(57)【要約】発癌性タンパク質を分解し、癌（新生物）細胞または前癌（前新生物）細胞のアポトーシスを増進させるために、ＵＢＥ１Ｌまたはユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５を誘導するあるいはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する組成物および組成物を使用する方法を提供する。これらの組成物の投与により癌を予防または処置するための方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＢＥ１Ｌまたはユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５を誘導する剤、あるいはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する剤を含む、癌の予防または処置のための組成物。
【請求項２】
剤が、ＵＢＥ１Ｌまたはユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５を選択的に誘導する、あるいはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を選択的に阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細胞を請求項１に記載の組成物と接触させることを含む、新生物細胞または前新生物細胞のプロアポトーシス経路および分解経路を増進させるための方法。
【請求項４】
細胞を請求項２に記載の組成物と接触させることを含む、新生物細胞または前新生物細胞のプロアポトーシス経路および分解経路を増進させるための方法。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を患者に投与することを含む、患者の癌を予防または処置するための方法。
【請求項６】
請求項２に記載の組成物を患者に投与することを含む、患者の癌を予防または処置するための方法。
【請求項７】
剤の、ＵＢＥ１Ｌまたはユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５を誘導するあるいはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する能力を決定することを含む、癌の予防または処置において使用するための剤を同定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序文
この研究は、National Institutes of Health Grant RO-1-CA62275およびNational Institutes of Health Grant RO-1-CA87546により一部支援され、そして、米国政府は、本発明について一定の権利を有することとする。
【０００２】
発明の分野
ＵＢＥ１Ｌ、ユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５およびデコンジュガーゼ(deconjugase)ＵＢＰ４３は、現在、ＰＭＬ／ＲＡＲαなどの発癌性(oncogenic)タンパク質の発癌効果に打ち勝つ直接の薬学的標的として同定されており、発癌性タンパク質の分解を誘発し、発癌性タンパク質を発現している癌細胞内のアポトーシスの前兆となる。本発明は、ＰＭＬ／ＲＡＲαなどの発癌性タンパク質の効果に対抗するプロアポトーシス経路および分解経路を増進させるのに有用である、ＵＢＥ１Ｌおよび／またはＩＳＧ１５などのユビキチン様タンパク質またはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を標的にした組成物の開発の方法のみならず、新しい組成物にも関する。本発明はまた、ＵＢＥ１Ｌおよび／またはＩＳＧ１５などのユビキチン様タンパク質の誘導に関与する、あるいは代わりに、新生物(neoplastic)細胞および前新生物(pre-neoplastic)細胞でのプログラムされた細胞死（アポトーシス）を増加させるためにデコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する、癌の処置および予防のための方法に関する。
【０００３】
発明の背景
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）（ＦＡＢ  Ｍ３）の症例は、ｔ（１５；１７）染色体再配置(rearrangement)の癌遺伝子産物である、前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）／レチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）を発現する（Nason-Burchenal et al. (1996) in Molecular Biology of Cancer, ed. Bertino, J.R. (Academic San Diego), 1st Ed., pp 1547-1560; Nason-Burchenal, K. and Dmitrovsky, E. (1999) in Retinoids: The Biochemical and Molecular Basis of Vitamin A and Retinoid Action, eds. Nau, H. & Blaneer, W. (Springer, Berlin), pp. 301-322）。全トランス型レチノイン酸（ＲＡ）処置は、白血病細胞の分化の誘導を通じて、これらのＡＰＬ症例において、完全寛解をもたらす（Nason-Burchenal et al. (1996) in Molecular Biology of Cancer, ed. Bertino, J.R. (Academic San Diego), 1st Ed., pp 1547-1560; Nason-Burchenal, K. and Dmitrovsky, E. (1999) in Retinoids: The Biochemical and Molecular Basis of Vitamin A and Retinoid Action, eds. Nau, H. & Blaneer, W. (Springer, Berlin), pp. 301-322）。ＡＰＬにおけるＲＡ応答の特徴は、ＰＭＬ／ＲＡＲαの発癌効果を逆にするＰＭＬ／ＲＡＲαの分解である（Kakizuka et al. Cell 1991 68:663-674; de The et al. Cell 1991 68:675-684; Yoshida et al. Cancer Res. 1996 56:2945-2948; Raelson et al. Blood 1996 88:2826-2832; Nervi et al. Blood 1998 92:2244-2251; Zhu et al. Proc. Natl Acad. Sci USA 1999 96:14807-14812）。
【０００４】
プロテアソーム阻害剤は、この分解においてプロテアソーム依存経路を示すＲＡ処置であるにもかかわらず、ＰＭＬ／ＲＡＲαのタンパク質分解を抑制する（Yoshida et al. Cancer Res. 1996 56:2945-2948; Raelson et al. Blood et al. 1996 88:2826-2832; Nervi et al. Blood 1998 92:2244-2251; Zhu et al. Proc. Natl Acad. Sci USA 1999 96:14807-14812）。ＰＭＬ／ＲＡＲαの発現は、優性阻害型(dominant-negative)転写抑制の結果となる（Kakizuka et al. Cell 1991 68:663-674; de The et al. Cell 1991 68:675-684）。この抑制は、ヒストン脱アセチル化酵素活性を有するＮ−Ｃｏｒ／ＳＭＲＴ阻害補体(corepressor)の複合体の転写への阻害効果に打ち勝つ、薬理学的ＲＡ投薬量により拮抗される（Lin et al. Nature (London) 1998 391:811-814; Grignani et al. Nature (London) 1998 391:815-818）。ＲＡ処置は、標的遺伝子の活性化の結果となる転写を刺激するコアクチベーター複合体を増進させる（Lin et al. Nature (London) 1998 391:811-814; Grignani et al. Nature (London) 1998 391:815-818）。
【０００５】
ＡＰＬにおけるＲＡの応答の分子基盤を理解するためには、ＲＡ標的遺伝子の同定が必要である。
ＧＯＳ２は、ＡＰＬ細胞のマイクロアレイ分析により同定された、推定ＲＡ標的遺伝子である（Tamayo et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1999 96:2907-2912）。ＧＯＳ２の正確な機能まだ知られていないが、細胞周期中に制御されるとして最初に同定されたことから（Russell, L. and Forsdyke, D.R. DNA Cell Biol. 1991 10:581-591）、細胞周期制御での役割を示唆している。
別の候補レチノイド標的遺伝子は、ＡＰＬにおけるレチノイド転写効果に貢献する、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質ε（Ｃ／ＥＢＰ  ε）である（Park et al.  J. Clin. Invest. 1999 103:1399-1408）。しかしながら、この種類は、ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解とはつながりがなかった。
【０００６】
ＲＡ処置をしたＮＢ４  ＡＰＬ細胞の、最近のマイクロアレイ分析は、ＵＢＥ１Ｌ（ユビキチン活性化酵素Ｅ１様(ubiquitin-activating enzyme E1-like)）の目立った誘導を報告した（Tamayo et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1999 96:2907-2912）。ＰＭＬ／ＲＡＲαのプロテアソーム依存分解もまた、ＲＡが、ＰＭＬ／ＲＡＲαの発癌効果に打ち勝つ仕組みとして提案されてきた（Yoshida et al. Cancer Res. 1996 56:2945-2948; Raelson et al. Blood et al. 1996 88:2826-2832; Nervi et al. Blood 1998 92:2244-2251; Zhu et al. Proc. Natl Acad. Sci USA 1999 96:14807-14812）。ＵＢＥ１Ｌは、ＰＭＬ／ＲＡＲαおよびおそらく他の発癌性タンパク質のプロテアソーム依存分解の原因ということもあり得る。
【０００７】
ＰＭＬ／ＲＡＲαを標的とするハンマーヘッド型(hammerhead)リボザイムは、ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解が、どのように、ＲＡ感受性またはＲＡ耐性のどちらかであるトランスフェクトされた(transfected)ＡＰＬ細胞においての分化ではなく、アポトーシスを合図するかを示すのに使用されている（Nason-Burchanel et al. Blood 1998 92:1758-1767; Nason-Burchanel et al. Oncogene 1998 17:1759-1768）。
【０００８】
現在、ＵＢＥ１Ｌは、ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解を誘発することにより、ＰＭＬ／ＲＡＲαの発癌効果に拮抗する、ＡＰＬにおけるレチノイド標的遺伝子であることが分かっている。この作用の結果が、ＡＰＬにおけるおよび潜在的に他の新生物細胞または前新生物細胞の関連におけるＵＢＥ１Ｌの抗発癌効果となる、アポトーシスの促進である。したがって、ユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５またはデコンジュガーゼＵＢＰ４３などの、ＵＢＥ１Ｌまたはそれらに関連する他のタンパク質を標的とする組成物は、癌の予防および処置に有用であると予想されている。
【０００９】
発明の概要
本発明の目的は、ＵＢＥ１Ｌまたはユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５を誘導する剤あるいはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する剤を含む、癌の予防または処置のための組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、ＵＢＥ１Ｌおよび／またはＩＳＧ１５などのユビキチンタンパク質を誘導する剤の能力の決定あるいはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する剤の能力の決定を含む、癌に対する潜在的治療法としての剤を同定するための方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ＵＢＥ１Ｌおよび／またはＩＳＧ１５などのユビキチン様タンパク質を誘導する剤、あるいはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する剤により、新生物（癌）細胞または前新生物（前癌）細胞のプロアポトーシス経路および分解経路を増進させるための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、ＵＢＥ１Ｌおよび／またはＩＳＧ１５などのユビキチン様タンパク質を誘導する剤、あるいはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する剤の患者への投与を含む、患者内の癌を予防または処置するための方法を提供することである。
【００１１】
発明の詳細
本発明は、抗癌剤、新しい抗癌剤を開発するための方法、ならびにユビキチン活性化酵素Ｅ１様タンパク質（ＵＢＥ１Ｌ）および／またはＩＳＧ１５などのユビキチン様タンパク質の活性および／または発現を誘導する剤の使用方法に関する。あるいは、本発明の剤は、デコンジュガーゼＵＢＰ４３の活性および／または発現を阻害してもよい。本発明の剤は、前癌または前新生物のみならず癌または新生物の細胞の予防または処置に有用である。
【００１２】
ＵＢＥ１Ｌは、多様なヒト組織および腫瘍細胞株において、広く発現している。ＵＢＥ１Ｌは、ユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５のための活性化酵素としての役目を務める。本明細書中に明示してあるように、ＵＢＥ１Ｌは、急性前骨髄球性白血病ならびにＵ９３７細胞およびＴＨＰ１細胞において、ＲＡが誘導しうる遺伝子標的であり、ＵＢＥ１Ｌの広範囲にわたる生物学的役割に関与する。デコンジュガーゼＵＢＰ４３の発現のみならず、ＩＳＧ１５の発現もまた、ＲＡにより誘導されることが見いだされ、ＵＢＥ１Ｌにより調整される方法で制御されるようである。本明細書に示してあるように、この誘導は、ＲＡ非感受性細胞内ではなく、ＲＡ感受性細胞内でのみ生じる。さらに、ＵＢＥ１ＬおよびＩＳＧ１５の調整制御および物理的関連性が、ＲＡ感受性細胞内において発癌性タンパク質の分解を誘導し、発癌性タンパク質は、ＰＭＬ／ＲＡＲα、サイクリンＤ１、およびＰＭＬを含むがこれに限定されるものではない。加えて、ＵＢＥ１ＬおよびＩＳＧ１５によるこれらの発癌性タンパク質の分解の誘導は、アポトーシスを選択的に誘発するようである。ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解は、ＵＢＰ４３のトランスフェクションにより阻害される。したがって、ＵＢＥ１ＬまたはＩＳＧ１５などのユビキチン様タンパク質の活性および／または発現を誘導する剤ならびにデコンジュガーゼＵＢＰ４３の活性および／または発現を阻害する剤は、新生組織形成および前新生組織形成、特にＲＡ感受性癌およびＰＭＬ／ＲＡＲαなどの発癌性タンパク質を発現する癌の処置に有用であると予想される。
【００１３】
全トランス型レチノイン酸（ＲＡ）処置は、ｔ（１５；１７）遺伝子産物である前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）／レチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）を発現する急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の症例において、寛解を誘導する。マイクロアレイ分析は、ＮＢ４  ＡＰＬ細胞のＲＡ処置後のＵＢＥ１Ｌ（ユビキチン活性化酵素Ｅ１様）の誘導を明らかにした。この誘導の動態学を、逆転写ＰＣＲアッセイを用いて、ＲＡ感受性ＮＢ４−Ｓ１  ＡＰＬ細胞にて研究した。ＵＢＥ１Ｌ  ｍＲＮＡの誘導は、１０μＭのＲＡ処置後３時間までに起こった。これらの結果を、ノーザン分析により、および１μＭのＲＡ処置後逆転写ＰＣＲアッセイにより、独立して確認した。対照的に、ＵＢＥ１Ｌ発現は、ＲＡ耐性ＮＢ４−Ｒ１細胞株の１０μＭのＲＡ処置にもかかわらず、同期間に誘導されなかった。これは、ＵＢＥ１Ｌが直接的なレチノイド標的であることを示す。
【００１４】
さらに、ＵＢＥ１Ｌの誘導とＡＰＬ細胞の効果的なレチノイド処置との直接的な関係は、ＵＢＥ１Ｌイムノブロット発現を調べることにより立証された。これらの実験のために、例５に詳細に記載されている免疫原ペプチドが、ＵＢＥ１Ｌタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端をそれぞれ認識する、別々のポリクローナル抗血清を作製するのに用いられた。基本的に(basally)ＵＢＥ１Ｌ  ｍＲＮＡを発現しなかったチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に、全長ＵＢＥ１Ｌ  ｃＤＮＡまたはインサートなしの(insertless)ベクターをトランスフェクトした。ＵＢＥ１ＬがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、ＵＢＥ１Ｌタンパク質を発現した。対照的に、インサートなしのベクターがトランスフェクトされた細胞は、この１１２−ｋＤａの種を発現しなかった。ＵＢＥ１Ｌイムノブロット発現プロファイル(profiles)もまた、ＲＡ感受性ＮＢ４細胞対ＲＡ耐性ＮＢ４細胞で比較した。ＵＢＥ１Ｌタンパク質は、基本的に両方の細胞株にて低レベルで発現していた。しかしながら、タンパク質の発現は、ＮＢ４−Ｓ１  ＡＰＬ細胞のＲＡ（１μＭ）処置後にのみ誘導された。
【００１５】
ＡＰＬにおけるＲＡ応答の特徴とは、ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解である（Yoshida et al. Cancer Res. 1996 56:2945-2948; Raelson et al. Blood et al. 1996 88:2826-2832; Nervi et al. Blood 1998 92:2244-2251; Zhu et al. Proc. Natl Acad. Sci USA 1999 96:14807-14812）。ＲＡ処置は、ＲＡ耐性ＮＢ４−Ｒ１細胞内ではなく、ＮＢ４−Ｓ１内でのＰＭＬ／ＲＡＲαの発現をも抑制すると報告されてきた（Nason-Burchenal Differentiation 1997 61:321-331）。ＡＰＬ細胞におけるＵＢＥ１ＬおよびＰＭＬ／ＲＡＲαの発現の関係を調べるために、これらの種類のためのイムノブロット発現プロファイルを、ＮＢ４−Ｓ１細胞の２４時間ＲＡ（１μＭ）処置前および後に調べた。反比例の関係が、ＲＡ処置前および後にＵＢＥ１ＬおよびＰＭＬ／ＲＡＲαの発現間で明白であり、よって、ＰＭＬ／ＲＡＲαのためにＵＢＥ１Ｌの発現を制御する直接的役割を示している。
【００１６】
それから、ＵＢＥ１Ｌプロモーターの１．３−ｋｂフラグメントは、レチノイド受容体選択的にＲＡへ転写応答を介する能力があることが立証された。ＲＡ標的遺伝子のリプレッサーであるＰＭＬ／ＲＡＲαは、このＵＢＥ１Ｌプロモーターの活性を抑制した。ＵＢＥ１Ｌに作用するためのＰＭＬ／ＲＡＲαについての潜在性を調べるために、ＡＴＧ翻訳開始位置のＵＢＥ１Ｌプロモーターの上流１．３キロベース（ｋｂ）を、ルシフェラーゼ含有レポータープラスミドにクローン化した。このレポータープラスミドを、ＲＡ処置の存在下および非存在下において、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＵＢＥ１Ｌプロモーターのこのフラグメントは、レチノイド受容体選択的に、ＲＡに対する転写応答を介する能力があることが立証された。
【００１７】
ＰＭＬ／ＲＡＲαがこのレポータープラスミドと共にコトランスフェクト(cotransfect)された場合の、ＰＭＬ／ＲＡＲαおよびこのＵＢＥ１Ｌレポータープラスミドの活性の間の関係を調べた。ＲＡＲαを用いたＰＭＬ／ＲＡＲαのコトランスフェクション(cotransfection)は、ＲＡ（１μＭ）処置前および後のＵＢＥ１Ｌレポーター活性の際立った抑制となった。この阻害は、トランスフェクトされたＰＭＬ／ＲＡＲαの投薬量に依存した。各実験では、コトランスフェクトされたβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドを、トランスフェクション効率を調節するために使用した。β−ガラクトシダーゼレポータープラスミドの転写活性における、ＰＭＬ／ＲＡＲαの相当な効果は観察されなかった。よって、ＰＭＬ／ＲＡＲαが、このＵＢＥ１Ｌレポータープラスミドの活性を抑制した。
ＵＢＥ１Ｌは、Ｅ１に対して相同性を有する。しかしながら、Ｅ１  ｍＲＮＡが、ＮＢ４−Ｓ１細胞のＲＡ（１μＭ）処置後に誘導されなかったことは、したがって、ＵＢＥ１ＬおよびＥ１の発現へのＲＡの異なる効果を示している。
【００１８】
ＡＰＬにおけるＲＡ応答の特徴とは、ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解である。したがって、Ｅ１のみならずＵＢＥ１ＬのＰＭＬ／ＲＡＲαの分解を誘発する能力を、次に調べた。コトランスフェクションアッセイを、ＰＭＬ／ＲＡＲαを発現しない細胞を使用して行った。これらの実験では、ＵＢＥ１Ｌを発現しないＣＨＯ細胞および、ＵＢＥ１Ｌを低レベル発現するがＲＡＲまたはＰＭＬ／ＲＡＲαを用いて簡単にトランスフェクトされ得るＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を使用した。トランスフェクトされたＰＭＬ／ＲＡＲαの分解は、ＣＨＯ細胞またはＢＥＡＳ−２Ｂ細胞のトランスフェクション後、用量依存的に、ＵＢＥ１Ｌにより誘発された。ＰＭＬ／ＲＡＲαのこの分解は、ＲＡ処置の非存在下にて生じた。ＰＭＬ／ＲＡＲαのＰＭＬドメインは、ＲＡＲαドメインよりも、ＵＢＥ１Ｌによる分解により感受性があるように見える。切断ＵＢＥ１Ｌ（ｐＳＧ５−ＵＢＥ１Ｌ−Ｔ）のトランスフェクションは、ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解を引き起こさなかった。ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解が、はっきりとしたＵＢＥ１Ｌの機能であったことを確立するために、Ｅ１をまた、ＰＭＬ／ＲＡＲαと共にＢＥＡＳ−２Ｂ細胞にトランスフェクトした。Ｅ１は、ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解を引き起こさなかった。よって、Ｅ１ではなくＵＢＥ１Ｌのトランスフェクションが、ＲＡ処置なしでもＰＭＬ／ＲＡＲαの分解を引き起こした。
【００１９】
これらの細胞の増殖または分化状態における、ＡＰＬ細胞内のＵＢＥ１Ｌの人工的に作り出された(engineered)過剰発現の効果を、次に調べた。ＡＰＬ細胞内でＵＢＥ１Ｌを過剰発現させるために、レトロウィルスベクター（Ory et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1996 93:11400-11406）が、ＵＢＥ１Ｌまたはインサートなしを発現するために構築された。共発現した(coexpressed)ＧＦＰを、ＦＡＣＳにて分別した後にレトロウィルス発現細胞のために高めるため使用した。ＰＭＬ／ＲＡＲαを発現せず、基本的にＵＢＥ１Ｌを低レベルで発現するＨｅＬａ細胞を、これらの細胞においてレトロウィルス形質導入条件を以前最適化したため、これらの実験用に対照として使用した。ＵＢＥ１Ｌの過剰発現は、独立して、前記のレトロウィルス形質導入方法を使用して、ＮＢ４−Ｓ１細胞およびＨｅＬａ細胞において人工的に作り出された。対照として、未挿入対照ベクターが、イムノブロット分析で確認されたとおり、これらの細胞株に独立して導入された。生物学的効果における著しい相違が、ＵＢＥ１Ｌの、ＮＢ４−Ｓ１細胞対ＨｅＬａ細胞への形質導入後に観察された。ＮＢ４−Ｓ１細胞におけるＵＢＥ１Ｌ過剰発現が、形質導入細胞のヘキスト(Hoechst)染色により測定されたように、アポトーシスの急速な誘導となった。３種の独立した領域を、未挿入対照ＮＢ４−Ｓ１トランスフェクタント(transfectant)について調べ、これらの細胞の５．１％が、アポトーシスであった。ＵＢＥ１Ｌが形質導入されたＮＢ４−Ｓ１細胞の分析は、アポトーシス細胞の割合が高い（３９．７％）ことを明らかにした。これらの形質導入株は、白血病細胞の成熟の形態的な証拠を示さなかった。誘導された分化のこの欠如は、ＮＢＴ陽性細胞の非存在下で確認された（表１参照）。
【００２０】
表１：ＲＡ（１μＭ）［指定＋ＲＡ］またはビークル（ＤＭＳＯ［指定−ＲＡ］またはＵＢＥ１Ｌレトロウィルスの変換、指定＋ＵＢＥ１Ｌ］での処置の５日後に、インサート[指定−ＵＢＥ１Ｌ]無しの同じレトロウィルスの形質導入を比較するために、ＮＢ４−Ｓ１  ＡＰＬ細胞について行われたＮＢＴ成熟アッセイ
細胞系                           ＮＢＴ、％
ＮＢ４−Ｓ１（−ＲＡ）             ０
ＮＢ４−Ｓ１（＋ＲＡ）           ９２
ＮＢ４−Ｓ１（−ＵＢＥ１Ｌ）       ０
ＮＢ４−Ｓ１（＋ＵＢＥ１Ｌ）       ０
【００２１】
アポトーシスの促進は、ＵＢＥ１Ｌまたはインサートなしのレトロウィルスベクターにより形質導入されたＨｅＬａ細胞中では、観察されなかった。よって、ＵＢＥ１Ｌ形質導入は、ＰＭＬ／ＲＡＲα発現細胞内でアポトーシスを選択的に誘発した。しかし、アポトーシスの誘導は非常に急速であったので、アポトーシスをシグナル伝達するメカニズムを調べることができなかった。
【００２２】
本明細書で立証したとおり、ＵＢＥ１Ｌの誘導とＰＭＬ／ＲＡＲαの分解の間に、密接な関連性がある。より厳密に言えば、本明細書に記載の実験は、ＵＢＥ１ＬとＰＭＬ／ＲＡＲαとの間の拮抗関係を証明する。さらに、ＵＢＥ１Ｌの発現の増加は、ＰＭＬ／ＲＡＲαを発現する細胞内でアポトーシスを急速に誘導する。したがって、ＵＢＥ１Ｌは、ＰＭＬ／ＲＡＲαによる抑制およびこの発癌性タンパク質を発現する細胞内のアポトーシスの誘導のための標的であると信じられている。
【００２３】
ＢＥＡＳ−２Ｂヒト気管支上皮細胞における追加実験は、トランスフェクトされたサイクリンＤ１とのＵＢＥ１Ｌのコトランスフェクションは、発癌性タンパク質であるサイクリンＤ１の分解を誘発することが確認された。よって、本明細書に記載の分解プログラムは、白血病に対して活性である。この研究では、β−アクチンを、対照として使用し、同様の総タンパク質量を、レーン毎に追加したことを確認した。先行の実験は、化学的予防の標的として、サイクリンＤ１の分解に関与した（Langenfeld et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:12070-12074; Boyle et al. J. Natl Cancer Inst. 1999 91:373-379）。よって、これらの実験は、癌の化学的予防において、ＵＢＥ１Ｌを直接関与させる。デコンジュガーゼＵＢＰ４３もまた、ＵＢＰ４３のトランスェクションが、ＢＥＡＳ−２Ｂヒト気管支上皮細胞中のＵＢＥ１Ｌのトランスフェクションにもかかわらず、サイクリンＤ１を安定化させる、上記の分解プログラムにおいて関与することができる。
【００２４】
ＲＡもまた、ＲＡに感受性があるが耐性がないＮＢ４細胞におけるユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５の発現を増加させる。加えて、ＲＡ処置は、レチノイド感受性ＮＢ４細胞における細胞内ＩＳＧ１５接合を増加させる。これは、増加したＩＳＧ１５およびＵＢＥ１Ｌの発現と、骨髄性分化の誘導との関連性を示す。これと一致しているのが、ＲＡ処置が、レチノイド感受性ＮＢ４細胞における細胞内ＩＳＧ１５接合を増加させることである。ＵＢＥ１ＬとＩＳＧ１５との間の物理的相互作用が、一過性コトランスフェクションアッセイを用いてin vivoにて確立された。この相互作用は、重要なｃ−末端グリシンを欠如しているの突然変異ＩＳＧ１５を調べた場合に、観察されなかった。よって、これらの実験は、ＵＢＥ１ＬおよびＩＳＧ１５の調整制御を示す。したがって、ＵＢＥ１Ｌのように、ＩＳＧ１５の誘導もまた、ＰＭＬ／ＲＡＲαなどの発癌性タンパク質の分解を増進させ、これらの発癌性タンパク質を発現する癌細胞のアポトーシスを促進することができることを確信している。
【００２５】
ＡＰＬにおけるＵＢＥ１Ｌおよび／またはＩＳＧ１５の発現および／または活性を選択的に誘導する剤は、よって、ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解およびアポトーシスを制御することによって、抗白血病効果を引き起こすと予想される。本明細書および先のレポート（Yuan, W. and Krug, R.M. EMBO 2001 20:362-371）で示した発見に基づいて、ＵＢＥ１Ｌはまた、ＡＰＬを超えた、重要な生物学的役割を有することが予想されている。ＵＢＥ１Ｌは、肺癌において頻繁に抹消される領域である染色体３ｐに位置する；ＵＢＥ１Ｌ抑制は、腫瘍抑制効果を発揮するであろう肺癌においてたびたび起こる（Kok et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1993 90:6071-6075; Carritt et al. Cancer Res. 1992 52:1536-1541）。この可能性は、ヒト組織または腫瘍細胞におけるＵＢＥ１Ｌの発現パターン（McLaughlin et al. Int. J. Cancer 2000 85:871-876）および本明細書で報告されたＵＢＥ１Ｌレトロウィルス形質導入の結果に加えて、ＵＢＥ１Ｌが、通常の細胞と新生物細胞または前新生物細胞と両方の増殖を調節することを示す。
【００２６】
ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解もまた、ＵＢＰ４３が、ＰＭＬ／ＲＡＲαの分解を誘発するＵＢＥ１Ｌの能力に打ち勝つことができた、ＰＭＬ／ＲＡＲαおよびＵＢＰ４３とのコトランスフェクション実験により確認されたように、ＵＢＰ４３トランスフェクションにより阻害される。したがって、デコンジュガーゼＵＢＰ４３の発現および／または活性を選択的に阻害する剤もまた、ＰＭＬ／ＲＡＲαを発現する癌細胞内のＰＭＬ／ＲＡＲαの分解およびアポトーシスを誘発すると予想されている。
【００２７】
癌細胞、特にＲＡ感受性癌細胞またはＰＭＬ／ＲＡＲαなどの発癌性タンパク質を発現する癌細胞は、ＵＢＥ１Ｌおよび／またはＩＳＧ１５の発現および／または活性を誘導する、あるいはＰＭＬ／ＲＡＲαなどの発癌性タンパク質の分解および癌細胞内のアポトーシスを誘発するために、デコンジュガーゼＵＢＰ４３の発現および／または活性を阻害する本発明の剤と接触させてもよい。この新しく確認された経路の活性化もまた、他の新生物細胞または前新生物細胞を含む非白血病細胞における他の発癌性タンパク質の分解を誘発すると予想されている。好ましい態様においては、使用された剤は、ＵＢＥ１Ｌおよび／またはＩＳＧ１５の活性および／または発現を選択的に誘導するか、あるいは、ＵＢＰ４３の活性および／または発現を選択的に阻害する。
【００２８】
ＵＢＥ１ＬまたはＩＳＧ１５の活性および／または発現を誘導するあるいはＵＢＰ４３の発現および／または活性を阻害する剤を含む本発明の組成物は、癌、特に発癌性タンパク質ＰＭＬ／ＲＡＲαを発現するＡＰＬなどの癌を予防または処置するために、患者に投与することができる。好ましい態様では、これらの剤の選択性は、ＲＡまたは三酸化ヒ素の処置を複雑化する、望ましくない臨床毒性を軽減すべきであることから、該剤は、ＵＢＥ１ＬまたはＩＳＧ１５の活性および／または発現を選択的に誘導するかあるいはＵＢＰ４３を選択的に阻害する。本発明で表される組成物は、好ましくはさらに、処置する癌の型および癌のその型の処置に最も適している投与経路に基づき、当業者により日常的に選択される薬学的に許容しうる賦形剤を含む。投与される剤の効果的な量は、本明細書に記載されているような、薬理学的活性を証明するin vitroおよびin vivoアッセイに基づき、当業者により日常的に決定することができる。
【００２９】
ＵＢＥ１Ｌおよび／またはＩＳＧ１５などのユビキチン様タンパク質の発現および／または活性を誘導するあるいはデコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する本発明の組成物に使用するための剤は、本明細書に記載のように、in vitroアッセイを用いて、当業者が日常的に同定することができる。例えば、試験剤を、本明細書に記載のようにＵＢＥ１Ｌ  ｍＲＮＡの増加を測定する逆転写ＰＣＲによって、または本明細書に記載のように試験剤の存在下および非存在下においてＵＢＥ１Ｌタンパク質を測定するイムノブロット発現によって、ＵＢＥ１Ｌ発現を誘導する能力について選別することができる。試験剤の非存在下におけるＵＢＥ１Ｌ  ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルと比較して、試験剤の存在下におけるＵＢＥ１Ｌ  ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの増加は、ＵＢＥ１Ｌを誘導し、抗癌剤として潜在的に有用である試験剤を示す。同様のアッセイを行い、ＩＳＧ１５などのユビキチン様タンパク質を誘導する剤を同定することができる。デコンジュガーゼＵＢＰ４３を阻害する剤もまた、日常的に同定することができる。このような剤は、その後、癌を予防および処置するために投与される。
【００３０】
以下の限定的でない例は、本発明をさらに説明するために提供される。
例
例１:細胞培養および誘導プロトコル
ＲＡおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）（St. Louis, MO）から購入した。スナックのＲＡ（１０μＭ）溶液をＤＭＳＯに溶解し、液体窒素中に保管し、実験中は暗所にて使用した。ＲＰＭＩ１６４０およびＤ−ＭＥＭをセルグロ／メディアテック（Cellgro/Mediatech）（Herndon, VA）から購入した。ＮＢ４  ＡＰＬ細胞株は、ＰＭＬ／ＲＡＲαを発現する（Lanotte et al. Blood 1991 77:1080-1086）。ＮＢ４−Ｓ１およびＮＢ４−Ｒ１は、それぞれＮＢ４細胞のＲＡ感受性およびＲＡ耐性クローンである（Nason-Burchanel et al. Differentiation 1997 61:321-331）。これらの細胞を、Nason-Burchenal et al.（Differentiation 1997 61:321-331）により記載されたように、１０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ  １６４０培地にて培養した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、３７℃の５％ＣＯ２の加湿機付培養器内で、ＦＢＳ５％、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００単位／ｍｌ、および２ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＤ−ＭＥＭにて培養した。ヒト気管支上皮細胞（ＢＥＡＳ−２Ｂ）を、確立された技術（Langenfeld et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:12070-12074; Boyle et al. J. Natl Cancer Inst. 1999 91:373-379）に従い、無血清のＬＨＣ−９培地（Biofluids, Rockville, MD）にて培養した。ＨｅＬａ細胞を、３７℃の５％ＣＯ２の加湿機付培養器内で、ＦＢＳ１０％、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００単位／ｍｌ、および２ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＤ−ＭＥＭにて培養した。
【００３１】
例２：分化およびアポトーシスマーカー
ＮＢ４細胞分化を、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元アッセイ（Nason-Burchenal et al. Differentiation 1997 61:321-331; Nason-Burchenal et al. Blood 1998 92:1758-1767; Nason-Burchanel et al. Oncogene 1998 17:1759-1768）を用いて記録した。形質導入株を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の共発現により同定した。アポトーシスを、確立された手法およびＧＦＰを共発現した形質導入株のヘキスト染色を用いて記録した（Nason-Burchenal et al. Blood 1998 92:1758-1767; Nason-Burchenal et al. Oncogene 1998 17:1759-1768; Stadheim et al. Cancer Res. 2001 61:1533-1540）。デジタル画像を、Olympus 1X70倒立顕微鏡、冷却電荷結合素子カメラ、およびMiraCal Pro Single Cell Imaging System（Olympus LSR Research, Melville, NY）を用いて収集した。
【００３２】
例３：プラスミドの構築
全長ＵＢＥ１Ｌ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドを、Kote et al.の方法に従って得た（Gene Expression 1995 4:163-175）。ｐＧＥＭ−ＨＡ−１Ｅ１プラスミドを、Handley et al.の方法に従って得た（Proc. Natl Acad. Sci. USA 1991 88:250-262）。ｐＳＧ５−ＨＡ−１Ｅ１を、ｐＳＧ５発現ベクターにフラグメント化したＨＡ−１Ｅ１をクローニングすることにより、構築した。ＵＢＥ１Ｌ  ｃＤＮＡを含むＥｃｏＲ１フラグメントを、ｐＳＧ５−ＵＢＥ１Ｌプラスミドを生み出すために、ＥｃｏＲｌで制限酵素処理されたｐＳＧ５にクローニングした。切断されたＵＢＥ１Ｌプラスミド（ＵＢＥ１Ｌ−Ｔ）は、ＵＢＥ１Ｌのカルボキシ末端においてＥｃｌＸＩ／ＳｎａＢＩフラグメントを欠如している。ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付ＰＭＬ／ＲＡＲα発現ベクターを、ｐＣＭＸ−ＰＭＬ／ＲＡＲαおよびｐＣＭＶ−ＨＡ（CLONTECH）プラスミドから構築した。ｐＧＬ３−ＵＢＥ１Ｌ  Ｌｕｃレポータープラスミドは、ルシフェラーゼ遺伝子およびＵＢＥ１Ｌの５’プロモーターエレメントを含有した。それを、ＮＢ４−ＳＩゲノムＤＮＡ（フォワードプライマー：5'-GCAACCGAGTGAGACTGTCT-3'（配列番号：１）；リバースプライマー5'-GCGCTCAGAGATAGGGTTT-3'（配列番号：２））から派生したＵＢＥ１ＬプロモーターのＰＣＲ増幅フラグメントを用いて構築した。ＤＮＡ配列分析で、このクローニングを確認した。  
【００３３】
例４：ＵＢＥ１Ｌ  ｍＲＮＡ発現アッセイ
ＵＢＥ１Ｌ  ｍＲＮＡの発現を、確立された方法に従い、逆転写ＰＣＲアッセイにより評価した（Kakizuka et al. Cell 1991 68:663-674）。フォワードプライマーは、5'-AGGTGGCCAAGAACTTGGTT-3'（配列番号：３）であり、リバースプライマーは、5'CACCACCTGGAAGTCCAACA-3'（配列番号：４）であった。ＰＣＲ産物を、３２Ｐで標識したプライマーを用いたプローブにより視覚化した。結果を、標準的な技術に従い、１．０−ｋｂ  ＥｃｏＲ１／ＮｃｏＩで放射線標識したＵＢＥ１Ｌプローブを用いて、ノーザン分析により、独立して確認した（Langenfeld et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1997 94:12070-12074）。このプローブは、Ｅ１への限定された相同性を有した。
【００３４】
例５：抗ＵＢＥ１Ｌ抗血清の作製
ＵＢＥ１Ｌに対する２種のウサギポリクローナル抗体は、アミノ末端（DCDPRSIHVREDGSLEIGD（配列番号：５））内の１つのペプチドおよびカルボキシル末端（PGSQDWTALRELLKLL（配列番号：６））内の２つ目のペプチドを用いて、独立して得られた（Covance Research Products, Denver, PA）。これらの抗血清の特異性を、ＵＢＥ１ＬトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のイムノブロット分析により、確認した。
【００３５】
例６：イムノブロット分析
イムノブロット分析を、確立された技術を用いて行った（Langenfeld et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1997 94:12070-12074; Spinella et al. J. Biol. Chem. 1999 274:22013-22018）。抗ＲＡＲα抗体は、ＰＭＬ／ＲＡＲαを検出するために、P. Chambon（Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Strasbourg, France）より提供または購入することができる（Nason-Burchenal et al. Blood 1998 92:1758-1767; Nason-Burchenal et al. Oncogene 1998 17:1759-1768）。抗ＨＡ  ｍＡｂを購入し（Babco, Richmond, CA）、同様に抗アクチンポリクローナル抗体、Ｃ−１１を購入した（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）。
【００３６】
例７：トランスフェクションの手順
ＢＥＡＳ−２ＢまたはＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションを、メーカーの使用説明書（Qiagen, Valencia, CA）に従って、Effecteneおよびトランスフェクション方法を用いて行った。β−ガラクトシダーゼレポータープラスミド（ｐＣＨ１１１）は、トランスフェクションの効率を調節するために、コトランスフェクトされた。
【００３７】
例８：レトロウィルスの構築および形質導入の手順
ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを、ＥｃｏＲ１フラグメントをｐＳＧ５−ＵＢＥ１ＬからこのレトロウィルスベクターのＥｃｏＲ１部位にクローニングすることにより、ＵＢＥ１Ｌ  ｃＤＮＡを発現するために構築した。制限エンドヌクレアーゼおよび部分的ＤＮＡ配列分析が、クローニングが所望の配向であったことを確認した。インサート無しのベクターは、対照の役割をした。各ベクターについて、１０μｇを、セルフェクト(CellPhect)トランスフェクションキット（Amersham Pharmacia）と共に、リン酸カルシウム沈殿を用いて、一過性にトランスフェクトした。２９３ＧＰＧパッケージング細胞株は、R. Mulligan（Harvard University, Cambridge MA）により提供され、それは、他の研究者も入手可能である。４８時間後、２９３ＧＰＧトランスフェクタントからのウィルスの上清（Ory et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 11400-11406）を用いて、ポリブレン(polybrene)６μｇ／ｍｌの存在下で、ＮＢ４−Ｓ１またはＨｅＬａ細胞に形質導入した（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO）。２４時間後、ＦＡＣＳ分析を行い、ＧＦＰ発現について陽性の細胞を分別して収穫し、これらの実験に用いた。
【配列表】
2005532999.tif 000002
2005532999.tif 000003
【国際調査報告】
2005532999.tif 000004
2005532999.tif 000005