(57)【要約】本発明は特定のオンコジーン経路に欠損のある癌細胞を選択的に標的とする化合物を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) TRAIL-DR5細胞死受容体経路に欠損のある癌細胞に候補化合物を接触させる段階；
b) 正常細胞に候補化合物を接触させる段階；
c) 癌細胞および正常細胞中で細胞死のレベルを決定する段階；および
d) 正常細胞と比較して癌細胞における細胞死を増加させる候補化合物を選択し、それにより化学療法耐性癌細胞に対して選択的に細胞毒性のある化合物を同定する段階、
を含む、化学療法耐性癌細胞に対して選択的に細胞毒性のある化合物を同定する方法。
【請求項２】
化学療法耐性癌細胞が非ホジキンリンパ腫細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
化学療法耐性癌細胞が、濾胞性リンパ腫細胞である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
細胞がK422細胞またはRL-7細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
化学療法耐性癌細胞がDNA傷害性薬剤に耐性である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
癌細胞がbcl-2を過剰発現する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
TRAIL-DR5細胞死受容体経路における欠損がp53の欠損である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
TRAIL-DR5細胞死受容体経路における欠損がカスパーゼ3の欠損である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
癌細胞がp53およびカスパーゼ3中に欠損を持つ、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
正常細胞に候補化合物を接触させる段階が、化合物の選択前に行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
候補化合物が、癌細胞の増殖を阻害するが正常細胞の増殖は阻害しないことについて試験される候補化合物のライブラリーのメンバーである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
TRAIL DR5アポトーシス経路に第1の欠損を持つ第1のリンパ腫から得られる第1の細胞集団を提供する段階；
第1の細胞集団に候補化合物を接触させる段階；
第1の細胞集団中の細胞死のレベルを検出する段階；
TRAIL DR5経路に第2の欠損を持つ第2の化学療法耐性リンパ腫から得られる第2の細胞集団を提供する段階；
第2の細胞集団に候補化合物を接触させる段階；
第2の細胞郡中の細胞死のレベルを検出する段階；および
1つの細胞集団のみで細胞死を増加させる化合物を選択し、それにより化学療法耐性リンパ腫の第1または第2のサブセットに選択的な化合物を得る段階
を含む、化学療法耐性リンパ腫のサブセットに対して選択的に細胞毒性である化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
リンパ腫のbcl-2レベルが上昇している、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
リンパ腫が非ホジキンリンパ腫である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
リンパ腫が濾胞性リンパ腫である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
第1の欠損がp53中の欠損である、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
p53中の欠損が4量体化ドメインの欠如または異なるアミノ酸によるCys135の置換である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
第2の欠損がカスパーゼ3中の欠損である、請求項12記載の方法。
【請求項１９】
第1の細胞集団がK422細胞を含み、かつ第2の細胞集団がRL-7細胞を含む、請求項12記載の方法。
【請求項２０】
請求項1または請求項12に記載されるようにして選択された化合物を投与する段階を含む、癌細胞を殺す方法。
【請求項２１】
有効量のスタウロスポリンアナログを投与する段階を含む、p53に欠損を持つ化学療法耐性リンパ腫細胞を殺す方法。
【請求項２２】
リンパ腫が非ホジキンリンパ腫である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
非ホジキンリンパ腫が濾胞性リンパ腫である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
a) TRAIL-DR5細胞死受容体経路における欠損について癌患者から得られた癌細胞を試験する段階；および
b) 細胞がTRAIL-DR5細胞死受容体経路における欠損を示す場合に、DNA損傷の誘導を主な作用機序とはしない治療薬によって癌を治療する段階
を含む、癌患者の治療方法。
【請求項２５】
癌細胞がbcl-2を過剰発現する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
欠損がp53欠損である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
p53欠損がp53に結合する抗体を用いて検出される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
TRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損が、カスパーゼ3レベルの低下により特徴づけられる、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
治療薬がアポトーシス誘導性薬剤である、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
治療薬が、抗CD20抗体、同種Tリンパ球、bcl-2阻害剤、アゴニストの抗TRAIL抗体、およびTRAIL受容体リガンドからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項３１】
治療薬がアゴニストの抗DR5抗体またはDR5のリガンドである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
治療薬がリツキシマブまたはTRAIL/Apo2Lである、、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
癌がリンパ腫である、請求項24記載の方法。
【請求項３４】
リンパ腫が非ホジキンリンパ腫である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
非ホジキンリンパ腫が濾胞性リンパ腫である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
癌患者が、TRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損について試験される前に、DNA傷害性の化学療法剤で治療される、請求項24記載の方法。
【請求項３７】
TRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損が検出された場合にDNA傷害性薬剤による癌患者の治療が中止される、請求項24記載の方法。
【請求項３８】
DNA傷害性薬剤がアルキル化剤またはトポイソメラーゼII阻害剤である、請求項24記載の方法。
【請求項３９】
TRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損について、癌治療の間に定期的に患者から得られた癌細胞を試験する段階を含む、癌患者の化学療法をモニターする方法であって、欠損を持つ癌細胞の割合が増加していれば、DNA損傷の誘導を主な作用機序とはしない治療薬によって該患者を治療する段階をさらに含む方法。
【請求項４０】
癌がリンパ腫である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
欠損がp53の欠損である、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
TRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損が、カスパーゼ3のレベルの低下によって特徴づけられる、請求項39記載の方法。
【請求項４３】
表1に記載される遺伝子によってコードされる標的ポリペプチドの活性を低下させる能力について候補薬剤を試験する段階を含む、癌細胞の増殖を阻害する薬剤を同定する方法であって、標的ポリペプチドの活性を低下させる候補薬剤が癌細胞の増殖を抑制するために有用である方法。
【請求項４４】
薬剤が癌細胞を殺す、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
薬剤がアポトーシスを誘導することによって癌細胞を殺す、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
候補薬剤が、標的ポリペプチドの酵素活性を阻害する能力について試験される、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
候補薬剤が、標的ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下させる能力について試験される、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
候補薬剤が、
a) 標的ポリペプチドをコードする遺伝子から得られた調節領域を含むポリヌクレオチドに機能的に連結されたレポーターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むレポーターコンストラクトを含む細胞を提供する段階；
b) 細胞に候補薬剤を接触させる段階；および
a) 候補薬剤の非存在下におけるレポーターコンストラクトの発現と比較して、候補薬剤の存在下におけるレポーターコンストラクトの発現が低下しているかどうかを決定する段階
によって試験される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
標的ポリペプチドをコードする遺伝子を含む細胞に候補薬剤を接触させ、かつ候補薬剤に暴露されていない細胞と比較して、候補薬剤に暴露された細胞中での標的ポリペプチドをコードするmRNAの低下を検出することによって候補薬剤が試験される、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
標的遺伝子をコードする核酸に相補的なヌクレオチド配列を持つプローブに、細胞から得られた核酸をハイブリダイズさせる段階を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
a) 各ライブラリーメンバーが細胞中に存在している、cDNAまたは阻害性RNA分子のライブラリーを提供する段階；
b) cDNAまたは阻害性RNA分子を含まない細胞中で細胞死を調節できる化合物を、細胞に接触させる段階；および
c) 化合物がcDNAまたは阻害性RNA分子を含まない細胞中とは異なるように細胞死を調節するライブラリーメンバーを同定する段階
を含む、細胞死経路に関与する遺伝子を同定する方法。
【請求項５２】
阻害性RNA分子が小さい干渉性RNA (siRNA)分子である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
細胞がリンパ腫細胞である、請求項51記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、ともに参照として本明細書に組み入れられる2002年6月18日出願の米国特許仮出願第60/390,256号および2003年3月21日出願の米国特許仮出願第60 456,585号に基づく優先権を伴う出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は化学療法耐性リンパ腫を含む、化学療法耐性癌の診断、予後診断、および治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
発癌は複雑な多段階の過程であるが、癌の遺伝子型のさまざまな差異は、すべてのヒトの腫瘍の持つ6つの共通する基本的な能力の主要な発現にあると考えられている（HanabanおよびWeinberg, Cell 100:57-70, 2000を参照されたい）。これらの能力の中心は、アポトーシスに対する耐性の獲得である（例、EvanおよびVousden, Nature 411:342-8, 2001を参照されたい）。細胞死に対する耐性については多くの機構が明らかにされてきたが、哺乳類として初のアポトーシスの負の調節因子bcl-2（B細胞リンパ腫に関する）は、濾胞性リンパ腫(FL)の患者に由来する腫瘍細胞において発見された（例、AdamsおよびCory, Science 281:1322-1326, 1998; Bakhshiら、Cell 41:899-906, 1985; およびTsuijimotoら、Science 228:1440-1443, 1985を参照されたい）。この低悪性度B細胞非ホジキンリンパ腫は、染色体の転座t(14;18)(q32;21)で特徴づけられ、これにより、bcl-2遺伝子とその発現が、免疫グロブリンH鎖エンハンサーにカップリングされる。FLは無痛性の進行の遅いリンパ腫で、平均生存期間が8年から10年であり、これはおそらくbcl-2が有糸分裂を刺激するというよりも生存因子としては働くことを反映していると考えられる。
【０００４】
FLの患者では標準的な化学療法による第1回の治療後に、しばしば臨床的に完全奏効が見られる;しかし、大部分の症例、特に進行したステージIIIおよびIVでの臨床経過では、繰り返し再発が見られる（例、Freedmanら、Oncology (Huntingt) 14:321-326, 329, 考察330-2, 338, 2000; Horning Ann Oncol 11 Suppl 1:23-27, 2000; およびPeterson, Semin Oncol 26:2-11, 1999を参照されたい）。その後の治療で完全緩解または部分緩解が誘導され得るが、その率は次第に低下し、期間は短くなる。初めは臨床的奏効が見られるのに再発率が高いことの1つの説明は、微小残存病変（MRD）の存在である。CTスキャンは、末梢血および/または骨髄標本のt(14;18)特異的PCRのような分子的手法よりも感度が低く、化学療法で残った残存リンパ腫細胞は、CTスキャンを含む標準的な臨床診断手順の検出限界より低いレベルで生き残る。MRDのマーカーとしてbcl-2/IgH再配列特異的PCRを用いた最近の研究では、標準的化学療法では、PCR陰性になることはまれであることが示されている。したがって、分子の反応の決定は、FL患者の失敗のない生存を予測するために最も重要な要因であると考えられる（例、Lopez-Guillermoら、Blood 91:2955-60, 1998を参照されたい）。
【０００５】
2つのアポトーシス経路がアポトーシスを開始できる：(1)細胞死受容体（外因性）経路、または(2)ミトコンドリア依存性（内因性）経路。いずれの場合も、細胞の基質を切断するシステイン・アスパルチル特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）が活性化し、アポトーシス細胞の生化学的および形態学的特徴が誘導される（例、SalversenおよびDixit, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10964-10967, 1999; Budihardjoら、Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 15:239-90, 1999; およびZimmermannおよびGreen, J. Allergy Clin Immnol. 108:99-103, 2001を参照されたい）。DNA傷害性の抗癌剤は、最終的にカスパーゼ-3のようなエフェクターカスパーゼを活性化するが、DNA損傷反応がどの経路でカスパーゼの活性化に結びついているかに関しては、論争がある（例、KaufmannおよびEarnshaw, Exp Cell Res. 256:42-9, 2000を参照されたい）。
【０００６】
抗癌剤は、BAX, PUMAおよびNOXAのようなアポトーシス促進性bcl-2ファミリーメンバーの発現を上昇されることが報告されている（例、NakanoおよびVousden, Mol. Cell Biol. 7:683-94, 2001; Odaら、 Science 288:1053-58, 2000; およびWuおよびDeng, Front Biosci. 7:151-6, 2002を参照されたい）。これらのアポトーシス促進性蛋白質は、ミトコンドリアを標的とし、チトクロームcのようなアポトーシス開始因子の放出を促進する（例、HuangおよびStrasser, Cell 103:9357-60, 2000）。細胞質に放出されると、チトクロームcはApaf-1およびプロカスパーゼ9と会合し、「アポトソーム」と呼ばれる複合体を形成する。プロカスパーゼ9の活性化はアポトソーム内で起こり、それによりカスパーゼ-3のようなエフェクターカスパーゼの活性化が始まる（例、Liら、Cell 91:479-489, 1997を参照されたい）。bcl-2およびbcl-XLのようなbcl-2ファミリーの抗アポトーシス性のメンバーは、ミトコンドリアのチトクロームc放出およびそのApaf-1との会合を阻止することによって、この内在性の細胞死経路を抑制できる。
【０００７】
最近、抗癌剤は細胞死受容体（CD95, TRAIL-DR4またはTRAIL-DR5）および/またはその対応するリガンド（CD95L, TRAIL）の発現を誘導することによって、感受性のある腫瘍細胞を殺すことができることがいくつかの報告で示唆されている（例、Friesenら、Leukemia 13:1854-8, 1999; Gibsonら、Mol. Cell Biol. 20:205-12, 2000; Mullerら、J Exp Med 188:2033-45, 1998およびWenら、Blood 96:3900-6, 2000を参照されたい）。細胞死受容体が始動すると、アダプター分子FADDおよびプロカスパーゼ-8のリクルートが誘導され、これらは細胞死誘導性のシグナル伝達複合体(DISC)を形成するが、ここでプロカスパーゼ-8は自己触媒性の切断によって活性化される（例、Kisckelら、EMBO J 14:5579-88, 1995; およびSalvesonおよびSixit、上記）。活性カスパーゼ-8は、CD95受容体で示されているような、高次の表面受容体クラスターの形成に関与し（例、Algeciras-Schimnichら、Mol.Cell Biol. 22:207-20, 2002）、下流のエフェクターカスパーゼ、特にカスパーゼ-３の蛋白質分解性の活性化を誘導する。このように、細胞死受容体経路は、過剰発現したbcl-2ファミリーの抗アポトーシス性メンバー（例、Walczakら、Cancer Res 60:3051-7, 2000）によって仲介される細胞死の阻害を迂回することができる。しかし、細胞死受容体または外因性経路と、内因性の細胞死プログラムは必ずしも相互排他的なものではない。たとえば、ある種の細胞では、外因性と内因性の経路は、アポトーシス促進性のbcl-2ファミリーメンバーであるBidの、カスパーゼ-8を介する切断によって、相互に結びついている。切断後、切断されたBidはミトコンドリアに移動し、チトクロームcの放出を促進するが、これはbcl-2の過剰発現によって容易に阻止される（Scaffidiら、EMBO J 17:1675-87, 1998）。
【０００８】
bcl-2が細胞死を抑制する多能性を考慮すると（例、Reed, Semin Hematol 34:9-19, 1997; およびSimonianら、Blood 90:1208-16, 1997）、その癌細胞がbcl-2を過剰発現するFL患者のような癌患者が、最初の化学療法治療に反応することは驚くべきことである。同様に当惑することは、FL患者は最初に反応するにもかかわらず、非常に高い再発率を示すことである。したがって、耐性の機構を同定し、化学療法耐性の濾胞性リンパ腫を治療するための手段が必要とされている。本発明は、これらおよび他のニーズを充足する。さらに、本明細書で開示される方法は、たとえば他の化学療法耐性腫瘍のような、他の癌の治療のための選択的薬剤療法を同定するために使用できる。
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な概要
いくつかの態様では、本発明は癌細胞、特に化学療法耐性癌細胞に対して選択的に細胞毒性のある化合物をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、a)候補化合物を、通常は、細胞死の経路、例、TRAIL-DR5細胞死受容体経路に1つまたは複数の確定した欠陥を持つ化学療法耐性の癌細胞に接触させる段階；およびb)候補化合物が正常細胞と比較して、または例えばTRAIL-DR5アポトーシス経路のようなアポトーシス経路に1つまたは複数の異なる欠陥を持つ癌細胞集団と比較して、癌細胞に対して細胞毒性があるかどうかを決定する段階を含む。このスクリーニングで癌細胞に対して細胞毒性のある候補化合物は、化学療法耐性癌細胞に対して有効である。
【００１０】
本発明はまた、癌患者の治療法も提供する。これらの方法は：a)癌患者から得られる癌細胞を、TRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損について試験する段階；およびb)細胞がTRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損を示す場合は、DNA損傷の誘導が薬剤の主な作用機序ではない治療薬で癌を治療する段階を含む。そのような治療薬には、例えば抗CD20抗体、同種異系Tリンパ球、bcl-2阻害剤、アゴニストの抗TRAIL抗体、またはTRAIL受容体リガンドが含まれる。例えば、アゴニストの抗DR5抗体またはDR5のリガンドは、リタキシマブまたはTRAIL/Apo2Lのように、化学療法耐性癌の治療薬として使用できる。
【００１１】
いくつかの態様では、癌患者はp53欠損またはTRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損の試験の前に、DNA傷害性薬剤で治療される。例えば、DNA傷害性薬剤は、 アルキル化剤、トポイソメラーゼII阻害剤、または当技術分野で周知の他の化合物であり得る。
【００１２】
他の態様では、本発明は、化学療法耐性リンパ腫のような、化学療法耐性癌を持つ、またはこれを発生するリスクをもつ患者を同定する方法を提供する。これらの方法には、患者から得られる癌細胞をTRAIL-DR5細胞死受容体経路における欠損について試験する段階が含まれる。経路に欠損があれば、化学療法耐性癌であることを示す。化学療法耐性癌は、例えば、アルキル化剤およびトポイソメラーゼII阻害剤からなる群より選択される化学療法剤に対して抵抗である可能性がある。TRAIL-DR5細胞死受容体経路における欠損は、例えば、アポトーシスを誘導する化学療法剤が無効であることで示される。欠損は、例えばp53の欠損、カスパーゼ3発現の欠損、細胞死受容体経路の他の成分における欠損などの可能性がある。本方法は、例えば、濾胞性リンパ腫のような非ホジキンリンパ腫を含む癌の診断および予後診断に有用である。本方法が適した癌には、Bcl-2を過剰発現するものが含まれる。
【００１３】
別の態様では、本発明は癌患者の治療のモニタリング方法を提供する。これらの方法には、患者から癌治療中に定期的に得られた癌細胞を、TRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損について試験する段階が含まれる。治療中にそのような欠損をもつ癌細胞の率が増加すれば、癌細胞がその癌治療に耐性になっていることを示す。したがって、いくつかの態様では、本方法はさらに、TRAIL-DR5細胞死受容体経路の欠損が癌細胞で観察された場合に、DNA損傷の導入が薬剤の主な作用機序ではない治療薬で患者を治療する段階を含む。
【００１４】
本発明はまた、細胞死の経路に関与している遺伝子を同定する方法も提供する。これらの方法には：a)各ライブラリーメンバーが細胞内に存在する、cDNAまたは阻害性RNA分子のライブラリーを提供する段階；b)その細胞に、cDNAまたは阻害性RNA分子を含まない細胞中で細胞死を調節できる化合物を接触させる段階；およびc)cDNAまたは阻害性RNA分子を含まない細胞中と比較して、その中では化合物が細胞死を異なるように調節するライブラリーメンバーを同定する段階が含まれる。
【００１５】
定義
動物の「癌」とは、調節されない細胞増殖を特徴とする生理的状態の存在を指す。一般に癌細胞は、速い成長および増殖率、不死、転移可能性、ならびに特定の特有の形態学的特徴のような特徴によって特徴づけられる。しばしば、癌細胞は腫瘍の形態をとるが、そのような細胞は動物中で単独に存在したり、骨髄中に存在するか白血病細胞のように独立した細胞として血中を循環したりする場合もある。本明細書で使用される「癌細胞」は、例えばヒトのような動物の癌からもともと単離されるが、細胞培養中で継代されたり、例えば特定の蛋白質を発現するように操作するなど、さらに操作されている場合がある。「癌細胞」と「腫瘍細胞」という用語は、互換的に使用される。
【００１６】
本明細書で使用される「正常」細胞は、癌細胞ではない細胞であり、すなわち、軟寒天中での増殖、調節されない増殖等のような癌細胞の特徴を示さない細胞である。
【００１７】
本明細書で使用される「化学療法耐性腫瘍」または「化学療法耐性癌」という用語は、例えばDNA損傷を誘導する薬剤のような、化学療法剤に反応して細胞死が起こらない癌を指す。
【００１８】
「細胞増殖の変化」という用語は、インビトロまたはインビボにおける細胞の成長および増殖の特徴の任意の変化を指す。しばしば、本発明のスクリーニング方法に関して細胞増殖の変化とは、細胞の生存率の変化を指す。しかし、「細胞増殖の変化」は、接着非依存性、半固体または軟寒天での増殖、接触阻害および増殖密度の制約の変化、増殖因子または血清の要求性の変化、細胞の形態の変化、不死性の獲得または消失、腫瘍特異的マーカーの変化、適当な動物宿主に注入された時に腫瘍を形成または抑制する能力、および/または細胞の不死化のような他の特徴も含む場合がある。Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique pp. 231-241 （第3版、1994）を参照されたい。
【００１９】
「アポトーシス」という用語は、細胞死の調節された形をさし、通常は、細胞質の凝縮、形質膜の微絨毛の消失、核の分断化、染色体DNAの分解、またはミトコンドリア機能の消失を含む、1つまたは複数の特徴的な細胞の変化を伴う。アポトーシスは、細胞の生存率アッセイ法、FACS解析、DNA電気泳動等のような、当技術分野で周知のアッセイ法を用いて、評価できる。
【００２０】
「TRAIL受容体」という用語は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）に特異的に結合し、アポトーシスを仲介する、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーを指す。TRAIL受容体には、DR5およびDR4が含まれる。
【００２１】
「TRAIL-DR5経路における欠損」とは、アポトーシスが阻害されるような、外因性の細胞死経路の機能不全を指す。
【００２２】
「抗体アゴニスト」という用語は、受容体を活性化して、受容体を介する応答を完全または部分的に誘導する能力のある抗体を指す。例えば、DR5のアゴニストはDR5に結合して、DR5を介するシグナル伝達を誘導する。いくつかの態様では、DR5抗体アゴニストは、DR5に結合してアポトーシスを誘導する能力によって同定できる。例えばJurkat細胞のような、DR5がアポトーシスの誘導に活性であることが知られている細胞を用いてアゴニスト活性を試験できる。
【００２３】
「アポトーシス誘導性物質」という用語は、そのタイプの細胞に接触した時に、少なくとも1つのタイプの細胞においてアポトーシスを誘導または促進する化合物を指す。アポトーシス誘導性物質の例には、例えば、以下のもののアゴニストまたは類似体：SMAC, Bax, Bik, Bok, Bim, Bak, Bid, Noxa, Puma, Hrk, またはBad; p53, TRAILリガンド、Fadd, Myc,およびMekk1、ならびに以下のもののアンタゴニストまたは阻害剤：26Sプロテアソーム阻害剤、C-flip,NFκB経路、IAPファミリーメンバー（例、XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, MLIAP/Livin, survivin）、プロテアソーム経路メンバー（例、E1, E2およびE3）；キナーゼPI3, Akt1, 2, および3, Rip, Nik; CD40; Bcl2ファミリーメンバー（例、Bcl2, Bcl-xl, A1, Mcl1）、オステオプロテグリン、が含まれる。他のアポトーシス誘導性物質の例には、例えば、DR5およびDR4の発現および/または安定性を増強する物質、カスパーゼの活性または安定性を増強する物質、およびDNA損傷応答を誘導または増強する物質が含まれる。上記のリストのアゴニストまたは類似体には、遺伝子産物自身が含まれ、例えばp53はp53アゴニストである。アンタゴニストには、活性を直接に阻害する物質、および標的分子mRNAまたは蛋白質の発現または安定性を低下させることによって間接的に活性を阻害する物質が含まれる。
【００２４】
癌細胞の増殖を「予防または低下する」薬剤は、増殖を部分的または完全に阻止する化合物を指す。細胞の増殖は、薬剤で処理されない対照細胞と比較して、少なくとも例えば5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、または100％低下する。本明細書に記述される発明では通常、細胞増殖の阻害は、薬剤によって誘導される細胞死に起因する。
【００２５】
本明細書で使用される「細胞毒性のある」または「細胞毒性」とは、細胞を殺す能力を指す。したがって、「細胞毒性のある」物質は、細胞死を誘導する。本用語には、アポトーシスと壊死性の細胞死の両方が含まれる。
【００２６】
本明細書で使用される「選択的阻害」または「選択的細胞毒性」という用語は、比較される細胞集団に対して、1つの細胞集団に対して化合物が持つ優先的な効果を指す。「選択的な」化合物、例、他の細胞集団と比較して1つの細胞集団において細胞死のレベルを上昇させる化合物は、比較群に対する効果と比べて、細胞死を少なくとも例えば5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、または100％上昇させる可能性がある。同様に、例えば、他の細胞集団と比較して癌細胞集団の増殖を阻害する「選択的」化合物は、比較群に対する効果と比べて、増殖を少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、または100％低下させる可能性がある。
【００２７】
「標的化合物」という用語は、固体支持体上または固体支持体から除去された後に、生物活性または他の性質についてスクリーニングされる化合物または化合物群を指す。「標的化合物」という用語は、「低分子」という用語と互換的に使用される。
【００２８】
「化学ライブラリー」または「アレイ」という用語は、合成または生合成によって調製できる異なる標的化合物または分子の、意図的に作製したコレクションであって、さまざまな形式で生物活性のスクリーニングができるものを指す（例、可溶性化合物のライブラリー、固体支持体に結合した化合物のライブラリー等）。本用語は、意図的に作製した立体異性体のコレクションも指す。ライブラリーは、少なくとも2つのメンバー、好ましくは少なくとも10のメンバー、より好ましくは少なくとも102のメンバー、さらに好ましくは少なくとも103のメンバーを含む。特に好ましいライブラリーは、少なくとも104のメンバー、より好ましくは105のメンバー、さらに好ましくは少なくとも106のメンバーを含む。
【００２９】
「抗体」という用語は、抗原を特異的に結合および認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその機能的断片によってコードされるポリペプチドを指す。認識された免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。L鎖はκまたはλに分類される。H鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらはそれぞれ免疫グロブリンのクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを特徴づける。
【００３０】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造ユニットは、四量体を含む。各四量体は、各々が1つの「軽」（約25 kDa）および1つの「重」鎖（約50~70 kDa）を持つ2つの同一のポリペプチド鎖のペアを含む。各鎖のN末端は主に抗原の認識をする100から110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域で特徴づけられる。可変L鎖（VL）および可変H鎖（VH）という用語は、それぞれこれらのLおよびH鎖を指す。
【００３１】
抗体の機能的断片の例には、完全な抗体分子、Fv、一本鎖Fv (scFv)、ジスルフィド安定化Fv (dsFv)、相補的な決定領域を含む蛋白質断片（CDRs）、VL（L鎖可変領域）、VH（H鎖可変領域）、Fab、F(ab)2’、およびこれらの任意の組み合わせのような抗体断片、または標的抗原に結合する能力のある免疫グロブリンペプチドの任意の他の機能的部分が含まれるが、これらに限定されない（例、Fundamental Immunology (Paul編、第3版、1993)を参照されたい）。当業者には理解されるように、種々の抗体断片は、例えば、ペプシンのような酵素による完全な抗体の消化；または新規の合成などのさまざまな方法によって得られる。抗体断片は、しばしば化学的または組換えDNA法を用いて新規に合成される。したがって、本明細書で使用される抗体という用語には、抗体全体の修飾によって生産される抗体断片、または組換えDNA法を用いて新規で生産されるもの（例、一本鎖Fv）またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定されるもの（例、McCaffertyら、Nature 348:552-554 (1990)を参照されたい）が含まれる。抗体という用語には、二価または二重特異性分子、ダイアボディ、トライアボディ、およびテトラボディも含まれる。二価および二重特異性分子は、例えば、Kostelnyら(1992) J Immunol. 148:1547, PackおよびPluckthun (1992) Biochemistry 31:1579, Hollingerら、1993、上記、Gruberら(1994) J Immunol:5368, Zhuら(1997) Protein Sci 6:781, Huら、(1996) Cancer Res. 56:3055, Adamsら(1993) Cancer Res. 53:4026, およびMcCartneyら(1995) Protein Eng. 89:301に記述されている。
【００３２】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製には、当技術分野で周知の任意の技術が使用できる（例えば、KohlerおよびMilstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozborら、Immunology Today 4:72 (1983); Coleら、pp 77-96、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)を参照されたい）。「モノクローナル」抗体とは、単一のクローンに由来する抗体を指す。一本鎖抗体の生産技術（米国特許第4,946,778号）を適用して、本発明のポリペプチドに対する抗体を生産できる。また、トランスジェニックのマウスまたは他の哺乳類のような他の生物を利用して、ヒト化抗体を発現できる。または、ファージディスプレイ技術を利用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体またはヘテロマーのFab断片を同定できる（例えば、McCaffertyら、Nature 348:552-554 (1990); Marksら、Biotechnology 10:779-783 (1992)を参照されたい）。
【００３３】
「キメラ抗体」とは、(a) 定常領域またはその一部が変化、置換、または交換されているため、抗原結合部位（可変領域）が異なるまたは変化したクラス、エフェクター機能および/または種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい性質を与える全く異なる分子、例、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤等に結合している；または (b) 可変領域またはその一部が、異なるまたは変化した抗原特異性を持つ可変領域と交換、置換、または変化している、抗体分子である。
【００３４】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持しながら、ヒトでの免疫原性が低下している抗体である。これは、例えば、非ヒトCDR領域を保持しながら抗体の残りの部分をヒトの対応物で置換することによって作製できる。例えば、Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); MorrisonおよびOi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyenら、Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照されたい。
【００３５】
蛋白質またはペプチドに関して、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応する」という用語は、蛋白質または他の生体分子の不均質な群において、その蛋白質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、規定の免疫アッセイ法条件下では、指定された抗体は特定の蛋白質に対してバックグラウンドの少なくとも2倍結合し、試料中に存在する他の蛋白質には有意な量の結合をしない。そのような条件下で抗体に特異的に結合するためには、特定の蛋白質のためにその特異性が選択されている抗体が必要である。この選択は、例えば、他種のDR5分子と交差反応する抗体を除去することによって行える。特定の蛋白質と特異的に免疫反応する抗体を選択するためには、さまざまな免疫アッセイ法形式が使用できる。例えば、固相ELISA免疫アッセイ法は、蛋白質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、通常用いられている（特異的な免疫反応の決定に使用できる免疫アッセイ法形式および条件の説明は、例えば、HarlowおよびLane, 「抗体、実験室マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」(1988)を参照されたい）。通常、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍で、より一般的にはバックグラウンドの10倍から100倍以上である。
【００３６】
本明細書では「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「蛋白質」という用語は互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに用いられる。本明細書では、本用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合で連結している、全長の蛋白質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を含む。
【００３７】
「siRNA」は、例えば哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）のような細胞中、および例えば哺乳類（ヒトを含む）の体内のような体内で、特定の遺伝子を転写後にサイレンシングする、干渉性の小さなRNAを指す。RNA干渉の現象は、Bass, Nature 411:428-29 (2001); Elbahirら、Nature 411:494-98 (2001); およびFireら、Nature 391:806-11 (1998);および干渉RNAの作製方法も論じられている国際公開公報第01/75164号に説明および考察されている。本明細書で開示される遺伝子産物をコードする配列および核酸に基づくsiRNAは、通常100塩基対未満で、例えば約30 bpsかそれ以下である可能性があり、相補的DNA鎖の利用または合成法を含む、当技術分野で周知の方法によって作製できる。本発明に係る典型的なsiRNAは、最高29 bps, 25 bps, 22 bps, 21 bps, 20 bps, 15 bps, 10 bps, 5 bpsまたはその程度またはその間の任意の整数であり得る。最適な阻害性siRNAを設計する手段には、DNAengine Inc.（ワシントン州シアトル）およびAmbion, Inc.（テキサス州オースチン）から販売されているものが含まれる。
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は化学療法耐性癌の増殖を阻害するために使用できる薬剤の同定方法を提供する。さらに、本発明は化学療法耐性癌細胞のTRAIL-DR5アポトーシス経路における変異の同定に基づく、診断および予後診断方法を提供する。
【００３９】
化学療法耐性癌細胞に選択的に細胞毒性を持つ薬剤の同定
1つの局面では、本発明は化学療法耐性癌細胞集団を選択的に標的とする化合物を同定するためのスクリーニング戦略を提供する。例えば、細胞死を誘導することによって、化学療法耐性細胞の増殖を選択的に阻害するが、正常細胞は阻害しない薬剤は、本明細書に開示される方法を用いて同定できる。さらに、例えばアポトーシスを減少させるp53変異のような、TRAIL-DR5経路における特定の欠損を持つ化学療法耐性癌細胞集団の増殖を選択的に阻害する薬剤も、本発明の方法を用いて同定できる。スクリーニングアッセイ法で同定された化合物は、別の細胞死経路を探ったり細胞死の調節分子を同定したりするための道具として使用するか、または癌を治療するために使用できる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法は、1つまたは複数の化学療法剤および/または化学療法剤のクラスに耐性の腫瘍細胞を利用する。抗癌剤は伝統的にアルキル化剤；代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、ヌクレオチドアナログまたはトポイソメラーゼ阻害剤として分類される。これらの多くは、主にDNA損傷を通して機能する。アルキル化剤には、メコエタマイト、クロラムブシル、メルファラン、サイクロホスファミド、イフォスファミド、チオテップ、およびブサルファンが含まれる。他のアルキル化剤は、より複雑な機序で作用する；これらには、ダカルバジン、カルナスチン、ロマスチン、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、およびアルトレタミンが含まれる。天然産物由来の薬剤もDNA損傷を引き起こすことができる。例えば、抗生物質はDNAに結合して、その構造をゆがめ、フリーラジカルの形成および金属イオンのキレート化によってDNAを損傷させる可能性がある。天然に由来するそのような化合物は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシンC、プリカマイシン、およびストレプトゾシンを含む。例えばエプトポシドのようなエピポドフィロトキシン等のトポイソメラーゼ阻害剤も、DNA鎖の破壊を誘導する。医療従事者に有用な化学療法剤耐性癌細胞は、通常は、その主な作用機序がDNA損傷を介する化学療法剤による治療に抵抗性である。上述のように、これらの薬剤にはアルキル化剤、抗生物質、およびトポイソメラーゼ阻害剤が含まれる。化学療法抵抗性腫瘍細胞は、通常はこれらのDNA傷害性薬剤のうち複数のものに非感受性である。
【００４１】
本発明で使用される化学療法耐性腫瘍細胞は、外因性、内因性、またはその両方のアポトーシス経路の活性化を抑える1つまたは複数の変異を持つ。欠損はこれらの経路のメンバーのうちの任意のものの機能に起こり得る（外因性および内因性経路に関する総説は、例えば、IgneyおよびKrammer, NATURE REVIEWS CANCER 2:277-288, 2002, およびそれに引用される参考文献を参照されたい）。化学療法耐性腫瘍で欠損（例、変異または発現レベルの変化）している可能性のある典型的な蛋白質には、例えば、DR4, DR5, p53, 抗アポトーシス性Bcl-2ファミリーメンバー（例、Bcl-2, Bcl-10, Bcl-xl, A1, Mc11）；アポトーシス促進性Bcl-2ファミリーメンバー（例、Bax, Bcl-xs, Bid, Bad, Bik, Bok, Bim, Bak, Noxa, Puma, またはHrk）;
IAPファミリーメンバー（例、XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, MLIAP/Livin, サバイビン）、細胞死ドメイン蛋白質、例、Fadd, TRADD; およびカスパーゼ、例、カスパーゼ8、カスパーゼ7、カスパーゼ9、カスパーゼ3；ならびにMyc; Mekk1; c-flip, NFκB経路メンバー；プロテアソーム経路メンバー（例、E1, E2およびE3）;キナーゼ、PI3, Akt1, 2, および3, Rip, Nik; CD40; fas, およびTNF受容体が含まれる。しばしば、細胞はTRAIL-DR5経路に欠損を持つ。また、化学療法耐性腫瘍はしばしばbcl-2ファミリーメンバーに欠損を持ち、例えば、bcl-2を過剰発現する場合があり、これによりミトコンドリア依存性経路が抑制されることがある。他の一般的な変異には、例えば、p53をコードする遺伝子の変異のようにp53を不活化またはその活性を低下させる変異があるが、p53は内因性および外因性経路の両方に参加するため、内因性および外因性細胞死経路の両方に影響を与える可能性がある。同様に、カスパーゼ3変異は、両方の細胞死経路に影響を与える可能性があるが、カスパーゼ9またはカスパーゼ8は、優先的に1つの経路を阻害する可能性がある。
【００４２】
いくつかの態様では、細胞死経路中の少なくとも1つの欠損において異なる少なくとも2つの腫瘍細胞集団が、候補薬剤に対する感受性に関してスクリーニングされる。2つの異なる化学療法耐性群を比較するスクリーニングアッセイ法は、薬剤に対する感受性に関して正常細胞をスクリーニングする段階を含む場合があるが、必ずしも含むとは限らない。例えば、同一の患者由来である場合もそうでない場合もある2つの腫瘍細胞集団をスクリーニングに使用する。両方ともbcl-2を過剰発現し、p53に欠損を持つが、変異は異なる。これらの2つの細胞集団は、異なる細胞集団と見なされる。
【００４３】
アポトーシス経路の欠損の同定
アポトーシス関連ポリヌクレオチドの検出
例えば上記のような、内因性および外因性アポトーシス経路のメンバーにおける変異は、蛋白質をコードする核酸のレベルの変化もしくは変異を検出する、または機能不全のポリペプチドもしくは変化したポリペプチドレベルを検出する、いくつかの異なる方法を用いて、決定できる。しばしば、化学療法耐性癌細胞は、まず選択的に、例えば、アルキル化剤またはトポイソメラーゼ阻害剤の適用に対する、および/またはTRAIL受容体アゴニスト、例、TRAILまたは抗体アゴニストのようなアポ2受容体リガンド、に応答した、アポトーシスのレベルの低下について直接スクリーニングできる。アポトーシスを検出するアッセイ法は、以下にさらに説明する。その後、正常細胞または化学療法剤感受性癌細胞と比較して、細胞死が低下している細胞は、アポトーシス経路における特定の欠損を検出するためにさらに解析できる。
【００４４】
変異の検出には、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの定量的または定性的な検出が含まれることがある。ポリヌクレオチドレベルはDNAまたはRNAのレベルを決定することで、検出できる。変異ポリペプチドまたはポリペプチドレベルの変化は、例えば免疫アッセイ法を用いたポリペプチドの検出、または例えばカスパーゼ活性のような蛋白質活性の検出によって、検出できる。
【００４５】
1つの態様では、機能不全のアポトーシス経路メンバーの存在は、アポトーシス関連蛋白質をコードする核酸配列を評価することによって調べられる。そのような解析は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ法、増幅アッセイ法、配列決定アッセイ法、およびこれらの手法の組み合わせによって行える。これらの技術の方法論は、当技術分野で周知であり、例えば、本発明に使用される一般的方法を開示した基礎のテキストに記述されている（例えば、Sambrook and Russell, 「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第3版、2001;「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」(Ausubelら編、1999), および「ヒト遺伝学の最新プロトコール (Current Protocols in Human Genetics)」(Dracopoliら編、2000)を参照されたい）。
【００４６】
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて特異的なDNAおよびRNAを測定するさまざまな方法が当業者に周知である。いくつかの方法では、電気泳動による分離（例、RNA検出のためのノーザンブロット）を用いるが、DNAおよびRNAの測定は、電気泳動による分離なしでも実施できる（例、ドットブロット、RNase保護アッセイ法、インサイチューハイブリダイゼーション、さまざまな増幅反応）。核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は、決定的ではない。さまざまな核酸ハイブリダイゼーション形式が当業者には周知である。ハイブリダイゼーション技術は、一般的にHamesおよびHiggins「核酸ハイブリダイゼーション、実際的手法(Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach)」、IRL Press (1985); Gall and Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:378-383 (1969);およびJohnら、Nature 223:582-587 (1969)に記述されている。
【００４７】
1つのハイブリダイゼーション形式では、アポトーシス経路の複数の成分の核酸レベルが、アレイ形式で容易に測定できる。いくつかの態様では、標的核酸またはプローブは、固体支持体の上に固定されている。本発明のアレイに使用するために適した固体支持体は、当業者に周知である。本明細書で使用される固体支持体は、実質的固定された配置の、材料のマトリックスである。さまざまな自動化固相アッセイ法技術も適している。例えば、カリフォルニア州サンタクララのAffymetrix, Incが販売している超大型スケールの固定化ポリマーアレイ（VLSIPSTM）、すなわちジーンチップまたはマイクロアレイを用いて、同じ調節経路に関与している複数の遺伝子の発現レベルの変化を同時に検出できる。Tijssen、上記、Fodorら(1991) Science, 251:767-777; Sheldonら(1993) Clinical Chemistry 39(4):718-719, およびKozalら(1996) Nature Medicine 2(7):753-759を参照されたい。同様に、スポットされたcDNAアレイ（ナイロン、ガラス、または別の固体支持体に結合したcDNA配列のアレイ）を用いて複数の遺伝子の発現をモニターすることもできる。
【００４８】
別の態様では、増幅に基づくアッセイ法を用いて、アポトーシス関連ポリヌクレオチドの発現レベルを測定できる。定量的増幅では、増幅産物の量は、元の試料中の鋳型の量に比例する。定量的増幅方法は、当業者に周知である。定量的PCRの詳細なプロトコールは、例えば、Innisら(1990)「PCRプロトコール、方法と適用のガイド (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications)」Academic Press, Inc. N.Y.に記述されている。例えば、TaqManに基づくアッセイ法のような定量的RT-PCR反応は、アポトーシス関連ポリヌクレオチドの定量に使用できる。他の適当な増幅方法には、リガーゼ連鎖反応(LCR)（WuおよびWallace (1989) Genomics 4:560、Landegrenら(1988) Science 241:1077, およびBarringerら(1990) Gene 89:117を参照されたい）、転写増幅（Kwohら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173）、自立した配列複製（Guatelliら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）、ドットPCR、およびリンカーアダプターPCR等が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
特異的な変異は、例えばp53をコードする核酸のような核酸の配列決定をして、野生型配列と比べて変異が存在するかどうかを検討することでも決定できる。配列決定は、通常、適当な量の核酸を得るための増幅技術と合わせて行われる。
【００５０】
アポトーシス関連ポリペプチドの検出
アポトーシス経路の欠損は、癌細胞中の蛋白質レベルを測定することによっても同定できる。例えば、免疫アッセイ法を用いて、ポリペプチドを定性的または定量的に解析できる。適用できる技術の一般的な概説は、HarlowおよびLane、「抗体：実験室マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)」(1988)、ならびにHarlowおよびLane、「抗体の利用：実験室マニュアル(Using Antibodis: A Laboratory Manual)」(1999)に記載されている。
【００５１】
さまざまなアポトーシス関連蛋白質に特異的な抗体は、当技術分野で周知である。例えば、抗DR5抗体（例、Cayman Cheicals）、ならびにさまざまな他の抗体、例、Fas抗体(MBL), p53抗体（Pharmingen）、カスパーゼ3抗体（Pharmingen）、カスパーゼ8抗体（Pharmingen）、カスパーゼ9抗体（Pharmingen）、およびbcl-2抗体（Pharmingen）は市販されている。
【００５２】
アポトーシス特異的蛋白質に選択的に結合する抗体を、生産することもできる。特異的なポリクローなるおよびモノクローナル抗体を生産する方法は、当技術分野で周知である（例、Coligan, 「免疫学の最新プロトコール(Current Protocols in Immunology)」(1991); HarlowおよびLane、上記；Goding「モノクローナル抗体：原理と実践(Monoclonal Antibodies; Principles and Practice)」（第2版、1986）；およびKohlerおよびMilstein, Nature 256:495-497 (1975)を参照されたい）。これらの技術には、ファージまたは同様なベクター中の組換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体の調製、ならびにウサギまたはマウスを免疫することによるポリクローなるおよびモノクローナル抗体の調製が含まれる。そのような抗体は、候補化合物のスクリーニングプロトコールのため、ならびに診断/予後診断および治療用途のための、癌細胞の解析に使用できる。
【００５３】
アポトーシス関連蛋白質は、いくつかの周知の免疫結合アッセイ法のいずれを用いても検出および/または定量できる。一般的な免疫アッセイ法の総説については、HarlowおよびLane、上記；および「細胞生物学の方法；細胞生物学における抗体(Methods in Cell Biology; Antibodies in Cell Biology)」、第37巻（Asai編、1993）；および「基礎および臨床免疫学 (Basic and Clinical Immunology)」(StitesおよびTerr編、第7版、1991)を参照されたい。免疫アッセイ法は、競合的または非競合的形式で良い。しばしば、ポリペプチドの発現レベルを決定するために、ELISAまたはウェスタンブロットが用いられる。
【００５４】
または、アポトーシス経路における特定の蛋白質の機能不全は、例えばカスパーゼ活性のような活性を解析することによっても評価できる。カスパーゼ活性は、プロテアーゼ活性を測定する実施例1に概説されるような既知の技術を用いて評価できる。例えばさまざまなキナーゼのような他のアポトーシス経路メンバーの活性を測定するアッセイ法も、やはりリン酸化アッセイ法のような既知の方法を用いて実施できる。
【００５５】
細胞増殖の阻害
本発明の化合物スクリーニングアッセイ法は、例えば、アポトーシスまたは壊死による細胞死を誘導することなどにより、化学療法耐性腫瘍細胞の増殖を選択的に阻害できる薬剤を同定する。増殖の阻害は、いくつかの一般的なアッセイ法を用いて測定できる。そのようなアッセイ法は、直接または間接的に、細胞の生存率または細胞数を測定する場合がある。そのようなアッセイ法およびアッセイ法システムの多くは当技術分野で周知で、市販されている。それらには、蛍光、比色分析、放射活性、または他の一般的なシグナルシステムにより、シグナルを発生するものが含まれる。
【００５６】
いくつかの態様では、化学療法耐性癌細胞集団と正常細胞集団（および/または第2の化学療法耐性癌細胞集団）において、候補化合物に応答した細胞の生存率を調べる。細胞の生存率は、細胞質酵素のレベル、色素に対する細胞の透過性、DNA断片化、51Crのような放射性同位体標識の放出、または他の形式を含む、多くの異なるエンドポイントを測定することによって、評価できる。通常は、細胞の生存率は、比色分析または蛍光生存率アッセイ法のような、ハイスループットスクリーニング形式に適したアッセイ法を用いて測定される。例えば、アラマーブルー(AB)アッセイ法では、代謝活性に応答して色または蛍光が変わる酸化還元標示薬を用いる。アラマーブルーは、生きた細胞の存在下では蛍光を発するが、死細胞では蛍光を発しない。そのようなアッセイ法は、マイクロプレートまたはフローサイトメトリーによって簡便に読み取ることができる。MTT (3-(4.5-ジメチル)チアゾル-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)のホルマザンへの還元を測定するMTTアッセイ法のような比色分析アッセイ法も、ハイスループット形式で簡便に使用し、細胞の生存率および増殖を測定することができる。
【００５７】
細胞数を測定する他のアッセイ法も使用できる。それらには、細胞のDNA中への色素のインターカレーションを測定するアッセイ法が含まれる。インターカレーションされる色素の量は、細胞数に正比例する。例えば、生細胞のDNAにインターカレーションするHoechst 33342のような色素で細胞を染色し、蛍光の量を測定することによって細胞数を決定できる。細胞は直接数えることもできる。
【００５８】
候補化合物およびハイスループットスクリーニング
本発明の方法は、化学療法耐性腫瘍群に対して、例えば選択的な細胞毒性のような、選択的な細胞増殖抑制効果を示す化合物も提供する。特定の腫瘍細胞集団に対する選択性を調べる化合物は、任意の化学的低分子化合物または生体分子、例、蛋白質、糖、核酸、または脂質のような巨大分子であり得る。したがって、試験化合物は化学的低分子；コンビナトリアル化学ライブラリー；オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等を含むオリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、および短いペプチドを含むポリペプチド；例えば天然源からの抽出物等である可能性がある。
【００５９】
通常は、試験化合物は化学的低分子およびポリペプチドである。本発明のアッセイ法は、通常は、典型的には平行して実行されるアッセイ法段階を自動化することによって、大きな化学的ライブラリーをスクリーニングするように設計されている（例、ロボットアッセイ法においてマイクロタイタープレートでのマイクロタイター形式）。化学的化合物の供給業者は、Sigma（ミズーリ州セントルイス）、Aldrich（ミズーリ州セントルイス）、Sigma-Aldrich（ミズーリ州セントルイス）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika（スイスBuchs）などを含め、多くあることが理解される。
【００６０】
1つの好ましい態様では、ハイスループットスクリーニング法が使用される。これらの方法には、多数の治療用化合物候補を含むコンビナトリアル化学またはペプチドライブラリーを提供する段階が含まれる。その後、本明細書に記述される細胞の生存率アッセイ法のような1つまたは複数のアッセイ法で、そのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」をスクリーニングして、例えば化学療法耐性腫瘍細胞に対する選択的な細胞毒性のような、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。このように同定された化合物は、従来の「リード化合物」となるか、潜在的または実際の治療薬としてそれ自身が使用される可能性がある。
【００６１】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学合成または生合成のいずれかにより、試薬のようないくつもの「基礎単位」を組み合わせることによって作製される、多様な化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーのようなリニアなコンビナトリアル化学ライブラリーは、一定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）になるように可能なすべてのやり方で化学的基礎単位（アミノ酸）を組み合わせることによって作製される。化学的基礎単位のそのようなコンビナトリアルな混合によって、何百万もの化学的化合物が合成さできる。
【００６２】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)、およびHoughtonら、Nature 354:84-88 (1991)を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。化学的多様性を持つライブラリーを作製するために、他の化学物質も利用できる。そのような化学物質には、ペプトイド（例、国際公開公報第91/19735号）、コードされるペプチド（例、国際公開公報第93/20242号）、ランダムなバイオオリゴマー（例、国際公開公報第92/00091号）、ベンゾジアゼピン（例、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドのようなdiversomer（Hobbsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)）、vinylogousポリペプチド（Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)）、グルコース骨格をもつ非ペプチド性ペプチド類似体（Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成（Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)）、オリゴカルバメート（Choら、Science 261:1303 (1993)）、および/またはペプチジルフォスフォネート（Campbellら、J. Org. Chem. 59:658 (1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel, Berger, ならびにRussellおよびSambrook、すべて上記、を参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリー（例、米国特許第5,539,083号を参照されたい）、抗体ライブラリー（例、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)およびPCT/US96/10287を参照されたい）、炭水化物ライブラリー（例、Liangら、Science 274:1520-1522 (1996)、および米国特許第5,593,853号を参照されたい）、有機低分子ライブラリー（例、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, 1月18日, p33 (1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン5,288,514号などを参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
コンビナトリアルライブラリーを調製するための装置は市販されている（例、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, ケンタッキー州ルイスビル、Symphony, Rainin、マサチューセッツ州ウォーバーン、433A Applied Biosystems, カリフォルニア州フォスターシティ、9050 Plus, Millipore, マサチューセッツ州ベッドフォードを参照されたい）。また、数多くのコンビナトリアルライブラリー自身も、市販されている（例、ComGenex, ニュージャージー州プリンストン、Tripos, Inc., ミズーリ州セントルイス、3D Pharmaceuticals, ペンシルベニア州エクストン、Martek Biosciences, メリーランド州コロンビア、等）。
【００６４】
候補化合物には、多くの化学的クラスが含まれる；しかし、通常は有機低分子であり、一般的に約100を越え約2,500ダルトン未満の分子量を持つ。通常の低分子は約2000ダルトン未満、約1500ダルトン未満、約1000ダルトン未満、または約500ダルトン未満である。候補化合物は、例えば水素結合のような、蛋白質との構造的相互作用に必要な官能基を含み、通常は少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも2つの官能基を含む。候補薬剤はしばしば、1つまたは複数の上述の官能基で置換された、環状炭素または複素環構造、および/または芳香族または多環芳香族構造を含む。候補化合物には、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、およびさまざまな構造的アナログまたはその組み合わせが含まれる。
【００６５】
ハイスループットアッセイ法
本発明のハイスループットアッセイ法では、1日のうちに何千もの異なるモジュレーターをスクリーニングできる。特に、例えば96、384、または1536ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択した潜在的モジュレーターに対する別々のアッセイ法を行ったり、濃度またはインキュベーション時間の効果を観察する場合には、5〜10ウェルずつ用いて、単一のモジュレーターを試験したりできる。したがって、1枚の標準的なマイクロタイタープレートで、多数のモジュレーターのアッセイ法ができる。例えば、1536ウェルのプレートを使用する場合には、約100〜1500の異なる化合物を容易にアッセイ法できる。例えば、国際公開公報第02/31747号に記述されるように、ハイスループットシステムを用いて、例えば1日に100万以上のウェルのように、多数のプレートを試験することができる。したがって、1日のうちに何千もの化合物をスクリーニングできる。
【００６６】
ハイスループットシステムには、液体運搬および分注装置を含め、自動化構成品が含まれる。いくつかの液体運搬システムが利用できるが、または既存のコンポーネントから容易に作製することもできる。例えば、Microlab 2200 (Hamilton; ネバダ州リーノー)ピペッティングステーションを用いた自動化ロボットZymate XP (Zymark Corporation; マサチューセッツ州ホプキントン)は、マイクロタイタープレートに平行して試料を移すために使用できるので、平行していくつかのアッセイ法を同時に設定することができる。そのような液体移動装置は通常、一連の容器を含んでおり、その容器の出口はマイクロウェルプレートのウェルに合うように並んでいる。Robbins Hydra (Robbins, Scientific, カリフォルニア州サニーベール)は、ハイスループットスクリーニングシステムで使用できる液体分注装置のもう1つの例である。他の液体分注装置には、Cartesian SynQUAD（米国特許第6,063,339号、カリフォルニア州アーバインのCartesian Technologies, Inc.が販売している）のように、容積式ポンプと分注弁を組み入れたものもある。
【００６７】
当業者には理解できるように、本スクリーニング法で使用されるハイスループット装置は、例えば、細胞のための特定の増殖条件を提供するために、インキュベーターのような他の構成品を含む可能性がある。
【００６８】
検出器もハイスループットアッセイ法システムに含まれている可能性がある。検出器は、試料の任意の物理特性を測定できる。例えば、蛍光、発光、リン光、放射活性、または他の任意の物理特性が検出器で測定される可能性がある。細胞ベースのハイスループットスクリーニングアッセイ法でしばしば使用される検出器の例には、カリフォルニア州サニーベールのMolecular Devices Corp.が販売しているFluormetric Imaging Plate Reader System (FLIPRR); および化学発光イメージングプレートリーダー(CLIPRTM)が含まれる。別のイメージングシステムは、例えば国際公開公報第00/17643号に記載されている。
【００６９】
カメラまたは他の記録装置（例、光ダイオードおよびデータ保存装置）により見た（および選択的に、記録した）光学的画像は、選択的に、例えば、画像のデジタル化およびコンピュータによる画像の保存および解析などによって、本明細書の任意の態様でさらに加工される。ハイスループットスクリーニングシステム用に、デジタル化ビデオおよびデジタル化光学画像のデジタル化、保存、および解析のために、さまざまな周辺装置およびソフトウェアが市販されている。
【００７０】
当技術分野で一般的に使用される1つの通常のシステムは、検体視野からの光を冷却電荷結合素子(CCD)カメラに運ぶ。CCDカメラには、一連の画素（ピクセル）が含まれている。検体からの光は、CCD上で画像になる。検体の領域（例、生体ポリマーのアレイ上の個々のハイブリダイゼーション部位）に対応する特定の画素をサンプリングして、各位置の光の強度が得られる。速度を上げるために、平行して複数の画素が処理される。この種の装置は、例えば、蛍光または暗視野顕微鏡技術によって、任意の試料の観察に使用できる。
【００７１】
投与および薬学的組成物
選択的阻害をする化合物は、癌細胞の増殖を阻害するために哺乳類対象者に投与できる。以下に詳述するように、阻害性化合物は、選択的に薬学的に許容されるキャリアとともに、任意の方法で投与できる。これらの化合物は、他の治療法と合わせて使用できる。組成物は、患者において有効な保護または治療の反応を引き起こすために十分な量で患者に投与される。そのために適当な量は、「治療に有効な用量」として定義される。この用量は、利用する特定の阻害剤の有効性および対象者の状態、ならびに体重または治療する部分の表面積によって、決定される。用量のレベルは、特定の対象者において、特定の化合物またはベクターの投与に伴う任意の副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。
【００７２】
そのような化合物の毒性および治療の有効性は、例えば、LD50（集団の50％に致死的な量）およびED50（集団の50％で治療に有効な用量）を決定するなどにより、細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定できる。毒性および有効性の用量比は治療係数であり、LD50/ ED50という比によって表すことができる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物も使用できるが、正常細胞に対する潜在的損傷を最低限に押さえるために、そのような化合物を患部に送り込むための送達システムを設計し、それにより副作用を低下させるように注意する必要がある。
【００７３】
細胞培養アッセイ法および動物試験から得られたデータは、ヒトで使用する用量範囲を計算するために使用できる。そのような化合物の用量は、好ましくは毒性がほとんどまたは全くなく、ED50を含む、血中濃度範囲内である。用量は使用する剤形および投与経路によって、この範囲内で変わり得る。本発明の方法で使用される任意の化合物について、治療に有効な用量は、まず細胞培養アッセイ法から見積もることができる。細胞培養で決定されるIC50（症状の最大阻害の半分を示す試験化合物濃度）を含む、血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルで用量を計算できる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量を、より正確に決定できる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)によって測定できる。一般に、モジュレーターの用量当量は、典型的な対象者では約1 ng/kgから10 mg/kgである。
【００７４】
本発明に使用される約学的組成物は、1つまたは複数の生理的に許容されるキャリアまたは賦形剤を用いて、標準的な技術で調合できる。化合物およびその生理的に許容される塩および溶媒和物は、吸入、局所、経鼻、経口、非経口（例、静脈内、腹腔内、膀胱内、または髄腔内）、または経直腸を含む、任意の適当な経路によって投与するために調合できる。 
【００７５】
経口投与のためには、薬学的組成物は、例えば、薬学的に許容される、結合剤、例、アルファ化トウモロコシでんぷん、ポリビニルピロリドン、またはハイドロキシプロピルメチルセルロース；充填剤、例、乳糖、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム；潤滑剤、例、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ；崩壊剤、例、馬鈴薯澱粉、スターチグリコール酸ナトリウム；または湿潤剤、例、ラウリル硫酸ナトリウム、を含む賦形剤とともに通常の手法で調製された錠剤またはカプセルの形であり得る。錠剤は、当技術分野で周知の方法でコーティングできる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、懸濁液のような形態をとるか、使用前に水または適当な媒体で再生する乾燥産物でよい。そのような液体調製物は、例えば、懸濁剤、例、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用油；乳化剤、例、レシチンまたはアカシア；非水性媒体、例、アーモンド油、油のエステル、エチルアルコール、または分画植物油；および保存剤、例、メチルまたはプロピル-p-ハイドロキシ安息香酸、またはソルビン酸のような、薬学的に許容される添加剤を用いて通常の方法で調製できる。また調製物は、適当な緩衝塩、着香料、着色剤、および/または甘味料を含む可能性がある。必要ならば、経口投与のための調製物は、活性化合物の放出をコントロールするために適するように処方することもできる。
【００７６】
吸入による投与のためには、化合物は適当な噴射剤、例、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当な気体を用いて、加圧パックまたはネブライザーからのエアゾルスプレーの形態で簡便に送達できる。加圧エアゾルの場合には、投与単位は、計量した量を送達するために、弁を提供することによって決定できる。例えば、吸入器または注入器で使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物および適当な粉末ベース、例えば、乳糖またはでんぷんを含むように調合できる。
【００７７】
化合物は、例えば、大量注射または連続注入のような注射によって、非経口投与するために調合できる。注射用の製剤は、例えば、保存剤を添加した、アンプルまたは複数回の用量を入れた容器のような単位剤形で提供できる。組成物は、油性または水性の媒体中の懸濁液、溶液、または乳濁液のような形態をとり、例えば、懸濁剤、安定剤、および/または分散剤のような調製剤を含む場合がある。または、活性成分は、例えば、使用前に無菌で発熱物質を含まない水のような適当な媒体で再生するための粉末の可能性もある。
【００７８】
化合物は、例えば、通常の座薬基剤、例えばココアバターまたは他のグリセリドを含む、座薬または保持浣腸のような直腸用組成物として調合することもできる。
【００７９】
さらに、組成物はデポ製剤として調合することもできる。そのような長時間作用性製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって、投与できる。したがって、例えば、化合物は適当なポリマーまたは疎水性物質（例えば、許容できる油注の乳濁液として）、またはイオン交換樹脂とともに調合するか、例えば難溶性塩のような難溶性の誘導体として、調合することができる。
【００８０】
必要ならば、組成物は活性成分を含む1つまたは複数のユニット剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置中で提供できる。パックは、例えばブリスターパックのような、金属またはプラスチックのフォイルを含む場合がある。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書が添付されている場合がある。
【００８１】
診断/予後診断の用途
本発明では、「癌細胞の増殖の阻害方法」は、動物中の癌細胞の数を低下もしくは排除する、または癌の症状を軽減するように設計された、手順または行為をさす。癌の治療または癌の増殖阻害は、癌細胞が実際に排除される、癌細胞の数が実際に低下する、または癌の症状が実際に軽減することを必ずしも意味するものではない。しばしば、癌の治療方法は、成功の可能性が少ないが、それでも動物の病歴および見積もられる余命を考慮すると全体として有用だと考えられる場合でも、実施される。
【００８２】
アポトーシス経路における1つまたは複数の変異の検出は、癌を持つ哺乳類の診断および/または予後診断を決定し、好ましい治療法を決定する助けとするために、使用できる。例えば、特定の態様では、本発明は、生体試料中のDR5 TRAIL経路における欠損のレベルおよび/またはその診断上の存在を検出し、診断上の存在またはレベルの上昇が検出された場合は、DNA傷害性ではない抗癌剤、またはDNA傷害性抗癌剤の組み合わせを適用する、癌の治療法を提供する。
【００８３】
化学療法耐性腫瘍細胞は通常、1つまたは複数のアポトーシス経路に機能不全を持つ。腫瘍細胞は、治療前または治療中に、癌細胞集団においてそのような変異の発生をモニターするために解析できる。単一の患者内に存在する細胞のサブポピュレーションでは、異なる変異が発生する可能性がある。例えば、p53における変異のような特定の変異の有無に基づいて、例えばDNA非傷害性薬剤のような治療薬を治療プロトコールに加えたり、例えばアルキル化剤のような特定の治療薬を中止する決定を行うことができる。例えば、bcl-2を過剰発現する、例えば濾胞性リンパ腫のような腫瘍から得られる腫瘍細胞において、p53を阻害するp53変異が検出されれば、DNA損傷を誘導しない別の治療薬、例えば抗CD20抗体、同種Tリンパ球、bcl-2阻害剤、または例えばDR5抗体アゴニストのようなTRAIL受容体を活性化する薬剤、またはTRAIL受容体の発現をアップレギュレーションする薬剤、を加えるという決定が行われる可能性がある。
【００８４】
特定の態様では、DR5 TRAIL受容体経路の欠損の検出に基づく診断後に、癌治療のために免疫療法が用いられる。動物中で癌細胞を破壊する動物の免疫系の能力を増強する方法は、当技術分野で周知である。当業者にはそのような数多くの方法が周知である。これには、腫瘍細胞上に存在する、腫瘍細胞に生産される、または腫瘍細胞の存在を示す、特定の分子に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、例、上述の抗体、による治療が含まれる。いくつかの態様では、抗DR4または抗DR5抗体アゴニストが、癌治療を受ける個体に投与される。抗DR5抗体は、以前に例えば、国際公開公報第01/83560号（抗体TRA-8; ATCC PTA-1428）および国際公開公報第02/079377号に記述されている。例えばリンパ腫の治療の他の態様では、抗CD20抗体、例、リツキシマブ、が単独または他の薬剤と組み合わせて投与される。治療用の抗体の単独または毒素と組み合わせた投与を含む免疫療法は、当業者に周知である（例えば、Pastanら、(1992) Ann. Rev. Biochem., 61:331-354, BrinkmanおよびPastan (1994) Biochemica Biophysica Acta, 1198:27-45等を参照されたい）。他の、抗体に基づかない免疫療法、例、同種リンパ球の投与（例、米国特許第5,843,435号、米国特許第6,207,147号およびそれらに引用された参考文献を参照されたい）も、TRAIL DR5経路に欠損を持つ化学療法耐性癌を治療するための他の治療法と組み合わせて、または単独で使用することができる。
【００８５】
したがって、本発明はアポトーシス、特にTRAIL DR5経路に1つまたは複数の欠損を持つ細胞集団を含む癌を持つ哺乳類の治療を最適化するための多くの方法を提供する。患者および他の臨床的要因の状態に基づいて、DNA非傷害性化合物は、1つまたは複数の通常の周知の抗癌療法、例、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法、免疫療法、抗血管新生療法等、と組み合わせても投与できる。
【００８６】
実施例
実施例1. 化学療法耐性の機序の同定および化学療法耐性リンパ腫細胞の増殖を阻害する化合物の選択
本実施例は、化学療法耐性癌細胞を用いて、癌の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする例を提供する。
【００８７】
方法
材料
蛍光発生するAFCカスパーゼ基質（Ac-DEVD-AFC）、およびカスパーゼ阻害剤Z-IETD-fmkおよびZ-LEHD-fmkはCalbiochemから購入した。細胞培養試薬はGibcoから、その他のすべての化学物質（エトポシドおよびドキソルビシンを含む）はSigmaから購入した。
【００８８】
リンパ腫細胞DOHH2, K422, RL-7およびJurkat細胞は、10％の熱失活させたウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPESおよび1.0 mMピルビン酸ナトリウムを添加したRPMI1640中で培養した。DOHH2およびK422細胞株は、DSMZ（ドイツBraunschweig）から、RL-7細胞はDr. Bertrand Nadel（オーストリア、ウィーン大学）から入手し、Jurkat細胞はATCCから購入した。
【００８９】
さまざまなアポトーシス刺激で処理した後の生細胞数を決定するためには、MTT細胞毒性アッセイ法が使用された。96ウェルプレートの各ウェルに細胞（8 x 105細胞/mlを100μl）を添加し、エトポシドまたはドキソルビシンと24〜72時間インキュベーションした。その後MTT色素溶液を4時間添加し、青い結晶産物を37℃で一晩可溶化し、570 nmで吸光度を測定した。MTTアッセイ法は増殖停止も測定するので、MTTの結果はカスパーゼ活性アッセイ法で確認した。
【００９０】
蛋白質発現の評価にはウェスタンブロット解析が使用された。細胞（2.4 x 106ウェル）を6ウェルプレートに播き、それぞれのアポトーシス刺激で処理した。記載の時間の後、細胞を氷冷したPBSで洗い、低張の溶解緩衝液（20 mM HEPES pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTAおよび1 mM DTT）を含む1％ Triton X-100で溶解した。蛋白質（40μg）は10〜20％勾配SDSポリアクリルアミドゲル上で、還元条件下で電気泳動した。ニトロセルロースメンブレンに電気ブロッティングした後（SchleicherおよびSchuell）、10％脱脂粉乳で1時間ブロックし、以下の1次抗体で1時間免疫ブロッティングした：ウサギ抗DR5ポリクローナル抗体（1:500, Cayman Chemicals）、マウス抗Fasモノクローナル抗体CH-11 (MBL)、ウサギ抗カスパーゼ3ポリクローナル抗体（1:1000, Pharmingen）、ウサギ抗カスパーゼ8ポリクローナル抗体（1:1000, Pharmingen）、マウス抗カスパーゼ9モノクローナル抗体5B4（1:1000, MBL）、マウス抗bcl-2モノクローナル抗体（1:500, Pharmingen）またはヤギ抗アクチンポリクローナル抗体（1:200, Santa Cruz Biotechnology）。メンブレンはTBS/0.05% Tweenで5回洗い、それぞれのペルオキシダーゼの結合したアフィニティ精製した2次抗体（1:5000, Biorad）と30分間インキュベートし、さらに5回洗って、増強した化学発光を用いて現像した。（ECL, Amersham）。
【００９１】
DR5抗体アゴニストの単離
DR5抗体アゴニストは、機能スクリーニングを用いて単離した。簡単に述べると、チオレドキシン-DR5融合蛋白質を用いて、Balb-Cマウスを免疫した。免疫はRIMMS（複数部位への繰り返し免疫）手順を用いて行った。プールした末梢リンパ節から単離されたB細胞をbcl-2でトランスフェクトされた骨髄腫細胞と融合させた。得られたハイブリドーマの培養上清を、ヤギ抗マウスFcと架橋し、アラマーブルー酸化還元スクリーニング中で機能活性のアッセイ法をした。陽性のウェルを同定し、限界希釈によりハイブリドーマをさらにサブクローニングし、さらなる解析のためにモノクローナル抗体を単離した。続いて、抗体はDR5特異的であり、DR1, DR2, DR3, またはDR4特異的ではなく、さまざまなDR5発現腫瘍細胞株中でカスパーゼ3を活性化する能力があることが示された。
【００９２】
カスパーゼアッセイ法
カスパーゼ活性は、以前に記述されたようにして（StennickおよびSalvesen, 2000）、100μMの蛍光発生ペプチドAc-DEVD-AFCを含むカスパーゼ緩衝液（50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 10%スクロース、1 mM EDTA, 0.1% CHAPSおよび10 mM DTT）40μl中で、37℃で測定された。活性は、405-510フィルター対を用い、キネティックモードでMolecular Devices蛍光光度計を用いて、DEVD-AFCからのAFCの放出によって、標示された時間の間、連続的に測定された。種々のアポトーシス刺激で処理した後の、無傷の細胞のカスパーゼ活性の評価には、細胞の総蛋白質10〜20μg（Triton X-100抽出物）を40μlのカスパーゼ緩衝液（10μM DEVD-AFCを含む）中で使用した。インビトロでのチトクロームcによるカスパーゼ活性の開始には、Triton X-100を含まない、低張サイトゾル抽出物を調製し、10μMウマ心臓チトクロームc（Sigma）と1 mM dATP、または組換え活性カスパーゼ8（20 nM）をカスパーゼ活性化（Deverauxら、1997）に使用した。RL-7低張細胞抽出物の再生のためには、以前に記述されたように（Stennickeら、1998）組換えプロカスパーゼ3が使用された。
【００９３】
半定量的PCR
カスパーゼ3 mRNAの相対的定量のためには、製造元の指示に従って（Ambion; QuantumRNA TM 18S内部標準）、18sRNA内部標準を用いた逆転写(RT)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用した。細胞の全RNAはRNeasyKit (Quiagen)を用いて3 x 106 細胞から調製され、1μgの総RNAはTermoscript RT-PCR System（Life Technologies）のTaqGoldポリメラーゼとオリゴdTプライマーを用いて、逆転写された。RT産物（1μl）は、18sリボゾームRNA特異的プライマーおよび経験的に決定した比の18s competimerの存在下で、カスパーゼ3特異的プライマーによって増幅された。増幅は、2.5 mM MgCl2を含む最終容量20μl中で、1ユニットのポリメラーゼを用いて行った。TaqGoldは95℃、5分間のインキュベーションによって活性化し、反応は95℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で2分のサイクルを20〜37回行い、その後、最後に72℃で10分間伸長させた。PCR産物はエチジウムブロマイド染色を用いて1％アガロースゲル上で視覚化した。
【００９４】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ解析
RNeasy Kit (Quiagen)を用いて、未処理およびエトポシド処理の細胞から、2時間および4時間後（3 x 106）に、細胞の総RNAを調製した。標識cRNAを調製し、アレイは50℃で16〜20時間ハイブリダイズさせ、すべての実験が二重に重複して行われたこと以外は以前に記述されたようにして（Wodickaら、1997）、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（U95Av2 GeneChip; Affymetrix Incorporated, カリフォルニア州サンタクララ）にハイブリダイズさせた。スキャンされた画像ファイルは、GENECHIP 3.1（Affymetrix）、GeneSpringおよびCluster/TreeViewによって解析された。各細胞株中でエトポシドに応答してアップまたはダウンレギュレーションされる遺伝子は、以下の基準で選択した：最大ハイブリダイゼーション強度(AD)が少なくとも1つの試料（未処理、エトポシド処理の2hまたは4h後）で＞200であること、重複した試料のt検定のp値が0.2未満であること、および増加または減少が平均少なくとも2.0倍であること。各遺伝子につき、すべての細胞株の平均の変化倍率は中央値を中心として「Cluster」で正規化し、「TreeView」で出力した。細胞株（DOHH2, K422またはRL-7）のうちの1つで上記の3つの基準を満たした遺伝子のみを、含むようにした。
【００９５】
プラスミドおよび配列決定
DOHH2、K422およびRL-7細胞のカスパーゼ3およびp53のコード配列の配列決定のためには、遺伝子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行い、PCR産物をpCR4-TOPO（Invitrogen）にクローニングした。
【００９６】
結果
抗癌剤に対する感受性を決定するために、さまざまなヒトFL細胞株が調べられた。リンパ腫細胞株DOHH2, K422, およびRL-7のアポトーシス刺激に対する応答を比較すると、化学療法剤に対して異なる感受性があることが示された。細胞は、トポイソメラーゼII阻害剤であるエトポシド、およびアンスラサイクリンであるドキソルビシンについて試験されたが、これらはDNAの二本鎖の破壊を引き起こしてアポトーシスを誘導することが示されているものである。K422およびRL-7細胞株では、生存率が同様に50％低下するためには（図1A）、DOHH2細胞と比較して、50倍高い薬物濃度が必要だった。カスパーゼ活性アッセイ法は、これらの実験の細胞生存率と正の相関を示し、この結果が薬剤に誘導される細胞周期の調整の差を反映しているのではないことが示された。3つの細胞株で観察された薬剤感受性は、各々の臨床歴と関連している：K422およびRL-7は化学療法耐性患者に由来する細胞株である。
【００９７】
エトポシドおよびドキソルビシンがDOHH2細胞で細胞死を誘導するみかけのIC50濃度は、対照として使用されたJurkat T-ALL細胞で観察された値と類似していた（図1A）。これらの細胞は検出可能な量のbcl-2を発現せず、スタウロスポリン、アゴニストの抗Fas抗体、紫外線暴露、γ線照射、およびDNA傷害性薬剤を含む大部分のアポトーシス刺激に感受性であることが知られている。安定してトランスフェクトされbcl-2発現で選択されたJurkat T細胞における薬物応答も、評価された。bcl-2蛋白質を劇的に過剰発現するこれらの細胞は、野生型Jurkat T細胞と比較して、DNA傷害性薬剤に対する耐性が、わずかに上昇しているのみだった。
【００９８】
FL細胞株におけるBcl-2過剰発現は紫外線に誘導される細胞死の抑制に十分である
紫外線に誘導されるアポトーシスは、チトクロームcのミトコンドリアからの放出に依存すると報告されており、これはbcl-2発現で阻害され得る。したがって、3つのFL細胞株のすべてで、bcl-2がミトコンドリア依存性アポトーシス経路を有意に阻害することを確認するために、紫外線暴露（16〜24時間）後の細胞毒性アッセイ法が行われた（図1B）。紫外線に誘導される細胞毒性は、試験されたすべての細胞株中で、bcl-2蛋白質の量と負の相関があった。DOHH2, K422, RL-7およびbcl-2を安定的に発現するJurkat T細胞は、紫外線に誘導される細胞死に対して類似した耐性を示したが、bcl-2を欠如したJurkat T細胞は、より感受性が高かった。したがって、化学療法感受性DOHH-2細胞におけるbcl-2発現は、内因性のミトコンドリア依存性細胞死経路を抑制するために十分だったが、抗癌剤に誘導されるアポトーシスの抑制には十分ではない。したがって、これらのDNA傷害性薬剤および紫外線暴露は、FL細胞中で、異なるアポトーシスプログラムに関与している。
【００９９】
エトポシド処理後のFL細胞株の遺伝子発現プロファイリング
DNA傷害性薬剤への暴露後のFL細胞の化学療法感受性および耐性表現型をさらに解析するために、12,533遺伝子に相補的なプローブセットを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Affymetrix U95Av2, 図2A）を用いて遺伝子発現が評価された。エトポシド処理前、および処理の2時間および4時間後に、DOHH2, K422, およびRL-7細胞から総RNAが単離された。最初のフィルターとして、未処理の対照と比較して、エトポシド処理の2時間および4時間後に、少なくとも2倍のRNAレベル変化を示した遺伝子を各細胞株中で探した（さらなる選択基準に関しては材料と方法を参照されたい）。エトポシドに応答して発現が変化した遺伝子の数の最も多かったのは薬剤感受性のDOHH2細胞中で（DOHH2では43遺伝子、K422では13遺伝子、RL-7では12遺伝子）、これらの大部分（88％）は、化学療法耐性のK422およびRL-7細胞株中では有意に変化しなかった。遺伝子のこのサブセットには、TRAIL細胞死受容体DR5、および例えばアポトーシス促進性bcl-2ファミリーメンバーのPUMAおよびNOXAのような他のアポトーシス関連遺伝子が含まれている。
【０１００】
DOHH2においてエトポシド処理に応答した遺伝子の多くは、p21 (Cip-1/WAF1/MDA6), GADD45, DR5, Fas-R, NOXAおよびPUMAのようなp53に調節される既知の遺伝子を含めた、p53コンセンサス要素（0〜13塩基対の間隔で5’PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy-3’）に高度に類似したプロモーター配列を含んでいる。p53に調節される既知の遺伝子のいくつかの発現の生データでは、FL細胞株の各々における、発現の変化の程度が示された（図2B）。p53に非依存性のGADD34およびNFκB阻害因子α（NFκBIα）のようなごくわずかの遺伝子が、3つのFL細胞株のすべてで共通してアップレギュレーションされていた。NFκBIαの仲介する転写因子NFκBの阻害は、抗アポトーシス遺伝子の発現を抑制し、それにより細胞をアポトーシス刺激に感受性にすると予測される。しかし、上述のp53に調節される遺伝子の少なくともいくつかが共に発現していないと、NFκBIα発現単独ではアポトーシスの促進には十分ではない。
【０１０１】
化学療法耐性FL細胞株におけるp53変異
DOHH2細胞中でエトポシドに応答する遺伝子の多くは、p53によって調節されていることが知られている。したがって3つのFL細胞株のそれぞれから得られたp53 cDNAの配列決定をして、FLにおける抗癌剤耐性にp53の変異が寄与しているかどうかが決定された。その結果、DOHH2細胞は野生型のp53を含むが、RL-7とK422細胞は変異型のp53を含むことが示された。RL-7細胞中のp53の配列には、DNA結合ドメインのエクソン5に単一塩基対置換があった（C135F）。WHO International Agency for Research on Cancer (フランス、リヨン)のp53変異データベースと比較したところ、このシステインからフェニルアラニンへのアミノ酸置換は、ヒトの癌で非常に多いことがわかった（図3）。これに対して、K422細胞中のp53遺伝子は、319の位置に珍しい末端前の終止コドンを含んでいた。得られたp53の短縮型蛋白質は4量体化ドメインを持たないため、活性のある4量体のp53を形成できない。現在までにp53のエクソン9にあるこの変異は、C型肝炎ウイルス（HCV）陽性の肝細胞癌の1人の日本人患者でのみ報告されている。
【０１０２】
DNA傷害性薬剤はTRAIL-DR5受容体のアップレギュレーションを誘導する
Bcl-2を発現するDOHH2細胞は、DNA傷害性薬剤に感受性であることが示された。したがって、カスパーゼ8を介するカスパーゼ3の活性化を通してbcl-2を回避する能力のある細胞死受容体経路をDNA損傷が作動させることができるかどうか、およびTRAIL-DR5受容体アップレギュレーションを伴う遺伝子発現プロファイリング結果を確認するために、この細胞死受容体の作用が、FL細胞株の薬剤に誘導される細胞死を増強するかどうかが決定された。DOHH2, K422, およびRL-7細胞をエトポシド、アゴニストの抗DR5抗体、またはその両方で処理した（図４A）。エトポシドでDOHH2細胞をあらかじめ処理すると、薬剤または抗DR5抗体処理のみの場合と比較して、抗DR5抗体によって誘導されるアポトーシスが有意に増加したが、K422またはRL-7細胞ではそのような効果はなかった。同様なアッセイ法で、アゴニストの抗Fas抗体はDNA傷害性薬剤の有無にかかわらずこれらの細胞株のいずれでも有意な効果を示さなかったが、抗Fas抗体はJurkat T細胞などの他の細胞株では、アポトーシスを強力に誘導する。
【０１０３】
DOHH2細胞において、抗DR5抗体とDNA傷害性薬剤の間の相乗効果をさらに解析するために、この細胞死受容体経路の成分の蛋白質レベルを評価した。DR5に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット解析では、エトポシド（およびドキソルビシン）への暴露後に、DOHH2細胞でDR5蛋白質レベルが有意に増加した（図4B）。DR5の増加は、プロカスパーゼ8の活性化と相関していたが、これはDOHH2細胞におけるカスパーゼ3の蛋白質分解性プロセッシングおよび活性化と相関している。これに対して、DNA傷害性薬剤への暴露後、K422およびRL-7細胞ではDR5レベルは一定であり、FL細胞におけるp53の変異がこの細胞死受容体経路の活性化を抑制しているという更なる証拠を提供した。
【０１０４】
DR5経路において、カスパーゼ8は最初のカスパーゼであるので、この酵素のペプチジル阻害剤を用いてDNA傷害性薬剤への応答におけるDR5経路の役割をさらに評価した。カスパーゼ8を阻害すると、DOHH2細胞において、エトポシドに誘導されるカスパーゼの活性化およびアポトーシスが予防され、これによりDNA損傷に誘導されるアポトーシスがTRAIL-DR5およびカスパーゼ8経路の作動に依存することがさらに支持された。
【０１０５】
薬剤耐性RL-7細胞はカスパーゼ3のダウンレギュレーションによってアポトーシスを抑制する
K422およびRL-7細胞において薬剤耐性の増強に寄与する欠損をさらに解析するために、無細胞抽出物にそれぞれチトクロームcまたは活性カスパーゼ8を添加することにより（Deverauxら、EMBO J. 17:2215-2223, 1998）、内因性（ミトコンドリア）および外因性（細胞死受容体）の両方の細胞死経路をインビトロでモデル化した。細胞溶解物に対してチトクロームcまたはカスパーゼ8を直接に添加すると、FL細胞においてbcl-2によって仲介されるミトコンドリアの阻害およびp53変異による転写の欠損を「迂回」するはずで、そのためにこの典型的な細胞死経路の更なる変化を調べることができる。その結果、チトクロームcとカスパーゼ8の両方が、DOHH2細胞および化学療法耐性K422細胞抽出物中でカスパーゼ活性を有意に誘導することが示された。しかし、RL-7細胞抽出物では、いずれの蛋白質を加えた場合の応答でも、カスパーゼ活性が著しく低下していた（図5A）。
【０１０６】
RL-7細胞によって阻害される生化学的段階を決定するために、カスパーゼ特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングを用いて、チトクロームcまたは活性カスパーゼ8の添加により誘導されるカスパーゼプロセッシングおよび活性化を調べた（図5B）。これらのデータでは、すべての細胞中でチトクロームcがプロカスパーゼ9を切断し、活性カスパーゼ9に特徴的な大きなp35サブユニットを生成した；しかし、内因性経路における次のプロテアーゼであるカスパーゼ3は、RL-7中にほとんど存在しないが、DOHH2およびK422溶解物にはプロカスパーゼ3が豊富に存在し、チトクロームcまたは活性カスパーゼ8の添加後にこれは活性の大きなサブユニット（〜p20、p17）へプロセスされる（図5B）。活性カスパーゼ8の添加により外因性経路を模倣すると、カスパーゼ3が活性化し、これがカスパーゼ9をp37型の大きなサブユニットへとプロセスする。RL-7溶解物では、カスパーゼ9はおそらく残存カスパーゼ3活性のために、後の時点でもプロセスされる。RL-7溶解物に組換えプロカスパーゼ3を補うと、チトクロームcとカスパーゼ8に誘導されるカスパーゼのプロセッシングおよび活性化が回復し、これはDOHH2およびK422溶解物中で内在性カスパーゼ3で観察されるものと類似している（図5C）。
【０１０７】
カスパーゼ3のmRNAの半定量的PCR解析では、RL-7細胞で転写物レベルが低下していることが示され、これはプロカスパーゼ3蛋白質のレベルの低下は翻訳または翻訳後の欠損ではなく、カスパーゼmRNAレベルの低下であることを示唆している。RL-7ならびにK442およびDOHH2細胞から得られたカスパーゼ3のDNAの配列決定をしたが、この遺伝子のコード領域には変異は見られなかった。このように、RL-7 FL細胞では、bcl-2の過剰発現および変異p53に加えて、プロカスパーゼ3蛋白質のレベルが極度に低下している。これは、これらの細胞が、どうして細胞死受容体とミトコンドリア依存性の両方のアポトーシスプログラムに極度に耐性であるかをさらに説明するものである。
【０１０８】
代替細胞死経路を誘導する低分子のハイスループット細胞毒性ディファレンシャルスクリーニング
本明細書に記述されるように、K422, RL-7, およびDOHH2 FL細胞株はDNA傷害性薬剤に対して異なる応答を示す。これらの差異を利用して、代替細胞死誘導機構を持つ化合物がスクリーニングされた。K422またはRL-7の生存率を有意に低下させるが、DOHH2細胞の生存率は低下させない化合物について、ハイスループット形式で低分子ライブラリーがスクリーニングされた（詳細は材料および方法を参照されたい）。K422細胞株で選択的な細胞毒性を示した2つの化合物が同定されたが（図６A）、これらは既知で市販されている化合物ブレフェルディンAおよび以下に構造を示すスタウロスポリン誘導体のStaur-F3である。ブレフェルディンAおよびスタウロスポリン誘導体は、試験した他の細胞と比較して、K422細胞に対してIC50でそれぞれ6倍および25倍の差を示した。
スタウロスポリン誘導体：
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スタウロスポリンアナログは、例えば、Caravattiら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 4:399-404, 1994に記述されている。例えば、アクリル化誘導体のような誘導体は、既知である。例えば、米国特許第5,093,330号を参照されたい。そのような誘導体は、アポトーシスの誘導に使用できる可能性がある。
【０１０９】
ブレフェルディンAまたはスタウロスポリンアナログで処理されたFL細胞を形態学的に調べたところ、K422のみが古典的アポトーシスの特徴、すなわち、細胞の凝縮、膜の小胞形成、および最終的な断片化のような特徴を示すことがわかった。この応答を定量するために、処理および未処理細胞を溶解し、カスパーゼ活性を測定した（図6B）。100 nMブレフェルディンAまたはスタウロスポリンアナログを添加すると、カスパーゼの活性化が誘導され、これらの試料のウェスタンブロット解析では、K422細胞のみでカスパーゼ2, 3, 7, および9がプロセッシングされるがDOHH2またはカスパーゼ3欠損のRL-7細胞ではプロセッシングされないことが示された（図6C, D）。カスパーゼ9の大きなサブユニットのp37型が主に観察され、p35型ではなかったので、カスパーゼ9のプロセッシングは、内因性経路での自己触媒性活性化ではなく、カスパーゼ3またはカスパーゼ7による可能性が高い。細胞死受容体関連のカスパーゼ8は、すべての細胞株中でプロセスされずに残った。したがって、K422では内因性および外因性の両方の経路が阻害されたままであり、これらの化合物は、別の手段で執行人カスパーゼ3および7を活性化すると考えられる。興味深いことに、類似したカスパーゼプロセッシングが両方の化合物で観察されており、これはこれらの薬剤が共通の経路を通してアポトーシスを誘導することを示している。ブレフェルディンAは、局所カスパーゼ2活性化を促進できると報告されている（ChardinおよびMcCormick, Cell 97:153-5, 1999; Manciniら、J Cell Biol. 149:603-12, 2000; およびFerri Kroemer, Nat Cell Biol. 3:E255-63, 2001）ゴルジ体の分解による小胞体ストレスの強力な誘導物質であるので、カスパーゼ2はおそらくこの代替経路の最初のカスパーゼである。
【０１１０】
概要
bcl-2の過剰発現のために、FLは標準的な化学療法では治癒できない、無痛性の進行の遅いリンパ腫となっている。bcl-2を介してミトコンドリア経路の細胞死が阻害されているため、抗癌剤は、例えばp53および/またはカスパーゼ3のようなTRAIL-DR5細胞死経路に変異を持つFLサブポピュレーションを選択する可能性が高い（図7を参照されたい）。薬剤耐性のリンパ腫細胞が継続するという考えと一致して、標準的化学療法が分子応答を生成する能力を持つことはまれであることが観察されている。
【０１１１】
「古典的」および「形質転換/生存特異的」化学療法に誘導される細胞死経路は図8に示されている。濾胞性リンパ腫細胞は抗アポトーシス蛋白質bcl-2を過剰発現するが、もともとは抗癌剤に感受性である。この見掛け上のパラドックスの理由は、DNA傷害性薬剤は、NOXAおよびPUMAのようなアポトーシス促進性bcl-2ファミリーメンバーを誘導するだけではなく、TRAIL-DR5細胞死受容体も誘導し、これがbcl-2非依存性にカスパーゼ8およびカスパーゼ3を活性化するためである。両方のアポトーシス開始経路に共通の上流の調節因子は、転写因子p53である。DNA傷害性薬剤に耐性のFL細胞では、p53を介する転写の変異による不活化か、カスパーゼ3発現の抑制のために、この細胞死受容体経路が極度に働かなくなっている。それでも、正常または標的を持たない腫瘍細胞では毒性のない濃度において、K422細胞においてp53およびbcl-2非依存的アポトーシスを誘導した、ブレフェルディンAおよび潜在的蛋白質キナーゼ阻害剤Staur-F3で示されたように、細胞特異的形質転換または生存分子を標的とすることで、化学療法耐性腫瘍細胞において別のプログラムされた細胞死経路を誘導する可能性がある。
【０１１２】
したがって、選択的スクリーニング戦略を利用することによって、類似した細胞死プログラムを誘導する既知の薬剤ブレフェルディンAおよびスタウロスポリンアナログ（Staur-F3）が同定された。ブレフェルディンAはGTP結合蛋白質ARF-1の特異的「非競合」阻害剤であることが知られているが、ARF-1はゴルジ複合体の形成に必要とされている（ChardinおよびMcCormick、上記）。ブレフェルディンAで処理すると、小胞体(ER)ストレスが誘導されるが、これは最近、新規の代替アポトーシス経路と考えられている（Raoら、J Biol Chem. 272:21836-42, 2002）。興味深いことに、NCI 60腫瘍細胞パネルのブレフェルディンAに対する感受性のNCIデータベースを検討すると、最も感受性の高い細胞株はNCI/ADRである（データはhttp://.nci.nih.govで見られる）。これらの細胞はK422同様、ドキソルビシン（アドリアマイシン）に耐性である。
【０１１３】
スタウロスポリン誘導体は、蛋白質キナーゼ阻害剤（例、PKC）として機能できるため、ER/ゴルジのアポトーシス経路にキナーゼが関係していると考えられる。
【０１１４】
要約すると、化学療法感受性および耐性の患者から確立された細胞株を用いて、薬剤に誘導される細胞死経路をさらに解析し、化学療法耐性に寄与するような、これらの経路中の変異が同定された。細胞を用いて、エトポシドおよびドキソルビシンのようなDNA傷害性薬剤とは異なる機構で細胞死を誘導する化合物のスクリーニングが行われた。
【０１１５】
実施例2：TRAILを介するアポトーシスを調節する蛋白質の同定
本実施例は、TRAIL-DR5細胞死受容体経路の調節のための治療標的のリストを提供する。表1にリストされている各遺伝子のための干渉性低分子（siRNA）を合成し、別々に細胞に導入した。その後、DR5を介したTRAIL-DR5細胞死経路の誘導に対する効果を決定した。各々の場合、遺伝子発現を破壊すると、TRAILを介する細胞死が増強された。したがって、リストされた遺伝子は、アポトーシスを刺激し、そのために癌の治療に有用である化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ法に使用するために適当な標的である。
【０１１６】
スクリーニングアッセイ法は、表1に記載されている標的ポリペプチドの活性を低下させる能力について、候補物質を試験する段階を含む可能性がある。活性は、直接または間接的に測定できる。例えば、活性は、種々の標的ポリペプチドに関して、例えば酵素アッセイ法のような既知のアッセイ法を用いて測定できる。または、活性は本明細書に記載されるように、標的ポリペプチドを発現する細胞中で、mRNAまたは蛋白質のいずれかの発現レベルを測定することによっても評価できる。
【０１１７】
標的ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる調節領域を含むポリヌクレオチドに機能的に連結されたレポーターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むレポーターコンストラクトを用いても、候補物質は試験できる。そのようなアッセイ法は、当技術分野で周知である。代表的な方法を開示した基本的なテキストには、Sambrookら、上記、およびAusubel、上記が含まれる。
【０１１８】
表1の蛋白質を標的とする阻害剤のスクリーニングには、細胞および固体アッセイ法のいずれも使用できる。しばしば、標的ポリペプチドの阻害剤のスクリーニングアッセイ法は、細胞ベースのアッセイ法を用いて行われる。細胞は内在性の蛋白質を発現するか、または標的ポリペプチド、もしくは標的ポリペプチドの活性断片、もしくはレポーターコンストラクトをコードする核酸配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞であり得る。阻害剤のスクリーニングにはインビトロアッセイ法も使用できる。しばしば、そのようなアッセイ法で使用されるポリペプチドは、組換えで生産される。
【０１１９】
標的ポリペプチドの阻害剤のスクリーニングアッセイ法は、手作業またはハイスループットの形式で実施できる。
【０１２０】
【表１】
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【０１２１】
本明細書に引用されるすべての出版物および特許出願は、各出版物または特許出願が明確に個々に参照として本明細書に組み入れられると記されている場合と同じく、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２２】
前述の発明は、明確な理解のために、図や実施例によって詳細に記載されているが、本発明の開示を考えると、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずに、特定の変更および修正を加えることができるのは当業者には明らかであると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】(A) 抗癌剤に対するFL細胞株のさまざまな感受性。DOHH2 (■)、Jurkat (●)、Jurkat bcl-2 (+)、K422 (▲)、およびRL-7 (□)細胞を、記載の濃度のエトポシドおよびドキソルビシンで24時間処理した。細胞の生存率はMTTアッセイ法(A)で決定し、カスパーゼアッセイ法ではDOHH2の薬剤感受性とK422およびRL-7細胞の耐性が確認された（データは示さず）。データは3つの値の平均で、4つの独立した実験、およびチューブリン阻害剤（例、ビンクリスチン）でも同様な結果が得られた。(B) FL細胞株はUVに誘導される細胞死に耐性である。記載の細胞株にUV光を徐々にレベルを上昇させて照射し（x100μJ/cm2）、細胞の生存率をMTTアッセイ法で決定したが、FL細胞株は対照のJurkat T細胞よりもUVに誘導されるアポトーシスに耐性であることが示された。Bcl-2蛋白質レベルは、blc-2蛋白質に特異的な抗体を用いて、ウェスタンプロット解析で確認された（上パネル）。
【図２】(A) エトポシド処理したFL細胞の遺伝子発現解析。4.25μMエトポシドに暴露した0, 2, 4時間後に、各FL細胞株からRNA試料を調製した。遺伝子発現解析は、U95Av2アレイ（Affymetrix）を用いて以前に記述されたようにして行った（Wodickaら、Nat Biotechnol. 15:1359-67, 1997）。すべての遺伝子（12,533）は以下の基準を用いて選択した：3つのFL細胞株（DOHH2, K422またはRL-7）のうちの1つで、エトポシド処理の2または4時間後に、平均の変化が≧2.0倍、および最大ハイブリダイゼーション強度（AD）＞200（少なくとも1つの試料で：未処理、エトポシド処理後2h、または4h）。2つの独立した実験のデータを平均した。これらの基準を満たした各遺伝子について、すべての細胞株での平均の変化倍率を中央値を中心として正規化し、平均の変化倍率と比較して増加は赤、低下は青で表示した。色の彩度は、平均からの差の程度に比例している。(B) p53に調節されることが報告されているいくつかの遺伝子の発現の生データ。エトポシド添加後0, 2, および4時間後の中央値および標準偏差は、2つの独立した実験の結果である。灰色はDOHH2、白色はK422、および斜線はRL-7を表す。
【図３】化学療法耐性K422およびRL-7細胞株で観察されたp53変異およびp53ドメイン構造内の局在性。DHOO2, K422, およびRL-7細胞のコード配列をmRNA特異的プライマーで増幅し、pCR4-TOPO (Invitrogen) にクローニングし、配列決定した。各コドン変異の頻度は、単一塩基対置換の％として上パネルに示されており、これはWHOのInternational Agency for Research on Cancer (Hernandez-Boussardら、International Agency for Research on Cancer, Hum Mutat. 14:1-8, 1999)との比較で作製された。
【図４】(A) エトポシドはDOHH2における抗DR5に誘導されるアポトーシスを増強するが、K422およびRL-7細胞では増強しない。異なるFL細胞株をエトポシド（0.425μM、4時間）、その後アゴニストの抗DR5抗体（表示された濃度、単位はng/ml、12時間）で処理、または薬剤（0.425μMエトポシド、4時間＋12時間無処理）もしくは抗体（4時間無暴露＋12時間抗DR5）単独で処理した。生細胞の割合は、16時間後にMTTアッセイ法により決定した。(B) エトポシドはDOHH2細胞中でのみ、DR5のアップレギュレーションおよびカスパーゼの活性化を誘導する。表示された時間（単位は時間）4.25μMエトポシドで処理した後、細胞全体の溶解物を調製し、蛋白質濃度を標準化した。カスパーゼの活性化は、ウェスタンブロット（各レーン40μg蛋白質）で測定し、カスパーゼ活性アッセイ法で確認した（データは示さず）。蛋白質ロードを同等にするためにβアクチンの発現を使用し、各実験はエトポシドおよびドキソルビシンを用いて2度繰り返したが、類似した結果が得られた。*は抗DR5免疫反応性産物を示す。カスパーゼ8およびカスパーゼ3パネルの下側の小さな矢印は、プロテアーゼの活性サブユニットを表す。
【図５】薬剤耐性RL-7細胞株におけるカスパーゼ3のダウンレギュレーション。(A)(B) カスパーゼ8 (Casp8)およびチトクロームc (Cyt-c)は、DOHH2, K422、およびRL-7細胞から調製された細胞質抽出物において、カスパーゼ活性を誘導した。カスパーゼ8（20 nM）またはチトクロームc（10μM＋1 mM dATP）の添加後、細胞溶解物をそれぞれ37℃（C8）または30℃（cyt-c）で表示の時間（単位は分）インキュベーションし、DEVD-AFCからのAFC放出(A)またはウェスタンブロット解析(B)によってカスパーゼ活性を測定した。細胞溶解物（各レーン40μg）を10-20% SDS-PAGEによって分離し、材料と方法に記述されるようにして、カスパーゼ9および3のウェスタンブロット解析を行った。カスパーゼ9の大きな活性サブユニットは〜35 kDa（自己分解性蛋白質分解）および〜37 kDa（カスパーゼ3によるカスパーゼ9の切断）に検出され、活性カスパーゼ3の大きなサブユニットは〜17 kDaおよび20 kDaに観察された。両方のカスパーゼの小さなサブユニット（〜p10）は我々の抗体では検出されない。(C) RL-7細胞溶解物中でのカスパーゼ3の再構成。組換えプロカスパーゼ（10 ng）をRL-7細胞の細胞質抽出物に添加し、カスパーゼ8またはチトクロームc/dATPで活性化し、上述のようにカスパーゼ活性を測定した。
【図６】(A) ブレフェルディンAおよびスタウロスポリンアナログStaur-F3（各構造は右に示されている）で例証されるK422の特異性。DOHH2（■）、Jurkat（●）、Jurkat bcl-2（＋）、K422（▲）、およびRL-2（□）細胞を、表示された化合物濃度で24時間処理し、細胞の生存率をMTTアッセイ法で決定した（データは3つの値の平均値）。ブレフェルディンAおよびStaur-F3は酵素活性アッセイ法（DEVD-AFCからのAFC放出）(B)およびウェスタンブロット解析(C)および(D)で測定したカスパーゼ活性を誘導した。表示された時間（単位は時間）100 nMブレフェルディンまたは100 nM Staur-F3で処理した後、細胞溶解物全体を調製し、蛋白質濃度について標準化した。カスパーゼ2, 3, 7, 8, および9のカスパーゼ活性アッセイ法（10μg総蛋白質）およびウェスタンブロット解析（40μg）は、材料と方法に記述されるようにして実行した。蛋白質ロードを同等にするためにβアクチンの発現を使用し、各実験は2度繰り返し、類似した結果が得られた。
【図７】(A) FLにおける疾病の経過と分子イベントの相関。
【図８】「古典的」および「形質転換/生存特異的」化学療法に誘導される細胞死経路。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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