(57)【要約】本発明は、グラチラマー・アセテートの試験バッチの相対強度を測定するための方法を提供する。加えて、本発明は、グラチラマー・アセテートのバッチを薬学的な使用に許容されるように調製するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラチラマー・アセテートの試験バッチの強度を参照バッチの既知の強度と比較して測定するための方法であって、
ａ．雌性（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスを８および１２週齢の間に参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量で免疫することと；  
ｂ．工程（ａ）のマウスから免疫後９〜１１日にリンパ節細胞の初代培養を調製することと；
ｃ．少なくとも５つの参照サンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と参照バッチからの１μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの間のグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）を別々にインキュベートすることと；
ｄ．少なくとも２つのサンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）をインキュベートすることと；
ｅ．工程（ｃ）および（ｄ）における各サンプルに関して、各サンプルの細胞により分泌されたインターロイキン―２の量を、かかるサンプルのインキュベーションの１８〜２１時間後に決定することと；
ｆ．グラチラマー・アセテートの試験バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたインターロイキン―２の量と、グラチラマー・アセテートの参照バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたインターロイキン―２の量とを、グラチラマー・アセテートの試験バッチのグラチラマー・アセテートの参照バッチと比較した強度を決定するために、相関させることと；を含み、
工程（ｃ）および（ｄ）の各サンプルの前記規定細胞数は実質的に同一であり、および試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量を含有している各サンプルに対し、参照バッチからの実質的に同一のグラチラマー・アセテートの規定量を含有している対応する参照サンプルが存在する方法。  
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、６つの参照サンプルが工程（ｄ）において別々にインキュベーションされる方法。  
【請求項３】
グラチラマー・アセテートの試験バッチの強度を参照バッチの既知の強度と比較して測定するための方法であって、
ａ．試験する哺乳類を参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量で免疫することと；
ｂ．工程（ａ）の試験する哺乳類からの細胞の初代培養を免疫後の規定時間に調製することと；
ｃ．少なくとも２つの参照サンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）を別々にインキュベートすることと；
ｄ．少なくとも２つのサンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）をインキュベートすることと；
ｅ．工程（ｃ）および（ｄ）における各サンプルに関して、各サンプルの細胞により分泌されたサイトカインの量を、かかるサンプルのインキュベーションの規定期間後に決定することと；
ｆ．グラチラマー・アセテートの試験バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたサイトカインの量と、グラチラマー・アセテートの参照バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたサイトカインの量とを、グラチラマー・アセテートの試験バッチのグラチラマー・アセテートの参照バッチと比較した強度を決定するために、相関させることと；を含み、
工程（ｃ）および（ｄ）の各サンプルの前記規定細胞数は実質的に同一であり、および試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量を含有している各免疫サンプルに対し、参照バッチからの実質的に同一のグラチラマー・アセテートの規定量を含有している対応する参照サンプルが存在する方法。  
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記サイトカインがインターロイキンである方法。  
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記インターロイキンがインターロイキン―２である方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記インターロイキンがインターロイキン―６である方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、前記インターロイキンがインターロイキン―１０である方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法であって、前記サイトカインがインターフェロン―ガンマである方法。  
【請求項９】
請求項３に記載の方法であって、前記哺乳類はグラチラマー・アセテート参照スタンダード（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に特異的なＴ細胞を産生する方法。  
【請求項１０】
請求項３に記載の方法であって、前記哺乳類が齧歯類である方法。  
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記齧歯類がマウスである方法。  
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記マウスが雌（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスである方法。  
【請求項１３】
請求項３に記載の方法であって、前記哺乳類が約８〜約１２週齡である方法  
【請求項１４】
請求項３に記載の方法であって、前記細胞がリンパ節細胞である方法。  
【請求項１５】
請求項３に記載の方法であって、前記細胞が脾臓細胞である方法。  
【請求項１６】
グラチラマー・アセテートのバッチを薬学的な使用に許容されるように調製するための方法であって、
ａ．グラチラマー・アセテートのバッチを調製することと；
ｂ．請求項１に記載の方法に従ってバッチの相対強度を測定することと；および
ｃ．そのように測定された相対強度がグラチラマー・アセテートの参照バッチの８０％および１２５％の間である場合、前記バッチを薬学的な使用に許容されると認定することと；を含む方法。  
【請求項１７】
グラチラマー・アセテートを薬学的な使用のために調製するための方法であって、
ａ．グラチラマー・アセテートのバッチを調製することと；
ｂ．請求項３に記載の方法に従ってバッチの相対強度を測定することと；および
ｃ．そのように測定された相対強度がグラチラマー・アセテートの参照バッチの８０％および１２５％の間である場合、前記バッチを薬学的な使用に許容されると認定することと；を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連文献】
【０００１】
本出願は、２００１年１２月４日に出願された米国仮出願番号６０／３３８，７６７の優先権を主張するものであり、この出願の内容は本明細書中に参照によって援用される。  
この出願の全体で、様々な文献が、括弧内の短い引用文を用いて参照される。これら文献の完全なる書誌的事項は、本明細書の「図面の簡単な説明」の前に記載される。これら公開文献の開示の全体は、本明細書中に引用することにより本出願に援用され、当該発明が属する技術の状況をより完全に記載する。  
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、グラチラマー・アセテートのＴ細胞による特異的な認識に基づく、グラチラマー・アセテートの強度の測定を標準化（ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｉｎｇ）する方法に関する。  
【背景】
【０００３】
活性成分の最適な強度（ｐｏｔｅｎｃｙ）および品質を得るために、薬学的組成物の強度の測定を標準化することが望まれている。  
グラチラマー・アセテート（ＧＡ、コポリマー−１（医師用卓上参考書）、コポリマー１、Ｃｏｐ−１またはＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）としても知られる）は、多発性硬化症（ＭＳ）を治療するための認可された薬物である。  
グラチラマー・アセテートは、合成ポリペプチドの酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ  ｓａｌｔｓ）からなり、４つの天然のアミノ酸を含有している（医師用卓上参考書）：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、およびＬ−リジン（医師用卓上参考書）、それぞれＬ−グルタミン酸：０．１２９〜０．１５３；Ｌ−アラニン：０．３９２〜０．４６２；Ｌ−チロシン：０．０８６〜０．１００；Ｌ−リジン：０．３００〜０．３７４の平均モル分率を有する。グラチラマー・アセテートの平均分子量は、４，７００〜１１，０００ダルトン（医師用卓上参考書）である。  
化学的に、グラチラマー・アセテートは、Ｌ−アラニン、Ｌ−リジンおよびＬ−チロシン、アセテート（塩）（医師用卓上参考書）を有するＬ−グルタミン酸ポリマーと明示される。その構造式は：  
（Ｇｌｕ，  Ａｌａ，  Ｌｙｓ，  Ｔｙｒ）ｘ・  ＸＣＨ３ＣＯＯＨ
（Ｃ５Ｈ９ＮＯ４・Ｃ３Ｈ７ＮＯ２・Ｃ６Ｈ１４Ｎ２０２・Ｃ９Ｈ１１ＮＯ３）ｘ・ＸＣ２Ｈ４０２
ＣＡＳ−１４７２４５−９２−９
（医師用卓上参考書）。また、グラチラマー・アセテートは、次のように記載される：ポリ［Ｌ−Ｇｌｕ１３−１５，  Ｌ−Ａｌａ３９−４６，  Ｌ−Ｔｙｒ８．６−１０，  Ｌ−Ｌｙｓ３０−３７］  ｎＣＨ３ＣＯＯＨ。  
グラチラマー・アセテートが、実験的な自己免疫性の脳脊髄炎（ＥＡＥ）――多様な動物種における多発性硬化症（ＭＳ）に対する実験モデル、を抑制することが示された（Ｌａｎｄｏら、１９７９；  Ａｈａｒｏｎｉ，  １９９３）。マウスのＥＡＥの研究は、ＥＡＥに対する防御がＴ細胞活性により媒介されることを示唆した（Ａｈａｒｏｎｉ，  １９９３）。ＥＡＥの積極的な誘導からのマウス脊髄ホモジネートによる、この防御（いくつかの自己抗原が関与する）は、正常なレシピエントにグラチラマー・アセテート特異的なＴサプレッサー細胞の注射により養子性に（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ）伝達できた（Ａｈａｒｏｎｉ，  １９９３）。フェーズＩＩＩ臨床治験において、グラチラマー・アセテートの毎日の皮下注射により、能力障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）の進行を緩徐にさせるようになり、多発性硬化症の増悪（ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｎｇ）  ―  軽減（ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ）における再発率（ｒｅｌａｐｓｅ  ｒａｔｅ）を減少させる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  １９８７）。グラチラマー・アセテートを製造する方法は、米国特許第３，８４９，５５０および５，８００，８０８並びにＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ００／０５２５０に記載されている。
【０００４】
高いレベルの抗原特異性がＴ細胞活性化の特性であることは一般に認識されている。免疫系のＴ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩまたはＩ分子（抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される）と複合体形成した免疫原性ペプチドを認識する。Ｔ細胞による抗原認識の特異性は、いくつかのパラメーターにより規定される：１）ＭＨＣペプチド複合体に対するＴ細胞受容体の親和性；２）抗原性ペプチドの一次配列；および３）抗原性ペプチド内の特定のアミノ酸の組み合わせの相乗効果。グラチラマー・アセテートの作用機構における現在の知識に基づいて、ＭＳにおけるグラチラマー・アセテートの生物学的な活性がＴ細胞活性の免疫調節（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）により媒介されることが信じられている。  
【発明の概要】
【０００５】
本発明は次の方法を提供する、即ち、グラチラマー・アセテートの試験バッチの強度をグラチラマー・アセテートの参照バッチの既知の強度と比較して測定するための方法であって、
ａ．雌性（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスを８および１２週齢の間に参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量で免疫することと；
ｂ．工程（ａ）のマウスから免疫後９〜１１日後にリンパ節細胞の初代培養を調製することと；
ｃ．少なくとも５つの参照サンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と参照バッチからの１μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの間のグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）を別々にインキュベートすることと；
ｄ．少なくとも２つのサンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）をインキュベートすることと；
ｅ．工程（ｃ）および（ｄ）における各サンプルに関して、各サンプルの細胞により分泌されたインターロイキン―２の量を、かかるサンプルのインキュベーションの１８〜２１時間後に決定することと；
ｆ．グラチラマー・アセテートの試験バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたインターロイキン―２の量と、グラチラマー・アセテートの参照バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたインターロイキン―２の量とを、グラチラマー・アセテートの試験バッチのグラチラマー・アセテートの参照バッチと比較した強度を決定するために、相関させることと；を含み、
工程（ｃ）および（ｄ）の各サンプルの前記規定細胞数は実質的に同一であり、および試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量を含有している各サンプルに対し、参照バッチからの実質的に同一のグラチラマー・アセテートの規定量を含有している対応する参照サンプルが存在する方法。  
また、本発明は次の方法を提供する、即ち、グラチラマー・アセテートの試験バッチの強度をグラチラマー・アセテートの参照バッチの既知の強度と比較して測定するための方法であって、
ａ．試験する哺乳類を参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量で免疫することと；
ｂ．工程（ａ）の試験する哺乳類からの細胞の初代培養を免疫後の規定時間に調製することと；
ｃ．少なくとも２つの参照サンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）を別々にインキュベートすることと；
ｄ．少なくとも２つのサンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）をインキュベートすることと；
ｅ．工程（ｃ）および（ｄ）における各サンプルに関して、各サンプルの細胞により分泌されたサイトカインの量を、かかるサンプルのインキュベーションの規定期間後に決定することと；
ｆ．グラチラマー・アセテートの試験バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたサイトカインの量と、グラチラマー・アセテートの参照バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたサイトカインの量とを、グラチラマー・アセテートの試験バッチのグラチラマー・アセテートの参照バッチと比較した強度を決定するために、相関させることと；を含み、
工程（ｃ）および（ｄ）の各サンプルの前記規定細胞数は実質的に同一であり、および試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量を含有している各免疫サンプルに対し、参照バッチからの実質的に同一のグラチラマー・アセテートの規定量を含有している対応する参照サンプルが存在する方法。  
【詳細な記載】
【０００６】
本発明は次の方法を提供する、即ち、グラチラマー・アセテートの試験バッチの強度をグラチラマー・アセテートの参照バッチの既知の強度と比較して測定するための方法であって、
ａ．雌性（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスを８および１２週齢の間に参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量で免疫することと；  
ｂ．工程（ａ）のマウスから免疫後９〜１１日にリンパ節細胞の初代培養を調製することと；
ｃ．少なくとも５つの参照サンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と参照バッチからの１μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの間のグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）を別々にインキュベートすることと；
ｄ．少なくとも２つのサンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）をインキュベートすることと；
ｅ．工程（ｃ）および（ｄ）における各サンプルに関して、各サンプルの細胞により分泌されたインターロイキン―２の量を、かかるサンプルのインキュベーションの１８〜２１時間後に決定することと；
ｆ．グラチラマー・アセテートの試験バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたインターロイキン―２の量と、グラチラマー・アセテートの参照バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたインターロイキン―２の量とを、グラチラマー・アセテートの試験バッチのグラチラマー・アセテートの参照バッチと比較した強度を決定するために、相関させることと；を含み、
工程（ｃ）および（ｄ）の各サンプルの前記規定細胞数は実質的に同一であり、および試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量を含有している各サンプルに対し、参照バッチからの実質的に同一のグラチラマー・アセテートの規定量を含有している対応する参照サンプルが存在する方法。  
一態様において、６つの参照サンプルが工程（ｄ）において別々にインキュベーションされる。  
また、本発明は次の方法を提供する、即ち、グラチラマー・アセテートの試験バッチの強度をグラチラマー・アセテートの参照バッチの既知の強度と比較して測定するための方法であって、
ａ．試験する哺乳類を参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量で免疫することと；
ｂ．工程（ａ）の試験する哺乳類からの細胞の初代培養を免疫後の規定時間に調製することと；
ｃ．少なくとも２つの参照サンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）を別々にインキュベートすることと；
ｄ．少なくとも２つのサンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）をインキュベートすることと；
ｅ．工程（ｃ）および（ｄ）における各サンプルに関して、各サンプルの細胞により分泌されたサイトカインの量を、かかるサンプルのインキュベーションの規定期間後に決定することと；
ｆ．グラチラマー・アセテートの試験バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたサイトカインの量と、グラチラマー・アセテートの参照バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたサイトカインの量とを、グラチラマー・アセテートの試験バッチのグラチラマー・アセテートの参照バッチと比較した強度を決定するために、相関させることと；を含み、
工程（ｃ）および（ｄ）の各サンプルの前記規定細胞数は実質的に同一であり、および試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量を含有している各免疫サンプルに対し、参照バッチからの実質的に同一のグラチラマー・アセテートの規定量を含有している対応する参照サンプルが存在する方法。  
一態様において、前記サイトカインは、インターロイキンである。  
好適な態様において、前記インターロイキンはインターロイキン―２である。
【０００７】
別の態様において、前記インターロイキンはインターロイキン―６である。
【０００８】
更なる一態様において、前記インターロイキンはインターロイキン―１０である。
【０００９】
付加された態様において、前記サイトカインはインターフェロン―ガンマである。  
一態様において、前記哺乳類はグラチラマー・アセテート参照スタンダードに特異的なＴ細胞を産生する。  
別の態様において、前記哺乳類は齧歯類である。  
更に別の態様において、前記齧歯類はマウスである。  
付加的な態様において、前記マウスは雌（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスである。  
更なる一態様において、前記哺乳類は約８〜約１２週齡である。  
一態様において、前記細胞は、リンパ節細胞である。  
一態様において、前記細胞は、脾臓細胞である。  
本発明は更に次の方法を提供する、即ち、グラチラマー・アセテートのバッチを薬学的な使用に許容されるように調製するための方法であって、
ａ．グラチラマー・アセテートのバッチを調製することと；
ｂ．請求項１に記載の方法に従ってバッチの相対強度を測定することと；および
ｃ．そのように測定された相対強度がグラチラマー・アセテートの参照バッチの８０％および１２５％の間である場合、前記バッチを薬学的な使用に許容されると認定することと；を含む方法。  
付加的に、本発明は次の方法を提供する、即ち、薬学的な使用に許容されるグラチラマー・アセテートを調製するための方法であって、
ａ．グラチラマー・アセテートのバッチを調製することと；
ｂ．請求項３に記載の方法に従ってバッチの相対強度を測定することと；および
ｃ．そのように測定された相対強度がグラチラマー・アセテートの参照バッチの８０％および１２５％の間である場合、前記バッチを薬学的な使用に許容されると認定することと；を含む方法。  
従って、本発明は、ＧＡの強度の測定の標準化（ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ）を提供する。強度試験は、定量的にＧＡの生物活性を決定する。これは、これまでにない試験を初めて示すものである。この標準化方法は、ＤＳおよびＤＰの強度および品質に関してバッチ間の再現性を示すために必須である。この出願の関連において、ＤＳは活性成分を意味する（即ち、ＧＡ）。ＤＰは、最終製品を示すために使用される（即ち、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））。ＲＳは、約７０００Ｄａの平均分子量を有するグラチラマー・アセテートのバッチを意味する。  
本発明は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）とインキュベートしたＴ細胞が、そのサイトカインと反応して増殖するとの観察を利用する（Ｌｉｓａｋ  ｅｔ  ａｌ．  ，  １９７４）。  
以下に記載される実施例は、如何に発明のある特定の代表的な態様が作り出されるかに関して発明の詳細を記載するが、材料、装置および方法の工程は例示の目的でのみを意図している。特に、本発明は、本明細書中に特に記載される方法、材料、条件、方法のパラメータ、装置などに限定されない。  
【実施例】
【００１０】
実験的な実施例
一般的な手順の概要
マウスをＣＦＡ中の２５０μｇ  ＧＡ  ＲＳで免疫した。ＧＡ  ＲＳは、米国特許第５，８００，８０８またはＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ００／０５２５０に記載のとおりに生産された。ＧＡ  ＲＳは、上記に記載のＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の中央範囲（ｍｉｄｒａｎｇｅ）における化学的および生物学的な特性に基づいて選択された。９〜１１日後、ＬＮ細胞の初代培養を調製し、そして細胞を様々な濃度のＧＡ  ＲＳおよび試験サンプルとインキュベートした。加湿したＣＯ２インキュベーターにおける３７℃でのインキュベーションの１８〜２１時間後、培養液を集め、ＩＬ−２のレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。各ＤＳバッチに対するＴ細胞応答を２つの濃度（直線範囲内）で試験し、そしてＤＳバッチの％強度をＧＡ  ＲＳバッチのものと比較して計算した。  
［実施例１］  標準の手順
目的
この手順の目的は、ＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞を用いて、インビトロにおけるＧＡ  ＤＳバッチの相対強度を決定することである。  
設備
層状フード（Ｌａｍｉｎａｒ  ｈｏｏｄ）、血球計算器（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）、使い捨てのカバーガラス、細胞カウンター遠心機、温度制御振盪インキュベーター、加湿され温度制御された５％ＣＯ２インキュベーター、光学倒立顕微鏡、ＥＬＩＳＡリーダー（４５０ｎｍフィルター）、」フリーザー、冷蔵庫、ハサミ、ピンセット、ステッパー（ｓｔｅｐｐｅｒ）、ピペットマン４０〜２００μｌ、ピペットマン２００〜１０００μｌ、ピペットマン５〜４００μｌ、パワーペット（ｐｏｗｅｒｐｅｔｔｅ）、無菌ガラス注射器およびルアーブリッジ（ｌｕｅｒ  ｂｒｉｄｇｅｓ）。  
使い捨て品（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅｓ）
クリオチュウブ（Ｃｒｙｏｔｕｂｅｓ）、９６ウェル増強結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，  Ｃａｔ．＃４４２４０４）、９６ウェル未滅菌マイクロテストプレート（Ｆａｌｃｏｎ  Ｃａｔ．＃３９１１）、２４ウェル平底無菌組織培養プレート（Ｎｕｎｃ，  Ｃａｔ．＃１４３９８２）、ペトリ皿、エッペンドルフチュウブ（ポリプロピレン）、滅菌ピペットチップ２００−１０００μｌ、ピペット：２，５  ＆  １０ｍｌ、白衣（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏａｔ）、手袋、０．２μセルロースアセテートフィルター、フィルターシステム２００ｍｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｃａｔ．＃４３０７６７）、キムワイプ（Ｋｉｍ  ｗｉｐｅｓ）、サポートプラットフォーム（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）、１０ｍｌ注射器、２１Ｇｘ１  １／２”注射針、インシュリン注射器およびコンビチップ（ｃｏｍｂｉｔｉｐｓ）５ｍｌ。  
材料及び方法
免疫操作に関して  
９５％エタノール（Ｂｉｏ  Ｌａｂ，  Ｃａｔ．＃１３６８０６０５、または均等物）、７０％エタノール（９５％エタノールから蒸留水で希釈して調製された）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）ｘ１（ＳＩＧＭＡ，  Ｃａｔ．＃３８１３、または均等物）、ＣＦＡ（１ｍｇのｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴ）（Ｈ３７Ｒａ，  ＡＴＣＣ  ２５５１７７），  （ＳＩＧＭＡ，  Ｃａｔ．＃Ｆ−５８８１、または均等物）を含有している）およびＧＡ  ＲＳバッチ。  
インビトロ・バイオアッセイ処置に関して  
９５％エタノール（Ｂｉｏ  Ｌａｂ，  Ｃａｔ．＃１３６８０６０５、または均等物）、７０％エタノール（９５％エタノールから蒸留水で希釈して調製された）、トリパンブルー（ＢＤＨ，  Ｃａｔ．＃３４０７）、ＤＣＣＭ１（Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ）（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，  Ｃａｔ．＃０５−０１０−ｌＡ、または均等物）、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，  Ｃａｔ．＃０１−１００−１Ａ）、滅菌Ｌ−グルタミン  ２ｍＭｘ１００（Ｂｉｏ  Ｌａｂ，  Ｃａｔ．＃１３．０１５）、滅菌ＭＥＭ（最小必須培地）−非必須アミノ酸ｘ１００（Ｂｉｏ  Ｌａｂ，  Ｃａｔ．＃１１．０８０）、滅菌塩化ピルベート（ｓｔｅｒｉｌｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）１ｍＭｘ１００（Ｂｉｏ  Ｌａｂ，  Ｃａｔ．＃１３．０１６）、抗生物質／抗真菌物質（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）溶液１（Ｂｉｏ  Ｌａｂ，  Ｃａｔ．＃１３．０２０）、２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ，  Ｃａｔ．＃Ｍ−７１５４）、ＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ，  Ｃａｔ．＃３８１３）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）  （ＳＩＧＭＡ，  Ｃａｔ．＃Ｃ−５２７５）、ＭＢＰ（Ｍｙｅｌｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ミエリン塩基性蛋白質）ペプチド（８７−９９）（ＢＡＣＨＥＭ，  Ｃａｔ．＃Ｈ−１９６４、または均等物）、およびＧＡ  ＲＳ。  
ＥＬＩＳＡに関して  
ＩＬ−２をＥＬＩＳＡキットにより測定した：ＯｐｔＥＩＡＴＭセット：マウスＩＬ−２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｃａｔ．＃２６１４ＫＩ、または均等物）。  
動物
８〜１２週齡の雌（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）を使用したが、他の供給源からの８〜１２週齡の雌（ＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスを使用し得る。動物の飼育（ｈｏｕｓｉｎｇ）および世話（ｃａｒｅ）の条件は、特定病原体除去の（ＳＰＦ）条件で維持した。  
溶液
【表１−１】
2005511060.tif 000002
【表１−２】
2005511060.tif 000003
免疫化
ＣＦＡ中でＧＡ  ＲＳエマルジョンを無菌条件下で調製した（即ち、層状フード中で無菌の設備および材料を用いて）。  
ＧＡ  ＲＳ溶液の調製
約１５ｍｇのＧＡ  ＲＳを正確に秤量し、無菌のＰＢＳに溶解して５ｍｇ／ｍｌの濃度にした。  
ＧＡ  ＲＳエマルジョンの調製
ＧＡ  ＲＳ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）およびＣＦＡの等容量を混合した。混合物を無菌のガラス注射器に移した、この注射器はルアーブリッジ（ｌｕｅｒ  ｂｒｉｄｇｅ）を通して第２のガラス注射器に連結されている。混合物を、１つの注射器から別の注射器に移して、混合物がよく乳化するまで撹拌した。安定なエマルジョンが確認された（エマルジョンの液滴が拡散することなく水上で浮いた場合）。  
注射
ＧＡ  ＲＳエマルジョンをインシュリン・シリンジに移した。  
次に、１００μｌのエマルジョン（２５０μｇ  ＧＡ／マウス）を各未処置マウス（各足蹠に約２５μｌ）の４つの足蹠に注射した。免疫したマウスをインビトロ試験のために使用した（免疫後９〜１１日）。  
ＬＮ細胞の初代培養の調製
次の手順にしたがって、ＬＮ細胞の初代培養を免疫後９〜１１日に調製した。  
ＬＮ細胞の除去のための外科的な処置
層状フードにおいて作業を開始する２０分前にＵＶランプを点灯し、作業開始時に消灯した。前記フード下で何らかの試薬を配置する前に、作業台表面を７０％エタノール溶液で清潔にした。富化（Ｅｎｒｉｃｈｅｄ）したＤＣＣＭ１培地を調製した。富化したＤＣＣＭ１およびＲＰＭＩ培地を使用前に３７℃で予め温めた。マウスを頚部脱臼により屠殺した。各マウスの背部を配置し、サポートプラットフォームに固定した。腹部に７０％アルコールを噴霧し、中央切開を施した（２ｃｍ長の切開で通常十分であった）。皮膚を後肢に向かって分離させ（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｅｄ）、ＬＮを後肢および前肢から取った（ＬＮ  ｗａｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｉｎｄ  ａｎｄ  ｆｏｒｅｌｅｇｓ）。ＬＮを約５ｍｌの無菌ＲＰＭＩ培地を含有している無菌のペトリ皿に移し、ＬＮ細胞を無菌の注射器プランジャーで細かくした（ｔｅａｓｅｄ  ｏｕｔ）。無菌注射器を使用して細胞懸濁液をペトリ皿から採取した（組織破片が採取されることを無菌針を用いることにより回避した）。細胞懸濁液を５０ｍｌ無菌チュウブに移した。  
細胞計数：５匹の免疫したマウスに由来するＬＮ細胞を計数するための処置例細胞チュウブを４０ｍｌまでのＲＰＭＩ培地で満たした。ＬＮ細胞を２００ｘｇで１０分間、室温（１５〜２５℃）で遠心分離した。ペレットを４０ｍｌのＲＰＭＩで再懸濁した。５０μｌの２つのアリクウォットを、それぞれ、マイクロテストウェル中で１５０μｌの０．１％トリパンブルーで４倍に希釈した細胞懸濁液からとった。アリクウォットを上下に穏やかにピペッティングすることでよく混合した。血球計算器をカバーガラスでカバーした。５０〜２００μｌのピペットマンを使用して両方のアリクウォットを血球計算器の上部および下部チャンバーにロードした（各チャンバーに１懸濁液）。混合物を約２分間チャンバー内に定着（ｓｅｔｔｌｅ）させた。チャンバーに泡が入らないように注意した。混合物（細胞懸濁液＋トリパンブルー）をチャンバーの表面全体に行き渡らせた。泡がチャンバーに存在した場合、またはオーバーロードした場合、血球計算器は完全に洗浄され、拭いて乾燥され、チャンバーは再ロードされた。  
生細胞を上部および下部チャンバーの中心部の四角（各々１６小四角の２５大四角から構成される）において計数した。生細胞はトリパンブルーを吸収しないので、透明な外観で特徴づけられた。  
しかし、死細胞は、トリパンブルーを浸透させ、青色を呈した。中央の四角の境界に出現している細胞は、細胞の一部が実際に中央の四角内にある場合のみ計数された。細胞が境界にあり、中央の四角内にない場合、細胞は計数されなかった。細胞密度は、下記の式を用いて計算された：  
平均数  生細胞（両方のチャンバー）ｘ４ｘ１０４＝細胞／ｍｌ
細胞を２００ｘｇで１０分間、室温で遠心分離した。細胞を富化したＤＣＣＭ１で１Ｘ１０７細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。  
インビトロ・バイオアッセイ
インビトロ・バイオアッセイを２４ウェル、平底組織培養試験プレートで１ｍｌの終容量（ｆｉｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）で実施した。  
ＧＡ  ＲＳキャリブレーション曲線の調製
１ｍｇ／ｍｌのＧＡ  ＲＳストックの１アリクウォットを解凍した。ＧＡ  ＲＳストック溶液を富化したＤＣＣＭ１培地で１００μｇ／ｍｌ（１０倍）に希釈し、０．２μ  セルロースアセテートフィルターを通して濾過した。ＧＡ  ＲＳ溶液の６つの段階希釈（富化したＤＣＣＭ１培地による）を２〜５０μｇ／ｍｌの間で調製した（表２の例により記載されるとおり）。
【表２】
2005511060.tif 000004
【００１１】
ＧＡ  ＤＳ希釈の調製
試験するバッチから約１０〜２０ｍｇのＧＡ  ＤＳを正確に秤量し、１．２ｍｇ／ｍｌにまでｄｄＨ２Ｏで溶解した。ＯＤマイナス溶液のブランク（Ｔｈｅ  ＯＤ  ｍｉｎｕｓ  ｂｌａｎｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を２７５ｎｍで測定した。サンプルのＯＤを凡そ１．０３にｄｄＨ２Ｏで調整して、１ｍｇ／ｍｌのＧＡのストック溶液を得た。１００μｇ／ｍｌのストック溶液を富化したＤＣＣＭ１培地で調製し、０．２μ  セルロースアセテートフィルターを通して濾過した。ストック溶液を１０および２０μｇ／ｍｌに希釈した（ＲＳバッチに関して、表２に記載の通り）。  
アッセイ反応
以下を２４ウェル平底組織培養プレートに添加した（下記のプレートテンプレートの例を参照されたい）：  
ＧＡ  ＲＳ
０．５ｍｌのＬＮ細胞（最終密度、例えば、５ｘ１０６細胞／ウェル）。  
０．５ｍｌの各ＧＡ  ＲＳ希釈、したがってウェルのＧＡ  ＲＳの最終濃度は２５、１５、１０、５、２．５および１μｇ／ｍｌであった。  
ＧＡ  ＤＳサンプル
０．５ｍｌのＬＮ細胞（最終密度、例えば、５ｘ１０６細胞／ウェル）。  
０．５ｍｌの各サンプル希釈、したがってウェルにおける試験サンプルの最終濃度は５および１０μｇ／ｍｌであった。  
各試験は、以下のコントロールを含んでいた：
１）ネガティブコントロール  ―  コントロールペプチドとインキュベートしたＬＮ細胞：
０．５ｍｌのＬＮ細胞（最終密度、５ｘ１０６細胞／ウェル）
０．５ｍｌのＭＢＰペプチド溶液（２０μｇ／ｍｌ）、富化したＤＣＣＭ１中、（終濃度  １０μｇ／ｍｌ）
２）ポジティブコントロール  ―  Ｃｏｎ  Ａ（非特異的なＴ細胞刺激因子）で刺激したＬＮ細胞：
０．５ｍｌのＬＮ細胞（最終密度、５ｘ１０６細胞／ウェル）
０．５ｍｌのＣｏｎ  Ａ（５μｇ／ｍｌ）、富化したＤＣＣＭ１中、（終濃度  ２．５μｇ／ｍｌ）
【表２−１】
2005511060.tif 000005
細胞の密度は、ＧＡに対するそれらの応答に応じて変化した。培養物を３７℃で加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で１８〜２１ｈｒｓ維持した。プレートを２００ｘｇで１０分間、室温で遠心分離した。上清をクリオチュウブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅｓ）に採取した。上清を作業アリクウォット（ｗｏｒｋｉｎｇ  ａｌｉｑｕｏｔｓ）に分けてサンプルの繰り返しの凍結／解凍を避けた。上清を１週間まで−２０℃で保存した。フードを７０％エタノール溶液で清潔にし、キムワイプで乾燥させた。手袋をはずし、手を消毒薬ですぐに洗浄した。  
ＩＬ−２検出のためのＥＬＩＳＡ
全サンプルをトリプリケート（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で試験した。各プレート・ラン（ｐｌａｔｅ  ｒｕｎ）は、以下を含んでいた：  
１）ＩＬ−２検量線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ）  ―  少なくともＩＬ−２の６つの非ゼロ濃度を含む。
【００１２】
２）ブランク
＋１次抗体、ＩＬ−２スタンダードなし、＋２次抗体（ゼロポイント）。  
３）サンプル
ＧＡ  ＲＳの培養液、試験サンプルおよびコントロールを富化したＤＣＣＭ１で以下のとおり希釈した：  
ａ）１および２．５μｇ／ｍｌのＧＡ  ＲＳサンプルの及びネガティブコントロールサンプルの２倍希釈；
ｂ）５〜２５μｇ／ｍｌのＧＡ  ＲＳサンプルの及び試験サンプルの５〜１０倍希釈；並びに
ｃ）ポジティブコントロールサンプル（Ｃｏｎ  Ａ）の１５〜２０倍希釈。  
ＩＬ−２レベルを測定するためのＥＬＩＳＡプロトコールを、製造者の推奨にしたがって実施した。任意のサンプルの光学濃度がプレートリーダーの上／下限に達した場合、サンプルをそれぞれ高／低希釈で再解析した。  
計算および受諾判定基準（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）
ＥＬＩＳＡ測定平均値吸光度は、スタンダード、サンプルおよびコントロールの吸光度からブランクサンプル（ゼロ  ＩＬ−２スタンダードポイント）を減じたものであり、トリプリケートの各セットに関して、平均（吸光度−ブランク）、標準偏差（ＳＤ；ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）、および相対標準偏差（ＲＳＤ；ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）が計算された。  
サンプル・リプリケート
全体的な結果に影響し得る任意の潜在的な問題を解明するため、疑わしいアウトライアー（ｏｕｔｌｉｅｒ）が存在した場合は常に、そのアウトライアーが統計学に基づいていることを満たす必要があった。トリプリケート測定値間のＲＳＤが１０％を超え及び平均ＯＤブランクが＞０．３００の場合、アウトライアー棄却（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）をディクソンＱ−試験を用いて適用した。信頼性のある受諾判定基準がリプリケート（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）に基づく試験において満たされない場合、ディクソンＱ−試験を存在しえる（ｐｏｓｓｉｂｌｅ）アウトライアーを棄却するために使用した。アウトライアー試験は、同じ標準液（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）のリプリケート測定（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）のみに適用可能であった。１０回未満の観察に対し、ただ１つのアウトライアーを決定および除外することができた。この操作は、３および７の間のリプリケート測定の任意の数からアウトライアーを棄却（９５％の信頼水準で）することにおいて、ディクソンＱ−試験の使用を拡大した。  
操作
疑われるアウトライアーをＸ１と呼称した。全ての他の測定を疑わしいアウトライアーを参照してラベルした、例えば、Ｘ２は疑わしいアウトライアーの次の（ｎｅｘｔ  ｔｏ）値であり、Ｘ３は疑わしいアウトライアーの第２の値であり、Ｘｋは疑わしいアウトライアーから最も離れた値であり、及びＸｋ−１は最も離れた値から第２の値、等々、であった。
【００１３】
３〜７  リプリケート（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）に対して、次の式が使用された：Ｘ２−Ｘ１／Ｘｋ−Ｘ１。
【００１４】
適切なｋ値を表３を用いて計算された分数（ｆｒａｃｔｉｏｎ）から決定した。
【表３】
2005511060.tif 000006
【００１５】
アウトライアーがディクソンＱ−試験により同定されないが、３回のリプリケートのうち２回の間の％差異（％  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）が１０％を超えない場合、最も近接する２つのリプリケートを％強度を計算するために使用した。或いは、ＥＬＩＳＡ試験をこのサンプルに関して繰り返した。  
ＯＤ＜０．３００（ブランク、ネガティブコントロールおよび低いスタンダードポイント）を有するサンプルからのアウトライアー棄却を適用した。アウトライアーが確認された（ｌｏｃａｔｅｄ）場合、アウトライアーが棄却された場合、報告される。二重の（Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ；デュプリケート）測定値を％強度の計算に関して使用した。  
ブランク・サンプル
ブランク・サンプルの各々の吸光度は、ＩＬ−２スタンダードの最大濃度の平均吸光度の≦１０％であった。ブランク・リプリケートの１つが上記の限界（ｌｉｍｉｔｓ）を超えた場合、それは棄却され、二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）のサンプルが使用された。  
ＩＬ−２検量線
ＩＬ−２検量線を、製造者の推奨にしたがってグラフにした。曲線に６つの非ゼロ濃度  ＩＬ−２スタンダードの最小値が残っていた場合、低い感受性（ｐｏｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）またはサンプル処理エラー（ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｒｒｏｒ）を提示するＩＬ−２スタンダードを棄却することは可能であった。逆算（ｂａｃｋ−ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）したスタンダード濃度は、２０％（低いキャリブレーションポイントに関して）および±１５％（全ての他の濃度に関して）を超える相対誤差（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｒｒｏｒ；ＲＥ）を有していた。ＩＬ−２キャリブレーション曲線を、少なくとも６つの非ゼロ濃度ポイント（少なくとも１７キャリブレーションポイント）から構築した、これは予想される濃度の範囲をカバーしている。高または低濃度が失敗した場合、検量線範囲を切り捨てる（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ことが可能であった。直線回帰曲線のＲ２は、≧０．９７であった。  
アッセイ・コントロール
ＩＬ−２の濃度を、全てのサンプルにおいて、ＩＬ−２スタンダードの直線回帰プロットから、直線回帰曲線の式を利用して計算した。ＩＬ−２の終濃度は、全てのサンプルにおいて、サンプルの希釈係数を乗じることによって計算された。  
ネガティブコントロール（ＭＢＰペプチド）
ネガティブコントロールサンプルの３リプリケートのうち少なくとも２つにおいて、ＩＬ−２の終濃度は、ＧＡ  ＲＳ曲線の最低のキャリブレーションポイントに対して測定されたＩＬ−２のレベル以下であった。  
ポジティブコントロール（Ｃｏｎ  Ａ）
ポジティブコントロールサンプルの３リプリケートのうち少なくとも２つにおいて、ＩＬ−２の終濃度は、ＧＡ  ＲＳ曲線の最大のキャリブレーションポイントにおけるＩＬ−２のレベルと同様のレベルまたは超えるレベルであった。  
ＧＡ  ＤＳバッチの相対強度の計算
ＧＡ  ＲＳ曲線
ＧＡ  ＲＳ曲線をｌｏｇ−ｌｏｇスケールでプロットした（ｙ軸にｌｏｇ  ＩＬ−２濃度およびｘ−軸にｌｏｇ  ＧＡ  ＲＳ濃度）。キャリブレーション曲線を少なくとも５つの非ゼロ濃度（少なくとも１４キャリブレーションポイント）から構築した。  
キャリブレーションポイントをＩＬ−２スタンダードポイントに関して記載のとおりに棄却した。最良適合回帰曲線（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）をスタンダードポイントで計算した。Ｒ２は≧０．９７であった。傾き（β）は、≧
０．７７であった。  
並行性分析（Ｐａｒａｌｌｅｌｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
各試験サンプルの用量反応曲線をｌｏｇ−ｌｏｇスケールでプロットした（ｙ軸にｌｏｇ  ＩＬ−２濃度およびｘ−軸にｌｏｇ  ＧＡ  ＤＳ濃度）。最良適合回帰曲線（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）をサンプルポイントで計算した。傾き（β＊）は、次の範囲内であった：  
βｘ０．６３５≦β＊≦ｘ１．３６５。  
β＊が限界外（ｏｕｔ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔ）であった場合、インビトロ試験を二重（２つの別々のサンプル調製）に繰り返した。１つの再試験におけるβ＊が失敗（ｆａｉｌｅｄ）した場合、そのバッチは棄却された。両方の再試験におけるβ＊が限界内であった場合、％強度および９５％信頼限界が決定された。  
％強度および信頼限界の推定（Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）
信頼限界（「真の％強度（ｔｒｕｅ  ％  ｐｏｔｅｎｃｙ）」を含む９５％の確率を有する）を決定するために使用される偶然誤差（ｒａｎｄｏｍ  ｅｒｒｏｒ）の推定をＡＮＯＶＡを用いることにより取得した。この統計学的なテクニックは、観察された反応間のトータル変動を、別々の成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）に分ける、即ち：  
【表３−１】
2005511060.tif 000007
成分３および４は、それぞれ直線性（ｌｉｎｅａｒｉｔｙ）および並行性（ｐａｒａｌｌｅｌｉｓｍ）からの非有意偏差（ｎｏｎ−ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ）による偶然誤差項（ｔｈｅ  ｒａｎｄｏｍ  ｅｒｒｏｒ  ｔｅｒｍ）に含められた。総平方和（ｔｏｔａｌ  ｓｕｍ  ｏｆ  ｓｑｕａｒｅｓ）は、３成分（ＳＳ−回帰、ＳＳ−標本およびＳＳ−誤差）、適切な自由度および有意差に関するＦ−検定に分けられた（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｄ）。  
試験バッチの％強度を計算し、推定された強度に対する９５％信頼限界を以下に記載のとおりに計算した：  
相対強度および９５％信頼限界の計算のためのコンピュータアルゴリズム。  
工程１：特定データ（ＧＡ．バッチおよびＧＡ．  ＲＳ．）のｌｏｇ１０スケールへの変換を計算する：  
Ｙｋｉ＝ｌｏｇ１０（応答ｋ１）；ｉ＝１，．．．ｎｋ
Ｘｋｉ＝ｌｏｇ１０（用量ｋ１）；ｉ＝１，．．．，ｎｋ
式中のｋ＝１，２は、それぞれＧＡ．バッチおよびＧＡ．  ＲＳの標本インデックス（ａ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）であり；ｎ１およびｎ２は、それぞれＧＡ．バッチおよびＧＡ．  ＲＳに関して実施された測定の総数である。  
従って、Ｎ＝ｎ１＋ｎ２は観察の全体総数（ａｎ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｔｏｔａｌ  ｎｕｍｂｅｒ）である。  
工程２：次の式によって、全ての測定されたデータポイントに基づく直線回帰に対する共通の傾き（ｃｏｍｍｏｎ  ｓｌｏｐｅ）を計算する：  
【数１】
2005511060.tif 000008
【００１６】
式中、Ｙはｌｏｇ１０（反応）の全体の平均値であり；
Ｘはｌｏｇ１０（用量）の全体の平均値である。  
工程３：ｌｏｇ１０（用量）における回帰による平方和を計算する、即ち：  
【数２】
2005511060.tif 000009
【００１７】
工程４：平方和の偶然誤差を計算する、即ち：  
【数３】
2005511060.tif 000010
【００１８】
式中、Ｙｋ、Ｘｎは、それぞれ標本ｋの平均のｌｏｇ１０（反応）およびｌｏｇ１０（用量）値である。
【００１９】
工程５：平均平方誤差項（Ｍｅａｎ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｅｒｒｏｒ  ｔｅｒｍ）を次のとおり計算する：  
ＤＦＥＲＲ（ｒａｎｄｏｍ  ｅｒｒｏｒ  ｄｅｇｒｅｅｓ  ｏｆ  ｆｒｅｅｄｏｍ；偶然誤差自由度）＝Ｎ−３；
ＭＳＥＲＲ＝ＳＳＥＲＲ／ＤＦＥＲＲ。  
工程６：ｔ−統計（ｔ−ｓｔａｔｉｓｔｉｃ）の適切な値を発見するためにｔ−分布の統計テーブルを使用する：  
ｔ＝ｔ（０．９７５，  ＤＦＥＲＲ）。
【００２０】
工程７：相対強度の点推定（ｐｏｉｎｔ  ｅｓｔｉｍａｔｅ）を次のとおり計算する：  
【数４】
2005511060.tif 000011
【００２１】
工程８：次の式によって、Ｃで表示される表式（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を計算する：  
【数５】
2005511060.tif 000012
【００２２】
工程９：９５％信頼限界の低および上限の対数を計算する：
【数６】
2005511060.tif 000013
【００２３】
工程１０：前の工程において計算した値を、最初のスケール（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｓｃａｌｅ）に、生じたｌｏｇ−限界（ｌｏｇ−ｌｉｍｉｔｓ）の真数（ａｎｔｉ−ｌｏｇａｒｉｔｈｍｓ）を取り、そして１００％を乗じることにより、変換する。  
ＧＡ  ＤＳバッチの推定強度（Ｔｈｅ  ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ）は、規定された強度（ｔｈｅ  ｓｔａｔｅｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ）の８０％以上、１２５％以下であった。推定強度の誤差の信頼限界（Ｐ＝０．９５）は、規定された強度の７０％未満、１４３％以下であった。バッチが上記限界の外側（ｏｕｔｓｉｄｅ）であった場合、インビトロ試験は二重に繰り返された。両方の再試験の結果が規格（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）内であった場合、バッチは承認（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）された。１つの再試験（ｒｅ−ｔｅｓｔ）が失敗した場合、バッチは棄却された。  
ドキュメンテーション
ＬＮ細胞カウントおよびＥＬＩＳＡプレートテンプレートを記録した。最初の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）ＥＬＩＳＡリーダーの記録および結果フォーム（ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔ  ｆｏｒｍ）をファイルした。  
［実施例２］  実施例１の標準手順の開発
実験２Ａ：ＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞から分泌されるサイトカインのプロフィール
９〜１１日前にＣＦＡ中の２５０μｇ  ＧＡ  ＲＳで免疫した雌（ＳＪＬ  ｘ  ＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウス由来のＬＮ細胞を、様々な濃度のＧＡ  ＲＳの存在下で培養した。細胞をＧＡ  ＲＳと共に５％ＣＯ２  加湿恒温器により３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。次に、培養物を遠心分離し、上清を集め、ＥＬＩＳＡによってサイトカインをアッセイした。  
ＥＬＩＳＡはサイトカインに特異的なビオチン化抗体を用いて行ない、そしてストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合体を検出に用いた。各々のプレートランには、ブランクコントロール（サイトカインスタンダードを含まない１次および２次抗体）を含めた。また、各々のプレートランには、品質管理（ＱＣ）のサンプル（アッセイの直線範囲中のサイトカインスタンダードの３濃度）を含めた。各インビトロ試験には、ポジティブコントロール（Ｃｏｎ  Ａ、非特異的Ｔ細胞刺激因子）とネガティブコントロール（ＧＡおよび他のいかなる抗原もない）を含めた。全てのサイトカインは、１８〜２４時間のインキュベーション後に測定された。ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０およびＩＬ−４のレベルを７２時間のインキュベーション後に再び試験した。結果を表４に示す。
【表４】
2005511060.tif 000014
【００２４】
表４では、各サイトカインに関して測定した最大値は、任意の単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔｓ）で提示される：（−）＜検出限界；（＋）〜４００ｐｇ／ｍｌまで；および（＋＋）＞４００ｐｇ／ｍｌ。表４は培養でのＧＡ  ＲＳに対する反応を示している。ＬＮ細胞は、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−６を分泌したが、一方ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＴＧＦ−βは培養液中で検出されなかった。これらの結果は、ＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞によって造り出されるサイトカインが、Ｔｈ０タイプのものであることを示している。  
注目されるべきはＴｈ０プロファイルが異なった免疫プロトコール（すなわち、ＩＦＡでの又は低投与量のＧＡでの免疫）でも見られたことである。
【００２５】
ＩＬ−２がＴ細胞活性化のための良いマーカーであり、ＧＡ  ＲＳに反応したＩＬ−２分泌がきわめて再現可能であり、直線的用量反応相関があったので、ＩＬ−２はＴ細胞活性化を測定する最適なサイトカインであるように思えた。  
実験２Ｂ：免疫操作の最適化
いくつかの実験が、最適の免疫プロトコールを確立するために行われた。最初の実験は、ＧＡ  ＲＳ（免疫する抗原）用量のＬＮおよび脾臓におけるＴ細胞反応への効果を試験した。２群のそれぞれ１０匹のマウスを、ＣＦＡに２５０μｇ  ＧＡ（グループ１）（ＥＡＥブロッキングテストのように）またはＣＦＡに１０μｇ  ＧＡ（グループ２）で免疫した。初代培養は、免疫されたマウスのＬＮおよび脾臓の両方から調製された。  
培養物を様々な用量のＧＡ  ＲＳと共に一晩インキュベートし、その後培養液を実験２Ａのように集めてＩＬ−２に関してアッセイした。図４の結果は、両方の免疫プロトコールにおいて、ＬＮ細胞から分泌されるＩＬ−２のレベルが、脾臓細胞から分泌されるそれらと比べて、高いことを明確に示している。これらの結果に基づいて、アッセイにはＬＮ細胞の初代培養を使用することが決定された。加えて、マウスに注射されるＧＡ  ＲＳの用量は培養でのＴ細胞応答に影響しなかった。ＬＮおよび脾臓細胞の両方は、ＧＡ  ＲＳの免疫用量にかかわらず同様量のＩＬ−２を分泌した。これは、免疫手順が確固としており（ｒｏｂｕｓｔ）、ＧＡ  ＲＳ免疫用量の大きな変動でさえ免疫結果に影響しないことを示している。  
免疫プロトコールのさらなる最適化のために、第一のグループはＣＦＡ中の２５０μｇのＧＡ  ＲＳを注射され、第二のグループはＩＣＦＡ中の１０ｍｇのＧＡが注射された。２番目のグループにおけるＧＡ  ＲＳの用量がより高かったため、より弱いアジュバントであるＩＣＦＡが用いられた。１０日後に、両グループからのＬＮ細胞のＧＡ  ＲＳに対する反応が、インビトロで試験された。図５は、ＣＦＡ中の２５０μｇＧＡ  ＲＳでの免疫が、より少ない用量の抗原が使用されたにもかかわらず、培地中でより強力な反応を誘発したことを示している。  
これらの所見、およびＣＦＡ中の２５０μｇ／マウスのＧＡがＥＡＥをブロッキングするのに大変効果的である（このマウス系統において、少なくとも８０％のＥＡＥのブロッキング）ことに基づくと、ＣＦＡ中の２５０μｇ／マウスのＧＡが最適用量であるように思われる。  
特異的Ｔ細胞はＣＦＡで単回免疫された後、通常は約１０日以内に産生された。図６は培地中でのＬＮ細胞のＧＡ  ＲＳへの反応を示している（免疫後９、１０および１１日に調製された）。ＩＬ−２分泌の用量反応がすべての日数で同様であったので、免疫期間は９〜１１日間継続し得る。  
実験２Ｃ：インビトロ試験条件の最適化
いくつかの実験をインビトロ反応での最適プロトコルを確立するために実施した。これらの研究は、培養条件の最適化、インキュベーション時間、試験サンプル中のＩＬ−２の安定性およびＧＡ  ＲＳの−２０℃での安定性を含んでいた。
【００２６】
ｉ）培養液
マウスリンパ球系細胞の培養は、１％正常マウス血清を添加したＲＰＭＩ中で通常は維持される。正常マウス血清は、ＥＬＩＳＡキットで使用されている抗マウスＩＬ−２モノクローナル抗体によって検出可能な内因性ＩＬ−２を含む可能性がある。加えて、異なるロットの正常血清の使用は、インビトロ試験の日変動（ｉｎｔｅｒ−ｄａｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）を増加させる可能性がある。内因性マウスＩＬ−２の相互汚染を避けるために、および、この方法の日変動を減少させるために、ＧＡ特異的Ｔ細胞の応答は４つの異なる培養液において試験された：即ち、１）ＲＰＭＩ＋１％正常マウス血清（ＮＭＳ）；２）ＲＰＭＩ＋１％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ウシＩＬ−２はＥＬＩＳＡキットで使用されている抗マウスＩＬ−２によって認識されない）；３）バイオターゲット（Ｂｉｏｔａｒｇｅｔ）（独占的にイスラエルのＢｅｉｔＨａｅｍｅｋ社で製造されている無血清培地）；４）ＤＣＣＭ１（様々な製造者によって生産された無血清培地）である。  
図７は異なる培地でＬＮ細胞のＧＡ  ＲＳに対する反応を比較した代表的な実験の結果を示している。無血清培地が使用されたときに最も良い反応が観測された。用量反応範囲は無血清の時、左方に変位した。ＧＡがアルブミンおよび他の血清タンパク質に結合するのを示した先の研究によってこのことは説明できる。  
この結合は、ＡＰＣｓと相互作用する培養基中でのＧＡの有効性を減らす可能性があり、その結果、より高濃度のＧＡがＴ細胞を刺激するのに必要となる。これらの結果に基づけば、最も適した培地は、ＤＣＣＭ−１培地であるように思える。  
ｉｉ）ＩＬ−２分泌の速度論
ＩＬ−２は、クローン的なＴ細胞増殖とＢ細胞およびマクロファージの機能特性とに必須の自己分泌およびパラ分泌成長因子である。ＧＡ  ＲＳによる培養への刺激後に、ＩＬ−２は活性化されたＧＡ特異的Ｔ細胞によって分泌され、次に、ＬＮ細胞によって消費される。ＩＬ−２分泌の速度論研究は、ＧＡ刺激後の上清を回収するための最適（ピーク）時間を決定するために実施された。ＬＮ細胞は、３７℃の加湿ＣＯ２恒温器の中で、様々な濃度のＧＡ  ＲＳとともに培養およびインキュベートされた。図８に示される間隔をとって、アリコットが採取され、そして細胞は遠心分離で除去された。上清は、２０℃で保たれ、実験の最後にＥＬＩＳＡによってＩＬ−２がアッセイされた。  
図８は、培養液でのＩＬ−２レベルのピークが、１８〜２１時間の間であることを示している。２４〜４８時間に採取されたサンプルのＩＬ−２レベルの減少は、ＬＮ細胞によるＩＬ−２の消費によって説明することができる。したがって、上清採取のための最適な時間は、インキュベーションの１８〜２１時間後であるように思われる。  
ｉｉｉ）サイトカインの測定
この方法は、ＧＡ  ＲＳサンプルおよび試験サンプル中のＩＬ−２が正確に測定できるかに依存している。この実験の間、ＩＬ−２のレベルはマウスＩＬ−２測定のために特化したＥＬＩＳＡキットであるＯｐｔＥＩＡ（ファーミンジェン、Ｃａｔ．＃２６１４ＫＩ）によって測定された。  
ｉｖ）ＩＬ−２の試験サンプル中−２０℃での安定性
実施された実験のほとんどでは、ＥＬＩＳＡによって分析される前に、培養液は採取され−２０℃に保たれた。  
培養液中のＩＬ−２の安定性をみる予備検討では、サイトカインは−２０℃で１週間安定なことが示されている（図９）。  
したがって、インビトロ試験サンプルの培地は、ＩＬ−２を測定するのに先だつ１週間までは−２０℃で維持できる。また、この実験結果は、ＥＬＩＳＡの結果がきわめて再現可能であることを示した−−１週間離れた別々の日に行われた２つのＥＬＩＳＡプレートのサンプル中のＩＬ−２レベルの測定結果は、事実上同一であった。  
ｖ）ＧＡ  ＲＳ溶液の−２０℃での安定性
ＧＡ  ＲＳ溶液の−２０℃での安定性をテストするために、調製後直ちに、および−２０℃で５カ月保存後に、ＧＡ  ＲＳ溶液の用量反応性を試験した。
【００２７】
図１０は、実際に、−２０℃で５カ月の保存した前後で、ＧＡ  ＲＳ溶液の用量反応曲線には事実上違いがないことを示している。したがって、少なくとも使用の５カ月前から、ＧＡ  ＲＳ溶液のアリコットを調製して−２０℃で保持しておくことができる。  
実験２Ｄ：ＧＡ  ＲＳ検量線の直線範囲の決定
計算されたＧＡ  ＲＳキャリブレーション曲線に基づいて統計的なバリデーションが行われ、分析のために認められた２１のプレートの各自が別々に評価された。これらの２１のサンプルは、およそ４カ月の期間をかけて異なる時に集められた。割り当てられたプレートのＧＡ濃度範囲は、０．２５〜５０μｇ／ｍｌの間で変動していた。ＧＡ  ＲＳキャリブレーション曲線から得られた、以下のバリデーションの特性は、分析における主な関心事を構成していた。  
１．  より広い直線範囲の限界を確保するための最適な変換；
２．  直線範囲限界（ｌｉｎｅａｒ  ｒａｎｇｅ  ｌｉｍｉｔｓ）の決定；
３．  キャリブレーション曲線を承認するための総合的な評価基準；
４．  アッセイの正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）および精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）の推定；
５．  二重信頼性（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ）の評価（以下のパラグラフを参照されたい）。  
実験の性質（ｎａｔｕｒｅ）は、各キャリブレーションポイントで典型的には３リプリケート（トリプリケート）を行うというものであった。しかしながら、いくつかの例では、トリプリケート測定を用意できなかった場合、二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）の信頼性の評価が必須となった。  
ＧＡ用量反応相関の直線性
以下に提示されたバリデーションの検討において、多くの面での基礎は直線回帰モデルであった。それはＩＬ−２濃度（ｐｇ／ｍｌ）をＧＡ濃度（μｇ／ｍｌ）と関連づけた。この相関（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）の直線性の仮定（ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ）は、直線回帰モデルを適切に当てはめるのに必要であった。データはＬｉｎｅａｒ−Ｌｉｎｅａｒスケールでプロットされた。この同じ相関は、Ｌｏｇ−Ｌｏｇスケール、同様にＬｏｇ−Ｌｉｎｅａｒスケール、およびＬｏｇ−Ｓｑｕａｒｅ  Ｒｏｏｔスケールに変換された。Ｌｏｇ−Ｌｏｇ変換が最も適切な直線的特徴を示した。したがって、回帰モデルから選択された形式はＬｏｇ−Ｌｏｇスケールであった：  
Ｌｏｇ１０（ＩＬ−２  ｃｏｎｃ）＝ａ＋β＊Ｌｏｇ１０（ＧＡ  ｃｏｎｃ）＋誤差
反応変数（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）は、各キャリブレーションポイントで測定された３リプリケートのＬｏｇ変換平均（ａ  ｌｏｇ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｍｅａｎ）であった。このモデルを各キャリブレーションサンプルに適合（ｆｉｔｔｅｄ）させ、そして適切な統計値（Ｒ２、切片、および傾き）を各々の適合させた曲線から計算した。  
Ｒ２  の値は、残差変動（ＲＳＳ；ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｓｕｍ  ｏｆ  ｓｑｕａｒｅｓ）の、総平方和（ＴＳＳ）に対する比率を次の式を介して反映したものであった：  
Ｒ２＝１−ＲＳＳ／ＴＳＳ
直線範囲決定
直線範囲を以下の評価基準に基づいて決定した：  
１．  プロットされたＬｏｇ１０（ＩＬ−２  ｃｏｎｃ）  ｖｓ．  Ｌｏｇ１０（ＧＡ  ｃｏｎｃ）の目視による検査；
２．  クックの当該技術において知られる距離統計（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃ）のような回帰影響診断（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；
３．  いくつかの潜在的な直線範囲を定義するキャリブレーション曲線について計算された精度および正確度の値の変異を評価することにより、相関の直線性の目視による評価が提供された。選択された直線範囲１〜２５μｇ／ｍｌの内側での相関が非直線性であるという証拠はなかった。  
実験２Ｅ：ＧＡ  ＲＳ標準曲線に関する評価基準の決定
ＧＡ  ＲＳキャリブレーション曲線から導かれ、直線範囲の中で選択された限界（１−２５μｇ／ｍｌ）内に適合していた、バリデーションパラメータは以下であると決定された：  
１．  この研究における各プレートの、Ｌｏｇ１０  （ＩＬ−２  ｃｏｎｃ）からＬｏｇ１０  （ＧＡ  ｃｏｎｃ）への直線回帰適合のＲ２；
２．  これらの直線適合（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｌｉｎｅ  ｆｉｔｓ）のための傾き（Ｓｌｏｐｅｓ）および切片（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｓ）
３．  各々のプレートに関して各々のキャリブレーションポイントで計算された正確度；および
４．  すべてのプレートのために各々のキャリブレーションポイントで計算された精度。  
正確度および精度を計算するために、それぞれのキャリブレーション曲線を使用してＩＬ−２濃度の値を与えるＧＡ濃度をキャリブレーション（逆算）した：  
Ｘｉ−ｂａｃｋ＝１０（ｌｏｇ１０（ＩＬ−２Ｃｏｎｃ）ｉ−α）／β
ｉ＝１、２、３−トリプリケートインデックス。  
使用された（不）正確度の基準的尺度（ｂａｓｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅ）は、トリプリケートサンプルにおいて、濃度の推定の平均値と真の濃度との間の、パーセント相違（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）であった：  
不正確度（ｉｎａｃｃｕｒａｃｙ）＝（［平均値（Ｘｉ−ｂａｃｋ）−ＧＡ  ｃｏｎｃ．］／ＧＡ  ｃｏｎｃ．）＊１００％。  
使用された精度の基準的尺度は、濃度のトリプリケート推定値の相対標準偏差（ＲＳＤまたはＣＶ）であった：  
精度＝ＣＶ（（Ｘｉ−ｂａｃｋ）＝［Ｓｔｄ．Ｄｅｖ．（Ｘｉ−ｂａｃｋ）／平均値（Ｘｉ−ｂａｃｋ）］＊１００％  
分析のゴールは、方法の正確度および精度が適切であったことを保証する、適合させたキャリブレーション曲線のための受諾判定基準を提案することであった。受諾判定基準は、ＧＡ  ＲＳキャリブレーション曲線のＲ２および傾きに基づいていた。小さい不正確度値（＜１３％）および良好な（ｇｏｏｄ）精度（１．１％〜６．７％）によってプレートの約８０％を特徴付けることができた。  
これらの１６の「行儀のよい（ｗｅｌｌ  ｂｅｈａｖｅｄ）」標準曲線に関して、以下の結果が得られた：  
１．  高いＲ２値（＞０．９８）；
２．  用量反応相関を反映している、比較的高い傾きの値（１６枚のうち１５枚のプレートにおいて＞０．７８）。  
キャリブレーション曲線の大部分が比較的高いＲ２（平均＝０．９９）および比較的急な傾き（平均＝０．８７）によって特徴づけられていたので、〔除外されたプレートが比較的低いＲ２（平均＝０．９４）及びかなり平坦な傾き（平均＝０．７２）の両方を持っていたのとは対照的に〕、キャリブレーション曲線のための総合的な受諾判定基準はＲ２および傾きに関して考慮された。承認パラメータを定義する簡単な規則は、傾きとＲ２とで別々のカット−オフポイントの計算に基づいており、拒絶された曲線のための最大値（ｍａｘ＿Ｒ２＝０．９５  ｍａｘ＿傾き＝０．７７）と承認された曲線のための最小値（ｍｉｎ＿Ｒ２＝０．９８  ｍｉｎ＿傾き＝０．７７）との間の中途（ｍｉｄ−ｗａｙ）にそれらの位置を定めた。したがって、受諾判定基準は以下の通り導かれた：  
１．  Ｒ２≧０．９７；
２．  傾き≧０．７７。
【００２８】
これらの評価基準は、ＧＡ濃度の範囲１〜２５μｇ／ｍｌの中でキャリブレーション曲線に適合させるために、少なくとも５つの異なった（トリプリケート）濃度に適用された。さらに、切片の値の範囲は１．４２〜１．７８の間にあり、平均＝１．５８であった。この範囲は、１６の適格な（ｅｌｉｇｉｂｌｅ）及び５つの除外されたプレートに関して類似していた。  
正確度および精度を、各曲線のために、およびプレート上の各濃度のために計算した。また、これらの個別値（各曲線と濃度のための）も下記の要素に対して平均された：  
１．  それぞれの曲線に関する異なった濃度；
２．  それぞれの濃度に関する異なった曲線；および
３．  全ての曲線および濃度。  
これに関連した結論は次のようなことであった、直線範囲１〜２５μｇ／ｍｌで少なくとも５つの異なるキャリブレーションポイントに基づいたＧＡ  ＲＳキャリブレーション曲線に対して、キャリブレーション曲線がＲ２  ≧０．９７および傾き≧０．７７であるように制限された場合、結果として生じた平均の正確度および精度は以下のように推定された：  
１．  この方法に関する平均正確度値（±ＳＤ）は、８．０％±２．３％であった  
２．  この方法に関する平均精度値（±ＳＤ）は２．９％±１．７％であった。    
二重測定に基づくＧＡ  ＲＳキャリブレーション曲線の信頼性評価（Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）
アッセイの正確度および精度の記述統計の比較を、それぞれのキャリブレーションポイントで二重測定を用いて適合したＧＡ  ＲＳキャリブレーション曲線の信頼性を評価するために実施した。加えて、個々の正確度および精度の値（各々の曲線および濃度に関する）を、二重測定のすべての３つの可能な選択に関して（特定のトリプリケートに由来する）、研究した。前のセクションに記載された受諾判定基準を満たす及び規定された直線範囲１〜２５μｇ／ｍｌの限界内で適合された、それらの曲線に集中する（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ）場合、トリプリケート測定がいくつかの理由で用意することができないとき、二重測定によって首尾よくそれの代用にできることは明白であった。  
【表５】
2005511060.tif 000015
【００２９】
トリプリケートに基づく方法の平均（±ＳＤ）正確度および精度は、それぞれ８．０％±２．３％および２．９％±１．７％であった（表５）。  
二重測定に基づく方法の平均（±ＳＤ）正確度および精度は：  
１．  正確度：８．１％±２．８％；  精度：２．５％±１．７％；
２．  正確度：８．０％±２．５％；  精度：２．９％±２．１％；および
３．  正確度：８．４％±２．８％；  精度：２．４％±１．５％。  
実験２Ｆ：統計的な相関の決定
この方法の平均（不）正確度（ｔｈｅ  ｍｅａｎ  （ｉｎ）  ａｃｃｕｒａｃｙ）は、８．０％（ＳＤ＝２．３％）であることが分かった。目的は２つのｌｏｇ（用量）−ｌｏｇ（反応）直線の新しいＧＡバッチ  ＶＳ．  ＧＡ  ＲＳの傾き比較のための信頼できるテストを開発することであった。前記テストは、上記の方法の（不）正確度を考慮に入れたものであった。この方法の平均（不）正確度のための概算９５％個体許容領域（ｔｈｅ  ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ  ９５％  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｒｅｇｉｏｎ）の最大限界は、閾値として利用された：平均値＋２＊ＳＤ＝１２．６％。したがって、前記範囲±１２．６％内の変化は非有意（ｎｏｎ−ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）であると考えられた。  
β＊（バッチ線の傾き）、β（標準線の傾き）及び許容された最大の（不）正確度の値の間にある相関の完全な数学的な説明は後に続く。一般性を失うことなく、β＊  ＞βのケースのみ、詳細が証明される（既存の対称による、β＊  ＜βが明白であるケースに関する証明の拡大）。特定のｌｏｇ（反応）のための逆算された用量値は、以下のものであった：  
Ｘｉ−ｂａｃｋ＝  １０（Ｙ−α）／β、式中のＹ＝ｌｏｇ１０（ＩＬ−２濃度）。  
（不）正確度の計算のための式は、以下のものであった：  
（不）正確度＝［（１０（Ｙ−α）／β−Ｘｔｒｕｅ）／Ｘｔｒｕｅ］＊１００％。  
ＹｌｏｗとＹｈｉｇｈは、±１２．６％の最大許容（不）正確度によって容認される最低および最大のｌｏｇ（反応）値であった。  
したがって、傾きの同等性（ｅｑｕａｌｉｔｙ）の仮説が承認される領域は、以下の通りであった。  
【数７】
2005511060.tif 000016
【００３０】
直線（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｌｉｎｅ）の傾きは、以下の通りである：  
β＊  ＝（Ｙｈｉｇｈ−Ｙｌｏｗ）／（ｌｏｇＸ２−ｌｏｇＸ１）＝［β・ｌｏｇ（［Ｘ２／Ｘ１］・［１．１２６／０８．７４］）］／ｌｏｇ（Ｘ２／Ｘ１）
β＝［β・ｌｏｇ（１．２８８）］／ｌｏｇ（Ｘ２／Ｘ１）＝β・（１＋ｌｏｇ（１．２８８）／ｌｏｇ（Ｘ２／Ｘ１））
特定のケースとしてＸ２／Ｘ１＝２（５および１０μｇ／ｍｌの用量レベルに関して）であると仮定して、β＊は以下の通り計算された：  
β＊＝β・（１＋ｌｏｇ（１．２８８）／ｌｏｇ２）＝β・１．３６５
この結果とβ＊＜βの対称のケースが得られたものとを組み合わせ、限界が以下のとおり計算された：  
【数８】
2005511060.tif 000017
【００３１】
特定のデータにおいて、全ての傾き値は、適合している臨界限界（ｔｈｅ  ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｉｍｉｔｓ）内であり、並行性仮定（ｔｈｅ  ｐａｒａｌｌｅｌｉｓｍ  ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ）からの偏差が観測されなかったことを意味している。  
バッチがいったん統計的に有効（ｖａｌｉｄ）であると承認されると（直線性および並行性の存在が立証された）、試験標本のスタンダードと比較した強度比（ｐｏｔｅｎｃｙ  ｒａｔｉｏ）が推定された。  
これは、データに対して直線の平行線を適合させること及びそれらの間の水平距離を決定する平行線アッセイによって行われた：  
【数９】
2005511060.tif 000018
【００３２】
式中ρは強度を表し、ＹＳ、ＹＴ、ＸＳ、ＸＴはそれぞれスタンダードおよび試験標本の平均のｌｏｇ（反応）およびｌｏｇ（用量）であった。Ｂは、スタンダードおよび試験のｌｏｇ（用量）−ｌｏｇ（反応）線に関する共通の傾きであった。共通の傾き−Ｂの最小２乗推定値は、別々に標準線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｌｉｎｅ）および試験線（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）からの２つの傾きの最小２乗推定値の加重平均であった。上記の式の真数を取ることで、そのスタンダードと比較した、試験標本の「真の％強度」の点推定値を得ることができた：  
【数１０】
2005511060.tif 000019
【００３３】
［実施例３］  実施例１の標準手順のバリデーション
以下に提示された分析の目標は、ＧＡバッチの相対強度のためのバリデートされた放出の規格（ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）を確立することであった。統計的推測（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ）に基づく以下の評価基準が満たされた場合、ＧＡバッチは有効であると考えられた：  
１．  バイオアッセイ分析アプローチにかかわる仮定に違反（ｖｉｏｌａｔｉｏｎｓ）はない：  
（ａ）ｌｏｇ（反応）の独立性（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）および正常性（ｎｏｒｍａｌｉｔｙ）；
（ｂ）ｌｏｇ（反応）の分散の均等性（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）；
（ｃ）アウトライアーなし；
（ｄ）並行性（スロープ比率テストの非有意）；
２．  相対強度の点推定値は、事前に指定された範囲：８０％〜１２５％内であった；および
３．  「真の相対強度（ｔｒｕｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ）」値に関する９５％信頼限界は、より広い既定の信頼範囲（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｒａｎｇｅ）：７０％〜１４３％内であった。  
モデルは、スタンダードおよび試験標本が、あたかも一方が他方の単純な希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）であるかのように振舞うべきであることを仮定した。  
このことは、２つの標本のｌｏｇ（用量）−反応線（ｔｈｅ  ｌｏｇ  （ｄｏｓｅ）−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｌｉｎｅｓ）が、直線性および並行性から有意に逸脱すべきでないことを意味している。したがって、これらの直線間の一定の水平移動の真数は、強度比の推定として利用することができた。これらの２つの要件（直線性および並行性）が、アッセイの有効性の概念を構成した。  
有効性のチェックは、相対強度及びその信頼限界の推定に対する必須条件であった。  
偶然誤差の推定が、相対強度の真値の信頼限界の計算に必要であった。この測定は、「分散分析」（ＡＮＯＶＡ）として知られている統計的手法の実施によって得られた。したがって、ＡＮＯＶＡの古典的な統計的な仮定は、満たされなければならない。平行−線バイオアッセイモデルの統計的分析のための必要条件（ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）は以下の通りであった：  
１．  反応は、それらの期待値について独立に正規に分布した；
２．  反応の分散は、平均反応値によって影響されなかった；
３．  アウトライアーが存在しなかった；
４．  ｌｏｇ（用量）と反応との間の相関は、用量の範囲上の直線で表すことができた；および
５．  試験標本の直線は、スタンダードのそれと平行であった。  
バッチ分析データは、異なった日に異なったオペレータによって実施された異なった実験から得られた。実施例１の標準手順のバリデーション試験は一連の実験により実行され、各々は以下を伴っていた：  
１）２５０μｇのＧＡ  ＲＳ（ＣＦＡ中）によるマウスの免疫；
２）免疫に続く９〜１１日のＬＮ細胞からの初代培養の調製；
３）様々な濃度のＧＡ  ＲＳと及び試験サンプルとともに行われるＬＮ細胞のインキュベーション；
４）培養液の収集とＥＬＩＳＡによるＩＬ−２レベルの分析；
５）１〜２５μｇ／ｍｌの６つの用量レベルで得られた、トリプリケートのＩＬ−２測定値に基づいてＧＡ  ＲＳ曲線をプロットすること；
６）直線範囲（５および１０μｇ／ｍｌ）内の２つの濃度でのＲＳバッチ（トリプリケート）への反応に対する各試験サンプルのＴ細胞応答の比較。また、トリプリケート間の変異性に関連している任意の問題を検出するため、各トリプリケートの％ＣＶを計算した（通常、トリプリケート間の％ＣＶは１０〜１５％を超えるべきではない）。与えられたデータに関しては、条件の違反は検出されなかった。  
分析手法の性能に関する総合的な知識を提供するのに使用されたバリデーションの特性は：直線性、範囲、正確度、精度、特異性および頑健性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）であった。バリデーション評価基準および分析は、ＩＣＨコンセンサスガイドライン、「分析手法の妥当性：方法論」、１９９６年１１月（ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／２８１／９５）に基づいた。  
「ヨーロッパ薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）」ガイドラインで推薦される統計的方法が、分析目的に関して与えられたデータに適合された。  
実験３Ａ：直線性および範囲
各インビトロ試験において、ＧＡ  ＲＳバッチの用量−反応曲線を使用して、細胞の試験したサンプルに対する相対反応（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を計算した。各キャリブレーション曲線は、少なくとも５ポイント（ゼロのない）を含んでいた。開発およびバリデーション段階の間に行われた、異なったインビトロ試験からの２１キャリブレーション曲線が、各プレートについてプロットされ、評価された。  
データの統計的分析は、ｌｏｇ１０（ＩＬ−２濃度）対ｌｏｇ１０（ＧＡ  ＲＳ濃度）のプロットが最も良く直線的に適合したことを明らかにした。直線範囲は、目視検査と、キャリブレーションポイントの正確度および精度の評価とによって主に現れた（ｅｍｅｒｇｅｄ）。トリプリケート間の変異性に関連している任意の問題を検出するため、各トリプリケートの％ＲＳＤを計算した（通常、トリプリケート間の％ＲＳＤは１０〜１５％を超えるべきではない）。ＧＡ  ＲＳ曲線の範囲は、１〜２５μｇ／ｍｌの間で特定された。  
これらの分析に基づいて、ＧＡ  ＲＳ曲線は、少なくとも６つのキャリブレーションポイント、１つは濃度ゼロ（ネガティブコントロール）から、および１〜２５μｇ／ｍｌの間の範囲における少なくとも５つの濃度のＧＡ  ＲＳから、構成されるべきである。ｌｏｇ１０（ＩＬ−２濃度）に対するｌｏｇ１０（ＧＡ  ＲＳ濃度）の直線回帰は、Ｒ２≧０．９７および傾き≧０．７７を有するべきである。  
実験３Ｂ：正確度
この方法の正確度は、ＧＡ  ＲＳ曲線の指定された直線範囲と交差（ａｃｒｏｓｓ）して達成された。データの統計的分析は、この方法の平均値正確度が８．０％±２．３％であることを明らかにした。  
実験３Ｃ：精度
使用された精度の基準的尺度（ｂａｓｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅ）は、濃度のリプリケート（通常はトリプリケート）推定値の相対標準偏差（ＲＳＤ）であった。  
ＲＳＤはＧＡ  ＲＳ曲線の直線範囲と交差して達成された。  
データの統計的分析は、この方法の平均値精度が２．９％±１．７％であることを明らかにした。二重測定の信頼性は、トリプリケートのものと同等であった。それゆえ、３つのリプリケートの１つがアウトライアーとして特定されたとき、該アウトライアーが無視（ｏｍｉｔｔｅｄ）され、二重測定の結果が承認された。  
実験３Ｄ：方法の反復性（ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ）
ＧＡ  ＤＳバッチへのＧＡ特異的なＴ細胞応答は、同じインビトロ試験で、３回繰り返して測定された。同じバッチの３つの重量を、それぞれ５および１０μｇ／ｍｌに希釈して、ＧＡ特異的Ｔ細胞とインキュベートした。試験サンプルの及びＧＡ  ＲＳサンプルの培養液の中のＩＬ−２のレベルは、ＥＬＩＳＡでトリプリケートに測定された。各リプリケートに対する細胞の％強度および９５％信頼限界は、ＧＡ  ＲＳと比較して計算された。表６は、各リプリケートに関して計算された％反応を示す。  
【表６】
2005511060.tif 000020
【００３４】
実験３Ｅ：中等度精度（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）
ＧＡ  ＤＳバッチの％反応は、３つの異なったインビトロ試験で、異なった日に、同じ実験室の３人の異なった研究者によって試験された。表７に、このバッチのために３回の繰返し実験で決定した％強度と９５％信頼限界とを要約する。  
【表７】
2005511060.tif 000021
【００３５】
実験３Ｆ：方法の再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）
この方法の再現性は、研究室間での研究の平均によって評価された。％反応  ＧＡ  ＤＳバッチは、２つの異なった実験室で、異なった分析者、機器、および試薬を用いて実施される２つの異なった実験でテストされた。表８に両方の実験室の結果を要約する。  
【表８】
2005511060.tif 000022
【００３６】
上記の実験に基づいて、インビトロ試験が再現可能であると結論づけることができる。  
実験３Ｇ：特異性
この方法の識別（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）は３つのレベルでテストされた：  
１）ＧＡ  ＲＳの有／無でインキュベーションされたサンプルの間の識別（マトリックス効果）；
２）ＧＡ  ＲＳと、ＧＡ  ＤＳを含む他の関連する及び非関連のタンパク質およびペプチドとの間の識別；並びに
３）ＧＡ  ＲＳと、ペプチド配列が意識的に修飾されたＧＡ関連のコポリマーとの間の識別。  
ｉ）ＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞（マトリックス効果）によるＧＡ  ＲＳの認識
ＧＡ特異的Ｔ細胞は、ＣＦＡ中の２５０  ｇのＧＡ  ＲＳによる雌（ＳＪＬｘＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスの免疫によって引き起こされた。この用量のＧＡは、このマウス系統でＥＡＥブロッキングテストを用いて、ＧＡバッチの生物活性をテストするのに通常使用されている。この実験におけるコントロール群は、ＣＦＡ単独を注射された。  
免疫１０日後、ＬＮ細胞を両群のマウスから除去した。細胞をＧＡ  ＲＳと共に５％ＣＯ２  加湿恒温器により３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。  
次に、培養物を遠心分離し、上清を採取し、そして、検出のためにＩＬ−２に特異的なビオチン化抗体とストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲートとを用いるＥＬＩＳＡで、インターロイキン−２（ＩＬ−２、活性化Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン）をアッセイした（図１）。各々のプレートラン（ｐｌａｔｅ  ｒｕｎ）には、ブランクコントロール（サイトカインスタンダードを含まない１次および２次抗体）を含めた。また、各々のプレートランには、品質管理（ＱＣ）のサンプル（アッセイの直線範囲中のサイトカインスタンダードの３濃度）を含めた。各インビトロ試験には、ポジティブコントロール（Ｃｏｎ  Ａ、非特異的Ｔ細胞刺激因子）およびネガティブコントロール（ＧＡおよび他のいかなる抗原もない）を含めた。図２は、コントロール・マウスのＬＮ細胞は培養中ＧＡ  ＲＳに応答しないが、ＧＡ  ＲＳで免疫されたマウスのＬＮ細胞は培養中ＧＡ  ＲＳに反応して用量依存的にＩＬ−２を分泌することを示す。通常、ネガティブコントロールサンプルのＩＬ−２のレベルは、ＥＬＩＳＡの検出限界（およそ３ｐｇ／ｍｌ）未満か又はそれに近似する。これらのＩＬ−２レベルは、常にＧＡ  ＲＳ（１μｇ／ｍｌ）の最小キャリブレーションポイントによって分泌されるレベル未満である。これらの結果は、ＧＡ特異的Ｔ細胞によるＩＬ−２の分泌がＧＡ依存的であることを示す、  
ｉｉ）関連および非関連の抗原間の識別
関連および非関連の抗原（タンパク質および単一のペプチド）間の識別は、ＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞の様々な抗原に対する応答をインビトロで試験することによって示された。ＬＮ細胞の初代培養は、９〜１１日前にＣＦＡ中の２５０μｇのＧＡ  ＲＳで免疫された雌（ＳＪＬｘＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスに由来した。初代培養は、５％ＣＯ２の加湿インキュベータで３７℃でＧＡ  ＲＳと及び他の様々な抗原とともに一晩インキュベートされた。次に、培養物を遠心分離して、上清を採取し、実験３Ｇ（ｉ）のようにＥＬＩＳＡでＩＬ−２をアッセイした。  
表９は、この実験システムでは、ＧＡ特異的Ｔ細胞が、ヒトＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）、ＭＢＰ免疫優性ペプチドｐｐ．８７−９９（脳炎誘発性のペプチド）、またはその類似物ｐｐ．８７−９９Ａｌａ９６（ＥＡＥ抑制ペプチド）の何れとも反応しなかったことを示す。  
また、リゾチーム（非関連の塩基性タンパク質）は、ＧＡ特異的Ｔ細胞によって認識されなかった。ＴＶ−３５およびＴＶ−１０９は、それぞれ分子量３７５７および１１７２７の分子量を有するペプチドであった（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ００／１８７９４）。これらのペプチドは、ＧＡと同じモル比で、ＧＡと同じ４つのアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ）から構成される特定配列を有していた。ＧＡ  ＲＳ特異的なＬＮ細胞は、ＴＶ−３５とは反応せず、またＴＶ−１０９とは非常に低い交叉反応性を有していた。ＧＡ  ＲＳでの免疫が、ＧＡに存在する複数のＴ細胞エピトープに対して異なった特異性を有する、Ｔ細胞の混合物の形成を誘導したという観察によって、これらの結果を説明することができる。ＴＶ−３５およびＴＶ−１０９はＧＡと共通の配列を共有し得る、しかし、ＧＡ特異的Ｔ細胞を単独のペプチドでインキュベーションすることは、おそらく培養中のＧＡ特異的細胞の少ない割合に僅かな部分的な刺激を引き起こしたであろう。したがって、全体的なＴ細胞応答（ＩＬ−２の分泌）は、検出限界未満か又はそれに近似するものであった。  
【表９】
2005511060.tif 000023
【００３７】
インビトロ試験は、ＧＡバッチの平均分子量（ＭＷ）に感受性があった。図１１は、ＧＡ  ＲＳ  特異的な細胞のＧＡ  ＲＳ（ＭＷ＝７９００）への及び平均ＭＷの異なるＧＡ  ＤＳバッチへの応答を示す。見られるように、一般に応答は、平均ＭＷに関連する；平均ＭＷが高いほど、反応は大きくなる。しかしながら、平均ＭＷのＧＡ  ＤＳの放出の規格は４７００〜１００００の間であること、また同様なレベルのＩＬ−２が規格内の平均ＭＷを有するＤＳバッチに応答して分泌されたことに注目すべきである（図１１）。これらの結果は、この方法がＧＡに非常に特異的であり、ＧＡの平均ＭＷの変化に感受性があったことを示している。
【００３８】
ｉｉｉ）ＧＡ製剤原料（ＤＳ；ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）およびＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）医薬品製剤（ＤＰ；ｄｒｕｇ  ｐｒｏｄｕｃｔ）のＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞による認識
２５０μｇのＧＡ  ＲＳ（ＣＦＡ中）による雌（ＳＪＬｘＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスの免疫後に続く９〜１１日間で、ＬＮ細胞は取りだされ、様々な用量のＧＡ  ＲＳバッチ（免疫抗原）と及びＤＳバッチと培養された  
ＩＬ−２を実験３Ｇ（ｉ）のように測定した。図１２Ａは、ＬＮ細胞が両方のスタンダードバッチと交叉反応したことを示す。両方のバッチによるＩＬ−２分泌（上記のＥＬＩＳＡによって測定された）の用量反応曲線は、類似しており、テストされたバッチが同様なＴ細胞エピトープを共有したことを示している。ＧＡ  ＲＳおよびＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）バッチの間の比較は、ＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞もＤＰバッチと交叉反応したこと、またマンニトール（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の製剤における賦形剤）がＴ細胞応答に影響または干渉しなかったことを示す（図１２Ｂ）。したがって、この方法はバッチとバッチの再現性の指標を提供する。  
ｖ）ＧＡと関連するコポリマーとの間の識別
実験３Ｇ（ｉｉ）では、それらの平均ＭＷの異なるＧＡ  ＤＳバッチを用いて、インビトロ試験がＧＡペプチドの平均ＭＷに感受性であることが示された。実験はＧＡ特異的Ｔ細胞によるＧＡの生物的認識に基づいており、特異的に直線配列（ｌｉｎｅａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に応答したので、この方法がＧＡペプチド配列の変動（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）／修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）に感受性があるだろうことが予想された。これは以下を使用することによって、示された：  
１）ＧＡを含む４つのアミノ酸のうちの３つのみから合成されたコポリマー；
２）製造条件で意図的な修飾から生じたＧＡバッチ（ＸＸ）、すなわち過剰量の遊離アミノ酸のＧＡモノマーへの合成中の添加。このバッチの平均ＭＷは、高く規格外であった（ＭＷ＝１１１５０Ｄａ）；
３）トリプシンとキモトリプシンによるタンパク質分解によって得られるＧＡ  ＲＳの分解生成物。  
表１０は、ＧＡ特異的Ｔ細胞が、リジン、アラニンまたはチロシンを欠いている３アミノ酸コポリマーに応答しなかったことを示す。  
さらに、細胞のバッチＸＸへの％応答が、比較的高く、方法の規格（１００±３０％）を超えていた、このことは方法が生産プロセスでの修飾に感受性があるかもしれないことを示している。また、示されたように、テストのＧＡペプチドのＭＷに対する感度によって、高い％反応について説明することができる。  
【表１０】
2005511060.tif 000024
【００３９】
トリプシンとキモトリプシンによるＧＡ  ＲＳタンパク質分解の速度論研究は、インビトロ試験がＧＡペプチドの分解に感受性であったことを示す。図１３と１５は、細胞によるＩＬ−２の分泌がタンパク質分解時間に応じて減少し、タンパク質分解されたペプチドへの細胞の％強度が、この方法の規格を超えていた（１００±３０％）ことを示す（表１１）。分解サンプル（図１４と１６）のオーバレイクロマトグラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、それぞれトリプシンとキモトリプシンのタンパク質分解の動態を示した。すべての特異性研究の累積結果は、この方法がＧＡに対して非常に特異的であり、ＧＡと密接に関連する抗原とを識別したことを明らかにした。  
【表１１】
2005511060.tif 000025
【００４０】
実験３Ｇ：頑健性（Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）
ｉ）受諾判定基準の頑健性
定義された受入基準の一貫性および頑健性は、繰り返されたＧＡバッチから得られる相対強度の推定を比較することによって、調べられた。バッチ分析データは、多くの繰り返されたＧＡバッチを含んでいた。２つのバッチは、異なった３日間に異なったオペレータによって測定された。また、１つのバッチが異なった２日間に、異なったオペレータによってテストされた  
繰り返されたＧＡバッチの並行性試験において、すべてのＧＡバッチの傾きの値は、並行性スロープ比率試験のための適切な臨界限界内であった。すべてのＧＡバッチが９５％の信頼限界に従った相対強度値の点推定値のための受入基準を満たした（推定された％強度は８０％〜１２５％の限界内であり、また９５％信頼限界は７０％〜１４３％の範囲内であった）。繰り返されたＧＡバッチの分析データに関して、それらの有効性（ｖａｌｉｄｉｔｙ）は実験日やテストを行ったオペレータによらなかった。このデータは、確立した規格の頑健性を支持する。  
ｉｉ）免疫手順およびインビトロ反応のクリティカルパラメータの頑健性
免疫手順およびインビトロ反応の両方のクリティカルパラメータの頑健性が、評価された。簡単に、以下のことが示された：  
１）ＬＮ細胞の免疫応答はＧＡ  ＲＳの免疫量によって影響されなかった；
２）免疫期間は９〜１１日間であった；
３）ＧＡ  ＲＳへのＬＮ細胞の反応は、脾臓細胞反応と比べて、より高かった；
４）ＧＡ  ＲＳ＋ＣＦＡによる免疫は、ＩＣＦＡによる免疫と比較して強い応答を有するＬＮ細胞を生じた；
５）培養液における血清の存在は、強くＧＡ特異的Ｔ細胞応答に影響し、その結果、インビトロ反応は無血清培地で実施された；
６）培養液を集めるための最適時間フレーム（ｏｐｔｉｍａｌ  ｔｉｍｅ  ｆｒａｍｅ）は、ＧＡ  ＲＳと試験サンプルとのインキュベーションに続く１８〜２１時間であった；および
７）培地を、ＥＬＩＳＡでテストする１週間前までは−２０℃で保つことができる。  
かくして、この方法が頑健であることが示された。  
相対強度の点推定値および９５％の信頼限界に関するサマリー統計
平均相対強度に関する９５％許容限界（Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｌｉｍｉｔｓ）
新しいバッチの推定された相対強度の受託限界（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｌｉｍｉｔｓ）を評価するため、個々のｌｏｇ（強度）の推定値の平均および標準偏差が計算された：  
平均値（Ｍｉ）＝０．００７４；
ＳＤ（Ｍｉ）＝０．０４０２．
分析データに基づく、平均相対強度値に関するおおよその９５％許容範囲は以下の通りであった：  
［１０  Ｍｅａｎ（Ｍｉ±２＊ＳＤ（Ｍｉ）］＊１００％＝［８４％，１２２％］．  
相対強度の９５％信頼限界の範囲
個々の相対強度の推定値に関する９５％信頼限界の最小および最大値は以下の通りであった：  
最小（下限）＝７９．３％
最大（上限）＝１４７．３％
受諾判定基準の充足（Ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ）
分析に基づいて、受諾判定基準を以下のように決定した：  
１．  １．バイオアッセイ分析アプローチにかかわる仮定を満たす、すなわち：  
ａ．  ｌｏｇ（反応）の独立性（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）および正常性（ｎｏｒｍａｌｉｔｙ）；
ｂ．  ｌｏｇ（反応）の分散の均等性（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）；
ｃ．  アウトライアーなし；および
ｄ．  並行性（スロープ比率テストの非有意）。  
２．  ２．  推定された相対強度は、標準強度の８０％以上、１２５％以下であった；および
３．  推定される相対強度の誤差の９５％信頼限界は、標準強度の７０％以上、１４３％以下であった。  
実施例３の考察
インビトロ試験のバリデーションは、この方法が再現可能であること並びに正確度および精度の平均は許容できる範囲にあることを明らかにした。この方法は、ＧＡペプチドに非常に特異的であって、作用物質の品質に感受性があった。  
概要および考察
インビトロ法はＧＡ  ＤＳおよびＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）バッチのために開発された。  
この方法はＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞によるＴ細胞エピトープ（直線配列）の生物学的認識に基づいていた。ＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞は、培地中のＧＡに反応してＴｈ０サイトカインを分泌する。この方法では、Ｔ細胞によるＧＡバッチの認識は、ＥＬＩＳＡで培養液のＩＬ−２のレベルを測定することによって、モニターされる。ＧＡ  ＲＳ特異的Ｔ細胞がＤＳおよびＤＰバッチの両方と交差反応することは、これらのバッチがＲＳバッチと類似配列を共有することを示しており、またマンニトール（ＤＰ製剤における賦形剤）が反応に干渉しないことが示された。  
前記方法は、ＧＡペプチドに非常に特異的であり、ペプチド混合物の平均ＭＷに感受性がある。ＭＢＰは、ＧＡ特異的Ｔ細胞によって認識されなかった。ＭＢＰ免疫優性ペプチド（脳炎誘発性と抑制型ペプチドの両方）、同様にＧＡのものと類似するアミノ酸組成を有する単一ペプチドは、Ｔ細胞を刺激しなかった。免疫手順における、同様にインビトロ反応におけるクリティカルパラメータは、この実験の間に最適化された。この実験は、前記方法が非常に再現性があり、頑健であることを示した。  
前記方法は、薬学的組成物における使用に関して、他のＴ細胞抗原を標準化するために適用することができる。ＧＡ  ＲＳの代わりに抗原ＲＳに特異的なＴ細胞の初代培養は、抗原ＲＳに対して免疫された動物から作出することができる。この培養物の、抗原ＲＳに応答した及びサンプル抗原に応答したサイトカイン産生は測定可能である。抗原ＲＳに応答したサイトカイン産生を、抗原ＲＳ濃度に対してプロットして標準曲線を作成することができる。サンプル抗原に応答したサイトカイン産生を、その抗原が許容できる強度範囲内にあるかどうかを決定するために、標準曲線と比較することができる。  
モニターするために最適なサイトカインは、実験２Ａのように決定することができる。免疫およびインビトロ試験のための条件は、実験２ＢおよびＣのように最適化し得る。
【参照文献】
【００４１】
2005511060.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１：ＧＡ  ＲＳ（参照スタンダード）での免疫化ＬＮ細胞の初代培養ＥＬＩＳＡによるＩＬ−２検出
【図２】図２：ＧＡ−特異的なＴ細胞の誘導。２５０μｇのＧＡ  ＲＳ＋ＣＦＡまたはＣＦＡ単独で免疫したマウスに由来するＬＮ細胞の初代培養を、ＧＡ  ＲＳの増加濃度（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）の存在下で培養した。３７℃での一晩のインキュベーション後、培養液を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２に関してアッセイした。
【図３】図３：血球計算器の図
【図４】図４：免疫プロトコールの最適化  ―  培養供給源およびＧＡ  参照スタンダード（ＲＳ）用量効果。リンパ節（ＬＮ）および脾臓細胞の初代培養は、１０または２５０μｇのＧＡ  ＲＳ＋完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で免疫したマウスから由来した。細胞をＧＡ  ＲＳの増加濃度の存在下で培養した。３７℃での一晩のインキュベーション後、培養液を採取し、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によりＩＬ−２に関してアッセイした。
【図５】図５：免疫プロトコールの最適化  ―  アジュバントおよび用量効果２５０μｇのＧＡ  ＲＳ＋ＣＦＡで又は１０ｍｇのＧＡ  ＲＳ＋不完全フロイントアジュバント（ＩＣＦＡ）で免疫したマウスに由来するＬＮ細胞の初代培養を、ＧＡ  ＲＳの増加濃度（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）の存在下で培養した。３７℃での一晩のインキュベーション後、培養液を採取し、ＥＬＩＳＡによりインターロイキン―２（ＩＬ−２）に関してアッセイした。
【図６】図６：免疫期間の効果マウスを２５０μｇのＧＡ  ＲＳ（ＣＦＡ中）で免疫し、ＬＮを９、１０および１１日後に除去した。異なるグループからのＬＮ細胞の、様々な濃度のＧＡ  ＲＳに対する反応を、インビトロにおいてＩＬ−２分泌をＥＬＩＳＡで測定することにより試験した。
【図７】図７：ＧＡ−特異的なＴ細胞応答における培養液の効果ＬＮ細胞の初代培養を、１％正常マウス血清（ＮＭＳ）、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）または規定された細胞培養液（ＤＣＣＭ１；ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）の何れかを含有している異なる培養液で培養した。細胞をＧＡ  ＲＳの増加濃度で２１時間、３７℃でインキュベートした。次に、培養液を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２に関してアッセイした。
【図８】図８：ＧＡ  ＲＳに応答したＩＬ−２分泌の速度論（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）。ＬＮ細胞の初代培養を２５０μｇのＧＡ  ＲＳ＋ＣＦＡで免疫したマウスから調製した。細胞を０、０．５、２．５および５μｇ／ｍｌのＧＡ  ＲＳで３７℃で明示したインターバルでインキュベートした。各タイムポイントで、５Ｘ１０６細胞のアリクウォットを遠心し、上清を−２０℃に維持した。全てのサンプルをＩＬ−２に関してＥＬＩＳＡで同時にアッセイした。
【図９】図９：培養液中でのＩＬ−２の安定性。ＬＮ細胞の初代培養を２５０μｇのＧＡ  ＲＳ＋ＣＦＡで免疫したマウスから調製した。細胞を様々な濃度のＧＡ  ＲＳと３７℃でインキュベートした。一晩インキュベーションした後、上清を採取し、２つのアリクウォットに分けた。第一のアリクウォットをＥＬＩＳＡで即時にアッセイし、第二をアッセイする前に７日間、−２０℃で保持した。
【図１０】図１０：ＧＡ  ＲＳ溶液の−２０℃での安定性。１ｍｇ／ｍｌのＧＡ  ＲＳ溶液を調製し、アリクウォットに分け、そして−２０℃で保持した。
【００４３】
ＧＡ特異的細胞のＧＡ  ＲＳ溶液に対する用量反応をゼロ時間（第１日）および５ヶ月後（−２０℃で）に試験した。
【図１１】図１１：ＧＡ  ＲＳ−特異的Ｔ細胞応答における平均分子量（ＭＷ）の効果。ＬＮ細胞の初代培養を２５０μｇのＧＡ  ＲＳ＋ＣＦＡで免疫したマウスから調製した。細胞を、異なる分子量のＧＡ  ＲＳの及びＧＡ製剤原料（ＤＳ；Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の２つの異なる濃度の存在下で培養した。３７℃での一晩のインキュベーション後、培養液を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２に関してアッセイした。
【図１２Ａ】図１２（Ａ）：ＧＡ  ＲＳ−特異的Ｔ細胞のＧＡ  ＤＳおよび製剤（ＤＰ；Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）バッチとの交差反応性。ＬＮ細胞の初代培養を２５０μｇのＧＡ  ＲＳ＋ＣＦＡで免疫したマウスから調製した。  ＧＡ  ＲＳ−特異的Ｔ細胞の、別のＧＡ  ＤＳバッチ（図１２Ａ）に対する反応を、ＧＡ  ＲＳバッチに対する反応と比較した。培養液におけるＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡで測定した。
【図１２Ｂ】図１２（Ｂ）：ＧＡ  ＲＳ−特異的Ｔ細胞のＧＡ  ＤＳおよび製剤（ＤＰ；Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）バッチとの交差反応性。ＬＮ細胞の初代培養を２５０μｇのＧＡ  ＲＳ＋ＣＦＡで免疫したマウスから調製した。  ＧＡ  ＲＳ−特異的Ｔ細胞の、ＧＡ  ＤＰバッチに対する及びマンニトール（図１２Ｂ）に対する反応を、ＧＡ  ＲＳバッチに対する反応と比較した。培養液におけるＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡで測定した。
【図１３】図１３：トリプシンによるＧＡ  ＲＳタンパク質分解の速度論。ＧＡ  ＲＳをトリプシンにより明示したタイムポイントでタンパク質分解した。タンパク質分解されたサンプルの活性を、インビトロの強度試験で試験した。
【図１４】図１４：ＧＡの逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（トリプシンによるタンパク質分解の前後）。ＧＡ  ＲＳをトリプシンでタンパク質分解し、サンプルのクロマトグラフィープロフィールをＲＰ−ＨＰＬＣにより試験した。
【図１５】図１５：キモトリプシンによるＧＡ  ＲＳタンパク質分解の速度論。ＧＡ  ＲＳをキモトリプシンにより明示したタイムポイントでタンパク質分解した。  タンパク質分解されたサンプルの活性を、インビトロの強度試験で試験した。
【図１６】図１６：ＧＡのＲＰ−ＨＰＬＣ（キモトリプシンによるタンパク質分解の前後）。ＧＡ  ＲＳをキモトリプシンでタンパク質分解し、サンプルのクロマトグラフィープロフィールをＲＰ−ＨＰＬＣで試験した。
【図１】
2005511060.tif 000027
【図２】
2005511060.tif 000028
【図３】
2005511060.tif 000029
【図４】
2005511060.tif 000030
【図５】
2005511060.tif 000031
【図６】
2005511060.tif 000032
【図７】
2005511060.tif 000033
【図８】
2005511060.tif 000034
【図９】
2005511060.tif 000035
【図１０】
2005511060.tif 000036
【図１１】
2005511060.tif 000037
【図１２Ａ】
2005511060.tif 000038
【図１２Ｂ】
2005511060.tif 000039
【図１３】
2005511060.tif 000040
【図１４】
2005511060.tif 000041
【図１５】
2005511060.tif 000042
【図１６】
2005511060.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月30日(2004.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラチラマー・アセテートの試験バッチの強度を参照バッチの既知の強度と比較して測定するための方法であって、
ａ．雌性（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスを８および１２週齢の間に参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量で免疫することと；
ｂ．工程（ａ）のマウスから免疫後９〜１１日にリンパ節細胞の初代培養を調製することと；
ｃ．少なくとも５つの参照サンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と参照バッチからの１μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの間のグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）を別々にインキュベートすることと；
ｄ．少なくとも２つのサンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）をインキュベートすることと；
ｅ．工程（ｃ）および（ｄ）における各サンプルに関して、各サンプルの細胞により分泌されたインターロイキン―２の量を、かかるサンプルのインキュベーションの１８〜２１時間後に決定することと；
ｆ．グラチラマー・アセテートの試験バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたインターロイキン―２の量と、グラチラマー・アセテートの参照バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたインターロイキン―２の量とを、グラチラマー・アセテートの試験バッチのグラチラマー・アセテートの参照バッチと比較した強度を決定するために、相関させることと；を含み、
工程（ｃ）および（ｄ）の各サンプルの前記規定細胞数は実質的に同一であり、および試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量を含有している各サンプルに対し、参照バッチからの実質的に同一のグラチラマー・アセテートの規定量を含有している対応する参照サンプルが存在する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、６つの参照サンプルが工程（ｄ）において別々にインキュベーションされる方法。
【請求項３】
グラチラマー・アセテートの試験バッチの強度を参照バッチの既知の強度と比較して測定するための方法であって、
ａ．試験する哺乳類を参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量で免疫することと；
ｂ．工程（ａ）の試験する哺乳類からの細胞の初代培養を免疫後の規定時間に調製することと；
ｃ．少なくとも２つの参照サンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と参照バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）を別々にインキュベートすることと；
ｄ．少なくとも２つのサンプル（その各々は、工程（ｂ）の初代培養からの規定細胞数と試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量とを含有する）をインキュベートすることと；
ｅ．工程（ｃ）および（ｄ）における各サンプルに関して、各サンプルの細胞により分泌されたサイトカインの量を、かかるサンプルのインキュベーションの規定期間後に決定することと；
ｆ．グラチラマー・アセテートの試験バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたサイトカインの量と、グラチラマー・アセテートの参照バッチとインキュベーションしたサンプルにより分泌されたサイトカインの量とを、グラチラマー・アセテートの試験バッチのグラチラマー・アセテートの参照バッチと比較した強度を決定するために、相関させることと；を含み、
工程（ｃ）および（ｄ）の各サンプルの前記規定細胞数は実質的に同一であり、および試験バッチからのグラチラマー・アセテートの規定量を含有している各免疫サンプルに対し、参照バッチからの実質的に同一のグラチラマー・アセテートの規定量を含有している対応する参照サンプルが存在する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記サイトカインがインターロイキンである方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記インターロイキンがインターロイキン―２である方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記インターロイキンがインターロイキン―６である方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、前記インターロイキンがインターロイキン―１０である方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法であって、前記サイトカインがインターフェロン―ガンマである方法。
【請求項９】
請求項３に記載の方法であって、前記哺乳類はグラチラマー・アセテート参照スタンダード（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に特異的なＴ細胞を産生する方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の方法であって、前記哺乳類が齧歯類である方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記齧歯類がマウスである方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記マウスが雌（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスである方法。
【請求項１３】
請求項３に記載の方法であって、前記哺乳類が約８〜約１２週齡である方法
【請求項１４】
請求項３に記載の方法であって、前記細胞がリンパ節細胞である方法。
【請求項１５】
請求項３に記載の方法であって、前記細胞が脾臓細胞である方法。
【請求項１６】
グラチラマー・アセテートのバッチを薬学的な使用に許容されるように調製するための方法であって、
ａ．グラチラマー・アセテートのバッチを調製することと；
ｂ．請求項１に記載の方法に従ってバッチの相対強度を測定することと；および
ｃ．そのように測定された相対強度がグラチラマー・アセテートの参照バッチの８０％および１２５％の間である場合、前記バッチを薬学的な使用に許容されると認定することと；を含む方法。
【請求項１７】
薬学的な使用に許容されるグラチラマー・アセテートを調製するための方法であって、
ａ．グラチラマー・アセテートのバッチを調製することと；
ｂ．請求項３に記載の方法に従ってバッチの相対強度を測定することと；および
ｃ．そのように測定された相対強度がグラチラマー・アセテートの参照バッチの８０％および１２５％の間である場合、前記バッチを薬学的な使用に許容されると認定することと；を含む方法。
【請求項１８】
ポリペプチド（このポリペプチドの各々は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リジンから成る）の水性混合物を含有している薬学的組成物において、前記混合物は前記薬学的組成物に包含（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）するために認容できる規定強度（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ）を有し、本方法の間にポリペプチド（このポリペプチドの各々は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リジンから成る）の水性混合物のバッチを試験して、前記混合物が前記規定強度を有するかどうかを決定する、前記薬学的組成物を調製するための方法において：
ポリペプチド混合物の参照スタンダードバッチの一定量（ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｍｏｕｎｔ）で免疫後９〜１１日の雌（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスから取得したリンパ節細胞の初代培養により分泌されたインターロイキン―２の量を別々に測定することと、
ａ．  ここで、かかる細胞の規定数を含有しているサンプルは、参照スタンダードバッチの規定量の存在下でインキュベーションされる、
ｂ．  ここで、実質的に同一の規定数の細胞を含有しているサンプルは、試験されているポリペプチドの混合物のバッチの同じ規定量の存在下でインキュベーションされる；
そのように測定された、分泌されたインターロイキン―２の量を比較することと；および
前記薬学的組成物に、前記強度が参照スタンダードバッチの８０％および１２５％の間である場合のみ、そのように試験されたバッチを含ませることと；を改善点として含む方法。
【請求項１９】
ポリペプチド（このポリペプチドの各々は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リジンから成る）の水性混合物を含有している薬学的組成物において、前記混合物は薬学的組成物に包含するために認容できる規定強度を有する、前記薬学的組成物を調製するための方法であって、
ポリペプチド（そのポリペプチドの各々は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リジンから成る）の水性混合物のバッチを取得することと；
ポリペプチドの混合物の参照スタンダードバッチの一定量（ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｍｏｕｎｔ）で免疫後９〜１１日の雌（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスから取得したリンパ節細胞の初代培養により分泌されたインターロイキン―２の量を別々に測定することと、
ａ．  ここで、かかる細胞の規定数を含有しているサンプルは、参照スタンダードバッチの規定量の存在下でインキュベーションされる、
ｂ．  ここで、実質的に同一の規定数の細胞を含有しているサンプルは、試験されているポリペプチドの混合物のバッチの同じ規定量の存在下でインキュベーションされる；
そのように測定された、分泌されたインターロイキン―２の量を比較することと；および
前記薬学的組成物にバッチを、そのように測定されたその強度が参照スタンダードバッチの８０％および１２５％の間である場合のみ、含ませることと；を含む方法。
【請求項２０】
ポリペプチド（そのポリペプチドの各々は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リジンから成る）の水性混合物のバッチの強度を決定するための方法であって、
ポリペプチドの混合物の参照スタンダードバッチの一定量（ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｍｏｕｎｔ）で免疫後９〜１１日の雌（ＳＪＬＸＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスから取得したリンパ節細胞の初代培養により分泌されたインターロイキン―２の量を別々に測定することと、
ａ．  ここで、かかる細胞の規定数を含有しているサンプルは、参照スタンダードバッチの規定量の存在下でインキュベーションされる、
ｂ．  ここで、実質的に同一の規定数の細胞を含有しているサンプルは、試験されているポリペプチドの混合物のバッチの同じ規定量の存在下でインキュベーションされる；
そのように測定された、分泌されたインターロイキン―２の量を比較して、前記バッチの強度を決定することと；を含む方法。
【請求項２１】
ポリペプチド（そのポリペプチドの各々は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リジンから成る）の水性混合物が、薬学的組成物に包含するために認容できる規定強度を有するかどうかを決定するための方法であって、
ポリペプチドの混合物の参照スタンダードバッチの一定量（ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｍｏｕｎｔ）で免疫後９〜１１日の雌（ＳＪＬＸＢＡＬＩＢ／Ｃ）Ｆ１マウスから取得したリンパ節細胞の初代培養により分泌されたインターロイキン―２の量を別々に測定することと、
ａ．  ここで、かかる細胞の規定数を含有しているサンプルは、参照スタンダードバッチの規定量の存在下でインキュベーションされる、
ｂ．  ここで、実質的に同一の規定数の細胞を含有しているサンプルは、試験されているポリペプチドの混合物のバッチの同じ規定量の存在下でインキュベーションされる；
そのように測定された、分泌されたインターロイキン―２の量を比較して、前記バッチの強度を決定することと；および
そのように測定された前記強度を規定強度と比較して、前記バッチが前記薬学的組成物に含有するために認容されるかどうかを決定することと；を含む方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１の何れか１項に記載の方法であって、前記参照スタンダードバッチおよび試験されているバッチの双方がグラチラマー・アセテートを含む方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２１の何れか１項に記載の方法であって、前記参照スタンダードバッチが７０００  Ｄａの平均分子量を有しているグラチラマー・アセテートのバッチである方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、前記参照スタンダードバッチが７０００  Ｄａの平均分子量を有しているグラチラマー・アセテートのバッチである方法。
【国際調査報告】
2005511060.tif 000044
2005511060.tif 000045