(57)【要約】本出願は、野生型および変異型シャペロニンポリペプチドからなるナノ鋳型、ナノ構造、ナノ配列、ナノ装置、それら合成物の作成法および使用法、それら合成物の製造に使用される特定のシャペロニンポリペプチドに関するものである。
2005519780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは数個のシャペロニンを含むナノ鋳型であって、該１つまたは数個のシャペロニンのうち少なくとも１つのシャペロニンが、少なくとも１つの変異シャペロニンポリペプチドを含む変異シャペロニンであることを特徴とするナノ鋳型。
【請求項２】
２、３、４、５、６または７回対称の構造を有することを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項３】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、グループIシャペロニンを含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項４】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、グループIIシャペロニンを含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項５】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、グループIおよびグループIIシャペロニンを含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項６】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、原核生物または古細菌のシャペロニンポリペプチドであることを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項７】
前記シャペロニンポリペプチドが、極限環境微生物由来であることを特徴とする請求項６記載のナノ鋳型。
【請求項８】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、１環状構造あたり７、８または９サブユニットからなることを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項９】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、野生型または変異型GroELを含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項１０】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、真核生物型の野生型または変異型TCP1を含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項１１】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、８または９回対称の環構造を有することを特徴とする請求項１０記載のナノ鋳型。
【請求項１２】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、アルファサブユニット、ベータサブユニット、ガンマサブユニット、デルタサブユニット、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１０記載のナノ鋳型。
【請求項１３】
前記１つまたは数個のシャペロニンが、野生型もしくは変異型のサーマルファクター５５（TF55）シャペロニンポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項１４】
前記シャペロニンが、８または９回対称の環構造を有することを特徴とする請求項１３記載のナノ鋳型。
【請求項１５】
前記シャペロニンが、アルファサブユニット、ベータサブユニット、ガンマサブユニット、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１３記載のナノ鋳型。
【請求項１６】
前記変異シャペロニンポリペプチドが、１つまたは数個の点変異を含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項１７】
前記変異シャペロニンポリペプチドが、１つまたは数個の欠損配列を含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項１８】
前記変異シャペロニンポリペプチドが、１つまたは数個の挿入配列を含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項１９】
前記変異シャペロニンポリペプチドが、NまたはC末端に欠失または挿入を含むことを特徴とする請求項１記載のナノ鋳型。
【請求項２０】
少なくとも１つの請求項１記載のナノ鋳型と、少なくとも１つのナノ粒子および／または少なくとも１つのクオンタムドットとを含むナノ構造。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が、ナノ柱、ナノ結晶、ナノ棒、ナノ管、ナノ線、ナノフィラメント、ナノ繊維、または合金／誘電ナノ殻であることを特徴とする請求項２０記載のナノ構造。
【請求項２２】
前記ナノ粒子またはクオンタムドットが、金属を含むことを特徴とする請求項２０記載のナノ構造。
【請求項２３】
前記ナノ粒子またはクオンタムドットが、半導体を含むことを特徴とする請求項２０記載のナノ構造。
【請求項２４】
前記ナノ粒子またはクオンタムドットが、金、銀、炭素、亜鉛、カドミウム、シリコン、ガリウム、鉛、インジウム、白金、パラジウム、コバルト、水銀、砒素またはニッケルを含むことを特徴とする請求項２０記載のナノ構造。
【請求項２５】
前記ナノ粒子が高分子ナノ粒子であることを特徴とする請求項２０記載のナノ構造。
【請求項２６】
前記ナノ粒子が誘電ナノ粒子であることを特徴とする請求項２０記載のナノ構造。
【請求項２７】
前記クオンタムドットが磁気クオンタムドットであることを特徴とする請求項２０記載のナノ構造。
【請求項２８】
前記磁気クオンタムドットが、コバルト、鉄、銅、ニッケルまたは銀を含むことを特徴とする請求項２７記載のナノ構造。
【請求項２９】
前記磁気クオンタムドットが、コバルト／銅、鉄／銅、ニッケル／鉄／銀、またはコバルト／銀の合金を含むことを特徴とする請求項２８記載のナノ構造。
【請求項３０】
請求項２０記載のナノ構造が規則正しく配列したアレイを含むナノアレイ。
【請求項３１】
２、３、４または６方充填対称構造を有することを特徴とする請求項３０記載のナノアレイ。
【請求項３２】
前記規則正しく配列したアレイが、一次元、二次元または三次元のアレイであることを特徴とする請求項３０記載のナノアレイ。
【請求項３３】
前記ナノ構造が、ナノ柱、ナノ棒、ナノ管、ナノ線、またはナノフィラメントであることを特徴とする請求項３０記載のナノアレイ。
【請求項３４】
光量子的結晶であることを特徴とする請求項３０記載のナノアレイ。
【請求項３５】
少なくとも１つのナノ鋳型、少なくとも１つのナノ構造、少なくとも１つのナノアレイ、またはそれらの組み合わせを含むナノ装置。
【請求項３６】
電界効果トランジスター、統合回路、電界放出素子、プローブ、ナノコンピューター、量子コンピューターまたはセンサーであることを特徴とする請求項３５記載のナノ装置。
【請求項３７】
ナノ電子化学システムであることを特徴とする請求項３５記載のナノ装置。
【請求項３８】
光学電子スイッチ、光学スイッチ、レンズ、レーザー、光量子結晶、または増幅器であることを特徴とする請求項３５記載のナノ装置。
【請求項３９】
磁気記憶装置、磁気格納装置、ハードディスク読み取りヘッド、磁気RAM、磁場センサー、磁気論理ゲート、または磁気スイッチであることを特徴とする請求項３５記載のナノ装置。
【請求項４０】
電子半導体的、機械的、電子機械的、磁気的、光量子的、光学的、または光電子的装置であることを特徴とする請求項３５記載のナノ装置。
【請求項４１】
多重ナノウェルアッセイプレート、またはDNA検出およびハイブリダイゼーションのための単分子プローブであることを特徴とする請求項３０記載のナノアレイ。
【請求項４２】
少なくとも１つの請求項２０記載のナノ構造、少なくとも１つの請求項２９記載のナノアレイ、またはそれらの組み合わせを含む被膜。
【請求項４３】
光学的、電子的、磁気的、触媒的、または酵素的部分を含むことを特徴とする請求項４２記載の被膜。
【請求項４４】
ナノ構造を作成する方法であって：
（ａ）（i）少なくとも１つのナノ鋳型、（ii）少なくとも１つの野生型シャペロニン、または（iii）(i)と(ii)の混合物を含む１つまたは数個のナノ単位を表面に添加し；
（ｂ）（i）少なくとも１つのナノ粒子、（ii）少なくとも１つのクオンタムドット、または（iii）(i)と(ii)の混合物を含む１つまたは数個のナノ単位をさらに前記表面に添加し；
（ｃ）結合しなかったナノ単位を除去し；さらに
（ｄ）ナノ構造ができるまで前記(a)、(b)、(c)の工程を繰り返すことを特徴とする方法。
【請求項４５】
前記ナノ鋳型が、前記少なくとも１つのナノ粒子またはクオンタムドットに特異的に結合することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記ナノ鋳型または野生型シャペロニンに少なくとも１つのナノ粒子またはクオンタムドットがあらかじめ結合していることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記ナノ粒子の大きさが、１から５００ナノメートルであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記クオンタムドットの大きさが、１から５００ナノメートルであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
前記ナノ粒子またはクオンタムドットが金属を含むことを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
前記ナノ粒子またはクオンタムドットが、半導体を含むことを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５１】
前記ナノ粒子またはクオンタムドットが、金、銀、炭素、亜鉛、カドミウム、シリコン、ガリウム、鉛、インジウム、白金、パラジウム、コバルト、水銀、砒素、またはニッケルを含むことを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５２】
前記ナノ粒子が高分子ナノ粒子であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５３】
前記ナノ粒子が誘電ナノ粒子であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５４】
前記クオンタムドットが磁気クオンタムドットであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５５】
前記磁気クオンタムドットが、コバルト、鉄、銅、ニッケル、または銀を含むことを特徴とする請求項５４記載の方法で。
【請求項５６】
前記磁気クオンタムドットが、コバルト／銅、鉄／銅、ニッケル／鉄／銀、またはコバルト／銀の合金を含むことを特徴とする請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記ナノ鋳型が１つまたは数個の孔を含むことを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１つのクオンタムドットが、前記１つまたは数個の孔の内側に存在することを特徴とする請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも１つのナノ粒子が、前記１つまたは数個の孔の内側に存在することを特徴とする請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
前記ナノ構造が自動的集合によって形成されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６１】
前記ナノ構造が２つまたはそれ以上のナノ鋳型もしくは野生型シャペロニンを含み、該ナノ構造がナノ鋳型または野生型シャペロニンを表面にパターン化することによって形成されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも１つのクオンタムドットおよび／または少なくとも１つのナノ粒子がナノ装置を形成するように、前記ナノ鋳型を除去する工程をさらに含むことを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記ナノ構造がナノアレイを形成することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６４】
前記ナノ構造がナノ装置を形成することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６５】
前記ナノ構造が、K+、Mg2+、ATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSのいずれの存在下でも形成されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６６】
前記ナノ構造が、K+、Mg2+、ATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSのいずれの非存在下でも形成されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６７】
前記少なくとも１つのナノ鋳型または少なくとも１つの野生型シャペロニンが、約0.1、1、2、5、または20mg/mlの濃度で用いられることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６８】
配列番号1の配列において残基２９８がシステインからアラニンに置換された配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項６９】
配列番号1の配列において残基２７０がグルタミンからシステインに置換された配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項７０】
配列番号1の配列において残基２５４から２８１が欠失した配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項７１】
配列番号1の配列において結合特異性を持つペプチド配列が挿入された配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項７２】
配列番号1の配列において欠失または挿入がN末端に導入された配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項７３】
配列番号1の配列において欠失または挿入がC末端に導入された配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項７４】
変異シャペロニンポリペプチドを作成する方法であって：
（ａ）シャペロニンポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を導入して１つまたは数個の変異シャペロニンポリペプチドを作成し；
（ｂ）前記１つまたは数個の変異シャペロニンポリペプチドを集合させて１つの変異シャペロニンを作成する；工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７５】
前記集合が、K+、Mg2+、ATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSのいずれの存在下でも生じることを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記K+、Mg2+、ATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSが、1mMから10、20、30mMまたはそれ以上の濃度で存在することを特徴とする請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記変異シャペロニンが、自動的に１つまたは数個のシャペロニンを形成することを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７８】
前記変異シャペロニンポリペプチドが、インビボで集合することを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７９】
前記変異シャペロニンポリペプチドが、インビトロで集合することを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項８０】
前記変異シャペロニンポリペプチドが、0.1、1、2、5、10、30、50mg/mlまたはそれ以上の濃度で存在することを特徴とする請求項７４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願への相互参照
本出願は、２００１年１１月８日出願の米国仮特許出願第60/340,538号「極限環境微生物のヒートショックタンパク質によって作られる秩序立った生物学的ナノ構造」から得られる利益を請求するものであり、その出願は、サンショウによって図面を含むその全てが本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の起源
ここに記載された発明は米国政府の職員によりなされたものであり、米国政府のためおよび米国政府の使用目的のために使用あるいは加工される場合には報酬および使用料は発生しない。
【０００３】
発明分野
本出願は、野生型および変異型シャペロニンポリペプチドからなるナノ鋳型、ナノ構造、ナノ配列、ナノ装置、それらの合成物の作成法および使用法、それらの合成物製造に使用される特定のシャペロニンポリペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
無機物質をアドレス可能な多次元配列へと秩序立てて組み立てることは論理および記憶装置や非線形光学ならびに認識装置の発明の基礎である（非特許文献１）。これらの装置の多くはリトグラフによる模様付け（パターンニング）工程を採用しており、この工程はより高密度で小サイズへと進化してきた。しかし従来型のリトグラフはサブミクロンのレベルで実践的にも理論的にも限界に達した。１００ナノメートル以下のレベルではイオンや電子線によるリトグラフは法外に高額で時間がかかるだけでなく、量子効果により性質変化がおきてしまう(非特許文献２)。
【０００５】
ナノメートルレベルの鋳型の構築およびナノメートルレベルの無機物アレイへの模様付けは人工物と自然物質の両方を用いて行われてきた。人工物ではブロックコポリマーのミクロ相分離（非特許文献３）や、球体の六方最密充填（非特許文献４）が用いられている。自然物質ではDNA（非特許文献５および６）、バクテリアや古細菌の表層タンパク（S層タンパク）（非特許文献７から９）、ウイルス外殻タンパク（非特許文献１０から１３）、ファージ（非特許文献１４）、球状タンパク（非特許文献１５）などが鋳型やほかのナノスケール構造に使われている。
【０００６】
従来と異なる方法で作られたナノサイズ粒子のアレイなどがナノスケールの物体として従来のリトグラフによる模様付けに取って代わってきている。ナノ粒子（量子ドット、QD）は単電子トランジスターに代表される単独装置部品として使えることがわかってきた（非特許文献１６および１７）。理論家たちはナノスケール分解能を持つQDの二次元アレイが次世代の電子音響機器を可能にすると見ている。それらの機器は、クーロン力、QD間トンネリングや、他のコヒーラントな性質（封じ込めやナノ粒子独特の、体積に対する表面積の大きさから発生する電子的な力）などの現象にもとづいてつくられると考えられている（非特許文献１８から２１）。
【０００７】
無機物基盤の上に模様付けを行う従来の方法ではイオン線リトグラフィや分子線エピタクシーが用いられている。これらの方法の限界は、模様付けの際高分子で光をさえぎる必要があることと、理論的に数１００ナノメートル以下の分解能は得られないということである。
【０００８】
ナノスケール構造の構築が強く望まれてはいるものの、それには従来と異なる方法とナノスケール物質の挙動への新しい見識が必要である（非特許文献２２）。
【非特許文献１】Zhirnov et al., 2001, Computer 34, 34-43, Xia et al., 2000, Adv. Mater. 12, 693-713
【非特許文献２】Sato et al., 1997, J. Appl. Phys. 82, 696
【非特許文献３】Park et al., 2001, Appl. Phys. Lett. 79, 257-259
【非特許文献４】Hulteen et al., 1995, J. Vac. Sci. Technol. A, 1553-1558
【非特許文献５】Richter et al., 2000, Adv. Mater. 12, 507-510
【非特許文献６】Keren et al., 2002, Science 297, 72-75
【非特許文献７】Sleytr et al., 1999, Angew. Chem. Int. Ed. 38, 1034-1054
【非特許文献８】Douglas et al., Appl. Phys. Lett. 48, 676-678
【非特許文献９】Hall et al., 2001, CHEMPHYSCHEM 3, 184-186
【非特許文献１０】Shenton et al., 1999, Adv. Mater. 11, 253-256
【非特許文献１１】Douglas et al., 1999, Adv. Mater., 679-681
【非特許文献１２】Douglas et al., Nature 393, 152-155
【非特許文献１３】Wang et al., 2002, Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462
【非特許文献１４】Lee et al., 2002, Science 296, 892-895
【非特許文献１５】Yamashita, I., 2001, Thin Solid Films 393, 12-18
【非特許文献１６】Likharev, K. K., 1999, Proc. IEEE 87, 606-632
【非特許文献１７】Thelander et al., 2001, Appl. Phys. Lett. 79, 2106-2108
【非特許文献１８】Maier, S. A. et al., 2001, Adv. Mater. 13, 1501-1505
【非特許文献１９】Maier et al., Phys. Rev. B 65, 193408
【非特許文献２０】Zrenner, A. et al., 2002, Nature 418, 612-614
【非特許文献２１】Berven et al., 2001, Adv. Mater. 13, 109-113
【非特許文献２２】Nalwa, H.S., 2000, Handbook of materials and nanotechnology, Academic Press, San Diego
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、少なくとも１種の変異型シャペロニンポリペプチドからなる高次元構造の作成法を提供する。その高次元構造はナノ鋳型、ナノアレイ、ナノ装置を含む。
【００１０】
本発明は、少なくとも１種の変異型ポリペプチドを含むシャペロニンポリペプチドからなるナノ鋳型を提供する。本発明は少なくとも１種の変異型シャペロニンポリペプチドと少なくとも１種のナノ粒子またはQD（クオンタムドット）、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置からなる高次元構造を提供する。ナノ装置は少なくとも１種のナノ鋳型、少なくとも１種のナノ構造、少なくとも１種のナノアレイ、もしくはそれらの組み合わせから成る。
【００１１】
本発明はナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置の作成方法を提供する。それは次の各工程からなる（a）１または数個のナノユニットを表面に加える。そのナノユニットはナノ鋳型またはナノ鋳型と野生型シャペロニンの混合物を含む。次に（b）以下のものから成る１または数個のナノユニットを加えるもしくはその場で（インサイチュに）合成する（i）少なくとも１つのナノ粒子（ii）少なくとも１つのクオンタムドット、または（iii）（i）と（ii）の組み合わせ。次に（c）もし必要であれば結合しなかったナノユニットを除去する。ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置の作成に当たりこれらの工程はいかなる順序で何度でも繰り返される。
【００１２】
本発明はシャペロニンポリペプチド配列の選択的変異により得られた種々の変異型シャペロニンポリペプチドサブユニットを提供する。変異型シャペロニンは１または数個の変異型シャペロニンポリペプチド配列からなる。本発明は１または数個の点変異をもつシャペロニンポリペプチドを提供する。本発明は１または数個のアミノ酸残基もしくは一連のアミノ酸残基の挿入または欠失変異をもつシャペロニンポリペプチドを提供する。その場合、挿入されたポリペプチド配列は、ナノ粒子やクオンタムドットのようなナノスケール材料もしくは特定の性質を持つ表面のみに結合するようデザインされる。本発明はポリペプチド配列のNまたはC末端の欠失および挿入をふくむ変異を提供する。特定の実施形態ではシャペロニンポリペプチドは熱ショックタンパク６０（HSP60）をさす。
【００１３】
本発明は変異シャペロニンの作成法を提供する。それは次の工程からなる。シャペロニンポリペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基を変異させる。次に１もしくは数個の変異シャペロニンポリペプチドを作成し、さらにそれらを組み合わせて変異シャペロニンを作る。
【００１４】
シャペロニンポリペプチドはシャペロニンとして知られる二重環構造体を自動的にかたちづくる。そのポリペプチドを遺伝子工学的に変化させることで、本発明は、成型された金属、半導体ナノ粒子、クオンタムドットなどのナノ粒子集合体をナノ構造体、ナノアレイ、ナノ装置へと変換する方法を示す。本発明は変異シャペロニンポリペプチドから次のような機能構造体を作る方法を示す。ナノ管、ナノ線、ナノ鋳型、ナノ織物、ナノアレイ（DNA、RNAまたはペプチドやポリペプチドナノアレイなど）。
【００１５】
本発明は、特にシャペロニンや変異シャペロニン（少なくとも１種の変異シャペロニンポリペプチドからなる）を用いたマイクロ電子機器のようなナノ装置の作成法を述べる。一実施形態では変異シャペロニンとは極限環境微生物由来の少なくとも１種の変異熱ショックタンパク６０（HSP６０）よりなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書で引用された特許は、参照によってその全てが組み込まれる。相違がある場合には、定義、用語を含む本特許明細中の記載を優先的に採用するものとする。
【００１７】
１．用語
「ナノ鋳型」は他に記載がない限り、１つまたは数個のシャペロニンから構成され、１シャペロニンは少なくとも１つの変異型シャペロニンポリペプチドを含む。例えば、ナノ鋳型は野生型もしくは変異型シャペロニンの両方を含む。「シャペロニンポリペプチド」、「シャペロニンサブユニット」、「シャペロニンポリペプチドサブユニット」の用語は互換性があるものとする。
【００１８】
「ナノ構造」は他に記載がない限り、１つまたは数個のナノ鋳型と１つまたは数個のナノスケール物質（例えばナノ粒子やクオンタムドット）から成る。
【００１９】
「ナノアレイ」は他に記載がない限り、規則正しく配列されたナノ鋳型またはナノ構造を意味する。
【００２０】
「ナノ装置」は他に記載がない限り、少なくとも１つのナノ鋳型、少なくとも１つのナノ構造もしくはナノアレイからなる装置を意味する。例えば電子的、半導体的、機械的、ナノ電子機械的、磁性的、音響学的、光学的、電子光学的、生物医学的装置などであり、ここに挙げられていないものも含む。
【００２１】
「ナノ単位」は他に記載がない限り、ナノ構造の「基礎単位構造」をなすもので、例えばナノ粒子やクオンタムドット、ナノ鋳型、野生型もしくは変異型シャペロニンもしくはシャペロニンポリペプチド、などのナノスケール物体を含む。
【００２２】
望ましい実施形態の詳細な記載
以下に示す応用は野生型または変異型シャペロニンポリペプチドからなるナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置、それら構造体の作成法、使用法、それらの構造体の作成に使用される特定のシャペロニンポリペプチド、に関するものである。
【００２３】
シャペロニン
本発明における構造体と装置すなわちナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置は、他に記載がない限り、少なくとも１つの変異型シャペロニンポリペプチドからなる少なくとも１つの変異型シャペロニンより構成される。さらに多くの具体例では、変異型シャペロニンは野生型シャペロニンをも含む。本発明に記載された方法と構造体の一部として使用されるシャペロニンとシャペロニンポリペプチドの例を以下に記載する。
【００２４】
シャペロニン（またはcpn60）はおよそ６０kDa（± 5 kDa）のタンパク質からなる二重環構造をしている（Hartl et al., 2002, Science 295, 1852-8参照）。自然界ではシャペロニンはすべての生物種に存在する必須な細胞内構造で、１４、１６、ないし１８個のサブユニットからなり、２個の環状構造が積み重なってできた高さ約１６から１８ナノメートル、幅約１５から１７ナノメートルの構造体（大きさは生物種により異なる）である。図１は１６サブユニット（１環状構造あたり８サブユニット）からなるシャペロニンの鳥瞰図と側面図である。
【００２５】
異なる生物間でのシャペロニンおよびシャペロニンポリペプチドのアミノ酸配列や立体構造上の類似性により、いかなる生物種のシャペロニンおよびシャペロニンポリペプチドも本発明中の構造体および装置の一部として日常的に使用される。さらにこの類似性により、いかなる生物種のシャペロニンポリペプチドからも本発明中の構造体および装置を作成するための変異型シャペロニンポリペプチドを得ることができる。図２A-Rおよび図３に示された異なる生物種のシャペロニン間でのアミノ酸配列と三次元構造の類似性は本発明中のナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置の形成の根拠となる。
【００２６】
シャペロニンはアミノ酸配列と立体構造の比較からグループIとグループIIに分類される（Trent et al., 1991, Nature 354, 490-493; Horwich et al., 1993, Phil. Trans R. Soc. Lond. 339, 313-326参照）。グループIとグループIIのシャペロニン、シャペロニンポリペプチドまたは変異型シャペロニンポリペプチド（少なくとも１つの変異型グループIまたはグループIIシャペロニンポリペプチドよりなる）は本発明中の構造体および装置の一部として用いられうる。一実施形態ではシャペロニンまたは変異型シャペロニンはグループIシャペロニンポリペプチドまたは変異型シャペロニンポリペプチドを意味する。別の実施形態ではシャペロニンまたは変異型シャペロニンはグループIIシャペロニンポリペプチドまたは変異型シャペロニンポリペプチドを意味する。
【００２７】
グループIシャペロニンは細菌と真核生物の細菌由来細胞内小器官（ミトコンドリアと葉緑体）に存在し、グループIIシャペロニンは古細菌と真核生物細胞質に存在する。参考文献United States Patent 5,428,131 to Trent et alには、S. shibatae野生型TF55の細胞内発現と、グループI（GroEL）とグループIIのシャペロニンTF55の比較が記載されている。
【００２８】
野生型グループIシャペロニンの二重環構造は７サブユニットからなる環からできている。そのサブユニットは５５０から５８０アミノ酸残基からなり由来生物種により異なる名称を持つ。たとえば（これだけに限らないが）大腸菌GroELタンパク、シアノバクテリアgroEL類似タンパク、マイコバクテリア・チュバキローシスとライ菌では６５kD抗原、コクシエラ・バーネッティ熱ショックタンパクB（遺伝子htpB）、リケッチア・ツツガムシ主要抗原５８、クラミジア５７kD高感受性抗原（遺伝子hypB）、葉緑体ルビスコサブユニット結合タンパクアルファおよびベータ鎖、哺乳類ミトコンドリアマトリックスタンパクP1（マイトニンまたはP60）、酵母菌HSP60タンパクなどである。上記のうちのどのシャペロニンまたはその変異タンパクも本発明の構造体と装置の一部として使用されうる。
【００２９】
一実施形態ではグループIシャペロニン、シャペロニンポリペプチド、変異型シャペロニン、変異型シャペロニンポリペプチド、コシャペロニンのいずれも本発明の高次構造を作るのに使用されうる。そのような実施形態の一つでは本発明の構造体もしくは装置はさらにコシャペロニンをも含む。コシャペロニンの作用についてはHarris et al., 1995, J. Structural Biol. 115, 68-77を参照のこと。別の実施形態では（この例に限らないが）コシャペロニンはナノフィラメントの作成に使用されうる。例えば大腸菌のcpn60(GroEL)は自然界ではGroESと呼ばれる１０kDのタンパク（コシャペロニンまたはcpn10）と結合した状態で存在する。GroESポリペプチドが示すように、いかなる生物種のコシャペロニンもグループIシャペロニンたとえばGroELやGroEL類似シャペロニン、シャペロニンポリペプチド、変異シャペロニン、シャペロニンポリペプチドとともに使用されうる。本発明中の別の実施形態では、１つもしくは数個のシャペロニンと１つもしくは数個のコシャペロニンが片方または両方のシャペロニン端に結合したものからナノ鋳型やナノ構造などの構造体が作成される。
【００３０】
グループIIシャペロニンは同一あるいは類似した８または９個のサブユニット（生物種によって異なる）が環状に集合したのもである。酵母菌Saccharomyces cerevisiaeでは各環状構造につき８個の異なるサブユニットが存在する（Lin et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10780-10785）。古細菌類の好熱性メタン菌（Methanopyrus kandleri, Methanococcus jannaschii, Methanococcus thermolithotrophicus）ではシャペロニンは同一のサブユニットよりなり、（Furutani et al., 1998, J. Biol. Chem. 273, 28399-28407）、常温性メタン菌Methanosarcina acetivoransでは５種の異なるサブユニットが存在する（Galagan et al., 2002, Genome Research 12, 532-542）。データベース中の５０の古細菌シャペロニンでは多くの種間で４０％以上の高いアミノ酸配列同一性が見られる。それらいずれのシャペロニンまたは変異型も本発明の構造体と装置の一部として使用されうる。
【００３１】
古細菌グループIIシャペロニンの多くは１環状構造あたり８個のサブユニットを持ち「サーモソーム」と呼ばれるが（Klumpp, M., and Baumeister, W., 1998, FEBS Letters 430, 73-77）、スルホロバス属の好酸好熱性古細菌のシャペロニンは１環状構造あたり９個のサブユニットを持つ（Trent et al., 1991, Nature 354, 490-493; Marco et al., 1994, FEBS 341, 152-155）。これらスルホロバスの１８量体シャペロニンは「ロゼッタソーム」と呼ばれ（Kagawa et al., 1995, J. Mol. Biol. 253, 712-725）サーモソームと区別される。他のサーモソームの例としてはピロディクティウム・オカルタム、サーモプラズマ・アシドフィラム、メタノパイラス・カンデュレリ（Ellis et al., 1998, J. Struc. Biol. 123, 30-36）などがある。ロゼッタソームは２種のHSP60、TF55アルファとベータからなり、TF55アルファとベータはS. shibataeの至適生育温度（75-83°C）で細胞中もっとも豊富なタンパクであり、その生合成は熱ショック温度（85-88°C）でさらに増加することが以前報告された（Kagawa et al., 1995, J. Mol. Biol. 253, 712-725）。さらにS. shibataeでアルファとベータに次ぐ第三のサブユニット、ガンマの存在がDNA配列決定により確認された（Archibald et al., 1999, Current Biology 9, 1053-1056）。S. solfataricus（Charlebois et al., 1998, Current Opinion in Microbiology 1, 584-588）におけるDNA配列情報から、TF55アルファ、ベータ、ガンマの遺伝子発現量がコドン使用頻度より予測された（Karlin et al., 2001, J. Bacteriol. 183, 5025-5040）。真核生物の細胞質中に存在するシャペロニンは「TCP1」と呼ばれ、TCP1を含む環状構造を「TriC」（TCP1 ring chaperonin）または「CCT」（chaperonin containing TCP1）と呼ぶ。これらいずれのシャペロニンまたはその変異体も本発明中の構造体と装置の一部として使用されうる。
【００３２】
一実施形態ではシャペロニンは熱ショックにより発現誘導されるHSP６０（熱ショックタンパク）を含む。
【００３３】
図２A-2RはグループＩ（細菌型）とグループＩＩ（古細菌、真核生物型）シャペロニンの代表例のタンパク質アミノ酸配列の比較である。タンパク質アミノ酸配列はS. shibatae TF55 ベータサブユニット (配列番号1)、細菌型 E. coli GroEL(配列番号2)、サーモソーム T. acidophilum ベータサブユニット (配列番号3)、シアノバクテリア シネココッカス HSP60 (配列番号4)、M. acetivorans HSP60-4(配列番号5)、M. tuberculosis HSP65 (配列番号6)、サーモソーム A. pernixアルファサブユニット (配列番号7)、サーモソーム M. mazei アルファサブユニット (配列番号8)、mitochondrial A.thaliana HSP60 (配列番号9)、yeast TCP1アルファサブユニット (配列番号10)、ヒトミトコンドリア HSP60 (配列番号11)、マウス ミトコンドリア HSP60 (配列番号12)、ヒト TCP1 アルファサブユニット (配列番号13)、マウス TCP1 アルファサブユニット (配列番号14)、共通配列 (配列番号15)である。黒地に白字は同一なアミノ酸残基、実線で囲まれた領域は類似のアミノ酸残基、破線で囲まれた領域は進化上よく保存されているアミノ酸配列領域を示す。
【００３４】
かようにアミノ酸配列が類似していることより、いかなるシャペロニンまたはシャペロニンポリペプチドも単一もしくは組み合わせで本発明中の構造体や装置の一部として使用されうる。また次項に詳しく述べるが、類似配列を利用して変異型シャペロニンポリペプチドの作成や改造を行い、得られた変異型シャペロニンは本発明の構造体や装置の一部として用いられる。
【００３５】
グループＩシャペロニンが時に５０％以上のアミノ酸配列同一性を見せるのに対し、グループＩＩシャペロニンは３３％どまりである。異なる生物種間のcpn60サブユニットではアミノ酸配列上の違いはあるものの、立体構造はグループＩとグループＩＩ間で非常に似通っている。図３は古細菌のサーモソーム（Thermoplasma acidophilum）と細菌（大腸菌）のGroELの立体構造を比較したものである。この比較には反復動的プログラムによるアルゴリズムを使用した（Gerstein, M. & Levitt, M., Protein  Science 7, 445-456, 1998; Gerrstein, M. & Levitt, M, Proc. of ISMB-96, pp.59-67, 1996）。
【００３６】
かように三次元構造が類似していることより、いかなるシャペロニンまたはシャペロニンポリペプチドも単一もしくは組み合わせで本発明中の構造体や装置の一部として使用されうる。また次項に詳しく述べるが、類似配列を利用して変異型シャペロニンポリペプチドの作成や改造を行い、得られた変異型シャペロニンは本発明の構造体や装置の一部として用いられる。
【００３７】
図３に示されたシャペロニンの２つのサブユニットは構造的によく類似しており、ともに赤道面部、中間部、頂上部、を有する。これら２つのcpn60サブユニットはアミノ酸配列上ではかなりかけ離れているが（図２Ａ−２Ｒ）、結晶構造解析ではほとんどのらせん、シート構造、ランダムコイルは図３中央の黒線で示されたようによい一致を示した。構造の相違は頂上部のループ部分で見られたが、赤道部では折り畳みモチーフはよい一致を示した。
【００３８】
シャペロニンは現在のところ１環状構造当たり７、８、もしくは９個のサブユニットからなるものしか発見されていないが、本発明中のナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置の作成にあたり、１環状構造当たりいかなる数のサブユニットからなるシャペロニンをも開発する方法を提供する。
【００３９】
ある生物種由来のシャペロニンは一種類のサブユニットのみからなり、他の生物種由来のシャペロニンは数種のサブユニットからなる（例えば古細菌のシャペロニンはアルファ、ベータ、ガンマサブユニットからなる）。それらのサブユニットはタンパクのアミノ酸配列上の違いに基づいてアルファ、ベータ、ガンマと呼ばれる。ある生物種由来のシャペロニンは他の生物種由来のものにくらべて多種のサブユニットを有することが知られている。Ellis et al., 1998, J. Struc. Biol. 123, 30-36ではSulfolubus solfataricus 由来のシャペロニンはアルファ：ベータ比が２：１の９サブユニットからなる環状構造（サーモソーム）をとると報告されている。本発明は一種類の野生型もしくは変異型サブユニットのみからなるシャペロニンや、数種の野生型もしくは変異型のシャペロニンポリペプチドを多様な混合比で組み合わせたシャペロニンの作成法も提供する。
【００４０】
一実施形態としては、高温で生育する生物「好熱菌」由来のHSP６０（熱ショックタンパク）が野生型および変異型シャペロニンポリペプチド材料として使用される。このタンパクはすべての生物種に存在し、超好熱菌では細胞中もっとも多量に存在するタンパクの一つで、現存する生物種中で最高温の生育温度を示すPyrodictium  occultumでは全タンパク量の７３％を占めると報告されている（Phipps et al.,1991, The EMBO Journal 10(7), 1711-1722）。
【００４１】
シャペロニンや変異シャペロニンポリペプチドは確立された標準的な手法で日常的に生産される。シャペロニンポリペプチドや変異シャペロニンポリペプチドをコードする遺伝子は標準的な遺伝子組み替え技術により、大腸菌やサルモネラ菌などの原核細胞宿主もしくは酵母菌やほ乳類細胞などの真核細胞宿主に導入、発現されたのち単離される。
【００４２】
例えば(この例に限らないが)、高温で安定なシャペロニンをコードする遺伝子を大腸菌に導入し大腸菌の生育温度である常温で培養する。発現されたポリペプチドは熱処理と遠心分離により大腸菌タンパクから分別され、簡単に精製することができる。遠心分離の際、高温で不安定な大腸菌のタンパクは沈澱し、高温で安定なポリペプチドは９０％以上の純度で精製される。もう一つの利点は、HSP６０からできる環、管、フィラメントなどのナノ鋳型構造（次項に詳しく述べるが）は「ゲルシフト法」とオートラジオグラフィによりＤＮＡやＲＮＡとの結合が示されているだけでなく、リポソームや脂質一重層とも結合する。
【００４３】
変異型シャペロニン
本発明は、シャペロニンポリペプチドに選択的変異をほどこし、種々の条件下で多様な高次構造を構築する方法を提供する。種々の条件下とは本発明中のナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置を作成するための種々の条件のことである。
【００４４】
本発明中のナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置などの構造体や装置は、他に記述のない限り、少なくとも一つの変異型シャペロ二ンポリペプチドからなる少なくとも一つのシャペロニンを含む。本発明中の構造や手法の一部として使用されうる変異型シャペロニンや変異型シャペロニンポリペプチドの例をここに記載する。
【００４５】
変異型シャペロニンや変異型シャペロニンポリペプチドについて述べる際、「変異型」とは野生型のアミノ酸配列との違いを意味する。種々の野生型シャペロニンポリペプチドのアミノ酸配列の例を図２Ａ−２Ｒに示した。さらに、もし変異型シャペロニンポリペプチドが細胞や宿主生物中に存在すると、野生型のみが存在した場合と異なる表現型を示す。一般に、変異型シャペロニンのアミノ酸配列は、標準的な方法と入手可能なデータより計算すると天然には１０％（+/- 10%）以下の確率でしか起こり得ない。例えば、S. shibatae の一つの変異型シャペロニンは１０％（+/- 10%）以下の確率でしか起こり得ない遺伝子の組み合わせが発現してできる。
【００４６】
先に論じたように、異生物種由来のシャペロニン間で三次元構造が類似しているので、いかなるシャペロニンポリペプチドやシャペロニンも本発明中の構造体と装置の一部として日常的に使用されうる。さらに、その類似性により、いかなるシャペロニンポリペプチドからも本発明中の構造体と装置を構成するための変異型シャペロ二ンポリペプチドを作成することができる。この図２Ａ−２Ｒと図３に示されたアミノ酸配列と三次元構造の類似性により、本発明中のナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置の作成が可能となる。
【００４７】
さらに、シャペロニン立体構造の詳細は原子レベルの分解能（2.3-2.8Å）で解析されうる（Figure ;1 and Xu, Z. et al., 1997, Nature 388, 741-750; Ditzel, L., J. Lowe, et al., 1998, Cell 93, 125-138を参照）。これによりシャペロニン二重環構造中のすべてのアミノ酸残基のすべての原子の位置情報を得ることが可能となり(図４)、その情報は修飾に適した部位を選択したり、変異シャペロニンの特性を評価したりするのに日常的に使用しうる。
【００４８】
シャペロニンの生物種間でのアミノ酸配列や三次元構造上の類似性と、三次元構造の原子レベルでの分解能に基づいて、シャペロニンポリペプチドの高次構造構築能、力学的強度、特定の物質への結合能、などに影響を与える変異が施される。
【００４９】
かような構造類似性は、ふさわしい変異体を選択する際に利用される。例えば、望ましい特性を持ったある生物種由来の変異シャペロニンの特定の領域を、そのまま他の生物種由来のシャペロニンの相当する部位に導入するためには、それらのシャペロニン間のアミノ酸配列または三次元構造の類似性に基づいて導入する領域および導入される部位を決定する。一実施形態として、S. shibataeのアミノ酸配列情報は以下に示される例のように、他のシャペロニンへの導入の際に日常的に使用され、得られた変異シャペロニンポリペプチドは本発明中の構造体と装置として使用される。
【００５０】
部位特異的変異法などの今日よく知られた標準的な方法によりシャペロニン中の特定のアミノ酸や領域を変換し、得られた変異シャペロニンポリペプチドの、ナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置の構築能、具体的には管構造やフィラメント構造の構築能を日常的に試験する。一実施形態として、金属など種々のナノスケール物質と結合能を持つアミノ酸配列をシャペロニンポリペプチドサブユニットのある部位に導入する。その部位にはシャペロニン構造内部を含む種々の部位が考えられるが、環状構造構築能や管構造構築能を妨げない部位を選ぶ。一実施形態として、温泉に生育し至適生育温度85℃至適生育pH 2.0 のSulfolobus shibatae由来のHSP60のベータサブユニットが変異型シャペロニンの作成に用いられた。S. shibatae のシャペロニンは１環状構造当たり９サブユニットを持つ１８量体である。図１５はS. shibatae TF55 のアルファ（配列番号39）、ベータ（配列番号1）、ガンマ（配列番号38）サブユニットのアミノ酸配列の比較である。ベータサブユニットが選ばれた理由は、熱安定性に優れているため遺伝子組み替えでできたタンパクの精製が容易であること、アミノ酸配列と立体構造の詳細な情報が入手可能であるため変異体のデザインがしやすいこと、である。
【００５１】
一般的に、シャペロニンサブユニットには挿入や欠失を許す領域がそれぞれ赤道部、中間部、頂上部にいくつかある（図３）。図４は変異導入の際に用いられるグループＩＩシャペロニンサブユニットの詳細構造を示したものである。さまざまな場所に１または数個のクオンタムドットやナノ粒子の特異的結合部位を導入したり、種々の分子やポリペプチドを付加したり、といった変異が施される。それらの変異により、シャペロニンの長さ、内側の穴の直径、外側の直径などの値は変化しうる。また、特異的結合部位はシャペロニンの頂上部、中間部、赤道部に導入されうる。変異は本発明中の種々の用途、ナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置の作成、に応じて選択される。
【００５２】
変異はシャペロニンにどのような構造が求められるかによって選択され、そのつど確認される。一実施形態として、１環状構造中に７個以下や９個以上のサブユニットを含む変異シャペロニンからなる高次構造がある。１環状構造中にいかなる数のサブユニットをも含む変異シャペロニンからなる高次構造も考えられる。１環状構造中のサブユニット数を変える変異は、それによって作られるナノ構造中の環状構造の直径を変えることができる。
【００５３】
どのシャペロニンポリペプチドを選ぶか（どの生物種、どのサブユニット）、どんな変異を導入するかは、求められる構造の大きさ（長さ、中央坑の直径、外径）や特異的結合部位を導入するか否か、によって決まる。グループＩ、グループＩＩ両シャペロニンサブユニットともに、点変異であるかぎりどんな変異にも耐える。アミノ酸配列の比較データに基づいて変異箇所を決定する場合、生物種間で保存されていない箇所が最も望ましい。三次元構造の比較データに基づいて変異箇所を決定する場合、図３のようなシャペロニンサブユニット構造の比較がサブユニット上のどの部位に変異を導入するかの道しるべになる。２つの構造間で直接重なりあわないループやターンは挿入や欠失をも含んだ変異導入箇所のよい候補である。ポリペプチドのＮ末端やＣ末端は一般的に細工しやすい場所である。
【００５４】
一実施形態として、グループＩＩシャペロニンの頂上部のループを欠失させた変異体が作られた。それは図３の構造比較と、頂上部のループを持たないグループＩシャペロニンサブユニットが二重環構造を形成したという事実に基づいてなされた。もう一つの実施形態として、Ｎ末端やＣ末端が除去された。さらなる実施形態として、Ｎ末端やＣ末端に新しい配列が挿入された。その配列はシステインやチロシンなど化学修飾が可能な、特異的結合をもたらすためのものである。
【００５５】
特異な実施形態として変異シャペロニンは１または数箇所の点変異を含む１または数個のシャペロニンポリペプチドからなる。点変異の例として、Sulfolobus shibatae由来のTF55ベータサブユニットでは２９８番目の残基はシステインからアラニンへ、２７０番目の残基はグルタミンからシステインへと変換された。もう一つの実施形態として、その変異シャペロニンは１または数アミノ酸配列の欠失を持つ１または数個の変異シャペロニンポリペプチドからなる。Sulfolobus shibatae 由来TF55のベータサブユニットでは２５４ー２８１番目の残基が除去された。もう一つの実施形態として、その変異シャペロニンポリペプチドは１または数アミノ酸配列の挿入を持つ１または数個の変異シャペロニンポリペプチドからなる。Sulfolobus shibatae 由来TF55のベータサブユニットでは特異的結合能を持つペプチドが挿入された。すでに述べたように、類似の変異は他のいかなるシャペロニンポリペプチドにも導入されうる。
【００５６】
もうひとつの実施形態として、ナノ粒子やクオンタムドットなどのナノスケール物質に結合するようデザインされたペプチドが用いられる。また他の実施形態では特定の表面にのみ結合するペプチドが用いられる。また、赤道部にあるN、C末端に欠失、置換、挿入を含む変異が施される場合、フィラメントに代表されるシャペロニン構造（環状構造）やナノ鋳型構造の形成を妨げることのないよう注意しなければならない。例えば、シャペロニンのN、C末端の５、１０、１５、２０、２５、３０個のアミノ酸までは除去しても問題がない。例えばGroELの場合、C末端のアミノ酸２７個を除去しても二重環構造の形成に問題はなかった。
【００５７】
シャペロニンにおける特定のアミノ酸残基の変異改変については総説Fenton et al., 1997, Protein Science 6, 743-760を参照されたい。
【００５８】
図2A-2Rのアミノ酸配列比較によると、S. shibataeで改変された領域は他の生物種にも存在することがわかる。ある生物種でうまくいった改変は他の生物種でも、細菌型、古細菌型、真核生物型のどれであろうがうまくいくことが多い。アミノ酸配列比較上で互いに相当する領域は、他の生物種で新たに改変を行おうとするときの目安になる。ある生物種のシャペロニンポリペプチドの変異が成功するか否かは、シャペロニンポリペプチドが変異後もナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置などの本発明中の高次構造を構築する能力を保持し続けられるかにかかっている。
【００５９】
一実施形態として、Sulfolobus shibataeのベータサブユニットはシャペロニン（環構造）および二次元結晶構造を構築する能力を失うことなく、化学的に活性な部位を遺伝子工学的に付加することに成功した。S. shibataeでは詳細な三次元構造は解明されていないが、類似したシャペロニンの三次元構造はすでに解析されている（Xu et al. And Diztel et al., supra）。S. shibataeのシャペロニンでは詳細な透過型電子顕微鏡による解析はすでになされており（Trent et al., 1997, Proc. Nat. Acad. Sci 94, 5383-5388）、類似シャペロニンの三次元構造とS. shibataeシャペロニンの電子顕微鏡解析より仮想三次元構造モデルがつくられ、遺伝子工学の手法を用いたタンパクの改変に用いられた（Peitsch, M.C., 1995, Bio/Technology 13, 658; Guex, N., Peitsch, M. C., 1997, Electrophoresis 18, 2714; Guex, N., Diemand, A., Peitsch, M.C., 1999, TiBS 24, 364）。
【００６０】
部位特異的変異法を用いて、少なくとも２つの異なるタイプに分類されるいくつかの変異ベータサブユニットがつくられ、多くの場合二次元結晶構造を作る能力は保持されていた（図7Bと7D）。
【００６１】
どちらのタイプの変異体を作成する場合でもまず野生型ベータサブユニットに１個存在するシステイン（化学的に活性で他のシステインと間違った結合を作りやすい）を変異体作成前にあらかじめアラニンのような化学的に不活性な残基に改変しておくと、変異サブユニットに起こりうる折りたたみのまちがいや環状構造構築の失敗などを防ぐことができる。そののち新たなシステインをもっと別の、溶媒中に露出している場所に改めて導入しておく。そうすれば、各サブユニットのシステインを（以下に詳しく述べるように）金や亜鉛のような柔らかい金属との特異的結合に使うことができる。第一のタイプの変異体ではシステインはベータサブユニットの頂上部の２８アミノ酸からなるループの先に導入された。そこはシャペロニン二重環構造が形成された際には中央の空間に向かって突出する場所である。このような変異を導入されたシャペロニンでは二重環構造の上部と下部に、半径約３ナノメートルの環状に並んだ９個の活性チオール基を有することになる(図7A)。第二のタイプの変異体では、突出した２８アミノ酸よりなるループを除去してシステインに置き換えた。この変異によって得られたシャペロニンは、半径約９ナノメートルの環状に並んだ９個の活性なチオール基と大きく開いた中央孔を有することになる(図7D、7E)。
【００６２】
S. shibatae由来シャペロニンベータサブユニットの頂上部は、アミノ酸置換や欠失を施しても環状構造や二次元結晶構造の構築になんら支障をきたさないほど柔軟性に富んでいることが確かめられている。還元条件下で、上述した２つのタイプのどちらの変異シャペロニンも直径２０マイクロメートルに及ぶ円盤状の六方充填二次元結晶を構築し(図7Bと7D)、その結晶格子は透過型電子顕微鏡による高速フーリエ変換法により確認された(図7D囲み中)。
【００６３】
グループIおよびグループIIシャペロニンポリペプチドのアミノ酸配列情報を使えば、シャペロニンポリペプチドの頂上部、中間部、赤道部のうちの１つまたは複数の領域に、いかなる数の変異も導入することができる。図2Aから2Rのアミノ酸配列比較で示されたように、S. shibataeで改変された領域に相当する領域は他の生物種のシャペロニンにも存在する。ある生物種で可能な変異は他の生物種でも可能である。したがって、種々の特異的結合部位をシャペロニン中の種々の領域に導入した変異体が本発明中のナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置の作成に使用されうる。
【００６４】
シャペロニンの作成
シャペロニンポリペプチドサブユニットは本発明のナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイ、ナノ装置などの装置や構造体の作成に用いられる。シャペロニン遺伝子の供給源は例えば（以下の例のみには限らないが）GroEL/ESなどの細菌型、TF55,TF56,アルファ，ベータ，ガンマ，cpn60などの古細菌型、Hsp60,Hsp10,TCP1,cpn60などの真核生物型、あるいは他の生物種のシャペロニン類似遺伝子などである（J. G. Wall and A. Pluckthun, Current Biology, 6:507-516 (1995); Hartl, Nature, 381:571-580 (1996)）。それに加えていかなる生物種のゲノムおよびcDNA遺伝子ライブラリーもシャペロニン遺伝子の供給源として使用されうる。
【００６５】
本発明で使用されるシャペロニンポリペプチド（野生型および変異型）をコードする遺伝子は発現ベクターと呼ばれるDNAに組み込まれる。発現ベクターは環状プラスミドで選択マーカー遺伝子（たいていの場合はベクターをとりこんだ細菌を選択するため抗生物質耐性遺伝子）、宿主大腸菌中でのプラスミド複製に必要とされるDNA配列、誘導可能なプロモーターと、リボソーム結合部位のすぐ下流に外来遺伝子導入のための多重クローニングサイトを含んでいる。市販されているベクターの例にはpETシステム（Novagen, Inc., Madison, WI）、スーパーリンカーベクターpSE280,pSE380（Invitrogen, San Diego, CA）などがある。
【００６６】
本発明中のシャペロニンの自動的構築は、今日ではよく知られた組み換えDNA技術と細菌中での遺伝子発現によって可能となる。まず対象となる遺伝子を構築し、ベクターの多重クローニングサイトにクローンする。他のポリペプチド配列が挿入されなければならないときは他の遺伝子も同じベクターに同時にクローンしなければならないこともしばしばある。例えば、以下に列挙されたポリペプチド配列の欠失を起こすのに、制限酵素による挿入サイトの切断とそれに続くベクターと挿入断片の結合（ライゲーション）が行われる。あるいは、制限酵素による切断の後エキソヌクレアーゼ（EXO-SIZE, New England Biolabs, Beverly, MA）反応により挿入DNA断片は一端もしくは両端から適当な種々の長さまで短縮され、ベクターと結合される。これにより同じ領域を含んだ種々の長さの挿入断片をもつプラスミドができる。同様に、異種のシャペロニン遺伝子から得られたDNA断片同士をつなげて新たな変異シャペロニン遺伝子を作成することもできる。一般に、このような方法はN、C末端を改変するのに用いられる。したがって、シャペロニンポリペプチドに基づいた新たな構造体をつくるため、新たな変異ポリペプチドやポリペプチドの組み合わせが作成される。
【００６７】
大腸菌は種々の外来タンパク（自身のタンパクも含めて）を製造する効率的で便利な工場として利用されている。遺伝的に組み換えられたプラスミドを取り込んだ大腸菌中で、クローンされた遺伝子が誘導発現される。ポリペプチドの発現に適した宿主大腸菌としてはBL21(DE3)、BL21(DE3/pLysS) (Novagen, Madison, WIにて市販)や、HMS174(DE3)、HMS174(DE3/pLysS)などのrecA欠失株などがある。組み替えプラスミドの大腸菌への取り込みは標準的な方法で行う（Sambrook, J., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY。この参考文献には本発明で用いられる組み換えDNAの標準的な手法の詳細も記載されている）。プラスミドを取り込んだ大腸菌はアンピシリンやカナマイシンなどの抗生物質耐性に基づいて選択される。クローンされたシャペロニンポリペプチド遺伝子の発現は使用されるプロモーターによって異なる。望ましいプロモーターのひとつとしてplacがあげられる。このプロモーターはIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）を加えることによって制御され、同じベクター上に存在するlaciq遺伝子により、非誘導時にノイズとして起こりうる低レベルの発現がほぼ完全に抑えられるようデザインされている。もうひとつのプロモーターとしてはpT7N10がある。このプロモーターはT7RNAポリメラーゼに特異的に認識され、大腸菌のRNAポリメラーゼによっては認識されない。このT7RNAポリメラーゼはリファンピシン耐性を持ち、宿主大腸菌BL21の染色体上の不活性な溶原性ラムダファージDE配列中にコードされている。宿主大腸菌BL21(DE3)中のT7ポリメラーゼの発現ふだんはlaciq遺伝子により抑制されており、IPTG存在下でのみ発現し、その特異プロモーターpT7N10下流に組み込まれた目的遺伝子の読み取り／発現を開始する。
【００６８】
目的遺伝子を持つプラスミドを持った宿主菌は誘導化学物質（IPTG）の存在下で一定時間培養される。その誘導培養時間はあらかじめ目的タンパクの生産量をモニターすることで決定しておく。この例では、細菌の抽出液中の全タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、シャペロニンポリペプチドを検出する。目的タンパクの発現に十分な時間宿主大腸菌が培養されたのち、タンパクは分離／精製される。
【００６９】
シャペロニンポリペプチドを大腸菌中で発現させると、大量にシャペロニンを得られるだけでなく、場合によっては異種のタンパク同士を同一細胞内で組み合わせることも可能である。組み替えタンパク生産の規模拡大方法は今日では比較的簡単で広く知られており、野生型もしくは変異型シャペロニンポリペプチドを細菌培養液から回収するには多くの標準的なプロトコルが適用可能である。
【００７０】
シャペロニンサブユニットの精製には標準的な方法が用いられる。精製手順は以下の１）から３）の単独あるいは組み合わせからなる。１）分子ふるい、イオン交換、疎水性樹脂を用いたクロマトグラフィ、２）分離用超遠心、３）アフィニティクロマトグラフィ。
【００７１】
一実施形態として、シャペロニンポリペプチドは好熱性細菌由来なので熱安定性に優れており、大腸菌細胞抽出液を加熱処理することでシャペロニンの精製が簡単にできる。たとえば、大腸菌中で発現させたSulfolobus shibataeのベータサブユニットの精製には、細胞抽出液を３０分間８５℃で加熱する工程が含まれる。この加熱処理により大部分の大腸菌タンパク質は沈殿し、熱安定なベータサブユニットは上清に残る。したがって、細胞抽出液の加熱と遠心分離によりベータサブユニットは大部分の大腸菌タンパク質から分離され、その後のイオン交換クロマトグラフィによる精製が容易になる（Kagawa, H. K. et al., 1995, The 60 kDa heat shock proteins in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus shibatae. J Mol Biol 253, 712-25）。
【００７２】
一実施形態として、いくつかの異なるタイプのシャペロニンポリペプチドをひとつの細菌細胞中で同時に発現させることが可能である。野生型および遺伝子工学的に改変されたサブユニットポリペプチドによるシャペロニン環状構造やさらに高次な構造はインビボ（細胞内）で組み立てられた後上述した方法で精製することができる。高次構造の一例はナノ鋳型である。
【００７３】
本発明中のシャペロニンの二重環構造（および、後述するように、ナノ鋳型）は、精製されたサブユニットをインビトロ（試験管内、細胞外）でMg2+とATP、ADP、AMP-PNP、GTP またはATPγSと混合することによって作成される。別の実施形態では、精製されたシャペロニンはインビトロでMg2+とATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSと混合することによってナノ鋳型を構築する。しかしまた別の実施形態では、精製されたサブユニットと精製されたシャペロニンがインビトロでMg2+とATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSと混合することによってナノ鋳型を構築する。高次構造構築の際の温度やpHはシャペロニンポリペプチドまたはシャペロニンの種類や熱安定性によって異なる。例えば、熱安定なS. shibataeのシャペロニンのベータサブユニットでは７５℃から８５℃あるが、他の種類のポリペプチドではもっと低い温度（４０℃以下）が適用されうる。各シャペロニンポリペプチドやナノ鋳型で、環構造や高次構造の構築に最適な条件（Mg2+に対するATP、ADP、AMP-PNP、GTP あるいはATPγSの濃度や比率など）を日常的な実験で容易に決定することができる。それは条件を一つ一つ変えていき、目的の構造物の生成を確認することで行う。シャペロニンまたはナノ鋳型の生成においてはMg2+、ATP、ADP、AMP-PNP、GTP、ATPγSのいずれの化合物も1mMから10 mM、20 mM、30 mMもしくはそれ以上の濃度で反応溶液中に存在しうる。例えばYoai et al., 1998, Archives of Biochemistry and Biophysics 356, 55-62によればフィラメント構造は25 mM MgCl2と1 mM ATPを含む5mM Hepes バッファー(総量 300 μl)中で形成が確認され、S. shibataeのアルファ、ベータサブユニットから成るシャペロニンあるいはナノ鋳型はK+がなくても形成されたが、他の生物種由来のサブユニットから高次構造を生成するにはK+が必要かもしれない。  
しかしもうひとつの実施形態では、シャペロニンあるいはナノ鋳型はMg2+、ATP、ADP、AMP-PNP、GTP、ATPγSのいずれの化合物も必要としない。シャペロニンが十分に高い濃度で存在する場合（２−５mg/mlもしくは３０mg/mlまで、もしくはそれ以上）、ナノ鋳型のようないくつかの高次構造は自動的に形成されうる（Quaite-Randall et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 28818-28823）。種々の実施形態におけるシャペロニンあるいはシャペロニンポリペプチドの濃度は0.1 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、30 mg/ml、50 mg/mlまたはそれ以上である。
【００７４】
あるいは、シャペロニンポリペプチドをふくむ１種または数種の細菌細胞粗抽出液をタンパク精製の前に混合し、高次構造の形成を行うこともありうる。
【００７５】
ひとつの実施形態では、グループIとグループIIの両方のシャペロニンまたはシャペロニンポリペプチドサブユニットはインビボあるいはインビトロのいずれにおいても混合され高次構造の構築に使用される。
【００７６】
もうひとつの実施形態では、発現されたシャペロニンポリペプチドとそれから生成されたシャペロニンはシャペロニン以外のタンパクを含まない。
【００７７】
ここに述べたシャペロニンの生成法と生成条件は本発明中のナノ鋳型、ナノ構造、ナノ装置、ナノアレイなどの生成に適用されうる。なぜならシャペロニンおよびシャペロニンポリペプチドはそのような条件下で自動的に高次構造を形成するからである。
【００７８】
ナノ鋳型
本発明はシャペロニンサブユニットを使ってナノ鋳型を作成する方法を提供する。ひとつのナノ鋳型は１つまたは数個のシャペロニンからなり、ここで少なくともひとつのシャペロニンは少なくともひとつの変異ポリペプチドからなる変異シャペロニンである。ナノ鋳型はいかなる数のいかなる変異型対野生型比のシャペロニンからも生成される。一実施形態（この例に限らないが）では、ナノ鋳型は変異型シャペロニンのみより成る。ナノ鋳型を形成するシャペロニンはグループIまたはグループIIシャペロニン、もしくはその組み合わせのいずれもありうる。また別の実施形態では、ナノ鋳型は真核生物のTCP1、TF55、TF56、GroELなどのシャペロニンからなる。望ましい実施形態では、ナノ鋳型はHSP60やその類似種よりなる。ナノ鋳型作成のためにどのシャペロニンを選ぶかはナノ鋳型に求められる条件による。特定の実施形態では、もしナノ鋳型が高温で操作される予定であれば、１個または数個のシャペロニンは極限環境微生物由来のものを使う。その１個または数個のシャペロニンは１環状構造あたり７、８、または９個のサブユニットすなわち７、８、または９回対称のシャペロニンである。そのシャペロニンは異なる種類のサブユニット例えばアルファ、べータ、ガンマまたはそれらの組み合わせからできる。
【００７９】
一実施形態では、本発明のナノ鋳型はシャペロニンサブユニットもしくはインビトロでMg2+とATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγS存在下で形成されたシャペロニンから生成される。一実施形態では、シャペロニンの生成にはK+が必要とされることもありうる。別の実施形態では、ナノ鋳型は自動的に形成され、シャペロニンサブユニットもしくはシャペロニンにインビトロでK+、Mg2+、ATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSを加えることなしに形成される。十分高い濃度でシャペロニンは（２−５mg/mlまたは３０mg/mlまで、もしくはそれ以上）ナノ鋳型のようないくつかの高次構造を自動的に形成する（Quaite-Randall et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 28818-28823）。そのナノ鋳型は0.1 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/ml、20 mg/mlまたはそれ以上の濃度のシャペロニンもしくはシャペロニンポリペプチドから生成されうる。
【００８０】
フィラメントやある種のナノ鋳型の長さはATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSのどれが使用されるかによって調節可能である。ATPを使用すると大きな網目状のフィラメントができ、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSを使うと短いフィラメントができる。例えば、S. shibatae由来の変異型または変異型と野生型のTF55アルファとベータサブユニットからできるナノ鋳型では、シャペロニン環状構造は約0.1mg/mlの濃度でも形成されるが、フィラメントは約0.5mg/mlの濃度で形成される。より長いよくそろったフィラメントは約1.0mg/mlの濃度で形成される。平均長が異なるフィラメントや二次元アレイなどの構造を形成するのに適用される条件の例についてはYaoi et al., 1998, Archives of Biochemistry and Biophysics 356, 55-62, and Trent et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci 94, 5383-5388を参照。したがって、日常的に得られる特定の構造が一定のタンパク濃度を必要とする場合、フィラメントの長さは、形成条件を選ぶことやその他の操作によって制御されうる。
【００８１】
種々の形成条件や方向付けられた結合または各シャペロニンの配向によりナノ鋳型は別の構造的対称性を有することが可能である。したがって、ナノ鋳型は１、２、３、４、５、６、７回対称の構造的対称性を持つことが可能である。本発明中のシャペロニンは、たとえばMg2+やヌクレオチド存在下でナノフィラメント（一次元の構造的対称性を持つナノ鋳型）を作るのに使用されうる。これらのナノフィラメントはミクロン長、ミクロン厚のフィラメント集合体を形成することができる。
【００８２】
図５の電子顕微鏡写真で、二重環構造中の個々のHSP60は黒い「小球体」（A鳥瞰図）または黒白交互の縞模様（B側面図）として観察される。これらの二重環構造は自動的に鎖状構造もしくは管構造（C）を形成し、この管構造がフィラメントとして集合する（D）。図６はHSP60環状構造が油脂被膜された金属グリッド上で形成した二次元結晶（A）と敷き詰められた環状構造（背景にみえる斑点）の上にのったフィラメント集合体（B）である。一般に、ATPとMg2+の比がシャペロニンとナノ鋳型の構造（フィラメントかアレイか）を決める。ナノ鋳型は以下に詳しく述べるが、自動的な集合により、長い領域にわたる二次元もしくは三次元の三方もしくは六方充填型の規則的構造を形成しうる（図６）。
【００８３】
マスキング法や方向付けられた結合法によってシャペロニンが基盤に結合する際の構造的対称性を制御することが可能である（Whaley et al., 2000, Nature 405, 665-668,この論文にはガリウム砒素、シリコン、またはインジウム燐表面に特異的に結合するペプチドが記載されている）。種々のガリウム砒素またはインジウム燐に結合するアミノ酸配列の例（これらに限らないが）として以下のものが挙げられる（Whaley et al., 2000, Nature 405, 665-668,）：
VTSPDSTTGAMA (配列番号16)
AASPTQSMSQAP (配列番号17)
AQNPSDNNTHTH (配列番号18)
ASSSRSHFGQTD (配列番号19)
WAHAPQLASSST (配列番号20)
ARYDLSIPSSES (配列番号21)
TPPRPIQYNHTS (配列番号22)
SSLQLPENSFPH (配列番号23)
GTLANQQIFLSS (配列番号24)
HGNPLPMTPFPG (配列番号25)
RLELAIPLQGSG (配列番号26)
Whaleyらはさらに、シリコンには結合するが二酸化シリコンには結合しないアミノ酸配列も報告している。ZnS(102)に結合するアミノ酸配列の例として以下のものが挙げられる(Lee et al., 2002, Science 296, 892-895）：
CNNPMHQNC (配列番号27)
銀に結合するアミノ酸配列の例として以下のものが挙げられる（Naik et al., 2002, Nature Materials 1, 169-172）：
AYSSGAPPMPPF (配列番号28)
NPSSLFYRLPSD (配列番号29)
SLATQPPRTPPV (配列番号30)
金に結合するアミノ酸配列の例として以下のものが挙げられる（Brown et al., 2000, J. Mol. Biol. 299, 725-735; Brown, S, 1997, Nature Biotechnol. 15, 269-272）：
MHGKTQATSGTIQS (配列番号31)
ALVPTAHRLDGNMH (配列番号32)
他のナノ鋳型としては、長方形、五角形、六角形、もしくは七角形の構造的配置をもつナノ環などの短い領域での規則構造もある。
【００８４】
特定の実施形態としてナノ鋳型は、「スペーサー」として使われる１つもしくは数個の野生型または変異型シャペロニンを含む。そのスペーサーシャペロニンはナノ鋳型上の一定の領域のみに存在し、ポリペプチドやナノスケール物質やリンカー分子に対する特異的結合部位を持たない。したがってスペーサーは半導体作成時のマスクと似た働きをする。
【００８５】
目的サブユニットにいくつかの異なる変異を導入すると、シャペロニンがナノ鋳型を形成する際次元の異なる構造を作ることが可能である。例えば、S. shibataeのベータサブユニットの２８アミノ酸から成る頂上部のループを除去した場合、シャペロニンの中央孔の内径は2.5ナノメートルから9ナノメートルに広がった（図７B-D）。これはナノ粒子やクオンタムドットなどのナノスケール物質を結合させるための中央孔の直径が異なるシャペロニンを混合したナノ鋳型をつくるのに利用できる。
【００８６】
生成されるシャペロニンおよびナノ鋳型は、もととなるサブユニットのタイプとその組み合わせによって異なる。たとえば、S. shibataeのアルファおよびベータサブユニットはインビトロでそれぞれ単独でロゼッタソームを形成するが、アルファ、ベータおよびガンマの混合物は異種サブユニット混合ロゼッタソームを形成する。さらにS. shibataeではベータのみからなるロゼッタソームもほかのすべての異種サブユニット混合ロゼッタソームもフィラメントを形成する。図１５はS. shibataeTF55のアルファサブユニット（配列番号39）、ベータサブユニット（配列番号1）と、ガンマサブユニット（配列番号 38）のタンパク質アミノ酸配列を示したものである。インビボではロゼッタソームは異種サブユニット混合型で、平均的なサブユニット比は７５℃の培養では1α: 1β: 0.1γ、６０℃の培養では1α:3β:1γ、８６℃の熱ショックを与えると2α:3β:0γのように変化する。さらに、ガンマを含むものはアルファおよびベータのみを含むものに比べて比較的不安定である。S. shibataeのアルファ、ベータ、ガンマのアミノ酸配列の比較（図参照）はシャペロニンポリペプチドに変異を導入するのに有用な情報を提供する。図１６Aと１６BにはS. shibatae TF55のガンマサブユニットのDNAとアミノ酸の配列を示す。
【００８７】
ある生物から単離されたシャペロニンポリペプチドサブユニットは種々のタイプのナノ鋳型や高次構造を作りうる（Kagawa et al., Mol Microbiol. 2003 48(1):143-56）。S. shibatae TF55のアルファサブユニット（配列番号 39）は単独で単一サブユニットからなる９回対称のロゼッタソームとロゼッタソームのアレイを作る。S. shibatae TF55のベータサブユニット（配列番号１）はロゼッタソームのフィラメントとフィラメント集合体を作る。S. shibatae TF55のガンマサブユニット（配列番号３８）はロゼッタソームは作らないが不定形の凝集体と不規則な大きさの丸い物体を作る。それらは透過型電子顕微鏡で観察された（図６C）。ある生物種由来の異なるサブユニットを種々の比で混合すると種々の異なる高次構造ができる（Kagawa et al., Mol Microbiol. 2003 48(1):143-56）。S. shibatae TF55のアルファ、ベータ、ガンマサブユニットを１：１：１で混合すると異種サブユニット混合ロゼッタソームと、ベータサブユニットのみからできたロゼッタソームに比べて集合度の低いフィラメントができる。アルファとベータの１：１混合物では、アルファ、ベータ、ガンマ１：１：１混合物が作るのと変わらないフィラメントができる。
【００８８】
一実施形態では、ナノ鋳型やナノ構造などの高次構造は少なくとも１つのS. shibatae TF55ガンマサブユニットを含む。この実施形態では変異型もしくは野生型のシャペロニンポリペプチドを含む。特定の実施形態ではその高次構造は少なくとも１つのS. shibatae TF55ガンマサブユニットと野生型シャペロニンポリペプチドを含む。
【００８９】
別の実施形態では、ナノ鋳型は被膜もしくはナノ織物を生成する。シャペロニンはその中央孔の大きさに比べるとずっと大きいスケールの規則構造を自動的に形成することができるので、被膜やナノ織物の構築に応用できる。さらに、できあがった被膜やナノ織物は、光学的、電子的、磁気的、触媒的、もしくは酵素的な部品を機能単位として含むことが可能である。それらは、シャペロニンの頂上部すなわちナノ鋳型の中央孔付近あるいはシャペロニンのほかの結合部位またはシャペロニン間に、種々のナノスケール物質を配置することで得られる。ナノ鋳型にナノスケール物質を導入することについてはさらにナノ構造の項で述べる。
【００９０】
サブユニット比の変化はシャペロニン中央孔の体積と反応性に影響するのでナノ鋳型の種々の応用に利用できる。特定の理論や分子機構に限るわけではないが、シャペロニンサブユニットのN、C末端は中央孔内に突出し中央孔をふさいでいる。それらの末端はサブユニット間で異なっているので（たとえばS. shibataeのロゼッタソーム）、サブユニット比が異なると中央孔に変化を与えることができる。シャペロニン中央孔の体積と結合特性の変化はシャペロニンサブユニットの比を変えることで制御可能であり、それは複数種のナノスケール物質の結合部位を有するナノ構造を作成するのに役立つ。ある実施形態ではN、C末端は短縮された。
【００９１】
シャペロニンポリペプチドたとえばHSP60から環、管、フィラメント、シート（二次元結晶）などの構造を作る過程は化学的に制御可能である。それらの構造の組み立てはたとえば、ATP/Mg2+の比や濃度を変えることによって操作されうる。HSP60の環、管、フィラメントはもし気体や化学物質、医学、薬学上重要な試薬などを吸収、保持、保護あるいは放出することができればナノ管として機能する。ナノスケールではフィラメント構造（HSP60構造が望ましい）は中空で、フィラメント内に拡散もしくは結合した化学物質は目的の位置でフィラメントに結合またはフィラメントから放出されうる。
【００９２】
環、管、フィラメントなどの構造は基盤表面で規則的な構造を形成しうる。制御された条件下でシャペロニンは基盤表面上で二次元結晶を、基盤表面上で方向付けられうるフィラメント集合体を形成する。別の実施形態では、ナノ鋳型は多重ナノウェルアッセイプレートもしくはハイブリダイゼーションによるDNA検出の単分子プローブとして機能する。
【００９３】
互いにからみあったシャペロニンフィラメントはナノ織物をつくりうる。そのような織物は油脂層の上に生成されたり、物質表面を被膜するのにも使われる。これは医療用の移植に応用されうる。たとえば、移植受容者のHSP60で移植される物質を被膜し、移植時の免疫反応を抑制する。
【００９４】
HSP60の核酸結合能を利用して、HSP60からなるシャペロニンの織物または二次元結晶からDNAまたはRNAのナノアレイを作ることが可能である。そのようなアレイは今までに例を見ないほど高い密度でDNAプローブを呈示できるので、面積あたりの情報密度を飛躍的に上げることができる。HSP60と関連したほかの分子に基づくほかのプローブも開発可能である。
【００９５】
ナノ管の内容物やナノ線の連続性を調べたり、鋳型実験の生成物やナノ織物の性質を調べたりするのには電子顕微鏡や電子プローブ法（EDAX）が用いられる。原子間力顕微鏡（AFM）もそれらのナノ鋳型の特性を視覚化したり分析するのに用いられる。DNAナノアレイはハイブリダイゼーション法によって試験される。
【００９６】
ナノ構造
本発明はナノ構造の作成法を提供する。他の多くの分子が複雑な集合体を形成するのに制御が必要なのに対し、シャペロニンは自動的に集合体を形成する点が有利である。目的とする構造的配置にしたがい、自動的集合や方向付けられた結合などの選択的配置過程を経てナノ構造は生成される。ナノ構造生成の工程にはまず以下のものから成る１つまたは数個のナノ単位を加える過程がある。（１）少なくともひとつのナノ鋳型（２）少なくとも１つの野生型シャペロニン、または（３）（１）と（２）の混合物を基盤表面に加える。そして次に以下のものから成る１つまたは数個のナノ単位を加える過程がある。（１）少なくとも１つのナノ粒子（２）少なくとも１つのクオンタムドット、または（３）（１）と（２）の組み合わせを目的表面に加える。目的とする構造を維持するため、結合しなかったナノ単位は除去される。各工程はナノ構造の作成に必要とされるだけ何回も繰り返される。集合体作成の最適条件（たとえばMg2+とATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSの比や濃度）は日常の実験（条件を変えて生成物をモニターする）で容易に決定される。別の実施形態では、ナノ構造はMg2+、ATP、ADP、AMP-PNP、GTP、ATPγSのいずれも存在しない条件下でつくられる。しかし別の実施形態ではK+の存在下でつくられる。
【００９７】
タンパクを用いて構造の集合を制御することで出来上がったナノ構造は、ある実施形態では、金属、半導体、磁気ナノ粒子などの有機物質や無機物質をその一部として取り込む可能性がある（Bruchez et al., 1998, Science 281, 2013-16; Peng et al., 2000, Nature 404(6773), 59-61; Whaley et al., 2000, Nature 405: 665-68）。
【００９８】
ナノ構造の生成において、ナノスケール物質はシャペロニンポリペプチドもしくはシャペロニンと適当な条件下（たとえばMg2+とATP、ADP、AMP-PNP、GTPまたはATPγSの比や濃度）で組み合わされる。そのナノスケール物質（ナノ粒子やクオンタムドット）はナノ構造形成以前に前もってシャペロニンあるいはポリペプチドサブユニットの特異的結合部位に付加される。そのナノスケール物質はナノ鋳型形成前に導入される。すなわちサブユニットやシャペロニンがナノ構造をとる前に、直接サブユニットと結合する。別の実施形態では、ナノスケール物質はナノ鋳型が形成された後に特異的結合部位に付加される。そのような実施形態では、まずナノ構造をどこに選択的に結合させるかがあらかじめ決めてあるナノ鋳型を作り、それからナノ構造を導入する。
【００９９】
別の実施形態では、ナノ粒子はナノ鋳型上のあらかじめ決められた特定の場所にのみ結合できるように被膜される。図１０Aは、金属表面に結合可能なチオール反応性のマレイミド基を結合させた金粒子（モノマレイミド・ナノ金、Nanoprobes, Inc）を示している。このナノ金・クオンタムドットはS. shibataeの変異ベータサブユニットのシステインと共有結合を介して結合した。
【０１００】
別の実施形態ではナノスケール物質は高分子、タンパク、ペプチド、ホルモン、抗体、核酸、受容体、反応性化学基、結合試薬などの無機物もしくは有機物で被膜される。たとえば、ナノスケール物質は化学的に反応性の高いアミン基をもつポリエチレングリコール類の化合物で被膜されうる。
【０１０１】
しかし別の実施形態では、ナノスケール物質はビオチンやストレプトアビジンで被膜される。特定な実施形態では、ナノスケール物質は牛血清アルブミン（BSA）やビオチンで被膜され、ストレプトアビジンはナノ鋳型上の１つまたは数個の結合部位に置かれる。別の例では、ナノスケール物質はアミノ酸や短いペプチドで被膜されたり、高分子や他のタイプの分子で化学修飾される。
【０１０２】
ナノスケール物質の例は（これらに限らないが）、金、銀や他の金属ナノ粒子などのナノ粒子、CdSe-ZnS、CdS、ZnS、CdSe、InP、InGaAs、CuClなどの合金ナノ粒子すなわちクオンタムドット、そのクオンタムドットとしてはシリコンナノ結晶、ナノピラミッド、銀ナノ粒子、磁気クオンタムドットとしてはCoCu、FeCu、NiFe/Ag、CoAgなどのナノ磁石があげられる。ナノスケール物質は以下にあげる物質のうち１つまたは数個の物質または物質の組み合わせからなる。たとえば金、銀、亜鉛、カドミウム、白金、パラジウム、コバルト、水銀、ニッケルなどの遷移金属、ナトリウム、カリウム、カルシウム、セシウムなどのアルカリまたはアルカリ土類金属、アルミニウム、ガリウムまたはインジウムなどのIII類元素、シリコン、ゲルマニウム、すず、鉛などのIV類元素、リン、砒素、アンチモンまたはビスマスなどのV類元素、イオウ、セレン、テルルなどのVI類元素である。ここに挙げられた物質はいかようにも組み合わせられる。III―V類元素の組み合わせ例としては、GaAs やAlGaAsがある。ナノスケール物質としてはa fullerene、炭素ナノ管、誘電ナノ粒子、高分子ナノ粒子、半導体ナノ粒子などもある。別の実施形態として、柔軟性にとんだタンパクを硬い炭素ナノ管同士をつなげるちょうつがいとして利用し、両ナノ構造の特性を失わずに構造の多様性を広げることができる。
【０１０３】
ナノスケール物質の大きさは約0.5、1、10、50、100、200、500ナノメートルまたはそれ以上である。ナノ粒子の大きさはナノ鋳型上の結合部位の位置による。もし結合部位がシャペロニンの頂上部または中央孔内部である場合、ナノスケール物質の大きさは結合する中央孔の直径に応じて決められる。図７Cと7Eはナノスケール物質がS. shibataeのベータサブユニットの変種からできたシャペロニンの頂上部に結合したところを示している。図７Cは３ナノメートルの孔をもつ二次元結晶（ｐ３１２）に５ナノメートルの金粒子が結合したところを示している。図７Eは９ナノメートルの孔をもつ二次元結晶（ｐ３１２）に１０ナノメートルの金粒子が結合したところを示している。ナノスケール物質はナノ鋳型の隙間の領域（シャペロニンとシャペロニンの間）にも導入可能である。ナノスケール物質がシャペロニン間隙に導入される場合には、２つ以上のシャペロニンに同時に結合可能である。別の実施形態ではナノスケール物質はナノ鋳型の上に遮蔽物のように結合する。その場合ナノスケール物質は５００ナノメートルの大きさまで可能になる。
【０１０４】
ナノ粒子の形状にはナノ柱、ナノ結晶、ナノ棒、ナノ管、ナノ線、ナノフィラメント、ナノ繊維や合金／誘電体から成るナノ殻などの例が挙げられる。
【０１０５】
特定の実施形態では電場をかけることによってナノ構造を破壊する。
【０１０６】
別の実施形態ではATP、ADP、AMP-PNP、GTPやATPγSの量や比を変えることでナノ構造またはナノ鋳型を破壊し、またはナノスケール物質をナノ構造またはナノ鋳型から放出させることができる。
【０１０７】
一実施形態では、ある長さのアミノ酸配列を、シャペロニンポリペプチドまたはHSP60の環状構造や管構造の形成に邪魔にならない部位に付加し、ナノスケール物質がシャペロニン内部の頂上部、赤道部、中間部またはその他の部分に結合できるようにする。
【０１０８】
HSP60を含む変異型シャペロニンポリペプチドは、ナノメートルもしくはミクロンスケールの管、フィラメント、金属、ドープされたまたはドープされていない半導体、を含んだアレイを生成することが可能である。あるいはナノ線として電界効果トランジスター、スイッチ、ダイオードや論理装置にも利用されうる。シャペロニンポリペプチドに金属を結合することができるのでシャペロニンの集合でできた管はタンパクで被膜された金属のコンジットすなわち線を作ることができる。そのような線を方向付けたり配線することでナノ回路の作成も潜在的に可能となる。それはコンピューター産業に有用であろう。
【０１０９】
ナノ構造は光学的、電子的、磁気的、触媒的、酵素的部品の一部に機能単位として用いられうる。
【０１１０】
ナノアレイ
ナノアレイはナノ鋳型またはナノ構造がナノスケールもしくはマイクロスケールで秩序だって配列されたものである。したがってナノアレイはナノ構造の秩序だったアレイを含む。ナノアレイは、２、３、４または６回対称などのいかなるタイプの長い範囲にわたる充填構造をも有しうる。ナノアレイは一次元、二次元、三次元のいずれの構造もとりうる。一実施形態では、ナノ粒子が誘電体であった場合、三次元ナノアレイは光量子バンドギャップ結晶となりうる。ナノアレイの集合と結晶化の最適条件（たとえばMg2+とATP、ADP、AMP-PNP、GTP またはATPγSの比や濃度）は各条件を変えていって目的産物の生成をモニターする日常的な実験を行うことで決定される。
【０１１１】
S. shibataeの２つのタイプの変異ベータサブユニットで、野生型では１箇所しか存在しないシステイン残基が反応性に乏しいアラニンに置換された。これは反応性に富むシステインが、変異型サブユニットに導入された新たなシステインと不都合な結合を起こし間違ったフォールディングや集合を起こすのを防ぐためである。そして新たなシステインは溶媒中に露出する部位に導入された。このシステイン中のチオール基が金や亜鉛などのやわらかい金属への結合部位となる。１つのタイプの変異ベータサブユニットでは、新たなシステインは頂上部の２８アミノ酸からなるループの先に導入され、シャペロニンを形成した場合中央孔内に突出する。図７A-Eは細工されたHSP60が集合して望ましい実施形態であるナノ粒子アレイ鋳型を形成したところを示している。この変異シャペロニンは環状構造の上下に直径約３ナノメートルの環状に並んだ反応性チオール基を持つ(図７A左)。もうひとつのタイプの変異ベータサブユニットでは、２８アミノ酸のループは除去され、ループの代わりにシステインが導入された。この変異シャペロニンは直径約９ナノメートルの環状に並んだ反応性チオール基を持ち、中央孔の入り口は大きく開いている(図７A右)。図７A(左上)は頂上部のループ先端にシステインを導入されたHSP60変異ベータサブユニットのモデルを示し、システインの導入部位が矢印で示してある。側面図はどちらのタイプの変異シャペロニンでもほぼ同じで、変異ベータサブユニットがつくる９回対称環状構造が２つ積み重なったものである(図７A中央)。一方図７A（左下）は９個のシステインが直径３ナノメートルの環状に並んだ変異ベータシャペロニンの鳥瞰図を示している。
【０１１２】
図７Bは頂上部のループがシステインに置換された変異ベータシャペロニンの二次元結晶をネガティブ染色した透過型電子顕微鏡像である。S. shibataeのベータシャペロニンの二次元結晶は電子顕微鏡像より二面性の平面ｐ３１２に属する結晶格子をもつことがわかった（Koeck et al., Biochim. Biophys. Acta 1429, 40-44）。図７A(右上)はベータサブユニットの頂上部の２８アミノ酸からなるループを除去し、切れたループの根元をシステインを通じてつなぐ操作を遺伝子組み換え技術を用いて行った結果を示している。ループのアミノ酸配列のどこからどこまでを除去するかは図７A（左上）のモデルに基づいて決定し、矢印の位置でループを切断した。図７A(右下)はシステインが直径９ナノメートルの環状に並んだ変異ベータシャペロニンの鳥瞰図を示している。図７Dは９ナノメートルの中央孔を持つベータシャペロニンの二次元結晶で、あきらかに中央孔の大きさが増しているのがネガティブ染色の電子密度からわかる。どちらの写真も同じコンデンサー焦点距離設定で撮影された。結晶の配列は電顕像の高速フーリエ変換によって示された。図７Cは３ナノメートルの中央孔をもつベータシャペロニンの二次元結晶（ｐ３１２）で、直径５ナノメートルの金粒子が中央孔に結合したところを図解したものである。図７Eは９ナノメートルの中央孔を持つベータシャペロニンの二次元結晶（ｐ３１２）で、直径１０ナノメートルの金粒子が中央孔に結合したところを図解したものである。
【０１１３】
S. shibataeのベータサブユニットの頂上部は柔軟性に富んでおり、アミノ酸置換や欠失を導入してもシャペロニンや二次元結晶の形成能に影響がないことがわかっている。還元条件下で、どちらのタイプの変異ベータサブユニットも直径２０ミクロンにも及ぶ円盤型の六方充填型二次元結晶を形成した(図７B,D)。その結晶格子の配列は電顕像の高速フーリエ変換（周期性を示す光学回折像を生じた）によって示された(図７D囲み中)。
【０１１４】
チオール基を持つシャペロニンの二次元結晶がクオンタムドットのようなナノ粒子と結合しそれをアレイ状に整列させることができるかどうかを確かめるため、市販されている種々の直径の金ナノ粒子（Ted Pella, Inc, Redding, CA）を使用してみた(図８)。図８は細工されたシャペロニンとシャペロニン鋳型に金クオンタムドットが結合したところを示している。金クオンタムドットは水溶液中に均一に拡散して存在するので水和したシャペロニン鋳型に結合させることができる。システインのチオール基への得意的結合を高めるためナノ粒子はBSPP（bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphine (BSPP) (Loweth, C. J., Caldwell, W. B., Peng, X., Alivisatos, A. P. & Schultz, P. G. (1999) DNA-based assembly of gold nanocrystals. Angew. Chem. Int. Ed. 38, 1808-1812)で被膜しておくことができる。BSPPは金クオンタムドット生成中に生じたクエン酸の殻に取って換わる（Novak, J. P., Nickerson, C., Franzen, S. & Feldheim, D. L. (2001)）。金属ナノ粒子が分子的に架橋されたアレイを遠心分離や分子ふるいクロマトグラフィで精製すると（Anal. Chem. 73, 5758-5761）クオンタムドットのタンパク鋳型への非特異的な結合を減らすことができる。被膜された金クオンタムドットはフォームヴァー被膜された電顕用グリッド (実施例６参照) 上のシャペロニン鋳型と反応し、透過型電子顕微鏡で60kVで観察された。低倍率ではシャペロニンの二次元結晶は金クオンタムドットそのものの電子密度のみで(ネガティブ染色なしに)視覚化された。図８Aは９ナノメートルの中央孔を持つベータシャペロニンの二次元結晶に直径１０ナノメートルの金粒子が結合したところをタンパク染色なしで低倍率で観察したものである。タンパク鋳型の結晶格子上に結合した金クオンタムドットのコントラストのみによって構造が視覚化された。乾燥によるひび割れでアレイ内の規則構造に乱れと分離が生じることがある。図８Bは５ナノメートル金クオンタムドットが３ナノメートル孔変異シャペロニンの頂上部にとらえられているところを側面からとらえた、タンパク染色後の高倍率電顕写真である。高倍率では、シャペロニン−金結合は酢酸ウラニルによるネガティブ染色で視覚化された。図８B(囲み中)は二種のシャペロニン変異種の頂上部にそれぞれ結合する５，１０ナノメートル金クオンタムドットのモデル断面図である。図８Cは５ナノメートル金クオンタムドットが３ナノメートル孔シャペロニン結晶鋳型の中央孔に結合している様子の染色像である。金が結合している環ではクオンタムドット（黒い領域）がタンパクに囲まれているのが見て取れる。何も結合していない環は明るく見え、中央孔の電子密度が低いことがわかる。図８Dは１０ナノメートルのクオンタムドットが９ナノメートル孔のシャペロニン鋳型に結合したもので、図８Cとほぼ同じ面積の規則構造をとっている領域を示している。クオンタムドットの大きさが大きいため、それを保持しているタンパクはより見づらくなっている。溶液中で個々のシャペロニンは両端もしくは一端で金クオンタムドットと結合することが観察されている。クオンタムドットは、中央孔中のチオールと金表面の間でできる複数の結合によって中央孔入り口にとどめられていると考えられる(図８B)。
【０１１５】
露出したシステインを持たないシャペロニンの二次元結晶を用いた対照実験では、アミノ酸ループの欠失の有無にかかわらず、金クオンタムドットはシャペロニン結晶上にでたらめに分布し特異的結合を示さなかった。しかしシステインを持つシャペロニンの二次元結晶上では、金クオンタムドットは中央孔に特異的に結合し(図８C)、乾燥によるひび割れで分断されたタンパク領域上に整列した領域を形成した(図８D)。これらは細工されたシャペロニン結晶が溶液中で金クオンタムドットの鋳型として機能していることを示している。これらのシャペロニン鋳型は基盤に付着させられたときは特定の大きさの粒子のみを結合し、溶液に露出した側のみにクオンタムドットを結合する。システインを頂上部ループ先端に導入した、３ナノメートルの環状に並んだチオールを持つベータ変異体を鋳型にした場合、５ナノメートル（+/-３ナノメートル）金クオンタムドットは特異的に結合したが、１０ナノメートル（+/-２ナノメートル）や１５ナノメートル（+/-１ナノメートル）金クオンタムドットはでたらめに分布し特異的結合を示さなかった。金クオンタムドットの大きさのばらつきは製造者の合成方法によるものである。頂上部ループをシステイン残基に置換した、９ナノメートルの環状に並んだチオールを持つベータ変異体を鋳型にした場合、１０ナノメートル（+/-２ナノメートル）金クオンタムドットは特異的に結合したが、５ナノメートル（+/-３ナノメートル）や１５ナノメートル（+/-１ナノメートル）金クオンタムドットはでたらめに分布し特異的結合を示さなかった。ここに示された結合粒子の大きさに対する特異性は、鋳型中央孔システインへの接近しやすさとその位置に起因する。
【０１１６】
シャペロニン鋳型によって整列させられた金クオンタムドットの中心から中心までの間隔は５，１０ナノメートル金クオンタムドットのどちらのアレイの場合も、電顕写真の解析によると１６ナノメートル（+/-２ナノメートル、n = 200）であった。この値は鋳型を形成した場合のシャペロニン中央孔の中心から中心までの間隔と一致した。金粒子の端から端までの距離は、３ナノメートル孔シャペロニンに５ナノメートル（+/-３ナノメートル）金クオンタムドットが結合した場合６から１０ナノメートル、９ナノメートル孔シャペロニンに１０ナノメートル（+/-２ナノメートル）金クオンタムドットが結合した場合４から６ナノメートルであった。この間隔のばらつきは金クオンタムドット自体の大きさのばらつきと、乾燥、ひび割れ、アレイ内での転位によるシャペロニン鋳型の格子欠陥によるものと考えられる。このばらつきは、もっと大きさのばらつきの少ないクオンタムドットを入手することで減らすことができる。ばらつきの少ないクオンタムドットを用いて高精度の間隔の金ナノアレイができれば、異なる大きさのクオンタムドットを使って粒子間カップリングを制御することによりアレイの物理特性を調整することができる（Dujardin, et al., 2002, Adv. Mater. 14, 775-788）。
【０１１７】
シャペロニンナノ鋳型アレイは半導体クオンタムドットを結合、整列させ、ナノアレイを作ることができる。4.5ナノメートルの発光コア・シェル（CdSe-ZnSクオンタムドット）が使用された（Dabbousi, B. O. et al. (1997) (CdSe)ZnS core-shell quantum dots: Synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites. J. Phys. Chem. B 101, 9463-9475）。これらのクオンタムドットはガラスまたはフォームヴァー基盤に付着した３ナノメートル孔シャペロニン鋳型と反応させられた。半導体クオンタムドットは水溶液に溶けにくい。クオンタムドットはブタノールで希釈されたトリオクチルホスフィン／酸化トリオクチルホスフィン中に懸濁したのち、乾燥したシャペロニン鋳型と反応させられた。その条件下でクオンタムドットはシステインを持つシャペロニン鋳型と結合した（図９）が、露出したシステインを持たないシャペロニン二次元結晶とはほとんど結合しなかった（図１２，１３）。この結果はCdSe-ZnSの外側のZnS シェル中の亜鉛が溶媒中に露出したチオール基に結合したという報告と矛盾しない（Chan, W. C. & Nie, S. (1998) Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science 281, 2016-2018）。
【０１１８】
図９A-Dは半導体クオンタムドットからなるナノアレイの特定実施形態である。図９Aは３ナノメートル孔シャペロニン鋳型に4.5ナノメートルの発光CdSe-ZnSクオンタムドットを結合させてできた８ミクロンの結晶円盤の微分干渉顕微鏡(DIC)像である。クオンタムドットが結合した鋳型の微分干渉顕微鏡像（図９A）とその蛍光顕微鏡像はクオンタムドットがシステインのチオール基を通じて結合してもその発光特性は変わらないことを示している（Bruchez, M., Jr., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S. & Alivisatos, A. P. (1998) Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science 281, 2013-2016）。図９Bは乾燥した円盤も水和された円盤も、鋳型表面に結合したクオンタムドット由来の蛍光を発しているのをとらえたものである。システインを導入されていないベータ変異体の二次元結晶ではクオンタムドットの結合がほとんど観察されなかったので（補足情報）この結合はシステインへの選択的結合であることが確かめられた。このことは図９Cの染色されていないCdSe-ZnSクオンタムドットアレイの低倍率電顕像からも明らかである。この像のコントラストは結合した半導体クオンタムドットによるものである。光学顕微鏡での発光像にも低倍率電顕像の電子密度にも見られるまだらな模様は、クオンタムドットがシャペロニン鋳型上に不均一に分布していることを示している。図９Dは同じ結晶上で、クオンタムドットがタンパク格子上でよく整列している領域の高倍率電顕像である。染色していなくても、高倍率でクオンタムドットが整列した領域がよく見える。これらの領域（クオンタムドットがタンパク格子上でよく整列しているいくつかの領域）は、タンパク鋳型上にクオンタムドットが結合しなかった領域によって分断されている。この違い（クオンタムドットが結合した領域としない領域）は、乾燥またはブタノールの溶媒効果により、シャペロニン鋳型の構造とチオール基への近づきやすさに違いがでたせいかもしれない。水溶性のCdSe-ZnSクオンタムドット（シリカを被膜した、Gerion, D. et al., 2001, “Synthesis and properties of biocompatible water-soluble silica-coated semiconductor nanocrystals,” J. Phys. Chem. B 105, 8861-8871）は露出したチオール基をもっており、水和したシャペロニン鋳型ともっと均一に結合するかもしれない。しかし、このクオンタムドット上のチオール基同士が凝集を起こし欠陥アレイを生じる可能性がある。その場合はチオール基を除去しなければならない。
【０１１９】
ナノスケール物質をまずシャペロニンサブユニットにつなぎとめ、それからシャペロニン環構造や二次元結晶（ナノアレイ）や他のナノ構造を作り上げることも可能である。市販されている例として、表面にチオール反応性のマレイミドを持った1.4ナノメートルの金クオンタムドットがある（monomaleimido Nanogold, Nanoprobes, Inc., Yaphank, NY）。図１０A-Dはナノ金ナノアレイの実施形態である。図１０Aは1.4ナノメートルモノマレイミドナノ金が、ループを持たないS. shibataeベータ変異体のサブユニットに、システインのチオール基とマレイミド基の間のマイケル付加によって共有結合するのを示したものである。図１０A（右）はナノ金クオンタムドットと共有結合したサブユニットからできる、９つの1.4ナノメートル金粒子をもつシャペロニン環状構造の鳥瞰図である。図１０Bはバナジウム酸メチルアミンで軽く染色した二次元結晶アレイの低倍率電顕像である。黒く丸い場所（矢印）は図１０Dの破線に見られるスペクトルの分析に用いられた場所を示しており、可動性の炭水化物が電顕ビームの周辺に引き寄せられ高分子化した結果である。図１０Cは結晶鋳型上に広がる規則正しい電子密度パターンの高倍率エネルギーフィルター電顕の明視野像である。図１０Dは図１０Bで示された領域でプローブから得られたカーボンフィルム(実線)とナノ金アレイ(破線)のXEDS（X線エネルギー分散型分光）スペクトルである。金に特異的なX線のピーク（Au Mα〜2 keV と Au Lα〜9.7 keV）により、アレイ中にナノ金が存在し、支持フィルム中には金が存在しないことが確かめられた。
【０１２０】
これらのナノ金クオンタムドットは変異ベータサブユニット頂上部の２８アミノ酸ループのかわりに導入されたシステインに共有結合した(図１０A-D)。ナノ金が結合したサブユニットはATP/Mg2+存在下でシャペロニン環状構造を形成し（図１０A）、そのシャペロニンから二次元結晶が形成された(図１０B,C)。ナノ金クオンタムドットのシャペロニン結晶への結合と中央孔への局在は分析型電顕により確かめられた（図１０と１１A-C）。図１１A-Cはナノ金アレイの高角度散乱暗視野走査透過型電顕像である。図１１A-Cより各環状構造中の物体の直径はどこでもほぼ同じで、したがってアレイの周期もどこでもほぼ同じであることがわかる。アレイを形成しているシャペロニン環中の電子密度の直径は1.4ナノメートルナノ金クオンタムドットの約８から１２倍である（図１１A-C）。図１１A-Cは結晶全体に広がる環状構造中に局在するナノ金クオンタムドットの周期的配列を示している。
【０１２１】
結晶内の物体は等間隔で六角形状に整列しており、それが金を含んでいることはバナジウム酸メチルアミン染色されたナノ金のエネルギーフィルター透過型電顕とX線エネルギー分散分光法(XEDS)により確かめられた(図１０B-D)。酸素プラズマ処理された炭素フィルムはフォームヴァーより電子線に対して安定なので、その炭素フィルムが支持体として用いられた。タンパク鋳型はプラズマ処理された炭素にもフォームヴァーにも付着しないので、基盤上でのタンパクの位置を知るため試料はバナジウム酸メチルアミンで染色された。ナノ金アレイのXEDSスペクトルは、染色剤や炭素／銅支持基盤に含まれるバナジウムや銅とはっきり区別される金に帰属されるピークを示した(図１０D)。
【０１２２】
ナノ金アレイ中に局在／整列した金粒子を観察するのに、高角度散乱暗視野走査透過型電顕（HAADF-STEM）が使われた(図１１A-C)。はだかのナノ金と整列したナノ金の比較から、結晶化したシャペロニンの中央孔内には複数のナノ金クオンタムドットが局在していることが明らかになった(図１１A,B)。そのナノ金結晶のHAADF像からもシャペロニン中央孔内に金が存在することが確かめられた。なぜならHAADF像のコントラストは物質の原子量に依存し、焦点距離や厚さにはほとんど依存しないからである。炭素フィルム上のはだかのナノ金粒子とシャペロニン鋳型によって整列させられたナノ金粒子の比較より、シャペロニン中央孔の直径は１ナノ金クオンタムドットの直径の約８から１２倍であることがわかった。この結果は、各シャペロニン環状構造あたり９個まで(サブユニットあたり１個)のナノ金クオンタムドットを保持できるというモデルと矛盾しない。それと同等な領域の低倍率HAADF像から、金粒子が整列している範囲は鋳型全体に及んでいることがわかった(図１１C)。高分解能XEDSでアレイ中の金を検出しようと試みたが、その測定に必要な電子線量をあてると結晶が破壊されてしまったのでうまくいかなかった。Au Oシェルを用いて電子エネルギー損失分光法（EELS）によるマッピングも試みたが、V Mシェルの端がAu Oシェルのすぐ近くにあって、金のシグナルをマスクしてしまうためうまくいかなかった。図１２は対照実験として、システインの変異体でないシャペロニン結晶とCdSe-ZnSクオンタムドットをインキュベートしたのちの微分干渉顕微鏡像(左)と蛍光顕微鏡像(右)である。クオンタムドットの結合は蛍光像ではやっと目に見える程度しか起こっていない。図１３は典型的シャペロニン二次元結晶の厚みの分布をエネルギーフィルター透過電顕を用いて視覚化したものである。この像における強度は非弾性シグナルと弾性シグナルの比に比例し、t/λに比例する。ここでtは局在する物体の厚さ、λは非弾性散乱の平均光路長である。強度が同じ領域は物体の厚みも同じ領域ということになる。強度が増している領域では厚みも増している。いろいろな領域や結晶の端でははっきりした強度の変化が見られ、結晶が数層からなっていることがわかる。
【０１２３】
結晶の厚み測定（原子間力顕微鏡および透過型電子顕微鏡による）より、結晶は１から５層からなる多重層（約２０ー２００ｎｍ）らしいことがわかる。クオンタムドットをまずシャペロニンサブユニットに共有結合させ、それからアレイを作る方が欠陥の少ないアレイができやすい。なぜならシャペロニンにはそれぞれ１８個のサブユニットがあるので、アレイのそれぞれの位置に少なくとも１個のクオンタムドットが結合するチャンスが１８回あるからである。同様に、クオンタムドットが整列している領域はシャペロニン結晶が広がっている領域全体に及び、しかも以前よりも欠陥が少なかった。このタイプのアレイは５、１０ｎｍ金、半導体ナノ粒子の結合プロトコルで得られたのより長い領域にわたる整列が要求される用途に適しているかも知れない。
【０１２４】
従って、タンパクの働きをうまく細工して変えることさえできれば、本発明は生物／無機物ハイブリッドを用いてナノ状態材料をつくりだす方法を提供している。タンパク構造の情報と遺伝子組み替え技術を用いて、遺伝子工学的に細工されたシャペロニンはナノ鋳型や、クオンタムドット（ナノ磁石など）をナノアレイ状に整列させるための器として機能させることが可能である。たとえばシャペロニンの別の部位にあらたな結合部位をつくることで、これらのナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイを「配線」してつなぎ、機能を持ったナノ装置を作ることが可能である。
【０１２５】
ナノ装置
本発明のナノ装置作成において、アレイにタンパク結晶による別の切子面を導入し非対称にしようという試みがなされた。ナノ装置は少なくとも１つのナノ鋳型、少なくとも１つのナノ構造、少なくとも１つのナノアレイと以上の組み合わせを含む。ナノ装置は、少なくとも１つのナノ構造、少なくとも１つのナノアレイもしくは少なくとも１つのナノ鋳型から作られる例えば、電子的、半導体的、機械的、ナノ電子機械的、磁気的、光電子的、光学的、光学電子的、または生物医学的装置をさす。
【０１２６】
特定の実施形態では、ナノ構造はシャペロニンがまだ存在するうちにナノ装置へと組立てられる。別の実施形態ではシャペロニンはナノ装置が機能する前に除去される。ナノ鋳型とナノ構造は、ナノ粒子やクオンタムドットなどの結合分子が整列するための基盤となる。結合したナノスケール物質は等間隔に（例えば１５ｎｍ間隔）あるいはあらかじめきめられた位置に整列する。プロテアーゼなどの酵素がシャペロニンを特異的に除去することができることを利用して、ナノ鋳型は純物質を表面の正確な位置
に残すために使われる。
【０１２７】
ナノ装置を作る工程はナノ構造をつくるのに似ているが、構築単位がナノ鋳型、ナノ構造、またはナノアレイであることだけが違う。その工程は１つまたは数個のナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイまたはそれらの組み合わせを表面に加え、結合しなかったナノ鋳型、ナノ構造、ナノアレイを除去することである。その工程は求められるナノ装置ができるよう、導入する物質を変えながら何回でも繰り返される。他のマスキング法（半導体の製作など）も本発明中のナノ装置の作成に組み合わせされる。
【０１２８】
本発明は現在の半導体工業における発明とは直接的には類似していない。自動的に集合する秩序だったタンパク鋳型を使えば、現在得られているのよりももっと小さいサイズの半導体材料の細工が可能になる。さらにシャペロニンシステムの多様性（例えば脂質、ＤＮＡやＲＮＡなど他の生体物質と結合する能力）を考えれば、本発明中の構造体と装置は生物医学領域（生物医学的な装置）にも利用しうる。
【０１２９】
本発明はさらに、ナノ粒子やクオンタムドットを無機物基盤上に整列したアレイに選択的に結合させる方法を提供する。シャペロニン遺伝子のＤＮＡ操作と遺伝子工学により、シャペロニンの特定の部位に特異的な分子認識能を導入することが可能である。例えば、システイン残基を導入することでシャペロニンは、システインのスルフヒドリル基と酸化金との結合を通じて金コロイドに特異的に結合しうる。これにより金ナノ粒子は基盤上に整列したアレイを形成する。金粒子が表面に整列したら、反応性イオンコールドプラズマを使ってタンパクを除去し、整列した金粒子のみを清潔な表面に残すことができ（図１４）本発明のナノ装置ができる。タンパクやペプチドに結合したHSP60はＡＴＰ存在下または酸性条件下で結合タンパクやペプチドを解離する（Udono and Srivastava, 1993, J. Exp. Med. 178,1391-1396）。
【０１３０】
ファージや細胞表面ディスプレイを利用して無機物に結合するペプチド配列を同定する（Whaley et al., Nature 405, 665-668）などの微生物遺伝学の応用（例えばシャペロニンの除去されたループのかわりにそれらのペプチド配列を導入するなど）で、このシステムの有用性は柔軟金属だけでなく他の金属にも広がることになる。
【０１３１】
ナノ装置の応用例としては（これに限らないが）電界放出素子、センサー、光電子、光スイッチ、レンズ、プローブ、レーザー、ナノ電子機械システム（NEMS）、電子回路、ナノ電子、ナノ機械（ナノモーターを取り付けて）、神経ネットワーク（連結にナノ電極を用いて）、ナノコンピューター、量子コンピューター、高密度磁気メモリもしくは記憶装置、光電子結晶、ナノ結晶、ナノ結晶アンテナ、マルチナノウェルアッセイプレート、ナノ触媒（パラジウムなど）、単分子DNA配列決定のためのナノ孔、電気通信における増幅器（７ｎｍ径のPbSe や PbS クオンタムドットは１５００ｎｍ付近に整調可能なギャップを持つ）などがある。さらに記憶装置（ハードディスク読み取りヘッド、磁気RAM）、磁場センサー、磁気論理装置、論理ゲート、スイッチなどもある。
【０１３２】
また、バイオチップへの応用も考えられる。たとえばバイオチップ中のクオンタムドットは少なくとも１つまたは数データビットを持つことができる。クオンタムドット中の１電子の位置はいくつかの状態を示すことができるので、１クオンタムドットは１バイトを表現できる。別の実施形態では、１クオンタムドットは一度に１個以上のコマンドに使用されうる。
【０１３３】
クオンタムドットの他の応用としては、ナノ機械、神経ネットワーク、高密度メモリまたは記憶装置がある。
【０１３４】
別の実施形態としては、DNAの検出、ハイブリダイゼーション、配列決定のための単分子プローブとして機能するナノ装置、ナノ鋳型、ナノアレイ機能がある。
【０１３５】
高分子を均一に埋め込んだ高分子ミクロ球は、たとえば、平面パネルディスプレイ上の活性蛍光素子や生物学的検出法における発光ラベルなどに利用される。この応用は高分子ナノ粒子を埋め込んだナノアレイからなるナノ装置を作ることにより可能になる。
【０１３６】
生物医学領域での分子モーターのような分子モーター関連の応用も可能である。
【実施例】
【０１３７】
実施例1：モデル
S. shibatae HSP60ベータのホモロジーモデルはウェブサービスのスイスモデル（http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）を使用して作成した。類似タンパクのすでに解明された７つの構造がテンプレートとして使用され、S. shibataeのベータと４８％から６４％の同一アミノ酸を示した。作成されたモデル構造はGROMOS96力場を用いて真空中で緩和された。サブユニットを９回対称二重環構造の１８量体シャペロニンへと組み立てるには対称操作を適用した。すべてのモデルは透過型電顕像より得られた実際のシャペロニンの寸法に合わせてつくられた。
【０１３８】
実施例２：S. shibataeシャペロニンガンマサブユニット遺伝子のクローニングと配列決定
ガンマ遺伝子はQiagen Genomic Tips (Qiagen)を用いて精製されたS. shibataeゲノムDNAより、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によって増幅された。用いられたPCRプライマー（P1: 5'-ATGAACTTAGAGCCTTCCTAT-3' (配列番号33) および P2: 5'-TTAACTCCATAAGAAACTTGT-3'） (配列番号34)はさきに公表されたガンマ配列の一部（Archibald et al., 1999, Current Biology 9, 1053-1056）に基づいて設計された。ガンマ遺伝子全体とその隣接領域をクローニングするため、インバースPCR(Ochman et al., 1988, Genetics 120, 621-623)法を行った。ゲノムDNAはAseIで切断後自己ライゲーションにより環化され、Ventポリメラーゼ（New England BioLabs）を用いたPCRで反応を２５サイクル（94°C３０秒、50°C１分、72°C１分）繰り返した後1.2kbのDNA断片を得た。得られたDNA断片はベクターpBluescript SK(+) (Stratagene)と連結され、得られたプラスミドは大腸菌DH5αに導入された。ガンマ遺伝子は両鎖ともジデオキシ法（Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467）により配列決定がなされ、遺伝子解析プログラムDNASTAR (DNASTAR, Inc.)により解析された。図１６A,BはそのDNA配列(配列番号37)とそれから推定されるアミノ酸配列(配列番号38)を示している。
【０１３９】
実施例３：S. shibataeシャペロニンガンマサブユニット遺伝子の大腸菌中での発現
ガンマ遺伝子の全領域は一対のプライマー(Primer 1: 5' GAAAGAACATATGGCCTATTTATTAAGAGAAGGAACACAG-3'(配列番号35)とPrimer 2: 5'-TAAAGTACTCGAGAAAACCTAAATAAAATAATCATATCTTAAC-3' (配列番号36))を使用してS. shibataeのゲノムDNAより増幅された。得られたDNA断片はベクターpET22b (Novagen)のNde I、Xho I部位に挿入された。ガンマ遺伝子の発現は、50 mg/mlカナベニシリン(Sigma)を含むLB培地で培養された大腸菌BL21(DE3)コドンプラス株中でイソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）の添加により誘導された。アルファ、ベータ遺伝子も同様に発現された（Kagawa et al., 1995, J. Mol. Biol. 253, 712-725）。
【０１４０】
実施例４：遺伝子の改変
あらたなシステイン残基の導入や頂上部ループの除去にはCurrent Protocols in Molecular Biologyに記載されている標準的なPCR変異法を使用した。すべての変異サブユニットは本文中および参考文献に記載された方法に従って精製された。
【０１４１】
実施例５：シャペロニンの組み立てと結晶化
シャペロニンは精製されたサブユニットより形成され、同時に二次元結晶も溶液中で界面を必要とせずに形成される。ATPおよびMgCl2の高濃度保存溶液を、精製されたサブユニットに加え（タンパク濃度1.5 mg/ml、（25 mM）、3.5 mM TCEPを含む25 mM HEPESバッファー）最終濃度を４mM  ATP、１０mM MgCl2とする。溶液は４℃で一晩インキュベートされ、結晶は白沈として観察される。
【０１４２】
実施例６：クオンタムドットのナノアレイ形成
金クオンタムドットの結合では、まず結晶タンパク鋳型をフォームヴァー被膜された２００メッシュの透過電顕用グリッド上に置き、グリッドのタンパクが乗っている側を被膜されたクオンタムドットの液滴（5 μl）上にのせ、金クオンタムドットを結合させる。グリッド上の余分な液をろ紙で吸い取ったのち、グリッドをHATバッファー（25 mM HEPES, 0.1% sodium azide, 3 mM tris[2-carboxyethyl] phosphine hydrochloride, pH 7.5）滴にのせることで１０分間洗う。この過程は鋳型のクオンタムドットによる占有率があがるまで１０回以内で繰り返される。１０ナノメートル金クオンタムドットは５ナノメートルのものより少ない繰り返しでよい結合を示す。１０回の繰り返しの後、３ナノメートル鋳型はかなり破壊された。グリッドはLEO 912 AB透過型電顕を用い60 kVで観察された。すべての定量的測定はソフトウェアAnalySIS 3.5 (Soft Imaging System Corp., Lakewood, CO)を用いて行った。
【０１４３】
半導体クオンタムドットは金クオンタムドットとほぼ同様なただし以下の点のみが異なる方法で結合／視覚化された。鋳型を透過電顕グリッドにのせた後水で洗い、乾燥後ブタノールで膨潤させクオンタムドットを結合させた。光学顕微鏡観察では、結晶をフォームヴァーで被膜されたガラススライドに付着させ、水洗、乾燥、ブタノール洗浄の後カバーガラスで覆った。CdSe-ZnSクオンタムドットのTOP/TOPO/ブタノール希釈スラリーは、カバーガラスの下から毛管現象を利用して挿入され、ブタノールでよく洗った後Leica DMR/X顕微鏡の明視野微分干渉コントラストモードで観察された。
【０１４４】
ナノ金アレイは以下のようにして作成された。ループがシステインに置換された変異型サブユニットは過剰量のナノ金と、製造業者の説明書記載の方法で反応させた。ナノ金の結合したサブユニットはゲルろ過(BioRad BioGel P-10)を用いて、未反応タンパクおよび過剰ナノ金から分離され、1.5 mg/mlにまで濃縮された後上述のように環状構造と二次元結晶へと組み立てられた。
【０１４５】
出来上がった構造は炭素被膜されたグリッドにのせ、短時間酸素プラズマ処理してタンパクの炭素への吸着を高めた。試料は室温でFEI TecnaiF20 AEMの二重傾斜Beステージ上で観察された。顕微鏡は透過型、透過走査型、高角度散乱暗視野型、エネルギーフィルター型などのモードで出力２００kV電子源として Schottky型電界放出微小電子源を用いた。すべてのX線エネルギー分散型分光測定はMn Kαで約150 eVのFWHM をもつEDAX超薄ウィンドウSi(Li)検出器を用いて行われ、エネルギーフィルターと電子分光はGatan GIF2000電子エネルギー損失分光法を用いて行われた。使用されたプローブの大きさは各測定や観察によって異なるが0.5-500ナノメートルであった。
【０１４６】
その他
本発明はここに挙げた特定の実施形態に限定されない。ここに記載された発明に加えて、種々の発明の改良が上記の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような改良も添付した請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１４７】
ここに挙げた参考文献は、個々の刊行物、特許および特許出願について実際にその全てが参照によって組み込まれることが特別および個別に指摘されたのと同様に、参照によって実際にその全てが本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
全ての刊行物の引用は、それら刊行物が出願日前に開示されたことを示すものであるが、それらが本発明の先行技術となることを認めたものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１はシャペロニンHSP６０の鳥瞰図と側面図を2.3オングストローム分解能で示したものである。側面図の線で囲まれた領域はHSP６０の単一サブユニットを示している。
【図２】図２A-Rは種々の生物から単離されたHSP60タンパク質のアミノ酸配列を比較したものである。S. shibatae TF55 ベータサブユニット (配列番号1)、細菌型 E. coli GroEL (配列番号2)、サーモソーム T. acidophilum ベータサブユニット (配列番号3)、シアノバクテリア型 synechococcus HSP60 (配列番号4)、M. acetivorans HSP60-4 (配列番号5)、M. tuberculosis HSP65 (配列番号6)、サーモソーム A. pernix アルファサブユニット (配列番号7)、thermosome M. mazei アルファサブユニット (配列番号8)、ミトコンドリア型 A. thaliana HSP60 (配列番号9)、酵母菌 TCP1 アルファサブユニット (配列番号10)、ヒトミトコンドリア型 HSP60 (配列番号11)、マウスミトコンドリア型 HSP60 (配列番号12)、ヒト TCP1 アルファサブユニット (配列番号13)、マウス TCP1 アルファサブユニット(配列番号14)、それらすべてに共通する配列 (配列番号15)。同一残基は点破線、類似残基は実線、共通残基は破線で囲んだ。
【図３】図３は古細菌シャペロニン（サーモソーム）と細菌型シャペロニン（GroEL）の立体構造を比較したものである。グループIに属するシャペロニンとグループIIのそれとの構造類似性を示している。両構造を重ね合わせたもの（図中央）ではまったく一致する領域を黒で示した。
【図４】図４はグループIIシャペロニンサブユニットの構造の詳細を示している。
【図５】図５A-DはシャペロニンHSP60とそれがかたちづくるフィラメント構造の電子顕微鏡写真である。
【図６】図６AとBは油脂で被膜された金属グリッド上で形成されたHSP60環状構造体の二次元結晶（6A）と、環状構造体（背景に点として存在する）の上に形成されたフィラメント束（6B）である。
【図７】図７A-Eはナノ粒子などのナノスケール物質から成るナノアレイ作成のため、変異型HSP60によって作られるナノ鋳型を示す。
【図８】図８A-Dは変異型シャペロニンに結合した金ナノ粒子とシャペロニンナノ鋳型を示す。
【図９】図９A-Dは半導体QDナノアレイを示す。
【図１０】図１０A-D金ナノ粒子によるナノアレイ形成を示す。図１０Dは図１０Bで矢頭で示された領域での炭素フィルム(実線)と金ナノ粒子ナノアレイ（破線）のXEDSスペクトル
【図１１】図１１A-Cはナノ金アレイの高角度散乱暗視野走査透過電顕像を示す。
【図１２】図１２はシステイン変異型でないシャペロニンの結晶をCdSe-ZnS QD中でインキュベートしたのちの光学顕微鏡像である。微分干渉顕微鏡像(左)と蛍光像(右)。
【図１３】図１３は典型的なタンパク二次元結晶のエネルギーフィルター透過型電子顕微鏡による厚み地図である。
【図１４】図１４は基盤上でのナノ粒子による秩序だったナノアレイの形成法を示す。
【図１５】図１５はS. shibatae TF55 アルファサブユニット (配列番号 39)、ベータサブユニット (配列番号1)、ガンマサブユニット (配列番号38)のタンパク質アミノ酸配列の比較を示す。
【図１６】図１６AとBはS. shibatae TF55ガンマサブユニットのDNA配列（配列番号37）とアミノ酸配列（配列番号38）を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図２Ｑ】
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【図２Ｒ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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