(57)【要約】本発明は、ヒドロキシピリジノン及びヒドロキシピリミジノン系のキレート剤を提供する。同様に、磁気共鳴画像法のコントラスト強調剤として有用である、これらの薬剤のGd(III)錯体をも提供する。本発明は、本発明に関する化合物の製造方法、並びに磁気共鳴画像法の適用における上記化合物の使用方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガドリニウム(III)イオンと該ガドリニウム(III)イオンに配位する酸素ドナー原子としてのみを含む有機配位子との錯体であって、該錯体を形成するガドリニウム・イオンが少なくとも約10×106 sec-1の水交換速度を有し、かつ、該錯体の水への溶解度が少なくとも約20 mMである上記錯体。
【請求項２】
前記錯体の水への溶解度が約50 mM〜約1 Mである、請求項１に記載の錯体。
【請求項３】
前記錯体の水への溶解度が約100 mM〜約300 mMである、請求項２に記載の錯体。
【請求項４】
前記水交換速度が約15×106 sec-1〜約1×109 sec-1である、請求項1に記載の錯体。
【請求項５】
前記配位子が少なくとも6個の酸素ドナー原子を含む、請求項1に記載の錯体。
【請求項６】
前記配位子が6〜9個の酸素ドナー原子を含む、請求項5に記載の錯体。
【請求項７】
いずれの酸素ドナー原子もカルボン酸基を構成しない、請求項1に記載の錯体。
【請求項８】
約5 mM-1s-1を超える水中での緩和度を有する、請求項1に記載の錯体。
【請求項９】
水中での緩和度が約5 mM-1s-1〜約15 mM-1s-1である、請求項1に記載の錯体。
【請求項１０】
前記錯体の水性溶液が18を超えるpMをもつ、請求項1に記載の錯体であって、該溶液が約pH7.4であり、かつ、約10 μMの前記配位子及び約1 μMの前記ガドリニウム(III)イオンを含む上記錯体。
【請求項１１】
請求項1に記載の錯体及び医薬として許容される担体を含む医薬製剤。
【請求項１２】
患者にコントラスト強調磁気共鳴画像法を実施する方法であって、
(i)該患者にコントラストを強調するのに十分な量の請求項1に記載の錯体を投与するステップ、及び
(ii)該患者から磁気共鳴画像データセットを収集するステップ、
を含む上記方法。
【請求項１３】
ガドリニウム(III)イオンと該ガドリニウム(III)イオンに配位する酸素ドナー原子のみを含む有機配位子との錯体の水性溶液であって、該水溶液が少なくとも約15を超えるpMをもち、約pH 7.4であり、そして約10 μMの上記配位子及び約1μMの上記ガドリニウム(III)イオンを含み、そして少なくとも約20 mMの水への溶解度をもつ前記水溶液。
【請求項１４】
ガドリニウム(III)イオンと、以下の式(Ｉ)：
【化１】
2005500387.tif 000043
｛式中、
R1、R2及びR3が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド、エステル及びアミノ基から独立に選択されるメンバーであり、ただしAが窒素ならば、R1はアミノ基以外であり、またEが窒素ならば、R3は存在しない;
R4が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換へテロアルキル、置換又は非置換アリール、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド及びエステル基から選択されるメンバーであり; そして
A、E及びZが、独立に炭素及び窒素から選択される。｝によって表される構造を含む有機配位子との錯体であって、少なくとも約15 mMの水への溶解度をもつ上記ガドリニウム錯体。
【請求項１５】
前記錯体の水への溶解度が約25 mM〜約500 mMである、請求項14に記載の錯体。
【請求項１６】
前記錯体の水への溶解度が約50 mM〜約300 mMである、請求項15に記載の錯体。
【請求項１７】
前記有機配位子が、酸素ドナー原子のみを介してガドリニウム(III)イオンと錯体を形成する、請求項14に記載の錯体。
【請求項１８】
R1、R2、R3及びR4の少なくとも1つが、アルコール、ポリオール、ポリエーテル、炭水化物、アミノ酸、2以上のアミノ酸を含むペプチド及びポリアミンから選択される、請求項14に記載の錯体。
【請求項１９】
R1、R2、R3及びR4の少なくとも1つが、ポリ(エチレングリコール)である、請求項18に記載の錯体。
【請求項２０】
R1、R2、R3及びR4の少なくとも1つが、デンドリマーである、請求項18に記載の錯体。
【請求項２１】
R1、R2、R3及びR4の1つが、前記ガドリニウム(III)イオンとさらに錯体を形成している第2有機配位子に結合した連結メンバーとの結合である、請求項14に記載の錯体。
【請求項２２】
前記第2有機配位子が、前記第1有機配位子と異なる構造をもつ、請求項21に記載の錯体。
【請求項２３】
前記第2有機配位子が、酸素ドナー原子のみを介してガドリニウム(III)イオンと錯体を形成する、請求項21に記載の錯体。
【請求項２４】
式(Ｉ)によって表される構造が、以下の：
【化２】
2005500387.tif 000044
｛式中、
R1及びR4が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド及びエステル基から独立に選択されるメンバーであり; そして
R2及びR3が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド、エステル及びアミノ基から独立に選択されるメンバーである。｝である、請求項14に記載の錯体。
【請求項２５】
R1、R2又はその組み合わせから選択されるメンバーが、置換又は非置換C1-C4アルキル基である、請求項24に記載の錯体。
【請求項２６】
R1、R2又はその組み合わせから選択されるメンバーが、メチル基である、請求項25に記載の錯体。
【請求項２７】
R1及びR2がメチルとHから独立に選択され；そしてR3及びR4がHである、請求項26に記載の錯体。
【請求項２８】
R1が置換又は非置換アリール基及び置換又は非置換(アルキル)アリール基から選択され、そしてR2が置換又は非置換C1-C4アルキル基である、請求項24に記載の錯体。
【請求項２９】
R2がメチル基である、請求項28に記載の錯体。
【請求項３０】
式(Ｉ)によって表される構造が、以下の：
【化３】
2005500387.tif 000045
｛式中、
R1及びR4が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド及びエステル基から独立に選択されるメンバーであり; そして
R2が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド、エステル及びアミノ基から選択されるメンバーである。｝である、請求項14に記載の錯体。
【請求項３１】
R1、R2及びR4が、H及び置換又は非置換C1-C4アルキル基から独立に選択されるメンバーである、請求項33に記載の錯体。
【請求項３２】
R1及びR2の少なくとも一方がメチル基である、請求項31に記載の錯体。
【請求項３３】
式(Ｉ)によって表される構造が、以下の：
【化４】
2005500387.tif 000046
である、請求項14に記載の錯体。
【請求項３４】
以下の式(II)：
【化５】
2005500387.tif 000047
｛式中、3つの環系の各々について、各R1、R2、R3及びR4；並びに各A、E及びZが、独立に選択される。｝によって表される構造をもつ、請求項14に記載の錯体。
【請求項３５】
式(II)によって表される構造が、以下の：
【化６】
2005500387.tif 000048
｛式中、
R1及びR4が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド及びエステル基から独立に選択されるメンバーであり;
R2及びR3が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド、エステル及びアミノ基から独立に選択されるメンバーであり; そして
pが、1〜3の整数である。｝である、請求項34に記載の錯体。
【請求項３６】
式(II)によって表される構造が、以下の：
【化７】
2005500387.tif 000049
｛式中、
R1及びR4が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド及びエステル基から独立に選択されるメンバーであり;
R2が、連結メンバーとの結合、H、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド、エステル及びアミノ基から独立に選択されるメンバーであり; そして
pが、1〜3の整数である。｝である、請求項34に記載の錯体。
【請求項３７】
式(II)によって表される構造が、以下の：
【化８】
2005500387.tif 000050
｛式中、qが、1又は2である。｝である、請求項34に記載の錯体。
【請求項３８】
少なくとも1のR1がメチル及び置換又は非置換ベンジル基より選択される、請求項37に記載の錯体。
【請求項３９】
前記ベンジル基がアルコキシ基によって置換される、請求項38に記載の錯体。
【請求項４０】
R1及びR2から選択される少なくとも一方のメンバーが置換又は非置換C1-C4アルキル基である、請求項37に記載の錯体。
【請求項４１】
C1-C4アルキル基がメチル基である、請求項40に記載の錯体。
【請求項４２】
少なくとも1のR1がメチル及びポリエーテル基より選択される、請求項37に記載の錯体。
【請求項４３】
式(II)によって表される構造が、以下の：
【化９】
2005500387.tif 000051
｛式中、qが、1又は2である。｝である、請求項34に記載の錯体。
【請求項４４】
式(Ｉ)によって表される構造が、以下の：
【化１０】
2005500387.tif 000052
｛式中、R5が、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換へテロアルキル及び置換又は非置換アリール基から選択されるメンバーであり、場合により、前記ガドリニウム(III)と錯体を形成する1以上の有機配位子により置換基される。｝である、請求項14に記載の錯体。
【請求項４５】
請求項14に記載の画像診断用造影剤であって、
a.  酸素原子のみに配位する金属イオン；及び
b.  血漿タンパク質結合性部分、
を含み、被検者に投与された用量の約10%が少なくとも1つの血漿タンパク質に結合する上記造影剤。
【請求項４６】
前記血漿タンパク質がヒト血清アルブミンである、請求項45に記載の造影剤。
【請求項４７】
前記血漿タンパク質結合性部分が、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アリール基及びそれらの組み合わせから選択されるメンバーを含む、請求項46に記載の造影剤。
【請求項４８】
前記血漿タンパク質結合性部分がポリ(エチレングリコール)部分を含む、請求項46に記載の造影剤。
【請求項４９】
前記血漿タンパク質結合性部分が、少なくとも1個のアリール環を含む、請求項46に記載の造影剤。
【請求項５０】
前記血漿タンパク質結合性部分が、異なるヒドロキシピリドナート基に独立に結合した少なくとも2個のアリール環を含む、請求項46に記載の造影剤。
【請求項５１】
前記血漿タンパク質結合性部分が、3個の独立したヒドロキシピリドナート及びテレフタルイミド部分に独立に結合した少なくとも3個のアリール環を含む、請求項46に記載の造影剤。
【請求項５２】
前記血漿タンパク質結合性部分が、アリール環とポリ(エチレングリコール)置換基の両方を含む、請求項46に記載の造影剤。
【請求項５３】
前記血漿タンパク質結合性部分が、疎水性アミノ酸残基より選択されるメンバーを含む請求項46に記載の造影剤。
【請求項５４】
前記造影剤の少なくとも約60%が血漿タンパク質に結合する、請求項45に記載の造影剤。
【請求項５５】
前記造影剤を、選択された生体成分に導くことを可能にするようなターゲティング部分をさらに含む、請求項45に記載の造影剤。
【請求項５６】
前記ターゲティング部分が親油性物質、受容体リガンド及び抗体から成る群から独立に選択される、請求項55に記載の造影剤。
【請求項５７】
MRIシグナル発生部分として請求項14に記載の錯体を含む画像診断用造影剤であって、以下の式：
SGM−[(L)n−(BCTM)o]p
｛式中、
SGMが、MRIシグナル発生部分であり;
Lが、リンカー部分であり;
BCTMが、少なくとも6個の炭素原子を含む生体成分ターゲティング部分であり; そして
n、p及びoが、1以上の整数より独立に選択される。｝によって表される造影剤。
【請求項５８】
MRIシグナル発生部分として請求項14に記載の錯体を含む画像診断用造影剤であって、以下の式：
(HM)q−SGM−[(L)n−(BCTM)o]p
｛式中、
HMが、少なくとも1個の炭素原子と1個の酸素原子とを含む親水性部分であり;
SGMが、NMRシグナル発生部分であり;
Lが、リンカー部分であり;
BCTMが、少なくとも6個の炭素原子を含む生体成分ターゲティング部分であり; そして
n、p、q及びoが、1以上の整数より独立に選択される。｝によって表される造影剤。
【請求項５９】
MRIシグナル発生部分として請求項14に記載の錯体を含む画像診断用造影剤であって、以下の式：
SGM−[(HM)q−(BCTM)o]p
｛式中、
HMが、少なくとも1個の炭素原子と1個の酸素原子とを含む親水性部分であり;
SGMが、NMRシグナル発生部分であり;
BCTMが、少なくとも6個の炭素原子を含む生体成分ターゲティング部分であり; そして
p、q及びoが、1以上の整数より独立に選択される。｝によって表される造影剤。
【請求項６０】
MRIシグナル発生部分として請求項14に記載の錯体を含む画像診断用造影剤であって、以下の式：
SGM−[(L)n−(BCTM)o−(HM)q]p
｛式中、
HMが、少なくとも1個の炭素原子と1個の酸素原子とを含む親水性部分であり;
SGMが、NMRシグナル発生部分であり;
Lが、リンカー部分であり;
BCTMが、少なくとも6個の炭素原子を含む生体成分ターゲティング部分であり; そして
n、p、q及びoが1以上の整数より独立に選択される。｝によって表される造影剤。
【請求項６１】
MRIシグナル発生部分として請求項14に記載の錯体を含む画像診断用造影剤であって、以下の式：
【数１】
2005500387.tif 000053
｛式中、
HMが、少なくとも1個の炭素原子と1個の酸素原子とを含む親水性部分であり;
SGMが、NMRシグナル発生部分であり;
Lが、リンカー部分であり;
BCTMが少なくとも6個の炭素原子を含む生体成分ターゲティング部分であり; そして
n、p、q及びoが、1以上の整数より独立に選択される。｝によって表される造影剤。
【請求項６２】
マウスに投与された前記錯体の用量の少なくとも90%が、約24時間以内に該マウスによって排泄される、請求項14に記載の錯体。
【請求項６３】
マウスに投与された前記錯体の用量の少なくとも90%が、約1時間以内に該マウスによって排泄される、請求項62に記載の錯体。
【請求項６４】
ガドリニウムに対する親和性が、亜鉛、カルシウム及びその組み合わせから選択されるメンバーに対する親和性よりも少なくとも約5桁大きい、請求項14に記載の錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は米国暫定特許出願第60/312,132号(2001年8月13日提出)の非暫定出願であり、該暫定出願は参照により全体が本願に組み込まれる。
【０００２】
米連邦政府の後援による研究開発の下でなされた発明に対する権利についての声明
この研究は支援の一環としてDOE Contract # DE-AC03-76SF00098(LBNL)、NIH Grant # DK57814及びNIH Grant # HL69832に基づく助成金を受けた。
【背景技術】
【０００３】
核磁気共鳴(NMR)試験の静磁場に線形傾斜磁場を重ね合せると物体の三次元画像が得られることは1972年に初めて明らかにされた (Lauterbur, P.C., Nature 1973, 190)。この新技術は磁気共鳴画像法(MRI)として知られるようになった。その後MRIは目覚しい発達を遂げ、「物体を透視する」最強の手段となるに至った(Aime, S.B. et al., E. Acc. Chen. Res. 1999, 32, 941) 。20世紀初めのX線画像法と同様に、MRIは現代診断医学に革命をもたらした(Caravan, P.E. et al., Chem. Rev. 1999, 99, 2293) 。従来のX線は骨格構造を示すのに対して、MRIは生体内の水の分布を高分解能の三次元画像として示す。この強力な診断手段は腫瘍、病変及び血栓などを含む種々の生理的異常の発見にきわめて有益である。加えて、ダイナミックMRIの最近の進歩は生化学活性のリアルタイム画像化という刺激的な可能性を切り開く(“A New Generation of In Vivo Diagnostics”, MetaProbe, 2000)。
【０００４】
MRIの診療面の効用はスキャン前の造影剤投与により、造影剤近傍のプロトンの緩和時間を変化させて健全組織と病変組織のコントラストを強調することで、一段と増す。造影剤の使用は診療プロトコールでますます一般化しており、今日ではMRI検査の30〜35%程度が造影剤検査となっている(Caravan, P.E. et al., Chem. Rev. 1999, 99, 2293; Aime, S.B. et al., E. Acc. Chen. Res. 1999, 32, 941) 。従って、造影剤は今日では大市場を形成しており、2000年にはその規模が2億5,000万ドル台に達した(“RC-211, Contrast Agent for Medical Imaging,” Business Communication Company, Inc., 1999)。
【０００５】
目下、数種の新造影剤が開発中であり、いずれも部位特異性を強めて、たとえば心血管の特徴の詳細な画像化を容易にすることが狙いである(Lauffer, R.B., Magn. Reson. Med. 1991, 22, 339)。さらに、最近の報告では造影剤が酵素や金属イオンの存在を検出しうることも立証されている(Moats, R.A.F. et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 726; Li, W.F. et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1413)。
【０００６】
現在、臨床的に許容されている造影剤はポリ(アミノカルボン酸)配位子のガドリニウム錯体、たとえばDTPA、DOTA、DO3A及びDTPA-BMAのガドリニウム・キレートがベースである(図1)。これらは細胞外液性造影剤であり、生体の原形質及び間質空間全体に非特異的に分布する。こうした造影剤の代表的な用途は脳腫瘍の検出である。
【０００７】
市販造影剤の画像強調能は理論的な最適値をはるかに下回る(Aime, S.B. et al., Coord. Chem. Rev., 321:185-6, 1999)。画像強調特性が相対的に低いため、満足なコントラストの画像を得るには造影剤をグラム単位で注入する必要がある。相当の画像強調にはそうした高用量が必要となるため、現在の造影剤は高濃度で蓄積することが見込まれる部位をターゲットにするしかない。低用量で高分解能を実現し、また種々のターゲット選択的な(たとえば肝胆道の特徴などの)画像化を可能にするためには、画像強調能と対応する水プロトン緩和度とを高めた造影剤が求められる。さらに、有用な錯体は水への溶解度が高く、キレートからの金属イオンのin vivo解離に対する抵抗が大きく、また許容範囲内の低毒性でなければならない。有力な新種の金属結合配位子は複素環式ピリジノン及びピリミジノン核をベースにする。
【０００８】
ポリ(アミノカルボン酸)キレート系MRI造影剤とは構造も特性も異なるのが、1以上のヒドロキシピリジノン又はヒドロキシピリミジノン・サブユニットを含む化合物類である。ヒドロキシピリジノン又はヒドロキシピリミジノン部分を組み込んだホモ脚型（homopodal）及びヘテロ脚型（heteropodal）キレート剤はどちらも技術上周知である。既報化合物はその種の化合物に特徴的な望ましい水交換反応速度と錯体安定度を示すものの、水への溶解度に関する既報値は一般に低すぎるで、そうしたGd(III )錯体をMRIコントラスト強調剤の候補とみなすには難がある。
【０００９】
たとえばXu et al. (J. Am, Chem. Soc., 117:7245-7246, 1996)はGd(III )-TREN-Me-3,2-HOPO(トリス(3-ヒドロキシ-1-メチル-2-オキソ-1,2-ジデヒドロピリジン-4-カルボキサミド)エチル)アミン)の合成と特性解析を開示している。該開示錯体の水への溶解度は0.1mM程度にすぎず、MRIコントラスト強調剤としては理想に程遠い。
【００１０】
さらにCohen et al. (Inorg. Chem., 39:5747-5746, 2000)は、TREN-Me-3,2-HOPOプラットホームをベースにした一連の混合配位子系を調製している。該配位子系は2つのHOPOキレーターと1つの非HOPOキレーターとを含む。該配位子系は非HOPOキレーターとしてサリチルアミド、2-ヒドロキシイソフタルアミド、2,3-ジヒドロキシテレフタルアミド及びビス(酢酸)を組み込んでいる。開示モチーフをもつ配位子のGd(III )錯体は水への溶解度が中程度(約1〜3mM)である。
【００１１】
Hajela et al. (J. Am. Chem. Soc. 122:11228-11229, 2000)は、官能化TREN骨格をベースにしたホモ脚型のMe-3,2-HOPOキレートを調製した。該官能化TREN骨格はホモキラルなトリス(2-ヒドロキシメチル)-TREN-Me-3,2-HOPOであった。この配位子のGd(III )錯体は水への溶解度が約15mMである。
【００１２】
ピリジノン部分の環内窒素を官能化したHOPO配位子は公知である。たとえば配位子TREN-MOE-3,2-HOPO (トリス(3-ヒドロキシ-1-メトキシエチル)-2-オキソ-1,2-ジデヒドロピリジン-4-カルボキサミド)エチル)アミン)とそのGd(III )錯体はJohnson et al. (Inorg. Chem. 39:2652-2660, 2000)が調製、解析している。該錯体の水への溶解度は報告では約1mMである。
【００１３】
以上の文献に加えて、米国特許第5,049,280号明細書は2,3-ジヒドロキシテレフタルアミド部分をベースにしたホモ脚型キレート剤を開示している。’280号明細書は該開示部分のHOPO又はHOPYサブユニットとの結合によるヘテロ脚型キレート剤の形成については開示又は示唆していない。米国特許第4,698,431号明細書は1-ヒドロキシ-2-ピリジノンをサブユニットとするキレート剤を開示している。開示によればその錯体は鉄イオン及びアクチノイド元素[Pu(IV)など]に対し高親和性を示す。’280号、’431号いずれの明細書も新規キレート剤のGd(III )錯体形成への使用を示唆していない。
【００１４】
米国特許第5,892,029号及び5,624,901号明細書は、少なくとも1個の3,2-HOPOサブユニットを構造中にもつホモ及びヘテロ脚型キレート剤を開示している。’029号、’901号いずれの明細書も、開示の配位子が水への溶解度の高いGd(III )キレートの形成に有用であるとは示唆していない。
【００１５】
他の関連技術文献として米国特許第4,666,927号明細書があり、そこでは-CONH-基を含む結合基類の多様な組み合わせによって連結された構造中に1,2-HOPO、3,2-HOPO又は3,4-HOPO部分を組み込んだ多数のキレート剤が開示されている。しかし、米国特許第4,666,927号明細書の教示によれば、HOPO部分は該HOPO環のヒドロキシル基又はオキソ基に対するオルト位に置換基をもたない。米国特許第6,221,476号明細書は膜担体に結合させたポリヒドロキシピリジノン配位子を開示している。該組成物は溶液から金属イオンを除去するのに有用である。Zbinden(米国特許第5,688,815号明細書)は鉄キレーターとして有効であり鉄過剰症の治療に有用である3-ヒドロキシピリジン-4-オンを開示している。’927号、’476号いずれの明細書も、コントラスト強調剤として有用な高水への溶解度のGd(III )キレートの調製方法を当業者に教示していない。
【００１６】
前述のように、ヒドロキシピリミジノン及びヒドロキシピリジノン配位子のGd(III )キレートは、広く使用されているGd(III )-ポリ(アミノカルボン酸)に優るMRI造影剤としての特性を多数備える。しかし、ピリミジノン及びピリジノン環系をベースにした新規造影剤の開発は、その低水への溶解度がネックとなってきた。この複素環式環系をベースにした新世代Gd(III )錯体が出現すればMRI造影技術は大きく発展することになろう。実に驚くべきことに、本発明はそうした錯体を提供するものである。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の簡単な要約
金属キレート及びキレート剤は診断、治療の両用途分野で有用な薬剤である。本発明は、磁気共鳴画像法(MRI)などの画像診断モダリティー用の造影剤として有用な新種の高水への溶解度常磁性金属キレートに関連する。本発明の常磁性キレートは予想外の高水交換速度とそれに対応する高プロトン緩和速度を有し、MRI造影剤として大いに有効である。そのうえ、本発明キレートの合成経路はキレートの1以上の特性を改変するようなサブユニットの組込みを容易にする。たとえば、水溶性基やターゲッティング基などを含むキレート、多様な高分子とコンジュゲートを形成したキレートなどが提供される。
【００１８】
本発明は新種の高水への溶解度Gd(III )錯体を提供するが、該錯体は優れたin vivo安定度及び解離抵抗をも示す。そのうえ該錯体は水交換反応が驚くほど高速であり、緩和度が大きい。従って本発明は水溶性の強力かつ無害なプロトン緩和剤を提供する。
【００１９】
本発明は熱力学的に安定なHOPO配位子-Gd(III )錯体を提供するが、その緩和度は市販造影剤たとえばGd[DOTA]及びGd[DTPA]の緩和度の約2倍である。該Gd錯体の安定度はまた、他金属イオンの存在下での該配位子のGd(III )に対する選好にも表れている。そのうえ、本発明の特定化合物の緩和度は市販剤の緩和度の約2倍以上である。加えて本発明の錯体は水交換速度が最適に近く、既存剤の約100倍である。
【００２０】
従って本発明は第1態様で、Gd(III )イオンと該Gd(III )イオンに配位する酸素ドナー原子のみを含む有機配位子との錯体を提供する。Gd錯イオンは水交換速度が約10×106sec-1以上である。該錯体の水への溶解度は約15mM以上、好ましくは約20mM以上である。
【００２１】
本発明は第2態様で、本発明化合物の水溶液を提供する。該水溶液はGd(III )イオンと該Gd(III )イオンに配位する酸素ドナー原子のみを含む有機配位子との錯体を含む。該溶液はpMが約15以上である。該溶液はpHが約7.4であり、また約10μMの配位子と約1μMのGd(III )とを含む。該錯体は水への溶解度が約15mM以上、好ましくは約20mM以上である。
【００２２】
本発明は第3態様で、ガドリニウム(III )と有機配位子との錯体を提供する。該配位子は式(Ｉ)
【００２３】
【化１】
2005500387.tif 000002
【００２４】
で示される構造を含む。式中、記号R1、R2及びR3は独立に連結メンバー、アリール基置換基、H、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド、エステル、アミン及び反応性官能基より選択される。ただしAが窒素ならばR1はアミノ基以外であり、Eが窒素ならばR3は存在しない。記号R4は連結メンバー、H、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換へテロアルキル基、置換又は非置換アリール、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド又はエステル基である。A、E及びZは独立に炭素と窒素より選択される。このガドリニウム錯体は好ましくは水への溶解度が約15mM以上、より好ましくは約20mM以上である。
【００２５】
コントラスト強調MRIを患者に実施する方法もまた提供される。該方法は、コントラストを強調するに足る量の本発明化合物を患者に投与するステップとコントラスト強調MR画像を得るステップとを含む。
【００２６】
本発明はまた、配位子の足場の選択的な構造修飾を提供する。該修飾は類似の非修飾化合物に比してin vivo滞留時間を長くする効果がある。他に、修飾Gd3+錯体のin vivo分布における特異性を強めるような修飾も提供される。
【００２７】
本発明の他の目的及び特長は当業者には以下の詳細な説明から自明となろう。
【００２８】
本発明の詳細な説明
1.  はじめに
本発明は、画像診断モダリティー(例: MRI、CT)や金属イオン(例: 鉄、アクチノイド類)の排泄などを非限定的に含む数多くの目的に有用なキレート剤を提供する。該キレート剤はまた放射線医療、ガンマカメラシンチグラフィー及び他の医療用途で使用される放射性同位体を結合させるうえでも有用である。本発明はまた、本発明のキレートと多数の金属イオンの間で形成される一群の金属錯体を提供する。本発明のキレート剤は金属イオンと、驚くほど安定した高水への溶解度の錯体を形成する。
1.1  用語の意味
用語「pGd」は本書ではpH=7.4及び予備平衡濃度[L]=10μM、[GdIII ]=1μMでの-log10[GdIII ]freeである。
【００２９】
「HOPO」は本書ではヒドロキシピリドナートを指す。
【００３０】
「HOPY」はヒドロキシピリミジノンを指す。
【００３１】
「TAM」はジヒドロキシテレフタルアミドを指す。
【００３２】
「反応性官能基」は本書ではオレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアン酸塩、イソシアン酸塩、チオシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸塩、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミド酸塩、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜流酸塩、エナミン、イナミン、ウレア、シュードウレア、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバミン酸塩、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物及びニトロソ化合物を非限定的に含む基をいう。反応性官能基にはまた、バイオコンジュゲートの調製に使用されるもの、たとえばN-ヒドロキシスクシンイミド=エステル、マレイミドなども含まれる。これらの各官能基を調製する方法は技術上周知であり、また特定目的に応じたそれらの適用又は修飾は当業者の能力の範囲内である(たとえばSandler and Karo, eds. Organic Functional Group Preparations, Academic Press, San Diego, 1989を参照)。
【００３３】
「非共有タンパク質結合性基」は、非変性又は変性ポリペプチドと会合的に相互作用する化学構造部分である。この相互作用は生体環境中で可逆的でも不可逆的でもよい。本発明のキレート剤又は錯体に「非共有タンパク質結合性基」を組み込むと、ポリペプチドと非共有的に相互作用しうる薬剤又は錯体が得られる。非共有相互作用の例は疎水性-疎水性相互作用や静電相互作用などである。「非共有タンパク質結合性基」の例は陰イオン基たとえばリン酸、チオリン酸、ホスホン酸、カルボン酸、ボロン酸、硫酸、スルホン、チオ硫酸及びチオスルホン酸などである。
【００３４】
「連結メンバー(linking member)」は本書では、少なくとも1つのヘテロ原子を含む共有化学結合をいう。連結メンバーの例は-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-などである。
【００３５】
「ターゲティング基」は化学構造部分であって、それと結合した化学物質(造影剤など)を(a)ターゲット領域たとえば腫瘍へと能動的に導くことができる部分、又は(b)ターゲット組織たとえば腫瘍により選択的受動的に吸収される又は取り込まれるようにする部分をいう。ターゲティング基は、非ペプチドとペプチドの両方を組み込めるようにした低分子でもよいし、多糖、レクチン、レセプター及びレセプターに対応する配位子、タンパク質たとえばBSA、抗体、ポリ(エーテル)、デンドリマー、ポリ(アミノ酸)などを非限定的な例とする高分子でもよい。
【００３６】
「切断可能な基」は、キレート(又はキレート-リンカーアーム構成体)をコンジュゲートの残りの部分と結び付けている結合を切断することによりコンジュゲートの残りの部分からのキレートの解離を可能にする化学構造部分をいう。そうした切断は化学的切断でも酵素的切断でもよい。酵素的に切断可能な基の例は天然アミノ酸、又は天然アミノ酸を末端にもつペプチド配列などである。
【００３７】
酵素的に切断可能な部位に加えて、酵素以外の作用因子によって切断される部位を1以上含むこともまた本発明の範囲内である。酵素以外の切断作用因子の非限定的な例は酸、塩基、光(たとえばニトロベンジル誘導体、フェナシル基、ベンゾインエステルなどの場合)及び熱である。たとえばJung et al., Biochem. Biophys. Acta. 761:152-162 (1983); Joshi et al., J. Biol. Chem., 265:14518-14525(1990); Zarling et al., J. Immunol., 124:913-920 (1980); Bouizar et al., Eur. J. Immunol., 155:141-147 (1986); Park et al., J. Biol. Chem., 261:205-210 (1986); Browning et al., J. Immunol.,  143:1859-1867 (1989)を参照。さらに、多種多様の切断可能な二官能性(ホモ及びヘテロ両二官能性)スペーサーアームもPierceなどから市販されている。
【００３８】
式中の波線は、結合として用いようが結合に対して垂直に表示しようが、分子の表示部分と残りの部分、固相担体、その他との結合点を示す。
【００３９】
本発明のある種の化合物は非溶媒和型、(水和型を含む)溶媒和型のいずれで存在してもよい。一般に溶媒和型は非溶媒和型と等価であり、本発明の範囲に包摂される。本発明のある種の化合物は多結晶又はアモルファス型で存在してもよい。一般に本発明で見込まれる用途では諸々の物理的形態が等価であり、本発明の範囲に包摂される。
【００４０】
本発明のある種の化合物は不斉炭素原子(光学中心)又は二重結合をもつが、ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体及び個別異性体は本発明の範囲に包摂される。
【００４１】
本発明の化合物は単一異性体(たとえば鏡像異性体、シス-トランス異性体、位置異性体、ジアステレオマー)、異性体混合物のいずれでもよい。好ましい実施態様では、化合物を実質的に単一異性体として調製する。実質的に純粋な異性体の化合物を調製する方法は技術的に周知である。たとえば濃縮鏡像異性体混合物や純粋な鏡像異性体化合物は、純粋な鏡像異性体である合成中間体を使用して、キラル中心の原子の立体配置を不変のままにするか又は完全反転させるような反応と組み合せることにより、調製することができる。あるいは、合成経路の最終生成物又は中間体を単一立体異性体へと分割してもよい。特定のキラル中心を反転させる又は不変のままにしておく技法、及び立体異性体の混合物を分割する技法は技術上周知であり、当業者は特定の状況に応じて適切な方法を選ぶことができる。一般にFurniss et al. (eds.), Vogel’s Encyclopedia of Practical Organic Chemistry 5th Ed., Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, pp. 809-816及びHeller, Acc. Chem. Res. 23:128 (1990)を参照。
【００４２】
本発明の化合物はまた、そうした化合物を構成する1以上の原子について人為的な比率の同位体を含んでもよい。たとえば本発明化合物はトリチウム(3H)、ヨウ素125 (125I)、炭素14 (14C)などのような放射性同位体で標識してもよい。本発明化合物の同位体変異は放射性であってもなくても本発明の範囲に包摂されるものとする。
【００４３】
左から右への表記方式による通常の化学式で指定される置換基は構造を右から左へと表記しただけで化学的には同一の置換基も等しく包摂する。たとえば-CH2O-は-OCH2-をも意味するものとする。
【００４４】
用語「アルキル」は特に断らない限り、それ自体で、又は他置換基の一部として、直鎖又は分岐鎖又は環式炭化水素基、又はそれらの組み合わせを意味するが、完全飽和、モノ又はポリ不飽和いずれでもよいし、また表記数の炭素原子をもつ(すなわちC1-C10は1〜10個の炭素を意味する)二価及び多価基を含んでもよい。飽和炭化水素基の非限定的な例はメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、s-ブチル、シクロヘキシル、(シクロヘキシル)メチル、シクロプロピルメチル、たとえばn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルの同族体及び異性体などである。不飽和アルキル基は1以上の二重結合又は三重結合をもつ基であり、その非限定的な例はビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-及び3-プロピニル、3-ブチニル及び高級同族体及び異性体である。用語「アルキル」は特に断らない限り、後でもっと詳しく定義するアルキル誘導体たとえば「ヘテロアルキル」をも含むものとする。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」という。
【００４５】
用語「アルキレン」はそれ自体で、又は他置換基の一部として、アルカンから誘導される二価基を意味し、その非限定的な例は-CH2CH2CH2CH2-であり、また後述の「ヘテロアルキレン」をさらに含む。一般にアルキル(アルキレン)基は炭素原子数が1〜24であろうが、本発明では炭素原子数10以下の基が望ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は炭素鎖が比較的短いアルキル又はアルキレン基であり、一般に炭素数は8以下である。
【００４６】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ(又はチオアルコキシ)」は通常の意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基及び硫黄原子を介して分子の残りの部分に結合しているアルキル基をいう。
【００４７】
用語「ヘテロアルキル」は特に断らない限り、それ自体で、又は他の用語と組み合せて、安定した直鎖又は分岐鎖又は環式炭化水素基、又はそれらの組み合わせを意味し、表記数の炭素原子とO、N、Si及びSからなる群より選択される少なくとも1個のヘテロ原子とからなる。その場合、ヘテロ原子の窒素及び硫黄は随意に酸化され、また窒素は随意に四級化される。ヘテロ原子のO、N、Si及びSはヘテロアルキル基の任意の内部位置にあっても、該アルキル基が分子の残りの部分へと結合する位置にあってもよい。その非限定的な例は-CH2-CH2-O-CH3-、-CH2-CH2-NH-CH3-、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3-、-CH2-S-CH2-CH3-、-CH2-CH2-S(O)-CH3-、-CH2-CH2-S(O)2-CH3-、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3及び-CH=CH-N(CH3)-CH3などである。ヘテロ原子はたとえば-CH2-NH-OCH3-や-CH2-O-Si(CH3)3-などのように2個までなら連続してもよい。同様に、用語「ヘテロアルキレン」はそれ自体で、又は他置換基の一部として、ヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。その非限定的な例は-CH2-CH2-S-CH2-CH2-及び-CH2-S-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-などである。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子が炭素鎖の一端又は両端を占めてもよい(たとえばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど)。さらにまた、アルキレン及びヘテロアルキレン結合基では、結合基の式の向きは結合基の配向を何ら示唆しない。たとえば式-C(O)2R’-は-C(O)2R’-と-R’C(O)2-の両方を表わす。
【００４８】
用語「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」は特に断らない限り、それ自体で、又は他の用語と組み合せて、それぞれ環式の「アルキル」及び「ヘテロアルキル」を表わす。さらにヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子は該複素環と分子の残りの部分との結合位置を占めてもよい。シクロアルキルの非限定的な例はシクロペンチル、シクロヘキシル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどである。ヘテロシクロアルキルの非限定的な例は1-(1,2,5,6-テトラヒドロピリジル)、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1-ピペラジニル、2-ピペラジニルなどである。
【００４９】
用語「ハロ」又は「ハロゲン」は特に断らない限り、それ自体で、又は他の用語と組み合せて、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を意味する。また「ハロアルキル」などの用語はモノハロアルキルとポリハロアルキルを包含するものとする。たとえば用語「ハロ(C1-C4)アルキル」はトリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどを非限定的に含む。
【００５０】
用語「アリール」は特に断らない限り、単環、(縮合又は共有結合した)多環(1〜3環が好ましい)いずれでもよいポリ不飽和芳香族置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を含むアリール基(又は環)をいい、ヘテロ原子の窒素及び硫黄は随意に酸化され、また窒素は随意に四級化される。ヘテロアリール基はヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合していてもよい。アリール及びヘテロアリール基の非限定的な例はフェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソオキサゾリル、4-イソオキサゾリル、5-イソオキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジニル、4-ピリミジニル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンゾイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリニル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリニル及び6-キノリルである。以上の各アリール及びヘテロアリール環系の置換基は後述の許容可能な置換基群より選択される。
【００５１】
用語「アリール」は、他の用語と組み合せて使用される場合(たとえばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルなど)にも、簡潔を期す意味で前述のアリール環及びヘテロアリール環の両方を包含する。従って用語「アリールアルキル」は、アリール基がアルキル基(ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど)に結合した基を包含する。その場合のアルキル基は炭素原子(たとえばメチレン基の炭素原子)がたとえば酸素原子に置き換わったもの[フェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ)プロピルなど]を包含する。
【００５２】
以上の各用語(アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリールなど)は表示した基の置換体と非置換体を共に含むものとする。以下、各タイプの基の好ましい置換基について述べる。
【００５３】
アルキルおよびヘテロアルキル基(アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれる基を含む)の置換基は「アルキル基置換基」と総称され、-OR’、=O、=NR’、=N-OR’、-NR’R”、-SR’、-ハロゲン、-SiR’R”R’’’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’’’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’’’)=NR’’’’、-NR-C(NR’R”)=NR’’’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN及び-NO2を非限定的に含む群より選択される多様な基のうちの1つ又は複数とすることができ、その数は0〜(2m’+1)である。ただしm’はそうした置換基中の総炭素原子数である。R’、R”、R’’’及びR’’’’は各々好ましくは独立に水素、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール(たとえば1-3ハロゲン置換アリール)、置換又は非置換アルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を指す。たとえば本発明の化合物が複数のR基を含む場合、各R基は独立に選択されるが、各R’、R”、R’’’及びR’’’’基についてもそれが複数存在する場合には同様とする。R’とR”が同じ窒素原子と結合する場合には、それらは該窒素原子と共に5員環、6員環又は7員環を形成してもよい。たとえば-NR’R”は1-ピロリジニルや4-モルホリニルを非限定的に包含するものとする。置換基に関する以上の説明から当業者には自明であろうが、用語「アルキル」は水素以外の基に結合した炭素原子を含む基たとえばハロアルキル(-CF3や-CH2CF3など)及びアシル[-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3など]を包含するものとする。
【００５４】
アルキル基に関する置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基の置換基は「アリール基置換基」と総称する。該置換基はたとえばハロゲン、-OR’、=O、=NR’、=N-OR’、-NR’R”、-SR’、-ハロゲン、-SiR’R”R’’’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’’’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’’’)=NR’’’’、-NR-C(NR’R”)=NR’’’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN及び-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、フルオロ(C1-C4)アルコキシ及びフルオロ(C1-C4)アルキルからなる群より選択され、その数は0ないし芳香環上の空いた原子価の総数であり、またR’、R”、R’’’及びR’’’’は好ましくは独立に水素、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール及び置換又は非置換へテロアリールより選択される。たとえば本発明の化合物が複数のR基を含む場合、各R基は独立に選択されるが、各R’、R”、R’’’及びR’’’’基についてもそれが複数存在する場合には同様とする。
【００５５】
アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち2つは随意に式-T-C(O)-(CRR’)q-U-(式中、T及びUは独立に-NR-、-O-、-CRR’-又は単結合であり、またqは0〜3の整数である)で示される置換基に置き換わる。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち2つは随意に式-A-(CH2)r-B-[式中、A及びBは独立に-CRR’、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-又は単結合であり、rは1〜4の整数である]で示される置換基に置き換わる。そうして形成される新しい環の単結合のうちの1つは随意に二重結合に置き換わる。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうち2つは随意に式(CRR’)s-X-(CR”R’’’)d-[式中、s及びdは独立に0〜3の整数であり、またXは-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-又は-S(O)2NR’-である]で示される置換基に置き換わる。置換基R’、R”、R’’’及びR’’’’は好ましくは独立に水素又は置換又は非置換(C1-C6)アルキルより選択される。
【００５６】
用語「ヘテロ原子」は本書では酸素(O)、窒素(N)、硫黄(S)及びケイ素(Si)を包含する。
【００５７】
「MRIシグナル発生部分」はMRI実験を受ける試料又は被験者中の水分子のT1又はT2に影響を及ぼす化学種である。
【００５８】
化学構造の構成要素としての破線は、化学結合則に従う限りで、該結合の位置が環構造内部などで変化してもよいことを、又は該結合が存在する場合も存在しない場合もあることを示唆する。
【００５９】
MRI造影剤としてのキレート剤
主に水プロトン(1H)のNMR信号からなるMRIの画像強度は多数の因子の複雑な相互作用の結果である。そうした因子の例は縦(T1)及び横(T2)プロトン緩和時間、画像化組織のプロトン密度及び装置パラメーター(磁場強度など)である(Aime, S.B. et al., Coord. Chem. Rev. 1999, 1865-6, 321)。造影剤(常磁性体イオンの錯体)は双極子相互作用により近傍の水プロトンの緩和時間を短縮し、その結果として造影剤を取り込んだ組織の信号強度が増大する(Lauffer, R.B., Chem. Rev. 1987, 87, 901)。Gd(III )は高磁気モーメントと比較的長い電子緩和時間を特徴とするためMRI造影剤の活性成分として好適である(Banci, L.B. et al., C. Nuclear and Electronic Relaxation; VCH: Weinheim, 1991)。Gd(III )造影剤を使用して得られる画像は「T1強調画像」として視覚化するのが好ましい。組織中の1/T1変動率は1/T2変動率よりもずっと大きいからである(Caravan, P.E. et al., Chem. Rev. 1999, 99, 2293)。
【００６０】
本発明は一態様で、高水交換速度(すなわちτm及びτrが好ましくは低ns領域である)と好ましいin vivo滞留時間を特徴とする新規MRI造影剤及び新規MRI造影剤の組成物に関連する。これらの新規造影剤は身体の特定領域の生理的異常について現在よりも長い時間にわたる診断を可能にする。
【００６１】
以下の説明は本発明のキレート剤が配位する代表的な常磁性体イオンとしてガドリニウムに焦点を合わせるが、本発明のキレート剤が多数の金属イオンを錯化するうえでも好適であることは当業者には自明であろう。従って、たとえば遷移金属類やガドリニウム以外のランタノイド元素類のイオンを利用することも本発明の範囲内である。そうした金属イオンの例はDy、Fe、Mn、Pu及びUなどである。
【００６２】
金属キレートがMRI用コントラスト強調剤として有用であるためには、いくつかの要件を満たさなければならない。大まかかに言えば安定度、緩和度及び水への溶解度が3大要件であり、いずれも高い値でなければならない。本発明者は酸素だけをドナー原子とする配位子系が、高安定度、高緩和度及び高水への溶解度を示すGd(III )錯体を与えることに気づいた。
【００６３】
・水への溶解度
ほとんどの診断用薬剤と同様、MRIコントラスト強調剤は水への溶解度が可能な限り高いのが望ましい。MRI造影剤は画像診断の被験者にグラム単位で投与されるため、その水への溶解度は特に重要である。水への溶解度が高いほど投与のための注入量は少なくて済む。所要注入量が減れば、投与し易くなるし、患者の不快感も軽減する。
【００６４】
本発明者は、MRI造影剤の有力候補である酸素だけをドナー原子とする配位子とのGd(III )錯体では、水への溶解度が好ましくは約15mM以上、より好ましくは約20mM以上であることに気づいた。本発明はこの要件を満たす又は超過するようなGd(III )と酸素だけをドナー原子とする配位子との間の錯体を提供する。本発明は、水への溶解度が約50mM〜約300mM好ましくは約100mM〜約1Mである前述のようなGd(III )錯体を提供する。
【００６５】
本発明の化合物とは対照的に、公知の化合物は水への溶解度が比較的低い。たとえばTREN-MOE-3,2-HOPOはpH 7.4での水への溶解度が約1mMである。それに対して本発明の化合物たとえばTREN-HOPYのGd(III )錯体は水への溶解度が約100mMである。さらに本発明は公知化合物に比して水への溶解度を劇的に向上させたホモ脚型及びヘテロ脚型配位子のポリ(エーテル)コンジュゲートを提供する。Table 1は本発明化合物と公知化合物の例示的な水への溶解度の比較である。
【００６６】
【表１】
2005500387.tif 000003
【００６７】
・緩和度
MRI造影剤の効能は一般に緩和度の大きさで表わされる。MRI造影剤の緩和度r1は本書ではGd(III )ミリモルあたりの1/T1信号強度増大量をいう。水分子と造影剤の相互作用を原子スケールで検討するときは、緩和度を内圏と外圏の寄与に細分割することができる(図2)(Lauffer, R.B., Chem. Rev. 1987, 87, 901)。
【００６８】
本発明錯体の高緩和度の基礎をなす機構は該錯体の水交換反応速度の理想に近い時間スケールである。本発明者は、MRI造影剤候補であるGd(III )と酸素だけをドナー原子とする配位子との間で形成される錯体では、その金属イオンの水交換速度が約10×106sec-1であるのが好ましいことに気づいた(図3)。
【００６９】
臨床的に承認されているガドリニウム(III )キレートはいずれも配位水分子が1個(q=1)の八座配位子キレートであるが(Caravan, P.E. et al., Chem. Rev. 1999, 99, 2293)、六座三脚型のヒドロキシピリドナート系配位子たとえばTREN-1-Me-HOPOはGd3+と安定したジアクア錯体(q=2)を形成する(Xu, J. et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 7245; Johnson, A.R. et al., Inorg. Chem. 2000, 39, 2652-2660)。本発明錯体の緩和度は一般に、ポリアミノカルボン酸モチーフをベースにした造影剤の2倍以上である(図3)。
【００７０】
たとえばTREN-1-Me-HOPOの37℃、20MHzでの緩和度(r1)は10.5mM-1s-1であり、[Gd(DTPA)(H2O)]の緩和度の約2.5倍である。これは1つには配位水分子の数が多い(q=2)こと、また分子量が大きい(結果として回転相関時間τrが長くなる)ことに由来する。ポリアミノカルボン酸に比して本発明錯体の緩和度を向上させるもう1つの因子は本発明錯体の水交換反応速度の理想に近い時間スケールである(図4)。臨床用TREN-1-Me-HOPOのもう1つの特長はその中性度であり、これはin vivo浸透圧効果を弱め、従って静脈内投与時の患者の不快感を和らげる(Lauffer, R.B., Chem. Rev. 1987, 87, 901)。
【００７１】
本発明錯体の水中での緩和度は好ましくは約5mM-1s-1よりも大きく、さらに好ましくは約6mM-1s-1よりも大きい。本発明化合物の目下の好ましい緩和度範囲は約6mM-1s-1〜約15mM-1s-1である。
【００７２】
・安定度
遊離Gd(III )は有害であり、多座配位子で拘束して高安定度の錯体を形成しなければ患者に安全投与することができない。いくつかのグループがGd(III )錯体の化学的性質と毒性の関係をすでに研究している(Cacheris, W.P.Q. et al., Magn. Reson. Imag. 1990, 8, 467; Wedeking, P.K. et al., Magn. Reson. Imag. 1991, 10, 641; Pattagunta, N.R.G. et al., Invest. Radiol. 1996, 10, 619; Pattagunta, N.R.G. et al., Invest. Radiol. 1996, 12, 739; Kumar, K.T. et al., Inorg. Chem. 1995, 34, 6472)。その毒性はGd3+と生理的陽イオンたとえばZn(II)、Cu(II)及びCa(II)の交換に起因する。すなわち遊離配位子及びGd(III )イオンは完全な錯体よりも著しく有害である(Lauffer, R.B., Chem. Rev. 1987, 87, 901)。
【００７３】
他のMRI造影剤と同様に、酸素だけをドナー原子とする配位子とGd(III )との錯体は安定度及び無害性が許容範囲内でなければならない。酸素配位の配位子とGd(III )との錯体は、pH 7.4程度、配位子約10μM、Gd約1μMのときにpGdが約18以上となるような水溶液を形成するが好ましいことに本発明者は気づいた。後掲の方程式(4)を参照。
【００７４】
本発明の例示錯体Gd(III )-TREN-1-Me-HOPOの水中での存在形態はpH 5.5〜10の範囲で不変であり(図5)、生理的pHでは配位子が脱プロトン化したままであり、錯体は完全な状態にとどまることを示唆する。TREN-1-Me-HOPOはまた、熱力学的安定度が高く(pGd=20.3)、きわめて低毒性でもある。TREN-1-Me-HOPOはDTPA、DTPA-BMA及びDOTAと比較して、生理的金属イオンCa2+及びZn2+に比した場合のGd3+に対する選択性がより強く(図6) (Xu, J. et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 7245)、TREN-1-Me-HOPOのin vivo解離が最小限であることを示唆する。マウスに対するTREN-1-Me-HOPOの低毒性もまた臨床的に重要である[Xu, J. et al., J. Med. Chem. 1995, 38, 2606-2614; Raymond, K.N. et al.米国特許第5,892,029号明細書(1990)]。
【００７５】
・錯体
本発明は第1態様で、Gd(III )イオンと該Gd(III )イオンに配位するドナー原子として酸素原子だけを含む有機配位子との間の錯体を提供する。Gd錯イオンは水交換速度が約10×106sec-1以上である。該錯体の水への溶解度は約15mM以上好ましくは約20mM以上である。
【００７６】
本発明は例示的な実施態様で、ガドリニウム(III )と有機配位子との間の錯体を提供する。該配位子は式(Ｉ)
【００７７】
【化２】
2005500387.tif 000004
【００７８】
で示される構造を含むが、式中、R1、R2及びR3は独立に連結メンバー、アリール基置換基、H、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド、エステル及びアミノ基より選択される。ただしAが窒素ならばR1はアミノ基以外であり、またEが窒素ならばR3は存在しない。記号R4は連結メンバー、アルキル基置換基、H、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換へテロアルキル基、置換又は非置換アリール、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド又はエステル基である。A、E及びZは独立に炭素と窒素より選択される。このガドリニウム錯体は好ましくは水への溶解度が約15mM以上好ましくは約20mM以上である。
【００７９】
別の実施態様では、式(Ｉ)で示される部分は式(Ia)の構造
【００８０】
【化３】
2005500387.tif 000005
【００８１】
をもつが、式中、R1及びR4は連結メンバー、H、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド又はエステル基より独立に選択される。R2及びR3は連結メンバー、アリール基置換基、H、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド、エステル又はアミノ基より独立に選択される。
【００８２】
式(Ia)に従うさらに別の実施態様では、R1及びR2は独立に置換又は非置換C1-C4アルキル基たとえばメチル基である。さらなる実施態様では、R1及びR2はメチル基及びHより独立に選択され、またR3及びR4はHである。さらに別の実施態様では、R1は置換又は非置換アリール基及び置換又は非置換(アルキル)アリール基より選択され、またR2は置換又は非置換C1-C4アルキル基である。
【００８３】
別の例示的な実施態様では、式(Ｉ)で示される部分は式(Ib)の構造
【００８４】
【化４】
2005500387.tif 000006
【００８５】
をもつが、式中、R1及びR4は連結メンバー、H、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド及びエステル基より独立に選択される。R2は連結メンバー、アリール基置換基、H、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換へテロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アミド、エステル及びアミノ基より独立に選択される。
【００８６】
式(Ｉ)で示される構造が前記の構造である別の実施態様では、R1、R2及びR4はH及び置換又は非置換C1-C4アルキル基より独立に選択される。さらなる実施態様では、R1とR2のうちの少なくとも一方はメチル基である。
【００８７】
さらに別の実施態様では、式(Ｉ)で示される構造は
【００８８】
【化５】
2005500387.tif 000007
【００８９】
であるが、式中、R1〜R4は実質的に式(Ｉ)の場合と同じである。
【００９０】
別の例示的な実施態様では、本発明は式(Ｉ)で示される構造が式(Id)の構造
【００９１】
【化６】
2005500387.tif 000008
【００９２】
である錯体を提供するが、式中、R5は置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換へテロアルキル基、もしくは置換又は非置換アリール基である。R5は随意に、やはりガドリニウム(III )イオンと錯体を形成する1以上の有機配位子を置換基としてもつ。残りの基は実質的に式(Ｉ)の場合と同じである。R5は本書で「足場」と呼ぶ部分の一例である。この足場は、2以上のキレート化ユニットを一緒につなぎとめて本発明の配位子を形成させるようにする骨格である。足場は随意に反応性官能基をさらなる置換基としてもつ。該官能基を使用すれば、配位子を別の化学種たとえばターゲティング基やポリマーなどに結合させることができる。
【００９３】
本発明の別の例示的な錯体は式(II)
【００９４】
【化７】
2005500387.tif 000009
【００９５】
で示される構造をもつが、式中、3環系各々に対応するR1、R2、R3及びR4、それにA、E及びZは式(Ｉ)のとおりであり、それぞれ独立に選択される。従ってたとえば第1キレート化環構造上の第1のR1はメチル、第2環上の第2のR1はエチル、また第3環上の第3のR1はベンジル、という組み合わせでもよい。
【００９６】
本発明は別の例示的な実施態様で、式(II)で示される構造が式(IIa)
【００９７】
【化８】
2005500387.tif 000010
【００９８】
の構造である錯体を提供する。ただし式中の記号pは1〜3の整数を表わす。
【００９９】
本発明はさらに別の例示的な実施態様で、式(II)で示される構造が式(IIb)
【０１００】
【化９】
2005500387.tif 000011
【０１０１】
の構造である錯体を提供する。
【０１０２】
式(IIa)及び(IIb)で、p<3なら括弧外の窒素の原子価は置換又は非置換アルキル基か置換又は非置換ヘテロアルキル基による置換によって満たされる。アルキル又はヘテロアルキル基が置換体である場合、好ましい置換基は括弧内の構造とは異なる構造をもつキレート化部分である。p>1ならp個の環各々の上の各基は独立に選択される。置換基は式(II)の場合と同じである。
【０１０３】
本発明はさらに別の例示的な実施態様で、式(II)で示される構造が式(IIc)
【０１０４】
【化１０】
2005500387.tif 000012
【０１０５】
の構造である錯体を提供する。ただし式中の各置換基は実質的に式(II)の場合と同じである。式(IIc)に従うさらに別の実施態様では、R1はメチル基もしくは置換又は非置換ベンジル基である。例示的な実施態様でベンジル基が置換体であるあるとき、その置換基はアルコキシ基である。さらに別の実施態様では、R1とR2より選択される少なくとも1つの基は置換又は非置換C1-C4アルキル基たとえばメチル基である。別の実施態様では、少なくとも1つのR1はメチル基及びポリエーテル基より選択される。記号qは1〜2の整数を表わす。
【０１０６】
本発明はさらに別の実施態様で、式(II)で示される構造が式(IId)
【０１０７】
【化１１】
2005500387.tif 000013
【０１０８】
の構造である錯体を提供する。ただし式中の基は実質的に前記のとおりであり、各々独立に選択される。記号qは1〜2の整数を表わす。
【０１０９】
式(IIc)及び(IId)で、q<3なら括弧外の窒素の原子価は置換又は非置換アルキル基もしくは置換又は非置換へテロアルキル基との置換によって満たされる。該アルキル又はヘテロアルキル基が置換体の場合には、その好ましい置換基は括弧内の構造とは異なる構造をもつキレート化部分である。q>1なら各q個の環各々の上の各基は独立に選択される。置換基は式(II)の場合と同じである。
【０１１０】
合成
本発明は、前述の望ましい特性を備えた酸素配位の配位子の合成方法を提供する。本発明のホモ脚型配位子の合成は[Gd(TREN-1-Me-HOPO)(H2O)2](トリス[(3-ヒドロキシ-1-メチル-2-オキソ-1,2-ジデヒドロピリジン-4-カルボキサミド)エチル]アミン)の合成によって例示される。これはMRI造影剤として望ましい性質をもつ一連の複素環式(ピリドナート)酸素配位錯体の一番手にあたる(Xu, J. et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 7245)。TREN-1-Me-HOPOの合成方法をスキーム1に示す。
【０１１１】
【化１２】
2005500387.tif 000014
【０１１２】
スキーム1
スキーム1では、N-メチル-ヒドロキシピリジノン前駆体1をカルボキシル化して、対応する酸2を形成する。酸2のヒドロキシル基をベンジル付加体3として保護し、対応するチアゾリド4へと変換する。チアゾリドをTREN骨格と結合させて、5を形成し、それを接触水素化により脱保護して6を与える。この配位子を、塩基の存在下にガドリニウム・イオン源と結合させてガドリニウム錯体7を形成する。
【０１１３】
当業者には自明であろうが、前記の方法は他の骨格モチーフをベースにした配位子の合成にも通用する。さらに、該方法は配位子内のキレート化ユニットが親HOPOキレート化ユニットとは別の構造をもつ配位子の合成にも有用である。また、N-メチル前駆体はその非置換類似体で、又はメチル基以外の基たとえば置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換ヘテロアルキル基、もしくは置換又は非置換アリール基でN置換した類似体で、容易に代用される。
【０１１４】
ピリジノン・ユニットの環内窒素の官能化はスキーム2に記載の方法を用いれば容易である。
【０１１５】
【化１３】
2005500387.tif 000015
【０１１６】
スキーム2
保護基の付いたヒドロキシピリジノン・カルボン酸エステル8は種々の置換基をもつキレート化ユニットの合成中間体として用途が広い。そこで、一経路では8を各可能部位でベンジル化して化合物10を与える。別の経路では、環内アミンをベンジル化しないままで化合物9を与える。
【０１１７】
化合物9のエステルを加水分解して対応するカルボン酸11とした後、チアゾリド12へと変換する。チアゾリドにアミン骨格を結合して13を生成し、次いで脱ベンジル化して化合物14とする。Gd(酸)錯体15は標準方法で形成する。
【０１１８】
同様にして、化合物10にアミン骨格を結合した後、脱ベンジル化してヒドロキシル基を生成し、ガドリニウムキレート18を形成する。この経路はヘテロ脚型配位子たとえば19の形成及び環内窒素をベンジル基以外の基たとえば20で官能化した配位子の形成にもつながる。
【０１１９】
[Gd(TREN-MOE-HOPO)(H2O)2]は、メチル基以外の基でN-置換した配位子の代表的な実施態様である。この本発明配位子はHOPOキレート化部分を含むが、該部分はピリジノン部分の環内窒素をリンカー又は他の基で官能化してある(Johnson, A.R. et al., Inorg. Chem. 2000, 39, 2652-2660)。このMOE誘導体は水への溶解度が親錯体より10倍余りも大きい。さらに、[Gd(TREN-MOE-HOPO) (H2O)2]の安定度は親メチル誘導体のそれとほぼ同じであった(pGd=19.8)。
【０１２０】
テレフタルアミドを組み込んだ配位子
本書で規定した本発明キレートの足場とピリジン窒素とを官能化する方法に加えて、キレートを官能化して後に別の化学種に結合させ又は所望の特性が得られるようにする方法も提供される。該方法は足場に結合したTAM部分の遊離アミド基を利用する。TAM部分を官能化するのは足場に結合する前でも後でもよい。本発明の例示的な化合物の合成経路はHOPO及びTAMキレート化部分をTREN骨格に結合するものであるが、これをスキーム3に示す。
【０１２１】
【化１４】
2005500387.tif 000016
【０１２２】
スキーム3
スキーム3では、TREN骨格21を保護チアゾリド22と接触させて単一の遊離一級アミン基をもつ二置換TREN 24を生成する。化合物24を保護ジチアゾリドTAM誘導体23と接触させて活性化ヘテロ脚型配位子25を生成した後、アミンと反応させれば官能化へテロ脚型配位子27を形成することができる。
【０１２３】
代替経路では、保護ジチアゾリド23をアミンで官能化し、アミド26を生成した後、二置換TREN誘導体24と反応させてヘテロ脚型配位子27を生成する。
【０１２４】
本発明のTREN-HOPO-TAM化合物はスキーム3のいずれかの合成経路によって容易に合成される。TAMに使用する保護基はベンジル(Bn)のほうがすでに報告されているメチル基(Cohen, S.M. et al., Inorg. Chem. 2000, 39, 4339)よりも一般に好ましい。というのは脱保護条件がゆるいので、より広範囲の一級アミン(RNH2)との併用に対応しうるからである。特定アミン(RNH2)の反応条件の最適化は十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１２５】
混合配位子の他の例は次のとおりである:
【０１２６】
【化１５】
2005500387.tif 000017
【０１２７】
たとえばCohen, S.M. et al., Inorg. Chem. 39: 5747 (2000)を参照。R及びR’基は一般にH、置換又は非置換アルキル基、もしくは置換又は非置換ヘテロアルキル基である。例示的な実施態様ではR及び/又はR’は、エーテル又は反応性官能基を含む基である。
【０１２８】
さらに別の例示的な実施態様では、本発明は式(Ｉ)で示される化合物を提供するが、式中、R1、R2、R3及びR4は該化合物を他の化学種に結合することを可能にする反応性官能基などを含むリンカーアームである。あるいはR1、R2、R3及びR4は、その結合相手となる親化合物の特性、たとえば水への溶解度、分子量、回転相関時間、錯体安定度などを変えるような基である。
【０１２９】
代表的な実施態様では、R1、R2、R3及びR4の少なくとも1つは構造
【０１３０】
【化１６】
2005500387.tif 000018
【０１３１】
をもつ。ただしZ1はH、CH2、OR10、SR10、NHR10、OCOR11、OC(O)NHR11、NHC(O)OR10、OS(O)2OR10及びC(O)R11より選択される。記号R10はH、置換又は非置換アルキル基、もしくは置換又は非置換ヘテロアルキル基を表わす。R11はH、OR12、NR12NH2、SH、C(O)R12、NR12H、置換又は非置換アルキル基及び置換又は非置換ヘテロアルキル基より選択される。R12はH、置換又は非置換アルキル基及び置換又は非置換ヘテロアルキル基より選択される。XはCH2、O、S及びNR13より選択されるが、ただしR13はH、置換又は非置換アルキル基及び置換又は非置換ヘテロアルキル基より選択される。また記号j及びkは独立に1〜20の整数である。本発明化合物に有用な他の結合基は当業者には自明であろう。
【０１３２】
別の例示的な実施態様では、R1、R2、R3及びR4の少なくとも1つはエーテル又はポリエーテルであり、好ましくは、分子量が約60Da〜約10,000Da好ましくは約100Da〜約1,000Daのエチレングリコール及びエチレングリコール・オリゴマーより選択される。
【０１３３】
代表的なポリエーテル系置換基の非限定的な例は次の構造
【０１３４】
【化１７】
2005500387.tif 000019
【０１３５】
を含むが、式中、bは好ましくは1〜100の数である。他の官能化ポリエーテルは技術上周知であり、Shearwater Polymers, Inc.  (Alabama)の商品など市販品も多い。
【０１３６】
好ましい実施態様では、リンカーは本発明の化合物を別の分子又は表面に結合させる反応性官能基を含む。代表的かつ有用な反応性基については後でさらに詳しく述べる。有用な反応性基についての追加情報は公知である。たとえばHermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996を参照。
【０１３７】
さらに別の例示的な実施態様では、R1、R2、R3及びR4の少なくとも1つに結合する部分は前記の基のうち1以上の基の特性を兼ね備える。たとえば下記の好ましい一リンカー基
【０１３８】
【化１８】
2005500387.tif 000020
【０１３９】
はポリエーテルと反応性基の属性を兼ね備えるが、式中、jは1〜100の整数である。他の「二官能性」リンカー基の非限定的な例は糖(たとえば反応性ヒドロキシル基をもつポリオール)、アミノ酸、アミノアルコール、カルボキシアルコール、アミノチオールなどのような部分である。
【０１４０】
本発明化合物に有用なリンカーは切断可能な基を含んでもよい。例示的な実施態様では、切断可能な基はシグナル発生部分すなわち錯体とターゲッティング部分又は骨格の間に挿入する。
【０１４１】
・6-カルボキサアミド-2,3-メチル-5,4-ヒドロキシピリミジノン配位子の合成と特性
本発明はまた、新しい複素環式配位子系すなわち水素結合で安定化させたオキソヒドロキシ配位の二座配位子をベースにした錯体を提供する。例示的な実施態様では、この新しい複素環式配位子系はTREN-HOPO型配位子のピリミジノン類似体すなわちTREN-HOPY (HOPY=6-カルボキサミド-2,3-メチル-5,4-ヒドロキシピリミジノン)を利用する。TREN-HOPYのpKaは6.37であり、TREN-1-Me-HOPOのそれ(6.12)に近く、塩基性度はHOPYサブユニットのほうがやや高いことを示唆する。しかし[Gd(TREN-HOPY)(H2O)2]のpGdは許容範囲内の18.0である。同様に重要なことに、TREN-HOPYは生理的陽イオンCa(II)及びZn(II)に比した場合のGd(III )に対する選択性がTREN-1-Me-HOPOとほぼ同じである。
【０１４２】
[Gd(TREN-HOPY)(H2O)2]の水への溶解度は0.1M超である。これは他のHOPO系錯体のそれよりもずっと高いし、またこの錯体の意外な特徴でもある。[Gd(TREN-HOPY)(H2O)2]の水中での緩和度は20MHz、25℃、pH 7.2の条件下で9.0mM-1s-1であり、[Gd(TREN-HOPO)(H2O)2]のそれに匹敵し、また市販MRI造影剤を著しく上回る。298Kで2nsという短い水滞留時間はHOPO及びヘテロ脚型系列の錯体に匹敵し、またHOPY錯体の緩和度が遅い水交換反応速度による制限を受けないことを示唆する。[Gd(TREN-HOPY)(H2O)2]の回転相関時間はDOTA及びDTPA Gd(III )錯体のそれを約50%上回る。
【０１４３】
好ましい実施態様では、[Gd(TREN-HOPY)(H2O)2]などのようなキレートの緩和度は内在性陰イオンの存在下では本質的に一定であり、これは一般に、配位圏の完全性が維持され、2個の水分子が押しのけられないことを示唆する。
【０１４４】
[Gd(TREN-HOPY)(H2O)2]の血清中、298Kでの緩和度は純水中での緩和度を著しく(20MHzで約35%)上回る。これは錯体とHSAとの弱い相互作用(Kaが約100M-1)のためである(結果的にτrは大きくなる)。[Gd(TREN-HOPY)(H2O)2]はこうした大いに望ましい特性を備えるため、高緩和度の高分子MRI造影剤の有力候補となる。
【０１４５】
・HOPYモチーフをもつ化合物の合成
HOPYモチーフをもつ化合物の合成については他の複素環系の研究における予想外の生成物としてではあるが、すでに報告されている[Culbertson, T.P., J. Heterocyclic Chem., 16:1423 (1979); Golankiewicz, K., Wyrzykiewicz, E., Roc. Chem. Ann. Soc. Chim. Pol., 47:1965 (1973); Budesinsky et al., J. Coll. Czec. Chem. Comm., 27:2550(1963)]。しかし種々の問題−再現精度[Budesinsky et al., J. Coll. Czec. Chem. Comm., 27:2550 (1963)]、分取へのスケールアップ [Golankiewicz, K., Wyrzykiewicz, E., Roc. Chem. Ann. Soc. Chim. Pol., 47:1965 (1973)]又は基質特異性(一般的な合成法の開発を不可能にする)[Culbertson, T.P., J. Heterocyclic Chem., 16:1423(1979); Golankiewicz, K., Wyrzykiewicz, E., Roc. Chem. Ann. Soc. Chim. Pol., 47:1965(1973)]−は新しい合成経路の必要を浮き彫りにしている。
【０１４６】
本発明では、所望の種類の官能化HOPYの合成を、28が報告されているDavollとLaneyの5,4-ヒドロキシピリミジノン合成法[Davoll, J., Laney, D.H., J. Chem. Soc., 2124 (1956)]の改良及び拡張により実現する(スキーム4)。
【０１４７】
【化１９】
2005500387.tif 000021
【０１４８】
スキーム4
テトラヒドロピラン(THP)保護グリコール酸エチルを自己縮合させて[Davoll, J., Laney, D.H., J. Chem. Soc., 2124(1956)]、対応するβ-ケトエステルとし、それをエタノールに溶解したアセトアミジンとin situで結合させて28を与える。28の1H及び13C NMRスペクトルは、それが2つのジアステレオマーの等量混合物であり、2つのTHPアセタール炭素のキラリティーに由来することを示している。28のNaH/MeI/DMFによるメチル化は[Jonak et al., J. Org. Chem., 35:2512 (1970)]純度90%超の濃厚油30を与える。30を脱保護(4M HClジオキサン/2-プロパノール)して、純粋な31・HClとし、もって油性前駆体31の再精製の必要を緩和する。5-ヒドロキシル基の再保護(BnCl/K2CO3/DMF)は32を与える。
【０１４９】
化合物32は、アミド基の電子的、構造的影響を無用とする含HOPY多座配位子の合成における有用な中間体である。
【０１５０】
相間移動条件下での漂白剤/TEMPO触媒による32の酸化[Anelli et al., J. Org. Chem., 52:2559 (1987)]と粗反応抽出物の慎重な酸性化により、分析的に純粋な33を得た。例示的な実施態様では、本発明は含HOPYキレートの合成経路を提供するが、該経路は主要な配位子前駆体のHOPYカルボン酸33の調製でクロマトグラフィーを必要としない。
【０１５１】
スキーム5に示すような33の第2合成経路も開発した。
【０１５２】
【化２０】
2005500387.tif 000022
【０１５３】
スキーム5
シュウ酸エチルと2-ベンジルオキシベンジルアセタートのClaisen縮合反応生成物をアセトアミジン/エタノールと反応させて34を与えた。前記の方法(NaH/MeI/DMF)によるN-メチル化でN3アルキル化異性体35を与え、加水分解してHOPY酸33とした。
【０１５４】
別の例示的な実施態様(スキーム6)では、(スキーム5由来の)36から37を(次いで38を)合成した。
【０１５５】
【化２１】
2005500387.tif 000023
【０１５６】
スキーム6
36をCDIで活性化エステルへと変換し、次いで適当なアミンと反応させると収率70〜90%で37a〜37cが得られた(スキーム6)。ベンジル保護基の除去と再結晶により、分析的に純粋な白色固形物として遊離配位子38が得られた。TrenHOPY 38a、N-EtHOPY 38b及びN-Me2HOPY 38cはこの方法で合成した。
【０１５７】
本発明では、配位子はHOPYキレート化部分だけを特定の足場に結合させて含んでもよい。あるいはHOPYサブユニットを特定骨格上のHOPO及び/又はTAMキレート化ユニットと結合させて、一連の混合配位子としてもよい。さらに、HOPOサブユニットと同様にHOPYサブユニットを随意に1以上のリンカーアーム又は反応性官能基で誘導体化してもよい。
【０１５８】
足場
本明細書では終始、本発明の錯体を、1以上の複素環式錯形成基を線状の多官能性足場に結合して、金属イオンを錯化する適正な幾何形状を備えたキレート剤を生成するような実施態様で例示している。一般に、本発明の錯体及びキレート剤に有用な足場はTRENをもって例示している。TREN足場に焦点を合わせるのは、説明の明快を期すという趣旨にすぎず、TREN骨格をもつキレート剤及び錯体に本発明の範囲を限定するものと解してはならない。当業者には自明であろうが、多様な足場構造が本発明化合物の足場部分として使用可能である。たとえば本発明に有用な足場は線状、環状、飽和又は不飽和いずれの化学種でもよい。足場部分の若干の例は次のとおりである:
【０１５９】
【化２２】
2005500387.tif 000024
【０１６０】
さらに、他分子上の基と相互作用させうるような部分で官能化して足場を利用することも本発明の範囲内である。従って、足場の例には足場とキレート化複素環式環の間の結合に使用されるものだけでなく、後述の反応性官能基をも含めることができる。
【０１６１】
TREN足場の官能化
別の例示的な実施態様では、本発明錯体の水への溶解度を適正な基による足場の官能化によって高める。たとえばTREN-1-Me-HOPOの水への溶解度を、TRENキャップを官能化してホモキラルなトリス(2-ヒドロキシメチル)-TREN-1-Me-HOPOを形成させることにより高めるという合成方法が開発されている(Hajela, S.B. et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 11228)。
【０１６２】
本発明は例示的な実施態様で、Gd(III )錯体[Gd(SerTREN-1-Me-HOPO)(H2O)2]を提供する(図7)。該錯体は水への溶解度が約15mM (25℃、pH 7)であり、プロトン緩和度(rl)が現在のモノアクアMTI造影剤のそれを著しく上回る9.0mM-1s-1(25℃、20MHz)である。重要なことに、水滞留寿命(τm)は極端に短く(14ns)、市販MRI造影剤よりも少なくとも2桁以上短い。こうした水交換速度は低速回転MRI造影剤では最適に近い。Gd(III )陽イオンは基底状態では8配位であるため、この水交換機構は会合機構で説明がつくと期待される(Helm, L. et al., Coord. Chem. Rev. 1999, 187, 151)。観測された高速水交換は8配位状態と9配位状態の間のわずかなエネルギー差に起因する。従ってDOTA及びDTPA誘導体とは違って、TREN-1-Me-HOPO誘導体の緩和度は低速水交換による制限を受けない。
【０１６３】
図8に示すように、足場上の置換基は実質的に任意の基でよい。その非限定的な例は反応性置換基、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換ヘテロアルキル基、もしくは置換又は非置換アリール基である。
【０１６４】
さらに別の例示的な実施態様では、配位子骨格はエーテル又はポリ(エーテル)好ましくはエチレングリコールのオリゴマーを含む。例示的なエーテル誘導体化骨格の合成スキームをスキーム7に示す:
【０１６５】
【化２３】
2005500387.tif 000025
【０１６６】
スキーム7
スキーム7では、保護基のついたチロシン誘導体39をフェノール酸素の位置でハロゲン化アルキレングリコールによりアルキル化してエーテル40を形成する。40のエステル基を加水分解して酸41を与え、そのカルボニル基を還元してCH2として42を与える。化合物42のヒドロキシル基をNaOClの作用で酸化して、対応するアルデヒドとし43を与える。三量体44を、Schiff塩基を形成することにより合成し、次いでそれを対応するアミンへと還元する。BOC保護基の除去によりアミン足場45が得られる。
【０１６７】
当業者には自明であろうが、前記の経路は側鎖をもつアミノ酸(システイン、グルタミン酸、リシン、セリンなど)並びに他の非アミノ酸化学種を非限定的に含む実質的に任意の置換基で実施することができる。
【０１６８】
反応性官能基
前述のように、本発明の錯体は他化学種に、配位子上の反応性官能基又は配位子に結合したリンカーと該他化学種上の相補反応性をもつ反応性官能基との間の結合を介して、固定化する。明快を期す意味で以下の説明では本発明の代表的な配位子及び錯体の、ポリ(エーテル)やデンドリマーを含むポリマーとの、また血液プール像用のターゲティング物質との結合を中心に取り上げる。そこでは本発明の特定の実施態様を例示するが、そこから他実施態様を推察することは当業者には容易である。説明の中心が代表的な実施態様になるとしても、それは本発明の限定を示唆するものではない。
【０１６９】
本発明の例示的な配位子及び錯体は他化学種への結合を容易にするような反応性官能基をもつが、その位置は一般に足場上、もしくは足場に結合した置換又は非置換アルキル又はヘテロアルキル鎖上又はキレート化部分上である。反応性基の好都合な位置は分子鎖の末端である。
【０１７０】
本発明の実施に際して有用な反応性基及び反応タイプは一般にバイオコンジュゲート技術の分野では周知のものである。反応性配位子類似体に対して有効な目下の好ましいタイプの反応は比較的穏やかな条件の下で進行する反応である。その非限定的な例は求核置換反応(アミン及びアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応など)、求電子置換反応(エナミン反応など)、及び炭素-炭素及び炭素-ヘテロ原子多重結合への付加反応(Michael反応、Diels-Alder反応など)である。これらや他の有用な反応を論じた文献の例はMarch, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996;及びFeeney et al., Modification of Proteins, Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982などである。
【０１７１】
例示的な反応タイプは、カルボキシル基及びその多様な誘導体(非限定的な例はN-ヒドロキシスクシンイミド=エステル、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール=エステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、n-ニトロフェニル=エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル及び芳香族エステルなど)の反応である。ヒドロキシル基はエステル、エーテル、アルデヒドなどに変換することができる。ハロアルキル基はたとえばアミン、カルボン酸陰イオン、チオール陰イオン、カルバニオン又はアルコキシドイオンなどと反応させて新化学種に変換する。ジエノフィル(たとえばマレイミド)基はDiels-Alder反応に関与する。アルデヒド又はケトン基はGrignard付加反応又はアルキルリチウム付加反応などの機構を介してイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン又はオキシムへと変換することができる。ハロゲン化スルホニルはアミンと容易に反応し、たとえばスルホンアミドを形成する。アミン又はスルフヒドリル基はたとえばアシル化、アルキル化又は酸化される。アルキレンは付加環化、アシル化、Michael付加反応などによって一連の新化学種へと変換することができる。エポキシドはアミン及びヒドロキシル化合物と容易に反応する。
【０１７２】
本発明配位子上に見られる反応性官能基とターゲティング部分(もしくはポリマー又はリンカー)上に見られる反応性官能基との例示的な組み合わせをTable 2に示す。
【０１７３】
【表２】
2005500387.tif 000026
【０１７４】
当業者には自明であろうが、これらの結合は多様な方法及び条件によって形成させうるものも多い。それがたとえばエステルなら前掲March, p.1157を、チオエステルなら前掲March, pp. 362-363, 491, 720-722, 829, 941及び1172を、炭酸なら前掲March, pp.346-347を、カルバミン酸なら前掲March, 1156-57を、アミドなら前掲March, p.1152を、ウレア及びチオウレアなら前掲March, p.1174を、アセタール及びケタールなら前掲Greene et al., pp.178-210及び前掲March, p.1146を、アシルオキシアルキル誘導体ならProdrugs: Topical and Ocular Drug Delivery, K.B. Sloan, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1992を、エノールエステルなら前掲March, p.1160を、Ｎ-スルスルホニルイミド酸ならBundgaard et al., J. Med. Chem., 31:2066 (1988)を、無水物なら前掲March, pp.355-56, 636-37, 990-91及び1154を、N-アシルアミドなら前掲March, p.379を、N-Mannich塩基なら前掲March, pp.800-02及び828を、ヒドロキシメチルケトン=エステルならPetracek et al. Annals NY Acad. Sci., 507:353-54 (1987)を、ジスルフィドなら前掲March, p.1160を、それぞれ参照。またホスホン酸エステル及びホスホンアミド酸についても同様である。
【０１７５】
反応性官能基は反応性配位子類似体の集成に必要な反応に関与しない、又は該反応を妨げないものを選択することができる。あるいは反応性官能基を該反応に関与しないように保護基で保護してもよい。選択された一群の反応条件を妨げないように特定の官能基を保護するための方法は当業者には自明であろう。有用な保護基の例はGreene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, New York, 1991を参照。
【０１７６】
一般に、配位子とターゲティング(又は他)物質及び随意にリンカー基の間の結合を形成する前に、少なくとも1つの官能基を活性化させることになろう。当業者には自明であろうが、多様な官能基たとえばヒドロキシル、アミノ及びカルボキシル基などを多様な標準方法及び条件で活性化させることができる。たとえば配位子(又はターゲティング物質)のヒドロキシル基をホスゲンで処理し、対応するクロロホルマートを、又はp-ニトロフェニルクロロホルマートを形成させ、次いで対応する対応する炭酸塩を形成させるようにして活性化してもよい。
【０１７７】
本発明は例示的な実施態様で、カルボキシル基を含むターゲティング物質を利用する。カルボキシル基はたとえば対応するハロゲン化アシル又は活性エステルへの変換により活性化してもよい。この反応は前掲March, pp.388-89で示されているような多様な条件下で行うことができる。例示的な実施態様では、カルボキシル基をもつ基を塩化オキサリルと反応させハロゲン化アシルを形成させる。この活性化物質を配位子又は配位子-リンカーアーム結合体と結合させて本発明のコンジュゲートとする。当業者には自明であろうが、カルボキシル基をもつターゲティング物質の使用は例示にすぎず、他の多数の官能基をもつ物質を本発明の配位子に結合させることも可能である。
【０１７８】
高分子錯体
本発明は例示的な実施態様で、高分子すなわちMW>1000Daである本発明Gd(III )錯体を提供する。一実施態様では、反応性官能基を介して錯体を高分子に共有結合させて本発明の高分子錯体をコンジュゲートとして形成する。別の実施態様では、錯体と高分子たとえば血清タンパク質の間の非共有相互作用によって該高分子錯体を形成する。
【０１７９】
以下、ホモ脚型及びヘテロ脚型の配位子及びキレートのポリ(エチレングリコール)付加体を引き合いにしながら本発明を説明する。当業者には自明であろうが、ポリ(エチレングリコール)付加体を中心に取り上げるのは説明を分かりやすくするためであって、本発明の範囲を限定するものではない。たとえば本発明は生体分子と合成分子に由来する成分を含む高分子錯体を提供する。生体分子の例はポリペプチド(抗体、酵素、受容体、抗原など)、多糖(でんぷん、イヌリン、デキストランなど)、レクチン、非ペプチド抗原などである。合成ポリマーの例はポリ(アクリル酸)、ポリ(リシン)、ポリ(グルタミン酸)、ポリ(エチレンイミン)などである。
【０１８０】
・共有結合によるコンジュゲート形成
所望の高分子化学種を形成させるための本発明錯体上の適切な反応性官能基の選択は当業者には十分可能である。本発明の共有結合コンジュゲートを形成するうえで有用な反応性官能基の例は前述のとおりである。コンジュゲート形成のための結合相手がもつ反応性基に対して相補反応性を有する適切な反応性官能基をもつ本発明配位子の選択及び合成は当業者には十分可能である。
【０１８１】
一実施態様では、高分子と錯体の両反応性官能基の間に形成される結合は配位子を高分子に、両構成部分間の「安定結合」を介して本質的に不可逆的に結合する。「安定結合」は本書では、広範囲の条件にわたりその化学的完全性を維持する(たとえばアミド、カルバミン酸、炭素-炭素)結合である。別の実施態様では、高分子と錯体は「切断可能な結合」によって結合される。「切断可能な結合」は本書では、特定の条件下で切断をこうむるような結合である。切断可能な結合の非限定的な例はジスルフィド、イミン、カルボン酸及びエステル結合である。前述のように、反応性官能基の位置は足場の1以上の位置及び/又はキレート化環構造上の1以上の位置とすることができる。
【０１８２】
・高分子コンジュゲート
本発明はまた、本発明のキレート剤及び錯体と線状、分岐及び環式ポリマーたとえば多糖、ポリ(アミノ酸)、シクロデキストリン、合成ポリマーなどとのコンジュゲートを提供する。
【０１８３】
・緩和度を高めた高分子錯体
プロトン緩和度最適化の有力経路では、錯体の分子量を大きくして結果的に溶液中での分子の回転を遅くすることにより回転相関時間τrが長くなるようにする。その実現には様々な方法が採用されてきた。いくつかのグループがDTPAをポリマーたとえばポリリシン、ポリ(エチレングリコール)又はポリデキストランに結合させたポリマー系造影剤を研究している(Dresser, T.R. et al., J. Magn. Reson. Imaging 1994, 4, 467; Toth, E.H. et al., Chem. Eur. J. 1999, 5, 1202; Corot, C.S. et al., D. Acta Radiologica 1997, 38, 91)。これらのポリマー系造影剤では一般に緩和度の(小幅な)改善が認められるが、それは使用ポリ(アミノカルボン酸)キレートに由来するポリマー分子鎖内の速い局所運動と遅い水交換とを反映するものである。その種の系は血液プール画像用として、特に心筋血流用の静脈内MRI造影剤として研究されている(Casali, C.J. et al., Acad. Radiol. 1998, 5, S214)。
【０１８４】
・多糖
本発明は酸素配位の配位子と糖類たとえば多糖とのコンジュゲートを提供する。本発明は例示的な実施態様で、酸素配位のキレートとイヌリンとのコンジュゲートを提供する。イヌリンは天然多糖であり、(DTPA及びDOTA誘導体を使用する)Gd(III )キレート用の担体として研究されてきた(Rongved, P.K., J. Carbohydr. Res. 1991, 214, 315; Corsi, D.M.V.E. et al., Chem. Eur. J. 2001, 7, 64)。37 [Gd(DO3ASQ](SQ=スクアリン酸)ユニットの25鎖長イヌリン・ポリマーへの結合が最近報告された(Corsi, D.M.V.E. et al., Chem. Eur. J. 2001, 7, 64)。これはτrを約9倍(735ns)に伸ばし、結果として20.3mM-1s-1(@ 20MHz、37℃)の緩和度をもたらす効果があった。ほとんどのDTPA及びDOTA誘導体の場合と同様に、緩和度の改善はきわめて遅いτm(この場合は260ns)によって制約された。
【０１８５】
イヌリンの構造は末端にα-D-グルコピラノシル・ユニットをもつの線状β-(2→1)-結合α-D-フルクトフラノシル鎖の混合体である。種々の分子量のイヌリンが市販されており、その重合度10〜30に応じて1500〜5000Daの分子量分布となる。イヌリンは高親水性、pH安定度、低溶液粘度及び生体適合性であり、そのコンジュゲートMRI造影剤が優れた薬理学的特性をもつのは確実である。
【０１８６】
例示的な実施態様ではイヌリンをTREN-HOPO足場に結合させる。該結合は、HOPY部分の環内窒素に結合させたカルボン酸誘導体の活性化中間体を使用して形成させる。他の形態の結合も当業者には十分可能である。たとえば類似の分子の合成は、HOPO-TAM部分を使用して、TMA部分のアミド基を活性化し、次いでイヌリンに結合させれば容易である。
【０１８７】
【化２４】
2005500387.tif 000027
【０１８８】
スキーム8
スキーム8はTREN-6-Me-HOPOをイヌリン骨格に結合させる例示的な合成経路である。該高分子鎖は柔軟な構造なので、高置換度の誘導体の合成を可能にし、もってGd(III )錯体の堅牢性の向上を容易にする。
【０１８９】
本発明には、ポリマー骨格と本発明のキレート化配位子の結合相手となる少なくとも1つの官能基とをもつキレート剤の合成方法も含まれる。好適なポリマーの非限定的な例はポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)、アガロース(“Affi-Gel”; Bio-Rad Corp., Richmond, CA)及びポリアクリルアミドである。当業者には自明であろうが、本発明の方法は特定の骨格化学種に限定されるものではなく、本発明の方法の実施にはアミノ基、ヒドロキシル基及びスルフヒドリル基をもつ多数の化合物が骨格として有用である。
【０１９０】
・デンドリマー系造影剤
本発明は別の態様で、前述のような金属キレートであって、反応性官能基を介してデンドリマーに結合させた金属キレートを提供する。前述のポリマーと似たように、該デンドリマーは少なくとも2つの官能基をもつ。一実施態様では、1以上の配位子を完全に集成したうえでデンドリマーに結合させる。あるいはキレートをデンドリマー上で直接形成させる。
【０１９１】
デンドリマーは線状ポリマーと異なり比較的堅牢な構造を有し、また分子の全体的な回転がGd-Hベクトルの回転相関時間に著しく寄与する。Gd(III )キレート-デンドリマーの高単分散性、最小限の形状変動及び表面の均一な化学的性質もまたMRI造影剤としてのその潜在用途には重要な特徴である(Krause, W. et al., Top. Curr. Chem. 2000, 210, 261)。回転相関時間はデンドリマーの高世代化に伴って増すものの、プロトン緩和度の上昇はやがて頭打ちになる。これはGd(III )DTPA-及びDOTA-系コンジュゲートに固有の遅い水交換(τm)に起因する効果である(Toth, E. et al., Chem. Eur. J. 1996, 2, 1607)。そのためデンドリマー・コンジュゲートに関する緩和度の報告値はキレートの性質とデンドリマーの構造に応じてGd(III )中心原子あたり11〜36mM-1s-1の範囲となっている(Dong, Q.H. et al., Invest. Radiol. 1998, 33, 699; Wiener, E.C.B. et al., Magn. Reson. Med. 1994, 31, 1; Adam, G. et al., Magn. Reson. Imaging 1994, 4, 462; Margerum, L.D. et al., J. Alloys Compd. 1997, 249, 185; Bryant, L.H. et al., In Proceedings of the 6th International Society of Magnetic Resonance in Medicine Conference: Sydney, Australia, 1998)。
【０１９２】
Gd(III )-キレート-デンドリマー・コンジュゲートは緩和度が増しているが、それは堅牢な球状構造(τrを遅くする効果がある)に由来する。EPR効果(Enhanced Permeation and Retention Effect)によれば、高分子量の高世代デンドリマーは腫瘍細胞によって優先的に取り込まれるはずである(Narayanan, V.V. et al., Macromolecules 2000, 33, 3944; Wiener, E.C. et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7774; Maeda, H. et al., J. Controlled Release 2000, 75, 271; Malik, N. et al., J. Controlled Release 2000, 65, 133)。しかし以前の研究から、高分子錯体の溶解度はGdキレートの特性とデンドリマー自体の両方に依存することが判明している(Cohen, S.M. et al., Chem. Eur. J. 2000, 6, 2)。高水への溶解度のPAMAMデンドリマーを疎水性1-Me-HOPOで官能化すると不溶性化合物が生成した。
【０１９３】
例示的な実施態様では、水溶性の、生体に適合させたポリエステル(ポリプロピオン酸)タイプのデンドリマー造影剤を設計して有利な薬物動態特性を付与するようにした。たとえばIhre, H. et al., Macromolecules 1998, 31, 4061; Ihre, H. et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6388; Anders, H., Ihre, H.スウェーデン特許W0/9900440号明細書を参照。例示的な実施態様では、デンドリマーの末端を本発明の酸素配位の配位子たとえばTREN-1-Me-HOPO-TAMに結合する。デンドリマーはチアズ活性化酸素配位型配位子たとえば活性化TREN-1-Me-HOPO-TAM配位子で容易に官能化した後、Gd3+との錯形成に回す(Dong, Q.H. et al., Invest. Radiol. 1998, 33, 699)。
【０１９４】
・PEG官能基を含むキレート剤
本発明は別の実施態様で、式(Ｉ)で示される構造を含む錯体を提供する。ただし式中、R1、R2、R3及びR4のうちの少なくとも1つはポリ(エチレングリコール)から誘導した部分を含む。本発明は例示的な実施態様で、TREN-1-Me-HOPO-TAMの誘導体たとえばGd-TREN-bis-(1-Me-HOPO)-(TAM-PEG-2000) (46)及びGd-TREN-bis-(1-Me-HIPO)-(TAM-PEG-5000) (47)を提供する。平均分子量450のPEGをもつ錯体もまた調製された。
【０１９５】
前記の例示的な実施態様では、平均分子量がそれぞれ2000及び5000のPEG部分をTREN-bis-(1-Me-HOPO)-(TAM)のTAM部分のアミド基に結合させた。両錯体は水への溶解度が高く、水滞留寿命(τm)をH217Oの横緩和速度に関する温度可変17O NMRで決定することを可能にした。重要なことに、τmはPEG鎖の伸長につれて伸び、その値はTREN-bis-(1-Me-HOPO)-(TAM)、Gd-TREN-bis-(1-Me-HOPO)-(TAM-PEG-450) (48)、Gd-TREN-bis-(1-Me-HOPO)-(TAM-PEG-2000) (46)、Gd-TREN-bis-(1-Me-HIPO)-(TAM-PEG-5000) (47)でそれぞれ約8±1、10±1、19±2、31±2 nsであった(図9)。これらの値は、プロトン緩和度の極大値を実現するうえで最適と考えられる範囲にまたがる。τmの最適値はいくつかの変数特にMRIスキャナー装置の磁場強度に依存する。従ってHOPO-TAM配位子にPEG鎖を組み込むと、MRI造影剤を特定の磁場強度に合わせて最適化する方法がもたらされる。
【０１９６】
【化２５】
2005500387.tif 000028
【０１９７】
本発明の方法はτmを体系的に変化させるだけでなく、MRI造影剤に関連する追加のパラメーターを最適化する。たとえばコア錯体の緩和度は錯体のPEGによる置換によって増大させる(図10)。
【０１９８】
当業者には自明であろうが、本発明はPEG部分をTREN-bis-(12-Me-HOPO)-(TAM)のTAM部分のアミド基以外の位置に結合させた化合物をも提供する。たとえばPEG部分はピリミジノン部分の環内窒素又は別の位置、別のキレート化部分、足場、又はこれらの位置の組み合わせに結合してもよい。
【０１９９】
ポリエチレングリコール(PEG)は生物工学や生物医学の用途分野で使用されている。この物質の用法についてはすでに概説がある[Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris, Ed., Plenum Press, New York, 1992]。PEGの用法に関する最近の進歩例は酵素の修飾[Chiu et al., J. Bioconjugate Chem., 4:290-295 (1993)]、RGDペプチド[Braatz et al., Bioconjugate Chem., 4:262-267 (1993)]、リポソーム[Zalipsky, S., Bioconjugate Chem., 4:296-299 (1993)]及びCD4-IgG糖タンパク質[Chamow et al., Bioconjugate Chem., 4:133-140 (1993)]などである。PEGによる表面処理はタンパク質の沈着を阻止し、また血液と接触する生体材料に適用した場合には抗血栓形成性が高まると判明している[前掲Harris編 Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, pp. 199-220所載のMerrill, “Poly(ethylene oxide) and Blood Contact: A Chronicle of One Laboratory”]。
【０２００】
本発明キレートをポリマー又はオリゴマー化学種に結合させるには多数の経路が利用可能である。たとえばDunn, R.L. et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991; Herren et al., J. Colloid and Interfacial Science 115:46-55 (1987); Nashabeh et al., J. Chromatography 559:367-383 (1991); Balachandar et al., Langmuir 6:1621-1627 (1990);及びBurns et al., Biomaterials 19: 423-440 (1998)を参照。
【０２０１】
多数の活性化ポリ(エチレングリコール)誘導体が市販され、また文献で紹介されている。本発明に有用な担体の調製材料として好適な活性化PEG誘導体の選定及び(必要なら)合成は当業者には十分可能である。以下の文献を参照。Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186 (1984); Abuchowski et al. J. Biol. Chem., 252:3582-3586 (1997); Jackson et al., Anal. Biochem., 165:114-127 (1987); Koide et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 111: 659-667 (1983)。トレシル化物(tresylate)についてはNilsson et al., Methods Enzymol., 104:56-69 (1984); Delgado et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 12:119-128 (1990)、N-ヒドロキシスクシンイミド誘導活性化エステルについてはBuckmann et al., Makromol. Chem., 182:1379-1384 (1981); Joppich et al., Makromol. Chem., 180:1381-1384 (1979); Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186 (1984); Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:1487-1491 (1987); Kitamura et al., Cancer Res., 51:4310-4315 (1991); Boccu et al., Z. Naturforsch., 38C:94-99 (1983)、炭酸エステルについては前掲Harris編Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, pp.347-370所載のZalipsky et al.; Zalipsky et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 15:100-114 (1992); Veronese et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141-152 (1985)、ギ酸イミダゾリルについてはBeauchamp et al., Anal. Biochem., 131:25-33 (1985); Berger et al., Blood, 71:1641-1647 (1988)、4-ジチオピリジンについてはWoghiren et al., Bioconjugate Chem., 4:314-318 (1993)、イソシアン酸エステルについてはByun et al., ASAIO Journal, M649-M653 (1992)、またエポキシドについてはNoishiki et al.の米国特許(1989)第4,806,595号明細書を参照。他の結合基の例はアミノ基と活性化PEGの間のウレタン結合などである。Veronese et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 11:141-152 (1985)を参照。
【０２０２】
PEG基を選好する理由は2つある。第1に、PEG鎖に関連する高水への溶解度は親錯体のどちらかと言えば低い溶解度を高める。第2に、PEG鎖内の速い内部運動はτrの小幅な上昇をもたらすにすぎないことは判明していたものの(Toth, E. et al., Magn. Reson. Chem. 1998, 36, S125)、PEG鎖は広いpH範囲にわたってHSAに結合しうることも証明済みである(Azegami, S.T. et al., Langmuir 1999, 15, 940)。HSA錯体に関する(GdIII 中心原子あたりでは)緩和度の観測値はこれまでに報告された他のどの誘導体よりもかなり高い。これは最適化された水交換速度と遅い回転相関時間とを反映している。そこで、本発明ではτrと緩和度の上昇を引き起こすこの非共有相互作用を利用した。
【０２０３】
生体特異的な造影剤
組織/器官特異性を高めたMRI造影剤の開発は磁気共鳴画像法の将来を大きく左右するとみられる(Caravan, P.E. et al., Chem. Rev. 1999, 99, 2293)。造影剤の特異性を高める方法の非限定的な例は造影剤[たとえば酸素配位の配位子とGd(III )との錯体]のシグナル発生部分を、該錯体を特定組織へと能動的に導くような化学種に結合させる方法などである。そうした活性物質の例は生物学的に関連する受容体に対応した抗体及びリガンドである。造影剤の生体分布を改善する別のアプローチは、生物学的に関連する化学種たとえば血清タンパク質と受動的(非特異的)に相互作用するような物質の調製に依存する。さらに別の戦略では、損傷又は病変組織が高分子物質を優先的に取り込むようになる透過性及び吸収機構の変質を利用する。
【０２０４】
本発明は例示的な実施態様で、in vivoで血清タンパク質に結合する物質を、従って血液プール造影剤を提供する。本発明の酸素配位の配位子-金属錯体と血清タンパク質の間の相互作用からは第2の利点が生じる。すなわち該錯体の回転相関時間が長くなり、該錯体の緩和度の上昇を招く(Lauffer, R.B., Magn. Reson. Med. 1991, 22, 339)。
【０２０５】
Gd(III )錯体は高分子とin vivo結合することにより、高分子並みの回転相関時間をとることが可能になり、緩和度の劇的な上昇を招く。またこの結合は生体分子の局在化領域のGd(III )錯体濃度及び滞留を改善する。さらに、結合錯体の緩和度は非結合錯体のそれを大きく上回るため、高ターゲット-バックグラウンド比につながる。
【０２０６】
錯体MS-325は血液タンパク質であるヒト血清アルブミン(HSA)と非共有付加体を形成する(Parmalee, D.J.W. et al., Invest. Radiol. 1997, 32, 741; Lauffer, R.B.P. et al., Radiology 1998, 207, 529)。形成されるHSA付加体の緩和度は42.0mM-1s-1であり、遊離錯体の水中でのin vitro緩和度(6.6 mM-1s-1)の7倍近い。MS-325は目下、心血管系画像診断についての第II及びIII 相臨床試験中である。他の高分子をターゲットとするような錯体も設計されてきた。たとえばGd-BOPTAは肝胆道の画像化を容易にするために肝細胞をターゲットとするよう設計された(Cavanga, F.M. et al., Invest. Radiol. 1997, 32, 780)。このMRI造影剤は緩和度が水中で4.4mM-1s-1、ラット血漿中で6.9 mM-1s-1、ラット肝細胞中で30 mM-1s-1である。
【０２０７】
MS-325やGd-BOPTAなどのような第2世代造影剤の成功にもかかわらず、達成された緩和度と理論的に可能な最大緩和度の間にはなおかなりの開きがある。その主な理由はGd(III )中心原子での低水交換速度にある。最適水滞留時間(τm)は数十ナノ秒と推定されており(Aime, S.B. et al., Chem. Soc. Rev. 1998, 27, 19)、その厳密な値はMRIスキャナーの磁場強度など、いくつかの変数に依存する。市販造影剤の水滞留寿命は一般に100〜1000nsであり、最適値よりもずっと長い。これは高速回転する低分子の緩和度をそれほど制限することはないが、その効果は回転相関時間の長い高分子ではずっと大きくなる(Toth, E.H. et al., Chem. Eur. J. 1999, 5, 1202)。使用中又は開発中の高分子造影剤はどれも、同じ基本的なDTPA、DTPA-BMA又はDOTAキレートを使用しており、遅い水交換と比較的低いプロトン緩和度という結果になっている。
【０２０８】
本発明は高水交換速度(すなわち好ましくは低ns領域のτmとτr)を特徴とする低速回転のGd(III )錯体を提供する。本発明はまた、特定身体部位の生理的異常の、現在可能となっているよりも長い時間にわたる診断を容易にするような、好ましいin vivo持続性を備えたMRI造影剤を提供する。生体分子親和性τm及びτrを最適化する場合、他の本質的特質(安定度や水への溶解度など)を低下させてはならない。従って、本発明の主題である新規のMRI造影剤はより優れた形態学的、機能的情報を備えた画像をもたらす結果となるような必須の構造的特徴を含む(Comblin, V. et al., Coord. Chem. Rev. 1999, 185-186, 451)。
【０２０９】
例示的な実施態様では、本発明の錯体は内在生体分子との非共有相互作用を容易にするような置換基を、酸素配位の配位子コアに共有結合させて含む。低速回転の高分子を造影剤に結合させれば、診断の特異性を高めると同時に、緩和度の劇的な上昇につながるようにin vivo回転相関時間を長くすることが可能になる。
【０２１０】
・血液プールMRI造影剤
血液プール造影剤を引き合いにしながら本発明を例示する。本発明錯体の血液プール中の滞留は多数の構造的特徴に左右される。たとえば糸球体ろ過による急速な排泄を防ぐような値まで本発明錯体の分子サイズ(分子量)を大きくするのは容易である。分子サイズは高分子部分を配位子に結合させれば大きくすることができる。あるいは一連の配位子を高分子の担体たとえばポリ(ペプチド)、ポリ(多糖)、又はデンドリマー等の合成ポリマーに結合させてもよい。これによって形成される構成体は一般に、生体適合性、実質的な非免疫原性、水溶性であり、また許容範囲の緩和度を示すのが好ましい。本発明配位子(又は錯体)と高分子化学種の結合は安定結合を介してでも、生物学的に関連する条件の下で切断可能な結合を介してでもよい。切断可能な結合の例は前述の切断可能な基などである。生分解性造影剤の合成方法は技術上周知である。たとえば米国特許第6,312,664号明細書を参照。
【０２１１】
本発明キレートの血液プール滞留時間を長くする別の方法は、キレートと血液成分たとえばタンパク質との非共有的、可逆的な相互作用に依存する。
【０２１２】
ヒト血清アルブミン(HSA)は4.5%の血漿を含み血清中に最も豊富に含まるタンパク質であるため、血液プール画像化の魅力的なターゲットである。MRI造影剤をHSAに結合する目的は3つある。第1に、HSAは錯体を血液プールへと導き、MR血管造影評価時に動脈と静脈の選択的強調を可能にする。第2に、HSAとの結合は錯体の分子回転時間を遅くするし、また緩和の強調を親錯体と比較して5〜10倍強めるはずである(Caravan, P. et al., Inorg. Chem. 2001, 40, 2170)。最後に、HSAとの結合は造影剤のin vivo半減期を長くすることで、放射線技師に複数の身体部位を画像化しかつ高分解能の画像をもたらすようなパルス系列を使用するに足る時間的余裕を与える。しかしHSAは疎水性及び親水性の度合いが異なる、従って低分子に対する親和性が異なる多数の結合部位をもつ(図11)。ワルファリン結合部位(HSAのサブドメインIIA内)はそうした部位の1つであり、最近の研究(Zaton, A.M.L.V., J.P. Chem.-Bio. Int. 2000, 124, 1)により、4-ヒドロキシクマリン(CMN)は構造類似体やウラシル(ピリミジノン誘導体)と比較してこの部位に対する親和性がきわめて高いことが判明した。CMNの結合によるTREN-6-Me-HOPO合成スキームをスキーム9に示す。
【０２１３】
【化２６】
2005500387.tif 000029
【０２１４】
スキーム9
スキーム9では、保護基付きのHOPO誘導体をホルムアルデヒドの存在下にヒドロキシクマリンと結合して保護基付きのクマリン-HOPO付加体を形成する。次いで該付加体を前述のアミン骨格と反応させ、また随意に別のキレート化部分たとえば環内窒素を酢酸残基で置換したHOPOなどと反応させる。ベンジル保護基は配位子の合成が完了した後に随意に除去する。
【０２１５】
他の例示的な本発明HSA結合性配位子は親水基と疎水基たとえばベンジル基とを含む(図12)。一実施態様では、親水基はPEGである。別の代表的な実施態様では、親水基はカルボン酸などのような化学種である。目下の好ましい疎水基は置換又は非置換ベンジル基などである。このモチーフをもつ代表的な配位子は
【０２１６】
【化２７】
2005500387.tif 000030
【０２１７】
などである。
【０２１８】
本発明錯体のHSAに対する親和性の調節はPEG置換基の構造を変化させることで可能となることがすでに判明している(図13)。錯体がHSAに結合すると錯体の緩和度が高まる(図14)。疎水基と親水基の結合相手となるキレート化サブユニットは同じでも異なってもよい(図15)。
【０２１９】
6-Me-HOPO足場のピリミジン窒素へのベンジル基(Bn)又はp-メトキシベンジル基(MOB)の結合はスキーム10に従えば容易に実現される。
【０２２０】
【化２８】
2005500387.tif 000031
スキーム10
スキーム10では、エチルエステル10を加水分解して対応する酸49とし、それをチアゾリド50に変換する。2つのチアゾリド・ユニットをTREN骨格に結合して、遊離アミン基をもつ配位子51を与え、それに保護基付きのPEG-TAM誘導体52を結合する。形成されたヘテロ脚型配位子53を脱ベンジル化し、TAMサブユニットのフェノール性ヒドロキシル基を遊離させる。得られた化合物54に金属イオンを結合してGd(III )キレート55を与える。
【０２２１】
【化２９】
2005500387.tif 000032
【０２２２】
スキーム11
スキーム11に示すように、スキーム10の方法はベンジル基を置換した酸素配位の配位子の合成にも等しく適用しうる。
【０２２３】
【化３０】
2005500387.tif 000033
【０２２４】
スキーム12
スキーム12は、本発明の酸素配位の配位子の形成に使用するthiaz-TAM-(L)Phen-TRIの合成方法である。たとえばN-保護フェニルアラニン59をチアゾリド60として活性化し、それをアミノ-PEGに結合してPEG化フェニルアラニン61とする。次いでBOP保護基を切断してアミン62を生成する。化合物62をジチアズ-TAM 23にカップリングして、疎水性と親水性を兼ね備えた化合物63を与える。化合物63は前述のような配位子の足場(24など)に結合する。
【０２２５】
本発明のGd錯体はHSAと相互作用する。酸素配位の配位子上の置換基を変えて錯体の水への溶解度の調節を図るようにするのは本発明の範囲内である。さらにタンパク質結合性部分とGdキレートの間のリンカーを調節してタンパク質-配位子相互作用の度合いを調節するようにしてもよい。
【０２２６】
肝特異的MRI造影剤
本発明はまた、肝臓及び/又は他の網内皮系構成部分へと誘導される錯体を提供する。該錯体は例示的な実施態様では、肝臓又は他の網内皮系構成部分により優先的に吸収されることが判明している疎水基又は他基を含む。たとえば肝特異的MRI造影剤の直接合成経路では既知の生体コレステロール分布を活用する。コレステロールは肝臓で合成され肝臓と胆肝腺で代謝される。
【０２２７】
例示的な実施態様では、コレステロール誘導体たとえばコール酸(CHOL)をTREN-HOPO-TAM足場に結合させる(スキーム13)。この結合はMRI造影剤コンジュゲートの網内皮系組織への特異的in vivo局在化を可能にし(Anelli, P.L. et al., Bioconj. Chem. 1999, 10, 137; Anelli, P.L. et al., Acta Radiologica 1997, 38, 15)、それが肝胆道のコントラストを強調する結果となる。[Gd(TREN-HOPOAC-TAM-CHOL)(H2O)2]-1の肝細胞への非共有結合もまた分子の回転を遅くし、プロトン緩和度を高める結果となる。コール酸は無害であり、また肝臓内でMRI造影剤から切断されることもないと見込まれる(Anelli, P.L. et al., Bioconj. Chem. 1999, 10, 137; Anelli, P.L. et al., Acta Radiologica 1997, 38, 15)。
【０２２８】
【化３１】
2005500387.tif 000034
【０２２９】
スキーム13
スキーム13では、コール酸を活性化し、その活性化中間体をエチレンジアミンで処理してエチルアミン誘導体64へと変換する。中間体64を本発明配位子の活性チアゾリド誘導体65と結合させ、対応するコレステロール誘導体化配位子66を形成する。
【０２３０】
別の例示的な実施態様で、本発明はポリ(エーテル)と疎水性部分たとえばコレステロール誘導体とを含む肝選択的錯体を提供する。代表的な合成経路はスキーム14のとおりである。
【０２３１】
【化３２】
2005500387.tif 000035
【０２３２】
スキーム14
スキーム14では、活性アミンを末端基とするポリ(エーテル)で官能化した配位子67を活性化コレステロールチアゾリド68と結合させて、ポリ(エーテル)とコレステロール部分とをもつ二官能化配位子69を形成する。二官能化配位子の形成に続いて、TAM部分のフェノール酸素からベンジル保護基を除去して配位子70とする。
【０２３３】
腫瘍選択的薬剤
本発明はまた腫瘍選択的である薬剤を提供する。本発明は例示的な実施態様で、Gdキレート-サフィリンのコンジュゲートを提供する。サフィリンは拡張ポルフィリンであり、陰イオン・バインダー及び光線感作物質としての医療用途への使用が広く研究されてきたし、また(膵がん全体の75%余りを占める)膵腺がんの腫瘍をターゲットとするためのがんモデルによる研究も行われてきた。従って(検査用として安価で入手も容易である)ポルフィリン及び拡張ポルフィリンの膵特異性と本発明キレートの高水交換速度とを組み合せれば、有望な、膵選択的でかつ高水交換速度のGd-TREN-HOPO-ポルフィリン剤が得られる。
【０２３４】
膵がんは膵腺がんの形をとることをが最も多い。ごく最近の大変興味深い研究によれば、サフィリンの水溶性誘導体はマウスに移植し増殖させたヒト膵腺がんに特異的に集積する[Ferucci, J.T. Annals of Oncology 10, Suppl. 4:S18 (1999)]。この研究では薄い組織切片をUV及び共鳴Raman分光法で分析しサフィリン濃度を求めると、注入後のいずれの時点でも腫瘍中に高濃度に存在することが判明した。腫瘍中の最大濃度では、マウスモデルにおける膵腫瘍選択性が肝、腎又は筋組織選択性を数百倍も上回る。
【０２３５】
この本発明化合物の例示的な合成法をスキーム15に示す。
【０２３６】
【化３３】
2005500387.tif 000036
【０２３７】
スキーム15
C2対称サフィリンをアミン・ペンダント基で二置換する。サフィリン誘導体71 (R=Me)と2当量の23の付加により二置換誘導体72を形成し、次いで周知のアミン・カップリングにより2当量の24で処理して73を形成するが、これは [TREN-HOPO-TAM]ジェオメトリーの完全性を保持している。配位子73をさらに脱保護し、GdCl3と結合させて74を形成する。
【０２３８】
本発明はまた、水溶性サフィリン-Gd(III )錯体を提供する。例示的な実施態様では、該サフィリンをポリエチレングリコール部分で誘導体化してサフィリンの親油性を封じる。75のPEGペンダントはスキーム16に示すようにヒドロキシピリジノアート窒素に結合させることができる。次いで塩素化76をHOPO環窒素の位置で12に直接付加して単置換77を形成する。誘導体77はさらに24と結合し、スキーム15の第2ステップに組み込むことができる。
【０２３９】
【化３４】
2005500387.tif 000037
【０２４０】
スキーム16
別の実施態様では、錯体の安定度を損なわないようなやり方でTRENをPEGで官能化する。たとえばTRENアームのうち1以上をアミン窒素のTf保護と同時並行的な近隣プロトンの置換活性化とによって官能化し、アルコール・ペンダントアームを備えたサフィリンで置換できるようにする(スキーム17)。例示的な錯体はGd対サフィリン比が4:1である。スキーム17では、TREN(市販品がある)を保護し、モノヨウ化し、80と結合する。生成物を還元して81を形成する。このテトラTRENは本発明化合物の合成に柔軟に使用することができる。
【０２４１】
【化３５】
2005500387.tif 000038
【０２４２】
スキーム17
別の例示的な実施態様では、本発明化合物をキナクリン又はセクレチンへとさらに結合して、それらの個別分子認識に由来する膵親和性を、また膵腫瘍選択性を、さらに高めるようにする。当初、キナクリン82は酸性リン脂質及び膵臓ホスホリパーゼA2酵素に対する親和性を示す。アクリジン基はまた蛍光マーカーとしても機能するので、組織中の該化合物を検出する手段を与えてくれる。市販の化合物82をボラン官能化プロペンアミン(市販品がある)と鈴木カップリングで結合し、次いで23とのアミド結合によりキナクリン-TAM連結断片を生成する(スキーム18)。84はGdマルチコンジュゲートを合成するために23の代りに(スキーム15、ステップ1)、試薬24の代りのテトラ-TREN 81(0.25当量)と共に使用する。
【０２４３】
【化３６】
2005500387.tif 000039
【０２４４】
スキーム18
セクレチン(市販品がある)はまたそのN末端でコンジュゲートを形成することができる。27アミノ酸のポリペプチドであるセクレチンはそのC末端で膵柔細胞にin vivo受容される。N末端は6-Me-HOPO窒素位置での置換に先立って相応の収率で選択的にヨウ化してもよい。
【０２４５】
化合物の特性解析
本発明は一般に、新規配位子及びその金属錯体の特性解析を技術的に認められた方法で行う。以下、本発明化合物の特性解析方法を例示する。以下の方法は本発明化合物の特性を解析するうえで有用な技法を説明するものであって、本発明化合物の特性解析方法を限定するものではない。
【０２４６】
安定度定数を求める方法の非限定的な例はJohnson, A.R. et al., Inorg. Chem. 2000, 39, 2652-2660及びCohen, S.M.X. et al., Inorg. Chem. 2000, 39, 5747に記載の方法である。
【０２４７】
Bjerrum法は錯体安定度の測定(配位子と配位子+金属のpH滴定)に使用することができる。超安定錯体の安定度を求めるには、直接pH滴定法は不適切であり、DTPAによる競合滴定を行うことができる。金属-配位子の錯形成反応は可視/UVスペクトルが親金属及び配位子化学種の場合と異なるので、該反応のモニタリングには分光法を用いることができる。デジタル記録式の自動分光滴定装置を用いて可視/UVスペクトルの因子解析を行えば、溶液中の化学種、その個別スペクトル及び化学種を相関させる平衡定数が簡単に判明する。
【０２４８】
・実験的な水への溶解度測定
中性pHを実現するために、0.01M緩衝液(HEPES, pKa 7.55)/ 0.1M KClを酸性形態で調製し、KOHでpH 7に中性化した。既知濃度の(金属錯体)希釈液を調製し、UV/可視スペクトルをとった。次にBeer-Lambertの法則を用いて(一般に波長320〜360nmでの)最大吸光度での吸光係数(ε)を計算した。次いで該金属錯体の飽和溶液を調製し、UV/可視スペクトルをとり、(一般に波長320〜360nmでの)最大吸光度を記録した。飽和溶液が極端に高い吸光度を示す場合には、飽和溶液を希釈してからスペクトルを記録した。次いで、既知εを使用して飽和溶液の濃度を求めた。これは錯体の最小水への溶解度(pH 7、25℃、0.1M)に対応する。錯体の溶解度は塩濃度の低下に伴って上昇することが観測された。pH 7での錯体スペクトルは金属-配位子錯形成反応の分光溶液熱力学研究で観測される既知MLスペクトル(注: M=金属、L=配位子)と一致し、遊離配位子が存在しないことを示す。
【０２４９】
一般に、錯体の最小溶解度の予備研究では既知量の錯体を精密容量の溶媒に溶解する。粒子状物質の濁りが時間と共に又は場合により瞬時に消えれば、錯体が完全に溶解したことを意味する。そうして錯体最小溶解度を求めてからスペクトル分析を行う。
【０２５０】
・配位子のプロトン付加定数
本発明キレートのプロトン付加定数は電位差滴定によって容易に求められる。この定数は方程式(2)により定義される:
【０２５１】
【数１】
2005500387.tif 000040
【０２５２】
・Gd(III )、Zn(II)及びCa(III )生成定数
本発明化合物(たとえばTren-Me2-5,4-HOPY)+Gdに関する生成定数の分光定量用データは一般にpH 2〜8の範囲で収集する。
【０２５３】
生成定数は方程式(3)により定義される:
【０２５４】
【数２】
2005500387.tif 000041
【０２５５】
分光定量データはモデルを使用して緻密化する。たとえばGd[TrenHOPY]の場合、モデルは4成分すなわちLH4+、GdL、GdLH+及びGdLH22+を含む。この存在形態はTren-MOE-3,2-HOPOの溶液挙動に類似するが、ただし親錯体Gd[Tren-Me-3,2-HOPO]が脱プロトン化化学種をもつとの公式報告はなかった[Johnson et al., Inorg. Chem. 39:2652 (2000)]。
【０２５６】
logKML値は反応系M+L ⇔ MLでの脱プロトン化配位子に関する金属-配位子親和性を反映する。pM値は実溶液での配位子をめぐるプロトンによる競合を斟酌したものであり、従って配位子の金属キレート化効果について、より完全な姿を示す。
【０２５７】
pGd値は方程式(4)によって定義される:
pGd=-log[Gd]free  pH 7.4 において； [Gd]=1μM, [L]=10μM   (4)
pM値は数多くの条件に対応するものを求めることができるが、一般に生物学的な検討事項に関連する条件に対応するものを求めるのが好ましい。
【０２５８】
配位子及び/又はZn及びCaイオンとの錯体の電位差滴定を行ってもよい。電位差滴定はTrenHOPO系で実現される高Gd(III )選択性との比較を可能にする[Xu et al., J. Am. Chem. Soc., 117:7245 (1995)]。
【０２５９】
例示的な検定では、金属イオン対配位子比1:1の溶液をpH 2.4〜11の範囲にわたり滴定する。一般にpH 5.5〜6.5領域でのCa2+、Zn2+両系の沈殿を防ぐために低濃度(0.25mM)溶液を使用する。
【０２６０】
・水プロトン緩和
MRI造影剤候補としての常磁性錯体の効果は溶媒プロトンの核磁気緩和速度を増進する性能に依存する[Lauffer, R.B., Chem. Rev., 87, 901 (1987); Tweedle, M.F., Kumar, K. In Magnetic Resonance Imaging (MRI) Contrast Agents, Clarke, M.I., Sadler, P.J., Eds., Springer, Berlin, Germany, Vol.2, p.1 (1999); Koenig et al., Prog. NMR Spectrosc., 22:487 (1990)]。この特性は緩和度r1pで測定されるが、所定の温度及び磁場強度での常磁性錯体1mML-1溶液によって誘発される水プロトン縦緩和速度の増大として定義される[Aime et al., Chem. Soc. Rev., 27:19 (1998)]。特異的相互作用が存在しなければ、in vitro及び血清中でのr1p値はほぼ同等であるため、in vivo挙動の予測では水中での常磁性溶質の緩和特性の解析が重要となる。
【０２６１】
・1H及び17O NMR緩和度評価
新規Gd(III )錯体のプロトン緩和度の評価は一般に、技術的に認められた方法で行う。たとえばAime, S.B. et al., Acc. Chem. Res. 1999, 32, 941; Aime, S.B. et al., Coord. Chem. Rev. 1999, 185-6, 321; Aime, S.B. et al., Chem. Soc. Rev. 1998, 27, 19; Aime, S.B. et al., Magn. Reson. Chem. 1998, 36, S200; Aime, S.B. et al., J. Biol. Inorg. Chem. 1997, 2, 470; Botta, M., Eur. J. Inorg. Chem. 2000, 399を参照。
【０２６２】
例示的な検定では、20MHzでの水プロトン縦緩和度を(一般に0.5Tを使用するNMR分光計で)T1データ再現精度±0.5%で測定する。測定時には温度制御装置(正確さ±0.1℃)を使用する。
【０２６３】
平均水滞留寿命(τm)は一般に、種々の温度での17O NMR横緩和速度(R2p)を測定して求める。この温度可変17O NMR測定は、種々の磁場強度(一般に2.1Tと9.4T)を使用する5mmプローブ付き分光計で行う。D2O外部ロックと17O同位体2.6%を含む溶液とを使用する。観測横緩和速度は信号の半値幅から計算する。装置、実験方法及びデータ解析の詳細は他で報告されており、参照により本書に組み込まれる(Cohen, S.M.X. et al., Inorg. Chem. 2000, 39, 5747; Aime, S.B. et al., J. Biol. Inorg. Chem. 1997, 2, 470; Aime, S.B. et al., Magn. Reson. Chem. 1998, 36, S200)。
【０２６４】
本書で開示のHOPO及びHOPY系Gd(III )錯体は高(交換)速度を特徴とする配位水分子2個の存在に起因する高熱力学的安定度及び高緩和度を示すため、有力なMRI造影剤候補となる。本発明錯体の緩和度は20MHz、25℃、pH=7.2で測定して一般に5.0mM-1s-1を上回るし、少なくとも約9.0 mM-1s-1〜約11 mM-1s-1の緩和度は容易に実現される。高いほうの値は現在使用されているポリアミノカルボン酸系造影剤のそれを少なくとも2倍上回る。
【０２６５】
・NMRD研究
存在量の多い核の緩和速度を大きな磁場範囲にわたって測定する方法をリラクソメトリー(relaxometry)という。リラクソメトリー・プロフィールは、対数目盛上のLarmor周波数又は磁場強度の関数としての核磁気緩和速度(通常は1/T1)のグラフである(図7)。このグラフは核磁気緩和分散(Nuclear Magnetic Relaxation Dispersion -NMRD)曲線ともいう。比較的高磁場(>1MHzプロトンLarmor周波数、0.023T)では緩和速度の測定は日常的であるが、比較的低磁場では感度が劇的に低下するため実用が限られる。しかし、常磁性溶液のNMRDプロフィールは1MHz未満の周波数で興味深い特徴を示すことが多い。この特殊な実験技法では磁場循環型リラクソメーターの高速磁場循環を利用する(Caravan, P.E. et al., Chem. Rev. 1999, 99, 2293; Toth, E. et al., Top. Curr. Chem. 2002, 221)。
【０２６６】
NMRDプロフィールを使用すれば、Gd(III )錯体の緩和度に寄与するパラメーター(q及びτrなど)の値を求めることができる。それらの方法はGd(III )錯体存在下での溶媒プロトン縦緩和速度の磁場強度(又はLarmor周波数)依存度の測定を伴う。プロトン1/T1 NMRDプロフィールは一般に循環磁場型リラクソメーターで、ある連続領域の磁場強度にわたって測定する。リラクソメーターは一般にコンピューター制御であり、その1/T1絶対不確実性は±1%である。装置、実験方法及びデータ解析の詳細は他で報告されており、参照により本書に組み込まれる(Aime, S.B. et al., J. Biol. Inorg. Chem. 1997, 2, 470; Aime, S.B. et al., Magn. Reson. Chem. 1998, 36, S200; Cohen, S.M.X. et al., Inorg. Chem. 2000, 39, 5747)。
【０２６７】
・内水和圏評価
例示的な検定では、金属イオンに結合した水分子の数(q)を発光減衰速度によって評価する。この方法では強力なNd-YAGレーザーにより金属イオンを直接励起し、減衰速度を記録する。一般にこの方法は新規配位子のテルビウム(III )錯体の合成に依存する。あるいは新規配位子のユウロピウム(III )錯体の合成に依存してもよい。
【０２６８】
qの正確な評価は、内圏水分子が金属イオンの発光を消滅させる際の、H2O及び(発光を最小限消滅させるだけの)D2O中での錯体の減衰速度を比較して行う。
【０２６９】
・温度可変17O NMR
本発明錯体のNMRDプロフィールは高速交換領域内にあるが、これはプロトン緩和度の磁界依存度の分析から水交換速度の評価を除外する条件である。造影剤の効率を評価するうえでの決定的なパラメーターであるτm値は、十分に確立した技法を用いる水プロトン横緩和速度(R2)の温度可変プロトンデカップル17O NMR測定によって独立に求めることができる[Powell et al., J. Am. Chem. Soc. 118:9333(1996); Aime et al., Acc. Chem. Res., 32:941 (1999)]。R2はスカラー緩和機構によって支配されるが、この機構はkexとその温度依存度(ΔHM)、電子緩和速度とその温度依存度(Δ2、τv、ΔHV)及び超微細結合定数A/hに依存する。
【０２７０】
超微細結合定数には標準値の-3.8×106 rad s-1を、また電子緩和(Δ2及びτv)にはNMRDプロフィールの解析で得た値を、それぞれ使用する。これらのデータをSwift-Connick方程式にあてはめる。
【０２７１】
・生体分子親和性の測定
生体分子親和性は一般に技術的に認められた方法で測定する。たとえばHSAと疎水基を含む金属錯体との間の非共有相互作用は(金属錯体)-HSA付加体の結合パラメーター(Ka)と緩和度強調の両方の測定を可能にする十分に確立されたプロトン緩和強調(PRE)法を使用して徹底的に研究されてきた(Caravan, P.E. et al., Chem. Rev. 1999, 99, 2293)。この方法では、金属錯体と逓増濃度のHSAを含む溶液の水プロトン緩和速度を測定する。
【０２７２】
競合プローブ(ワルファリンやイブプロフェンなど)を使用した例示的な検定法により、MRI造影剤と相互作用するHSA結合部位を解明する。測定は一般に、生理的条件に近いpH 7.4 (リン酸緩衝液中)及び298Kで行う。
【０２７３】
HSAには、異なる度合いのプロトン緩和強調を引き起こすような複数の非同一結合部位がしばしば存在する。従って結合定数を求めるための独立した方法によりPRE法を補完する必要があろう。
【０２７４】
Eu(III )及び/又はTb(III )の発光特性を使用するのは、金属イオンが占める識別可能な部位での発光減衰速度を反映させるのが目的である。従って新規配位子のEu(III )及びTb(III )錯体+HSAの発光滴定は生体分子親和性を測定する良法である(Feig, A.L.P. et al., Chem. & Biol. 1999, 6, 801; Chaudhuri, D.H. et al., Biochem. 1997, 36, 9674; Cronce, D.T.H. et al., Biochem. 1992, 31, 7963)。
【０２７５】
・生体分布と急性毒性の研究
特定身体部位をターゲットとする置換基への金属キレートの結合は新規MRI造影剤に関する生体分布の研究を必然的に伴った。一般に、特定の哺乳動物細胞(筋細胞、肝細胞など)に対してこれらの造影剤がもつ可能性のある高親和性を確認するために、予備的なin vitro細胞スクリーニングを行う。造影剤のin vitro細胞毒性はたとえばトリパンブルー分染法を用いて評価する。錯体のLD50データは健常マウス及びラットを対象にした毒性試験でとる。
【０２７６】
別の例示的な検定では、腫瘍誘発ラットでキレート剤の生体分布を調べて腫瘍による造影剤の吸収を評価する。例示的な検定ではたとえば153Gdの使用による放射性トレーサー法を行う。特定の腫瘍をラットに誘発させ、生体分布試験に適した直径へと数週間増殖させる。次いでラットを通常の食餌に移して、適当な期間をおく。次いで放射性MRI造影剤を注射し、定期的に尿と糞を回収して解析にかけ放射線をカウントする。後にラットを犠牲にし、器官を摘出し放射線解析を行う。次いでMRI造影剤の生体分布を器官あたり注射用量の百分率(%ID)として、また%ID/g-組織重量として計算する。これを対照群(同じ細胞系の健常ラット群)のMRI造影剤分布と比較する。キレート剤のin vivo生体分布に関する研究は腫瘍の存在及び不存在下でのMRI造影剤の局所分布の解明を可能にする。
【０２７７】
製剤
本発明化合物は多様な経口用、注射用及び局所用剤形に調製し、投与することができる。たとえば本発明化合物は注射により、静脈内、筋内、皮内、皮下、十二指腸内又は腹腔内に投与することができる。また、吸入によりたとえば鼻内投与することもできる。さらに経皮投与することもできる。従って本発明はまた、医薬として許容される担体又は賦形剤と1以上の本発明化合物とを含む製剤組成物を提供する。
【０２７８】
本発明化合物から製剤組成物を調製するための医薬として許容される担体は固体でも液体でもよい。固形製剤の例は散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、座剤及び分散性顆粒剤などである。固体担体は1以上の物質とすることができ、また希釈剤、香料添加剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤又は被包材の役目を果たしてもよい。
【０２７９】
散剤は、微粉化した固体担体を微粉化した活性成分と混和する。錠剤は、活性成分を必要な結合特性をもつ担体と好適な比率で混和し、所望の形状及びサイズへと圧縮する。
【０２８０】
散剤と錠剤は活性成分を5%又は10%〜70%含むのが好ましい。好適な担体は炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、でんぷん、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウム=カルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバターなどである。用語「製剤」は、担体としての被包材をカプセルとして活性成分を他担体と共に又は他担体抜きで被包し、もって活性成分と担体が会合するようにした製剤を含むものとする。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤及び舐剤は経口投与に適した固形製剤として使用することができる。
【０２８１】
座剤の調製では、低融点ワックスたとえば脂肪酸グリセリド又はカカオバターの混合物をまず融解し、その中に活性成分をかき混ぜながら均一に分散させる。次いでこの融解均一混合物を手頃なサイズの鋳型に注入し、冷まして凝固させる。
【０２８２】
液体製剤の例は溶液、懸濁液又は乳液、たとえば水溶液又は水/エチレングリコール溶液などである。注射用液体製剤は水性ポリエチレングリコール溶液の溶液として調製することができる。
【０２８３】
経口用に適した水溶液は活性成分を水に溶解し、必要に応じて好適な着色料、香料添加剤、安定剤及び増粘剤を加えて調製することができる。経口用に適した水性懸濁液は微粉化した活性成分を粘性物質たとえば天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウム=カルボキシメチルセルロース、及び他の周知の懸濁剤などと共に水に溶解して調製することができる。
【０２８４】
これには、使用直前に経口投与用の液体製剤へと変換することを意図した固形製剤も含まれる。そうした液体製剤には溶液、懸濁液及び乳液がある。これらの製剤は活性成分の他に着色量、香料添加剤、安定剤、緩衝液、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでもよい。
【０２８５】
製剤は単位型剤形にするのが好ましい。そうした剤形では適正量の活性成分を含有する単位量に製剤を再分割する。単位型剤形は包装製剤、すなわち離散量の製剤を含む包装たとえばバイアル又はアンプル入り小包錠剤、カプセル剤又は散剤とすることができる。また単位量型剤形はカプセル剤、錠剤、カシェ剤又は舐剤それ自体でもよいし、以上のうち任意の剤形を適正数包装した形態でもよい。
【０２８６】
単位型剤形に含まれる活性成分量は特定の用途や活性成分の効能に応じて0.1mg〜10g、より一般的には1.0mg〜1g、最も一般的には10mg〜500mgの範囲内で加減又は調節してよい。組成物は必要なら相性の良い他の診断治療薬をさらに含んでもよい。
【０２８７】
有効量
MRI造影剤は一般に用量0.1〜0.3mmol/kg-患者を0.5M溶液として投与する(Caravan, P.E. et al., Chem. Rev. 1999, 99, 2293)。本造影剤は特性を向上させてあり、技術的に認められたアミノカルボン酸系造影剤よりも少ない投与量で済む。最大限の効き目を人間で実現するための前述の方法や技術上周知の他の方法に基づく用量の調節は当業者には十分可能である。
【０２８８】
方法
本発明は例示的な実施態様で、被検者を対象にコントラスト強調画像診断を行うための方法を提供する。該方法は本発明の金属錯体を被検者に投与するステップ及び被検者の画像を得るステップを含む。本発明錯体はMRI、X線及びCTを非限定的に含む多様な画像診断モダリティーに有用である。
【０２８９】
本発明はまた、本発明の金属錯体の物性を調節する方法を提供する。本発明の方法によって調節される物性の非限定的な例は水交換速度、回転相関時間、in vivo滞留時間、緩和度、水への溶解度などである。一実施態様では、該方法は配位子成分としてポリ(エーテル)を含む又は含まない親錯体を合成するステップ及び該錯体の物性を測定するステップを含む。測定した物性が理想を下回る場合には、ポリ(エーテル)を含む該配位子の類似体、又は該第1配位子とは異なるサイズ及び/又は構造のポリ(エーテル)をもつ配位子を合成することにより該物性を調節する。本発明者は、この方法を繰り返すことにより、本発明キレートの多様な物性を調節し緻密化することが可能であることに気付いた。
【０２９０】
本発明はまた、患者の金属イオン過剰症を治療する方法を提供する。該方法はそうした治療を必要とする患者に本発明の方法で合成された化合物を投与するステップを含む。該化合物の投与量は患者の金属イオン負荷を軽減するための有効量である。特定の患者に応じた適正な用量及び治療計画の確認は当業者には十分可能である。
【０２９１】
好ましい実施態様では、本発明の方法で合成した化合物で患者を治療すると、公知の方法で合成された同用量の同じ化合物で患者を治療したときの除去量を上回る量の金属イオンが除去される結果となる。
【０２９２】
以下の実施例により本発明の材料、方法及び装置をさらに説明する。以下の実施例は説明が目的であり、特許請求の範囲に記載されている本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０２９３】
実施例1  6-メチル-3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノン-4-カルボン酸エチルエステル(スキーム2の式(8))の合成
6-メチル-3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノン-4-カルボン酸エチルエステルは既知の物質であるが、従来の合成法は低収率であり、生成物は不純物を含む。そこで、高純度の生成物が大量に得られるようスケールアップすることができる高収率の改良合成法を開発した。その詳細は次のとおりである。
【０２９４】
ジエチルオキシル酢酸ナトリウム(42.1g, 200mmol)をTHF (500ml)に溶解し、次いで1Lの三つ口丸底フラスコに入れた。クロロアセトン(16ml, 200mmol)を加え、10分間待ってからNH3ガスを反応液に通し、AlCl3(2.67g, 20mmol)をゆっくり慎重に加えた。反応液を周囲条件下で5日間撹拌した。生成したオレンジ色固形物をろ取し、1M HCl(500ml)に溶解しpH<3となるようにした。この懸濁液を30分間撹拌し、沈殿をろ取し蒸留水で洗い、熱EtOH(約1L)から再結晶させて無色の結晶を得た(収量: 15.7%, 40%)。mp 227-229℃. 1H NMR (d6-DMSO, 300MHz): δ=1.24(t, 3H, CH3), 2.07(s, 3H, CH3), 4.22(q, 2H, CH2), 6.07(s, 1H, CH) ppm. Anal. Calcd (Found) for C9H11O4N: C, 54.82 (55.06); H, 5.62 (5.53); N, 7.11 (7.07). EI-MS(+): m/z 198[M+H]+.
【０２９５】
実施例2  3-ベンジルオキシ-4-カルボキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン (スキーム2の式(11))の合成
6-メチル-3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノン-4-カルボン酸エチルエステル(11.8g, 60mmol)とK2CO3(9.06g, 65mmol)を超音波処理の助けを借りながらH2O(650ml)に溶解した。この溶液を2L三つ口丸底フラスコの臭化ベンジル(7.8ml, 65mmol)/CH2Cl2(500ml)溶液に加えた。この反応の相間移動触媒として塩化セチルピリジニウム(9.09g, 30mmol)を加えた。溶液をオーバーヘッドスターラーにより40℃で1日間、TLCで反応の完了が確認されるまで撹拌した。2層を分離し、水相をCH2Cl2 (100ml)で2回抽出した。有機相を合わせて溶媒を留去した。この粗生成物3-ベンジルオキシ-4-カルボキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン-カルボン酸エチルエステル9はカラムクロマトグラフィーで精製することができたが、粗生成物を後続のエステル化水分解反応に直接回し、このステップの後で精製するほうがもっと好都合であると判明した。1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ=1.29(t, 3H, CH3), 2.35(s, 3H, CH3), 4.30(q, 2H, CH2), 5.26(d, 2H, CH2), 6.22(s, 1H, CH), 7.35(m, 5H, Ph) ppm. 生成物をKOH (16.68g, 297mmol)/MeOH (300ml)溶液に溶解し、溶液を24時間又はTLCで反応の完了が確認されるまで還流下に加熱した。溶液をろ過し、6M HClでpH=1に酸性化した。白色固形物をろ取し、100mlのH2Oで洗い、EtOH(400ml)から再結晶させて白色の結晶質固形物を得た(収量: 7.06g、4-カルボキシエチルエステル-6-メチル-3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノンを基準にして46%)。1H NMR (d6-DMSO, 300MHz): δ=2.11(t, 3H, CH3), 5.07(d, 2H, CH2), 5.97(s, 1H, CH), 7.30(m, 5H, Ph) ppm. Anal. Calcd (Found) for C14H13O4N: C, 64.88 (64.73); H, 5.02 (5.15); N, 5.41 (5.37). EI-MS(+): m/z 259[M]+.
【０２９６】
実施例3  3-ベンジルオキシ-6-メチル-4-(2-チオキソ-チアゾリジン-3-カルボニル)-2(1H)-ピリジノン(スキーム2の式(12))の合成
3-ベンジルオキシ-4-カルボキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン(5.39g, 21.1mmol)を無水THF(200ml)に溶解した。次いで2-メルカプトチアゾリン(2.71g, 23.2mmol)とDMAP(0.25g, 2.0mmol)を加えて、溶液をN2雰囲気下に1時間撹拌した。次いでジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC, 5.12g, 25.3mmol)を3時間かけて間をおきながら少しずつ加えた。反応液を16時間撹拌し、次いでさらに24時間0℃に静置した。ジシクロヘキシルウレア(DCU)をろ去し、溶媒を留去した。残渣をCH2Cl2に溶解し、ろ過し、グラジエントフラッシュシリカカラム(2〜6% CH3OH/CH2Cl2)で精製した。然るべき画分から溶媒をロータリーエバポレーションで留去し、残渣をアセトンから再結晶させて黄色結晶を得た(3.78g, 56%)。1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ=7.32-7.47(m, 5H, aromatic Bn), 5.98(s, 1H, CH), 5.34(s, 2H, Bn CH2), 4.34(t, J=7.3Hz, 2H, CH2), 2.92(t, J=7.3Hz, 2H, CH2), 2.34(s, 3H, CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C17H16N2O3S2: C, 56.65 (56.50); H, 4.47 (4.51); N, 7.77 (7.70). FAB-MS(+): m/z 361[M+H]+.
【０２９７】
実施例4  1-ベンジル-3-ベンジルオキシ-4-カルボキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン(スキーム10の式(49))の合成
K2CO3 (10.5g, 75.4mmol)をN2雰囲気下、6-メチル-3-ヒドロキ-2(1H)-ピリジノン-4-カルボン酸エチルエステル(5.20g, 26.4mmol)/無水DMF (10ml)懸濁液に加えた。塩化ベンジル(6.96g, 55.0mmol)を加え、反応液を65℃で30時間撹拌し、反応の進行をTLCでモニターした。溶媒をロータリーエバポレーションで留去し、残渣をEtOAc(100ml)と水(100ml)に溶解した。有機相を水(5×100ml)で洗い、乾燥させ(Na2SO4)、ろ過し蒸発乾固した。粗生成物1-ベンジル-3-ベンジルオキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン-4-カルボン酸エチルエステル(式(10))をカラムクロマトグラフィー(溶離液: CH2Cl2)で部分精製し淡褐色油を得た(粗収量: 7.46g, 75%)。1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ=7.10-7.51(m, 10H, Bn), 6.18(s, 1H, HOPO), 5.36(s, 2H, Bn-CH2), 5.31(t, 2H, Bn-CH2), 4.30(q, J=7.1Hz, 2H, CH2), 2.26(s, 3H, HOPO CH3), 1.28(t, J=6.9Hz, 3H, CH3 Et ester) ppm. FAB-MS(+): m/z 378.2[M+H]+.
【０２９８】
得られた油をKOH(2.3g, 40mmol)/MeOH (200ml)に溶解した。この反応液を2日間撹拌し、その時点で反応の完了をTLCで確認した。溶媒を留去し、残渣を蒸留水に溶解した。6.0M HClを加えて溶液のpHを1に下げ、白色沈殿を生じさせた。これをろ取し、乾燥させた(収量: 6.27g、6-メチル-3-ヒドロキ-2(1H)-ピリジノン-4-カルボン酸エチルエステルを基準にして68%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ=7.30-7.44(m, 10H, Bn), 6.58(s, 1H, HOPO), 5.63(s, 2H, Bn-CH2), 5.37(s, 2H, Bn-CH2), 2.30(s, 3H, HOPO CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C21H19NO4・0.4H2O: C, 70.73 (72.19); H, 5.60(5.66); N, 3.93 (3.94). FAB-MS(+): m/z 350[M+1]+. AcOEt溶液をゆっくりと蒸発させてX線回折に適した結晶を得た。
【０２９９】
実施例5  1-ベンジル-3-ベンジルオキシ-6-メチル-4-(2-チオキソ-チアゾリジン-3-カルボニル)-2(1H)-ピリジノン(スキーム10の式(50))の合成
1-ベンジル-3-ベンジルオキシ-4-カルボキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン(5.36g, 15.3mmol)を窒素雰囲気下、CH2Cl2(100ml)に溶解した。次いで2-メルカプトチアゾリン(1.88g, 16.1mmol)とジメチルアミノピリジン(DMAP, 0.16g, 1.0mmol)を加え、溶液を1時間撹拌した。次いでジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC, 3.45g, 16.9 mmol)を少しずつ加え、反応液を16時間撹拌し、次いで0℃で24時間静置した。反応混合物をろ過し、溶媒をロータリーエバポレーションで留去した。EtOAc(10ml)を加え、溶液をろ過した。この最終ステップを3回繰り返してジシクロヘキシルウレア(DCU)を除去し、黄色油を得た。この生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカ、溶離液CH2Cl2)で精製した。溶媒をロータリーエバポレーションで留去し、得られた粘性黄色油をアセトンから再結晶させて黄色の結晶質固形物を得た(収量: 5.10g, 74%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ=7.12-7.49(m, 10H, Bn), 5.98(s, 1H, HOPO), 5.38(s, 2H, Bn-CH2), 5.34(s, 2H, Bn-CH2), 4.59(t, J=7.3Hz, 2H, thiaz), 2.90(t, J=7.3Hz, 2H, thiaz), 2.27(s, 3H, HOPO CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C24H22N2O3S2: C, 63.98 (64.04); H, 4.92(5.02); N, 6.22 (6.03). FAB-MS(+): m/z 451[M+H]+.
【０３００】
実施例6  4-(2-エタノールカルバモイル)-3-ヒドロキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン(式(10C))の合成
(1)  3-ベンジルオキシ-4-(2-エタノールカルバモイル)-6-メチル-2(1H)-ピリジノン(10B)の合成
3-ベンジルオキシ-6-メチル-4-(2-チオキソ-チアゾリジン-3-カルボニル)-2(1H)-ピリジノン(0.200g, 0.577mmol)/CH2Cl2(15ml)溶液にエタノールアミン(0.044ml, 0.672mmol)を加えた。得られた溶液を暗所で10時間、周囲条件下で撹拌すると、その間に溶液が黄色から無色へと変化した。この溶液をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜8% CH3OH/CH2Cl2)で精製し、溶媒を留去して白色固形物を得た(収量: 0.161g, 97%)。1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ=8.21 (t, 1H, NH), 7.38-7.46(m, 5H, Bn), 6.64(s, 1H, HOPO-H), 5.38(s, 6H, Bn CH2), 3.61(t, J=4.8Hz, 2H, CH2), 3.38(q, J=4.8Hz, 2H, CH2), 2.33(s, 3H, CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C16H18N2O4: C, 63.56 (63.21); H, 6.00(6.12); N, 9.27 (8.99). ES-MS(+): m/z 302[M]+.
【０３０１】
(2)  4-(2-エタノールカルバモイル)-3-ヒドロキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン(式(10C))の合成
3-ベンジルオキシ-4-(2-エタノールカルバモイル)-6-メチル-2(1H)-ピリジノン(0.100g, 0.348mmol)のAcOH(5ml)+MeOH(5ml)溶液に5% Pd/C (0.100g)を加え、混合物をH2雰囲気、周囲条件下で12時間撹拌した。次いで反応液をろ過し、溶媒を留去した。残渣をAcOH/MeCNから再析出させて淡黄褐色の固形物を得た(収量: 0.042g, 61%)。1H NMR (D2O, 500MHz): δ= 6.44(s, 1H, HOPO-H), 3.79(t, J=5.3Hz, 2H, CH2), 3.56(t, J=5.3Hz, 2H, CH2), 2.27 (s, 3H, CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C9H12N2O4: C, 50.94 (50.60); H, 5.70 (5.72); N, 13.20 (13.29) ppm. EI-MS(+): m/z 212 [M]+.
【０３０２】
実施例7  N,N,N-トリス[3-ヒドロキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン-4-カルボキシルアミドエチル]アミン(TREN-6-Me-3,2-HOPO、スキーム2の式(14))の合成
(1)   N,N,N-トリス[3-ベンジルオキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン-4-カルボキシルアミドエチル]アミン(スキーム2の式(13))の合成
3-ベンジルオキシ-6-メチル-4-(2-チオキソ-チアゾリジン-3-カルボニル)-2(1H)-ピリジノン(1.5g, 4.3mmol)をCH2Cl2(30ml)に溶解し、これにトリス(2-アミノエチルアミン)を少量ずつ逐次4時間間隔で、溶液が黄色から無色に変化するまで加えた。この溶液をグラジエントシリカカラム(溶離液: 2〜8% MeOH/CH2Cl2)で2回溶出して精製した。溶媒を留去して白色ガラス質固形物を得た(収量: 0.91g, 76%)。1H NMR (d6-DMSO, 400MHz): δ=8.12(t, J=7.2Hz, 3H, NH), 7.20-7.37(m, 15H, Bn), 5.95(s, 3H, HOPO-H), 5.12(s, 6H, Bn CH2), 3.14(m, 6H, TREN CH2), 2.42(m, 6H, TREN CH2), 2.08(s, 9H, CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C48H51N7O9: C, 66.27 (65.97); H, 5.91 (5.91); N, 11.27 (11.17). FAB-MS(+): m/z 870[M+H]+.
【０３０３】
(2)  N,N,N-トリス[3-ヒドロキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン-4-カルボキシルアミドエチル]アミン(TREN-6-Me-3,2-HOPO、スキーム2の式(14))の合成
5% Pd/C(0.235g)をN,N,N-トリス[3-ベンジルオキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン-4-カルボキシルアミドエチル]アミン(0.360g, 0.414mmol)のAcOH(10ml)+H2O(5ml)溶液に加え、混合物をH2雰囲気下、周囲条件で2時間撹拌した。次いで反応液をろ過し、溶媒を留去した。残渣をMeOH(10ml)と1滴の濃HClに溶解してCl-塩に変換し、溶媒を留去した(×3)。次いで残渣をMeOH(10ml)に溶解して過剰量のHClを除去し、また溶媒を減圧留去した(×3)。残渣をMeOH(2ml)に溶解し、急速撹拌Et2O溶液(200ml)に加えて白色沈殿を生じさせ、ろ取し、減圧乾燥させた(収量: 0.225g, 78%)。1H NMR (D2O, 500MHz): δ= 5.87(s, 3H, HOPO-H), 3.79(m, 6H, TREN CH2), 3.61(m, 6H, TREN CH2), 1.96 (s, 9H, CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for TREN-6-Me-3,2-HOPO・3H2O, C27H34N7O8Cl・3H2O: C, 46.39 (46.09); H, 5.91 (5.82); N, 14.02 (13.80) ppm. FAB-MS(+): m/z 600[M]+.
【０３０４】
実施例8  ガドリニウム(III )イオンのN,N,N-トリス[3-ヒドロキシ-6-メチル-2(1H)-ピリジノン-4-カルボキシルアミドエチル]アミンとの錯体(Gd-TREN-6-Me-3,2-HOPO)(スキーム2の式(15))の合成
TREN-6-Me-3,2-HOPO (0.100g, 0.143mmol)/H2O(10ml)溶液にGdCl3・6H2O (0.0532g, 0.136mmol)を過剰量のピリジンと共に加え2時間加熱還流した。溶液から析出した微結晶質の白色固形物をろ取し減圧乾燥させた(収量: 0.080g, 70%)。Anal. Calcd (Found)  for Gd(TREN-6-Me-3,2-HOPO(H2O)2・H2O, C27H38N7O10Gd・H2O: C, 39.05 (39.37); H, 4.87 (4.42); N, 13.80 (13.37); Gd, 15.49 (15.39).
【０３０５】
実施例9  2,3-ビス-ベンジルオキシ-1,4-ビス(2-チオキソ-チアゾリジン-3-カルボニル)-ベンゼン(BnTAMdiThiaz)(スキーム3の式(23))の合成
塩化オキサリル(14ml, 160mmol)とDMF(1滴)を2,3-ビス-ベンジルオキシ-テレフタル酸(20g, 52mmol)/無水トルエン(250ml)懸濁液に加えた。N2雰囲気下に24時間撹拌後、淡褐色溶液を得た。溶媒をロータリーエバポレーションで留去し、残渣を無水THF(200ml)に溶解した。溶液を-35℃に冷却し、2-メルカプトチアゾリン(12.6g, 104mmol)+NEt3(10.1g, 100mmol)のTHF(100ml)溶液を2時間にわたって滴下した。溶液を0℃でろ過してNEt3・HClを除去した。溶媒を留去し、残渣をCH2Cl2(50ml)に溶解し、シリカプラグでろ過して鮮黄色の溶液を得た。溶媒を留去し、生成物をアセトン(500ml)から再結晶させて鮮黄色の角柱状結晶を得た(収量: 22.9g, 76%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ=7.20-7.36 (m, 12H, aromatic H), 5.08(s, 4H, Bn CH2), 4.32(t, J=7.3Hz, 4H, CH2), 2.96(t, J=7.3Hz, 4H, CH2) ppm. Anal. Calcd (Found) for C28H24N2O4S4: C, 57.91 (57.92); H, 4.17(4.13); N, 4.82 (4.74). FAB-MS(+): m/z 581[M+H]+.
【０３０６】
実施例10  TREN-1-Bn-6-Me-3,2-HOPO-TAM (19C)の合成
(1)  ベンジル保護TREN-1-Bn-6-Me-3,2-HOPO-TAM-チアゾリド(19A)の合成
1-ベンジル-3-ベンジルオキシ-6-メチル-4-(2-チオキソ-チアゾリジン-3-カルボニル)-2(1H)-ピリジノン(1.5g, 3.3mmol)/CH2Cl2 (100ml)溶液を、トリス(2-アミノエチルアミン)(TREN, 0.219g, 1.5 mmol)/CH2Cl2(100ml)の急速撹拌溶液に滴下した。得られた溶液をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜10%CH3OH+1%Et3N/ CH2Cl2)で精製した。この化合物TREN-(1-Bn-6-Me-3,2-HOPO)2(式(7); R1=ベンジル, R2=メチル, c=1, p=2)をCH2Cl2に溶解し、BnTAMdiThiaz(式(8), 14g, 24mmol)/CH2Cl2(100ml)の急速撹拌溶液に2時間にわたり滴下した。生成物をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜5% CH3OH/CH2Cl2)で精製し、黄色フォームを得た(収量: 1.39g, 73%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ=8.30 (br s, 1H, TAM NH), 7.94(br s, 2H, HOPO NH), 7.85(d, 1H, TAM CH), 7.27(br s, 1H, TAM NH), 7.09-7.38(m, 31H, aromatic H), 6.58(s, 2H, HOPO-H), 5.35(s, 8H, HOPO Bn CH2), 5.12(s, 2H, TAM Bn CH2), 5.09(s, 2H, TAM Bn CH2), 4.37(t, J=7.3Hz, 2H, thiazolide CH2), 3.38(m, 6H, TREN CH2), 2.93(t, J=7.3Hz, 2H, thiazolide CH2), 2.37(m, 6H, TREN CH2), 2.25(s, 6H, HOPO CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C73H71N7O10S2・3.5H2O: C, 65.77 (65.52); H, 5.86(5.56); N, 7.36 (7.04). FAB-MS(+): m/z 1270.5[M+1]+.
【０３０７】
(2)  ベンジル保護TREN-1-Bn-Me-3,2-HOPO-TAM(19B)の合成
過剰量のメチルアミン(水溶液)をベンジル保護TREN-1-Bn-6-Me-3,2-HOPO-TAM-チアゾリド(1.12g, 0.883mmol)/CH2Cl2(100ml)溶液と共に振ると、溶液は数秒で黄色から無色に変わった。生成物をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜10% CH3OH/CH2Cl2)で精製し、溶媒留去後に白色フォームを得た(収量: 0.76g, 73%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ=8.20-8.25 (m, 4H, NH), 7.05-7.37(m, 32H, aromatic H), 6.18(s, 2H, HOPO-H), 5.28(s, 4H, HOPO Bn CH2), 5.18(s, 4H, HOPO Bn CH2), 5.03(s, 2H, TAM Bn CH2), 5.00(s, 2H, TAM Bn CH2), 3.29(m, 6H, TREN CH2), 2.71(d, 3H, TAM CH3), 2.51(m, 6H, TREN CH2), 2.17(s, 6H, HOPO CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C71H71N7O10S2・2H2O: C, 69.99 (69.96); H, 6.20(6.03); N, 8.05 (7.88). FAB-MS(+): m/z 1182.6[M+1]+.
【０３０８】
(3)  TREN-1-Bn-6-Me-3,2-HOPO-TAM (19C)の合成
10% Pd/C(0.235g)をベンジル保護TREN-1-Bn-6-Me-3,2-HOPO-TAM (0.540g, 0.457mmol)のAcOH(10ml)+H2O(5ml)溶液に加え、混合物をH2雰囲気下、周囲条件で48時間撹拌した。次いで反応液をろ過し、溶媒を留去した。残渣をMeOH(10ml)と1滴の濃HClに溶解してCl-塩に変換し、溶媒を留去した(×3)。残渣をMeOH (10ml)に溶解して過剰量のHClを除去し、また溶媒を減圧留去した(×3)。残渣をMeOH(2ml)に溶解し、急速撹拌Et2O溶液(200ml)に加えて白色沈殿を生じさせ、ろ取し、減圧乾燥させた(収量: 0.324g, 79%)。1H NMR (d6-DMSO, 300MHz): δ= 9.11(br s, 1H, NH), 8.90(br s, 1H, NH), 8.68(br s, 2H, NH), 7.04-7.32 (m, 12H, aromatic H), 6.36(s, 2H, HOPO-H), 5.27(s, 4H, Bn CH2), 3.72 (m, 6H, TREN CH2), 3.46 (m, 6H, TREN CH2), 2.79 (d, J=3.3Hz, 3H, CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C43H47N7O10・HCl・3H2O: C, 56.61 (56.60); H, 5.97 (5.89); N, 10.75 (10.46). FAB-MS(+): m/z 822[M+H]+.
【０３０９】
実施例11  Gd(III )イオンのTREN-1-Bn-6-Me-3,2-HOPO-TAMとの錯体 (スキーム2の式(19))の合成
過剰量のピリジンをGdCl3・6H2O (0.040g, 0.109mmol)とTREN-1-Bn-6-Me-HOPO-TAM (0.100g, 0.114mmol)とのH2O(10ml)溶液に加えた。浅黄色溶液を2時間加熱還流するとクリーム状の沈殿が形成された。溶媒を留去し、残渣をiPrOH中に懸濁させ超音波処理しろ過した(×3)。淡褐色固形物を減圧乾燥させた(収量: 0.114g, 95%)。Anal. Calcd (Found) for GdH(TREN-1-Bn-6-Me-HOPO-TAM)(H2O)2・2H2O C43H51N7O12Gd ・2H2O: C, 49.32 (48.95); H, 4.90 (4.09); N, 9.36 (8.91). FAB-MS(-): m/z 975.2[M]-.
【０３１０】
実施例12  TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-DME (27B)の合成
(1)  ベンジル保護TREN-1-Me-HOPO-3,2-TAM-DME (スキーム3の式(27)、R=-CH2CH2N(CH3)2)の合成
1,1-ジメチルエチルジアミン(0.11ml, 1.00mmol)をTREN-Me-3,2-HOPO-TAM-Thiaz (1.00g, 0.973mmol)/CH2Cl2(30ml)溶液に加えた。混合物を周囲条件で8時間撹拌すると、色が黄色から透明に変わった。溶媒をロータリーエバポレーションで留去し、残渣をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜10%CH3OH+1%Et3N / CH2Cl2)で精製した。溶媒を留去して得られた白色固形物をMeOH (10ml)に溶解し、再び蒸発させ(×2)過剰量のNEt3を除去した(収量: 0.84g, 85%)。1H NMR (微量のNEt3を添加してDMEプロトンの信号を改善するようにしたCDCl3, 500MHz): δ=8.04 (t, 1H, TAM amide NH), 7.80(m, 3H, TAM-H and HOPO amide NH), 7.68(d, J=8.4Hz, 1H, TAM-H), 7.57(br t, 1H, TAM amide NH), 7.28-7.41 (m, 20H, Bn), 7.06(d, J=7.2Hz, 2H, HOPO-H), 6.61(d, J=7.2Hz, 2H, HOPO-H), 5.29(s, 4H, HOPO Bn CH2), 5.15(s, 2H, TAM Bn CH2), 5.06(s, 2H, TAM Bn CH2), 3.57(s, 6H, HOPO CH3), 3.45(q, 2H, DME CH2), 3.10(m, 6H, TREN CH2), 2.30(m, 8H, TREN CH2 and DME CH2), 2.13(s, 6H, DME CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C60H66N8O10・2.5H2O: C, 65.29 (65.28); H, 6.44(6.31); N, 10.15 (10.01). ES-MS(+): m/z 1059.3[M+H]+.
【０３１１】
(2)  TREN-1-M-3,2-HOPO-TAM-DME (27B)の合成
10% Pd/C (0.10g)をベンジル保護TREN-Me-3,2-HOPO-TAM-DME (0.826g, 0.781mmol)/AcOH(10ml)溶液に加えた。この混合物をH2雰囲気下、周囲条件で2日間撹拌した。Pd/Cをろ去し、溶媒をロータリーエバポレーションで留去した。残渣をMeOH(10ml)と1滴の濃HClに溶解してCl-塩に変換し、溶媒を留去した(×3)。残渣をMeOH (10ml)に溶解して過剰量のHClを除去し、また溶媒を減圧留去した(×3)。残渣をMeOH(2ml)に溶解し、急速撹拌Et2O溶液(200ml)に加えて白色沈殿を生じさせ、ろ取し、減圧乾燥させた(収量: 0.640g, 95%)。1H NMR (D2O, 500MHz): δ= 7.01(d, J=10.9Hz, 1H, TAM-H), 6.97(d, J=10.9Hz, 1H, TAM-H), 6.88(d, J=9.1Hz, 2H, HOPO-H), 6.23 (d, J=9.1Hz, 2H, HOPO-H), 3.87(m, 6H, TREN-CH2), 3.82(t, J=7.4Hz, 2H, DME CH2), 3.70(m, 6H, TREN CH2), 3.48(s, 6H, DME CH3), 3.43(t, J=7.4Hz, 2H, DME CH2), 2.97 (s, 6H, TREN CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C32H42N8O10・2HCl・3.5H2O: C, 46.05 (46.15); H, 6.16 (6.29); N, 13.42 (13.33). FAB-MS(+): m/z 699[M+H]+.
【０３１２】
実施例13  ガドリニウム(III )イオンのTREN-1-Me-HOPO-TAM-DMEとの錯体(27C)の合成
GdCl3・6H2O (0.073g, 0.195mmol)をTREN-HOPO-TAM-DME (0.150g, 0.195mmol)/H2O(10ml)溶液に加え、溶液を1時間撹拌した。イミダゾール(0.093g, 1.17mmol)を加え、溶液を2時間加熱還流し、白色沈殿を生じさせた。溶媒を留去し、残渣をiPrOH中に懸濁させ、超音波処理し、ろ過し、減圧乾燥させた(収量: 0.128g, 74%)。Anal. Calcd (Found) for Gd(L)(H2O)2, C32H43N8O12Gd: C, 43.28 (42.97); H, 4.88 (4.87); N, 12.60 (12.33); Gd, 17.69 (18.14). ES-MS(+): m/z 853[M+H]+. UV/可視スペクトルは中性pHでGd-TREN-1-Me-HOPO-TAMのそれと同じであった。
【０３１３】
実施例14  TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000(式(47A))の合成
(1)  ベンジル保護TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-チアゾリド(スキーム3の式(25))の合成
TREN(1-Me-HOPO)2 (3.00g, 4.77mmol)/CH2Cl2(150ml)溶液をBnTAMdiThiaz (20.77g, 47.7mmol)/CH2Cl2(250ml)溶液に1時間かけて滴下した。得られた溶液をさらに8時間撹拌した後、グラジエントフラッシュシリカカラム(0〜4% CH3OH/CH2Cl2)で2回精製した。溶媒を減圧留去して黄色フォームを得た(収量: 3.56g, 68%)。1H NMR (CDCl3, 500MHz): δ= 7.82(t, J=5.3Hz, 2H, HOPO amide H), 7.78(d, J=8.2Hz, 1H, TAM-H), 7.22-7.41(m, 20H, Bn), 7.18 (d, J=8.2Hz, 1H, TAM-H), 7.08(d, J=7.2Hz, 2H, HOPO-H), 6.65(d, J=7.2Hz, 2H, HOPO-H), 5.30(s, 4H, HOPO Bn CH2), 5.11(s, 2H, TAM Bn CH2), 5.06(s, 2H, TAM Bn CH2), 4.38(t, J=7.3Hz, 2H, TAM thiaz), 3.57(s, 6H, CH3), 3.12 (m, 6H, TREN CH2), 2.93(t, J=7.3Hz, 2H, TAM thiaz), 2.29(m, 6H, TREN CH2) ppm. Anal. Calcd (Found) for C59H59N7O10S2: C, 65.00 (64.68); H, 5.45 (5.30); N, 8.99 (8.73). FAB-MS(+): m/z 1090.5[M+H]+.
【０３１４】
(2)  ベンジル保護TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000 (スキーム3の式(27)、R=(CH2CH2O)nCH3、平均n=121)の合成
PEG-5000モノアミン(1.85g, 0.370mmol)をベンジル保護TREN-1-Me-HOPO-TAM-チアゾリド(0.4g, 0.377mmol)/無水CH2Cl2 (5ml)溶液に加えた。得られた溶液を窒素雰囲気下、313Kで数日間撹拌した。4日後、数滴のEt3Nと触媒量のジメチルアミノピリジン(DMAP)を加えた。TLCで反応の完了を確認した後、溶媒を留去し残渣をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜10%CH3O/ CH2Cl2)及びSepahdex LH-20 (溶媒: MeOH)カラムクロマトグラフィーにより、GPC分析で純粋と確認されるまで、精製した(収量: 1.95g, 91%)。1H NMR (AcOH添加CDCl3, 500MHz): δ=8.12 (m, 4H, NH’s), 7.70(d, J=8.3Hz, 1H, TAM-H), 7.54(d, J=8.3Hz, 1H, TAM-H), 7.26-7.37(m, 20H, Bn), 7.06(d, J=7.5Hz, 2H, HOPO-H), 6.53(d, J=7.5Hz, 2H, HOPO-H), 5.30(s, 4H, HOPO Bn CH2), 5.12(s, 2H, TAM Bn CH2), 5.09 ppm. 他のピークはすべて2〜4 ppmの間のPEG及びAcOHピークにより覆い隠されている。MS-ES(+): m/z 1582(平均質量),[M]4+ with 121-(CH2CH2O)- units. この領域のピーク間隔は、PEG化合物に関する予想どおり、11マスユニット分であった。
【０３１５】
(3)  TREN-1-Me-HOPO-TAM-PEG-5000 (47A)の合成
5% Pd/C(0.2g)をベンジル保護TREN-1-Me-HOPO-TAM-PEG-5000 (2.00g, 0.334mmol)/AcOH(20ml)溶液に加え、混合物をH2雰囲気下、周囲条件で3日間撹拌した。Pd/Cをろ去し、溶媒をロータリーエバポレーションで留去した。残渣をMeOH(10ml)と1滴の濃HClに溶解してCl-塩に変換し、溶媒を留去した(×3)。残渣をMeOH (10ml)に溶解して過剰量のHClを除去し、また溶媒を減圧留去した(×3)。残渣をMeOH(2ml)に溶解し、急速撹拌Et2O溶液(200ml)に加えて白色沈殿を生じさせ、ろ取し、減圧乾燥させた(収量: 1.95g, 91%)。1H NMR (D2O, 500MHz): δ= 6.96(d, 1H, TAM-H), 6.91(d, 1H, TAM-H), 6.73(d, J=7.2Hz, 2H, HOPO-H), 6.04(d, J=7.2Hz, 2H, HOPO-H), 3.2-2.8(m, large integral, PEG and other protons) ppm. Anal. Calcd (Found) with 121 -(CH2CH2O)- units for C271H520N7O131Cl: C, 54.17 (53.76); H, 8.72 (8.77); N, 1.62 (1.35).
【０３１６】
実施例15  ガドリニウム(III )イオンのTREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000との錯体 (式(47))の合成
GdCl3・6H2O (0.0146g, 0.0392mmol)をTREN-1-Me-HOPO-TAM-PEG-5000 (0.220g, 0.0392mmol)/H2O(10ml)溶液に溶解した。過剰量のアンモニア水を加え、溶液を2時間加熱還流した。溶液をろ過し、ろ液から溶媒を留去した。生成物をSephadex LH-20カラムで溶出、精製後、溶液を急速撹拌Et2O溶液(200ml)に加えて浅黄色の沈殿を生じさせ、ろ取し、減圧乾燥させた(収量: 0.196g, 87%)。Anal. Calcd (Found) with 121 -(CH2CH2O)- units for [Gd(L)]・NH4・3NH4Cl, C271H531N11O131GdCl3: C, 51.63 (51.53); H, 8.49 (8.91); N, 2.44 (2.65); Gd, 2.49 (2.89). MS-ES-TOF(-): m/z 3093 (平均質量)。質量、同位体分布とも[Gd(LH)+2Cl]2-と-(CH2CH2O)-ユニット×121に対応する。この化合物のUV/可視スペクトルは中性pHでGd-TREN-1-Me-HOPO-TAMのそれと同じであった。
【０３１７】
実施例16  TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-2000 (46A)の合成
(1)  TAM-チアゾリド-PEG-2000 (スキーム3の式(26)、R=(CH2CH2O)nCH3、平均n=42)の合成
PEG-2000モノアミン(1.0g, 0.5mmol)/CH2Cl2(50ml)溶液をN2雰囲気下、急速撹拌BnTAMdiThiaz (10.0g, 17.5mmol)/CH2Cl2 (150ml)溶液に滴下した。2日後、溶液を減容し、グラジエントフラッシュシリカカラム(2〜10%CH3OH/CH2Cl2)で精製した。第1黄色バンドは未反応BnTAMdiThiazであり、将来の使用に備えて保存した。第2黄色バンドは所望の生成物であった。溶媒を留去し得られた粘稠な黄色油を4時間静置して凝固させた(収量: 1.08g, 87%)。1H NMR (d6-DMSO, 400MHz): δ= 8.06(br s, 1H, NH), 7.88(d, J=8.3Hz, 1H, TAM CH), 7.33-7.38(m, 10H, aromatic H), 7.20(d, J=8.3Hz, 1H, TAM CH), 5.10(s, 4H, Bn CH2), 4.37(t, J=6.8Hz, 2H, thiazolide CH2), 3.55-3.70(m, large integral, PEG H), 2.94(t, J=6.8Hz, 2H, thiazolide CH2). Anal. Calcd (Found) with 42 -(CH2CH2O)- units for C110H192N2O46S2: C, 56.39 (56.29); H, 8.26 (8.19); N, 1.20(1.26). MS-ES(+): m/z 1172(平均質量),[M]2+ with 42 -(CH2CH2O)- units。この領域のピーク間隔は、PEG化合物に関する予想どおり、22マスユニット分であった。
【０３１８】
(2)  ベンジル保護TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-2000(スキーム3の式(27)、R=(CH2CH2O)nCH3、平均n=42)の合成
TAM-チアゾリド-PEG-2000(1.0g, 0.42mmol)をTREN(1-Me-HOPO)2 (0.341g, 0.54mmol)/CH2Cl2(20ml)溶液に加えた。得られた黄色溶液をN2雰囲気下、2日後に無色となるまで撹拌した。生成物をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜8% CH3OH/ CH2Cl2)で精製した。溶媒を留去して白色固形物を得た(収量: 0.91g, 85%)。1H NMR (D2O, 500MHz): δ= 8.36(t, 1H, TAM amide NH), 8.18(t, 1H, TAM amide NH), 8.15(t, 2H, HOPO amide NH), 7.47(d, J=8.9Hz, 2H, HOPO CH), 7.26-7.40(m, 22H, aromatic H), 6.23(d, J=8.9Hz, 2H, HOPO CH), 5.18(s, 4H, HOPO Bn CH2), 5.05(s, 2H, TAM Bn CH2), 5.03(s, 2H, TAM Bn CH2), 3.17-3.66(m, PEG and TREN H) ppm. Anal. Calcd (Found) with 42 -(CH2CH2O)- units for C141H228N7O52: C, 59.35 (59.09); H, 8.05 (8.30); N, 3.44 (3.34). MS-ES(+): m/z 1427(平均質量),[M2++1] with 42 -(CH2CH2O)- units.この領域のピーク間隔は、PEG化合物に関する予想どおり、22マスユニット分であった。
【０３１９】
(3)  TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-2000 (46A)の合成
5% Pd/C(0.15g)をベンジル保護TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-2000 (0.86g, 0.167mmol)/AcOH(10ml)溶液に加え、混合物をH2雰囲気下、周囲条件で3日間撹拌した。Pd/Cをろ去し、溶媒をロータリーエバポレーションで留去した。残渣をMeOH(10ml)と1滴の濃HClに溶解してCl-塩に変換し、溶媒を留去した(×3)。残渣をMeOH (10ml)に溶解して過剰量のHClを除去し、また溶媒を留去した(×3)。残渣をMeOH(2ml)に溶解し、急速撹拌Et2O溶液(200ml)に加えて白色沈殿を生じさせ、ろ取し、減圧乾燥させた(収量: 0.65g, 85%)。1H NMR (d6-DMSO, 500MHz): δ= 9.09(br s, 1H, TAM amide NH), 8.96(br s, 1H, TAM amide NH), 8.66(br s, 1H, HOPO amide NH), 7.33(d, 1H, TAM-H), 7.31(d, 1H, TAM-H), 7.11(d, J=7.2Hz, 2H, HOPO-H), 6.42(d, J=7.2Hz, 2H, HOPO-H), 3.22-3.71(m, large integral, PEG and TREN H) ppm. Anal. Calcd (Found) with 42 -(CH2CH2O)- units for C113H203N7O52・HCl・3H2O: C, 52.56 (52.27); H, 8.20 (8.00); N, 3.80 (3.96). MS-ES(+): m/z 1246(平均質量), [M]2+ with 42 -(CH2CH2O)- units.この領域のピーク間隔は、PEG化合物に関する予想どおり、22マスユニット分であった。
【０３２０】
実施例17  ガドリニウム(III )イオンのTREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-2000との錯体 (式(46))の合成
GdCl3・6H2O (0.043g, 0.135mmol)をTREN-1-Me-HOPO-TAM-PEG-2000 (0.35g, 0.135mmol)/H2O(10ml)溶液に溶解した。過剰量のアンモニア水を加え、溶液を2時間加熱還流した。溶液をろ過し、ろ液から溶媒をロータリーエバポレーションで除去した。生成物をSephadex LH-20カラムで溶出、精製した後、溶液を急速撹拌Et2O溶液(200ml)に加えて浅黄色の沈殿を生じさせ、それをろ取し減圧乾燥させた(収量: 0.297g, 84%)。Anal. Calcd (Found) with 42 -(CH2CH2O)- units for [Gd(L)]・NH4・NH4Cl, C113H207N9O52GdCl: C, 49.96 (49.72); H, 7.68 (7.48); N, 4.63 (4.19); Gd, 5.79 (5.55). MS-ES-TOF(-): m/z 2681 (平均質量)。質量、同位体分布とも[Gd(LH)+Cl]- with 42 -(CH2CH2O)- unitsに対応する。
【０３２１】
実施例18  TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-O2-NH2 (27D)の合成
(1)  ベンジル保護TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-O2-NH2 [スキーム3の式(27)、R=(CH2CH2O)2CH2CH2NH2 ]の合成
TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-チアゾリド(1.50g, 1.41mmol)/ CH2Cl2(100ml)溶液を2-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-エチルアミン(10.46g, 70.6mmol)/CH2Cl2(200ml)急速撹拌溶液に加えた。得られた透明溶液をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜10%  CH3OH+1%Et3N/CH2Cl2)で精製した。溶媒を留去して無色油を得た(収量: 0.96g, 61%)。1H NMR (d6-DMSO, 400MHz): δ= 8.37(br s, 1H, TAM NH), 8.18(br s, 1H, TAM NH), 8.14(br s, 2H, HOPO NH), 7.46(d, J=6.8Hz, HOPO H), 7.25-7.39(m, 22H, aromatic H), 6.22(d, J=6.9Hz, HOPO-H), 5.17(s, 4H, Bn CH2), 5.02(s, 4H, Bn CH2), 3.18-3.54(m, 18H, CH2 and HOPO CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C62H70N8O12・2H2O: C, 64.46 (64.45); H, 6.46 (6.45); N, 9.70 (9.45). FAB-MS(+): m/z 1119.7 [M+H]+.
【０３２２】
(2)  TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-O2-NH2 (27D)の合成
ベンジル保護TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-O2-NH2 (0.83g, 0.74 mmol)をAcOH(10mL)と濃HCl(10ml)に溶解し、3日間撹拌した。溶媒を留去し、残渣の固形物をMeOH(2ml)、H2O(10ml)及び濃HCl(5ml)に溶解し10時間置いた。溶媒留去後、残渣をMeOH (10ml)に溶解し、再び溶媒をロータリーエバポレーションで留去した。この手順を6回繰り返したが、当初3回までは溶液に6M HClを2滴加えた。最終残渣をMeOH(3ml)に溶解し、急速撹拌Et2O (150ml)溶液に加えて、得られた白色粉末をろ取し、減圧乾燥させた(収量: 0.48g, 73%)。1H NMR (d6-DMSO/D2O, 500MHz): δ= 7.27 (d, 1H, TAM), 7.24(d, 1H, TAM), 7.06(d, J=7.4Hz, 2H, HOPO), 6.35(d, J=7.4Hz, 2H, HOPO), 3.43-3.63(m, aliphatic H) ppm. Anal. Calcd (Found) for C34H46N8O12・2HCl・3H2O: C, 46.11 (46.48); H, 6.14 (6.16); N, 12.65 (12.21). FAB-MS(+): m/z 759 [M+H]+.
【０３２３】
実施例19  ガドリニウム(III )イオンのTREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-O2-NH2との錯体(27E)の合成
GdCl3・6H2O(0.060g, 0.16mmol)とTREN-HOPO-TAM-O2-NH2 (0.150g, 0.169 mmol)とのH2O(10ml)溶液にイミダゾール(0.058g, 0.85mmol)を加えた。得られた浅黄色の溶液を2時間加熱還流し、溶媒を留去して黄色残渣を得た。それをiPrOH中に懸濁させ、超音波処理し、ろ過した(×3)。得られた淡褐色の固形物を減圧乾燥させた(収量: 0.117g, 73%)。Anal. Calcd (Found) for Gd(TREN-HOPO-TAM-O2-NH2(H2O)2, C34H47N8O14Gd: C, 43.03 (42.87); H, 4.99 (4.61); N, 11.81 (11.63). FAB-MS(+): m/z 913.2 [M+H]+.
【０３２４】
実施例20  TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM2 (27H)の合成
(1)  TAM-チアゾリド-エタノールアミン(27F)の合成
エタノールアミン(0.32g, 5.26mmol)/CH2Cl2(100ml)溶液を周囲条件下、BnTAMdiThiaz(15.0g, 26.3mmol)/CH2Cl2 (150ml)急速撹拌溶液に滴下した。反応液を8時間撹拌し、次いで生成物をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜10%CH3OH/CH2Cl2)で単離した。溶媒を留去し黄色油を得たが、これは数時間静置すると凝固した(収量: 2.17g, 79%)。1H NMR (D2O, 500MHz): δ= 8.17 (t, J=5.4Hz, NH), 7.93(d, J=8.2Hz, 2H, TAM CH), 7.39(m, 10H, Bn H), 7.23(d, J=8.2Hz, 2H, TAM CH), 5.14(s, 2H Bn CH2), 5.13, (s, 2H Bn CH2), 4.40(t, J=7.3Hz, 2H, thiazolide CH2), 3.62 (t, J=4.7Hz, 2H, OCH2), 3.39(q, J=5.4Hz, 2H, HCH2), 2.97(t, J=7.3Hz, thiazolide CH2) ppm. Anal. Calcd (Found) for C25H26N2O5S2:C, 62.05(61.81); H, 5.01 (5.06); N, 5.36 (5.14). FAB-MS(+): m/z 523 [M+H]+.
【０３２５】
(2)  ベンジル保護TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM2 (27G)の合成
TAM-チアズ-エタノールアミン(1.50g, 2.81mmol)/CH2Cl2(100ml)溶液を急速撹拌トリス(2-アミノエチルアミン)(TREN, 0.229g, 1.57 mmol)/CH2Cl2(100ml)溶液に滴下した。TLCで必要と判断されたため、追加の1-Bn-6-Me-3,2-HOPO-チアゾリドを少量加えた。反応混合物をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜10% CH3OH+1% Et3N/CH2Cl2)で精製した。溶媒を留去して無色油を得た(収量: 0.63g, TRENを基準にして34%)。1H NMR (d6-DMSO, 400MHz): δ= 8.31 (br t, 2H, TAM NH), 8.22(br t, 2H, TAM NH), 8.14(t, 1H, HOPO NH), 7.45(d, J=7.0Hz, 1H, HOPO CH), 7.29-7.40(m, 29H aromatic H), 6.21(d, J=7.0Hz, 1H, HOPO CH), 5.19(s, 2H, HOPO Bn CH2), 5.03(s, 8H, TAM Bn CH2), 4.75(t, 2H, OH), 3.45(s, 3H, HOPO CH2), 3.24-3.33(m, 20H, CH2) ppm. Anal. Calcd (Found) for C68H71N7O13・2H2O: C, 66.38 (66.60); H, 6.14 (6.20); N, 7.97 (7.83). FAB-MS(+): m/z 1194.6 [M+1]+.
【０３２６】
(3)  TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM2 (27H)の合成
ベンジル保護TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM2 (0.470g, 0.382mmol)をAcOH(5ml)+濃HCl(5ml)に溶解し周囲条件下3日間撹拌した。溶媒を留去し、残渣を6.0M HClに溶解し、さらに24時間撹拌した(これは脱保護反応時に形成されたことが判明したアセチルエステルを加水分解することが目的であった)。溶媒を留去し、残渣をMeOH(5ml)に溶解し、次いでロータリーエバポレーションで溶媒を留去した(×3)。残渣をMeOH(3ml)に溶解し、急速撹拌Et2O (200ml)溶液に加えて白色沈殿を形成させ、それをろ取し減圧乾燥させた(収量: 0.248g, 77%)。1H NMR (d6-DMSO, 300MHz): δ= 9.14 (br s, 2H, TAM NH), 8.93(br s, 2H, TAM NH), 8.70(br s, 1H, HOPO NH), 7.41(d, J=8.8Hz, 2H, TAM CH), 7.34(d, J=8.8Hz, 2H, TAM CH), 7.13(d, J=7.3Hz, 1H, HOPO CH), 6.43(d, J=7.3Hz, 1H, HOPO CH), 3.36-3.75(m, 23H, aliphatic H) ppm (約0.15当量のEt3Nの存在も確認されたが、これは前段反応のカラムに由来すると推測される). Calcd (Found) for C33H42N7O13Cl・0.15Et3N・HCl・2.5H2O: C, 48.14 (48.36); H, 5.89 (5.91); N, 11.84 (11.84). FAB-MS(+): m/z 744 [M+H]+.
【０３２７】
実施例21  TREN-Gly-1-Me-3,2-HOPO (6A)の合成
(1)  Gly-1-Me-3,2-HOPO (4A)の合成
1-Me-HOPO-3,2-チアゾリド(スキーム1の式(4))(3.00g, 8.334 mmol)をCH2Cl2(50ml)+iPrOH(50ml)に溶解し、NaOH (0.350g, 8.60mmol)+グリシン(0.626g, 8.334mmol)の水(3ml)溶液に加えた。次いで黄色混合物を24時間撹拌して無色に変え、反応の完了をTLCで確認した。反応混合物をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜10% CH3OH/CH2Cl2)で精製した。溶媒を留去し、生成物をさらに精製するために熱EtOHから再結晶させて白色針状結晶を得た(収量: 2.06g, 78%)。1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ= 8.51 (t, J=5.4Hz, 1H, NH), 7.33-7.49(m, 5H, Bn), 7.12(d, J=7.2Hz, 1H, HOPO CH), 6.78(d, J=7.2Hz, 1H, HOPO CH), 5.43(s, 2H, Bn CH2), 4.05(d, J=5.4Hz, 2H, glycine CH2), 3.61(s, 3H, N-CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for C16H16N2O5: C, 60.75 (60.84); H, 5.10 (5.11); N, 8.86 (8.70). EI-MS(+): m/z 317 [M+H]+.
【０３２８】
(2)  ベンジル保護TREN-Gly-1-Me-3,2-HOPO (5A)の合成
N-ヒドロキシスクシンイミド(0.534g, 4.64mmol)を窒素雰囲気下、Gly-1-Me-HOPO (1.220g, 3.87mmol)/無水THF(60ml)溶液に加えた。20分間撹拌後、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC, 0.956g, 4.64mmol)とジメチルアミノピリジン(DMAP, 0.044g, 0.46 mmol)を加えた。9時間後、ジシクロヘキシルウレア(DCU)の白色沈殿がすでに形成されていたが、NHS活性化エステルの形成の完了をTLCで確認した。TREN(0.141g, 0.967mmol, 0.25当量)を加えた。溶媒を留去し、残渣を0.1M HCl水溶液(150ml)に加え、この懸濁液をろ過し、ろ液をCH2Cl2(2×50ml)で洗った。次いで有機画分を合わせて1.0M HCl(50ml)で逆抽出した。水性画分を合わせ、それに10M NaOHをpHが11になるまで滴下した。ついで水性画分をCH2Cl2(10×50ml)とEtOAc(3×50ml)で抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥させ(Na2SO4)、蒸発乾固した。生成物をグラジエントフラッシュシリカカラム(2〜8% CH3OH/CH2Cl2)で精製した。溶媒を留去して白色フォームを得た(収量: 0.753g, 56%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 8.58 (t, J=5.4Hz, 3H, HOPO-glycine NH), 7.27-7.51(m, 18H, Bn and glycine-TREN NH), 7.00(d, J=7.2Hz, 3H, HOPO), 6.59(d, J=7.2Hz, 3H, HOPO), 5.42(s, 6H, Bn CH2), 3.85(d, J=5.4Hz, 6H, glycine CH2), 3.51(s, 9H, N-CH3), 3.20(m, 6H, TREN NHCH2), 2.51(m, 6H, TREN NCH2) ppm. Anal. Calcd (Found) for C54H60N10O12・2H2O: C, 60.21 (59.96); H, 5.99 (5.96); N, 13.00 (12.93). FAB-MS(+): m/z 1041.5 [M+H]+.
【０３２９】
(3)  TREN-Gly-1-Me-3,2-HOPO (6A)の合成
TREN-Gly-1-Me-3,2-HOPO-Bn (0.650g, 0.624mmol)をMeOH (325ml)+EtOH(325ml)の混合物に溶解し、5% Pd/C(0.65g)/EtOH (65ml)懸濁液に加えた。反応液を水素雰囲気下、6時間撹拌した。溶液をろ過し、溶媒を留去して白色固形物を得た(収量: 0.296g, 62%)。この固形物は吸湿性であると判明したので、減圧デシケーターに保存した。1H NMR (d6-DMSO, 400MHz): δ= 8.71 (br s, 3H, HOPO-glycine NH), 7.95(br s, 3H, glycine-TREN NH), 7.17(d, J=7.3Hz, 3H, HOPO), 6.52(d, J=7.3Hz, 3H, HOPO), 3.92(br s, 6H, glycine CH2), 3.46(s, 9H, N-CH3), 2.54(br s, 6H, TREN CH2) ppm. Anal. Calcd (Found) for C33H42N10O12・3.5H2O: C, 47.54 (47.49); H, 5.92 (5.46); N, 16.80 (16.48). FAB-MS(+): m/z: 771 [M+H]+.
【０３３０】
実施例22  ガドリニウム(III )イオンのTREN-Gly-1-Me-3,2-HOPOとの錯体(7A)の合成
GdCl3・6H2O (0.0327g, 0.124mmol)をTREN-Gly-1-Me-HOPO (0.100g, 0.138mmol)/H2O(30ml)溶液に溶解した。次いで過剰量のアンモニア水を加えて淡黄色沈殿を生じさせた。この懸濁液を2時間加熱還流した。冷却後、溶液を減容し、生成物をろ取し減圧乾燥させた(収量: 0.079g, 71%)。Anal. Calcd (Found) for Gd(TREN・Gly-1-Me-3,2-HOPO)(H2O)2・3H2O, C33H43N10O14Gd・3H3O: C, 39.05 (39.37); H, 4.87 (4.42); N, 13.80 (13.37); Gd, 15.49 (15.35). FAB-MS(+): m/z 924 [M]+.
【０３３１】
実施例23  ポリ(エチレングリコール)官能化Gd(III )錯体の核磁気共鳴分散(NMRD)研究
Gd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000に関連する緩和度パラメーターを観測するために、一組の緩和度パラメーターから生成した理論曲線を核磁気共鳴分散(Nuclear Magnetic Resonance Dispersion, NMRD)プロフィールにあてはめた。図16はGd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000の水中、25℃、pH=7.4でのNMRDプロフィールを示す。実線はパラメーターr=3.1Å、q=1、τR=300ps、τM=31ns(17O NMRより)、τV=24ns、Δ2=7.3×1019、a=4.0Å、D=2.24×10-5cm2s-1をあてはめた曲線である。適合度が比較的低いのは、金属中心原子の近傍で水素結合水分子網を組織するPEG分子鎖に由来する余分な緩和度が大きいことを反映する可能性がある。この「第2圏」緩和度は定量的に説明することができないが、τR値、又は実際よりも長い電子緩和時間τS0のゼロ磁場値をたぶん反映しよう。にもかかわらず、17O NMR分析で得られた値と一致するq=1では、群を抜く最高の適合度が得られた。実際、q=2 (点線)での適合度はきわめて低く、この分子量の錯体としては不当に低いτR値(147ns)をとらせる結果となる。
【０３３２】
実施例24  ポリ(エチレングリコール)官能化Gd(III )錯体上の水交換の17O NMR分析
Gd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM、Gd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-2000及びGd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000のH217Oの横緩和速度(R2p)を2.1Tで温度可変17O NMRにより調べた。図17はR2p-温度プロフィールである。これらのプロフィールを分析すると配位水分子数qの評価も可能となる。興味深いことに、Gd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAMはq=2であり、またGd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-2000及びGd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000はq=1であることが判明した。PEG分子鎖の存在下でqが減少するのは、2個の水分子がPEGの酸素ドナー原子により部分的に押しのけられるためと説明することができる。重要なことには、PEG分子鎖の伸長に伴いτM値が増大するように見受けられる。因みに、その値はGd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM、Gd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-2000及びGd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000でそれぞれ8±1 ns、19±2 ns及び31±2 nsである。
【０３３３】
最適τM値はいくつかの変数、特にMRIスキャナーの磁場強度に依存する。従来の報告では最適τM値は数十ナノ秒と示唆されている。本発明錯体について、もっともらしい最適τM値を調べるために、一般的なMRI磁場強度の範囲で最適τM値を計算した(図18)。その結果は、水交換速度が臨床MRIにとって最適である範囲にまたがることを明示している。
【０３３４】
実施例25  ポリ(エチレングリコール)官能化Gd(III )錯体の緩和度に対するHSA結合の効果
Gd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000のpH=7.5での緩和度は9.1mM-1s-1(20MHz、25℃)であり、Gd-TREN-HOPO-TAMの8.8mM-1s-1(20MHz、25℃)に匹敵する。PEG分子鎖の付加に伴う観測緩和度の上昇は分子量の大幅な増大を考えればごく小幅であるが、これはqの減少及びPEG分子鎖の急速内部運動のτRに対する効果を反映している。
【０３３５】
Gd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000の0.25M溶液中での水プロトンの縦緩和速度(R1)を20MHz、25℃で、HSA濃度を高めながら測定した(図19)。その結果はHSA濃度の上昇に伴うR1の増大をはっきりと示している。これらのデータから、Gd-TREN-1-Me-3,2-HOPO-TAM-PEG-5000のHSA付加体の緩和度を、生成定数Ka=186±50 M-1として、74±14 mM-1s-1と計算した。これは比較的弱い結合を表わており、生理的HSA濃度の下では結合及び未結合錯体の混合物をもたらす結果となろう。この付加体の緩和度観測値は今日までに報告されている他のどの錯体よりも(GdIII 中心原子あたりで)ずっと大きいが、これは最適水交換速度と遅い回転相関時間とを反映している。
【０３３６】
実施例26  1,2-HOPOBn酸塩化物の合成
(1)  一般
薬品類はすべて商業供給者(Aldrich又はFisher)から購入し、受領したままの状態で使用した。6-ヒドロキシピコリン酸はFlukaから購入した。Me-3,2-HOPOBn-チアゾリドは前述の要領で合成した[Xu et al., J. Med. Chem. 38:2606-2614 (1995)]。反応は窒素雰囲気下に行った。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーはMerck 40-70メッシュシリカゲルを使用して行った。特に断らない限り、NMRスペクトルはすべてカリフォルニア大学バークレー校NMR  LaboratoryのBruker DRX 500、AMX 400又はAMX 300分光計を使用して周囲温度で記録した。HPLC分析はDynamax-60A C18逆相カラム(移動相: 65%メタノール/水)使用のVarian Pro Star Systemで行った。微量分析はカリフォルニア大学バークレー校化学部のMicroanalytical Services Laboratoryで行った。質量スペクトルは同Mass Spectrometry Laboratoryで記録した。
【０３３７】
(2)  6-カルボキシ-1,2-HOPO (35A)の合成
無水酢酸(100ml)を30% H2O2溶液(25ml)と冷却しながら混合した。混合物を4時間撹拌し、均一な過酢酸溶液が形成されるようにした。この過酢酸溶液を6ヒドロキシピコリン酸(Fluka, 25g, 0.18mol)/[トリフルオロ酢酸(150ml)+氷酢酸(100ml)混合物]溶液に撹拌しながらゆっくりと加えた(注意: 混合物中の固体粒子は激しく酸素を発生させるので、暴走反応を引き起こしかねない)。この混合物を室温で1時間撹拌し、次いで80℃(油浴温度)へと徐々に加熱し、80℃に10時間保った。この間に形成された白色沈殿をろ取し、冷メタノールで洗い、乾燥させた。それを10% KOH水溶液に溶解し、80℃に6時間加熱し、濃HClで再沈殿させた。生成物をろ取し、水で洗い、減圧乾燥させた。収量20.5g(0.132mol, 73%)。mp 176-177℃。Anal. Calcd (Found) for C6H5NO4 (F.W. 155.51): C, 46.46 (46.31); H, 3.25 (3.45); N, 9.03(9.12). 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 6.63(dd, J=7.0, 1.5Hz, 1H). 6.71(dd, J=9.2, 1.5Hz, 1H), 7.43 (dd, J=9.0, 7.1Hz, 1H). 13C NMR (125MHz, DMSO-d6): δ 106.9, 120.5, 134.9, 137.3, 157.4, 163.3. IR (KBr pellet):1734cm-1 (br, C=O); 1616cm-1(m, C=O).
【０３３８】
(3)  1-ベンジルオキシ-6-カルボキシ-2(1H)-ピリミジノン(36A)の合成
35A (15.5g, 0.1mol)と無水炭酸カリウム(27.6g, 0.2mol)を塩化ベンジル(15.2g, 0.12mol)/メタノール(250ml)と混合した。混合物を16時間還流し、ろ過し、ろ液を蒸発幹固した。残渣を水(50ml)に溶解し、6N HClでpH 2に酸性化した。形成された白色沈殿をろ取し、冷水で洗い、減圧乾燥させて22.3g(91%)の36Aを得た。mp 176-177℃。Anal. Calcd (Found) for C13H11NO4: C, 63.66 (63.75); H, 4.53 (4.55); N, 5.71(5.52). 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 5.26(s, 2H, CH2). 6.54(dd, J=6.7, 1.1Hz, 1H), 6.73 (dd, J=9.2, 1.6Hz, 1H), 7.39-7.51(m, 6H). 13C NMR (125MHz, DMSO-d6): δ 77.9, 106.0, 124.1, 128.5, 129.1, 129.6, 133.8, 138.7, 140.4, 157.6, 161.7.
【０３３９】
(4)   1,2-HOPOBn酸塩化物(37A)の合成
ベンジルオキシ1,2-HOPOカルボン酸(5.0g, 20mmol)/トルエン又はベンゼン(50〜70ml)懸濁液に過剰量の塩化オキサリル(5.0g)を撹拌しながら加えた。触媒としてDMFを1滴加えるとガスが発生して懸濁液が透明になった。次いで混合物を4〜6時間、60℃に加温した(油浴)。溶媒をロータリーエバポレーションで留去すると、淡褐色油が残った。トルエン(5ml)との同時蒸発を2回行った後、残渣を無水THFに溶解し、フラッシュシリカゲルプラグに通し、無水THFで溶出した。溶媒を減圧留去し、1,2-HOPObn酸塩化物を粘稠な淡黄色油として得た(粗収量: 5.0g, 95%)。この粗生成物は再精製せずにそのまま反応に使用した。1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 5.32(s, 2H, CH2), 6.88(d, J=7.0Hz, 1H), 6.726 (d, J=9.0Hz, 1H), 7.32-7.51(m, 6H). 13C NMR (125MHz, DMSO-d6): δ 78.5, 112.2, 128.5, 129.4, 130.3, 132.7, 136.4, 140.1, 158.1, 158.8.
【０３４０】
実施例27  3,4,3-LI(1,2-Me-3,2-HOPO)の合成
(1)  3,4,3-LI(1,2-HOPO)Bn (38A)の合成
粗製1,2-HOPOBn酸塩化物(5.0g, 19mmol)とトリエチルアミン(2.5ml)との無水THF(60ml)溶液にスペルミン(0.8g, 4mmol)を3分割して撹拌しながら加えた。混合物をストッパー付き100ml丸底フラスコで60℃に一晩加熱した(油浴)。次いで溶媒をロータリーエバポレーターで留去し、残渣を水(50ml)とジクロロメタン(50ml)の混合物に分配した。有機相を分離し、1M NaOH (100ml)、1M HCl (100ml)及び食塩水(100ml)で順次洗い、フラッシュシリカカラムに導入した。2〜6%メタノール/ジクロロメタンで溶出してベンジル保護前駆体3,4,3-LI-(1,2-HOPOBn)を白色フォームとして得た。収率: 70%。1H NMR (500MHz, CDCl3): δ 0.4-1.8(m, 16H), 2.8-3.6(m, 24H), 4.8-5.1(m, 24H), 4.88-5.05(m, 2H), 5.15-5.30(m, 4H), 5.30-5.45(m, 2H), 6.00-6.45(m, 4H), 6.55-6.70(m, 4H),7.25-7.55(m, 24H), 8.72-8.95(m, 2H, NH). 13C NMR (125MHz, DMSO-d6): δ 23.4, 24.2, 24.5, 24.6, 26.4, 26.7, 27.3, 27.7, 36.6, 36.7, 41.8, 42.0, 42.4, 43.7, 46.2, 47.4, 47.7, 48.1, 79.2, 102.7, 104.7, 123.1, 128.3, 128.4, 128.7, 129.2, 129.3, 129.4, 130.0, 130.1, 130.2, 130.3, 130.4, 132.8, 132.9, 133.0, 133.1, 138.2, 142.0, 142.5, 142.6, 143.3, 157.9, 158.1, 158.3, 160.4, 160.6, 161.2, 161.3. MS(FAB+): 1111.5(MH+).
【０３４１】
(2)  3,4,3-LI(1,2-HOPO) (39A)の合成
前駆体3,4,3-LI-(1,2-HOPOBn)を1:1 HCl/氷酢酸の作用により室温で4日間脱保護した。揮発物を完全に減圧留去し、残渣を最小量の水に溶解し、ろ過し、蒸発乾固した。収率:81%。1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 0.25-1.87 (m, 8H), 2.81-3.63 (m, 24H), 6.11-6.22 (m, 3H), 6.29-6.34 (m, 2H), 6.48-6.58 (m, 4H), 7-31-7.42 (m, 4H), 8.82 (q, J=7.2Hz, 1H), 8.91 (q, J=7.2Hz, 1H). 13C NMR (125MHz, D2O): δ 23.1, 23.7, 24.2, 25.4, 26.7, 36.6, 36.8, 41.9, 44.0, 45.8, 47.7, 48.1, 106.2, 106.5, 108.7, 109.0, 118.9, 120.1, 138.8, 139.0, 139.6, 140.0, 140.5, 159.2, 161.1, 161.2, 162.2.  MS(FAB+):751(MH+). Anal. Calcd (Found) for C34H38N8O12・H2O・2HCl(841.68); C, 48.52 (48.16); H, 5.03 (4.82); N, 13.31 (13.23).
【０３４２】
(3)  3,4,3-LI-Bis(Me-3,2-HOPOBn) (41A)の合成
スペルミン(0.5g, 2.5mmol)/無水ジクロロメタン(60ml)溶液にMe-3,2-HOPO-チアゾリド(2.0g, 5.5mmol)を撹拌しながら加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで1M KOH溶液で洗った(30ml×3)。次いで有機相を減圧乾燥させ、淡褐色油を得た。収率85%。1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 1.434 (m br, 4H), 1.506 (q, J=6.7Hz, 4H), 2.443(t, J=6.7Hz, 8H), 3.255(q, J=6.7Hz, 4H), 3.575(s, 6H), 5.341(s, 4H, OCH2), 6.725(d, J=7.2Hz, 2H), 7.101(d, J=7.2Hz, 2H), 7.2-7.5(m, 10H), 8.095(t, J=5.3Hz, 2H). 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ 27.25, 28.74, 37.43, 37.69, 46.84, 49.22, 74.56, 104.66, 128.52, 128.60, 128.81, 130.72, 132.00, 136.12, 146.08, 159.42, 163.16. MS(FAB+): 685.3 (MH+).
【０３４３】
(4)  3,4,3-LI(1,2-Me-3,2-HOPO)Bn (41B)の合成
粗製3,4,3-LI-Bis(Me-3,2-HOPOBn)(41A)(0.82g, 1.2mmol)を無水THF(50ml)+トリエチルアミン(1.2ml)に溶解し、粗製ベンジルオキシ1,2-HOPO酸塩化物(1.7g, 6.4mmol)/無水THF(60ml)溶液に4時間かけてゆっくりと加えた。反応混合物を一晩60℃に保った。溶媒を留去した後、残渣を水(50ml)+ジクロロメタン(50ml)混合物に分配した。有機相を1M NaOH (100ml)、1M HCl (100ml)及び食塩水(100ml)で順次洗い、フラッシュシリカカラムに導入した。3〜8%メタノール/ジクロロメタンで溶出してベンジル保護前駆体を白色フォームとして得た。収率: 75%。1H NMR (500MHz, CDCl3): δ 0.9-1.6 (m, 16H), 2.65-3.45 (m, 24H), 3.546(s, 6H), 4.90-5.02(m, 4H), 5.20-5.6(m, 8H), 5.80-6.10 (m, 4H), 6.54-6.80(m, 8H), 7.07-7.11(m, 4H), 7.15-7.51(m, 20H), 7.75(m br, 2H), 7.99 (m br, 1H). 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ 24.99, 26.35, 26.65, 26.66, 36.47, 36.60, 36.68, 37.39, 41.80, 43.68, 45.61, 47.85, 74.39, 74.42, 74.75, 74.82, 78.88, 79.03, 104.19, 104.22, 104.35, 104.40, 122.51, 128.18, 128.20, 128.24, 128.41, 128.44, 128.47, 128.50, 128.54, 128.70, 128.73, 128.75, 129.86, 129.91, 131.95, 133.11, 142.81, 157.80, 157.93, 159.14, 159.26, 161.42, 163.04, 163.12. MS(FAB+): 1139.8.
【０３４４】
(5)  3,4,3-LI(1,2-Me-3,2-HOPO) (43A)の合成
ベンジル保護前駆体3,4,3-LI(1,2-Me-3,2-HOPO)Bnを前記3,4-LI-(1,2-HOPO)の場合と同様にして脱保護した。粗生成物を最小量の水に溶解した。冷却後、純粋な3,4,3-LI(1,2-Me-3,2-HOPO)がベージュ色の固形物として沈殿した。固形物をろ取し、減圧乾燥させた。収率73% (スペルミンを基準にして)。1H NMR (500MHz, DMSO-d6): δ 1.2-1.85 (m, 16H), 2.85-3.35 (m, 24H), 3.453(s, 6H), 6.10-6.52(m, 6H), 7.10-7.41(m, 4H), 8.32 (m, 1H), 8.48(m, 1H). 13C NMR (500MHz, D2O/NaOD): δ 23.85, 24.02, 24.14, 24.19, 24.54, 24.83, 25.05, 26.89, 27.06, 28.13, 28.30, 35.67, 35.71, 36.47, 36.51, 36.58, 37.55, 42.93, 43.04, 43.16, 44.76, 44.90, 44.93, 45.11, 46.77, 48.34, 48.41, 48.67, 105.74, 106.15, 106.22, 106.44, 106.93, 107.14, 114.87, 114.96, 115.02, 115.87, 116.17, 119.61, 119.98, 132.70, 132.80, 133.06, 142.87, 143.12, 160.37, 161.93, 162.21, 164.41, 164.47, 165.60, 165.75, 169.49, 169.64. MS(FAB+): 779.4(MH+). Anal. Calcd (Found) for C36H42N8O12・3H2O・2HCl (905.76): C, 47.74 (48.05); H, 5.56 (5.22); N, 12.37 (12.16).
【０３４５】
化合物43Aの純度は分析用HPLCで確認した。クロマトグラムによれば該化合物の純度は99%超である。
【０３４６】
実施例28  2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキシ-4-ピリミジノンの合成
(1)  テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-酢酸エチルエステル(スキーム4の式(28))の合成
数個のp-トルエンスルホン酸結晶を含むグリコール酸エチル(35.3g, 0.339mol)撹拌溶液に3,4-ジヒドロピラン(30.0g, 0.375 mol)を(15gを1時間で、次いで15gを30分で)少量ずつ加えた。室温で一晩撹拌後、混合物をジエチルエーテル(80ml)で希釈し、NaHCO3溶液(飽和NaHCO3 30ml+水10ml)で洗った。有機相を分離し乾燥させ(Na2SO4)、エーテルを留去した。残渣を減圧下に蒸留して58.4g (91.5%)の28を透明な液体として得た。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 1.29 (t, 3H, J=7.1Hz, CH3),1.53-1.95(m, 6H, 3,4,5-THP- 3.50-3.55 (m, 1H, 6-THP-CH2), 3.83-3.89(m, 1H, 6-THP-CH2’s), 4.19(s, 2H, OCH2CO2R), 4.20(t, 2H, J=7.1Hz, CH2Me), 4.75 (m, 1H, THP-CH). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 14.1, 18.7, 25.2, 30.0, 60.7, 61.9, 63.8, 170.4.
【０３４７】
(2)  2-メチル-3H-5-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-6-テトラヒドロピラン-2-イルオキシメチル-4-ピリミジノン(29)の合成
THPO-グリコール酸エチル(34.0g, 0.195mol)/エーテル(180ml)を窒素雰囲気下、粒状Na (2.24g, 0.0974mol)と共に20時間撹拌して黄色溶液とした。Naの代りにNaH(0.54当量)を使用することも可能であるが、その場合は通常、反応を促進するために2〜5% m/mのEtOHを添加する必要がある。エーテルを留去し、残渣を無水エタノール(20ml)に浸した。アセトアミジン・HCl(9.32g, 0.0989mol)からアセトアミジン溶液を調製し、ナトリウムエトキシド/エタノール(130ml)(2.36gのNaを添加)に加えて2時間撹拌した。この懸濁液を、エタノールに浸した残渣上にろ過し、またろ過ケーキをエタノール(5ml)で洗った。次いで反応混合物を撹拌し、3.5時間還流下に加熱し、室温に冷まし、溶媒を留去した。残渣をCH2Cl2(80ml)に溶解し、AcOHを加え(湿らせたpH試験紙で調べてpHを6とし)た。水で洗った後(2×80ml)、有機相を乾燥させ(Na2SO4)、溶媒をほとんど留去した。この粘性CH2Cl2溶液にヘキサン(100ml)を加えて白色沈殿を生じさせ、それをろ取し、ヘキサンで洗って20.6g  (65.2%)の29を得た。mp 113-114℃。(+)FABMS: m/z 325+. 1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 1.4-2.0 (m, 12H, 3,4,5-THP-CH2), 2.42 (s, 3H, 2-CH3), 3.50-3.56 (m, 2H, 6-THP-CH2), 3.86-3.96 (m, 2H, 6-THP-CH2), 4.44-4.81 (4 d’s, 2H, CH2-OTHP), 4.79 (br m, 1H, THP-CH), 5.83 (br m, 1H, THP-CH), 11.44 (br s, 1H, NH). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 10.5, 18.5, 18.5, 19.1, 19.3, 21.1, 25.0, 25.38, 25.40, 29.9, 30.3, 30.4, 61.9, 62.2, 62.70, 62.74, 63.6, 63.8, 82.8, 98.4, 98.6, 98.63, 98.7, 138.58, 138.63, 152.4, 152.9, 161.6. Anal. Calcd (Found) for C15H24N2O5: C, 59.25 (59.10); H, 7.46 (7.51); N, 8.64 (8.94).
【０３４８】
(3)  2,3-ジメチル-5-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ-6-テトラヒドロピラン-2-イルオキシメチル-4-ピリミジノン(30)の合成
DMF(70ml)に溶解したTHP-保護ピリミジン29 (17.9g, 54.9 mmol)をNaH(2.30g, 60% in oil, 57.5mmol)/DMF(100ml)懸濁液に穏やかな泡立ちを維持しながら滴下した。反応液をさらに10分間撹拌し、次いでMeI(3.45ml, 55.4mmol)を加えた。18時間撹拌後、メタノールを数滴加え、数分後に溶媒を減圧留去した。残渣をCH2Cl2 (150ml)に溶解し、水で洗った(3×50ml)。溶媒を留去し、残渣をアセトニトリルに溶解し、次いでヘキサン(50ml)で洗った。溶媒を留去して16.2〜18.6g(87-100%)の粗生成物を得た(1H NMRによれば純度は90%超)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 1.52-1.89 (m, 12H, 3,4,5-THP-CH2), 2.49 (s, 3H, 2-CH3), 3.49 (s, 3H, N-Me), 3.49-3.55 (m, 2H, 6-THP-CH2), 3.92-3.96 (m, 2H, 6-THP-CH2), 4.39-4.82 (m, 3H, CH2-OTHP+THP-CH), 5.77 (br s, 1H, THP-CH).
【０３４９】
(4)  2,3-ジメチル-5-ヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)-4-ピリミジノン・HCl (31・HCl)の合成
方法A:  保護ピリミジノン30 (3.38g, 10mmol)をiPrOH(20ml)、ジエチルエーテル(20ml)及び濃HCl(1ml)に溶解した。室温で4時間静置後、この結晶化溶液を一晩冷蔵(0℃)した。ろ過し1:1 iPrOH/Et2O(3×5ml)とEt2O (10ml)で順次洗った後、白色固形物を室温で減圧乾燥させて1.83g(88.8%)の31・HClを得た。
【０３５０】
方法B:  保護ピリミジン30 (30.1g, 89mmol)/EtOH(20ml)溶液にHCl/ジオキサン溶液(50ml, 4M)を滴下した。白色固形物がすぐに沈殿したが、室温で数時間静置後、該固形物をろ取し、ジオキサン(3×10ml)とジエチルエーテル(2×10ml)で洗った。40℃で一晩減圧乾燥させて16.08g(88.8%)の31・HClを得た。これは空気にさらして静置すると1当量のH2Oを吸収する。mp >200℃(dec.). (+)FABMS: m/z 171[MH]+. 1H NMR (DMSO-d6, 300MHz): δ 2.68 (s, 3H, 2-Me), 3.49 (s, 3H, N-Me), 4.47 (s, 2H, CH2O). 13C NMR (DMSO-d6, 100MHz): δ 18.7, 31.8, 54.1, 132.9, 138.0, 155.2, 157.2. Anal. Calcd (Found) for C7H13ClN2O4: C, 37.43 (37.65), H, 5.83 (5.91); N, 12.47 (12.46).
【０３５１】
(5)  2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-(ヒドロキシメチル)-4-ピリミジノン(32)の合成
直射光から保護したフラスコを使用して、DMF(300ml)、前記ピリミジン31・HCl (14.14g, 68.43mmol)及びK2CO3 (20.0g, 145 mmol)を65℃で1時間機械撹拌し、次いでBnCl (8.30ml, 72.1 mmol)を一挙に加えた。TLC分析で必要と判断されれば、反応進行中に追加のBnClを加えた。65℃で18時間撹拌後、反応混合物を室温に冷却し、ろ過し(ケーキを2×20mlのDMFで洗い)、溶媒を留去した。残渣をCH2Cl2(100ml)に溶解し、再びろ過し、〜20mlに濃縮すると、その時点で冷却溶液は白色結晶塊を析出し始めた。ジエチルエーテル(〜100ml)で希釈し、ややオフホワイトの結晶5を得た(10.1g, 56.7%)。mp 93〜95℃。(+)FABMS: m/z 261 [MH]+. 1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 2.49 (s, 3H, 2-Me), 3.19 (br s, 1H, OH), 3.53 (s, 3H, N-Me), 4.37 (s, 2H, CH2O), 5.17 (s, 2H, CH2Ph), 7.28-7.40 (m, 5H, Ph). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 22.9, 31.3, 58.8, 73.2, 128.3, 128.4, 128.6, 136.7, 137.5, 150.6, 153.9, 158.9. Anal. Calcd (Found) for C14H16N2O3: C, 64.60 (64.62), H, 6.20 (6.04); N, 10.76 (10.82).
【０３５２】
(6)  2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキシ-4-ピリミジノン(33)の合成
前記ピリミジン32 (9.00g, 34.6mmol)、TEMCO触媒(55mg)、Adogen-464相間移動触媒(690mg)及びNaBr (360mg, 3.50mmol)をCH2Cl2(400ml)+水(10ml)と混合した。0℃に冷却後、反応液を1500 rpmで撹拌し反応液を<4℃に保ちながら、冷却(10℃)緩衝漂白剤溶液(市販漂白剤125ml +水125ml+NaHCO3 12.5g)を加えた(所要時間約15分)。さらに5分後、2M NaOHを加えpH 10の溶液とした。CH2Cl2層を分離し、塩基性の水(pH 10, 100ml)で抽出した。水溶液を合わせ、CH2Cl2(50ml)で洗った。水相を〜200-250mlに濃縮し、pH 2へと慎重に酸性化(濃HCl)すると、沈殿が生じた。5℃で一晩静置後、白色固形物をろ取し、水で洗い、減圧乾燥させて5.20g (54.9%)の33を得た。mp 180-181℃。(+)FABMS: m/z 275. 1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 2.53 (s, 3H, 2-Me), 3.55 (s, 3H, N-Me), 5.46 (s, 2H, BnCH2), 7.30-7.38 (m, 3H, Ph), 7.49-7.52 (m, 2H, Ph). 13C NMR (DMSO-d6, 100MHz): δ 22.6, 31.2, 73.3, 128.0, 128.2, 128.3, 136.9, 139.1, 143.0, 155.7, 159.2, 165.7. Anal. Calcd (Found) for C14H14N2O4: C, 61.31 (61.36), H, 5.14 (5.06); N, 10.21 (10.30).
【０３５３】
実施例29  2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキシ-4-ピリミジノン=エチルエステル(35)経由の2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキシ-4-ピリミジノン(33)の合成
(1)  2-メチル-3H-5-ベンジルオキシ-6-カルボキシ-4-ピリミジノン=エチルエステル(34)の合成
ベンジルオキシ酢酸ベンジル(14.13g, 55.13mmol)、シュウ酸ジエチル(8.060g, 55.13mmol)及びエタノール(0.2ml)を無水THF  (100ml)+NaH(2.34g, 60% in oil, 58.5mmol)に加え、室温で24時間撹拌した。THFをロータリーエバポレーターで留去し、残渣をエタノール(100ml)に溶解し、次いでナトリウムエポキシド(3.75g, 55.1mmol)とアセトアミジン塩化物(5.21g, 5.11mmol)を加えた。60℃で1.5時間撹拌後、懸濁液を室温に冷却し、溶媒を留去した。生成した油をCH2Cl2(80ml)と水(50ml)に分配し、pHを〜6に調整した。必要に応じてろ過を行った。CH2Cl2を分離し、水相洗浄液のCH2Cl2(30ml)と合わせた。このCH2Cl2溶液を水で洗い分離し、乾燥させ(Na2SO4)、減容して粘稠油を得た。これをただちにジエチルエーテル(30ml)と共に振って白色固形物を沈殿させた。ヘキサン(〜10容量%)で希釈後、溶液をろ過し、ケーキを冷エーテル(3×10ml)で洗った。乾燥後7.2g(45%)の34を淡色粉末として得た。mp  125-126℃。(+)FABMS: m/z 289[MH]+. 1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 1.31 (t, 3H, J=7.1Hz, ethyl-Me), 2.50 (s, 3H, 2-Me), 4.35 (q, 2H, J=7.1Hz, OCH2), 5.25 (s, 2H, NCH3), 7.32-7.38, 7.44-7.46 (m, 3+2H, Ph), 13.14 (br t, 1H, amide NH). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 14.1, 21.3, 62.2, 74.5, 128.4, 128.5, 136.4, 141.9, 144.9, 153.6, 162.2, 164.2. Anal. Calcd (Found) for C15H16N2O4: C, 62.49 (62.51), H, 5.59 (5.62); N, 9.72 (9.71).
【０３５４】
(2)  2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキシ-4-ピリミジノン=エチルエステル(35)の合成
33 (0.380g, 1.39mmol)の撹拌CH2Cl2(20ml)懸濁液にカルボニルジイミダゾール(0.230g, 1.42mmol)をくわえた。懸濁液は急速に溶解し溶液と化した。〜3分後にエタノール(20ml)を加えて一晩撹拌した。クロマトグラフィー(SiO2, 2%MeOH/CH2Cl2)精製とエーテル/へキサンからの再結晶により、白色粉末として35を得た(0.19g, 45%)。mp 110-115℃。(+)FABMS: m/z 303 [MH]+. 1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 1.29 (t, 3H, J=7.1Hz, ethyl-Me), 2.52 (s, 3H, 2-Me), 3.55 (s, 3H, NCH3), 4.32 (q, 2H, J=7.1Hz, OCH2), 5.23 (s, 2H, BnCH2), 7.30-7.36, 7.45-7.47 (m, 3+2H, Ph). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 13.9, 23.0, 31.5, 61.8, 74.0, 128.1, 128.2, 128.4, 136.5, 141.2, 141.6, 154.1, 159.8, 164.2. Anal. Calcd (Found) for C16H18N2O4: C, 63.56 (63.78), H, 6.00 (6.09); N, 9.27 (9.24).
【０３５５】
(3)  2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキシ-4-ピリミジノン=エチルエステル(35)経由の2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキシ-4-ピリミジノン(33)の合成
NaH(0.745g, 60% in oil, 18.6mmol)/無水DMF(30ml)懸濁液に34 (4.88g, 16.9mmol)/DMF(20ml)溶液を〜20分かけて(穏やかな泡立ちを維持しながら)滴下した。H2の発生が止んだら、ヨウ化メチル(1.27ml, 20.4mmol)を一挙に加え、反応液を周囲温度で撹拌した。微結晶が析出し、〜2時間後に反応が完了した(TLCで確認。シリカゲル、4%MeOH/CH2Cl2)。過剰量の水素化物をエタノール(2ml)でクエンチし、DMFをロータリーエバポレーションで留去した。水を加えると油状固形物が生じたが、それをさらに振とうするとオフホワイトの結晶塊となった。この固形物をろ取し、ざっと乾燥させ、次いでヘキサンで洗い(3×20ml)、3.0g(〜10mmol)粗生成物35 (NMRにより純度90%超と確認)を得た。この物質の分光特性は前に合成した35のそれに対応する。この粗生成物をメタノール(50ml)とKOH(0.660g, 11.8mmol)に溶解し、室温で撹拌した。6時間後、加水分解が完了し、白色微細沈殿が生じていた。溶媒を減圧留去した後、残渣を水(20ml)に溶解し、ろ過し、濃HClで酸性化した。当初、少量の黄色みがかった粘着性固形物が沈殿したので、デカントして溶液を取り除いた。次いで(pH 2に)酸性化し、白色固形物をろ取し、水で洗い(2×10ml)、減圧乾燥して2.63g (34を基準にすると57%)の33を得た。この物質の分光特性は前に合成した33と同じであった。mp 179-180℃。Anal. Calcd (Found) for C14H14N2O4: C, 61.31 (61.50), H, 5.14 (5.13); N, 10.21 (10.30).
【０３５６】
実施例30  HOPY酸(33)からの配位子の合成
(1)  トリス[(2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキサミド-4-ピリミジノン)エチル]アミン(33A)の合成
HOPY酸(33)(1.99g, 7.26mmol)/CH2Cl2(20ml)懸濁液にカルボニルジイミダゾール(1.25g, 7.71mmol)を〜3gずつ10分間かけて加えた。さらに5分後、トリス(2-アミノエチル)アミン(0.350g, 1.39 mmol)/CH2Cl2(5ml)を5分間で滴下し、反応液を一晩撹拌した。CH2Cl2を留去し、得られた油を振とうしながらエタノール(20ml)に加えた。静置しておくと白色結晶塊が分離したので、それをろ取し、エタノールで洗った(5×5ml)。40℃で減圧乾燥後、1.53g(69%)の33Aを得た。mp 110-113℃。(+)FABMS: m/z 915 [MH]+. 1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 2.28(s, 3H, 2-Me), 2.64 (t, 2H, J=5.8Hz, capNCH2), 3.34-3.37(m, 3+2H, NCH3+ CH2NHCOR), 5.10(s, 2H, BnCH2), 7.27-7.35 (m, 3H, Ph), 7.50-7.52(m, 2H, Ph), 7.79(br t, 1H, amide NH). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 22.8, 31.9, 37.8, 53.3, 74.6, 128.3, 128.4, 129.0, 136.7, 141.1, 141.4, 153.4, 160.1, 162.9. Anal. Calcd (Found) for C48H54N10O9・H2O: C, 61.79 (61.48), H, 6.05 (5.98); N, 15.01 (14.98).
【０３５７】
(2)  N-エチル-2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキサミド-4-ピリミジノン(33B)の合成
前記33Aの場合と同様の方法で合成し、クロマトグラフィー(SiO2, 2%MeOH/CH2Cl2)精製後に白色固形物として単離した(収率59%)。(+)FABMS: m/z 302[MH]+. 1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 1.08 (t, 3H, J=7.3Hz, ethyl-Me), 2.49 (s, 3H, 2-Me), 3.33 (m, 2H, CH2NHCOR), 3.50 (s, 3H, N-Me), 5.22 (s, 2H, BnCH2), 7.27-7.35, 7.38-7.40(m, 3+2H, Ph), 7.41(br s, 1H, amide NH). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 14.4, 23.1, 31.6, 34.3, 74.7, 128.4, 128.9, 136.3, 140.6, 141.9, 153.1, 160.3, 162.4. Anal. Calcd.(Found) for C16H19N3O3: C, 63.77 (63.84), H, 6.36 (6.27); N, 13.94 (14.00).
【０３５８】
(3)  N,N-ジメチル-2,3-ジメチル-5-ベンジルオキシ-6-カルボキサミド-4-ピリミジノン(33C)の合成
前記33Aの場合と同様の方法で合成し、クロマトグラフィー(SiO2, 2%MeOH/CH2Cl2)精製後に白色固形物として単離した(収率68%)。(+)FABMS: m/z 302[MH]+. 1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 2.48(s, 3H, 2-Me), 2.74(s, 3H, amide N-Me), 2.99 (s, 3H, amide N-Me), 3.52(s, 3H, N-Me), 5.16(s, 2H, BnCH2), 7.26-7.33, 7.38-7.40(m, 3+2H, Ph). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 23.4, 31.43, 34.30, 37.50, 74.02, 128.11, 128.27, 128.43, 136.83, 138.43, 145.98, 154.95, 159.50, 165.56. Anal. Calcd (Found) for C16H19N3O3: C, 63.77 (64.08), H, 6.36 (6.35); N, 13.94 (13.90).
【０３５９】
(4)  トリス[(2,3-ジメチル-5-ヒドロキシ-6-カルボキサミド-4-ピリミジノン)エチル]アミン(33D)の合成
ベンジルオキシピリミジノン33A (1.12g, 1.22mmol)を酢酸(10ml)に溶解し、5%Pd/C(60mg)を加えた。反応混合物をH2雰囲気下、室温で2時間撹拌した。Pd/Cをろ去し、溶液を濃縮して粘稠油とした。MeOH(5ml)と水(25ml)で順次希釈すると生成物が白色粉末として沈殿した。それを減圧乾燥させて0.70gの33Dを得た(収率88%)。mp 217-219℃(融解し再凝固する)、242-244℃(dec.). (+)FABMS: m/z 665[MH]+. 1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 1.63 (br s, 2H, water), 2.36 (br s, 3H, 2-Me), 2.81 (br t, 2H, J=6Hz, cap NCH2), 3.48 (br t+s, 2+3H, CH2NHCOR+NCH3), 7.83 (br t, 1H, amide NH), 11.91 (s, 1H, OH). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 22.1, 31.3, 37.1, 52.6, 125.1, 145.4, 149.0, 157.5, 168.1. Anal. Calcd (Found) for C27H36N10O9・H2O: C, 48.94 (48.69); H, 5.78 (5.89); N, 21.14 (20.78).
【０３６０】
(5)  N-エチル-2,3-ジメチル-5-ヒドロキシ-6-カルボキサミド-4-ピリミジノン(33E)の合成
前記33Dの場合と同様の方法で合成し、粗ろ液を2-プロパノール/エーテルから結晶させて白色固形物として得た(収率95%)。mp 138-139℃。(+)FABMS: m/z 212[MH]+. 1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 1.24 (t, 3H, J=7.3Hz, ethyl-Me), 2.44 (s, 3H, 2-CH3), 3.43 (m, 2H, CH2NCOR), 3.52 (s, 3H, NCH3), 7.61 (br s, 1H, amide NH), 12.06 (s, 1H, OH). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 14.5, 22.5, 31.6, 33.9, 125.2, 146.4, 147.9, 158.6, 168.0. Anal. Calcd (Found) for C9H13N3O3: C, 51.18 (51.40); H, 6.20 (6.10); N, 19.89 (19.79).
【０３６１】
(6)  N,N-ジメチル-2,3-ジメチル-5-ヒドロキシ-6-カルボキサミド-4-ピリミジノン(33F)の合成
前記33Dの場合と同様の方法で合成し、粗ろ液をエタノールから結晶させて白色固形物として得た(収率92%)。mp 203-204℃。(+)FABMS: m/z 212[MH]+. 1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 2.42 (s, 3H, 2-Me), 3.04 (br s, 3H, amide NCH3), 3.22 (br s, 3H, amide NCH3), 3.50 (s, 3H, NCH3), 9.98 (s, 1H, OH). 13C NMR (CDCl3, 100MHz): δ 22.5, 31.6, 36.2, 38.7, 130.4, 143.2, 147.5, 159.2, 167.2. Anal. Calcd (Found) for C9H13N3O3: C, 51.18 (51.40); H, 6.20 (6.08); N, 19.89 (19.88).
【０３６２】
実施例31  PEG置換基をもつ配位子の合成
(1)  TREN-bis(6-Me-1-Bn-HOPOBn2)-NH2 (スキーム10の式(51))の合成
急速撹拌トリス(2-アミノエチルアミン)(TREN, 0.201g, 1.37 mmol)/CH2Cl2(100ml)溶液に6-Me-1-Bn-3,2-HOPO-thiaz (1.125g, 2.50mmol)/CH2CCl2 (100 ml)溶液を、20時間かけて滴下した。反応を30時間続行させた(三置換、二置換及び一置換生成物の形成をTLCで確認した)。溶媒を留去し、二置換生成物をグラジエントフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカ、溶離液: 0〜5% MeOH/  99:1 CH2Cl2:Et3N)で精製した。溶媒を留去して白色フォームを得た(収量: 1.02g, 92.0%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 8.02-8.08 (t, 3H, 2H, amide NH), 7.02-7.36 (m, 20H, ar. H), 6.52 (s, 1H, HOPO), 6.48 (s, 1H, HOPO), 5.33 (s, 4H, Bn-CH2), 5.29 (s, 4H, Bn-CH2), 3.26 (m, 4H, TREN NH-CH2), 2.32-2.47 (m, 8H, TREN CH2), 2.18 (s, 3H, CH3), 2.19 (s, 3H, CH3).
【０３６３】
(2)  PEG550-Cl (52A)の合成
SOCl2 (2.32ml, 32mmol)をポリ(エチレングリコール)メチルエーテル(平均Mn約550)(10.89ml, 18mmol)/トルエン(20ml)溶液に70℃で加えた。2日後に温度を室温に下げ、撹拌をさらに2日間続行した。次いで反応混合物をpH 7に中和した。溶媒を留去し、粗生成物をCH2Cl2に溶解した。未溶解塩をろ去し、有機相を水で洗った(2×80ml)。溶媒を留去して淡黄色の半固形物を得た(収量: 10.4g, 98.0%)。FAB-MS(+): m/z 579(平均) [M+1]+ with 12 (CH2CH2O) units。ピーク間隔は7〜12 (CH2CH2O)ユニットに対応する359〜887 m/zの範囲で44 m/zユニットである。
【０３６４】
(3)  PEG550-フタルアミド(52B)の合成
PEG550-Cl (10.40g, 18.0mmol)とカリウムフタルイミド(10.74g, 58.0mmol)を無水DMF(75ml)に溶解し、42時間130℃加熱した。反応混合物をろ過し、ろ液を蒸発させた。残渣の黄色ペーストを1:1 CH2Cl2:H2O (100ml×4)に分配し、有機成分を抽出しMgSO4により乾燥させた。CH2Cl2を留去して得られた粗生成物をグラジエントフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカ、溶離液: 0〜10% MeOH/CH2Cl2)で2回精製した。生成物を黄色油として単離した(収量: 6.83g, 55%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.61-7.71 (m, 2H, ar. H), 7.51-7.57(m, 2H, ar. H), 3.69(t, 2H, CH3O-CH2), 3.54(t, 2H, CH3OCH2-CH2), 3.33-3.50(m, large integral, PEG-CH2), 3.17(s, 3H, CH3) ppm.
【０３６５】
(4)  PEG550-NH3・Cl (52C)の合成
PEG550-フタルイミド16 (5.19g, 7.53mmol)とヒドラジン一水和物(1.26g, 25.2mmol)をMeOH(120ml)中で2時間還流した。反応混合物を冷却し、溶媒を留去して白色固形物の残渣を得た。H2O (200ml)と濃HCl(10ml)を加え、混合物を1時間還流し、次いで0℃に冷却した。白色残渣のフタルヒドラジンをろ去し、ろ液を蒸発させて生成物を半固形物として得た。この半固形物を無水エタノールで洗い、生じた沈殿をろ取した。MeOHを使用してこのステップを繰り返し、ろ液を蒸発させて半固形物とし、減圧乾燥させた(収量: 4.19g, 99%)。1H NMR (D2O, 400MHz): δ= 3.54-3.72 (m, 48H, CH2), 3.31(s, 3H, CH3) ppm. FAB-MS(+): m/z 516(平均); [MH]+ with 11 (CH2CH2O) units. ピーク間隔は6〜15 (CH2CH2O)ユニットに対応する296〜693 m/zの範囲で44 m/zユニットである。
【０３６６】
(5)  PEG550-TAM-thiaz (スキーム10の式(52))の合成
PEG550-NH3・Cl (0.54g, 98mmol)/CH2Cl2(200ml)を23 (5.73g, 987mmol)/無水CH2CL2(250ml)急速撹拌溶液に48時間かけて滴下した。その黄色溶液にトリエチルアミン(0.09g, 100mmol)/CH2Cl2 (50ml)溶液を一晩滴下した。次いで溶媒を留去し、生成物をグラジエントカラムクロマトグラフィー(シリカ、溶離液: 0〜9% MeOH/ CH2Cl2)で精製した。生成物を黄色油として単離した(0.806g, 収率87.0%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 8.05(s, 1H, NH), 7.89(d, 1H, TAM H), 7.18-7.7(m, 10H, Bn H), 7.19(d, 1H, TAM H), 5.09(s, 4H, Bn CH2), 4.35(t, 2H, thiaz CH2), 3.46-3.64(m, 44H, PEG CH2), 3.36(s, 3H, PEG CH3), 2.90(t, 2H, thiaz CH2) ppm. FAB-MS(+): m/z 977(平均) [MH]+ with 11 (CH2CH2O) units。ピーク間隔は6〜15 (CH2CH2O)ユニットに対応する768〜1153 m/zの範囲で44 m/zユニットである。
【０３６７】
(6)  TREN-bis(6-Me-HOPO-Bn2)-(Bn2-TAM-PEG550) (スキーム10、式(53))の合成
51 (0.72g, 0.89mmol)と52 (0.72g, 0.73mmol)をCH2Cl2 (420ml)に溶解し、N2雰囲気下に2日間撹拌した。溶液は鮮黄色のままであり、反応が未完了であることがTLCにより判明した。トリエチルアミン(0.09g, 0.89mmol)とジメチルアミノピリジン(DMAP, 0.01g, 0.09mmol)を加え、反応を2日間続行させた。次いで黄色溶液をCH2Cl2+0.5M KOH溶液に分配した。有機成分を抽出し、MgSO4により乾燥させ、次いでろ過した。溶媒を留去し、残渣の褐色油をグラジエントカラムクロマトグラフィー(シリカ、溶離液: 0〜5% MeOH/CH2Cl2)で精製した。生成物を淡褐色油として単離した(収量: 1.08g, 88%)。1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 8.06(t, 1H, NH), 7.92(t, 2H, NH), 7.80(d, 1H, TAM CH), 7.73(d, 1H, TAM CH), 7.62(t, 1H, NH), 7.26-7.39(m, 26H, aromatic H), 7.07(m, 4H, aromatic H), 6.52(s, 2H, HOPO H), 5.31(s, 8H, Bn CH2), 5.14(s, 2H, TAM Bn CH2), 5.08(s, 2H, TAM Bn CH2), 3.47-3.64(m, 52H, PEG CH2), 3.36(s, 3H, PEG CH3), 3.16(m, 6H, TREN CH2), 2.33(m, 6H, TREN CH2), 2.23(s, 6H, HOPO CH3) ppm.
【０３６８】
(7)  TREN-bis(HOPO-Bn)-(TAM-PEG550) (スキーム10の式(54))の合成
TREN-bis(6-Me-HOPO-Bn2)-(Bn2-TAM-PEG550)(53, 0.36g, 0.22 mmol)を酢酸(10ml)に溶解し、次いで12N HCl(10ml)を加えた。溶液を暗所、室温で2日間撹拌した。溶媒を留去して黄色の結晶質固形物を得た。MeOH(10ml)を加え、次いで溶媒を留去した(×3)。次いで残渣にMeOH(2ml)を加えた溶液を、急速撹拌ジエチルエーテル(450ml)に滴下した。一晩撹拌後、混合物をろ過し、残渣を一晩減圧乾燥させた。最終生成物を黒色のガラス様固形物として単離した(収量: 0.29g, 96%)。1H NMR (d6-DMSO, 400MHz): δ= 9.2(br s, 1H, NH), 8.9(br s, 1H, NH), 8.7(br s, 2H, NH), 7.2-7.4(m, 8H, Bn and TAM CH), 7.06(d, 4H, Bn CH), 6.38(s, 2H, HOPO H), 5.27(s, 4H, Bn CH2), 3.73(m, 6H, HOPO CH3), 3.3-3.6(m, H2Oピークで隠された大きな積分値, PEG and TREN CH2), 2.12(s, 6H, HOPO CH3) ppm. Anal. Calcd (Found) for 54・HCl・2H2O (11エーテルの平均): C, 56.62(56.81); H, 7.02(7.07); N, 7.11(6.85). FAB-MS(+): m/z 1307(平均); [MH]+ with 11 (CH2CH2O) units. ピーク間隔は7〜15 (CH2CH2O)ユニットに対応する1130〜1483 m/zの範囲で44 m/zユニットである。
【０３６９】
(8)  Gd-TREN-bis(HOPO-Bn)-(TAM-PEG550) (スキーム10の式(55))の合成
TREN-bis(HOPO-Bn)-(TAM-PEG550) (54, 0.180g, 0.131mmol)とGd(acac)3・2H2O(0.060g, 0.126mmol)をMeOH(15ml)に溶解し、還流下に15分間加熱した。ピリジン(0.030g, 0.382mmol)を加え、2時間加熱を続行した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(Sephadex LH-20、溶離液: MeOH)で精製した。単離生成物を次いでMeOH(4ml)に溶解し、急速撹拌ジエチルエーテル(450ml)に滴下した。混合物を一晩撹拌し、次いでろ過した。残渣を一晩減圧乾燥させ、灰色の粉末として単離した(収量: 0.135g, 73%)。Anal. Calcd (Found) for H55・3H2O (11エーテルの平均): C, 51.54 (51.47); H, 6.25 (6.42); N, 6.47(6.39). ES-MS(-): m/z 1458(平均); [GdL]-、すなわちL + 11 (CH2CH2O)ユニット。ピーク間隔は7〜15 (CH2CH2O)ユニットに対応する1284〜1636 m/zの範囲で44 m/zユニットである。
【０３７０】
・結果
(1)  水プロトン緩和
表3はTREN-bisHOPO-TAM系列の特定Gd錯体の若干の緩和度特性を示す。
【０３７１】
【表３】
2005500387.tif 000042
【０３７２】
温度可変17O NMR
τm値は水原子核横緩和速度(R2)の温度可変(VT)17O NMR測定により独立に求めた。55と58に関するVT 17O NMRは図20に示すとおりである。データは2.1T (プロトンでは90MHz、17Oでは12MHz)、pH 7程度で測定した。曲線は、既定のSwift-Connick式をGdに適合した形に整理したものを用いて分析した。55のプロフィールへのあてはめでは、構造及び動力学パラメーターの初期推定値として、47に関してすでに求められていたものを使用した。q=1、τM=11ns、ΔHM=20kJ/mol、Δ2=1.4×1020s-1、τV=27psのあてはめパラメーターで優れた適合度が得られた。GdIII では、電子緩和速度は通常、溶媒衝突又は分子振動によってもらされる過渡ゼロ磁場分裂(ZFS)に帰属させる。τVはこのZFSの変調に関する相関時間であり、またΔ2はZFSエネルギーの平均平方である。
【０３７３】
HSAへの結合
Bn及びMOBキレートを合成する目的は両キレートのHSAとの相互作用を調べることにあった。HSAとGd錯体の間の非共有相互作用は、(Gd3+錯体)-HSA付加体の結合パラメーター(KA)と緩和度増進の両方を求めることを可能にする既定のプロトン緩和強調(PRE)法を用いて調べた。この方法では、Gd錯体を含む逓増HSA濃度溶液の水プロトン縦緩和速度(R1)を測定する。55、58及び48に関するHSA濃度に応じたPRE法による測定結果は図21のとおりである。
【０３７４】
実施例32  生体分布研究
マウスを使用した153Gd[TREN-bisHOPO-(TAM-DME)]の生体分布に関する予備的な24時間研究では、該錯体は投与後24時間以内に体外に排泄されることが示唆された。注入量の約75%は肝腎経由で(糞尿として)排泄される。組織1グラムあたり注入量排泄%の測定結果は図22のとおりである。
【０３７５】
実施例33  溶液熱力学的な一般方法
(1)  一般方法
溶液の調製にはいつも、蒸留水をMillipore Mill-Qカートリッジシステム(抵抗率=18MΩcm)に通してさらに精製し、次いでArバブリングしながら少なくとも30分間沸騰させて脱気したものを使用した。調製後の溶液は、AscariteIIスクラバー(A.H. Thomas)に通して精製したArの弱正圧下に保存して、酸素と二酸坂炭素の侵入を防いだ。
【０３７６】
99.99% KCl (Fisher Scientific)から0.100M KCl溶液を調製し、これを使用して諸々の滴定に際して定イオン強度を維持するようにした。無炭酸0.1M KOHをBaker Dilut-It分析用濃KOHから調製し、フタル酸水素カリウムを用いてフェノールフタレイン終点まで標定した。〜0.100M HClに溶解して金属イオン濃度をそれぞれ〜0.100MとしたGd(III )及びZn(II)溶液を無水99.99%塩化物(Alpha)から調製した。金属イオン濃度は、酢酸ナトリウム緩衝液と指示薬としてのXylenol Orangeを使用したEDTA滴定でチェックした。標準溶液のプロトン濃度は、既知量の金属イオン溶液と弱過剰量(〜1.005当量)のEDTAの、当量点までの滴定によってチェックした[Harris et al., J. Am. Chem. Soc., 101:2722 (1979)]。諸々の滴定では、観測pHをlog[H+]として測定した。ガラス電極は50.00mlの0.100M KClで希釈した2.000mlの標定HClを4.200mlの標定KOHで滴定することにより、水素イオン濃度単位で校正した。校正滴定データは非線形最小二乗プログラムで解析した[Martell, A.; Motekaitis, R.M., Determination and Use of Stability Constants; VCH: New York (1988)]。
【０３７７】
(2)  電位差pH滴定
既報[Turowski et al, Inorg. Chem., 27:474(1988)]の要領で、電位差滴定をAccumet pH計(モデル925、825M又は15)、pH電極(Orion Rossセミマイクロコンビネーション、Cole Parmerセミマイクロコンビネーション、又はCorningハイパフォーマンスコンビネーション電極)、5mlピストン交換ユニット付きオートビュレット(Metrohm 665 Dosimat又は702 SM Titrino)及びLauda K-2/R又はNeslab RTE-111恒温循環浴により25℃に維持されたジャケット形Ar置換滴定セルからなる自動化装置を使用して行った。自動データ収集を図るため、電子装置はIBM PCクローンと統合した。
【０３７８】
この研究では配位子及び金属錯体溶液を低→高pHへと滴定し、また可能な場合には逆方向にも滴定した。Zn/HOPY系の滴定は、混合ML水酸化物錯体が形成されるためであろうが、不可逆であった。この場合には、平衡時間(〜45-125 sec)を逐一変えて低→高pH滴定を行い、測定の一貫性をチェックするようにした。電位差滴定データから計算した生成定数の決定では、FORTRAN非線形最小二乗精緻化プログラム(BETA 90)の助けを借りた[Harris et al., Am. Chem. Soc., 103:2667 (1981); Kappel et al., Inorg. Chem., 21:  3437 (1982)]。Tren-Me2-5,4-HOPYの中性LH3化学種は低溶解度であるため、>0.25mMの配位子濃度では滴定が行えなかった。これは電位差滴定としては低濃度であるが、プロトン付加ステップに対応する緩衝領域はほぼ中性pHであるため、なお決定が可能であろう。
【０３７９】
(3)  分光pH滴定
既報[Garrett et al., Am. Chem. Soc., 113:2965 (1991)]の要領で、HP 8450A又はHP 8452A分光計と前述の電位差滴定用pH計とを使用する特製自動滴定装置により分光滴定を行った。溶液は低→高pHと高→低pHで滴定して平衡に達したことを確認した。少なくとも3つのデータセットを収集し、スペクトル(〜50-100)、pH値及び容量データをIBM PCクローンに転送して解析した。精緻化には230〜400nmからのデータを用いた。滴定データをあてはめ生成定数を決定するために使用するモデルの精緻化には、因子解析及び最小二乗法精緻化プログラムREFSPECを使用した[Turowski et al., Inorg. Chem., 27:474 (1988)]。
【０３８０】
(4)  緩和度の測定
水プロトン緩和データの測定は0.5〜2 mMのGd(III )錯体溶液を対象にStelar Spinmaster Spectrometer (Mede, Pv, Italy)により20MHzで行った。スピン-格子緩和時間(T1)は一般的な90°パルス幅3.5msを採用する標準反転回復法で、4スキャン実験×16により測定した。データ再現精度は±1%である。温度は銅コンスタンタン熱電対を備えたStelar VTC-91通風ヒーターで制御した(不確実性±1%)。水プロトンの1/T1核磁気緩和分散(NMRD)プロフィールはトリノ大学(Italy)の磁場循環型Koenig-Brownリラクソメーターにより、1.5mM錯体溶液を対象に、磁場強度0.00024〜1.2 T(プロトンLarmor周波数レンジ0.01〜50 MHzに対応)、温度15℃、25℃及び39℃で測定した。温度は外部浴からフレオンを循環させて制御し、試料近傍のフレオン中に差し込んだ温度計により測定した。測定T1値の再現精度は±2%と推定された。装置類とデータ収集手順の詳細は他で開示されている[Koenig, S.H.; Brown III , R.D., NMR Spectroscopy of Cells and Organism; CRC Press: Boca Raton (1987)]。血清中NMRDプロフィール用の試料は、北欧系血液銀行の管理任意献血者からの凍結乾燥ヒト由来血清(SeronormTM, Nycomed)に1 mol L-1 Gd(III )錯体溶液を溶解して調製した。
【０３８１】
温度可変17O NMR測定値は、5mmプローブを備えたJOEL EX-400(9.4T)分光計で、D2O磁場外部ロックを使用して記録した。実験条件は次のとおりであった:スペクトル幅10000Hz、パルス7μs、データ収集時間10ms、1000スキャン、試料回転無し。使用溶液は17O濃厚水(2.6%, Yeda, Israel)を含んでいた。観測横緩和速度(R02obs)は半値共鳴線幅から計算した。
【０３８２】
(5)  単結晶X線回折
N,N-ジメチル-6-カルボキサミド-2,3-ジメチル-5,4-ヒドロキシピリミジノンの回折用結晶は、室温でエーテルをエタノール溶液中に拡散して成長させた。
【０３８３】
(6)  物理測定
NMRスペクトルはBruker AMX 300、AMX 400又はDRX 500分光計で記録した。化学シフト(δ)は残留プロトン-溶媒共鳴を基準にしてppm単位で表記している。融点はBuchi装置で測定しており、未補正のままである。電子吸収スペクトルは1cm石英セル付きのHP 8450A又はHP 8452A UV-Visダイオードアレイ分光計で記録した。元素分析はカリフォルニア大学バークレー校化学部のAnalytical Services Laboratoryで行った。質量スペクトル(FAB+及びEI)は同Mass Spectrometry Laboratoryで記録した。
【０３８４】
以上開示した実施例及び実施態様はもっぱら説明が目的であり、開示に照らして種々の変更態様又は変化が当業者には示唆されるであろうが、それらは本願の趣旨と範囲並びに添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。引用した諸々の刊行物、特許及び特許出願明細書は参照によりその全体が本書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３８５】
【図１】Gd(III )のキレート化に使用される一群のポリ(アミノカルボン酸)配位子である。
【図２】Gd(III )錯体の図であり、内圏及び外圏水分子、それに内圏緩和度を左右するパラメーターを示す。
【図３】本発明化合物とGd(III )-ポリアミノカルボン酸の緩和度データを比較したグラフである。
【図４】本発明化合物とGd(III )-ポリアミノカルボン酸の水交換速度を比較したグラフである。
【図５】Gd3+/TREN-1-Me-HOPO系の化学種分布図である(1μM Gd及び1μM配位子で計算)。図のLが配位子を表わす。
【図６】DTPA及びDTPA-BMAと比較した場合のTREN-1-Me-HOPOの(対Ca2+及びZn2+の)Gd3+選択性を示すグラフである。
【図７】代表的なGd(III )-HOPOキレートの構造を示し、またこの化合物と代表的なGd(III )-ポリアミノカルボン酸についてNMRDプロフィールを比較している。
【図８】種々の鎖長のアルキレン部分を備えた誘導体化骨格をもつ本発明化合物の合成経路の例である。
【図９】PEG鎖長に応じたτmの変動を示すグラフである。
【図１０】種々の本発明錯体の緩和度を示すグラフである。
【図１１】ヒト血清アルブミン(HSA)と相互作用することが判明している構造の例である。
【図１２】本発明のタンパク質結合性キレート例の構造を示す。
【図１３】本発明錯体の疎水性/親水性の変化に応じた該錯体のHSAに対する親和性の変動に関するグラフであり、本発明が錯体の血清タンパク質に対する結合度及び結合力を体系的に変化させる方法を提供するものであることを示唆する。
【図１４】HSAに結合した本発明錯体の疎水性/親水性の変化に応じた該錯体の緩和度の変動に関するグラフであり、本発明が錯体の血清タンパク質に対する結合度及び結合力を基に錯体の緩和度を体系的に変化させる方法を提供するものであることを示唆する。
【図１５】本発明のタンパク質結合性錯体のモチーフ構造を示す。
【図１６】47の水中、25℃、pH=7.4でのNMRDプロフィールである。曲線のあてはめパラメーターはr=3.1Å、q=1、τR=300ps、τM=31ns(17O NMRより)、τV=27ns、Δ2=8.4×1019、a=4.0Å、D=2.24×10-5 cm2s-1である。
【図１７】下記錯体の21mM水溶液について2.1 T (90MHzプロトンLarmor周波数に相当)で測定した、温度(273〜355K)の関数としての17O NMR横緩和速度のグラフである: (a) Gd-TREN-bisHOPO-TAM-Me、pH=7.4、曲線のあてはめパラメーターはq=2、Δ2=1.9×1020s-2、τM=8±1ns(@298K)及びΔHM=2.4kJ/mol; (b) 46、pH=7.6、曲線のあてはめパラメーターはq=1、Δ2=8.0×1019s-2、τM=19±2ns(@298K)及びΔHM=10kJ/mol及び; (c) 47、pH=7.5、曲線のあてはめパラメーターはq=1、Δ2=7.3×1019s-2、τM=31±2ns(@298K)及びΔHM=6kJ/mol。
【図１８】高分子錯体(τR=10ns)についてτMの関数としての緩和度を20、40、60及び80MHzで求めた計算値である。DOTA様Gd(III )錯体の一般的なパラメーターとして次の値を使用した: q=1、r=3.0Å、Δ2=1.5×1019s-2、τV=20ps、a=3.8Å、D=2.24×10-5 cm2s-1。
【図１９】HSA濃度の関数としてのH2Oの1H縦緩和速度を示す。実験は47の0.25mmol/L溶液のHSAによる、20MHz、25℃、pH=6.5での滴定を伴った。PRE(プロトン緩和強調)法によるデータの解析でKA=186±50M-1及びrlp(bound)=74±14mM-1s-1が得られる。相互作用がこのように比較的弱いため、結果として標準誤差が大きくなる。
【図２０】55(左)と58(右)の水17O横緩和速度に対する常磁性寄与(R2)の温度依存性を示す。
【図２１】錯体溶液の水プロトン縦緩和速度をHSA濃度の関数として示す: 55(上左)、58(上右)、48(下)。
【図２２】153Gd[TREN-bis(HOPO)-(TAM-DME)]の注入24時間後の生体内分布を示す。
【図２３】種々の金属イオン及び配位子に関するpM値を示す表である。
【図２４】金属-配位子錯体の水への溶解度を示す表である。
【図２】
2005500387.tif 000054
【図３】
2005500387.tif 000055
【図４】
2005500387.tif 000056
【図５】
2005500387.tif 000057
【図７】
2005500387.tif 000058
【図９】
2005500387.tif 000059
【図１０】
2005500387.tif 000060
【図１１】
2005500387.tif 000061
【図１２】
2005500387.tif 000062
【図１４】
2005500387.tif 000063
【図１５】
2005500387.tif 000064
【図１６】
2005500387.tif 000065
【図１７】
2005500387.tif 000066
【図１８】
2005500387.tif 000067
【図２１】
2005500387.tif 000068
【図２２】
2005500387.tif 000069
【図２３】
2005500387.tif 000070
【図２４】
2005500387.tif 000071
【国際公開パンフレット】
2005500387.tif 000072
2005500387.tif 000073
2005500387.tif 000074
2005500387.tif 000075
2005500387.tif 000076
2005500387.tif 000077
2005500387.tif 000078
2005500387.tif 000079
2005500387.tif 000080
2005500387.tif 000081
2005500387.tif 000082
2005500387.tif 000083
2005500387.tif 000084
2005500387.tif 000085
2005500387.tif 000086
2005500387.tif 000087
2005500387.tif 000088
2005500387.tif 000089
2005500387.tif 000090
2005500387.tif 000091
2005500387.tif 000092
2005500387.tif 000093
2005500387.tif 000094
2005500387.tif 000095
2005500387.tif 000096
2005500387.tif 000097
2005500387.tif 000098
2005500387.tif 000099
2005500387.tif 000100
2005500387.tif 000101
2005500387.tif 000102
2005500387.tif 000103
2005500387.tif 000104
2005500387.tif 000105
2005500387.tif 000106
2005500387.tif 000107
2005500387.tif 000108
2005500387.tif 000109
2005500387.tif 000110
2005500387.tif 000111
2005500387.tif 000112
2005500387.tif 000113
2005500387.tif 000114
2005500387.tif 000115
2005500387.tif 000116
2005500387.tif 000117
2005500387.tif 000118
2005500387.tif 000119
2005500387.tif 000120
2005500387.tif 000121
2005500387.tif 000122
2005500387.tif 000123
2005500387.tif 000124
2005500387.tif 000125
2005500387.tif 000126
2005500387.tif 000127
2005500387.tif 000128
2005500387.tif 000129
2005500387.tif 000130
2005500387.tif 000131
2005500387.tif 000132
2005500387.tif 000133
2005500387.tif 000134
2005500387.tif 000135
2005500387.tif 000136
2005500387.tif 000137
2005500387.tif 000138
2005500387.tif 000139
2005500387.tif 000140
2005500387.tif 000141
2005500387.tif 000142
2005500387.tif 000143
2005500387.tif 000144
2005500387.tif 000145
2005500387.tif 000146
2005500387.tif 000147
2005500387.tif 000148
2005500387.tif 000149
2005500387.tif 000150
2005500387.tif 000151
2005500387.tif 000152
2005500387.tif 000153
2005500387.tif 000154
2005500387.tif 000155
2005500387.tif 000156
2005500387.tif 000157
2005500387.tif 000158
2005500387.tif 000159
2005500387.tif 000160
2005500387.tif 000161
2005500387.tif 000162
2005500387.tif 000163
2005500387.tif 000164
2005500387.tif 000165
2005500387.tif 000166
2005500387.tif 000167
2005500387.tif 000168
2005500387.tif 000169
2005500387.tif 000170
2005500387.tif 000171
2005500387.tif 000172
2005500387.tif 000173
2005500387.tif 000174
2005500387.tif 000175
2005500387.tif 000176
2005500387.tif 000177
2005500387.tif 000178
2005500387.tif 000179
2005500387.tif 000180
2005500387.tif 000181
2005500387.tif 000182
2005500387.tif 000183
2005500387.tif 000184
2005500387.tif 000185
2005500387.tif 000186
2005500387.tif 000187
2005500387.tif 000188
2005500387.tif 000189
2005500387.tif 000190
2005500387.tif 000191
2005500387.tif 000192
2005500387.tif 000193
2005500387.tif 000194
2005500387.tif 000195
2005500387.tif 000196
2005500387.tif 000197
2005500387.tif 000198
2005500387.tif 000199
2005500387.tif 000200
2005500387.tif 000201
2005500387.tif 000202
2005500387.tif 000203
2005500387.tif 000204
2005500387.tif 000205
2005500387.tif 000206
2005500387.tif 000207
2005500387.tif 000208
2005500387.tif 000209
2005500387.tif 000210
2005500387.tif 000211
2005500387.tif 000212
2005500387.tif 000213
2005500387.tif 000214
2005500387.tif 000215
2005500387.tif 000216
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500387.tif 000217
【国際調査報告】
2005500387.tif 000218