(57)【要約】本発明は、細胞、組織、器官または生物で生化学的または生理学的応答の刺激に関する特性を有する、新規ポリペプチド、それらをコードする核酸に関する。より特に、新規ポリペプチドは、新規遺伝子の遺伝子産物であり、またはその特定された生物学的活性フラグメントまたは誘導体である。使用方法は、診断および予後アッセイ手法並びに広範な病理学的状態を処置する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２ｎからなる群より選択される配列決定されたアミノ酸の成熟型を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし６１の整数である、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし６１の整数であるポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ここでｎが１ないし６１の整数である、ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列において１または２以上の保存置換を含むアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし６１の整数である、ポリペプチド。
【請求項５】
当該ポリペプチドが天然に存在する、請求項１のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１のポリペプチドおよび担体を含む組成物。
【請求項７】
１または２以上の容器、請求項６の組成物を含むキット。
【請求項８】
請求項１のポリペプチドと連関する病理から選択される、ヒト疾患と連関する症候群を処置する医薬の製造における治療剤の使用であって、該治療剤が請求項１のポリペプチドを含む、使用。
【請求項９】
試料中の請求項１のポリペプチドの存在または量を決定する方法であって、該方法が
（ａ）試料を提供する、
（ｂ）該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に当該試料を導入する、および
（ｃ）当該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定し、それによって当該試料中のポリペプチドの存在または量を決定する
ことを含む方法。
【請求項１０】
第一哺乳動物対象中の請求項１のポリペプチドの発現の変更されたレベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法であって、該方法は：
ａ）第一哺乳動物対象からの試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定する、および
ｂ）工程ａ）の試料の当該ポリペプチドの発現を、当該疾患を有しないまたは素因がないことが知られる第二哺乳動物対象からの対照試料中に存在するポリペプチドの発現と比較する
ことを含み、ここで
対照試料と比較したときの第一対象におけるポリペプチドの発現のレベルの変更が、当該疾患の存在または素因を指摘する、方法。
【請求項１１】
請求項１のポリペプチドに結合する薬剤を同定する方法であって：
（ａ）当該薬剤へ当該ポリペプチドを導入する、および
（ｂ）当該ポリペプチドに当該薬剤が結合するか決定する
ことを含む方法。
【請求項１２】
該薬剤が細胞性レセプターまたは下流エフェクターである請求項１１の方法。
【請求項１３】
病理の処置における使用のための潜在治療薬剤を同定する方法であって、ここで該病理が請求項１のポリペプチドの異常発現または異常生理学的相互作用に関し、該方法は：
（ａ）請求項１のポリペプチドを発現する、かつポリペプチドに帰すべき特性または機能を有する提供する、
（ｂ）細胞を候補物質を含む組成物と接触する、および
（ｃ）物質がポリペプチドに帰すべき特性または機能を変更するか決定する
ことを含み、ここで
もし細胞が物質の不存在の組成物と接触したとき、物質の存在下で観察される変更が観察されないならば、物質が潜在治療薬剤として同定される、方法。
【請求項１４】
請求項１のポリペプチドと連関する病理の潜在または素因の活性のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、該方法は
（ａ）試験化合物を、請求項１のポリペプチドと連関する病理の増加リスクにある試験動物に投与する、ここで当該試験動物が請求項１のポリペプチドを組み換え的に発現する、
（ｂ）工程（ａ）の化合物を投与した後、当該試験動物における当該ポリペプチドの活性を測定する、および
（ｃ）当該試験動物における当該ポリペプチドの活性を、当該ポリペプチドが投与されていない対照動物における当該ポリペプチドの活性と比較する、
ことを含み、ここで
試験化合物が、当該対照動物についての当該試験動物における当該ポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドと連関する病理の潜在または素因のモジュレーター活性である、方法。
【請求項１５】
当該試験動物が、試験タンパク質トランスジーンを、またはプロモーターの制御下のトランスジーンを、野生型試験動物に対して増加レベルで発現する組み替え体試験動物である、請求項１４の方法であって、ここで当該プロモーターが当該トランスジーンの本来の遺伝子プロモーターではない、方法。
【請求項１６】
請求項１のポリペプチドの活性を調節する方法であって、該方法は請求項１のポリペプチドを発現する細胞試料を、ポリペプチドの活性を調節するのに十分量の当該ポリペプチドに結合する化合物と接触する事を含む、方法。
【請求項１７】
対象に請求項１のポリペプチドを投与することを含む、請求項１のポリペプチドに連関する病理を処置または予防する方法であって、ここでかかる処置または予防が対象の病理を処置または予防するのに十分量で望まれる、方法。
【請求項１８】
対象がヒトである請求項１７の方法。
【請求項１９】
哺乳動物の病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、病理学的状態を緩和するのに十分量であるポリペプチドを哺乳動物に投与することを含み、ここで該ポリペプチドが配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ｎが１ないし６１の整数である、方法。
【請求項２０】
配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子であって、ｎが１ないし６１の整数である分子。
【請求項２１】
核酸分子が天然に存在する請求項２０の核酸分子。
【請求項２２】
核酸分子が、配列番号２ｎ−１からなる軍より選択される核酸配列と、単一ヌクレオチドによって異なる、核酸分子であって、ｎが１ないし６１の整数である核酸分子。
【請求項２３】
配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟型をコードする単離核酸分子であって、ｎが１ないし６１の整数である、分子。
【請求項２４】
２ｎ−２からなる群より選択される核酸を含む単離核酸分子であって、ｎは１ないし６１の整数である、分子。
【請求項２５】
当該核酸分子が、配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列または当該ヌクレオチド配列の相補物に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、請求項２０の核酸分子であって、ここでｎが１ないし６１の整数である、分子。
【請求項２６】
請求項２０の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
当該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含むベクター。
【請求項２８】
請求項２６のベクターを含む細胞。
【請求項２９】
請求項１のポリペプチドに免疫特異的に結合された抗体。
【請求項３０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２９の抗体。
【請求項３１】
ヒト化抗体である請求項２９の抗体。
【請求項３２】
試料中の請求項２０の核酸分子の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）当該試料を提供する、
（ｂ）当該核酸分子に結合するプローブに当該試料を導入する、および
（ｃ）当該核酸分子に結合した当該プローブの存在または量を決定する
ことを含み、それによって当該試料中の核酸分子の存在または量を決定する、方法。
【請求項３３】
該核酸分子の存在または量が細胞または組織型についてのマーカーとして使用される、請求項３２の方法。
【請求項３４】
該細胞または組織型が癌性である請求項３３の方法。
【請求項３５】
第一哺乳動物対象における請求項２０の核酸分子の、発現の変更されたレベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法であって、
ａ）第一哺乳動物対象からの試料中の核酸の発現のレベルを測定する、および
ｂ）工程ａ）の試料中の当該核酸の発現のレベルを、該疾患を有しないまたは素因がないことが既知の第二哺乳動物対象からの対照試料中に存在する核酸の発現のレベルと比較する
ことを含みここで、
対照試料と比較したときの第一対象における核酸の発現のレベルの変更が、該疾患の存在または素因を指摘する、方法。
【請求項３６】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、該方法はポリペプチドの発現につながる条件下で、細胞を培養することを含み、ここで当該細胞は配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含み、ここでｎは１ないし６１の整数である、方法。
【請求項３７】
該細胞が細菌細胞である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
該細胞が昆虫細胞である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
該細胞がコウボ細胞である、請求項３６の方法。
【請求項４０】
該細胞が哺乳動物細胞である、請求項３６の方法。
【請求項４１】
請求項２のポリペプチドを生産する方法であって、該方法はポリペプチドの発現につながる条件下で細胞を培養することを含み、ここで当該細胞が配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含み、ここでｎは１ないし６１の整数である、方法。
【請求項４２】
該細胞が細菌細胞である、請求項４１の方法。
【請求項４３】
該細胞が昆虫細胞である、請求項４１の方法。
【請求項４４】
該細胞がコウボ細胞である、請求項４１の方法。
【請求項４５】
該細胞が哺乳動物細胞である、請求項４１の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、細胞、組織、器官または生物の生物化学的または生理学的応答の刺激に関する特性を有する、新規ポリペプチド、およびそれらをコードする核酸に関する。より特に、新規ポリペプチドは、新規遺伝子の遺伝子産物であり、または生物学的活性フラグメントまたはその誘導体である。使用の方法は、診断および予後検定手法ならびに広範な病理学的状態を処置する方法を包含する。
【０００２】
（背景技術）
真核細胞は、通常の条件下では細胞の維持および増殖を達成するために精妙にバランスを受けている、生化学的および生理学的方法を特色とする。そのような細胞が脊椎動物のような多細胞生物、またはさらに特別には哺乳動物のような生物の構成要素であるとき、生化学的および生理学的方法の調節には精緻な情報伝達経路を伴う。しばしば、そのような情報伝達経路は、細胞外の情報伝達タンパク質、情報伝達タンパク質に結合する細胞性受容体、および細胞内に局在する情報伝達構成要素に関与する。
【０００３】
情報伝達タンパク質は、内分泌性エフェクター、パラクリンエフェクターまたはオートクリンエフェクターに分類され得る。内分泌性エフェクターは特定の器官により循環系中に分泌される情報伝達分子であり、これは次いで遠隔の標的器官または標的組織へと輸送される。標的細胞は内分泌性エフェクターの受容体を含み、内分泌性エフェクターが結合すると情報伝達カスケードが誘導される。パラクリンエフェクターには、互いに近傍にある分泌細胞と受容細胞、例えば同じ組織または器官内の２つの異なるクラスの細胞が関与する。あるクラスの細胞がパラクリンエフェクターを分泌し、これが次いで、例えば細胞外液を介する拡散により、第２のクラスの細胞に到達する。第２のクラスの細胞はパラクリンエフェクターに対する受容体を含有しており、エフェクターの結合は情報伝達カスケードを誘導し、これが対応する生化学的または生理学的作用を誘起する。オートクリンエフェクターは、オートクリンエフェクターを分泌する同じタイプの細胞が受容体をも含有していること以外は、パラクリンエフェクターと高度の類似性を有している。かくして、オートクリンエフェクターは、同じ細胞上でまた同じ近接する細胞上で受容体に結合する。次いで、結合過程は特色的な生化学的または生理学的作用をひき起こす。
【０００４】
情報伝達過程は細胞および組織に対し、これらに限定されない例として、細胞または組織の増殖の誘導、成長または増殖の抑制、細胞または組織の分化または成熟の誘導、および細胞または組織の分化または成熟の抑制を含む多様な影響をひき起こし得る。
【０００５】
多くの病態には、重要なエフェクタータンパク質の発現の調節不全が関与している。特定のクラスの病態においては、調節不全は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の縮減または抑制レベルとして現れる。病理の他の種類では、非調節は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の増加または上方調節レベルとして明示される。臨床現場において、対象が興味のあるタンパク質エフェクターレベルの増加または過多によりもたらされる異常に罹患していることを疑うことがある。
【０００６】
それ故に、そのような対象由来の生物学的試料中の興味のあるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、そしてそのレベルを非病態的状態に特色的なものと比較する必要がある。また、製造の産物としてタンパク質エフェクターを提供する必要性がある。その必要のある対象にエフェクターを投与することは、病理学的状態の処置に有用である。よって、興味あるタンパク質エフェクターの縮減または抑制レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法のための必要性がある。加えて、興味のタンパク質エフェクターの増加または上方調節レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法の必要性がある。
【０００７】
抗体は、特定の抗原に特異的に結合し、同族の抗原とは見なされない物質には弱く結合するか、または全く結合しない複数鎖タンパク質である。抗体は、Ｌ鎖と呼称する２本の短い鎖とＨ鎖と呼称する２本の長い鎖から成る。これらの鎖はイムノグロブリン領域より構成され、これらには一般的に２種類のクラス、即ち鎖１本当たり１個の可変領域およびＬ鎖の中には１個の定常領域、Ｈ鎖の中には３個以上の定常領域がある。免疫グロブリン分子の抗原特異的な部位は可変領域中に存在し、１本のＬ鎖および１本のＨ鎖の可変領域が互いに会合して抗原結合部分を形成する。同族のまたは標的の抗原に免疫特異的に結合する抗体は高親和性で結合する。従って、これらは試料中の抗原の存在を特異的にアッセイするのに有用である。加えて、これらは抗原の活性を不活化する潜在能力を有している。
【０００８】
それ故に、そのような対象由来の生物学的試料中の興味のあるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、そしてそのレベルを非病態的状態に特色的なものと比較する必要がある。特に、抗原に免疫特異的に結合する抗体の使用に基づくそのようなアッセイの必要性がある。さらに、病態が、エフェクターに免疫特異的に結合する抗体の使用に基づいてエフェクターのレベルの増加または過多によりひき起こされる症例において、タンパク質エフェクターの活性を阻害する必要がある。かくして、生産産物としての抗体の必要性がある。さらに抗体を対象に投与することに基づく興味のあるタンパク質エフェクターのレベルの増加または過多によりもたらされる病態の処置方法の必要性がある。
【０００９】
(発明の要約)
本発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟型から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの発見に一部基づき、ここでｎは、１と６１の間の整数である。新規核酸及びポリペプチドはＮＯＶＸまたはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３など核酸およびポリペプチドとしてここに言及する。これらの核酸及びポリペプチド並びにその誘導体、相同物、類似体およびフラグメントは、以後集合的に「ＮＯＶＸ」核酸またはポリペプチド配列として命名する。
【００１０】
発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟型の変異体に一部基づき、ここでｎは、１と６１の間の整数であり、ここで成熟型の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化している。ただし、成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸残基はそのように変化している。他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここでｎは、１と６１の間である。他の実施態様では、発明はまた、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の変異体を含み、ここでｎは、１と６１の間の整数であり、ここで選択された配列中に特定される任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化している。ただし、配列中の１５％を超えないアミノ酸残基が、そのように変化している。発明はまた、配列番号２ｎからなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型のいずれかのフラグメント、またはこの群から選択される任意の他のアミノ酸配列に関係し、ここでｎは１と６１の間の整数である。発明は、残基の１５％までが変化しているこれらの群からのフラグメントを含む。
【００１１】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択される配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるポリペプチドを含み、ここで、ｎは１と６１の間の整数である。これらの対立遺伝子変異体は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列からの単一ヌクレオチドによって異なる核酸配列の翻訳物である、アミノ酸配列を含み、ここでｎは１と６１の間である。変異体ポリペプチドは、選択された配列で任意のアミノ酸が変化している場合、変化して保存置換を提供する。
【００１２】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ここでｎは１と６１の間の整数であり、および薬学的許容可能担体に関係する医薬組成物を含む。他の実施態様では、発明は、１または２以上の容器中にこの医薬組成物を含む、キットに関係する。
【００１３】
他の実施多様では、発明は、ヒト疾患に随伴する症候群を処置する医薬の製造における治療剤の用途を含み、該疾患は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと連関する病理から選択され、ここでｎは、１と６１の間での整数であり、ここで当該治療剤は、この群から選択されるポリペプチドである。
【００１４】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在または量を決定する方法を含み、ここでｎは１と６１の間の整数であり、該方法は、試料を提供すること；試料を、ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入すること；およびポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定し、それによって試料中のポリペプチドの存在または量を決定することに関係する。
【００１５】
別の実施態様では、発明は、第一哺乳動物対象において、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの変化したレベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法を含み、ここでｎは１と６１の間の整数であり、該方法は、第一哺乳動物対象からの試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定すること；およびこの試料中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有しない、または素因がないと知られる第二哺乳動物対象からの対照試料中に存在する該ポリペプチドの量と比較することに関係し、ここで該対照試料と比較した場合の、該第一対象のポリペプチドの発現レベルの変化は、該疾患の存在または素因を指摘する。
【００１６】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する薬剤を同定する方法に関係し、ここでｎは１と６１の間の整数であり、該方法は、該薬剤へ該ポリペプチドを導入すること；および該薬剤が該ポリペプチドに結合するか否か決定することを含む。該薬剤は、細胞性レセプターまたは下流エフェクターでありうる。
【００１７】
他の実施態様では、発明は、病理の処置における使用のための潜在的治療薬剤を同定する方法に関係し、ここで該病理は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの異常発現または異常生理学的相互作用に関し、ここでｎは１と６１の間の整数であり、該方法は、発明のポリペプチドを発現するおよび該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を有する細胞を提供する；該細胞を、候補物質を含む組成物と接触する；および物質がポリペプチドに帰すべき特性または機能を変化させるか決定する；それによってもし物質の存在下観察される変化が、細胞を物質のない組成物と接触させたときに観察されないならば、該物質は、潜在的治療的剤として同定される。
【００１８】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに連関する病理の活性または潜在または素因のモジュレーターについてのスクリーニング方法に関係し、ここでｎは１と６１の間の整数であり、該方法は、発明のポリペプチドと連関する病理の増加リスクのある試験動物へ試験化合物を投与すること、ここで該試験動物は、発明のポリペプチドを組み換え的に発現し；試験化合物を投与後の、試験動物におけるポリペプチドの活性を測定すること；および試験動物のタンパク質の活性を、ポリペプチドを投与してない対照動物のポリペプチドの活性と比較すること、ここで試験動物におけるポリペプチドの活性の、対照動物に対する変化は、発明のポリペプチドと連関する病理の潜在または素因のモジュレーターであることを指摘する。組み換え体試験動物は、野生型試験動物に対する増加レベルの、タンパク質トランスジーンまたはプロモーターの制御下のトランスジーンを発現しうる。
【００１９】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列のポリペプチドの活性を調節する方法に関し、ここでｎは１と６１の間の整数であり、該方法はポリペプチドの活性を調節するために十分な量の、ポリペプチドに結合する化合物と、該ポリペプチドを発現する細胞試料を導入することを含む。
【００２０】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと連関する病理を処置または予防する方法に関係し、ここでｎは１と６１の間の整数であり、該方法は、そのような処置または予防が、該対象の病理を処置または予防するため十分の量で望まれる対象に、ポリペプチドを投与することを含む。
【００２１】
他の実施態様では、発明は、哺乳動物の病理学的状態を処置する方法に関係し、該方法は、該病理学的状態を緩和するのに十分量のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含み、ここで該ポリペプチドは、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその生物学的活性フラグメントであり、ここでｎは、１と６１の間の整数である。
【００２２】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子、ここでｎは１と６１の間の整数である；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟型の変異体、ここでｎは１と６１の間の整数であり、ここで選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化されている。ただし成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸残基はそのように変化している；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列、ここでｎは１と６１の間の整数である；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の変異体、ここでｎは１と６１の間の整数であり、ここに選択された配列中に特定される任意のアミノ酸は異なるアミノ酸に変化される。ただし配列中の１５％を超えないアミノ酸残基は、そのように変化している；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸フラグメント、ここでｎは１と６１の間の整数であり、またはポリペプチドの任意の変異体であり、ここで選択の配列の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化される。ただし、配列中の１０％を超えないアミノ酸残基は、そのように変化される；および核酸分子のいずれかの相補物に関係する。
【００２３】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と６１の間の整数であり、ここで核酸分子は、天然に存在する対立遺伝子核酸変異体のヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子に関係し、ここでｎは１と６１の間の整数であり、それは変異体ポリペプチドをコードし、ここで該変異体ポリペプチドは、天然存在ポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。
【００２５】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と６１の間の整数であり、ここで核酸分子は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列と単一ヌクレオチドによって相違し、ここでｎは１と６１の間の整数である。
【００２６】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と６１の間の整数であり、ここで核酸分子は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み；ここでヌクレオチド配列中の１または２以上のヌクレオチドが配列番号２ｎ−１からなる群より選択される、ここでｎは１と６１の間の整数である、ヌクレオチド配列が、選択された配列からなる群より選択されるものから、異なるヌクレオチドに変化している。ただし１５％を超えないヌクレオチドがそのように変化する；配列番号２ｎ−１からなる群より選択される配列の核酸フラグメント、ここでｎは１と６１の間の整数である；およびここでヌクレオチド配列中の１または２以上のヌクレオチドが、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される、ここでｎは１と６１の間の整数である、核酸フラグメントが、選択配列からなる群より選択されるものから、異なるヌクレオチドに変化している。ただし１５％を超えないヌクレオチドがそのように変化する。
【００２７】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と６１の間の整数であり、ここで該核酸は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の相補物に、厳密（ストリンジェント）条件下でハイブリダイズし、ここでｎは１と６１の間の整数である。
【００２８】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と６１の間の整数であり、ここで核酸分子はヌクレオチド配列を有し、ここに選択されたヌクレオチド配列のコーディング配列中に特定される任意のヌクレオチドは、選択配列からなる群より選択されるものから、異なるヌクレオチド（ただし、選択されたコーディング配列中の、１５％を超えないヌクレオチドは、そのように変化されている）、第一ポリヌクレオチドの相補物である単離第二ポリヌクレオチド、またはそれらいずれかのフラグメントに変化される。
【００２９】
他の実施態様では、発明は、配列番号２に与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子を含むベクターを含み、ここでｎは１と６１の間の整数である。このベクターは核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターを有することができる。このベクターは、細胞内に位置することができる。
【００３０】
別の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子の存在または量を決定する方法に関係し、ここでｎは１と６１の間の整数であり、該方法は、試料を提供すること；試料を、核酸分子に結合するプローブに導入すること；および核酸分子に結合したプローブの存在または量を決定し、それによって試料中の核酸分子の存在または量を決定することを含む。核酸分子の存在または量を細胞または組織型のためのマーカーとして使用する。細胞型は、がんであることができる。
【００３１】
別の実施態様では、発明は、第一哺乳動物対象において、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子の変化レベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法に関し、ここでｎは１と６１の間の整数であり、該方法は、第一哺乳動物対象からの試料中の核酸の量を測定すること；および工程（ａ）の試料中の核酸の量を、疾患を有しないまたは素因がないと知られる第二哺乳動物対象からの対照試料中に存在する核酸の量を比較することを含み；ここで対照試料と比較した場合の、第一対象中に存在する核酸のレベルの変化は、疾患の存在または素因を指摘する。
【００３２】
本発明はさらに、ＮＯＶＸポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を提供する。ＮＯＶＸ抗体は、モノクローナル、ヒト化、または完全なヒト抗体であっても良い。好ましくは、抗体はＮＯＶＸポリペプチドの抗体に対する１×１０−９Ｍ未満の解離定数を有する。さらに好ましくは、ＮＯＶＸ抗体はＮＯＶＸポリペプチドの活性を中和する。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに関連したヒトの疾患に関連した症候群を処置する医薬品の製造における治療薬の使用を提供する。好ましくは、治療薬はＮＯＶＸ抗体である。
【００３４】
なおさらなる態様では、本発明は、疾患を処置しまたは予防するのに十分な量でＮＯＶＸ抗体を対象に投与することにより、ＮＯＶＸ関連疾患を処置または予防する方法、哺乳動物における病態の処置方法、およびポリペプチドに関連する病変を処置または予防する方法を提供する。
【００３５】
特に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野に通常の技能を有する業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許申請、特許、および他の参考文献は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。抵触がある場合には本明細書が、定義を含め優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示的なものであって限定することを意図しない。
【００３６】
本発明の他の特性および利点は以下の発明の開示および請求項より明らかであろう。
【００３７】
（発明の開示）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによりコードされたポリペプチドを提供する。本発明は、新規核酸配列、それらのコードされたポリペプチド、抗体、および他の関連化合物を含む。本明細書において、配列を「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と称する。別段の記述がない限り、「ＮＯＶＸ」は本明細書に開示される任意の新規配列を指すことを意味する。表１ＡにＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドの要約を示す。
【００３８】
表１Ａ：配列および対応する配列番号
【表１】
2005519629.tif 000002
【表２】
2005519629.tif 000003
【００３９】
表１ＡはＮＯＶＸポリペプチドの既知のタンパク質ファミリーとの相同性を示す。従って、表１の第１欄で特定されるＮＯＶＸに対応する本発明に従う核酸およりポリヌクレオチド、抗体および関連化合物は、例えば、表１Ａの第５欄に特定される既知タンパク質ファミリーに関連する病変および疾患に関係する治療的応用および診断的応用において有用である。
【００４０】
ＮＯＶＸ配列と連関する病理、疾患、障害および状態などは、限定しないが、例えば以下のものを含む：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、肥満に連関する代謝妨害、移植、副腎白質萎縮症、先天性副腎過形成、前立腺癌、糖尿病、代謝障害、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、移植片対宿主疾患、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、Albright遺伝性骨ジストロフィー（Ostoeodystrophy）、感染性疾患、食欲不振、癌連関悪液質、癌、神経変性性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害であって自己免疫障害を含むもの、造血障害、および種々の異常脂血症、代謝症候群Ｘおよび慢性疾患および種々の癌、並びに状態例えば移植及び不妊と連関する消耗性障害。
【００４１】
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、前記タンパク質とのドメインおよび配列関連性の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを用いて、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定し得る。
【００４２】
表１Ａの第５欄で特定されるタンパク質ファミリーの他の既知のメンバーと一致して、本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、そのようなタンパク質ファミリーの他のメンバーに相同性を示し、そしてそれらを特徴とするドメインを含有する。それぞれのＮＯＶＸについての配列関連性分析およびドメイン分析の詳細を実施例Ａに示す。
【００４３】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または促進する分子をスクリーニングするのに使用し得る。特に、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、表Ａに掲げたタンパク質ファミリーと関連する疾患を調整または阻害する低分子の同定用の標的として使用され得る。
【００４４】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、特定の細胞タイプを検出にも有用である。ＮＯＶＸそれぞれに対する発現分析の詳細を実施例Ｃに示す。従って、本発明に従うＮＯＶＸ核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、正常組織対疾患組織、例えば、種々のがん、において異なる発現を有する種々の疾患の検出における診断的応用および治療的応用を有する。
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドのさらに別の利用法が本明細書に開示される。
【００４５】
ＮＯＶＸクローン
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、上記該タンパク質と関連するドメインおよび配列の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドが所属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用し得る。
【００４６】
ＮＯＶＸ遺伝子およびそれらの対応するコードされたタンパク質は、例えば、タンパク質治療または遺伝子治療により、医学的状態を予防、処置または緩和するのに有用である。病態を、試料中の新規タンパク質の量を測定または新規遺伝子中の変異の存在を測定することにより診断し得る。ＮＯＶＸ遺伝子が最も高発現する組織に基づいて、それぞれのＮＯＶＸ遺伝子に対する特異的な使用を説明する。使用は、種々の疾患および障害を診断または処置するための産物を開発することを含む。
【００４７】
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、潜在的な診断応用および治療応用、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的核酸、またはタンパク質、診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことを含む。ここで核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的な治療応用を評価する：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬の標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療的、診断的、薬のターゲティング／細胞毒性性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子手術）に有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防衛兵器。
【００４８】
一つの特定の実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体、但し、成熟型中の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ変異体、但し、選択された配列で特定される任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；およびｅ）ａ）ないしｄ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択したアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを含む。
【００４９】
もう一つの特別な実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）を与えられたアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体であり、選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であり、選択された配列中の特定されるアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；および(ｅ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部分、または選択された配列の任意のアミノ酸が、配列においてアミノ酸残基の１０％未満が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、ポリペプチドの任意の変異体をコードする核酸のフラグメント；および(ｆ) 核酸分子のいずれかの相補的分子、からなる群より選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
【００５０】
なおもう一つの特別な実施態様では、本発明は単離核酸分子を含む。ここで該核酸分子は、(ａ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列；(ｂ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；(ｃ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択される配列を持つ核酸フラグメント；および(ｄ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメント、からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５２】
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(例えば、宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の工程により生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
【００５３】
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から約１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６，０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
【００５４】
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施態様において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、０.１ｋｂ以下、またはそれ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５５】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
【００５６】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
【００５７】
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列を含む。本発明の一つの実施態様では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
【００５８】
もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
【００５９】
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
【００６０】
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。
【００６１】
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００６２】
誘導体および類似体は全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当分野において公知のコンピューター相同性プログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施態様において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が本発明のタンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
【００６３】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
【００６４】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
【００６５】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
【００６６】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施態様において、プローブは検出可能な標識がつけられており、例えば、標識は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
【００６７】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
【００６８】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００６９】
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）に示すヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００７０】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
【００７１】
従って、もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施態様では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６５％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
【００７２】
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【００７３】
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【００７４】
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
【００７５】
第２の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardtの溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
【００７６】
第３の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
【００７７】
保存的変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当分野内で周知である。
【００７８】
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）とアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施態様では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）のアミノ酸配列と少なくとも約５０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）に少なくとも約９５％相同である。
【００７９】
配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
【００８０】
突然変異を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーを当分野内で定義された。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施態様では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）の突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
【００８１】
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
【００８２】
一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
【００８３】
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
【００８４】
一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
【００８５】
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
【００８６】
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、５−メトキシウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
【００８７】
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
【００８８】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
【００８９】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
【００９０】
一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜６１の整数である）)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【００９１】
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
【００９２】
種々の実施態様において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個の核酸塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
【００９３】
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
【００９４】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra and Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
【００９５】
他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等に複合し得る。
【００９６】
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２ｎ（ｎは１〜６１の整数である）に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
【００９７】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
【００９８】
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施態様では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【００９９】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施態様では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
【０１００】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施態様では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
【０１０１】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６１の整数である)に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
【０１０２】
一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６１の整数である)に示すアミノ酸配列を有する。他の実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６１の整数である)に実質的に相同であり、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６１の整数である)のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６１の整数である)のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６１の整数である)のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【０１０３】
２個またはそれ以上の配列間の相同性を測定すること
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の相同性の割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
【０１０４】
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６１の整数である)に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０１０５】
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１０６】
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６１の整数である)のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１０７】
一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０１０８】
もう一つの実施態様では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
【０１０９】
なおもう一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【０１１０】
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施態様では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
【０１１１】
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施態様では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
【０１１２】
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【０１１３】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施態様では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１１４】
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
【０１１５】
抗ＮＯＶＸ抗体
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体は本発明に含まれる。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ' およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
【０１１６】
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜６１の整数である)に示すアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
【０１１７】
本発明の特定の実施態様において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数ＫＤが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＯＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
【０１１８】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
【０１１９】
当分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
【０１２０】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
【０１２１】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳動物から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
【０１２２】
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
【０１２３】
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【０１２４】
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳動物源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
【０１２５】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１２６】
ハイブリドーマが培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
【０１２７】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's Medium培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖し得る。
【０１２８】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
【０１２９】
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の通常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の通常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
【０１３０】
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレーム枠領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１３１】
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
【０１３２】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
【０１３３】
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施態様はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
【０１３４】
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
【０１３５】
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳動物宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳動物宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
【０１３６】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０１３７】
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１３９】
二重特異性抗体の作成方法は当分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１４０】
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの通常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の通常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１４１】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の通常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
【０１４２】
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
【０１４３】
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１４４】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変領域(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１４５】
３価以上の結合価をもつ抗体も考得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
【０１４６】
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
【０１４７】
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体依存性細胞溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１４８】
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１４９】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica charantia(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１５０】
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド誘導体(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１５１】
もう一つの実施態様では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１５２】
イムノリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl  Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
【０１５３】
特に有用なリポソームリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームリポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
【０１５４】
本発明のタンパク質に対して指向した抗体の診断応用
１実施態様では、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は限定しないが、エライザ（ＥＬＩＳＡ）および他の当業者既知免疫学的介在技法を含む。具体的実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、そのようなドメインを保有するＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易化される。かくして、ＮＯＶＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体、または相同物に特異的で合える抗体をまたここに提供する。
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して指向化された抗体を、ＮＯＶＸタンパク質の局在化及び／または定量に関する当業界内既知方法で使用し得る（例えば適当な生理学的サンプル内のＮＯＶＸタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施態様では、ＮＯＶＸ、その誘導体、フラグメント、類似体または相同物に特異的な抗体であって、抗体由来抗原結合ドメインを含むものは、薬理学的活性化合物として利用する（以後「治療剤」と称する）。
【０１５５】
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して特異的な抗体を（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために使用し得る。ＮＯＶＸポリペプチドへの抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産したＮＯＶＸ抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、抗原性ＮＯＶＸタンパク質の存在量または発現パターンを評価するために抗原性ＮＯＶＸタンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。ＮＯＶＸタンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
【０１５６】
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
【０１５７】
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的を、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
【０１５８】
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、特定の場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存するし、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週１回の範囲であり得る。
【０１５９】
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995、Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends,  Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa.,  1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker,  New Yorkに提供されている。
【０１６０】
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要なニつ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
【０１６１】
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ハイドロキシメチルセルローズまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
【０１６２】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
【０１６３】
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)２)を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
【０１６４】
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳動物のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳動物の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
【０１６５】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
【０１６６】
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
【０１６７】
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
【０１６８】
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
【０１６９】
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
【０１７０】
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
【０１７１】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
【０１７２】
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバクロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
【０１７３】
なおもう一つの実施態様では、本発明の核酸を、哺乳動物の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現し得る。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳動物細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０１７４】
もう一つの実施態様では、組換え哺乳動物表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
【０１７５】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０１７６】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０１７７】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０１７８】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０１７９】
哺乳動物細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
【０１８０】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施態様では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施態様では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０１８１】
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０１８２】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６１の整数である)のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０１８３】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６１の整数である)のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６１の整数である)のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施態様では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
【０１８４】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
【０１８５】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０１８６】
もう一つの実施態様では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０１８７】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
【０１８８】
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび脂肪油のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０１８９】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０１９０】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０１９１】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１９２】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０１９３】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０１９４】
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０１９５】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０１９６】
一つの実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０１９７】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
【０１９８】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０１９９】
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＮＯＶＸｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＮＯＶＸ活性を調整することができる。加えて、ＮＯＶＸタンパク質を用いて、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＮＯＶＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝的シンドロームＸならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＮＯＶＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を方法で使用して、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響させることができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０２００】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
【０２０１】
一つの実施態様では、本発明は、膜結合型のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
【０２０２】
本明細書において使用する「低分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０２０３】
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当分野に見出し得る。
【０２０４】
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
【０２０５】
ある実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳動物由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施態様では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２０６】
もう一つの実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＮＯＶＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶＸの標的分子は、非ＮＯＶＸ分子または本発明のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＮＯＶＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
【０２０７】
ＮＯＶＸタンパク質をあるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＮＯＶＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
【０２０８】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２０９】
なおもう一つの実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施態様では、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質がさらにあるＮＯＶＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
【０２１０】
なおもう一つの実施態様では、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
【０２１１】
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
【０２１２】
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施態様において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施態様では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
【０２１３】
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、ＮＯＶＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
【０２１４】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に有意に多い)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に有意に少ない)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
【０２１５】
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶＸと結合または相互作用をしてＮＯＶＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流の要素としてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅に関与する可能性が高い。
【０２１６】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
【０２１７】
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
【０２１８】
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６１の整数である)であるＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＮＯＶＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
【０２１９】
略述すれば、ＮＯＶＸ遺伝子を、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を使用して、そのため増幅プロセスを複雑にする、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのが、増幅したフラグメントを生成する。
【０２２０】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
【０２２１】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＮＯＶＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
【０２２２】
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１,０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、そしてさらに好ましくは２,０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988を参照されたい。
【０２２３】
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
【０２２４】
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、in McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egeland, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
【０２２５】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
【０２２６】
組織タイピング
本発明のＮＯＶＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２２７】
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
【０２２８】
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に因る。
【０２２９】
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１,０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６１の整数である)の配列のような予想するコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２,０００である。
【０２３０】
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を挙げ得る。本発明はまた、個体がＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
【０２３１】
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
【０２３２】
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
【０２３３】
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜６１の整数である)の核酸のような全長ＮＯＶＸ核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
【０２３４】
ＮＯＶＸタンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶＸｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２３５】
一つの実施態様では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
【０２３６】
もう一つの実施態様では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
【０２３７】
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶＸの量を測定する手段；および試料中のＮＯＶＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
【０２３８】
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
【０２３９】
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
【０２４０】
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施態様において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＮＯＶＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＮＯＶＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＮＯＶＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＮＯＶＸ遺伝子の染色体再編成、(v)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＮＯＶＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２４１】
特定の実施態様では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
【０２４２】
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
【０２４３】
さらに別の実施態様では、試料細胞由来のあるＮＯＶＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
【０２４４】
他の実施態様では、ＮＯＶＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
【０２４５】
なおもう一つの実施態様において、当分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
【０２４６】
ＮＯＶＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当分野の技術は、野生型ＮＯＶＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得る潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施態様では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
【０２４７】
なおもう一つの実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施態様によれば、あるＮＯＶＸ配列、例えば、野生型ＮＯＶＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
【０２４８】
他の実施態様では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得る変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施態様では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
【０２４９】
なおもう一つの実施態様では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施態様では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
【０２５０】
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２５１】
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施態様では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２５２】
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
【０２５３】
さらに、ＮＯＶＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２５４】
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶＸ活性(例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、障害を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。障害としては、限定しないが、表Ａに要約するような代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、慢性疾患および種々のがんに関連した代謝性シンドロームＸならびに消耗性疾患を挙げ得る。そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基く予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。
【０２５５】
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
【０２５６】
例示的実施態様として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認する。
【０２５７】
従って、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＮＯＶＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２５８】
臨床試験の作用モニタリング
ＮＯＶＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
【０２５９】
限定しない例として、ＮＯＶＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または低分子)を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＮＯＶＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
【０２６０】
一つの実施態様において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
【０２６１】
処置方法
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患のリスクにある(感受性)かまたは疾患を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。障害としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症(ＡＳＤ)、房室(Ａ−Ｖ)管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症(ＶＳＤ)、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、副腎白質萎縮症、先天性副腎過形成、前立腺がん、新生物、腺がん、リンパ腫、子宮がん、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、移植片対宿主病、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、アルブライト遺伝性骨ジストロフィーの処置ならびに類似の他の疾患、障害および異常を挙げ得、前列挙のこれらの疾患、障害および状態に限定しないが、より具体的には表Ａに要約されるもののような、ＮＯＶＸタンパク質の相同物と連関するそれらの疾患、障害または状態を含むものである。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
【０２６２】
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２６３】
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２６４】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２６５】
予防的方法
一つの態様では、異常なＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０２６６】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施態様では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０２６７】
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有すると思われる状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
【０２６８】
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施態様において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
【０２６９】
種々の特定の実施態様において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
【０２７０】
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は：代謝性障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を限定することなく、含み、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。
【０２７１】
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、限定しないがここに列挙のものを含む疾患、障害または状態などに罹患する対象の処置のための効験を有するであろう。
【０２７２】
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
本発明を、以下の実施例でさらに記載し、これらはクレームに記載の発明の範囲を限定しない。
【０２７３】
実施例
実施例A:ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列および相同性データ
【０２７４】
実施例１
ＮＯＶ１クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１Ａに示す。
【表３】
2005519629.tif 000004
【０２７５】
【表４】
2005519629.tif 000005
【０２７６】
【表５】
2005519629.tif 000006
【０２７７】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表６】
2005519629.tif 000007
【０２７８】
ＮＯＶ１ａタンパク質の更なる分析は、表１Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表７】
2005519629.tif 000008
【０２７９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１ａタンパク質の検索により、表１Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表８】
2005519629.tif 000009
【０２８０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１ａタンパク質は、表１ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表９】
2005519629.tif 000010
【０２８１】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１ａタンパク質は表１Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表１０】
2005519629.tif 000011
【０２８２】
実施例２
ＮＯＶ２クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２Ａに示す。
【表１１】
2005519629.tif 000012
【０２８３】
【表１２】
2005519629.tif 000013
【０２８４】
ＮＯＶ２ａタンパク質の更なる分析は、表２Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１３】
2005519629.tif 000014
【０２８５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２ａタンパク質の検索により、表２Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１４】
2005519629.tif 000015
【０２８６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２ａタンパク質は、表２ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１５】
2005519629.tif 000016
【０２８７】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２ａタンパク質は表２Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１６】
2005519629.tif 000017
【０２８８】
実施例３
ＮＯＶ３クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表３Ａに示す。
【表１７】
2005519629.tif 000018
【０２８９】
【表１８】
2005519629.tif 000019
【０２９０】
【表１９】
2005519629.tif 000020
【０２９１】
【表２０】
2005519629.tif 000021
【０２９２】
【表２１】
2005519629.tif 000022
【０２９３】
【表２２】
2005519629.tif 000023
【０２９４】
【表２３】
2005519629.tif 000024
【０２９５】
【表２４】
2005519629.tif 000025
【０２９６】
【表２５】
2005519629.tif 000026
【０２９７】
【表２６】
2005519629.tif 000027
【０２９８】
【表２７】
2005519629.tif 000028
【０２９９】
前記タンパク質配列の配列比較は、表３Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表２８】
2005519629.tif 000029
【０３００】
ＮＯＶ３ａタンパク質の更なる分析は、表３Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表２９】
2005519629.tif 000030
【０３０１】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３ａタンパク質の検索により、表３Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３０】
2005519629.tif 000031
【０３０２】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３ａタンパク質は、表３ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３１】
2005519629.tif 000032
【０３０３】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ３ａタンパク質は表３Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表３２】
2005519629.tif 000033
【０３０４】
実施例４
ＮＯＶ４クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表４Ａに示す。
【表３３】
2005519629.tif 000034
【０３０５】
【表３４】
2005519629.tif 000035
【０３０６】
ＮＯＶ４ａタンパク質の更なる分析は、表４Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表３５】
2005519629.tif 000036
【０３０７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４ａタンパク質の検索により、表４Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３６】
2005519629.tif 000037
【０３０８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４ａタンパク質は、表４ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３７】
2005519629.tif 000038
【０３０９】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ４ａタンパク質は表４Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表３８】
2005519629.tif 000039
【０３１０】
実施例５
ＮＯＶ５クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表５Ａに示す。
【表３９】
2005519629.tif 000040
【０３１１】
ＮＯＶ５ａタンパク質の更なる分析は、表５Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表４０】
2005519629.tif 000041
【０３１２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ５ａタンパク質の検索により、表５Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表４１】
2005519629.tif 000042
【０３１３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ５ａタンパク質は、表５ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表４２】
2005519629.tif 000043
【０３１４】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ５ａタンパク質は表５Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表４３】
2005519629.tif 000044
【０３１５】
実施例６
ＮＯＶ６クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表６Ａに示す。
【表４４】
2005519629.tif 000045
【０３１６】
【表４５】
2005519629.tif 000046
【０３１７】
前記タンパク質配列の配列比較は、表６Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表４６】
2005519629.tif 000047
【０３１８】
ＮＯＶ６ａタンパク質の更なる分析は、表６Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表４７】
2005519629.tif 000048
【０３１９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ６ａタンパク質の検索により、表６Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表４８】
2005519629.tif 000049
【０３２０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ６ａタンパク質は、表６ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表４９】
2005519629.tif 000050
【０３２１】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１ａタンパク質は表６Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表５０】
2005519629.tif 000051
【０３２２】
実施例７
ＮＯＶ７クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表７Ａに示す。
【表５１】
2005519629.tif 000052
【０３２３】
【表５２】
2005519629.tif 000053
【０３２４】
前記タンパク質配列の配列比較は、表７Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表５３】
2005519629.tif 000054
【０３２５】
ＮＯＶ７ａタンパク質の更なる分析は、表７Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表５４】
2005519629.tif 000055
【０３２６】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ７ａタンパク質の検索により、表７Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表５５】
2005519629.tif 000056
【０３２７】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ７ａタンパク質は、表７ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表５６】
2005519629.tif 000057
【０３２８】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ７ａタンパク質は表７Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表５７】
2005519629.tif 000058
【０３２９】
実施例８
ＮＯＶ８クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表８Ａに示す。
【表５８】
2005519629.tif 000059
【０３３０】
【表５９】
2005519629.tif 000060
【０３３１】
ＮＯＶ８ａタンパク質の更なる分析は、表８Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表６０】
2005519629.tif 000061
【０３３２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ８ａタンパク質の検索により、表８Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表６１】
2005519629.tif 000062
【０３３３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ８ａタンパク質は、表８ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表６２】
2005519629.tif 000063
【０３３４】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ８ａタンパク質は表８Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表６３】
2005519629.tif 000064
【０３３５】
実施例９
ＮＯＶ９クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表９Ａに示す。
【表６４】
2005519629.tif 000065
【０３３６】
【表６５】
2005519629.tif 000066
【０３３７】
ＮＯＶ９ａタンパク質の更なる分析は、表９Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表６６】
2005519629.tif 000067
【０３３８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ９ａタンパク質の検索により、表９Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表６７】
2005519629.tif 000068
【０３３９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ９ａタンパク質は、表９ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表６８】
2005519629.tif 000069
【０３４０】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ９ａタンパク質は表９Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表６９】
2005519629.tif 000070
【０３４１】
実施例１０
ＮＯＶ１０クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１０Ａに示す。
【表７０】
2005519629.tif 000071
【０３４２】
【表７１】
2005519629.tif 000072
【０３４３】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１０Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表７２】
2005519629.tif 000073
【０３４４】
ＮＯＶ１０ａタンパク質の更なる分析は、表１０Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表７３】
2005519629.tif 000074
【０３４５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１０ａタンパク質の検索により、表１０Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表７４】
2005519629.tif 000075
【０３４６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１０ａタンパク質は、表１０ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表７５】
2005519629.tif 000076
【０３４７】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１０ａタンパク質は表１０Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表７６】
2005519629.tif 000077
【０３４８】
実施例１１
ＮＯＶ１１クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１１Ａに示す。
【表７７】
2005519629.tif 000078
【０３４９】
ＮＯＶ１１ａタンパク質の更なる分析は、表１１Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表７８】
2005519629.tif 000079
【０３５０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１１ａタンパク質の検索により、表１１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表７９】
2005519629.tif 000080
【０３５１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１１ａタンパク質は、表１１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表８０】
2005519629.tif 000081
【０３５２】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１１ａタンパク質は表１１Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表８１】
2005519629.tif 000082
【０３５３】
実施例１２
ＮＯＶ１２クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１２Ａに示す。
【表８２】
2005519629.tif 000083
【０３５４】
【表８３】
2005519629.tif 000084
【０３５５】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１２Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表８４】
2005519629.tif 000085
【０３５６】
ＮＯＶ１２ａタンパク質の更なる分析は、表１２Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表８５】
2005519629.tif 000086
【０３５７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１２ａタンパク質の検索により、表１２Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表８６】
2005519629.tif 000087
【０３５８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１２ａタンパク質は、表１２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表８７】
2005519629.tif 000088
【０３５９】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１２ａタンパク質は表１２Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表８８】
2005519629.tif 000089
【０３６０】
実施例１３
ＮＯＶ１３クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１Ａに示す。
【表８９】
2005519629.tif 000090
【０３６１】
ＮＯＶ１３タンパク質の更なる分析は、表１３Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表９０】
2005519629.tif 000091
【０３６２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１３ａタンパク質の検索により、表１３Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表９１】
2005519629.tif 000092
【０３６３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１３ａタンパク質は、表１３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表９２】
2005519629.tif 000093
【０３６４】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１３タンパク質は表１３Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表９３】
2005519629.tif 000094
【０３６５】
実施例１４
ＮＯＶ１４クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１４Ａに示す。
【表９４】
2005519629.tif 000095
【０３６６】
【表９５】
2005519629.tif 000096
【０３６７】
【表９６】
2005519629.tif 000097
【０３６８】
【表９７】
2005519629.tif 000098
【０３６９】
【表９８】
2005519629.tif 000099
【０３７０】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１４Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表９９】
2005519629.tif 000100
【０３７１】
ＮＯＶ１４ａタンパク質の更なる分析は、表１４Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１００】
2005519629.tif 000101
【０３７２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１４ａタンパク質の検索により、表１４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１０１】
2005519629.tif 000102
【０３７３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１４ａタンパク質は、表１４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１０２】
2005519629.tif 000103
【０３７４】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１４ａタンパク質は表１４Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表１０３】
2005519629.tif 000104
【０３７５】
実施例１５
ＮＯＶ１５クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１５Ａに示す。
【表１０４】
2005519629.tif 000105
【０３７６】
【表１０５】
2005519629.tif 000106
【０３７７】
ＮＯＶ１５ａタンパク質の更なる分析は、表１５Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１０６】
2005519629.tif 000107
【０３７８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１５ａタンパク質の検索により、表１５Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１０７】
2005519629.tif 000108
【０３７９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１５ａタンパク質は、表１５ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１０８】
2005519629.tif 000109
【０３８０】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１５ａタンパク質は表１５Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１０９】
2005519629.tif 000110
【０３８１】
実施例１６
ＮＯＶ１６クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１６Ａに示す。
【表１１０】
2005519629.tif 000111
【０３８２】
ＮＯＶ１６ａタンパク質の更なる分析は、表１６Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１１１】
2005519629.tif 000112
【０３８３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１６ａタンパク質の検索により、表１６Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１１２】
2005519629.tif 000113
【０３８４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１６ａタンパク質は、表１６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１１３】
2005519629.tif 000114
【０３８５】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１６ａタンパク質は表１６Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１１４】
2005519629.tif 000115
【０３８６】
実施例１７
ＮＯＶ１７クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１７Ａに示す。
【表１１５】
2005519629.tif 000116
【０３８７】
【表１１６】
2005519629.tif 000117
【０３８８】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１７Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１１７】
2005519629.tif 000118
【０３８９】
ＮＯＶ１７ａタンパク質の更なる分析は、表１７Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１１８】
2005519629.tif 000119
【０３９０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１ａタンパク質の検索により、表１７Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１１９】
2005519629.tif 000120
【０３９１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１７ａタンパク質は、表１７ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１２０】
2005519629.tif 000121
【０３９２】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１７ａタンパク質は表１７Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表１２１】
2005519629.tif 000122
【０３９３】
実施例１８
ＮＯＶ１８クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１８Ａに示す。ＮＯＶ１８ｅ核酸（配列番号１２１）は、ＮＯＶ１８ａ残基２４７−３４９の逆相補物である（配列番号８１）。ＮＯＶ１８ｅポリペプチドは、実施例Ｂに記載されるような、増幅プライマー内に取り込まれた制限エンドヌクレアーゼ部位によってコードされる、ＯＲＦアセンブリの末端に追加的アミノ酸を含む。
【表１２２】
2005519629.tif 000123
【０３９４】
【表１２３】
2005519629.tif 000124
【０３９５】
【表１２４】
2005519629.tif 000125
【０３９６】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１８Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１２５】
2005519629.tif 000126
【０３９７】
ＮＯＶ１８ａタンパク質の更なる分析は、表１８Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１２６】
2005519629.tif 000127
【０３９８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１８ａタンパク質の検索により、表１８Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１２７】
2005519629.tif 000128
【０３９９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１８ａタンパク質は、表１８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１２８】
2005519629.tif 000129
【０４００】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１８ａタンパク質は表１８Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表１２９】
2005519629.tif 000130
【０４０１】
実施例１９
ＮＯＶ１９クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表１９Ａに示す。
【表１３０】
2005519629.tif 000131
【０４０２】
ＮＯＶ１９ａタンパク質の更なる分析は、表１９Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１３１】
2005519629.tif 000132
【０４０３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１９ａタンパク質の検索により、表１９Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１３２】
2005519629.tif 000133
【０４０４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１９ａタンパク質は、表１９ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１３３】
2005519629.tif 000134
【０４０５】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ１９ａタンパク質は表１９Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１３４】
2005519629.tif 000135
【０４０６】
実施例２０
ＮＯＶ２０クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２０Ａに示す。
【表１３５】
2005519629.tif 000136
【０４０７】
【表１３６】
2005519629.tif 000137
【０４０８】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２０Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１３７】
2005519629.tif 000138
【０４０９】
ＮＯＶ２０ａタンパク質の更なる分析は、表２０Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１３８】
2005519629.tif 000139
【０４１０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２０ａタンパク質の検索により、表２０Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１３９】
2005519629.tif 000140
【０４１１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２０ａタンパク質は、表２０ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１４０】
2005519629.tif 000141
【０４１２】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２０ａタンパク質は表２０Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表１４１】
2005519629.tif 000142
【０４１３】
実施例２１
ＮＯＶ２１クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２１Ａに示す。
【表１４２】
2005519629.tif 000143
【０４１４】
ＮＯＶ２１ａタンパク質の更なる分析は、表２１Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１４３】
2005519629.tif 000144
【０４１５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２１ａタンパク質の検索により、表２１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１４４】
2005519629.tif 000145
【０４１６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２１ａタンパク質は、表２１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１４５】
2005519629.tif 000146
【０４１７】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２１ａタンパク質は表２１Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１４６】
2005519629.tif 000147
【０４１８】
実施例２２
ＮＯＶ２２クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２２Ａに示す。
【表１４７】
2005519629.tif 000148
【０４１９】
ＮＯＶ２２ａタンパク質の更なる分析は、表２２Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１４８】
2005519629.tif 000149
【０４２０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２２ａタンパク質の検索により、表２２Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１４９】
2005519629.tif 000150
【０４２１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２２ａタンパク質は、表２２ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１５０】
2005519629.tif 000151
【０４２２】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２２ａタンパク質は表２２Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１５１】
2005519629.tif 000152
【０４２３】
実施例２３
ＮＯＶ２３クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２３Ａに示す。
【表１５２】
2005519629.tif 000153
【０４２４】
ＮＯＶ２３ａタンパク質の更なる分析は、表２３Ｂ示す以下の特性をもたらした。
【表１５３】
2005519629.tif 000154
【０４２５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２３ａタンパク質の検索により、表２３Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１５４】
2005519629.tif 000155
【０４２６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２３ａタンパク質は、表２３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１５５】
2005519629.tif 000156
【０４２７】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２３ａタンパク質は表２３Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１５６】
2005519629.tif 000157
【０４２８】
実施例２４
ＮＯＶ２４クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２４Ａに示す。
【表１５７】
2005519629.tif 000158
【０４２９】
【表１５８】
2005519629.tif 000159
【０４３０】
ＮＯＶ２４ａタンパク質の更なる分析は、表２４Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１５９】
2005519629.tif 000160
【０４３１】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２４ａタンパク質の検索により、表２４Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１６０】
2005519629.tif 000161
【０４３２】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２４ａタンパク質は、表２４ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１６１】
2005519629.tif 000162
【０４３３】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２４ａタンパク質は表２４Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１６２】
2005519629.tif 000163
【０４３４】
実施例２５
ＮＯＶ２５クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２５Ａに示す。
【表１６３】
2005519629.tif 000164
【０４３５】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２５Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１６４】
2005519629.tif 000165
【０４３６】
ＮＯＶ２５ａタンパク質の更なる分析は、表２５Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１６５】
2005519629.tif 000166
【０４３７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２５ａタンパク質の検索により、表２５Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１６６】
2005519629.tif 000167
【０４３８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２５ａタンパク質は、表２５ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１６７】
2005519629.tif 000168
【０４３９】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２５ａタンパク質は表２５Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表１６８】
2005519629.tif 000169
【０４４０】
実施例２６
ＮＯＶ２６クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２６Ａに示す。
【表１６９】
2005519629.tif 000170
【０４４１】
ＮＯＶ２６ａタンパク質の更なる分析は、表２６Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１７０】
2005519629.tif 000171
【０４４２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２６ａタンパク質の検索により、表２６Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１７１】
2005519629.tif 000172
【０４４３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２６ａタンパク質は、表２６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１７２】
2005519629.tif 000173
【０４４４】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２６ａタンパク質は表２６Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１７３】
2005519629.tif 000174
【０４４５】
実施例２７
ＮＯＶ２７クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２７Ａに示す。
【表１７４】
2005519629.tif 000175
【０４４６】
ＮＯＶ２７ａタンパク質の更なる分析は、表２７Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１７５】
2005519629.tif 000176
【０４４７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２７ａタンパク質の検索により、表２７Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１７６】
2005519629.tif 000177
【０４４８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２７ａタンパク質は、表２７ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１７７】
2005519629.tif 000178
【０４４９】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２７ａタンパク質は表２７Ｅに示すドメインを含有すると予測する。
【表１７８】
2005519629.tif 000179
【０４５０】
実施例２８
ＮＯＶ２８クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされるポリペプチド配列を表２８Ａに示す。
【表１７９】
2005519629.tif 000180
【０４５１】
【表１８０】
2005519629.tif 000181
【０４５２】
【表１８１】
2005519629.tif 000182
【０４５３】
【表１８２】
2005519629.tif 000183
【０４５４】
【表１８３】
2005519629.tif 000184
【０４５５】
【表１８４】
2005519629.tif 000185
【０４５６】
【表１８５】
2005519629.tif 000186
【０４５７】
【表１８６】
2005519629.tif 000187
【０４５８】
【表１８７】
2005519629.tif 000188
【０４５９】
【表１８８】
2005519629.tif 000189
【０４６０】
【表１８９】
2005519629.tif 000190
【０４６１】
【表１９０】
2005519629.tif 000191
【０４６２】
【表１９１】
2005519629.tif 000192
【０４６３】
【表１９２】
2005519629.tif 000193
【０４６４】
【表１９３】
2005519629.tif 000194
【０４６５】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２８Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１９４】
2005519629.tif 000195
【０４６６】
ＮＯＶ２８ａタンパク質の更なる分析は、表２８Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１９５】
2005519629.tif 000196
【０４６７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権データベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２８ａタンパク質の検索により、表２８Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１９６】
2005519629.tif 000197
【０４６８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２８ａタンパク質は、表２８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１９７】
2005519629.tif 000198
【０４６９】
ＰＦａｍ解析は、ＮＯＶ２８ａタンパク質は表２８Ｆに示すドメインを含有すると予測する。
【表１９８】
2005519629.tif 000199
【０４７０】
【表１９９】
2005519629.tif 000200
【０４７１】
【表２００】
2005519629.tif 000201
【０４７２】
実施例Ｂ
配列決定方法およびNOV Xクローンの同定
1.  GeneCalling（登録商標）テクノロジー：これは、CuraGenで開発され、Shimketsら, "Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query", Nature Biotechnology 17:198-803 (1999)に記載されている、2もしくは3つ以上のサンプル間のディファレンシャル遺伝子発現プロファイリングを行う独自の方法である。cDNAは、種々のドナーからの多数の組織タイプ、正常および疾患状態、生理的状態、ならびに発達状態を表す種々のヒトサンプルから誘導する。サンプルは、全組織、初代細胞または組織培養した初代細胞もしくは細胞株として入手した。細胞および細胞株は、例えば、成長因子、ケモカインもしくはステロイドのような遺伝子発現を調節する生物学的もしくは化学的物質で処理することができる。このように誘導したcDNAを、その後120対までの多数の制限酵素で消化し、そして各対の制限酵素に特異的なリンカー−アダプターの対を適切な末端へ連結させた。この制限消化により、独特のcDNA遺伝子フラグメントの混合物を生成する。限界PCR増幅を、リンカーーアダプター配列に相同性のプライマーを用いて行い、このとき一方プライマーをビオチニル化し、もう一方のプライマーは蛍光標識する。二重標識された物質を単離し、蛍光標識された一本鎖をキャピラリーゲル電気泳動法によって分解する。コンピュータ・アルゴリズムにより、各々の制限消化物について実験群と対照群とからのエレクトロフェログラム（電気泳動図）を比較した。この配列および追加の配列に由来する情報を使用して、種々の遺伝子情報データベースを利用して、各々のディファレンシャルに発現された遺伝子フラグメントの同一性を予測するために使用する。遺伝子フラグメントの同一性を、さらに、遺伝子特異的競合PCRまたは遺伝子フラグメントの単離および配列決定によって確認する。
【０４７３】
2.  SeqCalling（登録商標）テクノロジー：cDNAは、種々のドナーからの多数の組織タイプ、正常および疾患状態、生理的状態、そして発達状態を表す種々のヒトサンプルから誘導する。サンプルは、全組織、初代細胞または組織培養した初代細胞もしくは細胞株として入手した。細胞および細胞株は、例えば、成長因子、ケモカインもしくはステロイドのような遺伝子発現を調節する生物学的もしくは化学的物質で処理することができる。このようにして誘導したcDNAを、CuraGenの独自のSeqCallingテクノロジーを使用して配列決定した。配列解析トレースを手作業により評価し、適切な場合には補正のために手を加えた。全てのサンプル由来のcDNA配列を、一緒にまとめ、多くの場合は、各アセンブリについてのコンセンサス配列を作製するためにバイオインフォマティクス・プログラムを使用して公共ヒト配列を含めた。各アセンブリは、CuraGen Corporationのデータベースに含まれている。配列は、他の構成要素との同一性の程度が50bpにわたり少なくとも95%である場合にアセンブリのための構成要素として含めた。各アセンブリは、遺伝子もしくはその一部を表しており、例えばスプライス形単一ヌクレオチド多型（SNPs）、挿入、欠失およびその他の配列変形のような変異体に関する情報を含んでいる。
【０４７４】
3.  PathCalling（登録商標）テクノロジー：NOV X核酸配列は、ツーハイブリッド・アプローチによるcDNAライブラリーの実験スクリーニングによって誘導する。DNA配列の全長、もしくは配列の一部のいずれか、またはその両方を含むcDNAフラグメントを配列決定する。インシリコ予測はCuraGen Corporationの独自の配列データベース内または公共ヒト配列データベース内で入手できる配列に基づいており、全長DNA配列、もしくはそのある部分のいずれかを提供した。
【０４７５】
実験スクリーニングを、下記にまとめる方法を使用して行った：
cDNAライブラリーを、種々のドナーからの多数の組織タイプ、正常および疾患状態、生理的状態、そして発達状態を表す種々のヒトサンプルから誘導する。サンプルは、全組織、初代細胞または組織培養した初代細胞もしくは細胞株として入手した。細胞および細胞株は、例えば、成長因子、ケモカインもしくはステロイドのような遺伝子発現を調節する生物学的もしくは化学的物質で処理することができる。このように誘導したcDNAはその後、適切なツーバイブリッド・ベクター内へ方向性を持たせてクローニングした（Gal4活性化ドメイン（Gal4-AD）融合）。次いで、このようなcDNAライブラリー、ならびにClontech（Palo Alto, CA）から市販により入手できるcDNAライブラリーをE. coliからCuraGen Corporationの専有酵母菌株内へ導入した（それらの全体が参照して本明細書中に組み込まれる米国特許第6,057,101号および第6,083,693号に開示されている）。
【０４７６】
CuraGen Corporationのヒト配列の専有ライブラリーGal4-結合ドメイン（Gal4-BD）融合体を使用して複数のGal4-AD融合cDNAライブラリーをスクリーニングし、それにより各々のGal4-AD融合体が別のcDNAを含有している酵母ハイブリッド二倍体を選択した。各サンプルを、cDNA挿入境界の非特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して増幅した。このようなPCR産物を配列決定した；配列解析トレースは手作業により評価し、適切な場合は補正のために手を加えた。全てのサンプル由来のcDNA配列を一緒にまとめ、多くの場合には、各アセンブリについてのコンセンサス配列を作製するためにバイオインフォマティクス・プログラムを使用し、公共ヒト配列を含めた。各アセンブリは、CuraGen Corporationのデータベースに含まれている。配列は、他の構成要素との同一性の程度が50bpにわたり少なくとも95%である場合にアセンブリのための構成要素として含めた。各アセンブリは、遺伝子もしくはその一部を表しており、例えばスプライス形単一ヌクレオチド多型（SNPs）、挿入、欠失およびその他の配列変形のような変異体に関する情報を含んでいる。
【０４７７】
物理的クローン：スクリーニング方法により誘導するオープンリーディングフレーム全体を含むcDNAフラグメントを、組み換えDNAとして、cDNAライブラリーを作製するために使用したpACT2プラスミド（Clontech）内へクローニングした。組み換えプラスミドを宿主内に挿入し、CuraGen Corporationの独自酵母菌株N106'およびYULHの両方の接合により、スクリーニング法の間に酵母ハイブリッド二倍体を生じさせることによって選択する（米国特許第6,057,101号および第6,083,693号）。
【０４７８】
4.  RACE：cDNA末端の迅速増幅（RACE）法のようなポリメラーゼ連鎖反応に基づく方法を使用して、予想される本発明のcDNAの配列を単離もしくは完成した。通常は、フラグメントの配列を誘導するために1もしくは2つ以上のヒトサンプルから複数のクローンを配列決定した。RACE反応には種々のドナー由来の種々のヒト組織サンプルを使用した。これらの方法により誘導した配列を先の段落に記載したSeqCalling Assemblyプロセスに含めた。
【０４７９】
5.  エクソン連結：配列を確証するために、本発明で同定したNOV X標的配列を用いてエクソン連結プロセスを行った。PCRプライマーは、フォワードプライマーについては入手可能な最も上流の配列で、そしてリバースプライマーについては入手可能な最も下流の配列で開始するように設計した。それぞれの場合について、唯一または高度に選択的のいずれかである適切な配列に遭遇するまで、またはリバースプライマーの場合には終止コドンに達するまで、各末端からコード配列へ向かって内向きに進みながら配列を試験した。このようなプライマーは、全長cDNA、DNAの一部（1つもしくは2つ以上のエクソン）もしくは標的配列のタンパク質配列についてはコンピューターでの予測に基づいて、または他種に由来するの密接に関連するヒト配列については、予測されるエクソンの翻訳物の相同性に基づいて設計した。
【０４８０】
その後、これらのプライマーを以下のヒトcDNAのプールに基づいたPCR増幅に使用した：副腎、骨髄、脳−小脳扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎、胎児肝、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Raji細胞、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮、骨髄、肝臓、リンパ腫。通常は、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングし、高い冗長性へ配列決定した。エクソン連結から誘導したPCR産物をInvitrogen製のpCR2.1ベクター中にクローニングした。得られた細菌クローンは、pCR2.1ベクター中にクローニングした全オープンリーディングフレームを含むインサートを有している。得られた全てのクローン由来の配列を集め、これには、CuraGen Corporationのデータベース中の他のフラグメントおよび公共ESTsを含めた。フラグメントおよびESTsを、センブリの他の構成要素とのそれらの同一性の程度が50bpにわたり少なくとも95%である場合に、アセンブリのための構成要素として含めた。さらに、配列解析トレースを手作業により評価し、適切な場合は補正のために手を加えた。これらの方法により、ここに報告した配列を得る。
【０４８１】
6.  物理的クローン：エクソンを相同性により予測し、イントロン/エクソン境界を標準的な遺伝学的規則を使用して決定した。エクソンをさらに、複数のBLAST（例えば、tBlastN、BlastX、およびBlastN）検索、そして場合によってはGeneScanおよびGrailを使用した類似性決定手段により選択しそして精度を高めた。さらに遺伝子配列の定義および完成のために有効である場合は、公共データベースおよび専有データベースの両方いより公表されている配列もまた加えた。次いで、DNA配列を明白な不一致について手作業により修正し、それにより全長タンパク質をコードする配列を得る。
【０４８２】
エクソン連結により誘導した全オープンリーディングフレームを含むPCR産物を、発現およびスクリーニングの目的のために使用するクローンを得るためにInvitrogen製のpCR2.1ベクター中にクローニングした。
【０４８３】
CG 110725-01（17-290 aa）の分子クローニング
NOV11aの残基17〜290のCG 110725-01の成熟形態のcDNAコードをPCRによる「インフレーム」クローニングの標的とした。PCRテンプレートは、以前に同定したプラスミドに基づいた。
【０４８４】
表BAのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標的cDNA配列をクローニングした。
【０４８５】
【表２０１】
2005519629.tif 000202
【０４８６】
下流をクローニングするために、フォワードプライマーにはインフレームのBamHI制限酵素認識部位を含め、リバースプライマーにはインフレームのXhoI制限酵素認識部位を含めた。
【０４８７】
テンプレートとしてのFIS：各反応のためのテンプレートとして計0.5〜1.0ngのヒトのプールされたcDNAを使用して2つの平行して行うPCR反応をセットアップした。プールは、以下のヒト組織cDNAの各5マイクログラムから構成する：副腎、脳全体、扁桃、小脳、視床、骨髄、胎児脳、胎児腎、胎児肝、胎児肺、心臓、腎臓、肝臓、リンパ腫、Burkitt型Raji細胞株、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、甲状腺、気管、子宮。発現組織が既知で入手可能である場合は、上記のプライマーおよび0.5〜1.0ngの下記のヒト組織cDNAの1つを使用して第2回目のPCRを行った：骨格筋、精巣、乳腺、副腎、卵巣、結腸、正常小脳、正常脂肪、正常皮膚、骨髄、脳−小脳扁桃、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、甲状腺、胎児肺、胎児肝、胎児脳、腎臓、心臓、脾臓、子宮、下垂体、リンパ節、唾液腺、小腸、前立腺、胎盤、脊髄、末梢血、気管、胃、膵臓、海馬。
【０４８８】
2つのPCR反応を、CG 110725-01のインサートを含有する計1〜5ngのプラスミドを使用してセットアップした。反応混合液は、50μLの反応液容量中に各2μLのプライマー（最初の濃度：5pmol/μL）、1μLの10mM dNTP（Clontech Laboratories, Palo Alto CA）および1μLの50×Advantage-HF 2ポリメラーゼ（Clontech Laboratories）含有している。以下の反応条件を使用する：
PCR条件1：
a）96℃  3分間
b）96℃  30秒間の変性
c）96℃  30秒間のプライマーのアニーリング
d）72℃  6分間の伸長
b〜dのステップを15回繰り返す
e）96℃  15秒間の変性
f）60℃  30秒間のプライマーのアニーリング
g）72℃  6分間の伸長
e〜gのステップを29回繰り返す
e）72℃  10分間の最後の伸長
PCR条件2：
a）96℃  3分間
b）96℃  15秒間の変性
c）76℃  30秒間のプライマーのアニーリング、温度を1サイクルにつき1度ずつ下げる
d）72℃  4分間の伸長
b〜dのステップを34回繰り返す
e）72℃  10分間の最後の伸長
【０４８９】
増幅産物を、アガロースゲル電気泳動法により検出した。フラグメントを、製造業者の推奨にしたがってゲル精製し、pCR2.1ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に連結させた。1つのPCR反応物につき12個のクローンを取り出して配列決定した。これらのインサートを、ベクター特異的M13フォワードプライマーおよびM13リバースプライマー、および表BBに示す遺伝子特異的プライマーを使用して配列決定した。
【０４９０】
【表２０２】
2005519629.tif 000203
【０４９１】
引き続いてこのインサートを、制限酵素認識部位BamHIおよびXhoIを用いた消化/連結（ligation）により発現ベクターpMel-V5-HisおよびpCEP4-Sec（CuraGen Corporation）中にクローニングした。
【０４９２】
インサート・アセンブリ209934449は、CG 110725-01の標的配列の残基17〜290の間にオープンリーディングフレームをコードすることが見いだした。クローニングしたインサートは、もとのアミノ酸配列と100%同一である。CG 110725-01とのアライメントは、下記のCLUSTAL W(1.7)マルチプル配列アライメントに表示す。異なるアミノ酸は白色もしくはグレーのバックグラウンドを与えて示し、そして欠失/挿入アミノ酸はコードしていない配列中の位置を点線によって明らかにすることができることに留意されたい。インサート・アセンブリ209934449の最初2つのアミノ酸および最後2つのアミノ酸はこれらのプライマーによってコードされている。
【０４９３】
CG 115187-01の分子クローニング：新規のヒト膜貫通型タンパク質
NOV18aの残基247〜349に由来するCG 115187-01の部分的なORFのcDNAコードをPCRによる「インフレーム」クローニングの標的とした。PCRテンプレートは、入手できるときは以前に同定したプラスミドに、またはヒトcDNA(s)に基づいた。
【０４９４】
表BC内のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標的cDNA配列をクローニングした。
【０４９５】
【表２０３】
2005519629.tif 000204
【０４９６】
下流をクローニングするために、フォワードプライマーにはインフレームのBamHI制限酵素認識部位を含ませ、リバースプライマーにはインフレームのXhoI制限酵素認識部位を含める。
【０４９７】
反応混合液は、50μLの反応液容量中に各2μLのプライマー（最初の濃度：5pmol/μL）、1μLの10mM dNTP（Clontech Laboratories, Palo Alto CA）および1μLのPfu DNAポリメラーゼ（Strategene）含有している。条件は、上記に記載したPCR条件1およびPCR条件2を使用した。
【０４９８】
増幅産物を、アガロースゲル電気泳動法により検出した。フラグメントを、製造業者の推奨にしたがってゲル精製し、pCR2.1 TOPOベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に連結させた。1つのPCR反応物につき12個のクローンを取り出して配列決定した。インサートを、ベクター特異的M13フォワードプライマーおよびM13リバースプライマーを使用して配列決定した。
【０４９９】
インサート・アセンブリ257788219は、CG 115187-01の標的配列の残基247〜349の間にオープンリーディングフレームをコードすることを見いだした。クローニングしたインサートは、もとの配列と100%同一である。CG 115187-01とのアライメントを下記のCLUSTAL Wに表示す。異なるアミノ酸は白色もしくはグレーのバックグラウンドを与えて示し、そして点線は欠失もしくは挿入アミノ酸を示すことに留意されたい。アセンブリORFの末端の追加のアミノ酸は、増幅プライマー内に含ませた制限酵素部位によってコードされる。
【０５００】
CG 110725-04タンパク質のクローニングおよび発現
哺乳動物発現ベクターpCEP4-Secの構築。
pcDNA3.1-V5His（Invitrogen, Carlsbad, CA）発現ベクター由来のフラグメントを増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマー、ｐSec-V5-His ForwardおよびpSpec-V5-His Reverseを設計した。オリゴヌクレオチドプライマーを表BDに示す。PCR産物を、XhoIおよびApaIで消化し、XhoI/ApaIで消化したpSecTag2 Bベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に連結する。得られたベクターであるpSpecV5Hisの正確な構造を、DNA配列解析によって確認する。ベクターpSpecV5HisをPmeIおよびNheIで消化し、PmeI-NheIフラグメントをBamHI/KlenowとNheIで処理したベクターｐCEP4（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に連結する。得られたベクターをpCEP4/Secと名付けた。
【０５０１】
【表２０４】
2005519629.tif 000205
【０５０２】
ヒト胚性腎293細胞中のCG 110725-04の発現
CG 110725-04配列を含有する0.8kbのBamHI-XhoIフラグメントをBamHI-XhoIで消化したpCEP4/Sec中にサブクローニングしてプラスミド1323を得る。得られたプラスミド1323を、製造業者（Gibco/BRL）の推奨にしたがってLipofectaminePlus試薬を使用して293細胞中にトランスフェクトする。細胞ペレットおよび上清をトランスフェクションの72時間後に回収し、そして抗V5抗体を使用するWesternブロット（還元条件）によりCG 110725-04発現について試験した。表BEは、CG 110725-04が293細胞によって分泌された35kDaタンパク質として発現されることを示している。いくらか分子量が大きいバンドもまた視認できるが、これはこのタンパク質の非還元形態を表している可能性がある。
【０５０３】
【表２０５】
2005519629.tif 000206
【０５０４】
実施例Ｃ
種々の細胞および組織中でのクローンの定量的発現解析
種々のクローンの定量的発現を、実時間定量的PCR（RTQ-PCR）を使用して、多様な正常および病変由来細胞、細胞株および組織由来のRNAサンプルを含有するマイクロタイタープレートを用いて評価する。RTQ-PCRは、Applied Biosystems製ABI PRISM（登録商標）7700またはABI PRISM（登録商標）7900 HT Sequence Detection Systemで行った。プレート上にサンプルの種々のコレクションを集め、パネル1（正常組織および癌細胞株を含有する）、パネル2（正常および癌の検体由来の組織から誘導したサンプルを含有する）、パネル3（癌細胞株を含有する）、パネル4（正常組織由来の細胞および細胞株ならびに炎症状態に関連する細胞を含有する）、パネル5D/5I（代謝性疾患に重点を置いたヒト組織および細胞株を含有する）、AI_包括的_パネル（正常組織および自己免疫疾患/自己炎症性疾患からのサンプルを含有する）、パネルCNSD.01（正常な脳および疾患脳由来のサンプルを含有する）およびCNS_神経変性_パネル（正常な脳およびアルツハイマー病（Alzheimer's disease）に罹患した脳由来のサンプルを含有する）する。
【０５０５】
全てのサンプルに由来するRNA完全性を、ガイドとして28Sおよび18SリボソームRNA染色強度比（2:1〜2.5:1  28s:18s）を使用したアガロースゲル電気泳動図の目視評価および変性産物の指標である低分子量RNAsが存在しないことによって品質を管理する。サンプルは、1つのエクソンの範囲の全域を増幅するように設計したプローブ-プライマーセットを使用して、逆転写酵素を含まずに行ったRTQ-PCR反応によりゲノムDNA汚染について管理する。
【０５０６】
最初に、RNAサンプルは、例えば恒常的に発現される遺伝子（例えば、p-アクチンおよびGAPDH）のような参照核酸に対して標準化する。標準化したRNA（5μL）をcDNAへ転換させ、製造業者の取扱説明書にしたがって、One Step RT-PCR Master Mix Reagents（Applied Biosystems; Catalog No. 4309169）および遺伝子特異的プライマーを使用して、RTQ-PCRによって解析する。
【０５０７】
他の場合には、標準化していないRNAサンプルを、製造業者の取扱説明書にしたがって、Superscript II（Invitrogen Corporation; Catalog No. 18064-147）およびランダムヘキサマーを使用して一本鎖ｃDNA（sscDNA）へ転換させた。10μgまでの全RNAを含有する反応を、20μLの容量で実施し、42℃で60分間インキュベートする。この反応は、最終容量100μL中50μgの全RNAまでスケールアップすることができる。次いで、sscDNAサンプルを、製造業者の取扱説明書にしたがって、1X TaqMan（登録商標）Universal Master mix（Applied Biosyslems; catalog No. 4324020）を使用して、先に記載したように参照核酸に対して標準化する。
【０５０８】
プローブおよびプライマーを、インプットとして標的配列を使用するApplied Biosystems Primer Express Softwareパッケージ（Apple Computer's Macintosh Power PC用のバージョン1）または同様のアルゴリズムにしたがってそれぞれのアッセイについて設計する。反応条件についてはデフォルト設定を使用し、プライマーを選択する前に以下のパラメータを設定する：プライマー濃度=250nM、プライマー融解温度（Tm）範囲=58℃〜60℃、プライマー最適Tm=59℃、最大プライマー差=2℃、プローブは5'Gを有しておらず、プローブのTmはプライマーのTmより10℃高くなければならず、アンプリコンの大きさは75bp〜100bpである。選択したプローブおよびプライマー（下記参照）は、Synthegen（Houston, TX, USA）によって合成する。プローブは、HPLCにより二重精製して結合していない色素を除去し、プローブのそれぞれ々5'および3'末端へのレポーターおよびクエンチャー色素の結合を確認するために質量分析法により評価する。それらの最終濃度は以下の通りである：フォワードプライマーおよびリバースプライマーはそれぞれ900nM、そしてプローブは200nM。
【０５０９】
PCR条件：RNAサンプルを用いて作業をするときは、各組織および各細胞株由来の標準化したRNAを96ウェルまたは384ウェルPCRプレート（Applied Biosystems）のいずれかの各ウェル内にスポットする。PCR混合物は、単一遺伝子特異的プローブとプライマーセット、または2つの多重プローブとプライマーセット（標的クローンに特異的なセットおよび標的プローブと多重化された別の遺伝子特異的セット）のいずれかを含む。PCR反応は、製造業者の取扱説明書にしたがって、TaqMan（登録商標）One-Step RT-PCR Master Mix （Applied Biosystems, 製品番号4313803）を使用してセットアップする。逆転写を48℃で30分間行い、その後に以下のように増幅/PCRサイクルを行った：95℃で10分間、その後に95℃で15秒間、60℃で1分間の40サイクル。結果は、所定のサンプルとデルタCTの出力に対して2で表される最も低いCT値を持つサンプルとの間のRNA濃度の差とともに、対数スケールを使用してCT値（所定サンプルが蛍光の閾値レベルを越えるサイクル）として記録する。次いで、このRNA差の逆数を取ってこれに100を掛けることによって相対発現率を得る。
【０５１０】
sscDNAサンプルを用いて作業をするときは、RNAサンプルについて先に記載したように標準化したsscDNAを使用する。1もしくは2セットのプローブおよびプライマーを含有するPCR反応は、製造業者の取扱説明書にしたがって、1X TaqMan（登録商標）Universal Master mix（Applied Biosystems; catalog No. 4324020）を使用して、先に記載したようにセットアップする。PCR増幅は以下のように行った：95℃で10分間、その後に95℃で15秒間、60℃で1分間の40サイクル。結果は、先に記載したように解析しそして処理する。
【０５１１】
パネル1、1.1、1.2、および1.3D
パネル1、1.1、1.2および1.3Dのプレートは、2個の対照ウェル（ゲノムDNA対照および化学対照）と種々のサンプル由来のcDNAを含有する94個のウェルを含む。これらのパネル中のサンプルは、2つのクラスに分けられる：培養細胞株から誘導したサンプルおよび初代正常組織から誘導したサンプル。細胞株は、以下のタイプの癌から誘導する：肺癌（lung cancer）、乳癌（breast cancer）、黒色腫（melanoma）、結腸癌（colon cancer）、前立腺癌（prostate cancer）、CNS癌（CNS cancer）、扁平上皮癌（squamous cell cancer）、卵巣癌（ovarian cancer）、肝臓癌（liver cancer）、腎臓癌（renal cancer）、胃癌（gastric cancer）および膵臓癌（pancreatic cancer）。これらのパネルに使用した細胞株は、培養細胞株の寄託機関であるAmerican Type Culture Collection（ATCC）を通して幅広く入手することができ、そしてこれらをATCCが推奨する条件を使用して培養する。これらのパネル上で見いだした正常組織は、単一の成人もしくは胎児に由来する全主要器官系から誘導するサンプルから構成される。これらのサンプルは、以下の器官から誘導する：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
【０５１２】
パネル1、1.1、1.2および1.3Dについての結果では、以下の略語を使用する：
ca.=癌腫（carcinoma）
*=転移により確定された、
met=転移、
s cell var=小細胞変異体、
non-s=non-sm=非小、
squam=扁平、
pl. eff=pl effusion=胸郭浸出液、
glio=神経膠腫（glioma）
astro=星細胞腫（astrocytoma）
neuro=神経芽細胞腫（neuroblastoma）
【０５１３】
一般_スクリーニング_パネル_vl.4、vl.5およびvl.6
パネル1.4、v1.5およびv1.6のプレートは、2個の対照ウェル（ゲノムDNA対照および化学対照）と種々のサンプル由来のcDNAを含有する94個のウェルを含む。パネル1.4、v1.5およびv1.6中のサンプルは、2つのクラスに分けられる：培養細胞株から誘導するサンプルおよび初代正常組織から誘導するサンプル。細胞株は、以下のタイプの癌から誘導する：肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、CNS癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。パネル1.4、v1.5およびv1.6に使用した細胞株は、培養細胞株の寄託機関であるAmerican Type Culture Collection（ATCC）を通して広い範囲で入手することができ、そしてこれらをATCCが推奨する条件を使用して培養した。パネル1.4、v1.5およびv1.6上で見いだした正常組織は、2〜5人の異なる成人もしくは胎児からの全主要器官系から誘導したサンプルのプールから構成する。これらのサンプルは、以下の器官から誘導する：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。略語は、パネル1、1.1、1.2、および1.3Dについて記載した通りである。
【０５１４】
パネル2D、2.2、2.3、および2.4
パネル2D、2.2、2.3および2.4のプレートは一般に、2個の対照ウェルと、National Cancer Institute's Cooperative Human Tissue Network（CHIN）またはNational Disease Research Initiative（NDRI）との緊密な連携における外科手術によって得られたヒト組織から、あるいはArdaisもしくはClinomicsから単離したRNAまたはｃDNAから構成される94個の試験サンプル含有している。組織を、ヒト悪性腫瘍から誘導し、そして示す多数の悪性腫瘍組織が「適合辺縁（matched margins）」を有する場合には腫瘍に直接隣接する非癌性組織から得る。これらを正常隣接組織と呼び、下記の結果には「NAT」と示す。腫瘍組織および「適合辺縁」を、2人の無関係の病理学者（外科病理学者およびNDRI/CHTN/Ardais/Clinomicsの病理学者）によって評価した。悪性腫瘍の見られない組織（正常組織）由来の非適合RNAサンプルもまたArdaisもしくはClinomicsから入手した。この解析により、腫瘍分化度の大まかな組織病理学的評価を得る。さらに、大多数のサンプルには、患者の臨床病期に関する情報を提供する最初の外科病理学報告が含まれている。これらの適合辺縁を、手術ゾーンの周辺（すなわち、すぐ近位にある）組織から採取した（表RRでは、正常隣接組織を「NAT」と表示する）。さらに、RNAおよびcDNAサンプルは高齢者もしくは事故の被害者（交通事故等）について行った剖検により得る種々のヒト組織から入手した。これらの組織について、疾患がないことを確認し、例えばClontech（Palo Alto, CA）、Research GeneticsおよびInvitrogenのような種々の商業的入手源から購入した。一般的な腫瘍学スクリーニングパネル_v_2.4はパネル2Dの更新版である。
【０５１５】
HASSパネルv1.0
HASSパネルv1.0プレートには、93個のｃDNAサンプルと2個の対照を含む。詳細には、これらのサンプルのうち81個は、種々の期間にわたって血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素状態にした培養ヒト癌細胞株ならびにこれらの処理についての対照から誘導し、3個のサンプルはヒト初代細胞、9個のサンプルは悪性脳腫瘍（brain cancer）（4例の骨芽細胞種（medulloblastoma）および5例の膠芽細胞腫（glioblastoma））から誘導し、そして2個のサンプルは対照を構成する。ヒト癌細胞株は、ATCC（American Type Culture Collection）から入手し、これらは以下の組織群に分類される：乳癌、前立腺癌、膀胱癌（bladder cancer）、膵臓癌およびCNS癌細胞株。これらの癌細胞の全てを、標準的な推奨される条件下で培養した。処理（血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素）は、科学文献に以前に公表されたものを使用した。初代ヒト細胞は、Clonetics（Walkersville, MD）から入手し、Cloneticsが推奨する培地および条件で増殖させる。悪性脳腫瘍サンプルは共同研究（Henry Ford Cancer Center）の一部として入手し、CuraGenがサンプルを受領する前に病理学者に評価させた。RNAを、標準方法を使用してこれらのサンプルから調製した。ゲノムおよび化学対照ウェルについては、先に記載した。
【０５１６】
パネル3Dおよび3.1
パネル3Dおよび3.1のプレートは、94個のｃDNAサンプルと2個の対照サンプルから構成する。詳細には、これらのサンプルのうち92個は培養ヒト癌細胞株、2サンプルはヒト初代小脳組織から誘導し、2個は対照サンプルである。ヒト細胞株は、一般にATCC（American Type Culture Collection）、NCIもしくはドイツ腫瘍細胞バンクから入手した、これらは以下の組織群に分類される：舌の扁平上皮細胞癌（squamou cell carcinoma）、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌（epidermoid carcinoma）、肉腫（sarcoma）、膀胱癌、膵臓癌、腎臓癌、白血病（leukemias）/リンパ腫（lymphomas）、卵巣/子宮/子宮頸部癌（cervical cancer）、胃癌（gastric cancer）、肺癌およびCNS癌細胞株。さらに、小脳の2個の無関係なサンプルがある。これらの細胞の全部を標準的な推奨される条件下で培養し、標準的な方法を使用してRNAを抽出した。パネル3Dおよび1.3Dの細胞株は、科学文献において使用される最も一般的な細胞株である。腫瘍学_細胞_株_スクリーニング_パネル_v3.2は、パネル3の更新版である。パネル3D、3.1、1.3Dおよび腫瘍学_細胞_系_スクリーニング_パネル_v3.2の細胞株は、科学文献において使用される最も一般的な細胞株である。
【０５１７】
パネル4D、4R、および4.1D
パネル4は、炎症性状態に関連する種々のヒト細胞株または組織から単離したRNA（パネル4R）もしくはｃDNA（パネル4D/4.1D）から構成される96ウェルプレート（2個の対照ウェル、94個の試験サンプル）上にサンプルを含む。例えば結腸および肺（Stratagene, La Jolla, CA）ならびに胸腺および腎臓（Clontech）のような対照正常組織由来の全RNAを使用した。肝硬変（cirrhosis）患者の肝臓組織および狼瘡（lupus）患者の腎臓由来の全RNAは、BioChain（Biochain Institute, Inc., Hayward, CA）から入手した。クローン病（Crohn's disease）および潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis）と診断された患者からRNAを調製するための腸組織を、National Disease Research Interchange（NDRI）（Philadelphia, PA）から入手した。
【０５１８】
星状膠細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠動脈平滑筋細胞、末梢気道上皮、気管支上皮、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞はすべてClonetics（Walkersville, MD）から購入し、Cloneticsにより供給されるこれらの細胞タイプ用の培地中で増殖させる。これらの初代細胞タイプを、示すように、6および/または12〜14時間にわたり種々のサイトカインもしくはサイトカインの組み合わせを用いて活性化した。以下のサイトカインを使用した；約1〜5ng/mLのIL-1β、約5〜10ng/mLのTNFα、約20〜50ng/mLのIFNγ、約5〜10ng/mLのIL-4、約5〜10ng/mLのIL-9、約5〜10ng/mLのIL-13。場合によっては、内皮細胞を、0.1%血清を含むCloneticsによる基本培地中での培養によって種々の期間にわたり飢餓させた。
【０５１９】
単核細胞は、Ficollを使用して、CuraGen Corporationの従業員の血液から調製した。LAK細胞を、5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco/Life Technologies, Rockville, MD）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、および10mMのHepes（Gibco）およびインターロイキン2を含むDMEM中での4〜6日間の培養によってこれらの細胞から調製した。次いで、細胞を10〜20ng/mLのPMAおよび1〜2μg/mLのイオノマイシン、5〜10ng/mLのIL-12、20〜50ng/mLのIFNγおよび5〜10ng/mLのIL-18のいずれかを用いて6時間にわたって活性化させた。場合によっては、単核細胞を5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、および約5μg/mLのPHA（フィトヘマグルチニン）もしくはPWN（ヤマゴボウ有糸分裂促進物質）を含む10mMのHepes（Gibco）を含むDMEM中で4〜5日間培養した。RNAの調製のために、サンプルを24、48および72時間後に採取した。MLR（混合リンパ球反応）サンプルを2人のドナーから採取によって得、Ficollを用いて単核細胞を単離し、そして単離した単核細胞を、5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5×10-5M）（Gibco）、および約10mMのHepes（Gibco）を含むDMEM中で約2×106cells/mLの最終濃度となるように1：1で混合した。MLRを培養し、RNA調製のために、1〜7日の範囲内の種々の時点でサンプルを採取した。
【０５２０】
単球は、製造業者の取扱説明書にしたがって、CD14 Miltenyi Beads、+ve VS選択カラムとVario Magnetを使用して単核細胞から単離した。単球は5% ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone, Logan, UT）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、および10mMのHepes（Gibco）、50ng/mLのGM CSFおよび5ng/mLのIL-4を含むDMEM中での5〜7日間の培養によって樹状細胞へ分化させた。マクロファージは5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、10mMのHepes（Gibco）および約50ng/mLで10%のABヒト血清もしくはMCSFを含むDMEM中で単球を5〜7日間培養することにより調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞は、リポ多糖（LPS）を100ng/mLで用いて6および12〜14時間にわたり刺激した。樹状細胞をさらに、10μg/mLの抗CD40モノクローナル抗体（Pharmingen）で6および12〜14時間刺激した。
【０５２１】
CD4リンパ球、CD8リンパ球およびNK細胞はまた、製造業者の取扱説明書にしたがって、CD4、CD8およびCD56 Miltenyiビーズ、陽性VS選択カラムとVario Magnetを使用して単核細胞から単離した。CD45RAおよびCD45RO CD4リンパ球は、CD8、CD56、CD14およびCD19 Miltenyiビーズおよびポジティブ選択を使用して、CD8、CD56、CD14およびCD19細胞の単核球細胞を枯渇させることによって単離した。次いで、CD45ROビーズを使用してCD45RO CD4リンパ球を単離すると、残った細胞はCD45RA CD4リンパ球である。CD45RA CD4、CD45RO CD4およびCD8リンパ球を、5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、および10mMのHepes（Gibco）を含有するDMEM中に入れ、PBS中の0.5μg/mLの抗CD28（Pharmingen）および3μg/mLの抗CD3（OKT3、ATCC）で一晩かけてコーティングしておいたFalcon 6ウェル組織培養皿上に106cells/mLでプレーティングした。RNAを調製するために、細胞を6および24時間後に採取した。慢性的に活性化されたCDSリンパ球を調製するために、本発明者らは単離したCDSリンパ球を抗CD28および抗CD3をコーティングプレート上で4日間活性化し、その後細胞を採取して、5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、および10mMのHepes（Gibco）およびIL-2を含有するDMEM中でそれらを拡大させた。次いで、拡大させたCDS細胞を、プレートに結合させた抗CD3および抗CD28とともに再度4日間活性化させ、以前と同様に拡大させた。RNAを、第2回目の活性化の6および24時間後、および第2回目の拡大培養の4日後に単離した。単離したNK細胞を、RNAを調製する前に、5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、および10mMのHepes（Gibco）およびIL-2を含むDMEM中で4〜6日間培養した。
【０５２２】
B細胞を得るために、扁桃をNDRIから調達した。扁桃を滅菌した解剖用鋏で切断し、その後ふるいにかけた。次いで、扁桃細胞を遠沈させて、5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、および10mMのHepes（Gibco）を含むDMEM中に106cells/mLで再懸濁した。これらの細胞を活性化するため、本発明者らは5μg/mLのPWNもしくは約10μg/mLの抗CD40（Pharmingen）と、5〜10ng/mLのIL-4を使用した。細胞を、RNAを調製するために24、48および72時間後に採取した。
【０５２３】
初代および二次Th1/Th2およびTrl細胞を調製するために、6ウェルのFalconプレートを10μg/mLの抗CD28（Pharmingen）および2μg/mLのOKT3（ATCC）で一晩コーティングし、その後PBSで2回洗浄した。臍帯血CD4リンパ球（Poietic Systems, German Town, MD）を、5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、10mMのHepes（Gibco）およびIL-2（4ng/mL）を含むDMEM中に105〜106cells/mLで培養した。Th1に向かわせるためにはIL-12（5ng/mL）および抗IL4（1μg）を使用し、Th2に向かわせるためにはIL-4（5ng/mL）および抗IFNγ（1μg/mL）を使用し、Trlに向かわせるためには5ng/mLのIL-10を使用した。4〜5日後、活性化したTh1、Th2およびTrlリンパ球をDMEM中で1回洗浄し、そして5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、10mMのHepes（Gibco）およびIL-2（1ng/mL）を含むDMEM中で4〜7日間拡大させた。この後、活性化したTh1、Th2およびTrlリンパ球を、上記に記載したように、ただしアポトーシス（細胞死）を防止するために抗CD95L（1μg/mL）を添加して、抗CD28/OKT3およびサイトカインとともに5日間再刺激した。4〜5日後に、Th1、Th2およびTrlリンパ球を洗浄し、その後IL-2を用いて4〜7日間にわたって再度拡大させた。活性化したTh1およびTh2リンパ球は、最大で3サイクルにわたりこの方法で維持した。RNAを、抗CD3および抗CD28 mAbsを結合させたプレートでの第2回目および第3回目の活性化の6および24時間後、およびインターロイキン2中での第2回目および第3回目の拡大培養の4日後に初代および二次Thl、Th2およびTrlから調製した。
【０５２４】
以下の白血球細胞株はATCCから入手した：Ramos、EOL-1、KU-812。EOL細胞については、3日毎に培地を取り替え、そして細胞濃度を5×105cells/mLに調整しながら、5×105cells/mLで0.1mM dbcAMP中での8日間の培養によって分化させた。これらの細胞を培養するために、本発明者らは5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、10mMのHepes（Gibco）を添加したDMEMもしくはRPMI（ATCCによって推奨されるように）を使用した。RNAは、休止細胞または10ng/mLのPMAおよび1μg/mLのイオノマイシンで6および14時間活性化した細胞のいずれかから調製した。角化細胞株CCD106および気道上皮性腫瘍株NCI-H292もまたATCCから入手した。いずれも、5%のFCS（Hyclone）、100μMの非必須アミノ酸（Gibco）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5×10-5M（Gibco）、および10mMのHepes（Gibco）を含むDMEM中で培養した。CCD1106細胞は、適切な5ng/mLのTNFαおよび1ng/mLのIL-1βで6および14時間活性化し、NCI-H292細胞は以下のサイトカインで6および14時間活性化した5ng/mlのIL-4、5ng/mlのIL-9、5ng/mlのIL-13および25ng/mlのIFNγ。
【０５２５】
これらの細胞株および血液細胞については、RNAはTrizol（Gibco BRL製）を使用して約107個細胞/mLを溶解させることによって調製した。簡潔には、1/10容量のブロモクロロプロパン（Molecular Research Corporation）をRNAサンプルに添加し、ボルテックスし、室温で10分間の後、試験管をSorvall SS34ローター内で14,000rpmで回転させた。水相を除去し、15mLのFalconチューブに入れた。等量のイソプロパノールを加え、-20℃で一晩放置した。沈殿したRNAをSorvall SS34ローター内で9,000rpm、15分間遠沈させ、70%エタノールで洗浄した。ペレットを300μLのRNAseを含まない水および35μLの緩衝液（Promega）中に再溶解させ、5μLのDTT、7μLのRNAsinおよび8μLのDNAseを加えた。チューブを、混入しているゲノムDNAを除去するために37℃で30分間インキュベートし、フェノールクロロホルムで1回抽出し、1/10容量の3Mの酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノールで再度沈殿させた。RNAを遠沈させ、RNAseを含まない水に入れた。RNAは-80℃で保存した。
【０５２６】
AI_包括的パネル_v1.0
AI_包括的パネル_v1.0のプレートには、2個の対照ウェルと、Backus HospitalおよびClinomics（Frederick, MD）から入手した外科および死後ヒト組織から単離したcDNAから構成される89個の試験サンプルが含まれる。全RNAを、CuraGenの施設内のBackus Hospitalによる組織サンプルから抽出した。他の組織由来の全RNAを、Clinomicsから入手した。
【０５２７】
滑液、滑膜、骨および軟骨を含む関節組織は、Backus Hospitalで膝関節全置換術または股関節全置換術を受けた患者から得る。組織サンプルを、単離したRNAが最高品質の物で分解しないことを確実にするために液体窒素中で直ちに急速凍結した。変形性関節症（osteoarthritis）および関節リウマチ（rheumatoid arthritis）の関節組織のさらなるサンプルをClinomicsから入手した。正常な対照組織はClinomicsから供給され、そして事故の被害者の剖検により入手した。
【０５２８】
乾癬（psoriatic）組織および隣接している適合組織の外科標本を、Clinomicsから全RNAとして得る。年齢が25〜47歳の男性患者2人および女性患者2人を選択した。サンプルを単離した時点では、患者は処方箋を投与されていなかった。
【０５２９】
潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis）およびクローン病（Crohn's disease）の患者に由来する罹患した結腸および隣接している適合組織の外科標本を、Clinomicsから得る。年齢41〜69歳の女性3人および男性3人のクローン病患者に由来する腸組織を使用した。2人の患者は処方箋投薬を受けていなかったが、他の患者はデキサメタゾン、フェノバルビタール、またはタイレノールを投与される。潰瘍性大腸炎組織は男性患者3人および女性患者4人からのものである。患者のうち4人はレブビドを投与されており、2人はフェノバルビタールを投与される。
【０５３０】
疾患を有していない事故の被害者、または肺気腫（emphysema）、喘息（asthma）もしくはCOPDの事故の被害者の死後肺組織由来の全RNAを、Clinomicsから購入した。肺気腫患者の年齢は40〜70歳の範囲であり、全員が喫煙者である。喫煙に関連する肺気腫の患者に焦点を当て、そしてα-1アンチトリプシン欠損症の患者を回避するために、この年齢範囲を選択した。喘息患者の年齢は36〜75歳の範囲であり、COPDも有している可能性がある患者を避けるために喫煙者を除外した。COPD患者の年齢は35〜80歳の範囲であり、喫煙者および非喫煙者の両方を含めた。大多数の患者が、コルチコステロイド剤および気管支拡張薬を摂取していた。
【０５３１】
Al_包括的パネル_v1.0パネルの組織を識別するために使用したラベルには、下記の略語を使用した：
AI=自己免疫性
Syn=滑液
Normal=明白な疾患なし
Rep22/Rep20=個別患者
RA=関節リウマチ
Backus=Backus Hospitalから
OA=変形性関節症
(SS)(BA)(MF)=個別患者
Adj=隣接している組織
Match control（マッチ対照）=隣接組織
-M=男性
-F=女性
COPD=慢性閉塞性肺疾患（Chronic obstructive pulmonary disease）
【０５３２】
パネル5Dおよび5I
パネル5Dおよび5Iのプレートには、2個の対照ウェルと、代謝性疾患に重点を置いたヒト組織および細胞株から単離した種々のcDNAが含まれる。代謝性組織は、妊娠糖尿病（Gestational Diabetes）試験に登録された患者から入手した。細胞はヒト間葉幹細胞からの脂肪細胞の分化における種々の段階で得る。ヒト膵島もまた入手した。
【０５３３】
妊娠糖尿病試験では、被験者は若齢（18〜40歳）の、ルーチン（待期的）帝王切開を受けた妊娠糖尿病であるおよび妊娠糖尿病ではない、他の点では健常な女性である。乳児の摘出後、外科的切開部を修復/閉鎖する際に、産科医はそれぞれの外科的レベルを閉じる際に露出させた代謝性組織の小さいサンプル（＜1cc）を採取した。生検材料を滅菌した生理食塩液中ですすぎ洗いし、水分を拭い取り、切除から5分間以内に急速冷凍した。この組織を液体窒素中で瞬間冷凍し、個別に滅菌のスクリュートップ・チューブ内に保存し、CuraGenへ輸送するため、またはCuraGenにより回収されるためにドライアイス上に保持した。目的とする代謝性組織には、子宮壁（平滑筋）、内臓脂肪、骨格筋（直筋）および皮下脂肪が含まれる。患者についての説明は以下の通りである：
患者2  糖尿病の中南米系アメリカ人、過体重、非インスリン依存性
患者7〜9  糖尿病ではない白人、肥満体（BMI＞30）
患者10  糖尿病の中南米系アメリカ人、過体重、インスリン依存性
患者11  糖尿病ではないアフリカ系アメリカ人、過体重
患者12  糖尿病の中南米系アメリカ人、インスリン依存性
【０５３４】
脂肪細胞分化は、2回しか行えなかったドナー3Uを除いて、Osirus（Clonetics/BioWhittakerの1部門）から入手したドナー造血前駆細胞中で3回ずつ誘発した。Cloneticsの化学者が、Mark F. Pittengerら, Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells Science Apr 2 1999:143-147の中に見ることができる公表されたプロトコルに基づいてCuraGenの間葉幹細胞（HuMSCs）を単離し、増殖させ、そして分化させた。Clinomicsは、mRNAの単離およびds cDNAの生成に適切なTrizol溶解液もしくは凍結ペレットを提供した。各ドナーについての一般的な説明は以下の通りである：
ドナー2および3  U：間葉幹細胞、未分化の脂肪
ドナー2および3  AM：脂肪、分化途中の脂肪
ドナー2および3  AD：脂肪、分化した脂肪
【０５３５】
ヒト癌細胞株を、大部分は、ATCC（American Type Culture Collection）、NCIもしくはドイツ腫瘍細胞バンクから入手し、これらは以下の組織群に分類される：近位曲尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝HepG2癌細胞、心臓の初代間質細胞、および副腎皮質腺腫細胞。これらの細胞の全てを、標準的な推奨される条件下で培養し、標準的な方法を使用してRNAを抽出した。全てのサンプルを、一本鎖cDNAを得るためにCuraGenで加工処理した。
【０５３６】
パネル5Iには、University of Miami School of MedicineのDiabetes Research Instituteから得る58歳の女性患者からの膵島を加えて、先に記載した全サンプルが含まれている。膵島組織を、パネル5Iに加えるために、外部の業者により全RNAへと処理し、CuraGenへ送った。
【０５３７】
5Dおよび5Iパネルの組織を識別するために使用したラベルには、下記の略語を使用した：
GO Adipose=大網脂肪
SK=骨格筋
UT=子宮
PL=胎盤
AD=分化した脂肪
AM=分化途中の脂肪
U=未分化の幹細胞
【０５３８】
パネル CNSD.01
パネルCNSD.01のプレートには、2個の対照ウェルと、Harvard Brain Tissue Resource Centerから入手した死後ヒト脳組織から単離したcDNAから構成される94個の試験サンプルが含まれる。脳は死後4〜24時間の間にドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者によって切片が作製され、-80℃の液体窒素蒸気中で冷凍された。明確な関連神経病理を有するという診断を確定するために、脳全体を切片とし、神経病理学者によって検査した。
【０５３９】
疾患の診断は、患者記録から取り出した。パネルには、以下の診断のそれぞれから2つの脳が含まれる：アルツハイマー病、パーキンソン病（Parkinson's disease）、ハンチントン病（Huntington's disease）、進行性核上性麻痺（Progressive Supernuclear Palsy）、うつ病（Depression）、および「正常対照」。これらの脳の各々において、以下の領域を表示す：帯状回、大脳側頭極、淡蒼球、黒質、ブロードマン野4（一次運動帯）、ブロードマン野7（頭頂皮質）、ブロードマン野9（前前頭皮質）、およびブロードマン野17（後頭皮質）。すべての場合に全ての脳領域を示すわけではない；例えば、ハンチントン病は一部には淡蒼球での神経変性を特徴とするので、確証されたハンチントン病症例からこの領域を入手するのは不可能である。同様に、パーキンソン病は黒質の変性を特徴とするので、この領域を入手するのはさらに困難である。正常対照脳を神経病理について検査さし、神経変性と一致する病理を何も有していないことを見いだした。
【０５４０】
CNSパネルの組織を識別するために使用したラベルには、下記の略語を使用した：
PSP=進行性核上性麻痺
Sub Nigra=黒質
Glob Palladus=淡蒼球
Temp Pole=大脳側頭極
Cing Gyr=帯状回
BA 4=ブロードマン野4
【０５４１】
パネルCNS_神経変性_V1.0
パネルCNS_神経変性_V1.0のプレートには、2個の対照ウェルと、Harvard Brain Tissue Resource Center（McLean Hospital）およびthe Human Brain and Spinal Fluid Resource Center（VA Greater Los Angeles Healthcare System）から入手した死後ヒト脳組織から単離したcDNAから構成される47個の試験サンプルが含まれる。脳は死後4〜24時間の間にドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者によって切片が作製され、-80℃の液体窒素蒸気中で冷凍された。明確な関連神経病理を有するという診断を確定するために、脳全体を切片とし、神経病理学者によって検査した。
【０５４２】
疾患診断は、患者記録から取り出した。このパネルには、アルツハイマー病（AD）患者に由来する6個の脳、および死亡前に痴呆の兆候を示さなかった「正常対照」に由来する8個の脳が含まれる。8個の正常対照脳は下記の2つのカテゴリーに分けられる：痴呆もアルツハイマー病様の病理も有していない対照（Controls）、および痴呆は有していないが重度アルツハイマー病様病理の証拠を有していない対照（特に0〜3のスケールのレベル3と評価された老人斑負荷；0=老人斑の証拠なし、3=重度のAD老人斑負荷）。これらの脳のそれぞれにおいて、下記の領域を表示す：海馬、側頭皮質（ブロードマン野21）、頭頂皮質（ブロードマン野7）、および後頭皮質（ブロードマン野17）。これらの領域を、ADでの全てのレベルの神経変性を含むように選択した。海馬は、ADにおいて初期にひどくニューロンが消失する領域である；側頭皮質は、ADにおいて海馬の後に神経変性を示すことが知られている；頭頂皮質はこの疾患の後期に中等度のニューロン死を示す；後頭皮質はADでは侵されないので、AD患者において「対照」領域として使用される。すべての場合に全ての脳領域を示すわけではない。
【０５４３】
CNS_神経変性_V1.0パネルの組織を識別するために使用したラベルには、下記の略語を使用した：
AD=アルツハイマー病の脳；患者は痴呆で、剖検時にAD様病理を示す
Control=対照脳；患者は、痴呆ではなく、神経病理を示していなかった
Control（Path）=対照脳；患者は、痴呆ではなかったが、重度のAD様病理を示していた
SupTemporal Ctx=上側頭皮質
Inf Temporal Ctx=下側頭皮質
【０５４４】
A.  CG 103191-02およびCG 103191-03：クロマグラニンA
全長の物理的クローンCG 103191-02およびCG 103191-03の発現を、表AAおよびABに記載したプライマー-プローブセットAg6794およびAg6785を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表ACに示す。Ag6794はCG 103191-02に特異的であり、そしてAg6785はCG 103191-03に特異的であることに注目されたい。
【０５４５】
【表２０６】
2005519629.tif 000207
【０５４６】
【表２０７】
2005519629.tif 000208
【０５４７】
【表２０８】
2005519629.tif 000209
【０５４８】
【表２０９】
2005519629.tif 000210
【０５４９】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag6794/Ag6785  CG 103191-02遺伝子を用いた1つの実験による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。
【０５５０】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag6794  CG 103191-02の最も高い発現は、副腎中で検出される（CT=31.6）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は下垂体、甲状腺、および大脳皮質や黒質を含む脳の一部の領域でも見られる。このため、この遺伝子によりコードされるタンパク質の治療による調節がアルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん（epilepsy）、多発性硬化症（multiple sclerosis）、精神分裂病（schizophrenia）およびうつ病を含む神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０５５１】
CG 103191-02は、クロマグラニンA（CgA）の1つの変異体をコードする。CgAは、神経内分泌系全体にわたって分泌小胞のコア内で見ることができる酸性の可溶性タンパク質であり、CgAは神経内分泌系から種々のアミンおよびペプチドホルモンならびに神経伝達因子一緒にエキソサイトーシス（細胞外排出）によって放出される（O'Connorら, 1994, Ann N Y Acad Sci 1994 Sep 15;733:36-45, PMID:7978886）。神経内分泌細胞の分泌顆粒はイノシトール1,4,5-三リン酸（InsP(3)）感受性Ca(2+)ストアであり、その中ではCa(2+)貯蔵タンパク質CGAが顆粒膜内に位置するInsP(3)ゲートCa(2+)チャネル（InsP(3)R）と結合する。この結合の機能的な局面を、CGAが存在する場合と存在しない場合について、遊離試験および平面脂質二重膜実験（planar lipid bilayer experiments）によって調べた。CGAは、チャネル開放確率を9倍、そして平均開放時間を12倍増加させることによってInsP(3)Rの遊離活性を劇的に増大させた。CGAが結合したInsP(3)Rは、結合していないレセプターよりも活性化に対してより敏感である。CGAによるこのInsP(3)Rチャネル活性の調節は、分泌顆粒による細胞内Ca(2+)濃度の制御に不可欠な構成部分であると思われ、小胞融合およびエキソサイトーシスの比率を調節する可能性がある（Thrower ECら, 2002, J Biol Chem 277:15801-6, PMID:11842082）。CgAから誘導されたペプチドホルモンであるパンクレアスタチンは、インスリン放出および外分泌性膵臓分泌物を負に調節することが証明されている（Schmidt WE, Creutzfeldt W, 1991, Acta Oncol 30(4):441-9, PMID:1854501）。このため、この遺伝子によりコードされるCgAタンパク質の治療による調節が神経疾患ならびに糖尿病（diabetes）および肥満症（obesity）を含む代謝性疾患の治療に有効である可能性がある。
【０５５２】
さらに、この遺伝子の有意な発現はCNS癌および3種の肺癌細胞株でも見られる。CgAは、極めて様々なペプチドを産生する内分泌性新生物によって発現され分泌されることが示されている：クロモ親和性細胞種（pheochromocytoma）、甲状腺腺腫（parathyroid adenoma）、甲状腺髄様癌（medullary thyroid carcinoma）、カルチノイド（carcinoids）、燕麦細胞性肺癌（oat-cell lung cancer）、膵島細胞腫瘍（pancreatic islet-cell tumors）、および大動脈体腫瘍（aortic-bodv tumor）（O'Connor and Deftos (1986, New Eng. J. Med. 314:1145-1151, PubMed ID:3007986）。このため、CG 103191-02遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するための診断マーカーとして使用することができ、そしてさらに、この遺伝子産物の治療による調節がこれらの癌の治療において有用である可能性がある。
【０５５３】
Ag6785  CG 103191-02遺伝子の発現は、このパネルのサンプルのすべてにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０５５４】
パネル4.1Dのまとめ：Ag6794/Ag6785  CG 103191-02遺伝子の発現は、このパネルのサンプルのすべてにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０５５５】
B.  CG 105757-01：KelchおよびBTB/POZドメインを含有している膜タンパク質
遺伝子CG 105757-01の発現を、表BAおよびBBに記載したプライマー-プローブセットAg4337およびAg372を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を表BC、BD、BEおよびBFに示す。
【０５５６】
【表２１０】
2005519629.tif 000211
【０５５７】
【表２１１】
2005519629.tif 000212
【０５５８】
【表２１２】
2005519629.tif 000213
【０５５９】
【表２１３】
2005519629.tif 000214
【０５６０】
【表２１４】
2005519629.tif 000215
【０５６１】
【表２１５】
2005519629.tif 000216
【０５６２】
【表２１６】
2005519629.tif 000217
【０５６３】
【表２１７】
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【０５６４】
【表２１８】
2005519629.tif 000219
【０５６５】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4337  このパネルにより、無関係な個体の群の脳での低レベルのCG 105757-01遺伝子の発現を確認する。しかし、この実験のアルツハイマー病に罹患した死後脳と痴呆ではない対照の死後脳との間では、この遺伝子の発現の差は検出されなかった。中枢神経系障害の治療におけるこの遺伝子の潜在的有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０５６６】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4337  この遺伝子の最も高い発現は、脳U-118-MG癌細胞株中で検出される（CT=26.4）。この遺伝子の高レベルから中レベルの発現は、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫および脳腫瘍から誘導された一群の癌細胞株の中でも見られる。したがって、この遺伝子の発現はこれらの癌の存在を検出するためのマーカーとして使用できる。さらにその上、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節が、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫および脳腫瘍の治療に有効である可能性がある。
【０５６７】
代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織の中では、この遺伝子は膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において高レベルから中レベルで発現される。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性がある。
【０５６８】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において高レベルで発現される。このため、この遺伝子産物の治療による調節が、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病のような中枢神経系疾患の治療に有効である可能性がある。
【０５６９】
パネル1のまとめ：Ag4337  この遺伝子の最も高い発現は、卵巣癌OVCAR-8細胞株中で検出される（CT=26.5）。この遺伝子の高レベルから中レベルは、肝臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫および脳腫瘍から誘導された一群の癌細胞株の中で見られる。さらに、高レベルから中レベルの発現は、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管を含む代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織内および扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において見られる。この遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０５７０】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4337  この遺伝子の最も高い発現は、TNF-αで処理した皮膚線維芽細胞中で検出される（CT=29）。この遺伝子は、健康な状態および疾患状態の免疫反応に重要である広範囲の細胞タイプにおいて高レベルから中レベルで発現される。これらの細胞には、T細胞、B細胞、内皮細胞、マクロファージ/単球、および末梢血単核球ファミリーのメンバーならびに肺および皮膚に由来する上皮細胞および線維芽細胞タイプ、さらには結腸、肺、胸腺および腎臓によって代表される正常組織が含まれる。この偏在性の発現パターンは、この遺伝子産物がこれらやその他の細胞タイプおよび組織についての恒常性プロセスに関係している可能性を示唆している。このパターンは、一般_スクリーニング_パネル_v1．4の発現プロファイルと一致しており、さらに細胞の生存性および増殖におけるこの遺伝子産物の役割を示唆している。このため、機能的治療薬でのこの遺伝子産物の調節は、これらの細胞タイプと関連する機能の変更をもたらし、例えば喘息（asthma）、アレルギー（allergies）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）、紅斑性狼瘡（lupus erythematosus）、乾癬（psoriasis）、関節リウマチおよび変形性骨関節症のような自己免疫および炎症性疾患に罹患している患者の症状の改善をもたらす可能性がある。
【０５７１】
C.  CG 108175-01およびCG 108175-02およびCG 108175-03およびCG 108175-04およびCG 108175-05：ノイレキシンIII-α分泌1型前駆物質
表CA、CB、CC、CDおよびCEに記載した遺伝子CG 108175-01、および変異体CG 108175-02、CG 108175-03、CG 108175-04、および CG 108175-05の発現は、プライマー-プローブセットAg4351、Ag6039、Ag6040、Ag6041、およびAg6043を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表CF、CG、CH、CIおよびCGに示す。CG 10817S-01およびCG 108175-02はプローブ-プライマーセットAg4351およびAg6039のみに対応する。さらに、Ag6040はCG 108175-03に特異的であり、Ag6041はAg108175-04に特異的であり、そしてAg6043はAg108175-05に特異的である。
【０５７２】
【表２１９】
2005519629.tif 000220
【０５７３】
【表２２０】
2005519629.tif 000221
【０５７４】
【表２２１】
2005519629.tif 000222
【０５７５】
【表２２２】
2005519629.tif 000223
【０５７６】
【表２２３】
2005519629.tif 000224
【０５７７】
【表２２４】
2005519629.tif 000225
【０５７８】
【表２２５】
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【０５７９】
【表２２６】
2005519629.tif 000227
【０５８０】
【表２２７】
2005519629.tif 000228
【０５８１】
【表２２８】
2005519629.tif 000229
【０５８２】
【表２２９】
2005519629.tif 000230
【０５８３】
【表２３０】
2005519629.tif 000231
【０５８４】
【表２３１】
2005519629.tif 000232
【０５８５】
【表２３２】
2005519629.tif 000233
【０５８６】
【表２３３】
2005519629.tif 000234
【０５８７】
【表２３４】
2005519629.tif 000235
【０５８８】
【表２３５】
2005519629.tif 000236
【０５８９】
AI_包括的_パネル_1.0のまとめ：Ag6043  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプル中で低/検出不能である（CT＞35）（データは示していない）。
【０５９０】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4351/Ag6039/Ag6040/Ag6041  3種のプローブ-プライマーセットを用いた4種の実験は素晴らしく一致する結果を生じた。この遺伝子は、アルツハイマー病ではディファレンシャルには発現されなかった。しかし、この発現プロファイルによりこの遺伝子が脳に存在することを確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０５９１】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4351  この遺伝子は、脳中で優先的に発現するようであり、胎児脳サンプル中で最も高い発現を示す（CT=28.1）。この遺伝子は、シナプス発生および細胞間シグナル伝達に関係しているニューロン細胞表面分子であるノイレキシンと相同性を有するタンパク質をコードする。PFAMでの解析に基づくと、このタンパク質は表皮増殖因子様配列およびラミニンAのGドメイン繰り返し配列と相同であるドメインの両方を含んでおり、このことは細胞−細胞相互作用においてこのタンパク質が役割を果たすことを裏づける。ノイレキシンはシナプス形成に関係しているので、したがって学習、記憶および行動に影響を及ぼす可能性がある（Scheiffele P. Cell 2000 Jun 9;101(6):657-69）。ノイロキシンもまた、強力な神経毒素であるα-ラトロトキシンに対するレセプターでもある（Geppert M. J Biol Chem 1998 Jan 16;273(3);1705-10）。したがって、このパネルで見られる結果に基づくと、この遺伝子の発現を使用して、脳組織と非ニューロン組織とを区別することができる。さらにその上、このタンパク質はノイレキシンと相同であるので、この遺伝子の発現もしくは機能の調節は、神経変性疾患の治療に、特に、脊髄もしくは脳腫瘍、脳卒中（stroke）、アルツハイマー病、パーキンソン病もしくはハンチントン病、または脊髄小脳性運動失調におけるニューロン死に応答して代償性シナプスを発生するように向けることに有用である可能性がある。
【０５９２】
一般_スクリーニング_パネル_v1.5のまとめ：Ag6039/Ag6040/Ag6041  この遺伝子の発現は、パネル1.4での発現と一致して、脳について高度に特異的である。さらに、各々CG 108175-03およびCG 108175-04に特異的であるAg6040およびAg6041を用いた実験は、CNSの他の領域での発現と比較して小脳において有意に高いレベルを示す（CTs=27.7）。これは、この変異体が小脳でより高度に発現されることに示唆する可能性がある。したがって、これらの遺伝子もまた、例えば自閉症（autism）および失調症（ataxias）のようなこの脳領域を病理の部位として有するCNS障害を治療するための薬物の特異的標的として有用である可能性がある。Ag6043  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプル中で低/検出不能である（CT＞35）（データは示していない）。
【０５９３】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4351/Ag6040  この遺伝子の発現は、腎臓、胸腺および肺由来の正常組織サンプル中で低いが有意なレベルで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらのサンプルをこのパネル上の他のサンプルから区別するため、そして腎臓組織のマーカーとして使用できる。正常組織中の発現は、この遺伝子産物がこれらの組織の正常な恒常性を維持することに関係している可能性を示唆している。このため、この遺伝子産物の調節は、これらの器官に影響を及ぼす自己免疫疾患を有する患者の症状を低減もしくは排除する可能性がある。Ag6039/Ag6041  これらの遺伝子を用いた1つの実験による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。Ag6043  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプル中で低/検出不能である（CT＞35）（データは示していない）。
【０５９４】
パネルCNS_1.1のまとめ：Ag4351  この発現プロファイルによりこの遺伝子が脳に存在することを確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０５９５】
D.  CG 108624-01：プロトカルドヘリン68変異体
遺伝子CG 108624-01の発現を、表DAに記載したプライマー-プローブセットAg4366を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表DB、DC、DDおよびDEに示す。
【０５９６】
【表２３６】
2005519629.tif 000237
【０５９７】
【表２３７】
2005519629.tif 000238
【０５９８】
【表２３８】
2005519629.tif 000239
【０５９９】
【表２３９】
2005519629.tif 000240
【０６００】
【表２４０】
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【０６０１】
【表２４１】
2005519629.tif 000242
【０６０２】
【表２４２】
2005519629.tif 000243
【０６０３】
【表２４３】
2005519629.tif 000244
【０６０４】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4366  このパネルにより、無関係な個体の群の脳における低レベルでのCG 108624-01遺伝子の発現を確認する。しかし、この実験のアルツハイマー病に罹患した死後脳と痴呆ではない対照の死後脳との間では、この遺伝子の発現の差は検出されなかった。中枢神経系障害の治療におけるこの遺伝子の潜在的有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０６０５】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4366  CG 108624-01遺伝子の最も高い発現は、胎児肺中で検出される（CT=25）。興味深いことに、この遺伝子の発現は成人肺と比較すると胎児において高い（CT=32.7）。この観察は、この遺伝子の発現を使用して胎児肺を成人肺と区別できることを示唆している。さらに、胎児肺中のこの遺伝子の相対過剰発現は、このタンパク質産物が胎児における肺の成長もしくは発達を増強することができる、したがって成人の再生能力においても機能できる可能性を示唆している。このため、この遺伝子によりコードされるタンパク質の治療による調節が筋肉関連疾患の治療に有効である可能性がある。
【０６０６】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域で高レベルで発現される。CG 108624-01遺伝子はプロトカルドヘリン68をコードする。プロトカルドヘリンは、例えば細胞接着、細胞骨格の形成および形態発生のような多数の生物学的プロセスに関係している分子のカドヘリンスーパーファミリーに属する膜貫通型糖タンパク質である。プロトカルドヘリンは、概して中等度の接着活性しか示さず、神経系で高度に発現される。カドヘリンは、特に発育の間と傷害に反応して、軸策誘導および細胞接着タンパク質として機能することができる（Ranscht B., 2000 Cadherins:molecular codes for axon guidance and synapse formation. Int. J. Dev. Neurosci. 18:643-651, PMID:10978842）。このため、このタンパク質のレベルの治療による調節がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳変性運動失調（soinocerebellar ataxia）、進行性核上性麻痺（progressive supranuclear palsy）、ALS（筋萎縮性側索硬化症）、頭部外傷、脳卒中、または神経消失と関連する他の疾患/状態におけるニューロン死に対して代償性シナプス発生性反応を誘発することに有用である可能性がある。
【０６０７】
この遺伝子の中等度の発現は、結腸癌ならびに脳腫瘍、肺癌、乳癌、卵巣癌および黒色腫癌細胞下部を含む多数の癌細胞株から誘導されたサンプル中でも見られる。このため、この遺伝子産物の治療による調節がこれらの癌の治療に有効である可能性がある。
【０６０８】
代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において高レベルから中レベルで発現される。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０６０９】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4366  CG 108624-01遺伝子の最も高い発現は、肺中で検出される（CT=28.7）。さらに、この遺伝子の高度な発現はHUVEC、HPAEC、肺微小血管および微小血管皮膚内皮細胞を含む内皮細胞中でも見られる。内皮細胞は、エフェクター炎症細胞の活性化および補充現象に関係している表面タンパク質の発現を変化させることによって、炎症性反応において重要な役割を果たすことが知られている。これらの内皮細胞中のこの遺伝子の発現は、このタンパク質産物が、乾癬、喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、および肺気腫を含む皮膚および肺疾患に対する炎症性反応に関係している可能性を示唆している。このため、この遺伝子によりコードされるタンパク質の治療による調節が、乾癬、喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、および肺気腫に関連する症状の改善をもたらすことがある。
【０６１０】
この遺伝子の中レベルの発現は、休止好中球、冠動脈SMC、肝硬変（liver cirrhosis）、および結腸、胸腺、および腎臓によって代表される正常組織中でも見られる。このため、この遺伝子産物の治療による調節が、炎症性腸疾患、狼瘡および糸球体腎炎（glomerulonephritis）を含む結腸および腎臓に影響を及ぼす炎症性疾患および自己免疫疾患の治療に有効である可能性がある。
【０６１１】
パネルCNS_1.1のまとめ：Ag4366  このパネルにより、無関係な個体の群の脳におけるこの遺伝子の低レベルでの発現を確認する。中枢神経系障害の治療におけるこの遺伝子の潜在的有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０６１２】
E.  CG 108771-01：Ib型膜タンパク質
全長の物理的クローンCG 108771-01の発現を、表EAに記載したプライマー-プローブセットAg6806を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表EB、ECおよびEDに示す。
【０６１３】
【表２４４】
2005519629.tif 000245
【０６１４】
【表２４５】
2005519629.tif 000246
【０６１５】
【表２４６】
2005519629.tif 000247
【０６１６】
【表２４７】
2005519629.tif 000248
【０６１７】
【表２４８】
2005519629.tif 000249
【０６１８】
【表２４９】
2005519629.tif 000250
【０６１９】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag6806  このパネルにより、無関係な個体の群の脳におけるこの遺伝子の低レベルから中レベルでの発現を確認する。しかし、この実験のアルツハイマー病に罹患した死後脳と痴呆ではない対照の死後脳との間では、この遺伝子の発現の差は検出されなかった。中枢神経系障害の治療におけるこの遺伝子の潜在的有用性の考察についてはパネル1.6を参照されたい。
【０６２０】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag6806  CG 108771-01遺伝子の発現は、肺癌細胞株において最も高い（CT=28.2）。この遺伝子は、このパネル上の大多数の組織中で低レベルから中レベルで発現される。興味深いことに、この遺伝子の発現は成人組織と比較すると胎児の筋肉、腎臓および肝臓中で高い。このため、この遺伝子の発現を使用して、成人および胎児の骨格筋、腎臓および肝臓間を区別することができる。さらに、胎児骨格筋、腎臓および肝臓でのこの遺伝子の相対過剰発現は、このタンパク質産物が胎児の成長および発育を増強することができる、したがって成人の再生能力においても機能できる可能性を示唆している。このため、この遺伝子によりコードされるシングルパス膜貫通型タンパク質の治療による調節が筋肉、腎臓および肝臓関連疾患の治療に有用であり得る。
【０６２１】
この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において中レベルで発現される。このため、この遺伝子は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病のような中枢神経系疾患において役割を果たす可能性がある。
【０６２２】
代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において低レベルから中レベルで発現される。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０６２３】
パネル4.1Dのまとめ：Ag6806  CG 108771-01遺伝子の発現は、休止好中球中で最高であり（CT = 29.3）、活性化された好中球中では低レベルの発現が検出される（CT = 32.3）。このため、この遺伝子の発現を使用して、休止好中球と活性化された好中球とを区別することができる。さらに、CG 108771-01遺伝子産物は、これらの炎症性細胞の活性化を低下させ、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺気腫、関節リウマチ、紅斑性狼瘡、または乾癬を有する患者の症状を低減もしくは排除するためのタンパク質治療薬として有用である可能性がある。さらに、この遺伝子産物の小分子もしくは抗体アンタゴニストは、AIDSもしくはその他の免疫不全症を有する患者の免疫反応を増加させることに有用である可能性がある。
【０６２４】
この遺伝子は、健康な状態および疾患状態の免疫反応に重要である多数の細胞タイプにおいて低レベルから中レベルで発現される。これらの細胞には、内皮細胞、マクロファージ/単球、好塩基球、好酸球、末梢血単核球、肺および皮膚上皮細胞、肺および皮膚線維芽細胞、ならびに胸腺および腎臓によって代表される正常組織が含まれる。この偏在性の発現パターンは、この遺伝子産物がこれらやその他の細胞タイプおよび組織についての恒常性プロセスに関係している可能性を示唆している。このパターンは、パネル_v1．6の発現プロファイルと一致しており、さらに細胞の生存性および増殖におけるこの遺伝子産物の役割を示唆している。このため、機能的治療薬でのこの遺伝子産物の調節は、これらの細胞タイプと関連する機能の変更をもたらし、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、紅斑性狼瘡、乾癬、関節リウマチおよび変形性骨関節症のような自己免疫および炎症性疾患に罹患している患者の症状の改善をもたらす可能性がある。
【０６２５】
F.  CG 108782-01およびCG 108782-02：膜貫通型タンパク質
遺伝子CG 108782-01および全長の物理的クローンCG 108782-02の発現を、表FAおよびFBに記載したプライマー-プローブセットAg4367およびAg6790を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表FC、FD、FEおよびFFに示す。CG 108782-02はAg6790のみに対応することに注目されたい。
【０６２６】
【表２５０】
2005519629.tif 000251
【０６２７】
【表２５１】
2005519629.tif 000252
【０６２８】
【表２５２】
2005519629.tif 000253
【０６２９】
【表２５３】
2005519629.tif 000254
【０６３０】
【表２５４】
2005519629.tif 000255
【０６３１】
【表２５５】
2005519629.tif 000256
【０６３２】
【表２５６】
2005519629.tif 000257
【０６３３】
【表２５７】
2005519629.tif 000258
【０６３４】
【表２５８】
2005519629.tif 000259
【０６３５】
【表２５９】
2005519629.tif 000260
【０６３６】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4367/Ag6790  2種のプローブ-プライマーセットを用いた2種の実験は素晴らしく一致する。これらの結果により、無関係な個体の群の脳におけるこの遺伝子の中レベルでの発現を確認する。この遺伝子は、痴呆ではない対照と比較するとアルツハイマー病患者の側頭皮質中でダウンレギュレートされる（Ancovaによる解析ではp=0.01、変量として使用した1ウェル当たりにロードした全cDNAの推定値）。このため、この遺伝子もしくはそのタンパク質産物のアップレギュレーション、またはこのレセプターの特異的アゴニストを用いた治療は、この疾患に関連する痴呆、記憶喪失、およびニューロン死を逆転させることに有用である可能性がある。
【０６３７】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4367
この遺伝子は、神経系に由来するサンプル中でほぼ排他的に発現されるようであり、脊髄中で最も高い発現を示す（CT=26.6）。高レベルから中レベルは、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質でも見られる。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節が、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０６３８】
膵臓癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌および黒色腫から誘導されたサンプルを含む、このパネル上の多数の癌細胞株中でも低レベルだが有意な発現が見られる。
【０６３９】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag6790  このパネルでの発現は、パネル1.4での発現と一致しており、最も高い発現は脊髄中で見られる（CT=25.8）。試験した全CNS領域において高レベルから中レベルの発現が見られ、このパネル上の大多数の癌細胞株においては低レベルだが有意なレベルの発現が見られる。中枢神経系疾患におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０６４０】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4367  この遺伝子の最も高い発現は、NCI-H292肺粘膜類表皮腫細胞株由来の未処理サンプル中で見られる。低レベルの発現は、サイトカインで活性化したNCI-H292一群のサンプル中で検出される。したがって、このタンパク質を使用して、NCI-H292に類似する一定の肺腫瘍を同定することができる。このコードされるタンパク質は、肺内の杯状細胞の正常機能にも関係している。このため、このタンパク質に対する治療薬を設計することは肺気腫および喘息ならびにそれらが産生する杯状細胞もしくは粘膜が病理学的結果を有する他の肺疾患の治療に有効である可能性がある。AG6790を用いた第2回目の実験は、低/検出不能なレベルの発現を示す（CT＞35）（データは示していない）。
【０６４１】
G.  CG 108801-01およびCG 108801-02：EGF-ドメイン膜貫通型タンパク質
遺伝子CG 108801-01および変異体CG 108801-02の発現を、表GAおよびGBに記載したプライマー-プローブセットAg2449およびAg737を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表GC、GD、GEおよびGFに示す。
【０６４２】
【表２６０】
2005519629.tif 000261
【０６４３】
【表２６１】
2005519629.tif 000262
【０６４４】
【表２６２】
2005519629.tif 000263
【０６４５】
【表２６３】
2005519629.tif 000264
【０６４６】
【表２６４】
2005519629.tif 000265
【０６４７】
【表２６５】
2005519629.tif 000266
【０６４８】
【表２６６】
2005519629.tif 000267
【０６４９】
【表２６７】
2005519629.tif 000268
【０６５０】
【表２６８】
2005519629.tif 000269
【０６５１】
【表２６９】
2005519629.tif 000270
【０６５２】
【表２７０】
2005519629.tif 000271
【０６５３】
パネル1.3Dのまとめ：Ag2449  同じプローブ-プライマーセットを使用した2回の実験による結果は良好には一致せず、結論を出すことができない（データは示していない）。
【０６５４】
パネル2Dのまとめ：Ag2449  CG 108801-01遺伝子の発現は、正常および癌性の両方の、前立腺由来サンプルにおいて最も高い（CT=30〜32）。したがって、この遺伝子の発現を使用して、前立腺をこのパネル上の他の組織から区別することができる。さらに、この遺伝子は正常な前立腺の機能において1つの役割を果たす可能性がある。この遺伝子は、正常結腸、乳房、腎臓および肺中でも低レベルで発現される。
【０６５５】
パネル3Dのまとめ：Ag2449  CG 108801-01遺伝子の発現は、類上皮癌細胞株において最も高い（CT=28）。この遺伝子の中レベルの発現は、膵臓癌および肺癌細胞株のサブセットでも見られる。このため、小分子薬、タンパク質治療薬もしくは抗体の使用によるこの遺伝子もしくはそのタンパク質産物の活性の治療による調節が、これらのタイプの癌の治療に有効である可能性がある。
【０６５６】
パネル4Dのまとめ：Ag2449  同じプローブ-プライマーセットを使用した2回の実験による結果は良好に一致する結果を生じた。CG 108801-01遺伝子の発現は、ムチンを産生するヒト気道上皮細胞株であるNCI-H292細胞株において最も高い（CT=29）。粘液過剰産生は、気管支喘息および慢性閉塞性肺疾患の重要な特徴である。IL-1βおよびTNF-αで処置された小気道上皮中では転写産物もまた低いが有意なレベルで発現される。気道上皮のためのモデル（NCI-H292細胞）としてしばしば使用されるこの粘膜類上皮細胞株中での転写産物の発現は、この転写産物が気道上皮の増殖もしくは活性化に重要である可能性を示唆している。このため、この転写産物によりコードされるタンパク質を用いて設計された治療薬は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギー、および肺気腫におけ肺上皮の炎症によって引き起される症状を低減もしくは排除できる可能性がある。
【０６５７】
この遺伝子は、休止角質細胞（CT=29.3）中では中レベルで、そして処理された角質細胞（CT=32.6）中では低レベルで発現される。このため、小分子治療薬の適用によるこの転写産物によりコードされるタンパク質の発現もしくは機能の調節は、乾癬および創傷治癒の治療に有効である可能性がある。
【０６５８】
H.  CG 109717-01：膜貫通型タンパク質
遺伝子CG 109717-01の発現を、表HAおよびHBに記載したプライマー-プローブセットAg4296およびAg4396を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表HC、HDおよびHEに示す。
【０６５９】
【表２７１】
2005519629.tif 000272
【０６６０】
【表２７２】
2005519629.tif 000273
【０６６１】
【表２７３】
2005519629.tif 000274
【０６６２】
【表２７４】
2005519629.tif 000275
【０６６３】
【表２７５】
2005519629.tif 000276
【０６６４】
【表２７６】
2005519629.tif 000277
【０６６５】
【表２７７】
2005519629.tif 000278
【０６６６】
【表２７８】
2005519629.tif 000279
【０６６７】
AI_包括的パネル_1.0のまとめ：Ag4396  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT＞35）（データは示していない）。
【０６６８】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4396/Ag4296  同じプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験は素晴らしく一致する。このパネルにより、無関係な個体の群の脳におけるこの遺伝子の低レベルでの発現を確認する。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質においてわずかにダウンレギュレートされることを見いだした。このため、この遺伝子もしくはそのタンパク質産物のアップレギュレーション、またはこのレセプターの特異的アゴニストを用いた治療は、この疾患に関連する痴呆、記憶喪失、およびニューロン死を逆転させることに有用である可能性がある。
【０６６９】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4396/Ag4296  同じプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験は素晴らしく一致し、この遺伝子の最も高い発現は胎児脳中で見られる（CTs=29）。この遺伝子の高度な発現は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において見られる。このため、この遺伝子の発現を使用して、脳サンプルをこのパネルで使用した他のサンプルから区別することができる。さらにその上、この遺伝子産物の治療による調節が、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病のような中枢神経系疾患の治療に有効である可能性がある。
【０６７０】
さらに、この遺伝子の低レベルの発現は2種の肺癌細胞株でも見られる。このため、この遺伝子の治療による調節が肺癌の治療に有効である可能性がある。
【０６７１】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4396/Ag4296  同じプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験は素晴らしく一致し、この遺伝子の最も高い発現はIL-2で処理したLAK細胞中で見られる。このため、この遺伝子の発現を使用して、このサンプルをこのパネル中で使用した他のサンプルから区別することができる。この遺伝子の低レベルの発現はIL-2で処理したNK細胞でも見られる。これらのキラー細胞は、ウイルスおよび細菌に感染した細胞ならびに腫瘍の腫瘍免疫学および細胞クリアランスに関係している。このため、小分子薬もしくは抗体の投与によるこの遺伝子によりコードされたタンパク質の機能の調節は、これらの細胞の機能を変化させ、これらの状態に関連する症状の改善をもたらす可能性がある。
【０６７２】
I.  CG 110477-01：デスモグレイン3変異体
遺伝子CG 110477-01の発現を、表IAに記載したプライマー-プローブセットAg4420を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表IB、ICおよびIDに示す。
【０６７３】
【表２７９】
2005519629.tif 000280
【０６７４】
【表２８０】
2005519629.tif 000281
【０６７５】
【表２８１】
2005519629.tif 000282
【０６７６】
【表２８２】
2005519629.tif 000283
【０６７７】
【表２８３】
2005519629.tif 000284
【０６７８】
【表２８４】
2005519629.tif 000285
【０６７９】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4420  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプル中で低/検出不能である（CT＞35）（データは示していない）。
【０６８０】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4420  この遺伝子の発現は、このパネル上の少数のサンプルに限定されており、最も高い発現は胃癌細胞株中で見られる（CT=25.4）。結腸癌および扁平上皮細胞癌株中でも高レベルの発現が見られる。胸腺、子宮、および気管においては中レベルの発現が見られ、大脳皮質、黒質、ならびに胎児および全脳サンプル中では低レベルだが有意なレベルで見られる。したがって、この遺伝子の発現を使用して、胃癌細胞株をこのパネル上の他のサンプルから区別することができ、そして胃癌のマーカーとして使用できる。この遺伝子産物は、細胞−細胞接着を媒介することに関係している細胞間デスモソームジャンクションの1構成要素であるデスモグレインと相同性である。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節が胃癌、結腸癌もしくは皮膚癌の治療に有効である可能性がある。
【０６８１】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4420  このパネル上での発現は少数サンプルに限定されていうるようであり、最も高い発現はTNF-aおよびIL1-bで活性化した気管支および小気道上皮において見られる（CT=27.2）。中レベルの発現は、未処理の小気道上皮、処理および未処理の角質細胞、NCI-H292細胞ならびに胸腺および腎臓に由来する一群のサンプルでも見られる。この発現プロファイルは、この遺伝子産物が肺および皮膚の炎症状態に関係している可能性を示唆している。この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節が、乾癬、喘息、アレルギーおよび肺気腫の治療に有効である可能性がある。
【０６８２】
一般腫瘍学スクリーニングパネル_v_2.4のまとめ：Ag4420  このパネル中でのこの遺伝子の最も高い発現は、扁平上皮細胞癌サンプル中で見られる（CT=25.4）。結腸癌からのサンプル中でも高レベルの発現が見られ、黒色腫および前立腺癌中では中レベルの発現が見られる。この発現は、パネル1.4の癌細胞株で見られる発現と一致している。したがって、この遺伝子の発現はこれらの癌のマーカーとして使用できる。この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節が、皮膚癌、結腸癌もしくは前立腺癌の治療に有効である可能性がある。
【０６８３】
J.  CG 110540-01：フェロモンレセプター
遺伝子CG 110540-01の発現を、表JAに記載したプライマー-プローブセットAg4422を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表JB、JC、JDおよびJEに示す。
【０６８４】
【表２８５】
2005519629.tif 000286
【０６８５】
【表２８６】
2005519629.tif 000287
【０６８６】
【表２８７】
2005519629.tif 000288
【０６８７】
【表２８８】
2005519629.tif 000289
【０６８８】
【表２８９】
2005519629.tif 000290
【０６８９】
【表２９０】
2005519629.tif 000291
【０６９０】
【表２９１】
2005519629.tif 000292
【０６９１】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4452  このパネルは、アルツハイマー病におけるこの遺伝子のディファレンシャルな発現を示さなかった。しかし、この発現プロファイルによりこの遺伝子が脳に存在することを確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０６９２】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4452  この遺伝子の最も高い発現は胎児脳中で見いだされた（CT=30.2）。この遺伝子の顕著な発現は、CNS全体を通しても見られる。この遺伝子は、フェロモンレセプターファミリーの推定メンバーをコードする。これらのレセプターは感覚ニューロン中で発現され、生得的生殖行動および社会的行動の開始に関係している。この遺伝子の組織分布および予測される機能から、この遺伝子の発現を使用して脳組織と非ニューロン組織とを区別することができる。さらに、この遺伝子の発現もしくは機能の調節が、行動傷害および生殖障害の治療に有効である可能性がある。
【０６９３】
すべてが代謝性機能を有する組織である膵臓、心臓および胎児骨格筋においては、低レベルだが有意なレベルの発現が見られる。この発現は、この遺伝子産物がさらに神経内分泌機能にも関係している可能性を示唆している。
【０６９４】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4452  この遺伝子の最も高い発現は腎臓で見られ（CT=29.3）、結腸、肺、胸腺、休止PBMCs、およびIL-18/IL-2で処理したLAK細胞中では、中レベルの発現が検出される。したがって、この遺伝子の発現を用いて、腎臓由来サンプルをこのパネル上の他のサンプルから区別でき、そして腎臓組織のマーカーとして使用することができる。さらに、この遺伝子の発現もしくは機能の治療上の標的とすることにより、腎臓機能を調節することができ、これは狼瘡および糸球体腎炎を含む腎臓に影響を及ぼす炎症性疾患もしくは自己免疫疾患の治療に有効である可能性がある。
【０６９５】
一般腫瘍学スクリーニングパネル_v_2.4のまとめ：Ag4452  この遺伝子の最も高い発現は前立腺癌中で見られる（CT=32.1）。黒色腫、肺および腎臓癌においても低レベルだが有意なレベルの発現が見られる。
【０６９６】
K.  CG 110725-01：オステオポンチン前駆細胞
全長の物理的クローンCG 110725-01の発現を、表KAおよびKBに記載したプライマー-プローブセットAg6782およびAg6796を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表KCおよびKDに示す。
【０６９７】
【表２９２】
2005519629.tif 000293
【０６９８】
【表２９３】
2005519629.tif 000294
【０６９９】
【表２９４】
2005519629.tif 000295
【０７００】
【表２９５】
2005519629.tif 000296
【０７０１】
【表２９６】
2005519629.tif 000297
【０７０２】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag6782  このパネルにより、無関係な個体の群の脳におけるCG 110725-01遺伝子の発現を確認する。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質においてアップレギュレートされているようである。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節はニューロン死を減少させ、この疾患の治療に有効である可能性がある。
【０７０３】
Ag6796  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT＞35）（データは示していない）。
【０７０４】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag6782  CG 110725-01遺伝子の発現は、卵巣癌細胞株において最も高い（CT=21.2）。この遺伝子は、それらのそれぞれの正常組織と比較すると肺癌および腎臓癌細胞株のサブセットにおいてより高レベルで発現される。このため、小分子薬、タンパク質治療薬もしくは抗体の使用によるこの遺伝子もしくはそのタンパク質産物の活性の治療による調節は、これらの肺癌、腎臓癌および卵巣癌の治療に有効である可能性がある。
【０７０５】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において高レベルで発現される。このため、この遺伝子は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病のような中枢神経系疾患において役割を果たす可能性がある。
【０７０６】
代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管で発現される。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０７０７】
CG 110725-01遺伝子は、破骨細胞を骨基質の無機質へ固定することに関係しているカルシトリオールによる刺激下で骨芽細胞によって産生されるタンパク質であるオステオポンチンのスプライス変異体形態をコードする。オステオポンチンは、マウスにおいてマクロファージによって媒介される1型免疫反応の鍵となるサイトカインの1つである（S. Ashkarら, Science 287:860-864, 2000, PubMed ID :10657301）。さらに、オステオポンチンは種々のヒト腫瘍中で過剰発現されることが証明されており、転移性癌を有する一部の患者の血液中に高レベルで存在する（K.A. Furgerら, Curr Mol Med. 2001 Nov;l(5):621-32, PMID:11899236）。オステオポンチンタンパク質は、インテグリン媒介性シグナル伝達を通して腫瘍浸潤および転移において1つの役割を果たすと考えられる。これらの観察は、ここに記載したオステオポンチンスプライス変異体が癌の治療において優性ネガティブとして有用である可能性を示唆している。
【０７０８】
Ag6796  この実験における遺伝子発現のパターンはAG6782を用いた場合に類似していたが、発現レベルははるかに低かった。AG6796およびAG6782プローブ-プライマーセットは、この遺伝子の異なる領域を認識した。
【０７０９】
パネル4.1Dのまとめ：Ag6782  CG 110725-01遺伝子を用いた1つの実験による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。
【０７１０】
Ag6796  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT＞35）（データは示していない）。
【０７１１】
L.  CG 111683-03：肺サーファクタント関連タンパク質C前駆細胞
全長の物理的クローンCG 111683-03の発現を、表LAに記載したプライマー-プローブセットAg6780を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表LB、LCおよびLDに示す。
【０７１２】
【表２９７】
2005519629.tif 000298
【０７１３】
【表２９８】
2005519629.tif 000299
【０７１４】
【表２９９】
2005519629.tif 000300
【０７１５】
【表３００】
2005519629.tif 000301
【０７１６】
【表３０１】
2005519629.tif 000302
【０７１７】
【表３０２】
2005519629.tif 000303
【０７１８】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag6780  このパネルにより、無関係な個体の群の脳におけるこの遺伝子の低レベルでの発現を確認する。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質においてわずかにアップレギュレートされるようである。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、ニューロン死を減少させ、この疾患の治療に有効である可能性がある。
【０７１９】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag6780  この遺伝子の最も高い発現は胎児肺中で見いだされた（CT=22.7）。このため、この遺伝子の発現を使用して、胎児および成人の肺組織間を区別することができる（CT=40）。この遺伝子産物は、サーファクタント脂質の表面張力低下特性を増強し、肺の呼吸面を虚脱に対して安定化させることを助ける疎水性の肺特異的タンパク質であるサーファクタント関連タンパク質SP-Cに対して相同性を有する。Nogeeらは、この遺伝子SP-Cにおける変化が成人における肺疾患の発生に関連する可能性があることを証明した（N Engl J Med 2001, 344:573579.）。Devendraは、肺サーファクタント系における異常が慢性閉塞性肺疾患、および喘息の発生においても1つの役割を果たす可能性があると提起した（Respir Res 2002;3(1):19）。したがって、SP-Cに対するこの遺伝子産物の相同性および発達中の肺において見られる高度に特異的な発現に基づくと、この遺伝子の発現もしくは機能の調節はこれらの肺関連疾患の治療に有効である可能性がある。
【０７２０】
この遺伝子は、脳中でも低レベルだが有意なレベルで発現される。CNSにおけるこの遺伝子の有用性の考察についてはCNS_神経変性_v1.0を参照されたい。
【０７２１】
パネル4.1Dのまとめ：Ag6780  この遺伝子の発現は、このパネル中では肺についてのみ見られる（CT=26.2）。したがって、この遺伝子の発現はこれらの肺組織のマーカーとして使用できる。自己免疫疾患におけるこの遺伝子の有用性についての詳細な考察についてはパネル1.6を参照されたい。
【０７２２】
M.  CG 112655-01：生殖細胞無-少量の1タンパク質を含む
遺伝子CG 112655-01の発現を、表MAに記載したプライマー-プローブセットAg6812を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表MBに示す。
【０７２３】
【表３０３】
2005519629.tif 000304
【０７２４】
【表３０４】
2005519629.tif 000305
【０７２５】
【表３０５】
2005519629.tif 000306
【０７２６】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag6812  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプル中で低/検出不能である（CT＞35）（データは示していない）。
【０７２７】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag6812  この遺伝子の発現は、精巣中でのみ見いだされた（CT=31.8）。したがって、この遺伝子の発現は、このサンプルをこのパネル上の他のサンプルと区別するため、そして精巣組織のマーカーとして使用できる。この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、男性不妊症および性機能低下症の治療に有効である可能性がある。
【０７２８】
パネル4.1Dのまとめ：Ag6812  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプル中で低/検出不能である（CT＞35）（データは示していない）。
【０７２９】
N.   CG 112813-01およびCG 112813-02およびCG 112813-04およびCG 112813-05およびCG 112813-06：ナチュラルキラー細胞レセプター
遺伝子CG 112813-01、変異体CG 112813-05およびCG 112813-06、ならびに全長の物理的クローンCG 112813-02およびCG 112813-04は、表NB、NC、ND、NE、NF、NG、NH、およびNIに記載したプライマー-プローブセットAg4465、Ag4783、Ag4784、Ag5089、Ag6237、Ag6508、Ag6654 およびAg6247を使用して評価した。個々の変異体とプローブ-プライマーセットとの対応は、表NAに示す。RTQ-PCRの実行の結果を、表NJ、NK、NLおよびNMに示す。
【０７３０】
【表３０６】
2005519629.tif 000307
【０７３１】
【表３０７】
2005519629.tif 000308
【０７３２】
【表３０８】
2005519629.tif 000309
【０７３３】
【表３０９】
2005519629.tif 000310
【０７３４】
【表３１０】
2005519629.tif 000311
【０７３５】
【表３１１】
2005519629.tif 000312
【０７３６】
【表３１２】
2005519629.tif 000313
【０７３７】
【表３１３】
2005519629.tif 000314
【０７３８】
【表３１４】
2005519629.tif 000315
【０７３９】
【表３１５】
2005519629.tif 000316
【０７４０】
【表３１６】
2005519629.tif 000317
【０７４１】
【表３１７】
2005519629.tif 000318
【０７４２】
【表３１８】
2005519629.tif 000319
【０７４３】
【表３１９】
2005519629.tif 000320
【０７４４】
【表３２０】
2005519629.tif 000321
【０７４５】
【表３２１】
2005519629.tif 000322
【０７４６】
【表３２２】
2005519629.tif 000323
【０７４７】
【表３２３】
2005519629.tif 000324
【０７４８】
AI_包括的パネル_1.0のまとめ：Ag4783  同じプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験の結果は、潰瘍性大腸炎患者から誘導されたサンプル中でのこの遺伝子の最も高い発現と良好に一致する(CT=32-33)。さらに、この遺伝子の低レベルの発現は、肺気腫、乾癬および潰瘍性大腸炎サンプルに限定されるようである。このため、この遺伝子の発現を使用して、これらのサンプルをこのパネル中の他のサンプルから区別できる可能性がある。さらに、この遺伝子によりコードされるタンパク質の治療による調節は、肺気腫、乾癬および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患の治療に有効である可能性がある。このプローブ-プライマーセットを使用した3回目の実行である実行211063353は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能な発現レベルを示す（CT>35）（データは示していない）。
【０７４９】
Ag5089/Ag6237/Ag6247  発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）。プローブAg6237およびAg6247は、CG 112813-05およびCG 112813-06各々に特異的であることに注目されたい。
【０７５０】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4465  このパネルにより、無関係な個体の群の脳におけるこの遺伝子の低レベルでの発現を確認する。しかし、この実験のアルツハイマー病に罹患した死後脳と痴呆ではない対照の死後脳との間では、この遺伝子の発現の差は検出されなかった。脳でのこの遺伝子の低レベルの発現は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病のような中枢神経系疾患において役割を果たす可能性があることを示唆している。
【０７５１】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4465/Ag4783  異なるプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験は良好に一致し、CG 112813-01遺伝子の最も高い発現は脾臓および肺癌SHP-77細胞株中で見られる。この遺伝子の低レベルの発現は乳癌細胞株においても検出される。このため、この遺伝子の発現は肺癌および乳癌を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。さらにその上、脾臓中でのこの遺伝子の発現は、この遺伝子が二次的な免疫反応に関わっている可能性を示唆している。このため、この遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を遮断する抗体もしくは小分子治療薬は、アレルギー、自己免疫疾患および炎症性疾患を治療するための抗炎症薬として有用である可能性がある。
【０７５２】
さらに、この遺伝子の低レベルの発現は膵臓でも見られる。このため、この遺伝子によりコードされるタンパク質の治療による調節は、肥満症および糖尿病を含む膵臓に関連する疾患の治療に有効である可能性がある。
【０７５３】
一般_スクリーニング_パネル_v1.5のまとめ：Ag5089  CG 112813-01遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０７５４】
Ag6237  CG 112813-05遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０７５５】
Ag6247  CG 112813-06遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０７５６】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4465/Ag4783/Ag4784/Ag5089  4種のプローブ-プライマーセットを用いた6回の実験による結果は良好に一致し、CG 112813-01遺伝子の最も高い発現はイオノマイシン/PMAで処理した好酸球中で見られる（CT=24.6-34）。このため、この遺伝子の発現を使用して、このサンプルをこのパネル中で使用した他のサンプルから区別できる可能性がある。
【０７５７】
好酸球およびサイトカインならびにそれらによって産生される炎症媒介因子は、炎症性腸疾患（IBD）（1）および喘息（2）の病因に関係している可能性がある。クローン病および潰瘍性大腸炎を含むIBDは、好酸球の浸潤と強く関係している。好酸球は、急性IBDにおいて存在する最も優勢な顆粒球である（1）。IL-16（3）およびTGFα（4）のような好酸性産物は、炎症およびこれに続くこの疾患に付随する慢性的変化に関係しているようである。
【０７５８】
喘息における好酸球の役割については、細菌、抗IL-5 Mabs SCH55700およびSB-240563を用いた近年の第I相臨床試験（3において精査された）により疑問が投げかけらた。IL-5は、骨髄中での好酸球の生成および末梢における好酸球の生存性に重要である。したがって、好酸球はいぜんとして喘息の治療における重要な治療上の細胞標的である。
【０７５９】
CG 112813遺伝子は、染色体19上のキラー細胞免疫グロブリン（Ig）様レセプターファミリー（KIR;5）に属するタンパク質をコードする。KIRは、ヒトNK細胞の活性化を抑制することができるMHCクラスI結合免疫レセプターである（5,6）。NK細胞は、炎症を調節し、自己免疫寛容の消失に介在することが証明されている（7）。このため、この遺伝子によってコードされるKIRタンパク質はまた、NK細胞の調節においても役割を果たし、したがって自己免疫疾患の調節において役割を果たす可能性がある。
【０７６０】
さらに、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はTNFαで処理した皮膚線維芽細胞、IL-2で処理したNK細胞、サイトカインで処理したLAK細胞、活性化させた二次CDSリンパ球、および二次Th1、Th2、およびTr1細胞中でも見られる。好酸球を含むこれらの細胞は、肺病理、炎症性腸疾患、および関節リウマチを含む自己免疫疾患において重要な役割を果たすので、この遺伝子によってコードされるタンパク質を用いて設計された抗体もしくは小分子治療薬は喘息、アレルギー、高血圧性反応、炎症性腸疾患、乾癬、肺気腫、ウイルス感染症および自己免疫疾患の結果として生じる炎症および組織を遮断もしくは阻害することができる。
【０７６１】
Ag6508  CG 112813-05に特異的である1種のプローブ-プライマーセットを用いた結果は、上記に提示す結果と一致する。
【０７６２】
この実験における最も高い発現は、イオノマイシン/PMAで処理した好酸球中で見られる（CT=31）。
【０７６３】
Ag6237  CG 112813-05遺伝子の発現は、予想されるプローブもしくは化学的失敗を原因としてこのパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０７６４】
Ag6247  CG 112813-06遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。この遺伝子を用いた1つの実験（258176981実行）による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。
【０７６５】
参考文献：
1. Jeziorska M, Haboubi N, Schofield P, Woolley DE. Distribution and activation of eosinophils in inflammatory bowel disease using an improved immunohistochemical technique. J Pathol 2001 Aug;194(4):484-92.
2. Seegert D, Rosenstiel P, Pfahler H, Pfefferkorn P, Nikolaus S, Schreiber S. Increased expression of IL-16 in inflammatory bowel disease. Gut 2001 Mar;48(3.):326-32.
3. Grip O, Malm J, Veress B, Bjartell A, Lindgren S, Egesten A. Increased presence of cells containing transforming growth factor alpha (TGF-alpha) in ulcerative colitis, both during active inflammation and in remission. Eur J Gastroenterol Hepatol 2000 Jul;12(7):761-6.
4. Trifilieff FA, Fujitani Y, Coyle AJ, Kopf M, Bertrand C. IL-5 deficiency abolishes aspects of airway remodelling in a murine model of lung inflammation. Clin Exp Allergy 2001 Jun;31(6):934-42.
5. Ann. Rev. Immunol. 16:359-93. 1998. NK Cell Receptors. Lanier, Lewis.
6. Yusa S, Catina TL, Campbell KS. SHP-1- and Phosphotyrosine-Independent Inhibitory Signaling by a Killer Cell Ig-Like Receptor Cytoplasmic Domain in Human NK Cells. J Immunol 2002 May l5;l68(10):5047-57, PMID: 11994457.
7. Flodstrom M, Shi FD, Sarvetnick N, Ljunggren HG. The natural killer cell-friend or foe in autoimmune disease? Scand J Immunol 2002 May;55(5):432-41, PMID: 11975754.
【０７６６】
一般腫瘍学スクリーニングパネル_v_2.4のまとめ：Ag4465  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）。
【０７６７】
O.  CG 112869-01：Pecanex様
遺伝子CG 112869-01の発現を、表OAに記載したプライマー-プローブセットAg6810を使用して評価した。
【０７６８】
【表３２４】
2005519629.tif 000325
【０７６９】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag68l0  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプル中で低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０７７０】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag6810  この遺伝子を用いた1つの実験による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。
【０７７１】
パネル4.1Dのまとめ：Ag6810  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプル中で低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０７７２】
P.  CG 113377-01：G1関連ジンクフィンガータンパク質
遺伝子CG 113377-01の発現を、表PAに記載したプライマー-プローブセットAg6802を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表PB、PCおよびPDに示す。
【０７７３】
【表３２５】
2005519629.tif 000326
【０７７４】
【表３２６】
2005519629.tif 000327
【０７７５】
【表３２７】
2005519629.tif 000328
【０７７６】
【表３２８】
2005519629.tif 000329
【０７７７】
【表３２９】
2005519629.tif 000330
【０７７８】
【表３３０】
2005519629.tif 000331
【０７７９】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag6802  このパネルは、アルツハイマー病におけるこの遺伝子のディファレンシャルな発現を示さなかった。しかし、この発現プロファイルによりこの遺伝子が脳に存在することを確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.6を参照されたい。
【０７８０】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag6802  このパネルにおけるこの遺伝子の最も高い発現は、脳腫瘍細胞株中で見られる（CT=26.7）。したがって、この遺伝子の発現は、これらのサンプルをこのパネル上の他のサンプルから区別するため、そして脳腫瘍の存在を検出するためのマーカーとして使用できる。さらに、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、脳腫瘍の治療に有効である可能性がある。
【０７８１】
代謝機能を有する組織間では、この遺伝子は下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、胎児肝、ならびに成人および胎児骨格筋および心臓において中レベルから低レベルで発現される。これらの組織間でのこの広範囲の発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能において役割を果たすこと、そしてこの遺伝子の反対に調節された（disregulated）発現が神経内分泌障害または肥満症および糖尿病のような代謝性疾患に関係している可能性を示唆している。
【０７８２】
この遺伝子は、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むCNS中で中レベルで発現される。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、精神分裂病、脳卒中およびてんかんのような神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０７８３】
パネル4.1Dのまとめ：Ag6802  この遺伝子は、腎臓において最も高度に発現される（CT=31.8）。したがって、この遺伝子の発現は、腎臓由来サンプルをこのパネル上の他のサンプルから区別するため、そして腎臓組織のマーカーとして使用できる。さらに、この遺伝子の発現もしくは機能を治療上の標的とすることにより、腎臓機能を調節することができ、狼瘡および糸球体腎炎を含む腎臓に影響を及ぼす炎症性疾患もしくは自己免疫疾患の治療に有効である可能性がある。
【０７８４】
Q.  CG 113730-01：結節前駆物質
遺伝子CG 113730-01の発現を、表QAに記載したプライマー-プローブセットAg4473を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表QB、QC、QDおよびQEに示す。
【０７８５】
【表３３１】
2005519629.tif 000332
【０７８６】
【表３３２】
2005519629.tif 000333
【０７８７】
【表３３３】
2005519629.tif 000334
【０７８８】
【表３３４】
2005519629.tif 000335
【０７８９】
【表３３５】
2005519629.tif 000336
【０７９０】
【表３３６】
2005519629.tif 000337
【０７９１】
【表３３７】
2005519629.tif 000338
【０７９２】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4473  このパネルは、アルツハイマー病におけるこの遺伝子のディファレンシャルな発現を示さなかった。しかし、この発現プロファイルにより、この遺伝子が脳において低レベルで存在することを確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０７９３】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4473  この遺伝子の最も高い発現は結腸癌細胞株中で見られる（CT=30.9）。この遺伝子はこのパネル上の癌細胞株間で広い範囲にわたって発現されており、脳腫瘍、結腸癌、胃癌、肺癌、乳癌および卵巣癌細胞株中では中レベルから低レベルの発現が見られる。この発現プロファイルは、この遺伝子産物の細胞の生存性および増殖における役割を示唆している。この遺伝子産物の調節は癌の治療に有効である可能性がある。
【０７９４】
代謝機能を有する組織間では、この遺伝子は脂肪、膵臓、ならびに成人および胎児骨格筋、心臓、および肝臓において低いが有意なレベルで発現される。この発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能において役割を果たすこと、そしてこの遺伝子の反対に調節された発現が神経内分泌障害または肥満症および糖尿病のような代謝性疾患に関係している可能性を示唆している。
【０７９５】
この遺伝子は、視床、黒質、小脳および大脳皮質を含むCNS中で低いが有意なレベルで発現される。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、精神分裂病、脳卒中およびてんかんのような神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０７９６】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4473  最も高い発現は、好酸球中で見られる（CT=32.5）。低いが有意な発現は、健康な状態および疾患状態における免疫反応において重要な多数の他の細胞タイプでも見られる。これらの細胞には、Ｔ細胞およびB細胞ファミリーのメンバーが含まれる。このパターンは、一般_スクリーニング_パネル_v1．4の発現プロファイルと一致しており、さらに細胞の生存性および増殖におけるこの遺伝子産物の役割を示唆している。このため、機能的治療薬でのこの遺伝子産物の調節は、これらの細胞タイプと関連する機能の変更をもたらし、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、紅斑性狼瘡、乾癬、関節リウマチおよび変形性骨関節症のような自己免疫および炎症性疾患に罹患している患者の症状の改善をもたらす可能性がある。
【０７９７】
一般腫瘍学スクリーニングパネル_v_2.4のまとめ：Ag4473  この遺伝子はこのパネルにおいて広い範囲にわたって発現されており、最も高い発現は転移性黒色腫で見られる（CT=32.5）。さらに、この遺伝子は前立腺癌中で中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現はこれらの癌のマーカーとして使用できる。さらに、この遺伝子産物の発現もしくは機能の治療による調節は、前立腺癌および黒色腫の治療に有効である可能性がある。
【０７９８】
R.  CG 115187-01およびCG 115187-02：新規のヒト膜貫通型タンパク質
遺伝子CG 115187-01および変異体CG 115187-02の発現を、表RAおよびRBに記載したプライマー-プローブセットAg4480およびAg5587を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表RC、RD、RE、RF、RG、RH、RI、RJおよびRKに示す。
【０７９９】
【表３３８】
2005519629.tif 000339
【０８００】
【表３３９】
2005519629.tif 000340
【０８０１】
【表３４０】
2005519629.tif 000341
【０８０２】
【表３４１】
2005519629.tif 000342
【０８０３】
【表３４２】
2005519629.tif 000343
【０８０４】
【表３４３】
2005519629.tif 000344
【０８０５】
【表３４４】
2005519629.tif 000345
【０８０６】
【表３４５】
2005519629.tif 000346
【０８０７】
【表３４６】
2005519629.tif 000347
【０８０８】
【表３４７】
2005519629.tif 000348
【０８０９】
【表３４８】
2005519629.tif 000349
【０８１０】
【表３４９】
2005519629.tif 000350
【０８１１】
【表３５０】
2005519629.tif 000351
【０８１２】
【表３５１】
2005519629.tif 000352
【０８１３】
【表３５２】
2005519629.tif 000353
【０８１４】
【表３５３】
2005519629.tif 000354
【０８１５】
【表３５４】
2005519629.tif 000355
【０８１６】
AI_包括的パネル_1.0のまとめ：Ag4480  この遺伝子はこのパネル上の多数のサンプル中で低レベルで広い範囲にわたって発現されており、最も高い発現は正常な肺中で見られる（CT=31.5）。自己免疫疾患におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル4.1Dを参照されたい。
【０８１７】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4480  このパネルは、アルツハイマー病におけるこの遺伝子のディファレンシャルな発現を示さなかった。しかし、この発現プロファイルによりこの遺伝子が脳に存在することを確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０８１８】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4480  このパネルにおけるこの遺伝子の最も高い発現は黒色腫細胞株中で見られ（CT=27）、中レベルの発現は脳腫瘍細胞株中で見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらのサンプルをこのパネル上の他のサンプルから区別するため、そして黒色腫の存在を検出するためのマーカーとして使用できる。さらに、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は黒色腫の治療に有効である可能性がある。
【０８１９】
代謝機能を有する組織間では、この遺伝子は下垂体、脂肪、副腎、膵臓、心臓ならびに成人および胎児骨格筋において低いが有意なレベルで発現される。これらの組織間でのこの広範囲の発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能において役割を果たすこと、そしてこの遺伝子の反対に調節された発現が神経内分泌障害または肥満症および糖尿病のような代謝性疾患に関係している可能性を示唆している。
【０８２０】
この遺伝子は、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むCNS中で中レベルで発現される。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、精神分裂病、脳卒中およびてんかんのような神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０８２１】
一般_スクリーニング_パネル_v1.5のまとめ：Ag4480  この遺伝子の最も高い発現は脳腫瘍細胞株中で見られる（CT=30）。この遺伝子はこのパネルにおいて広い範囲にわたって発現されており、脳腫瘍、結腸癌、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および黒色腫細胞株中では中レベルの発現が見られる。この発現プロファイルは、この遺伝子産物の細胞の生存性および増殖における役割を示唆している。この遺伝子産物の調節は癌の治療に有効である可能性がある。
【０８２２】
代謝機能を有する組織間では、この遺伝子は下垂体、副腎、膵臓、甲状腺、ならびに成人および胎児骨格筋、心臓、および肝臓において中レベルから低レベルで発現される。これらの組織間でのこの広範囲の発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能において役割を果たすこと、そしてこの遺伝子の反対に調節された発現が神経内分泌障害または肥満症および糖尿病のような代謝性疾患に関係している可能性を示唆している。
【０８２３】
この遺伝子は、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むCNS中で低いが有意なレベルで発現される。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、精神分裂病、脳卒中およびてんかんのような神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０８２４】
Ag5887  この遺伝子を用いた1つの実験による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。
【０８２５】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag4480  このパネルにおけるこの遺伝子の最も高い発現は黒色腫細胞株中で見られ（CT=28）、中レベルの発現は脳腫瘍および卵巣癌細胞株中で見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらのサンプルをこのパネル上の他のサンプルから区別するため、そして黒色腫の存在を検出するためのマーカーとして使用できる。さらに、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は黒色腫の治療に有効である可能性がある。
【０８２６】
代謝機能を有する組織間では、この遺伝子は下垂体、脂肪、副腎、心臓および胎児骨格筋において低いが有意なレベルで発現される。これらの組織間でのこの広範囲の発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能において役割を果たすこと、そしてこの遺伝子の反対に調節された発現が神経内分泌障害または肥満症および糖尿病のような代謝性疾患に関係している可能性を示唆している。
【０８２７】
この遺伝子は、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むCNS中で中レベルから低レベルで発現される。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、精神分裂病、脳卒中およびてんかんのような神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０８２８】
HASSパネルv1.0のまとめ：Ag4480  この遺伝子は、このパネル上のU87-MG細胞株および神経膠腫サンプル中で中レベルで発現されており、このことは脳腫瘍におけるその役割を示唆している。最も高い発現は、神経膠腫サンプル中で見られる（CT=28.55）。血清飢餓はU87-MG細胞中でのこの遺伝子の発現を誘発しが、このことは血管新生が少ない脳腫瘍の領域についてのマーカーとしてこれを使用できることを示唆している。
【０８２９】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4480  同じプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験は、穏当に一致する結果を生じ、最も高い発現はLPSで活性化した単球中で見られる（CTs=32）。これとは対照的に、休止単球中では発現を検出できない（CT=36-37）。休止および活性化された樹状細胞およびマクロファージ中では低いが実質的なレベルの発現が見られる。これらの転写物の発現パターンに基づくと、この遺伝子産物は単球の活性化および分化に関係している可能性がある。このため、この遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体は、単球の活性化もしくは分化が原因である炎症を減少もしくは阻害して、喘息および関節炎のような疾患の治療に有効である可能性がある。［Anrei ChapovalGPDP］
【０８３０】
パネル5Dのまとめ：Ag5887  この遺伝子の最も高い発現は脂肪中で見られ（CT=31.3）、脂肪および骨格筋から誘導された一群のサンプル中では低いが有意なレベルの発現が検出される。代謝性疾患におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０８３１】
一般腫瘍学スクリーニングパネル_v_2.4のまとめ：Ag4480  この遺伝子の最も高い発現は黒色腫サンプル中で見られる（CT=29.7）。中レベルの発現は、黒色腫由来一群のサンプル中でも検出される。したがって、この遺伝子の発現は、このパネル上でこれらのサンプルと他のサンプルとを区別するため、そして黒色腫の存在を検出するためのマーカーとして使用できる。さらに、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は黒色腫の治療に有効である可能性がある。
【０８３２】
S.  CG 115187-03：膜貫通型タンパク質
全長の物理的クローンCG 115187-03の発現を、表SAおよびSBに記載したプライマー-プローブセットAg5929およびAg5887を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表SC、SDおよびSEに示す。
【０８３３】
【表３５５】
2005519629.tif 000356
【０８３４】
【表３５６】
2005519629.tif 000357
【０８３５】
【表３５７】
2005519629.tif 000358
【０８３６】
【表３５８】
2005519629.tif 000359
【０８３７】
【表３５９】
2005519629.tif 000360
【０８３８】
【表３６０】
2005519629.tif 000361
【０８３９】
【表３６１】
2005519629.tif 000362
【０８４０】
AI_包括的パネル_1.0のまとめ：Ag5929  この遺伝子はこのパネル上の多数のサンプル中で低レベルで広い範囲にわたって発現されており、最も高い発現は正常肺中で見られる（CT=28）。
【０８４１】
一般スクリーニング_パネル_1.5のまとめ：Ag4480  この遺伝子の最も高い発現は脳腫瘍細胞株中で見られる（CT=30）。この遺伝子はこのパネルにおいて広い範囲にわたって発現されており、脳腫瘍、結腸癌、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および黒色腫細胞株中では中レベルの発現が見られる。この発現プロファイルは、この遺伝子産物の細胞の生存性および増殖における役割を示唆している。この遺伝子産物の調節は癌の治療に有効である可能性がある。
【０８４２】
代謝機能を有する組織間では、この遺伝子は下垂体、副腎、膵臓、甲状腺、ならびに成人および胎児骨格筋、心臓、および肝臓において中レベルから低レベルで発現される。これらの組織間でのこの広範囲の発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能において役割を果たすこと、そしてこの遺伝子の反対に調節された発現が神経内分泌障害または肥満症および糖尿病のような代謝性疾患に関係している可能性を示唆している。
【０８４３】
この遺伝子は、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むCNS中で低いが有意なレベルで発現される。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、精神分裂病、脳卒中およびてんかんのような神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０８４４】
Ag5887  この遺伝子を用いた1つの実験による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。
【０８４５】
パネル4.1Dのまとめ：Ag5929  この遺伝子の最も高い発現は、LPSで活性化した単球およびIL-9で処理したNCI-H292細胞中で見られる（CTs=31.3）。これとは対照的に、休止単球中では発現を検出できない（CTs=36-37）。休止および活性化樹状細胞およびマクロファージ中では、低いが実質的なレベルの発現が見られる。この転写物の発現パターンに基づくと、この遺伝子産物は単球の活性化および分化に関係している可能性がある。このため、この遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体は、単球の活性化もしくは分化が原因である炎症を減少もしくは阻害して、喘息および関節炎のような疾患の治療において重要である可能性がある。さらに、この転写物はNCI-H292細胞から誘導された一群のサンプル中で発現される。これらの細胞の処理は、この粘膜-類表皮細胞株内でのこの転写物の発現を有意に変化させるとは思われない。したがって、このタンパク質を使用して、NCI-H292に類似する一定の肺腫瘍を同定することができる。このコードされるタンパク質は、肺内の杯状細胞の正常な機能にも関係している可能性がある。このため、このタンパク質に対する治療薬を設計することは肺気腫および喘息ならびにそれらが産生する杯状細胞もしくは粘膜が病理学的結果を有する他の肺疾患の治療に有効である可能性がある。
【０８４６】
パネル5Dのまとめ：Ag5887  この遺伝子の最も高い発現は脂肪中で見られ（CT=31.3）、脂肪および骨格筋から誘導された一群のサンプル中では低いが有意なレベルの発現が検出される。代謝性疾患におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０８４７】
T.  CG 115540-01：コラーゲン三重らせん繰り返し配列を含有する新規の膜タンパク質
遺伝子CG 115540-01の発現を、表TAに記載したプライマー-プローブセットAg4483を使用して評価した。
【０８４８】
【表３６２】
2005519629.tif 000363
【０８４９】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4483  CG 115540-01遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０８５０】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4483  CG 115540-01遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０８５１】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4483  CG 115540-01遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０８５２】
一般腫瘍学スクリーニングパネル_v_2.4のまとめ：Ag4483  CG 115540-01遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０８５３】
U.  CG 118689-01：ウロプラキン1bスプライス変異体
遺伝子CG 118689-01の発現を、表UAおよびUBに記載したプライマー-プローブセットAg4485およびAg4484を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表UC、UD、UEおよびUFに示す。
【０８５４】
【表３６３】
2005519629.tif 000364
【０８５５】
【表３６４】
2005519629.tif 000365
【０８５６】
【表３６５】
2005519629.tif 000366
【０８５７】
【表３６６】
2005519629.tif 000367
【０８５８】
【表３６７】
2005519629.tif 000368
【０８５９】
【表３６８】
2005519629.tif 000369
【０８６０】
【表３６９】
2005519629.tif 000370
【０８６１】
【表３７０】
2005519629.tif 000371
【０８６２】
【表３７１】
2005519629.tif 000372
【０８６３】
【表３７２】
2005519629.tif 000373
【０８６４】
【表３７３】
2005519629.tif 000374
【０８６５】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4484/Ag4485  2種のプローブ-プライマーセットを用いた4回の実験の結果は極めて良好に一致しており、CG 118689-01遺伝子の最も高い発現は肺癌および卵巣癌から誘導された2種の癌細胞株中で見られる（CTs=27.9-32）。さらに、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、扁平上皮細胞癌および脳腫瘍から誘導された多数の癌細胞株中でも見られる。このため、この遺伝子の発現は、これらの癌の検出のための診断マーカーとして使用することができ、そしてこの遺伝子の治療による調節はこれらの癌の治療に有効である可能性がある。
【０８６６】
CG 118689-01遺伝子は、ウロプラキン1B（UPK1B）のスプライス変異体をコードする。UPK1Bは、構造タンパク質であり、哺乳動物の膀胱の先端面上の非対称単位膜の末端分化構成要素である。UPK1Bは、その多くが癌において発現パターンが統制解除されているテトラスパンファミリーのタンパク質のメンバーである。UPK1B mRNAは、移行上皮性膀胱癌および一部の膀胱癌細胞株中でダウンレギュレートされることが証明されている（Finchら, 1999, Int J Cancer 80(4):533-8; PMID:9935153）。このため、この遺伝子によりコードされるUPK1Bタンパク質の治療による調節は膀胱癌の治療に有効である可能性がある。
【０８６７】
この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、脂肪および膵臓でも見られる。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０８６８】
この遺伝子を用いた3回の実験（Ag4484：217218123実行および218333106実行；Ag4485：218981791実行）による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。
【０８６９】
腫瘍学_細胞_株_スクリーニング_パネル_v3.1のまとめ：Ag4484/Ag4485  2種の異なるプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験は良好に一致し、CG 118689-01遺伝子の最も高い発現は胃癌および膀胱癌細胞株中で見られる（CTs=28.4-31.7）。さらに、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、腎臓癌および舌癌細胞株でも見られる。このため、この遺伝子の治療による調節はこれらの癌の治療に有効である可能性がある。
【０８７０】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4485  CG 118689-01遺伝子の最も高い発現は、TNFα＋IL-1βで処理した末梢気道上皮中で見られる（CT=33.5）。このため、この遺伝子の発現を使用して、このサンプルをこのパネル中で使用した他のサンプルから区別することができる。さらに、抗体もしくは小分子治療薬の適用によるこの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現もしくは活性の治療による調節は、喘息、COPD、および肺気腫の治療に有効である可能性がある。
【０８７１】
さらに、この遺伝子の低レベルの発現は腎臓サンプル中でも見られる。このため、この遺伝子の治療による調節は、紅斑性狼瘡および糸球体腎炎を含む、腎臓に影響を及ぼす炎症性疾患および自己免疫疾患の治療に有効である可能性がある。
【０８７２】
Ag4485  これらの遺伝子を用いた1つの実験による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。
【０８７３】
一般腫瘍学スクリーニングパネル_v_2.4のまとめ：Ag4484/Ag4485  2種の異なるプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験の結果は素晴らしく一致し、CG 118689-01遺伝子の最も高い発現は扁平上皮細胞癌中で見られる（CT=27.5-33.7）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、腎臓癌および膀胱癌でも見られる。この遺伝子の発現は、対応する対照サンプルと比較して癌において高い。このため、この遺伝子の発現は腎臓癌および前立腺癌の存在を検出するための診断マーカーとして使用できる。さらに、この遺伝子によりコードされるタンパク質の治療による調節はこれらの癌の治療に有効である可能性がある。この遺伝子の有用性についての詳細な考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０８７４】
V.  CG 118689-02：ウロプラキン1B
全長の物理的クローンCG 118689-02の発現を、表VAに記載したプライマー-プローブセットAg6811を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表VBおよびVCに示す。
【０８７５】
【表３７４】
2005519629.tif 000375
【０８７６】
【表３７５】
2005519629.tif 000376
【０８７７】
【表３７６】
2005519629.tif 000377
【０８７８】
【表３７７】
2005519629.tif 000378
【０８７９】
【表３７８】
2005519629.tif 000379
【０８８０】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag6811  CG 118689-02遺伝子の発現は、このパネルのサンプルのすべてにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０８８１】
一般_スクリーニング_パネル_v1.6のまとめ：Ag6811  CG 118689-02遺伝子の最も高い発現は、卵巣癌OVCAR-3細胞株中で検出される（CT=27.3）。
【０８８２】
さらに、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、扁平上皮細胞癌および脳腫瘍から誘導された多数の癌細胞株中でも見られる。このため、この遺伝子の発現は、これらの癌の検出のための診断マーカーとして使用することができ、そしてこの遺伝子の治療による調節はこれらの癌の治療に有効である可能性がある。
【０８８３】
CG 118689-01遺伝子は、ウロプラキン1B（UPK1B）のスプライス変異体をコードする。UPK1Bは、構造タンパク質であり、哺乳動物の膀胱の先端面上の非対称単位膜の末端分化構成要素である。UPK1Bは、その多くが癌において発現パターンが統制解除されているテトラスパンファミリーのタンパク質のメンバーである。UPK1B mRNAは、移行上皮性膀胱癌および一部の膀胱癌細胞株中でダウンレギュレートされることが証明されている（Finchら, 1999, Int J Cancer 80(4):533-8; PMID:9935153）。このため、この遺伝子によりコードされるUPK1Bタンパク質の治療による調節は膀胱癌の治療に有効である可能性がある。
【０８８４】
この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、脂肪および脊髄サンプルでも見られる。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患および脊髄に影響を及ぼす疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０８８５】
パネル4.1Dのまとめ：Ag6811  CG 118689-02遺伝子の最も高い発現は、TNFα＋IL-1βで処理された末梢気道上皮中で見られる（CT=33.5）。このため、この遺伝子の発現を使用して、このサンプルをこのパネル中の他のサンプルから区別することができる。さらに、抗体もしくは小分子治療薬の適用によるこの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現もしくは機能の治療による調節は、喘息、COPD、および肺気腫の治療に有効である可能性がある。
【０８８６】
さらに、この遺伝子の低レベルの発現は腎臓サンプル中でも見られる。このため、この遺伝子の治療による調節は、紅斑性狼瘡および糸球体腎炎を含む、腎臓に影響を及ぼす炎症性疾患および自己免疫疾患の治療に有効である可能性がある。
【０８８７】
W.  CG 120748-01：LMBR1ロングフォーム
遺伝子CG 120748-01の発現を、表WAに記載したプライマー-プローブセットAg4507を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表WB、WCおよびWDに示す。
【０８８８】
【表３７９】
2005519629.tif 000380
【０８８９】
【表３８０】
2005519629.tif 000381
【０８９０】
【表３８１】
2005519629.tif 000382
【０８９１】
【表３８２】
2005519629.tif 000383
【０８９２】
【表３８３】
2005519629.tif 000384
【０８９３】
【表３８４】
2005519629.tif 000385
【０８９４】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4507  このパネルは、アルツハイマー病におけるこの遺伝子のディファレンシャルな発現を示さなかった。しかし、この発現プロファイルによりこの遺伝子が脳に存在することを確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０８９５】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4507  この遺伝子の最も高い発現は結腸癌細胞株中で見られる（CT=26）。この遺伝子はこのパネルにおいて広い範囲にわたって発現されており、脳腫瘍、結腸癌、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および黒色腫細胞株中では高レベルから中レベルの発現が見られる。この発現プロファイルは、この遺伝子産物の細胞の生存性および増殖における役割を示唆している。この遺伝子産物の調節は癌の治療に有効である可能性がある。
【０８９６】
代謝機能を有する組織間では、この遺伝子は下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、ならびに成人および胎児骨格筋、心臓、および肝臓において中レベルで発現される。これらの組織間でのこの広範囲の発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能において役割を果たすこと、そしてこの遺伝子の反対に調節された発現が神経内分泌障害または肥満症および糖尿病のような代謝性疾患に関係している可能性を示唆している。
【０８９７】
この遺伝子は、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むCNS中で高レベルから中レベルで発現される。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、精神分裂病、脳卒中およびてんかんのような神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０８９８】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4507  この遺伝子は、健康な状態および疾患状態の免疫反応に重要である広範囲の細胞タイプにおいて中レベルから低レベルで発現されており、最も高い発現は未処理の肺微小血管内皮細胞中で見られる（CT=28.4）。さらに、発現はT細胞、B細胞、内皮細胞、マクロファージ/単球、および末梢血単核細胞ファミリーのメンバーならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞タイプ、ならびに結腸、肺、胸腺および腎臓によって代表される正常組織でも見られる。この偏在性の発現パターンは、この遺伝子産物がこれらやその他の細胞タイプおよび組織についての恒常性プロセスに関係している可能性を示唆している。このパターンは、一般_スクリーニング_パネル_v1．5の発現プロファイルと一致しており、さらに細胞の生存性および増殖におけるこの遺伝子産物の役割を示唆している。このため、機能的治療薬でのこの遺伝子産物の調節は、これらの細胞タイプと関連する機能の変更をもたらし、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、紅斑性狼瘡、乾癬、関節リウマチおよび変形性骨関節症のような自己免疫および炎症性疾患に罹患している患者の症状の改善をもたらす可能性がある。
【０８９９】
X.  CG 121519-01：新規のLDLレセプタードメインを含有しているタンパク質
遺伝子CG 121519-01の発現を、表XAに記載したプライマー-プローブセットAg4512を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表XB、XCおよびXDに示す。
【０９００】
【表３８５】
2005519629.tif 000386
【０９０１】
【表３８６】
2005519629.tif 000387
【０９０２】
【表３８７】
2005519629.tif 000388
【０９０３】
【表３８８】
2005519629.tif 000389
【０９０４】
【表３８９】
2005519629.tif 000390
【０９０５】
【表３９０】
2005519629.tif 000391
【０９０６】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4512  このパネルにより、無関係な個体の群の脳における低レベルでのCG 121519-01遺伝子の発現を確認する。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質においてわずかにアップレギュレートされることを見出した。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、ニューロン死を減少させ、この疾患の治療に有効である可能性がある。
【０９０７】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4512  CG 121519-01遺伝子の最も高い発現は、乳癌MCF-7細胞株中で検出される（CT=28）。さらに、この遺伝子の中レベルの発現は、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌および脳腫瘍から誘導された多数の癌細胞株中でも検出される。このため、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するための診断マーカーとして使用することができ、そしてこの遺伝子の治療による調節はこれらの癌の治療に有効である可能性がある。
【０９０８】
代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、胎児肝臓および消化管において中レベルから低レベルで発現される。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０９０９】
興味深いことに、この遺伝子は成人肝（CT=40）と比較すると胎児（CT=34.2）中ではるかに高レベルで発現される。この観察は、この遺伝子の発現を使用して胎児肝を成人肝から区別できることを示唆している。さらに、胎児肝中のこの遺伝子の相対過剰発現は、このタンパク質産物が胎児における肝の成長もしくは発達を増強することができる、したがって成人の再生能力においても機能できる可能性を示唆している。このため、この遺伝子によりコードされるタンパク質の治療による調節は肝関連疾患の治療に有用である。
【０９１０】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において中レベルから低レベルで発現される。このため、この遺伝子産物の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病のような中枢神経系疾患の治療に有効である可能性がある。
【０９１１】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4512  CG 121519-01遺伝子の最も高い発現は、結腸で検出される（CT=31.1）。この遺伝子の低レベルの発現は、肺、腎臓および胸腺でも見られる。この遺伝子の発現は正常組織に限定されるようである。このため、この遺伝子の発現を使用して、結腸、肺、腎臓および胸腺によって代表される正常組織をこのパネル中で使用した他のサンプルから区別することができる。さらに、この遺伝子の治療による調節は、IBD、クローン病、潰瘍性大腸炎、紅斑性狼瘡、糸球体腎炎、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫を含むこれらの組織に影響を及ぼす炎症性疾患および自己免疫疾患の治療に有効である可能性がある。
【０９１２】
Y.  CG 122176-01：Fnドメインを含有している膜タンパク質
遺伝子CG 122176-01の発現を、表YAに記載したプライマー-プローブセットAg4524を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表YB、YCおよびYDに示す。
【０９１３】
【表３９１】
2005519629.tif 000392
【０９１４】
【表３９２】
2005519629.tif 000393
【０９１５】
【表３９３】
2005519629.tif 000394
【０９１６】
【表３９４】
2005519629.tif 000395
【０９１７】
【表３９５】
2005519629.tif 000396
【０９１８】
【表３９６】
2005519629.tif 000397
【０９１９】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4524  このパネルにより、無関係な個体の群の脳におけるこの遺伝子の中レベルから高レベルでの発現を確認する。しかし、この実験のアルツハイマー病に罹患した死後脳と痴呆ではない対照の死後脳との間では、この遺伝子の発現の差は検出されなかった。中枢神経系障害の治療におけるこの遺伝子の潜在的有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０９２０】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4524  CG 122176-01遺伝子の発現は、骨格筋において最も高い（CT=26.1）。一般に、この遺伝子の発現は癌細胞株と比較して正常な組織において高いようである。このため、小分子薬、タンパク質治療薬もしくは抗体の使用によるこの遺伝子もしくはそのタンパク質産物の活性の治療による調節は、癌の治療に有効である可能性がある。
【０９２１】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において高レベルから中レベルで発現される。このため、この遺伝子は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病のような中枢神経系疾患において役割を果たす可能性がある。
【０９２２】
代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において低レベルから中レベルで発現される。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０９２３】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4524  CG 122176-01遺伝子の発現は、インターフェロンγ（CT=32.5）もしくはIL-4（CT=33.5）で処理した皮膚線維芽細胞において最も高い。このため、この遺伝子の発現を使用して、皮膚線維芽細胞をこのパネル上の他のサンプルから区別することができる。さらにその上、処理された皮膚線維芽細胞中でのこの遺伝子の発現は、この遺伝子産物が乾癬を含む皮膚障害に関係している可能性を示唆している。さらに、正常な肺および腎臓組織においても低レベルの発現が見られる。
【０９２４】
Z.  CG 122691-01：Fn3/TSPN/コラーゲンドメインを含有しているタンパク質
遺伝子CG 122691-01の発現を、表ZAに記載したプライマー-プローブセットAg4531を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表ZB、ZCおよびZDに示す。
【０９２５】
【表３９７】
2005519629.tif 000398
【０９２６】
【表３９８】
2005519629.tif 000399
【０９２７】
【表３９９】
2005519629.tif 000400
【０９２８】
【表４００】
2005519629.tif 000401
【０９２９】
【表４０１】
2005519629.tif 000402
【０９３０】
【表４０２】
2005519629.tif 000403
【０９３１】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4531  このパネルは、アルツハイマー病におけるこの遺伝子のディファレンシャルな発現を示さなかった。しかし、この発現プロファイルによりこの遺伝子が脳に存在することを確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル1.4を参照されたい。
【０９３２】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4531  この遺伝子の発現は、このパネルにおいては脳でのみ見られ、最も高い発現は胎児脳中で見られる（CT=32.7）。このため、この遺伝子の発現を使用して、脳組織と非ニューロン組織との間を区別することができる。さらにその上、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、精神分裂病、脳卒中およびてんかんのような神経疾患の治療に有効である可能性がある。
【０９３３】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4531  この遺伝子の発現は、このパネルにおいては腎臓のみに限定された（CT=32.9）。したがって、この遺伝子の発現は、腎臓由来サンプルをこのパネル上の他のサンプルから区別するため、そして腎臓組織のマーカーとして使用できる。さらに、この遺伝子の発現もしくは機能を治療上の標的とすることにより、腎臓機能を調節することができ、狼瘡および糸球体腎炎を含む腎臓に影響を及ぼす炎症性疾患もしくは自己免疫疾患の治療に有効である可能性がある。
【０９３４】
AA.  CG 122863-01およびCG 122863-02：新規の膜タンパク質
遺伝子CG 122863-01および全長の物理的クローンCG 122863-02の発現を、表AAAに記載したプライマー-プローブセットAg4542を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表AABおよびAACに示す。CG 122863-02は、CG 122863-01遺伝子の全長の物理的クローンを表しており、これにより遺伝子配列の予測を確認することに注目されたい。
【０９３５】
【表４０３】
2005519629.tif 000404
【０９３６】
【表４０４】
2005519629.tif 000405
【０９３７】
【表４０５】
2005519629.tif 000406
【０９３８】
【表４０６】
2005519629.tif 000407
【０９３９】
【表４０７】
2005519629.tif 000408
【０９４０】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag4542  この遺伝子の発現は、このパネル上のすべてのサンプルにわたり低/検出不能である（CT>35）（データは示していない）。
【０９４１】
一般_スクリーニング_パネル_v1.4のまとめ：Ag4542  CG 122863-01遺伝子の発現は、乳癌細胞株において最も高い（CT=31）。さらにその上、CG 122863-01遺伝子の発現は、それらの正常組織対照と比較すると乳癌および腎臓癌細胞株のサブセットにおいてアップレギュレートされるようである。このため、小分子薬、タンパク質治療薬もしくは抗体の使用によるこの遺伝子もしくはそのタンパク質産物の活性の治療による調節は、腎臓癌および乳癌の治療に有効である可能性がある。
【０９４２】
代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は脂肪、副腎および胎児肝臓において低レベルで発現される。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０９４３】
興味深いことに、この遺伝子は成人組織と比較すると胎児肝および肺において高レベルで発現される。このため、この遺伝子の発現を使用して、成人および胎児の肝臓もしくは肺を区別することができる。
【０９４４】
パネル4.1Dのまとめ：Ag4542  CG 122863-01遺伝子の発現は、TNFα＋IL-1βで処理されたHPAECsにおいて最も高い（CT=30.9）。
【０９４５】
一般に、この転写物は内皮細胞中で高レベルで発現される。IL-1βおよびTNFαでの処理は、HPAEC、HUVEC、微小血管皮膚ECおよび肺微小血管ECを含む内皮サンプル中で一貫して転写物レベルを増加させる。このため、この遺伝子もしくはそのタンパク質産物の活性の治療による調節は、喘息、IBDおよび乾癬の間の炎症の主要な構成要素である白血球管外遊出を含む内皮細胞機能を調節することにおいて重要であり得る。
【０９４６】
この遺伝子の中レベルの発現は、PMA/イオノマイシンで処理されたリンホカインで活性化されたキラー細胞（LAK）中で検出される。これらの細胞は、ウイルスおよび細菌に感染した細胞ならびに腫瘍の腫瘍免疫学および細胞クリアランスに関係している。このため、小分子薬もしくは抗体の投与によるこの遺伝子によりコードされるタンパク質の機能の調節は、これらの細胞の機能を変化させ、これらの状態に関連する症状の改善をもたらす可能性がある。
【０９４７】
AB.  CG 50880-04：ノイロトリミン
全長の物理的クローンCG 50880-04の発現を、表ABAに記載したプライマー-プローブセットAg93を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表ABB、ABC、ABDおよびABEに示す。
【０９４８】
【表４０８】
2005519629.tif 000409
【０９４９】
【表４０９】
2005519629.tif 000410
【０９５０】
【表４１０】
2005519629.tif 000411
【０９５１】
【表４１１】
2005519629.tif 000412
【０９５２】
【表４１２】
2005519629.tif 000413
【０９５３】
【表４１３】
2005519629.tif 000414
【０９５４】
【表４１４】
2005519629.tif 000415
【０９５５】
【表４１５】
2005519629.tif 000416
【０９５６】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag93  このパネルにより、無関係な個体の群の脳における低レベルでのCG 50880-04遺伝子の発現を確認する。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質においてわずかにダウンレギュレートされることを見いだした。このため、この遺伝子もしくはそのタンパク質産物のアップレギュレーション、またはこのレセプターの特異的アゴニストでの治療は、この疾患に関連する痴呆、記憶喪失、およびニューロン死を逆転させることに有用である可能性がある。
【０９５７】
パネル1のまとめ：Ag93  同じプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験の結果は素晴らしく一致しており、CG 50880-04遺伝子の最も高い発現は小脳中で見られる（CT=23）。さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において高レベルで発現される。この遺伝子は、神経細胞接着分子のIgLONファミリーに属するノイロトリミン（Ntm）のスプライス変異体をコードする。Ntmは、視床皮質および橋小脳突起部の発達において役割を果たす。Ntmは同種親和性接着を媒介し、DRGニューロンの生長を促進する。しかし、膜結合したNtmおよび可溶性Ntmはいずれも交感神経ニューロンの生長を阻害する（Gilら, 1998, J Neurosci 18(22): 9312-25, PMID:9801370）。このため、この遺伝子産物の治療による調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病のような中枢神経系疾患の治療に有効である可能性がある。
【０９５８】
この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、黒色腫、肺癌、腎臓癌および脳腫瘍から誘導された多数の癌細胞株中でも見られる。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、黒色腫、肺癌、腎臓癌および脳腫瘍の治療に有効である可能性がある。
【０９５９】
代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において中レベルで発現される。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０９６０】
パネル1.3Dのまとめ：Ag93  CG 50880-04遺伝子の最も高い発現は、小脳中で検出される（CT=26.5）。さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において高レベルで発現される。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、黒色腫、肺癌、腎臓癌、結腸癌、肝臓癌および脳腫瘍から誘導された多数の癌細胞株中でも見られる。このため、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、黒色腫、肺癌、腎臓癌、結腸癌、肝臓癌および脳腫瘍の治療に有効である可能性がある。代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において中レベルで発現される。この遺伝子の有用性についての詳細な考察についてはパネル1を参照されたい。
【０９６１】
パネル2Dのまとめ：Ag93  CG 50880-04遺伝子を用いた1つの実験による結果は含まれていない。ampプロットは、この実行に関して実験上の困難があることを示している。
【０９６２】
パネル4Dのまとめ：Ag93  CG 50880-04遺伝子の最も高い発現は、サイトカインで処理された肺線維芽細胞中で検出される（CT=27.5）。この遺伝子の最も高い発現は、サイトカインで処理したおよび未処理の肺線維芽細胞および皮膚線維芽細胞中で検出される。したがって、この遺伝子の発現を使用して、線維芽細胞をこのパネル中で使用した他のサンプルから区別することができる。さらに、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、HUVEC、HPAEC、肺微小血管内皮細胞を含む内皮細胞、TNFα＋IL-1βで処理された気管支上皮細胞、末梢気管上皮、星状膠細胞（アストロサイト）、角質細胞、サイトカインで処理されたNCI-H292細胞、肝硬変および狼瘡腎臓サンプルならびに肺、結腸、胸腺および腎臓によって代表される正常組織中でも検出される。したがって、この遺伝子によってコードされるNtmタンパク質の治療による調節は、乾癬、喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、クローン病や潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、紅斑性狼瘡、糸球体腎炎および肝硬変のような結腸、腎臓、肺、心臓および脳に影響を及ぼす炎症性疾患および自己免疫疾患の治療に有効である可能性がある。
【０９６３】
さらに、この遺伝子の中レベルの発現は、活性化されたナイーブT細胞を提示する活性化されたCD45RA CD4リンパ球（CT=30.5）中でも見られる。活性化された記憶T細胞（CD45RO CD4リンパ球）またはCD4 Th1もしくはTh2細胞、休止CD4細胞中では、この遺伝子の発現は強度にダウンレギュレートされており（CT=40）、このことはナイーブT細胞の分化もしくは活性化におけるこの推定タンパク質の役割を示唆している。したがって、この遺伝子によってコードされるNtmタンパク質の発現および/または活性の調節は、例えば関節炎、乾癬、IBDおよび喘息のような自己免疫疾患およびT細胞媒介性疾患の管理に有用である可能性がある。
【０９６４】
AA.  CG 51923-01およびCG 51923-02：プロトカドヘリン FAT2
遺伝子CG 51923-01および変異体CG 51923-02の発現を、表ACA、ACB、ACC、ACDおよびACＥに記載したプライマー-プローブセットAg395、Ag706、Ag888、Ag944およびAg945を使用して評価した。RTQ-PCRの実行の結果を、表ACF、ACG、ACH、ACI、ACJ、ACKおよびACLに示す。
【０９６５】
【表４１６】
2005519629.tif 000417
【０９６６】
【表４１７】
2005519629.tif 000418
【０９６７】
【表４１８】
2005519629.tif 000419
【０９６８】
【表４１９】
2005519629.tif 000420
【０９６９】
【表４２０】
2005519629.tif 000421
【０９７０】
【表４２１】
2005519629.tif 000422
【０９７１】
【表４２２】
2005519629.tif 000423
【０９７２】
【表４２３】
2005519629.tif 000424
【０９７３】
【表４２４】
2005519629.tif 000425
【０９７４】
【表４２５】
2005519629.tif 000426
【０９７５】
【表４２６】
2005519629.tif 000427
【０９７６】
【表４２７】
2005519629.tif 000428
【０９７７】
【表４２８】
2005519629.tif 000429
【０９７８】
【表４２９】
2005519629.tif 000430
【０９７９】
【表４３０】
2005519629.tif 000431
【０９８０】
【表４３１】
2005519629.tif 000432
【０９８１】
【表４３２】
2005519629.tif 000433
【０９８２】
【表４３３】
2005519629.tif 000434
【０９８３】
【表４３４】
2005519629.tif 000435
【０９８４】
【表４３５】
2005519629.tif 000436
【０９８５】
【表４３６】
2005519629.tif 000437
【０９８６】
CNS_神経変性_v1.0のまとめ：Ag888  同じプローブ-プライマーセットを用いた2回の実験は良好に一致する。このパネルにより、無関係な個体の群の脳における低レベルでのCG 51923-01遺伝子の発現を確認する。しかし、この実験のアルツハイマー病に罹患した死後脳と痴呆ではない対照の死後脳との間では、この遺伝子の発現の差は検出されなかった。中枢神経系障害の治療におけるこの遺伝子の潜在的有用性の考察についてはパネル1.1を参照されたい。
【０９８７】
パネル1.1のまとめ：Ag395  CG 51923-01遺伝子の最も高い発現は、小脳中で検出される（CT=21）。このため、この遺伝子の発現を使用して、小脳をこのパネル中で使用した他のサンプルから区別することができる。さらに、この遺伝子の高レベルから中レベルの発現は、扁桃、海馬、黒質、視床、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域において見られる。この遺伝子は、ショウジョウバエ癌抑制遺伝子fatのホモログであるプロトカドヘリンFat2タンパク質をコードする。プロトカドヘリンは、例えば細胞接着、細胞骨格の形成および形態発生のような多数の生物学的プロセスに関係している分子のカドヘリンスーパーファミリーに属する膜貫通型糖タンパク質である。プロトカドヘリンは、概して中等度の接着活性しか示さず、神経系で高度に発現される。FAT2はカドヘリンスーパーファミリー内で孤立した位置を占有するが、それはそれらが古典的カドヘリン繰り返し配列と一緒にEGFドメインを含有しているからである（Nolletら, 2000, J Mol Biol 299(3):551-72, PMID:10835267）。カドヘリンは、特に発育の間と傷害に反応して、軸策誘導および細胞接着タンパク質として機能することができる（Ranscht B.,2000, Int. J. Dev. Neurosci. 18:643-651, PMID:10978842）。したがって、このタンパク質のレベルの操作はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳変性運動失調、進行性核上性麻痺、ALS、頭部外傷、脳卒中、または神経消失と関連する他の疾患/状態におけるニューロン死に応答して代償性シナプスの発生を誘導することにおいて有用である可能性がある。
【０９８８】
この遺伝子の中レベルから高レベルの発現は、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫および脳腫瘍から誘導された1群の癌細胞株中でも見られる。したがって、この遺伝子の発現もしくは機能の治療による調節は、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫および脳腫瘍の治療に有効である可能性がある。
【０９８９】
代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において高レベルから中レベルで発現される。このため、この遺伝子の活性の治療による調節が、例えば肥満症および糖尿病のような内分泌/代謝性関連疾患の治療に有効である可能性が示されている。
【０９９０】
パネル1.2のまとめ：Ag706/Ag888  2種のプローブ-プライマーセットを用いた4回の実験の結果は極めて良好に一致する。CG 51923-01遺伝子の最も高い発現は、小脳および卵巣癌細胞株中で検出される（CT=23-25）。さらに、この遺伝子の高レベルから中レベルの発現は、扁桃、海馬、黒質、視床、大脳皮質および脊髄を含む検査した中枢神経系のすべての領域、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫および脳腫瘍から誘導された1群の癌細胞株中で見られる。代謝機能もしくは内分泌機能を有する組織間では、この遺伝子は膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において高レベルから中レベルで発現される。この遺伝子の有用性についての詳細な考察についてはパネル1.1を参照されたい。
【０９９１】
パネル1.3Dのまとめ：Ag888  CG 51923-01遺伝子の最も高い発現は、小脳中で検出される（CT=27）。さらに、この遺伝子の中レベルの発現は卵巣癌から誘導された2種の癌細胞株でも見られる。この遺伝子の有用性についての詳細な考察についてはパネル1.1を参照されたい。
【０９９２】
パネル2Dのまとめ：Ag395/Ag888  2種のプローブ-プライマーセットを用いた3回の実験の結果は良好に一致する。CG 51923-01遺伝子の最も高い発現は、2種の肺癌細胞株および対照乳房サンプル中で検出される（CT=29-32）。この遺伝子の中レベルの発現は、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、肺癌、および前立腺癌から誘導されたサンプル中でも見られる。この遺伝子の発現は、それらの対応する対照サンプルと比較して卵巣癌、膀胱癌、および肺癌中で高い。したがって、この遺伝子の発現はこれらの癌の検出のための診断マーカーとして使用できる。さらに、抗体もしくは小分子薬の使用によるこの遺伝子によりコードされたプロトカドヘリンの治療による調節は、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、肺癌、および前立腺癌の治療に有効である可能性がある。
【０９９３】
パネル3Dのまとめ：Ag395  CG 51923-01遺伝子の最も高い発現は、小脳中で検出される（CT=28）。さらに、この遺伝子の中レベルの発現は、舌癌、乳癌、類上皮癌、リンパ腫、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮癌、および肺癌から誘導された多数の癌細胞株中でも見られる。この遺伝子の有用性についての詳細な考察についてはパネル1.1を参照されたい。
【０９９４】
パネルCNS_1のまとめ：Ag888  このパネルにより、無関係な個体の群の脳におけるこの遺伝子の低レベルでの発現を確認する。中枢神経系障害の治療におけるこの遺伝子の潜在的有用性の考察についてはパネル1.1を参照されたい。
【０９９５】
実施例Ｄ
NOV X核酸配列中の単一ヌクレオチド多型の同定
本特許出願には変異体配列も含まれている。変異体配列は、単一ヌクレオチド多型（SNP）を含むことができる。SNPは、一部の例ではSNPを含有するヌクレオチド配列がcDNAを起源とすることを表示するために、「cSNP」と称することができる。SNPは数種の方法による生じ得る。例えば、SNPは多型部位での1つのヌクレオチドの他のヌクレオチドでの置換により生じる可能性がある。このような置換は、転位または転座のいずれかである可能性もある。SNPはさらにまた、基準対立遺伝子と比較して、ヌクレオチドの欠失もしくはヌクレオチドの挿入により生じる可能性もある。この場合、多型部位は、1つの対立遺伝子がそこで別の対立遺伝子内の特定ヌクレオチドに関してギャップを有する部位である。遺伝子内で発生するSNPsはそのSNPの位置で遺伝子によりコードされるアミノ酸の変化を生じさせることがある。遺伝子内SNPはさらにまた、SNPを含有するコドンが遺伝子コードの縮重の結果として同一アミノ酸をコードする場合には、サイレントであることもある。遺伝子領域の外側、または遺伝子内のイントロンで発生するSNPsは、タンパク質のいずれのアミノ酸配列においても変化を生じないが、発現パターンの調節の変更を生じる可能性がある。その例には、一時的発現、生理的反応の調節、細胞タイプの発現調節、発現強度、および転写されるメッセージの安定性における変化が含まれる。
【０９９６】
以下の基準を使用して、エクソン連結プロセスによって得るSeqCallingアセンブリを選択して伸長させた。初期もしくは伸長配列の全部もしくは一部に対して98%の同一性を有している領域を含むゲノムクローンを、ヒトゲノムデータベースの検索のために関連する配列を使用するBLASTN検索によって同定した。得られたゲノムクローンを、その後の解析のために選択した。なぜなら、この同一性は、これらのクローンがこれらのSeqCallingアセンブリに対応するゲノム遺伝子座を含むことを示しているからである。これらの配列を推定コード領域ならびに既知のDNA配列およびタンパク質配列との類似性について解析した。これらの解析に使用したプログラムには、Grail、Genscan、BLASAT、HMMER、FASTA、Hybridおよびその他の関連プログラムが含まれる。
【０９９７】
いくつかの別のゲノム領域もまた同定される可能性がある。なぜなら、選択されたSeqCallingアセンブリがそれらの領域にマッピングされるからである。このようなSeqCalling配列は、相同性もしくはエクソン予測によって定義される領域と重複している可能性がある。それらもまた含まれる可能性がある。なぜなら、フラグメントの位置が、最初に予想された配列に含まれる配列の類似性もしくはエクソン予測によって同定されたゲノム領域の近傍にあるためである。このように同定された配列を手作業により組み立て、CuraGen CorporationのヒトSeqCallingデータベースから取り出した1もしくは2つ以上の別の配列を使用して伸長させることができる。含まれるのに適切なSeqCallingフラグメントは、CuraTools（登録商標）プログラムSeqExtendによって、または解析されたゲノムクローンの適切な領域へのSeqCallingフラグメントのマッピングを同定することによって同定した。
【０９９８】
上記に記載した方法によって定義した領域は、ここに開示す最終配列を誘導するために、その後手作業により統合し、例えば最初のフラグメント内の誤称された塩基もしくは予測エクソン連結部、EST位置および配列類似性の領域間の不一致により生じる可能性がある明白な不一致について補正した。必要な場合は、全長配列を誘導するためにSeqCallingアセンブリおよびゲノムクローンを同定および解析するためのプロセスを繰り返した（Alderbornら, Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing Genome Research. 10 (8) 1249-1265, 2000）。
変異体を個別に報告したが、変異体の全てもしくは選択されるサブセットの任意の組み合わせもまた、本発明の意図されるNOV X実施形態として含まれている。
【０９９９】
CG 108175-01 SNPのデータ：
CG 108175-01の2つのSNP変異体を同定し、表D1に示す。
【１０００】
【表４３７】
2005519629.tif 000438
【１００１】
CG 108782-01 SNPのデータ：
【１００２】
CG 108782-01の1つのSNP変異体を同定し、表D2に示す。
【１００３】
【表４３８】
2005519629.tif 000439
【１００４】
CG 108801-01 SNPのデータ：
CG 108801-01の6つのSNP変異体を同定し、表D3に示す。
【１００５】
【表４３９】
2005519629.tif 000440
【１００６】
CG 111815-01 SNPのデータ：
CG 111815-01の2つのSNP変異体を同定し、表D4に示す。
【１００７】
【表４４０】
2005519629.tif 000441
【１００８】
CG 112813-01 SNPのデータ：
CG 112813-01の3つのSNP変異体を同定し、表D5に示す。
【１００９】
【表４４１】
2005519629.tif 000442
【１０１０】
CG 112881-02 SNPのデータ：
CG 112881-02の1つのSNP変異体を同定し、表D6に示す。
【１０１１】
【表４４２】
2005519629.tif 000443
【１０１２】
CG 113377-01 SNPのデータ：
CG 113377-01の1つのSNP変異体を同定し、表D7に示す。
【１０１３】
【表４４３】
2005519629.tif 000444
【１０１４】
CG 123772-01 SNPのデータ：
CG 123772-01の1つのSNP変異体を同定し、表D8に示す。
【１０１５】
【表４４４】
2005519629.tif 000445
【１０１６】
CG 50880-04 SNPのデータ：
CG 50880-04の4つのSNP変異体を同定し、表D9に示す。
【１０１７】
【表４４５】
2005519629.tif 000446
【１０１８】
CG 51923-01 SNPのデータ：
CG 51923-01の2つのSNP変異体を同定し、表D10に示す。
【１０１９】
【表４４６】
2005519629.tif 000447
【１０２０】
CG 103191-02 SNPのデータ：
CG 51923-01の1つのSNP変異体を同定し、表D11に示す。
【１０２１】
【表４４７】
2005519629.tif 000448
【１０２２】
CG 110725-01 SNPのデータ：
CG 110725-01の2つのSNP変異体を同定し、表D12に示す。
【１０２３】
【表４４８】
2005519629.tif 000449
【１０２４】
CG 121519-01 SNPのデータ：
CG 121519-01の2つのSNP変異体を同定し、表D13に示す。
【１０２５】
【表４４９】
2005519629.tif 000450
【１０２６】
（その他の実施形態）
特定の実施形態を本明細書中で詳細に開示してきたが、これは例示する目的で例として開示すだけであって、以下の添付のクレームの範囲を限定することは意図していない。特に、本発明者らは添付のクレームによって定義された本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対して種々の置換、変更、および修飾を加えることができると理解している。核酸の出発原料、目的クローンまたはライブラリータイプの選択は、本明細書中に記載した実施形態についての知識を有している当業者にとっては日常的な作業であると考えられる。その他の態様、利点、および修飾は、以下のクレームの範囲内に含まれると見なされる。ここに提示すクレームはここに開示す発明の代表である。その他の、請求されていない発明もまた意図されている。本出願人らは、後のクレームにおいてこのような発明を求める権利を留保している。
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月10日(2004.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005519629000001.app