(57)【要約】本発明は、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸を構築するための組成物および方法を提供する。本発明の核酸分子は、多数の組換えおよび／またはトポイソメラーゼ認識部位を含むように構築してもよい。組成物には、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む独自の特異性を有する多数の組換え部位を有するベクターが含まれる。方法によって、組換えおよび／またはトポイソメラーゼ媒介クローニングを用いてウイルスゲノムに対象配列を挿入することができる。本発明はまた、組換え型ウイルスを構築する方法、ポリペプチドを発現させる方法、および融合ポリペプチドを発現させる方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの組換え部位が、ラムダ組換えにおいて活性な少なくとも一つのタンパク質の存在下で適合性の組換え部位との組換えを受けることができ、核酸分子が原核細胞および真核細胞において複製する、少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、互いに実質的に組換えしない少なくとも二つの組換え部位をさらに含む核酸分子。
【請求項２】
アデノウイルスゲノムおよびアデノ随伴ウイルスゲノムからなる群より選択される少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項３】
少なくとも一つのレトロウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項４】
レトロウイルスゲノムがレンチウイルスゲノムである、請求項3記載の核酸分子。
【請求項５】
ヘルペスウイルスゲノムおよびポックスウイルスゲノムからなる群より選択される少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項６】
少なくとも一つのRNAウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項７】
RNAウイルスが、フラビウイルスゲノム、トガウイルスゲノム、およびアルファウイルスゲノムからなる群より選択される、請求項6記載の核酸分子。
【請求項８】
原核細胞複製起点および選択マーカーを含むプラスミドまたはバクミド（bacmid）である、請求項1記載の核酸分子。
【請求項９】
プロモーター、ウイルス末端反復配列、スプライス部位、パッケージングシグナル、一つまたは複数のウイルスタンパク質に反応性の核酸配列、認識部位、組換え部位、一つまたは複数のマーカータンパク質またはポリペプチドをコードする配列、抗体によって認識されうる一つまたは複数のエピトープをコードする配列、複製起点、介在配列、配列内リボゾーム進入配列、およびポリアデニル化シグナルからなる群より選択される一つまたは複数の特徴をさらに含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項１０】
二つの組換え部位のあいだに対象ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1記載の核酸分子。
【請求項１１】
対象配列が、一つまたは複数のポリペプチドをコードする配列、一つまたは複数のtRNA配列をコードする配列、一つまたは複数のリボザイム配列をコードする配列、一つまたは複数のプロモーター配列、一つまたは複数のエンハンサー配列、および一つまたは複数のリプレッサー配列からなる群より選択される一つまたは複数の配列を含む、請求項10記載の核酸分子。
【請求項１２】
少なくとも一つの組換え部位が、ラムダ組換えにおいて活性な少なくとも一つのタンパク質の存在下で適合性の組換え部位との組換えを受けることができる、バキュロウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、一つまたは複数の組換え部位をさらに含む核酸分子。
【請求項１３】
互いに実質的に組換えしない二つの組換え部位を含む、請求項12記載の核酸分子。
【請求項１４】
対象配列が、一つまたは複数のポリペプチドをコードする配列、一つまたは複数のtRNA配列をコードする配列、一つまたは複数のリボザイム配列をコードする配列、一つまたは複数のプロモーター配列、一つまたは複数のエンハンサー配列、および一つまたは複数のリプレッサー配列からなる群より選択される一つまたは複数の配列を含む、請求項13記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項1記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項１６】
請求項12記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項１７】
以下を含む、組換え型ウイルスを構築する方法：
（a）少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部、ならびに互いに実質的に組換えしない少なくとも第一および第二の組換え部位を含む、第一の核酸分子を提供する段階；
（b）組換えが第一と第三の組換え部位のあいだで、および第二と第四の組換え部位のあいだで起こるような条件で、少なくとも第三および第四の組換え部位が隣接する対象配列を含む第二の核酸分子を第一の核酸分子に接触させる段階；ならびに
（c）段階（b）の核酸分子をパッケージングする細胞に、段階（b）の核酸分子を導入する段階。
【請求項１８】
第一の核酸分子が、アデノウイルスゲノムおよびアデノ随伴ウイルスからなる群より選択される少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第一の核酸分子が少なくとも一つのレトロウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
レトロウイルスゲノムがレンチウイルスゲノムである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
第一の核酸分子が、ヘルペスウイルスゲノムおよびポックスウイルスゲノムからなる群より選択される少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
第一の核酸分子が少なくとも一つのRNAウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
RNAウイルスが、フラビウイルスゲノム、トガウイルスゲノム、およびアルファウイルスゲノムからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
第一の核酸分子が、複製起点および選択マーカーを含むプラスミドまたはバクミドである、請求項17記載の方法。
【請求項２５】
組換え部位のあいだの第二の核酸分子の一部が、対象ヌクレオチド配列を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２６】
対象配列が、一つまたは複数のポリペプチドをコードする配列、一つまたは複数のtRNA配列をコードする配列、一つまたは複数のリボザイム配列をコードする配列、一つまたは複数のプロモーター配列、一つまたは複数のエンハンサー配列、および一つまたは複数のリプレッサー配列からなる群より選択される一つまたは複数の配列を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
組換え部位のあいだの部位で第一の核酸を切断する制限酵素によって第一の核酸分子を消化することをさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２８】
請求項17記載の方法によって産生された組換え型ウイルス。
【請求項２９】
請求項28記載の組換え型ウイルスを含む組成物。
【請求項３０】
以下を含む、融合ポリペプチドを産生する方法：
配列が、終止コドンを含む配列によって隔てられた少なくとも第一のコード領域と第二のコード領域とを含む、融合ポリペプチドをコードする第一の核酸配列を含む宿主細胞を提供する段階；
終止コドンを抑制する一つまたは複数のサプレッサーtRNAを含む第二の核酸配列を細胞において発現させる段階；ならびに
第一および／または第二の核酸配列の少なくとも一つが、少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子上に存在する、第一のコード領域と第二のコード領域とを含む融合ポリペプチドを発現させるために十分な条件で宿主細胞をインキュベートする段階。
【請求項３１】
第一と第二の核酸配列とを含む核酸分子を宿主細胞に導入する段階をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
第二の核酸配列を含む核酸分子が、アデノウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
第一のコード領域および終止コドンが、互いに実質的に組換えしない組換え部位に隣接する、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
以下を含む、ポリペプチドを発現させる方法：
核酸分子がウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、プロモーターおよびリプレッサー配列に機能的に結合したポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子を細胞に接触させる段階；
リプレッサー配列に結合するタンパク質をコードする核酸分子を細胞に接触させる段階；ならびに
ポリペプチドを発現させるために十分な条件で細胞をインキュベートする段階。
【請求項３５】
ウイルスゲノムがレンチウイルスゲノムである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
ウイルスゲノムがHIV-1ゲノムである、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
リプレッサー配列がテトラサイクリンオペレータ配列であって、タンパク質がテトラサイクリンリプレッサー配列である、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドを発現させるために十分な条件が、テトラサイクリンの存在下で細胞をインキュベートする段階を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
以下を含む、ポリペプチドを発現させる方法：
核酸分子がウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、細胞がリプレッサー配列に結合するタンパク質を発現する、プロモーターおよびリプレッサー配列に機能的に結合したポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子を細胞に接触させる段階；ならびに
ポリペプチドを発現させるために十分な条件で細胞をインキュベートする段階。
【請求項４０】
ウイルスゲノムがレンチウイルスゲノムである、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
ウイルスゲノムがHIV-1ゲノムである、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
リプレッサー配列がテトラサイクリンオペレータ配列であって、タンパク質がテトラサイクリンリプレッサータンパク質である、請求項39記載の方法。
【請求項４３】
ポリペプチドを発現させるために十分な条件が、テトラサイクリンの存在下で細胞をインキュベートすることを含む、請求項42記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーおよび分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、多数の組換え部位を含み、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸と共に、多数の組換え部位を含むウイルスおよび／またはプラスミドおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
組換え型ウイルスは現在、広範な応用に用いられている。ウイルスは、医学的応用、例えば遺伝子治療応用のためおよび／またはワクチンとして用いてもよい。ウイルスはまた、バイオテクノロジーでの応用において、例えば対象となる核酸をクローニングするおよび／またはタンパク質を産生するためのベクターとして用いてもよい。用いられている組換え型ウイルスには、ヘルペスウイルス（例えば、Kellyらに交付された米国特許第5,672,344号を参照されたい）、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（例えば、Mossら、1997、「Current Protocols in Molecular Biology」、16.15〜16.18章、John Wiley & Sonsを参照されたい）、乳頭腫ウイルス（例えば、Bruckらに交付された米国特許第6,342,224号を参照されたい）、レトロウイルス（例えば、Chavezらに交付された米国特許第6,300,118号を参照されたい）、アデノウイルス（例えば、Crouzetらに交付された米国特許第6,261,807号を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（AAV、例えばSrivastavaらに交付された米国特許第5,252,479号を参照されたい）、およびコクサッキーウイルス（例えば、米国特許第6,323,024号を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されない。
【０００３】
ウイルス核酸が感染性でない場合、例えばポックスウイルスである場合、組換え型ウイルスの構築は、ウイルス感染細胞において、ウイルスゲノムと、ウイルス配列が隣接する対象配列を有する同時トランスフェクトしたプラスミドとのあいだでインビボ相同的組換えを必要とする可能性がある。ウイルス核酸が感染性である場合、例えばアデノウイルスである場合、改変ウイルス核酸を調製して、宿主細胞にトランスフェクトしてもよい。いずれの方法論も、対象となる配列およびウイルス配列の一部または全てを含む核酸分子を調製することが必要である。この核酸分子の調製は、時間がかかり、骨の折れるプロセスとなる可能性がある。
【０００４】
アデノウイルスは、30個より多いタンパク質をコードする36 kb DNAゲノムを有する非エンベロープウイルスである。ゲノムの末端は、約100〜150 塩基対の逆方向末端反復配列（ITR）である。ゲノムをウイルスカプシドにパッケージングするためには、5'-ITRに隣接して存在する約300塩基対の配列が必要である。ビリオンにパッケージングされたゲノムは、直線状のゲノムの末端に共有結合された末端タンパク質を有する。
【０００５】
アデノウイルスゲノムによってコードされる遺伝子は、ウイルスDNAの複製に対するその発現の時期に応じて、初期および後期遺伝子に分類される。初期遺伝子は、E1〜E4と呼ばれるアデノウイルスゲノムの四つの領域から発現され、DNA複製の開始前に転写される。多数の遺伝子がそれぞれの領域から転写される。アデノウイルスゲノムの一部は、欠失されたウイルスの感染性に影響を及ぼすことなく欠失される可能性がある。領域E1、E2、およびE4から転写された遺伝子は、ウイルス複製にとって必須であるが、E3領域から転写された遺伝子を欠失させても、複製に影響を及ぼさない可能性がある。必須領域からの遺伝子を別の場所で供給して、欠損ウイルスを増殖させることができる。例えば、アデノウイルスゲノムのE1領域の欠失によって、複製欠損であるウイルスが得られる。この領域が欠失したウイルスは、細胞のゲノムからのウイルスE1遺伝子を発現する293細胞上で増殖する。
【０００６】
より安全な複製欠損ウイルスの構築を可能にすることに加えて、アデノウイルスゲノムの一部の別の場所での欠失および相補、および／または非必須領域の欠失により、アデノウイルスゲノムにおいて異種DNA配列を挿入するための空白が作製される。ウイルスDNAのウイルス粒子へのパッケージングは大きさが制限され、上限はDNAの約38 kbである。挿入およびパッケージングされる可能性がある異種DNAの量を最大にするために、ITRおよびパッケージング配列を除くウイルスゲノムの全てを欠損するウイルスが構築されている（米国特許第6,228,646号を参照されたい）。複製およびパッケージングに必要なウイルス機能は全て、パッケージングシグナルが欠失されている欠損ヘルパーウイルスから別の場所で提供される。
【０００７】
組換え型アデノウイルスは、インビトロおよびインビボの双方において遺伝子輸送ベクターとして用いられている。遺伝子輸送ベクターとしてのその主たる魅力は、分裂および非分裂細胞を含む広範な細胞に感染できること、そして細胞培養において高いウイルス力価まで増殖できることである。アデノウイルスゲノムに異種DNAを挿入するために多くの系（system）が開発されている。アデノウイルスゲノムは酵母人工染色体（YAC、Ketnerら、PNAS 91：6186〜90、1994を参照されたい）に挿入されている。アデノウイルスYACを含む酵母細胞に変異含有プラスミドをトランスフェクトさせることによって、変異をゲノムに導入してもよい。YACとプラスミドとの相同的組換えにより、アデノウイルスゲノムに変異が導入される。アデノウイルスゲノムは、制限酵素消化によってYACから除去することができ、制限酵素消化によって放出されたゲノムは、宿主細胞にトランスフェクトした場合に感染性である。二つのプラスミドを用いる類似の系が大腸菌において開発されている（Crouzetら、PNAS 94：1414〜1419、1997、および米国特許第6,261,807号を参照されたい）。この系において、アデノウイルスゲノムをinc-P由来レプリコンに導入する。ColE1複製起点を含むプラスミドとの相同的組換えによって、変異が導入される。inc-PプラスミドにおけるITRは、ウイルスゲノムの残りには存在しない制限部位に隣接し、このように感染性のDNAが制限酵素消化によってプラスミドから放出されうる。
【０００８】
組換え部位配列を含むおよび／またはリコンビナーゼをコードする多くのウイルスが調製されている。例えば、Creリコンビナーゼは、組換え型アデノウイルスから発現されて、lox部位に隣接するマウスゲノムから断片を切除するために用いられている（Wangら、PNAS 93：3932〜3936、1996を参照されたい）。米国特許第6,156,497号は、ITR、パッケージングシグナル、対象DNA、および組換え部位を有する第一の核酸と、組換え部位およびそれに対して末端タンパク質が結合するITRを有する第二の核酸とを利用して、アデノウイルスゲノムを構築する系を記述している。リコンビナーゼの存在下で二つの分子を結合させて、感染性のウイルスDNAを形成する。
【０００９】
バキュロウイルスは、節足動物に感染する大きいエンベロープを有するウイルスである。バキュロウイルスゲノムは、長さが約130 kbpの二本鎖DNA分子である。ウイルスを培養するために用いられる昆虫細胞は、翻訳後改変をより厳密に模倣する可能性があることから、バキュロウイルスは、タンパク質、特に真核生物（例えば、哺乳類）からのタンパク質を発現させるための系として広く用いられるようになった。
【００１０】
組換え型バキュロウイルスを利用する多数の発現系が開発されている。異種タンパク質を発現させるための組換え型バキュロウイルスを構築する一般的な方法は、Piwnica-Wormsら（1997）「Expression of Proteins in Insect Cells Using Baculovirus Vectors」、「Current Protocols in Molecular Biology」、16章、16.9.1〜16.11.12、Ausubelら編、John Wiley & Sons,Incに認められるであろう。他の発現系も既知であり、例えばClarkらに交付された米国特許第6,255,060号は、タグを含むヌクレオチド配列を発現するためのバキュロウイルス発現系を開示している。Millerに交付された米国特許第5,244,805号は、バキュロウイルスにおいて本来認められない改変プロモーターを利用するバキュロウイルス発現系を開示している。Summersらに交付された米国特許第5,169,784号は、二つのプロモーター（例えば、バキュロウイルス初期プロモーターおよびバキュロウイルス後期プロモーター）を利用するバキュロウイルス発現系を開示している。Guarinoらに交付された米国特許第5,162,222号は、バキュロウイルス前初期プロモーター（すなわち、IEN）からの異種タンパク質を発現する安定した細胞株または感染性ウイルスを作製するために用いることができるバキュロウイルス発現系を開示している。Summersらに交付された米国特許第5,155,037号は、異種遺伝子のプロセシングおよび分泌の効率を改善するための昆虫細胞分泌シグナルを利用するバキュロウイルス発現系を開示している。Guarinoらに交付された米国特許第5,077,214号は、安定な細胞株発現異種遺伝子を構築するためにバキュロウイルス初期遺伝子プロモーターを用いることを開示している。Smithらに交付された米国特許第4,879,239号は、異種遺伝子の発現を制御するためにバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを利用するバキュロウイルス発現系を開示している。
【００１１】
組換え型バキュロウイルスを構築するための様々な方法が用いられている。しばしば用いられる方法は、バキュロウイルスDNAおよび異種配列に隣接するバキュロウイルス配列を含むプラスミドをトランスフェクトすることを含む。プラスミドとバキュロウイルスゲノムとの相同的組換えによって、異種配列を含む組換え型バキュロウイルスが得られる。これによって、組換え型および非組換え型ウイルスの混合集団が得られる。組換え型バキュロウイルスは、プラーク精製によって非組換え型から単離してもよい。このようにして産生されたウイルスは、純粋な株を得るためにプラーク精製を数ラウンド必要とする可能性がある。相同的組換え法によって産生された非組換え型ウイルスのバックグラウンドを減少させる方法が開発されている。例えば、致死的欠失を含む直線状のバキュロウイルスゲノム、BaculoGold（商標）が、BDバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、サンノゼ、カリフォルニア州から市販されている。致死的欠失は、ポリヘドリン座からのバキュロウイルス配列を含むプラスミドとの相同的組換えによって救出される。
【００１２】
バキュロウイルスゲノムへの外来配列の直接挿入を利用する方法も同様に既知である。例えば、Peakmanら（Nucleic Acids Res. 20（3）：495〜500、1992）は、ゲノムにおけるlox部位を有するバキュロウイルスの構築を開示する。Creレコンビナーゼの存在下で、lox部位を有するプラスミドとバキュロウイルスゲノムとのあいだのインビトロ部位特異的組換えによって、異種配列をゲノムに移動させてもよい。Leeらに交付された米国特許第5,348,886号は、Tn7トランスポゾンの組換え部位を含むバクミド（bacmid）（バキュロウイルスゲノム、原核細胞複製起点、および選択マーカーを含むハイブリッド分子）を利用するバキュロウイルス発現系を開示している。バクミドを有する原核細胞を、Tn7組換え部位を有するプラスミドによって、およびTn7部位のあいだの組換えを触媒するために必要な活性を発現するプラスミドによって形質転換する。プラスミド上に存在する異種配列は、Tn7部位のあいだの部位特異的組換えによってバクミドに導入される。組換え型バクミドを原核細胞宿主から精製して、感染を開始するために昆虫細胞に導入してもよい。異種配列を有する組換え型ウイルスは、バクミドをトランスフェクトした細胞によって産生される。
【００１３】
レトロウイルス科は、三つの亜科を含む：1）オンコウイルス亜科；2）スプマウイルス亜科；および3）レンチウイルス亜科。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）は、DNA中間体を通して複製するRNAゲノムを有するウイルスである。レトロウイルス粒子は、RNA-タンパク質ウイルスコアにおいてRNAゲノム2コピーおよびウイルス複製酵素を含む。コアは、ウイルスによってコードされる糖タンパク質および宿主細胞膜で構成されるウイルスエンベロープによって取り囲まれる。感染の初期段階において、レトロウイルスは、RNA-タンパク質複合体を標的細胞の細胞質に輸送する。RNAを二本鎖cDNAに逆転写させて、cDNAと標的細胞ゲノムにcDNAを組み入れるために必要なウイルス因子とを含む組込み前複合体を形成する。複合体は標的細胞の核に移動して、cDNAが標的細胞のゲノムに組み入れられる。この組込みの結果として、ウイルスゲノムに対応するDNA（およびウイルスゲノムに含まれる任意の異種配列）が複製されて、娘細胞に伝えられる。これによって、異種配列を細胞に永続的に導入することが可能となる。
【００１４】
広く多様なレトロウイルスが知られており、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）のような白血病ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）のような免疫不全ウイルスが知られている。レトロウイルスの代表的な例には、テナガザル白血病ウイルス（GALV）、ならびにラウス肉腫ウイルス（RSV）、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）、トリ赤芽球症ウイルス（AEV）ヘルパーウイルス、トリ骨髄細胞腫症ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、ラウス関連ウイルス（RAV）、および骨髄芽球症関連ウイルス（MAV）が含まれるがこれらに限定されないトリ肉腫白血病ウイルス（ASLV）が含まれるがこれらに限定されない。
【００１５】
レトロウイルスは、遺伝子治療ベクターとして広範に用いられている。遺伝子治療ベクターが伝幡するリスクを減少させるために、標的細胞に導入された後複製コンピテントウイルスの産生を防止する改変を有する遺伝子治療ベクターが開発されている。例えば、Pathakらに交付された米国特許第5,741,486号は、宿主細胞において逆転写された場合に欠失されることが望ましい（例えば、シス作用パッキングシグナル）配列に隣接する同方向反復配列を含むレトロウイルスベクターについて記述している。パッキングシグナルの欠失は、レトロウイルス粒子への組換え型ウイルスゲノムのパッケージングを防止して、このように、複製コンピテントウイルスによる感染時に非標的細胞へのレトロウイルスベクターの伝幡を防止する。米国特許第5,686,279号、第5,834,256号、第5,858,740号、第5,994,136号、第6,013,516号、第6,051,427号、第6,165,782号、および第6,218,187号は、組換え型レトロウイルスの高力価保存液を調製するためのレトロウイルスパッケージング系を記述する。組換え型レトロウイルスゲノムをパッケージングするために必要なレトロウイルス機能をコードするプラスミドは、別の場所で提供される。パッケージングされた組換え型レトロウイルスゲノムを回収して、これを用いて所望の標的細胞を感染させてもよい。
【００１６】
ヘルペスウイルス科は、三つの亜科を含む：1）中でもヒトヘルペスウイルスを含むアルファヘルペスウイルス亜科；2）サイトメガロウイルスを含むベータヘルペスウイルス亜科；および3）ガンマヘルペスウイルス亜科。ヘルペスウイルスは、エンベロープを有するDNAウイルスである。ヘルペスウイルスは、形状がほぼ球形の粒子を形成して、これは、直線状のdsDNA 1分子と構造タンパク質約20個とを含む。多くのヘルペスウイルスが広範な宿主から単離されている。例えば、Cochranらに交付された米国特許第6,121,043号は、七面鳥ゲノムのヘルペスウイルスの非必須領域に挿入された外来DNAを含む七面鳥の組換え型ヘルペスウイルスを記述し、Cochranらに交付された米国特許第6,410,311号は、ネコヘルペスウイルスの3.0 kb EcoRI-SalI断片に対応する領域に挿入した外来DNAを含む組換え型ネコヘルペスウイルスを記述し、Meredithらに交付された米国特許第6,379,967号は、ウイルスベクターとしてヘルペスウイルスsaimiri（HVS；リスザルのリンパ球向性ウイルス）を記述し、そしてZambらに交付された米国特許第6,086,902号は、組換え型ウシ1型ヘルペスウイルスワクチンを記述する。
【００１７】
ヘルペスウイルスは、宿主細胞に外因性の核酸材料を輸送するためのベクターとして用いられている。上記の例の他に、Roizmanに交付された米国特許第4,859,587号は、組換え型単純ヘルペスウイルス、ワクチン、および方法について記述し、Fraefelらに交付された米国特許第5,998,208号は、ヘルパーウイルスを用いないヘルペスウイルスベクターパッケージングシステムを記述し、O'Hareらに交付された米国特許第6,342,229号は、融合タンパク質を含むヘルペスウイルス粒子ならびにその調製および用途を記述し、Speckに交付された米国特許第6,319,703号は、必須糖タンパク質gH遺伝子を欠損して、遺伝子産物VP16の機能を障害する変異を有する1型単純ヘルペスウイルス（HSV-1）変異体のような二重変異体ヘルペスウイルスが含まれる組換え型ウイルスベクターを記述している。
【００１８】
フラビウイルス科およびトガウイルス科のウイルスのようなRNAウイルスも同様に、外因性の核酸を標的細胞に輸送するために用いられている。例えば、トガウイルス科のアルファウイルス属のメンバーは、異種RNAおよびポリペプチドを高レベルで発現するために操作されている（Frolovら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：11371〜11377（1996））。アルファウイルスは、プラス鎖RNAウイルスである。一つのゲノムRNA分子がビリオンにパッケージングされる。RNAの複製は、完全長のマイナス鎖RNA中間体の合成によって起こり、これはプラス鎖ゲノムRNAの合成のためのみならず、内部プロモーターから開始したプラス鎖サブゲノムRNAの合成のための鋳型として用いられる。サブゲノムRNAは、感染細胞において非常に高いレベルまで蓄積することができ、そのためにアルファウイルスは一過性の発現系として魅力的である。アルファウイルスの例は、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルスである。クンジンウイルスは、フラビウイルスの例である。クンジンウイルスのサブゲノムレプリコンは、異種ポリペプチドを発現するように操作されている（Khromykh および Westaway、J. Virol. 71：1497〜1505（1997））。フラビウイルスおよびトガウイルスのゲノムRNAはいずれも感染性である；裸のゲノムRNAのトランスフェクションによって、感染性のウイルス粒子が産生される。
【００１９】
組換え型ウイルスを構築する方法は、典型的に労力がかかり時間を要する。対象となる核酸領域を含む組換え型ウイルスを迅速かつ正確に構築するための材料および方法が当技術分野においてなおも必要である。この必要性およびその他は本発明によって満たされる。
【発明の開示】
【００２０】
発明の簡単な概要
本発明は、一部、ウイルスゲノム（例えば、アデノウイルスゲノム、バキュロウイルスゲノム、ヘルペスウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、アデノ随伴ウイルスゲノム、レトロウイルスゲノム、フラビウイルスゲノム、トガウイルスゲノム、アルファウイルスゲノム、RNAウイルスゲノム等）の全てまたは一部を含む核酸分子を提供する。本発明の核酸分子はさらに、ほとんどの場合、互いに組換えを行わない少なくとも二つ（例えば、3、4、5、6、7、8、9、10個等）の組換え部位を含んでもよい。特定の態様において、ウイルスゲノムはアデノウイルスゲノム、バキュロウイルスゲノム、レトロウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスゲノム）、RNAウイルスゲノム、またはヘルペスウイルスゲノムであってもよい。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムではなく、バキュロウイルスゲノムではなく、レトロウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスゲノム）ではなく、および／またはヘルペスウイルスゲノムではない。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、原核生物に感染するウイルスに由来しない。いくつかの態様において、二つまたはそれ以上の組換え部位の一つまたは複数はlox部位ではない。いくつかの態様において、対象となる一つまたは複数の配列を含む核酸分子を、トランスポゾン（例えば、Tn7）に由来する組換え系を用いない組換え系を用いて、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子と混合する。いくつかの態様において、本発明の核酸分子はlox部位を含まなくてもよい。
【００２１】
選択的に、本発明の核酸分子は、核酸分子に対して所望の特徴を付与する一つまたは複数の特徴を含んでもよい。特徴の例には、プロモーター、ウイルス末端反復配列（例えば、長末端反復配列（LTRs））、スプライス部位（例えば、5'-スプライスドナー部位および／または3'-スプライスアクセプター部位）、パッケージングシグナル、一つまたは複数のウイルスタンパク質に反応する核酸配列（例えば、rev反応エレメント（RRE））、認識部位（例えば、制限酵素認識部位）、組換え部位、マーカータンパク質またはポリペプチドをコードする配列（例えば、抗生物質耐性酵素、毒素タンパク質等）、抗体によって認識可能なエピトープをコードする配列（例えば、V5エピトープ）、複製起点（原核および／または真核細胞において機能してもよい）、介在配列（例えば、β-グロビンイントロン）、リボソーム内部認識配列（IRES）、およびポリアデニル化シグナル（例えば、SV40ポリアデニル化シグナル）が含まれるがこれらに限定されない。そのような核酸分子のさらなる例には、少なくとも（1）図1、2、4、5、6、7、8、9、10、15、18、20、22、34、36、37、49、57、58、59、60、69、70、71、もしくは72に示されるベクターの一つもしくは複数の一つもしくは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9個等）の成分、または（2）同じもしくは類似の特徴を核酸分子に付与するそのようなベクターの一つもしくは複数の成分、を含む核酸が含まれる。特定の例として、本発明の核酸分子は、組換え部位の他に、少なくとも一つのブラスチヂジン耐性マーカー（例えば、図22を参照されたい）、少なくとも一つのGP64プロモーター（例えば、図22を参照されたい）、少なくとも一つのRSVプロモーター（例えば、図36Aを参照されたい）、少なくとも一つのβ-グロビンイントロン（例えば、図37Aを参照されたい）、少なくとも一つのアンピシリン耐性マーカー（例えば、図37Aを参照されたい）、および少なくとも一つの細菌複製起点（例えば、37Aを参照されたい）を含むベクターであってもよい。ほとんどの例において、核酸分子に封入するために選択される成分の組み合わせは、特定の用途を意図する活性を提供するように設計されるであろう。例えば、一つより多いタイプの真核細胞（例えば、ヒト細胞および昆虫細胞）において核酸インサートを発現させることができ、原核細胞（例えば、大腸菌細胞）において複製することができるベクターが望ましい場合がある。このように、本発明の核酸分子に含めるように選択された成分は、典型的に、それが設計される特定の用途によって左右されるであろう。本発明にはさらに、例えば本明細書において他でも記述されるように、そのような核酸分子を作製および使用する方法が含まれる。
【００２２】
本発明の核酸を用いて産生されたウイルスは、例えば、細胞または生物に外因性の配列を輸送するために、ウイルスベクター（例えば、少なくとも一つの異種配列を含むウイルス）として用いてもよい。本発明はまた、本発明の核酸および／またはウイルスを含む組成物と共に、そのような核酸、ウイルス、および組成物を作製および使用する方法を企図する。
【００２３】
本発明と共に用いてもよいウイルスゲノム（例えば、レトロウイルスゲノム、アデノウイルスゲノム、ヘルペスウイルスゲノム、RNAウイルスのゲノム、および／またはバキュロウイルスゲノム）は、野生型であってもよく、または一つもしくは複数の変異、挿入、および／または欠失を含んでもよい。いくつかの態様において、本発明の実践において用いられるウイルスゲノムは、一つまたは複数の欠失を含むアデノウイルスゲノムであってもよい。欠失アデノウイルスゲノムは、ゲノムの一つまたは複数の領域において欠失されてもよい。欠失させてもよいアデノウイルスの領域には、E1およびE3領域が含まれるがこれらに限定されない。
【００２４】
本発明において用いられるアデノウイルスゲノムは、感染性であってもよい。いくつかの態様において、アデノウイルスゲノムは一つまたは複数のアデノウイルスタンパク質を発現する細胞（例えば、293細胞におけるE1タンパク質）に導入する場合、感染性であってもよい。いくつかの態様において、本発明において用いられるウイルスゲノムは、Ad5ウイルスゲノムである。
【００２５】
本発明の実践において用いてもよいバキュロウイルスゲノムは、完全なゲノムであってもよく、または例えば、ポリヘドリン座で一つもしくは複数の欠失を含んでもよい。適したゲノムには、バキュロウイルス科の任意のウイルスからのゲノムが含まれる。適したウイルスゲノムには、閉塞バキュロウイルス（例えば、オートグラファ核多角体ウイルス（AcMNPV）、コリストニューラ・フミフェラナ（Choristoneura fumiferana）MNPV（CfMNPV）、マメストラ・ブラッシカ（Mamestra brassicae）MNPV（MbMNPV）、オルジア・シュードツガタ（Orgyia pseudotsugata）MNPV（OpMNPV）、カイコガS核多角体ウイルス（BmNPV）、ヘリオジス・ジー（Heliothis zea）SNPV（HzSnpv）、およびトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni ）SNPV（TnSnpv）のような核多角体ウイルス（NPV））、ならびにグラニュロシスウイルス（GV）（例えば、プロディアグラニュロウイルス（PiGV）、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）グラニュロシスウイルス（TnGV）、ピエリス・ブラッシカ（Pieris brassicae）グラニュロシスウイルス（PbGV）、アルトゲイア・ラパエ（Artogeia rapae）グラニュロシスウイルス（ArGV）、およびシディア・ポモネラ（Cydia pomonella）グラニュロシスウイルス（CpGV））からのゲノムが含まれるがこれらに限定されない。適したゲノムにはまた、非閉塞バキュロウイルス（NOB）（例えば、ヘリオジス・ジー（Heliothis zea）NOB（HzNOB）、オリクテス・リノセロス（Oryctes rhinoceros）ウイルス）等からのゲノムが含まれるがこれらに限定されない。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明の実践において用いられるウイルスゲノムは、一つまたは複数の欠失を含むレトロウイルスゲノムであってもよい。欠失されたレトロウイルスゲノムは、ゲノムの一つまたは複数の領域において欠失されてもよい。欠失されてもよいレトロウイルスゲノムの領域には、gag、pol、env、およびrev領域が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、レトロウイルスゲノムは、5'-LTR、3'-LTRおよびパッケージングシグナル（Ψ）を除く全てのレトロウイルス配列が欠失されてもよい。いくつかの態様において、本発明のレトロウイルスゲノムは、一つまたは複数の異種配列（例えば、もう一つのウイルスのようなもう一つの生物に由来する配列）を含んでもよい。特定の態様において、本発明の核酸分子は、欠失レトロウイルスゲノムを含んでもよく、プロモーター配列であってもよい一つまたは複数の異種配列を含んでもよい。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、欠失レトロウイルスゲノムを含んでもよく、CMVプロモーターをさらに含んでもよい。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、一つまたは複数の複製起点、および選択的に一つまたは複数の選択マーカーを含むプラスミドおよび／またはバクミドの形であってもよい。特定の態様において、本発明の核酸分子（例えば、プラスミドおよび／またはバクミド）は、同じまたは異なる酵素によって認識される可能性がある一つまたは複数の認識配列（例えば、組換え配列、トポイソメラーゼ配列、制限酵素配列等）を含んでもよい。例えば、いくつかの態様において、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含むプラスミドは、互いに組換えしない一つまたは複数の組換え部位を含んでもよい。特定の態様において、本発明の核酸分子（例えば、プラスミドおよび／またはバクミド）は、認識配列を認識する一つまたは複数の制限酵素による消化によってウイルスゲノムを含む直線状の分子が産生されるように配列された、同じまたは異なる制限エンドヌクレアーゼによって認識されてもよい制限酵素認識配列を含んでもよい。いくつかの態様において、制限酵素による消化は、プラスミドおよび／またはバクミドの一部を除去してもよい。例えば、いくつかの態様において、アデノウイルスゲノムの全てまたは一部を含むプラスミドは、複製起点を除去するように、選択的にプラスミドから選択マーカーを除去するように消化してもよい。もう一つの例において、バキュロウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子は、バキュロウイルスゲノムを直線状にする制限酵素によって、例えば二つの組換え部位のあいだに存在する認識部位で核酸分子を切断することによって消化してもよい（図20を参照されたい）。このタイプの態様において、バキュロウイルスゲノムは、バキュロウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子においてそれらと組換えすることができる組換え部位を有する第二の核酸分子との組換えによって再度環状化してもよい。特定の態様において、制限酵素認識部位は、二つの異なる制限酵素によって認識されてもよい。このように、本発明には、組換え型核酸分子（例えば、組換え型バキュロウイルスベクター）を選択する方法が含まれる。方法は、直線状であってもよい第一の核酸分子を第二の核酸分子と組換えさせて、適した宿主細胞に導入した場合に複製することができる環状分子を生成することを含んでもよい。方法はまた、第二の核酸分子との組換えを受けなかった再度環状化された第一の核酸分子に対して選択することを含んでもよい。いくつかの態様において、第一の核酸分子は、直線状のバキュロウイルスゲノムであってもよい。
【００２８】
対象となる核酸配列は、組換えクローニング技術を用いて本発明の核酸分子に挿入してもよい。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、対象となる核酸配列が一つまたは複数の組換え部位との組換えによって本発明の核酸分子に挿入され、挿入後、対象核酸配列が異種プロモーターに機能的に結合するように配列された、異種プロモーター（例えば、CMVプロモーター）および一つまたは複数の組換え部位を含んでもよい。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、互いに組換えしない二つの組換え部位に隣接して存在する異種プロモーターを有してもよい。対象となる核酸配列を、二つの組換え部位のあいだの本発明の核酸分子に挿入して、次に、異種プロモーターに機能的に結合させてもよい。
【００２９】
本発明の核酸に存在する組換え部位のあいだに、如何なる対象核酸配列を配置してもよい。例えば、組換え部位のあいだの核酸配列は、一つまたは複数の対象ポリペプチドをコードしてもよい。本発明のウイルスベクターを用いて、配列のライブラリ、例えばゲノムラブラリまたはcDNAライブラリを発現させてもよい。対象配列は、ポリペプチドをコードする配列であってもよく、またはポリペプチドをコードしない配列であってもよい。ポリペプチドをコードしない対象配列の例には、tRNA配列（例えば、サプレッサーtRNA配列）をコードする配列、リボザイム配列をコードする配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列等が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、対象配列は、一つまたは複数のポリペプチドをコードしてもよく、配列において一つまたは複数の終止コドンをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、組換え部位のあいだの核酸は少なくとも一つの選択マーカーを含む。いくつかの態様において、対象配列は、少なくとも一つのサプレッサーtRNAおよび／または少なくとも一つのアミノアシル-tRNAシンテターゼをコードする配列を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、本発明は、一つより多いウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子を提供する。例えば、本発明の核酸分子は、第一のウイルスゲノム（例えば、レトロウイルスゲノム）の全てまたは一部、および一つまたは複数のさらなるウイルスゲノム（例えば、アデノウイルスゲノム、バキュロウイルスゲノム、ヘルペスウイルスゲノム、ポックスウイルスゲノム、RNAウイルスゲノム等）の全てまたは一部を含んでもよい。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、一つより多いウイルスからの核酸配列を含んでもよい。このタイプの核酸分子は、一つより多いタイプの生物（例えば、哺乳類細胞および昆虫細胞）において核酸の複製を可能にするウイルス配列を含んでもよく、一つより多い細胞種において機能する転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等）として機能することができる配列が含まれてもよい。例えば、一つのウイルス配列は、一つの細胞種（例えば、哺乳類）においてプロモーターとして機能してもよく、もう一つのウイルス配列は、もう一つの細胞種（例えば、昆虫）においてプロモーターとして機能してもよい。
【００３１】
もう一つの局面において、本発明は、一つまたは複数のウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子（例えば、ウイルスベクターのような組換え型ウイルス）を構築する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の方法は、少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含む少なくとも第一の核酸分子、および互いに組換えしない少なくとも第一と第二の組換え部位を提供することを含んでもよい。本発明の方法はまた、第一と第三の組換え部位のあいだ、および第二と第四の組換え部位のあいだでの組換えを引き起こす条件で、少なくとも第三および第四の組換え部位に隣接する少なくとも一つの対象配列を含む少なくとも第二の核酸分子を、少なくとも第一の核酸分子に接触させることを必要としてもよい。いくつかの態様において、ウイルスゲノムはアデノウイルスゲノムであってもよく、例えばAd5アデノウイルスゲノムであってもよい。いくつかの態様において、ウイルスゲノムはバキュロウイルスゲノム、例えばオートグラファ核多角体ウイルス（AcMNPV）ゲノムであってもよい。いくつかの態様において、ウイルスゲノムはレトロウイルスゲノムであってもよい（例えば、レンチウイルスゲノム）。
【００３２】
いくつかの態様において、本発明の方法において用いられるウイルスゲノムの全てまたは一部を含む第一の核酸分子は、複製起点および選択マーカーを含んでもよいプラスミドであってもよい。第一の核酸分子は、選択的に、適当な制限酵素または複数の制限酵素による消化によって、ウイルスゲノム（例えば、アデノウイルスゲノム）を含み、複製起点および／または選択マーカーを欠損する直線状の分子が生成されるように配列された、同じまたは異なる制限酵素に対する配列であってもよい、二つの制限酵素認識配列を含んでもよい。
【００３３】
いくつかの態様において、第一の核酸分子は、互いに組換えしてもしなくてもよい少なくとも第一および第二の組換え部位を含んでもよく、第一および第二の組換え部位のあいだの第一の核酸分子の一部は、少なくとも一つの選択マーカーをコードする配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ウイルス配列を含んでも含まなくてもよい第二の核酸分子は、少なくとも第三および第四の組換え部位、ならびに第三と第四の組換え部位のあいだに対象配列を含んでもよい。対象配列は、如何なる配列であってもよく、例えば、ポリペプチドをコードする配列または機能的RNAの配列（例えば、サプレッサーtRNA配列）であってもよい。いくつかの態様において、対象配列が第一の核酸分子に移入されて、それによってウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、少なくとも一つの対象配列（例えば、ポリペプチドコード領域、tRNAコード配列等）をさらに含む第一の核酸分子が得られるように、第一および第二の核酸分子を一つまたは複数の組換えタンパク質に接触させてもよい。本発明はまた、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、少なくとも一つの対象配列をさらに含む核酸分子を含む組成物と共に、そのような核酸および組成物を作製および用いる方法を企図する。いくつかの態様において、対象配列は、tRNAコード配列であってもよい。
【００３４】
いくつかの態様において、本発明の方法において用いられるウイルスゲノムの全てまたは一部を含む第一の核酸分子は、複製起点と選択マーカーとを含ンでもよいバクミドであってもよい。第一の核酸分子は、選択的に、適当な制限酵素による消化によってウイルスゲノム（例えば、バキュロウイルスゲノム）を含む直線状の分子が生成されるように存在する制限酵素認識配列を含んでもよい。いくつかの態様において、第一の核酸分子は、互いに組換えしてもしなくてもよい少なくとも第一および第二の組換え部位を含んでもよく、制限酵素の認識部位は、組換え部位のあいだに存在してもよい。選択的に、第一と第二の組換え部位のあいだの第一の核酸分子の一部は、少なくとも一つの選択マーカーをコードする配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ウイルス配列を含んでも含まなくてもよい第二の核酸分子は、少なくとも第三および第四の組換え部位を含んでもよく、第三と第四の組換え部位のあいだの配列は、機能的RNAの配列（例えば、サプレッサーtRNA配列）を含む。いくつかの態様において、機能的配列（例えば、サプレッサーtRNA配列をコードする配列）が第一の核酸分子に移入されて、それによって再環状化して、少なくとも一つの機能的配列（例えば、tRNAをコードする配列）をさらに含む第一の核酸分子が得られように、第一および第二の核酸分子を一つまたは複数の組換えタンパク質に接触させてもよい。本発明はまた、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子を含み、少なくとも一つの機能的配列をさらに含む核酸分子を含む組成物と共に、そのような核酸および組成物を作製および用いる方法を企図する。
【００３５】
本発明はまた一部分、ウイルスゲノム（例えば、レトロウイルスゲノム、アデノウイルスゲノム、および／またはバキュロウイルスゲノム）の全てまたは一部を含む核酸分子を構築するために、二つまたはそれ以上（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50、75、100、200個等）の核酸セグメントおよび／または核酸分子を、その少なくとも一つがそれぞれの分子および／またはセグメント上に存在する、組換え部位間の組換え反応によって結合または組み合わせるための材料および方法を提供する。このタイプの態様において、一つまたは複数の核酸セグメントおよび／または核酸分子はウイルス核酸配列を含んでもよい。本発明に従って多数の核酸セグメントおよび／または核酸分子を結合させるためのそのような組換え反応は、インビボ（例えば、細胞、組織、臓器、または生物内で）、またはインビトロで（例えば、無細胞系）で行ってもよい。本発明はまた、本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子を含む宿主および宿主細胞にも関する。本発明はまた、本発明の方法を行うためのキット、本発明の方法を行うための組成物と共に、本発明の方法を行う際に用いられ生成される組成物にも関する。
【００３６】
本発明の方法によって調製された核酸分子は、当業者に既知の如何なる目的に用いてもよい。例えば、本発明の核酸分子を用いて、これらの核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドを発現させてもよく、同様に本発明の方法によって結合される異なる核酸配列を発現させることによって新規融合タンパク質を作製するために用いてもよい。本発明の核酸はまた、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されないRNA分子、例えばtRNA、アンチセンス分子、干渉RNAおよび／またはリボザイムを産生するために用いてもよい。
【００３７】
本発明の核酸分子は、複製欠損ウイルス粒子を作製するための系の一部として用いてもよい。例えば、本発明の核酸分子を、当技術分野で既知の技術を用いてウイルス粒子にパッケージングしてもよい。パッケージングは、必要なパッケージング活性を別の場所で提供することによって、例えば細胞の異なる核酸分子上および／またはゲノム内に提供することによって行ってもよい。特定の例において、本発明の核酸分子を用いて複製欠損レンチウイルスを構築してもよい。特定の態様において、本発明の核酸分子は、レンチウイルスの長末端反復およびパッケージングシグナルを含んでもよく、本発明の核酸分子をパッケージングするために必要な他の活性は、別の場所で提供されてもよく、例えば一つまたは複数のプラスミドから発現されてもよい。
【００３８】
いくつかの局面において、本発明の方法は、本発明の核酸分子を細胞または細胞集団に導入すること、および核酸分子の有無を検出することを含んでもよい。そのような検出は、例えば核酸分子上に存在する一つまたは複数の選択マーカーの有無を検出することによって行ってもよい。選択的に、選択マーカーは、β-ラクタマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であってもよい。検出は、β-ラクタマーゼ活性の蛍光原基質を細胞または細胞集団に接触させること、および細胞または細胞集団の蛍光を検出することによって行ってもよい。特定の態様において、蛍光原基質は、CCF2/AMであってもよく、蛍光は、波長405 nmを有する光を細胞に照射して、波長約450 nmおよび波長約520 nmでの蛍光を検出することによって検出してもよい。方法はまた、450 nmおよび520 nmで認められた蛍光の量を、例えば認められた蛍光量の比を決定することによって比較することを含んでもよい。方法はまた、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）によって所望の核酸分子を有する細胞を物理的に分離することを含んでもよい。
【００３９】
本発明は、本発明の核酸分子を宿主細胞に感染させる、トランスフェクトさせる、形質導入する、および／または導入して、選択的に本発明の核酸分子上に存在する一つまたは複数の対象配列を発現させる方法を提供する。適した宿主細胞は分裂または非分裂細胞であってもよい。特定の態様において、本発明の方法と共に用いられる宿主細胞は非分裂細胞である。例えば、本発明の一つまたは複数の核酸分子を一つまたは複数の非分裂細胞に導入してもよい。一つまたは複数の核酸分子は、ポリペプチドまたは非翻訳RNAをコードしてもよい対象配列を含んでもよい。本発明の方法によって、非分裂細胞において、対象配列によってコードされるポリペプチドまたは非翻訳RNAの産生が得られてもよい。非分裂細胞における対象配列の発現に用いられる本発明の核酸分子は、一つまたは複数のウイルス、例えばアデノウイルスおよび／またはレンチウイルスに由来する一つまたは複数の配列を含んでもよい。非分裂細胞において対象配列を発現させるための本発明の核酸分子は、一つまたは複数のアデノウイルス配列を含んでもよい。非分裂細胞において対象配列を発現させるための本発明の核酸分子は、一つまたは複数のレンチウイルス配列を含んでもよい。
【００４０】
本発明の方法および／または組成物において用いられる組換え部位は、一つまたは複数の組換えタンパク質によって媒介または触媒される組換え反応に関与する核酸分子上の如何なる認識配列であってもよい。一つより多い（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50個等）組換え部位を利用する本発明のそれらの態様において、そのような組換え部位は同じまたは異なっていてもよく、互いに組換えしてもしなくてもよく、または互いに実質的に組換えしなくてもよい。本発明によって企図される組換え部位にはまた、野生型または天然に存在する組換え部位の変異体、誘導体、または変種が含まれる。所望の改変はまた、改変された組換え部位を超えて転写が起こる場合に、転写産物（例えば、mRNA、tRNA、リボザイム等）に所望の配列変化を引き起こすおよび／または翻訳産物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）において所望のアミノ酸変化を引き起こす組換え部位のヌクレオチド配列に対する変化が含まれるように組換え部位に行うことができる。
【００４１】
本発明に従って用いられる好ましい組換え部位には、att部位、frt部位、dif部位、psi部位、cer部位、およびlox部位、またはその変異体、誘導体、および変種（またはその組み合わせ）が含まれる。本発明によって企図される組換え部位にも、そのような組換え部位が含まれる。用いられる組換え部位の特異性に応じて、本発明によって、連結された分子の所望の方向を提供するために核酸分子の一定方向の連結を行うことができ、または連結された分子が無作為な方向を向くように非方向性の連結を行うことができる。
【００４２】
特定の態様において、本発明の実践において用いられる組換え部位は、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3リゾルバーゼ、TndX、XerC、XerD、およびΦC31からなる群より選択される一つまたは複数のタンパク質を含む。特定の態様において、組換え部位は、lox部位、psi部位、dif部位、cer部位、frt部位、att部位、および組換えを受ける能力を保持しているこれらの組換え部位の変異体、変種、および誘導体からなる群より選択される一つまたは複数の組換え部位を含む。
【００４３】
特定の局面において、本発明は、一つまたは複数の終止コドンの抑制によって融合ポリペプチドの制御された発現を可能にする核酸分子および／またはウイルスベクターを提供する。本発明に従って、任意の核酸分子、例えばウイルスゲノムの全てまたは一部を含むプラスミドおよび／または核酸分子、および／または本発明の方法によって産生されたウイルスベクターであってもよい核酸分子は、抑制されてもよい一つまたは複数の終止コドン（例えば、TAG、TAA、および／またはTGA）を含んでもよい対象配列を含んでもよい。このタイプの態様において、mRNAは核酸分子から転写される。転写されたmRNA分子は、対象配列に対応する少なくとも第一のコード配列と、終止コドンによって第一のコード配列から離れている第二のコード領域を含む少なくとも一つのさらなる配列とを含む。終止コドンを抑制することによって、単一のポリペプチド分子における第一および第二のコード配列の双方を発現させることができる。さらなる配列に対応する核酸配列は、対象配列上に含まれてもよく、または組換え部位にもしくは核酸分子上に含まれてもよい。一つまたは複数のサプレッサーtRNA分子は、例えば、プラスミド、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子、および／または本発明のウイルスベクターのような任意の核酸分子から提供してもよい。
【００４４】
本発明のいくつかの態様は、選択された終止コドンの抑制を変化させることにより、選択的または制御された融合タンパク質発現を可能にする。例えば、本発明のウイルスベクターであってもよい核酸分子は、終止コドンを含む領域によって離れている三つの対象コード領域を含んでもよい。一つまたは複数の対象コード領域は、組換え部位に隣接してもよい。第一と第二のコード領域のあいだの終止コドンを抑制することによって、第一および第二のコード領域によってコードされるアミノ酸を含むが、第三の領域によってコードされるアミノ酸を含まない融合ポリペプチドを産生してもよい。このように、異なる終止コドンおよび多様な抑制の制御を用いることによって、対象核酸配列の全てまたは異なる部分によってコードされる様々な融合タンパク質またはその一部を産生することができる。いくつかの態様において、対象配列におけるコード領域の一つまたは複数は、以下の一つまたは複数の全てまたは一部をコードする配列（好ましくはN末端および／またはC末端タグ配列）を含むポリペプチドをコードしてもよい：免疫グロブリンのFc部分、抗体、β-グルクロニダーゼ、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質等）、転写活性化ドメイン、翻訳に関与するタンパク質またはドメイン、タンパク質局在タグ、タンパク質安定化または脱安定化配列、タンパク質相互作用ドメイン、DNA結合ドメイン、タンパク質基質、精製タグ（例えば、エピトープタグ、マルトース結合タンパク質、6ヒスチジンタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ等）、およびエピトープタグ。
【００４５】
一つの局面において、終止コドンは、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子であってもよい、対象配列内、または核酸分子に含まれる組換え部位内のどこに含まれてもよい。好ましくは、終止コドンは、対象配列の末端または末端近傍に存在するが、終止コドンは配列の内部に含まれてもよい。もう一つの局面において、対象配列は、コード配列の後に終止コドンが続く、対象標的遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ORF）の全てまたは一部のコード配列を含んでもよい。終止コドンの後に、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子であってもよいもう一つの核酸分子に対象配列を結合させる組換え部位が続いてもよい。対象配列を核酸分子と結合させて組換え型核酸分子を形成した後、終止コドンを、選択的にサプレッサーtRNA分子によって抑制してもよい。このタイプのいくつかの態様において、一つまたは複数のサプレッサーtRNA分子（同じであっても異なっていてもよい）をコードする一つまたは複数の遺伝子を、同じ核酸分子またはもう一つの核酸分子上に提供してもよい。一つまたは複数のサプレッサーtRNA分子（同じであっても異なっていてもよい）をコードする一つまたは複数の遺伝子は、異なる核酸分子、例えばウイルスゲノム、プラスミド、バクミド、コスミド、BAC、YAC、本発明の核酸分子が挿入される宿主細胞の染色体、または当業者に既知の他の任意の核酸分子上で提供してもよい。いくつかの態様において、サプレッサーtRNAをコードする一つまたは複数の配列は、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子上に提供してもよい。いくつかの態様において、サプレッサーtRNAをコードする1コピーより多い（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50コピー等）遺伝子を提供してもよい。いくつかの態様において、サプレッサーtRNAの転写は、調節可能な（例えば、誘導型または抑制型）プロモーターの制御下であってもよい。他の態様において、サプレッサーtRNAの転写は、構成的プロモーターの制御下であってもよい。サプレッサーtRNAをコードする一つより多い遺伝子が提供される場合、遺伝子は、同じまたは異なっていてもよく、同じまたは異なるプロモーターから発現されてもよい。
【００４６】
対象配列は、終止コドンが抑制されていない場合に本来のN末端を有するORFからポリペプチドを発現させるために、翻訳開始シグナル（例えば、シャイン-ダルガルノ配列、コザック配列および／またはIRES配列）を提供してもよい対象ORFを含んでもよい。さらに、対象配列は、対象配列内の組換え部位となる二つまたはそれ以上の異なる配列の組換えクローニングによって構築してもよい。融合タンパク質の成分をコードする核酸セグメントのあいだに存在する組換え部位は、終止コドンをコードしない、または融合タンパク質の読み取り枠において終止コドンをコードしないように設計してもよい。ポリペプチドをコードする対象配列も同様に、コード配列の3'末端で終止コドン（例えば、抑制型終止コドン）を提供してもよい。同様に、融合タンパク質が、多数の核酸セグメントから形成される場合（例えば、セグメント3、4、5、6、8、10個等）、終止コドンをコードする核酸配列を、各核酸セグメントのあいだから削除することができ、および／または終止コドンをコードする核酸を、一つまたは複数のセグメントの3'末端および／または融合タンパク質コード領域の最も3'のセグメントの3'末端に配置することができる。
【００４７】
いくつかの態様において、タグ配列を対象遺伝子のN末端とC末端の双方に提供してもよい。選択的に、N末端でタグ配列に終止コドンを提供してもよく、対象ORFに終止コドンを提供してもよく、C末端でタグに終止コドンを提供してもよい。終止コドンは同じまたは異なっていてもよい。
【００４８】
いくつかの態様において、N末端タグの終止コドンは、対象ORFの終止コドンとは異なる。このタイプの態様において、終止コドンの一つまたは双方に対応するサプレッサーtRNAを提供してもよい。双方が提供される場合、サプレッサーtRNAのそれぞれは、同じベクター上（例えば、プラスミド、ウイルス等）、異なるウイルスベクターもしくは他のベクター上、または宿主細胞ゲノムにおいて独立して提供してもよい。サプレッサーtRNAは双方が同じように提供される必要はなく、例えば一つを対象遺伝子を含むベクター上に提供してもよく、他方を宿主細胞ゲノムにおいて提供してもよい。
【００４９】
発現シグナル（例えば、プロモーター）の位置に応じて、発現の際に終止コドンを抑制すると、発現されたタンパク質のN末端および／またはC末端でタグ配列を有する融合ペプチドが産生される。終止コドンを抑制しないことによって、N末端および／またはC末端タグ配列を有しない対象配列の発現を得てもよい。このように、本発明は、必要に応じて融合タンパク質の発現を制御するために、組換えによって、一つまたは複数のORF（例えば、1、2、3、4、5、6、10個またはそれ以上のORF）または他の対象配列（例えば、RNAi、tRNA、リボザイム等のような非翻訳配列）を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）の効率的な構築を行うことができる。当業者は、抑制が100％有効ではないことを認識するであろう。このように、抑制条件において、終止コドンで停止するポリペプチドと、終止コドン後をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、ポリペプチドの混合物が産生される。例えば、三つのコード領域が二つの終止コドンによって隔てられている先に考察した場合において、双方の終止コドンを抑制するように設計された条件で、第一のコード領域によってコードされたポリペプチド、プラス第一および第二のコード領域によってコードされるポリペプチド、および三つ全てのコード領域のアミノ酸を含むポリペプチドの多様な量を含む混合物を提供してもよい。
【００５０】
本発明は、本発明の方法によって作成された安定な細胞株および細胞株を作製する方法を提供する。安定な細胞株は、細胞のゲノムに組み入れられてもよい一つもしくは複数の対象配列を組み入れてもよく、または染色体外で維持してもよい。選択的に、対象配列には、その一つまたは複数が対象配列内に存在するコード配列の3'末端またはその近傍に存在してもよい一つまたは複数の終止コドンを含んでもよい。本発明の安定な細胞株は、対象配列に存在する一つまたは複数の終止コドンの抑制を引き起こす条件で、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む一つまたは複数の核酸分子に接触させてもよい。ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子はまた、サプレッサーtRNAを産生する配列の一つまたは複数のコピー（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個等）を含んでもよい。サプレッサーtRNAを発現する核酸分子、例えば、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、サプレッサーtRNAをコードする一つまたは複数の配列を含む核酸分子の非存在下において、本発明の安定な細胞株は、ポリペプチドが本来の一次構造を有するように対象配列によってコードされるポリペプチドを発現してもよい。サプレッサー発現核酸分子、例えばウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、サプレッサーtRNAをコードする一つまたは複数の配列を含む核酸分子の非存在下において、本発明の安定な細胞株は、対象配列によってコードされるポリペプチドといくつかのさらなるペプチド配列とを組み入れる融合タンパク質を発現してもよい。本発明の安定な細胞株はまた、細胞のゲノムにおいて、その配列が誘導型であるプロモーター（例えば、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸、またはそのような核酸分子によってコードされるポリペプチドによって誘導される）の制御下であってもよいサプレッサーtRNAコード配列を含んでもよい。このように、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子を細胞に接触させることによって、サプレッサーtRNAの産生および対象配列に存在する一つまたは複数の終止コドンの抑制が起こる可能性がある。
【００５１】
本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子に組み入れられる対象配列は、少なくとも一つのオープンリーディングフレーム（ORF）（例えば、ORF 1、2、3、4、5、7、10、12、または15個）を含んでもよい。そのような配列はまた、機能的配列（例えば、プライマー結合部位、転写または翻訳部位もしくはシグナル）、ターミネーション部位（例えば、選択的に抑制されてもよい終止コドン）、複製起点等を含んでもよく、しばしば、転写調節配列およびリボゾーム内部認識部位（IRES）として機能する配列を含む、遺伝子の発現を調節する配列を含むであろう。対象配列および／または対象配列に隣接するウイルスゲノムを含む核酸の一部のいずれかは、プロモーターとして機能する配列を含む。対象配列および／またはウイルスゲノムの全てもしくは一部を含む核酸のいずれかまたは双方も同様に、転写終了配列、選択マーカー、制限酵素認識部位等を含んでもよい。
【００５２】
いくつかの態様において、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む本発明の核酸分子は、それぞれのコピーが二つの組換え部位に隣接する同じ選択マーカー2コピーを含んでもよい。他の態様において、これらの分子は、それぞれが二つの組換え部位に隣接する二つの異なる選択マーカーを含んでもよい。いくつかの態様において、これらの選択マーカーの一つまたは複数は、陰性選択マーカー（例えば、ccdB、kicB、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ等）であってもよい。
【００５３】
一つの局面において、本発明は、一つまたは複数のサプレッサーtRNAをコードする組換え型ウイルスベクターを含む組成物を提供する。そのような組成物は、任意の数のさらなる成分、例えば細胞、培地、緩衝液、タンパク質、脂質等を含んでもよい。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスであってもよい。ウイルスベクターは、TAG、TGA、またはTAAから選択される終止コドンの一つを認識する一つまたは複数のサプレッサーtRNAをコードしてもよい。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、複数のサプレッサーtRNA、例えば、終止コドンTAGを認識するサプレッサーtRNA 8個をコードする。
【００５４】
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、実質的に互いに組換えしない少なくとも二つの組換え部位をさらに含む核酸分子と、ポリペプチドとを含む組成物を提供する。このタイプの組成物には任意のポリペプチドが含まれてもよく、例えばポリペプチドはウイルスエンベロープポリペプチドであってもよい。このタイプの組成物は、核酸分子とポリペプチドとを含む粒子の形であってもよい。任意のウイルスゲノムの全てまたは一部が、核酸分子に含まれてもよく、例えばウイルスゲノムは、レンチウイルスゲノム、例えばHIVゲノム（HIV-1のような）であってもよい。このタイプの組成物にとって適したポリペプチドは、水疱性口内炎ウイルスG-タンパク質である。
【００５５】
もう一つの局面において、本発明は、配列が少なくとも第一のコード領域、終止コドンを含む配列によって隔てられている第二のコード領域、および終止コドンを抑制する一つまたは複数のサプレッサーtRNAを含む第二の核酸配列を含む、融合ポリペプチドをコードする第一の核酸配列を含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、第一および／または第二の核酸配列の少なくとも一つは、少なくとも一つのウイルスゲノム（例えば、アデノウイルスゲノム）の全てまたは一部を含む核酸分子上に存在する。いくつかの態様において、一つまたは複数のサプレッサーtRNAは、少なくとも一つのウイルスゲノム（例えば、アデノウイルスゲノム）の全てまたは一部を含む核酸分子から発現される。核酸分子は、TAG、TGA、またはTAAから選択される終止コドンの一つを認識する一つまたは複数のサプレッサーtRNAをコードしてもよい。いくつかの態様において、核酸分子は、複数のサプレッサーtRNAをコードしてもよい。いくつかの態様において、核酸分子は、終止コドンTAGを認識して、アデノウイルスゲノムの全てまたは一部を含んでもよいサプレッサーtRNA 8個をコードしてもよい。
【００５６】
一つの局面において、本発明は、少なくとも一つのウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、互いに実質的に組換えしない少なくとも二つの組換え部位をさらに含む核酸分子を含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、ウイルスゲノムの少なくとも一つは、レンチウイルスゲノム（例えば、HIVゲノム）であってもよい。いくつかの局面において、核酸分子は、宿主細胞のゲノムに安定に組み入れられてもよい。いくつかの態様において、ウイルスゲノムの少なくとも一つは、RNAウイルス（例えば、アルファウイルス、シンドビスウイルス、およびクンジンウイルスのようなトガウイルス科またはフラビウイルス科の）ゲノムであってもよい。
【００５７】
一つの局面において、本発明は、ポリペプチドを発現させる方法を提供する。そのような方法は、核酸分子がウイルスゲノムの全てまたは一部を含む、プロモーターおよびリプレッサー配列に機能的に結合したポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子を細胞に接触させること、リプレッサー配列に結合するタンパク質をコードする核酸分子を細胞に接触させること、およびポリペプチドを発現させるために十分な条件で細胞をインキュベートすることを含んでもよい。このタイプの態様において、ウイルスゲノムは、レンチウイルスゲノム（例えば、HIVゲノム）であってもよい。いくつかの局面において、リプレッサー配列は、テトラサイクリンオペレータ配列であってもよく、タンパク質は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質であってもよく、ポリペプチドを発現するために十分な条件は、リプレッサー配列に対するタンパク質の結合を減少させる化合物（例えば、テトラサイクリン）の存在下で細胞をインキュベートすることを含む。
【００５８】
もう一つの局面において、本発明は、核酸分子が、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、細胞がリプレッサー配列に結合するタンパク質を発現する、プロモーターおよびリプレッサー配列に機能的に結合したポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子を細胞に接触させる段階、ならびにポリペプチドを発現させるために十分な条件で細胞をインキュベートする段階を含む、ポリペプチドを発現させる方法を提供する。このタイプの態様において、ウイルスゲノムは、レンチウイルスゲノム（例えば、HIV）であってもよい。いくつかの局面において、リプレッサー配列は、テトラサイクリンオペレータ配列であってもよく、タンパク質は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質であってもよく、ポリペプチドを発現させるために十分な条件は、リプレッサー配列に対するタンパク質の結合を減少させる化合物（例えば、テトラサイクリン）の存在下で細胞をインキュベートすることを含む。
【００５９】
本発明はまた、本発明の方法を行うため、特に本発明の組換え型ウイルスベクターおよび／または核酸分子を作製するために用いられるキットにも関する。本発明のキットはまた、本発明の方法によって産生された核酸および／またはウイルスベクターをさらに操作するためのさらなる成分を含んでもよい。本発明のキットは、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む一つまたは複数の核酸分子を含んでもよい。そのようなキットは選択的に、一つまたは複数の宿主細胞（例えば、2、3、4、5個等）、分子または化合物を一つまたは複数の宿主細胞に導入する（例えば、トランスフェクションまたは形質転換によって）ための一つまたは複数の試薬、一つまたは複数のヌクレオチド、一つまたは複数のポリメラーゼおよび／または逆転写酵素（例えば、2、3、4、5個等）、一つまたは複数の適した緩衝液（例えば、2、3、4、5個等）、一つまたは複数のプライマー（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50個等）、組み合わせライブラリを作製するための一つまたは複数の分子集団（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50個等）、および一つまたは複数の組み合わせライブラリ（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50個等）からなる群より選択される一つまたは複数のさらなる成分を含んでもよい。本発明のキットはまた、本発明の一つまたは複数の方法を行うための説明書またはプロトコールを含んでもよい。
【００６０】
もう一つの局面において、本発明は、本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子において、核酸セグメントを結合、欠失、または置換するキットを提供し、これらのキットは（1）一つまたは複数の組換えタンパク質、（2）一つまたは複数の組換えタンパク質を含む一つまたは複数の組成物、（3）一つまたは複数の組換え部位を含む少なくとも一つの核酸分子（好ましくは、少なくとも二つの異なる組換え特異性を有するベクター）、（4）ウイルスゲノムの全てまたは一部および一つまたは複数の組換え部位を含む一つまたは複数の核酸分子、（5）リガーゼ活性を有する一つまたは複数の酵素、（6）ポリメラーゼ活性を有する一つまたは複数の酵素、（7）逆転写酵素活性を有する一つまたは複数の酵素、（9）制限エンドヌクレアーゼ活性を有する一つまたは複数の酵素、（10）一つまたは複数のプライマー、（11）一つまたは複数の核酸ライブラリ、（12）高分子を細胞に導入するための一つまたは複数の試薬、（13）一つまたは複数の緩衝液、（14）一つまたは複数の界面活性剤または界面活性剤を含む溶液、（15）一つまたは複数のヌクレオチド、（16）一つまたは複数の終了物質、（17）一つまたは複数のトランスフェクション試薬、（18）一つまたは複数の宿主細胞、（19）一つまたは複数のトポイソメラーゼ、（20）少なくとも一つのトポイソメラーゼが結合する一つまたは複数の核酸分子、（21）少なくとも一つのトポイソメラーゼ認識配列を含む一つまたは複数の核酸分子、および（22）キットの成分の使用説明書、からなる群より選択される少なくとも一つの成分を含む。
【００６１】
さらに、本発明のキットは、一つまたは複数の組換えタンパク質を含んでもよい。当業者に既知の如何なる組換えタンパク質も本発明のキットにおいて提供してもよい。適した組換えタンパク質の例には、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3リゾルバーゼ、ΦC31、TndX、XerC、およびXerDが含まれるがこれらに限定されない。
【００６２】
さらに、本発明のキットは、一つより多い組換え部位（例えば、異なる7個の塩基対オーバーラップ領域を有するatt部位のような、異なる組換え特異性を有する一つまたは複数の組換え部位）を有する一つまたは複数の核酸を含んでもよい。特定の態様において、本発明のキットは、組換え部位、例えばatt部位のあいだの組換えを触媒することができる一つまたは複数の組換えタンパク質を含む組成物を含む。関連する態様において、これらの組成物は、attB×attP（BP）反応、attL×attR（LR）反応、またはBPおよびLR反応の双方を触媒することができる一つまたは複数の組換えタンパク質を含む。
【００６３】
本発明はまた、本発明の方法を行うための組成物および本発明の方法を行う際に作製される組成物にも関する。特に、本発明には、本発明の方法によって調製された組換え型ウイルスベクター、これらのウイルスベクターを含む宿主細胞を調製する方法、これらの方法によって調製された宿主細胞、これらのウイルスベクターによってコードされる産物（例えば、RNA、タンパク質等）を生成するためにこれらの宿主細胞を用いる方法、およびこれらのウイルスベクター（例えば、RNA、タンパク質等）によってコードされる産物が含まれる。
【００６４】
本発明の組成物、方法、およびキットは、Invitrogen Corporation（カールスバッド、カリフォルニア州）から販売されているGATEWAY（商標）組換えクローニングシステムのようなファージラムダ部位特異的組換えシステムを用いて調製して行ってもよい。GATEWAY（商標）テクノロジー説明マニュアル（カタログ番号12539-011、バージョンC、Invitrogen Corporation、カールスバッド、カリフォルニア州）は、このシステムについてより詳細に記述し、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【００６５】
本発明のその他の態様は、当技術分野において公知であることに照らして、本発明の以下の図面および説明に照らして、ならびに請求の範囲に照らして当業者に明らかとなるであろう。
【００６６】
発明の詳細な説明
定義
以下の説明において、組換え型核酸技術において用いられる多数の用語は、広範に利用されている。所定のそのような用語に対する範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確でより一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。
【００６７】
遺伝子：本明細書において用いられるように、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、または非翻訳RNA（例えば、rRNA、tRNA、アンチセンスRNA）の発現にとって必要な情報を含む核酸を指す。遺伝子がタンパク質をコードする場合、これには、プロモーターおよび構造遺伝子のオープンリーディングフレーム配列（ORF）と共に、タンパク質の発現に関与する他の配列が含まれる。遺伝子が非翻訳RNAをコードする場合、これにはプロモーターおよび非翻訳RNAをコードする核酸が含まれる。
【００６８】
構造遺伝子：本明細書において用いられるように、「構造遺伝子」という句は、メッセンジャーRNAに転写されて、その後特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列に翻訳される核酸を指す。
【００６９】
宿主：本明細書において用いられるように、「宿主」という用語は、複製可能な発現ベクター、クローニングベクター、または任意の核酸分子のレシピエントである、任意の原核生物または真核生物（例えば、哺乳類、昆虫、酵母、植物、トリ、動物等）を指す。核酸分子は、対象配列、転写調節配列（プロモーター、エンハンサー、リプレッサー等のような）、および／または複製起点を含んでもよいがこれらに限定されない。本明細書において用いられるように、「宿主」、「宿主細胞」、「組換え型宿主」、および「組換え型宿主細胞」という用語は、互換的に用いてもよい。そのような宿主の例に関しては、Sambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、ニューヨークを参照されたい。
【００７０】
転写調節配列：本明細書において用いられるように、「転写調節配列」という句は、（1）メッセンジャーRNAへの一つもしくは複数の構造遺伝子（例えば、2、3、4、5、7、10個等）の転写、または（2）一つもしくは複数の遺伝子の非翻訳RNAへの転写、を調節するように作用する任意の形状または幾何学の核酸分子に含まれるヌクレオチドの機能的鎖を指す。転写調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、オペレーター（例えば、tetオペレーター）等が含まれるがこれらに限定されない。
【００７１】
プロモーター：本明細書において用いられるように、プロモーターは、転写調節配列の例であり、特に、開始コドンまたは非翻訳RNAをコードする核酸に対して近位に存在する遺伝子の5'-領域として一般的に記述される核酸である。隣接する核酸セグメントの転写は、プロモーターまたはその近傍で開始される。抑制型プロモーターの転写速度は、抑制物質に反応して減少する。誘導型プロモーターの転写速度は、誘導物質に反応して増加する。構成的プロモーターの転写速度は、特に調節されないが、これは一般的な代謝条件の影響下で変化しうる。
【００７２】
標的核酸分子：本明細書において用いられるように、「標的核酸分子」という句は、対象核酸セグメント、好ましくは、本発明の化合物および方法を用いた場合に作用すべき核酸を指す。そのような標的核酸分子は、一つもしくは複数（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50個等）の遺伝子または遺伝子の一つもしくは複数の領域を含んでもよい。
【００７３】
インサートドナー：本明細書において用いられるように、「インサートドナー」という句は、インサートを有する本発明の二つの親核酸分子（例えば、RNAまたはDNA）の一つを指す（図1を参照されたい）。インサートドナー分子は、双方の側に組換え部位が隣接するインサートを含む。インサートドナーは、直線状または環状となりうる。本発明の一つの態様において、インサートドナーは、選択的に高次コイルを形成する環状の核酸分子であり、組換えシグナルの外側でクローニングベクター配列をさらに含む。インサートの集団または核酸セグメントの集団を用いてインサートドナーを作製する場合、インサートドナー集団が得られ、これを本発明に従って用いてもよい。インサートドナーは、エントリークローンと呼んでもよい。
【００７４】
インサート：本明細書において用いられるように、「インサート」という用語は、より大きい核酸分子の一部である所望の核酸セグメントを指す。多くの場合、インサートは、より大きい核酸分子に導入されるであろう。例えば、図2においてccdB、DNA-A、およびDNA-Bと呼ばれる核酸セグメントは、そこに示されるより大きい核酸分子に関して核酸インサートである。多くの場合、インサートは、組換え部位、トポイソメラーゼ部位、および／または他の認識配列（例えば、少なくとも一つの認識配列がそれぞれの末端に存在するであろう）に隣接するであろう。しかし、特定の態様において、インサートは、一方の末端で認識配列を含むのみであろう。
【００７５】
産物：本明細書において用いられるように、「産物」という用語は、組換えクローニングプロセスの際の第二の組換え事象後に産生されるAおよびD配列を含む所望の娘分子の一つを指す（図1を参照されたい）。産物は、クローニングまたはサブクローニングすべきであった核酸を含む。本発明に従って、インサートドナー集団を用いる場合、得られた産物分子の集団はインサートドナーのインサート集団の全てまたは一部を含み、好ましくは、インサートドナーの当初の分子の代表的な集団を含むであろう。
【００７６】
副産物：本明細書において用いられるように、「副産物」という用語は、クローニングまたはサブクローニングされることが望ましいセグメントを欠損する娘分子（組換えクローニングプロセスの際の第二の組換え事象後に産生される新しいクローン）を指す。
【００７７】
同時組込体：本明細書において用いられるように、「同時組込体」とは、双方の親（開始）分子を含む本発明の少なくとも一つの組換え中間体核酸分子を指す。同時組込体は、直線状または環状であってもよい。RNAおよびポリペプチドは、適当な宿主細胞株、例えば大腸菌DB3.1（特に、大腸菌LIBRARY EFFICIENCY（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞）を用いて同時組込体から発現させて、同時組込分子上に認められる双方の選択マーカーに関して選択してもよい。
【００７８】
認識配列：本明細書において用いられるように、「認識配列」または「認識部位」という句は、それに対してタンパク質、化学化合物、DNA、またはRNA分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、改変メチラーゼ、トポイソメラーゼ、またはリコンビナーゼ）が認識して結合する特定の配列を指す。本発明において、認識配列は、組換え部位またはトポイソメラーゼ部位を指してもよい。例えば、Creリコンビナーゼの認識配列はloxPであり、これは8塩基対のコア配列に隣接する13塩基対の逆方向反復配列（リコンビナーゼ結合部位として作用する）2個を含む34塩対の配列である（Sauer, B.、Current Opinion in Biotechnology、5：521〜527（1994）の図1を参照されたい）。認識配列の他の例は、attB、attP、attL、およびattR配列であり、それらはリコンビナーゼ酵素λインテグラーゼによって認識される。attBは、二つの9塩基対コアタイプInt結合部位と7塩基対のオーバーラップ領域とを含む約25塩基対の配列である。attPは、コアタイプInt結合部位とアームタイプのInt結合部位と共に、補助タンパク質組込宿主因子（IHF）、FIS、およびエキシジョナーゼ（Xis）の部位を含む約240塩基対の配列である（Landy、Current Opinion in Biotechnology 3：699〜707（1993）を参照されたい）。そのような部位はまた、本発明の方法における産物の産生を増強するために本発明に従って操作してもよい。例えば、そのような操作部位が、組換え反応を非可逆的にするためにP1またはH1ドメインを欠損する場合（例えば、attRまたはattP）、そのような部位は、これらの部位のドメインがある程度改変されていることを示すために、attR'またはattP'と命名してもよい。
【００７９】
組換え型タンパク質：本明細書において用いられるように、「組換えタンパク質」という句には、野生型タンパク質（Landy、Current Opinion in Biotechnology 3：699〜707（1993）を参照されたい）、またはその変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質）、断片、および変種であってもよい一つまたは複数の組換え部位（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50個等）を含む組換え反応に関与する切除または組込みタンパク質、酵素、共因子、または関連タンパク質が含まれる。組換えタンパク質の例には、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3リゾルバーゼ、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、SpCCE1、およびParAが含まれる。
【００８０】
リコンビナーゼ：本明細書において用いられるように、「リコンビナーゼ」という用語は、組換え反応において鎖の切断および再ライゲーションを触媒するタンパク質を指すために用いられる。部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物（例えば、ウイルスおよび細菌）に存在するタンパク質であり、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼ特性の双方を有するという特徴を有する。これらのリコンビナーゼ（場合によっては関連タンパク質と共に）、核酸分子における塩基の特異的配列を認識して、それらの配列に隣接する核酸セグメントを交換する。リコンビナーゼおよび関連タンパク質は、集合的に「組換えタンパク質」と呼ばれる（例えば、Landy、Current Opinion in Biotechnology 3：699〜707（1993）を参照されたい）。
【００８１】
様々な生物に由来する多くの組換え系が記述されている。例えば、Hoessら、Nucleic Acids Research 14（6）：2287（1986）；Abremskiら、J. Biol. Chem. 261（1）：391（1986）；Campbell、J. Bacteriol. 174（23）：7495（1992）；Qianら、J. Biol. Chem. 267（11）：7794（1992）；Arakiら、J. Mol. Biol. 225（1）：25（1992）；Maeser および Kahnmann、Mol. Gen. Genet. 230：170〜176（1991）；Espositoら、Nucl. Acids. Res. 25（18）：3605（1997）を参照されたい。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Argosら、EMBO J. 5：433〜440（1986）；Voziyanovら、Nucl. Acids. Res. 27：930（1999））。おそらくこれらの中で最もよく研究されているのは、バクテリオファージλのインテグラーゼ/att系（Landy A.、Current Opinions in Genetics and Devel. 3：699〜707（1993））、バクテリオファージP1のCre/loxP系（Hoess および Abremski（1990）、「Nucleic Acids and Molecular Biology」、第4巻、Eckstein and Lilley編、Berlin-Heidelberg:Springer-Verlag；90〜109頁）、および出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）2μサークルプラスミドのFLP/FRT系（Broachら、Cell 29：227〜234（1982））である。
【００８２】
組換え部位：本明細書において用いられるように、「組換え部位」という用語は、組換えタンパク質によって組込／組換え反応に関与する核酸分子上の認識配列を指す。組換え部位は、組込または組換えの初期段階の際に部位特異的組換えタンパク質によって認識および結合される関与核酸分子上の核酸の不連続な部分またはセグメントである。例えば、Creリコンビナーゼの組換え部位は、loxPであり、これは8塩基対のコア配列に隣接する13塩基対の逆方向反復配列（リコンビナーゼ結合部位として作用する）2個を含む34塩対の配列である（Sauer, B.、Curr. Opin. Biotech.、5：521〜527（1994）の図1を参照されたい）。組換え部位の他の例には、その全てが参照として本明細書に特に組み入れられる、1999年5月28日に提出された米国特許仮出願第60/136,744号、2000年3月9日に提出された第60/188,000号、ならびに同時係属中の米国特許第出願第09/517,466号および第09/732,91号に記載されるattB、attP、attL、およびattR配列、ならびにその変異体、断片、変種、および誘導体が含まれ、それらは組換えタンパク質λIntならびに補助タンパク質組込宿主因子（IHF）、FIS、およびエキシジョナーゼ（Xis）によって認識される（Landy、Curr. Opin. Biotech. 3：699〜707（1993）を参照されたい）。
【００８３】
組換え部位は、かなり多数の既知の方法によって分子に付加してもよい。例えば、組換え部位は、平滑末端ライゲーション、完全もしくは部分的ランダムプライマーによって行ったPCR、または組換え部位に隣接する制限部位を用いてベクターに核酸分子を挿入することによって、核酸分子に付加することができる。
【００８４】
トポイソメラーゼ認識部位：本明細書において用いられるように、「トポイソメラーゼ認識部位」または「トポイソメラーゼ部位」は、部位特異的トポイソメラーゼによって認識および結合される規定のヌクレオチド配列を意味する。例えば、ヌクレオチド配列5'-(C/T)CCTT-3'は、ワクシニアウイルスDNAトポイソメラーゼIを含むほとんどのポックスウイルストポイソメラーゼが特異的に結合するトポイソメラーゼ認識部位であるが、これは認識部位の最も3'に近いチミジンの後で鎖が切断されて、5'-(C/T)CCTT-PO4-TOPOを含むヌクレオチド配列、すなわち、トポイソメラーゼにおけるチロシン残基を通して3'リン酸基に共有結合したトポイソメラーゼ複合体を産生する（Shuman、J. Biol. Chem. 266：11372〜11379、1991；Sekiguchi および Shuman、Nucl. Acids. Res. 22：5360〜5365、1994を参照されたい；そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる；同様に参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,766,891号；PCT/US第95/16099号、およびPCT/US第98/12372号も同様に参照されたい）。比較すると、ヌクレオチド配列5'-GCAACTT-3'は、タイプIA大腸菌トポイソメラーゼIIIのトポイソメラーゼ認識部位である。
【００８５】
組換えクローニング：本明細書において用いられるように、「組換えクローニング」という用語は、米国特許第5,888,732号、第6,143,557号、第6,171,861号、第6,270,969号、および第6,277,608号（その内容は完全に参照として本明細書に組み入れられる）に記述されるような方法を指し、それによって核酸分子セグメントまたはそのような分子の集団が、インビトロまたはインビボで交換、挿入、置換、置換、または改変される。好ましくは、そのようなクローニング法はインビトロ法である。
【００８６】
規定の組換え部位で組換えを利用するクローニングシステムは、全てがInvitrogen Corporation、カールスバッド、カリフォルニア州に与えられ、その開示の全文が特に参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,888,732号、米国特許第6,143,557号、米国特許第6,171,861号、米国特許第6,270,969号、および米国特許第6,277,608号ならびに2000年3月2日に提出された係属中の米国特許出願第09/517,466号、および公告された米国特許出願第2002 0007051-A1に既に記述されている。簡単に説明すると、これらの特許および出願に記載されるGATEWAY（商標）クローニングシステムは、インビボまたはインビトロで所望の核酸分子をクローニングするために少なくとも一つの組換え部位を含むベクターを利用する。いくつかの態様において、システムは、野生型（att0）部位から変異したバクテリオファージλシステムに基づいてもよい少なくとも二つの異なる部位特異的組換え部位（例えば、att1およびatt2）を含むベクターを利用する。それぞれの変異部位は、同じタイプ（例えば、attB1とattP1、またはattL1とattR1）のその同源のパートナーatt部位（すなわち、その結合パートナー組換え部位）に関して独自の特異性を有し、他の変異型の組換え部位または野生型att0部位と相互反応しないであろう。部位特異性が異なることによって、所望の分子の方向性のクローニングまたは連結を行うことができ、このようにしてクローニングされた分子の所望の方向を提供する。時にデスチネーションベクターと呼ばれるレシピエントプラスミド分子上のatt部位に隣接する選択マーカー（例えば、ccdb）を置換することによって、GATEWAY（商標）システムを用いて、組換え部位に隣接する核酸断片をクローニングおよびサブクローニングする。次に、所望のクローンをccdB感受性宿主株の形質転換およびレシピエント分子上でのマーカーの陽性選択によって選択する。哺乳類および昆虫におけるチミジンキナーゼ（TK）のような陰性選択に関する類似の戦略（例えば、毒素遺伝子の利用）を、他の生物において用いることができる。
【００８７】
att部位のコア領域における特定の残基を変異させると、多数の異なるatt部位を作製することができる。GATEWAY（商標）において利用されるatt1およびatt2部位と同様に、それぞれのさらなる変異は、おそらく、同じ変異を有するその同源のパートナーatt部位に限って組換えして、他の任意の変異体または野生型att部位とは交叉反応しないであろう独自の特異性を有する新規att部位を作製する。新規変異att部位（例えば、attB 1-10、attP 1-10、attR 1-10、およびattL 1-10）は、特に参照として本明細書に組み入れられる、2000年3月2日に提出された以前の特許出願番号第09/517,466号に記載されている。独自の特異性を有する他の組換え部位（すなわち、第一の部位はその対応する部位と組換えして、異なる特異性を有する第二の部位とは組換えしない、または実質的に組換えしないであろう）を用いて、本発明を実践してもよい。適した組換え部位の例には、loxP部位；loxP部位変異体、変種またはloxP511のような誘導体（米国特許第5,851,808号を参照されたい）；frt部位；frt部位変異体、変種または誘導体；dif部位；dif部位変異体、変種、または誘導体；psi部位；psi部位変異体、変種または誘導体；cer部位；およびcer部位変異体、変種、または誘導体が含まれるがこれらに限定されない。
【００８８】
リプレッションカセット：本明細書において用いられるように、「リプレッションカセット」は、サブクローニングベクターに存在するリプレッサーまたは選択マーカーを含む核酸セグメントを指す。
【００８９】
選択マーカー：本明細書において用いられるように、「選択マーカー」という句は、分子（例えばレプリコン）またはそれを含む細胞に関して陽性または陰性の選択をさせる、および／または核酸セグメントを含むまたは含まない細胞または生物の同定を可能にする核酸セグメントを指す。しばしば、選択および／または同定は特定の条件で起こり、他の条件では起こらない。
【００９０】
マーカーは、RNA、ペプチド、もしくはタンパク質の産生のような、しかしこれに限定されない活性をコードしうる、またはRNA、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物または組成物等の結合部位を提供しうる。選択マーカーの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：（1）そうでなければ毒性である化合物（例えば、抗生物質）に対して耐性を提供する産物をコードする核酸セグメント；（2）レシピエント細胞においてそうでなければ欠損している産物（例えば、tRNA遺伝子、栄養要求マーカー）をコードする核酸セグメント；（3）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；（4）容易に同定されうる産物（例えば、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、および細胞表面タンパク質のような表現型マーカー）をコードする核酸セグメント；（5）細胞の生存および／または機能にとってそうでなければ有害である産物に結合する核酸セグメント；（6）先の1〜5に記載した任意の核酸セグメントの活性をそうでなければ阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（7）基質を改変する産物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に結合する核酸セグメント；（8）所望の分子（例えば、特異的タンパク質結合部位）を単離または同定するために用いることができる核酸セグメント；（9）そうでなければ非機能的となりうる特異的ヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の亜集団のPCR増幅のため）；（10）存在しなければ、特定の化合物に対して直接または間接的に耐性または感受性を付与する核酸セグメント；および／または（11）レシピエント細胞において、毒性である（例えば、ジフテリア毒素）産物、または比較的非毒性の化合物を毒性化合物に変換する産物（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）をコードする核酸セグメント；（12）それらを含む核酸分子の複製、分配、または遺伝を阻害する核酸セグメント；および／または（13）条件的複製機能、例えば特定の宿主もしくは宿主細胞株における、または特定の環境条件（例えば、温度、栄養条件等）における複製をコードする核酸セグメント。
【００９１】
選択および／または同定は、当技術分野で周知の技術を用いて行ってもよい。例えば、選択マーカーは、そうでなければ毒性である化合物に対する耐性を付与してもよく、選択は、選択マーカーを含むそれらの宿主細胞のみが生存する条件で毒性化合物を宿主細胞集団に接触させることによって行ってもよい。もう一つの例において、選択マーカーは、そうでなければ良性の化合物に耐性を付与してもよく、選択は、選択マーカーを含まない宿主細胞のみが生存する条件で、良性の化合物を宿主細胞集団に接触させることによって行ってもよい。適当な条件を選択することによって、選択マーカーによって、マーカーを含むまたは含まない宿主細胞を同定することが可能となるであろう。一つの局面において、選択マーカーによって、マーカーの有無を決定するために宿主細胞の視覚的スクリーニングを行うことができる可能性がある。例えば、選択マーカーは、それを含む細胞の色および／または蛍光特徴を変化させる可能性がある。この変化は、選択マーカーによってコードされるポリペプチドと化合物との相互作用（例えば、基質として化合物を用いる酵素反応）の結果として、一つまたは複数の化合物の存在下で起こってもよい。視覚的特徴におけるそのような変化を用いて、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）によって、選択マーカーを含む細胞を、それを含まない細胞と物理的に分離することができる。
【００９２】
多数の選択マーカーを同時に用いて、様々な細胞集団を区別してもよい。例えば、本発明の核酸分子は、その一つまたは複数が適した反応（例えば、組換え反応）によって核酸分子から除去されてもよい多数の選択マーカーを有してもよい。反応後、核酸分子を宿主細胞集団に導入して、選択マーカーの全てを有する核酸分子を含む宿主細胞を、一つまたは複数の選択マーカーが除去されている（例えば、組換え反応によって）核酸分子を含む宿主細胞と区別してもよい。例えば、本発明の核酸分子は、1対の組換え部位の外部にブラスチシジン耐性マーカー、および組換え部位内に選択マーカーをコードするβ-ラクタマーゼを有してもよい。組換え反応および反応混合物を細胞集団に導入した後、ブラスチシジンを細胞集団に接触させることによって、任意の核酸分子を含む細胞を選択することができる。組換え反応を受けた核酸分子を含む細胞は、下記のように蛍光原性のβ-ラクタマーゼ基質を細胞集団に接触させること、および細胞集団の蛍光を観察することによって、無反応の核酸分子を含む細胞と区別することができる。選択的に、所望の細胞を、例えばFACSによって望ましくない細胞から物理的に分離することができる。
【００９３】
本発明の特定の態様において、選択マーカーは、酵素活性（例えば、β-ラクタマーゼ活性）を有するポリペプチドをコードする核酸配列であってもよい。β-ラクタマーゼ活性のアッセイは当技術分野で既知である。1999年9月21日にTsienらに交付された米国特許第5,955,604号、1998年4月21日にTsienらに交付された第5,741,657号、2000年2月29日にTsienらに交付された第6,031,094号、2001年9月18日にTsienらに交付された第6,291,162号、および2002年10月29日にTsienらに交付された第6,472,205号は、レポーター遺伝子としてのβ-ラクタマーゼおよびβ-ラクタマーゼ活性を検出するために用いられる蛍光原基質を用いることを開示し、これは参照として本明細書に特に組み入れられる。本発明の一つの態様において、選択マーカーは、β-ラクタマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であってもよく、β-ラクタマーゼ活性に関して宿主細胞をアッセイすることによって所望の宿主細胞を同定してもよい。
【００９４】
β-ラクタマーゼは、β-ラクタム環の加水分解を触媒する。当業者は、β-ラクタマーゼ活性を有する多くのポリペプチドの配列が既知であることを認識するであろう。先に記載したTsienらの特許に開示された特異的β-ラクタマーゼの他に、β-ラクタマーゼ活性を有する如何なるポリペプチドも本発明において用いるために適している。
【００９５】
β-ラクタマーゼは、アミノ酸およびヌクレオチド配列に基づいてクラスA〜Dに分類される（Ambler, R.P.、Phil. Trans. R. Soc. Lond.[Ser.B]289：321〜331（1980））。クラスAβ-ラクタマーゼは、活性部位においてセリンを有し、分子量は約29 kDである。このクラスは、pBR322のRTEM酵素のようなプラスミド媒介TEMβ-ラクタマーゼを含む。クラスBβ-ラクタマーゼは、システイン残基に結合した活性部位亜鉛を有する。クラスC酵素は、活性部位セリンを有し、分子量約39 kDを有するが、クラスA酵素とアミノ酸相同性を有しない。クラスD酵素も同様に、活性部位セリンを含む。それぞれのクラスの代表的な例を、酵素の配列が表記のデータベースにおいて得られるアクセッション番号と共に下記に提供する。
2005532829.tif 000002
2005532829.tif 000003
2005532829.tif 000004
【００９６】
さらなるβ-ラクタマーゼおよび基質特異性に関するより詳しい詳細に関しては、Bushら（1995）、Antimicrob. Agents Chemother. 39：1211〜1233を参照されたい。当業者は、本明細書に開示のβ-ラクタマーゼ活性を有するポリペプチドが、例えば、一つまたは複数のアミノ酸の変異、欠失、および／または付加によって改変される可能性があること、そしてポリペプチドが検出可能なβ-ラクタマーゼ活性を有する限り、なおも本発明の実践において用いてもよいことを認識するであろう。β-ラクタマーゼ活性を有する適切に改変されたポリペプチドの例は、原核および／または真核細胞の細胞質においてポリペプチドが保持されるようにシグナルペプチド配列が欠失および／または改変されているポリペプチドである。そのようなポリペプチドのアミノ酸配列を表30に提供する。
【００９７】
上記の米国特許に記載されるように、アッセイされる宿主細胞を、β-ラクタマーゼ活性の蛍光原基質に接触させてもよい。β-ラクタマーゼの存在下で、基質は切断されて、基質の蛍光放出スペクトルが変化する。一例として、非切断基質は、波長405 nmを有する光で励起した場合に、緑色の蛍光を発し（すなわち、約520 nmで放出最大値を有する）、切断された基質は青色の蛍光を発してもよい（すなわち、約447 nmで放出最大値を有する）。青色蛍光強度に対する緑色蛍光強度の比を決定することによって、産生されたβ-ラクタマーゼの量を決定することができ、そこから細胞の何％がβ-ラクタマーゼを発現するかを計算することができる。蛍光に基づくβ-ラクタマーゼアッセイを行うためのキットは、例えばPan Verra、LLC、マディソン、ウィスコンシン州、カタログ番号K1032から市販されている。
【００９８】
本発明において用いるために好ましいβ-ラクタム蛍光原基質には、β-ラクタムが加水分解されると、アクセプタ部分が分子から放出されるようにセファロスポリン骨格に結合した蛍光ドナー部分と蛍光アクセプター部分とを含む基質が含まれる。β-ラクタムが加水分解される前、ドナーおよびアクセプター部分は、効率的な蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）が起こるように配置される。適した波長の光によって励起されると、アクセプター部分からの蛍光が認められる。β-ラクタムが加水分解されると、アクセプター部分が分子から放出されて、FRETが破壊され、それによって蛍光放出スペクトルの変化が起こる。適した蛍光ドナー分子の例は、クマリンまたはその誘導体（例えば、6-クロロ-7-ヒドロキシクマリン）であり、適したアクセプター分子の例には、フルオレセイン、ロドール、またはローダミンまたはその誘導体が含まれるがこれらに限定されない。適した基質の例には、CCF2およびそのアセトキシメチルエステル誘導体（CCF2/AM）が含まれる。当業者は、CCF2/AMが膜透過性であり、内因性のエラスターゼ酵素の作用によって細胞内でCCF2に変換されることを認識するであろう。β-ラクタマーゼによるCCF2の加水分解の結果を示す略図を図65に示す。
【００９９】
選択スキーム：本明細書において用いられるように、「選択スキーム」という句は、所望の核酸分子またはそれらを含む宿主細胞の選択、濃縮、または同定を可能にする任意の方法を指す（特に、エントリークローンまたはベクター、デスチネーションベクター、ドナーベクター、発現クローンまたはベクター、任意の中間体（例えば、同時組込み体またはレプリコン）、および／または副産物を含む混合物からの産物または産物）。一つの局面において、本発明の選択スキームは、一つまたは複数の選択マーカーに依存する。一つの態様の選択スキームは、組換えクローニングの際に連結しているまたは連結していない少なくとも二つの成分を有する。一つの成分は選択マーカーである。他の成分は、選択マーカーのインビトロもしくはインビボ発現、または選択マーカーを有するプラスミドを有する細胞（または核酸分子、例えばレプリコン）の生存を制御する。一般的に、この制御エレメントは、選択マーカーのリプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マーカーの発現または活性を制御する他の手段を用いることができる。リプレッサーまたはアクチベータを用いるか否かは、当業者に容易に明らかであろうように、マーカーが陽性または陰性選択であるか否か、および様々な核酸セグメントの正確な配置に依存するであろう。いくつかの好ましい態様において、選択スキームによって、一つまたは複数の所望の核酸分子（産物のような）のみの選択または濃縮が起こる。本明細書において定義したように、核酸分子の選択には、（a）所望の核酸分子が存在した場合に選択または濃縮すること（「陽性選択スキーム」と呼ばれる）、および（b）所望の核酸分子ではない核酸分子が存在しない場合に選択または濃縮すること（「陰性選択スキーム」と呼ばれる）が含まれる。
【０１００】
一つの態様において、選択スキーム（逆に行うことができる）は、三つの型の一つとなり、これは図1に関して考察されるであろう。第一に、選択マーカーおよびリプレッサーに関して本明細書において例示したように、セグメントDを有し、セグメ細胞に対して毒性である遺伝子を有する核酸セグメントを有するであろう。毒性遺伝子は、毒性の遺伝子産物（毒性タンパク質またはRNA）として発現される核酸となりうる、またはそれ自身が毒性となりうる。（後者の場合、毒性遺伝子は、「遺伝形質」に関するその古典的な定義を有すると理解される。）
【０１０１】
そのような毒性遺伝子の例は当技術分野で周知であり、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、DpnI、Nla3等）；アポトーシス関連遺伝子（例えば、ASK1またはbcl-2/ced-9ファミリーメンバー）；ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の遺伝子を含むレトロウイルス遺伝子；NP-1のようなデフェンシン；逆方向反復配列または対のパリンドローム核酸配列；ΦX174またはバクテリオファージT4遺伝子のようなバクテリオファージ溶解性遺伝子；rpsLのような抗生物質感受性遺伝子；pheSのような抗菌感受性遺伝子；GATA-1のような細菌に対して毒性の遺伝子産物を産生する、プラスミドキラー遺伝子の真核細胞転写ベクター遺伝子；抑制機能の比存在下で宿主を殺す遺伝子、例えばkicB、ccdB、ΦX174E（Liu, Qら、Curr. Biol. 8：1300〜1309（1998））；およびレプリコンの安定性および／または複製に負の影響を及ぼす他の遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。毒性遺伝子は、またはインビトロで選択可能となりうる、例えば制限部位となりうる。
【０１０２】
誘導型プロモーターに機能的に結合した制限エンドヌクレアーゼをコードする多くの遺伝子が既知であり、本発明において用いてもよい（例えば、米国特許第4,960,707号（DpnIおよびDpnII）；第5,082,784号および第5,192,675号（KpnI）；第5,147,800号（NgoAIIIおよびNgoAI）；第5,179,015号（FspIおよびHaeIII）；第5,200,333号（HaeIIおよびTaqI）；第5,248,605号（HpaII）；第5,312,746号（ClaI）；第5,231,021号および第5,304,480号（XhoIおよびXhoII）；第5,334,526号（AluI）；第5,470,740号（NsiI）；第5,534,428号（SstI/SacI）；第5,202,248号（NcoI）；第5,139,942号（NdeI）；および第5,098,839号（PacI）を参照されたい）（同様に、Wilson, G.G.、Nucl. Acids. Res. 19：2539〜2566（1991）；およびLunnen, K.D.ら、Gene 74：25〜32（1988）も参照されたい）。
【０１０３】
第二の型において、セグメントDは選択マーカーを有する。毒性遺伝子は、ベクタードナー、同時組込体、および副産物分子を有する形質転換体を消失させるが、選択マーカーを用いて、産物を含む細胞を含むように、インサートドナーのみを有する細胞を含まないように選択することができる。
【０１０４】
第三の型は、同じ分子上で同じ側にセグメントAおよびDの双方を有する細胞を選択するが、異なる分子上で異なる側に双方のセグメントを有する細胞を選択しない。これは、それぞれがセグメントAおよびD上に一つずつ存在する二つの不活性断片に分割される選択マーカーによって具体化されうるであろう。
【０１０５】
断片は、セグメントが組換え事象によって生じる場合、それらが機能的選択マーカーを再構成するように組換え部位に対して配置される。例えば、組換え事象はプロモーターを構造的核酸分子（例えば、遺伝子）に連結することができ、構造的核酸分子の二つの断片を連結させることができ、生存にとって必要なヘテロダイマー遺伝子産物をコードする核酸分子を連結させることができ、またはレプリコンの一部を連結させることができる。
【０１０６】
部位特異的リコンビナーゼ：本明細書において用いられるように、「部位特異的リコンビナーゼ」は、典型的に少なくとも以下の四つの活性（またはその組み合わせ）を有するリコンビナーゼのタイプを指す：（1）特異的核酸配列の認識；（2）該配列または複数の配列の切断；（3）鎖の交換に関与するトポイソメラーゼ活性；および（4）切断された核酸鎖を再度結合させるリガーゼ活性（Sauer, B.、Current Opinions in Biotechnology 5：521〜527（1994）を参照されたい）。保存的部位特異的組換えは、双方のパートナーに対する配列特異性の程度が高いことから、相同的組換えおよび転位とは区別される。鎖交換メカニズムは、DNA合成の非存在下で特異的核酸配列の切断および再結合を含む（Landy, A.、（1989）Ann. Rev. Biochem. 58：913〜949）。
【０１０７】
サプレッサーtRNA：翻訳されるmRNAにおける終止コドンに対応する位置でポリペプチドにアミノ酸の組込みが起こるtRNA分子。
【０１０８】
相同的組換え：本明細書において用いられるように、「相同的組換え」という句は、類似のヌクレオチド配列を有する核酸分子が会合してヌクレオチド鎖を交換するプロセスを指す。したがって、第二の核酸分子の既定の位置で相同的組換えを行うために有効な第一の核酸分子のヌクレオチド配列は、第一の核酸分子と第二の核酸分子の既定の位置とのあいだのヌクレオチド鎖の交換を促進するヌクレオチド配列を有するであろう。このように、第一の核酸は一般的に、ヌクレオチドの塩基対形成を促進するために第二の核酸分子の一部と十分に相補的であるヌクレオチド配列を有するであろう。
【０１０９】
相同的組換えは、二つの組換えパートナー核酸において相同な配列を必要とするが、如何なる特定の配列も必要としない。上記のように、例えばatt部位のような組換え部位で起こる部位特異的組換えは、本明細書において用いられるように、「相同的組換え」とは見なされない。
【０１１０】
ベクター：本明細書において用いられるように、「ベクター」という用語は、有用な生物学的または生化学的特性をインサートに提供する核酸分子（好ましくはDNA）を指す。ベクターは、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子であってもよい。例には、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ARS）、動原体、およびインビトロもしくは宿主細胞において複製することができるもしくは複製されうる、または宿主細胞内で所望の位置に所望の核酸セグメントを伝搬することができる他の配列が含まれる。ベクターは、ベクターの本質的な生物機能を失うことなくその場所で既定の方法で配列を操作することができ、その複製およびクローニングを得るためにその中で核酸断片をスプライシングすることができる、一つまたは複数の認識部位（例えば、2、3、4、5、7、10個等の組換え部位、制限部位、および／またはトポイソメラーゼ部位）を有しうる。ベクターは、さらにプライマー部位（例えば、PCRのための）、転写および／または翻訳開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカー等を提供することができる。明らかに、組換え、転位、または制限酵素を用いる必要がない、所望の核酸断片を挿入する方法（PCR断片のウラシルN-グリコシラーゼ（UDG）クローニング（その双方が完全に参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,334,575号および第5,888,795号）のような、しかしこれに限定されない方法）も同様に、本発明に従って用いられるクローニングベクターに断片をクローニングするために応用することができる。クローニングベクターは、クローニングベクターによって形質転換された細胞の同定に用いるために適した一つまたは複数（例えば、2、3、4、5、7、10個等）の選択マーカーをさらに含みうる。
【０１１１】
サブクローニングベクター：本明細書において用いられるように、「サブクローニングベクター」という句は、好ましくは適当なレプリコンを含む環状または直線状の核酸分子を含むクローニングベクターを指す。本発明において、サブクローニングベクター（図1のセグメントD）はまた、クローニングされた核酸インサートに作用するまたはそれと共に作用するために、最終産物に組み入れられることが望ましい機能的および／または調節エレメントを含みうる（図1におけるセグメントA）。サブクローニングベクターはまた、選択マーカー（好ましくはDNA）を含みうる。
【０１１２】
ベクタードナー：本明細書において用いられるように、「ベクタードナー」という句は、所望の産物の一部となる核酸ベクターを含む核酸セグメントを有する本発明の二つの親核酸分子（例えば、RNAまたはDNA）の一つを指す。ベクタードナーは、サブクローニングベクターD（またはインサートドナーがクローニングベクターをまだ含んでいない場合にはクローニングベクターと呼ぶことができる）、および組換え部位に隣接するセグメントCを含む（図1を参照されたい）。セグメントCおよび／またはDは、選択スキームに関して先に記述したように、所望の産物の娘細胞の選択に関与するエレメントを含みうる。組換えシグナルは、同じまたは異なっていてもよく、同じまたは異なるリコンビナーゼによって作用されうる。さらに、ベクタードナーは、直線状または環状となりうる。ベクタードナーは、デスチネーションベクターと呼ばれてもよい。
【０１１３】
プライマー：本明細書において用いられるように、「プライマー」という用語は、核酸分子（例えば、DNA分子）の増幅または重合化の際にヌクレオチド単量体の共有結合によって伸長する一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを指す。一つの局面において、プライマーは、シークエンシングプライマー（例えば、万能シークエンシングプライマー）であってもよい。もう一つの局面において、プライマーは、組換え部位またはその一部を含んでもよい。
【０１１４】
アダプター：本明細書において用いられるように、「アダプター」という用語は、環状または直線状のインサートドナー分子のみならず本明細書に記述の他の核酸分子に付加することができる一つまたは複数の組換え部位を含むオリゴヌクレオチドまたは核酸断片もしくはセグメント（好ましくはDNA）を指す。組換え部位の一部を用いる場合、欠失部分は、インサートドナー分子によって提供されてもよい。そのようなアダプターは、環状または直線状分子内の任意の位置に付加してもよいが、アダプターは、好ましくは直線状分子の一つまたは双方の末端またはその近傍に付加される。好ましくは、アダプターは、特定の対象核酸分子の両側に（隣接して）配置される。本発明に従って、アダプターは、標準的な組換え技術（例えば、制限消化およびライゲーション）によって対象核酸分子に付加してもよい。例えば、アダプターは、第一に分子を適当な制限酵素によって消化して、アダプターを切断部位に付加して、切断部位でアダプターを含む環状分子を再形成することによって環状分子に付加してもよい。もう一つの局面において、アダプターは、相同的組換えによって、RNA分子の組込み等によって付加してもよい。または、アダプターを、直線状の分子の一つまたは複数、および好ましくは双方の末端に直接ライゲーションして、それによって一つまたは双方の末端でアダプターを有する直線状の分子を得てもよい。本発明の一つの局面において、アダプターを、直線状の分子集団（例えば、切断または消化されているcDNAライブラリまたはゲノムDNA）に付加して、該集団の全てまたは実質的な部分の一つおよび好ましくは双方の末端でアダプターを含む直線状の分子集団を形成してもよい。
【０１１５】
アダプター-プライマー：本明細書において用いられるように、「アダプター-プライマー」という句は、本明細書に記述の環状または直線状の核酸分子に付加することができる一つまたは複数の組換え部位（またはそのような組換え部位の一部）を含むプライマー分子を指す。組換え部位の一部を用いる場合、欠失部分は、本発明の核酸分子（例えば、アダプター）によって提供されてもよい。そのようなアダプター-プライマーは、環状または直線状分子内の任意の位置で付加してもよいが、アダプター-プライマーは、好ましくは直線状の分子の一つまたは双方の末端またはその近傍に付加される。そのようなアダプター-プライマーを用いて、多様な状況で、増幅（例えば、PCR）、ライゲーション（例えば、酵素的または化学／合成的ライゲーション）、組換え（例えば、相同的または非相同的（非正統的）組換え）等を含むがこれらに限定されない多様な技術を用いて、環状または直線状核酸分子に対して一つまたは複数の組換え部位または部分を付加してもよい。
【０１１６】
鋳型：本明細書において用いられるように、「鋳型」という用語は、増幅、合成、またはシークエンシングされる二本鎖または一本鎖核酸分子を指す。二本鎖DNA分子の場合、第一および第二の鎖を形成するためのその鎖の変性は、好ましくは、これらの分子が増幅、合成、もしくはシークエンシングされる前に行われるか、または二本鎖分子を鋳型として直接用いてもよい。一本鎖鋳型の場合、鋳型の少なくとも一部と相補的なプライマーが適当な条件でハイブリダイズして、ポリメラーゼ活性を有する一つまたは複数（例えば、2、3、4、5、または7個のDNAポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）のポリペプチドが、鋳型の全てまたは一部と相補的な分子を合成してもよい。または、二本鎖鋳型の場合、一つまたは複数の転写調節配列（例えば、2、3、4、5、7個またはそれ以上のプロモーター）を、一つまたは複数のポリメラーゼと組み合わせて用いて、鋳型の全てまたは一部と相補的な核酸分子を作製してもよい。本発明に従って新たに合成された分子は、当初の鋳型と比較して長さが同じまたはより短くてもよい。新たに合成された分子の合成または伸長の際のミスマッチ取り込みまたは鎖のずれによって一つまたは多くのミスマッチ塩基対が得られる可能性がある。このように、合成された分子は、鋳型と正確に相補的である必要はない。さらに、核酸鋳型の集団は、当初の鋳型集団を典型的に代表する核酸分子集団を作製するために合成または増幅の際に用いてもよい。
【０１１７】
組み入れる：本明細書において用いられるように、「組み入れる」という用語は、核酸（例えば、DNA）分子またはプライマーの一部となることを意味する。
【０１１８】
ライブラリ：本明細書において用いられるように、「ライブラリ」という用語は、核酸分子（環状または直線状）のコレクションを指す。一つの態様において、ライブラリは、共通の起源の生物、臓器、組織、または細胞に由来してもしなくてもよい複数の核酸分子（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50、100、200、500、1000、5000個、またはそれ以上）を含んでもよい。もう一つの態様において、ライブラリは、生物の核酸含有量の全てまたは一部または有意な部分を表す、または細胞、組織、臓器、または生物において発現された核酸分子（それに由来するcDNAライブラリまたはセグメント）の全てまたは一部または有意な部分を表す核酸分子の組である。ライブラリはまた、一つまたは複数の核酸分子のデノボ合成、変異誘発等によって作製されたランダム配列を有する核酸分子を含んでもよい。そのようなライブラリは、一つまたは複数（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50個等）のベクターに含まれてもよく含まれなくてもよい。
【０１１９】
増幅：本明細書において用いられるように、「増幅」という用語は、ポリメラーゼ活性を有する（例えば、1、2、3、4個またはそれ以上の核酸ポリメラーゼまたは逆転写酵素）一つまたは複数のポリペプチドを用いることによって核酸分子のコピー数を増加させる任意のインビトロ法を指す。核酸の増幅によって、DNAおよび／またはRNA分子またはプライマーにヌクレオチドが組み入れられ、それによって鋳型と相補的な新しい核酸分子が形成される。形成された核酸分子およびその鋳型は、さらなる核酸分子を合成するための鋳型として用いることができる。本明細書において用いられるように、一つの増幅反応は、多くの核酸複製ラウンドからなってもよい。DNA増幅反応には、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が含まれる。一つのPCR反応は、DNA分子の変性および合成の5〜100サイクルからなってもよい。
【０１２０】
ヌクレオチド：本明細書において用いられるように、「ヌクレオチド」という用語は、塩基-糖-リン酸基の組み合わせを指す。ヌクレオチドは、核酸分子（DNAおよびRNA）の単量体単位である。ヌクレオチドという用語には、リボヌクレオシド三リン酸、ATP、UTP、CTG、GTPおよびdATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTPのようなデオキシリボヌクレオシド三リン酸、またはその誘導体が含まれる。そのような誘導体には、例えば、例えば、[α-S]dATP、7-デアザ-dGTP、および7-デアザdATPが含まれる。本明細書において用いられるヌクレオチドという用語はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ddNTP）およびその誘導体を指す。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の説明される例には、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、およびddTTPが含まれるがこれらに限定されない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は、標識しなくともよく、または周知の技術によって検出可能に標識してもよい。検出可能な標識には、例えば、放射活性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が含まれる。
【０１２１】
核酸分子：本明細書において用いられるように、「核酸分子」という句は、任意の長さの連続したヌクレオチド（riboNTP、dNTP、ddNTP、またはその組み合わせ）の配列を指す。核酸分子は、完全長のポリペプチドもしくはその任意の長さの断片をコードしてもよく、または非コードであってもよい。本明細書において用いられるように、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に用いてもよく、RNAおよびDNAの双方が含まれる。
【０１２２】
オリゴヌクレオチド：本明細書において用いられるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一つのヌクレオチドの五炭糖の3'位置と隣接するヌクレオチドの五炭糖の5'位置のあいだのホスホジエステル結合によって結合されたヌクレオチドの共有結合配列を含む合成または天然の分子を指す。
【０１２３】
ポリペプチド：本明細書において用いられるように、「ポリペプチド」という用語は、任意の長さの連続したアミノ酸の配列を指す。「ペプチド」、「オリゴペプチド」、または「タンパク質」という用語は、本明細書において「ポリペプチド」という用語と互換的に用いられる可能性がある。
【０１２４】
ハイブリダイゼーション：本明細書において用いられるように、「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズする」という用語は、二本鎖分子を生じる二つの相補的な一本鎖核酸分子（RNAおよび／またはDNA）の塩基対形成を指す。本明細書において用いられるように、二つの核酸分子はハイブリダイズする可能性があるが、塩基対形成は完全には相補的でない。したがって、ミスマッチ塩基は、当技術分野で周知の適当な条件を用いる限り、二つの核酸分子のハイブリダイゼーションを防止しない。いくつかの局面において、ハイブリダイゼーションは、「ストリンジェントな条件」であると言われる。本明細書において用いられる句である「ストリンジェントな条件」とは、50％ホルムアミド、5×SSC（750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、10％硫酸デキストラン、および20 μg/ml変性切断サケ精子DNAを含む溶液において42℃で一晩インキュベートした後、約65℃で0.1×SSCにおいて濾紙を洗浄することを意味する。
【０１２５】
形質導入する：本明細書において用いられるように、「形質導入する」および「形質導入」とは、ウイルスの複製を支持しない細胞種にウイルスを導入して、それによって感染性のウイルス子孫を生じないプロセスを指す。対照的に、「感染する」または「感染症」は、複製を支持し、それによって感染性のウイルス子孫が産生される細胞種へのウイルスの導入を示すために用いられる。
【０１２６】
本明細書において用いられるように、組換え核酸技術ならびに分子および細胞生物学の分野において用いられる他の用語は、利用可能な技術分野の当業者によって一般的に理解されるであろう。
【０１２７】
概要
本発明は、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子、例えば組換え型ウイルスベクターを生成するために、二つまたはそれ以上のセグメントまたは核酸分子を組換えによって結合させるための方法、組成物、およびキットに関する。さらに、本発明は、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子、例えば組換え型ウイルスベクターを産生するために、二つまたはそれ以上のセグメントまたは核酸分子をトポイソメラーゼによって結合させるための方法、組成物、およびキットに関する。本発明はまた、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子、例えば組換え型ウイルスベクターを生成するために、二つまたはそれ以上のセグメントまたは核酸分子を他の手段（例えば、リガーゼ）によって結合させるための方法、組成物、およびキットにも関する。本発明にはまた、そのような核酸分子を調製する方法と共に、そのような核酸分子を含む組成物が含まれる。本発明はまた、これらの分子を利用して宿主細胞を生成する方法、ポリペプチドおよび／またはRNA発現産物を産生するためにこれらの分子を利用する方法を企図する。
【０１２８】
一つの態様において、それぞれが少なくとも一つの組換え部位を含む、少なくとも二つの核酸セグメントを適した組換えタンパク質に接触させて、組換えを受ける組換え部位の分子における位置に応じて、二つの分子の全てまたは一部の結合を行う。それぞれの個々の核酸セグメントは、ウイルス配列、プライマー結合部位として用いるために適した配列（例えば、シークエンシングプライマーまたは増幅プライマーのようなプライマーがハイブリダイズして核酸合成、増幅またはシークエンシングを開始する可能性がある配列）、転写もしくは翻訳シグナル、またはプロモーターおよび／またはエンハンサーのような調節配列、リボソーム結合部位、コザック配列、開始コドン、終止コドンのような終了シグナル、複製起点、組換え部位（またはその一部）、選択マーカー、ならびにGST、GUS、GFP、YFP、CFP、マルトース結合タンパク質、6ヒスチジン（His6）、エピトープ、ハプテン等およびその組み合わせのようなタンパク質融合体（例えば、N末端またはC末端）を作製するための遺伝子または遺伝子の一部、を含むがこれらに限定されない多様な配列を含んでもよい。そのようなセグメントをクローニングするために用いられるベクターも同様に、これらの機能的配列（例えば、プロモーター、プライマー部位等）を含んでもよい。
【０１２９】
セグメントを結合させた後、産物分子はしばしば、ウイルス粒子における産物分子のパッケージングを許容する少なくとも十分なウイルス配列を含むであろう。ウイルス配列がアデノウイルス配列である場合、産物分子は、左のITR、パッケージング配列、および右のITR、および／またはパッケージングにとって適当な大きさの分子を得るために十分な他の配列を含んでもよい。いくつかの態様において、産物分子は、許容性の宿主細胞に導入した場合に、感染性のウイルスゲノムとなるために十分なウイルス配列を含む。いくつかの態様において、本発明の方法によって産生された組換え型アデノウイルスベクターは、左のITR、パッケージング配列、第一の組換え部位、対象配列、第二の組換え部位、および右のITRを含むさらなるアデノウイルス配列を含んでもよい。ウイルスベクターがレトロウイルス配列である場合、産物分子は、5'-LTR、3'-LTR、およびパッケージング配列（Ψ）、および／またはパッケージングにとって適当な大きさの分子が得るために十分な他の配列を含んでもよい。いくつかの態様において、産物分子は、それが導入される宿主細胞のゲノムに組み入れられるために十分であるが、宿主細胞において感染性ウイルスを生じるほど十分ではないレトロウイルス配列を含む。いくつかの態様において、本発明の方法によって産生された組換え型レトロウイルスベクターは、5'-LTR、パッケージング配列、第一の組換え部位、対象配列、第二の組換え部位、および3'-LTRを含むさらなるレトロウイルス配列を含むプラスミドであってもよい。
【０１３０】
組換え部位
本発明において用いられる組換え部位は、組換え反応において基質として役立ちうる任意の核酸であってもよい。そのような組換え部位は、野生型もしくは天然に存在する組換え部位であってもよく、または改変、変種、誘導体、もしくは変異体組換え部位であってもよい。本発明において用いられる組換え部位の例には、ファージラムダ組換え部位（attP、attB、attL、およびattR、ならびにその変異体または誘導体のような）およびphi80、P22、P2、186、P4およびP1のような他のバクテリオファージからの組換え部位（loxPおよびloxP511のようなlox部位を含む）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３１】
いくつかの態様において、本発明の実践において用いてもよい組換え部位には、ファージラムダ組換え系において活性な一つまたは複数の組換えタンパク質、例えば一つまたは複数のInt、IHF、FIS、および／またはXisの存在下で適合性の組換え部位との組換えを受ける組換え部位が含まれる。本発明はまた、そのような組換え部位を含む核酸分子およびそのような核酸分子を含む組成物を企図する。好ましい組換えタンパク質および本発明において用いるための変異体、改変、変種、または誘導体組換え部位には、米国特許仮出願第60/108,324号（1998年11月13日提出）に基づいて、米国特許第5,888,732号、第6,143,557号、第6,171,861号、第6,270,969号、および第6,277,608号ならびに米国特許出願第09/438,358号（1999年11月12日提出）に記載されるものが含まれる。変異att部位（例えば、attB 1-10、attP 1-10、attR 1-10、およびattL 1-10）は、その開示の全文が特に参照として本明細書に組み入れられる、2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/517,466号および2000年12月11日に提出された第09/732,914号（2002 0007051-A1として公開）に記述されている。他の適した組換え部位およびタンパク質は、Invitrogen Corporation、カールスバッド、カリフォルニア州から入手できるGATEWAY（商標）クローニング技術に関連したものであり、その全ての全開示が特に参照として本明細書に組み入れられる、GATEWAY（商標）クローニング技術に関する製品説明書に記載されている。
【０１３２】
本発明において用いてもよい部位には、att部位が含まれる。全ての野生型att部位において同一である野生型のatt部位
2005532829.tif 000005
の15 bpのコア領域は、一つまたは複数の位置で変異させてもよい。他のatt部位と特異的に組換えする他のatt部位は、コア領域の塩基6〜12位である7塩基対のオーバーラップ領域においておよびその近傍でヌクレオチドを変化させることによって、構築することができる。このように、本発明の方法、分子、組成物、およびベクターにおいて用いるために適した組換え部位にはまた、15塩基対のコア領域内でヌクレオチド塩基1、2、3、4個またはそれ以上の挿入、欠失、または置換を有する部位が含まれるがこれらに限定されない（コア領域についてさらに詳しく説明し、その開示の全文が参照として本明細書に組み入れられる、1996年6月7日に提出された米国特許出願第08/663,002号（現在では米国特許第5,888,732号）および1998年10月23日に提出された米国特許出願第09/177,387号を参照されたい）。本発明の方法、組成物、およびベクターにおいて用いるために適した組換え部位にはまた、この15塩基対のコア領域と少なくとも50％同一、少なくとも55％同一、少なくとも60％同一、少なくとも65％同一、少なくとも70％同一、少なくとも75％同一、少なくとも80％同一、少なくとも85％同一、少なくとも90％同一、または少なくとも95％同一である15塩基対のコア領域内でヌクレオチド塩基1、2、3、4個、またはそれ以上の挿入、欠失、または置換を有する部位が含まれる。
【０１３３】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば所定の組換え部位ヌクレオチド配列またはその一部と少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるか否かは、初回配列アラインメントのためにDNAsisソフトウェア（ヒタチソフトウェア、サンブルノ、カリフォルニア州）を用いた後に、多数の配列アラインメントのためにESEEバージョン3.0 DNA/タンパク質配列ソフトウェア（cabot@trog.mbb.sfu.ca）のような既知のコンピュータープログラムを用いて通常通りに決定することができる。または、そのような決定は、二つの配列間の最善の相同性セグメントを発見するために局所相同性アルゴリズム（Smith および Waterman、Advances in Applied Mathematics、2：482〜489（1981））を用いるBESTFITプログラム（ウィスコンシン配列分析パッケージ、ジェネティクスコンピューターグループ、University Research Park、575 Science Drive、Madison、WI 53711）を用いて行ってもよい。特定の配列が、例えば本発明に従う参照配列と95％同一であるか否かを決定するためにDNAsis、ESEE、BESTFIT、または他の任意の配列アラインメントプログラムを用いる場合、同一性の割合（％）が参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列におけるヌクレオチドの総数の5％までのギャップが相同性において許容されるようにパラメータを設定する。上記のようなコンピュータープログラムはまた、アミノ酸レベルで二つのタンパク質間の同一性の割合（％）および相同性を決定するために用いてもよい。
【０１３４】
同様に、attB1、attP1、attL1、およびattR1におけるコア領域は、attB2、attP2、attL2およびattR2におけるコア領域と同様に互いに同一である。本発明において用いるために適した核酸分子にはまた、7塩基対のオーバーラップ領域（TTTATAC、コア領域の塩基6〜12位）内でヌクレオチド1、2、3、4個またはそれ以上の挿入、欠失、または置換を含む核酸分子が含まれる。オーバーラップ領域は、インテグラーゼタンパク質の切断部位によって定義され、鎖の交換が起こる領域である。そのような変異体、断片、変種、および誘導体の例には、（1）7 bpのオーバーラップ領域における1位のチミンが、欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはアデニンに置換されている；（2）7 bpのオーバーラップ領域における2位のチミンが欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはアデニンに置換されている；（3）7 bpのオーバーラップ領域における3位のチミンが欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはアデニンに置換されている；（4）7 bpのオーバーラップ領域における4位のアデニンが欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはチミンに置換されている；（5）7 bpのオーバーラップ領域における5位のチミンが欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはアデニンに置換されている；（6）7 bpのオーバーラップ領域における6位のアデニンが欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはチミンに置換されている；および（7）7 bpのオーバーラップ領域における7位のシトシンが、欠失している、またはグアニン、チミン、もしくはアデニンに置換されている；またはこの7 bpのオーバーラップ領域内でのそのような欠失および／または置換の一つまたは複数（例えば、2、3、4、5個等）の任意の組み合わせである核酸分子が含まれるがこれらに限定されない。代表的な7塩基対のコア領域のヌクレオチド配列を下記に示す。
【０１３５】
変化したatt部位が構築されており、それらは（1）7塩基対オーバーラップ（TTTATAC）の最初の三つの位置においてなされた置換は、組換えの特異性に強く影響を与える、（2）最後の四つの位置（TTTATAC）においてなされた置換は、組換えの特異性をごく部分的に変化させる、および（3）7 bpのオーバーラップ外であるが15塩基対のコア領域内のどこかでのヌクレオチド置換は、組換えの特異性に影響を及ぼさないが、組換え効率には影響を及ぼすことを証明する。このように、本発明の核酸分子および方法には、組換えの特異性に影響を及ぼす組換え部位1、2、3、4、5、6、8、10個またはそれ以上、特に組換え特異性に影響を及ぼす一つまたは複数の変異を有する15塩基対のコア領域内での7塩基対のオーバーラップに実質的に対応する可能性がある一つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、8、10、20、30、40、50個）の異なる組換え部位を含むまたは用いる核酸分子および方法が含まれる。特に好ましいそのような分子は、「N」が任意のヌクレオチドを指す（すなわち、A、G、T/U、またはCであってもよい）NNNATACのようなコンセンサス配列を含んでもよい。好ましくは、コンセンサス配列における最初の三つのヌクレオチドの一つがT/Uである場合、最初の三つのヌクレオチドの他の二つの少なくとも一つはT/Uではない。
【０１３６】
それぞれのatt部位（attB、attP、attL、およびattR）のコア配列は、インテグラーゼ結合部位、インテグラーゼ切断部位、および特異性を決定する配列からなる機能的単位に分割することができる。特異性決定因子は、インテグラーゼの上の鎖の切断部位後の最初の三つの部位によって定義される。これらの三つの位置を、以下の参照配列において下線を引いて示す：
2005532829.tif 000006
。これらの三つの位置の改変（起こりうる組み合わせ64通り）を用いて、7塩基対のオーバーラップ領域の最初の三つのヌクレオチドに関して同じ配列を有する他のatt部位と高い特異性で組換えするatt部位を生成することができる。オーバーラップ領域の最初の三つのヌクレオチドについて起こりうる組み合わせを表1に示す。
【０１３７】
（表１）組換えの特異性を変化させるatt部位7塩基対オーバーラップ領域の最初の三つのヌクレオチドの改変
2005532829.tif 000007
【０１３８】
本発明の方法、組成物、およびベクターにおいて適用した7塩基対att部位オーバーラップ領域の代表的な例を表2に示す。本発明はさらに、表2に示した一つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、8、10、20、30、40、50個等）のヌクレオチド配列を含む核酸分子が含まれる。このように、例えば、一つの局面において、本発明は、ヌクレオチド配列GAAATAC、GATATAC、ACAATAC、またはTGCATACを含む核酸分子を提供する。
【０１３９】
（表２）本発明の組換え部位において用いるために適した7塩基対att部位オーバーラップ領域の代表的な例
2005532829.tif 000008
【０１４０】
上記のように、上記の3塩基対領域に対して3'に位置するヌクレオチドの変化はまた、組換え特異性に影響を及ぼしうる。例えば、7塩基対オーバーラップの最後の四つの位置における変化も同様に、組換え特異性に影響を及ぼしうる。
【０１４１】
例えば、本発明の実践において用いてもよい変異att部位には、
2005532829.tif 000009
が含まれる。表3は、野生型att部位（attB0、P0、R0、およびL0）のコア領域周辺の領域と共に、多様な他の適した組換え部位の配列を提供する。当業者は、残りの部位が上記の対応する部位（B、P、L、またはR）と同じであってもよいことを認識するであろう。
【０１４２】
（表３）att部位のヌクレオチド配列
2005532829.tif 000010
2005532829.tif 000011
【０１４３】
独自の特異性を有する他の組換え部位（すなわち、第一の部位は、その対応する部位とは組換えするが、異なる特異性を有する第二の部位と実質的に組換えしない）は、当業者に既知であり、本発明を実践するために用いてもよい。これらの系の対応する組換えタンパク質を、表記の組換え部位と共に本発明に従って用いてもよい。本発明において用いられる組換え部位および組換えタンパク質を提供する他の系には、出芽酵母のFLP/FRT系、リゾルバーゼファミリー（例えば、γδ、TndX、TnpX、Tn3リゾルバーゼ、Hin、Hjc、Gin、SpCCE1、ParA、およびCin）およびIS231、ならびに他のバチルス・スリンジエンシス転位可能エレメントが含まれる。本発明において用いられる他の適した組換え系には、XerCおよびXerDリコンビナーゼおよび大腸菌におけるpsi、dif、およびcer組換え部位が含まれる。他の適した組換え部位は、特に参照として本明細書に組み入れられる、ElledgeおよびLiuに交付された米国特許第5,851,808号に認められるであろう。
【０１４４】
本発明の材料および方法はさらに、組換えを1回受けて、その後は低い頻度（例えば、その後の組換え反応において、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、もしくは少なくとも1000倍低い組換え活性を有する）で組換えを受けるか、または本質的に組換えを受けることができない「1回使用」の組換え部位を用いることを含んでもよい。本発明はまた、そのような1回使用の組換え部位を含む核酸分子およびこれらの部位を含む分子を作製および用いる方法を提供する。そのような1回使用組換え部位を作製および同定するために用いることができる方法の例を下記に示す。そのような1回使用組換え部位を作製および同定するために用いることができる方法のさらなる例は、その双方が参照として本明細書に特に組み入れられる、1999年8月9日に提出された米国特許仮出願第60/147,892号に対する優先権を主張する国際公開公報第01/11058号として公開されたPCT/US第00/21623号に記載される。
【０１４５】
att系のコアインテグラーゼ結合部位は、以下のヌクレオチド配列：
2005532829.tif 000012
を有する中断された7塩基対の逆方向反復配列と共に、完全または不完全な反復配列のいずれかを含みうるその変種を含む。
【０１４６】
反復エレメントは、中央の定義されていない配列に対して遠位に存在する（そのヌクレオチドは、「n」の文字で表す）caac/gttgセグメント（下線）と、中央の定義されていない配列に対して近位に存在するttt/aaaセグメントとからなる二つの遠位および／または近位「ドメイン」に分割することができる。
【０１４７】
中央の定義されていない領域の片方または双方の側の遠位および／または近位ドメインの配列組成の変化は、組換え反応の結果に影響を及ぼしうる。効果の範囲および規模は、なされた特異的変化と共に特定の組換え事象（例えば、LR対BP反応）の関数である。
【０１４８】
例えば、attB部位は、以下のヌクレオチド配列：
2005532829.tif 000013
を有するように改変されると考えられ、同源のattPと機能的に相互作用して、attLおよびattRを作製するであろう。しかし、「caag」（上記の配列の左側に存在する）を含むセグメントを獲得する後者の二つの組換え部位はいずれも、その後の組換え事象に対して非機能的となるであろう。上記は、1回の組換え事象に関与した後att部位を非機能的にすることができるコアインテグラーゼ結合配列における多くの起こりうる変化の一つに過ぎない。このように、1回使用の組換え部位は、att部位の7塩基対のオーバーラップ領域に隣接する7塩基対の逆方向反復領域におけるヌクレオチドを変化させることによって調製してもよい。この領域は、以下のように示される：
2005532829.tif 000014
【０１４９】
1回使用の組換え部位を作製する場合、配列CAACTTTまたはAAAGTTG（すなわち7塩基対逆方向反復領域）のヌクレオチドの1、2、3、4個またはそれ以上を、他のヌクレオチドによって置換してもよく、全く欠失してもよい。これらの7塩基対逆方向反復領域は、互いに関して相補的な配列を表す。このように、1回使用の組換え部位を作製するために、いずれかの7塩基対逆方向反復領域に改変を行ってもよい。さらに、DNAが二本鎖であって、7塩基対逆方向反復領域1個が存在する場合、他の7塩基対逆方向反復領域も同様に、他の鎖に存在するであろう。
【０１５０】
説明のために配列CAACTTTを用いて、1回使用の組換え部位を形成することができる7塩基対逆方向反復領域の例には、（1）7 塩基対の逆方向反復配列領域の1位のシトシンが、欠失している、またはグアニン、アデニン、もしくはチミンに置換されている；（2）7 塩基対の逆方向反復配列領域の2位のアデニンが、欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはチミンに置換されている；（3）7 塩基対の逆方向反復配列領域の3位のアデニンが、欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはチミンに置換されている；（4）7 塩基対の逆方向反復配列領域の4位のシトシンが、欠失している、またはグアニン、アデニン、もしくはチミンに置換されている；（5）7 塩基対の逆方向反復配列領域の5位のチミンが、欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはアデニンに置換されている；（6）7 塩基対の逆方向反復配列領域の6位のチミンが、欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはアデニンに置換されている；および（7）7 塩基対の逆方向反復配列領域の7位のチミンが、欠失している、またはグアニン、シトシン、もしくはアデニンに置換されている；またはこの7塩基対領域内でのそのような欠失および／または置換1、2、3、4個またはそれ以上の任意の組み合わせである核酸分子が含まれるがこれらに限定されない。上記の7塩基対逆方向反復領域のヌクレオチド配列の代表的な例を、下記の表4に示す。
【０１５１】
（表４）7塩基対逆方向反復領域のヌクレオチド配列の代表的な例
2005532829.tif 000015
【０１５２】
1回使用組換え部位を形成するヌクレオチド配列の代表的な例はまた、表5のセクション1に示されるヌクレオチド配列を、表5のセクション2に示されるヌクレオチド配列と組み合わせることによって調製してもよい。1回使用組換え部位はまた、これらの領域の内部に一つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7個等）のヌクレオチドを挿入することによって調製してもよい。
【０１５３】
（表５）1回使用組換え部位を形成するヌクレオチド配列の代表的な例
2005532829.tif 000016
【０１５４】
特定の核酸セグメントに関する組換え事象を防止しようとする多くの場合において、改変された配列は、核酸セグメントに対して近位に存在するであろう。説明のために以下の式：
= 5'核酸セグメント3' = caac ttt（7塩基対オーバーラップ領域）AAA GTTG
を用いると、7塩基対逆方向反復領域（すなわちcaac ttt）を表す小文字の核酸配列は、示される核酸セグメントの3'末端（すなわち、核酸セグメントに関して近位の末端）での組換えを防止しようとする場合、1回組換え部位を形成するために、一般的に、挿入、欠失、および／または置換によって変化した配列を有するであろう。このように、例えば、1回組換え反応を用いて、核酸セグメントをもう一つの核酸分子に組み入れることができ、その後組換え部位は、有効に非機能的となり、その部位がさらなる組換え反応に関与することは防止される。同様に、核酸セグメントがもう一つの核酸分子に組み入れられて、環状化し、リコンビナーゼの存在下であっても組み入れられたまままたは環状のままであるように、1回使用の組換え部位は核酸セグメントの双方の末端に存在しうる。
【０１５５】
多くの方法を用いて、機能的活性（例えば、1回組換え事象を受けた後、その後の組換え事象を受けない）に関して可能性がある1回使用の組換え部位をスクリーニングしてもよい。例えば、1回組換え事象後に非機能的となる部位を同定するための組換え部位のスクリーニングに関して、第一の組換え反応を行って、その中で陰性選択マーカーが一つまたは複数の可能性がある欠損組換え部位に結合しているプラスミドを作製してもよい。次に、プラスミドを、同様に組換え部位に連結した陽性選択マーカーを含むもう一つの核酸分子と反応させてもよい。このように、この選択システムは、組換えする分子が陰性選択に対して感受性を示し、組換えしない分子が陽性選択によって選択されるように設計される。そのような系を用いて、所望の1回使用のコア部位変異体を直接選択してもよい。
【０１５６】
当業者は認識するであろうように、上記と同じ結果が得られるかなり多数のスクリーニングアッセイを設計してもよい。多くの場合において、これらのアッセイは、最初の組換え事象が起こって、その後の組換え事象に関与することができない組換え部位が同定され、そのような組換え部位を含む分子が選択されるように設計されるであろう。関連するスクリーニングアッセイによって、2回目の組換え事象を受けた核酸分子を排除する選択がなされるであろう。さらに、先に記したように、その後の組換え事象に関与する分子を選択せず、およびその後の組換え事象に関与しない分子を選択するスクリーニングアッセイを設計することができる。
【０１５７】
1回使用の組換え部位は、多数の核酸セグメントが互いに結合している場合、または多数の組換え反応を行う場合には、組換えの頻度を減少させるまたは組換えを防止するために特に有用である。このように、本発明にはさらに、1回使用組換え部位を含む核酸分子と共に、これらの部位を用いて組換えを行う方法が含まれる。
【０１５８】
本発明において用いられる組換え部位はまた、埋め込まれた機能または特性を有してもよい。埋め込まれた機能性は、組換え効率または特異性に直接関連しない組換え部位におけるヌクレオチド配列によって付与された機能または特性である。例えば、組換え部位は、タンパク質コード配列（例えば、インテインコード配列）、イントロン／エキソンスプライス部位、複製起点、および／または終止コドンを含んでもよい。さらに、一つより多い（例えば、2、3、4、5個等）埋め込まれた機能または特性を有する組換え部位も同様に調製してもよい。
【０１５９】
いくつかの場合において、組換え部位に対応するRNAをRNA転写物から、または組換え部位によってコードされるアミノ酸残基をそのようなRNAから翻訳されたポリペプチドから除去することが都合がよいであろう。そのような配列の除去は、いくつかの方法で行うことができ、RNAまたはタンパク質レベルで起こりうる。組換え部位から転写されるRNAを除去するために都合がよい一つの例は、対象となるポリペプチドとベクター上に存在するコード配列との融合ポリペプチドを構築する場合であろう。対象ポリペプチドのORFとベクターコード配列とのあいだに介在する組換え部位の存在によって、（1）mRNAにコドンを与え、それによって発現産物にさらなるアミノ酸残基が含まれる、（2）mRNAに終止コドンを与え、それによって所望の融合タンパク質の産生が防止される、および／または（3）二つのタンパク質が「フレームが一致して」融合されないように、mRNAの読み取り枠をシフトさせる、組換え部位が得られる可能性がある。
【０１６０】
一つの局面において、本発明は、組換え部位によってコードされるヌクレオチド配列をRNA分子から除去する方法を提供する。そのような方法の一例は、組換え部位によってコードされるRNAを転写物から除去するためにイントロン／エキソンスプライス部位を用いることを利用する。イントロン／エキソンスプライス部位をコードするヌクレオチド配列は、本発明において用いられる組換え部位に完全または部分的に埋め込まれてもよく、および／または隣接する核酸配列によってコードされてもよい。RNA分子から切除される配列は、対象配列内および／またはベクター上に適切に存在するスプライス部位に隣接する可能性がある。例えば、一つのイントロン／エキソンスプライス部位は、組換え部位によってコードされてもよく、もう一つのイントロン／エキソンスプライス部位は、他のヌクレオチド配列（例えば、対象となるベクターまたは核酸の核酸配列）によってコードされてもよい。核酸のスプライシングは、当業者に周知であり、以下の刊行物において考察されている：
2005532829.tif 000017
【０１６１】
スプライス部位は、多くの位置に適切に配置することができる。例えば、挿入されたORFをN末端融合体、例えば検出マーカー−第一のスプライス部位と共に発現するように設計されたデスチネーションベクターは、検出マーカーコード配列に対して3'に存在するベクター配列によってコードされ、第二のスプライス部位は、検出マーカーコード配列をORFのコード配列と隔てる組換え部位において部分的に埋め込まれうる。さらに、第二のスプライス部位は、組換え部位の3'末端に隣接しうる、または組換え部位に対して3'の短い距離（例えば、2、4、8、10、20ヌクレオチド）に存在しうるであろう。さらに、組換え部位の長さに応じて、第二のスプライス部位を、組換え部位に完全に埋め込むことができるであろう。
【０１６２】
上記の方法の改変は、発現されると、融合タンパク質の産生が起こる多数の核酸セグメントの結合を伴う。一つの特定の例において、一つの核酸セグメントは検出マーカー、例えばGFPをコードして、もう一つの核酸セグメントは対象ORFをコードする。これらのセグメントはそれぞれ組換え部位に隣接する。さらに、検出マーカーをコードする核酸セグメントは、その3'末端近傍でイントロン／エキソンスプライス部位を含み、対象ORFを含む核酸セグメントも同様にその5'末端でイントロン／エキソンスプライス部位を含む。組換えの際に、検出マーカーをコードする核酸セグメントは、対象ORFをコードする核酸セグメントに対して5'の位置に存在する。さらに、これらの二つの核酸セグメントは、イントロン／エキソンスプライス部位に隣接する組換え部位によって隔てられている。介在する組換え部位の切除は、このように融合mRNAの転写後に起こる。このように、一つの局面において、本発明は、組換え部位から転写されたRNAを本明細書に記述の核酸から生成された転写物から除去する方法に向けられる。
【０１６３】
スプライス部位は、多様な方法で本発明において用いられる核酸分子に導入してもよい。核酸セグメントにイントロン／エキソンスプライス部位を導入するために用いられうる一つの方法は、PCRである。例えば、プライマーを用いて、対象ORFに対応して、組換え部位とイントロン／エキソンスプライス部位の双方を含む核酸セグメントを生成することができる。
【０１６４】
上記の方法はまた、もう一つの核酸セグメントと組換えする核酸セグメントが、翻訳可能なフォーマットで産生されないRNAをコードする場合、組換え部位に対応するRNAを除去するために用いることができる。そのような場合の一例は、核酸セグメントを、それによってアンチセンスRNAが産生されるようにベクターに挿入する場合である。下記のように、このアンチセンスRNAは、例えばリボザイムをコードするRNAに融合させてもよい。このように、本発明はまた、そのような分子からの組換え部位に対応するRNAを除去する方法を提供する。
【０１６５】
本発明はさらに、タンパク質のスプライシングによって、組換え部位によってコードされるアミノ酸配列をタンパク質発現産物から除去する方法を提供する。タンパク質スプライス部位をコードするヌクレオチド配列は、タンパク質から切除されたアミノ酸配列をコードする組換え部位に完全または部分的に埋め込まれてもよく、またはタンパク質スプライス部位は、隣接するヌクレオチド配列によってコードされてもよい。同様に、一つのタンパク質スプライス部位は、組換え部位によってコードされてもよく、もう一つのタンパク質スプライス部位は、他のヌクレオチド配列によってコードされてもよい（例えば、対象となるベクターまたは核酸の核酸配列）。
【０１６６】
タンパク質のスプライシングは、タンパク質分子からのインテインの切除および隣接するセグメントのライゲーションによって起こりうることが示されている（例えば、Derbyshireら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：1356〜1357（1998）を参照されたい）。簡単に説明すると、インテインは、自己触媒スプライシングプロセスによってタンパク質から翻訳後に切除されるアミノ酸セグメントである。かなりの数のインテインコンセンサス配列が同定されている（例えば、Perler、Nucleic Acids Res. 27：346〜347（1999）を参照されたい）。
【０１６７】
イントロン／エキソンスプライシングと同様に、N末端およびC末端インテインモチーフは、タンパク質スプライシングに関与することが示されている。このように、本発明はさらに、タンパク質スプライシングによって、組換え部位によってコードされるアミノ酸残基をタンパク質発現産物から除去するための組成物および方法を提供する。特に、本発明のこの局面は、二つのコード領域のあいだに存在する組換え部位の5'および3'末端の双方におけるインテインスプライス部位をコードする核酸配列の配置に関連する。このように、タンパク質発現産物を適した条件でインキュベートすると、これらの組換え部位によってコードされるアミノ酸残基が切除されるであろう。
【０１６８】
タンパク質スプライシングを用いて、組換え部位によってコードされるアミノ酸配列の全てまたは一部を除去してもよい。インテインをコードする核酸配列は、組換え部位に完全または部分的に埋め込んでもよく、またはそのような部位に隣接してもよい。特定の状況において、組換え部位によってコードされるアミノ酸配列のN末端および／またはC末端を超えてアミノ酸残基のかなりの数を除去することが望ましい可能性がある。そのような場合、インテインコード配列は、組換え部位に対して5'および／または3'で距離を置いて（例えば、30、50、75、100ヌクレオチド等）存在してもよい。
【０１６９】
インテイン切除のために適した条件は、特定のインテインと共にこのインテインを含むタンパク質と共に変化するが、Chongら、Gene 192：271〜281（1997）は、Sce VMAインテインと呼ばれる改変された出芽酵母のインテインが、1,4-ジチオスレイトール（DTT）、β-メルカプトエタノール、およびシステインを含む多様な物質によって自己切断を受けるように誘導されうることを証明した。例えば、インテインの切除／スプライシングは、30 mM DTTの存在下で4℃で16時間インキュベートすることによって誘導することができる。
【０１７０】
トポイソメラーゼのクローニング
本発明はまた、その任意の一つまたは複数が、例えばウイルスゲノムの全てまたは一部を含んでもよい二つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む本発明の組換え核酸分子（例えば、ウイルスベクターのようなウイルスゲノムの全てまたは一部を含む分子）を作製するために一つまたは複数のトポイソメラーゼを用いる方法にも関する。トポイソメラーゼは、上記の組換えクローニング技術と共に用いてもよい。例えば、トポイソメラーゼ媒介反応を用いて、一つまたは複数の核酸セグメントに一つまたは複数の組換え部位を結合させてもよい。次に、セグメントをさらに操作して、例えば組換えクローニング技術を用いて結合させてもよい。
【０１７１】
一つの局面において、本発明は、少なくとも一つ（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個等）のトポイソメラーゼ（例えば、IA型、IB型、および／またはII型トポイソメラーゼ）によって、連結したセグメントの一つまたは双方の鎖がセグメントが連結される部位で共有結合するように、第一のおよび少なくとも第二の核酸セグメントを連結する方法を提供する。
【０１７２】
一つの鎖において共有結合した二本鎖組換え型核酸分子を作製する方法は、第二のヌクレオチド配列が第一のヌクレオチド配列に共有結合することができるように、5'または3'末端で、部位特異的トポイソメラーゼ認識部位（例えば、IA型、またはII型トポイソメラーゼ認識部位）またはその切断産物を有する第一の核酸分子を、第二の（または他の）核酸分子、および選択的にトポイソメラーゼ（例えば、IA型、IB型、および／またはII型トポイソメラーゼ）に接触させることによって、行うことができる。本明細書に開示するように、本発明の方法は、少なくとも一つのヌクレオチド配列が、5'および／または3'末端の一つまたは双方で、部位特異的トポイソメラーゼ認識部位（例えば、IA型、IB型、またはII型トポイソメラーゼ認識部位）またはその切断産物を有する、かなり多くのヌクレオチド配列、典型的に核酸分子を用いて行うことができる。
【０１７３】
いくつかの態様において、二つの二本鎖核酸分子を、より大きい分子のそれぞれの鎖が共有結合するように（例えば、より大きい分子はニックを有しない）、一つのより大きい分子に結合させることができる。図3を参照して、一つの末端の5'末端および3'末端のそれぞれに結合したトポイソメラーゼを有する第一の二本鎖核酸分子を、第一の核酸分子の双方の鎖を第二の核酸分子の双方の鎖に連結させる条件で、第二の核酸に接触させてもよい。それに対してトポイソメラーゼが結合する第一の核酸分子の末端は、5'-突出末端、3'-突出末端のいずれを有してもよく、または平滑末端であってもよい。第一の核酸分子に結合される第二の核酸分子の末端は、第一の核酸分子のトポイソメラーゼ結合末端と同じタイプの末端を有してもよい。結合されない第二の分子の末端は、セグメントの方向性の連結が望ましい場合には異なる末端を有してもよく、方向性が必要でない場合には、同じタイプの末端を有してもよい。
【０１７４】
もう一つの態様において、一つの末端の3'末端にトポイソメラーゼが結合した第一の核酸分子、および一つの末端の3'末端にトポイソメラーゼが結合した第二の核酸分子を、本発明の方法を用いて結合させてもよい（図3B）。共有結合した二本鎖組換え型核酸分子は、トポイソメラーゼ負荷基質核酸分子を含む末端を接触させることによって作製される。
【０１７５】
図3Cは、一つの末端の5'末端にトポイソメラーゼが結合した第一の核酸分子、および一つの末端の5'末端にトポイソメラーゼが結合した第二の核酸分子を示し、トポイソメラーゼ負荷基質核酸分子を含む末端を接触させることによって生成された共有結合二本鎖組換え型核酸分子の産生を示す。
【０１７６】
図3Dは、双方の末端の5'末端および3'末端のそれぞれにトポイソメラーゼが結合した核酸分子を示し、それぞれの末端に一つずつ二つの核酸分子に対するトポイソメラーゼ負荷核酸分子の結合をさらに示す。5'末端のそれぞれおよび／または3'末端のそれぞれでのトポイソメラーゼは同じまたは異なりうる。当業者は、図3A〜3Dに関して先に記述した方法のいずれか一つからトポイソメラーゼの一つを削除することによって、ニックを有する分子（例えば、一つのみの鎖において共有結合した）を産生してもよいことを認識するであろう。
【０１７７】
双方の鎖が共有結合した二本鎖組換え核酸分子を作製する方法は、例えば、第一の末端、第二の末端または双方の末端で、第一の核酸分子が5'または3'末端またはその近傍でトポイソメラーゼ認識部位（またはその切断産物）を有する、第一の末端と第二の末端とを有する第一の核酸分子；第一の末端、第二の末端または双方の末端で、少なくとも第二の二本鎖ヌクレオチド配列が5'または3'末端またはその近傍でトポイソメラーゼ認識部位（またはその切断産物）を有する、第一の末端と第二の末端とを有する少なくとも第二の核酸分子；および少なくとも一つの部位特異的トポイソメラーゼ（例えば、IA型および／またはIB型トポイソメラーゼ）を、全ての成分が接触して、トポイソメラーゼがその活性を発揮できる条件で接触させることによって、行うことができる。本発明のこの局面に従って産生された共有結合二本鎖組換え核酸は、部分的に、核酸分子が結合される位置でいずれかの鎖にニックを含まないという特徴を有する。一つの態様において、方法は、そのそれぞれが、ウイルス配列および／または対象配列の他に、共有結合される二つの末端の3'末端または5'末端でトポイソメラーゼ認識部位、またはその切断産物を有する、第一の核酸分子と第二の（または他の）核酸分子とを接触させることによって行われる。もう一つの態様において、方法は、少なくとも一つの末端の5'末端および3'末端でトポイソメラーゼ認識部位またはその切断産物を有する第一の核酸分子、および認識部位を含む第一の核酸分子の末端に結合される末端で3'ヒドロキシル基および5'ヒドロキシル基を有する第二の（または他の）核酸分子を接触させることによって行われる。本明細書に開示するように、方法は、末端と末端の様々な組み合わせを有するかなり多数の核酸分子を用いて行うことができる。
【０１７８】
トポイソメラーゼは、二本鎖核酸分子の一本鎖を切断するIA型およびIB型トポイソメラーゼを含むI型、および核酸分子の双方の鎖を切断するII型トポイソメラーゼ（ジャイレース）として分類される。IAおよびIB型トポイソメラーゼは、核酸分子の一つの鎖を切断する。IA型トポイソメラーゼによる核酸分子の切断は、切断部位で5'ホスフェートと3'ヒドロキシルとを生成し、IA型トポイソメラーゼは、切断された鎖の5'末端に共有結合する。比較すると、IB型トポイソメラーゼによる核酸分子の切断は、切断部位で3'ホスフェートと5'ヒドロキシルとを生成し、IB型トポイソメラーゼは、切断鎖の3'末端に共有結合する。本明細書に開示するように、I型およびII型トポイソメラーゼは、その触媒ドメインおよび変異型と共に、本発明の方法に従って双方の鎖に共有結合される二本鎖組換え型核酸分子を作製するために有用である。
【０１７９】
IA型トポイソメラーゼには、大腸菌トポイソメラーゼI、大腸菌トポイソメラーゼIII、真核細胞トポイソメラーゼII、アーキアル（archeal）リバースジャイレース、酵母トポイソメラーゼIII、ショウジョウバエトポイソメラーゼIII、ヒトトポイソメラーゼIII、肺炎球菌トポイソメラーゼIII等が含まれ、他のIA型トポイソメラーゼも含まれる（そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、
2005532829.tif 000018
を参照されたい）。大腸菌トポイソメラーゼIIIは、配列5'-GCAACTT-3'を認識、結合、および切断するIA型トポイソメラーゼであり、本発明の方法において特に有用となりうる（参照として本明細書に組み入れられる、Zhangら、J. Biol. Chem. 270：23700〜23705、1995）。相同体であるプラスミドRP4のtraEタンパク質は、Liら、J. Biol. Chem. 272：19582〜19587（1997）によって記述され、同様に本発明の実践において用いることができる。DNA-タンパク質付加物は、切断が二つのチミジン残基のあいだで起こる、5'チミジン残基に共有結合する酵素によって形成される。
【０１８０】
IB型トポイソメラーゼには、全ての真核細胞に存在する核I型トポイソメラーゼ、ならびにワクシニアおよび他の細胞ポックスウイルスによってコードされるトポイソメラーゼが含まれる（参照として本明細書に組み入れられる、Chengら、Cell 92：841〜850、1998を参照されたい）。真核細胞IB型トポイソメラーゼの例は、酵母、ショウジョウバエ、およびヒト細胞を含む哺乳類細胞において発現されるトポイソメラーゼである（そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、Caron および Wang、Adv. Pharmacol. 29B：271〜297、1994；Guptaら、Biochim. Biophys. Acta 1262：1〜14、1995を参照されたい；同様にBerger、上記1998を参照されたい）。ウイルスのIB型トポイソメラーゼの例は、脊椎動物のポックスウイルス（ワクシニア、ショープ線維腫ウイルス、ORFウイルス、鶏痘ウイルス、および伝染性軟属腫ウイルス）および昆虫のポックスウイルス（アムサクタモーレイエントモポックスウイルス）によって産生されるトポイソメラーゼである（そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、
2005532829.tif 000019
を参照されたい；同様にChengら、上記、1998も参照されたい）。
【０１８１】
II型トポイソメラーゼには、例えば、細菌ジャイレース、細菌DNAトポイソメラーゼIV、真核細胞DNAトポイソメラーゼII、およびT-イーブンファージコードDNAトポイソメラーゼが含まれる（そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、Roca および Wang、Cell 71：833〜840、1992；Wang、J. Biol. Chem. 266：6659〜6662、1991；Berger、上記、1998）。IB型トポイソメラーゼと同様に、II型トポイソメラーゼは、切断およびライゲーション活性の双方を有する。さらに、IB型トポイソメラーゼと同様に、基質核酸分子は、II型トポイソメラーゼが切断部位で一つの鎖と共有結合を形成することができるように調製することができる。例えば、仔ウシ胸腺II型トポイソメラーゼは、5'末端からヌクレオチド3個の位置に存在する5'凹型トポイソメラーゼ認識部位を含む基質核酸を切断することができ、それによって、切断部位に対して5'のヌクレオチド3個の配列が解離され、および核酸分子の5'末端に対するトポイソメラーゼの共有結合が起こる（Andersenら、上記、1991）。さらに、そのようなII型トポイソメラーゼ負荷核酸分子を、3'ヒドロキシル基を含む第二のヌクレオチド配列に接触させると、II型トポイソメラーゼは、配列を共にライゲーションすることができ、その後組換え核酸分子から放出される。そのため、II型トポイソメラーゼも同様に、本発明の方法を行うために有用である。
【０１８２】
様々なトポイソメラーゼが、広範な配列特異性を示す。例えば、II型トポイソメラーゼは、多様な配列に結合することができるが、非常に特異的な認識部位で切断することができる（参照として本明細書に組み入れられる、Andersenら、J. Biol. Chem. 266：9203〜9210、1991を参照されたい）。比較すると、IB型トポイソメラーゼには、特異的ヌクレオチド配列（「トポイソメラーゼ認識部位」）に結合して切断する部位特異的トポイソメラーゼが含まれる。トポイソメラーゼ、例えばIB型トポイソメラーゼによって核酸分子が切断されると、ホスホジエステル結合のエネルギーは、トポイソメラーゼにおける特異的チロシン残基とトポイソメラーゼ認識部位の3'ヌクレオチドとのホスホチロシル結合の形成によって保存される。トポイソメラーゼ切断部位が核酸分子の3'末端近傍である場合、下流の配列（切断部位に対して3'）が解離して、新たに生成された3'末端に共有結合するトポイソメラーゼを有する核酸分子が放出されうる。
【０１８３】
図4を参照して、制限消化／ライゲーションおよび組換えクローニングの組み合わせを用いて、本発明の核酸分子を構築してもよい。少なくとも一つの認識部位（例えば、組換え部位）（RS1）および少なくとも一つの制限酵素部位（RE）を有する核酸分子（例えば、プラスミド）を構築してもよい。このタイプの分子は、選択的に制限酵素部位に隣接して存在するタグ配列を含んでもよい。分子を制限酵素によって消化してそれによって直線状の分子を得てもよい。得られた直線状の分子を、少なくとも一つの組換え部位を含み、直線状の第一の核酸分子の制限消化された末端と適合性の末端を有する第二の核酸分子に接触させてもよい。リガーゼおよび適当な組換えタンパク質の存在下で、第二の核酸分子を、第一の核酸分子に共有結合させて、組換え部位と制限酵素部位とのあいだで第一の核酸分子の一部を置換する。当業者は、制限酵素消化および／またはライゲーション反応の代わりにまたは組み合わせて一つまたは複数のトポイソメラーゼを用いてもよいことを認識するであろう。このように、本発明は、少なくとも一つの組換え部位を含み、一つまたは複数のトポイソメラーゼを一つの末端に負荷してもよい直線状の分子を企図する。本発明はまた、そのような分子を含む組成物、そのような分子を含む反応混合物、ならびにそのような分子を作製および用いる方法を企図する。
【０１８４】
サプレッサーtRNA
通常、終止コドンである部位を認識する変異体tRNA分子は、mRNA分子の翻訳の終了を抑制して、サプレッサーtRNAと呼ばれる。遺伝子の末端を知らせるために、三つのコドンが真核生物と原核生物の双方によって用いられる。mRNAに転写される場合、コドンは以下の配列を有する：UAG（アンバー）、UGA（オパール）、およびUAA（オーカー）。ほとんどの状況において、細胞は、これらのコドンを認識する如何なるtRNAも含まない。このように、mRNAを翻訳するリボソームがこれらのコドンの一つに達した場合、リボソームは停止して、RNAから離れ、mRNAの翻訳を終了する。mRNAからのリボソームの放出は、特異的因子によって媒介される（S. Mottagui-Tabar、Nucleic Acids Research 26（11）、2789、1998を参照されたい）。インフレームの終止コドン（TAA、TAG、またはTGA）を有する遺伝子は、当初、本来のカルボキシ末端を有するタンパク質をコードするであろう。しかし、サプレッサーtRNAによって、アミノ酸の挿入が起こり、終止コドンを超えて翻訳が継続されうる。
【０１８５】
そのような多くのサプレッサーtRNAが発見されている。例には、アンバー終止コドンの翻訳の終了を抑制するsupE、supP、supD、supF、およびsupZサプレッサー、オーカー終止コドンの機能を抑制するsupB、glT、supL、supN、supC、およびsupMサプレッサー、ならびにオパール終止コドンの機能を抑制するglyT、trpT、およびSu-9サプレッサー含まれるがこれらに限定されない。一般的に、サプレッサーtRNAは、終止コドンとして通常機能するコドンとtRNAとに塩基対を形成させるtRNAのアンチコドンループにおける一つまたは複数の変異を含む。変異体tRNAは、その同源のアミノ酸残基を負荷され、終止コドンに遭遇した場合に同源のアミノ酸残基が翻訳ポリペプチドに挿入される。サプレッサーtRNAに関するより詳細な考察に関しては、Eggertssonら（1988）、Microbiological Review 52（3）：354〜374、およびEngleerg-Kuklaら（1996）、「Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology」、第60章、909〜921頁、Neidhardtら編、ASM出版、ワシントンDCを参考にされたい。
【０１８６】
終了サプレッサーの効率を増強する、すなわち終止コドンの読み過ごしを増加させる変異が同定されている。これらには、uar遺伝子（prfA遺伝子としても知られる）の変異、ups遺伝子の変異、sueA、sueB、およびsueC遺伝子の変異、rpsD（ramA）およびrpsE（spcA）遺伝子の変異、ならびにrplL遺伝子の変異が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８７】
通常の状況において、宿主細胞は、終止コドンの抑制が効率的過ぎる場合には健康ではないと予想されるであろう。これは、ゲノムにおける何千または何万もの遺伝子のためであり、有意な分画は本来三つの終止コドンの一つまたは複数を有するであろう；これらの完全な読み過ごしによって、そのカルボキシ末端にさらなるアミノ酸を含む大量の異常なタンパク質が得られるであろう。抑制性tRNAの何らかのレベルが存在すれば、アミノ酸の取り込みとリボソームの放出のあいだに競争が存在する。より高いレベルのtRNAによって、より多くの読み過ごしが起こる可能性があるが、コドンのコンテクストのような他の要因は抑制効率に影響を及ぼしうる。
【０１８８】
生物は通常、tRNAに関する多くの遺伝子を有する。遺伝子コードの縮重（多くのアミノ酸に関する多数のコドン）と組み合わせると、一つのtRNA遺伝子がサプレッサーtRNA状態へと変異しても、高レベルの抑制は起こらない。TAA終止コドンは最強であり、抑制することが最も難しい。TGAは最も弱く、本来（大腸菌において）3％程度漏出する。TAG（アンバー）コドンは比較的強いが抑制がない場合の読み過ごしは〜1％である。さらに、アンバーコドンは、天然に存在するサプレッサー変異体と50％の次数で効率よく抑制することができる。いくつかの生物（例えば、大腸菌）における抑制は、終止コドン後のヌクレオチドがアデノシンである場合に増強される可能性がある。このように、本発明は、終止コドンの後にアデノシンが続く（例えば、TAGA、TAAA、および／またはTGAA）核酸分子を企図する。
【０１８９】
抑制は、細菌およびバクテリオファージにおいて何十年ものあいだ研究されてきた。さらに、抑制は、酵母、ハエ、植物および哺乳類細胞を含む他の真核細胞において知られている。例えば、Caponeら（Molecular and Cellular Biology 6（9）：3059〜3067、1986）は、哺乳類tRNAに由来するサプレッサーtRNAを用いて、哺乳類細胞において終止コドンを抑制できることを証明した。27位のセリンに関するコドンの代わりに終止コドンを有する大腸菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子1コピーを、遺伝子のアンバー、オーカー、またはオパールサプレッサー誘導体を形成するように変異されているヒトセリンtRNAをコードする遺伝子と共に哺乳類細胞にトランスフェクトした。cat遺伝子の発現の成功が認められた。誘導型哺乳類アンバーサプレッサーは、ポリオウイルスのレプリカーゼ遺伝子において変異を抑制するために用いられており、サプレッサーを発現する細胞株を用いて、変異ウイルスの増殖に成功した（Sedivyら、Cell 50：379〜389（1987））。サプレッサーtRNAによる終止コドンの抑制効率に及ぼすコンテクストの効果は、大腸菌と比較して哺乳類細胞において異なることが示されている（Phillips-Jonesら、Molecular and Cellular Biology 15（12）：6593〜6600（1995）；Martinら、Biochemical Society Transactions 21（1993））。いくつかのヒト疾患は、必須遺伝子のナンセンス変異によって引き起こされることから、遺伝子治療の抑制の可能性が認識されている（Templeら、Nature 296（5857）：537〜40（1982）を参照されたい）。ジフテリア毒素A遺伝子に導入された一重および二重ナンセンス変異の抑制は、毒素遺伝子治療のバイナリシステムの基礎として用いられている（Robinsonら、Human Gene Therapy 6：137〜143（1995））。
【０１９０】
融合タンパク質を条件的に発現するためにサプレッサーtRNAの利用
本発明の核酸を作製するために用いられる方法は部位特異的であるため、第一の核酸分子における核酸配列の方向および／または読み取り枠は、分子の全てまたは一部が組換えおよび／またはトポイソメラーゼ媒介反応において結合される場合に、第二の核酸分子上の配列の方向および／または読み取り枠に関して制御することができる。この制御は、異なる核酸分子上に存在する配列間の融合体の構築を単純にする。
【０１９１】
一般的な用語において、オープンリーディングフレームは、四つの形で発現されてもよい：アミノおよびカルボキシ末端の双方で改変を受けない、いずれかの末端で改変されている、または双方の末端で改変されている。対象ORFを含む対象核酸配列には、N末端メチオニンATGコドン、およびORFのカルボキシ末端での終止コドン、このようにATG-ORF-終止が含まれてもよい。しばしば、対象配列を含む核酸分子には、遺伝子を発現させるATGの上流に存在してもよい翻訳開始配列tisが含まれ、このように、tis-ATG-ORF-終止となるであろう。この種の構築物は、本来のクローニングされていないタンパク質の場合と同じアミノおよびカルボキシアミノ酸を含むタンパク質としてORFを発現させる。そのような構築物をアミノ末端タンパク質タグ、例えばGSTとフレームが一致して融合させる場合、タグは、その自身のtisを有し、このようにtis-ATG-タグ-tis-ATG-ORF-終止コドンとなり、ORFのtisを含む塩基は、タグとORFのあいだのアミノ酸に翻訳されるであろう。さらに、何らかのレベルの翻訳開始が、mRNAの下位（すなわちORFのATGであってタグのATGではない）で予想される可能性があり、それによって所望のタンパク質が混入した本来のタンパク質発現の一定量が得られる。
【０１９２】
DNA（小文字）：tis1-atg-tag-tis2-atg-orf-終止
【０１９３】
RNA（小文字、斜体）：tis1-atg-tag-tis2-atg-orf-終止
【０１９４】
タンパク質（大文字）：ATG-TAG-TIS2-ATG-ORF（tis1および終止は翻訳されない）＋混入ATG−ORF（tis2で始まるORFの翻訳）。
【０１９５】
本明細書に開示の方法を用いて、当業者は、組換え部位に隣接するタグを含むベクターを構築することができ、それによって対象ORFのC末端および／またはN末端に対するタグのインフレーム融合を行うことができる。
【０１９６】
多様なベクターにおいて多数のクローンを迅速に作製できることを考慮すると、構築物そのものを操作する必要なく、1回クローニングORFを発現させることができる多くの方法を最大限にすることが当技術分野で必要である。本発明は、終止コドンで翻訳の終了を抑制するために一つまたは複数のサプレッサーtRNAを用いて標的ORFにC末端および／またはN末端融合物の制御された発現のための材料および方法を提供することによってこの必要性を満足する。このように、本発明は、組換え部位に隣接する遺伝子構築物が調製される材料および方法を提供する。
【０１９７】
構築物は、好ましくは対象タンパク質をコードするORFのC末端で終止コドンをコードする配列によって調製してもよい。いくつかの態様において、終止コドンは、遺伝子に隣接する組換え部位内でまたは組換え部位の前に対象配列の3'末端もしくはその近傍でORFに隣接して存在しうる。標的遺伝子構築物は、様々なC末端またはN末端タグ（例えば、GFP、GST、Hisタグ、GUS等）を対象ORFに提供しうる様々なベクターとの組換えを通して移入することができる。終止コドンがORFのカルボキシ末端に存在する場合、「本来の」カルボキシ末端アミノ酸配列を有するORFの発現は、非抑制条件（すなわち、サプレッサーtRNAが発現されない条件）で起こるが、カルボキシ融合タンパク質としてのORFの発現は、抑制条件で起こる。当業者は、如何なるサプレッサーおよび如何なるコドンも、本発明の実践において用いることができるであろうと認識するであろう。サプレッサーは、終止コドンに対応する位置で如何なるアミノ酸も挿入してもよく、例えば、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValを挿入してもよい。いくつかの態様において、セリンを挿入してもよい。
【０１９８】
いくつかの態様において、抑制性tRNAをコードする遺伝子を、標的ORFが発現されるベクターに組み入れてもよい。他の態様において、サプレッサーtRNAの遺伝子は宿主細胞のゲノムに存在してもよい。なお他の態様において、サプレッサーの遺伝子は、異なるウイルスベクターまたは他のベクター、すなわちプラスミドに存在してもよく、別の場所で提供されてもよい。このタイプの態様において、サプレッサー遺伝子を含むベクターは、組換え型アデノウイルスベクターであってもよく、細胞は、対象配列を発現するウイルスベクターおよびサプレッサーtRNAを発現するウイルスベクターと同時トランスフェクトしてもよい。
【０１９９】
サプレッサーtRNAの1個より多いコピーを、本明細書に記述の全ての態様において提供してもよい。例えば、サプレッサーtRNAをコードする遺伝子の多数のコピーを含む宿主細胞を提供してもよい。または、同じまたは異なるプロモーターの下でサプレッサーtRNAの多数の遺伝子コピーを、対象標的ORFと同じベクターバックグラウンドに提供してもよい。いくつかの態様において、サプレッサーtRNAの多数のコピーを、対象標的ORFを含むベクターとは異なるベクターにおいて提供してもよい。他の態様において、サプレッサーtRNA遺伝子の一つまたは複数のコピーを、対象タンパク質のORFを含むベクターに、および／またはもう一つのベクターに、および／または宿主細胞のゲノムに、または上記を組み合わせて提供してもよい。サプレッサーtRNA遺伝子の一つより多いコピーが提供される場合、遺伝子は、対象タンパク質をコードするORFを発現するために用いられるプロモーターと同じまたは異なってもよい同じまたは異なるプロモーターから発現されてもよい。
【０２００】
いくつかの態様において、二つまたはそれ以上の異なるサプレッサーtRNA遺伝子を提供してもよい。このタイプの態様において、個々のサプレッサーの一つまたは複数を多数のコピーで提供してもよく、特定のサプレッサーtRNA遺伝子のコピー数は、もう一つのサプレッサーtRNA遺伝子のコピー数と同じであっても異なってもよい。他の任意のサプレッサーtRNA遺伝子とは無関係に、それぞれのサプレッサーtRNA遺伝子は、対象ORFを発現するために用いられるベクターにおいて、および／または異なるベクターにおいて、および／または宿主細胞のゲノムにおいて提供してもよい。いくつかの態様において、所定のtRNA遺伝子を一つより多い場所で提供してもよい。例えば、サプレッサーtRNAの1コピーを対象ORFを含むベクター上に提供してもよく、一つまたは複数のさらなるコピーをさらなるベクターおよび／または宿主細胞のゲノムにおいて提供してもよい。1コピーより多いサプレッサーtRNA遺伝子を提供する場合、遺伝子は対象タンパク質をコードするORFを発現するために用いられるプロモーターと同じまたは異なってもよく、異なるtRNA遺伝子を発現するために用いられるプロモーターと同じまたは異なっていてもよい同じまたは異なるプロモーターから発現されてもよい。
【０２０１】
本発明のいくつかの態様において、対象となる標的ORFおよびサプレッサーtRNAを発現する遺伝子は、同じプロモーターによって制御されてもよい。他の態様において、対象標的ORFはサプレッサーtRNAとは異なるプロモーターから発現されてもよい。当業者は、特定の状況において、誘導型プロモーターを用いて、サプレッサーtRNAおよび／または対象標的ORFの発現を制御することが望ましい可能性があることを認識するであろう。例えば、対象標的ORFおよび／またはサプレッサーtRNAを発現する遺伝子のいずれかを、lacプロモーターまたはtacプロモーターのようなその誘導体のようなプロモーターによって制御してもよい。いくつかの態様において、対象標的ORFおよびサプレッサーtRNA遺伝子はいずれも、T7 RNAポリメラーゼプロモーターから発現され、選択的に、一つのRNA分子の一部として発現される。このタイプの態様において、サプレッサーtRNAに対応するRNAの部分は、当初転写されたRNA分子から細胞因子によってプロセシングされる。
【０２０２】
いくつかの態様において、サプレッサーtRNA遺伝子の発現は、対象ORFとは異なるプロモーターの制御下であってもよい。いくつかの態様において、標的ORFの発現前にサプレッサー遺伝子を発現することが可能である場合がある。これによって、終止コドンの抑制によって融合タンパク質を発現させるために必要とされる前に、サプレッサーを高レベルまで構築することが可能となる。例えば、サプレッサー遺伝子がIPTGによって誘導可能なプロモーターによって制御される本発明の態様において、標的ORFは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターによって制御され、T7 RNAポリメラーゼの発現は、IPTG以外の誘導シグナル、例えば、NaClによって誘導可能なプロモーターによって制御され、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子と対象ORFのその後の発現前にIPTGによるサプレッサーtRNA遺伝子の発現のスイッチを入れることができるであろう。いくつかの態様において、サプレッサーtRNAの発現は、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導前約15分から約1時間誘導してもよい。一つの態様において、サプレッサーtRNAの発現は、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導前約15分〜約30分誘導してもよい。いくつかの態様において、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発現は、誘導型プロモーターの制御下である。
【０２０３】
さらなる態様において、対象標的ORFおよびサプレッサーtRNAの発現は、フィードバックループの形で配置することができる。例えば、対象標的ORFは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に置かれてもよいが、サプレッサー遺伝子は、T7プロモーターとlacプロモーターの双方の制御下に置かれる。T7 RNAポリメラーゼ遺伝子自身も同様に、T7プロモーターとlacプロモーターの双方の制御下に置かれる。さらに、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子は、通常のチロシンコドン、例えば28位のコドン（883個中）を置換するアンバー終止変異を有する。活性なT7 RNAポリメラーゼは、サプレッサーレベルが、有意な抑制を生じるために十分に高くなる前に作製することができない。次に、T7ポリメラーゼがサプレッサー遺伝子と共に自身を発現することから、ポリメラーゼの発現が急速に増加する。他の好ましい態様において、サプレッサー遺伝子のみがT7 RNAポリメラーゼプロモーターから発現される。このタイプの態様は、T7 RNAポリメラーゼの過剰量を産生することなく、高レベルのサプレッサーを生じるであろう。他の好ましい態様において、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子は、一つより多いアンバー終止変異を有する。これは、活性なT7 RNAポリメラーゼが産生される前に高レベルのサプレッサーを必要とするであろう。
【０２０４】
本発明のいくつかの態様において、一つより多いサプレッサーtRNAによって抑制可能な一つより多い終止コドンを有することが望ましい場合がある。同じ構築物からの対象タンパク質のN末端および／またはC末端融合体の調節可能な発現を可能にするために、組換えウイルスベクターを構築してもよい。ウイルスベクターは、プロモーターから発現された第一のタグ配列を含んでもよく、タグと同じ読み取り枠において第一の終止コドンが含まれてもよい。終止コドンは、タグ配列のどの場所に存在してもよく、好ましくはタグ配列のC末端またはその近傍に存在する。終止コドンはまた、組換え部位またはリボソーム内部認識配列（IRES）に存在してもよい。ウイルスベクターにはまた、第二の終止コドンが含まれる対象ORFを好ましくは含む対象配列が含まれてもよい。第一のタグおよび対象ORFは好ましくは同じ読み取り枠に存在するが、対象ORFと同じ読み取り枠に第一のタグを生じるためにフレームシフトを引き起こす配列を含めることは、本発明の範囲内である。第二の終止コドンは、好ましくは対象ORFと同じ読み取り枠に存在し、好ましくはORFのコード配列の末端またはその近傍に存在する。第二の終止コドンは選択的に、対象配列に対して3'に存在する組換え部位内に存在してもよい。構築物にはまた、対象ORFと同じ読み取り枠において第二のタグ配列が含まれてもよく、第二のタグ配列には、選択的に、第二のタグと同じ読み取り枠において第三の終止コドンが含まれてもよい。第二のタグのコード配列後に、転写ターミネータおよび／またはポリアデニル化配列が構築物に含まれてもよい。第一、第二、および第三の終止コドンは同じであっても異なっていてもよい。いくつかの態様において、三つの終止コドンは全て異なっている。第一および第二の終止コドンが異なる態様において、同じ構築物を用いて、適当なサプレッサーtRNAの発現を変化させることによって、N末端融合物、C末端融合物、および本来のタンパク質を発現させてもよい。例えば、本来のタンパク質を発現させるために、サプレッサーtRNAは発現されず、タンパク質の翻訳は適当に配置されたIRESによって制御される。N末端融合体が望ましい場合、第一の終止コドンを抑制するサプレッサーtRNAが発現されるが、C末端融合体を産生する場合には、第二の終止コドンを抑制するサプレッサーtRNAが発現される。いくつかの態様において、対象二重タグ標識タンパク質を発現させることが望ましい可能性があるが、その場合第一と第二の終止コドンの双方を抑制するサプレッサーtRNAが発現される可能性がある。
【０２０５】
本発明の核酸分子の構築と利用
下記により詳細に考察するように、一つの局面において、本発明は、特定の機能または活性を有するウイルス、例えばウイルスベクターを構築するためのモジュールシステムを提供する。本発明にはまた、一つより多い核酸インサート（例えば、インサート2、3、4、5、6、8、10、12、15、20、30、40、50個等）を含むウイルス、例えばウイルスベクターを調製する方法が含まれる。本発明の一つの一般的な態様において、本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子は以下のように調製される。ウイルスベクターに最終的に組み入れられる核酸分子を得る（例えば、購入する、PCRによって調製する、または逆転写酵素を用いてCDNAの調製によって）。適した組換え部位を、合成の際に核酸分子の5'および／または3'末端に組み入れるか、後に付加する。ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸および組み入れられる核酸を、所望のウイルスベクターを構築するために一つまたは複数の組換えタンパク質の存在下で組み合わせる。
【０２０６】
本発明のいくつかの態様において、当技術分野で既知の技術の様々な組み合わせを用いて、本発明の核酸分子を組み合わせてもよい。第一の核酸分子を第二の核酸分子に結合させる場合、同じまたは異なる技術を用いて分子の末端を結合させてもよい。例えば、第二の核酸分子に結合させる第一の核酸分子の一つの末端は、一つのタイプの認識部位（例えば、トポイソメラーゼ認識部位）を含んでもよく、他の末端は、異なるタイプの部位（例えば、組換え部位または制限酵素部位）を含んでもよい。様々な態様において、核酸分子は一つの末端で制限酵素部位を有し、他の末端でトポイソメラーゼ部位を有してもよく、一つの末端で制限酵素部位を有し、他の末端で組換え部位を有してもよく、または一つの末端でトポイソメラーゼ部位を有し、他の末端で組換え部位を有してもよい。当業者は、リガーゼおよび／またはトポイソメラーゼを用いて、制限部位を有する一つの末端をもう一つの核酸分子に連結させてもよい。トポイソメラーゼを用いて二つの核酸分子を結合させる場合、いずれかまたは双方の鎖を共有結合させてもよい。図3は、鎖の両方が共有結合した例を示す。
【０２０７】
モジュールウイルスベクターを構築するために、一つまたは複数の組換え部位を含み、同様にウイルス配列を含む一つまたは複数の核酸セグメントを調製してもよい。いくつかの態様において、それぞれが少なくとも一つの組換え部位を有し、いくつかはウイルス配列（例えば、バキュロウイルスまたはアデノウイルス配列）を有する多数のセグメントを構築して、これを合わせて本発明の核酸分子を産生してもよい。例えば、アデノウイルスITRと組換え部位とを含む核酸セグメントを調製してもよい。さらに、それぞれが組換え部位に隣接するアデノウイルスゲノムの異なる部分を含む、複数の核酸セグメントを調製してもよい。いくつかの態様において、アデノウイルスのゲノム全体を、組換え部位に隣接するセグメントにおいて調製してもよい。そのようなセグメントは、組み合わせた後、アデノウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、対象配列を含む核酸が形成されるように、さらなる対象配列を含む一つまたは複数のさらなるセグメントと組み合わせてもよい。
【０２０８】
アデノウイルスゲノムのセグメントは、異なる血清型のアデノウイルス、例えばAd5、Ad3、Ad10等から調製してもよく、混合血清型（例えばAd5のいくつかの決定因子とAd10のいくつかの決定因子）を有するウイルスベクターを調製してもよい。ウイルスベクターの多数回投与が企図される状況では、ウイルスの最も免疫原性の部分を変化させることが望ましい場合がある。
【０２０９】
アデノウイルスゲノムのそれぞれのセグメントは、一つまたは複数のゲノム領域、例えば左ITR、右ITR、パッケージングシグナル、E1、E2、E3、E4および／または一つまたは複数の後期領域を含んでもよい。いくつかの態様において、セグメントは、異なるセグメントに存在する一つの領域を除き、アデノウイルスゲノム全体を含んでもよい。例えば、パッケージングシグナルを除く完全なアデノウイルスゲノムを一つのセグメントにおいて調製して、パッケージングシグナルを異なるセグメントにおいて調製してもよい。二つのセグメントを合わせて（例えば、組換えクローニングを用いて）、本発明のウイルスベクターを産生してもよい。同様に、以下のエレメントの一つまたは複数を欠損するアデノウイルスゲノム全体を調製してもよい：左ITR、E1、E2、E3、E4、または右ITR。欠損するエレメントは異なるセグメントにおいて調製してもよく、二つのセグメントを組み合わせてウイルスベクターを産生してもよい。一つまたは複数の対象配列を含むアデノウイルスベクターを産生するために、一つまたは複数の対象配列を、セグメントと組み合わせる前にいずれかのセグメントに組み入れてもよい。一つより多いウイルス領域、例えば左ITR、パッケージングシグナル、およびE3領域を、一つまたは複数の他のセグメント上に存在するウイルスベクターを調製するために必要なアデノウイルス機能の残りと共に、一つのセグメント上で調製してもよい。対象配列は如何なる一つのセグメントに存在してもよい。
【０２１０】
典型的に、核酸分子を水性緩衝液に溶解して、反応混合物に加える。一つの適した条件の組は、CLONASE（商標）酵素混合物（例えば、Invitrogen Corporation、カタログ番号11791-019および11789-013）4 μl、5×反応緩衝液4 μl、および核酸、ならびに水を最終容積を20 μlにすることである。これによって典型的に、BP反応20 μlにおいてInt約200 ngおよびIHF約80 ngが含まれ、LR反応20 μlにおいてInt約150 ng、IHF約25 ng、およびXis約30 ngが含まれる。
【０２１１】
LR反応を行うためのタンパク質は、適当な緩衝液、例えばpH約7.5の約50 mMトリス、約50 mM NaCl、約0.25 mM EDTA、約2.5 mMスペルミジン、および約0.2 mg/ml BSAを含んでもよいLR保存緩衝液に保存してもよい。保存された場合、LR反応のタンパク質を約37.5 ng/μl INT、10 ng/μl IHF、および15 ng/μl XISの濃度で保存してもよい。BP反応を行うためのタンパク質は、適した緩衝液、例えば、pH約7.5の約25 mMトリス、約22 mM NaCl、約5 mM EDTA、約5 mMスペルミジン、約1 mg/ml BSA、および約0.0025％トライトンX-100を含んでもよいBP保存緩衝液において保存してもよい。保存する場合、BP反応のためのタンパク質は、約37.5 ng/μl INTおよび20 ng/μl IGFの濃度で保存してもよい。当業者は、異なる酵素調製物において酵素活性が変化してもよいと認識するであろう。上記で示唆された量は、酵素の任意の特定の調製物において活性量に関して調節するために改変してもよい。
【０２１２】
組換え反応を行うための適した5×反応緩衝液は、pH 7.5の100 mMトリス、88 mM NaCl、20 mM EDTA、20 mMスペルミジン、および4 mg/ml BSAを含んでもよい。このように、組換え反応において、緩衝液の最終濃度は、pH 7.5の20 mMトリス、17.6 mM NaCl、4 mM EDTA、4 mMスペルミジン、および0.8 mg/ml BSAであってもよい。当業者は、最終反応混合物は、混合物を調製するために用いられる試薬と共に付加されるさらなる成分を組み入れてもよく、例えばBP反応には、BP  Clonase（商標）から組み入れられた0.005％トライトンX-100が含まれてもよいと認識するであろう。
【０２１３】
いくつかの好ましい態様において、特にattL部位をattR部位と組換えする態様において、最終反応混合物には、組換え酵素および組み合わせられる核酸の他に、pH 7.5の約50 mMトリス塩酸、約1 mM EDTA、約1 mg/ml BSA、約75 mM NaCl、および約7.5 mMスペルミジンが含まれてもよい。他の好ましい態様において、特にattB部位をattP部位と組換えする態様において、最終反応混合物には、pH 7.5の約25 mMトリス塩酸、約5 mM EDTA、約1 mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、約22 mM NaCl、および約5 mMスペルミジンが含まれてもよい。
【０２１４】
いくつかの好ましい態様において、特にattL部位をattR部位と組換えする態様において、最終反応混合物には、組換え酵素および組み合わせられる核酸の他に、pH 7.5の約40 mMトリス塩酸、約1 mM EDTA、約1 mg/ml BSA、約64 mM NaCl、および約8 mMスペルミジンが含まれてもよい。当業者は、反応条件をいくぶん変化させてもよく、それも本発明に含まれることを認識するであろう。例えば、反応物のpHは、約7.0〜約8.0まで変化してもよい；緩衝液の濃度は、約25 mM〜約100 mMまで変化してもよい；EDTAの濃度は約0.5 mM〜約2 mMまで変化してもよい；NaClの濃度は約25 mM〜約150 mMまで変化してもよい；およびBSAの濃度は、0.5 mg/ml〜約5 mg/mlまで変化してもよい。他の好ましい態様において、特に、attB部位をattP部位と組換えする態様において、最終反応混合物には、pH 7.5の約25 mMトリス塩酸、約5 mM EDTA、約1 mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、約22 mM NaCl、約5 mMスペルミジン、および約0.005％界面活性剤（例えば、トライトンX-100）が含まれてもよい。
【０２１５】
本発明にはまた、一つまたは複数のウイルスゲノムの全てまたは一部を含むアデノウイルスベクターの他にウイルスベクター（例えば、バキュロウイルスベクター）が含まれる。説明する目的のためにバキュロウイルス核酸を含むベクターを用いて、本発明のベクターには、バキュロウイルスゲノムの一つまたは複数のエレメント（例えば、一つまたは複数の機能的エレメント）を含むベクターと共に、一つまたは複数の他のウイルスゲノムの一つまたは複数のエレメント（例えば、プロモーター、転写ターミネータ、ポリAシグナルまたは配列、リボソーム結合部位、エンハンサー、ORF、またはその一部）を含むベクターが含まれる。典型的に、これらのベクターには、本明細書において他の場所で記述されているように、一つまたは複数の組換え部位が含まれるであろう。
【０２１６】
本発明のベクターの一つの特定の例を図13に略図で示す。このベクターは、異なる三つのバキュロウイルスエレメントを含む。より詳しく述べると、図13に示すベクターは、オルジア・シュードツガタ（Orgyia pseudotsugata）のIE2遺伝子プロモーターおよびIE2遺伝子ポリA領域を含む。ベクターにはまた、オートグラファ核多角体ウイルスのGP64プロモーターが含まれる。このように、本発明の核酸分子には、一つまたは複数のウイルスゲノム（例えば、アデノウイルスゲノム、バキュロウイルスゲノム等）に由来する一つまたは複数のエレメント（例えば、本明細書に記述のエレメント）を含むベクターが含まれる。さらに、これらのエレメントは同じまたは異なるウイルスに由来してもよい。
【０２１７】
本発明にはさらに、ウイルスゲノムの改変エレメントを含む核酸分子が含まれる。これらの改変エレメントは、多くの方法で本発明の範囲内であると定義されおよび／または記述される可能性がある。そのような方法の例には、（1）機能（例えば、エレメントを含む核酸に付与される特性）、（2）配列同一性の割合（％）、および（3）発現産物の相同性または配列同一性の割合（％）と共にこれらの方法の組み合わせが含まれる。相同性または配列同一性の割合（％）は、典型的に、もう一つの核酸またはポリペプチドのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を参照して決定されるであろう。
【０２１８】
先に示したように、本発明によって用いるために適したウイルスエレメントおよび改変ウイルスエレメントは、それらを含む核酸分子上に一つまたは複数の機能的特性を付与できることによって記述してもよい。例としてGP64プロモーターを用いるが、このプロモーターは、低レベルの基礎構成的活性を示す誘導型プロモーターである。言い換えれば、誘導の非存在下で、GP64プロモーターは、核酸セグメントに機能的に結合した場合に、低レベルの転写を可能にする。機能的特性も同様に、複製起点、ポリAテール配列、パッケージングシグナル、LTR等のような他のウイルスエレメントに関連している。さらに、特定のエレメントに応じて、機能的活性をベクター（例えば、DNAまたはRNAレベル）、転写産物（例えば、RNAレベル）、および／または翻訳産物（例えば、ポリペプチドレベル）のいずれかのレベルで評価することができる。このように、本発明にはさらに、それらが由来するウイルスエレメント（例えば、「野生型」ウイルスエレメント）の機能の全てまたは一部を保持する改変ウイルスエレメントを含む核酸分子が含まれる。多くの場合、改変エレメントは、それらが由来するエレメントの少なくとも一つの機能的特性を保持するであろう。特定の態様において、改変エレメントは（1）それが由来するエレメントに関連しない少なくとも一つのさらなる特性を有する、（2）それが由来するエレメントに関連する少なくとも一つの特性が欠損している、および／または（3）それが由来するエレメントに関連する少なくとも一つの特性に関して活性が増加または減少している、と考えられる。
【０２１９】
先にも示したように、本発明の核酸分子に含まれる改変エレメント（例えば、改変ウイルスエレメント）は、それらが由来するエレメントとその構造的類似性によって記述してもよい。例えば、改変エレメントは、それらが由来する核酸分子と、核酸レベルで少なくとも50％同一、少なくとも55％同一、少なくとも60％同一、少なくとも65％同一、少なくとも70％同一、少なくとも75％同一、少なくとも80％同一、少なくとも85％同一、少なくとも90％同一、または少なくとも95％同一であってもよい。改変エレメントは、二つの核酸がハイブリダイズするように、それらが由来する核酸分子（例えば、そのヌクレオチド配列が本明細書のどこかで記載されているエレメント）と十分な構造類似性を有するとして定義してもよい。しばしば、これらの分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で互いにハイブリダイズするであろう。多くの場合、これらの改変エレメントは、それらが由来するエレメントに関連する少なくとも一つの特性を保持するであろう。
【０２２０】
ウイルスゲノムの改変エレメントがポリペプチド発現産物をコードする場合、ポリペプチドは、改変エレメントが由来する核酸から発現されるポリペプチドのアミノ酸配列と、アミノ酸レベルで少なくとも50％同一もしくは相同、少なくとも55％同一もしくは相同、少なくとも60％同一もしくは相同、少なくとも65％同一もしくは相同、少なくとも70％同一もしくは相同、少なくとも75％同一もしくは相同、少なくとも80％同一もしくは相同、少なくとも85％同一もしくは相同、少なくとも90％同一もしくは相同、または少なくとも95％同一もしくは相同であってもよい。典型的に、改変エレメントのポリペプチド発現産物は、改変エレメントが由来する核酸から発現されるポリペプチドの少なくとも一つの機能的特性を保持するであろう。特定の態様において、改変エレメントのポリペプチド発現産物は、（1）それが由来するエレメントからのポリペプチド発現産物に関連しない少なくとも一つのさらなる特性を有する、（2）それが由来するエレメントからのポリペプチド発現産物に関連する少なくとも一つの特性が欠損している、および／または（3）それが由来するエレメントからのポリペプチド発現産物に関連した少なくとも一つの特性に関して活性が増加または減少している、と考えられる。
【０２２１】
本発明のベクターの一つの例は、異種核酸に機能的に結合したオートグラファ核多角体ウイルスのGP64プロモーターを含むベクターである。特定の態様において、GP64プロモーターは、表12に記載したヌクレオチド3364位で始まるヌクレオチド配列の全てまたは一部を有する。本発明にはさらに、GP64プロモーターの改変型を含む核酸分子が含まれる。GP64プロモーターのこれらの改変型には、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、または少なくとも95ヌクレオチドを含むプロモーターの欠失型が含まれる。
【０２２２】
先に述べたように、本発明のベクターは、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含んでもよい。例えば、本発明のベクターは、ベクターを調製するために用いられるウイルスゲノムの少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または100％を含んでもよい。例えば、これを調製するために用いられるゲノムの約50％を含むバキュロウイルスベクターは、バキュロウイルス核酸約66 kbを含んでもよい。
【０２２３】
複製にとって必要な全てのウイルス機能がセグメントに含まれる必要はなく、そしてウイルスゲノムの全てまたは一部を含む最終的な核酸分子に含まれる必要はない。一つまたは複数の必要な機能は、別の場所で提供してもよい。例えば、必要な機能を細胞株のゲノムに組み入れて、なおも機能を提供してもよい。機能を欠損するウイルスは、機能を発現する細胞株において調製することができるであろう。これらのウイルスは、機能を発現する細胞株において複製できるのみならず、このように、他の任意の細胞株において複製欠損となるであろう。任意の必要な機能、例えばアデノウイルスE2および／またはE4機能をこのようにして用いることができる（Weinberg ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：5383、5386、1983を参照のこと）。
【０２２４】
上記のようにして調製されたセグメントは、直線状の断片（例えば、PCR断片）であってもよく、またはセグメントはより大きい核酸分子（例えば、プラスミド）の一部であってもよい。セグメントを組み合わせて、本発明のウイルスベクターを形成してもよい。セグメントを組み合わせる場合、得られたアデノウイルスベクターは、例えば組換えクローニングを用いて直線状のセグメントを組み合わせることによって直線状の分子であってもよい。直線状のウイルスベクターを適当な宿主細胞に導入して（例えば、トランスフェクション、電気穿孔等によって）、パッケージングされたウイルスを本明細書のどこかで記述されるように単離してもよい。または、ウイルスベクターは、環状分子（例えば、プラスミド）の一部として調製してもよく、ウイルスベクターは環状分子から放出されて（例えば、制限消化によって）、適当な宿主細胞に導入され、パッケージングされたウイルスを単離してもよい。
【０２２５】
多数の核酸インサートを含むウイルスベクターを調製または構築しようとする場合、これらのインサートを一つの反応混合物または一連の反応混合物のいずれかにおいてウイルスベクターに挿入することができる。例えば、多数の核酸セグメントの末端と末端とを連結させて、例えば1回反応混合物において行われる反応を用いてウイルスベクターに挿入することができる。この反応混合物における核酸セグメントは、その5'および3'末端上の組換え部位によって、特異的な順序でそして特異的な5'から3'方向にウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸への挿入が起こるように設計することができる。または、核酸セグメントは、それらがインサートの順序、方向（すなわち、5'から3'方向）、数、および／または複製インサートの数とは無関係に、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸に挿入されるように設計することができる。
【０２２６】
本発明の方法はまた、ウイルスベクターに含まれる対象配列が発現されると、一つまたは複数の所望の特性、機能、または活性（例えば、酵素活性、核酸結合能等）を有する一つまたは複数のポリペプチドを産生するウイルスベクターを調製するために用いることができる。例えば、一つまたは複数の酵素活性を有するポリペプチドを、本発明のウイルスベクターから発現させてもよい。このタイプのウイルスベクターは、例えば遺伝子治療プロトコールにおいて失われた酵素活性を置換するために用いてもよい。本発明のウイルスベクターから産生されたポリペプチドは、他の望ましい特徴を有してもよく、例えば、ポリペプチドは一つまたは複数の抗原性決定因子を含んでもよい。そのようなポリペプチドの発現によって、発現されたポリペプチドに対して特異的な免疫応答が起こる可能性がある。そのようなウイルスベクターは、例えば、免疫治療物質、例えばワクチンとして用いてもよい。
【０２２７】
本発明の方法はまた、ウイルスベクターに含まれる対象配列が発現されると、一つまたは複数の非翻訳RNA分子、例えばリボザイム、アンチセンス分子、RNAi等を産生するウイルスベクターを調製するために用いることができる。そのようなウイルスベクターは、例えば、宿主生物によって産生される一つまたは複数のRNAまたはポリペプチド分子の発現を調節（例えば、阻害）するために用いてもよい。そのようなベクターは、例えば疾患関連RNAまたはポリペプチドの発現を阻害するために用いてもよい。
【０２２８】
本発明の方法はまた、ウイルスベクターに含まれる対象配列が発現されると、一つより多い特性、機能、または活性を有する融合タンパク質を産生するウイルスベクターを調製するために用いることができる。さらに、発現産物は、細胞から細胞外への輸送を促進するように産生することができる。例えば、これらの発現産物は、それによって細胞からのタンパク質の細胞外輸送が起こるシグナルペプチドを含む融合タンパク質となりうる。細胞外輸送が望ましい一つの応用は、細胞外輸送されるタンパク質が細胞外基質と相互作用する酵素である場合である。
【０２２９】
特定の態様において、本発明はさらに、遺伝子治療プロトコールの一部として動物（例えば、ヒト）および動物細胞（例えば、ヒト細胞）に本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子を導入する方法を提供する。本発明のウイルスベクターは、ベクターを含む組成物が標的細胞において複製コンピテントであるウイルスベクターを含まないように設計してもよい。このように、いくつかの態様において、本発明のウイルスベクターは、複製が制限される、すなわち許容される細胞種、例えば293細胞では複製することができるが、標的細胞種、例えば患者の細胞では複製することができない。
【０２３０】
遺伝子治療は、発現されたまたは発現されうる核酸分子を被験者に投与することによって行われる治療を指す。本発明の多くの態様において、本発明の核酸分子は、少なくとも一つの治療効果を媒介する一つまたは複数のタンパク質（例えば、一つまたは複数の融合タンパク質）をコードするであろう。このように、本発明は、遺伝子治療において用いられる核酸分子および方法を提供する。
【０２３１】
本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子を用いて、細胞のゲノムに存在する遺伝子を置換するように、そのような遺伝子を欠失するように、または異種遺伝子もしくは遺伝子集団を挿入するように設計された遺伝子治療ベクターを調製することができる。本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子が、遺伝子または複数の遺伝子を欠失または置換するように機能する場合、欠失または置換される遺伝子または複数の遺伝子によって、「通常の」表現型または異常な表現型のいずれかの発現が起こる可能性がある。異常な表現型の一例は疾患の嚢胞性線維症である。さらに、遺伝子治療ベクターは、安定に維持されるか（例えば、相同的または部位特異的組換えによって細胞の核酸に組み入れられる）、または細胞において不安定に維持されてもよい。
【０２３２】
さらに、本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子を用いて、「異常な」表現型を抑制する、または内因性の遺伝子の発現に起因する「通常の」表現型を補足もしくは補助してもよい。異常な表現型を抑制するように設計される本発明のウイルスベクターの一例は、ウイルスベクターの発現産物がドミナント／ネガティブ活性を有する場合であろう。通常の表現型を補助するように設計された本発明のウイルスベクターの例は、ウイルスベクターの誘導によって細胞に存在する遺伝子の増幅が効率的に起こる場合であろう。
【０２３３】
いくつかの態様において、本発明のウイルスベクターおよび／または核酸を用いて、例えば相同性依存的遺伝子サイレンシング（HDGS、例えば、Bernsteinら、RNA 7：1509〜21（2001）、およびBass、Cell 101：235〜238（2000）を参照されたい）によって、生物における一つまたは複数の遺伝子の発現を防止または阻害してもよい。その発現が阻害される、すなわちサイレンシングされる遺伝子は、生物に対して内因性であってもよく、または生物に対して外因性であってもよい。
【０２３４】
本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子は、干渉RNA（RNAi）を作製するために調製してもよい。RNAiは、特異的mRNAを分解し、同様に遺伝子発現を低下または消失させるために用いることができる二本鎖RNAである。本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子は、例えば、ウイルスベクターおよび／または核酸分子が転写された場合に折り畳まれて二本鎖部分を含むヘアピン分子を生成する配列を有するように操作することによって、dsRNA分子を生成するように操作してもよい。二本鎖部分の一つの鎖は、サイレンシングされる遺伝子から転写されたmRNAのセンス鎖の全てまたは一部に対応してもよいが、二本鎖部分の他の鎖は、アンチセンス鎖の全てまたは一部に対応してもよい。二本鎖RNA分子を産生する他の方法を用いてもよく、例えばウイルスベクターおよび／または核酸分子は、転写されると、サイレンシングされる遺伝子から転写されたmRNAのセンス鎖の全てまたは一部に対応する第一の配列と、転写された場合に、サイレンシングされる遺伝子から転写されたmRNAのアンチセンス鎖（すなわち逆相補鎖）の全てまたは一部に対応する第二の配列とを有するように操作してもよい。これは、ウイルスベクターの同じ鎖に存在する第一および第二の鎖をそれぞれ、それ自身のプロモーターの制御下に置くことによって行ってもよい。または、二つのプロモーターは、それぞれのプロモーターからの発現によって、二本鎖RNAの一つの鎖に転写が起こるように、ウイルスベクターの反対側の鎖に配置してもよい。いくつかの態様において、一つのウイルスベクターまたは核酸分子上に第一の配列を有し、第二のウイルスベクターまたは核酸分子上に第二の配列を有すること、およびサイレンシングされる遺伝子を含む細胞に双方のベクターまたは分子を導入することが望ましい場合がある。他の態様において、アンチセンス鎖のみを含むウイルスベクターまたは核酸分子を導入して、サイレンシングされる遺伝子から転写されたmRNAが二本鎖RNAの他の鎖として作用してもよい。いくつかの態様において、遺伝子をサイレンシングするために用いられるdsRNAは、サイレンシングされる遺伝子に対して一つまたは複数の相同性領域を有してもよい。相同性領域は、長さが約20 bp〜約5 kbp、長さが20 bp〜約4 kbp、長さが20 bp〜約3 kbp、長さが20 bp〜約2.5 kbp、長さが20 bp〜約2 kbp、長さが20 bp〜約1.5 kbp、長さが約20 bp〜約1 kbp、長さが20 bp〜約750 bp、長さが約20 bp〜約500 bp、長さが20 bp〜約400 bp、長さが20 bp〜約300 bp、長さが20 bp〜約250 bp、長さが約20 bp〜約200 bp、長さが約20 bp〜約150 bp、長さが約20 bp〜約100 bp、長さが約20 bp〜約90 bp、長さが約20 bp〜約80 bp、長さが約20 bp〜約70 bp、長さが約20 bp〜約60 bp、長さが約20 bp〜約50 bp、長さが約20 bp〜約40 bp、長さが約20 bp〜約30 bp、長さが約20 bp〜約25 bp、長さが約15 bp〜約25 bp、長さが約17 bp〜約25 bp、長さが約19 bp〜約25 bp、長さが約15 bp〜約23 bp、長さが約17 bp〜約23 bp、長さが約19 bp〜約23 bp、長さが約15 bp〜約21 bp、長さが約17 bp〜約21 bp、または長さが約19 bp〜約21 bpであってもよい。
【０２３５】
上記のように、二本鎖領域を有する分子を含むヘアピンをRNAiとして用いてもよい。二本鎖領域の長さは、長さが約20 bp〜約2.5 kbp、長さが約20 bp〜約2 kbp、長さが20 bp〜約1.5 kbp、長さが約20 bp〜約1 kbp、長さが20 bp〜約750 bp、長さが約20 bp〜約500 bp、長さが20 bp〜約400 bp、長さが20 bp〜約300 bp、長さが20 bp〜約250 bp、長さが約20 bp〜約200 bp、長さが約20 bp〜約150 bp、長さが約20 bp〜約100 bp、長さが20 bp〜約90 bp、長さが20 bp〜約80 bp、長さが20 bp〜約70 bp、長さが20 bp〜約60 bp、長さが20 bp〜約50 bp、長さが20 bp〜約40 bp、長さが20 bp〜約30 bp、長さが約20 bp〜約25 bp、長さが約15 bp〜約25 bp、長さが約17 bp〜約25 bp、長さが約19 bp〜約25 bp、長さが約15 bp〜約23 bp、長さが約17 bp〜約23 bp、長さが約19 bp〜約23 bp、長さが約15 bp〜約21 bp、長さが約17 bp〜約21 bp、または長さが約19 bp〜約21 bpであってもよい。ヘアピンの非塩基対部分（すなわち、ループ）は、ヘアピンの二本鎖部分を構成する二つの相同性領域を互いに折れ曲がらせる如何なる長さともなりうる。
【０２３６】
任意の適したプロモーターを用いて、本発明の核酸分子からのRNAの産生を制御してもよい。プロモーターは、任意のポリメラーゼ酵素によって認識されるプロモーターであってもよい。例えば、プロモーターは、RNAポリメラーゼII、またはRNAポリメラーゼIIIのプロモーター（例えば、U6プロモーター、H1プロモーター等）であってもよい。他の適したプロモーターには、T7プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）プロモーター、メタロチオネイン、RSV（ラウス肉腫ウイルス）、長末端反復配列、SV40プロモーター、ヒト成長ホルモン（hGH）プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。他の適したプロモーターは、当業者に既知であり、本発明の範囲内である。
【０２３７】
RNAiを産生するように設計された構築物の一つの例を図5Bに示す。この構築物において、双方の鎖に対応するRNAが二つの異なる転写物として産生されるように、DNAセグメントをベクターに挿入する。RNAiを産生するように設計された構築物のもう一つの例を図5Cに示す。この構築物において、双方の鎖に対応するRNAが再度産生されるように、DNAセグメント2コピーを挿入する。RNAiを産生するように設計される構築物のさらにもう一つの例を、図5Dに示す。この構築物において、双方の鎖に対応するRNAが単一の転写物として産生されるように、DNAセグメント2コピーをベクターに挿入する。図5Eおよび5Fに示される例としてのベクター系は、そのそれぞれが同じDNAセグメントのコピーを含む二つのベクターを含む。これらのDNAセグメントの一つの発現によって、センスRNAが産生されるが、他の発現によってアンチセンスRNAが産生される。図5B〜5Fにおいて示されるベクターから産生されたRNA鎖は、このように相補的ヌクレオチド配列を有し、生理的条件で互いにまたは分子内で一般的にハイブリダイズするであろう。
【０２３８】
図5B〜5Fに示されるベクターのように、RNAiを産生するように設計された核酸セグメントは、完全長の遺伝子またはオープンリーディングフレームに対応する必要はない。例えば、核酸セグメントがORFに対応する場合、セグメントはORFの一部に対応するのみであってもよい（例えば、ORFの5'または3'末端で50ヌクレオチド）。さらに、図5B〜5Fは、RNAiを産生するように設計されたベクターを示すが、核酸セグメントはまた、他の形で（例えば、宿主細胞の染色体に挿入された場合）同じ機能を行ってもよい。
【０２３９】
RNAiおよびアンチセンスRNAのような化合物を用いることを含む遺伝子サイレンシング法は、例えば、遺伝子機能を同定するために特に有用である。より詳しく述べると、遺伝子サイレンシング法を用いて、細胞または生物における一つまたは複数の遺伝子の発現を減少または予防することができる。次に、遺伝子機能の選択的阻害に関連した表現型発現を用いて、「サイレンシングされる」遺伝子または複数の遺伝子に役割を割付することができる。一例として、Chuangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：4985〜4990（2000）は、RNAiがインビボで産生されると、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において遺伝子活性が変化しうることを証明した。このように、本発明は、RNAiおよびアンチセンスRNAの発現を含む細胞および組織において核酸分子の発現を調節する方法を提供する。本発明はさらに、DNA分子の一つまたは双方の鎖に対応するRNAを産生するために用いることができる核酸分子を調製する方法を提供する。
【０２４０】
さらに、本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子を用いて、特定の生物経路の各段階（例えば、リジン、トレオニン等のようなアミノ酸の生合成）に関与する発現産物、またはそのような経路の一つもしくはいくつかの段階に関与する発現産物をコードする核酸セグメントを細胞に挿入してもよい。これらの核酸分子は、実際にそのような経路において発現産物をコードする遺伝子を増幅するように、細胞において通常認められない経路に関与する発現産物をコードする遺伝子を細胞に挿入するように、または細胞における特定の生物経路の一つもしくは複数の段階に関与する一つもしくは複数の遺伝子を置換するように設計することができる。このように、本発明の遺伝子治療ベクターは、一つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、8、10、15個等）の産物の産生が得られる核酸を含んでもよい。そのようなベクター、特に一つより多い産物の産生が得られるベクターは、一つより多い遺伝子の発現および／または発現の欠損に起因する疾患および／または病態を治療するために、または一つより多い疾患および／または病態を治療するために、特に有用となるであろう。
【０２４１】
このように、関連する局面において、本発明は、一つまたは複数の発現産物（例えば、一つまたは複数の融合タンパク質）を発現する遺伝子治療ベクター、そのようなベクターを産生する方法、本発明のベクターを用いて遺伝子治療を行う方法、そのようなベクターの発現産物（例えば、コードされるRNAおよび／またはタンパク質）、および本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０２４２】
遺伝子治療の方法に関する一般的な概要に関しては、
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を参照されたい。用いることができる組換えDNA技術の技術分野において一般的に既知の方法は、Ausubelら（編）、1993、「Currrent Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、ニューヨーク州；およびKriegler、1990、「Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual」、ストックトン出版、ニューヨーク州に記述される。
【０２４３】
本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子の患者への輸送は、患者が本発明の核酸および／またはウイルスベクターに直接曝露される直接的であってもよく、または細胞を最初にインビトロで核酸／ウイルスベクターにトランスフェクト／形質導入させてから患者に移植する間接的であってもよい。これらの二つのアプローチはそれぞれ、インビボまたはエクスビボ遺伝子治療として知られる。
【０２４４】
もう一つの特定の態様において、本発明の抗体または他の抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを用いる。遺伝子治療において用いられる抗体をコードする核酸配列を、患者への遺伝子の輸送を促進する一つまたは複数のウイルスベクターにおいてクローニングする。
【０２４５】
アデノウイルスは、遺伝子治療において用いることができるウイルスベクターを調製するために用いることができるウイルスの例である。アデノウイルスベクターは、呼吸器上皮に遺伝子を輸送するための特に魅力的な媒体であり、そのようなベクターを用いることは、本発明の範囲に含まれる。アデノウイルスは本来、呼吸器上皮に感染して、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく輸送システムに関する他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができる長所を有する。Kozarsky and Wilson、Current Opinion in Genetics and Development 3：499〜503（1993）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療に関する論評を示す。Boutら、Human Gene Therapy 5：3〜10（1994）は、アカゲザルの呼吸器上皮に遺伝子を移入するためにアデノウイルスベクターを用いることを証明した。遺伝子治療においてアデノウイルスベクターを用いる他の例は、その全ての開示の全文が参照として本明細書に組み入れられる、Rosenfeldら、Science 252：431〜434（1991）；Rosenfeldら、Cell 68：143〜155（1992）；Mastrangeliら、J. Clin. Invest. 91：225〜234（1993）；PCT出願国際公開公報第94/12649号および国際公開公報第96/17053号；米国特許第5,998,205号；ならびにWangら、Gene Therapy 2：775〜783（1995）において認められうる。一つの態様において、アデノウイルスベクターはインビボ遺伝子治療のために用いられる。
【０２４６】
遺伝子治療に対するもう一つのアプローチは、例えば本発明のウイルスベクターの感染によって、組織培養において細胞に遺伝子を移入することを含む。ウイルスベクターは、治療ポリペプチドまたは核酸（すなわち、アンチセンス分子）をコードする配列を含んでもよく、選択マーカーをコードする配列がさらに含まれてもよい。次に、移入された遺伝子を取り込んで発現する細胞を単離するために、細胞を選択下に置く。次に、それらの細胞を患者に輸送する。
【０２４７】
本態様において、ウイルスベクターを細胞に導入してから得られた組換え型細胞をインビボで投与する。得られた組換え型細胞は、当技術分野で既知の様々な方法によって患者に輸送することができる。組換え型血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、一般的に静脈内投与されるであろう。使用が想像される細胞の量は、所望の効果、患者の状態等に依存して、当業者によって決定することができる。
【０２４８】
その中に遺伝子治療の目的でウイルスベクターを導入することができる細胞は、如何なる所望の利用できる細胞種も含み、これには上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；T-リンパ球、B-リンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血液細胞；様々な幹または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝等から得られた）が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４９】
特定の態様において、遺伝子治療に用いられる細胞は患者に対して自己である。
【０２５０】
組換え型細胞を遺伝子治療において用いる態様において、抗体または他の抗原結合タンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターは、それらが、細胞および／またはその子孫によって発現可能であるように細胞に導入され、次に治療効果を得るために組換え細胞をインビボで投与する。特定の態様において、幹細胞または造血細胞を用いる。インビトロで単離および維持することができる如何なる幹細胞および／または造血細胞も、おそらく本発明のこの態様に従って用いることができる（例えば、1994年4月28日付のPCT国際公開公報第94/08598号；Stemple and Anderson、Cell 71：973〜985（1992）；Rheinwald、Meth. Cell Biol. 21A：229（1980）；およびPittelkow and Scott、Mayo Clinic Proc. 61：771（1986）を参照されたい）。
【０２５１】
特定の態様において、本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子は、核酸配列の発現が、転写の適当な誘導物質の有無を制御することによって制御可能であるように、コード領域に機能的に結合した誘導型プロモーターの制御下で遺伝子治療の目的のために導入される核酸配列を含む。
【０２５２】
本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子はまた、トランスジェニック生物（例えば、動物）を作製するために用いることができる。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、およびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）が含まれるがこれらに限定されない任意の種の動物を用いてトランスジェニック動物を作製してもよい。所望の細胞種を感染させることができるウイルスは、当技術分野で既知であり、これらのウイルスに基づくウイルスベクターを本発明の方法において用いてもよい。
【０２５３】
本発明は、その全ての細胞に、本発明のウイルスベクターおよび／または核酸配列、または本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子によって提供される核酸配列を有するトランスジェニック生物のみならず、その細胞の全てではないがいくつかにこれらのウイルスベクターまたは配列を有する生物、すなわちモザイク生物またはキメラ生物を提供する。本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子は、単一のコピーまたは多数のコピーとして組み入れてもよい。本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子はまた、例えば、Laskoら（Lascoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：6232〜6236（1992））の教示に従って特定の細胞種に選択的に導入して活性化させてもよい。そのような細胞種特異的活性化に必要な調節配列は、対象となる特定の細胞種に依存し、当業者に明らかとなるであろう。本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子に含まれる対象配列が、内因性の遺伝子の染色体部位に組み入れられることが望ましい場合、これは通常、遺伝子ターゲティングによって行われるであろう。簡単に説明すると、そのような技術を利用する場合、内因性の遺伝子と相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むウイルスベクターは、染色体配列との相同的組換えによって内因性の遺伝子のヌクレオチド配列に組み入れて、その機能を破壊する目的のために設計される。本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子はまた、特定の細胞種に選択的に導入してもよく、このように、例えば、Guら（Guら、Science 265：103〜106（1994））の教示に従ってその細胞種に限って内因性の遺伝子を不活化してもよい。そのような細胞種特異的活性化に必要な調節配列は、対象となる特定の細胞種に依存し、当業者に明らかであろう。本段落において引用した文書のそれぞれの内容は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【０２５４】
トランスジェニック生物を作製した後、標準的な技術を利用して、組換え型遺伝子の発現をアッセイしてもよい。初回スクリーニングは、本発明の核酸分子の組込が起こったことを確認するために生物組織を分析するために、サザンブロット分析またはPCR技術によって行ってもよい。トランスジェニック生物の組織における本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子によって導入される核酸配列のmRNAの発現レベルも同様に、生物から得られた組織試料のノザンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション分析、および逆転写PCR（RT-PCR）が含まれるがこれらに限定されない技術を用いて評価してもよい。挿入された配列を発現する組織の試料も同様に、これらの核酸分子の発現産物に対して特異的な抗体を用いて、免疫細胞化学または免疫組織化学によって評価してもよい。
【０２５５】
創始生物を作製した後、それらを交配、近交系交配、非近交系交配、または交雑して、特定の生物のコロニーを産生してもよい。そのような交配戦略の例には、異なる系統を確立するために一つより多い組換え部位を有する創始動物を非近交系交配させること；本発明の核酸分子のそれぞれのコピーの付加的な発現の効果のために、より高いレベルで対象配列を発現する複合トランスジェニック生物を作製するために、異なる系統の近交系交配を行うこと；発現を増強させて、DNA分析による生物のスクリーニングの必要をなくすために所定の組換え部位に関してホモ接合である生物を作製するためにヘテロ接合トランスジェニック生物を交雑させること；複合ヘテロ接合またはホモ接合系統を作製するために異なるホモ接合系統を交雑させること；および対象となる実験モデルにとって適当である明確なバックグラウンドに本発明の核酸分子を置くように交配させることが含まれるがこれらに限定されない。
【０２５６】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」生物は、対象配列の発現産物の生物機能を作製する、対象配列の発現産物の異常な発現に関連した病態および／または障害を研究する、およびそのような病態および／または障害を改善するために有効な化合物をスクリーニングするために有用であるモデル系（例えば、動物モデル系）が含まれるがこれらに限定されない用途を有する。
【０２５７】
当業者は、対象配列を含むウイルスベクターを後生生物に導入する多くの状況において、発現産物をコードする配列を、発現産物の産生が望ましい場所で組織特異的転写調節配列（例えば、組織特異的プロモーター）に機能的に連結させることが望ましいであろうと認識するであろう。そのようなプロモーターを用いて、所望の組織におけるこれらの発現産物の産生を促進することができる。かなりの数の組織特異的プロモーターが当技術分野で既知である。
【０２５８】
宿主細胞
本発明はまた、一つまたは複数（例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50個等）の対象配列を含む本発明のウイルスベクター、特に本明細書において詳細に記述したウイルスベクターおよび／または核酸分子の一つまたは複数を含む宿主細胞にも関する。本発明のこの局面に従って用いてもよい代表的な宿主細胞には、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。好ましい細菌宿主細胞には、エシェリキア種の細胞（特に、大腸菌細胞、および最も特に大腸菌株DH10B、Stb12、DH5α、DB3、DB3.1（好ましくは大腸菌LIBRARY EFFICIENCY（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞；Invitrogen Corporation、カールスバッド、カリフォルニア州）、DB4、DB5、JDP682およびccdA-over（その開示の全文が参照として本明細書に組み入れられる、2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/518,188号、および「Cell Resistant to Toxic Genes and Uses Thereof」と題するLouis Leongらによって2003年6月3日に提出された米国特許仮出願第60/475,004号を参照されたい）；DB3細胞（寄託番号NRRL B-30097）、DB3.1細胞（寄託番号NRRL B-30098）、DB4細胞（寄託番号NRRL B-30106）、DB5細胞（寄託番号NRRL B-30107）、JDP682細胞（寄託番号NRRL B-30667）、ccdA-over細胞（寄託番号NRRL B-30668））、またはその変異体もしくは誘導体；バシラス種の細胞（特に、枯草菌（B. subtilis）および巨大菌（B. megaterium）細胞）、ストレプトミセス（Streptomyces）種の細胞、エルウィニア（Erwinia）種の細胞、クレブシエラ（Klebsiella）種の細胞、セラチア（Serratia）種の細胞（特に、霊菌（S. marcessans）細胞）、シュードモナス（Pseudomonas）種の細胞（特に、緑膿菌（P. aeruginosa）細胞）、およびサルモネラ（Salmonella）種の細胞（特に、ネズミチフス菌（S. typhimurium）およびチフス菌（S. typhi）細胞）が含まれる。好ましい動物宿主細胞には、昆虫細胞（最も特に、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）Sf9およびSf21細胞およびトリコプルサ（Trichoplusa）ハイファイブ細胞）、線虫細胞（特に、シーエレガンス（C. elegans）細胞）、トリ細胞、両生類細胞（特に、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）細胞）、爬虫類細胞、および哺乳類細胞（最も特に、NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、BHK、およびヒト細胞）が含まれる。好ましい酵母宿主細胞には、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）細胞およびピチア・パストリス（Pichia pastoris）細胞が含まれる。これらおよび他の適した宿主細胞は、例えばInvitrogen Corporation（カールスバッド、カリフォルニア州）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（マナッサス、バージニア州）、および農業研究培養物コレクション（NRRL；ピオリア、イリノイ州）から販売されている。
【０２５９】
本発明において用いられる核酸分子は、一つまたは複数の複製起点（ORI）、および／または一つまたは複数の選択マーカーを含んでもよい。いくつかの態様において、分子は、その少なくとも二つが異なる生物（例えば、原核細胞一つと真核細胞一つ）において機能することができる二つまたはそれ以上のORIを含んでもよい。例えば、核酸は、一つまたは複数の原核細胞（例えば、大腸菌、バシラス等）において機能するORIを有し、一つまたは複数の真核細胞（例えば、酵母、昆虫、哺乳類細胞等）において機能するもう一つのORIを有してもよい。選択マーカーも同様に、異なる生物における選択を可能にするために本発明の核酸分子に含めてもよい。例えば、核酸分子は、その一つまたは複数が原核細胞において機能し、その一つまたは複数が真核細胞において機能する多数の選択マーカーを含んでもよい。
【０２６０】
本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子の一つまたは複数を含む宿主細胞を産生するために、本明細書に記述の本発明のウイルスベクターおよび／または核酸分子を宿主細胞に導入する方法は、当業者に周知であろう。例えば、本発明の核酸分子および／またはウイルスベクターを感染、形質導入、電気穿孔、トランスフェクション、および形質転換の周知の技術を用いて宿主細胞に導入してもよい。本発明の核酸分子および／またはウイルスベクターは、単独または他の核酸分子および／またはベクターおよび／またはタンパク質、ペプチド、またはRNAと共に導入してもよい。または、本発明の核酸分子および／またはウイルスベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物として、または脂質との複合体として宿主細胞に導入してもよい。電気穿孔も同様に用いて本発明の核酸分子および／またはウイルスベクターを宿主に導入してもよい。同様に、そのような分子は、大腸菌のような化学的にコンピテントな細胞に導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、これをインビトロでパッケージング細胞にパッケージングまたは導入してもよく、パッケージングされたウイルスを宿主細胞に形質導入してもよい。このように、本発明の核酸分子は、一つまたは複数のパッケージングシグナル（例えば、ウイルス核酸分子のパッケージングを指示するウイルスパッケージングシグナル）を含むおよび／またはコードしてもよい。したがって、本発明のこの局面に従って本発明の核酸分子および／またはベクターを導入するために適した広範な技術は、当業者に周知であり、日常的である。そのような技術は、例えば、Sambrook, J.ら、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、第2版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州；コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、16.30〜16.55頁（1989）、Watson, H.D.ら、「Recombinant DNA」、第2版、ニューヨーク州；W.H.フリーマン社、213〜234頁（1992）；およびWinnacker, E.L.、「From Genes to Clones」、ニューヨーク州；VCH出版社（1987）において詳細に論評されており、それらはこれらの技術を詳細に記述する多くの実験マニュアルを説明し、その関連する開示に関してその全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【０２６１】
キット
もう一つの局面において、本発明は本発明の方法において用いてもよいキットを提供する。本発明のこの局面に従うキットは、本発明の一つまたは複数の核酸分子（例えば、一つまたは複数のウイルス配列および／または一つまたは複数の組換え部位を含む核酸分子）および／またはウイルスベクター、一つまたは複数のプライマー、本発明の分子および／または化合物、一つまたは複数のポリメラーゼ、一つまたは複数の逆転写酵素、一つまたは複数の組換えタンパク質（または本発明の方法を行うための他の酵素）、一つまたは複数のリガーゼ、一つまたは複数の緩衝液、一つまたは複数の界面活性剤、一つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ、一つまたは複数のヌクレオチド、一つまたは複数の終了物質（例えば、ddNTP）、一つまたは複数のトランスフェクション試薬、ピロホスファターゼ等からなる群より選択される一つまたは複数の成分を含んでもよい一つまたは複数の容器を含んでもよい。
【０２６２】
本発明の広範な核酸分子および／またはウイルスベクターを本発明において用いることができる。さらに、本発明のモジュラリティのために、これらの核酸分子を多様な方法で組み合わせることができる。本発明のキットにおいて供給することができる核酸分子の例には、プロモーター、シグナルペプチド、エンハンサー、リプレッサー、選択マーカー、転写シグナル、翻訳シグナル、プライマーハイブリダイゼーション部位（例えば、シークエンシングまたはPCRのため）、組換え部位、制限部位およびポリリンカー、サプレッサーtRNAの存在下で翻訳の終了を抑制する部位、サプレッサーtRNAコード配列、融合タンパク質を調製するためのドメインおよび／または領域をコードする配列（例えば、6 Hisタグ）、複製起点、テロメア、動原体等を含む核酸分子が含まれる。同様に、本発明のキットにライブラリを提供することができる。これらのライブラリは、複製可能な核酸分子の形であってもよく、またはそれらは複製起点に関連しない核酸分子を含んでもよい。当業者は認識するであろうように、複製起点に関連しない他の核酸分子と共にライブラリの核酸分子は、複製起点を有する他の核酸分子に挿入することができるか、または使い捨てのキット成分であろう。
【０２６３】
さらに、いくつかの態様において、本発明のキットにおいて供給されるライブラリは二つの成分を含んでもよい：（1）これらのライブラリの核酸分子、（2）5'および／または3'組換え部位。いくつかの態様において、ライブラリの核酸分子が5'および／または3'組換え部位と共に供給される場合、組換え反応を用いて、同様にキットの成分として供給されてもよいウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子にこれらの分子を挿入することが可能であろう。他の態様において、組換え部位は、使用前にライブラリの核酸分子に結合させることができる（例えば、同様にキットと共に供給されてもよいリガーゼを用いることによって）。そのような場合、組換え部位を含む核酸分子、または組換え部位を作製するために用いることができるプライマーを、キット共に供給してもよい。
【０２６４】
本発明のキットにおいて供給されるウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子は大きく異なりうる。いくつかの場合において、これらの分子は、複製起点、少なくとも一つの選択マーカー、および少なくとも一つの組換え部位を含むであろう。例えば、本発明のキットにおいて供給される分子は、例えば図2に示すように核酸分子の二つの異なる位置で対象配列の挿入を可能にする異なる四つの組換え部位を有しうる。本発明のキットにおいて供給されるベクターの他の属性は、本明細書において他所で記述されている。
【０２６５】
いくつかの態様において、本発明のキットは、それぞれの容器が、ウイルス配列を含む一つまたは複数の核酸セグメントおよび／または一つまたは複数の組換え部位および／またはトポイソメラーゼ認識部位を含む、複数の容器を含んでもよい。セグメントは、本発明のウイルスベクターまたは他の核酸分子を構築するために、一連のセグメント（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個等）が組み合わせられるように組換え部位と共に提供してもよい。セグメントは、二つまたはそれ以上のセグメント（例えば、3、4、5、6、7、8、9、10個等）を含む反応において組み合わせてもよい。それぞれの個々のセグメントは、他の如何なるセグメントとも無関係に、長さが約100 bp〜約35 kb、長さが約100 bp〜約20 kb、長さが約100 bp〜約10 kb、長さが約100 bp〜約5 kb、長さが約100 bp〜約2.5 kb、長さが約100 bp〜約1 kb、または長さが約100 bp〜約500 bpであってもよい。本発明はまた、そのようなセグメントを組み立ておよび用いる方法、そのような方法によって組み立てられた核酸分子、およびそのような核酸分子を含む組成物も企図する。
【０２６６】
セグメントは、ウイルス転写部位を含むように調製してもよい。例えば、アデノウイルスベクターを調製する場合、一つのセグメントは、一つまたは複数の組換え部位および／または一つまたは複数のトポイソメラーゼ認識部位の他に、E1領域、E2領域、E3領域、および／またはE4領域に対応する配列を含んでもよい。他のセグメントは、一つまたは複数の後期転写単位および／またはウイルス逆方向末端反復配列に対応する配列を含んでもよい。対象核酸配列を含むセグメントは、野生型ウイルスに存在する一つまたは複数のウイルス核酸配列がウイルスベクターには存在しないウイルスベクターまたは他の核酸分子を構築するために調製してもよい。対象核酸配列を含むセグメントを調製して、ウイルス配列を含む一つまたは複数のセグメントの代わりにウイルスベクターに挿入してもよい。いくつかの態様において、野生型ウイルスには存在するが本発明のウイルスベクターには存在しない配列は、培養細胞において複製にとって必要ではない配列である。例えば、対象核酸配列を含むセグメントを用いて、対象核酸配列がE1領域および／またはE3領域の一つまたは複数を置換するアデノウイルスベクターを構築してもよい。必要であれば（例えば、E1機能の場合）、ウイルスベクターの複製を支持するために必要なウイルス機能は、別の場所で（例えば、宿主細胞のゲノムから）供給してもよい。セグメントは、対象核酸配列が例えばE4領域の上流での核酸挿入を認容することが知られている位置にウイルスゲノムが存在するウイルスベクターを構築するために調製してもよい。
【０２６７】
本発明のキットは、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、互いに組換えしない二つの組換え部位を含む核酸分子を含む容器を含んでもよい。組換え部位は、宿主細胞における核酸分子の存在を選択するもしくは存在しないことを選択することができる、または核酸を含むもしくは含まない宿主細胞を同定することができる選択マーカーに隣接してもよい。キットに含まれる核酸分子は、二つより多い組換え部位を含んでもよく、例えば核酸分子は、組換え部位の対のメンバーが互いに組換えしない、または実質的に組換えしない、多数の組換え部位の対（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個等）を含んでもよい。いくつかの態様において、組換え部位の一つの対のメンバーは、同じ核酸分子に存在するもう一つの対のメンバーと組換えしない。
【０２６８】
本発明のキットは、一つまたは複数の組換えタンパク質を含む容器を含んでもよい。適した組換えタンパク質は先に開示されており、これらには、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3リゾルバーゼ、ΦC31、TndX、XerC、およびXerDが含まれるがこれらに限定されない。
【０２６９】
本発明のキットはまた、一つまたは複数のトポイソメラーゼタンパク質および／または一つまたは複数のトポイソメラーゼ認識配列を含む一つまたは複数の核酸を含んでもよい。適したトポイソメラーゼには、IA型トポイソメラーゼ、IB型トポイソメラーゼ、および／またはII型トポイソメラーゼが含まれる。適したトポイソメラーゼには、ワクシニアウイルスDNAトポイソメラーゼIを含むポックスウイルストポイソメラーゼ、大腸菌トポイソメラーゼIII、大腸菌トポイソメラーゼI、トポイソメラーゼIII、真核細胞トポイソメラーゼII、アーキアル（archeal）リバースジャイレース、酵母トポイソメラーゼIII、ショウジョウバエトポイソメラーゼIII、ヒトトポイソメラーゼIII、肺炎球菌トポイソメラーゼIII、細菌ジャイレース、細菌DNAトポイソメラーゼIV、真核細胞DNAトポイソメラーゼII、およびT-evenファージコードDNAトポイソメラーゼ等が含まれるがこれらに限定されない。適した認識配列は先に記述されている。
【０２７０】
使用にあたって、本発明のキットにおいて供給されるウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子を、組換えクローニングを用いて対象配列を含む核酸分子と組み合わせてもよい。ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子は、例えば、互いに組換えしない二つの組換え部位と共に提供してもよい。対象配列を含む核酸分子も同様に、そのそれぞれがウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子上に存在する二つの部位の一つと組換えすることができる二つの組換え部位を提供してもよい。適当な組換えタンパク質の存在下で、核酸分子は、対象配列およびウイルスゲノムの全てまたは一部を含む組換え型核酸分子を形成するために、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子と反応する。ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子が多数の組換え部位対を含む場合、同じまたは異なっていてもよい対象配列を含む多数の核酸分子を、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含み、同様に多数の対象配列を含む核酸分子を形成するために、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸配列と組み合わせてもよい。
【０２７１】
本発明のキットはまた、プライマーと共に供給することができる。これらのプライマーは一般的に、特異的ヌクレオチド配列を有する分子にアニールさせるように設計されるであろう。例えば、これらのプライマーは、特定の核酸分子を増幅するためにPCRにおいて用いるように設計することができる。さらに、本発明のキットと共に供給されるプライマーは、ベクター配列とハイブリダイズするように設計されたシークエンシングプライマーとなりうる。このように、そのようなプライマーは一般的に、ベクターに挿入されている核酸分子をシークエンシングするためのキットの一部として供給されるであろう。
【０２７２】
一つまたは複数の緩衝剤（例えば、1、2、3、4、5、8、10、15個）を本発明のキットにおいて供給してもよい。これらの緩衝剤は、作業濃度で供給してもよく、または濃縮型で供給してから作業濃度に希釈してもよい。これらの緩衝剤はしばしば、緩衝剤そのものまたは緩衝剤における分子のいずれかの安定化活性を増強するために、塩、金属イオン、共因子、金属イオンキレート剤等を含むであろう。さらに、これらの緩衝剤は、乾燥または水溶性型で提供してもよい。緩衝剤が乾燥型で供給される場合、それらは一般的に使用前に水に溶解されるであろう。
【０２７３】
本発明のキットは、本明細書において先にまたは他所で記載した成分の実質的に如何なる組み合わせを含んでもよい。当業者は認識するであろうように、本発明のキットと共に提供される成分は、キットに関して意図される用途によって変化するであろう。このように、キットは、本出願に記載される様々な機能を行うように設計してもよく、そのようなキットの成分はそれに従って変化するであろう。
【０２７４】
本発明のキットは、本発明の方法を行うための書面での説明書の一つまたは複数の頁を含んでもよい。例えば、説明書は、組換え部位と共に提供されるORF、ならびに同様に、組換え部位および選択的に一つまたは複数の機能的配列をさらに含むベクターの組換えクローニングを行うために必要な方法の段階を含んでもよい。
【０２７５】
本明細書に記述した方法および出願に対する他の適した改変および応用は、業者に既知の情報を考慮して本明細書に含まれる本発明の説明から容易に明らかとなること、そしてそれらを行ってもよく、それらも本発明またはその如何なる態様の範囲にも含まれることは当業者によって理解されるであろう。さて、本発明を詳細に記述してきたが、このことは、説明する目的に限って本明細書に含められ、本発明を制限すると解釈されない以下の実施例を参照してより明らかに理解されるであろう。
【０２７６】
1995年6月7日に提出された米国特許出願第08/486,139号（現在は放棄）、1996年6月7日に提出された米国特許出願第08/663,002号（現在は米国特許第5,888,732号）、1999年1月20日に提出された米国特許出願第09/233,492号（現在は米国特許第6,270,969号）、1999年1月20日に提出された米国特許出願第09/233,493号（現在は、米国特許第6,143,557号）、1998年1月12日に提出された米国特許出願第09/005,476号（現在は米国特許第6,171,861号）、1999年11月2日に提出された米国特許出願第09/432,085号、2000年2月4日に提出された米国特許出願第09/498,074号、1997年10月24日に提出された米国特許出願第60/065,930号、1998年10月23日に提出された米国特許出願第09/177,387号、1999年4月22日に提出された米国特許出願第09/296,280号（現在は米国特許第6,277,608号）、1999年4月22日に提出された米国特許出願第09/296,281号（現在は放棄）、2000年8月28日に提出された米国特許出願第09/648,790号、2000年12月11日に提出された米国特許出願第09/732,914号（US2002 0007051として公開）、2001年5月16日に提出された米国特許出願第09/855,797号、2001年7月19日に提出された米国特許出願第09/907,719号、2001年7月19日に提出された米国特許出願第09/907,900号、2001年11月2日に提出された米国特許出願第09/985,448号、1998年11月13日に提出された米国特許出願第60/108,324号、1999年11月12日に提出された米国特許出願第09/438,358号、1999年10月25日に提出された米国特許出願第60/161,403号、2000年10月25日に提出された米国特許出願第09/965,065号、2001年10月29日に提出された米国特許出願第09/984,239号、1999年3月2日に提出された米国特許出願第60/122,389号、1999年3月23日に提出された米国特許出願第60/126,049号、1999年5月28日に提出された米国特許第60/136,744号、2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/517,466号、1999年3月2日に提出された米国特許出願第60/122,392号、2000年3月2日に提出された米国特許出願第09/518,188号、1999年12月10日に提出された米国特許第60/169,983号、2000年3月9日に提出された米国特許出願第60/188,000号、2001年12月11日に提出された米国特許出願第09/732,914号、2001年4月19日に提出された米国特許出願第60/284,528号、2001年5月21日に提出された米国特許出願第60/291,973号、2001年9月14日に提出された米国特許出願第60/318,902号、2001年11月27日に提出された米国特許出願第60/333,124号、および2001年12月7日に提出された米国特許出願第10/005,876号の全ての開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０２７７】
実施例
本発明は、核酸のモジュール構築およびポリペプチドの産生のための極めて多用途である方法を提供する。挿入核酸セグメントとベクターの両方が、生成物分子に所望の特性を付与するために選択される配列を含み得る。いくつかの態様において、挿入断片に隣接するウイルスゲノムのすべてまたは一部を含む1つまたは複数の核酸が、1つまたは複数の選択された配列を含み得る。選択された配列は、リボザイム、構造ドメイン、選択マーカー、内部リボソームエントリー配列、プロモーター、エンハンサー、組換え部位などをコードし得る。
【０２７８】
いくつかの態様において、1つより多い関心対象の配列がウイルスゲノムのすべてまたは一部を含む核酸分子に組み込まれ得る。関心対象の組み込み配列は互いに隣接し得るか、またはウイルスゲノムのすべてまたは一部を含む核酸分子の一部によって分離され得る。分離された場合、関心対象の配列を分離する核酸分子の一部は、核酸セグメントを挿入するために使用される組換え部位を含むことに加えて、反応性の対の組換え部位が隣接する1つまたは複数の選択マーカーを含み得る。関心対象の配列を分離する核酸分子の一部はまた、ウイルス配列、および/または核酸分子に所望の特性を付与する他の配列、および/または、関心対象の配列を含み得る。
【０２７９】
関心対象の配列は、任意の型の配列であり得る。例えば、この配列は、1つまたは複数のポリペプチドをコードし得るか、および/または1つまたは複数の非翻訳領域を含み得る。関心対象の配列は、転写されかつポリペプチドに翻訳されてもよいし、または、転写されかつポリペプチドに翻訳されなくてもよい（例えば、アンチセンス分子、リボザイム、およびRNAi）。関心対象の配列は、終止コドンを含んでもよいし、または含まなくてもよい。終止コドンを含む配列は、終止コドンに対して5'である配列にインフレームであり得る、終止コドンに対して3'であるさらなる配列を含んでもよいし、または含まなくてもよい。いくつかの態様において、終止コドンは、融合ポリペプチドを産生するために抑制され得る。
【０２８０】
本開示を通して、関心対象の遺伝子（GOI）という用語が便宜のために使用され得る。これは、本発明を、遺伝子を含む核酸分子に限定することとして解釈されるべきではない。関心対象の核酸は、本明細書中に記載される材料および方法を使用して本発明のベクターに挿入され得る。
【０２８１】
実施例1
本発明のウイルスベクターの調製
図6は、pAd/CMV/V5-DESTベクターのプラスミドマップであり、これは、本発明に従うウイルスゲノムのすべてまたは一部を含む核酸の1つの例である。プラスミドのヌクレオチド配列は表6（配列番号:）に提供されている。このプラスミドは、Ad5の最初の458ヌクレオチドを含み、これは、左側ITRおよびパッケージング配列、続いてサイトメガロウイルスプロモーター（CMV）およびT7プロモーターを含む。プロモーターには、組換え部位attR1およびattR2が隣接する選択マーカーを含む配列が続く。組換え部位の他の任意な適切な対は、それらが互いに組換えされないように選択される限り使用され得る。attR2部位の後で、配列をコードするV5エピトープに、3つすべての読み枠における終止コドンおよびヘルペスウイルスチミジンキナーゼポリアデニル化シグナルが続く。これには、3513位から、右側ITRを含むアデノウイルスゲノムの右側末端までのヌクレオチドが続く。アデノウイルス配列の後に、プラスミドの複製起点、続いてアンピシリン耐性遺伝子がある。プラスミド配列には、PacI制限酵素認識部位が隣接する。従って、組換え反応における、置き換え可能な配列の、attL1およびattL2が隣接する関心対象の配列での置き換えの後、感染性ウイルスゲノムは、プラスミド配列を除去するために、PacIを用いる組換え反応生成物の消化によって調製され得る。この特定の態様において、ウイルスゲノムはE1領域およびE3領域における欠失されたアデノウイルスゲノムである。E1機能は、例えば、293細胞におけるような宿主細胞から複製されるように、ウイルスに対してトランスで提供されなければならない。E3領域の遺伝子産物は複製のために必要とされない。
【０２８２】
本発明に係るウイルスベクターを調製するために、関心対象の特定の配列は、pAd/CMV/V5-DESTベクターにおけるものと適合性の組換え部位を用いて調製され得る。これは、標準的な技術、例えば、適切な組換え部位配列を含むプライマーを用いて関心対象の配列を増幅することによって達成され得る。PCR産物が適切な組換え部位配列を含む場合、これは組換え反応において直接的に使用され得る。任意で、関心対象の配列を含むPCR産物または他の核酸は、GATEWAY（商標）エントリーベクターにクローニングされ得る。これは、任意の従来的な技術を使用して、例えば、a）従来の制限断片ライゲーション、b）関心対象の配列を含む核酸の、pENTR-dTOPOへのTOPO媒介クローニング、またはc）pDONR DNAと隣接するattB部位を含むPCR増幅された関心対象の配列（例えば、関心対象の遺伝子（GOI））の間のGATEWAY（商標）クロナーゼ反応によって達成され得る。これらの3つの方法のいずれかがエントリーベクターに挿入された関心対象の配列を生じる。GATEWAY（商標）技術の用語を使用して、得られるベクターは、関心対象の遺伝子（GOI）を含むエントリーベクターについてpENTR-GOIと命名される。これは、関心対象の遺伝子をこれらのコード遺伝子に限定するものとして解釈されるべきではない。任意の関心対象の配列がこの様式でpENTRベクターに挿入され得る。この例において、これにより、attL1組換え部位およびattL2組換え部位が隣接する関心対象の配列を生じる。
【０２８３】
インビトロGATEWAY（商標）LR反応において、pENTR-GOIベクターはpAd-CMV-DESTと組み合わせられ得る。この反応は、適切な時間の間、例えば、1時間室温でインキュベートされ得る。この反応は、関心対象の配列を、アデノウイルスベクターpAd-CMV-DESTに移動される。
【０２８４】
関心対象の配列を含むアデノウイルスベクターはコンピテント細菌（すなわち、DH5α、TOP10、HB101など）を形質転換するために使用される。LR反応混合物のすべてまたは一部がコンピテント細菌を形質転換するために使用され、形質転換された細胞はLBアンピシリン細菌プレート上に置いて37℃で一晩インキュベートする。
【０２８５】
いくつかの細菌コロニー（2-4個が通常十分である）を選ぶことができ、およびLBアンピシリン液体培地中の一晩培地に接種するために使用され得、および37℃で一晩増殖され得る。
【０２８６】
プラスミドDNAは、従来的な技術を使用して培養物から調製され、例えば、制限酵素消化またはPCRによって、関心対象の配列の存在について分析される。
【０２８７】
大量のウイルスベクターを調製するために、関心対象の配列を含む2〜5マイクログラムのデスティネーションベクターは、アデノウイルスITR（アデノウイルスゲノムの5'末端および3'末端上のPacI部位に直接隣接する）に露出させるためにPacI制限酵素で消化され得る。消化されたDNAは、従来的な技術、例えば、フェノール/クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿、またはこの目的のために使用可能な市販のキットの使用によって精製され得る。
【０２８８】
消化されたDNAは適切な宿主細胞（例えば293細胞）にトランスフェクトされる。トランスフェクション前日に、ウェルあたり5×105の293細胞を有する6穴細プレート調製され得る。トランスフェクションの日に、2マイクログラムのDNAを使用して各ウェル中の細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム、脂質、エレクトロポレーションなどを使用する標準的な技術を使用して達成され得る。好ましいトランスフェクションの方法には、カチオン性脂質またはカチオン性脂質および中性脂質を使用する方法が含まれる。適切なトランスフェクション試薬は、例えば、Invitrogen Corporation, Carlsbad, Caから市販されている。1つの適切な脂質処方物はLipofectamine（商標）2000である。
【０２８９】
トランスフェクションの後の日に、トランスフェクション媒体は除去され新鮮な媒体で置き換えられ得る。翌日、トランスフェクトされた細胞はトリプシン処理され移動され得る。1つのウェルからの細胞を使用して100mmディッシュに播種する。その細胞を7-10日間、100mmディッシュ中で増殖する。培地を2-3日毎に新鮮な培地で置き換える。トランスフェクションの約9日後に、293細胞の単層中に形成する「プラーク」を観察し得る。プラークは、肉眼によって観察される場合に明確な領域として現れる。顕微鏡下では、プラークは、円形の溶解している細胞で縁取りされている。これは、細胞変性効果（CPE）と呼ばれる。培地は、細胞の大部分がCPEを実証するまで、2日ごとに新鮮な培地に置き換えるべきである。
【０２９０】
増殖培地を使用して細胞を注ぎ込むことによってプレートを収集し、細胞および培地を15mlチューブに移す。チューブを、-80℃および37℃に変化させることによって3回凍結/融解する。これは、細胞からウイルス粒子を放出する。望ましくない細胞細片を除去するためにチューブを遠心分離する（3000rpm×10分間）。上清を除去し、それを新鮮なチューブに移す。ここでこの物質は関心対象の配列を含む組換えアデノウイルスベクターを含む。これは、関心対象の配列を送達するための実験において直接的に使用され得る。
【０２９１】
ウイルスベクターの力価を増加させるために、ウイルスベクターは、例えば、293細胞の新鮮なプレートに少量（一般的には、100マイクロリットル）の最初のウイルスベクターを適用することによって増幅され得る（一般的には、100mmディッシュ中5×106 293細胞）。細胞の感染は最初の2時間以内に起こり、3日後にCPEプレートの全体にわたって観察される。ウイルスベクターは上記のように収集される。
【０２９２】
このやり方で産生されたウイルスベクター（「粗ウイルス溶解物またはCVLと呼ばれる」）は、一般的には高力価（>109感染性ウイルス/ml）であり、大部分の応用のために直接的に使用され得る。CVL（または任意のアデノウイルスストック）の正確な力価を決定するために、293細胞を6穴プレート中でウェルあたり1×106でプレーティングする。翌日、各ウェルに、10-5〜10-10の範囲のCVLの10倍の段階希釈を含む1ml培地で形質導入する。一晩のインキュベーションの後に、培地を除去し、0.4％超高純度アガロースを含む新鮮培地の2mlを用いて細胞単層に重層する。この半固体培地は、ウイルスベクターがプレート全体にわたって拡散することを妨害し、個々のプラークを識別可能に保つ。7〜10日後、識別可能なプラークは肉眼に見ることができる。MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル))-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド）は、ウェルを染色してプラークの可視化を補助するために使用され得る。プラークを計数し、かつその数に希釈率を乗じてもともとのCVLに存在する感染性ウイルスベクターの力価を得る。より高い力価のベクターが必要とされる場合、CVL中のウイルスベクターは、塩化セシウム密度超遠心分離、HPLC、またはウイルス精製のために設計された市販のカラム（例えば、Virapur）を含む多数の異なるアプローチを使用して濃縮および精製され得る。これらの方法は一般的には>1011感染性ウイルス/mlの力価を生じる。
【０２９３】
実施例2
融合ポリペプチドを生成するためのサプレッサーtRNAの使用
発現されたポリペプチドの検出は、しばしば、エピトープタグ（V5またはmyc）または検出可能なマーカー（例えば、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、GFPなど）の使用によって容易にされる。これは、関心対象のポリペプチドのために使用可能な特異的抗体が存在しない場合にとりわけ有用である。しかし、検出可能なマーカーへのエピトープタグおよび/または融合物の付加は、ポリペプチド活性、構造、または他の分子とのその相互作用に有害な影響を与え得る。この問題への1つの一般的なアプローチは、タグとともにおよびタグを伴わずに関心対象の遺伝子を2回クローニングすることである。
【０２９４】
本発明は、同じ遺伝子構築物から、タグまたはマーカーとともに、またはそれらを伴わずにポリペプチドを発現するための物質または方法を提供する。このことは、3つの終止コドン（オーカー、アンバー、およびオパール）の1つを特異的に認識および解読し、ならびに終止コドンによってコードされる位置にアミノ酸の挿入を生じる哺乳動物サプレッサーtRNAを使用して達成される。このサプレッサーtRNAは、終止コドンによってコードされる位置に任意のアミノ酸を挿入し得る。以下に記載される特定の態様において、アミノ酸セリンが挿入された。しかし、本発明に従う適切なサプレッサーtRNAを調製および発現することによって、所望される任意のアミノ酸が挿入され得る。
【０２９５】
C末端タグとインフレームである3つすべての可能な終止コドンを有するレポーター遺伝子をコードする発現プラスミドを構築した。サプレッサーtRNAのトランスでの送達後、遺伝子とエピトープタグとの間の終止コドンが抑制され、これは3'配列の翻訳を可能にする。
【０２９６】
各サプレッサーtRNAをコードするプラスミドは、抑制の効率を試験するために対応する発現プラスミドと同時発現された。TAAおよびTAGの抑制は、約50％〜60％の効率であったのに対して、TGAは30％のみであった。TGA終止コドンの後のヌクレオチドをアデニンからシトシンに変化させることは抑制を約70％まで改善した。
【０２９７】
サプレッサーtRNAを発現する組換えアデノウイルスベクターを構築した。アデノウイルス構築物pAd-GW-TO/tRNAを含むプラスミド（サプレッサーtRNAがテトラサイクリン誘導性CMVプロモーターの制御下にある）のマップを図7に示す。pAd-GW-TO/tRNAのヌクレオチド配列を表7（配列番号:）に提供する。サプレッサーtRNAを発現するさらなるアデノウイルス構築物は、図8において示されるpAdenoTAG tRNAである。pAdenoTAG tRNAのヌクレオチド配列を表8に提供する。表9は、本発明の核酸分子を含むサプレッサーtRNA（例えば、pAdenoTAG tRNA）を構築するために使用され得るSau3A断片のヌクレオチド配列を提供する。転写ターミネーターは、その断片の600〜606塩基に位置し、サプレッサーtRNAに対応する配列はその断片の512〜593塩基に位置し、アンチコドンは545〜547塩基に位置し、かつテトラサイクリンオペレーター配列は474〜511塩基に位置する。この配列から産生されるサプレッサーtRNAはアンバー終止コドンUAGを抑制する。当業者は、アンチコドンを終止コドンの逆相補物にするために、アンチコドンにおける塩基を変異させることによって（すなわち、オパール終止コドンのためのTCAおよびオーカー終止コドンのためのTTA）、オパール終止コドンおよびオーカー終止コドンについてのサプレッサーを調製することが可能であることを認識する。他のアンチコドンは、例えば、ゆらぎ位置において他の塩基を使用するコドンを使用し得る。そこから所望のサプレッサーtRNAを産生するために適切な配列を構築することは（例えば、配列において1つまたは複数の点変異を導入することによる）、当技術分野において日常的である。
【０２９８】
プラスミドは、感染性アデノウイルスゲノムを生成するためにPacIで消化され得る。サプレッサーtRNAを発現するウイルスベクターは、抑制される終止コドンを有する配列を含む任意のベクターを組み合わせて使用され得る。いくつかの態様において、サプレッサーtRNAを発現するウイルスベクターおよび関心対象の配列を含むウイルスベクターは、細胞に同時感染するために使用され得、かつ融合ポリペプチドを産生するために使用され得る。融合ポリペプチドは関心対象の配列によって完全にコードされ得、例えば、その配列は、終止コドンによって別のオープンリーディングフレーム（ORF）から分離されたORFを有し得る。代替的には、1つのORFは関心対象の配列上に存在し得、および1つまたは複数のさらなるORFはウイルスベクター上に存在し得る。サプレッサー発現ウイルスベクターと発現ベクターを用いる同時発現は融合ポリペプチドの発現を生じ；サプレッサー発現ウイルスベクターを用いない感染は天然型のポリペプチドを産生する。従って、発現技術は、単一の発現ベクターを使用して、タグを付けられたポリペプチドおよびタグを付けられていないポリペプチドの発現を可能にする。
【０２９９】
実施例3
アデノウイルスベクターおよびキットの構築のための詳細な材料および方法
本発明のキットは、本発明の方法を実行するための1つまたは複数の指示書のセットを含み得る。例えば、これらの指示書は、本発明の方法において使用される細胞の増殖、および/または本発明の方法の一部である個々の反応を実施することに関連し得る。1つの態様において、本発明のキットは、本発明の方法において使用される細胞の増殖および維持のための指示書（例えば、293A細胞株マニュアル、カタログ番号R705-07バージョンB、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）および本発明のウイルスベクターの調製のためのマニュアル（例えば、ViraPower（商標）アデノウイルス発現システム（Adenoviral Expression System）マニュアル、カタログ番号K4930-00、バージョンA、Invitrogen Corporation, Carlbad, CA）を含み得る。
【０３００】
1つの態様において、本発明のキットは、本発明に従うウイルスベクターを調製するために必要な試薬および指示書を含み得る。このようなキットは、Vira Power（商標）Adenoviral GATEWAY（商標）発現キット、Vira Power（商標）Adenoviral Promoterless GATEWAY（商標）発現キット、pAd/CMV/V5-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターパック（Vector Pack）、またはpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターパック（すべてInvitrogen Corporation, Carlsbad, CAより市販されている）からなる群より選択される1つまたは複数の成分を含み得る。
【０３０１】
pAd/PL-DEST（商標）のプラスミドマップは図9に提供され、このプラスミドの配列は表10に提供される。
【０３０２】
キットはまた、1つまたは複数の対照試薬を含み得る。例えば、キットは、細胞のトランスフェクションおよび細胞の感染のための対照として使用され得る検出マーカーを含むアデノウイルスベクターを含み得る。1つの適切な対照試薬は、pAd/CMV/V5-GW/lacZ対照である。pAd/CMV/V5-GW/lacZプラスミドのマップは図10に提供され、プラスミドの配列のマップは表11に提供される。
【０３０３】
本発明のキットは、1つまたは複数のさらなる生成物（例えば、補助生成物）を含み得る。このような生成物には、核酸を精製するための試薬および物質（例えば、プラスミド精製）、プラスミドおよび/またはウイルスを増殖させるための宿主細胞（例えば、大腸菌（E. coli）および293細胞）、トランスフェクション試薬（例えば、脂質）、対照ベクター発現をアッセイするための試薬（例えば、βラクタマーゼアッセイ試薬、βガラクトシダーゼアッセイ試薬、βガラクトシダーゼに対する抗体）、組換えポリペプチド、および形質転換細胞の選択のための抗生物質が含まれるがこれらに限定されない。1つの適切なキットの内容物には、Vira Power（商標）Adenoviral GATEWAY（商標）発現キット、Vira Power（商標）Adenoviral Promoterless GATEWAY（商標）発現キット、293A細胞株、GATEWAY（商標）LR Clonase（商標）酵素ミックス（Enzyme Mix）、Library Efficiency（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞（Competent Cells）、One Shot（登録商標）TOP10 ケミカルコンピテント大腸菌（Chemically Competent E. coli）、S.N.A.P.（商標）ミディプレップキット、Lipofectamine（商標）2000、β-gal抗血清、およびアンピシリン（すべてInvitrogen Corporation, Carlsbad, CAより市販されている）。
【０３０４】
関心対象の配列によってコードされるポリペプチドは、検出可能なエピトープを有する融合ポリペプチドとして発現され得る。例えば、pAd/CMV/V5-DEST（商標）（図6）から発現されるポリペプチドは、V5エピトープに対する抗体を用いて検出され得る。検出可能なエピトープに対する抗体は標識され得、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）またはアルカリホスファターゼ（AP）が抗体に結合され、化学発光法または比色定量検出法を使用する1段階検出を可能にし得る。蛍光標識（例えば、FITC）は抗体に結合され、免疫蛍光実験における1段階検出を可能にし得る。従って、本発明のキットは1つまたは複数のエピトープに対する1つまたは複数のの抗体を含み得る。検出可能なエピトープに対する抗体は標識され得る。適切な抗体には、抗V5抗体、抗V5-HRP抗体、抗V5-AP抗体、および/または抗V5-FITC抗体が含まれるがこれらに限定されない。
【０３０５】
本発明の核酸分子の例には、pAd/CMV/V5-DEST（商標）（36.7kb）およびpAD/PL-DEST（商標）（34.9kb）が含まれ、これらは、組換えクローニング（例えば、GATEWAY（商標）技術）を用いる使用のために適合されたデスティネーション（destination）ベクターであり、例えば、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAから市販されているViraPower（商標）アデノウイルス発現システム、カタログ番号K4930-00およびK4940-00を使用して、分裂している哺乳動物細胞および分裂していない哺乳動物細胞中での組換え融合ポリペプチドの高レベルの一過性発現を可能にするように設計される。
【０３０６】
ベクターの選択は、関心対象の配列を発現するアデノウイルスの構築を可能にする。各々のベクターは、異なる状況下で有用であり得る異なる特徴を提供する。例えば、pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターは、関心対象の配列の高レベルの構成的発現を提供するCMVプロモーターおよび抗V5抗体を使用する組換えポリペプチドの検出のためのC末端V5エピトープを含む。pAd/PL-DEST（商標）ベクターは、任意で本発明のウイルスベクターへの挿入の前に、関心対象の配列に作動可能に連結され得る任意の所望のプロモーターから、関心対象の配列の発現を可能にするプロモーターを有しない。さらに、Ad/PL-DEST（商標）ベクターは、C末端エピトープタグ（所望される場合）および選択のポリアデニル化シグナルの付加を可能にする3'配列を有しない。
【０３０７】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクター（36686bp）は以下の特徴を含む。
2005532829.tif 000021
2005532829.tif 000022
【０３０８】
pAd/PL-DEST（商標）ベクター（34864bp）は以下の特徴を含む。
2005532829.tif 000023
【０３０９】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターおよびpAd/PL-DEST（商標）ベクターは以下の特徴を有する：「左側」逆方向末端反復（L-ITR）およびウイルスパッケージングのために必要とされるキャプシド形成シグナル配列を含む、attR1部位の上流である、5型ヒトアデノウイルス（Ad 1-458）、広範な哺乳動物細胞中における関心対象の遺伝子の高レベルの構成的発現のためのヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期プロモーター（pAd/CMV/V5-DEST（商標）においてのみ（Andersonら、1989, J. Biol. Chem., 264, 8822-8829; Boshartら、1985, Cell 41, 521-530; Nelsonら、1987, Molec. Cell. Biol. 7, 4125-4129））；エントリークローンからの関心対象のDNA配列の組換えクローニングのための2つの組換え部位、attR1およびattR2；対抗選択のための2つのattR部位間に位置するクロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）；attR部位間に位置する陰性選択のためのccdB遺伝子；関心対象の組換えポリペプチドの検出のためのC末端V5エピトープ（pAd/CMV/V5-DEST（商標）においてのみ（Southernら、1991, J. Gen. Virol. 72, 1551-1557）；正確なパッケージングおよびアデノウイルスの産生のために必要とされる遺伝子およびエレメント（例えば、E2領域およびE4領域、後期遺伝子、および「右側」ITR）を含む5型ヒトアデノウイルス配列（Ad3513-35935）（Hittら（1999）The Development of Human Gene Therapy, T. Friedmann編（Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press）61-86頁; Russell,（2000））；大腸菌選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；ならびに大腸菌中のプラスミドの高コピー複製および維持のためのpUC起点。本発明のこの局面の1つの代替において、カセット中のクロラムフェニコール耐性遺伝子はスペクチノマイシン耐性遺伝子によって置き換えられ得（Hollingsheadら、Plasmid 13(1):17-30 (1985)、NCBIアクセッション番号X02340 M10241）、かつccdBおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子に隣接するattP部位を含むデスティネーションベクターはアンピシリン/スペクチノマイシン含有培地上で選択され得る。クロラムフェニコールの代わりのスペクチノマイシンの使用が選択プレート上で得られるコロニーの数の増加を生じることが最近見い出され、このことは、スペクチノマイシン耐性遺伝子の使用は、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むカセットを使用して観察されるクローニングの効率の増加をもたらし得ることを示す。
【０３１０】
プラスミドpAd/CMV/V5-GW/lacZは、選択の哺乳動物細胞株に含められ、そこで陽性発現対照として使用され得る。pAd/CMV/V5-GW/lacZ（図10）は、β-ガラクトシダーゼを発現する37567bpのベクターであり、lacZを含むエントリークローンとpAd/CMV/V5-DEST（商標）との間のGATEWAY（商標）LR組換え反応を使用して生成された。β-ガラクトシダーゼは、約120kDaの分子量を有するC末端V5融合ポリペプチドとして発現される。
【０３１１】
本発明の核酸分子は、当業者に公知である任意の方法を使用して、例えば、組換えクローニング（例えば、GATEWAY（商標）を使用して）構築され得る。GATEWAY（商標）は、バクテリオファージλの部位特異的組換え特性（Landy, 1989）を利用して、マルチプルベクター系に関心対象のDNA配列移動させるための迅速かつ高い効率の方法を提供する一般的なクローニング技術である。GATEWAY（商標）技術を使用して哺乳動物細胞において関心対象の配列を発現させるために、以下の方法が使用され得る。第1に、関心対象の配列が、エントリークローンを作製するために選択のGATEWAY（商標）エントリーベクターにクローニングされ得る。pAd-DEST（商標）が使用される場合、選択のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは関心対象の配列に作動可能に連結され得る。次に、組換え反応（例えば、LR反応）は、GATEWAY（商標）デスティネーションベクター（例えば、pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAD-DEST（商標））に関心対象の配列を運搬することによって発現クローンを生成するように実行され得る。次いで、発現クローンは、ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムを使用してウイルスベクターを生成し得る。
【０３１２】
GATEWAY（商標）技術、エントリークローンを生成すること、およびLR組換え反応を実行することに関する詳細な情報については、GATEWAY（商標）技術マニュアルを参照されたい。
【０３１３】
本発明の材料および方法（例えば、ViraPower（商標）アデノウイルス発現システム）は、複製無能力アデノウイルスを使用して、分裂している哺乳動物細胞および分裂していない哺乳動物細胞への、高度に効率的なインビボまたはインビトロでの標的遺伝子の送達を容易にする。この系は、GATEWAY（商標）適合性デスティネーションベクターを使用して、従来の相同組換えの必要性およびアデノウイルスを産生するためのrecA+細菌の使用を回避する、高度に効率的かつ迅速なアデノウイルスベクターの作製を可能にする。ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムを使用して哺乳動物細胞中で関心対象の配列を発現するために、以下の方法が使用され得る。第1に、pAd/CMV/DEST（商標）またはpAD-DEST（商標）中で発現クローンが作製され得る（例えば、GATEWAY（商標）技術または他の適切な方法論）。次に、発現クローンはPacIで消化されて、ウイルスの逆方向末端反復（ITR）に露出され得る。消化された発現クローンは、アデノウイルスを生成するために適切な宿主細胞（例えば、293細胞または293A細胞）に導入され得る。アデノウイルスは、さらなる細胞に感染すること、およびそのウイルスを複製可能にすることによって増幅され得る。このウイルスは、適切な細胞株（例えば、選択の哺乳動物細胞株）に形質導入するために使用され得る。この形質導入された細胞株は、任意の適切な手段を使用して関心対象の配列の発現のためにアッセイされ得る。
【０３１４】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターおよびpAd/PL-DEST（商標）ベクターは線状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドである。各デスティネーションベクターは、6μgプラスミド、TE、pH8.0中で凍結乾燥されたものとして供給され得る。使用するために、デスティネーションプラスミドを40μlの滅菌水中で最終濃度150ng/μlに再懸濁する。
【０３１５】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターおよびpAd/PL-DEST（商標）ベクターを増殖および維持することが所望され得る。1つの適切な方法は、形質転換のためにLibrary Efficiency（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を使用することである。DB3.1（登録商標）大腸菌株はCcdB効果に対して抵抗性であり、かつccdB遺伝子を含むプラスミドの増殖を支持し得る。ベクターの完全性を維持するために、50-100μg/mlアンピシリンおよび15-30μg/mlクロラムフェニコールを含む培地中で形質転換体を選択する。TOP10またはDH5αを含む一般的な大腸菌クローニング株は増殖および維持のための推奨されない。これらの株はCcdB効果に対して感受性であるからである。
【０３１６】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）およびpAd/DEST（商標）に関心対象の配列を組換えるために、関心対象の配列はエントリークローンにクローニングされるべきである。pENTR/D-TOPO（登録商標）を含む多くのエントリーベクターは、エントリークローンの生成を容易にするために、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAから入手可能である。
【０３１７】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）はC末端融合ベクターであるが、しかし、このベクターは天然型のポリペプチドまたはC末端融合ポリペプチドを発現するために使用され得る。関心対象のポリペプチドをコードする関心対象の配列は、哺乳動物細胞における正確な翻訳の開始のためにコザック（Kozak）コンセンサス配列の文脈においてATG開始コドンを含まなくてはならない（Kozak, M.(1987) Nucleic Acids Res. 15. 8125-8148、Kozak, M.(1991)、J. Cell Biology 115, 887-930、Kozak, M.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8301-8305 ）。コザックコンセンサス配列の例は
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である。ATGコドンに下線を付す。他の配列が可能であるが-3位のGまたはA、および+4位のGが機能のために最も決定的である（太字で示す）ことに注意されたい。
【０３１８】
V5エピトープタグを含まないことが所望される場合、エントリークローンにおける関心対象の配列は終止コドンを含むべきではない。さらに、ポリペプチドをコードする配列は組換え後にV5エピトープタグとインフレームであるべきである。関心対象の配列から天然型のポリペプチド（例えば、タグ配列を有しない）を発現するために、関心対象の配列はエントリークローン中に終止コドンを含まなければならない。V5エピトープおよびattB2部位を含むC末端ペプチドは、関心対象の配列から発現されたポリペプチドのサイズに約4.3kDaを加える。
【０３１９】
pAd/PL-DEST（商標）は、その発現が選択のプロモーターによって制御される関心対象の配列を含むアデノウイルスの生成を可能にする。pAd/PL-DEST（商標）からの関心対象の配列の正確な発現を容易にするために、以下を含むエントリークローンが生成されるべきである：1）哺乳動物細胞における関心対象の配列の発現を制御するための選択のプロモーター；2）関心対象の配列；3）終止コドン；および4）正確な転写終結およびmRNAのポリアデニル化のための選択のポリアデニル化シグナル。関心対象の配列からポリペプチドを発現するために、ポリペプチドのORFは、哺乳動物細胞における正確な翻訳の開始のためのコザックコンセンサス配列の文脈におけるATG開始コドンを含むべきである（Kozak、1987；Kozak、1991；Kozak、1990）。所望される場合、N末端および/またはC末端融合タグ配列が含まれ得る。
【０３２０】
いくつかの態様において、エントリークローンは関心対象の配列に隣接するattL部位を含む。エントリークローンにおける関心対象の配列は、GATEWAY（商標）LR Clonase（商標）酵素ミックス, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAを用いてDNAを混合することによって、デスティネーションベクター主鎖に運搬される。次いで、得られるLR組換え反応は、大腸菌（例えば、TOP10またはDH5α（商標）-T1R）に形質転換され、アンピシリンを用いて発現クローンが選択される。デスティネーションベクター上のattR部位とエントリークローン上のattL部位との間の組換えは、クロラムフェニコール（CmR）遺伝子およびccdB遺伝子を関心対象の配列で置き換え、発現クローンにおけるattB部位の形成を生じる。
【０３２１】
ccdB遺伝子は非常に低い頻度で変異し、非常に少ない数の偽陽性を生じる。真の発現クローンはアンピシリンおよびブラスチシジン耐性であり、ならびにクロラムフェニコール感受性である。変異したccdB遺伝子を有するプラスミドを含む形質転換体は、アンピシリン、ブラスチシジン、およびクロラムフェニコール耐性である。推定の発現クローンを調べるために、30μg/mlのクロラムフェニコールを含むLBプレート上での増殖について試験する。真の発現クローンはクロラムフェニコールの存在下で増殖しないはずである。
【０３２２】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）xエントリークローンから生じる発現クローンの組換え領域は図8に示される。影を付けた領域は、組換えによってエントリークローンからpAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターに移動されたDNA配列に相当する。影を付けていない領域は、pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターに由来する。pAd/CMV/V5-DEST（商標）配列の1414塩基および3657塩基に印を付けている。pAd/PL-DEST（商標）xエントリークローンから生じる発現クローンの組換え領域は図9に示される。影を付けた領域は、組換えによってエントリークローンからpAd/PL-DEST（商標）ベクターに移動されたDNA配列に相当する。影を付けていない領域は、pAd/PL-DEST（商標）ベクターに由来する。pAd/PL-DEST（商標）配列の519塩基および2202塩基に印を付けている。
【０３２３】
関心対象の配列が融合タグ（存在する場合）と正確な方向かつインフレームにあることを確証するために、発現構築物をシークエンシングし得る。以下の結合するプライマーを発現構築物をシークエンシングするために使用し得る。プライマー結合部位の位置については、図8および9を参照されたい。pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターはT7プロモーター/プライミング部位
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およびV5（C末端）リバースプライミング部位
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を含む。pAd/PL-DEST（商標）ベクターはpAdフォワードプライミング部位
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およびpAdリバースプライミング部位
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を含む。
【０３２４】
一旦、pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）の発現構築物の精製されたプラスミドDNAが得られると、そのベクターは、PacIで消化することによってViraPower（商標）アデノウイルス発現システム（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）において使用され得る。Pac-1消化されたベクターはアデノウイルスストックを産生するために使用され、増幅後、次いでそれは選択の哺乳動物細胞株に形質導入して、関心対象の配列または関心対象の配列によってコードされるポリペプチドを発現するために使用され得る。
【０３２５】
一旦、pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）の発現クローンが構築されると、精製されたプラスミドDNAが調製され得る。適切な精製方法には、S.N.A.P.（商標）ミディプレップキット（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）およびCsCl勾配遠心分離が含まれる。プラスミド調製後に発現構築物の完全性を確認するために、プラスミドを制限消化によって分析し得る。
【０３２６】
発現クローンの293A細胞へのトランスフェクトの前に、ベクター上の左側および右側のウイルスITRが正確なウイルス複製およびパッケージングを可能にするために露出されるべきである。pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターおよびpAd/PL-DEST（商標）ベクターの両方はPacI制限部位を含む。PacIを用いるベクターの消化は、左側および右側のウイルスITRの露出、ならびに細菌配列（すなわち、pUC起点およびアンピシリン耐性遺伝子）の除去を可能にする。関心対象の配列はいかなるPacI制限部位をも含まないはずである。
【０３２７】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）の発現構築物の少なくとも5μgの精製プラスミドDNAを、市販のPacI酵素を使用して、PacIを用いて消化する。製造業者の指示書に従う。フェノール/クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿、またはDNA精製キット（例えば、S.N.A.P. Miniprep（商標）キット、カタログ番号K19001、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を使用して、消化されたDNAを精製する。ゲル精製は必要ではない。
【０３２８】
精製されたプラスミドを、必要に応じて滅菌水またはTE緩衝液（pH 8.0）中に、0.1-3.0μg/μlの最終濃度まで、再懸濁または溶解する。
【０３２９】
InvitrogenのViraPower（商標）アデノウイルス発現システムを使用してpAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）から関心対象の遺伝子を発現するために、以下の試薬が必要である：1）宿主細胞（例えば、293細胞株または293A細胞株）；および2）トランスフェクション試薬（例えば、Lipofectamine（商標）2000試薬、カタログ番号11668019、Invitrogen Corporation, Carlbad, CA）。293A細胞株は293細胞株のサブクローンであり、複製コンピテントなアデノウイルスの産生のために必要とされるE1タンパク質を供給し、およびプラークの可視化を増強する平らな形態を示す。
【０３３０】
pAd/CMV/V5-GW/lacZは、ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムにおける発現のための陽性対照としての使用のための各キットとともに含められる。pAd/CMV/V5-GW/lacZにおいて、β-ガラクトシダーゼは、ウェスタンブロットまたは機能的アッセイ法によって容易に検出され得るC末端タグを付けられた融合ポリペプチドとして発現される。プラスミドを増殖および維持するために：10μlの滅菌水にベクターを再懸濁し、1μg/μlストック溶液を調製する。TOP10、DH5α（商標）、TIR、または等価物のようなrecA、endA 大腸菌株を形質転換させるためにこのストック溶液を使用する。形質転換のために10ngのプラスミドを使用する。50-100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天プレート上で形質転換体を選択する。長期保存のためにプラスミドを含む形質転換体のグリセロールストックを調製する。
【０３３１】
実施例4
本発明のキットのための典型的な取り扱い説明書
本発明の方法において提供されるのは、分裂している哺乳動物細胞および分裂していない哺乳動物細胞において、高レベルの一過性発現のためのウイルス系を含むキットである。このようなキットの1つの非限定的な例は、本実施例において記載されているような、ViraPower（商標）アデノウイルス発現システム、Invitrogenカタログ番号K4930-00およびK4940-00、バージョンA、2002年7月15日、25-0543である。
【０３３２】
ViraPower（商標）アデノウイルス発現キットは以下の成分を含む。各成分の詳細な内容の説明については、以下を参照されたい。
2005532829.tif 000029
【０３３３】
ViraPower（商標）アデノウイルス発現キットは以下に記載されるようにで出荷される。受領の際には、以下に記載されるように各成分を保存する。
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【０３３４】
各ViraPower（商標）アデノウイルス発現キットは、関心対象のDNA配列および対応する発現制御ベクターをクローニングするためのデスティネーションベクター（pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターまたはpAd/PL-DEST（商標）ベクター）を含む。ベクターに関する情報のためには、例えば、pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターおよびpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターマニュアル、カタログ番号V493-20および494-20、バージョンB、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAを参照されたい。
【０３３５】
本発明の方法は任意の適切な細胞株（例えば、293A細胞株、カタログ番号R-705-07、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を使用して実施され得る。
【０３３６】
市販されている多数の試薬が本発明の方法と共に使用され得る。例えば、以下の試薬がInvitrogen Corporation, Carlsbad, CAから入手され得る。
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【０３３７】
ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムは、分裂している哺乳動物細胞または分裂していない哺乳動物細胞のいずれかにおいて関心対象の遺伝子を送達および発現するために使用され得る複製無能力アデノウイルスの作製を可能にする。ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムの主要な構成要素には以下が含まれる：ヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期エンハンサー/プロモーター（pAd/CMV/V5-DEST（商標））または選択のプロモーター（pAd/PL-DEST（商標））の制御下で関心対象の遺伝子を含む組換えアデノウイルスの高度に効率的な産生を可能にするGATEWAY（商標）適合アデノウイルスベクターの選択；組換えアデノウイルスの産生および引き続く力価測定を可能にする最適化された細胞株293A；ならびに、ビリオンにパッケージングされかつ哺乳動物細胞株に形質導入された場合にβ-ガラクトシダーゼを発現する、lacZ遺伝子を含む制御発現プラスミド。アデノウイルスベクター、lacZ遺伝子を含む対応する陽性対照ベクター、およびGATEWAY（商標）技術に関する詳細については、pAd/CMV/V5-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターおよびpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターのマニュアルを参照されたい。このマニュアルは、各ViraPower（商標）アデノウイルス発現キットと一緒に提供されるが、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CAに連絡することによっても入手され得る。
【０３３８】
関心対象の遺伝子のDNAウイルスに基づく発現を容易にするViraPower（商標）アデノウイルス発現システムの使用は以下の利点を提供する：ヒト細胞または細菌細胞におけるシャトルベクターおよび非効率的な相同組換えの必要性を回避することによって、関心対象の遺伝子の全長アデノウイルスベクターへの高度に効率的かつ迅速なクローニングを可能にするためにGATEWAY（商標）技術を使用すること；高力価アデノウイルスストック（すなわち、粗調製物中1×109pfu/mlおよび1×1011pfu/ml）の生成を可能にすること；培養中またはインビボで、活性に分裂している哺乳動物細胞および分裂していない哺乳動物細胞に関心対象の遺伝子を効率的に送達すること；系がハイスループット適用またはライブラリー移動手順における使用に受容可能であるような高度な効率および正確性でアデノウイルス構築物を生成すること；ならびに、系の生物災害管理および遺伝子送達ビヒクルとしてのその使用を高める複製無能力ウイルスの産生を可能にすること。
【０３３９】
本実施例は、ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムの概観を提供し、および以下のための指示および指針を提供する：pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）の発現構築物を293A細胞株にトランスフェクトし、アデノウイルスストックを産生するため；アデノウイルスストックを増幅するため；アデノウイルスストックを力価測定するため；選択の任意の哺乳動物細胞株に形質導入するために増幅したアデノウイルスストックを使用するため；および、任意の関心対象のポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチドの一過性発現をアッセイするため。この発現は、例えば、ポリペプチド、タンパク質、または翻訳されないRNA（例えば、tRNA）を発現するために使用され得、これらのすべては、本明細書中で使用される場合、「関心対象の遺伝子」という用語によって包含される。
【０３４０】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）を使用する発現構築物を生成するための詳細および指示書については、pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターマニュアルを参照されたい。293A産生細胞株を培養および維持するための指示書については、293A細胞株マニュアルを参照されたい。これらのマニュアルはViraPower（商標）アデノウイルス発現キットと共に供給され、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAからもまた入手可能である。
【０３４１】
ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムは、複製無能力アデノウイルスを使用して、分裂している哺乳動物細胞および分裂していない哺乳動物細胞への標的遺伝子の、高度に効率的なインビトロまたはインビボでの送達を容易にする。Bett, A. J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8802-8806 (1994)によって開発された第2世代ベクターに基づいて、ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムは、単純化および高力価組換えアデノウイルスを生成する効率を非常に高めるために、GATEWAY（商標）技術を使用する。
【０３４２】
本実施例において記載される系の最初の主要な構成要素は、関心対象の遺伝子がそこからクローニングされる、E1およびE3が欠失した、pAd-DEST（商標）に基づく発現ベクターである。関心対象の遺伝子の発現は、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（pAd/CMV/V5-DEST（商標）において）または選択のプロモーター（pAd/PL-DEST（商標）において）によって制御される。このベクターはまた、ビリオンへの発現構築物のパッケージングを可能にするために必要とされるエレメント（例えば、5'ITRおよび3'ITR、キャプシド化シグナル、アデノウイルス後期遺伝子）を含む。pAd/PL-DEST（商標）発現ベクターに関する詳細な情報については、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であるpAd/CMV/V5-DEST（商標）およびpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターマニュアルを参照されたい。
【０３４３】
この系の第2の主要な構成要素は、複製無能力アデノウイルスの最初の産生、増幅、および力価測定を容易にするために使用される最適化された293A細胞株である。この293A細胞は、アデノウイルスを生成するために必要とされる、トランスでE1タンパク質（E1aおよびE1b）を供給するE1の安定に統合されたコピーを含む。293細胞株に関する詳細については、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能である293A細胞株マニュアルを参照されたい。関心対象の遺伝子を含むpAd-DEST（商標）ベクターは293A細胞にトランスフェクトされ、複製無能力アデノウイルスを産生する。粗アデノウイルスストックは293A細胞に感染して増幅されたアデノウイルスストックを産生するために使用される。一旦アデノウイルスストックが増幅されかつ力価測定されると、この高力価ストックが使用されて、関心対象の組換えポリペプチドの発現のために選択の哺乳動物細胞に組換えアデノウイルスを形質導入され得る。
【０３４４】
アデノウイルスは、コクサッキー/アデノウイルスレセプター（CAR）への結合によって標的細胞に侵入する。CARへの結合後、アデノウイルスはインテグリン媒介エンドサイトーシスを介して内部移行し、続いて核への活性な移動を行う。一旦核に入ると、初期事象が開始され（例えば、E1タンパク質の転写および翻訳）続いてアデノウイルス後期遺伝子の発現およびウイルス複製が行われる。後期遺伝子の発現はE1に依存する。ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムにおいては、E1は293A産生細胞によって供給される。ウイルスの生活環は約3日間にわたる。アデノウイルスの生活環およびアデノウイルスの生物学に関する詳細については、以下の参考文献ならびに刊行された概説を参照されたい：Bergelson, J. M.ら、Science 275:1320-1323 (1997); Hitt, M. M.ら、「Structure and Genetic Organization of Adenovirus Vectors」、The Development of Human Gene Therapy, Friedmann, T.編、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1999)、61-86。 
【０３４５】
アデノウイルスが標的細胞に形質導入され、および核に移動される後では、これは宿主ゲノムに組み込まれない。それゆえに、関心対象の遺伝子の発現は一般的には形質導入後24時間以内に検出可能でありかつ一過性であり、ウイルスゲノムが存在する限りのみ持続する。アデノウイルスベクターおよび宿主細胞の使用に関するさらなる情報は、以下の参考文献から得られ得る。
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【０３４６】
ウイルス感染は本実施例中でいくつかの手順においてが引用され、および他の手順においてウイルス形質導入が引用される。これらの用語は以下に定義される。
【０３４７】
感染：
ウイルス複製が起こりかつ感染性ウイルスの子孫が生成する状況に適合する。E1を安定に発現する細胞株のみが感染され得る。
【０３４８】
形質導入：
ウイルス複製が起こりかつ感染性ウイルスの子孫が生成しない状況に適合する。E1を発現しない哺乳動物細胞株が形質導入される。この場合において、アデノウイルスが遺伝子送達ビヒクルとして使用される。
【０３４９】
ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムはインビボ遺伝子送達適用のための適切である。多くのグループがアデノウイルスを首尾よく使用して、骨格筋、肺、心臓、および脳を含む多数の組織において標的遺伝子を発現している。アデノウイルスに基づくベクターをインビボで使用して首尾よく発現された標的遺伝子に関する詳細な情報については、前記の刊行物を参照されたい。
【０３５０】
ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムは、以下の安全性特徴を含む。全体のE1領域はpAd/CMV/V5-DEST（商標）発現ベクターまたはpAd/PL-DEST（商標）発現ベクターにおいて欠失されている。E1タンパク質の発現は他のウイルス遺伝子（例えば、後期遺伝子）の発現のために必要とされ、従って、ウイルス複製はE1を発現する細胞においてのみ起こる。pAd/CMV/V5-DEST（商標）発現ベクターまたはpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）発現ベクターから産生されたアデノウイルスは、E1aタンパク質およびE1bタンパク質を発現しない任意の哺乳動物細胞において複製無能力である。アデノウイルスは、形質導入の際に宿主ゲノムに組み込まれない。ウイルスは複製無能力であるので、ウイルスゲノムの存在は一過性であり、細胞分裂が起こるにつれて最終的には希釈される。アデノウイルスの形質導入および発現に関する詳細については、前記に列挙された刊行物を参照されたい。
【０３５１】
上記に挙げられた安全性特徴の存在に関わらず、この系を用いて産生されたアデノウイルスは、なおある程度の生物災害の危険性を提示し得る。これは一次ヒト細胞に形質導入し得るからである。この理由のために、この系を使用して生成されるアデノウイルスストックは生物災害管理レベル2（BL-2）生物として扱われ、かつBL-2のための厳密にすべての公開されたガイドラインに従うべきである。さらに、潜在的に有害または毒性の遺伝子（例えば、活性化されたオンコジーン）を有するアデノウイルスを作製する場合、またはウイルスの大規模調製を産生する場合に、特別の注意が払われるべきである。BL-2ガイドラインおよびアデノウイルスの取り扱いに関する詳細な情報については、疾病対策センター（CDC）によって出版されている文書「Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratoties」第4版を参照されたい。この文書はCDCウェブサイトからダウンロードされ得る。
【０３５２】
293細胞株におけるE1のゲノムコピーは、pAd/CMV/V5-DEST（商標）ベクターおよびpAd/PL-DEST（商標）ベクターとの重複の相同領域を含む。まれな例において、293細胞中のE1ゲノム領域とウイルスDNAとの間の相同組換えが起こることが可能であり、関心対照の遺伝子がE1領域と置換され、その結果、「野生型」複製コンピテントアデノウイルス（RCA）の生成を生じる。この事象は、大規模調製またはウイルスの増幅の間に最も起こりやすく、RCAの増殖の利点はそれに組換えアデノウイルスの培養を迅速に上回ることを可能にする。RCA夾雑アデノウイルスストックを伝播する可能性を減少するために、BL-2材料と見なされているすべてのウイルス調製物を取り扱う場合に注意が払われるべきである。大規模ウイルス調製後の野生型RCA夾雑物の存在について日常的スクリーニングが実行されるべきである。RCA夾雑物をスクリーニングするための適切な方法には、PCRスクリーニングおよび上清レスキューアッセイ法が含まれる。RCA夾雑が起こる場合、プラーク生成は関心対象の組換えアデノウイルスを再単離するために実行され得る。代替物としては、アデノウイルスベクターとの相同的重複の領域を含まない、911またはPER.C6のようなE1含有産生細胞株が、RCA生成の発生を減少することを補助するために使用され得る。RCAに関する詳細については、前記に列挙された刊行物、特にLochmullerら（1994）およびZhangら（1995）を参照されたい。
【０３５３】
図13は、ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムを使用する関心対象の遺伝子を発現するために必要とされる一般的工程を記載する。pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）を使用するアデノウイルス発現クローンを生成するための指示書については、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であるpAd/CMV/V5-DEST（商標）およびpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターマニュアルを参照されたい。
【０３５４】
第1に、関心対象の遺伝子を含むアデノウイルス発現クローンは、本明細書中に記載される方法、または公開された方法（例えば、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAからのpAd/CMV/V5-DEST（商標）およびpAd/PL-DEST（商標）マニュアル）に従って、ITRを露出するために生成およびPacIを用いて消化する。次に、293A産生細胞株はアデノウイルス発現クローンでトランスフェクトされる。細胞は収集され、および粗ウイルス溶解物を産生するために溶解される。アデノウイルスは粗ウイルス溶解物を用いて293A産生細胞に感染させることによって増幅され得、および得られるウイルスストックが力価測定される。ウイルスストックは関心対象の哺乳動物細胞株に感染するために使用され、次いでこれは、関心対象の遺伝子の発現についてアッセイされる。
【０３５５】
ViraPower（商標）アデノウイルス発現システムは哺乳動物細胞中で関心対象の遺伝子を送達および一過性に発現するためのアデノウイルスを作製するために設計される。この系は、最も単純な、最も直接的な様式で関心対象の任意の組換えポリペプチドを発現するように設計されたが、この系の使用は、DNAウイルスおよびアデノウイルスベクターの生物学に精通し、ウイルスおよび組織培養の技術の実際上の知識を有するユーザーに対して適合されている。これらのトピックスに関する詳細については、以下の刊行された概説を参照されたい。アデノウイルス生物学：Russell, W. C. J. Gen. Virol. 81:2573-2604 (2000)。アデノウイルスベクター：
2005532829.tif 000033
を参照されたい。アデノウイルス適用：Wang, I.I.およびHuang, I.I、Drug Discovery Today 5:10-16 (2000) を参照されたい。
【０３５６】
ヒトCMVプロモーターの制御下で関心対象の遺伝子を発現するpAd/CMV/V5-DEST（商標）、プロモーターを有しないpAd/PL-DEST（商標）において関心対象のDNA配列を含む発現クローンが作製され得、これは、任意のプロモーターの制御下で関心対象の遺伝子を含むカセットの挿入を可能にする。さらなる取り扱い説明書については、pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターマニュアルを参照されたい。一旦発現クローンが作製されると、清浄でありかつフェノールおよび塩化ナトリウムを含まない、精製されたプラスミドDNAを調製するための任意の方法が使用され得る。夾雑物は細胞を殺傷し得、および塩は脂質複合体化を妨害し得、これはトランスフェクション効率を減少する。プラスミドDNAを単離する適切な方法には、S.N.A.P.（商標）ミディプレップキット（カタログ番号K1910-01、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）および塩化セシウム勾配遠心分離が含まれるがこれらに限定されない。
【０３５７】
任意の293由来細胞株またはE1タンパク質を発現する他の細胞株がアデノウイルスを産生するために使用され得る。本発明における使用のために特に適切なこのような細胞株の1つはヒト293A細胞株であり、これは、E1欠損pAd-DEST（商標）ベクターからのアデノウイルス産生を容易にするためにViraPower（商標）アデノウイルス発現キットと共に含まれる。293細胞株のサブクローンである293A細胞株は、アデノウイルス後期遺伝子の発現のために、従ってウイルス複製のために必要とされるE1タンパク質をトランスで供給する。この細胞株は平らな形態を示し、これはプラークのより容易な可視化を可能にする。293A細胞をいかにして培養および維持するかに関する詳細については、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能である293A細胞株マニュアルを参照されたい。
【０３５８】
一旦発現クローン（例えば、pAd-DEST（商標）発現クローン）が作製されると、この発現クローンは、適切な宿主細胞株（例えば、293A細胞）にトランスフェクトされ、アデノウイルスストックを産生する。以下の節では、本発明の方法を例証するために、pAd-DEST（商標）を使用してアデノウイルスストックを生成するためのプロトコールおよび指示書を提供する。
【０３５９】
pAd-DEST（商標）発現クローンを293細胞にトランスフェクトする前に、左側および右側のウイルスITRを正確なウイルス複製およびパッケージングを可能にするために露出される。各pAd-DEST（商標）ベクターはPacI制限部位を含む（PacI部位の位置についてはpAd/CMV/V5-DEST（商標）およびpAd/PL-DEST（商標）マニュアルにおけるマップを参照されたい）。PacIを用いてのベクターの消化は、左側および右側のウイルスITRの露出および細菌配列（すなわち、pUC起点およびアンピシリン耐性遺伝子）の除去を可能にする。関心対象のDNA配列は、いかなるPacI制限部位をも含むべきでなない。pAd/PL-DEST（商標）発現構築物の生成されたプラスミドDNAの少なくとも5mgが、製造業者の指示書に従ってPacI（New England Biolabs、カタログ番号R0547S）を用いて消化される。消化されたプラスミドDNAは、フェノール/クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿、または市販のDNA精製キット（InvitrogenのS.N.A.P. Midiprep（商標）キット；カタログ番号K1900-01）を使用して精製され得る。ゲル精製は必要とされない。精製されたプラスミドを、必要に応じて滅菌水またはTE緩衝液、pH 8.0中に、0.1-3.0mg/mlの最終濃度まで、再懸濁または溶解する。
【０３６０】
以下の材料が開始前に必要とされる：関心対象のDNA配列を含むPac-1消化pAd/DEST（商標）発現クローン（滅菌水またはTE、pH 8.0中、0.1-3.0mg/ml）；pAd/CMV/V5-GW/lacZ陽性対照ベクター（キットと共に供給される；1mg/mlの濃度で滅菌水中に再懸濁される）；適切な培地中で培養された293A細胞（詳細については293A細胞株マニュアルを参照されたい）；293A細胞をトランスフェクトするために適切なトランスフェクション試薬（例えば、Lipofectamine（商標）2000）；Opti-MEM（登録商標）I 血清使用量低減培地（Reduced Serum Medium)（Lipofectamine（商標）2000を使用する場合；事前に暖めておく）；胎仔ウシ血清（FBS）；滅菌6穴および10cm組織培養プレート；ならびに滅菌組織培養供給品（例えば、15ml滅菌、キャップ付き、コニカルチューブ、卓上遠心分離機、ウォーターバス（37℃に設定）、および凍結用バイアル）。
【０３６１】
pAd/CMV/V5-GW/lacZプラスミドは、発現のための陽性対照ベクターとして各ViraPower（商標）アデノウイルス発現キットと共に含められる。陽性対照ベクターは、関心対象の哺乳動物細胞株中での発現条件を最適化することを補助するために使用され得る対照アデノウイルスストックを生成するために、トランスフェクション実験に含まれ得る。陽性対照ベクターに関する詳細については、pAd/CMV/V5-DEST（商標）およびpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターマニュアルを参照されたい。
【０３６２】
任意の適切なトランスフェクション試薬が、293A細胞にpAd/DEST（商標）発現構築物を導入するために使用され得る。特に適切なものは、Invitrogenから入手可能である、カチオン性脂質に基づくLipofectamine（商標）2000である。293A細胞にトランスフェクトするためにLipofectamine（商標）2000を使用することは、いくつかの利点を提供する：293A細胞中で最も高いトランスフェクション効率を提供すること；DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体は血清の存在下で培地中で細胞に直接付加され得ること；および、複合体の除去またはトランスフェクション後の培地の変更もしくは付加は必要でないが、複合体は活性を損失することなく4-6時間後に除去され得ること。DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体の最適な形成を容易にするために、Invitrogenから入手可能なOpti-MEM（登録商標）I 血清使用量低減培地が使用され得る。Opti-MEM（登録商標）に関する詳細については、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAに連絡されたい。
【０３６３】
以下に提供されるものは、アデノウイルスストックが、それによって以下の最適化されたトランスフェクション条件を使用して293A細胞中で産生され得る1つの方法である。これらの推奨される条件を使用して産生されるアデノウイルスの量は、1×107から1×108までの範囲のプラーク形成単位（pfu）/mlの力価を有する粗ウイルス溶解物約10mlである。Lipofectamine（商標）2000は1つの適切なトランスフェクション試薬である。他のトランスフェクション試薬は容易に使用可能であり、適切なプロトコールに従って使用され得る。
2005532829.tif 000034
【０３６４】
293A培地は完全培地中のトランスフェクションの24時間前にプレーティングされ、トランスフェクションの日に健常でありかつ90-95％コンフルエントであるべきである。
【０３６５】
Lipofectamine（商標）2000を使用して293A細胞をトランスフェクトするための方法が本明細書中で提供される。提供される方法の1つの特徴は、細胞がトランスフェクションの間に培地中に保持され得ることである。陽性対照および陰性対照（DNAなし、Lipofectamine（商標）2000なし）が結果の評価において補助するために実験に含まれ得る。
【０３６６】
トランスフェクションの前日に、293A細胞がトリプシン処理されかつ計数され、次いで、血清を含む通常の増殖培地2mlを含む6穴プレート中でウェルあたり5×105細胞でプレーティングされる。トランスフェクションの日に、293A細胞からの培地は除去され、血清を含む通常の増殖培地（または血清を含むOpti-MEM（登録商標）I 培地）1.5mlで置き換えられる。抗生物質は含められるべきではない。
【０３６７】
DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体は以下のように各トランスフェクション試料から調製される。1μgのPac I消化されたpAd/DEST（商標）発現プラスミドDNAを、250μlの血清を含まないOpti-MEM（登録商標）I 培地中で希釈し、穏やかに混合する。Lipofectamine（商標）2000試薬を使用前に穏やかに混合し、次いで、250μlの血清を含まないOpti-MEM（登録商標）I 培地中で3μlを希釈する。この溶液を穏やかに混合し、5分間室温でインキュベートする。5分間のインキュベート後、希釈したDNAをLipofectamine（商標）2000と合わせ、穏やかに混合する。次いで、この溶液を室温で20分間インキュベートして、DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体が形成することを可能にする。この溶液は濁って見え得るが、これはトランスフェクションを妨害しない。DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体を各ウェルに滴下して加え、プレートを前後に振動させることによって穏やかに混合する。細胞をCO2インキュベーター中で、37℃で一晩インキュベートする。
【０３６８】
翌日、DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体を含む培地を除去し、完全な培地（すなわち、10％ FBS、2mM L-グルタミン、および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むD-MEM）で置き換える。トランスフェクションの48時間後、細胞をトリプシン処理し、10mlの完全な培地を含む滅菌10cm組織培養プレートに移す。BL-2生物体を用いて作用させるための推奨されるガイドラインは、これらの手順の全体を通して従うべきである。培地は、細胞変性効果（CPE）の目に見える領域が観察されるまで（一般的にはトランスフェクション後7-10日）、2-3日毎に新鮮な完全培地で置き換える。感染は、約80％CPEが観察されるまで（一般的にはトランスフェクション後10-13日）まで進行する。組換えアデノウイルス含有細胞を、10ml組織培養ピペットを用いてプレートから細胞を注ぎ出すことによって収集する。細胞および培地を、以下に記載されるように、溶解するために滅菌した15mlのキャップ付きチューブに移す。
【０３６９】
本実施例においては、Pac I消化されたpAd/CMV/V5-GW/lacZプラスミドを、前記に記載されたプロトコールを使用して293A細胞にトランスフェクトした。図14A-Cは、それらがCPEを受ける際のトランスフェクトされた細胞を示す。
【０３７０】
トランスフェクション後4-6日（図14A）：
この初期の段階では、アデノウイルスを産生する細胞は最初に円形の死滅しつつある細胞のパッチとして現れる。
【０３７１】
トランスフェクション後6-8日（図14B）：
感染が進行するにつれて、ウイルス粒子を含む細胞が溶解し、隣接する細胞に感染する。プラークが形成し始める。
【０３７２】
トランスフェクション後8-10日（図14C）：
この後期の段階では、感染した隣接する細胞が溶解し、明確に見えるプラークを形成する。
【０３７３】
アデノウイルス含有細胞および培地を収集した後、数回の凍結/融解サイクル、その後の遠心分離が使用されて、粗ウイルス溶解物を調整し得る。この凍結/融解サイクルは、細胞が溶解すること、および細胞内ウイルス粒子の放出を可能にすることを引き起こす。収集されたトランスフェクトされた細胞および培地を含むチューブは-80℃に30分間置かれ、次いで、融解するために15分間37℃のウォーターバス中に置かれる。凍結および融解の工程は2回反復される。細胞溶解物は、卓上遠心分離機で、3000rpmで15分間、室温で遠心分離され、細胞細片をペレット化する。ウイルス粒子を含む上清、ウイルスストックは、1mlアリコートで凍結バイアルに移し、-80℃で保存され得る。
【０３７４】
一旦粗バイアルストックが調製されると、それは以下に記載されるように293A細胞に感染することによって増幅され得る。この手順は、最も高いウイルス力価および形質導入研究において最適な結果を得るために推奨される。粗ウイルスストックの力価が決定され得、かつこのストックが関心対象の哺乳動物細胞に形質導入するために使用されて、予備的発現実験においてアデノウイルス構築物の機能性を確認し得る。
【０３７５】
このウイルスストックを、長期保存のために-80℃に置く。アデノウイルスはエンベロープを有さないので、ウイルスストックは比較的安定なままであり、かつウイルスストックのある程度の凍結および融解は許容される。10回より多くウイルスストックを凍結および融解することは、ウイルスの力価の損失が起こり得るため避けるべきである。正しく保存された場合、適切な力価のウイルスストックは1年までの間使用のために適合性であり得る。長期保存後、ウイルスストックの再力価測定が使用前に実行され得る。
【０３７６】
一旦粗ウイルスストックが作製されると、このストックは、293A細胞に感染してより高いウイルスストックを生成するために（すなわち、ウイルスを増幅するために）使用され得る。293A細胞に感染することから得られる最初のウイルスストックの力価は、一般的に、1×107から1×108までのプラーク形成単位（pfu）/mlの範囲である。増幅は、1×108から1×109までのpfu/mlの範囲の力価を有するウイルスストックの産生を可能にし、一般的に推奨される。10cmディッシュにおいてプレーティングされる293A細胞を使用して組換えアデノウイルスを増幅するためのガイドラインおよびプロトコールが、本実施例において提供される。大規模増幅が可能である。他の293細胞株またはE1タンパク質を発現する細胞株もまた適切である。
【０３７７】
BL-2生物体を用いて作業するための推奨される連邦政府のガイドラインは、感染性ウイルスを用いるすべての作業に準じるはずである。すべての操作は、認証された生物災害管理キャビネット内で実行されるべきである。ウイルスを含む培地は漂白剤で処理されるべきである。使用したピペット、ピペットチップ、および他の組織培養供給品は生物災害廃棄物として漂白されるかまたは処分されるべきである。ウイルスストックおよびウイルスを含む培地を扱う際には、手袋、実験室コート、および安全めがねまたはゴーグルを着用するべきである。
【０３７８】
野生型RCA夾雑物は、以下に提供されるプロトコールを使用する小規模（すなわち、10cmディッシュにプレーティングされた3×106 293A細胞）アデノウイルス増幅において観察されなかった。しかし、ウイルスの大規模増幅は野生型RCA夾雑物についてスクリーニングされるべきである。大規模調製においてでさえ、野生型RCAを伴うアデノウイルスストックの夾雑はまれな事象である。
【０３７９】
以下の材料がウイルスストックを増幅するために必要とされる：pAdDEST（商標）構築物の粗アデノウイルスストック；滅菌10cm組織培養プレート；組織培養供給品である15ml滅菌キャップ付きコニカルチューブ；卓上遠心分離機、37℃ウォーターバス、および凍結バイアルのような装置および供給品。
【０３８０】
代表的な293A細胞の感染は以下の条件を使用する。
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【０３８１】
感染のために、293Aの10cmプレートが力価測定されていない100μlの粗ウイルスストックで感染される。1×107〜1×108pfu/mlのウイルス力価を仮定すると、これは、一般的に、感染2-3日後に所望の数のアデノウイルス含有細胞を収集することを可能にする。細胞に感染させるために使用される粗ウイルスストックの容量は、所望の細胞の数および/または1mlの粗ウイルスストックと同程度までの粗ウイルスストックの量に従って比例して変化し得る。粗ウイルスストックの力価が既知である場合、293A細胞は感染多重度（MOI）=3〜5で感染する。
【０３８２】
以下の手順は293A細胞を使用してアデノウイルスストックを増幅するために使用され得る。感染の前日に、293A細胞を10cmプレートあたり3×106細胞をプレーティングする前にトリプシン処理および計数する。細胞を、血清を含む10mlの通常の増殖培地にプレーティングする。感染の日に、先に進む前に細胞を80-90％コンフルエントであることを確認する。所望の量の粗アデノウイルスストック（例えば100μl）を細胞に加える。プレートを穏やかに回転させて混合する。細胞をCO2インキュベーター中で37℃でインキュベートし、感染を、80-90％の細胞が処理されかつ浮遊するかまたは組織培養皿に軽く付着するかまで（一般的には感染後2-3日）進行させる。CPEは、細胞がアデノウイルス粒子と共にローディングされることを示す。100μlより少ない粗ウイルスストック、または感染についてより少ない力価のストックを使用することは、CPEを達成するためにより長いインキュベーションを必要とし得る。アデノウイルス含有細胞を、10ml組織培養ピペットを用いてピペットから細胞を注ぎ出すことによって収集する。細胞および培地を、滅菌した15mlのキャップ付きチューブに移し、次いでこれを-80℃に30分間置く。チューブを取り出し、融解するために37℃のウォーターバス中に15分間置く。凍結および融解の工程を2回反復する。細胞溶解物を、卓上遠心分離機で、3000rpmで15分間、室温で遠心分離して細胞細片をペレット化する。ウイルス粒子を含む上清を1mlアリコートで凍結バイアルに移し、-80℃で保存し得る。
【０３８３】
増幅手順は、任意のサイズの組織培養皿またはローラーボトルに容易に拡張可能である。増幅を拡張することが所望される場合、細胞の数ならびに使用される粗ウイルスストックおよび培地の量は、培養容器の表面積の差違に比例して増加される。増幅されたストックにおける野生型RCA夾雑物の存在のスクリーニングは、当業者に公知の公開された文献において記載される適切なスクリーニングプロトコールに従って実行され得る。
【０３８４】
関心対象の哺乳動物細胞株を形質導入すること、および関心対象のポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチドを発現することに進む前に、アデノウイルスストックの力価を決定することが有用であり得る。この手順はいくつかの応用のために必要とはされないのに対して、各細胞に導入されるアデノウイルス粒子の数が制御されるべきでかつ再現可能な発現の結果を生成するべきである場合には、これは必要である。ガイドラインおよびプロトコールは本実施例において提供される。
【０３８５】
アデノウイルスストックの力価を決定するために、293A細胞を6穴組織培養プレートにプレーティングする。アデノウイルスストックの10倍の段階希釈を調製し、次いで、293A細胞を感染するために一晩使用する。プラークアッセイ法を、アガロース/プラーク形成培地溶液を用いて、感染した293A細胞に最初に重層すること、次いで8-12日間プラークを形成させることによって実行する。細胞を染色し、および各希釈中でプラークの数を計数する。
【０３８６】
多数の要因がウイルス力価に影響を与え得る。力価は、一般的には、挿入断片のサイズが増加するにつれて減少する。野生型5型アデノウイルスゲノムのサイズは約35.9kbである。研究により、組換えアデノウイルスが、E1およびE3欠失ベクターからの野生型ウイルスサイズの108％までを効率的にパッケージングし得ることが実証された。各pAd-DEST（商標）ベクターからの発現のために必要とされるエレメントのサイズを考慮に入れると、関心対象のDNA配列または遺伝子は、効率的なパッケージングのためには以下に示されるサイズを超えるべきではない。
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【０３８７】
他の要因には、力価測定のために使用される細胞株の特性およびアデノウイルスストックの齢（age）が含まれる。ウイルス力価は-80℃での長期保存で減少し得る。アデノウイルスストックが6ヶ月から1年間の間保存された場合、そのアデノウイルスストックを再力価測定することが、発現実験における使用の前に実行され得る。凍結/融解サイクルおよびアデノウイルスストックの保存の回数もまた、力価に影響を与え得る。限られた回数の凍結/融解サイクルが許容され得るが、ウイルス力価は10回より多い凍結/融解で減少し得る。アデノウイルスストックはアリコートとして-80℃で保存され得る。
【０３８８】
キットと共に供給される293A細胞株は、アデノウイルスストックを力価測定する際の使用のために特に適切であるが、しかし、他の細胞株が使用され得る。別の細胞株が使用される場合、これは、E1タンパク質を発現し、付着性の細胞株として増殖し、取り扱いが容易で、18-25時間の範囲の分裂時間を示し、かつ非移動性であるべきである。
【０３８９】
アデノウイルス構築物の力価は、どの細胞株が選択されるかに依存して変化し得る。1種より多くのアデノウイルス構築物が力価測定される場合、すべてのアデノウイルス構築物は、同じ哺乳動物細胞株を使用して好ましく力価測定される。
【０３９０】
アデノウイルス構築物の力価を決定するために、以下の材料が必要とされる：pAd-DEST（商標）アデノウイルスストック（使用まで-80℃に保存）；293A細胞株または選択の他の適切な哺乳動物細胞株（上記を参照されたい）；細胞株のための完全な培地；6穴組織培養プレート；4％アガロース（レシピを参照されたい；使用前に65℃に平衡化する）；プラーク形成培地（2％FBSを含む通常増殖培地；使用前に37℃に平衡化する）；および5mg/ml MTT溶液または染色のための他の適切な試薬（レシピを参照されたい；代替物については以下を参照されたい）。
【０３９１】
生体染色用色素、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（チアゾリルブルー（MTT））は、プラークを可視化することを補助するための染色試薬としての使用のために適切である。ニュートラルレッド（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、カタログ番号N7005）を含む、他の生体染色用色素が適切である。ニュートラルレッドを使用するために、1％溶液（100倍ストック溶液）を水で調製し、+4℃で保存する。
【０３９２】
本実施例中に提示される手順は、293A細胞株または他の適切な細胞株を使用してアデノウイルスストックの力価を決定するための方法である。他の適切な方法が使用可能であり、当技術分野において公知である。少なくとも1枚の6穴プレートが、力価測定されるすべてのアデノウイルスストックについて必要とされる（6段階の希釈または1つの偽のウェルおよび5段階の希釈）。pAd/CMV/V5-GW/lacZ陽性発現対照のアデノウイルスストックが生成された場合、このストックを力価測定することが同様になされ得る。感染の前日（1日目）、細胞をトリプシン処理し、それらの感染の時点で80-90％コンフルエントであるような密度でのプレーティングのために計数する。例えば、293A細胞はアデノウイルスストックを力価測定するために使用され得、ウェルあたり1×106細胞が6穴プレートの各ウェルにプレーティングされ得る。細胞を37℃で一晩インキュベートする。
【０３９３】
感染の日（2日目）に、アデノウイルスストックを融解し、10-4から10-9までの範囲の濃度に段階的に10倍希釈する。各希釈について、アデノウイルス構築物し1mlの最終容量まで完全培地に希釈して、穏やかに転倒させることによって混合する。培地を細胞から除去し、希釈物を細胞の1つのウェルに加える（総容量=1ml）。プレートを穏やかに回転させて培地を分散させ、次いで37℃で一晩インキュベートする。次の日（3日目）に、ウイルスを含有する培地を除去し、ウェル当たり2mlのアガロース重層液を用いて細胞を重層する。
【０３９４】
アガロース重層溶液（一度に1枚の6穴プレートに重層するのに十分である）を以下のように調製し得る。1枚の6穴プレート（ウェルあたり2mlの重層）について、12mlのあらかじめ暖めた（37℃で）プラーク形成培地および1.2mlのあらかじめ暖めた（65℃で）4％アガロースを、泡の形成を避けながら穏やかに混合する。重層を、早すぎる固化を妨害するために速やかに作業しながら、各吸引したウェルの側面に重層を穏やかにピペットを用いて下ろすことによって細胞に適用する。6穴プレートを、室温で15分間またはアガロース重層が固化するまで、水平な組織培養フード中に配置する。プレートを37℃の加湿CO2インキュベーターに戻す。最初の重層の3-4日間後（6-7日目）、細胞に、ウェルあたりさらなる1mlのアガロース重層溶液（前と同様に調製）を用いて穏やかに重層する。アガロース重層を、プレートを37℃の加湿CO2インキュベーターに戻す前に固化させる。プラークが目に見えるまで（一般的に感染の8-12日後）、プレートをモニターする。各ウェルについて、5mg/ml MTT溶液（アガロース重層の1/10容量）を、染色するための固化した寒天の上端に穏やかに重層する。例えば、各ウェルは3mlのアガロース重層、300μlの5mg/ml MTTが使用される。プレートを37℃で3時間インキュベートする。アデノウイルスストックの力価を決定するためにプラークを計数する。
【０３９５】
293A細胞を使用してpAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）のアデノウイルスストックを力価測定する場合、1×108から1×109pfu/mlまでの範囲の力価が得られる。この範囲における力価を有するアデノウイルス構築物は、大部分の適用における使用のために適切である。アデノウイルスストックの力価が1×107pfu/ml未満である場合、新規なアデノウイルスストックが力価を増加するように産生され得る。ウイルス収量を最適化するためのさらなる情報およびガイドラインについては、以下のトラブルシューティングの節を参照されたい。
【０３９６】
いくつかの適用について、1×109pfu/mlより高いウイルス力価が所望され得る。それらの形質導入効率に有意に影響を与えることなく、種々の方法（例えば、CsCl精製；Engelhardt, J.F.ら、Nature Genetics 4:27-34 (1993)）を使用してアデノウイルスストックを濃縮することが可能である。これらの方法の使用は、1×1011pfu/mlまでの高さの力価を有するアデノウイルスストックの生成を可能にする。
【０３９７】
適切な力価を有するアデノウイルスストックが一旦生成されると、それは選択の哺乳動物細胞株にアデノウイルス構築物を形質導入するため、および関心対象のポリヌクレオチドの発現についてアッセイするために使用され得る。形質導入の1つの方法を例証するガイドラインを以下に提供するが、多くのこのような方法が当技術分野において公知であり、本発明において使用され得ることが認識される。
【０３９８】
pAd/CMV/V5-DEST（商標）またはpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）のアデノウイルス構築物は複製コンピテントでなく、宿主ゲノムに組み込まれない。それゆえに、一旦選択の哺乳動物細胞に形質導入されると、関心対象の遺伝子が、ウイルスゲノムが存在する限りのみに発現される。アデノウイルス末端タンパク質（TP）はウイルスDNAの末端に共有結合し、核におけるウイルスゲノムを安定化することを補助する。活動的に分裂している細胞において、アデノウイルスゲノムは細胞分裂が起こるにつれて次第に希釈され、時間の経過とともに導入遺伝子発現の全体的な減少を生じる（一般的に、形質導入後1-2週間以内にバックグラウンドまで）。分裂していない細胞（例えば、静止CD34+細胞）または動物組織（例えば、骨格筋、神経細胞）において、導入遺伝子発現はより安定であり、かつ形質導入後6ヶ月の長さの間持続し得る。
【０３９９】
活動的に分裂している細胞（すなわち、約24時間の分裂時間）において、導入遺伝子発現は一般的に形質導入の24時間以内に検出可能であり、形質導入後48-96時間（2-4日）で最大の発現が観察される。発現レベルは、形質導入後5日目までに減少し始める。より長い分裂時間を示す細胞株または分裂しない細胞株において、高レベルの導入遺伝子発現は一般的にはより長い時間の間持続する。最初に哺乳動物細胞株にアデノウイルス構築物を形質導入する場合、発現の時間経過が関心対象の遺伝子の発現のための最適条件を決定するために実行され得る。
【０４００】
関心対象の遺伝子の発現を得るために、アデノウイルス構築物を適切なMOIを使用して選択の哺乳動物細胞株に形質導入し得る。MOIは細胞あたりのウイルス粒子の数として定義され、一般的に発現と相関する。一般的には、発現レベルはMOIが増加するにつれて直線的に増加する。
【０４０１】
多数の要因が最適なMOIの決定に影響を与え得、これには、使用される哺乳動物細胞株の性質（例えば、分裂しない細胞株対分裂する細胞株）、その形質導入効率、関心対象の適用、および関心対象の遺伝子の性質が含まれる。最初に選択の哺乳動物細胞株にアデノウイルス構築物を形質導入する場合、関心対象のDNAまたは組換えポリペプチドの最適な発現を得るために必要とされるMOIを決定するために、一定の範囲のMOI（例えば、0、0.5、1、2、5、10、20、50）を使用することが実行され得る。
【０４０２】
一般的に、活発に分裂している細胞株（例えば、HT1080）における80-90％の細胞は約1のMOIで形質導入された場合に標的遺伝子を発現する。分裂していない細胞を含む他の細胞株は、より低い効率でアデノウイルス構築物を形質導入し得る。分裂していない細胞型にアデノウイルス構築物を形質導入する場合、MOIは、関心対象のポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチドについて最適な発現レベルを達成するために増加され得る。
【０４０３】
pAd/CMV/V5-GW/lacZ対照アデノウイルス構築物は、特定の細胞株および適用のために最適なMOIを決定するために使用され得る。一旦pAd/CMV/V5-GW/lacZアデノウイルスが選択の哺乳動物細胞株に形質導入されると、β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子が構成的に発現され、かつ容易にアッセイされ得る（詳細については、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であるpAd/CMV/V5-DEST（商標）およびpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターマニュアルを参照されたい）。
【０４０４】
ウイルス上清は293A産生細胞から収集された使用済み培地にウイルスを含む細胞を溶解することによって生成される。使用済み培地は栄養を欠き、何らかの毒性の老廃物を含み得る。大量のウイルス上清（例えば、6穴プレート中のウェルあたり1mlのウイルス上清）が使用されて哺乳動物細胞株を形質導入する場合、標的細胞の増殖特性または形態学は形質導入の間に影響を受け得る。これらの効果は、一般的に、培地が新鮮な完全培地で置き換えられる形質導入後に緩和される。
【０４０５】
本実施例中に記載される手順は、アデノウイルス構築物を用いて選択の哺乳動物細胞株に形質導入するために1つの方法を例証する。本発明を用いる使用のために適切な他の方法は当業者による使用のために容易に利用可能である。選択の哺乳動物細胞は完全培地中でプレーティングされる。形質導入の日（1日目）に、アデノウイルスストックを融解し、適切な量のウイルスを新鮮な完全培地に希釈する（必要な場合）。培地を細胞から取り除く。ウイルスを含む培地を、ピペットを使用することによって穏やかに混合し、および細胞に加える。プレートを穏やかに回転させて培地を分散させ、次いで37℃で一晩インキュベートする。次の日（2日目）に、ウイルスを含む培地を除去し、新鮮な完全培地で置き換える。細胞を所望の日（例えば、形質導入の2日後）に収集し（必要である場合）、かつ関心対象のポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチドの発現についてアッセイする。
【０４０６】
関心対象のポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチドを検出するための選択の任意の方法には、機能的分析、免疫蛍光、ノーザンブロット、またはウェスタンブロットが含まれる。関心対象の遺伝子がエピトープタグとインフレームでクローニングされる場合、関心対象の組換えポリペプチドはエピトープタグに対する抗体を使用して検出され得る（詳細については、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であるpAd/CMV/V5-DEST（商標）およびpAd/PL-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターマニュアルを参照されたい）。
【０４０７】
トラブルシューティング
以下に列挙したものは、同時トランスフェクションおよび力価測定実験のトラブルシューティングの助けとなり得る、いくつかの潜在的な問題点および可能な解決法である。
2005532829.tif 000037
2005532829.tif 000038
【０４０８】
哺乳動物細胞の形質導入
以下に列挙したものは、形質導入および発現実験のトラブルシューティングの助けとなり得る、いくつかの潜在的な問題点および可能な解決法である。
2005532829.tif 000039
2005532829.tif 000040
【０４０９】
処方
4％アガロース
この手順は4％アガロース溶液を調製するために使用され得る。
【０４１０】
必要とされる材料：
Ultra Pure Agarose（Invitrogenカタログ番号15510-027）、脱イオン化した滅菌水。
【０４１１】
プロトコール：
脱イオン化した滅菌水中で4％ストック溶液を調製する。滅菌するために121℃で20分間オートクレーブする。ウォーターバス中で65℃に平衡化し、すぐに使用するかまたは室温で無期限に保存する。アガロース溶液が室温で保存される場合、アガロースを溶解することが使用前に必要とされる。溶解するために、電子レンジを使ってアガロースを溶解し、次いで使用前にウォーターバス中で65℃に平衡化する。
【０４１２】
5mg/ml MTT
この手順は5mg/ml MTT溶液を調製するために使用され得る。
【０４１３】
必要とされる材料：
3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド；チアゾリルブルー（MTT；Sigma-Aldrich, St/ Louis, MO、カタログ番号M2128）。リン酸緩衝化生理食塩水（PBS；Invitrogen、カタログ番号10010-023）。
【０４１４】
プロトコール：
PBS中で5mg/mlストック溶液を調製する。フィルター滅菌し、および滅菌したコニカルチューブに5mlアリコートを分配する。+4℃で6ヶ月まで保存する。
【０４１５】
実施例5
本発明は、細胞（例えば、昆虫細胞）における異種ポリペプチドの安定な発現のための材料および方法を提供する。pIB/V5-His-DESTおよびpIB/V5-His-GW/lacZは、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから市販されている本発明の核酸分子である。これらのベクターの構築および使用に関する情報は、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であるカタログ番号12550-018バージョンA、2002年7月15日、25-0607において見い出され得る。
【０４１６】
本発明の核酸分子は融合タンパク質の一部として関心対象のポリペプチドを発現するために使用され得る。多数の適切な融合パートナーが当技術分野において公知である。例えば、関心対象のポリペプチドはV5エピトープを含む融合ポリペプチドとして発現され得る。V5エピトープ（配列
2005532829.tif 000041
を有する、パラミクソウイルス、SV5のPタンパク質およびVタンパク質に由来する14アミノ酸エピトープ）を検出するための抗体はInvitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であり、これは例えば、Anti-V5Antibodyカタログ番号R960-25、Anti-V5-HRP Antibodyカタログ番号R961-25、およびカタログ番号Anti-V5-AP Antibody R962-25である。関心対象のポリペプチドはポリヒスチジン配列との融合ポリペプチドとして発現され得る。ポリヒスチジン配列を検出するための抗体は、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから市販されている。例えば、Anti-His(C-term)Antibodyカタログ番号R930-25、Anti-His(C-term)-HRP Antibodyカタログ番号R931-25、Anti-His(C-term)-AP AntibodyR932-25であり、これらのすべてはC末端ポリヒスチジン（6×His）タグを検出し、および検出のために遊離のカルボキシル基を必要とする（すなわち、配列
2005532829.tif 000042
を検出する、Lindner, P.ら、Biotechniques 22:140-149(1997)を参照されたい）。
【０４１７】
関心対象の配列上に存在するオープンリーディングフレームは、V5エピトープを含むC末端ペプチドとインフレームにクローニングされ得、かつポリヒスチジン（6×His）および固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）が使用されて組換え融合ポリペプチドを精製し得る。ProBond（商標）精製システムならびにNi-NTA精製システムはInvitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能である。
2005532829.tif 000043
【０４１８】
pIB/V5-His-DESTはpIB/V5-His由来の5.0kbベクターであり、GATEWAY（商標）技術を用いる使用のために適合される。これは、ポリペプチドをコードし得る関心対象の配列の昆虫細胞株における一過性または安定な発現を可能にするように設計される。
【０４１９】
pIB/V5-His-DESTは以下の特徴を含む。
2005532829.tif 000044
2005532829.tif 000045
【０４２０】
pIB/V5-His-DESTのマップは図15に提供され、ベクターのヌクレオチド配列は表12に提供される。
【０４２１】
GATEWAY（商標）は、バクテリオファージλ（Landy、1989）の部位特異的組換え特性を利用して、多数のベクター系に関心対象の遺伝子を移動させるための迅速かつ高度に効率的な方法を提供する汎用性のクローニング技術である。GATEWAY（商標）技術を使用して関心対象の配列を発現するために：エントリークローンを作製するためにGATEWAY（商標）エントリーベクターに関心対象の配列をクローニングし；エントリークローンとGATEWAY（商標）デスティネーションベクター（例えば、pIB/V5-His-DEST）との間のLR組換え反応を実行することによって発現クローンを生成し；および一過性または安定な発現のために昆虫細胞に発現クローンを導入する。
【０４２２】
バキュロウイルス最初期プロモーターは宿主細胞転写機構を利用し、活性化のためにウイルスの因子を必要としない。OplE2プロモーターはバキュロウイルスオルギア・シュードツガータ（Orgyia pseudotsugata）マルチキャプシド核多角体病ウイルス（OpMNPV）由来であり、pIB/V5-His-DESTにおける関心対象の遺伝子の構成的発現を駆動する。ウイルスの天然の宿主はベイマツドクガである；しかし、このプロモーターは以下におけるタンパク質発現を可能にする：マイマイガ（Lymantria dispar）（LD652Y）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞（Sf9）（Hegedus, D.D.ら、Gene 207:241-249 (1998); Pfeifer, T.A.ら、Gene 188:183-190 (1997)）、Sf21（Invitrogen）、Trichoplusia ni（High Five（商標）、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）、ショウジョウバエ（Drosophila）（Kcl、S2）（Hegedus, D.D.ら、Gene 207:241-249 (1998); Pfeifer, T.A.ら、Gene 188:183-190 (1997)）および蚊細胞株。OplE2プロモーターはシークエンシングされかつ分析されている。プロモーターの配列は図16に提供される。
【０４２３】
OplE2プロモーターは比較的高レベルの構成的発現を提供するが、いくつかのタンパク質は、ポリヘドリンのようなバキュロウイルス後期プロモーターまたはp10のような最後期プロモーターを用いて見られるレベルでは発現されないかもしれない（Jarvis, D.L.ら、Protein Expression and Purification 8:191-203 (1996)）。代表的な発現レベルは1-2μg/ml（ヒトIL-6；Invitrogen）から8-10μg/ml（ヒトメラノトランスフェリン）までの範囲である（Hegedus, D.D.ら、Protein Expression and Purification 15:296-307 (1999)）。
【０４２４】
OplE2プロモーターは、マイマイガ（Lymantria dispar）（LD652Y）細胞およびスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞（Sf9）の両方においてCATプロモーターを使用する欠失分析によって分析された。Sf9細胞における発現は、LD652Y細胞における発現よりもはるかに高かった。欠失分析は、転写の開始から-275塩基対までの配列が最大発現のために必要であることを示した（Theilmann, D.A.およびStewart, S.、Virology 187;84-96 (1996)）。-275を超えるさらなる配列は、他の昆虫細胞株にこのプラスミドの宿主範囲発現を広げ得る。さらに、18bpエレメントが発現のために必要とされるようである。この18bpエレメントは、3つの異なる位置でほぼ完全に反復され、および6つの他の位置で部分的に反復される。これらは図16において印付けられている。3つの主要な18bpエレメントの除去は、発現を基底レベルに減少させる（Theilmann, D.A.およびStewart, S.、Virology 187;84-96 (1992)）。プライマー伸長実験は、転写が示されるCまたはAのいずれかから開始することを示した。これらの2つの転写開始部位は、多数の初期遺伝子において保存されていることが示されているCAGT配列モチーフに隣接する（Blissard, G.W.およびRohrmann, G.F.、Virology 170;537-555 (1989)）。
【０４２５】
GP64プロモーターは、出芽ビリオンのバキュロウイルス主要エンベロープ糖タンパク質遺伝子（GP64）の発現を調節する。研究は、GP64プロモーターがトランス活性化因子IE-1によって刺激されるのに対して、トランス活性化なしで低レベルの活性がなお起こることを示した（Blissard, G.W.ら、Virology 190:783-793 (1992); Blissard, G.W.およびRohrmann, G.F.、J. Virology 65:5820-5827 (1991)）。さらに、欠失分析は、IE-1の非存在下で転写開始のために必要とされる特定の領域を同定した（Blissard, G.W.ら、Virology 190:783-793 (1992); Blissard, G.W.およびRohrmann, G.F.、J. Virology 65:5820-5827 (1991)）。
【０４２６】
pIB/V5-His-DESTは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）GP64プロモーターの100bp領域を含み、このプロモーターは、いかなるバキュロウイルスタンパク質の非存在下においてもブラスチシジン耐性遺伝子（bsd）の活性化のために十分である。標準的なブラスチシジン濃度（10-80μg/ml）を使用して、bsd遺伝子が適切なレベルで発現される場合に、安定な形質転換体が選択されるのみである。理論に束縛されることを望むことなしに、GP64プロモーターの最小活性のために、最も転写的に活性なゲノム遺伝子座に組み込まれたpIB/V5-His-DESTを含む安定なトランスフェクト体のみが選択される可能性がある。このことは、親のpIB/V5-Hisベクターにおけるように、OplE1プロモーターからのbsd遺伝子産物を発現する細胞株と比較して、より高いレベルの関心対象のタンパク質を発現する安定な細胞株の生成を可能にする。
【０４２７】
Sf9細胞（カタログ番号B82501、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）、Sf21細胞（カタログ番号B82101、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）、またはHigh Five（商標）細胞（カタログ番号B85502、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）のいずれかの細胞培養が本発明と共に使用され得、および当技術分野において周知である従来的な技術（例えば、バキュロウイルス（Baculoviral）発現システムおよび昆虫細胞株（Insect Cell Lines）マニュアル、2002年2月27日、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用して増殖および保存され得る。
【０４２８】
pIB/V5-His-DESTベクターはスーパーコイルプラスミドとして供給される。このベクターの線状化は任意の下流の適用について最適な結果を得るために必要ではない。このベクターは、滅菌水、pH 8.0中に50-150μg/μlの濃度で再懸濁され得る。pIB/V5-His-DESTを増殖および維持するために、Library Efficiency（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）、カタログ番号11782-018が使用され得る。DB3.1（商標）大腸菌株はCcdB効果に対して耐性であり、ccdB遺伝子を含むプラスミドの増殖を補助し得る。ベクターの完全性を維持するために、50-100μg/mlアンピシリンおよび15μg/mlクロラムフェニコールを含む培地中で形質転換体を選択する。TOP10またはDH5αを含む一般的な大腸菌クローニング株の使用は増殖および維持のために推奨されない。なぜなら、これらの株はCcdB効果に対して感受性であるからである。本発明のこの局面の1つの代替において、カセット中のクロラムフェニコール耐性遺伝子はスペクチノマイシン耐性遺伝子によって置き換えられ得（Hollingsheadら、Plasmid 13(1):17-30 (1985)、NCBIアクセッション番号X02340 M10241）、かつccdB遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子に隣接するattP部位を含むpcDNAデスティネーションベクターがアンピシリン/スペクチノマイシン含有培地上で選択され得る。クロラムフェニコール選択の代わりのスペクチノマイシン選択の使用が選択プレート上で得られるコロニーの数の増加を示すことが最近見い出された。このことは、スペクチノマイシン耐性遺伝子の使用は、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むカセットを使用して観察されるものよりも増加したクローニングの効率をもたらし得る。
【０４２９】
pIB/V5-His-DESTに関心対象の配列を組換えるために、関心対象の配列を含むエントリークローンが調製され得る。市販のキット（例えば、pENTR Directional TOPO（登録商標）クローニングキット、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA、カタログ番号K2400-20、バージョンB）が使用され得る。他の適切なエントリーベクターはInvitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能である。エントリークローンを構築する際の詳細な情報は、特定のエントリーベクターと共に供給されるマニュアルから入手され得る。LR組換え反応を実施する際の詳細な情報については、GATEWAY（商標）技術マニュアル、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAを参照されたい。
【０４３０】
関心対象の配列は、正確な翻訳の開始のためのATG開始コドンを伴うコザックコンセンサス配列を含み得る（Kozak, M.、Nucleic Acids Res. 15:8125-8148 (1987); Kozak, M.、J. Cell Biology 115:887-903 (1991); Kozak, M.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8301-8305 (1990)）。コザックコンセンサス配列の例は以下に提供される。他の配列が可能であるが、-3位のGまたはAおよび+4位のGは機能のために最も決定的である（太字で示す）。ATG開始コドンに下線を付す。
（G/A）NNATGG
【０４３１】
ベクターによってコードされるV5エピトープおよび/または6×Hisタグを含めるために、関心対象の配列は終止コドンを含まなくてもよい。コード配列はまた、組換えの後にC末端エピトープとインフレームであるように設計されるべきである。天然型のC末端を有する（すなわち、V5エピトープおよび/または6×Hisタグを伴わない）ポリペプチドを発現するためには、関心対象の配列はエントリークローン中に終止コドンを含むべきである。
【０４３２】
各エントリークローンは関心対象の配列に隣接するattL部位を含む。エントリークローン中の関心対象の配列は、GATEWAY（商標）LR Clonase（商標）酵素混合物とDNAを混合することによって、デスティネーションベクター主鎖に移動され得る。次いで、得られるLR組換え反応物は大腸菌に形質転換され得、かつ発現クローンが選択され得る。1つの態様において、デスティネーションベクター上のattR部位と、エントリークローン中のattL部位との間の組換えは、ccdB遺伝子およびクロラムフェニコール（CmR）遺伝子を関心対象の配列で置き換え、かつ発現クローン中にattB部位の形成を生じる。
【０４３３】
LR Clonase（商標）反応；
引き続く適切な大腸菌の形質転換、および発現クローンの選択は、GATEWAY（商標）技術マニュアルにおいて提供されるもののような標準的な技術を使用して実行され得る。
【０４３４】
ccdB遺伝子は非常に低い頻度で変異し、非常に少ない数の偽陽性を生じる。真の発現クローンはアンピシリン耐性でありかつクロラムフェニコール感受性である。変異したccdB遺伝子と共にプラスミドを含む形質転換体は、アンピシリン耐性およびクロラムフェニコール耐性の両方である。推定の発現クローンは、30μg/mlクロラムフェニコールを含むLBプレート上での増殖によって試験され得る。真の発現クローンはクロラムフェニコールの存在下で増殖しない。
【０４３５】
pIB/V5-His-DEST×エントリークローンから得られた発現クローンの組換え領域は図17に示される。影を付けた領域は、組換えによってエントリークローンからpIB/V5-His-DESTに移動したDNA配列に相当する。影を付けていない領域はpIB/V5-His-DESTベクターに由来する。影を付けた領域に隣接する下線を付したヌクレオチドは、pIB/V5-His-DESTベクター配列の、それぞれ609塩基および2292塩基に相当する。
【０４３６】
関心対象の配列上のコード配列がC末端V5エピトープおよびポリヒスチジンタグとインフレームであることを確認するために、発現構築物を、例えば、OpIE2のフォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列を使用してシークエンシングし得る。プライマー結合部位の配列および位置については図17を参照されたい。
【０４３７】
昆虫細胞へのトランスフェクションのためのプラスミドDNAは、非常に清浄でなければならず、かつフェノールおよび塩化ナトリウムを含んではならない。夾雑物は細胞を殺傷し、かつ塩は脂質複合体化を妨害し、トランスフェクション効率を低下させる。発現構築物プラスミドは、標準的な技術、例えば、カラムクロマトグラフィー（例えば、S.N.A.P.（商標）ミニプレップキット、カタログ番号K1900-01、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用して調製され得る。この技術を使用するプラスミドの代表的な収率は、10-15mlの細菌培養から10-15μgのプラスミドDNAである。プラスミドは昆虫細胞のトランスフェクションのために直接的に使用され得る。
【０４３８】
本発明の核酸分子を宿主細胞に導入するために適切な1つの技術は、脂質媒介トランスフェクションである（例えば、Cellfectin（登録商標）試薬、カタログ番号10362010、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAを使用する）。他の脂質は置換され得るが、トランスフェクション条件は最適化されなくてはならないかもしれない。Cellfectin（登録商標）試薬を使用して予測されるトランスフェクション効率は：Sf9細胞またはSf21細胞に対して40-60％、およびHigh Five（商標）細胞に対して40-60％である。他のトランスフェクション方法（例えば、リン酸カルシウムおよびエレクトロポレーション（MannおよびKing、1989））もまた、High Five（商標）細胞を用いて使用され得る。
【０４３９】
対照がトランスフェクション反応において含められ得、例えば、トランスフェクションおよび発現についての陽性対照としてIB/V5-His-GW/lacZベクター、ならびにDNA夾雑について調べるのみのための陰性対照DNAとしての脂質のみである。
【０４４０】
pIB/V5-His-GW/lacZはトランスフェクションおよび発現のための陽性対照クローンとして提供される（マップについては図18を参照されたい）。このベクターは、ウェスタンブロットまたは機能的アッセイ法によって検出され得るC末端タグ付加β-ガラクトシダーゼ融合ポリペプチドの発現を可能にする。pIB/V5-His-GW/lacZはβ-ガラクトシダーゼについての遺伝子を含む6478bpの対照ベクターである。pIB/V5-His-GW/lacZは、lacZ遺伝子を含むエントリークローンとpIB/V5-His-DESTとの間のGATEWAY（商標）LR組換え反応を使用して構築された。β-ガラクトシダーゼはC末端タグへの融合物として発現される。この融合ポリペプチドの分子量は約120kDaである。
【０４４１】
プラスミドを増殖および維持するために：ベクターを10μlの滅菌水中に再懸濁し、1μg/μgのストック溶液を調製し、かつTOP10、DH5a、JM109、または等価物のようなrecA、endA 大腸菌株を形質転換するためのストック溶液として使用する。50-100μlアンピシリンを含むLB寒天プレート上で形質転換体を選択する。任意で、プラスミドを含む形質転換体のグリセロールストックを、正気保存のために調製し得る。
【０４４２】
トランスフェクションのために、95％より高い生存度を有する対数期の細胞を使用し得る。関心対象の配列の発現の時間経過を実行し得る。例えば、関心対象の配列によってコードされるポリペプチドの発現は、トランスフェクションの2日後、3日後、および4日後にアッセイされ得る。1つまたは複数の60mmプレートが各時点のために使用され得る。Sf9、Sf21、またはHigh Five（商標）細胞については、1×106細胞が、60mmディッシュ中の適切な無血清培地中に播種され得る。穏やかに左右に2〜3分間揺すり、最終的に細胞を分散させる。細胞は50〜60％コンフルエントであり得る。
【０４４３】
細胞を少なくとも15分間、揺することなくインキュベートして、細胞をディッシュの底に完全に付着させ、細胞の単層を形成させる。
【０４４４】
細胞が付着したことを倒立顕微鏡下でそれらを検査することによって確認する。
【０４４５】
本発明の核酸分子は、標準的な技術を使用して宿主細胞に導入され得る。Cellfectin（登録商標）試薬の使用のためのプロトコールは以下に提供される。トランスフェクションのための他の条件は、日常的な実験を使用して当業者によって経験的に決定され得る。好ましくは、プラスミドは、宿主細胞への導入の前に線状化されない。プラスミドを線状化することは、タンパク質発現を減少するようである。この理由は知られていない。
【０４４６】
適切なトランスフェクションは以下を使用し得る：1-10μgの精製したpIB/V5-His-DEST発現構築物（TE緩衝液中に約1μg/μl）；無血清培地（例えば、補充物を含まないGrace培地）中で増殖している、対数期のSf9細胞もしくはSf21細胞（1.6-2.5×106細胞/ml、>95％生存度）、または対数期のHigh Five（商標）細胞（1.8-2.3×106細胞/ml、>95％生存度）のいずれか；無血清培地60mm組織培養皿；1.5ml滅菌微量遠心分離チューブ；振盪プラットフォームのみ（軌道状でない）；27℃インキュベーター；倒立顕微鏡；ペーパータオルおよび気密性バッグまたは容器；ならびに5mM EDTA、pH 8。
【０４４７】
トランスフェクションは、適切な培地中でプラスミドDNAおよびCellfectin（登録商標）を混合すること、ならびに新鮮に播種した昆虫細胞とともにインキュベートすることを含み得る。本明細書中に記載される細胞、リポソーム、およびプラスミドDNAの量は60mm培養プレートのために最適化された。他のトランスフェクション条件は他のサイズのプレートまたはフラスコを用いて使用され得る。他の容量のトランスフェクションのための条件を最適化することは、日常的な実験を使用して当業者によって達成され得る。無血清培地（例えば、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能である、Sf9細胞またはSf21細胞をトランスフェクトするためのSf-900II SFM（カタログ番号1090207）、およびHigh Five（商標）細胞をトランスフェクトするためのExpress Five（登録商標）SFM（カタログ番号10486017））が使用され得る。補充物を含まないGrace培地もまた使用され得る。FBSおよび補充物中のタンパク質はリポソームに干渉し、トランスフェクション効率の減少を引き起こす。
【０４４８】
各トランスフェクション混合物を調製するために、1.5ml微量遠心分離チューブが使用され得る。以下の試薬が加えられ得る：1mlのGrace培地または適切な無血清培地；TE（pH8）中約1μg/μlの濃度の1-10μlの本発明の核酸分子（例えば、pIB/V5-Hisプラスミドまたは構築物）；20μlのCellfectin（登録商標）試薬（使用前に十分に混合され、常に最後に加えられる）。このトランスフェクション混合物は10秒間穏やかに混合され得、室温で15分間インキュベートされ得る。
【０４４９】
トランスフェクトされる細胞を覆う培地は、単層を破壊することなく除去されるべきである。培地が血清を含む場合、2mlの新鮮な補充物を含まないGrace培地またはFBSを注意深く加えて、リポソームトランスフェクションの効率を減少させる痕跡量の血清を除去し、および洗浄液を除去することによって細胞を洗浄する。
【０４５０】
上記に記載した完全なトランスフェクション混合物は60mmディッシュに滴下して加えられ得る。滴下は単層にわたって均一に分配され得る。この方法は、単層を乱す可能性を減少させる。すべてのトランスフェクションを繰り返す。
【０４５１】
ディッシュを、側面から側面に振盪するプラットフォーム上で室温で4時間インキュベートし得る。プラットフォームの適切な速度は、1分間あたり約2回の側面から側面への動きである。プラットフォーム振盪機の代わりに、ディッシュを手動で周期的に振盪させ得る。
【０４５２】
4時間のインキュベーション時間後、1-2mlの完全TNM-FH培地（Sf9細胞もしくはSf21細胞）または適切な無血清培地（Sf9、Sf21、もしくはHigh Five（商標）細胞）が各60mmディッシュに加えられ得る。ディッシュを、蒸発を防ぐために湿らせたペーパータオルと共にシールしたプラスチックバッグ中に配置し得、27℃でインキュベートし得る。Cellfectin（登録商標）試薬は細胞に対して毒性ではないので、トランスフェクション溶液を除去する必要はない。異なる脂質を使用しかつ生存度の損失が観察される場合には、4時間後にトランスフェクション溶液を除去し、培地で2回すすぎ、かつ1-2mlの新鮮な培地で置き換える。
【０４５３】
細胞を、例えば、トランスフェクションの2日後、3日後、および4日後に収集し得、および関心対象の配列の発現についてアッセイし得る。細胞が湿らせたペーパータオルと共に気密性のプラスチックバッグ中にシールされている場合には、さらなる新鮮な培地を細胞に加える必要はない。
【０４５４】
発現クローンからの関心対象の配列の発現は、一過性にトランスフェクトされた細胞または安定な細胞株において実行され得る。融合ポリペプチドとして発現された、関心対象の配列によってコードされるポリペプチドをウェスタンブロットによって検出するための試料プロトコールは以下に提供される。
【０４５５】
1つの60mmプレートからの細胞が各発現実験のために使用され得る。適切な細胞溶解緩衝液が使用され得る。1つの適切な緩衝液は50mM トリス、pH 7.8、150mM NaCl、1％ Nonidet P-40である。
【０４５６】
培地は細胞から除去され得る。関心対象の配列から発現されたポリペプチドが分泌されることが予測される場合、培地と細胞ペレットの両方を保存およびアッセイする。細胞溶解緩衝液100μlをプレートに加え得、細胞を微量遠心チューブに落とすかまたはこすり落とし得る。細胞をボルテックスしてそれらが完全に溶解されることを確実にし得る。溶解した細胞は微量遠心管中で最大速度で1分間遠心分離し、核および細胞膜をペレット化し得る。上清を新しいチューブに移し得る。膜タンパク質が関心対象の配列から発現される場合、それはペレット中に局在し得る。ペレットおよび溶解物がアッセイされ得る。溶解物中のタンパク質濃度は、例えば、Bradfordアッセイ法、Lowryアッセイ法、またはBCAアッセイ法（Pierce）によって決定され得る。
【０４５７】
試料は以下のSDS-PAGE試料緩衝液：10μl 4×SDS-PAGE試料緩衝液を伴う30μl溶解物と共に混合され得る。ペレットを100μl 1×SDS-PAGE試料緩衝液中に再懸濁し得る。30μl培地を10μl 4×SDS-PAGE試料緩衝液と共に混合され得る。培地の容量のために、SDS-PAGEゲル上にローディングされる量を標準化することは困難である。任意で、培地は標準化を容易にするために濃縮され得る。試料を5分間煮沸し、手短に遠心分離し、および約3〜30μgタンパク質をSDS-PAGEゲルのレーンあたり30μgタンパク質をローディングし得る。同じ容量の試料を、ペレット試料および溶解物試料の両方について加えられ得る。ローディングする量は、日常的な実験を使用して当業者によって決定され得る。試料は、標準的な技術を使用して、電気泳動によって分離され、ブロットされ、および適切な抗体を用いてプロービングされ得る。
【０４５８】
融合ポリペプチドとして関心対象の配列から発現されたポリペプチドは、例えば、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であるAnti-V5抗体もしくはAnti-His(C-term)抗体、またはそのポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、ウェスタンブロッティングによって検出され得る。さらに、Positope（商標）対象タンパク質（Control Protein）（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA、カタログ番号R900-50）は、V5エピトープまたは6×Hisタグを含む融合タンパク質の検出のための陽性対照としての使用のために利用可能である。
【０４５９】
pIB/V5-His-GW/lacZプラスミドを陽性対照ベクターとして使用する場合、β-ガラクトシダーゼ発現はウェスタンブロット分析または活性アッセイ法によってアッセイされ得る（Miller, J.H.、Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York（1972））。市販の抗体（例えば、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA、β-Gal Antiserum、カタログ番号R901-25）またはアッセイキット（例えば、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA、β-Galアッセイキット、カタログ番号K1455-01およびβ-Gal染色（Staining）キットカタログ番号K1465-01）がβ-ガラクトシダーゼ発現の検出のために使用され得る。
【０４６０】
V5エピトープおよびポリヒスチジンタグを含むC末端ペプチドは、関心対象の配列から発現されるポリペプチドに分子量で約5kDaを付加する。
【０４６１】
安定な細胞株の選択
安定な発現細胞株は、所望のポリペプチドの長期保存および大規模製造のために作製され得る。安定な細胞株はベクターの複数コピーの組み込みによって作製されることに注意されたい。ショウジョウバエ（Drosophila）においてリン酸カルシウムおよびハイグロマイシン耐性を用いる場合のような増幅は一般には観察されない。
【０４６２】
安定に形質転換された細胞を選択するためにブラスチシジンが使用され得る。ブラスチシジンを取り扱う場合には、手袋、マスク、ゴーグル、および保護着（例えば、実験室コート）が着用されるべきである。ブラスチシジンの秤量および溶液の調製はフード中で行われるべきである。ブラスチシジンは炭酸水素ナトリウムを加えることによって廃棄のために不活性化され得る。ブラスチシジンは水および酢酸に可溶性である。5〜10mg/mlのストック溶液を調製するために水が一般的に使用される。ブラスチシジンは滅菌水または溶解され得るか、またはフィルター滅菌され得る。ブラスチシジンは8.0より高いpHを有する溶液中では不安定である。ブラスチシジンの溶液のpHは7.0であり得る。ブラスチシジン溶液は等量のアリコートに分割され得、長期保存のためには-20℃で凍結され得、または短期保存のためには+4℃で保存され得る。水性ストック溶液は+4℃で1-2週間の間、-20℃で6-8週間の間安定である。ストック溶液は多数回の凍結/融解サイクルに供するべきではない（霜の付かない冷凍庫では保存しない）。溶液は+4℃での保存の1-2週間後廃棄するべきである。
【０４６３】
培地中のブラスチシジンの濃度に依存して、3-5日以内に細胞変性効果が見られるはずである。感受性の細胞は大きくなり、小胞で満たされるようになる。外膜は小疱形成の徴候を示し、細胞は最終的にはプレートから脱離する。ブラスチシジン耐性細胞は規則的な間隔で分裂して識別可能なコロニーを形成するはずである。ブラスチシジンを用いる選択下にない細胞と比較して、ブラスチシジン耐性細胞間ではいかなる明確な形態学的な変化も存在しないはずである。
【０４６４】
一般的に、1週間以内に、10μg/ml周辺のブラスチシジンの濃度はSf9細胞またはSf21細胞を殺傷し（完全TNM-FH培地中で）、20μg/ml周辺の濃度はHigh Five（商標）細胞を殺傷する（Express Five（登録商標）SFM中で）が、トリパンブルーを排除するいくつかの細胞が残存し得る。より速くかつより徹底的な殺傷を得るためには、50-80μg/mlのブラスチシジンが使用され得る。一旦ブラスチシジン耐性クローンが得られると、細胞はより低い濃度のブラスチシジン中で維持され得る（例えば、10-20μg/ml）。任意の特定の細胞型のためのブラスチシジンの適切な濃度は、殺傷曲線を実行することによって当業者によって決定され得る。
【０４６５】
殺傷曲線を確立するための適切なプロトコールが提供される。アッセイ法は、24穴組織培養プレート中で行われ得る。適切な培地（例えば、TNM-FH培地または選択の無血清培地）が調製され得、および0から100μg/mlまでの範囲の濃度のブラスチシジンで補充され得る。一般的に、1週間以内に鱗翅目昆虫細胞を効果的に殺傷する濃度は50〜80μg/ml範囲にある。10-20μg/mlのブラスチシジンが1週間以内に細胞を殺傷するのに対して、より高い濃度はより速くかつより徹底的な殺傷を生じる。さらに、より高濃度のブラスチシジンを使用することは、関心対象の配列の複数の組み込みを含むクローンの濃縮を生じ得る。関心対象の細胞株に対してブラスチシジンの濃度を変化させる試験は、1週間以内に細胞を殺傷する濃度を決定する（殺傷曲線）。1週間以内に関心対象の細胞を殺傷する薬物の濃度が使用されるべきである。
【０４６６】
安定な細胞株を単離するために、偽のトランスフェクションおよび陽性対照（例えば、pIB/V5-His-GW/lacZ）が使用され得る。細胞は上記のようにトランスフェクトされ得る。トランスフェクションの48時間後、トランスフェクション溶液は除去され得、ブラスチシジンを含まない新鮮な培地が加えられ得る。細胞を1:5に分け得（20％コンフルエント）、選択培地を加える前に一晩付着させる。培地を除去し得、適切な濃度のブラスチシジンを含む培地で置き換えし得る。細胞を27℃でインキュベートし得る。選択培地を、増殖巣が観察されるまで、3〜4日毎に置き換え得る。クローニングシリンダーまたは限界希釈を使用してクローンの細胞株を単離し得る。任意で、耐性細胞は、ポリクローナル細胞株についてコンフルエントな状態まで増殖し続けさせる（2〜3週間）。
【０４６７】
ポリクローナル細胞株は、耐性細胞をコンフルエントな状態まで増殖させること、および細胞を1:5に分けることによって単離され得る。このポリクローナル細胞株を発現について試験し得る。ブラスチシジンを含まない培地は、細胞を分ける際に使用されるべきであり、細胞は選択培地を加える前に付着されるべきである。
【０４６８】
耐性細胞は凍結ストックを調製するためにフラスコに拡大され得る。ブラスチシジンを含む培地は安定な鱗翅目細胞株を維持する場合に使用されるべきである。ブラスチシジンの濃度は維持のために10μg/mlまで低下され得る。
【０４６９】
クローニングシリンダーを使用するクローン細胞株の単離
複数の増殖巣が発現の試験のために単離され得る。哺乳動物細胞培養におけるのと同様に、組み込みの位置は関心対象の配列の発現に影響を与え得る。選択は小さなプレートまたはウェル中で実行され得る。細胞は選択の間に乾燥させるべきではない。
【０４７０】
密閉したプレートを、顕微鏡およびプレートの上端に印を付けた1つまたは複数の位置の下で試験し得る。次いで、その印をプレートの下端に移動させ得る。方向のマークも含められ得る。各コロニーは50〜200細胞を含み得る。Sf9細胞はHigh Five（商標）細胞より一層拡散する傾向がある。培養皿は滅菌キャビネットに移動され得、かつ蓋が取り外され得る。滅菌シリコングリースの薄層を、滅菌したコットンの先端を有する木製のアプリケーターを使用して、クローニングシリンダー（Scienceware、カタログ番号378747-00またはBelco、カタログ番号2090-00608）の底に適用し得る。この層は、内部の開口部を覆うことなく、シリンダーからの液体の流れを遅らせるのに十分に厚くあるべきである。クローニングシリンダーおよびシリコングリースは、ガラスのペトリ皿中に少量のグリースを配置すること、およびグリース中に直立したクローニングシリンダーを配置することによって互いに滅菌され得る。オートクレーブ後、グリースは薄層中で拡散し、シリンダーの底をコートする。
【０４７１】
培地は取り除かれ得、およびシリンダーは印を付けた領域の上に固くかつ直接的に配置され得る。顕微鏡がシリンダーの配置を方向付けるために使用され得る。20〜100μlの培地（ブラスチシジンを含まない）が細胞を取り除くために使用され得る。細胞および培地は取り除かれかつマイクロタイタープレートに移され得、および細胞が脱離され得る。培地は取り除かれかつ培養のための選択培地で置換され得る。細胞株は関心対象の配列の発現のために拡大されかつ試験され得る。
【０４７２】
希釈方法を使用するクローン細胞株の単離
クローン細胞株は希釈方法を使用して確立され得る。この方法の目的は、細胞を希釈して、その結果、選択圧の下でウェルあたり1つのみの安定な生存可能な細胞が獲得されることである。トランスフェクション効率が高くなるほど、より多くの細胞が希釈されるべきである。以下のプロトコールは、細胞が5-10％の効率でトランスフェクトされた場合に良好に作用する。
【０４７３】
トランスフェクションの48時間後、細胞は、ブラスチシジンを含まない培地中で1×104細胞/mlに希釈され得る。培養物の他の希釈もまた、トランスフェクション効率が、いかに多くの形質転換された細胞がウェルあたりに存在するかを決定するように使用され得る。100μlの細胞溶液が96穴マイクロタイタープレートの32ウェルに加えられ得る（8行×4列）。残存している細胞はブラスチシジンを含まない培地で1:1に希釈され得、およびこの溶液100μlを次のグループの32ウェル（8×4）に加える。残存している細胞はブラスチシジンを含まない培地で1:1に希釈され得、およびこの溶液100μlを最後のグループの32ウェルに加える。細胞は少ない数に希釈され得るが、細胞密度は生存度のために決定的である。細胞密度が一定のレベルより下に下がると細胞は増殖しない。
【０４７４】
細胞は一晩付着され得、次いで培地を除去し、かつブラスチシジンを含む培地で置き換えられ得る。培地を除去および置き換えることは冗漫であり得る。任意で、細胞が穏やかに取り扱われる場合には、細胞を選択培地に直接的に希釈することが可能である。
【０４７５】
プレートを覆い得、および27℃で1週間インキュベートし得る。培地を交換すること、または湿潤環境に配置することは必要ではない。プレートは1週間後調べ得、および1つのみのコロニーを有するウェルが注意され得る。コロニーがウェルの大部分を満たすまでプレートをインキュベートし得る。細胞を収集し得、およびブラスチシジンを含む0.5mlの新鮮培地を有する24穴プレートに移し得る。クローンを12穴プレートおよび6穴プレート、ならびに最終的にT-25フラスコに拡大し得る。
【０４７６】
各細胞株を所望のポリペプチドの収率についてアッセイし得、ならびに最も高い収率を有するものをスケールアップし得、組換えポリペプチドの精製のために使用し得る。分泌ポリペプチドについては、細胞ペレットならびに培地がアッセイされ得る。細胞におけるポリペプチドの収率は、培地中のポリペプチドの収率に比較され得る。
【０４７７】
安定細胞株のマスターストックおよび作業ストックが、スケールアップおよび精製の前に調製され得る。
【０４７８】
精製
関心対象の配列から発現されたポリペプチドは標準的な技術を使用して生成され得る。上記のように調製された安定細胞株は、所望の収率のポリペプチドを得るために、より大きなフラスコ、スピンナー、振盪フラスコ、または生物反応器中に拡大され得る。関心対象の配列から発現されたポリペプチドが分泌される場合、細胞は精製を単純化するために無血清培地中で培養され得る。
【０４７９】
6Hisタグ付加融合ポリペプチドが、ProBond（商標）精製システム、Ni-NTA精製システム、または同様の製品を使用して精製され得る。両方の精製系は、6×Hisタグ付加ポリペプチドを精製するために特別に設計された金属キレートレジンを含む。
【０４８０】
細胞は10μg/mlの濃度のブラスチシジンを有する培地中に維持され得る。細胞は、継代の間、完全TNM-FH培地から無血清培地に交換され得る。
【０４８１】
分泌されたポリペプチドを無血清培地から精製するために、ProBond（商標）のような金属キレートレジンに無血清培地を直接加えることは、レジンからのニッケルイオンをはぎ取る。培地から6×Hisタグ付加組換えポリペプチドを精製するために、金属キレートレジン上でのアフィニティークロマトグラフィーの前に透析またはイオン交換クロマトグラフィーが実行され得る。透析は、金属キレートレジンからNi2+をはぎ取る培地成分の除去を可能にする。イオン交換クロマトグラフィーは、金属キレートレジンからNi2+をはぎ取る培地成分の除去、および引き続く精製工程におけるより容易な操作のための試料の濃縮を可能にする。
【０４８２】
成功するイオン交換クロマトグラフィーのための条件はポリペプチドに依存して変化する。詳細については、
2005532829.tif 000046
を参照されたい。
【０４８３】
多くの昆虫細胞タンパク質は、天然にヒスチジンが豊富であり、いくつかは6ヒスチジンのストレッチ領域を有する。ProBond（商標）精製システムまたは他の同様の製品を使用して6×Hisタグ付加ポリペプチドを精製する場合に、これらのヒスチジンリッチポリペプチドは関心対象のポリペプチドと同時精製され得る。この夾雑は、関心対象のポリペプチドが低いレベルで発現される場合には有意であり得る。カラムにポリペプチド混合物を加える前に、5mM イミダゾールを結合緩衝液に加え得る。イミダゾールの添加は、低い特異性を有するポリペプチドの金属キレートレジンへの結合を妨害することによって、バックグラウンド夾雑を減少させることの補助を行い得る。
【０４８４】
関心対象のポリペプチドが6×Hisタグを付けられかつ細胞内で発現される場合、その細胞は溶解され得、溶解物はProBond（商標）カラムに直接加えられ得る。5×106〜1×107細胞が2mlのProBond（商標）カラム上での関心対象のポリペプチドの精製のために使用され得る（ProBond（商標）精製システムマニュアル、カタログ番号R801-01、R801-15、バージョンF、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAを参照されたい）。
【０４８５】
適切なプロトコールは、2個または3個の25cm2フラスコに2×106細胞を播種すること；細胞がコンフルエンス（4×106）に達するまで選択培地中で細胞を増殖させること；PBS（リン酸緩衝化生理食塩水、pH 7.4；Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA、カタログ番号10010-023）で1回細胞を洗浄すること；脱落によって細胞を収集すること；滅菌遠心チューブに細胞を移すこと；および細胞を1000×gで5分間遠心分離することである。細胞をすぐに溶解させ得るか、または液体窒素で凍結および必要とされるまで-80℃で保存する。
【０４８６】
多くのプロトコールが培地からポリペプチドを精製するために適切である。プロトコールの選択は精製されるポリペプチドの性質に依存する。十分な量のポリペプチドを精製するために必要とされる培地の量は、ポリペプチドの発現レベルおよび検出の方法に依存する。当業者は、日常的な実験を使用して適切な精製プロトコールを開発し得る。
【０４８７】
実施例6
組換えバキュロウイルスの構築
バキュロウイルスは、昆虫細胞における異種発現のための非常に有用なツールである。バキュロウイルスゲノム（例えば、134kb AcMNPVゲノム）への遺伝子のクローニングのための改善された方法は、組換えバキュロウイルス構築のプロセスを非常に単純化した。しかし、精製されたウイルスストックを得ることは、プラーク精製および最短で10-14日をなお必要とする。現在の方法は昆虫細胞または細菌細胞における組換えに頼っており、ハイスループット実験のために適合されていない。これらの難問に対処するために、本発明の材料および方法はインビトロでの組換えバキュロウイルスの構築を可能にする。このバキュロウイルスは、バキュロウイルスストックを生成するために昆虫細胞に直接的にトランスフェクトされ得る。
【０４８８】
GATEWAY（商標）エントリーベクター（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）と適合可能なattR組換え部位によって結合される組換えカセット（DEST）を含むバキュロウイルスゲノムを構築した。2つの転位カセットを構築し、1つはメリチンリーダー配列を有し、1つはそれを有しなかった。メリチン配列を有しないカセットの模式図は図19Aに提供され、その配列は表13において提供される。メリチン配列を有するカセットの模式図は図19Bに提供され、その配列は表14において提供される。DESTカセットは、最初期プロモーター（IE-0プロモーター）によって駆動されるHSVチミジンキナーゼ（TK）遺伝子および後期プロモーター（P10プロモーター）によって駆動されるlacZ遺伝子を含む。これらの遺伝子は、青白スクリーニングプロトコールおよびガンシクロビルを使用する非組換えウイルスに対する選択を使用して、非組換えウイルスの同定を可能にする。これらのカセットはまた、attR2組換え部位の外側にV5エピトープおよび6-ヒスチジン配列を含む。このカセットの配列は、ウイルスゲノムを線状化するために使用される制限酵素Bsu36I（およびそのアイソシゾマーであるAocI）のための認識部位を含む。
【０４８９】
このカセットは、ウイルスゲノムへの関心対象の配列の挿入の際にエントリークローン中の配列がバキュロウイルスプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター（図20におけるph pr））に作動可能に連結されるように、バキュロウイルスゲノムに挿入され得る。実際上、任意の真核生物細胞プロモーターまたはウイルスプロモーターが、エントリークローンから導入される遺伝子を発現するために使用され得る（例えば、それらが初期、後期、または最後期であるに関わらず、上記に名前を挙げたバキュロウイルス種のいずれかからのプロモーター）。図20において遺伝子配列として示されているが、任意の関心対象の配列が挿入され得る；本発明はポリペプチドをコードする配列に限定されない。
【０４９０】
1つの態様において、関心対象の核酸配列は、TK遺伝子およびlacZ遺伝子を置き換えることによって、ポリヘドリンプロモーターの下流のバキュロウイルスゲノムに直接的に組み換えられ得る。図20を参照すると、線状化されたバキュロウイルスゲノムはギャップを付けた円として示される。適切な組換えタンパク質の存在下では、バキュロウイルスゲノム上の組換え部位（例えば、attR1部位およびattR2部位）は、関心対象の配列を含む核酸分子（図20におけるエントリークローン）上の組換え部位（例えば、attR1部位およびattR2部位）を用いて組換えて、バキュロウイルスゲノムの再環状化を生じる。この組換え反応は、バキュロウイルスゲノムへの関心対象の配列（図20において関心対象の遺伝子（GOI）として示される）の移動を生じる。この移動はまた、attR組換え部位間でのバキュロウイルスゲノムの一部の切除を生じる。
【０４９１】
得られるDNAは組換えウイルスストックを産生するために昆虫細胞に直接的にトランスフェクトされ得る。細胞がガンシクロビル上で増殖される場合、組換えウイルスのみが複製することができ；親のウイルスの複製はTK遺伝子産物のために妨害される。デスティネーションカセットはまた、バキュロウイルスを使用して哺乳動物細胞に形質導入する目的のために、CMVプロモーターまたは哺乳動物細胞中で活性である他のプロモーターの制御下に配置され得る。
【０４９２】
この系の実行可能性を実証するため、および条件を最適化するために、GFPコード配列は2つの組換え部位間の核酸に最初にクローニングされ、次いで、組換えクローニングを使用して2つの適合可能な組換え部位を含むバキュロウイルスゲノムに移動された。Sf21細胞は組換え反応混合物でトランスフェクトされた。3日後、複製の最初のラウンドから産生された出芽ウイルスを含む細胞からの培地を使用して第2の細胞の集団を感染させ、今回はガンシクロビル選択下で増殖させた。4日後、これらの細胞をGFP蛍光について試験し、およびLacZ発現について染色した。GFPを発現する組換えウイルスによって感染された細胞は蛍光性であったのに対して、残存する親のウイルスで感染された細胞は、LacZ発現について陽性に染色された。このアッセイ方法を使用して、トランスフェクションのための条件およびガンシクロビル対抗選択の条件が最適化された。理想的な条件下では、実質的に親のウイルスを含まない小スケールウイルスストックはトランスフェクション後7日以内に製造された。これらのストックは、高力価ストックの作製またはさらなる発現研究のために適切である。
【０４９３】
エントリーベクターにクローニングされた遺伝子のコレクションを用いて、96穴形式における使用のためのこの系の有用性が実証された。96穴プレート中の複数の遺伝子が、同時並行でクローニングおよびスクリーニングされた。7日以内に、精製されたウイルスストックはスケールアップまたはさらなる発現研究のために使用可能であった。
【０４９４】
いくつかの態様において、本発明は、より迅速で、手間のかかる時間の要求が少なく、より信頼性が高く、かつ96穴プレート中でのハイスループット発現のために適切である、λ組換えに基づくバキュロウイルスクローニングのための新規な方法を提供する。
【０４９５】
いくつかの態様において、本発明は、プロモーターとして機能する核酸配列を含む単離された核酸を提供する。任意で、この核酸分子は、プロモーターとして機能する1つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結された1つまたは複数の関心対象の配列（例えば、ORFなど）を含み得る。これらのプロモーターは任意の細胞型（例えば、哺乳動物、昆虫など）において機能し得る。
【０４９６】
いくつかの態様において、このプロモーターは強固に調節されている。例えば、いくつかの態様において、このプロモーターは、1つまたは複数のトランス活性化因子が存在しない限り活性ではない。いくつかの態様において、プロモーターとして機能する核酸配列は、AcMNPV ORF 25プロモーター配列、AcMNPV lef3プロモーター配列、AcMNPV TLPプロモーター配列、AcMNPV相同反復5配列、他のバキュロウイルス相同反復配列などを含むがこれらに限定されない。AcMNPV ORF 25プロモーター配列、AcMNPV lef3プロモーター配列、AcMNPV TLPプロモーター配列、およびAcMNPV相同反復5配列の核酸配列は表15に提供される。
【０４９７】
いくつかの態様において、上記に挙げられたプロモーターは1つまたは複数のトランス活性化因子が存在しない限り活性ではない。1つの適切なトランス活性化因子はバキュロウイルスIE-1タンパク質である。IE-1プロモーター配列、コード配列、およびポリペプチド配列は表16に提供される。トランス活性化因子は、プロモーター配列または別の核酸分子（例えば、プラスミド、ウイルス、宿主ゲノムなど）を含む同じ核酸分子中に供給され得る。いくつかの態様において、関心対象の配列に作動可能に連結されたプロモーター配列は1つの核酸分子（例えば、プラスミド）であり得、およびトランス活性化因子は異なる核酸分子（例えば、バキュロウイルスのようなウイルス）上にあり得る。関心対象の配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸分子は、例えば、トランスフェクションによって宿主細胞に導入され得る。関心対象の配列は、トランス活性化因子の非存在下では、発現されないかまたは実質的に発現されない。いくつかの態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞であり得る。関心対象の配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸分子を含む宿主細胞は、トランス活性化因子をコードする配列を含む第2の核酸分子とさらに接触され得る。トランス活性化因子の発現の際に、関心対象の配列が発現される。いくつかの態様において、トランス活性化因子ポリペプチドは、関心対象の配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸分子を含む細胞に直接的にトランスフェクトされ得る。このようなトランス活性化因子ポリペプチドは、天然型のポリペプチドとして、または融合ポリペプチドとして（例えば、ヘルペスウイルスVP22ポリペプチドとの融合物として）存在し得る。
【０４９８】
上記に挙げたプロモーターを含む核酸分子は、任意の関心対象の配列を条件付きで発現するために使用され得る。いくつかの態様において、関心対象の配列は毒性のポリペプチドをコードし得る。
【０４９９】
いくつかの態様において、上記のプロモーター配列を含む核酸分子はプロモーターとシスである相同反復（hr）配列を有し得る。このような反復配列はhr-依存性IE-1トランス活性化のために必要であり得る。
【０５００】
表15に提供される配列は条件付きで活性化されるプロモーターとして機能することができる。本発明はまた、条件付きで活性なプロモーターとして機能する表15の配列の一部を含む。このようなプロモーターは、IE-1ポリペプチドによって活性化され得る。このような部分は、表15における配列の1つまたは複数の、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはそれ以上を含み得る。
【０５０１】
実施例7
いくつかの態様において、本発明の材料および方法は、関心対象の核酸配列を発現する安定な細胞株を作製するために使用され得る。非限定的な1つの例は、Insect（商標）システム（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）であり、これは、発現および選択のための単一のプラスミドを使用する、昆虫細胞発現系である。本発明の核酸分子（例えば、Insect（商標）ベクター）は、関心対象の配列の発現のための異なるバキュロウイルス最初期プロモーターおよび選択マーカーを使用し得る。本発明の核酸分子は、組換えクローニング方法において使用されるために構築され得る。例えば、pIB/V5-His（カタログ番号V802001、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）は、組換えクローニング（例えば、GATEWAY（商標）クローニング）を含む方法において使用するために修飾された。修飾されたベクターにおいて、pIB/V5-HISにおいて使用されるOpIE-1プロモーター以外の異なるプロモーターが使用されてブラスチシジン耐性遺伝子の転写を駆動する。
【０５０２】
OpIE-1プロモーターを、トポイソメラーゼI媒介ライゲーションストラテジー（図21）を使用して、AcMNPVgp64プロモーターまたはpe38プロモーターの長いバージョンまたは短いバージョンで置き換えた。AcMNPVgp64プロモーターおよびpe38プロモーターを、コスミド#58（AcMNPVゲノムのコスミドライブラリーからのAcMNPV塩基99803-132856を含む、Harwoodら、Virology. 250:113-134, 1998）から、それらの5'末端にアンチセンスTOPO部位および6つのさらなる塩基が付加されたプロモーター特異的プライマーを用いて増幅した（図21）。pIB/V5-Hisを、アンチセンストポイソメラーゼ部位、およびトポイソメラーゼ結合後に突出となる6つのさらなる塩基配列を含むプライマーを用いて増幅した。各プロモーター（gp64を図示する）を、同様に設計したプライマーを用いて増幅した。結合後、突出をアニーリングし、酵素によってライゲーションした。オリゴヌクレオチド配列を以下に示す。アンチセンストポイソメラーゼ部位に下線を付す。
2005532829.tif 000047
2005532829.tif 000048
【０５０３】
pIB/V5 His主鎖を同様に設計したプライマーを使用して増幅した。PCR産物をゲル電気泳動およびSNAPミニプレップカラムによって精製した。残渣の鋳型ベクターを除去するためのDpnI処理後、PCR産物をSNAPミニプレップによって再精製し、30μlの水に溶解し、かつトポイソメラーゼを使用して結合させる（図21）。トポイソメラーゼ反応を室温で10分間インキュベートし、これには、20μlの総容量中、8μlの各PCR産物、50mM トリス、pH 7.5、0.1μg/μl酵素が含まれた。TOP10大腸菌を結合したPCR産物で形質転換した。アンピシリンプレート上での選択後、得られるコロニーを一晩増殖させ、かつミニプレップ（SNAP）によってプラスミドDNAを単離した。プロモーターの存在を制限消化分析によって確認した。gp64を含む構築物を、究極的には、GATEWAY（商標）適合について選択した（以下を参照されたい）。
【０５０４】
pIB/V5-His gp64にpDEST38からのHindIII/Xbal断片をクローニングすることによって、pIB/V5-His gp64を制限酵素部位を含むように修飾し（すなわち、GATEWAY（商標）適合される）、同じ酵素で切断した。このベクターを完全にシークエンシングした。プラスミドマップを提供する（図22）。
【０５０５】
組換えクローニング反応において修飾したベクターを試験するために、pIB/V5-His gp64Destを、LacZ、カルモジュリン、TFIIS、およびアポリポタンパク質を含むattLエントリーベクターを用いるLR反応のために使用した。使用したプロトコールは、GATEWAY（商標）マニュアルにおいて示唆されたプロトコールとはわずかに異なった。使用した反応条件は以下であった。
2μl LRクロナーゼ酵素混液（カタログ番号11791043、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）
2μl LR反応緩衝液
1μl pENTRクローン（〜300ngDNA）
1μl pDESTベクター（〜300ngDNA）
4μl 0.5M トリス緩衝液（pH 7.5）
【０５０６】
組換え反応を室温で3時間インキュベートした。反応物はプロテイナーゼK処理しなかった。2μlの各組換え反応物を使用して50μlのTOP10ケミカルコンピテント細菌を形質転換した。形質転換混液の半分をプレーティングし、平均230コロニーを産生した。従って、1μgのエントリーベクターあたり約8000コロニーが得られた。コロニーをLB/Amp中で一晩増殖し、DNAをSNAPミニプレップによって単離した。
【０５０７】
血清含有培地および無血清培地（SFM）中でSf21細胞またはHighFive細胞を用いて実験を実行した。10％FBSを有するGraceの補充培地を、Sf21細胞およびHighFive細胞について使用した。SFM処理については、Sf900II培地またはExpressFive培地を、それぞれSf21細胞またはHighFive細胞のために使用した。24穴プレートにウェルあたり1.8×105細胞を播種し、1時間の付着後、Grace非補充培地で洗浄した。トランスフェクション混液は、40μlのGrace非補充培地中に0.2μg DNAおよび1μlのCellfectin（登録商標）を含み、室温で30分間インキュベートした。次いでこのトランスフェクション混液を、200μlの最終容量のGrace非補充培地中に希釈し、各ウェルに加えた。細胞およびトランスフェクション混液を穏やかに振盪しながら5時間インキュベートし、その後、混液を上記のように適切な培地で置換する。48時間後、培地を、実験に依存して10〜25μg/μlの間のブラスチシジンを含む同じ培地で置換する。安定な培養物から使用する細胞を少なくとも7日間選択した。必要に応じて、対数期増殖を維持するために細胞を分けた。一般的には、10μg/mlブラスチシジンが一般的な目的のために使用され得る。しかし、当業者は、日常的な実験のみを使用して各構築物のための選択パラメーターを最適化し得る。
【０５０８】
タンパク質発現をウェスタンブロットまたはLacZ活性アッセイ法によってモニターした。6穴プレートからの細胞（ウェルあたり約106細胞）をPBS中で2回洗浄し、1.7mlチューブに移し、遠心分離し、500μlの溶解緩衝液（Tropix Galacto light kit、カタログ番号T1006、Applied Biosystems, Foster City, CA）中に再懸濁し、次いで2回の凍結-融解サイクルに供した。溶解物を、16,000×g、5分間微量遠心分離した。上清を使用するまで-20℃で保存した。溶解物のタンパク質濃度は、標準としてのBSAに対してBioRadタンパク質アッセイ法を使用して測定した。種々の量のタンパク質をLDS試料緩衝液（カタログ番号NP008、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）中で変性させ、4-12％ NuPAGEゲル（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）上にローディングした。電気泳動後、タンパク質をPVDFに転写した。Western Breezeキット（カタログ番号WB7104、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用して、他に注記されない限り、1:5000の希釈で抗V5結合アルカリホスファターゼを使用してタンパク質を可視化した。
【０５０９】
理論に束縛されることなく、抗生物質耐性を駆動するより弱いプロモーターの使用が、より高いレベルで関心対象の遺伝子を発現する安定な培養物を生じることが考えられた。なぜなら、bsd遺伝子（ブラスチシジン耐性遺伝子）がより低いレベルで発現され、bsd遺伝子を含むプラスミドの組み込みがより多くの遺伝子座または転写的により活性であった遺伝子座で起こるからである。多くのバキュロウイルス遺伝子の転写は特徴付けされ、および適切なプロモーターが選択された。gp64プロモーターおよびpe38プロモーターは両方とも広範に研究されてきた（Friesen、Regulation of baculovirus early gene expression、141-170頁、The Baculoviruses. L. K. Miller（編）、Plenum Press, New York, 1997）。pe38プロモーターは最初期プロモーターであり、従ってその活性のためにバキュロウイルス感染を必要としない。gp64プロモーターはIE-1によってトランス活性化されるが、トランス活性化なしで活性の基底レベルを保持する（Blissard, J.、Virol. 65:5820-5827, 1991、Blissard、Virology 190;783-793, 1992）。IE-1トランス活性化の原因である配列は同定され、基底プロモーターから分離される（Blissard, 1992）。各プロモーターの長いバージョン（ATGの500bp上流）および短いバージョン（ATGの100bp上流）を入手し、TOPO-媒介連結を使用してOplE-1の代わりにクローニングした。LacZを得られるベクターにクローニングした。これらの構築物をpIB Lac/V5-HisのOpIE1プロモーターバージョンと共にSf21細胞にトランスフェクトし、ポリクローナル培養物を2つの異なる投薬量のブラスチシジンで選択した。より長いgp64構築物は明らかに十分なレベルのbsd発現を提供せず、細胞は対照細胞と共に死滅した。生存する安定な培養物は他の4つの構築物から得られた。細胞を選択の2週間後に収集し、発現レベルをβ-ガラクトシダーゼアッセイ法を使用して測定した（図23）。安定な細胞培養物についてのβ-ガラクトシダーゼ活性は異なるバージョンのpIB/V5-Hisを用いて確立した。アッセイあたり20μgのタンパク質を使用した。20μg/mlおよび100μg/mlのブラスチシジンの両方でOpIE-1プロモーターを用いて得られるよりも、より高いレベルの発現を、3つすべての代替的なプロモーターについて得た。いずれかのブラスチシジンの濃度で選択された培養間でのLacZ活性の明確な差違は存在しなかった。
【０５１０】
gp64プロモーター構築物をGATEWAY（商標）適合のために使用した。このベクターのgp64 GATEWAY（商標）適合バージョンについてクローニング効率および遺伝子発現を調べるために、LR反応を使用して、4つの遺伝子（アポリポタンパク質、カルモジュリン、TFIIs、およびLacZ）を、pIB/V5-HisおよびpIB/V5-His gp64ベクターのGATEWAY（商標）適合バージョンに移動させた。すべてのLR反応はμgプラスミドあたり数千のコロニーを生じ、アガロース電気泳動によって調べた場合に正確であった。各構築物をSf21細胞にトランスフェクトした。アポリポタンパク質の一過性および安定な発現を、pIBアポリポタンパク質/V5-HisGATEWAY（商標）のgp64バージョンおよびOpIE-1バージョンの間で比較した。一過性の発現レベルはgp64バージョンとOpIE1バージョンとの間で等価であったが（図24、レーン1および2）、しかし発現は選択後のgp64バージョンについてより高かった（図24、レーン3および4）。gp64プロモーターについて観察されたより高い安定な発現レベルが一般的な減少であったことを確認するために、pIB/V5-His GATEWAY（商標）のgp64バージョンおよびOpIE-1バージョンの間で、カルモジュリン、TFIIS、およびLacZの発現を比較した（図25）。図25Aは、pIB/V5-HisのOpIE-1バージョン（レーン1および3）ならびにgp64バージョンで安定にトランスフェクトされたSf21細胞からのカルモジュリンおよびTFIIsの発現を示す。レーンあたり8.6μgの総タンパク質をローディングした。図25Bは、pIB/V5-HisのOpIE-1バージョン（レーン1）およびgp64バージョン（レーン2）で安定にトランスフェクトされたSf21細胞からのLacZの発現を示す。レーン3はトランスフェクトしていない対照である。レーンあたり5.7μgのタンパク質をローディングした。アポリポタンパク質については、カルモジュリン、TFIIS（図25A）、およびLasZ（図25B）はgp64バージョンよりも高かった。
【０５１１】
上記の実験を血清含有培地中でSf21細胞を用いて行った。抗生物質耐性マーカーの発現のための異なるプロモーターの使用は、使用される細胞型または培地の関数としての選択の動力学を変化させ得る。血清培地および無血清培地におけるHighFive細胞からの選択および発現を分析した。一般的に、トランスフェクトしていない細胞は1週間以内に死滅したが、SFM中で選択された細胞は、血清と含む培地中で選択されたものよりもより早く（3-4日で）死滅する傾向があった。以前の実験と同様に、それらが血清培地または無血清培地において増殖したかに関わらず、安定にトランスフェクトされたHighFive細胞を用いて、gp64構築物からより高いレベルの遺伝子発現が得られた。同様の結果は、SFM培地中のSf21細胞を用いて得られた。図26は、pIB/V5-HisのGp64バージョンおよびOpIE-1バージョンを用いて安定にトランスフェクトされた、血清培地および無血清培地中で増殖したHighFive細胞を示す。アッセイあたり24.5μgの総タンパク質である。
【０５１２】
bsd遺伝子の発現のために異なるバキュロウイルスプロモーターを使用するpIB/V5-Hisの組換えクローニング適合バージョンを調製した。基底のgp64プロモーターは、おそらく、pIB/V5-Hisにおいて使用されるOpIE-1プロモーターよりも低いレベルのbsd遺伝子産物を生じ、プラスミドの組み込みをより多くの染色体遺伝子座および/またはより多いコピー数に強制する。
【０５１３】
実施例8
いくつかの態様において、本発明は組換えクローニングを使用して組換えウイルスを作製する方法を提供する。1つの非限定的な例は、BaculoDirect（商標）と称する。この型の方法は、組換えクローニング技術（例えば、GATEWAY（商標）クローニング技術、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用する新規なバキュロウイルスクローニング方法を提供する。BaculoDirect（商標）を用いて、関心対象の核酸配列（例えば、関心対象の遺伝子を含む配列）を含むエントリークローンが、1時間以内に、インビトロ反応で組換え部位を含むバキュロウイルスゲノムに組み換えられ得る。この反応からのDNA産物は適切な細胞（例えば、Sf9細胞またはSf21細胞）に直接的にトランスフェクトされ、組換えウイルスを生成しおよび発現のためにスクリーニングし得る。関心対象の配列（例えば、関心対象の遺伝子（GOI））の配列をインビトロでバキュロウイルスゲノムいクローニングする能力は、組換え工程が昆虫細胞または細菌において実行されるすでにあるバキュロウイルスクローニング方法と対照的である。これらのすでにあるバキュロウイルス技術と比較して、BaculoDirect（商標）は顕著により早く、手間のかかる時間の必要が少なく、かつより信頼性がある。これはまた、ハイスループット実験のために容易に適合される。従って、BaculoDirect（商標）は現在のバキュロウイルスクローニング系を超えて有意な利点を提供する。
【０５１４】
本開示を通して、関心対象の遺伝子（GOI）という用語は便宜のために使用され得る。これは、遺伝子を含む核酸配列に本発明を限定するように見なされるべきではない。関心対象の任意の核酸配列が、本明細書中に記載される材料および方法を使用して本発明のベクターに挿入され得る。
【０５１５】
緒言
バキュロウイルスは、異種タンパク質の真核生物発現のための最も一般的なツールの1つである。伝統的に、GOIは移入ベクターに最初にクローニングされなければならず、次いで、許容的な昆虫細胞中でポリヘドリン遺伝子座への異種組換えによってウイルスに移動されなければならなかった。これは低い頻度で起こった。プラークアッセイ法は冗漫でありかつずっと多くのポリヘドリン陽性プラークの間からのポリヘドリン陰性プラークの同定を必要とした。
【０５１６】
最近20年間の間、技術革新がバキュロウイルスクローニングをより便利にした。線状DNAの使用、および組換えが本質的なバキュロウイルス遺伝子の機能を回復したような組換えストラテジーの設計は、得られる組換えプラークの比率を1-2％から90％超まで高めた（KittsおよびPossee、1993、BioTechniques 14:810-817）。しかし、多数ラウンドのプラーク精製がなお必要とされ、有用なウイルスストックを得るための完全なプロセスは3-4週間および実質的な労働の量を要した。この技術を使用する発現キットは、BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA（Baculogold（商標））、Novagen Inc., Madison, WI、およびInvitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA（Bac-n-Blue（商標））によって市販されている。
【０５１７】
バキュロウイルスクローニングのための第2の方法は、バキュロウイルスDNAにGOIを導入するための細菌における部位特異的組換えを使用する（Lucklowら、1993、J. Virol. 67:4566-4579）。GOIは移動プラスミドにクローニングされ、F'プラスミド（バクミド）として増殖されるバキュロウイルスゲノムを含む特別化された細菌株を形質転換するために使用される。次いで、GOIは、移動プラスミド上およびバキュロウイルスゲノム中のTn7部位間の部位特異的組換えによってバクミドに導入される。次いで、組換えバクミドを含む細菌は適切な培地を用いて抗生物質選択マーカーを使用して選択される。バクミドDNAは抽出され、次いで昆虫細胞にトランスフェクトされる。理論的には、プラーク精製は必要とされず（大部分の厳密な適用を除く）、かつウイルスストックを精製するための移動プラスミドからの全体のプロセスは10-12日間を必要とする。Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAはこの系をBac to Bac（商標）、カタログ番号10359-016の商品名の下で市販している。
【０５１８】
バキュロウイルスクローニングにおけるこれらの進歩が日常的なタンパク質発現のためのバキュロウイルスの使用を非常に単純化したのにも関わらず、上記の方法は、有意な「手間のかかる」時間をなお必要とし、多数の遺伝子の同時並行的処理（すなわち、ハイスループット）のために十分に適してはいない。本発明は、バキュロウイルス組換え体のクローニングおよび精製のためのプロセスを非常に単純化および短縮する新規な方法を提供する。本発明の1つの非限定的な例はBaculoDirect（商標）であり、これはGATEWAY（商標）組換えクローニング技術（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用してGOIをバキュロウイルスゲノムにインビトロで1時間以内に室温の反応で組換える。得られる組換え体ウイルスDNAは昆虫細胞に直接的にトランスフェクトされる。ちょうど6日以内に、高力価ストックの作製のために適切である純粋なウイルス上清を得るための発現スクリーニングのための細胞が収集され得る。
【０５１９】
材料および方法
本研究において使用されるすべての材料は、制限酵素（Roche Applied Sciences, Indianapolis, INまたはNEB, Beverly, MA）およびガンシクロビルナトリウム塩（GCV、Invivogen, San Diego, CAカタログ番号#sud-gcv）以外は、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手した。
【０５２０】
細胞およびウイルス
Sf21細胞は、他に言及されない限りは、補充物および10％FBSを有するGrace培地中で培養した。野生型AcMNPVまたは他のウイルスを用いる細胞の感染は記載されたように実行した（O'Reillyら、1992、「Baculovirus Expression Vectors:a Laboratory Manual.」W. H. Freeman Co., New York）。
【０５２１】
プラスミドおよびウイルスの構築
3つのバージョンのBaculoDirect（商標）を構築した。第1のものはメリチン分泌シグナルを含み、第2のものはメリチンシグナルおよびC末端V5/Hisタグの両方を含み、かつ第3のものは分泌シグナルなしでC末端V5/Hisタグを有した。図19Aおよび19Bは、メリチンリーダーを伴って（19B）およびそれを伴わない（19A）C末端V5/Hisタグを有する組換えカセットの模式図を提供する。
【０５２２】
プラスミドpVL1393 GST p10ストップ（図34）をBamHIおよびNcoIで消化した。15kbバンドを精製し（GSTタグを取り除いた）、これに、BamHIおよびNotIの突出が隣接するメリチンシグナルを含む二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲーションした。このライゲーション生成物をTOP10細菌に形質転換し、正しいクローンを制限消化およびシークエンシングによって確認した。このプラスミド（pVL1393 Mel Stop）は、PCR指向性部位特異的変異誘発によって除去されなければならないattR2部位の下流の終止コドンを含んだ。プライマーEcoRIセンス
2005532829.tif 000049
およびBglIIアンチセンス
2005532829.tif 000050
を使用して、pVL1393 Mel Stopからの断片を増幅し、かつ得られた209bp断片をEcoRIおよびBglIIを用いて切断し、次いで、同じ酵素を用いて消化したpVL1393 Mel Stopにライゲーションした。正しいクローンを、制限消化および配列分析によって同定した。これは、pVL1393 Mel Stopなしを与えた。
【０５２３】
次に、V5-HisタグをattR2部位の下流に加えた。V5/His配列をpIND/V5-His-TOPO（カタログ番号K101001）から、各5'末端にBglII部位を含むプライマー
2005532829.tif 000051
を用いて増幅した。このアンプリコンをpCR2.1 TOPO TAにクローニングし、次いで、BglII消化によって取り出し、かつBglIIで切断したpVL1393 Mel Stopなしにライゲーションした。正しいクローンを、シークエンシングにより同定および確認した。これは、プラスミドpVL1393 Mel/V5-Hisを生じた。メリチンシグナルは、NotIおよびBamHIを使用してpVL1393-NativeからのattR1配列でpVL1393 Mel/V5-Hisからメリチン-attR1配列を置き換えることによって引き続き除去された。正しいプラスミドクローンをシークエンシングと付けられたpVL1393V5/Hisによって確認した。図27は、BaculoDirect（商標）DNAの構築のためのストラテジーの模式図を示す。図27Aにおいて、GATEWAY（商標）対抗選択カセットを、pVL1393 V5-Hisを用いてその間の相同組換えによって野生型AcMPNVのポリヘドリン遺伝子座にクローニングした。得られるウイルスDNAは、ポリヘドリンプロモーターのすぐ下流でかつV5/Hisタグの上流のattR部位によって結合された対抗選択カセットを含む。図27Bにおいて、BaculoDirect（商標）とエントリークローン間のLR組換えは、体躯選択が関心対象の遺伝子によって置き換えられる発現ウイルスを生じる。
【０５２４】
BaculoDirect（商標）ウイルスの生成
BaculoDirect（商標）ウイルスを、AcMNPVと、pVL1393に含まれる相同組換え配列との間の従来の相同組換えを介して作製した（図27、O'Reillyら、1992）。手短に述べると、Sf21細胞を、0.5μgの野生型AcMNPV E2ウイルスDNAおよび3-5μgのpVL1393 V5/Hisを用いて同時トランスフェクトした。5日後、上清を収集した。この上清は組換えBaculoDirect（商標）ウイルスおよび野生型ウイルスを含んだ。組換えウイルスを、3回〜4回のラウンドのプラーク精製を通して単離および精製した（O'Reillyら、1992）。組換えプラークは、表現型によって野生型から区別することができた（すなわち、組換えプラークはβ-gal+、ポリヘドラ(-)であったのに対して、野生型プラークはβ-gal(-)、ポリヘドラ(+)であった）。
【０５２５】
組換え発現ウイルスの生成
発現ウイルスを、BaculoDirect（商標）DNAと、attL1およびattL2に隣接されるGOIを含むエントリークローンとの間の標準的なLRクロナーゼ反応を実行することによって生成した（図27B、GATEWAY（商標）取り扱い説明書バージョンC、6/02、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）。示されている場合、BaculoDirect（商標）DNAを、lacZ遺伝子の5'末端において切断するAocI（Bsu36Iのアイソシゾマー）を使用して線状化した。反応を直線化してまたは直線化せずに実行した。20μlのLR反応には、300ngのウイルスDNA、100ngのエントリークローン、4μlのLRクロナーゼが含まれ、かつ室温で1時間インキュベートした。200万個のSf21細胞を、6μlのCellfectin（登録商標）（カタログ番号10362-010、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）およびSf900IIを製造業者の指示書に従って使用して完了した種々の量のLR反応物を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの5時間後、トランスフェクション緩衝液を、10％FBSおよび100μMガンシクロビルを含むGrace補充昆虫培地で置き換えた。3〜5日後、上清を収集し、種々の量を使用して、ガンシクロビル選択ありまたはなしで新鮮なSf21細胞に感染させた。
【０５２６】
発現のハイスループット（HTP）スクリーニング
96プレート形式でLR反応およびトランスフェクションを実行するための方法を開発した。図28は、96穴プレートにおけるBaculoDirect（商標）クローニングおよび発現の模式図を提供する。エントリーベクターDNA、希釈したCellfectin（登録商標）、およびSf21細胞を96穴プレート中でアッセイした。構成成分を別々に整列させることによって、バキュロウイルスDNAのピペッティング操作の数を最小化する。第1世代のトランスフェクションからの発現スクリーニング後、関心対象のタンパク質の発現を示すウェルのみがさらに処理される必要がある。
【０５２７】
3枚の96穴プレートがこの実験に必要であった。プレートAにおいて、10μlのLR反応を個々のウェル中で集合し、複数のウェル中に整列された5つの異なるエントリープラスミドを用いて開始した。使用したエントリークローンは以下であった。pENTR APO/V5-His（アポリポタンパク質）pENTR CAL/V5-His（カルモジュリン）、pENTR GUS、pENTR lacZ、およびpENTR CAT。各10μl反応には、50ngエントリークローン、150ng精製線状BaculoDirect（商標）DNA、2μl LRクロナーゼ緩衝液、および2μl LRクロナーゼが含まれた。LR反応をプレート中で、室温で1時間インキュベートした。LRインキュベーションの間、Sf21細胞をウェルあたり4.8×104細胞で別々のプレートに播種し、プレートB中で脱離させた。プレートC中で、2μlのCellfectin（登録商標）をGrace培地でウェルあたり40μlに希釈した。LR反応の1時間後、40μlのGrace補充培地をプレートAの各ウェルに加えた。プレートCからの40μlのCellfectin（登録商標）混合物を希釈したLR反応物に加え、27℃で30-45分間インキュベートした。このインキュベーション後、150μlのGrace非補充培地をプレートAのウェルに加えた。プレートB中の細胞をGrace培地で2回洗浄し、次いでプレートAからの種々の量のトランスフェクション混液で置換した。プレートBを27℃で5時間インキュベートし、次いでトランスフェクション混液を除去し、100μMガンシクロビルを有するGrace完全培地で置換した。細胞を3-4日間増殖させた。各ウェルからの上清を別々のプレートに移した。プレートA中に残存している細胞を100μl LDS溶解緩衝液を用いてインサイチューで溶解し、80℃で5分間加熱した。アポリポタンパク質が分泌されたので、15μlの上清4×試料緩衝液中で変性させた。タンパク質試料をSDS-PAGEゲル上で分離し、PVDFに転写し、かつウェスタンブロットによって可視化した。
【０５２８】
ウイルス力価の見積もり
ウイルス力価を2つの方法を使用して見積もった。ウイルスプラークアッセイ法を、当技術分野で周知の技術を使用して実行した（例えば、Bac to Bacバキュロウイルス（Baculovirus）発現システムマニュアル、カタログ番号10359-016、バージョンC、27頁、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）。各ウイルスのアポリポタンパク質発現バージョンを使用するP1およびウイルス上清（P1ストックから感染）を、10-1から10-8まで10倍で段階希釈し、6穴プレート中で200万細胞を感染させるために使用した。組換えプラークを計数し、各プレートについて希釈係数に基づいて力価を見積もった。
【０５２９】
TCID50（組織培養感染性用量）測定を記載されるように行った（O'Reillyら、1992）。手短に述べると、96穴プレートにウェルあたり4.8×104Sf21細胞を播種した。P1ストックまたはウイルス上清は上記と同様であった。マルチチャンネルピペッターを使用してウェルあたり10μl、希釈あたり12ウェルに各希釈物を加えた。TCID50を、O'Reillyら、1992に記載されるようにエクセル（マイクロソフト）スプレッドシートを使用して計算した。
【０５３０】
結果
BaculoDirect（商標）DNAを使用する最適化またはLRクロナーゼ反応
BaculoDirect（商標）DNAはGATEWAY（商標）デスティネーションベクターの機能的等価物である。細菌（例えば大腸菌）における使用のために設計されたGATEWAY（商標）デスティネーションベクターは、attR部位によって結合されたccdB遺伝子およびクロラムフェニコール耐性マーカーを含む対抗選択カセットを含む。エントリークローンを含むattLとデスティネーションプラスミドとの間の組換えは、ccdB遺伝子およびChl(r)マーカーを関心対象の遺伝子で置き換えて、attB部位によって結合された発現クローンを産生する。この選択スキームは昆虫細胞においては作用しない。バキュロウイルスを用いる使用のための対抗選択カセットを作製するために、野生型バキュロウイルスDNAを、attR部位によって結合される、ヘルペスウイルスTK遺伝子（HSV tk）およびlacZ遺伝子（両方ともバキュロウイルスプロモーターの制御下にある）を含むカセットを用いて操作した（図27A）。attRカセットをポリヘドリンプロモーターのすぐ下流に配置した。「デスティネーションウイルス」とエントリークローンとの間の組換えは、対抗選択カセットをポリヘドリンプロモーター制御下のGOIで置き換える（図27B）。得られるDNAのトランスフェクションは、組換えウイルスおよび存在する親のウイルスの両方での混合バキュロウイルス感染を生み出す。親のウイルスの複製は、ガンシクロビルの存在下で細胞を増殖させることによって妨害され、これは、HSV tk遺伝子によってDNA複製の毒性インヒビターに代謝される（Godeauら、1992、Nucl. Acads Res. 20:6239-6246）。親のウイルスによって感染された細胞はまた、感染した細胞を染色することによってアッセイされ得るlacZ遺伝子を発現し、ウイルス感染の純度を調べるための方法を提供する。
【０５３１】
LR反応が3-4kbエントリークローンと140kbBaculoDirect（商標）ウイルスDNAとの間で働くか否かを試験するために、メリチンBaculoDirect（商標）とGFPエントリークローンとの間のLR反応を実行した。GFP発現はトランスフェクション後48時間までの初期に蛍光によって明確に目に見え、および72時間ではより強く、このことはLR反応が成功しており、およびGFPがポリヘドリンプロモーターの制御下に配置されたことを実証した。次いで、トランスフェクション、感染、および選択の条件を最適化して、GFP蛍光およびβ-ガラクトシダーゼ染色によって示されるような、残渣の親のウイルスから生じるバックグラウンドを最小化した。
【０５３２】
線状および環状のBaculoDirect（商標）DNAを比較した。従って、標準的LR反応を、線状または環状（切断していない）のメリチンBaculoDirect（商標）DNAを用いて、ガンシクロビル選択なしで実行した。10μl、20μl、または30μlのLR反応を使用してSf21細胞をトランスフェクトした（20μlトランスフェクションからの結果のみを図29に示す）。3日後、各トランスフェクションからの種々の量の上清（「第1世代」からのP1ストック）を使用して新しいSf21細胞を感染させた。4日後、感染した細胞をGFP蛍光について試験し、次いで、β-ガラクトシダーゼ活性について染色した。これらの細胞は「第2世代」からであり、これらからの上清は小スケール力価ストックである（以下の力価データを参照されたい）。すべての処理における実質的にすべての細胞は蛍光性であり、このことは、生産的なバキュロウイルス感染が確立されたこと、およびウイルスは活性にGFPを発現していたことを実証した。図29は、BaculoDirect（商標）DNAのメリチンバージョンからのLR反応産物を用いてトランスフェクトした細胞の分析の結果を示す。メリチンBaculoDirect（商標）DNA間のLR反応を、AocI切断したかまたは環状のウイルスDNAおよびGFPエントリークローンを用いて実行した。Sf21細胞を、10μl、20μl、または30μlの各LR反応を用いて、示されるような線状ウイルスDNAまたは環状ウイルスDNAのいずれかを使用して、GCV選択なしでトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの72時間後に蛍光およびβ-Gal染色によって試験した。20μlのLR反応からここに示される結果が代表的であった。ある程度のβ-Gal陽性細胞が試験されたあらゆるウェルに見い出された。β-ガラクトシダーゼ活性（すなわち、バックグラウンド）は、線状化されたBaculoDirect（商標）DNAよりも、環状のそれを使用したLR反応を用いてトランスフェクトされた細胞に由来するP1ウイルスで感染された細胞においてはるかにより高かった（図29、上のパネル）。バックグラウンドは、線状化されたBaculoDirect（商標）DNAを用いるLR反応に由来するP1ストックで細胞が感染された場合には、はるかにより低かったが、より多くのP1ストックが感染のために使用された場合にはある程度のバックグラウンドが検出された（図29、下のパネル）。
【０５３３】
次いで、ガンシクロビルの効果を、ガンシクロビルの存在下および非存在下で細胞を増殖させることによって試験した。LR反応を、上記のように、環状または線状化したメリチンBaculoDirect（商標）DNAを用いて実行した。Sf21細胞を、種々の量のLR反応を用いてトランスフェクトし、次いでGCVなしで増殖させた（第1世代）。72時間後、各トランスフェクションから得られた種々の量のP1ストックを使用して新しいSf21細胞を感染させ、ここで100μM GCVの存在下で増殖させた。4日後（第2世代）、細胞を、GFP蛍光について試験し、およびβ-ガラクトシダーゼについて染色した。GCVは、感染が環状ウイルスを使用するLR反応に由来した場合に、β-ガラクトシダーゼ活性について陽性に染色した細胞の数を認知可能に減少しなかったのに対して、GCVは、線状化ウイルスを使用したLR反応に由来する感染からのβ-Gal陽性細胞の数を減少した。
【０５３４】
第1世代、第2世代、または両方の世代の間に使用された場合の、バックグラウンドを除去する際のガンシクロビルの有効性を試験した。ガンシクロビルが、第1世代または第2世代において使用された場合には、少なくともある程度の青色細胞が第2世代の後に観察された。一般的に、より多くのLR反応がトランスフェクトされた場合に、より多くのバックグラウンドが見い出された。しかし、ガンシクロビルが両方の世代において使用された場合に、青色細胞は見い出されなかった。このことは、2回のラウンドのガンシクロビル選択後には親のウイルスによって感染した細胞が存在しなかったことを示唆する。さらに、トランスフェクションの間に使用されたLR反応の量がいかに多いかに関係なく、バックグラウンドは見い出されなかった。これらの実験からの代表的な結果を図30に示す。図30において示される実験において、細胞は、上記のように両方の世代の間にトランスフェクトおよび選択された。第2世代の後で、細胞を写真撮影して、選択プロトコール後の代表的な結果を例証した。実質的にすべての細胞がGFPを産生していたが、GCV選択が両方の世代の間に維持された場合には細胞はβ-Gal陽性に染色されなかった。従って、親のウイルスはこれらの細胞においては複製していない。これらの結果は、血清中で増殖した細胞を用いて得られた。同じ結果は、無血清適合Sf21細胞が増殖され、無血清培地中でGCVを用いて選択された場合に見い出された。同様の結果は線状化したV5/Hisウイルスを使用して引き続き見い出された。
【０５３５】
ハイスループットスクリーニング発現
細菌中でのプラーク精製または選択なしでバキュロウイルスから遺伝子をクローニングおよび発現する能力は、BaculoDirect（商標）が発現のハイスループットスクリーニングのために便利に使用され得ることを示唆する。5つのpENTRクローンを発現のために選択した（CAT、GUS、LacZ、アポリポタンパク質/V5-His、およびカルモジュリン/V5-His）。各pENTR DNAを、図28において図示されるように96穴プレートの複数ウェル中に整列させた。LRクロナーゼ反応混液を、材料と方法において記載されるように、線状V5/His BaculoDirect（商標）DNAを使用して、加えた。すべての操作は、マルチチャンネルまたはリピーティングピペッターを使用し、従って、これはまたロボット使用で実行され得る。第1世代の間のガンシクロビル選択後、各ウイルスからの発現をウェスタンブロットによってアッセイした。5つすべての遺伝子が、容易に検出されるのに十分なレベルで発現した（図31）。上清を別個の96穴プレートに保存し、第2のラウンドの感染および選択のために使用可能であった。
【０５３６】
図31は、96穴プレート中で実行されたLR反応からのタンパク質発現のスクリーニングの結果を示す。示されたpENTR DNAを96穴プレート中に整列させ、かつLR反応を上記のように実行した。上清を別個のプレートに取り出し、次いで100μlのLDS試料緩衝液を使用して細胞を溶解した。レーンあたり15μlの溶解物を、アポリポタンパク質（これは分泌された）以外、適用した。アポリポタンパク質については、11μlの上清を細胞溶解物の代わりに使用した。ブロットを、1:5000の抗V5:AP結合体を用いて可視化し、15秒間フィルムに露出した。
【０５３７】
力価比較
2つの方法を使用して、Bac to Bac（商標）またはBac-n-blue（商標）を用いてBaculoDirect（商標）から得られたウイルス力価を比較した。アポリポタンパク質をpBlueBac 4.5/V5-Hisにクローニングし、かつ周知の技術（例えば、Bac-n-blue（商標）マニュアル、カタログ番号K855-01、バージョンM、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用して、線状Bac-n-blue DNAとともにこれをSf21に同時トランスフェクトした。1ラウンドのプラーク精製後、高力価ストックを作製した。全体のアポリポタンパク質/V5-HisリーディングフレームをpFastBacにクローニングし、バクミドDNAを標準的な技術（例えば、Bac to Bac（商標）マニュアル、カタログ番号11827-011、11806-015、11804-010、および11807-03、バージョンC、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用して生成した。バクミドDNAをSf21細胞にトランスフェクトし、かつ高力価ストックを作製した。アポリポタンパク質/V5-HisリーディングフレームもまたpENTRにクローニングし、かつLR反応において、線状化したV5-His BaculoDirect（商標）DNAに移した。力価を、トランスフェクションおよび感染の後に、プラークアッセイ法およびTCID50法を使用して測定した。感染後に得られた力価は、いずれかの方法を使用して、3つすべてのバキュロウイルス発現系についても同様であり、3×108〜7×108pfu/mlの範囲であった（図32）。108pfu/mlはバキュロウイルスについて典型的な力価であり、従って、BaculoDirect（商標）バキュロウイルスは他の系において使用されるバキュロウイルスと同様に複製する。
【０５３８】
図32は、プラークアッセイ法およびTCID50測定を使用するウイルス力価の見積もりを示す。アポリポタンパク質をpENTR、pFASTBAC、またはpBlueBac 4.5/V5-His（カタログ番号V207520、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）にクローニングした。MaxBacおよびBac to Bacのための手順は、それらのそれぞれの取扱説明書において記載されているものに従った。第2世代の上清からのP1またはウイルスストックの希釈を段階希釈し、寒天重層のため（プラーク精製）または96穴プレートにおいて（TCID50）細胞を感染させるために使用した。BaculoDirect（商標）については、細胞を両方の世代のために100μM ガンシクロビル上で選択した。力価を記載されるように計算した（O'Reillyら、1992）。
【０５３９】
考察
BaculoDirect（商標）は、機能的にはバキュロウイルスゲノムのGATEWAY（商標）適合である。λに基づく組換えは、バキュロウイルスゲノム中で操作されたattR部位と、エントリークローン中のGOI周辺のattL部位との間で起こる。LRクロナーゼ反応後、バキュロウイルスプロモーターによって駆動され、かつバキュロウイルス上でattR部位によって各側で結合されるHSV tk遺伝子およびlacZを含む対抗選択カセットは、エントリークローンからのGOIによって置き換えられる。これは、ウイルスDNAの再環状化を生じる。親のウイルスの複製は、それが線状のままであること、およびtk遺伝子産物がガンシクロビルの存在下でDNA複製を妨害することの両方の理由により妨害される。線状化は親のウイルスの複製を妨害する際に高度に有効であった（図29）。LR反応が環状ウイルスを用いて実行された場合に、実質的にすべての細胞がトランスフェクションおよびガンシクロビル選択の後でβ-Galを発現したのに対して、線状ウイルスの使用は95％より高く促進された（図29）。
【０５４０】
対抗選択カセットにおけるlacZの存在は、ウイルスストックの純度を判断する手段を提供する。なぜなら、β-Gal細胞染色の非存在は、ウイルスストックが夾雑する親のウイルスを含まないことの良好な指標であるからである。
【０５４１】
文脈に依存して、attB2部位は、時折、C末端V5エピトープタグからの発現および/または検出のための問題を引き起こし得る。図31において、APOおよびCALは内部attB2部位なしでクローニングされたのに対して、残りの3つの遺伝子はその遺伝子とV5-Hisタグとの間の内部attB2部位を用いてクローニングされた。APOおよびCALについて使用されるエントリークローンはコードされたC末端V5-Hisを有した。CAL以外のすべての遺伝子は発現されたように見え、高レベルで検出された（図31）。CALは大部分の実験においてより低いレベルで発現する傾向があることが観察された。リーディングフレームの内部にattB2を有するかまたは有しないGUSを発現するBaculoDirect（商標）ウイルスが構築された。GUS発現は両方のバージョンについて等しく良好に検出された。このことは、attB2部位が、それがBaculoDirect（商標）において使用される文脈においてV5タグからの発現または検出を妨害するように見えないことを示唆する。
【０５４２】
GATEWAY（商標）カセットの付加、ポリヘドリン遺伝子座におけるattBの存在、またはガンシクロビル選択は、他のバキュロウイルス発現系と比較した場合に、ウイルス力価に影響を与えないようであった（図32）。108pfu/mlを超える力価は、第2世代のウイルス感染後に日常的に得られた。ガンシクロビルでの選択後に得られたウイルスストックは実質的に純粋であることが見い出されたので（β-Gal陽性であった感染細胞の欠如に基づく）、この段階で得られたウイルス上清はプラーク精製を必要とせず、および高力価ストックの製造のためにスケールアップされ得る。LRクローニングから純粋なウイルスストックまでの全体のプロセスは、96穴プレート中で同時に複数の遺伝子について実行され得る。現在の方法論は5種の遺伝子のみを使用して例証されてきたが、当業者は任意の数の遺伝子（例えば、20、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000など）が同様の様式において処理され得ることを認識する。本発明の方法は、わずか3日後に発現のためのスクリーニングを可能にし、かつ継続する選択およびスケールアップは、所望のタンパク質産物を発現するウェルのみに焦点を当てることができる。
【０５４３】
図33は、BaculoDirect（商標）とBac to Bacとの間での、発現試験およびウイルス精製のために必要とされる時間の比較を示す。工程間の矢印の次の数字は累積の労働時間（時間で）である。発生順の経過した時間を日数で示す。両方の系について共通である手順を等しい時間で示した（例えば、トランスフェクションのために2時間、発現試験のために4時間）。
【０５４４】
他のバキュロウイルス発現系と比較すると、本明細書中に記載された方法（例えば、BaculoDirect（商標））は、はるかにより少ない手間のかかる時間を必要とし、かつ経時的により迅速である。例えば、Bac to Bac（商標）は精製されたウイルスストックを得るために10日間、および17時間までの実際の労働を必要とする（図33）。これは、Bac to Bac（商標）を用いて得られたP1ストックがプラーク精製を必要としないと仮定している。実際には、当業者は、プラーク精製なしで純粋なストックを得ることに困難を有する可能性がある。結果として、プラーク形成は、現在、Bac to Bac（商標）ユーザーに奨励されている。MaxBaxバキュロウイルス発現系は、昆虫細胞中での相同組換えに頼っており、かつ他の方法と同様に、相同組換えを使用することは、プラーク形成ならびにより一層の経時的な時間および労働でさえも必要とする。対照的に、BaculoDirect（商標）は、高力価ストックの製造のために適切な精製されたウイルスストックを得るために、6日間にわたる8時間のみの労働を必要とする。
【０５４５】
要約すると、組換えクローニング方法における使用のために適合されたクローン（例えば、GATEWAY（商標）法のために適合されたpENTRクローン）のコレクションを有する当業者は、本発明のバキュロウイルス発現系において、単純なプロトコールを使用して、および同時並行反応において、迅速に関心対象の遺伝子をクローニングおよび発現することができる。
【０５４６】
本発明の組換えバキュロウイルスの産生のための適切なプロトコールは以下の通りである。
【０５４７】
材料：
対数増殖において増殖しているSf9細胞またはSf21細胞；線状BaculoDirectウイルスDNA；L1/L2エントリークローン（例えば、pENTR CAT）にクローニングされたGOI；LRクロナーゼ緩衝液；LRクロナーゼ；および塩化ガンシクロビル（水中100mM溶液）。
【０５４８】
関心対象の配列をL1/L2エントリーベクターにクローニングし得る。適切な細胞（例えば、Sf9細胞またはSf21細胞）を推奨される密度で配置し得る（例えば、Guide to Baculovirus Expression Systems and Insect Cell Culture、カタログ番号10359016、10360014、10608016、1182701、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA、2002年2月27日）。HighFiveは、これらが低い感染能力/力価を与えるためあまり好ましくない。適切な方法は、200万個のSf21細胞を有する6穴プレートを使用し得る。LR反応は、エントリーベクターとBaculoDirect（商標）線状DNA（GATEWAY（商標）マニュアル）との間で、100ngエントリーベクターおよび300ng線状BaculoDirect（商標）DNAを使用して実行し得る。室温で1時間置く。LR反応のアリコート（例えば、10μl）を細胞にトランスフェクトさせ得る（例えば、Cellfectin（登録商標）プロトコール）。トランスフェクション培地を、100μMガンシクロビルで補充した選択の培地で置き換え得る。72時間後、トランスフェクトされた細胞からの上清のアリコート（例えば、10μl）を、増殖培地中の100μMガンシクロビルを有する新鮮な細胞のウェルに加え得る。タンパク質発現を、ウェスタンブロッティングによってこの時点で調べ得る。72時間後、上清を収集し得る（例えば、滅菌チュ−ブ中に）。推奨するもの：β-Gal染色キットを用いて細胞を染色する。ウイルスは標準的なプロトコールによって増幅され得る。
【０５４９】
実施例9
いくつかの態様において、本発明は、構築のための材料および方法、ならびに組換えレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）の使用を提供する。本発明はレンチウイルスを使用して例示されるが、任意の他の型のレトロウイルスが本発明を実施するために類似の様式で使用され得る。組換えレンチウイルスの構築のための市販の系は、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であるViraPower（商標）レンチウイルス（Lentiviral）発現システムである。ViraPower（商標）システムは、分裂している真核細胞および分裂していない真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）における高レベル発現のためのレトロウイルス系を提供する。Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能である製品の例には、ViraPower（商標）Lentiviral Directonal TOPO（登録商標）発現キットカタログ番号K4950-00、ViraPower（商標）Lentiviral GATEWAY（商標）発現キットカタログ番号K4960-00、およびVitaPower（商標）レンチウイルス補助キット（Lentiviral Support Kit）カタログ番号K4970-00が含まれる。
【０５５０】
本発明は、当業者が、関心対象の1つまたは複数の配列（例えば、遺伝子）を送達および発現するために、複製無能力レンチウイルスを作製することを可能にする。これらのウイルス（大まかにHIV-1に基づく）は、分裂している真核細胞および分裂していない真核細胞（培養中でまたはインビボで）有効に形質導入され得、従って、従来のモロニー（MLV）に基づくレトロウイルス系のもの（Clontech、Stratageneなど）を超えて、適用の可能性を広げる。指向性のTOPOおよびGATEWAY（商標）レンチウイルスベクターが、所望される場合、V5エピトープを伴う関心対象の1つまたは複数の遺伝子をクローニングするために作製された。このベクターはまた、形質導入された細胞の選択を可能にするためのブラスチシジン耐性遺伝子（bsd）を有する。さらなる修飾なしで、これらのベクターは〜6kbの外来遺伝子までに理論的には適応し得る。3つのスーパーコイルパッケージングプラスミド（gag/pol、rev、およびVSV-Gエンベロープ）が、ヘルパー機能およびウイルスタンパク質をトランスで供給することが提供される。最終的に、高力価ウイルスの産生を容易にする最適化された産生細胞株（293FT）が提供される。レンチウイルスゲノムのすべてまたは一部を含む核酸分子の産生の模式図は図35に示される。レンチウイルスゲノムのすべてまたは一部を含む核酸分子の産生におけるGATEWAY（商標）およびトポイソメラーゼクローニングを用いる使用のために適合されたベクターのプラスミドマップは、それぞれ、図36A（pLenti6/V5-DEST）、36B（pLenti6/V5-TOPO（登録商標））、36C（pLenti4/V5-DEST）、および36D（pLenti6/UbC/V5-DEST）に示される。プラスミドのヌクレオチド配列は表17-20において提供される。3つのパッケージングプラスミドpLP1、pLP2、およびpLP/VSVGのプラスミドマップは、それぞれ、図37A、37B、および37Cにおいて示され、これらのプラスミドのヌクレオチド配列は、それぞれ、表21、22、および23に提供される。
【０５５１】
レトロウイルスは、それらのゲノムを逆転写し、および標的細胞の染色体にDNAコピーを組換えるRNAウイルスである。レトロウイルスパッケージングタンパク質（gag、pol、およびenv）がトランスで供給され、従って、関心対象の遺伝子を安定に送達し得る複製無能力ウイルス粒子の作製を可能にすることが発見された。これらのレトロウイルスベクターは、何年もの間遺伝子送達のために使用可能であった（Millerら（1989）Biotechniques 7:980-990）。レトロウイルスに基づく送達の1つの顕著な利点は、関心対象の遺伝子が非常に高い効率で、宿主のゲノムに安定に組み込まれることである。さらに、ウイルス遺伝子はこれらの組換えベクター中では発現されず、これらをインビボおよびインビトロの両方で使用することを安全にする。しかし、従来のモロニーに基づくレトロウイルスの主要な欠点の1つは、標的細胞が、核輸送および安定な組み込みが起こるために1回の細胞分裂を受けなければならないことである。従来のレトロウイルスは、それらが宿主ゲノムDNAに接近し得る前に、有糸分裂の間に宿主細胞核膜が分解することを待たなければならない（Millerら（1990）Mol. Cell. Biol. 10: 4239-42）。
【０５５２】
従来のレトロウイルスとは異なり、HIV（「レンチウイルス」として分類される）は、分裂していない細胞の核に活性に移入される（Lewisら（1994）J. Virol. 68:510-516）。HIVはなお、基本的なレトロウイルス生活環を通過する（RNAが宿主細胞に逆転写され、宿主ゲノムに組み込まれる）。しかし、シス作用性エレメントは活性な核移入を容易にし、HIVが分裂していない細胞に安定に感染することを可能にする（概説としては、Buchschacherら（2000）Blood 95:2499-2504、Naldiniら（1999）「The Development of Human Gene Therapy」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、47-60頁を参照されたい）。レンチウイルスおよび従来のレトロウイルスの両方について、ウイルスRNAゲノムが逆転写されかつ宿主ゲノムに組み込まれた後まで、遺伝子発現が起こらないことに注意することは重要である。
【０５５３】
他のレトロウイルス発現系と同様に、HIVのパッケージング機能はトランスで供給され得、遺伝子送達のためのレンチウイルスベクターの作製を可能にする。除去されるすべてのタンパク質を用いて、遺伝子送達ベクターは使用することが安全になり、および外来性DNAが効率的にパッケージングされることを可能にする。さらに、レンチウイルス（または他のレトロウイルス）エンベロープタンパク質がより広い向性を有するものに置換され得ることが示されてきた。エンベロープの置換はシュードタイピング（pseudotyping）と呼ばれ、これは、レンチウイルスベクターの作製が、CD4+細胞のみに加えて広範な種々の細胞に感染可能にすることを可能にする。多くの研究者が、水疱性口内炎ウイルス（VSV-G）からのGタンパク質は、ウイルスに非常にクローニング版な宿主範囲を付与する、優秀なシュードタイピングエンベロープタンパク質であることを見い出してきた（Yeeら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9564-9568）。広範な分裂していない細胞に感染するシュードタイピングを受けたレンチウイルスの能力は、動物の遺伝子送達および遺伝子治療におけるその広範な使用をもたらした（Baekら（2001）Hum Gene Ther 12:1551-8、Parkら（2000）Mol Ther 4:164-73、Pengら（2001）Gene Ther 8:1456-63）。
【０５５４】
材料および方法
ベクター構築
レンチウイルスベクター材料をCell Genesysから受領し（Foster City, CA、米国特許第5,686,279号；同第5,834,256号；同第5,858,740号；同第5,994,136号；同第6,013,516号；同第6,051,427号；同第6,165,782号；および同第6,218,187号、ならびにDullら（1998）J. Virol. 72(11):8463-8471を参照されたい）、かつ標準的な技術を使用して、ブラスチシジン発現カセットおよびV5エピトープタグを組み入れるように改変し、pRRL6/V5（pLenti6/V5とも呼ばれる）を作製した。pRRL6/V5のヌクレオチド配列は表36に提供される。GATEWAY（商標）デスティネーションベクターpLenti6/V5-DESTを作製するために、Destination Vector ConversionカセットB（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能、カタログ番号11828-019）をpRRL6/V5にライゲーションした。このデスティネーションベクターを、完全性を維持するためにDB3.1細菌中でアンピシリン（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（15μg/ml）の存在下で増殖させた。本発明のこの局面の1つの代替において、カセット中のクロラムフェニコール耐性遺伝子はスペクチノマイシン耐性遺伝子（Hollingsheadら、Plasmid 13(1):17-30 (1985)を参照されたい、NCBIアクセッション番号X02340 M10241）によって置き換えられ得、かつccdB遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子に隣接するattP部位を含むデスティネーションベクターがアンピシリン/スペクチノマイシン含有培地上で選択され得る。クロラムフェニコール選択の代わりのスペクチノマイシン選択の使用は選択プレート上で得られるコロニーの数の増加を生じ、これはスペクチノマイシン耐性遺伝子の使用が、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むカセットを使用して観察されたものよりもクローニングの効率の増加をもたらし得ることが、最近見い出されてきた。
【０５５５】
対照モロニーレトロウイルスベクターprKAT6/V5-DESTを作製するために、prKat（Cell Genesys）をBamHIで消化し、Klenowでフィルインした。これを、pLenti6/V5-DESTのSpeIおよびAcc65Iを用いる消化、続いてKlenowフィルインおよびゲル精製から得られた、DESTカセットおよびSV40-BsdRカセットを含む2732bp断片にライゲーションした。このデスティネーションベクターを、DB3.1細菌中で、完全性を維持するためにDB3.1細菌中でアンピシリン（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（15μg/ml）の存在下で増殖させた。本発明のこの局面の1つの代替において、カセット中のクロラムフェニコール耐性遺伝子はスペクチノマイシン耐性遺伝子（Hollingsheadら、Plasmid 13(1):17-30 (1985)を参照されたい、NCBIアクセッション番号X02340 M10241）によって置き換えられ得、かつccdB遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子に隣接するattP部位を含むデスティネーションベクターがアンピシリン/スペクチノマイシン含有培地上で選択され得る。クロラムフェニコール選択の代わりのスペクチノマイシン選択の使用は選択プレート上で得られるコロニーの数の増加を生じ、これはスペクチノマイシン耐性遺伝子の使用が、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むカセットを使用して観察されたものよりもクローニングの効率の増加をもたらし得ることが、最近見い出されてきた。
【０５５６】
発現対照ベクターpLenti6/V5-GW/lacZおよびコグネートモロニーレトロウイルス対照ベクターprKAT/V5-GW/lacZを作製するために、GATEWAY（商標）LR反応を、DESTベクターおよび終止コドンを有しないlacZ遺伝子のコピーを有するエントリーベクターを用いて、製造業者のプロトコールに従って実行した。
【０５５７】
指向性TOPO適合
pRRL6/V5ベクターを、完全性を維持するためおよびTOPO適合におけるバックグラウンドを減少させるために、アンピシリン（100μg/ml）およびブラスチシジン（10μg/ml）中で増殖させた。pRRL6/V5ベクターは、EcoRI（5'末端）部位およびXhoI（3'末端）部位に指向性にTOPO適合された。EcoRI緩衝液（New England Biolabs, Beverly, MA）を消化の全体にわたって使用した。ベクターを最初に3時間XhoIで酵素6ユニット/DNAμgにて消化し、その後、3時間EcoRIで酵素4ユニット/DNAμgにて消化した。消化したDNAを、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（PCA）抽出、エタノール沈殿、80％エタノール洗浄によって精製し、続いてイソプロパノール沈殿、ならびに、酵素およびEcoRI部位とXhoI部位との間の〜30bpのマルチクローニング部位を除去するための別の80％エタノール洗浄によって精製した。この時点で、切断したDNAの濃度を定量し、10ngをケミカルコンピテントTOP10 大腸菌に形質転換し、切断していないベクター（マルチプルクローニング部位を欠失するように組み換えられたベクター、または両方の制限酵素活性を「回避した」もともとのベクター）の量を評価した。
【０５５８】
指向性適合のために使用されるオリゴヌクレオチドは以下に列挙される：
EcoRI（5'末端）非再生部位
2005532829.tif 000052
XhoI（3'末端）：再生部位
2005532829.tif 000053
【０５５９】
オリゴヌクレオチドを対として使用した：ベクターに対して200倍モル濃度過剰のTopo-D1/D2およびTopo-D6/D7（100μgベクターDNAあたり51μgのTopo-D1/D2および40μgのTopo-D6/D7）。
Topo-D1/D2をそれぞれ2.3対1の重量比で対とした。
Topo-D6/D7をそれぞれ3.7対1の重量比で対とした。
【０５６０】
1μgのベクターDNAあたり50ユニットのT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を一晩のライゲーションにおいて（〜16時間）14℃のウォーターバス中で使用して、アダプターオリゴヌクレオチドをベクターにライゲーションした。引き続いて、試料を67.5℃で15分間加熱し、次いでEcoRIを用いて、2ユニット酵素/μgベクターDNAで1.5時間再消化した。
【０５６１】
遊離のオリゴヌクレオチドを、PCA抽出および修飾したS.N.A.P.カラム精製プロトコールによって以下のようにオリゴヌクレオチド-アダプター化ベクターから精製した。PCA抽出されたDNA（トップアガロース相）を5容量の修飾結合緩衝液（MBB）[60％のS.N.A.P.結合緩衝液；40％の（100％）イソプロパノール]に加え、混合し、かつS.N.A.P.ミニまたはミディ（B）カラムに1回以上戻して再ローディングし、素通り画分をもう一度カラムへ再ローディングした。次いで、カラムをSNAP洗浄緩衝液で2回、最終洗浄緩衝液（EtOH）で1回洗浄し、かつTE（ミニカラムのためには60-100μlおよびミディカラムのためには750μl）中に溶解し、かつpLenti6/V5-D-TOPO（商標）を生じる濃度が分光測定的に決定された（OE260/280）。
【０５６２】
少なくとも50μgのオリゴ適合ベクターを、以下の反応においてワクシニアトポイソメラーゼを用いて「変化させた」（列挙した順番で試薬を加えた）：
キナーゼを用いるTopo充填
2005532829.tif 000054
反応を37℃ウォーターバスで10分間インキュベートし、次いで以下を加える：
2005532829.tif 000055
反応を37℃ウォーターバスで5分間インキュベートし、次いでQカラムに反応物のすべてをローディングする。
【０５６３】
TOPOベクター精製
Qカラム精製を、TOPO充填試料上で、0-1M NaCl（50mM トリス pH 7.5）勾配を用いて、TOPO適合エントリーベクターについて報告されているように実行した。Hoechst色素番号33258（Sigmaカタログ番号B-2883）の存在下でDNA蛍光特徴付けを使用して、精製したTOPO充填ベクターを含む個々のまたはプールした画分の濃度を定量した。一般的に、カラムにローディングした総DNAの約50％が精製の間に失われ、ベクターTOPO複合体は〜500mM NaClにおいて溶出される。等量の2×TOPO-ベクター緩衝液（50mM トリス 7.5、2mM EDTA、2.5mM DTT、0.1mg/ml BSA、0.1％ Triton X 100、90％グリセロール）を試料画分に加える。それゆえに、最終的なTOPOベクター緩衝液=50mM トリス 7.5、1mM EDTA、1.25mM DTT、0.05mg/ml BSA、0.05％ Triton X 100、45％グリセロールである。試料を試験するまで-20℃で保存する。
【０５６４】
標準的なトポゲーション反応は以下のように設定した：
1μl Topo充填ベクター
1μl 指向性挿入断片PCR産物*
1μl 塩溶液または1μl 水
3μl 水
*TOPO充填ベクターに依存して、PCR産物挿入断片は収率を最大化するために調整されるべきである。1ngベクター：1-2ng 750bp挿入断片（または1:10-20、ベクター：挿入断片モル濃度比）が良好な収率を与える。
【０５６５】
トポゲーション反応は、室温で5分間インキュベーションされた。2μlの反応物をTOP10細胞に加え、氷上で〜20分間インキュベートし42℃で40秒間熱ショックを与え、氷上に置き、次いで250μlのSOCを形質転換細胞に加えた。細胞を37℃で1時間振盪し、100μlの細胞混合物を、ブラスチシジン（最終50μg/ml）を含むLB-ampプレート上にプレーティングした。
【０５６６】
細胞培養および増殖制止
293FT産生細胞（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能である、カタログ番号R7007）を、500μg/ml G418を含む、DMEM/10％ FBS/L-グルタミン/非必須アミノ酸/ペニシリン/スペクチノマイシン中で培養した。MJ190初代ヒト包皮線維芽細胞、HT1080ヒト線維肉腫（ATCC番号CCL-121）およびHela頸部癌細胞（ATCC番号CCL-2）を、DMEM/10％ FBS/非必須アミノ酸/ペニシリン/スペクチノマイシン中で培養した。チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO-K1、ATCC番号CCL-61）を、Hams F12/10％ FBS/L-グルタミン/ペニシリン/スペクチノマイシン中で培養した。ブラスチシジン選択のために、以下の最終濃度を使用した：HT1080：10μg/ml、CHO：5μg/ml、HeLa：2μg/ml。
【０５６７】
MJ90初代細胞を接触阻害によって増殖制止させた。手短に述べると、6穴プレートのウェルあたり1×105細胞をプレーティングし、培地の交換を、7〜14日の間3日ごとに、または静止単層が達成されるまで実行した。アフィジコリン（Sigma, St. Louis, MO、カタログ番号A0781）を使用して、G1/S移行でHT1080細胞を制止させた。指数関数的に増殖している培養物を、6穴プレートのウェルあたり2×105細胞でプレーティングし、次の日に、1μg/mlアフィジコリンを含む新鮮な培地を供給した。アフィジコリン制止された細胞の形質導入を、薬物の継続した存在下で実行した。
【０５６８】
初代の、有糸分裂後のラット海馬および皮質の神経細胞組織をBrainBits Inc.から受領した（Greg Brewer博士、 University of Southern Illinois）。組織をパスツールピペットを用いて解離させ、1100rpmで1分間遠心分離し、かつB27補充物（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA、Gibco番号17504-010）、0.5mM L-グルタミン、および25μM グルタミン酸を含むNeuroBasal Medium（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA、Gibco番号21103-049）中に再懸濁した。24穴プレート中のウェルあたり5×104海馬神経細胞または1×105皮質神経細胞をプレーティングした。プレーティングの4日後、培地の半分を取り除き、完全NeuroBasal培地（上記と同様）（しかしグルタミン酸を有しない）で置き換えた。次の日、細胞にウイルスで形質導入した。
【０５６９】
ウイルス産生
最適なウイルス産生のために、100mmプレートあたり5×106 293FT細胞をプレーティングした。24時間後、培地を5mlのOptiMem/10％FBS（Oti-MEM（登録商標）、カタログ番号22600050、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）で置き換え、細胞を以下のように4通りで同時トランスフェクトした。全体で12μgのDNAを、1:1:1:1の重量比のpLenti6/V5/遺伝子：pLP-1：pLP-2：pLP/VSVG（各3μgのDNA）で、1.5mlのOptiMem培地と混合した。別個のチューブ中で、36μlのLipofectamine2000もまた、1.5mlのOptiMem培地と混合した。室温で5分間のインキュベーション時間後、2つの混合物を合わせて室温でさらに20分間インキュベートした。インキュベーション時間の完了時に、トランスフェクション混合物を細胞に滴下して加え、培養プレートを穏やかに旋回させて混合した。次の日、トランスフェクション複合体を完全培地（DMEM、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミン、および非必須アミノ酸）で置換した。トランスフェクションの48時間〜72時間後、ウイルス含有上清を収集し、3000rpmで15分間遠心分離して死滅した細胞を除去し、かつ1mlアリコートで凍結バイアル中に入れた。力価測定を、新鮮な上清（以下を参照されたい）上で実行し、残りのウイルスアリコートを-80℃で保存した。
【０５７０】
ウイルス力価測定および形質導入
細胞へのウイルスのすべての適用を、6μg/mlポリブレン（Sigma, St. Louis, MO、カタログ番号H9268）の存在下で実行し、培地交換を形質導入の12-24時間後に実行した。ウイルスを力価測定するために、6穴プレートにウェルあたり2×105細胞で、形質導入の前日にHT1080を播種した。形質導入されていない対照（偽）として働いた1つのウェルおよび残りの5つのウェルは、各1mlの10-2から10-6までの範囲のウイルス上清の10倍段階希釈を含んだ（以下の実施例を参照されたい）。この希釈物を、細胞を加える前に穏やかな転倒によって混合した（希釈物はボルテックスするべきではない）。6μg/mlのポリブレンを各ウェルに加えた。プレートを混合するために穏やかに旋回させた。次の日、培地を完全培地で置換した。形質導入の48時間後、細胞を、10μg/mlブラスチシジン選択（Invitrogen）下に配置した。10〜12日間の選択後、得られるコロニーをクリスタルバイオレットで染色した。1％のクリスタルバイオレット溶液を10％エタノール溶液中で調製した。各ウェルを2ml PBSで洗浄し、続いて1mlのクリスタルバイオレット溶液で室温で10分間加えた。過剰の色素を2回のPBS洗浄によって除去し、肉眼に見えるコロニーを計数してもともとの上清のウイルス力価を決定した。典型的な例においては、コロニーは10-5希釈および10-6希釈で計数され得る。
【０５７１】
タンパク質分析
全細胞溶解物をNP-40溶解緩衝液（Igepal CA636, Sigma, St. Louis, MO）を使用して調製し、かつタンパク質（20μg/レーン）を4-20％ Novex トリス-グリシンゲル上で分離した。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースに転写した。ウェスタンブロッティングを、Western Breeze化学発光（Chemiluminescence）キット（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用して、抗ラージT抗原マウスモノクローナル抗体（例えば、カタログ番号554149、BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA）、抗lacZウサギポリクローナル抗体（1:5000希釈、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）、または抗V5-マウスモノクローナル抗体（1:2000希釈、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用して実行した。β-ガラクトシダーゼ活性アッセイ法を、製造業者の指示書に従って、Galacto-Light Plusキット（Tropix, Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して実行した。β-ガラクトシダーゼ染色を、β-Gal染色キット（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）を使用して、製造業者の指示書に従って実行した。
【０５７２】
本発明は、レンチウイルスゲノムのすべてまたは一部（例えば、レンチウイルスベクター）を含む核酸分子の容易な構築、産生、および使用を可能にする、産生および発現キットを提供する。本発明の局面には、以下が含まれるがこれらに限定されない：1）有用な選択マーカーおよびエピトープタグを有する、指向性TOPO（登録商標）ベクターおよびGATEWAY（商標）デスティネーションpLenti6/V5ベクター、2）mlあたり>105感染性ウイルス粒子を再現可能に達成する、最適化されたウイルス産生条件および細胞株、3）活動的に分裂している哺乳動物細胞への少なくとも2種の遺伝子の安定な遺伝子送達および発現、ならびに4）少なくとも2種の分裂していない細胞型の形質導入。
【０５７３】
4回のプラスミド同時トランスフェクションを使用して、感染性レンチウイルスベクターを作製する（Dullら（1988）J. Virol. 72:8463-8471）。1種のベクター（pLenti6/V5-DEST、pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）、pLenti4/V5-DEST、またはpLenti6/UbC/V5-DEST）は関心対象の遺伝子を含み、およびビリオンにパッケージングされる（ベクターマップについては、図36A-Dを参照されたい）。他の3種のプラスミドは、トランスでウイルスタンパク質を供給するために同時トランスフェクトされる。これらの3種のベクターのいずれもビリオンにパッケージングされない。各ベクターおよびその特徴の記載は以下により詳細に記載される。ベクターマップは図37A、37B、および37Cとして提供される。
【０５７４】
pLenti6/V5-DESTまたはpLenti6/V5-D-TOPOは関心対象の遺伝子およびブラスチシジン耐性遺伝子を有し、ウイルス粒子にパッケージングされる。このベクターはRSVプロモーターを含み、これは、産生細胞中でのウイルスゲノムRNAの産生を増強し、かつHIV tatタンパク質への依存性を除去する。このベクターはまた、ウイルスの5'および3'LTR（長い末端反復配列）を含み、これは、ウイルスパッケージングおよびウイルスRNAの逆転写のために必要とされる。3'LTRはまた、ポリAシグナルを含む。このベクターは、Ψ（プサイ）パッケージングシグナルを含む。revの存在下でのスプライシングされていないウイルスゲノムRNAの核搬出は、ベクター中に存在するRRE（Rev応答性エレメント）の結果として起こる。このベクターはまた、宿主細胞においてもはやrev依存性でない関心対象の遺伝子の発現を生じる、プサイおよびRREの除去を生じる5'および3'スプライシング部位を取り込む。このベクターはまた、形質導入された標的細胞においてウイルスゲノムの逆転写後に5'LTRにコピーされる、3'LTRにおける400bp欠失であるDeltaU3を含む。これは、生物災害管理のための5'LTRの「自己不活性化」を生じる。
【０５７５】
pLP1は、HIV-1のgag遺伝子およびpol遺伝子をトランスで発現し、この系を用いて産生されたウイルス粒子にはパッケージングされない。このプラスミドは、gag/pol遺伝子の発現をrev依存性にするRREを含む（安全性目的のため）。
【０５７６】
pLP2は、HIV-1のrev遺伝子をpLP1と同様にトランスで発現し、ウイルス粒子にはパッケージングされない。このプラスミドは、gag/pol発現のために必要であり、およびビリオンへのパッケージングのための、スプライシングされていないウイルスゲノム（pLenti6/v5-DESTまたはD-TOPO（登録商標）由来）の核搬出のために必要であるrevタンパク質をコードする。
【０５７７】
pLP/VSVGは、VSV-Gエンベロープ遺伝子をトランスで発現する。このプラスミドはウイルス粒子にパッケージングされないが、VSV-Gタンパク質はウイルス粒子に組み込まれる。VSV-Gは、宿主範囲を広げかつウイルス粒子を安定化する非HIVエンベロープである（Yee 1994）。
【０５７８】
結果および考察
ベクター構築
ベクターpRRLsin.hCMV.GFPpreを、Cell Genesysからの出発物質として使用した。このベクターはレンチウイルスパッケージングのための必須の構成要素を含む（例えば、5'および3'LTR、プサイパッケージングシグナル、rev応答性エレメント（RRE）、および必要なスプライシング部位；記載については上記を参照されたい）。さらに、これは、標的細胞のゲノムへのウイルスゲノムの組み込み後に5'LTRの自己不活性化を生じる3'LTR（「ΔU3」と呼ばれる）における欠失を含む（Dull 1998、Zuffereyら（1998）J. Virol. 72:9873-80）。これは、さらなる安全性の尺度であり（以下の「安全性」の節を参照されたい）、ベクターの性能に対しては効果を有しない。なぜなら、5'LTRがウイルス産生の間に必要とされるのみであり、標的細胞における遺伝子発現には必要とされないからである（Zufferey 1988）。最後に、すべてのポリアデニル化機能（ポリA）が3'LTRによって供給される。3'LTRはウイルスゲノムのためのポリA（RSV/5'LTRによって駆動される）、CMVプロモーター（関心対象の遺伝子）、およびSV40プロモーター（ブラスチシジン耐性）として働く。異種ポリAシグナルはこれまでLTR間に含められるべきであったか、またはウイルス産生は、3'LTRの前の転写終結に起因して厳しく損なわれる。pLenti6/V5ベクターにおける下流のSV40ポリAは、産生細胞中でウイルスゲノムRNA産生を増強し、およびビリオンにパッケージングされない。
【０５７９】
TOPO適合および精製
50μgのTOPO充填されたpLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）をQカラムにローディングし、7つの0.5ml画分中の精製されたベクターを含む画分を収集した。ピーク画分（画分41）は、Hoechst（H33258）色素DNA蛍光特徴付けによると〜20μgのDNAを含み、〜500mM NaClで溶出した。この画分のみを分析したが、画分39-45もまたTOPO充填DNAを含んだ。これらの画分を2×TOPO希釈緩衝液中に希釈し、従って画分41は〜20ng/mlの最終濃度のベクターを含んだ。2つの実験（1つは750bp挿入断片を有し、1つはlacZ-αを有する）における画分41を使用するTOPO形質転換の結果は、表24に示される。
【０５８０】
（表２４）pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）形質転換体
2005532829.tif 000056
注記：pUC19を用いる形質転換効率：4008コロニー/10pg＝4.0×108cfu/μg効率
【０５８１】
ベクターの不安定性
ベクターに対して操作を実行するときに、LTR中に存在する182塩基対の直接反復の存在が、TOP10に形質転換されたとき、およびLB-ampにプレーティングされたときに、相同組換えを引き起こしていたことが発見された。これは、目に見えるコロニーの表現型を生じた。LTR組換えが起こったコロニーにおいてクローンは大きかったが、組換えされていない（正しい）クローンは小さなコロニーを生じた。図38は、2つのLR反応がpLenti6/V5-DEST単独またはpLenti/V5-DESTとpENTR/CATのいずれかを用いて実行され、各3μlをTOP10細胞に形質転換した実験の結果を示す。100μlの形質転換体を通常のLB-ampプレート上で（図38におけるBsdなし）または50μg/mlブラスチシジンを含むLB-amp上でプレーティングした。37℃での一晩のインキュベーション後、コロニーを写真撮影し（図38A）、計数した（図38B）。DEST+CATプレート（+/-Bsd）からの24のクローン（2つの独立した実験からの各々12）をランダムに拾い上げ、制限消化によってスクリーニングして正しいクローンの割合を決定した。
【０５８２】
ブラスチシジン耐性（EM7プロモーターによって駆動される）はLTR間に存在するので、細菌プレート上にブラスチシジンを拡散させることは（50μg/mlの最終濃度）、すべて小さなコロニーを生じ、これらのどれもLTR組換え産物を含まなかったことが見い出された（示さず）。このことは、GATEWAY（商標）LR反応が、pENTR-CATプラスミドを含めて、またはそれを含めずにpLenti6/V5-DESTを使用して実行された場合にさらに確認された（図38B）。プレート中にブラスチシジンがないと、バックグラウンドコロニーがDESTベクター単独から生じ、DEST+CATクローンの50％のみが無傷であった。しかし、ブラスチシジンがプレートに含められた場合、DESTベクター単独はバックグラウンドコロニーを与えず、すべてのDEST+CATクローンが正しくかつ無傷であった（図38B）。それゆえに、関心対象の遺伝子をpLenti6/V5ベクターに導入する場合に2つのアプローチのうちの1つが使用されることが推奨される：1）高い効率のクローニング（すなわち、ライブラリースケール）が必要とされない場合、ミニプレップ分析のために小さなコロニーを単に拾い上げる；または2）〜100％正しいクローンを保証するために、形質転換後に細菌プレート中にブラスチシジン（50μg/ml）を含める。一旦クローンが単離され、および無傷であることが示されれば、これはブラスチシジンなしで大規模増殖の多数のラウンドにわたって安定なままであるように見えることが観察された。それでもなお、各DNA調製物は、ウイルス産生に進む前に制限消化によって確認されることが推奨される。
【０５８３】
一過性トランスフェクション発現試験
V5エピトープタグのタンパク質発現および機能性を確認するために、lacZ ORF（終止コドンを伴うかまたは伴わない）をpLenti6/V5-DESTにGATEWAY（商標）クローニングした。得られるattB発現クローンをCOS細胞に一過性にトランスフェクトし、抗β-ガラクトシダーゼおよび抗V5ウェスタンブロッティングによって分析した（図39）。COS-7細胞は以下を用いて一過性にトランスフェクトした：
レーン1：偽；レーン2：pcDNA3.1/V5His/lacZ；レーン3：pLenti6/V5-GW-lacZ（終止なし）；レーン4：pLenti6/V5-GW-lacZ（終止あり）；および、溶解物を、示されるように、抗lacZまたは抗V5ウェスタンブロッティングによって分析した。
【０５８４】
pcDNA3.1/V5His/lacZと比較して、pLenti6/V5-GW/lacZは、V5エピトープタグを伴って、または伴わずに等しく良好に発現した。さらに、lacZ（終止なし）は、効率的に発現されたV5タグ付加融合タンパク質を生じた（レーン3）。このベクターは、発現対照ベクターとして使用され得、本発明のキットに含められ得る。
【０５８５】
ウイルス産生の最適化
以前の報告は、ウイルス産生がSV40ラージT抗原を発現するヒト293細胞において最大であることを示した（Naldiniら（1996）Proc. Natl. Acad. USA 93:11382-11388）。ウイルス産生をいくつかのネオマイシン耐性293FTクローン中で試験した。これらの細胞株は、pCMV/Sport6-T抗原プラスミドを用いて293F細胞を安定にトランスフェクトすることによって作製された。ここで、SV40起点は欠失されていた。293FTクローン番号42は、最大レベルの感染性ウイルスを産生することが見い出された。SV40ラージT抗原の発現をウェスタンブロット分析によって確認し、産生細胞ストックをラージT抗原発現を維持するためにG418中で増殖させた。
【０５８６】
ウイルスの産生は4通りのトランスフェクションを必要とするので、4種のプラスミドの比率の重要性を試験した。公開された報告は、種々の比率が「最適」であり（Dull 1998；Naldini 1996；Mochizukiら（1998）J. Virol. 72:8873-8883）、それゆえに各々公開された比率を評価および単純な1:1:1:1と比較した。単純な1:1:1:1とより精巧な比率（例えば、4:2.6:1:1.4）との間にはわずかな差違が見られた。最も高くかつ最も再現性がある力価は、単純な1:1:1:1の比率を使用して生じた。ウイルスの産生のための最も有効な時間経過を決定した。以下の最適化されたプロトコールに従って種々の遺伝子をpLenti6/V5にクローニングして、ウイルスを293FT細胞中で産生した：
0日目  100mmプレートあたり5×106 293FT細胞をプレーティングする
1日目  4プラスミドの同時トランスフェクション（比率=1:1:1:1）
12μg 全DNA（各3μg）
36μl Lipofectamine 2000
2日目  培地の交換
3-4日目  ウイルスを含む上清を収集する
3000rpm×15分間の遠心分離、および/または0.45μmフィルターを通す
上清をアリコートとし、力価測定のために使用し、-80℃で保存する
【０５８７】
空のベクター（pLenti6/V5-DEST）またはlacZ、GFP、CAT、もしくはプロテインキナーゼCを有するかのいずれかの独立したウイルス産生を、上清mlあたりに生成した得られるブラスチシジン耐性コロニーの数を計数することによってHT1080に対して力価測定し、結果を図40に示す。最適化プロトコールは、293FT細胞の高密度プレーティング（100mmプレートあたり5×106細胞）およびLipofectamine 2000を含む最適な脂質対DNA比を含んだ。ウイルス上清は、トランスフェクション後2日または3日のいずれかで収集され得、ウイルス収量には最小限の差違があることが見い出された。おそらく、37℃の培地中のウイルスの短い半減期が1日の余分の日にわたるウイルスの蓄積のいかなる利点も打ち消している。保存のために、ウイルスストックを-80℃でのアリコートとすることが推奨される。粗上清の各凍結融解サイクルについてウイルス力価の0〜10％までの損失のいずれかが観察された。
【０５８８】
挿入された関心対象の遺伝子のサイズはウイルス力価に影響を与え得る。3種の異なる遺伝子をpLenti6/V5-DESTにGATEWAY（商標）クローニングし（lacZ、CAT、およびプロテインキナーゼC）、1種の遺伝子を指向性にTOPOクローニングした（GFP）。これらの4種の遺伝子含有ベクターと空のベクターpLenti6/V5との間で比較した（図40）。3回の独立した実験からの平均は、空のベクターが最大のウイルス力価（平均1.4×107cfu/ml）を生じたのに対して、最大の挿入断片（lacZ）は最も低い力価（平均4.7×105cfu/ml）を生じたことを示した。中間のサイズの挿入遺伝子（GFP、CAT、およびPKC）は間のどこかの力価を生じた（それぞれ、4×106、9×106、および3×106）。これらのデータは、これらのベクターのGATEWAY（商標）バージョンおよびTOPOバージョンの両方が、大きなlacZ遺伝子を用いる場合においてでさえ、容易に105のウイルス力価を超えるウイルス上清を産生し得ることを示した。野生型HIV-1ゲノムは約10kBであり、pLenti6/V5ベクター中に存在するエレメントは3.7kbまでを加える。それゆえに、理論的な遺伝子パッケージング限界は約6kbである。
【０５８９】
ウイルスの遺伝子送達および発現
レンチウイルスベクターが種々の遺伝子を送達および発現する能力をさらに調べた。HT1080細胞に、pLenti6/V5-GW/lacZウイルス（GATEWAY（商標））またはpLenti6/V5-dT/GFPウイルス（D-TOPO（登録商標））のいずれかを形質導入し、10μg/mlブラスチシジンを用いて10日間選択した。lacZを、β-Gal染色キットを使用して可視化し、およびGFPを、蛍光顕微鏡を使用して可視化した（図41）。GATEWAY（商標）lacZおよびD-TOPO（登録商標）GFPベクターの両方は、安定に形質導入された細胞の異種プールを効率的に生成し、ここではほぼ100％の細胞が異種遺伝子を発現した。HT1080に加えて、HeLa細胞およびCHO細胞が、同様の効率および遺伝子発現のレベルで安定に形質導入された。
【０５９０】
上記の結果を確認するために、および機能的V5エピトープタグが発現されたタンパク質に効率的に加えられたことを確認するために、lacZ、CAT、GFP、またはプロテインキナーゼCのいずれかのウイルスを用いて安定に形質導入されたHT1080細胞から細胞溶解物を調製した（図42）。HT1080細胞を、lacZ、CAT、GFP、またはPKCのいずれかについての遺伝子を有するレンチウイルスベクターを用いて2通りで形質導入し、10μg/mlブラスチシジンで10日間選択した。細胞溶解物を、抗V5ウェスタンブロッティングによって分析した。分子量マーカーおよび各V5融合タンパク質を示す。*はバックグラウンドV5バンドを示す。4つすべてのタンパク質が効率的に発現され、かつすべてが検出可能なV5エピトープに適切に融合される。さらに、プロテインキナーゼCの送達および効率的な発現（「関連する」遺伝子、すなわち、lacZ、GFP、またはCATではない）は、このウイルス産生系の強固さおよび広い適用性を示す。
【０５９１】
MOIと相関する遺伝子発現
理論的には、感染多重度（MOI=細胞あたりのウイルスの数）は、遺伝子送達および発現と相関するはずである。このことを調べるために、HT1080細胞に、2通りで0.05〜1の範囲の種々のMOIで形質導入した（図43）。HT1080細胞に、2通りで、Lenti6/V5-GW/lacZウイルスを用いて、0.05、0.1、0.5、および1の感染多重度（MOI）で形質導入した。48時間後、細胞をβ-Galで染色し（図43A）、または収集しかつβ-Gal活性について分析した（図43B）。β-Gal染色が示すように、MOIが増加するにつれて、増加する数の細胞がlacZ陽性になる。MOIが1では、80％より多い細胞がlacZを発現する。より高いMOIでは（例えば、MOI 5）、100％の細胞が形質導入された。細胞溶解物がlacZ活性について分析された場合、MOIが0.05〜1に増加するにつれて、ほぼ直線状の用量応答が観察された（図43B）。より高いMOIでは（例えば、MOI 5）、lacZ活性は増加し続けるが、グラフは横這いになる傾向がある。
【０５９２】
分裂していない細胞のレンチウイルス形質導入
従来のレトロウイルスを超えるレンチウイルスの鍵となる利点の1つは、これらを分裂していない細胞に安定に形質導入することができることである。このことは、以下を含む、潜在的に形質導入可能な標的細胞に拡張される：1）培養中の増殖-または薬物-制止された細胞、2）分裂していない初代細胞培養物、および3）動物/組織。本発明のレンチウイルスベクターがこれらの条件下で作用し得ることを確認するために、これらを3つの異なるアプローチを使用した。
【０５９３】
薬物制止細胞
培養中で活動的に増殖している細胞は、種々の薬物を使用して細胞周期の特定の相で制止され得る。このアプローチは、細胞周期分析および腫瘍生物学において広範に使用されている。1つの一般的に使用されている薬物、アフィジコリンは、DNAポリメラーゼδに可逆的に結合し、G1/S移行で細胞を制止するために使用される（Sekiら（1980）Biochem Biophys Acta 610:413）。細胞周期制止の条件下での本発明のレンチウイルスベクターの活性を試験するために、アフィジコリン-ブロックされたHT1080細胞にLenti6/V5-GW/lacZウイルスを形質導入した（図44A）。HT1080細胞は、活動的に増殖しているか、またはアフィジコリンによってG1/Sで増殖制止されたかのいずれかであり、および、1のMOIで、2通りで、rKAT6/V6-GW/lacZレトロウイルスまたはLenti6/V5-GW/lacZレンチウイルスのいずれかを用いて形質導入した。形質導入の48時間後、細胞溶解物をβ-ガラクトシダーゼ活性について分析した。対照ウイルスであるrKAT6/V5-GW/lacZウイルスは、同じlacZ遺伝子を有する、従来のモロニーに基づくレトロウイルスである。レトロウイルスおよびレンチウイルスの両方は、活動的に増殖している細胞に形質導入することができるが、レンチウイルスベクターのみが分裂していない培養物に形質導入することができた。
【０５９４】
静止初代細胞
第2のアプローチは、分裂していない初代ヒト細胞にレンチウイルスベクターを適用することであった。少ない継代の初代ヒト包皮線維芽細胞培養（MJ90、Grand Island）を6穴形式でプレーティングし、コンフルエントな状態まで増殖させた。初代線維芽細胞は強く接触阻害され、かつコンフルエント培養として維持された場合には、静止期（G0）に数週間制止されたまま維持され得る。接触阻害された、分裂していない静止初代ヒト包皮線維芽細胞にレトロウイルス（rKAT6/V5-GW/lacZ）およびレンチウイルス（Lentis6/V5-GW/lacZ）を1のMOIで形質導入し、かつ形質導入の24時間後にβ-Gal染色した。アフィジコリン制止細胞における結果と同様に、レンチウイルスベクターのみが分裂していない細胞に形質導入することができた（およびレトロウイルスrKATベクターではできなかった）。静止初代細胞の約50％に、1のMOIを用いて形質導入した（図44）。
【０５９５】
有糸分裂後の初代神経細胞
神経細胞研究は、レンチウイルスベクターが他の遺伝子移入方法を超える有意な利点を提供し得る1つの分野である。神経細胞培養は、一般的には分裂しない、乏しく形質導入される「有糸分裂後」細胞である。従来のモロニーレトロウイルスは、細胞が有糸分裂を通らないために有用ではなかった。レンチウイルスベクターは、これらのハードルを克服するための1つの解決法であり、および本発明のベクターは、これらがこれらの細胞に安定に形質導入し得るか否かを決定するために試験された。最初に、有糸分裂後のラット神経細胞組織（皮質または海馬）をBrainBitsから受領し、次いで、処理およびプレーティングした。プレーティングの4日後、細胞に、1のMOIで、Lenti6/V5-GW/lacZレンチウイルスまたはrKAT6/V5-GW/lacZレトロウイルスのいずれかを用いて形質導入した。形質導入の3日後、培養物をβ-ガラクトシダーゼについて染色した。レンチウイルスベクターで形質導入されたすべてのウェルは青色に染色され、細胞の約50％が検出可能なβ-ガラクトシダーゼを発現した。逆に、rKATレトロウイルスで形質導入されたウェルは、いかなるβ-ガラクトシダーゼ発現も示さなかった。これらの結果は、本発明のレンチウイルスが、皮質または海馬のいずれかの起源の有糸分裂後神経細胞を効果的に形質導入したことを示した。
【０５９６】
レンチウイルスベクターからの長期的遺伝子発現
レンチウイルス形質導入による送達後の遺伝子発現の安定性を試験した。HT1080細胞に、Lenti6/V5-GW/lacZレンチウイルスまたはrKAT6/V5-GW/lacZレトロウイルスのいずれかを用いて形質導入し、10μg/mlブラスチシジンを用いて安定に選択した。培養はブラスチシジン中で維持され、形質導入後10日（図45A）および6週間（図45B）にβ-Gal染色された。培養中6週間にわたって遺伝子発現の損失は観察されなかった。このことは、レンチウイルス遺伝子送達が安定であり、かつ遺伝子発現が形質導入後6週間においてさえ持続していることを示す。
【０５９７】
本発明は、HIV-1のゲノムおよび生活環に基づく感染性レンチウイルス粒子の生成を記載する。相当な努力により、使用することが安全であり、かつ可能な限り野生型HIVから移動されない系を開発した。この「第3世代」系に組み込まれている鍵となる安全性特徴は以下の通りである。
【０５９８】
この系において産生されるウイルス粒子は複製コンピテントでなく、関心対象の遺伝子のみを有する。他のウイルス種は産生されない。このことはまた、構造的HIV遺伝子（ウイルス子孫の産生のために必要）のいずれもがパッケージングされたウイルスゲノムに存在しないことを意味する。ウイルスLTRに隣接する配列のみがビリオンにパッケージングされる（すなわち、pLenti6/V5ベクター）。3種のパッケージングプラスミドのいずれもがLTRを含まず（図37A-C）；従って、それらは産生細胞中で発現されるが、それらはビリオンには決してパッケージングされない。一旦細胞が感染された（この事象についての正確な用語は「形質導入された」である）ならば、送達されかつ発現される遺伝子は、関心対象の遺伝子および選択マーカーのみである。gag遺伝子、pol遺伝子、rev遺伝子、およびエンベロープ遺伝子はウイルスゲノムに存在せず、それゆえに、標的細胞中で決して発現せず、従って新規なウイルスは産生され得ない。
【０５９９】
上記の系は4プラスミド系である。必要なHIV-1遺伝子（gag-polおよびrev）は個々のプラスミドに分離されており、HIVでないエンベロープが第3のプラスミド上にある（図37A-C）。4種すべてのプラスミドが、複製コンピテントウイルスの生成をもたらし得る所望されない組換え事象を妨害するために、互いに相同性のいかなる領域をも含まないように操作されている（Dull 1998）。換言すれば、すべての必要な構成要素を得るためには、多数の非相同性組換え事象が1つのウイルスゲノム中で起こる必要がある。さらに、gagおよびpol（pLP1由来）はrev依存性であり、gag/pol転写物中のRREに基づく。これは、revが存在しない場合に望ましくないgag/pol発現を妨害する（Dull 1998）。他の態様において、本発明の方法に従う複製無能力レトロウイルスの生成のために必要である1つまたは複数の遺伝子（すなわち、gag、pol、rev、およびシュードタイピングエンベロープタンパク質）が宿主細胞のゲノムから発現され得る。従って、いくつかもしくはすべての必要な遺伝子はプラスミドから発現され得るか、またはいくつかもしくはすべての必要な遺伝子は宿主細胞ゲノムから発現され得る。特定の態様において、1つまたは複数の必要な遺伝子は、宿細胞ゲノムから発現され得、かつ宿主細胞ゲノムから発現された少なくとも1つの遺伝子は誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。別の態様において、必要なすべての遺伝子は宿主細胞のゲノムから発現され得、かつ1つまたは複数が誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。1つより多くの遺伝子が誘導性プロモーターに作動可能に連結される場合、その誘導性プロモーターは同じかまたは異なり得る。
【０６００】
遺伝子移入ベクターpLenti6/V5は「自己不活性化」されるように修飾されている（Yuら（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3194-3198、Yeeら（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5197-5201、Zufferey 1998）。欠失が3'LTR中で作製されており（「ΔU3」と呼ばれる）、これは、産生細胞中でのパッケージングのためのウイルスゲノムの生成に効果を有しない。しかし、一旦産生されたウイルスが標的細胞に形質導入されると、逆転写の機構が3'LTRを鋳型として使用して5'LTRを作製する。最終的な結果は、その5'および3'LTRの両方において欠損している組み込まれたウイルスゲノムであり、かつもはやパッケージング可能なウイルスゲノムを産生することができない。このことは、本発明のレンチウイルスベクターを用いる形質導入が生産的な感染を生じず、その代わりに、宿主細胞ゲノムに組み込まれた関心対象の遺伝子で終了することを意味する。
【０６０１】
これらのすべての安全性の特徴にも関わらず、この系を用いて産生されたレンチウイルスはなお、生物災害の危険性を引き起こし得る。上記に示されたように、これらは初代ヒト細胞に完全に形質導入することができ、従って、これらのウイルスは生物災害管理2レベル生物として取り扱われるべきである。有害な遺伝子または毒性遺伝子（例えば、活性化されたオンコジーン）を有するウイルスを作製する場合には、十分すぎる注意が払われるべきである。BL-2ガイドラインおよびレンチウイルスの取り扱いにかんするさらなる情報については、「Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories」第4版、疾病対策センターを参照され、およびCDCに連絡されたい。
【０６０２】
結論
本発明のレンチウイルス産生および発現系は、Cell Genesys（Dull 1998）で作製された第3世代レンチウイルス系に基づく。この系は、当業者が、GATEWAY（商標）または指向性TOPOを介して、関心対象の遺伝子をパッケージング可能なレンチウイルスベクターに迅速にクローニングすることを可能にし、感染性のウイルス粒子の作製のために必要な材料を提供する。最後に、これらのウイルスは、活動的に分裂しているもの、および分裂していないものの両方である、初代ヒト細胞株および不死化ヒト細胞株に種々の遺伝子を安定に送達することができる。
【０６０３】
実施例10
本発明の材料および方法（例えば、ViraPower（商標）レンチウイルス発現システム）は、複製無能力レトロウイルス（例えば、HIV-1に基づくレンチウイルス）の作製を可能にし、これは次いで、分裂しているかまたは分裂していないかのいずれかである、真核生物（例えば、哺乳動物）細胞中に、関心対象の配列を送達およびそれを発現するために使用され得る。いくつかの態様において、本発明の材料には以下が含まれるがこれらに限定されない：発現プラスミド、例えば、適切なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期エンハンサー/プロモーター；Anderrsonら（1989）J. Biol. Chem. 264, 8222-8229; Boshartら（1985）Cell 41, 521-530; Nelsonら（1987）Molec. Cell. Biol. 7, 4125-4129を参照されたい）の制御下にある関心対象の配列を含み、および構築物のビリオンへのパッケージングを可能にするエレメントもまた含む発現プラスミド。本発明の実施のために適切な他の材料には、組換えレトロウイルスを産生するために必要とされる、トランスで構造タンパク質および複製タンパク質を供給し得るパッケージングプラスミド（例えば、pLP1、pLP2、およびpLP/VSVG）の最適化された混合物が含まれる。いくつかの態様において、本発明は細胞株（例えば、293FT）を提供し、これは、発現プラスミドおよびパッケージング混合物中のプラスミドの同時トランスフェクション後にレンチウイルスの産生を可能にする。いくつかの態様において、本発明はlacZ遺伝子を含む対照発現プラスミドを提供し、これは、ビリオンにパッケージングされかつ哺乳動物細胞株に形質導入された場合に、β-ガラクトシダーゼを発現する。
【０６０４】
関心対象の遺伝子のレトロウイルスに基づく発現を容易にするために本発明の材料および方法（例えば、ViraPower（商標）レンチウイルス発現システム）を使用することは以下の利点を提供する：1）分裂している哺乳動物細胞および分裂していない哺乳動物細胞の両方に効果的に形質導入する、HIV-1に基づくレンチウイルスを生成し、従って、従来のモロニー白血病ウイルス（MoMLV）に基づくレトロウイルス系（Naldini、1998）のそれを超えて、潜在的な適用を広げる；2）培養中またはインビボで哺乳動物細胞に関心対象の遺伝子を効率的に送達する（Dull、1998）；3）従来のアデノウイルスに基づく系によって提供されるものを超えて、標的遺伝子の安定な長期的発現を提供する（Dull、1998; Naldiniら、1996）；4）拡張された宿主の範囲でシュードタイピングを受けたウイルスを産生する（Yeeら、1994）；および5）系の生物災害管理を高めるように設計された多数の特徴を含む。
【０６０５】
当業者は、本明細書中に提供される教示を使用して以下を行い得る。本明細書中に記載されるベクター（例えば、pLenti6/V5-に基づく発現ベクター）およびViraPower（商標）パッケージングミックス（Packaging Mix）を293FT細胞株に形質導入してレンチウイルスストックを産生する。レンチウイルスストックを力価測定する。レンチウイルスストックを使用して選択の哺乳動物細胞株に形質導入する。形質導入されたベクターによってコードされる1つまたは複数の組換えタンパク質の「一過性」発現をアッセイする。および/または、所望される場合、安定に形質導入された細胞株を生成する。
【０６０６】
pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）またはpLenti6/V5-DEST（商標）を使用して発現ベクターを生成するためのさらなる詳細および指示書が使用可能である（例えば、、pLenti6/V5指向性TOPO（登録商標）クローニングキットマニュアル、カタログ番号K4955-10、バージョンB、またはpLenti6/V5-DEST（商標）GATEWAY（商標）ベクターパックマニュアル、カタログ番号V496-10、V498-10、およびV499-10、バージョンC、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA）。293FT産生細胞株を培養および維持するための指示書については、以下の実施例13を参照されたい。
【０６０７】
本発明の発現系（例えば、ViraPower（商標）レンチウイルス発現システム）は、複製無能力レンチウイルスを使用して、分裂している哺乳動物細胞および分裂していない哺乳動物細胞の両方への、高度に効率的なインビトロまたはインビボでの標的遺伝子の送達を容易にする。Cell Genesys（Dullら、1998）によって開発されたlentikat（商標）系に基づいて、ViraPower（商標）レンチウイルス発現システムは、従来のレトロウイルス系よりも個広い範囲の細胞型において高レベルの遺伝子発現を可能にしながら、その生物災害管理を高める特徴を有する。
【０６０８】
本発明の系の1つの構成要素は、関心対象の配列（例えば、関心対象の遺伝子をコードする）がクローニングされる発現ベクター（例えば、pLenti6/V5に基づく発現ベクター）である。関心対象の配列の発現は、選択のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター）によって制御される。このベクターはまた、ビリオンへの発現構築物のパッケージングを可能にするために必要とされるエレメントを含む（例えば、5'および3'LTR、Ψパッケージングシグナル）。
【０６０９】
本発明の系の別の構成要素は、発現ベクターから産生されるRNAをパッケージングするために必要な活性をコードする1つまたは複数のプラスミドである（例えば、3種のパッケージングプラスミド、pLP1、pLP2、およびpLP/VSVGの最適化された混合物を含むViraPower（商標）パッケージングミックス）。これらのプラスミドは、ヘルパー機能ならびにレンチウイルスを産生するために必要とされるトランスでの構造タンパク質および複製タンパク質を供給する。
【０６１０】
この系の選択的な構成要素は、SV40ラージT抗原を安定に発現し得る最適化された細胞株（例えば、293FT産生細胞株）である。SV40ラージT抗原の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター（例えば、CMVプロモーター）の制御下にあり得る。ラージT抗原の発現は、ウイルスの最適な発現を容易にする。
【０６１１】
1つの態様において、パッケージング活性を含むプラスミド（例えば、ViraPower（商標）レンチウイルスパッケージングキット）および発現プラスミド（例えば、関心対象の配列を含むpLenti6/V5ベクター）は、適切な宿主細胞株（例えば、293FT細胞）に同時トランスフェクトされて、複製無能力レンチウイルスを産生し、次いでこれは、関心対象の哺乳動物細胞株に形質導入され得る。一旦レンチウイルスが標的細胞に入ると、そのウイルスRNAは逆転写され、核まで活性に輸送され（Lewisら、1994；Naldiniら、1999）、かつ宿主ゲノムに安定に組み込まれる（Buchschacherら、2000；Luciw（1996）Fields Virology、B.N.Fieldsら編（Philadelphia, PA: Lippincott-Raven Publishers）1881-1975頁）。一旦レンチウイルス構築物がゲノムに組み込まれると、組換えタンパク質の一過性発現がアッセイされ得るか、またはブラスチシジン選択が使用されて、長期間の発現のための安定な細胞株を生成し得る。
【０６１２】
大部分のレトロウイルスベクターは、それらの制限された向性および一般的に低い力価によって、遺伝子送達ビヒクルとしてのそれらの有用性が限られている。本発明の系において（例えば、ViraPower（商標）レンチウイルス発現システム）、この制限は、シュードタイピングエンベロープとしての水疱性口内炎ウイルス（VSV-G）からのG糖タンパク質遺伝子の使用によって克服され、従って、顕著に広げられた宿主細胞範囲を有する高力価レンチウイルスの産生を可能にする（Burnsら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90、8033-8037、Emiら（1991）J. Virol. 65、1202-1207、Yeeら、1994）。
2005532829.tif 000057
【０６１３】
本発明はインビボ遺伝子送達適用のために適切である。多くのグループがレンチウイルスベクターを首尾よく使用して、脳、網膜、膵臓、筋肉、肝臓、および皮膚を含む組織において標的遺伝子を発現してきた。
2005532829.tif 000058
レンチウイルスに基づくベクターを使用してインビボで首尾よく発現された標的遺伝子に関するさらなる情報については、上記の参考文献ならびに以下のさらなる参考文献（Baekら、2001；Dullら、1998；Parkら、2001；Pengら、2001）を参照されたい。
【０６１４】
本発明の系（例えば、ViraPower（商標）レンチウイルス発現システム）はDullら（1998）によって開発されたレンチウイルスベクターに基づく第3世代系である。これらの第3世代レンチウイルス系は、それらの生物災害管理を高めるように、および野生型ヒトHIV-1ウイルスへのそれらの関連性を最小化するように設計された顕著な数の安全性特徴を含む。これらの安全性特徴は以下に挙げられる。
【０６１５】
発現ベクター（pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）またはpLenti6/V5-DEST（商標））は、産生細胞株中でのウイルスゲノムの生成に影響を与えない3'LTR（ΔU3）に欠失を含むが、標的細胞の形質導入後にレンチウイルスの「自己不活性化」を生じる（Yeeら、1987；Yuら、1986；Zuffereyら、1998）。形質導入された標的細胞に一旦組み込まれると、レンチウイルスゲノムはもはやパッケージング可能なウイルスゲノムを産生することができない。
【０６１６】
本発明の系において使用されるHIV-1からの遺伝子の数が3つまで減少された（すなわち、gag、pol、およびrev）。
【０６１７】
水疱性口内炎ウイルスからのVSV-G遺伝子はHIV-1エンベロープの代わりに使用される（Burnsら、1993；Emiら、1991；Yeeら、1994）。
【０６１８】
ウイルスゲノムをパッケージングするために必要である構造的および他の成分をコードする遺伝子は4種のプラスミドに分けられる。4種すべてのプラスミドが、複製コンピテントなウイルスの生成をもたらし得る望ましくない組換え事象を妨害するために互いにいかなる相同性の領域をも含まないように操作された（Dullら、1998）。
【０６１９】
3種のパッケージングプラスミドは、293FT産生細胞株中でウイルス子孫を産生するために必要であるタンパク質（例えば、gal、pol、rev、env）のトランスでの発現を可能にするが、これらのいずれもがLTRまたはΨパッケージング配列を含まない。このことは、HIV-1構造遺伝子のいずれもがパッケージングされたウイルスゲノム中に実際には存在せず、従って、形質導入された標的細胞中で決して発現しないことを意味する。新たな複製コンピテントウイルスは産生されることはできない。
【０６２０】
この系において産生されたレンチウイルス粒子は複製コンピテントではなく、関心対象の遺伝子を運ぶのみである。他のウイルス種は産生されない。
【０６２１】
pLP1からのgag遺伝子およびpol遺伝子の発現は、gag/pol mRNA転写物中のHIV-RREによってRev依存性にされた。RREの付加はRevの非存在下でのgagおよびpol発現を妨害する（Dullら、1998）。
【０６２２】
構成的プロモーター（RSVプロモーター、Gormanら（1982）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781）は、ウイルスRNAの効率的な産生においてTatの要求性を相殺するためにpLenti6/V5発現ベクター中の5'LTRの上流に配置された（Dullら、1998）。
【０６２３】
上記に挙げられた安全性特徴の包含にも関わらず、本発明の系を用いて産生されたレンチウイルスは、なおある程度の生物災害の危険性を提示し得る。これは一次ヒト細胞に形質導入し得るからである。この理由のために、BL-2のための公開されたガイドラインに従うべきである。さらに、潜在的に有害または毒性の遺伝子（例えば、活性化されたオンコジーン）を有するレンチウイルスを作製する場合、特別の注意が払われるべきである。
【０６２４】
BL-2ガイドラインおよびレンチウイルスの取り扱いに関する詳細な情報については、疾病対策センター（CDC）によって出版されている文書「Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratoties」第4版を参照されたい。
【０６２５】
図35における図表は、本発明の例示的な系を使用して関心対象の配列を発現するために必要である一般的工程を記載する。
【０６２６】
本発明は当業者が哺乳動物細胞中で関心対象の遺伝子を送達および発現するためのレンチウイルスを作製することを補助するように設計されている。レンチウイルス生物学および真核生物細胞培養に関するさらなる情報については、以下の出版されている概説を参照されたい：
Buchschacherら（2000）；Luciw（1996）；Naldini（1999）、Naldini（1998）、およびYee（1999）Retroviral Vectors. The Development of Human Gene Therapy, T. Friedmann編（Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press）21-45頁。
【０６２７】
pLP1プラスミド、pLP2プラスミド、pLP/VSVGプラスミドは、293FT産生細胞への同時トランスフェクション後、発現ベクター（例えば、pLenti6/V5に基づく発現ベクター）のウイルスパッケージングを容易にするために、最適化された混合物中で提供される。キットにおいて供給されるパッケージング混合物（195μg）およびLipofectamine（商標）2000トランスフェクション試薬（0.75ml）の量は、本明細書中に記載される推奨されるプロトコールを使用して10cmプレートにおいて20の同時トランスフェクションを実行するために十分である。ViraPower（商標）パッケージングミックスを使用するために、195μlの滅菌水中に再懸濁し、1μg/μlストックを得る。
【０６２８】
pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）またはpLenti6/V5-DEST（商標）中に関心対象の遺伝子を含むpLenti6/V5発現ベクターを、本明細書中に記載される方法を使用して生成し得る。一旦発現構築物が構築されると、精製されたプラスミドDNAを調製するために選択の任意の方法を使用する。真核生物中へのトランスフェクションのためのプラスミドDNAは清浄でなければならずかつフェノールおよび塩化ナトリウムを含んではならない。夾雑物は細胞を殺傷し得、および塩は脂質複合体化を妨害し得、これはトランスフェクション効率を減少するからである。十分な純度のプラスミドDNAを単離する適切な方法には、S.N.A.P.（商標）ミディプレップキット（Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CA、カタログ番号K1910-01）および塩化セシウム勾配遠心分離が含まれる。
【０６２９】
関心対象の遺伝子を含む精製された発現プラスミド（例えば、pLenti6/V5発現プラスミド）を、0.1-3.0μg/μlの範囲の濃度で滅菌水またはTE、pH 8.0に再懸濁する。3μgの発現プラスミドを各トランスフェクションのために使用し得る。
【０６３０】
適切な宿主細胞株は、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であるヒト293FT細胞株であり、ViraPower（商標）レンチウイルス発現キットとともに供給される（Naldiniら、1996）。293F細胞株の誘導体である293FT細胞株は、pCMVSPORT6TAg.neoからのSV40ラージT抗原を安定にかつ構成的に発現し、およびこれはGeneticin（登録商標）を含む培地中で維持されなければならない。
【０６３１】
関心対象の遺伝子を発現する安定に形質導入された細胞株が作製され得る前に、レンチウイルスストック（パッケージングされた発現構築物を含む）が、最適化されたパッケージングプラスミド混合物および発現ベクター（例えば、pLenti6/V5に基づく発現ベクター）を適切な宿主細胞株（例えば、293FT細胞株）に同時トランスフェクトすることによって作製されなければならない。
【０６３２】
レンチウイルスストックを生成するための1つの適切なプロトコールは、以下の材料を使用する：ViraPower（商標）パッケージングミックス（キットと共に供給される；195μlの滅菌水中に、1μg/μlの濃度に再懸濁する）；関心対象の遺伝子を含むpLenti6/V5発現ベクター（滅菌水またはTE、pH 8.0中、0.1-3.0μg/μl）；pLenti6/V5に基づく陽性対照ベクター（キットと共に供給される；滅菌水中に1μg/μlの濃度に再懸濁する）；適切な培地中で培養した293FT細胞（実施例13を参照されたい）；Lipofectamine（商標）2000トランスフェクション試薬（キットと共に供給される；使用まで+4℃で保存する）；Opti-MEM（登録商標）I 血清使用量低減培地（あらかじめ暖める；以下を参照されたい）；胎仔ウシ血清（FBS）；滅菌10cm組織培養プレート（レンチウイルス構築物、陽性対照、および陰性対照のために各1つ）；滅菌組織培養供給品；15ml滅菌、キャップ付きコニカルチューブ；および凍結バイアル。
【０６３３】
各pLenti6/V5に基づく発現ベクターキットは発現対照としての使用のための陽性対照ベクター（例えば、pLenti6/V5-GW/lacZ）を含む。陽性対照ベクターは、関心対象の哺乳動物細胞株における発現条件を最適化することを補助するために使用され得る対照レンチウイルスストックを生成するための同時トランスフェクション実験に含められることが推奨される。
【０６３４】
任意の適切なトランスフェクション試薬が、産生細胞株にプラスミドを導入するために使用され得る。1つの適切なトランスフェクション試薬はLipofectamine（商標）2000試薬である（Ciccaroneら（1999）Focus 21, 54-55）。この試薬は独自製品であり、真核生物細胞への核酸のトランスフェクションのために適切なカチオン性脂質に基づく処方物である。293FT細胞をトランスフェクトするためにLipofectamine（商標）2000を使用することは以下の利点を提供する。293FT細胞において最大のトランスフェクション効率を提供する。DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体は血清の存在下で培地中の細胞に直接的に加えられ得る。および、トランスフェクション後の複合体の除去または培地の交換もしくは追加は必要とされないが、複合体は活性の損失なしで4-6時間後に除去され得る。
【０６３５】
DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体の最適な形成を容易にするために、減血清培地（例えば、Invitrogen Corporarion、Carlsbad,、CAから入手可能であるOpti-MEM（登録商標）I 血清使用量低減培地）が使用され得る。
【０６３６】
293FT細胞中のレンチウイルスストックは、本明細書中に記載された最適化されたトランスフェクション条件を使用して産生された。これらの推奨される条件（1×105〜1×107形質導入ユニット(TU)/ml）を使用して産生されたレンチウイルスの量は、一般的に、感染多重度（MOI）=1で、1×106〜1×108細胞に形質導入するのに十分である。
2005532829.tif 000059
【０６３７】
293FT細胞はトランスフェクションの24時間前に完全培地にプレーティングされるべきであり、トランスフェクションの日に90-95％コンフルエントであるべきである。細胞がプレーティングの時点で健常であることを確認する。
【０６３８】
293FTに同時トランスフェクトするために以下の手順に従う。細胞はトランスフェクションの間、培地中に保持され得ることを思い出すこと。陽性対照および陰性対照（DNAなし、Lipofectamine（商標）2000なし）は結果を評価することの補助のために推奨される。
【０６３９】
トランスフェクションの前日、293FT細胞をトリプシン処理および計数し、それらを10cmプレートあたり5×106細胞でプレーティングする。血清を含む10mlの通常の増殖培地に細胞をプレーティングする。
【０６４０】
トランスフェクション当日、293FT細胞から培地を取り除き、血清を含む5mlの通常の増殖培地（または血清を含有するOpti-MEM（登録商標）I Medium）で置き換える。抗生物質は含めない。
【０６４１】
以下を実行することによって、各トランスフェクション試料についてDNA-Lipofectamine（商標）2000複合体を調製する。9μgの最適化されたパッケージング混合物および3μgのpLenti6/V5発現プラスミドDNA（全体で12μg）を、血清を含まない1.5mlのOpti-MEM（登録商標）I 培地中で希釈する。穏やかに混合する。使用前にLipofectamine（商標）2000を穏やかに混合し、次いで、36μlを血清を含まない1.5mlのOpti-MEM（登録商標）I 培地中で希釈する。穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートする。5分間のインキュベーション後、希釈したDNAを希釈したLipofectamine（商標）2000とを合わせる。穏やかに混合する。室温で20分間インキュベートし、DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体を形成させた。溶液は濁って見え得るが、これはトランスフェクションを妨害しない。
【０６４２】
DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体を、各プレートに滴下して加える。プレートを前後にゆすることによって穏やかに混合する。細胞を、37℃で一晩、CO2インキュベーター中でインキュベートする。
【０６４３】
次の日、DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体を含む培地を除去し、完全培地（すなわち、10％FBS、2mM L-グルタミン、および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むD-MEM）に置き換える。VSV G糖タンパク質の発現は、293FT細胞が融合することを引き起こし、多核合包体の外見を生じる。この形態学的変化は正常であり、レンチウイルスの産生に影響を与えない。
【０６４４】
トランスフェクションの48-72時間後に15mlの滅菌キャップ付きコニカルチューブに培地を移すことによってウイルス含有上清をを収集する。上清がトランスフェクションの48時間後または72時間後に収集されるかに関わらず、ウイルス収量の最小限の差違が観察される。BL-2生物を用いる作業のための推奨されるガイドラインに従う。
【０６４５】
卓上臨床遠心分離機で3000rpmで15分間、4℃で遠心分離する。
【０６４６】
所望される場合、濾過工程を実行する。ウイルス上清を1mlアリコートで凍結バイアルにピペットで移す。バイアルストックを-80℃で保存する。
【０６４７】
レンチウイルス構築物がインビボ適用のために使用される場合、またはストックがより高い力価を得るために濃縮される場合、低速遠心分離工程後に滅菌した0.45μm低タンパク質結合フィルターを通してウイルス上清を濾過することが推奨される。適切なフィルターはMillex-HV 0.45μm PVDFフィルター（Millipore、カタログ番号SLHVR25LS）である。
【０６４８】
バイアルストックを長期保存のために-80℃に保存する。反復する凍結および融解は、それがウイルス力価の損失を生じ得るので推奨されない。正しく保存された場合、適切な力価のウイルスストックは1年間までの間使用のために適切であるはずである。長期保存後、関心対象の細胞株を形質導入する前にウイルスの力価を決定することが推奨される。
【０６４９】
所望される場合、大量のレンチウイルスを産生するために同時トランスフェクション実験をスケールアップすることが可能である。例えば、同時発現実験は、10cmプレートからT225フラスコにスケールアップされ得、かつ50mlまでのウイルス上清が収集され得る。スケールアップするために、プレーティングされる細胞の数、ならびにDNA、Lipofectamine（商標）2000、および培養容器の表面積の差違に比例して使用される培地の量を増加させる。関心対象の哺乳動物細胞株を形質導入すること、および組換えタンパク質を発現することに進む前に、レンチウイルスストックの力価を決定することが推奨され得る。この手順はいくつかの適用のためには必要とされないが、レンチウイルスの組み込まれたコピーの数を制御すること、または再現性のある発現結果を生じることは必要である。
【０６５０】
レンチウイルスストックの力価を決定するために、レンチウイルスストックの10倍の段階希釈を調製し；Polybrene（登録商標）の存在下で選択の哺乳動物細胞株に異なる希釈のレンチウイルスを形質導入し；安定に形質導入された細胞をブラスチシジンを使用して選択し；ならびに、染色しおよび各希釈中のブラスチシジン耐性コロニーの数を計数する。
【０６５１】
要因の数はウイルス力価に影響を与え得る。1つの要因は発現ベクターに挿入される関心対象の配列のサイズである。力価は一般的に挿入断片のサイズが増加するにつれて減少する。野生型HIV-1ゲノムのサイズは約10kbである。pLenti6/V5からの発現のために必要であるエレメントのサイズは全体で約4kbであるので、関心対象の遺伝子のサイズは、効率的なパッケージングのために理論的には6kbを超えるべきではない。
【０６５２】
ウイルス力価に影響を与え得る他の要因は、力価測定のために使用される細胞株の特性、レンチウイルスストックの齢、ストックが受けた凍結融解サイクルの回数、およびストックの保存条件である。ウイルス力価は-80℃での長期保存で減少し得る。レンチウイルスが6ヶ月から1年間保存された場合、発現実験における使用の前に力価が決定されることが推奨される。ウイルス力価は凍結/融解サイクルに伴って10％までの量が減少し得る。レンチウイルスストックはアリコートとし、-80℃で保存されるべきである。
【０６５３】
レンチウイルスストックの力価は、選択の任意の哺乳動物細胞株を使用して決定され得る。一般的に、レンチウイルスストックを力価測定するために使用されたのと同じ哺乳動物細胞株が発現研究を実行するために使用されることが推奨される。しかし、いくつかの例において、異なる細胞株がレンチウイルスを力価測定するために使用され得る（例えば、分裂していない細胞株または初代細胞株における発現研究を実行する場合）。これらの場合において、レンチウイルスを力価測定するために用いる適切な細胞株は：付着細胞株として増殖し；取り扱いが容易であり；18-25時間の範囲の分裂時間を示し；および移動性でない。力価測定目的のための適切な細胞の例は、HT1080ヒト線維肉腫細胞株（ATCC、カタログ番号CCL-121）であるが、他の細胞株（HelaおよびNIH3T3を含む）もまた適切である。
【０６５４】
レンチウイルス構築物の力価は、どの細胞が選択されるかに依存して変化し得る。1種より多くのレンチウイルス構築物が使用される場合、すべてのレンチウイルス構築物を同じ細胞株を使用して決定することが推奨される。
【０６５５】
pLenti6/V5発現構築物は、レンチウイルス構築物を安定に形質導入した哺乳動物細胞のブラスチシジン選択（Takeuchiら（1958）The Journal Anibiotics, Series A 11, 1-5；Yamaguchiら（1965）J. Biochem (Tokyo) 57, 667-677）を可能にするためのブラスチシジン耐性遺伝子（bsd）（Kimuraら（1994）Biochim. Biophys. ACTA 1219, 653-659、Izumiら（1991）Exp. Cell Res. 197, 229-233）を含む。
【０６５６】
安定に形質導入された細胞はブラスチシジンを使用して選択されるので、形質導入されていない細胞を殺傷するために必要とされるブラスチシジンの最小濃度が決定されなくてはならない（すなわち、殺傷曲線実験を実行する）。一般的には、2-10μg/mlの範囲のブラスチシジン濃度が、形質導入されていない大部分の哺乳動物細胞株を殺傷するために十分である。関心対象の任意の所定の細胞株については、細胞株のために必要な最小濃度が使用されていることを確認するために一定の範囲の濃度が試験されるべきである（以下のプロトコールを参照されたい）。所定の細胞株のためのブラスチシジンの適切な濃度を決定するための適切な方法は以下の通りである。
【０６５７】
6プレートのセットを準備する。約25％コンフルエンスで細胞をプレーティングする。細胞を一晩付着させる。
【０６５８】
次の日、種々の濃度のブラスチシジン（例えば、0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/mlブラスチシジン）を含む培地で培地を置き換える。
【０６５９】
選択培地を3-4日毎に補充し、生存している細胞のパーセンテージを観察する。
【０６６０】
ブラスチシジンの付加後10日以内に細胞を殺傷するブラスチシジンの適切な濃度を決定する。
【０６６１】
レンチウイルス構築物の力価を決定するために、以下の材料が必要である：レンチウイルスストック（使用まで-80℃で保存）；選択の付着性哺乳動物細胞株；細胞株のための完全培地；ヘキサジメトリンブロミド（Polybrene（登録商標）；Sigma、カタログ番号H9268）；6穴組織培養プレート；ブラスチシジン（10mg/mlストック溶液）；クリスタルバイオレット（Sigma、カタログ番号C3886；10％エタノール中に1％クリスタルバイオレット溶液を調製する）；およびリン酸緩衝化生理食塩水（PBS；Invitrogen、カタログ番号10010-023）。
【０６６２】
哺乳動物細胞にウイルスを加える場合、細胞へのウイルスの形質導入を高めるためにPolybrene（登録商標）を含める。Polybrene（登録商標）を使用するために：脱イオン化した滅菌水中に6mg/mlのストック溶液を調製し；フィルター滅菌しおよび1mlのアリコートを滅菌微量遠心分離チューブに分注し；長期保存のために-20℃で保存する。ストック溶液を最大1年間-20℃で保存してもよい。ストック溶液を3回より多くは凍結/融解しない。なぜならこれは活性の損失を生じ得るからである。作業ストックは2週間まで、+4℃で保存され得る。
【０６６３】
培地は感染性ウイルスを含み、適切な安全性予防措置が取られるべきである。例えば、すべての操作を認定された生物災害管理キャビネット内で実行する。ウイルスを含む培地を漂白剤で処理する。使用済みのピペット、ピペットチップ、および他の組織培養供給品を漂白剤で処理し、または生物災害廃棄物として処分する。ウイルスストックおよびウイルスを含む培地を取り扱う際には手袋、実験室コート、および安全眼鏡またはゴーグルを着用する。
【０６６４】
選択の哺乳動物細胞株を使用してレンチウイルスストックの力価を決定するために以下の手順に従う。少なくとも1つの6穴プレートを、力価測定されるレンチウイルスストック毎に使用する（1つの偽および5段階の希釈）。pLenti6/V5-GW/lacZ陽性発現対照のレンチウイルスストックが作製された場合、このストックを同様に力価測定することが推奨される。
【０６６５】
形質導入の日（1日目）に、細胞をトリプシン処理および計数し、それらが形質導入の時点で30-50％コンフルエントであるように細胞をプレーティングする。細胞を37℃で一晩インキュベートする。
【０６６６】
実施例：
HT1080細胞を使用する場合、一般的に6穴プレート中のウェルあたり2×105細胞をプレーティングする。
【０６６７】
形質導入の日（2日目）に、レンチウイルスストックを融解し、10-2から10-6までの範囲の10倍の段階希釈を調製する。各希釈について、レンチウイルス構築物を完全培地に1mlの最終容量に希釈する。ボルテックスはしない。所望される場合、より広い範囲の段階希釈（10-2から10-8）が使用され得る。
【０６６８】
培地を細胞から取り除く。転倒により各希釈物を穏やかに混合し、細胞の1つのウェルに加える（総量=1ml）。
【０６６９】
Polybrene（登録商標）を各ウェルに6μg/mlの最終濃度で加える。プレートを穏やかに回転させ混合する。37℃で一晩インキュベートする。
【０６７０】
次の日（3日目）、ウイルスを含む培地を取り除き、2mlの完全培地で置き換える。
【０６７１】
次の日（4日目）、培地を取り除き、安定に形質導入した細胞を選択するために適切な量のブラスチシジンを含む完全培地で置き換える。
【０６７２】
3-4日毎に、培地を取り除き、ブラスチシジンを含む新鮮な培地で置き換える。
【０６７３】
選択の10-12日後（14日目-16日目）、偽細胞には生細胞が見られず、および1つまたは複数の希釈ウェル中では分散したブラスチシジン耐性コロニーが見られるはずである。培地を取り除き、2mlのPBSで細胞を洗浄する。洗浄を繰り返す。
【０６７４】
1mlのクリスタルバイオレット溶液を加え、室温で10分間インキュベーションする。
【０６７５】
クリスタルバイオレット染色液を取り除き、2mlのPBSで細胞を洗浄する。洗浄を繰り返す。
【０６７６】
青色に染色されたコロニーを計数し、レンチウイルスストックの力価を決定する。
【０６７７】
HT1080細胞を使用してLenti6/V5レンチウイルスストックを力価測定する場合、一般的に、5×105〜2×107形質導入ユニット(TU)/mlの範囲の力価が観察される。レンチウイルスストックの力価が1×105TU/ml未満である場合、新たなレンチウイルスストックが作製されるべきである。
【０６７８】
例として、Lenti6/V5-GW/lacZレンチウイルスストックは本明細書中に記載されたプロトコールを使用して生成された。上記のプロトコールに従って、HT1080細胞はレンチウイルス上清（10-2〜10-6希釈）の10倍段階希釈を用いて形質導入されたか、または形質導入されなかった（偽）。形質導入の48時間後、細胞をブラスチシジン選択下に置いた（10μg/ml）。選択の10日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し（以下のプレートを参照されたい）、コロニーを計数した。プレートにおいて、コロニーの計数は：偽：コロニーなし；10-2希釈：コンフルエント；不確実、10-3希釈：コンフルエント；不確実、10-4希釈：コンフルエント；不確実、10-5希釈：46；および10-6希釈：5であった。従って、このレンチウイルスストックの力価は4.8×106TU/ml（すなわち、46×105および5×106の平均）である。
【０６７９】
一旦適切な力価を有するレンチウイルスストックが生成されると、そのレンチウイルス構築物は選択の哺乳動物細胞株に形質移入され得、組換えタンパク質の発現についてアッセイされ得る。関心対象の遺伝子の発現のためのアッセイ法は以下のやり方において実行され得る：
1）細胞の不均一な集団をプールし、形質導入後に直接的に発現について試験する（すなわち、「一過性」発現）。レンチウイルスゲノムが染色体DNAに逆転写および組み込みを行うための時間を与えるために、形質導入後細胞を収集する前に24-48時間が経過しなくてはならないことに注意されたい。組み込みは、関心対象の遺伝子の発現が起こり得る前に起こらなくてはならない。
2）ブラスチシジンを使用して安定に形質導入された細胞を選択する。これは、形質導入後最小で10-12日間を必要とするが、関心対象の遺伝子を安定に発現するクローン細胞株の生成を可能にする。
【０６８０】
標的遺伝子の安定な発現は、形質導入および選択後少なくとも6週間の間観察され得る。
【０６８１】
安定に形質導入された細胞を選択するために、形質導入されていない哺乳動物細胞株を殺傷するために必要とされるブラスチシジンの最小濃度が上記のように決定されなければならない。レンチウイルス構築物の力価が、安定な発現実験を実行するために使用されたのと同じ細胞株において決定された場合には、同じ濃度のブラスチシジンが、力価測定のために使用されたように選択のために使用され得る。
【０６８２】
関心対象の遺伝子の最適な発現を得るために、細胞は適切なMOIのレンチウイルスで形質導入されなければならない。MOIは、細胞あたりのウイルス粒子の数として定義され、組換え事象の数、および結果として発現と一般的に相関する。一般的には、発現レベルはMOIが増加するにつれて直線的に増加する。
【０６８３】
要因の数は最適なMOIの決定に影響を与え得、これには、細胞株の性質（例えば、分裂していない細胞型対分裂している細胞型）、その形質導入効率、関心対象の適用、および関心対象の遺伝子の性質が含まれる。レンチウイルス構築物を選択の哺乳動物細胞株に最初に形質導入する場合には、特定の適用のための組換えタンパク質の最適な発現を得るために必要とされるMOIを決定するために、一定の範囲のMOI（例えば、0、0.05、0.1、0.5、1、2、5）が使用されるべきである。
【０６８４】
一般的に、活動的に分裂している細胞株（例えば、HT1080、HeLa、CHO-K1）中の80-90％の細胞が、〜1のMOIで形質導入された場合に標的遺伝子を発現する。いくつかの分裂していない細胞型は、より低い効率でレンチウイルス構築物を形質導入する。例えば、初代ヒト線維芽細胞における約50％のみの細胞が、〜1のMOIで形質導入された場合に標的遺伝子を発現する。分裂していない細胞型にレンチウイルス構築物を形質導入する場合、組換えタンパク質の最適な発現レベルを達成するためにMOIを増加させることが必要であり得る。
【０６８５】
Lenti6/V5-GW/lacZ対照レンチウイルス構築物が構築された場合、特定の細胞株および適用のために最適なMOIを決定するように補助するためにこれが使用され得る。一旦、Lenti6/V5-GW/lacZレンチウイルスが選択の哺乳動物細胞株に形質導入されると、β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子が構成的に発現され、標準的な技術を使用して容易にアッセイされ得る。
【０６８６】
ウイルス上清が、293FT産生細胞からのウイルスを含む使用済みの培地を収集することによって生成されることを思い出されたい。使用済み培地は栄養を欠き、いくつかの毒性の老廃物を含み得る。大量のウイルス上清が哺乳動物細胞株に形質導入するために使用される場合（例えば、6穴プレート中のウェルあたり1mlのウイルス上清）、細胞の増殖特性または形態学は形質導入の間に変化され得ることに注意されたい。これらの効果は、一般的に、培地が新鮮な完全培地で置き換えられた場合、形質導入後に緩和される。
【０６８７】
それらの形質導入能力に有意に影響を与えることなく、種々の方法を使用してVSV-Gシュードタイピングを受けたレトロウイルスを濃縮することが可能である。レンチウイルスストックの力価が比較的低く（5×105TU/ml未満）、実験が大量のウイルス上清を必要とする（例えば、比較的高いMOI）場合、ウイルスは形質導入に進む前に濃縮され得る。ウイルスを濃縮するための詳細およびガイドラインについては、公開された参考文献の情報源を参照されたい（Yee、1999）。
【０６８８】
選択された細胞株に形質導入するために、以下の材料が必要とされる：力価測定されたウイルスのストック（例えば、Lenti6/V5レンチウイルスストック）（これは使用まで-80℃で保存されるべきである）；選択の細胞株（例えば、哺乳動物細胞株）；細胞株のための完全培地；ヘキサジメトリンブロミド（Polybrene（登録商標）；6mg/mlストック溶液）；意図された適用のための適切なサイズの組織培養プレート；およびブラスチシジン（安定に形質導入された細胞を選択する場合；10mg/mlストック溶液）。
【０６８９】
レンチウイルス構築物を用いて選択の哺乳動物細胞株に形質導入するためには以下の手順に従う。
【０６９０】
必要に応じて、意図される適用のために細胞を完全培地中にプレーティングする。
【０６９１】
形質導入の日（1日目）に、レンチウイルスストックを融解し、および適切な量のウイルスを（適切なMOIで）新鮮な完全培地に希釈する（必要な場合）。ボルテックスはしない。
【０６９２】
培地を細胞から取り除く。ピペッティングによってウイルスを含む培地を穏やかに混合し、細胞に加える。
【０６９３】
Polybrene（登録商標）を6μg/mlの最終濃度まで加える。プレートを穏やかに旋回させ混合する。37℃で一晩インキュベートする。希釈していないウイルスストックを用いて細胞を形質導入することのあり得る負の効果を減少させるために、培地を交換する前に6時間まで少ない時間の間細胞をインキュベートすることが可能である。
【０６９４】
次の日（2日目）、ウイルスを含む培地を取り除き、新鮮な完全培地で置き換える。
【０６９５】
次の日（3日目）、以下のうちの1つを実行する：一過性発現実験を実行する場合、細胞を収集し、関心対象の組換えタンパク質の発現についてアッセイする；または、安定に形質導入された細胞を選択するために、培地を取り除き、適切な量のブラスチシジンを含む新鮮な完全培地で置き換える。
【０６９６】
ブラスチシジン耐性コロニーが同定され得るまで（一般的には選択後10-12日）、3-4日毎に、培地を取り除きブラスチシジンを含む新鮮培地で置き換える。
【０６９７】
少なくとも5つのブラスチシジン耐性コロニーを拾い上げ、組換えタンパク質の発現をアッセイするために各クローンを拡大する。
【０６９８】
ゲノムへのレンチウイルスの組み込みはランダムであることに注意されたい。組み込み部位での周辺のゲノム配列の影響に依存して、組換えタンパク質発現のレベルの変化が異なるブラスチシジン耐性クローンから見られ得る。少なくとも5つのブラスチシジン耐性クローンを試験すること、および関心対象の組換えタンパク質の最適な発現を提供するクローンを選択することが推奨される。
【０６９９】
当業者に公知である任意の選択の方法が関心対象の組換えタンパク質を検出するために使用され得、これには機能的分析、免疫蛍光、またはウェスタンブロットが含まれるがこれらに限定されない。関心対象の遺伝子はエピトープタグとインフレームでクローニングされ、この組換えタンパク質はこのエピトープタグに対する抗体を使用するウェスタンブロットにおいて検出され得る。
【０７００】
以下に列挙するものは、同時発現および力価測定の実験のトラブルシューティングの助けとなり得る、いくつかの潜在的な問題点および可能な解決法である。
2005532829.tif 000060
2005532829.tif 000061
【０７０１】
以下に列挙するものは、形質導入および発現の実験のトラブルシューティングの助けとなり得る、いくつかの潜在的な問題点および可能な解決法である。
2005532829.tif 000062
【０７０２】
表25は、ベクターpLP1の特徴のいくつかを提供する。その完全配列は表21に提供される。プラスミドマップは図37Aに提供される。
【０７０３】
（表２５）
2005532829.tif 000063
【０７０４】
表26は、ベクターpLP2の特徴のいくつかを提供する。その完全配列は表22に提供される。プラスミドマップは図37Bに提供される。
【０７０５】
（表２６）
2005532829.tif 000064
【０７０６】
表27は、ベクターpLP/VSVGの特徴のいくつかを提供する。その完全配列は表23に提供される。プラスミドマップは図37Cに提供される。
【０７０７】
（表２７）
2005532829.tif 000065
【０７０８】
実施例11
ViraPower（商標）レンチウイルス発現システムを使用する哺乳動物細胞におけるクローニングおよび高レベル発現のためのGATEWAY（商標）に適合したデスティネーションベクター
ViraPower（商標）レンチウイルス発現産物
pLenti6/V5-DEST（商標）ベクター、pLenti4/V5-DESTベクター、およびpLenti6/UbC/V5-DESTベクターは、上記にいくぶん詳細に論じた、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能なViraPower（商標）レンチウイルス発現システムと併用するために設計されている。選択されるベクターに依存して、関心対象の遺伝子の発現を制御するためのヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期プロモーターまたはヒトユビキチンC（UbC）プロモーター、および大腸菌（E. coli）または哺乳動物細胞中での選択用のZeocin（商標）耐性遺伝子またはブラスチシジン耐性遺伝子を有するpLenti-DESTベクターが利用可能である。
【０７０９】
組換え融合タンパク質の発現はV5エピトープに対する抗体を使用して検出され得る。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）またはアルカリホスファターゼ（AP）結合抗体は化学発光的または分光学的な検出方法を使用する1段階検出を可能にする。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗体は免疫蛍光実験において1段階検出を可能にする。融合タンパク質のための適切な検出試薬はInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であり、例えば、抗V5抗体、カタログ番号R960-25、抗V5-HRP抗体、カタログ番号R961-25、抗V5-AP抗体、カタログ番号R962-25、抗V5-FITC抗体、カタログ番号R963-25である。
【０７１０】
pLenti6/V5-DEST（商標）は、GATEWAY（商標）技術との使用に適合した8.7kbベクターであり、InvitrogenのViraPower（商標）レンチウイルス発現システムを使用して、分裂している細胞および分裂していない細胞において組換え融合タンパク質が高レベルに発現されるように設計されている。このベクターのマップは図36Aとして提供され、このベクターの配列は表17として提供される。
【０７１１】
pLenti-DESTベクターは以下の特徴を含む：産生細胞株におけるウイルスmRNAのTat非依存的産生用のラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー/プロモーター（Dullら、1998）；ウイルスパッケージングおよびウイルスmRNAの逆転写用の修飾されたHIV-1 5'および3'の長い末端反復配列（LTR）（Dullら、1998；Luciw、1996）（注記：3'LTRのU3流域は欠失され（ΔU3）、ベクターのバイオセーフティーを高めるために、形質導入した後の5'LTRの自己不活性化を容易にする）；ウイルスパッケージング用のHIV-1プサイ（Ψ）パッケージング配列（Luciw、1996）；スプライシングされていないウイルスmRNAのRev依存性核搬出用のHIV Rev応答エレメント（RRE）（Kjemsら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88. 683-687; Malimら、1989、Nature 338, 254-257）；それぞれ、ウイルスプロモーターまたは細胞プロモーターからの関心対象の遺伝子の構成的発現用のヒトCMVプロモーターまたはUbCプロモーター；エントリークローンからの関心対象遺伝子の組換えクローニング用のヒトCMVプロモーターまたはUbCプロモーターの下流2か所の組換え部位、attR1およびattR2；対抗選択用の2つのattR部位間に位置するクロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）；ネガティブ選択用のattR部位間に位置するccdB遺伝子；関心対象の組換えタンパク質の検出用のC末端V5エピトープ（Southernら、1991、J. Gen. Virol 72, 1551-1557）；大腸菌細胞および哺乳動物細胞における選択用のブラスチシジン耐性遺伝子（Izumiら、1991；Kimuraら、1994；Takeuchiら、1958；Yamaguchiら、1965）またはZeocin（商標）耐性遺伝子（Drocourtら、1990、Nucleic Acids Res. 18, 4009; Mulsantら、1988、Somat. Cell Mol. Genet. 14, 243-252）；大腸菌における選択用のアンピシリン耐性遺伝子；ならびに大腸菌におけるプラスミドの高コピー複製用のpUC起点。
【０７１２】
選択の哺乳動物細胞株における陽性発現対照としての使用のために、lacZ遺伝子を含む対照プラスミドが、各pLenti-DESTベクターとともに含められる。
【０７１３】
pLenti4/V5-DESTベクターおよびpLenti6/V5-DESTベクターは、哺乳動物細胞中で関心対象の遺伝子の高レベルの構成的発現を可能にするためにヒトCMV最初期プロモーターを使用する（Anderssonら、1989；Boshartら、1985；Nelsonら、1987）。pLenti4/V5-DESTプラスミドの配列は表19として提供される。大部分の哺乳動物細胞株中で高度に活性であるが、ウイルスCMVプロモーターの活性は、メチル化（Curradiら、2002、Mol. Cell. Biol. 22, 3157-3173）、ヒストン脱アシル化（Rietveldら、2002、EMBO J. 21, 1389-1397）、またはその両方に起因していくつかの細胞株において下方制御され得る。
【０７１４】
pLenti6/UbC/V5-DESTベクターは、哺乳動物細胞において関心対象の遺伝子からの、構成的であるがより生理学的なレベルの発現を可能にするヒトUbCプロモーターを使用する（Marinovicら、2000、Biophys. Res. Comm. 274, 537-541）。pLenti6/UbC/V5-DESTプラスミドの配列は表20として提供される。CMVプロモーターと比較した場合、UbCプロモーターは一般的に2〜4倍活性が弱い。UbCプロモーターは下方制御されず、これによりUbCプロモーターはトランスジェニック研究にとって有用となる（Gillら、2001、Gene Ther. 8, 1539-1546; Loisら、2002、Science 295, 868-872; Marinovicら、2000; Schorppら、1996、Nuc. Acids Res. 24, 1787-1788; Yewら、2001、Mol. Ther. 4, 75-82）。ヒトユビキチンC（UbC）プロモーター（pLenti6/UbC/V5-DEST中）により、大部分の哺乳動物細胞株において（Wulffら、1990、FEBS Lett. 261, 101-105）およびトランスジェニックマウスにおいて試験された実質的にすべての組織において（Schorppら、1996）、組換えタンパク質の高レベル発現が可能となる。以下の図表は、Nenoiら、1996、Gene 175, 179-185によって記載されたようなUbCプロモーターの特徴を示す。
【０７１５】
GATEWAY（商標）は、迅速かつ効率的な方法を提供して関心対象の遺伝子を複数のベクター系に移動させるためにバクテリオファージλの部位特異的組換え特性を利用する汎用性のクローニング技術である（Landy、1989）。GATEWAY（商標）技術を使用して哺乳動物細胞中で関心対象の配列（例えば、関心対象のポリペプチドをコードする配列）を発現させるためには、単に、選択のGATEWAY（商標）エントリーベクターに関心対象の配列をクローニングしてエントリークローンを作製し；エントリークローンとGATEWAY（商標）デスティネーションベクター（例えば、pLenti4/V5-DEST、pLenti6/V5-DEST、またはpLenti6/UbC/V5-DEST）との間でLR組換え反応を実施することによって発現クローンを生成し；かつViraPower（商標）レンチウイルス発現システム中で発現クローンを使用する。
【０７１６】
GATEWAY（商標）システム、エントリークローンの生成、およびLR組換え反応の実施に関するさらに詳細な情報については、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるGATEWAY（商標）技術マニュアルを参照されたい。
【０７１７】
pLenti4/V5-DESTベクター、pLenti6/V5-DESTベクター、またはpLenti6/UbC/V5-DESTベクターは、スーパーコイルプラスミドとして供給される。GATEWAY（商標）技術マニュアルは、以前には、より効率的な組換えのために線状化デスティネーションベクターを使用することを推奨してきたが、Invitrogenでのさらなる試験により、pLenti6/V5-DEST（商標）の線状化は、いかなる下流への適用において最適な結果を得るためには必要とされないことが見い出された。
【０７１８】
pLenti4/V5-DESTベクター、pLenti6/V5-DESTベクター、またはpLenti6/UbC/V5-DESTベクターを増殖および維持するために、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAからのLibrary Efficiency（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞（カタログ番号11782-018）が形質転換のために推奨される。DB3.1（商標）大腸菌株はCcdB効果に対して抵抗性であり、ccdB遺伝子を含むプラスミドの増殖を補助し得る。ベクターの完全性を維持するために、50〜100μg/mlアンピシリンおよび15μg/mlクロラムフェニコールを含む培地中で形質転換体を選択する。本発明のこの局面の1つの代替において、カセットにおけるクロラムフェニコール耐性遺伝子はスペクチノマイシン耐性遺伝子によって置き換えることができ（Hollingsheadら、Plasmid 13(1):17-30 (1985)、NDBIアクセッション番号X02340 M10241）、そしてccdB遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子に隣接するattP部位を含むデスティネーションベクターがアンピシリン/スペクチノマイシン含有培地上で選択され得る。クロラムフェニコール選択の代わりにスペクチノマイシン選択を使用すると選択プレート上で得られるコロニーの数が増加することが最近見い出され、このことは、スペクチノマイシン耐性遺伝子の使用は、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むカセットを使用して観察されるものよりもクローニングの効率を上げる可能性があることを示す。増殖および維持のためにTOP10またはDH5αを含む一般的な大腸菌クローニング株は使用しない。これらの株はCcdB効果に感受性であるからである。
【０７１９】
pLenti4/V5-DEST、pLenti6/V5-DEST、またはpLenti6/UbC/V5-DESTに関心対象の配列を組換えるために、その配列を含むエントリークローンが作製されなければならない。エントリークローンの生成を容易にするための多くのベクター（pENTR/D-TOPO（登録商標）を含む）がInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能である。
【０７２０】
pLenti4/V5-DEST、pLenti6/V5-DEST、およびpLenti6/UbC/V5-DESTはC末端融合ベクターである。関心対象の配列およびベクター中に存在するそれに伴うV5エピトープコード配列によってコードされるポリペプチドである融合ポリペプチドを発現させるために、関心対象の配列は、哺乳動物細胞における翻訳の正確な開始のためのコザック（Kozak）翻訳開始配列の関連内でATG開始コドンを含まなくてはならない（Kozak、1987；Kozak、1991；Kozak、1990）。コザックコンセンサス配列の例は
2005532829.tif 000066
である。他の配列が可能であるが、-3位のGまたはA、および+4位のGは機能上最も重要である（太字で示す）。ATGコドンに下線を付す。関心対象の配列によってコードされるポリペプチドのリーディングフレームは、組換え後にV5エピトープを含むC末端タグとインフレームでなくてはならず、および関心対象の配列はこのリーディングフレームにおいて終止コドンを含んではならない。V5エピトープおよびattB2部位を含むC末端ペプチドには、関心対象の配列によってコードされるポリペプチドのサイズ約4.5kDaが付け加えられる。
【０７２１】
各エントリークローンは関心対象の遺伝子に隣接するattL部位を含む。各エントリークローンにおける遺伝子は、DNAを、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるGATEWAY（商標）LR Clonase（商標）酵素ミックスと混合することによってデスティネーションベクター主鎖に移される。次いで、得られる組換え反応物を大腸菌（例えば、TOP10またはDH5α（商標）-T1R）に形質転換し、そして発現クローンを選択する（例えば、アンピシリンおよびブラスチシジンを使用する）。デスティネーションベクター上のattR部位と、エントリークローン上のattL部位との間の組換えにより、クロラムフェニコール（CmR）遺伝子およびccdBが関心対象の遺伝子で置き換えられ、その結果、発現クローンにおいてattB部位が形成される。
【０７２２】
任意のrecA、endA 大腸菌株（TOP10、DH5α（商標）または等価物を含む）が形質転換のために使用され得る。F'エピソームを含む大腸菌株（例えば、TOP10F'）にはLR反応混合物を形質転換しない。これらの株はccdA遺伝子を含み、かつccdB遺伝子を用いたネガティブ選択を妨害する。
【０７２３】
大腸菌を組換え反応を用いて形質転換する場合（pLenti4/V5-DEST、pLenti6/V5-DEST、またはpLenti6/UbC/V5-DEST×エントリークローン）、アンピシリンを含むLB寒天プレート上で形質転換体を選択したときに5'LTRと3'LTRとの間の望ましくない組換え（5％未満）が観察された。これらの事象は、選択が100μg/mlアンピシリンおよびさらなる選択（例えば、pLenti6/V5-DESTもしくはpLenti6/UbC/V5-DESTのための50μg/mlブラスチシジン、またはpLenti4/V5-DESTのための25μg/ml Zeocin（商標））を使用して実施される場合に、低い頻度で起こる。Zeocin（商標）が活性であるためには、細菌培地の塩濃度は<90mMでなければならず、かつpHは7.5でなければならない。それゆえに、50〜100μg/mlアンピシリンおよびさらなる選択剤を含むLB寒天プレート上での選択が推奨される。形質転換された大腸菌は、アンピシリンおよびブラスチシジンを含むLB培地中ではよりゆっくりと増殖し、目視できるコロニーを得るには若干長めのインキュベーション時間を必要とし得ることに注意されたい。組換えプラスミドを含む形質転換体は、一般的に、インタクトなプラスミドを含む形質転換体よりも大きなコロニーを生じる。
【０７２４】
ccdB遺伝子は非常に低い頻度で変異し、これは非常に少ない数の偽陽性を生じる。真の発現クローンは、クロラムフェニコール感受性、ならびにアンピシリンおよびブラスチシジン耐性（pLenti6ベクターについて）、ならびにアンピシリンおよびZeocin（商標）耐性（pLenti4/V5-DESTについて）である。変異したccdB遺伝子を有するプラスミドを含む形質転換体は、必要に応じて、アンピシリン、ブラスチシジン、またはZeocin（商標）、およびクロラムフェニコール耐性である。推定の発現クローンをチェックするために、30μg/mlクロラムフェニコールを含むLBプレート上での増殖について試験する。真の発現クローンはクロラムフェニコールの存在下で増殖しないはずである。
【０７２５】
図46Aは、関心対象の配列との組換え反応後のpLenti6/V5-DEST（商標）またはpLenti4/V5-DESTの組換え領域の図を提供する。影を付けた領域は、組換えによってエントリークローンからpLenti6/V5-DEST（商標）ベクターに移動した関心対象の配列に相当する。影を付けていない領域はpLenti6/V5-DEST（商標）ベクターまたはpLenti4/V5-DESTベクターに由来する。pLenti4/V5-DEST配列およびpLenti6/V5-DEST（商標）配列の塩基2448位および4130位に印を付けている。制限部位は実際の切断部位を示すために標識される。
【０７２６】
図46Bは、pLenti6/UbC/V5-DEST×エントリークローンから生じる発現クローンの組換え領域を示す。この図はUbCプロモーターの完全配列を含まないことに注意されたい。UbCプロモーターの図については図46Cを参照されたい。図46Bにおける影を付けた領域は、組換えによってエントリークローンからpLenti6/UbC/V5-DESTベクターに移動したDNA配列に相当する。影を付けていない領域はpLenti6/UbC/V5-DESTベクターに由来する。pLenti6/UbC/V5-DEST配列の塩基3079位および4762位に印を付けている。
【０７２７】
一旦発現クローンがpLenti6/V5-DEST主鎖に生成されたならば、50〜100μg/mlアンピシリンを含むLB培地中でプラスミドを維持および増殖させる。ブラスチシジンの添加は必要ない。
【０７２８】
関心対象の遺伝子がC末端タグとインフレームであることを確認するために、所望の場合、発現構築物をシークエンシングする。発現構築物のシークエンシング用に使用するための推奨されるプライマー結合部位（CMVまたはUbCフォワードプライミング部位およびV5（C末端）リバースプライミング部位）の位置については図46を参照されたい。pLenti4/V5-DESTまたはpLenti6/V5-DEST構築物をシークエンシングするために、
CMVフォワードプライマー
2005532829.tif 000067
およびV5（C末端）リバースプライマー
2005532829.tif 000068
を使用し得る。pLenti6/UbC/V5-DEST構築物をシークエンシングするために、
UBフォワードプライマー
2005532829.tif 000069
およびV5（C末端）リバースプライマー
2005532829.tif 000070
を使用できる。
【０７２９】
一旦、発現構築物の精製プラスミドDNAが得られれば、ウイルスストックを調製し、上記のような選択の細胞株に形質導入するために使用できる。発現クローンを含む宿主細胞は、アンピシリンを有するLB培地中で増殖させることができる。さらなる選択剤を加える必要はない。
【０７３０】
高度な塩および酸性または塩基性はZeocin（商標）を不活性化する。それゆえに、薬物を活性に保つためには、細菌培地中の塩を減らし、かつpHを7.5に調整することが推奨される。pHおよび塩濃度はZeocin（商標）を含む組織培養培地を調製する際には調整の必要がないことに注意されたい。Zeocin（商標）を-20℃に保存し、そして使用前に氷上で融解する。Zeocin（商標）は光感受性である。薬物、および薬物を含むプレートまたは培地は暗所で+4℃に保存する。Zeocin（商標）を含む培養培地は、光に対する露出から保護して+4℃で、1ヶ月まで保存できる。Zeocin（商標）含有溶液を取り扱う際には、手袋、実験室用コート、および安全眼鏡またはゴーグルを着用する。Zeocin（商標）は毒性である。この薬物を含有する溶液を摂取または吸入してはならない。
【０７３１】
pLenti6/V5-DEST（商標）ベクター（8688bp）は、示された位置に以下の特徴を含む。pLenti6/V5-DESTプラスミドにおける特徴の位置は以下の通りである：RSV/5'LTRハイブリッドプロモーター 塩基1〜410位；RSVプロモーター 塩基1〜229位；HIV-1 5'LTR 塩基230〜410位；5'スプライスドナー 塩基520位；HIV-1プサイ（Ψ）パッケージングシグナル 塩基521〜565位；HIV-1 Rev応答エレメント（RRE）塩基1075〜1308位；3'スプライスアクセプター 塩基1656位；3'スプライスアクセプター 塩基1684位；CMVプロモーター 塩基1809〜2392位；attR1部位 塩基2440〜2564位；クロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）塩基2673〜3332位；ccdB遺伝子 塩基3674〜3979位；attR2部位 塩基4020〜4144位；V5エピトープ 塩基4197〜4238位；SV40初期プロモーターおよび起点 塩基4293〜4602位；EM7プロモーター 塩基4657〜4723位；ブラスチシジン耐性遺伝子 塩基4724〜5122位；ΔU3/3'LTR 塩基5208〜5442位；ΔU3 塩基5208〜5261位；3'LTR 塩基5262〜5442位；SV40ポリアデニル化シグナル 塩基5514〜5645位；blaプロモーター 塩基6504〜6602位；アンピシリン（bla）耐性遺伝子 塩基6603〜7463位；ならびにpUC起点 塩基7608〜8281位。
【０７３２】
pLenti4/V5-DESTベクター（8634ヌクレオチド）は、示された位置に以下の特徴を含む：RSV/5'LTRハイブリッドプロモーター 塩基1〜410位；RSVプロモーター 塩基1〜229位；HIV-1 5'LTR 塩基230〜410位；5'スプライスドナー 塩基520位；HIV-1プサイ（Ψ）パッケージングシグナル 塩基521〜565位；HIV-1 Rev応答エレメント（RRE）塩基1075〜1308位；3'スプライスアクセプター 塩基1656位；3'スプライスアクセプター 塩基1684位；CMVプロモーター 塩基1809〜2392位；attR1部位 塩基2440〜2564位；クロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）塩基2673〜3332位；ccdB遺伝子 塩基3674〜3979位；attR2部位 塩基4020〜4144位；V5エピトープ 塩基4197〜4238位；SV40初期プロモーターおよび起点 塩基4293〜4602位；EM7プロモーター 塩基4621〜4687位；Zeocin（商標）耐性遺伝子 塩基4688〜5062位；ΔU3/3'LTR 塩基5154〜5388位；ΔU3 塩基5154〜5207位；3'LTR 塩基5208〜5388位；SV40ポリアデニル化シグナル 塩基5460〜5591位；blaプロモーター 塩基6450〜6548位；アンピシリン（bla）耐性遺伝子 塩基6549〜7409位；ならびにpUC起点 塩基7554-8227。
【０７３３】
pLenti6/UbC/V5-DESTベクター（9320ヌクレオチド）は、示された位置に以下の特徴を含む：RSV/5'LTRハイブリッドプロモーター 塩基1〜410位；RSVプロモーター 塩基1〜229位；HIV-1 5'LTR 塩基230〜410位；5'スプライスドナー 塩基520位；HIV-1プサイ（Ψ）パッケージングシグナル 塩基521〜565位；HIV-1 Rev応答エレメント（RRE）塩基1075〜1308位；3'スプライスアクセプター 塩基1656位；3'スプライスアクセプター 塩基1684位；UbCプロモーター 塩基1798〜3016位；attR1部位 塩基3072〜3196位；クロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）塩基3305〜3964位；ccdB遺伝子 塩基4306〜4611位；attR2部位 塩基4652〜4776位；V5エピトープ 塩基4829〜4870位；SV40初期プロモーターおよび起点 塩基4925〜5234位；EM7プロモーター 塩基5289〜5355位；ブラスチシジン耐性遺伝子 塩基5356〜5754位；ΔU3/3'LTR 塩基5840〜6074位；ΔU3 塩基5840〜5893位；3'LTR 塩基5894〜6074位；SV40ポリアデニル化シグナル 塩基6146〜6277位；blaプロモーター 塩基7136〜7234位；アンピシリン（bla）耐性遺伝子 塩基7235〜8095位；ならびにpUC起点 塩基8240-8913。
【０７３４】
実施例12
ViraPower（商標）レンチウイルス発現システム用発現ベクターへの平滑末端PCR産物の指向性TOPO（登録商標）クローニング（5分間）
トポイソメラーゼを用いた核酸セグメントのクローニングには、以下のプロトコールが使用され得る。当業者に公知の他のプロトコールもまた適切である。別の適切なプロトコールの例は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるpENTR指向性TOPO（登録商標）クローニングキットマニュアル（カタログ番号25-0434）に見い出すことができる。
2005532829.tif 000071
【０７３５】
対照反応を実施するために、キットと共に含まれる対照PCR鋳型および対照OCRプライマーを使用することが推奨される。以下のプロトコールを詳細に参照されたい。
【０７３６】
pLenti6/V5指向性TOPO（登録商標）クローニングキットはドライアイス上で出荷され、2つの箱を含む。受領次第、以下に詳述されるように箱を保存する。
2005532829.tif 000072
【０７３７】
pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）試薬（箱1）を以下に列挙する。使用者は、熱安定性プルーフリーディングポリメラーゼおよび適切なPCR緩衝液を調達しなくてはならないことに注意されたい。
-20℃の保存箱1
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【０７３８】
CMVフォワードシークエンシングプライマーおよびV5（C末端）リバースシークエンシングプライマーの配列。各プライマー2μgは以下の通りである。
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【０７３９】
TOP10細胞は以下の遺伝子型を有する：F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 deoR araD139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA nupG。形質転換効率は1×109cfu/μg DNAであり、これらは-80℃に保存すべきである。
【０７４０】
pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）ベクターは、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるViraPower（商標）レンチウイルス発現システムとともに使用するために設計されている。ViraPower（商標）レンチウイルス発現システムならびに他のViraPower（商標）レンチウイルス補助製品および発現ベクターについての注文案内は以下に提供される。詳細については、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAウェブサイトを参照されたい。
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【０７４１】
pLenti6/V5指向性TOPO（登録商標）クローニングキットにおいて供給されるいくつかの試薬、ならびにこのキットとともに使用するために適切な他の試薬は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能である。これらの試薬についての注文案内は以下に提供される。
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【０７４２】
pLenti6/V5指向性TOPO（登録商標）クローニングキットは、ViraPower（商標）レンチウイルス発現システムをTOPO（登録商標）クローニング技術と組み合わせて、分裂している哺乳動物細胞および分裂していない哺乳動物細胞における発現用ベクターへの平滑末端PCR産物の挿入のための、高効率で迅速なクローニング戦略を提供する。TOPO（登録商標）クローニングは、リガーゼ、PCR後の手順、または制限酵素を必要としない。
【０７４３】
pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるViraPower（商標）レンチウイルス発現システム（カタログ番号K4950-00）を使用して哺乳動物細胞中で迅速で指向性のTOPO（登録商標）クローニングおよびPCR産物の高レベル発現を容易にするように設計された7.0kbの発現ベクターである。このベクターの特徴には以下が含まれる：RSVエンハンサー/プロモーター 塩基1〜229位；HIV-1 5'LTR 塩基230〜410位；5'スプライスドナー 塩基520位；HIV-1プサイ（Ψ）パッケージングシグナル 塩基521〜565位；HIV-1 Rev応答エレメント（RRE）塩基1075〜1308位；3'スプライスアクセプター 塩基1656位；3'スプライスアクセプター 塩基1684位；CMVプロモーター 塩基1809〜2392位；CMVフォワードプライミング部位 塩基2274〜2294位；指向性TOPO（登録商標）部位 塩基2431〜2444位；V5エピトープ 塩基2473〜2514位；V5（C末端）リバースプライミング部位 塩基2482〜2502位；SV40初期プロモーターおよび起点 塩基2569〜2878位；EM7プロモーター 塩基2933〜2999位；ブラスチシジン耐性遺伝子 塩基3000〜3398位；ΔU3/HIV-1 3'LTR 塩基3485〜3718位；ΔU3 塩基3485〜3537位；短縮型HIV-1 3'LTR 塩基3538〜3718位；SV40ポリアデニル化シグナル 塩基3790〜3921位；blaプロモーター 塩基4780〜4878位；アンピシリン（bla）耐性遺伝子 塩基4879〜5739位；ならびにpUC起点 塩基5884-6557。
【０７４４】
対照プラスミドであるpLenti6/V5-GW/lacZは、選択の哺乳動物細胞株において陽性発現対照として使用され得る。
【０７４５】
ViraPower（商標）レンチウイルス発現システムは、複製コンピテントでないレンチウイルスを使用して、分裂している哺乳動物細胞および分裂していない哺乳動物細胞への標的遺伝子の、高度に効率的なインビボ送達またはインビトロ送達を容易にする。Cell Genesysによって開発されたlentikat（商標）システム（Dullら、1998）に基づいて、ViraPower（商標）レンチウイルス発現システムでは、伝統的なレトロウイルス系よりも広範囲の細胞株における高レベル遺伝子発現が可能となり、一方でそのバイオセーフティーを高めるといった特徴を有する。ViraPower（商標）レンチウイルス発現システムを使用して哺乳動物細胞中で関心対象の遺伝子を発現するためには、
1. 関心対象の遺伝子をpLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）にTOPO（登録商標）クローニングして、発現構築物を作製する。
2. pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）発現プラスミドおよびViraPower（商標）パッケージングミックスを293FT細胞株に同時トランスフェクトして、レンチウイルスを産生する。
3. レンチウイルスストックを使用して、選択の哺乳動物細胞株に形質導入する。
4. 組換えタンパク質の「一過性」発現をアッセイするか、またはブラスチシジン選択を使用して安定な細胞株を生成する。
【０７４６】
組換えレンチウイルスを作製するための詳細なプロトコールは公知である（例えば、ViraPower（商標）レンチウイルス発現システムマニュアル、カタログ番号K4950-00、K4960-00、K4970-00、K4975-00、K49580-00、K49585-00、およびK49590-00、バージョンD、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）。
【０７４７】
TOPO（登録商標）充填オリゴヌクレオチドを使用する二本鎖DNAの指向性結合は、入ってくるDNAに3'一本鎖末端（突出）を付加することによって起こる（ChengおよびShuman、2000、Mol. Cell. Biol. 20, 8059-8068）。この一本鎖突出はTOPO（登録商標）充填DNAフラグメントの5'末端と同一である。pLenti6/V5-D-ベクターは4ヌクレオチド突出配列を含む。
【０７４８】
この系において、PCR産物はフォワードプライマーに対して4塩基（CACC）を付加することによって指向性にクローニングされる。クローニングベクター中の突出（GTGG）はPCR産物の5'末端に侵入し、付加された塩基にアニーリングし、そして正しい方向のPCR産物を安定化させる。挿入物は、90％以上の効率で正しい方向でクローニングされ得る。この過程の模式図は図47に示される。
【０７４９】
関心対象の遺伝子を増幅するためのPCRプライマーの設計は発現にとって重要である。PCRプライマーを設計する際には以下を考慮する：指向性クローニングを容易にするために必要である配列；PCR産物の適切な翻訳開始に必要である配列；およびPCR産物によって含まれるコード配列がC末端エピトープタグとインフレームで融合されるか否か。
【０７５０】
フォワードPCRプライマーを設計する際には以下の点を考慮する。pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）のTOPO（登録商標）クローニング部位の図については図48を参照されたい。
【０７５１】
指向性クローニングを可能にするために、フォワードPCRプライマーは、プライマーの5'末端に配列CACCを含まなくてはならない。4ヌクレオチドCACCは、pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）における突出配列GTGGとの塩基対を形成する。
【０７５２】
関心対象の配列は、翻訳の適切な開始のためにATG開始コドンを有するコザック翻訳開始配列を含むべきである（Kozak、1987；Kozak、1991；Kozak、1990）。コザックコンセンサス配列の例は
2005532829.tif 000077
である。他の配列が可能であるが、-3位におけるGまたはAおよび+4位におけるGは機能上最も重要である（太字で示す）。ATG開始コドンに下線を付す。
【０７５３】
以下は理論上のタンパク質のN末端におけるDNA配列およびフォワードPCRプライマーのための提案される配列である。ATG開始コドンに下線を付す。
2005532829.tif 000078
【０７５４】
フォワードPCRプライマーが上記のように設計される場合、このプライマーは、指向性クローニングに必要とされる4ヌクレオチドCACCを含み、かつATG開始コドンはコザック配列の関連内に収まり（枠で囲んだ配列を参照されたい）、哺乳動物細胞におけるPCR産物の適切な翻訳開始が可能となる。5'CACC突出に続くPCR産物の最初の3つの塩基対は機能的コドンを構成する。
【０７５５】
リバースPCRプライマーを設計する際には以下の点を考慮する。pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）のTOPO（登録商標）クローニング部位の図については図48を参照されたい。PCR産物が高効率で指向性にクローニングされることを確実にするために、リバースPCRプライマーは5'末端における突出配列GTGGに相補的であるべきではない。1塩基対のミスマッチは指向性クローニング効率を90％から50％に減少させることがあり、反対の方向にPCR産物をクローニングする可能性が高まる（以下を参照されたい）。2つの塩基対のミスマッチにより反対方向にPCR産物がクローニングされた証拠は観察されていない。
【０７５６】
PCR産物をV5エピトープを含むC末端タグとインフレームで融合させるために、リバースPCRプライマーは、関心対象の遺伝子の天然型の終止コドンを除去するように設計され得る（以下を参照されたい）。発現されるポリペプチド上で天然型のC末端を産生するためには、リバースプライマー中に終止コドンを含む天然型の配列を含めるか、または終止コドンがリバースPCRプライマー結合部位から上流に位置していることを確認する。
【０７５７】
リバースプライマー設計の第1の例
以下は理論上のタンパク質のC末端における配列である。終止コドンに下線を付す。
2005532829.tif 000079
【０７５８】
タンパク質をpLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）中のC末端タグとインフレームで融合させるために、終止コドンのすぐ上流のコドンで開始するが、最後の2つのコドンは4bp突出配列と同一であるGTGG（以下に下線を付す）を含むリバースPCRプライマーを設計する。結果として、このリバースプライマーは4bp突出配列に相補的であり、PCR産物が反対の方向でクローニングされる可能性を増加させる。この状況は回避されるべきである。
2005532829.tif 000080
【０７５９】
別の解決法は、終止コドンのすぐ下流にハイブリダイズするが、なおORFのC末端を含むようなリバースプライマーを設計することである。終止コドンは、グリシン、アラニン、またはリジンのような無害なアミノ酸のコドンによって置き換えられる必要があることに注意されたい。
【０７６０】
リバースプライマー設計の第2の例
以下は理論上のタンパク質のC末端における配列である。終止コドンに下線を付す。
2005532829.tif 000081
【０７６１】
ORFをpLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）中のC末端タグとインフレームで融合させるために、最後のコドン（TRC）に相補的なヌクレオチドで開始することによって終止コドンを除去し、かつ上流へと続ける。リバースプライマーは
2005532829.tif 000082
である。
【０７６２】
これは、終止コドンなしでC末端を増幅し、かつORFをインフレームでC末端タグと結合させる。ORFがインフレームでC末端タグと結合することを回避するためには、終止コドンを含むようにリバースプライマーを設計する。
2005532829.tif 000083
【０７６３】
pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）は平滑末端PCR産物を受容する。PCR用のプライマーには5'リン酸を加えない。これはpLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）ベクターへのライゲーションを妨害する。とりわけそれらが長い場合に（>30ヌクレオチド）、オリゴヌクレオチドをゲル精製することが推奨される。pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）は、トポイソメラーゼIを用いて適合された両方の末端で線状化されて供給されることに注意されたい（図47を参照されたい）。pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）の配列は表18として提供される。
【０７６４】
一旦、PCR戦略が決定されかつプライマーが合成されれば、平滑末端PCR産物を、熱安定性のプルーフリーディングポリメラーゼ（PCR用のThermalAce（商標）、Platinum（登録商標）Pfx、Pfu、またはVent（登録商標）が含まれるがこれらに限定されない）を使用して産生することができる。
【０７６５】
平滑末端PCR産物を産生するには製造業者の指示書および推奨に従う。単一で別個のPCR産物を産生するようにPCR条件を最適化することが重要である。PCRフラグメントは標準的な技術を使用してゲル精製され得る。
【０７６６】
すべてのPCR産物が完全に伸長されることを確実にするために、PCR反応において、7〜30分間の最終伸長が使用される。
【０７６７】
PCR反応後、PCR産物は、PCR産物の質および量を確認するために、各PCR反応物から5〜10μlを取り出し、かつアガロースゲル電気泳動を使用することによってチェックされるべきである。正しいサイズの単一で別個のバンドについてチェックする。単一で別個のバンドが存在しない場合は、選択のポリメラーゼを用いてPCRを最適化するための製造業者の推奨に従う。または、所望の産物をゲル精製する。
【０７６８】
PCR産物の濃度を見積もる。5:1モル濃度比率のPCR産物：TOPO（商標）ベクターが最大のTOPO（登録商標）クローニング効率を得るために推奨される（例えば、TOPO（登録商標）クローニング反応において5〜10ngの1kb PCR産物または10〜20ngの2kb PCR産物を使用する）。必要に応じて、TOPO（登録商標）クローニングに進む前にPCR産物の濃度を調整する。ThermalAce（商標）ポリメラーゼが平滑末端PCR産物を産生するために使用される場合、ThermalAce（商標）は他のプルーフリーディングポリメラーゼよりも高い収率を生じ得ることに注意されたい。0.5〜1.0kbの範囲のPCR産物を生じる場合、一般的に、TOPO（登録商標）クローニング反応を実施する前に、PCR反応は1×ThermalAce（商標）緩衝液中で1:5に希釈され得る。1.0kbよりも大きなPCR産物については希釈は必要とされない場合がある。
【０７６９】
TOPO（登録商標）クローニング反応に塩（250mM NaCl、10mM MgCl2）を含めることは形質転換体の数の増加を生じ得る。それゆえに、TOPO（登録商標）クローニング反応に塩を加えることが推奨される。ストック塩溶液がこの目的のためにキット中で供給される。TOPO（登録商標）クローニング反応に加えられる塩の量は、ケミカルコンピテント細胞（提供される）またはエレクトロコンピテント細胞のいずれが形質転換されるかに依存して変化することに注意されたい。この理由のために、2つの異なるTOPO（登録商標）クローニング反応が、最良の可能な結果を得るために提供される。
【０７７０】
ケミカルコンピテント大腸菌を形質転換する。TOPO（登録商標）クローニングおよびケミカルコンピテント大腸菌への形質転換のために、最終濃度250mM NaCl、10mM MgCl2まで塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムを加えることにより、時間の経過とともにコロニーの数を増大させる。塩溶液（1.2M NaCl、0.06M MgCl2）は、推奨された濃度のNaClおよびMgCl2にTOPO（登録商標）クローニング反応を調整するために提供される。
【０７７１】
エレクトロコンピテント大腸菌を形質転換する。エレクトロコンピテント大腸菌の形質転換のために、TOPO（登録商標）クローニング反応における塩の量は作用を妨害するために減少されるべきである（例えば、50mM NaCl、2.5mM MgCl2まで）。TOPO（登録商標）クローニング反応への都合よく添加するために、塩溶液を水で4倍に希釈して300mM NaCl、15mM MgCl2溶液を調製する（以下を参照されたい）。
【０７７２】
TOPO（登録商標）クローニング反応を設定する。以下の表は、ケミカルコンピテントOne Shot（登録商標）TOP10 大腸菌（提供される）またはエレクトロコンピテント細胞のいずれかへの永続的な形質転換のために、いかにしてTOPO（登録商標）クローニング反応（6μl）を設定するかを記載する。TOPO（登録商標）クローニング反応を最適化する際のさらなる情報は本明細書中に見い出され得る。PCR産物がThermalAce（商標）ポリメラーゼを使用して生成された場合、先に進む前にPCR反応物を希釈することが必要となり得ることに注意されたい。TOPO（登録商標）ベクター溶液の青色は正常であり、溶液を可視化するために使用される。
2005532829.tif 000084
＊すべての試薬は完了した時点で-20℃に保存する。塩溶液および水は室温または+4℃で保存できる。
【０７７３】
TOPO（登録商標）クローニング反応を実施する。反応物を穏やかに混合し、室温で（22〜23℃）5分間インキュベートする。大部分の適用のために、5分間は分析のための多数のコロニーを生じる。必要性に依存して、TOPO（登録商標）クローニング反応の長さは、30秒間〜30分間まで変化され得る。PCR産物の日常的なサブクローニングのためには、30秒間が十分となりうる。大きなPCR産物（>1kb）またはPCR産物のTOPO（登録商標）クローニングのプールのためには、反応時間を増加させることでより多くのコロニーを得ることができる。
【０７７４】
反応物を氷上に置き、標準的なプロトコールを使用して適切な宿主細胞を形質転換する。TOPO（登録商標）クローニング反応物を-20℃で一晩保存してもよい。
【０７７５】
One Shot（登録商標）TOP10コンピテント大腸菌を形質転換する。一旦TOPO（登録商標）クローニング反応が実施されたら、pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）構築物がコンピテント大腸菌に形質転換される。One Shot（登録商標）TOP10ケミカルコンピテント大腸菌（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）は形質転換を容易にするためにキットと共に含まれるが、しかし、エレクトロコンピテント細胞もまた使用され得る。ケミカルコンピテント大腸菌またはエレクトロコンピテント大腸菌を形質転換するためのプロトコールは当業者に公知である。pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）は、形質転換体の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子およびブラスチシジン耐性遺伝子を含む。形質転換体がアンピシリンを含むLB寒天プレート上で選択される場合に、5'LTRと3'LTRとの間の望ましくない組換え（5％未満）が観察された。これらの事象は、形質転換体がアンピシリンおよびブラスチシジンを含むLB寒天プレート上で選択される場合には、この事象が起きる頻度はより少ない。形質転換体は、50〜100μg/mlアンピシリンおよび50μg/mlブラスチシジンを含むLB寒天プレート上で選択されるべきである。形質転換された大腸菌がアンピシリンおよびブラスチシジンを含むLB寒天プレート上でよりゆっくりと増殖し、かつ目視できるコロニーを得るためには若干長めのインキュベーション時間を必要とし得ることに注意されたい。
【０７７６】
組換えプラスミドを含む形質転換体は、一般的には、インタクトなプラスミドを含む形質転換体よりもより大きなコロニーを生じる。挿入物の存在について青色-白色スクリーニングが存在する。大部分の形質転換体は正しい方向でクローニングされた関心対象のPCR産物を伴う組換えプラスミドを含む。シークエンシングプライマーは、マルチプルクローニング部位中の挿入物にわたってシークエンシングし、方向およびリーディングフレームを確認するために、キットに含められる。
【０７７７】
TOPO（登録商標）クローニング反応に希釈塩溶液を加える際は、反応中のNaClおよびMgCl2の最終濃度をそれぞれ50mMおよび2.5mMにする。エレクトロポレーションの際に試料の放電を阻止するために、細胞の容量は50〜80μl（0.1cmキュベット）または100〜200μl（0.2cmキュベット）の間であるべきである。形質転換の際に放電が見られる場合は、エレクトロポレーターを荷電するために通常使用される電圧を10％減少させること、負荷抵抗を100オームに低下してパルス長を減少させること、および/またはTOPO（登録商標）クローニング反応物をエタノール沈殿し、エレクトロポレーションの前に水中に再懸濁させることを試みる。
【０７７８】
形質転換およびプレーティング後、5つのコロニーを拾い、それらを、50〜100μg/mlアンピシリンを含むLBまたはSOB中で一晩培養する。ブラスチシジンの付加は必要とされない。選択の方法を使用してプラスミドDNAを単離する。超高純度プラスミドDNAが自動化またはマニュアルでのシークエンシングのために必要とされる場合、S.N.A.P.（商標）ミディプレップキット（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号K1910-01）が使用され得る。挿入物の存在および正しい方向を確認するために制限分析によってプラスミドを分析する。1度ベクター中で切断し、かつ1度挿入物中で切断した、制限酵素または制限酵素の組み合わせを使用する。
【０７７９】
シークエンシング
関心対象の配列が正しい方向で、かつV5エピトープとインフレームにクローニングされていることを確認するために、構築物をシークエンシングすることができる。CMVフォワードプライマーおよびV5（C末端）リバースプライマーがキットに含められ、および挿入物をシークエンシングするために使用され得る。
【０７８０】
表18に示されるpLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）の配列は、CACCにハイブリダイズする突出配列（GTGG）を含む。
・PCRによって形質転換体を分析する。形質転換体はPCRを使用して分析し得る。PCRプライマーについては、CMVフォワードプライマーまたはV5（C末端）リバースプライマーおよび挿入物内にハイブリダイズするプライマーの組み合わせを使用する。適切な増幅条件は当業者によって決定され得る。PCR反応からの結果は並行して制限分析を行うことによって確認され得る。ミスプリンティングまたは鋳型の夾雑により、PCR反応においてアーティファクトが得られ得る。
【０７８１】
形質転換体または正しい挿入物が得られない場合は、以下に記載される対照反応を実施する。
【０７８２】
一旦正しいクローンが同定されたら、そのプラスミドを含む細菌のグリセロールストックが長期保存のために調製され得る。また、プラスミドDNAのストックが調製され、-20℃で保存され得る。
【０７８３】
一旦、pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）発現プラスミドを含む宿主細胞が調製されたら、50-100μg/mlアンピシリンを含むLB培地中でそのプラスミドを維持および増殖させる。ブラスチシジンの付加は必要ない。
【０７８４】
TOPO（登録商標）クローニング反応の最適化
高効率のTOPO（登録商標）クローニングはクローニング過程を合理化する。PCR産物をクローニングする過程をスピードアップするために、TOPO（登録商標）クローニング反応を、5分間の代わりに30秒間のみインキュベートし得る。より少ない形質転換体が得られ得る；しかし、TOPO（登録商標）クローニングの高効率のために、形質転換の大部分が挿入物を含む。TOPO（登録商標）クローニング反応物2μlをケミカルコンピテント細胞に加えた後に、氷上で5分間のみインキュベートする。インキュベーション時間を30分間まで増加させることは、形質転換効率を有意に改善しない。
【０７８５】
大きなPCR産物、毒性遺伝子、またはPCR産物のクローニングプールをTOPO（登録商標）クローニングする場合、所望のクローンを得るためにより多くの形質転換体が必要とされ得る。コロニーの数を増加させるために、塩を補充したTOPO（登録商標）クローニング反応は、5分間ではなく20〜30分間インキュベートする。塩を補充したTOPO（登録商標）クローニング反応のインキュベーション時間を増加することにより、より多くの分子がライゲーションされ、かつ形質転換効率が増大し得る。塩の付加は、トポイソメラーゼIがPCR産物をライゲーションしかつDNAから解離した後で、トポイソメラーゼIがDNAに再結合しかつそれにニックを入れることを妨害するようである。
【０７８６】
希釈PCR産物をクローニングするために、PCR産物の量を増加し、TOPO（登録商標）クローニング反応物を20〜30分間インキュベートし、および/またはPCR産物を濃縮する。
【０７８７】
一旦、関心対象の配列がpLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）にTOPO（登録商標）クローニングされれば、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAからのViraPower（商標）レンチウイルス発現システムをウイルスストックの産生に使用でき、次いでこれは、組換えタンパク質発現用の選択の哺乳動物細胞株に形質導入するために使用できる（上記と同様に）。
【０７８８】
実施例13
293FT細胞株の増殖および維持
293FT細胞株は、当業者に公知の任意の技術を使用して、例えば、細胞を凍結することおよびそれをドライアイス上に移すことによって、移動できる。長期保存のために、細胞は液体窒素中で保存され得る。293FT細胞株は、1mlの凍結培地中に3×106凍結細胞を含む1つのバイアルとして供給される。
【０７８９】
293FT細胞株は遺伝的に改変され、およびpUC由来プラスミドpCMVSPORT6TAg.neoを有する。このベクターのマップは図49として提供される。pCMVSPORT6TAg.neoプラスミドは、哺乳動物細胞中での安定な選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を含むように改変されたpCMVSPORT6に由来する（SouthernおよびBerg、1982、J. Molec. Appl. Gen. 1, 327-339）。ネオマイシン耐性遺伝子の発現は、SV40複製起点がそこから除去されている、SV40初期エンハンサー/プロモーターによって制御されている。このプラスミドはまた、最適なウイルス産生を容易にするために（例えば、InvitrogenのViraPower（商標）レンチウイルス発現システム）、ならびに、SV40初期プロモーターおよび起点を含むプラスミドのエピソーム性複製を可能にするために、SV40ラージT抗原をコードする遺伝子を含む。SV40ラージT抗原の発現は、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターによって制御される。
【０７９０】
293FT細胞株は293F細胞株に由来し（以下を参照されたい）、およびpCMVSPORT6TAg.neoプラスミドからのSV40ラージT抗原を安定に発現する。SV40ラージT抗原の発現は、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターによって制御され、高レベルでありかつ構成的である。pCMVSPORT6TAg.neoに関するさらなる情報については、以下を参照されたい。
【０７９１】
研究は、SV40ラージT抗原を発現しているヒト293細胞における最大ウイルス産生を実証し（Naldiniら、1996）、これは、293FT細胞を、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるViraPower（商標）レンチウイルス発現システム（カタログ番号K4950-00およびK4960-00）を使用してレンチウイルス構築物を生成するための特に適した宿主にする。
【０７９２】
293細胞株は、剪断されたヒト5型アデノウイルスDNAを用いて形質転換された初代胚性ヒト腎臓から樹立された永続的な株である（Grahamら、1977；Harrisonら、1977, Virology 77, 319-329）。E1Aアデノウイルス遺伝子はこれらの細胞において発現されかついくつかのウイルスプロモーターのトランス活性化に関与し、これらの細胞が非常に高レベルのタンパク質を産生することを可能にする。Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA（カタログ番号11625）から入手可能である293F細胞株は、293細胞株の迅速増殖改変体であり、そしてPharmacopeiaのRobert Horlickからもともと入手可能であった。
【０７９３】
抗生物質耐性
293FT細胞はpCMVSPORT6TAg.neoからのネオマイシン耐性遺伝子を安定に発現し、および以下に列挙する濃度でGeneticin（登録商標）を含む培地中で維持されるべきである。293FT細胞中でのネオマイシン耐性遺伝子の発現は、SV40エンハンサー/プロモーターによって制御される。Geneticin（登録商標）はInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから別個に入手可能である（カタログ番号11811-023）。
【０７９４】
293FT細胞のための培地
293FT細胞は、完全培地（D-MEM（高グルコース）、10％ウシ胎仔血清（FBS）、2mM L-グルタミン、1％Pen-Strep（選択的））中で増殖させることが推奨される。選択のために500μg/mlのGeneticin（登録商標）が含められるべきである。凍結させるためには、90％完全培地および10％DMSOが使用されるべきである。FBSは293FT細胞株を伴う使用のためには熱不活性化させる必要はない。293FTは、上記に列挙する濃度でGeneticin（登録商標）を含む培地中で維持されるべきである。細胞が1:5〜1:10希釈で分けられる場合、それらは一般的に3〜4日間で80〜90％コンフルエントに達する。
【０７９５】
293FT細胞を増殖および維持するためには以下の一般的ガイドラインに従う。細胞と接触するすべての溶液および器具は滅菌されなければならない。常に適切な滅菌技術を使用し、層流フード中で作業する。実験を開始する前に、樹立された細胞があること、およびいくらかの凍結ストックが手元にあることを確認する。継代初期の細胞が実験用に推奨される。Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAからの受領の際に、293FT細胞株の複数のバイアルを増殖および凍結して、継代初期の細胞が適切に供給可能であることを確認する。
【０７９６】
細胞の一般的な維持のために、293FT細胞が80〜90％コンフルエントであるときに（一般的に3〜4日毎）、これを継代する。継代前に細胞を過剰増殖させることを避ける。
【０７９７】
トリパンブルー排除法を使用して細胞生存度を決定する。対数期の培養物は>90％生存度であるべきである。
【０７９８】
細胞を融解または継代培養する場合、細胞をあらかじめ温めておいた培地に移す。
【０７９９】
細胞は適切なコンフルエント状態であるべきであり、かつトランスフェクション前には90％より大きな生存度であるべきである。
【０８００】
他のヒト細胞株を用いる場合と同様に、293FT細胞を用いて作業する場合、少なくともバイオセーフティーレベル2（BL-2）の封じ込めレベルの下で潜在的にバイオハザード性物質を取り扱う。
【０８０１】
以下のプロトコールは、293FT細胞を融解して細胞培養を開始するために設計されている。293FT細胞株は、1mlの凍結培地中に3×106細胞を含むバイアル中に供給される。
【０８０２】
細胞のバイアルを液体窒素から取り出し、37℃のウォーターバス中ですばやく融解する。細胞が完全に融解する直前に、70％エタノールを用いてバイアルの外側を汚染除去し、細胞を、Geneticin（登録商標）を含まない12mlの完全培地を含むT-75フラスコに移す。フラスコを37℃で2〜4時間インキュベートして、細胞をフラスコの底から脱離させる。培地を吸引して除き、Geneticin（登録商標）を含まない12mlの新鮮な完全培地で置き換える。細胞を37℃で一晩インキュベートする。次の日、培地を吸引して除き、そして上記に列挙した推奨濃度でGeneticin（登録商標）を含む新鮮な完全培地で置き換える。細胞をインキュベートし、および細胞が80〜90％コンフルエントになるまで（2〜7日間）毎日チェックする。
【０８０３】
細胞の継代
細胞が〜80％から90％コンフルエントになったときに、すべての培地をフラスコから除く。細胞を10ml PBSで1回洗浄して、余分な培地および血清を取り除く。血清はトリプシンのインヒビターを含む。5mlのトリプシン/ヴェルセン（EDTA）溶液を単層に加え、細胞が脱離するまで室温で1〜5分間インキュベートする。顕微鏡下で細胞をチェックし、大部分の細胞が脱離していることを確認する。細胞がなお付着している場合には、大部分の細胞が脱離するまで少し長くインキュベートする。5mlの完全培地を加えてトリプシン処理を停止する。手短にピペット中で溶液を上下させ、細胞の凝集塊を破壊する。
【０８０４】
75cm2フラスコ中で細胞を維持するために、10ml細胞懸濁物の1mlを上記から新たな75cm2フラスコに移し、Geneticin（登録商標）を含む15mlの新鮮な完全培地を加える。細胞がより早くコンフルエントに達するように、より低い希釈で（すなわち、1:4）細胞を分ける。
【０８０５】
細胞を175cm2フラスコに増量するために、Geneticin（登録商標）を含む28mlの新鮮な完全培地を3つの175cm2フラスコの各々に加え、次いで、2mlの細胞懸濁物を各フラスコに移して、総容量30mlを得る。
【０８０６】
フラスコを、加湿、37℃、5％CO2インキュベーター中でインキュベートする。
【０８０７】
細胞を維持または増量するために、必要に応じて細胞を継代する。
【０８０８】
細胞の凍結
293FT細胞株を凍結する際に、細胞を少なくとも3×106生存可能細胞/mlの密度で凍結することが推奨される。90％完全培地および10％DMSOからなる凍結培地を使用する。完全培地は血清を含む培地である。
【０８０９】
凍結培地の調製
凍結培地は使用直前に調製されるべきである。滅菌したコニカル遠心分離チューブ中で、必要とされる1ml毎に、0.9mlの新鮮な完全培地および0.1mlのDMSOを一緒に混合する。チューブを使用まで氷上に置く。使用後にすべての残りの凍結培地を廃棄する。
【０８１０】
細胞の凍結
開始前に、凍結バイアルにラベルを付け、凍結培地を調製する（上記を参照されたい）。凍結培地を氷上に保つ。細胞を収集するために、上記の凍結培地の継代において記載されたようにトリプシン処理によって調製された細胞を計数する。細胞を、250×gで5分間、室温で卓上遠心分離機でペレット化し、そして注意深く培地を吸引して除く。細胞を、冷やした凍結培地中で、少なくとも3×106細胞/mlの密度で再懸濁する。バイアルを微量遠心管ラックに入れて、細胞懸濁物の1mlのアリコートを各凍結バイアルに入れる。標準的な手順に従って、細胞を自動または手動の、速度制御凍結装置中で凍結させた。理想的な凍結保存のために、凍結速度は1分間あたり1℃の減少であるべきである。長期保存のために、バイアルを液体窒素に移す。
【０８１１】
上記の融解において概説した手順に従って、液体窒素中に凍結バイアルを保存した24時間後に、凍結細胞の生存度および回復率をチェックしてもよい。
【０８１２】
細胞のトランスフェクション
293FT細胞株は、一般的に、標準的な方法（リン酸カルシウム沈殿（ChenおよびOkayama、1987、Molec. Cell. Biiol. 7, 2745-2752; Wiglerら、1977、Cell 11, 223-232）、脂質介在トランスフェクション（Felgnerら、1989、Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; FelgnerおよびRingold、1989、Nature 337, 387-388）およびエレクトロポレーション（Chuら、1987、Nucleic Acids Res. 15, 1311-1326; ShigekawaおよびDower、1988、BioTechniques 6, 742-751）を含む）を使用するトランスフェクションに対して受け入れ可能である。典型的には、カチオン性脂質に基づくトランスフェクション試薬が293FT細胞のトランスフェクトに使用される。Lipofectamine（商標）2000（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号11668-027）が推奨されるが、他のトランスフェクション試薬も適切である。
【０８１３】
一過性トランスフェクション
293FT細胞株は、任意のプラスミドを用いて一過性にトランスフェクトされ得る。細胞がプレーティングの時点で健常であることを確認する。継代の前の細胞の過剰増殖はそれらのトランスフェクション効率を損ない得る。トランスフェクションの前日に、細胞がトランスフェクションの時点で約60％コンフルエントになるように、細胞をプレーティングする。Lipofectamine（商標）2000がトランスフェクション試薬として使用される場合、細胞がトランスフェクションの時点で90〜95％コンフルエントになるように、細胞をプレーティングする。選択の方法を使用して、プラスミド構築物を293FT細胞株にトランスフェクトする（上記を参照されたい）。トランスフェクション後、500μg/ml Geneticin（登録商標）を含む新鮮な培地を加えて、関心対象の遺伝子の発現のアッセイに進む前、24〜48時間かけて細胞を回復させる。
【０８１４】
安定な細胞株の生成
293FT細胞を宿主として使用して、大部分のプラスミドからの関心対象の遺伝子を発現する安定な細胞株を生成できる。導入されたプラスミドは、ネオマイシン耐性以外の選択マーカーを含まなくてはならないことを思い出されたい。次いで、安定な細胞株が、トランスフェクションならびにGeneticin（登録商標）および適切な選択剤を用いるデュアル選択によって生成され得る。
【０８１５】
293FTはSV40ラージT抗原を安定に発現するので、SV40の複製起点を含むプラスミドを有する安定な細胞株を生成することは推奨されない。
【０８１６】
実施例14
関心対象のタンパク質を一過性に標識するためのサプレッサーtRNAの使用
本実施例は、3つの終止コドン：アンバー（TAG）、オパール（TGA）、またはオーカー（TAA）の1つを1つのアミノ酸（例えば、セリン）として特異的に認識および解読する哺乳動物サプレッサーtRNA（例えば、tRNAser）の使用を記載する。これらの終止コドンの1つを有する関心対象の遺伝子をコードする発現プラスミドは、通常の条件下で天然型のタンパク質を発現する（図50を参照されたい）。適切なtRNAサプレッサーが供給される場合、その終止コドンは翻訳され（例えば、tRNAserが使用される場合はセリンとして）、および翻訳は任意の下流のリーディングフレームにかけて続き、特定のC末端エピトープタグを有する関心対象のタンパク質からなる融合タンパク質を作製する（図50を参照されたい）。「関心対象の遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、例えば、ポリペプチド、タンパク質、または翻訳されないRNA（例えば、tRNA）をコードする核酸配列をいい、これらのすべてがこの用語に含まれる。
【０８１７】
この終止抑制技術の1つの非限定的な例は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるTag-On-Demand（商標）と呼ばれ、これは、単一の遺伝子発現ベクターを使用して、タグを付加されたか、またはタグを付加されていないタンパク質の発現を可能にする。この態様において、アンバー（TAG）終止サプレッサーtRNA遺伝子を有する組換えアデノウイルスベクター、ならびに哺乳動物細胞中での関心対象のタンパク質を一過性にタグ付けする際の使用のための最適化されたプロトコールが開発された。本明細書に記載される特定の態様は、精製され力価測定されたアデノウイルス（Adeno-tRNATAG）および1つの新規なGATEWAY（商標）デスティネーションベクター（pcDNA6.2/GFP-DEST）である。Tag-On-Demand（商標）は、終止コドンがTAGであるならば、任意の関心対象の遺伝子を用いて使用され得る。例えば、Tag-On-Demand（商標）と適合可能であるさらなるInvitrogen哺乳動物発現ベクターは以下に列挙される。
【０８１８】
pcDNA6.2/V5およびpcDNA6.2/GFPデスティネーションベクターの使用は、主として選択マーカーとしてのブラスチシジンの卓越性およびBGHポリAの非存在に起因して、Tag-On-Demand（商標）における使用のために推奨される。上記に列挙された推奨されるベクターに加えて、以下の3種のデスティネーションベクター：pcDNA3.2/V5-DEST、pcDNA-DEST40、およびpcDNA-DEST47においてもまた、首尾よく使用されてきた。以下のInvitrogenベクターはすべてTag-On-Demand（商標）と適合可能であり、関心対象の遺伝子がC末端タグとインフレームであるTAG終止を伴ってクローニングされるならば、C末端エピトープタグの下流のTAGでない終止コドンが含まれる：pcDNA-V5Hisベクターファミリー；pEF/V5Hisベクターファミリー；pUbC/V5Hisベクター；pcDNA/mycHisベクターファミリー；pEF/mycHisベクターファミリー；pcDNA3.1/CT-GFPベクター；pcDNA4/TO/mycHisベクター；pGene/V5Hisベクター；pIND/V5Hisベクター；pcDNA5/FRT/V5His；およびpEF5/FRTベクター。
【０８１９】
材料および方法
ベクター構築
（a）pUC12-tRNATAG：
3種のサプレッサーtRNAベクターをマサチューセッツ工科大学のUttam RajBhandary博士から受領した。pUCtS Su+アンバー、pUCtS Su+オパール、およびpUCtS Su+オーカーと名付けられた各サプレッサーtRNAベクターは、終止アンチコドン以外は同一である（Caponeら、1985、EMBO, 4(1):213-221）。便宜上、pUCtS Su+アンバーベクターをここではpUC12-tRNATAGと呼ぶ。テトラサイクリン調節されるバージョン（本明細書中ではpUC12-TO-tRNATAGと呼ばれる）を作製するために、2つのテトラサイクリンオペレーター（tetO2）を、以下のアニーリングされるオリゴヌクレオチドを使用してpUC12-tRNATAG中のSnaBI部位にクローニングした。
tetO2フォワードプライマー
2005532829.tif 000085
およびtetO2リバースプライマー
2005532829.tif 000086
斜字体で示したものはこのオリゴヌクレオチドを用いて導入された独特なBglII部位である。下線を付した配列はXhoI部位である。すべてのtRNA構築物は確証された配列である。
【０８２０】
（b）pcDNA6.2/GFP-DEST：
pcDNA6.2/GFP-DESTをApaIおよびPmeIを用いて消化し、V5タグを除去した。pcDNA3.1/lacZ-stopTAG-GFPもまた、ApaIおよびPmeIを用いて消化して、GFPフラグメントを単離した。GFP融合タグを、pcDNA6.2 DESTベクター（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号12489-027）にライゲーションし、DB3.1細胞に形質転換した。コロニーをLB-Ampプレート上で増殖させた。NdeIで消化したときに正しいバンドを生じるクローンを選択し、次いで配列を確認した。
【０８２１】
（c）pENTR CATTAA, TAG, TGA：
GATEWAY（商標）CATエントリークローンをPCR増幅し、続いて、pENTR dTにTOPOクローニング（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA製品マニュアル番号25-0434）を行った。両方のベクターについての情報は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAに連絡することによって得られ得る。使用したプライマー配列は、
2005532829.tif 000087
であった。下線を付した配列は、どの終止コドンが必要とされたかによって変化した。プラスミド構築物を配列を確認した。
【０８２２】
（d）pcDNA3.2/V5-GW/CATTAA, TAG, TGA：
pcDNA3.2/V5-DESTおよび各々の終止を有するpENTR CATをLRクロナーゼを使用して組換えてプラスミドpcDNA3.2/V5-GW/CATTAA, TAG, TGAを生成した。クローンを、制限酵素消化によって正しいと同定し、および配列を確認した。
【０８２３】
（e）pcDNA6.2/GFP-GW/CATTAA, TAG, TGA：
pcDNA6.2/GFP-DESTおよび各々の終止を有するpENTR CATをLRクロナーゼを使用して組換えてプラスミドpcDNA6.2/GFP-GW/CATTAA, TAG, TGAを生成した。クローンを、制限酵素消化によって正しいと同定し、および配列を確認した。
【０８２４】
（f）pENTR p48TAG：
GATEWAY（商標）エントリークローンをUltimate（商標）ORFeomeコレクション（Collection）（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）から入手した。これはいくつかの名称で呼ばれる：HS8-E6（Invitrogen内部の命名）、BC000141（GenBankアクセッション番号）、またはORF 12（便宜上使用される）。このORFはp48と呼ばれ、ヒトc-myc改変体である（結果の節を参照されたい）。このクローンについての情報は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、またはGenBankに連絡することによって得られ得る。
【０８２５】
（g）pcDNA6.2/GFP-GW/p48TAG：
pcDNA6.2/GFP-DESTおよびpENTR p48TAGをLRクロナーゼを用いて組換えて、pcDNA6.2/GFP-GW/p48TAGを生成した。この組換え反応物をTOP10細胞（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号C4040-10）に形質転換し、LBアンピシリンプレート上にプレーティングした。コロニーを拾い、およびクローンを、制限酵素消化および機能的抑制によって正しいと同定した。
【０８２６】
（h）pcDNA6.2/V5-GW/p48TAG：
pcDNA6.2/V5-DESTおよびpENTR p48TAGをLRクロナーゼを用いて組換えて、pcDNA6.2/V5-GW/p48TAGを生成した。この組換え反応物をTOP10細胞に形質転換し、LBアンピシリンプレート上にプレーティングした。コロニーを拾い、およびクローンを、制限酵素消化および機能的抑制によって正しいと同定した。
【０８２７】
（i）pENTR-TO-tRNATAG：
pENTR1A （Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）およびpUC12-TO-tRNATAG（上記の（a）に記載される）をSalIおよびEcoRIを用いて消化する。消化の後、適切なバンドをゲル精製およびライゲーションする。ライゲーション生成物をTOP10細胞に形質転換し、LB-カナマイシンプレート上にプレーティングした。クローン1をSalIおよびEcoRI診断的消化の後に選択した。
【０８２８】
（j）pENTR-tRNA8TAG：
5'末端のEcoRI配列およびXbaI配列、ならびに3'末端のSpeI配列およびHindIII配列を用いてpUC12 TO tRNATAGからのtRNAを増幅するためにプライマーを作製した。これらのプライマーは以下であった。
2005532829.tif 000088
tRNA PCR産物をゲル精製し、pENTR dTにTOPOクローニングし、およびTOP10細胞に形質転換した。コロニーをLBカナマイシンプレート上で選択した。正しい挿入の確認の際に、2つの別個の消化を行った。EcoRIおよびXbaIを用いる第1の消化ではpENTR-tRNATAGを開裂させた。EcoRIおよびSpeIを用いる第2の消化では、tRNA遺伝子を切除した。正しいフラグメントをゲル精製し、XbaIおよびSpeIは相補性末端を有するので2つのフラグメントをライゲーションし、このようにしてtRNAのダイマーを作製した。正しい挿入を確認して、同じ2つの以前の消化物をダイマープラスミドとともに反復させ、フラグメントをゲル精製し、ライゲーションを実施してテトラマーを作製した。最後の2つの消化物は、前述と同様に、テトラマーで反復され、フラグメントをゲル精製し、ライゲーションを実施して、pENTR主鎖中にオクタマーtRNAを作製した（Buvoliら、Mol. Cell. Biol. 20:3116-3124 (2000)、「Suppression of Nonsense Mutations in Cell Culture and Mice by Multimerized Suppressor tRNA Genes」）。
【０８２９】
アデノウイルスtRNA
サプレッサーtRNATAGを有するアデノウイルスをGATEWAY（商標）LxR反応を使用して作製した。pAd/PL-DESTベクター（表10、図9）を、pENTR-tRNATAGまたはpENTR-tRNA8TAGのいずれかを用いて組換えて、pAd-tRNATAG発現ベクター（表8）またはpAd-tRNA8TAG発現ベクターをそれぞれ作製した。これらのベクターを、引き続いてPacIで切断し、TREx 293（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号R710-07）細胞にトランスフェクトして、組換えアデノウイルスの初期ストックを産生した。次のウイルス増幅および力価測定は、実施例4において前述のように、293A細胞中で実施した。
【０８３０】
アデノウイルスの産生および精製
10個のT-175フラスコの293A細胞をフラスコあたり25mlの完全培地（DMEM/10％FBS/L-グルタミン/非必須アミノ酸/ペニシリン/ストレプトマイシン）にプレーティングした。感染の日、細胞は80〜90％コンフルエントであった。古い培地を除去し、5のMOIとして十分なウイルスを細胞あたりに含む25mlの完全培地で置き換えた。培養は37℃で一晩インキュベートを行い、次の日、培地を25mlの新鮮な培地で置き換え、>80％の細胞変性効果（CPE）が観察されるまで細胞を2〜3日インキュベートした。CPEは明白である。細胞が膨潤し、円形となり、そしてプレートから脱離し始める。この時点において、50mlピペットを使用して細胞を穏やかに取り除き、250mlの滅菌コニカルボトルにプールした。培養物を1000rpmで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを5mlのPBSに溶解し、そして15mlのポリプロピレンチューブに移した。3回の凍結/融解（-80℃〜37℃）によって細胞を溶解してウイルスを遊離させた。試料が溶解するのに必要であるよりも長く試料を37℃に放置しないよう注意を払う。なぜなら、ウイルス分解が37℃で加速されるからである。凍結/融解サイクル後、150μlを野生型アッセイのために取り出した（以下を参照されたい）。次いで、溶解物をDOC（デオキシコール酸、ナトリウム塩、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO、カタログ番号D6750）で処理して、ウイルス収量を増加させる。10％DOCのストックを水中で調製して（そのすべてを溶液にするためには加熱が必要であった）、DOCを0.2％の最終濃度までアデノウイルス溶解物に加えた。この溶解物を回転プラットフォーム上で室温で30分間インキュベートした。不溶性物質を遠心分離（卓上遠心分離機において3000rpm、15分間）によって除去し、粗高力価ウイルス上清（CHT）を新鮮なチューブに移した。MgCl2を最終5mMまで加え、ウイルスは-80℃で保存したか、または塩化セシウム精製した（以下を参照されたい）。
【０８３１】
塩化セシウムステップグラジエント超遠心分離は、アデノウイルス遺伝子送達の最適な効率および最小限の毒性を達成するために、細胞夾雑物を除去することによって組換えアデノウイルスを精製および濃縮する。2種の塩化セシウム（分子生物学グレードCsCl、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO、カタログ番号C3032）溶液を以下の密度：1.4g/mlおよび1.25g/ml（10mM Tris (pH 8.0)中）で調製した［1.4g/ml=38.83g CsCl+61ml 10mM Trisおよび1.25g/ml=26.99g CsCl+73ml 10mM Tris］。これらの重量/容量密度は1mlの各溶液を秤量することによって確認した。正確な密度を達成するために、さらに塩化セシウムまたは10mM Trisを必要に応じて加えることによって密度を調整した。各溶液をフィルター滅菌し、室温で保存した。
【０８３２】
ステップグラジエントを調製するために、2.5mlの1.25g/ml CsCl溶液を1つの超遠心分離チューブ（SW41 Beckman遠心分離チューブ、薄壁ポリアロマー 14×89、部品番号331372）中に配置し、次いで、2.5mlの1.4g/ml CsCl溶液で注意深く下層を作製した。下層作製のために長いガラス製パスツールピペットを使用した。次に、ステップグラジエントを、5mlの粗高力価ウイルス溶解物を用いて穏やかに重層し、そしてBeckman SW41遠心分離ローターに注意深く移す。試料を35,000rpmで1時間および10分間、20℃で遠心分離した。超遠心分離後、細胞の脂質および細胞質の細片がチューブの上端に残り、そして濁ったアデノウイルスのバンドが2つのCsClの層の界面近くに移動した。ウイルスバンドは肉眼で非常に明確であった。チューブをスタンドに固定し、チューブの側面を70％エタノールで拭った。ウイルスバンドを、20または21ゲージの針を装着した3mlシリンジを使用して、側面に穴をあけることによって収集した。ウイルスを15mlコニカルチューブに移し、容量を測定した。グリセロールを最終10％に加えた。
【０８３３】
組換えアデノウイルス調製物中の塩化セシウムを、4回のラウンドの透析によって除去した。各超遠心分離チューブについて、4リットルの透析緩衝液が必要であった。透析緩衝液は、最終で10mM Tris (pH 7.5)、1mM MgCl2、150mM NaCl、および10％グリセロールからなり、4℃に保った。緩衝液は透析の前日に調製し、攪拌子とともに一晩低温室に置いた。回収したウイルスバンドを、Spectrum Specta/Por CE Float-A-Lyzerを使用して、300,000ダルトンの分子量カットオフ（MWCO）（Fischer 3mlサイズ番号08-700-51または5mlサイズ番号08-700-64）を用いて、4℃で透析した。ウイルス調製物を4回透析した。各透析は1時間および1リットルで、定常的に穏やかに攪拌しながら行った。最終ウイルス生成物をFloat-A-Lyzerからプラスチックピペットを用いて取り出し、エッペンドルフチューブに供給しアリコートとした。ウイルスのアリコートを-80℃で保存し、複数回の凍結/融解は避けた。
【０８３４】
10個のフラスコの塩化セシウム調製物からの典型的な力価は、7×109〜6.5×1010pfu/mlの範囲である。得られた組換えアデノウイルスの容量は、典型的には1.0mlであり、これは10フラスコからの全体のウイルス収量を7×109〜6.5×1010pfuにする。このストックは、50のMOIを使用する1つの96ウェルプレートにとって十分な材料を含む。
【０８３５】
野生型アッセイ
「上清レスキューアッセイ」は、標準的な手順を使用して組換えアデノウイルスストック中の野生型アデノウイルス夾雑物を検出するために実施される（Dionら、J. Virol. Methods 56:99-107 (1996)）。
【０８３６】
レポーター細胞株
pcDNA6/FRT/V5をPstIおよびPmeIで消化してV5タグをコードする核酸配列を除去した。pcDNA3.1 lacZ stopTAGGFPをPstIおよびPmeIで消化してlacZ stopTAGGFPを含むフラグメントを単離した。上記のフラグメントをゲル精製し、ライゲーションし、およびTOP10細胞に形質転換した。得られるレポータープラスミド、pcDNA6/FRT/lacZ-stopTAG-GFPを、診断的消化およびシークエンシングによって確認した。FlpIn CHO細胞（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号R758-07）に、ベクターpcDNA6/FRT/lacZ stopTAGGFPおよびpOG44（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号V6005-20）を、1:10の比率で同時トランスフェクトさせた。ブラスチシジン選択をトランスフェクションの4日後に、15μg/mlの濃度で開始した。選択を24時間後に完了させた。
【０８３７】
同時トランスフェクション
トランスフェクションの前日、6ウェルプレートに細胞を播種した。同時トランスフェクションの日に90％コンフルエントより高くなるような密度で播種された場合、細胞はトランスフェクションに最も寛容性である。同時トランスフェクションは最短5時間から一晩まで実施した。次いで、脂質複合体を除去し、新鮮な培地で置換した。室温で5〜10分間、250μlのOpti-MEM（登録商標）I血清使用量低減培地（OPTI-MEM）中、組み合わせた1.5μgサプレッサーtRNAおよび0.5μgの対応するレポーターベクターを使用して、同時トランスフェクションを最適化した。6μlのLipofectamine（商標）2000を250μlのOPTI-MEMと組み合わせ、DNA混合物と組み合わせる前に5分間室温に放置した。DNA-脂質複合体を20分間、室温で形成させた。引き続いて、DNA-脂質複合体を、2mlの培地を含むウェル中の細胞に加えた。GFP融合された発現ベクターの抑制は、次の日およびトランスフェクション後72時間まで観察され得る。細胞を、典型的には、トランスフェクションの24時間後に、ロイペプチン、ペプスタチン、およびPMSFを有する、IGE PAL CA630溶解緩衝液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO、カタログ番号I-3021）またはRIPA溶解緩衝液（10mM Tris(8.0)、 150mM NaCl、0.1％ SDS、1.0％ NP-40（またはTriton X-100）、1.0％ デオキシコール酸、2mM EDTA）を用いて、溶解しかつ収集した。
【０８３８】
形質導入
細胞に、6ウェル形式で総量1mlの培地中で、最短で5時間から最長で一晩の間、サプレッサーtRNAを用いて形質導入した。形質導入の完了の際に、ウイルスを除去し、2mlの新鮮な培地を加えた。次いで、細胞を一晩または次の日にトランスフェクトした。細胞を、典型的には、トランスフェクションの3日後に、ロイペプチン、ペプスタチン、およびPMSFを有する、IGE PAL CA630溶解緩衝液またはRIPA溶解緩衝液を用いて、溶解しかつ収集した。
【０８３９】
ウェスタン
細胞溶解物を最大速度で1〜2分間遠心分離した。次いで、溶解物を新たなチューブに移し、ペレットを廃棄した。Bradfordタンパク質アッセイを、各溶解物のタンパク質濃度を決定するために行った。ウェスタンブロッティングのために、10〜30μg/mlのタンパク質をゲルにロードした。抑制パーセントの決定を、高分子量タンパク質の分解能を最大化するためにβ-ガラクトシダーゼ融合タンパク質のウェスタンブロッティングのための6％Trisグリシンゲルを使用して実施した。CAT、GFP、およびV5ブロットについては、4〜20％ Trisグリシンゲルを使用した。ゲルからのタンパク質を、ウェスタンブロッティング技術を使用して0.45μmニトロセルロースに転写した。種々の抗体をタンパク質の検出において使用した：抗β-Gal（1:5000）、抗CAT（1:5000）、抗GFP（1:5000）、抗V5（1:5000）。Western BreezeキットおよびInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAからの抗体が、全体を通して使用された。
【０８４０】
製造されたウイルスについてのQCアッセイ
製造において産生されたウイルスは野生型ウイルスについてスクリーニングされ、塩化セシウム精製され、およびプラークアッセイ力価測定されるべきである。活性アッセイのために、COS-7細胞（ATCC番号CRL-1651）を6ウェル形式において、10％FBS、1％L-グルタミン、および1％Pen/Strepを含む2mlのDMEMを用いて、3×105細胞に密度で播種した。次の日、培地を吸引し、そして1mlを形質導入するために培養ウェルに戻して加えた。CsCl精製されたAd-tRNATAGを0、25、50、および100のMOIで各ウェルに加えた。形質導入を37℃で5〜6時間進行させた。形質導入時間の後、ウイルスを含む培地を除去し、2mlの新鮮な培地を各ウェルに戻して加えた。形質導入された細胞を、レポータープラスミドのトランスフェクションの前に1日間回復させた。各形質導入されたウェルについて、2μgのpcDNA6.2/GFP-GW/p48TAG（またはpcDNA3.1/lacZ-stopTAG-GFP）発現プラスミドを250μlのOPTI-MEM中で希釈し、および室温で5分間インキュベートした。6μlのLipofectamine（商標）2000を250μlのOPTI-MEM中で希釈し、および室温で5分間インキュベートした。DNAおよび脂質希釈物もまた、トランスフェクトされる4ウェルについてバッチで設定し得る。次いで、あらかじめAd-tRNA8TAGを用いて形質導入したCOS-7細胞に加える前に、DNAおよび脂質を合わせ、かつ室温で20分間インキュベートして複合体形成させた。DNA-脂質複合体は、除去されかつ新鮮な培地が細胞に加えられる前に、5〜18時間の間、細胞上に残った。GFP蛍光を、形質導入の1〜3日後に観察した。細胞を、形質導入の3日後に、ロイペプチン、ペプスタチン、およびPMSFを有する、氷冷した150〜200μlのRIPA溶解緩衝液（10mM Tris(8.0)、 150mM NaCl、0.1％ SDS、1.0％ NP-40（またはTriton X-100）、1.0％ デオキシコール酸、2mM EDTA）を用いて、溶解しかつ収集した。次いで、溶解物を最大速度で5分間（好ましくは4℃で）遠心分離した。溶解物を新たな1.5mlエッペンドルフチューブに移し、およびウェスタンブロッティングのためにすぐに使用しない場合には-80℃で凍結させる。抗myc（または抗β-ガラクトシダーゼ、使用する発現プラスミドに依存する）についてのウェスタンブロッティングの後、デンシトメトリーを、Fujifilm LAS-1000デンシトメーター上で、ソフトウェアImage Reader LAS-1000 Lite v1.0およびImageGauge v.254を使用して実施した。抑制パーセントを、上部バンドの密度を全体（低いバンドおよび上部バンド）で除算することによって計算した。本実施例の目的のために、50％抑制が所望のレベルの抑制であった。
【０８４１】
結果および考察
3種すべての可能なヒトtRNAサプレッサー（TAG、TAA、およびTGA）を、ヒトtRNAセリン遺伝子のアンチコドンを変異させることによって作製した（Caponeら、EMBO, 4:213-221 (1985)）。この研究はRajBhandaryの実験室において実施された。彼はまた、3種の各tRNAserサプレッサーを含むpUC12に基づくベクターを提供した。細菌tRNAサプレッサーは何年も前に同定されていたが、哺乳動物tRNAサプレッサーの使用により、同族（cognate）tRNA充填酵素を同時発現する必要なく、哺乳動物細胞における終止抑制が可能となる。
【０８４２】
各tRNAサプレッサーの効率をいくつかの同時トランスフェクション実験において試験した（図51A〜B）。3種のGATEWAY（商標）エントリークローンを作製した。これらは、関心対象の遺伝子（GOI）としてのCAT、その後の各終止コドン（pENTR-CATTAA、pENTR-CATTAG、およびpENTR-CATTGA）を有する。これらのエントリークローンはpcDNA3.2/V5-DESTまたはpcDNA6.2/GFP-DESTのいずれかに交雑され、従って、V5またはGFPのいずれかを、天然型CAT ORFの下流に（およびインフレームに）配置する。これらのデスティネーションベクターはまた、インフレームで、C末端タグの下流に3種すべての終止コドンを有する。3種すべての終止コドンを有することは、どのtRNAサプレッサーが使用されるかに関わらず、タグの後の翻訳の終結を確実にする。
【０８４３】
V5エピトープTag-On-Demand（商標）
CHO細胞を、以下の発現ベクター：pcDNA3.2/V5-GW/CATTAA、-GW/CATTAG、または-GW/CATTGAの1種を用いて、その同族tRNAサプレッサー：pUC12-tRNATAA、pUC12-tRNATAG、またはpUC12-tRNATGAの存在下または非存在下で、同時トランスフェクトした（図51A）。V5エピトープに対する抗体を使用するウェスタンブロッティング分析は、tRNAサプレッサーの存在下で検出可能なV5エピトープタグ付加タンパク質を示した（左のパネル）。これはさらに、抗CATウェスタンブロット上のCATタンパク質の上方「シフト」によって例証された。抑制の効率は、シフトしたバンドおよびシフトしていないバンドの強度をスキャンするためにデンシトメトリーを使用することによって計算し得る。この実験ならびに本明細書中に記載されていない他の実験において、TAG終止サプレッサーは他の2種に対して明確に卓越しており、このことは、TAAおよびTGAについては、それぞれ44％および53％のみであることと比較して、サプレッサーの存在下での天然型CATからCAT-V5への転換が>70％であることを実証する（図51A、右側のパネル、抗CATブロット）。
【０８４４】
GFP Tag-On-Demand（商標）
293FT細胞（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号R700-07）を、3種の発現ベクター（pcDNA6.2/GFP-GW/CATTAA、-GW/CATTAG、または-GW/CATTGA）のうちの1種、およびpU12-tRNAベクターの1種を用いて同時トランスフェクトした（図51B）。抗CATウェスタンブロッティングは、正しいtRNAが供給された場合に、天然型CATからCAT-GFPへの明確なシフトを示した。再度、tRNATAGは、他の2種のtRNAサプレッサーと比較して、卓越した終止抑制を実証した。終止抑制およびタンパク質タギングが非常に特異的であることに注意することもまた重要である。換言すれば、正しくないtRNAサプレッサーが供給される場合、終止抑制は観察されず、天然型のタンパク質のみが発現される（例えば、tRNATAGまたはtRNATGAを有するTAA CATレポーターを参照されたい、図51B）。抑制の特異性は、異なるレポーターベクター、pcDNA3.1/lacZ-stopTAG-GFPを用いてさらに実証される（図52）。正しいtRNAサプレッサー（pUC12-tRNATAG）の存在下においてのみ、β-ガラクトシダーゼ-GFP融合タンパク質が発現され、これは、細胞の検出可能な発光をもたらす（図52、中央のパネル）。他のサプレッサーのいずれかが使用される場合（tRNATAAまたはtRNATGA）、トランスフェクト細胞において、TAG終止の抑制は起こらず、β-ガラクトシダーゼ-GFPは発現されず、発光は観察されない（図52、左側および右側のパネル）。
【０８４５】
アデノウイルスtRNA送達
Tag-On-Demand（商標）は主としてタンパク質の一過性のタギングのために設計されているので、哺乳動物細胞へのサプレッサー遺伝子の理想的な送達方法は、組換えアデノウイルスを使用することである。アデノウイルスは、異なる哺乳動物細胞種に対して非常に広い向性を有し、形質導入効率は100％に達し得る（概説については、Russell 2000,「Update on adenovirus and its vectors.」J. Gen. Virol., 81:2573-2604を参照されたい）。さらに、このウイルスは宿主ゲノムに安定に組み込まれないため、発現は一過性である。活動的に分裂している細胞（24時間の倍加時間）において、アデノウイルスベクターからの遺伝子発現は、典型的には、24時間以内に検出され、7〜8日間持続する。
【０８４６】
tRNATAG遺伝子をpENTRにクローニングしてpENTR-tRNATAGを作製し、かつこれをpAd/PL-DESTを用いるGATEWAY（商標）LR反応において使用して（表10、図9）pAd-tRNATAGを作製した。ウイルスの何回かの大スケール調製を実施し、機能的試験を行った。アデノウイルスはtRNAを送達する非常に効率的なやり方であることがわかったが、しかし、予備的な実験は、生物学的に関連した量のtRNAを送達するために数100のMOI（感染多重度）を必要とした。目標は、レポーター遺伝子の1つでトランスフェクトしたCOS細胞において、50のMOIを使用して少なくとも50％抑制を達成することであった。tRNAは、終止コドンを占める内因性のタンパク質「終止因子」と競合するに違いないと考えられている。これは、サプレッサーtRNA配列をコードする核酸分子の複数のコピーの存在下でのより効率的な抑制を説明し得る。効率的な抑制を必要とするウイルス粒子の数を減少させる試みにおいて、8コピーのtRNA遺伝子をpENTR（penTR-tRNA8TAGと呼ばれる）にクローニングし、アデノウイルスプロモーター欠失デスティネーションベクターに組み込んだ。この新規なアデノウイルス（Adeno-tRNA8TAG）を、終止抑制について、もとのモノマーウイルス（Adeno-tRNATAG）と比較した。蛍光顕微鏡法（上のパネル）および抗β-ガラクトシダーゼウェスタンブロッティング（下のパネル）の両方によって示されるように、抑制効率の中程度の増加が8mer tRNAで観察され、これらの発現レベルは、プラスミドに基づくtRNAを用いて見られるのと同様であった（レーン2および4）。確かに、すべての引き続く実験において、Ad-tRNA8TAG形質導入は、同様にまたはpUC-tRNATAGよりも良好に機能し、この組換えアデノウイルス配置を、特に本発明の方法のために適合させた。
【０８４７】
最初のアデノウイルス実験は、溶解した産生細胞（5ml PBS中に溶解したおよそ108細胞）からの細片のすべてをなお含む、アデノウイルス調製物を使用した。この材料は機能的であるが、標的細胞に対して受容不可能な高い毒性を生じる。種々の精製方法を、活性アデノウイルスから毒性成分を除去ことを試みるために評価した。ラージポア透析（300,000 MWCO）、スクロース密度勾配精製、およびHPLCを、伝統的な塩化セシウム精製および2種の市販のアデノウイルス精製カラム（ViraPur, Carlsbad, CAおよびPureSyn, Malvern, PA）と同様に、本発明の方法における使用のために評価した。変更を加えた、単回ラウンドの塩化セシウムステップグラジエント精製（上記に記載）は、活性なウイルスの最大収量をもたらす安価な選択肢であり、かつ標的細胞に対して最小の毒性を示し、このことは、この方法を本発明の方法における使用のために特に適合させることが推定された。
【０８４８】
Ultimate（商標）ORFコレクションTag-On-Demand（商標）
本明細書中に記載される発明は、終止コドンが提供されたサプレッサーtRNAをによって認識されるならば、関心対象の任意の遺伝子またはORFを伴う使用のために適合可能である。この終止コドンは関心対象の遺伝子に対して天然型であってもよく、またはそれは、標準的な生物学的技術（例えば、本明細書中に記載されたもの）によって挿入することができる。本発明の方法における使用のために特に適切であるものは、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるUltimate（商標）ORFコレクションにおけるクローンである。この遺伝子のコレクションは、TAG終止コドンを有する天然型ORFを含むGATEWAY（商標）エントリークローンとして供給される。Tag-On-Demand（商標）は、天然型タンパク質に対する抗体の生成を必要とすることなく、または別個の発現ベクターに遺伝子を再クローニングすることなく、発現されたタンパク質産物の迅速かつ容易な検出を可能にする（V5またはGFPタギングのいずれかを介して）。
【０８４９】
Ultimate（商標）ORFコレクションからのORFを有するTag-On-Demand（商標）の有用性を実証するために、3つのヒトORFを選択し、pcDNA6.2/GFP-DESTまたはpcDNA6.2/V5-DESTのいずれかに組換えた。Ad-tRNA8TAGを用いる細胞の形質導入、その後のORF-GFP発現クローンを用いる細胞のトランスフェクションは、容易に目に見えるGFP陽性細胞を生じた（図54、上のパネル）。顕著に、タンパク質は、蛍光顕微鏡法を使用して容易に検出可能であったそれらの通常の細胞下局在を保持した。ORF6（BC003357）はCGI130様タンパク質（23.4kD）をコードし、これは、主として細胞質性であり、いくつかの細胞においては核の排除が観察された。ORF7（BC000997）はヒトmRNAスプライシング因子（27.4kD）をコードし、予測されたように、明確に核に局在した。ORF12（BC000141）は短縮型のc-myc（48.8kD）をコードし、これもまた核であり、点状核構造への特異的標的化を有する。ORF12は上記のp48TAGとも呼ばれ、本発明の方法において提供される場合、キットにおける使用のための陽性発現対照であり得る。本実施例において、この実験は、最初にアデノウイルスを用いて6時間、細胞に形質導入し、続いてレポータープラスミドを用いて一晩、トランスフェクトすることによって実施した。または、形質導入およびトランスフェクションは、一緒に、またはトランスフェクションを先に、続いて形質導入を行い得る。3つすべての方法は良好な抑制を生じたが、形質導入、次のトランスフェクションは、最大の発現および最小の毒性を達成し得る。
【０８５０】
ORFのV5エピトープタギングもまた、本発明の方法を使用して成功した。各発現したタンパク質は、tRNATAGの存在下で抗V5ウェスタンブロッティングを介して容易に検出可能であり、正しい分子量に移動した（図54、下のパネル）。V5エピトープの付加は関心対象のタンパク質に約4.2kDを加える。ORF-V5の発現レベルは、tRNATAGを用いて抑制されたlacZ-stopTAG-V5と比較可能であり、および、驚くべきことに、pcDNA/GFP-V5（最後のレーン）から構成的に発現された真のV5融合タンパク質GFP-V5と同様であった。この実験は、pUC12-tRNATAGを用いるORF-V5プラスミドの同時発現によって実施されるが、しかし、同様の結果はAd-tRNA8TAGを使用して得られる。
【０８５１】
これらのようなORF発現ベクターが通常の条件下で天然型のタンパク質を発現でき、その本来の機能の研究を可能にすることは本発明の重要な局面である。Tag-On-Demand（商標）の適用は、正確な同じ発現構築物の使用を可能にして、タンパク質のタグ付加バージョンを一過性に作製する。この局面は、特定のタンパク質に対する抗体の生成、または真のC末端融合物としてのORFの再クローニングを伴うことなく、タンパク質発現の確認、その細胞下局在の分析、さらにはFACソーティングのために有用であり得る。
【０８５２】
一過性遺伝子標的および安定な遺伝子標的の両方で使用され得るTag-On-Demand（商標）
本発明の1つの局面は、本明細書中に記載されるような発現または局在を確認するためのタグを有する関心対象のタンパク質の一過性発現である。本発明の別の局面は、以下の実験によって実証されるように、関心対象のタンパク質を安定に発現することである。単一コピーのpcDNA6/FRT/lacZ-stopTAG-GFPを安定に発現するFlp-In CHO細胞を、種々のMOIでAdeno-tRNA8TAGを用いて形質導入した（図55A）。抗lacZウェスタンブロッティングは、増加量のAdeno-tRNATAGを用いる終止抑制の用量依存性増加を示し、およびTag-On-Demand（商標）が安定に発現された遺伝子はC末端タグ付けのために使用され得る。この実験は、C末端タグを付加された組換えタンパク質が試験されたすべてのMOIで産生されることを示す。細胞が増加するMOIで形質導入されるにつれて、抑制％が増加する；しかし、産生される全体の組換えタンパク質の量（タグ付けされていないタンパク質およびGFPタグを付加されたタンパク質）はほぼ等価なままである。アスタリスクで標識されたバンドは、Flp-In（商標）-CHO細胞中に存在する内因性のlacZ-Zeocin（商標）融合物であり、Flp-In（商標）-CHO細胞株を作製するために使用される構築物に由来する。並行した実験において、COS細胞を同じ範囲のMOIで6時間かけて形質導入し、続いてlazZ-stopTAG-GFP発現ベクターの一過性トランスフェクションを行った（図55B）。ウイルスの量の増加を伴う抑制の用量依存性増加が示され、および19までの低いMOIで50％を超える高い抑制レベルがもたらされ、本発明の効率が実証された。この実験では、試験されたすべてのMOIにおいて、抑制％が>60％に達し、有意なレベルのGFPタグ付加組換えタンパク質の産生を生じる。細胞が増加するMOIで形質導入されるにつれて、抑制％は増加する；しかし、産生された全体の組換えタンパク質の量（タグ付けされていないタンパク質およびGFPタグを付加されたタンパク質）は減少する。これは、増加するウイルス量の付加の結果としての細胞毒性を示している可能性がある。
【０８５３】
一般的な哺乳動物細胞種におけるTag-On-Demand（商標）
5種の一般的に使用される哺乳動物細胞：BHK、CHO、COS、HeLa、およびHT1080をTag-On-Demand（商標）の効率を評価するために選択した。細胞をAdeno-tRNATAGを用いて、50のMOIで6時間形質導入し、その後lacZ-stopTAG-GFP発現ベクターを用いるトランスフェクションを行った。試験されたすべての細胞種において、Tag-On-Demand（商標）は、各細胞種においてGFP蛍光を容易に検出するために十分なlacZ-GFP融合タンパク質を明確に産生した（図56）。これらの実験においてわずかな毒性が観察され、これはおそらく精製されたアデノウイルス調製物中の塩化セシウムから生じたものである。
【０８５４】
まとめ
本発明の1つの態様はTag-On-Demand（商標）システムによって例示される。Tag-On-Demand（商標）は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAのUltimate（商標）ORFコレクションからの、タンパク質の検出を生じるtRNAサプレッサー遺伝子を送達するための組換えアデノウイルスを使用する系である。結果の節に記載されたように、Tag-On-Demand（商標）は主として、a）発現されたタンパク質産物の一過性検出および局在化、およびb）発現している細胞のソーティングまたな分析のために設計されている。細胞によって通常利用される3種の終止コドンのいずれかを正しいtRNAを用いて抑制でき、TAG終止抑制が最も効率的であった。アデノウイルスはtRNA送達方法として選択されてきており、良好であることまたはプラスミド送達よりもより良好であることが示された。アデノウイルスは多くの理由により、tRNA遺伝子を送達するための理想的な方法である。
【０８５５】
アデノウイルスは、広い哺乳動物細胞向性を有する。アデノウイルスは、「大部分の哺乳動物細胞上に存在するCAR受容体に結合する。しかし、すべての細胞種が等しいレベルの必要とされるCAR受容体を発現するわけではなく、従って、効率は1つの細胞種から別の細胞種まで様々であり得ることに注目することが重要である。幸運にも、抑制効率は、より多くのウイルスを適用することによって増加され得る（図55A〜Bを参照されたい）。任意のE1欠失組換えアデノウイルスベクターと同様に、293細胞またはアデノウイルスのE1遺伝子を発現している任意の哺乳動物細胞におけるTag-On-Demand（商標）アデノウイルスの使用は、ウイルス複製および可能な標的細胞の死をもたらす。
【０８５６】
アデノウイルスは標的細胞のゲノムに安定に組み込まれず、そしてその発現は一過性である。tRNAサプレッサーの安定な送達または構成的発現は細胞に対して毒性である可能性が高い。なぜなら、内因性の終止コドンの3分の1が抑制され、多くの細胞タンパク質のC末端に余分なアミノ酸の付加を生じるからである。
【０８５７】
アデノウイルスは非常に安定なウイルスであり、大量に産生される。ウイルスの製造は単回ラウンドの塩化セシウム精製を含んでいてもよく（材料および方法を参照されたい）、これは標的細胞に対して最小限の毒性を有する純粋なウイルスストックを生じる。
【０８５８】
まとめると、Tag-On-Demand（商標）システムは、単一の発現ベクターが天然型タンパク質またはC末端タグ付加タンパク質のいずれかを発現することを可能にする。この系はGATEWAY（商標）クローニング技術およびUltimate（商標）ORFコレクションと完全に適合可能である。本発明は、pcDNA6.2/V5およびpcDNA6.2/GFPデスティネーションベクターを用いる使用のために特に適しているが、当業者は、種々の他のInvitrogenベクターならびに他のベクター（材料および方法に記載されているような、多くのTOPOベクター、mycおよび6×Hisベクター、T-RExおよびFlp-In、を含む）もまた、Tag-On-Demand（商標）と適合可能であることを容易に認識する。本発明においてさらに提供されるものは、C末端タグの末端にTAGでない終止コドンが存在する場合に、任意の関心対象のタンパク質に融合するための任意の下流「タグ」をクローニングする能力である。
【０８５９】
実施例15
Tag-On-Demand（商標）GATEWAY（登録商標）ベクター
いくつかの態様において、本発明は、融合ポリペプチド（例えば、関心対象の配列および少なくとも1つの付加的なポリペプチド配列）を発現するために使用され得る核酸分子（例えば、ベクター）を提供する。本発明における使用のために適切なベクターの非限定的な例は、GATEWAY（登録商標）適合デスティネーションベクターである。このようなベクターは、同じ核酸分子から、天然型ポリペプチドおよびC末端タグ付加ポリペプチドの高レベル発現のために使用され得る。いくつかの態様において、このようなベクターは、哺乳動物細胞中でポリペプチド（これは融合ポリペプチドであり得る）を発現するために使用され得る。このようなベクターは、宿主細胞にベクターを導入すること、およびまた宿主細胞にサプレッサーtRNAを導入することによって、融合ポリペプチドを発現するために使用され得る。細胞tRNAの任意の適切な供給源が使用され得る（例えば、プラスミド、線状核酸分子、ウイルスなど）いくつかの態様において、本発明は、1つまたはそれ以上のサプレッサーtRNA分子および/またはサプレッサーtRNA分子の1つまたはそれ以上のコピーを発現するアデノウイルスを提供する。tRNAを発現するアデノウイルスを利用する方法は、Tag-on-Demand（商標）システムと呼ばれ得る。
【０８６０】
1つまたはそれ以上の以下の市販品目が本発明の方法と共に使用され得る。これらの品目を、括弧内のそれらのInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号と共に列挙する：Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清（Suppressor Supernatant）（K400-01またはK405-01）；GATEWAY（登録商標）LR Clonase（商標）酵素ミックス（11791-019または11791-043）；Library Efficiency（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞（11782-018）；One Shot（登録商標）TOP10ケミカルコンピテント大腸菌（C4040-03）；Library Efficiency DH5α（商標）ケミカルコンピテント大腸菌（18263-012）；ブラスチシジン（R210-01）；アンピシリン（Q100-16）；S.N.A.P.（商標）ミディプレップキット（K1910-01）；Lipofectamine（商標）2000（11668-027または11668-019）；およびリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、pH 7.4（10010-023）。
【０８６１】
いくつかの態様において、本発明は、1つまたはそれ以上の付加的なポリペプチド配列に融合された関心対象のポリペプチド配列を含む融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。融合ポリペプチドが産生される場合（例えば、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTから）、融合ポリペプチドは、1つまたはそれ以上の付加的なポリペプチド配列に結合する抗体を使用して検出され得る（例えば、V5エピトープまたはGFPに対して）。市販の抗体調製物を使用でき、例えば、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能もの、例えば、抗V5抗体（カタログ番号R960-25）、抗V5-HRP抗体（カタログ番号R961-25）、抗V5-AP抗体（カタログ番号R962-25）、抗V5-FITC抗体（カタログ番号R963-25）、GFP抗血清（カタログ番号R970-01）である。
【０８６２】
いくつかの態様において、本発明の方法は、p64のすべてまたは一部を含む融合ポリペプチドを発現するために使用され得る。本発明の材料および方法を使用して発現されたp64（ヒトc-myc）タンパク質を検出するために、市販の抗myc抗体を使用し得る（例えば、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、抗myc抗体 カタログ番号R950-25、抗myc-HRP抗体 カタログ番号R951-25、抗myc-AP抗体 カタログ番号R952-25、および/または抗myc-FITC抗体 カタログ番号R953-25）。
【０８６３】
本発明の実施において使用され得る核酸分子の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：pcDNA（商標）6.2/V5-DEST（7.3kb）およびpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST（8.0kb）、これらはGATEWAY（登録商標）技術（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）を用いる使用のために適合されたデスティネーションベクターであり、哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの高レベル構成的発現を可能にする。これらのベクターは、核酸分子を産生するサプレッサーtRNAを用いる使用のために設計され（例えば、InvitrogenのTag-On-Demand（商標）システム）、これは、同じ発現構築物からの天然型組換えポリペプチドおよびC末端タグ付加組換えポリペプチドの両方の発現を可能にする。
【０８６４】
pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターおよびpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターは、選択のC末端タグを含む組換えポリペプチドの発現を可能にする。pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターは抗V5抗体を使用する組換えポリペプチドの検出のためのV5エピトープをコードする。プラスミドマップは図57として提供され、このベクターの配列は表28として提供される。pcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターは、関心対象のポリペプチド配列への融合物のためのサイクル（cycle）3 GFPをコードし、レポーター遺伝子として使用する。このベクターのプラスミドマップは図58として提供され、このベクターの配列は表29として提供される。
【０８６５】
pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターおよびpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターは以下の特徴を含む：広範な哺乳動物細胞中における関心対象の遺伝子の高レベルの構成的発現のためのヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期プロモーター（Anderson, S.ら、 J. Biol. Chem., 264, 8822-8829(1989); Boshart, Mら、 Cell 41, 521-530(1985); Nelson, J.A.ら、 Molec. Cell. Biol. 7, 4125-4129(1987)）；エントリークローンからの関心対象のDNA配列の組換えクローニングのためのCMVプロモーターの下流の2つの組換え部位、attR1およびattR2；対抗選択のための2つのattR部位間に位置するクロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）；attR部位間に位置するネガティブ選択のためのccdB遺伝子；関心対象の組換えポリペプチドの検出のためのC末端V5エピトープ（pcDNA（商標）6.2/V5-DESTにおいてのみ（Southern, J.A.ら、J. Gen. Virol. 72, 1551-1557(1991)）；レポーターへの関心対象の組換えポリペプチドの融合のためのC末端サイクル3緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子（pcDNA（商標）6.2/GFP-DESTにおいてのみ）（Chalfie, M.ら、Science 263:802-805 (1994); Crameri, A.ら、Nature Biotechnol. 14:315-319 (1996)）；効率的な転写終結およびmRNAのポリアデニル化のための単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）ポリアデニル化配列（Cole, C.N.およびStacy, T.P.、Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)）；安定な細胞株の選択のためのブラスチシジン耐性遺伝子（Kimura, M.ら、Biochim. Biophys. ACTA 1219:653-659 (1994)）；大腸菌中のプラスミドの高コピー複製および維持のためのpUC起点；大腸菌における選択のためのアンピシリン（bla）耐性遺伝子。本発明のこの局面の1つの代替として、本発明のこの局面の1つの代替において、カセット中のクロラムフェニコール耐性遺伝子はスペクチノマイシン耐性遺伝子によって置き換えることができ（Hollingsheadら、Plasmid 13(1):17-30 (1985)、NCBIアクセッション番号X02340 M10241を参照されたい）、そしてccdB遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子に隣接するattP部位を含むpcDNAデスティネーションベクターは、アンピシリン/スペクチノマイシン含有培地上で選択することができる。クロラムフェニコールの代わりにスペクチノマイシンを使用することにより、選択プレート上で得られるコロニーの数が増加することがあり、このことは、スペクチノマイシン耐性遺伝子の使用が、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むカセットの使用において観察されるクローニングの効率を増加させ得ることを示す。
【０８６６】
上記に論じた特徴のpcDNA（商標）6.2/V5-DEST（7341ヌクレオチド）のプラスミド配列における位置は以下の通りである：CMVプロモーター 塩基232〜819位；T7プロモーター/プライミング部位 塩基863〜882位；attR1部位 塩基911〜1035位；ccdB遺伝子 塩基1464〜1769位 (c)；クロラムフェニコール耐性遺伝子 塩基2111〜2770位 (c)；attR2部位 塩基3051〜3175位；V5エピトープ 塩基3201〜3242位；V5リバースプライミング部位 3210〜3230位；TKポリアデニル化シグナル 塩基3269〜3540位；fl起点 3576〜4004位；SV40初期プロモーターおよび起点 4031〜4339位；EM7プロモーター 塩基4394〜4460位；ブラスチシジン耐性遺伝子 塩基4461〜4859位；SV40初期ポリアデニル化シグナル 塩基5017〜5147位；pUC起点 塩基5530〜6200位(c)；アンピシリン（bla）耐性遺伝子 塩基6345〜7205位(c)；blaプロモーター 塩基7206〜7304位(c)、ここで(c)は相補鎖上に存在することを示す。
【０８６７】
上記に論じた特徴のpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST（7995ヌクレオチド）のプラスミド配列における位置は以下の通りである：CMVプロモーター 塩基232〜819位；T7プロモーター/プライミング部位 塩基863〜882位；attR1部位 塩基911〜1035位；ccdB遺伝子 塩基1464〜1769位 (c)；クロラムフェニコール耐性遺伝子 塩基2111〜2770位 (c)；attR2部位 塩基3051〜3175位；サイクル3 GFP 塩基3195〜3908位；GFPリバースプライミング部位 3303〜3324位；TKポリアデニル化シグナル 塩基3923〜4194位；fl起点 4230〜4658位；SV40初期プロモーターおよび起点 4685〜4993位；EM7プロモーター 塩基5048〜5114位；ブラスチシジン耐性遺伝子 塩基5115〜5513位；SV40初期ポリアデニル化シグナル 塩基5671〜5801位；pUC起点 塩基6184〜6854位(c)；アンピシリン（bla）耐性遺伝子 塩基6999〜7859位(c)；blaプロモーター 塩基7860〜7958位(c)、ここで(c)は相補鎖上に存在することを示す。
【０８６８】
いくつかの態様において、陽性対照核酸分子（例えば、プラスミド）が本発明の方法と共に使用され得る。適切な陽性対照核酸分子は、同じリーディングフレーム中に2つのポリペプチド配列をコードし、およし配列間に終止コドンを有する核酸配列を含むものである。例えば、終止コドンに対して3'にコードされたポリペプチドは検出可能な活性（すなわち、酵素活性、蛍光活性、結合活性など）を有し得る。適切な対照核酸分子の例には、pAd/CMV/V5-GW/lacZ、pcDNA（商標）6.2/V5-GW/p64TAG、およびpcDNA（商標）6.2/GFP-GW/p64TAGが含まれるがこれらに限定されない。これらは、示されたコード配列（すなわち、lacZまたはp64コード配列（c-mycとしてもまた知られる））を含むエントリーベクターを用いてLxR反応を行うことによって、対応するベクターから調製された。対照ベクターpcDNA（商標）6.2/V5-GW/p64TAGおよびpcDNA（商標）6.2/GFP-GW/p64TAGのプラスミドマップは、それぞれ図59および60として提供される。
【０８６９】
pcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターにおいて使用されるGFP遺伝子は、Crameri, A.ら、Nature Biotechnol. 14:315-319 (1996)に記載されている。この論文において、コドン使用頻度は大腸菌中で最適化され、ならびに、3サイクルのDNAシャッフリングを使用して、哺乳動物細胞中で十分に発現し、野生型GFPと同じ励起および発光の極大を有し（一次および二次励起について、それぞれ395nmおよび478nm、ならびに発光について507nm）、および野生型GFPよりも>40倍蛍光収率を増加する変異型GFPを生成した。この変異型GFPは、野生型GFPと区別するためにサイクル3 GFPと呼ばれる。
【０８７０】
本発明の材料および方法（例えば、Tag-On-Demand（商標）システム、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）は、単一の発現構築物（例えば、GATEWAY（商標）を使用して調製されたもの）からC末端タグを付加された組換えポリペプチドおよびタグ付けされていない組換えポリペプチドの一過性発現を容易にする。この系は、RajBhandaryおよび共同研究者によってもともと開発された終止抑制技術に基づいており（Capone, J.P.ら、EMBO J. 4:213-221 (1985)）、および2つの主要な構成成分からなる：関心対象の遺伝子がクローニングされる発現ベクター、および1つまたはそれ以上のtRNAを発現する核酸分子（またはそのような核酸分子を含む組成物）（例えば、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清）である。ベクター（例えば、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST）は、終止コドンを抑制するためにサプレッサーtRNAを導入することによって（例えば、Tag-On-Demand（商標）システムを使用することによって）C末端タグを付加された組換えポリペプチドの発現と適合可能である配置になけれならない。1つの非限定的な態様において（すなわち、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清）、サプレッサーtRNA分子は、ヒトtRNAserサプレッサーを含む複製コンピテントでないアデノウイルスを用いて宿主細胞に形質導入することにより、宿主細胞に導入され得る。このtRNAサプレッサーは、TAG（アンバー終止）コドンを認識するように変異され、それをセリンとして解読する。哺乳動物細胞に加えられる場合、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清を形質導入し、tRNASerサプレッサーの一過性の供給源が提供される。
【０８７１】
TAG終止コドンを有する関心対象の遺伝子をコードする発現ベクターが哺乳動物細胞にトランスフェクトされる場合、その終止コドンはセリンとして翻訳され、翻訳が任意の下流のリーディングフレーム（例えば、C末端タグ）を通して継続することを可能にし、および終止コドンに対して3'であるコードされたアミノ酸（例えば、マーカーまたはタグ配列）に融合された関心対象の遺伝子によってコードされるポリペプチドを含む融合ポリペプチドの産生を生じる。当業者は、同様の様式で、TAA（オーカー）またはTGA（オパール）終止コドンを抑制するサプレッサーtRNAを発現する核酸分子（例えば、複製コンピテントでないアデノウイルス）が調製され得、および本発明の実施において使用され得ることを認識する。
【０８７２】
関心対象のDNA配列を本発明の核酸分子（例えば、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST）と組み合わせるために、関心対象の配列を含むDNAを含むヌクレオチドエントリークローンを調製し得る。エントリークローンにおいて、関心対象の配列は組換え部位（例えば、1つまたはそれ以上のデスティネーションベクターにおける部位と適合可能である部位）に隣接され得る。エントリークローンの生成を容易にするための多くのベクターがInvitrogenから利用可能である。例としては以下が含まれるがこれらに限定されない：pENTR/D-TOPO（登録商標）（カタログ番号K2400-20）、pENTR/SD/D-TOPO（登録商標）（カタログ番号K2420-20）、pENTR（商標）1A（カタログ番号11813-011）、pENTR（商標）2B（カタログ番号11816-014）、pENTR（商標）3C（カタログ番号11817-012）、pENTR（商標）4（カタログ番号11818-010）、およびpENTR（商標）11（カタログ番号11819-018）。
【０８７３】
いくつかの態様において、本発明は、ヒトポリペプチドのすべてまたは一部を含む融合ポリペプチドの発現を含む。ヒトポリペプチドをコードする核酸分子の1つの適切な供給源は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるUltimate（商標）ヒトORF（hORP）クローンコレクションである。pcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTから関心対象のヒト遺伝子を発現するために、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるUltimate（商標）ヒトORF（hORP）クローンが使用され得る。各Ultimate（商標）ヒトORF（hORP）クローンは、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTとのLR組換え反応においてすぐに使用できるGATEWAY（登録商標）エントリーベクターにおいて供給される完全にシークエンシングされたクローンである。さらに、各Ultimate（商標）ヒトORF（hORP）クローンはTAG終止コドンを含み、これをTag-On-Demand（商標）システムにおける使用のために完全に適合させる。Ultimate（商標）ヒトORF（hORP）クローンに関するさらなる情報については、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAのウェブサイトを参照するか、またはInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAに連絡されたい。
【０８７４】
エントリークローンを生成する際に、エントリークローン中に関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列は、上記で論じたように、哺乳動物細胞中の翻訳の正しい開始のためのコザックコンセンサス配列の関連内でATG開始コドンを含まなければならない。
【０８７５】
Tag-On-Demand（商標）システムを使用して、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTからの、天然型のおよびC末端タグを付加された関心対象の組換えポリペプチドの両方の発現を可能にするために、エントリークローン中の関心対象の遺伝子は終止コドンを含み得る。この終止コドンは、ヌクレオチドTAGによってコードされ得る。さらに、この遺伝子は、組換え後C末端とインフレームであるべきである。当業者は、他の終止コドンが、他の終止コドンを認識するサプレッサーtRNAを発現するベクターを構築することによって、同様に使用され得ることを認識するものと思われる。
【０８７６】
pcDNA（商標）6.2/V5-DESTおよびpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTの組換え領域は、それぞれ図61Aおよび61Bとして提供される。図61Aにおいて、影を付けた領域は、組換えによってエントリークローンからpcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターに移動したDNA配列に相当する。影を付けていない領域は、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターに由来する。関心対象の遺伝子によってコードされる配列を枠で囲んだ。Tag-On-Demand（商標）システムを用いる使用を容易にするために、関心対象の遺伝子はTAG終止コドンを有しかつC末端タグとインフレームでなければならない。pcDNA（商標）6.2/V5-DEST配列の塩基918位および3161位に印を付けている。TAAおよびTGA終止コドンがV5エピトープの下流に含められ、Tag-On-Demand（商標）システムにおける翻訳を終結させることに注意されたい。図61Bにおいて、pcDNA（商標）6.2/GFP-DEST×エントリークローンから生じる発現クローンの組換え領域が示される。影を付けた領域は、組換えによってエントリークローンからpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターに移動したDNA配列に相当する。影を付けていない領域は、pcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターに由来する。関心対象の遺伝子によってコードされる配列を枠で囲んだ。Tag-On-Demand（商標）システムを用いる使用を容易にするために、関心対象の遺伝子はTAG終止コドンを有るべきである。pcDNA（商標）6.2/GFP-DEST配列の塩基918位および3161位に印を付けている。TAAおよびTGA終止コドンがGFP遺伝子の下流に含められ、Tag-On-Demand（商標）システムにおける翻訳を終結させる（示さず）。
【０８７７】
発現クローンを生成するために：attL含有エントリークローンおよびattR含有pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターを使用するLR組換え反応を実施してもよい。エントリークローンおよびデスティネーションベクターの両方は、スーパーコイルであるかまたは線状であり得る。LR反応が実施された後、反応混合物のすべてまたは一部を使用して適切な大腸菌宿主を形質転換し得る。発現クローンはアンピシリンおよび/またはブラスチシジンを使用して選択され得る。
【０８７８】
pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターはスーパーコイルプラスミドとして供給される。GATEWAY（登録商標）技術マニュアルはより効率的な組換えのためには線状化デスティネーションベクターを使用することを以前に推奨していたが、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターの線状化は、任意の下流の適用のための最適な結果を得るためには必要とされないことが見い出された。
【０８７９】
本発明の核酸分子（例えば、デスティネーションベクター）は長期保存のために凍結乾燥させてもよい。凍結乾燥プラスミドは適切な緩衝液（例えば、TE、pH 8.0）に再懸濁され得る。いくつかの態様において、このベクターは緩衝液（例えば、TE、pH 8.0）中で凍結乾燥してもよく、および滅菌水の添加により再懸濁してもよい。本発明の実施において使用される核酸分子の溶液のための適切な濃度は約150ng/μlであるが、他の濃度が使用されてもよい。
【０８８０】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子は適切な宿主細胞中で増殖することができる。pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターを増殖および維持するために、Library Efficiency（登録商標）DB3.1（商標）コンピテント細胞（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号11782-018）を使用できる。DB3.1（商標）大腸菌株はCcdB効果に耐性であり、ccdB遺伝子を含むプラスミドの増殖を補助し得る。ベクターの完全性を維持するために、50〜100μg/mlアンピシリンおよび15〜30μg/mlクロラムフェニコールを含む培地中で形質転換体を選択する。TOP10またはDH5αを含む一般的な大腸菌クローニング株はCcdB効果に感受性であるため、増殖および維持用に使用すべきではない。
【０８８１】
一旦関心対象の遺伝子を含むエントリークローンが調製されたならば、エントリークローンと、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターとの間のLR組換え反応を実施し、および適切な大腸菌宿主に反応混合物を形質転換する。陰性対照（エントリーベクターを含まない）は、結果を評価することを補助するために推奨される。形質転換のためのTOP10、DH5α（商標）、または等価物を含むrecA、endA 大腸菌株を使用し得る。F'エピソームを含む大腸菌株（例えば、TOP10F'）にLR反応混合物を形質転換しない。これらの株はccdA遺伝子を含み、ccdB遺伝子を用いるネガティブ選択を妨害する。
【０８８２】
pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターおよびpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターは、それぞれ、アンピシリンまたはブラスチシジンを使用する大腸菌形質転換体の選択を可能にするための、アンピシリンまたはブラスチシジン耐性遺伝子を含む。ブラスチシジンを使用して形質転換体を選択するために、100μg/mlブラスチシジンを含む低塩LB寒天プレートを使用する。ブラスチシジンが活性であるために培地の塩濃度は低い（<90mM）ままでなくてはならない。そしてpHは7.0ある必要がある。低塩プレートは、10gトリプトン、5g NaCl、5g酵母抽出物を混合すること、および滅菌脱イオン水を950mlまで加えることによって調製し得る。1N NaOHを用いてpHを7.0に調整する。用量をリットルにする。プレートについては、15g/L寒天をオートクレーブの前に加える。液体サイクルで、15psiおよび121℃、20分間オートクレーブする。ブラスチシジンを100μg/mlの最終濃度まで加える前に、培地を少なくとも55℃に冷却させる。プレートを+4℃で暗所に保存する。ブラスチシジンを含むプレートは2週間まで安定である。ブラスチシジンはInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能である。
【０８８３】
LR組換え反応は、エントリークローンの精製したプラスミドDNA（TE、pH 8.0中、50〜150ng/ml）；pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクター（TE、pH 8.0中、150ng/ml）；LR Clonase（商標）酵素ミックス（Invitrogenカタログ番号11791-019；使用直前まで-80℃に保つ）；5×LR Clonase（商標）反応緩衝液（LR Clonase（商標）酵素ミックスと共に供給される）；TE緩衝液、pH 8.0（10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA）；2μg/ml プロテイナーゼK溶液（LR Clonase（商標）酵素ミックスと共に供給される；融解し使用まで氷上に保つ）；適切なコンピテント大腸菌宿主および発現のための増殖培地；SOC培地；ならびに選択プレート（例えば、100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天プレートまたは100μg/mlブラスチシジンを含む低塩LBプレート）を用いて実施し得る。
【０８８４】
以下の構成成分を1.5ml微量遠心分離チューブに室温で加え混合する。
2005532829.tif 000089
【０８８５】
LR Clonase（商標）酵素ミックスを-80℃から取り出し、氷上で融解する（〜2分間）。LR Clonase（商標）酵素ミックスをボルテックスし、手短に2回混合する（各回2秒間）。上記の各試料に、4μlのLR Clonase（商標）酵素ミックスを加える。ピペットを使って上下させて十分に混合する。LR Clonase（商標）酵素ミックスを使用後すぐに-80℃に戻す。25℃で1時間反応をインキュベートする。18時間までインキュベーション時間を延長することにより、典型的にはより多くのコロニーが生じる。2μlのプロテイナーゼK溶液を各反応に加える。37℃で10分間インキュベートする。1μlのLR組換え反応物を適切な大腸菌宿主に形質転換し（製造業者の指示書に従う）、発現クローンを選択する。LR反応物は、所望の場合、形質転換の1週間前まで-20℃で保存することができる。
【０８８６】
1×108cfu/mgの形質転換効率を有する大腸菌細胞を使用する場合、LR反応物は、全体の形質転換体がプレーティングされたときに、約>5,000コロニーを与えるべきである。
【０８８７】
ccdB遺伝子は非常に低い頻度で変異し、非常に少ない数の偽陽性を生じる。真の発現クローンはアンピシリン耐性でありかつクロラムフェニコール感受性である。変異型ccdB遺伝子を有するプラスミドを含む形質転換体はアンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性である。推定の発現クローンをチェックするために、30μg/mlクロラムフェニコールを含むLBプレート上での増殖を試験する。真の発現クローンはクロラムフェニコールの存在下では増殖しないはずである。
【０８８８】
関心対象の遺伝子が正しい方向にあり、かつC末端融合タグがインフレームであることを確認するために、発現構築物をシークエンシングしてもよい。以下のプライマーを、発現構築物をシークエンシングするために使用することができる。図61Aおよび61Bは、各ベクターにおけるプライマー結合部位の位置を提供する。pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターをシークエンシングするために、T7プロモーター/プライミング部位に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、
2005532829.tif 000090
）およびV5(C末端)リバースプライミング部位に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、
2005532829.tif 000091
）が使用され得る。pcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターをシークエンシングするために、T7プロモーター/プライミング部位に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、
2005532829.tif 000092
）およびGFPリバースプライミング部位に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、
2005532829.tif 000093
）が使用され得る。
【０８８９】
一旦発現クローンが調製されれば、トランスフェクションのためのプラスミドDNAを調製できる。真核生物細胞へのトランスフェクションのためのプラスミドDNAは非常に清浄でなくではならず、フェノールおよび塩化ナトリウムを含んでいてはならない。夾雑物は細胞を死滅させ、塩は脂質複合体形成を妨害してトランスフェクション効率を減少させる。プラスミドDNAはS.N.A.P.（商標）ミディプレップキット（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号K1910-01）またはCsClグラジエント遠心分離を使用して単離することができる。
【０８９０】
樹立された細胞株（例えば、COS、HeLa）については、オリジナルの参考文献を閲覧するか、またはトランスフェクションの最適方法については細胞株の供給業者に相談されたい。個々の細胞株のために開発されたプロトコールに従うことが推奨される。トランスフェクション効率に影響を与え得る要因には、培地の要求性、いつ細胞を継代するか、および細胞を分けるためにどの程度希釈するかが含まれる。さらなる情報は、「Current Protocols in Morecular Biology」（Ausubel, F.M.ら、「Current Protocols in Molecular Biology」, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York (1994)）に提供される。
【０８９１】
トランスフェクションのための方法には、リン酸カルシウム（Chen,C.およびOkayama, H.、Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987); Wigler, M.ら、Cell 11:223-232 (1977)）、脂質介在（Felgner, P.L.ら、Proc. West. Pharmacol. Soc. 32:115-121 (1989); Felgner, P.L.およびRingold, G.M.、Nature 337:387-388 (1989)）、ならびにエレクトロポレーション（Chu, G.ら、Nucleic Acids Res. 15:1311-1326 (1987); Shigekawa, K.およびDower, W.J.、Biotechniques 6:742-751 (1988)）が含まれる。トランスフェクションのためにカチオン性脂質に基づく試薬が使用される場合、1つの適切な試薬は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるLipofectamine（商標）2000試薬（カタログ番号11668-027）である。他の適切なトランスフェクション試薬もまた使用され得る。
【０８９２】
pcDNA（商標）6.2/V5-GW/p64TAGまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-GW/p64TAGは、哺乳動物細胞トランスフェクションおよび発現のための陽性対照ベクターとして提供され、特定の細胞株における組換えタンパク質発現レベルを最適化するために使用され得る。これらのベクターは、ウェスタンブロットによって検出され得る天然型のまたはC末端タグ付加組換えヒトc-myc（p64）タンパク質の発現を可能にする。これらのベクターを発現対照として使用する場合、p64タンパク質には天然に核構造が付随し、ウェスタンブロット分析の前に全細胞溶解物中で十分に溶解するためのイオン性界面活性剤（RIPAまたはSDSゲルローディング緩衝液）が必要であることを承知されたい。
【０８９３】
各対照プラスミドを増殖および維持するために、ベクターを10μlの滅菌水に再懸濁して1μg/μlストック溶液を調製し、そしてTOP10、DH5α（商標）または等価物のようなrecA、endA 大腸菌株を形質転換するためにこのストック溶液を使用する。形質転換体を、100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天プレートまたは100μg/mlブラスチシジンを含む低塩LB寒天プレート上で選択することができる。プラスミドを含む形質転換体のグリセロールストックを長期保存のために調製することができる。
【０８９４】
本明細書中に記載される方法（例えば、Tag-On-Demand（商標）システム）は、同じpcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST発現構築物からの哺乳動物細胞における天然型組換えポリペプチドおよびC末端タグ付加組換えポリペプチドの両方を発現するために使用され得る。Tag-On-Demand（商標）システムを使用するために、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清を特定の時点で哺乳動物細胞に加える。
【０８９５】
いくつかの態様において、特に、サプレッサーtRNAの発現用にアデノウイルスを使用して宿主細胞に形質導入する場合には、宿主細胞はアデノウイルスで形質導入され、その直後に、関心対象のポリペプチドをコードしている関心対象の配列を含む発現構築物を用いてトランスフェクションが行われる。この型の態様は、組換えポリペプチドの発現（または局在化、可能である場合）について迅速にスクリーニングするため、または多数のポリペプチドの発現についてスクリーニングするために使用され得る。この型の態様は以下の実施例でより詳細に論じる。
【０８９６】
いくつかの態様において、関心対象のポリペプチドをコードする核酸分子を含む安定な細胞株を生成することが所望され得る。この型の態様において、サプレッサーtRNAをコードする核酸分子が、付加的なポリペプチド配列（例えば、タグ配列など）に融合された関心対象のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを産生するために安定な細胞に導入されてもよい。例えば、安定な細胞株は、C末端タグ付加組換えポリペプチドを産生するために、1つまたはそれ以上のサプレッサーtRNA（例えば、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清）を発現するアデノウイルスベクターを用いて形質導入され得る。
【０８９７】
いくつかの態様において（例えば、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清）、本発明の核酸分子は、精製され、力価測定され、複製コンピテントではない、ヒトtRNATAGサプレッサーを含む組換えアデノウイルスであり得る。哺乳動物細胞へのアデノウイルスの形質導入は、関心対象の遺伝子におけるTAGコドンの一過性終止抑制を容易にし、C末端タグ付加組換えポリペプチドの産生を可能にする。
【０８９８】
いくつかの態様において（例えば、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清）、本発明の核酸分子は、E1領域で欠失している組換えアデノウイルスであり得る。このようなアデノウイルスは、E1タンパク質を発現しない任意の哺乳動物細胞中で複製コンピテントでない。293細胞またはアデノウイルスE1遺伝子を発現する任意の細胞株（Graham, F.L.ら、J. Gen. Virol. 36:59-74 (1977); Kpzarsky, K.F.およびWioson, J.M.、Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 499-503 (1993); Krougliak, V.およびGraham, F.L.、Hum. Gene. Ther. 6:1575-1586 (1995)）においてこのようなアデノウイルスを使用することは、ウイルス複製をもたらし、かつ感染後1〜2日以内に標的細胞の迅速な死をもたらす。
【０８９９】
本発明の方法を使用して、融合ポリペプチドが一過性または安定に発現され得る。融合ポリペプチドを一過性に発現するために、関心対象の融合ポリペプチドをコードする核酸分子およびサプレッサーtRNAをコードする核酸分子が宿主細胞に導入され得る。当業者は、関心対象の融合ポリペプチドおよびサプレッサーtRNAをコードする配列が、同じであるかまたは異なる核酸分子であり得ることを認識することと思われる。アデノウイルスがサプレッサーtRNAを発現するために使用する態様において、細胞はアデノウイルスを用いて形質導入されてもよく、次いで、発現構築物（すなわち、融合ポリペプチドをコードする核酸分子）を用いてトランスフェクトされてもよい。
【０９００】
安定な細胞株から組換え融合ポリペプチドを発現するために、関心対象の融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む安定な細胞株が、任意の標準的な技術または本明細書中に記載される1つもしくはそれ以上の技術を使用して作製され得る（例えば、レンチウイルスベクターを使用すること、またはpcDNA（商標）6.2/V5-DESTもしくはpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST発現構築物を用いて哺乳動物細胞株に形質導入することなど）。サプレッサーtRNAをコードする核酸分子（例えば、サプレッサーtRNAを発現するアデノウイルス）は、融合ポリペプチドを産生するために安定な細胞株に導入され得る。
【０９０１】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子（例えば、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクター）は、安定な細胞株を選択するために使用され得る1つまたはそれ以上の選択マーカーを含み得る。1つの態様において、本発明の核酸分子は、安定な細胞株の選択を可能にするためのブラスチシジン耐性遺伝子を含み得る。本発明のいくつかの方法は、選択の哺乳動物細胞株に構築物をトランスフェクトし、かつブラスチシジンを使用して増殖巣を選択することによって、安定な細胞株の作製を引き起こし得る。安定な細胞株を作製する方法はまた、本発明の核酸分子（例えば、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST発現構築物）を、宿主細胞にトランスフェクトする前に線状化することを含み得る。ベクターを線状化することはトランスフェクションの効率を改善しないかもしれないが、これは、哺乳動物細胞中での発現のために必要なエレメントを破壊しないやり方でベクターが組み込まれる機会を増加させる。線状化は、決定的なエレメント中または関心対象の遺伝子中に位置していない独特な位置で切断する制限酵素により構築物を消化することを含み得る。
【０９０２】
いくつかの態様において、関心対象のポリペプチドを発現する安定な細胞株を生成する方法は、本明細書中に記載されたプロトコールのいずれか1つを使用して、死滅曲線実験を実施することにより、トランスフェクトされていない宿主細胞を死滅させるのに必要であるブラスチシジンの最小濃度を決定する工程を含み得る。典型的には、2.5〜10μg/mlの濃度範囲のブラスチシジンが、大部分のトランスフェクトされていない哺乳動物細胞株を死滅させるために十分である。
【０９０３】
一旦、選択のために使用する適切なブラスチシジン濃度が決定されたならば、関心対象の融合ポリペプチド（例えば、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST構築物）を発現する安定な細胞株が生成され得る。安定な細胞株を作製する方法は、任意の選択のトランスフェクション方法を使用して、関心対象の哺乳動物細胞株に、本発明の核酸分子（例えば、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST構築物）をトランスフェクトする工程、および安定な細胞株を選択する工程を含み得る。選択する工程は、トランスフェクションの24時間後に、細胞を洗浄する工程および新鮮な増殖培地を加える工程を含み得る。トランスフェクションの48時間後に、細胞が25％コンフルエントを超えないように、細胞を新鮮な増殖培地に分ける。細胞の密度が高すぎる場合、抗生物質は細胞を死滅させない。抗生物質は、活動的に分裂している細胞に対して最も良好に作用する。選択する工程は、細胞が培養ディッシュに付着するまで、細胞を37℃で2〜3時間インキュベートする工程、増殖培地を除去する工程、および細胞株に必要とされる所定の濃度のブラスチシジンを含む新鮮な増殖培地で置き換える工程をさらに含み得る。安定な細胞株を作製する方法はまた、ブラスチシジン耐性コロニーが同定され得るまで、3〜4日毎に選択培地を与える工程を含み得る。少なくとも5つのブラスチシジン耐性コロニーを拾い、これらを組換えポリペプチド発現についてアッセイするために増量する。
【０９０４】
本発明の方法は、本発明の融合タンパク質を検出する工程を含み得る。例えば、pcDNA（商標）6.2/V5-DESTから発現されるV5融合ポリペプチドは、ウェスタンブロット、免疫蛍光、または関心対象のポリペプチドに特異的な機能的アッセイを使用して検出され得る。発現の時間経過が、組換えポリペプチドの発現を最適化するために準備され得る（例えば、24、48、72時間など）。抗V5抗体はInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であり、V5タグ付加組換え融合ポリペプチドを検出するために使用され得る：ウェスタンブロット分析のためには、抗V5西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）抗体または抗V5アルカリホスファターゼ（AP）抗体が検出用に使用され得る。免疫蛍光のためには、抗V5フルオレセインイソチオシアネート（FITC）抗体が検出用に使用され得る。
【０９０５】
融合ポリペプチドを検出する方法は、ウェスタンブロットを実施する工程を含み得る。このような方法は、トランスフェクトされた細胞から細胞溶解物を調製する工程を含み得る。当業者に公知である細胞溶解物を調製するための任意の適切なプロトコールが使用され得る。細胞溶解物を調製する工程は、細胞単層を洗浄する工程を含み得る（例えば、〜5×105から1×106までの細胞がリン酸緩衝化生理食塩水（PBS、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号10010-023）で洗浄され得る）。細胞溶解物を調製する工程は、細胞を緩衝液中にこすり落とす工程、および細胞を遠心分離する工程をさらに含み得る。例えば、細胞は1ml PBSにこすり落としてもよく、そして細胞は1500×gで5分間遠心分離されて細胞ペレットを形成し得る。細胞溶解物を調製する方法は、細胞ペレットを溶解緩衝液に再懸濁する工程を含み得る。例えば、細胞は、50μl溶解緩衝液（例えば、50 mM Tris、pH 7.8、150mM NaCl、1％Nonidet P-40）中に再懸濁され得る。当業者に公知である他の細胞溶解緩衝液もまた適切である。再懸濁は、細胞ペレットを溶解緩衝液中で混合（例えば、ボルテックス）して細胞懸濁物を形成すること、および細胞を溶解させるために適切な条件下で（例えば、37℃で10分間）細胞懸濁物をインキュベートすることを含み得る。細胞は室温または氷上で（ポリペプチドの分解が潜在的な問題である場合）溶解され得る。細胞溶解物を調製する方法は、細胞溶解物を、例えば、10,000×gで10分間、+4℃で遠心分離して核をペレット化する工程、および上清を新鮮なチューブに移す工程をさらに含み得る。
【０９０６】
本発明に従って調製された溶解物は、当技術分野で周知の技術を使用してさらに分析され得る。例えば、溶解物は、タンパク質濃度についてアッセイされ得る。NP-40が色素とタンパク質の結合を妨害するため、当業者は、溶解緩衝液がNP-40を含む場合にはクマシーブルーまたは他の色素を利用するタンパク質アッセイを使用するべきではないことを認識するものと思われる。
【０９０７】
ウェスタンブロットを実施する方法は、細胞溶解物のアリコートをSDS-PAGEと混合する工程を含み得る。例えば、SDS-PAGE試料緩衝液は細胞溶解物に加えられて混合物を形成することができ、この混合物は煮沸することができる（例えば、5分間）。約20μgのタンパク質を含む混合物の一定量をSDS-PAGEにロードすることができ、電気泳動することができる。当業者は、融合ポリペプチドの予測サイズに基づいて、ゲルを調製するために使用されるアクリルアミドの適切な濃度を選択し得る。
【０９０８】
当業者は、attB2部位を含むC末端タグおよびV5エピトープにより、関心対象のポリペプチドに対して約4kDaが加えられることを認識すると思われる。本発明の融合ポリペプチドはまた、関心対象のポリペプチドと付加的なポリペプチド配列との間に位置する付加的なアミノ酸を含み得る（例えば、V5エピトープのようなタグ）。
【０９０９】
いくつかの態様において、本発明の方法は、p64ポリペプチドのすべてまたは一部を含む融合ポリペプチドの存在を検出する工程を含む。この型の方法（例えば、pcDNA（商標）6.2/V5-GW/p64TAG対照から発現された融合ポリペプチド）は、任意の適切な検出手段（例えば、上記に論じた抗V5抗体および/または抗myc抗体のいずれか）を利用し得る。p64のすべてまたは一部を含む融合ポリペプチドを発現する細胞からの細胞溶解物を調製する方法は、より厳しい抽出条件の使用を含み得る。なぜなら、NP-40溶解液を用いる手順は、p64タンパク質を遊離させる際に有効でないからである。p64は核小体に局在しているので、RIPAまたはSDS-PAGE試料緩衝液を使用するより厳しい溶解手順が、全体の細胞溶解物中でp64を十分に可溶化するために必要である。この種の方法は、細胞単層を洗浄する工程（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号10010-023）を用いて1回）を含み得る。方法は、細胞を含む各ウェルに1×SDS-PAGE試料緩衝液を加える工程をさらに含み得る。1×SDS-PAGE試料緩衝液は、2.5ml 0.5M Tris-HCl, pH 6.8、2mlのグリセロール(100％)、0.4mlのβ-メルカプトエタノール、0.02gブロモフェノールブルー、0.4g SDS、および容量を20mlにするための十分な滅菌水を混合することによって調製され得る。24ウェルプレートについては、ウェルあたり100μlの1×SDS-PAGE試料緩衝液を使用する。方法は、プレートから細胞を取り除くことをさらに含み得る（例えば、ピペットチップを、溶解した細胞をプレートから浮遊させるために使用する）。溶解した細胞を1.5ml微量遠心分離チューブに移し得る。この方法に従って調製した溶解物は典型的には粘性である。方法は、試料を加熱する工程（例えば、70℃で10分間）、および試料を混合する工程（例えば、数分毎のボルテックスおよび手短に試料を遠心分離することによる）をさらに含み得る。
【０９１０】
方法は、細胞溶解物のアリコート（例えば、5μlの細胞溶解物）をSDS-PAGEゲルにロードする工程、および電気泳動する工程をさらに含み得る。当業者は、V5タグ付加p64TAGタンパク質が約53kDaの分子量を有することを認識するものと思われる。
【０９１１】
pcDNA（商標）6.2/GFP-DESTからサイクル3 GFP融合ポリペプチドとして発現されたポリペプチドを検出するために、蛍光、ウェスタンブロット分析、または関心対象のポリペプチドに特異的な機能的アッセイが使用され得る。時間経過が、組換えポリペプチドの発現を最適化するために準備され得る（例えば、24、48、72時間など）。本明細書中に記載されるものを含む任意の適切な技術が発現を評価するために使用され得る。
【０９１２】
サイクル3 GFP融合ポリペプチドは、蛍光顕微鏡法を使用してインビボで検出され得る。pcDNA（商標）6.2/GFP-DESTからのサイクル3 GFP融合タンパク質の発現を制御するために使用されるCMVプロモーターは強力なプロモーターであり、典型的には、サイクル3 GFP蛍光は、トランスフェクションまたは形質導入の約24時間後に検出され得る。
【０９１３】
本発明の方法は蛍光細胞を検出する方法を含み得る。このような方法の実施において、検出を最適化するために最良のフィルターセットを選定することが重要である。サイクル3 GFPの一次励起ピークは395nmである。478nmに二次励起ピークが存在する。これらの波長のいずれかにおける励起は、507nmで最大の蛍光発光ピークを生じる。量子収率は、GFP蛍光団を励起するために使用される光の波長に依存して5〜10倍変化し得ることに注意されたい。
【０９１４】
サイクル3 GFPスペクトルの最適領域を励起および透過することは、最良のフィルターセットの使用により保証される。適切なフィルターセットには、野生型GFPからの蛍光を検出するために設計されたものが含まれる（例えば、Omega Optical XF76フィルター；www.omegafilters.comを参照されたい）。FITCフィルターセットはサイクル3 GFP蛍光を検出するために使用され得るが、これらは最適ではなく、かつ蛍光シグナルはより弱い可能性があることに注意されたい。例えば、FITCフィルターセットはサイクル3 GFPを励起させ、その光は460nm〜490nmであり、515〜550nmの第2の励起ピークおよび透過光をカバーすることができる。この型のセットはサイクル3 GFP蛍光のすべてではないにしても大部分の検出を可能にし得る。
【０９１５】
大部分の組織培養培地はリボフラビンの存在のために蛍光を発し（Zylka, K.J.およびSchnapp, B.J., BioTechniques 21:220-226 (1996)）、そしてサイクル3 GFP蛍光の検出を妨害し得る。この問題を緩和するために、アッセイの間、培地は除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号10010-023）で置き換えることができる。細胞がアッセイ後にさらに培養される場合は、再インキュベーションの前にPBSを除去して新鮮な増殖培地で置き換える。
【０９１６】
サイクル3 GFP融合ポリペプチドの発現をウェスタンブロットによって検出するために、関心対象のポリペプチドに対する抗体、またはサイクル3 GFPに対する抗体が使用され得る。GFP抗血清は、検出のために別個にInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能である（カタログ番号R970-01）。GFP抗血清は、組換えサイクル3 GFPに対して惹起された、精製されたポリクローナルウサギ抗血清であり、サイクル3 GFPおよび野生型GFPタンパク質の両方を検出し得る。
【０９１７】
attB2部位およびサイクル3 GFPを含むC末端タグは、融合ポリペプチドのサイズに約23.8kDaを付加するものと考えられる。本発明の融合ポリペプチドは、関心対象のポリペプチドとサイクル3 GFPとの間に位置する付加的なアミノ酸をさらに含み得る。
【０９１８】
実施例16
いくつかの態様において、本発明は、融合ポリペプチドの発現のための材料および方法を提供する。1つの局面において、同じ核酸分子が、関心対象のポリペプチドおよび関心対象のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを発現するために使用される。いくつかの局面において、このことは、付加的なポリペプチド配列と同じリーディングフレームに関心対象のポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする核酸分子を、宿主細胞に導入することによって達成される。典型的には、融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、1つまたはそれ以上の終止コドンを含んでいてもよく、それらの1つが、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の部分と、付加的なポリペプチド配列をコードする核酸配列の部分との間に位置し得る。サプレッサーtRNA分子をコードする1つまたはそれ以上の核酸配列を発現する核酸分子の存在下では、2つのポリペプチド配列間の終止コドンは抑制され、そして融合ポリペプチドが発現される。
【０９１９】
従って、1つの局面において、本発明は、tRNA分子（例えば、サプレッサーtRNA分子）が発現され得る核酸分子（および/またはそのような分子を含む組成物）を含む。tRNA分子が発現され得る核酸分子は、当業者に公知である任意の型の核酸分子であってもよく、例えば、プラスミド、線状核酸分子、ウイルスなどであってもよい。特定の態様において、本発明は、tRNA分子が発現され得るウイルス（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルスなど）を提供する。特定の態様において、本発明は、1つまたはそれ以上のtRNA分子が発現され得るアデノウイルスを提供する。
【０９２０】
1つの態様において、本発明は、1つまたはそれ以上のサプレッサーtRNA分子を発現するアデノウイルスを提供する。このようなアデノウイルスの1つの非限定的な例は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるTag-On-Demand（商標）システム（カタログ番号K400-01）において見い出される。本発明の方法は、単一の発現ベクターから、タグ付けされていない（すなわち、天然型の）またはC末端タグを付加された関心対象の組換えポリペプチドを宿主細胞中で発現させるために、アデノウイルスに基づく終止抑制技術を利用し得る。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、Tag-On-Demand（商標）GATEWAY（登録商標）ベクターおよび/または発現構築物を生成するために使用され得る他のベクターを含み得る。
【０９２１】
1つの局面において、本発明の材料および方法は、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）における関心対象のC末端タグ付加組換えポリペプチドの一過性発現を容易にするために使用され得る。本発明の材料および方法は、利用可能な特異的抗体が存在しない組換えポリペプチドの発現または局在を容易に検出するための手段を提供するために使用され得る。これは、例えば、一旦タグ付加組換えポリペプチド発現が確認されれば、天然型ポリペプチド発現実験を同じ構築物を用いて実施できるという点で有用であり得る。
【０９２２】
いくつかの局面において、本発明は送達ビヒクルとしてアデノウイルスを使用し、これは、広範な宿主細胞種（例えば、哺乳動物細胞種）へのサプレッサーtRNAの効率的な送達を可能にする。典型的には、本発明の方法において、サプレッサーtRNAは、毒性を最小化するように細胞に一過性に送達され得る。
【０９２３】
本発明のいくつかの局面において、本発明の方法は、ハイスループットへの適用（特定の細胞種における発現のための多数の遺伝子の迅速スクリーニングを含む）のために使用され得る。
【０９２４】
いくつかの態様において、本発明の材料および方法は、単一の発現構築物から、哺乳動物細胞においてC末端タグ付加組換えポリペプチドおよび天然型の組換えポリペプチドを一過性に発現するために使用され得る。哺乳動物細胞において機能するサプレッサーtRNAは記載されている（Caponeら（1985）EMBO J. 4, 213-221）。
【０９２５】
1つの局面において、本発明は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列がそこにクローニングされる核酸分子（例えば、哺乳動物発現ベクター）を提供する。好ましくは、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列は、1つまたはそれ以上の終止コドンの抑制によるC末端タグ付加組換えポリペプチドの発現と適合可能である配置で、本発明の核酸分子（pcDNA（商標）6.2/V5-DESTまたはpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST）にクローニングされ得る。
【０９２６】
別の局面において、本発明は、そこからサプレッサーtRNAが発現され得る核酸配列（例えば、ヒトtRNAserサプレッサー遺伝子）を含む核酸分子（例えば、複製コンピテントでないアデノウイルス）を提供する。いくつかの態様において、サプレッサーtRNAは、1つまたはそれ以上の終止コドン（例えば、TAG（アンバー終止）コドン）を認識し、かつそれをセリンとして解読するようにtRNA変異され得る。本発明のこの局面に従う核酸分子は、宿主細胞に導入されて、tRNAserサプレッサーの一過性の供給源を提供する。TAG終止コドンを有する関心対象の遺伝子をコードする発現構築物が宿主細胞に存在する場合、終止コドンはセリンとして翻訳され、翻訳は任意の下流のリーディングフレーム（すなわち、C末端タグ）を通して継続される。これは、C末端タグ付加融合ポリペプチドの産生を生じる。
【０９２７】
1つの局面において、そこからサプレッサーtRNA分子が発現され得る核酸分子が組換えアデノウイルスであってもよく、かつ以下のように構築してもよい。その天然型プロモーターおよびターミネーターを有するtRNAser遺伝子をコードする遺伝子を含むベクターを、例えば、マサチューセッツ工科大学のUttam RajBhandary博士から取得可能である。このtRNAser遺伝子は、アンチコドンがTAG（アンバー）終止コドンを認識するように変異しており、tRNAserサプレッサー遺伝子と呼ばれる（Caponeら（1985）を参照されたい）。tRNAserサプレッサー遺伝子は、PCR増幅し、およびInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であるpENTR/D-TOPO（登録商標）ベクターにTOPO（登録商標）クローニングして、GATEWAY（登録商標）エントリークローンを生成し得る。上記のエントリークローンおよびBuvoliら、2000（Buvoliら、(2000) Mol. Cell. Biol. 20, 3116-3124）に記載される多量体化手順を使用して、tRNAserサプレッサー遺伝子の8タンデムコピーを含むGATEWAY（登録商標）エントリークローンを生成し得る。1つのこのようなエントリークローンは、pENTR（商標）-tRNA8TAGと名付けられた。pENTR（商標）-tRNA8TAGエントリークローンを、GATEWAY（登録商標）LR組換え反応を使用してInvitrogenのpAd/PL-DEST（商標）デスティネーションベクター（カタログ番号V494-20）と組換えて、アデノウイルス発現クローン、pAd/GW-tRNA8TAGを生成した。pAd/GW-tRNA8TAG発現構築物を、InvitrogenのViraPower（商標）アデノウイルス発現システム（カタログ番号K4940-00）において使用して、組換えアデノウイルスを産生し、これを、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清を生成するためにCsCl精製しかつ力価測定した。
【０９２８】
いくつかの態様において、サプレッサーtRNA分子を発現する核酸分子は組換えアデノウイルスであってもよく、これは、例えば、tRNAserサプレッサーを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）に送達するために使用され得る。アデノウイルスは非常に広い向性を有し、tRNAserサプレッサーを種々の宿主細胞株および細胞種に送達するために使用され得るが、本発明の材料および方法はアデノウイルスを用いて形質導入され得る細胞に限定されず、従って、本発明の材料および方法は、当業者に公知の任意の宿主細胞株または細胞種を用いて使用され得る。
【０９２９】
本発明の実施において、1種またはそれ以上のサプレッサーtRNA分子を発現する核酸分子が宿主細胞に導入され得る。このような核酸分子が宿主細胞に導入される場合、これらは細胞集団の約25％〜約100％に、または細胞集団の約25％〜約90％に、約25％〜約80％に、約25％〜約70％に、約25％〜約60％に、約25％〜約50％に、約50％〜約100％に、約60％〜約100％に、約70％〜約100％に、約80％〜約100％に、約90％〜約100％に、約50％〜約90％に、約50％〜約80％に、約50％〜約75％に、約50％〜約70％に、または約50％〜約60％に導入され得る。いくつかの態様において、1種またはそれ以上のtRNAを発現する核酸分子はアデノウイルスであってもよく、極度に高い効率で哺乳動物細胞に形質導入されてもよく、その結果哺乳動物細胞のほぼ100％にtRNAserサプレッサーが送達される。
【０９３０】
いくつかの態様において、本発明のサプレッサーtRNAを発現する核酸分子は宿主ゲノムに組み込まれなくてもよく、サプレッサーtRNAの発現は一過性で、核酸分子（例えば、ウイルスゲノム）が存在する間（典型的には形質導入後7〜8日間）の持続のみでもよい。典型的には、一旦サプレッサーtRNAを発現する核酸分子が宿主細胞に導入されると、サプレッサーtRNAは24時間以内に発現される。
【０９３１】
いくつかの態様において、サプレッサーtRNA分子を発現する核酸分子はウイルス（例えば、アデノウイルス）であり得る。当技術分野において公知であるように、ウイルスは、細胞表面に存在し得る1種またはそれ以上の受容体に結合する能力を有し得る。例えば、アデノウイルスは、コクサッキー/アデノウイルス受容体（CAR）への結合（Bergelsonら（1997）Science 275, 1320-1323を参照されたい）、インテグリン介在エンドサイトーシスを介する内部移行（Russell, W.C.（2000）J. Gen. Virol. 81, 2573-2604）によって標的細胞に侵入する。一旦内部移行されると、組換えアデノウイルスは核に活動的に移動し、サプレッサー遺伝子の発現を開始する。従って、サプレッサーtRNAを発現する核酸分子がアデノウイルスである場合、宿主細胞株はCARを含むはずである。大部分の哺乳動物細胞種はCARを発現するが、レベルは異なる。アデノウイルスがサプレッサーtRNAを発現するために使用される場合、特定の標的細胞株において発現されるCARの量に依存して、形質導入効率は変化し得る。当業者は、他のウイルスが本発明の実施においてサプレッサーtRNAを発現するために使用され得ることを認識し、このウイルスは、例えば、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、植物ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルスなど）、負鎖RNAウイルス（センダイウイルスなど）、正鎖RNAウイルス（例えば、アルファウイルスなど）である。当業者は、特定の細胞種についての特異的なウイルスの既知の向性に基づいて、任意の所望の標的細胞種への感染用の適切なウイルスを容易に選択し得る。
【０９３２】
いくつかの態様において、本発明のサプレッサーtRNAを発現する核酸分子はアデノウイルスであり得る。本発明のこの局面における使用のためのアデノウイルスは、野生型アデノウイルスゲノム（例えば、Ad2、Ad5など）と比較して、アデノウイルスゲノム中に1つまたはそれ以上の欠失を有し得る。例えば、本発明における使用のためのアデノウイルスは、E1領域および/またはE3領域において欠失され得る。いくつかの態様において、完全なE1領域およびE3領域が欠失され得る。このようなウイルスは、E1aタンパク質またはE1bタンパク質を発現しない哺乳動物細胞に形質導入された場合、複製コンピテントでない場合がある（Grahamら（1977）J. Gen. Virol. 36, 59-74; KozarskyおよびWilson（1993）Curr. Opin. Genet. Dev. 3, 499-503; ならびにKrougliakおよびGraham (1995) Hum. Gene. Ther. 6, 1575-1586を参照されたい）。
【０９３３】
当技術分野で公知であるように、アデノウイルスは形質導入の際に宿主ゲノムに組み込まれない。このウイルスは複製コンピテントでないので、ウイルスゲノムの存在は一過性であり、細胞分裂が起こるにつれて最終的に希釈される。アデノウイルスは哺乳動物細胞中に一過性に存在するので、終止抑制から得られたC末端タグ付加ポリペプチドの産生もまた一過性である。アデノウイルスのレベルが減少するにつれて、産生されるC末端タグ付加ポリペプチドは減少する。
【０９３４】
いくつかの態様において、本発明に従うサプレッサーtRNAを発現するために使用されるウイルスは、それらがサプレッサーtRNAを発現する細胞種において複製コンピテントでない場合がある。本発明のこの局面における使用のためのウイルスは、当技術分野において公知の技術を使用して野生型複製コンピテントウイルスの存在についてスクリーニングし得る。例えば、本発明における使用のためのアデノウイルスの集団は、上清レスキューアッセイ（Dionら（1996）J. Virol. Methods 56, 99-107）を使用して、109個の組換えアデノウイルスあたり1個の野生型RCAといった検出感度で、複製コンピテントアデノウイルス（RCA）夾雑の存在についてスクリーニングされ得る。いくつかの態様において、本発明の方法に従って1種またはそれ以上のサプレッサーtRNA分子を発現するために使用されるウイルス調製物は、検出可能な野生型RCAを含まない場合がある。
【０９３５】
いくつかの態様において、本発明はC末端タグ付加融合ポリペプチドを発現する方法を提供し、この方法は、1種またはそれ以上のサプレッサーtRNA分子を発現するウイルスを用いて宿主細胞に形質導入する工程、形質導入された細胞を融合ポリペプチドのすべてまたは一部をコードする1種またはそれ以上の核酸分子でトランスフェクトする工程、およびC末端タグ付加融合ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で宿主細胞をインキュベートする工程を包含する。この型の態様の模式図を図62に提供する。別の態様において、本発明は、C末端タグ付加融合ポリペプチドを発現する方法を提供し、この方法は、1種またはそれ以上のサプレッサーtRNA分子を発現するウイルスを用いて、融合ポリペプチドのすべてまたは一部をコードする1種またはそれ以上の核酸分子を含む安定な細胞株に形質導入する工程、およびC末端タグ付加融合ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で形質導入された宿主細胞をインキュベートする工程を包含する。この型の態様の模式図を図63に提供する。
【０９３６】
本発明の方法は、ウイルス（例えば、1種またはそれ以上のサプレッサーtRNA分子を発現するウイルス）のストックの使用を必要とし得る。当業者によって認識されるように、ウイルスのストックは-80℃で保存され得る。一般的には、これらの条件下で保存されたストックは少なくとも6ヶ月間安定である。ウイルス力価は長期保存で減少することがあるため、ウイルスストックが6ヶ月よりも長く-80℃で保存された場合には、ストックの力価が標準的な技術を使用して決定され得る。ウイルス力価は3回より多くの凍結/融解サイクルで減少することがあるため、ウイルスストックは反復して融解および再凍結されるべきではない。
【０９３７】
当業者は、ウイルスを含む材料の取り扱いが、潜在的に危険な生物を用いる作業のための連邦政府のおよび施設の適用可能なガイドラインに従って行われるべきであることを承知している。例えば、すべての操作は認定されたバイオセーフティーキャビネット内で行われ、ウイルスを含むすべての培地は漂白剤で処理されるべきであり、ウイルスと接触するすべての物質は（例えば、ピペット、ピペットチップ、および他の組織培養供給品）漂白剤で処理されるか、またはバイオハザード性廃棄物として廃棄されるべきであり、そしてウイルスを含む材料を取り扱う人は適切な安全着（例えば、手袋、実験室用コート、および安全眼鏡またはゴーグル）を着用するべきである。
【０９３８】
いくつかの態様において、本発明の方法は、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を作製するために使用され得る。本発明の1つの局面に従って、融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリペプチド配列（例えば、関心対象のポリペプチド）をコードする第1の核酸配列を有する第1の核酸分子を、付加的なポリペプチド配列（例えば、ポリペプチドタグ配列）をコードする第2の核酸配列を有する第2の核酸分子と組み合わせることによって構築され得る。関心対象のポリペプチドをコードする核酸分子は、哺乳動物細胞における翻訳の正しい開始のためにコザックコンセンサス配列の関連内でATG開始コドンを含むべきである（Kozak、1987；Kozak、1991；Kozak、1990）。コザックコンセンサス配列の例は
2005532829.tif 000094
であり、ここでATG開始コドンに下線を付している。他の配列は可能であるが、-3位におけるGまたはA、および+4位におけるGはその機能上最も重要である（太字で示す）。
【０９３９】
典型的には、関心対象のポリペプチドをコードする核酸分子は終止コドン（例えば、ヌクレオチドTAG、TAA、またはTGAによってコードされる終止コドン）を含む。当業者は、適切なサプレッサーtRNA（すなわち、終止コドンに対応するアンチコドンを用いる）が使用されなければならないことを認識するものと思われる。
【０９４０】
当業者は、第1の核酸分子および第2の核酸分子を結合させて融合ポリペプチドをコードする核酸分子を産生した後に、関心対象のポリペプチドをコードする配列が、付加的なポリペプチド配列として同じリーディングフレームに存在しなければならないことを認識するものと思われる。
【０９４１】
付加的なポリペプチド配列をコードする第2の核酸分子は、典型的には、付加的なポリペプチド配列をコードする配列の後に1つまたはそれ以上の終止コドンを含む。一般的に、第2の核酸分子上の終止コドンは、第1の核酸分子上の終止コドンとは異なる。
【０９４２】
広範な種々の核酸分子が、本発明に従う第2の核酸分子として使用するために適切である。このような核酸分子の非限定的な例には、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから市販されているベクターが含まれる。このようなベクターの例は、括弧内のそれらのInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号とともに提供される。このようなベクターには以下が含まれるがこれらに限定されない：pLenti4/V5-DEST(商標)(K4980-00)、pLenti6/V5-DEST(商標)(K4950-00)、pLenti6/UbC/V5-DEST(商標)(K4990-00)、pLenti6/V5-D-TOPO(登録商標)(K4960-00)、およびpAd/CMV/V5-DEST(K4930-00)、これらはウイルス発現のために使用され得る；pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO(登録商標)(K6020-01)、pSecTag/FRT/V5-His-TOPO(登録商標)(K6025-01)、pEF5/FRT/V5-DEST(商標)(V6020-20)、およびpEF5/FRT/V5-D-TOPO(登録商標)(V6035-01)、これらはFlp-In（商標）システムを使用する特定のゲノム遺伝子座からの発現のために使用され得る；pcDNA(商標)4/TO/myc-His(K1030-01)、pGene/V5-His(K1060-01)、これらは誘導性発現のために使用され得る；pcDNA(商標)6.2/V5-DEST(K420-01)、pcDNA(商標)3.2/V5-DEST(12489-019)、pcDNA(商標)-DEST40(12274-015)、pcDNA6.2/V5-GW/D-TOPO(登録商標)(K2460-20)、pcDNA3.2/V5-GW/D-TOPO(登録商標)(K2440-20)、pcDNA3.1D/V5-His-TOPO(登録商標)(K4990-01)、pcDNA(商標)3.1/V5-His-TOPO(登録商標)(K4800-01)、pcDNA(商標)3.1/V5-His(V810-20)、pcDNA(商標)3.1/myc-His(V800-20)、pcDNA(商標)3.1(-)/myc-His(V855-20)、pcDNA(商標)4/V5-His(V861-20)、pcDNA(商標)4/myc-His(V863-20)、pcDNA(商標)6/V5-His(V220-20)、およびpcDNA(商標)6/myc-His(V221-20)、これらはCMVプロモーターからの構成的発現のために使用され得る；pEF6/V5-His-TOPO(登録商標)(K9610-20)、pEF1/V5-His(K920-20)、pEF1/myc-His(K921-20)、pEF4/V5-His(K941-20)、pEF4/myc-His(K942-20)、pEF6/V5-His(K961-20)、およびpEF6/myc-His(K962-20)、これらはEF-1αプロモーターからの構成的発現のために使用され得る；pUB6/V5-His(V250-20)、これはUbCプロモーターからの構成的発現のために使用され得る；pSecTag2(V900-20)およびpSecTag2/Hygro(V910-20)、これらは構成的分泌発現のために使用され得る；pcDNA(商標)6.2/GFP-DEST(K410-01)、pcDNA(商標)-DEST47(12281-010)、およびpcDNA3.1/CT-GFP-TOPO(登録商標)(K4820-01)、これはGFPレポーター遺伝子への融合物のために使用され得る。
【０９４３】
種々の要因が本発明に従う融合ポリペプチドを産生するために最適化され得る。要因には以下が含まれるがこれらに限定されない：宿主細胞株の特徴；細胞の健常性および実験的細胞培養条件；宿主細胞株に核酸分子を導入するために使用されるトランスフェクション方法；使用される形質導入手順；ならびに宿主細胞に導入されるサプレッサーtRNAをコードする核酸の量（例えば、サプレッサーtRNAをコードする核酸分子がアデノウイルスのようなウイルスである場合の感染多重度）。
【０９４４】
いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質は、当業者に公知の任意の宿主細胞において発現され得る。いくつかの態様において、宿主細胞株は哺乳動物宿主細胞株であり得る。アデノウイルスが本発明の実施において1種またはそれ以上のサプレッサーtRNAを発現するために使用される場合、宿主細胞は好ましくは1種またはそれ以上の受容体を発現して、アデノウイルスによる細胞株の効率的な形質導入を可能にする。適切な受容体の例は、コクサッキー/アデノウイルス受容体（CAR）である（Bergelsonら（1997）Science 275, 1320-1323を参照されたい）。大部分の哺乳動物細胞種はCARを発現するがレベルは異なる。当業者は、細胞株の形質導入効率が所定の細胞株において発現されるCARの量に依存して変化することを認識し、日常的な実験を使用して、任意の特定の適用のために必要とされるような感染多重度および/または細胞株のいずれかを調整できるものと思われる。
【０９４５】
いくつかの態様において、本発明の実施において使用される細胞株は、宿主細胞へのサプレッサーtRNAの導入用に使用されるウイルスの複製のために必要なウイルスタンパク質を発現しない可能性がある。例えば、アデノウイルスが宿主細胞へのサプレッサーtRNAの導入用に使用される場合、その宿主細胞はアデノウイルスE1タンパク質を発現しない可能性がある。
【０９４６】
典型的には、本発明の実施において使用される宿主細胞は、効率的なトランスフェクションを受容可能であり得る。例えば、標準的な技術を使用して、高い割合で細胞に本発明の融合ポリペプチドをコ−ドする核酸分子を導入することが可能であり得る。例えば、脂質介在トランスフェクションを使用して（例えば、Lipofectamine 2000を用いて）、所定の細胞の試料（例えば、ウェル中または組織培養プレートの細胞）の、約25％〜約100％、約25％〜約99％、約25％〜約95％、約25％〜約80％、約25％〜約70％、約25％〜約60％、約25％〜約50％、約25％〜約40％、約40％〜約95％、約50％〜約95％、約60％〜約90％、約75％〜約95％、または約80％〜約95％の細胞に本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子を導入することが可能であり得る。適切な細胞株の例には、COS-7、CHO-S、HeLa、HT1080、およびBHK-21、初代ラット海馬および皮質神経細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【０９４７】
いくつかの態様において、本発明における使用のためのサプレッサーtRNAをコードする核酸分子はアデノウイルスであり得る。このようなアデノウイルスはE1領域が欠失していてもよく、このことにより、これらは、E1タンパク質を発現しない任意の細胞において複製コンピテントではなくなる。典型的には、本発明の方法は、アデノウイルスE1タンパク質を発現する細胞（例えば、293細胞または誘導体）中では実施されない。なぜなら、ウイルス複製がこれらの細胞中では起こり、感染後1〜2日以内に標的細胞の急速な死滅をもたらすからである。いくつかの例においては、アデノウイルスE1タンパク質を発現する細胞中で本発明の方法を実施することが所望され得る。
【０９４８】
当業者は、本発明の方法において使用される細胞の健常性がこれらの細胞において発現される本発明の融合ポリペプチドの発現に影響を与え得ることを認識するものと思われる。一般的に、本発明の方法において、細胞はプレーティングの時点で健常であるべきである（すなわち、>95％の生存度を示す）。品質のよくないウイルスストック（例えば、継代前に過剰増殖またはコンフルエントになった細胞、再補給前に黄色になった増殖培地）は抑制効率および発現される融合ポリペプチドの量に負の影響を与え得る。一般的に、新鮮に調製された培地が本発明の方法の実施において使用され得る。
【０９４９】
本発明の方法は、1種またはそれ以上の核酸分子を1種またはそれ以上の宿主細胞に導入する工程を伴い得る。任意の選択の方法を使用して、核酸分子を細胞にトランスフェクトすることができる。適切な方法には以下が含まれるがこれらに限定されない：リン酸カルシウム（ChenおよびOkayama（1987）; Wiglerら（1977）を参照されたい）、脂質介在（Felgnerら（1989）; FelgnerおよびRingold（1989）を参照されたい）およびエレクトロポレーション（Chuら（1987）; ShigekawaおよびDower（1988）を参照されたい）。核酸分子を任意の特定の細胞株に導入するための適切な条件（例えば、試薬、インキュベーション条件など）は、公開された文献を調べること、問題の細胞株の供給業者に相談すること、および/または日常的な実験によって決定され得る。いくつかの態様において、本発明の方法は、適切な脂質試薬（例えば、カチオン性脂質に基づく試薬Lipofectamine（商標）2000試薬のようなInvitrogen Corporarion, Carlsbad, CAからの脂質試薬）を用いて、脂質介在トランスフェクションを使用して、1種またはそれ以上の核酸分子を1種またはそれ以上の細胞に導入する工程を伴い得る。
【０９５０】
いくつかの態様において、本発明の方法は、真核生物細胞への核酸のトランスフェクションのために設計された、カチオン性脂質に基づく製剤であるLipofectamine（商標）2000試薬（Ciccaroneら（1999）Focus 21, 54-55を参照されたい）を使用して、1種またはそれ以上の核酸分子を1種またはそれ以上の細胞に導入する工程を含み得る。この型の方法は、核酸分子およびLipofectamine（商標）2000試薬を含む複合体を形成させること、および血清の存在下で培養培地中でその複合体に細胞を接触させることを包含する。このような方法は、トランスフェクションの後での複合体の除去または培地の交換もしくは付加を含まなくてもよい。または、方法は、トランスフェクションの後での複合体の除去または培地の交換もしくは付加を含んでいてもよく、例えば、複合体と細胞とを接触させた4〜6時間後に行う。
【０９５１】
いくつかの態様において、本発明はポリペプチドの発現をスクリーニングする方法を含んでいてもよく、この方法は、サプレッサーtRNAを発現する核酸分子およびポリペプチドをコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程；ならびにポリペプチドの存在を検出する工程を包含する。いくつかの態様において、このような方法は、ポリペプチドの発現もしくは局在をスクリーニングするため、または多数の遺伝子の発現をスクリーニングするために使用され得る。このような方法は、サプレッサーtRNAを発現するアデノウイルスの使用を含んでいてもよく、かつアデノウイルスを用いて宿主細胞に形質導入する工程、およびポリペプチドをコードする核酸分子をトランスフェクトする工程を含み得る。典型的には、核酸分子のトランスフェクションは、アデノウイルスを用いる形質導入後、実際的には直ちに行われる。いくつかの態様において、細胞は、アデノウイルスを含む溶液と接触してもよく、次いで核酸分子（例えば、トランスフェクション試薬との複合体中の）をアデノウイルスを含む溶液に加えてもよい。任意で、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、1種またはそれ以上のサプレッサーtRNAを発現するアデノウイルスを用いる宿主細胞への形質導入の前に、宿主細胞に導入されてもよい。当業者は、アデノウイルスを用いる宿主細胞への形質導入、および同時に（すなわち、実際的にできるだけ直ちに）本発明のポリペプチドをコードするプラスミドを用いるトランスフェクトを行うことで、プラスミドによって誘導される遺伝子発現を増大させることができ、かつ細胞に対する毒性を減少させることができることを認識するものと思われる（
2005532829.tif 000095
を参照されたい）。
【０９５２】
いくつかの態様において、標準的な技術を使用して、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含む安定な細胞株を作製すること、および1種またはそれ以上のサプレッサーtRNAを発現するアデノウイルスを用いて安定な細胞株に形質導入することが所望され得る。
【０９５３】
1種またはそれ以上のサプレッサーtRNAを発現するウイルス（例えば、アデノウイルス）を用いて宿主細胞に形質導入する工程を含む本発明の方法において、細胞は所望の量のウイルスを用いて形質導入され得る。例えば、細胞は、約0.1〜約500、約0.25〜約500、約0.5〜約500、約0.75〜約500、約1〜約500、約2〜約500、約3〜約500、約4〜約500、約5〜約5000、約10〜約500、約25〜約500、約50〜約500、約75〜約500、約100〜約500、約200〜約500、約300〜約500、約400〜約500、約1〜約250、約1〜約200、約1〜約150、約1〜約100、約1〜約75、約1〜約50、約1〜約25、約1〜約20、約1〜約15、約1〜約10、約1〜約5、約10〜約400、約10〜約300、約10〜約200、約10〜約100、約10〜約75、約10〜約70、約10〜約65、約10〜約60、約10〜約55、約10〜約50、約10〜約45、約10〜約40、約10〜約35、約10〜約30、約10〜約25、約10〜約20、約10〜約15の感染多重度（MOI）でウイルスを用いて形質導入され得る。従って、細胞は約1、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、または約100のMOIで形質導入され得る。MOIは細胞あたりのウイルス粒子の数として定義され、一般的に発現と相関する。日常的な実験を用いて本発明の融合ポリペプチドの発現を最適化するために、使用される細胞株および関心対象の遺伝子の性質に依存してMOIを変化させてもよい。
【０９５４】
例として、試験される細胞株（すなわち、COS-7、CHO-S、HeLa、HT1080、BHK-21、および初代ラット海馬および皮質神経細胞）に対する、50のMOIでの形質導入、その直後の本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子のトランスフェクションにより、一般的に50〜80％の抑制がもたらされる。これは、融合ポリペプチドをコードする核酸分子から発現されるポリペプチドの50〜80％が融合ポリペプチドとして発現されることを意味する。100％の抑制はいかなるMOIにおいても達成することができないことに注意されたい。いくらかのタグ付けされていないポリペプチドが常に発現される。
【０９５５】
当業者は、細胞が特定のMOI（例えば、MOI=50）で形質導入される場合に達成される抑制％（すなわち、抑制効率）は変動することがあり、かつ以下を含む多数の要因に依存することを認識すると思われる：哺乳動物細胞において発現されるCARの数；発現される遺伝子の性質；形質導入の時点での細胞の健常性；終止コドン抑制から生じる細胞に対する表現型の変化。
【０９５６】
抑制効率、および結果的に発現される融合ポリペプチドの量に依存して、抑制％は、日常的な実験を使用してMOIを変動させることによって最適化され得る。抑制％はMOIを増加させることによって増大し得るが、そうすることは細胞に対する表現型の変化の可能性を増加させ得ることに注意することは重要である。
【０９５７】
内因性終止コドンの1/3（すなわち、サプレッサーtRNAによって認識される終止コドンを含むすべての遺伝子）が抑制され得るため、宿主細胞におけるサプレッサーtRNAの発現は細胞における表現型（例えば、毒性）の変化をもたらすことがある。このことは、関心対象の融合ポリペプチド以外の細胞タンパク質のC末端への余分なアミノ酸の潜在的な付加をもたらす。いくつかの態様において、関心対象の特定の細胞株において表現型の効果を最小化するために本発明の方法を最適化することが所望され得る。
【０９５８】
1種またはそれ以上のサプレッサーtRNAがアデノウイルスから発現される本発明の態様において、アデノウイルスは、標的細胞へのサプレッサーtRNAの一過性の供給源を送達することができる。アデノウイルスが複製コンピテントでない場合、これは標的細胞のゲノムに安定に組み込まれず、細胞分裂が起こるに従って次第に希釈される。このことは、時間の経過と共にサプレッサーtRNA発現の全体的な減少をもたらす。いくつかの態様において、関心対象の細胞への形質導入の、約1時間〜約5日後、約1時間〜約4日後、約1時間〜約3日後、約1時間〜約2日後、約1時間〜約1日後、約1時間〜約20時間後、約1時間〜約16時間後、約1時間〜約12時間後、約1時間〜約8時間後、約1時間〜約4時間後、約1時間〜約3時間後、約1時間〜約2時間後、約8時間〜約72時間後、約8時間〜約60時間後、約8時間〜約48時間後、約8時間〜約36時間後、約8時間〜約24時間後、約8時間〜約20時間後、約8時間〜約16時間後、約8時間〜約12時間後、本発明の融合ポリペプチドを検出することが所望され得る。従って、融合ポリペプチドは、細胞への形質導入の、約4時間後、約8時間後、約12時間後、約16時間後、約20時間後、約24時間後、約28時間後、約32時間後、約36時間後、約40時間後、約44時間後、約48時間後、約52時間後、約56時間後、約60時間後、約64時間後、約68時間後、約72時間後、約76時間後、約80時間後、約84時間後、約88時間後、または約92時間後に検出され得る。
【０９５９】
本発明の方法は、当技術分野で公知の目的のための任意の装置（例えば、組織培養プレート、組織培養フラスコ、ローラーボトル、バイオリアクターなど）において増殖させた任意の数の細胞を使用して実施され得る。いくつかの態様において、組織培養プレートが使用され得る（例えば、6ウェル、24ウェル、または96ウェルのプレート）。ハイスループットへの適用のために、96ウェルプレートが使用され得る。細胞が本発明における使用のための組織培養プレートにおいて増殖される場合、細胞は形質導入の時点で90％コンフルエントであるようにプレーティングしてもよい。例として、細胞は、50のMOIで、サプレッサーtRNAを発現するアデノウイルスを用いて形質導入し、かつ本発明の融合ポリペプチドをコードするプラスミドを用いて形質導入することができる。上記に論じたように、任意の適切なトランスフェクションプロトコールおよび/または試薬が使用され得る。本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子およびトランスフェクション試薬の量は、当技術分野において周知の技術を使用して、トランスフェクトされる細胞の数と一致するように調整することができる。
【０９６０】
非限定的な例において、COS-7細胞は、例えば、24ウェルプレートのウェルあたり8×104 COS-7細胞でプレーティングし、37℃で一晩培養することができる。次の日に、細胞を、例えば、MOI=50を使用して（例えば、サプレッサーtRNAを発現するアデノウイルスを用いて）形質導入することができる。一晩培養の間に細胞が倍化し、その結果、細胞の数は2×8×104=1.6×105細胞であることが想定され得る。ウイルスストックの力価は、例えば、1×109pfu/mlであり、細胞に加えるウイルスストックの量は以下のように計算することができる：
50pfu/細胞×1.6×105細胞=8×106pfu/1×109(pfu/ml)=.008ml=8μl（各ウェルに加える）。
【０９６１】
いくつかの態様において、本発明の方法において1種またはそれ以上の対照を含めることが所望され得る。例えば、本発明の方法は、サプレッサーtRNAを発現するウイルスを用いて宿主細胞に形質導入する工程、細胞に対照核酸分子（例えば、レポーター活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸分子）をトランスフェクトする工程、およびレポーター活性を検出する工程を包含し得る。例えば、pcDNA（商標）6.2/GFP-GW/p64TAGが、形質導入、トランスフェクション、および発現のための陽性対照として使用され得る。このプラスミドにおいて、TAG終止コドンを含むp64タンパク質（ヒトc-myc）がサイクル3 GFPレポーター遺伝子とインフレームにクローニングされる（Chalfie, M.ら、Science 263:802-805 (1994); Crameri, A.ら、Nature Biotechnol. 14:315-319 (1996)を参照されたい）。本発明の形質導入およびトランスフェクションを実施する場合に、pcDNA（商標）6.2/GFP-GW/p64TAGを含むプラスミドを含むことにより、レポーター遺伝子活性の検出（例えば、蛍光顕微鏡法を使用してサイクル3 GFP発現をアッセイするか、またはウェスタンブロット分析を使用してc-myc発現をアッセイする）、ならびにトランスフェクションおよび/または形質導入の評価が可能になる。
【０９６２】
1つの非限定的な例において、本発明の方法は、本発明の融合ポリペプチドを発現するために使用され得る。本発明の方法は、適切な組織培養容器に適切な密度で（例えば、細胞が、形質導入の時点で約90％コンフルエントになるような密度で）細胞を播種する工程を含む。任意で、細胞は播種後にインキュベートしてもよい（例えば、37℃、一晩）。24ウェル組織培養プレートが使用された場合、細胞は500μlの完全培地に播種され得る。本発明の方法は、形質導入の当日に、各細胞のウェルから増殖培地を除去する工程、および新鮮な増殖培地で置き換える工程を包含し得る（24ウェルプレートに250μlの培地を使用してもよい）。方法はさらに、細胞を、サプレッサーtRNAをコードする核酸分子と接触させること（例えば、細胞を、サプレッサーtRNAを発現するアデノウイルスを用いて形質導入する）を包含し得る。tRNAを発現する核酸分子がウイルスである場合、任意の適切なMOIが使用され得る（例えば、50）。方法は、形質導入された細胞をインキュベーターに戻す工程をさらに含み得る。
【０９６３】
宿主細胞株が、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む安定な細胞株である態様において、本発明の方法は、サプレッサーtRNAをコードする核酸分子の導入後（例えば、サプレッサーtRNAを発現するアデノウイルスを用いる形質導入後）、細胞をインキュベートする工程（例えば、37℃で5〜6時間）をさらに含み得る。形質導入効率はより短い時間であるほど減少するため、典型的には、細胞は、少なくとも5時間インキュベートされる。より長いインキュベーション時間が可能であるが（例えば、一晩）、形質導入効率が増大せずに細胞毒性が増加することがある。方法は、細胞からのウイルスを含む培地を除去する工程（例えば、5〜6時間後）、細胞を洗浄する工程（例えば、24ウェルプレートに500μlの新鮮な完全増殖培地）、完全増殖培地を加える工程（例えば、24ウェルプレートに500μlの新鮮な完全増殖培地）、および本発明の融合ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で細胞をインキュベートする工程（例えば、適切な期間、インキュベーター中で37℃）をさらに含み得る。本発明の方法はさらに、融合ポリペプチドを検出する工程を含み得る。
【０９６４】
いくつかの態様において、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子は宿主細胞に導入され得る（例えば、上記のように細胞が形質導入された後）。例えば、形質導入後、本発明の融合ポリペプチドをコードする適切な量の核酸分子は、適切な培地と混合され得る。例えば、24ウェルプレートのウェルについて、500ngのプラスミドDNAは、血清を含まない50μlのOpti-MEM（登録商標）I 血清使用量低減培地に溶解してもよく、そして適切な量のトランスフェクション試薬（例えば、カチオン性脂質トランスフェクション試薬）が適切な量の培地と混合してもよい（例えば、例えば、24ウェルプレートのウェルについて、1.5μlのLipofectamine（商標）2000が50μlのOpti-MEM（登録商標）I 血清使用量低減培地中で混合され得る）。両方の混合物（すなわち、DNA：培地および試薬：培地）が、例えば、室温で5分間インキュベートされ得る。2つの混合物を組み合わせ、かつ、例えば、室温で20分間インキュベートして、核酸：トランスフェクション試薬複合体（例えば、DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体）を形成させることができる。本発明の方法は、複合体（例えば、DNA-Lipofectamine（商標）2000複合体）を直接的に、使用されるウイルスを含む増殖培地に加えて宿主細胞に形質導入する工程をさらに含み得る。方法は、細胞をインキュベートする工程を含み得る（例えば、37℃で5〜6時間）。形質導入効率は時間が短くなるにつれて減少するため、典型的には、細胞は少なくとも5時間インキュベートされる。より長いインキュベーション時間が可能であるが（例えば、一晩）、形質導入効率が増大せずに細胞毒性が増加することがある。方法はさらに、細胞からのウイルスを含む培地を除去する工程（例えば、5〜6時間後）、細胞を洗浄する工程（例えば、24ウェルプレートに500μlの新鮮な完全増殖培地を用いる）、完全増殖培地を加える工程（例えば、24ウェルプレートに500μlの新鮮な完全増殖培地）、および本発明の融合ポリペプチドを発現させるのに十分な条件下で細胞をインキュベートする工程（例えば、適切な期間、インキュベーター中で37℃）を包含し得る。本発明の方法はさらに、融合ポリペプチドを検出する工程を包含し得る。
【０９６５】
当業者は、使用される組織培養プレートの表面積の違いに比例して、異なる組織培養形式にある細胞に形質導入するために上記の種々の試薬の容量を容易に調整することができる（例えば、使用される細胞および培地の量を変化させる）。例えば、96ウェルプレートをウェルあたり0.3cm2の表面積を有して使用してもよく、細胞を100μlの容量で播種してもよく、かつ50μlの容量で形質導入してもよい；6ウェルプレートをウェルあたり10cm2の表面積を有して使用してもよく、細胞を2mlの容量で播種してもよく、かつ1mlの容量で形質導入してもよい。
【０９６６】
非限定的な例として、COS-7細胞を使用する本発明の方法のために、形質導入およびトランスフェクションのための以下の播種密度および試薬量が様々な組織培養形式において使用され得る。示唆されるDNAの量はLipofectamine（商標）2000試薬を使用するトランスフェクションについてのものであることに注意されたい。
2005532829.tif 000096
【０９６７】
アデノウイルスが宿主細胞においてサプレッサーtRNAを発現するのに使用される本発明の方法において、当業者は、このような発現が一過性であることを認識するものと思われる。従って、一過性にトランスフェクトされたプラスミドからの本発明の融合ポリペプチドの発現は、一般的に、トランスフェクション後24〜48時間でピークとなる。最大レベルの本発明の融合ポリペプチドを得るために、トランスフェクション後24〜48時間の間に、細胞を収集し、かつ本発明の融合ポリペプチドの発現をアッセイしてもよい。発現条件は本発明の特定の融合ポリペプチドの性質およびその半減期に依存して変化するので、最大レベルの融合ポリペプチド発現を得るために、日常的な実験を使用して上記の条件を最適化してもよい。
【０９６８】
本発明の方法は、本発明の融合ポリペプチドを検出する工程を含み得る。いくつかの態様において、検出はウェスタンブロットおよび/または免疫蛍光によって行われてもよい。この種の方法において、融合タンパク質の関心対象のポリペプチドの部分に特異的に結合する抗体が使用され得る。当業者は、これにより関心対象のポリペプチドの融合型および非融合型が検出されることを認識するものと思われる。または、本発明の融合ポリペプチドの付加的なポリペプチド配列に特異的に結合する抗体では、融合ポリペプチドのみが検出され、付加的なポリペプチド配列を欠く関心対象のポリペプチドは検出されない。
【０９６９】
いくつかの態様において、本発明の融合ポリペプチドにおける付加的なポリペプチド配列は蛍光ポリペプチドであり得る（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP））。この型の態様において、蛍光ポリペプチドの蛍光を検出することが所望され得る。特定の態様において、本発明の方法は、GFPを検出する工程を含み得る。GFPは、例えば、インビボ蛍光顕微鏡法を使用して検出することができる。本発明の融合ポリペプチドの例は、プラスミドpcDNA（商標）6.2/GFP-GW/p64TAGから発現されたGFPタグ付加p64TAG融合タンパク質である。GFPタグ付加p64TAGタンパク質は強力なCMVプロモーターから発現されるので、融合タンパク質は、一般的にトランスフェクション後24時間以内に検出可能である。
【０９７０】
蛍光細胞を検出するために、検出を最適化するための適切なフィルターセットが利用され得る。サイクル3 GFPの一次励起ピークは395nmである。478nmに二次励起ピークが存在する。これらの波長のいずれかにおける励起は、507nmで最大の蛍光発光ピークを生じる。量子収率は、GFP蛍光団を励起するために使用される光の波長に依存して5〜10倍まで変化し得ることに注意されたい。
【０９７１】
サイクル3 GFPスペクトルの最適領域を励起および透過（発光）することは、最良のフィルターセットの使用により保証される。野生型GFPからの蛍光を検出するために設計されたフィルターセットが使用される（例えば、Omega Optical XF76フィルター）。または、FITCフィルターセットがサイクル3 GFP蛍光を検出するために使用され得る。当業者は、これらのフィルターセットが最適ではなく、かつ蛍光シグナルがより弱い可能性があることを認識している。例えば、FITCフィルターセットはサイクル3 GFPを励起させ、その光は460nm〜490nmであり、第2の励起ピークをカバーする。このフィルターセットは515〜550nmの光を透過し、サイクル3 GFP蛍光のすべてではないにしても大部分の検出を可能にする。
【０９７２】
大部分の組織培養培地はリボフラビンの存在のために蛍光を発し（Zylka, M.J.およびSchnapp, B.J., (1996)BioTechniques 21:220-226を参照されたい）、そしてサイクル3 GFP蛍光の検出を妨害し得る。この問題を緩和するために、本発明の方法は、GFP蛍光についてアッセイする前に、増殖培地を除去する工程、および増殖培地をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号10010-023）で置き換える工程を含み得る。細胞がアッセイ後にさらに培養される場合、本発明の方法は、PBSを除去する工程、および再インキュベーションの前に新鮮な増殖培地で置き換える工程を含み得る。
【０９７３】
いくつかの態様において、本発明の方法は、ウェスタンブロッティングによってGFPのポリペプチド配列を含む本発明の融合ポリペプチドを検出する工程を含む。例えば、GFPタグ付加p64TAG融合ポリペプチドは、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能である以下の抗体を使用してウェスタン分析によって検出され得る：タグ付けされていないタンパク質およびGFPタグ付加p64TAGタンパク質の両方を検出するために、融合ポリペプチドのp64部分に特異的に結合する抗体（すなわち、抗myc抗体の1つ）が使用され得る；GFPタグ付加p64TAGタンパク質のみを検出するために、融合ポリペプチドのGFP部分に特異的に結合する抗体（例えば、GFP抗血清）が使用され得る。
【０９７４】
本発明の融合ポリペプチドをウェスタンブロッティングによって検出する工程を含む本発明の方法において、融合ポリペプチドを発現する宿主細胞の溶解物が調製され得る。例えば、天然型p64タンパク質またはGFPタグ付加p64タンパク質をアッセイするための細胞溶解物が調製され得る。当業者は、NP-40溶解液を使用する手順がp64タンパク質を遊離させる際に有効でないことを認識するものと思われる。p64は核小体に局在しているため、RIPAまたはSDS-PAGE試料緩衝液を使用するより厳しい溶解手順が、全体の細胞溶解物中でp64を十分に可溶化するために使用され得る。p64タンパク質をアッセイするための細胞溶解物の調製方法は、細胞単層を洗浄する工程（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAカタログ番号10010-023）を用いて1回）；細胞を含む各ウェルに適切な溶解緩衝液（例えば、1×SDS-PAGE試料緩衝液）を加える工程（例えば、24ウェルプレートに対して、使用され得るウェルあたり100μlの1×SDS-PAGE試料緩衝液）；溶解した細胞をプレートから浮遊させる工程（例えば、溶解した細胞をプレートから浮遊させるためにピペットチップを使用してもよい）；および細胞を遠心チューブに移す工程（例えば、24ウェルプレートの1ウェルの細胞を1.5ml微量遠心分離チューブに移す）を含み得る。溶解物は粘性である。
【０９７５】
溶解物を調製する方法は、試料を70℃で10分間加熱する工程をさらに含み得る。任意で、方法は、1回またはそれ以上混合する工程（例えば、ボルテックスミキサーを使用する）、および手短に試料を遠心分離する工程を含んでいてもよい。本発明の方法によって調製した溶解物は、当技術分野において周知の技術を使用してさらに処理および分析され得る。例えば、溶解物のアリコート（例えば、5μlの溶解物）はSDS-PAGEゲルにロードされ、かつ電気泳動され得る。GFPタグ付加p64TAGタンパク質は約77.2kDaの分子量を有する。
【０９７６】
適切な溶解緩衝液の1つの例は、1×SDS-PAGE試料緩衝液であり、これは、以下の試薬を以下に示す量で組み合わせることによって調製することができる：0.5M Tris-HCl, pH 6.8（2.5ml）、グリセロール(100％)（2ml）、β-メルカプトエタノール（0.4ml）、ブロモフェノールブルー（0.02g）、SDS（0.4g）、および最終容量を20mlにするための滅菌水。緩衝液のアリコ−トを必要があるまで-20℃で凍結してもよい。
【０９７７】
1つ特定の態様において、以下のORFをTAG終止コドンを含むように増幅し、pENTR/D-TOPO（登録商標）Gataway（登録商標）ベクターにクローニングし、エントリークローンを生成した。次いで、エントリークローンを、Gateway（登録商標）LR組換え反応を使用してpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTベクターに移して発現クローンを作製した：1）ヒトCGI-130（GenBankアクセッション番号BC003357）（細胞質に局在する）；2）ヒト核スプライシング因子（GenBankアクセッション番号BC000997）（核に局在する）；および3）ヒトc-myc（GenBankアクセッション番号BC000141）（核小体に局在する）。COS-7細胞は、サプレッサーtRNA分子を発現するアデノウイルスを用いて50のMOIで形質導入され（すなわち、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）、その後、上記の手順を使用してpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST発現構築物を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションの24時間後、蛍光顕微鏡法を使用してGFP蛍光をアッセイした。各発現構築物の蛍光顕微鏡像を図64に示す。上記の3種すべてのタンパク質について、本発明の方法は、トランスフェクションの24時間後のGFP蛍光によって測定されるように、検出可能なレベルのGFPタグ付加組換えタンパク質の発現を生じる。また、GFPタグ付加組換えタンパク質は、適切な細胞内オルガネラに局在している。ORF3（BC000141）を含む発現構築物は、上記の対照pcDNA（商標）6.2/GFP-GW/p64TAGプラスミドと同じ構築物である。
【０９７８】
いくつかの例において、形質導入後5〜6時間のインキュベーション時間を伴って、形質導入およびトランスフェクションが連続して行われる場合、細胞毒性が観察され得る。抑制がこれらの状況下で明確に観察され得るが、細胞は健全な外見でない場合があり、かつプレートから脱離している可能性がある。この現象は、ウイルス単独で、またはトランスフェクション単独のいずれかに起因するものではない。
【０９７９】
プラスミドのトランスフェクションと同時に実施されるアデノウイルス形質導入は、毒性の減少およびプラスミド由来の遺伝子発現の増加をもたらすことが実証された（
2005532829.tif 000097
を参照されたい）。
【０９８０】
一連の実験を、連続的形質導入/トランスフェクションの方法を同時的形質導入/トランスフェクションの方法と直接的に比較するために実施した。実施することがより容易であることに加えて、同時方法は、連続的方法（図66、左のパネル）と比較して、毒性の証拠を示さず（図66、右のパネル）、明らかに健常であった（正常な形態および適切な付着）。さらなる利点として、トランスフェクション効率がより高く、蛍光細胞の検出がより容易となった。図66において、8×104 COS-7細胞は、以下のように、24ウェル形式でプレーティングされ、およびトランスフェクト/形質導入された：連続的方法（左のパネル）：細胞を、サプレッサーtRNA分子（Ad-tRNATAG）を発現するアデノウイルスを用いて、50のMOIで5時間形質導入し、培地を交換し、細胞を一晩増殖させた。次の日、細胞を、0.5μgのpcDNA（商標）6.2/GFP-GW/p64TAGを用いて、1.5μlのLipofectamine（商標）2000を使用して、6時間トランスフェクトし、培地を交換し、細胞を一晩増殖させた。GFP蛍光および明視野顕微鏡の写真を次の日に撮影した。同時的方法（右のパネル）：細胞は同時にトランスフェクト/形質導入した。サプレッサーtRNA分子（Ad-tRNATAG）を発現するアデノウイルスを50のMOIで細胞に適用し、あらかじめ形成させたDNA：脂質複合体（0.5μg DNA+1.5μl Lipofectamine 2000）を、ウイルスおよび細胞に直接的に5時間加えた。培地を交換し、GFP蛍光および明視野顕微鏡の写真を次の日に撮影した。
【０９８１】
種々の脂質/DNA比率がまた、同時形質導入/トランスフェクション方法を使用して評価された（図67）。試験されたすべての脂質/DNA比率は、健常で、正常な外見の細胞を生じた。ウェスタンブロッティングは、試験されたすべての比率が、50％より高い終止抑制を与え、MOI25においてでさえ、同時形質導入/トランスフェクションを使用した場合には63％〜87％の範囲の抑制レベルであったことを示した（図67、上のパネル）。図67において、8×104 COS-7細胞は24ウェル形式でプレーティングされ、上記の連続的方法および同時的方法について記載したものと同様にトランスフェクト/形質導入された。示されるように、種々の脂質/DNA比率が試験された。形質導入/トランスフェクションの24時間後、各全体の細胞溶解物の5μlを4〜12％のNuPageゲル、MOPS泳動用緩衝液で分析し、PVDFメンブレンに移し、そして抗myc抗体を使用してウェスタンブロットのプロービングを行った。抑制％をデンシトメトリーによって決定した。
【０９８２】
ゲル発現レベルは同時的方法では目立ってより高く、連続的方法において見られた遺伝子発現のMOI依存的シャットダウン（すなわち、MOI依存性毒性）は存在しなかった（図67、上のウェスタンブロットパネルを下のパネルと比較されたい）。
【０９８３】
従って、本発明に従う融合ポリペプチドを産生する方法は、サプレッサーtRNAを発現するアデノウイルスを用いて宿主細胞に形質導入する工程、および融合ポリペプチドをコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程を含んでいてもよく、ここで、宿主細胞は、アデノウイルスおよび核酸分子に同時に接触される。このような方法は、宿主細胞を播種する工程、アデノウイルスを用いて宿主細胞に形質導入する工程、および、1種またはそれ以上の核酸分子および1種またはそれ以上のトランスフェクション試薬を含む1種またはそれ以上の複合体と細胞を接触させる工程を含み得る。アデノウイルスは、上記に論じたように、任意の適切なMOIで使用され得る（例えば、約50）。方法は、約10分間〜約48時間、約10分間〜約36時間、約10分間〜約24時間、約10分間〜約20時間、約10分間〜約16時間、約10分間〜約12時間、約10分間〜約8時間、約10分間〜約7時間、約10分間〜約6時間、約10分間〜約5時間、約10分間〜約4時間、約10分間〜約3時間、約10分間〜約2時間、約10分間〜約1時間、約10分間〜約45分間、約10分間〜約30分間、約1時間〜約48時間、約1時間〜約36時間、約1時間〜約24時間、約1時間〜約20時間、約1時間〜約16時間、約1時間〜約12時間、約1時間〜約8時間、約1時間〜約7時間、約1時間〜約6時間、約1時間〜約5時間、約1時間〜約4時間、約1時間〜約3時間、約1時間〜約2時間、約2時間〜約48時間、約3時間〜約48時間、約4時間〜約48時間、約5時間〜約48時間、約6時間〜約48時間、約7時間〜約48時間、約8時間〜約48時間、約9時間〜約48時間、または約10時間〜約48時間、アデノウイルスおよび複合体の存在下で細胞をインキュベートする工程を含み得る。従って、細胞は約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約12時間、約16時間、約20時間、約24時間、約36時間、または約48時間、ウイルスおよび核酸分子の存在下でインキュベートされ得る。
【０９８４】
方法はさらに、ウイルスおよび複合体を含む溶液を除去する工程；適切な培地（例えば、完全培地）と細胞を接触させる工程；および本発明の融合ポリペプチドを産生するために十分な条件下で細胞をインキュベートする工程を含み得る。方法はさらに、当業者に公知の任意の技術を使用して融合ポリペプチドを検出する工程を含み得る（例えば、蛍光顕微鏡法、ウェスタンブロッティングなど）。いくつかの例において、毒性が観察されることがあり、かつ毒性は細胞種特異的であり得る。細胞は、インキュベーションが時間を延長して実施される場合（例えば、約24〜48時間より長く）、毒性の証拠について密接にモニターされるべきである。
【０９８５】
種々のサイズの組織培養トレイのための適切な量の細胞、培地、ウイルス、DNA、およびトランスフェクション試薬（Lipofectamine 2000=LF2K）は以下の通りである。
2005532829.tif 000098
【０９８６】
本発明の方法は、他に示されない限り、本明細書中に記載されるような、完全培地中で実施され得る1つまたはそれ以上のインキュベーション工程を含み得る。細胞数はCOS-7細胞についてのものである。他の細胞種は異なる細胞数を必要とし得る。細胞は、ウイルス形質導入の日に〜90％コンフルエントとなるべきである。細胞の数は、播種の時点から、MOIを計算する目的のための形質導入の時点までに倍化すると仮定する。
【０９８７】
完全培地の例は、10％の最終濃度のFBS、4mMの最終濃度のL-グルタミン、および0.1mMの最終濃度のMEM非必須アミノ酸を補充したDMEM（高グルコース）である。これらの試薬は、例えば、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから市販されている（DMEM（高グルコース）カタログ番号11960-044、FBSカタログ番号16000-044、L-グルタミン（200mM）カタログ番号25030-081、MEM非必須アミノ酸（10mM=100×）カタログ番号11140-050）。培地は、ウォーターバス中で温めるべきではない。培地は暗所で室温にするべきである。
【０９８８】
上記に論じたように、いくつかの態様において、本発明の方法は細胞溶解物を作製する工程を含み得る。溶解物を作製するための1つの適切な方法は以下の工程を伴う：ウェルから培地を除去し、適切な溶解緩衝液を加える工程（例えば、24ウェルプレートについては、100μlの2×NuPAGE（登録商標）LDS試料緩衝液（4×NuPAGE（登録商標）LDS試料緩衝液は、Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CAから入手可能であり（カタログ番号NP0007）、水で希釈され得る））（各ウェルに1/50容量のβ-メルカプトエタノールを有する）；プレートから細胞を浮遊させる工程（例えば、溶解した細胞をプレートから離すためにピペットチップを旋回させる動作で使用する）；および、遠心分離チューブ（例えば、1.5mlエッペンドルフチューブ）に移す工程。典型的には、溶解物は粘性である。それが粘性すぎる場合には、より多くの2×NuPage LDS試料緩衝液（β-メルカプトエタノールを伴う）を総量200μlまで加え得る。試料は、最終的なウェスタンブロッティングが完了するまで、-80℃に保存するべきである。
【０９８９】
方法は、以下の工程をさらに伴い得る：試料を加熱する工程（例えば、70℃で10分間）；1回またはそれ以上、試料を混合する工程（例えば、全体にわたるボルテックスおよび遠心分離）；SDS-PAGEゲルに試料のアリコートをロードする工程（例えば、4〜12％NuPage Bis-Trisゲル（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号NP0322BOX）に5μl（収集した100μlあたり）をロードする）。各ゲルは1種またはそれ以上の対照分子量マーカー（例えば、5μlのMagic Mark（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号LC5600）、10μlのSee Blue Plus 2（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号LC5925））、およびウェスタンブロット対照（例えば、70℃に加熱した10μlのPositope（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号R90050））を含み得る。電気泳動は、例えば、1×NuPage MOPS SDS試料泳動用緩衝液（Sample Running Buffer）（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号NP0001）を使用して実施され得る。500μlのNuPage抗酸化剤（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号NP0005）を、「インナーコア」中の試料泳動緩衝液に加える。電気泳動を、適切な期間、適切な条件下で実施することができる（例えば、200ボルトで約50分間）。
【０９９０】
ゲルのウェスタンブロッティングのために、適切な転写緩衝液を作製する（例えば、20％メタノールを有する1×NuPage転写緩衝液（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号NP0006））。1リットルの1×NuPage転写緩衝液に1mlの抗酸化剤を加える。PVDFメンブレン（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号LC2002）をメタノール中で湿らせ、H2Oですすぎ、次いで転写緩衝液中で平衡化する。30ボルトで90分間、PVDFメンブレンへの転写を行う。NuPage Bis-Trisゲルパッケージ付属のすべての手順および推奨に従う（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）。
【０９９１】
転写後、メンブレンを20mlのH2Oで2回洗浄する。適切なブロッキング溶液を使用してメンブレンをブロックする（例えば、抗マウスWestern Breeze化学発光キット（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号WB7104）に提供される）。ブロッキングを、30分間から一晩行ってもよい。適切な緩衝液中の適切な希釈抗体（例えば、mycタンパク質を検出するための抗myc抗体（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号R95025、R95225、またはR95325））を、PVDF一次抗体希釈剤中で1:5000に希釈してもよい。抗体溶液をメンブレンと共にインキュベートし、洗浄し、そして使用される抗体のために適切な標準的な技術（例えば、化学発光検出、蛍光発生検出、放射性標識検出など）を使用して検出する。このような技術は当業者に周知である。
【０９９２】
2つのタンパク質のコード領域間の終止コドンの抑制の際にGFPでタグ付けされるmycタンパク質（例えば、pcDNA（商標）6.2/GFP-GW/p64TAGから発現されるようなもの）を使用するときに、タグ付けされていないmyc（ウイルスなしの対照）はMagic Marks 50kDa付近にバンドがあり、GFPタグを付加されたmycはMagic Marks 80kDa付近にバンドがあるばずである。デンシトメトリーを行って、タグ付けされていないmycからGFPタグを付加されたmycまでのシフトの割合（％）（すなわち、抑制パーセント）を決定することができる。
【０９９３】
他の適切な溶解技術が使用され得る。例えば、100μlの1×Trisグリシン試料緩衝液（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号LC2676）を用いて（各ウェルに1/50容量のβ-メルカプトエタノールを含む）24ウェルプレートから細胞を収集する。ピペットチップを旋回させる動作で使用して、溶解した細胞をプレートから離し、1.5mlエッペンドルフチューブに移す。溶解物は粘性であり、これは正常である。粘性がありすぎる場合には、より多くの1×Trisグリシン試料緩衝液（β-メルカプトエタノールを含む）を総量200μlまで加えてもよい。試料を4℃で保存することができる。4〜20％ Trisグリシンゲル（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、EC60252BOX）に5μl（収集した100μlあたり）をロードする前に、試料を100℃で10分間加熱する（全体にわたってボルテックスおよび遠心分離を伴う）。ウェスタンブロット分析を上記のように実施してもよく、または当業者に公知である他の適切な技術を使用して実施してもよい。
【０９９４】
別の適切な溶解技術は以下の通りである。完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche、カタログ番号1 697 498、50×、H2O中）およびペプスタチン（Roche、カタログ番号253 286、1000×、EtOH中）を含む100μlの1×RIPA溶解緩衝液を用いて24ウェルプレートから細胞を収集する。ピペットチップを旋回させる動作で使用して、溶解した細胞をプレートから離し、1.5mlエッペンドルフチューブに移す。溶解物は粘性である。粘性がありすぎる場合には、より多くのRIPA溶解緩衝液を総量150μlまで加え得る。これらの溶液は上記のように分析してもよく、または当業者に公知である他の適切な技術を使用して分析してもよい。ロードしたタンパク質の総量を定量するために、この溶解緩衝液を用いてBradfordタンパク質アッセイを実施してもよい。試料を、使用する体勢が整うまで-80℃で保存する。室温で融解し、次いで氷上に保つ。
【０９９５】
Bradfordタンパク質アッセイを実施するための1つの適切なプロトコールは以下の通りである。
96ウェルU底フレキシブルポリビニルクロライドプレート（Falconカタログ番号35-3911）中で実施する。
細胞溶解物（例えば、上記のように調製されたもの）の1:10希釈を、ウェル中で直接的に行う（9μlのH20および1μlの溶解物）。
96ウェルプレートに10μlのBSA標準曲線をロードする（1000μg/mlを1:2で段階希釈して15.625μg/mlまで）。
190μlのBradford試薬を10μlの希釈した溶解物および標準曲線に加える（BioRadタンパク質アッセイ溶液（Protein Assay Solution）（Bio-Rad Corporation, Hercules, CA、カタログ番号500-002）の1:5希釈、1ml Solutionおよび4ml H2O）。
プレートリーダー上で595nmの波長の終点を読み取り、換算した数字を表示する。
4パラメーター適合度をグラフのために使用する。
【０９９６】
上記に記載された方法は、使用する細胞の数に対して適切であるように規模を増減することができる。いくつかの態様において、特にハイスループットへの適用を含む態様において、96ウェル形式で多数の試料を分析することが所望され得る。96ウェルプレートへの適用のためのプロトコールは、以下の修正を伴う以外は、前述の24ウェル形式と同じである。
96ウェルプレートにおいては、100μl/ウェルで、1×104細胞/ウェルでCOS-7細胞を播種する。
24時間の間に2×104細胞/ウェルまで細胞が倍化すると仮定する。
形質導入およびトランスフェクションを、50μl/ウェル容量（100μl総量-50培養培地、50複合体）で5時間行う。複合体は、25μl培地（例えば、1×OPTIMEM）および1μlトランスフェクション試薬（例えば、Lipofectamine 2000）および25μl培地および320ng DNAを使用して形成することができ、別々に室温で5分間インキュベートした後、組み合わせて室温で20分間インキュベートしてもよい。
細胞は、粘度に依存して、30〜60μlの試料緩衝液または30〜50μlの溶解緩衝液を用いて収集できる。
試料緩衝液を用いて収集した10μlの試料（30μl収集物あたり）をゲルにロードする。
【０９９７】
低い抑制効率である可能性が最も高い供給源は、プレーティング実験の時点で細胞ストックの品質が劣った（すなわち、細胞が非常にコンフルエントである、培地がピンク色でない）、および古い培地の使用を含む。培地は、形質導入/トランスフェクションにおける使用のために新鮮に調製されるべきである。
【０９９８】
本発明の方法の別の特定の例において、上記に記載された手順、およびpcDNA（商標）6.2/GFP-p64TAGプラスミドを用いてLipofectamine（商標）2000試薬を使用する同時トランスフェクトの手順、および上記に記載された手順に従って、COS-7細胞に、種々のMOIで、サプレッサーtRNA分子を発現するアデノウイルス（すなわち、Tag-On-Demand（商標）サプレッサー上清）を用いて形質導入した。トランスフェクションの24時間後、細胞溶解物を調製し、抗myc抗体およびWesternBreeze（登録商標）化学発光抗マウスキット（カタログ番号WB7104）を使用するウェスタンブロッティングによって分析して、天然型のおよびGFPタグを付加されたp64TAG（c-myc）タンパク質を検出した。結果を図68に示す。図68において、レーン1はMagicMark（商標）MW標準を含み、レーン2はトランスフェクトされていないCOS-7細胞を含み、レーン3はMOI=0で形質導入された細胞を含み、レーン4はMOI=50で形質導入された細胞を含み、レーン5はMOI=100で形質導入された細胞を含み、レーン6はMOI=200で形質導入された細胞を含む。GFPタグ付加c-mycタンパク質が産生され、トランスフェクション後24時間以内にウェスタンブロットによって検出可能である。細胞がMOI≧50で形質導入される場合、達成される抑制％は>80％である。この実験において、MOIを増加させることは抑制効率にほとんど効果がなかった。GFPタグ付加c-mycタンパク質の最大レベルはMOI=50を使用して産生される。
【０９９９】
本発明の方法の別の実施例において、96種の異なるキナーゼをコードする96個のInvitrogenのUltimate（商標）ヒトORFクローンを、Gateway（登録商標）LR組換え反応を使用してpcDNA（商標）6.2/V5-DESTベクターに移して、発現クローンを生成した。この発現構築物を精製し、プラスミドDNA（20ng〜300ngの範囲）を、Lipofectamine（商標）2000試薬を使用して、上記に記載された手順に従って、50のMOIでTag-On-Demand（商標）サプレッサー上清を用いて形質導入されたCOS-7細胞（96ウェル形式でプレーティングされた）にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞溶解物を調製し、および抗V5抗体（Invitrogen、カタログ番号R961-25）およびWesternBreeze（登録商標）化学発光抗マウスキット（カタログ番号WB7104）を使用するウェスタンブロットによって分析し、V5タグ付加融合ポリペプチドを検出した。この抗体を使用すると、天然型のポリペプチドは検出されない。V5タグ付加融合ポリペプチドは、トランスフェクション後48時間以内に産生され、ウェスタンブロッティングによって検出可能である。産生されるV5タグ付加融合ポリペプチドのレベルは、遺伝子によって広範に変化する。これは予測されることである。なぜなら、トランスフェクションおよび発現の条件は各遺伝子について最適化されないし、関心対象の遺伝子の性質に依存して変化し得るからである。この実施例において、トランスフェクトされたプラスミドDNAの量、およびポリアクリルアミドゲルにロードされた細胞溶解物の量は各試料について定量しなかった（すなわち、トランスフェクションおよび発現の条件は最適化しなかった）。さらに、96の異なるキナーゼタンパク質の各々に対する抗体は存在していない。この実施例は、現在抗体が存在していない多数の組換えタンパク質の発現を、迅速にスクリーニングおよび分析するための本発明の方法の有用性を実証する。
【１０００】
上記に論じたように、本発明の方法は、所望の量の本発明の融合ポリペプチドを産生するために日常的な実験を使用して最適化され得る。実験条件を最適化する際には、種々の要因が考慮され得る。例えば、いくつかの初期の実験においては、所望の融合ポリペプチドの低い発現が観察され得る。これは、1つもしくはそれ以上の、または多数の理由のうちの1つに起因する可能性があり、例えば、1）低抑制効率；2）観察される表現型効果；3）不十分なトランスフェクション効率；および4）アッセイの不適切なタイミング（すなわち、アッセイが早すぎるかまたは遅すぎる）に起因する可能性がある。
【１００１】
低抑制効率は、所望の融合ポリペプチドの産生の減少をもたらすことがあり、使用される宿主細胞が健常でなく、および/または正しい密度でプレーティングされなかった場合に観察され得る。当業者は、細胞がプレーティング前に健常でありかつ>95％生存度であること、および細胞が適切な密度でプレーティングされていることを確実にすることによってこの要因を最適化することができる。低抑制効率は、培地が新鮮でなかった場合に観察され得る。この要因は、本発明の実施における使用のために新鮮な培地を調製することによって最適化され得る。低抑制効率は、宿主細胞が少なすぎるウイルスで形質導入される場合に（すなわち、低MOI）観察され得る。当業者は、約50で開始してMOIを変動させて試験することによって形質導入を最適化し得る。低抑制効率は、宿主細胞がCARを低レベルで発現する場合に最適化され得る。当業者は、適切なレベルのCARを発現する細胞株（例えば、COS-7、GCHO、HeLa）を使用することによってこの要因を最適化し得る。低抑制効率は、宿主細胞が最適な時間の長さで形質導入されない場合に観察され得る。当業者は、種々の期間、例えば、約5〜6時間、形質導入を行うことによってこの要因を最適化することができる。
【１００２】
本発明の方法によって引き起こされる宿主細胞上での表現型効果は、本発明の所望の融合ポリペプチドの産生の減少をもたらすことがある。表現型効果を緩和するために最適化され得る要因には、形質導入およびトランスフェクションの後のインキュベーションの長さが含まれる。当業者は、形質導入およびトランスフェクションの後のさまざまな時点（例えば、24〜48時間）で融合ポリペプチドをアッセイすることによってこの要因を最適化することができる。表現型効果は、使用される宿主細胞が形質導入およびトランスフェクションに感受性である場合に観察され得る。当業者は、異なる宿主細胞株において本発明の方法を実施すること、および/または融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む安定な細胞株を作製し、続けてサプレッサーtRNAをコードする核酸分子を導入すること（例えば、サプレッサーtRNAを発現するウイルスを用いて形質導入すること）によって、この要因を最適化することができる。
【１００３】
不十分なトランスフェクション効率は、本発明の所望の融合ポリペプチドの産生の減少をもたらすことがある。当業者は、種々のトランスフェクション試薬を試験して、使用される細胞株にとって高いトランスフェクション効率を提供する試薬を同定することによってこの要因を容易に最適化することができる。
【１００４】
本発明の融合ポリペプチドの産生の減少は、融合ポリペプチド発現が準最適時間（sub-optimal time）（すなわち、早すぎるかまたは遅すぎる時間）にアッセイされる場合に観察され得る。当業者は、最適発現が観察される時期を決定するために種々の時間でアッセイすることによって（例えば、発現の時間経過を実施することによって）、この要因を最適化することができる。
【１００５】
実施例17
いくつかの態様において、本発明は、転写調節配列（例えば、プロモーター、リプレッサーなど）を含むウイルスゲノムのすべてまたは一部を含む核酸分子を提供する。1つの特定の態様において、本発明は、リプレッサー配列を含むウイルスゲノム（例えば、レトロウイルスゲノム）のすべてまたは一部を含む核酸分子を提供する。リプレッサー配列は、それが作動可能に連結されるヌクレオチド配列の転写を阻害または妨害することができる。
【１００６】
リプレッサー配列は、1種またはそれ以上の分子（例えば、ペプチド、低分子など）を結合してもよく、またはそれらによって結合されてもよい。1つの態様において、リプレッサー配列はタンパク質（例えば、リプレッサータンパク質）を結合してもよい。リプレッサータンパク質を結合するリプレッサーの1つの例は、テトラサイクリンオペレーターであり、これにテトラサイクリンリプレッサータンパク質が結合する。テトラサイクリンの非存在下では、リプレッサータンパク質はテトラサイクリンオペレーターに結合し、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の転写を妨害または阻害する。テトラサイクリンの存在下では、リプレッサータンパク質はテトラサイクリンに結合し、それ以上リプレッサー配列に結合しない。
【１００７】
いくつかの態様において、リプレッサー配列およびプロモーター配列は、関心対象の配列に作動可能に連結され得る。この型の態様において、リプレッサー配列は、ある条件下では（例えば、リプレッサータンパク質がリプレッサー配列に結合する場合）プロモーターからの関心対象の配列の転写を妨害することができるが、他の条件下では（例えば、リプレッサータンパク質の非存在下で、またはリプレッサータンパク質がリプレッサー配列に結合しない条件下で）そのようなことはない。
【１００８】
本発明の1つの態様において、レンチウイルスゲノムのすべてまたは一部を含む核酸分子はまた、リプレッサー配列（例えば、テトラサイクリンオペレーター）を含み得、および/またはリプレッサーに結合するポリペプチド（例えば、テトラサイクリンリプレッサータンパク質）をコードする核酸配列を含み得る。この型の態様は、リプレッサー配列に作動可能に連結された関心対象の核酸配列を含む宿主細胞および/または宿主細胞株を構築するために使用され得る。任意で、このような宿主細胞および/または宿主細胞株は、リプレッサー配列に結合するポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。特定の態様において、本発明は、関心対象の配列がテトラサイクリンリプレッサー配列およびプロモーター配列に作動可能に連結されている宿主細胞および/または宿主細胞株を含み、そしてさらに、テトラサイクリンリプレッサータンパク質をコードする核酸配列を含む。このような宿主細胞は、関心対象の配列の転写を調節する能力を提供する。すなわち、テトラサイクリンの非存在下では、関心対象の配列が転写されず、または有意でないレベルで転写されるのに対して、テトラサイクリンの存在下では、関心対象の配列がはるかに高いレベルで転写される（すなわち、転写がテトラサイクリンによって誘導される）。
【１００９】
本発明の宿主細胞および/または宿主細胞株は、任意の型の細胞であってもよく（例えば、分裂している細胞または分裂していない細胞）、および単離された細胞であってもよく、またはより大きな生物体内にあってもよい。本発明の方法は、組織培養細胞および全体の生物体において遺伝子発現の制御を可能にする。
【１０１０】
いくつかの態様において、本発明は、リプレッサータンパク質を発現する細胞を作製する方法、およびそのような方法によって作製される細胞を提供する。方法は、ウイルスゲノムのすべてまたは一部を含み、かつリプレッサータンパク質を発現する核酸分子を細胞に導入する工程を含み得る。このような方法はまた、リプレッサーを安定に発現する細胞を選択する工程を含む。
【１０１１】
いくつかの態様において、本発明は、関心対象の配列を発現する方法を含み、この方法は、リプレッサーおよびプロモーターに作動可能に連結された関心対象の配列を含む1種またはそれ以上の核酸配列を、リプレッサータンパク質を発現する宿主細胞に導入する工程を含む。いくつかの態様において、リプレッサーおよびプロモーターに作動可能に連結された関心対象の配列を含む1種またはそれ以上の核酸配列は、ウイルスゲノム（例えば、レンチウイルスゲノム）のすべてまたは一部を含み得る。方法はさらに、リプレッサータンパク質がリプレッサー配列に結合しない条件下で細胞をインキュベートする工程を含む。このような条件は、リプレッサータンパク質のリプレッサー配列への結合を妨害する分子の存在下でのインキュベーションを含み得る。例えば、リプレッサー配列がテトラサイクリンオペレーターである場合、リプレッサータンパク質はTetRであり、このような条件は、テトラサイクリンの存在下で細胞をインキュベートすることを含み得る。
【１０１２】
1つの特定の態様において、本発明は、本発明の実施において使用され得る2種の核酸分子（例えば、プラスミド、ウイルスベクターなど）を提供する。第1の核酸分子は、リプレッサー配列およびプロモーターを含み、リプレッサーおよびプロモーターに作動可能に連結された関心対象の配列を含み得る。第1の核酸分子は1つまたはそれ以上の認識配列（例えば、組換え部位、トポイソメラーゼ部位、制限酵素部位など）も含み得る。第1の核酸部位の1つの非限定的な例は、プラスミドpLenti4/TO/V5-DESTであり、これは、CMVプロモーター（CMVTetO2）中に2コピーのテトラサイクリンオペレーター配列（TO）を含む。このベクターのマップは図70Aとして提供され、そのヌクレオチド配列は表31に提供される。このプラスミドはまた、互いに組換えしない2つの組換え部位を含む。関心対象の配列は、当技術分野において公知の任意の技術を使用して、プロモーターおよびリプレッサーに作動可能に連結され得る。1つの態様において、関心対象の配列は、組換え部位に隣接する関心対象の配列と、本発明の核酸分子との間で組換え反応を行うことによって、プロモーターおよびリプレッサーに作動可能に連結され得る。例えば、pLenti4/TO/V5-DEST（図70A）は、LR組換え反応において、attR1部位およびattR2部位に隣接する関心対象の配列と反応させて、その関心対象の配列をCMVプロモーターおよびテトラサイクリンオペレーターに作動可能に連結させ得る。テトラサイクリンリプレッサータンパク質の存在下で発現を調節するのためには、この反応によって、関心対象の配列をCMVTetO2の下流に配置する。
【１０１３】
本発明の第2の核酸分子は、リプレッサー配列と相互作用する1種またはそれ以上のタンパク質を発現し得る。リプレッサータンパク質の1つの非限定的な例はテトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetR）である。適切な第2の核酸分子の1つの例はリプレッサープラスミドpLenti6/TRであり、これはTetRを発現する。このベクターのマップは図69として提供され、そのヌクレオチド配列は表32として提供される。TetRは発現ベクターのCMVTetO2プロモーター中のテトラサイクリンオペレーター部位に結合し、誘導物質の非存在下でプロモーターからの転写をブロックする。しかし、テトラサイクリン誘導物質がTetRに結合する場合、後者はプロモーターから解離し、転写が進行する。
【１０１４】
本発明の方法は、形質転換された分裂している細胞、およびトランスフェクトすることが困難である増殖が制止された初代細胞において、関心対象の配列の発現を調節するための使用であり得る。本発明の方法は、一過性または安定な遺伝子調節のために使用され得る。発現の誘導は、約2倍〜約100倍、約5倍〜約100倍、約10倍〜約100倍、約25倍〜約100倍、約50倍〜約100倍、約75倍〜約100倍、約5倍〜約5倍〜約70倍、約10倍〜約70倍、約25倍〜約70倍、約50倍〜約70倍、または約60倍〜約70倍であり得る。従って、遺伝子発現は、約5倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、または約100倍誘導され得る。
【１０１５】
本発明のいくつかの態様において、本発明は、宿主細胞に形質導入するために使用され得るウイルスストックを含んでいてもよい。ストックは任意の適切な濃度であり得る。例えば、pLenti6/TRは、約1×105cfu/ml以上であるウイルスストックを作製するために使用することができ、これは、ブラスチシジン含有培地中で、TetRを標的細胞に形質導入するために使用することができる。この様式で形質導入された細胞は、典型的には、ウェスタンブロットによって検出可能なレベルでTetRタンパク質を発現する。
【１０１６】
本発明の別の局面において、本発明は、関心対象の配列が作動可能に連結され得るプロモーター配列およびリプレッサー配列を含む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、ウイルスストックを作製するために使用することができる。例えば、pLenti4/TO/V5-DESTへのlacZ遺伝子の組換えクローニングおよび得られるpLenti4/TO/V5-GW/lacZベクターのパッケージングは、約1×105cfu/ml以上であるウイルスストックを産生するために使用され得る。このようなウイルスストックは、宿主細胞に形質導入するためおよび関心対象の配列（例えば、lacZ配列）を発現するために使用され得る。
【１０１７】
いくつかの態様において、関心対象の配列に作動可能に連結されたプロモーターおよびリプレッサー配列を含む核酸分子、ならびにリプレッサー配列に結合するポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子が宿主細胞に導入され得る。この型の方法において、核酸配列は、同時にまたは連続的に導入され得る。典型的には、一旦両方の型の核酸分子が宿主細胞に導入されたならば、関心対象の配列の発現は誘導可能である。例えば、Lenti6/TRおよびLenti4/TO/V5-GW/lacZの一過性の同時形質導入は、HT1080細胞において少なくとも20倍の誘導を示し得る。いくつかの態様において、両方の型の核酸分子が宿主細胞に導入された後で、安定な細胞株が、例えば、関心対象の配列とリプレッサータンパク質の両方を発現する細胞を選択することによって産生され得る。1つの例において、Lenti6/TRおよびLenti4/TO/V5-GW/lacZを含む細胞株を作製してもよく、かつそのような細胞は少なくとも20倍の誘導を示し得る。
【１０１８】
本発明の1つの局面は、分裂していない細胞における関心対象の配列の発現を調節する能力である。特定の態様において、本発明は、関心対象の配列を含む分裂していない宿主細胞を提供し、調節可能であるこの発現は、例えば、細胞の増殖培地へのテトラサイクリンの付加によって誘導可能である。本発明は、このような細胞を含む組成物、ならびに、誘導物質（例えば、テトラサイクリン）、増殖培地、および緩衝液からなる群より選択される1つまたはそれ以上の構成成分をさらに含む組成物に関する。
【１０１９】
テトラサイクリンリプレッサータンパク質を発現する核酸分子は、当技術分野で公知の任意の技術を使用して構築され得る。例えば、テトラサイクリンリプレッサーコード配列を含む核酸フラグメントは、当技術分野で公知の任意の技術を使用してクローニングすることができる。テトラサイクリンリプレッサーのコード配列を含む核酸フラグメントのヌクレオチド配列は、表35として提供される。この1.4kbフラグメントはまた、β-グロビンイントロンを含む。この1.4kb TetR含有フラグメントを、pLenti6/V5（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）にクローニングした。pLenti6/V5のマップは図71として提供され、そのヌクレオチド配列は表33として提供される。得られるプラスミド、pLenti6/TRは、制限消化およびシークエンシング分析によって確認した。pLenti6/TRのマップは図69に示される。pLenti6/TRは、テトラサイクリンリプレッサーTetRを安定に発現するブラスチシジン耐性哺乳動物細胞を生成するために使用され得る。
【１０２０】
プロモーター配列およびリプレッサー配列を含む核酸分子は、当技術分野において公知である任意の技術を使用して構築することができる。例えば、pLenti4/TO/V5-DESTはpLenti3/V5-TREx（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）から、後者のネオマイシン耐性遺伝子をゼオシン耐性遺伝子に置き換えることによって作製された。pLenti3/V5-TRExは、pT-REx-DEST30（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号12301016）のCMVプロモーターおよびTetオペレーターを含む。pLenti3/V5-TRExのマップは図72として提供され、そのヌクレオチド配列は表34に提供される。
【１０２１】
pLenti3/V5-TRExをSalIで消化し、Klenowを使用してフィルインし、次いでKpnI消化し、5917bpのベクター主鎖をゲル精製した。次に、pLenti4/V5-DEST（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号K498000およびV49810）をSpeIで消化し、Klenowでフィルインし、次いでKpnIで消化した。GATEWAY（商標）デスティネーションカセット、SV40プロモーター、およびゼオシン耐性カセットを含むpLenti4/V5-DESTの2682bpフラグメントをゲル精製し、SalI-Klenow-KpnI処理したpLenti3/V5-TRExにライゲーションした。ライゲーション混合物をDB3.1に形質転換し、Amp（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（15μg/ml）を含むLB培地上で選択した。形質転換体のコロニーを制限分析によって分析した。pLenti4/TO/V5-DESTのマップは図70Aに示される。GATEWAY（商標）デスティネーションベクターpLenti4/TO/V5-DESTは、tet調節されるCMVTetO2 T-RExプロモーター（CMVプロモーターおよび2つのtetオペレーター部位を含む）を含む。TetRタンパク質は遺伝子転写を阻害するためのtetO部位に結合する；テトラサイクリンはこの転写阻害を解放する。pLenti4/TO/V5-DESTはゼオシン耐性を付与し、V5エピトープタグに対する関心対象の遺伝子のインフレーム融合物を許容する。
【１０２２】
pLentiTO/V5-GW/lacZは、pLenti4/TO/V5-DESTとpENTR/dT-lacZ（終止なし）との間の標準的なGateway LxR反応によって生成された（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA）。pLenti4/TO/V5-GW/lacZのクローンを、制限分析および配列分析によって確認した。pLenti4/TO/V5-GW/lacZのマップは図70Bに示される。
【１０２３】
293FT（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号R70007）細胞およびGripTite 293（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号R7957）細胞を、500μg/ml G418を含むDMEM/10％ FBS/L-グルタミン/非必須アミノ酸/ペニシリン/ストレプトマイシン中で培養した。MJ90初代ヒト包皮線維芽細胞（Grand Island）およびHT1080ヒト線維肉腫（ATCC番号CCL-121）を、DMEM/10％ FBS/非必須アミノ酸/ペニシリン/ストレプトマイシン中で培養した。10μg/mlブラスチシジンを使用して安定なpLenti6/TR形質導入細胞を選択した。MJ90初代細胞は接触阻害によって増殖制止された。手短に述べると、6ウェルプレートのウェルあたり1×105細胞をプレーティングし、培地交換を3日毎に7〜14日間行うか、または静止単層に達するまで行った。
【１０２４】
ウイルス産生のために、100mmプレートあたり5×106 の293FT細胞をプレーティングした。24時間後、培養培地を5ml OptiMem/10％FBSで置き換え、細胞を以下のように4成分で同時トランスフェクトした。総量12μgDNAで、1:1:1:1の重量比で、pLenti6/TRまたはpLentiTO/V5-GW/lacZ：pLP1：LP2：pLP/VSVG（各3μgDNA）を1.5mlのOptiMem培地を用いて混合した。別個のチューブに、36μlのLipofectamine 2000を1.5mlのOptiMem培地を用いて混合した。室温での5分間のインキュベーション後、2つの混合物を合わせて、室温でさらに20分間インキュベートした。インキュベーション時間の完了後、トランスフェクション混合物を、細胞に滴下して加え、培養プレートを、穏やかに旋回させて混合した。次の日、トランスフェクション複合体を完全培地（DMEM、10％ FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミン、および非必須アミノ酸）で置き換えた。トランスフェクションの48〜72時間後、ウイルス含有上清を収集し、3000rpmで5分間遠心分離して死滅した細胞を除去し、そして1mlアリコートで凍結バイアル中に配置した。力価測定を新鮮な上清で実施し、残りのウイルスアリコートは-70℃に保存した。
【１０２５】
細胞へのウイルスのすべての適用を、6μg/mlポリブレン（Sigma、製品番号H9268）の存在下で行い、培地の交換を形質導入後12〜24時間後に行った。ウイルスを力価測定するために、形質導入の前日、6ウェルプレートに、ウェルあたり2×105細胞でHT1080を播種した。形質導入されていない対照（偽）としての役割りである1つのウェル、および残りの5つのウェルは、10-2から10-6までの範囲のウイルス上清の10倍段階希釈液各1mlを含んだ。この希釈液を、細胞を加える前に穏やかに転倒させて混合した。6μg/mlのポリブレンを各ウェルに加えた。プレートを混合するために穏やかに旋回させた。次の日、培地を完全培地で置換した。形質導入の48時間後、細胞を、必要に応じて10μg/mlブラスチシジン選択または100μg/mlゼオシン選択下に配置した。特に、ゼオシン選択は以下のように行った：形質導入の24時間後、6ウェルプレートからの細胞をトリプシン処理し、100mmプレートに増量した。100mmプレートへの増量の24時間後、100μg/mlゼオシンを、形質導入した細胞培養培地に選択のために加えた。7〜10日間のブラスチシジン選択後、または2〜3週間のゼオシン選択後、得られるコロニーをクリスタルバイオレットで染色した：1％のクリスタルバイオレット溶液は10％エタノール溶液中で調製した。各ウェルを2ml PBSで洗浄し、続いて1mlのクリスタルバイオレット溶液を室温で10分間加えた。過剰の色素を2mlのPBS洗浄2回で除去し、肉眼で見えるコロニーを計数してもともとの上清のウイルス力価を決定した。
【１０２６】
ウェスタンブロットおよび向性アッセイのための細胞溶解物を以下のように調製した：培養培地を吸引し、細胞を1回PBSで洗浄し、続いてVersene（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号15040066）中で2分間、室温にてインキュベーションを行った。脱離した細胞をエッペンドルフチューブ中でペレット化し、プロテアーゼインヒビターを含む、氷冷した100μlのNP-40溶解緩衝液（50mM Tris, 150mM NaCl, 1% NP-40, pH 8.0）中で溶解した。溶解物を14000rpmで5分間遠心分離して細胞細片をペレット化し；上清を収集して、アッセイの必要があるまで-70℃で凍結させた。タンパク質濃度を、製造業者（BioRad）の推奨に従って、BioRadタンパク質アッセイプロトコールを使用して決定した。
【１０２７】
ウェスタンブロットを、4×ローディング色素中の20μgの標準化したタンパク質を使用して実施した。試料をNovex（登録商標）Trisグリシン 4〜20％ゲル（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号EC60252BOX）上で、200ボルトで45分間泳動した。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写し、WesternBreeze（登録商標）化学発光キット（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号WB7104）を用いて、必要に応じてポリクローナル抗TetRおよびモノクローナル抗V5（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号R96025）一次抗体を使用して検出した。
【１０２８】
pLenti6/TRおよびpLenti4/TO/V5-GW/lacZを、293FT細胞に、ViraPowerパッケージングキットの存在下でトランスフェクトし、それぞれのウイルスを産生した。pLenti6/TRおよびpLenti4/TO/V5-GW/lacZは、それぞれ、6×105および1×105cfu/mlのウイルス力価を生じた。従って、β-グロビンイントロンおよびTetRのpLenti6への導入、ならびにTetオペレーターのpLenti4-DESTへの導入は、ウイルスパッケージングおよび形質導入効率を損なわない。
【１０２９】
本発明の材料および方法は、広範な種々の目的のために使用され得る。例えば、リプレッサータンパク質を発現する核酸分子（例えば、Lenti6/TRウイルス）は、リプレッサーを発現する細胞株を生成するために使用され得る。このような細胞株には、関心対象の配列に作動可能に連結されたプロモーター配列およびリプレッサー配列を含む核酸分子（例えば、Lenti4/TO/V5-GW/関心対象の配列）を用いて形質導入することができ、次いで、関心対象の配列の発現を調節することができる（例えば、テトラサイクリンを使用する）。本発明の材料および方法の別の用途は、リプレッサーをコ−ドする核酸分子、ならびに関心対象の配列に作動可能に連結されたプロモーター配列およびリプレッサー配列を含む核酸分子（例えば、Lenti6/TRおよびLenti4/TO/V5-GW/関心対象の配列）を、分裂していない初代細胞に同時形質導入し、次いで、関心対象の配列の発現を調節すること（例えば、テトラサイクリンを使用する）である。
【１０３０】
HT1080細胞に、Lenti6/TRウイルスを用いて1、10、または32のMOIで形質導入し、偽が死滅するまでブラスチシジン培地中で選択した。次に、ブラスチシジン耐性細胞に、Lenti4/TO/V5-GW/lacZウイルスを用いて5のMOIで形質導入した。Lenti4/TO/V5-GW/lacZを用いる形質導入の24時間後、1μg/mlのテトラサイクリンを培養培地に加えた。細胞を、誘導物質補充培地中で48時間インキュベートした。その後、細胞溶解物を調製し（i）lacZ活性をアッセイすること；（ii）抗V5抗体を使用してlacZ-V5についてのウェスタンブロットを実施すること；（iii）TetRについてのウェスタンブロットを実施することによって遺伝子発現について分析した。
【１０３１】
増加量の形質導入されたTetRウイルスは、テトラサイクリンの非存在下でlacZ発現を減少させた。1μg/mlのテトラサイクリンはlacZ発現を、全長CMVプロモーター活性に到達するレベルまで誘導した。倍数誘導を決定するために、テトラサイクリンの存在下および非存在下におけるβ-ガラクトシダーゼ活性の比率（所定のMOIについて）を計算した。lacZ発現の誘導は、1、10、および32のTetR MOIでそれぞれ4倍、17倍、および27倍であった。このことは、誘導がTetRの量に依存することを示した。抗V5抗体を使用するウェスタンブロットは、β-ガラクトシダーゼ酵素活性データと一致した。TetRタンパク質の発現は、ポリクローナル抗TetR抗体を使用するウェスタンブロットによって確認された。
【１０３２】
これらの結果は、レンチウイルスベクター中のCMVTetO2およびTetRが機能的であり、テトラサイクリンに対して応答性であることを確証する。より低いLenti6/TRのMOIでのCMVTetO2からの比較的高レベルの基底的な転写は、低TetR MOIで生成されたすべてのブラスチシジン耐性細胞が実際にTetRを発現するわけではないという事実が原因であり得る。TetRを発現しない細胞は、阻害なしでCMVTetO2プロモーターからlacZを発現し、高いバックグラウンドを生じる。対照的に、高いLenti/TR MOIでは、生成された100％に近いブラスチシジン耐性細胞がTetRを発現し、CMVTetO2プロモーターからの転写を阻害し、そしてより低いバックグラウンドlacZ発現を生じる。
【１０３３】
HT1080におけるデータは、細胞集団においてより低い基底的な転写がより高いTetRレベルで達成されることを示した。それゆえに、GripTite 293細胞における誘導を試験する際には、Lenti6/TRは、MOI=10およびMOI=32で形質導入され、ブラスチシジン耐性のGripTite-10およびGripTite-32の集団をそれぞれ生じた。これらの集団は、Lenti4/TO/V5-GW/lacZウイルスを用いて、MOI=1またはMOI=5で形質導入され、およびlacZ誘導について試験された。テトラサイクリンは1μg/mlまたは5μg/mlで使用されて、誘導物質がより高いTetR濃度に限定されているか否かを決定した。
【１０３４】
TetRは、インディーサーの非存在下でGripTite-10細胞においてlacZ発現を阻害し、そしてこの抑制はテトラサイクリンによって解放された。1μg/mlテトラサイクリンは、遺伝子発現を誘導する際には5μg/mlテトラサイクリンとほぼ同程度に有効であった。倍数誘導を、所定のLenti4/TO/V5-GW/lacZ MOIおよびテトラサイクリン濃度での、誘導あり：誘導なし比率として計算した。lacZ発現は、Lenti4/TO/V5-GW/lacZ MOI=1における7倍より上と比較して、Lenti4/TO/V5-GW/lacZ MOI=5において27倍を超えて誘導された。抗V5抗体を使用するウェスタンブロット分析は、β-gal酵素向性データを反映した。TetRタンパク質の発現は、ポリクローナル抗TetR抗体を使用するウェスタンブロットによって確認された。
【１０３５】
GripTite293-10細胞における結果は、GripTite-32細胞において繰り返された。GripTite293-10細胞におけるものと同様に、GripTite-32細胞において遺伝子発現を誘導する際には1μg/mlが5μg/mlテトラサイクリンとほぼ同程度に有効であった。倍数（fold）lacZ誘導がGripTite293-32細胞においては有意に高かったが、しかし、Lenti4/TO/V5-GW/lacZ MOI=1およびLenti4/TO/V5-GW/lacZ MOI=5では、それぞれ、57〜72倍の範囲であった。
【１０３６】
データは、1μg/mlテトラサイクリンがlacZを誘導する際には限定的ではないことを示す。lacZ誘導は、Lenti4/TO/V5-GW/lacZ MOI=5においてMOI=1よりも高かった。従って、発現の量は、プロモーターおよびリプレッサー配列に作動可能に連結された関心対象の配列を含むウイルスのMOIを変化させることによって調整され得る（例えば、脱抑制された場合は、より高い発現レベルのためにより高いMOI、脱抑制された場合は、より低い発現レベルのためにより低いMOI）。MOI増加は、TetRが限定されていない場合（例えば、10および32のMOI）、誘導されていないバックグラウンドのレベルへの影響はほとんどない。
【１０３７】
1つの特定の態様において、本発明の材料および方法は、分裂していない初代細胞における遺伝子発現を調節するために使用され得る。MJ90は、コンフルエンスで増殖制止を受ける接触阻害される初代線維芽細胞であり、脂質トランスフェクションおよびモロニーレトロウイルスベクターによる形質導入の両方に対して抵抗性である。MJ90細胞は、2×106cfu/ウェルのLenti6/TRウイルスを用いて24時間形質導入され、その後2×106cfu/ウェルのLenti4/TO/V5-GW/lacZウイルスを用いて形質導入を行った（MOIの見積もり=各7.5）。Lenti4/TO/V5-GW/lacZ を用いるトランスフェクションの後、lacZ発現を、1μg/mlテトラサイクリンで48時間誘導した。形質導入した細胞からの溶解物をタンパク質誘導のために分析した。TetRはlacZの発現を90%を超えて抑制し、10倍の誘導を生じた。先の実験で、等しいMOIのLenti6/TRおよびLenti4/TO/V5-GW/lacZを用いて実施したことは注目する価値がある。より高いLenti6/TR MOI、または異なるLenti6/TR：Lenti4/TO/V5-GW/lacZ比率を、より高い誘導性を与えるために使用し得る。本発明が静止している初代細胞中で遺伝子発現を調節できることの実証は、この細胞が形質導入することが難しく、かつモロニーレトロウイルスベクターによる形質導入に対して抵抗性であるため、とりわけ有意義である。
【１０３８】
関心対象の配列に作動可能に連結されたプロモーターおよびリプレッサー配列を含む本発明の核酸分子は、リプレッサータンパク質を発現する任意の核酸分子と組み合わせて使用され得る。例えば、Lenti4/TO/V5-GW/lacZウイルスを、Flp-In TREx 293産生細胞株（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号R78007）に、1および2.5のMOIで形質導入した。遺伝子発現は1μg/mlテトラサイクリンを用いて48時間誘導した。テトラサイクリンはFlp-In T-REx 293細胞中でLenti4/TO/V5-GW/lacZからのlacZ発現を誘導した。MOI=1からMOI=2.5までの増加量のLenti4/TO/V5-GW/lacZ形質導入では、GripTite-10およびGripTite-32集団における結果と同様に、それぞれ16倍から24倍まで誘導を増加させた。
【１０３９】
実施例18
いくつかの態様において、本発明は、核酸分子に酵素（例えば、トポイソメラーゼ）を共有結合させる方法を提供する。1つの局面において、この型の方法における使用のための核酸分子は、制限酵素認識配列（例えば、II型制限酵素認識）およびトポイソメラーゼ認識配列を含み得る。いくつかの態様において、II型認識配列は、トポイソメラーゼ認識配列に隣接して位置し得る。この点に関して、隣接とは、2つの酵素の切断部位が、互いから、約1〜約50、約1〜約45、約1〜約40、約1〜約35、約1〜約30、約1〜約25、約1〜約20、約1〜約15、約1〜約10、約1〜約9、約1〜約8、約1〜約7、約1〜約6、約1〜約5、約1〜約4、約1〜約3、約1〜約2、塩基対以内にあり得ることを意味する。任意のII型酵素が使用され得る。いくつかの態様において、適切なII型酵素は3'-突出配列を残し得る。適切なII型酵素にはBaeIが含まれる。
【１０４０】
図73を参照すると、本発明の核酸分子は2つのトポイソメラーゼ認識部位および2つのII型認識部位（例えば、2つのトポイソメラーゼ認識部位間に2つの制限酵素部位を有する）を含み得る。任意で、この型の核酸分子は、制限酵素部位間に核酸配列を含んでいてもよい。制限酵素部位間の核酸分子は、ポリペプチド、例えば、ccdB遺伝子のような選択マーカーをコードしていてもよい。
【１０４１】
制限酵素部位は、所望の長さの3'突出がトポイソメラーゼ切断部位（図73における3'-Tの後）を含む鎖に産生されるように配置され得る。トポイソメラーゼ切断部位の位置は、切断部位を含む鎖の最も3'側のヌクレオチドに関連して変化され得る。これは、二本鎖挿入物に侵入し得る配列を生成するためにトポイソメラーゼ切断の後の反対の鎖に5'突出を生成する際に有用である可能性がある（図47を参照されたい）。
【１０４２】
制限酵素切断後、切断されたベクターは、3'突出配列にアニールしてもよく、および/またはトポイソメラーゼと接触され得るオリゴヌクレオチドと接触してもよい。
【１０４３】
いくつかの態様において、本発明の方法は、本発明の核酸分子（例えば、20μg）を、II型制限酵素（例えば、100ユニットのBaeI、New England Biolabs、カタログ番号R0613S）を用いて、例えば、250μlの最終容量で消化する工程を含み得る。当技術分野において公知である任意の他の制限酵素もまた使用され得る。反応は、適切な緩衝液中で（例えば、100μg/mlのBSAおよび20μM S-アデノシルメチオニンを有する1×NE緩衝液2、New England Biolabs）、適切な条件下で（例えば、37℃で6時間）実施され得る。消化は、例えば、250μlのフェノール/クロロホルム（Invitrogen Corporarion, Carlsbad, CA、カタログ番号15593-031）を添加することおよび混合することによって停止され得る。有機相および水相は、14,000×g、4℃、5分間の遠心分離によって分離できる。水層（上層）を新たなチューブに移し、25μlの3M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）を添加および混合することができる。次に、625μlの100％エタノールを添加し、氷中で5分間インキュベーションする。沈殿したDNAを、14,000×g、5分間、4℃の遠心分離によって収集し得る。DNAペレットを500μlの70％エタノールで洗浄し、14,000×g、5分間、22℃の遠心分離によって収集できる。ペレットを乾燥させ、次いで100μlのTEに再懸濁する。DNA濃度を260nmにおけるその光学密度によって決定することができる。
【１０４４】
消化したベクターを、制限酵素によっておよび/または適切なトポイソメラーゼ酵素（例えば、ワクシニアDNAトポイソメラーゼ）を用いて生じた3'突出のすべてまたは一部にアニールするオリゴヌクレオチドと、適切な緩衝液中で（例えば、1×NE緩衝液#1、New England Biolabs）、例えば、50μlの最終容量で接触させてもよい。反応を、適切な条件下でインキュベートすることができる（例えば、25℃で15分間）。次いで、反応を5μlの10×停止緩衝液の添加を用いて終結させ得る。トポイソメラーゼ連結ベクターは、ゲル電気泳動によって精製され得る（Heymanら、Genome Research 9:383-392 (1999)を参照されたい）。
【１０４５】
ここで本発明を例示目的でいくぶん詳細に、および実施例を理解の明確化のために十分に記載してきたが、本発明が、広範かつ等価な範囲の条件、処方、および他のパラメーターの範囲内で、本発明の範囲またはいかなるその特定の態様に影響を与えることなく、修正および変更を加えることによって実施され得ること、ならびにこのような修正および変更が添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることは、当業者には明らかである。
【１０４６】
本明細書中に言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の水準を示し、各々の個別の刊行物、特許、および特許出願が具体的にかつ個々に参照として組み入れられることが示されるのと同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【１０４７】
（表６）pAd/CMV/V5-DESTのヌクレオチド配列
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【１０４８】
（表７）pAd-GW-TO/tRNAのヌクレオチド配列
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【１０４９】
（表８）pAdenoTAG tRNAのヌクレオチド配列
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【１０５０】
（表９）サプレッサーtRNA配列を含むベクターを構築するために使用されるSau3Aフラグメントのヌクレオチド配列
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【１０５１】
（表１０）pAd/PL-DEST（商標）のヌクレオチド配列
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【１０５２】
（表１１）pAd/CMV/V5-GW/lacZ.PL-DEST（商標）のヌクレオチド配列
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【１０５３】
（表１２）pIB/V5-His-DESTのヌクレオチド配列
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【１０５４】
（表１３）V5-His DESTカセットのヌクレオチド配列
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【１０５５】
（表１４）Mel/V5-His DESTカセットのヌクレオチド配列
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【１０５６】
（表１５）バキュロウイルスプロモーター配列
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【１０５７】
（表１６）IE-1プロモーター配列、コード配列、およびポリペプチド配列
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【１０５８】
（表１７）プラスミドpLenti6/V5-DESTのヌクレオチド配列
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【１０５９】
（表１８）プラスミドpLenti6/V5-D-TOPO（商標）のヌクレオチド配列
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【１０６０】
（表１９）pLenti4/V5-DESTのヌクレオチド配列
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【１０６１】
（表２０）pLenti6/UbC/V5-DESTのヌクレオチド配列
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【１０６２】
（表２１）プラスミドpLP1のヌクレオチド配列
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【１０６３】
（表２２）プラスミドpLP2のヌクレオチド配列
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【１０６４】
（表２３）プラスミドpLP/VSVGのヌクレオチド配列
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【１０６５】
（表２８）プラスミドpcDNA（商標）6.2/V5-DESTのヌクレオチド配列
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【１０６６】
（表２９）プラスミドpcDNA（商標）6.2/GFP-DESTのヌクレオチド配列
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【１０６７】
（表３０）β-ラクタマーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
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【１０６８】
（表３１）pLenti4TO/V5-DESTのヌクレオチド配列
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【１０６９】
（表３２）pLenti6/TRのヌクレオチド配列
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【１０７０】
（表３３）pLenti6/V5のヌクレオチド配列
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【１０７１】
（表３４）pLenti3/V5-TRExのヌクレオチド配列
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【１０７２】
（表３５）テトラサイクリンリプレッサーコード配列を含む核酸フラグメントのヌクレオチド配列
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【１０７３】
（表３６）pLenti6/V5とも呼ばれるpRRL6/V5のヌクレオチド配列
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【図面の簡単な説明】
【１０７４】
【図１】基本的な組換えクローニング反応の略図である。
【図２】LR組換え反応を行うことによって二つの核酸セグメントをクローニングするために本発明を用いる略図である。
【図３】共有結合した二本鎖組換え型核酸分子を作製するための本発明の組成物および方法の様々な態様を示す。トポイソメラーゼは、黒丸として示し、基質核酸分子の末端に結合しているか、または連結反応後に放出される。説明されるように、基質核酸分子は、5'突出末端を有するが、それらはまた3'突出末端も有しうる、または平滑末端となりうる。さらに、説明される核酸分子は、トポイソメラーゼがそれに結合した状態（トポイソメラーゼ負荷）で示されるが、それにトポイソメラーゼが結合したとして示される一つまたは複数の末端は同様に、トポイソメラーゼ認識部位を有すると表すことができ、その場合、連結反応は、適当であれば一つまたは複数の部位特異的トポイソメラーゼの付加をさらに必要とするであろう。図3Aは、一つの末端の5'末端と3'末端のそれぞれに結合したトポイソメラーゼを有する第一の核酸分子を示し、第二の核酸分子に対する第一の核酸分子の結合をさらに示す。図3Bは、一つの末端の3'末端に結合したトポイソメラーゼを有する第一の核酸分子、および一つの末端の3'末端に結合したトポイソメラーゼを有する第二の核酸分子を示し、トポイソメラーゼ負荷基質核酸分子を含む末端を接触させることにより生成された共有結合二本鎖組換え型核酸分子をさらに示す。図3Cは、一つの末端の5'末端に結合したトポイソメラーゼを有する第一の核酸分子、および一つの末端の5'末端に結合したトポイソメラーゼを有する第二の核酸分子を示し、トポイソメラーゼ負荷基質核酸分子を含む末端を接触させることにより生成された共有結合二本鎖組換え型核酸分子をさらに示す。図3Dは、双方の末端の5'末端と3'末端のそれぞれに結合したトポイソメラーゼを有する核酸分子を示し、それぞれの末端で一つずつ二つの核酸分子とのトポイソメラーゼ負荷核酸分子の結合をさらに示す。5'末端のそれぞれおよび／または3'末端のそれぞれでのトポイソメラーゼは同じまたは異なりうる。
【図４】本発明の一つの態様の略図である。
【図５】本発明の例としてのベクターの略図である。図5Aは、その転写がプロモーター（例えば、ポリヘドリン、p10、T7、CMV、MMTV、メタロチオネイン、RSV、SV40、hGHプロモーター）によって異なる方向に促進される二つの異なるDNAインサートを含むベクターを示す。産生される転写物のタイプに応じて、DNA-Aおよび／またはDNA-Bのいずれかは、センスまたはアンチセンスRNAの産生が起こる方向であってもよい。図5Bは、同じまたは異なってもよい二つのプロモーターによって促進されるいずれかの方向（または両方向）にその転写が進行してもよい一つのDNAインサートを含む本発明の例としてのベクターの略図である。このように、一つのプロモーターによって促進された転写によって産生されたRNAはセンスRNAであって、他のプロモーターによって促進された転写によって産生されたRNAはアンチセンスRNAであろう。RNAは、例えば小さい干渉RNA（iRNA）を作製するために、双方のプロモーターから産生することができる。図5Cは、同じまたは異なってもよい二つの異なるプロモーターによってその転写が異なる方向に促進される、同じヌクレオチド配列（すなわち、DNA-A）を有する二つの異なるDNAインサートを含む本発明の例としてのベクターの略図である。本例において、一つのプロモーターによって促進された転写によって産生されたRNAはセンスRNAであって、他のプロモーターによって促進された転写によって産生されたRNAは、アンチセンスRNAであろう。図5Dは、その転写が一つのプロモーター（例えば、CMVプロモーター）によって促進される、反対方向に同じヌクレオチド配列（すなわち、DNA-A）を有する二つのDNAインサートを含む本発明の例としてのベクターの略図である。転写終了シグナルは、DNA-Aの二つのコピーとDNA-Aインサートとのあいだに存在しない。一つのセグメントの転写はセンスRNAを生成し、他のセグメントの転写はアンチセンスRNAを生成する。このベクターによって産生されたRNAは、分子内ハイブリダイゼーションを受けて、このように、ヘアピン型に折れ曲がった二本鎖分子を形成するであろう。図5Eおよび5Fは、そのそれぞれが同じヌクレオチド配列（すなわち、DNA-A）を有するDNAインサートを含む、本発明の例としての二つのベクターの略図である。これらのインサートの転写によって、センスおよびアンチセンスRNAが生成され、次にこれらがハイブリダイズして二本鎖RNA分子を形成してもよい。
【図６】pAd/CMV/V5-DESTのプラスミドマップである。
【図７】pAd-GW-TO/tRNAのプラスミドマップである。
【図８】pAdenoTAG tRNAのプラスミドマップである。
【図９】pAd/PL-DESTのプラスミドマップである。
【図１０】pAd/CMV/V5-GW/lacZのプラスミドマップである。
【図１１】pAd/CMV/V5-DESTの組換え領域を示す。
【図１２】pAd/PL-DESTの組換え領域を示す。
【図１３】実施例4に説明したように産生された例としてのアデノウイルスベクターを産生する略図を示す。
【図１４】実施例4に説明したようにPac I消化pAd/CMV/V5-GW/lacZプラスミドをトランスフェクトした293A細胞における細胞変性作用（CPE）を示す。図14Aは、トランスフェクション後4〜6日目の293A細胞を示す。この初期段階において、アデノウイルスを産生する細胞は、斑状に丸くなり死につつある細胞のように見える。図14Bは、トランスフェクション後6〜8日目の293A細胞を示す。感染が進行するにつれて、ウイルス粒子を含む細胞は溶解して、隣接する細胞に感染する。プラークが形成し始める。図14Cは、トランスフェクション後8〜10日目での細胞を示す。この後期段階では、感染した隣接細胞は溶解して、明らかに目に見えるプラークを形成する。
【図１５】pIB/V5-His-DESTのプラスミドマップである。
【図１６】OpIE2プロモーターのヌクレオチド配列を提供する。
【図１７】pIB/V5-His-DESTの組換え領域を示す。
【図１８】pIB/V5-His-GW/lacZのプラスミドマップである。
【図１９】図19Aは、BaculoDirect（商標）V5-His Destカセットの略図を示す。図19Bは、BaculoDirect（商標）Mel/V5-His Destカセットの略図を示す。
【図２０】本発明のバキュロウイルスのゲノムおよびバキュロウイルスゲノムに対象遺伝子を導入するためのエントリークローンの略図を示す。
【図２１】トポイソメラーゼがpIB/V5-Hisへのgp64プロモーターの挿入を媒介する略図を示す。
【図２２】pIB/V5-His/gp64/DESTのプラスミドマップである。
【図２３】一過性のトランスフェクションアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図２４】安定にトランスフェクトした細胞および一過性にトランスフェクトした細胞のタンパク質発現レベルを示すウェスタンブロットである。
【図２５】安定にトランスフェクトした細胞のタンパク質発現レベルを示すウェスタンブロットである。
【図２６】lacZトランスフェクションアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図２７】図27Aは、BaculoDirect（商標）ベクターの構築の略図を示す。図27Bは、BaculoDirect（商標）ベクターと対象遺伝子を含むエントリークローンとのあいだのLR反応の略図を示す。
【図２８】本発明のバキュロウイルスを用いるハイスループットクローニングプロトコールの略図を示す。
【図２９】最初のLRクロナーゼ反応において環状ウイルスDNAおよび直線状のウイルスDNAを用いることを比較した結果を示す。
【図３０】ガンシクロビル選択の存在下で得られた結果を示す。
【図３１】BaculoDirect（商標）を用いて発現された様々なポリペプチドのウェスタンブロットの結果を示す。
【図３２】様々な技術を用いて得られた組換え型バキュロウイルス力価の比較を示す。ウイルス力価は、TCID50技術（上のパネル）を用いて、およびプラークアッセイによって得た。
【図３３】Bac to Bac（商標）およびBaculoDirect（商標）を用いてウイルス保存液を調製するために必要な累積時間の比較を示す。
【図３４】プラスミドpVL1393 GST p10 stopの略図を示す。
【図３５】レンチウイルスゲノムの全てまたは一部を含む核酸分子を作製する方法の略図を示す。
【図３６】本発明において用いられるプラスミドの略図を示す。図36Aは、pLenti6/V5-DESTのプラスミドマップを示す。図36Bは、pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）の略図を示す。図36Cは、pLenti4/V5-DESTのプラスミドマップを示す。図36Dは、pLenti6/UbC/V5-DESTのプラスミドマップを示す。
【図３７】本発明において用いられるプラスミドの略図を示す。図37Aは、pLP1の略図を示す。図37Bは、pLP2の略図を示す。図37Cは、pLP/VSLGの略図を示す。
【図３８】二つのLR反応をpLenti6/V5-DEST単独またはpLenti6/V5-DESTプラスpENTR/CATのいずれかによって行い、それぞれ3 μlをTOP10細胞に形質転換した実験結果を示す。形質転換体100 μlを、通常のLB-ampプレート（Bsdなし）または50 μg/mlブラスチシジンを含むLB-amp上に播種した。図38Aは、観察されたコロニーの形態を示す写真である。図38Bは、表にして結果を示す。
【図３９】抗lacZ抗体（図39A）および抗V5抗体（図39B）によるウェスタンブロットの結果を示す。
【図４０】様々な大きさのインサートによって調製したレンチウイルス保存液の力価を表にして示す。
【図４１】レンチウイルス発現系を用いたマーカー遺伝子の発現を示す。図41Aは、GATEWAY（商標）を適合させたレンチウイルス系を用いるLacZの発現を示す。図41Bおよび41Cは、トポイソメラーゼ適合レンチウイルス系を用いたGFPの発現を示す。
【図４２】本明細書に記載のレンチウイルス発現系を用いた様々な遺伝子の発現のウェスタンブロットを示す。図42Aは、lacZ、CAT、およびGFPの発現を示す。図42Bは、PKCおよびGFPの発現を示す。
【図４３】本発明のレンチウイルス発現系を用いてlacZの認められた発現レベルに対して感染多重度を変化させた結果を示す。図43Aは、β-ガラクトシダーゼ活性を検出するために染色した細胞の写真を示す。図43Bは、MOIの関数としてのβ-ガラクトシダーゼ活性のグラフである。
【図４４】本発明の方法に従って調製されたレンチウイルスベクターによる様々な細胞種の形質導入の結果を示す。図44Aは、様々な活発に増殖するまたはG1/S停止細胞種において認められたβ-ガラクトシダーゼ活性の棒グラフである。図44Bは、レンチウイルスベクターを形質導入し、lacZ活性を検出するために染色した接触阻害初代培養包皮細胞の写真を提供する。
【図４５】本発明の核酸分子を形質導入した細胞からの遺伝子の長期発現を示す。図45Aは、10日後にβ-ガラクトシダーゼ活性に関して染色した形質導入細胞の写真を示す。図45Bは、6週間後にβ-ガラクトシダーゼ活性に関して染色した形質導入細胞の写真を示す。
【図４６】図46Aは、pLenti6/V5-DESTの組換え領域を示す。図46Bは、pLenti6/UbC/V5-DEST×エントリークローンに起因する発現クローンの組換え領域を示す。図46Cは、UbCプロモーターの完全な配列を示す。
【図４７】本発明に従う方向性のトポイソメラーゼクローニングの略図である。
【図４８】pLenti6/V5-D-TOPO（登録商標）のクローニング領域を示す。
【図４９】pCMVSPORT6TAg.neoのプラスミドマップを示す。
【図５０】実施例14に記述されるTag-On-Demand（商標）法の略図を示す。対象コード配列（GOI）は、それがプロモーター（一例として、CMVプロモーターを図に示す）に機能的に結合するようにTAG終止コドンと共に発現ベクターにクローニングされる。その本来の終止コドンがTAGでなければ、この特定の方法と適合するようにTAGに変更しなければならないが、サプレッサーtRNA分子上のアンチコドンを変化させることによって任意の終止コドンを用いることができる。GOIの下流にフレームが一致して、対象タンパク質（例えば、V5、GFP等）のC末端に融合されるエピトープが存在する。通常の発現条件（すなわち、tRNAサプレッサーの非存在下では（-tRNATAG））、本来のタンパク質が発現される。tRNAサプレッサーの存在下では（+tRNA）、TAG終止コドンは、本実施例においてセリンとして翻訳され、翻訳は、TAG標識タンパク質を産生し続ける。発現ベクターは、融合タンパク質の翻訳を終了させるためにC末端エピトープタグの下流に少なくとも一つの非TAG終止コドン（例えば、TAAまたはTGA）を含む。
【図５１】V5エピトープタグおよび実施例14に記載されるGFP Tag-On Demand（商標）法を用いてプラスミドtRNA抑制からのウェスタンブロットを示す。図51Aは、表記のように、その同源のtRNAサプレッサー：pUC12-tRNATAA、pUC12-tRNATAG、またはpUC12-tRNATGAの存在下または非存在下で、三つのレポーターの一つ：pcDNA3.2/V5-GW/CATTAA、-GW/CATTAG、または-GW/CATTGAを同時トランスフェクトしたCHO細胞のウェスタンブロットを示す。トランスフェクションの48時間後、細胞溶解物20 μgを、表記のように抗V5または抗CATウェスタンブロッティングのいずれかによって分析した。pcDNA3.1/CATの対照トランスフェクションも同様に各実験に含めた（CATレーン）。図51Bは、表記のように、三つのレポーターの一つ：pcDNA6.2/GFP-GW/CATTAA、-GW/CATTAG、または-GW/CATTGAおよびtRNAサプレッサーの一つ：pUC12-tRNATAA、pUC12-tRNATAG、またはpUC12-tRNATGAを同時トランスフェクトした293FT細胞のウェスタンブロットである。トランスフェクションの48時間後、表記のように細胞溶解物20 μgを抗CATウェスタンブロッティングによって分析した。pcDNA3.1/CATの対照トランスフェクションも同様に各実験に含めた（CATレーン）。
【図５２】プラスミドtRNA抑制を用いるtRNA抑制の終止コドン特異性を示す。CHO細胞を、pcDNA3.1/lacZ-stopTAG-GFPおよび三つのtRNAサプレッサーのそれぞれの一つ：pUC12-tRNATAA、pUC12-tRNATAG、またはpUC12-tRNATGAを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、明視野（上のパネル）および蛍光（下のパネル）写真を撮影した。
【図５３】単量体対八量体tRNATAG構築物のアデノウイルス輸送後の対象遺伝子の発現を示す。COS-7細胞に、Adeno-tRNATAG（単量体）またはAdeno-tRNA8TAG（八量体）の粗溶解物をMOI 50で6時間形質導入した後、pcDNA3.1/lacZ-stopTAG-GFPを一晩トランスフェクションした。形質導入後72時間に、蛍光写真（上のパネル）および抗lacZウェスタンブロッティング（下のパネル）を行った。レーン1：偽、レーン2：pUC12-tRNATGAとレポーターベクター（陽性対照）の同時トランスフェクション、レーン3：Adeno-tRNATAG（単量体）、レーン4：Adeno-tRNA8TAG（八量体）。
【図５４】表記のpENTR-ORFクローンの発現を示す。三つのpENTR-ORFクローンをInvitrogen Corporation、カールスバッド、カリフォルニア州のヒトORFコレクションから得て、LxRをpcDNA6.2/GFP-DESTまたはpcDNA6.2/V5-DESTのいずれかに交差させて発現ベクターを作製した。COS-7細胞にAd-tRNA8TAGを形質導入した（MOI 50）後、ORF発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、蛍光写真を撮影した（上のパネル）。ORF発現クローンおよびpUC12-tRNATAG（下のパネル）とをCOS-7細胞に同時トランスフェクトした後のRIPA溶解物について、V5-ウェスタンブロッティングを行った。ORF6は、CGI-130と類似のタンパク質を発現し、ORF7は、スプライシング因子を発現し、そしてORF12は、切断型c-myc p64タンパク質を発現する。「lacZ」は、pcDNA3.1/lacZ-stopTAG-V5を指し、「GFP-V5」は、pcDNA5/GFPからの構成的GFP発現を指す。
【図５５】一過性または安定な標的遺伝子のいずれかを抑制するために、アデノウイルスtRNATAGを形質導入した細胞からのウェスタンブロットを示す。図55Aは、安定に発現された標的遺伝子のtRNA抑制のウェスタンブロットを示す。pcDNA6/FRT/lacZ-stopTAG-GFP 1コピーを安定に発現するFlpIn-CHO細胞に、様々なMOIでAdeno-tRNA8TAGを形質導入した。形質導入48時間後、細胞溶解物を抗lacZウェスタンブロッティングによって分析して、抑制（％）を密度測定によって決定した。「安定なGOI」ウェスタンブロットに存在するさらなるバンド（*で示す）は、Flp-In CHO細胞株に存在する内因性のlacZeo融合タンパク質である。図55Bは、一過性に発現された標的遺伝子のtRNA抑制のウェスタンブロットを示す。COS-7細胞にプラスミドpcDNA3.1/lacZ-stopTAG-GFPを一過性にトランスフェクトした後、CsCl精製Adeno-tRNA8TAGを様々なMOIで形質導入した。形質導入48時間後、細胞溶解物を抗lacZウェスタンブロッティングによって分析して、抑制（％）を密度測定によって決定した。
【図５６】哺乳類細胞株5個にTag-On-Demand（商標）法を用いることを示す。BHK-21、CHO-S、COS-7、HeLaおよびHT1080細胞に、CsCl精製Adeno-tRNA8TAGをMOI 50で形質導入した後、pcDNA3.1/lacZ-stopTAG-GFPをトランスフェクトした。明視野（上のパネル）および蛍光（下のパネル）写真を形質導入の48時間後に撮影した。
【図５７】pcDNA（商標）6.2/V5-DESTのプラスミドマップである。
【図５８】pcDNA（商標）6.2/GFP-DESTのプラスミドマップである。
【図５９】pcDNA（商標）6.2/V5-GW/p64TAGのプラスミドマップである。
【図６０】pcDNA（商標）6.2/GFP-GW-p64TAGのプラスミドマップである。
【図６１】ベクターpcDNA（商標）6.2/V5-DEST（図61A）およびpcDNA（商標）6.2/GFP-DEST（61B）の組換え領域の配列を提供する。
【図６２】一過性のトランスフェクション実験においてC末端融合タンパク質を産生するために本発明のアデノウイルスを用いる方法の略図を提供する。
【図６３】発現構築物を含む安定な細胞株においてC末端融合タンパク質を産生するために本発明のアデノウイルスを用いる方法の略図を提供する。
【図６４】本発明を用いて作製されたGFP融合タンパク質の蛍光顕微鏡写真を示す。
【図６５】本発明の一つの局面に従って、β-ラクタマーゼ活性をアッセイするために蛍光原基質を用いる略図を示す。
【図６６】連続的（左のカラム）対同時（右のカラム）の形質導入／トランスフェクションの比較を示す。
【図６７】同時の形質導入／トランスフェクション法（上のパネル）および連続的形質導入／トランスフェクション法（下のパネル）における様々な脂質／DNA比およびMOIの影響を示すウェスタンブロットを示す。
【図６８】COS-7細胞に、様々なMOIでアデノウイルス発現サプレッサーtRNA分子を形質導入して、同時にpcDNA（商標）6.2/GFP-GW-p64TAGプラスミドをトランスフェクトした実験の結果を示すウェスタンブロットである。
【図６９】テトラサイクリンリプレッサー、TetRを安定に発現するブラスチシジン耐性哺乳類細胞を作製するために用いることができる本発明の核酸分子であるpLenti6/TRのベクターマップである。
【図７０】本発明の核酸分子であるpLenti4/TO/V5-DESTのベクターマップである。
【図７１】pLenti6/V5のベクターマップである。
【図７２】pLenti3/V5-TRExのベクターマップである。
【図７３】本発明の核酸分子にトポイソメラーゼを結合させる方法の略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【国際調査報告】
2005532829.tif 000305
2005532829.tif 000306