(57)【要約】酵素のための基質を含むマイクロカンチレバーの偏向の変化を測定することにより酵素を検出するための装置及び方法を提供する。
2005502873.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を検出する方法であって、該方法は以下を含む：少なくとも１のマイクロカンチレバーの第１の表面上にコーティング物質を溶着する工程；酵素と相互作用できる少なくとも１の基質をコーティング物質に加える工程；基質を含むマイクロカンチレバーをサンプルに暴露する工程；及びマイクロカンチレバーの偏向を測定する工程であって、該偏向はサンプル中の酵素の存在を示す。
【請求項２】
基質の添加は少なくとも１の生体物質の添加を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体物質の添加は、核酸、タンパク質、脂質、炭化水素及び多糖類からなる群より選択される物質を加える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
加える基質が薬物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
偏向がマイクロカンチレバー表面上の応力変化により生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
偏向測定が、光学的手段、電子トンネル手段、静電容量手段、圧電手段及びピエゾ抵抗手段からなる群より選択される手段により変化を観測する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
偏向測定が光学的手段を用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
光学的手段がレーザーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、マイクロカンチレバー偏向をマイクロカンチレバーがサンプルに暴露された時間から決定される時間パラメーターの関数として分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
偏向分析が、時間パラメーターの関数としてマイクロカンチレバーの偏向を比較、計算及び記憶するように適応させた超小型演算装置を用いることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
偏向分析がさらに、酵素濃度、基質濃度、共同因子の存在及び阻害物質の存在より選択されるパラメーターを分析することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
マイクロカンチレバーが長さ約１００μｍ〜約７５０μｍ、幅約２０μｍ〜約３００μｍ、及び厚さ約０．１μｍ〜約１０μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
コーティング物質の溶着は、さらに金属の溶着を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
金属が、アルミニウム、銅、金、クロム、チタニウム及び銀からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
金属が金である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
コーティング物質の溶着は、さらに複数の金属の溶着を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
複数の金属の溶着がさらに、クロムの第１の層及び金の第２の層を溶着することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
複数の金属の溶着がさらに、チタニウムの第１の層及び金の第１の層を溶着することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
金属がアマルガムまたは合金である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
マイクロカンチレバーが酸化アルミニウム、酸化イリジウム、シリコン、酸化シリコン、窒化シリコン、五酸化タンタラム及びプラスティックポリマーからなる群より選択される第２の表面を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
第１の表面に基質を加える前に、さらに基質と反応できる二官能性架橋剤と第１の表面を反応させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
二官能性架橋剤が、ジチオビス（スクシンイミド  ウンデカノエート）（ＤＳＵ）；長鎖スクシンイミド−６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣＳＰＤＰ）；スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰ）：及びｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
二官能性架橋剤がＤＳＵである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
基質の添加により、加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、リアーゼ、及びリガーゼからなる群より選択される酵素を検出するためのマイクロカンチレバーに設計する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
酵素が加水分解酵素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
加水分解酵素がプロテアーゼである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
酵素がキナーゼ、ホスファターゼ、エンドペプチターゼ、エキソペプチターゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
プロテアーゼがメタロプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
転移酵素がグリコシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
リアーゼが多糖リアーゼ、３−ヒロドキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡリアーゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ及びイソシトレートリアーゼからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
酸化還元酵素がヒドロキシルアミン・オキシドレダクターゼ、グリホスフェート・オキシドレダクターゼ、キニーネ・オキシドレダクターゼ、ユビキノン・オキシドレダクターゼ及びタンパク質ジスルフィド・オキシドレダクターゼからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
サンプルが十分に精製された酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
サンプルが生体液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
生体液が細胞溶解物、培養基、使用済み媒体、動物抽出物及び植物抽出物からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
生体液が脊椎動物の体液を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
脊椎動物が哺乳類である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
哺乳類が人間である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
体液が、血液、リンパ液、組織液、尿、胆汁、汗、滑液、羊水、腹水、心嚢液、胸膜液、脳脊髄液、胃液、腸液、関節腔液、涙液及び鼻汁からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
酵素が脊椎動物の病状に関連するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
病状が遺伝的欠陥である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
病状が、ファブリー病、ゴーシェ病、テイ−サックス病、レッシュ−ナイハン病、マンノシドーシス病、Ｘ連鎖性糸球体病、及びムコ多糖症からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
病状が癌である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
癌が脳、肝臓、すい臓、肺、前立腺または乳癌からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
癌が前立腺癌であり、酵素が前立腺特異抗原である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
癌が乳癌であり、酵素がコラゲナーゼである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
病状が病原菌の存在によるものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
病原菌が、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、ぜん虫からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１のマイクロカンチレバーが複数のマイクロカンチレバーを有するブロックアレイである、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
基質に結合するサンプル中の関連物質を検出する方法であって、該物質検出はマイクロフォースに応答するように構成された少なくとも１のマイクロカンチレバーを含み、該方法は以下を含む：マイクロカンチレバーの第１の表面上にコーティング物質を溶着する工程；該物質と相互作用できる少なくとも１の基質をコーティング物質に加える工程；基質を含むマイクロカンチレバーをサンプルに暴露する工程；及びマイクロカンチレバー表面上の最終的な自由表面エネルギー電荷を測定する工程であって、表面エネルギー電荷はサンプル中の関連物質が基質へ結合したことを示す。
【請求項５０】
関連物質が、結合タンパク質、酵素、共同因子、受容体配位子、抗体、多糖類、脂質、核酸及びステロイドからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
関連物質が酵素である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
酵素が基質に結合して分離しない、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
酵素が基質上で活性を有さない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
基質が非切断型偽基質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
基質が複数の生体物質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
基質が酵素活性の阻害物質を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
コーティングを有するマイクロカンチレバー上の酵素含有基質の阻害物質をスクリーニングする方法であって、該方法は以下を含む：第１のマイクロカンチレバー及び第２のマイクロカンチレバーの第１の側面に酵素と相互作用できる基質を加える工程；候補阻害物質と酵素を含むサンプルに基質を有する第１のマイクロカンチレバーを暴露する工程；及び第１のマイクロカンチレバーの偏向を、候補阻害物質を含まない同一の酵素に暴露した第２のマイクロカンチレバーの偏向と比較して測定する工程。
【請求項５８】
第１のマイクロカンチレバーがマイクロ流体工学装置の第１の相互作用細胞中に位置し、及び第２のマイクロカンチレバーが第２の相互作用細胞中に位置する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
第３の相互作用細胞中に位置する第３のマイクロカンチレバー及び第４の相互作用細胞中に位置する第４のマイクロカンチレバーが第１及び第２の細胞と異なる濃度の酵素に暴露される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
第３の相互作用細胞中に位置する第３のマイクロカンチレバー及び第４の相互作用細胞中に位置する第４のマイクロカンチレバーが、第１の相互作用細胞中の候補物質と異なる候補阻害物質を含有するサンプルに暴露される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
酵素と生体物質間の相互作用により生じるマイクロフォースを測定するための装置であって、少なくとも１のマイクロカンチレバーを含み、該マイクロカンチレバーは長さ、幅及び厚みを有し、マイクロカンチレバーの第１の表面上に溶着されるコーティング物質、コーティング物質に付着させる生体物質、及び少なくとも１の相互作用細胞を含有するマイクロカンチレバーであり、相互作用細胞含有マイクロカンチレバーはサンプルを受け取るためにマイクロ流体装置中に収納され、及びマイクロフォース測定はサンプル中の酵素の存在によりマイクロカンチレバーが偏向することにより示される、装置。
【請求項６２】
生体物質は酵素基質を含む、請求項６１に記載の装置。
【請求項６３】
生体物質は酵素偽基質を含む、請求項６１に記載の装置。
【請求項６４】
少なくとも１のマイクロカンチレバーが複数のマイクロカンチレバーを有するブロックアレイをさらに含む、請求項６１に記載の装置。
【請求項６５】
マイクロカンチレバーが長さ約１００μｍ〜約７５０μｍ、幅約２０μｍ〜約３００μｍ、及び厚さ約０．１μｍ〜約１０μｍである、請求項６１に記載の装置。
【請求項６６】
コーティング物質が銅、金、アルミニウム、クロム、チタニウム及び銀からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６４に記載の装置。
【請求項６７】
コーティング物質が金である、請求項６６に記載の装置。
【請求項６８】
マイクロカンチレバーの第２の表面が、シリコン、窒化シリコン、その他のシリコン化合物、金属化合物、ガリウム砒素、ゲルマニウム、二酸化ゲルマニウム、ガラス、酸化亜鉛、ダイアモンド、石英、パラジウム及びプラスティックポリマーからなる群より選択される、請求項６１に記載の装置。
【請求項６９】
装置が使い捨てである、請求項６１に記載の装置。
【請求項７０】
装置が再利用可能である、請求項６１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明の分野は、サンプル中の酵素の存在をマイクロカンチレバーの偏向（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）を測定することにより検出する装置及び方法に関し、マイクロカンチレバーの表面は酵素基質を有する。種々の実施態様において、本発明はプロテオミクス、ドラッグ・デリバリー、医学研究、医療、獣医学、歯科診断学、法医学及び軍事利用に有用である。
【０００２】
背景
多数の酵素は医薬、産業及びその他の用途に重要である。新規な酵素の発見は特定の産業と同調して進展してきた。例えば、細菌性制限酵素の発見及び遺伝子工学の発展である。酵素は、新規な治療法として（米国特許第６，２１０，６６７号、２００１年４月３日発行）、新規な治療薬、例えば、ＨＩＶプロテアーゼ（米国特許第６，２７１，２３５号、２００１年８月７日発行）の開発のための目的として、様々な内科病理学において重要であり（Ｆａｎｇ  Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．９７：３８８４−３８８９、２０００）、抗生物質の生合成などの産業プロセスにおいて（米国特許第６，２５８，５５５号、２００１年７月１０日発行）、ポリウレタンなどの不要物質の分解（米国特許第６，１８０，３８１号、２００１年１月３０日発行）、及び食品産業（米国特許第５，８２７，７１２号、１９９８年１０月２７日発行）において重要である。新規な酵素活性を得る必要性は非常に大きく、従ってタンパク質工学研究は触媒抗体の開発に向けられてきた（米国特許第５，８０７，６８８号、１９９８年９月１５日発行）。
【０００３】
薄い素子マイクロカンチレバーは暴露されるに従い差応力によりたわみ（偏向）を受け、その環境由来の化合物を例えば液体サンプル中で結合し得る。０．１Ｎ／ｍ以下のバネ定数を有する軟らかいマイクロカンチレバーは非常に少量のマイクロカンチレバー表面上の基質とサンプル中の１以上の物質間の相互作用の結果として生じる応力差に敏感である。特別に設計したコーティング層を有する所定のマイクロカンチレバーは、その偏向によりマイクロカンチレバーが暴露された環境の成分についての情報を得る。マイクロカンチレバーは酵素媒介触媒生物学的熱量反応をフェムトジュール最小変位で検出することが可能である（Ｔｈｕｎｄａｔ  ｅｔ  ａｌ．、“マイクロカンチレバー・センサー”、Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｅｎｇｒ．１、１８５〜１９９頁、１９９７）。サンプル内のオリゴヌクレオチド相互作用は、サンプルが適用される表面上に形成された試験部位のモノリシック・アレイを用いて検出できる（米国特許第５，６５３，９３９号）。
【０００４】
自由表面エネルギー及び結合エネルギーにおける変化により生じる応力に対するマイクロカンチレバーの反応を測定して、酵素とその酵素基質間の相互作用を検出する、または酵素活性を有するタンパク質または触媒抗体のような関連分子、または結合タンパク質を検出するための方法と装置が必要とされている。酵素と酵素様タンパク質の結合及び活性の検出及び分析のための医療及び獣医診断学、及び研究において必要性がある。
【０００５】
概要
１の実施態様において、本発明は酵素の検出方法を提供し、該方法は以下を含む：少なくとも１のマイクロカンチレバーの第１の表面上にコーティング物質を溶着する工程；コーティング物質に少なくとも１の基質を加える工程であって、該基質は酵素と相互作用できる；基質を含むマイクロカンチレバーをサンプルに暴露する工程；及びマイクロカンチレバーの偏向を測定する工程であって、ここで偏向はサンプル中の酵素の存在を示すものである。関連実施態様において、基質の添加は少なくとも１の生体材料を添加することを含み、生体材料は例えば核酸、タンパク質、脂質、炭化水素、及び多糖類からなる群より選択される。他の関連実施態様において、基質は薬物である。
【０００６】
本方法の関連実施態様において、偏向はマイクロカンチレバー表面上の応力変化により生じる。好ましい実施態様において、偏向は光学的方法により変化を観測することにより測定し、好ましくはレーザーなどである。もしくは、電子トンネル手段、静電容量手段、圧電手段またはピエゾ抵抗手段は偏向変化を観測するために用いることができる。
【０００７】
関連実施態様において、本方法はさらに、マイクロカンチレバーがサンプルに暴露される時間から測定される時間パラメーターの関数として、マイクロカンチレバー偏向を分析することを含む。偏向分析は、時間パラメーターの関数としてマイクロカンチレバーの偏向を比較、計算及び記憶するように適応させた超小型演算装置を用いることを含む。偏向分析はさらに、以下から選択したパラメーターを分析することを含む：酵素濃度、基質濃度、共同因子の存在、及び阻害物質の存在。
【０００８】
関連実施態様において、本方法は長さが少なくとも約２０μｍ、少なくとも約２０μｍ〜約１５０μｍであるマイクロカンチレバーを含み、例えば、長さは約５０μｍ〜約２５０μｍ、約１００μｍ〜約４００μｍ、約２００μｍ〜約５００μｍ、または２５０μｍ〜約７５０μｍである。さらに、幅は少なくとも約５μｍ〜約２０μｍ、約１０μｍ〜約３０μｍ、約２０μｍ〜約５０μｍ、約２５μｍ〜約１００μｍ、または〜約３００μｍである。高さは少なくとも約０．１μｍであり、例えば、少なくとも約０．４μｍ、約４μｍ〜約１０μｍである。コーティング物質の溶着は、さらに金属溶着も含む。金属はアルミニウム、銅、金、クロム、チタニウム及び銀からなる群より選択される少なくとも１つである。例えば、金属は金である。
【０００９】
関連実施態様において、本方法はさらに複数の金属を溶着することを含む。複数の金属の溶着はさらに、クロムの第１の層及び金の第２の層を溶着することを含む。関連実施態様において、本方法はさらにチタニウムの第１の層及び金の第２の層を溶着することを含む。その他の実施態様における金属はアマルガムまたは合金である。
【００１０】
関連実施態様において、マイクロカンチレバーは酸化アルミニウム、酸化イリジウム、シリコン、酸化シリコン、窒化シリコン、五酸化タンタラム及びプラスティックポリマーからなる群より選択される第２の表面を有する。
【００１１】
関連実施態様において、本発明は複数個のマイクロカンチレバーを有するブロックアレイである少なくとも１のマイクロカンチレバーを提供するものである。
【００１２】
関連実施態様において、本方法はさらに、基質を第１の表面に加える前に、マイクロカンチレバーと二官能性架橋剤を反応させる工程を含み、二官能性架橋剤はさらに基質と反応することができる。二官能性架橋剤は以下からなる群より選択される：ジチオビス（スクシンイミド  ウンデカノエート）（ＤＳＵ）；長鎖スクシンイミド−６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣＳＰＤＰ）；スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰ）：及びｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル。例えば、二官能性架橋剤はＤＳＵである。
【００１３】
本方法の関連実施態様において、マイクロカンチレバーは以下からなる群より選択される酵素を検出する：加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、リアーゼ、及びリガーゼ。例えば、酵素は加水分解酵素である。加水分解酵素はプロテアーゼである。例えば、プロテアーゼはメタロプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼである。さらに、該酵素は以下からなる群より選択される：キナーゼ、ホスファターゼ、エンドペプチターゼ、エキソペプチターゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼ。
【００１４】
転移酵素は以下からなる群より選択される：グリコシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ。例えば、リアーゼは以下からなる群より選択される：多糖リアーゼ、３−ヒロドキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡリアーゼ、アルギニノスクシネートリアーゼ及びイソシトレートリアーゼ。例えば、酸化還元酵素は以下からなる群より選択される：ヒドロキシルアミン・オキシドレダクターゼ、グリホスフェート・オキシドレダクターゼ、キニーネ・オキシドレダクターゼ、ユビキノン・オキシドレダクターゼ及びタンパク質ジスルフィド・オキシドレダクターゼ。本発明の関連実施態様において、サンプルは十分に精製された酵素を含む。本方法の別の実施態様において、サンプルは生体液を含む。生体液は以下からなる群より選択される：細胞溶解物、培養基、使用済み媒体、動物抽出物及び植物抽出物。例えば、生体液は脊椎動物の体液であり、例えば人間またはその他の哺乳類である。本方法の実施態様によると、体液は以下からなる群より選択される：血液、リンパ液、組織液、尿、胆汁、汗、滑液、羊水、腹水、心嚢液、胸膜液、脳脊髄液、胃液、腸液、関節腔液、涙液、鼻汁。
【００１５】
本発明の関連実施態様において、酵素は脊椎動物の病状に関連するものである。病状は遺伝的欠陥であり例えば、病状は以下からなる群より選択される：ファブリー病、ゴーシェ病、レッシュ−ナイハン病、テイ−サックス病、マンノシドーシス病、Ｘ連鎖性糸球体病、及びムコ多糖症。他の実施態様において、病状は癌であり、例えば、癌は脳、肝臓、すい臓、肺、前立腺または乳癌から選択される。関連実施態様において、癌は前立腺であり、酵素は前立腺特異抗原である。関連実施態様において、癌は乳癌であり、酵素はコラゲナーゼである。他の実施態様における病状は病原菌の存在によるものである。例えば、病原菌は以下からなる群より選択される：ウイルス、細菌、真菌、原生動物、ぜん虫。
【００１６】
本発明の実施態様はサンプル中で基質に結合する関連物質を検出する方法を提供し、物質の検出はマイクロフォースに応答するように構成された少なくとも１のマイクロカンチレバーを含み、該方法は以下を含む：マイクロカンチレバーの第１の表面上でコーティング物質を溶着する工程；物質と相互作用することができる、少なくとも１の基質をコーティング物質に添加する工程；基質を含むマイクロカンチレバーをサンプルに暴露する工程；及びマイクロカンチレバー表面上の最終的な自由表面エネルギー電荷を測定する工程であって、表面エネルギー電荷はサンプル中の関連物質の基質への結合を示す。
【００１７】
本発明の関連実施態様において、関連物質は以下からなる群より選択される：結合タンパク質、酵素、共同因子、受容体配位子、抗体、多糖類、脂質、核酸及びステロイド。例えば、関連物質は酵素であり、該酵素は基質に結合し、かつ分離できない。他の例において、酵素は基質上で活性を有さない。さらに他の例において、基質は非切断型偽基質である。
【００１８】
関連実施態様において基質は複数の生体物質である。他の関連実施態様において基質は酵素活性の阻害物質を含む。
【００１９】
他の実施態様において、本発明は酵素阻害物質のスクリーニング方法を提供し、阻害物質の検出はマイクロカンチレバー上に酵素のための基質を有することを含み、該方法は以下を含む：コーティングを有する第１のマイクロカンチレバーの第１の側面へ、酵素及びコーティングと相互作用できる基質を添加する工程；基質を有する第１のマイクロカンチレバーを候補阻害物質と酵素を含むサンプルに暴露する工程；及び第１のマイクロカンチレバーの偏向を、候補阻害物質を含まない酵素に暴露した第２のマイクロカンチレバーの偏向と比較して測定する工程。本方法の関連実施態様において、第１のマイクロカンチレバー及び第２のマイクロカンチレバーは、マイクロ流体工学装置の第１の相互作用細胞及び第２の相互作用細胞中に位置する。関連実施態様において、第３のマイクロカンチレバー及び第４のマイクロカンチレバーは、第３の相互作用細胞及び第４の相互作用細胞中に位置し、第３の細胞及び第４の細胞は第１の細胞及び第２の細胞に比べて異なる酵素濃度を有する。関連実施態様において、第３のマイクロカンチレバー及び第４のマイクロカンチレバーは第３及び第４の相互作用細胞中に位置し、第３の細胞及び第４の細胞は第１の細胞及び第２の細胞とは異なる候補阻害物質のサンプルを有する。
【００２０】
本発明の実施態様は、酵素と生体物質間の相互作用により生じるマイクロフォースを測定するための装置を提供し、以下を含む：少なくとも１のマイクロカンチレバーであって、該マイクロカンチレバーは長さ、幅及び厚みを有する；マイクロカンチレバーの第１の表面上に溶着されるコーティング物質；コーティング物質に付着できる生体物質；及び少なくとも１の相互作用細胞、ここで、コーティング物質と生体物質を含むマイクロカンチレバーはサンプルに暴露され、該サンプルは酵素を含む。生体物質は酵素基質を含む。もしくは、生体物質は酵素偽基質を含む。特定の実施態様において、マイクロカンチレバーは複数のマイクロカンチレバーを有するブロックアレイを含む。マイクロカンチレバーの寸法は極微であり、長さが少なくとも約２０μｍであり、例えば、約５０μｍ〜約１５０μｍ、約５０μｍ〜約２５０μｍ、約１００μｍ〜約４００μｍ、約２００μｍ〜約５００μｍ、または２５０μｍ〜約７５０μｍである。さらに、幅は少なくとも約５μｍであり、例えば、幅は約５μｍ〜約２０μｍ、約１０μｍ〜約３０μｍ、約２０μｍ〜約５０μｍ、約２５μｍ〜約１００μｍ、または約３００μｍ以下である。高さは少なくとも約０．１μｍであり、例えば、少なくとも約０．４μｍであり、約４μｍ〜約１０μｍである。マイクロカンチレバーのコーティングは銅、金、アルミニウム、クロム、チタニウム及び銀からなる群より選択される少なくとも１つである。例えば、コーティングは金コーティングである。本装置の別の実施態様において、マイクロカンチレバーの第２の表面は、シリコン、窒化シリコン、その他のシリコン化合物、金属化合物、ガリウム砒素、ゲルマニウム、二酸化ゲルマニウム、ガラス、酸化亜鉛、ダイアモンド、石英、パラジウム及びプラスティックポリマーからなる群より選択される。１の実施態様において、該装置は使い捨てである。他の実施態様において、該装置は再利用が可能である。
【００２１】
実施態様の説明
図１は第１の表面１０１、第２の表面１０５、高さ１０２、幅１０４、及び長さ１０９を有するマイクロカンチレバーを示す。第１の表面は少なくとも１のコーティング１０６を有することができる。酵素基質１０８は第１の表面に直接固定され１０７、または二官能性架橋剤１１０との共有反応により固定される。非共有結合性基質分子は架橋剤を用いた反応により第１の表面から洗い流すことができ、例えば低ｐＨまたは中性洗剤を有する緩衝液の使用である。基質分子の共有結合は、直接結合するよりもむしろ好ましい実施態様である。なぜなら、前者の方法は基質分子をより幾何学的に均一な配置とするからである。
【００２２】
図２は、マイクロカンチレバーへ酵素サンプルを追加することによる、マイクロカンチレバーの第１の表面上の酵素と基質分子の相互作用の種類を示すものである。サンプル添加の前は、全基質分子はパネルＡで右から２番目の基質分子が示すように完全長である。パネルＡで酵素は平行線模様の円で示され、基質分子（左の基質分子）の内面の認識部位に結合し、基質分子を切断し、表面に共有結合した短い生成物を残す（左から２、３、５、７番目等の基質分子）。この結果は例えばＢａｍＨ１またはＥｃｏＲ１の制限酵素などのエンドヌクレアーゼによるＤＮＡ基質分子の消化から得られ、またはトリプシンなどのプロテアーゼによるタンパク質基質分子の消化から得られる。パネルＢで酵素は平行線模様の円で示され、結合末端からの基質分子末端の遊離端に結合し、さらに基質を切断する。この結果は例えば、それぞれエキソヌクレアーゼまたはスキソペプチダーゼによる核酸またはタンパク質基質分子の消化から得られる。パネルＣは、基質分子を有する結合タンパク質（無地または点描の円）または不活性酵素の相互作用を示す。結合によって、基質分子の消化は得られない。
【００２３】
図３は初期位置Ａからのマイクロカンチレバーの偏向を示す。第１の表面に基質分子を添加することにより、マイクロカンチレバーの位置を新たな位置に変えることができ、例えば、位置Ｂまたは位置Ｃである。図２、パネルＡまたは図２、パネルＢに示す続いて起こる酵素消化はさらに偏向を変えることができ、例えば、位置Ｂから位置Ｃまたは位置Ｃから位置Ａである。基質への不活性酵素または結合タンパク質の結合は偏向を生じ、マイクロカンチレバーの位置を変化させることができ、例えば、位置Ｃから位置Ｂである。
【００２４】
図４はマイクロカンチレバー偏向の時間的経過を示し、第１の表面はタンパク質基質、ＩｇＧ抗体分子溶液に共有結合している。共有結合した抗体を含むマイクロカンチレバーはまず対照緩衝液（下側の関数）に暴露し、結果として暴露による偏向の変化は観測されない。同じマイクロカンチレバーをそれから、実施例１に記載するようにプロテアーゼ・パパインの適当な濃縮物に暴露する。データは約６０ｎｍの著しい偏向の変化を示し、パパインへの暴露により数分にわたって経時的に起こる。
【００２５】
定義
文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書及び請求項に用いられる用語の意味は以下に示す通りである。
【００２６】
“マイクロカンチレバー”の語は構造上の用語であり、その用途により棒状、Ｖ型、またはその他の形状を取り得る曲がり易い梁（ｂｅａｍ）をいう。マイクロカンチレバーの一端は支持ベースに固定され、他方の端は自由な状態である。マイクロカンチレバーは通常微視的な大きさであり、例えば、マイクロカンチレバーは寸法が極微であり、長さが少なくとも約２０μｍであり、約５０μｍ〜約１５０μｍ、例えば約５０μｍ〜約２５０μｍ、約１００μｍ〜約４００μｍ、約２００μｍ〜約５００μｍ、または２５０μｍ〜約７５０μｍである。さらに、幅は少なくとも約５μｍであり、例えば、幅は約５μｍ〜約２０μｍ、約１０μｍ〜約３０μｍ、約２０μｍ〜約５０μｍ、約２５μｍ〜約１００μｍ、または約３００μｍ以下である。高さは少なくとも約０．１μｍであり、例えば、少なくとも約０．４μｍであり、約４μｍ〜約１０μｍである。シリコン及び窒化シリコンはマイクロカンチレバーを作るために用いられる最も一般的な分子である。マイクロカンチレバーを作るためのその他の分子も報告されており、圧電分子、プラスティック分子及び種々の金属である。
【００２７】
特に、マイクロカンチレバーは種々の物質から製造でき、例えば、セラミックス、シリコン、窒化シリコン、その他のシリコン化合物、金属化合物、ガリウム砒素、ゲルマニウム、二酸化ゲルマニウム、酸化亜鉛、ダイアモンド、石英、パラジウム、五酸化タンタラム及びプラスティックポリマーである。プラスティックは以下を含む：ポリスチレン、ポリイミド、エポキシ、ポリノルボルネン、ポリシクロブテン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフェニレンエーテル、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリピロール、及びポリチオフェン。従来から製造されているマイクロカンチレバーは例えば、Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｔｄ．、Ｗａｉｔｓｆｉｅｌｄ、ＶＴ．（ウェイツフィールド、バーモント州）などの製造元から得られる。
【００２８】
自由末端上表面に固定化された化合物有するマイクロカンチレバーは受容体／配位子相互作用、抗体／抗原相互作用及び核酸相互作用を検出及びスクリーニングするために用いられてきた（米国特許第５，９９２，２２６号、１９９９年１１月３０日発行）。偏向は光学的及び圧電的方法を用いて測定する。マイクロカンチレバーは自然の共鳴周波数と適合できる位相差シグナルを検出する電気的手法を用いて濃度を測定できる（米国特許第６，０４１，６４２号、２０００年３月２８日発行）。公知の分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質などの生体分子が配置されたマイクロカンチレバーの共鳴特性の変化を用いる標的種の濃度測定については、米国特許第５，７６３，７６８号に記載されている。
【００２９】
サンプル媒体中の物理的及び化学的パラメーターを検出及び測定するための方法及び装置はマイクロメカニカル電位差センサーを用いる（米国特許第６，０１６，６８６号、２０００年１月２５日発行）。化学的検体の検出については米国特許第５，９２３，４２１号（１９９９年７月１３日発行）に記載されている。マイクロカンチレバー偏向を生じる標的種に特異な抗体を用いるラジオイミューン・アッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  ａｓｓａｙｓ）の磁気及び電気的観測、例えば標的がマイクロカンチレバーに結合する電磁ビーズは米国特許第５，８０７，７５８号（１９９８年９月１５日発行）に記載されている。
【００３０】
ここで用いる“第１の表面”の語は、酵素のための基質分子を受け取り、結合するために設計されたマイクロカンチレバーの幾何学的表面をいう。この第１の表面上に１以上のコーティングを溶着することができる。従って、“第２の表面”の語はコーティングまたは酵素基質を含まないように設計されたマイクロカンチレバーの反対側の領域をいう。通常第２の表面はコーティングされないので、第１の表面にコーティング手順が適用される前の、一般にマイクロカンチレバーまたはマイクロカンチレバー・アレイが作られる物質からなる。もしくは、第１の表面のコーティングとは異なる物質でコーティングされてもよい。
【００３１】
マイクロカンチレバーの第１の表面は中間層を有するように組み立ててもよく、例えば金を含んだ第１の表面と例えば窒化シリコンを含んだ第２の表面間にはさまれた中間層である。中間層は複数の金属を含んだ合金であってもよく、例えば、中間層はクロム、銀及びチタニウムの少なくとも１つと水銀とを含んだアマルガムである。水銀は通常、酵素のようなタンパク質を有する環境とは適合性がないが、いくつかの実施態様において、中間層のアマルガムまたは合金は水銀を含んでもよい。
【００３２】
米国特許第６，０９６，５５９号（２０００年８月１日発行）及び第６，０５０，７２２号（２０００年４月１８日発行）はマイクロカンチレバーの組み立てについて記載しており、セラミックス、プラスティックポリマー、石英、窒化シリコン、シリコン、酸化シリコン、酸化アルミニウム、五酸化タンタラム、ゲルマニウム、二酸化ゲルマニウム、ガリウム砒素、酸化亜鉛及びシリコン化合物などの物質の使用を含む。様々な相互作用分子を含むマイクロメカニカル・センサーのコーティングは米国特許第６，１１８，１２４号（２０００年９月１２日発行）に記載されている。
【００３３】
第１の位置から少なくとも第２の位置へのマイクロカンチレバーの偏向またはたわみは、第２の表面と比較したマイクロカンチレバーの第１の表面上の差応力によるものであり、表面応力の変化はマイクロカンチレバーを特定の環境成分へ暴露することに起因するものである。マイクロカンチレバーは第１の環境から第２の環境への変化に従って屈折し得る。例えば、環境は以下の多くの可能な方法において変化し得る：酵素の添加または削除、または酵素濃度の低下または上昇；特異な酵素共同因子の添加または削除、または共同因子濃度の低下または上昇；特異な酵素阻害物質の添加または削除、または阻害物質の濃度の低下または上昇；マイクロカンチレバーへの暴露前、暴露の間、または暴露後のサンプルの希釈または濃縮；マイクロカンチレバーへの暴露前、暴露の間、または暴露後のサンプルの温度変化；マイクロカンチレバーへの暴露前、暴露の間、または暴露後のサンプルのｐＨ変化；マイクロカンチレバーへの暴露前、暴露の間、または暴露後のサンプルの伝導性の変化；及びマイクロカンチレバーへの暴露前、暴露の間、または暴露後のサンプルの粘度変化。
【００３４】
偏向測定は最初に占有していた位置から変化した、マイクロカンチレバーの動いた位置または位置変化の距離を測定する。環境中における、マイクロカンチレバーの第１の表面上に生体物質を含むマイクロカンチレバーがまだ酵素と結合または反応していない最初の位置から、酵素を含むマイクロカンチレバー上で生体物質の結合または反応によりその位置を変化させた後のマイクロカンチレバーにより占有された第２の位置であり、及び生体物質の変化の結果である。
【００３５】
偏向特性は運動距離の及ぶ範囲で再生可能なマイクロカンチレバーの偏向パターンであり、例えばｎｍ、及び単位時間当たりの頻度で測定する。偏向特性は酵素と基質の特異条件を識別でき、さらに温度、濃度、イオン強度、イオンまたはその他の共同因子の存在、プロテアーゼ阻害物質などの保存料の存在のような反応条件、及び酵素学の当業者に公知なその他の細胞条件を識別できる。これら条件の特定の組み合わせ下における偏向範囲は特定反応のサインとなり得る。偏向特性は、サンプル添加時間の関数として、または酵素濃度、基質濃度、阻害物質濃度、共同因子濃度、ｐＨまたは温度等の関数としての運動範囲として、マイクロカンチレバーの運動範囲を測定することにより測定する。
【００３６】
装置または方法において超小型演算装置を含むことができ、例えば計算能力、ロジック、及びコンピュータープログラムからの指示を解釈及び実行するために必要なコントロール回路を含んだ集積回路などがある。測定装置の超小型演算装置部品はマイクロカンチレバー偏向を検出するための装置内にある。
【００３７】
環境内の酵素検出
“環境”の語はマイクロカンチレバーが暴露される、全体的な因子の集合体を意味する。例えば、因子の集合体は以下のような物質を含んだサンプルを含む；実質的に純化された酵素；少なくとも１の酵素を含む体液；実質的に純粋な阻害物質；阻害物質を含む体液、及びこれら成分の組み合わせ等。“環境”の語は酵素活性に影響を与え得るサンプルの任意の各成分の濃縮物も含む。環境温度のような因子は、応力に寄与するが、標準的手段、当業者に公知の細胞によって制御し、例えば、分離した熱的に制御可能なハウジングの使用であり、及び基質、酵素または必須の共同因子のいずれかを削除するために設計した環境中で基準マイクロカンチレバーの偏向を観測することにより制御する。基準マイクロカンチレバーは不活性酵素に暴露してもよく、またはサンプル中に見られる酵素と比較する対照酵素を含んでもよい。基準マイクロカンチレバーと実験マイクロカンチレバーの環境間の差は、その他全てのマイクロカンチレバー偏向を測定する際の背景としての基準環境で見られる偏向と比較した、実験マイクロカンチレバーによって得られる偏向量の測定結果となる。
【００３８】
ここで用いる、第１の位置から少なくとも第２の位置へのマイクロカンチレバーの偏向は、酵素活性により、マイクロカンチレバー表面に対する酵素基質分子結合の物理的または化学的変化により起こり得るものである。例えば、センサー物質、例えば、基質分子の表面伸張応力における変化である物理的変化は、ＤＮＡ基質がエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼなどのＤＮＡヌクレアーゼ、またはＤＮＡリガーゼと反応した際に起こり得る。第１のケースにおいて、変化はマイクロカンチレバー上の物質量の減少である。第２のケースにおいて、変化はマイクロカンチレバー上の物質量の増加である。マイクロカンチレバー表面上の表面応力は基質上で作用する酵素活性の結果として変化する。マイクロカンチレバーの偏向はヌクレアーゼ酵素分子がＤＮＡ分子に結合する際にも変化する。基質の消化及び酵素の放出または除去に従い、他の位置へのマイクロカンチレバー偏向が観測され得る。同様にマイクロカンチレバー偏向は、基質が酵素と相互作用して結合する際の表面上の物質量増加による、機械応力における変化により第１の位置から第２の位置へ変化し得る。偏向は例えば、ＤＮＡからＤＮＡ基質分子の長さ増加を生じるリガーゼ分子の活性に従い、第２の位置から少なくとも第３の位置に変化し得る。偏向はリガーゼがＤＮＡ基質から分離する際、第３の位置から少なくとも第４の位置に変化し得る。
【００３９】
マイクロカンチレバー偏向の他の実施態様は、例えばＤＮＡ基質がＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼと反応した際に基質分子の物理的変化が起こった場合に観測される。マイクロカンチレバーの偏向は、基質が酵素と相互作用した際における表面上の物質量の増加により、第１の位置から少なくとも第２の位置に変化できる。偏向は、ヌクレアーゼがＤＮＡ基質分子からＤＮＡを取り除いた場合に第２の位置から少なくとも第３の位置に変化できる。偏向は、ヌクレアーゼがＤＮＡ基質から分離した場合に第３の位置から少なくとも第４の位置に変化できる。しかし、これらの相互作用はｎ（ナノ）秒〜μ（マイクロ）秒速度で起こるため偏向を測定する実際の時間は、酵素の酵素的活性による基質量及び表面上の酵素量を含む、マイクロカンチレバー表面上全てにおける全体的な変化の測定となる。
【００４０】
マイクロカンチレバーの偏向は容量性手段、圧電性手段、ピエゾ抵抗手段、または光学的手段により測定できる。“容量性”の語は物質表面上の力または応力から生じる非導電性物質中のエネルギー保存を意味する。この力または応力はマイクロカンチレバーの偏向を生じ得る。“圧電性”の語は、機械的応力を適用した際の、固体非導電性物質の表面間に生じる圧力及び／または電流を意味する。“ピエゾ抵抗”の語は、圧力または力が物質表面上に与えられた際の物質の電気抵抗変化を意味する。光学的手段は周辺光の使用及びレーザーなどその他の光源の使用を含む。光学的、電気的及び機械的手段によるマイクロカンチレバー偏向の検出は、１９９７年８月５日に発行された米国特許第５，６５３，９３９号に示されている。レーザー光源の使用については、２０００年１月２５日に発行された第６，０１６，６８６号、及び２０００年９月２６日に発行された第６，１２３，８１９号に記載されている。Ｍａｊｕｍｄａｒら（国際公開公報第ＷＯ０１／１４８２３  Ａ１、２００１年３月１日）は、一連の固定フレーム・フィンガーに関連して偏向し得る一連のマイクロカンチレバー・フィンガー配列単位のマイクロフォースを測定するために入射光線の回折測定を用いる。偏向検出のための磁気及び電気的手段は１９９８年９月１５日に発行された米国特許第５，８０７，７５８号、１９９２年１０月２０日に発行された第５，１５６，８１０号、及び１９９９年１１月９日に発行された第５，９８１，２９７号及び２０００年８月２２日に発行された第６，１０７，０００号にそれぞれ示されている。偏向測定のための圧電的手段は１９９８年９月２９日に発行された米国特許第５，８１４，５２５号；１９９５年８月２９日に発行された第５，４４５，００８号；及び１９９８年２月１７日に発行された第５，７１９，３２４号にそれぞれ示されている。
【００４１】
時間パラメーターは第１の時点から少なくとも第２の時点、及び第３、第４等の時点の事象または発生を測定するための時間間隔である。通常、第１の時点はマイクロカンチレバーをサンプルに暴露した時間を意味する。
【００４２】
応力は、表面上の分子間相互作用に関連するマイクロカンチレバー表面上に与えられる力であり、例えば：酵素放出に従う、マイクロカンチレバーの第１の表面上基質の酵素的変化；またはサンプル中のタンパク質の基質への不可逆的結合である。応力は、特異酵素基質または特定酵素阻害物質または潜在的基質と酵素との相互作用から得られるマイクロカンチレバー表面上に与えられるいかなる種類の力も含む。マイクロカンチレバーは、第１の物質表面のコーティング層に添加された１以上の物質を含むサンプル成分の様々な相互作用による応力差に敏感である。
【００４３】
“応答”の語は、すべてのコーティング及び酵素のための基質のようなセンサー物質を含むマイクロカンチレバーが酵素が特異的に基質と相互作用した際に生じる相互作用力により発生した応力の結果として偏向できるということを意味する。得られる力は化学・機械的力、熱機械力、静電気力、磁力及びその他の種類の力を単独または組み合わせて含む。
【００４４】
酵素
“酵素”の語は多数のタンパク質生物学的触媒を包含し、反応を触媒するものとして知られ、または予測されるものである。最も一般的には、酵素は生物学的経路を含む可能性のある多数の生物学的反応のうち少なくとも１つを触媒することができる。さらに、酵素はエタノールから酢酸への変換のような有機化学反応または分子窒素の還元のような無機反応を触媒することができる。
【００４５】
酵素的触媒反応の結果である分子は“生成物”と呼ばれる。酵素、基質及び生成物の語は酵素学及び生化学の当業界において標準用語である。酵素の語は例えば、マイクロカンチレバー上で酵素生成物を生じるためにその酵素基質を修飾できるサンプル中の活性酵素；触媒異常を有する遺伝子組換え酵素；触媒活性に必須の共同因子が欠如した酵素；及び偽基質に不可逆的に結合するサンプル中の酵素を含み得る。基質分子上の酵素活性により生じる相互作用力は化学・機械力、熱機械力、静電気力、磁力及びその他の種類の力を含む。
【００４６】
酵素は触媒する反応に基づき６つに大別される：異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ及びリガーゼ。異性化酵素は化合物である基質変換を触媒し、同じ数及び種類の原子を含むが異なる構造構成を有する異なる化合物生成物にする。酸化還元酵素は酸化、還元を伴い、基質の電子またはプロトン移動反応を伴う。転移酵素は原子群を基質分子から、または基質分子へ移動させる反応を触媒する。加水分解酵素は加水分解により基質の様々な共有結合の１以上を切断する。リガーゼは共有結合を形成するために２以上の基質成分を結合し、各成分が基質複合体の一部となる。当業者に公知の酵素は酵素を精製するために採取及び濃縮された細胞から精製できる。細胞は微生物学及び細胞生物学の当業者に通常用いられる方法により破裂させ、例えば、高周波による分解、加圧型細胞破壊装置、凍結融解及び洗剤溶解である。
【００４７】
分泌型微生物酵素は使用済み培養基、すなわち細胞の培養及び成長に従い除去した細胞由来の成長培地から得られる。酵素はカラムクロマトグラフィー、特に親和性カラムクロマトグラフィー及びイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーなどの手順により精製でき、融合タンパク質として、高特異性の親和性配位子を用いて精製できる（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔａｌｏｇ、２０００−２００１、第１４２〜１４３頁を参照）。
【００４８】
酵素はジチオトレイトールまたはメルカプトエタノールなどの酸化防止剤を含んだ適当な緩衝液中で精製及び保存し、削減条件下で天然システインジスルフィド結合を保持する。また、ＥＤＴＡなどのキレート剤を用いて重金属不活性化から酵素を保護する。酵素は水結晶形成を防止するためにグリセロールまたはＤＭＳＯなどの試薬を用いて、または適当な緩衝液中において−２０℃または−７０℃で保存できる。関連する酵素の多くは市販されている（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．、セントルイス、ミズーリ州；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア州；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．ベバリー、マサチューセッツ州）。また、保存及び濃縮反応のために適当な緩衝液も市販されており、最適な酵素活性のために処方して混合し、適当なイオンを含む。もしくは、酵素は精製結晶として入手可能であり、使用前に特有の適当な濃度で適当な緩衝液中に溶解できる。
【００４９】
ここでの酵素は、化学的変化を促進するためのその他の分子、例えば触媒抗体と反応できる遺伝子組換えまたは半合成ペプチド含有分子の範囲を含む。酵素の語はさらに、特性は明らかにされていないが、基質及び分析システムが考察できる活性を含むものとして想定され、例えば、１０以上のヌクレオチドからなる反復性または非反復性配列を認識及び結合するＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼである。さらに、酵素の語は、公知の活性を有する酵素の天然または遺伝子組換え誘導体を含み、活性の減少した、または不活性の誘導体を含む。
【００５０】
公知の活性を有する酵素は、本方法及び装置を用いてその活性パラメーターにより、特定の酵素基質に関連した特性を示し、基質への親和力及び生成物を生じるための基質の代謝回転速度などである。パラメーターは基質への親和力測定に関するものはＫｍ（ミカエリス定数）及び最大速度Ｖｍａｘとして知られる。これらのパラメーターは酵素と基質濃度の関数として酵素活性を分析することにより、及び時間の関数として反応を観測することにより測定する。酵素阻害物質の存在下における変異酵素及び活性酵素は、特定の基質に関してより低い親和性（増加したＫｍ）またはより低い回転数（減少したＶｍａｘ）を示す。本発明の方法及び装置は酵素誘導体のＫｍ及びＶｍａｘの変化を測定するために、及び酵素阻害物質の同定及び分析のために最適化することができる。
【００５１】
酵素活性のための基質
“基質”の語は酵素の生化学における当業者により具体的に選択された分子を意味し、目的の酵素と反応する物質として知られるものである。基質分子または異なる基質分子の混合物は少なくとも１種の分子が特異的に酵素の活性部位に結合することが知られていることにより選択でき、従って酵素が基質を変化させる化学反応を触媒作用する。例えば、基質はプロテアーゼ酵素のための特定のタンパク質であり；または基質は制限エンドヌクレアーゼ分子により認識できる特定のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子である。
【００５２】
基質は新規な酵素活性を検出するために設計でき、すなわち、多数の天然生成物サンプルの１つに存在する可能性があるが、現在は存在することが知られていない酵素活性、または変異酵素ライブラリー由来の酵素活性である。“基質”の語は工学技術において他の物質の担体として働く表面を示すために通常使用され、例えば、２０００年９月２６日に発行された米国特許第６，１２３，８１９号である。本明細書中の“基質”の語は、最初の基質物質と化学的に異なる生成物を生じるために、選択した酵素と特異的に相互作用できる分子からなる特定の分類の一部、及び酵素に結合でき、さらに酵素に触媒された反応により化学的に変化する分子の特定分類の一部についてのみ言及するために用いるものである。
【００５３】
基質は酵素の天然基質である必要はなく、使用者の特定の目的に従って設計でき、例えば診断、阻害物質調査、純度モニタリング、または新規酵素の発見などである。基質は天然型であってもよく、例えば、野生型構造のタンパク質であり、または変性、及びさらに化学的に修飾したものでもよい。基質はさらにその他の検出手段で用いるために修飾してもよく、例えば基質は、発色性（ｃｏｌｏｒｉｇｅｎｉｃ）、蛍光発生性、または放射性であってもよいが、これらの修飾はマイクロカンチレバー偏向側面に影響を与える必要はない。
【００５４】
ある環境において、基質分子の配置が密度の高いものであることは望ましく、例えば、より長い基質分子の低密度配置とは対照的に短い基質分子である。マイクロカンチレバー表面上の基質の酵素消化運動は、例えば酵素のストークス半径など特定酵素の大きさに依存し、従って、基質分子の密度及び大きさの最適範囲は使用者の実験により決定されるべきである。マイクロカンチレバーの第１の表面上の基質密度は、酵素濃度、酵素と架橋剤の反応温度または該反応の継続時間など１以上の因子を変化させることにより調整できる。さらに、基質は、酵素学の当業者により決定される適当な分子の混合物であってもよい。
【００５５】
センサー物質はマイクロカンチレバー表面上に溶着でき、サンプル成分と相互作用できる。例えば、センサー物質は生体物質である。他の実施態様において、センサー物質はタンパク質、特に酵素と相互作用できる任意の物質であり、マイクロカンチレバー上に固定化できるものである。
【００５６】
“生体物質”の語は天然源から単離できる有機物質を意味し、または有機出発物質を用いて化学合成により合成または半合成して生成される有機物質を意味する。例えば、生体物質は動物組織、植物などの天然源から、または細菌性細胞から当業者に公知の細胞技術を用いて単離できる。タンパク質などの生体物質は組換えＤＮＡ技術を用いて半合成的に合成でき、または当業者に公知の細胞方法により真核無細胞系において合成できる。タンパク質は固体状態または溶液ペプチド合成化学を用いて、ペプチド合成の当業界において公知の市販の装置及び基質細胞により新規に合成できる。生体物質は細胞全体または細胞の一部であってもよい。微小構造上の抗体を用いる固定化された結合大腸菌の検出のためのセンサーはＩｌｉｃら“Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（機械的共鳴免疫特異性の生物学的検出器）”（Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ．７７、Ｎｏ．３、第４５０−４５２頁、２０００年７月１７日）に開示されている。生体物質及びその他のセンサー物質は市販で手に入り、または研究室内で当業者により生成できる。
【００５７】
“非切断型偽基質”の語は天然酵素基質に化学的に類似する分子を意味し、酵素に結合できるが、偽基質は化学的に変化しない。偽基質は酵素活性部位に共有結合または非共有結合できるが、化学反応の最終生成物に変換できない。例えば、タンパク性プロテアーゼ阻害物質はプロテアーゼのための偽基質として作用でき、例えば、合成阻害物質はｃＡＭＰ依存型タンパク質キナーゼのための偽基質として作用できる。
【００５８】
“実質的に純粋”の語は、目的の酵素が他の非酵素物質に対して初期濃度と比較した最終濃度を増加させるために物理的に操作されたことを意味し、例えば、酵素溶液が溶液の非酵素成分に対して少なくとも８０％純粋であり、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋または少なくとも９９％純粋となるようにする。
【００５９】
サンプル
“サンプル”の語は流体状態で溶解また分散させた成分を意味する。目的のサンプルはテーマから診断上重要なサンプル中の酵素の存在に関して分析できる；あるいは、サンプルは新規酵素活性の存在に関して分析できる。
【００６０】
“体液”の語は動物の体から生成または分泌される液体、血液、リンパ液、組織液、尿、胆汁、汗、滑液、羊水、腹水、心嚢液、胸膜液、脳脊髄液、胃液、腸液、関節腔液、涙液、鼻汁を意味する。
【００６１】
“病状”の語は正常な機能が損なわれた、対象の健康状態を意味する。病状は例えば、遺伝的欠陥、感染、白血病などの癌または腫瘍等を含む。
【００６２】
“感染”の語は、集合的に病原体と呼ばれる病気を引き起こす有機体である、細菌、ウイルス、真菌、または原生動物の１種以上により引き起こされる人間または動物対象の疾患を含むことを意味する。“真菌”の語は酵母菌を含むことを意味する。本発明において病原体は、限定されないが、以下のものが例示される：エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス肺炎病原菌、リステリア・モノサイトゲネス、ヒト型結核菌、ハンセン菌、プロピオニバクテリウム・アクネス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタヒロコッカス・インターメディア、溶血性連鎖球菌、肺炎連鎖球菌などのグラム陽性細菌；フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム、ヘリコバクター・ピロリ、ヘモフィルス肺炎病原菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、淋菌、緑膿菌、シゲラ・ディゼンテリエ、チフス菌、パラチフス菌、大腸菌抗原型Ｏ１５７：Ｈ７、クラミジア属などのグラム陰性細菌；ＨＩＶ−１、−２及び−３、ＨＳＶ−Ｉ及びＩＩ、非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型肝炎ウイルス、ポックス・ウイルス、狂犬病ウイルス、及びニューカッスル病ウイルスなどのウイルス；カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリ、カンジダ・ｋｒｕｓｅｉ、カンジダ・ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・ｑｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ、カンジダ・ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、アスペルギルス・フミガーツス、黒色アルペルギルス、アスペルギルス・ｎｉｄｕｌａｎｓ、アスペルギルス・フラーブス、アスペルギルス・テレウス、アブシディア・コリンビフェラ、アブシディア・ｒａｍｏｓａ、クリプトコッカス・ｎｅｏｆｏｒｍｓ、ヒストプラスマ・カプスラーツム、コクシジオイデオ・イミティス、ニューモシスティス・カリニ、リゾプス・アリツス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）（クモノスカビ）、リゾプス・オリゼー、ムコール・プシルス及びその他の真菌などの真菌；及び赤痢アメーバ、大腸アメーバ、ランブル鞭毛虫、ジアルジア（Ｇ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、アイメリア属、トキソプラズマ属、クリプトスポリジウム・パルヴム、クリプトスポリジウム・ムリス、クリプトスポリジウム・ベイレイ、クリプトスポリジウム・メレアグリディス、クリプトスポリジウム・ｗｒａｉｒｉ及びクリプトスポリジウム・ｎｏｓａｒｕｍなどの原生動物。これらの有機体から、タンパク質をスクリーニングすることにより、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチドを分析することにより固有のエピトープを得ることは当業者に公知である。
【００６３】
“遺伝的欠陥”の語は変異対立遺伝子または病気遺伝子の存在により生じる遺伝による病的状態を意味する。例としては、限定されないが、ファブリー病、ゴーシェ病、テイ−サックス病、レッシュ−ナイハン病、マンノシドーシス病、Ｘ連鎖性糸球体病、及びムコ多糖症が挙げられる。
【００６４】
架橋剤
酵素基質及びマイクロカンチレバーの第１の表面に関する“結合”の語は共有結合またはマイクロカンチレバーの第１の表面上のコーティング物質に結合したその他の物理的な基質結合分子を意味する。好ましい実施態様において、結合は基質から化学的リンカー原子への共有結合であり、例えば、異なる原子を通じて第１の表面に共有結合する、二官能性架橋剤または架橋剤である。また結合は、第１の表面または生体分子が変化しない、生体物質が第１の表面上のコーティング物質へ直接非共有結合するものであってもよい。このような結合は形、電荷の相補性及び／または水の水和、疎水性の排除、または第１の表面と特定の基質の特定の組み合わせのその他の特性に起因する（米国特許第６，１２３，８１９号、２０００年９月２６日発行）。
【００６５】
“二官能性架橋剤”の語は、第１の成分から第２の成分へ結合できる物質を意味し、架橋剤は炭素鎖からなり、該物質の第１の末端に第１の化学反応基及び該物質の第２の末端に第２の生物反応基を有する。第１の成分と該物質の第１の末端との化学反応、及び第２の成分と該物質の第２の末端との化学反応は本発明の第１及び第２の成分の架橋を生じる。二官能性架橋剤は基質分子をマイクロカンチレバーの第１の表面に結合するために用い、例えば、コラーゲンなどのタンパク質基質を金コーティングを有する第１の表面に結合する。
【００６６】
例えば、二官能性架橋剤は以下の化合物を含むことができる：ジチオビス（スクシンイミジル−ウンデカノエート）（ＤＳＵ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ロックフォード、イリノイ州）から市販；スルフドリル基及びアミノ基と反応するピリジルジチオ及びＮＨＳエステル反応基を含む、長鎖スクシンイミド−６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサン酸（ＬＣＳＰＤＰ）、Ｐｉｅｒｃｅから市販；スルフドリル基及びアミノ基と反応するピリジルジチオ及びＮＨＳエステル反応基を含む、スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサン酸（ＳＰＤＰ）、Ｐｉｅｒｃｅ（ロックフォード、イリノイ州）から市販；及びスルフドリル基及びアミノ基と反応するＮＨＳエステルとマレイミド反応基を含むｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｐｉｅｒｃｅ（ロックフォード、イリノイ州）から市販。
【００６７】
ここで用いる“タンパク質”、“ポリペプチド”及び“ペプチド”の語は同じ意味を持つものとする。
【００６８】
本発明の上述の実施態様を十分に説明するために、以下の実施例及び請求項により具体的に説明するが、さらに限定することを意図するものではない。言及した参考文献の内容はここに引用することとする。
【００６９】
実施例
実施例１  免疫グロブリンＩｇＧ抗体基質のパパイン消化
金コーティングを有するマイクロカンチレバー表面を１０分間オゾン濃縮雰囲気にさらすことにより消毒した。架橋剤をＤＳＵの０．１％（ｗ／ｖ）ジオクサン溶液中に６０分間マイクロカンチレバーを浸すことにより付着させた。マイクロカンチレバーをジオクサンで３回洗浄し、続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．６で洗浄した。
【００７０】
マイクロカンチレバーをさらにＰＢＳ溶液中で６０分間、免疫グロブリンＧ溶液を用いて培養し、パパイン酵素のためのタンパク質基質をマイクロカンチレバーの第１のコーティング表面に共有結合させた。マイクロカンチレバーを抗体溶液から取り除き、ｐＨ８．５の炭酸緩衝液に３０分間浸して非反応ＤＳＵを加水分解した。
【００７１】
マイクロカンチレバーを原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）の細胞中に取り付け、マイクロカンチレバー偏向測定を開始した。安定基準に到達後、洗剤Ｔｗｅｅｎの０．１％（ｗ／ｖ）溶液を含んだＰＢＳ溶液１００マイクロリットルのサンプルを細胞中に注入した。マイクロカンチレバー偏向を時間の関数として観測し、“対照”として図４に描いた。次に、１００マイクロリットルのパパインサンプル（１００μｇ／ｍＬ；ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を細胞中に注入した。マイクロカンチレバー偏向を時間の関数として観測し、結果を“パパイン”と示して図４に描いた。
【００７２】
図４に示すマイクロカンチレバーの安定上昇したたわみは、マイクロカンチレバー第１の金コーティング表面からのタンパク質基質の変化によるマイクロカンチレバー上の表面張力の変化を意味する。データは１の実施例のいくつかの観測結果を示し、同じ結果を有する。データはパパインの酵素活性観測を時間の関数として示す。さらに、これらのデーターは酵素活性を測定するためのマイクロカンチレバー性能を示す。
【００７３】
実施例２  ＩｇＧ基質の淋菌分泌プロテアーゼ消化
金コーティングを有するマイクロカンチレバー表面を１０分間オゾン濃縮雰囲気にさらすことにより消毒する。架橋剤をＤＳＵの０．１％（ｗ／ｖ）ジオクサン溶液中に６０分間マイクロカンチレバーを浸すことにより付着させる。マイクロカンチレバーをジオクサンで洗浄し、続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．６で洗浄する。
【００７４】
マイクロカンチレバーをさらにＰＢＳ溶液中で６０分間、免疫グロブリンＧ溶液（１ｍｇ／ｍＬ；ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて培養し、ＩｇＧタンパク質基質を表面に共有結合させる。マイクロカンチレバーを抗体溶液から取り除き、ｐＨ８．５の炭酸緩衝液に３０分間浸して非反応ＤＳＵを加水分解する。
【００７５】
マイクロカンチレバーをＡＦＭの細胞中に取り付け、偏向測定を開始する。安定基準に到達後、洗剤Ｔｗｅｅｎの０．１％（ｗ／ｖ）溶液を含んだＰＢＳ溶液１００マイクロリットルのアリコートを細胞中に注入する。マイクロカンチレバー偏向を時間の関数として観測する。次に、淋菌分泌プロテアーゼを含んだ１００マイクロリットルのアリコートサンプルを細胞中に注入した。マイクロカンチレバー偏向をさらに時間の関数として観測する。
【００７６】
マイクロカンチレバーの安定上昇するたわみは金コーティング側のマイクロカンチレバーからタンパク質基質の表面張力が変化することを示す。その他の多くの細菌病原体が、病気の過程中に類似の抗体特異性タンパク質分解酵素を分泌し、マイクロカンチレバーの使用により酵素を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】マイクロカンチレバーの上面図の一部の略図であり、３次元の、第１及び第２の表面、及び第１の表面上に溶着させた基質分子を表す。
【図２】マイクロカンチレバー表面及び生体物質に付着した二官能性架橋剤分子及びマイクロカンチレバー表面に直接結合した生体物質を有するマイクロカンチレバーの側面図の概念図である。さまざまな酵素及び結合形態及び消化基質分子を表す。
【図３】様々な偏向位置の可能性及び本来の位置への戻りを示すマイクロカンチレバーの概略図である。
【図４】緩衝液のみに暴露した同じマイクロカンチレバーを用いた事前の対照（下側の関数）と比較した、ＩｇＧがパパインを消化した結果の（上側の関数）、マイクロカンチレバー（ｎｍ、縦軸）の時間的経過（秒、横軸）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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