(57)【要約】本発明はバチルスメガテリウムを用いたビタミンB12の調製方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルスメガテリウムを含む培養を用いたビタミンB12の製造方法であって、醗酵を嫌気性条件下で行うことを特徴とする上記方法。
【請求項２】
バチルスメガテリウムを最初は好気的にそのあと嫌気的に醗酵させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記好気性から嫌気性醗酵への変換を好気性醗酵細胞の指数増殖期に行うことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記好気性から嫌気性醗酵への変換を好気的に増殖している細胞の指数増殖期の中央でまたは終わりで、好ましくは終わりで行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
培養培地に少なくともコバルトを加えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
hemAXCDBLオペロンまたはその一部が増強された発現を示すバチルスメガテリウム菌株を醗酵させることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
hemAXCDBLオペロンが細胞中に増加したコピー数で存在するバチルスメガテリウム菌株を醗酵させることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
配列番号 1に示されるヌクレオチド配列またはその対立遺伝子を有するhemAXCDBLオペロン中に組込まれている、配列番号 2〜6に示されるウロポルフィリノーゲンIIIの生合成に関与する酵素またはそのアイソフォームをコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項８に記載の単離されたヌクレオチド配列またはその一部、およびそれに動作可能に連結されていて調節機能を有するヌクレオチド配列を含む遺伝子構造。
【請求項１０】
請求項８に記載の単離されたヌクレオチド配列もしくはその一部または請求項９に記載の遺伝子構造、および、セレクション、宿主細胞中での複製、および／または宿主細胞ゲノム中への組み込みのためのさらなるヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のビタミンB12製造方法で用いる形質転換されたバチルスメガテリウム菌株であって、請求項８に記載のヌクレオチド配列またはその一部の増強された発現および／または増加したコピー数を示すことを特徴とする上記菌株。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換されたバチルスメガテリウム菌株であって、それが、複製型において請求項９に記載の遺伝子構造または請求項１０に記載のベクターを含んでいることを特徴とする上記菌株。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の形質転換されたバチルスメガテリウム菌株を製造するための、請求項８に記載の単離されたヌクレオチド配列もしくはその一部または請求項９に記載の遺伝子構造または請求項１０に記載のベクターの使用。
【請求項１４】
ビタミンB12を製造するための、請求項１１または１２に記載の形質転換されたバチルスメガテリウム菌株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバチルスメガテリウム[Bacillus megaterium](巨大菌)を用いたビタミンB12の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
1930年代というかなり前に、ビタミンB12はGeorge MinotとWilliam Murphy (Stryer, L., 1988, in Biochemie, fourth edition pp. 528-531, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, New York）により人体に対するその作用から間接的に発見された。ビタミンB12は1948年に最初に精製、単離され、たったの８年後1956年にその複雑な三次元結晶構造がDorothy Hodgkin (Hodgkin, D.C. et al., 1956, Structure of Vitamin B12. Nature 176, 325-328 and Nature 178, 64-70）により解明された。天然に生成するビタミンB12の生合成の最終生成物は5'-デオキシアデノシルコバラミン（B12補酵素）およびメチルコバラミン（MeCbl） であり、他方ではビタミンB12はシアノコバラミン（CNCbl）とも呼ばれ、これは主に産業界によって製造され取り扱われている化学物質形である。本発明においては、特に断らない限り、ビタミンB12は常に三つすべての類縁分子を指す。
【０００３】
バチルスメガテリウムは100年以上前(1884年)にDe Baryによって初めて報告された。土壌菌として一般分類されているが、バチルスメガテリウムは様々な他の生息地例えば海水、沈殿物、コメ、乾燥肉、牛乳または蜂蜜においても検出されることがある。バチルスメガテリウムはシュードモナス菌[pseudomonads]およびアクチノミセス菌[actinomyces]を伴うことが多い。バチルスメガテリウムはその近い関係にあるバチルススブチリス菌[Bacillus subtilis]と同様グラム陽性菌であり、なかでも2×5 μmというその相対的に目立ったサイズ（これによりその名前が付けられている）、約38%というG+C含有量、および非常に際だった胞子形成能力を特徴としている。増殖培地に極僅かでもマンガンがあればこの種が完全なる胞子形成を行うのには十分であり、これは一部の好熱性バチルス菌の胞子形成効率とのみ匹敵する能力である。そのサイズおよびその非常に効率的な胞子形成と発生がために、バチルスメガテリウムにおけるこれらのプロセスの分子的基礎に関して広範な研究が行われ、その胞子形成と発生に関係している150超個のバチルスメガテリウム遺伝子が今までに報告されている。バチルスメガテリウムについての生理学的な研究 (Priest, F.G. et al., 1988, A Numerical Classification of the Genus Bacillus, J. Gen. Microbiol. 134, 1847-1882）によりこの種は、ウレアーゼ陽性およびフォゲス‐プロスカウアー陰性であり、硝酸を還元することができない偏性好気性、胞子形成性の細菌として分類された。バチルスメガテリウムの最も際だった特性のうちの１つは、多くの炭素源を利用することができるという能力である。つまりバチルスメガテリウムは非常に数多くの糖類を消費し、例えばコーンシロップ、食肉産業からの廃棄物、さらには石油化学産業の廃棄物の中にでも見られる。極めて広い範囲の炭素源を代謝できるというこの能力に関して、バチルスメガテリウムは制限なしにシュードモナス菌と同じとみなすことができる（Vary, P.S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium）。
【０００４】
広範な種類の酵素やビタミンなどの工業的生産にバチルスメガテリウムを広く用いることの利点は多数ある。これらには、先ず第１にまた当然に、バチルスメガテリウムの中に形質導入されるプラスミドが非常に安定しているということが分かっているその状況が挙げられる。このことは、この種が、例えばポリエチレングリコール処理により形質転換されるという今や確立されている可能性と直接関連づけて見なければならない。数年前までは、これは、バチルスメガテリウムを生産菌株として用いるということに対してはまだ大きな障害であった。比較的よく発達した遺伝学からの利益もこれと並行して考慮されなければならず、バチルス属のなかではバチルススブチリスによってのみ越されている。第２には、バチルスメガテリウムはアルカリ性プロテアーゼをもっていないので、異種タンパク質の生産の低下がこれまでにほとんど観察されていないということである。さらに、バチルスメガテリウムは、例えばα-およびβ-アミラーゼの生産で用いられているように、商業的に価値のある生成物を効率よく分泌することが知られている。加えて、バチルスメガテリウムのサイズは、過度の生息密度による死滅に至らしめられる前に大きなバイオマスを蓄積することが可能である。バチルスメガテリウムを用いた工業生産における非常に重要なさらなる好都合な状況は、この種は、廃棄物材料や低品質材料から高価値で非常に高品質の生成物を調製することができるという事実である。非常に広範な種類の基質を代謝するというこの可能性は、バチルスメガテリウムを、シアン化合物、除草剤および持続性殺虫剤でも分解できる土壌無害化剤として用いられているということにも反映されている。最後に、バチルスメガテリウムは完全に非毒性(apathogenic)であり全く毒素を産生しないという事実は、特に食品および化粧品の製造においては非常に重要なことである。これらの多くの利点のために、バチルスメガテリウムはすでに多数の工業用途例えばα-およびβ-アミラーゼの製造、ペニシリンアミダーゼの製造、有害廃棄物の処理、あるいは好気的なビタミンB12生産に用いられている（Vary, P.S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium にまとめられている）。
【０００５】
バチルスメガテリウムの使用は、それが、工業的価値のある各種生成物の生物工学的な生産における使用に対して多くの利点を有しているので大きな経済的関心事である。しかしながら好気性微生物の大規模工業醗酵においては問題が恒常的に発生し、特に細菌培養液への効率的な酸素供給に関して問題が発生し、これは生成物収率の相当なロスを伴うものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的はバチルスメガテリウムを用いたビタミンB12調製の最適化である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、醗酵を嫌気性条件下で行う、バチルスメガテリウム含有培養液を用いたビタミンB12の調製方法によりこの目的が達成されることを見いだした。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
基本的には本発明の目的のためにはビタミンB12生産菌株として好適なすべての通常のバチルスメガテリウム菌株を用いることができる。ビタミンB12生産菌株とは、本発明の目的のためには、古典的手法および／または分子遺伝学的手法により、代謝フラックスがビタミンB12またはその誘導体の生合成の方向に増大されている（代謝工学）バチルスメガテリウム菌株または同族微生物を意味する。例えば、これらの生産菌株中では、極めて重要であり相応して複雑な調節を受けることになる代謝経路（ボトルネック）における鍵となる場所に位置する１つ以上の遺伝子および／またはその対応する酵素において、その調節が改変されているかあるいはそれが調節解除されている。この関連において本発明には、これまでに知られているすべてのビタミンB12生産菌株、好ましくはバチルス属の菌または同族生物の菌株が含まれる。本発明で有利である菌株としては、特にバチルスメガテリウムの菌株DSMZ 32、DSMZ 509およびDSMZ 2894が挙げられる。
【０００９】
本発明により、バチルスメガテリウムは嫌気的に棲息することができ、さらにビタミンB12生産はこれらの条件下のほうが、好気性条件下よりも高いことを示すことができた。好気性増殖条件下と嫌気性増殖条件下におけるバチルスメガテリウムによるビタミンB12生成の比較により、嫌気性ビタミンB12生成は調べたすべての菌株において好気性ビタミンB12生成と比較して少なくとも3〜4倍増大していることが明確に示された。増殖条件、培養培地の組成、および用いる細菌株の全体的な最適化によりさらなる増加を達成することができる。
【００１０】
本発明ではバチルスメガテリウムを用いたビタミンB12の調製を例えば培養培地に少なくともコバルトを加えることにより増大させることができる。例えば、ベタイン、メチオニン、グルタメート、ジメチルベンズイミダゾールまたはコリンあるいはこれらの組み合せの添加もまた本発明の方法を用いたビタミンB12生成に対して有利な効果を与える。上記の化合物単独またはそれらの組み合せとコバルトとの組み合せも有利である可能性がある。
【００１１】
従って本発明はまた、培養培地に少なくともコバルトを添加することを特徴とする方法にも関する。すなわち、コバルトを、例えば単独で、あるいは少なくともベタイン、メチオニン、グルタメート、ジメチルベンズイミダゾールもしくはコリンまたは最後に記載した化合物の組み合せとの組み合せで加えることができる。本発明の１つの実施形態では、ビタミンB12の含有量を、培養培地1リットル当りコバルトを約200〜750 μm、好ましくは250〜500 μm加えることで増大させることができる。
【００１２】
本発明の別の実施形態には、バチルスメガテリウムが最初は好気的にそのあと嫌気的に醗酵させられる上記したタイプの方法が含まれる。有利な実施形態では、好気性醗酵から嫌気性醗酵への変換が好気性醗酵細胞の指数増殖期に行なわれる。この関連においては好気性醗酵から嫌気性醗酵への変換を、好気性増殖細胞の指数増殖期の中央でまたは終わりで、好ましくは終わりで行うのが有利である。
【００１３】
この関連において本発明では、好気性から嫌気性醗酵への変換を好気性培養液がその最高光学密度、または少なくとも約2〜3の光学密度に達した時点で行う方法が好ましい。
【００１４】
嫌気性条件とは、本発明の１段階法および２段階法のいずれにおいても、本発明の目的のためには、細菌を好気性培養のあと嫌気性ボトルの中に移し、そこで醗酵させる場合に生じるような条件を意味する。嫌気性ボトルに移す時期は、特に２段階法の場合、好気的に培養された細菌細胞が指数増殖期に入る時点で行う。これは、嫌気性ボトルの中に移された後、細菌がその中に存在している酸素を消費し、新たな酸素は供給されないことを意味する。これらの条件は半嫌気性ともいえる。似たような方法は一般の実験室で日常行われていることであり、当業者には知られている。
【００１５】
細菌を醗酵機の中で最初に好気的に培養し、そのあと酸素の供給を次第に減らして半嫌気性条件が最終的にできあがる場合も同様な条件が達成される。
【００１６】
本発明の特別の実施形態では、例えば培養培地に還元剤を加えることにより厳格な嫌気性条件をつくることもできる。
【００１７】
細菌を好気的に培養すること（予備培養）は、（半嫌気性であれ厳格な嫌気性であれ）嫌気性条件下における本発明の醗酵には通常必ずしも必要ではない。これは、細菌を嫌気性条件下で培養し、そのあとさらに半嫌気性または厳格な嫌気性条件下で醗酵させることもできることを意味する。接種物を直接維持菌株から採取し、嫌気性条件下でのビタミンB12の調製に用いることも考えられる。
【００１８】
本発明の１つの実施形態では、醗酵をコバルト約250 μmを添加して好気性条件下で行い；嫌気性条件下ではコバルト約500 μmを添加するのが有利である。
【００１９】
また本発明には、古典的な変異誘発または標的分子生物学的手法および適切なセレクション方法によりつくることができる遺伝子改変細菌株も含まれる。標的遺伝子組み替えのための開始点は特にビタミンB12を生じる生合成経路が分岐する点で、これにより代謝フラックスを最大ビタミンB12生成の方向に意図的に誘導することができる。代謝フラックスの調節に関与する遺伝子の標的改変には、構造遺伝子の上流および下流にある調節領域の調査と改変、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位などの最適化および／または交換が含まれる。本発明にはまたDNA、mRNAの安定性またはそれらがコードするタンパク質の安定性を、例えばヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる分解を減らすまたは防ぐことにより改善することも含まれる。
【００２０】
本発明は、ビタミンB12の生合成に関与する酵素をコードする対応するヌクレオチド配列に関する。本発明は、特に、配列番号 1に示されるヌクレオチド配列またはその対立遺伝子を有するバチルスメガテリウム由来のhemAXCDBLオペロンに組込まれた、ウロポルフィリノーゲンIIIの生合成に関与する酵素をコードする単離されたヌクレオチド配列にも関する。また本発明では、バチルスメガテリウム由来のhemAXCDBLオペロンによりコードされ、配列番号 2〜6に示されるアミノ酸配列を有する酵素、およびそれのイソ酵素（アイソフォーム）または改変形も含まれる。
【００２１】
アイソフォームとは、同じまたは似たような基質特異性および作用特異性を有するが異なる一次構造を有する酵素を意味する。
【００２２】
改変形とは本発明では、例えばポリペプチドのN末端および／またはC末端でまたは保存アミノ酸の領域で配列の改変が存在するが、酵素の機能は損なわれていない酵素を意味する。これらの改変は、それ自体公知の方法によりアミノ酸交換の形で行うことができる。
【００２３】
本発明の特定の実施形態には、活性が例えばアミノ酸交換によりそれぞれの元のタンパク質と比較して弱められているまたは強められている本発明のポリペプチドの変形体が含まれる。同じことが、例えばプロテアーゼによる分解に対して感受性が大きくなっているまたは小さくなっている細胞における本発明の酵素の安定性についても当てはまる。
【００２４】
単離された核酸または単離された核酸断片とは本発明では、一本鎖または二本鎖であってもよい、場合によっては天然の、化学合成された、改変された、または人工のヌクレオチドを含んでいてもよいRNAまたはDNAのポリマーを意味する。
【００２５】
対立遺伝子とは本発明では、機能的に同等なヌクレオチド配列、すなわち実質的に同じ作用をもつものを意味する。機能的に同等な配列は、ヌクレオチド配列が異なっていても、例えば遺伝子コードの縮退によりなお所望の機能を有している配列である。従って機能同等体には、本明細書で記載した配列の天然に生じる変異体、ならびに例えば化学合成により得られたおよび適当な場合は宿主生物のコドン使用に適合させた人工ヌクレオチド配列が含まれる。機能同等配列には、酵素に例えば阻害因子に対する非感受性または耐性を付与する改変ヌクレオチド配列を有しているものも含まれる。
【００２６】
機能同等体は特に、所望の機能を示し続ける最初に単離された配列の天然または人工の変異体も意味する。（突然）変異は、１つ以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、転位または挿入からなる。これらには、タンパク質レベルにおいて例えば保存アミノ酸の交換に至ることがあるがタンパク質の活性の基本的な変化には至らない従って機能的に中性であるいわゆるセンス突然変異[sense mutation]が含まれる。しかしながらこれにはまた、タンパク質の機能をほとんど損傷することなくタンパク質のN末端またはC末端にタンパク質レベルで影響を及ぼすヌクレオチド配列における変化も含まれる。これらの変化は実際タンパク質構造に対して安定化作用を発揮する場合がある。
【００２７】
本発明はまた例えばヌクレオチド配列を改変して対応する誘導体を生じさせることにより得られるヌクレオチド配列も包含する。そのような改変の目的は、例えばそこに存在しているコーディング配列のさらなる局在化、あるいは例えばさらなる制限酵素の切断部位の挿入でありうる。機能が元の遺伝子または遺伝子断片と比較して弱められているまたは強められている変異体もまた機能同等体である。
【００２８】
本発明はさらに、人工DNA配列が上記したように所望の特性を付与する限りにおいてそれらの人工DNA配列にも関する。そのような人工DNA配列は、例えばコンピューターを利用したプログラム（分子モデリング）により作成されたタンパク質を逆翻訳することによりあるいはインビトロでセレクションを行うことにより見出すことができる。宿主生物に特異的なコドン使用に基づいたポリペプチド配列の逆翻訳により得られるコーディングDNA配列は特に適している。特異的コドン使用は、形質転換される予定の生物の他の既知の遺伝子のコンピューター解析による分子遺伝学的手法に通じている当業者なら容易に見つけることができる。
【００２９】
相同配列とは本発明では、本発明のヌクレオチド配列に相補的であるものおよび／または後者とハイブリッド形成するものを意味する。ハイブリッド形成配列という用語には本発明では、それ自体公知である緊縮条件下で既に記載したヌクレオチド配列と特異的相互作用をする（結合する）DNAまたはRNAのグループからの実質的に同様なヌクレオチド配列が含まれる。これらにはまた長さが例えばヌクレオチド10〜30個、好ましくはヌクレオチド12〜15個を有する短いヌクレオチド配列も含まれる。これにはまた本発明では特にいわゆるプライマーまたはプローブが含まれる。
【００３０】
本発明にはまたコーディング領域（構造遺伝子）に先行する（5-または上流）および／またはそれに続く（3’または下流）配列領域が含まれる。これらの配列領域には特に調節機能を有するものが含まれる。そららは転写、RNAの安定性またはRNAのプロセシング、および翻訳に影響を及ぼすことがある。調節配列の例は、なかでもプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーターまたは翻訳エンハンサーである。
【００３１】
本発明にはさらに、上記したタイプの単離されたヌクレオチド配列またはその一部、およびそれに動作可能に連結された調節機能を有するヌクレオチド配列を含む遺伝子構造が含まれる。
【００３２】
動作可能連結とは、例えばプロモーター、コーディング配列、ターミネーターおよび適切な場合はさらなる調節エレメントがコーディング配列の発現においてそれぞれの調節エレメントがその固有の機能を実行することができるような連鎖配列を意味する。これらの調節ヌクレオチド配列は天然起源のものであってもよいし、あるいは化学合成により得ることもできる。好適なプロモーターは基本的には適切な宿主生物において遺伝子発現を調節することができるプロモーターであればどのようなものであってもよい。本発明によるこれに対する１つの可能性はまた、宿主細胞の中にある特定の時間さらした場合に遺伝子の発現を調節することができる化学的誘導性プロモーターである。例としてβガラクトシダーゼシステムまたはアラビノースシステムを挙げることができる。
【００３３】
好適なプロモーターと少なくとも１個の本発明のヌクレオチド配列を、例えばSambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに書かれている組み換えとクローニングの通常の手法により融合することで遺伝子構造はつくられる。
【００３４】
DNA断片を１つに結合させるためには断片にアダプターまたはリンカーを付けることができる。
【００３５】
本発明はまた、上記したタイプの単離ヌクレオチド配列もしくはその一部または上記した遺伝子構造、および、セレクション、宿主細胞における複製、および／または宿主細胞ゲノム中への組み込みのためのさらなるヌクレオチド配列を含むベクターも包含する。多数のそのようなさらなる配列の例は文献に記載されており、ここではこれ以上触れない。
【００３６】
バチルスメガテリウムにおいて記載した遺伝子を形質転換および過剰発現させるのに好適なシステムは、例えばプラスミドpWH1510およびpWH1520、ならびにプラスミドなしの過剰発現菌株バチルスメガテリウムWH320であり、これらはRygus, T. et al.（1991, Inducible High-Level Expression of heterologous Genes in Bacillus megaterium using the Regulatory Elements of the Xylose-Utilization Operon, Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599） により報告されている。プラスミドはまた市販もされている（Q biogensおよびMoBiTec）。しかしながら、記載したシステムは本発明を限定するものではない。
【００３７】
本発明はまた、hemAXCDBLオペロンまたはその一部が増強された発現を示すバチルスメガテリウム菌株の醗酵を特徴とする方法にも関する。
【００３８】
本発明の１つの実施形態には、hemAXCDBLオペロンまたはその一部が細胞中において遺伝子改変されていないバチルスと比較して増加したコピー数で存在している遺伝子工学的に改変されたバチルスメガテリウムの醗酵が行なわれる方法も含まれる。コピーの数は2〜数百の間で変わりうる。
【００３９】
増大した遺伝子発現（過剰発現）は、適切な遺伝子のコピー数を増やすことで達成することができる。さらなる１つの可能性は、構造遺伝子の上流に位置するプロモーター領域および／または調節領域および／またはリボソーム結合部位を適当に、発現が増大した量で起るように改変することである。構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットは同じように作用する。さらに、誘導性プロモーターによってビタミンB12生成中における発現を増大させることも可能である。
【００４０】
mRNAの寿命を長くする方法によっても発現は同様に増大する。遺伝子または遺伝子構築物をプラスミド中に様々なコピー数で存在させるか、および／またはそれらを染色体中に組み込むか、および／または増幅させることもできる。
【００４１】
さらなる１つの可能性はまた、酵素自体の活性を、酵素タンパク質の分解を防止することによって増大または増強させることである。
【００４２】
関係する遺伝子の過剰発現を達成するさらなる考えられうる別の方法は、培地の組成を改変し、培養を管理することである。
【００４３】
本発明はさらに、hemAXCDBLオペロンまたはその一部のヌクレオチド配列が増強された発現および／または増加したコピー数を示す、上記したタイプのビタミンB12の生産方法で使用される形質転換されたバチルスメガテリウム菌株に関する。
【００４４】
また本発明には、複製型において上記したタイプの遺伝子構造またはベクターを含む形質転換されたバチルスメガテリウム菌株も含まれる。
【００４５】
本発明はさらに、上記したタイプの形質転換バチルスメガテリウム菌株を生産するための、hemAXCDBLオペロンもしくはその一部の単離されたヌクレオチド配列、または上記したタイプの遺伝子構造もしくはベクターの使用にも関する。本発明はまたビタミンB12を生産するための上記したタイプの形質転換バチルスメガテリウム菌株の使用も含む。
【実施例】
【００４６】
以下の例示的な実施形態は本発明を説明するためのものである。しかしながら、それらは本発明を限定するためのものではない。
【００４７】
1. 化学物質および分子生物学試薬
DNA単離用キット                Qiagen
Fast-Link連結キット            Biozym
分子生物学的酵素          Amersham-Pharmacia, NEN-LifeScience
増殖培地                  Difco
2. 細菌株およびプラスミド
この研究で用いた細菌株およびプラスミドのすべてを表１および２に掲載する。
【００４８】
3. 緩衝液および溶液
3.1. 最小培地
E. coli(大腸菌)最小培地
K2HPO4        60.3 mM
KH2PO4        33.1 mM
(NH4)2SO4      7.6 mM
クエン酸ナトリウム    1.7 mM
MgSO4         1.0 mM
D-グルコース         10.1 mM
チアミン      3.0 μM
カザミノ酸          0.025 % (w/v)
固体培地にはカンテン15 g/Lを加えた。
【００４９】
Mopso最小培地
Mopso  (pH 7.0)    50.0 mM
Tricine    (pH 7.0) 5.0 mM
MgCl2      520.0 μM
K2SO4      276.0 μM
FeSO4       50.0 μM
CaCl2        1.0 mM
MnCl2      100.0 μM
NaCl        50.0 mM
KCl         10.0 mM
K2HPO4        1.3 mM
(NH4)6Mo7O24  30.0 pM
H3BO3         4.0 nM
CoCl2       300.0 pM
CuSO4       100.0 pM
ZnSO4       100.0 pM
D-グルコース      20.2 mM
NH4Cl        37.4 mM
滴定試薬はKOH溶液であった。
【００５０】
S. typhimurium最小培地
NaCl      8.6 mM
Na2HPO4   33.7 mM
KH2PO4    22.0 mM
NH4Cl    18.7 mM
D-グルコース      20.2 mM
MgSO4     2.0 mM
CaCl2     0.1 mM
固体培地にはカンテン15 g/Lを加えた。
【００５１】
3.2. バチルスメガテリウムのプロトプラスト形質転換用溶液
SMMP緩衝液
Antibiotic Medium No. 3 (Difco)  17.5 g/L
スクロース              500.0 mM
マレイン酸Na (pH 6.5)    20.0 mM
MgCl2    20.0 mM
滴定試薬はNaOH溶液であった。
【００５２】
PEG-P溶液
PEG 6000        4 0.0 % (w/v)
スクロース      500.0 mM
マレイン酸Na (pH 6.5)    20.0 mM
MgCl2    20.0 mM
滴定試薬はNaOH溶液であった。
【００５３】
cR5上部カンテン
スクロース      300.0 mM
Mops (pH 7.3)    31.1 mM
NaOH    15.0 mM
L-プロリン       52.1 mM
D-グルコース     50.5 mM
K2SO4       1.3 mM
MgCl2 x 6 H2O    45.3 mM
KH2PO4    313.0 μM
CaCl2      13.8 mM
カンテン        4.0 g/L
カザミノ酸      0.2 g/L
酵母エキス    10.0 g/L
滴定試薬はNaOH溶液であった。
【００５４】
4. 培地および培地への添加物
4.1. 培地
特に断らない限り、Sambrook, J. et al. (1989, in Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）に書かれているLuria-Bertaniブロス（LB）完全培地を用いた。
【００５５】
4.2. 添加物
炭素源、アミノ酸または抗生物質などの添加物は、培地に加えて一緒にオートクレーブ処理するかまたは水中の濃縮ストック溶液として作製し、適切ならば濾過により滅菌した。各物質は、オートクレーブ処理し、50℃未満に冷却しておいた培地に加えた。テトラサイクリンのような光に対して感受性のある物質に関しては、暗所でインキュベートするように注意した。通常用いた最終濃度は以下のとおりであった：
アンピシリン       296 μM
テトラサイクリン    21 μM
ALA      298 μM
Heme     153 μM
X-Gal     98 μM
メチオニン    335 μM
システイン    285 μM
硝酸ナトリウム          10 mM
亜硝酸ナトリウム        10 mM
フマル酸二ナトリウム    10 mM
グルコース    10 mM
塩化アンモニウム        37 mM
キシロース    33 mM
リソザイム    10 μg/mL
カザミノ酸          0.025 % (w/v)
5. 微生物学的手法
5.1. 滅菌
特に断らない限り、すべての培地および緩衝液は120℃およびゲージ圧1バールで20分間スチーム滅菌した。熱的に影響を受け易い物質は濾過により滅菌し、ガラス器具は180℃で少なくとも3時間熱滅菌した。
【００５６】
5.2. 共通の増殖条件
好気性細菌培養液はバッフル付フラスコ中で37℃、最低180rpmでインキュベートした。インキュベーション時間はその細菌培養液の所望の光学密度に応じて変えた。
【００５７】
5.3. バチルスメガテリウムの増殖用条件
好気性培養液の考えられうる最高の空気混和のためにはバッフル付フラスコ中250rpmで、特に断らない限り30℃でインキュベートした。嫌気性培養液は小さな嫌気性ボトル中容量100 mLで30℃100rpmで培養した。いずれの場合も、一定品質の培地を用いること、一晩培養液から1:100の比で接種すること、その一晩培養に同じ条件を用いることに注意した。
【００５８】
5.4. 細胞密度の決定
細菌培養液の細胞密度は578 nmで光学密度（OD）を測定することにより決定し、OD578の１は1×109個の細胞の細胞数に相当すると仮定した。
【００５９】
5.5. 比較増殖試験
各種バチルスメガテリウム菌株の好気的および嫌気的増殖挙動の比較試験を行った。それらを図１、２および３に示す。用いた菌株は、好気性条件下でのビタミンB12生成に好適である菌株バチルスメガテリウム DSMZ 32（野生型）または「生産菌株」DSMZ 509およびDSMZ 2894である。しかしながら、本発明はこれらの菌株の使用に限定されるものではない。ビタミンB12を調製するのに好適である他の菌株もまた考えられ、例えば古典的変異誘発法または特定の分子生物学的手法および適切なセレクション方法により生産することができる遺伝子改変細菌株が挙げられる。
【００６０】
バチルスメガテリウムが嫌気的にどの程度増殖することができるかに関する試験において、培養培地に好気性電子受容体である酸素の代わりに別の電子受容体である硝酸塩、亜硝酸塩およびフマル酸塩を加えた（図４〜６）。バチルスメガテリウムがこれらの電子受容体を加えていない培地中でも醗酵することができるかどうかについても並行試験を行った。
【００６１】
この関連において本発明の結果から、電子受容体である亜硝酸塩が細菌の増殖に対して有毒作用を及ぼすことが明らかである。フマル酸塩もまた増殖を阻害するように作用する。加えられた見込みのあった電子受容体はすべて、発酵性増殖の程度を越えて嫌気性増殖を刺激することはできない。
【００６２】
5.6. ビタミンB12生成の比較試験
バチルスメガテリウムについての好気性および嫌気性増殖条件下でのビタミンB12生成の解析も行った。本発明で用いた例は、グルコース含有（完全LB）培地中嫌気性条件下での菌株バチルスメガテリウムDSMZ 32、DSMZ 509およびDSMZ 2894であり、ピコモル/OD578で表わしたビタミンB12含有量を指数増殖期の終わりに測定した。これと並行して、好気的に棲息している間のビタミンB12生成を指数増殖期の中央で調べた。結果を図７に示す。
【００６３】
5.7. ビタミンB12生成に対する5-アミノレブリン酸 (ALA) の影響
ビタミンB12を合成するためのテトラピロール生合成経路における中央調節点は5-アミノレブリン酸 (ALA)の生成であるので、本発明のバチルスメガテリウムにおけるビタミンB12生成に対するALAの影響を調べた。ALAの外的添加ありおよびなしのバチルスメガテリウムによる好気性ビタミンB12生成を図８に示す。これには約50 μg/mLのALA濃度の培養培地を用いた。
【００６４】
本発明では、ALAの添加は、本細菌の好気性発酵および嫌気性発酵の両方でビタミンB12生成に対して影響がないことを示すことができた。これに基づくと、ビタミンB12の生合成の調節はALAの生成だけに制限されるわけではないように思われる。
【００６５】
5.8. 定量的ビタミンB12分析
指数増殖期の中央で好気性バチルスメガテリウム培養液を採取し、指数増殖期の終わりで、5 000 rpm15分間の遠心分離（Centrifuge 5403, Eppendorf）によるOD578の決定の後に嫌気性培養液を採取した。生理食塩水40 mLで洗ったあと再度5000 rpmで15分間遠心分離（Centrifuge 5403, Eppendorf）した。得られた細胞沈殿物を最終的に凍結乾燥した。S. typhimurium metE cysG二重変異体（Raux, E. et al., 1996, J. Bacteriol., 178: 753-767）をメチオニンおよびシステイン含有最小培地で一晩37℃でインキュベートし、プレートから掻き落とし、等張性生理食塩水40 mLで洗った。遠心分離のあと、細胞沈殿物を等張性生理食塩水中に再懸濁させた。洗った細菌培養液を慎重に47〜48℃のシステイン-含有最小培地カンテン400 mLと混ぜた。滅菌脱イオン水中に再懸濁させ、水浴中で15分間沸騰させたバチルスメガテリウムサンプル10 μLを冷却したプレート上に載せ、37℃で18時間インキュベートした。成長するSalmonellaコロニーの直径は施与したバチルスメガテリウムサンプル中のビタミンB12含有量に比例する。調べたサンプル中のビタミンB12含有量は、ビタミンB12 0.01、0.1、1、10および40ピコモルを加えることにより作成した検量線プロットと比較することにより推定した。この標準的な方法によって、生物材料中におけるビタミンB12の僅かな量を迅速にかつ非常に再現性よく検出することが可能となる。
【００６６】
6. 分子生物学手法
DNAの調製、DNAの制限、連結、PCR、シークエンシング、機能的補完、タンパク質発現などの一般的な手法は通常の実験室実務の一部を形成するものであり、Sambrook, J. et al. (1989, in Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）に書かれている。
【００６７】
6.1. バチルスメガテリウムのプロトプラスト形質転換
プロトプラストの調製：
LB培地50 mLにバチルスメガテリウムの一晩培養液1 mLを接種し、37℃でインキュベートした。OD578が1で、細胞を15 000 rpm4℃で15分間遠心分離（RC 5B Plus, Sorvall）し、SMMP緩衝液5 mL中に再懸濁させた。SMMP緩衝液中のリソザイムを加えたあと、懸濁液を37℃で60分間インキュベートし、顕微鏡下でプロトプラスト形成をチェックした。細胞を室温3 000 rpmでの遠心分離（Centrifuge 5403, Eppendorf）により回収した後、細胞沈殿物を慎重にSMMP緩衝液5 mL中に再懸濁させ、２回目の遠心分離工程および洗浄工程を行った。そうして、10% (w/v)グリセロールを加えたあとプロトプラスト懸濁液を分割部分に分け、それらを-80℃で凍結させることができた。
【００６８】
形質転換：
プロトプラスト懸濁液500 μLをSMMP緩衝液中のDNA0.5〜1 μgと混ぜ、PEG-P溶液1.5 mLを加えた。室温で2分間インキュベートしたあと、SMMP緩衝液5 mLを加え、慎重に混合した後、懸濁液を室温3 000 rpmで10分間遠心分離（Centrifuge 5403, Eppendorf）した。そのあと直ちに、上澄み液を取り除き、僅かに見える沈殿物をSMMP緩衝液500 μL中に再懸濁させた。懸濁液を37℃で優しく振盪しながら90分間インキュベートした。次に形質転換細胞50〜200 μLをcR5上部カンテン2.5 mLと混ぜ、セレクションに好適な抗生物質を含有するLB-カンテンプレート上に載せた。37℃で２日間インキュベートした後形質転換コロニーが目に見えた。
【００６９】
6.2. バチルスメガテリウムのhemAXCDBLオペロンの同定とシークエンシング
hemAXCDBLオペロンをクローニングするのに選んだ方法は、ヘム-栄養素要求性E. coli変異株の機能的相補の方法であった。この目的のために、バチルスメガテリウム遺伝子ライブラリーを通常の方法により作製した。E. coli hemB変異体RP523とこのゲノムバチルスメガテリウムプラスミド遺伝子ライブラリーとの機能的相補により、再び完全テトラピロール生合成をすることができる、すなわち表現型がヘム-原栄養野生型となったコロニーを単離することができた。プラスミドDNA調製および、ベクター所在バチルスメガテリウムDNAのDNAシークエンシングのあと、求めるhemAXCDBLオペロンをコードするサイズ3855 kbの挿入物を同定することができた。対応するヌクレオチド配列を配列番号 1に掲載し、そこから導かれるアミノ酸配列を配列番号 2〜6に示す。
【００７０】
機能的相補により得られたDNA断片の上流および下流にある配列はSigma GenosisのVectorette TMシステムを用いて得た。StrategeneのTurbo Pfu DNAポリメラーゼは、その校正機能により非常に低いエラー率を示す。
【００７１】
6.3. 形質転換システムおよび発現システム
バチルスメガテリウムにおける遺伝子の形質転換と過剰発現に好適なプラスミドはpWH1510およびpWH1520ならびにプラスミドなしの過剰発現菌株バチルスメガテリウムWH320である（Rygus, T. et al., 1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. およびBiotechnol., 35, 5: 594-599）。
【００７２】
コントロールプラスミドpWH1510は分断されたxylAリーディングフレーム中にspoVG-lacZ融合体を有している。SpoVG-lacZとはこの場合B. subtilis胞子形成タンパク質（spoVG）の非常に強力なリボソーム結合配列と、β-ガラクトシダーゼ (lacZ)をコードするE. coli遺伝子の融合体を意味する。このプラスミドは従ってバチルスメガテリウムにおける形質転換効率および過剰発現条件を調べるのに極めて好適である。
【００７３】
プラスミドpWH1520は、実際のクローニングおよび発現ベクターとして機能する。２つのベクターのいずれもテトラサイクリン耐性およびアンピシリン耐性をもち、E. coliおよびBacillus sppにおける複製にとって重要なエレメントである。つまりそれらは、E. coliにおいてプラスミドpBR322の誘導体に対して確立されているすべての手法に従順に合う。２つのベクターはいずれもその調節配列と一緒にxylオペロンのバチルスメガテリウム xylAおよびxylR遺伝子を含有する（Rygus, T. et al., 1991, Molecular Cloning, Structure; Promoters and Regulatory Elements for Transcription of the Bacillus megaterium Encoded Regulon for Xylose Utilization, Arch. Microbiol. 155, 535-542）。xylAはキシロースソメラーゼをコードし、xylRは、xylAに強力な転写調節を働きかける調節タンパク質をコードする。xylAはキシロースの不存在下では抑制される。キシロースを加えるとxylAの抑制解除により凡そ200倍の誘導が起る。xylAリーディングフレーム中のポリリンカーが遺伝子を、その時同様にXylRの強力な転写調節の下にあるxylAと融合することを可能とする。さらに、xylAリーディングフレームはポリリンカーの上流においてまだ完全に無傷であるので、転写融合を生成させるかまたは翻訳融合を生成させるかという選択肢の間で選択が可能である。
【００７４】
図表について
表１および２に示す細菌株およびプラスミドを用いた。
【００７５】
表１：用いた細菌株
【表１】
2005500852.tif 000002
【００７６】
表２：用いたプラスミド
【表２】
2005500852.tif 000003
【００７７】
本発明をさらに以下の図により説明する。
【００７８】
図１は、30℃での好気性および嫌気性条件下におけるバチルスメガテリウム DSMZ32（野生型）の増殖の比較を示す。嫌気性増殖は硝酸塩10 mM（白抜き菱形）、亜硝酸塩10 mM（白抜き三角）およびフマル酸塩10 mM（×印）を添加して測定した。発酵性増殖（白抜き円）および好気性増殖（黒抜き菱形）をLB培地中で添加なしで行った。サンプルは記載された時間に採取し、578 nmにおける光学密度を測定した。
【００７９】
図２は、30℃での好気性および嫌気性条件下におけるバチルスメガテリウム DSM509の増殖の比較を示す。嫌気性増殖は硝酸塩10 mM（白抜き菱形）、亜硝酸塩10 mM（白抜き三角）およびフマル酸塩10 mM（×印）を添加して測定した。発酵性増殖（白抜き円）および好気性増殖（黒抜き菱形）はLB培地中で添加なしで行った。サンプルは記載された時間に採取し、578 nmにおける光学密度を測定した。
【００８０】
図３は、30℃での好気性および嫌気性条件下におけるバチルスメガテリウム DSM2894の増殖の比較を示す。嫌気性増殖は硝酸塩10 mM（白抜き菱形）、亜硝酸塩10 mM（白抜き三角）およびフマル酸塩10 mM（×印）を添加して測定した。発酵性増殖（白抜き円）および好気性増殖（黒抜き菱形）はLB培地中で添加なしで行った。サンプルは記載された時間に採取し、578 nmにおける光学密度を測定した。
【００８１】
図４は、硝酸塩10 mM（菱形）、亜硝酸塩10 mM（三角）およびフマル酸塩10 mM（×印）を添加した30℃におけるバチルスメガテリウム DSM32（野生型）の嫌気性増殖を示す。発酵性増殖（円）はLB培地中で添加なしで行った。サンプルは記載された時間に採取し、578 nmにおける光学密度を測定した。
【００８２】
図５は、硝酸塩10 mM（菱形）、亜硝酸塩10 mM（三角）およびフマル酸塩10 mM（×印）を添加した30℃におけるバチルスメガテリウム DSM509の嫌気性増殖を示す。発酵性増殖（円）はLB培地中で添加なしで行った。サンプルは記載された時間に採取し、578 nmにおける光学密度を測定した。
【００８３】
図６は、硝酸塩10 mM（菱形）、亜硝酸塩10 mM（三角）およびフマル酸塩10 mM（×印）を添加した30℃におけるバチルスメガテリウム DSM2894の嫌気性増殖を示す。発酵性増殖（円）はLB培地中で添加なしで行った。サンプルは記載された時間に採取し、578 nmにおける光学密度を測定した。
【００８４】
図７は、好気性および嫌気性増殖条件下におけるバチルスメガテリウムによるビタミンB12生成を示す。ピコモル/OD578の単位で測定したバイオマス中のビタミンB12含有量を、野生型菌株バチルスメガテリウム DSM32を好気的に増殖させたもの(1)および嫌気的に増殖させたもの(2)、バチルスメガテリウム DSM509を好気的に増殖させたもの(3)および嫌気的に増殖させたもの(4)、ならびにバチルスメガテリウム DSM2894を好気的に増殖させたもの(5)および嫌気的に増殖させたもの(6)について示してある。
【００８５】
図８は、ALA 50 μg/mLの外的添加ありおよびなしの場合のバチルスメガテリウムによる好気性ビタミンB12生成を示す。ピコモル/OD578の単位で測定したバイオマス当りのビタミンB12含有量を、野生型菌株バチルスメガテリウム DSM32のALA添加なし(1)、ALA添加あり(2)、バチルスメガテリウム DSM509のALA添加なし(3)、ALA添加あり(4)、ならびにバチルスメガテリウム DSM2894のALA添加なし(5)およびALA添加あり(6)について測定した。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１：30℃での好気性および嫌気性条件下におけるバチルスメガテリウム DSMZ32の増殖の比較を示す図である。
【図２】図２：30℃での好気性および嫌気性条件下におけるバチルスメガテリウム DSM509の増殖の比較を示す図である。
【図３】図３：30℃での好気性および嫌気性条件下におけるバチルスメガテリウム DSM2894の増殖の比較を示す図である。
【図４】図４：硝酸塩10 mM（菱形）、亜硝酸塩10 mM（三角）およびフマル酸塩10 mM（×印）を添加した30℃におけるバチルスメガテリウム DSM32（野生型）の嫌気性増殖を示す図である。
【図５】図５：硝酸塩10 mM（菱形）、亜硝酸塩10 mM（三角）およびフマル酸塩10 mM（×印）を添加した30℃におけるバチルスメガテリウム DSM509の嫌気性増殖を示す図である。
【図６】図６：硝酸塩10 mM（菱形）、亜硝酸塩10 mM（三角）およびフマル酸塩10 mM（×印）を添加した30℃におけるバチルスメガテリウム DSM2894の嫌気性増殖を示す図である。
【図７】図７：好気性および嫌気性増殖条件下におけるバチルスメガテリウムによるビタミンB12生成を示す図である。
【図８】図８：ALA 50 μg/mLの外的添加ありおよびなしの場合のバチルスメガテリウムによる好気性ビタミンB12生成を示す図である。
【図１】
2005500852.tif 000004
【図２】
2005500852.tif 000005
【図３】
2005500852.tif 000006
【図４】
2005500852.tif 000007
【図５】
2005500852.tif 000008
【図６】
2005500852.tif 000009
【図７】
2005500852.tif 000010
【図８】
2005500852.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2005500852.tif 000012
2005500852.tif 000013
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500852.tif 000070
【国際調査報告】
2005500852.tif 000071
2005500852.tif 000072
2005500852.tif 000073
2005500852.tif 000074
2005500852.tif 000075
2005500852.tif 000076