(57)【要約】化合物を細胞関門を通過して，細胞内に，細胞を通って，および細胞の外に輸送する複合体および化合物，およびそのような複合体および化合物を製造する方法および使用する方法が開示される。本発明の複合体および化合物は，生物学的に活性な部分，およびリガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，リガンドに向けられたターゲティング要素を含むが，ただし，ターゲティング要素は抗体ではない。リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，リガンドに向けられた２またはそれ以上のターゲティング要素を含む複合体および化合物もまた開示される。好ましいリガンドとしては，限定されないが，ｐＩｇＲの茎，ｐＩｇＲドメイン，種々の動物からのｐＩｇＲの間で保存されているアミノ酸配列，および本明細書において規定されるｐＩｇＲのいくつかの領域の１つが挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性な部分と，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，リガンドに向けられたターゲティング要素とを含み，前記ターゲティング要素は抗体ではない，複合体または化合物。
【請求項２】
前記ターゲティング要素が核酸である，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項３】
前記リガンドが，ｐＩｇＲ茎またはそのドメイン，保存配列または領域である，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項４】
前記リガンドが，ＬＲＫＥＤ，ＱＬＦＶＮＥＥ，ＬＮＱＬＴ，ＹＷＣＫＷ，ＧＷＹＷＣ，ＳＴＬＶＰＬ，ＳＹＲＴＤ，およびＫＲＳＳＫからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項５】
生物学的に活性な部分と，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，リガンドに向けられたターゲティング要素とを含む化合物であって，前記ターゲティング要素は抗体ではなく，かつ，前記リガンドは，
Ｒ１  ＫＲＳＳＫからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ２ａ  ＳＹＲＴＤからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ２ｂ  ＳＹＲＴＤからＫＲＳＳＫ，
Ｒ３ａ  ＳＴＬＶＰＬからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ３ｂ  ＳＴＬＶＰＬからＫＲＳＳＫ，
Ｒ３ｃ  ＳＴＬＶＰＬからＳＹＲＴＤ，
Ｒ４ａ  ＧＷＹＷＣからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ４ｂ  ＧＷＹＷＣからＫＲＳＳＫ，
Ｒ４ｃ  ＧＷＹＷＣからＳＹＲＴＤ，
Ｒ４ｄ  ＧＷＹＷＣからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ５ａ  ＹＷＣＫＷからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ５ｂ  ＹＷＣＫＷからＫＲＳＳＫ，
Ｒ５ｃ  ＹＷＣＫＷからＳＹＲＴＤ，
Ｒ５ｄ  ＹＷＣＫＷからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ５ｅ  ＹＷＣＫＷからＧＷＹＷＣ，
Ｒ６ａ  ＬＮＱＬＴからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ６ｂ  ＬＮＱＬＴからＫＲＳＳＫ，
Ｒ６ｃ  ＬＮＱＬＴからＳＹＲＴＤ，
Ｒ６ｄ  ＬＮＱＬＴからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ６ｅ  ＬＮＱＬＴからＧＷＹＷＣ，
Ｒ６ｆ  ＬＮＱＬＴからＹＷＣＫＷ，
Ｒ７ａ  ＱＬＦＶＮＥＥからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ７ｂ  ＱＬＦＶＮＥＥからＫＲＳＳＫ，
Ｒ７ｃ  ＱＬＦＶＮＥＥからＳＹＲＴＤ，
Ｒ７ｄ  ＬＮＱＬＴからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ７ｅ  ＱＬＦＶＮＥＥからＧＷＹＷＣ，
Ｒ７ｆ  ＱＬＦＶＮＥＥからＹＷＣＫＷ，
Ｒ７ｇ  ＱＬＦＶＮＥＥからＬＮＱＬＴ，
Ｒ８ａ  ＬＲＫＥＤからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ８ｂ  ＬＲＫＥＤからＫＲＳＳＫ，
Ｒ８ｃ  ＬＲＫＥＤからＳＹＲＴＤ，
Ｒ８ｄ  ＬＲＫＥＤからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ８ｅ  ＬＲＫＥＤからＧＷＹＷＣ，
Ｒ８ｆ  ＬＲＫＥＤからＹＷＣＫＷ，
Ｒ８ｇ  ＬＲＫＥＤからＬＮＱＬＴ，および
Ｒ８ｈ  ＬＲＫＥＤからＱＬＦＶＮＥＥ
からなる群より選択される領域中に存在することを特徴とする化合物。
【請求項６】
前記ターゲティング要素が，カルモジュリン，ＡＰ−１ゴルジアダプターまたは細菌ポリペプチドに由来するポリペプチドである，請求項３記載の複合体または化合物。
【請求項７】
前記化合物がＰＴＤまたはＭＴＳをさらに含む，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項８】
前記生物学的に活性な部分が，ペプチド模倣体であってもよいポリペプチド，核酸，脂質，炭水化物，金属を含む化合物または複合体，小分子，またはこれらのいずれかの機能的誘導体である，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項９】
前記生物学的に活性な部分が，金属を含む複合体または化合物である，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項１０】
前記金属が，白金（ＩＩ），パラジウム（ＩＩ），亜鉛およびコバルト（ＩＩＩ）からなる群より選択される，請求項７記載の複合体または化合物。
【請求項１１】
前記生物学的に活性な部分が核酸である，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項１２】
前記生物学的に活性な部分がポリペプチドである，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが，成長因子，インターロイキン，免疫原，ホルモン，酵素，酵素阻害剤，抗体，凝固因子，レセプター，レセプターのリガンド，キナーゼ，ホスファターゼ，足場蛋白質，アダプター蛋白質，優性ネガティブ変異体，プロテアーゼ，シグナリング分子，制御分子，トランスポーター，転写レギュレーター，核酸結合蛋白質，およびそれらの機能的誘導体からなる群より選択される，請求項１２記載の複合体または化合物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが，インスリン，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ｈＧＨ，ｓＣＴおよびｈＣＴからなる群より選択される，請求項１２記載の複合体または化合物。
【請求項１５】
前記生物学的に活性な部分が，前記リガンド以外の分子ターゲットに向けられる第２のターゲティング要素である，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項１６】
前記複合体または化合物が，ターゲティング要素ではない生物学的に活性な部分をさらに含む，請求項１５記載の複合体または化合物。
【請求項１７】
前記第２のターゲティング要素が抗体または抗体誘導体である，請求項１５記載の複合体または化合物。
【請求項１８】
１またはそれ以上のリガンドに向けられた，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する２またはそれ以上のターゲティング要素を含む複合体または化合物。
【請求項１９】
前記複合体または化合物中の前記ターゲティング要素の少なくとも１つが，前記化合物中の少なくとも１つの別のターゲティング要素と同一または実質的に同一である，請求項１８記載の複合体または化合物。
【請求項２０】
前記複合体または化合物中の前記ターゲティング要素の少なくとも１つが，前記第２の化合物の少なくとも１つの別のターゲティング要素とは異なる，請求項１８記載の複合体または化合物。
【請求項２１】
前記リガンドが，ｐＩｇＲ茎またはそのドメイン，保存配列または領域である，請求項１８記載の複合体または化合物。
【請求項２２】
前記リガンドが，ＬＲＫＥＤ，ＱＬＦＶＮＥＥ，ＬＮＱＬＴ，ＹＷＣＫＷ，ＧＷＹＷＣ，ＳＴＬＶＰＬ，ＳＹＲＴＤ，およびＫＲＳＳＫからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである，請求項１記載の複合体または化合物。
【請求項２３】
前記リガンドが，ＬＲＫＥＤ，ＱＬＦＶＮＥＥ，ＬＮＱＬＴ，ＹＷＣＫＷ，ＧＷＹＷＣ，ＳＴＬＶＰＬ，ＳＹＲＴＤ，およびＫＲＳＳＫからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである，請求項１８記載の複合体または化合物。
【請求項２４】
前記リガンドがｐＩｇＲの領域中にあり，前記ｐＩｇＲは任意の動物に由来するものであることができ，前記領域が，
Ｒ１  ＫＲＳＳＫからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ２ａ  ＳＹＲＴＤからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ２ｂ  ＳＹＲＴＤからＫＲＳＳＫ，
Ｒ３ａ  ＳＴＬＶＰＬからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ３ｂ  ＳＴＬＶＰＬからＫＲＳＳＫ，
Ｒ３ｃ  ＳＴＬＶＰＬからＳＹＲＴＤ，
Ｒ５ｅ  ＹＷＣＫＷからＧＷＹＷＣ，
Ｒ６ｅ  ＬＮＱＬＴからＧＷＹＷＣ，
Ｒ６ｆ  ＬＮＱＬＴからＹＷＣＫＷ，
Ｒ７ｅ  ＱＬＦＶＮＥＥからＧＷＹＷＣ，
Ｒ７ｆ  ＱＬＦＶＮＥＥからＹＷＣＫＷ，
Ｒ７ｇ  ＱＬＦＶＮＥＥからＬＮＱＬＴ，
Ｒ８ｅ  ＬＲＫＥＤからＧＷＹＷＣ，
Ｒ８ｆ  ＬＲＫＥＤからＹＷＣＫＷ，
Ｒ８ｇ  ＬＲＫＥＤからＬＮＱＬＴ，および
Ｒ８ｈ  ＬＲＫＥＤからＱＬＦＶＮＥＥ
からなる群より選択される，請求項１または１８に記載の複合体または化合物。
【請求項２５】
前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物が細胞毒性薬剤であり，ｐＩｇＲまたはｐＩｇＲ茎をディスプレイする癌性またはその他の疾病細胞に輸送される，請求項１または１８に記載の複合体または化合物。
【請求項２６】
リガンドに結合する化合物に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，リガンドに向けられたｎ個のターゲティング要素を含む化合物であって，前記化合物の１またはそれ以上の望ましい性質がｍ個のターゲティング要素を有する第２の化合物と比較して増強されており，ここで，ｎおよびｍはいずれも整数であり，かつｎ＞ｍであることを特徴とする化合物。
【請求項２７】
前記１またはそれ以上の望ましい性質が，前記リガンドに対するアフィニティーまたはアビディティーの変化である，請求項２６記載の化合物。
【請求項２８】
前記薬理学的特性が，半減期，分泌の減少，効力および選択性からなる群より選択される，請求項２７記載の化合物。
【請求項２９】
リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，１またはそれ以上のリガンドに向けられた２またはそれ以上のターゲティング要素と，少なくとも１つの生物学的に活性な部分とを含む複合体または化合物。
【請求項３０】
生物学的に活性な部分と，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，リガンドに向けられたターゲティング要素とを含む複合体または化合物であって，前記ターゲティング要素は抗体ではなく，前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物は，動物の臓器の管腔から体内に吸収されることを特徴とする複合体または化合物。
【請求項３１】
生物学的に活性な部分と，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，リガンドに向けられたターゲティング要素と，少なくとも１つの生物学的に活性な部分とを含む複合体または化合物であって，前記ターゲティング要素は抗体ではなく，前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物は，動物の臓器の管腔から体内に吸収されることを特徴とする複合体または化合物。
【請求項３２】
リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，１またはそれ以上のリガンドに向けられた２またはそれ以上のターゲティング要素と，少なくとも１つの生物学的に活性な部分とを含む複合体または化合物であって，前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物は，動物の臓器の管腔から体内に吸収されることを特徴とする複合体または化合物。
【請求項３３】
上皮細胞が前記管腔の内側に並ぶ，請求項３１または３２に記載の複合体または化合物。
【請求項３４】
前記管腔が，胃腸管腔，肺管腔，鼻管腔，鼻咽頭管腔，咽頭管腔，口腔管腔，舌下管腔，膣管腔，尿生殖器管腔，眼管腔，鼓室管腔，眼表面，子宮内膜腺，尿道腺，膀胱腺，乳腺，唾液腺，涙腺，呼吸洞腺，胆汁腺，汗腺からなる群より選択される，請求項３１または３２に記載の複合体または化合物。
【請求項３５】
前記化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物が，前記動物の血液，リンパ，間質液または羊水に輸送される，請求項３１または３２に記載の複合体または化合物。
【請求項３６】
前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分が，有効量の前記化合物またはその生物学的に活性な部分の輸送をもたらす薬物動態学的プロファイルをもって体内に輸送される，請求項３１記載の複合体または化合物。
【請求項３７】
前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物が，経細胞移動しうる，請求項１または１８記載の複合体または化合物。
【請求項３８】
前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物が，先端から基底外側へトランスサイトーシスしうる，請求項１または１８記載の複合体または化合物。
【請求項３９】
前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物が，先端のエンドサイトーシスを行うことができる，請求項１または１８記載の複合体または化合物。
【請求項４０】
前記化合物，またはその生物学的に活性な部分が基底外側のエキソサイトーシスを行うことができる，請求項１または１８記載の複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物。
【請求項４１】
前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物が，細胞内輸送されることができる，請求項１または１８記載の複合体または化合物。
【請求項４２】
前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物が，細胞内コンパートメントに輸送される，請求項１または１８記載の複合体または化合物。
【請求項４３】
前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物が細胞関門を横切って輸送される，請求項１または１８記載の複合体または化合物。
【請求項４４】
請求項１または１８記載の複合体または化合物を含む医薬組成物。
【請求項４５】
１またはそれ以上の抗プロテアーゼまたは担体ポリペプチドをさらに含む，請求項４４記載の医薬組成物。
【請求項４６】
生物学的に活性な薬剤をこれを必要とする動物に輸送する方法であって，前記動物を請求項１または１８記載の複合体または化合物と接触させることを含む方法。
【請求項４７】
生物学的に活性な薬剤を上皮関門または粘膜関門を通して輸送する方法であって，前記上皮関門または粘膜関門を請求項１または１８記載の複合体または化合物と接触させることを含む方法。
【請求項４８】
動物において疾病を治療する方法であって，前記動物を請求項１または１８記載の複合体または化合物と接触させることを含む方法。
【請求項４９】
請求項４８記載の医薬組成物を含む医療機器またはキット。
【請求項５０】
前記複合体または化合物が検出可能な成分をさらに含む，請求項１または１８記載の化合物。
【請求項５１】
動物において疾病を同定する方法であって，前記動物を請求項１または１８記載の複合体または化合物と接触させることを含む方法。
【請求項５２】
請求項１または１８記載の化合物または複合体を含む診断用組成物。
【請求項５３】
請求項５２記載の診断用組成物を含む診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は，以下の出願に基づく優先権を主張する：
（ａ）米国特許出願６０／２３７，９２９（代理人書類番号０５７２２０．０３０１｛０３０８５４．０００９．ＰＲＶ１｝，表題”Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐＩｇＲ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｇｌｙｎｎ，Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐｈｉｌｉｐ，Ｌ．，２０００年１０月２日出願）は，ターゲティング要素および生物学的に活性なポリペプチドを含む融合蛋白質に関する。
【０００２】
（ｂ）米国特許出願６０／２４８，４７８および６０／２４８，８１９（それぞれ代理人書類番号０５７２２０．０６０１｛０３０８５４．０００９．ＰＲＶ２｝，および０５７２２０．０６０２｛０３０８５４．０００９．ＰＲＶ３｝，表題”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｐＩｇＲ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈａｗｌｅｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，それぞれ２０００年１１月１３日出願および２０００年１１月１４日出願）は，ターゲティング要素および生物学的に活性なポリペプチドを含む蛋白質コンジュゲートに関する。
【０００３】
（ｃ）米国特許出願６０／２６７，６０１（代理人書類番号０５７２２０．０４０１，表題”Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  ａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐｈｉｌｉｐ，Ｌ．，２００１年２月９日出願）は，（ａ）ｐＩｇＲ分子または茎分子に特異的に結合する少なくとも１つのリガンド，および（ｂ）（ｉ）生物学的に活性な化合物に特異的に結合する，および／または（ｉｉ）それ自身が生物学的に活性な化合物である，少なくとも１つのリガンドを有する多特異性組成物および化合物に関する。
【０００４】
（ｄ）米国特許出願０９／８９８，５０３（代理人書類番号０５７２２０．１４０１，表題”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｈａｗｌｅｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｃｈａｐｉｎ，Ｓｔｅｖｅ，ａｎｄ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，２００１年７月２日出願）は，ターゲティング要素およびリガンドを用いてモノクローナル抗体および関連する化合物および組成物を輸送することに関する。
【０００５】
（ｅ）米国特許出願（代理人書類番号０５７２２０．１３０１，表題”Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｔｉｃ  Ｌｉｇａｎｄｓ”，Ｈａｗｌｅｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｃｈａｐｉｎ，Ｓｔｅｖｅ，Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐｈｉｌｉｐ，ａｎｄ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，２００１年９月６日出願）は，トランスサイトーシス輸送特性を有する多価化合物に関する。
【０００６】
出願（ａ）−（ｅ）のそれぞれは，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００７】
発明の分野
本明細書に開示される本発明は，細胞関門を通過して化合物を細胞の中に，それを通って，およびその外に輸送する組成物，およびそのような組成物を製造および使用する方法に関する。
【０００８】
発明の背景
以下の本発明の背景の記載は，単に本発明の理解を助けるために提供され，本発明に対する先行技術を記載または構成すると認めるものではない。
【０００９】
治療用薬剤は，種々の処方を用いて，種々の投与経路により体内に導入することができる。多くの理由により，投与の好ましい経路は，非侵襲的なもの，すなわち，身体に物理学的障害を与えないものである。一般に，このタイプの物理学的障害は，針などの医療機器を使用して動物の皮膚表面または他の外表面を貫くかまたは破ることにより生ずる。投与の侵襲的経路には，例えば，外科的移植および注射が含まれる。注射は血管内，鞘内または皮下に行うことができるが，これらのいずれも，望ましくない特性を有する。投与の非侵襲的経路には，胃腸管からの取り込み，ならびに非侵襲的な非経口的（すなわち胃腸以外）経路，例えば吸入療法が含まれる。
【００１０】
現在のところ，比較的新しい種類の治療用薬剤である蛋白質を投与するための処方は，あるとしてもわずかしかない。これは投与の非侵襲的経路およびそのための処方については特にあてはまる。治療用蛋白質の多大な可能性にもかかわらず，問題とする特定の蛋白質によって，蛋白質の非侵襲的投与のための組成物および方法がないことにより，その医療における使用が限定または妨げられている。
【００１１】
化合物は，種々の分子により，細胞の中へ，細胞から外へ，および細胞の中で移動する。”エンドサイトーシス”は，分子の細胞内在化のプロセス，すなわち，細胞が受動的または能動的に分子をその環境から取り込むプロセスを表す一般的用語である。”エキソサイトーシス”は，分子が受動的または能動的に細胞の内部から細胞の周囲の媒体に移動するプロセスを表す一般的な用語である。”トランスサイトーシス”は，分子が細胞の１つの表面から別の表面に輸送されるプロセスを表す一般的な用語である。
【００１２】
能動的エンドサイトーシス，エキソサイトーシスおよびトランスサイトーシスは，典型的には，細胞の表面に少なくとも部分的にはディスプレイされる分子であるレセプターが関与するかまたはこれにより媒介される。レセプターは種々の程度の特異性を有する。あるものは１つの分子に特異的であり（例えば，表皮成長因子に特異的なレセプター，またはＣａ＋＋を特異的に認識するレセプター），あるものは半特異的であり（例えば，細胞成長因子のファミリーの多くのメンバーの細胞内在化を媒介するレセプター，またはＣａ＋＋，Ｍｇ＋＋およびＺｎ＋＋を認識するレセプター），または限定された特異性を有する（例えば，すべてのリン酸化された蛋白質の細胞内在化を媒介するレセプター，またはすべての２価カチオンを認識するレセプター）。分子が細胞内に入ることを引き起こすかまたはそれに影響を及ぼすことができる他のタイプの分子としては，例えば，細胞孔，ポンプ，および被覆された壁孔が挙げられる。ゲート型のチャネルおよびイオノフォア型のチャネル等の孔は，細胞膜を越えて広がり，ある種の分子がこれを通って通過することができる。細胞ポンプは，細胞内の１つのタイプの分子を細胞の環境中の別のタイプの分子と交換する。被覆壁孔は，とげ構造で”被覆”され，周囲の外部分子を凝縮する細胞表面中のくぼみである。凝縮された被覆された壁孔は，次に摘み取り”，膜に結合した被覆された小胞を細胞内に形成する。
【００１３】
エンドサイトーシス，エキソサイトーシスおよび／またはトランスサイトーシスを引き起こすか，これに影響を及ぼすか，これを行う分子は，構成的に，すなわちいつも行うか，または制御されて，例えば，ある種の条件下においてのみ，または特定の時間に行うことができる。そのような分子のあるものは，エンドサイトーシスのみを媒介および／または行うことができ，あるものはトランスサイトーシスならびにエンドサイトーシスを媒介および／または行うことができる。さらに，そのような分子のあるものはすべてのまたはほとんどの細胞に存在し（すなわち偏在的），またはある種の組織（すなわち，組織特異的）または特定の細胞タイプに，ほとんどまたはそれのみに存在する。
【００１４】
治療用，診断用または分析用化合物および組成物のエンドサイトーシスを引き起こし，増強し，媒介し，または制御する組成物および方法がないことにより，そのような化合物の種々の用途が妨げられるかまたは妨害されている。特に，多くの化合物の治療上の完全な潜在能力は，これらが胃腸管に沿って並ぶ細胞により取り込まれる場合に実現可能となる。このことによって，治療剤を患者に投与するための丸薬または錠剤を処方することができるからである。典型的には，治療剤を胃腸管に経口輸送するための丸薬および他の処方，および直腸輸送するための座剤は，他の輸送のモダリティー，例えば，静脈内投与と比較して，患者の承諾が選られやすく，医療資源の使用が少ない。同様に，多くの化合物の治療上の潜在的能力は，呼吸管，例えば鼻腔に沿って並ぶ細胞；胃腸管に沿って並ぶ細胞；膣表面；皮膚表面；および眼表面および口腔表面により取り込まれる場合に実現可能となる（Ｓａｙａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １３：８５−１８４，１９９６を参照）。蛋白質のための経口輸送処方の開発の試みは，Ｗａｎｇ（Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ４：１９５−２３２，１９９６），Ｓｉｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：５２７，１９９９）およびＳｔｏｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６４：２１７−２２８，２０００）により議論されている。
【００１５】
生物学的に活性な分子を細胞の中に入れるための組成物および方法の必要性に加えて，トランスサイトーシスを引き起こし，増強し，媒介し，制御し，またはその方向を調節するための組成物および方法がさらに必要とされている。トランスサイトーシスは，分子，例えば生物学的に活性な分子が細胞の一方の側または表面から他方の側に移動するプロセスについて与えられる一般的用語である。
【００１６】
さらに，慣用の手段により輸送された化合物の分解および不十分な吸収は，これらの化合物の効力をさらに低下させる。代替の輸送経路を使用し，特定の細胞および組織を輸送のターゲットとし，輸送すべき化合物の保持および吸収を改良し，輸送の間に有効化合物を保護する能力は，医薬およびバイオ医薬業界に非常に重要であろう。
【００１７】
分子の細胞輸送に関する上述の制限は，インビトロ（例えば，細胞培養中）でもインビボ（例えば動物中）でも存在する。そのような制限は，種々の化合物および組成物の，動物，例えば哺乳動物（ヒトであってもよい）における治療用，診断用および／または分析用途を妨害または制限する。そのような用途は本明細書に記載される。
【００１８】
エンドサイトーシス，エキソサイトーシス，ならびにフォワードおよびリバーストランスサイトーシスを行うかこれを媒介する分子の一例は，重合体イムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）である。ｐＩｇＲに関する以下の情報は，本発明の背景の理解を助けるために提供される。
【００１９】
典型的には，ｐＩｇＲ分子は上皮細胞上でディスプレイされる。上皮細胞は，封入，準封入またはコンパートメント化された空間を有する臓器の内部に沿って並んでいる。そのような臓器内部（例えば，管，導管，腔等）は，管腔と総称される。特定の臓器の管腔は，特定の名称，例えば，胃腸管腔，肺管腔，鼻管腔，鼻咽頭管腔，咽頭管腔，口腔（口の中）管腔，舌下（舌の下側）管腔，膣管腔，尿生殖器管腔，眼管腔，または鼓室管腔，を有する。例えば，Ｆａｈｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７：１６７−１８０，１９９８；Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：２３−５０，１９９７；Ｋａｕｓｈｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：９５８−９６６，１９９７；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：９５−１１２；Ｋａｕｓｈｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：２８３６−２８４４，１９９５を参照されたい。これらのいくつかは，表面，例えば眼表面としても特徴づけられる。
【００２０】
隣接する上皮細胞は，タイトジャンクションにより連結されている。タイトジャンクションが破壊されることにより，管腔（しばしば動物の外部環境への開口部を有する）中の薬剤が体内に浸透することができる。そのような薬剤は治療剤を含むことができるかもしれないが，破壊されたタイトジャンクションによる体内への侵入は特異的ではない。望ましくない因子（例えば，細菌，最近，ウイルス，毒素等）もまた体内に取り込まれる。この特異性の欠失のため，ならびに他の因子のため，薬剤の輸送を目的とするタイトジャンクションの破壊は，一般に実行可能ではなく，いずれにしても多くの望ましくない副作用の可能性がある。
【００２１】
上皮細胞は２つの異なる表面を有する。先端側は管腔に面し，その中に存在する水性または気体性媒体に暴露されている。反対側の基底外側（基底側方としても知られる）は，基礎をなす基底膜上に位置し，これにより支持されている。隣接する上皮細胞間のタイトジャンクションが，個々の上皮細胞の先端側と基底外側を分離している。
【００２２】
上皮細胞は極性を有すると言われる。すなわち，この細胞はこれらを分離するコンパートメントの間で勾配を生成することができる（概要については，Ｋｎｕｓｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：４７１−４７５，２０００；Ｍａｔｔｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：Ｒ３９−Ｒ４２，２０００；Ｙｅａｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７９：７３−９８，１９９９を参照）。この極性は，細胞が，異なる輸送および透過特性を有する異なる形質膜ドメイン（先端および基底外側）を有することを反映する。例えば，先端側はしばしば管腔から物質を吸着するための微小絨毛を含み，線毛をもつ細胞においては，先端の膜に線毛が見いだされる。別の例としては，Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプは，その特徴として，基底外側の膜においてのみ見いだされる。
【００２３】
図１は，ｐＩｇＲ蛋白質が関与する細胞輸送の経路を示し，これは，上皮細胞において，エンドサイトーシス，エキソサイトーシス，ならびにフォワードおよびリバーストランスサイトーシスを行うかまたは媒介する。ｐＩｇＲの分子は，典型的には上皮細胞の表面でディスプレイされ，イムノグロブリン（ＩｇＡ）分子の通行を指示する。他のクラスおよび種のイムノグロブリンもまた通行することができる。図１の右側は，ｐＩｇＲ分子の”フォワード”（すなわち，基底外側から先端への）トランスサイトーシスを図解し，”リバース”（先端から基底外側への）トランスサイトーシスは図の左側に示されている。
【００２４】
フォワードトランスサイトーシスは，ｐＩｇＲの最もよく特性決定されている生物学的機能であり，保護的抗体（ＩｇＡおよびＩｇＭイムノグロブリン）を循環系から臓器の管腔に運搬する作用をする。フォワードトランスサイトーシスにおいては，細胞の基底外側にディスプレイされたｐＩｇＲ分子が血流中のＩｇＡ分子に結合し，次にｐＩｇＲ：ＩｇＡ複合体はエンドサイトーシスされる，すなわち，細胞中および小胞中に取り込まれる。ｐＩｇＲ：ＩｇＡ複合体は，細胞の先端側に輸送され，ここで，細胞表面上にディスプレイされる。ＩｇＡの管腔への輸送は，ｐＩｇＲ：ＩｇＡ複合体のｐＩｇＲ部分が切断されるとき，すなわち蛋白質分解されるときに生ずる。この事象によりｐＩｇＲ分子は２つの成分に分離する。一方は”分泌成分”（ＳＣ）であり，これは管腔中に放出され，ＩｇＡを分解から保護するためにＩｇＡに結合したままである。他方は”茎”（ｓｔａｌｋ）であり，これは細胞の先端側の表面に少なくとも一時的にはディスプレイされたままである。
【００２５】
驚くべきことに，細胞の先端側にディスプレイされた茎に結合したリガンドは，リバーストランスサイトーシス，すなわち，フォワードトランスサイトーシスと逆の方向の，細胞の先端側からその基底外側へのトランスサイトーシスを行う。リバーストランスサイトーシスにおいては，ｐＩｇＲ分子またはその一部は，臓器の管腔に沿って並ぶ細胞の先端側の表面からこれらの細胞の基底外側の表面に移動する。理論的には，ｐＩｇＲ媒介性リバーストランスサイトーシスを用いて，管腔（例えば，胃腸管の内側または肺の気道）から循環系またはある種の他の内部系，身体の臓器，組織，部分または液体（例えば，非限定的例として，リンパ系，硝子体液等）に薬剤を輸送することができるかもしれない。例えば，図１に示されるように，リバーストランスサイトーシスを行うｐＩｇＲの一部に結合する要素を有する化合物は，ｐＩｇＲ茎との会合により細胞の基底外側に運ばれることができ，ここで，これは血流と接触し，および／またはその中に放出されるであろう。
【００２６】
フォワードトランスサイトーシスが小胞のプロセスにより媒介されることを示す証拠が提示されている（Ａｐｏｄａｃａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５：６７−８６，１９９４；Ｍｏｓｔｏｖ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：６３−８４，１９９４）。しかし，このプロセスは種々の細胞のタイプにより異なるであろう（Ｓａｒｎａｔａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ＦＲＴ  ａｎｄ  ＭＤＣＫ  ｃｅｌｌｓ，Ｔｒａｆｆｉｃ  ２０００  Ｏｃｔ；１（１０）：７９４−８０２）。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが，図１は，リバーストランスサイトーシスの，小胞に媒介される類似の輸送メカニズムを示す。図１は，そのようなメカニズムが実際に存在することを暗示することを意図するものではない。これは，この事実に対する証拠が入手可能ではないためである。リバーストランスサイトーシスの小胞性の性質は，フォワードトランスサイトーシスについて知られていることに基づく仮説にすぎない。
【００２７】
ポリイムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）は，Ｍｏｓｔｏｖ  ａｎｄ  Ｋａｅｔｚｅｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２：Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９，ｐａｇｅｓ  １８１−２１１（１９９９）により概説されている。ｐＩｇＲ，トランスサイトーシスおよび粘膜免疫についての他の概説には以下のものが含まれる：Ａｐｏｄａｃａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８７：１８７７−８２，１９９１；Ｋａｅｔｚｅｌ，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｄｅｆｅｎｄｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｒｔ  ｏｒ  Ｔｒｏｊａｎ  ｈｏｒｓｅ？Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：Ｒ３５−８，２００１；Ｍｏｓｔｏｖ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｆｆｉｃ  ｉｎ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｅｐｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  １０：４２３−３１，１９９５；Ｍｏｓｔｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｆｆｉｃ  ｉｎ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｅｐｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １７：１２９−３８，１９９５；Ｍｏｓｔｏｖ，Ｔｒａｎｓｅｐｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：６３−８４，１９９４；Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｃｏｓａｅ  ａｎｄ  ｅｘｏｃｒｉｎｅｇｌａｎｄｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ１９９９Ｏｃｔ；１７１：４５−８７；およびＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（Ｒｅｖｉｅｗ），Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１９（５−６）：４８１−５０８。
【００２８】
ｐＩｇＲの構造または発現が変化しているトランスジェニック動物が記載されている（Ｓｈｉｍａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｗｉｔｈ  ｍａｒｋｅｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ＩｇＡ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９  Ｎｏｖ１５：１６３（１０）：５３６７−７３；Ｊｏｈａｎｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｐｔｈｅｌｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｅａｋｉｎｅｓｓ，ｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９９  Ｏｃｔ４：１９０（７）：９１５−２２；およびｄｅＧｒｏｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ１９９９  Ａｐｒ；８（２）：１２５−３５，Ｅｒｒａｔｕｍｉｎ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ１９９９  Ａｕｇ；８（４）：３１９）。
【００２９】
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ−Ｑｕａｇｌｉａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｔｈｅ  ＩｇＡ／ＩｇＭ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｓ  ｐｏｌｙ−Ｉｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ  １；１６５（５）：２５４４−５５）は，胃腸管付随リンパ様組織に由来するマウスＢリンパ腫であるＴ５６０がｐＩｇＲを発現することを示すと述べられている。
【００３０】
ｐＩｇＲおよびそのＩｇリガンドの構造は，分子遺伝学的手法を用いて研究されている（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｉｓｃｌｏｓｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｔｓ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ＩｇＡ  ａｎｄ  ｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ  ＩｇＭ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９  Ｏｃｔ；２９（１０）：３４０１−９；Ｃｒｏｔｔｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｕｎｒａｖｅｌ  ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｏ  ｄｉｍｅｒｉｚｅ  ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＩｇＡ  ｌｉｇａｎｄ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９  Ｏｃｔ  ２９；２７４（４４）：３１４４５−５５；Ｂｒｅｉｔｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｔｉｃ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｅｎｄｏｃｙｔｏｔｉｃ  ｔｒａｆｆｉｃ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９０  Ａｕｇ  １５；２６５（２３）：１３７５０−７；Ｃａｓａｎｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０  Ｍａｙ１１；２４８（４９５６）：７４２−５。
【００３１】
Ｓｉｎｇｅｒら（Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｌｇｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｔｓ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｔｉｃ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １９９８  Ａｐｒ；９（４）：９０１−１５）は，ダイマーＩｇＡのキメラｐＩｇＲ／ＴＣＲ分子への結合はそのダイマー化を誘導することを示すと述べられている（ＴＣＲはＴ細胞レセプターの略号である）。Ｔ細胞レセプター−ゼータ鎖の細胞質ドメインをレセプターオリゴマー化の指標として用いて，Ｊｕｒｋａｔ細胞において発現されたｐＩｇＲ：ゼータキメラレセプターは，ダイマーまたはテトラマーＩｇＡに暴露されたときにゼータ−特異的シグナル伝達カスケードを開始させるが，モノマーＩｇＡに暴露されたときには開始させないことを示した。
【００３２】
Ｅｃｋｍａｎら（Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９  Ａｕｇ；２１（２）：２４６−５２）は，ヒトｐＩｇＲの分泌成分（ＳＣ）に向けられたｓＦｖおよびヒトアルファ−（１）−抗トリプシンからなる融合蛋白質を開示すると述べている。Ｆｅｒｋｏｌら（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６１：９４４−９５１，２０００）は，Ｅｃｋｍａｎらの融合蛋白質が極性化呼吸上皮細胞のインビトロモデル系を横切って基底外側から先端へ輸送されることを記述すると述べている。
【００３３】
Ｇｕｐｔａら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：５８６−９２，２００１）は，ヒトｐＩｇＲの分泌成分（ＳＣ）に向けられた一本鎖抗体を用いて，インビトロでレポーター遺伝子を上皮細胞に輸送することを開示すると述べている。クロスリンカーＳＰＤＰを用いて，ｓＦｖをポリリジンとコンジュゲートさせたと述べている。
【００３４】
Ｚｈａｎｇら（Ｃｅｌｌ  １０２：８２７−８３７，２０００）は，ｐＩｇＲがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを鼻咽頭上皮細胞を横切ってトランスロケーションさせると述べている。細菌のトランスロケーションは，先端から基底外側への（逆の）方向に生ずると報告されている。
【００３５】
Ｐｉｌｅｔｔら（Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｐｔｈｅｌｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ａｉｒｗａｙｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｉｒｆｌｏｗ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００１  Ｊａｎ；１６３（１）：１８５−９４）は，気道上皮中のＳＣの発現の減少は，重症の慢性閉塞性肺疾病における気流障害および好中球浸潤と関連することを示していると述べている。
【００３６】
米国特許５，４８４，７０７（Ｇｏｌｄｂｌｕｍら）は，動物においてｐＩｇＲの遊離の分泌成分（ＳＣ）の濃度に基づいて臓器拒絶をモニターする方法に関する。
【００３７】
ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３０５９２およびＷＯ９９／２０３１０（いずれもＨｅｉｎら），および米国特許６，０４５，７７４（Ｈｉａｔｔら）は，ＩｇＡ分子を模倣し，したがって蛋白質分解的に生成されるｐＩｇＲの分泌成分（ＳＣ）と会合する合成蛋白質に関する。
【００３８】
米国特許６，０７２，０４１（Ｄａｖｉｓら）は，ｐＩｇＲの分泌成分に対する一本鎖抗体を含む融合蛋白質に関する。Ｄａｖｉｓらの組成物は，上皮細胞の基底外側の表面から先端の表面に特異的に輸送されると述べられている。
【００３９】
米国特許６，２６１，７８７Ｂ１（Ｄａｖｉｓら）は，（１）ｐＩｇＲの分泌成分に向けられたリガンド，および（２）非蛋白質治療分子，を含む二官能性分子に関する。二官能性分子は，上皮細胞の基底外側の表面からその先端の表面に特異的に輸送されると述べている。
【００４０】
米国特許６，２８７，８１７Ｂ１（Ｄａｖｉｓら）は，ｐＩｇＲの分泌成分に向けられた一本鎖抗体を含む融合蛋白質を用いることにより治療的蛋白質を上皮細胞に輸送する方法に関する。蛋白質は上皮細胞の基底外側の表面からその先端の表面に特異的に輸送されると述べている。
【００４１】
ＰＣＴ出願ＷＯ００／５３６２３（２０００年９月１４日公開，表題”Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｄａｖｉｓ，ＰａｍｅｌａＢ．，ＦｅｒｋｏｌＪｒ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｗ．，ａｎｄ  Ｅｃｋｍａｎ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ）は，ｐＩｇＲの分泌成分（ＳＣ）に特異的に結合する二官能性分子を開示していると述べている。二官能性分子は，上皮細胞の基底外側の表面からその先端の表面に特異的に輸送されると述べている。
【００４２】
ＰＣＴ出願ＷＯ００／５３６２３（Ｚｉａｄｙ，Ａｓｓｅｍ，Ｄａｖｉｓ，ＰａｍｅｌａＢ．，ＦｅｒｋｏｌＪｒ．，ＴｈｏｍａｓＷ．，ａｎｄ  Ｍａｌｏｕｆ，Ａｌｆｒｅｄ）は，２０００年９月１４日に公開され，その表題は”Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｉａ  Ｓｅｒｐｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”である。
【００４３】
米国特許６，０４２，８３３（Ｍｏｓｔｏｖら）は，リガンドがｐＩｇＲ分子の一部に結合し，このことによりｐＩｇＲを発現またはディスプレイする細胞内に取り込まれるか細胞を通って輸送される方法に関する。米国特許出願０９／４７５，０８８（代理人書類番号２３０７Ｅ−０６７９１１ＵＳおよび０５７２２０−０９０８）は，米国特許６，０４２，８３３（１９９９年１２月３０日出願）の分割出願である。対応するＰＣＴ出願は，ＷＯ９７／４６５８８として１９９７年１２月１１日に公開され，その表題は”Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＩｇＲ  Ｓｔａｌｋ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”である。
【００４４】
米国特許出願（代理人書類番号１８０６２Ｅ−０００９００ＵＳ，３月２６日出願２００１年，Ｍｏｓｔｏｖ，ｅｔ  ａｌ．）は”Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，Ｎｏｎ  Ｓｔａｌｋ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｐＩｇＲ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”と題する。
【００４５】
米国特許出願０９／８３９，７４６（代理人書類番号０５７２２０．０２０２），２００１年４月１９日出願，表題”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，）は，本発明の組成物および方法に適用することができる種々の医薬組成物を開示する。
【００４６】
米国特許出願６０／２３７，９２９（代理人書類番号０５７２２０．０３０１｛０３０８５４．０００９．ＰＲＶ１｝，表題”Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐＩｇＲ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｇｌｙｎｎ，Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐｈｉｌｉｐ  Ｌ．，２０００年１０月２日出願）は，ターゲティング要素および生物学的に活性なポリペプチドを含む融合蛋白質に関する。
【００４７】
米国特許出願６０／２４８，４７８および６０／２４８，８１９（それぞれ代理人書類番号０５７２２０．０６０１｛０３０８５４．０００９．ＰＲＶ２｝，および０５７２２０．０６０２｛０３０８５４．０００９．ＰＲＶ３｝，表題”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｐＩｇＲ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈａｗｌｅｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，それぞれ２０００年１１月１３日出願および２０００年１１月１４日出願）は，ターゲティング要素および生物学的に活性なポリペプチドを含む蛋白質コンジュゲートに関する。
【００４８】
米国特許出願６０／２６６，１８２（代理人書類番号０５７２２０．０７０１，表題”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，ＰｈｉｌｉｐＬ．，２００１年２月２日出願）は，トランスサイトーシスおよびトランス上皮分子に向けられたリガンドおよびターゲティング要素の同定および使用に関する。
【００４９】
米国特許出願６０／２６７，６０１（代理人書類番号０５７２２０．０４０１，表題”Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  ａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐｈｉｌｉｐ  Ｌ．，２００１年２月９日出願）は，（ａ）ｐＩｇＲ分子または茎分子に特異的に結合する少なくとも１つのリガンド，および（ｂ）（ｉ）生物学的に活性な化合物に特異的に結合する，および／または（ｉｉ）それ自身が生物学的に活性な化合物である少なくとも１つのリガンドを有する多特異性組成物および化合物に関する。
【００５０】
米国特許出願６０／２８１，２７５（代理人書類番号０５７２２０．０５０１，表題”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｅｐｔｈｅｌｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂｏｕｎｄｅｄ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｖｉｒｉｏｎｓ”，Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐｈｉｌｉｐ  Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，２００１年４月３日出願）は，ターゲティング要素およびリガンドを用いて，結合した組成物，例えば，リポソーム，ビリオン等を輸送することに関する。
【００５１】
米国特許出願０９／８９８，５０３（代理人書類番号０５７２２０．１４０１，表題”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｈａｗｌｅｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｃｈａｐｉｎ，Ｓｔｅｖｅ，ａｎｄ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，２００１年７月２日出願）は，ターゲティング要素およびリガンドを用いてモノクローナル抗体および関連化合物および組成物を輸送することに関する。
【００５２】
米国特許出願（代理人書類番号０５７２２０．１３０１，表題”Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｔｉｃ  Ｌｉｇａｎｄｓ”，Ｈａｗｌｅｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｃｈａｐｉｎ，Ｓｔｅｖｅ，Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐｈｉｌｉｐ，ａｎｄ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，２００１年９月６日出願）は，トランスサイトーシス輸送特性を有する多価化合物に関する。
【００５３】
発明の概要
１つの観点においては，本発明は，生物学的に活性な部分と，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，リガンドに向けられたターゲティング要素とを含み，ただしターゲティング要素は抗体ではない，複合体または化合物を提供する。
【００５４】
”化合物”との用語は，化学の分野において用いられるように本明細書において用いられる。すなわち，これは２またはそれ以上の要素の物質であって，要素は固定された割合で存在し，規定された化学構造を有する。”分子複合体”または”複合体”は，非共有結合的相互作用により互いに会合している少なくとも２つの異なる分子を含む。”会合”とは，複合体中の分子，または化合物中の成分が互いに特異的に結合していることを意味する。本発明の化合物においては，ターゲティング要素と生物学的に活性な部分は，互いに共有結合的に会合しているが，本発明の分子複合体においては，ターゲティング要素と生物学的に活性な部分は非共有結合的に会合している。
【００５５】
”ターゲット分子”または”分子ターゲット”とは，ターゲティング要素またはリガンドがそれに向けられる化合物，２またはそれ以上の化合物の分子複合体，成分（化合物の一部），または２またはそれ以上の化合物の間に形成されるインターフェースである。”リガンド”との用語は，分子ターゲットに特異的に結合することができるすべてのタイプの組成物または化合物を包含する。”ターゲティング要素”との用語は，それぞれ化合物または分子複合体中に含まれる，分子ターゲットに特異的に結合することができるすべての成分または化合物を包含する。リガンドは，別の化合物と共有結合的にまたは非共有結合的に会合する場合，ターゲティング要素である。分子ターゲットに向けられた（これに特異的に結合することができる）ターゲティング要素を含む化合物または組成物は，そのターゲットのリガンドである。リガンドが化合物または複合体中に取り込まれている場合，ターゲットに特異的に結合する能力を保持する限り，これはターゲティング要素となる。逆に，ターゲティング要素が化合物の残部と分離されている場合，これは分子ターゲットに特異的に結合する能力を保持する限り，リガンドとなる。分子ターゲットに特異的に結合することができるリガンドのすべての部分または誘導体はリガンドである。
【００５６】
”生物学的に活性な”との用語は（”生物活性”と同義），組成物または化合物それ自体が生物学的効果を有すること，またはこれが生物学的効果を有する内因性分子の産生または活性を調節，起因，促進，増強，ブロック，減少，限定するか，またはそれと反応するか，それに結合することを意味する。”生物学的効果”は，限定されないが，免疫反応性応答を刺激するかまたは引き起こすもの；動物における生物学的プロセスに影響を与えるもの；病原体または寄生虫における生物学的プロセスに影響を与えるもの；検出可能なシグナルを生成するかそれが生成される原因となるもの等である。生物学的に活性な組成物，複合体または化合物は，治療，予防および診断方法および組成物において用いることができる。生物学的に活性な組成物，複合体または化合物は，動物において所望の効果を引き起こすかまたは刺激するよう作用する。所望の効果の非限定的例には，罹患した動物において疾病または状態を予防，治療または治癒させること；感染した動物において病原体の成長を制限するかこれを殺すこと；動物の表現型または遺伝子型を増大させること；動物において予防的免疫反応性応答を刺激すること；または動物において疾病または疾患を診断することが含まれる。
【００５７】
本発明の治療的用途の文脈においては，”生物学的に活性な”との用語は，組成物，複合体または化合物が，疾病または疾患に罹患した動物にポジティブな意味で影響を与えるか，および／または病原体または寄生虫にネガティブな意味で影響を与える活性を有することを示す。すなわち，生物学的に活性な組成物，複合体または化合物は，動物において，病原体または寄生虫，または異常な成長または生化学的特性を有する動物の細胞，組織または臓器，例えば癌細胞の成長および／または維持に有害な生物学的または生化学的活性を引き起こすか促進することができる。
【００５８】
本発明の診断用途の文脈においては，”生物学的に活性な”との用語は，組成物，複合体または化合物が，インビボまたはエクスビボで，診断方法および診断用組成物およびキット中で用いることができることを示す。診断目的のためには，好ましい生物学的に活性な組成物または化合物は，典型的には（必要ではないが），検出可能なポリペプチドを含むことによって，検出されることができるものである。組成物または化合物中に見いだされるエピトープに対する抗体もまたこの検出に用いることができる。
【００５９】
本発明の予防用途の文脈においては，”生物学的に活性な”との用語は，組成物または化合物が，免疫反応性応答を誘導するか刺激することを示す。ある好ましい態様においては，免疫反応性応答は予防的であるよう，すなわち，病原体による感染を防止するように設計される。別の好ましい態様においては，免疫反応性応答は，動物の免疫系が異常な成長または生化学的性質を有する動物の細胞，例えば癌細胞に有害なように反応することを引き起こすように設計される。本発明のこの用途においては，抗原を含む複合体または化合物はワクチンとして処方される。
【００６０】
当業者には，所定の組成物，複合体または化合物は，治療，診断および予防用途において生物学的に活性でありうることが理解されるであろう。”細胞において生物学的に活性な”と記述される組成物，複合体または化合物は，インビトロで（すなわち，細胞培養物中で）またはインビボで（すなわち動物の細胞内で），生物学的活性を有するものである。組成物または化合物の”生物学的に活性な成分”とは，組成物または化合物から開放されたときに生物学的に活性なその一部である。しかし，そのような成分はまた，組成物または化合物の状況内においても生物学的に活性でありうることに注意すべきである。
【００６１】
生物学的に活性ではない組成物，複合体および化合物の特定の例としては，生物学的機能には影響を及ぼさないが，コンジュゲートまたはそのメンバーの操作を容易にするために取り込ませる要素，例えば，組成物または化合物をインビトロで別の分子に化学的にコンジュゲートさせるためのポリ−（Ｌ）−リジン；組成物または化合物をインビトロでファージディスプレイライブラリ中で用いることが意図される場合に用いられるファージ表面蛋白質に由来するポリペプチド，または別の組成物または化合物のための担体として作用する組成物または化合物，例えば，免疫原性組成物または化合物の担体として作用するＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）；または本明細書に開示される”任意の融合蛋白質要素”が含まれる。
【００６２】
”経細胞輸送特性”とは，移動のメカニズムにかかわらず，細胞の片側から反対側への分子の移動をもたらす任意のタイプのプロセスを引き起こし，促進し，または増強する性質である。
【００６３】
”トランスサイトーシス輸送特性”とは，エンドサイトーシス，エキソサイトーシス，トランスサイトーシスおよび／または細胞内輸送を引き起こし，促進し，または増強する性質である。トランスサイトーシス特性には，非限定的例として，先端のエンドサイトーシス，先端のエキソサイトーシス，先端から基底外側へのトランスサイトーシス，基底外側のエンドサイトーシス，基底外側のエキソサイトーシス，基底外側から先端へのトランスサイトーシス，および細胞内輸送からなる群より選択される少なくとも１つのプロセスを行う能力が含まれる。
【００６４】
”細胞内輸送”とは，複合体または化合物が，細胞の内部に輸送され，内部に残存することを意味し，これはサイトゾルまたはオルガネラのいずれであってもよい。関連する観点においては，本発明の組成物および化合物は，選択されたオルガネラに輸送するためのオルガネラターゲティング配列を含む。”オルガネラ”は，１またはそれ以上の特定の生物学的および／または生化学的機能を行う亜細胞成分である。”オルガネラターゲティング配列”とは，オルガネラターゲティング配列を有する複合体または化合物を目的とするオルガネラ，例えば，ミトコンドリア，小胞体，ゴルジ装置，リソソーム，ペルオキシソーム，エンドソーム，細胞膜または細胞内に含まれる任意の膜，核，または核小体への輸送を媒介するアミノ酸配列である。
【００６５】
”傍細胞輸送特性”とは，傍細胞輸送を引き起こすかまたは促進する特性であり，例えば，非限定的例として，上皮または粘膜細胞層に見いだされるタイトジャンクションを通る輸送が含まれる。タイトジャンクションは，隣接する上皮細胞をその先端の表面のすぐ近くで狭い帯の中に封入し，その結果，上皮層の一方の側の薬剤は，関門の他方の側に到達するためには，上皮細胞を通って移動しなければならない。そのような移動は，単純な拡散（受動輸送）から生じてもよく，または細胞の，通常はＡＴＰ依存性の活性（能動輸送）の結果として生じてもよい。
【００６６】
本明細書においてより詳細に説明されるように，”抗体”との用語は，ポリクローナル，単一特異性，モノクローナル，ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ），ヒト化および一本鎖抗体；Ｆａｂ，Ｆａｂ’（Ｆａｂ’）２フラグメント；ＣＤＲ等を含む。
【００６７】
抗体以外のターゲティング要素は，化学構造にかかわらず，選択されたリガンドのためのターゲティング要素として機能する任意の種類の分子または成分でありうる。すなわち，ターゲティング要素は，脂質，炭水化物，小分子，または核酸でありうる。予め選択された分子ターゲットに特異的に結合する核酸，例えばアプタマーは，本発明の複合体および化合物においてターゲティング要素として用いられる。ターゲティング要素はまた，抗体ではないポリペプチドでありうる。化合物の両方の生物活性部分がポリペプチドである場合，化合物は融合蛋白質または蛋白質コンジュゲートであり，これらの用語が本明細書において用いられる。
【００６８】
本発明のこの観点および別の観点においては，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する選択されたリガンドは，ｐＩｇＲ茎，またはそのドメイン，保存配列または領域である。
【００６９】
関連する観点においては，リガンドは，様々な種からのｐＩｇＲ蛋白質において保存されているアミノ酸配列に対応するポリペプチドであることができ，例えば，リガンドは，ＬＲＫＥＤ，ＱＬＦＶＮＥＥ，ＬＮＱＬＴ，ＹＷＣＫＷ，ＧＷＹＷＣ，ＳＴＬＶＰＬ，ＳＹＲＴＤ，およびＫＲＳＳＫからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００７０】
関連する観点においては，リガンドは，以下の領域からなる群より選択される規定された領域中に存在するアミノ酸配列に対応するポリペプチドであってもよい：
Ｒ１  ＫＲＳＳＫからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ２ａ  ＳＹＲＴＤからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ２ｂ  ＳＹＲＴＤからＫＲＳＳＫ，
Ｒ３ａ  ＳＴＬＶＰＬからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ３ｂ  ＳＴＬＶＰＬからＫＲＳＳＫ，
Ｒ３ｃ  ＳＴＬＶＰＬからＳＹＲＴＤ，
Ｒ４ａ  ＧＷＹＷＣからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ４ｂ  ＧＷＹＷＣからＫＲＳＳＫ，
Ｒ４ｃ  ＧＷＹＷＣからＳＹＲＴＤ，
Ｒ４ｄ  ＧＷＹＷＣからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ５ａ  ＹＷＣＫＷからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ５ｂ  ＹＷＣＫＷからＫＲＳＳＫ，
Ｒ５ｃ  ＹＷＣＫＷからＳＹＲＴＤ，
Ｒ５ｄ  ＹＷＣＫＷからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ５ｅ  ＹＷＣＫＷからＧＷＹＷＣ，
Ｒ６ａ  ＬＮＱＬＴからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ６ｂ  ＬＮＱＬＴからＫＲＳＳＫ，
Ｒ６ｃ  ＬＮＱＬＴからＳＹＲＴＤ，
Ｒ６ｄ  ＬＮＱＬＴからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ６ｅ  ＬＮＱＬＴからＧＷＹＷＣ，
Ｒ６ｆ  ＬＮＱＬＴからＹＷＣＫＷ，
Ｒ７ａ  ＱＬＦＶＮＥＥからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ７ｂ  ＱＬＦＶＮＥＥからＫＲＳＳＫ，
Ｒ７ｃ  ＱＬＦＶＮＥＥからＳＹＲＴＤ，
Ｒ７ｄ  ＬＮＱＬＴからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ７ｅ  ＱＬＦＶＮＥＥからＧＷＹＷＣ，
Ｒ７ｆ  ＱＬＦＶＮＥＥからＹＷＣＫＷ，
Ｒ７ｇ  ＱＬＦＶＮＥＥからＬＮＱＬＴ，
Ｒ８ａ  ＬＲＫＥＤからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ８ｂ  ＬＲＫＥＤからＫＲＳＳＫ，
Ｒ８ｃ  ＬＲＫＥＤからＳＹＲＴＤ，
Ｒ８ｄ  ＬＲＫＥＤからＳＴＬＶＰＬ，
Ｒ８ｅ  ＬＲＫＥＤからＧＷＹＷＣ，
Ｒ８ｆ  ＬＲＫＥＤからＹＷＣＫＷ，
Ｒ８ｇ  ＬＲＫＥＤからＬＮＱＬＴ，および
Ｒ８ｈ  ＬＲＫＥＤからＱＬＦＶＮＥＥ。
【００７１】
リガンドがｐＩｇＲ茎またはその一部である場合，ターゲティング要素は，非限定的例として，ｐＩｇＲ茎またはその一部に結合する蛋白質に由来するポリペプチドでありうる。
【００７２】
特に，ｐＩｇＲ茎に向けられたターゲティング要素として機能するポリペプチドは，カルモジュリン，ＡＰ−１ゴルジアダプターまたは細菌ポリペプチドに由来するポリペプチドに由来するものであることができる。
【００７３】
ｐＩｇＲ茎に向けられたターゲティング要素として用いることができる細菌蛋白質からのポリペプチドの非限定的例は，図１７において下線で示されているＣｂｐＡからのアミノ酸配列を有するものである。
【００７４】
関連する観点においては，本発明の複合体および化合物はＰＴＤまたはＭＴＳをさらに含む。
【００７５】
”蛋白質伝達ドメイン”（ＰＴＤ）および”膜輸送シグナル”（ＭＴＳ）とは，典型的には約１０−３５アミノ酸の長さを有し，細胞による蛋白質および他のポリペプチドの取り込みを容易にし，促進し，または誘導するポリペプチドである。ＰＴＤはＨＩＶ−ＴＡＴ，ＨＳＶ−ＶＰ２２およびアンテナペディア（Ａｎｔｅｎａｐｅｄｉａ）（ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）の起源）に由来し，正に荷電したアルギニン（Ａｒｇ）およびリジン（Ｌｙｓ）残基の含有量が高いことを特徴とする。ＭＴＳは，分泌シグナル配列に由来する非常に疎水性のペプチドであり，膜脂質二重層の疎水性層中に分配される。
【００７６】
生物学的に活性な部分は，化学構造にかかわらず，所望の生物学的効果を達成することができる任意の種類の分子または成分であることができる。すなわち，生物学的に活性な部分は，ペプチド模倣体を含むポリペプチド，核酸，脂質，炭水化物，金属を含む化合物または複合体，小分子，または上述のいずれかの機能的誘導体である。
【００７７】
”機能的誘導体”との用語は，任意の所定の用途のためにその化合物の目的とする生物学的機能を保持している，化合物の化学的修飾型，類似体，またはホモログを示す。ポリペプチドの場合，化学的修飾には，非限定的例として，化合物に化学基を付加する（例えば，グリコシル化，リン酸化，チオール化等），目的とする機能に影響を与えない化合物の一部を除去する（目的とする活性を保持する切断型蛋白質を製造する，例えばクレノーフラグメント），ポリペプチド中の１またはそれ以上のアミノ酸の組を変更する（変異体を製造する）ことが含まれる。類似体とは，例えばペプチド模倣体である。ホモログとは，例えば，生物学的活性を保持する他の種の動物からのポリペプチド（例えば，ヒトおよびブタインスリン，ヒトおよびサケカルシトニン等），またはポリペプチドの種内異性体（蛋白質”ファミリー”，例えばチトクロームＰ４５０ファミリー）である。
【００７８】
複合体または化合物の生物活性部分は，金属を含む複合体または化合物であってもよい。そのような金属には，非限定的例として，白金（ＩＩ），パラジウム（Ｉｌ），亜鉛，コバルト（ＩＩＩ）が含まれる。金属系のまたは金属を含む薬剤には，限定されないが，シスプラチンが含まれる。
【００７９】
生物学的に活性な部分は核酸である。生物活性な核酸には，非限定的例として，アプタマー，リボザイムを含むアンチセンス分子，治療用ポリペプチドをコードする核酸，および生物学的に活性な核酸の製造のテンプレートとして作用する核酸が含まれる。
【００８０】
複合体または化合物の生物学的に活性な部分はポリペプチドでありうる。非限定的例として，生物活性ポリペプチドは，成長因子，インターロイキン，免疫原，ホルモン，酵素，酵素阻害剤，抗体，凝固因子，レセプター，レセプターのリガンド，キナーゼ，ホスファターゼ，足場蛋白質，アダプター蛋白質，優性ネガティブ変異体，プロテアーゼ，シグナリング分子，制御分子，トランスポーター，転写レギュレーター，核酸結合蛋白質，および上述のいずれかの機能的誘導体でありうる。特に興味深い生物活性ポリペプチドには，インスリン，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ｈＧＨ，ｓＣＴおよびｈＣＴが含まれる。
【００８１】
関連する観点においては，生物学的に活性な部分は，前記リガンド以外の分子ターゲットに向けられた第２のターゲティング要素である。前記リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与するリガンド以外の分子ターゲットに向けられたターゲティング要素は，生物活性部分の１つのタイプである。そのような化合物は，２以上の分子ターゲットに結合する点において，二重特異性（多特異性）である。外来ターゲット分子を体内に輸送するために，多特異性複合体または化合物を第２のターゲティング要素のターゲットとともに処方し，次に投与することができる。あるいは，多特異性複合体または化合物は，別々に，すなわち，第２のターゲティング要素のターゲットなしで処方することができる。後者の複合体または化合物は，投与したときに外来性分子ターゲットに結合する。すなわち，本発明のこの観点は，外来性薬剤および外来性分子に結合し，中和し，および／または封鎖する”分子スポンジ”の輸送を提供する。
【００８２】
関連する観点においては，本発明は，ターゲティング要素ではない生物学的に活性な部分をさらに含む，多特異性複合体または化合物を提供する。すなわち，例えば，本発明の複合体または化合物は，（１）前記リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する，リガンドに向けられたターゲティング要素であって，複合体または化合物を体内に輸送するよう機能するターゲティング要素；（２）予め選択された細胞または組織のみにまたは主として見いだされる分子ターゲットに向けられた第２のターゲティング要素であって，これは複合体または化合物を細胞または組織にターゲティングするよう機能する；および（３）目的とする細胞または組織に優先的に輸送される生物活性部分を含むことができる。部分（３）は，非限定的例として，好ましくは疾病細胞（例えば，癌細胞またはウイルス感染細胞）に輸送されるサイトトキシンであってもよく，または好ましくはそのような治療を必要とする細胞に輸送される治療上有益な薬剤であってもよい。
【００８３】
第２のターゲティング要素は，抗体または抗体誘導体であってもよい。抗体それ自体としては，限定されないが，ポリクローナル，単一特異性，およびモノクローナル抗体が含まれる。抗体誘導体には，組換えＤＮＡ手法により製造されるもの，例えば，一本鎖（ｓＦｖ）抗体，および全抗体から化学的操作により製造されるもの，例えば，Ｆａｂ，Ｆａｂ’および（Ｆａｂ）２フラグメントが含まれる。
【００８４】
本発明の別の観点は，多価複合体または化合物，すなわち，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する１またはそれ以上のリガンドに向けられた２またはそれ以上のターゲティング要素を含む複合体または化合物を提供する。
【００８５】
非限定的例として，本発明の多価複合体または化合物は，リガンドに向けられた２個，３個，または４個のターゲティング要素を含む（それぞれ，ダイマー，トリマー，テトラマー）。任意の所定の多価化合物または複合体において，本明細書においてこの用語が用いられる場合，ターゲティング要素（Ｔ１，Ｔ２）は，同一であってもよく（Ｔ１＝Ｔ２），実質的に同じであってもよく（Ｔ１〜Ｔ２）または互いに異なっていてもよい。すなわち，関連する観点においては，本発明は，複合体または化合物中のターゲティング要素の少なくとも１つが複合体または化合物中の少なくとも１つの別のターゲティング要素と同一または実質的に同一である本発明の複合体または化合物；ならびに，複合体または化合物中の前記ターゲティング要素の少なくとも１つが第２の複合体または化合物の少なくとも１つの別のターゲティング要素と異なる複合体または化合物を提供する。
【００８６】
関連する観点においては，リガンドに特異的に結合する多価薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与するリガンドは，ｐＩｇＲ茎またはそのドメイン，保存配列または領域である。
【００８７】
関連する観点においては，リガンドは，様々な種からのｐＩｇＲ蛋白質において保存されているアミノ酸配列に対応するポリペプチド，例えば，ＬＲＫＥＤ，ＱＬＦＶＮＥＥ，ＬＮＱＬＴ，ＹＷＣＫＷ，ＧＷＹＷＣ，ＳＴＬＶＰＬ，ＳＹＲＴＤ，およびＫＲＳＳＫからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることができる。
【００８８】
関連する観点においては，リガンドは，規定された領域，例えばｐＩｇＲの領域中に存在するアミノ酸配列に対応するポリペプチドであってもよく，ここで，前記ｐＩｇＲは，任意の動物に由来するものであることができ，前記領域は，以下の領域からなる群より選択される：
Ｒ１  ＫＲＳＳＫからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ２ａ  ＳＹＲＴＤからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ２ｂ  ＳＹＲＴＤからＫＲＳＳＫ，
Ｒ３ａ  ＳＴＬＶＰＬからｐＩｇＲのカルボキシ末端，
Ｒ３ｂ  ＳＴＬＶＰＬからＫＲＳＳＫ，
Ｒ３ｃ  ＳＴＬＶＰＬからＳＹＲＴＤ，
Ｒ５ｅ  ＹＷＣＫＷからＧＷＹＷＣ，
Ｒ６ｅ  ＬＮＱＬＴからＧＷＹＷＣ，
Ｒ６ｆ  ＬＮＱＬＴからＹＷＣＫＷ，
Ｒ７ｅ  ＱＬＦＶＮＥＥからＧＷＹＷＣ，
Ｒ７ｆ  ＱＬＦＶＮＥＥからＹＷＣＫＷ，
Ｒ７ｇ  ＱＬＦＶＮＥＥからＬＮＱＬＴ，
Ｒ８ｅ  ＬＲＫＥＤからＧＷＹＷＣ，
Ｒ８ｆ  ＬＲＫＥＤからＹＷＣＫＷ，
Ｒ８ｇ  ＬＲＫＥＤからＬＮＱＬＴ，および
Ｒ８ｈ  ＬＲＫＥＤからＱＬＦＶＮＥＥ。
【００８９】
関連する観点においては，ｐＩｇＲ茎またはその部分，ドメインまたは領域に向けられた複合体または化合物は，細胞毒性薬剤であり，癌細胞またはｐＩｇＲまたはｐＩｇＲ茎をディスプレイするそれ以外の疾病細胞に輸送される。
【００９０】
別の観点においては，本発明は，前記リガンドに結合する化合物に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与するリガンドに向けられたｎ個のターゲティング要素を含む化合物を提供し，ここで，前記化合物の望ましい特性の１またはそれ以上が，ｍ個のターゲティング要素を有する第２の化合物と比較して増強されている（ｎおよびｍはいずれも整数であり，ｎ＞ｍである）。
【００９１】
”増強された”とは，複合体または化合物において，１またはそれ以上の望ましい性質，例えば，限定されないが，トランスサイトーシス輸送および傍細胞輸送特性が増大しているか，改良されているかまたは導入されていることを意味する。非限定的例として，増強されたトランスサイトーシス輸送特性には，１またはそれ以上のプロセス，例えば，エンドサイトーシス，トランスサイトーシスまたはエキソサイトーシスのプロセスの相対的速度の増加；特定のタイプおよび種のｐＩｇＲおよび茎分子についての認識の範囲の増加またはより高い特異性；またはより高い分子量および／または異なる組成物の化合物をトランスサイトーシスする能力が含まれる。同様に，傍細胞輸送の増強された特性には，限定されないが，輸送の相対速度の増加；またはより高い分子量の化合物を輸送する能力が含まれる。
【００９２】
本発明のマルチマー化合物または複合体の”相対的速度”とは，設定された時間内に所定のプロセス（エンドサイトーシス，トランスサイトーシス，傍細胞輸送，等）を行うマルチマーの分子の数を，同じ時間内に同じプロセスを行う匹敵するモノマーの分子の数と比較したものを表す。速度はまた，絶対的意味で，例えば，ナノ秒あたりｘモルの分子として表してもよい。同様に，複合体および化合物の他の特性は，絶対的な意味でまたは相対的な意味で測定することができる。
【００９３】
増強された特性はまた，フォワード（基底外側から先端への）トランスサイトーシスと比較したリバーストランスサイトーシス（先端から基底外側へのトランスサイトーシス）に対する優先性であってもよい。リバーストランスサイトーシスの優先性は，複合体および化合物を臓器の管腔から循環系に輸送することが所望の目標であるような本発明の観点において望ましい。
【００９４】
本発明の複合体および化合物において増強されることができる他の特性には，非限定的例として，複合体および化合物のインビトロまたはインビボでの安定性の増加；特に組換えＤＮＡ発現系により製造される場合の複合体および化合物の収率の増加または純度の改良；１またはそれ以上の望ましくない特性，例えば，望ましくない副作用などの除去または減少が含まれる。
【００９５】
望ましい性質には，限定されないが，複合体および化合物を細胞，特に上皮細胞，および上皮関門または粘膜関門を通る輸送に関連する性質，すなわち，経細胞輸送特性，エンドサイトーシス特性，トランスサイトーシス輸送特性，エキソサイトーシス特性，および傍細胞輸送特性が含まれる。すなわち，例えば，望ましい性質には，限定されないが，エンドサイトーシス，トランスサイトーシス，エキソサイトーシス，経細胞輸送および傍細胞輸送等のプロセスの相対的速度の増加，または一方の方向または別の方向へのトランスサイトーシスの優先性が含まれ，先端から基底外側へのトランスサイトーシスおよび経細胞移動が好ましい。
【００９６】
別の種類の望ましい性質には，複合体または化合物の結合特性，例えば，非限定的例として，リガンドに対するアフィニティーまたはアビディティーが含まれる。別の種類の望ましい性質には，薬理学的特性，例えば，半減期，分泌の減少，効力，選択性等が含まれる。
【００９７】
別の観点においては，本発明は，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する１またはそれ以上のリガンドに向けられた２またはそれ以上のターゲティング要素，および少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む複合体または化合物を提供する。
【００９８】
そのような多価生物活性複合体および化合物は，好ましくは，リガンドに向けられた１個のターゲティング要素のみを有する類似の複合体および化合物と比較して増強された１またはそれ以上の望ましい性質を有する。
【００９９】
別の観点においては，本発明は，生物学的に活性な部分と，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与するリガンドに向けられたターゲティング要素とを含む複合体または化合物を提供し，ここで，前記ターゲティング要素は抗体ではなく，前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物は，臓器の管腔から動物の体内に吸収される。
【０１００】
別の観点においては，本発明は，生物学的に活性な部分と，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与するリガンドに向けられたターゲティング要素と，少なくとも１つの生物学的に活性な部分とを含む複合体または化合物を提供し，ここで，前記ターゲティング要素は抗体ではなく，前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物は，臓器の管腔から動物の体内に吸収される。
【０１０１】
本発明の別の観点は，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与する１またはそれ以上のリガンドに向けられた２またはそれ以上のターゲティング要素と，少なくとも１つの生物学的に活性な部分とを含む複合体または化合物であり，ここで，前記複合体または化合物，またはその生物学的に活性な部分または代謝産物は，臓器の管腔から動物の体内に吸収される。
【０１０２】
細胞関門である上皮細胞は，前記管腔の内側に並んでいる。特に興味深い管腔には，非限定的例として，胃腸管腔，肺管腔，鼻管腔，鼻咽頭管腔，咽頭管腔，口腔管腔，舌下管腔，膣管腔，尿生殖器管腔，眼管腔，鼓室管腔，眼表面，子宮内膜腺，尿道腺，膀胱腺，乳腺，唾液腺，涙腺，呼吸洞腺，胆汁腺，汗腺が含まれる。
【０１０３】
複合体または化合物は，身体の液体部分，例えば，動物の血液，リンパ，間質液または羊水に輸送することができる。
【０１０４】
複合体または化合物は，好ましくは，有効量の前記化合物またはその生物学的に活性な部分の輸送をもたらす薬物動態学的プロファイルで体内に輸送される。
【０１０５】
本発明の別の観点においては，本発明の複合体および化合物は，分子輸送に関連する種々のプロセスの１またはそれ以上を行うことができる。すなわち，複合体または化合物は，経細胞移動，および／または先端から基底外側へのトランスサイトーシスを行う。先端のエンドサイトーシス，基底外側のエキソサイトーシス，細胞内輸送は，細胞内コンパートメント，すなわちオルガネラへの輸送を導くことができる。複合体または化合物は，好ましくは，必要な場合には細胞関門を越えて輸送される。細胞関門は上皮関門または粘膜関門でありうる。
【０１０６】
本発明はさらに，複合体および化合物を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物はさらに，１またはそれ以上の抗プロテアーゼまたは担体ポリペプチドを含むことができる。
【０１０７】
代表的な抗プロテアーゼとしては，限定されないが，ロイペプチン，アプロチニン，およびキモスタチンが挙げられる。代表的な担体蛋白質としては，限定されないが，アルブミン，血清アルブミン，卵白アルブミン，カゼイン，ホエイ，大豆蛋白質，ヘモグロビン，およびグルテンが挙げられる。
【０１０８】
本発明はさらに，生物学的に活性な薬剤をこれを必要とする動物に輸送する方法を提供し，該方法は，前記動物を本発明の複合体または化合物と接触させることを含む。すなわち，本発明は，生物学的に活性な薬剤を上皮関門または粘膜関門を通って輸送する方法を提供し，該方法は，前記上皮関門または粘膜関門を本発明の複合体または化合物と接触させることを含む。
【０１０９】
本発明はさらに，動物を本発明の複合体または化合物と接触させることを含む，動物において疾病を治療する方法を提供する。本発明はさらに，本発明の医薬組成物を含む医療機器およびキットを提供する。
【０１１０】
本発明の複合体および化合物は，検出可能な成分をさらに含んでいてもよい。これらの複合体および化合物は，前記動物を本発明の複合体または化合物と接触させることを含む，動物において疾病を同定する方法において用いられる。本発明はさらに，検出可能なように標識された化合物または組成物を含む診断用組成物，およびこの診断用組成物を含む診断用キットを提供する。
【０１１１】
図面の簡単な説明
図１は，上皮細胞におけるポリイムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）のフォワードおよびリバーストランスサイトーシス輸送経路を示す。
【０１１２】
図２は，ｐＩｇＲホモログのアミノ酸配列のアライメントを示す。パネル２Ａ，ヒト，ブタ，ウシ，マウス，ラット，オポッサムおよびウサギｐＩｇＲ分子のアライメント；リーダー配列，ｐＩｇＲのイムノグロブリン（Ｉｇ）に結合する分泌成分の領域，保存配列（上部境界が太いボックスで囲まれている），ドメイン１−６，および貫膜ドメイン（矢印，ドメインの間の境界）の相対的位置を示す；パネル２Ｂ，ヒト，サル（ＣｙｎＭｏｎｋ），ウサギおよびラットの茎のアミノ酸配列のアライメント；パネル２Ｃ，ヌクレオチド配列のアライメント。
【０１１３】
図３は，一本鎖抗体ｓＦｖ５ＡＦをコードするプラスミドであるｐＳｙｎＳＡＦのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。太字で示したヌクレオチド配列はリーディングフレーム（ＡＴＧ，出発コドン；ＴＡＡ，停止コドン）を示し；ボックスで囲まれた配列は制限酵素部位（ａａｇｃｔｔ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位；ｇａａｔｔｃ，ＥｃｏＲＩ部位）を示す。
【０１１４】
図４は，ｐＳｙｎ５ＡＦによりコードされる，分泌された形のｓＦｖ５ＡＦのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。記号：Ｐｅｌｂリーダー，Ｅ．ｃｏｌｉからの分泌を指示するリーダー配列；ＦＬＡＧ，ＦＬＡＧエピトープ；リンカー，アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３；ｍｙｃ，ｃ−ｍｙｃエピトープ；６ＨＩＳ，６ｘＨｉｓタグ；ＣＤＲ，相補性決定領域；ＦＲ，フレームワーク要素；およびｓＦｖの重鎖および軽鎖が示されている。ｓＦｖ５ＡＦの配列は，ｓＦｖ５Ａの配列と類似しているが，ｓＦｖ５ＡＦにはＦＬＡＧタグが存在し，ｓＦｖ配列の５番目の残基は，５Ａではグルタミン（Ｑ）であり，５ＡＦではバリン（Ｖ）である。アミノ末端Ｐｅｌｂリーダー配列はＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡであり，カルボキシ末端配列はＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨである。
【０１１５】
図５は，分泌型のｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ（配列番号１２）のアミノ酸配列を示す。ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ蛋白質は，アミノ末端からカルボキシ末端方向に，ｐｅｌｂリーダー（Ｅ．ｃｏｌｉでの分泌用），ＦＬＡＧエピトープタグ，重鎖可変領域，スペーサー配列［ＧＧＧＧＳ，３回反復，すなわち，（Ｇ４Ｓ）３］，軽鎖可変領域，別の（Ｇ４Ｓ）３リンカー，ｓＦｖＳＡＦに対してｓＦｖ中に導入されたシステイン残基（太字の”Ｃ”），ｃ−ｍｙｃエピトープタグ，および６ｘＨｉｓタグ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー，ＩＭＡＣにより精製するため）から構成される。重鎖および軽鎖のフレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が示されている。非イムノグロブリン領域（Ｐｅｌｂリーダー，ＦＬＡＧエピトープタグ，リンカー（Ｇ４Ｓ）３，ｃ−ｍｙｃタグおよび６ｘＨｉｓタグ）には影が付けられている。ＦＬＡＧタグに加え，ｓＦｖ５ＡＦのアミノ酸配列は，ｓＦｖ配列中の５番目の残基がグルタミン（Ｑ）からバリン（Ｖ）アミノ酸残基に変化している点においてｓＦｖ５Ａと異なる。
【０１１６】
図６，７および８は，２つの異なる結合領域の間（例えば，２つのｓＦｖ分子の間，２つのＦａｂ分子の間，またはｓＦｖとＦａｂ分子との間）にジスルフィド結合を形成する反応スキームを図解する。図７は，２−イミノチオランで誘導化した１つのｓＦｖおよびＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）で誘導化した１つのｓＦｖを用いて製造した二重特異性結合分子を図解する。
【０１１７】
図９は，ヒトカルシトニン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２６０９５；配列番号７−８）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列を示す。開始（ＡＴＧ）コドンおよび停止（ＴＡＡ）コドンには下線が施されている。
【０１１８】
図１０は，サケカルシトニン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号６４３１２；配列番号９−１０）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列を示す。開始（ＡＴＧ）コドンおよび停止（ＴＡＡ）コドンには下線が施されている。
【０１１９】
図１１は，異なる種からのいくつかの代表的なカルシトニン蛋白質のアミノ酸配列アライメントを示す。
【０１２０】
図１２は，マウスｐＩｇＲ配列をクローニングするために用いた戦略および配列を示す。
【０１２１】
図１３は，ヒトｐＩｇＲ配列をクローニングするために用いた戦略および配列を示す。
【０１２２】
図１４は，ラットｐＩｇＲ配列をクローニングするために用いた戦略および配列を示す。
【０１２３】
図１５は，キメラウサギ／ラットｐＩｇＲ分子を示す。パネル１５Ａは，キメラｐＩｇＲの構造を示す。パネル１５Ｂは，キメラｐＩｇＲ（配列番号１３）のアミノ酸配列を示す。キメラの貫膜ドメインには下線が施されている。分子のラット部分は太字で示されている。このセグメントは，ドメイン５の半分，ドメイン６，および貫膜ドメインのほとんどから構成される。シグナル配列の切断部位は黒丸で示される。
【０１２４】
図１６は，ＧＳＴ−ｐＩｇＲ融合蛋白質中にコードされる種々のｐＩｇＲ種のアミノ酸配列を示す。ｐＩｇＲ蛋白質中に含まれないアミノ酸は，太字および下線で示される。配列（ＧＳ）中の最もアミノ末端のアミノ酸は，融合蛋白質のＧＳＴ部分のカルボキシ末端に含まれるアミノ酸残基グリシンおよびセリン残基を示す。融合蛋白質のカルボキシ末端は，ｐＩｇＲ蛋白質中に含まれない追加のアミノ酸を含む。場合によっては，これらの追加の残基には，”Ｈｉｓエピトープタグ”（ＨＨＨＨＨＨ）が含まれる。ｐＩｇＲ蛋白質のこの部分のコンセンサスアミノ酸配列は，カニクイザル，ヒト，ラットおよびウサギ配列の配列の下に示される。
【０１２５】
図１７は，細菌接着蛋白質ＣｂｐＡ（配列番号１４）の部分アミノ酸配列を示す。太字の下線のアミノ酸配列は，ｐＩｇＲに結合するか，またはこれに結合する要素を含むアミノ酸配列を示す。
【０１２６】
図１８は，トランスウエルトランスサイトーシスアッセイシステムを示す。
【０１２７】
図１９は，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓモノマーおよびダイマーのトランスサイトーシスを比較したアッセイの結果を示す。
【０１２８】
図２０は，ｓＦｖ５ＡＦに媒介されるＭ１抗体のトランスサイトーシスを示すアッセイの結果を示す。
【０１２９】
図２１は，１価（モノマー）および多価（ダイマー）ｓＦｖ５分子のトランスサイトーシスの経時変化を示す。
【０１３０】
図２２は，ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号４５０３９８８；配列番号３−４）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列を示す。ｈＧＨのリーディングフレームは太字で示され，その開始（ＡＴＧ）コドンおよび停止（ＴＡＧ）コドンには下線が施されている。
【０１３１】
図２３は，ラットにおけるｓＦｖ５ＡＦ−ヒト成長ホルモン融合蛋白質（５ＡＦ−ｈＧＨ）の薬物動態学的プロファイルを示す。パネル（Ａ）は，０．３３ｍｇ／ｋｇの５ＡＦ−ｈＧＨを静脈内（ＩＶ）投与した後の応答を示す。パネル（Ｂ）は，２．０ｍｇ／ｋｇの５ＡＦ−ｈＧＨを空腸内（ＩＪ）投与した後の応答を示す。データは，各投与量群につき２匹の動物の平均で示される。
【０１３２】
図２４は，ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２；配列番号１１）をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
【０１３３】
図２５は，ヒトインターロイキン−４（ＩＬ−４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１３９８２；配列番号：１５）をコードするｃＤＮＡの配列を示す。ＩＬ−４リーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）および停止コドン（ＴＧＡ）には下線が施されている。
【０１３４】
図２６は，ヒトインスリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号４５５７６７０；配列番号５−６）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列を示す。開始コドン（ＡＴＧ）および停止コドン（ＴＧＡ）には下線が施されている。前駆体シグナルペプチドが除去された後，プロインスリンは翻訳後切断されて，２つの鎖となり（ペプチドＡおよびペプチドＢ），これらは２つのジスルフィド結合により共有結合する。この成熟型のインスリンがインスリンレセプター（ＩＮＳＲ）に結合するとグルコース取り込みが刺激される。コーディング領域の変化を伴う種々の変異体アレルが同定されている。
【０１３５】
表の一覧
表１：ｐＩｇＲホモログ間で保存されているアミノ酸配列
表２：アミノ酸の略号
表３：遺伝コード
表４：ｐＩｇＲおよび茎分子の領域
表５：ヒト以外の種からのｐＩｇＲおよびｐＩｇＲ様蛋白質
表６：保存的アミノ酸置換
表７：架橋剤の化学反応性の種類
表８：化学架橋剤およびそのいくつかの特性
表９：カルシトニンのホモログおよび類似体
表１０：ＩＬ−４中のシステイン置換または挿入用の部位
表１１：モノクローナル抗体およびその用途
表１２：ＧＳＴ−茎融合蛋白質
表１３：サケカルシトニンを誘導化するために用いた架橋剤
表１４：ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの精製モノマーまたはダイマーへの結合の比較
表１５：ｓＣａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｓＦｖコンジュゲートのＢｉａｃｏｒｅアッセイの結果
表１６：ＳＰＤＰ反応の試薬および添加順序
表１７：コンジュゲート調製物ＡＺ００８およびＡＺ００９を用いたＢｉａｃｏｒｅの結果
表１８：コンジュゲート調製物ＡＺ０１８ａ，ＡＺ０１８ｂおよびＡＺ０１９を用いたＢｉａｃｏｒｅの結果
【０１３６】
発明の詳細な説明
本明細書に記載される本発明は，細胞関門を通過して化合物を細胞の中に，これを通って，およびその外へ輸送する複合体および化合物，およびそのような複合体および化合物を製造し使用する方法に関する。本発明の複合体および化合物は，生物学的に活性な部分と，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与するリガンドに向けられたターゲティング要素とを含み，ただし，ターゲティング要素は抗体ではない。別の態様においては，本発明の複合体または化合物は，リガンドに特異的に結合する薬剤に経細胞輸送，トランスサイトーシス輸送または傍細胞輸送特性を付与するリガンドに向けられた２またはそれ以上のターゲティング要素を含む。好ましいリガンドには，限定されないが，ｐＩｇＲの茎，ｐＩｇＲドメイン，異なる動物からのｐＩｇＲの間で保存されているアミノ酸配列，および本明細書において定義されるｐＩｇＲのいくつかの領域の１つが含まれる。
【０１３７】
１．ＰＩＧＲの構造および機能
Ｉ．Ａ．ｐＩｇＲの構造
ポリイムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）分子は，以下に規定される，構造的よび機能的に区別されるいくつかの領域を有する。当該技術分野においては，ｐＩｇＲ分子は一般に，”茎”および”分泌成分”（ＳＣ）と称される，２つの異なる，おおまかに規定された領域から構成されると記述されている。ｐＩｇＲ分子は，基底外側で重合体イムノグロブリン（ＩｇＡまたはＩｇＭ）に結合し，次にイムノグロブリンを先端側に輸送する。上皮細胞の先端側でｐＩｇＲのＳＣと茎との間の蛋白質分解性切断が生ずる。ＳＣ分子は細胞膜から放出され，イムノグロブリンに結合したまま残ってこれを保護し，一方，茎分子は細胞膜に結合したまま残る（”Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｕｃｏｓｏａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐ．Ｌ．Ｏｇｒａ，Ｍ．Ｅ．Ｌａｍｍ，Ｊ．Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ，ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．ＭｃＧｈｅｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照）。
【０１３８】
特に好ましいｐＩｇＲ分子は，米国特許６，０４２，８３３に記載されるもの，および米国特許出願６０／２６６，１８２（代理人書類番号０５７２２０．０７０１，表題”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，ＰｈｉｌｉｐＬ．，２００１年２月２日出願）に記載されるサルｐＩｇＲである。しかし，本発明の文脈においては，ｐＩｇＲはまた，そのレセプターのファミリーまたはスーパーファミリーメンバーの任意のもの，他の生物中で同定されたこれらのレセプターのすべてのホモログ，これらのレセプターのすべてのアイソフォーム，すべてのｐＩｇＲ様分子，ならびに細胞，例えば呼吸管，胃腸管，尿管および生殖管，鼻腔，口腔，眼表面，皮膚表面および他の任意の粘膜上皮細胞においてまたはそれにより発現されるすべてのフラグメント，誘導体，変異体，または他の修飾物を意味することが理解される。好ましいｐＩｇＲおよびｐＩｇＲ様蛋白質は，蛋白質の上皮細胞中にまたはこれを横切るエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスを指示するものである。
【０１３９】
本明細書において用いる場合，”分泌成分”および”ＳＣ”との用語は，先端の蛋白質分解されたｐＩｇＲ分子の，イムノグロブリン（ＩｇＡおよびＩｇＭ）に結合する能力を保持した最小の部分（最短のアミノ酸配列）を表す。ｐＩｇＲの蛋白質分解切断の後，いくつかのアミノ酸残基はＳＣ：イムノグロブリン複合体に会合したまま残るが，最終的には分解され，および／またはそのような複合体から除去される（Ａｈｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７７：１８４１−１８４８，１９８６）。本明細書において用いられる分泌成分の定義にしたがえば，そのようなアミノ酸はＳＣの一部ではない。本発明のある態様においては，ＳＣを認識せず，またはこれに結合しないｐＩｇＲターゲティング要素が好ましい。
【０１４０】
本明細書において用いる場合，”茎”との用語は，ｐＩｇＲに由来するアミノ酸配列を有する分子を表し，ここで，茎配列はＳＣ由来のアミノ酸配列を含まない。茎分子は，蛋白質分解切断が生じたときに，先端の蛋白質分解切断の後に先端の膜に結合したまま残るアミノ酸配列およびそのような切断に必要なアミノ酸配列を含む。好ましい茎分子は，それに結合したリガンドに１またはそれ以上のトランスサイトーシス輸送特性を与える。最も好ましいものは，これに結合したリガンドに先端から基底外側へのトランスサイトーシスを行う能力を与える茎分子である。
【０１４１】
Ｉ．Ａ．１．蛋白質ドメイン
ｐＩｇＲ分子の異なる部分，およびそれに由来するＳＣおよび茎分子を描写することができる別の方法は，そのドメインを参照することによる方法である。蛋白質の”ドメイン”とは，蛋白質の一部の比較的小さい（すなわち，約１５０アミノ酸未満）の球状のユニットである。蛋白質は，比較的フレキシブルなアミノ酸のストレッチにより連結された２またはそれ以上のドメインを含んでいてもよい。準独立構造を有することに加えて，所定のドメインは，通常は無傷の蛋白質により行われる機能をかなりまたは完全に行うことができる。蛋白質分子のインビトロ操作により決定されたドメインに加えて，当該技術分野においては，”ドメイン”はまたインシリコで，すなわち，ドメインの範囲を予測するために核酸によりコードされるアミノ酸配列を分析するよう設計されたソフトウエアにより同定されたものであってもよいことが理解される。後者のタイプのドメインは，より正確には”予測”または”推定”ドメインと称されるが，本明細書においては，ドメインとの用語は，特に断らない限り，既知のドメインおよび予測されるドメインの両方を包含する。
【０１４２】
ｐＩｇＲ分子のドメインは，リーダー配列，細胞外ドメイン１−６，貫膜ドメインおよび細胞内ドメインを含む（本明細書の図２およびＰｉｓｋｕｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１７３５−１７４７，１９９５の図３を参照）。細胞内ドメインはトランスサイトーシスおよびエンドサイトーシスのシグナルを含む。本明細書において特に興味深いｐＩｇＲ分子のドメインには，限定されないが，ドメイン５，ドメイン６，貫膜ドメインおよび細胞内ドメインが含まれる。好ましいドメインは，これに結合したリガンドに先端から基底外側へのトランスサイトーシスを行う能力を付与する。
【０１４３】
Ｉ．Ａ．２．保存配列により規定される領域
ｐＩｇＲ分子の異なる部分を規定することができる別の方法は，ｐＩｇＲホモログ（すなわち，ヒト以外の種から単離されたｐＩｇＲ分子；以下を参照）間で保存されているアミノ酸配列を参照することによる方法である。保存アミノ酸配列の非限定的例には，表１に見いだされるものが含まれる。図２も参照のこと（簡単のために，表１においてはアミノ酸の１文字略号を用いるが，配列表においては３文字アミノ酸表記の配列を用いる；表２も参照）。
【０１４４】
表１：ＰＩＧＲホモログ間で保存されているアミノ酸配列
【表１】
2005500002.tif 000002
【０１４５】
表２：アミノ酸の略号
【表２】
2005500002.tif 000003
【０１４６】
表３：遺伝コード
【表３】
2005500002.tif 000004
【０１４７】
すなわち，例えば，所定のｐＩｇＲ分子の特定の内部部分は，アミノ酸配列ＥＫＹＷＣＫＷを有するアミノ末端境界およびアミノ酸配列ＤＥＧＷＹＷＣＧを有するカルボキシ末端境界を有する領域として定義することができるであろう。ヒトｐＩｇＲにおいては，そのように定義される領域は，残基４７４−５２９のアミノ酸配列であろう。本発明においては，特に興味深い任意の所定のｐＩｇＲ分子の領域には，限定されないが，異なる種からのｐＩｇＲホモログ間で保存されていない，表４に記載される領域が含まれる。
【０１４８】
表４：ＰＩＧＲおよび茎分子の領域
【表４】
2005500002.tif 000005
【０１４９】
好ましい領域は，これに結合したリガンドに，先端から基底外側へのトランスサイトーシスの能力を付与する。
【０１５０】
Ｉ．Ａ．３．ターゲット分子
ｐＩｇＲ分子，分泌成分（ＳＣ）分子，または茎分子，またはドメイン，保存配列，およびその規定された領域に由来するターゲット分子は，本明細書に記載されるように製造し，本発明のリガンドおよびターゲティング要素の製造のためのターゲット分子として用いられる。好ましいターゲット分子は，ＳＣに由来するアミノ酸配列を含まない。
【０１５１】
ターゲット分子は，キメラ，すなわち，少なくとも２つの異なる種に由来する分子から誘導されるハイブリッド分子であってもよい。キメラ茎ターゲット分子の例は，本明細書に記載されるラット／ウサギハイブリッド茎分子である。ターゲット分子はまた，融合蛋白質，例えば，実施例に記載されるドメイン６−ＧＳＴ融合蛋白質であってもよい。
【０１５２】
好ましいターゲット分子は，ｐＩｇＲ分子または茎分子に結合したリガンドに，先端から基底外側へのトランスサイトーシスを行う能力を付与し，ここで，リガンドはＳＣ分子に特異的に結合しない。他の好ましいターゲット分子は，茎分子からの配列を含む。ターゲット分子は，組換え遺伝子発現系，ｐＩｇＲ，ＳＣまたは茎分子の化学的または酵素的消化，またはオリゴペプチドのインビトロ合成等の適当な手法を用いて製造することができる。さらに，ターゲット分子は，トランスサイトーシス輸送特性を評価するよう設計された手法および実験のために，細胞中で遺伝的に発現させてもよい。
【０１５３】
Ｉ．Ｂ．ｐＩｇＲに関連する蛋白質
Ｉ．Ｂ．１．ｐＩｇＲのホモログ
ｐＩｇＲのホモログもまた本発明の範囲内である。ｐＩｇＲのホモログは，ホモサピエンス以外の種からのｐＩｇＲ蛋白質である。非限定的例としては，種々の種からのｐＩｇＲ蛋白質には，ヒト，ラット，マウス，ウサギ，ウシおよびおよびオポッサムからのものが含まれる（表５，Ｍｏｓｔｏｖ  ａｎｄ  Ｋａｅｔｚｅｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，”Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”，Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９，ｐａｇｅｓ  １８１−２１１；ａｎｄＰｉｓｋｕｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１７３５−１７４７，１９９５の図３も参照）。
【０１５４】
表５：ヒト以外の種からのＰＩＧＲおよびＰＩＧＲ様蛋白質
【表５】
2005500002.tif 000006
【０１５５】
Ｉ．Ｂ．２．ｐＩｇＲ様蛋白質
ｐＩｇＲ様蛋白質もまた本発明の範囲内に含まれる。”ｐＩｇＲ様蛋白質”とは，既知のｐＩｇＲ蛋白質にホモロジーを有するアミノ酸配列を有する蛋白質である。多くの場合，そのようなｐＩｇＲ様分子のアミノ酸配列は，核酸のヌクレオチド配列は決定されているが蛋白質をコードすることが知られていない，核酸のインシリコ翻訳により得られている。非限定的例としては，ｐＩｇＲ様蛋白質には，ＰＩＧＲＬ１（米国特許６，１１４，５１５）；ＰＩＧＲ−１（米国特許６，２３２，４４１）；ｐＩｇＲの１つに類似したエクソンを有するマウス遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号６８２６６５２）；ｐＩｇＲ蛋白質にホモロジーを有するインシリコで翻訳されたヒト蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１０６２７４７および１０６２７４１）；およびＤｉｇｒｌ（Ｌｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇｒｌ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８７（１）：３５−４１，２００１）が含まれる。
【０１５６】
Ｉ．Ｂ．３．実質的に同一なおよび相同なｐＩｇＲ分子
本明細書において用いる場合，ｐＩｇＲ蛋白質またはｐＩｇＲ様蛋白質の”ホモログ”とは，ヒトｐＩｇＲ，または（ｉ）ヒトｐＩｇＲのアミノ酸配列と”同一である”か，または”実質的に同一である”（以下に記載されるようにして決定する），または（ｉｉ）ヒトｐＩｇＲをコードする遺伝子と同一のまたは実質的に同一の遺伝子によりコードされる，ヒト以外の種の蛋白質のアイソフォームまたは変異体である。このタイプのｐＩｇＲアイソフォームの非限定的例には，例えば，ＲＮＡの選択的スプライシングまたは蛋白質分解性切断により生ずる異なる分子量のアイソフォーム；および異なる翻訳後修飾，例えばグリコシル化を有するアイソフォーム等が含まれる。
【０１５７】
２つのアミノ酸配列は，２つの配列を互いにアライメントしたときに，ギャップ，置換，挿入または欠失がなく完全に同じであるとき，”同一である”と言われる。２つのアミノ酸配列は，２つの配列を互いにアライメントしたときに，（ｉ）２つの配列の間でアミノ酸残基の３０％以下，好ましくは２０％以下，最も好ましくは１５％以下または１０％以下で変化している；（ｉｉ）ギャップ，または挿入，欠失および置換の数が，２つのアライメントした配列の最も短いものの長さにわたって生ずるアミノ酸残基の数の１０％以下，好ましくは５％以下である；または（ｉｉｉ）ポリペプチドのフォールディングまたは活性に有意な影響を与えない保存的アミノ酸置換（１つのポリペプチド中で別のポリペプチドと比較して）のみを有する場合，”実質的に同一である”と言われる。保存的アミノ酸置換は，表６に記載される。２つの蛋白質の全アミノ酸配列が互いに実質的に同一であってもよく，または，蛋白質中の配列が他の蛋白質中の同様の長さの配列と同一性または実質的同一性を示してもよい。いずれの場合にも，そのような蛋白質は互いに実質的に同一である。典型的には，同一のまたは実質的に同一の配列のストレッチが，５−２５，好ましくは６−１５，最も好ましくは７−１０個のヌクレオチドまたはアミノ酸にわたって生ずる。
【０１５８】
表６：保存的アミノ酸置換
【表６】
2005500002.tif 000007
【０１５９】
ｐＩｇＲ蛋白質をコードするヌクレオチド配列が実質的に同一であることの１つの指標は，２つの核酸分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするか否かである。ストリンジェントな条件は，配列に依存し，異なる状況下では異なるであろう。一般に，ストリンジェントな条件は，規定されたイオン強度およびｐＨにおいて，特定の配列についての熱溶融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍとは，（規定されたイオン強度およびｐＨにおいて）ターゲット配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。典型的には，ストリンジェントな条件は，ｐＨ７で塩濃度が約０．０２Ｍであり，温度が少なくとも約６０℃である条件であろう。
【０１６０】
２つの配列が実質的に同一であるかどうかを判定することができる別の方法は，適当なアルゴリズムを用いて，実質的に同一の配列についての上述の基準に当てはまるか否かを決定することである。２個（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は，典型的にはアルゴリズムにより，例えば，ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所ホモロジーアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）により，ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアライメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）により，ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８）により，これらのアルゴリズムのコンピュータ化された履行（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）により，または肉眼検査により行う。
【０１６１】
Ｉ．Ｃ．結合およびトランスサイトーシスアッセイ
本発明のｐＩｇＲリガンドが，異なるｐＩｇＲ分子，フラグメントおよびこれらの誘導体に結合し，エンドサイトーシス，トランスサイトーシス，および／またはエキソサイトーシスを行う能力は，これらの蛋白質の望ましい性質である。融合蛋白質のｐＩｇＲ結合能力は，以下の手法を用いて調べる。そのようなアッセイの非限定的例には以下のものが含まれる。
【０１６２】
そのようなアッセイにおいて用いることができる細胞株は，一般に上皮細胞であり，特に先端側の表面および基底外側の表面を有する極性化された細胞である。そのような細胞としては，好ましくは変更または操作することができる因子および条件に応答して天然にｐＩｇＲまたはｐＩｇＲ茎を発現する細胞，および，ｐＩｇＲ分子，茎分子またはこれらから調製されたターゲット分子をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞が挙げられる。
【０１６３】
前者のタイプの細胞の非限定的例は，ヒト気管，鼻咽頭または気管支から単離された上皮細胞である。これらの初代培養細胞は，プラスチック上で成長させたとき，ｐＩｇＲの発現をダウンレギュレートするが，コラーゲンでコーティングした多孔質ファイバー上で成長させたとき，ｐＩｇＲを産生する（米国特許６，２６１，７８７Ｂ１およびＦｅｒｋｏｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１６１：９４４−９５１，２０００）。
【０１６４】
他の非限定的例には，消化管関連リンパ球様組織に由来し，ｐＩｇＲを発現するマウスＢリンパ腫であるＴ５６０（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ−Ｑｕａｇｌｉａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＩｇＡ／ＩｇＭ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｓ  ｐｏｌｙ−Ｉｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ  １；１６５（５）：２５４４−５５）；およびＦｉｓｃｈｅｒラット甲状腺（ＦＲＴ）細胞（Ｓａｒｎａｔａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ＦＲＴ  ａｎｄ  ＭＤＣＫ  ｃｅｌｌｓ，Ｔｒａｆｆｉｃ  ２０００  Ｏｃｔ；１（１０）：７９４−８０２；Ａｇｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ＮＡＤＰＨ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＣＹＰ２Ｂ１＆２，ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｌｅ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４  ｒａｔｓ）が含まれる。
【０１６５】
通常はｐＩｇＲまたは茎を発現しないが，遺伝的にトランスフェクトするか，またはｐＩｇＲ，茎またはターゲット分子を発現するようトランスフェクトすることができる細胞株としては，Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（本明細書の全体，およびＧｉｆｆｒｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．５３：５６−６４，２００１に記載される）；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ａｓａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９８  Ｍａｙ１；２１４（１−２）：１３１−９）；内皮細胞株，例えばＥＣＶ３０４（Ｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｅｐｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １９９８  Ｍａｙ；１１１（Ｐｔ９）：１１９７−２０６）；および，特に化合物の吸入輸送を試験する場合には，１６ＨＢＥｏ気管支細胞株からの細胞（Ｆｅｒｋｏｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  １６：９４４−９５１，２０００）が含まれる。その中でｐＩｇＲ分子を発現させるために細胞をトランスフェクトする方法は当該技術分野において知られている（Ｂｒｅｉｔｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３２：３２９−３３７，１９８９）。
【０１６６】
Ｉ．Ｃ．１．リガンド結合のエクスビボ試験
ｐＩｇＲをターゲットとする蛋白質のエクスビボでのｐＩｇＲ結合能力は，哺乳動物上皮細胞において結合したリガンドのエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスを測定することにより評価する。レセプター媒介性エンドサイトーシスは，細胞表面レセプターに結合する物質の細胞による摂取を引き起こす有効な手段を提供する（Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９４４３２，１９８７；Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：３４１０−３４１４，１９９０，およびＥＰＯ特許公開ＥＰ−Ａ１０３８８７５８を参照）。エンドサイトーシスをアッセイする多数のよく知られる方法を用いて，結合を評価することができる。例えば，結合，トランスサイトーシス，および内在化アッセイは，Ｂｒｅｉｆｔｆｅｌｄら（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０９：４７５４８６，１９８９）に詳細に記載されている。
【０１６７】
リガンド−ｐＩｇＲ結合は，当該技術分野において知られる種々の手法，例えばイムノアッセイおよび免疫沈澱により測定する。一例として，蛋白質コンジュゲートの生物学的に活性な部分に対する抗体を用いて，検出可能なように標識したｐＩｇＲまたは茎分子を結合および沈澱させることができる。このようにして沈澱した標識物質の量は，ｐＩｇＲ−ターゲティング要素を有する蛋白質コンジュゲート等のリガンドへのｐＩｇＲの結合の程度に対応する（Ｔａｊｉｍａ，Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｓｃｉ．４２：２７−３１，２０００を参照）。
【０１６８】
Ｉ．Ｃ．２．先端のエンドサイトーシス
先端のエンドサイトーシスは，リガンド，例えば，ｓＦｖ５Ａまたはその誘導体を，トランスフェクトしたＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞の先端の表面の茎分子に４℃で結合させ，短時間（０−１０分間）３７℃に暖め，再び細胞を４℃に冷却することにより都合よく測定される（図３から５を参照）。ｐＨ２．３でストリッピングすることにより表面上に残存するリガンド分子を除去する。細胞内リガンド分子は，ストリッピング後に細胞に会合したままである分子であり，表面結合リガンド分子は酸洗浄により除去される分子である。非特異的固着のための対照としては，例えば，リガンドと構造的に関連するがｐＩｇＲまたは茎分子に結合しない分子（例えば，ｓＦ５の場合には無関係ｓＦｖ），および／またはｐＩｇＲ分子または茎分子をコードする遺伝子配列でトランスフェクトされていないＭＤＣＫ細胞を用いる。
【０１６９】
１．Ｃ．３．先端から基底外側へのトランスサイトーシス
先端から基底外側への（”リバース”）トランスサイトーシスは，ＭＤＣＫ細胞を４℃で先端の表面のリガンドに結合させ，次に３７℃で０−２４０分間インキュベートし，次に基底外側の培地中に輸送されたリガンドの量を測定することにより評価する。この基底外側に輸送されたリガンドを，細胞と会合したまま残存したリガンド（細胞内または酸によりストリッピングされる）と放出されて先端の培地に戻ったリガンドとの合計と比較する。
【０１７０】
あるいは，トランスサイトーシスは，以下のようにして評価する。典型的には，そして本明細書において特に記載しないかぎり，先端から基底外側へのトランスサイトーシスアッセイの一般的プロトコルは以下のとおりである。
【０１７１】
トランスフェクトしていない（または野生型）ＭＤＣＫ細胞，および様々な種に由来するｐＩｇＲまたはハイブリッドｐＩｇＲ分子，例えば本明細書に記載されるラット／ウサギハイブリッドｐＩｇＲをコードする遺伝子でトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞を，トランスウエルプレート中の多孔質膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，＃３４０１，直径１２ｍｍ，孔サイズ０．４マイクロメーターのポリカーボネート膜）の表面上で成長させる。細胞は，コンフルエントとなり，細胞層を通って物質が漏出しないようタイトジャンクションを形成するまで成長させる。ＭＤＣＫ細胞は，トランスウエルチャンバ中でこのようにして成長させたとき，極性化する。トランスウエル中の細胞をＭＥＭ／ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｍ４６４２，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，０．６％ＢＳＡ，ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む）で３回洗浄し，試験品または対照品を３００μｌのＭＥＭ／ＢＳＡの容量でトランスウエルのコンパートメントの上部チャンバ（先端側の表面）に入れる。トランスウエルを８００μｌのＭＥＭ／ＢＳＡとともに基底外側のコンパートメント中の１２ウエルプレート中に入れる。所定の時間，通常は８−１６時間後，上部および下部（基底外側の）チャンバのサンプルを取り出し，試験品および対照品の存在について分析する。
【０１７２】
先端および基底外側の培地をＭＥＭ／ＢＳＡで１ｍｌに調節する。次に，１００μｌの先端の培地を９００μｌのＭＥＭ／ＢＳＡに加えて，１／１０の希釈とする。基底外側の培地の全量（１００％）および先端の培地の１／１０希釈物（１０％）を調製し，適当なアフィニティーマトリクスとともにインキュベートする。（あるいは，５００μｌ（５０％）の調節した基底外側の培地および５０μｌ（５％）の調節した先端の培地をアッセイすることができる）。ｓＦｖ５Ａポリペプチドを含む複合体または化合物については，プロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が特に良いアフィニティーマトリクスである。典型的には，１００μｌのプロテインＡセファロースの１０％スラリーをサンプルに加える。４℃で回転させながら一夜インキュベーションした後，Ｂｅｃｋｍａｎ微量遠心機で最大速で２分間遠心分離することによりビーズをペレット化する。上清を除去し，１ｍｌのＰＢＳを加え，次に遠心分離して上清を除去する。さらに２回洗浄を繰り返す。過剰の液体をハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）シリンジで除去することによりビーズを乾燥させる。５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加え，サンプルを５分間煮沸し，軽く遠心分離し，２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し（典型的には，８−１６％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１．０ｍｍ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ３４５−００３８），１５０ｍａｍｐで６０−８０分間流す），次に，ＰＶＤＦフィルターに移してウエスタンブロッティングを行う。ｓＦｖ５Ａ，ＦＬＡＧまたは他のエピトープタグ，または目的とする複合体または化合物の生物学的に活性な部分に対する抗体でフィルターを探索する。ウエスタンブロットのレーンは，トランスウエルコンパートメントの先端のチャンバまたは基底外側のチャンバから取り出したサンプルに対応する。先端のレーンと基底外側のレーンとの間の染色の相対的強度は，トランスサイトーシスの効率を示す。ゲル中に存在する先端の培地の容量は基底外側の培地の容量の１／１０であるため，これらのバンドの強度が等しいことは，約１０％のトランスサイトーシスを示す。
【０１７３】
１．Ｃ．４．基底外側のエンドサイトーシス
基底外側のエンドサイトーシスは，例えば，Ｔａｊｉｍａ（Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｓｃｉ．４２：２７−３１，２０００）に記載される方法により評価することができる。非特異的輸送（例えば，液相エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシス，または細胞間の傍細胞輸送漏出）は，対照としてｐＩｇＲまたは茎蛋白質でトランスフェクトしていないＭＤＣＫ細胞を用いることにより，および／またはｐＩｇＲまたは茎分子に向けられたものではない抗体を加えることにより，評価することができる。
【０１７４】
Ｉ．Ｃ．５．インビボアッセイ
インビボでのトランスサイトーシスは，無病原体実験動物，例えばスプラグ・ドーリーラットを用いて評価する。検出可能なように標識したリガンド（例えば，放射性ヨード標識抗体）を，例えば，鼻孔（鼻の１対の開口部または脊椎動物の鼻腔）または腸内に投与する（これらのタイプのアッセイのより詳細な説明は本明細書の実施例に記載される）。当業者には理解されるように，”検出可能な標識”とは，分光光学的，光化学的，生化学的，免疫化学的，電磁気的，放射化学的，または化学的手段，例えば，蛍光，化学蛍光，または化学発光，または他の適当な方法により検出可能な組成物または成分である。
【０１７５】
インビボでの先端から基底外側への（”リバース”）トランスサイトーシスは，試験している蛋白質中に取り込まれた検出可能な標識の存在により測定して，ｐＩｇＲをターゲットとするリガンドの循環中への輸送を測定することにより評価する。循環中から回収されたリガンドの一体性は，ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動でリガンドを分析することにより評価することができる。そのようなアッセイは，実施例においてより詳細に記載される。
【０１７６】
インビボでの基底外側から先端への（”フォワード”）トランスサイトーシスは，米国特許６，０７２，０４１（２０００年６月６日発行，Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．；米国特許６，２６１，７８７ＢＩ（２００１年７月１７日発行，Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．；ＰＣＴ公開ＷＯ００／５３６２３（２０００年９月１４日公開，Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．；Ｅｃｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９  Ａｕｇ；２１（２）：２４６−５２；およびＦｅｒｋｏｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６１：９４４−９５１，２０００に記載される方法にしたがって評価する。
【０１７７】
Ｉ．Ｃ．６．結合の特異性
リガンドの結合は，リガンドとターゲット分子とが互いに接触する混合物中に他の分子が存在するかもしれないが，リガンドは他の（非ターゲット）分子には認めうるほどには結合しないという意味において，ターゲット特異的である。例えば，ｐＩｇＲの場合，ｐＩｇＲとｐＩｇＲリガンドとの間の結合の強度，すなわち，ｐＩｇＲリガンドのｐＩｇＲに対するアフィニティーは，程度の問題であることが認識されている。本明細書において用いる場合，”ターゲット特異的”とは，ｐＩｇＲリガンドがそのターゲット分子（ｐＩｇＲ）に対して夾雑する分子に対するより強いアフィニティーを有し，このアフィニティーの相違が本発明の所定の態様について十分であることを意味する。一般に，ｐＩｇＲリガンドのｐＩｇＲに対するターゲット特異性は，抗体のその抗原に対する特異性に匹敵する。すなわち，非限定的例として，リガンドのｐＩｇＲに対する特異性は，一本鎖抗体（ｓＦｖ）のｐＩｇＲに対する特異性と少なくとも同程度であるべきである。ｐＩｇＲリガンドのターゲット特異性を評価するために用いることができるｓＦｖの例には，限定されないが，ｓＦｖ５Ａ，およびｐＩｇＲの茎に結合し本明細書に記載されるその誘導体，例えばｓＦｖ５ＡＦ；および分泌成分（ＳＣ）に結合するｓＦｖ，例えば，米国特許６，０７２，０４１に記載されるものが含まれる。
【０１７８】
結合の特異性は，絶対的および相対的結合パラメータ，例えば，無関係の分子および組成物に対するリガンドの解離定数と比較した，そのターゲット分子に対するリガンドの競合的解離定数（Ｋｄ）の値として定義される。典型的には，そのターゲット分子に対するリガンドのＫｄは，無関係な分子および組成物に対するリガンドのＫｄより，２倍，好ましくは５倍，より好ましくは１０倍低いであろう。さらにより好ましくは，Ｋｄは５０倍低く，より好ましくは１００倍低く，より好ましくは２００倍低い。
【０１７９】
ターゲット分子に対するリガンドの結合アフィニティーは，解離定数（Ｋｄ）により定義される。Ｋｄの値は，よく知られる方法により直接決定することができ，複合体混合物についても，例えばＣａｃｅｃｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｙｔｅ（１９８４）９：３４０−３６２に記載される方法により計算することができる。場合によっては，Ｋｄの直接決定には問題があり，ミスリードされた結果を生ずる可能性がある。そのような状況下においては，競合結合アッセイを実施して，リガンドのそのターゲット分子に対するアフィニティーを，ターゲット分子に結合することが知られている分子のアフィニティーと比較することができる。５０％の阻害が生ずる濃度の値（Ｋｉ）は，理想的な条件下では，ほぼＫｄと等しい。さらに，ＫｉはＫｄより小さいことはありえない；Ｋｉの濃度を決定すると，Ｋｄの最大値が設定される。技術的な困難性によりＫｄの正確な測定が妨げられる状況下では，便宜的に代替としてＫｉを測定することにより，少なくともＫｄの上限値を得ることができる。
【０１８０】
Ｋｄは，以下の刊行物に記載される手法および組成物を用いて溶液中で測定することができる：Ｂｌａｋｅ，Ｄ．Ａ．；Ｂｌａｋｅ，Ｒ．Ｃ．；Ｋｈｏｓｒａｖｉａｎｉ，Ｍ．；Ｐａｖｌｏｖ，Ａ．Ｒ．”Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎｓ．”Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １９９８，３７６，１３−１９．Ｂｌａｋｅ，Ｄ．Ａ．；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｐ．；Ｋｈｏｓｒａｖｉａｎｉ，Ｍ．；Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｆ．Ｍ．；Ｗｅｓｔｈｏｆｆ，Ｃ．Ｍ．；Ｇｏｅｂｅｌ，Ｐ．；Ｗｙｌｉｅ，Ｄ．Ｅ．；Ｂｌａｋｅ，Ｒ．Ｃ．”Ｍｅｔａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｗａｒｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６，２７１（４４），２７６７７−２７６８５．Ｂｌａｋｅ，Ｄ．Ａ．；Ｋｈｏｓｒａｖｉａｎｉ，Ｍ．；Ｐａｖｌｏｖ，Ａ．Ｒ．；Ｂｌａｋｅ，Ｒ．Ｃ．”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｅｔａｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ．”Ａｇａ，Ｄ．Ｓ．；Ｔｈｕｒｍａｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｅｄｓ．；ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ６５７；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９７；ｐｐ４９−６０。
【０１８１】
結合定数および速度論的定数は，熱量測定，平衡透析，および停止流法を用い，吸収，蛍光，光スキャッタリング，濁度，蛍光異方性等を用いて見積もることができる。あるいは，Ｋｄは，チップ上の固定化結合成分を用いて，例えば，ＢＩＡｃｏｒｅチップ上で表面プラズモン共鳴を用いて測定する。
【０１８２】
Ｉ．Ｃ．７．表面プラズモン共鳴
結合パラメータは，表面プラズモン共鳴，例えば，固定化結合成分でコーティングされたＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）チップを用いて測定する。表面プラズモン共鳴を用いて，ｐＩｇＧ関連分子に向けられたｓＦｖまたは他のリガンドとｐＩｇＲおよびｐＩｇＲフラグメントとの間の反応の微視的会合および解離定数を特性決定する。そのような方法は，以下の文献に一般的に記載されており，これらを本明細書の一部としてここに引用する。ＶｅｌｙＦ．，ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＡｃｏｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｔｅｓｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ−ＳＨ２  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１２１：３１３−２１，２０００；Ｌｉｐａｒｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．１２：３１６−２１，１９９９；Ｌｉｐｓｃｈｕｌｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０）：３１０−８，２０００；Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ．，ＢＩＡＣＯＲＥ：ａｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２７：３３５−４０，１９９９；Ａｌｆｔｈａｎ，Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ．１３：６５３−６３，１９９８；Ｆｉｖａｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＡｃｏｒｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９：９７−１０１，１９９８；Ｐｒｉｃｅ，ｅｔ  ａｌ．；Ｓｕｍｍａｒｙ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＩＳＯＢＭＴＤ−４  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ５６  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ＭＵＣ１  ｍｕｃｉｎ．Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９  Ｓｕｐｐｌ  １：１−２０，１９９８；Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１：３７８−８３，１９９７；Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｓｅｕｄｏ−ｆｉｒｓｔ−ｏｒｄｅｒ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２３６：２７５−８３，１９９６；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｌＡｃｏｒｅ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１８３：７−１３，１９９５；Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ．８３：１４３−５１，１９９４；およびＯ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ａ  ｃｒｉｔｉｑｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．５：６５−７１，１９９４。
【０１８３】
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）は，表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的特性を用いて，金／ガラスセンサーチップ界面の表面に位置するデキストランマトリクス，すなわちデキストランバイオセンサーマトリクスに結合した蛋白質の濃度の変化を検出する。簡単には，蛋白質を既知の濃度でデキストランマトリクスに共有結合させ，蛋白質のリガンド（例えば抗体）をデキストランマトリクスを通して注入する。センサーチップ表面の反対側に向けられた近赤外線光は，反射され，また，金フィルム中でエバネセント波を誘導する。これは次に，共鳴角として知られる特定の角度で反射光の強度低下を引き起こす。センサーチップ表面の屈折率が変わると（例えば，結合蛋白質へのリガンドの結合により），共鳴角のシフトが生ずる。この角度シフトを測定し，共鳴単位（ＲＵ）として表すことができる。１０００ＲＵは，１ｎｇ／ｍｍ２の表面蛋白質濃度の変化と等しい。これらの変化をセンソグラムのｙ軸に沿って時間に対して表示し，これは，任意の生物学的反応の会合および解離を示す。
【０１８４】
ＩＩ．リガンドおよびターゲティング要素の化学的構造
本発明の複合体および化合物においては，ターゲティング要素および生物学的に活性な分子は，独立して，小分子，核酸またはポリペプチドである。
【０１８５】
本発明の組成物および化合物においてターゲティング要素として用いることができる化合物および成分の例を以下に記載する。
【０１８６】
ＩＩ．Ａ．小分子および誘導体
”小分子”との用語は，生物学的プロセスに影響を及ぼすよう作用しうる任意の化学的または他の成分を含む。小分子は，現在知られており用いられている任意の治療剤であってもよく，または生物学的機能についてのスクリーニングの目的でそのような分子のライブラリとして合成された小分子であってもよい。小分子は，サイズによっって高分子と区別される。本発明の小分子は，通常，約５，０００ダルトン（Ｄａ）未満，好ましくは約２，５００Ｄａ未満，より好ましくは１，０００Ｄａ未満，最も好ましくは約５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【０１８７】
小分子としては，限定されないが，有機化合物，ペプチド模倣体およびこれらのコンジュゲートが挙げられる。本明細書において用いる場合，”有機化合物”との用語は，高分子，例えば核酸およびポリペプチド以外の任意の炭素系化合物を表す。有機化合物は，炭素に加えて，カルシウム，塩素，フッ素，銅，水素，鉄，カリウム，窒素，酸素，イオウおよび他の元素を含むことができる。有機化合物は，芳香族または脂肪族の形であることができる。有機化合物の非限定的例としては，アセトン，アルコール，アニリン，炭水化物，単糖類，オリゴ糖類，多糖類，アミノ酸，ヌクレオシド，ヌクレオチド，脂質，レチノイド，ステロイド，プロテオグリカン，ケトン，アルデヒド，飽和，不飽和およびポリ不飽和脂肪，油脂およびワックス，アルケン，エステル，エーテル，チオール，スルフィド，環状化合物，複素環化合物，イミダゾールおよびフェノールが挙げられる。本明細書において用いる場合，有機化合物には，窒素化有機化合物およびハロゲン化（例えば塩化）有機化合物も含まれる。以下にペプチド模倣体を製造する方法を記載する。小分子の集合物および，本発明にしたがって同定される小分子は，加速質量分析（ＡＭＳ；Ｔｕｒｔｅｌｔａｕｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ２０００６（１０）：９９１−１００７，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ；およびＥｎｊａｌｂａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ２０００１９（３）：１３９−６１，Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照）等の手法により特性決定する。
【０１８８】
好ましい小分子は，比較的容易にかつ安価に製造し，処方し，または他の方法により調製することができる。好ましい小分子は，種々の保存条件下で安定である。好ましい小分子は，高分子と密接に会合させて，生物学的に活性な，改良された薬学的特性を有する分子を形成することができる。改良された薬学的特性には，循環時間，分布，代謝，修飾，排泄，分泌，排除，および安定性の，所望の生物学的活性について好ましい変化が含まれる。改良された薬学的特性には，化学物質の毒物学的特性および効力特性の変化が含まれる。
【０１８９】
ＩＩ．Ｂ．核酸
伝統的には，ターゲット分子を検出し精製する手法には，そのようなターゲットに特異的に結合するポリペプチド，例えば抗体が用いられてきた。核酸は，他の核酸（例えば，相補的配列を有する核酸）と特異的に結合することが長い間知られている。しかし，アプタマー，すなわち，非核酸ターゲット分子に結合する核酸が開示されている。例えば，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１１０４−１１１０；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１１４９−１１５２；Ｔｕｅｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：５０５−５１０；Ｊｏｙｃｅ，Ｇｅｎｅ（１９８９）８２：８３−８７；および米国特許５，８４０，８６７（表題”Ａｐｔａｍｅｒ  ａｎａｌｏｇｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”）を参照されたい。
【０１９０】
アプタマーについて適用する場合，”結合する”との用語は，伝統的にＤＮＡ二重らせんと関連する”ワトソン・クリック”タイプの結合相互作用（すなわち，Ａ：ＴおよびＧ：Ｃ塩基対形成）を特定的に除く。したがって，”アプタマー”との用語は，ターゲット分子に特異的に結合する核酸または核酸誘導体を表し，ここで，ターゲット分子は（ｉ）核酸ではないか，または（ｉｉ）デュープレックスタイプまたはトリプレックスタイプの塩基対形成以外のメカニズムにより結合している核酸またはその構造要素である。そのような分子は，本明細書において”非核酸分子”と称される。
【０１９１】
ＩＩ．Ｂ．１．核酸の構造
本明細書において用いる場合，”核酸”とは，天然起源から単離された；ＰＣＲ増幅または化学合成等の手法を用いてインビトロで製造された；例えば組換えＤＮＡ技術によりインビボで製造された；または任意の適当な方法により製造された核酸を表す。核酸は，いずれの形（直鎖，環状など）またはトポロジー（一本鎖，二本鎖，スーパーコイルド等）であってもよい。”核酸”との用語はまた，限定されないが，核酸誘導体，例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）およびポリペプチド−核酸コンジュゲート；少なくとも１つの化学的に修飾された糖残基，主鎖，ヌクレオチド間結合，塩基，ヌクレオシド，またはヌクレオチド類似体を有する核酸；ならびに，化学的に修飾された５’または３’末端を有する核酸；および２またはそれ以上のそのような修飾を有する核酸を含む。核酸中のすべての結合が同一である必要はない。
【０１９２】
アプタマーである核酸は，しばしば（必要ではないが），オリゴヌクレオチドとして製造される。オリゴヌクレオチドには，限定されないが，最小長さ２，４，６，８，１０，１１，１２，１３，１４または１５ヌクレオチド，および，それとは無関係に，最大長さ約１００，７５，５０，４０，２５，２０または１５またはそれ以上のヌクレオチドの長さの配列を有する，ＲＮＡ，ＤＮＡおよび混合ＲＮＡ−ＤＮＡ分子が含まれる。一般に，最小約６ヌクレオチド，好ましくは１０，より好ましくは１４または１５ヌクレオチドが，特異的結合を行うのに必要である。
【０１９３】
一般に，オリゴヌクレオチドは，一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡまたはＲＮＡ，またはコンジュゲート（例えば，５’および３’ＤＮＡ”クランプ”を有するＲＮＡ分子）またはハイブリッド（例えば，ＲＮＡ：ＤＮＡ対分子），または誘導体（その化学的に修飾された形）であることができる。しかし，一本鎖ＤＮＡが好ましい。これは，ＤＮＡはＲＮＡよりヌクレアーゼ分解を受けにくいためである。同様に，アプタマーの特異性または安定性を増強する化学的修飾が好ましい。
【０１９４】
ＩＩ．Ｂ．２．核酸の化学的修飾
アプタマーおよび他の核酸中に取り込ませることができる化学的修飾としては，限定でも排他的でもないが，塩基修飾，糖修飾，および主鎖修飾が挙げられる。
【０１９５】
ＩＩ．Ｂ．２．ａ．塩基修飾
アプタマー中の塩基残基は，天然に生ずる塩基（例えば，Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ，Ｕ，５ＭＣ等）以外のものであってもよい。プリンおよびピリミジンの誘導体は当該技術分野において知られている。その例としては，網羅的なリストではないが，アジリジニルシトシン，４−アセチルシトシン，５−フルオロフルオロウラシル，５−ブロモウラシル，５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル，５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル，イノシン，Ｎ６−イソペンテニルアデニン，１−メチルアデニン，１−メチルシュードウラシル，１−メチルグアニン，１−メチルイノシン，２，２−ジメチルグアニン，２−メチルアデニン，２−メチルグアニン，３−メチルシトシン，５−メチルシトシン（５ＭＣ），Ｎ６メチルアデニン，７−メチルグアニン，５−メチルアミノメチルウラシル，５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル，ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン，５−メトキシウラシル，２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン，ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル，シュードウラシル，ケオシン，２−チオシトシン，５−メチル−２−チオウラシル，２−チオウラシル，４−チオウラシル，５−メチルウラシル，ウラシル−５オキシ酢酸，および２，６−ジアミノプリンが含まれる。１またはそれ以上のそのような塩基誘導体を取り込んだ核酸に加え，プリンまたはピリミジン塩基を欠失したヌクレオチド残基を有する核酸もまたアプタマーに含めることができる。
【０１９６】
ＩＩ．Ｂ．２．ｂ．糖の修飾
アプタマー中の糖残基は，一般的なリボースおよびデオキシリボース残基以外のものであってもよい。非限定的例として，フラノース残基の２’−位の置換は，ヌクレアーゼ安定性を増強する。修飾された糖残基の例としては，網羅的リストではないが，２’置換糖，例えば，２’−Ｏ−メチル−，２’−Ｏ−アルキル，２’−Ｏ−アリル，２’−Ｓ−アルキル，２’−Ｓ−アリル，２’−フルオロ−，２’−ハロ，または２’−アジド−リボース，炭素環状糖類似体，アルファ−アノマー糖，エピマー糖，例えば，アラビノース，キシロースまたはリキソース，ピラノース糖，フラノース糖，セドヘプチュロース，非環状類似体および無塩基ヌクレオシド類似体，例えば，メチルリボシド，エチルリボシドまたはプロピルリボシドが挙げられる。
【０１９７】
ＩＩ．Ｂ．２．ｃ主鎖修飾
化学的に修飾された主鎖としては，非限定的例として，ホスホロチオエート，キラルホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，ホスホトリエステル，アミノアルキルホスホトリエステル，メチルおよび他のアルキルホスホネート，例えば，３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート，ホスフィネート，ホスホルアミデート，例えば３’−アミノホスホルアミデート，およびアミノアルキルホスホルアミデート，チオノホスホルアミデート，チオノアルキルホスホネート，チオノアルキルホスホトリエステル，およびボラノホスフェートが挙げられる。通常の３’−５’結合，これらの２’−５’結合類似体，および隣接する対のヌクレオシドユニットが３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’で結合している反転した極性を有するものが含まれる。リン原子を含まない化学的に修飾された主鎖は，短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合，混合複素原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合，または１またはそれ以上の短鎖複素原子または複素環ヌクレオシド間結合から形成された主鎖を有し，例えば，限定されないが，モルホリノ結合；シロキサン主鎖；スルフィド，スルホキシドおよびスルホネート主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；およびアミド主鎖が含まれる。
【０１９８】
ＩＩ．Ｂ．３．核酸ターゲティング要素
核酸ターゲティング要素の１つのタイプはアプタマーである。一般に，アプタマーを同定する手法は，予め選択された非核酸ターゲット分子と，アプタマーである可能性のある種々の核酸の混合物（２−５０のメンバー），プール（５０−５，０００のメンバー）またはライブラリ（５０またはそれ以上のメンバー）とを，ターゲット分子とアプタマーとの複合体が形成される条件下でインキュベートすることを含む。”種々の核酸”とは，それぞれの潜在的アプタマーのヌクレオチド配列が他のメンバーとは異なっていてもよいことを意味する。すなわち，潜在的アプタマーの配列は，互いにランダムである。ランダム性は，種々の方法，例えば，インビボで核酸を有する細胞を変異剤に暴露することにより，インビトロで核酸を化学的に処理することにより，またはインビトロで生化学的複製（例えばＰＣＲ）を故意に複製プロセスの充実度を減少させる条件下で進行させることにより行うことができる突然変異誘発により；ランダム化化学合成，すなわち，配列中の少なくとも１つの位置についてランダムである予め選択された配列を有する複数の核酸を合成することにより，導入することができる。”予め選択された配列中の位置においてランダムである”とは，配列中の，通常は例えば可能な限り１００％Ａに近いように合成される位置（例えば，５’−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’）を，この位置においてランダムであるように，例えば，合成反応は各２５％のＡ，Ｔ，ＣおよびＧ；またはｘ％のＡ，ｗ％のＴ，ｙ％のＣおよびｚ％のＧ（ｘ＋ｗ＋ｙ＋ｚ＝１００）であるように合成する（Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｎ−Ｇ−Ｔ，ここで，Ｎはランダム化された位置を示す）ことを意味する。プロセスの後の工程においては，配列は次第にランダム性が低くなり，コンセンサス配列が現れるかもしれない。いずれにしても，最終的にユニークなヌクレオチド配列を有するアプタマーを得ることが好ましい。
【０１９９】
アプタマーおよびアプタマーのプールは，任意の適当な手法，例えば，インビトロ合成，組換えＤＮＡ手法，ＰＣＲ増幅等を用いる手法により，製造し，同定し，特性決定し，および／または精製する。ターゲット：アプタマー複合体が形成された後，これを核酸混合物中の複合体化していないメンバーから分離する。複合体から調製することができる核酸が候補アプタマーである（この手法の初期の段階においては，アプタマーは一般に，ターゲットに対して種々の程度の特異性を有するヌクレオチド配列の多様性集団である）。次に，反復して進むこの一連の工程において，得られるアプタマー（混合物またはプール）で出発アプタマー（ライブラリまたはプール）を置き換える。限定された数の（例えば，プールまたは混合物，好ましくは１０未満のメンバーの混合物，最も好ましくは１）満足しうる特異性を有する核酸が得られれば，アプタマーを配列決定し，特性決定する。所定のアプタマーの純粋な調製物は，適当な手法のいずれかにより作成する（例えば，ＰＣＲ増幅，インビトロ化学合成等）。
【０２００】
例えば，ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：５０５−５１０）は，”指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化”（ＳＥＬＥＸ）と称される方法の使用を開示する。この方法においては，特定の位置でランダム化された核酸分子のプールを，核酸結合蛋白質への結合について選択する（例えば，ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／１９８１３および米国特許５，２７０，１６３を参照）。このようにして得られたオリゴヌクレオチドを配列決定し，あるいは特性決定する。Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７：３６４５−３６５３）は，類似の手法を用いて，ＤＮＡ結合ポリペプチドが特異的に結合した合成二本鎖ＤＮＡ分子を同定した。Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．ら（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６：８１８−８２２）は，多数のランダム配列ＲＮＡ分子の生成および特定の染料，例えばチバクロンブルーに特異的に結合するＲＮＡ分子の選択および同定を開示する。
【０２０１】
非核酸ターゲット分子に結合する核酸を同定する別の手法は，Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１，１８５３（１９９３））により開示され，”ランダム化されたフラグメントの合成非ランダム化”（ＳＵＲＦ）として知られるオリゴヌクレオチドコンビナトリアル手法である。これは，次第に簡単になるオリゴヌクレオチド類似体ライブラリ，プールおよび混合物の組の，合成およびスクリーニングの繰り返しに基づく（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，５０５（１９９０））。出発ライブラリは，各プールの１つの位置に既知の類似体を含み，残りの位置にすべての他の類似体の等モル混合物を含む，規定された長さのオリゴヌクレオチド類似体から構成される。最適化された核酸リガンドアプタマーの配列が発見されるまで，合成および選択の各ラウンドについて，オリゴマーの少なくとも１つの位置の種類が決定される。
【０２０２】
ＳＵＲＦ，ＳＥＬＥＸまたは他のいずれかの手法により特定の候補アプタマーが同定されれば，そのヌクレオチド配列を決定し（当該技術分野において知られるように），核磁気共鳴（ＮＭＲ）によりその３次元分子構造を調べることができる。これらの手法は，トロンビンに結合する核酸リガンドの３次元構造の決定に関して説明されている（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４，１７６５１（１９９３）；Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，１８９９（１９９３）；およびＭａｃａｙａ，Ｒ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，３７４５（１９９３））。選択されたアプタマーは，１またはそれ以上の修飾塩基，糖または主鎖連結を用いて再合成することができる。アプタマーは，結合特異性を与えるのに必要な核酸の最小配列から本質的になるが，５’末端，３’末端，またはその両方で延長することができ，または他の方法により誘導化またはコンジュゲート化することができる。
【０２０３】
ＩＩ．Ｂ．４．生物学的に活性な核酸
生物学的に活性な核酸，および／またはそのためのテンプレートは，本発明の複合体または化合物の生物活性部分でありうる。非限定的例としては，生物活性核酸は，アンチセンスオリゴヌクレオチド，アプタマー，アンチセンス転写産物，酵素的核酸，例えばリボザイム，リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ），または分子デコイでありうる。
【０２０４】
種々の化学的種類および構造形の核酸が生物学的に活性でありうる。これらには，非限定的例として，ＤＮＡ，例えば一本鎖（ｓｓＤＮＡ）および二本鎖（ｄｓＲＮＡ）；ＲＮＡ，例えば，限定されないが，ｓｓＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ；ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド；トリプレックスＤＮＡ（例えば，短いオリゴヌクレオチドと会合したｄｓＤＮＡ）等が含まれる。
【０２０５】
核酸の配列は，生物活性核酸，例えばアンチセンス転写産物またはリボザイムのためのテンプレートであってもよい。核酸配列は，ポリペプチドをコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）であってもよい。本発明のこの観点において特に興味深いＯＲＦとしては，限定されないが，細胞中に存在しないか不十分であるポリペプチドをコードするもの；治療上有益性または診断用途のためにそのポリペプチド活性または発現が増加または減少するもの；治療上有益性または診断用途のためにその活性が増加または減少するポリペプチドの優性ネガティブ変異体；および診断用途において用いることができる検出可能なポリペプチドが挙げられる。
【０２０６】
ＩＩ．Ｃ．ポリペプチドおよび誘導体
本明細書において用いる場合，”ポリペプチド”との用語は，蛋白質，融合蛋白質，オリゴペプチドおよびポリペプチド誘導体を含むが，ただし，ペプチド模倣体は，本明細書においては小分子であると考えられる。抗体および抗体誘導体は別の節において開示されるが，抗体および抗体誘導体は，本発明の目的のためには，ポリペプチドおよび誘導体のサブクラスとして扱う。
【０２０７】
”蛋白質”とは，ペプチド結合により互いに連結して直線状分子となっているアミノ酸の配列を有する分子である。蛋白質との用語は，天然起源から単離されるか，または単離されたｃＤＮＡから組換えＤＮＡ技術を用いて製造され，少なくとも約２００アミノ酸の長さのアミノ酸の配列を有するポリペプチドを表す。
【０２０８】
”融合蛋白質”とは，２またはそれ以上の通常は別々のポリペプチドのアミノ酸配列の結合の結果として生じ，キメラリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質の１種である。融合蛋白質を製造し使用する方法は，米国特許出願６０／２３７，９２９（代理人書類番号０３０８５４．０００９；表題”Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐＩｇＲ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｇｌｙｎｎ，Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐｈｉｌｉｐ  Ｌ．，２０００年１０月２日出願，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に開示されている。
【０２０９】
”蛋白質フラグメント”とは，蛋白質であっても融合蛋白質であってもよいより大きいポリペプチドの蛋白質分解性フラグメントである。蛋白質分解性フラグメントは，より大きいポリペプチドのインビボまたはインビトロ蛋白質分解性切断により製造することができ，一般に，化学合成により製造するには大きすぎる。蛋白質分解フラグメントは，約２００から約１，０００アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を有する。
【０２１０】
”オリゴペプチド”とは，短いアミノ酸配列（すなたち，２から約２００アミノ酸）を有するポリペプチドである。オリゴペプチドは一般に化学合成により製造される。
【０２１１】
オリゴペプチドおよび蛋白質フラグメントは，その他の方法により製造することもできるが，組換えＤＮＡ技術および／またはインビトロ生化学的操作を用いることが可能である。例えば，あるアミノ酸配列をコードする核酸を製造し，インビトロ転写／翻訳反応のためのテンプレートとして用いることができる。そのような反応においては，予め選択されたポリペプチドをコードする外来性核酸を，外来性核酸を本質的に含まず，転写および翻訳に必要な細胞性成分を全て含む混合物中に導入する。１またはそれ以上の放射性標識したアミノ酸を外来性ＤＮＡの前にまたはそれとともに加え，転写および翻訳を進行させる。反応混合物中に存在する唯一の核酸が反応に加えられた外来性核酸であるため，これによりコードされるポリペプチドのみが産生され，放射性標識したアミノ酸を取り込む。このようにして，予め選択された核酸によりコードされるポリペプチドを放射性標識する。反応混合物中には他の蛋白質が存在するが，予め選択されたポリペプチドが放射性標識したアミノ酸の存在下で産生される唯一のものであり，したがって，これのみが標識される。
【０２１２】
以下に詳細に説明されるように，”ポリペプチド誘導体”には，限定されないが，変異体ポリペプチド，化学的に修飾したポリペプチド，およびペプチド模倣体が含まれる。
【０２１３】
類似体および他の修飾した変種を含む本発明のポリペプチドは，一般に，既知の手法にしたがって製造することができる。好ましくは，本発明のポリペプチドの合成製造は固相合成法にしたがって行う。例えば，固相合成は，よく理解されており，ポリペプチドの製造のための一般的な方法であり，この手法の種々の改変も同様である［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９８４），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４），Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ（１９８９），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］。また，以下の実施例１に開示される特定の方法も参照されたい。
【０２１４】
あるいは，本発明のポリペプチドは，ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いて組換え系において製造することができる。例えば，融合蛋白質は，典型的には組換えＤＮＡ技術を用いて製造される。
【０２１５】
ＩＩ．Ｃ．１．ポリペプチド誘導体
ポリペプチドの”誘導体”とは，その定義によりポリペプチドではない化合物である。これは，ペプチド結合ではない少なくとも１つの化学結合を有する。すなわち，ポリペプチド誘導体には，限定されないが，自然に翻訳後修飾，例えば，グリコシル化を受ける蛋白質が含まれる。本発明のポリペプチドが，同じポリペプチド中に２以上の次のような修飾を含んでいてもよいことが理解される。好ましいポリペプチド誘導体は，望ましい性質，例えば生物学的活性を保持しており；より好ましくは，ポリペプチド誘導体は１またはそれ以上の望ましい性質について増強されており，または親ポリペプチドには見いだされない１またはそれ以上の望ましい性質を有する。これらはこの節で記載されるが，ペプチド模倣体は本明細書の開示においては小分子として扱う。
【０２１６】
ＩＩ．Ｃ．Ｉ．ａ．変異体ポリペプチド
天然起源から調製した蛋白質において見いだされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは”野生型”ポリペプチドである。変異体オリゴペプチドは，化学合成，例えば，限定されないが，コンビナトリアル合成により製造することができる。
【０２１７】
オリゴペプチドより大きい変異体ポリペプチドは，ポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を変更することにより，組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。ヌクレオチド配列の変更のあるものはこれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないであろうが（”サイレント”変異），多くは親配列に対して変更されているアミノ酸配列を有するポリペプチドが生ずる。そのような変更されたアミノ酸配列は，アミノ酸の置換，欠失および付加を含んでいてもよいが，ただし，そのようなアミノ酸は天然に生ずるアミノ酸である。
【０２１８】
すなわち，ポリペプチドをコードする核酸を突然変異に供することは，変異体ポリペプチド，特にアミノ酸の置換を有するが欠失または挿入を有しないものを製造するのに用いることができる１つの手法である。インビトロまたはインビボで用いることができる種々の突然変異誘発手法，例えば，限定されないが，化学的変異およびＰＣＲ媒介性変異が知られている。そのような突然変異誘発は，ランダム標的のものであってもよく（すなわち，変異は核酸中のいずれの部位でも起こりうる），または特に興味深いアミノ酸のストレッチをコードする核酸の部分に向けてもよい。そのような手法を用いることにより，ランダム化された，コンビナトリアルまたは集束化合物ライブラリ，プールおよび混合物を製造することが可能である。
【０２１９】
天然に生ずるアミノ酸の欠失または挿入を有するポリペプチドは，親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づくが，親ポリペプチドの配列に対して１またはそれ以上のアミノ酸が挿入または欠失されているアミノ酸配列の化学合成により得られる合成オリゴペプチドであってもよい。より長いアミノ酸配列を有するポリペプチドにおけるアミノ酸残基の挿入および欠失は，部位特異的変異誘発により製造することができる。
【０２２０】
ＩＩ．Ｃ．ｌ．ｂ．化学的に修飾されたポリペプチド
本発明により企図される場合，”ポリペプチド”との用語には，別のポリペプチドに対して１またはそれ以上の化学的修飾を有するもの，すなわち，化学的に修飾されたポリペプチドが含まれる。化学的に修飾されたポリペプチドを誘導する元のポリペプチドは，野生型蛋白質，変異体蛋白質または変異体ポリペプチド，またはそれらのポリペプチドフラグメント；抗体または本発明にしたがう他のポリペプチドリガンド，例えば，限定されないが，一本鎖抗体，細菌蛋白質およびそのポリペプチド誘導体；または本明細書の開示にしたがって製造されるポリペプチドリガンドでありうる。好ましくは，化学的修飾は，ポリペプチドの望ましい性質を与えるかまたは改善するが，その生物学的活性を実質的に変更または低下させない。望ましい性質には，限定されないが，半減期の増加；血清または他のインビボ安定性の増加；プロテアーゼに対する耐性等が含まれる。そのような修飾には，非限定的例として，Ｎ末端アセチル化，グリコシル化，およびビオチニル化が含まれる。
【０２２１】
ＩＩ．Ｃ．１．ｂ．１．Ｎ−末端またはＣ−末端化学基を有するポリペプチド
ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端残基に作用するペプチダーゼに対する耐性を付与する有効な方法は，修飾されたポリペプチドがもはやペプチダーゼの基質ではないように，ポリペプチド末端の一方または両方に化学基を付加することである。そのような化学的修飾の１つはポリペプチドのいずれかまたは両方の末端におけるグリコシル化である。ある種の化学的修飾，特にＮ末端グリコシル化は，ヒト血清におけるポリペプチドの安定性を増加させることが示されている（Ｐｏｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．１０：１２６８−１２７３）。血清安定性を増大させる他の化学的修飾には，限定されないが，１−２０個の炭素原子を有する低級アルキル，例えばアセチル基からなるＮ末端アルキル基の付加，および／またはＣ末端アミドまたは置換アミド基の付加が含まれる。
【０２２２】
ＩＩ．Ｃ．ｌ．ｂ．２．末端Ｄ−アミノ酸を有するポリペプチド
Ｎ末端Ｄ−アミノ酸が存在すると，その代わりにＬ−アミノ酸を含む場合よりもポリペプチドの血清安定性が増加する。これは，Ｎ末端残基に作用するエキソペプチダーゼがＤ−アミノ酸を基質として用いることができないためである。同様に，Ｃ末端残基に作用する血清エキソペプチダーゼはＤ−アミノ酸を基質として用いることができないため，Ｃ末端Ｄ−アミノ酸が存在する場合にもポリペプチドが安定化される。Ｎ末端および／またはＣ末端Ｄ−アミノ酸を有するポリペプチドのアミノ酸配列は，通常は，これらの末端修飾以外は元のＬ−アミノ酸ポリペプチドの配列と同一である。
【０２２３】
ＩＩ．Ｃ．１．ｂ．３．非天然アミノ酸による天然アミノ酸の置換を有するポリペプチド
ポリペプチドの部分配列において非天然アミノ酸で天然アミノ酸を置換することにより，望ましい性質，例えば，生物学的活性を付与するかまたは増強することができる。そのような置換は，例えば，Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによる蛋白質分解に対する耐性を付与することができる。非天然アミノ酸を有するポリペプチドの合成は日常作業であり，当該技術分野において知られている（例えば，Ｃｏｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）（上掲）を参照）。
【０２２４】
ＩＩ．Ｃ．ｌ．ｂ．４．翻訳後化学的修飾
異なる宿主細胞は，そのような修飾に必要なアミノ酸配列が融合蛋白質中に存在する場合に，融合蛋白質の特定のタイプの翻訳後修飾を与えることができる異なる翻訳後修飾メカニズムを含むであろう。多数（約１００）の翻訳後修飾が記載されており，そのいくつかを本明細書において議論する。当業者は，適当な宿主細胞を選択し，特定のタイプの修飾に必要なアミノ酸配列を含む蛋白質メンバーをコードするキメラ遺伝子を設計することができるであろう。
【０２２５】
グリコシル化は，多くの真核生物系において生ずる翻訳後化学修飾の１つのタイプであり，蛋白質の活性，安定性，薬理遺伝学，免疫原性および／または抗原性に影響を及ぼすことができる。しかし，適当なグリコシル化機構をリクルートするためには，そのような部位に特定のアミノ酸が存在しなければならず，かつ，すべての宿主細胞が適当な分子機構を有するわけではない。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは，グリコシル化された蛋白質を産生することができ，昆虫細胞を用いる発現系も産生することができるが，融合蛋白質を製造するためにいずれの宿主細胞を用いるかにより，グリコシル化のパターンは変化するであろう。
【０２２６】
別のタイプの翻訳後修飾は，１またはそれ以上のＳｅｒ，ＴｈｒまたはＴｙｒ残基の側鎖の遊離ヒドロキシル基のリン酸化である。蛋白質キナーゼがそのような反応を触媒する。リン酸化は，蛋白質ホスファターゼ，すなわちアミノ酸残基の脱リン酸化を触媒する酵素の作用により，しばしば可逆性である。
【０２２７】
異なる宿主細胞により，アミノ末端残基の，その各々が開始コドンによりコードされる異なる化学的種類のメチオニン残基を有するであろう化学構造の相違が得られ，これにより異なる化学的修飾を有するアミノ末端が生ずるであろう。
【０２２８】
例えば，多くのまたはほとんどの細菌蛋白質は，修飾された形のメチオニン，すなわち，Ｎ−ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ）であるアミノ末端アミノ酸を伴って合成される。しばしば，すべての細菌蛋白質はｆＭｅｔ開始アミノ酸を有して合成されると記述されるが，これはＥ．ｃｏｌｉについては正しいであろうが，最近の研究は，他の細菌種，例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの場合には正しくないことを示している（Ｎｅｗｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２１４３−２２１４６，１９９９）。いずれにしても，Ｅ．ｃｏｌｉにおいては，ｆＭｅｔのホルミル基は，通常は翻訳後に酵素的に除去されて，アミノ末端メチオニン残基を生ずるが，時にはｆＭｅｔ残基全体が除去される（Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ４０，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃ．，Ｅｄｉｔｏｒｉｎ  Ｃｈｉｅｆ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８７，Ｖｏｌｕｍｅ１，ｐａｇｅｓ  ６１３−６４７（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。そのような翻訳後修飾を触媒する酵素（例えばホルミラーゼ）を欠失しているＥ．ｃｏｌｉ変異体は，アミノ末端ｆＭｅｔ残基を有する蛋白質を産生するであろう（Ｇｕｉｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：４２９４−４３０１，１９９２）。
【０２２９】
真核生物においては，開始メチオニン残基の，または開始メチオニンが除去されている場合には末端から２番目の残基のアセチル化は，典型的には，翻訳とともに，または翻訳後に生ずる。アセチル化反応はＮ末端アセチルトランスフェラーゼにより触媒され（ＮＡＴ，Ｎ−アルファ−アセチルトランスフェラーゼとしても知られる），開始メチオニン残基の除去はメチオニンアミノペプチダーゼにより触媒される（総説としては，Ｂｒａｄｓｈａｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：２６３−２６７，１９９８；およびＤｒｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：２８１−３２５，１９８５を参照）。アミノ末端でアセチル化されている蛋白質は，”Ｎ−アセチル化されている”，”Ｎアルファアセチル化されている”，または単に”アセチル化されている”と称される。
【０２３０】
真核生物中で生ずる別の翻訳後プロセシングは，カルボキシ末端のアルファアミド化である。総説としては，Ｅｉｐｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０：３３３−３４４，１９８８，およびＢｒａｄｂｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ１４：２３９−２５１，１９９６を参照。既知の内分泌および神経内分泌ペプチドホルモンの約５０％がアルファアミド化されている（Ｔｒｅｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．４：９１１−９２０，１９９３）。ほとんどの場合，これらのペプチドホルモンを活性化するためには，カルボキシアルファアミド化が必要である。
【０２３１】
ＩＩ．Ｄ．ペプチド模倣体
一般に，ポリペプチド模倣体（”ペプチド模倣体”）は，ポリペプチドの生物学的活性を模倣するが，化学的性質としてはもはやペプチド性ではない分子である。厳密な定義によれば，ペプチド模倣体は，ペプチド結合（すなわち，アミノ酸間のアミド結合）を含まない分子である。しかし，時には，ペプチド模倣体との用語は，もはや完全にペプチド性の性質を有していない分子，例えば，シュードペプチド，セミ−ペプチドおよびペプトイドを記述するために用いられる。より広い定義によるペプチド模倣体（ポリペプチドの一部がペプチド結合を欠失している構造により置き換えられているもの）の例が以下に記載される。本発明にしたがうペプチド模倣体は，完全に非ペプチドであっても部分的に非ペプチドであっても，ペプチド模倣体の元になったポリペプチド中の活性基の３次元配置と非常に類似する反応性化学成分の空間的配置を与える。この活性部位の類似する幾何学のため，ペプチド模倣体は，生物系に対してポリペプチドの生物学的活性と類似する影響を及ぼす
【０２３２】
ポリペプチドそれ自体ではなく所定のポリペプチドの模倣体を用いることにはいくつかの潜在的利点がある。例えば，ポリペプチドは望ましくない性質，すなわち，低い生物利用性および短い作用時間を示すかもしれない。ペプチド模倣体はしばしば，経口で活性でありかつ長い作用持続時間を有するのに十分小さい。ポリペプチドには，安定性，保存性および免疫反応性の問題が伴うが，これはペプチド模倣体では認められない。
【０２３３】
所望の生物学的活性を有する候補，リードおよび他のポリペプチドを，同様の生物学的活性を有するペプチド模倣体の開発において用いることができる。ポリペプチドからペプチド模倣体を開発する手法は知られている。ペプチド結合は，ペプチド模倣体が元のポリペプチドと類似の構造，したがって類似の生物学的活性を有することができる非ペプチド結合で置き換えることができる。アミノ酸の化学基を類似の構造を有する他の化学基で置き換えることにより，さらに修飾することができる。ペプチド模倣体の開発は，遊離でまたはリガンドに結合させて，ＮＭＲ分光，結晶学および／またはコンピュータ補助分子モデリングにより，元のポリペプチドの三次元構造を決定することにより促進される。これらの手法は，元のポリペプチドと比較してより強い効力および／またはより高い生物利用性および／またはより高い安定性を有する新規組成物の開発に役立つであろう［（Ｄｅａｎ  （１９９４），Ｂｉｏ  Ｅｓｓａｙｓ，  １６：  ６８３−６８７；  Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｔｚｍｉｌｌｅｒ  （１９９３），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｇｒａｐｈ．，  １１：  １６６−１７３；Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈ  （１９９３），  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．，  １３：  ３２７−３８４；  Ｍｏｏｒｅ  （１９９４），  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，  １５  ：  １２４−１２９；  Ｈｒｕｂｙ  （１９９３），  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ３３：  １０７３−１０８２；  Ｂｕｇｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３），  Ｓｃｉ．Ａｍ．，  ２６９：  ９２−９８（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）］。
【０２３４】
すなわち，上述の方法を用いることにより，本発明は，上述のポリペプチドと比較して増強された治療活性を示す化合物を提供する。上述の方法により得られる，上述のポリペプチドの生物学的活性および類似の三次元構造を有するペプチド模倣体化合物は，本発明により包含される。当業者には，ペプチド模倣体は，先の節に記載される修飾ポリペプチドの任意のものから，または先の節に記載される修飾の２以上を有するポリペプチドから生成することができることが容易に明らかであろう。さらに，治療用化合物としての用途に加えて，さらにより強力な非ペプチド性化合物の開発にも本発明のペプチド模倣体を用いることができることが明らかであろう。
【０２３５】
先の節に記載されるポリペプチドから誘導されるペプチド模倣体の特定の例は，以下に記載される。これらの例は例示的なものであり，他のまたは追加の改変を制限するものではない。
【０２３６】
ＩＩ．Ｄ．１．還元型立体異性シュードペプチド結合を有するペプチド
プロテアーゼはペプチド結合に作用する。したがって，ペプチド結合をシュードペプチド結合で置き換えると，蛋白質分解に対する耐性が付与される。多くのシュードペプチド結合は，一般に，ポリペプチドの構造および生物学的活性には影響を与えないと記述されている。還元型立体異性（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｓｏｓｔｅｒｅ）シュードペプチド結合は，生物学的活性をほとんどまたは全く失うことなく酵素的切断に対する安定性を増強することが知られている適当なシュードペプチド結合である（Ｃｏｕｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１８１−１８４（本明細書の一部としてここに引用する））。すなわち，これらの化合物のアミノ酸配列は，その親Ｌ−アミノ酸ポリペプチドの配列と同一であることができ，ただし，ペプチド結合の１またはそれ以上が立体異性シュードペプチド結合により置き換えられている。好ましくは，最もＮ末端のペプチド結合を置換する。これは，そのような置換が，Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによる蛋白質分解に対する耐性を付与するためである。
【０２３７】
ＩＩ．Ｄ．２．レトロインベルソシュードペプチド結合を有するペプチド
蛋白質に対する耐性を付与するために，ペプチド結合をレトロインベルソ（Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ）シュードペプチド結合により置換してもよい（Ｄａｌｐｏｚｚｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：５６１−５６６（本明細書の一部としてここに引用する））。この修飾によれば，化合物のアミノ酸配列はそのＬ−アミノ酸親ポリペプチドの配列と同一であることができ，ただし，ペプチド結合の１またはそれ以上がレトロソインベルソシュードペプチド結合に置き換えられている。好ましくは，最もＮ末端のペプチド結合を置換する。これは，そのような置換が，Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによる蛋白質分解に対する耐性を付与するためである。
【０２３８】
ＩＩ．Ｄ．３．ペプトイド誘導体
ポリペプチドのペプトイド誘導体は，生物学的活性に重要な構造的決定基を保持しているが，ペプチド結合を有さず，このことにより蛋白質分解に対する耐性が付与されている，別の形の修飾ポリペプチドである（Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９３６７−９３７１（本明細書の一部としてここに引用する））。ペプトイドはＮ置換グリシンのオリゴマーである。それぞれ天然のアミノ酸の側鎖に対応する多数のＮ−アルキル基が記載されている。
【０２３９】
ＩＩＩ．抗体，例えばモノクローナル抗体
”抗体”との用語は，インビトロまたはインビボで免疫原性応答が生ずることにより得られるイムノグロブリン分子を包含することを意味し，ポリクローナル抗体，単一特異性抗体およびモノクローナル抗体のいずれをも含む。”免疫原性応答”とは，１またはそれ以上の蛋白質に向けられた抗体の産生を引き起こす応答であり，これは，適当な細胞が，そのような蛋白質またはそのポリペプチド誘導体と，蛋白質の１またはそれ以上の部分がエピトープとして機能するように接触した後に生ずる。エピトープとは，分子中の単一の抗原性決定基である。蛋白質においては，特に変性蛋白質においては，エピトープは典型的には連続するアミノ酸配列により規定され表される。しかし，非変性蛋白質の場合には，エピトープはまた，蛋白質のアミノ酸配列の別々の部分からのアミノ酸が互いに密接に物理学的に接触するような蛋白質の３次元フォールディングにより形成される活性部位等の構造を含む。
【０２４０】
野生型抗体は，４つのポリペプチド鎖，すなわち，２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を有する。いずれのタイプのポリペプチド鎖も，定常領域（同じクラス（すなわち，ＩｇＡ，ＩｇＭ，等）の抗体の間では変化しないかほとんど変化しない），および可変領域を有する。以下に説明するように，可変領域は特定の抗体について独特であり，エピトープのための認識要素を含む。
【０２４１】
抗体の各軽鎖は１つの重鎖と会合しており，２つの鎖は，抗原結合ドメインの部分を構成する各鎖のアミノ末端領域とは離れた各鎖のカルボキシ末端領域のシステイン残基の間に形成されるジスルフィド架橋により連結されている。抗体分子はさらに，重鎖の，重鎖および軽鎖の間のジスルフィド架橋が形成される位置よりもカルボキシ末端に近い位置で，ヒンジ領域として知られる領域内の２つの重鎖の間のジスルフィド結合により安定化されている。ヒンジ領域はまた，抗体の抗原結合部分にフレキシビリティーを与える。
【０２４２】
抗体の特異性は，軽鎖および重鎖のアミノ末端領域に位置する可変領域により決定される。軽鎖およびこれに会合している重鎖の可変領域は，特定のエピトープを認識する”抗原結合ドメイン”を形成する。したがって，抗体は，２つの抗原結合ドメインを有する。野生型抗体の抗原結合ドメインは，免疫原性蛋白質の同じエピトープに向けられており，したがって，１つの野生型抗体は，免疫原性蛋白質の２つの分子と同時に結合することができる。
【０２４３】
ＩＩＩ．Ａ．抗体のタイプ
抗体の組成物は，抗体を調製した方法に依存して，種々の異なるタイプの抗体を含む。特に興味深い抗体のタイプは，ポリクローナル抗体，単一特異性抗体およびモノクローナル抗体である。
【０２４４】
ポリクローナル抗体は，多くのエピトープを有する蛋白質に対する免疫原性応答において生成される。したがって，ポリクローナル抗体の組成物は，蛋白質中の同じまたは異なるエピトープに向けられた多様な種類の抗体を含む。ポリクローナル抗体を製造する方法は当該技術分野において知られている（例えば，Ｃｏｏｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩＩ  ｏｆ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１：  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ  １１−３７  ｔｏ  １１−４１を参照）。
【０２４５】
単一特異性抗体（抗ペプチド抗体とも称される）は，これが誘導された元の蛋白質の少数の（好ましくは１個の）単離されたエピトープに対応する短い（典型的には，５−２０アミノ酸の）免疫原性ポリペプチドに対する体液性応答において生成される。複数の単一特異性抗体は，蛋白質の特定の部分，すなわち，少なくとも１つの，好ましくは唯一のエピトープを含むアミノ酸配列に向けられた種々の異なる抗体を含む。単一特異性抗体を製造する方法は当該技術分野において知られている（例えば，Ｃｏｏｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩＩ  ｏｆ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１：Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄＥｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ  １１−４２から１１−４６を参照）。
【０２４６】
モノクローナル抗体は，免疫原性蛋白質の単一の特定のエピトープを認識する特異的抗体である。複数のモノクローナル抗体においては，各抗体分子はその複数の中の他のものと同一である。モノクローナル抗体を単離するためには，まず，特定のモノクローナル抗体を発現し，ディスプレイし，および／または分泌するクローン化された細胞株を同定する。このクローン化された細胞株は，本発明の抗体を製造する１つの方法において用いることができる。クローン化細胞株およびこれにより発現されるモノクローナル抗体を製造する方法は当該技術分野において知られている（例えば，Ｆｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩ  ｏｆ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１：  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ  １１−２２  ｔｏ  １１−１１−３６を参照）。
【０２４７】
抗体の変種および誘導体には，抗原決定基に特異的に結合する能力を保持している抗体およびＴ−細胞レセプターフラグメントが含まれる。好ましいフラグメントには以下のものが含まれる：Ｆａｂフラグメント（すなわち，抗原結合ドメインを含み，ジスルフィド結合により架橋された軽鎖および重鎖の一部を含む抗体フラグメント）；Ｆａｂ’（ヒンジ領域を介してＦａｂおよび重鎖の追加の部分を含む１個の抗結合ドメインを含む抗体フラグメント）；Ｆ（ａｂ’）２（重鎖のヒンジ領域中の鎖間ジスルフィド結合により結合した２つのＦａｂ’分子；Ｆａｂ’分子は同じエピトープに向けられていてもよく，異なるエピトープに向けられていてもよい）；二重特異性Ｆａｂ（２つの抗原結合ドメインを有し，そのそれぞれが異なるエピトープに向けられていてもよいＦａｂ分子）；可変領域を含む一本鎖Ｆａｂ鎖（ｓＦｖとしても知られる）（１０−２５アミノ酸の鎖により連結されている抗体の一本の軽鎖および重鎖の可変，抗原結合決定領域）；ジスルフィド結合Ｆｖ，またはｄｓＦｖ（ジスルフィド結合により一緒に連結されている抗体の一本の軽鎖および重鎖の可変，抗原結合決定領域）；ラクダ化ＶＨ（ＶＨ界面のいくつかのアミノ酸が天然に生ずるラクダ抗体の重鎖に見いだされるものである，抗体の一本の重鎖の可変，抗原結合決定領域）；二重特異性ｓＦｖ（２つの抗原−結合ドメインを有し，そのそれぞれが異なるエピトープに向けられていてもよいｓＦｖまたはｄｓＦｖ分子）；ジアボディー（第１のｓＦｖのＶＨドメインと第２のｓＦｖのＶＬドメインとを組み立て，第１のｓＦｖのＶＬドメインを第２のｓＦｖのＶＨドメインとを組み立てたときに形成されるダイマー化ｓＦｖ；ジアボディーの２つの抗原結合領域は，同じエピトープに向けられていてもよく，異なるエピトープに向けられていてもよい）；およびトリアボディー（三量体化ｓＦｖ，ジアボディーと同様の方式で形成されるが，単一の複合体中に３つの抗原結合ドメインが作成される；３つの抗原結合ドメインは，同じエピトープに向けられていてもよく，異なるエピトープに向けられていてもよい）。抗体の誘導体にはまた，抗体組み合わせ部位の１またはそれ以上のＣＤＲ配列が含まれる。２またはそれ以上のＣＤＲ配列が存在する場合，ＣＤＲ配列は足場上で一緒に連結されていてもよい。
【０２４８】
”抗体”との用語はまた，遺伝子工学的に処理した抗体および／または組換えＤＮＡ技術により製造した抗体，および”ヒト化”抗体を含む。抗体を投与することが意図される動物中における抗体または抗体フラグメントの抗原性を低下させるために，ヒト化抗体は，遺伝的操作および／またはインビトロ処理により，アミノ酸配列，グリコシル化パターン等の点においてよりヒトに近いように改変されてきた（Ｇｕｓｓｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚ．２０３：９９１２１，１９９１）。
【０２４９】
ＩＩＩ．Ｂ．抗体および抗体変種を製造する方法
本発明の抗体および抗体フラグメントは，任意の適当な方法，例えば，インビボ（ポリクローナルおよび単一特異性抗体の場合），培養細胞（典型的には，所望の抗体を発現するハイブリドーマ細胞を適当な条件下で培養するモノクローナル抗体の場合），インビトロ翻訳反応，および組換えＤＮＡ発現系（蛋白質を製造するための後者の方法は，本明細書において”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”の節においてより詳細に開示される）により製造することができる。抗体および抗体変種は，種々の動物細胞から，好ましくは哺乳動物細胞から製造することができ，特にネズミおよびヒト細胞が好ましい。抗体の抗原結合部位により付与される所望の抗原ターゲティング能力のみを保持する，天然に生じない抗体およびＴ−細胞レセプター変種を含む抗体は，既知の細胞培養手法および組換えＤＮＡ発現系により製造することができる（例えば，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：８８−９８，１９９１；Ｍｏｌｌｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７３−８１，１９９８；Ｓｃｈｏｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００：６９−７７，１９９７を参照）。抗体変種，例えば，二重特異性抗体およびｓＦｖ分子の製造においては，典型的には組換えＤＮＡ発現系が用いられる。好ましい組換えＤＮＡ発現系としては，高レベルの特定の蛋白質を産生するよう工学処理されている宿主細胞および発現構築物を用いる系が挙げられる。好ましい宿主細胞および発現構築物としては，プラスミドまたはウイルス（バクテリオファージ）に由来する発現構築物を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；エピゾームまたは染色体にインテグレートされた発現構築物を有する酵母，例えば，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ；昆虫細胞およびウイルス，例えば，Ｓｆ９細胞およびバキュロウイルス；およびエピゾームまたは染色体にインテグレートされた（例えば，レトロウイルス）発現構築物を有する哺乳動物細胞が挙げられる（総説としては，Ｖｅｒｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１６：１６５−１８１，１９９８を参照）。また，抗体は，植物において（米国特許６，０４６，０３７；Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：７１６−７１９，１９９５），またはファージディスプレイ技術により（Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５，１９９４），製造することができる。
【０２５０】
ゼノマウス株は，ネズミＩｇＨおよびＩｇｋ遺伝子座が酵母人工ＹＡＣトランスジン上のそのＩｇ対応物で機能的に置き換えられている，遺伝子工学的に処理されたマウスである。これらのヒトＩｇトランスジンは，ヒト可変レパートリーの大部分を有することができ，ＩｇＭからＩｇＧアイソタイプへのクラススイッチングが可能である。ゼノマウスの免疫系は，投与されたヒト抗原を外来物として認識し，強い体液性応答を生ずる。ゼノマウスをよく確立されたハイブリドーマ手法とともに用いることにより，ヒト抗原に対してナノモル以下の親和性を有する完全なヒトＩｇＧｍＡｂを得ることができる（米国特許５，７７０，４２９（表題”Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ａｎｉｍａｌｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”）；６，１６２，９６３（表題”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”）；６，１５０，５８４（表題”Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｘｅｎｏｍｉｃｅ”）；６，１１４，５９８（表題”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”）；および６，０７５，１８１（表題”Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｘｅｎｏｍｉｃｅ”）；総説としては，Ｇｒｅｅｎ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ：ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ａｒｅ  ａｖｅｈｉｃｌｅｆ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｆａｃｉｌｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，ａ  ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ：Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５−６；およびＤａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ１９９９；１８（４）：４２１−５）を参照）。
【０２５１】
ＩＶ．融合蛋白質
本発明の化合物の１つのタイプは融合蛋白質である。”融合蛋白質”とは，２またはそれ以上の，通常は別々の蛋白質に由来し，キメラリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を有する単一の蛋白質である。
【０２５２】
米国特許出願６０／２３７，９２９（代理人書類番号０３０８５４．０００９および０５７２２０．０３０１；表題”Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐＩｇＲ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｇｌｙｎｎ，Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｐｈｉｌｉｐ  Ｌ．，２０００年１０月２日出願）は，ｐＩｇＲリガンドおよび生物学的に活性なポリペプチドを含む融合蛋白質に関するものである。
【０２５３】
ＩＶ．Ａ．融合蛋白質の構造およびキメラリーディングフレーム
ポリペプチドは，アミノ酸のポリマーであり，ヌクレオチドとして知られる構造単位のポリマーである核酸として知られる別の種類の分子によりコードされる。特に，蛋白質は，ＤＮＡおよびＲＮＡ（それぞれデオキシリボ核酸およびリボ核酸）として知られる核酸によりコードされる。
【０２５４】
核酸のヌクレオチド配列は，蛋白質の”ブループリント”を含む。核酸は，ヌクレオチドのポリマーであり，所与の核酸中には４種類のヌクレオチドが存在する。ＤＮＡ中のヌクレオチドは，アデニン，シトシンおよびグアニンおよびチミン（それぞれ，Ａ，Ｃ，Ｇ，およびＴで表される）であり；ＲＮＡ中では，チミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）により置き換えられている。核酸の構造は，５’（”５プライム”）から３’（”３プライム”）方向に配置されたそのヌクレオチドの配列，例えば，５’−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−３’により表される。
【０２５５】
生物系においては，蛋白質は，典型的には以下のようにして産生される。蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子がテンプレートとして用いられて，メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（これもまた蛋白質をコードする）の産生を導く。このプロセスは転写として知られている。翻訳と称される次のプロセスにおいて，ｍＲＮＡが”読みとられ”，特定のアミノ酸配列を有する蛋白質の合成を指示する。
【０２５６】
蛋白質中の各アミノ酸は，一連の３つの連続するヌクレオチドによりコードされ，その各々は，コドンとして知られる。”遺伝コード”においては，いくつかのアミノ酸はいくつかのコドンによりコードされており，各コドンは異なる配列を有するが，別のアミノ酸は唯一のコドン配列によりコードされている。蛋白質全体（すなわち，完全なアミノ酸配列）は，リーディングフレームと称される核酸配列によりコードされている。リーディングフレームは，蛋白質のアミノ酸配列をコードする連続するヌクレオチド配列であり，リーディングフレームの境界は，その開始（出発）および末端（停止）コドンにより規定される。
【０２５７】
核酸から蛋白質が産生されるプロセスは以下のように図解することができる。
2005500002.tif 000008
【０２５８】
融合蛋白質をコードするキメラリーディングフレームは，以下のようにして製造する。”キメラリーディングフレーム”は，２またはそれ以上の通常は別々のリーディングフレーム（通常はそれぞれ別々のポリペプチドをコードする）またはそのフラグメントの融合の結果として生ずる，遺伝子工学的に操作されたリーディングフレームである。キメラリーディングフレームを生成するために，組換えＤＮＡ手法を用いて，第１のアミノ酸配列をコードする第１のリーディングフレームを第２のアミノ酸配列をコードする第２のリーディングフレームに連結する。キメラリーディングフレームはまた，任意の融合蛋白質要素（以下を参照）をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。２つの通常は別々のリーディングフレームから作成されるキメラリーディングフレームの仮想的例を以下のフローチャートに示す。
【０２５９】
第１のリーディングフレームおよび”蛋白質−１”：
2005500002.tif 000009
第２のリーディングフレームおよび”蛋白質−２”：
2005500002.tif 000010
蛋白質−１および蛋白質−２からの融合蛋白質を有する配列をコードするキメラリーディングフレーム：
2005500002.tif 000011
【０２６０】
キメラリーディングフレームが機能的であるためには，その中に存在する通常は別々のそれぞれのリーディングフレームが，すべてのリーディングフレームが互いにインフレームであるように，通常は別々のリーディングフレームの他のすべてと融合しなければならない。”互いにインフレームである”とは，キメラリーディングフレームにおいて，２つのリーディングフレームが，互いに見当が合うように”読まれる”（翻訳される）ように，第１のリーディングフレームを有する第１の核酸が第２のリーディングフレームを有する第２の核酸と共有結合していることを意味する。その結果，キメラリーディングフレームは，通常は別々のリーディングフレームのそれぞれによりコードされるアミノ酸配列を含む１つの延長されたアミノ酸配列をコードする。
【０２６１】
本発明の融合蛋白質は，モノクローナル抗体およびターゲティング要素であるポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ターゲティング要素は，抗体誘導体，例えば一本鎖抗体であってもよく，または分子ターゲットに結合しうる別のポリペプチドであってもよい。ｐＩｇＲ−ターゲティング要素であるポリペプチドの非限定的例は実施例１に記載される。
【０２６２】
融合蛋白質を製造する方法は当該技術分野において知られている。Ｗｈｉｔｅら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ２１：４４６−４５５，２００１）は，遺伝的操作によりその中に導入されたアミノ末端ドメインに連結されたＩｇＧ分子のフレームワーク（定常領域の一部）を有する融合蛋白質の作成を可能とするクローニングベクターを記載する。本発明の融合蛋白質を製造する１つの方法は，ＰＣＲおよび他のクローニング手法を用いて，モノクローナル抗体の可変領域をそのようなベクター中に導入して，アミノ末端にターゲティング要素であるポリペプチドのアミノ酸配列を付加することである。
【０２６３】
ＩＶ．Ｂ．任意の融合蛋白質要素
ｐＩｇＲターゲティング要素および生物学的に活性なポリペプチドに加えて，本発明の融合蛋白質は，１またはそれ以上の生物学的に不活性なアミノ酸配列，すなわち，任意の融合蛋白質要素をさらに含むことができる。そのような生物学的に不活性な要素には，限定されないが，以下の任意の融合蛋白質要素が含まれる。キメラリーディングフレームがそのような任意要素をコードするヌクレオチド配列を含むこと，およびこれらのヌクレオチド配列は融合蛋白質をコードするリーディングフレームとインフレームであるように配置されることが理解される。任意の融合蛋白質要素は，ｐＩｇＲ−ターゲティング要素と生物学的に活性なポリペプチドの間に，これらのおよび他の要素の上流または下流に（それぞれアミノ隣接およびカルボキシ隣接），またはｐＩｇＲ−ターゲティング要素および生物学的に活性なポリペプチドの中に挿入することができる。当業者は，融合蛋白質の製造の望ましい方法または意図される用途に基づいて，本発明の融合蛋白質中にいずれの任意要素を含ませるべきか，およびどの順序で含ませるべきかを決定することができるであろう。
【０２６４】
蛋白質輸送要素は，蛋白質の細胞内への取り込みを容易にするが，ｐＩｇＲターゲティング要素ではない任意の融合蛋白質要素である。ＥＴＡ（無毒化エキソトキシンＡ）蛋白質輸送要素は，米国特許６，０８６，９００（Ｄｒａｐｅｒ）に記載される。ＶＰ２２蛋白質輸送要素は，単純ヘルペスウイルス−１から誘導され，ＶＰ２２蛋白質輸送要素をコードする配列を含むベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；また，米国特許６，０１７，７３５（Ｏｈａｒｅ，ｅｔ  ａｌ．）も参照）。Ｔａｔ蛋白質輸送要素は，ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴａｔ蛋白質のアミノ酸配列から誘導される（米国特許５，８０４，６０４；５，７４７，６４１；および５，６７４，９８０を参照）。
【０２６５】
オルガネラ輸送要素は，融合蛋白質を特定のオルガネラの中にまたはそこから外に向ける任意の融合蛋白質要素である。例えば，リシンＡ鎖を融合蛋白質中に含ませて，エンドソームからサイトゾルへのその輸送を媒介することができる。あるいは，他のオルガネラまたは亜細胞空間，例えば核，核小体，ミトコンドリア，ゴルジ装置，小胞体（ＥＲ），細胞質等への輸送要素を用いることができる。オルガネラ輸送要素を取り込んだ哺乳動物発現構築物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ：ｐＳｈｏｏｔｅｒ（登録商標）ベクター）。融合蛋白質をＥＲに向けるために，Ｈ／ＫＤＥＬ（すなわち，Ｈｉｓ／Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ配列）を本発明の融合蛋白質中に，好ましくはカルボキシ末端に取り込ませることができる（Ａｎｄｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４２７７１４２７８２，１９９１；およびＰｅｌｈａｍ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏ．Ｓｃｉ．１５：４８３−４８６，１９９０を参照）。
【０２６６】
別のタイプのオルガネラ輸送要素は，融合蛋白質を細胞膜に向けるものであり，これは膜アンカリング要素を含んでいてもよい。アンカリング要素は，その性質に応じて，膜の内部リーフレットまたは外部リーフレットの上で切断することができ，このことにより，融合蛋白質をそれぞれ細胞内または細胞外コンパートメントに輸送することができる。例えば，哺乳動物蛋白質は，ｉ）Ｎ末端グリシン残基へのアミド結合によりミリスチン酸に，ｉｉ）Ｎ末端システインのアミド結合またはチオエーテル結合を介してそれぞれ脂肪酸またはジアシルグリセロールに，またはｉｉｉ）蛋白質のＣ末端アミノ酸を介してホスファチジルイノシトール（ＰＩ）分子に共有結合的に結合させることができることが示されている（概説として，Ｌｏｗ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４４：１−１３，１９８７を参照）。後者の場合，ＰＩ分子を介在グリカン構造を介して蛋白質のＣ末端に結合させ，次にＰＩはリン脂質二重層に包埋される。したがって，”ＧＰＩ”アンカーと称される。ＧＰＩアンカーおよびそのＣ末端アミノ酸配列を有することが知られている蛋白質の特定の例が報告されている（Ｌｏｗ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，９８８：４２７−４５４，１９８９の表１および図４；およびＦｅｒｇｕｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７：２８５−３２０，１９８８の表３を参照）。ＧＰＩアンカーおよび他の膜ターゲティング要素を融合蛋白質のアミノ−またはカルボキシ−末端に取り込ませることにより，キメラ分子を細胞表面に向けることができる。
【０２６７】
検出可能なポリペプチドは，検出可能なシグナルを発生するか，または検出可能なように標識した薬剤により特異的に認識される任意の融合蛋白質要素である。検出可能なポリペプチドの前者の例は，グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）である。後者の例は，エピトープ，例えば”ＦＬＡＧタグ”およびｃ−ｍｙｃエピトープである。これらのおよび他のエピトープは，そのエピトープに特異的な標識抗体を用いて検出することができる。いくつかのそのような抗体が市販されている。
【０２６８】
蛋白質精製要素（蛋白質単離要素としても知られる）は，他の分子を含む混合物から融合蛋白質を精製または単離することを容易にするために，融合蛋白質中に取り込ませることができるアミノ酸配列である。
【０２６９】
蛋白質精製要素にはまた，組換え的に製造された蛋白質を宿主細胞から外へ細胞培地中に出すことを指示する分泌配列が含まれる。次に，単に培地を回収することにより，分泌された蛋白質をこれを産生する宿主細胞から分離することができる。分泌要素の例としては，米国特許５，８４６，８１８；５，２１２，０７０；５，６３１，１４４；５，６２９，１７２；および６，１０３，４９５；およびＨａｒｄｉｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３０３３−３０３６，１９９３；Ｓｉｚｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＹｅａｒＩｍｍｕｎｏｌ．７：１１９−１３０，１９９３；およびＰｏｗｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １１３：９５−９９，１９９２）に記載されるものが含まれる。蛋白質精製要素にはまた，組換え蛋白質を細菌のペリプラズム空間に向ける配列が含まれる（Ｂａｔｔｉｓｔｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６：５７９−５８７，１９９５）。当業者は，所定の融合蛋白質および／または発現系にはいずれの精製要素が望ましいか，適切であるか，または必要であるかを決定することができるであろう。
【０２７０】
特に興味深いものは，発現系の宿主細胞または培地から融合蛋白質を単離するために用いることができる精製要素である。精製要素の例としては，ニッケルでコーティングした表面に結合する”Ｈｉｓタグ”（６連続Ｈｉｓ残基，６ｘＨｉｓとしても知られる）；ビオチンでコーティングされたかまたは”ビオチン化”された表面に結合するストレプトアビジンまたはアビジン（米国特許４，８３９，２９３およびＡｉｒｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７：１３９−１４５，１９９９を参照）；およびグルタチオンに結合するグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Ｋａｐｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．６：３９９−４０６，１９９７；米国特許５，６５４，１７６）が挙げられる。また，鉛イオンに結合するポリペプチドも記載されている（米国特許６，１１１，０７９）。”エピトープタグ”，例えばｃ−ｍｙｃエピトープまたはＦＬＡＧ−タグを用いて，組換え蛋白質を，そのようなエピトープタグに対する抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０２７１】
本明細書において用いる場合，”蛋白質精製要素”との用語には，溶解性を促進し，および／または蛋白質の正しいフォールディングを助けるよう設計された要素も含まれる。そのような要素には，ＧＳＴおよび蛋白質の１４−３−３ファミリーのメンバーが含まれる（米国特許６，０７７，６８９）。
【０２７２】
ＩＶ．Ｃ．スペーサー
スペーサー（リンカーとしても知られる）は，融合蛋白質中の，融合蛋白質の別の部分の間（例えば，生物学的に活性なポリペプチドとｐＩｇＲ−ターゲティング要素の間，または任意の融合蛋白質要素と融合蛋白質の残部との間）に含めることができるアミノ酸配列である。スペーサーは，種々の理由により含めることができる。例えば，スペーサーは，さもなくば，例えば立体障害により互いに干渉するであろう蛋白質の２つの部分の間にある種の物理学的分離を提供することができる。このタイプのスペーサーの１つの例は，反復アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｘ（ここで，ｘは１−１０であり，好ましくは１−４である）である。
【０２７３】
ＩＶ．Ｄ．プロテアーゼ切断部位
本発明の関連する態様においては，ｐＩｇＲターゲット融合蛋白質は，試薬によりまたはそのような切断を引き起こすかまたは促進する条件下で切断される部位（”プロテアーゼ切断部位”または単に”切断部位”）を含むよう設計することができる。本発明のある好ましい態様においては，切断部位は，切断により例えば融合蛋白質のｐＩｇＲターゲティング要素をその生物学的に活性なポリペプチドから分離するように，スペーサー要素中に含まれ，これはインビボ治療方法に有用である。または，切断部位は，任意の蛋白質精製要素と融合蛋白質の残部との間に含まれ，これは，インビトロで融合蛋白質を精製するプロセスにおいて，無関係なものおよび精製要素を妨害する可能性のあるものを除去するのに有用である。
【０２７４】
切断部位または切断部位を含むスペーサーの性質および組み合わせ方は，目的とするインビボまたはインビトロ方法の性質により異なるであろう。当業者には，プロテアーゼにより切断することが望まれる融合蛋白質のアミノ酸配列は，特別のプロテアーゼ切断部位を保持するよう設計しなければならないことが理解される。インビトロおよびインビボ切断部位およびシステムの非限定的例は以下のとおりである。
【０２７５】
ＩＶ．Ｄ．１．インビボ切断
スペーサーおよび他の任意の融合蛋白質要素に由来するポリペプチドフラグメントは，切断された融合蛋白質から独立してはずしてもよく，またはｐＩｇＲターゲティング要素または生物学的に活性なポリペプチドと会合させたままにしてもよい。最も好ましくは，切断反応は主として，融合蛋白質が上皮細胞の中にまたはこれを越えて，または亜細胞コンパートメント，例えばオルガネラ中に輸送された後に生ずる。例えば，例示的目的のためのみであるが，切断反応は，上皮細胞中に見いだされるプロテアーゼまたはエステラーゼにより，腫瘍細胞の近くに見いだされる酸性条件により，ジスルフィドコンジュゲーションを不安定化させる血液中の状態により，またはオルガネラ中に見いだされるプロテアーゼにより生じうる。
【０２７６】
インビボ用途のための好ましい切断部位としては，限定されないが，カスパーゼにより認識される切断部位が挙げられる。これは，例えば，アポトーシスの初期事象の間に融合蛋白質から生物学的に活性なポリペプチドを切断し活性化するために用いることができる。また，融合蛋白質をその中に輸送することが望まれるオルガネラに特異的なプロテアーゼにより認識される切断部位も挙げられ，その１つの意図される結果は，切断された融合蛋白質中の生物学的に活性な部分がオルガネラ中に保持されるであろうことである（すなわち，オルガネラリーダー配列）。
【０２７７】
カスパーゼは細胞内システインプロテアーゼであり，アポトーシス性細胞死の開始および遂行時期において必須の役割を果たすことが示されている。概説として，Ｆａｄｅｅｌら（ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ４９：４２１−４２５，２０００），Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．７：５８９−６０２，２０００）およびＥａｒｎｓｈａｗら（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：３８３−４２４，１９９９）を参照のこと。融合蛋白質は，これが生物学的に活性となる前に蛋白質分解活性化を必要とするように設計することができる。そのような融合蛋白質中に所定のカスパーゼ切断部位を含ませることにより，特定のカスパーゼにより切断され活性化される融合蛋白質を設計することができる。融合蛋白質の生物学的に活性な成分が融合蛋白質から放出されるまで活性ではない場合，後者のタイプの融合蛋白質は，アポトーシスのプロセスの間の特定の時に作用するポリペプチドを生物学的に提供する。細胞の他の小胞コンパートメント中において，同様にしてカテプシンを用いることができる。オルガネラリーダー配列には，非限定的例として，ミトコンドリア内に輸送された後に蛋白質から蛋白質分解的に除去されるミトコンドリアリーダーペプチドが含まれる。
【０２７８】
カテプシンＢ切断部位を用いることができる。以下の４つのペプチドは，カテプシンＢにより切断されることが知られている：ＧＦＱＧＶＱＦＡＧＶ，ＧＦＧＳＶＱＦＡＧＦ，ＧＬＶＧＧＡＧＡＧＦ，ＧＧＦＬＧＬＧＡＧＦ，ＧＦＧＳＴＦＦＡＧＦ（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：５５３−５５７，１９９９）。以下の配列のいずれかを有するペプチドをアミノ末端でマレイミド基に連結させるよう修飾する。この場合，括弧内のアミノ酸の任意の１つを，括弧内の他のアミノ酸の任意の１つと組み合わせて用いることができる。１，７２８の可能な組み合わせがある。そのような配列の非限定的例は，ＧＦＱＧＶＱＦＡＧＶ，ＧＦＧＳＶＱＦＡＧＦ，ＧＬＶＧＧＡＧＡＧＦ，ＧＧＦＬＧＬＧＡＧＦ，およびＧＦＧＳＴＦＦＡＧＦである。
【０２７９】
種々のリンカーがカテプシンＡ，カテプシンＢ，カテプシンＣ，カテプシンＤ，カテプシンＧ，カテプシンＳおよび他のカテプシンにより切断される能力は，ＰｅｔｅｒｓｏｎおよびＭｅａｒｅｓ（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９：６１８−６２６，１９９８）により用いられた方法により試験することができる。
【０２８０】
Ｇ−［Ｆ，ＬまたはＧ］−［Ｑ，Ｇ，ＶまたはＦ］−［Ｇ，ＳまたはＬ］−［Ｖ，ＧまたはＴ］−［Ｑ，Ａ，ＬまたはＦ］−［ＦまたはＧ］−Ａ−Ｇ−［ＶまたはＦ］
これらのアミノ酸の組み合わせの１つを有するデカペプチドを，アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで配列で挟み，リガンド，蛋白質，ペプチド，または高分子間に追加的なフレキシビリティーおよび空間を提供することができる。そのようなフランキング配列は，例えば，（ＧｌｙｘＳｅｒｙ）ｚであることができ，ここで，ｘおよびｙは，０−４であることができ，ｚは１−４であることができる。ある場合には，ｘは４であり，ｙは１であり，ｚは１−２である。
【０２８１】
そのようなペプチドは，当業者によく知られる化学を用いて，固相により合成することができる。そのようなペプチドは，１つのアミノ基のみを含み，これはペプチドのアミノ末端に存在する。
【０２８２】
ＩＶ．Ｄ．２．インビトロ切断
また，切断可能なスペーサーを他の目的に，特に蛋白質精製スキームにおいて用いることができる。一例として，アミノ末端６ｘＨｉｓタグおよびＨｉｓタグのすぐカルボキシ末端側に，すなわち，Ｈｉｓタグと製造する融合蛋白質の残りの部分との間にプロテアーゼ切断部位を有する融合蛋白質の場合を考える。ニッケルコーティング表面に対するＨｉｓタグのアフィニティーを用いて融合蛋白質を精製した後，Ｈｉｓタグを蛋白質の残りの部分から分離するために，次にこれを適当なプロテアーゼで切断することができる。蛋白質精製目的には有用であるが融合蛋白質の生物学的活性を妨害するかもしれないＨｉｓタグ等の要素を除去することがしばしば望ましい。切断可能なスペーサーは，元の蛋白質に存在するアミノ末端のアミノ酸配列を再生するよう設計することができる。
【０２８３】
インビトロ用途のための好ましい切断部位としては，限定されないが，遺伝的操作により融合蛋白質中に導入することができ，融合蛋白質の意図されるインビボでの使用に必要ではなく有害であるかもしれない融合蛋白質の部分に位置する切断部位を認識するものが含まれる。切断部位を導入するために用いることができる市販の発現系には，非限定的例として，エンテロキナーゼ，トリプシン，Ｘａ因子，ＩＸａ因子およびトロンビンにより認識される切断部位が含まれる。
【０２８４】
エンテロキナーゼを用いてスペーサー要素を切断することができる（米国特許４，７４５，０６９を参照）。好ましいエンテロキナーゼは，組換えＤＮＡ手法により製造されたものである。これは他のプロテアーゼを事実上含まず，部分的に精製された調製物中で効率よく融合蛋白質を切断することができるためである（Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：９８２−９８７，１９９５）。さらに，エンテロキナーゼは，認識配列の下流のアミノ酸残基に関して比較的寛容である（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｏｃｈｅｍ．２６９：１０−１６，１９９９）。また，トリプシンをこのようにして用いることができる（米国特許６，０３７，１４３）。蛋白質を精製する目的のための切断部位を提供することに加え，胃腸プロテアーゼ，例えばエンテロキナーゼまたはトリプシンによるインビボ切断は，消化管中で融合蛋白質が担体から脱離するメカニズムとして作用する。
【０２８５】
Ｘａ因子（Ｐｅｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０１：１１５８−１１６４，２０００；米国特許６，０１０，８８３）およびトロンビンは，血液凝固因子である。発現ベクターはトロンビンまたはＸａ因子用の切断部位をコードする配列を含むことができ，これは，精製要素（例えばＨｉｓタグ）がその精製の目的を果たした後，これを融合蛋白質から除去するために用いることができる。
【０２８６】
ＩＶ．Ｅ．組換えＤＮＡ発現系による融合蛋白質の製造
融合蛋白質の組換え発現を行うためには，キメラリーディングフレームを発現することができる発現カセットまたは構築物を適当な宿主細胞中に導入して，発現系を作製する。本発明の発現カセットおよび構築物は，非複製性ＤＮＡとして，またはＲＮＡ分子のいずれかとして，レシピエント原核生物または真核生物細胞に導入することができ，これらは直鎖状分子であってもよく，または，より好ましくは，閉環状分子である。このような分子は自己複製をすることができないため，遺伝子の発現は，導入された配列の過渡的発現により生ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列を宿主染色体中にインテグレートさせることにより永久的発現が生ずる。
【０２８７】
本発明の発現系において用いることができる宿主細胞は，目的とするキメラｐＩｇＲターゲティングペプチドの発現において用いるのに適当なものである限り，厳密に制限されない。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含む。好ましい真核生物宿主としては，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞が挙げられ，これはインビボでも組織培養でもよい。
【０２８８】
発現カセットおよび構築物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェクション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等のいずれかにより適当な宿主細胞に導入することができる。ベクターを導入した後，ベクターを含む細胞の成長を選択する選択培地中でレシピエント細胞を成長させる。クローニングされた遺伝子の発現により，本発明のキメラｐＩｇＲターゲティングペプチド，またはそのフラグメントが産生される。
【０２８９】
導入された核酸分子は，レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまたはウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために，広範な種類のベクターの任意のものを利用することができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択において重要な因子としては，以下のものが挙げられる：ベクターを含むレシピエント細胞を認識し，これをベクターを含まない細胞から分離することの容易性；特定の宿主中で望まれるベクターのコピー数；および，ベクターを異なる種の宿主細胞間で”シャトル”しうることが望ましいか否か。
【０２９０】
種々の組換えＤＮＡ発現系を用いて，本発明の融合蛋白質を製造することができる。特に興味深い発現系には，原核生物系，酵母発現系，昆虫発現系および哺乳動物発現系が含まれる。
【０２９１】
原核生物発現系は，用いる宿主と適合した種に由来する複製部位および制御配列を含むプラスミドおよびウイルス（バクテリオファージ）発現ベクターを利用する。適当なファージまたはバクテリオファージベクターとしては，λｇｔ１０，λｇｔ１１等が挙げられる。適当なウイルスベクターとしては，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が挙げられる。適当な原核生物プラスミドベクターとしては，Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製しうるもの（例えば，非限定的例としては，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，πＶＸ；”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，１９８９，上掲）が挙げられる。枯草菌プラスミドにはｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９８２）。適当な放線菌プラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３，１９８７），および放線菌バクテリオファージ，例えばΦＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ  Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ，ｐｐ．４５５４，１９８６）が含まれる。シュードモナスプラスミドは，Ｊｏｈｎら（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。Ｂｒｅｎｔら，”Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ，”Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩ，およびＬｅｃｈら，”Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｌａｍｂｄａ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ”Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩＩ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｏｆ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ  １−１３  ｔｏ  １−２７；Ｌｅｃｈ，ｅｔ  ａｌ．”Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｌａｍｂｄａ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ”Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩＩ  ａｎｄ  Ｉｄ．ｐａｇｅｓ  １−２８  ｔｏ  ｐａｇｅ  １−５２も参照されたい。
【０２９２】
認識されている原核生物宿主としては，Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等の細菌が含まれる。しかし，このような宿主においては，融合蛋白質はグリコシル化されない。いずれにしても，宿主細胞は，発現カセット中のレプリコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【０２９３】
本発明のキメラｐＩｇＲターゲティングペプチド（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞中で発現させるためには，本発明のキメラｐＩｇＲターゲティングペプチドをコードする配列を機能的原核生物プロモーターに動作可能なように連結することが必要である。このようなプロモーターは，構成的であってもよく，または，より好ましくは制御可能である（すなわち，誘導可能または抑制可能）。構成的プロモータの例としては，バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が挙げられる。誘導可能な原核生物プロモーターの例としては，バクテリオファージλの主要右および左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃＩ，およびｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５），およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのプロモーター（Ｇｉｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８，１９８６）が挙げられる。原核生物プロモーターは，Ｇｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６８：５０５−５１６，１９８６），およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２，１９８４）により概説されている。
【０２９４】
原核生物細胞における正しい発現には，遺伝子配列をコードする配列の上流にリボソーム結合部位が存在することも必要である。このようなリボソーム結合部位は，例えば，Ｇｏｌｄら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５−４０４，１９８１）に開示されている。制御配列，発現ベクター，トランスフォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細胞の種類によって異なる。本明細書において用いる場合，”細胞”，”細胞株”，および”細胞培養”は，互換的に用いられ，そのような名称はすべて子孫を含む。すなわち，”トランスフォーマント”または”トランスフォームした細胞”との語句は，初期の対象細胞および移動の回数にかかわらず，これらから誘導される培養物を含む。また，故意または偶然の変異のため，すべての子孫がＤＮＡ含有物について厳密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義されるように，変異体の子孫は，元のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【０２９５】
細菌系は，大量のシャトルベクターを作成し製造するためにも用いることができる。シャトルベクターとは，原核生物宿主，例えばＥ．ｃｏｌｉ中で複製するが，シャトルベクターおよびその中に取り込まれているキメラリーディングフレームを真核生物ウイルスベクターまたは他のベクター，例えばバキュロウイルスまたはアデノウイルスに移動させることができる配列を含むように設計された構築物である。
【０２９６】
酵母がグルコースに富む培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を取り込んだ酵母発現系を利用することができる。既知の解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率のよい転写制御シグナルを提供することができる。酵母細胞は，融合蛋白質の翻訳後修飾を行うことができる点において，原核生物発現系よりも実質的な利点を提供する。酵母において所望の蛋白質を製造するために用いることができる，強いプロモーター配列および高いコピー数のプラスミドを利用する多くの組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母は，クローニングされた哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して，リーダー配列を有するペプチドを分泌する（すなわち，ｐｒｅ−ペプチド）。
【０２９７】
好ましい酵母発現ベクターには，２−ミクロン環として知られるエピゾーム要素，ならびに，酵母インテグレート（ＹＩｐ），酵母複製（ＹＲｐ），酵母セントロメア（ＹＣｐ），酵母エピゾーム（ＹＥｐ），および酵母直線状（ＹＬｐ）プラスミドの誘導体が含まれる（Ｂｒｏａｃｈ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０，１９８１；Ｌｕｎｄｂｌａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩ  ａｎｄ，Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩＩ，ｏｆ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ：  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄＥｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ１３−１９ｔｏ１３−４１）。
【０２９８】
昆虫発現系は，昆虫宿主細胞，例えばＳｆ９およびＳｆ２１細胞を利用する。これらの細胞はいずれも，シロナヤガ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のサナギ卵巣組織に由来するｉｐｌｂｓｆ−２１細胞株に由来する（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。また，ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３９；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ  Ｔｏｔｏｗａ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９２；およびＶａｕｇｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  １３：２１３−２１７，１９７７も参照。細胞株ｂｔｉ−ｔｎ−５ｂｌ−４（ｈｉｇｈ５ｔｍ細胞株）はイラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ  ｎｉ）の卵巣細胞に由来する（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１１４８−１１５０，１９９２；Ｇｒａｎａｄｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．Ｐａｔｈｏｌ．６４：２６０−２６６，１９９４；Ｗｉｃｋｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇ．８：３９１−３９６，１９９２；Ｗｉｃｋｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．９：２５−３０，１９９３）。バキュロウイルスベクターを発現させるために用いることができる他の昆虫細胞株が記載されている（Ｈｉｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．７：９−１４，１９９１）。また，Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂａｃｕｌｏ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩ  ｉｎ  ｃｈａｐｔｅｒ  １６  ｏｆ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２も参照。昆虫細胞を宿主として用いる場合には，ショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルスベクターを遺伝子工学処理して，本発明のキメラｐＩｇＲ−ターゲティングペプチドを昆虫細胞中で大量に発現させることができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１６５３，１９８７；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．２７７−２９７，１９８６）。
【０２９９】
哺乳動物発現系は，宿主細胞，例えばＨｅＬａ細胞，線維芽細胞に由来する細胞，例えばＶＥＲＯ，ＣＶ−１サル腎臓細胞およびＣＯＳ−１（ラージＴ抗原でトランスフォームしたＣＶ−１細胞）またはＣＨＯ−Ｋ１，またはリンパ球由来の細胞またはその誘導体を利用する。好ましい哺乳動物宿主細胞としては，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫の細胞株，例えばＩＭＲ３３２（これはより高い正しい翻訳後プロセシングの能力を与えるであろう）が挙げられる。
【０３００】
本発明のキメラｐＩｇＲターゲティングペプチドの哺乳動物宿主における発現のためには，いくつかの発現ベクターが利用可能である。宿主の性質に応じて，広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることができる。転写および翻訳制御シグナルは，ウイルス起源，例えば，アデノウイルス，ウシパピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することができ，ここで，制御シグナルは高レベルの発現を有する特定の遺伝子配列と関連している。あるいは，哺乳動物発現産物，例えば，アクチン，コラーゲン，ミオシン等からのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝子配列の発現を調節することができるよう，抑制または活性化が可能なものを選択することができる。特に興味深いものは，温度を変化させることにより，発現を抑制または開始させることができるように温度感受性であるか，または化学物質（例えば代謝産物）制御に供することができる制御シグナルである。
【０３０１】
好ましい真核生物プラスミドには，例えば，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，２ミクロン環等，またはこれらの誘導体が含まれる。このようなプラスミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉａｍｉ  Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒｏａｃｈ，ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏｌｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｉｎ：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．５６３−６０８，１９８０）。
【０３０２】
本発明のキメラｐＩｇＲ−ターゲティングペプチドの真核生物宿主における発現には，真核生物制御領域の使用が必要である。このような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を指令するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターは，例えば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８１）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）］である。
【０３０３】
真核生物ｍＲＮＡの翻訳は，最初のメチオニンをコードするコドンで開始される。この理由のため，真核生物プロモーターと本発明のキメラｐＩｇＲ−ターゲティングペプチド（またはその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の結合がメチオニンをコードすることが可能な介在コドン（すなわちＡＵＧ）を含まないことを確実にすることが好ましい。そのようなコドンが存在すると，融合蛋白質の形成（ＡＵＧコドンが本発明のキメラｐＩｇＲ−ターゲティングペプチドのコーディング配列と同じリーディングフレームにある）またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが本発明のキメラｐＩｇＲターゲティングペプチドのコーディング配列と同じリーディングフレームにない）のいずれかが生ずる。
【０３０４】
Ｖ．蛋白質コンジュゲート
本発明の化合物の１つのタイプは，蛋白質コンジュゲート，すなわち，ポリペプチドであるターゲティング要素に共有結合的に結合した生物学的に活性なポリペプチドである。
【０３０５】
Ｖ．Ａ．ターゲティング要素の生物活性化合物への共有結合
ｐＩｇＲ−ターゲティング要素であるポリペプチドは，例えば，限定されないが抗体誘導体およびｐＩｇＲに結合する細菌蛋白質であり，種々の方法により生物活性化合物に結合させることができる。一般に，蛋白質コンジュゲートのメンバーを他の蛋白質コンジュゲートのメンバーに結合させるためには４つの方法がある。第１に，例えばジスルフィド架橋に見られるように，第１の蛋白質メンバーの天然の配列中に存在するアミノ酸残基を，第２の蛋白質メンバーの天然のアミノ酸配列中のアミノ酸残基に直接共有結合させることができる。第２に，分子遺伝学を用いて，そのような蛋白質メンバーをコードするリーディングフレームを変更するか，または，合成オリゴペプチドの場合には，そのインビトロ合成の間に直接，共有結合に有用な変異体アミノ酸を１またはそれ以上の蛋白質メンバー中に導入することができる。第３に，単離された蛋白質中に存在する天然のまたは変異体アミノ酸配列は，天然のアミノ酸中には存在しないが，オリゴペプチド，ポリペプチド，および蛋白質の化学的コンジュゲーションに有用な化学基を含むように”誘導化”（すなわち，インビトロでの化学的修飾）することができる。関連する方法論において，化学的コンジュゲーションに有用な成分を含む非天然のアミノ酸を，インビトロでの合成の間に，オリゴペプチドまたはペプチド模倣体中に導入することができる。第４に，架橋試薬（”架橋剤”としても知られる），典型的には２またはそれ以上のコンジュゲートメンバーの間に共有結合を形成する二官能性（２つのアームを有する）化学リンカーを用いて，コンジュゲートメンバーを互いに共有結合させることができる。そのような二官能性リンカーは，ホモ二官能性（リンカーの両方の”アーム”が同じ化学成分である）であってもよく，またはヘテロ二官能性（２つの”アーム”のそれぞれが他方とは異なる化学成分である）であってもよい。
【０３０６】
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；本明細書の一部としてここに引用する）は，種々の架橋剤または誘導化剤に存在する種々の反応性官能基を用いて，蛋白質および他の分子を一緒に結合するために用いられる多くの化学的方法をまとめている。ポリペプチド架橋剤は，蛋白質およびペプチドのアミノ酸側鎖，ならびに別の側鎖および他の高分子を修飾し結合させる反応性官能基に基づいている。二官能性架橋剤は，２またはそれ以上の官能性反応基を有する。二官能性架橋剤中の官能性反応基は，同じであってもよく（ホモ二官能性），または異なっていてもよい（ヘテロ二官能性）。多くの種類の架橋剤が，種々の蛋白質，ペプチド，および高分子を架橋させるために利用可能である。表７は，商業的販売元から入手可能な架橋剤をその化学反応性の種類にしたがって一覧にしたものである。表８は，化学架橋剤のいくつかの特性およびこれが反応する官能基の種類の一覧である。
【０３０７】
表７：架橋剤の化学反応性の種類
【表７】
2005500002.tif 000012
【表８】
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【表９】
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【０３０８】
表８：化学架橋剤およびそのいくつかの特性
【表１０】
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【表１１】
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【０３０９】
二官能性架橋剤は，その官能基，化学的特異性，得られる架橋の長さ，類似の官能基または非類似の官能基の存在，化学的または光化学的反応性，還元または他の手段により内部で切断される能力，および放射性標識（すなわち放射性ヨード化）により試薬をさらに修飾するか，または検出可能なタグまたは標識を付加することができる可能性にしたがって分類することができる。架橋剤上の選択基は，選択基が同一であるホモ二官能性の取り合わせで存在してもよく，または選択基が非類似のヘテロ二官能性の取り合わせで存在してもよい。
【０３１０】
化学的修飾は，１級アミン，スルフヒドリル（チオール）基，カルボニル，カルボキシル基，ヒドロキシル，または炭水化物および蛋白質またはペプチド上に置かれる他の基と（特に細胞内における翻訳後修飾により）反応する選択基を含む架橋剤を用いて行うことができる。選択的基としては，限定されないが，イミドエステル，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはスルホスクシンイミジルエステル，１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホン酸のエステル，マレイミド，ピリジルジスルフィド，カルボジイミド，ヒドラジドおよびα−ハロセチル基が挙げられる。
【０３１１】
スルフヒドリル反応性官能基には，マレイミド，アルキルおよびアリールハロゲン化物，α−ハロアシル，およびピリジルジスルフィドが含まれる。マレイミド，アルキルおよびアリールハロゲン化物，およびα−ハロアシルはチオールと反応して安定なチオエーテル結合を形成し，これは２−メルカプトエタノールおよびジチオスレイトール等の試薬によって還元されない。ピリジルジスルフィドは，チオール基とともに混合ジスルフィドを形成し，混合ジスルフィドは，２またはそれ以上の高分子を架橋するための中間体として用いることができる。最初にカルボキシル基と反応して活性化中間体を形成し，次にアミノ基，例えば，リジンのα−アミノ基またはアミノ末端アミノ酸のα−アミノ基と反応する架橋剤を用いることができる。
【０３１２】
スペーサーアームまたはスペーサー基または官能基，例えば，ジスルフィド結合またはヒンダードジスルフィド結合からなる”架橋（ｃｒｏｓｓ−ｂｒｉｄｇｅ）”領域を用いて，生物学的に活性なポリペプチドをターゲティング要素につなげることができる。スペーサーアームの長さは様々でありうる。官能基の間の距離がスペーサーアームの長さを確立する。一緒に架橋された２つの分子間の立体的障害を減少させるかまたは排除するためには，より長いスペーサーアームが必要であろう。分子間架橋はより長いスペーサーアームを用いたときにより有効である。短いスペーサーアームは分子内架橋を生じやすく，これは本発明においては好ましくは回避すべきである。
【０３１３】
スペーサーアームは，さらなる修飾を可能とする反応性結合をその中に有していてもよい。例えば，内部の切断可能結合を，スペーサー，例えばジスルフィドまたはヒンダードジスルフィド，１またはそれ以上のエステル結合，またはビシナルヒドロキシル基中に配置してもよい。内部のジスルフィド結合の切断は，チオール含有試薬，例えば２−メルカプトエタノールおよびジチオスレイトールによる還元を用いて行うことができる。１またはそれ以上の代謝可能な結合を架橋試薬の内部に挿入して，コンジュゲートが細胞内および体内に輸送された後に，カップリングされた成分が，結合が破壊された後に分離する能力を与えることができる。
【０３１４】
ホモ二官能性架橋剤は，少なくとも２つの同一の官能基を含む。ヘテロ二官能性架橋剤は，異なる特異性で反応する２またはそれ以上の官能性反応基を含む。ヘテロ二官能性架橋剤は異なる反応基を含むため，それぞれの末端は，独立して，蛋白質，ペプチド，および高分子上の異なる官能基を指向することができる。この特徴のため，例えば，ある分子上のアミノ基を別の分子上のカルボキシル基に，またはある分子上のアミノ基を別の分子上のスルフヒドリル基に結合させることができる。
【０３１５】
官能基には，化学反応が進行することができる蛋白質，ペプチド，および高分子上の反応性部分が含まれる。官能基には，アミノ基およびカルボキシル基，ヒドロキシル基，フェノレートヒドロキシル基，カルボニル基，グアニジニル基，および炭素−炭素二重結合が含まれる。さらに，光に暴露されたときに反応性となる光活性試薬を用いることができる。例えば，アリールアジドは，活性化して，活性化中間体，例えばアリールニトレンまたはデヒドロアゼピン中間体を形成することができ，これは，炭素−水素結合に非選択的に（すなわちアリールニトレンにより）挿入するか，またはアミンと反応する（デヒドロアゼピン）。他の例としては，官能化アリールアジド，ベンゾフェノン，ある種のジアゾ化合物，およびジアジリン誘導体が挙げられる。
【０３１６】
Ｖ．Ａ．１．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＮＨＳ−エステルは，水性緩衝液，好ましくはリン酸，炭酸水素／炭酸，ＨＥＰＥＳ，およびホウ酸緩衝液中で，１０−２００ｍＭの濃度で，アミノ基と効率よく反応する。緩衝液は１級アミンを含んでいてはならない。１級アミンを反応液に加えて，ＮＨＳ−エステル反応を停止または急冷し，このことにより，蛋白質，ペプチド，および高分子上のアミノ基のさらなる修飾を終了させることができる。修飾またはカップリングは，典型的には，ｐＨ７−ｐＨ９，好ましくはｐＨ７．５−８．０で行う。反応の時間および温度は，修飾する特定の分子に応じて様々でありうる。修飾の時間は，４℃−３７℃，好ましくは４℃−２５℃の温度で，１０−１８０分間，好ましくは３０−６０分間でありうる。ＮＨＳ−エステルの濃度は様々でありうるが，１．１−１００倍モル過剰であり，好ましくは１．１−１０倍モル過剰である。蛋白質濃度は，１μＭ−１００μＭ，好ましくは５μＭ−１００μＭの範囲でありうる。
【０３１７】
Ｖ．Ａ．２．１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホン酸のエステル
マレイミド−脂肪族カルボン酸は，１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホン酸のヒドロキシル基とエステルを形成することができる。マレイミド基は，短い，中程度の，または長い脂肪族酸の末端に置くことができる。この例はｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡ（米国特許４，９５４，６３７）である。Ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡを用いて，蛋白質，ペプチド，および高分子上のアミノ基をアシル化することができる。次にマレイミドを別の蛋白質，ペプチド，および高分子上のスルフヒドリル基と反応させて，安定な切断されないチオエーテル結合を形成することができる。水性緩衝液，例えばリン酸ナトリウム，および中性から弱アルカリ性の条件，すなわち，ｐＨ６．５−９，好ましくはｐＨ７−８，および０℃−３７℃，好ましくは４℃−２５℃の温度を用いることができる。
【０３１８】
Ｖ．Ｂ．化学架橋用に修飾することができる高分子上の成分
Ｖ．Ｂ．１．天然に生ずる修飾成分
蛋白質およびペプチドは，アミノ末端にα−アミノ基を，リジンにε−アミノ基を，アスパラギン酸にβ−カルボキシル基を，グルタミン酸にγ−カルボキシル基を，ヒスチジンにイミダゾール環を，セリンおよびトレオニンにヒドロキシル基を，チロシンにフェノレートヒドロキシル基を，システインにスルフヒドリル基を，２つのシステインの間にジスルフィド結合を，メチオニンにメルカプチド結合を，トリプトファンにインドール環を有しており，これらはすべて架橋剤により選択的に修飾することができる。
【０３１９】
炭水化物または炭水化物含有高分子は，架橋剤が反応することができる官能基の非限定的例として，ケトン，アルデヒド，ヒドロキシル，アミン，カルボキシレート，スルフェート，およびホスフェート基を有する。隣接するヒドロキシル基（隣接する炭素原子上のヒドロキシル基）を含む炭水化物を過ヨウ素酸ナトリウムで処理して，炭素−炭素結合を切断することができる。このことにより，処理した炭水化物上に反応性ホルミル基が生じ，これは適切に設計された架橋剤のターゲットとして用いることができる。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎは，炭水化物を架橋する他の方法を開示しており，これを本明細書の一部としてここに引用する。
【０３２０】
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎは，化学的修飾することができる核酸上の主要な部位を開示する。Ｃｙｓ残基を含むオリゴヌクレオチドを合成しコンジュゲート化するための組成物および方法は，ＳｔｅｔｓｅｎｋｏおよびＧａｉｔにより記載されている（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １９：１７５１−１７６４，２０００）。
【０３２１】
Ｖ．Ｂ．２．後の化学的修飾のためのポリペプチド中へのシステインの置換または挿入
治療用および診断用の生物学的に活性な蛋白質およびペプチドに遺伝子工学的に融合させたリガンドは，常に所望の結果をもたらすとは限らない。遺伝的融合は，典型的にはリガンドを，必要な場合にはスペーサーを用いて，生物学的に活性な蛋白質またはペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合させることにより行う。したがって，リガンドと生物学的に活性な蛋白質およびペプチドとの幾何学的配置は必然的に制限される。表面システイン基による生物学的に活性な蛋白質またはペプチドの結合は，リガンドがｐＩｇＲを認識し，生物学的に活性な蛋白質またはペプチドが上皮輸送後にその機能を発揮することの両方を可能とする組み合わせを設計する上で，より大きなフレキシビリティーを与える。蛋白質，ペプチドまたは高分子上に所望のスルフヒドリル基が存在しない場合には，遺伝子工学的改変によりスルフヒドリルを導入することができる。したがって，本発明は，システインを蛋白質またはペプチド中に置換または挿入する方法，および架橋による化学的コンジュゲーションにシステインを用いる方法を提供する。
【０３２２】
アミノ酸をシステインによる置換のために選択することができ，そのような選択されたアミノ酸は，分子の表面に存在するべきであり，生物学的に活性な部位または生物学的活性または機能に必要な分子の重要な部位の機能の妨害または立体障害とならないような位置にあるべきである。システインでアミノ酸を置換することは，当業者によく知られる方法により，例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｓｃｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載される方法を用いることにより行うことができる。
【０３２３】
比較的大きい分子，例えばｐＩｇＲ結合ｓＦｖをシステイン残基とカップリングさせることにより生ずる立体障害の可能性を最小限にするように，ポリペプチドの結晶構造中の領域を選択する。ループまたは構造化されていない領域のアミノ酸のいずれもシステインで置換することができが，好ましい位置がある。そのような好ましい位置は，その側鎖が他のアミノ酸側鎖（または骨格原子）に水素結合しないか，または他のアミノ酸側鎖との塩橋または荷電架橋の形成に関与または寄与しないアミノ酸の位置である。ヘリックス領域中のアミノ酸もまた，その側鎖が蛋白質の主要部と反対方向に向いており，構造に安定性を与える他のアミノ酸側鎖との相互作用に関与していない場合には，置換することができる。好ましい位置は，バルク溶媒に完全に暴露されており，ポリペプチドの３次元構造中のアミノ酸と有意な相互作用を有さず，生物学的活性またはレセプター結合，シグナル伝達等の分子の機能に関与しないアミノ酸側鎖である。
【０３２４】
置換可能なアミノ酸は，３次元構造を可視化する目的で設計されたソフトウエアを用いて結晶構造を調べることにより，選択することができる。分析用にいくつかのプログラムが入手可能であり，例えば，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ，Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ，ＭＤＬ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ａｍｂｅｒ，Ｃｈａｒｍ，Ｃｈｅｍ−Ｘ，Ｃｈｉｍｅ，ＤＯＣＫ，Ｈｏｍｏｌｏｇｙ，ＭＡＧＥ，ＳＹＢＹＬ，ＭｉｄａｓＰｌｕｓ，および当業者に知られる他のものが挙げられる。当業者は，肉眼検査およびこれらのプログラムによる計算および表示の両方を用いて，置換位置を選択することができる。
【０３２５】
システインによるアミノ酸の置換または蛋白質配列中へのシステインの挿入が蛋白質の活性を顕著に変更または改変しない部位について，蛋白質またはペプチド表面を調べる。蛋白質またはペプチドの結晶学的データを調べることにより，水分子がアミノ酸またはその側鎖と接触する能力により判定して，いずれのアミノ酸残基および側鎖が暴露されているかを明らかにすることができる。
【０３２６】
システイン残基をループ，好ましくは結晶構造において規定されていないループ中に挿入または置換する。これはそのようなループはあまり構造化されておらず，データ収集の間に移動するためである。ヘリックスの溶媒側のアミノ酸をシステイン残基で置換する。当業者には，システイン置換または挿入の目的で蛋白質の表面特性を分析するためにどのようにソフトウエアプログラムを用いるかがわかるであろう（例えば，米国特許４，８５３，８７１および４，９０８，７７３を参照）。
【０３２７】
いくつかの結晶構造においては，ループの全体は観察されない。これは，その領域のフレキシビリティーのためにデータが記録されないからである。したがって，骨格鎖がフレキシブル領域に入るにしたがってその痕跡は終了し，次にフレキシブルループの反対側で現れる。そのような領域はシステイン置換または挿入に適している。水と接触しているすべてのアミノ酸がシステインによる置換の候補である。そのようなアミノ酸を１つずつシステインによって置換し，生物学的活性に及ぼす置換の影響を調べることができる。生物学的活性に０−２０パーセント，好ましくは０−１０パーセント，最も好ましくは０−５パーセント以上の影響を及ぼさない置換を用いて，ｐＩｇＲおよびｐＩｇＲ茎に結合するリガンドに架橋することができる。
【０３２８】
蛋白質またはペプチドの表面で５−１５アミノ酸の小さいストレッチにより形成されるループを用いて，システインを蛋白質配列中に挿入する。表面を調べることにより，バルク溶媒に対して最大の暴露を有する部位が明らかになると予測される。溶媒にアクセス可能な側鎖は，蛋白質のコノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ／Ｒｉｃｈａｒｄｓ）表面を調べることにより識別する。これは，本質的に，側鎖が分子の表面のまわりを’巻く’水分子と接触する能力により規定される。バルク溶媒にアクセス可能な部位またはそこから２−４アミノ酸残基以内にシステインを挿入することにより，ｐＩｇＲまたはｐＩｇＲ茎に結合するリガンドに架橋するのに適した蛋白質の変種を製造する。ループはまた，蛋白質について分子ダイナミック分析を行うことにより識別することができる。５０−２５０ピコ秒間にわたって行う分子ダイナミック分析により，蛋白質の構造中のシステイン置換または挿入に用いられるフレキシブル領域が明らかになると予測される。そのような分析においては，フレキシブルループ中のそれぞれの対のアミノ酸の間で，システイン残基を１回に１つずつ置換する。ヘリックス輪を用いて，ヘリックスのバルク溶媒に面している側を識別する。
【０３２９】
ヘリックスの胴部を見下ろすことにより，ヘリックスの一方の側または他方の側の残基を同定することができる。蛋白質構造の結晶学的解釈が入手可能な場合，ヘリックス輪上の残基を構造中で観察してそのバルク溶液に対するアクセスを見積もることができる。ヘリックス輪のバルク溶液側の残基は，しばしばレセプター結合に関与している。そのような残基をシステインで置換することは望ましくない。本発明においては，ヘリックス中のバルク溶媒に向いた残基における置換が提供されるが，ただし，残基はレセプター結合に関与しないか，またはさもなくば分子の生物学的活性に関与している。システインの置換または挿入は，生物学的機能および活性を変更してはならない。システイン挿入または置換の影響は，修飾蛋白質の機能を適当にかつ適切に測定する生物学的アッセイを用いて分析することができる。
【０３３０】
システイン修飾蛋白質と親の非修飾蛋白質との比較により，修飾が機能に及ぼす定量的および定性的な影響が明らかになる。生物学的活性に寄与する重要な部位または突然変異誘発により改変することができない部位が蛋白質表面上のどこに位置しているかを同定し，位置決定し，または示唆するデータが入手可能であれば，生物学的におよび機能的に感受性のある領域から遠い部位を回避することができる。例えば，システイン置換または挿入は，蛋白質またはペプチドの，蛋白質の機能的に感受性の表面と反対側の表面，すなわち可能な限り遠く離れた位置に配置することができる。
【０３３１】
抗体についてのシステイン置換または挿入は記載されている（米国特許５，２１９，９９６を参照）。抗体の部位特異的コンジュゲーションにおいて用いるためにＩｇＧ抗体の定常領域にＣｙｓ残基を導入する方法は，Ｓｔｉｍｍｅｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７５：３３０４４５−３０４５０，２０００）により記載されている。
【０３３２】
Ｖ．Ｂ．３．ポリペプチドおよび他の高分子へのスルフヒドリル基の化学的付加
所望のスルフヒドリル基が蛋白質，ペプチドまたは高分子上に存在しない場合には，化学的修飾によりスルフヒドリルを導入することができる。非限定的例として，化学的修飾によりチオールを導入するためにｓＦｖまたは治療用高分子を修飾することができる。システインアミノ酸は，遺伝子操作により蛋白質またはペプチドの表面に挿入または置換することができる。スルフヒドリル基は，２−イミノチオラン（ＩＴ）（トラウト試薬としても知られる）を用いる化学的修飾により付加することができる。例えば，０．１−１０ｍｇ／ｍｌ，好ましくは１−５ｍｇ／ｍｌのターゲット分子を１．１−１００倍，好ましくは１．１−１０倍モル過剰の２−イミノチオランとともに，５０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡを含む）中で４℃で３時間インキュベートすることにより，スルフヒドリルを導入することができる。次に，０．１５ＭＮａＣＩおよび１ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）で平衡化したＰ１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）またはＧ２５，Ｇ−５０，またはＧ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）サイズ排除カラムで脱塩することにより，過剰の２−イミノチオランを除去する。脱塩用のＰ１０，セファデックスＧ−２５，またはセファロースＧ−１００カラムは，誘導化蛋白質の質量にしたがって選択する。
【０３３３】
保護されたスルフヒドリル基を付加することにより，誘導化蛋白質をジスルフィド結合の形成により自己会合させることなく保存することができる。ＩＴおよびＤＴＮＢを一緒に反応させて，ＴＮＢ−活性化ＩＴを形成し，次にこれを用いて直接ターゲット分子に付加することができる。また，置換ＩＴを合成し（Ｇｏｆｆ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：３８１−６，１９９０），これらを用いてスルフヒドリル基をターゲット蛋白質に付加し，インビボで増加した安定性を示すジスルフィド結合コンジュゲートを得ることができる（Ｃａｒｒｏｌｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：２４８−５６，１９９４）。保護されたスルフヒドリルはまた，１級アミンと選択的に反応する基に加えて保護されたチオールを含む修飾試薬を用いて付加することができる。例えば，Ｓ−アセチルチオ酢酸（ＳＡＴＡ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ）のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルを製造元の指針にしたがって用いて，保護されたチオール基をｓＦｖまたは治療用高分子のいずれかに導入することができる。これは，５μｌのＤＭＳＯ中１５ｍｇ／ｍｌのＳＡＴＡを５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡを含む）（Ｐ−ＥＤＴＡ）中の１．０ｍｌの６０μＭｓＦｖまたは治療用高分子に加えることにより行うことができる。室温で３０分間インキュベーションした後，Ｐ−ＥＤＴＡで平衡化したＰ１０またはＧ２５サイズ排除カラムで脱塩することにより過剰のＳＡＴＡを除去することができる。チオール基の脱保護は，１ｍｌの誘導化蛋白質を１００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム（２５ｍＭＥＤＴＡおよび０．５Ｍヒドロキシルアミンを含む，ｐＨ７．５）と室温で２時間インキュベートすることにより行うことができる。過剰のヒドロキシルアミンは，ＰＢＳ−ＥＤＴＡで平衡化したＰ１０またはＧ２５サイズ排除カラムで脱塩することにより除去することができる。あるいは，ＳＡＴＡと類似するがスペーサーアーム中に追加の炭素を有するＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）を用いることができる。この使用はＳＡＴＡと同じである。
【０３３４】
スルフヒドリル基はまた，１級アミンと選択的に反応する基に加えてジスルフィド結合を含む修飾試薬を用いることにより付加することができる。例えば，ヘテロ二官能性架橋剤であるスルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）は，製造元の指針にしたがって用いると，蛋白質をチオール化する。チオール化はまた，２０ｍＭリン酸ナトリウム（０．１５ＭＮａＣｌを含む，ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）中１０ｍｇ／ｍｌのｓＦｖまたは治療用高分子１ｍｌあたり３００μｇのｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰを加えることによっても行うことができる。他の不溶性形，例えば，Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）またはＮ−スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）は，２０ｍＭの濃度でＤＭＳＯ中に溶解し，２５μｌから１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ蛋白質を加えることにより，これらの反応において用いることができる。ＳＰＤＰ誘導化蛋白質を穏和な条件化で還元することにより，ピリジン−２−チオンを放出させて，脂肪族チオールが得られる。穏和な還元条件の例は，１／１００容量の１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を上述のＳＰＤＰ誘導化ターゲット蛋白質に加え，室温で３０分間インキュベートするか，またはＳＰＤＰ誘導化ターゲット蛋白質をＰＢＳ−ＥＤＴＡ中５０ｍＭの２−メルカプトエチルアミンとともに３７℃で９０分間インキュベートすることである。次に，ＰＢＳ−ＥＤＴＡで平衡化したＰ１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）またはＧ２５（ＰＤ１０カラム，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラムで脱塩することにより，過剰のＳＰＤＰ，ＬＣ−ＳＰＤＰまたはｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ，およびピリジン−２−チオンを除去することができる。
【０３３５】
これらの修飾試薬はまた，酸化されたときにヒンダードジスルフィドを形成するように，付加されるチオールの近くに基を有していてもよい。これらの試薬，例えば，４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）により，インビボで増加した安定性を示すコンジュゲートが得られる（Ｔｈｏｒｐｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１，１９８７）。蛋白質チオール化に他の架橋試薬を用いることができ，これらは当業者には知られている。これらの試薬の多くは，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．のカタログ，またはＪｉ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０−６０９，１９８３）およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１−７８５，１９９６）に記載されている。
【０３３６】
Ｖ．Ｂ．４．ポリペプチドまたは高分子の表面への１級アミン基の化学的付加
ｓＦｖまたは治療用高分子のいずれかに追加の１級アミンを付加することが必要である場合には，これらは化学的修飾または遺伝子操作により導入することができる。１級アミンを付加する化学的修飾は，可逆的であっても不可逆的であってもよい。例えば，システインのアミノ化は，Ｎ−（ヨードエチル）−トリフルオロアセトアミド（アミノエチル−８（登録商標），Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて，ヨードアルキル基がスルフヒドリル基と特異的に反応して，安定なチオエーテル結合を形成し遊離ヨウ素を放出する反応により行うことができる。次に，トリフルオロアセテート保護基を加水分解して，導入された１級アミンを暴露する。システインの可逆的アミノ化は，例えば，２−アミノエチル−２’−アミノエタンチオスルホネート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて行うことができる。この化合物により生成した１級アミンは，ジスルフィド還元剤により除去することができる。
【０３３７】
Ｖ．Ｂ．５．スルフヒドリル残基間のコンジュゲーション
最も一般的には，ｓＦｖおよび治療用高分子は，架橋剤の標的としてスルフヒドリルまたは１級アミンのいずれかを有し，スルフヒドリルおよび１級アミンのいずれも，天然にまたは上述のような化学的修飾の結果として存在することができる。ｓＦｖおよび治療用高分子が両方とも還元スルフヒドリルを有する場合には，マレイミド，ピリジルジスルフィド，またはα−ハロアセチル基を含むホモ二官能性架橋剤を架橋に用いることができる。そのような架橋剤の例としては，限定されないが，ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）または１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）が挙げられる。あるいは，マレイミド，ピリジルジスルフィド，またはα−ハロアセチル基の組み合わせを含むヘテロ二官能性架橋剤を架橋に用いることができる。架橋剤がチオフタルイミド誘導体またはジスルフィドジオキシド誘導体を含むことができることはあまり好ましくない。また，外来性スルフヒドリル基をｓＦｖおよび治療用高分子に導入し，酸化してジスルフィド形成により架橋させることができる。
【０３３８】
Ｖ．Ｂ．６．１級アミン間のコンジュゲーション
ｓＦｖおよび治療用高分子の両方の上の標的として１級アミンを選択する場合には，スクシンイミドエステル，イミドエステル，アシルアジド，またはイソシアネート基を含むホモ二官能性架橋剤を架橋に用いることができる。そのような架橋剤の例としては，限定されないが，ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ），ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ），ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ｓｕｌｆｏ−ＢＳＣＯＣＯＥＳ），ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ），ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ），ＢＩＳ−（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３），ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ），ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ），ジスルホスクシンイミジルタートレート（ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ），ジチオ−ビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ），エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ），エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ），ジメチルマロンイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＭ），ジメチルスクシンイミデート−２ＨＣｌ（ＤＭＳＣ），ジメチルアジピミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＡ），ジメチルピメリミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＰ），ジメチルスベリミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＳ），およびジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・２ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）が挙げられる。イミドエステルまたはスクシンイミドエステル基の組み合わせを含むヘテロ二官能性架橋剤も架橋に用いることができる。
【０３３９】
Ｖ．Ｂ．７．スルフヒドリルと１級アミンとの間のコンジュゲーション
異なる標的に対して選択的な基を組み合わせるヘテロ二官能性架橋剤が一般に好ましい。これは，選択的におよび順番に反応を行うことができ，自己会合または重合を最小限にすることができるためである。また，ヘテロ二官能性試薬は，結合すべき個々の分子に適した化学を選択することを可能とし，ｓＦｖ−治療用高分子コンジュゲートに必要な酵素活性，結合活性，シグナリングまたは他の活性の阻害を最小限にすることができる。例えば，ある酵素は活性部位に存在する１級アミンを有し，このアミンを修飾すると酵素的機能が阻害される。これらの酵素は，治療用活性に必要なアミンではなくチオール基が修飾されるような代替のコンジュゲーション化学を用いることが適当である候補である。そのような架橋剤の例としては，限定されないが，Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ），Ｎ−スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ），スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ），ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ），ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ），スクシンイミジル４−［Ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ），スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ），Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ），Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ），Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ），Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ），Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ），スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ），スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ），スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ），スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミド−カプロレート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ），４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ），およびｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ等が挙げられる。
【０３４０】
Ｖ．Ｃ．チオール修飾およびジスルフィド架橋
Ｖ．Ｃ．１．ジスルフィド架橋の形成（チオールとエルマン試薬，ＤＴＮＢとの反応）
ＤＴＮＢ［５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）］中のジスルフィドは，蛋白質およびペプチドおよび他の高分子中のチオール基と交換される。ＤＴＮＢとジスルフィド交換されて混合ジスルフィドを形成する各チオール基について，１分子の５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）が放出される。アルカリのｐＨ（ｐＨ＞７．５，好ましくはｐＨ＞８．０）において４１２ｎｍの吸収を測定して，吸光計数１．３６ｘ１０４Ｍ−１ｃｍ−１（ｐＨ８．０）を用いてＴＮＢのモル濃度を計算する。蛋白質はリン酸緩衝化食塩水溶液（ｐＨ８）中で１−１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いる。エルマン試薬は，０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８）中に４ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することができる。４μｌのエルマン試薬を各１００μｌの蛋白質溶液と混合し，４１２ｎｍの吸収を測定する。ＴＮＢの濃度は，ｐＨ８での吸光計数を用いて決定する。
【０３４１】
蛋白質は，水性緩衝液中のセファデックスＧ−２５またはＢｉｏｒａｄＰ１０のカラムでのゲル濾過により，エルマン試薬およびＴＮＢから混合ジスルフィド（蛋白質−ＳＳ−ＴＮＢ）として分離される。
【０３４２】
Ｖ．Ｃ．２．アルキル化によるチオールのブロッキング
酢酸ヨードおよびヨードアセトアミドを用いて，蛋白質上の遊離チオールと反応させて，これらが望まないジスルフィド結合を形成することを防止する。ヨードアセトアミドは，チオールに対する非常に反応性かつ選択的な試薬であり，ブロッキング剤として用いることができる。しかし，ヨードアセトアミドは，ヒスチジンのイミダゾール側鎖とゆっくり反応する。
【０３４３】
ブロッキングすべき，蛋白質，ペプチド，またはチオール基を含む高分子は，中性またはわずかにアルカリ性のｐＨ，ｐＨ６．５−１０，好ましくはｐＨ７．０−８．０の水性緩衝液中に，０．１−１０ｍｇ／ｍｌ，好ましくは１−５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。新たに溶解したヨードアセトアミドを最終濃度０．１−１０ｍＭ，好ましくは０．５−２ｍＭで加え，室温で１時間反応させる。反応は好ましくは暗所で行う。ヨードアセトアミドは，好ましくは遊離のヨウ素を含まず，これの存在は色（黄色がかった）または当業者に知られる他の方法により検出することができる。
【０３４４】
Ｖ．Ｃ．３．マレイミド化によるチオールのブロッキング
Ｎ−エチルマレイミドは，チオールと迅速に反応して，安定なチオエーテル結合を形成し，これは２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールによって還元されない。ブロックすることが望まれるチオール基を有する蛋白質，ペプチド，または高分子を水性緩衝液中にｐＨ６．５−８．０で，好ましくは６．５−７．５で溶解する。ｐＨ７−７．５のリン酸ナトリウム緩衝液（０．０１−０．１Ｍ）が好ましい。緩衝液はまた，０．０１−０．５ＭのＮａＣｌ，好ましくは０．０１−０．１ＭのＮａＣｌを含んでいてもよい。Ｎ−エチルマレイミドは，希釈後のＮ−エチルマレイミドの最終濃度が１．１−２０倍モル過剰，好ましくは２−１０倍モル過剰となる濃度で，新たに水性緩衝液中に溶解させることができる。室温で５−１２０分間，好ましくは５−３０分間反応させた後，修飾した蛋白質をセファデックスＧ−２５またはＢｉｏｒａｄＰ１０のカラムでゲル濾過することにより，過剰のＮ−エチルマレイミドから分離することができる。
【０３４５】
ＶＩ．単離および精製の方法
合成後，組成物または化合物を単離または精製，好ましくは実質的に精製することが好ましい。”単離された”とは，組成物または化合物が生物学的活性またはそのｐＩｇＲターゲティング能力を妨害する分子から分離されていることを意味する。本明細書において用いる場合，”実質的に精製された”との用語は，蛋白質コンジュゲートを製造および／または修飾するために用いられた他の成分を含まない，少なくとも約９５％，好ましくは少なくとも約９９％純粋であることを意味する。”精製された”との用語は，望ましくない要素の少なくとも約５０％から分離されている組成物または化合物を表す。ｓＦｖ５Ａを含む機能性コンジュゲートの分離および単離の手法および方法は，本明細書において非限定的例として用いられており，この手法は本発明のすべての茎結合蛋白質コンジュゲートに適用することができる。
【０３４６】
ｓＦｖおよびコンジュゲート化された物質の精製は，蛋白質，ペプチド，および高分子を精製するための当業者に知られる任意の方法を用いて行う。このような方法には，ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィーを用いるＨＰＬＣ，固定化金属アフィニティークロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，選択的沈澱，および結晶化が含まれる。
【０３４７】
クロマトグラフィー法は，未反応試薬，例えば，未反応誘導化蛋白質，ペプチド，および高分子，および未反応ｐＩｇＲ結合リガンドを除く能力のために選択される。クロマトグラフィー法はまた，ｐＩｇＲ結合リガンドに対して異なるモル比の蛋白質，ペプチド，または高分子を有するコンジュゲートを分離する能力のために選択される。このようなコンジュゲートは，しばしば，１−’ｍｅｒｓ（１：１コンジュゲート），２−’ｍｅｒｓ（２：１コンジュゲート），３−’ｍｅｒｓ（３：１コンジュゲート）等と称される。異なる’ｍｅｒｓの生成は，コンジュゲーション混合物中でインキュベートされる各分子上に存在する反応基の数の関数である。
【０３４８】
ＶＩ．Ａ．精製要素
任意の蛋白質要素を融合蛋白質中に取り込ませることができ，これは，本発明の化合物であってもよく，本発明の蛋白質コンジュゲートのメンバーであってもよく，または本発明の組成物中に含まれておりその精製および／または製造の間に用いられるものであってもよい。例えば，上記でより詳細に議論したように，蛋白質メンバーは，蛋白質精製要素，例えば，”Ｈｉｓタグ”（Ｈｉｓ６）を含んでいてもよい。Ｈｉｓタグを付けた蛋白質メンバーまたはそのコンジュゲートは，組成物を金属結合マトリクス上に固定化されたニッケルのカラムと接触させることにより，望ましくない化合物をさらに含む組成物から単離，または少なくとも部分的に精製することができる。Ｈｉｓタグ付き蛋白質のメンバーまたはコンジュゲートはニッケルカラムに結合し，したがって，カラム上に残存する。望ましくない化合物はカラムを通過する。上でより詳細に説明したように，種々の方法を用いて，そのような工程の後に，蛋白質メンバーまたはコンジュゲートから蛋白質精製要素を除去することができる。
【０３４９】
ポリペプチドに対する翻訳後修飾は，インビトロまたはインビボで作成することができる。種々の化学的処理を，純粋なまたは半純粋な蛋白質のインビトロ修飾に用いることができる。一方，インビボ修飾は，発現系および宿主細胞の選択の結果生ずる。翻訳後修飾には，非限定的例として，グリコシル化，切断，リン酸化，架橋，ジスルフィド架橋の形成または還元等が含まれる。
【０３５０】
ＶＩ．Ｂ．アフィニティークロマトグラフィー
ｐＩｇＲに結合するｓＦｖ分子が結合するエピトープと同一または類似するｐＩｇＲ由来アミノ酸配列を含むポリペプチドは，既知の方法にしたがって製造することができる。エピトープ含有ポリペプチドを，チオールセファロースに共有結合させる（活性化チオセファロース４Ｂは，チオール基を含み，これにペプチドが共有結合することができる）。チオール含有ペプチドをエルマン試薬（ＤＴＮＢ）と反応させて，混合ジスルフィドを形成する。ＴＮＢ−ペプチドは，ゲルサイジングカラムクロマトグラフィーにより２−ニトロ−５−チオ安息香酸から分離する。ＴＮＢ−ペプチドをチオールセファロースと反応させて，樹脂に共有結合したペプチドの混合ジスルフィドを形成する。
【０３５１】
別の例として，マレイミド基をペプチドのアミノまたはカルボキシル末端に配置する。ペプチド上のマレイミド基は，チオールセファロースと反応して，チオエーテル結合を形成する。あるいは，エピトープ含有ポリペプチドをポリペプチド上に存在する１級アミンと反応する活性化支持体と共有結合させる。そのような支持体としては，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等の官能基を有する架橋アガロースまたはアクリル酸マトリクスが挙げられる。これらの活性化された支持体には，Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ），Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ），Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＮＨＳ−活性化セファロース４ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。ポリペプチドの固定化はまた，エポキシ活性化マトリクス，例えば，エポキシ−活性化セファロース６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）または臭化シアン−活性化マトリクス，例えばＣｎＢｒ−活性化セファロース４ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行ってもよい。
【０３５２】
ペプチド−セファロース樹脂を用いて，ｓＦｖ，または抗体により認識されるｐＩｇＲ中のエピトープに結合する他の抗体誘導体またはそのような抗体を含むコンジュゲートを結合させる。ｐＩｇＲ中のｓＦｖが結合するエピトープに依存して，アミノ酸配列を修飾して，アミノ酸配列にチオールセファロースに共有結合させることができる残基を含むエピトープを提供することができる。
【０３５３】
ｓＦｖＳおよびその誘導体（ｓＦｖ５ＡＦおよびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ）の場合，ｐＩｇＲ中のエピトープのアミノ酸配列は知られている。米国特許出願（代理人書類番号１８０６２Ｅ−０００９００ＵＳ，表題”Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，Ｎｏｎ−Ｓｔａｌｋ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｐＩｇＲ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”，２００１年３月２６日出願，Ｍｏｓｔｏｖ，ｅｔ  ａｌ．）を参照。アミノ酸配列は，最小でＤＰＲＬＦである。最大のエピトープアミノ酸配列は，ヒトにおいてはＱＤＰＲＬＦおよびＬＤＰＲＬＦであり，このことは，エピトープ配列中の最もアミノ末端側の残基はｓＦｖ５の結合には必要ではないことを示唆する。
【０３５４】
ｓＦｖまたはコンジュゲートをカラムに適用した後，未反応物質をカラムから洗浄する。ｓＦｖ’ｓ，またはｓＦｖ’ｓを含むコンジュゲートは，ペプチドとの特異的相互作用によりカラムに結合したままである。特異的に結合したｓＦｖまたはコンジュゲートは低いｐＨ（ｐＨ３−４）で短時間（好ましくは１５分未満，好ましくは５分未満）処理することにより，遊離ペプチドをカラムに通すことにより，または共有結合したペプチドをＤＴＴまたはメルカプトエタノールで還元することにより，カラムから分離する。遊離ペプチドを用いてｓＦｖまたはコンジュゲートを溶出させる場合，ペプチドはｓＦｖが結合するエピトープのみを含むことが必要であり，または樹脂にコンジュゲートするために用いたものと同じペプチド配列（システインなし）を含んでいてもよい。
【０３５５】
チオールセファロース樹脂へのマレイミドコンジュゲート化ペプチドについては，還元によってはペプチド：ｓＦｖまたはコンジュゲート複合体は放出されない。したがって，遊離ペプチドまたは低ｐＨによる溶出を用いることができる。
【０３５６】
エピトープ中の配列は，天然のエピトープと比較して相互作用が弱められるように改変することができる。配列中の異なるアミノ酸を置換することにより，より弱い結合のペプチド配列を同定することができる。固定化ペプチドのチオールセファロースへの弱い結合を用いて，ｓＦｖおよびコンジュゲートをカラムにある程度保持させて，未結合成分がカラムに結合せずに通過するようにする。したがって，溶出のために厳しい条件を必要とせず，溶出のために遊離ペプチドを必要としない。Ｔｒｉｂｂｉｃｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１３９：１５５−１６６，１９９１）は，類似の方法を記載する。エピトープについてアラニンスキャンを行って，結合特異性および強度のほとんどを与えるアミノ酸側鎖を同定することにより，弱く結合するペプチドエピトープを同定する。
【０３５７】
ペプチドエピトープは，蛋白質の結合領域のすべてを探査するよう設計された１組のペプチド，すなわちゼネラルネットを用いて同定する。蛋白質と相同の規定された長さの重複するペプチドをすべて合成する。最初の試行では，オフセットは，１−５残基，好ましくは３−４残基に設定する。入れ子の組においては，ペプチドは，エピトープを２つのペプチドに’分割する’ことによりこれを逃すことがないように，十分な長さであるべきである。ペプチドは，好ましくは８−１２アミノ酸の長さ，好ましくは１０−１５アミノ酸の長さであるべきである。エピトープの境界は，種々のサイズの一連の可動ウインドウにより蛋白質の線形配列を調べるプロセスを用いて，より精密に同定することができる−ウインドウネット。エピトープにおける各アミノ酸側鎖の寄与度は，エピトープ中の各アミノ酸位置を他の１９アミノ酸のすべてで置換し，ｓＦｖのペプチドの結合特性に及ぼす影響を判定することにより評価することができる−置換ネット。そのような戦略は，Ｇｅｙｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９０７１５，１９８６），Ｇｅｙｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０２：２５９−２７４，１９８７），Ｔｒｉｂｂｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３９：１５５−１６６，１９９１），およびＧｅｙｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．１：３２−４１，１９８８）により記載されている。
【０３５８】
ＶＩ．Ｃ．イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーにおいては，荷電を有するカラム物質により荷電した物質を分離する。カチオン交換においては，固相は負の電荷を有するが，アニオン交換においては，固定相は正の電荷を有する。カラムの固相はゲルマトリクスに共有結合したイオン基から構成される。サンプルをカラムに通す前に，カラム緩衝液中に存在する低い濃度のカウンターイオンにより固相中におけるイオン荷電を補う。サンプルをカラムに加えると，弱く結合したカラム緩衝液中のカウンターイオンとサンプル中に存在するより強く結合したイオンとの交換が生ずる。結合した分子は，ｐＨまたはイオン強度を変更した溶液をカラムに通すまで，カラムから溶出されない。所望の場合には，分離の程度は勾配の傾斜を変更することにより改良することができる。目的とする化合物が選択された条件下でカラムに結合しない場合には，出発緩衝液の濃度および／またはｐＨ値を変更することができる。
【０３５９】
ポリペプチドのイオンクロマトグラフィーは，ポリペプチドが多価アニオンまたはカチオンであるために生ずる。強塩基性条件下では，アミノ基が遊離塩基でありカルボキシ基が解離しているため，ポリペプチドはアニオンである。強酸性条件下では，カルボキシ基の解離およびアミノ基のプロトン化が抑制される結果，ポリペプチドはカチオンである。ポリペプチドの正味電荷のため，塩濃度を低く保つ限り，これらを対応する荷電した固定相に結合させることが可能である。
【０３６０】
クロマトグラフィーに用いるために，種々のイオン交換樹脂，セルロース誘導体および高極性ゲルが利用可能である。イオン交換物質は一般に，カチオン性またはアニオン性基を含む水不溶性ポリマーである。カチオン交換マトリクスの非限定的例は，アニオン性官能基，例えば，−ＳＯ３−，−ＯＰＯ３−および−ＣＯＯ−を有し，アニオン交換マトリクスは，一般式−ＮＨＲ＋＋および−ＮＲ＋＋＋を有するカチオン性３級および４級アンモニウムを含んでいてもよい。蛋白質は，付随するカウンターイオンとの交換により結合するようになる。
【０３６１】
イオン交換クロマトグラフィーの概説については，Ｂｏｌｌａｇ，Ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ３６：１１−２２，１９９４；Ｈｏｌｔｈｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７：２４３−９９，１９９５；およびＫｅｎｔ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１５：１９−２２，１９９９を参照されたい。
【０３６２】
ＶＩ．Ｄ．疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるポリペプチドおよび他の化合物の分離は，溶媒に提示される化合物の疎水性に基づく。ＨＩＣは，逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）と類似のメカニズムにより，ただし水性緩衝液中の穏やかな逆塩勾配溶出条件下で化合物を分離する。ＨＩＣにおいては有機溶媒を用いないため，ポリペプチドおよび他の化合物の生物学的活性はおそらく保持されるであろう。
【０３６３】
ＨＩＣは，蛋白質が非共有結合性の疎水性結合を介して固体マトリクスに順番に吸着および脱着させることを含む。一般に，高塩濃度の緩衝液中のサンプル分子をＨＩＣカラムに付加する。緩衝液中の塩は水分子と相互作用して溶液中の分子の溶媒和物を減少させ，このことにより，サンプル分子中の疎水性領域を暴露させ，その結果これはＨＩＣカラムに吸着される。化合物がより疎水性であればあるほど，結合を促進するために必要な塩は少ない。減少する塩濃度の勾配を用いて，カラムからサンプルを溶出させることができる。イオン強度が低下するにつれて，分子の親水性領域の暴露が増加し，化合物は疎水性の増加の順番でカラムから溶出される。また，サンプルの溶出は，穏和な有機緩和剤または界面活性剤を溶出緩衝液に加えることによっても行うことができる。化合物を分離するよう機能することができる，ＨＩＣに固定化される官能基の非限定的例には，オクチル基，例えば，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のオクチルセファロースＣＬ４Ｂ媒体中の基，およびプロピル基，例えば，Ｂａｋｅｒ社のハイプロピル媒体中の基が含まれる。アルコキシ，ブチル，およびイソアミル官能基樹脂を用いてもよい。
【０３６４】
親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）は，疎水性またはほぼ有機の可動性相を中性の親水性固定相に通し，溶質を親水性の高い順番に溶出させることにより，化合物を分離する。例えば，中性ペプチドについては，１５ｍＭギ酸アンモニウムおよび逆有機条件を用いることができる。高度に荷電した分子を脱着させるためには，イオン抑制のために少量（例えば１０ｍＭ）の塩，および微量の過塩素酸塩または硫酸塩勾配（高い有機溶媒濃度中で）を必要とする。ＨＩＬＩＣは，ホスホペプチド，粗抽出物，ペプチド消化物，膜蛋白質，炭水化物，ヒストン，オリゴヌクレオチドおよびそれらのアンチセンス類似体，および極性脂質について首尾よく用いられている。
【０３６５】
疎水性−相互作用クロマトグラフィーにおいては，比較的疎水性の高い化合物は，より親水性の化合物と比較してカラム上により長く保持される。逆に，親水性−相互作用クロマトグラフィーを用いると，親水性化合物は，より疎水性の化合物と比較してカラム上により長く保持される。
【０３６６】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の概説および使用例については，Ｇｈｏｓｈ，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ９２３（１−２）：５９−６４，２００１；Ｑｕｅｉｒｏｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８７（２）：１４３−５９，２００１；Ａｒａｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３（２）：１５１−７２，１９９１；ｅｌＲａｓｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ９：４４７−９４，１９９０；Ｋａｔｏ，Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｄｖ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ２６：９７１１５，１９８７；Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，ｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｎｏｎ−ｃｈａｒｇｅｄ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｇｅｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｎａｌ  ２７：８９−１０８，１９８１；Ｏｃｈｏａ，Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６０（１）：１−１５，１９７８；およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ１７６−１７９（１９８８）を参照されたい。
【０３６７】
親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）の概説および使用例については，Ｚｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｎｇ  ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  ５４８（１−２）：１３−２４，１９９１；Ｏｌｓｅｎ，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｕｓｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｎｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃｏｌｕｍｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．９１３（１−２）：１１３−２２，２００１；Ｏｌｓｅｎ，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｕｓｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｎｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃｏｌｕｍｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ，Ｊ  ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ．９１３（１−２）：１１３−２２，２００１；およびＡｌｐｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．６７６（１）：１９１−２２，１９９４；およびＡｌｐｅｒｔ，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｏｌａｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４９９：１７７−９６，１９９０を参照されたい。
【０３６８】
ＶＩ．Ｅ．純度および活性のアッセイ
精製プロセスの間またはその後に，精製している組成物，複合体または化合物の量および生物学的活性をモニターすることがしばしば望ましい。組成物または化合物の量は，そのエピトープに向けられた抗体を用いることにより検出することができる。あるいは，本発明の組成物または化合物は，それによって蛋白質コンジュゲートをモニターすることができる検出可能なポリペプチドを含むことができる。
【０３６９】
本発明の組成物または化合物の生物学的活性のいくつかは，その中に含まれる生物学的に活性なポリペプチドの性質により様々であり，親蛋白質の生物学的活性に特異的なアッセイが用いられる。組成物または化合物は，ｐＩｇＲに結合する能力および種々の形の細胞輸送を行う能力についてもアッセイする。これらのおよびｐＩｇＲに関連する性質のアッセイは，本明細書に記載されており，本発明の任意の組成物または化合物に適用可能である。
【０３７０】
純度は，任意の適当な方法，例えば，ＨＰＬＣ分析および蛋白質コンジュゲートを含む調製物のアリコートを電気泳動したゲルを染色することにより評価することができる。当業者には，所定の用途のためにはどの程度の単離または精製が適当であるかがわかるであろう。例えば，（少なくとも米国においては）生物製剤は，例えば化合物の純度の基準を満たす必要はない。
【０３７１】
ＶＩＩ．多価および多特異性複合体および化合物
本発明の１つの観点においては，多価および多特異性複合体および化合物が包含される。”多価”とは，複合体または化合物が，同じターゲットに向けられた２またはそれ以上のターゲティング要素を有することを意味する。２またはそれ以上のターゲティング要素は，同一であってもよいが，その必要はない。”多特異性”とは，複合体または化合物が，第１のターゲットに向けられた少なくとも１つのターゲティング要素，および第２のターゲットに向けられた第２のターゲティング要素を有することを意味する。種々の方法，例えば，限定されないが，以下のものを用いて，本発明の多価および多特異性複合体および化合物を製造することができる。
【０３７２】
ＶＩＩ．Ａ．一本鎖抗体
ジアボディーは，ダイマー性抗体フラグメントである（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ”：ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９３  Ｊｕｌ  １５；９０（１４）：６４４４−８）。各ポリペプチドにおいて，重鎖可変ドメインＶ（Ｈ）は軽鎖可変ドメインＶ（Ｌ）と連結しているが，一本鎖Ｆｖフラグメントとは異なり，各抗原結合部位は２つの異なるポリペプチドからの１つのＶ（Ｈ）と１つのＶ（Ｌ）ドメインとの対形成により形成されている。したがって，ジアボディーは，２つの抗原−結合部位を有し，二重特異性または２価であることができる（Ｐｅｒｉｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｄｉａｂｏｄｙ，ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９９４  Ｄｅｃ１５；２（１２）：１２１７−２６）。
【０３７３】
ＶＩＩ．Ａ．１ｓＦｖ抗体中のリンカー長さを変更することによるｓＦｖのマルチマー化
Ｖ−ドメイン間のリンカーの長さは，一本鎖Ｆｖ抗体フラグメント（ｓＦｖ’ｓ）のサイズ，フレキシビリティーおよび結合価に影響を及ぼす。Ｖ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）ドメインが少なくとも１２アミノ酸残基のポリペプチドリンカーにより連結される場合には，ｓＦｖ分子は主としてモノマーである。３−１２アミノ酸残基のリンカーを有するｓＦｖ分子は，モノマー，すなわちＶ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）ドメインが分子内で対形成している一本鎖Ｆｖの形にフォールディングされにくい。しかし，モノマーを容易に形成しないｓＦｖは，第２のｓＦｖ分子と相互作用して，”ジアボディー”を形成することができる。ジアボディーは二重特異性であってもよく（Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｖｉｄｉｔｙ”，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ，４３２（１９９８），ｐｐ．４５−４９），または２価であってもよい。２価のジアボディーは，互いに同一であるかまたは実質的に同じ２つのｓＦｖから形成され，これは同じターゲット分子に向けられた２つの結合［Ｖ（Ｈ）：：Ｖ（Ｌ）］領域を有する。二重特異性ジアボディーは，互いに異なる２つのｓＦｖから形成され，それぞれが異なるターゲット分子に向けられた２つの結合［Ｖ（Ｈ）：：Ｖ（Ｌ）］領域を有する。
【０３７４】
リンカー長さを３アミノ酸残基未満に減少させると，ｓＦｖ分子が会合して，リンカー長さ，組成物およびＶ−ドメインの配向に応じて，マルチマー（例えば，トリマー（トリアボディーとしても知られる），テトラマー（テトラボディーとしても知られる）等）を形成するよう強制することができる（例えば，米国特許５，８３７，２４２を参照）。ｓＦｖマルチマーの結合価が増加すると，よりアビディティーが高くなるかもしれない（低いオフレート）（Ｈｕｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｓｃＦｖ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ；ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９  Ｄｅｃ１０；２３１（１−２）：１７７−８９；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ，ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１  Ｆｅｂ１；２４８（１−２）：４７−６６；Ｈｕｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｓｃＦｖ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ；ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９  Ｄｅｃ  １０；２３１（１−２）：１７７−８９）。
【０３７５】
１０−残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２または５−残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）リンカーを有するか，またはリンカーを有しないＶ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）ドメインを有する一本鎖抗体が調べられている。１つの報告（Ｋｏｒｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＮＣ１０  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｖｅ−  ａｎｄ  ｔｅｎ−ｒｅｓｉｄｕｅ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ｆｏｒｍ  ｄｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｗｉｔｈ  ｚｅｒｏ−ｒｅｓｉｄｕｅ  ｌｉｎｋｅｒ  ａ  ｔｒｉｍｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：４２３−４３３，１９９７）においては，ゼロ残基リンカーｓＦｖは３つの活性抗原結合部位を有するトリマーを形成した。ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー実験は，ｓＦｖｓをセンサー表面に固定化したとき，１０−および５−残基リンカーｓＦｖダイマーおよびゼロ残基ライナーｓＦｖトリマーのいずれにおいても，それぞれの個々の抗原結合部位のアフィニティーは本質的に同じであることを示した。しかし，ｓＦｖを被検物質として用いた場合，ダイマーおよびトリマーｓＦｖは，多価ｓＦｖの結合のアビディティーによる結合アフィニティーの見かけ上の増加を示した。
【０３７６】
一般に，Ｖ（Ｈ）とＶ（Ｌ）ドメインとの間のアミノ酸残基の数が０−１５であるｓＦｖ分子は，モノマーを形成しにくく，あるタイプのマルチマーを形成しやすい。リンカーの長さが１または２アミノ酸である場合，トリマーおよび／または他のマルチマーが形成されやすい。リンカーの長さが３−１２アミノ酸である場合には，ダイマーが形成されやすいが，１２またはそれ以上のアミノ酸のリンカーを有するｓＦｖは，モノマーを形成しやすい。これらの規則は絶対ではないが，当業者は，種々の長さのリンカーを有するｓＦｖを製造して分析し，モノマーおよび種々のマルチマーの存在を試験することができる。
【０３７７】
より高いマルチマーのｓＦｖ分子は，多価であってもよく，多特異性であってもよく，またはその両方であってもよい（例えば，Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｖｉｄｉｔｙ”，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ，４３２（１９９８），ｐｐ．４５−４９を参照）。ｓＦｖのより高いマルチマーの非限定的例としてトリアボディーを用いると，ｓＦｖ分子の３つの可能な組み合わせがあることがわかる。第１に，トリアボディーは，それぞれが同じターゲット分子に向けられた３つの同一のまたは実質的に同一のｓＦｖ分子を含み，したがって，３価のトリアボディーであることができる。第２に，トリアボディーは，それぞれが異なるターゲット分子に向けられた３つの異なるｓＦｖ分子を含み，したがって，三重特異性トリアボディーであることができる。第３に，トリアボディーは，２つのタイプのｓＦｖ分子を含み，その１組（ｓＦｖ１ａおよびｓＦｖ１ｂ）はターゲット分子＃１に向けられており，一方，トリアボディー中の第３のｓＦｖはターゲット分子＃２に向けられている。後者のトリアボディーは，ターゲット分子＃１およびターゲット分子＃２の両方に特異的に結合するために二重特異性であり，かつ，ターゲット分子＃１に向けられた２つの結合領域を有するために２価である。
【０３７８】
ＶＩＩ．Ａ．３．ジスルフィド安定化一本鎖抗体（ｄｓＦｖ）
ジスルフィド−安定化ｓＦｖ（ｄｓＦｖ）は，不安定な可変重鎖Ｖ（Ｈ）および可変軽鎖Ｖ（Ｌ）のヘテロダイマーが，ｓＦｖの結合活性を認めうるほどに変更させない特定の部位で遺伝子工学処理された，ジスルフィド結合により安定化されている抗体の組換えＦｖフラグメントである。そのような部位は，Ｖ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）の構造的に保存されているフレームワーク位置の間に存在する。保存的フレームワーク領域中の位置を用いて，多くの異なるｓＦｖをジスルフィド安定化することができるはずである（Ｒｅｉｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｂｙ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｉｎｔｏ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９４  Ｍａｙ  １０；３３（１８）：５４５１−９）。ｓＦｖ分子がモノマーまたはマルチマーを形成する傾向に影響を及ぼすことに加えて，その中にＣｙｓ残基を導入したｓＦｖ分子は，場合によっては，異なる製造特性および安定特性を有するかもしれない。
【０３７９】
Ｆｖ分子の安定性を改良するために，重鎖および軽鎖可変ドメインの両方の保存フレームワーク領域中のドメイン間ジスルフィド結合の形成に適合する位置にシステイン残基を導入する。ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は，対応する一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）より，加熱または尿素処理による変性に対する耐性が高いであろう。さらに，ｄｓＦｖの収率はｓＦｖより高いであろう（Ｗｅｂｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−Ｔａｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎａｌｏｇ，ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ  １９９５  Ｍａｒ；３２（４）：２４９−５８；Ｒｅｉｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄｓ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ１９９４Ｍａｙ１５；５４（１０）：２７１４−８）。
【０３８０】
分子グラフィックモデリングを用いて，ｓＦｖ分子のフレームワーク領域の鎖間ジスルフィド結合を導入する部位を同定する。ｓＦｖ分子をコードするリーディングフレーム中に，任意の適当な方法，例えば，ＰＣＲ媒介性突然変異誘発を用いて，部位のＣｙｓ修飾をもたらす変異を導入する。ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）を発現させ，その結合活性について試験する（Ｌｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖ１−ｌｉｎｋｅｒ−Ｖｈ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１９９５  Ｏｃｔ；１１８（４）：８２５−３１）。
【０３８１】
ＶＩＩ．Ｂ．多特異性および多価抗体フラグメントの製造
ＶＩＩ．Ｂ．１．組換えＤＮＡによる製造
多価抗体誘導体の製造に適した技術としては，Ｅ．ｃｏｌｉで発現させるか，モノクローナル抗体の限定蛋白質分解により単離されたＦａｂ’フラグメントから組み立てたＦ（ａｂ’）２；ロイシンジッパーを用いて組み立てたＦ（ａｂ’）２；およびジアボディーが挙げられる（Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  １９９５  Ｏｃｔ；４（５）：４６３−７０）。
【０３８２】
ジアボディーを構築する１つの方法は，リフォールディング系を用いる（Ｔａｋｅｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｍａｌｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２０００  Ａｕｇ；１３（８）：５８３−８）。多価ジスルフィド安定化ｓＦｖ（ｄｓＦｖ）は，種々の方法，例えば，限定されないが，ファージディスプレイにより製造することができる（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９５  Ｍａｙ１１；１８２（１）：４１−５０）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｙｉｅｌｄｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｓＦｖ’ｓ  ｍａｙ  ｂｅ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｏｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＣＣ４９  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔｒａｃｔｓ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｅｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）２０００Ｍａｙ；１２７（５）：８２９−３６；Ｐｏｗｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ−Ｆｃ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５１（１−２）：１２３−３５，２００１）。
【０３８３】
２つの異なる抗原結合部位を有するか（二重特異性ジアボディー），または同じまたは実質的に同じ２つの結合部位を有する（２価ジアボディー）ジアボディー分子のレパートリーを作成することができるクローニング戦略が知られている（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅｄｉａｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９６  Ｓｅｐ；１４（９）：１１４９−５４；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９７  Ｊｕｎ；３（２）：８３−１０５）；Ｐｏｌｊａｋ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９９４  Ｄｅｃ  １５；２（１２）：１１２１−３；および米国特許６，０７１，５１５）。
【０３８４】
ファージディスプレイ２価ジアボディー，または多コピーのｓＦｖモノマーを用いて，ドメイン６，ｐＩｇＲ茎，またはｐＩｇＲの任意の他の部分または領域に結合する多価化合物および複合体を同定する。ファージディスプレイ２価ジアボディー，または多コピーのｓＦｖモノマーを用いて，ファージディスプレイモノマーｓＦｖより効率よくエンドサイトーシスを行う多価の化合物および複合体を同定する。細胞質内からのファージの回収率を，適用したファージタイターの関数として測定することを用いて，ファージディスプレイ多価ｓＦｖの相対的エンドサイトーシス特性を測定することができる（Ｂｅｃｅｒｒｉｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｗａｒｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９９  Ｆｅｂ  １６；２５５（２）：３８６−９３）。ファージディスプレイｓＦｖ分子，およびトランスサイトーシス輸送および／または傍細胞輸送特性を付与する他のポリペプチド配列を同定する方法は，米国特許出願６０／２６６，１８２（代理人書類番号０５７２２０．０７０１，表題”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．，およびＳｈｅｒｉｄａｎ，ＰｈｉｌｉｐＬ．，２００１年２月２日出願）に記載されている。これは，トランスサイトーシス輸送およびトランス上皮細胞分子に向けられたリガンドおよびターゲティング要素の同定および使用に関する。
【０３８５】
Ｔ−細胞レセプターに由来する多価および／または多特異性化合物および成分も製造することができる。例えば，Ｇｏｌｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ，ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ａｌｐｈａ  ｂｅｔａ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９７  Ａｕｇ  ７；２０６（１−２）：１６３−９を参照。
【０３８６】
ＶＩＩ．Ｂ．２．一本鎖抗体の化学的処理による製造
遺伝子工学的に挿入されたシステインを含むｓＦｖ分子を，配列のアミノ末端またはカルボキシ末端，またはｓＦｖの表面の抗原を認識する能力を妨害しない場所のいずれかで置換することにより，図６の反応３および４を用いて二重特異性ｓＦｖを形成することができる。ｐＩｇＲを認識するｓＦｖは，システイン残基を含むよう遺伝子工学的に改変することができる。そのシステインと大モル過剰のビス−マレイミド化合物を反応させることにより，追加の反応性マレイミド基を有する１つのビス−マレイミド−ｓＦｖコンジュゲートが形成される。コンジュゲートを未反応ビス−マレイミドから精製することにより，コンジュゲートの純粋なサンプルを得ることができる。このコンジュゲートは，第２の反応において，異なる認識特異性を有する別のｓＦｖと反応させることができる。この別のｓＦｖもまたシステインを含み，これはアミノ末端またはカルボキシ末端にあってもよく，またはｓＦｖの表面にあってもよい。いずれのタイプのｓＦｖにおいても，アミノまたはカルボキシ末端のシステインは，ｓＦｖの表面とシステインとの間に十分な距離を提供して，化学反応性を容易にし，２つのコンジュゲート化されたｓＦｖ成分にフレキシビリティーを持たせるスペーサーを用いて遺伝子的に結合させてもよい。いずれのｓＦｖもいずれの向きであってもよい。すなわち，ＶＬ−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−リンカー−ＶＬ。いずれのｓＦｖも，アミノまたはカルボキシ末端またはｓＦｖの表面のスペーサー上（またはスペーサー配列中）にシステインを含んでいてもよい。スペーサーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘからなることができ，ここで，ｘは１−５，好ましくは２または３である。他のスペーサーを用いてもよいが，スペーサーは免疫原性であってはならない。
【０３８７】
還元可能なジスルフィド結合を，異なる認識特性を有する２つのｓＦｖ分子の間に配置することができる。図７は，２−イミノチオラン，すなわちアミノ基（主としてリジン，および蛋白質およびペプチドのα−アミノ基）と反応する試薬で誘導化されている１つのｓＦｖと，やはりアミノ基と反応する試薬であるＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）で誘導化されている１つのｓＦｖを用いた結合を図解する。種々の他の架橋剤，例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９４カタログに記載されるものを用いてもよい。図８は，２つの異なるｓＦｖ分子間にジスルフィド結合を形成する別の方法を図解する。１つのｓＦｖをＳＰＤＰで修飾する。過剰の試薬を分離した後，システイン置換またはシステインを含むスペーサーの付加によりその表面にシステインが付加されているｓＦｖを加えることにより，ジスルフィド交換を行うことができる。
【０３８８】
ＶＩＩ．Ｃ．全抗体の化学的処理による多特異性および多価抗体フラグメントの製造
ＶＩＩ．Ｃ．１．Ｆ（ａｂ’）２
二重特異性抗体から作成されるＦ（ａｂ’）２フラグメントは，慣用の方法を用いて製造することができる。Ｉｇ分子の酵素的切断は，個々の分子の特性によって異なる。例えば，ペプシンは，Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの製造に常に成功するわけではなく，しばしば，許容しうる収率を得るために消化条件を最適化する必要がある。Ｆ（ａｂ’）２の製造には，ペプシンの他，フィシンを用いることができる。
【０３８９】
ＶＩＩ．Ｃ．２．Ｆａｂ’−ＳＨ
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは，２価分子のＨ鎖間のジスルフィド結合により一緒に保持されている。穏やかな還元により，１価のＦａｂ’フラグメントを放出させることができる。この目的のためには，２−メルカプトエチルアミンおよび他の還元剤を用いる。
【０３９０】
ＶＩＩ．Ｃ．３．Ｆａｂ
Ｆａｂフラグメントは，パパイン消化により製造することができる１価の抗体フラグメントである。慣用の方法は，酵素を容易に除去し，消化を終了させることができるよう，樹脂に固定化したパパインを用いる。Ｆａｂフラグメントは，Ｆ（ａｂ’）２のＨ鎖の間に存在するジスルフィド結合を有しない。
【０３９１】
ＶＩＩ．Ｃ．２．４．Ｆａｂ二重特異性物質
無傷の抗体を１ｍＭシステインの存在下でペプシン消化またはフィシン消化することにより形成することができるＦ（ａｂ’）２分子を還元することにより，Ｆａｂ’−ＳＨが得られる。Ｆａｂ’−ＳＨは，エルマン試薬を用いて混合ジスルフィドに変換することができる。次に，異なる特異性を有するＦａｂ’−ＳＨをジスルフィド交換において用いて，２つの異なる抗原に向けられた組み合わせ部位を含むＦａｂ二重特異性物質を形成する。
【０３９２】
ＶＩＩ．Ｃ．
Ｆａｂ’ｓを結合させる別の方法は，非還元性共有結合を用いる。Ｆａｂ’−ＳＨパートナーの一方を二官能性試薬，例えば２つの反応性マレイミド基を有する試薬（ビス−マレイミド化合物）で修飾する。マレイミド試薬がＦａｂ−ＳＨよりモル大過剰であれば，ビスマレイミド上のマレイミド基のみが反応して，チオエーテル結合を形成する。したがって，誘導体，例えばＦａｂ’−Ｓ−マレイミド−スペーサー−マレイミド基が単離される。この誘導体は，ほぼ等モル量の別のＦａｂ’−ＳＨ（異なる抗原認識特異性を有する）と反応して，別のチオエーテル結合を形成することができる。この一連の反応の生成物は，チオエーテル結合により一緒に保持された２つの異なる認識特異性を有する２価分子である。スペーサーは，ビスマレイミドヘキサンに見られるように比較的短くてもよく，または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３に見られるようにより長くより親水性であってもよい。
【０３９３】
ＶＩＩ．Ｄ．多価および多特異性融合蛋白質
ＶＩＩ．Ｄ．１．ｓＦｖ配列の反復を含む融合蛋白質
本発明の融合蛋白質の結合価を増加させるために，［Ｖ（Ｈ）−Ｖ（Ｌ）］ドメインをコードするＤＮＡ配列の１またはそれ以上のタンデム反復を，融合蛋白質をコードするキメラリーディングフレーム中に導入することができる。例えば，ダイマーの場合，２コピーの各抗体可変ドメイン，Ｖ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）を一本鎖構築物中で組み合わせる（例えば，米国特許６，１２１，４２４を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた後，好ましくは可溶性ペリプラズム抽出物から分子内でフォールディングされた２価ジアボディーを調製する。２つの別々のジアボディーのＶ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）ドメインの会合により形成される分子間テトラボディーに対する分子内ジアボディーの相対的量は，鎖の途中のリンカーの長さおよび細菌の成長条件に依存する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｎｄｅｍ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９  Ｏｃｔ  １５；２９３（１）：４１−５６）。
【０３９４】
４価一本鎖抗体，例えば｛［Ｖ（Ｈ）−Ｖ（Ｌ）］２｝２（ここで，各Ｖ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）は一緒になってｓＦｖを形成する）を含む融合蛋白質は，類似の戦略を用いて製造することができる（Ｂｏｏｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  Ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＣ４９：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０，６９６４−６９７１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，２０００）。また，米国特許５，８６９，６２０；５，８７７，２９１；および５，８９２，０２０も参照。
【０３９５】
一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）フラグメントを含む融合蛋白質においては，Ｖ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）ドメインの互いの方向，および他の融合蛋白質要素に対する方向は，ｓＦｖ部分の発現および活性に影響を及ぼす。（Ｌｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｌ−ｌｉｎｋｅｒ−Ｖｈ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１９９５  Ｏｃｔ；１１８（４）：８２５−３１）。
【０３９６】
ＶＩＩ．Ｄ．２．他のターゲティング要素を含む融合蛋白質
多価融合蛋白質は他のポリペプチド性ターゲティング要素を含むことができる。例えば，融合蛋白質は，ｐＩｇＲおよび／またはｐＩｇＲ茎分子に結合する，細菌蛋白質に由来するポリペプチドを含むことができる。ｐＩｇＲおよび／またはｐＩｇＲ茎分子に向けられたモノクローナル抗体の誘導体，例えば，相補性決定配列（ＣＤＲ），（Ｆａｂ）２分子等を製造し，融合蛋白質中に取り込ませることができる。
【０３９７】
ＶＩＩ．Ｅ．マルチマー化の別の方法
ＶＩＩ．Ｅ．１．化学結合
化学的に結合したマルチマーを作成するために，天然に存在するかまたはモノマー分子中に人工的に導入されたシステインを他の反応性アミノ酸残基と反応させることができる。Ｃｙｓ残基の場合，分子間ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ）結合を形成させてモノマーを一緒に結合させることができる。そのような分子間ジスルフィド架橋は，還元剤，例えば，ＤＴＴを加えることにより除去または還元することができる。化学的架橋剤，例えば，二官能性リンカーを用いて，モノマー間に化学結合を形成することができる。
【０３９８】
すなわち，非限定的例として，多価化合物は，それぞれがターゲティング要素を含む２つの１価分子を化学的に結合させることにより製造することができる。次に，多価コンジュゲートを生物活性分子と共有結合的または非共有結合的に会合させることができる。別の例として，多価生物活性化合物は，２つの１価生物活性分子（すなわち，生物活性成分および１個のターゲティング要素を含む分子）を互いに化学的に複合体化させることにより製造することができる。これは，生物活性分子とターゲティング要素との比率を調節することができる１つの方法である。前者の場合，コンジュゲートは２つのターゲティング要素および１つの生物活性成分を有し，後者のコンジュゲートは２つのターゲティング要素および２つの生物活性成分を含む。
【０３９９】
ＶＩＩ．Ｅ．２．ロイシンジッパー
多くの真核生物転写因子は”ロイシンジッパー”と称されるダイマー化モチーフを含む。これらのロイシンジッパー蛋白質は，ロイシンジッパーモチーフを含む他の蛋白質とホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーを形成する。ロイシンジッパーの存在または導入によりダイマー化する蛋白質は，”ロイシンジップされた”と称される。Ｒｉｅｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０００；３２８：２８２９６；Ｈｏｙｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ａ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２０００  Ａｕｇ  １１；４７９（１−２）：１５−８；Ｂｅｈｎｃｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨ）−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＨ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ａ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００  Ｊｕｎ  ２；２７５（２２）：１７０００−７；Ｂｕｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｍｅｒｓ，ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １９９０  Ｆｅｂ；６（２）：３６−４０；Ｒｉｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ：ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃ−Ｊｕｎ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｉｓ  ａ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ，Ｅｒｒａｔｕｍｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９６  Ｓｅｐ；９（９）：８３１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ１９９６  Ｆｅｂ；９（２）：２２３−３０；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄｏｒｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬｅｘＡ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｊｕｎ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ：ａ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｔｕｄｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１  Ｏｃｔ  ８；３０（４０）：９６５７−６４；Ｄｍｉｔｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｅｗ  ＬｅｘＡ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９９８  Ｊａｎ；２５７（２）：２０５−１２．Ｇｒａｎｇｅｒ−Ｓｃｈｎａｒｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−Ｊｕｎ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉ��ｐｅｒ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２  Ｍａｙ  １５；８９（１０）：４２３６−９を参照。ロイシンジップされた多価ｓＦＶを製造する方法が記載されている（ｄｅＫｒｕｉｆ，Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓＦｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６  Ｍａｒ  ２９；２７１（１３）：７６３０−４）。
【０４００】
ＶＩＩ．Ｅ．３．他のダイマー化ドメイン
コイルドコイルダイマー化は，Ｗｉｌｌｃｏｘ，ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｌｐｈａ  ｂｅｔａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９９９  Ｎｏｖ；８（１１）：２４１８−２３）により記載されている。
【０４０１】
プロテインＡのイムノグロブリンとの相互作用を用いて蛋白質をダイマー化させることが記載されている（ＤｅＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｍｕ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９７  Ａｕｇ；１０（８）：９３５−４１）。
【０４０２】
ＧＳＴ配列をダイマー化配列として用いることができる（Ｔｕｄｙｋａ，Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ａｓ  ａ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ  ｆｏｒ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９９７  Ｏｃｔ；６（１０）：２１８０−７）。
【０４０３】
ＶＩＩ．Ｅ．２．組み合わせ
共有結合および非共有結合の任意の可能な組み合わせを用いて，本発明の多価複合体を生成することができる。多数のＶ（Ｈ）領域が共有結合している融合蛋白質は，互いに共有結合している多数のＶ（Ｌ）領域を有する第２の融合蛋白質と，非共有結合的に会合させることができる（例えば，米国特許６，２３９，２５９を参照）。このような複合体は以下の図解に見いだされる構造を有する。
2005500002.tif 000017
【０４０４】
ＶＩＩＩ．カルシトニンポリペプチド
カルシトニンは生物学的に活性な蛋白質であり，実施例において議論される。カルシトニンは，３２アミノ酸を有するポリペプチドホルモンである。カルシトニンを，鼻，口，膣および直腸経路で輸送するのに適した処方，例えば油系またはポリマー系輸送システムである処方を作成するための努力は，Ｔｏｒｒｅｓ−Ｌｕｇｏ，ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２１：１１９１−１１９６，２０００）に概説されている。これらの努力にもかかわらず，カルシトニンを投与するための広く用いられ認可されている非侵襲的方法はない。いずれにしても，カルシトニンは，骨粗鬆症および変形性関節症等の疾病の治療用薬剤としての可能性に多大な興味が持たれている（Ｍｉｌｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ｔｈｅｒ．２６：１８３−１８９，２０００；Ｋｅｎｎｙ，Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．ＮｏｒｔｈＡｍ．２６：５６９−５９１，２０００）。
【０４０５】
カルシトニンは，哺乳動物においては甲状腺の傍濾胞細胞により，鳥類および魚類においては鰓後腺により，主として産生され分泌されるポリペプチドホルモンであるが，他の広範な種類の組織，例えば，肺および腸管においても合成される。
【０４０６】
カルシトニンは，カルシウムおよびリンの代謝に関与することが知られているホルモンである。カルシトニンは，破骨細胞（古く弱った骨を破壊する細胞）の活性を調節するため，これは新たな骨で置き換えられる。カルシトニンは，血液中のカルシウム濃度を低下させ（Ｈｉｒｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，ＳｃｉｅｎｃｅＶｏｌ．１４６，ｐａｇｅ４１２，１９６３），摂食（Ｆｒｅｅｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２０６，ｐａｇｅ８５０，１９７９）および胃液分泌（Ｈｅｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅ１４０（１９７１）を阻害することが示されている。
【０４０７】
ＶＩＩＩ．Ａ．カルシトニンの構造
カルシトニンの構造的特徴としては，以下のものが挙げられる：３２アミノ酸の一定の鎖の長さ，１位と７位のシステイン残基間がジスルフィド架橋されて，Ｎ末端において７アミノ酸残基の環を形成すること，およびカルボキシ末端のプロリンアミド。すべてのカルシトニンに共通のアミノ酸残基は，１位，４−７位，２８位および３２位である（図９−１１を参照）。すなわち，全長カルシトニンは，例えば，一般にポリペプチド鎖の１位と７位の間の架橋，あるいはまたはこれに加えて，９位のロイシン残基，および／または２８位置のグリシン残基，および／または３２位のプロリン残基により特徴づけることができる。
【０４０８】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが，すべてのカルシトニンに共通のＣ末端のプロリンアミドは，その生物学的活性に不可欠であると考えられている（Ｐｏｔｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｕｍ，Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｓ，ｐａｇｅ  １２１  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｂｙ  Ｅｘｃｅｒｐｔａ  Ｍｅｄｉｃａ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９７１）；Ｓｉｅｂｅｒ，Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ１９６９，ｐａｇｅ  ２８，Ｐｒｏｃ．２ｎｄ  Ｓｙｍｐ．，ｐｒｉｎｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９７０）；およびＲｉｔｔｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，Ｖｏｌ．３２，ｐａｇｅ  ２４６（１９７６））。
【０４０９】
ＶＩＩＩ．Ｂ．カルシトニン誘導体
カルシトニンの誘導体としては，限定されないが，天然蛋白質に対して変更されているカルシトニン構造，例えば，（ａ）１またはそれ以上のアミノ酸ラジカルが１またはそれ以上の他のアミノ酸ラジカル（天然または合成）で置き換えられている，および／または（ｂ）ジスルフィド架橋がアルキレン架橋で置き換えら得ているか，および／または開裂しており，および／または（ｃ）１またはいくつかのアミノ酸ラジカルが欠失している（デスアミノアシル誘導体）ものが挙げられる。
【０４１０】
カルシトニンのホモログ，すなわち，ヒトカルシトニンの配列と関連するがこれとは異なるアミノ酸配列を有する，ヒト以外の種に由来するポリペプチドもまた，本発明の範囲内のカルシトニン誘導体である。カルシトニンのホモログの非限定的例は表９に示され，図９−１１に記載される。当業者は，カルシトニンホモログをコードするそれぞれの特定の遺伝子配列について，適当なＤＮＡ起源，プライマーの配列，ＰＣＲ条件等を選択して，他のカルシトニン融合蛋白質を生成することができるであろう。
【０４１１】
表９：カルシトニンのホモログおよび類似体
【表１２】
2005500002.tif 000018
【０４１２】
カルシトニン類似体もまた本発明の範囲内である。このような類似体は，例えば，カルシトニン蛋白質に由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドでありうる。本明細書においてこの用語が用いられる場合，１つの種からと別の種からのカルシトニン配列の組み合わせであるカルシトニン遺伝子および蛋白質もまたカルシトニン類似体である。後者のタイプのカルシトニン類似体の例は，サケカルシトニンに融合されたアミノ末端ヒトカルシトニン前駆体を有するものである（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８：４３９−４４４，１９９７）。また，米国特許６，２６５，５３４；６，２５１，６３５；６，１２４，２９９；６，１０７，２７７；５，９７７，２９８；５，９６２，２７０；５，７１０，２４４；および５，５４１，１５９も参照。
【０４１３】
ハイブリッドまたはキメラカルシトニンポリペプチドを製造することもでき，これらも本発明の範囲内のカルシトニン誘導体である。例えば，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ１８：４３９４４（１９９７）；米国特許５，８３１，０００；および二本特許１９９３−２５５３９１−Ａ４を参照。
【０４１４】
輸送のモードおよびターゲットの組織により，カルシトニン輸送には種々の処方が好ましい。例えば，米国特許６，１４９，８９３；６，０８７，３３８；５，９１２，０１４；５，７２６，１５４；５，７１９，１２２；５，５７１，７８８；，５，５１４，３６５；およびＳｅｒｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：１９６−２０１，１９９６を参照。
【０４１５】
ＶＩＩＩ．Ｃ．カルシトニンポリペプチドおよび誘導体の生物学的活性の試験
カルシトニンポリペプチドとの用語は，カルシトニンの１またはそれ以上の生物学的活性を有するカルシトニン誘導体を包含する。当該技術分野においては，カルシトニン誘導体の生物学的活性を評価するために用いることができる。種々の方法が知られている。例えば，低カルシウム血症ラットモデルを用いて，合成カルシトニン模倣体が血清カルシウムに及ぼす影響を決定することができ，卵巣摘出ラットまたはマウスを骨粗鬆症のモデル系として用いることができる。これらのモデルと，ヒトにおいてエストロゲン欠損の初期に見られる骨の変化は，質的に類似している。カルシトニンは，卵巣摘出ヒトおよびラットにおける骨喪失の予防に有効な薬剤であることが示されている（Ｍａｚｚｕｏｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．４７：２０９−１４，１９９０；Ｗｒｏｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：２２４６−５０，１９９１）。
【０４１６】
カルシトニンは，細胞表面レセプターであるカルシトニンレセプター（ＣＲＥ）により破骨細胞に直接作用する。ＣＲＥは，Ｇ−蛋白質レセプターファミリーのメンバーであり，アデニレートシクラーゼの活性化を介してシグナルを伝達し，細胞ｃＡＭＰレベルの上昇をもたらす（Ｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１０２２−４，１９９１）。カルシトニン媒介性レセプター活性化は，以下のようにして検出することができる：（１）アデニレートシクラーゼ活性の測定（Ｓａｌｏｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５４１−８，１９７４；Ａｌｖａｒｅｚ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８７：９８−１０３，１９９０）；（２）慣用のラジオイムノアッセイ方法を用いる細胞内ｃＡＭＰレベルの変化の測定（Ｓｔｅｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：１１０６−１３，１９７２；Ｈａｒｐｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｏｏｋｅｒ，Ｊ．Ｃｙｃ．Ｎｕｃｌ．Ｒｅｓ．１：２０７−１８，１９７５）；または（３）ｃＡＭＰシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）方法の使用（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，１１１）。
【０４１７】
ＶＩＩＩ．Ｄ．カルシトニンの治療的用途
カルシトニンは，破骨細胞上の特定のカルシトニンレセプターの結合および活性化により骨再吸収を阻害し（Ｔｈｅ  Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｓ−Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ａｚｒｉａ（ｅｄ．），Ｋａｒｇｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｕ．，１９８９），その結果骨から血清に放出されるカルシウムの量が減少する。この骨再吸収の阻害は，例えば，カルシトニンを骨粗鬆症（しばしば衰弱および痛い骨折をもたらす骨格の質量の減少を特徴とする疾病）の治療，および骨形成不全症における骨折の予防として用いることにより利用されてきた。
【０４１８】
カルシトニンは，ページェット病の治療にも用いられており，この疾病にしばしば伴う主要な症状である骨の痛みの急速な軽減を与える。この鎮痛性の効果はまた，骨粗鬆症または転移性骨疾病を有する患者においても示されており，糖尿病性ニューロパシー，癌，片頭痛および子宮摘出術後の痛みを緩和することが報告されている。骨の痛みの低下は，骨の再吸収の低下の前に生ずる。
【０４１９】
カルシトニンの他の用途には，限定されないが，高カルシウム血症およびページェット病の治療，血管痙攣の阻止，虚血，腎不全，および雄の不能の治療が含まれる。
【０４２０】
ＩＸ．インターロイキンポリペプチド
インターロイキンは，生物学的に活性な蛋白質の１種であり，そのある種のメンバーは実施例において議論される。インターロイキンは，リンパ球増殖を促進するヘルパーＴ−細胞から放出される。本発明の方法および組成物に適合することができる特に興味深いインターロイキンには，インターロイキン−１，−２，−３，−４および−５（それぞれ，ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４およびＩＬ−５）が含まれる。
【０４２１】
ＩＸ．Ａ．インターロイキン−２（ＩＬ−２）
ＩＸ．Ａ．１．ＩＬ−２の生物学的活性
ＩＬ−２は，活性化Ｂ細胞およびＴ細胞，例えば抗腫瘍Ｔ細胞の増殖を媒介し，抗炎症性反応において役割を果たす，免疫応答の中心的なレギュレーターである。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は，抗原または有糸分裂刺激の後にある種のＴリンパ球により分泌されるリンホカインである。ＩＬ−２の作用は，ＩＬ−２蛋白質が，活性化されたリンパ球の膜に存在するが静止リンパ球には存在しない特定の高アフィニティーレセプターに結合することにより媒介される。ＩＬ−２の生物学，生化学および分子生物学はＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉにより概説されている（Ｂｌｏｏｄ  ８４：４００８−４０２７，１９９４）。
【０４２２】
ＩＸ．Ａ．２．ＩＬ−２の構造
ヒトＩＬ−２は，１５３アミノ酸の前駆体蛋白質として合成され，２０アミノ酸の疎水性リーダー配列を含む。ＩＬ−２分子は，約１５．４ｋＤの分子量およびわずかに塩基性のｐＩを有する。この蛋白質は，ＩＬ−２の生物学的活性に必要な１つの分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ１０５）を含む（Ｙａｍａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２５７：１９４−１９９，１９８７）。
【０４２３】
ある形のＩＬ−２は，化学的修飾を含む。ウシＩＬ−２のＴｈｒ３でＯ−グリコシル化が生じ，この変種はグリコシル化の存在のために異なる質量を有することが報告されている。しかし，グリコシル化されていないＩＬ−２は生物学的に活性なままである（Ｋｕｈｎｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  ２  ａｎｄ  ４  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  １  ａｒｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ７７（Ｐｔ９）：２２３１−２２４０，１９９６）。
【０４２４】
Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣＯＳ細胞のいずれかで発現された組換えヒトＩＬ−２は，インビトロで蛋白質キナーゼＣによりリン酸化されることが示されている（Ｋｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２（ＩＬ−２），ＣＭｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ８９：２９−３５，１９８９）。リン酸化されたトリプシン処理ペプチドは，７位のセリン残基（Ｓｅｒ７）に１個のリン酸化部位を含むＮ末端フラグメントとして同定された。Ｔ細胞成長アッセイにより判定して，リン酸化されていないＩＬ−２とリン酸化されたＩＬ−２には生物学的活性の相違はなかった。
【０４２５】
ＩＸ．Ｂ．インターロイキン−４（ＩＬ−４）
ＩＸ．Ｂ．１．ＩＬ−４の構造
インターロイキン４（ＩＬ−４）は，種々の細胞，特に造血系起源の細胞に影響を及ぼす強力な多面発現性のリンホカインである。ＩＬ−４は，免疫応答の主要なレギュレーターとして重要な機能を有し，Ｔ−細胞におけるＴＨ２表現型の誘導を指図し，Ｂ−細胞を活性化し，ＩｇＥ抗体の合成を刺激することにより，アレルギーおよびぜん息において役割を果たす。ＩＬ−４レセプターアルファ鎖（ＩＬ−４−ＢＰ，ＩＬ−４結合蛋白質）は，ＩＬ−４に対して高いアフィニティーおよび特異性を示す。インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびそのＩＬ−４レセプターアルファ鎖との複合体の結晶構造はＨａｇｅ，ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ９７：２７１−８１，１９９９）により公表されている。ヒトＩＬ−４およびＩＬ−４−ＢＰの結晶構造は，各蛋白質の特定の表面および領域が相互作用し，互いに接触することを示す。ＩＬ−４のみの結晶構造（Ｐｏｗｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１６７３−１６７７，１９９２；Ｗａｌｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０３−２０３７６，１９９２；ａｎｄ  Ｗｌｏｄａｗｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４，１９９２），ならびに溶液構造（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４，１９９２）も記載されている。ＩＬ−４のレセプターアルファ鎖に結合する領域は，ＡＣヘリックス面である（Ｋｒｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：５１２１−５１２９，１９９３）。ＩＬ−４ＢＰとの接触に関与する機能的アミノ酸は，Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１６５７−１６６２，１９９７）により同定されている。ＩＬ−４の構造は，レセプター結合および未結合型の間で非常に類似しているが，小さいが有意な相違が存在する。Ｈａｇｅ，ｅｔ  ａｌ．は，Ｉ１１，Ｎ１５，およびＹ１２４がレセプター相互作用における主要な接触部位であることを開示している。ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＬｅｄｅｒ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１１９５７１１９６３，１９９２）は，ネズミＩＬ−４のＥ１２，Ｉ１４，Ｌ１０４，Ｄ１０６，Ｆ１０７，およびＬ１１１が機能に重要であることを開示している。ヒトＩＬ−４において相同であるかまたは同一である対応する残基は，それぞれＥ９，Ｉ１１，Ｌ１０９，Ｎ１１１，Ｆ１１２，およびＬ１１７である。
【０４２６】
Ｍｕｌｌｅｒら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：３６０−３７２１９９５）によりＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ中に１Ｈ１Ｋとして報告されているＩＬ−４のアミノ酸配列（配列番号：）は以下のとおりである：
ＨＫＣＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴＬＣＴＥＬＴＶＴＤＩＦＡＡＳＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＨＨＥＫＤＴＲＣＬＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＬＡＧＬＮＳＣＰＶＫＥＡＮＱＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＣＳＳ
【０４２７】
ＩＸ．Ｃ．インターロイキン誘導体
ＩＬ−４におけるシステイン置換および挿入部位
１ＨＩＫ，すなわち，ヒトＩＬ−４の結晶構造は，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅにアクセスすることにより得た。目視により調べたところ，以下の４つのループが見いだされた：ループ１，Ｑ２０−Ｔ２５，ループ２，Ｆ３３−Ｅ４１，ループ３，Ｋ６１−Ｔ２９，およびループ４，Ａ９４−Ａ１０４。いくつかのループ，特にループ４は，β構造に類似する成分を有していた。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅに開示されている，インターロイキン２のδ−鎖レセプターおよびインターロイキン４のδレセプター（１ＩＴＥ）の細胞外ドメインと複合体化したＩＬ−４の結晶構造はまた，レセプターと接触していないＩＬ−４のアミノ酸側鎖の表面アクセス可能性について調べた。大量の溶媒への目視による暴露に基づいて，ある種のアミノ酸が，残基のいずれかの側にシステインを挿入することができる部位，またはシステインを置換することができる部位として選択された。さらに，その側鎖が大量の溶媒に暴露されており，蛋白質の本体と離れている他のアミノ酸を選択した。これらの多くはＩＬ−４のヘリックス領域に存在していた。１ＩＴＥおよび１ＨＩＫにおけるヒトＩＬ−４のこの目視検査の結果は，表１０にまとめられている。
【０４２８】
表１０：ＩＬ−４中のシステイン置換または挿入用の部位
【表１３】
2005500002.tif 000019
【０４２９】
ヒトＩＬ−４配列中のシステインの置換は，セグメント１９−３０，３１−４０，６０−６９，９５−１０３，および１０４−１０９中に含まれる任意の残基について行うことができる（表６を参照）。さらに，らせん領域中のアミノ酸も，その側鎖が蛋白質の主要部と反対方向に向いており，構造に安定性を与える他のアミノ酸側鎖との相互作用に関与していなければ，置換することができる。さらに，これらの側鎖は，分子の生物学的活性または機能に関与していてはならない。システイン置換のためのアミノ酸の位置の例としては，Ｈｉｓ５８，Ａｒｇ８１，Ｈｉｓ７４，Ｇｌｎ７１，およびＡｒｇ５３が挙げられる。ＩＬ−４構造中の特定の残基の種類は限定であることを意味するものではなく，他の置換も可能である。
【０４３０】
ＩＸ．Ｄ．他のインターロイキン
ファミリーのメンバーである蛋白質の相同的システイン置換
多くの蛋白質およびペプチドは，他の蛋白質およびペプチドとホモロジーを示す。そのようなホモロジーは，蛋白質およびペプチドをファミリーおよびサブファミリーに分類する基準である。ホモロジーは，蛋白質およびペプチドの配列，または蛋白質およびペプチドの３次元構造，またはこれらの両方の組み合わせに基づくことができる。同じファミリーまたはサブファミリーのメンバーである蛋白質およびペプチドの同じ一般的領域および表面領域が，レセプターと相互作用し，または他の生物学的機能に関与し，活性化すると考えられる。したがって，１つのファミリーメンバーにおいてシステインで置換することができる残基を同定すれば，これを他のファミリーメンバーにおいて置換することができる残基に翻訳することができる。
【０４３１】
１つのファミリーメンバーにおけるシステイン置換および挿入部位についての情報を用いて，別のファミリーメンバーまたはすべてのファミリーメンバーでシステイン置換および挿入を行うことができる。これは，ファミリーのメンバーのレセプターも相同である場合に特に意味がある。例えば，ＩＬ−１３はＩＬ−４と相同であり，ＩＬ−１３は，ＩＬ−４が有する生物学的活性のサブセットを示す。ＩＬ−４のレセプターとＩＬ−１３のレセプターは，共通のサブユニットを有する。ＩＬ−４レセプターの主要な結合サブユニットであるＩＬ−４レセプターのα鎖に向けられた抗体は，ＩＬ−１３のそのレセプターへの機能および結合を妨害する（Ｚｕｒａｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８６９−１３８７８，１９９５）。現在Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅにおいて結晶学的構造は入手可能ではないが，ホモロジープログラムにより配列を比較することにより，ＩＬ−４に存在しシステインにより置換することができる残基は，ＩＬ−１３におけるホモロジーにより同定することができ，これをシステインで置換することができる。別の例においては，ＩＬ−２，ＩＬ−７，ＩＬ−９，およびＩＬ−１５のすべてのレセプターにおいてガンマｃレセプターサブユニットを用いる。ヒトＩＬ−２，ＩＬ−４，ＧＭ−ＣＳＦ，および成長ホルモンに対するホモロジーに基づいてＩＬ−７の理論的３次元モデルが作成されている（Ｋｒｏｅｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ９：４９３−４９８，１９９６）。本発明の一部は，これらのサイトカインの１つにおいてシステイン置換および挿入部位を用いて，相同の構造を用いてそのような部位を同定することにより，残りのサイトカインにおける同等のシステイン置換および挿入部位を予測することに関する。ＩＬ−２およびＩＬ−３のシステイン置換または挿入誘導体は記載されている（それぞれ米国特許５，２０６，３４４および５，１６６，３２２）。
【０４３２】
機能的アミノ酸およびドメインは，種々の手段，例えば，化学的修飾，部位特異的変異，欠失分析，アラニンスキャン等により同定することができる。
【０４３３】
Ｘ．他の生物学的に活性なポリペプチド
Ｘ．Ａ．ホルモン
カルシトニンは，３２アミノ酸を有するポリペプチドホルモンである（上述を参照）。興味深い他のホルモンには，他のカルシトニン，例えば，限定されないが，ヒトサケカルシトニン，インスリン；成長ホルモン（ソマトトロピン）；上皮小体ホルモン；レプチン；メラノサイト刺激ホルモン；オレキシン；ニューロペプチドＹ；副腎皮質刺激ホルモン；コルチコトロピン様中間体ローブペプチド；メラニン；濃縮（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ）ホルモン；オピオイドペプチド，例えば，限定されないが，エンドルフィン，エンケファリン，およびジノモルフィン；ウロテンシン，例えば，限定されないが，ウロテンシンＩＩ；アミリン関連ペプチド，例えば，限定されないが，アミリン；ゴナドトロピン放出ホルモン；卵胞刺激ホルモン，黄体ホルモン，すべての卵胞刺激ホルモン，および上皮小体ホルモンが含まれる。
【０４３４】
Ｘ．Ｂ．成長因子
成長因子は，細胞の成長，組織化，分化および／または維持を誘導し，促進し，あるいは媒介する蛋白質である。成長因子は，しばしば所定の組織または細胞タイプに特異的であり，それにしたがって命名されている。成長因子の例としては，限定されないが，様々な種のＮＴ３；様々な種の線維芽細胞成長因子，例えば，限定されないが，ＦＧＦ−１，ＦＧＦ−２，ＦＧＦ−３，ＦＧＦ−４，ＦＧＦ−５，ＦＧＦ−６およびＦＧＦ−７；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；表皮成長因子（ＥＤＧＦ）；内皮成長因子；様々な種の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および血管透過性因子，例えば，限定されないが，ＶＥＧＦ−１，ＶＥＧＦ−２，ＶＥＧＦ−１２１，ＶＥＧＦ−１６５，ＶＥＧＦ−１８９；神経成長因子（ＮＧＦ），胎盤成長因子（ＰＧＦ），例えば，限定されないが，ＰＧＦ−１およびＰＧＦ２；肝細胞成長因子；肝細胞成長因子／スキャッター因子；脳由来神経親和性因子（ＢＤＮＦ）；種々のインスリン様成長因子（ＩＬＧＦ），例えば，限定されないが，ＩＬＧＦ−１およびＩＬＧＦ−２；マクロファージ刺激蛋白質；オンコスタチンＭ；乳由来ペプチド成長因子；眼由来成長因子；種々の形のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ），例えば，限定されないが，ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ；潜伏性トランスフォーミング成長因子ベータ結合蛋白質；種々の形のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ），例えば，限定されないが，ＴＧＦ−ベータ１，ＴＧＦ−ベータ２，ＴＧＦ−ベータ３；種々の形の骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ），例えば，限定されないが，ＢＭＰ−１およびＢＭＰ−７；骨形成蛋白質１；エンドスタチン；アンジオスタチン；および毛様向神経因子からなる群より選択される。
【０４３５】
Ｘ．Ｃ．酵素
酵素は生化学的反応を触媒する蛋白質であり，生物学的に活性な蛋白質として機能することができる。興味深い酵素には，限定されないが，１型ゴシェ病の管理のためのグルコセレブロシダーゼ；グルコセルブロシダーゼの改変型であるアルグルセラーゼ；β−グルコセレブロシダーゼ（ββ−Ｄ−グルコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ）；細胞内分子（シンターゼ，ホスファターゼ，キナーゼ，例えばＭＡＰキナーゼ，グリコゲンシンターゼキナーゼ）；膜結合成長因子レセプター（例えばＣＤ４５レセプター）キナーゼおよびホスファターゼ；ヌクレオチド交換因子（ｍＳＯＳ）が含まれる。酵素の阻害剤の例には，カスパーゼ，キナーゼ，ホスファターゼ等の阻害剤が含まれる。
【０４３６】
Ｘ．Ｄ．アポトーシスを媒介する因子
アポトーシスのメディエータおよびこれに関与するものは，別の種類の生物学的に活性な蛋白質である。そのような蛋白質の非限定的例には，死亡ドメイン蛋白質，例えばＴＮＦレセプター付随死亡ドメイン（ＴＲＡＡＤ）；ＦＡＳ付随死亡ドメイン（ＦＡＤＤ）；ＴＮＦ付随因子１−３（ＴＲＡＦ１−３）；白血病阻害因子；レセプター相互作用蛋白質，例えば，レセプター相互作用蛋白質付随Ｉｃｈ−ｌ／ＣＥＤ−３；カスパーゼ；カテプシン；蛋白質のｂｃｌ−２ファミリーのメンバー；およびヌクレアーゼが含まれる。
【０４３７】
Ｘ．Ｅ．抗癌剤
本発明の生物学的に活性な蛋白質はまた，抗増殖薬剤または抗腫瘍剤であってもよい。そのような蛋白質の非限定的例には，プラスミノーゲンの内部クリングルフラグメント，例えばクリングル１−３（アンジオスタチン）およびクリングル１−４；ウロキナーゼのアミノ末端フラグメント；基底膜コラーゲンＸＶＩＩＩのフラグメント，例えばエンドスタチン；可溶性ＦＬＴ−１レセプター；およびインターフェロンアルファ誘導性蛋白質１０が含まれる。
【０４３８】
Ｘ．Ｆ．レセプターフラグメント
生物学的に活性なポリペプチドはまた，レセプターまたはそのフラグメントであってもよい。そのようなレセプターの非限定的例には，ＴＮＦ−アルファレセプター；サイトカインレセプター；およびホルモンレセプターが含まれる。
【０４３９】
Ｘ．Ｇ．新脈管形成を媒介する因子
特に興味深いいくつかの生物学的に活性なポリペプチドは，新脈管形成の媒介剤，阻害剤または関係物である。そのような蛋白質の非限定的には，血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ），例えば，限定されないが，ＶＥＧＦ−１，ＶＥＧＦ−２，ＶＥＧＦ−１２１，ＶＥＧＦ−１６５，ＶＥＧＦ−１８９；および血管透過性因子；メタロプロテアーゼ，インテグリンに対する抗体；プラスミノーゲン；プラスミノーゲンアクチベータ；およびウロキナーゼが含まれる。
【０４４０】
Ｘ．Ｈ．サイトカイン
サイトカインは，免疫応答の間の細胞間のシグナリングに関与するか，または炎症性応答に関与する蛋白質である。リンホカインは，リンパ球により産生されるサイトカインの一種である。代表的なサイトカインおよび成長因子には，例えば，インターフェロン（ＩＦＮ；例えば，ＩＦＮα，ＩＦＮβ，およびＩＦＮγ）；インターロイキン（例えばＩＬ−１からＩＬ−１５）；およびコロニー刺激因子（例えば，骨髄幹細胞およびその子孫の分裂および分化に関与するもの，例えば，幹細胞因子（ＳＣＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），エリスロポエチン（ＥＰＯ），顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＳＣＦ），線維芽細胞成長因子（例えばＦＧＦ１およびＦＧＦ２），ＰＤＧＦ，ＥＤＧＦ，様々な種のＶＥＧＦ，ＮＴ３，およびＮＧＦ，ＢＤＮＦ，第ＶＩＩＩ因子，第ＩＸ因子およびインスリン様成長因子が含まれる。
【０４４１】
Ｘ．Ｉ．抗原
生物学的に活性な蛋白質は，抗原性ポリペプチド，すなわち，免疫応答を付与するよう設計されているものであってもよい。例えば，生物学的に活性な抗原性蛋白質は，抗原，スーパー抗原，エピトープまたは病原体の一部であるか，これに由来するか，これに付随する蛋白質から誘導された他のポリペプチドでありうる。生物学的に活性な抗原性蛋白質との用語はまた，病原性感染に応答して体内の細胞により産生される蛋白質を包含する。この用語はさらに，適当な成長のパターンまたは望ましくない活性を有する体内の細胞，例えば，癌細胞および自己免疫疾病を媒介する細胞により産生される蛋白質を包含する。抗原性部分を含む本発明の融合蛋白質は，動物の体内に導入されたときに免疫応答を付与することが意図される。この応答が予防的効果を提供するならば，融合蛋白質をワクチンとして処方することができる。抗原性ポリペプチドの非限定的例には，病原体，例えば，限定されないが，細菌，ウイルス，リケッチアまたはクラミジアからの蛋白質；腫瘍抗原である蛋白質；および複製に必要な蛋白質が含まれる。特に興味深いものは，ヒト免疫不全ウイルス，ＲＳウイルスウイルス，パラインフルエンザウイルス，インフルエンザウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルスからのウイルス蛋白質である。
【０４４２】
Ｘ．Ｊ．抗ウイルス蛋白質
生物学的に活性な蛋白質はまた，抗ウイルス蛋白質であってもよい。抗ウイルス蛋白質の非限定的には，ＨＩＶ複製およびヒト免疫不全ウイルス，ＲＳウイルス，パラインフルエンザウイルス，インフルエンザウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルスによる感染，およびヒト免疫不全ウイルス感染細胞の融合を阻害するペプチド，例えば，ＨＩＶ−１糖蛋白質４１および糖蛋白質ｇｐｌ２０のアミノ酸配列に関連するペプチドが含まれる。
【０４４３】
Ｘ．Ｋ．治療用および診断用モノクローナル抗体
現在，種々のモノクローナル抗体が，米国食品医薬品局または他の国の対応する機関によりその使用が認可されている。いくつかのモノクローナル抗体が臨床試験中であり，さらに多くのものが試験用に開発されつつある。表１１に本発明の組成物，化合物および方法において用いることができる治療用および診断用モノクローナル抗体を挙げるが，これは包括的または限定的であることを意味するものではない。
【０４４４】
表１１：モノクローナル抗体およびその用途
【表１４】
2005500002.tif 000020
【表１５】
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【表１６】
2005500002.tif 000022
【０４４５】
本発明のある観点においては，モノクローナル抗体はサイトカインに向けられたものである。”サイトカイン”は，一般に，５−２０ｋＤの範囲の分子量を有し，細胞により放出されて他の細胞の挙動に影響を及ぼす蛋白質である。技術的には，サイトカインはホルモンであるが，この用語はインターロイキン，リンホカインおよびいくつかの関連するシグナリング分子，例えばＴＮＦおよびインターフェロンの便利な遺伝子的簡単表記として使用される傾向にある。一般に，成長因子はサイトカインとしては分類されないが，ＴＧＦは例外である。ケモカインはサイトカインのサブセットである。
【０４４６】
ＸＩ．医薬組成物および治療方法
本発明の別の観点は，組成物，例えば，限定されないが，医薬組成物に関する。本発明にしたがえば，”組成物”とは，少なくとも１つの担体，好ましくは生理学的に許容しうる担体，および本発明の１またはそれ以上の組成物または化合物を含む混合物を表す。”担体”との用語は，組成物または化合物の細胞または組織内への取り込みを阻害または防止しない化学化合物を規定する。担体は，典型的には，活性成分を処方または混合して適当な剤形（例えば，丸薬，カプセル，ゲル，フィルム，錠剤，微粒子（例えばミクロスフェア），溶液；軟膏；ペースト，エアロゾル，液滴，コロイドまたは乳剤等）とすることができる不活性物質である。”生理学的に許容しうる担体”は，生理学的条件下で使用するのに適した，本発明の組成物または化合物の生物学的活性および特性を排除（低下，阻害または妨害）しない担体である。例えば，ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は，多くの有機化合物の生物の細胞または組織への取り込みを促進するため，担体である。好ましくは，担体は生理学的に許容しうる担体，好ましくは薬学的にまたは獣医学的に許容しうる担体であり，この中に本発明の組成物または化合物を入れる。
【０４４７】
ＸＩ．Ａ．薬剤のタイプ
薬剤は，種々の治療モダリティーのいずれかにより，動物，例えばヒトに投与される（接触するようにする）薬剤および剤（化合物および複合体）である。”治療的”との用語は，限定されないが，以下のモダリティーを含む：疾病を予防する予防的使用；疾病を除去する治癒的使用；疾病を緩和し，よりよくし，またはより耐性とするが疾病を治癒しない待機的および改善的使用；疾病の進行を遅らせ，防止し，または逆行させる退行的使用；および疾病の発現の一時的または永久的な減少を引き起こす寛解的使用。治療的使用には，それ自体は疾病に関与しないが，それでもなお動物の健康に影響を及ぼすものも含まれる。そのような薬剤の例は，抗毒素，鎮痛薬，麻酔薬含有剤，物理学的および感情的外傷を治療するために用いられる薬剤，および精神活性薬剤，例えば，抗うつ薬，気分安定剤，および抗不安薬である。
【０４４８】
ある薬剤は，必要に応じて投与され，別の薬剤は定期的に投与しなければならない。投与の種類，タイミングまたは過程にかかわらず，治療上有効量を投与しなければならない。”治療上有効量”との用語は，過度の望ましくない副作用（例えば，毒性，刺激またはアレルギー応答）なしに意図される目的を達成するのに有効な薬剤の量を示す。何が薬剤の治療上有効量を構成するかは種々の因子に依存しており，当業者は所望の投与計画に到達する際にこれを考慮に入れるであろう。
【０４４９】
薬剤の予防的使用には，限定されないが，細菌，ウイルス，および他の感染性病原体による感染の予防，細胞のそれ以上の過増殖の予防または阻害（すなわち，腫瘍の退行），および治療されたが再発するかもしれない疾病の再発の予防が含まれる。予防的効果は，薬剤に対する免疫応答の誘導の結果，すなわち，薬剤が免疫原であってもよいが，その必要はない。予防的薬剤は，集団に投与してもよく，または高リスクの個人の亜集団を標的としてもよい。本明細書において用いる場合，”高リスクの個人”との用語は，例えば，個人または家族の病歴または遺伝的試験により，疾病または疾患の発症または再発を起こす確立が通常より有意に高いと判定された個人を表すことを意味する。高リスクの個人のための治療計画の技術として，その個人を予防的に治療して疾病または疾患の発症または再発を防止することができる。”予防上有効量”との用語は，疾病または疾患の発症または再発の予防として観察される効果を生ずる薬剤の量を意味する。医薬組成物の予防上有効量は，典型的には，活性な薬剤を含まない第２の医薬組成物を同様の状態の個人に投与したときに観察される影響と比較したそれらの効果により決定される。
【０４５０】
”薬剤”との用語は，プロドラッグをも包含することを意味する。”プロドラッグ”とは，所望の生物学的活性をほとんどまたは全く有しない形でまたはそのような化合物として投与される薬剤である。プロドラッグは，インビボでのプロセスにより，より活性な薬剤を生成するよう変化する。化合物の場合，典型的には，プロドラッグは活性な薬剤を生成するためにインビボで代謝される。すなわち，活性な薬剤は患者に投与された化合物の代謝産物である。プロドラッグのよく知られている例はＡＺＴである。複合体の場合，化合物は複合体中に保持されているときは不活性でありうる。しかし，複合体（化合物）の一部はインビボで複合体から分離し，このことにより活性な薬剤を生ずる。一般的な例はインビボで塩が溶解すると薬剤が活性となる，薬剤の塩である。すなわち，”薬剤”との用語は，インビトロで活性である剤，ならびにインビボで活性となる剤を包含する。
【０４５１】
Ｘ．ＩＩ．Ｂ．投与経路
薬剤は，典型的には経口的にまたは経腸的に投与される。経腸的とは，薬剤を胃腸管に，好ましくは経口投与により投与することを表す。非経口投与は，他のいずれかの経路，例えば，血流中への直接静脈内注射による薬剤の投与である。いずれの場合においても，薬剤投与の目標は，薬剤を投与の部位から薬剤が作用してその効果を生み出す体内の部位に移動させること，または全身的に治療上有効量の薬剤を投与することである。
【０４５２】
薬剤の経口投与は，これまでのところ，最も一般的な方法である。経口投与されたとき，薬剤吸収は通常は胃腸管内の上皮細胞の膜を越えて輸送されることにより生ずる。経口投与後の吸収は，胃腸（ＧＩ）管の長さ方向に沿って様々である多数の因子により混乱される。これには，限定されないが，管腔ｐＨ，管腔体積あたりの表面積，組織の潅流，胆汁および粘液の流れ，および上皮関門が含まれる。薬剤の肺投与，すなわち，呼吸器系を通る輸送もまた知られている。
【０４５３】
非経口投与は，経口投与にともなって存在する多くの変動を排除するための方法を提供するが，非経口投与は好ましい経路ではない。これは，非経口投与は通常医療従事者を必要とし，多くの薬剤の投与には実用的ではないためである。非経口投与は，これが必要とされる場合でさえ，患者の不快，感染のリスク等の懸念，ならびに装置および必要なコストのため，好ましくない。しかし，場合によっては，種々の試みにもかかわらず，ある種の療法には非経口的に輸送される薬剤が必要である。このような薬剤には，体内で分解されるポリペプチドおよび他の高分子が含まれる。体内の分解は，胃腸管で高程度に生ずる。そのような障害にもかかわらず，例えば，インスリン，成長ホルモン，インターロイキン，およびモノクローナルおよびその他の抗体は，非経口以外の形の投与により輸送することが望ましい。非経口以外の投与経路，例えば経口および肺投与を達成するためには，上皮関門を克服しなければならない。
【０４５４】
これらのおよび他の投与の経路において，薬剤は，一般循環またはその作用のターゲット部位に到達するまでに，いくつかの準透過性細胞膜を横切らなければならない。これらの膜は，薬剤分子の通過を阻害する生物学的関門として作用する。多くの場合，関門は上皮細胞を含み，したがって，上皮関門である。上皮関門には，非限定的例として，臓器の管腔に沿って並ぶものが含まれる。したがって，上皮関門には，限定されないが，胃腸管腔，肺管腔，鼻管腔，鼻咽頭管腔，咽頭管腔，口腔管腔，舌下管腔，膣管腔，尿生殖器管腔，眼管腔，鼓室管腔，および眼表面に沿って並ぶ表面が含まれる。
【０４５５】
ＸＩ．Ｂ．医薬組成物
”医薬組成物”とは，担体が薬学的に許容しうる担体である，薬剤を含む組成物を表し，”獣医薬組成物”とは，担体が獣医学的に許容しうる担体であるものを表す。”薬学的に許容しうる担体”または”獣医学的に許容しうる担体”との用語は，生物学的にまたは他の意味でも，望ましくないものではない任意の媒体および材料を含む。すなわち，担体は，望ましくない生物学的影響を引き起こさず，または複合体またはそのいずれかの成分または生物と有害であるように相互作用せずに，本発明の組成物または化合物とともに生物に投与することができる。薬学的に許容しうる薬剤の例は，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  １９９０，（その全体を本明細書の一部としてここに引用する），ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ    Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ＆Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｓｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９９に記載されている。
【０４５６】
薬剤は，患者で所望の効果を生成するのに十分な量で医薬組成物中に含まれる。本発明の医薬組成物は，さらに他の化学成分成分，例えば，希釈剤および賦形剤を含むことができる。”希釈剤”とは，溶媒，好ましくは水性溶媒中に希釈されて，溶媒中への薬剤の溶解を容易にする化学化合物であり，これは薬剤またはその１またはそれ以上の成分の生物学的に活性な形を安定化させるよう機能することができる。当該技術分野においては，緩衝化溶液中に溶解された塩が希釈剤として用いられる。例えば，好ましい希釈剤は，１またはそれ以上の異なる塩を含む緩衝液化溶液である。好ましい緩衝液化溶液はリン酸緩衝化食塩水（特に薬物としての投与が意図される組成物との組み合わせ）であり，これはヒト血液の塩条件を模倣するためである。緩衝液塩は低濃度で溶液のｐＨを調節することができるため，緩衝化希釈剤は生物学的に活性なペプチドの生物学的活性をめったに変更しない。
【０４５７】
”賦形剤”とは，適当な特性，例えば，適当な堅さを付与するために，または薬剤を形成するために，組成物に加えることができる任意の幾分不活性な物質である。適当な賦形剤および担体としては，特に，充填剤，例えば，糖，例えば，ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトールセルロース調製物，例えば，トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，寒天，ペクチン，キサンタンガム，グアーガム，イナゴマメガム，ヒアルロン酸，カゼイン，ジャガイモデンプン，ゼラチン，トラガガントガム，ポリアクリル酸，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられる。所望の場合には，崩壊剤，例えば架橋ポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナトリウムを含んでいてもよい。他の適当な賦形剤および担体には，ハイドロゲル，ゲル化可能なハイドロコロイド，およびキトサンが含まれる。キトサンミクロスフェアおよびマイクロカプセルを担体として用いることができる。ＷＯ９８／５２５４７（これは化合物を胃にターゲティングするためのミクロスフェア処方を記載しており，この処方は，１またはそれ以上の活性成分を含む不活性コア（任意にゲル化ハイドロコロイドを含んでいてもよい），活性成分の放出速度を調節するための水不溶性ポリマーからなる膜（例えばエチルセルロース），および生物接着性カチオン性ポリマー，例えば，カチオン性多糖類，カチオン性蛋白質，および／または合成カチオン性ポリマーからなる外層を含む），および米国特許４，８９５，７２４を参照。典型的には，適当な試薬，例えば，グルタルアルデヒド，グリオキサール，エピクロロヒドリン，およびスクシンアルデヒドを用いてキトサンを架橋させる。キトサンを担体として用いる組成物は，種々の剤形，例えば，丸薬，錠剤，マイクロ粒子，およびミクロスフェア（例えば，活性成分の制御放出を与えるもの）中に処方することができる。他の適当な生物接着性カチオン性ポリマーには，酸性ゼラチン，ポリガラクトースアミン，ポリアミノ酸，例えば，ポリリジン，ポリヒスチジン，ポリオルニチン，ポリ４級化合物，プロラミン，ポリイミン，ジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥ），ＤＥＡＥ−イミン，ＤＥＡＥ−メタクリレート，ＤＥＡＥ−アクリルアミド，ＤＥＡＥ−デキストラン，ＤＥＡＥセルロース，ポリ−ｐ−アミノスチレン，ポリオキシエタン，コポリメタクリレート，ポリアミドアミン，カチオン性デンプン，ポリビニルピロリドン，およびポリチオジエチルアミノメチルエチレンが含まれる。
【０４５８】
ＸＩ．Ｄ．医薬組成物の処方
本発明の組成物および化合物は，任意の適当な様式で処方することができる。組成物または化合物は，均一に（ホモジニアス）または不均一に（ヘテロジニアス）担体中に分散させることができる。適当な処方には乾燥および液体処方が含まれる。乾燥処方には凍結乾燥および凍結乾燥粉体が含まれ，これは洞または肺へのエアロゾル輸送に，または長期間保存した後，投与前に適当な希釈剤中で再構成する場合に特に適している。他の好ましい乾燥処方には，本発明にしたがう医薬組成物を経口投与に適した錠剤または丸薬の形に圧縮したもの，または混合して持続放出処方としたものが含まれる。医薬組成物は経口投与が意図されるものであるが，本発明の組成物または化合物が腸中の上皮に輸送すべきものである場合，処方を腸溶性コーティングでカプセル化して，処方を保護し，その中に含まれる薬剤の早期放出を防止することが好ましい。当業者には理解されるように，本発明の医薬組成物は，任意の適当な剤形中に入れることができる。丸薬および錠剤は，そのような剤形の例である。医薬組成物はまた，任意の適当なカプセルまたは他のコーティング材料中に，例えば，圧縮，浸漬，パンコーティング，噴霧乾燥等によって封入することができる。適当なカプセルには，ゼラチンおよびデンプンから作成されるものが含まれる。さらに，そのようなカプセルは，所望の場合には，１またはそれ以上の追加の材料，例えば腸溶性コーティングでコーティングすることができる。液体処方には，水性処方，ゲル，およびエマルジョンが含まれる。
【０４５９】
ある好ましい態様は，生物接着性，好ましくは粘膜接着性のコーティングを含む組成物に関する。”生物接着性コーティング”とは，コーティングがない場合よりも，薬剤が生物学的表面または物質によりよく吸着できるようにするコーティングである。”粘膜接着性コーティング”は，コーティングがない場合よりも，物質，例えば，本発明にしたがう組成物が粘膜によりよく吸着できるようにする好ましい生物接着性コーティングである。例えば，微粉化粒子（例えば，約５，１０，２５，５０，または１００μｍの平均直径を有する粒子）を粘膜接着性物質とともにコーティングすることができる。次に，コーティングした粒子を集めて，生物に輸送するのに適した剤形とすることができる。好ましくは，そしてターゲティングすべき細胞表面輸送成分を発現させる場所に依存して，次に剤形を別のコーティングで被覆して，処方をそれが所望の場所に達するまで保護し，その場所で粘膜接着性物質は本発明の組成物または化合物がターゲット細胞表面輸送成分と相互作用している間処方が保持されるようにする。
【０４６０】
ＸＩ．Ｅ．医薬組成物の投与
本発明の医薬組成物は，モノクローナル抗体を，生物に，好ましくは動物に，好ましくは，哺乳動物，鳥類，魚類，昆虫，または節足動物に投与することを容易にする。好ましい哺乳動物には，ウシ，イヌ，ウマ，ネコ，ヒツジおよびブタ，およびヒト以外の霊長類が含まれる。ヒトが特に好ましい。当該技術分野においては，化合物を投与または輸送する多くの技術が存在し，例えば，限定されないが，経口，直腸（例えば，浣腸または座剤），エアロゾル（例えば，鼻または肺輸送用），非経口，および局所投与が挙げられる。好ましくは，十分な量の本発明の組成物または化合物を輸送して意図される効果を達成する。輸送すべき組成物または化合物の特定の量は，多くの因子に依存し，これには例えば，達成すべき効果，組成物を輸送する生物の種類，輸送経路，投与計画，およびその生物の年齢，健康状態，および性別が含まれる。そのように，所定の処方中に含まれる本発明の組成物または化合物の特定の投与量は，当業者が判断することができる。
【０４６１】
当業者は，本発明の医薬組成物を薬剤として投与して特定の所望の生物学的結果，例えば治療的または保護的効果（ワクチン接種を含む）を達成する場合に，本発明の組成物または化合物を適当な薬学的担体と組み合わせることが必要であることを理解するであろう。薬学的担体の選択および治療用または予防用薬剤としての組成物または化合物の製造は，意図される用途および投与のモードにより異なるであろう。治療剤の投与の適当な処方および方法には，限定されないが，経口，肺，鼻，口腔，眼，皮膚，直腸，または膣輸送用のものが含まれる。
【０４６２】
状況依存的機能性物質は，用いられる輸送のモードに依存して，種々の薬学的に許容しうる形で輸送することができる。例えば，状況依存的機能性物質は，固体，溶液，エマルジョン，分散剤，ミセル，リポソーム等の形で，丸薬，カプセル，錠剤，座剤，エアロゾル，液滴，またはスプレー中に取り込ませて輸送することができる。丸薬，錠剤，座剤，エアロゾル，粉体，液滴，およびスプレーは，複雑な多層構造を有していてもよく，広い範囲のサイズを有していてもよい。エアロゾル，粉体，液滴，およびスプレーは，小（１ミクロン）から大（２００ミクロン）のサイズの範囲でありうる。
【０４６３】
本発明の医薬組成物は，固体，凍結乾燥粉体，溶液，エマルジョン，分散物，ミセル，リポソーム等の形で使用することができ，得られる組成物は腸内または非経口適用に適した有機または無機担体または賦形剤との混合物中に１またはそれ以上の本発明の化合物を活性成分として含む。活性成分は，例えば，錠剤，ペレット，カプセル，座剤，溶液，エマルジョン，懸濁液，および使用に適した他の任意の形態のための通常の無毒性の薬学的に許容しうる担体とともに混合することができる。用いることができる担体としては，グルコース，ラクトース，マンノース，アカシアガム，ゼラチン，マンニトール，デンプンペースト，三ケイ酸マグネシウム，タルク，コーンスターチ，ケラチン，コロイド状シリカ，ジャガイモデンプン，尿素，中程度の長さの鎖のトリグリセリド，デキストラン，および固体，半固体，または液体の形の製剤を製造するために用いるのに適した他の担体が挙げられる。さらに，補助剤，安定剤，増粘剤および着色剤および香料を用いることができる。安定化乾燥薬剤の例には，トリウロース，好ましくは０．１％またはそれ以上の濃度のものが含まれる（例えば，米国特許５，３１４，６９５を参照）。
【０４６４】
ＸＩ．Ｆ．投与量
個々の要求は様々であろうが，医薬組成物の有効量の最適範囲の決定は，当業者の技術の範囲内である。ヒトへの投与量は，動物実験から推定することができる（Ｋａｔｏｃｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２７  Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）。一般に，有効量の医薬組成物を与えるのに必要な投与量は，当業者が調節することができ，投与される者の年齢，健康状態，身体の状態，体重，疾病または疾患の種類および程度，治療の頻度，同時に行う療法の性質（あれば），および所望の効果の性質および範囲により様々であろう。例えば，Ｎｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈＥｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６を参照されたい。
【０４６５】
治療用組成物の投与は，数日間から数ヶ月，または治癒するまで，または疾病状態の縮小が得られるまでの治療の過程において，治療すべき疾病状態の重篤度および応答性に依存して様々である。最適な投与スケジュールは，患者の体内の薬剤の蓄積を測定して計算することができる。”患者”との用語は，動物（例えば，ネコ，イヌおよびウマ）ならびにヒトを含むことが意図される。当業者は，最適投与量，投与方法論および反復速度を容易に決定することができる。最適投与量は，個々の治療剤の相対的効力により様々であり，一般に，インビトロおよびインビボの動物モデルにおいて有効であることが見いだされたＥＣ５０に基づいて見積もることができる。
【０４６６】
一般に異なる哺乳動物についての治療効果の効力は広範囲に変化するため，投与量の範囲（投与される薬剤の量）は広い。典型的には，ラットに比べてヒトにおいては投与量は２０，３０または４０倍少ない（単位体重あたり）。一般に，投与量は，０．０１μｇ−１００ｇ／ｋｇ体重，好ましくは０．０１μｇ−１０ｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−１０００ｍｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−１０ｍｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−１ｍｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−１００μｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−１０μｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−１μｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−１０μｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−１μｇ／ｋｇ体重，０．０１μｇ−０．１μｇ／ｋｇ体重，および上述の濃度範囲の境界に基づく範囲である。すなわち，例えば，投与量に関する上述の記載は，１００−１０ｇ／ｋｇ体重，１０ｇ−１０００ｍｇ／ｋｇ体重，１０００ｍｇ−１００ｍｇ等の範囲の間の投与量を包含する。
【０４６７】
投与は，１日に１回またはそれ以上，毎週，毎月または毎年，または２−２０年に１回行うことができる。当業者は，体液または組織中の薬剤の測定された滞留時間および濃度に基づいて，反復速度を容易に見積もることができる。治療の成功の後，患者に維持療法を行って，疾病状態の再発を防止することが望ましい。維持療法においては，治療用薬剤は，０．０１μｇ−１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の維持用量で，１日に１回またはそれ以上から２０年に１回の範囲で投与する。ある種の薬剤，例えばワクチンは，生涯に１回投与すればよく，または状況が保証する場合にのみブースター投与すればよい。
【０４６８】
特定の投与量は，患者のおよその体重または表面積にしたがって計算する。適当な投与量を決定する上でのその他の因子には，治療または予防すべき疾病または状態，疾病の重篤度，投与の経路，および患者の年齢，性別および健康状態が含まれる。適当な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる改良は，特に本明細書に記載される投与量情報およびアッセイを参照して，当業者が日常的に行うことができる。投与量はまた，適当な用量−応答データと組み合わせて投与量を決定するための既知のアッセイを用いて決定することができる。
【０４６９】
個々の患者の投与量は，疾病の進行を監視しながら調節することができる。患者における薬剤の血中レベルを測定して，有効濃度に達するかこれを維持するために投与量を調節する必要があるか否かを調べることができる。薬理遺伝学を用いて，所定の個人についていずれの薬剤およびその投与量が最も有効でありそうかを判定することができる（Ｓｃｈｍｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：４３−５３，２００１；Ｓｔｅｉｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：３３−４１，２００１）。
【０４７０】
ＸＩ．Ｇ．医薬組成物の使用
本発明の医薬組成物は，生物学的に活性な複合体および化合物を，生物に，好ましくは動物に，好ましくは，哺乳動物，鳥類，魚類，昆虫，または節足動物に投与することを容易にする。好ましい哺乳動物には，ウシ，イヌ，ウマ，ネコ，ヒツジおよびブタ等の動物，および非ヒト霊長類が含まれる。ヒトは特に好ましい。当該技術分野においては，医薬組成物を投与または輸送する多数の手法が存在し，例えば，限定されないが，経口，エアロゾル（例えば，鼻または肺輸送用），非経口および局所投与が含まれる。好ましくは，十分な量の医薬組成物の生物学的に活性な複合体または化合物，またはその生物活性部分または代謝産物を輸送して，意図される効果を達成する。生物学的に活性な複合体または化合物の輸送すべき特定の量は，多くの因子，例えば，達成すべき効果，医薬組成物が輸送される生物の種類，輸送経路，投与計画，および生物の年齢，健康状態，および性別に依存するであろう。そのように，所定の処方中に含まれる本発明の組成物または化合物の特定の投与量は，当業者の裁量により決定される。
【０４７１】
別の治療上の分脈においては，本発明の医薬組成物は，生物学的に活性な複合体または化合物，またはその生物活性部分または代謝産物が，ｐＩｇＲターゲティング組成物または化合物の一部として効率よく輸送されることを可能とする。ｐＩｇＲ−リガンドは能動輸送により細胞内に輸送されるため，本発明の医薬組成物は，受動輸送メカニズムと比較して，モノクローナル抗体の生物利用性のより優れた調節を提供する。そのように，本発明のｐＩｇＲターゲティング蛋白質コンジュゲートおよび組成物により，モノクローナル抗体の改良された取り込みおよび利用が可能となる。
【０４７２】
本発明の組成物および化合物は，診断用および関連する用途においても有用である。本発明の１つの観点は，好ましくはキットの形で，ある種の疾病を診断およびモニタリングすることを含む。この観点は，疾病の診断および予防の経過のアッセイおよびモニタリングに，患者内における治療用薬剤または外来化合物の有効性および／または分布のモニタリングに，ならびに他の関連する機能において有用である。
【０４７３】
本発明のこの観点においては，患者のｐＩｇＲディスプレイ細胞が，検出可能なように標識した本発明の組成物または化合物をエンドサイトーシスすることが可能であるかまたは現にエンドサイトーシスしているか否か，およびその程度をモニターまたは判定することが望ましい。そのような方法は，所定の蛋白質コンジュゲートのｐＩｇＲターゲティング要素の性質に応じて，種々の系において用いられる。
【０４７４】
例えば，患者またはそこからの生物学的サンプルが，ｐＩｇＲに結合する細菌蛋白質に由来するｐＩｇＲ−ターゲティング要素を有する組成物または化合物をエンドサイトーシスする程度は，その要素を有する細菌による感染に対する患者の感受性の尺度である。検出可能な標識の取り込みの程度が大きいかまたは速度が早いことは，その患者がそのような感染に対してより感受性が高いことを示す。
【０４７５】
別の例として，外来性ｐＩｇＲ蛋白質の活性，分布および／または濃度は，疾病または疾患の経過の間に種々の方法により変更することができる。患者の中のｐＩｇＲ蛋白質は，診断および予後目的で疾病の過程にわたって，ならびにｐＩｇＲ蛋白質の効果をモニターするために疾病または疾患の治療の過程にわたって測定する。本発明のこの観点を適用することができる疾病には，限定されないが，呼吸系が関与する疾病，例えば，肺癌および腫瘍，ぜん息，病原体感染，アレルギー関連疾患等；胃腸管が関与する疾病，例えば，癌，腫瘍，病原体感染，胃腸ホルモンに関連する疾患，クローン病，摂食疾患等；およびｐＩｇＲをディスプレイする細胞が関与することが知られているかまたは疑われている任意の疾病または疾患が含まれる。
【０４７６】
本発明の組成物および化合物は，検出可能なポリペプチド，例えば，グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）またはその誘導体により検出可能なように標識することができる。蛋白質コンジュゲートが，それに対する抗体が入手可能なエピトープ（例えば，限定されないが，ｃ−ｍｙｃエピトープおよびＦＬＡＧ−タグ等の市販のもの）を含む場合，これは種々のイムノアッセイの任意のもの，例えば，酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて検出することができる
【０４７７】
ＸＩＩ．薬理学的特性
当業者には，薬剤の効力に影響を及ぼす薬理学的特性，およびいかにしてこれらの特性を反映するパラメータを決定するかがわかる。一般に，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉ  ｓａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｅｒｋｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。薬理学的特性のいくつかは次のとおりである。
【０４７８】
ＸＩＩ．Ａ．ターゲティング
その意図される作用部位に特異的にまたは優先的に輸送されるよう設計される薬剤は，ターゲティングされていると言われる。すなわち，そのような薬剤は，所望の作用部位に向けられたターゲティング要素を含む。特定の細胞タイプに特異的な表面抗原に向けられた抗体，特に一本鎖抗体は，薬剤と会合させてこれをターゲティングするために用いられている。例えば，Ｋｕｒｏｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）ｗｉｔｈ  ａ  Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ＣＥＡ，”Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｐｐ．４０６７−７１，２０００；米国特許６，１４６，８８５，Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，表題”Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”；Ｊｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｅｌｌ  Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ＶｅｃｔｏｒｓＴｈａｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９，６：１９８２−７；Ｅｎｇｅｌｓｔａｄｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｙ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００，１１：２９３−３０３；Ｊｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｉｎｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ１９９８，７２：１０１４８−５６；Ｃｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｏｗａｒｄ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ１９９７，７１：７２０−５；Ｃｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｏｆ  Ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ１９９５，６９：２６５９−６３；Ｃｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｅｌｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９４，１：２９２−９；Ｅｉｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｓｅｕｄｏｒｅｃ��ｐｔｏｒ  Ｔｈａｔ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  Ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  Ｆｉｂｅｒｏｒ  Ｐｅｎｔｏｎ  Ｂａｓｅ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９，７３：９１３０−９１３６；Ｍａｒｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＣｌａｓｓＩ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ−ｒｉｖｅｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９６，７０：２９５７−２９６２；Ｓｏｍｉａ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：Ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２：７５７０−７５７４；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏ  ｆ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｗｉｔｈ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｉｇ  Ｇａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｂｌｏｏｄ，１９９８，９２：２１０３−２１１２；Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  Ｔｒｏｐｉｓｍ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｔｏ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３：６９２３−６９２９；Ｒａｍｊｉａｗａｎ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  Ｂｒｏａｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”Ａｍｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０００，８９：１１３４−１１４４；Ｓｎｉｔｋｏｖｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，”ＡＴＶＡ−Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｓｕｂｇｒｏｕｐ  Ａ  Ａｖｉａｎ  Ｌｅｕｋｏｓ  ｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００，７４：９５４０−９５４５；Ｃｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｏｗａｒｄ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７，７１：７２０−７２５；Ｋｕｌｋａｒｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐ��ｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０００  Ｍａｒ  ２７；６９（６）：１２０９−１７を参照されたい。
【０４７９】
ｐＩｇＲ茎または本明細書に記載される他のｐＩｇＲドメインおよび領域に向けられたターゲティング要素は，上皮関門の浸透を越えた追加の目的にかなうことができる。ある種の癌細胞は，ｐＩｇＲを異常に発現する（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ−Ｑｕａｇｌｉａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２５４４−２５５５，２０００）。ｐＩｇＲ茎または他のｐＩｇＲドメインおよび領域に向けられたターゲティング要素は，そのような癌細胞，またはｐＩｇＲを異常に発現する他の細胞に対するターゲティング要素として働く。これらの例においては，ｐＩｇＲ茎または他のｐＩｇＲドメインおよび領域に向けられたターゲティング要素は，細胞毒と会合させて，治療的有益性のために癌細胞に輸送することができる。
【０４８０】
ＸＩＩ．Ｂ．吸収の速度
吸収速度定数は，薬剤吸収の速度を表現する。薬剤吸収は薬剤が薬剤の投与の部位から動物の体内に移動するプロセスを表す。種々の因子，例えば，薬剤の処方は，薬剤の吸収の速度の効率に影響を及ぼす。例えば，ほとんどの経口的に投与される薬剤は，錠剤またはカプセルの形であり，これは，便利さ，経済性，安定性，および患者の容認および承諾等の理由のためである。これらのカプセルまたは錠剤は，薬剤の吸収が生ずることができる前に崩壊するか溶解しなければならない。固形剤形の崩壊を変更または遅延させ，溶解速度に影響を及ぼし，このことにより吸収のための薬剤の利用性を決定することができる種々の因子が存在する。
【０４８１】
ある種の薬剤の吸収は，さらに食物の消費から生ずる因子により影響される。例えば，胃腸管中に繊維または他の物質が存在すると，薬剤の吸収が制限されるかもしれず，摂取に応答して生ずるかまたは消化の間に生ずる液体の分泌もまたその吸収に影響を及ぼしうる。そのような液体が胆汁である場合，薬剤を含む多くの物質の吸収が促進される。消化酵素の放出は，摂食により誘導することができ，これらの酵素は，丸薬，錠剤等の溶解の速度および／または薬剤の分解に影響を及ぼすことができる。
【０４８２】
ＸＩＩ．Ｃ．生物利用性
薬剤の生物利用性は別の薬理学的特性である。生物利用性は，薬剤，またはその生物学的に活性な代謝産物または部分が一般循環および／またはそのターゲット作用部位に入る速度および程度として定義される。生物利用性は，多くの因子，例えば，薬剤製品がいかにして設計され製造されるか，その物理化学的特性，薬剤が体内から排出される速度，および患者の生理学および病理学に関連する因子により影響を受ける。吸収と競合する反応は，生物利用性を低下させうる。これらには，錯体形成（例えば，テトラサイクリンと多価金属イオンとの間等），胃酸または消化酵素による加水分解（例えば，ペニシリンおよびクロラムフェニコールパルミテート加水分解），腸壁におけるコンジュゲーション（例えばイソプロテレノールのスルホコンジュゲーション），他の薬剤への吸着（例えば，ジゴキシンおよびコレスチラミン），および管腔ミクロフローラによる代謝が含まれる。これらの因子のいずれも，生物利用性に影響するよう変化させることができ，これは所望の性質を達成または増強するよう調節することができる薬理学的特性である。
【０４８３】
血漿濃度−時間のデータから生物利用性を評価することは，通常は，最大（ピーク）血漿薬剤濃度，最大血漿薬剤濃度が生ずる時間（ピーク時間），および血漿濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣ）を決定することを含む。血漿薬剤濃度は，吸収の程度とともに増加し，薬剤の排出速度が吸収速度と等しくなったときにピークに達する。薬剤が血流に入るやいなや薬剤排出が始まるため，ピーク血漿濃度に基づく生物利用性の決定は，ミスリードとなる可能性がある。吸収速度の最も広く用いられている一般的指標はピーク時間である。吸収が遅ければ遅いほど，ピーク時間は遅くなる。しかし，ピーク時間は，血液サンプリングの頻度，およびピーク近くの比較的平坦な濃度の場合にはアッセイの再現性に依存する不連続的な値であるため，しばしば優れた統計学的尺度ではない。ＡＵＣは，全身循環に達する変化していない薬剤の総量に直接比例するため，より信頼しうる生物利用性の尺度である。
【０４８４】
ＸＩＩ．Ｄ．排出およびクリアランス
体内からの薬剤の排出速度は様々であり，その効力に影響を及ぼす。排出速度がより早いことは，生物利用性がより低いことと対応する。すなわち，より遅い排出速度が一般に好ましいが，望ましくない影響，例えば毒性を有する薬剤についてはより早い排出速度が好ましいかもしれない。血漿濃度への排出速度に関連する１つのパラメータは，総クリアランスであり，これは，腎臓クリアランスと腎臓外（代謝的）クリアランスとの和に等しい。排出速度定数は，薬剤がどのようにして排出臓器により血液からクリアーされるか，および薬剤がどのようにして身体全体に分布するかの関数である。排出に関連する別の因子は，変化せずに排泄される割合であり，これは，代謝される薬剤の量に対する排泄される薬剤の量を反映する。割合が低いことは，肝臓代謝が排出のメカニズムであろうことを示し，割合がより高いことは，腎臓排出が薬剤排出の主要な形であることを示す。
【０４８５】
排出の速度は，望ましくは，問題とする薬剤の性質および用途に依存して増加または減少する。しばしば，排出速度が低いと生物利用性が増加するために望ましい。しかし，ある種の薬剤の場合には，排出速度が高いことが好ましいかもしれない。例えば，導入されるターゲット化薬剤のすべての分子がその意図する作用部位を見いだすとは限らず，これらの分子を体内の別の部位で望ましくない影響を引き起こす前に体内から除去することが望ましいかもしれない。
【０４８６】
ＸＩＩ．Ｅ．治療指数
別の薬理学的特性としては治療指数があり，これは，特定の治療結果に到達するための薬剤の相対的な望ましさの尺度である。治療指数は，通常は，所望の治療効果を得るための最小投与量に対する毒性症状を引き起こさない最大投与量として表される。治療指数がより高いことが好ましく，ある種の末端疾病の場合を除き，１未満の指数は許容しえない。
【０４８７】
ＸＩＩ．Ｇ．ファーストパス効果
多くの薬剤は，経口投与の後，胃腸管から無傷のまま吸収され，最初に門脈系を通って肝臓に輸送され，ここで大きく代謝される。このような代謝は，薬剤を不活性化または分解するかもしれず，したがって，その生物学的活性が低下するか排除され，これは次に生物利用性を低下させる。このようなプロセスは，典型的には肝臓で生ずるが必ずしもそうではなく，ファーストパス効果と称される。ファーストパス効果は，経口的に投与された薬剤の生物利用性をこのように大きく制限するかもしれないため，治療上有効量の薬剤を達成するためには，投与の代替経路を用いなければならない。上皮組織を通って輸送される薬剤は，ファーストパス効果をバイパスすることができ，これは望ましい性質である薬理学的特性である。
【０４８８】
ＸＩＩ．Ｆ．半減期
薬剤の半減期は，体内の薬剤濃度または薬剤の量が５０％に減少するのに必要な時間である。ほとんどの薬剤について，半減期は，どのような量の薬剤が体内にあるかにかかわらず一定であるが，例外もある（例えば，フェニトイン，テオフィリンおよびヘパリン）。一般に，半減期がより長いことが好ましい。これは，その意図される治療効果を達成するのに必要な薬剤の投与の量を低下させ，頻度を減少させるためである。しかし，特に，薬剤が望ましくない副作用，例えば毒性を有する場合，半減期が短いことが好ましい場合がある。
【０４８９】
実施例
実施例１：分子試薬
１．１．ポリクローナル抗ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ抗体の製造
実施例においては，ｓＦｖ５ＡＦに向けられたポリクローナル抗体を用いて，一本鎖抗体ｓＦｖ５ＡＦおよびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ，およびこれらのｓＦｖを含むコンジュゲートを同時に検出する。抗ｓＦｖ５ＡＦポリクローナル抗体は以下のようにして製造した。
【０４９０】
ＦＬＡＧ−タグ付きｓＦｖ５ＡＦを免疫原として用いて，抗血清（ポリクローナル抗体）を製造した。抗血清は，ＨＴＩＢｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ）により商業的に製造された。簡単には，２００μｇのＦＬＡＧ−タグ付きｓＦｖ５ＡＦを完全フロインドアジュバントとともに最初の注射に用い（第１日），２００μｇの融合蛋白質を不完全フロインドアジュバントとともに２週間ごとにブーストした。注射は皮下に行った。約７週間および９週間に採血した。
【０４９１】
ＥＬＩＳＡを用いて，血清をｓＦｖ５ＡＦとの反応性についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡにおいて試験してポジティブであった血清をウエスタンブロットにより調べて，ｓＦｖ５ＡＦと反応性のポリクローナル抗体の存在を確認した。
【０４９２】
実施例２：サルＰＩＧＲのクローニング
２．１．サル腸組織からのｐＩｇＲｃＤＮＡの単離
アカゲザルおよびカニクイザルの腸組織は，Ｙｅｒｋｅｓ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）から入手した。回腸および結腸切片からそれぞれ少なくとも３０グラムの組織標本を調製した。死後３０分以内に組織を切除し，ＰＢＳですすいで糞便を除去し，次に液体窒素を用いて急速に冷凍し，ドライアイス上で一夜搬送し，−８０℃で凍結保存した。
【０４９３】
重さ５．３グラム（湿重量）のカニクイザルの結腸の切片を５０ｍｌの円錐管に入れ，約３０ｍｌのＰＢＳで迅速に３−５回洗浄して，残留糞便物質を除去した。結腸のセグメントを取り出して非常に小さいプラスチックの秤量皿に入れ，長さ方向に切開し，管腔表面を露出させ，これを約５０ｍｌのＰＢＳで迅速に穏やかに洗浄した。１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を重層し，管腔表面上でマッサージし，１５ｍｌの円錐管に回収し，製造元の指針にしたがって総細胞ＲＮＡを単離した。簡単には，ＲＮＡ溶液を１２，０００ｘｇで遠心分離して，不溶性細胞破片を除去し，合計７００μｌの溶液を遠心管に移した。１４０μｌのクロロホルムを加え，溶液を１４，０００ｒｐｍｓ，１５分間，４℃で遠心分離した。４３０μｌの水性相を回収し，２１５μｌのイソプロパノールを加え，室温で１０分間インキュベートし，１４，０００ｒｐｍｓ，１０分間，４℃の遠心分離によりＲＮＡを沈澱させた。白色ペレットを１ｍｌの７５％エタノールで洗浄し，５−１０分間風乾し，ＲＮＡペレットを５０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。総ＲＮＡの定量は，１ＯＤ２６０＝４０μｇＲＮＡ／ｍｌの値を用いて分光学的に決定した。
【０４９４】
カニクイザルの部分ｃＤＮＡの第１鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＰＣＲ増幅に用いた合成縮重ＤＮＡプライマー（Ｇｅｎｓｅｔ，Ｉｎｃ．，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅにより製造）の配列は以下のとおりである。
ＲＴ−ＰＣＲプライマー：ＥＰＫＫＡＫＲＳ−Ｌｏｗリバースプライマー（配列番号：）
５’−ＧＴＡＴＣＧＡＴＣＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＹＴＣ−３’
ＰＣＲフォワードプライマー：ＥＫＹＷＣＫＷフォワードプライマー
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＡＲＡＡＲＴＡＹＴＧＧＴＧＹＡＡＲＴＧＧ−３’
注：”Ｒ”はＡまたはＧのプリン塩基のいずれかであることを表し；Ｙは，ＣまたはＴのピリミジン塩基のいずれかであることを表す。
ＰＣＲリバースプライマー：ＥＰＫＫＡＫ−Ｌｏｗリバースプライマー（配列番号：）
５’−ＧＴＡＴＣＧＡＴＣＸＲＴＴＸＧＣＲＴＴＲＴＴＮＧＧＲＴＣ−３’
注：”Ｎ”はＡ，Ｃ，ＧまたはＴ塩基のいずれかであることを表し；”Ｒ”は，ＡまたはＧのプリン塩基のいずれかであることを表し；”Ｙ”はＣまたはＴのピリミジン塩基のいずれかであることを表し；”Ｘ”はヌクレオチド類似体であることを表す。
【０４９５】
オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：，ＲＴ−ＰＣＲプライマー）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第１鎖合成キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに用いて，製造元の指針にしたがって，５μｇのカニクイザル総ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成した。簡単には，１００ｐｍｏｌのプライマー（配列番号：，ＲＴ−ＰＣＲプライマー）および５μｇの総ＲＮＡを１０μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応に加え，７０℃で１０分間加熱し，次に４℃に冷却した。次に，９μｌの１０ＸＲＴ緩衝液混合物をＲＴ−ＰＣＲ反応に加え，４２℃で２分間インキュベートし，次に１μｌのＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ酵素を各反応に加えた。逆転写反応は４２℃で５０分間進行させた。適切な対照反応も組立て，同時に流した。７０℃で１５分間加熱することにより反応を停止した。続くＰＣＲ増幅工程におけるＲＮＡの干渉を防止するために，１μｌのＲＮａｓｅＨを加え，反応液を３７℃で２０分間インキュベートした後，一本鎖ｃＤＮＡ物質を−２０℃で保存した。
【０４９６】
２．２．サルｐＩｇＲ配列の単離，同定および配列決定
カニクイザルｃＤＮＡ反応液の２μｌのアリコートを５０μｌのＰＣＲ反応中で用い，０．２μＭ濃度のフォワードプライマー（配列番号：，ＰＣＲフォワードプライマー）およびリバースプライマー（配列番号：，ＰＣＲリバースプライマー）を２．５ユニットのＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに用いて，部分カニクイザル二本鎖ｃＤＮＡを増幅した。増幅は，製造元の指針にしたがって行い，熱サイクル条件は以下のとおりであった：１）９４℃で１０分間の変性；２）９４℃で１分間の変性，６０℃で１分間のプライマーアニーリング，７２℃で３０秒間のプライマー伸長を３０サイクル，および３）最終の４℃保存工程。アガロースゲル電気泳動により正しいサイズの７３０ｂｐのＰＣＲ産物を確認した。全ＰＣＲ反応産物を調製用アガロースゲルに流し，７３０ｂｐの部分ｃＤＮＡフラグメントを夾雑するプライマーから分離し，Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ精製キットを用いて精製した。精製部分ｃＤＮＡフラグメントを，上述のようにして再増幅し，精製した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用するため，すべてのＰＣＲ産物は３’−Ａオーバーハングを含み，ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて容易に中間ベクター中にライゲーションした。得られたＰＣＲ産物を製造元の指針にしたがってｐＣＲ−ＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にライゲーションし，ライゲーション反応物をＴＯＰＯワンショットコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。コロニーを選択し，３ｍｌのミニ培養物を成長させ，Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてミニプレップＤＮＡを調製し，ＥｃｏＲＩ制限酵素分析によりポジティブクローンを同定した。
【０４９７】
ＥｃｏＲＩ消化により，ＰＣＲＤＮＡ産物を含む４個のポジティブクローンが同定された。２個のクローンについてマキシプレップＤＮＡを調製し（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ），ＤＮＡをＳｐ６（配列番号：，Ｓｐ６）およびＴ７（配列番号：，Ｔ７）配列決定プライマー（ＳＤＳＵ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）の両方を用いて配列決定することにより，ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドを選択し，”ｐＴＡ−ＣｙｎＭｏｎｋ−ｐＩｇＲ”と名付けた。
【０４９８】
２．３．結果
縮重オリゴヌクレオチドを用いて，サル腸組織からカニクイザルｐＩｇＲｃＤＮＡの７３０ヌクレオチド領域をクローニングした。この部分ｃＤＮＡ配列は，ドメイン５から細胞質ドメインのほとんどをコードする（ヒトｐＩｇＲ分子のアミノ酸Ｇｌｕ４７４−Ｓｅｒ７１７に対応する領域と相同，）。ヒトとカニクイザルのｐＩｇＲｃＤＮＡを比較した詳細な配列およびアライメント分析により，この２４２アミノ酸の領域（Ｇｌｕ４７４−Ｓｅｒ７１７）中で１８アミノ酸の配列が異なることが示された。サルｐＩｇＲのアミノ酸配列は図２Ｂに示される。
【０４９９】
２．４．異なる種からのｐＩｇＲホモログの配列決定
カニクイザルからのｐＩｇＲ，またはこれらの配列の一部の，それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する核酸およびポリペプチドを，種々の方法および組成物中に取り込む。カニクイザルｃＤＮＡを用いて，これらの方法および組成物の製造および使用を例示する。
【０５００】
核酸を用いて組換えＤＮＡ技術によりｐＩｇＲポリペプチドを製造する。核酸を用いて，ｐＩｇＲまたはその部分，ドメインまたは領域を取り込んだキメラリーディングフレームを生成する。キメラリーディングフレームは，融合蛋白質（例えばＧＳＴ−ドメイン６融合蛋白質），キメラ蛋白質（例えば，ラット／ウサギハイブリッドｐＩｇＲ），アミノ酸置換ポリペプチド，およびｐＩｇＲの他の誘導体，およびヒト等の動物の細胞中で発現させたときに治療的有益性を有するポリペプチドをコードする。核酸，またはこれに由来する配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて，他の種，およびその核酸が由来するものと同じ種のゲノム中に存在する蛋白質のｐＩｇＲファミリーの他のメンバーからのｐＩｇＲをコードする核酸を同定および／または増幅する。核酸のセンス鎖と逆相補である配列，または配列の一部を有する核酸はアンチセンス分子として用いることができる。記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体には，限定されないが，オリゴペプチド，蛋白質分解フラグメント，融合蛋白質，およびペプチド模倣体が含まれる。これらのポリペプチドは，治療剤であるか，および／または本発明の方法においてターゲット分子として用いられる。
【０５０１】
実施例３：他の種からのＰＩＧＲ遺伝子のクローニング
３．１．ラットｐＩｇＲｃＤＮＡのクローニング
ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をラットｐＩｇＲ配列の増幅のためのテンプレートの起源として用いた。ｐＩｇＲｃＤＮＡは，５個の別々のフラグメントとして増幅し，これを組み合わせて全ラットｐＩｇＲ配列を再生することができる（図１４を参照）。あるいは，別々にクローニングされたｃＤＮＡ中に含まれる配列を，ラット茎分子をコードする配列またはそれに由来する配列の起源として用いることができる。
【０５０２】
図１４に見られるように，ラットｃＤＮＡを増幅するために用いられるプライマーにより，サブクローニングおよび続く他の操作を容易にするために，ｃＤＮＡ中に制限酵素部位を再生または導入した。”中間ベクター”を生成するために，各フラグメントを適当な制限酵素で処理し，クローニングベクター（例えば，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＵＣ１９（ＮＥＢ））にライゲーションした。増幅されたＤＮＡの配列を確認するために，挿入されたｃＤＮＡの配列を決定した。
【０５０３】
３．２．マウスｐＩｇＲｃＤＮＡのクローニング
マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をマウスｐＩｇＲ配列の増幅用のテンプレートの起源として用いる。ラットｐＩｇＲｃＤＮＡの場合と同様に，マウスｃＤＮＡは５個の別々のフラグメントとして増幅し，これを組み合わせて全マウスｐＩｇＲ配列を生成することができる（図１２を参照）。あるいは，別々にクローニングされたｃＤＮＡ中に含まれる配列を，マウス茎分子をコードする配列またはそれに由来する配列の起源として用いることができる。図１２に見られるように，マウスｃＤＮＡを増幅するために用いられるプライマーは，サブクローニングおよびその後の他の操作を容易にするために，ｃＤＮＡ中に制限酵素部位を導入するよう設計される。”中間ベクター”を生成するために，各フラグメントを適当な制限酵素で処理し，クローニングベクター中にライゲーションする。増幅されたＤＮＡの配列を確認するために，中間ベクター中のｃＤＮＡの配列を決定する。
【０５０４】
３．３．ヒトｐＩｇＲｃＤＮＡのクローニング
ヒト結腸ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を，ヒトｐＩｇＲ配列の増幅用のテンプレートの起源として用いた。ヒトｃＤＮＡ配列を３つの別々のフラグメントとして増幅し，これを中間ベクターに挿入し，上述したように組み立てた（図１３を参照）。
【０５０５】
３．４．ウサギ／ラットキメラｐＩｇＲの構築
レトロウイルスベクターを用いるＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞におけるｐＩｇＲの発現は，Ｂｒｅｉｔｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３２：３２９−３７，１９８９）により記載されている。ウサギおよびヒトｐＩｇＲのＭＤＣＫ細胞における発現は，それぞれ，Ｂａｒｒｏｓｏ，ｅｔ  ａｌ．（ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１９９４１２４：８３−１００）およびＴａｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９５１５５：７０７１４，１９９５）に記載されている。ラットはインビボアッセイに有用であるため，最初のインビトロトランスサイトーシスアッセイには，ラットｐＩｇＲでトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞を用いた。しかし，トランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞におけるラットｐＩｇＲの発現は，ウサギｐＩｇＲでトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞で得られた結果と比較して減少していた。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが，ラットｐＩｇＲの比較的減少した発現は，ラットｐＩｇＲｃＤＮＡの中の５’非翻訳領域の異常な構造のためであろう（Ｆａｂｒｅｇａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：５３６５，２００１；Ｆｏｄｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：２１５−２５，１９９７；Ｋｏｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：１０９８−１１２，１９９５）。
【０５０６】
トランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞におけるラット様ｐＩｇＲの産生を増強させるために，キメラ蛋白質は，ラットおよびウサギｐＩｇＲｃＤＮＡ配列に対するプライマーおよび当該技術分野において知られる方法を用いて，ＰＣＲにより製造した。キメラ蛋白質は，ウサギｐＩｇＲのアミノ酸１−５５４，次にラットｐＩｇＲのアミノ酸５５３−６４５，次にウサギｐＩｇＲのアミノ酸６５１−７５６から構成される。このキメラ蛋白質はラットｐＩｇＲの貫膜および膜近傍領域を含むが，分子の残部はウサギｐＩｇＲに由来する。キメラｐＩｇＲは，ｐＩｇＲアッセイ，例えば，ＩｇＡの基底外側から先端表面へのトランスサイトーシス（フォワードトランスサイトーシス）において，野生型ウサギｐＩｇＲと同じ活性を有する。キメラｐＩｇＲ蛋白質の構造およびアミノ酸配列は，それぞれ図１５Ａおよび１５Ｂに示される。キメラ蛋白質は，発現ベクターｐＣＢ７を含む発現構築物から発現させた。
【０５０７】
実施例４：ＧＳＴ−茎融合蛋白質
４．１．ＧＳＴ−茎融合蛋白質
ＧＳＴ−茎融合蛋白質はｐＩｇＲターゲット分子の１種である。ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ，特に示さない限りＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃａ由来）ポリペプチドは，いくつかの例示的な望ましい性質を有する。これはグルタチオンに特異的に結合し，グルタチオンでコーティングした固体表面に融合蛋白質を結合させるために用いることができるような十分に高いアフィニティーを有しており，多くのそのような表面は市販されている。ＧＳＴエピトープに向けられた検出可能なように標識した抗体が市販されている。ＧＳＴアミノ酸配列は，融合蛋白質が増強された性質，例えば，増強された溶解性，生物学的に活性なコンフォメーションなどを有することを可能とする。
【０５０８】
ＧＳＴ融合蛋白質は，任意に，ＧＳＴ融合蛋白質の検出，単離，精製および操作に有用な要素を含んでいてもよい。そのような要素の非限定的例としては，６ｘＨｉｓタグ，ＦＬＡＧタグ，ｃ−ｍｙｃエピトープ，蛍光ポリペプチド（例えばＧＦＰ），検出可能な酵素的ポリペプチド（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ），またはビオチン結合ポリペプチド（例えば，アビジンまたはストレプトアビジン）ポリペプチド等の要素が挙げられる。ＧＳＴ融合蛋白質は，既知の技術により，Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ，グルタチオンカラムで精製し，固体表面に結合させることができる（例えば，Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｉｔ１６．７，”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｐｐ．１６−２８ｔｏ１６−３１，１９９２を参照）。
【０５０９】
ＧＳＴ融合蛋白質の非限定的例としては，所望の反応部位，例えば，ドメイン５およびドメイン６，ドメイン６，またはドメイン６のより小さい部分を含む茎の部分；またはｐＩｇＲおよび茎分子の任意の他の領域の部分を含むもの，例えば本明細書の表１および４に記載されるものが挙げられる。ＧＳＴ融合蛋白質中で用いられるｐＩｇＲまたは茎分子のフラグメントは，ＧＳＴ融合蛋白質の特定の用途の性質により変更することができるが，当業者は，所定のＧＳＴ融合蛋白質中にいずれのアミノ酸配列を含有させることが適当であるかを理解するであろう。表１２はＧＳＴ−茎融合蛋白質の一般的特徴をまとめたものであり，これは以下の節および図１６においてより詳細に記載する。
【０５１０】
表１２：ＧＳＴ−茎融合蛋白質
【表１７】
2005500002.tif 000023
【０５１１】
４．２．ＧＳＴ−（カニクイザル茎）融合蛋白質
カニクイザルｐＩｇＲ配列（”ｐＴＡ−ＣｙｎＭｏｎｋ−ｐＩｇＲ”，サルｐＩｇＲ配列を有するｐＣＲ−ＩＩプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体）を含むプラスミドをテンプレートとして用い，ＣｙｎＭｐＩｇＲｓｔａｌｋ−５’ＦＯＲおよびＣｙｎＭｐＩｇＲｓｔａｌｋ−３’ＲＥＶ配列決定プライマーを用いて，カニクイザルｐＩｇＲ茎領域のＰＣＲ増幅を行った。これらのプライマーにより，指向性クローニング戦略（ＢｇｌＩＩからＥｃｏＲＩへのライゲーション）を使用することが可能であり，その結果，融合蛋白質を単離するかまたはこれを固体表面に結合するために用いることができるＣ末端の６ｘＨｉｓタグを取り込ませることができる。
ＣｙｎＭｐＩｇＲｓｔａｌｋＧＳＴ５’ＦＯＲ，５’−フォワードＰＣＲプライマー，ＢｇｌＩＩ部位（下線）を含み，次の配列を有する（配列番号：）
５’−ＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＴＡＴＧＧ−３’
ＣｙｎＭｐＩｇＲｓｔａｌｋＧＳＴ３’ＲＥＶ，３’−リバースＰＣＲプライマー，インフレームの６ｘＨｉｓタグおよびＥｃｏＲＩ部位（下線）を含む（配列番号：）
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴＧＴＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣ−３’
【０５１２】
３０９ｂｐのＰＣＲフラグメントをゲル精製し，ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ酵素を用いて制限酵素で消化し，得られた３０５ｂｐのフラグメントをゲル精製した。精製したＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＢａｍＨＩおよびＥｃｏ  ＲＩで消化したｐＧＥＸ−２ＴＫ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（クローニングされたＤＮＡとインフレームで融合することができるＧＳＴをコードする核酸配列を有するプラスミド）中にクローニングした。得られたプラスミドをＤＮＡ配列分析して，ＰＣＲにより導入された変異が存在しないことを確認し，ＧＳＴおよびｐＩｇＲ配列が互いにインフレームで結合していることを確認した。
【０５１３】
４．３．他のＧＳＴ−茎融合蛋白質
ヒト，ラットおよびウサギ茎配列に由来するＧＳＴ融合蛋白質は，上述の節においてＧＳＴ−（カニクイザル茎）融合蛋白質の製造において用いた方法に本質的にしたがって製造した。１つの例外は，場合によってはそれぞれｐＩｇＲヒト，ラットおよびウサギ配列のフラグメントを含む上述のｃＤＮＡ中間ベクターから茎配列を増幅したことである。
【０５１４】
例えば，ＧＳＴ−（ウサギ茎）融合蛋白質の場合には，ウサギｐＩｇＲ配列を含むプラスミド（”ｐＧＳＴ−ＲａｂｐＩｇＲＳｔａｌｋ”）をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して，３１２ｂｐのフラグメントを得た。３１２ｂｐのフラグメントをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処理ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（クローニングしたＤＮＡとインフレームで融合することができるＧＳＴをコードする核酸配列を有するプラスミド）中にクローニングした。得られたプラスミドをＤＮＡ配列分析して，ＰＣＲにより導入された変異が存在しないことを確認し，ＧＳＴおよびｐＩｇＲ配列が互いにインフレームで結合していることを確認した。
【０５１５】
実施例５：ドメイン６およびＰＩＧＲ茎分子に向けられたリガンドの製造
５．１．リガンド用のアッセイ
アッセイは，精製ｐＩｇＲ茎分子またはＧＳＴ−ｐＩｇＲ茎分子，または他のｐＩｇＲターゲットをマルチウエル（４８ウエル，９６ウエルおよび他のサイズ）のプレートに適用して，一夜インキュベーションの間に蛋白質をプレートのウエルに接着させることにより用意する。プレートを洗浄して未結合蛋白質を除去する。免疫したマウスからの血清のサンプルを，ｐＩｇＲまたはＧＳＴ−ｐＩｇＲコーティングプレートとともにインキュベートする。１−２時間インキュベーションした後（室温で穏やかに振盪），プレートを洗浄して未反応免疫血清蛋白質を除去する。各ウエルにマウスイムノグロブリン（すなわち，ネズミイムノグロブリンのすべてのサブクラス）に対して作成されたヤギ抗体のサンプルを加えることにより，固定化ＧＳＴ−ｐＩｇＲ蛋白質と反応するマウス抗体を検出する。ヤギ抗体を検出に用いられる酵素とコンジュゲート化する。非限定的例としては，西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。未反応のヤギ抗マウスイムノグロブリンコンジュゲート化西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼをウエルから洗浄した後，西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼの基質を加える。十分に発色したら，反応を停止させ，分光光度計を用いて定量する。ポジティブウエルにおいては，ＧＳＴ−ｐＩｇＲ蛋白質に対する抗体が存在する。ＧＳＴ−ｐＩｇＲを用いる場合，これらの抗体のいくつかは蛋白質のＧＳＴ部分に向けられたものである。他のＧＳＴ融合蛋白質に対してアッセイすることにより，抗体がＧＳＴに対するものであるかまたはｐＩｇＲに対するものであるかを判定する。また，このアッセイを用いて，９６ウエルプレート中での抗体産生細胞およびクローンを同定することができ，これは所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンを単離するプロセスの一部である。
【０５１６】
ＧＳＴ−融合蛋白質上のＧＳＴ成分に結合するビーズをアッセイに用いてもよい。ビーズに結合したＧＳＴ−ｐＩｇＲを，ｐＩｇＲに対する抗体を含む血清と反応させる。次に，ｐＩｇＲと反応しこれに結合する抗体を，西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼとコンジュゲート化した抗抗体により検出することができる。ｐＩｇＲと反応する抗体がマウスに由来する場合，マウス抗体の存在を検出する抗体は別の動物種，例えばヤギまたはヒツジから得る。当業者には，所望の結果を得るために，検出抗体コンジュゲート（すなわち，抗ＦＬＡＧタグ抗体とコンジュゲート化した西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）の起源および特異性をいかにして調節するかがわかるであろう。
【０５１７】
５．２．モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）の製造
モノクローナル抗体は，ｐＩｇＲの部分（一般に，規定されたアミノ酸配列を有するオリゴペプチドとして製造される）を用いてマウスを免疫することにより作成する。例えば，ｐＩｇＲの保存領域に見いだされるアミノ酸配列（例えば表１に記載されるもの），またはホモログ間で異なるアミノ酸配列，例えば，Ｒ１，Ｒ２ａ，Ｒ２ｂ，Ｒ３ａ，Ｒ３ｂ，Ｒ３ｃ等（表４）をコードする核酸を用いて，Ｅ．ｃｏｌｉ等の宿主細胞で発現されるｐＩｇＲ−ターゲット−ＧＳＴ融合蛋白質を作成する。融合蛋白質のＧＳＴ部分を用いて融合蛋白質を単離し，精製ＧＳＴ−ｐＩｇＲ蛋白質をアジュバントと混合し，マウスに注入して免疫応答を起こさせる。免疫したマウスから定期的に血液を取り出して，イムノアッセイ，例えばＥＬＩＳＡを用いてＧＳＴ−ｐＩｇＲ融合蛋白質に向けられた抗体のレベルを測定することにより，免疫応答の程度を経時的に測定する。
【０５１８】
免疫されたマウスがＧＳＴ−ｐＩｇＲ融合蛋白質に向けられた抗体を産生することが示されれば，Ｍａｂ産生ハイブリドーマ細胞株を作成するために，ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにしたがって，マウスの脾臓を回収し，そこからの細胞を不死化融合パートナー，例えばＮＳ／１細胞株との融合用に調製する。独立して単離されたクローンおよびサブクローンを適当な密度まで成長させ，ＥＬＩＳＡを用いて細胞上清をアッセイして，各クローンまたはサブクローンがＧＳＴｐＩｇＲ融合蛋白質と反応する抗体を産生するか否かを判定する。限界希釈を用いてポジティブのウエルをアッセイし，最終的に，ＧＳＴ−ｐＩｇＲ融合蛋白質のいずれかに対するＭａｂｓを産生するクローン化またはサブクローン化細胞株を得る。
【０５１９】
ＧＳＴおよびｐＩｇＲを含まないＧＳＴ融合蛋白質に向けられた市販のモノクローナル抗体，ならびにｐＩｇＲに向けられたポリクローナル抗体を用いてアッセイし，アッセイからの結果を比較することにより，ｐＩｇＲ特異的であるか，またはｐＩｇＲまたはＧＳＴのいずれかに存在しないがその接合部に生ずるエピトープに特異的である，単離されたＭａｂを同定することが可能である。Ｍａｂｓは，ＭＤＣＫ細胞および異なる種のｐＩｇＲ（ヒト，ラット，マウス，ブタ，ウサギ，サル等）でトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞を用いて，さらに特異性について試験することができる。
【０５２０】
ｐＩｇＲドメイン６（ｐＩｇＲ茎を含む）の多くの，好ましくはすべてのエピトープに累積的に結合するモノクローナル抗体およびｓＦｖｓの収集物を調製する。各ｓＦｖｓおよびＭａｂｓは，オーバーラップオリゴペプチドの入れ子になった組（それぞれが５−２０アミノ酸を含む）を用いて，エピトープマッピングする。線形エピトープおよび確認エピトープを，その結合の強さおよび入れ子になった組の中のペプチドの位置に基づいて同定する。
【０５２１】
５．３．一本鎖抗体
ｐＩｇＲ−ターゲティング要素の１つのタイプは，トランスサイトーシス輸送分子，例えばｐＩｇＲ茎に向けられた抗体，または抗体誘導体である。非限定的例として，ｐＩｇＲアミノ酸配列の規定された領域中のエピトープに向けられた一本鎖Ｆｖ抗体フラグメント（ｓＦｖ）を用いることができる。そのようなｓＦｖ抗体の非限定的例は図３−５に示される。
【０５２２】
”ＦＬＡＧタグ”として知られるエピトープを取り込んだｓＦｖ５Ａの誘導体は”ｓＦｖ５ＡＦ”と称される（図３）。ｓＦｖ５ＡＦのアミノ酸配列は，これが構築された方法のため，ｓＦｖ５Ａに対して変異を有しており，これは”ＱＳＶ”で表される（５位のＧｌｎがＶａｌに変化）。
【０５２３】
そのカルボキシル末端の近くにシステイン残基を含むｓＦｖ５ＡＦの誘導体は”ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ”と称される（図５）。このｓＦｖ５ＡＦの誘導体は，カルボキシ末端領域にＰＣＲ突然変異誘発によりｓＦｖ５ＡＦをコードするリーディングフレーム中に導入されたシステイン残基を有する（実施例５を参照）。
【０５２４】
５．４．細胞内分子ターゲットに向けられたターゲティング要素
ｐＩｇＲのためのリガンドを提供するアミノ酸配列の別の起源は，ｐＩｇＲ茎の細胞内部分，領域またはドメインに結合するターゲティング要素である。そのようなターゲティング要素の１つの起源は，カルモジュリンとして知られる蛋白質である。カルモジュリンがｐＩｇＲに結合するという証拠があり，したがって，カルモジュリン中のアミノ酸配列がｐＩｇＲと相互作用し，これを単離してｐＩｇＲに対するポリペプチドリガンドを製造するために用いることができると予測される（Ｅｎｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２４：２２６−２３２；１９９６；Ｃｈａｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１３３５−１３４２；１９９６）。トランスゴルジネットワークのＡＰ−１クラスリンアダプター複合体は，ｐＩｇＲ茎の細胞内部分と結合することが報告されている別の蛋白質であり，したがってこれはターゲティング要素の起源として機能しうる（Ｏｒｚｅｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰ−１  Ｇｏｌｇｉ  ａｄａｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ  ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（４）：２２０１−１５，１９９９）。
【０５２５】
これらのターゲティング要素は，ｐＩｇＲ茎の細胞内部分（細胞内または細胞質ドメイン）に向けられているため，これらを含む複合体または化合物をｐＩｇＲ茎のこれらの部分に向けるためには，細胞への取り込みを促進する別の要素が必要である。ターゲティング要素は，いったん細胞内に入ると，ｐＩｇＲの細胞内部分に結合することができ，したがって，これとともに輸送される。そのような細胞取り込み要素の例としては，限定されないが，ＰＴＤおよびＭＴＳ配列が含まれる。
【０５２６】
最も活発に研究されている方法は，１０−３５アミノ酸の長さの，”蛋白質伝達ドメイン”（ＰＴＤ）または”膜輸送シグナル”（ＭＴＳ）と称される特定のクラスのペプチドを用いる。ＰＴＤは，ＨＩＶ−ＴＡＴ，ＨＳＶ−ＶＰ２２およびアンテナペディア（Ａｎｔｅｎａｐｅｄｉａ）（ペネトラチンの起源）から誘導され，高い含量の正に荷電したアルギニン（Ａｒｇ）およびリジン（Ｌｙｓ）残基を有することを特徴としており，これは，負に荷電した細胞膜脂質との接触に重要であろう（Ｓｃｈｗａｒｚｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎｔｏ ａｌｌ ｃｅｌｌｓ？，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０（７）：２９０−５，２０００；Ｓｃｈｗａｒｚｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（５４３３）：１５６９−７２，１９９９）．Ｔｈｅ  ＭＴＳ  ａｒｅ  ｖｅｒｙ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｗｈｉｃｈ  ｍａｙ  ｂｅ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ（Ｒｏｊａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６（４）：３７０−５，１９９８；Ｒｏｊａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９６．２７１（４４）：２７４５６−６１，１９９６）。場合によっては，ＰＴＤおよびＭＴＳペプチドは，これらを融合構築物として一緒にクローニングすることにより，さもなくば細胞中に入らないであろう蛋白質に膜透過性を付与することができる。
【０５２７】
ＰＴＤおよびＭＴＳ配列を組換え的に産生される蛋白質中に取り込むことを簡単にするクローニングベクターが市販されている（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。これらの配列を合成したものを用いて，本発明の複合体または化合物と共有結合的にまたは非共有結合的に会合させてもよい。ＴＡＴの場合，これらには，限定されないが，ポリ−Ａｒｇ，ポリ−Ｌｙｓ，ポリ−オルニチン，およびＡｒｇ，Ｌｙｓおよびオルニチンのポリマーが含まれる。
【０５２８】
５．５．細菌蛋白質に由来するｐＩｇＲターゲティング要素
Ｚｈａｎｇら（Ｃｅｌｌ  １０２：８２７−８３７，２０００）は，ｐＩｇＲが細菌により利用されて，細菌細胞が接着，侵入，および先端から基底外側へのトランス移動（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の高い能力を有するメカニズムを与えることを示す研究を発表した。これらの結果は，細菌の表面蛋白質に由来するｐＩｇＲ−ターゲティング要素を提供する。
【０５２９】
Ｚｈａｎｇらは，アドヘシン蛋白質ＣｐｂＡが，細菌細胞の外表面の一部として，または遊離分子として，ヒトｐＩｇＲ（ｈｐＩｇＲ）と相互作用するという証拠を示している。ＣｐｂＡ：ｈｐＩｇＲ相互作用の領域は，ＣｐｂＡに由来する一連の大きいペプチドフラグメントを用いてマッピングされた。ＣｐｂＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号０３０８７４）は，残基４５４−６６３および，Ｒ１およびＲ２（それぞれ配列番号：）と称され，それぞれ残基９７−２０３および２５９−３６５中に含まれる２つのＮ末端反復領域を含むコリン結合ドメインを含む。Ｚｈａｎｇらは，Ｒ１（１０７アミノ酸残基）およびＲ２（図１７を参照）を含むポリペプチドはｈｐＩｇＲのＳＣ部分と相互作用するが，ＣｐｂＡの残基１−１０１を含むポリペプチドはｈｐＩｇＲに結合しないことを示した。
【０５３０】
ヒトおよび動物種のｐＩｇＲと相互作用することができる能力を保持した小さいポリペプチドは，本発明においてｐＩｇＲターゲティング要素として用いることができる。そのようなポリペプチドには，上述したジスルフィド束縛ペプチドのファージディスプレイにより同定されたもの，または，限定されないが，Ｚｈａｎｇらにより記載されているＣｂｐＡｌ，ＣｂｐＡ２，およびＣｂｐＡ３ポリペプチド等のポリペプチドが含まれる。さらに，ＣｐｂＡと相同の細菌蛋白質からの他のポリペプチド，Ｚｈａｎｇらにより研究されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの肺炎双球菌アドヘシン蛋白質は，本発明の一部である。そのような相同の蛋白質は，事実上すべての肺炎双球菌血清型に存在する。当業者は，ゲノムおよび蛋白質データベース，例えば，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ，Ｅｎｔｒｅｚ，およびＧｅｎＢａｎｋから，追加の相同の蛋白質を同定することができるであろう。
【０５３１】
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ検索により，ＲｌおよびＲ２と相同の配列を有する以下の蛋白質の一覧が明らかになった（受託番号により示す）：０３０８７４，０６９１８８，０３３７４１，０３３７４２，Ｑ９ＲＱＴ５，ＡＡＦ７３７７９，ＡＡＦ７３７８１，ＡＡＦ７３７８８，ＡＡＦ７３８１４，ＡＡＦ７３７９０，Ｑ９ＲＱＴ３，Ｑ９ＲＱＴ２，ＡＡＦ７３７７６，ＡＡＦ７３７８６，ＡＡＦ７３７９２，ＡＡＦ７３７９８，ＡＡＦ７３８０７，ＡＡＦ７３８１０，ＡＡＦ７３８１２，ＡＡＦ７３８２２，ＡＡＦ７３７９５，Ｑ９ＲＱＴ６，ＡＡＦ７３７８５，Ｑ９ＺＡＹ５，Ｑ９ＲＱＴ４，Ｑ９ＲＱＴ１，ＡＡＦ７３７７７，ＡＡＦ７３７９９，ＡＡＦ７３８０１，ＡＡＦ７３８０９，ＡＡＦ７３７８４，ＡＡＦ７３８１７，ＡＡＦ７３７７８，ＡＡＦ７３８１１，ＡＡＦ７３８１３；０３３７５３，ＡＡＦ７３７８７，ＡＡＦ７３８０８，ＡＡＦ７３７７３，ＡＡＦ７３７８０，ＡＡＦ７３７９７，ＡＡＦ７３７７５，ＡＡＦ７３７９１，ＡＡＦ７３８０４，ＡＡＦ７３８１６，ＢＡＢ０１９５２，０５８２８８，Ｑ９Ｙ１０２，およびＱ５４９７２。
【０５３２】
ＣｂｐＡおよびＣｂｐＡの蛋白質ホモログの配列全体の部分，および好ましくはＲ１およびＲ２，およびＲ１およびＲ２のポリペプチドホモログの部分を含むより小さいポリペプチドは，ｐＩｇＲの動物種，好ましくはヒトｐＩｇＲに結合する能力に基づいて同定する。オーバーラップする入れ子の組のペプチドを合成し，ｐＩｇＲと相互作用するその能力を試験して，生物学的に活性なポリペプチド，例えばワクチンを上皮細胞関門に（先端のおよび基底外側のエンドサイトーシス），およびそれを越えて（フォワードまたはリバーストランスサイトーシス）輸送することができるペプチドを同定することができる。ペプチドは，（ｉ）ＳＣのｐＩｇＲコーティングビーズへの結合を妨害する能力，または（ｉｉ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６ｘによるデトロイト細胞への付着，侵襲，またはトランス移動（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を妨害する能力について試験することができる。いずれの方法もＺｈａｎｇらにより記載されている。ペプチドは，５−１００アミノ酸の長さ，好ましくは６−５０，最も好ましくは６−２０アミノ酸の長さでありうる。１−５アミノ酸，および好ましくは３−４アミノ酸のオフセットを用いることができる。３アミノ酸のオフセットを有する１５アミノ酸の長さのペプチドの入れ子のオーバーラップした組は，残基１−１５，４−１８，７−２１，１０−２４，１３−２７等（ポリペプチド配列中の最後の残基に達するまで）を含むであろう。ペプチド中の，ＣｐｂＡ中で連続しておりｐＩｇＲにポジティブな結合を示すアミノ酸を比較することにより，ｐＩｇＲに結合するのに必要なコアの直鎖配列を同定することができる。大きなペプチドは，ｐＩｇＲに対してポジティブの結合を生成する最小のペプチドが同定されるまで，系統的にそのサイズを減少させることができる。コアの直線配列を同定する方法は，Ｇｅｙｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１０２：２５９２７４，１９８７），Ｔｒｉｂｂｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１３９：１５５−１６６，１９９１），Ｇｅｙｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  １：３２−４１，１９８８），Ｔａｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５，１９８６）により記載されている。
【０５３３】
実施例６：トランスサイトーシスを行う一本鎖抗体の遺伝的操作
インビトロ遺伝子操作を用いて，反応部位においてアミノ酸の置換または挿入を有する誘導体を作成するように，ｓＦｖ５Ａのリーディングフレームを変更した。例えば，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓは，反応性Ｃｙｓ残基が挿入されているｓＦｖ５ＡＦの誘導体であり，新たに導入されたＣｙｓ残基とポリペプチドのｓＦｖ部分との間に１つのＧＧＧＧＳリンカーをも有する（図３−５を参照）。Ｃｙｓ残基は側鎖−ＳＨを含み，これは別のＣｙｓ残基の−ＳＨ側鎖と反応して，２つのＣｙｓ残基および各Ｃｙｓが結合しているアミノ酸を連結するジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を形成することができる。ｓＦｖ誘導体中のＣｙｓ残基の位置は，これが同じ分子中のＣｙｓ残基と反応するか（すなわち，分子内ジスルフィド結合を有するモノマーを生成する），または別のｓＦｖ分子中のＣｙｓ残基と反応するか（すなわち，分子間ジスルフィド結合を有する多量体ｓＦｖ分子を生成する）について影響を及ぼす。
【０５３４】
６．１．ｓＦｖ５ＡＦへのシステイン残基の導入
カルボキシ末端領域にシステイン残基を導入するために，ｓＦｖ一本鎖分子ｓＦｖ５ＡＦをＰＣＲ変異誘発により変更した。テンプレートである，ｓＦｖ５ＡＦをコードするｐＳｙｎ発現ベクターを，ｐＳｙｎ中のｓＦｖ５ＡＦコーディング領域の５’側の領域に相補的な配列（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＧＡＣ−３’，配列番号：）を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー”ＬＭＢ３”，および配列：
５’−ＡＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴ−３’（配列番号：）
を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマー”シス−ロング”を用いて増幅した。
【０５３５】
後者のプライマーは，ｓＦｖ５ＡＦの最後の４コドンに相補的であり，プライマーの５’末端はｓＦｖ５ＡＦとインフレームでアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＣをコードし，次にＮｏｔＩ制限部位を有する。
【０５３６】
増幅は，Ｔａｑ−プラスプレシジョンポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて，製造元の指針にしたがって実施した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで切断し，ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで切断したｐＳｙｎ発現ベクターＤＮＡ中にライゲーションした。得られた発現構築物はｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓをコードし，これは，アミノ末端からカルボキシ末端の方向に，ｐｅｌｂリーダー配列（Ｅ．ｃｏｌｉ中における分泌用），およびＦＬＡＧエピトープタグ（いずれもベクター配列によりコードされる）；ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ，すなわち，重鎖可変領域，スペーサー配列［ＧＧＧＧＳ，３回反復，すなわち，（Ｇ４Ｓ）３］，軽鎖可変領域，別の（Ｇ４Ｓ）３リンカー，ｓＦｖ５ＡＦに対してｓＦｖ中に挿入されているシステイン残基（太字の”Ｃ”）；およびベクター配列によりコードされるｃ−ｍｙｃエピトープおよび６ｘＨｉｓタグを有する（図４を参照）。
【０５３７】
任意の蛋白質，例えば，一本鎖抗体ｓＦｖ５Ａおよびその誘導体（ｓＦｖ５ＡＦ，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ等）のアミノ酸配列はヌクレオチド配列のリーディングフレームによりコードされる。インビトロでの遺伝的操作を用いて，ダイマー，トリマーおよび他の多量体の形成を有利にするようにｓＦｖ５Ａのアミノ酸配列を変更して，ｓＦｖ５Ａの所望の特性を加えるかまたは増強し，および／または望ましくない特性を減少または除去する。
【０５３８】
６．２．ｓＦｖ５Ａへのシステイン残基の導入
カルボキシ末端領域のｍｙｃ−６ｘＨｉｓ−タグ（図４）をＧＧＧＧ−ＣｙｓＣ末端テールで置き換えるために，ＰＣＲ増幅によりｓＦｖ一本鎖分子ｓＦｖ５Ａを変更した。この構築物のために，Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて，製造元の指針にしたがってＰＣＲ増幅反応を組み立てた（１ｘＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ緩衝液，各０．２ｍＭのｄＮＴＰ，２ｍＭのＭｇＳＯ４，各０．２μＭのプライマー，２．５ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ，および必要なテンプレートＤＮＡ；これは初期段階の非特異的プライミング事象の発生を最小とする”ホットスタート”ＰＣＲを可能とする）。増幅は，ＲｏｕｘおよびＨｅｃｋｅｒ（ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐｐ．３９−４５）から適合させた改変法を用いて行った。すなわち，ＰＣＲプログラム中のリンクしたファイルを用いて熱サイクリング反応を以下のように行った：１）９４℃で１０分間の変性；２）９４℃で１分間の変性，６０℃で１分間のプライマーアニーリング，７２℃で６０秒間のプライマー伸長を３０サイクル，および３）最後の４℃の冷却工程（分析するまで）。アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズを確認し，次にスピンカラムクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ精製キット）により，夾雑するプライマーから精製した。
【０５３９】
テンプレートである，ｓＦｖ５ＡをコードするｐＳｙｎ発現ベクターを，ｐＳｙｎ５Ａベクター中のｐｅｌｂ−コーディング配列の５’−部分に相補的な”フォワード”オリゴヌクレオチドプライマー，”Ｐｅｌｂ−５フォワード，”（配列番号：），および以下に示す配列を有する”ｐＳｙｎＧ４Ｃｙｓアンチセンス”，”リバース”オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
Ｐｅｌｂ−５’フォワードプライマー（配列番号：）
５’−ＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣ−３’
ｐＳｙｎＧ４Ｃｙｓアンチセンスリバースプライマー（配列番号：）
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＴＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’
【０５４０】
後者のプライマーは，ｓＦｖ５Ａコーディング領域のＣ−末端に近い７コドンに相補的であり，プライマーの５’末端は，ＮｏｔＩ制限部位，次にｓＦｖ５Ａとインフレームのアミノ酸配列ＧＧＧＧＣ，次に２つのタンデムＴＡＧ停止コドン，およびＥｃｏＲＩ制限部位をコードする。
【０５４１】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し，次にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＳｙｎ発現ベクターＤＮＡ中にライゲーションした。得られた発現構築物はｓＦｖ５Ａ−Ｇ４Ｃｙｓをコードし，これは，アミノ末端からカルボキシ末端方向に，ベクター配列によりコードされるｐｅｌｂリーダー配列（Ｅ．ｃｏｌｉ中での分泌用）；ｓＦｖ５Ａ−Ｃｙｓ，すなわち，重鎖可変領域，スペーサー配列［ＧＧＧＧＳ，３回反復，すなわち（Ｇ４Ｓ）３］，軽鎖可変領域，別のＧ４Ｓリンカー，およびＣ末端システイン残基（ｓＦｖ５Ａに対してｓＦｖ中に，図５に示されるベクター配列によりコードされるｃ−ｍｙｃエピトープおよび６ｘＨｉｓタグを置き換えて導入された）を含む。
【０５４２】
６．３．ｓＦｖ５ＡおよびｓＦｖ５ＡＦへのＣ−末端システイン残基の導入
ｓＦｖ一本鎖分子ｓＦｖ５ＡおよびｓＦｖ５ＡＦは，ＮｏｔＩ制限部位を除去し，カルボキシ末端領域のｍｙｃ−６ｘＨｉｓ−タグをＧＧＧＧ−ＣｙｓＣ末端テイルで置き換えるために，ＰＣＲ増幅により変更した。この構築物のためには，ＰＣＲ増幅反応は，Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて，上述するように製造元の指針にしたがって組み立てた。
【０５４３】
テンプレートである，ｓＦｖ５ＡをコードするｐＳｙｎ発現ベクターは，”フォワード”オリゴヌクレオチドプライマー，”Ｐｅｌｂ−５フォワード”（配列番号：），ｐＳｙｎ５Ａベクター中のｐｅｌｂ−コーディング配列の５’−部分に相補的），および”５Ａ−（ｄｅｌｔａＮ）Ｇｌｙ４−Ｃｙｓ”，”リバース”オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：）を用いて増幅した。これらの配列は以下に示す。
Ｐｅｌｂ−５’フォワードプライマー（配列番号：）
５’−ＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣ−３’
５Ａ−（ｄｅｌｔａＮ）Ｇｌｙ４−Ｃｙｓ  リバースプライマー（配列番号：）
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’
【０５４４】
後者のプライマーは，ｓＦｖ５Ａコーディング領域の７個のＣ末端コドンに相補的であり，次にｓＦｖ５Ａとインフレームのアミノ酸配列ＧＧＧＧＣ，次に２つのタンデムＴＡＧ停止コドン，および順番にＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含む。
【０５４５】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し，次にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＳｙｎ−ＳＡまたはｐＳｙｎ−ＳＡＦ発現ベクターＤＮＡのいずれかにライゲーションした。得られる発現構築物は，それぞれｓＦｖ５Ａ−（ｄｅｌｔａＮ）Ｇｌｙ４−ＣｙｓまたはｓＦｖ５ＡＦ−（ｄｅｌｔａＮ）Ｇｌｙ４−Ｃｙｓをコードする。アミノ酸配列は，アミノ末端からカルボキシ末端方向に，ｐｅｌｂリーダー配列（Ｅ．ｃｏｌｉにおける分泌用）プラス／マイナスベクター配列によりコードされるＦＬＡＧエピトープタグ；ｓＦｖ５Ａ−Ｃｙｓ，すなわち，重鎖可変領域，スペーサー配列［ＧＧＧＧＳ，３回反復，すなわち（Ｇ４Ｓ）３］，軽鎖可変領域，別のＧ４Ｓリンカー，およびＣ末端システイン残基（ｓＦｖ５Ａに対してｓＦｖ中に，図４に示されるベクター配列によりコードされるＮｏｔＩ制限部位およびｃ−ｍｙｃエピトープおよび６ｘＨｉｓタグを置き換えて導入された）を含む。
【０５４６】
６．４．リンカーの長さ，組成および数
一緒になってリガンド結合部位を形成するｓＦｖの２つの可変領域は，Ｖ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）として知られる。モノマーｓＦｖにおいては，各分子のＶ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）は互いに会合している。ダイマーｓＦｖの１つのタイプにおいては，１つのモノマーのＶ（Ｈ）［Ｖ（Ｈ）１］がもう１つのモノマーのＶ（Ｌ）［Ｖ（Ｌ）２］と会合しているか，その逆である［すなわち，Ｖ（Ｈ）２がＶ（Ｌ）１と会合している］。
【０５４７】
ｓＦｖのＶ（Ｈ）領域とＶ（Ｌ）領域との間のリンカーの長さおよび組成は，ｓＦｖがモノマーまたはマルチマーを形成する傾向に影響を及ぼす１つの因子である（Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ，ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１  Ｆｅｂ  １；２４８（１−２）：４７−６６；Ａｒｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｉｍｅｒ  ｔｏ  Ｍｏｎｏｍｅｒ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ”，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３７，ｐｐ．１２９１８−１２９２６）。例えば，Ｖ（Ｈ）領域とＶ（Ｌ）領域との間に比較的短いリンカーを有するｓＦｖ分子は，あまりそれ自身とはフォールディングされずに，モノマーを形成する。すなわち”短いリンカーの”ｓＦｖ誘導体は，そのＶ（Ｈ）領域およびＶ（Ｌ）領域がそれぞれ第２のｓＦｖ分子のＶ（Ｌ）領域およびＶ（Ｈ）領域と対を形成しなければならないため，しばしば，ダイマーを形成しやすい。Ｖ（Ｈ）領域とＶ（Ｌ）領域との間に比較的長いリンカーを有するｓＦｖ誘導体は，しばしば，それ自身とフォールディングされ，したがって，モノマーを形成する傾向が大きい。しかし，Ｖ（Ｈ）とＶ（Ｌ）との間に長いリンカーを有するある種のｓＦｖ誘導体は，マルチマーを形成する傾向を有するかもしれない。
【０５４８】
ｓＦｖ５ＡのＶ（Ｈ）領域とＶ（Ｌ）領域との間のリンカーの数を変更して，１組のｓＦｖ誘導体を生成し，これを所望の特性についてスクリーニングおよびアッセイする。すなわち，モノマーまたはマルチマーのいずれを形成する能力を有するかについてｓＦｖ５Ａ誘導体をアッセイし，マルチマー型を分析して，ダイマー，トリマー等，またはそれらの混合物のいずれが存在するかを決定する。絶対的な意味で，ならびに，変更されていないｓＦｖ５Ａ分子との比較の意味で，傍細胞輸送およびトランスサイトーシス輸送特性，薬物動態学的，安定性等を決定するために，誘導体について，アッセイ（例えば本明細書に記載される非限定的例のアッセイ）を実施する。
【０５４９】
種々のアミノ酸配列が本発明の化合物において適当なスペーサーとして働きうることが知られている（概説として，Ｓｉｍｏｎｓ，Ｓｐａｃｅｒｓ，ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｙｉｅｌｄｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ１９９９Ｊａｎ−Ｆｅｂ；１０（１）：３−８を参照）。ｓＦｖにおいて用いられた配列の非限定的例としては，ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ，１またはそれ以上のコピーのＧＧＧＧＳ［（Ｇ４Ｓ）Ｘとしても知られる］（Ｎｅｗｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｏｎｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｓｐａｃｅｒｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６  Ｊａｎ１６；３５（２）：５４５−５３），ＧＳＧＳ［（ＧＳＧＳ）ｘとしても知られる］およびＧＳＳＧ［（ＧＳＳＧ）ｘとしても知られる］である。
【０５５０】
重鎖および軽鎖［それぞれＶ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）］をＰＣＲ増幅により別々に生成するオーバーラップＰＣＲ手法を用いて，存在するリンカー配列ＧＧＧＧＳの繰り返しの数が異なる，Ｖ（Ｈ）からＶ（Ｌ）への距離が異なる種々のｓＦｖ５Ａ誘導体を製造する。Ｖ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）のＰＣＲ産物はそれぞれその３’および５’末端にオーバーラップする相補的配列を含むように設計する。ＰＣＲ産物を混合し，９５℃に加熱してＤＮＡを溶融させ，次に５８℃に冷却して，相補的オーバーラップリンカー（異なる長さ）配列を介して２つの産物をアニーリングさせる。アニーリングさせ連結したＰＣＲ産物は，次に，それぞれＶ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）の５’および３’配列に相補的なプライマーセットを用いる第２ラウンドのＰＣＲ増幅のための全長重軽鎖ＤＮＡテンプレートとして働く。ＰＣＲ増幅により，重鎖と軽鎖との間に取り込まれた異なるリンカー長さを有する全長ｓＦｖが得られる。
【０５５１】
親のｓＦｖは，ｐＳｙｎ５Ａ，ｐＳｙｎ−５ＡＦまたはｐＳｙｎ−５ＡＦ−Ｃｙｓのいずれかであった（図３および４）。ｓＦｖ５ＡＦおよびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓは，そのＶ（Ｈ）とＶ（Ｌ）との間に３つの反復リンカー，すなわち，（ＧＧＧＧＳ）３を有する。１つのリンカー（ＧＧＧＧＳ），４つのリンカー，すなわち（ＧＧＧＧＳ）４および５つのリンカー，すなわち（ＧＧＧＧＳ）５を有する誘導体を製造した。２つのリンカーを有する誘導体は同様にして製造することができる。
【０５５２】
種々のＣ末端リンカー配列を有する重鎖領域を生成するために，テンプレート（ｓＦｖ５ＡまたはｓＦｖ５ＡＦをコードするｐＳｙｎ発現ベクター）を，ｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦベクターの両方においてｐｅｌｂ−コーディング配列の５’−部分に相補的な”フォワード”オリゴヌクレオチドプライマー，”Ｐｅｌｂ−５フォワード”，（配列番号：），およびリンカーＧＧＧＧＳ（配列番号：），（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号：）または（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号：）のいずれかとインフレームである５Ａ重鎖可変配列の８個のＣ末端コドンに対応する”リバース”オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。配列は以下に示される。
【０５５３】
種々の長さのＣ末端リンカーを有する重鎖領域を生成するために，以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
Ｐｅｌｂ−５’フォワードプライマー（配列番号：）
５’−ＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣ−３’
１個のＧＧＧＧＳリンカー：５Ａ−ＧＳ−１リバースプライマー（配列番号：）
５’−ＴＧＡＣＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣ−３’
（ＧＧＧＧＳ）４リンカー：５ＡＡＧＳ４−Ｓ２／Ｇリンカーリバースプライマー（配列番号：）
５’−ＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＣＣ−３’
（ＧＧＧＧＳ）５リンカー：５ＡＡＧＳ５−Ｓ２／Ｇリンカーリバースプライマー（配列番号：）
５’−ＧＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＣＣ−３’
【０５５４】
種々のＮ末端リンカー配列を有する軽鎖領域を生成するために，テンプレートであるｓＦｖ５ＡをコードするｐＳｙｎ発現ベクターを，”リバース”オリゴヌクレオチドプライマー，”５Ａ−Ｓａｌ−Ｈ６−Ｓａｌ，Ｘｈｏ，Ｅｃｏリバースプライマー”（配列番号：）を用いて増幅した。じれがｍｐＳｙｎ５Ａベクター中の５Ａ軽鎖可変配列の８個のＣ末端コドンに相補的であり，ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限部位，６ｘＨｉｓエピトープタグ，ＳａｌＩ部位，タンデムＴＡＧ停止コドン，およびＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位をコードする配列とインフレームである。このリバースプライマーを，５Ａ軽鎖可変配列の８Ｎ末端コドンとインフレームのリンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号：），（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号：）または（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号：）のいずれかに対応する３つの”フォワード”オリゴヌクレオチドプライマーの１つとともに用いた。配列は以下に示される。
【０５５５】
以下のオリゴヌクレオチドを用いて，種々のＮ末端リンカー長さを有する軽鎖領域を生成した：
５Ａ−Ｓａｌ−Ｈ６−Ｓａｌ，Ｘｈｏ，Ｅｃｏリバースプライマー（配列番号：）
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’
１個のＧＧＧＧＳリンカー：５Ａ−ＧＳ−１フォワードプライマー（配列番号：）
５’−ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＣＴ−３’
（ＧＧＧＧＳ）４リンカー：ＡＧＳ−４５Ａ−リンカーフォワードプライマー（配列番号：）
５’−ＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＣＣＣ−３’
（ＧＧＧＧＳ）５リンカー：ＡＧＳ−５５Ａ−リンカーフォワードプライマー（配列番号：）
５’−ＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＣＣＣ−３’
【０５５６】
上述した重鎖および軽鎖を生成するために，プルーフリーディング用のＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて，製造元の指針にしたがって（１ｘＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ  ＰＣＲ緩衝液，０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ，０．１μＭの各プライマー，２．５ユニットのＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，および必要なテンプレートＤＮＡ），ＰＣＲ増幅反応を組み立てた。これは，初期の非特異的プライミングが生ずることを最小にするための”ホットスタート”ＰＣＲを可能とする。増幅は，ＲｏｕｘおよびＨｅｃｋｅｒにより適用された改変方法を用いて上述のようにして行った（ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐｐ．３９−４５）。ＰＣＲ産物のサイズをアガロースゲル電気泳動により確認し，次に，スピンカラムクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ精製キット）により夾雑するプライマーから精製した。
【０５５７】
個々の重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物を精製した後，各５０ｎｇの対応するフラグメントを混合し，Ｐｅｌｂ−５’フォワード（配列番号：）および５Ａ−Ｓａｌ−Ｈ６−Ｓａｌ，Ｘｈｏ，Ｅｃｏリバース（配列番号：）プライマーを用いる第２ラウンドのＰＣＲ増幅に供した。上述のように，ＰｒｏｏｆＳｔａｒ  ｔＤＮＡポリメラーゼを５０μｌの反応液で用いたが，ただしアニーリング工程は５８℃で行った。１個のＧＧＧＧＳリンカー，または（ＧＧＧＧＳ）４または（ＧＧＧＧＳ）５リンカーのいずれかにより隔てられた重鎖および軽鎖可変領域を含む全長ＰＣＲ産物をゲル精製し，ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ，またはＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩのいずれかで消化した。
【０５５８】
１個のＧＧＧＧＳリンカー，または（ＧＧＧＧＳ）４および（ＧＧＧＧＳ）５リンカーのいずれかを含む第２工程の全長ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し，次に，ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断した誘導化されたｓＦｖ５Ａ発現ベクターＤＮＡのいずれかにライゲーションした（例えば，ｐＳｙｎ−５Ａ，ｐＳｙｎ−５ＡＦ，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｇ４Ｃｙｓ，ｓＦｖ５Ａ−（ｄｅｌｔａＮ）Ｇｌｙ４−Ｃｙｓ，ｓＦｖ５ＡＦ−（ｄｅｌｔａＮ）Ｇｌｙ４−Ｃｙｓ）。得られる発現構築物は，１個のＧＧＧＧＳ，（ＧＧＧＧＳ）４または（ＧＧＧＧＳ）５の代替リンカーを重鎖と軽鎖可変領域の間に含み，親ベクターのＣ末端アミノ酸を完全に保持するｓＦｖ５Ａ誘導体をコードする。ＮｃｏｌおよびＥｃｏＲＩで切断した，種々の型のリンカーについて得られる発現構築物は，重鎖および軽鎖可変領域とＣ末端６ｘＨｉｓエピトープタグとの間に代替のリンカーを有するであろう。アミノ酸配列は，アミノ末端からカルボキシ末端方向に，ｐｅｌｂリーダー配列（Ｅ．ｃｏｌｉ中での分泌用）プラス／マイナスベクター配列によりコードされるＦＬＡＧエピトープタグ；ｓＦｖ５Ａ−Ｃｙｓ，すなわち，重鎖可変領域，ＧＧＧＧＳ，（ＧＧＧＧＳ）４または（ＧＧＧＧＳ）５のリンカー領域，軽鎖可変領域；および，Ｃ末端にＣ末端Ｃｙｓまたは１個の６ｘＨｉｓエピトープタグのいずれかを含む。
【０５５９】
ｓＦｖ５ＡおよびｓＦｖ５ＡＦ誘導体は，Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞で発現させ，ｓＦｖ５ＡＦについて用いたものと同じ手法および材料を用いて細菌細胞のペリプラズム空間から調製する。モノマーおよび存在する場合にはダイマーおよび他のマルチマーは，実施例および本明細書に記載されるように製造し分離する。
【０５６０】
同様にして，５から３０リンカーを有する誘導体を調製する。他のｓＦｖ５Ａ誘導体は，種々の数の他のリンカーを有していてもよい。任意の数または種類のリンカーをｓＦｖ誘導体に取り込ませて，これを製造し所望の特性について試験することができる。ｓＦｖ配列（Ｖ（Ｈ）とＶ（Ｌ）を合わせた配列）と他の要素との間の間隔は，種々の特性のために変更することができる。例えば，特定の精製戦略または意図される用途に応じて，ポリペプチド精製または検出可能な要素，または反応性基の位置を，融合蛋白質のｓＦｖ部分から遠くにまたは近くになるよう変更することが望ましいであろう。
【０５６１】
実施例７：モノマー型およびダイマー型ｓＦｖ５ＡＦ−ＣＹＳ分子の精製および評価
７．１．ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの還元
モノマー性ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの調製物を，ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度１０ｍＭで加え，２５℃で３０分間インキュベートすることにより還元した。
【０５６２】
反応において用いたＤＴＴの濃度（１０ｍＭ）は，これがｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ分子中のジスルフィドの定量的還元を引き起こさないために選択した。むしろ，これは内部システイン残基間のジスルフィドを還元せずに，Ｃ末端システインのジスルフィド結合を還元するのに十分である。これは，ｓＦｖダイマーの形成には不利であるが，ｓＦｖ分子の天然の構造およびこれに依存する生物学的活性を保持することを可能とする。
【０５６３】
７．２．サイズ排除クロマトグラフィー
モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ分子を，サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により，１ｘ４４ｃｍ  スーパーデックス７５カラムで，１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１ＭＰＯ４，ｐＨ６．２５で，ダイマーから（および存在する場合にはより高いマルチマーから）分離した。画分２９−３４をダイマーとして回収し，画分３８−４３をモノマーとして回収した。
【０５６４】
７．３．トランスサイトーシスアッセイの設計
アッセイは，図１８に示すトランスウエルシステムにおいて行った。細胞を先端のコンパートメントと基底外側のコンパートメントとを分離する多孔質膜上で成長させる。試験すべき複合体および化合物を先端のコンパートメントに入れ，次に基底外側のコンパートメントからサンプルを取り出すことによりアッセイする。正常なＩｇＡ輸送の方向は，基底外側から先端である。しかし，本発明の好ましい複合体および化合物は，”リバース”（先端から基底外側への）トランスサイトーシスを行う。
【０５６５】
複合体または化合物をトランスウエルの先端のコンパートメントに入れ，ある時間の経過後，先端のコンパートメントからのサンプルおよび基底外側のコンパートメントからのサンプルを取り出し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する。ゲル電気泳動後，蛋白質をＰＶＤＦ膜に移し，これをウエスタンブロットとして，ポリクローナル抗ｓＦｖ抗体，または試験している複合体または化合物中のエピトープに対する抗体で探索し，次に，ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート，トルイジン塩（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を用いて抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼを検出する。抗ｓＦｖ５Ａを用いるウエスタンブロッティングは，ｓＦｖが本発明の組成物または化合物の一部として存在していても，または”遊離”ｓＦｖ分子として存在していても，ｓＦｖを含むあらゆる分子種を検出する。
【０５６６】
対照（トランスフェクトされていない）ＭＤＣＫ細胞は有意なレベルのｐＩｇＲを含まないかまたは全く含まない。したがって，これらの細胞においては，ｐＩｇＲまたは茎を標的とする複合体または化合物のトランスサイトーシスが観察されないと予測される。すなわち，先端のコンパートメントのサンプルはこれに加えられた複合体または化合物を含むであろうが，基底外側のコンパートメントのサンプルはｓＦｖまたはそのコンジュゲートを示さないはずである。
【０５６７】
これに対し，ｐＩｇＲまたは茎分子，またはこれらの誘導体をコードしこれを発現する発現構築物でトランスフェクトしＭＤＣＫ細胞は，ｐＩｇＲ特異的トランスサイトーシスの能力を有する。これらの細胞においては，先端のコンパートメントから基底外側のコンパートメントへのトランスサイトーシスが観察されると予測される。したがって，分子がトランスサイトーシス可能であれば，複合体または化合物に対応するバンドが基底外側のコンパートメントに存在するであろう。
【０５６８】
典型的には，ｐＩｇＲまたは茎分子（またはこれらの誘導体）を発現するＭＤＣＫ細胞，または対照（トランスフェクトしていない）ＭＤＣＫ細胞の４日間培養物を，トランスウエルトランスサイトーシスチャンバの先端のチャンバ中で，１０ｎｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの試験すべき複合体または化合物の存在下でインキュベートする。細胞は，種々の時間，典型的には，特に記載しない限り，約２０時間インキュベートする。
【０５６９】
インキュベーション期間の終了後，先端のチャンバおよび基底のチャンバの両方を回収する。典型的には，先端のチャンバからの培地の容量の１／３，および基底のチャンバからの培地のすべてを，プロテインＡ−セファロースビーズとともにインキュベートする。プロテインＡは，ＩｇＧ分子のＦｃ領域に結合し，そのＶＨＩＩＩドメインを介してある種のｓＦｖに結合する（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７７（１−２）：１５１−１６３，１９９４）。プロテインＡに結合するｓＦｖは，培養培地または他の起源から，プロテインＡマトリクス（例えば，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能なもの等）のアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。プロテインＡはｓＦｖ５およびその誘導体に結合するが，これはある種のｓＦｖ，例えば本発明の化合物において用いることができる他のｓＦｖには結合しない。しかし，結合スペクトルの範囲が増加したプロテインＡ誘導体が知られている（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬＡ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−  ａｎｄ  Ｆａｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５８（２）：８９０−８９６，１９９８）。さらに，免疫沈澱をプロテインＡの代わりに用いることができる。例えば，ｓＦｖ５およびその誘導体に向けられたポリクローナル抗体を用いてｓＦｖ５分子を免疫沈澱させることができる。
【０５７０】
ビーズを洗浄し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁し，蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する。蛋白質をＰＶＤＦに移し，ポリクローナル抗−ｓＦｖ抗体（または本明細書に記載されるような適当な他の抗体）を用いて膜のウエスタンブロットを行い，次に，例えば抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼおよび呈色基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰで検出する。
【０５７１】
実験によっては，ダイマー型のｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓはダブレットとして流れる。これはおそらくは，ｃ−ｍｙｃエピトープおよびＨｉｓタグアミノ酸配列を含むカルボキシ末端ポリペプチドの欠失によるものであろう。ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓダイマーを蛋白質のカルボキシ末端に位置するｃ−ｍｙｃタグ中のエピトープに向けられたモノクローナル抗体（９Ｅ１０，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で探索すると，ダブレットの小さい方のバンドは検出されない。
【０５７２】
７．４．トランスサイトーシスアッセイ
ｓＦｖ５ＡＦ（モノマー）およびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ（モノマーおよびダイマー）のトランスサイトーシス輸送特性を，ＭＤＣＫ細胞において評価および比較した。図１９に示されるように，ｓＦｖ５ＡＦはｐＩｇＲ依存性様式で先端の培地から基底外側の培地へ効率よくトランスサイトーシスされた。すなわち，ｐＩｇＲでトランスフェクトされこれを発現するＭＤＣＫ細胞ではｓＦｖ５ＡＦのリバーストランスサイトーシスが生じたが，トランスフェクトしていない細胞では生じなかった。
【０５７３】
モノマーおよびダイマーの両方を含むｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの調製物のトランスサイトーシスも評価した。結果は図２０に示される（パネル”Ｄ”および”Ｈ”；ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓモノマーは，Ｃｙｓ残基およびＧＧＧＧＳリンカーが付加されているためｓＦｖ５ＡＦのモノマーよりわずかに大きい見かけ上の分子量を有することに注意されたい）。モノマーおよびダイマー型のｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ分子のトランスサイトーシスはｐＩｇＲ特異的であった。ｐＩｇＲを発現する細胞の基底外側の培地中の１６および２４時間におけるダイマーおよびモノマーバンドの強度の比較は，これらの時点において，モノマーと比較してより多くのダイマーがトランスサイトーシスされたことを示す。
【０５７４】
７．５．トランスサイトーシスの経時変化
ｓＦｖ５ＡＦのモノマーとダイマーとの混合物を，ｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞において，上述のようにして所定の時間アッセイした。選択された時間は，先端のチャンバに物質を導入した後，０−２，２−４，４−６，６−８，８−１２および１２−２４時間であった。
【０５７５】
結果を図２１に示す。ダイマーを示すダブレットのバンドは，モノマーより早い速度で先端から基底外側へのトランスサイトーシスを示した。いずれの種のトランスサイトーシスも，経時的には比較的一定であった。
【０５７６】
７．６．フォワードおよびリバーストランスサイトーシスの比較
一本鎖抗体ｓＦｖ５ＡＦ−ＣｙｓをｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞または対照ＭＤＣＫ細胞のいずれかの先端のコンパートメントまたは基底外側のコンパートメントに濃度６μｇ／ｍｌで適用した。１６時間後，先端の培地および基底外側の培地を回収し，リガンドを加えた側の容量の１０％，およびトランスサイトーシスされたリガンドを示す側の容量の１００％を，プロテインＡセファロースを用いてアフィニティー精製し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ｓＦｖ５ＡＦポリクローナル抗血清を用いるウエスタンブロッティングに供した。すなわち，先端のレーンおよび基底外側のレーンにおける等しい強度のバンドは，１０％のトランスサイトーシスを示す。
【０５７７】
精製したｓＳＡＦ−Ｃｙｓモノマーおよびダイマーを，ｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞または対照（ｐＩｇＲネガティブ）ＭＤＣＫ細胞を含むトランスウエルの先端のチャンバに加えた。３７℃で１６時間後，基底外側の培地の１００％および先端の培地の１０％を，本質的に上述したように，蛋白質Ａプルダウン，還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，および抗ｓＦｖ５ＡＦ抗血清を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。還元剤（ベータ−メルカプトエタノール）を加えることにより，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ分子間の共有結合性のジスルフィド結合が切断される。すなわち，すべてのｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ種は，これらが還元前にモノマーまたはダイマーのいずれであっても，モノマーの位置に移動する傾向を示す。
【０５７８】
結果を図１９に示す。ｐＩｇＲを発現する細胞の先端のレーンと基底外側のレーンとを比較するとわかるように，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓダイマーの約１０％がトランスサイトーシスされた，モノマーの５％未満がトランスサイトーシスされた。対照ＭＤＣＫ細胞はダイマーまたはモノマーの有意なトランスサイトーシスを示さなかった。
【０５７９】
別の実験においては，ｓＦｖ５ＡＦＣｙｓダイマーおよびモノマーの基底外側から先端の（フォワード）トランスサイトーシスを実験した。ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓダイマーのフォワードトランスサイトーシスは１０％未満であり，モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓのトランスサイトーシスは検出不可能であった。
【０５８０】
実施例８：成長ホルモン（ＧＨ）ポリペプチドを含む融合蛋白質の製造
８．１．ヒト成長ホルモンをコードする核酸の調製
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードするＤＮＡ分子を調製するために，２段階クローニング法を用いる。第１工程においては，ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列（図２２；配列番号：）をＰＣＲにより増幅し，制限エンドヌクレアーゼで処理し，これをＴ４リガーゼを用いて中間クローニングベクター中に挿入する。ＰＣＲ増幅反応は，Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて，製造元の指針にしたがって組み立てる（１ＸＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ緩衝液，各０．２ｍＭのｄＮＴＰ，２ｍＭのＭｇＳＯ４，各０．２μＭのプライマー，２．５ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ，および必要なテンプレートＤＮＡ）。これは初期の非特異的プライミング事象の発生を最小限にする”ホットスタート”ＰＣＲを可能とする。増幅は，Ｒｏｕｘ  ａｎｄ  Ｈｅｃｋｅｒ（ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐｐ．３９−４５）の方法から改変した方法を用いて実施する。熱サイクリング反応は，ＰＣＲプログラム中のリンクしたファイルを用いて，以下のように行う：（１）９４℃で１０分間の変性；（２）変性，１分間，９４℃，プライマーアニーリング，１分間，６０℃，およびプライマー伸長，６０秒間，７２℃を３０サイクル；および（３）分析するまで４℃で冷却。ＰＣＲ増幅工程は，商業的供給源から購入したヒトｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ヒト下垂体ＨＬ１１３９ａまたはＨＬ１１３９ｂ）からｈＧＨｃＤＮＡ配列を増幅するよう設計されたプライマーを用いて行い，ｓＦｖ融合蛋白質をコードする発現構築物（例えば，ｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎＳＡＦ）の５’（アミノ末端）または３’（カルボキシ末端）のいずれかに挿入する。
【０５８１】
ＰＣＲ産物のサイズをアガローススラブゲル電気泳動により確認し，次にスピンカラムクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ精製キット）によりＰＣＲ産物を夾雑するプライマーから精製する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いるため，すべてのＰＣＲ産物は３’−Ａオーバーハングを含み，ｐＣＲ−ＴＯＰＯ中間ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に容易にライゲーションすることができる。あるいは，ＰＣＲ産物を適当な制限酵素で消化し，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にライゲーションして中間クローニングベクターを作成する。
【０５８２】
中間ベクターを用いて，ＤＮＡ配列決定により，ベクター中に挿入されたｈＧＨをコードするｃＤＮＡ配列が正しいことを確認する。クローニングされたｈＧＨヌクレオチド配列を確認した後，ｈＧＨをコードするＤＮＡを制限酵素を用いて中間クローニングベクターから切り出し，ｓＦｖをコードするベクター中に，ｓＦｖリーディングフレームとインフレームとなるように挿入する。ＰＣＲプライマーは，ＰＣＲ産物を発現ベクター中に挿入した後に，ｈＧＨアミノ酸コーディング配列がｓＦｖ蛋白質発現構築物のアミノ酸リーディングフレームとインフレームであるように，かつ，得られるキメラリーディングフレームがｈＧＨ−ｓＦｖまたはｓＦｖｈＧＨ融合蛋白質をコードするように設計する。この実施例において用いられるプライマーは，目的とする生物学的に活性な蛋白質をコードする配列をｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎＳＡＦ（いずれもＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミド）中にクローニングするよう設計されている。しかし，類似のプライマーを用いて，他の発現系（例えば，酵母，昆虫，ウイルスまたは哺乳動物発現系）における製造のためにｓＦｖ融合構築物を設計することができる。構造的に無傷であり機能的なｓＦｖ融合蛋白質の発現は，蛋白質分析手法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ分析）および市販のインビトロ診断用キットを用いて確認する。任意の融合蛋白質要素としてエピトープが存在する場合には，このエピトープに対する市販の抗体を用いる。同様の生化学的分析手法を用いて，インビボ動物研究から得られる血液および血清サンプル中の機能的融合蛋白質をスクリーニングする。
【０５８３】
８．２．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）アミノ末端融合構築物
アミノ末端ｈＧＨポリペプチドを有する融合蛋白質を生成するためには，２μｌのヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＨＬ１１３９ａまたはＨＬ１１３９ｂ）をテンプレートＤＮＡとして，およびｈＧＨ−ＮＨ２−Ｆｏｒ（配列番号：２６）およびｈＧＨ−ＮＨ２−Ｒｅｖ（配列番号：２７）プライマーを用いて，上述のようにＰＣＲ増幅反応を実施する。フォワードプライマー（配列番号：２６）は５’ＮｃｏＩ制限部位を含む。リバースプライマー（配列番号：２７）は，内部インフレームＧｌｙ４−Ｓｅｒリンカー配列をコードする配列および３’ＳａｌＩ部位を有する。
【０５８４】
ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にライゲーションし，ｃＤＮＡ配列を確認する。次に，ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで切断し，ゲル精製し，ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＳｙｎＳＡ−５’／３’−ＭＣＳ−６ｘＨｉｓ発現ベクター中にライゲーションすることにより，ｈＧＨコーディング配列を中間ベクターから切り出す。このベクターは，５Ａコーディング配列を挟む５’−および３’−領域中にインフレームで挿入された延長されたマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を有する。ＳａｌＩオーバーハングをＸｈｏＩオーバーハングと結合させることにより，新規キメラ発現ベクター中ではいずれの部位も喪失する。得られるキメラリーディングフレームは，ｓＦｖのアミノ末端にインフレームで融合したｈＧＨ蛋白質−Ｇ４Ｓリンカーペプチドを有する融合蛋白質をコードする。この融合蛋白質はｈＧＨ−ｓＦｖと称される。
ｈＧＨ−ＮＨ２−Ｆｏｒ（配列番号：）
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣ−３’
ｈＧＨ−ＮＨ２−Ｒｅｖ（配列番号：）
５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＣＴＧ−３’
【０５８５】
８．３．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）カルボキシ−末端融合構築物
カルボキシ末端ｈＧＨポリペプチドを有する融合蛋白質を生成するために，２μｌのヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：ＨＬ１１３９ａまたはＨＬ１１３９ｂ）をテンプレートＤＮＡとして，および第１世代の（１ｓｔ）または第２世代の（２ｎｄ）ｈＧＨ−ＣＯＯＨ−Ｆｏｒ（配列番号：）およびｈＧＨ−ＣＯＯＨ−Ｒｅｖ（配列番号：）のプライマーを用いて，上述したようにＰＣＲ増幅反応を実施する。フォワードプライマー（配列番号：２８および第２世代ＦＯＲ）の配列は，５’ＮｏｔＩ制限部位，続いてｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦ構築物中のｓＦｖのカルボキシ末端にインフレーム挿入するための内部Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカーをコードする配列を含む。リバースプライマー（配列番号：）の配列は，インフレームの６ｘＨｉｓタグ，続いてタンデムＴＡＡ停止コドン，および３’ＥｃｏＲＩ部位を含む。リバースプライマー（配列番号：，第２世代ＲＥＶ）の配列は，以下をコードするインフレーム配列を含む：ＳａｌＩ−（ヒスチジン）６ｔａｇ−ＳａｌＩ−（ＴＡＧ停止コドン）２−ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位。
【０５８６】
ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にライゲーションし，この中間ベクターのｃＤＮＡ配列を確認する。次に，ｈＧＨをコードするＤＮＡを，ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化することにより中間ベクターから切り出し，ゲル精製し，ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦ発現ベクター中にライゲーションする。得られるキメラリーディングフレームは，ｓＦｖ（５Ａまたは５ＡＦ）のカルボキシ末端にインフレームで融合したＧ４Ｓリンカーペプチド−ｈＧＨ蛋白質を有する，ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見かけ分子量約５６ｋＤ（分子量計算値，５０．５ｋＤ）の融合蛋白質をコードする。これらの融合蛋白質は，それぞれｓＦｖ−ｈＧＨ（第１世代）およびｓＦｖ−ｈＧＨ−Ｈ６（第２世代）と称される。
ｈＧＨ−ＣＯＯＨ−Ｆｏｒ（配列番号：）
５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＣＧＴＣＣＣＴＧ−３’
ｈＧＨ−ＣＯＯＨ−Ｒｅｖ（配列番号：）
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＧ−３’
ｈＧＨ−ＣＯＯＨ−Ｈ６フォワード（配列番号：，第２世代ＦＯＲ）
５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣ−３’
ｈＧＨ−ＣＯＯＨ−Ｈ６リバース（配列番号：，第２世代ＲＥＶ）
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＣＴＧ−３’
【０５８７】
８．４．ｓＦｖ５−ｈＧＨ−６ｘＨｉｓ融合蛋白質の精製
ｓＦｖ−ｈＧＨ６ｘＨｉｓプラスミドでトランスフォームした細菌細胞の大スケール培養物（６−１２リットル）を，ｈＧＨ融合蛋白質を発現するよう誘導することができる。融合蛋白質は，可溶性ペリプラズム画分から，および／または不溶性ペレット（ＩＰ）から，改変した浸透圧溶解プロトコルおよび変性／再生抽出方法を用いて単離する。可溶化ｓＦｖ−ＨＧＨ融合蛋白質は，次に，プロテインＡ，金属イオンアフィニティー（例えば，６ｘＨｉｓタグのＮｉへの結合）および／またはサイズ排除（例えば，セファデックス／セファクリル）樹脂を利用する一連のカラムアフィニティークロマトグラフィーを用いてさらに精製することができる。
【０５８８】
６リットルのｓＦｖ−ｈＧＨ調製物からの可溶化ペリプラズム画分（１７０ｍｌｓ）を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に供し，２５０ｍＭイミダゾールを用いてＮｉ＋＋−アフィニティー樹脂から溶出した。投入物，フロースルー，洗浄物，および一連のカラム画分の２０μｌのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し，ｓＦｖ特異的抗血清およびｈＧＨ特異的抗血清を用いてウエスタンブロッティングにより分析した。
【０５８９】
ｓＦｖ−ポリクローナル抗血清を用いて５６ｋＤａのｓＦｖ−ｈＧＨ融合蛋白質を追跡し，これをＮｉ＋＋−樹脂に対するその特異的結合により，投入物画分から濃縮する。部分的に精製し濃縮した融合蛋白質物質は画分１６−２０に溶出され，切断されたｓＦｖ物質はカラムフロースルーに認められた（約３３ｋＤａ）。ｈＧＨポリクローナル抗血清は，５６ｋＤａのｓＦｖ−ｈＧＨ融合蛋白質について同一の溶出パターンを示す。さらに，融合分子の蛋白質分解されたＣ末端側半分であるトリプレットｈＧＨ−６ｘＨｉｓバンドは，全長融合蛋白質分子とともに分画される。６ｘＨｉｓタグを有するすべてのポリペプチドは，これが融合蛋白質であってもその分解生成物であってもＮｉ＋＋に結合するであろうという意味で，後者の結果は予測されるものである。
【０５９０】
ｓＦｖ−ｈＧＨ融合蛋白質を表す単一のｈＧＨ種は，プロテインＡビーズまたはＮｉ＋＋−樹脂によりアフィニティー沈澱させた。プロテインＡビーズＩＰ−物質およびＮｉ＋＋−樹脂の溶出物はいずれも，免疫官能性ＩＦｈＧＨ  ＥＬＩＳＡにおいて陽性であった（下記を参照）。
【０５９１】
実施例９：成長ホルモンポリペプチドを含む蛋白質コンジュゲートの製造
ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ分子，すなわち，遺伝子工学により導入されたＣｙｓ残基を含むｓＦｖ５誘導体を用いる。あるいは，その表面にシステイン基を含まない一本鎖抗体ｓＦｖ５ＡＦを，Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いてチオール化する。ＳＡＴＰは１級アミンと反応して，保護スルフヒドリルを付加する。遊離のスルフヒドリル基を生成するために，チオアセチル基を０．０２Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩で脱保護することができる（Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６８−７３，１９８３）。
【０５９２】
１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２５（ＰＥ））中の４ｍｇ／ｍｌのｓＦｖ５ＡＦ１ｍｌあたり，２０μｌのＤＭＳＯ中４．４ｍｇ／ｍｌＳＡＴＰを加えることにより，ｓＦｖ５ＡＦ蛋白質に保護スルフヒドリル基を導入した。反応液を２５℃で１時間インキュベートし，次にＰＥで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムで脱塩することにより，過剰のＳＡＴＰを除去した。
【０５９３】
ｓＦｖ５ＡＦのスルフヒドリル基は，１００μｌの，０．１ＭＮａＰＯ４（ｐＨ７．５）中１．１ｍｇ／ｍｌの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ，エルマン試薬とも称される）を加え，２５℃で１時間インキュベートすることにより活性化した。ＰＥで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムで脱塩することにより過剰のＤＴＮＢを除去した。チオールは，１／１０容量の０．５Ｍヒドロキシルアミン／ＰＥ（ｐＨ７．５）をＳＡＴＰ−誘導化ｓＦｖ５ＡＦに加え，次に２５℃で３０分間インキュベートすることにより脱保護した。次に，チオール化ｓＦｖ５ＡＦをセファデックスＧ−２５／ＰＥで脱塩した。
【０５９４】
ヒト成長ホルモンは，例えば，ｓＦｖ５ＡＦおよび他の分子について本明細書に記載されるチオール化方法のいずれかを用いてチオール化する。次に，チオール化成長ホルモンをチオール化ｓＦｖ５ＡＦに加え，反応混合物を２５℃で２時間インキュベートする。反応を停止させ，本明細書に記載される方法にしたがって，コンジュゲート分子を精製する
【０５９５】
実施例１０：成長ホルモンポリペプチドを含む分子のアッセイ
１０．１．トランスサイトーシスアッセイ
トランスサイトーシスアッセイは，本質的に上述したように，トランスウエルシステムにおいて行った。対照細胞（ｐＩｇＲを発現していないＭＤＣＫ細胞）を用いて，ｓＦｖ−ｈＧＨ融合蛋白質を先端のコンパートメントに入れた場合，トランスサイトーシスは生じないはずであり，基底外側のコンパートメントは，有意な量の５６ｋＤａｓＦｖｈＧＨ融合蛋白質（またはｓＦｖ−ｈＧＨ画分とともに精製される切断されたｓＦｖフラグメント）を含まないはずである。すべてのｓＦｖ−ｈＧＨは先端のコンパートメント中に残るはずである。しかし，常にある低レベルの蛋白質の液相輸送が存在する。ｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞（Ｂｒｅｉｔｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３２：３２９−３７，１９８９）を用いた場合，ｓＦｖ−ｈＧＨ分子は基底外側のコンパートメントに見いだされる。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し，ポリクローナル抗−ｓＦＶ５または抗ｈＧＨを用いるウエスタンブロッティングを行う。
【０５９６】
部分的に精製したｓＦｖ−ｈＧＨ画分を，トランスウエルアッセイにおいて，精製ｓＦｖ５（陽性対照）およびｈＧＨ（陰性対照）蛋白質と比較した。等モル量の精製ｓＦｖ（陽性対照），部分精製ｓＦｖ−ＨＧＨ画分（ＰＢＢ１およびＰＰＢ２），および精製ＨＧＨ（陰性対照）を，対照ＭＤＣＫ細胞またはｐＩｇＲを発現する細胞のいずれかを播種したトランスウエルのウエルの先端のコンパートメントに入れた。トランスウエルを３７℃で１６−２０時間インキュベートし，基底コンパートメントから培地を回収した。
【０５９７】
対照（トランスフェクトされていない）ＭＤＣＫ細胞においては，ｓＦｖ−ｈＧＨ画分（ＰＰＢ１およびＰＰＢ２）およびＨＧＨ陰性対照サンプルについて，トランスサイトーシスは認められなかった。ｓＦｖ内部対照については少量の輸送が認められた。ｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞においては，対照のｓＦｖ蛋白質の約１０−１５％のトランスサイトーシスがみられ，これはトランスサイトーシスを示した。トランスサイトーシスはまた，２つの部分的に精製したｓＦｖ−ｈＧＨ融合蛋白質においても認められた。トランスサイトーシスは，ｓＦｖ−ｈＧＨとともに精製され，ある種のｓＦｖ−ｈＧＨ調製物中に存在する切断されたｓＦｖフラグメントについても観察された。ｓＦｖフラグメントは，ｓＦｖ−ｈＧＨ融合蛋白質と競合するようであり，したがって，融合蛋白質のトランスサイトーシスの見かけ上の量を減少させた。
【０５９８】
１０．２．”プルダウン”アッセイ
プルダウンアッセイにおいては，［ＧＳＴ］−［茎］または［ＧＳＴ］−［ドメイン６］融合蛋白質（上述を参照）をＧＳＴ成分によりグルタチオン−セファロースビーズにカップリングさせる。ｓＦｖ５ポリペプチドは，遊離分子として存在していても，または化合物の一部として存在していても，ビーズに結合した［ＧＳＴ］−［茎］または［ＧＳＴ］−［ドメイン６］融合蛋白質に特異的に結合するはずである。ビーズを回収し，次にＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して未結合物質を除去する。ビーズ上に残存する物質をＳＤＳ負荷用染料中で煮沸し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングに供した。
【０５９９】
ｓＦｖ−ＨＧＨの粗可溶性ペリプラズム画分を，［ＧＳＴ］−［ラットドメイン６］融合蛋白質または，対照としてＧＳＴ蛋白質に結合させたグルタチオンビーズとともにインキュベートした。平行実験においてはプロテインＡ結合ビーズも用いた。結合反応は，４℃で一夜進行させた。次にビーズを１ｘＰＢＳで３回洗浄し，ＳＤＳ負荷用染料中で煮沸し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングに供した。等容量のペリプラズム（Ｉ），沈澱後上清（ＦＴ），洗浄液（Ｗ）およびビーズ溶出（Ｅ）画分を分析した。ＧＳＴ結合ビーズおよびプロテインＡ結合ビーズは，それぞれ負対照および全蛋白質対照として働く。
【０６００】
可溶性ペリプラズム分画からのｓＦｖ５−ｈＧＨ融合蛋白質は，［ＧＳＴ］−［ラットドメイン６］ビーズに結合したが，ＧＳＴ−ビーズ（陰性対照）には結合しなかった。さらに，［ＧＳＴ］−［ラットドメイン６］結合ビーズは，ｓＦｖ−ｈＧＨ融合蛋白質の陽性対照であるｓＦｖプロテインＡ結合ビーズにより結合されたものと同様のレベルで結合された。このことは，ｓＦｖ−ＨＧＨ融合蛋白質の大部分が活性であること，すなわち，［ＧＳＴ］−［ラットドメイン６］融合蛋白質に結合することを示唆する。
【０６０１】
実施例１１：ｓＦｖ５ＡＦ−ＨＧＨ融合蛋白質の生物学的活性
１１．１．免疫機能性アッセイ
機能性免疫アッセイを用いて，ｓＦｖ５−ＧＨ融合蛋白質の生物学的活性を評価した。免疫機能性ｈＧＨアッセイキットは，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＴＸ）から購入した。アッセイは，本質的に，製造元の指針にしたがって行った。
【０６０２】
簡単には，免疫機能性アッセイは以下のように行う。詳細については，Ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ｈＧＨ）ｉｎ  ｓｅｒｕｍ：Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｈＧＨ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８１：２６１３，１９９６；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨ）  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏ−ａｎｄ  ｂｉｏ−ａｓｓａｙｓ．Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １６０（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｐ９９，１９９９；およびＳｔｒａｓｂｕｒｇｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＧＨ，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ  ＩＧＦ  Ｒｅｓ  ８：４１−４６，１９９８を参照のこと。
【０６０３】
膜結合ｈＧＨレセプターは，非レセプター蛋白質チロシンキナーゼと共役しているサイトカインレセプターファミリーのメンバーである。ｈＧＨ分子は，大きい方の部位１を介して１つのＧＨレセプター分子に結合し，次にこの１：１複合体は，ｈＧＨのＮ末端の小さい方の部位２への結合を介して第２のＧＨレセプターと会合する。インビボでは，このことにより，レセプターが二量体化し，非レセプターチロシンキナーゼ（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路が活性化する。
【０６０４】
ヒト成長ホルモン免疫機能性ＥＬＩＳＡアッセイは，サンプル中のｈＧＨ分子が固定化モノクローナル抗体により結合される（”捕捉される”），”捕捉”ＥＬＩＳＡである。固定化されたＭａｂは，ｈＧＨの結合部位２と重複するＮ末端に位置するエピトープに特異的である。第２のインキュベーション工程において，ｈＧＨと結合するｈＧＨレセプタードメインと構造的に同一であるビオチン化組換えヒトＧＨ結合蛋白質（ｂ＊ｒｈＧＨＢＰ）が，ｈＧＨの結合部位１に結合して，”サンドウィッチ”を形成する。第３のインキュベーション工程において，検出可能なストレプトアビジン分子を加え，ストレプトアビジン分子は捕捉されたビオチン成分に強く結合する。ストレプトアビジン分子は，西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合されている。次に，ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＫＰＬ，Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加え，反応生成物（濃青色を有し，分光硬度計を用いて測定される）に変換されたＴＭＢの量を測定することにより，４成分複合体を検出し定量する。
【０６０５】
両方のＧＨＢＰ結合部位が正しくフォールディングされている三次元構造を有するｈＧＨ分子のみが，ｂ＊ｒｈＧＨＢＰ分子に結合して，検出可能なビオチン−ストレプトアビジン結合を確立することができる。すなわち，アッセイは，分子を溶液から捕捉するために抗体を用いるが，３１アミノ酸の決定基を認識するために成長ホルモンレセプター組換え蛋白質を用いるため，確認的ＥＬＩＳＡである。ＧＨ分子または成分がシグナルを与えるためには，これが両方の結合部位を正しいコンフォメーションで有する必要がある。
【０６０６】
１１．２ｓＦｖ５ＡＦ−ｈＧＨ融合蛋白質の大スケール調製
ｐＳｙｎ５ＡＦ−ｈＧＨ−Ｈ６プラスミドを含む細菌のグリセロール保存物を用いて，２０ｍｌの出発培養物に摂取し，これを３７℃で一夜成長させた。翌日，大スケール培養物（２または４Ｌフラスコで合計２０Ｌ）を３７℃で成長させ，１ｍＭのＩＰＴＧで蛋白質の発現を誘導した。誘導は，２５℃で一夜行い，その後，細菌培養物を回収した。細胞を遠心分離によりペレット化し，ペレットを５００ｍｌのＰＢＢ緩衝液（３０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ８，１ｍＭＥＤＴＡ，２０％ショ糖，０．０２％ＮａＮ３）に再懸濁した。細胞の懸濁液を回転装置で４℃で３０分間混合し，その後，ＭｇＳＯ４を最終濃度１．２５ｍＭで加え，次に，４℃でさらに２０分間回転を続けた。
【０６０７】
混合物を１４，３００ｘｇで３０分間遠心分離し，可溶性蛋白質画分を回収した。抽出工程を繰り返し，可溶性蛋白質画分（約１Ｌ）を１０ＮＮａＯＨでｐＨ８．０に調節し，次にＵｌｔｒａｆｌｏｗプロテインＡセファロースカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で分画した。蛋白質画分を，ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色，またはゲル電気泳動と５ＡＦ特異的ポリクローナル抗血清を用いるウエスタンブロッティングとの組み合わせにより分析した。ｓＦｖ５ＡＦ−ｈＧＨ−６ｘＨｉｓ融合蛋白質を含む選択されたプロテインＡセファロース画分を同定し，プールし，Ｎｉ＋＋−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗマトリクス（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に供した。精製５ＡＦ−ｈＧＨ−Ｈ６融合蛋白質を含む活性カラム画分は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色により，またはｓＦｖ５ＡＦ特異的またはｈＧＨ特異的（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）ポリクローナル抗血清のいずれかを用いて，ゲル電気泳動とウエスタンブロッティングとの組み合わせにより同定した。プールしたＩＭＡＣ画分をＰＢＳ中で透析し（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ，ｐＨ７．２），０．２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して滅菌濾過した。蛋白質濃度は，クマシープラスプロテインアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて，０．６６ｍｇ／ｍｌであると決定された。精製した蛋白質を，Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて，４１ｍｌから１４ｍｌに濃縮した。再びクマシープラスアッセイを用いる定量を行い，最終濃度は１．６ｍｇ／ｍｌであると決定された。このロットＡＺ−ｈＧＨ−０９１２０１（Ｌｏｔ＃２）をインビボ研究において用いた。これは組換え的に製造した本発明のこのポリペプチドおよび他のポリペプチドを製造する方法の代表例である。
【０６０８】
１１．３．ラットにおけるインビボ研究
予め空腸および／または頸静脈にカニューレを移植した雄スプラグドーリーラット（体重２８０−３００ｇ）を用いた。静脈内（ＩＶ）投与のためには，各ラットに１．０ｍｇ／ｍｌのＳＡＦ−ｈＧＨ融合蛋白質をリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．２）中に含む０．１ｍｌの溶液を投与した。空腸輸送用には，ハンクスバランス塩中に調製し，Ｈｅｐｅｓ緩衝液でｐＨ６．５に調節し，プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン，アプロチニンおよびキモスタチン）を補充した０．３３３ｍｇ／ｍｌの５ＡＦ−ｈＧＨを含む投与溶液を用いた。各ラットに１．８ｍｌのこの投与溶液を空腸中に投与した。種々の時間に頸静脈から血液サンプルを採取した。遠心分離により血漿サンプルを調製し，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＴＸ）から入手したｈＧＨ特異的ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。
【０６０９】
ＩＶ投与の後，５ＡＦ−ｈＧＨ融合蛋白質は，中心コンパートメントから２相的に排除された。最初の鋭い分布相においては，５ＡＦｈＧＨは約２５分間の末端半減期で排除された（図２３Ａ）。蛋白質を小腸に直接投与した後，５ＡＦ−ｈＧｈ融合蛋白質は速やかに吸収され，最大濃度は投与の約３０分後に観察された（図２３Ｂ）。
【０６１０】
実施例１２：インターロイキン−２を含む融合蛋白質の製造
ｓＦｖ５ＡおよびＩＬ−２を含む融合蛋白質の製造および評価は，この実施例に記載される。これらの融合蛋白質はおおまかに”ＩＬ−２−５Ａ”融合蛋白質と称される。この意味は，ＩＬ−２ポリペプチドが融合蛋白質のアミノ末端部分に位置し，ｓＦｖ５Ａポリペプチドがカルボキシ末端に位置することを反映している。当業者は，本明細書に記載される方法を用いて，他の融合蛋白質，例えば，ＩＬ−２ポリペプチドが融合蛋白質のカルボキシ末端部分に位置しているもの，またはより強いまたは異なる生物学的活性を有するものを製造することができる。
【０６１１】
１２．１．ＩＬ−２ｃＤＮＡの調製
ＩＬ−２をコードするｍＲＮＡを生成し，単離するために，末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し，マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体でウエルを予めコーティングしたプレートに移した（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。プレートを１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３で処理し，３回洗浄した後，細胞をウエルに加えた。予め抗ＣＤ３でコーティングした市販のプレートを用いてもよい（ＢＤ  Ｂｉｏ  Ｃｏａｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅｓ，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）。次に，マウス抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を１μｇ／ｍｌで加え，プレートを３７℃で６時間インキュベートした。
【０６１２】
Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて，本質的に製造元の指針にしたがって，刺激された細胞から総細胞ＲＮＡを抽出した。オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて，本質的に製造元の推奨にしたがって，ＩＬ−２メッセージの一本鎖ｃＤＮＡコピーを作成した。プライマー”ＩＬ−２ＦｏｒｍＭｕｔ３”および”ＩＬ−２Ｒｅｖ２”を用いて，ＩＬ−２および合成リンカーの一部をコードする配列をＰＣＲにより増幅した。
ＩＬ−２ＦｏｒＭｕｔ３（配列番号：）
５’−ＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧ−３’ＩＬ−２Ｒｅｖ２（配列番号：）
５’−ＧＡＴＴＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＡＧＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＡ−３’
ＩＬ−２ｃＤＮＡの配列は図２４に示される。
【０６１３】
１２．２．ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質をコードする発現構築物の製造
２つのＰＣＲ産物を一緒に合わせるＰＣＲの一種であるオーバーラップＰＣＲを用いて，ＩＬ−２ＰＣＲ産物をｓＦｖ５ＡをコードするＰＣＲ産物と結合させた。この方法においては，意図されるジャンクション配列をＰＣＲプライマー中に設計する（５’末端）。最初にポリペプチドをコードする各個別の配列を増幅した後，種々の産物を希釈し，合わせ，変性し，アニーリングし，伸長する。次に，”ファイナル”フォワードおよびリバースプライマーを用いて，それ以外は標準的なＰＣＲを行う。
【０６１４】
オーバーラップＰＣＲに用いたプライマーは，ｓＦｖ５Ａポリペプチドに連結された合成リンカーをコードする配列を含むよう設計した。リンカーは，ＩＬ−２とアルファ−葉酸レセプターに向けられたｓＦｖとの融合蛋白質の正しいフォールディングを促進することが先に示されている１３アミノ酸のスペーサー（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ；配列番号：）を含む（Ｍｅｌａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｏｆ  ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８（１８）：４１４６−４１５４，１９９８）。用いたプライマーは以下のとおりである。
ｓｃＦｖＦｏｒ（配列番号：）
５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＡＧＧＧＧＧＡ−３’
ｓｃＦｖＲｅｖ４（配列番号：）
５’−ＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’
このＰＣＲは，約６０℃で約２５サイクル行った。
【０６１５】
ＩＬ−２，リンカーおよびｓＦｖ配列は，ＩＬ−２およびｓＦｖ５のＰＣＲ産物の混合物から，”ＩＬ−２Ｆｏｒ”プライマー（配列番号：；上述）および”ｓｃＦｖＲｅｖプライマー”（配列番号：；上述）を用いて増幅する。約４５℃で３サイクルのＰＣＲを実施し，次に，約６８℃で約２５サイクルを実施する。
【０６１６】
１２．３．ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質をコードする発現構築物の調製
オーバーラップＰＣＲからのＰＣＲ産物をゲル精製し，哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に直接クローニングした。この発現ベクターは，高レベルの構成的発現のためのＣＭＶ由来プロモーター；抗Ｖ５抗体で検出することができるＣ末端Ｖ５エピトープタグ；およびさらに抗６ｘＨｉｓタグ抗体で検出することができるかまたはこれを用いてＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質を精製することができるＣ末端６ｘＨｉｓタグを含む。抗Ｖ５および抗６ｘＨｉｓ抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である。
【０６１７】
ＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉをトランスフォームし，ベクターがアンピシリン耐性遺伝子を含むため，アンピリシンを用いてトランスフォーマントを選択した。個々のコロニーをアンピリシンを含むＬＢ培地で選択および成長させた。８個のコロニーからのプラスミドＤＮＡの小スケール調製物（ミニプレップ）を調製した。独立して選択された４つのプラスミドの推定構造は，ＸｂａＩで消化し，消化したＤＮＡをゲル電気泳動に供することにより確認した。４つすべての候補物は，予測産物と一致する電気泳動パターンを示した。ＰＣＲ反応の正確性および忠実度を確認するために，発現構築物中に見いだされるＩＬ−２−ｓＦｖ融合蛋白質をコードするキメラリーディングフレームのヌクレオチド配列を決定した。
【０６１８】
１２．４．真核生物細胞におけるトランスフェクションおよび発現
配列を確認したトランスフォーマントの１つからプラスミドＤＮＡを大量に調製し，これを用いて，ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ）を用いて，本質的に製造元の指針にしたがって，ＣＯＳ−１細胞を過渡的にトランスフェクトした（Ｗｈｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｉｔ  ９．４，ｐａｇｅｓ９−１１  ｔｏ  ９−１２，ａｎｄ  Ｕｎｉｔ  １６．１３，Ａｒｕｆｆｏ，ｐａｇｅｓ  １６−５３  ｔｏ  １６−５５：Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２を参照）。抗ｓＦｖ５Ａポリクローナル抗体を用いて，ｓＦｖ５Ａポリペプチドを含む融合蛋白質を検出した。トランスフェクタントはまた，ヒトＩＬ−２に対する抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ）およびＶ５エピトープに対する抗体を用いるＥＬＩＳＡまたはウエスタン分析により，ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質の産生および分泌についてスクリーニングした。ヒトＩＬ−２に対する抗体は，例えば，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）およびＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から市販されている。これらの３つの抗体のいずれによっても所望の融合蛋白質が検出されるであろう。場合によっては，トランスフェクトした細胞からの上清を少なくともＩＭＡＣクロマトグラフィーにより半精製して，さらなる実験に用いた。
【０６１９】
１２．４．精製
過渡的にトランスフェクトした細胞からＩＭＡＣクロマトグラフィーを用いてＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質を精製した。簡単には，４８−１４４時間インキュベートしたトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞からの約４００ｍｌの培地を回収した。培地をプールし，イミダゾールを最終濃度１０ｍＭで加えた。Ｐｅｌｌｉｃｏｎカセットシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いてプールを濃縮して，最終容量約７５ｍｌとした。次に濃縮したサンプルを，６ｘＨｉｓタグが結合するニッケルカラムを用いて精製した。
【０６２０】
１２．５．１．ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質のアッセイ
１２．１．５．１．トランスサイトーシスアッセイ
トランスサイトーシスアッセイは，本質的に上述のように行った。トランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞の上清から調製した融合蛋白質をトランスサイトーシスアッセイにおいて用いた。ｓＦｖに対するポリクローナル抗体，またはＶ５エピトープに対するモノクローナル抗体を用いて，先端の培地および基底外側の培地の両方においてＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質を検出した。抗ｓＦｖ５Ａを用いた場合，ポリクローナル抗体により検出されたｓＦｖ以外の物質の存在により，トランスサイトーシスアッセイの結果が不明瞭になった。しかし，アッセイにおいてモノクローナル抗Ｖ５を用いて融合蛋白質を検出した場合，結果はより率直であり，融合蛋白質の先端から基底外側への，わずかではあるが再現性のある量のトランスサイトーシスが認められた。対照（トランスフェクトしていない）ＭＤＣＫ細胞においてトランスサイトーシスが認められなかったことから示されるように，トランスサイトーシスは，ｐＩｇＲ茎の存在に依存していた。
【０６２１】
１２．１．５．２．プルダウンアッセイ
上述の実施例において詳細に記載されているプルダウンアッセイを用いて，ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質の［ＧＳＴ］−［ラットドメイン６］融合蛋白質への結合を調べた。わずかではあるが，ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質の［ＧＳＴ］−［ラットドメイン６］融合蛋白質への結合が観察された。この結果は，トランスサイトーシスアッセイと一致する。すなわち，ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質は［ＧＳＴ］−［ラットドメイン６］融合蛋白質に弱く結合し，比較的低い程度で先端から基底外側へのトランスサイトーシスが生ずる。改良された所望の特性を有する，すなわち，茎分子により強く結合しより高い程度でトランスサイトーシスを行うＩＬ−２融合蛋白質を同定するために，ＩＬ−２ポリペプチド配列およびｓＦｖ５配列を含む融合蛋白質を調製し，本明細書に記載される方法にしたがって試験した。
【０６２２】
１２．１．５．３．検出および定量
種々の方法および組成物を用いて，ＩＬ２−ＳＡ融合蛋白質を検出および定量することができる。非限定的例として，市販のＩＬ−２ＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ  Ｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いることができる。ＩＬ−２に対する種々のモノクローナル抗体が知られており，これを用いることができる（例えば，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ＩＬ−２，１７：Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ５：Ｓ２９−Ｓ３４，１９８６）を参照。ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質はまた，Ｖ５エピトープおよび６ｘＨｉｓタグを有しており，これらのエピトープのそれぞれに向けられた多くのポリクローナルおよびモノクローナル抗体が市販されている。本明細書に記載される抗ｓＦｖ５Ａポリクローナル抗体を用いて融合蛋白質を検出することができる。ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質は，これらの３種類の抗体のいずれによっても検出される。
【０６２３】
１２．１．５．４生物学的活性
ＩＬ−２依存性ネズミ細胞毒性Ｔ細胞株であるＣＴＬＬ−２の増殖を維持する能力を評価することにより，ＩＬ−２−５Ａ融合蛋白質のＩＬ−２の生物学的活性を試験した（Ｍｅｌａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｏｆ  ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８（１８）：４１４６−４１５４，１９９８）。ＩＬ−２融合蛋白質は，このアッセイにおいてＴ細胞の増殖を濃度依存的様式で支持した。ＩＬ−４−５Ａ融合蛋白質を同じアッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて細胞増殖を支持したＩＬ−２とは異なり，ＩＬ−４は支持しなかった。予測されたように，ＩＬ−４−５Ａ融合蛋白質はＩＬ−４と同様に挙動し，すなわち，このアッセイにおいて細胞増殖を支持することができない。
【０６２４】
融合蛋白質がリガンド，例えば可溶性ＩＬ−２−レセプターポリペプチド（Ｄｒａｃｈｅｖａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ６：７３７−４７，１９９５；Ｊｕｎｇｈａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｔａｃ）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７１：１０４５３−６０，１９９６）またはリポテイコ酸（Ｐｌｉｔｎｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２（ＩＬ−２）  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＩＬ−２，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８（５）：９７２−９，２００１）に結合する能力は，表面に固定化した場合には直接的に，または間接的に，ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＩＬ−２の抗体への結合を競合的に阻害する能力により測定することができる。ＩＬ−２の量および生物学的活性を測定する他の方法は，Ｇａｔｅｌｙら（Ｕｎｉｔ  ６．１６：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００；Ｉｎｄｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｌａ  Ｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４３：４５−４７，１９９７）により記載されている。
【０６２５】
実施例１３：インターロイキン−４を含む融合蛋白質の製造
ｓＦｖ５ＡおよびＩＬ−４を含む融合蛋白質の製造および評価がこの実施例に記載される。これらの融合蛋白質は，おおまかに，”ＩＬ−４−５Ａ”融合蛋白質と称される。この命名は，ＩＬ−２ポリペプチドが融合蛋白質のアミノ末端部分に，ｓＦｖ５Ａポリペプチドがカルボキシ末端に位置していることを反映している。当業者は，本明細書に記載される方法を用いて他の融合蛋白質，例えば，ＩＬ−４ポリペプチドが融合蛋白質のカルボキシ末端部分に位置しているもの，またはより強いかまたは異なる生物学的活性を有するものを製造することができるであろう。
【０６２６】
１３．１．ＩＬ−４ｃＤＮＡの製造
ＩＬ−４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図２５を参照；配列番号：）を，プラスミドｐｃＤ−ｈＩＬ−４（ＡＴＣＣ＃５７５９３）から以下のプライマーを用いて増幅した：
ＩＬ−４Ｆｏｒ２（配列番号：）
５’−ＣＡＣＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴ−３’
ＩＬ−４ＲｅｖＭｕｔ２（配列番号：）
５’−ＧＡＴＴＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＧＣＴＣＧＡＡＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴ−３’
【０６２７】
オーバーラップＰＣＲにおいて，ＩＬ−４ＰＣＲ産物を上述のｓＦｖ５ＡＰＣＲ産物と組み合わせた。得られたＰＣＲ産物は，［ＩＬ−４］−［ｓＦｖ５Ａ］融合蛋白質をコードするキメラリーディングフレームを含み，これをゲル精製して，［ＩＬ−２］−［ｓＦｖ５Ａ］融合蛋白質のために用いた方法と同様の方法を用いて，哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３ｌＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（登録商標）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に直接クローニングした。
【０６２８】
トランスウエルアッセイにおいてＩＬ−４−５Ａ融合蛋白質のトランスサイトーシス輸送特性を評価し，融合蛋白質の先端から基底外側への，わずかではあるが再現性のあるトランスサイトーシスが見られた。対照（トランスフェクトしていない）ＭＤＣＫ細胞においてトランスサイトーシスが認められなかったことにより示されるように，トランスサイトーシスはｐＩｇＲ茎の存在に依存していた。
【０６２９】
１３．２．インターロイキン誘導体の融合蛋白質
上述の方法を用いて，そのインターロイキン由来部分がインターロイキンホモログまたは誘導体であるかそれに由来するものである本発明の融合蛋白質を製造することができる。
【０６３０】
非限定的例として，用いることができるヒトＩＬ−２の相同体としては，ネズミＩＬ−２（Ｒｏｂｂｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ６（４）：４８１−４８６，１９９５；Ｓｔｅｉｄｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６１（４）：１６２７−１６２９，１９９５；Ｇｕｉｓｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ４（３）：２４０−２４６，１９９３），ヒツジＩＬ−２（Ｓｅｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５６：１０７−１１７，１９９７，Ｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５４：３３−４４，１９９６），シカＩＬ−２（Ｉｎｄｒｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｉａ．Ｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４３：４５−４７，１９９７），ウシＩＬ−２（Ｋａｓｈｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６１：１７１−１７３，１９９９，Ｋａｓｈｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６１：７０５−７０７，１９９９；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１３５（５）：３１８４−３１９０，１９８５），およびカニクイザルＩＬ−２（Ｙａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：４１７−４２３１９９７）が挙げられ，これらはすべて，種々の発現系において製造されている。当業者は，所定のＩＬ−２相同体または誘導体をコードするそれぞれの特定の遺伝子配列について，ＤＮＡの適当な起源，プライマーの配列，ＰＣＲ条件等を選択することができる。非限定的例としては，用いることができるＩＬ−２の誘導体には，ＩＬ−２から誘導される機能的オリゴペプチド（Ｂｏｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｎａｌｏｇｓ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ  ６９：１５７−１６８，１９８８）が含まれる。
【０６３１】
非限定的例として，用いることができるヒトＩＬ−４のホモログには，イヌ，ヤギ，ヒツジ，およびバンドウイルカのＩＬ−４配列が含まれる（それぞれ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋａａｉｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｄｏｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４９（２）：１４２−３，１９９９；Ｓｎｅｋｖｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｒｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４，Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ７８：２１９−２９，２００１；Ｃｈａｐｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｏｎ  Ｔ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２０：４１９−２５，２０００；およびＩｎｏｕｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｂｏｔｔｌｅ−ｎｏｓｅｄｄｏｌｐｈｉｎ（Ｔｕｒｓｉｏｐｓｔｒｕｎｃａｔｕｓ）  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃＤＮＡ，およびＪ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ６１：６９３−６，１９９９を参照）。非限定的例として，用いることができるＩＬ−４の誘導体には，選択的スプライシングにより生ずるＩＬ−４変種が含まれる（Ｓａｋｋａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４（ＩＬ−４  ｄｅｌｔａ２）  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ６：６６０−４，１９９９）。
【０６３２】
実施例１４：インスリンポリペプチドを含む融合蛋白質
１４．１．インスリンポリペプチドを含む融合蛋白質の調製
ヒトインスリン（ｈＩｎｓｕｌｉｎ）をコードするＤＮＡ分子を調製するために，２段階クローニング法を用いる。第１の工程においては，商業的供給源（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：ヒト膵臓ＨＬ５０３２ｔ）から購入したヒトｃＤＮＡライブラリから，ＰＣＲを用いてインスリンｃＤＮＡ配列を増幅する（図２６；配列番号：）。プライマーは，ＰＣＲ産物がｓＦｖ発現ベクター中に挿入された後に，インスリンアミノ酸コーディング配列がｓＦｖ蛋白質発現構築物のアミノ酸リーディングフレームとインフレームであるように，したがって，ｓＦｖ−インスリン融合蛋白質をコードするように設計する。
【０６３３】
ＤＮＡ増幅，ＰＣＲ産物の分析，精製，中間ベクター中へのクローニング，および配列の確認は，上述のように行う。”フォワード”プライマー（配列番号第２世代ＦＯＲ）の配列は，５’ＮｏｔＩ制限部位，次にｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦ構築物中のｓＦｖのカルボキシ末端とインフレーム挿入するための内部Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカーをコードする配列を含む。”リバース”プライマー（配列番号第２世代ＲＥＶ）の配列は，インフレームで以下をコードする配列を含む：ＳａｌＩ−６ｘＨｉｓタグ−ＳａｌＩ−（ＴＡＧ停止コドン）２−ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位。中間ベクター中のインスリンをコードするヌクレオチド配列を確認した後，ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いてインスリンリーディングフレームを切り出し，ゲル精製し，ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦ発現ベクター中にライゲーションする。得られるキメラリーディングフレームは，ｓＦｖ（５Ａまたは５ＡＦ）のカルボキシ末端とインフレームで融合したＧ４Ｓリンカーペプチド−ｈＩｎｓｕｌｉｎ蛋白質を有する融合蛋白質をコードする。得られる融合蛋白質は，ｓＦｖ−ｈＩＮＳ−Ｈ６（それぞれ，ｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦ中）と称される。
ヒトインスリン−ＣＯＯＨ−Ｈ６フォワード（配列番号：）
５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣ−３’
ヒトインスリン−ＣＯＯＨ−Ｈ６リバース（配列番号：）
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＧＡＧＧＧＡＧＣ−３’
【０６３４】
１４．２．ｓＦｖ−インスリン融合蛋白質のアッセイ
インスリンのＥＬＩＳＡアッセイは，例えば，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＴＸから市販されている。これらのアッセイを用いて，種々のフォーマットで全インスリンを検出することができる。
【０６３５】
インスリンのＣ−ペプチドに対するＥＬＩＳＡは市販されており（ＤＳＬ，Ｉｎｃ．），場合によってはこれを用いる。Ｃ−ペプチドは生物学的には不活性であるが，これは血液中でより長い半減期を有し，肝臓代謝が相対的に少ない。すなわち，Ｃペプチドのアッセイは，動物に投与したインスリンの量の感度の高い測定を与えることができる。
【０６３６】
実施例１５：カルシトニンポリペプチドを含む融合蛋白質の製造
１５．１．ヒトカルシトニンペプチドを含む融合蛋白質
１５．１．１．ヒトカルシトニンをコードする核酸の調製
ヒトカルシトニン（ｈＣａｌｃｉｔｏｎｉｎ）をコードするＤＮＡ分子を調製するために，２段階クローニング法を用いる。第１の工程においては，ＰＣＲを用いて，商業的供給源から購入したヒトｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：ヒト下垂体ＨＬ１１３９ａまたはＨＬ１１３９ｂ；ヒト胎盤ＨＬ５０２０ｔ）からヒトカルシトニン（ｈＣａｌｃｉｔｏｎｉｎ，図９；配列番号：）をコードする配列を増幅する。プライマーは，ＰＣＲ産物がｓＦｖ発現ベクター中に挿入された後に，カルシトニンアミノ酸コーディング配列がｓＦｖ蛋白質発現構築物のアミノ酸リーディングフレームとインフレームであるように，したがって，カルシトニン−ｓＦｖまたはｓＦｖ−カルシトニン融合蛋白質のいずれかをコードするように設計する。
【０６３７】
ＰＣＲ産物は上述のようにして中間ベクター中に挿入する。ＤＮＡ増幅，ＰＣＲ産物の分析，精製および配列の確認は上述のようにして行う。
【０６３８】
中間ベクター中のカルシトニンをコードするヌクレオチド配列を確認した後，制限酵素を用いてカルシトニンリーディングフレームを切り出し，例えば，ｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦ中のｓＦｖリーディングフレームにインフレームで挿入する。得られるキメラリーディングフレームは，カルシトニン−ｓＦｖまたはｓＦｖ−カルシトニン融合蛋白質のいずれかをコードする。
【０６３９】
１５．１．２．ヒトカルシトニンアミノ末端融合蛋白質
ＰＣＲ増幅反応は，２μｌのヒト下垂体または胎盤ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：ＨＬ１１３９ａ，ＨＬ１１３９ｂまたはＨＬ５０２０ｔ）をテンプレートＤＮＡとして用い，ｈｕＣａｌｃ−ＮＨ２−Ｆｏｒ（配列番号：）およびｈｕＣａｌｃ−ＮＨ２−Ｒｅｖ（配列番号：）のアミノ末端ヒトカルシトニン融合構築物作成用プライマーを用いて，上述したように実施する。フォワードプライマー（配列番号：）は，カルシトニンをコードする配列をｐＳｙｎ５Ａまたは５ＡＦ構築物中のｓＦｖのアミノ末端にインフレームで挿入するためのＮｃｏＩ制限部位を含む。リバースプライマー（配列番号：）は，内部インフレームＧｌｙ４Ｓｅｒリンカー配列およびｓＦｖ５ＡまたはｓＦｖ５ＡＦのアミノ末端にカルシトニン遺伝子を挿入するためのＮｃｏＩ部位をコードする配列を有する。
【０６４０】
ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にライゲーションし，ｃＤＮＡ配列を確認する。次に，ＮｃｏＩで消化することによりｈＣａｌｃｉｔｏｎｉｎをコードする配列を中間ベクターから切り出し，ゲル精製し，ＮｃｏＩ消化ｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５Ａｆ発現ベクター中にライゲーションする。得られるキメラリーディングフレームは，ｓＦｖ（例えば，ｓｃ５Ａまたはｓｃ５ＡＦ）のアミノ末端にインフレームで融合したｈＣａｌｃｉｔｏｎｉｎ蛋白質−Ｇ４Ｓリンカーペプチドを有する融合蛋白質をコードする。この融合蛋白質はｈＣａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｓＦｖと称される。
ｈｕＣａｌｃ−ＮＨ２−Ｆｏｒ（配列番号：）
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＴＣＣＣＣＣ−３’
ｈｕＣａｌｃ−ＮＨ２−Ｒｅｖ（配列番号：）
５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＧＣＴＡＡＣ−３’
【０６４１】
１５．１．３．ヒトカルシトニンカルボキシ末端融合蛋白質
カルボキシ末端ヒトカルシトニンポリペプチドを有する融合蛋白質を生成するために，２μｌのヒト下垂体または胎盤ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：ＨＬ１１３９ａ，ＨＬ１１３９ｂまたはＨＬ５０２０ｔ）およびカルボキシ末端（ＣＯＯＨ）ヒトカルシトニン融合構築物作成用のｈｕＣａｌｃ−ＣＯＯＨ−Ｆｏｒ（配列番号：）およびｈｕＣａｌｃ−ＣＯＯＨ−Ｒｅｖ（配列番号：）を用いて，上述したようにＰＣＲ増幅反応を実施する。フォワードプライマー（配列番号：）は，ＮｏｔＩ制限部位，およびその後にｓＦｖ５ＡのＣ末端にインフレームで挿入するための内部Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーを有する。リバースプライマー（配列番号：）の配列は，タンデムのインフレームのＴＡＡ停止コドン，およびその後にヒトカルシトニン遺伝子をｓＦｖ（５Ａまたは５ＡＦ）のカルボキシル末端に挿入するためのＥｃｏＲＩ部位を含む。
【０６４２】
ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にライゲーションし，この中間ベクターのｃＤＮＡ配列を確認する。次に，ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化することによりｈＣａｌｃｉｔｏｎｉｎをコードするＤＮＡを中間ベクターから切り出し，ゲル精製し，ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦ発現ベクター中にライゲーションする。得られるキメラリーディングフレームは，ｓＦｖ（ｓＦｖ５ＡまたはｓＦｖ５ＡＦ）のカルボキシ末端にインフレームで融合したＧ４ＳリンカーペプチドｈＣａｌｃｉｔｏｎｉｎ蛋白質を有する融合蛋白質をコードする。これらの融合蛋白質は，それぞれ，ｓＦｖ５Ａ−ｈＣａｌｃｉｔｏｎｉｎおよびｓＦｖ５ＡＦ−ｈＣａｌｃｉｔｏｎｉｎと称される。
ｈｕＣａｌｃ−ＣＯＯＨ−Ｆｏｒ（配列番号：）
５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＴＣＴＣＣＣＣＣ
ｈｕＣａｌｃ−ＣＯＯＨ−Ｒｅｖ（配列番号：）
５’−ＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＧＣＴＡＡＣ−３’
【０６４３】
１５．２．サケカルシトニンペプチドを含む融合蛋白質
サケカルシトニン（図１０；配列番号：）ｓＦｖ融合蛋白質は，合成オリゴヌクレオチドを用いて調製し，互いにアニーリングさせ，次にＮｃｏＩ−またはＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ−消化ｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦプラスミドＤＮＡのいずれかにライゲーションして，成熟活性サケカルシトニンペプチドをコードする配列がｓＦｖＤＮＡ配列のそれぞれアミノ末端またはカルボキシ末端側に融合されているキメラリーディングフレームを得る。
【０６４４】
リン酸化した合成オリゴヌクレオチドを作成するかまたは購入し（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ），９５℃に加熱し，室温までゆっくり冷却することによりアニーリングさせ，次に，Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて，本質的に製造元（ＮＥＢＬａｂｓ）の指針にしたがって，消化したベクター中にライゲーションする。配列番号：のオリゴヌクレオチドは，サケカルシトニン遺伝子のセンス鎖のヌクレオチド２４８−３４３に対応するｃＤＮＡ配列であり（図１０に示されるアミノ酸配列において下線が施されている成熟活性ペプチドをコードする），５’−ＮｃｏＩオーバーハング配列を含む。配列番号：のオリゴヌクレオチドをヌクレオチド３４３−２４８に対応する相補的（アンチセンス）ｃＤＮＡ配列，ならびにＧ４Ｓリンカー配列および末端３’−ＮｃｏＩオーバーハング配列を含む配列番号：とアニーリングさせる。上述の操作により，サケカルシトニン遺伝子配列がｓＦｖ５ＡまたはｓＦｖ５ＡＦのアミノ末端側にインフレームで挿入されたものが得られる。
【０６４５】
配列番号：は，５’−ＮｏｔＩオーバーハング配列，続いてＧ４Ｓリンカーをコードする配列を含む。ｃＤＮＡ配列は，サケカルシトニン遺伝子のセンス鎖のヌクレオチド２４８−３４３に対応する（図１０に示されるアミノ酸配列において下線が施されている成熟活性ペプチドをコードする；配列番号：）。配列番号：のオリゴヌクレオチドは，ヌクレオチド３４３−２４８に対応する相補的（アンチセンス）ｃＤＮＡ配列，タンデム停止コドン配列，および末端３’−ＥｃｏＲＩオーバーハング配列に対応する配列を含む。配列番号：のオリゴヌクレオチドを配列番号：とアニーリングさせ，ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＳｙｎ５ＡまたはｐＳｙｎ５ＡＦベクター中に挿入して，ｓＦｖ５ＡまたはｓＦｖ５ＡＦのカルボキシ末端側にサケカルシトニンコーディング配列がインフレームで挿入されたものを得る。
ＮＨ２−ｓａｌＣａｌｃｉｔｏｎｉｎセンス（配列番号：）
５’−ＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＡＡＴＴＧＣＡＧＡＣＧＴＡＣＣＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＣＡＣＧＧＧＡＡＧＴＧＧＣＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣ−３’
ＮＨ２−ｓａｌＣａｌｃｉｔｏｎｉｎアンチセンス（配列番号：）
５’−ＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＴＡＣＧＴＣＴＧＣＡＡＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣ−３’
ＣＯＯＨ−ｓａｌＣａｌｃｉｔｏｎｉｎセンス（配列番号：）
５’−ＧＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＡＡＴＴＧＣＡＧＡＣＧＴＡＣＣＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＣＡＣＧＧＧＡＡＧＴＧＧＣＡＣＧＣＣＴＴＡＡＴＡＡＧ−３’
ＣＯＯＨ−ｓａｌＣａｌｃｉｔｏｎｉｎアンチセンス（配列番号：）
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＣＧＴＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＴＡＣＧＴＣＴＧＣＡＡＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴＧＧＡＧＣＡＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣ−３’
【０６４６】
実施例１６：カルシトニンポリペプチドを含む蛋白質コンジュゲートの製造
１６．１．サケカルシトニンに適した架橋剤のスクリーニング
種々の架橋剤を，蛋白質の沈澱を形成せずにサケカルシトニン（ｓＣａｌｃｉｔｏｎｉｎ）を誘導化する能力についてスクリーニングした。誘導化反応にアセトニトリルを加えることにより，蛋白質沈澱の防止が助けられることが見いだされた。スクリーニングした架橋剤の一覧および沈澱が形成されたか否か，および各架橋剤の化学構造を示す概略図が表１３に示される。架橋剤スクリーニングに基づいて，ｓＦｖカルシトニンコンジュゲーションにおいて用いるべき架橋剤としてｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡが選択された。
【０６４７】
表１３：サケカルシトニンを誘導化するために用いた架橋剤
【表１８】
2005500002.tif 000024
【０６４８】
【化１】
2005500002.tif 000025
【０６４９】
１６．２．サケカルシトニンのｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓへのコンジュゲーション
１６．２．１．ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓの調製
ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓの調製物を，ＤＴＴを最終濃度１０ｍＭで加えることにより還元し，モノマーおよびダイマー画分を，ＳＥＣで１ｘ４４ｃｍ  スーパーデックス７５カラムで，１０ｍＭＰＯ４，１００ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ６．２５で分離した。
【０６５０】
１６．２．２．ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓ−ｍａｌｓａｃ−ｓＣａｌｃｉｔｏｎｉｎコンジュゲーション
サケカルシトニン（ｓＣＴ）は，５倍モル過剰のｍａｌ−ｓａｃＨＮＳＡを用いて，ＯＤ４０６をモニターすることにより観察して，計算置換比０．９４に達するまで誘導化した。５ｍｌのＧ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｈｉ  Ｔｒａｐ）で脱塩することにより過剰のｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡを除去した。誘導化ｓＣＴをｓＦｖ５ＡＧ４Ｃｙｓモノマーに加え，反応液を２５℃で３時間インキュベートした。化学的コンジュゲーション反応は以下に示される。
【０６５１】
１６．２．３．ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓ−ｍａｌｓａｃ−ｓＣａｌｃｉｔｏｎｉｎコンジュゲートの精製
ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓ−ｍａｌｓａｃ−ｓＣａｌｃｉｔｏｎｉｎコンジュゲートは，ＳＥＣにより，１ｘ４４ｃｍのスーパーデックス７５カラムで，０．１ＭＰＯ４，ｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡを用いて精製した。ピーク画分を回収し，クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。かなりの量のモノマーｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓ−ｓＣＴコンジュゲートがダイマー化しており，回収されたダイマーコンジュゲートは，モノマーｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓ−ｓＣＴコンジュゲートとともに，トランスサイトーシスアッセイに含めた。
【０６５２】
１６．３．サケカルシトニンのｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓへのコンジュゲーション
１６．３．１．ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの製造
ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの溶液（９．５ｍｌ，１０ｍｇ／ｍｌ，０．３６ｍＭ）を，１０ｍＭのＤＴＴとともに３０分間インキュベートし，次にサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて，１．６ｘ６０ｃｍ  スーパーデックス７５（登録商標）カラムで１００ｍＭＰＯ４，１００ｍＭＮａＣＩおよび１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ６．２５中で精製した。３回続けて流して，モノマーおよびダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓを精製した。ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓは，モノマーおよびダイマーのｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓピークに分離した。ダイマーおよびモノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓは，プールした後に，Ａ２８０を測定することにより定量し，ダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの蛋白質収量は２６．４ｍｇであり，濃度は１．２ｍｇ／ｍｌまたは０．０４３ｍＭであると計算された。モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓは，蛋白質収量は３０ｍｇであり，濃度は１．１８ｍｇ／ｍｌまたは０．０４２ｍＭであると計算された。
【０６５３】
１６．２．２．サケカルシトニン（ｓＣＴ）の誘導化
【化２】
2005500002.tif 000026
【０６５４】
サケカルシトニンは，２４ｍｌのＰ２（登録商標）カラムで，３０％アセトニトリル，１００ｍＭＰＯ４，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．２５中で脱塩した。Ａ２８０を測定することにより，ｓＣＴの濃度は２２．３ｍｇ／ｍｌであると計算された。ｓＣＴは少なくとも９．０ｍｇ／ｍｌまで可溶であることが知られているため，２２．３ｍｇ／ｍｌのｓＣＴを９．０ｍｇ／ｍｌまで希釈して，沈澱が生ずることを防止した。５．５ｍｌ（９．０ｍｇ／ｍｌ）のｓＣＴをモノマーコンジュゲーションに用い，別の５．５ｍｌ（９．０ｍｇ／ｍｌ）ｓＣＴをダイマーコンジュゲーションに用いた。モノマーコンジュゲーション用の５．５ｍｌ（９．０ｍｇ／ｍｌ）のｓＣＴは，５倍モル過剰のｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡで誘導化した。反応液は，Ａ４０６をモニターすることにより１：１の置換比に達するまで，２５℃で１時間インキュベートした。ｍａｌ−ｓａｃ−ｓＣＴ反応液は，２４ｍｌのＰ２（登録商標）カラムで１００ｍＭのＰＯ４，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．２５中でただちに脱塩した。５．５ｍｌ（９．０ｍｇ／ｍｌ）のダイマーコンジュゲーションについて誘導化を繰り返した。
【０６５５】
モノマーおよびダイマーｍａｌ−ｓａｃ−ｓＣＴ誘導化の両方の蛋白質濃度は，Ａ２８０を測定することにより決定した。モノマーコンジュゲーションからのｍａｌ−ｓａｃ−ｓＣＴは，蛋白質収量１４．９ｍｇ（２．７ｍｇ／ｍｌ，０．７９ｍＭ）であると決定された。ダイマーコンジュゲーションについてのｍａｌ−ｓａｃ−ｓＣＴの収量は，２２ｍｇ（３．７ｍｇ／ｍｌ，１．０８ｍＭ）であると決定された。
【０６５６】
１６．２．３．モノマーおよびダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓのｍａｌ−ｓａｃ−ｓＣＴへのコンジュゲーション
８倍モル過剰（１４．９ｍｇ）のｍａｌ−ｓａｃ−ｓＣＴ（モノマーコンジュゲーション用）を，１４．９ｍｇのモノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓに，最終容量１８ｍｌで加えた。８倍モル過剰（２２．０ｍｇ）のｍａｌ−ｓａｃ−ｓＣＴ（ダイマーコンジュゲーション用）を，２２．０ｍｇのダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓに，最終容量２４ｍｌで加えた。モノマーおよびダイマーコンジュゲーションの反応液はいずれも，４℃で一夜インキュベートした。インキュベーション後，両方の反応液をＰａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ  １０Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）を用いて３ｍｌに濃縮した。モノマーおよびダイマーコンジュゲートは，１．６ｘ６０ｃｍ  ＳＥＣ  スーパーデックス７５（登録商標）カラムでＰＢＳ中で精製した。
【０６５７】
実施例１７：カルシトニンポリペプチドを含む分子のアッセイ
１７．１．トランスサイトーシスアッセイ
サケカルシトニンとｓＦｖ５ＡＦ−ＣｙｓまたはｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓモノマーまたはダイマーとの化学的コンジュゲートを調製した。これらのコンジュゲートは，その分子と結合した複合体にトランスサイトーシス輸送特性を付与する分子に向けられた１価（ｓＦｖ５ＡＦモノマー）および多価（ｓＦｖ５ＡＦダイマー）のリガンドと共有結合的に会合した，生物学的に活性な分子（カルシトニン）の例である。
【０６５８】
１７．２．方法
トランスサイトーシスアッセイは，本質的に上述のようにして行った。１μｇのｓＦｖまたはコンジュゲート分子をキメラｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞または対照ＭＤＣＫ細胞の先端のチャンバに加える二重のアッセイを行った。トランスサイトーシスは３７℃で１１時間行った。先端および基底外側の培地を回収し，容量を１ｍｌに調節し，５００μｌの基底外側の培地および５０μｌの先端の培地を蛋白質Ａセファロースで沈澱させた。サンプルは非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗５ＡＦ抗体を用いるウエスタンブロッティングによりアッセイした。
【０６５９】
１７．３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓおよびそのコンジュゲートのいずれも，非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてモノマー型およびダイマー型に対応するバンドを示す（それぞれ”ゲル−モノマー”および”ゲル−ダイマー”）。ゲル−ダイマー分子のほとんどは，おそらくはジスルフィド結合したものである。ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓの場合，工学操作されたＣ末端システインの間および／または内部システインの間にジスルフィド架橋が生ずる可能性がある。後者の架橋は，サンプル負荷の前にサンプルをＳＤＳ中で煮沸する間に生じたものであるかもしれない。
【０６６０】
コンジュゲートの場合，ｃ末端システインの１つがチオエーテル結合によりカルシトニンに結合しているため，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でダイマーとして移動する形は，おそらくは，ＳＤＳ中で煮沸される際にｓＦｖ中の内部システイン間に，または，１つのｓＦｖ分子のＣ末端システインと別のｓＦｖ分子の内部システインとの間に形成されるジスルフィド架橋のためであろう。ダイマーコンジュゲート調製物のほぼ半分はダイマーとして移動し，これはおそらくは，煮沸中のダイマー分子の架橋の効率を反映しているのであろう。モノマーコンジュゲート調製物においては，少ない割合のコンジュゲートがダイマーとして移動する。ダイマー物質は基底外側の媒体中に豊富である。
【０６６１】
１７．３．１．ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓ
ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓ調製物は，モノマーとダイマーとの混合物である。ｓＦｖ調製物の主要な部分は，非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてダイマーとして移動する。ダイマー種は，おそらくは，ＳＤＳ中で煮沸する前に生ずる共有結合性または非共有結合性の相互作用により生成されるのであろう。すなわち，ゲル上のモノマーのバンドとダイマーのバンドを比較することにより，同じサンプル中のモノマーのトランスサイトーシスおよびダイマーのトランスサイトーシスをモニターすることができる。ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓダイマーのトランスサイトーシスは，典型的には，１０％より高く，一方，ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓモノマーのトランスサイトーシスは通常は１０％より低く，しばしば５％より低い。
【０６６２】
１７．３．２．ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓ−カルシトニンコンジュゲート
試験したモノマーｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓ−カルシトニンの調製物は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で２つのコンジュゲート種を示す。これらのコンジュゲート種は異なるように挙動する。ゲル−モノマーコンジュゲートのトランスサイトーシスは，比較的効率が低く，ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓモノマーのものと類似している。これに対し，ゲル−ダイマーコンジュゲートのトランスサイトーシスは比較的効率が高い。
【０６６３】
総合すると，これらの結果は，ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓについて，およびｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓカルシトニンコンジュゲートについて，ダイマー型のｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓは対応するモノマー型より効率の高いトランスサイトーシスを示すことを示唆する。
【０６６４】
実施例１８：ｓＦｖ５ＡＦ−ＣＹＳのＩＮＦＬＩＸＩＭＡＢへのコンジュゲーション
１８．１化学的コンジュゲーション
Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用いる，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標），Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，ＭａｌｖｅｒｎＰＡの製品）のｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓへのコンジュゲーションの間に生ずる化学反応が以下に示される。
【０６６５】
第１の反応においては，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂの１またはそれ以上の１級アミンがＳＰＤＰと反応する。１級アミンは，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ分子中のリジン残基の側鎖，または蛋白質のアミノ末端において見いだされる。１級アミンは，第１の反応により修飾されて，芳香族脱離基へのジスルフィド結合を有する化学構造に１級アミンが結合している中間体を生ずる。
【０６６６】
第２の反応においては，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ分子が１０ｍＭＤＴＴで還元される。すべてのＣｙｓ残基が還元されるが，一般にＣ末端Ｃｙｓ残基はより還元されやすい。未反応ＤＴＴをサイズ排除クロマトグラフィーおよび／または透析により除去する。
【０６６７】
還元されたｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓは，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ中間体と反応する。中間体中の芳香族脱離基が活性化Ｃｙｓ残基により置き換えられて，このプロセス中でジスルフィド結合が生ずる。
【０６６８】
コンジュゲーション反応物および生成物のおよその分子量は以下のとおりである：ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓモノマー，２８ｋＤａ；Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ，１５０ｋＤａ；［ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓモノマー：Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ］コンジュゲート，１７８ｋＤａ。モノマー性ｓＦｖ−５ＡＦ−Ｃｙｓのコンジュゲートの構造は以下のように表される：
【０６６９】
１８．２１：１ＳＰＤＰ：Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂの誘導化に必要なモル比を求めるためのＳＰＤＰの滴定
ＳＰＤＰで誘導化するために，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））を１０ｍｇ／ｍｌに溶解し，１０μｌ（２５０μｇ）のアリコートを調製した。ＳＰＤＰをＩｎｆｌｉｘｉｍａｂのアリコートｓに１．０−３．５倍モル過剰で加えた。反応液を２５℃で約２０−３０分間インキュベートし，各反応液を５ｍｌのＨｉＴｒａｐＧ２５脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で脱塩緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡを含有）を用いて脱塩した。ピーク画分をプールし，１００μｌを取り出して，ＯＤ２８０で分光分析して，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ濃度を計算した。Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂに加えたＳＰＤＰの量は，１００μｌの誘導化Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂを取り出し，ＤＴＴを１０ｍＭとなるように加え，次に分光光度計を用いてＯＤ３４３で測定して，放出されたピリジン−２−チオンの量を計算することにより決定した（ｓ＝８，０８０Ｍ−ｌｃｍ−１）。結果は以下に示され，１：１ＳＰＤＰ：Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂのモル比は誘導化比１．０を与えることが示された。この誘導化比は，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ対ｓＦｖ−ＡＦ−Ｃｙｓの比率が様々である大量の多量体の形成を制限または防止するため，望ましい。
【０６７０】
ＳＰＤＰ滴定の結果
【表１９】
2005500002.tif 000027
【０６７１】
ＳＰＤＰは，１０ｍｇのＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ（１０ｍｇ／ｍｌ）にモル比１：１で加えた。ＳＰＤＰはＤＭＳＯに溶解し，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂの容量の２．５％の容量で加えた。反応液を２５℃で３０分間インキュベートし，脱塩し，上述したようにして誘導化の量を決定した。等重量の誘導化Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂおよび精製５ＡＦ−Ｃｙｓモノマー（実施例７を参照）を一緒に加えて，約５倍モル過剰の５ＡＦ−Ｃｙｓを得た。コンジュゲーション反応は４℃で一夜インキュベートした。
【０６７２】
１８．４．モノマー性ｓＦｖ５ＡＦｃｙｓ−ＳＰＤＰ−Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂコンジュゲートの精製
コンジュゲーション反応液を７５０μｌに濃縮し，１ｘ４４ｃｍのスーパーデックス７５ＳＥＣカラムに０．３ｍｌ／分間で負荷した。
【０６７３】
モノマー性（ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ）−ＳＰＤＰ−Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂは，ＳＥＣにより，１ｘ４４ｃｍのスーパーデックス７５カラムで，１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１ＭＰＯ４，ｐＨ７．５で精製した。画分２０−２９および３８−４６を回収した。
【０６７４】
両方のコンジュゲートからプールしたＳＥＣ画分の定量。プールした画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０濃縮器を用いて濃縮した。プール画分の蛋白質濃度は，ＢＣＡ蛋白質アッセイにより決定した。プール画分２０−２９は，７８２μｇ／ｍｌの蛋白質濃度を有しており，プール画分３８−４６は１０４２μｇ／ｍｌの蛋白質濃度を有していた。
【０６７５】
１８．５．精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
それぞれのプールした画分の３μｇまたは０．３μｇを，非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルはコロイド性クマシーブルー（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）で染色した。また，ゲルをフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移し，抗５ＡＦ−Ｃｙｓ抗体で探索して，ウエスタンブロットによる分析を行った。結合した抗５ＡＦ−Ｃｙｓは，抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼを加え，次にニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートトルイジン塩（ＢＣＩＰ）を加えることにより検出した。組換えｓＦｖ蛋白質中に存在するエピトープおよび精製タグはいくぶん不安定であり，ｓＦｖをコンジュゲート化していない状態で長期間保存すると，種々の程度で失われる。
【０６７６】
実施例１９：ＭＡＢコンジュゲートのアッセイおよび特性決定
１９．１トランスサイトーシスアッセイの設計
アッセイは，図１８に示されるトランスウエルシステムで行った。細胞を，先端のコンパートメントと基底外側のコンパートメントを隔てる多孔質膜上で成長させる。多特異性結合分子を先端のコンパートメントに入れ，次に，基底外側のコンパートメントからサンプルを取り出すことによりアッセイする。
【０６７７】
トランスサイトーシスアッセイは，本質的に上述のようにして行った。組成物または化合物を含むＭａｂをトランスウエルの先端のコンパートメントに入れ，ある時間が経過した後，先端のコンパートメントからのサンプルおよび基底外側のコンパートメントからのサンプルを取り出し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する。ゲル電気泳動後，蛋白質をＰＶＤＦ膜に移し，これをウエスタンブロットとしてポリクローナル抗ｓＦｖ抗体で探索し，次に抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼでニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート，トルジニウム塩（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を用いて検出する。ウエスタンブロッティングは，ｓＦｖを含むあらゆる分子種を検出し，ｓＦｖは，本発明の組成物または化合物の一部として存在していてもよく，”遊離の”ｓＦｖ分子として存在していてもよい。
【０６７８】
対照（トランスフェクトしていない）ＭＤＣＫ細胞は，有意なレベルのｐＩｇＲを含まないか，または全く含まない。したがって，これらの細胞においては，ｓＦｖまたはコンジュゲートのトランスサイトーシスは観察されないことが予測される。先端のコンパートメントのサンプルは，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓおよびそのコンジュゲートを示すはずであり，基底外側のコンパートメントのサンプルはｓＦｖまたはそのコンジュゲートを示さないはずである。
【０６７９】
これに対し，ｐＩｇＲの一部をコードしこれを発現する発現構築物でトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞は，ｐＩｇＲ特異的トランスサイトーシスの能力を有する。すなわち，先端から基底外側コンパートメントへのトランスサイトーシスが観察されることが予測される。したがって，分子がトランスサイトーシスをすることができる場合には，基底外側のコンパートメントにｓＦｖまたはそのコンジュゲートに対応するバンドが存在するであろう。
【０６８０】
１９．２．ｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞におけるｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ−ＩｇＧコンジュゲートのトランスサイトーシス
ｐＩｇＲ茎を発現するＭＤＣＫ細胞，またはｐＩｇＲを欠失した対照ＭＤＣＫ細胞の４日間培養物を，トランスウエルトランスサイトーシスチャンバの先端のチャンバ中で，２０μｇのｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ−Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂの存在下でインキュベートした。細胞をコンジュゲートの存在下で２０時間インキュベートし，インキュベーション期間の終了後，先端のチャンバおよび基底チャンバの両方を回収した。プロテインＡ−セファロースビーズとともにインキュベートすることにより，先端のチャンバの培地の１／３および基底チャンバの全部の培地からコンジュゲートを単離した。ビーズを洗浄し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁し，蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。蛋白質をＰＶＤＦに移し，膜をウエスタンブロットとしてポリクローナル抗ｓＦｖ抗体で，次に抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼで探索し，ＮＢＴ／ＢＣＩＰで検出した。
【０６８１】
対照ＭＤＣＫ細胞の場合には，先端のコンパートメントからのサンプルにおいてはウエスタンのレーンにおいてバンドが観察されたが，基底外側のコンパートメントから取り出したサンプルのレーンにおいては検出可能なバンドは事実上観察されなかった。しかし，ｐＩｇＲ茎を発現する細胞においては，両方のコンパートメントにおいてバンドが認められ，このことは，ある程度の分子がリバース（先端から基底外側への）トランスサイトーシスを行ったことを示す。
【０６８２】
実施例２０：ｓＦｖ５ＡＦに非共有結合的に結合した試薬のトランスサイトーシス
Ｍ１は市販のネズミ抗−ＦＬＡＧ−Ｔａｇモノクローナル抗体である（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。Ｍ１は，ＦＬＡＧエピトープが融合蛋白質の遊離アミノ末端に存在するときこれに結合するため，Ｍ１を用いて，免疫沈澱，免疫ブロッティング，またはＥＩＡにより，アミノ末端ＦＬＡＧ融合蛋白質を検出することができる。ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ分子はそのアミノ末端にＦＬＡＧエピトープを含む（図４）。すなわち，Ｍ１を非共有結合的にｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓに結合させて，［Ｍ１］：：［ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］分子複合体を作成し，この分子複合体がトランスサイトーシスを行う能力を調べた。
【０６８３】
Ｍ１（フィルターあたり０．４μｇ）をｓＦｖ５ＡＦ（フィルターあたり２μｇ）または緩衝液のみと組み合わせた。室温で１時間インキュベーションした後，本質的に上述したように１６−２４時間トランスサイトーシスアッセイを行った。１６時間のトランスサイトーシスにより平衡に達したようである。ｓＦｖ５ＡＦ単独およびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓのトランスサイトーシスもアッセイした。基底外側の媒体の１００％，または先端の媒体の１０％から，アフィニティー濃縮により蛋白質を濃縮した。ｓＦｖ５ＡＦまたはｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓを含むサンプルはプロテインＡを用いて濃縮した。Ｍ１を含むサンプルはプロテインＡおよびプロテインＧで濃縮した。サンプルは非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析した。Ｍ１を用いてｓＦｖ５ＡＦおよびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓを探索した。次に，アルカリホスファターゼ−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧをプローブとして用いて，ｓＦｖ５ＡＦおよびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ，ならびにトランスサイトーシスアッセイからのＭ１を検出した。
【０６８４】
図２０（パネル”Ａ”，”Ｂ”，”Ｅ”および”Ｆ”）に示されるように，ｓＦｖ５ＡＦ（約２０％のダイマーと約８０％のモノマーの混合物）は，ｐＩｇＲ依存的様式でＭ１のリバーストランスサイトーシスを引き起こすかまたは増強する。ｓＦｖ５Ａが存在しない場合には，ｐＩｇＲが存在してもしなくても，基底外側のコンパートメントではＭ１は検出されない。
【０６８５】
この実験ではｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓのトランスサイトーシスも調べた。ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓのモノマーおよびダイマーの混合物を用いた。モノマーおよびダイマーのトランスサイトーシスは両方ともｐＩｇＲ依存性であったが，トランスサイトーシスされたダイマーのパーセントは，同じサンプル中に存在するモノマーより多かった。
【０６８６】
実施例２１：タンデム一本鎖抗体を含む融合蛋白質
２１．１．多価一本鎖抗体
一本鎖抗体のアミノ酸配列の２またはそれ以上のコピーをコードするリーディングフレームを調製し，これを用いて２またはそれ以上のコピーのｓＦｖを含む一本鎖ポリペプチドである分子を調製する。多価一本鎖抗体は，本明細書に記載されるように，組換えＤＮＡ発現系を用いて調製する。多価一本鎖抗体を生物学的に活性な分子に非共有結合的に会合させるかまたは化学的に結合させて，本発明の化合物を作成する。
【０６８７】
当業者は，特定の用途のために最適化された抗体を同定および製造するために，種々の多価一本鎖抗体を望ましい特性および望ましくない特性についてアッセイすることができるであろう。最適化された多価一本鎖抗体を生物学的に活性な分子に会合させるかまたは結合させて，本発明の化合物を作成する。
【０６８８】
２１．２．多価一本鎖抗体を含む融合蛋白質
生物学的に活性な分子がポリペプチドである場合には，ｓＦｖおよび生物学的に活性なポリペプチドの２またはそれ以上のタンデムコピーをコードするリーディングフレームを調製する。このリーディングフレームを組換えＤＮＡ発現系で発現させると，生物学的に活性なポリペプチドおよび多価ｓＦｖを一本鎖ポリペプチド中に含む融合蛋白質が産生される。
【０６８９】
生物学的に活性な分子ポリペプチドおよびｓＦｖの２またはそれ以上のＶ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）領域の距離および方向を変更して，１またはそれ以上の望ましい性質について最適化された融合蛋白質を製造することが適当であろう。要素の任意の順番または配置を用いることができる。非限定的例としては，ｓＦｖおよび生物学的に活性なポリペプチド（ＢＡＰ）の２つのタンデム反復を有する融合蛋白質は，以下の構造のいずれかを有することができる：
ＶＨ１−ＶＬ１−ＢＡＰ−ＶＨ２−ＬＶ２
ＶＨ１−ＶＬｌ−ＶＨ２−ＶＬ２−ＢＡＰ
ＢＡＰ−ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＬＶ２
ＢＡＰ−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２−ＬＶ１
ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２−ＶＬ１−ＢＡＰ，等。
【０６９０】
多数の，例えば２つのＢＡＰを有する分子もまた本発明の範囲内である：
ＢＡＰ１−ＶＨ１−ＶＬ１−ＢＡＰ２−ＶＨ２−ＶＬ２
ＢＡＰ１−ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２−ＢＡＰ２
ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２−ＢＡＰ１−ＢＡＰ２
ＢＡＰ１−ＢＡＰ２−ＶＨｌ−ＶＬｌ−ＶＨ２−ＶＬ２，等。
【０６９１】
実施例２２：ｓＦｖ５ＡＦ−ＣＹＳおよびその複合体の安定性
２２．１．プロテアーゼ安定性アッセイ
多価複合体および化合物の相対的安定性を評価するために，以下の実験を行った。
【０６９２】
基質（典型的には２０μＭ）を，１：４０基質：酵素比で，トリプシン，キモトリプシン，またはエラスターゼとともに，１８０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．４，および１０ｍＭＣａＣｌ２を含む総容量２００μＬの緩衝液中でインキュベートする。プロテアーゼ阻害剤の効力は，これらをアッセイ中に所望の濃度で含めることにより評価することができる。氷上で，または室温または３７℃で種々の時間（通常は１５，９０および２４０分間）インキュベーションした後，１０μｌのサンプルを３０μｌの熱２ＸＬａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳサンプル緩衝液（１６０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ６．８，２％ＳＤＳ，２０％グリセロール，１０．６％β−メルカプトエタノール）に加え，加熱ブロックで９０℃以下で５分間加熱する。所望の場合にはベータ−メルカプトエタノールを加えなくてもよい（例えば，切断可能な架橋剤とのコンジュゲート用）。すべてのサンプルを回収した後，これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色または適当な抗体ウエスタンブロットにより分析する。
【０６９３】
試験した基質は，ｓＦｖ５ＡＦ，モノクローナル抗体Ｍ１，およびｓＦｖ５ＡＦ：Ｍ１複合体であった。用いたプロテアーゼおよび抽出物は，トリプシン，キモトリプシン，サル，ラットおよびヒト腸液であった。トリプシンおよびキモトリプシンは商業的供給元（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）から購入した。サンプルは，プロテアーゼまたは抽出物（Ｓ，出発物質）を加える前，ｔ＝０分間，１５分間，９０分間および４時間において取り出した。氷上に置いたサンプルからｔ＝０のサンプルを取り出し，その後の時点のサンプルは特定の温度でインキュベーションしている間に取り出した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し，ゲルをニトロセルロースに移し，ポリクローナル抗ｓＦｖ５ＡＦ抗体，Ｍ１（ｓＦｖ５ＡＦのＮ末端に存在するＦＬＡＧタグに向けられたもの），およびＭ１を検出するＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧで探索した。インキュベーションは，特定の温度で，種々のプロテアーゼ阻害剤の存在または非存在下で行った。
【０６９４】
２２．１．１．室温インキュベーション
抗５ＡＦを用いる免疫ブロッティングは，４時間の間にほとんど分解が生じないことを示した。ｓＦｖ５ＡＦ分子からのｍｙｃ６ｘＨｉｓタグを示すであろうサイズシフトは，ｔ＝０のサンプルにおいても見られ，このことは，４℃でのプレインキュベーション，ＳＤＳサンプル緩衝液中でのサンプル加熱，および／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥの間にタグが失われることを示す。
【０６９５】
Ｍ１を用いる免疫ブロッティングにより，ｓＦｖ５ＡＰのＮ末端のＦＬＡＧタグが検出される。ＦＬＡＧタグは，ｔ＝０のトリプシンのサンプルで欠失していたが，このタグはキモトリプシンおよびヒト腸液中でゆっくり失われた。この結果は，ＦＬＡＧタグが２つのリジン残基を含み，このため他の酵素に比べてトリプシンについてより優れた基質であることと一致する。
【０６９６】
２２．１．２．プロテアーゼ阻害剤の存在下または非存在下におけるインキュベーション
３７℃でのインキュベーションは，上述した室温インキュベーションについて記載したように行った。５ＡＦの安定性は，トリプシン，キモトリプシン，ヒト腸液，およびサル腸液の存在下で室温でアッセイした。１組のサンプルはプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチン，ロイペプチン，およびアプロチニンを含み，別の組のサンプルはプロテアーゼ阻害剤を含んでいなかった。
【０６９７】
抗５ＡＦを用いる免疫ブロッティングによりｓＦｖ５ＡＦが検出される。３７℃においても，キモトリプシンおよびトリプシンによるｓＦｖ５ＡＦの実質的な分解は認められない。ｍｙｃ６ｘＨＩＳタグの欠失を示唆するサイズシフト（見かけのＭｗの減少）が，ｔ＝０のキモトリプシンサンプルおよびプロテアーゼ阻害剤を含むすべてのキモトリプシンサンプルを除くすべての場合において見られる。Ｍ１を用いる免疫ブロッティングにより５ＡＦのＮ末端のＦＬＡＧタグが検出される。ＦＬＡＧタグは，ｔ＝０のトリプシンサンプルにおいて欠失しているが，キモトリプシンおよび腸液中ではより安定である。
【０６９８】
２２．２．界面活性剤安定性アッセイ
１２５μｇのｓＦｖ５ＡＰ−Ｃｙｓを，単独でまたは０．１％Ｔｗｅｅｎ２０または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のいずれかの存在下で，ＰＢＳ中で１ｘ４４ｃｍのスーパーデックス７５カラムでサイズ排除クロマトグラフィーに供した。モノマーおよびダイマーの相対的な量は，界面活性剤処理により変化しなかった。
【０６９９】
結果はピーク下面積のパーセントとして表され，以下のとおりである：
【表２０】
2005500002.tif 000028
【０７００】
実施例２３：機能的スクリーニングおよび精製
茎分子および／またはｐＩｇＲドメインに結合する固定化されたリガンドを含む組成物を用いて，そのような分子またはドメインに向けられたターゲティング要素を特性決定し，アッセイする。また，この実施例において記載されるように，そのような組成物を用いて，複数のターゲティング要素を含む調製物からターゲティング要素を選択およびスクリーニングする。
【０７０１】
２３．１．一般的戦略
選択および／またはスクリーニングのために，以下の例示的方法にしたがって候補ターゲティング要素を含む化合物の収集物を用意する。
【０７０２】
２３．１．１．リガンド保持
茎分子および／またはｐＩｇＲドメインおよび／または領域に結合することが知られている固定化ポリペプチドを用いて，新規ターゲティング要素を特性決定し，アッセイし，同定する。茎分子またはｐＩｇＲドメインまたは領域から誘導されたポリペプチドを含む化合物を固体または半固体表面に固定化する。例示的なモードにおいては，固体または半固体はカラムとして調製し，これを通して液体を流すことができる。
【０７０３】
化合物をカラムを通して流し，洗浄後にカラム上に残留したものは，候補リガンドであり，これを茎分子またはｐＩｇＲドメインまたは領域に向けられたターゲティング要素として用いることができる。候補リガンドの特異的結合は，茎分子またはｐＩｇＲドメインまたは領域から誘導されたポリペプチドを含む分子を候補化合物が結合しているカラムに加えることにより調べる。候補ターゲティング要素の非固定化ターゲット分子が過剰量存在する場合には，溶液中のターゲット分子は候補リガンドに結合し，これを固定化ターゲット分子から遊離させて，カラムを通って流れるようにする。そのようなカラムに結合する化合物の構造を決定することにより，新規ターゲティング要素を製造することができる。
【０７０４】
ポリペプチドのリガンド／ターゲティング要素の場合には，ターゲティング要素として用いることができる１またはそれ以上のコンセンサス配列を生成するために，これらのアミノ酸配列を決定し，アライメントする。ポリペプチド配列はまた，ｐＩｇＲに結合するペプチド模倣体の設計にも用いられる。当業者は，ペプチドの構造のモデルを作製して，ペプチド中の結合を非ペプチド結合に変換することができる。
【０７０５】
２３．１．２．結合の競合阻害
前節に記載される例示的カラムを用いて，茎分子またはｐＩｇＲドメインおよび／または領域に向けられた新規リガンドを別の方法で製造することができる。この方法においては，茎分子またはｐＩｇＲドメインおよび／または領域に結合することが知られている予め特性決定された化合物をカラムに加え，固定化ターゲット分子に結合するようにする。化合物をカラムを通して流し，予め特性決定された結合化合物を置き換える化合物は，新規ターゲティング要素の候補である。
【０７０６】
２３．２．ｓＦｖ５Ａにより認識されるエピトープに向けられたリガンド
ｓＦｖ５Ａのペプチドエピトープは，ＱＤＰＲＬＦ（配列番号：；米国特許出願，代理人書類番号１８０６２Ｅ−００９０００ＵＳ，２００１年３月２６日出願を参照）であると決定されている。このアミノ酸配列は，ｓＦｖ５Ａが結合するエピトープである。
【０７０７】
ＱＤＰＲＬＦを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造し，固体または半固体媒体に結合させる。インビトロで合成することができるオリゴペプチドが一般に好ましい。ＩＥＮＫＡＩＱＤＰＲＬＦＡＥＥＫＡＶ（配列番号：）等のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを，ジスルフィド結合またはマレイミド結合を用いてチオールセファロース表面に結合させる。
【０７０８】
あるいは，ポリペプチドをカラムに結合させるために用いることができる反応性チオール基を与えるために，アミノ末端またはカルボキシル末端のシステイン残基をペプチド中に取り込ませることができる。このようなペプチドは，例えば，アミノ酸配列ＣＧＧＧＧＩＥＮＫＡＩＱＤＰＲＬＦＡＥＥＫＡＶ（配列番号：）またはＩＥＮＫＡＩＱＤＰＲＬＦＡＥＥＫＡＶＧＧＧＧＧＣ（配列番号：）を有する。システイン含有ペプチドを，１０−２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ約７−約８，０，約２００ｍＭのＮａＣｌを含む）中で，１０倍モル過剰のＤＴＮＢと反応させる。未反応ＤＴＮＢおよびＴＮＢは，セファデックスＧ２５またはＢｉｏ−ＧｅｌＰ−１０のカラムで，１０−２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ約６−約８）を用いてゲルサイジングクロマトグラフィーを行うことにより除去する。次に，ＴＮＢ−ペプチドをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌを含む）中でチオールセファロースと反応させる。
【０７０９】
修飾されたセファロースを洗浄して未反応ペプチドを除去し，カラムに充填して，ＱＤＰＲＬＦエピトープに特異的なｓＦｖおよびコンジュゲートを通す用意をする。ｓＦｖ５Ａ，またはｓＦｖ５ＡＦ，ｓＦｖ５ＡＦ−ＣｙｓおよびｓＦｖ５Ａの他の誘導体の分子，またはｓＦｖ５またはその誘導体を含む化合物または組成物をカラムに加える。好ましいｓＦｖおよびｓＦｖ化合物または組成物コンジュゲートは，固定化ペプチドを認識し，これに結合する。カラムを洗浄して非結合成分を除去した後，カラムを以下のいずれかで処理する：（ａ）１０ｍＭＤＴＴで処理して，ペプチドと樹脂との間のペプチドジスルフィド結合を還元する，（ｂ）２５ｍＭの，例えばＱＤＰＲＬＦ，ＡＩＱＤＰＲＬＦＡＥ（配列番号：）等のエピトープを含む遊離ペプチド，または置換ネットの結果にしたがって修飾されているペプチドで処理する，または（ｃ）ｐＨ約３−約４に調節され，１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのグリシン溶液で処理する。溶出された蛋白質を回収し，低いｐＨ溶出を用いた場合にはＴｒｉｓ塩基で速やかに中性ｐＨとする。次に，ｓＦｖまたはｓＦｖコンジュゲートを溶出するためにペプチドを用いた場合には，調製物を透析し，さらに，またはこれに代えて，セファデックスＧ−２５またはＢｉｏ−ＧｅｌＰ−１０のカラムを通して，遊離ペプチドを除去する。夾雑している可能性のある微生物は，滅菌し滅菌容器中で提供される０．２ミクロンフィルターを通すことにより，コンジュゲートを含む組成物から除去する。
【０７１０】
２３．３．茎またはｐＩｇＲに結合する細菌由来のリガンド
Ｚｈａｎｇらは，肺炎双球菌の接着蛋白質ＣｐｂＡが，細菌細胞の外表面の一部としてまたは遊離分子として，ヒトｐＩｇＲ（ｈｐＩｇＲ）と相互作用する証拠を提示している。ＣｐｂＡ：ｈｐＩｇＲ相互作用の領域は，ＣｐｂＡに由来する一連の大きいペプチドフラグメントを用いてマッピングされた。ＣｐｂＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号０３０８７４）は，残基４５４−６６３を含むコリン結合ドメイン，およびそれぞれ残基９７−２０３および２５９−３６５に含まれるＲ１およびＲ２（配列番号：）と称される２つのＮ末端反復領域を含む。Ｚｈａｎｇらは，Ｒ１およびＲ２を含むポリペプチド（図１７を参照）はｈｐＩｇＲの一部と相互作用するが，ＣｐｂＡの残基１−１０１を含むポリペプチドはｈｐＩｇＲに結合しないことを示した。肺炎双球菌ＣｐｂＡ中に含まれる配列，ならびに他の種のＣｐｂＡホモログ中の類似の配列を，新規リガンド／ターゲティング要素を含むポリペプチドの起源として用いることができる。ＣｐｂＡの領域Ｒ１およびＲ２に由来するアミノ酸を有するポリペプチドを製造し，上述のようにリガンドについてスクリーニングすることができる。
【０７１１】
２３．４．化合物および組成物の機能的精製
茎分子またはｐＩｇＲドメインまたは領域に結合する化合物は，ターゲット分子またはその誘導体を含むカラムを用いて精製する。例えば，ｓＦｖ５ＡまたはｓＦｖ５Ａ含有化合物をカラムに結合させ，溶出する。溶出液を適当な条件下で保存する。これらの条件には，−８０℃，２−８℃で保存すること，および／または凍結乾燥により乾燥状態，例えば粉体とすることが含まれる。例えば，この方法により精製されたコンジュゲートは，ターゲット分子に結合することができる種の化合物に富み，非コンジュゲート化ｓＦｖ５Ａ分子，非機能性ｓＦｖ部分を含むコンジュゲート，および固定化されたターゲット分子に結合する能力を欠失したコンジュゲートが比較的少ない。このようにして涸渇させる化合物には以下のものが含まれる：（ａ）望ましくないように化学的に修飾されており，したがってｐＩｇＲへの結合に欠陥を有する；（ｂ）代替的な望ましくないコンジュゲート生成物（例えば，マルチマー対モノマーコンジュゲート，または別の化学結合から形成されたコンジュゲート）である；または（ｃ）別の理由によりターゲット分子に結合することができないｓＦｖ５Ａコンジュゲート分子である。
【０７１２】
このようにして，機能性（ターゲット結合）蛋白質コンジュゲートの質が高められた組成物を製造する。そのような組成物は，別の方法で製造された組成物に対して多くの利点を有するであろう。これらの利点には，限定されないが，非機能性コンジュゲートにより引き起こされる望ましくない副作用の減少または排除，改良された保存期間，本発明の化合物を含む組成物の治療的効力の増強，および改良されたレベルの一貫性を有する化合物の調製物が含まれる。
【０７１３】
結合リガンドおよび生物学的に活性な分子または成分を含む多数の組成物および化合物を製造することができる。しかし，選択またはスクリーニングすることができる特性および特徴に基づいて，ある種の組成物および化合物が好ましいであろう。例えば，機能的分子の好ましい特性は，ターゲット分子に結合する能力である。本発明の組成物および化合物のためには，本明細書に記載されるドメイン６−ＧＳＴ融合蛋白質を用いることができる。ＧＳＴ融合蛋白質は，本質的に本明細書に記載されるように，および／または既知の手法（例えば，Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｉｔ  １６．７  ｏｆ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １６：Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄＥｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ  １６−２８  ｔｏ  １６−３１を参照）にしたがって，精製し，調製し，グルタチオンカラムに結合させる。
【０７１４】
実施例２４：表面プラズモン共鳴による結合特性の評価
２４．１．実験方法
各ｓＦｖまたはｓＦｖ−コンジュゲートを，組換えｐＩｇＲドメイン６ＧＳＴ（Ｄ６−ＧＳＴ）融合蛋白質に結合する能力について試験した。ｐＩｇＲドメイン６融合蛋白質は，ヒト，カニクイザルおよびラットｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）から構築し，Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて，５ＡＦ抗体融合または抗体コンジュゲートのドメイン６への特異的結合を実時間で捕捉フォーマットで測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は，抗ＧＳＴ抗体をＢｉａｃｏｒｅチップ表面に固定化し，特定のＤ６−ＧＳＴ融合蛋白質を抗体でコーティングされた表面に結合させる捕捉プロトコルを用いて行った。ｓＦｖ５ＡＦまたはｓＦｖ５ＡＦ含有コンジュゲートを，典型的には濃度範囲１５．６−５００ｎＭにわたってアッセイした。
【０７１５】
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）速度論評価ソフトウエア（ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，バージョン３．１）を用いて，会合速度（ｋａ），解離速度（ｋｄ），ならびにアフィニティー定数（ＫＡ＝ｋａ／ｋｄまたはＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を決定した。結合は，１：１ラングミュア結合モデルを用いて，抗体濃度範囲についてのデータのグローバルフィッティングにより定量した。
【０７１６】
２４．２．ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの精製モノマーまたはダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓへの結合活性の比較
種の間でＫＤはほとんど変動せず，これは表１４に反映されている。１つの特定の種のＤ６−ＧＳＴ融合に対する複数の型のｓＦｖの結合を比較した。精製したダイマーは精製したモノマーより高いアフィニティーを示す。それぞれの種（ヒト，ラット，サル）について，相違は３倍である。ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ出発物質は，モノマーおよびダイマーの混合物であり，これは，精製ダイマーと同様のアフィニティーを有する。これは，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ出発物質がモノマーおよびダイマー型のｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの混合物である場合の，データの単一結合部位モデリングのためであろう。精製したモノマー型と精製したダイマー型のｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓを比較したとき，ＫＤの相違は，会合速度定数（ｋａ）の変化に起因するように見える。解離速度定数（ｋｄ）は，モノマーとダイマー型のｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓでは変動しない。
【０７１７】
表１４：表面プラズモン共鳴による５ＡＦ−ＣＹＳの精製モノマーまたはダイマーへの結合の比較
【０７１８】
【表２１】
2005500002.tif 000029
【０７１９】
まとめると，レセプターに対するｓＦｖのアフィニティーは，精製モノマーｓＦｖと比較して精製ダイマーｓＦｖのほうが約３倍高かった。この相違は，主としてｋａの相違によるものであり，試験した異なる種からのＤ６−ＧＳＴ融合蛋白質への結合には有意な変動はない。
【０７２０】
２４．３モノマーおよびダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ−ｓＣａｌｃｉｔｏｎｉｎコンジュゲートのｐＩｇＲＤ６−ＧＳＴへの結合の比較
これらの実験には上述したものと同じ捕捉プロトコルを用いた。抗ＧＳＴ抗体をＢｉａｃｏｒｅチップ表面に固定化し，Ｄ６−ＧＳＴ融合蛋白質を抗体に結合させた。被検物質はｓＦｖＡＧ４−Ｃｙｓサケカルシトニンコンジュゲートであり，１５．６から５００ｎＭの濃度範囲で試験した。コンジュゲートは，非切断性ｍａｌ−ｓａｃリンカーを用いて製造した。ｓＦｖ５ＡＧ４−Ｃｙｓモノマーから製造したコンジュゲートはＡｚ０１４と称され，匹敵するダイマーコンジュゲートはＡｚ０１５と称される。
【０７２１】
表１５：ｓＣＡＬＣＩＴＯＮＩＮ−ｓＦｖコンジュゲートのＢＩＡＣＯＲＥアッセイの結果
【表２２】
2005500002.tif 000030
【０７２２】
表１５に示されるように，異なる種（ヒト，サル，ラット）の間ではＫＤにはほとんど変動がなく，実験間の変動は小さい。ｓＦｖ型の結合とある種のＤ６−ＧＳＴ融合の結合を比較すると，ダイマーコンジュゲートはモノマーコンジュゲートより高いアフィニティーを示す。差は，各種について７−１９倍である。モノマーとダイマーコンジュゲートのＤ６−ＧＳＴ融合に対するＫＤの相違は７−１９倍であり，ダイマーコンジュゲートはより高いアフィニティーを有する。モノマーコンジュゲートとダイマーコンジュゲートとを比較すると，ＫＤの相違は，会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）の両方の変化に起因するようである。
【０７２３】
まとめると，ダイマーカルシトニンコンジュゲートは，ｐＩｇＲドメイン６ＧＳＴ（Ｄ６−ＧＳＴ）に対して，モノマーコンジュゲートが示すアフィニティーより約１０倍高いアフィニティーを有する。モノマーおよびダイマーコンジュゲートのＤ６−ＧＳＴ構築物に対するアフィニティーは，異なる種の間で有意に相違せず，実験間の変動は小さい。このことは，この方法の再現性を示す。
【０７２４】
実施例２５：ＭＡＬ−ＳＡＣ−ＨＮＳＡを用いるＳＦＶ５ＡＦ−ＣＹＳの１５ｋＤ蛋白質へのコンジュゲーション
２５．１架橋剤の説明
非切断性ヘテロ二官能性架橋剤である，Ｎ−マレイミド−６−アミノカプロイル−（２’−ニトロ，４’−スルホン酸）−フェニルエステルＮａ＋（ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡ）（ＢＡＣＨＥＭ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）が合成され，スルフヒドリル（システイン）含有ペプチドをチオエーテル結合により担体蛋白質にコンジュゲートさせるために用いられている（Ａｌｄｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ，ｍｏｎｉｔｏｒａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８７  Ａｕｇ１；１６４（２）：４９４−５０１）。ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡは水溶性であるため，コンジュゲーション反応のパラメータを最大化するためにその濃度を容易に調節することができる。ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡとアミノ基との反応によりジアニオンフェノレートである１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−ベンゼンスルホン酸（ＨＮＳＡ）が放出され，これは黄色の発色団である。ＨＮＳＡの濃度をモニターして，例えば，進行中のコンジュゲーション反応または種々の条件での平行反応の程度および速度を分光光学的に定量する。このＨＮＳＡの検出方法はまた，精製の間に活性化ペプチドの遊離架橋剤からの分離をモニターすることを助けるためにも用いられる。
【０７２５】
２５．２モノマーおよびダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの製造
１７．６ｍｇの精製ｓＦｖ５ＡＦ−ＣｙｓからモノマーおよびダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓを単離した。８．８ｍｇのアリコートを１０ｍＭＤＴＴで還元して２回のモノマー／ダイマー単離を行い，１０ｍＭリン酸ナトリウム，０．１ＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ６．２５中で，１．６ｘ６０ｃｍのスーパーデックス７５カラムでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。各クロマトグラフィーからのモノマーおよびダイマーのｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ画分をプールした。単離後の蛋白質の収量は１１．０４ｍｇであり，そのうち６．０８ｍｇ（５５％）はモノマー種であり，４．９６ｍｇ（４５％）はダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓであった。カラムからのｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの回収率は６３％であった。
【０７２６】
２５．３誘導化１５ｋＤ蛋白質の製造
１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．２５を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム中で脱塩することにより，Ｍａｌ−Ｓａｃ−ＨＮＳＡ誘導化用の１５ｋＤ蛋白質を調製した。１回あたり１１．６ｍｇ／ｍｌの１５ｋＤ蛋白質を０．９ｍｌ用いて，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｇ−２５ＨｉＴｒａｐ脱塩カラムで７回脱塩した。すべてのクロマトグラフィーからの画分をプールし，ＯＤ２８０を測定した。１５ｋＤ蛋白質の濃度の計算値は３．４６ｍｇ／ｍｌであり，１５ｋＤ蛋白質の収量の計算値は１１．８ｍｌ中４０．８ｍｇであった。
【０７２７】
脱塩した１５ｋＤ蛋白質をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０で２．７ｍｌに濃縮し，ＯＤ２８０を測定した。１５ｋＤ蛋白質の濃度の計算値は１３．０ｍｇ／ｍｌであり，蛋白質収量の計算値は３５．１ｍｇであった。脱塩および濃縮の後，最終的な１５ｋＤ蛋白質の回収率は４５．６％であった。実験によっては，脱塩／濃縮工程に加えて，またはその代わりに，一晩の透析を用いた。
【０７２８】
２５．４コンジュゲーション反応
１５ｋＤ蛋白質を２．５モル過剰のｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡとともに室温で３０分間インキュベートした。ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡと等モル量のグリシンを加えることにより反応を停止させた。ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡで誘導化した１５ｋＤ蛋白質を５ｍｌのＧ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｈｉ  Ｔｒａｐ）で脱塩して，過剰のｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡを除去した。０．９ｍｌの［１５ｋＤ蛋白質］−［ｍａｌ−ｓａｃ］（１３ｍｇ／ｍｌ）を１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２５）で脱塩した。脱塩は４回行い，すべての［１５ｋＤ蛋白質］−［ｍａｌ−ｓａｃ］が脱塩されるまで，各操作からの［１５ｋＤ蛋白質］−［ｍａｌ−ｓａｃ］調製物の半分を等容量のモノマーまたはダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓのいずれかに加えた。
【０７２９】
０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることにより，反応のｐＨは，ｐＨ６．２５からｐＨ７．２５に上昇し，残りのｓＦｖをそれぞれの適当な反応容器に加えた。各反応の最終容量は約１８ｍｌであった。反応液を両方とも２５℃で［モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［１５ｋＤ蛋白質］反応容量が１．６５ｍｌとなり，［ダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［１５ｋＤ蛋白質］が１．５５ｍｌとなるまで濃縮した。反応は室温で５０分間，および２５℃で２時間行い，次に精製するまで４℃で保存した。
【０７３０】
２５．５．［ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートの精製
２５．５．１モノマーコンジュゲート（コンジュゲート調製物Ａｚ００８）の調製
［モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートは，ＳＥＣにより１．６ｘ６０ｃｍのセファデックス７５カラムで，０．１ＭＰＯ４（ｐＨ７．２５）および１ｍＭＥＤＴＡの溶液を用いて精製した。溶出物のクロマトグラフは，種々の画分がコンジュゲート物質を含むことを示した。画分３２−４３，４５，５１，５６および６６を，さらなる特性決定のために選択した。選択された画分の１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し，ゲルをコロイド状クマシーブルーで染色することにより，選択された画分の蛋白質含量およびおよその分子量を調べた。染色ゲル上で可視化した蛋白質のサイズを見積もるために，別のレーンで分子量マーカーを電気泳動した。染色ゲルの結果に基づいて，画分３９−４５をプールした。以下の節では，このプールを”精製モノマーコンジュゲート”（すなわち，［モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］）と称する。プールした画分の蛋白質濃度は，ＢＣＡ蛋白質アッセイを用いて決定した。これらの測定値をさらなる特性決定，例えば，ウエスタン分析用のＳＤＳ−ＰＡＧＥの負荷量の計算において用いた。
【０７３１】
２５．５．２ダイマーコンジュゲート（コンジュゲート調製物Ａｚ００９）の調製
［ダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］は，ＳＥＣにより，１．６ｘ６０ｃｍスーパーデックス７５カラムで，０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２５）および１ｍＭＥＤＴＡを用いて精製した。画分２６−３９，５１および５９をクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために選択し，分析は上述のようにして実施した。画分２８−３３をプールして，”精製ダイマーコンジュゲート”調製物とした。画分３６−３９，４７−５５，および５９−６１もまたプールして，さらなる分析に用いた。プールした画分の蛋白質濃度は，ＢＣＡ蛋白質アッセイを用いて決定した。
【０７３２】
２５．６．疎水性相互作用クロマトグラフィーによるコンジュゲートの精製
フェニルセファロースでの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて，所望のコンジュゲートからコンジュゲーション反応蛋白質を精製する。２００μｌの未精製ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの１５ｋＤ蛋白質へのコンジュゲーション反応物を，３．０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む０．１Ｍリン酸Ｎａ（ｐＨ５．５）中で１ｍｌのフェニルセファロースカラムに負荷し，１５％エチレングリコールを含む０．１Ｍリン酸Ｎａ（ｐＨ５．５）の勾配を流す。溶出プロファイルのクロマトグラムを用いて，さらなる分析のためにいずれの画分をプールすべきかを決定する。
【０７３３】
実施例２６：［ＳＦＶ５ＡＦ−ＣＹＳ］−［ＭＡＬ−ＳＡＣ］−［１５ＫＤ蛋白質］コンジュゲートの特性決定
２６．１クマシー染色ゲル
プールした画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルのクマシー染色に供した。クマシー染色ゲルは，モノマーコンジュゲート調製物中には未反応ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓがほとんど存在しないことを示す。ダイマーコンジュゲート調製物中にはわずかの量の未反応ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓが存在する。この結果は，ダイマーコンジュゲート調製物のほとんどは，２つの会合した形の［モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］分子，すなわち｛［モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］｝２として存在することを示唆する。しかし，１つのｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ分子と会合した１つの［モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］分子，すなわち（［モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］２−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］）から構成されるダイマーコンジュゲートも存在するであろう。
【０７３４】
２６．２．質量分析
コンジュゲートおよびコンジュゲーション反応物をＨ２Ｏで透析し，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供した。
【０７３５】
２６．２．１モノマーコンジュゲートの質量分析
［モノマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］をｍａｌｄｉ−ＴＯＦに供した。モノマーコンジュゲートに対応する分子量４６７４８のピーク，およびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓを示す分子量２９１０７のピークが存在した。また，遊離１５ｋＤ蛋白質に対応する分子量１８０００以下のピークも存在した。
【０７３６】
２６．３．２ダイマーコンジュゲートの質量分析
［ダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］をｍａｌｄｉ−ＴＯＦに供した。モノマーコンジュゲートに対応する分子量４５０２２のピーク，およびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓを示す分子量２６５１７のピークが存在した。また，遊離１５ｋＤ蛋白質に対応する分子量１８０００以下のピークも存在した。
【０７３７】
２６．４［ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［ｍａｌ−ｓａｃ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートのトランスサイトーシス
コンジュゲートをトランスサイトーシスアッセイにおいて試験し，これは本質的に上述したように実施した。ＳＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ，モノマーコンジュゲート，ダイマーコンジュゲートまたは１５ｋＤ蛋白質を，ｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞または対照ＭＤＣＫ細胞を含むトランスウエルの先端のチャンバ中で３７℃で１７時間インキュベートした。５μｌの先端の培地（総容量の１．７％）または５００μｌの基底培地（総容量の６２．５％）を５０μｌの１０％プロテインＡ−セファローススラリーとともに４℃で一夜インキュベートすることによりアフィニティー沈澱させた。ビーズを３回洗浄し，５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で溶出した。８−１６％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥでゲル電気泳動を行い，ゲルをＰＶＤＦに移し，ウエスタンブロットとして抗ｓＦｖ５ＡＦポリクローナル抗体で，次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗ＩｇＧ第二抗体で探索し，ＮＢＴ／ＢＣＩＰで可視化した。
【０７３８】
ｐＩｇＲ茎を発現するＭＤＣＫ細胞においては，先端のコンパートメントからのサンプルは，［ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートについて予測される分子量を有するバンドの存在を示し，これは，基底外側のコンパートメントから取り出したサンプルを含むレーンでも示される。これらの結果は，［ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートが基底外側のコンパートメントにトランスサイトーシスされたことを示す。これに対し，対照（ｐＩｇＲを発現していない）ＭＤＣＫ細胞を用いた場合には，先端のコンパートメントからのサンプルはコンジュゲートの存在を示すが，基底外側のコンパートメントのサンプルはこれを示さない。すなわち，観察されたトランスサイトーシスはｐＩｇＲ依存性である。
【０７３９】
２６．５．結合のパラメータ
表面プラズモン共鳴を用いてコンジュゲートの結合特性を特性決定した。実験は，上述したものと本質的に同じ方法を用いて行った。結果を表１７に示す。
【０７４０】
表１７：表面プラズモン共鳴によるコンジュゲート調製物Ａｚ００８およびＡｚ００９
【表２３】
2005500002.tif 000031
【０７４１】
実施例２７：ＳＰＤＰを用いるＳＦＶ５ＡＦ−ＣＹＳの１５ｋＤ蛋白質へのコンジュゲーション
２７．１架橋剤の説明
架橋剤中の２−ピリジルジスルフィド残基は，脂肪族チオールと反応してジスルフィド架橋を形成することができ，これは還元剤，例えばＤＴＴを導入することにより破壊することができる（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １７３：７２３−７３７，１９７８）。ヘテロ二官能性架橋剤であるＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ  ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能）は，コンジュゲートすべき蛋白質をチオール化蛋白質に活性化（スルフヒドリル基を導入）するために用いられている。これは比較的効率のよい反応であり，モニターが容易であるピリジル脱離基を生ずる。ＳＰＤＰと化学的に関連する化合物（例えば，ＬＣ−ＳＰＤＰ，Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）を用いてもよい。
【０７４２】
ＳＰＤＰは，蛋白質をＦａｂ’フラグメント一本鎖抗体およびモノクローナル抗体に結合させるために用いられている。例えば，Ｂｏｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎｔｉｆｉｂｒｉｎ  Ｆａｂ’  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９０  Ｊｕｎ；８１（６）：１９７４−１９８０；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ（ｈＴＮＦ  ａｌｐｈａ）  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  １９９８；５（２）：１０９−１２０；Ｇｕｐｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ：ａ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００１  Ａｐｒ；８（８）：５８６−５９２；Ｗｏｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＲｉｃｉｎＡ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｏｆ  ＩｇＧ  ａｎｄ  Ｆａｂｏｆａｎｔｉ−ＣＡＬＬＡ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ＳＰＤＰ  ｏｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｙｉｅｌｄ，ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １９９４  Ｄｅｃ；１７（６）：４５２−４５７；およびＷｏｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｆａｂ−ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ，Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｏｃｔ；２２（５）：４５９−４６３を参照。
【０７４３】
２７．２モノマー性およびダイマー性ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの製造
いくつかの起源からのｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの調製物をプールし，２ｍｌに濃縮した。ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓプールを１０ｍＭＤＴＴとともに３０分間インキュベートし，次に１．９５ｍｌのアリコートを１．６ｘ６０ｃｍスーパーデックス７５カラムでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供した。ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓは２つの主要ピークに分離し，後者のピークは鞍部を有していた。ピークおよび谷にわたる１６の画分を選択し，アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し，クマシー染色によりいずれの画分をプールすべきかを決定した。プールした画分は，画分２７−３４（ダイマー），３６−４０（モノマー）および４２−５０（モノマー）であった。ＯＤ２８０を測定し，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓの濃度を決定した。画分２７−３４（ダイマー）は５．０ｍｇの蛋白質を０．６６ｍｇ／ｍｌで含み，画分３６−４０（モノマー）は４．６ｍｇの蛋白質を０．９７ｍｇ／ｍｌで含み，画分４２−５０（モノマー）は６．９ｍｇの蛋白質を０．５６ｍｇ／ｍｌで含んでいた。
【０７４４】
２７．３  １５ｋＤ蛋白質の製造
１５ｋＤ蛋白質を１ｍＭＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で透析した。これに５ｍｌＨｉＴｒａｐ脱塩カラムで脱塩した１５ｋＤ蛋白質を補充して，１５ｋＤ蛋白質を最終量５９ｍｇ，濃度５．３ｍｇ／ｍｌとした。ＳＰＤＰを４倍モル過剰で１５ｋＤ蛋白質に加え，反応液を２５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションした後，１．５ｍｌの１００ｍＭグリシン（ｐＨ７．５）を加えて置換反応を停止した。［１５ｋＤ蛋白質］−ＳＰＤＰを１００ｍＭリン酸ナトリウム（１ｍＭＥＤＴＡを含む，ｐＨ７．５）で透析した。ＯＤ２８０を測定し，［１５ｋＤ蛋白質］−ＳＰＤＰの濃度を決定した（７．３ｍｇ／ｍｌ）。また，１５ｋＤ蛋白質−ＳＰＤＰのアリコートを取り出し，１０ｍＭのＤＴＴを加え，ＯＤ３４３を決定した。遊離ピリジン２−チオン脱離基の計算モル濃度を１５ｋＤ蛋白質−ＳＰＤＰのモル濃度と比較して，ＳＰＤＰ対１５ｋＤ蛋白質の比率を決定した（比率＝０．８３）。
【０７４５】
２７．４コンジュゲーション反応
３つの異なる種のｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓが存在するため，３つの別々のコンジュゲーション反応を行った。各ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓサンプルについて，０．５ＭＰＯ４（ｐＨ８．０）を加えてｐＨを７．２５以下にし，次に１５ｋＤ蛋白質−ＳＰＤＰを加えた（表１６は，順番に加えられた試薬の容量および質量を示す：ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ，０．５ＭＰＯ４，および１５ｋＤ蛋白質）。各反応液をｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れ，反応液を濃縮しながら，２５℃で２時間インキュベートした。反応液は４℃で一夜保存した。
【０７４６】
表１６：ＳＰＤＰ反応の試薬および添加順序
【表２４】
2005500002.tif 000032
【０７４７】
２７．５コンジュゲーション反応のスクリーニング
反応の最終容量は以下のとおりであった：反応３６−４０，２ｍｌ；反応４２−５０，３ｍｌ；およびダイマー反応，３ｍｌ。それぞれの濃縮した反応液を１．６ｘ６０ｃｍスーパーデックス７５カラムでＳＥＣに供した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりスクリーニングした。すなわち，選択された画分から等容量のサンプルを負荷し，蛋白質ピークを含む画分をプールした。各分画プール中の蛋白質濃度をＢＣＡアッセイを用いて定量した。各プールからの等負荷量の蛋白質を，５つの別々の８−１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１つのゲルはクマシー染色用，３μｇ／レーン；４つのゲルはウエスタンブロット分析用，０．３μｇ／レーン）でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。精製されたコンジュゲートを含む画分を同定し，最終的な収量を上述のようにして計算した。
【０７４８】
２７．６モノマーおよびダイマーコンジュゲートの精製
２７．６．１プールした画分３６−４０中のモノマーコンジュゲート（コンジュゲート調製物Ａｚ０１８Ａ）
２ｍｌの３６−４０コンジュゲーション反応物を，１．６ｘ６０ｃｍスーパーデックス７５カラムを用いてＳＥＣにより精製した。［ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−ＳＰＤＰ−［１５ｋＤ蛋白質］に対応する大きなピーク，未反応ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓに対応する第２のピークおよび１５ｋＤ蛋白質が存在した。画分２２，２３，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３６，４０，４３，および５１をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に選択した。各画分から１５μｌを取り出し，１５μｌの非還元サンプル緩衝液に加えた。このサンプルを８−１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し，クマシーブルーで染色した。画分２２−２７，２９−３６（コンジュゲート），３９−４０，および４２−４９を独立してプールした。
【０７４９】
２７．６．２プールした画分４２−５０中のモノマーコンジュゲート（コンジュゲート調製物Ａｚ０１８Ｂ）
２ｍｌの４２−５０（モノマー）コンジュゲーション反応物を，１．６ｘ６０ｃｍスーパーデックス７５カラムを用いてＳＥＣにより精製した。コンジュゲートである大きなピーク，ならびに未反応１５ｋＤ蛋白質である第２のピークが存在した。画分１０，１２，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２４，２６，３０，３４，および４３をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に選択した。
【０７５０】
２７．６．３ダイマーコンジュゲート（コンジュゲート調製物Ａｚ０１９）
３ｍｌのダイマー反応物を１．６ｘ６０ｃｍスーパーデックス７５カラムを用いてＳＥＣにより精製した。大きなピーク（ダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ−ＳＰＤＰ−１５ｋＤ蛋白質），ならびに，未反応ダイマーｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓに対応する第２のピーク，および未反応１５ｋＤ蛋白質に対応する第３のピークが存在した。画分７２，７４，７６，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８６，８８，９１，９６，および９８をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に選択した。
【０７５１】
実施例２８：［ＳＦＶ５ＡＦ−ＣＹＳ］−［ＳＰＤＰ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートの特性決定
２８．１クマシー染色ゲルおよびウエスタン分析
ウエスタン分析を行って，画分中に含まれる物質の種類を確認した。３μｇのプールしたピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し，次にＰＶＤＦフィルターに移した。フィルターをポリクローナル抗ｓＦｖ５ＡＦで探索し，次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合させた抗ＩｇＧ第２抗体とともにインキュベーションし，次にＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えて可視化した。
【０７５２】
コロイド性クマシー染色およびウエスタンのデータから，画分２９−３６（Ａｚ０１８ａ）が３６−４０のプールを用いる反応からのｃ−ｍｙｃタグを含むモノマーコンジュゲートを含むことが確認される。画分１８−２５（Ａｚ０１８ｂ）は，４２−５０プールからのｃ−ｍｙｃタグを含まないモノマーコンジュゲートを含み，画分７２−７９（Ａｚ０１８ａｂ）はｃ−ｍｙｃタグを含むか含まないダイマーコンジュゲートである。
【０７５３】
２８．２［ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓ］−ＳＰＤＰ−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートのトランスサイトーシスアッセイ
ｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞でコンジュゲート調製物Ａｚ００８，Ａｚ００９，Ａｚ００１８ｂ，およびＡｚ００１９のトランスサイトーシスを一夜分析した。比較のために，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓおよび非共有結合ｓＦｖ５ＡＦ：Ｍ１複合体の両方を分析した。Ａｚ００１９のトランスサイトーシスはＡｚ００８（非切断性モノマーコンジュゲート）より効率的であったが，Ａｚ００９（非切断性ダイマーコンジュゲート）より効率が低かった。Ａｚ０１８ｂのトランスサイトーシスは，Ａｚ００８よりわずかに効率が低かった。Ａｚ００８，Ａｚ０１９，およびＡｚ０１８ｂのトランスサイトーシスはすべて，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓダイマーより効率が低かったが（＞１０％），ｓＦｖ５ＡＦ：Ｍ１複合体，ｓＦｖ５ＡＦ，およびｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓモノマーと匹敵する範囲であった（約２％）。対照ＭＤＣＫ細胞によるｓＦｖ５ＡＦ：Ｍ１トランスサイトーシスがなかったことにより示されるように，トランスサイトーシスは特異的であった。
【０７５４】
２８．３結合パラメータ
表面プラズモン共鳴を用いて，コンジュゲートの結合特性を特性決定した。実験は，本質的に上述と同じ方法を用いて行った。結果を表１８に示す。
【０７５５】
表１８：コンジュゲート調製物Ａｚ０１８ａ，Ａｚ０１８ｂおよびＡｚ０１９を用いたＢＩＡＣＯＲＥの結果
【表２５】
2005500002.tif 000033
【０７５６】
実施例２９：ＳＦＶ５ＡＦのＳＡＴＰ−チオール化１５ｋＤ蛋白質へのコンジュゲーション
２９．１チオール化試薬の説明
Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ  ＣＯ）は，１級アミンと反応して，保護されたスルフヒドリル基を付加する（Ｄｕｎｃａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６８−７３，１９８３）。チオールアセチル基は，０．０２Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩で脱保護して，スルフヒドリル基を遊離させることができる。
【０７５７】
２９．２．１５ｋＤ蛋白質のチオール化
反応は，０．１ＭＰＯ４，ｐＨ７．２５，１ｍＭＥＤＴＡ中で行った。次に，１５ｋＤ蛋白質およびＳＡＴＰを，典型的には５０ｍＭＳＡＴＰおよび３５ｍＭ１５ｋＤ蛋白質の濃度で加えた。反応は２０℃で３０−６０分間進行させた。次に，強塩基，例えばヒドロキシルアミンを加えてチオール基を脱保護し，ｓＦｖ５ＡＦへのコンジュゲーションのために遊離型とする。
【０７５８】
２９．３．Ｍａｌ−Ｓａｃ−ＨＮＳＡを用いるｓＦｖ５ＡＦのＳＡＴＰ−チオール化１５ｋＤ蛋白質へのコンジュゲーション
２９．３．１．コンジュゲーション反応
一本鎖抗体ｓＦｖ５ＡＦをｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡを架橋剤として用いて１５ｋＤ蛋白質にコンジュゲート化させた。ｓＦｖ５ＡＦの調製物を，非切断性リンカー領域により架橋されたアミノ反応性ＨＮＳＡ基およびチオール反応性マレイミド基を有するヘテロ二官能性架橋剤であるｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡで誘導化した。ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡをｓＦｖ５ＡＦ上の１級アミンと反応させ，ＳＡＴＰでチオール化した１５ｋＤ蛋白質を誘導化ｓＦｖ５ＡＦに加えて，ｓＦｖ５ＡＦ−ｍａｌ−ｓａｃ上のマレイミド基を介してコンジュゲート化させた。
【０７５９】
２９．３．２．［ｓＦｖ５ＡＦ］−［Ｍａｌ−Ｓａｃ］−［ＳＡＴＰ］−［１５ｋＤ蛋白質］蛋白質コンジュゲートの精製
ｓＦｖ５ＡＦ−１５ｋＤ蛋白質コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。ＳＥＣは，１ｘ３０ｃｍスーパーデックス７５カラム上で，１ｍＭＥＤＴＡおよび０．４Ｍアルギニンを含む０．１ＭＰＯ４（ｐＨ７．５）を用いて０．３ｍｌ／分間で行った。
【０７６０】
２９．３．３．クマシー染色ゲルおよびウエスタン分析
いずれの画分および画分のプールがコンジュゲートを含むか，ならびにその中のコンジュゲートのおよその量（濃度）を決定するために，画分をクマシー染色ゲルおよびウエスタン分析により分析した。コンジュゲーション反応からの収量は２３７μｌ中９４８μｇのコンジュゲートであった。
【０７６１】
２９．４．ＬＣ−ＳＭＰＴを用いるＳＦｖ５ＡＦのＳＡＴＰ−チオール化１５ｋＤ蛋白質へのコンジュゲーション
２９．４．１．架橋剤の説明
架橋剤である４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）は，チオール反応性であり，ＮＨＳエステル切断性である。ＳＭＰＴは，ジスルフィド結合の次の炭素に隣接したベンゼン環およびメチル基を有する。官能基はジスルフィド結合を妨害し，したがって，ジスルフィド結合がチオレートアニオンにより容易に還元されることを防ぐ。ＳＭＰＴの水溶性型がＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ［スルホスクシンイミジル６−［ａ−メチル−ａ−（２−ピリジル−ジチオ）トルアミド］ヘキサノエートであり，これはコンジュゲーション緩衝液に加える前にＤＭＦまたはＤＭＳＯ等の有機溶媒に溶解する必要がない。延長されたスペーサーアーム（２０．０Å）をＳｕｌｆｏ−ＬＣＳＭＰＴに導入して，抗体の毒素へのコンジュゲーションの間に生ずるかもしれない立体障害効果を低下させている。すなわち，延長されたスペーサーアームは，場合によっては，この分子の反応性を増加させることができる。
【０７６２】
２９．４．２．コンジュゲーション反応
モノマー型またはダイマー型のｓＦｖ５ＡＦを精製し，別々の反応において１５ｋＤ蛋白質とコンジュゲート化した。ｓＦｖ５ＡＦはｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて誘導化した。ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴをｓＦｖ５ＡＦの１級アミンと反応させ，誘導化ｓＦｖ５ＡＦにＳＡＴＰ−チオール化１５ｋＤ蛋白質を加えた。５ＡＦ−ＬＣ−ＳＭＰＴのピリジルジスルフィド基間に化学結合が生ずる。このコンジュゲートを［ｓＦｖ５ＡＦ］−［ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ］−［ＳＡＴＰ］−［１５ｋＤ蛋白質］と称する。
【０７６３】
２９．４．３．［ｓＦｖ５ＡＦ］−［ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ］−［ＳＡＴＰ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートの精製
２９．４．３．１．［ｓＦｖ５ＡＦモノマー］−［ＬＣ−ＳＭＰＴ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートの精製
［ｓＦｖ５ＡＦモノマー］−［ＬＣ−ＳＭＰＴ］−［１５ｋＤ蛋白質］は，サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により，１ｘ３０ｃｍ  スーパーデックス７５カラムで１００ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）および１ｍＭＥＤＴＡを用いて０．４ｍｌ／分間でコンジュゲート反応液から精製した。溶出プロファイルに基づいて，画分の組をプールし，Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０濃縮器で濃縮し，ＢＣＡアッセイにより蛋白質濃度を決定した。
【０７６４】
２９．４．３．２．［ｓＦｖ５ＡＦダイマー］−［ＬＣ−ＳＭＰＴ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートの精製
［ｓＦｖ５ＡＦダイマー］−［ＬＣ−ＳＭＰＴ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートは，ＳＥＣにより，１ｘ３０ｃｍ  スーパーデックス７５カラムで１００ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）および１ｍＭＥＤＴＡを用いて０．４ｍｌ／分間でコンジュゲート反応液から精製した。溶出プロファイルに基づいて，画分の組をプールした。
【０７６５】
２９．４．３．３．クマシー染色ゲルおよびウエスタン分析
どの画分およびプールがコンジュゲートを含むか，ならびにその中のコンジュゲートのおよその量（濃度）を決定するために，画分および画分のプールをクマシー染色ゲルおよびウエスタン分析を用いて分析した。画分Ｍ２，Ｍ３，Ｍ４およびＭ５を［モノマーｓＦｖ５ＡＦ］−［ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ］［ＳＡＴＰ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートの調製物として，画分Ｄ２およびＤ３を［ダイマーｓＦｖ５ＡＦＩ−［ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ］−［ＳＡＴＰ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートの調製物として用いた。
【０７６６】
２９．５．ＬＣ−ＳＭＣＣを用いるＳＦｖ５ＡＦのＳＡＴＰ−チオール化１５ｋＤ蛋白質へのコンジュゲーション
２９．５．１．架橋剤の説明
スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）は，非切断性架橋により接続されたＮＨＳエステルおよびマレイミド官能基を有するヘテロ二官能性架橋剤である。ＮＨＳエステルは１級アミンと反応し，マレイミドはスルフヒドリルと反応する。典型的には，ＮＨＳ反応を最初に行い，次に過剰の架橋剤を除去し，次にＳＨ基を有する成分を加えて，架橋を行う。架橋反応は，より高い蛋白質濃度を用いると有利である。ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミド−カプロレート）は，スルフヒドリル反応性でありかつアミン反応性であるヘテロ二官能性架橋剤である。この特性は，ＳＭＣＣと類似しているが，これは延長された脂肪族スペーサーアームを有する（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，３９５−３９９，１９７９）。
【０７６７】
２９．５．２．コンジュゲーション反応
ｓＦｖ５ＡＦの調製物を１．５倍または２．５倍モル過剰のＬＣ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）のいずれかで誘導化した。誘導化ｓＦｖ５ＡＦを５ｍｌのＧ２５スーパーファインカラムで脱塩し，画分１０−１７をプールした。精製した誘導化ｓＦｖ５ＡＦは，２８０ｎｍの吸収により定量し，次にコンジュゲーション反応において用いた。
【０７６８】
１５ｋＤ蛋白質を２．７５倍モル過剰のＳＡＴＰを用いてチオール化し，次に，５０ｍＭヒドロキシルアミンを用いて脱アセチル化した。次に，活性化１５ｋＤ蛋白質を５ｍｌのＧ２５スーパーファインカラムで脱塩し，画分９−１６をプールした。１５ｋＤ蛋白質は，２８０ｎｍの吸収により定量し，ＤＴＮＢを用いて誘導化比を決定した。次に，精製し，誘導化した１５ｋＤ蛋白質をコンジュゲーション反応において用いた。
【０７６９】
ｓＦｖ５ＡＦに対して１．５倍または２．５倍モル過剰のＬＣ−ＳＭＣＣを用いるコンジュゲーション反応はいずれも，１：１の比率のｓＦｖ５ＡＦ−１５ｋＤ蛋白質コンジュゲートを有していた。コンジュゲートの電気泳動およびウエスタン探索は，２８ｋＤにｓＦｖ５ＡＦバンドを，および４３ｋＤにコンジュゲートバンドを検出した。いずれの反応も，２つのバンドの間でほぼ等しい強度を有しており，このことは，コンジュゲートの収率が優れていることを示す。
【０７７０】
２９．５．３．［ｓＦｖ５ＡＦ］−［ＬＣ−ＳＭＣＣ］−［１５ｋＤ蛋白質］コンジュゲートの精製
［ｓＦｖ５ＡＦ］−［ＬＣ−ＳＭＣＣ］−［１５ｋＤ蛋白質］蛋白質コンジュゲートは，１ｘ３０ｃｍスーパーデックス７５カラムで，流速０．３０ｍｌ／分間で０．２ｍｌの分画で回収することにより精製した。ＬＣ−ＳＭＣＣを架橋剤として用いた２つのコンジュゲーションをプールし，濃縮し，スーパーデックス７５でサイズ排除クロマトグラフィーにより３つの別々のバッチで精製した。
【０７７１】
画分１７−２０をターゲット１：１コンジュゲートとしてプールした。約０．５ｍｌのプールしたピーク画分を５ｍｌのＧ２５スーパーファインカラムでリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で脱塩し，セントリコン濃縮器で濃縮した。残りの精製コンジュゲートはＰＢＳ中で一夜透析し，セントリコン濃縮器で濃縮した。
【０７７２】
実施例３０：リポソーム処方
３０．１．リポソームの構造
リポソームは，二重層のコンフィギュレーションで配置された脂質からなる１またはそれ以上の外層に囲まれた水性のコアを有する微小球である（一般に，Ｃｈｏｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８を参照）。リポソームは，インビトロおよびインビボでの生物活性薬剤の細胞輸送ベヒクルとして用いることができる（Ｍａｎｎｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔＤｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９）。例えば，約０．２から約０．４ミクロンの範囲のサイズの大きい単層小胞（ＬＵＶ）が，大きい高分子を含む水性緩衝液の実質的な割合を封入しうることが示されている。ＲＮＡ，ＤＮＡおよび無傷のビリオンは，リポソームの水性内部中に封入されて，生物学的に活性な形で脳細胞に輸送されることができる（Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，７７）。リポソーム系の遺伝子療法は，Ｔｓｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．Ｔｏｄａｙ１：２０６−２１３，１９９８；およびＲｏｐｅｒｔ，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３２：６３−１６９，１９９９に概説されている。米国特許５，８３４，４４１は，ＡＡＶ−誘導化核酸の輸送のためのリポソームを記載すると述べられている。
【０７７３】
リポソームは，単層状（１枚層）であっても多層状（多層，しばしばタマネギの皮と比較される）であってもよく，薬剤，ペプチド，蛋白質，核酸，炭水化物，プラスミド，ビタミン，化粧品等を入れることができる（Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ１９９３；１２  Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ６１−６７；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｄｒｕｇｓ  １９９３  ４５：１５−２８）。分子をリポソーム内に封入する手法の例は，Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｉｐｉｄｓ  ４０：３３３−３４５，１９８６に記載されている。
【０７７４】
リポソームは，水溶性および水不溶性物質を封入して，乳化および／または界面活性剤に依存する他の処方を使用することを回避することを可能とする。リポソームは，リポソーム処方を構成する生分解性および無毒性の材料を用いて，物質の輸送特性を制御することを可能とする。物質はリポソーム中に含有されている間，リポソームの近くに存在する酵素および酸化剤に対して耐性である。リポソームは患者に注入することができ，静脈内または皮下注入を用いることができる。さらに，リポソームは，胃腸管または呼吸管に投与することができる。リポソームはカプセル化されていてもよい。
【０７７５】
リポソームは，一般に１またはそれ以上の中性のまたは負に荷電したリン脂質，典型的には１またはそれ以上の中性リン脂質を，通常は１またはそれ以上のステロール，特にコレステロールとともに含む小胞形成脂質から形成される。リポソームの製造において有用な脂質の非限定的例としては，ホスファチジル化合物，例えば，ホスファチジルグリセロール，ホスファチジルコリン，ホスファチジルセリン，スフィンゴ脂質，ホスファチジルエタノールアミン，セレブロシドおよびガングリオシドが挙げられる。
【０７７６】
リポソームの主要な脂質成分は，しばしば，ホスファチジルコリン（ＰＣ）またはＰＣ誘導体である。種々の鎖の長さおよび飽和の程度の種々のアシル鎖基を有するＰＣ誘導体は，市販されているか，または既知の手法により合成することができる。フィルター滅菌の目的のためには，特にリポソームを約０．３ミクロン以下にサイジングしなければならない場合には，あまり飽和していないＰＣが一般により容易にサイジングすることができる。約１４から約２２個の炭素原子の範囲の長さの炭素鎖を有する飽和脂肪酸を含むＰＣ，特に，ジアシルホスファチジルグリセロールが一般に用いられる。例示的リン脂質としては，例えば，ジパルミトイルホスファチジルコリン，ホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。モノ−およびジ−不飽和脂肪酸および飽和および不飽和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルコリンもまた用いられる。他の適当なリン脂質としては，コリン以外のヘッド基，例えば，エタノールアミン，セリン，グリセロールおよびイノシトールを有するものが挙げられる。他の適当な脂質としては，脂肪酸がエステル結合ではなくエーテル結合によりグリセロールに結合しているホスホノ脂質が挙げられる。ある態様においては，リポソームはステロール，例えば，コレステロールを，約０．１から約１．０（ステロール：リン脂質）のモル比で含む。
【０７７７】
３０．２．立体的に安定化されたリポソーム
”立体的に安定化されたリポソーム”との用語は，リポソーム中に取り込まれたときに，そのような特定の脂質を有しないリポソームと比較して循環寿命を増強することができる１またはそれ以上の特定の脂質を含むリポソームを表す。立体的に安定化されたリポソームの例は，リポソームの小胞形成脂質部分の一部が１またはそれ以上の糖脂質，例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１を含むか，または１またはそれ以上の親水性ポリマー，例えば，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分で誘導化されているリポソームである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが，少なくともガングリオシド，スフィンゴミエリン，またはＰＥＧ誘導化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームに関しては，当該技術分野においては，これらの立体的に安定化されたリポソーム誘導体の循環半減期の増強は，細網内皮系の細胞への取り込みが減少したためであると考えられている（Ａｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９３，５３，３７６５；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４；Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５，６９４９；米国特許４，８３７，０２８およびＰＣＴ公開ＷＯ８８／０４９２４（いずれもＡｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．），米国特許５，５４３，１５２（Ｗｅｂｂ，ｅｔ  ａｌ．）；およびＰＣＴ公開ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍ，ｅｔ  ａｌ．））。
【０７７８】
１またはそれ以上の親水性ポリマーで誘導化した脂質を含む多くのリポソーム，およびこれを製造する方法が当該技術分野において知られている。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は，非イオン性界面活性剤を含むリポソームを記載する。ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導化したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）または他のＰＥＧ誘導化リン脂質，例えば，ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧを含むリポソームは，顕著に増加した血液循環半減期を有する（Ｂｌｕｍｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．，１９９０，２６８，２３５）。共有結合したＰＥＧ成分をその外表面に有するリポソームは，欧州特許０，４４５，１３１ＢＥおよびＷＯ９０／０４３８４（Ｆｉｓｈｅｒ）に記載されている。ＰＥＧで誘導化した，約１から約２０モルパーセントのＰＥを含むリポソーム組成物およびこれを使用する方法は，Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許５，０１３，５５６および５，３５６，６３３）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許５，２１３，８０４および欧州特許ＥＰ０，４９６，８１３Ｂ１）により記載されている。多数の他の脂質ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは，ＷＯ９１／０５５４５および米国特許５，２２５，２１２（いずれもＭａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．），およびＷＯ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームはＷＯ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉ，ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。米国特許５，５４０，９３５（Ｍｉｙａｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．）および５，５５６，９４８（Ｔａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．）は，ＰＥＧ含有リポソームを記載し，これは，機能的表面成分によりさらに誘導化されていてもよい。
【０７７９】
３０．３．リポソームのターゲティング
リポソームは，受動的または能動的のいずれかによりターゲティングすることができる。受動的ターゲティングは，リポソームが洞様毛細血管を含む臓器中の細網内皮系の細胞に分配される自然の傾向を利用する。これに対し，能動的ターゲティングは，天然に生ずる局在部位以外の臓器および細胞に分配させるために，リポソームに特定のリガンド，例えばウイルス蛋白質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，８４７４），モノクローナル抗体（またはその適当な結合部分），糖，糖脂質または蛋白質（またはその適当なオリゴペプチドフラグメント）を結合させることにより，またはリポソームの組成および／またはサイズを変更することにより，リポソームを修飾することを含む。
【０７８０】
リポソームのターゲティングは，種々の方法により行うことができる。種々の連結基を用いて，リポソームの脂質鎖をターゲティング要素に結合させる。ターゲティング要素は，本発明の化合物を輸送することが望まれる細胞上で優位的に見いだされる特定の細胞表面分子に結合する。ターゲティング要素には，非限定的例として，輸送が望まれる細胞によりその表面上で優位的にディスプレイされる特定の細胞レセプターにより結合されるホルモン，成長因子またはそれらの適当なオリゴペプチドフラグメント，またはターゲットの細胞上で優位的に見いだされる抗原性エピトープに特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体，またはそれらの適当なフラグメント（例えば，Ｆａｂ；ｓＦｖ）が挙げられる。
【０７８１】
リポソームのターゲティングは，リポソームの外表面をターゲティング剤，例えば，抗体，抗体のＦ（ａｂ’）２またはＦａｂフラグメント，サイトカイン，酵素，ドメインおよび蛋白質の一部，ペプチド，ポリペプチド，炭水化物，核酸，オリゴヌクレオチド等で被覆することにより制御することができる。そのような被覆物質は，リポソームの表面上に種々の量で存在することができる。本発明においては，二重層脂質膜からｐＩｇＲリガンドが突き出している融合蛋白質を用いてリポソームをターゲティングする。
【０７８２】
種々の細胞タイプへのリポソームのターゲティングは，その中に存在する脂質の種類および比率を操作することによっても調節することができる。例えば，Ｄｕｚｇｕｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  １９９９  ４０：３−１８；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ４  ｕｓｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｇｐｌ２０．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４  ２６９：９０９０−９０９８；およびＳｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７５６７−７５７２，２０００；Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｏｙｂｅａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｒｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  １９９７  ２０：８８１−８８６を参照。
【０７８３】
３０．４．リポソームの調製
リポソームは，種々の既知の手法のいずれかにより調製する。例えば，リポソームは，多層脂質小胞（ＭＬＶ）を調製するための任意の慣用的な手法により，すなわち，脂質をクロロホルムに溶解し，クロロホルムを蒸発させ，次に容器中に封入すべき薬剤を含む水性溶液を加え，水性溶液を脂質に水和させ，得られた脂質懸濁液を渦巻かせるかまたはボルテックスすることにより，１またはそれ以上の選択された脂質を適当な容器の内壁上に沈積させることにより，形成することができる。この方法により，所望のリポソームを含む混合物が得られる。
【０７８４】
別の例としては，大きな一層小胞（ＬＵＶ）を製造するために用いられる手法，例えば，逆相蒸発，浸出法および界面活性剤希釈を用いてリポソームを製造することができる。これらの方法および脂質小胞を製造する他の方法は，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９８４）に記載されている。リポソームは，米国特許４，５８８，５７８および４，６１０，８６８（いずれもＦｏｕｎｔａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．），４，５２２，８０３（Ｌｅｎｋ，ｅｔ  ａｌ．），および５，００８，０５０（Ｃｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）に開示されているタイプの，ステロイド性脂質小胞，安定な多層小胞（ＳＰＬＶ），単相小胞（ＭＰＶ）または脂質マトリクス担体（ＬＭＣ）の形であってもよい。ＭＬＶの場合，所望の場合には，リポソームを多数回（５またはそれ以上）の凍結融解サイクルに供して，トラップされた容積およびトラップ効率を増大させ，より均一な溶質の層間分布を得ることができる（Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，８０２）。特定のオリゴデオキシヌクレオチド：リポソーム組成物を作成する特別の方法は，米国特許５，６６５，７１０（Ｒａｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。
【０７８５】
リポソームを調製した後，これをサイジングして，所望のサイズ範囲およびサイジングされた粒子の比較的狭い分布を達成する。好ましい態様においては，リポソームの直径の下限は約５０から約７５ｎＭであり，最も好ましくは約６０ｎＭであり，直径の上限は約７５から約１５０ｎＭ，最も好ましくは約１２５ｎＭであり，ここで，”約”とは±１０ｎＭを示す。
【０７８６】
リポソームを所望の大きさの範囲にサイジングするためのいくつかの手法が利用可能である。浴またはプローブ超音波処理法によりリポソーム懸濁液を超音波処理すると，漸進的にサイズが減少して，約０．０５ミクロン未満のサイズの小さい単層小胞（ＳＵＶ）が得られる。剪断エネルギーにより大きなリポソームを小さいものにフラグメント化するホモジナイズは，別の既知のサイジング手法であり，ここでは，選択されたリポソームのサイズ範囲，典型的には約０．１から約０．５ミクロンの範囲が達成されるまで，ＭＬＶを標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して再循環させる。リポソームをフィルターまたは膜を通して押し出すことは，所望のサイズ範囲を有するリポソームを製造する別の方法である（例えば，米国特許４，７３７，３２３（Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．）および５，００８，０５０（Ｃｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）を参照）。他の有用なサイジング方法は当業者に知られている。そのような方法のほとんどにおいては，粒子サイズ分布は，慣用的なレーザービームサイズ決定または当該技術分野において知られる他の手段によりモニターする。
【０７８７】
リポソームは，長期間保存用に，好ましくは減圧下で標準的な凍結乾燥装置を用いて脱水する。脱水してもしなくても，リポソームおよびその周囲の媒体は，まず液体窒素中で凍結させ，減圧下に置くことができる。後者の凍結工程を加えることは脱水の全体工程を長くするが，リポソームを脱水する前に凍結すると，脂質小胞に対する障害は少なく，その内容物の喪失も少ない。
【０７８８】
リポソームの重要な部分が脱水プロセスにおいて無傷のままであることを確実にするために，脂質小胞膜と相互作用して水が除去されるにつれてこれを無傷に保持する１またはそれ以上の保護糖が利用可能である。適当な糖としては，限定されないが，トレハロース，マルトース，ショ糖，ラクトース，グルコース，デキストラン等が挙げられる。一般に，二糖類は単糖類よりよく作用し，ほとんどの場合においてトレハロースおよびショ糖が特に有効であるが，そのかわりに他のより複雑な糖を用いてもよい。用いるべき糖の量は，糖の種類および脂質小胞の性質によって異なる。当業者は，種々の糖および濃度を容易に試験して，特定の脂質小胞の調製にどのような条件が最もよく作用するかを決定することができる（一般に，Ｈａｒｒｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，１９９０，５２，１３９，および米国特許４，８８０，６３５（Ｊａｎｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．）を参照）。一般に，約１００ｍＭまたはそれ以上の糖濃度により所望の程度の保護が得られることが見いだされている。いったんリポソームを脱水すれば，これを用いるときまで長期間保存することができる。保存のための適当な条件は，脂質小胞の化学組成およびそれが封入している活性薬剤によって異なるであろう。例えば，熱不安定性の薬剤を含むリポソームは，冷蔵下に保存して，活性薬剤の効力が失われないようにすべきである。
【０７８９】
３０．６．リポソームの医薬処方
種々の細胞タイプおよび組織への輸送のために開発されているリポソームの多くの医薬処方が記述されている。非限定的例としては，ワクチンの鼻内投与用処方（米国特許５，７５６，１０４），および抗癌薬剤の輸送用のエアロゾル処方（米国特許６，０９０，４０７）が挙げられる。リポソームは，消化管を通して，好ましくは経口投与により輸送するよう設計された処方，例えば，丸薬，錠剤，カプセル，カプレット，座剤，液体中にカプセル化させるか，および／または取り込ませることができる。リポソームを含み，高分子，例えば，限定されないが，蛋白質および核酸の輸送に用いられる医薬処方は，非限定的例として，米国特許６，１３２，７６４，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔｓ；５，８７９，７１３，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｉａ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ；５，８５１，５４８，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ；５，７５９，５１９，Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｉｏｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ；５，７５６，３５２，Ｔｈｉｏｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；５，７３９，２７１，Ｔｈｉｏｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ；５，７１１，９６４，Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ；および５，４９４，６８２，Ｉｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓに記載されている。
【０７９０】
実施例３１：経口輸送
本発明の組成物または化合物が，生物学的に活性な複合体または化合物またはその生物活性部分または代謝産物を胃腸管を通して輸送する能力は，以下のようにして評価することができる。
【０７９１】
３１．１．動物の用意
カニューレをラットの空腸，回腸，または結腸に挿入する。カニューレの末端を皮下に通して，ラットの肩の間の皮膚から出す。このように配置すると，ラットはカニューレを傷つけることができず，カニューレは長期間開放されたままである。また，カニューレを頸静脈中に入れ，皮下を通して，肩の間から出るようにする。ハーネスを用いてさらにカニューレを保護してもよい。腸カニューレを用いて物質を腸に直接投与することができる。頸静脈カニューレを用いて血液を回収し，これを質および生物学的および生物物理学的特性および機能についてさらに分析することができる。試験品（０．２−１ｍｌ）をカニューレを通して腸内に投与し，血液を一定間隔で採取する。ヘパリンを用いて頸静脈が凝固しないようにする。
【０７９２】
あるいは，尿道カテーテル，例えば，Ａｌｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｕｒｅｔｈｒａ  Ｃａｔｈｅｔｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｎｎｅｌ  Ｅｎｄ（Ｃ．Ｒ．Ｂａｒｄ，Ｉｎｃ．Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，ＧＡ，１６インチ長さ，２眼，Ｘ線不透明ゴム）を用いて試験品を結腸に投与する。この場合には，ラットをケタミンで麻酔する。カテーテルを切断して，約８ｃｍのカテーテルが残るようにする。ルアーロック固定具をカテーテルの切断末端に配置し，試験品を含む１ｍｌシリンジをルアーロック固定具に取り付ける。カテーテルを試験品で満たす。カテーテルの先端から７．５ｃｍにインクでマークを付け，カテーテルをマークがちょうど見えるようにラットの直腸に挿入する。次にシリンジを用いて必要な容量，一般に約０．０５から約５ｍｌの容量の試験品を輸送する。
【０７９３】
３１．２．アッセイ
試験品は，放射性ヨウ化または他の放射性標識により検出することができる。コンジュゲート蛋白質の１またはそれ以上の成分を標識する。次に，回収した血液を用いて，正確に計った重量または容量の血液中のｃｐｍの数を決定する。試験品は，適当な生化学的または生物学的アッセイ，例えば，限定されないが，ＥＬＩＳＡ，酵素，レセプター結合等により検出することができる。典型的には，生物学的に活性な複合体または化合物，またはその生物活性部分または代謝産物中に存在する抗原に対するモノクローナル抗体を用いる。
【０７９４】
試験品の生物物理学的特徴は，免疫沈澱により，ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー等の種々の画像化法による放射性標識の検出により，試験品に結合する試薬を用いるウエスタンブロッティングにより，適当なサイズのセファデックスまたはセファロース樹脂を用いるゲルサイジングにより，検出することができる。
【０７９５】
３１．３．薬物動態学
血液中に存在する試験品の量を時間の関数として表したグラフにより，時間経過にともなう輸送の量を観察することができる。血液中の試験品の量をラットに投与した試験品の量で割ることにより，吸収された用量のパーセントを求めることができる。同じ量の試験品を，腸を通して，および静脈内注入を通して投与し，曲線の下の面積を比較することにより，絶対的生物利用性を決定する。注入の他の経路，例えば皮下と比較した相対的な生物利用性も求めることができる。当業者には，薬物動態学的分析をどのようにして行うかがわかるであろう。
【０７９６】
試験品の輸送を，ターゲティング要素にコンジュゲート化されていない複合体または化合物の対照と比較することができる。そのような比較により，輸送の特異性および選択性が示される。
【０７９７】
実施例３２：生物学的に活性な複合体または化合物および／またはその生物活性部分または代謝産物のインビボ輸送のアッセイ
種々のアッセイを用いて，生物学的に活性な複合体または化合物，またはその生物活性部分または代謝産物の，臓器の管腔から動物の体内への輸送の程度を決定する。そのような臓器の非限定的例は，胃腸管および肺である。例えば，生物学的に活性な複合体または化合物，またはその生物活性部分または代謝産物の，胃腸管からの輸送を判定するためには，以下の方法にしたがうことができる。
【０７９８】
３２．１．動物の調製
種々の時間に血液サンプルを採取する目的で，ラットの頸静脈にカニューレを挿入する。治療剤を腸に投与する目的で，別のカニューレを小腸，空腸，回腸，または結腸の領域に挿入する。この目的のためには３５０−３７５グラムのスプラグドーリーラットが適しているが，他の系統のラットを用いてもよい。カニューレは，直接ラットの肩の間の皮膚に出るように皮下でガイドする。この位置は，ラットがカニューレを傷つけることを防止する。ケージあたり１匹のラットが必要である。カニューレを挿入した２−７日後に融合蛋白質をラットに投与する。この間に，一般的健康状態についてラットを観察して，カニューレの開通性を判定する。
【０７９９】
３２．２．試験品の投与およびサンプル採取
試験品（すなわち，本発明の複合体または化合物を含む組成物）を腸カニューレを通してラットに投与する。投与の前に，血液のサンプル（約２００μｌ）を頸静脈カニューレにより回収する。血液のサンプルは，８−４８時間にわたり採取する。頸静脈カニューレは少量のヘパリンを含む食塩水を用いて開放状態に維持して，凝固を防ぐ。血液は５μｌ（約５−５０ユニット／ｍｌ）のヘパリンを含む１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに回収して，凝固を防ぐ。血液は１時間を越えない時間，氷上に保持し，机上エッペンドルフ遠心分離器で３０−６０秒間遠心分離する。上清を回収し（血漿），適当な方法で，通常は−８０℃で凍結することにより保存する。血液は，回収し，凝固させて凝固物質を形成させ，次にこれを遠心分離により血清から分離してもよい。血清は適当な方法で，通常は−８０℃で凍結することにより保存する。
【０８００】
３２．３．アッセイ
生物学的に活性な複合体または化合物，またはその生物活性部分または代謝産物の存在または量は，任意の適当なアッセイを用いて測定することができる。例えば，複合体または化合物は，当業者に知られる通常の放射性ヨウ化方法のいずれかを用いて１２５Ｉで放射性標識することができる。これらの方法には，クロラミン−Ｔ，固定化クロラミン−Ｔ，一塩化ヨード，ラクトペルオキシダーゼビーズ，またはＩｏｄｏｇｅｎを用いることが含まれる。放射性ヨウ化した生物学的に活性な複合体または化合物は，クロマトグラフィー，例えば，非限定的例としては，セファデックスまたはセファロースでのサイズ分離により，または透析により，未反応１２５Ｉから分離する。血液の重量は，血液を予め秤量したエッペンドルフまたは小ガラス管に回収し，血液を含む管を秤量した後に差し引くことにより，血液の重量を決定する。管全体をガンマカウンターで計数し，１分間あたりの計数を血液の重量で割って，血液１グラムあたりのｃｐｍを求める（ｃｐｍ／ｍｌ血液と本質的に同等）。血液のｃｐｍ／ｍｌを放射性標識治療物質の投与後の時間の関数として表したグラフを用いて，複合体または化合物，および／またはその生物活性部分または代謝産物の腸から血液中への輸送を明らかにする。
【０８０１】
試験品をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べて，これが同じ分子量を有するか否かを判定する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより血漿のサンプルをカニューレを通して投与した放射性標識した試験品のサンプルと比較することができる。放射活性のパターン（オートラジオグラフィー）が同じであれば，血液中に存在する複合体または化合物は分解されていないと結論づけられる。血液サンプルを反応させて，治療剤を免疫沈澱させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離および可視化により，免疫沈澱したサンプルを放射性標識融合蛋白質ストックからの免疫沈澱したサンプルと比較する。血液サンプルからおよび放射性標識融合蛋白質ストックから免疫沈澱したｃｐｍの量を比較することにより，複合体または化合物，またはその生物活性部分または代謝産物の量を定量的に見積もる。
【０８０２】
イムノアッセイ，例えば，酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて，試験品の濃度を決定する。この場合，試験品は放射性標識しない。複合体，化合物，またはその生物活性部分または代謝産物に存在するエピトープ，すなわちＭａｂが向けられた抗原を認識するモノクローナル抗体を９６ウエルプレートの底にコーティングする。洗浄した後，Ｍａｂに向けられ，検出可能な成分（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）とコンジュゲート化された第２抗体を固定化Ｍａｂに加えることにより，結合したＭａｂの存在および量を決定する。洗浄した後，西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼの基質をウエル中でインキュベートする。基質は検出可能であるか，または検出可能な産物を生ずる。生成物の量を適当な波長で分光光学的に決定する。対照の曲線（既知の量の融合蛋白質を用いる）を用いて，血漿サンプルにおける生物学的に活性な複合体または化合物，またはその生物活性部分または代謝産物の濃度を決定する。
【０８０３】
３２．４．関連するプロトコル
同様の実験を行って，本発明の組成物および成分の，複合体または化合物の座薬等による直腸輸送についての能力を試験することができる。これらの実験においては，本発明の組成物または化合物を直腸管により投与する。麻酔ラットの肛門を通してカテーテルを挿入する。尿道カテーテルを肛門から７．５ｃｍ挿入すると結腸中に輸送を行うことができる。
【０８０４】
同様に，上述の方法を用いて，複合体または化合物，またはその生物活性部分または代謝産物の吸入による輸送を試験することができる。これらの実験においては，融合蛋白質をエアロゾルまたは微粒子処方として鼻または肺腔に投与する。
【０８０５】
実施例３３：インビボ試験
ラット癌モデルを用いて，本発明の組成物および化合物の効力を判定する（そのような方法の適用の例としては，Ｂｅｎｅｄｉｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：６４５−６５２，１９９９を参照）。例えば，表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）と反応するｐＩｇＲターゲット化Ｍａｂがラットに移植された腫瘍の成長を阻害する能力について試験する。ＭａｂがラットＥＧＦＲと反応すれば，移植された腫瘍細胞はラット起源のものであり，多くのタイプのラットで成長する。ＭａｂがヒトＥＧＦＲ（例えば，Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ，ＡＢＸ−ＥＧＦ）と反応すれば，移植された腫瘍細胞はヒト起源のものであり，免疫が非常に低下している（ＳＣＩＤ）ラット中で成長する。
【０８０６】
３３．１．動物の調製
カニューレを腸，例えば，空腸，回腸，または結腸の領域に挿入することにより，ラットを治療剤の投与用に用意する。カニューレを挿入するために必要な外科手術の後，ラットを２−７日間休ませて快復させてもよい。この間に，ラットをその一般的健康状態およびカニューレの開通性について観察する。この間に，または手術の直前に，腫瘍細胞をラットの側腹部の皮下に注入する。用いる特定の腫瘍細胞株およびこれが腫瘍を形成する能力に依存して，１０，０００−５，０００，０００個の細胞を皮下に注入する。細胞は最初に組織培養培地中で成長させ，取り出して懸濁液とする。細胞を動物の皮下に注入する。
【０８０７】
腫瘍細胞を５−１４日間成長させた後，腸カニューレを通して投与した胃腸管に適した処方の試験品で腫瘍を治療する。あるいは，蛋白質の吸入輸送用の処方をエアロゾルを用いて肺または鼻腔を通して投与して試験する。ＥＧＦＲ発現細胞株であるＴＥ８（食道扁平上皮癌）およびＥＧＦＲ欠失細胞株であるＨ６９を用いて，試験品の効力を判定することができる（Ｓｕｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．７５：６２６−６３４，１９９８）。また，Ａ４３１細胞株（ヒト類表皮癌腫瘍細胞株）を用いて，試験品の効果を試験することができる。Ａ４３１細胞を無胸腺齧歯類，例えばラット中で成長させる。正常位移植されたＬＮＣａＰ腫瘍を有する無胸腺ヌードラットに皮下的に移植し，試験品で治療する（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３１−１３６，１９９７）。
【０８０８】
また，腫瘍細胞，例えばＣ６細胞を，ウイスターラットの右尾核に定位的に移植してもよい。融合蛋白質を投与する目的で，これらのラットに腸内カニューレを挿入してもよい。よく確立した脳Ｃ６神経膠腫病巣を有するラットに，腸カニューレを通して融合蛋白質を投与することができる。
【０８０９】
３３．２．アッセイ
腫瘍サイズの測定は，カリパスを用いて腫瘍の大きさを２方向で測定することにより行う。腫瘍の体積は，最長の長さに最短の長さの２乗を乗じて，この積を２で割ることにより求める。融合蛋白質を投与したラットの群について，腫瘍体積を時間の関数としてプロットし（腫瘍体積の平均値または中間値を用いる），同じ様式で調製した腫瘍を有する未処理ラットの群についての同じプロットと比較することにより，試験品が腫瘍の成長を阻害または遅延させ，好ましくは，腫瘍を根絶させる能力を決定することができる。
【０８１０】
このモデルにおいては，腫瘍を有するラットの平均生存時間は約１５−２０日である。試験品の効力は，対照ラット（すなわち，腫瘍を有し，試験品を投与していないラット）の寿命を，試験品を投与したラットと比較することにより測定することができる（Ｐｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ９２：１３２−１３９，２０００）。
【０８１１】
実施例３４：組成物，複合体および化合物の医薬処方
３４．１．カプセル，錠剤およびカプレット
本発明の組成物または化合物の好ましい医薬処方は，経口投与に適した丸薬，例えば，カプセル，錠剤，カプレット等である。多数のカプセル製造，充填，および密封システムが当該技術分野においてよく知られている。好ましいカプセル剤形は，ゼラチンおよびデンプンから製造することができる。ゼラチンは伝統的な材料であり，剤形は一般に，よく知られる浸漬成形手法により製造される。ゼラチンカプセルは，製造した後，所望の組成物で充填し，次に密封する。ゼラチン剤形の代替として最近開発されたものは，デンプンから製造されるカプセルである。デンプンカプセル（典型的にはジャガイモデンプンから製造される）は，ゼラチンカプセルと比較していくつかの利点を有する。例えば，ｐＨに依存しない溶解，腸溶性コーティングへのより優れた適合性，剤形中の水がデンプンに強く結合していること（したがって，剤形中に封入されている組成物にあまり移動しない），および動物由来の成分が存在しないこと（これは抗原性を有するか，または病原体が混入しているかもしれない），（Ｖｉｌｉｖｉｌａｍ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＳＴＴ３：６４−６９，２０００）。デンプンカプセルは無臭かつ硬質であり，ゼラチンカプセルと同様の溶解特性を示す。
【０８１２】
任意の適当なサイズのカプセルを製造することができる。デンプンカプセルは，射出成形手法を用いて，典型的には２つの部分，すなわちキャップとボディーとして製造される。Ｅｉｔｈら（Ｍａｎｕｆ．Ｃｈｅｍ．５８：２１−２５，１９８７；Ｉｄｒｉｓｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ａｃｔａ．Ｈｅｌｖ．６６：２４６−２５２，１９９１）；Ｅｉｔｈら（ＤｒｕｇＤｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．１２：２１１３−２１２６，１９８６）を参照。次に充填する間に２つの部分を一緒に密封して，分離を防止する。密封は，キャップの内表面に水性アルコール溶液を塗布することにより行うことができる
【０８１３】
３４．２．腸溶性コーティング
カプセル剤形を製造した後，所望の場合には，これらを１またはそれ以上の適当な材料でコーティングすることができる。例えば，封入した組成物を腸に輸送することが望まれる場合，１またはそれ以上の腸溶性コーティングを適用することができる。伝統的には，腸溶性コーティングは，胃の刺激，吐き気を防止するため，または活性成分が酸または胃の酵素により分解されることを防止するために用いられていた。しかし，これらのコーティングは，薬剤を特定の胃腸領域に輸送するために用いることもできる。
【０８１４】
種々の腸溶性コーティングが当該技術分野において知られており，任意の適当なコーティング，またはコーティングの組み合わせを用いることができる。デンプンカプセル用の適当なコーティングには，メタクリル酸コポリマーの水性分散物およびセルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）の水系再構成分散物が含まれる。Ｂｒｏｇｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：Ｓ１６７；Ｖｉｌｉｖａｌａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：Ｓ−６５９，１９９９；Ｖｉｌｉｖａｌａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：Ｓ−６４５，１９９８；Ｂｕｒｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１３４：２２３−２３０，１９９６；Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，１９：９７１−９８６，１９９２を参照。実際に，種々のコーティングを用いて剤形をカプセル化することができる。これらのコーティングには，ｐＨ感受性材料，酸化還元感受性材料，および腸内に存在する特定の酵素または微生物により分解されることができる材料が含まれる。Ｗａｔｔｓら（（１９９５），国際公開Ｗ０３５１００）は，結腸中の部位にターゲティングするための腸溶性コーティングしたデンプンカプセル系を報告している。ｐＨ感受性腸溶性コーティングは，剤形が小腸に入ったときに溶解し始め，コーティングの厚さにより，腸のどの領域，例えば，末端回腸または上行，横行，または下行結腸でカプセルが分解するかが指図される。他のコーティングまたはコーティングの組み合わせを用いて同じ効果を得ることもできる。
【０８１５】
３４．３．包装
投与剤形を製造した後，これは典型的には適当な材料中に包装される。丸薬または錠剤剤形については，剤形は個々に包装するかまたは一緒に瓶詰めすることができる。個々の包装の例は，アルミニウムブリスターをＰＶｄＣ（塩化ポリビニリデン）でコーティングしたＰＶＣ（塩化ポリビニル）で覆って水蒸気および酸素保護を改良したＰＶＣ−ＰＶｄＣ−Ａｌｕである。適当な瓶詰め材料としては，着色した，透明な，または不透明な高密度ポリエチレンが挙げられる。
【０８１６】
当業者は，上述した情報を用いて，本発明の融合蛋白質の胃腸輸送用の適当な処方を製造することができるであろう。他の関連する情報は当該技術分野において知られており，これを利用して融合蛋白質の胃腸輸送用の適当な処方を製造することができる。
【０８１７】
実施例３５：吸入療法用の処方および医療機器
本発明の１つの観点は，モノクローナル抗体の輸送のためのエアロゾル吸入器，または他の医療機器に関する。このような機器は，本発明の組成物および化合物に基づく吸入療法に有用である。”吸入療法”との用語は，治療用薬剤，例えば，本発明の薬剤または融合蛋白質をエアロゾル形で呼吸管に輸送すること（すなわち，肺輸送）を表す。概説としては，Ｇｏｎｄａ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．８９：９４０−９４５，２０００）；Ｂｙｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｍｅｄ．７：４９−７５，１９９４；およびＮｉｖｅｎ（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１２：１５１−２３１，１９９５）を参照。
【０８１８】
本発明の組成物および化合物を肺輸送用に処方し，以下の考慮点および分類，ならびに当業者に知られる他の考慮点および分類にしたがって，吸入器などの医療機器に入れる。当業者は，以下の情報を使用して，本発明の組成物および化合物の肺輸送用の適当な処方および医療機器を用意することができるであろう。
【０８１９】
３５．１．モノクローナル抗体を用いる吸入療法
生物活性，特に治療用の薬剤複合体および化合物を含む吸入剤を用いて，これらをすみやかに自己投与により輸送することができる。そのような医療機器を用いて，薬剤を吸入経路により短時間で輸送することが望ましい慢性または急性の疾患または疾病を治療することができる。疾患または疾病の慢性的な発作には，例えば，ぜん息発作が含まれる。ぜん息の治療に有用な薬剤の非限定的例は，モノクローナル抗体ＣＤＰ８３５である。吸入により輸送されることが望ましい他のモノクローナル抗体には，限定されないが，ＢＥＣ２，ＡＢＸ−ＥＧＦ，Ｅ２５，Ｐａｌｉｖｉｘｕｍａｂ等が含まれる。
【０８２０】
３５．２．吸入療法用の処方
吸入療法において用いることが意図される組成物および化合物は，吸入による輸送に適した組成物に処方しなければならない。吸入療法に有用な治療剤の２つの処方としては，液体粒子および固体粒子の形のものが挙げられる。液体処方は，治療用薬剤の溶液を霧状にすることにより生成する。固体粒子処方は，計量用量吸入器から投与される推進剤中に懸濁された粉体の形であるか，または単に乾燥粉体吸入器から投与される粉体の形である。ポリペプチド治療剤の場合，固体粒子エアロゾルは，ポリペプチドを溶液から凍結乾燥し，次に凍結乾燥した薬剤を粉砕するかまたはすりつぶして，肺投与用の所望の粒子サイズとすることにより作成することができる。
【０８２１】
蛋白質等の治療剤の吸入療法用の処方の非限定的例は，Ｂｉｔｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１６：３２５−３４１，１９９９；Ｆｌａｍｅｎｔ，ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１７８：１０１−１０９，１９９９）；およびＬａｎｇｅｎｂａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｐｕｌｍｏｎｏｌ．２７：１２４−１２９，１９９９）に記載されており，これらを本明細書の一部としてここに引用する。蛋白質の吸入処方の非限定的例は，米国特許５，２３０，８８４；５，３５４，５６２；５，４５７，０４４；５，８８８，４７７；５，９５２，００８；５，９７０，９７３；６，０００，５７４；６，０５１，５５１；６，０６０，０６９；６，０８５，７５３；および６，１２１，２４７に記載されている。
【０８２２】
３５．３．エアロゾル吸入器
”エアロゾル吸入器”または”吸入器”は，患者が所定の用量の治療用薬剤を能動的に吸引することができる装置である。そのような医療機器の典型的な用途は，急性ぜん息発作の治療である。しかし，吸入による薬剤の輸送は，本明細書に記載されるもの等の多くの他の治療に用いることができる。例えば，吸入により投与される薬剤は，肺系の内側に並ぶ細胞により取り込まれ，そこから体内に輸送されることができる。本発明においては，生物学的に活性なポリペプチドおよび適当なｐＩｇＲターゲティングポリペプチドを含む融合蛋白質は，リバーストランスサイトーシスの結果，患者の循環系に輸送されるであろう。
【０８２３】
吸入器は，薬剤を患者の肺に輸送するために長い間用いられてきた。典型的には，吸入器は，治療剤および空気または別の種類の推進剤ガスの混合物を提供する。治療用薬剤の処方は，患者が吸入器のマウスピースから息を吸うときに患者に輸送される。一般に，エアロゾル輸送システムは，治療用薬剤と１またはそれ以上の推進剤，および任意に治療用薬剤の分散性および安定性を増加させる不活性成分との混合物を利用する。処方の吸入は，鼻または口のいずれによってもよく，しばしば，自己投与される。各投与量の容量が少ないため，推進剤は一般に，治療用薬剤の輸送と同時にまたはその直後に蒸発する。
【０８２４】
エアロゾル処方を正しく吸入するためには，手と呼吸とがよく調和することが必要である。ある吸入器の場合には，輸送は理想的には以下のような様式で進行する：患者は最初に息を吐き，次に装置を口に当て，患者が息を吸い始めると，吸入器の作動要素が活性化されることにより吸入器の作動が開始する。そのような活性化により，推進剤およびこの推進剤中に存在し分配されている治療用薬剤からなるエアロゾル処方が吸入器からノズルを通って患者の呼吸系に入る。治療用処方の呼吸系への吸入は，鼻腔，口腔前庭，またはその両方を通って行うことができる。患者がこれらの腔から能動的にガスを吸うことによりエアロゾル処方が肺に輸送される。吸入器中での治療用処方の噴霧および分散は，電子的にまたは機械的に開始させることができる。
【０８２５】
一般に，吸入療法の間に治療剤を輸送するために用いられている吸入器には３種類ある：ネブライザ，計量投与量吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉体吸入器（ＤＰＩ）。これらの各タイプの吸入器を，本発明の融合蛋白質を輸送するために用いることができる。
【０８２６】
ネブライザは，管により（または小児の場合には透明なマスクにより）治療用組成物を患者の口に直接送る電子機器である。ネブライザは手と呼吸との協調を必要としない。処方された量の薬剤を機器中に入れ，口中に管を挿入し（または，小児の場合には，鼻および口にマスクを置く），呼吸を開始し，通常は治療用組成物が涸渇するまで続ける。
【０８２７】
測定投与量吸入器（ＭＤＩ，計量投与量吸入器としても知られる）は，少量の加圧ガスを用いて計量された投与量の治療用組成物を口に送る。ＭＤＩにおいては，薬剤リザーバーと口との間に”スペーサー”を配置して，一回の投与で吸入される量を調節する。治療用組成物をスペーサー中に入れ，次に患者はこれを圧搾しながら組成物を急速に吸入する。慣用のＭＤＩ推進剤であるクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）が大気オゾン層を涸渇させることが見いだされ，ＣＦＣの製造および使用を段階的に中止するという国際的同意があるため，ＭＤＩは最近好まれなくなってきた。
【０８２８】
乾燥粉体吸入器（ＤＰＩ）は，評判のよい代替エアロゾル系吸入器である。ＤＰＩは，推進剤を必要としないという利点を有する。しかし，ＰＤＩは推進剤を有しないため，治療用組成物を肺中に入れるために吸入の力に依存する。小児，重症なぜん息を有する者，および急性の発作に罹患している者は，乾燥粉体吸入器を首尾よく使用するための十分な空気流を発生できないかもしれない。いずれにしても，ＤＰＩは，本発明の融合蛋白質を含む吸入療法において用いることができる。
【０８２９】
治療剤を輸送するための種々のタイプの吸入器が知られている。非限定的例として，米国特許３，９３８，５１６；４，６２７，４３２；５，９４１，２４０；６，１１６，２３９；６，１１９，６８８；および６，１１９，６８４を参照されたい。本発明の範囲内である乾燥粉体吸入器の一例は，ディスクハーレ（Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ）であり，これは，米国特許４，６２７，４３２に記載されている。米国特許５，９２１，２３７に記載されるスピロス（Ｓｐｉｒｏｓ）吸入器は，本発明の範囲内である別の乾燥粉体吸入器である。本発明の範囲内である他の乾燥粉体吸入器には，限定されないが，米国特許６，０１２，４５４；６，０４５，８２８；６，０５５，９８０；６，０５６，１６９；６，１１６，２３７；および６，１１６，２３８に記載されるものが含まれる。
【０８３０】
当業者は，上述の情報を用いて，本発明の分子の肺輸送のための適当な処方および医療機器を製造することができるであろう。他の必要な情報は，当該技術分野において知られており，適当な処方および医療機器を製造するために用いることができる。
【０８３１】
本明細書において言及されるかまたは引用される文献，特許および特許出願，および他のすべての書類および電子的に入手可能な情報の内容は，それぞれの文献が特定的にかつ個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，その全体が本明細書の一部として引用される。本出願人は，そのような文献，特許，特許出願，または他の書類からすべての材料および情報をこの出願中に物理的に取り込む権利を留保する。
【０８３２】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，”含む”との用語は拡張的にかつ制限せずに読むべきである。さらに，本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に具体的に開示される本発明の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０８３３】
本明細書においては，本発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属から任意の主題を除く”ただし・・・”またはネガティブ限定を含む発明の一般的記載が含まれる。
【０８３４】
他の態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。さらに，本発明の特徴および観点がマーカッシュグループについて記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループについても記載されていることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，上皮細胞におけるポリイムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）のフォワードおよびリバーストランスサイトーシス輸送経路を示す。
【図２】図２は，ｐＩｇＲホモログのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図３】図３は，一本鎖抗体ｓＦｖ５ＡＦをコードするプラスミドであるｐＳｙｎＳＡＦのヌクレオチド配列を示す。
【図４】図４は，ｐＳｙｎ５ＡＦによりコードされる，分泌された形のｓＦｖ５ＡＦのアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は，分泌型のｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓのアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は，２つの異なる結合領域の間にジスルフィド結合を形成する反応スキームを図解する。
【図７】図７は，２−イミノチオランで誘導化した１つのｓＦｖおよびＳＰＤＰで誘導化した１つのｓＦｖを用いて製造した二重特異性結合分子を図解する。
【図８】図８は，２つの異なる結合領域の間にジスルフィド結合を形成する反応スキームを図解する。
【図９】図９は，ヒトカルシトニンをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は，サケカルシトニンをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は，異なる種からのいくつかの代表的なカルシトニン蛋白質のアミノ酸配列アライメントを示す。
【図１２】図１２は，マウスｐＩｇＲ配列をクローニングするために用いた戦略および配列を示す。
【図１３】図１３は，ヒトｐＩｇＲ配列をクローニングするために用いた戦略および配列を示す。
【図１４】図１４は，ラットｐＩｇＲ配列をクローニングするために用いた戦略および配列を示す。
【図１５】図１５は，キメラウサギ／ラットｐＩｇＲ分子を示す。
【図１６】図１６は，ＧＳＴ−ｐＩｇＲ融合蛋白質中にコードされる種々のｐＩｇＲ種のアミノ酸配列を示す。
【図１７】図１７は，細菌接着蛋白質ＣｂｐＡの部分アミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８は，トランスウエルトランスサイトーシスアッセイシステムを示す。
【図１９】図１９は，ｓＦｖ５ＡＦ−Ｃｙｓモノマーおよびダイマーのトランスサイトーシスを比較したアッセイの結果を示す。
【図２０】図２０は，ｓＦｖ５ＡＦに媒介されるＭ１抗体のトランスサイトーシスを示すアッセイの結果を示す。
【図２１】図２１は，１価（モノマー）および多価（ダイマー）ｓＦｖ５分子のトランスサイトーシスの経時変化を示す。
【図２２】図２２は，ヒト成長ホルモンをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列を示す。
【図２３】図２３は，ラットにおけるｓＦｖ５ＡＦ−ヒト成長ホルモン融合蛋白質（５ＡＦ−ｈＧＨ）の薬物動態学的プロファイルを示す。
【図２４】図２４は，ヒトインターロイキン−２をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
【図２５】図２５は，ヒトインターロイキン−４をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
【図２６】図２６は，ヒトインスリンをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそのアミノ酸配列を示す。
【図１】
2005500002.tif 000034
【図２Ａ】
2005500002.tif 000035
【図２Ｂ】
2005500002.tif 000036
【図２Ｃ−１】
2005500002.tif 000037
【図２Ｃ−２】
2005500002.tif 000038
【図２Ｃ−３】
2005500002.tif 000039
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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