(57)【要約】  高い変異率を示すウイルス病原体（例えば、ＨＩＶ−１）の予防および処置のために意図されるワクチンの調製において特に有用な合成ペプチドおよびそのアミノ酸配列を形成する方法が、開示される。このようなウイルス病原の高い変異率は、ウイルスタンパク質配列の直鎖配列（例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０の可変直鎖配列）の極端な変動を生じる。高度に可変のウイルスに対する広いスペクトル範囲および／または交差クラッド範囲を有効にしそして提供するために、ワクチンは、ウイルスのような全ての感染性株の共通の特徴を標的化しなければならない。これらの機能の共通の特徴は、宿主細胞結合および感染性に対して必須のタンパク質の３次元形態にある。開示されたペプチドおよびそれを構成するための方法は、ウイルス病原体のために必要であってかつ要求される構造エピトープを規定するウイルスタンパク質の保存された残基の３次元的関係に由来する。
2005511704.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超可変ウイルス病原体の診断および処置において有効な表面シミュレーション合成ペプチドを形成する方法であって、該方法は、以下：
アミノ酸配列を有するウイルス病原体に必要であってかつ要求される該被検体病原体ウイルスのタンパク質を選択する工程；
該タンパク質の該アミノ酸配列内に、ウイルス病原性に要求される非連続的保存残基を同定する工程；
該タンパク質を天然の結合部位と複合体化する工程；
該タンパク質を画像スキャンに供し、該保存残基の各々に関して３次元関係データおよび空間的関係データを得、かつ記録する工程；
該画像スキャンによって得られた該３次元画像データを、タンパク質分析ソフトウェアによってコンピューター分析に供し、その機能的マップを得る工程；
該分析ソフトウェアプログラムによって、該ウイルスタンパク質内の該非連続的保存残基の各々について、３次元位置およびこれらの間の空間的関係を決定する工程；
相対的３次元近接度に関して、選択された保存非連続的残基の該同定された３次元関係に対応し、かつ近似するように配列されたアミノ酸配列を有する表面シミュレーション合成ペプチドに対する配列を設計する工程；
表面シミュレーション合成ペプチドを調製する工程であって、該ペプチドのアミノ酸配列が、ウイルス病原性に必要であってかつ要求される該保存残基の該同定された３次元的空間関係に対応するように配列される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記選択されたウイルスタンパク質が、ウイルス感染性に必要である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択されたウイルスタンパク質成分が、ウイルス結合に必要である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記画像スキャンが、Ｘ線結晶構造解析によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記同定された非連続的保存残基が、前記ウイルス感染性を提供するために要求される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記同定された保存残基が、前記ウイルス結合を提供するために必要である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記同定された非連続的保存残基が、ウイルス病原性に必要であって、かつ要求される３次元ウイルスタンパク質形態を、前記ウイルスタンパク質に提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記表面合成シミュレーションペプチドが、縦列に、鏡像に、および縦列反復配列に配列される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コンピューター検索エンジンを使用し、前記設計された表面シミュレーション合成ペプチドを、ヒト遺伝子データベース、ヒトタンパク質データベースおよびヒトペプチドデータベースと比較し、このようなデータベースにおけるペプチドと相同なアミノ酸配列を有する任意のこのような合成ペプチドを同定し、削除する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記表面シミュレーション合成ペプチドを、その抗原性、ハイドロパシー、接近性および可撓性について、タンパク質分析ソフトウェアを使用して、分析し評価する工程、ならびに、その後、該ソフトウェア分析の結果に従って、該表面シミュレーション合成ペプチドの配列を改変し、その抗原性および接近性を最適化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記表面シミュレーション合成ペプチドを、その抗原性、ハイドロパシー、接近性および可撓性について、タンパク質分析ソフトウェアを使用して、分析し評価する工程、ならびに、その後、該ソフトウェア分析の結果に従って、該表面シミュレーション合成ペプチドの配列を改変し、その抗原性および接近性を最適化する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記超可変ウイルス病原体が、ＨＩＶ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択されたタンパク質が、ｇｐ１２０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非連続的保存残基が、Ｔｈｒ２５７、Ａｓｐ３６８、Ｇｌｕ３７０、Ｔｒｐ４２７、Ａｓｐ４５７、Ａｒｇ４１９、Ｌｙｓ４２１、Ｇｌｎ４２２、Ａｓｎ２６２、Ｍｅｔ４３４、Ｃｙｓ３８５、Ｃｙｓ４１８、Ｃｙｓ３３１、Ｃｙｓ２９６およびＣｙｓ４１８を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面シミュレーション合成ペプチドが、前記非連続的保存アミノ酸配列の、縦列、鏡像、および縦列反復配列を組込むように設計される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
超可変ウイルス病原体の診断および処置において有効な表面シミュレーション合成ペプチドを構成するための方法であって、該方法は、以下：
アミノ酸配列を有するウイルス病原性に必要であってかつ要求される該被検体病原性ウイルスのタンパク質を選択する工程；
該タンパク質の該アミノ酸配列内に、ウイルス病原性に要求される非連続的保存残基を同定する工程；
該タンパク質を天然の結合部位と複合体化する工程；
該タンパク質を画像スキャンに供し、該保存残基の各々に関して３次元関係データおよび空間的関係データを得、かつ記録する工程；
該画像スキャンによって得られた該３次元画像データを、タンパク質分析ソフトウェアによってコンピューター分析に供し、その機能的マップを得る工程；
該分析ソフトウェアプログラムによって、該ウイルスタンパク質内の該非連続的保存残基の各々について、３次元位置およびこれらの間の空間的関係を決定する工程；
相対的３次元近接度に関して、選択された保存非連続的残基の該同定された３次元関係に対応し、かつ近似するように配列されたアミノ酸配列を有する表面シミュレーション合成ペプチドに対する配列を設計する工程；
コンピューター検索エンジンを使用し、該設計された表面シミュレーション合成ペプチドを、ヒト遺伝子データベース、ヒトタンパク質データベースおよびヒトペプチドデータベースと比較し、このようなデータベースにおけるペプチドと相同なアミノ酸配列を有する任意のこのような合成ペプチドを同定し、削除する工程；
さらに、該表面シミュレーション合成ペプチドを、その抗原性、ハイドロパシー、接近性および可撓性について、タンパク質分析ソフトウェアを使用して、分析し評価する工程；
該ソフトウェア分析の結果に従って、該表面シミュレーション合成ペプチドの配列を改変し、その抗原性および接近性を最適化する工程；
表面シミュレーション合成ペプチドを調製する工程であって、該ペプチドのアミノ酸配列が、ウイルス病原性に必要であって、かつ要求される該保存残基の該同定された３次元的空間関係に対応するように配列され、そして、該ペプチドのアミノ酸配列が、最適化された抗原性および接近性を提供するようにさらに精密化される、工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記選択されたウイルスタンパク質が、ウイルス感染性に必要である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記選択されたウイルスタンパク質成分が、ウイルス結合に必要である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記画像スキャンが、Ｘ線結晶構造解析によって得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記同定された非連続的保存残基が、前記ウイルス感染性を提供するために要求される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記同定された保存残基が、前記ウイルス結合を提供するために必要である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記同定された非連続的保存残基が、ウイルス病原性に必要であって、かつ要求される３次元ウイルスタンパク質形態を、前記ウイルスタンパク質に提供する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記表面合成シミュレーションペプチドが、縦列に、鏡像に、および縦列反復配列に配列される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記超可変ウイルス病原体が、ＨＩＶ−１である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択されたタンパク質が、ｇｐ１２０である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記非連続的保存残基が、Ｔｈｒ２５７、Ａｓｐ３６８、Ｇｌｕ３７０、Ｔｒｐ４２７、Ａｓｐ４５７、Ａｒｇ４１９、Ｌｙｓ４２１、Ｇｌｎ４２２、Ａｓｎ２６２、Ｍｅｔ４３４、Ｃｙｓ３８５、Ｃｙｓ４１８、Ｃｙｓ３３１、Ｃｙｓ２９６およびＣｙｓ４１８を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記表面シミュレーション合成ペプチドが、前記非連続的保存アミノ酸配列の、縦列、鏡像、および縦列反復配列を組込むように設計される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ウイルス病原性に要求され、かつ必要であるＨＩＶ−１糖タンパク質ｇｐ１２０の非連続的保存残基エピトープに対応する少なくとも１つのアミノ酸配列を有する、表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項２９】
前記ＨＩＶ−１の非連続的保存残基エピトープがＣＤ４の結合に要求され、かつ必要である、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３０】
前記ＨＩＶ−１の非連続的保存残基エピトープがＣＣ−ＣＫＲ５結合に要求され、かつ必要である、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３１】
前記ＨＩＶ−１の非連続的保存残基エピトープが感染力に要求され、かつ必要である請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３２】
ＨＩＶ−１の宿主ＣＤ４＋Ｔ細胞内への結合および侵入に必要であり、かつ要求されるｇｐ１２０の３次元コンフォメーションを維持するために、前記ＨＩＶ−１の非連続的保存残基エピトープが、要求され、かつ必要である、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３３】
前記ペプチドが、配列ＤＷＥＴＣＮＮＣＲＫＥＤＷ（配列番号１）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３４】
前記ペプチドが、配列ＮＣＲＫＥＤＷＤＥＫＲＣＮ（配列番号２）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３５】
前記ペプチドが、配列ＤＷＥＴＣＮＣＴＥＷＤ（配列番号３）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３６】
前記ペプチドが、配列ＷＤＥＴＣＮＣＴＥＤＷＤＥＴＣＮ（配列番号４）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３７】
前記ペプチドが、配列ＮＣＲＴＥＫＱＷＱＫＥＴＲＣＮ（配列番号５）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３８】
前記ペプチドが、配列ＱＷＫＥＲＴＣＮ（配列番号６）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項３９】
前記ペプチドが、配列ＱＫＷＥＴＣＣＲＫＷ（配列番号７）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドが、配列ＱＫＷＤＥＴＣＣＲＫＷ（配列番号８）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４１】
前記ペプチドが、配列ＤＷＥＴＣＮ（配列番号９）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４２】
前記ペプチドが、配列ＤＷＥＴＣＣＲＫＱＷＫ（配列番号１０）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４３】
前記ペプチドが、配列ＱＫＲＣＣＴＥＤＷ（配列番号１１）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４４】
前記ペプチドが、配列ＱＫＲＣＣＮＴＥＤＷＩＩＭＱ（配列番号１２）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４５】
前記ペプチドが、配列ＱＫＲＣＣＴＥＤ（配列番号１３）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４６】
前記ペプチドが、配列ＤＷＥＫＲＣＣＮＴＥＤＷＫ（配列番号１４）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４７】
前記ペプチドが、配列ＱＫＲＣＣＴＥＤ（配列番号１５）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４８】
前記ペプチドが、配列ＷＱＫＲＣＣＴＥＤＷ（配列番号１６）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項４９】
前記ペプチドが、配列ＫＷＥＴＣＣＲＫ（配列番号１７）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５０】
前記ペプチドが、配列ＫＷＥＴＣＣＲＫＱ（配列番号１８）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５１】
前記ペプチドが、配列ＴＮＣＣＲＫＥＴ（配列番号１９）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５２】
前記ペプチドが、配列ＤＷＥＴＮＣＣＲＫＱＷＫ（配列番号２０）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５３】
前記ペプチドが、配列ＩＷＤＥＴＮＣＣＲＫＱＩＷＫ（配列番号２１）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５４】
前記ペプチドが、配列ＩＷＤＥＴＮＣＣＲＫＱＮＩＷＫ（配列番号２２）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５５】
前記ペプチドが、配列ＬＰＣＲＫＱＭＩＷ（配列番号２３）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５６】
前記ペプチドが、配列ＬＰＣＲＫＱＭＩＷＤＷＥＴＮＣ（配列番号２４）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５７】
前記ペプチドが、配列ＬＰＣＲＩＫＱＭＩＷ（配列番号２５）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５８】
前記ペプチドが、配列ＬＰＣＲＩＫＱＭＩＷＤＷＥＴＮＣ（配列番号２６）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項５９】
前記ペプチドが、配列ＬＰＣＲＫＱＷＤＷＥＴＣＮＣ（配列番号２７）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項６０】
前記ペプチドが、配列ＬＰＣＣＴＥＷＤ（配列番号２８）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項６１】
前記ペプチドが、配列ＬＰＣＣＴＥＷＫＲ（配列番号２９）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項６２】
前記ペプチドが、配列ＬＰＣＣＣＣＲＫ（配列番号３０）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項６３】
前記ペプチドが、配列ＣＣＣＣＲＫＷＥＴＣＣＣＣＮ（配列番号３１）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項６４】
前記ペプチドが、配列ＣＣＣＣＲＫＱＷＫＥＴＣＣＣＣＮ（配列番号３２）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項６５】
前記ペプチドが、配列ＣＣＣＣＴＥＤＷＫＱＲＣＣＣＣＰＮ（配列番号３３）から構成される、請求項２８に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【請求項６６】
前記ペプチドが縦列、鏡像、および縦列反復配列に配置される、請求項３３〜６５に記載の表面シミュレーション合成ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫およびペプチド合成の分野に関連する。より具体的には、この開示された発明は、ウイルス病原性にとって必要な、非連続的保存性残基の３次元空間配置をシミュレートする、アミノ酸配列を組み込む表面シミュレーション合成ペプチドを設計および配置のための方法に関する。開示された表面シミュレーション合成ペプチドは、超可変ウイルス病原体（例えばＨＩＶ−１）に対する効果的な有効な広スペクトル免疫応答を誘起するのに有効なワクチンへの取り込み、ならびにそれらの診断キットにとって特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
この免疫系は、天然の物理的障壁の保護を乗り越えて透過する外来性抗原性物質の同定および破壊／除去を介して一般的に機能する部分系の複雑な群から構成される。
【０００３】
特異的な抗原免疫は、抗原ペプチドの露出部分／接触可能部分上に位置するアミノ酸の、提示、記憶、および同定に大きく依存している。一般的に、この標的は、免疫系活性の位置を提供する抗原性フラグメント中に存在するアミノ酸の直鎖状配列である。
【０００４】
「超可変ウイルス」は、用語として、この明細書を通して使用され、そして、この特許請求の範囲中に使用され、この用語は、実質的および連続な遺伝子変異に起因して、そのペプチドのアミノ酸配列およびそれらのタンパク質構造における実質的かつ連続的な改変を提示し、他方、同時に、病原性を提示し続けるウイルス病原体をいう。このような超可変ウイルス病原体は、免疫系認識および記憶のための、露出したかまたは利用可能な部位を提示する。しかし、上述の高変異率（および、そのために引き起こされる連続的なアミノ酸改変）に起因して、このような免疫系の認識および記憶は、顕著に阻害されるかまたは完全に無能となるかのいずれかである。より具体的には、目的のウイルスタンパク質残基配列は、免疫系によって効率的に認識され得、かつ記憶され得るが、その初回認識に応答して抗体が生成されるときまでに、この標的化された配列は、しばしば、目的の病原体ウイルスペプチド配列中には存在しておらず、このような抗体がエフェクター期（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｈａｓｅ）で機能することを可能にする。ＨＩＶ−１は、超可変病原性ウイルスのすばらしい例である。ＨＩＶ−１によって実証されるような高い変異率に対する原因因子は、プルーフリーディング機能を実証することを逆転写酵素が失敗することに存在する。従って、ＨＩＶ−１は、過度の量の転写誤差が複製の間、伝わるのを可能にする。このような転写誤差は、順に、それによって規定されるウイルスペプチドのアミノ酸配列における一定の改変を引き起すことについて責任がある。
【０００５】
ＨＩＶ−１配列改変にもかかわらず、得られた新規の株は、ヒト細胞の首尾よい感染の達成をどうにかなす。この免疫系は、ウイルスに対する応答を増加させるが、これらの応答は、これらの応答が株特異的であるという事実によって限定されている。このＨＩＶウイルスは、免疫系が応答し得るよりも速く変異する。このような場合に、このウイルスは、免疫系を打ちのめし、かつ打ち砕く。同様の様式でこの免疫系を逃れる他の超可変ウイルス病原体としては、インフルエンザおよびＣ型肝炎が挙げられる。
【０００６】
ＨＩＶ−１は、ＡＩＤＳの原因となる病原体である。超可変ウイルスＨＩＶ−１は、連続的可変直鎖アミノ酸配列から主に構成される、ウイルス病原性にとって重要なタンパク質を組み込む。例えば、ｇｐ１２０は、ウイルス病原性（例えば、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球に結合し、その後、そのウイルスＲＮＡが宿主Ｔ細胞に入ることを可能にする能力）に必要とされる重要な機能をＨＩＶ−１に提供する被覆タンパク質である。さらに、ＨＩＶ−１とは別の可溶性ｇｐ１２０は、Ｔリンパ球の誘導およびエフェクター機能の両方を阻害する。実際は、可溶性ｇｐ１２０は、非感染性Ｔ細胞のアポトーシスを引き起こすことが公知である。従って、ｇｐ１２０は、重要かつウイルス病原性に必要なウイルスタンパク質を必要とするが、そのタンパク質中の高い可変アミノ酸にもかかわらず、免疫系の介入に対して最も有効な標的を示す。ｇｐ１２０は、天然に存在する中和抗体の第一の標的として周知であるので、特にこの糖タンパク質は、大きな調査対象である（参考文献１−本明細書中の科学刊行物の参考文献は、本明細書の末尾の「参考文献」の節に列挙される）。
【０００７】
すべてのＨＩＶ−１タンパク質のように、ｇｐ１２０は、広範な変異を起こしやすい。実際は、ＨＩＶ−１株は、ｇｐ１２０分子内で遭遇する一般的なバリエーションに基づいてクラッドに分類される。各クラッド内で、無数の変異が、生じ続ける。従って、交差クラッド範囲でうまく免疫反応を増大させるという課題は、すべてのＨＩＶ株およびクラッドがいくつかの一般的な標準に低下され得ない限り、免疫系について克服できない問題を示す。以下にさらに説明されるように、ＳＳＳＰは、超可変ウイルスタンパク質（例えば、ｇｐ１２０）の３Ｄ形態において、そのような一般的な標準を出願人が定義することを可能にする。
【０００８】
上記のように、免疫系は、通常、抗原ペプチドフラグメント内の直鎖配列を標的化する。この抗原認識のプロセスは、ほとんどの部分についてウイルスタンパク質の３次元形態を考慮に入れない。このプロセスは、当然多くのタンパク質結合機能に対して重要である。より具体的には、抗原認識および標的化は、主に比較的少数のアミノ酸の連続的直鎖配列の提示に依存し、そして一般的に、空間的に近接であるが非連続的な残基から構成される非連続的エピトープの認識を含まない。本明細書を通しておよび特許請求の範囲内で使用される、用語「非連続的保存残基」および「非連続的エピトープ」とは、対象ペプチドの直鎖分子配置内で近接も隣接もしていないが、タンパク質直鎖配列の適切な折り畳みによって決定される３次元的な近接性について空間的に関連するアミノ酸残基のことをいう。本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって使用される、用語「適切な折り畳み」とは、対象タンパク質によって実証され、そしてタンパク質の機能（例えば、レセプター部位への結合）を提供するために必要な３次元分子形態のことをいう。ほとんどの抗原性タンパク質は、比較的一貫した保存された残基（直鎖配列の連続的構成要素のような）を維持するので、小さいフラグメント（８〜１０アミノ酸程度に少ないアミノ酸からなる）の免疫系記憶は、通常（超可変ウイルス／ウイルスタンパク質によって提示されない場合）その後の認識、提示およびエフェクターの機能についての十分な情報を提供する。
【０００９】
（上記で議論した増大したウイルス変異速度の結果として）直鎖アミノ酸配列内での高速での変化を示すウイルスタンパク質は、宿主の免疫系に、一貫した直鎖エピトープ標的を提供することができない。上記のように、ヒトの後天性免疫不全症候群の原因であるウイルスＨＩＶ−１は、この生物によって産生される逆転写酵素が、有効な「プルーフリーディング」機能を欠くという事実に起因して、非常に高い変異速度を示す。それゆえ、得られる転写エラーによって、一貫しないアミノ酸組成を示すウイルスタンパク質を回避不能にもたらされる。従って、ＨＩＶ−１タンパク質（例えば、ｇｐ１２０）は、一貫した直鎖エピトープを示すとは期待されず、そして提示しない。実際、ｇｐ１２０の直鎖アミノ酸配列は、異なる単離株の間で可変なだけでなく、単一の感染患者から得られた一連の単離株の間でも非常に可変である。さらに、ｇｐ１２０は、このような直鎖配列のバリエーションにもかかわらず、重要なタンパク質機能（例えば、ＣＤ−４結合）を示し続け得る。それゆえ、病原性に必要なこの重要なタンパク質の機能的結合部位の多くが、この分子の適切な折畳みに基づく３次元配置が近似する非直鎖アミノ酸配列から構成されることは驚くべきことではなく、そしてこれは現在周知である。従って、交差クラッド範囲を有する、有効な、天然に存在するｇｐ１２０  ｍａｂの大部分は、不連続エピトープ、非連続的エピトープ、または「コンフォメーション」エピトープを認識する（参考文献２および３）。例えば、ＣＣＲ５結合部位と共に、宿主のＣＤ４＋  Ｔリンパ球へのウイルス進入に必要とされる部位であるｇｐ１２０のＣＤ４＋結合部位が、いくつかの不連続な残基からなる非連続的エピトープから構成されることが公知である（参考文献４）。実際、Ｔｈｒ２５７、Ａｓｐ３６８、Ｇｌｕ３７０、Ｔｒｐ４２７、Ａｓｐ４５７（保存されていてかつＣＤ４結合に必要であることが公知の残基）は、非連続的エピトープを含む（参考文献４）。
【００１０】
非連続的な保存された残基から構成されるエピトープが、成功裏に標的とされ、そして抗体と成功裏に結合することもまた公知である。例えば、ｇｐ１２０に対する、広範なスペクトルの中和抗体が、このような非直鎖エピトープ（不連続なエピトープとしても公知）に結合することが公知である（参考文献１２）。
【００１１】
上記のように、免疫系は一般に、小さなペプチドフラグメント内の保存された直鎖残基の配列を介して抗原を認識する。それゆえ、過去において、（受動免疫および能動免疫の両方の発達において）抗体を調製する目的で合成されたペプチドが、天然に存在する直鎖エピトープの直鎖配列に同様に基づいていたことは驚くべきではない。しかし、ずっと低い程度まで、非直鎖合成ペプチドを、３−Ｄ配置においてネイティブな配列に対するアナログとして利用することもまた公知である。より具体的には、表面シミュレーション合成ペプチド「ＳＳＳＰ」が設計され、そして操作されて、大きなタンパク質のアミノ酸構成要素の３次元近傍が刺激される（参考文献１５）。
【００１２】
このようなＳＳＳＰは、このような合成ペプチドがパターン化されたネイティブタンパク質およびＳＳＳＰアナログの両方を認識するように免疫系を首尾よく感作することが知られている。しかし、このようなＳＳＳＰ技術で感作された免疫細胞は、実際には、変性した標的タンパク質とは複合体化しない（参考文献１４）。このような変性したタンパク質において、特定のペプチドコンホメーションを維持するため、そしてその間の残基間の必要な３次元空間的関係を達成するために要求されるイオウ結合は、破壊される。従って、ＳＳＳＰは、直鎖配列に対してではなく、固定された３次元空間的関係にある残基から構成されるエピトープに対して免疫系を感作させることにより機能する。ＳＳＳＰは、表面３Ｄ配置を直鎖配列に文字通り翻訳して免疫系をプライムする。免疫系は、直鎖配列をプロセシングする傾向があるので、ＳＳＳＰは、免疫系に不連続なエピトープをプロセシングおよび認識させて、そして標的化されたタンパク質の３Ｄ配置に対する免疫応答を開始させるための最も信頼性のあるストラテジーを提供する。従って、ＳＳＳＰストラテジーは、「狂牛病」およびスクレイピー（正常なタンパク質ＰｒＰｃが、プリオン実体の存在下で異なる（異常な）３Ｄ配置ＰｒＰｓｃで折り畳まれる）のような異常な病理についてワクチンの開発において必要であることが分かると考えられる。以下に考察されるように、ＨＩＶ−１のような超可変ウイルス病原体の保存実体は、それらの直鎖配列ではなくその分子の３Ｄ配置にある。
【００１３】
超可変ウイルス病原体が、保存された直鎖エピトープを欠くタンパク質構成要素（例えば、ｇｐ  １２０）を提示し得るとしても、このようなタンパク質は、基本的なウイルス病原性に必要な非連続的な保存された残基を維持する。これらの保存された残基は、そのタンパク質の適切なフォールディングの後、３次元配置に近似されるだけである。例えば、ｇｐ−１２０のＣＤ４＋結合部位の保存された残基（宿主Ｔリンパ球に結合し進入するために必要とされる）に加えて、同定されたＣＣ−ＣＫＲ５結合部位もまた、ウイルスの侵入およびＨＩＶ結合に必要とされる。ＣＣ−ＣＫＲ５部位が機能するために、保存された残基Ａｒｇ４１９、Ｌｙｓ４２１、およびＧｌｎ４２２が存在しなければならないことが公知である。次にＣＣ−ＣＫＲ５部位の保存された残基は、以下の２つの高度に保存された残基の間にある：Ｃｙｓ４１８（これは、Ｃｙｓ３８５とのジスルフィド結合における適切な構成を維持するために必要である）；およびＴｒｐ４２７（これは、ＣＤ４結合に必要とされる）。ｇｐ−１２０分子のこのセグメント（Ｃ４１８〜Ｗ４２７）はまた、「フリップ／スイッチ」現象を示すこのセグメントの能力のために、非常に興味深い。この現象により、このセグメントは、α−らせん配置からβ−シート配置へと、中間コンフォメーションを通ることなく同時に変化し得る。（参考文献５）「スイッチインヒビター」（これは、このセグメントを１つの配置で安定化させて、それにより双安定フリップ／スイッチのコンフォメーション変化を防止するように設計された分子である）がまた、ＣＤ−４結合を阻害することが示されるという事実は、双安定フリップ／スイッチ現象が、ＣＤ４結合に重要であることを強く示している。（参考文献１６）ＨＩＶ−１が感染性を示すために、残基Ａｓｎ２６２は、同様に保存されなければならない。
【００１４】
保存された残基Ｃ３８５およびＣ４１８は、ジスルフィド架橋を形成することによって、ｇｐ１２０の構造的一体性を維持するために必要であることが知られている。以下により詳細に議論されるように、これらのシステイン残基は、現在、重要に必要とされる三次元構築物を維持する、独特のテトラスルフィド架橋を維持するために必要とされることが見出されている。このテトラスルフィド架橋がなければ、ｇｐ１２０は、宿主ＣＤ４＋  Ｔリンパ球に結合することも入ることもできない。Ｃ４１８は、実際に、重要に必要とされる三次元構築物を維持する独特のテトラスルフィド架橋の形成に関与する。多数の研究は、ＣＤ４結合、シンシチウム（ｓｙｎｃｉｔｉｕｍ）形成および感染性のような機能を達成するために、これらのシステイン残基がｇｐ１２０分子中に存在することが、重要に必要とされることを実証した。従って、ｇｐ１２０のような非常に可変性のウイルスタンパク質が、保存された線状エピトープを欠き得るが、このような分子は、ウイルス生存性を維持するために、三次元の関係で保存された特定の残基を保持しなければならず、そして実際に保持する。
【００１５】
上で議論されたように、ＨＩＶ−１の高い変異割合は、ウイルスタンパク質の組成（そのアミノ酸配列）の変化を、対応して速い割合で生じる。さらに、ｇｐ１２０介在物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅ）は、このような変異割合にもかかわらず保存された残基の間で、非免疫原性イソロイシン残基を重複させ、免疫系をさらにブラインドする。従って、この免疫系は、非常に保存の少ない残基を提供し、これらの多くは、部分的にかまたは完全にマスクされている。これらの困難に加えて、ｇｐ１２０分子は、非常に可撓性の糖タンパク質である。このような可撓性に起因して、上記の三次元的に保存されたエピトープもまた、空間的に流動する状態にある。しかし、事実上全ての他のタンパク質と同様に、機能するため（例えば、ＣＤ４部位において結合するため、ＣＣＲ５結合を達成するため、フリップスイッチ作動を可能にするため（従って、宿主細胞に入り、そして感染性を示すため））には、ｇｐ１２０の保存された残基は、特異的な三次元配置を呈さなければならないこともまた、公知である。従って、ＨＩＶ−１の保存された実体は、その分子の三次元配置で主として存在し、それらの線状配列では存在しない。
【００１６】
非常に可変的なウイルス病原体（例えば、ＨＩＶ−１）が、保存された残基を三次元配置において保存することを考慮すると、主要なウイルスタンパク質のＸ線結晶学的研究を得ることが非常に有利である。しかし、ウイルスタンパク質（例えば、非常に可撓性のｇｐ１２０）の画像化は、タンパク質コンフォメーションの一定の変化に起因して、困難である。しかし、このような画像化は、問題のタンパク質が、標的タンパク質上に位置するレセプター部位と複合体を形成される場合に、可能である。例えば、Ｘ線結晶学的画像化は、ＣＤ４および中和抗体と複合したｇｐ１２０について得られている（参考文献６）。
【００１７】
このことは、一貫した線状アミノ酸エピトープを提示しないが、それらの三次元構造に関して保存された非連続的残基を提示する、ＨＩＶ−１のような超可変ウイルス病原体に対して免疫応答を引き起こす際に有効なワクチンに組み込むために特に適したペプチドの同定、設計および調製のための方法が工夫され得る場合に、非常に有利である。このような効果的な免疫応答を引き起こすように特に構成および適合されたペプチドを開示することは、さらに有利である。このようなペプチドが、超可変ウイルス性病原体の検出に有用な免疫原性試薬に組み込まれ得る場合、さらに有利である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
ここで、本発明によれば、特に、超可変ウイルス病原体に対する交差クラッド範囲を含む広いスペクトルで有効な免疫応答を惹起するために構成および配列決定された合成ペプチドを提供する方法が、開示される。より詳細には、本発明の方法は、例えばＨＩＶ−１のような超可変病原体の予防および処置において有効なワクチンへの組み込みに非常に有用な表面シミュレーション合成ペプチドの設計および合成に関する。さらに、超可変ウイルス病原体の検出において有用な試薬への上記ペプチドの組み込みが、開示される。
【００１９】
本発明の方法において、ウイルス性病原性に必要かつ要求されるウイルスタンパク質成分が、同定される。その後、上記ウイルス病原性に必要かつ要求されるその中の非連続的保存残基が、同定される。本発明のタンパク質は、天然の結合部位と複合体化される。ウイルスタンパク質エピトープ／結合部位複合体の形成の際に、複合体化したタンパク質の３次元分子構造に関する画像データを得、記録するために、本発明のウイルスタンパク質が、画像化スキャン（例えば、Ｘ線結晶構造解析）に供される。次いで、上記保存された残基の３次元空間的関係を同定し、得るために、上記画像化スキャンによって得られた３次元分子画像データが、３次元のタンパク質分析および翻訳プログラムを介して、コンピューター分析に供せられる。上記非連続的保存残基の空間的関係の同定の際に、上記同定された非連続的保存残基の３次元の近接度および配向に従って配列決定された保存アミノ酸を組み込む表面シミュレーション合成ペプチド（ＳＳＳＰ）を構成するために、上記ソフトウェアが利用される。次いで、この構成されたＳＳＳＰは、その抗原性を増大させるために、さらなるタンパク質コンピューターソフトウェア分析に供せられる。
【００２０】
本明細書を通して使用される用語「ウイルス病原性に必要とされるウイルスタンパク質」は、ウイルス結合および感染性のような重要なウイルス機能に要求されるタンパク質をいう。例えば、ｇｐ１２０は、ＨＩＶ−１がＴリンパ球に入るために要求される。より具体的には、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位は、実際に、宿主細胞侵入を開始するためにＣＤ４＋Ｔリンパ球と結合しなければならない。より重要なことに、全てのｇｐ１２０分子は、ＣＤ４結合、ＣＣＲ５結合および感染性のような重要な機能を達成するために必要であるいくつかの重要な残基を保存しなければならない。単純になされたウイルスタンパク質選択は、株またはクラッドに関わらず、全ての病原性ウイルス病原体が、多くの保存された残基（これがなければ病原性が可能ではない）を有する所定のタンパク質を必要とするという事実に基づく。
【００２１】
本発明の方法を実施する際に、ウイルスタンパク質の非連続的保存残基（これは、ウイルス病原体にとって必要であって、かつ要求される３次元エピトープを含む）が、初めに同定される。このような残基の同一性が、未知である場合に、目的のタンパク質は、免疫原性試験（部位指向性突然変異研究）に供され、非連続的保存性残基から構成されるこのような３次元エピトープを同定する。用語「（上記の）ウイルス病原性にとって必要であって、かつ要求される」とは、それらの３次元的に保存されたアミノ酸エピトープをいい、これらのエピトープなしでは、この目的のタンパク質は、上述の病原性機能を提供し得ない。例えば、ｇｐ１２０に関して、部位指向的突然変異研究は、Ｔｈｒ２５７、Ａｓｐ３６８、Ｇｌｕ３７０、Ｔｒｐ４２７およびＡｓｐ４５７が、ＣＤ４結合にとって必要な保存性の残基であることを示した（参考文献４）。同様に、ｇｐ１２０は、ＣＣ−ＣｋＲ５結合にとって保存されたＡｒｇ４１９、Ｌｙｓ４２１およびＧｌｎ４２２を必要とすることが示されている。Ａｓｎ２６２は、ＨＩＶ−１感染性に対して必要であるようである（参考文献７）。ｇｐ１２０が、非感染性に関してＭｅｔ４３４を必要とすることがまた示されている。さらに、ｇｐ１２０に関して、Ｃｙｓ３８５、Ｃｙｓ４１８、Ｃｙｓ３３１、Ｃｙｓ２９６およびＣｙｓ４１８がタンパク質の形状、構造、および機能を維持するために絶対に必要不可欠な保存性の残基であることが知られている。これらの保存残基の非存在下で、それらから構成されるｇｐ１２０エピトープおよびＣＤ４結合部位の間で必要とされ、そして、ウイルス結合および宿主進入にとって必要である、３Ｄ関係は、得られ得ない。さらに、これらのサイトカイン残基は、ＣＤ４部位と結合する要求されるタンパク質にとって必要である、以下で詳細に議論する特異的なテトラスルフィド架橋（「ＴＴＳＢ」）を形成することが、ここで、発見された。従って、本発明の方法は、目的のウイルスが複数段階プロセス感染性のための特殊な機能を実施することにとって絶対に必要でありかつ要求される、保存された、非連続残基の同定が必要である。
【００２２】
非連続的保存残基が決定された後に、この目的タンパク質は、天然の結合部位と（同様に、以下で議論する場合においては、それゆえ、中和抗体と）複合体形成する。結合は、このような結合の非存在下では、Ｘ線結晶構造解析または他の分子画像化技術にとって可撓性すぎるタンパク質構造の安定化を提供する。例えば、ｇｐ１２０は、高度に可撓性のタンパク質である。Ｘ線結晶構造解析は、それゆえに、まず糖タンパク質および中和抗体との複合体化によってｇｐ１２０の構造を安定化させることによって可能となる（参考文献６）。最も重要であるのは、このような結合が、保存されたエピトープによって達成される正確なコンフォメーション（すなわち、エピトープ機能を提供するのに必要な空間関係および形状であり、そしてそれなしにはウイルス病原性が存在しない）のマップを提供するという付加された有益性を提供する。
【００２３】
本発明の方法の実施において、ウイルスタンパク質／宿主結合部位複合体の形成の際に、目的のタンパク質は、画像スキャン（例えば、Ｘ線結晶構造解析）に供される。得られる画像は、問題のタンパク質の適切な折り畳みに基づく非線形／非連続的保存残基間の、３次元空間関係に関する情報を提供する。用語「３次元空間関係」とは、本明細書および特許請求の範囲全体で利用されるように、必要とされる重要なウイルスタンパク質機能（例えば、宿主細胞レセプター部位との結合）に必要かつ要求される目的のウイルスタンパク質エピトープの保存残基間の空間関係をいう。従って、画像データを利用して、３−Ｄにおける上記の保存残基間の干渉距離および角度関係を発見し得る。以下に論じられるように、非連続的保存残基は、多数の干渉非保存アミノ酸残基によって分離され得るが、それにもかかわらず、１つの別の空間−−３次元図における−−の、たった数オングストローム内に位置し得る。従って、保存残基は、以下に論じられるように、線形配列としてではなく、エピトープ機能に必要な３次元近接度において保存されるエピトープを形成する。ＳＳＳＰの使用を理解するための鍵となるものは、タンパク質が、直鎖として形成されているという事実である。各直鎖は、特定の３−Ｄ構造において各結合またはアミノ酸を配置する特定の方法で折り畳まる。タンパク質の適切な折り畳み後、線形配列（例えば、ｇｐ１２０中のＴ２５７およびＥ３７０）において離れている幾つかの残基は、実際には、３−Ｄ構造において互いに１０オングストローム未満だけ離れて近接し得る。
【００２４】
本発明の方法は、残基形状の３次元機能的マッピングのために、およびそれによって誘導されるＳＳＳＰの最適な構造を提供するためにタンパク質分析ソフトウェアを利用する。第１の例において、以下でより詳細に記載されるように、Ｘ線結晶構造解析データは、目的のタンパク質のアミノ酸成分の３次元での同一性および位置を決定するために、このようなソフトウェアを利用して分析される。タンパク質の３−Ｄ構造のこのようなコンピューター分析により、選択された非連続的保存残基の各々の位置を決定し得る。画像データのこのようなソフトウェア分析により作製された重要な残基の機能的マップは、結合長、結合角および残基間の距離の測定値を提供し、真の３次元完成図を提供する。次いで、このようなプログラム分析により同定された非連続的保存残基の空間的近接度を利用して、分子鎖に沿ったそれらの線形配置に関するこのような残基をしばしば分離する可変アミノ酸残基を無視しながら、機能的マップによって決定されるような保存残基の空間的近接度および適切な３−Ｄ配置を「模倣する」ＳＳＳＰを構成する。その後、計算されたＳＳＳＰは、以下により詳細に記載されるように、さらなるソフトウェア分析に供され、配列抗原性、利用可能性（疎水性／親水性）を最大にし、そして非抗原性アミノ酸を取り除き、そして一般的に、十分な免疫応答を引き起こす際のＳＳＳＰの有効性を増加させる。
【００２５】
上記で論じられたように、本発明の方法およびＳＳＳＰは、超可変ウイルス性病原体の診断、処置および予防に非常に有用である。このようなウイルス性病原体は、その他の点で全く異なり得るが、全てのこのような病原体は、宿主細胞と結合し得、そして宿主細胞への進入を可能にし得るウイルス性タンパク質を産生しなければならないことは、周知である。このようなウイルス性タンパク質機能は、特定の３次元構造において宿主細胞と結合する保存残基の生成を必要とするので、本発明の方法は、このようなウイルス性病原体のいずれかに適用可能である。
【００２６】
本発明はまた、上記および下記の方法に従って提供されるＳＳＳＰ、ならびにそのようなペプチドを組込んだ診断試薬およびキットを包含する。さらに、本発明はまた、本明細書中に提供されるペプチドのいずれかから生じかつそのペプチドに対して特異的である、抗体を包含する。本発明はまた、本明細書中に開示され、記載され、そして特許請求される方法に従って誘導される、ＳＳＳＰをコードする核酸配列を企図し、そしてその核酸配列を包含する。ＳＳＳＰは、天然に存在し得るペプチドまたは天然には存在しないかもしれないペプチドを生成するので、公知の任意のタンパク質との相同性について各ＳＳＳＰをスクリーニングする必要がある。この重要な工程の目的は、公知の何らかの宿主タンパク質と起こり得る交差反応を除外することである。そのような交差反応がＳＳＳＰベースのワクチンと生じる場合、２つの可能性が生じ得る。ａ）宿主免疫系が寛容され得、そしてその宿主免疫系が、ＳＳＳＰセグメントを「自己」として認識し得、そのＳＳＳＰに対していかなる免疫応答も惹起しないかもしれないこと、またはｂ）宿主タンパク質に対して相同性を有するそのようなＳＳＳＰに対して惹起された免疫応答が、その宿主において自己免疫疾患をもたらし得ること、である。
【００２７】
（詳細な説明）
上記のように、ＨＩＶ−１は、後天性免疫不全症候群−ＡＩＤＳ−の原因である非常に変異する病原性ウイルスである。ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質であるｇｐ１２０は、宿主Ｔ細胞への結合および宿主Ｔ細胞中への侵入のために必要であることが部位特異的変異誘発によって決定された保存残基をそのタンパク質が含有することに起因して、ＨＩＶ−１の病原性にとって重要である。例えば、ｇｐ１２０は、保存残基Ｔｈｒ２５７、Ａｓｐ３６８、Ｇｌｕ３７０、Ｔｒｐ４２７、およびＡｓｐ４５７から構成されるＣＤ４結合部位、ならびに保存残基Ａｒｇ４１９、Ｌｙｓ４２１およびＧｌｎ４２２から構成されるＣＣ−ＣＲＫ５結合部位を示し、このＣＤ４結合部位およびＣＣ−ＣＲＫ５結合部位の両方は、宿主ＣＤ４＋Ｔリンパ球へのウイルスの結合および宿主ＣＤ４＋Ｔリンパ球中へのウイルスの侵入のために必要とされるエピトープを規定する。Ａｓｎ２６２はまた、ＨＩＶ−１の感染性に必要なｇｐ１２０の保存残基である。さらに、ｇｐ１２０は、システイン残基Ｃｙｓ３８５、Ｃｙｓ４１８、Ｃｙｓ３３１、Ｃｙｓ２９６およびＣｙｓ４１８を、ｇｐ１２０の重要な病原性機能（ウイルス結合および感染性を含む）にとって重要な３次元ｇｐ１２０立体構造を維持するために必要な、非連続的な保存残基として含む。ＣＣ−ＣＫＲ５結合に必要とされる残基は、２つの高度に保存された残基である、Ｃｙｓ４１８（ｇｐ１２０の重要な３次元構造を維持するために必要とされる）と、ＣＤ４結合に必要なＴｒｐ４２７との間に位置するｇｐ１２０セグメント内にある。このセグメントはまた、上記のように、この残基Ｃ４１８〜Ｗ４２７間のセグメントがＣＤ４結合にも必要とされる双安定フリップ／スイッチ現象を示すという点でも、非常に重要である。このセグメントは、合計９つの残基（４１８〜４２７）のうちの５つの必要な残基Ｃｙｓ４１８、Ａｒｇ４１９、Ｌｙｓ４２１、Ｇｌｎ４２２、およびＴｒｐ４２７が高度に保存されている。高度に保存されているが、このセグメントは、必要な残基間に挿入された多くのイソロイシン残基によって、非免疫原性にされている。これらのイソロイシン残基は、実際に、こっそり秘密にすることを提供し、保存セグメントを免疫系から見えなくする。
【００２８】
図１は、ＣＤ４レセプター部位に結合するｇｐ１２０分子の分析の結果であるｇｐ１２０のコンピューター作成モデルである。図１において列挙された番号それぞれは、他のそのような残基と３次元関係に関し保存された残基を意味する。図１に示される残基は、それぞれ必要であり、そして重要なタンパク質機能に必要とされる。例えば、Ｔ−２５７（１）、Ｄ−３６８（２）、Ｗ−４２７（３）（棒およびボールで示される）、Ｅ３７０（４）およびＤ−４５７（この図において示されない）は、ＣＤ４結合に必要なエピトープを規定する。Ｆ４３（１９）（フェニルアラニン４３）は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０と相互作用するＣＤ４分子中の重要な残基である。ＣＣ−ＣＫＲ５結合に必要な残基は、Ｒ−４１９（５）、Ｋ−４２１（６）、およびＱ−４２２（７）である。Ｎ−２６２（８）は、感染力のために必要とされる。さらに、以下に考案される構造的に重要なジスルフィド架橋およびテトラスルフィド架橋についての必要なＣ−３８５（９）およびＣ−４１８（１０）もまた、示されている。前に記載された残基それぞれは、多数のアミノ酸によって互いに分離され得るが、ｇｐ１２０の直線エレメントとして示される場合、前に記載された保存された残基それぞれは、その最も近い３次元的に保存された隣接残基から１０オングストローム以下にある。
【００２９】
本発明は、特に、ｇｐ１２０分子の他のどの部分とも対照的に、ｇｐ１２０分子のＣＤ４結合部位を標的とする。以下に詳細に記載されるように、これは、ｇｐ１２０の可溶性形態の全ての潜在的な免疫調節効果を中和するために設計された戦略計画である。過去において、ｇｐ１２０のＣＤ４結合ポケットの凹んだ性質が、ＣＤ４結合部位に対応する高結合性抗体の生成および効果を制限し得ることが、推定された。実際において、様々なＨＩＶ株の広スペクトル中和を示す抗体に関する研究は、これらの抗体が、実際にＣＤ４結合ポケットに位置する残基を含むエピトープを有することおよびＣＤ４結合について必要であることが後に見出されたことを示す（参考文献１２）。ｇｐ１２０分子の免疫調節特性の観点において、本発明は、有利におよび特に、以下の理由のためｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を標的とする：
ｉ．ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の免疫抑制効果について増大する証拠がある。可溶性ｇｐ１２０は、Ｔ細胞活性化の誘導期およびエフェクター期の両方でＴ細胞依存性Ｂ細胞分化を阻害する（参考文献９）。可溶性ｇｐ１２０は、非感染ＣＤ４＋細胞においてアポトーシスを引き起こす。ＨＩＶ  ｇｐ１２０に対する体液性応答は、アポトーシスに対して非感染細胞を感作し得、そして組換えｇｐ１２０の投与の際のＴ細胞減少に対して寄与し得る（参考文献１０）。
【００３０】
ｉｉ．ＨＩＶワクチン標的が、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位の反対側（またはＣＤ４結合側以外の任意の側）に位置する場合、可溶性ｇｐ１２０分子は、免疫攻撃に対してそれらの標的側を露出しつつ、なお非感染ＣＤ４細胞に結合することを可能にされる。このことは、免疫システムによって（関係ない第３者として）非感染ＣＤ４細胞の破壊を偶然に引き起こし得る。
【００３１】
ｉｉｉ．ｇｐ１２０分子の任意の他の露出された側と反対のＣＤ４結合側を標的とすることは、シナリオ「ｉｉ」において上記される自己破壊メカニズムによる非感染ＣＤ４＋細胞の免疫媒介破壊を妨げる。
【００３２】
ｉｖ．本発明のＳＳＳＰに標的化される重要な残基は、ＣＤ４結合残基とＣＣＲ５結合残基とＴＴＳＢ（テトラスルフィド架橋）との間の領域を含む。以前に記載されたように、ＣＣＲ５結合セグメントはまた、双安定のフリップ／スイッチ現象に関与し、この現象は、ＣＤ４結合のために必要である。
【００３３】
上で言及したように、Ｃｙｓ３８５、Ｃｙｓ４１８、Ｃｙｓ３３１、Ｃｙｓ２９６およびＣｙｓ４１８が、タンパク質のジオメトリーおよび機能を維持するための絶対的に必須の保存される残基であることが、ここで、発見された。これらの保存される残基がないと、ｇｐ１２０エピトープとウイルス結合および宿主細胞侵入のために必要なＴ細胞ＣＤ４結合部位との間に必要とされる３−Ｄ関係は、達成され得ない。図２は、問題のＣＤ４結合ｇｐ１２０分子の外側ドメインを表すコンピューター作成画像である（参考文献６）。この画像は、中心領域にわたる３つの鎖と有するβ−プリーツシートを含む。これらの鎖の各々は、システイン残基を含む。これらのシステイン残基は、３次元配置において同じ平面で実際に並列される。図２において、これらのシステイン残基は、左から右で以下である：Ｃｙｓ４４５（１１）、Ｃｙｓ２９６（１２）およびＣｙｓ３３１（１３）。別の平面において、これらの３つの並列されたシステイン残基の後ろに、第１のシートに対してほぼ垂直に別のβシートがある。この第２のシートにおいて２つの他のシステイン残基が存在する：Ｃｙｓ３８５（９）およびＣｙｓ３７８（１４）。次いで、その側面において、Ｃｙｓ３３１（１３）とＣｙｓ３８５（９）との間に、Ｃｙｓ４１８（１０）を含むアミノ酸の別の鎖がある。
【００３４】
上で考察されるように、これまで、ｇｐ１２０が、ＣＤ４＋Ｔリンパ球にウイルスが結合することを可能にする３次元構成を得るために必要であり、そして必要とされるジスルフィド架橋を示すことが知られている。これらの重要な構造的な特徴を以下に挙げる：
１．Ｃｙｓ３７８は、Ｃｙｓ４４５（１５）とジスルフィド架橋を作る；
２．Ｃｙｓ２９６は、Ｃｙｓ３３１（１６）とジスルフィド架橋を作る；および
３．Ｃｙｓ３８５は、Ｃｙｓ４１８（１７）とジスルフィド架橋を作る。
【００３５】
図３は、以下を明らかにするために、異なる配向からの上記ジスルフィド架橋を示す。架橋「１６」から架橋「１７」に、Ｃｙｓ３３１由来の硫黄原子が、新たな結合（ＣＹＳ３３１：ＳＧ−ＣＹＳ３８５：ＳＧ（１８））を形成するＣｙｓ３８５の硫黄原子と別の結合を共有し、この新たな結合は、ＣＹＳ２９６：ＳＧ−ＣＹＳ３３１：ＳＧ架橋（１６）をＣＹＳ３８５：ＳＧ−ＣＹＳ４１８：ＳＧ架橋（１７）を連結する。従って、ＣＹＳ３３１：ＳＧ−ＣＹＳ３８５：ＳＧ（１８）は、２つのジスルフィド架橋の間に結合を形成して、新たに発見されたテトラスルフィド架橋またはＴＴＳＢを形成する。
【００３６】
ＴＴＳＢが他のタンパク質に存在することが発見され得るが、このＣＹＳ３３１：ＳＧ−ＣＹＳ３８５：ＳＧ（ＴＴＳＢ）は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０の構造内に独特の目印を表す。ジスルフィド架橋が、タンパク質構造に対する構造的一体性を加えることが周知である。テトラスルフィド架橋が、ジスルフィド安定化タンパク質セグメントのさらなる架橋を介してこのような構造的一体性を補助することが考えられる。ＨＩＶ−１の超可変の性質、およびｇｐ１２０配列の組成における得られる変化にも関わらず、糖タンパク質が、必要とされるウイルス機能に必要な上記の３次元構造を維持するように管理することが公知である。テトラスルフィド架橋の利用は、このような機能的に必要な構造を維持するために、ｇｐ１２０が、最小量の非連続的保存残基を利用するのに効率的な方法である。図２および図３に示されるように、異なる平面における２つのβシートは、１つのジスルフィド架橋（１５）および１つのテトラスルフィド架橋（１８）によって近くに維持される。テトラスルフィド架橋の非存在下において、Ａｌａ３３６およびＡｒｇ３３５において開始するαヘリックス（Ｃｙｓ３３１に対してすぐ遠位）は、このように維持されず、実際、ｇｐ１２０は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球（ウイルス病原性）と結合し、そしてＣＤ４＋Ｔリンパ球へ侵入するのに必要な３次元構造が、維持されないことを実証しない。実際、テトラスルフィド結合の重要な性質は、文献によって支持される。部位指向変異誘発研究は、Ｃｙｓ２９６、３３１、４１８および４４５が、非感染性変異を生じ、そのｇｐ１６０エンベロープ前駆体ポリペプチドが、切断が乏しいのに対して、Ｃｙｓ１３１およびＣｙｓ１９６における変異が、ライフサイクルにおける後期ブロックをともなう融合細胞形成に対して欠損である非感染性変異を生じることを証明した（参考文献８）。この同じ研究はまた、Ｃｙｓ３８６における変異を有するウイルスが、依然として感染性であるが、融合細胞形成に対して欠損性であることを示す。ＴＴＳＢに含まれるシステイン残基が、明らかに、ＨＩＶ−１の病原性において重要な役割を有し、そして本発明のＳＳＳＰに組み込まれる好ましい保存残基を含む。
【００３７】
ＨＩＶ−１ウイルスは、多くの独特な特性（例えば、ファゴソーム−リソソームの融合の阻害）を有し、従ってさらに残された説明されていない特性を有する。溶解性ｇｐ１２０は、適切なウイルスの非存在下で、ウイルス自身の独立した免疫抑制効果を有する。例えば、溶解性ｇｐ１２０は、Ｔ細胞活性化の誘導期およびエフェクター期の両方で、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞分化を阻害する（参考文献９）。溶解性ｇｐ１２０は、非感染ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、アポトーシスを引き起こすことがまた、周知である。ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に対する体液性応答は、非感染細胞をアポトーシスに感受性にし得、また、組換えｇｐ１２０の投与の際にＴ細胞の減少に寄与し得る（参考文献１０）。上記のｇｐ１２０の免疫抑制効果の原因である特定のメカニズムは、大部分が知られていない。確かに、そのような効果は、ジスルフィド架橋の立体配置に寄与されていない。しかし、グリオトキシン（ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ）および関連するエピポリチオジオキソピペラジン（ＥＴＰ）は、溶液中でＴＴＳＢを形成し、そして、ＴＴＳＢは、インビトロで同様の免疫調節活性（アポトーシスおよび貪食作用の阻害を含む）を有する。これらの免疫抑制効果は、詳細にはこれらの分子中の硫黄架橋にあると考えられている（参考文献１１）。
【００３８】
ウイルスに対して実用的であるが、ＴＴＳＢはまた、ｇｐ１２０について複雑な脆さを表し、それは、なぜＶ３ループ（ＴＴＳＢ中に含まれるＣｙｓ２９６とＣｙｓ３３１との間のジスルフィド架橋に位置する）に結合する多くの抗体が、簡単にＣＤ４結合を阻害し得また、ＨＩＶ−１を中和し得るのかについての１つの説明を提供する。ＴＴＳＢについての別の複雑な脆さは、このＴＴＳＢが、Ｃｙｓ４１８経由で、セグメント４１６〜４２７に接着する事実である。上述のように、このセグメントは、ＣＤ４結合に必要であるフリップ／スイッチ現象に含まれる。さらに、このセグメント［４１６−４２７］はまた、ＣＣ−ＣＫＲ５結合に必要な残基を含む。
【００３９】
上述の保存された残基に加えて、ｇｐ１２０のアミノ酸残基のいくつかは、糖タンパク質の特定の局所領域において、重複することが認められる。例えば、Ａｓｎ３８６は、重複するが、必ずしも保存されない。これらの残基の多くは、必ずしも個々に保存されることが証明されていないが、いくつかは、それらの３次元図において、上で同定した保存残基のいくつかに近接し、ＳＳＳＰによって誘発される免疫反応のための潜在的標的と考えられ得る（以下の表１（ｂ）を参照のこと）。例えば、Ｔｈｒ３７３およびＴｈｒ３８８は、保存残基Ｔｈｒ２５７から、それぞれほんの２．８６および１３．３８Åの位置に配置される。別の例として、Ｔｒｐ１１２は、Ｔｒｐ４２７から４．８２Å離れた位置に配置される。参考文献６）。本Ｘ線結晶構造解析が、ＣＤ４レセプターに結合するｇｐ１２０について行われたことは、注目すべき重要な点である。なぜなら、上述のようにｇｐ１２０は、高い可撓性の糖タンパク質であり、ｇｐ１２０単独の像は、不可能でない場合、非常に困難である。より重要なことには、ＣＤ  ４＋レセプターおよび抗体に結合するｐ１２０の調査は、そのような結合に必要とされる上述の保存残基の３次元的関係を明らかにする。３次元構造において結晶化した対象のｇｐ１２０は、ＨＩＶ−１のＨＸＢｃ２株由来であった（参考文献６）。ファイル１ＧＣ１のＰＤＢフォーマットは、ＰＤＢウェブサイトからダウンロードされた。
【００４０】
ｇｐ１２０分子の種々の研究（重要な残基の機能マップの作成、および結合長、結合角度、残基間の距離の測定および結合角度の測定を含む）を、Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒｓ（バージョン３．５および３．６β）、Ａｌｃｈｅｍｙ  ２０００（バージョン２．０５）、ＳｃｉＰｒｏｔｅｉｎ  バージョン２．０）およびＷｅｂＬａｂ  ＶｉｅｗｅｒＰｒｏ（バージョン３．７）ソフトウェアパッケージを使用して達成した。このＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ  ｖｉｅｗｅｒｓは、ＥｘＰＡＳｙウェブサイトからダウンロードした。Ａｌｃｈｅｍｙ  ２０００およびＳｃｉｐｒｏｔｅｉｎソフトウェアパッケージは、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．およびＳｃｉＶｉｓｉｏｎ，ｌｎｃ．からそれぞれ購入した。ＷｅｂＬａｂ  ＶｉｅｗＰｒｏは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．から購入した。全てのコンピューター補助操作を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ９８を搭載したＩＢＭ適合性のパーソナルコンピューターで実施した。作成したグラフィックは、それぞれのソフトウェアによりＢＭＰフォーマットで保存するか、またはＰｉｚｚａｚ  Ｐｌｕｓソフトウェアを使用してＢＭＰフォーマットで獲得したかのいずれかであった。
【００４１】
前述の残基の全てに加えて、特定の領域において塊状になっているようである多くの重複性イソロイシン残基（すなわち、Ｉｌｅ４２３、Ｉｌｅ４２４、Ｉｌｅ１０９、ｌｌｅ１１０およびｌｌｅ４２０）があることが見いだされた。ＳｃｉＰｒｏｔｅｉｎソフトウェアを利用するＳＳＳＰ抗原性の上記の分析は、ＳＳＳＰが含有するＩｌｅ残基が、Ｉｌｅ残基が、ストラテジー的に省略されているものよりも遙かに免疫原性が低いことを実証する。従って、ＨＩＶ−１ウイルスは、このような重複性Ｉｌｅ残基を上記の三次元的に保存された残基に対して近位に組み込むことにより、一部免疫系を免れていると考えられる。従って、イソロイシンがＭｅｔ４３４と置き換わった、Ｍｅｔ４３４における上記の変異に関して、Ｍｅｔ４３４改変体は、主題の残基の相対的抗原性に基づいて、ＳＳＳＰ設計について都合がよい。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態に従って、ＳＳＳＰは、上記のＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ  ｖｉｅｗｅｒｓ、Ａｌｃｈｅｍｙ  ２０００、ＳｃｉＰｒｏｔｅｉｎおよびＷｅｂＬａｂソフトウェアプログラムによって作成されたｇｐ１２０の機能マップ上で同定されるように、上記の保存された残基の空間的配置に基づいて設計される。より具体的には、主題の保存された残基の三次元空間的近位性に基づいて、導出された距離データに従ってＳＳＳＰを要求することによって、ＳＳＳＰ配列を、そのような三次元近位性を模倣するように設計した。従って、そのＳＳＳＰを、合成分子内に組み込まれた各連続するアミノ酸が、三次元においてその最も近位の保存されたネイティブ残基から１０Å以下でｇｐ１２０分子内に空間的に位置づけられたネイティブの保存されたアミノ酸の代表であるように設計する。従って、本発明のＳＳＳＰは、直鎖状のネイティブアミノ酸配列を示さないが、これらは、距離および配向に関して上記の保存された残基の三次元空間的関係を示す。
【００４３】
可能であるＳＳＳＰストラテジーについて、２つの要件が満たされなければならない：
ｉ．目的の重要な残基が同定されなければならない；および
ｉｉ．問題のタンパク質の三次元構造が利用可能でなければならない。
【００４４】
鍵となる残基は、種々の方法によって同定され得る。文献を見直すと、よく研究されたタンパク質中のいくつかの残基の重要性が明らかになり得る。標的タンパク質上の残基の重要性は、部位指向性変異誘発研究（ＳＤＭＳ）によって最もよく評価される。しかし、部位指向性変異誘発研究は、まず始めに上記のタンパク質の機能および特性の知識を事前に必要とする。ＳＤＭＳは高価かつ労働集約的なプロジェクトであるが、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のような、重要なよく研究されたタンパク質に関する文献に多く報告される。ＳＤＭＳは、特定の変異を挿入して特定の残基を置換した後に、鍵となる機能についての結果を試験することによって、上記のタンパク質に関して鍵となる重要性または機能的意義を有する、保存性残基を同定する。保存性残基の同定はまた、上記の標的タンパク質の改変系統の整列解析から達成され得る。多くの重要なタンパク質の種々の系統の配列は、インターネット上の種々のデータベースで入手可能である。整列化解析は、共通のセグメントまたは残基に基づいて配列を整合する方法で、互いの上に標的タンパク質のすべての入手可能な改変体の直線配列を置く工程からなる。
【００４５】
（標的タンパク質の３次元立体配置の決定）
タンパク質の３次元構造は、Ｘ線結晶構造解析によって最もよく解明され、この手順は当業者に周知である。しかし、現在までに、Ｘ線結晶構造解析は、多くの制限を有し、そして小さすぎるかまたは可撓性であり過ぎるかのいずれかであるタンパク質分子の３次元構造は解明し得ない。目的の多くの分子（例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０）は、３次元立体配置が標準のＸ線結晶構造解析で解明され得ない分子のカテゴリに該当する。この制限を解決するために、２つのストラテジーが使用され得る。第１のストラテジーとして、リガンドまたはレセプターが公知である場合、目的のタンパク質をそのリガンドまたはレセプターに結合し得る。最も重要なことには、このような結合は、結合の間に、保存性エピトープにより得られた正確な高次構造（すなわち、エピトープの機能を提供するのに必要な空間的関係およびジオメトリー、そしてこれがなければウイルスの病原性が存在しない）のマップを提供する別の利点を提供する。このストラテジーにおいて、結合しない実体と比較される場合、レセプターへの完全な結合が、標的タンパク質の３次元立体構造を有意に変化し得ることもまた、留意すべきである。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、上述の画像化ストラテジーの制限は、適切に「モザイク結晶解析」と名付けられ得るものによる。この現在開示される方法は、標準の結晶解析の制限を克服することにおいて、特に有利であり、ここで、小さくかつ可撓性のあるタンパク質が関係している。
【００４７】
本明細書中で開示される画像化プロトコルの目的は、標準の結晶解析を可能にするには可撓性があり過ぎかつ／または小さすぎるタンパク質の３次元立体構造を解明することである。ＳＳＳＰ（表面シミュレーション合成ペプチド）ストラテジーの出現により、目的のタンパク質に関する３次元立体構造は、ＳＳＳＰに基づく任意のプロジェクトの完了を可能にするために、解決されねばならない必須の課題となる。ＨＩＶ  ｇｐ１２０を含む、多くの目的の分子および、まだ発見されていない多くの他の可撓性であるかまたは小さいタンパク質（例えば、超可変ウイルス糖タンパク質、レセプター、腫瘍マーカー）が、ＳＳＳＰ技術に関する可能性のある標的のカテゴリに該当する。小さな可撓性を有するタンパク質の３次元立体構造はまた、入手可能な場合、それらを他の安定なリガンドまたはレセプターに結合することによって得られ得る。しかし、これらのリガンドまたはレセプターへの結合の完了は、非結合タンパク質の３次元立体構造を顕著に変化させ得る。以下に記載されるプロトコルは、このようなタンパク質の３次元立体構造の解明が、最も短い時間枠で達成されることを可能にする。
【００４８】
モザイク結晶構造解析は、従来の結晶構造解析によって解析され得ないタンパク質構造について、最もよく使用される。これは、大きな分子である抗体が、良好な結晶構造解析画像を可能にするという事実に基づく。いくつかのタンパク質は、可撓性および／または小さすぎて標準的な結晶構造解析を可能にし得ないが、抗体に結合された場合、この抗体は、この標的タンパク質の構造を解析するのに十分な完全性を保つ。タンパク質に結合した場合、この結合したタンパク質の断片は、実際、結晶構造解析の時に抗体に結合したままである。結晶構造解析画像において抗体に結合した標的タンパク質の残りの断片の大きさに依存して、この標的タンパク質のこの部分の三次構造および二次構造についての情報が、得られ得る。
Ｉ．例えば、小さい可撓性タンパク質を、５個の領域またはドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５）を有するＶＰ１と呼ぶと仮定する（ウイルスタンパク質＃１について）。
ＩＩ．ＶＰ１の線状配列を仮定すると、種々の抗体が、各ドメインに対して別々に作製され得る。これらが由来するドメインに従う抗体のそれぞれのバッチ：ＡｂＤ１、ＡｂＤ２、ＡｂＤ３、ＡｂＤ４、ＡｂＤ５を、標識する。
ＩＩＩ．ＶＰ１のそれぞれのドメインに結合した場合、得られた構造を、以下のように標識する：Ａｂ＊Ｄ１−ＶＰ１、Ａｂ＊Ｄ２−ＶＰ１、Ａｂ＊Ｄ３−ＶＰ１、Ａｂ＊Ｄ４−ＶＰ１、Ａｂ＊Ｄ５−ＶＰ１。この命名法は、これらの抗体がそれぞれのドメインに結合され、このドメインがなお、ＶＰ１の一部であることを表す。実際、これらの構造は、抗体に結合したＶＰ１の複合体であるが、これらの抗体は、異なるドメインに結合される。
ＩＶ．一連の抗体が、ネイティブのＶＰ１に結合しない場合、このことは、この抗体が作製されるドメインが、表面に接近可能ではなく、そしてＶＰ１構造のより深部の平面に位置し得ることを意味する。
Ｖ．当業者に周知のプロトコルに基づいて、各複合体（Ａｂ＊Ｄ１−ＶＰ１、Ａｂ＊Ｄ２−ＶＰ１、Ａｂ＊Ｄ３−ＶＰ１、Ａｂ＊Ｄ４−ＶＰ１、Ａｂ＊Ｄ５−ＶＰ１）に付いて、別々に、結晶構造解析研究を実施する。
ＶＩ．ＶＰ１の可撓性の性質を仮定すると、いずれか１の抗体と複合体化したＶＰ１の構造全体は予測され得ない。この結果は、それぞれのドメイン（Ａｂ＊Ｄ１、Ａｂ＊Ｄ２、Ａｂ＊Ｄ３、Ａｂ＊Ｄ４、Ａｂ＊Ｄ５）と別々に複合体化した抗体を生じる可能性が高い。各ドメインは、独立して捕獲される。
ＶＩＩ．三次元配置、より重要には、ＶＰ１の表面を解析するために、ここで本発明者らは、ベストフィットシナリオに基づいて独立して捕獲されたドメインのモザイクを構築することによって、パズルを解析する必要がある。この結果は、一次モザイク（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｓａｉｃ）と呼ぶ。この一次モザイクにおける構造（Ａｂ＊Ｄ１、Ａｂ＊Ｄ２、Ａｂ＊Ｄ３、Ａｂ＊Ｄ４、Ａｂ＊Ｄ５）を再配置することにより、ＶＰ１の表面に関する有意な情報が得られる。
ＶＩＩＩ．この一次モザイクの確認および／またはあいまい性は、以下のようにして、二次モザイクにおいて解析され得る：
ａ）一次モザイクに基づいて、どのドメインが互いに接近しているかを推定する。
【００４９】
ｂ）一次モザイクに基づいて、接近性に関してドメインを段階付けする。
【００５０】
ｃ）ＶＰ１を全てのドメイン抗体と反応させる。安定な構造が達成される場合、これをＡｂ＊Ｄ（１−５）−ＶＰ１で標識し、次いで、以下の工程ｆ）に進む。
【００５１】
ｄ）安定した構造が達成されないと、ＶＰ１を１ドメイン抗体（ＡｂＤｎ；ここで、ｎは５ドメインのうちの任意の番号である）と反応させる。この結果は、Ａｂ＊Ｄｎ−ＶＰ１を生じる。Ａｂ＊Ｄｎ−ＶＰ１を次の工程のために保存する。
【００５２】
ｅ）工程８ｂのランキングプロセスに基づいて、ｎに最も近い抗体ドメインとＡｂ＊Ｄｎ−ＶＰ１を反応させる。この抗体の連続的添加の目的は、抗体を用いてＶＰ１を安定化させ、その一方で、この構造の破壊を避けることである。隣接したドメインに抗体を加えた後に部分構造の各々を保存した。この点における幾つかの抗体の結合部位は、以前に添加した抗体によってブロックされ得る。観察されるか否かは、そのように留意されるべきである。次に近接する抗体を加え続ける。得られた構造は、好ましくは近接したドメインに対して２もしくは３またはそれ以上の抗体と複合体化したＶＰ１である。適切な命名法：Ａｂ＊Ｄｎ＿ｘ−ＶＰ１（ここで、ｎ＿ｘは、連続した近接性のうちにあるとみなされる抗体ドメイン複合体を示す）。
【００５３】
ｆ）Ａｂ＊Ｄｎ＿ｘ−ＶＰ１（または、可能であれば、Ａｂ＊Ｄ（１−５）−ＶＰ１）複合体を収集し、そして、当業者に周知のプロトコルに従って結晶学構造解析研究を実施する。この工程は、二次モザイク（ＳＥＣＯＮＤＡＲＹ  ＭＯＳＡＩＣ）結晶解析学法と呼ばれる。これは、複数の抗体に複合体化した、全タンパク質でないにしても、標的タンパク質の大部分の画像を生じる。
【００５４】
ｇ）３Ｄ表現閲覧ソフトウェアでの解析
モザイク（Ｍｏｓａｉｃ）結晶解析学法は、この用語が、その明細書全体に亘って、そしてその特許請求の範囲の中で使用される場合、上述の種々の抗体に結合したタンパク質の種々の部分の結晶解析学的スナップショットから解いたタンパク質の複合３Ｄ画像である。これは、標準的結晶解析法に小さすぎるか、また、可撓性すぎるタンパク質の３Ｄ配置を解く。
【００５５】
本発明の方法に従うと、結晶解析学的画像スキャン（好ましい実施形態において、モザイク結晶解析学法）によって取得される３次元分子画像データは、次いで、上述の非連続的保存性残基の３次元空間関係を同定および取得するために、３次元タンパク質解析および表現プログラムを介するコンピューター解析に供される。上述の非連続的保存性残基の空間関係の同定の際に、上述の解析ソフトウェアが、保存されている重要な残基の間の距離を測定し、かつ、上記の同定された非連続的保存性残基の３次元の近接性に従って配列決定された保存されているかまたは必要でないアミノ酸を取り込む表面シミュレーション合成ペプチドを構成するために利用される。次いで、この構成されたＳＳＳＰは、その抗原性を向上させるためにさらなるタンパク質コンピューターソフトウェア解析にさらに供される。
【００５６】
上記の方法に従ってＳＳＳＰを構成した後、各ＳＳＳＰ配列が、例えば、相同性パターンを検索するための、インターネット上のＦＡＳＴＡエンジンを利用して、データベースで検索される。各ＳＳＳＰは、このようなＳＳＳＰに由来するワクチンからの自己免疫副作用を生じ得る、ネイティブのヒト患者と交差反応することを回避するために、そのように試験されるべきである。その後、各ＳＳＳＰは、ＳＳＳＰの抗原性、ヒドロパシー、接近性および可撓性を評価するために、タンパク質分析ソフトウェア（例えば、上記のＳｃｉＰｒｏｔｅｉｎソフトウェア）を利用して評価される。このような試験の結果は、対象のＳＳＳＰの有効性を最適化するために利用される。例えば、トリプトファン４２７のような重要な残基は、その近傍で別の重要な残基（例えば、リジン）を置換することによって比較的低い抗原性を増大し得る。
【００５７】
本発明は、誘導されたＳＳＳＰ配列内に、複数の機能的エピトープアナログの組み込みを企図する。例えば、ＣＤ４結合に必要な保存された残基（Ｔｒｐ４２７、Ａｓｐ３６８、Ｇｌｕ３７０およびＴｈｒ２５７）ならびにＣＣ−ＣＫＲ５結合に必要な保存された残基（Ａｒｇ４１９、Ｌｙｓ４２１およびＧｌｕ４２２）は、同じＳＳＳＰの配列中に組み込まれ得る。このようなＳＳＳＰによって提示されるエピトープは、ネイティブの保存された残基の、３次元的な近位性に従って誘導される。本明細書中に記載されるＳＳＳＰは、以下のような、各アミノ酸残基についての国際的１文字記号システムおよび／または３文字略号によって示される：
Ａ  アラニン            Ａｌａ
Ｒ  アルギニン          Ａｒｇ
Ｎ  アスパラギン        Ａｓｎ
Ｄ  アスパラギン酸      Ａｓｐ
Ｃ  システイン          Ｃｙｓ
Ｑ  グルタミン          Ｇｌｎ
Ｅ（グルタミン酸）      Ｇｌｕ
Ｇ（グリシン）          Ｇｌｙ
Ｈ（ヒスチジン）        Ｈｉｓ
Ｉ（イソロイシン）      Ｉｌｅ
Ｌ（ロイシン）          Ｌｅｕ
Ｋ（リジン）            Ｌｙｓ
Ｍ（メチオニン）        Ｍｅｔ
Ｆ（フェニルアラニン）  Ｐｈｅ
Ｐ（プロリン）          Ｐｒｏ
Ｓ（セリン）            Ｓｅｒ
Ｔ（スレオニン）        Ｔｈｒ
Ｗ（トリプトファン）    Ｔｒｐ
Ｙ（チロシン）          Ｔｙｒ
Ｖ（バリン）            Ｖａｌ。
【００５８】
図１を参照して、１つの空間的に近位の順序に従って、配列ＱＷＫＥＲＴＣｃＮ（配列番号４３）を組み込む「ジッパー」様エピトープアナログを設計し得る。他方で、ＱＫＲＣｃＴＥＤのＳＳＳＰ配列を組み込む「Ｖ」字型エピトープもまた、設計し得る。さらに、ＫＷＥＲＣｃＲＫ（配列番号４４）のＳＳＳＰ配列によって提示される「小環」エピトープ、ＱＫＲＣｃＴＥＤＷおよびＱＫＲＣｃｎＴＥＤＷＩＭＱ（配列番号４５）のＳＳＳＰ配列から構成される２つの大きい「環」エピトープもまた設計し得る。このような任意の幾何学的エピトープを選択する際に、主な考慮事項は、込みこまれた順序が、その誘導された合成アナログのアミノ酸配列によって提示されるネイティブエピトープの連続アミノ酸の空間的近位性を反映すべきであるということである。以下の表１は、重要な保存された残基間の残基間距離を含む。この表中に列挙された測定値は、上記のｇｐ１２０の機能的マップ由来のそれぞれの残基の最も近位の原子間の距離に基づく。表１（ａ）は、それぞれの非連続的な保存された残基中の、種々の近接原子間で測定された距離を列挙し、そして表１（ｂ）は、目的の非連続的な保存された残基の前の距離および上記の冗長な残基の後の距離を列挙する。
【００５９】
【表１−１】
2005511704.tif 000003
【００６０】
【表１−２】
2005511704.tif 000004
【００６１】
【表１−３】
2005511704.tif 000005
本発明の方法に従って構成されたＳＳＳＰを表２に列挙する。表２内で：「Ｃｃ」は、架橋中の２つのシステイン残基を示す。小文字および影付きの大文字は、ＳＳＳＰをさらに最適化するために省略され得る残基を示した。異なる平面に存在する、Ａｓｎ２６２が対象のＳＳＳＰにおいて弱い標的であり得ることに注目のこと。これは、表では「Ｎ」として記述される。Ａｓｎ２６２は保存されているが、このＳＳＳＰに対する免疫応答は、距離および３次元配向から見て、潜在的な標的としてこれに対して最適に応答しないかもしれない。しかしながら、標的化され得る、多数の重複したＡｓｎ（例えば、Ａｓｎ３８６）が存在する。
【００６２】
【表２−１】
2005511704.tif 000006
【００６３】
【表２−２】
2005511704.tif 000007
本発明の方法に従って調製されたペプチドに基づくワクチンは、それによって誘導されたＳＳＳＰの多価混合物からなることが好ましい。例えば、ＨＩＶに関して、表１に列挙されたＳＳＳＰの多価混合物は、ワクチンの効力を増加させる。さらに、本発明の方法を用いて誘導されたＳＳＳＰは、より大きな自由度を提供あい、より大きな抗原性応答を惹起し、そしてそれによってより有効なワクチンを提供するために、縦列、鏡像、および縦列反復配列の様々な組み合わせで並べられることが好ましい。
【００６４】
本発明は、免疫原性組成物を企図する。この免疫原性組成物は、最小量で、有効な免疫原性応答を誘発するために十分な量の、少なくとも１つのそのＳＳＳＰ、もしくはそれによって誘導される少なくとも１つのＳＳＳＰ、またはそれによってコードされる少なくとも１つの核酸分子を組み込んでいる。本発明はまた、宿主を免疫化するための方法を提供し、この方法は、上記の免疫原性組成物をこの宿主に投与する工程を包含する。本発明のペプチドを含有するワクチンは、液体溶液、エマルジョン、注射液、坐剤、および吸入組成物／肺性組成物として調製され得る。上記免疫原性組成物は、上記少なくとも１つのＳＳＳＰまたはそれによってコードされる核酸に加えて、薬学的に受容可能な便宜剤（ｅｘｐｅｄｉｅｎｔ）（例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリコール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含有することが企図される。さらに、および特に、吸入投与に関して、本発明のＳＳＳＰは、このような投与に有用かつ有効な界面活性剤組成物に組み込まれ得るかまたはこの界面活性剤組成物によって輸送され得る。このような免疫原性組成物はまた、上記ＳＳＳＰおよび／またはコード分子の投与のためのリポソームキャリアを含有し得る。
【００６５】
本発明のＳＳＳＰは、それによってコードされる核酸分子によって提供され得る。このような分子は、この核酸を宿主系に直接投与することによる直接方法において、有利に利用され得る。あるいは、このようなコード分子は、生存ベクター（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニア、ポリオウイルス、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＢＣＧ）に組み込まれ得、そしてその後、このベクターに投与され得る。
【００６６】
上で言及されるように、前出のＳＳＳＰは、ワクチンに組み込まれるように設計される。ここで合成ペプチドは、種々の最適な組み合わせ（タンデム、鏡像および繰り返し順序）で配置され得る。当業者に周知のこのストラテジーは、抗原のサイズを広げそして種々の個体の免疫系に対する可動性を特定の程度に広げて、選択された３次元保存残基への焦点を維持しながら応答する。残基Ｉ、ＭおよびＬが免疫原性を低下させるので、これらの残基は、免疫応答を議論しそしてさらに最適にするために省かれるのが好ましい。トリプトファンもまた、乏しい抗原性を有するが、ＣＤ４結合のために必要とされるＴｒｐ４２７の重要な役割に起因して、選択されたＳＳＳＰにおいてはこの残基を保持することが好ましい。
【００６７】
本発明の表面シミュレーション合成ペプチドは、当該分野で周知の現在認められているタンパク質合成方法のいずれかに従って化学合成され得る。例えば、自動化ＡＢＩ  ４３０Ａ固相ペプチドシンセサイザーが、利用され得る、さらに、このＳＳＳＰ配列は、組換えＤＮＡ技術に基づいて大量生産するために、核酸配列に翻訳され得る。
【００６８】
本発明の方法によって提供されるＳＳＳＰは、予防処置および治療処置両方のためのワクチンの作製において特に有用である。言い換えると、本発明のＳＳＳＰを組み込むワクチンは、ＨＩＶ陰性個体におけるＨＩＶ感染を防ぐのに効果を有するだけでなく、ＨＩＶ−１に感染した人における効果的な処置も提供する。上で述べたように、本発明のＳＳＳＰは、ワクチンおよび診断試験に有用なアミノ酸標的を規定する。当業者は、ワクチンを作製するために、本発明のＳＳＳＰにおいて提供されるようなアミノ酸残基配列を利用するための方法をよく知っている。効果的なワクチンの設計は、ヒト被験体へ投与のために、前記ＳＳＳＰ標的を組み込む特定のワクチンの使用に最適なベクターおよび／またはアジュバントの決定のための通例かつ慣習的な試験を必要とする。本明細書中で提供されるワクチンはまた、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、またはアジュバント（例えば、フロイントアジュバントもしくは抗原性を高めるためのリン酸アルミニウムのような）のような補助物質をさらに含み得る。
【００６９】
ＨＩＶ−１に感染した個体について、本発明のＳＳＳＰを利用するワクチンは、少なくとも１４日間の間、抗レトロウイルスレジメンを含むプロテアーゼインヒビターを同時に投与することによってさらに最適化され得ることが、さらに企図される。このストラテジーの根拠は、免疫応答の有効性が、抗原の提示に大きく依存するという事実に基づく。Ｉ型免疫応答が考慮されていようとＩＩ型免疫応答が考慮されていようと、抗原の提示はプロセス中の重要な工程である。抗原の提示は、細胞の種々の分画における多くの異なるタンパク質を含む精緻なプロセスである。ＨＩＶプロテアーゼ酵素が、アクチン、アルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質、クラモデュリン（ｃｌａｍｏｄｕｌｉｎ）、インシュリンＢ鎖、ｐｒｏ−ＩＬ−１−βおよびトロポニンＣを含む多くの非ウイルス基質もまた消化することは公知である。ＨＩＶプロテアーゼ酵素が、抗原の提示に関与する任意の分子を実際に消化するか否かは、知られていない。しかし、プロテアーゼインヒビターで処置される患者由来の免疫細胞は、そのレジメンにＰＩを含まない患者由来の細胞よりも、抗原の提示においてより優れていることが知られている（参照１３）。さらに抗原の提示に関与する分子のコンピュ−ター分析は、これらの免疫分子が、ＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素による消化のための多くの潜在的部位を有することを示す。従って、ＨＩＶ注入された個体に関する場合、プロテアーゼインヒビターの使用は、抗原の提示を最適化することによって、ワクチンに対する免疫反応を改善する可能性が高い。
【００７０】
上記のように、本発明はまた、ＳＳＳＰの利用を企図し、それによって、ＨＩＶ−１のような超可変ウイルス病原体に特異的な抗体を検出するために有用な診断試薬およびキットが提供される。このようなキットは、例えば、表面；この表面上にこれによって固定化されて提供される少なくとも１つのＳＳＳＰ；検出され、かつこのＳＳＳＰ（単数または複数）が複合体の形成を可能にするような抗体に接触させるための手段；およびそれによって形成されるこの複合体を検出するための手段を含み得る。ＨＩＶ−１に特異的な抗体を検出することに関し、本発明は、表面：この表面上に固定化されたｇｐ１２０の少なくとも１つの非連続的エピトープに特異的な少なくとも１つのＳＳＳＰ；この少なくとも１つのＳＳＳＰおよび検出されるべき上記抗体を、複合体の形成を可能にするように接触するための手段；およびそれによって形成される複合体を検出するための手段を含むキットを企図する。このような診断キットは、個体が、ＨＩＶ感染または適切なワクチン接種の結果として後天的ＨＩＶ−１抗体を有するか否かに関する決定を可能にする。さらに、このようなキットは、ワクチン接種された人が、適切な量のＨＩＶ−１に対する保護抗体と反応したか否かに関する決定を可能にする定量的分析を提供する。
【００７１】
先行する明細書で採用されている用語および表現は、その中で、限定ではなく、説明の用語として用いられ、そして、このような用語および表現の使用において、示され、かつ記載された特徴またはその部分の相当物を排除する意図はなく、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ規定かつ限定されることが認識される。
【００７２】
（参考文献）
【００７３】
【表３−１】
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【００７４】
【表３−２】
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ＨＩＶ−１病原性について保存されておりかつ必要であることが示されているｇｐ１２０残基の３次元空間関係を示す、コンピューター作成画像である。
【図２】図２は、必須のテトラスルフィド架橋およびジスルフィド架橋の維持のために必要なｇｐ１２０システイン残基の保存残基を特に示す、コンピューター作成画像である。
【図３】図３は、図２に示されるシステイン架橋およびウイルス病原性に必要なテトラスルフィド架橋を、異なる空間透視法から示す、コンピューター作成画像である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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