(57)【要約】本発明によって、送達小胞内に含有されるビタミンＥに基づく抗癌化合物で構成される組成物をそうした治療を必要とする個体へ送達することによって細胞増殖性疾患を治療するための方法が提供され、上記化合物は下記構造式を有し、【化１】2005526705.tif 000014式中、R1は水素またはカルボン酸であり；R2及びR3は水素またはR4であり；R4はメチルであり；そして、R5はアルキルまたはアルケニルである。また、これらの化合物を含有する小胞が提供される。
2005526705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖性疾患を治療するための方法において、前記方法が、送達小胞内に含まれるビタミンＥに基づく抗癌化合物で構成される組成物をそうした治療を必要とする個体へ投与するステップで構成され、前記化合物は下記構造式を有し、
【化１】
2005526705.tif 000012
式中、R1は水素またはカルボン酸であり；R2及びR3は水素またはR4であり；R4はメチルであり；そして、R5はアルキルまたはアルケニルであることを特徴とする細胞増殖性疾患を治療するための方法。
【請求項２】
送達小胞内に含まれる抗癌剤で構成される組成物を投与するステップでさらに構成される請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗癌剤／送達小胞組成物がビタミンＥに基づく抗癌化合物／送達小胞組成物と組み合わされて、あるいは連続して投与されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
抗癌剤／送達小胞組成物がビタミンＥに基づく抗癌化合物／送達小胞組成物と組み合わされて、あるいは連続して投与され、前記ビタミンＥに基づく抗癌組成物を含んでいる送達小胞が前記抗癌剤も含んでいることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗癌剤が、9-ニトロカンプトセシン、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシンまたはセレコキシブであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６】
ビタミンＥに基づく抗癌化合物がトコフェロールであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
トコフェロールが、β-トコフェロール、δ-トコフェロール及び2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ)酢酸で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
ビタミンＥに基づく抗癌化合物がトコトリエノールであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
トコトリエノールが、α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノール及びトコトリエノール濃縮画分で構成される群から選択されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ビタミンＥに基づく抗癌化合物が合成ビタミンＥ化合物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
合成ビタミンＥ化合物が、dl-α-トコフェロール、dl-α-トコフェロール酢酸塩、dl-α-トコフェロール・ニコチネート及びdl-α-トコフェロール・リン酸塩で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
組成物の投与が、エアロゾル噴霧、エアロゾル吸入器、胃管栄養、経口摂取、軟ゲル・カプセルによる経口摂取、経皮パッチ、皮下注射、静脈注射、筋肉注射または腹腔内注射を介することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
組成物のエアロゾル噴霧がジェット噴霧器を介することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
送達小胞が、脂質で構成されるリポソームであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
脂質が、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
リポソーム内のビタミンＥに基づく抗癌化合物の最終濃度が20.0 mg/ml以下であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
送達小胞が、ナノ粒子、ミクロスフェアまたはニオソームであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
ビタミンＥに基づく抗癌化合物が、アポトーシス、DNA合成停止、細胞周期停止または細胞分化を含む抗増殖性効果を示すことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
抗増殖性効果が、定量分析、定性分析またはその組み合わせを介して、バイオマーカーの検出によって、または免疫組織化学アッセイによって判定されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
バイオマーカーがKI-67であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞増殖性疾患が、腫瘍性疾患及び非腫瘍性疾患で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍性疾患が、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、精巣癌、前立腺癌、神経膠種、線維肉腫、網膜芽腫、黒色腫、軟組織肉腫、骨肉腫、白血病、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、基底細胞癌及び扁平上皮癌で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
非腫瘍性疾患が、乾癬、良性増殖性皮膚病、魚鱗癬、乳頭腫、再狭窄、強皮症、血管腫、白斑症、ウイルス性疾患及び自己免疫疾患で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
自己免疫疾患が、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、疱疹状皮膚炎、セリアック病及び慢性関節リウマチで構成される群から選択されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
非腫瘍性疾患が、ウイルス性疾患及び自己免疫疾患で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
ウイルス性疾患がヒト免疫不全ウイルスであることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
自己免疫疾患が、心臓血管プラーク形成に関与する炎症プロセス、紫外線誘発性皮膚損傷及び免疫性構成要素に関与する疾患で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
ビタミンＥに基づく抗癌化合物を送達するための小胞において、前記化合物が下記構造式を有し、
【化２】
2005526705.tif 000013
式中、R1は水素またはカルボン酸であり；R2及びR3は水素またはR4であり；R4はメチルであり；そして、R5はアルキルまたはアルケニルであることを特徴とする小胞。
【請求項２９】
小胞が脂質で構成されるリポソームであることを特徴とする請求項２８記載の小胞。
【請求項３０】
リポソームを構成する脂質が、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンであることを特徴とする請求項２９記載の小胞。
【請求項３１】
ビタミンＥに基づく抗癌化合物と脂質の重量比が約１：３であることを特徴とする請求項２５記載の小胞。
【請求項３２】
小胞がナノ粒子、ミクロスフェアまたはニオソームであることを特徴とする請求項２９記載の小胞。
【請求項３３】
ビタミンＥに基づく抗癌化合物が、α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、δ-トコフェロール及び2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ)酢酸で構成される群から選択されるトコフェロール；α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノール及びトコトリエノール濃縮画分で構成される群から選択されるトコトリエノール；またはdl-α-トコフェロール、dl-α-トコフェロール酢酸塩、dl-α-トコフェロール・ニコチネート及びdl-α-トコフェロール・リン酸塩で構成される群から選択される合成ビタミンＥ化合物であることを特徴とする請求項２８記載の小胞。
【請求項３４】
ビタミンＥに基づく抗癌化合物が、2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ)酢酸であることを特徴とする請求項３３記載の小胞。
【請求項３５】
抗癌剤でさらに構成されることを特徴とする請求項２８記載の小胞。
【請求項３６】
抗癌剤が9-ニトロカンプトセシン、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシンまたはセレコキシブであることを特徴とする請求項３５記載の小胞。
【請求項３７】
小胞が、ビタミンＥに基づく化合物をエアロゾル噴霧、エアロゾル吸入器、胃管栄養、経口摂取、軟ゲル・カプセルによる経口摂取、経皮パッチ、皮下注射、静脈注射、筋肉注射または腹腔内注射を介して送達することを特徴とする請求項２８記載の小胞。
【請求項３８】
エアロゾル噴霧がジェット噴霧器を介することを特徴とする請求項３７記載の小胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許）
仮出願でない本特許出願は、現在は放棄された2002年10月15日出願の米国仮特許出願第60/416,602号、現在は放棄された2002年8月29日出願の米国仮特許出願第60/406,807号、及び現在は放棄された2001年12月19日出願の米国仮特許出願第60/342,156号の利益の権利を主張するものである。
【０００２】
本発明は薬理学及び癌治療の分野に関するものである。より具体的には、本発明は、癌の治療及び予防のための効果的な方法としてのビタミンＥに基づく化合物のリポソーム製剤の送達に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
生命促進性（生存）及び細胞死促進性（アポトーシス）の調節制御はきわめて複雑であり、多数の細胞間シグナル経路と多数の相互作用遺伝子産物が関与している。癌細胞は、細胞増殖を促進する遺伝子及び遺伝子産物の発現増強を提示することができ、癌細胞の数の増加を可能にする。生命促進性遺伝子の発現増強に加えて、癌細胞は細胞死促進性シグナルを制御する遺伝子及び遺伝子産物を抑制し、結果として生命を脅かすような癌細胞が増殖し、転移が増強される。無秩序な細胞増殖と細胞死誘導シグナル経路の抑制が組み合わさることにより、癌細胞には成長と生存の優位性の両方が与えられる。
【０００４】
ある細胞の数が増えるか否かは、マイナスに作用する及びプラスに作用する成長調節遺伝子産物の発現のバランス、及び機能的細胞死シグナル経路の有無によって決まる。マイナスに作用する成長調節遺伝子は、細胞周期における細胞の阻害(blockage)の原因となる。プラスに作用する成長調節遺伝子は細胞を刺激して、細胞周期の始めから終わりまで進行させる。アポトーシスに関与する遺伝子はアポトーシス促進性または抗アポトーシス性のいずれでもよく、それらの間の力学的なバランスが細胞の生死を決定する。
【０００５】
病的細胞の多種多様な増殖状態が存在し、そのため新規な治療上の戦略と薬剤が、利点を提供するために必要とされている。これら病的状態は、異常な細胞増殖または細胞死シグナルへの異常な応答性の能力を持つ殆どすべての細胞タイプに生じ得る。病的な状態または異常な成長及び細胞死の特性を示す細胞タイプには、線維芽細胞、血管内皮細胞及び上皮細胞などがある。従って、個体のすべての、あるいは殆どすべての器官及び組織系における局所性または播種性病的状態を治療するために新規な方法が必要とされている。
【０００６】
大部分の癌は、それらが前立腺癌や精巣癌のように男性特有のものであれ、乳癌、卵巣癌または子宮頸癌のように女性特有のものであれ、あるいは肝臓癌、皮膚癌または肺癌のように男女を問わず罹患するものであれ、時間の経過につれて遺伝子の損傷と連続的発現が増加し、ついには高度の転移性を示して治療が困難になる場合がある。限局在性癌の外科的除去については、癌が原発病変以外に広がっていないときにのみ有効なことがわかっている。いったん癌がその他の組織や器官に広がると、外科的処置は、異常または悪性細胞を根絶するための他のより特定的な処置によって補完されなければならない。化学療法あるいは放射線のような異常または悪性細胞を治療するために通例用いられる補完的処置の大部分は腫瘍細胞に限局されず、悪性細胞に対して比較的により大きな破壊効果を有するものの、多くの場合は正常細胞にある程度の悪影響をもたらす。
【０００７】
一部の天然ビタミンＥ化合物及び一部のビタミンＥ誘導体は、アポトーシス促進性及びDNA合成抑制剤として、従って、強力な抗癌剤として用いられてきた。構造的には、ビタミンＥはクロマノール頭部とアルキル側鎖から成る。ビタミンＥには８つの主要な天然型：アルファ（α）、ベータ（β）、ガンマ（γ）、及びデルタ（δ）トコフェロール及びα、β、γ、及びδトコトリエノールがある。トコフェロールは、不飽和イソプレニル側鎖ではなく飽和フィチル側鎖を有する点で、トコトリエノールと異なっている。トコフェロール及びトコトリエノールの４つの型は、表１に示されるようにクロマノール頭部上のメチル基の数が異なっている（αは３個、β及びγは２個、そしてδは１個）。表１にトコフェロール及びトコトリエノールの一般構造を示す。
【０００８】
【表１】
2005526705.tif 000003
【０００９】
いくつかの研究で、RRR-α-トコフェロールの加水分解型エステル誘導体であるRRR-α-トコフェリル・コハク酸塩（ビタミンＥコハク酸塩：VES）の強力な抗腫瘍活性について記述されている。Prasad及びEdwards-PrasadはビタミンＥコハク酸塩の能力について初めて記述したが、マウス黒色腫B-16細胞の形態的変化と成長抑制を誘導し、ビタミンＥコハク酸塩が有用な腫瘍治療薬であり得ることを示唆するビタミンＥのその他の型については記述しなかった（１）。別の研究で、ビタミンＥコハク酸塩が乳癌、前立腺癌、肺癌及び大腸癌など種々の上皮癌細胞タイプと、そして、in vitroで造血性-リンパ性白血病及びリンパ腫細胞との強力な成長インヒビターであることが示された（２−７）。
【００１０】
最近の研究で、ビタミンＥコハク酸塩は、腹腔内投与（i.p.）された場合に動物の異種移植及び同種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を有することが示され（８−１１）、治療上の潜在的可能性を示唆している。i.p.または経口（p.o.）投与されたビタミンＥコハク酸塩はマウスの発癌性［ベンゾ(a)ピレン］誘導噴門洞発癌に対する抑制効果を有することも示されており、抗発癌剤としての可能性を示唆している（１２）。研究によれば、ビタミンＥコハク酸塩は、DNA合成阻害(blockage)を介した癌細胞成長の濃度及び時間に依存する抑制、細胞分化の誘導、及びアポトーシスの誘導を誘導することが示されている（５、６、１０、１３−１５、未発表データ）。
【００１１】
細胞増殖の抑制には、部分的に、MAPキナーゼMEK1及びERK1によって媒介されるG0/G1細胞周期阻害、及び主要細胞周期調節蛋白質p21(waf1/cip1)の上方制御が関与する（３０）。分化の誘導は、形態学的変化、ベータ・カゼイン・メッセージの増強、乳脂質、サイトケラチン18蛋白質の増強、Her2/neu蛋白質の下方制御によって特徴づけられる（１３）。分化は、部分的に、MEK1の活性化、ERK1/2及びc-Jun蛋白質のリン酸化反応によって媒介される（１３、１４）。RRR-α-トコフェロール・コハク酸塩によって調節される多数のアポト−シス・シグナル・イベントのうち、特に注目に値するのは、Fas/Fasリガンド非応答性腫瘍細胞をFas/Fasリガンド応答性に変化させるその能力、及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）非応答性腫瘍細胞をTGF-α応答性に変化させるその能力であり、回復した両方の経路がJNK/c-Junに収束し、その後Bax蛋白質のミトコンドリアへの転座、ミトコンドリア透過性遷移の誘導が起き、その後チトクロームｃの細胞質への放出、カスパーゼ９及び３の活性化、ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ（PARP）の切断、及びアポトーシスが続く（１５、２９、３１）。
【００１２】
ビタミンＥコハク酸塩は、腫瘍細胞に対するその成長抑制効果の誘導に関してだけでなく、正常細胞及び組織に対するその毒性の欠如に関しても注目に値する（２−７、１１）。非加水分解型ビタミンＥコハク酸塩誘導体の利用によって、それがインタクトな化合物であること、その分解産物のいずれ（すなわち、RRR-α-トコフェロールまたはコハク酸）でもないこと、そして、それが抗増殖効果を担うことが示されている（４）。従って、このビタミンＥ誘導体の抗増殖性作用は、非抗酸化特性によると考えられる。
【００１３】
RRR-α-トコフェリル・コハク酸塩（VHS）は、クロマン頭部の位置６でヒドロキシル画分の代わりにスクシニル画分を含むようにエステル結合を介して構造的に修飾されているRRR-α-トコフェロールの誘導体である。RRR-α-トコフェロールのこのエステル結合コハク酸塩画分はビタミンＥのうち最も強力な形状であり、アポト−シスを引き起こす生物学的作用に影響を及ぼし、DNA合成を抑制する。ビタミンＥのこの形状は腫瘍細胞にアポト−シスが起きるよう誘導するが、正常細胞へのアポト−シス誘導効果は持たない。ビタミンＥのコハク酸塩化された形状は、インタクトな薬剤としての抗癌剤として効果的である。しかし、細胞性及び組織性エステラーゼは、コハク酸塩画分を切断可能であって、その結果RRR-α-トコフェロールのコハク酸塩の形状を遊離型のRRR-α-トコフェロールに変え、この化合物の抗癌剤としての効果をなくしてしまう。RRR-α-トコフェロールは、上皮または免疫由来の細胞内で、抗増殖性あるいはアポトーシス促進性の生物活性のいずれも示さない。
【００１４】
エーテル結合を介してアルファ-トコフェロールまたはアルファ-トコトリエノールのクロマン頭部の第１環の位置C6で修飾されるRRR-アルファ-トコフェロールまたはRRR-アルファ-トコトリエノールに基づく化合物の構造は、強力な抗癌特性を持つ化合物を提供するであろう。細胞性エステラーゼは細胞内では報告されておらず、従って、そうした化合物は細胞培養及びin vivoでインタクトなままである。米国特許第6,417,223号明細書では、純粋な形状で市販されているRRR-α-トコフェロールが出発原料として用いられ、それからビタミンＥ類縁物質を合成した。修飾はRRR-α-トコフェロール分子の３つの部分に施され、すなわち、クロマン頭部のフェノール環の６位の炭素、フェノール環及び複素環で構成されるクロマン頭部、またはフィチル末尾部である。RRR-α-トコフェロールにおいて、フェノール環の６位の炭素は、抗酸化活性にとって重要なヒドロキシル（−OH）画分を有する。
【００１５】
類縁物質の構造機能分析と合わせて、多種多様なヒトの癌細胞でアポトーシスを誘導するが、正常細胞では誘導しない能力に関する類縁物質のスクリーニングによって、水素結合ドナーからフィチル末尾部の先端までの全長は29Åで、それ自身の長さは17Åであり、完全にメチル化された閉じたフェノール環、閉じた飽和複素環、及びエーテル結合でフェノール環のC6に取り付けられた非加水分解型酢酸画分を有しているトコフェロール系類縁物質は、最も強力な抗癌活性を示すことが示唆される（図１）。
【００１６】
治療剤を送達する方法は、それが経口、食餌療法、胃管栄養法、皮下、腹腔内、局所用、静脈内、筋内、呼吸器などによるいずれであれ、薬剤の濃度及び組織内分布に大きな影響を持つ。米国特許第6,090,407号明細書には、抗癌剤パクリタキセル及びカンプトセシンが、噴霧を介して個体の気道へ送達するためのリポソームに組み込み可能であることが示されている。リポソームの吸入によるこれら抗癌剤の投与は、筋肉注射あるいは経口投与のいずれよりも、より迅速でより効果的な送達方法である。
【００１７】
植物アルカロイド９-ニトロカンプトセシンを送達するためのリポソーム・エアロゾルの利用は、筋肉注射による９-ニトロカンプトセシンの送達と比較して、免疫不全ヌードマウスにおけるヒト乳癌（２８）、大腸癌及び肺癌異種移植を抑制するための優れた方法である。９-ニトロカンプトセシンの濃度は、エアロゾル・リポソーム送達法による30分後に肺、肝臓及び脳でそれぞれ310 ng/g、192 ng/g及び61 ng/gであり、筋内送達法による30分後に肺、肝臓及び脳でそれぞれ2-4 ng/g、136 ng/g及び0 ng/gであった（１６）。さらに、この送達法はマウスにおける黒色腫及び骨肉腫の肺転移に対して効果が高いと考えられる（１８）。特に重要なことは、薬剤のエアロゾル送達は高い有効性を示し、ヒトによく許容されることである（１９）。従って、薬剤送達のためのエアロゾル・リポソーム法は、より高い濃度とより大きな組織分布を実現する上で効果的である。
【００１８】
さらに、本発明者等は、滞留時間がより長く、薬剤濃度がより高く、全身毒性がより低く、そして必要投薬量がより少ないビタミンＥに基づく抗癌剤のリポソームによる送達のさらに効果的な方法に対するニーズを認識している。従って、先行技術は、リポソームを介して個体へビタミンＥに基づく抗癌剤を送達する効果的な方法を欠いている点で不十分である。具体的には、ビタミンＥに基づく抗癌剤のリポソーム組成物のエアロゾル・リポソーム送達または胃管栄養による投与が望まれている。本発明は、本技術分野におけるこの長年のニーズと願望を満たすものである。
【発明の開示】
【００１９】
（発明の概要）
本発明の１つの実施の形態で、送達小胞内に含まれるビタミンＥに基づく抗癌化合物で構成される組成物をそうした治療を必要とする個体へ送達するステップで構成される細胞増殖性疾患を治療するための方法が提供され、上記化合物は次の構造式を有する。
【００２０】
【化１】
2005526705.tif 000004
式中、R1は水素またはカルボン酸であり；R2及びR3は水素またはR4であり；R4はメチルであり；R5はアルキルまたはアルケニルである。
【００２１】
本発明の別の実施の形態で、本明細書で述べられるようなビタミンＥに基づく抗癌化合物を送達するための小胞が提供される。
【００２２】
本発明のその他の、そしてさらなる形態、特徴、利益及び利点は、開示の目的で提供される本発明の現段階で好ましい実施の形態に関する以下の説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の１つの実施の形態で、細胞増殖性疾患を治療するための方法が提供され、上記方法は、送達小胞内に含有されるビタミンＥに基づく抗癌化合物で構成される組成物をそうした治療を必要とする個体へ送達するステップで構成され、上記化合物は下記構造式を有する。
【００２４】
【化２】
2005526705.tif 000005
【００２５】
式中、R1は水素またはカルボン酸であり；R2は及びR3は水素またはR4であり；R4はメチルであり；そして、R5はアルキルまたはアルケニルである。この実施の形態のすべての態様で、ビタミンＥに基づく抗癌化合物は、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、δ-トコフェロール、または2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ)酢酸のようなトコフェロールでよい。さらに、上記ビタミンＥに基づく抗癌化合物は、α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノールのようなトコトリエノール、またはトコトリエノール濃縮画分、または、dl-α-トコフェロール、dl-α-トコフェロール酢酸塩、dl-α-トコフェロール・ニコチネートまたはdl-α-トコフェロール・リン酸塩のような合成ビタミンＥに基づく化合物でもよい。
【００２６】
この実施の形態で、上記送達小胞は脂質、ナノ粒子、ミクロスフェアまたはニオソームでもよい。リポソーム内での適切な脂質の代表例は1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンである。好ましい例は、リポソーム内でのビタミンＥに基づく抗癌化合物の最終濃度が20.0 mg/ml以下であるリポソームである。ビタミンＥに基づく化合物／送達小胞は、エアロゾル噴霧、エアロゾル吸入器、胃管栄養、経口摂取、軟ゲル・カプセルによる経口摂取、経皮パッチ、皮下注射、静脈注射、筋肉注射または腹腔内注射を介して送達することができる。送達の好ましい手段はジェット噴霧器を介したリポソーム・エアロゾルである。
【００２７】
この実施の形態の１つの態様で、上記方法は、送達小胞内に含有される抗癌剤の第２の組成物を投与するステップでさらに構成されてもよい。上記第２の組成物は、ビタミンＥに基づく化合物／送達小胞組成物と組み合わせて、あるいは連続して投与することができる。上記組成物の投与が組み合わされる場合、ビタミンＥに基づく化合物と抗癌剤を同じ送達小胞内に含有することができる。抗癌剤の代表例は、9-ニトロカンプトセシン、シスプラテン、パクリタキセル、ドキソルビシンまたはセレコキシブである。
【００２８】
本発明によるビタミンＥに基づく抗癌化合物は、アポトーシス、DNA合成停止、細胞周期停止または細胞分化を含む抗増殖性効果を示す。この実施の形態で、抗増殖性効果の定量及び／又は定性分析は、バイオマーカーを検出することによって判定することができる。バイオマーカーの好ましい例は、細胞増殖マーカーKI-67である。あるいは、免疫組織化学アッセイを用いてもよい。
【００２９】
本発明によるビタミンＥに基づく、またはその他の抗癌化合物の送達を用いて、腫瘍性疾患及び非腫瘍性疾患を治療することができる。腫瘍性疾患の代表例は、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、子宮頸癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、神経膠種、線維肉腫、網膜芽腫、黒色腫、軟組織肉腫、骨肉腫、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、基底細胞癌及び扁平上皮癌である。非腫瘍性疾患の代表例は、乾癬、良性増殖性皮膚病、魚鱗癬、乳頭腫、再狭窄、強皮症及び血管腫、及び白斑症で構成される群から選択される。
【００３０】
本発明による方法を用いて、選択された細胞に正常なプログラム細胞死またはアポトーシスが起きないために発症する非腫瘍性疾患を治療することができる。細胞死の失敗のために引き起こされる疾患及び不調の代表例は自己免疫疾患である。自己免疫疾患は、自己の細胞、組織及び器官の免疫細胞の破壊によって特徴づけられる。自己免疫疾患の代表的な一群として、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、疱疹状皮膚炎、セリアック病及び慢性関節リウマチなどがある。本発明は自己免疫に限られるものではなく、心臓血管プラーク形成に関与する炎症プロセス、あるいは紫外線によって引き起こされる皮膚損傷のような免疫性構成要素を有するすべての不調を含んでいる。
【００３１】
本発明による方法を用いて、ウイルス感染によって発症する不調及び疾患を治療することができる。ウイルス感染によって起きる疾患及び不調の代表例はヒト免疫不全ウイルス（HIV）である。ビタミンＥに基づく化合物は細胞間アポトーシス・シグナル・ネットワークに作用するので、リポソーム・エアロゾルのような、本発明によるビタミンＥに基づく抗癌化合物を含んでいる送達小胞は、サイトカイン、ウイルス、バクテリア、毒素、重金属のようないずれのタイプの細胞外シグナルのシグナル伝達にも影響を与える能力を有する。
【００３２】
本発明の別の実施の形態で、その中に含有されているビタミンＥに基づく抗癌化合物を送達するための小胞が提供される。この実施の形態の1つの態様で、上記小胞は抗癌剤でさらに構成されてもよい。１つの好ましい態様で、上記送達小胞は、ビタミンＥに基づく抗癌化合物と脂質の重量比が約１：３のリポソームである。上記ビタミンＥに基づく抗癌化合物、抗癌剤、小胞の種類及び送達方法は上に開示されたようなものでよい。
【００３３】
以下の定義は、本明細書に開示される発明の理解を容易にする目的のために提供される。具体的に定義されないすべての用語は、本技術分野における用語の一般的な意味に従って解釈されなければならない。
【００３４】
本明細書で用いられるように、『エアロゾル』『胃管栄養』『リポソーム』『送達小胞』及び『小胞』という用語は、小胞／リポソーム製剤のための種々の化学組成物、及びこれら製剤のエアロゾル拡散または経口送達のための種々の方法を含むものとする。
【００３５】
本明細書で用いられるように、『個体』という用語は動物及びヒトを意味するものとする。
【００３６】
本明細書で用いられるように、同系腫瘍移植の成長の『生物学的な抑制』または『抑制』という用語は、部分的または全体的な成長抑制を含んでおり、腫瘍細胞の増殖または成長速度の減少という意味も含んでいる。本発明による組成物の生物学的抑制性投与量は、試験要素が組織培養での対象となる悪性または異常増殖細胞、動物及び細胞培養での腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に及ぼす影響を評価することによって判定することができる。
【００３７】
本明細書で用いられるように、『転移の抑制』という用語は、原発病変からその他の器官、特に上に提供されたデータでの肺への腫瘍細胞移動の部分的または全体的な抑制を含むものとする。本発明による組成物の生物学的転移抑制性投与量は、試験要素が組織培養での対象となる悪性または異常増殖細胞、動物及び細胞培養での腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に及ぼす影響を評価することによって判定することができる。
【００３８】
本明細書で用いられるように、『血管形成の抑制』という用語は、腫瘍血管形成の部分的または全体的な抑制または腫瘍に血液を供給する血管の血液運搬能力の低減を含むものとする。
【００３９】
本明細書で用いられるように、『プログラム細胞死またはアポトーシスの誘導』という用語は、細胞が確立された形態的及び生化学的アポトーシス特性を示している部分的または全体的な細胞死を含むものとする。アポトーシスを誘導する本発明による組成物の投与量は、試験要素が組織培養での対象となる悪性または異常増殖細胞、動物及び細胞培養での腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に及ぼす影響を評価することによって判定することができる。
【００４０】
本明細書で用いられるように、『DNA合成停止の誘導』という用語は、処理された細胞がG0/G1、SまたはG2/Mの細胞周期相で阻害されることによる成長停止を含むものとする。DNA合成停止を誘導する本発明による組成物の投与量は、試験要素が組織培養での対象となる悪性または異常増殖細胞、動物及び細胞培養での腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に及ぼす影響を評価することによって判定することができる。
【００４１】
本明細書で用いられるように、『細胞分化の誘導』という用語は、処理された細胞が、細胞増殖が起きない段階である、確立された形態的及び生化学的分化特性として定義されるような細胞分化を受けるよう誘導されることによる成長停止を含むものとする。細胞分化を誘導する本発明による組成物の投与量は、試験要素が組織培養での対象となる悪性または異常増殖細胞、動物及び細胞培養での腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に及ぼす影響を評価することによって判定することができる。
【００４２】
本明細書で用いられるように、『α-TEA』という用語は、RRR-α-トコフェロールの非加水分解型エーテル類縁物質であるRRR-α-トコフェロール・エーテル結合酢酸類縁物質、すなわち、RRR-α-トコフェロール酢酸と略記される2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ)酢酸を含むものとする。
【００４３】
本明細書で、リポソーム組成物のエアロゾル送達を介する、または天然または合成ビタミンＥに基づく抗癌化合物と脂質で構成されるリポソーム組成物の胃管栄養による送達を介する細胞増殖性疾患を治療する方法が提供される。本発明によるビタミンＥに基づく組成物は抗増殖性効果を示し、これら抗増殖性効果の代表例はアポトーシス、DNA合成停止、細胞周期停止あるいは細胞分化である。これら組成物は強力な抗転移効果を示すが、エアロゾル送達または胃管栄養のような臨床的に適切な経路によって投与される場合、正常細胞及び組織に対してin vivoで毒性を示さない。
【００４４】
オプションとして、ビタミンＥに基づく抗癌剤及び第２の抗癌剤、例えば、それだけに限られるものではないが、9-ニトロカンプトセシン（9NC）、ドキソルビシン、パクリタキセル、セレコキシブまたはシスプラテンをリポソーム組成物に含有させて、または腹腔内注入のような別の経路を介して投与し、α-TEAと組み合わせて、または連続して投与することができる。例えば、DNA複製の間に二本鎖切断に変えられる一本鎖DNA切断を引き起こすトポイソメラーゼ-1インヒビターとしての9-ニトロカンプトセシンは、α-TEAとは異なる殺細胞メカニズムを有する。さらに、９NCは、従来のCD95/CD95リガンド（FADD/カスパーゼ８）依存アポトーシス経路（29）を活性化することができ、それは従来と異なる経路、すなわち、CD95/Daxx/JNK/ミトコンドリアと相乗効果を示すと考えられる。これによって殺細胞が増強される。
【００４５】
本発明によるビタミンＥに基づく抗癌化合物には、クロマン構造の位置R1及びフィチルまたはイソプレニル側鎖の位置R5に化学的機能付与を有する天然または合成トコフェロールまたはトコトリエノール及びその誘導体などがある。好ましくは、R1はカルボン酸、例えば酢酸である。一般に、これら化合物の合成は、本技術分野における標準的な方法を用いてRRR-α-トコフェロールを適切なブロモ・アルカン酸と反応させることによって達成される。
【００４６】
天然トコフェロール及びトコトリエノールの誘導体は、細胞性エステラーゼによる非加水分解型であり、C6側鎖などに限定されるわけではないが、好ましくはこの位置に酢酸画分を有する。強力な抗癌活性に必要な構造要素を実現する好ましい化合物は、エーテル結合によってクロマン頭部の炭素６でフェノール性酸素と結合する酢酸画分がRRR-α-トコフェロールと異なっているα-TEAである。VESは、コハク酸画分がクロマン頭部の炭素６でフェノールとのエステル結合によって結合されている点でα-TEAと異なっている。親化合物であるRRR-α-トコフェロールの抗酸化特性は炭素６の−OH画分に存在するので、α-TEAの抗癌特性は抗酸化媒介されない。
【００４７】
本発明は治療剤として用いることができる。本発明による方法はあらゆる動物を治療するために用いることができる。最も好ましくは、本発明による方法はヒトに有用である。一般に、薬理学的に有効な殺細胞及び抗増殖性効果を達成するため、リポソーム／抗癌化合物組成物を薬理学的に効果的な任意の投与量で投与することができる。投与される適量は、年齢、臨床病期、その個体の疾病または遺伝子的素質の程度、疾患の位置、体重、もしあれば併用治療の種類、及び病理学的または悪性条件の種類による。好ましくは、投与量は約0.1 mg/kgから約100 mg/kgである。当業者であれば、過度な実験をせずに適切な投与量を容易に決定することができるであろう。
【００４８】
異所的または同所的のいずれかでヌードマウスのような免疫不全動物に移植されたヒト腫瘍細胞の腫瘍成長及び転移のin vivoでの研究、あるいは十分に認められた動物モデルを用いたin vivoでの実験によって臨床実験に向けた前臨床データが提供されている。これらの動物モデルに限定されることなく、そうしたin vivoでの実験は細胞増殖性疾患のその他の腫瘍性または非腫瘍性モデルに焦点を当てることができる。例えば、転移性非エストロゲン応答性MDA-MB-435乳癌細胞、66 cl.4 GFP細胞またはシスプラチン抵抗性cp-70ヒト卵巣癌細胞を用いることができる。
【００４９】
気道へのエアロゾル送達または胃管栄養を介した送達のような個体への送達のためのリポソーム組成物中に飽和フィチルまたは不飽和イソプレニル側鎖の誘導体またはその類縁物質を有しているか、または有していない別の新規なトコフェロール、トコトリエノール及びその他クロマン誘導体を利用することが特に検討されている。これらの分子は、クロマン構造の位置R1−R5の化学的機能付与、及びフィチル及びイソプレニル側鎖の化学的機能付与、特にトコフェロール及びトコトリエノールに基づく化合物を含んでいる。さらに、クロマン環酸素及び６ヒドロキシ基の酸素とのヘテロ原子置換（NまたはS）を有する化合物が検討されている。
【００５０】
アルキル化化学を用いて、特にXが酸素の場合、種々のR1基を含んでいる多数の化合物を合成することができる。アルキル化後、R1基のさらなる化学修飾によって広範囲の新規な化合物の合成が可能になる。R1置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボキサミド、エステル、チオアミド、チオール酸、チオールエステル、糖類、アルコキシ結合糖類、アミン、スルホン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、アルコール、エーテル及びニトリルが可能である。
【００５１】
クロマン基のベンジル型メチル基の窒素化は、R2、R3及びR4基の変形を可能にする中間体を提供する。R2及びR3に対する置換基は、水素または、R4に対する別な置換基、例えば、メチル、ベンジル・カルボン酸、ベンジル・カルボン酸塩、ベンジル・カルボキサミド、ベンジルエステル、糖類及びアミンでもよい。アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、アミド及びエステルのようなR5基の変形も、特に市販の6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸から始める場合に可能である。
【００５２】
クロマン環酸素に対する窒素のヘテロ原子置換が起きる場合、窒素は、水素またはメチルであるR6基で置換されてもよい。トコフェロール及びトコトリエノール中のXの本体である酸素以外の基に対するXの変形は、パラジウム化学（X = CH2）及び求核芳香族置換（X = NまたはS）を用いて達成することができる。クロマン構造に対するその他可能な変形には、位置3-4での不飽和及び５メンバー・フラニル環をつくるための環縮小などがある。
【００５３】
その他の脂質をリポソーム組成物で用いることも検討されている。これらビタミンＥに基づく抗癌化合物またはその他の抗癌化合物を組み込んで、治療投与量を送達することができるどんな脂質でも適当であろう。エアゾール化または胃管栄養を介するなどリポソーム送達の種々の方法を用いることができる。例えば、リポソーム送達のためのエアゾール化及び霧状化の方法、または胃管栄養によるリポソーム投与の方法を用いることができる。
【００５４】
α-TEAまたはその他誘導体化されたトコフェロール及びトコトリエノールをニオソーム、ミクロスフェアまたはナノ粒子の製剤に用いて、エアロゾル吸入またはエアロゾル噴霧を介した治療投与量として気道へ送達し、または胃管栄養、局所使用、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内またはその他確立された投与方法によって投与することができる。例えば、経口送達のための軟ゲル・カプセル内でのα-TEAのリポソームまたはナノ粒子製剤は、ヒトの化学防御において理想的に適している。軟ゲル・カプセルとして経口投与されるナノ粒子製剤は、より長時間消化管に滞留し、恐らくはより多く摂取されるであろう。さらに、ナノ粒子製剤は吸入による送達に有用であり得る。リポソーム又はナノ粒子製剤は、パッチのような経皮送達システムにおいて有用であり得る。
【００５５】
以下の実施例は、本発明の種々の実施の形態を説明する目的で提供されるものであり、いかなる意味でも本発明を限定することは意図されていない。
【実施例１】
【００５６】
2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ)酢酸（α-TEA）の合成及び特徴づけ
【００５７】
【化３】
2005526705.tif 000006
【００５８】
産生量拡大のために、α-TEAを以下のように調製した。NaH（5.0 g、124.9 mmol）を乾燥THF（300 ml）に懸濁させ、アルゴン下で０℃で10分間攪拌してから、100 mlの乾燥THFに溶解したα-トコフェロール（41.3 g、96.1 mmol）のカブラーを介して添加した。この混合物をアルゴン圧力下で０℃で15分間攪拌し、その後ブロモ酢酸エチル（19.26 g、115.3 mmol）を注射器を介して添加した。反応をTLC（ヘキサン：酢酸エチル＝10：１、Rf＝0.65）によってモニターし、3.5時間で完了した。反応混合物を150 mlのCH2Cl2で希釈し、有機相が透明になるまで飽和NaCl溶液（150 ml x ３）で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥してから、その溶媒を減圧下で回収した。その粗生成物はまだ少量の遊離型α-トコフェロールを含んでおり、ヘキサン：酢酸エチル（30：１から20：１）を用いてシリカ・ゲル上でカラム・クロマトグラフィによって除去し、純生成物であるα-TEAエチル・エステル（41.6 g、84%）を産生した。
【００５９】
α-TEAエチル・エステル（21.0 g、40.7 mmol）を250 mlのTHFに溶解し、その後75 mlの10％KOH（122.1 mmol）を加え、その混合物を室温で６時間攪拌した。反応をTLC（CHCl3：MeOH：CH3COOH＝97：2.5：0.5、Rf＝0.18）によってモニターし、100 mlの水で急冷した。その溶液を1N HClを用いてｐH３に調整し、生成物をCH2Cl2（100 ml x 4）で抽出、飽和NaCl溶液で洗浄、Na2SO4で乾燥して、その溶媒を減圧下で回収し、白色蝋質固体である最終生成物α-TEA（18.5 g、93%）を産生した。融点：54−55℃；分子量：488.8。
【実施例２】
【００６０】
マウス乳癌細胞株
66 cl.4-GFP細胞は、Balb/cfC3Hマウスに自然発生する乳癌にもとは由来するマウス乳癌細胞株であり、後に6-チオグアニン抵抗性クローンとして単離された（20、21）。その後これらの細胞は、増強された緑色蛍光蛋白質（GFP）で安定的にトランスフェクトされた。66 cl.4-GFP細胞は高度な転移性を持ち、肺に100％微小転移する。これらの研究に用いる前に、細胞をUniversity of Missouri Research Animal Diagnostic and Investigative Laboratory（RADIL; Colombia, MO）に送付し、それらは無菌であることが証明された。 
【００６１】
66 cl.4-GFP細胞を単層培養として成長媒質：10％ウシ胎仔血清（FBS, Hyclone Lab, Logan, UT）、100 μg/mlストレプトマイシン、100 IU/mlペニシリン、1 X（vol/vol）非必須アミノ酸、1 X（vol/vol）MEMビタミン、1.5 mMナトリウム・ピルビン酸塩、及び50 μg/mlゲンタマイシン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を添加したMcCoy媒質（Invitrogen Life Taechnologies, Carlsbad, CA.）に保持した。FBS含有量を５％に減らした以外は、この同じMcCoy添加媒質を使って処置を行った。マイコプラズマ汚染がないことを確認するため培養物を定期的に調べた。
【実施例３】
【００６２】
DAPI染色核の形態的評価によるアポトーシスの判定
アポトーシスを以前に発表された手順を使って判定した（22）。簡潔に述べると、12ウェル・プレート内の1 x 105細胞／ウェルを接着可能にするために１晩培養した。次に、その細胞をα-TEA、ビタミンＥコハク酸塩（Sigma）またはエタノール・コントロール（0.1％エタノール F.C. vol/vol）で実験媒質内でα-TEA及びビタミンＥコハク酸塩の種々の濃度で種々の時間間隔で処理した。処理後、浮遊細胞と擦れ落ちた付着細胞を５分間350 X gの遠心分離によってペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS；137 mM NaCl、2.7 mM KCL、10.4 mM Na2HPO4、10.5 mM KH2PO4；pH 7.2）で１回洗浄し、2 μg/mlの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール・ジヒドロクロライド（DAPI, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）で100％メタノール中で13分間37℃で染色した。
【００６３】
細胞を400倍の倍率でZeiss ICM 405蛍光顕微鏡で487701フィルタを使って観察した。核が凝縮されたクロマチンを含有した細胞あるいは核が断片化された細胞をアポトーシスとして記録した。データは細胞群あたりのアポトーシス細胞の比率、すなわち、アポトーシス細胞数／カウントされた細胞の総数として記録した。３つの異なる顕微鏡視野を観察し、１スライドあたりカウントされた最低細胞数が600に対して、各位置で200細胞をカウントした。アポトーシスのデータを３つの個別に行われた実験の平均値±標準偏差として示す。
【実施例４】
【００６４】
ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ（PARP）切断断片のウェスタン免疫ブロット検出
ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ（PARP）の切断を、アポトーシスを検出するための代替法として分析した。66 cl.4-GFP細胞を上に述べられたようにDAPIアッセイのために処理した。PBS洗浄の後、細胞を溶解緩衝液（1X PBS、1% Nonidet P-40、0.5%デオコシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、１μg/mlロイペプチン、１μg/mlアプロチニン、1 mMジチオスレイトール（DTT）、2 mMオルトバナジウム酸ナトリウム、10 μg/mlフェニルメチルスルホニルフッ化物（PMSF））中で30分間４℃で懸濁、ボルテックスし、上清を15,000 X gで20分間の遠心分離によって回収した。蛋白質濃度を、Bio-Rad（Bradford）蛋白質アッセイ（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を使って判定し、7.5%SDS-ポリアクリルアミド・ゲル上に分散した試料（100μg/レーン）を還元条件下で電気泳動させた。
【００６５】
蛋白質をニトロセルロース膜（0.2μM孔Optitran BA-S添加ニトロセルロース； Schleicher and Schuell, Keene, NH）上で電気ブロッティングした。移動後、膜をブロッキング緩衝液［25 mM Tris-HCl（pH 8.0）、125 mM NaCl、0.5% Tween-20、及び5%脱脂粉乳］で45分間室温でブロックした。免疫ブロット法を１μgの一次ウサギ抗ヒトポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ抗体［PARP (H-250), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA］を使って行ない、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを二次抗体として（Jackson Immunoresearch Laboratory, West Grove, PA）１：3,000の希釈率で用いた。洗浄したブロットからのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識バンドを増強化学発光（Pierce, Rockford, IL）及びオートラジオグラフィー（Kodak BioMax film; Rochester, NY）によって検出した。
【実施例５】
【００６６】
コロニー形成アッセイ
66 cl.4-GFP細胞を35 x 10 mm 組織培養プレート（Nunclon, Rochester, NY）あたり600細胞播種し、１晩37℃を保持した。翌日、成長媒質を取り除き、1.25、2.5、5及び10μg/mlのα-TEA 、エタノール・コントロール（0.1%エタノールF.C. vol/vol）、または媒質のみ（未処理）を含んでいる処理媒質と交換した。処理剤は媒質を交換せずに細胞上に10日間放置した。10日後、媒質を取り除き、プレートをPBSで３回洗浄した。細胞を30分間 PBS中の１％メチレンブルーで染色し、＞0.5 mmのコロニーを手作業でカウントした。
【実施例６】
【００６７】
Balb/cマウス
生後６週のメスBalb/cJマウス（体重25 gm）をJackson Labs（Bar Harbor, ME）で購入し、少なくとも１週間環境に順化させた。マウスを74±２oＦで湿度30−70％及び12時間毎の明暗サイクルでAustinのUniversity of TexasのAnimal Resource Centerで飼養した。１ケージあたり５匹のマウスを入れ、水と食餌は無制限に与えた。University of Texas Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたような動物の愛護的取り扱いのガイドラインに従った。
【実施例７】
【００６８】
腫瘍細胞接種
66 cl.4-GFP細胞を、トリプシン処理によって回収し、遠心分離にかけ、添加物を含まない2 X 10 5/100μlの濃度のMcCoy媒質中に再懸濁した。マウスの右側第４及び第５乳頭中間点の鼠径部に23標準規格注射針を使って注入した。
【００６９】
50匹のマウスをエアロゾル処置、エアロゾル・コントロール、経口処置、経口コントロール、あるいは未処置群に割り当て（１グループあたり10匹）、全群の平均腫瘍容積を近似させるようにした。各群は、腫瘍細胞接種の９日後に開始された処置開始の時点で、2 x 2-4 x 4 mmの範囲の腫瘍を有していた。腫瘍細胞を注入しない別のマウスをエアロゾルまたはα-TEA（各５匹）で17日間処置し、処置を終了して、長期の安全性を評価するためさらに11か月間観察した。腫瘍はキャリパーを使って1日おきに測定し、容積は式：容積（mm3）＝［幅（mm）2 X 長さ（mm）］／２を使って計算した。体重は毎週測定した。
【実施例８】
【００７０】
胃管栄養による送達のためのピーナツ油に溶解されたα-TEAの調製及び投与
α-TEAを100％エタノール（400 mg/ml）に溶解し、その後ピーナツ油（100％ピーナツ油；nSpired Natural Foods, San Leandro, CA）と１：８（v/v）の割合で混合した。コントロール処置は、α-TEA処置に含まれたのと同量のエタノール及びピーナツ油から成る。混合物を激しくボルテックスして、使用時まで４℃で保存した。α-TEA／ピーナツ油混合物を室温に戻し、１日あたり100μl／マウスを胃管栄養によって投与した。これは最終濃度が５mgのα-TEA／マウス／日に相当する。
【実施例９】
【００７１】
2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ)酢酸（α-TEA）を含んでいるリポソーム組成物の調製
α-TEA／リポソームの割合は１：３（w/w）が最適であると先に述べられた方法によって経験的に判断された（１７）。α-TEA／脂質の組み合わせを調製するため、その構成成分を先ず室温に戻した。脂質［1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC)；Avanti Polar-Lipids, Inc., Alabaster, AL］を濃度120 mg/mlで第三ブタノール（Fisher Scientific, Houston, TX）に溶解し、その後超音波分解して透明な溶液を得た。40 mg/mlでα-TEAも第三ブタノールに溶解し、すべての固体が溶解するまでボルテックスした。２つの溶液をその後等量（v：v）混合し、望ましい割合である１：３のα-TEA／リポソームを得て、ボルテックスによって混合し、−80℃で１−２時間凍結させ、そして、１晩凍結乾燥させて乾燥粉末にし、必要時まで−20℃で保存した。各処置用ガラス瓶は75 mgのα-TEAを包含した。
【実施例１０】
【００７２】
2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ)酢酸（α-TEA）を含んでいるリポソームのエアロゾル化及び投与
エアロゾルをマウスに先に述べたように投与した（１７）。簡潔に述べると、10 L/分の気流を産出するエア・コンプレッサ（Easy Air 15 Air Compressor; Precision Medical, Northampton, PA）をAeroTech II nebulizer（CIS-US, Inc. Bedford, MA）と共に使ってエアロゾルを生成した。AeroTech II nebulizerから放出されたα-TEAリポソーム・エアロゾルの粒子径をAnderson Cascade Impactorによって判定し、空気力学的質量中央径（MMAD）は2.01μm、幾何標準偏差は2.04であった。吸入時にそうした粒子の約30％がマウスの気道に沈着し、残り70％は吐出されるであろう（１７）。
【００７３】
霧状化の前に、α-TEA／脂質粉末を室温に戻し、その後3.75 mlの蒸留水を添加して元の状態にもどし、望まれる最終濃度20 mg/mlのα-TEAを得た。その混合物を室温で30分間定期的な反転とボルテックスで膨満させ、その後噴霧器に入れた。このα-TEA製剤を４mgα-TEA/0.1 mlの濃度で経口による胃管栄養で投与した。マウスを安全フード内の密閉上端部付きプラスチック製ケージ（7 x 11 x 5インチ）に入れた。エアロゾルを、１cmのアコーディオン・チューブの一端を介してケージに注入して他端から排出し、一方向排気弁を用いた。マウスを、すべてのα-TEA／リポソームがエアロゾル化するまで、約15分間エアロゾルに暴露した。
【実施例１１】
【００７４】
リポソームに組み込まれたα-TEAのエアロゾル特性
HPLC分析をAll Glass Impinger（Ace Glass Co., Vineland, NJ）中のエアロゾルから回収したα-TEAリポソームについて行なった。送達された投与量＝濃度（μg/L）ｘマウス分時拍出量（1-min/kg）ｘ送達持続時間（分）ｘ推定沈着率（30％；１７）。この式に基づいて、われわれは約36μgのα-TEAが各マウスの気道に毎日沈着したと推定した（316.2μg g/L x 1分/kg x 15分x 0.30＝1,422.9μg g/kg/日）。
【実施例１２】
【００７５】
腫瘍内のα-TEAのHPLC分析
腫瘍を解剖時に取り出し、各腫瘍の半分を液体窒素中で急速凍結し、その後HPLC分析を行なうまで−70℃で保存した。腫瘍を脂質の均質化及びヘキサン抽出によってHPLC分析のために処理した。簡潔に述べると、重量を測定した腫瘍を５mlの使い捨て円錐底部チューブ（Sarstedt, Newton, NC）内に戴置し、５−７個のKimble固体ガラスビーズ（４mm）、１mlの１％SDS水溶液、１−２mlの100％エタノール及び１mlのヘキサンを共に入れた。その後試料をCrescent Wig-L-Bug（model 3110B Densply International, Elgin, IL）を使ってそれぞれ１分間ずつ２回混合した。その後試料を５分間1,000 rpmで遠心分離にかけ、有機層を回収し、その水性層をヘキサンと再度混合し、ボルテックスし、遠心分離にかけ、そして、有機層が窒素下で乾燥する前にさらに２回処理した。試料を直ちに分析にかけた。逆相HPLC分析をトコフェロール・エーテル類縁物質の蛍光検出と共に、Tirmenstein, M.A.らによって記述されたように行なった（２３）。
【実施例１３】
【００７６】
肺及びリンパ節転移
５つの肺葉における転移性病変を致死時に目視でカウントした。左肺葉及びリンパ節の蛍光緑色微小転移性癌細胞コロニーを20倍対物レンズ（倍率200倍）付きNikon蛍光顕微鏡（TE-200）及び上記顕微鏡に付属するImage Pro-Plus（version 4.1；Media Cybernetics, Silver Spring, MD）ソフトウェアを使ってカウントした。蛍光病変を３つのサイズにグループ分けして（＜5μm、5-10μm及び＞10μm）分離した。
【実施例１４】
【００７７】
in vivoでのアポトーシス検出のためのTUNELアッセイ
腫瘍組織の脱パラフィン処理した切片（５μm）を、ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kit（Intergen, Purchase, NY）に提供された試薬を製造業者の指示に従って用いてアポトーシスを評価するために使用した。茶色に染色された核をアポトーシスに関してポジティブとして記録し、青色に染色された核はネガティブとして記録した。１腫瘍あたり少なくとも16箇所の400倍顕微鏡視野を記録した。データを、各群から３つの別個の腫瘍でカウントされたアポトーシス細胞の数の平均値±標準誤差で示す。腫瘍組織の写真は1000倍の倍率で撮影した。
【実施例１５】
【００７８】
腫瘍組織のH&E染色
腫瘍を10％中性緩衝ホルマリンで固定し、標準的な組織学的手順に従ってパラフィンに包埋した。H＆Eで染色した５μm厚さの切片を使って腫瘍を形態学的に調べた。
【実施例１６】
【００７９】
66 cl.4-GFP細胞の組織学的評価
上記マウス乳癌細胞を、高い分裂指数を有する低分化型の紡錘体細胞癌として特徴づけした。
【実施例１７】
【００８０】
統計分析
統計分析を、Prism software version 3.0（Graphpad, San Diego, CA）を使って行なった。実験用動物の数を指数計算によって判定した。実験動物の体重及び腫瘍容積をスチューデントｔ-テストによって分析した。
【実施例１８】
【００８１】
天然及び合成トコフェロール、トコトリエノール及び誘導体の抗癌特性評価
Balb/Cマウスの右半身の第４及び第５乳頭間の乳房脂肪体領域の皮下に200,000個の66 cl.4-GFP細胞を注入した。注入９日後、マウスを0.5 x 0.5 mm−1 x 2 mmの範囲の類似の大きさの腫瘍でグループ分けした（１群あたり10匹）。マウスを天然アルファ-及びガンマ-トコフェロール、天然アルファ-トコトリエノール、トコトリエノール濃縮画分（TRF；この画分は約32％のアルファ-トコフェロール、20％のアルファ-トコトリエノール、31％のガンマ-トコトリエノール、及び12％のデルタ-トコトリエノールを含んでいる；Gould, M. N. （３０））、合成dl-アルファ-トコフェロール、及び合成誘導体dl-アルファ-トコフェロール酢酸塩、のリポソーム製剤でエアロゾル送達によって19または21日間処置した。マウスに１日あたり75 mgの各化合物を噴霧を介して投与し、各マウスが１日あたり36μgの各化合物を摂取するようにした。マウスを１日おきに触診して、腫瘍容積を（w2 x I）／２として計算した。
【００８２】
データはRRR-ガンマ-トコフェロールとdl-アルファ-トコフェロールのもののみを示す（図２）。エアロゾルによって送達されたdl-アルファ-トコフェロール・リポソーム製剤は、66 cl.4-GFP細胞の成長を著しく抑制し、処置15日目と17日目にそれぞれ81％と73％の抑制であった。dl-アルファ-トコフェロールほど効果的ではないものの、dl-アルファ-トコフェロール酢酸塩、RRR-デルタ-トコフェロール、RRR-アルファ-トコトリエノール、トコトリエノール濃縮画分及びTRFも15日目にそれぞれ29、25、34、25％、そして、17日目にそれぞれ57％、40％、27％、40％腫瘍成長を抑制した。
【００８３】
エアロゾルによって送達されるRRR-α-トコフェロール及びRRR-γ-トコフェロール・リポソーム製剤は腫瘍成長を増強した。腫瘍容積によって判定した上記腫瘍成長の増強は、RRR-α-トコフェロールによるものはコントロールにおける腫瘍成長よりも著しく大きくはなかった。しかし、RRR-γ-トコフェロールを投与されたマウスの腫瘍容積は、コントロール・マウスの腫瘍容積よりも著しく大きかった（図２）。
【００８４】
表２に、ビタミンＥまたはその誘導体のこれらリポソーム製剤による可視的肺転移の抑制率を示す。これらのデータにより、エアロゾルによって送達されたdl-α-トコフェロール・リポソーム製剤はコントロールと比較して、可視肺転移性病変の数を著しく減少させたことが示される。
【００８５】
【表２】
2005526705.tif 000007
【００８６】
エアロゾルによって送達されたdl-α-トコフェロール・リポソーム製剤で処置されたマウスからの腫瘍切片の免疫組織化学分析により、この形状のビタミンＥは、腫瘍血管数を減少させることによって51％、アポトーシスを誘導することによって44％、そして細胞増殖を減少させることによって33％腫瘍成長を抑制していることが示された。表３に、エアロゾルによって送達されたdl-アルファ-トコフェロール・リポソーム製剤が66 cl.4-GFP腫瘍の成長を抑制するメカニズムを挙げる。
【００８７】
【表３】
2005526705.tif 000008
【００８８】
さらに、移植可能な同系マウス乳癌モデルにおけるα-TEAの作用メカニズムの分析によって、α-TEAは細胞増殖を減少させ、アポトーシスを誘導することが示されている。より具体的には、免疫化学によって検出される増殖バイオマーカーKI-67の平均値は56％も大幅に減少し、TUNEL免疫組織化学によって判定されるアポトーシスの平均値は、コントロールと比較して30％も大幅に増加した（未発表データ）。従って、これらの代替的マーカーは、α-TEAの化学防御効果を定量的及び／または定性的に判定するためのバイオマーカーとして関連性があると考えられている。
【実施例１９】
【００８９】
VES及びα-TEAは66 cl.4-GFP細胞においてin vitroでアポトーシスを誘導する
これまでの研究により、ビタミンＥコハク酸塩は、乳癌を含む多くのヒト癌細胞株における強力なアポトーシス誘導物質であることが示されている。比較の目的のために、われわれはα-TEA誘導アポトーシスのin vitro分析にビタミンＥコハク酸塩を含めた。Balb/c乳癌66 cl.4-GFP細胞をビタミンＥコハク酸塩またはα-TEAで処理し、縮合された核及び断片化されたDNAに関してDAPI染色細胞を形態的に分析することによってアポトーシスを評価した。
【００９０】
10μg/mlのα-TEAまたはビタミンＥコハク酸塩で３日間処理した66 cl.4-GFP細胞からの核は、アポトーシスに特徴的な縮合及びDNAの断片化を示したが、それに対して、未処理細胞からの核はこれらの特徴を示さなかった（図３Ａ）。2.5、5、10及び20μg/mlのα-TEAまたはビタミンＥコハク酸塩で３日間処理した66 cl.4-GFP細胞は、α-TEAについては5、6、34及び50％のアポトーシス、ビタミンＥコハク酸塩については3、5、16及び34％のアポトーシス、という投与量に依存するアポトーシスを示した（図３Ｂ）。未処理、VEH、及びエタノール・コントロールは、それぞれ2、2及び3％のアポトーシスのバックグラウンド・レベルを示した（図３Ｂ）。
【００９１】
α-TEAは時間依存的にアポトーシスを誘導することが示された。10μg/mlのα-TEAで２−５日間処理した66 cl.4-GFP細胞は、それぞれ20、35、47及び58％のアポトーシスを示した（図３Ｃ）。アポトーシスの誘導を、66 cl.4-GFP細胞を5、10及び20μg/mlのα-TEAで48時間の処理直後の、PARP切断の存在によって確認した（図３Ｄ）。PARPの84 kDa切断断片は10及び20μg/mlのα-TEA処理において明らかに示されたが、これに対して、５μg/mlのα-TEAで処理された細胞または未処理コントロール細胞では、インタクトなPARP蛋白質のみが検出された（図３Ｄ）。
【実施例２０】
【００９２】
α-TEAによるin vitroでのアポトーシス誘導
α-TEAがアポトーシスの誘導を介して66 cl.4-GFP腫瘍細胞の成長を抑制することを示すin vitroでのデータに照らして、リポソームα-TEA／エアロゾル処理及びエアロゾル・コントロール群のそれぞれからの３つの腫瘍をアポトーシスに関して５ミクロンの腫瘍切片のTUNEL染色を使って調べた。α-TEAで処置されたマウスからの腫瘍は、平均値±標準誤差が2.04±0.23アポトーシス細胞／領域であったが、これに対して、エアロゾル・コントロール・マウスからの腫瘍は、平均値±標準誤差が0.67±0.15アポトーシス細胞／領域であった（p＜0.03；図４Ａ）。リポソームα-TEAエアロゾル及びコントロール処置マウスからの腫瘍切片でのポジティブに染色されたアポトーシス細胞は図４Ｂで見ることができる。
【実施例２１】
【００９３】
α-TEAは66 cl.4-GFPのクローン成長を抑制する
1.25、2.5及び5μg/mlのα-TEAは、エタノール・コントロールと比較すると、コロニー形成をそれぞれ30、85及び100％減少させた（図５）。未処理（データ示さず）及びエタノール・コントロールでは、それぞれ平均して146±11標準偏差及び140±22標準偏差コロニーであった。1.25及び2.5μg/mlのα-TEAで処理された細胞では、それぞれ平均して98±20標準偏差及び21±6標準偏差コロニーであった。細胞を5（図５）あるいは10μg/mlのα-TEAで処理した場合、コロニーは形成されなかった。
【実施例２２】
【００９４】
体重に対するα-TEAリポソーム・エアロゾル処置の効果
10匹／群（４群、総数40匹）のBalb/cマウスに200,000個の66 cl.4-GFP細胞を述べられたように０日目に接種する。腫瘍接種後９日目に、処置群を開始する：エアロゾル処置（TX）＝α-TEAリポソームのエアロゾル送達（５mg／マウス）／23日目まで毎日。エアロゾル・コントロール＝リポソーム組成物のみのエアロゾル送達を23日目まで毎日。胃管栄養処置＝エタノール／ピーナツ油中に５mg／マウスでα-TEA胃管栄養投与を23日目まで毎日。胃管栄養コントロール＝エタノール／ピーナツ油のみの胃管栄養投与を23日目まで毎日。マウスの体重を処置開始時（９日目）に、その後13、16、20及び23日目に測定した（図６）。データを平均値±標準偏差で示す。４群の間に著しい体重の相違はない。
【実施例２３】
【００９５】
血清中及び組織内濃度に対するα-TEAリポソーム・エアロゾル処置の効果
マウス８匹を肺エアロゾル送達を介して６mlリポソーム中の40 mgのα-TEA（5 mg／マウス）で処置した。マウスは、送達が完了するまで30分間にわたってエアロゾルを吸入した。処置完了後、マウスを０、２、６または24時間に致死させた。α-TEAの血清中及び組織内濃度をHPLC分析によって判定する（図７）。最初の致死（時間＝０）で、α-TEAは胃組織にのみ見られる。処置完了後２時間で致死させたマウスで、α-TEAは血清と胃に見られる。処置完了後６時間で致死させたマウスで、α-TEAは肝臓と胃に見られる。処置完了後24時間で致死させたマウスで、α-TEAは肝臓と胃に見られる。
【実施例２４】
【００９６】
腫瘍重量に対するα-TEAリポソーム・エアロゾル処置の効果
マウスに200,000個の66 cl.4-GFPマウス乳癌細胞を述べられたように０日目に注入する。腫瘍サイズが１−３mmに達した９日目に処置を開始する。α-TEAリポソームのエアロゾル処置（５mgのα-TEA／マウス）を毎日16日間投与する（図８）。データは平均値±標準誤差（SE）を表し、コントロール及び処置群でN＝マウス10匹である。処置開始後16日である25日目の致死で、エアロゾルα-TEAリポソーム処置群の腫瘍サイズは、エアロゾルのみのコントロール群の腫瘍サイズより61％小さかった。
【実施例２５】
【００９７】
リポソームα-TEA／エアロゾル処置によってBalb/cマウスの66 cl.4-GFP腫瘍成長が抑制され、肺転移を減少させた
Balb/cマウスの右半身の第４及び第５乳頭間鼠径部に2 X 105個の66 cl.4-GFP細胞を皮下注射した。腫瘍が2 x 2-4 x 4 mmに達したとき（腫瘍注入後９日目）にマウスを５つの群に分け（マウス10匹／群である（群１：未処置コントロール、群２：リポソーム／エアロゾル・コントロール、群３：リポソームα-TEAエアロゾル処置、群４：ピーナツ油／胃管栄養コントロール、群５：ピーナツ油／胃管栄養中のα-TEA処置））、各群の平均腫瘍容積を近似させるようにした。毎日の処置を腫瘍注入後９日目に開始した。
【００９８】
リポソームα-TEA／エアロゾル処置群の平均腫瘍容積は、エアロゾル・コントロールと比較して、処置後9、11、13、15及び17日目にそれぞれ23、41、50、67及び61％減少した（図９Ａ）。致死時に肺を取り出し、転移病変を目視で調べ、蛍光発光による微小転移分析のために冷凍した。α-TEA処置群に可視腫瘍は見られず、それに対して、未処理及びエアロゾル・コントロール群は、表４に示すように、可視腫瘍／肺転移を示すマウスがそれぞれ3.25±1.7及び4.25±0.5であった。
【００９９】
Nikon蛍光顕微鏡及びImage-Pro Plusソフトウェアを用いて、緑色蛍光性微小転移を３つの大きさ、＜５μm、５−10μm及び＞10μmにグループ分けすることができた。この分析によって、α-TEA処置群では、エアロゾル及び未処置コントロールと比較して、３つの大きさすべてについて腫瘍転移の著しい減少が示された（図９Ｂ）。α-TEA処置群（11.4±3.5標準誤差；Ｎ＝８）では、エアロゾル・コントロール群（60.0±15標準誤差；Ｎ＝８）と比較して、微小転移の平均数が81％減少した（ｐ＜0.2）。エアロゾル・コントロール群対未処置群（Ｎ＝10）の微小転移の平均数は減少したが（60.0±15.2標準誤差対101.7±17.0標準誤差；ｐ＜0.9）、その差異は、これら２つの群内のマウスに広範囲にわたる数の微小転移があったため、有意であるとは見なされなかった（図９Ｂ）。
【０１００】
【表４】
2005526705.tif 000009
【実施例２６】
【０１０１】
エアロゾル化を介して送達されるα-TEAリポソームとビタミンＥコハク酸塩（VES）リポソームの66 cl.4-GFP腫瘍成長に関する比較
Balb/Cマウスの右半身第４及び第５乳頭間の乳房脂肪体領域の皮下に200,000個の66 cl.4-GFP細胞を注入した。注入９日後、マウスを0.5 x 0.5 mm−1 x 2 mmの範囲の類似の大きさの腫瘍でグループ分けした（１群あたり10匹）。マウスをエアロゾルを介してリポソーム内α-TEA、リポソーム内ビタミンＥコハク酸塩またはコントロール・リポソームのみで週7日、21日間処置した。マウスに１日あたり75 mgの化合物を噴霧を介して投与し、各マウスが１日あたり36μgの各化合物を摂取するようにした。マウスを１日おきに触診し、腫瘍容積を（w2 x I）／２として計算した。α-TEAリポソーム・エアロゾルは、腫瘍成長を15、17、19及び21日目にそれぞれ64、76、69及び67％減少させた（数値は、α-TEAとコントロールの間での17、19及び21日目にそれぞれｐ＝0.03、0.048及び0.03と統計的に著しく異なっている）。VESリポソーム・エアロゾルは、腫瘍成長を15、17、19及び21日目にそれぞれ76、76、69及び68％減少させた（図１０）。数値は、ビタミンＥコハク酸塩とコントロールの間での17及び21日目にそれぞれｐ＝0.029及び0.029と統計的に著しく異なっている。
【実施例２７】
【０１０２】
腫瘍重量に対するα-TEAの胃管栄養送達の効果
胃管栄養によるα-TEAの送達は、66 cl.4-GFPマウス乳癌細胞の成長を接種位置で抑制する効果はない（図１１）。各マウスの右半身第４及び第５乳頭間に200,000個の66 cl.4-GFP細胞を注入後９−21日目に腫瘍のサイズを測定した。処置は腫瘍接種後９日目から開始する。各群はｎ＝10±標準誤差から成る。胃管栄養処置＝エタノール及びピーナツ油（容積0.1 ml）中の5 mgのα-TEAを腫瘍接種後９日目から始めて毎日投与し、21日目まで継続する。胃管栄養コントロール＝マウスにピーナツ油及びエタノールのみを（容積0.1 ml）／日で、腫瘍接種後９日目から始めて毎日投与し、21日目まで継続した。データ（腫瘍サイズ）を、9、11、13、15、17、19及び21日目の平均値±標準誤差として表す。すべての時点でコントロールと胃管栄養／α-TEA処置群の間の腫瘍重量の著しい差異はない。
【実施例２８】
【０１０３】
胃管栄養によるα-TEA の送達は接種位置では腫瘍成長を減少させないが、肺転移を減少させた
リポソームα-TEA／エアロゾル処置と対照的に、胃管栄養によって投与される5 mg／日／マウスのα-TEAエタノール／ピーナツ油製剤を摂取したマウスからの平均腫瘍容積は、胃管栄養コントロールの平均腫瘍容積と違いがなかった（図１２Ａ）。しかし、胃管栄養によるα-TEAの投与によって、肺腫瘍転移の数は68％減少した。大きさによる３つのグループ分け（＜５μm、５−10μm及び＞10μm）に基づいた微小転移の数は、胃管栄養によってα-TEAを投与されたマウスについて 6.8±1.5、11.3±1.8及び3.1±1.2標準誤差であったが、これに対して、コントロール・マウスの微小転移は、それぞれ27.9±9.0、29.2±6.3及び8.4±1.5標準誤差であった（図１２Ｂ）。
【０１０４】
処置群またはコントロール群のいずれにも平均体重の相違は観察されなかった（データ示さず）。エアロゾル／α-TEAか胃管栄養のいずれかで17日間処置し、その後長期の効果を評価するため11か月間飼養した腫瘍のないマウスには、α-TEA処置のいかなる悪影響も示されなかった。
【０１０５】
胃管栄養によって投与されるα-TEAは、コントロール・マウスの腫瘍サイズと比較して、接種位置での腫瘍サイズを減少させなかったという点で、エアロゾルによるα-TEAの投与は胃管栄養による投与より優れていたが、α-TEAを胃管栄養によって投与した場合、コントロールと比較して肺微小転移の数が減少していたことは興味深い。これはα-TEAに生物学的利用能があったことを示唆する。α-TEAは非加水分解型であり、胃管栄養によって送達される場合に効果的な抗癌剤になると期待されるので、５mg／ml／日／マウスで投与されるα-TEAは、消化管を介する低摂取量の結果、腫瘍接種位置での腫瘍成長を減少させるには効果的でないと考えられる。従って、低レベルのα-TEAは、肺腫瘍病巣が確立されるのを抑制する上で効果的であるとさらに考えられる。
【実施例２９】
【０１０６】
α-TEA／胃管栄養、リポソームα-TEA／胃管栄養及びリポソームα-TEA／エアロゾルの腫瘍成長の抑制と、66 cl.4乳癌腫瘍の肺及びリンパ節転移の比較
肺微小転移の抑制には効果的であるものの、胃管栄養によって投与されるα-TEA／エタノール／ピーナツ油製剤は、移植可能な同系乳癌動物モデルにおける腫瘍成長を抑制しない。α-TEA／リポソーム製剤を経口による胃管栄養によって２日に1回6 mgのα-TEA／日で投与することは、しかしながら、メスBalb/cマウスにおける66 cl.4 Balb/c乳癌細胞の癌成長及び転移を抑制するための効果的な送達方法である。胃管栄養によって送達されるα-TEAのリポソーム製剤は腫瘍成長を70％抑制し、肺及びリンパ節転移をそれぞれ59％及び56％抑制する。α-TEA／リポソーム製剤がエアロゾルによって投与される場合、マウス／日で36μgのα-TEAが肺に沈着すると推定される。α-TEA／リポソームまたはα-TEA／エタノール／ピーナツ油製剤が胃管栄養によって投与される場合に組織に沈着するα-TEAの量は不明である。処置法の抗腫瘍効果の比較を表５に示す。
【０１０７】
【表５】
2005526705.tif 000010
【実施例３０】
【０１０８】
胃管栄養を介して送達されるα-TEAリポソームとビタミンＥコハク酸塩（VES）リポソームの66 cl.4-GFP腫瘍成長に関する比較
経口による胃管栄養によって送達されるα-TEAリポソーム製剤はBalb/cマウスに移植されたマウス乳癌細胞の成長を抑制した。経口による胃管栄養によって送達されるビタミンＥコハク酸塩リポソーム製剤は、Balb/cマウスに移植されたマウス乳癌細胞の成長を抑制しなかった。Balb/Cマウスの右半身第４及び第５乳頭間の乳房脂肪体領域の皮下に200,000個の66 cl.4-GFP細胞を注入した。注入９日後、マウスを0.5 x 0.5 mm−1 x 2 mmの範囲の類似の大きさの腫瘍でグループ分けした（１群あたり10匹）。マウスをリポソーム内α-TEA、リポソーム内ビタミンＥコハク酸塩またはコントロール・リポソームのみで経口胃管栄養を介して１日２回、週に7日、21日間処置した。マウスに１日あたり合計6 mgの化合物を投与した。マウスを１日おきに触診し、腫瘍容積を（w2 x I）／２として計算した。α-TEAリポソームの胃管栄養は、腫瘍成長を15、17、19及び21日目にそれぞれ85、85、80及び70％減少させた（数値は、α-TEAとコントロールの間で15、17及び19日目にそれぞれｐ＝0.03、0.039及び0.029と統計的に著しく異なっている）。VESリポソーム胃管栄養は、腫瘍成長を減少させなかった（図１３）。
【実施例３１】
【０１０９】
リポソームα-TEA胃管栄養処置は66 cl.4-GFPのびリンパ節及び肺転移を減少させた
Balb/Cマウスの右半身第４及び第５乳頭間の乳房脂肪体領域の皮下に200,000個の66 cl.4-GFP細胞を注入した。注入９日後、マウスを0.5 x 0.5 mm−1 x 2 mmの範囲の類似の大きさの腫瘍でグループ分けした（１群あたり10匹）。マウスをリポソーム内α-TEA、リポソーム内ビタミンＥコハク酸塩またはコントロール・リポソームのみで経口胃管栄養を介して１日２回、週に7日、21日間処置した。マウスに１日あたり合計6 mgの化合物を投与した。致死時に、各マウスの左肺葉を瞬間冷凍し、蛍光顕微鏡を介して微小転移病変を示すGFPの検出のために保存した。
【０１１０】
胃管栄養を介したα-TEAリポソーム製剤を投与したマウスは、コントロールと比較すると微小転移肺病変の著しい減少を示した（それぞれ21.5／肺対52.7／肺）。胃管栄養を介したビタミンＥコハク酸塩リポソーム製剤は、肺転移に対する効果がなかった（図１４Ａ）。致死時にリンパ節を回収して、微小転移肺病変を観察した。胃管栄養を介したα-TEAを投与されたマウスは、リンパ節の平均微小転移病変が3.1±0.8であったのに対して、コントロール群（ｐ＝0.036）の微小病変は7.1±1.7であった。胃管栄養を介したビタミンＥコハク酸塩は、微小転移肺病変の減少に効果的ではなかった（図１４Ｂ）。
【実施例３２】
【０１１１】
リポソームα-TEA胃管栄養処置はMDA-MB-435乳癌細胞の腫瘍成長をin vivoで減少させた
Nu/Nu胸腺欠損ヌードマウスの右半身第４及び第５乳頭間の乳房脂肪体領域の皮下に1.0 X 106個のMDA-MB-435 GFP FL細胞を注入した。注入８日後、マウスを0.5 x 0.5 mm−2 x 2 mmの範囲の類似の大きさの腫瘍でグループ分けした（１群あたり10匹）。マウスをリポソーム内アルファ-TEA、またはコントロール・リポソームのみで経口胃管栄養を介して１日２回、週に7日、21日間処置した。マウスに１日あたり合計８mgの化合物を投与した。マウスを１日おきに触診し、腫瘍容積を（w2 x I）／２として計算した。アルファ-TEAリポソームの胃管栄養は27、29、31、33及び35日目にそれぞれ腫瘍成長を68、75、78、79及び79％減少させた（図１５）。数値は、α-TEAとコントロールの間で33及び35日目に統計的に著しく異なっている（それぞれｐ＝0.045及び0.033）。
【実施例３３】
【０１１２】
エアロゾル・リポソーム／α-TEA＋９NCの組み合わせによるBalb/cマウスにおける66 cl.4-GFP腫瘍の腫瘍成長抑制及び肺転移の抑制
生後６週のメスBalb/cマウスの右半身第４及び第５乳頭間に200,000個の66 クローン4-GFP乳癌細胞を皮下注入した。腫瘍サイズが1 x 1ミリメータに達した時、エアロゾル処置を開始した。個別に投与され、低濃度である0.403μg／日の9-ニトロカンプトセシンと組み合わせたα-TEAは、腫瘍成長の強力なインヒビターである。α-TEAプラス9-ニトロカンプトセシンのエアロゾル送達は、マウス乳癌腫瘍成長を90％抑制したが、これに対して、α-TEA 及び9-ニトロカンプトセシンのみでは、それぞれ65％及び58％の腫瘍成長を抑制した。α-TEA プラス9-ニトロカンプトセシンのエアロゾル送達は腋窩リンパ節及び肺の微小転移病変を87％及び71％抑制したが、それに対して、エアロゾルによるα-TEA 及び9-ニトロカンプトセシンのみの投与は、それぞれリンパ節微小転移病変を94％及び60％抑制し、肺微小転移病変を71％及び55％抑制した。従って、連続投与されるα-TEAプラス9-ニトロカンプトセシンは、その２つの薬剤が個別に投与される場合よりも腫瘍成長をより多く抑制する。個別投与されるα-TEAは、9-ニトロカンプトセシンと組み合わせて投与される場合と同じ程度に肺及びリンパ節転移の抑制に効果的である。α-TEAの個別投与及び9-ニトロカンプトセシンとの組み合わせ投与の場合の腫瘍成長及び転移の抑制における比較データを下の表６に示す。
【０１１３】
【表６】
2005526705.tif 000011
【実施例３４】
【０１１４】
α-TEAはシスプラチン抵抗Cp-70ヒト卵巣癌細胞をシスプラチン感受性に変化させた
α-TEAとシスプラチンの組み合わせは、in vitro及びin vivoで腫瘍細胞を殺すことを増強する。ヒト卵巣癌であるcp-70細胞株は、卵巣腫瘍に対する第一選択治療として通例用いられる白金剤であるシスプラチンに抵抗性を示す。in vitroでA2780シスプラチン感受性細胞株から断続的暴露を通じて70 mMに至るまでシスプラチンのレベルを上げてcp-70サブクローンをつくった。α-TEAとの培養で処理すると、細胞株A2780及びcp-70の両方がアポトーシスを受ける（図１６Ａ）。cp-70ヒト卵巣癌細胞を最適下限レベルのシスプラチン（0.625及び1.25μg/ml）及びα-TEA（10μg/ml）で処理すると、cp-70細胞にシスプラチン感受性が回復し、A2780細胞でのアポトーシスのレベルが増加して、cp-70細胞株でのシスプラチン感受性が回復する（図１６Ｂ）。シスプラチンと組み合わせたα-TEAは、cp-70細胞の成長をin vivoで抑制する。緑色蛍光蛋白質（GFP）に対する遺伝子がcp-70細胞でウイルス感染を介して発現し、その結果上記細胞が発光して、異種移植マウス・モデルにおける共治療の効果を研究するために用いることができよう。シスプラチンとα-TEAの組み合わせ処置はin vivoでの異種移植ヌードマウス・モデルで実験する。このモデルでは、メス・ヌードマウスの第４及び第５乳頭間に1 x 106個の細胞を皮下接種した。平均腫瘍サイズが1.0 mm３に達した時点で、リポソームのエアロゾルを介して送達するα-TEAのみ、週１回３週間腹腔内注入するシスプラチンのみ（5 mg/kg）、シスプラチン＋α-TEA、またはエアロゾル・コントロールのいずれかの処置のためにマウスを選択した。データは、α-TEA＋シスプラチンがシスプラチン抵抗性cp-70ヒト卵巣癌細胞の成長を抑制するために効果的な方法であることを示している（図１６Ｃ）。
【実施例３５】
【０１１５】
MDA-MB-435-GFP-FL乳癌細胞に対するアルファ-TEA、メチルセレノシステイン及びトランス-リスベラトロールでの効果
Nu/Nu胸腺欠損ヌードマウスの右半身第４及び第５乳頭間の乳房脂肪体領域の皮下に100万個のMDA-MB-435 GFP FL細胞を注入した。注入９日後、マウスを0.5 x 0.5 mm−2.0 x 2.0 mmの範囲の類似の大きさの腫瘍によって10匹ずつ５群に分けた。マウスを胃管栄養による３ppmメチルセレノシステイン（MSC）水溶液、エアロゾルを介したリポソーム内α-TEA、または、胃管栄養を介して、初めはエタノール：生理食塩水が１：１、そして、24日目から6.5％エタノールと93.5％ネオビー・オイル中の10 mg/kgのb.w.トランス-リスベラトロール（t-RES）で処置した。組み合わせ群は上記３つの化合物のそれぞれで処置し、コントロール群はエアロゾル化リポソーム、100μLの水、及び50μLのt-Res溶媒で処置した。マウスは週7日、35＋日間処置した。腫瘍を１日おきに触診し、容積を式（w2 x I）／２を使って計算した。
【０１１６】
35日目に、コントロールと比較して、α-TEA群は47.8％の減少、MSC群は47.2％の減少、t-RES群は61.2％の増加、そして、組み合わせ群は19.8％の増加を示した（図１７）。各群をコントロールに対してｔ-テストとｐ値で統計的に分析したところ、α-TEA、MSC、t-RES及び組み合わせ群のそれぞれについてｐ＝0.0487、0.0347、0.2221及び0.6255であった。従って、個別に実験されたアルファ-TEA及びMSC群のみが、コントロールと著しく異なる腫瘍成長の減少をみた。トランス-リスベラトールのみの処置と３つの化合物の組み合わせは、腫瘍成長を増強した。
【０１１７】
本明細書では以下の参考文献が引用されている：
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【０１１８】
本明細書で述べられたいずれの特許または刊行物も、本発明が関する当業者の水準を示すものである。さらに、これらの特許または刊行物は、各個別の刊行物が引用によって具体的に個別に組み込まれるのと同一の程度に引用によって本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
当業者であれば、本発明が、目的を実施し、述べられた目標と利点、及び本明細書に内在するそれらを達成するため十分に適合していることを容易に理解するであろう。本明細書で述べられる方法、手順、処置、分子及び特定の化合物と共に、本実施例は現在のところ好ましい実施例を代表するものであり、例示のためのものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。当業者が想起するであろう本明細書内の変更及びその他の利用は、本特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
上記のことがらから、本発明の特徴、利点及び目的、詳細が理解され、また、添付の図面に示される本発明のいくつかの実施の形態を参照することによって行われる場合がある。これらの図面は本明細書の一部を形成するものである。しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであり、従って、それらの範囲を限定するものとはみなされないことに注意されたい。
【図１】強力な抗癌活性に必要な構造要素を表わすR,R,R-α-トコフェロールに基づく類縁物質のモデルを示す図である。C6でのR１基側鎖の長さは、その分子の全長が29Åを超えないようになっていなければならない。
【図２】66 cl.4 GFP乳癌細胞に対する天然アルファ-及びガンマ-トコフェロール、天然アルファ-トコトリエノール、トコトリエノール濃縮画分（TRF）、合成トコフェロール及び合成トコフェロール誘導体の抗癌効果を比較する図である。
【図３】図３Ａ−３Ｄは、α-TEA誘導アポトーシスを示す図である。図３Ａ：66 cl.4 GFPマウス乳癌細胞を10 μg/mlのα-TEAまたはビタミンＥコハク酸塩（正のコントロール）で処理し、あるいは未処理のままで、３日間培養した。細胞を回収し、核を蛍光DNA結合色素DAPIで標識付けし、Zeiss ICM 405蛍光顕微鏡（x400）で487701フィルタを使って細胞を観察した。凝縮されたクロマチンを有する細胞の核あるいは断片化された核をアポトーシスとして記録した。データは多数の実験のうち代表的なものである。図３Ｂ／３Ｃ：DAPIで着色した細胞の核の分析によって、α-TEAが濃度及び時間に依存するアポトーシスを誘導することが示されている。データを３つの実験の平均値±標準偏差として表す。図３Ｄ：ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）切断によるアポトーシスのα-TEA誘導を証明する別の例。66 cl.4 GFP細胞を5、10または20 μg/mlのα-TEAで48時間処理し、ウェスタン免疫ブロット法によって細胞溶解物をPARP分解産物（p84）に関して分析した。データは３つの別々の実験のうち代表的なものである。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、α-TEAが66 cl.4 GFP乳癌細胞にin vivoでアポトーシスが起きるよう誘導することを示す図である。アポトーシスのα-TEA誘導は、リポソームα-TEA／エアロゾル処置及びリポソーム・エアロゾル・コントロール群動物（Ｎ＝４）に由来する5 μmの腫瘍切片を使って判定した。アポトーシス細胞をApopTag In Situアポトーシス検出キット（Intergen, Purchase, NY）を使って判定した。図４Ａはリポソームα-TEAエアロゾル及びエアロゾル処置コントロール群におけるアポトーシスが起きた核の数を比較した図である。図４Ｂはリポソームα-TEAエアロゾル及びコントロール群として処置されたマウスからの腫瘍切片における陽性染色されたアポトーシスを表す図である。
【図５】66 cl.4 GFPクローン成長のα-TEA抑制を表す図である。66 cl.4 GFP細胞（細胞600個／組織培養皿で培養）をα-TEAが1.25、2.5及び5 μg/mlで10日間処理したところ、コロニー形成が抑制された。細胞をメチレンブルーで染色し、処理済とコントロール群のコロニーの数を数えた。
【図６】66 cl.4 GFP乳癌細胞を移植して、エアロゾルで送達されるリポソーム／α-TEA組成物で処置したbalb/cマウスの体重を表す図である。マウスの体重は移植後９日目からモニターした。
【図７】リポソーム／α-TEA１エアロゾル処置終了後、0、2、6または24時間のbalb/cマウスにおけるα-TEAの血清中及び組織内濃度を示す図である。
【図８】66 cl.4 GFP乳癌細胞を移植して、エアロゾルを介して送達されるリポソーム／α-TEA組成物で処置したbalb/cマウスの腫瘍重量を表す図である。腫瘍重量は移植後９日目からモニターした。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、リポソーム・エアロゾルα-TEAによる腫瘍成長及び微小転移の抑制を示す図である。図９Ａ：2 x 105／マウスで66 cl.4 GFP乳癌細胞を第４及び第５乳頭の中間点の鼠径部へ注入した。腫瘍接種後９日目から、マウス（10匹／群）を未処置、あるいはリポソームα-TEA／エアロゾルで毎日またはエアロゾルのみで17日間処置した。腫瘍容積／マウスを２日おきに判定した。腫瘍容積（mm３）を平均値±標準誤差で表す。図９Ｂ：解剖時に、Nikon蛍光顕微鏡（TE-200；200X）を用いてリポソームα-TEA／エアロゾル（８匹）、エアロゾルのみ（10匹）及び未処置（10匹）のマウスからの左肺葉の蛍光性微小転移の数を判定し、Image Pro-Plusソフトウェアを微小転移の大きさの判定に用いた。データを平均値±標準誤差で表す。
【図１０】エアロゾル噴霧を介して送達されるリポソ−ムα-TEA及びリポソーム・ビタミンＥコハク酸塩（VES）による66 cl.4 GFP乳癌細胞の腫瘍成長抑制を示す図である。
【図１１】66 cl.4 GFP乳癌細胞を移植して、胃管栄養を介して送達されるリポソ−ム／α-TEAで処置したbalb/cマウスの腫瘍重量を示す図である。腫瘍重量は移植後９日目からモニターした。図１１は、マウスを毎日胃管栄養によってピーナツ油中の5 mgのα-TEAで処置し、またはピーナツ油のみを摂取させ、13日間のみ処置した点だけが図８と異なる。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、胃管栄養によって投与されるα-TEAが、接種箇所での腫瘍成長を抑制するのではなく、肺微小転移を抑制することを表す図である。腫瘍容積及び微小転移データの判定は図９Ａ及び９Ｂの凡例に述べられたとおりである。
【図１３】胃管栄養を介して送達されるリポソ−ムα-TEA及びリポソーム・ビタミンＥコハク酸塩（VES）による66 cl.4 GFP乳癌細胞の腫瘍成長抑制を示す図である。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは胃管栄養で送達されるリポソ−ムα-TEA及びリポソーム・ビタミンＥコハク酸塩（VES）による66 cl.4 GFP乳癌細胞の肺転移（図１４Ａ）及びリンパ節転移（図１４Ｂ）の抑制を表す図である。
【図１５】胃管栄養を介して送達されるリポソ−ムα-TEAによるMDA-MB-435乳癌細胞の腫瘍成長の抑制を示す図である。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｃは、α-TEAまたはα-TEA／シスプラチンの組み合わせが、A2780シスプラチン感受性細胞株及びシスプラチン非感受性cp-70ヒト卵巣癌細胞に及ぼすアポトーシス効果を示す図であり、図１６Ａは、α-TEAがA2780及びcp-70ヒト卵巣癌細胞株に及ぼすin vitroでのアポトーシス効果を示す図である。図１６Ｂは、α-TEAはin vitroでcp-70にシスプラチン感受性を回復させることを示す図である。図１６Ｃは、α-TEAとシスプラチン両者の組み合わせがA2780及びcp-70に及ぼすin vivoでの成長抑制効果を示す図である。in vivoでのデータによれば、α-TEAはcp-70シスプラチン細胞をシスプラチン感受性に変化させること、そして、α-TEAとシスプラチンの組み合わせはヌードマウスのcp-70卵巣細胞異種移植の成長を低減することを示す。
【図１７】α-TEA、メチルセレノシステイン及びトランス-リスベラトロールがMDA-MB-435 GFP FL乳癌腫瘍成長に及ぼすin vivoでの効果を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2005526705.tif 000028
【図１５】
2005526705.tif 000029
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2005526705.tif 000031
【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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2005526705.tif 000036
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