(57)【要約】本発明は、ヒトゲノム中の遺伝子によりコードされる、本発明のプロテアーゼペプチドのアミノ酸配列を提供するものである。本発明は、特に、単離ペプチド及び核酸分子、プロテアーゼペプチドのオルソログ及びパラログを同定する方法、ならびにプロテアーゼペプチドのモジュレータを同定する方法を提供するものである。
2005502308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選択されるアミノ酸配列からなる単離ペプチド：
(a)配列番号：2に記載のアミノ酸配列；
(b)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体が、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列；
(c)配列番号：2に記載のアミノ酸配列のオルソログのアミノ酸配列であって、該オルソログが、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列；及び
(d)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の断片であって、少なくとも10個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列の断片。
【請求項２】
下記の群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド：
(a)配列番号：2に記載のアミノ酸配列；
(b)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体が、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列；
(c)配列番号：2に記載のアミノ酸配列のオルソログのアミノ酸配列であって、該オルソログが、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列；及び
(d)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の断片であって、少なくとも10個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列の断片。
【請求項３】
請求項2記載のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記の群より選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸分子：
(a)配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
(b)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号：2に記載のアミノ酸配列のオルソログをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(d)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列であって、該断片が、少なくとも10個の連続するアミノ酸を含むヌクレオチド配列；および
(e)(a)〜(d)のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項５】
下記の群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子：
(a)配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
(b)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号：2に記載のアミノ酸配列のオルソログをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(d)配列番号：2に記載のアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列であって、該断片が、少なくとも10個の連続するアミノ酸を含むヌクレオチド配列；および
(e) (a)〜(d)のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項5記載の核酸分子を含む遺伝子チップ。
【請求項７】
請求項5記載の核酸分子を含むヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項８】
請求項5記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項９】
請求項8記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項1記載のいずれかのペプチドを製造する方法であって、(a)〜(d)のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入する段階、およびペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項１１】
請求項2記載のいずれかのペプチドを製造する方法であって、(a)〜(d)のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する段階、およびペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項１２】
試料中における請求項2記載のいずれかのペプチドの存在を検出する方法であって、試料中における該ペプチドの存在を特異的に検出する検出試薬と試料を接触させる段階、および該ペプチドの存在を検出する段階を含む方法。
【請求項１３】
試料中における請求項5記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、ストリンジェントな条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと試料を接触させる段階、および試料中の該核酸分子とオリゴヌクレオチドが結合するかどうかを判定する段階を含む方法。
【請求項１４】
請求項2記載のペプチドのモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを試薬と接触させる段階、および該試薬が該ペプチドの機能又は活性を調節したかどうかを判定する段階を含む方法。
【請求項１５】
前記試薬が前記ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に投与される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
請求項2記載のいずれかのペプチドに結合する試薬を同定する方法であって、ペプチドと試薬を接触させる段階、および接触混合物をアッセイして、ペプチドと試薬との複合体が形成されるかどうかを判定する段階を含む方法。
【請求項１７】
請求項16記載の方法により同定された試薬と、薬学的に許容されるそれらの担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１８】
ヒトプロテアーゼタンパク質により媒介される疾患又は症状を治療する方法であって、薬学的に有効な量の請求項16記載の方法で同定された試薬を患者に投与する段階を含む方法。
【請求項１９】
請求項2記載のペプチドの発現のモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを発現する細胞と試薬とを接触させる段階、および該試薬が該ペプチドの発現を調節したかどうかを判定する段階を含む方法。
【請求項２０】
配列番号：2に記載のアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性を持つアミノ酸配列を有する単離ヒトプロテアーゼペプチド。
【請求項２１】
配列番号：2に記載のアミノ酸配列と少なくとも90％の相同性を持つアミノ酸配列を有する、請求項20記載のペプチド。
【請求項２２】
ヒトプロテアーゼペプチドをコードする単離核酸分子であって、配列番号：1または3に記載の核酸分子と少なくとも80％の相同性を有する核酸分子。
【請求項２３】
配列番号：1または3に記載の核酸分子と少なくとも90％の相同性を有している、請求項22記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、プロテアーゼタンパク質、組換えDNA分子、及びタンパク質の製造の分野に関する。本発明は、特に、タンパク質の切断/プロセシング/代謝回転に影響を与える新規ペプチドおよびタンパク質、ならびにこれらのペプチドおよびタンパク質分子をコードする核酸分子を提供するものである。これら全てはヒトの治療用及び診断用の組成物、ならびに方法の開発に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロテアーゼは、その切断部位の一方の端に位置する異なるアミノ酸配列（一般的に2〜10アミノ酸残基）によりファミリーに分類され得る。
【０００３】
細胞がその機能を適切に発揮するには、重要な構造タンパク質、酵素、及び調節タンパク質のレベルを厳密に制御することが必要である。細胞が、安定して発現している特定のタンパク質のレベルを低下させる手段の一つに、タンパク質分解がある。さらに、細胞が機能タンパク質を生み出す方法の一つは、タンパク質分解により活性部位を生じるようなプレタンパク質またはを産生することである。したがって、この分解を完成させるために、複雑で高度に制御された機構が発達している。
【０００４】
プロテアーゼは、タンパク質の代謝回転およびプロセシングを調節することにより、多くの異なる細胞の増殖、分化、及びシグナル伝達過程を調節する。プロテアーゼ活性の異常（上昇または低下のいずれか）は、炎症、癌、動脈硬化、及び変性疾患を含む様々な病態に関与している。
【０００５】
細胞内タンパク質分解のもう一つの役割は、ストレス反応におけるものである。枯渇、熱ショック、化学的損傷、または変異のなどのストレスを受けた細胞は、タンパク質分解速度を上昇させて反応する。このタンパク質分解亢進の一つの機能は、必須ではないタンパク質からのアミノ酸の回収である。その後、これらのアミノ酸は、必須タンパク質の合成に再利用されたり、またはエネルギー産生のために直接代謝されたりする。また別の機能として、ストレスにより生じた損傷の修復がある。例えば、酸化ストレスは様々なタンパク質に損傷を与え、それらを急速に分解させることが示されている。
【０００６】
生化学及び分子生物学国際連盟（The International Union of Biochemistry and Molecular Biology：IUBMB）は、ペプチド結合を加水分解する酵素のサブセット（サブクラスE.C 3.4.）に対してペプチダーゼという用語を用いることを推奨している。広く用いられているプロテアーゼという言葉は、ペプチダーゼと同義語である。ペプチダーゼは、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの2つの群の酵素を含む。エンドペプチダーゼは、タンパク質中のある部分のペプチド結合を切断し、エキソペプチダーゼは、N末端またはC末端のいずれかから順番にアミノ酸を除去する。プロテイナーゼという用語は、エンドペプチダーゼと同義語として用いられ、IUBMBによってプロテイナーゼは4つの機械論的分類が承認されている。これらのうちの2つについて後で詳述する（Handbook of Proteolytic Enzymes by Barrett, Rawlings, and Woessner AP Press, NY 1998も参照）。また、薬物標的としてのプロテアーゼの様々な利用に関する総説は、Weber M, Emerging treatments for hypertension: potential role for vasopeptidase inhibition; Am J Hypertens 1999 Nov;12(11 Pt 2):139S-147S、Kentsch M, Otter W, Novel neurohormonal modulators in cardiovascular disorders. The therapeutic potential of endopeptidase inhibitors, Drugs R D 1999 Apr;1(4):331-8、Scarborough RM, Coagulation factor Xa: the prothrombinase complex as an emerging therapeutic target for small molecule inhibitors, J Enzym Inhib 1998;14(1):15-25、Skotnicki JSら、Design and synthetic considerations of matrix metalloproteinase inhibitors, Ann N Y Acad Sci 1999 Jun 30;878:61-72、McKerrow JH, Engel JC, Caffrey CR, Cysteine protease inhibitors as chemotherapy for parasitic infections, Bioorg Med Chem 1999 Apr;7(4):639-44、Rice KD, Tanaka RD, Katz BA, Numerof RP, Moore WR, Inhibitors of tryptase for the treatment of mast cell-mediated diseases, Curr Pharm Des 1998 Oct;4(5):381-96、およびMaterson BJ, Will angiotensin converting enzyme genotype, receptor mutation identification, and other miracles of molecular biology permit reduction of NNT Am J Hypertens 1998 Aug;11(8 Pt 2):138S-142Sを参照。
【０００７】
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼ (SP) は、トリプシンおよびキモトリプシンなどの消化酵素、補体カスケードおよび血液凝固カスケードの構成因子、ならびに細胞外マトリックスの高分子の分解や代謝回転を制御する酵素を含むタンパク質分解酵素の中の巨大ファミリーである。SPがこのように呼ばれる理由は、タンパク質分解の活性触媒部位にセリン残基が存在するためである。SPは幅広い基質特異性を有し、この特異性に基づいてサブファミリーにさらに分類される。その主なサブファミリーは、トリパーゼ（アルギニン又はリジンのあとで分解される）、アスパーゼ（アスパラギン酸のあとで分解される）、チマーゼ（フェニルアラニン又はロイシンのあとで分解される）、メターゼ（メチオニンのあとで分解される）、及びセラーゼ（セリンのあとで分解される）である。
【０００８】
一連の6SPが、マウスの細胞傷害性T細胞（CTL）及びナチュラルキラー細胞（NK）で同定されている。これらのSPはCTLおよびNK細胞において、ウイルスでトランスフォームした細胞および腫瘍細胞の破壊、ならびに臓器および組織移植片の拒絶に関与している（Zunino, S. J.ら（1990）J. Immunol. 144:2001-9；Sayers, T. J.ら（1994）J. Immunol. 152:2289-97）。これらの酵素の大部分は、ヒトのホモログが同定されている （Trapani, J. A.ら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:6924-28；Caputo, A.ら（1990）J. Immunol. 145:737-44）。すべてのSPと同様に、CTL-SPは3つの際だった特徴を共有している：1）活性部位を形成するヒスチジン、セリン、及びアスパラギン酸の触媒3つ組の存在；2）活性部位のセリンを含むGDSGGP配列；ならびに3）成熟SPの特徴であるN末端のIIGG配列である。
【０００９】
SPは分泌タンパク質であり、小胞体を横切って未成熟タンパク質を輸送させ、その後切断されるN末端シグナルペプチドを有している（von Heijne（1986）Nuc. Acid. Res. 14:5683-90）。これらのシグナル配列の相違が、個々のSPを区別する手段になる。ある種のSP、特に消化酵素は、非活性型の前駆体またはプレプロ酵素として存在し、シグナルペプチドの3'端にリーダーペプチドまたは活性化ペプチド配列を有している。この活性化ペプチドは、長さが2〜12アミノ酸であってもよく、シグナルペプチドの切断部位から活性型成熟タンパク質のN末端のIIGG配列にまでわたる。この配列の切断により酵素は活性化される。この配列は異なるSPにより多様であり、その違いは生化学的経路及び/又はその基質による（Zuninoら、前出；Sayersら、前出）。多様なSPを区別するその他の特徴としては、膜へのアンカーを供給するN結合型糖鎖結合部位の有無、SPの2次構造を決定するシステイン残基の数と分布、及びS'のような基質結合部位の配列が挙げられる。S'基質結合領域はN末端のI（+1）から数えて約+17から+29にわたる残基によって決められる。この領域の分子の違いがSPの基質特異性を決定すると考えられている（Zuninoら、前出）。
【００１０】
トリプシノーゲン
トリプシノーゲンは膵臓の外分泌細胞より分泌されるセリンプロテアーゼである（Travis JおよびRoberts R. Biochemistry 1969；8: 2884-9；Mallory PおよびTravis J, Biochemistry 1973；12: 2847-51）。トリプシノーゲンには、陽イオントリプシノーゲンとも呼ばれるトリプシノーゲン-1と、陰イオントリプシノーゲンとも呼ばれるトリプシノーゲン-2の主に2つのアイソエンザイムがあり、それらの解析が行われている。トリプシノーゲンプレ酵素は、トリプシノーゲンのN末端から活性化ペプチドを除去するエンテロキナーゼによって腸管内でトリプシンに活性化される。トリプシノーゲンは配列の相同性が高いが、電気泳動又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて得られる電荷の違いに基づいて分類することができる。膵臓及び膵液中の主なトリプシノーゲンはトリプシノーゲン-1である（Guy COら、Biochem Biophys Res Commun 1984；125: 516-23）。健常者の血清中の主な型もトリプシノーゲン-1であるが、膵炎患者においてはトリプシノーゲン-2がより強く増加している（Itkonenら、J Lab Clin Med 1990；115:712-8）。トリプシノーゲンはある種の卵巣腫瘍にも生じる、その場合にはトリプシノーゲン-2が主な型である（Koivunenら、Cancer Res 1990；50: 2375-8）。α-1-アンチトリプシン（α-1-アンチプロテアーゼとも呼ばれる）と複合体を形成したトリプシン-1が、膵炎患者の血清中に存在することが見出されているが（Borgstrom AおよびOhlsson K, Scand J Clin Lab Invest 1984；44: 381-6）、この複合体の検出が、膵疾患とその他の胃腸疾患の鑑別に有用であるとは示されていない（Borgstromら、Scand J Clin Lab Invest 1989；49:757-62）。
【００１１】
トリプシノーゲン-1および-2は免疫学的に非常に関連しているが（Kimlandら、Clin Chim Acta 1989；184: 31-46；Itkonenら、1990）、モノクローナル抗体（Itkonenら、1990）又は吸収したポリクローナル抗血清（Kimlandら、1989）を用いることにより、トリプシノーゲンのそれぞれの型を特異的に測定する試薬を得ることが可能である。
【００１２】
活性型トリプシンが血流に到達した場合、主要なトリプシン阻害因子であるα-2-マクログロブリンとα-1-アンチトリプシン（AAT）により不活化される。AATは肝臓で合成される58 KDaのセリンプロテアーゼ阻害因子であり、血液中の主要なプロテアーゼ阻害因子の1つである。トリプシン-1とAATの複合体が血清中で検出される一方で（BorgstromおよびOhlsson, 1984）、α-2-マクログロブリンとの複合体は抗体を用いたアッセイ法では検出されない（Ohlsson K, Acta Gastroenterol Belg 1988；51: 3-12）。
【００１３】
膵臓の炎症又は膵炎は、臨床的診断基準により、急性又は慢性のいずれかに分類される。治療によって、急性膵炎はしばしば治癒し、正常な機能が回復する。慢性膵炎はしばしば一生の損傷となる。急性炎症を誘発する詳細なメカニズムは解っていない。しかしながら、いくつかの原因は解っており、重要度が高い順に並べると、アルコール摂取、胆管疾患、手術後の損傷、及び遺伝性膵炎である。自己消化、すなわち十二指腸ではなく膵臓におけるタンパク質分解酵素の成熟前の活性化が急性膵炎の原因であるという1つの論理が提唱されている。内毒素、外毒素、ウイルス感染、虚血、酸素欠乏、及び直接的損傷などを含む多数の他の要因もプレ酵素を活性化する可能性がある。加えて、膵管のいかなる内的又は外的妨害も、膵液の膵臓への蓄積を招き、細胞の傷害を起こし得る。
【００１４】
膵臓の解剖学、生理学、及び疾患についての総説がある。特に、Guyton AC（1991）「Textbook of Medical Physiology」、W B Saunders Co, Philadelphia Pa.；Isselbacher K Jら（1994）「Harrison's Principles of Internal Medicine」、McGraw-Hill, New York City；Johnson K E（1991）「Histology and Cell Biology」、Harwal Publishing, Media Pa.；および「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」（1992）Merck Research Laboratories, Rahway N.Jを参照。
【００１５】
メタロプロテアーゼ
メタロプロテアーゼは、プロテイナーゼの中で古い方のクラスに入るものの一つであり、細菌、真菌とともに、さらに高等な生物においても発見されている。それらの配列と構造は広く異なるが、ほとんど大部分の酵素は触媒活性を持つ亜鉛元素を保有している。いくつかの場合では、亜鉛が、コバルトまたはニッケルなどの別の金属に入れ替わっていることもあるが、活性は維持されている。細菌のサーモリシンは、これまでに詳細な特徴解析が行われており、その結晶構造により、亜鉛は2つのヒスチジンと1つのグルタミン酸に結合していることが示されている。酵素の多くは、HEXXHという配列を含み、この配列が亜鉛に2つのヒスチジンリガンドを提供する一方で、3つ目のリガンドはグルタミン酸（サーモリシン、ネプリリシン（neprilysin）、アラニルアミノペプチダーゼ）、またはヒスチジン（アスタシン）のいずれかとなる。その他のファミリーでは亜鉛元素への結合様式が異なっている。その触媒機構により、切断される結合のカルボニル基に亜鉛が結合した水分子が作用した後に、非共有結合4水素性中間体の形成が促進される。この中間体は、グルタミン酸の陽子を外される基に移すことにより、さらに分解される。
【００１６】
メタロプロテアーゼは、ペプチド骨格の加水分解に関与する触媒活性を有する亜鉛金属中心を含んでいる（PowerおよびHarper、「Protease Inhibitors」、A. J. BarrettおよびG. Salversen（編）Elsevier, Amsterdam, 1986, p. 219の総説参照）。亜鉛の活性中心は、その活性がカルシウムの存在に依存するカルパインおよびトリプシンと、メタロプロテアーゼのいくつかのものとを区別する。メタロプロテアーゼの例としては、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、およびサーモリシンが挙げられる。
【００１７】
メタロプロテアーゼは、多くの原核生物及び真核生物の起源から単離されている。その中には、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）（McConnら、1964, J. Biol. Chem. 239:3706）、巨大菌（Bacillus megaterium）、セラシア属（Serratia）（Miyataら、1971, Agr. Biol. Chem. 35:460）、腐敗菌（Clostridium bifermentans）（MacFarlaneら、1992, App. Environ. Microbiol. 58:1195-1200）、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Legionella pneumophila）（Moffatら、1994, Infection and Immunity 62:751-3）などが含まれる。特に、酸性メタロプロテアーゼは広帯域のアメリカマムシ毒（JohnsonおよびOwnby, 1993, Int. J. Biochem. 25:267-278）、ガラガラヘビ毒（Chlouら、1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:389-396）、及び関節軟骨（Treadwellら、1986, Arch. Biochem. Biophys. 251:715-723）から分離されている。中性メタロプロテアーゼ、特に中性pHにおいて至適活性を有するものは、例えばアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）（Sekine, 1973, Agric. Biol. Chem. 37:1945-1952）から分離されている。アスペルギルス属から単離される中性メタロプロテアーゼはnpI、npIIの2つに分類される（Sekine, 1972, Agric. Biol. Chem. 36:207-216）。これまでのところ、これらの真菌由来中性メタロプロテアーゼのアミノ酸配列情報を得るという試みの成功例は限られている。アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）から単離されたnpIIメタロプロテアーゼは、文献に提示されたアミノ酸配列を基にしてクローニングされている（Tatsumiら、1991, Mol. Gen. Genet. 228:97-103）。しかしながら、これまでのところ、真菌のnpIメタロプロテアーゼのなかで、クローニングまたは配列決定されたものはない。アルカリメタロプロテアーゼは、例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（Baumannら、1993, EMBO J 12:3357-3364）および昆虫の病原体であるゼノラブダス・ルミネッセンス（Xenorhabdus luminescens）（Schmidtら、1998, Appl. Environ. Microbiol. 54:2793-2797）から単離されている。
【００１８】
メタロプロテアーゼは、主に以下の活性および構造に基づいて、いくつかの異なるファミリーに分類される：1）水求核性試薬；2つのヒスチジン（HEXXHモチーフ内）とグルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギン酸とが結合した1つの亜鉛イオンにより結合される水；2）水求核性試薬；ヒスチジン、グルタミン酸（HXXHモチーフ内）、及びヒスチジンとが結合した1つの亜鉛イオンにより結合される水；3）水求核性試薬；ヒスチジン、アスパラギン酸、及びヒスチジンとが結合した1つの亜鉛イオンにより結合される水；4）水求核性試薬；2つのヒスチジン（HXXEHモチーフ内）とグルタミン酸とが結合した1つの亜鉛イオンにより結合される水；ならびに5）水求核性試薬；リジン、アスパラギン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸、及びグルタミン酸とが結合した2つの亜鉛イオンにより結合される水。
【００１９】
メタロプロテアーゼファミリーのメンバーには、以下の例が挙げられるが、これに限定されるものではない。膜アラニルアミノペプチダーゼ（ヒト（Homo sapiens））、胚ペプチジルジペプチダーゼA（ヒト）、チメットオリゴペプチダーゼ（ラット（Rattus norvegicus））、オリゴペプチダーゼF（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis））、マイコリシン（ストレプトマイセス・カカオイ（Streptomyces cacaoi））、免疫抑制因子A（バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis））、スナパリシン（ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans））、リューシマノリシン（森林型熱帯リーシュマニア（Leishmania major））、微生物コラゲナーゼ（ビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus））、微生物コラゲナーゼクラスI（ウェルシュ菌（Clostridium perfringens））、コラゲナーゼ1（ヒト）、セラリシン（霊菌（Serratia marcescens））、 フラジリシン（バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis））、ガメトリシン（クラミドモナス・レインハーディティ（Chlamydomonas reinhardtii））、アスタシン（アスタカス・フルビアティリス（Astacus fluviatilis））、アダマリシン（カロタルス・アダマンテウス（Crotalus adamanteus））、ADAM 10（ウシ（Bos taurus））、ネプリリシン（ヒト）、カルボキシペプチダーゼA（ヒト）、カルボキシペプチダーゼE（ウシ）、ガンマ-D-グルタミル-(L)-メソ-ジアミノピメレートペプチダーゼI（バチルス・スフェリクス（Bacillus sphaericus））、vanY D-Ala-D-Ala カルボキシペプチダーゼ（エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium））、エンドリシン（バクテリオファージA118）、 ピトリリシン（大腸菌（Escherichia coli））、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ（サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、リューシルアミノペプチダーゼ（ウシ）、アミノペプチダーゼI（サッカロマイセス・セレビシエ）、膜ジペプチダーゼ（ヒト）、グルタメートカルボキシペプチダーゼ（シュードモナス属）、Gly-X カルボキシペプチダーゼ（サッカロマイセス・セレビシエ）、O-シアログルコプロテインエンドペプチダーゼ（Pasteurella haemolytica）、ベータ-溶解性メタロエンドペプチダーゼ（アクロモバクター・リティカス（Achromobacter lyticus））、メチオニルアミノペプチダーゼI（大腸菌）、X-Pro アミノペプチダーゼ（大腸菌）、X-His ジペプチダーゼ（大腸菌）、IgA1-特異的 メタロエンドペプチダーゼ（サングイス連鎖球菌（Streptococcus sanguis））、テントキシリシン（破傷風菌（Clostridium tetani））、リューシルアミノペプチダーゼ（ビブリオ・プロテオリティカス（Vibrio proteolyticus））、アミノペプチダーゼ（ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus））、IAP アミノペプチダーゼ（大腸菌）、アミノペプチダーゼT（サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus））、ハイコリシン（スタフィロコッカス・ハイイカス（Staphylococcus hyicus））、カルボキシペプチダーゼ Taq（サーマス・アクアティカス）、炭疽致死因子（炭疽菌（Bacillus anthracis））、ペニシロリシン（ペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum））、ファンガリシン（アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus））、リゾスタフィン（スタフィロコッカス・シミュランス（Staphylococcus simulans））、ベータ-アスパチルジペプチダーゼ（大腸菌��、カルボキシペプチダーゼSs1（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus））、FtsH エンドペプチダーゼ（大腸菌）、グルタミルアミノペプチダーゼ（ラクトコッカス・ラクチス）、サイトファガリシン（サイトファガ属（Cytophaga sp.））、メタロエンドペプチダーゼ（ワクシニアウイルス）、VanX D-Ala-D-Alaジペプチダーゼ（エンテロコッカス・フェシウム）、Ste24pエンドペプチダーゼ （サッカロマイセス・セレビシエ）、ジペプチジル-ペプチダーゼ III（ラット）、 S2Pプロテアーゼ（ヒト）、 胞子形成因子SpoIVFB（枯草菌）、及び HYBD エンドペプチダーゼ（大腸菌）。
【００２０】
メタロプロテアーゼには数多くの用途があることが見出されている。例えば、メタロプロテアーゼが、血管収縮薬、エンドセリン-1のインビボにおけるタンパク質分解過程に関与することを示す強い証拠がある。ラットのメタロプロテアーゼが、ペプチドホルモンのプロセシングに関与していることが見出されている。メタロプロテアーゼの中の重要なサブファミリーの1つにマトリックスメタロプロテアーゼがある。
【００２１】
過剰なもしくは望まれないメタロプロテアーゼ活性、またはプロテアーゼファミリータンパク質の様々のメンバーの比率の不均衡が、様々な疾患に関与していると考えられている。これらには、以下のものが含まれる：a）変形性関節症（Woessnerら、J. Biol.Chem. 259(6), 3633, 1984；Phadkeら、J. Rheumatol. 10, 852, 1983）、b）慢性関節リュウマチ（Mullinsら、Biochim. Biophys. Acta 695, 117, 1983；Woolleyら、Arthritis Rheum. 20, 1231, 1977；Gravalleseら、Arthritis Rheum. 34, 1076, 1991）、c）敗血症性関節炎（Williamsら、Arthritis Rheum. 33, 533, 1990）、d）腫瘍転移（Reichら、Cancer Res. 48, 3307, 1988、およびMatrisianら、Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA 83, 9413, 1986）、e）歯周疾患（Overallら、J. Periodontal Res. 22, 81, 1987)、f）角膜潰瘍（Burnsら、Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 30, 1569, 1989)、g）タンパク質尿（Baricosら、Biochem. J. 254, 609, 1988)、 h）アテローム性動脈硬化症のプラーク破裂からの冠状動脈血栓症（Henneyら、Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA 88, 8154-8158, 1991)、i）動脈瘤性大動脈疾患（Vineら、Clin. Sci. 81, 233, 1991)、j）産児調節（Woessnerら、Steroids 54, 491, 1989)、k）ジストロフォビック（dystrophobic）表皮水疱症（Kronbergerら、J. Invest. Dermatol. 79, 208, 1982)、l）外傷性関節損傷後の変性軟骨欠損、m）炎症反応を惹起する状態、 MMP活性が関与する骨減少症、n）側頭下顎関節疾患、o）神経系の脱髄疾患（Chantryら、J. Neurochem. 50, 688, 1988)。
【００２２】
アスパラギンプロテアーゼ
アスパラギンプロテアーゼは、主に活性と構造に基づいて以下のいくつかの異なるファミリーに分類される：1）水求核性試薬；水が1量体または2量体からの2つのアスパラギン酸に結合するもの；真核生物、ウイルス、またはウイルス様生物由来の全てのエンドペプチダーゼ、および2）水求核性試薬であり、アスパラギン酸とアスバラギンに結合した水を有するエンドペプチダーゼ。
【００２３】
アスパラギン酸プロテアーゼの大部分は、ペプシンファミリーに属する。ペプシンファミリーには、ペプシンおよびキモシンなどの消化酵素とともに、ライソゾームのカテプシンDおよびレニンなどのプロセシング酵素、ならびにある種の真菌プロテアーゼ（ペニシロペプシン、リゾパスペプシン、エンドチアペプシン）が含まれる。第2のファミリーには、レトロペプシンとも呼ばれるエイズウイルス（HIV）由来のプロテアーゼのようなウイルスプロテアーゼが含まれる。結晶構造解析の研究から、これらの酵素は二葉性の分子であり、2つの相同性を持つ葉（lobe）間に活性部位を有していることが示されている。それぞれの葉は、触媒活性を有する2価アスパラギン酸塩の1つのアスパラギン酸残基を提供する。これらの2つのアスパラギン酸残基は活性化分子において幾何学的に十分近位に位置しており、一つのアスパラギン酸残基がイオン化している一方、もう一つはpH2〜3の至適pHにおいてイオン化していない。レトロペプシンは単量体であり、即ち触媒活性を有するアスパラギン酸を一つのみ保有し、従って活性化酵素を形成するためには二量体形成が必要である。
【００２４】
セリン及びシステインプロテアーゼとは対照的に、アスパラギン酸プロテアーゼによる触媒作用には、4水素性中間体は存在するが、共有結合の中間体は存在しない。求核反応は、2つの陽子の同時の移行により達成される。一つは水分子から2つのカルボキシル基の2価イオンへの移行であり、二つ目はCO-NH結合の切断と同時に起こる、その2価イオンから基質のカルボキシル基中の酸素への移行である。この通常起こる酸-塩基触媒反応は、「プッシュ-プル（push-pull）」機構とも呼べるもので、これにより非共有結合性中性4水素性中間体形成が誘導される。
【００２５】
アスパラギン酸プロテアーゼファミリーのタンパク質には、以下の例が挙げられるが、これに限定されるものではない。ペプシンA（ヒト）、HIV1 レトロペプシン（ヒト免役不全ウイルス1型）、エンドペプチダーゼ（カリフラワーモザイクウイルス）、杆状ウイルスの推定プロテアーゼ（イネ縞葉枯ウイルス（rice tungro bacilliform virus））、アスペルギロペプシンII（黒色アスペルギルス（Aspergillus niger））、サーモプシン（スルフロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius））、ノダウイルスエンドペプチダーゼ（フロックハウスウイルス（flock house virus））、シュードモナペプシン（シュードモナス属101）、シグナルペプチダーゼII（大腸菌）、ポリプロテインペプチダーゼ（ヒトスプーマレトロウイルス（human spumaretrovirus））、コピアトランスポゾン（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、SIRE-1 ペプチダーゼ（ダイズ（Glycine max））、レトロトランスポソンbs1エンドペプチダーゼ（トウモロコシ（Zea mays））、レトロトランスポソンペプチダーゼ（ドロソフィラ・ブザッティ（Drosophila buzzatii））、タスレトロトランスポソンペプチダーゼ（回虫（Ascaris lumbricoides））、パオレトロトランスポソンペプチダーゼ（カイコガ（Bombyx mori））、スキッピーレトロトランスポソンの推定プロテイナーゼ（フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum））、テトラウイルスエンドペプチダーゼ（ナダウレリアカペンシスオメガウイルス（(Nudaurelia capensis omega virus））、プレゼニリン1（ヒト）。
【００２６】
プロテアーゼと癌
プロテアーゼは癌転移が進行する過程のいくつかの段階において重要な要素である。この過程においては、基底膜の構造タンパク質のタンパク質分解により、原発巣の腫瘍の拡散、原発巣からの逸脱とともに、離れた次の部位へのホーミングと浸潤が可能になる。また、腫瘍誘導性血管新生は腫瘍の増殖に必要であり、これもタンパク質分解による組織再造形に依存している。様々なタイプのプロテアーゼを用いたトランスフェクション実験により、マトリックスメタロプロテアーゼ、特にゲラチナーゼAとB（それぞれMMP-2とMMP-9）がこれらの癌転移の過程に重要な役割を果たしていることが示されている。この分野の総説としては、Mullinsら、Biochim. Biophys. Acta 695, 177, 1983；Rayら、Eur. Respir. J. 7, 2062, 1994；Birkedal-Hansenら、Crit. Rev. Oral Biol. Med. 4, 197, 1993を参照。
【００２７】
さらに、自然のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤であるTIMP-2（タンパク質）によって細胞外基質の分解を阻害することにより腫瘍増殖が抑制されること（DeClerckら、Cancer Res. 52, 701, 1992）、および実験系においてTIMP-2が腫瘍誘導性血管新生を阻害すること（Mosesら、Science 248, 1408, 1990）が示されている。これに関する総説は、DeClerckら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 732, 222, 1994を参照。さらに、合成マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤であるバチマスタット（batimastat）を腹腔内投与することにより、ヌードマウスの同所移植モデルにおいてヒト大腸癌の増殖及び浸潤が抑えられること（Wangら、Cancer Res. 54, 4726, 1994）、ならびにヒト卵巣腫瘍の異種移植を受けたマウスで生存期間が延長すること（Daviesら、Cancer Res. 53, 2087, 1993）も示されている。これらおよび関連化合物の使用については、Brownらの国際公開公報第9321942 A2号に記載されている。
【００２８】
転移性腫瘍の抑制、腫瘍退縮の促進、癌細胞の増殖阻害、変形性関節症に伴う軟骨喪失の遅延もしくは阻止、または前述したこれら以外の疾患の治療に対して、メタロプロテアーゼ阻害剤を使用することを主張する特許おより特許出願はいくつか存在する（例えば、Levyら、国際公開公報第9519965 A1号；Beckettら、国際公開公報第9519956 A1号；Beckettら、国際公開公報第9519957 A1号；Beckettら、国際公開公報第9519961 A1号；Brownら、国際公開公報第9321942 A2号；Crimminら、国際公開公報第9421625 A1号；Dickensら、米国特許第4,599,361号；Hughesら、米国特許第5,190,937号；Broadhurstら、EP 574758 A1；Broadhurstら、EP 276436；ならびにMyersら、EP 520573 A1）。
【００２９】
プロテアーゼタンパク質は、薬剤作用と薬剤開発の主要な標的である。したがって、このサブファミリーのプロテアーゼタンパク質に属するこれまでに知られていないメンバーを同定し、特徴付けることは、製薬開発の分野において価値のあることである。本発明は、プロテアーゼファミリーのメンバーと相同性を有するこれまでに未知のヒトプロテアーゼタンパク質を提供するという点で、当技術分野の状況を促進するものである。
【発明の開示】
【００３０】
発明の概要
本発明は、プロテアーゼファミリー、これらの対立遺伝子変異体、および他の哺乳類におけるこれらのオルソログに関係する、ヒトプロテアーゼペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列同定の一部に基づいたものである。これらの特有のペプチド配列及びこれらのペプチドをコードする核酸配列は、ヒトの治療標的開発のためのモデルとして用いることができ、治療に用いるタンパク質の同定に役立ち、プロテアーゼを発現する細胞及び組織内でのプロテアーゼ活性を調節するヒトの治療薬の開発における標的となり得る。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。
【００３１】
発明の詳細な説明
概論
本発明は、ヒトゲノムの配列決定に基づいている。ヒトゲノムの配列決定及び構築に際して、配列情報を解析することによって、当技術分野においてプロテアーゼタンパク質、またはその一部であると同定及び特徴付けされるタンパク質/ペプチド/ドメインに対して構造及び/又は配列の相同性を有するペプチドをコードするヒトゲノムの未同定の断片が明らかになった。これらの配列を用いて、付加的なゲノム配列を構築、転写し、及び/又はcDNA配列を単離し、特徴付けた。この解析に基づき、本発明は、プロテアーゼファミリーに関連するヒトプロテアーゼペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列、これらのプロテアーゼペプチド及びタンパク質をコードする転写配列、cDNA配列、及び/又はゲノム配列形態における核酸配列、核酸変異（対立遺伝子情報）、発現の組織分布、ならびに本発明のプロテアーゼに対して構造又は配列の相同性を有する、最も関連性の高い既知のタンパク質/ペプチド/ドメインに関する情報を提供するものである。
【００３２】
本発明において提供されるペプチドは、従来より未知であることに加えて、商業的に重要な製品及びサービスの開発にとって有用であるという能力に基づいて、選択され得る。特に、本発明のペプチドは、プロテアーゼファミリーにおける既知のプロテアーゼタンパク質に対して相同性及び/又は構造上の相関性を有し、ならびに発現パターンが観察されることに基づいて選択される。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。この技術は、このファミリーのタンパク質、及び本発明の遺伝子に類似した発現パターンを有するタンパク質の商業的な重要性を明確に確立するものである。本発明のペプチドについてのより特異的な性質、及びその使用については、本明細書、特に発明の背景、図面の注釈に記載され、及び/又は既知のプロテアーゼファミリーもしくはプロテアーゼタンパク質サブファミリーのそれぞれについては、当技術分野で周知である。
【００３３】
特定の態様
ペプチド分子
本発明は、プロテアーゼファミリーのタンパク質のメンバーであると同定されたタンパク質分子をコードする核酸配列を提供するものである(図2にタンパク質配列、図1に転写/cDNA配列、図3にゲノム配列を示す)。図2にはペプチド配列が記載され、明らかな変異体、特に本明細書及び図3の情報を用いて同定される対立遺伝子変異体も記載されており、これらは、本明細書において、本発明のプロテアーゼペプチド、プロテアーゼペプチド、又は本発明のペプチド/タンパク質と呼ばれる。
【００３４】
本発明は、図2に示すプロテアーゼペプチド（図1の転写/cDNA、又は図3のゲノム配列に示される核酸分子によりコードされる）のアミノ酸配列からなる、または実質的になる、またはこれらを含む単離ペプチド及びタンパク質分子を提供するとともに、本技術に含まれ、作製および使用されるこれらのペプチドの全ての明らかな変異体を提供するものである。これらの変異体については、以下で詳述する。
【００３５】
本明細書で使用されているように、ペプチドが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前駆物質もしくは他の化学物質を含まない場合に、ペプチドは「単離」または「精製」されたという。本発明のペプチドは、均一、又は他の純度になるまで精製することができる。精製のレベルは使用目的に基づくと考えられる。重要な性質は、調製物中に他の成分が多量に存在していたとしても、所望のペプチドの機能を発揮できるということである（単離核酸分子の性質については、後述する）。
【００３６】
いくつかの使用では、「実質的に細胞物質を含まない」とは、他のタンパク質（すなわち汚染タンパク質）を約30％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約20％未満、他のタンパク質を約10％未満、又は、他のタンパク質を約5％未満有するペプチド調製物を含む。ペプチドが組換えにより製造される場合、培地がタンパク質調製物の容量に対して20％未満の場合には、実質的に培地を含まないとすることができる。
【００３７】
「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、合成に関与した化学前駆物質又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物を含む。ある態様においては、「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、化学前駆物質もしくは他の化学物質を約30％（乾燥重量）未満、化学前駆物質もしくは他の化学物質を約20％未満、化学前駆物質もしくは他の化学物質を約10％未満、又は化学前駆物質もしくは他の化学物質を約5％未満有するプロテアーゼペプチド調製物を含む。
【００３８】
単離プロテアーゼペプチドは、それを天然に発現する細胞、それを発現させるために変化させた（組換えられた）細胞から精製するか、又は、既知のタンパク質合成方法を用いて合成することができる。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。例えば、プロテアーゼペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクター中にクローニングされ、さらにこの発現ベクターは宿主細胞に導入されて、タンパク質が宿主細胞内で発現する。その後、タンパク質は標準のタンパク質精製技術を用いた適当な精製スキームによって、細胞から単離することができる。これらの多くの技術については、以下で詳述する。
【００３９】
したがって、本発明は、図2に示されるアミノ酸配列 (配列番号：2)からなるタンパク質、例えば、図1に示される転写/cDNA核酸配列 (配列番号：1)及び図3に示されるゲノム配列 (配列番号：3)によりコードされるタンパク質を提供するものである。このようなタンパク質のアミノ酸配列を図2に示す。このようなタンパク質の最終的なアミノ酸配列がこのアミノ酸配列である場合、タンパク質はアミノ酸配列からなる。
【００４０】
本発明はさらに、図2に示されるアミノ酸配列 (配列番号：2)から実質的になるタンパク質、例えば、図1に示される転写/cDNA核酸配列 (配列番号：1)及び図3に示されるゲノム配列 (配列番号：3) によりコードされるタンパク質を提供するものである。このようなアミノ酸配列に数個の付加アミノ酸残基、例えば、最終的なタンパク質中に約1〜約100個程度の付加残基、一般的には1個〜約20個の付加残基が存在する場合、タンパク質はアミノ酸配列から実質的になる。
【００４１】
本発明はさらに、図2に示されるアミノ酸配列 (配列番号：2)を含むタンパク質、例えば、図1に示される転写/cDNA核酸配列 (配列番号：1) 及び図3に示されるゲノム配列 (配列番号：3) によりコードされるタンパク質を提供するものである。このアミノ酸配列が、タンパク質の最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はアミノ酸配列を含む。このような場合、タンパク質はペプチドのみであるか、またはタンパク質と天然に結合しているアミノ酸残基（連続するコード配列）もしくは非相同アミノ酸残基/ペプチド配列のような付加アミノ酸分子を有することができる。このようなタンパク質は、数個の付加アミノ酸残基を有するか、又は数百もしくはそれ以上の付加アミノ酸を含むことができる。本発明のプロテアーゼペプチドが含まれるタンパク質の好ましい種として、天然の成熟タンパク質がある。これらの様々な種のタンパク質を調製/単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【００４２】
本発明のプロテアーゼペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために、非相同性の配列に結合することができる。このようなキメラ及び融合タンパク質は、プロテアーゼペプチドに対して実質的に相同性のないアミノ酸配列を有する非相同タンパク質に、機能的に結合されるプロテアーゼペプチドを含む。「機能的に結合される」とは、プロテアーゼペプチドと非相同タンパク質がフレーム中で融合していることを意味する。非相同タンパク質は、プロテアーゼペプチドのN末端又はC末端に融合されることができる。
【００４３】
いくつかの使用において、融合タンパク質は、プロテアーゼペプチド自体の活性に影響を及ぼさない。例えば、融合タンパク質には、βガラクトシダーゼ融合、酵母2-ハイブリッドGAL融合、ポリHis融合、MYC標識、HI標識及びIg融合などの酵素融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような融合タンパク質、特にポリHis融合は、組換えプロテアーゼペプチドの精製を容易にすることができる。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び/又は分泌は、非相同シグナル配列を用いることにより増加させることができる。
【００４４】
キメラ又は融合タンパク質は、標準の組換えDNA技術により製造することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードするDNA断片は、従来技術に従ってフレーム中に共に連結される。他の態様では、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来技術により合成することが可能である。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅にアンカープライマーを用い、2つの連続的な遺伝子断片間に相補的な突出部を形成し、その後アニーリングし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を作製することができる (Ausubelら、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、1992参照) 。さらに、既に融合部分（例えばGSTタンパク質）をコードした多くの発現ベクターが市販されている。プロテアーゼペプチドをコードした核酸を、融合部がフレーム中でプロテアーゼペプチドに結合するようにして、このような発現ベクター中にクローニングすることができる。
【００４５】
以上説明したように、本発明はまた、天然のペプチド成熟形態、ペプチドの対立遺伝子/配列変異体、非天然のペプチドの組換え誘導変異体、ならびにペプチドのオルソログ及びパラログなど、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における明らかな変異体を提供、及び実施可能にするものである。このような変異体は、核酸組換え技術及びタンパク質生化学の分野で公知の技術を用いることにより、容易に生成することができる。しかし、当然のことながら、この変異体には、本発明以前に開示されているいずれのアミノ酸配列も含まれないものである。
【００４６】
このような変異体は、本明細書に示される分子技術及び配列情報を用いることにより、容易に同定/製造することが可能である。さらに、このような変異体は、本発明のプロテアーゼペプチドに対する配列及び/又は構造上の相同性に基づいて、他のペプチドと容易に区別することができる。この相同性/同一性の程度は、主に、ペプチドが機能的な変異体であるか非機能的な変異体であるか、パラログファミリー中に存在する相違量、及びオルソログ間の進化距離に基づいて判断される。
【００４７】
2つのアミノ酸配列、又は2つの核酸配列の同一性割合（％）を決定するために、最適な比較を行う目的で配列は整列される（例えば、最適なアライメントのために、ギャップが第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入され、非相同性配列は比較を行う目的のために無視することができる）。好ましい態様としては、基準配列の長さの少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又はそれ以上が、比較目的に応じて整列化される。その後、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列での位置が、第二配列において対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置と同一である（ここで用いられているアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である）。2つの配列間の同一性割合（％）は、配列において共有される同一配置数の関数であり、ギャップ数及び各ギャップ長さを考慮し、ギャップは2つの配列の最適なアライメントのために導入される必要がある。
【００４８】
2つの配列間における、配列の比較ならびに同一性割合（％）および類似性割合（％）の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる(「計算分子生物学（Computational Molecular Biology）」、Lesk, A.M.編、Oxford University Press、New York、1988;「バイオコンピューティング：情報学およびゲノムプロジェクト（Biocomputing:  Informatics and Genome Projects）」、Smith, D.W.編、Academic Press、New York、1993;「配列データのコンピュータ解析、パート1（Computer Analysis of Sequence Data, Part 1）」、Griffin, A.M.,およびGriffin, H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994;「分子生物学における配列解析（Sequence Analysis in Molecular Biology）」、von Heinje, G.、Academic Press、1987;ならびに「配列解析プライマー（Sequence Analysis Primer）」、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991)。好ましい態様として、2つのアミノ酸配列間の同一性割合（％）はGCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれたNeedleman及びWunschアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）を用い、Blossom62マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれか、ならびにギャップ重量16、14、12、10、8、6または4、及び長さ重量1、2、3、4、5または6を用いて決定される。さらに好ましい態様としては、2つのヌクレオチド配列間の同一性割合（％）は、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラム (Devereux, J.,ら、(Nucleic Acids Res. 12(1) : 387 (1984))を用い、NWSgapdna.CMPマトリックス、ならびにギャップ重量40、50、60、70または80、及び長さ重量1、2、3、4、5または6を用いて決定される。他の態様としては、2つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性割合（％）は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれたE. Myers及びW. Millerのアルゴリズム (CABIOS、4:11-17 (1989))を用い、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を用いて決定される。
【００４９】
本発明の核酸及びタンパク質配列を、例えば他のファミリー又は関連した配列を同定するために、配列データベースに対して検索を行う「クエリー配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、AltschulらのNBLAST、及びXBLASTプログラム（バージョン2.0）(J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990))を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラムを用い、スコア（score）=100、ワード長（wordlength）=12で行うことができる。BLASTタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同性のあるアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラムを用い、スコア=50、ワード長=3で行うことができる。比較目的のギャップアライメントを得るために、Altschulらの記載のように、ギャップBLAST(Gapped BLAST)(Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997))を用いることができる。BLAST及びギャップBLASTプログラムを用いる際には、各プログラム（例えばXBLAST及びNBLAST）の既定のパラメータを用いることができる。
【００５０】
本発明のペプチドのうちの一つを含むタンパク質における、成熟プロセシングを受ける前の形態、およびプロセシングを受けた形態の全長は、本発明のプロテアーゼペプチドのうちの一つに対して完全な配列同一性を有し、本明細書により提供されるプロテアーゼペプチドと同じ遺伝子座によりコードされているものとして、容易に同定することができる。図3で提示されたデータに示されているように、マップ位置はePCRにより第3染色体上に同定され、これは放射線ハイブリッドマッピングにより確認された。
【００５１】
プロテアーゼペプチドの対立遺伝子変異体は、プロテアーゼペプチドの少なくとも一部に対して高度の（著しい）配列相同性/同一性を有するヒトタンパク質であり、同様に本明細書により提供されるプロテアーゼペプチドと同じ遺伝子座においてコードされるものとして、容易に同定することができる。遺伝子座は、基準となるヒトに対してマッピングされたゲノム配列のような、図3に示されるゲノム情報に基づいて容易に決定することができる。図3で提示されたデータに示されているように、マップ位置はePCRにより第3染色体上に同定され、これは放射線ハイブリッドマッピングにより確認された。本明細書において使用されるように、アミノ酸配列において、典型的には少なくとも約70〜80％、80〜90％、さらに典型的には少なくとも約90〜95％、又はそれ以上の相同性を有する場合、2つのタンパク質（又はタンパク質の領域）は著しい相同性を有している。本発明によれば、著しい相同性を有するアミノ酸配列は、より詳細には以下に述べられるようなストリンジェントな条件下で、プロテアーゼペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコードされると考えられる。
【００５２】
図3に、本発明のトランスポータータンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。SNPは、イントロン、ならびにORFの5'及び3'領域の37カ所の異なるヌクレオチド部位において同定された。このようなイントロン及びORFの外側のSNPは、制御/調節エレメントに影響を与える可能性がある。
【００５３】
プロテアーゼペプチドのパラログは、プロテアーゼペプチドの少なくとも一部に対して、ある程度の著しい配列相同性/同一性を有し、ヒト由来の遺伝子によってコードされ、且つ同様の活性又は機能を有しているものとして、容易に同定することができる。アミノ酸配列が、所与の領域又はドメインを通じて、典型的に少なくとも約60％またはそれ以上、さらに典型的には少なくとも約70％またはそれ以上の相同性を有する場合、2つのタンパク質は典型的にはパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるような穏やかな条件からストリンジェントな条件下で、プロテアーゼペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコードされると考えられる。
【００５４】
プロテアーゼペプチドのオルソログは、プロテアーゼペプチドの少なくとも一部に対してある程度の著しい配列相同性/同一性を有し、他の生物由来の遺伝子によってコードされているものとして、容易に同定することができる。好ましいオルソログは、哺乳類、好ましくは霊長類から単離され、ヒトの治療標的及び治療薬剤の開発のために用いられる。このようなオルソログは、より詳細には以下に述べられるような、穏やかな条件からストリンジェントな条件下で、プロテアーゼペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイズするような核酸配列によりコードされると考えられ、これはタンパク質を生成する2つの生物の関連性の程度に依存する。
【００５５】
図3で提示されたデータに示されているように、マップ位置はePCRにより第3番染色体上に同定され、これは放射線ハイブリッドマッピングにより確認された。
【００５６】
図3に、本発明のトランスポータータンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。SNPは、イントロン、ならびにORFの5'及び3'領域の37カ所の異なるヌクレオチド部位において同定された。このようなイントロン及びORFの外側のSNPは、制御/調節エレメントに影響を与える可能性がある。
【００５７】
本発明のプロテアーゼペプチドの非天然の変異体は、組換え技術を用いて容易に生成することができる。このような変異体には、プロテアーゼペプチドのアミノ酸配列中における欠失、付加、及び置換によるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、置換の1種として、保存的アミノ酸置換が挙げられる。この置換は、プロテアーゼペプチドにおける所与のアミノ酸が同様の特徴を持つ他のアミノ酸によって置換されるものである。保存的置換として典型的に見られるものには、脂肪族のアミノ酸Ala、Val、Leu及びIleの中の一つから他の一つへの置換、ヒドロキシル残基SerとThr間の置換、酸性残基AspとGluとの置換、アミド残基AsnとGln間の置換、塩基性残基LysとArgとの置換、ならびに芳香族残基PheとTyrとの置換がある。どのアミノ酸変化が表現型としてサイレントになる可能性を有するかに関する指針については、Bowieら、Science 247:1306-1310 (1990)に述べられている。
【００５８】
変異プロテアーゼペプチドは、完全に機能しているか、又は例えば基質結合能、基質切断能、シグナル伝達経路に関与する能力などの一つもしくは複数の活性において機能が欠失していることがある。完全に機能的な変異体には、典型的に、保存的な変異、又は致命的でない残基における変異もしくは致命的でない領域内での変異のみが含まれる。図2は、タンパク質分析の結果を示しており、致命的ドメイン/領域を同定するのに使用することができる。機能的変異体には、機能が変化しない、又は著しい機能変化の無い類似アミノ酸の置換も含まれるうる。他方、このような置換は、ある程度機能に対して正又は負の影響を及ぼすことがある。
【００５９】
非機能的変異体には、典型的に、1つもしくは複数の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転もしくは切断、又は致命的な残基もしくは致命的な領域内での置換、挿入、反転もしくは欠失が含まれる。
【００６０】
機能において必須のアミノ酸は、例えば、特定部位の突然変異誘発、又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Cunninghamら、Science 244:1081-1085 (1989)）等の当技術分野における既知の方法により、特に図2に示す結果を用いて同定することができる。アラニンスキャニング突然変異誘発では、分子内のすべての残基において、単独のアラニン突然変異を導入する。この結果生じた変異分子は、その後、プロテアーゼ活性のような生物活性、又はインビトロ増殖活性分析のようなアッセイのために試験される。結合対象/基質結合にとって重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴、または光学的親和性標識等の構造解析によって決定される（Smithら、J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) ; de Vosら、Science 255:306-312 (1992) ）。
【００６１】
本発明はさらに、プロテアーゼペプチドの断片を提供し、このような断片を含む、及びこのような断片からなるタンパク質及びペプチドに加え、特に図2に同定された残基を含むタンパク質及びペプチドを提供するものである。しかしながら、本発明に関連する断片は、本発明より以前に公開されている断片を含むものとは見なされない。
【００６２】
本明細書で使用されるように、断片は、プロテアーゼペプチドの少なくとも8個、10個、12個、14個、16個又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む。このような断片は、プロテアーゼペプチドの1つもしくは複数の生物活性を保持する能力に基づいて選択されるか、または基質との結合もしくは抗原としての作用等の機能を果たす能力によって選択され得る。特に重要な断片は生物活性断片であり、これは例えば、約8個又はそれ以上の長さのアミノ酸のペプチドである。このような断片は、典型的には、例えば活性部位、膜貫通ドメイン又は基質結合ドメインのような、プロテアーゼペプチドのドメイン又はモチーフを含むと考えられる。さらに、可能な断片としては、ドメイン又はモチーフ含有断片、可溶性ペプチド断片、免疫原性構造含有断片を含むが、これらに限定されるものではない。推定されるドメイン及び機能性部位は、当業者にとって容易に入手可能な公知のコンピュータプログラム（例えばPROSITE分析）により、容易に確認することができる。このような分析の1つによる結果を図2に示す。
【００６３】
ポリペプチドは、一般に、20天然アミノ酸と呼ばれている20種のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含む。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び他の翻訳後修飾等の天然の過程、又は当技術分野において公知の化学修飾技術によって修飾され得る。プロテアーゼペプチドにおいて天然に生じる一般的な修飾については、基本的なテキスト、詳細な文献及び研究論文に記述されており、これは当業者に周知である。（これらの特性のいくつかは図2において確認される）。
【００６４】
既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸の転写RNA媒介付加、及びユビキチン化を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
このような修飾は、当業者には周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されてきた。グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びADPリボシル化など、いくつかの特に一般的な修飾は、「タンパク質-構造と分子特性（Proteins - Structure and Molecular Properties）」、第2版、T.E. Creighton、W. H. Freeman and Company、New York (1993) のような多くの基本テキストに記載されている。この点に関する詳細な総説としては、Wold, F.、「タンパク質の翻訳後共有結合修飾（Posttranslational Covalent Modification of Proteins）」、B.C. Johnson編、Academic Press、New York 1-12 (1983); Seifterら、(Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990))およびRattanら、(Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)) のような多くの総説を利用することができる。
【００６６】
したがって、本発明のプロテアーゼペプチドは、誘導体又は類似体をも包括するものであり、ここで、置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされるものではなく、置換基が含まれ、成熟プロテアーゼペプチドが、プロテアーゼペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような他の化合物と融合するか、又は付加アミノ酸が、リーダー配列、分泌配列、成熟プロテアーゼペプチドの精製配列、または前タンパク質配列のような成熟プロテアーゼペプチドと融合する。
【００６７】
タンパク質/ペプチドの使用
本発明のタンパク質は、図面に示される機能情報に関連した、実質的かつ特異的なアッセイ法において、例えば、抗体を産生させる、又は他の免疫反応を誘導するため；生物液中におけるタンパク質（又はその結合対象、又はリガンド）レベルの定量のためのアッセイ法に用いる試薬（標識試薬を含む）として；および対応するタンパク質を選択的に発現する（組織の分化もしくは発達または疾患の状態において、構成的もしくは特定の段階のいずれかで発現する）組織のマーカーとして使用することができる。タンパク質が、別のタンパク質もしくはリガンドと結合するか、又は結合する可能性を有する場合（例えば、プロテアーゼ-エフェクタータンパク質の相互作用、又はプロテアーゼ-リガンドの相互作用）、このタンパク質を用いて結合対象/リガンドを特定し、結合相互作用の阻害因子を同定するシステムを開発することができる。これらの一部又はすべての使用により、商業製品として製品化するための試薬グレードまたはキット形式へと発展させることが可能となる。
【００６８】
上に列記した使用を実施する方法は、当業者に周知である。このような方法を開示している参考文献としては、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Sambrook, J.、E. F. FritschおよびT. Maniatis編、1989、ならびに「酵素学の方法：分子クローニング技術へのガイド（Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques）」、Academic Press、Berger, S. L.およびA. R. Kimmel編、1987がある。
【００６９】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパク質の起源、及びタンパク質の種類/作用に基づいている。例えば、ヒトから単離されたプロテアーゼ、及びそれらのヒト/哺乳類オルソログは、哺乳類の治療用の適用、例えば、ヒト用の薬物、特に、プロテアーゼを発現する細胞又は組織での生物学的反応又は病理学的反応の調節に用いられる物質を同定するための標的として有用である。図1の実験データにより、本発明のプロテアーゼタンパク質は、バーチャル・ノーザンブロット解析により、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。プロテアーゼタンパク質の活性を調節する薬物の多くは、現在開発中である（発明の背景を参照）。発明の背景及び図面に記載される構造情報及び機能情報は、特に、図1の発現情報と組み合わせることによって、本発明の分子の特異的及び実質的な使用が提供される。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。このような使用は、本明細書で提供される情報、当技術分野に既知の情報、及び日常的な実験を用いて、容易に決定することができる。
【００７０】
本発明のタンパク質（本発明以前に開示されている変異体及び断片を含む）は、プロテアーゼに関する生物学的アッセイ法に有用である。このようなアッセイ法は、任意の公知のプロテアーゼの機能もしくは活性、又は、特にプロテアーゼを発現する細胞及び組織における本発明の一つが属するプロテアーゼサブファミリーに特有のプロテアーゼに関連する症状の診断及び治療に有用な性質に関連している。図1の実験データにより、本発明のプロテアーゼタンパク質は、バーチャル・ノーザンブロット解析により、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。
【００７１】
本発明のタンパク質は、細胞ベース系又は無細胞系における薬物スクリーニングアッセイ法においても有用である。細胞ベース系は、天然型、すなわち、生検材料又は増殖する細胞培地中において、プロテアーゼを正常に発現する細胞である。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。代替的な態様において、細胞ベースのアッセイ法は、プロテアーゼタンパク質を発現する組換え宿主細胞に関係している。
【００７２】
ポリペプチドは、天然の状態、又はプロテアーゼに関連する特定の疾患もしくは症状を引き起こす改変された形態におけるタンパク質のプロテアーゼ活性を調節する化合物を同定するために用いることができる。本発明のプロテアーゼ、ならびに適当な変異体および断片はいずれも、このプロテアーゼに対して結合能力を持つ候補化合物をアッセイするためのハイスループット・スクリーニングにおいて使用することができる。これらの化合物は、さらに、これらのプロテアーゼ活性に対する化合物の作用を判定するために、機能性のプロテアーゼに対してスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系において、活性/効果を判定するために試験することができる。化合物は、プロテアーゼを望ましい程度まで活性化（アゴニスト）又は不活化（アンタゴニスト）するかどうかが同定される。
【００７３】
さらに、本発明のタンパク質は、プロテアーゼタンパク質と、該プロテアーゼタンパク質と通常相互作用する分子（例えば、プロテアーゼタンパク質が通常相互作用するシグナル経路の基質又は構成要素（例えば、プロテアーゼ））との間での相互作用を刺激又は阻害する能力について化合物をスクリーニングするために用いることができる。このようなアッセイ法には、一般的に、プロテアーゼタンパク質もしくは断片が標的分子と相互作用し、且つタンパク質と標的との複合物形成を検出することが可能な条件、又はタンパク質の切断、cAMP回転、及びアデニル酸シクラーゼ活性などのシグナル伝達に関連する作用のような、プロテアーゼタンパク質と標的との相互作用の生化学的結果を検出することが可能な条件で、プロテアーゼタンパク質と候補化合物が結合される工程が含まれる。
【００７４】
候補化合物としては、例えば、1)最終部がIgの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチド（例えば、Lamら、Nature 354:82-84 (1991); Houghtenら、Nature 354:84-86 (1991)参照）、ならびにD型及び/又はL型アミノ酸から構成されるコンビナトリアルケミストリーに由来の分子ライブラリーのメンバーを含むペプチド；2)ホスホペプチド（例えば、ランダムおよび部分的に変更されたホスホペプチドライブラリーのメンバー；例えば、Songyangら、Cell 72:767-778 (1993)参照）；3)抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、及び単鎖抗体、ならびにFab、F(ab')2、Fab発現ライブラリー断片、及び抗体のエピトープ結合断片）；ならびに4)小型の有機分子及び無機分子（例えば、コンビナトリアル及び天然生成物ライブラリーから得られる分子）が含まれる。
【００７５】
ある候補化合物は、基質結合において競合する受容体の可溶性断片である。他の候補化合物には、変異プロテアーゼ、又はプロテアーゼ機能に影響を及ぼす変異を含む適切な断片が含まれ、このため、基質と競合する。したがって、例えば高い親和性を有するか、又は断片が基質と結合し解離しないような、基質と競合する断片が本発明に包含される。
【００７６】
本発明はさらに、プロテアーゼ活性を調節（刺激又は阻害）する化合物を同定するための、他のエンドポイントアッセイ法を含む。このアッセイ法は、一般的に、プロテアーゼ活性を示すシグナル伝達経路における事象のアッセイに関連している。このため、プロテアーゼタンパク質依存性シグナルカスケードに対する応答を促進又は抑制するよう調節される、基質の切断、タンパク質の不活性化/活性化、遺伝子発現の変化についてのアッセイが行われる。
【００７７】
プロテアーゼにより媒介される生物学的又は生化学的な機能は、いずれもエンドポイントアッセイ法として使用されうる。これらは、本明細書に記載されている全ての生化学的又は生化学的/生物学的な事象を含み、本明細書に引用される文献には、これらのエンドポイントアッセイ法の標的が参照として本明細書に組み入れられ、また、これらは、当業者に公知であるか、又は図面、特に図2の情報を用いて、容易に同定することができる他の機能を含む。特に、プロテアーゼを発現する細胞又は組織の生物学的機能についてアッセイを行うことができる。図1の実験データにより、本発明のプロテアーゼタンパク質は、バーチャル・ノーザンブロット解析により、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。
【００７８】
結合及び/又は活性化化合物はまた、キメラプロテアーゼタンパク質を用いることによりスクリーニングを行うことができ、それはアミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、7回膜貫通セグメント又は細胞内もしくは細胞外ループのような膜貫通ドメイン全体又は小領域、及びカルボキシル末端細胞内ドメイン又はその一部において、異種ドメインもしくは小領域に置換され得る。例えば、基質結合領域を、異なる基質と相互作用するものとして用いることができ、さらに未処理のプロテアーゼによって認識される。したがって、異なるセットのシグナル伝達構成要素を活性化のエンドポイントアッセイ法として利用することができる。このような方法により、プロテアーゼが由来する特定の宿主細胞以外でアッセイを行うことが可能となる。
【００７９】
本発明のタンパク質はまた、プロテアーゼと相互作用する化合物（例えば、結合対象及び/又はリガンド）を発見するために設計された方法である、競争結合アッセイ法にも有用である。このために、化合物がポリペプチドと結合又は相互作用可能な条件下で、化合物をプロテアーゼポリペプチドと接触させる。可溶性プロテアーゼポリペプチドもまた混合物中に加えられる。試験化合物が可溶性プロテアーゼポリペプチドと相互作用する場合、プロテアーゼ標的から形成される複合体の量、又は活性は減少する。このタイプのアッセイ法は特にプロテアーゼの特定領域と相互作用する化合物を検索する場合に有用である。したがって、標的のプロテアーゼ領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象となる領域に対応したペプチド配列を含むように設計されている。
【００８０】
無細胞系の薬物スクリーニングアッセイを行うためには、タンパク質の一方又は両方の非複合形態からの複合体の分離を促進し、アッセイの自動化に適応させるために、プロテアーゼタンパク質もしくは断片、またはその標的分子のいずれかを固定化することが望ましい場合がある。
【００８１】
薬物スクリーニングアッセイ法においては、マトリックスにタンパク質を固定化する技術を使用することができる。ある態様では、融合タンパク質にはタンパク質をマトリックスに結合することのできるドメインを付加することができる。例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemica1、St. Louis、M0）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着することができ、次いで細胞溶解物（例えば、35S標識）と候補化合物とが結合され、複合体形成誘導条件（例えば、塩及びpHの生理学的条件）の下で混合物がインキュベーションされる。インキュベーションの後、非結合標識の除去のためにビーズを洗浄し、マトリックスを固定化して、放射性標識を直接、又は複合体を分離した後の上澄みを測定する。あるいは、複合体はSDS-PAGEによりマトリックスから分離することができ、標準の電気泳動技術を用いることによって、ゲルからビーズ画分中のプロテアーゼ結合タンパク質のレベルを定量することができる。例えば、ポリペプチド又はその標的分子のいずれかは、当技術分野に周知の技術を利用して、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定化される。あるいは、タンパク質と反応し、タンパク質と標的分子との結合を妨げない抗体は、プレートのウェルに誘導化され、このタンパク質は抗体との結合によりそのウェルの中に捕らえられる。プロテアーゼ結合タンパク質および候補化合物の調製物は、プロテアーゼタンパク質の存在するウェル中で培養され、ウェルに捕らえられた複合体の量を定量することができる。このような複合体を検出する方法としては、GST固定複合体による前述の方法に加えて、プロテアーゼタンパク質標的分子に反応性のある抗体、又は、プロテアーゼタンパク質に反応性があり標的分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出法、及び標的分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイ法が含まれる。
【００８２】
本発明のプロテアーゼのうちの1つを調節する物質は、上述のアッセイ法の1つまたは複数を単独または組み合わせて用いることにより同定することができる。一般的には、最初に細胞ベース系又は無細胞系を用い、次に動物又は他のモデル系における活性を確認することが好ましい。このようなモデル系は、当技術分野に周知であり、本記載において容易に用いることができる。
【００８３】
これらの薬物スクリーニングアッセイ法によって同定されるプロテアーゼタンパク質活性のモジュレータは、プロテアーゼを発現する細胞又は組織に処理することによって、プロテアーゼ経路により媒介される疾患に罹患する患者の治療に用いることができる。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。これらの治療方法には、薬学的組成物中のプロテアーゼ活性のモジュレータを患者の治療に必要な量投与する工程が含まれており、このモジュレータは本明細書に記載のようにして同定される。
【００８４】
本発明の他の観点では、プロテアーゼと結合又は相互作用し、プロテアーゼ活性に関連している他のタンパク質を同定するために、2-ハイブリッドアッセイ法又は3-ハイブリッドアッセイ法 (米国特許第5,283,317号; Zervosら、(1993) Cell 72:223-232; Maduraら、(1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartelら、(1993)  Biotechniques 14:920-924; Iwabuchiら、(1993) Oncogene 8:1693-1696;およびBrent国際公開公報第94/10300号参照）においてプロテアーゼタンパク質を「ベイト（bait）タンパク質」として使用することができる。このようなプロテアーゼ結合タンパク質は、例えば、プロテアーゼ媒介シグナル伝達経路の下流要素としてのプロテアーゼタンパク質、又はプロテアーゼ標的によるシグナル伝達に関与している可能性がある。あるいは、このようなプロテアーゼ結合タンパク質は、プロテアーゼ阻害因子である可能性も考えられる。
【００８５】
2-ハイブリッドシステムは、分離可能なDNA結合ドメイン及び活性化ドメインからなる大部分の転写因子のモジュラー性に基づいている。簡単に言うと、このアッセイ法では2つの異なるDNA構造を利用する。一方の構造においては、プロテアーゼタンパク質をコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えばGAL4）のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構造においては、DNA配列ライブラリーから得られ、未知のタンパク質（「プレイ（pray）」又は「サンプル（sample）」）をコードするDNA配列が既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイトタンパク質」及び「プレイタンパク質」がインビボで相互作用することができ、プロテアーゼ依存性の複合体を形成する場合、転写因子のDNA結合ドメイン及び活性化ドメインは近接する。この近接により、転写因子に反応する転写調節部位に機能的に結合するレポーター遺伝子（例えばLacZ）の転写を行うことができる。レポーター遺伝子の発現を検出することが可能であり、機能的転写調節因子を含む細胞コロニーを単離及び使用して、プロテアーゼタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得ることができる。
【００８６】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイ法によって同定される新規の物質にも関係する。したがって、本明細書に記載されるようにして同定された物質を適当な動物のモデルに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定された物質（例えばプロテアーゼ調節物質、アンチセンスプロテアーゼ核酸分子、プロテアーゼ特異的抗体、又はプロテアーゼ結合対象）を、これらの物質による治療の有効性、毒性、または副作用を判定するために、動物、又は他のモデルで用いることができる。あるいは、本明細書に記載のように同定された物質を、このような物質の作用メカニズムを決定するために、動物又は他のモデルで用いることができる。さらに、本発明は、本明細書に記載のように治療のための前記スクリーニングアッセイ法により同定された新規の薬物の使用に関する。
【００８７】
本発明のプロテアーゼタンパク質は、ペプチドにより媒介される疾患又は素因の診断のための標的を提供するのに有用である。したがって、本発明は、細胞、組織、もしくは生体中のタンパク質（又はコードするmRNA）の存在、またはそのレベルを検出する方法を提供するものである。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。方法には、プロテアーゼタンパク質との相互作用能力を有し、その相互作用が検出可能な化合物と生物試料とを接触させる工程が含まれる。このようなアッセイ法は、単一の検出形態、又は抗体チップアレイのようなマルチ検出形態で提供される。
【００８８】
試料中のタンパク質を検出する1つの物質は、タンパク質に選択的に結合することのできる抗体である。生物試料には、被験者から単離された組織、細胞、及び体液、ならびに被験者の内部に存在する組織、細胞、及び体液が含まれる。
【００８９】
本発明のペプチドはまた、変異ペプチドを持つ患者における、タンパク質の活性、疾患又は素因、特に現存するタンパク質ファミリーの他のメンバーで知られる活性及び症状の診断に用いるための標的を提供するものである。したがって、ペプチドを生物試料から単離することができ、且つ異常ペプチドを生じる遺伝子突然変異の存在についてアッセイを行うことができる。これは、アミノ酸の置換、欠失、挿入、再配置（異常なスプライシング事象の結果生じる）、及び不適当な翻訳後の修飾を含む。分析方法としては、電気泳動移動度の変化、トリプシンペプチド消化の変化、細胞ベース又は無細胞のアッセイ法によるプロテアーゼ活性の変化、基質又は抗体の結合パターンの変化、等電点の変化、直接アミノ酸配列決定、及びタンパク質の変異の検出に有用な他の公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイ法は、単一の検出形態、又は抗体チップアレイのような、マルチ検出形態で提供される。
【００９０】
ペプチドのインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降及び免疫蛍光検査法を含む。あるいは、標識された抗ペプチド抗体、又は他のタイプの検出物質を被験者に導入することにより、被験者中でペプチドのインビボ検出を行うことができる、例えば、抗体は放射性マーカーにより標識することができ、被験者中のこのマーカーの存在及び位置は、標準画像化技術によって検出することができる。被験者において発現されたペプチドの対立遺伝子変異体を検出する方法、及び試料中のペプチド断片を検出する方法は、特に有用である。
【００９１】
ペプチドはまた、薬理遺伝学的分析においても有用である。薬理遺伝学では、薬物の変化の傾向と、影響を受けたヒトの異常作用に従って、薬物に対する応答における臨床的に著しい遺伝的変異について取り扱う。例えば、Eichelbaum, M. (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11):983-985 (1996))、およびLinder, M.W. (Clin. Chem. 43(2):254-266 (1997))参照。これらの変異の臨床的な結果は、個体の代謝変異の結果として、ある個体に対しては治療薬物が重い毒性をもたらし、又はある個体に対しては治療の失敗に終わる。このように、個体の遺伝子型は、体内で治療化合物を作用させる方法、又は体が化合物を代謝する方法を決定することができる。さらに、酵素を代謝させる薬物の活性は、薬物作用の強度と期間の両方に影響する。このように、個体の薬理遺伝学は、個体の遺伝子型に基づいた予防、又は治療的な処置において、効果的な化合物、及びこのような化合物の効果的な投与量の選択を可能とする。酵素代謝性の薬物における、遺伝子多形性の発見により、ある患者は期待される薬効を得られない、過度の薬効を示す、又は標準の投薬量から重大な毒性を被るといったことの理由を説明することができる。多形性は、代謝能の高い個体(extensive metabolizer)の表現型と代謝能の低い個体(poor metabolizer)の表現型で表されることができる。したがって、遺伝子の多形性は、ある集団のプロテアーゼ機能の1つまたは複数が他の集団のそれと異なるような、プロテアーゼタンパク質の対立遺伝子タンパク質変異に至るかもしれない。このように、ペプチドは治療法に影響しうる遺伝子の素因を確認するための標的となり得る。このため、リガンドベースの治療において、多形性により、基質結合活性及びプロテアーゼ活性がより高い又はより低いアミノ末端細胞外ドメイン及び/又は他の基質結合領域が生じうる。したがって、多形性を含む所与の集団においては、治療効果を最大にするように、基質投薬量は必然的に修正されると考えられる。遺伝子型同定に代わるものとしては、特定の多形性のペプチドを同定することができる。
【００９２】
ペプチドはまた、タンパク質の発現がない、タンパク質の発現が不適当である、又はタンパク質の発現が望ましくないことによって特徴づけられる障害を治療するために有用である。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。したがって、治療方法には、プロテアーゼタンパク質又は断片の使用が含まれる。
【００９３】
抗体
本発明はまた、本発明のペプチド、このようなペプチドを含むタンパク質、それらの変異体及びその断片の1つに選択的に結合する抗体を提供するものである。本明細書で用いられているように、抗体が標的ペプチドと結合し、無関係なタンパク質と強く結合しないような場合、抗体は標的ペプチドと選択的に結合している。標的ペプチドと実質的に相同性の無い他のタンパク質と結合していても、そのタンパク質が抗体の標的となるペプチドの断片又はドメインと相同性を有している限り、抗体は選択的にペプチドと結合すると考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、なお選択的であると理解される。
【００９４】
本明細書で用いられるように、抗体は当技術分野で認められているものと同じ用語で定義され、これらは、抗原の投与に応答して哺乳類生物により生成されるマルチサブユニットタンパク質である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びこれらの抗体の断片を含み、Fab又はF(ab')2、及びFv断片を含むが、これに限定されるものではない。
【００９５】
所与の標的ペプチドに対する抗体の生成及び/又は同定について、多くの方法が知られている。このような方法のいくつかは、Harlow、「抗体（Antibodies）」、Cold Spring Harbor Press、(1989) に記載されている。
【００９６】
一般に、抗体を生成するためには、単離ペプチドを免疫原として用い、例えばラット、ウサギ、又はマウスのような哺乳類生物に投与する。全長タンパク質、抗原性ペプチド断片又は融合タンパク質を用いることができる。特に重要な断片は、図2において同定されるドメインのような、機能ドメインを含むものであり、タンパク質アライメント方法を使用して容易に同定することができ、図面に示されているようなファミリーと配列相同性又は相違性を持つドメインである。
【００９７】
抗体は、好ましくはプロテアーゼタンパク質の領域、又は単離された断片から調製される。抗体は、本明細書に記載されるように、ペプチドのいかなる領城からでも調製することができる。しかしながら、好ましい領域には、機能/活性、及び/又はプロテアーゼ/結合対象の相互作用に関係している領域が含まれると考えられる。図2は特に重要な領域を同定するのに用いることができ、この時、配列アライメントは保存された特有の配列断片を同定するのに用いることができる。
【００９８】
抗原性断片は、一般的に、少なくとも8個の連続するアミノ酸残基を含むと考えられる。抗原性ペプチドは、少なくとも10個、12個、14個、16個またはそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。このような断片は、例えば、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性の領域に対応する断片のような物理的な性質、または配列の特異性（図2参照）に基づいて選択することができる。
【００９９】
本発明の抗体の検出は、検出可能な物質と抗体とのカップリング（すなわち、物理的な結合）によって容易に行うことができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアピジン/ビオチン、及びアビジン/ビオチンを含み、好適な蛍光性物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、又はフィコエリトリンを含み、発光性物質の例としては、ルミノールを含み、生物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、ならびに好適な放射性物質の例として、は125I、131I、35S、又は3Hを含む。
【０１００】
抗体の使用
抗体は、本発明のタンパク質の1つを、アフィニティクロマトグラフィ、又は免疫沈降のような標準の技術によって単離するために用いることができる。抗体は、細胞からの天然型タンパク質、及び宿主細胞で発現される組換えによって生産されたタンパク質の精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は、生体内の様々な組織又は通常の発達工程におけるタンパク質の発現パターンを決定するため、細胞又は組織内における本発明のタンパク質の存在の検出に有用である。図1の実験データにより、本発明のプロテアーゼタンパク質は、バーチャル・ノーザンブロット解析により、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。さらに、このような抗体は、発現の量及びパターンを評価するための、インサイチュー、インビトロ、細胞溶解物中、及び上澄み中でのタンパク質の検出に用いることができる。また、このような抗体は、生物学的状態の発達又は進行の間、異常な組織分布又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパク質の循環断片における抗体検出は、代謝回転を同定するのに用いることができる。
【０１０１】
さらに、抗体は、タンパク質に関連した疾患の活発な段階、又は該疾患素因を持つ個体などの、疾患状態における発現を評価するのに用いることができる。障害が不適当な組織分布、発生における発現、タンパク質の発現レベル、又は発現/進行状態に起因する場合、抗体は通常のタンパク質に対して調製される。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。障害がタンパク質の特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗体を、特定の変異タンパク質の存在についてアッセイするために用いることができる。
【０１０２】
抗体はまた、生体内の各種組織における、細胞の正常又は異常な細胞内局在を評価するのに用いることができる。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。診断としての使用は、遺伝子の試験だけでなく、治療法をモニターすることにも適用することができる。したがって、治療が最終的に、発現レベル、又は異常配列及び異常組織分布の存在、又は発生における発現を修正することを目指すものである場合、タンパク質又は関連する断片に対して誘導された抗体を、治療の有効性をモニターするのに用いることができる。
【０１０３】
さらに、抗体は薬理遺伝学的分析に有用である。このように、多形性のタンパク質に対して調製される抗体は、治療法の修正を必要とする個体を特定するために用いることができる。抗体は、また、電気泳動移動度、等電点、トリプシンペプチド消化、及び当業者に周知の他の物理的なアッセイ法によって分析される異常タンパク質の免疫学的なマーカーのような診断上のツールとしても有用である。
【０１０４】
抗体はまた、組織型の分類にも有用である。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。このように、特定のタンパク質が特定の組織中の発現と相関していた場合、このタンパク質に特異的である抗体を、組織型を同定するために用いることができる。
【０１０５】
抗体はまた、タンパク質機能を阻害するのに有用であり、例えば、基質のような結合対象へのプロテアーゼペプチドの結合を妨害する。これらの使用はタンパク質の機能阻害に関連する治療状況において適用されることができる。抗体は、例えば、結合を妨害し、ペプチド活性を調節（アゴナイズ又はアンタゴナイズ）することに用いることができる。抗体は、機能のために必要な部位を含む特定の断片に対して、又は細胞もしくは細胞膜と関係している完全タンパク質に対して調製される。図2に、本発明のタンパク質に関する構造情報を示す。
【０１０６】
本発明はまた、生物試料中のタンパク質の存在を検出するために抗体を用いたキットを包含する。キットには、標識された抗体又は標識可能な抗体、及び生物試料中でタンパク質を検出するための化合物又は試薬；試料中のタンパク質量を決定する手段；試料中のタンパク質量と標準の量とを比較する手段；ならびに使用のための説明を含む。このようなキットは、単一のタンパク質もしくはエピトープを検出するために提供されるか、又は抗体検出アレイのように、多数のエピトープのうちの1つを検出するように設定されることができる。アレイとしては、核酸アレイが詳細に後述され、抗体アレイのための同様の方法も開発されている。
【０１０７】
核酸分子
本発明は、さらに本発明のプロテアーゼペプチド又はタンパク質をコードする単離核酸分子（cDNA、転写、及びゲノム配列）を提供するものである。このような核酸分子は、本発明のプロテアーゼペプチドの1つをコードするヌクレオチド配列、これらの対立遺伝子変異体、又はこれらのオルソログもしくはパラログからなる、本質的になる、又は含むと考えられる。
【０１０８】
本明細書に用いられているように、「単離された」核酸分子は、核酸の天然起源に存在する他の核酸から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸はその核酸の由来となる生物のゲノムDNAにおいて、核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の5'末端及び3'末端に位置する配列）は含まない。しかしながら、例えば、約5KB、4KB、3KB、2KB又は1KB未満まで、特に連続するペプチドをコードする配列、及び同一遺伝子内であるが、ゲノム配列中のイントロンにより分離されているペプチドをコードする配列のような、いくつかの隣接ヌクレオチド配列がある。重要な点は、核酸が、本明細書に記載されるような特定の操作、例えば、組換え発現、プローブやプライマ一の調製、及び核酸配列のための他の特定の使用等に取り扱うことができるように、離れた重要でない隣接配列から分離されているということである。
【０１０９】
さらに、例えば、転写/cDNA分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞物質、組換え技術により製造される場合には培地、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を、実質的に含まない。しかしながら、この核酸分子は、他のコード配列又は他の調節配列に融合されることができるが、これは単離されたものとして考えられる。
【０１１０】
例えば、ベクターに含まれる組換えDNA分子は、単離されたものとして考えられる。さらなる単離DNA分子の例には、非相同性の宿主細胞中に保持された組換えDNA分子、又は溶液中の精製（部分的又は実質的に）されたDNA分子が含まれる。単離されたRNA分子は、本発明の単離DNA分子の、インビボ又はインビトロでのRNA転写産物を含む。本発明による単離核酸分子としては、合成的に製造された分子をさらに含む。
【０１１１】
したがって、本発明は、図1又は図3（配列番号：1、転写配列、及び配列番号：3、ゲノム配列）に記載のヌクレオチド配列からなる核酸分子、又は図2（配列番号：2）に記載のタンパク質をコードする任意の核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列からなる。
【０１１２】
本発明はさらに、図1又は図3（配列番号：1、転写配列、及び配列番号：3、ゲノム配列）に記載のヌクレオチド配列から実質的になる核酸分子、又は図2（配列番号：2）に記載のタンパク質をコードする任意の核酸分子を提供するものである。最終的な核酸分子において、このようなヌクレオチド配列がごくわずかの付加核酸残基とともに存在するとき、核酸分子はヌクレオチド配列から実質的になる。
【０１１３】
本発明はさらに、図1又は図3（配列番号：1、転写配列、及び配列番号：3、ゲノム配列）に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は図2（配列番号：2）に記載のタンパク質をコードする任意の核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列が核酸分子の最終的なヌクレオチド配列の少なくとも一部である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。これによると、核酸分子は、そのヌクレオチド配列だけであるか、又は付加的な核酸残基、例えば、それに天然に関連する核酸残基、又は非相同性のヌクレオチド配列を有することもできる。このような核酸分子は、ごくわずかの付加的なヌクレオチドを有するか、又は数百もしくはそれ以上の付加的なヌクレオチドを含むこともできる。これらの種々のタイプの核酸分子を容易に生成/単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【０１１４】
図1及び図3に、コード配列及び非コードの配列の両者が示される。本発明の起源である、ヒトゲノム配列（図3）、及びcDNA/転写配列（図1）のため、図面中の核酸分子は、ゲノムイントロン配列、5'と3'の非コード配列、遺伝子調節領城、及び非コード遺伝子間配列を含むと考えられる。一般に、このような配列の特徴は、図1および図3の両方において記載されているか、または当技術分野において公知の計算ツールを用いて容易に同定することができる。以下で議論されるように、いくつかの非コード領域、特にプロモーターのような遺伝子調節要素は、例えば、非相同性の遺伝子発現の制御、遺伝子活性を調節する化合物同定のための標的等の種々の目的にとって有用であり、また特に、本明細書で提供されるゲノム配列の断片として主張されている。
【０１１５】
単離核酸分子は、成熟したタンパク質と付加的アミノ末端もしくはカルボキシル未端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸（例えば、成熟形態が1つより多くのペプチド鎖を有する場合）をコードすることができる。このような配列は、前駆体から成熟した形態へのタンパク質のプロセシングにおいて、タンパク質搬送の促進、タンパク質半減期の延長もしくは短縮、又はタンパク質のアッセイもしくは製造の際の操作の効率化、又は他の事象における役割を果たし得る。一般に、インサイチューの場合、付加アミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質へとプロセシングされてもよい。
【０１１６】
上述したように、単離核酸分子は、プロテアーゼペプチドのみをコードする配列、成熟したペプチドをコードする配列、及びリーダー配列又は分泌配列（例えば、プレ-プロ（pre-pro）、プロ-タンパク質（pro-protein）配列）のような付加的なコード配列を含むが、これに限定されるものではなく、付加的なコード配列及び付加的な非コード配列、例えば、イントロンと非コード5'配列及び3'配列のような、転写されるが翻訳はされない、転写、mRNAプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含む）、リボソームの結合、及びmRNAの安定性の役割を果たすものを含んでも含まなくても良い。加えて、核酸分子は、例えば、精製を容易にするペプチドをコードするマーカー配列と融合されることもできる。
【０１１７】
単離核酸分子は、mRNAのようなRNAの形態、又はクローニングによって得られるかもしくは化学合成技術もしくはその組み合わせによって生成されるcDNA及びゲノムDNAを含む、DNAの形態をとり得る。核酸、特にDNAは、二本鎖、又は一本鎖であり得る。一本鎖の核酸は、コード鎖（センス鎖）、又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１１８】
本発明はさらに、本発明のペプチドの断片をコードする核酸分子と同様に、上記したような本発明のプロテアーゼタンパク質の明らかな変異体をコードする核酸分子を提供するものである。このような核酸分子は、対立遺伝子変異体（同一遺伝子座）、パラログ（異なる遺伝子座）、及びオルソログ（異なる生物）のように天然に発生するか、又は組換えDNA法もしくは化学合成によって生成され得る。このような非天然に発生する変異体は、核酸分子、細胞又は生物に適用される技術を含む突然変異誘発技術によって生成され得る。したがって、上述したように、変異体にはヌクレオチドの置換、欠失、反転、及び挿入が含まれうる。変異は、コード領域及び非コード領域のいずれか、又は両方で起こりうる。変異は、保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換の両方を生じることができる。
【０１１９】
本発明はさらに、図1及び図3に示される核酸分子の非コードの断片を提供するものである。好ましい非コードの断片としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、遺伝子調節配列、及び遺伝子終結配列が含まれるが、これに限定されるものではない。このような断片は、非相同性の遺伝子発現の制御、及び遺伝子調節物質の同定を行うためのスクリーニングの開発において有用である。プロモーターは、図3のゲノム配列における5'からATG開始部位において容易に同定される。
【０１２０】
断片は、12個又はそれ以上のヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含む。さらに、断片は少なくとも30個、40個、50個、100個、250個、又は500個のヌクレオチド長であり得る。断片の長さは使用目的に基づく。例えば断片は、ペプチドのエピトープ関連領域をコードすることができるか、又はDNAプローブ及びDNAプライマーとして有用である。このような断片は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のヌクレオチド配列を用いて単離することができる。標識されたプローブは、コード領域と対応する核酸を単離するため、cDNAライブラリー、ゲノムDNAライブラリー、又はmRNAのスクリーニングに用いることができる。さらに、プライマーは、遺伝子の特定領域をクローニングするためのPCR反応に用いることができる。
【０１２１】
プローブ/プライマーは一般的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約12個、20個、25個、40個、50個又はそれ以上の連続するヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列領域を含む。
【０１２２】
オルソログ、ホモログ、及び対立遺伝子変異体は、当技術分野において周知の方法を用いて同定することができる。ペプチドの項で述べたように、これらの変異体は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列の断片に対して、典型的には、60〜70％、70〜80％、80〜90％、より典型的には、少なくとも約90〜95％またはそれ以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、穏やかな条件からストリンジェントな条件の下で、図面に示されるヌクレオチド配列又はこの配列の断片に対してハイブリダイズが可能なものとして、容易に同定することができる。対立遺伝子変異体は、コードする遺伝子の遺伝子座で容易に決定されることができる。
【０１２３】
本明細書に用いられるように、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、互いに少なくとも60〜70％の相同性を有し、互いにハイブリダイズしたままである程度にハイブリダイズ及び洗浄が行われる条件を意味している。この条件は、互いに少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、又はそれ以上の配列相同性を有するような配列が、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件でありうる。このようなストリンジェントな条件は、当業者に周知であり、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley & Sons、N.Y. (1989)、6.3.1-6.3.6. に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイズ条件の1つの例では、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中、約45℃でハイブリダイズし、その後、0.2×SSC、0.1％ SDS中、50〜65℃で1回または複数回洗浄する。穏やかな、低ストリンジェントのハイブリダイズ条件の例は、当業者において周知である。
【０１２４】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学合成中間体、及び生物学的アッセイ法において有用である。核酸分子は、図2に示されているペプチドをコードする全長cDNA及びゲノムクローンを単離するため、ならびに図2に示すペプチドと同一又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルソログ等）に対応するcDNA及びゲノムクローンを単離するために、メッセンジャーRNA、転写/cDNA、及びゲノムDNAのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。本発明のプロテアーゼタンパク質をコードする遺伝子中に、3個の挿入/欠失（indel）を含む37個のSNPが同定され、それらは図3に示されている。
【０１２５】
プローブは、図面に示されている核酸分子の全長において、いかなる配列とも対応することができる。したがって、それは5'非コード領域、コード領域、及び3'非コード領域から誘導することができる。しかしながら、すでに述べたように、断片は、本発明以前に開示された断片を含むものとして見なされることはない。
【０１２６】
核酸分子はまた、核酸分子のいずれかの所与の領域を増幅するPCRのプライマーとしても有用であり、所望の長さ及び配列のアンチセンス分子の合成においても有用である。
【０１２７】
核酸分子はまた、組換えベクターの構築にも有用である。このようなベクターには、ペプチド配列の一部又は全部を発現する発現ベクターが含まれる。ベクターはまた、挿入ベクターも含み、これは例えば細胞ゲノム中のような他の核酸分子中に組み込まれ、遺伝子及び/又は遺伝子産物のインサイチュー発現を変化させるために用いられる。例えば、内因性コード配列では、1つまたは複数の特異的に導入された変異を含むコード領域の全部又は一部との相同組換えを経て置換され得る。
【０１２８】
核酸分子はまた、タンパク質の抗原部分を発現するためにも有用である。
【０１２９】
核酸分子はまた、インサイチューハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体位置を決定するためのプローブとしても有用である。図3で提示されたデータに示されているように、マップ位置はePCRにより第3染色体上に同定され、これは放射線ハイブリッドマッピングにより確認されている。
【０１３０】
核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子調節領域を含むベクターの製造にも有用である。
【０１３１】
核酸分子はまた、本明細書に記載される核酸分子から生成されるmRNAの全部又は一部と対応しているリボザイムの設計にも有用である。
【０１３２】
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現するベクターの製造にも有用である。
【０１３３】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現する宿主細胞の構築にも有用である。
【０１３４】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現する遺伝子導入動物の製造にも有用である。
【０１３５】
核酸分子はまた、核酸発現の存在、レベル、形態、及び分布を決定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。図1の実験データにより、本発明のプロテアーゼタンパク質は、バーチャル・ノーザンブロット解析により、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。したがって、このプローブは、細胞、組織及び生物中での特定の核酸分子の存在を検出するか、またはそのレベルを測定するために使用することができる。レベルが測定される核酸は、DNAまたはRNAでありうる。したがって、本明細書で述べられるペプチドに対応するプローブは、所与の細胞、組織及び生物における発現、ならびに/または遺伝子コピー数の評価に用いることができる。これらの使用は、正常値と比較して上昇または低下しているプロテアーゼタンパク質の発現を含む障害の診断に適当である。
【０１３６】
mRNAを検出するインビトロの技術には、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。DNAを検出するインビトロの技術には、サザンハイブリダイゼーション及びインサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１３７】
プローブは、例えばmRNAもしくはゲノムDNAなどの被験者由来の試料細胞中でプロテアーゼをコードする核酸のレベルを測定したり、又はプロテアーゼ遺伝子が変異しているかどうかを確認することにより、プロテアーゼタンパク質を発現する細胞もしくは組織を同定する診断試験キットの一部として使用することができる。図1の実験データにより、本発明のプロテアーゼタンパク質は、バーチャル・ノーザンブロット解析により、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。
【０１３８】
核酸発現アッセイ法は、プロテアーゼの核酸発現を調節する化合物を同定する薬物スクリーニングに有用である。
【０１３９】
したがって、本発明は、プロテアーゼ遺伝子の核酸発現に関連した障害、特にそれを発現する細胞及び組織においてプロテアーゼが媒介する生物学的過程及び病理学的過程に関連した障害の治療に使用可能な化合物を同定する方法を提供するものである。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。この方法は、典型的には、プロテアーゼ核酸の発現を調節する化合物の能力についてアッセイを行う工程、及び望ましくないプロテアーゼ核酸発現により特徴づけられる障害を治療するのに用いることができる化合物を同定する工程を含む。このアッセイ法は、細胞ベース系及び無細胞系において実施することができる。細胞ベースのアッセイ法には、天然にプロテアーゼ核酸を発現する細胞、又は特定の核酸配列を発現するために遺伝子操作された組換え細胞が含まれる。
【０１４０】
プロテアーゼ核酸発現のアッセイ法は、例えばmRNAレベルのような核酸レベル、又はシグナル経路に関連する副次化合物の直接的なアッセイ法と関連している。さらに、プロテアーゼタンパク質シグナル経路における応答性を上方調節又は下方調節する遺伝子の発現についてもアッセイされる。この態様において、これらの遺伝子調節領域は、ルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に機能的に結合することができる。
【０１４１】
したがって、プロテアーゼ遺伝子発現のモジュレータは、細胞と候補化合物とを接触させ、mRNAの発現を判定する方法により同定されうる。候補化合物の存在下でのプロテアーゼmRNAの発現レベルは、候補化合物非存在下でのプロテアーゼmRNAの発現レベルと比較される。この比較に基づいて、候補化合物は核酸発現のモジュレータとして同定され、例えば、異常核酸発現により特徴付けられる障害の治療に用いることができる。候補化合物存在下でのmRNAの発現が、非存在下のものと比較して統計的に有意に大きい場合、候補化合物は核酸発現の刺激因子として同定される。候補化合物存在下での核酸発現が、非存在下のものと比較して統計的に有意に小さい場合、候補化合物は核酸発現の阻害因子として同定される。
【０１４２】
本発明はさらに、プロテアーゼを発現する細胞及び組織においてプロテアーゼ核酸発現を調節する遺伝子モジュレータとしての薬物スクリーニングを経て同定された化合物を用い、標的として核酸を用いる治療方法を提供するものである。図1の実験データにより、本発明のプロテアーゼタンパク質は、バーチャル・ノーザンブロット解析により、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。調節は、上方調節（即ち、活性化もしくはアゴニゼーション）もしくは下方調節（抑制もしくはアンタゴニゼーション）の両者、又は核酸発現を含む。
【０１４３】
あるいは、薬物又は小分子がタンパク質を発現する細胞及び組織中でプロテアーゼ核酸発現を阻害するものである限り、プロテアーゼ核酸発現のモジュレータは、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイ法を用いて同定される小分子又は薬物であり得る。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。
【０１４４】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、プロテアーゼ遺伝子の発現又は活性に対する調節化合物の効果をモニターするのに有用である。したがって、遺伝子発現パターンは、化合物、特に患者の耐性を向上させる化合物を用いた治療における、継続的効果のバロメータとなり得る。遺伝子発現パターンはまた、化合物に対して影響を受けた細胞の生理的反応を示すマーカーとなり得る。したがって、このようなモニタリングにより、化合物の投与量の増加、又は患者が耐性を示さない代替化合物の投与を行うことができる。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレベルまで低下した場合には、化合物の投与をこれに比例して減少することができる。
【０１４５】
核酸分子はまた、プロテアーゼ核酸発現の質的変化、特に疾患に至る質的変化の診断アッセイ法にも有用である。核酸分子は、プロテアーゼ遺伝子及びmRNAのような遺伝子発現産物における突然変異の検出に用いることができる。核酸分子は、プロテアーゼ遺伝子において天然に発生した遺伝子突然変異を検出し、それによって、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。突然変異は、遺伝子中の1つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、付加、又は置換、反転もしくは転位のような染色体の再編成、異常メチル化パターンのようなゲノムDNAの修飾、又は増幅のような遺伝子コピー数の変化を含む。機能障害に関連するプロテアーゼ遺伝子の変異体の検出は、疾患がプロテアーゼタンパク質の過剰発現、過小発現、又は変化した発現の結果生じる場合に、疾患の活性又は感受性の診断ツールを提供するものである。
【０１４６】
プロテアーゼ遺伝子中に突然変異を有する個体は、種々の技術によって核酸レベルにおいて検出されうる。図3に、本発明のトランスポータータンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。SNPは、イントロン、ならびにORFの5'及び3'領域の37カ所の異なるヌクレオチド部位において同定された。このようなイントロン及びORFの外側のSNPは、制御/調節エレメントに影響を与える可能性がある。図3で提示されたデータに示されているように、マップ位置はePCRにより第3染色体上に同定され、これは放射線ハイブリッドマッピングにより確認されている。ゲノムDNAは直接分析してもよく、又は予めPCRを用いて増幅した後で分析してもよい。RNA又はcDNAも、同様に用いることができる。ある使用においては、突然変異の検出は、アンカーPCRもしくはRACE PCRのような、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号参照）、又は他のものとして、ライゲーション連鎖反応（LCR）（例えば、Landegranら、Science 241:1077-1080 (1988);およびNakazawaら、PNAS 91:360-364 (1994) 参照）において、プローブ/プライマーの使用に関連し、後者は遺伝子中の点突然変異の検出に特に有用である（Abravayaら、Nucleic Acids Res. 23:675-682 (1995)参照）。この方法には、患者から細胞試料を回収する工程；試料細胞から核酸（例えば、ゲノム、mRNA、又はその両方）を単離する工程；遺伝子（存在する場合）のハイブリダイズ及び増幅が起こる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズする1つ又は複数のプライマーと、核酸試料とを接触させる工程；ならびに増幅産物の存在の有無を検出するか、又は増幅産物のサイズを検出し、対照試料の長さと比較する工程を含む。欠失及び挿入は、増幅産物のサイズの変化を、正常な遺伝子型のものと比較することにより検出することができる。点突然変異は、増幅DNAと正常なRNA又はアンチセンスDNA配列とハイブリダイズすることによって同定することができる。
【０１４７】
あるいは、プロテアーゼ遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変化により、直接的に同定することができる。
【０１４８】
さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第5,498,531号）を、リボザイム開裂部位の発生又は滅少により、特定の変異の存在のスコア化に用いることができる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ法、又は融解温度の違いによって、不一致の配列から識別することができる。
【０１４９】
特定位置での配列変化はまた、RNase及びS1保護、又は化学開裂法のようなヌクレアーゼ保護アッセイ法によって評価することができる。さらに、変異プロテアーゼ遺伝子と野生型遺伝子との配列の相違は、直接DNA配列決定によって決定することができる。種々の自動化された配列決定手段は、診断アッセイ法（Naeve, C.W.、(1995) Biotechniques 19:448）の実施に有用することができ、これらには、質量分析による配列決定（例えば、国際公開公報第94/16101号; Cohenら、Adv. Chromatogr. 36:127-162 (1996);およびGriffinら、Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159 (1993) 参照）も含まれる。
【０１５０】
遺伝子中の突然変異を検出する他の方法には、RNA/RNA又はRNA/DNA二本鎖から不一致の塩基を検出するために使用される、開裂試薬から保護する方法（Myersら、Science 230:1242 (1985)）; Cottonら、PNAS 85:4397 (1988); Saleebaら、Meth. Enzymol. 217:286-295 (1992)）、変異体と野生型の核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Oritaら、PNAS 86:2766 (1989); Cottonら、Mutat. Res. 285:125-144 (1993);およびHayashiら、Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79 (1992)）、及び変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型の断片の動きを、変性勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法（Myersら、Nature 313:495 (1985)）が含まれる。点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【０１５１】
核酸分子は、治療方法としての効果を持つにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型のための個体試験においても有用である。このため、核酸分子は、個体の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個体の応答との相関（薬理遺伝学的相関）についての研究に用いることができる。したがって、本明細書に記載される核酸分子は、治療のための適切な化合物又は投与計画を選択するために、個体におけるプロテアーゼ遺伝子の変異含量の評価に用いることができる。
【０１５２】
このように、治療に影響する遺伝子変異を示す核酸分子は、個体における目的に適合させた治療に使用可能な診断標的を提供するものである。したがって、これらの多形性を含む組換え細胞及び組換え動物の製造は、治療化合物及び投与計画についての効果的な臨床設計を可能とする。
【０１５３】
したがって、核酸分子は、細胞、組織、及び生物におけるプロテアーゼ遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構築物として有用である。DNAアンチセンス核酸分子は、転写に関連する遺伝子領域に対して相補的になるよう設計され、それ故に、プロテアーゼタンパク質の転写及び産生が阻害される。アンチセンスRNA又はDNA核酸分子はmRNAとハイブリダイズし、これによりプロテアーゼタンパク質中へのmRNAの翻訳が妨害される。図3に、本発明のトランスポータータンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。SNPは、イントロン、ならびにORFの5'及び3'領域の37カ所の異なるヌクレオチド部位において同定された。このようなイントロン及びORFの外側のSNPは、制御/調節エレメントに影響を与える可能性がある。
【０１５４】
あるいは、あるクラスのアンチセンス分子は、プロテアーゼ核酸の発現を減少させるためのmRNAの不活性化に用いることができる。したがって、これらの分子は、異常又は望ましくないプロテアーゼ核酸の発現により特徴づけられる障害の治療に用いることができる。この技術は、mRNAの翻訳能力を減少させるような、mRNAの1つ又は複数の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むリボザイム手段による開裂に関連している。可能な領域としては、コード領域、特に、基質結合のようなプロテアーゼタンパク質の触媒活性及び他の機能活性に対応したコード領域を含む。
【０１５５】
核酸分子はまた、プロテアーゼ遺伝子発現において異常な細胞を持つ患者の遺伝子治療のためのベクターを提供するものである。エクスビボで操作され患者に戻される患者の細胞を含む組換え細胞は、個体の体内に導入され、個体細胞内で、個体の治療のために所望のプロテアーゼタンパク質を生産する。
【０１５６】
本発明は、生物試料中のプロテアーゼ核酸の存在を検出するためのキットも包含する。図1の実験データにより、本発明のプロテアーゼタンパク質は、バーチャル・ノーザンブロット解析により、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞における発現が示されている。加えて、PCRに基づく組織スクリーニングパネルにより、ヒト白血球における発現が示されている。例えば、キットは、標識された核酸もしくは標識可能な核酸、又は生物試料中でプロテアーゼ核酸を検出可能な物質を含む試薬；試料中のプロテアーゼ核酸量を決定する手段；及び試料中のプロテアーゼ核酸量と標準の量とを比較する手段を含むことができる。この化合物又は物質は適当な容器に封入することができる。このキットは、プロテアーゼタンパク質mRNA又はDNAの検出キットとして使用するための説明をさらに含むことができる。
【０１５７】
核酸アレイ
本発明はさらに、核酸検出キットを提供するものであり、これらは、例えば、図1及び図3（配列番号：1及び3）に示される配列情報に基づいた核酸分子のアレイ又はマイクロアレイである。
【０１５８】
本明細書に用いられる「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン又は他のタイプの膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体のような基板上で合成された異なるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのアレイを意味する。1つの態様において、マイクロアレイは、米国特許第5,837,832号、Cheeら、国際公開公報第95/11995号(Cheeら)、Lockhart, D. J.ら(1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680)、およびSchena, M.ら(1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619)に記載される方法にしたがって調製及び使用され、これらの全ては参照として本明細書に組み入れられる。他の態様において、このようなアレイは、Brownら、米国特許第5,807,522号に記載される方法により製造される。
【０１５９】
マイクロアレイ又は検出キットは、好ましくは、多数の特有の一本鎖核酸配列により構成され、通常は合成アンチセンスオリゴヌクレオチドか、又はcDNAの断片のいずれかが固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドは、好ましくは約6〜60個のヌクレオチド長、より好ましくは15〜30個のヌクレオチド長、最も好ましくは約20〜25個のヌクレオチド長である。あるタイプのマイクロアレイ又は検出キットのためには、7〜20個のみのヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドを使うことが好適であり得る。マイクロアレイ又は検出キットは、既知の5'配列又は3'配列を含むオリゴヌクレオチド、全長配列を含む連続的なオリゴヌクレオチド、又は配列の長さにおいて特定領域から選択された特有のオリゴヌクレオチドを含むものであり得る。マイクロアレイ又は検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子又は対象となる遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１６０】
マイクロアレイ又は検出キットのための既知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するために、対象となる遺伝子（又は本発明のコンティグから同定されたORF）は典型的にはコンピュータアルゴリズムを用いて試験され、ヌクレオチド配列の5'末端又は3'末端から開始される。典型的なアルゴリズムでは、遺伝子に特有である規定された長さのオリゴマーが同定され、ハイブリダイゼーションに好適な範囲のGC含量を持ち、ハイブリダイゼーションを妨害しうる予測される二次構造を持たない。ある条件では、マイクロアレイ又は検出キットにおいて、オリゴヌクレオチド対を用いることが好適であり得る。オリゴヌクレオチドの「対」は、好ましくは、配列の中央に位置する1つのヌクレオチドを除いて、同一である。第二の対のオリゴヌクレオチド（一方とは不一致）は対照として用いられる。オリゴヌクレオチド対の数は、2から100万の間でありうる。オリゴマーは、光誘導化学プロセスを用いて、基板上の指定領域で合成される。基板は、紙、ナイロン又は他のタイプの膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体である。
【０１６１】
他の観点において、オリゴヌクレオチドは、国際公開公報第95/251116号(Baldeschweilerら)に記載されるように、化学カップリング手段、及びインクジェットアプリケーション装置を用いて基板の表面上で合成され、これらの全ては参照として本明細書に組み入れられる。他の観点において、ドット（又はスロット）ブロットと類似した「グリッド」アレイでは、真空システム、加熱、UV、力学的又は化学的結合工程を用いて、cDNA断片、又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に配列し、結合させることができる。上記のようなアレイは、手工又は利用可能な装置（スロットブロット、又はドットブロット装置）、材料（任意の適当な固形支持体）、及び機械（ロボット装置を含む）を用いて製造され、8、24、96、384、1536、6144もしくはこれ以上、又は市販の装置に効果的に使用される2から100万の間の他の数のオリゴヌクレオチドを含んでもいても良い。
【０１６２】
マイクロアレイ又は検出キットを用いて試料の分析を行うために、生物試料から得られたRNA又はDNAは、ハイブリダイゼーションプローブに調製される。mRNAが単離され、cDNAが調製され、アンチセンスのRNA（aRNA）を調製するためのテンプレートとして用いられる。aRNAを蛍光性ヌクレオチドの存在下で増幅し、標識されたプローブをマイクロアレイ又は検出キットと共にインキュベートし、プローブの配列がマイクロアレイ又は検出キット中の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。インキュベーション条件は、正確に相補的に一致しているか、又は様々な程度のより低い相補性でハイブリダイゼーションが起こるように調節される。ハイブリダイズしていないプローブを除去した後、蛍光のレベルおよびパターンを判定するためにスキャナが用いられる。スキャンされた画像は、マイクロアレイ又は検出キット上の、相補性の程度及び各々のオリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的な量を決定するために試験される。生物試料は、任意の体液（例えば血、尿、唾液、痰、胃液など）、培養細胞、生検材料、又は他の組織調製物から得られる。検出システムでは、全ての異なる配列において、ハイブリダイゼーションの存在、非存在、及び量を、同時に測定するために用いられる。このデータは、試料間での、配列、発現パターン、変異、変異体、又は多形性といった、大規模な相関性の研究に用いられる。
【０１６３】
本発明は、このようなアレイを用いて、本発明のプロテアーゼタンパク質/ペプチドの発現を同定するための方法を提供するものである。詳細には、このような方法は、試験試料と1つ又は複数の核酸分子とをインキュベートする工程、及び試験試料中の構成要素と核酸分子との結合についてアッセイを行う工程を含む。このようなアッセイ法は、典型的には、遺伝子の少なくとも1つが本発明の遺伝子及び/又は本発明のプロテアーゼ遺伝子の対立遺伝子である、多くの遺伝子を含むアレイに関連している。図3に、本発明のトランスポータータンパク質をコードする遺伝子中に見出されたSNPについての情報が示される。SNPは、イントロン、ならびにORFの5'及び3'領域の37カ所の異なるヌクレオチド部位において同定された。このようなイントロン及びORFの外側のSNPは、制御/調節エレメントに影響を与える可能性がある。
【０１６４】
試験試料と核酸分子のインキュベーション条件は変化する。インキュベーション条件は、使用されるアッセイ法の形式、使用される検出方法、及びアッセイ法に使用される核酸分子のタイプ及び性質に依存する。当業者は、一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイ法の形式を認識していると思われ、これらは本明細書に開示されるヒトゲノムの新規断片を使用するために容易に適用することができる。このようなアッセイ法の例は、Chard, T、「放射標識免疫アッセイ法および関連する技術の概論（An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques）」、Elsevier Science Publishers、Amsterdam、The Netherlands (1986); Bullock, G. R. ら、「免疫細胞化学における技術（Techniques in Immunocytochemistry）」、Academic Press、Orlando, FL、第1巻(1982)、第2巻(1983)、第3巻(1985); Tijssen, P.、「酵素免疫アッセイ法の実践と理論：生化学および分子生物学の実験技術（Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）」、Elsevier Science Publishers、Amsterdam、The Netherlands (1985) に記載されている。
【０１６５】
本発明の試験試料は、細胞、タンパク質、又は細胞からの膜抽出物を含む。上記の方法に用いられる試験試料は、アッセイ法の形式、検出方法の性質、及びアッセイ法の試料として用いられる組織、細胞、又はその抽出物に基づいて変化する。核酸抽出物又は細胞抽出物の調製方法は当技術分野において周知であり、使用されるシステムと適合する試料を得られるように、容易に適用させることができる。
【０１６６】
本発明の他の態様としては、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０１６７】
特に、本発明は、（a）本明細書に開示されるヒトゲノムの断片と結合可能な核酸分子を含む第一の容器と、（b）1つまたは複数の洗浄試薬、結合核酸の存在を検出可能な試薬を含む、1つまたは複数の他の容器とを含む、1つまたは複数の容器に閉鎖的に封入され、区分されたキットを提供するものである。
【０１６８】
詳細には、区分されたキットには、試薬が別々の容器に含まれている任意のキットを含む。このような容器としては、小さいガラスの容器、プラスチック容器、帯状のプラスチック、ガラスもしくは紙、又は二酸化ケイ素のようなアレイ材料を含む。このような容器は、試料と試薬が交叉汚染しないように、1つの区分から他の区分へと試薬を効率的に移動させることができ、それぞれの容器の試薬又は溶液は、1つの区分から他の区分へと定量的に添加されることができる。このような容器には、試験試料を入れる容器、核酸プローブを含む容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝食塩水、トリス緩衝液等）を含む容器、及び結合プローブの検出に用いられる試薬を含む容器を含むと考えられる。当業者は、本発明にかかる従来より未知のプロテアーゼ遺伝子を認識し、本明細書に開示される配列情報を用いて日常的に同定することができ、さらにこれを当技術分野において周知の確立されたキット形式、特に発現アレイに容易に組み込むことができる。
【０１６９】
ベクター/宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載される核酸分子を含むベクターを提供するものである。「ベクター」という用語は、ビヒクルのことを言い、好ましくは核酸分子であり、核酸分子を輸送することができるものである。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの観点では、ベクターは、プラスミド、一本鎖もしくは二本鎖のファージ、一本鎖もしくは二本鎖のDNAもしくはRNAウイルスベクター、又はBAC、PAC、YACもしくはMACのような人工染色体を含む。
【０１７０】
ベクターは宿主細胞中に染色体外の要素として保持されてもよく、そこで核酸分子の付加的なコピーを複製及び生成する。あるいは、ベクターは宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよく、宿主細胞の複製の際に核酸分子の付加的なコピーを生成する。
【０１７１】
本発明は、核酸分子の維持のためのベクター（クローニングベクター）、又は核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供するものである。このベクターは、原核生物細胞もしくは真核生物細胞、又はその両方で機能することができる（シヤトルベクター）。
【０１７２】
発現ベクターは、ベクター中で核酸分子と機能的に結合されたシス作用性調節領域を含み、これにより宿主細胞中での核酸分子の転写が可能となる。この核酸分子は転写に影響を及ぼしうる核酸分子と別々に、宿主細胞に導入されることができる。したがって、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を可能にするシス調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供するものである。あるいは、トランス作用性因子は宿主細胞により提供されてもよい。最終的に、トランス作用性因子は、ベクター自身から作り出すことができる。しかし、いくつかの態様では、核酸分子の転写及び/又は翻訳は無細胞系でも起こり得ることが理解される。
【０１７３】
本明細書に記載される核酸分子が機能的に結合できる調節配列は、mRNA転写を誘導するためのプロモーターを含む。これらには、パクテリオファージλからの左部プロモーター、大腸菌（E. coli）から得られたlac、TRP、及びTACプロモーター、SV40から得られた初期及び後期プロモーター、CMV極初期プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、ならびにレトロウイルスの末端反復配列が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１７４】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部位及びエンハンサーのような転写を調節する領域を含むものであり得る。この例としては、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの極初期のエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、及びレトロウイルスLTRエンハンサーが含まれる。
【０１７５】
転写の開始及び制御部位に加えて、発現ベクターはまた、転写終了のために必要な配列、及び転写領域における転写のためのリボソーム結合部位を含むことができる。他の発現調節制御要素としては、ポリアデニル化シグナルと同様に、開始及び終止コドンが含まれる。当業者には、発現ベクターに有用な多数の調節配列が既知であると思われる。このような調節配列は、例えば、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、(1989) に記載されている。
【０１７６】
各種発現ベクターは、核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターには、染色体、エピソーム、及びウイルス由来のベクターが含まれ、これらは例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工酵母染色体を含む酵母染色体要素、バキュロウイルス、SV40のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及びレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターである。ベクターはまた、これらの起源の組み合わせから得ることができ、例えば、コスミドとファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝子要素から得ることができる。原核及び真核生物の宿主細胞のための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、(1989) に記載されている。
【０１７７】
調節配列は、1つもしくは複数の宿主細胞の構成的な発現（すなわち組織特異性）又は、温度、養分添加、又はホルモンもしくは他のリガンドのような外因性因子による1つもしくは複数の細胞タイプでの誘導性の発現を提供するものである。原核及び真核生物の宿主細胞において構成的及び誘導的に発現する種々のベクターは、当業者に周知である。
【０１７８】
核酸分子を、周知の方法によってベクター核酸内に導入することができる。一般に、最終的に発現するDNA配列は、1つ又は複数の制限酵素によりDNA配列と発現ベクターとが開裂し、断片が互いにライゲーションすることによって、発現べクターと結合される。制限酵素の消化及びライゲーションの手順は、当業者に周知である。
【０１７９】
適切な核酸分子を含むベクターは、公知の技術を用いて、増殖又は発現のために適切な宿主細胞内へ導入することができる。細菌細胞には、大腸菌、放線菌（Streptomyces）、及びネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）が含まれるが、これに限定されるものではない。真核生物細胞には、酵母、ショウジョウバエ（Drosophila）のような昆虫細胞、COS及びCHO細胞のような動物細胞、ならびに植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８０】
本明細書に記載のように、融合タンパク質としてのペプチドの発現が望ましいと考えられる。したがって、本発明はペプチドの生産を可能にする融合ベクターを提供するものである。融合ベクターは組換えタンパク質の発現及び組換えタンパク質の溶解性を向上させることができ、また、例えば、アフィニティ精製のためのリガンドの作用によってタンパク質精製を促進することができる。タンパク質分解性開裂部位は、融合部分との結合位置に導入され、このために、所望のペプチドを最終的に融合部分から分離することができる。タンパク質分解酵素としては、ファクターXa、トロンビン、及びエンテロプロテアーゼを含むが、これに限定されるものではない。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、又はタンパク質Aのそれぞれを、標的組換えタンパク質に融合した、pGEX (Smithら、Gene 67:31-40 (1988))、pMAL (New England Biolabs、Beverly、MA)、およびpRIT5 (Pharmacia、Piscataway、NJ) が含まれるが、これに限定されるものではない。好適な誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例としては、pTrc (Amannら、Gene 69:301-315 (1988))、およびpET 11d (Studierら、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology）」、185:60-89 (1990))が含まれる。
【０１８１】
組換えタンパク質の発現は、宿主細胞において、組換えタンパク質のタンパク質分解性の開裂欠損能力を持つ遺伝的背景を提供することによって、宿主細菌において最大化することができる (Gottesman, S.、「遺伝子発現技術：酵素学における方法（Gene Expression Technology: Methods in Enzymology）」、185、Academic Press、San Diego、California (1990) 119-128)。あるいは、対象となる核酸分子の配列は、例えば、大腸菌のような特定の宿主細胞のために優先的に使用されるコドンとなるように変更されることができる (Wadaら、Nucleic Acids Res. 20:2111-2118 (1992))。
【０１８２】
核酸分子はまた、酵母において作用する発現ベクターにより発現されることもできる。S.セレビシエ（S. cerevisiae）のような酵母中で発現するベクターの例としては、pYepSec1 (Baldariら、EMBO J. 6:229-234 (1987))、pMFa (Kurjanら、Cell 30:933-943(1982))、pJRY88 (Schultzら、Gene 54:113-123 (1987))、およびpYES2 (Invitrogen Corporation、San Diego、CA) を含む。
【０１８３】
核酸分子はまた、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内で発現されることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）中のタンパク質の発現に利用されるバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ (Smithら、Mol. Cell Biol. 3:2156-2165 (1983)) およびpVLシリーズ (Lucklowら、Virology 170:31-39 (1989))を含む。
【０１８４】
本発明のある態様においては、本明細書に記載される核酸分子は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、pCDM8 (Seed, B. Nature 329:840(1987))およびpMT2PC (Kaufmanら、EMBO J. 6:187-195 (1987)) を含む。
【０１８５】
本明細書に列記されている発現ベクターとしては、核酸分子を発現するために有用であり、当業者が利用可能な周知のベクターのみが例示されている。本明細書に記載される核酸分子の維持増殖又は発現において、好適な他のベクターは、当業者に周知であると思われる。これらは、例えば、Sambrook, J.、Fritsh, E. F.,およびManiatis, T.、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:  A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されている。
【０１８６】
本発明はまた、本明細書に記載される核酸配列がベクター中に逆方向にクローニングされたベクターを含むものであり、このベクターは、アンチセンスRNAの転写を可能にする調節配列と機能的に結合される。このように、アンチセンス転写は、コード領域及び非コード領域の両方が含まれ、本明細書に記載される核酸分子配列の全部又は一部を生産することができる。このアンチセンスRNAの発現は、センスRNAの発現（調節配列、構成的又は誘導性の発現、組織特異的発現）に関して、前記した各パラメータに対応する。
【０１８７】
本発明はまた、本明細書に記載されるベクターを含む組換え宿主細胞に関連するものである。したがって、宿主細胞は、原核生物細胞、酵母のような下等真核生物細胞、昆虫細胞のような他の真核生物細胞、及び哺乳類細胞のような高等真核生物細胞を含む。
【０１８８】
組換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な技術により、本明細書に記載されるベクター構築物を細胞中に導入することにより調製することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクション、リポフェクション、及びSambrookら、(「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989) に記載されるような他の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８９】
宿主細胞は、1つ又は複数のベクターを含むことができる。このため、異なるヌクレオチド配列が、同じ細胞の異なるベクター中に導入されることができる。同様に、核酸分子は、単独で、又は発現ベクターのトランス作用性因子を提供しているような関連のない他の核酸分子と共に導入されることができる。1つまたは複数のベクターが細胞内に導入される場合、ベクターは単独で導入されるか、共に導入されるか、又は核酸分子ベクターに結合して導入されることができる。
【０１９０】
バクテリオファージ及びウイルスベクターの場合、これらはインフェクション及びトランスダクションの標準的な操作により、封入又はカプセル化されたウイルスとして細胞内に導入されることができる。ウイルスベクターは、複製可能、又は複製欠陥であり得る。ウイルスの複製に欠陥がある場合、複製は欠陥を相補する機能が提供される宿主細胞内で起こり得る。
【０１９１】
ベクターは一般に、組換えベクターの構築物を含む細胞の部分母集団の選択を可能とする選択マーカーを含む。このマーカーは、本明細書に記載される核酸分子を含む同一のベクター内か、又は別のベクター中に含まれることができる。マーカーは、原核生物宿主細胞のためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子、及び真核生物宿主細胞のためのジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性を含む。しかしながら、表現型特性の選択性を提供するマーカーはいずれも有効であると考えられる。
【０１９２】
成熟タンパク質は、適切な調節配列の制御下で、細菌、酵母、哺乳類細胞、及び他の細胞で生産されることができるが、無細胞転写系及び翻訳系もまた、本明細書に記載されるDNA構築物に由来のRNAを用い、これらのタンパク質を生産するために用いることができる。
【０１９３】
ペプチドの分泌が必要とされる場合、プロテアーゼのようなタンパク質を含む複数回膜貫通ドメインで達成することは困難であり、適切な分泌シグナルがベクター中に組み込まれる。シグナル配列は、これらのペプチドに対して内因性であるか、又はペプチドに対して非相同性であり得る。
【０１９４】
ペプチドが培地中に分泌されない場合、典型的にはプロテアーゼの場合、タンパク質を、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、分解物質の使用等を含む標準的な破壊操作によって、宿主細胞から単離することができる。ペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、又は陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む、公知の精製方法によって、回収及び精製されることができる。
【０１９５】
また、本明細書に記載されるペプチドの組換え産生においては宿主細胞に依存しており、ペプチドは細胞に依存して種々のグリコシル化パターンを持ち、細菌内で産生される場合にはグリコシル化されないであろうことが理解される。さらに、ペプチドは、宿主を媒介する過程の結果として、いくつかの場合で最初に修飾されたメチオニンを含むものであり得る。
【０１９６】
ベクター及び宿主細胞の使用
本明細書に記載されるペプチドを発現する組換え宿主細胞には、種々の用途がある。まず、この細胞は、所望の量のプロテアーゼタンパク質又は断片を生産するため、さらに精製を行うことのできるプロテアーゼタンパク質又はペプチドの生産に有用である。このため、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチドの生産に有用である。
【０１９７】
宿主細胞はまた、プロテアーゼタンパク質又はプロテアーゼタンパク質断片に関連している細胞ベースのアッセイ法、例えば上記したもの及び当技術分野に周知の他の形態のものの実施において有用である。このため、天然のプロテアーゼタンパク質を発現する組換え宿主細胞は、プロテアーゼタンパク質機能を刺激又は阻害する化合物のアッセイに有用である。
【０１９８】
宿主細胞はまた、機能が影響を受けるプロテアーゼタンパク質変異体を同定するために有用である。変異が天然に生じ病理を引き起こすような場合、突然変異を含む宿主細胞は、天然のプロテアーゼタンパク質の効果を示さずに、プロテアーゼタンパク質変異体に望ましい効果（例えば、機能を刺激又は阻害）を持つ化合物のアッセイに有用である。
【０１９９】
遺伝的に操作された宿主細胞は、さらにヒト以外のトランスジェニック動物を生産するために用いることができる。遺伝子組換え動物は、好ましくは哺乳類であり、例えば、この動物の1つ又は複数の細胞が導入遺伝子を含むラット又はマウスのような齧歯類動物である。導入遺伝子は発達中のトランスジェニック動物の細胞のゲノムに組み込まれ、1つ又は複数の細胞型又は組織において、成熟した動物のゲノム中に残存する外因性のDNAである。これらの動物は、プロテアーゼタンパク質の機能の研究、ならびにプロテアーゼタンパク質活性のモジュレータの同定及び評価に有用である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、及び両生類が含まれる。
【０２００】
トランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核内に核酸を導入し、卵母細胞を偽妊娠性の雌性育成動物中で発達させることにより作製される。任意のプロテアーゼタンパク質ヌクレオチド配列を、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。
【０２０１】
発現ベクターに有用な調節配列又は他の配列は、いずれも導入遺伝子配列の一部分を形成することができる。これには、既に含まれない場合、イントロン配列及びポリアデニル化シグナルが含まれる。組織特異性調節配列は、特定の細胞に対しプロテアーゼタンパク質が直接発現するために、導入遺伝子に機能的に結合されることができる。
【０２０２】
胚操作及びマイクロインジェクションを通して、トランスジェニック動物を生産する方法、特にマウスのような動物を用いる方法は、当技術分野において一般化されており、例えば、Lederらの米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号、Wagnerらの米国特許第4,873,191号、およびHogan, B.、「マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986) に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の生産のために用いられている。トランスジェニック創始動物を、ゲノム中の導入遺伝子の存在及び/又は動物の組織もしくは細胞内でのトランスジェニックmRNAの発現に基づいて確認することができる。その後、トランスジェニック創始動物を、さらに導入遺伝子を有する動物を繋殖させるために用いることができる。さらに、導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を、さらに他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物と交配することができる。トランスジェニック動物はまた、動物全体又は動物の組織が本明細書に記載される相同的な組換え宿主細胞を用いて作製された動物を含む。
【０２０３】
他の態様では、ヒト以外のトランスジェニック動物は、導入遺伝子の調節された発現を行う選択システムを含むものとして生産されることができる。このようなシステムの1つの例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼシステムである。cre/loxPリコンビナーゼシステムについての記載は、例えば、Laksoら、 PNAS 89:6232-6236 (1992) 参照。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、S.セレビシエのFLPリコンビナーゼシステムである (O'Gormanら、Science 251:1351-1355 (1991)。cre/loxPリコンビナーゼシステムが導入遺伝子の発現の調節に用いられる場合は、動物において、creリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質の両者をコードする導入遺伝子が含まれていることが必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を持ち、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を持った2つのトランスジェニック動物を交配させることにより、「二重」トランスジェニック動物を作製することによって提供される。
【０２０４】
本明細書に記載されるヒト以外の遺伝子組換え動物のクローンはまた、Wilmut, I.ら、Nature 385:810-813 (1997)および国際公開公報第97/07668号および国際公開公報第97/07669号に記載される方法に従って生産されることができる。簡単に述べると、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、増殖周期から出てG0期に入るように誘導することができる。静止細胞を、例えば電気パルスの使用によって、静止細胞を単離した動物と同種の動物の除核した卵母細胞と融合することができる。再構成された卵母細胞は、桑実胚又は胚盤胞に発達するよう培養され、その後、偽妊娠性の雌性育成動物中に移される。この雌性育成動物から誕生する子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンとなる。
【０２０５】
本明細書に記載されるペプチドを発現する組換え細胞を含むトランスジェニック動物は、インビボの環境で、本明細書に記載したようなアッセイを行うために有用である。したがって、インビボに存在し、基質結合、プロテアーゼタンパク質活性/活性化、シグナル伝達に影響を与えうる各種の生理学的因子は、インビトロの無細胞又は細胞ベースのアッセイ法では明らかにならない可能性がある。したがって、これらは、基質相互作用、プロテアーゼタンパク質機能及び基質相互作用に対する特定の変異体プロテアーゼタンパク質の影響、ならびにキメラプロテアーゼタンパク質の影響を含むプロテアーゼタンパク質機能を、インビボでアッセイするための、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供するために有用である。また、実質的に又は完全に1つ又は複数のプロテアーゼタンパク質機能を除去する突然変異である、ヌル変異の影響を評価することも可能である。
【０２０６】
本明細書において、上記の全ての刊行物及び特許は参照として本明細書に組み入れられる。本発明に記載された方法及びシステムの各種修正及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱しない限り、当業者において明らかなものであると思われる。本発明は、特定の好ましい態様に関連して記述されているが、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の態様に不当に限定されないと理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための上記方法の各種変形は、分子生物学又は関連する分野の業者において明らかであり、このようなものも特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】本発明のプロテアーゼタンパク質をコードするcDNA分子のヌクレオチド配列を示す（配列番号：1）。さらに、ATG開始、終結、及び組織分布のような構造及び機能情報が利用可能に提供され、この分子配列に基づく本発明の特定用途を容易に決定することが可能となる。図1の実験データにより、肺、結腸、卵巣腺癌、子宮内膜、バーキットリンパ腫、樹状細胞、及びヒト白血球における発現が示されている。
【図２】本発明のプロテアーゼの推定アミノ酸配列を示す（配列番号：2）。さらに、タンパク質ファミリー、機能、及び修飾部位のような構造及び機能情報が利用可能に提供され、この分子配列に基づく本発明の特定用途を容易に決定することが可能となる。
【図３】本発明のプロテアーゼタンパク質をコードする遺伝子のゲノム配列を示す（配列番号：3）。さらに、イントロン/エクソン構造、プロモーター位置などのような構造及び機能情報が利用可能に提供され、この分子配列に基づく本発明の特定用途を容易に決定することが可能となる。本発明により提供されるプロテアーゼタンパク質をコードする遺伝子中に、3つの挿入/欠失を含む37個のSNPが同定され、それらは図3に示されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2005502308.tif 000007
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502308.tif 000100
2005502308.tif 000101
【国際調査報告】
2005502308.tif 000102
2005502308.tif 000103
2005502308.tif 000104
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2005502308.tif 000106
2005502308.tif 000107