779、Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523、Kimura et al. (1994) J. Biochem. (Tokyo) 116:991-994、Pisetsky et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 772:152-163、Pisetsky (1996a) J. Immunol. 156:421-423、Pisetsky (1996b) Immunity 5:303-310、Zhao et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 51:173-182、Yi et al. (1996) J. Immunol. 156:558-564、Krieg (1996) Trends Microbiol. 4(2):73-76、Krieg et al. (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6:133-139、Klinman et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:2879-2883、Raz et al. (1996)、Sato et al. (1996) Science 273:352-354、Stacey et al. (1996) J. Immunol. 157:2116-2122、Ballas et al. (1996) J. Immunol. 157:1840-1845、Branda et al. (1996) J. Lab. Clin. Med. 128:329-338、Sonehara et al. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:799-803、Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158:3635-3639、Sparwasser et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1671-1679、Roman et al. (1997)、Carson et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1621-1622、Chace et al. (1997) Clin. Immunol. and Immunopathol. 84:185-193、Chu et al. (1, 997) J. Exp. Med. 186:1623-1631、Lipford et al. (1997a) Eur. J. Immunol. 27:2340-2344、Lipford et al. (1997b) Eur. J. Immunol. 27:3420-3426、Weiner et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10833-10837、Macfarlane et al. (1997) Immunology 91:586-593、Schwartz et al. (1997) J. Clin. Invest. 100:68-73、Stein et al. (1997) Antisense Technology, Ch. 11 pp. 241-264, C. Lichtenstein and W. Nellen, Eds., IRL Press、Wooldridge et al. (1997) Blood 89:2994-2998、Leclerc et al. (1997) Cell. Immunol. 179:97-106、Kline et al. (1997) J. Invest. Med. 45(3):282A、Yi et al. (1998a) J. Immunol. 160:1240-1245、Yi et al. (1998b) J. Immunol. 160:4755-4761、Yi et al. (1998c) J. Immunol. 160:5898-5906、Yi et al. (1998d) J. Immunol. 161:4493-4497、Krieg (1998) Applied Antisense Oligonucleotide Technology Ch. 24, pp. 431-448, C.A. Stein and A.M. Krieg, Eds., Wiley-Liss, Inc.、Krieg et al. (1998a) Trends Microbiol. 6:23-27、Krieg et al. (1998b) J. Immunol. 161:2428-2434、Krieg et al. (1998c) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12631-12636、Spiegelberg et al. (1998) Allergy 53(45S):93-97、Horner et al. (1998) Cell Immunol. 190:77-82、Jakob et al. (1998) J. Immunol. 161:3042-3049、Redford et al. (1998) J. Immunol. 161:3930-3935、Weeratna et al. (1998) Antisense & Nucleic Acid Drug Development 8:351-356、McCluskie et al. (1998) J. Immunol. 161(9):4463-4466、Gramzinski et al. (1998) Mol. Med. 4:109-118、Liu et al. (1998) Blood 92:3730-3736、Moldoveanu et al. (1998) Vaccine 16:1216-1224、Brazolot Milan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15553-15558、Briode et al. (1998) J. Immunol. 161:7054-7062、Briode et al. (1999) Int. Arch. Allergy Immunol. 118:453-456、Kovarik et al. (1999) J. Immunol. 162:1611-1617、Spiegelberg et al. (1999) Pediatr. Pulmonol. Suppl. 18:118-121、Martin-Orozco et al. (1999) Int. Immunol. 11:1111-1118、欧州特許第４６８５２０号明細書、国際公開第９６／０２５５５号パンフレット、国際公開第９７／２８２５９号パンフレット、国際公開第９８／１６２４７号パンフレット、国際公開第９８／１８８１０号パンフレット、国際公開第９８／３７９１９号パンフレット、国際公開第９８／４０１００号パンフレット、国際公開第９８／５２５８１号パンフレット、国際公開第９８／５５４９５号パンフレット、国際公開第９８／５���６０９号パンフレットおよび国際公開第９９／１１２７５号パンフレット。また、Elkins et al. (1999) J. Immunol. 162:2291-2298、国際公開第９８／５２９６２号パンフレット、国際公開第９９／３３４８８号パンフレット、国際公開第９９／３３８６８号パンフレット、国際公開第９９／５１２５９号パンフレットおよび国際公開第９９／６２９２３号パンフレットも参照。また、Zimmermann et al.(1998) J. Immunol. 160:3627-3630、Krieg (1999) Trends Microbiol. 7:64-65、米国特許第５，６６３，１５３号明細書、米国特許第５，７２３，３３５号明細書、米国特許第５，８４９，７１９号明細書および米国特許第６，１７４，８７２号明細書も参照。また、国際公開第９９／５６７５５号パンフレット、国際公開第００／０６５８８号パンフレット、国際公開第００／１６８０４号パンフレット、国際公開第００／２１５５６号パンフレット、国際公開第００／６７０２３号パンフレットおよび国際公開第０１／１２２２３号パンフレットも参照。また、国際公開第００／５４８０３号パンフレット、国際公開第００／６１１６１号パンフレット、国際公開第０１／１５７２６号パンフレット、国際公開第０１／２２９７２号パンフレット、国際公開第０１／２２９９０号パンフレット、国際公開第０１／３５９９１号パンフレット、国際公開第０１／５１５００号パンフレット、国際公開第０１／５４７２０号パンフレット、米国特許第６，１９４，３８８号明細書、米国特許第６，２０７，６４６号明細書、米国特許第６，２１４，８０６号明細書、および米国特許第６，２３９，１１６号明細書、ならびにVerthelyi et al. (2001) J. Immunol. 166:2372-2377も参照。
【００１１】
さらに、Godard et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:404-410は、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）ナノ粒子に結合したコレステロール修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。
【００１２】
ここに引用された特許、特許出願および刊行物はすべて、その全体が引用によってここに含まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、個体、特にヒトの個体の免疫応答を調節するための新規の組成物および方法に関する。
【００１４】
１つの側面において、本発明は、免疫調節性オリゴヌクレオチド／マイクロキャリヤー（ＩＭＯ／ＭＣ）複合体および被包体（encapsulates）を含む組成物に関する。ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、式５′−Ｘ１ＣＧＸ２−３′に従う配列（ここで、Ｘ１は０〜４個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜４個のヌクレオチドであり、配列５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′を除く。）を有する三量体、四量体、五量体または六量体（３〜６量体）の免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）を含む。好ましくは、ＩＭＯは、不溶性マイクロキャリヤー（ＭＣ）（生分解性でもよいし非生分解性でもよい。）に結合した、式５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′または５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′に従う配列（ここで、Ｘ１は０〜２個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドである。）を有する３〜６量体である。より好ましくは、本発明のＩＭＯ／ＭＣ複合体および被包体は配列５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′または５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０または１個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドであり、ＩＭＯはヌクレオチド６個より長くない。）を有するＩＭＯを含む。ある実施態様においては、複合体または被包体は、ヌクレオチド６個より長いオリゴヌクレオチドを含まない。ＩＭＯは、複合体中でマイクロキャリヤーに共有結合で結合していてもよいし、非共有結合で結合していてもよい。そして、ＩＭＯは複合体形成を容易にするために修飾されていてもよい。ＩＭＯ／ＭＣ複合体に用いられるマイクロキャリヤーは、液相マイクロキャリヤー（例えば重合体または油、好ましくは生分解性重合体または油を含む水中油型乳濁液）も考えられるが、典型的には固相マイクロキャリヤーである。マイクロキャリヤーは、通常、約１５０μｍ、１２０μｍまたは１００μｍ未満の大きさであり、より普通には約５０〜６０μｍ未満の大きさであり、約１０ｎｍ〜約１０μｍ、または約２５ｎｍ〜５μｍの大きさでもよい。ある実施態様においては、本発明の組成物はＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体、および薬理学的に許容される賦形剤を含む。ある実施態様においては、本発明の組成物は、抗原なしのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体、すなわち抗原に直接または間接的に結合していないＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含む。
【００１５】
別の側面において、本発明は、個体の免疫応答を調節するのに十分な量のＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を個体に投与することからなる、個体の免疫応答を調節する方法に関する。本発明の方法による免疫調節は、Ｔｈ２型免疫応答に関連した疾患（例えばアレルギーまたはアレルギー誘発喘息）を患っている個体、治療ワクチン（例えばアレルギーエピトープ、ミコバクテリアエピトープまたは腫瘍関連エピトープを含むワクチン）または予防ワクチンのようなワクチンを受ける個体、癌を患っている個体、感染症を患っている個体、および感染因子への曝露の危険性がある個体などの個体の診療において行うことができる。
【００１６】
さらなる側面において、本発明は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の有効量を個体に投与することからなる、個体のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を増加させる方法に関する。本発明に従うＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与は、個体のＩＦＮ−γを増加させる。これらの方法に適している被検者には、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、強皮症、皮膚の放射線誘発線維症、住血吸虫症誘発肝線維症を含む肝線維症、腎線維症の個体のほか、ＩＦＮ−γの投与によって改善されるかもしれない他の状態にある個体が含まれる。
【００１７】
別の側面において、本発明は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の有効量を個体に投与することからなる、個体のＩＦＮ−αを増加させる方法に関する。本発明に従うＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与は、個体のＩＦＮ−α値を増加させる。これらの方法に適している被検者には、ウイルス感染および癌を含むＩＦＮ−αの投与に応答する疾患がある個体が含まれる。
【００１８】
別の側面において、本発明は、感染症を患っている個体にＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の有効量を投与することからなる、感染症の１つまたはそれ以上の症状を改善する方法に関する。本発明に従うＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与は、感染症の１つまたはそれ以上の症状を改善する。本発明に従って治療することができる感染症には、細胞病原体によって引き起こされる感染症（例えば、ミコバクテリア症、マラリア、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、住血吸虫症または肝吸虫症）があり、ウイルス病を含んでもよいし、除いてもよい。
【００１９】
本発明は、さらに、本発明の方法を実行するためのキットに関する。本発明のキットは、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含む容器からなり、また、例えば、個体がＴｈ２型免疫応答に関連する疾患（例えばアレルギーまたはアレルギー誘発喘息）を患っているとき、治療ワクチン（例えば、アレルギーエピトープ、ミコバクテリアエピトープまたは腫瘍関連エピトープを含むワクチン）または予防ワクチンのようなワクチンを受けるとき、癌を患っているとき、感染症を患っているとき、または感染因子への曝露の危険性があるとき、個体の免疫調節にＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を使用するための使用説明書も含んでいてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
我々は、個体、特にヒトの個体の免疫応答を調節するための新規の組成物および方法を発見した。本発明の組成物は、不溶性マイクロキャリヤー（ＭＣ）と複合体を形成した、またはＭＣの中に包み込まれた免疫調節性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ）を含む。免疫調節性オリゴヌクレオチドが有効であるためには少なくともヌクレオチド８個の長さでなければならないと述べている先行技術の教示に反して、我々は、塩基３〜６個の長さのＩＭＯが、マイクロキャリヤーと組み合わせたときに、ヒト細胞を含む免疫細胞を調節することを見いだした。本発明のＩＭＯは、３〜６量体であり、式５′−Ｘ１ＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０〜４個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜４個のヌクレオチドである。）に従う配列（ただし、配列５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′を除く。）を有する。好ましくは、ＩＭＯは、不溶性マイクロキャリヤー（ＭＣ）に結合した、式５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′または５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０〜２個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドである。）に従う配列を有する３〜６量体である。より好ましくは、本発明のＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、配列５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′または５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′を有するＩＭＯ（ここで、Ｘ１は０または１個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドであり、ＩＭＯはヌクレオチド６個より長くない。）を含む。他の好ましい実施態様において、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は配列５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′または５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′を有するＩＭＯ（ここで、Ｘ１は０または１個のヌクレオチド、Ｘ２は２〜３個のヌクレオチドであり、ＩＭＯはヌクレオチド６個より長くない。）を含む。
【００２１】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、抗原を含んでもよいし、抗原を除いてもよい。ある実施態様において、本発明は、抗原なしのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体、すなわち抗原に（直接または間接的に）結合しておらず、抗原と混合されてもいないＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含む組成物を提供する。他の実施態様において、本発明は、１つまたはそれ以上の抗原と混合されたＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含む組成物を提供する。他の実施態様において、本発明は、抗原に結合したＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含む組成物を提供する。
【００２２】
本発明の免疫調節性オリゴヌクレオチド／マイクロキャリヤー（ＩＭＯ／ＭＣ）複合体は、共有結合で結合していてもよいし、非共有結合で結合していてもよく、水に不溶のマイクロキャリヤー（例えば約１５０μｍ未満の大きさの水不溶性キャリヤー）を含む。マイクロキャリヤーは生分解性でもよいし、非生分解性でもよく、液相マイクロキャリヤー（例えば生分解性重合体または油、好ましくは生分解性重合体または油を含む水中油型乳濁液）も有用であるが、一般には固相（例えばポリ乳酸ビーズ）である。ＩＭＯは、ＭＣへの結合を可能にしまたは増大するために、（例えば共有結合架橋のための遊離スルフヒドリルの組み入れまたは疎水結合のためにコレステロールのような疎水基の付加により）修飾してもよい。
【００２３】
本発明は、共有結合のＩＭＯ／ＭＣ複合体を形成するためのマイクロキャリヤーに共有結合で結合したＩＭＯを含む新規の組成物を提供する。ＩＭＯとＭＣの間の結合は（例えばＩＭＯとＭＣの上のスルフヒドリル間のジスルフィド結合によって）直接的であってもよいし、または、それらの成分が、ＩＭＯとＭＣへの結合を分離する１つまたはそれ以上の原子の架橋基によって結合していてもよい。
【００２４】
また、非共有結合のＩＭＯ／ＭＣ複合体を提供するためのマイクロキャリヤーに非共有結合で結合したＩＭＯを含む組成物も提供される。本来のＩＭＯの性質がマイクロキャリヤーに結合するために用いられてもよい（例えば陽イオン性ポリ（乳酸・グリコール酸）共重合体のような陽イオン性マイクロキャリヤーへの静電結合）が、非共有結合のＩＭＯ／ＭＣ複合体は一般に（例えば油または脂質を主成分としたマイクロキャリヤーへの疎水結合を可能にするためにＩＭＯへのコレステロール基の添加により）マイクロキャリヤーへの結合を可能にするために修飾されたＩＭＯを含む。
【００２５】
本発明は、また、個体にＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を投与することによって個体の免疫応答を調節する方法を提供する。
【００２６】
さらに、本発明の方法を実施するためのキットが提供される。キットは、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含む包装または容器からなり、被検者の免疫調節のためにＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を投与するための使用説明書もまた含んでいてもよい。
【００２７】
一般的手法
本発明の実施は、別段の明示がない限り、従来技術の範疇にある分子生物学（組み換え技術を含む。）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の手法を用いるであろう。そのような手法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989)、Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)、Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)、Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987)、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)、PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)、Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)、The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994)、Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996)、およびMethods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, and N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)のような文献に十分に説明されている。
【００２８】
定義
ここで使用するときは、単数形（ａ、ａｎ、ｔｈｅ）は、別段の明示がない限り、複数の場合をも含む。例えば、ＩＭＯは１つまたはそれ以上のＩＭＯをも意味する。
【００２９】
ここで使用するときは、用語「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、修飾されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドまたはそれらの組合わせを含む。オリゴヌクレオチドは、線状にまたは環状に配列することができる。ホスホロチオ酸エステルのような交互の結合がオリゴヌクレオチドにおいて排他的にまたは燐酸ジエステル結合と組み合わせて用いられてもよいが、オリゴヌクレオチドは一般に燐酸ジエステル結合を介して結合されたヌクレオシドの重合体である。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン（アデニンもしくはグアニン、またはそれらの誘導体、例えばイノシン）またはピリミジン（チミン、シトシンもしくはウラシル、またはそれらの誘導体）塩基からなる。ＤＮＡ中の４個のヌクレオシド単位（または塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと呼ばれる。さらに、デオキシイノシンおよびデオキシウリジンはＤＮＡの中に組み入れられてもよい。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００３０】
用語「免疫調節性オリゴヌクレオチド」と「ＩＭＯ」は、ここで使用するときは、交換可能であり、マイクロキャリヤーに結合したときは、試験管内、生体内および／または生体外で測定したときに測定可能な免疫応答をもたらす（すなわちマイクロキャリヤーと複合体を形成するか、マイクロキャリヤーの中に包み込まれたときに活性である）配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。測定可能な免疫応答の例としては、抗原特異抗体産生、サイトカインの分泌、ならびにＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球およびＢリンパ球のようなリンパ球母集団の活性化または拡大などが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、ＩＭＯ配列は優先的にＴｈ１型応答を活性化する。ＩＭＯは、配列５′−Ｘ１ＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０〜４個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜４個のヌクレオチドであり、配列５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′を除く。）を有する３〜６量体オリゴヌクレオチドである。
【００３１】
句「ＩＭＯのコア三量体のシトシン」とは、配列式５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′および５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０〜２個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜４個のヌクレオチドである。）に適合するＩＭＯのコア三量体５′−ＴＣＧ−３′または５′−ＵＣＧ−３′のシトシンをいう。この構造式から明らかなように、ＩＭＯ  ５′−ＴＣＧＴＣＧ−３′の「コア三量体のシトシン」は、位置２（例えば５′端から二番目の塩基）に入っている。
【００３２】
用語「マイクロキャリヤー」とは、水に不溶であって、約１５０、１２０、１００μｍ未満、または約５０〜６０μｍ未満、好ましくは約１０、５、２．５、２または１．５μｍ未満の大きさの粒状の組成物をいう。マイクロキャリヤーは、約１μｍ未満、好ましくは約５００ｎｍ未満の大きさのマイクロキャリヤーである「ナノキャリヤー」を含む。固相マイクロキャリヤーは、生物学的適合性天然重合体、合成重合体または合成共重合体から形成された粒子であってもよく、アガロースまたは架橋アガロースのほか当技術分野において知られている他の物質から形成されたマイクロキャリヤーを含んでもよいし除外してもよい。本発明で使用されるマイクロキャリヤーは生分解性であってもよいし、非生分解性であってもよい。生分解性の固相マイクロキャリヤーは、哺乳動物の生理学的条件下で分解性（例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそれらの共重合体）、侵食性（例えば、３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン（ＤＥＴＯＳＵ）、マロン酸ポリメチリデンのようなポリ（オルト）エステル、またはセバシン酸のポリ無水物のようなポリ無水物）の重合体から形成してもよい。非生分解性のマイクロキャリヤーは、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ラテックスおよびデキストランを含む有機重合体、シリカ、ヒドロキシアパタイト、ミョウバンおよびリン酸カルシウムのような無機結晶性物質、さらにセラミックス、金、強磁性体および常磁性体を含む無機物質のような、哺乳動物の生理学的条件下で非侵食性および／または非分解性の物質から形成することができる。マイクロキャリヤーは、（例えば油または脂質を主成分とする）液相であってもよく、例えば、リポソーム、抗原なしのＩＳＣＯＭ（コレステロール、リン脂質およびアジュバント活性サポニンの安定な複合体である免疫刺激複合体）、または水中油型もしくは油中水型乳濁液の中に見いだされる小滴またはミセルが挙げられるが、その液相マイクロキャリヤーは生分解性であることが前提である。生分解性液相マイクロキャリヤーは典型的には生分解性油を含む。生分解性油は当技術分野において数多く知られており、その中にはスクアレンおよび植物油がある。マイクロキャリヤーは、典型的には球形であるが、球形からはずれたマイクロキャリヤーも許容される（例えば、楕円体、棒状など）。それらの（水に）溶けない性質のために、マイクロキャリヤーは水および水系（水性）溶液から濾過可能である。
【００３３】
マイクロキャリヤーの「寸法」は、一般に、メーカーによって認定された粒子の「設計寸法」または意図した寸法である。寸法は、平均または最大部直径のような直接測定される大きさでもよいし、またはろ過スクリーニング分析のような間接測定法によって決定してもよい。マイクロキャリヤー寸法の直接測定は、典型的には、顕微鏡、一般には光学顕微鏡または走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって、既知の寸法の粒子と比較してまたは１マイクロメートルを参照して実行される。寸法の小さな変動が製造工程中に発生するので、もしマイクロキャリヤーが公称測定値の±約５〜１０％であることを測定値が示せば、マイクロキャリヤーは公称寸法であると見なされる。寸法特性は、動的光散乱または暗黒化法（obscuration techniques）によって決定することもできる。交替に、マイクロキャリヤー寸法はろ過スクリーニング分析によって決定することもできる。もし粒子の少なくとも９７％が公称寸法の「スクリーン型」フィルター（すなわち、保持された粒子がフィルターの中にひっかかる「デプスフィルタ」とは対照的に、ポリカーボネートまたはポリエーテルスルフォンフィルターのような、保持された粒子がフィルターの表面上にあるフィルター）を通り抜ければ、マイクロキャリヤーは公称寸法未満である。もしマイクロキャリヤー粒子の少なくとも約９７％が、公称寸法のスクリーン型フィルターによって保持されるならば、マイクロキャリヤーは公称寸法より大きい。したがって、約１０μｍ〜約１０ｎｍの大きさのマイクロキャリヤーの少なくとも約９７％は、１０μｍの細孔スクリーンフィルターを通り抜け、１０ｎｍのスクリーンフィルターに保持される。
【００３４】
上記の議論が示すように、マイクロキャリヤーの寸法または寸法範囲に対する言及は、暗黙に、公称寸法および／または寸法範囲の近似の変動および近似値を含む。これは、寸法および／または寸法範囲に言及するとき、用語「約」の使用によって反映される。そして、「約」に関係なく寸法または寸法範囲の言及は、寸法および／または寸法範囲が正確であることを意味しない。
【００３５】
マイクロキャリヤーが通常の哺乳動物の生理学的条件下で分解性または侵食性であるならば、マイクロキャリヤーは「生分解性である」と見なされる。一般に、マイクロキャリヤーが正常ヒト血清中に３７℃で７２時間温置したあと分解する（すなわちその質量および／または平均重合体長さの少なくとも５％を失う）ならば、マイクロキャリヤーは生分解性であると見なされる。したがって、そして逆に、マイクロキャリヤーが通常の哺乳動物の生理学的条件下で分解も侵食もしなければ、マイクロキャリヤーは「非生分解性である」と見なされる。一般に、マイクロキャリヤーが正常ヒト血清中に３７℃で７２時間温置後分解しない（すなわちその質量および／または平均重合体長さの５％未満を失う）ならば、マイクロキャリヤーは非生分解性であると見なされる。
【００３６】
用語「免疫調節性オリゴヌクレオチド／マイクロキャリヤー複合体」または「ＩＭＯ／ＭＣ複合体」とは、本発明のＩＭＯとマイクロキャリヤーの複合体（ただしＩＭＯはＭＣの中に包み込まれていない）をいう。複合体の成分は、共有結合で結合していてもよいし、非共有結合で結合していてもよい。非共有結合は、いかなる非共有結合力によって仲介されてもよい。非共有結合力には、例えば、疎水的相互作用、イオン（静電）結合、水素結合および／またはファンデルワールス引力がある。疎水結合の場合には、その結合は、一般に、ＩＭＯに共有結合で結合した疎水基（例えばコレステロール）を介して行われる。好ましくは、ＩＭＯ／ＭＣ複合体は純水に溶けない。
【００３７】
用語「免疫調節性」または「免疫応答を調節する」とは、ここで使用するときは、免疫抑制効果のみならず免疫刺激効果も含む。免疫調節と共に定量的変化も起こるかもしれないが、免疫調節は主として全免疫応答における質的変化である。本発明に従って免疫調節される免疫応答の例は、「Ｔｈ２型」免疫応答とは対照的に、「Ｔｈ１型」免疫応答の方へシフトしたものである。Ｔｈ２型応答は一般に「体液の」または抗体ベースであるが、Ｔｈ１型応答は典型的には細胞免疫系（例えば細胞傷害性リンパ球）応答と見なされる。Ｔｈ１型免疫応答は、通常、抗原に対する「遅延型過敏症」反応によって特徴づけられ、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６に加えてＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−βのようなＴｈ１関連サイトカインの増加したレベルによって生化学レベルで検出することができる（ＩＬ−６はＴｈ２型応答にも同様に関連しているかもしれないが）。Ｔｈ１型免疫応答は、一般に細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の産生に関連している。Ｔｈ２型免疫応答は、一般に、より高いレベルの抗体産生に関連しており、その抗体産生には、ＩＬ−４のようなＴｈ２関連サイトカインの発現に加えて、ＩｇＥ産生、最小限のＣＴＬ産生の欠如が含まれる。したがって、本発明に従う免疫調節は、例えば、治療をしないときと比較して、本発明の方法に従って治療した個体のＩＦＮ−γの増加および／またはＩｇＥ産生の減少によって認識することができる。
【００３８】
用語「抱合体」とは、その中のＩＭＯ、ＭＣおよび／またはＩＭＯ／ＭＣ複合体が（ＩＭＯもしくはＭＣのいずれかを介して、またはその両方を介して）抗原に結合している複合体をいう。そのような抱合体結合は共有結合および／または非共有結合を含む。その結合は、直接（例えばＩＭＯの１つまたはそれ以上の原子と抗原の１つまたはそれ以上の原子の間の結合）であってもよいし、抱合体パートナー（例えば、ＩＭＯと抗原、またはＭＣと抗原）に結合する基を含み、それによって（例えば、ＩＭＯと抗原の間の高い親和力の結合を形成するのを可能にするためにビオチンやアビジンを使用することによって、またはスペーサーアームを含む架橋剤を使用することによって）抱合体パートナーを結合するリンカーアームを介してでもよい。
【００３９】
用語「抗原」とは、抗体によって、またはＴ細胞抗原受容体によって特異的に認識され結合される物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、複合糖質、糖、ガングリオシド、脂質およびリン脂質、それらの部分およびそれらの組合わせを含むことができる。抗原は自然界に見いだされるものでもよいし、合成されたものでもよい。本発明のＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体と一緒に投与するのに適する抗原は、Ｂ細胞またはＴ細胞抗原に特異な応答を誘発し得るいかなる分子をも含む。抗原は、好ましくは、その抗原に特異な抗体反応を誘発する。ハプテンは「抗原」の範囲内に含まれる。ハプテンは、単独では免疫原でないが、抗原決定基を含む免疫原分子と抱合したとき免疫原になる低分子量化合物である。小さな分子は、抗原性にするために、ハプテン化する必要があるかもしれない。好ましくは、本発明の抗原は、ペプチド、脂質（例えばステロール、脂肪酸およびリン脂質）、ヘモフィルスインフルエンザワクチンに使用されるような多糖、ガングリオシドおよび糖タンパク質を含んでいる。
【００４０】
「アジュバント」とは、抗原のような免疫原物質に加えられたとき、その混合物への曝露に際して受容者宿主のその物質に対する免疫応答を非特異的に高めまたは強める物質をいう。
【００４１】
用語「ペプチド」とは、そのペプチドがハプテンであろうとなかろうと、生体応答、例えば抗体産生またはサイトカイン活性をもたらすのに十分な長さおよび組成物のポリペプチドをいう。典型的には、ペプチドは、長さが少なくとも６個のアミノ酸残基である。用語「ペプチド」とは、さらに、修飾アミノ酸（天然に見いだされようと天然に見いだされまいと）も含み、その修飾としては燐酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化およびメチル化が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４２】
「抗原性ペプチド」は、精製された天然ペプチド、合成ペプチド、組換えペプチド、粗ペプチド抽出物、または（弱毒化または不活性化されたウイルス、細胞または微生物の一部分であるペプチドのような）部分的に精製されたもしくは未精製の活性状態のペプチド、またはそのようなペプチドの断片を含むことができる。「抗原性ペプチド」または「抗原ポリペプチド」は、したがって、１つまたはそれ以上の抗原性を示すポリペプチドの全体または部分を意味する。したがって、例えば「Ａｍｂ  ａ  １抗原性ポリペプチド」または「Ａｍｂ  ａ  １ポリペプチド抗原」は、抗原性を示す（すなわち抗体またはＴ細胞受容体に特異的に結合する）Ａｍｂ  ａ  １からのアミノ酸配列（その全配列、その配列の一部分および／またはその配列の修飾）である。
【００４３】
「配達分子」または「配達手段」は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を特定の部位へおよび／または特定のタイミングで配達するのを容易にし、可能にしおよび／または増強する化学基である。配達手段は、さらに、免疫応答を刺激してもよいし、刺激しなくてもよい。
【００４４】
「抗原に対するアレルギー応答」は、一般に好酸球および／または抗原特異性ＩｇＥの生成およびそれらの結果として生ずる効果によって特徴づけられる免疫応答を意味する。当技術分野においてよく知られているように、ＩｇＥは、肥満細胞および好塩基性細胞の上のＩｇＥ受容体に結合する。ＩｇＥによって認識される抗原への後の暴露に際して、抗原は、肥満細胞および好塩基性細胞の上のＩｇＥを架橋し、これらの細胞の脱顆粒を引き起こす（脱顆粒は、ヒスタミン放出を含むが、それに限定されない。）。用語「抗原に対するアレルギー応答」、「アレルギー」および「アレルギー状態」は、本発明方法のいくつかの適用に等しく適することは理解され意図される。さらに、本発明の方法が先在するアレルギー状態の治療と同様にアレルギー応答の予防にも等しく適するものを含むことは理解され意図される。
【００４５】
ここで使用するときは、用語「アレルゲン」は、被検者に暴露したときにアレルギー応答を誘発する、抗原または分子（通常、タンパク質）の抗原性部分を意味する。典型的には、被検者は、例えば膨疹・潮紅試験または当技術分野において知られている任意の方法によって指摘されるようなアレルゲンに対しアレルギー性である。分子は、たとえその分子に暴露した際に被検者のほんの小さな部分集合だけがアレルギー性（例えばＩｇＥ）免疫応答を示したとしても、アレルゲンであると言われる。多くの単離されたアレルゲンが、当技術分野において知られている。これらには、本願の表１に掲載されたものが含まれるが、それらに限定されない。
【００４６】
用語「脱感作」とは、被検者が感受性を示したアレルゲンの用量を増加させる投与のプロセスをいう。脱感作に使用されるアレルゲン用量の例は当技術分野において知られている（例えば、Fornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111-127参照）。
【００４７】
「抗原特異免疫療法」とは、抗原を含み、免疫応答の抗原特異調節を生じさせる免疫療法の任意の形をいう。アレルギーの情況においては、抗原特異免疫療法は脱感作療法を含むが、それに限定されない。
【００４８】
「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜、スポーツ動物、げっ歯動物およびペットが含まれるが、それらに限定されない。また、脊椎動物には、鳥（すなわち鳥類の個体）および爬虫類（すなわち爬虫類の個体）も含まれるが、それらに限定されない。
【００４９】
個体が特定の疾患にかかる可能性が増加した状態にあれば、個体がその疾患にかかる「危険性がある」と見なされる。感染症に関しては、個体が（例えば感染個体との接近した関係によって）疾病を引き起こす病原体に暴露されるか、または（例えば、マラリアが地方病である地域のような病原体が蔓延している場所に旅行しまたは居住することによって）疾病を引き起こす病原体に暴露される危険性が高ければ、その個体は危険性がある。個体の遺伝または環境がその個体の無感染疾病（例えば癌、喘息、アレルギー）に罹る危険性を一般住民が罹る危険性の少なくとも２倍に増加させるとき、その個体はその無感染疾病の危険性がある。無感染疾患の危険性がある個体の例としては、ＢＲＣＡ１突然変異を持った女性（乳癌）、ＦＰＣ突然変異を持った個体（結腸癌）、肺癌を持った少なくとも１人の一親等親族を持つ個体、およびアレルギーを持った少なくとも１人の一親等親族を持つ個体（アレルギー）が挙げられる。
【００５０】
物質の「有効量」または「十分な量」とは、臨床の結果を含む有益な結果または望まれる結果をもたらすのに十分な量であり、そのため、「有効量」はそれが適用される情況に依存する。抗原に対する免疫応答を調節する組成物を投与する情況においては、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の有効量は、抗原が単独で投与されるときに得られた免疫応答と比較して、そのような調節を達成するのに十分な量である。有効量は１回またはそれ以上の投与で投与することができる。
【００５１】
用語「共投与」とは、ここで使用するときは、免疫応答を調節するために十分に近い時間内に少なくとも２つの異なる物質の投与をいう。好ましくは、共投与は、少なくとも２つの異なる物質の同時投与をいう。
【００５２】
Ｔｈ１応答のような免疫応答の「刺激」とは、応答の増加を意味し、それは応答の誘発および／または増強から生じ得る。
【００５３】
「ＩｇＥ関連疾患」とは、ひとつには、高いＩｇＥ値（それは持続性であってもいし持続性でなくてもよい。）によって特徴づけられる生理学的状態である。ＩｇＥ関連疾患には、アレルギー、およびアレルギー反応、（下記の）アレルギー関連疾患、喘息、鼻炎、結膜炎、蕁麻疹、ショック、膜翅類刺創アレルギー、薬物アレルギーおよび寄生虫病が含まれるが、それらに限定されない。その用語はこれらの疾患の関連する発現をも含む。一般に、そのような疾患におけるＩｇＥは抗原特異性である。
【００５４】
「アレルギー関連疾患」とは、抗原特異性ＩｇＥ免疫応答の効果から生じる疾患を意味する。そのような効果には、低血圧およびショックが含まれ得るが、それに限定されない。アナフィラキシーは、その間に循環の中に放出されたヒスタミンが、結果として生ずる循環からの血漿の著しい損失を伴う毛細管の浸透性の増加と同様に、血管拡張も引き起こす、アレルギー関連疾患の例である。アナフィラキシーは、全身に感じられる関連効果を伴って全身に起こることもあるし、特定の標的組織または器官に限られた反応を伴って局所的に起こることもある。
【００５５】
用語「ウイルス病」は、ここで使用するときは、その病因因子としてウイルスを持つ疾病をいう。ウイルス病の例としては、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群（エイズ）および帯状疱疹が挙げられる。
【００５６】
ここで使用されるときは、そして当技術分野において十分に理解されているように、「治療」とは、臨床の結果を含む有益な結果または望まれる結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益なまたは望まれる臨床結果には、検出できるか検出できないかにかかわらず、１つまたはそれ以上の症状の緩和もしくは改善、疾病の範囲の減少、安定した（すなわち悪化しない）疾病の状態、疾病の蔓延の防止、疾患進行を遅らせまたは遅くすること、疾病状態の改善または緩和、および寛解（部分的であろうと全体的であろうと）が含まれるが、それらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けなかったときに予想される生存と比較して生存を延長することも意味し得る。
【００５７】
疾病または疾患を「緩和する」とは、疾患または疾病状態の範囲および／または望ましくない臨床症状が減少すること、および／または、疾患を治療しない場合と比較して、その進行の時間的経過を遅くしまたは長くすることを意味する。特に、アレルギーの情況においては、当業者にはよく理解されているように、緩和は、アレルゲンに対する免疫応答の調節の際に起こるかもしれない。さらに、緩和は、１回分の服用量の投与では必ずしも起こらないが、連続する複数回の服用量の投与でしばしば起こる。したがって、応答または疾患を緩和するのに十分な量は、１回またはそれ以上の投与で投与してもよい。
【００５８】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体によって「誘発」される「抗体力価」または「抗体の量」は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与の後のある時点において測定された所与の抗体の量をいう。
【００５９】
「Ｔｈ１関連抗体」とは、その産生および／または増加がＴｈ１免疫応答に関連している抗体である。例えば、ＩｇＧ２ａはマウスのＴｈ１関連抗体である。本発明の目的のためには、Ｔｈ１関連抗体の測定は１つまたはそれ以上のそのような抗体の測定であってもよい。例えば、ヒトにおいては、Ｔｈ１関連抗体の測定は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３の測定を伴うかもしれない。
【００６０】
「Ｔｈ２関連抗体」とは、その産生および／または増加がＴｈ２免疫応答に関連している抗体である。例えば、ＩｇＧ１はマウスのＴｈ２関連抗体である。本発明の目的のためには、Ｔｈ２関連抗体の測定は１つまたはそれ以上のそのような抗体の測定であってもよい。例えば、ヒトにおいては、Ｔｈ２関連抗体の測定は、ＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４の測定を伴うかもしれない。
【００６１】
サイトカイン産生、抗体産生またはヒスタミン放出のような機能または活性を「抑える」または「抑制する」とは、関心のある状態またはパラメーターを除いて他の点では同一の状態と比較したとき、またはその代わりに別の状態と比較して、機能または活性を減じることである。例えば、抗原と一緒に投与されたまたは抗原を含むＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、例えば抗原単独で誘発されたヒスタミン放出と比較して、ヒスタミン放出を抑制しまたはヒスタミン放出を減じる。
【００６２】
ここで使用するときは、用語「含む（comprising）」およびその同語族の語は、それらの包括的な意味で使用される、すなわち、用語「含む（including）」およびその対応する同語族の語と同義である。
【００６３】
本明細書においては、ヌクレオチド配列の塩基を示すために単一の文字を使用する。ここで、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、Ｕはウラシル、Ｉはイノシン、Ｒはプリン、そしてＹはピリミジンである。
【００６４】
本発明の組成物
本発明は個体の免疫応答を調節するための新規の組成物を提供する。その新規の組成物は、マイクロキャリヤーと複合体を形成されたまたはマイクロキャリヤーの内部に包み込まれた免疫調節性オリゴヌクレオチドを含む免疫調節性オリゴヌクレオチド／マイクロキャリヤー（ＩＭＯ／ＭＣ）複合体または被包体である。ＩＭＯ／ＭＣ複合体は、複合体のＩＭＯ部分が直接またはリンカーを介して（すなわち間接的に）ＭＣに共有結合で結合した共有結合型複合体であってもよいし、直接または間接の非共有結合型複合体であってもよい。
【００６５】
免疫調節性オリゴヌクレオチド
本発明に従えば、免疫調節性オリゴヌクレオチドは配列５′−Ｘ１ＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０〜４個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜４個のヌクレオチドであり、配列５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′、５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′を除く。）を有する３〜６量体である。好ましくは、ＩＭＯは、配列５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′または５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０〜２個のヌクレオチド、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドである。）を含む３〜６量体、より好ましくは五量体または六量体である。他の好ましいＩＭＯは、配列５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′、５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０または１個のヌクレオチド、Ｘ２は２〜３個のヌクレオチドであり、ＩＭＯはヌクレオチド６個より長くない。）を有する。したがって、本発明は、５′−ＴＣＧ−３′および／または５′−ＣＧ−３′を含むヌクレオチド３〜６個の長さのＩＭＯを提供する。
【００６６】
ＩＭＯは、回帰性配列である必要はないが、回帰性（すなわち自己相補的）であってもよい。ＩＭＯは、マイクロキャリヤーと複合体を形成され、またはマイクロキャリヤーの中に包み込まれたとき、試験管内で、生体内で、および／または生体外で測定したとき測定可能な免疫応答に影響を与える。ある実施態様において、ＩＭＯは、複合体を形成されしておらず、包み込まれてもいないときは、試験管内で、生体内で、および／または生体外で測定したとき、不活性である。
【００６７】
ある実施態様において、ＩＭＯは、配列５′−ＴＣＧ−３′または５′−ＵＣＧ−３′を有するトリマー（三量体）である。
【００６８】
ある実施態様において、ＩＭＯは、式５′−Ｘ１ＴＣＧ−３′、５′−ＴＣＧＸ２−３′、５′−Ｘ１ＵＣＧ−３′または５′−ＵＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＵまたはＩであり、Ｘ２はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＵまたはＩである。）に従う配列を有する四量体（quatramer）である。
【００６９】
ある実施態様において、ＩＭＯは、式５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′もしくは５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＵまたはＩであり、Ｘ２はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＵまたはＩである。）に従う、または式５′−ＴＣＧＸ３−３′もしくは５′−ＵＣＧＸ３−３′（ここで、Ｘ３はＡＡ、ＡＣ、ＡＧ、ＡＴ、ＡＵ、ＡＩ、ＣＡ、ＣＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＣＵ、ＣＩ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＧ、ＧＴ、ＧＵ、ＧＩ、ＴＡ、ＴＣ、ＴＧ、ＴＴ、ＴＵ、ＴＩ、ＵＡ、ＵＣ、ＵＧ、ＵＴ、ＵＵ、ＵＩ、ＩＡ、ＩＣ、ＩＧ、ＩＴ、ＩＵまたはＩＩである。）に従う配列を有する五量体（pentamer）である。
【００７０】
ある実施態様において、ＩＭＯは、式５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′もしくは５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′に従う、または式５′−ＴＣＧＸ３−３′もしくは５′−ＵＣＧＸ２−３′に従う配列を有する六量体である。ここで、Ｘ１はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＵまたはＩであり、Ｘ２はＡＡ、ＡＣ、ＡＧ、ＡＴ、ＡＵ、ＡＩ、ＣＡ、ＣＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＣＵ、ＣＩ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＧ、ＧＴ、ＧＵ、ＧＩ、ＴＡ、ＴＣ、ＴＧ、ＴＴ、ＴＵ、ＴＩ、ＵＡ、ＵＣ、ＵＧ、ＵＴ、ＵＵ、ＵＩ、ＩＡ、ＩＣ、ＩＧ、ＩＴ、ＩＵまたはＩＩである。また、Ｘ３はＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＡＡＵ、ＡＡＩ、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ、ＡＣＵ、ＡＣＩ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＡＧＴ、ＡＧＵ、ＡＧＩ、ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＴＴ、ＡＴＵ、ＡＴＩ、ＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＧ、ＡＵＴ、ＡＵＵ、ＡＵＩ、ＡＩＡ、ＡＩＣ、ＡＩＧ、ＡＩＴ、ＡＩＵ、ＡＩＩ、ＣＡＡ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＣＡＵ、ＣＡＩ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＣＣＵ、ＣＣＩ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＣＧＵ、ＣＧＩ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＵ、ＣＴＩ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＴ、ＣＵＵ、ＣＵＩ、ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＴ、ＧＡＵ、ＧＡＩ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＴ、ＧＣＵ、ＧＣＩ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＴ、ＧＧＵ、ＧＧＩ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＴ、ＧＴＵ、ＧＴＩ、ＧＩＡ、ＧＩＣ、ＧＩＧ、ＧＩＴ、ＧＩＵ、ＧＩＩ、ＴＡＡ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＡＴ、ＴＡＵ、ＴＡＩ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＴＣＵ、ＴＣＩ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＴＧＴ、ＴＧＵ、ＴＧＩ、ＴＴＡ、ＴＴＣ、ＴＴＧ、ＴＴＴ、ＴＴＵ、ＴＴＩ、ＴＵＡ、ＴＵＣ、ＴＵＧ、ＴＵＴ、ＴＵＵ、ＴＵＩ、ＴＩＡ、ＴＩＣ、ＴＩＧ、ＴＩＴ、ＴＩＵ、ＴＩＩ、ＵＡＡ、ＵＡＣ、ＵＡＧ、ＵＡＴ、ＵＡＵ、ＵＡＩ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＴ、ＵＣＵ、ＵＣＩ、ＵＧＡ、ＵＧＣ、ＵＧＧ、ＵＧＴ、ＵＧＵ、ＵＧＩ、ＵＴＡ、ＵＴＣ、ＵＴＧ、ＵＴＴ、ＵＴＵ、ＵＴＩ、ＵＵＡ、ＵＵＣ、ＵＵＧ、ＵＵＴ、ＵＵＵ、ＵＵＩ、ＵＩＡ、ＵＩＣ、ＵＩＧ、ＵＩＴ、ＵＩＵ、ＵＩＩ、ＩＡＡ、ＩＡＣ、ＩＡＧ、ＩＡＴ、ＩＡＵ、ＩＡＩ、ＩＣＡ、ＩＣＣ、ＩＣＧ、ＩＣＴ、ＩＣＵ、ＩＣＩ、ＩＧＡ、ＩＧＣ、ＩＧＧ、ＩＧＴ、ＩＧＵ、ＩＧＩ、ＩＴＡ、ＩＴＣ、ＩＴＧ、ＩＴＴ、ＩＴＵ、ＩＴＩ、ＩＩＡ、ＩＩＣ、ＩＩＧ、ＩＩＴ、ＩＩＵまたはＩＩＩである。
【００７１】
追加の実施態様は六量体５′−ＴＴＴＣＧＴ−３′および５′−ＡＡＣＧＴＴ−３′を含む。
【００７２】
他の修飾／付加も考えられるが、ＩＭＯ中にあるシトシンはメチル化されていないことが好ましい。しかしながら、ある実施態様において、ＩＭＯは１つまたはそれ以上のメチル化されたシトシンを含んでいてもよい。そのような実施態様において、ＩＭＯのコア三量体配列（すなわち、式５′−Ｘ１ＴＣ１ＧＸ２−３′または５′−Ｘ１ＵＣ１ＧＸ２−３′に従うオリゴヌクレオチド配列のＣ１。ただし、Ｘ１は０または１個のヌクレオチドであり、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドであり、そしてオリゴヌクレオチドは塩基３〜６個の長さである。）のシトシンは位置Ｃ５でメチル化されていないことが好ましい。しかしながら、メチル化されたシトシンを含むそれらのＩＭＯにおいては、位置Ｎ４でのメチル化は考えられる。
【００７３】
ＩＭＯは修飾を含んでもよい。ＩＭＯの修飾は、当技術分野で知られているいかなるものでもよく、３′ＯＨまたは５′ＯＨ基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾および燐酸基の修飾が挙げられるが、それらに限定されない。種々のそのような修飾を以下に記述する。
【００７４】
ある実施態様において、コア三量体のシトシンは、好ましくは、シトシンのＣ−５および／またはＣ−６位置でハロゲン、好ましくは臭素、窒素またはヒドロキシル基のような電子求引基を付加することによって、例えばまたはアザシトシンもしくはシトシンアラビノシドのような修飾されたシトシンで置換することによって、修飾される。さらに、コア三量体にウラシルを含むＩＭＯ（すなわち式５′−Ｘ１Ｕ１ＣＧＸ２−３′の配列を有するＩＭＯ。ただし、Ｕ１はコア三量体中のウラシルであり、Ｘ１は０〜１個のヌクレオチドであり、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドであり、ＩＭＯは塩基３〜６個の長さである。）は、ＩＭＯ中のコア三量体に、または他の任意のウラシルの位置に、同様にまたは交替に修飾されたウラシルを含んでもよい。
【００７５】
ＩＭＯは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡであってもよく、また一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、またはその他の修飾されたポリヌクレオチドであってもよい。ＩＭＯは回帰性の部位を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。ＩＭＯは、天然に見いだされる塩基を含んでいてもよいし、修飾された、天然に見いだされない塩基を含んでいてもよい。また、修飾された糖、リン酸エステルおよび／または末端を含んでいてもよい。塩基修飾の例としては、ＩＭＯ中のシトシンのＣ−５および／またはＣ−６への電子求引基の付加（例えば５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヨードシトシン）があるが、それらに限定されない。例えば、国際公開第９９／６２９２３号パンフレット参照。
【００７６】
ＩＭＯは、当技術分野においてよく知られている方法および核酸合成装置を使用して、合成することができる。その方法には、酵素法、化学的方法、およびより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解があるが、それらに限定されない。例えば、Ausubel et al. (1987)およびSambrook et al. (1989)参照。酵素で組み立てるときは、個々の単位は、例えばＴ４  ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼのようなリガーゼで結合することができる。米国特許第５，１２４，２４６号明細書。オリゴヌクレオチド分解は、米国特許第４，６５０，６７５号明細書に例示されるように、ポリヌクレオチドをヌクレアーゼに暴露することによって達成することができる。
【００７７】
オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドを作るための方法は当技術分野において知られている。ホスホジエステル結合を含む天然に見いだされるＤＮＡまたはＲＮＡは、一般に、３′末端で固体担体に付着させた、成長するオリゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシ基に適当なヌクレオシドホスホルアミダイト（phosphoramidite）を連続して結合し、続いて中間の亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルに酸化することによって合成される。一旦所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されたならば、オリゴヌクレオチドは担体から取りはずされ、リン酸トリエステル基はリン酸エステルジエステルに脱保護され、ヌクレオシド塩基はアンモニア水または他の塩基を用いて脱保護される。例えば、Beaucage (1993) “Oligodeoxyribonucleotide Synthesis” in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ、Warner et al. (1984) DNA 3:401および米国特許第４，４５８，０６６号明細書参照。
【００７８】
ＩＭＯは、特に限定するものではないが、メチルホスホン酸エステル、ホスホロチオ酸エステル、アミド亜リン酸エステル（phosphoramidate）（架橋または非架橋）、ホスホトリエステルおよびホスホロジチオ酸エステルのような、リン酸エステルで修飾されたオリゴヌクレオチドを含んでもよい。修飾リン酸エステルは、ＩＭＯのいずれの位置でもよいし、すべての位置でもよく、および／またはいかなる組合わせで使用してもよい。修飾されたリン酸エステル結合または非リン酸エステル結合を含むポリヌクレオチドの合成もまた当技術分野で知られている。再考のために、Matteucci (1997) “Oligonucleotide Analogs: an Overview” in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D.J. Chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY参照。本発明のオリゴヌクレオチド中の糖または糖類似体部分に結合し得るリン誘導体（または修飾燐酸基）は、一燐酸エステル、二燐酸エステル、三燐酸エステル、アルキルホスホン酸エステル、ホスホロチオ酸エステル、ホスホロジチオ酸エステルなどであってもよい。上述のリン酸エステル類似体の製造およびヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの中へのそれらの組み込みも、それ自体、知られており、ここで詳細に記述される必要はない。Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848、Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323、およびSchultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973。例えば、ホスホロチオ酸エステルオリゴヌクレオチドの合成は、酸化工程を硫化（sulfurization）工程で置き換える点を除いて、天然に見いだされるオリゴヌクレオチドについて上述した合成と同様である（Zon (1993) “Oligonucleoside Phosphorothioates” in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190）。同様に、ホスホトリエステル（Miller et al. (1971) JACS 93:6657-6665）、非架橋アミド亜リン酸エステル（Jager et al. (1988) Biochem. 27:7247-7246）、Ｎ３′〜Ｐ５′アミド亜リン酸エステル（Nelson et al. (1997) JOC 62:7278-7287）およびホスホロジチオ酸エステル（米国特許第５，４５３，４９６号明細書）のような他のリン酸エステル類似体の合成も記述されている。他の非リン系修飾オリゴヌクレオチドも使用することができる（Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141）。ホスホロチオ酸エステル主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、宿主への注射の後の分解に対してより抵抗力があるように見える。Braun et al. (1988) J. Immunol. 141:2084-2089、およびLatimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1057-1064。好ましいＩＭＯは、完全なホスホロチオ酸エステル、完全なホスホジエステル、または混合ホスホロチオ酸エステル／ホスホジエステル主鎖を含む。
【００７９】
発明で用いられるＩＭＯは、（唯一または主要な糖成分としてリボースを含む）リボヌクレオチド、（主要な糖成分としてデオキシリボースを含む）デオキシリボヌクレオチドを含むことができ、または当技術分野で知られているように、修飾された糖または糖類似体がＩＭＯの中に取り込まれることができる。したがって、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソースおよび糖「類似」シクロペンチル基であってもよい。糖はピラノース（pyranosyl）形またはフラノース（furanosyl）形であってもよい。ＩＭＯにおいて、糖部分は、好ましくはリボース、デオキシリボース、アラビノースまたは２′−０−アルキルリボースのフラノシドであり、糖はαまたはβアノマー配置のいずれかでそれぞれの複素環の塩基に結合することができる。糖修飾には、２′−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２′−アミノ−ＲＮＡ類似体および２′−アルコキシ−またはアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが含まれるが、それらに限定されない。これらの糖または糖類似体およびそのような糖または類似体が複素環塩基（核酸塩基）に結合したそれぞれの「ヌクレオシド」の製造は、それ自体知られており、そのような製造が特定の実施例に関係し得る範囲以外はここで記述する必要はない。糖修飾もしてもよいし、ＩＭＯの製造においていかなるリン酸エステル修飾と組み合わせてもよい。
【００８０】
ＩＭＯの中に組み込まれる複素環塩基すなわち核酸塩基は、天然に見いだされる主要なプリン塩基およびピリミジン塩基（すなわち上述したようなウラシル、チミン、シトシン、イノシン、アデニンおよびグアニン）であってもよいし、イノシンのような該主要な塩基の天然に見いだされるおよび合成の修飾物であってもよい。
【００８１】
当業者は、種々の複素環塩基および種々の糖部分（および糖類似体）を含む数多くの天然のものでない「合成の」ヌクレオシドが当技術分野において入手可能であること、また本発明の他の基準が満足される限りにおいて、ＩＭＯは天然に見いだされる核酸の主要な５つの塩基成分以外の１つまたは数個の複素環塩基を含むことができることを認識するであろう。しかしながら、好ましくは、ＩＭＯ中の複素環塩基としては、ウラシル−５−イル、シトシン−５−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−３−イル基（ただし、プリンは９位で、ピリミジンは１位で、ピロロピリミジンは７位で、そしてピラゾロピリミジンは１位で、ＩＭＯの糖部分に結合している。）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８２】
ＩＭＯは、例えば共通に所有される国際公開第９９／６２９２３号パンフレットに記述されるような少なくとも１つの修飾塩基を含んでもよい。ここで使用するときは、用語「修飾塩基」は「塩基類似体」と同義であり、例えば「修飾シトシン」は「シトシン類似体」と同義である。同様に、「修飾」ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、ここではヌクレオシドまたはヌクレオチド「類似体」と同義であると定義される。塩基修飾の例としては、ＩＭＯのシトシンのＣ−５および／またはＣ−６への電子求引基の付加があるが、それに限定されない。好ましくは、電子求引基はハロゲンである。修飾シトシンとしては、アザシトシン、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、５−ニトロシトシン、５−ヒドロキシシトシンおよびその他の任意のピリミジン類似体または修飾ピリミジン（ただし、実施態様によっては、５−ブロモシトシンを除くこともある。）が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい修飾ウラシルは、好ましくはハロゲンで、Ｃ−５および／またはＣ−６で修飾されたものであり、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシル、およびヒドロキシウラシルが例示されるが、それらに限定されない。Kandimalla et al., 2001, Bioorg. Med. Chem. 9:807-13も参照。例えば、国際公開第９９／６２９２３号パンフレット参照。塩基修飾の他の例には、塩基への１つまたはそれ以上のチオール基の付加があり、６−チオグアニン、４−チオチミンおよび４−チオウラシルが挙げられるが、それらに限定されない。さらに、あるＩＭＯは、任意のグアノシン残基の代わりに７−デアザグアノシンのような修飾塩基を含んでもよいし、またはコア三量体のシトシンを含む任意のシトシン残渣の代わりにＮ４−エチルシトシンまたはＮ４−メチルシトシンまたは５−ヒドロキシシトシンから選ばれた修飾シトシンを含んでもよい。
【００８３】
塩基修飾ヌクレオシドの製造および前駆物質として該塩基修飾ヌクレオシドを用いた修飾オリゴヌクレオチドの合成は、例えば米国特許第４，９１０，３００号明細書、米国特許第４，９４８，８８２号明細書および米国特許第５，０９３，２３２号明細書に記述されている。これらの塩基修飾ヌクレオシドは、それらがオリゴヌクレオチドの末端または内部の位置のいずれかの中に化学合成によって組み込まれ得るように設計されてきた。オリゴヌクレオチドの末端または内部の位置のいずれかに存在するそのような塩基修飾ヌクレオシドは、ペプチドまたは他の抗原の結合のための部位としての役目を果たすことができる。それらの糖部分に修飾されたヌクレオシドもまた、（限定するものではないが、例えば米国特許第４，８４９，５１３号明細書、米国特許第５，０１５，７３３号明細書、米国特許第５，１１８，８００号明細書および米国特許第５，１１８，８０２号明細書に）記述されており、同様に用いることができる。
【００８４】
免疫刺激配列の免疫調節活性を検出する方法は、先行技術に記述されており、サイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化およびＴ細胞分裂反応のような免疫応答の種々の面を示す標準分析法を用いて容易に確認することができる。例えば、国際公開第９７／２８２５９号パンフレット、国際公開第９８／１６２４７号パンフレット、国際公開第９９／１１２７５号パンフレット、Krieg et al. (1995) Nature 374:546-549、Yamamoto et al. (1992a)、Ballas et al. (1996)、Klinman et al. (1997)、Sato et al. (1996)、Pisetsky (1996a)、Shimada et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816、Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156:4570-4575、Roman et al. (1997)、およびLipford et al. (1997a)参照。そのような方法は、ＩＭＯおよび／またはＩＭＯ／ＭＣ複合体もしくは被包体の免疫刺激活性の評価にも同様に適用できる。
【００８５】
ＩＭＯの１つの性質は、ＩＭＯのヌクレオチド配列に関連する「分離免疫調節活性」である。上述したように、本発明者は、驚くべきことに、ＩＭＯがポリヌクレオチド単独として提供されたならば匹敵する免疫調節活性を示さない配列を有しているときでさえ、ＩＭＯ／ＭＣ複合体が免疫調節活性を示すことを発見した。
【００８６】
ある実施態様において、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体のＩＭＯは、下記するように、「分離免疫調節活性」を有しない、または「劣った分離免疫調節活性」（すなわちＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体と比較したとき）を有する。
【００８７】
ＩＭＯの「分離免疫調節活性」は、ＩＭＯの一次配列を有し、かつ同一の核酸主鎖（例えばホスホロチオ酸エステル、ホスホジエステル、キメラの）を有する、分離されたポリヌクレオチドの免疫調節活性の測定によって決定される。例えばＩＭＯ／ＭＣ複合体中のＩＭＯの独立した免疫調節活性を決定するために、同一の配列（例えば５′−ＴＣＧＴＣＧ−３′）および同一の主鎖構造（例えばホスホロチオ酸エステル）を有する試験ポリヌクレオチドは型にはまった方法を用いて合成され、（もしあれば）その免疫調節活性が測定される。免疫調節活性は、ここに記述するような免疫応答の種々の面を示す標準分析法を用いて決定することができる。例えば、ここに記述されるヒトのＰＢＭＣ分析が用いられる。ドナー変動を説明するために、典型的には、その分析は多数のドナーにおいて実行される。ポリヌクレオチドと接触したＰＢＭＣによって分泌されたＩＦＮ−γの量が、試験化合物のない場合より、または（ある実施態様においては）、不活性な対照化合物（例えば５′−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））の存在する場合より、大多数のドナーにおいて有意に多くない（例えば約２倍未満）とき、ポリヌクレオチドは免疫調節活性を有しない（そして対応するＩＭＯは「分離免疫調節活性を有しない）。
【００８８】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体と分離されたポリヌクレオチドの免疫調節活性を比較するために、免疫調節活性は、必ずしも必要ではないが好ましくはヒトＰＢＭＣ分析を用いて、測定される。通常、２つの化合物の活性は、同一の条件で（例えば同一の細胞を用いて）、通常約２０μｇ／ｍｌの濃度で、それらを並列に分析することによって比較される。一般に、濃度は、２６０ｎｍで吸光度を測定し、換算式０．５  ＯＤ２６０／ｍｌ＝２０μｇ／ｍｌを使用することによって決定される。これは、試験サンプル中の核酸の全体の量を標準化する。その代わりに、当技術分野に知られている他の方法によって濃度または質量を測定することもできる。
【００８９】
試験ポリヌクレオチドが、比較されるＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体より活性が低いとき、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体のＩＭＯは「劣った免疫調節活性」を有すると見なされる。好ましくは、試験ポリヌクレオチドの分離免疫調節活性は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の活性の高々約５０％であり、より好ましくは高々約２０％であり、最も好ましくはＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の活性の高々約１０％であり、または実施態様によってはもっと低いことさえある。
【００９０】
マイクロキャリヤー
本発明に有用なマイクロキャリヤーは、大きさが約１５０μｍ、１２０μｍまたは１００μｍ未満であり、典型的には大きさが約５０〜６０μｍ未満であり、好ましくは大きさが約２０μｍまたは１０μｍ未満であり、純水に溶けない。本発明に使用されるマイクロキャリヤーは、非生分解性のマイクロキャリヤーも許容されるが、好ましくは生分解性である。マイクロキャリヤーは、一般に「ビーズ」またはその他の粒子のような固相であるが、生分解性重合体または油を含む水中油型乳濁液のような液相マイクロキャリヤーも考えられる。マイクロキャリヤーとしての使用が許容される種々様々の生分解性および非生分解性の物質が当技術分野において知られている。
【００９１】
本発明の組成物または方法において使用されるマイクロキャリヤーは、一般に大きさが約２０〜１０μｍ未満（例えば、約１０μｍ未満の平均直径を有するか、粒子の少なくとも約９７％が１０μｍのスクリーンフィルターを通り抜ける。）であり、ナノキャリヤー（すなわち大きさが約１μｍ未満のキャリヤー）を含む。好ましくは、マイクロキャリヤーは、上限が約９μｍ、７μｍ、５μｍ、２μｍ、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、または１００ｎｍであり、独立して選ばれる下限が約４μｍ、２μｍ、１μｍ、８００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ、または１０ｎｍの範囲（ただし下限は上限より小さい。）の大きさを有するものが選ばれる。ある実施態様において、マイクロキャリヤーは、大きさが約１．０〜１．５μｍ、約１．０〜２．０μｍまたは約０．９〜１．６μｍである。ある好ましい実施態様において、マイクロキャリヤーは、大きさが約１０ｎｍ〜約５μｍ、約１０ｎｍ〜約１０μｍ、１０ｎｍ〜約２０μｍ、または約２５ｎｍ〜約４．５μｍ、約１μｍ、約１．２μｍ、約１．４μｍ、約１．５μｍ、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍまたは約４．５μｍである。マイクロキャリヤーがナノキャリヤーであるとき、好ましい実施態様は約２５〜約３００ｎｍ、５０〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ、１００ｎｍ、または約２００ｎｍのナノキャリヤーを含む。
【００９２】
固相生分解性マイクロキャリヤーは含んでいる生分解性重合体から製造することができ、生分解性重合体としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびそれらの共重合体（ブロック共重合体を含む。）、さらにポリ乳酸のブロック共重合体、マロン酸ポリメチリデンおよびポリエチレングリコールのような生分解性ポリエステル；３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン（ＤＥＴＯＳＵ）を主成分とする重合体のようなポリオルトエステル；セバシン酸のような比較的親水性の単量体を主成分とするポリ（無水物）重合体のようなポリ無水物；グリシンまたはアラニンのようなアミノ酸を含む（すなわち、アミノ末端窒素を介してイミド結合によってセバシン酸に結合した）、セバシン酸から誘導された単量体を主成分とするポリ無水物重合体のようなポリ無水物イミド；ポリ無水物エステル；ポリホスファゼン、特にカルボン酸基の生成を通して重合体主鎖の分解に触媒作用を及ぼすことができる加水分解しやすいエステル基を含むポリホスファゼン（Schacht et al., (1996) Biotechnol. Bioeng. 1996:102）；および乳酸とリジンの共重合体（poly(lactic acid-co-lysine)）のようなポリアミドが挙げられるが、それらに限定されない。
【００９３】
マイクロキャリヤーを製造するのに適した種々様々な非生分解性物質も知られており、それらには、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ラテックス、デキストラン、ならびにシリカ、ヒドロキシアパタイト、ミョウバンおよびリン酸カルシウムのような無機結晶性物質、さらにセラミックス、金、および強磁性体または常磁性体を含む無機物質があるが、それらに限定されない。ある実施態様は、金、ラテックスおよび／または磁気ビーズを除外する。ある実施態様においては、マイクロキャリヤーは、第二の物質（例えばポリスチレン）で包み込まれた第一の物質（例えば磁性材料）で作られていてもよい。
【００９４】
固相小球体は当技術分野において知られている方法を使用して調製される。例えば、それらは乳化性溶剤抽出／蒸発法によって調製することができる。一般に、この方法においては、ポリ無水物およびポリα−ヒドロキシエステル（例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、Ｄ，Ｌ−乳酸・グリコール酸共重合体、およびポリカプロラクトン）のような生分解性重合体は、乳濁液の分散相（ＤＰ）を構成するために、塩化メチレンのような適当な有機溶媒に溶解される。ＤＰは、溶解された界面活性剤、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む過剰量の水性連続相（ＣＰ）に高速均質化によって乳化される。ＣＰ中の界面活性剤は、不連続な且つ適当なサイズの乳濁小滴の形成を確実にするためである。その後、有機溶媒はＣＰの中に抽出され、続いて系の温度を高めることによって蒸発させられる。その後、固体のミクロ粒子は遠心分離またはろ過によって分離され、４℃で保管する前に、例えば凍結乾燥または減圧の適用によって乾燥される。例えばポリ（アルキル−α−シアノアクリレート）からのマイクロメーター以下の大きさのマイクロキャリヤー（例えばナノキャリヤー）の製造は、好ましくは、米国特許第４，４８９，０５５号明細書に記述されているようなアルキルシアノアクリル酸エステルのミセル重合によって実行される。
【００９５】
乾燥した小球体の平均粒度、粒度分布および表面電荷のような物理化学的性質を決定してもよい。粒度特性は、例えば動的光散乱法（好ましくは約１〜２μｍ未満の公称寸法のマイクロキャリヤーに使用される。）または暗黒化法（好ましくは約１μｍより大きな公称寸法のマイクロキャリヤーに使用される。）によって決定される。表面電荷は、好ましくは、ゼータ電位の測定によって決定される。
【００９６】
液相マイクロキャリヤーは、生分解性重合体または油を含むリポソーム、ミセル、油滴およびその他の脂質または油系粒子を含む。ある実施態様においては、生分解性重合体は界面活性剤である。他の実施態様において、液相マイクロキャリヤーは、スクアレンまたは植物油のような生分解性の油を含むので生分解性である。一つの好ましい液相マイクロキャリヤーは水中油型乳濁液の中の油滴である。好ましくは、マイクロキャリヤーとして使用される水中油型乳濁液は、スクアレンのような生分解性の置換基を含む。
【００９７】
抗原
抗原を含むＩＭＯ／ＭＣ複合体および被包体を調製してもよいし、抗原を含まないＩＭＯ／ＭＣ複合体および被包体すなわち抗原に結合していないＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を調製してもよい。抗原を含むＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の製造には、いかなる抗原を使用してもよい。
【００９８】
ある実施態様において、抗原はアレルゲンである。組換えアレルゲンの具体例は表１に提供されている。多くのアレルゲンの製造が当技術分野においてよく知られている。それらの例としては、ブタクサ花粉アレルゲン抗原Ｅ（Ａｍｂ  ａＩ）（Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1229-1236）、主要チリダニアレルゲンＤｅｒ  ｐＩおよびＤｅｒ  ＰＩＩ（Chua et al. (1988) J. Exp. Med. 167:175-182; Chua et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124-129）、シラカバ花粉Ｂｅｔ  ｖ１（Breiteneder et al. (1989) EMBO J. 8:1935-1938）、家ネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  Ｉ（Rogers et al. (1993) Mol. Immunol. 30:559-568）および樹木花粉からのタンパク質抗原（Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31）の製造が挙げられるが、それらに限定されない。示されるように、樹木からのアレルゲンも知られており、その具体例としては、カバ、西洋ビャクシンおよびスギからのアレルゲンが挙げられる。生体内投与のための草花粉からのタンパク質抗原の製造が報告されている。Malley (1989) J. Reprod. Immunol. 16:173-186。表１が示すように、ある実施態様においてはアレルゲンはピーナッツアレルゲン（例えばＡｒａ  ｈ  Ｉ）のような食品アレルゲンであり、ある実施態様においてはアレルゲンはライ麦アレルゲン（例えばＬｏｌ  ｐ  １）のような草アレルゲンである。表１は、使用することができるアレルゲンの一覧表を示す。
【００９９】
【表１】
2005527465.tif 000002
【０１００】
【表２】
2005527465.tif 000003
【０１０１】
【表３】
2005527465.tif 000004
【０１０２】
【表４】
2005527465.tif 000005
【０１０３】
ある実施態様においては、抗原は感染因子からものであり、それらには原生動物、細菌、真菌（単細胞および多細胞を含む。）、およびウイルスの感染因子を含む。適当なウイルス抗原の具体例はここに記述され、当技術分野において知られている。細菌には、ヘモフィルスインフルエンザ、結核菌および百日咳菌が含まれる。原生動物感染因子には、マラリア熱のマラリア原虫、リーシュマニア属の種、トリパノソーマ属の種および住血吸虫属の種が含まれる。真菌には鵞口瘡カンジダが含まれる。
【０１０４】
ある実施態様において、抗原はウイルス抗原である。ウイルスポリペプチド抗原には、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質（膜固着（ＭＡ）タンパク質、コアカプシド（ＣＡ）タンパク質およびヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質を含むが、それらに限定されない。）、ＨＩＶポリメラーゼ、インフルエンザウイルス基質（Ｍ）タンパク質およびインフルエンザウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質のようなＨＩＶタンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コア蛋白質（ＨＢｃＡｇ）、Ｅ型肝炎タンパク質（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ型肝炎抗原などが含まれるが、それらに限定されない。インフルエンザワクチン接種を論じる論文としては、Scherle and Gerhard(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4446-4450、Scherle and Gerhard (1986) J. Exp. Med. 164:1114-1128、Granoff et al. (1993) Vaccine 11:S46-51、Kodihalli et al. (1997) J. Virol. 71:3391-3396、Ahmeida et al. (1993) Vaccine 11:1302-1309、Chen et al. (1999) Vaccine 17:653-659、Govorkova and Smirnov (1997) Acta Virol. (1997) 41:251-257、Koide et al. (1995) Vaccine 13:3-5、Mbawuike et al. (1994) Vaccine 12:1340-1348、Tamura et al. (1994) Vaccine 12:310-316、Tamura et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:477-481、Hirabayashi et al. (1990) Vaccine 8:595-599が挙げられる。抗原ポリペプチドの他の具体例は、群または亜群特異性抗原であり、それらは多くの感染因子について知られており、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、パピローマウイルス、呼吸系発疹ウイルスおよびポックスウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０５】
多くの抗原ペプチドおよびタンパク質が知られており、技術分野において入手可能であり、他のものは従来の技術を用いて識別することができる。腫瘍形成に対する免疫処置または存在する腫瘍の治療のために、免疫調節ペプチドには、（生きている、または照射された）腫瘍細胞、腫瘍細胞抽出物、またはＨｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｍａｒｔ１、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ガングリオシド、人乳脂肪球（ＨＭＦＧ）、ムチン（ＭＵＣ１）、ＭＡＧＥ抗原、ＢＡＧＥ抗原、ＧＡＧＥ抗原、ｇｐ１００、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、およびチロシナーゼのような腫瘍抗原のサブユニット蛋白質が含まれる。免疫系避妊のためのワクチンは、本発明のＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体と共に投与された精子タンパク質を含めることによって形成することができる。Lea et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:263。
【０１０６】
弱毒化ウイルスおよび不活性化ウイルスは、ここで抗原として使用するのに適している。これらのウイルスの調製は当技術分野においてよく知られており、多くのものが商業的に入手可能である（例えばPhysicians′ Desk Reference (1998) 52nd edition, Medical Economics Company, Inc.参照。）。例えば、ポリオウイルスはＩＰＯＬ（登録商標）（パスツール・メリュー・コンノート（Pasteur Merieux Connaught））およびＯＲＩＭＵＮＥ（登録商標）（レダール・ラボラトリーズ（Lederle Laboratories））として入手可能であり、Ａ型肝炎ウイルスはＶＡＱＴＡ（登録商標）（メルク（Merck））として入手可能であり、麻疹ウイルスはＡＴＴＥＮＵＶＡＸ（登録商標）（メルク）として入手可能であり、流行性耳下腺炎ウイルスはＭＵＭＰＳＶＡＸ（登録商標）（メルク）として入手可能であり、風疹ウイルスはＭＥＲＵＶＡＸ（登録商標）ＩＩ（メルク）として入手可能である。さらに、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、単純疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ロータウイルス、ヒトおよび非ヒト乳頭腫ウイルス、ならびに遅発性脳ウイルス（slow brain viruses）のような弱毒化ウイルスおよび非活性化ウイルスは、ペプチド抗原を提供することができる。
【０１０７】
ある実施態様において、抗原は、痘疹、アデノウイルスおよびカナリア痘のようなウイルスのベクターを含む。
【０１０８】
抗原は当技術分野において知られている精製技術を用いてそれらの原料から単離することができる。または、より好都合には、組換え法を用いて製造することができる。
【０１０９】
抗原ペプチドは、精製天然ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗タンパク質抽出物、弱毒化もしくは不活性化ウイルス、細胞、微生物、またはそのようなペプチドの断片を含むことができる。免疫調節ペプチドは、天然のものでもよいし、化学的にまたは酵素で合成したものでもよい。当技術分野において知られている化学合成のいかなる方法も適当である。溶液相ペプチド合成は適度な大きさのペプチドを構築するために用いることができ、またはペプチドの化学的構築のために、固相法を用いることができる。Atherton et al. (1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362:833-839。タンパク質分解酵素はまたペプチドを製造するためにアミノ酸を連結するのにも利用することができる。Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc.。代わりに、ペプチドは、細胞の生化学機械を用いることによって、または生物学的原料からの単離によって得ることができる。組換えＤＮＡ法を、ペプチドの製造のために用いることができる。Hames et al. (1987) Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press。ペプチドはアフィニティークロマトグラフィーのような標準的方法を用いて単離することもできる。
【０１１０】
好ましくは、抗原は、ペプチド、脂質（例えばコレステロール以外のステロール、脂肪酸およびリン脂質）、インフルエンザ菌ワクチンにおいて用いられるもののような多糖、ガングリオシドおよび糖タンパク質である。これらは当技術分野において知られているいくつかの方法によって得ることができ、その中には単離ならびに化学的方法および酵素法を用いた合成が含まれる。多くのステロール、脂肪酸およびリン脂質のためのような、ある場合においては、分子の抗原部分は商業的に入手可能である。
【０１１１】
主題組成物およびその組成物を用いる方法に有用なウイルス抗原の具体例には、ＨＩＶ抗原が含まれるが、それに限定されない。そのような抗原は、限定するものではないが、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１を含むＨＩＶエンベロープ糖タンパク質から誘導された抗原を含むが、それらに限定されない。ＨＩＶ遺伝子および抗原のための多数の配列が知られている。例えば、ロスアラモス国立研究所ＨＩＶ配列データベースは、ＨＩＶヌクレオチドおよびアミノ酸配列を収集し、管理し、注釈している。このデータベースは、インターネット（http://hiv-web.lanl.gov/）で、および年１回の刊行物でアクセス可能である（Human Retroviruses and AIDS Compendium(例えば1998年版)参照。）。
【０１１２】
感染因子から誘導される抗原は、当技術分野において知られている方法を用いて得ることができ、例えば、天然ウイルスまたは細菌抽出物から、感染因子に感染した細胞から、精製したポリペプチドから、組換え技術により製造したポリペプチドから、および／または合成ペプチドとして得ることができる。
【０１１３】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤は、限定するものではないが、サイトカイン、アジュバント、ならびに耐腫瘍抗体およびその誘導体のような抗体を含む他の免疫療法作用薬とともに調製することができる。これらのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤は、抗原と共に調製してもよいし、抗原なしで調製してもよい。
【０１１４】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体
ＩＭＯ／ＭＣ複合体は、マイクロキャリヤーの表面に結合したＩＭＯ（すなわち、ＩＭＯはＭＣの中に包み込まれていない。）を含み、好ましくは各マイクロキャリヤーに結合したＩＭＯの複数の分子を含む。ある実施態様においてＩＭＯ（またはＩＭＯの部分）はＭＣの表面の中に埋め込まれているかもしれないが、最も一般的には、ＩＭＯはＭＣの表面に結合している（表面の中には埋め込まれていない）。ある実施態様において、複数のＩＭＯ種がマイクロキャリヤーに結合するように、異なるＩＭＯの混合物がマイクロキャリヤーと複合体を形成してもよい。ＩＭＯおよびＭＣの間の結合は共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。当業者によって理解されるように、ＩＭＯは修飾されまたは誘導されてもよく、マイクロキャリヤーの組成はＩＭＯ／ＭＣ複合体形成のために望ましい所望の型の結合を提供するために選ばれおよび／または修飾されてもよい。
【０１１５】
本発明は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体を作る方法、さらにそのような方法の生成物を提供する。ＩＭＯ／ＭＣ複合体は、複合体を形成するためにＩＭＯとＭＣを組み合わせることによって作られる。複合体を形成するためにＩＭＯとＭＣを組み合わせる特定の方法は、もちろんＩＭＯとＭＣの抱合形式と同様にＭＣの型および特徴に依存するであろう。ＭＣが固相ＭＣであるときは、ＩＭＯ／ＭＣ複合体は、好ましくは複合体形成を促進する条件（それは複合体に使用される結合の型に依存するであろう。）下で、ＩＭＯとＭＣを接触させることによって作られる。ＭＣが液相であるときは、ＩＭＯは、複合体形成を促進する条件下で前もって形成されたＭＣと組み合わせてもよいし、ＭＣの形成前にＭＣの成分と組み合わせてもよい。ＩＭＯを液相ＭＣの成分と組み合わせる状況において、ＭＣを作るプロセスはＩＭＯを混合してもよく、それによりＩＭＯ／ＭＣ複合体の同時生成をもたらす。または、ＩＭＯを混合しないときは、プロセスは複合体形成を促進する条件下で追加の工程を含むであろう。
【０１１６】
発明に従うＩＭＯ／ＭＣ複合体は純水に不溶であり、ＩＭＯ／ＭＣ複合体組成物は好ましくはアセトニトリル、ジクロロエタン、トルエンおよび塩化メチレン（ジクロロメタン）を含まない。
【０１１７】
共有結合で結合するＩＭＯ／ＭＣ複合体は当技術分野において知られているいかなる共有結合架橋技術を使用して結合してもよい。典型的には、ＩＭＰ部分がマイクロキャリヤーに結合することができる部位を提供するために、ＩＭＯ部分が、追加の基（例えば遊離のアミン、カルボキシルまたはスルフヒドリル基）を含むように、または修飾された（例えばホスホロチオ酸エステル）ヌクレオチド塩基を含むように修飾されるであろう。複合体のＩＭＯとＭＣの部分の間の結合は、ＩＭＯの３′末端もしくは５′末端で作ることができるし、またはＩＭＯの内部の位置の適当な修飾塩基において作ることもできる。マイクロキャリヤー上に普通に存在する官能基を利用することもできるが、それを介して共有結合を形成することができる基を組み入れるために、マイクロキャリヤーもまた一般に修飾される。ＩＭＯ／ＭＣは、共有結合型複合体の形成を可能にする条件下で（例えば、架橋剤の存在下で、またはＩＭＯと共有結合を形成するであろう活性化された基を含む活性化されたマイクロキャリヤーの使用によって）、マイクロキャリヤーと共にＩＭＯを温置することによって形成される。
【０１１８】
種々様々の架橋技術が当技術分野において知られており、アミノ、カルボキシルおよびスルフヒドリル基と反応する架橋剤を含む。当業者には明らかなように、架橋剤および架橋プロトコルの選択は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体の所望の最終的な立体配置と同様に、ＩＭＯとマイクロキャリヤーの立体配置に依存するであろう。架橋剤は、ホモ二官能性であってもよいし、ヘテロ二官能性であってもよい。ホモ二官能性架橋剤を使用するときは、架橋剤はＩＭＯおよびＭＣの上の同一の基を利用する（例えば、アルデヒド架橋剤は、ＩＭＯとＭＣの両方が１つまたはそれ以上の遊離のアミンを含むようなＩＭＯとＭＣを共有結合させるために使用することができる。）。ヘテロ二官能性架橋剤は、ＩＭＯおよびＭＣの上の異なる基を利用し（例えば、マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ＩＭＯ上の遊離スルフヒドリルとＭＣ上の遊離アミンを共有結合させるために使用することができる。）、マイクロキャリヤー間結合の形成を最小限にするために好ましい。ほとんどの場合、マイクロキャリヤー上の第一の架橋基とＩＭＯ上の第二の架橋基（ただし第二の架橋基はマイクロキャリヤー上に存在しない。）を介して架橋することが好ましい。ＩＭＯ／ＭＣ複合体を製造する好ましい１つの方法は、ヘテロ二官能性架橋剤と共にマイクロキャリヤーを温置することによって「活性化」し、その後、反応に適した条件下でＩＭＯと活性化されたＭＣを温置することによってＩＭＯ／ＭＣ複合体を形成することによる。架橋剤は反応性基間に「スペーサー」アームを含んでもよいし、架橋剤中の２つの反応性基が直接結合してもよい。
【０１１９】
１つの好ましい実施態様において、ＩＭＯ部分はマイクロキャリヤーに架橋するために（例えば、５′−チオール修飾塩基またはリンカーによって提供された）少なくとも１つの遊離スルフヒドリルを含み、一方、マイクロキャリヤーは遊離アミン基を含む。４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジルのような、これらの２つの基と反応するヘテロ二官能性架橋剤（例えばマレイミド基およびＮＨＳエステルを含む架橋剤）が、ＩＭＯ／ＭＣ複合体を形成するために、ＭＣを活性化し、その後ＩＭＯを共有結合架橋するために使用される。
【０１２０】
非共有結合のＩＭＯ／ＭＣ複合体は、結合対がＩＭＯとＭＣを結合するものであるときは通常そうであるように、イオン（静電）結合、疎水的相互作用、水素結合、ファンデルワールス引力または２つ以上の異なる相互作用の組合わせを含む、任意の非共有結合または相互作用によって結合されてもよい。当業者には理解されるように、非共有結合のＩＭＯ／ＭＣ複合体は、ＭＣへのＩＭＯの吸着によって形成されてもよい。
【０１２１】
非共有結合のＩＭＯ／ＭＣ複合体は、典型的には、疎水性相互作用もしくは静電的（イオン性）相互作用またはそれらの組合わせによって複合体を形成される。ポリヌクレオチドの主鎖の親水性のために、複合体を形成するために疎水性相互作用に頼るＩＭＯ／ＭＣ複合体は、一般に、高疎水基を組み入れるために複合体のＩＭＯ部分の修飾を必要とする。好ましくは、疎水基は、生物学的適合性であり、非免疫原であり、かつ組成物を用いる予定の個体において生来見いだされる（例えば、哺乳類、特にヒトにおいて見いだされる）ものである。疎水基の例としては、脂質、ステロイド、コレステロールのようなステロール、およびテルペンが挙げられる。疎水基をＩＭＯに結合する方法は、もちろん、ＩＭＯの立体配置および疎水基の正体に依存するであろう。疎水基は、ＩＭＯ中の好都合ないかなる部位に付加してもよく、好ましくは５′末端または３′末端のいずれかに付加される。ＩＭＯにコレステロール基を付加する場合には、コレステロール基は、従来の化学反応を用いて、好ましくは、ＩＭＯの５′末端に付加される（例えば、Godard et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:404-410参照。）。疎水基を組み入れるために修飾された親水性物質も同様に利用できるけれども、好ましくは、疎水結合によって結合したＩＭＯ／ＭＣ複合体で使用されるマイクロキャリヤーは、油滴または疎水性ポリマーのような疎水性物質から作られる。マイクロキャリヤーがリポソームまたはその他の内腔を含む液相マイクロキャリヤーであるとき、ＩＭＯ／ＭＣ複合体は、ＭＣ製造プロセス中にＩＭＯの被包を避けるために、ＭＣの製造後にＩＭＯとＭＣを混合することによって形成される。
【０１２２】
静電結合によって結合した非共有結合ＩＭＯ／ＭＣ複合体は、典型的には、ポリヌクレオチド主鎖の高負電荷を利用している。したがって、非共有結合で結合されたＩＭＯ／ＭＣ複合体で使用されるマイクロキャリヤーは、一般に生理的ｐＨ（例えば約ｐＨ６．８〜７．４）において正に帯電（例えば陽イオン）している。マイクロキャリヤーは本来的に正電荷を持っていてもよいが、通常正電荷を持たない化合物から作られたマイクロキャリヤーは正に帯電（例えば陽イオンに）するために誘導体にしまたは他の方法で修飾してもよい。例えば、マイクロキャリヤーを作るのに用いられる重合体は、第一級アミンのような正に帯電した基を付加するために誘導体にしてもよい。交替に、正に帯電した化合物を製造中にマイクロキャリヤーの調合物に混合してもよい（例えば、結果として得られるマイクロキャリヤー粒子に正電荷を与えるために、例えば実施例２に記述するように、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体の製造中に正に帯電した界面活性剤を用いてもよい。）。したがって、マイクロキャリヤーは正に帯電した基を含んでもよい。
【０１２３】
一般に、陽イオン小球体を調製するために、陽イオンの脂質または重合体（例えば１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、またはポリリシン）が、ＤＰまたはＣＰのいずれかに、これらの相中のそれらの溶解度どおりに、添加される。
【０１２４】
一般に、ＩＭＯ／ＭＣ複合体は、好ましくは水性混合物中に、ＩＭＯと粒子を温置することによって陽イオン小球体上への吸着によって前もって形成することができる。そのような温置は、周囲温度（室温）（例えば約２０℃）または冷却下（例えば４℃）を含む、任意の所望の条件下で実行することができる。陽イオン小球体とＩＭＯは比較的迅速に会合するので、温置は、５分、１０分、１５分またはそれ以上（一晩およびもっと長い温置を含む。）のような任意の都合のよい時間であってもよい。しかしながら、陽イオン小球体とオリゴヌクレオチドは自然に会合するので、ＩＭＯ／ＭＣ複合体はＩＭＯとＭＣの単純な共投与によって形成することができる。小球体は、ＩＭＯ会合の前および後に、大きさと表面電荷について特徴づけられてもよい。その後、ここに記述されるように、選ばれたバッチは、例えば確立しているヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）とマウス脾細胞分析において適当な対照に対する活性について評価してもよい。製剤も適当な動物モデルで評価してもよい。
【０１２５】
他の実施態様において、結合対はＩＭＯ／ＭＣ複合体中のＩＭＯとＭＣを結合するために用いられてもよい。結合対は、受容体とリガンド、抗体と抗原（またはエピトープ）、または高い親和力（例えば約１０−８未満のＫｄ）で結合するその他の任意の結合対であってもよい。好ましい結合対の１つの型は、ビオチンとストレプトアビジン、またはビオチンとアビジンであり、それらは非常にしっかりと結合した複合体を形成する。ＩＭＯ／ＭＣ複合体結合を仲介するために結合対を用いるときは、ＩＭＯは、結合対の一方の構成要素で、典型的には共有結合によって、誘導され、ＭＣは結合対の他方の構成要素で誘導される。２つの誘導された化合物の混合はＩＭＯ／ＭＣ複合体形成をもたらす。
【０１２６】
多くのＩＭＯ／ＭＣ複合体の実施態様は抗原を含まず、ある実施態様は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体治療の対象である疾病または疾患に関連した抗原を排除する。さらなる実施態様においては、ＩＭＯはまた１つまたはそれ以上の抗原分子に結合される。抗原は、例えば国際公開第９８／１６２４７号パンフレットに記述されているように、共有結合および／または非共有結合の相互作用を含む様々な方法でＩＭＯ／ＭＣ複合体のＩＭＯ部分に結合していてもよい。交替に、抗原はマイクロキャリヤー（直接または間接的に）に結合していてもよい。ＩＭＯへの抗原の結合は、当技術分野において知られている非常に多くの方法のいずれによっても達成することができ、それらには直接の共有結合、架橋剤部分（それはスペーサーアームを含んでいてもよい。）を介する共有結合抱合、特異的結合対（例えばビオチンとアビジン）を介する非共有結合抱合および静電結合または疎水結合による非共有結合抱合が含まれるが、それらに限定されない。
【０１２７】
ＩＭＯに結合した抗原を含むＩＭＯ／ＭＣ複合体中の抗原とＩＭＯ間の結合は、ＩＭＯの３′または５′末端に、またはＩＭＯの内部の位置の適切に修飾された塩基のところに作ることができる。抗原がペプチドで、適当な反応性基（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含むならば、それはシトシン残基のＮ４アミノ基と直接反応させることができる。ＩＭＯ中のシトシン残基の数および位置に依存して、１つまたはそれ以上の残基での特定の結合を達成することができる。
【０１２８】
その代わりに、当技術分野において知られているような修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを、ＩＭＯの末端にまたは内部の位置に組み入れることができる。これらは、脱保護したときに、関心のある抗原の上に存在し得るまたは抗原に結合し得る様々な官能基と反応する、保護された官能基を含んでもよい。
【０１２９】
抗原がペプチドである場合、抱合体のこの部分は、固体担体の化学作用によってＩＭＯの３′末端に結合させることができる。例えば、ＩＭＯ部分は、担体上にあらかじめ合成されたポリペプチド部分に付加することができる。Haralambidis et al.(1990a) Nucleic Acids Res. 18:493-499、およびHaralambidis et al. (1990b) Nucleic Acids Res. 18:501-505。その代わりに、ＩＭＯは、それが３′末端から伸びる開裂し得るリンカーを介して固体担体に連結されるように合成してもよい。担体からのＩＭＯの化学開裂に際して、末端チオール基がオリゴヌクレオチドの３′末端に残されるか（Zuckermann et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:5305-5321およびCorey et al. (1987) Science 238:1401-1403）、または末端アミノ基がオリゴヌクレオチドの３′末端に残される（Nelson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:1781-1794）。ペプチドのアミノ基へのアミノ修飾ＩＭＯの抱合は、Benoit et al. (1987) Neuromethods 6:43-72に記述されているように行なうことができる。ペプチドのカルボキシル基へのチオール修飾ＩＭＯの抱合は、Sinha et al. (1991), pp. 185-210, Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Pressに記述されているように行なうことができる。ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖への付加マレイミドを有するオリゴヌクレオチドの結合も記述されている。Tung et al. (1991) Bioconjug Chem. 2:464-465。
【０１３０】
抱合体のペプチド部分は、オリゴヌクレオチドの合成中にオリゴヌクレオチドの中に組み入れられたアミン、チオールまたはカルボキシル基を介してＩＭＯの５′末端に結合させることができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは固体担体に固定されるが、一方の末端に保護されたアミン、チオールまたはカルボキシルを、他方の末端にホスホルアミダイトを含む結合基は、５′−ヒドロキシルに共有結合で結合する。Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245、Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502、Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909、Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139、Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164:336-344、Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299、ならびに米国特許第４，８４９，５１３号明細書、米国特許第５，０１５，７３３号明細書、米国特許第５，１１８，８００号明細書および米国特許第５，１１８，８０２号明細書。脱保護の後に続いて、アミン、チオールおよびカルボキシル官能基は、ペプチドにオリゴヌクレオチドを共有結合で結合させるために用いることができる。Benoit et al. (1987)、およびSinha et al. (1991)。
【０１３１】
ＩＭＯ抗原抱合体は、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合および／またはファンデルワールス引力のような非共有結合相互作用によって形成することもできる。
【０１３２】
非共有結合で結合した抱合体は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体のような非共有結合相互作用を含むことができる。ビオチニル基は、例えばＩＭＯの修飾塩基に結合させることができる。Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651。ペプチド部分の中へのストレプトアビジン部分の組み込みは、ストレプトアビジン抱合ペプチドとビオチニル化オリゴヌクレオチドの非共有結合複合体の形成を可能にする。
【０１３３】
非共有結合の会合もまた、ＩＭＯおよび帯電したアミノ酸のような抗原内の残基を含むイオン相互作用によって、またはオリゴヌクレオチドと抗原の両方と相互に作用することができる帯電した残基を含むリンカー部分の使用によって、起こり得る。例えば、非共有結合の抱合が、一般に負に帯電したＩＭＯと、ペプチドの正に帯電したアミノ酸残基（例えばポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン残基）との間に起こり得る。
【０１３４】
ＩＭＯと抗原の間の非共有結合抱合は、それらの生来のリガンドとしてＤＮＡと相互作用する分子のＤＮＡ結合モチーフを介して起こり得る。例えば、そのようなＤＮＡ結合モチーフは、転写因子および抗ＤＮＡ抗体の中に見いだすことができる。
【０１３５】
脂質へのＩＭＯの結合は標準方法を用いて形成することができる。これらの方法には、オリゴヌクレオチド・リン脂質抱合体（Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192）、オリゴヌクレオチド・脂肪酸抱合体（Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185:131-135およびStaros et al. (1986) Anal. Biochem. 156:220-222）およびオリゴヌクレオチド・ステロール抱合体の合成が含まれるが、それらに限定されない。Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731。
【０１３６】
オリゴ糖へのＩＭＯの結合は標準の既知の方法を用いて形成することができる。これらの方法には、オリゴヌクレオチド・オリゴ糖抱合体（ここでオリゴ糖は免疫グロブリンの部分である。）の合成が含まれるが、それらに限定されない。O'Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7:347-355。
【０１３７】
オリゴヌクレオチドへのペプチドおよびその他の分子の結合のための追加の方法は、米国特許第５，３９１，７２３号明細書、Kessler (1992) “Nonradioactive labeling methods for nucleic acids” in Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press、およびGeoghegan et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3:138-146に見いだすことができる。
【０１３８】
ＭＣの内部に包み込まれたＩＭＯ
本発明のもう一つの側面においては、ＩＭＯはマイクロキャリヤーの内部に包み込まれ（「ＩＭＯ／ＭＣ被包体」）、好ましくはＩＭＯの複数の分子が各々のマイクロキャリヤーの内部に包み込まれる。ある実施態様において、マイクロキャリヤーが１つを越えるＩＭＯ種を包み込むように、異なるＩＭＯの混合物がマイクロキャリヤーで包み込まれてもよい。ＩＭＯがＭＣの内部に包み込まれている実施態様のあるものでは、ＩＭＯは三量体、四量体または五量体（３〜５量体）である。ＩＭＯがＭＣの内部に包み込まれる、ある実施態様においては、ＩＭＯは、配列５′−ＴＴＣＧＡＡ−３′、５′−ＧＡＣＧＴＴ−３′および／または５′−ＧＡＧＣＴＴ−３′を除き、ここに記述されたいかなる六量体であってもよい。例えば、六量体ＩＭＯは配列５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′または５′−Ｘ１ＵＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０または１個のヌクレオチドであり、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドである。）を有する。ＩＭＯ／ＭＣ被包体において利用することができるＩＭＯの追加の具体例は上に述べられている。
【０１３９】
マイクロキャリヤーの中にオリゴヌクレオチドを包み込む方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば国際公開第９８／５５４９５号パンフレットに記述されている。小球体、ビーズ、巨大分子複合体、ナノカプセルのようなコロイド分散系ならびに水中油型乳濁液、ミセル、混合ミセルおよびリポソームのような脂質を主成分とする系は、ＭＣ組成物内にＩＭＯを効果的に包み込むことができる。被包組成物は、さらに種々様々の成分のいかなるものを含んでもよい。これらには、ミョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜組織（ＬＭＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびにポリペプチド、グリコペプチドおよび多糖のようなその他のポリマーが含まれるが、それらに限定されない。
【０１４０】
本発明の方法
本発明は、免疫応答の所望の調節が達成されるように、個体に（典型的には複合体または被包体および薬理学的に許容される賦形剤を含む組成物中の）ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を投与することからなる、個体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの免疫応答を調節する方法を提供する。免疫調節はＴｈ１型免疫応答を刺激することおよび／またはＴｈ２型免疫応答を抑制しまたは減少することを含んでいてもよい。
【０１４１】
ある実施態様において、免疫の調節は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２および／またはＩＦＮ−αのような、１つまたはそれ以上のＴｈ１関連サイトカインを刺激することを含む。ある実施態様においては、免疫の調節は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−５のような、１つまたはそれ以上のＴｈ２関連サイトカインの産生を抑制することを含む。これらのパラメーターの測定は、当技術分野において標準の方法を用い、そしてここで論じられた。
【０１４２】
ここに記述されるように、ＩＭＯ／ＭＣの投与は、さらに１つまたはそれ以上の追加の免疫療法作用薬（すなわち免疫系を介して作用しおよび／または免疫系から誘導される作用薬）の投与を含んでもよく、それらにはサイトカイン、アジュバントおよび抗体が含まれるが、これらに限定されない。治療抗体の具体例は、癌の情況において用いられるもの（例えば抗腫瘍抗体）を含む。そのような追加の免疫療法作用薬の投与は、ここに述べられたすべての方法に当てはまる。癌の情況において、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与は、例えば抗腫瘍抗体、化学療法生活規制および／または放射線治療のような１つまたはそれ以上の追加の治療薬の投与をさらに含んでもよい。抗腫瘍抗体（抗腫瘍抗体断片および／またはその誘導体、および単クローンの抗腫瘍抗体、その断片および／または誘導体を含むが、それらに限定されない。）は当技術分野において知られており、癌治療におけるそのような抗体試薬（例えばリツキシマブ、ハーセプチン）の投与も知られている。１つまたはそれ以上の追加の治療薬の投与は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与の前に行ってもよいし、その投与の後に行ってもよいし、その投与と同時に行ってもよい。
【０１４３】
ある実施態様においては、個体は、アレルギーまたはアレルギー誘発喘息のようなＴｈ２型免疫応答に関連した疾患に罹っている。ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与は免疫調節をもたらし、１つまたはそれ以上のＴｈ１型応答に関連するサイトカインの値を増加する。それは、個体のアレルゲンに対する応答に関連したＴｈ２型応答特徴の減少をもたらしてもよい。Ｔｈ２型応答関連疾患を持った個体の免疫調節は、疾患の症状の１つまたはそれ以上の減少または改善をもたらす。疾患がアレルギーまたはアレルギー誘発喘息である場合、症状の１つまたはそれ以上の改善は、鼻炎、アレルギー性結膜炎、ＩｇＥの循環値、ヒスタミンの循環値および／または「救助」吸入器治療（例えば計量式吸入器または噴霧器によって投与される吸入アルブテロール）の必要のうちの１つまたはそれ以上の減少を含む。喘息の治療に関する本発明の方法が、喘息の１つまたはそれ以上の症状の改善をもたらす、内在する原因の治療であると信じられることは注目されるべきである。したがって、喘息を患っている個体は、喘息と診察されており、治療の時またはその頃は急性喘息を患っている必要がない個体である。
【０１４４】
さらなる実施態様において、本発明の免疫調節療法を受ける個体は、ワクチンを受ける個体である。ワクチンは予防ワクチンであってもよいし、治療ワクチンであってもよい。予防ワクチンは、個体がその危険性があるかもしれない疾患に関連した１つまたはそれ以上のエピトープ（例えば、結核の予防のためのワクチンとしてのヒト結核菌抗原、アレルギーの予防のためのワクチンとしてのアレルゲン、癌の予防のための腫瘍関連抗原）を含む。治療ワクチンは、肺結核患者のヒト結核菌またはウシ結核菌表面抗原、アレルギーを起こしやすい個体においてその個体が抗原に対してアレルギー性であるときのその抗原（すなわちアレルギー減感作療法）、癌を患った個体からの腫瘍細胞（例えば米国特許第５，４８４，５９６号明細書に記述されているような）、または癌患者の腫瘍関連抗原のような、個体を冒す特定の疾患に関連した１つまたはそれ以上のエピトープを含む。
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、ワクチンと共に（例えば、同じ注射で、または同時ではあるが別々の注射で）投薬してもよいし、別々に（例えば、ワクチンの投与の少なくとも１２時間前または後に）投与してもよい。ある実施態様においては、ワクチンの抗原は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体に共有結合または非共有結合のいずれかの結合によってＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の一部となっている。ワクチンを受ける個体へのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体療法の投与は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体なしでワクチンを受ける個体と比較して、Ｔｈ１型応答の方へシフトしたワクチンに対する免疫応答をもたらす。Ｔｈ１型応答の方へのシフトは、ワクチン中の抗原に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答、増加したＩＦＮ−γおよびその他のＴｈ１型応答関連サイトカイン、増加したＩＦＮ−α、ワクチンの抗原に特異的なＣＴＬの産生、ワクチンの抗原に特異的なＩｇＥの低い値または減少させられた値、ワクチンの抗原に特異的なＴｈ２関連抗体の減少、および／またはワクチンの抗原に特異的なＴｈ１関連抗体の増加によって認識することができる。治療ワクチンの場合には、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体およびワクチンの投与もまた、ワクチンが治療しようとする疾患の症状の改善をもたらす。当業者には明らかなように、正確な症状およびそれらの改善の様子は、治療することが求められている疾患に依存するであろう。例えば、治療ワクチンが結核向けである場合、ワクチンを伴うＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体治療は、咳、胸膜痛または胸壁痛、熱、および／または当技術分野において知られている他の症状の減少をもたらす。ワクチンがアレルギー減感作療法において用いられるアレルゲンである場合、治療は、アレルギーの１つまたはそれ以上の症状の減少（例えば、鼻炎、アレルギー性結膜炎、ＩｇＥの循環値、および／またはヒスタミンの循環値の減少）をもたらす。
【０１４５】
本発明の他の実施態様は、癌または感染症のような先行疾病または疾患を持つ個体の免疫調節療法に関する。大部分の癌は身体中の他の細胞上に見いだされない腫瘍関連および／または腫瘍特異性抗原を発現するので、癌は免疫調節の興味を引く標的である。腫瘍細胞に対するＴｈ１型応答の刺激は、免疫系によって、腫瘍細胞の直接の死滅および／または局外者（bystander）の死滅をもたらし、癌細胞の減少および症状の軽減に至る。癌にかかっている個体へのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与は、腫瘍細胞に対するＴｈ１型免疫応答の刺激をもたらす。そのような免疫応答は、細胞免疫系の細胞（例えばＣＴＬ）もしくは体液免疫系の成分の直接作用によって、または免疫系の標的とされた細胞に隣接する細胞に対する局外者効果によって、腫瘍細胞を死滅させることができる。
【０１４６】
また、発明に従う免疫調節療法は、感染症、特に体液性免疫応答に抵抗力のある感染症（例えばミコバクテリア感染および細胞内病原体によって引き起こされた疾病）を持つ個体にも有用である。免疫調節療法は、細胞病原体（例えば細菌または原生動物）によって、または非細胞病原体（例えばウイルス）によって引き起こされた感染症の治療に用いてもよい。ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体療法は、結核（例えばヒト結核菌および／またはウシ結核菌感染）、ハンセン病（すなわちらい菌感染）、またはミコバクテリウムマリヌムもしくはミコバクテリウムウルセランス感染のような、ミコバクテリア症に罹っている個体に投与してもよい。また、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体療法は、インフルエンザウイルス、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、特に単純性疱疹ウイルス（ＨＳＶ２を含む）、および乳頭腫ウイルスによる感染を含むウイルス感染の治療にも有用である。マラリア（例えば三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫および／または四日熱マラリア原虫による感染）、リーシュマニア症（例えばドノバンリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、メキシコリーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、ペルーリーシュマニア、幼児リーシュマニア、シャーガスリーシュマニアおよび／またはエチオピアリーシュマニアによる感染）およびトキソプラズマ症（すなわちトキソプラズマ症ゴンディによる感染）のような細胞内寄生体によって引き起こされる疾病もまた、ＩＭＯ／ＭＣ複合体被包体療法から利益を得る。ＩＭＯ／ＭＣ療法は、住血吸虫症（すなわちビルハルツ住血吸虫、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫およびメコン住血吸虫のような住血吸虫属の住血吸虫による感染）および肝吸虫症（すなわち肝吸虫による感染）のような寄生虫症の治療にも有用である。感染症に罹っている個体へのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与は、感染症の１つまたはそれ以上の症状の改善をもたらす。
【０１４７】
本発明は、さらに、個体中の少なくとも１つのＴｈ１関連サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γを含む。）を増加させる方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、個体へのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の有効量を投与することによって、個体中の、特に増加したＩＦＮ−γ値を必要としている個体中の、ＩＦＮ−γを増加させる方法を提供する。増加したＩＦＮ−γを必要としている個体は、ＩＦＮ−γの投与に応答する疾患がある個体である。そのような疾患は、限定されないが潰瘍性大腸炎を含む数多くの炎症性疾患を含む。そのような疾患には多くの線維症の疾患も含まれ、線維症には、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、強皮症、皮膚の放射線誘発線維症、肝線維症（住血吸虫症に誘発された肝線維症を含む。）、腎線維症、さらにＩＦＮ−γの投与によって改善することができるその他の状態が含まれるが、それらに限定されない。本発明に従うＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与は、ＩＦＮ−γ値の増加をもたらし、ＩＦＮ−γに応答する疾患の１つまたはそれ以上の症状の改善、１つまたはそれ以上の症状の安定化、または進行の防止（例えば追加の病変または症状の軽減または除去）をもたらす。本発明の方法は、ＩＰＦにおける全身性コルチコステロイド療法（例えばコルチゾン）のような抗炎症剤の投与のような、疾患のための医療の標準を構築する他の療法と組み合わせて実施してもよい。
【０１４８】
ある実施態様において、本発明は、ＩＦＮ−α値が増加するように、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の有効量を個体に投与することによって、個体中の、特に増加したＩＦＮ−α値を必要としている個体中のＩＦＮ−αを増加させる方法を提供する。増加したＩＦＮ−αを必要としている個体は、ＩＦＮ−α（組換えＩＦＮ−αを含む。）の投与に応答する疾患がある個体であり、そのような疾患にはウイルス感染および癌が含まれるが、それらに限定されない。
【０１４９】
本発明に従うＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与は、ＩＦＮ−α値の増加をもたらし、ＩＦＮ−αに応答する疾患の１つまたはそれ以上の症状の改善、１つまたはそれ以上の症状の安定化、または進行の防止（例えば追加の病変または症状の軽減または除去）をもたらす。本発明の方法は、ウイルス感染のための抗ウイルス薬の投与のような、疾患のための医療標準を構築する他の療法と組み合わせて実施してもよい。
【０１５０】
また、ＩｇＥの値が減少するように、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の有効量を個体に投与することによって、ＩｇＥ関連疾患を持つ個体中のＩｇＥ値（特に血中濃度）を減少させる方法も提供される。ＩｇＥの減少は、ＩｇＥ関連疾患の症状の改善をもたらす。そのような症状には、鼻炎、結膜炎、アレルゲンに対する減少した感度、アレルギーを持った個体のアレルギーの症状の減少、またはアレルギー応答の激烈さの減少のような、アレルギー症状が含まれる。
【０１５１】
当業者には明らかなように、本発明の方法は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を投与するための特定の適応のために他の療法と組み合わせて実施してもよい。例えば、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体療法は、マラリア患者のためにクロロキンのような抗マラリア熱の薬と共に、リーシュマニア症患者のためにペンタミジンおよび／またはアロプリノールのようなリーシュマニア症の薬と共に、肺結核患者にイソニアジド、リファンピンおよび／またはエタンブトールのような抗ミコバクテリアの薬と共に、またはアトピー（アレルギー）患者のためにアレルゲン減感作療法と共に投与してもよい。
【０１５２】
投与および免疫応答の評価
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、他の製薬および／または免疫原性および／または免疫刺激性物質と組み合わせて投与することができ、それの生理学的に許容される担体と組み合わせることができる。
【０１５３】
したがって、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、他の免疫療法薬（サイトカイン、アジュバントおよび抗体を含むが、それらに限定されない。）と共に投与することができる。
【０１５４】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、ＩＭＯ／ＭＣが活性である限り、上記したＩＭＯおよびＭＣのいかなる組合わせを含んでもよい。一般に、ある実施態様において、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体が少なくとも１つの活性分析において負の対照の活性の少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも５倍、さらに好ましくは１０倍の活性を有する（すなわち、試験管内、生体内でおよび／または生体外で測定したときに測定可能な免疫応答に影響を与える）ならば、そのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は活性であると見なされるであろう。測定可能な免疫応答を評価する方法は、当技術分野においてよく知られており、ここに開示されたヒトＰＢＭＣ分析法を含む。
【０１５５】
すべての免疫原組成物に関し、特定のＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤の免疫学的有効量および投与方法は、個体、治療されるべき状態、および当業者に明らかなその他の因子をよって変わり得る。考慮すべき因子には、抗原性、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体がアジュバントまたは配達分子と一緒に投与されるかまたはアジュバントまたは配達分子と共有結合で結合しているか否か、投与経路、および投与される免疫用量の数値が含まれる。そのような因子は当技術分野において知られており、それは、過度の実験をしないでそのような決定をすることは十分に当業者の技量の範囲内である。適切な用量の範囲は、抗原に対する免疫応答の所望の調節を与える範囲である。一般に、用量は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の全体の量ではなく、むしろ患者に投与されるＩＭＯの量によって決定される。ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の有用な用量の範囲は、投与されるＩＭＯの量で示せば、例えば、約０．１〜１００μｇ／ｋｇ、０．１〜５０μｇ／ｋｇ、０．１〜２５μｇ／ｋｇ、０．１〜１０μｇ／ｋｇ、１〜５００μｇ／ｋｇ、１００〜４００μｇ／ｋｇ、２００〜３００μｇ／ｋｇ、１〜１００μｇ／ｋｇ、１００〜２００μｇ／ｋｇ、３００〜４００μｇ／ｋｇ、４００〜５００μｇ／ｋｇのいずれであってもよい。その代わりに、用量は、約０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、５．０μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇのいずれであってもよい。したがって、用量の範囲は、下限が約０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇおよび１．０μｇで、上限が約２５μｇ、５０μｇおよび１００μｇの範囲であってもよい。各患者に与えられる絶対量は、生物学的利用能、クリアランス率および投与経路のような薬理学的性質に依存する。
【０１５６】
特定のＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤の有効量および投与方法は、個々の患者、および疾病の病期、および当業者に明らかなその他の因子をよって変わり得る。特定の適用に有用な投与経路は当業者に明らかである。投与経路に、局所的、皮膚、経皮、経粘膜、表皮、非経口、胃腸、ならびに鼻咽頭および肺（経気管支および経肺胞を含む。）が含まれるが、それらに限定されない。適切な用量の範囲は、血中濃度によって測定したときに約１−１０μＭの組織中濃度を達成するために十分なＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を与える範囲である。各患者に与えられる絶対量は、生物学的利用能、クリアランス率および投与経路のような薬理学的性質に依存する。
【０１５７】
ここに記述されるように、ＡＰＣおよび高濃度のＡＰＣを含む組織は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の好ましい標的である。したがって、哺乳動物の皮膚および／または粘膜はＡＰＣが比較的高濃度で存在するので、そこへのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の投与が好ましい。
【０１５８】
本発明は局所適用に適するＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤を提供し、それらには生理学的に許容される埋没物、軟膏剤、クリーム剤、リンス剤およびゲル剤が含まれるが、これらに限定されない。局所的投与は、例えば、配達系をその中に分散させた包帯または帯具に、切り口または開いた傷口の中への配達系の直接投与に、または関心のある部位に向けられた経皮投与器具による。ＩＭＯ／ＭＣ複合体被包体をその中に分散させたクリーム剤、リンス剤、ゲル剤または軟膏剤は、局所軟膏または傷充填剤として使用するのに適している。
【０１５９】
経皮投与の好ましい経路は、侵襲性が最も少ない経路である。これらの手段の中で、経皮伝達、表皮投与および皮下注射が好ましい。これらの手段のうち、表皮投与は、皮内組織にあると予想されるＡＰＣのより大きな濃度に対して好ましい。
【０１６０】
経皮投与は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体が皮膚に浸透し、血流に入ることを可能にすることができるクリーム剤、リンス剤、ゲル剤などの塗布によって達成される。経皮投与に適する組成物には、皮膚に直接塗布されるかまたは経皮的な器具（いわゆる「貼付剤」）のような保護担体の中に含有せしめた、薬理学的に許容される懸濁液、油、クリーム剤および軟膏剤が含まれるが、それらに限定されない。適当なクリーム剤、軟膏剤などの具体例は、例えば、医師用添付文書集の中に見いだすことができる。
【０１６１】
経皮伝達については、イオン導入法が適切な方法である。イオン導入伝達は、数日またはそれ以上の期間の間、完全な皮膚を通して連続的にそれらの製品を配達する、商業的に入手可能な貼付剤を用いて達成することができる。この方法の使用は、比較的高濃度で製薬組成物の制御された伝達を可能にし、組合せ医薬品の注入を可能にし、吸収促進剤の同時使用を可能にする。
【０１６２】
この方法で使用される典型的な貼付剤製品は、カリフォルニア州ロサンゼルスのゼネラル・メディカル社（General Medical Company）のレクトロパッチ（LECTRO PATCH）という商標名の製品である。この製品は、電子的に中性のｐＨで貯蔵電極を維持し、連続的におよび／または周期的に投薬するために、異なる濃度の用量を提供するように適合させることができる。貼付剤の調製および使用は、レクトロパッチ製品に添付されたメーカーの印刷された使用説明書に従って行なわれるべきであり、それらの使用説明書は、この引用によってここに含まれる。他の閉鎖性貼付剤系も適している。
【０１６３】
経皮伝達については、低周波超音波配達もまた適切な方法である。Mitragotri et al. (1995) Science 269:850-853。低周波の超音波周波数（約１ＭＨｚ）の適用は、高分子量のものを含む治療用組成物の全身に制御された配達を可能にする。
【０１６４】
表皮投与は、本質的に、刺激原に対する免疫応答を誘発するために、表皮の最外層を機械的にまたは化学的に十分に刺激することを含む。特に、その刺激は、刺激した部位にＡＰＣを引き寄せるのに十分でなければならない。
【０１６５】
典型的な機械的な刺激手段は、尖叉の端から移されたＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を吸収するために、皮膚を刺激し、刺激の部位にＡＰＣを引き寄せるために用いることができる、多数の非常に狭い直径の短い尖叉を利用する。例えば、フランス国リヨンのパスツール・メリュー（Pasteur Merieux）によって製造されたＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ旧ツベルクリン試験は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含む組成物の導入に適した器具を含む。
【０１６６】
その器具は、ペンシルバニア州スイフトウォーターのコンノート・ラボラトリーズ社（Connaught Laboratories, Inc.）によって米国で流通しているが、一方の端に注射器プランジャーを、他方の端に尖叉ディスクを有するプラスチック容器からなる。尖叉ディスクは、最外層の表皮細胞だけを引っ掻く長さの多数の狭い直径の尖叉を支持している。ＭＯＮＯ−ＶＡＣＣキットの尖叉の各々は旧ツベルクリンが塗られ、本発明においては、各針はＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤の製薬組成物で塗られる。その器具の使用は、好ましくは、器具製品と一緒に含まれているメーカーの書面の使用説明書に従う。この実施態様にも用いることができる類似の器具は、アレルギーテストを行なうために広く用いられているものである。
【０１６７】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の表皮投与への別の適した手法は、表皮の最も外側の細胞を刺激する化学薬品を使用し、それによりその場所にＡＰＣを引き寄せるのに十分な免疫応答を誘発することである。一つの具体例は、ＮＡＩＲ（登録商標）の商標名でノグゼマ社（Noxema Corporation）によって販売されている商業的に入手可能な局所的脱毛剤クレームに用いられるサリチル酸のような角質剤（keratinolytic agent）である。この手法は、粘膜への上皮投与を達成するために用いることもできる。化学的刺激原は、（例えば、もしＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ型尖叉に化学的刺激原を塗れば起こるように）機械的刺激原と共同して塗布することもできる。ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、また化学的刺激原をも含む担体の中に懸濁してもよいし、それと一緒に共投与してもよい。
【０１６８】
非経口投与経路は、電気的注入（イオン導入法）または、中心静脈内への直接注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、または皮下注射のような直接注入を含むが、それらに限定されない。非経口投与に適するＩＭＯ／ＭＣ製剤は、一般に米国薬局方水または注射用水中で処方され、さらにｐＨ緩衝剤、塩充填剤、防腐剤およびその他の薬理学的に許容される賦形剤を含んでもよい。非経口注射剤用ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体は、注射のための食塩水および燐酸塩緩衝食塩水のような薬理学的に許容される無菌の等張液中で処方してもよい。
【０１６９】
胃腸投与経路は、経口摂取および直腸を含むが、それらに限定されない。本発明は胃腸投与に適するＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤を含み、それらには、経口摂取のための薬理学的に許容される粉末、ピルまたは液体、および直腸内投与のための坐剤が含まれるが、それらに限定されない。当業者には明らかなように、ピルまたは坐剤は、組成物に嵩を与えるために、デンプンのような薬理学的に許容される固体をさらに含むであろう。
【０１７０】
鼻咽頭および肺投与は、吸入によって達成され、鼻腔内、経気管支および経肺胞経路のような配達経路を含む。本発明は、吸入による投与に適するＩＭＯ／ＭＣの複合体または被包体製剤を含み、それらには、乾燥粉末吸入配達系用の粉末形態と同様に、エアゾール剤を形成するための液体懸濁液も含まれるが、これらに限定されない。ＩＭＯ／ＭＣの複合体または被包体製剤の吸入による投与に適する器具は、噴霧器（atomizers）、蒸発器、霧吹き器（nebulizers）および乾燥粉末吸入配達装置を含むが、それらに限定されない。
【０１７１】
配達経路の選択は誘発された免疫応答を調節するために用いることができる。例えば、インフルエンザウイルスベクターが、筋肉内または表皮（遺伝子銃）経路で投与されたとき、ＩｇＧ滴定濃度およびＣＴＬ活性は同一であった。しかしながら、筋肉接種は主としてＩｇＧ２ａを産出し、一方、表皮経路は多くの場合ＩｇＧ１を産出した。Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70:6119-6125。したがって、当業者は、本発明の免疫調節性オリゴヌクレオチドを投与する異なる経路によって誘発された免疫原性のわずかな違いを利用することができる。
【０１７２】
前述の組成物および投与方法は、本発明のＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤を投与する方法を記述しているが限定するものではない。種々の組成物および装置を製造する方法は、当業者の能力の範囲内であり、ここでは詳細には記述しない。
【０１７３】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤の活性の分析（定性的および定量的の両方）は、当技術分野において知られているいかなる方法によってもよい。その方法には、抗原特異抗体産生測定（特異抗体亜綱測定を含む。）、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞のようなリンパ球の特異的母集団の活性化、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２のようなサイトカインの産生、および／またはヒスタミンの放出が含まれるが、それらに限定されない。特異抗体応答を測定する方法は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を含み、当技術分野においてよく知られている。ＣＤ４＋Ｔ細胞のような多くの特異的な型のリンパ球の測定は、例えば蛍光細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）で達成することができる。細胞毒性分析は、例えば、Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523に記述されているように行なうことができる。サイトカイン濃度は、例えばＥＬＩＳＡで測定することができる。免疫原に対する免疫応答を評価するこれらのおよびその他の分析法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Selected Methods in Cellular Immunology (1980) Mishell and Shiigi, eds., W.H. Freeman and Co.参照。ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の活性を測定する好ましい１つの方法は、下記実施例に記述するような、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体に末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ、好ましくはヒトＰＢＭＣ））の応答を測定する分析法である。
【０１７４】
好ましくは、Ｔｈ１型応答は刺激される、すなわち、誘発されまたは増強される。本発明に関して、Ｔｈ１型免疫応答の刺激は、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体なしで治療されたものと比較して、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体で治療された細胞からのサイトカイン産生の測定によって、試験管内または生体外で、決定することができる。細胞のサイトカイン産生を決定する方法は、ここに記述されたそれらの方法および当技術分野において知られている任意の方法を含む。ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体治療に応答して産生したサイトカインの型は、細胞によるＴｈ１型またはＴｈ２型に偏った免疫応答を示す。ここで使用するときは、用語「Ｔｈ１型に偏った」サイトカイン産生とは、刺激がない状態でのＴｈ１型免疫応答に関連したサイトカインの産生と比較して、刺激物の存在下でＴｈ１型免疫応答に関連したサイトカインの測定可能な増加した産生をいう。そのようなＴｈ１型に偏ったサイトカインの具体例は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γを含むが、それらに限定されない。対照的に、「Ｔｈ２型に偏ったサイトカイン」とは、Ｔｈ２型免疫応答に関連したサイトカインをいい、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を含むが、それらに限定されない。ＩＭＯ／ＭＣの複合体または被包体活性の決定に有用な細胞は、免疫系の細胞、宿主および／または細胞系から単離された一次細胞、好ましくはＡＰＣおよびリンパ球、より好ましくはマクロファージおよびＴ細胞を含む。
【０１７５】
Ｔｈ１型免疫応答の刺激も、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体製剤で治療された宿主において測定することができ、当技術分野において知られているいかなる方法によって決定してもよい。その方法としては、限定するものではないが、次のものが挙げられる。（１）抗原攻撃の前および後に測定されたＩＬ−４またはＩＬ−５値の減少、または抗原で準備刺激された、もしくは準備刺激されかつ攻撃された、ＩＭＯなしで治療された対照と比較して、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体で治療された宿主中のＩＬ−４またはＩＬ−５のより低い（または不在の）値の検出、（２）抗原攻撃の前および後のＩＬ−１２、ＩＬ−１８および／またはＩＦＮ（α、βまたはγ）の値の増加、または抗原で準備刺激された、もしくは準備刺激されかつ攻撃された、ＩＭＯなしで治療された対照と比較して、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体で治療された宿主中のＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＦＮ（α、βまたはγ）のより高い値の検出、（３）ＩＭＯなしで治療された対照と比較して、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体で治療された宿主中の「Ｔｈ１型に偏った」抗体産生、および／または（４）抗原攻撃の前および後に測定されるような抗原特異性ＩｇＥの値の減少、または抗原で準備刺激された、もしくは準備刺激されかつ攻撃された、ＩＭＯなしで治療された対照と比較して、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体で治療された宿主中の抗原特異性ＩｇＥのより低い（または不在の）値の検出。様々なこれらの決定は、ここに記述された方法または当技術分野において知られている任意の方法を用いて、試験管内または生体外で、ＡＰＣおよび／またはリンパ球、好ましくはマクロファージおよび／またはＴ細胞によって作られたサイトカインを測定することによってなすことができる。これらの決定のいくつかは、ここに記述された方法または当技術分野において知られている任意の方法を用いて、抗原特異抗体の綱および／または亜綱を測定することによってなすことができる。
【０１７６】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体治療に応答して産生された抗原特異抗体の綱および／または亜綱は、細胞による、Ｔｈ１型またはＴｈ２型に偏った免疫応答を示す。ここで使用するときは、用語「Ｔｈ１型に偏った」抗体産生とは、Ｔｈ１型免疫応答に関連した抗体（すなわちＴｈ１関連抗体）の測定可能な増加した産生をいう。１つまたはそれ以上のＴｈ１関連抗体が測定されてもよい。そのようなＴｈ１型に偏った抗体の具体例には、ヒトＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３（例えばWidhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575-581およびde Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83:160-164参照。）およびネズミＩｇＧ２ａが含まれるが、それらに限定されない。対照的に、「Ｔｈ２型に偏った抗体」とは、Ｔｈ２型免疫応答に関連したものをいい、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ４および／またはＩｇＥ（例えばWidhe et al. (1998)およびde Martino et al. (1999)参照。）およびネズミＩｇＧ１またはＩｇＥを含むが、それらに限定されない。
【０１７７】
ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体投与の結果として発生するＴｈ１型に偏ったサイトカイン誘発は、ＮＫ細胞、細胞毒キラー細胞、Ｔｈ１ヘルパーおよび記憶細胞によって行なわれる応答のような増強された細胞性免疫応答を生じる。これらの応答は、腫瘍と同様に、ウイルス、真菌、原虫寄生体、細菌、アレルギー性疾患および喘息の予防または治療のワクチン注射において使用するのに特に有益である。
【０１７８】
ある実施態様においては、Ｔｈ２応答は抑制される。Ｔｈ２応答の抑制は、例えば、アレルゲンに応答して、ＩｇＥ減少およびヒスタミン放出の減少と同様に、ＩＬ−４およびＩＬ−５のようなＴｈ２関連サイトカインの値の減少によって決定することができる。
【０１７９】
本発明のキット
その本発明は、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。ある実施態様において、本発明のキットは、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含む１つまたはそれ以上の容器、および随意に意図した治療（例えば、免疫調節、感染症の１つまたはそれ以上の症状の改善、ＩＦＮ−γ値の増加、ＩＦＮ−α値の増加、またはＩｇＥ関連疾患の改善）のためのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の使用に関する一組の使用説明書、一般に書面の使用説明書を含む。さらなる実施態様において、本発明のキットは、ＩＭＯ／ＭＣを調製するための物質の容器、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を調製するための使用説明書、および随意に、意図した治療のためのＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の使用に関する使用説明書を含む。
【０１８０】
前もって形成されたＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含むキットは、任意の都合よい適正な包装に包まれたＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体を含む。例えば、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体が乾燥した製剤（例えば、凍結乾燥または乾燥した粉末）であるならば、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体が弾力のある栓を通して液体を注射することによって容易に再懸濁されるように、弾力のある栓を備えた薬瓶が通常用いられる。弾力のない取りはずしのきく閉鎖（例えば密封したガラス）または弾力のある栓を備えたアンプルは、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の液体製剤に最も都合よく用いられる。吸入器、鼻投与器具（例えば噴霧器）またはミニポンプのような輸液用器具のような特定の装置と組み合わせて使用するための包装も考えられる。
【０１８１】
ある実施態様においては（特にＩＭＯ／ＭＣ被包体のための）ＭＣを調製するための物質は、前もって形成されたＭＣではなく供給されるが、ＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体の調製のための物質を含むキットは一般にはＩＭＯとＭＣの別々の容器を含む。ＩＭＯとＭＣは、好ましくは、供給されたＩＭＯとＭＣを混合したときにＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体が形成されるような形で供給される。ＩＭＯ／ＭＣ複合体が非共有結合によって結合しているときまたはＩＭＯ／ＭＣ被包体が要望されるときは、この構成が好ましい。ＩＭＯとＭＣがヘテロ二官能性架橋剤を介して架橋するものであるときも、この構成が好ましく、ＩＭＯまたはＭＣのいずれかが「活性化」された形（例えば、ＩＭＯと反応する基が利用可能なようにヘテロ二官能性架橋剤に結合した形）で供給される。
【０１８２】
液相ＭＣを含むＩＭＯ／ＭＣ複合体または被包体用のキットは、好ましくは、液相ＭＣを調製するための物質を含む１つまたはそれ以上の容器を含む。例えば、水中油型乳濁液ＭＣ用のＩＭＯ／ＭＣのキットは、油相と水相を含む１つまたはそれ以上の容器を含んでもよい。容器の内容物はＭＣを調製するために乳化され、その後、ＩＭＯ、好ましくは疎水基を含むように修飾されたＩＭＯと混合してもよい。交替に、ＩＭＯと、ＭＣの調製のための物質はまず混ぜ合わされ、その後、乳化し、新しく形成されたＭＣの中に包み込まれたＩＭＯを調製してもよい。そのような物質は、水中油型乳濁液の調製のために、油と水を、または凍結乾燥されたリポソーム成分（例えばリン脂質、コレステロールおよび界面活性剤の混合物）の容器および水相（例えば薬理学的に許容される水性緩衝液）の１つまたはそれ以上の容器を含む。
【０１８３】
意図した治療のためのＩＭＯ／ＭＣ複合体の使用に関する説明書は、一般に、意図した治療のための用量、服薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。ＩＭＯ／ＭＣの容器（またはＩＭＯ／ＭＣ複合体の現地調製のためのＩＭＯおよびＭＣの別々の容器）は、単位用量でもよいし、バルク包装（例えば、多数用量包装）でもよいし、サブユニット用量でもよい。本発明のキットの中に供給される使用説明書は、典型的にはラベルまたは添付文書（例えばキットに含まれている紙シート）の上の書面の使用説明書であるが、機械読み込み可能な使用説明書（例えば、磁気または光記憶ディスク上に記録された使用説明書）もまた許容し得る。
【０１８４】
以下の実施例は本発明を例証するために提供されるが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１８５】
実施例１：  免疫調節性オリゴヌクレオチドの合成
ホスホロチオ酸エステル結合を含むオリゴヌクレオチドはパーセプティブ・バイオシステムズ・エクスペダイト８９０９自動ＤＮＡ合成装置で合成した。１５μｍｏｌのホスホロチオ酸エステルＤＮＡのためのメーカーのプロトコルは以下の変更を加えて使用した。３％のジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液１．６ｍｌを２．５分間にわたって脱トリチル工程で使用した点、および０．０２Ｍの３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＡＤＴＴ）の９：１アセトニトリル：ピリジン溶液３．０ｍｌを１．１分間にわたって、それに引き続き１．０ｍｌの配達（delivery）を１．１分間にわたって、硫化工程で使用した点。ヌクレオシドホスホルアミダイト単量体を、０．１Ｍ濃度に無水アセトニトリルに溶解した。機器は、３′から５′方向に生じる合成で、望まれる順にヌクレオチド単量体を添加するようにプログラムされた。合成サイクルは、脱トリチル工程、カップリング工程（ホスホルアミダイト単量体および１Ｈテトラゾール）、キャッピング工程、硫化工程および最終キャッピング工程からなっていた。
【０１８６】
ホスホジエステル結合（例えば６−１２）を含むオリゴヌクレオチドはパーセプティブ・バイオシステムズ・エクスペダイト８９０９自動ＤＮＡ合成装置で合成した。１５μｍｏｌのホスホジエステルＤＮＡのためのメーカーのプロトコルは以下の変更を加えて使用した。３％のジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液１．６ｍｌを２．５分間にわたって脱トリチル工程で使用した点、および酸化試薬３．０ｍｌを１．１分間にわたって、それに引き続き１．０ｍｌの配達を１．０分間にわたって、酸化工程に使用した点。ヌクレオシドホスホルアミダイト単量体は、０．１Ｍ濃度に無水アセトニトリルに溶解した。機器は、３′から５′方向に生じる合成で、望まれる順にヌクレオチド単量体を添加するようにプログラムされた。合成サイクルは、脱トリチル工程、カップリング工程（ホスホルアミダイト単量体および１Ｈテトラゾール）、キャッピング工程、酸化工程および最終キャッピング工程からなっていた。
【０１８７】
ＩＭＯは、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム中のアセトニトリルの増加勾配を使用して、ポリマー・ラブズ（Polymer Labs）ＰＬＲＰ−ＳカラムでＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。精製したＩＭＯは乾燥するまで濃縮し、４，４′−ジメトキシトリチル基を８０％酢酸水溶液で除去し、それから、その化合物を３倍容積量のイソプロパノールと共に０．６Ｍ酢酸ナトリウム水溶液／ｐＨ５．０から２回沈殿させた。ＩＭＯを逆浸透水に溶解し、収率を２６０ｎｍでの吸収度から決定した。最後に、ＩＭＯを凍結乾燥し、粉末にした。
【０１８８】
ＩＭＯは、組成物および純度を確認するために、キャピラリーゲル電気泳動、エレクトロスプレー質量分析およびＲＰ−ＨＰＬＣによって特徴づけられた。内毒素含量分析（ＬＡＬ分析、バイオ・ウィッタカー（Bio Whittaker））も行ったところ、内毒素値は５ＥＵ／ｍｇ  ＩＭＯ未満であった。
【０１８９】
表２は、種々のオリゴヌクレオチドの名称およびそれらの配列の一覧表である。コア５′−ＴＣＧ−３′または５′−ＵＣＧ−３′三量体を有するオリゴヌクレオチド中のコア三量体に下線が引かれている。別段の言及がなければ、この表に掲載されたオリゴヌクレオチドはホスホロチオ酸エステル結合した主鎖を有する。
【０１９０】
【表５】
2005527465.tif 000006
【０１９１】
実施例２：  生分解性マイクロキャリヤーの調製
陽イオン性ポリ（乳酸・グリコール酸）小球体（ｃＰＬＧＡ）を以下のように調製した。固有粘度０．４１ｄｌ／ｇ（０．１％、クロロホルム、２５℃）のＤ，Ｌ−ラクチド・グリコリド５０：５０共重合体０．８７５ｇを、０．３ｇのＤＯＴＡＰと一緒に、１０質量％の濃度に、塩化メチレン７．８７５ｇに溶解した。その後、透明な有機相を、実験室用ミキサー（シルバーソンＬ４Ｒ、シルバーソン・インストルメンツ（Silverson Instruments））を使用して、室温、３０分間、４０００ｒｐｍで均質化することによって、ＰＶＡ水溶液（０．３５％ｗ／ｖ）５００ｍｌ中に乳化させた。その後、混合容器のジャケットの中に熱水を循環させることによって、系の温度を４０℃まで上げた。同時に、攪拌速度を１５００ｒｐｍまで減らし、塩化メチレンを抽出し蒸発させるために、これらの条件を２時間維持した。小球体懸濁液が循環する冷水の助けを借りて室温まで冷えるのを許した。
【０１９２】
ミクロ粒子を室温、１０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離（ベックマン・インストルメンツ（Beckman Instruments））によって分離し、温和な浴槽超音波処理によって脱イオン水に再懸濁した。粒子表面から過剰ＰＶＡを取り除くために、遠心洗浄をさらに２回繰り返した。最後の遠心粒子ペレットを約１０ｍｌの水で懸濁し、一晩凍結乾燥した。乾燥した陽イオン小球体粉末は、大きさおよび表面電荷について特徴づけられた。平均の大きさ（数加重、μ）＝１．４、ゼータ電位（ｍＶ）＝３２．４。
【０１９３】
０．３ｇのＤＯＴＡＰを省略した以外は、上述したように、未修飾のポリ（乳酸・グリコール酸）生分解性小球体（ｕｍＰＬＧＡ）を合成し、すすぎ、乾燥した。乾燥した小球体粉末は、大きさおよび表面電荷について特徴づけられた。平均の大きさ（数加重、μ）＝１．１、ゼータ電位（ｍＶ）＝−１８．１。
【０１９４】
実施例３：  六量体ＩＭＯとＭＣの複合体による免疫調節
六量体オリゴヌクレオチド単独、および乳酸／グリコール酸共重合体マイクロキャリヤービーズと複合体を形成した六量体オリゴヌクレオチドについて、ヒト末梢血液単核細胞（ｈＰＢＭＣ）分析を用いて、免疫調節活性を試験した。末梢血液はヘパリン処理された注射器を使用して、静脈穿刺によって健康なボランティアから集めた。血液をＦＩＣＯＬＬ（登録商標）（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））座褥上に層にし、遠心分離した。ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）界面にあるｈＰＢＭＣを集め、それから冷たい燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄した。細胞を再懸濁し、５０単位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、３００μｇ／ｍＬのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を加えた１０％の熱で不活性化したヒトＡＢ血清と一緒に、ＲＰＭＩ  １６４０中で、３７℃で２×１０６細胞／ｍＬで４８個の溜り部のある皿で培養した。
【０１９５】
オリゴヌクレオチドは、単独の作用薬として、または（未修飾または陽イオンの）ＰＬＧＡ小球体と組み合わせて試験した。オリゴヌクレオチドはすべて１００％のホスホロチオ酸エステル結合を含み、２０μｇ／ｍｌで試験した。ＰＬＧＡマイクロキャリヤーは２５０μｇ／ｍｌで使用した。オリゴをＰＬＧＡマイクロキャリヤーと共に試験するときは、オリゴとマイクロキャリヤーは培養に同時に添加した。細胞を２４時間試験サンプルの存在下で培養し、その後、細胞がない培地を各溜り部から集め、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−α濃度について分析した。次の異なる２つのオリゴヌクレオチド、すなわち免疫刺激活性を有することが知られている第一のオリゴヌクレオチド（ＩＳＳを含む２２量体オリゴヌクレオチド（「ＩＳＳ＋」、５′−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２））、および類似した配列を有するが免疫刺激活性がない第二のオリゴヌクレオチド（「ＩＳＳ−」、５′−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））を、対照として使用した。ＳＡＣ（ＰＡＮＳＯＲＢＩＮ（登録商標）ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、１／５０００希釈）および未処理の培養を、それぞれ追加の陽性および陰性対照として使用した。ＳＡＣは黄色ブドウ球菌（Ｃｏｗａｎ  Ｉ）細胞物質を含む。試料はすべて二重に分析した。
【０１９６】
ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−αは、メーカーの使用説明書に従って、バイオソース・インターナショナル社（BioSource International, Inc.）製ＣＹＴＯＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＥＬＩＳＡキットを使用して分析した。
【０１９７】
ヒトＰＢＭＣ分析において、ＩＦＮ−γの背景強度は、ドナーによって著しく変わり得る。しかしながら、ＩＦＮ−αの値は、一般に安定な活性化パターンを示し、慣例的に刺激されていない条件下で低い背景強度を示す。
【０１９８】
３つの六量体オリゴヌクレオチド、６−１（５′−ＴＣＧＴＣＧ−３′）、６−１６（５′−ＡＡＣＧＴＴ−３′）および６−７（５′−ＡＴＣＧＡＴ−３′）を試験した。表３は分析結果を示す。結果は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）またはインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）１ミリリッター当たりのピコグラム（ｐｇ／ｍＬ）として示す。異なるヒトドナーからのＰＢＭＣを使用した分析間の変動性のために、結果は、異なるドナー細胞（ドナー２８０３３および２８０３４）を使用した分析について示し、かつ平均値として示す。
【０１９９】
表３に示されるように、ＰＬＧＡ（陽イオンまたは未修飾）も、いかなる六量体オリゴヌクレオチドも、単独では有意な活性を有していなかった。しかし、六量体オリゴヌクレオチド６−１および６−７は、陽イオンＰＬＧＡと組み合わせて使用したとき、活性であった。陽イオンＰＬＧＡは、静電結合によってオリゴヌクレオチドを吸着し、オリゴヌクレオチド／マイクロキャリヤー複合体を生じるであろう。一方、未修飾ＰＧＬＡはそうではないであろう。６−１および６−７は５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′（ここで、オリゴヌクレオチドは六量体であり、Ｘ１は０または１個のヌクレオチドであり、Ｘ２は２〜３個のヌクレオチドである。）の共通のモチーフを有している。興味深いことに、（ＴＣＧ）３が最小の刺激要素であるというＬｉａｎｇら(J. Clin. Invest. 98(5):119-29, 1996）の教示に反して、６−１すなわち（ＴＣＧ）２は、マイクロキャリヤーとの複合体の形で投与したとき、有意な免疫調節活性を示した。
【０２００】
ＣＧを含むがＴＣＧを含まない６−１６は、陽イオンＰＬＧＡと組み合わせて用いたとき、この実験における２つのドナーのうちの１つにおいてＩＦＮ−αを誘発することが見いだされた。最適モチーフがより少ないＩＭＯは、ドナーの間でより大きい変動性を示す。
【０２０１】
【表６】
2005527465.tif 000007
【０２０２】
実施例４：  ＭＣと六量体または五量体のＩＭＯとの複合体による免疫調節
追加の六量体および五量体のオリゴヌクレオチドを、ＰＢＭＣ分析で免疫調節活性について試験した。オリゴヌクレオチド６−６（５′−ＴＣＧＡＧＡ−３′）、６−８（５′−ＧＴＣＧＡＣ−３′）、６−９（５′−ＧＴＣＧＴＴ−３′）、６−２（５′−ＴＣＧＴＴＴ−３′）、６−３（５′−ＴＴＣＧＴＴ−３′）、６−４（５′−ＴＴＴＣＧＴ−３′）、５−１（５′−ＴＣＧＴＣ−３′）、および５−２（５′−ＴＣＧＴＴ−３′）を、単独で、またはオリゴとＰＬＧＡを培養に添加する前に室温で１５分間前もって混合した点を除いて実施例３に記述したように陽イオンＰＬＧＡと組み合わせて、試験した。被験物質はドナー２８０４４および２８０４５から単離されたＰＢＭＣを用いて分析した。
【０２０３】
表４に示されるように、７個のヌクレオチドより短いオリゴヌクレオチドは、単独で投薬したとき、活性を有していなかった。しかしながら、オリゴヌクレオチド／ＭＣ複合体を形成するためにｃＰＬＧＡと共に共投与したとき、共通配列５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′（ここで、Ｘ１は０または１個のヌクレオチドであり、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドであり、オリゴは五量体または六量体である。）に適合するオリゴヌクレオチドは、免疫調節活性を有していた。
【０２０４】
【表７】
2005527465.tif 000008
【０２０５】
実施例５：  ＭＣと六量体または五量体のＩＭＯとの複合体による免疫調節
実施例３および４において使用されたオリゴヌクレオチドの免疫調節活性を、追加の４つのドナー（ドナー２８０５１〜２８０５４）からのＰＢＭＣを用いたヒトＰＢＭＣ分析で確認した。オリゴヌクレオチドは、単独で、または４８個の溜り部のある皿に代えて９６個の溜り部のある皿を使用した点およびオリゴヌクレオチドと陽イオン小球体を培養に同時に添加するのではなく、培養に添加する前に１５分間室温でオリゴヌクレオチドを陽イオン小球体と前もって混合した点を除いて実施例３に記述したように陽イオンＰＬＧＡと組み合わせて、試験した。結果を表５に示す。
【０２０６】
実施例３および４の結果と一致して、共通配列５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′（ここで、オリゴヌクレオチドは六量体または五量体であり、Ｘ１は０〜１個のヌクレオチドであり、Ｘ２は２〜３個のヌクレオチドである。）を含むオリゴヌクレオチドは、単独で配達されたときは（６−６、６−１、６−７、６−８、６−９、６−２、６−３、５−１および５−２）不活性であったが、ＩＭＯ／ＭＣ複合体として配達されたときは非常に高活性であった。オリゴヌクレオチド６−１６および６−４は、この共通配列に適合せず、分析において変動する活性を示した。
【０２０７】
【表８】
2005527465.tif 000009
【０２０８】
実施例６：  ＭＣと、三量体、四量体、五量体および六量体のオリゴヌクレオチドとの複合体による免疫調節
追加のオリゴヌクレオチドは、ヒトＰＢＭＣ分析で免疫調節活性を試験した。オリゴヌクレオチドは、単独で、または実施例５に記述したようにｃＰＬＧＡと組み合わせて、試験した。
【０２０９】
表６に示されるように、７個のヌクレオチドより短いオリゴヌクレオチドは、単独で投薬されたときは、有意な活性を有していなかった。共通配列５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′（ここで、オリゴヌクレオチドは六量体であり、Ｘ１は０個のヌクレオチドであり、Ｘ２は３個のヌクレオチドである。）に一致するオリゴヌクレオチドは、ＩＭＯ／ＭＣ複合体として配達されたときは（６−２、６−１２）、非常に高活性であった。６−１２、すなわち配列５′−ＴＣＧＴＣＧ−３′を有するホスホジエステルＩＭＯは、ＩＭＯ／ＭＣ複合体として配達されたときは有意な活性を有していた。このことは、ＩＭＯがホスホジエステルまたはホスホロチオ酸エステル結合のいずれかを含んでもよいことを実証している。ＣＧを含むがＴＣＧを含まないオリゴヌクレオチド６−１３、６−１４および６−１５は、単独で配達されたときも、オリゴヌクレオチド／ＭＣ複合体として配達されたときも、ＰＢＭＣ分析において不活性であった。配列５′−ＴＣＧＴ−３′を有する四量体４−１および配列５′−ＴＣＧ−３′を有する三量体３−１は、４人のドナーのうちの２人において活性であった。このことは、共通配列を有する六量体および五量体がより最適なＩＭＯであることを示唆している。
【０２１０】
【表９】
2005527465.tif 000010
【０２１１】
追加のオリゴヌクレオチドを、同一の分析法を使用して、ボランティア１５４〜１５７からのｈＰＢＭＣを使用して試験した。結果は、表７に示すが、式５′−Ｘ１ＴＣＧＸ２−３′（ここで、オリゴヌクレオチドは３〜６量体であり、Ｘ１は０〜１個のヌクレオチドであり、Ｘ２は０〜３個のヌクレオチドである。）に適合するオリゴヌクレオチドの活性を確認する。興味深いことに、オリゴヌクレオチド６−１７および６−１８は、国際公開第９８／５２９６２号パンフレットの教示とは対照的に、この分析においては大部分は不活性であった。
【０２１２】
【表１０】
2005527465.tif 000011
【０２１３】
実施例７：  ＭＣと五量体および六量体オリゴヌクレオチドとの複合体による免疫調節
追加のオリゴヌクレオチドは、いくつかは修飾塩基を含むが、ヒトＰＢＭＣ分析で免疫調節活性を試験した。オリゴヌクレオチドは、単独で、または実施例５に記述したようにｃＰＬＧＡと組み合わせて、試験した。オリゴヌクレオチドは、陽イオンＰＬＧＡ小球体と、それぞれ２０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度で室温で１５分間前もって混合した。
【０２１４】
表８に示されるように、修飾塩基を含む六量体ホスホロチオ酸エステルオリゴヌクレオチドは、６−２（５′−ＴＣＧＴＴＴ−３′、陽性の六量体）および６−２０（５′−ＴＣＣＴＴＴ−３′、陰性の六量体対照）と一緒に、試験した。ｃＰＬＧＡと組み合わせたとき、６−２１および６−２４は活性であった。さらに、共通モチーフＸ１ＴＣＧＸ２（ここで、Ｘ１は２個のヌクレオチドであり、Ｘ２は１個のヌクレオチドである。）に適合する六量体である６−２５もまた、ｃＰＬＧＡとの組み合わせで活性であった。
【０２１５】
表８は、共通配列Ｘ１ＴＣＧＸ２（ここで、Ｘ１は０または１個のヌクレオチドであり、Ｘ２は１〜２個のヌクレオチドである。）に適合する五量体オリゴヌクレオチドがｃＰＬＧＡとの組み合わせで活性なことも示している。オリゴヌクレオチド５−２および５−３はそれぞれ、ｃＰＬＧＡと組み合わせたときに、４つのドナーのうちの２つにおいて活性であった。
【０２１６】
【表１１】
2005527465.tif 000012
【０２１７】
前述の発明は、明瞭および理解の目的のために実例および実施例を通ってかなり詳細に記述されたが、ある変更および修正を行ってもよいことは当業者に明らかであろう。したがって、記述および実施例は、添付された特許請求の範囲によって輪郭を描かれた発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【国際調査報告】
2005527465.tif 000013
2005527465.tif 000014