(57)【要約】本発明は骨折及び骨粗鬆症の予防及び治療に用いられる医薬組成物を提供する。該医薬組成物は漢方薬植物であるレタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子を含んで成り、各組成比は0.1〜1：2〜20：1〜5：0.1〜1：0.1〜1：0.1〜1である。該医薬組成物は上記植物の全部分又はある特定部分を用いて調製される。樹脂状沈香及び樹脂状乳香を用いるのがより好ましい。該医薬組成物は、錠剤、フィルム錠、硬カプセル、軟カプセル、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、乳剤、注射液、注射剤、軟膏、クリーム剤、噴霧剤又は吸入剤に成形することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子を含んで成り、各成分の重量比がレタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子＝0.1〜1：2〜20：1〜5：0.1〜1：0.1〜1：0.1〜1である、医薬組成物。
【請求項２】
レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子の重量比がレタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子＝0.5：5：2：0.5：0.25：0.5である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
沈香が樹脂状沈香である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
乳香が樹脂状乳香である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
公知の製剤技術に従って、医薬上容認されている賦形剤、担体又は希釈剤を用いて投与剤型に成形された、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
錠剤、フィルム錠、硬カプセル、軟カプセル、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、乳剤、注射液、注射剤、軟膏、クリーム剤、噴霧剤又は吸入剤の投与剤型に成形された、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
下記工程：
（１）レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子の抽出を行い、抽出物を得ること、
（２）有効量の該抽出物を、医薬上容認されている担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、適当な投与剤型に成形すること
を含んで成る、医薬組成物の製造方法。
【請求項８】
レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子の重量比がレタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子＝0.1〜1：2〜20：1〜5：0.1〜1：0.1〜1：0.1〜1である、請求項７に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項９】
レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮、及び菟絲子の重量比がレタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子＝0.5：5：2：0.5：0.25：0.5である、請求項８に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１０】
沈香が樹脂状沈香である、請求項８又は９に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
乳香が樹脂状乳香である、請求項８又は９に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１２】
公知の製剤技術に従って、医薬上容認されている賦形剤、担体又は希釈剤を用いて適当な投与剤型に成形する、請求項７に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１３】
錠剤、フィルム錠、硬カプセル、軟カプセル、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、乳剤、注射液、注射剤、軟膏、クリーム剤、噴霧剤又は吸入剤等の各種投与剤型に成形する、請求１２に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１４】
患者に有効量の請求項１に記載の医薬組成物を用いる、骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療する方法。
【請求項１５】
使用経路が内服、筋肉注射、静脈注射、口腔粘膜又は外用である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療する医薬に関する。具体的には本発明は漢方薬材からなる医薬組成物、その製造方法、及びその用途に関する。哺乳動物における体外及び体内実験により該医薬組成物の治療効果と安全性が証明されている。
【従来技術】
【０００２】
骨粗鬆症は各年齢層及び各民族にとって極めて重大な問題である。骨粗鬆症の発症率は加齢に伴って増加する。一般的には骨が粗になって薄く脆くなり、特に手首の骨、大腿骨及び脊椎骨が骨折しやすくなる。また骨粗鬆症の最も顕著な症状は脊椎の圧迫骨折であり、これにより背中が痛くなったり、身長が縮んだり、背中が湾曲したりする。骨密度は35〜40歳で頂点に達し、50歳の女性は閉経後、もともと緻密だった骨の中身がスカスカに、即ち「骨粗鬆症」になり、閉経婦女子は毎年１〜３％の速さで骨量が低下する。統計によると女性は男性の二倍、骨粗鬆症になりやすい。
【０００３】
現在の臨床薬、例えばビスホスホネート製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)、カルシトニン及び女性ホルモンは全て破骨細胞抑制作用を有し、副甲状腺ホルモンのみが骨芽細胞に作用する。これらの薬は共に副作用があり、長期的な安全性はまだ確認されていない。また不幸なことに骨粗鬆症患者は皆長期に服用せねばならず、このうちカルシトニン及び副甲状腺ホルモンは蛋白質薬物であるため、注射又は鼻孔スプレー方式で投与しなければならず、かなり不便である。
【０００４】
また、現在は自然療法が提唱される時代であるため、骨粗鬆症の治療または予防のために、一般的にはカルシウム含有量の高い食物を多く摂取すること、例えば牛乳をよく飲んだり、乳製品、小魚、豆類、緑黄色野菜等を多く摂取することが例外なく強調されている。勿論、適度な重量運動も骨量の低下を遅らせることができる。
【０００５】
幾つかの文献または特許において、ある特定の天然食品又は漢方薬を利用すると骨粗鬆症の予防及び治療効果が得られると述べられている。例えば、Diane Feskanich et al., Am. J. Clin. Nutr. 69: 74-79, 1999によると、毎日最低一食レタスを摂取した女性は、レタス摂取が一週間に一食にも満たない女性に比べて大腿骨骨折の発症率が明らかに45%低い。この著者によれば、レタスの葉に含まれるビタミンＫが効果をもたらしたとしている。一方、本発明の組成物はレタスの種を含むが、レタスの葉は含まず、かつ本発明の薬剤はビタミンＫを含まない。L. Cui. Y. F. Ma et al. J. of Bone and Mineral Res. 14, Suppl.1, S283, 1999によると、卵巣摘出したマウスに毎日1.0 g/kgの水抽出した淫羊角(Epimedium Sagittatum Maxim)、黄耆(Astragalus Mimbranaecus)及び白朮(Rhizoma Attractylodis Macrocephalac)の混合粉末を与えることにより、骨量の減少を予防し、骨量を増加させることができた。しかし本発明は上記文献と組成物が異なるだけでなく、卵巣摘出マウスの骨密度の回復に対しても、本発明のほうがより良い効果を発揮した。胡学挙の中国特許第1099294号(1995)によると、石膏、桂枝、陳皮、麻黄、白芍、枳殼、川▼きゅう▲、茯苓、牡丹皮、半夏、白朮、厚樸、黄か、青皮、蘇子、西党参、当帰、柴胡、附子、桃仁の散剤処方により、消炎健骨、骨髄炎治療、骨量増加の作用が得られる。しかしながら該特許組成物は20種類の漢方薬材で調製されており、本発明の組成物とは異なる。また該特許は消炎作用を強調しており、本発明のように骨折及び骨粗鬆症の予防及び治療作用をうたっているのではない。柳海峰の中国特許第1079160号(1993)によると、沈香、西紅花、木香、川ｎ、桂枝、白す、三七、川続断、土廬蟲、骨碎補、制馬銭子、牛膝、黄瓜子、鶏骨、大黄、自然銅、龍脳、血竭の散剤処方により、補腎強骨効果が得られ、骨形成不全、軟骨の発育不良が治療できる。しかしながら該特許の組成物は18種類の漢方薬材で調製されており、本発明の組成物とは異なる。また該特許はその中で強調している骨折及び骨粗鬆症の治療効果を裏付けるための厳正な研究を行なっていない。船田正の日本特許第4266820号(1992)によると、炭素数22〜38の直鎖飽和アルコール類により、骨量の低下が抑えられ、骨量の増加が促進される。しかしながら該特許の組成物はアルコールを用いて小麦胚芽油又は米糠油の中から抽出したものであり、本発明の組成物とは異なる。また、本発明はイネを含むが米糠は含まず、小麦胚芽油又は米糠油も含んでいない。この他の幾つかの従来技術もすべて本発明の組成物と異なり、多くの発明：中国特許第1195697号、第1266696号、第1180530号、第1287853号、第1181958号、第1071843号、第1219428号、第1245711号、第1312069号、第1113440号、第1083727号、及び第1277848号が押し並べて骨折の治療効果をうたっているが、漢方薬理論に基づいているだけで、該効果を裏付けるための実験データもなければ厳正な研究も行なっていない。本発明の組成物は上述の特許及び論文とはすべて異なり、体外・体内実験研究によって骨折及び骨粗鬆症の予防及び治療効果があることが証明されている。また、本発明は確実に新規性のある医薬組成物を提供し、天然中国薬草の組成物によって予防及び治療を行なうという自然療法の目標を達成することができる。
【発明の内容】
【０００６】
従来技術の欠点を克服するために、本発明は、一態様として、骨折及び骨粗鬆症の予防及び治療に用いる新規な医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明は、別の態様として、骨折及び骨粗鬆症の予防及び治療に用いる新規な医薬組成物を製造する方法を提供する。
【０００８】
本発明は、さらに別の態様として、骨折及び骨粗鬆症の予防及び治療に用いる医薬組成物としての本発明の新規組成物の使用、及び骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療する方法を提供する。
【０００９】
本発明の目的を達成するために、本発明の医薬組成物は、レタスの種(Semen Lactucae Sativae)、沈香(Lignum Aquilariae Resinatum)、イネ(Fructus Oryzae)、乳香(Resina Boswelliae Carterii)、白朮(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)及び菟絲子(Semen Cuscutae)を、重量比0.1〜1：2〜20：1〜5：0.1〜1：0.1〜1：0.1〜1で包含する。より好ましくはレタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子の重量比は0.5：5：2：0.5：0.25：0.5である。
【００１０】
本発明によれば、沈香は樹脂状沈香であってよく、また乳香は樹脂状乳香であってよい。上記医薬組成物を、公知の製剤技術に従って、医薬上容認されている賦形剤、担体又は希釈剤を用いて、臨床に必要な投与剤型に製剤することができる。このような投与剤型には、限定ではなく、錠剤、フィルム錠、硬カプセル、軟カプセル、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、乳剤、注射液、注射剤、軟膏、クリーム剤、噴霧剤又は吸入剤がある。
【００１１】
本発明は、下記工程を含む医薬組成物の製造方法に関する：
（１）レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子の抽出を行い、抽出物を得ること、
（２）有効量の該抽出物を、医薬上容認されている担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、適当な投与剤型に成形すること。
【００１２】
上記方法において、レタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子の重量比は0.1〜1：2〜20：1〜5：0.1〜1：0.1〜1：0.1〜1であり、より好ましくは該重量比は0.5：5：2：0.5：0.25：0.5である。
【００１３】
上記方法において、沈香は樹脂状沈香であってよく、また乳香は樹脂状乳香であってよい。
【００１４】
本発明の方法を用いて、本発明の医薬組成物を、医薬上容認されている賦形剤、担体又は希釈剤と共に適当な投与剤型に製剤することができる。通常は、本発明の製造方法を用いて、本発明の医薬組成物を適当な剤形、例えば錠剤、フィルム錠、硬カプセル、軟カプセル、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、乳剤、注射液、注射剤、軟膏、クリーム剤、噴霧剤又は吸入剤などの種々の投与剤型に製剤することができる。
【００１５】
そのほか、本発明は、患者に有効量の本発明の医薬組成物を用いることを含む骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療する方法に関する。当該使用は、内服、筋肉注射、静脈注射、口腔粘膜又は外用による。
【００１６】
具体的には、本発明の医薬組成物は、骨折及び骨粗鬆症の予防及び治療に用いられる複合漢方薬であり、その組成は、レタスの種(Semen Lactucae Sativae)、沈香(Lignum Aquilariae Resinatum)、イネ(Fructus Oryzae)、乳香(Resina Boswelliae Carterii)、白朮(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)及び菟絲子(Semen Cuscutae)などの六種類の漢方薬植物を所定の割合で含んで成る。該医薬組成物は、上記六種類の漢方薬植物の全部分又は特定部分を使用して製造される。上記六種類の薬材のうち、レタスの種(Semen Lactucae Sativae)はキク科植物Lactuca Sativa L.の乾燥種子であり；沈香(Lignum Aquilariae Resinatum)は沈丁花科植物Aquilaria agallocha Roxb.の樹脂含有木材であり；イネ(Fructus Oryzae)はイネ科植物Oryza sativa L.の果実であり；乳香(Resina Boswelliae Carterii)はオリーブ科植物Boswellia Carterii Birdw.又は同属植物の樹幹皮部分から得られるゼリー状樹脂であり；白朮(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)はキク科植物Atractylodes macrocephala Koidz.の乾燥根茎であり；菟絲子(Semen Cuscutae)はヒルガオ科植物Cuscuta chinensis L.、Cuscuta australis R. Br.又はCuscuta japonica choisyの乾燥種子である。
【００１７】
本発明の医薬組成物において、レタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子の重量比は0.1〜1：2〜20：1〜5：0.1〜1：0.1〜1：0.1〜1であり、より好ましくは該重量比は0.5：5：2：0.5：0.25：0.5である。
【００１８】
本発明の医薬組成物において、好ましくは沈香は樹脂状沈香であり、好ましくは乳香は樹脂状乳香である。
【００１９】
他方、本発明は、下記工程を含む医薬組成物の製造方法に関する：
（１）上述の比率のレタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子の抽出を行い、抽出物を得ること、
（２）有効量の該抽出物を、医薬上容認されている担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、適当な投与剤型に成形すること。
【００２０】
このような剤型は、錠剤、フィルム錠、硬カプセル、軟カプセル、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、乳剤、注射液、注射剤、軟膏、クリーム剤、噴霧剤又は吸入剤であってよい。
【００２１】
さらに他に、本発明は、患者に有効量の本発明の医薬組成物を用いることを含む骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療する方法に関する。当該使用は、内服、筋肉注射、静脈注射、口腔粘膜又は外用による。例えば経口用の錠剤、フィルム錠、軟カプセル、硬カプセル、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、乳剤；又は注射用の注射液、注射剤；又は吸入用の噴霧剤、吸入剤；又は外用の軟膏、クリーム剤などの投与剤型を用いて、骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療することができる。
【００２２】
本発明の医薬組成物の生物活性は、骨形成蛋白質-2(BMP-2)発現刺激作用、骨芽細胞分化増殖刺激作用、家兎骨折の癒合促進作用、ラットの骨粗鬆症治療作用、マウスの酢酸身もだえ反応に対する鎮痛作用、マウスの負荷遊泳能力増強、急性毒性試験、慢性毒性試験等を含む。
【００２３】
本発明の医薬組成物によるBMP-2発現刺激作用の実験から、濃度0.3％の本発明の組成物の散剤Ａ（実施例１）の添加は、BMP-2発現活性を70.2％増加し、濃度0.3％の本発明の組成物の散剤Ｂ（実施例２）の添加は、BMP-2発現活性を125.5％増加することが判った。
【００２４】
本発明の医薬組成物による骨芽細胞分裂刺激作用の結果から、本発明の組成物は、骨芽細胞の増殖を刺激し、この促進作用は薬剤量に正比例することが判った。
【００２５】
本発明の組成物による家兎骨折の癒合促進の体内試験の結果から、家兎骨折モデルの各癒合時期において、本発明の組成物は、明らかに癒合を促進する作用を示した。癒合初期には、本発明の組成物は、骨折断端間の血腫の組織化を促進し、骨芽細胞の増殖分化、骨梁形成を刺激し；癒合中期には、本発明の組成物は、骨梁の成熟と石灰化、仮骨形成を促進し；癒合後期には、本発明の組成物は、骨形の再建を促進し、骨髄腔の再貫通を加速した。
【００２６】
卵巣摘出ラットにおいて本発明の組成物による骨粗鬆症の予防及び治療の体内試験を行ったところ、本発明の組成物は、骨形成及び骨吸収に影響を与え、骨芽細胞生成、類骨形成及び鉱物の基質内への沈積を促進することが明確に示された。卵巣摘出後に70日間投薬した群では、単位骨量(trabecular bone volume,TBV)、テトラサイクリン一重標識面(single tetracycline signal, STS)、テトラサイクリン二重標識面(double tetracycline signal, DTS)、骨再建時間(bone rebuilt time)、補正石灰化速度(iMAR)等の骨代謝指標は、すべて偽手術対照群の正常レベルまで回復した。
【００２７】
マウスの酢酸身もだえ反応(鎮痛作用)の体内試験の結果から、本発明の組成物は、酢酸により誘発されるマウスの身もだえ反応を明らかに抑制することが判った。このうち、1.0、2.0、4.0ｇ生薬/kg群は、生理食塩水群と比べて統計学的差異が見られた。他方、0.5ｇ生薬/kg群の身もだえ回数は生理食塩水群と比べて僅かに減ったが、統計学的に差はなかった。このことは、本発明の医薬組成物が一定の鎮痛作用を備えていることを示している。
【００２８】
マウスの遊泳能力(筋力増強)の体内試験の結果から、本発明の組成物はマウスの負荷遊泳時間を明らかに延長させることが判った。四つの薬剤量群(生薬量0.5、1.0、2.0、4.0 g/kg)と生理食塩水群を比べると、全て統計学的差異が見られた。実験結果から、骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療する本発明の複合漢方薬は、一定の体力増強、抗疲労作用があることが明示された。
【００２９】
本発明の組成物の経口服用ラットにおける急性毒性体内試験の結果から、本発明の組成物の高濃度懸濁液投与群又は対照溶液投与群の別にかかわらず、観察14日後、全てのラットが生存していた。14日の観察期間において、どのラットもいかなる臨床毒性症状も示さず、また本発明の組成物群の雄ラット、雌ラットの体重増加率は対照群に近かった。試験終了後屍体解剖し、肉眼で器官及び組織変化を確認したところ、両群とも肉眼では何の病変も観察されなかった。本発明の組成物5000 mg/kgは何の影響も与えない薬剤量であり、実質的に毒性のない物質と言える。
【００３０】
本発明の組成物の経口服用ラットにおける長期毒性体内試験において、投薬期間中、各群ラットの活動状態は正常であり、外観特徴、糞便、餌摂取量は同様に正常だった。本発明の組成物の投薬群の体重は、溶媒対照群と比べて顕著な差はなかった。本発明の組成物の投薬群の血液学指標は、各項目とも対照群と比べて顕著な差はなかった。本発明の組成物の投薬群の血液生化学指標は、各項目とも対照群と比べて顕著な差はなかった。ラット臓器係数に対する影響では、投薬群の各臓器係数は対照群と比べて顕著な差はなかった。ラット臓器に対する病理組織学検査では、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、膀胱、肺臓、胃、十二指腸、回腸、結腸、膵臓、子宮、卵巣、睾丸、副睾丸、前立腺、脳、下垂体、甲状腺、副腎、胸腺、リンパ腺、及び骨髄等23種の臓器において、投薬群と対照群とを比べて、どちらも顕著な病理学的変化は認められなかった。試験データから、ヒト用薬剤量の106倍においても薬物の毒性反応は認められなかった。
【００３１】
以上の生物活性試験の結果をまとめると、本発明の医薬組成物は、毒性がなく、体外実験により、骨形成蛋白質(BMP)-2の発現及び骨芽細胞の増殖を刺激する複合処方薬であることが分かった。また、動物実験により、鎮痛作用及び筋力増強作用を有し、骨折癒合の促進、骨粗鬆症の治療に有用であることが分かった。よって、本発明の組成物は骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療することが可能である。
具体的な実施形態を以下に示す。
【実施例１】
【００３２】
本発明の組成物の散剤Ａ型の製造
沈香2000ｇ、イネ800ｇ、乳香200ｇ、レタスの種200ｇ、白朮100ｇ及び菟絲子200ｇをそれぞれ粉砕して粉末にし、均一に混ぜ合わせ、100目（メッシュ）の篩いにかける。
【実施例２】
【００３３】
本発明の組成物の散剤Ｂ型の製造
沈香400ｇ、イネ267ｇをそれぞれ粉状にすりつぶし、60目の篩いにかける。
別途、イネ533ｇ、乳香200ｇ、沈香1600ｇ、レタスの種200ｇ、白朮100ｇ及び菟絲子200ｇを抽出鍋に入れて脱イオン水に浸し、さらに100℃に加熱して2.5時間続けて煮沸する。抽出液を取り出して100目の篩いで濾過した後、これを減圧加熱して濃縮する。濃縮液と先に篩いにかけたイネ粉末267ｇ及び沈香粉末400ｇを混合し、顆粒を生成する。該顆粒を乾燥機に入れて60℃で４時間、水分が9%以下になるまで乾燥させる。これを再度200目の篩いにかける。
【実施例３】
【００３４】
本発明の組成物の散剤Ｃ型の製造
沈香2000ｇ、イネ800ｇ、乳香200ｇ、レタスの種200ｇ、白朮100ｇ及び菟絲子200ｇを抽出鍋に入れて脱イオン水に浸し、さらに100℃に加熱して2.5時間そのまま煮沸する。抽出液を取り出して100目の篩いで濾過する。該抽出液をさらに噴霧乾燥機で噴霧乾燥させ、粉末にする。
【実施例４】
【００３５】
本発明の組成物の蜜丸剤の製造
実施例１の粉末と丸い粒状のしずくになるまで煮詰めた蜂蜜を、1:1の割合で混合して蜜丸剤を製造する。
【実施例５】
【００３６】
本発明の組成物のカプセル剤の製造
実施例２又は実施例３の粉末に薬学的によく使われる賦形剤、担体又は希釈剤を加えて混合し、篩いにかけた後、カプセル内に装填する。
【実施例６】
【００３７】
本発明の組成物の錠剤の製造
実施例２又は実施例３の粉末に薬学的によく使われる賦形剤、担体又は希釈剤を加えて混合し、篩いにかけた後、直接錠剤に成型する。また、薬学的によく使われる従来の造粒技術を用いて顆粒を作製した後、錠剤に成型してもよい。
【実施例７】
【００３８】
本発明の組成物の内服液剤の製造
実施例２又は実施例３の粉末に薬学上よく使われる懸濁剤及び脱イオン水を加え、内服液剤を製造する。
【００３９】
生物活性実験
本発明の組成物の骨形成蛋白質-2刺激作用、骨芽細胞分化増殖刺激作用、家兎骨折の癒合促進作用、ラットの骨粗鬆症治療作用、マウスの酢酸身もだえ反応に対する鎮痛作用、マウスの負荷遊泳能力増強、急性毒性試験、慢性毒性試験等の生物活性実験の結果をそれぞれ以下に述べる。
【００４０】
実験に用いた薬剤
(1) 骨形成蛋白質-2作用実験：実施例１に記載の通りの散剤Ａ、実施例２に記載の通りの散剤Ｂ。
(2) 骨芽細胞分裂刺激作用実験：実施例３に記載の通りの散剤Ｃ。
(3) 家兎骨折モデルの癒合促進実験：実施例４に記載の通りの蜜丸剤。
(4) 卵巣摘出ラットの骨粗鬆症予防・治療試験：実施例３に記載の通りの散剤Ｃ。
(5) マウス酢酸身もだえ体内試験：実施例２に記載の通りの散剤Ｂ。
(6) マウス游泳能力試験：実施例２に記載の通りの散剤Ｂ。
(7) ラット経口服用急性毒性試験：実施例３に記載の通りの散剤Ｃ。
(8) ラット経口服用慢性毒性試験：実施例２に記載の通りの散剤Ｂ。
【実験例１】
【００４１】
体外実験：本発明の組成物の骨形成蛋白質-2(BMP-2)プロモーター活性化作用
参考文献
Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science, 1999, 286: 1946-1949.
Compactin and simvastatin, but not pravastatin, induce bone morphogenetic protein-2 in human osteosarcoma cells. Biochem. Biophy. Res. Commun., 2000, 271(3): 688-692.
In vitro and in vivo studies of bone morphogenetic protein-2 expressing adenoviral vector. J. Bone Joint Surg. Am., 2001, 83A suppl. 1 (Pt 2): S99-104.
【００４２】
骨形成蛋白質(BMP)-2遺伝子の5'プロモーター断片にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたベクター(レポーター遺伝子ベクター)を骨芽細胞内に導入する。ルシフェラーゼ活性を測定することにより、骨形成蛋白質(BMP)-2遺伝子の発現レベルが分かる。結果は表１及び表２の通りである。
【００４３】
表２に示す通り、散剤Ａ及びＢはルシフェラーゼ活性を全く示さなかった。表１に示す通り、濃度0.3%の散剤Ａを添加すると、骨形成蛋白質-2(BMP-2)活性を70.2%増加させることができた。また濃度0.3%の散剤Ｂを添加すると、骨形成蛋白質-2(BMP-2)活性を125.5%増加させることができた。
【実験例２】
【００４４】
体外実験：本発明の組成物の骨芽細胞分裂に対する刺激作用
参考文献
Menadione-induced cytotoxicity to rat osteoblasts. Cell Mal. Life Sci. 1997, 53: 967-976.
【００４５】
Wistar種の新生ラットの頭蓋冠を37℃で0.2%I型コラーゲナーゼ(Sigma)により連続し
て30分ずつ消化し、第三〜第五次消化で得られた細胞を採取する。その後、温度37℃、CO2濃度5%の空気中において、ペニシリンG 100 U/ml、10% FCS（ウシ胎児血清）、DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）、100 μg/mlストレプトマイシンを含む培養液で培養する。
【００４６】
1×104個/cm2の骨芽細胞を96ウェルプレートで培養し、48時間後、0.1、1、10、
100、1,000 μg/ml等異なる濃度でジメチルサルフォキシドに溶解した本発明の組成物(実施例３の通りの製剤)を添加し、引き続き１〜３日培養する。培養後、37℃の温度下で４時間、0.5 mg/ml濃度のMTT [臭化 3-(4,5-ジメチル-2-チアゾイル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム] 100 μlで細胞を処理し、上澄み液を取り除き、0.04NのHClを含むイソプロパノール100 μlを加えて溶解し、その後、波長570nmのELISA（酵素免疫測定法）リーダーで数値を読む。
【００４７】
以下の公式により、促進率の百分率を算出する：
促進率＝〔（薬物添加時の平均吸光度−薬物無添加時の平均吸光度）／薬物無添加時の平均吸光度〕×100
平均吸光度(AOD, 平均光学密度)、SE(標準誤差)
【００４８】
表３に結果を示す通り、本発明の組成物は培養24時間及び72時間のどちらにおいても骨芽細胞の増殖を刺激することができ、促進作用は薬物量と正比例した。しかし、72時間での促進率は24時間での促進率よりも低かった。原因としては、培養液の養分を使い切ったか又は代謝物が生成されたことが考えられる。
【実験例３】
【００４９】
本発明の組成物による家兎骨折モデルの癒合促進の体内試験
参考文献
An experimental study of dan sheng improving the mandibular bone fracture healing. Chinease J. Stomatology, 1992, 27(4); 215-216.
Effect of nicotine on the rate and strength of long bone fracture healing. Clin. Orthop. & related Res. 1998, 353: 231-237.
【００５０】
体重1.5〜2 kgの家兎40羽、雌雄半分ずつを一週間観察し、異状がなかった場合、麻酔下の無菌手術で前肢を切開し、橈骨上段1/3の部分に電動のこぎりで２mmの標準横断骨折を作製し、傷口を縫合する。家兎40羽を観察予定期日により５，12，17，23，30日群の５群に分け、各群８羽中、５羽を実験群、３羽を対照群とした。対照群には標準複合飼料を与え、実験群には標準飼料以外に、各群の観察予定期日まで毎日、朝晩投薬した。実験用薬剤の蜜丸剤は実施例４の方法で製造した。各群を第５〜12日、第17〜23日、第23〜30日の時期に屠殺し、Ｘ線写真及び病理学観察を行なった。
【００５１】
結果は以下の通りである。
(a) 身体能力観察：実験群は対照群より回復が早く、実験群の前肢は対照群よりも、幾分早く体重を支えられるようになった。
【００５２】
(b) Ｘ線写真検査：実験群の骨折癒合状況は、どの観察時期においても、対照群より好ましかった。
【００５３】
(c)病理組織学観察：
(c-i)手術後５日：対照群の骨折断端部に血腫及び壊死組織が認められ、皮質骨、内骨に著変はなかった。一方、本発明の組成物群の骨折断端部にも血腫及び壊死組織が認められ、患部に血管の侵入が見られ、皮質骨は骨芽細胞の増殖が認められ、骨内には毛細血管の増殖が認められた。
【００５４】
(c-ii)手術後12日：対照群ではまだ幾分、血腫及び壞死組織が認められ、繊維性の仮骨が形成され、皮質骨には幾分、生物活性が生まれ、小領域で軟骨様仮骨が認められた。他方、本発明の組成物群では骨折断端部に繊維性仮骨が形成され、骨折近位端において明らかに皮質骨が発生し、海綿骨様仮骨が確認された。
【００５５】
(c-iii)手術後17日：対照群の骨折断端部に大量の軟骨様仮骨が見られ、髄腔はまだ仮骨によって閉じられていない。他方、本発明の組成物群では骨折断端部に明らかに骨が発生し、仮骨の石灰化が始まり、髄腔はすでに仮骨によって閉じられ、血管も確認された。
【００５６】
(c-iv)手術後23日：対照群の骨折断端部はすでにほとんどが海綿骨様仮骨になったが、仮骨は未だ完全には骨性連結しておらず、骨折断端部中央には依然軟骨様仮骨が存在していた(図１参照)。他方、本発明の組成物群の骨折断端部はすでに完全に骨性癒合し、外仮骨は既にはっきりした形状を現し、骨梁内の血流も盛んであった(図２参照)。また、高倍率顕微鏡により、内仮骨によって閉じられた髄腔端部において、破骨細胞及び骨芽細胞による骨吸收、骨再建過程がはっきりと観察された。
【００５７】
(c-v)手術後30日：図４に示すように、本発明の組成物群では骨折断端部の仮骨が成熟し、仮骨と骨折断端部の皮質骨の連結は良好で、該皮質骨にも骨の再建が認められ、テトラサイクリンの二重の標識が明瞭であり、すでに臨床癒合基準に達した。他方、図３に示すように、対照群の骨折断端部の仮骨は成熟が遅く、依然、軟骨のカルシウム化を示す組織像が観察され、皮質骨の再建形状ははっきりせず、骨折断端部と仮骨の連結は不良で、テトラサイクリン標識はほとんど一重であった。
【００５８】
以上の結果から、本発明の組成物は家兎骨折モデルのどの癒合期においても顕著な癒合促進作用を示したことがわかる。本発明の組成物は、癒合初期には、骨折断端間の血腫の組織化を促進し、骨芽細胞の増殖分化、骨梁形成を刺激し；癒合中期には、骨梁の成熟と石灰化、仮骨形成を促進し；癒合後期には、骨形の再建を促進し、骨髄腔の再貫通を加速した。
【実験例４】
【００５９】
本発明の組成物による卵巣摘出ラットにおける骨粗鬆症予防・治療の体内試験
参考文献
Effect of ovariectomy and calcium deficiency on the ultrasound velocity, mineral density and strength in the rat femur. Clin. Biomech., 1998, 13(7): 480-484.
The use of estrogen, DHEA, and diosgenin in a sustained delivery setting as a novel treatment approach for osteoporosis in the ovarictomized adult rat model. Biomed. Sci., 2001, 37: 281-286.
Study of nylestriol effect on bone histomorphometric parameters in ovariectomized rats. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi, 1999, 34(2): 86-89.
【００６０】
体重200ｇのSD (Spraque-Dawley) 雌ラット52匹を以下の四群に分ける：偽手術対照群、卵巣摘出群、卵巣摘出30日後に本発明の組成物を40日間投薬する群（卵巣摘出＋投薬40日群）、卵巣摘出30日後に本発明の組成物を70日間投薬する群（卵巣摘出＋投薬70日群）。
【００６１】
(4-a) 卵巣摘出群：
ラット麻酔後、無菌状態で偽手術又は卵巣摘出術を施し、一ヶ月後、偽手術対照群と卵巣摘出群の各５匹を屠殺し、骨粗鬆が発生しているかどうか観察した。その結果、偽手術対照群ラットの大腿骨下端骨板下の骨梁構造は成熟し、配列連結も緊密で、平均して骨梁壁の厚さはほぼ一致した(図５参照)。卵巣摘出術30日後のラットの大腿骨下端骨板下の骨梁構造は極めて未成熟で、骨梁間の連結は非常に悪く、大量の骨梁の盲端が現れ、骨梁表面には大量の類骨が発生した。これは骨の再建が増加し、典型的な高代謝回転型の骨粗鬆モデルが発現したことを示している(図６参照)。卵巣摘出後30日のラットの骨梁構造は、偽手術対照群と比べて極めて著明な差異が認められた。
【００６２】
(4-b) 卵巣摘出後投薬群：
卵巣摘出術一ヶ月後、投薬する二群に、毎日それぞれ0.12ｇの散剤Ｃを経口投与した。40日後、四群のラットを各群４匹ずつ屠殺し、病理組織学観察を行なった。投薬70日群に引き続き30日間投薬した後、各群の残りのラットをすべて屠殺し、骨密度、病理組織学、骨組織形態計測学観察を行なった。
【００６３】
(4-c)骨密度測定：
ラットの右大腿骨の骨密度をHologic QDR-4500W (S/N 47192)を用いて測定した。
【００６４】
(4-d)骨組織形態計測学的観察：
各群とも骨板下1mm内側の骨梁切片を作製し、内側、中央、外側の三部位から三つの画像を選んでコンピュータに記録し、それぞれのサンプルに対し三つの観察方法、即ちGemisa染色による組織学的観察、Von Kossa染色による類骨観察、蛍光顕微鏡によるテトラサイクリン標識観察を採用して、以下の項目の骨組織形態計測分析を行なった：単位骨量(trabecular bone volume, TBV)、テトラサイクリン一重標識面(single tetracycline signal, STS)、テトラサイクリン二重標識面(double tetracycline signal, DTS)、テトラサイクリン一重／二重標識面比(STS/DTS)、類骨面(trabecular osteoid surface, TOS)、平均類骨幅(mean osteoid surface width, MOSW)、石灰化時間、骨再建時間、骨面(bone surface)、骨吸収面(bone resorption surface)、石灰化速度(MAR)、補正石灰化速度(iMAR)。
【００６５】
(4-e)以上の実験結果をそれぞれ以下に示す。
(4-e-i) 卵巣摘出＋投薬40日群の組織病理学的観察：
卵巣摘出群(卵巣摘出後70日目)の大腿骨下端骨板下の骨梁構造は、卵巣摘出30日後に比べて配列がさらに疎らになり、分散して薄くなった。骨梁表面の類骨がはっきり確認され、骨の形成と再建が活発化し、典型的な高代謝回転型骨粗鬆モデルが発現した。卵巣摘出＋投薬40日群は偽手術対照群の近似レベルにはまだ達していないものの、卵巣摘出群と比較すると、骨梁構造が明らかに増加して緻密になり、骨梁間の連結も明らかに改善された。
【００６６】
(4-e-ii) 卵巣摘出＋投薬70日群の組織病理学的観察：
偽手術群のラットでは大腿骨下端骨板下の骨梁構造が成熟し、配列の連結は緊密且つ規則的で、各骨梁壁の厚さもほぼ一致した(図７参照)。卵巣摘出群では卵巣摘出100日後、大腿骨下端骨板下の骨梁構造の配列が疎らになり、総量及び密度が明らかに減少し、骨梁間の連結性は悪く、厚さも不均一で、骨梁の多くが盲端に終わり、骨梁表面に類骨が増殖した。これは骨の再建が進んではいるものの、典型的な高代謝回転型骨粗鬆症が発現したことを示している(図８参照)。
【００６７】
図９に示す通り、卵巣摘出＋投薬70日群ラットの大腿骨下端骨板下の骨梁構造の配列は緊密で、偽手術対照群とその形態が似ており、骨梁間は網目状に連結し、配列は規則的で厚さはほぼ均一であり、骨梁表面の類骨は比較的少なく、正常に近かった。これは骨の再建があまり活発でないことを示している。
【００６８】
(4-e-iii)
骨密度計測結果を表４に示す。卵巣摘出＋投薬70日群の右大腿骨の骨密度は卵巣摘出群と比較して明らかな差異が認められ、且つ偽手術対照群のレベルまで回復している。
【００６９】
(4-e-iv)骨組織形態計測学的観察：
結果を表５に示す。本発明の組成物の骨粗鬆症に対する骨組織形態学的作用は以下の通りである。
単位骨量(TBV)：卵巣摘出＋投薬70日群の単位骨量は偽手術対照群のレベルまで回復した。
テトラサイクリン一重標識面(STS)：卵巣摘出＋投薬70日群のテトラサイクリン一重標識面は偽手術対照群のレベルまで回復した。
テトラサイクリン二重標識面(DTS)：卵巣摘出＋投薬70日群のテトラサイクリン二重標識面は偽手術対照群のレベルまで回復した。
テトラサイクリン一重／二重標識面比(STS/DTS)：三群の表面比に著明な差異は見られなかった。
類骨面(TOS)：卵巣摘出群の類骨面は偽手術対照群よりも高く、また、卵巣摘出＋投薬70日群の類骨面も偽手術対照群より高く、卵巣摘出群と類似していた。
平均類骨幅(MOSW)：卵巣摘出群と卵巣摘出＋投薬70日群の平均類骨幅は、どちらも偽手術対照群より明らかに広かった。
石灰化時間(Mineralization time)：三群間に著明な差異は見られなかった。
骨再建時間(Bone rebuild time)：偽手術対照群及び卵巣摘出＋投薬70日群の骨再建時間は卵巣摘出群に比べて明らかに長かった。
骨面(Bone surface)：卵巣摘出群及び卵巣摘出＋投薬70日群の骨面積は偽手術対照群より明らかに大きかった。
骨吸収面(Bone resorption surface)：卵巣摘出群及び卵巣摘出＋投薬70日群の骨吸収面積は偽手術対照群より明らかに大きく、また卵巣摘出＋投薬70日群の骨吸収面積は卵巣摘出群より明らかに大きかった。
石灰化速度(MAR)：卵巣摘出群及び卵巣摘出＋投薬70日群の石灰化速度は偽手術対照群よりも速く、また、卵巣摘出群の石灰化速度は卵巣摘出＋投薬70日群より速かった。
補正石灰化速度(iMAR)：卵巣摘出＋投薬70日群の補正石灰化速度は卵巣摘出群より遅く、且つ、偽手術対照群の速度まで回復した。
【００７０】
以上のように、本発明の組成物は骨形成及び骨吸收活性に影響を与え、骨芽細胞の生成、類骨及びミネラルの基質内への沈積を促進することが明確に示された。卵巣摘出術＋投薬70日群の単位骨量(TBV)、テトラサイクリン一重標識面(STS)、テトラサイクリン二重標識面(DTS)、骨再建時間(Bone rebuild time)、補正石灰化速度(iMAR)等の骨代謝指標は、すべて偽手術対照群の正常レベルまで回復した。
【実験例５】
【００７１】
酢酸によるマウスの身もだえ反応(鎮痛作用)の体内試験
参考文献
Peripheral and preemptive opioid antinociception in a mouse visceral pain model. Pain, 2001, 89(2-3): 221-227.
Preliminary studies on the analgesic activity of latex of Calotropris procera. J. Ethnopharmacol. 2000, 73(1-2): 307-311.
Studies on the anti-inflammatory and related pharmacological properties of the aqueous extract of Bridelia ferruginea stem bark. J. Ethnopharmacol. 2000, 71(1-2): 153-160.
【００７２】
昆明種のマウス72匹、雌雄半分ずつ、体重18〜22ｇを体重によってランダムに６群に分け、餌を与えずに徹夜させ、それぞれ生理食塩水、0.2 g/kgのアスピリン又は薬剤量の異なる散剤Ｂを投与した。各薬剤量はそれぞれ生薬量0.5、1.0、2.0、4.0 g/kgに相当する。
投薬１時間後、各マウスの腹腔に濃度0.3%の酢酸溶液を0.2 ml注射した。20分間観察し、その間のマウスの身もだえ回数によって薬効を判定した。
【００７３】
結果：
表６に示す通り、本発明の組成物は、酢酸により誘発されるマウスの身もだえ反応を明らかに抑制した。このうち、1.0、2.0、4.0ｇ生薬/kg群は生理食塩水群と比べて統計学的差異が見られた。他方、0.5ｇ生薬/kg群の身もだえ回数は生理食塩水群と比べて僅かに減ったが、統計学的に差はなかった。このことは、本薬物が一定の鎮痛作用を備えていることを示している。
【実験例６】
【００７４】
マウスの遊泳能力(筋力増強)の体内試験
参考文献
The effect of swimming on bone remodeling and composition in young adult rats. Calcif. Tissue Int., 1990, 47(3): 173-177.
Effects of exposure to hypobaric-hypoxia on body weight, muscular and hematological characteristics, and work performance in rats. Jpn. J. Physiol., 1997, 47(1): 51-57.
Pharmacological study on Agkistrodon blomhoffii BOIE. V. Anti-fatigue effect of the 50% ethanol extract in acute weight-loaded forced swimming-treated rats. Biol. Pharm. Bull., 1996, 19(1): 62-66.
【００７５】
昆明種のマウス72匹、雌雄半分ずつ、体重18〜22ｇを体重によりランダムに６群に分け、餌を与えずに徹夜させ、連続３日間、それぞれ生理食塩水、骨疏康3 g/kg又は薬剤量の異なる本発明の組成物を投与した。本発明の組成物薬物は実施例２の方法によって製造し、各薬剤量はそれぞれ生薬量0.5、1.0、2.0、4.0 g/kgに相当する。骨疏康は中国大陸で販売許可された骨粗鬆症治療の複合漢方薬であり、その成分は淫羊角、熟地黄、黄耆、丹参、骨碎補である。
【００７６】
最後の投薬から１時間後、マウスの尾部に質量２ｇの分銅をつけて、水温25℃、深さ15cmのプールに放し、計時を開始し、マウスの鼻孔が水中に10秒以上浸かった時をマウスの体力消耗の基準と見なし、計時を停止した。各種薬物投与群と生理食塩水群を比較し、薬効を判定した。
【００７７】
結果：
表７に示す通り、本発明の組成物はマウスの負荷遊泳時間を明らかに延長させることが判った。四つの薬剤量群(生薬量0.5、1.0、2.0、4.0 g/kg)と生理食塩水群を比べると、全て統計学的差異が見られた。実験結果から、骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療する本発明の複合漢方薬は、一定の体力増強、抗疲労作用があることが明らかになった。
【実験例７】
【００７８】
本発明の組成物の経口服用ラットの急性毒性体内試験
体重約200 gのSpraque-Dawley純系ラット24匹、雌雄半分ずつをランダムに二群に分け、一つを対照群、一つを本発明の組成物処理群とした。散剤Ｃを実施例３の方法で製造し、1%のカルボキシメチルセルロース(CMC)を溶媒として濃度250 mg/mlの高濃度懸濁液を作製した。本発明の組成物処理群には濃度250 mg/mlの散剤Ｃを10 ml/kg、対照群には1%のカルボキシメチルセルロース(CMC)をそれぞれ一日二回、二時間おきに与え、14日間臨床観察を行なった。
【００７９】
結果：
表８に示す通り、本発明の組成物の高濃度懸濁液投与群又は対照溶液投与群の別にかかわらず、観察14日後、全てのラットが生存していた。14日の観察期間において、どのラットもいかなる臨床毒性症状も示さず、また本発明の組成物群の雄ラット、雌ラットの体重増加率は対照群に近かった。試験終了後屍体解剖し、肉眼で器官及び組織変化を確認したところ、両群とも肉眼では何の病変も観察されなかった。本発明の組成物5000 mg/kgは何の影響も与えない薬剤量であり、実質的に毒性のない物質と言える。
【実験例８】
【００８０】
本発明の組成物の経口服用ラットの長期毒性体内試験
Wistar種(二級)ラットから体重80〜100ｇのラットを選び、一週間飼育した後、試験を行なった。雌雄半分ずつの６〜７週齢のラットが、中国医学科学院実験動物研究所により提供された。合格証番号：SCXR1100-0006。
【００８１】
試験方法：
(a)溶媒対照群：1%のカルボキシメチルセルロース(CMC)懸濁液。
(b)投薬群：体重１kg当たり生薬16ｇ、本発明の組成物の散剤Ｂ薬液の濃度＝生薬1.333 g/ml、投薬容積＝体重100ｇ当たり1.2 ml、毎日一回、毎週６回、連続３ヶ月間。
(c)動物数：上述のラットを選んで一週間飼育した後、溶媒対照群及び投薬群がそれぞれ雌雄半分ずつになるように、性別、体重によりランダムに二群に分け、雌雄別籠で飼育した。水は自由に飲ませ、毎週一回、体重及び餌の摂取量を計量した。投薬３ヶ月後ラットを屠殺し、採血して血液学及び血液生化学指標の測定を行なった。また、臓器を取り出し、その重量を計量し、病理組織学検査を行なった。
【００８２】
試験結果は以下の通りである：
(1)一般観察：
投薬期において、各群のラットの活動状態は正常であり、外観特徴、糞便、餌の摂取量は同様に正常だった。
雄ラットの体重変化：溶媒対照群は121±2.2 g(第0週)から365±20.0 g(第12週)に増加し、本発明の組成物群は123±2.7 gから357.5±23.3 gに増加した。
雌ラットの体重変化：溶媒対照群は119±4.2 g(第0週)から231±16.4g(第12週)に増加し、本発明の組成物群は117±2.7 gから220±10.8 gに増加した。
投薬群の体重と溶媒対照群の体重の間には、顕著な差はないことがわかる。
【００８３】
(2)血液学指標：
表９に示す通り、投薬期における各群のヘモグロビン(Hb)、赤血球数(RBC)、白血球数(WBC)、血小板数(PLT)、凝血時間(CT)の結果から、連続投薬三ヶ月の時点で、投薬群の血液学指標は各項目とも対照群と比べて顕著な差はないことがわかる。
【００８４】
(3)血液生化学指標：
投薬後の血液生化学検査の結果は表９に示す通りである。この結果から、連続投薬三ヶ月の時点で、投薬群の生化学指標は各項目とも対照群と比べて顕著な差はないことがわかる。
【００８５】
(4)ラット臓器係数に対する影響：
各群のラットをすべて投薬３ヶ月終了後に屠殺し，それぞれ主要臓器を取り出してその重量(即ち湿重量)を計量した。湿重量を体重で割ると体重100ｇ当たりの湿重量(g)が得られ、これを臓器係数と見なす。結果を表９に示す通り、投薬群の各臓器係数とも対照群と比べて顕著な差はなかった。
【００８６】
(5)ラット臓器の病理組織学検査：
連続投薬３ヶ月後、各群のラットを屠殺した。それぞれ心臓、肝臓、脾臓、腎臓、膀胱、肺臓、胃、十二指腸、回腸、結腸、膵臓、子宮、卵巣、睾丸、副睾丸、前立腺、脳、下垂体、甲状腺、副腎、胸腺、リンパ腺、骨髄等23種の臓器を取り出し、病理組織学検査を行なった。その結果、投薬群と対照群を比べると、どちらも顕著な病理学的変化は認められなかった。
【００８７】
試験中、投薬群にはラット体重１kg当たり生薬16ｇを本発明の組成物により投与した。ラットに三ヶ月連続で灌胃投薬し、一般観察、血液学、血液生化学、病理組織学等の検査、及び臓器の病理組織学検査を行なった。試験データから、ヒト用薬剤量の106倍においても薬物の毒性反応は見られないことが明らかである。
【００８８】
以上の生物活性試験の結果をまとめると、本発明の医薬組成物は、毒性がなく、体外実験により、骨形成蛋白質(BMP)-2の発現及び骨芽細胞の増殖を刺激する複合処方薬であることが分かった。また、動物実験により、鎮痛作用及び筋力増強作用を有し、骨折癒合の促進、骨粗鬆症の治療に有用であることが分かった。よって、本発明の組成物は骨折及び骨粗鬆症を予防及び治療することが可能である。
【００８９】
本発明の好ましい具体的な実施例について既に説明したが、当業者なら皆理解している通り、添付の特許請求の範囲に示す本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない範囲内で、各種変更、追加又は置換を行なうことができる。
【００９０】
【表１】
2005533020.tif 000002
【００９１】
【表２】
2005533020.tif 000003
【００９２】
【表３】
2005533020.tif 000004
【００９３】
【表４】
2005533020.tif 000005
【００９４】
【表５】
2005533020.tif 000006
【００９５】
【表６】
2005533020.tif 000007
【００９６】
【表７】
2005533020.tif 000008
【００９７】
【表８】
2005533020.tif 000009
【００９８】
【表９】
2005533020.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、骨折手術23日後の対照群の40倍Masson染色を示す。
【図２】図２は、骨折手術23日後の本発明の組成物群の40倍Masson染色を示す。
【図３】図３は、骨折手術30日後の対照群の100倍蛍光顕微鏡像である。
【図４】図４は、骨折手術30日後の本発明の組成物群の100倍蛍光顕微鏡像である。
【図５】図５は、偽手術30日後の偽手術対照群の40倍Von Kossa染色を示す。
【図６】図６は、卵巣摘出30日後の卵巣摘出群の40倍Von Kossa染色を示す。
【図７】図７は、偽手術群のラットの大腿骨下端骨板下の骨梁構造を示す。
【図８】図８は、卵巣摘出群の卵巣摘出100日後のラットの大腿骨下端骨板下の骨梁構造を示す。
【図９】図９は、卵巣摘出30日後から70日間投与した群のラットの大腿骨下端骨板下の骨梁構造を示す。
【図１】
2005533020.tif 000011
【図２】
2005533020.tif 000012
【図３】
2005533020.tif 000013
【図４】
2005533020.tif 000014
【図５】
2005533020.tif 000015
【図６】
2005533020.tif 000016
【図７】
2005533020.tif 000017
【図８】
2005533020.tif 000018
【図９】
2005533020.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月2日(2004.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子を含んで成り、各成分の重量比がレタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子＝0.1〜1：2〜20：1〜5：0.1〜1：0.1〜1：0.1〜1である、骨折及び骨粗鬆症の予防及び治療に用いられる医薬組成物。
【請求項２】
レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子の重量比がレタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子＝ 0.5：5：2：0.5：0.25：0.5である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
沈香が樹脂状沈香である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
乳香が樹脂状乳香である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
公知の製剤技術に従って、医薬上容認されている賦形剤、担体又は希釈剤を用いて投与剤型に成形された、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
錠剤、フィルム錠、硬カプセル、軟カプセル、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、乳剤、注射液、注射剤、軟膏、クリーム剤、噴霧剤又は吸入剤のいずれかの投与剤型に成形された、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
下記工程：
（１）レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子の抽出を行い、抽出物を得ること、
（２）有効量の該抽出物を、医薬上容認されている担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、投与剤型に成形すること
を含んで成る、骨折及び骨粗鬆症の予防及び治療に用いられる医薬組成物の製造方法。
【請求項８】
レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子の重量比がレタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子＝0.1〜1：2〜20：1〜5：0.1〜1：0.1〜1：0.1〜1である、請求項７に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項９】
レタスの種、沈香、イネ、乳香、白朮及び菟絲子の重量比がレタスの種：沈香：イネ：乳香：白朮：菟絲子＝0.5：5：2：0.5：0.25：0.5である、請求項８に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１０】
沈香が樹脂状沈香である、請求項８又は９に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
乳香が樹脂状乳香である、請求項８又は９に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１２】
公知の製剤技術に従って、医薬上容認されている賦形剤、担体又は希釈剤を用いて投与剤型に成形する、請求項７に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１３】
錠剤、フィルム錠、硬カプセル、軟カプセル、顆粒剤、粉末剤、丸剤、液剤、乳剤、注射液、注射剤、軟膏、クリーム剤、噴霧剤又は吸入剤のいずれかの投与剤型に成形する、請求１２に記載の医薬組成物の製造方法。
【国際調査報告】
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