(57)【要約】本発明は、シュクロース基質に対する乳酸菌のグルコシルトランスフェラーゼ活性により生産され得る新規グルカン、１０ｋＤａから１ＧＤａの間の平均分子量を有し、α（１，３）−およびα（１，６）−結合アンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）から本質的になるグルカン、およびシュクロースからこれらグルカンを生成することができるグルカンスクラーゼに関する。このグルカンは増粘および腐食防止特性を有する。このグルカンは化学的に修飾することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α（１，３）−および／またはα（１，６）−結合アンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）から本質的になる骨格を有する少なくとも１０個のアンヒドログルコース単位を有するグルカンの生産法であって、シュクロースをα（１，３）−および／またはα（１，６）−結合グルカンを生産することができるラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株により生産されるグルコシルトランスフェラーゼの活性に、またはグルコシルトランスフェラーゼを発現することができるラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株に供することを含んでなる上記方法。
【請求項２】
シュクロースの存在下で、α（１，３）−および／またはα（１，６）−結合ＡＧＵから本質的になる骨格を有する少なくとも１０個のアンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）を有するグルカンを生産することができるラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。
【請求項３】
１０ｋＤａから１ＧＤａの間、特に１０ｋＤａから５０ＭＤａの間の平均分子量を有し、そしてα（１，３）−およびα（１，６）−結合アンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）から本質的になる骨格を有する、シュクロース基質に対する乳酸菌のグルコシルトランスフェラーゼ活性により生産され得るグルカン。
【請求項４】
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種のグルコシルトランスフェラーゼ活性により生産され得る請求項３に記載のグルカン。
【請求項５】
１５〜８０％のα（１，３）−結合ＡＧＵ、２〜８０％のα（１，６）−結合ＡＧＵおよび２〜２５％のα（１，３，６）−結合ＡＧＵを含んでなる請求項４に記載のグルカン。
【請求項６】
５０ｋＤａ〜１ＭＤａの平均分子量を有し、そして３０〜４５％のα（１，３）−結合ＡＧＵ、３０〜４５％のα（１，６）−結合ＡＧＵおよび３〜１３％のα（１，３，６）−結合ＡＧＵを含んでなる請求項５に記載のグルカン。
【請求項７】
１０〜５０ＭＤａの平均分子量を有し、そして１５〜２６％のα（１，３）−結合ＡＧＵ、３０〜５０％のα（１，６）−結合ＡＧＵ、５〜２０％のα（１，３，６）−結合ＡＧＵを含んでなる請求項５に記載のグルカン。
【請求項８】
１〜５０ＭＤａの平均分子量を有し、そして４５〜６０％のα（１，３）−結合ＡＧＵ、４〜１０％のα（１，６）−結合ＡＧＵおよび１０〜２０％のα（１，３，６）−結合ＡＧＵを含んでなる請求項５に記載のグルカン。
【請求項９】
１０〜５０ＭＤａの平均分子量を有し、そして８０〜９９％のα（１，６）−結合ＡＧＵおよび０〜１５％のα（１，３）−結合ＡＧＵを含んでなる、シュクロース基質に対する乳酸菌のグルコシルトランスフェラーゼ活性により生産され得るグルカン。
【請求項１０】
シュクロースの存在下で、請求項３ないし９のいずれか１項に記載のグルカンを生産することができるグルコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性を示す少なくとも１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を含んでなり、かつ／または該アミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する１００アミノ酸の範囲を有するか、または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有し、かつ／または配列番号６のアミノ酸配列と１００％のアミノ酸同一性を有する１００個のアミノ酸の範囲を有する、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
請求項１１のタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸配列を含んでなる核酸構築物の１以上のコピーを含有し、そしてグルコシル−トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を発現することができる組換え宿主細胞。
【請求項１４】
請求項３ないし９のいずれか１項に記載のグルカンを生産することができるラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、特に本明細書に記載の３３、１８０またはＭＬ１株に相当するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株。
【請求項１５】
請求項９に記載のグルカンを生産することができるロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｋ）株、特に寄託番号ＬＭＧＰ−２０３５０で寄託された８６株に相当するロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｋ）株。
【請求項１６】
請求項３ないし９のいずれか１項に記載のグルカンの１以上のＡＧＵの２，３−酸化、６−酸化、リン酸化、アシル化、アルキル化、ヒドロキシアルキル化、カルボキシメチル化、アミノアルキル化により得られる化学的に修飾されたグルカン。
【請求項１７】
請求項３ないし９のいずれか１項に記載のグルカンの増粘剤としての使用。
【請求項１８】
請求項３ないし９のいずれか１項に記載のグルカンのプレバイオティック剤および／または生物活性剤としての使用。
【請求項１９】
請求項３ないし９のいずれか１項に記載のグルカンの腐食防止剤としての使用。
【請求項２０】
請求項３ないし９のいずれか１項に記載のグルカンを生産することができるラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌の、プロバイオティック剤として、または難消化性グルカンと一緒に、シンバイオティック剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は生体分子の酵素的生産の分野である。本発明は特に乳酸菌に由来する新規グルカン、そのような細菌に由来する新規グルコシル−トランスフェラーゼおよび、シュクロースからの新規かつ有用なグルカンの生産法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
数種の細菌はエキソポリサッカライド、すなわち培養基に分泌されるポリサッカライドを生産することが知られている。細菌のエキソポリサッカライドの周知な例には、ザントモナス  キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）に由来するキサンタン、スフィンゴモナス  パウチモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）に由来するジェラン、およびアウレオバシジウム  プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）に由来するプルランを含む。エキソポリサッカライドを生産することが知られている乳酸菌には、デキストラン、α（１→６）−結合ポリ−アンヒドログルコース、およびオルタナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）、すなわち交互のα（１→６）およびα（１→３）−結合を有するポリ−アンヒドログルコースを生産するロイコノストック  メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）株、口中歯垢形成の原因であるグルカンを生産する口中ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株、およびα（１，６）−およびα（１，４）−結合アンヒドログルコースを生産する特定のラクトバシラス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株を含む（非特許文献１）。エキソポリサッカライドの特性はモノサッカライドの単位の型、結合の型、分岐の程度および型、ポリサッカライド鎖の長さ、ポリマーの分子量および立体配座に依存する。
【０００３】
Ａｒｇｕｅａｌｌｏ−Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献２）は、ロイコノストック  メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１３５５に由来するオルタナンスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎｓｕｃｒａｓｅ）を記載する。Ｍｏｎｃｈｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献３；非特許文献４）は、例えばＬｃ．メゼンテロイデス（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１２９９に由来する２種のデキストランスクラーゼを記載する。デキストランに対して高比率のオルタナンを生産するロイコノストック  メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）株を選択する方法は、特許文献１に記載されている。従来技術はロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）またはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）以外にα（１→６）およびα（１→３）−結合の両方を有するグルカンを生産できる乳酸菌を開示も示唆もしていない。
【特許文献１】
米国特許第５，７８９，２０９号明細書
【非特許文献１】
Ｖａｎ  Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９９）６５，３００８−３０１４
【非特許文献２】
Ａｒｇｕｅａｌｌｏ−Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｏｌ  Ｌｅｔｔ．１８２（２０００）  ８１−８５
【非特許文献３】
Ｍｏｎｃｈｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８２（１９９６）２３−３２
【非特許文献４】
Ｍｏｎｃｈｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｌ  Ｌｅｔｔ．１５９（１９９８）３０７−３１５
【発明の開示】
【０００４】
発明の要約
本発明に従い数種の乳酸菌株が特定のクラスのグルカンを生産できることが判明した。これらのグルカンは共通して、それらのアンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）がα（１，３）−および／またはα（１，６）−グルコシド結合で連結し、すなわちそれらはα（１，４）−結合をほとんどまたは完全に欠いたα−グルカンである。これらのグルカンはオルタナン（交互α（１，３）およびα（１，６）結合）、ムタン（ｍｕｔａｎ）（混合（１，３）およびα（１，６）結合、通常はα（１，３）が優勢）またはデキストラン（主にα（１，６）結合、幾つかのα（１，３））型または他の型であり得る。このグルカンは乳酸菌中で活性なスクラーゼ酵素を使用してシュクロースから生産することができる。それらはグルカンが細菌細胞の外で生産されるか、またはたとえ細菌が存在しなくても単離したスクラーゼ酵素を使用して生産されるので、工業的に実現可能な方法で、大規模で生産そして単離することができる。グルカンは食品等級の株により生産され、そしてプレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）用途または水に基づく組成物の粘性を増すような興味深い特性を有する。
【０００５】
本発明はこれらの新規グルカン、乳酸菌、特にラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株およびシュクロースからこれらグルカンを生成するそれらの酵素タンパク質、ならびに株および／またはそれらの酵素を使用してグルカンを生産する方法、シュクロースを転換するこれら酵素タンパク質をコードするヌクレオチド配列、グルカンの増粘剤、プレバイオティックス、腐食防止剤等、および修飾グルカン用の出発材料としての使用に関する。
発明の説明
本発明は、シュクロースの存在下で、α（１，３）−および／またはα（１，６）−結合ＡＧＵから本質的になる骨格を有する少なくとも１０個のアンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）を有するグルカンを生産することができるグルコシルトランスフェラーゼ（グルカンスクラーゼ）を含有するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株に関する。そのような株は食料、サイレージ、哺乳動物サンプル等のようなラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の現在の供給源に見いだすこどかできる。グルコシルトランスフェラーゼを含有し、そしてグルカンを生産するこれらの株は、これらの供給源からラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を単離し、それらをシュクロースで成長させ、そしてクロマトグラフィーのような適当な分析法を使用してポリサッカライド産物を分析することにより同定することができる。これらのグルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、既知のグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子に基づくプライマーを使用して株のヌクレオチド配列フラグメントを増幅し、そして陽性株を維持することにより同定することができる（実施例を参照にされたい）。異なる供給源およびＬｂ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌｂ．ファーメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌｂ．サケ（ｓａｋｅ）およびＬｂ．パラボキネリ（ｐａｒａｂｕｅｃｈｎｅｒｉ）または関連株のような異なるラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株から数種のグルカン生産株が単離され、そして同定された。これらのグルカン生産株に由来するグルコシルトランスフェラーゼも同定し、そして完全にまたは部分的に配列決定した（実施例を参照にされたい）。
【０００６】
本発明の新規グルカンは、乳酸菌のグルコシルトランスフェラーゼ（グルカンスクラーゼ）活性によりシュクロース供与基質で生産され得る。グルカンは１０ｋＤａから１ＧＤａの間の平均分子量を有し、そしてα（１，３）−および／またはα（１，６）−結合アンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）から本質的になり、これにまたα（１，３）−および／またはα（１，６）−結合ＡＧＵからなる側鎖を結合することができる。
【０００７】
特に本発明のグルカンは、１５〜８０％のα（１，３）−結合ＡＧＵ、２〜８０％、特に４〜８０％、そしてより特別には１５〜８０％のα（１，６）−結合および２〜２５％のα（１，３，６）−結合（分岐）ＡＧＵ、あるいは８０〜９９％のα（１，６）−結合ＡＵＧおよび１〜２０％のα（１，３）結合もしくはα（１，３，６）−結合（分岐）ＡＧＵ、特に１〜１５％のα（１，３）−結合ＡＧＵおよび５〜１５％のα（１，３）結合およびα（１，３，６）−結合単位を一緒に含んでなる。すなわち本発明は５０ｋＤａ〜１ＭＤａの平均分子量を有し、そして２５〜５０％、特に２９〜３９％のα（１，３）−結合ＡＧＵ、２０〜４５％、特に３０〜４０％のα（１，６）−結合ＡＧＵ、５〜２５％、特に３〜１３％のα（１，３，６）−結合ＡＧＵおよび６〜３０％の末端ＡＧＵを含んでなるグルカンを網羅する。さらに本発明は１０〜５０ＭＤａの平均分子量を有し、そして１５〜２６％のα（１，３）−結合ＡＧＵ、３０〜５０％のα（１，６）−結合ＡＧＵ、５〜２０％のα（１，３，６）−結合ＡＧＵおよび５〜３５％の末端ＡＧＵを含んでなるグルカンに関する。また本発明の別の態様では、１〜５０ＭＤａの平均分子量を有し、そして４０〜６０％のα（１，３）−結合ＡＧＵ、２〜２０％、特に２〜１２％のα（１，６）−結合ＡＧＵ、１０〜２５％のα（１，３，６）−結合ＡＧＵおよび１０〜３０％の末端ＡＧＵを含んでなるグルカンを網羅する。さらに別の態様では本発明は１０ｋＤ〜５０ＭＤａの平均分子量を有し、そして８０〜９９％、特に８８〜９９％、そしてより特別には９０〜９９％のα（１，６）−結合ＡＧＵ、または８０〜９０％のα（１，６）−および１〜１０％のα（１，３）−結合ＡＧＵを含んでなり、残りは１，３，６結合および末端ＡＧＵである。
【０００８】
また本発明は、シュクロースから出発して上記のグルカンを生産することができる乳酸菌株、または組換え源に由来する酵素に関する。酵素は新規であり、そしてそれらはグルカンスクラーゼまたはグルコシルトランスフェラーゼに分類され得る。それらの部分配列情報は以下の配列番号の１〜１０に与える。より完全な配列情報は、配列番号の１１〜２２に与える。本発明のタンパク質は、配列番号２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および２２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、またはそれらの少なくとも２２１〜２２４アミノ酸の範囲、あるいはこれらの配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を示す少なくとも１００連続するアミノ酸を含んでなる。さらに好適な配列は以下に与える並列配列図の記載に示す。
【０００９】
この酵素は上記のグルカンを生産するために、または類似のα（１，３）および／またはα（１，６）結合グルカン構造を有するオリゴサッカライドおよびポリサッカライドを生産するためにそのまま使用することができる。それらの遺伝子もまた選択的グルカン−生産系を生成するために適当な宿主生物に包含することができる。また本発明は上記のグルカンスクラーゼの遺伝子を含有し、そしてグルカンスクラーゼを発現することができるそのような組換え体、好ましくは食品級微生物、例えば細菌、特に乳酸菌、酵母、真菌等に関する。
【００１０】
本発明は上記のグルカンの生産法にも関する。このグルカンは上記のラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株により、または本発明に従いグルコシルトランスフェラーゼを発現する組換え微生物により、または本発明に従い単離されたグルコシルトランスフェラーゼおよび例えばシュクロースのような適当なグルコース供給源により生産することができる。グルコシルトランスフェラーゼはグルコシルトランスフェラーゼ−陽性乳酸菌、特にラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種のカルチャーから、またはグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する組換え生物から通例の手段により単離することができる。
【００１１】
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株により生産されたグルカンおよびグルコ−オリゴサッカライドは、本発明に従いグルコシルトランスフェラーゼを含有する上記のラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株の培養上清から回収することができる。グルカンは上記の独自な構造を持つ少なくとも２０、最高約１００，０００のα−アンヒドログルコース単位を含んでなることができる。
【００１２】
本発明によるグルカン生成酵素、または少なくとも最も好適な酵素は、それらが常に存在するようにラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株中で構成的である。これは酵素がシュクロースの存在下で成長した時にのみ発現する従来技術のほとんどのグルカン（デキストラン−）生産ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）株とは対照的である。これにより本発明の微生物によるグルカンの効率的な生産が可能となる。
【００１３】
本発明のグルカンは様々な有用な特性を有する。それらはプレバイオティックスとして有用であり、すなわちそれらは胃腸管の状態を改善することを意図する栄養的または製薬学的組成物に包含することができる。この目的にそれらはそのまま、またはそれらのオリゴサッカライドの状態で使用することができる。それらはまたフルクタン、ガラクタン、キシラン、アラビナン、マンナン、難消化性グルカンおよびヘテロ−オリゴサッカライドのようなそれらのポリ−またはオリゴサッカライドと、あるいはシンバイオティック（ｓｙｎｂｉｏｔｉｃ）組成物をもたらすグルカンが由来する乳酸菌を含むプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）微生物と組み合わせることができる。グルカンおよびそれらの短縮化相同体も生物活性剤、例えば免疫調節剤、抗潰瘍剤およびコレステロールを下げる薬剤として有用である。
【００１４】
グルカンはまた増粘剤としても有用である。グルカンはそのままで飲料、ソース、ドレッシング、乳製品のような食料に１ｇ／リットル〜約１００ｇ／リットル、特に約１０〜５０ｇ／リットルの量で包含することができる。
【００１５】
本発明のグルカンはさらに腐食防止剤として、例えば船体の保護に有用である。そのためにグルカンは溶液または懸濁液の状態で噴霧、コーティング、浸漬および腐食制御の分野で知られている他の技術により適用され得る。
【００１６】
グルカンはそのままで使用することができる。それらは物理的または化学的手段により修飾され得る。化学的修飾の適当な例には、酸化、特に過ヨウ素酸塩またはハイポハライト（ｈｙｐｏｈａｌｉｔｅ）を使用したα−１，６結合を有するグルカンの２，３−または３，４−酸化、あるいは過酸またはハイポハライトを含むニトロキシルを使用したα−１，３結合を有するグルカンの６−酸化を含む。ハイポハライト酸化は環が開いた２，３−または３，４−ジカルボキシ−アンヒドログルコース単位を生じるが（例えば欧州特許出願公開第４２７３４９号明細書を参照にされたい）、過ヨウ素酸塩酸化は環が開いた２，３−または３，４−ジアルデヒド−アンヒドログルコース単位を生じ（例えば国際公開第９５／１２６１９号明細書を参照にされたい）、これはカルボキシル化された単位にさらに（部分的に）酸化され得る（例えば国際公開第００／２６２５７号明細書を参照にされたい）。ハイポクロライトまたは過酸を用いたニトロキシルが媒介する酸化は、６−アルデヒド−および６−カルボキシアンヒドログルコース単位を生じる（例えば国際公開第９５／０７３０３号明細書を参照にされたい）。
【００１７】
酸化グルカンは向上した水溶性、改変した粘性および遅延化した発酵性を有し、そして金属錯化剤、界面活性添加剤、強化添加剤、生物活性炭水化物、乳化剤および水結合剤として使用することができる。それらは架橋化および疎水性物質の導入のようなさらなる誘導化のための出発材料としても使用することができる。タンパク質にカップリングした酸化グルカンは乳化剤および安定化剤として使用することができる。本発明の酸化グルカンは例えば１，３−結合単位上の６−カルボキシル基のような、好ましくはアンヒドログルコース単位あたり０．０５〜１．０のカルボキシル基、より好ましくは０．２〜０．８のカルボキシル基を含む。
【００１８】
高比率のカルボキシル基を含む修飾グルカンを所望する時、２つの酸化方法を組み合わせることができ、または酸化を例えばカルボキシメチル化（以下を参照にされたい）と組み合わせることができる。すなわち０，３から１，０の間のカルボキシル基に関する置換度（ＤＳ）を有するα（１，３／１，６）−グルカンは、最初にニトロキシルが媒介する酸化により、グルクロン酸単位に酸化される１，３−置換単位を生じ、続いて例えば過ヨウ素酸塩およびクロライト酸化により環が開いたジカルボキシ−置換単位に転換される１，６−置換単位＊を生じることにより都合よく調製することができる。この方法の順序は逆にすることもでき、またはニトロキシルが媒介する６−酸化のような１つの酸化法をカルボキシメチル化と組み合わせることもできる。また酸化法の適当な適合により、混合アルデヒド−含有およびカルボキシル−含有ポリマーを得ることができる。
【００１９】
他の有用な修飾はアルキル化、アシル化、ヒドロキシアルキル化、アミノアルキル化、カルボキシアルキル化、リン酸化、硫酸化、ならびに物理的および化学的架橋化である。リン酸化（例えばＯ．Ｂ．Ｗｕｒｚｂｕｒｇ（１９８６）、修飾澱粉：特性および用途（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｔａｒｃｈｅｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ）、ＣＲＣ出版社、ボカラトン、９７−１１２）は、グルカンをリン酸水素１ナトリウムおよび２ナトリウムの混合物と、またはトリポリリン酸塩と乾燥加熱することにより達成することができる。リン酸化グルカンは製紙におけるウェット−エンド添加剤として、紙塗被組成物中の結合剤として、たて糸糊付剤として、および金属注型用の砂型のための中子粘結剤として適当である。アシル化、特に酢酸またはプロピオン酸アルデヒドをそれぞれ使用するアセチル化またはプロピオニル化は、漂白補助剤としておよびホイル（ｆｏｉｌ）に使用するために適する生成物を生じる。例えば無水コハク酸アルケニルまたは（活性化）脂肪酸を用いたアシル化は、表面活性剤、乳化剤および安定化剤として適する表面−活性生成物を生じる。例えば酸化誘導体をカップリングすることによる、またはトリリン酸、エピクロロヒドリンまたはジアルデヒドのような架橋剤を用いた反応による架橋化は、グルカンの物理的特性を調整するために、例えばグルカンの水−結合または増粘能を強化するために使用できる。
【００２０】
ヒドルキシアルキル化は、エチレンオキシド、プロピレンオキシドまたはエピクロロヒドリンのようなアルキレンオキシドを用いた塩基−触媒化反応により通常は行われ；ヒドルキシアルキル化生成物は向上した溶解性および粘度特性を有する。カルボキシメチル化は、グルカンとモノクロロ酢酸またはそのアルカリ金属塩との反応により達成され、そして結晶化阻害剤および金属コンプレクサント（ｃｏｍｐｌｅｘａｎｔ）を含む種々の目的に適するアニオン性ポリマーを生じる。アミノ−アルキル化はグルカンとアルキレン−イミン、ハロ−アルキルアミンまたはアミノ−アルキレンオキシドとの反応により、あるいはグルカンのエピクロロヒドリン付加物と適当なアミンとの反応により達成することができる。これらの生成物はカチオン性ポリマーとして種々の応用に、特に製紙におけるウェット−エンド添加剤として使用して強度を上げるために、増量剤またはファイン（ｆｉｎｅｓ）の保留のために、そして紙パルプの排水速度を向上するために使用することができる。他の有力な応用には糊剤および廃水の精製を含む。上に挙げた修飾は所望する生成物に依存して別々に、または組み合わせて使用することができる。さらに化学修飾の程度は可変性であり、そして意図する用途に依存する。必要ならば１００％の修飾、すなわちすべてのアンヒドログルコース単位の修飾を行うことができる。しかし例えば１００単位あたり１未満（例えば０．２）で修飾されたアンヒドログルコース単位からより高いレベルまでの部分的修飾で、所望の効果を得るためには十分であることが多い。
【００２１】
別の適当な誘導体の型は本グルカンの加水分解物から形成される。加水分解は例えば希釈酸またはグルカン分解酵素、特にα−１，３−グルカナーゼもしくはα−１，６−グルカナーゼを使用して、それ自体に既知である制御された様式で行うことができる。加水分解は鎖長が減少した（２０より大きい重合化度、ＤＰ）ポリサッカライドまたはオリゴサッカライド（２０未満のＤＰ）を生じる。
【００２２】
また本発明は上記の特徴的なグルカン構造を含むグルコ−オリゴサッカライドに関する。これらは本発明に従い単離されたグルカンスクラーゼまたはラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株、あるいは本発明に従いグルコシルトランスフェラーゼ（の一部）を含有する組換え微生物を使用して生産することができる。このようにして生産されたグルコ−オリゴサッカライドは、プレバイオティックスおよびプロバイオティックスとして使用することができる。グルコ−オリゴサッカライドの生産はグルカン合成反応とは異なる。さらにグルカンスクラーゼの基質であるシュクロースに加えて、マルトースまたはラクトースのような受容分子を受容体として使用してオリゴサッカライドを合成することができる。特定のグルカンスクラーゼにより決定される様式でグルコース単位を連続的に付加することにより、α（１，３）−および／またはα（１，６）−結合グルコ−オリゴサッカライドを生じ、その鎖長は適切な反応条件を選択することにより決定できる。より長い反応時間、高いシュクロースレベルおよび低い受容体レベルで通常、例えば１０より高い重合度（ＤＰ）、所望により最高数百までのＤＰを有する比較的長い鎖を生じ、一方、短い反応時間、より低いシュクロースレベルおよびより高い受容体レベルにより、例えば約３から最高１０以上のＤＰを持つ比較的短い鎖を生じる。グルコ−オリゴサッカライドを生成する別の方法は、上記グルカンの加水分解による。この加水分解はアミラーゼ、デキストラナーゼまたはプルラナーゼのような酵素を用いた酵素的加水分解のような既知の加水分解法により、あるいは酸加水分解により行うことができる。生成したグルコ−オリゴサッカライドは、プレバイオティックスとして使用される少なくとも１つの１，６−または１つの１，３−グルコシド結合を含む。
【００２３】
本発明は、本発明に従いグルカンおよび／またはグルコ−オリゴサッカライドを生産することができるラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を含有するプロバイオティックまたはシンバイオティック組成物にも関する。この株はフルクタンのような消化しにくい別のポリ−またはオリゴサッカライドも生産することができる。本発明のプロバイオティックまたはシンバイオティック組成物は、適当な賦形剤を用いて、または用いずに直接摂取することができ、あるいは食品と一緒に添加剤として使用することができる。それらは限定するわけではないがヨーグルト、アイスクリーム、チーズ、パン、ビスケットおよびケーキのような焼成品、乳製品および代替乳食品、製菓、可食性油組成物、スプレッド、朝食用シリアル、ジュース等を含む種々の食品および飲料に包含することができる。
【００２４】
さらに本発明は哺乳動物の結腸中の微生物状態を改善する方法に関し、この方法は本発明に従いにグルカンまたはグルコ−オリゴサッカライドを生産することができる有効量のラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を投与することを含んでなる。さらに本発明に従い有効量のグルカンまたはグルコ−オリゴサッカライドを投与することを含んでなる哺乳動物の結腸中の微生物状態を改善する方法も本発明の一部である。
【００２５】
実施例
一般的記載
種々の乳酸菌株は、発酵食品、種々のヒトまたは動物種の胃腸管およびサイレージを含む様々な供給源から単離した。
【実施例１】
【００２６】
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）に由来するグルカンスクラーゼ／グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子の同定およびヌクレオチド配列
グルカンスクラーゼ遺伝子は、種々の公開されたグルカンスクラーゼ遺伝子の保存アミノ酸配列に基づき縮重プライマー（ＧＴＦｒｅｖ、５’  ＡＤＲＴＣ  ＮＣＣＲＴ  ＡＲＴＡＮ  ＡＶＮＹＫ  ＮＧ３’およびＧＴＦｆｏｒｗ、５’−ＧＡＹＡＡＹＷＳＮＡ  ＡＹＣＣＮＲＹＮＧＴ  ＮＣ−３’；Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ、Ｙ＝ＴまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｒ＝ＡまたはＧ）を使用したＰＣＲで増幅することにより同定した。約６６０ｂｐの予想サイズを有する増幅産物を得、そして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０にｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（インビトロゲン：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローン化した。配列分析ではｇｔｆ遺伝子の一部が単離されたことを確認した。増幅された６６０ｂｐを使用してインバースＰＣＲ用のプライマーを設計した。インバースＰＣＲには染色体ＤＮＡを１０種の酵素で消化し、連結して、環状ＤＮＡ分子を得た。環状連結産物を鋳型とした多岐にわたるプライマーでのＰＣＲにより種々のサイズのアンプリコンを得、これら産物をｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（インビトロゲン）にクローン化し、そして配列決定した（ＧＡＴＣ、コンスタンツ、ドイツ）。必要ならばさらにインバースＰＣＲ反応を行って完全な遺伝子（１つまたは複数）を得た。全グルカンスクラーゼ遺伝子の両鎖を２回、配列決定した。
【実施例２】
【００２７】
ラクトバシラス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株に由来するα−（１，６）グルカンおよびグルカンスクラーゼの単離および同定
Ｌ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株は、ＬＭＧ  Ｐ−１８３８９としてベルギー、ゲントのＢＣＣＭ／ＬＭＧカルチャーコレクションに寄託した。この株を１８リットルのＭＲＳ−ｓ培地（ｋｇあたりのｇで）：酵母エキス（２２）、酢酸ナトリウム３水和物（５）、クエン酸ナトリウム２水和物（２．４２）、塩化アンモニウム（１．３２）、リン酸水素二カリウム（２）、硫酸マグネシウム６水和物（０．２）、硫酸マンガン６水和物（０．０５）、ソルビタンモノ−オレート（１）、ビタミン（ｋｇあたりのｍｇで：Ｂ１：１４．４、Ｂ２：３．６、Ｂ３：７２、Ｈ  ０．２１６）、シュクロース（１００）、水道水（残り）で嫌気的条件下にて３７℃で２１時間成長させた（ｐＨ５．５）。Ｖａｎ  Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）５０，６９７−７０３も参照にされたい。成長中、１３ｇ／リットルのポリサッカライドを生産した。このポリサッカライドは上記技術文献に記載されているように単離した。ポリサッカライド中のモノサッカライド組成は、ポリサッカライドの可溶性部分の加水分解および高性能アニオン交換カラムクロマトグラフィーにより測定した。これはグルカンであると特性決定された。このグルカンは株をシュクロースの代わりにグルコースで成長させた時には形成されなかった。メチル化分析（Ｖａｎ  Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）では、１７〜２４％のα（１，３）−結合グルコシル単位、３４〜４４％のα（１，６）−結合グルコシル単位、７〜１５％のα（１，３，６）−結合グルコシル単位および７〜３５％の末端グルコシル単位が明らかとなった。グルカンの平均分子量は３．６×１０７Ｄａと決定され、そしてＲｇは４５ｎｍであった。
【００２８】
ポリサッカライドの平均分子量はＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムを使用して確立した：０．０５２２ｇのグルカンを１０ｍｌのＤＭＳＯ／水（９０／１０）に溶解し、そして８０℃で１時間加熱し、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、そしてＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムに注入し、そして以下の条件を使用して分析した：
溶出液：０．１ＭのＮａＮＯ３を含むＤＭＳＯ／水（９０／１０）
流速：０．５ｍｌ／分
注入容量：０．２４７ｍｌ
カラム：ＰＬｇｅｌ  Ｇｕａｒｄ、混合−Ａおよび混合−Ｄ
温度：９０℃
検出：ＭＡＬＬＳ（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ）、５０℃、Ａ２＝０、ｄｎ／ｄｃ＝０．０７４、Ｆ２セル、ＲＩ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ続いてＰＡＳ染色（Ｖａｎ  Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）では、約１９０ｋＤａの分子量を持つ細胞外スクラーゼの存在が明らかとなった。このスクラーゼ酵素をコードする遺伝子の部分をＰＣＲ技法を使用して単離し、そして配列決定した。フラグメントの推定されるアミノ酸配列では、他のグルカンスクラーゼとの高い相同性が見いだされた。この部分配列情報を配列番号１（ＤＮＡ）および２（タンパク質）に与える。完全な配列情報は配列番号１１および１２に与える。Ｌ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株により生産されるグルカンは、腐食を防止するために船体の適用について試験された（実施例８を参照にされたい）。
【実施例３】
【００２９】
ラクトバシラス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＭＬ１株に由来するα−（１，６／１，３）グルカンおよびグルカンスクラーゼの単離および同定
ＬＭＧ  Ｐ−２０３４７としてベルギー、ゲントのＢＣＣＭ／ＬＭＧカルチャーコレクションに寄託されたＬ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＭＬ１株は、シュクロースを補充したＭＲＳで３７℃にて嫌気的条件下で一晩成長させた（実施例２を参照にされたい）。この細胞を遠心により取り出し、そして２容量のエタノールを上清に加えた。沈殿したポリサッカライドを遠心により回収し、そして２〜３リットルのデミウォーター（ｄｅｍｉ−ｗａｔｅｒ）に再懸濁し、そして２容量のエタノールで再度沈殿させた。この株により生産されたグルカン（７ｇ）は実施例２に記載したようにメチル化分析およびモノサッカライド組成分析により特性決定した。ポリマーは４８〜５３％のα（１，３）結合グルコシル単位、３〜８％のα（１，６）結合グルコシル単位、１２〜２０％のα（１−３−６）結合グルコシル単位（分岐単位）および２０〜３０％の１−結合（末端）グルコース単位からなることが分かった。このグルカンはグルコースでの成長中には生産されなかった。ポリサッカライドの平均分子量は実施例２に記載したＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムを使用して７．６×１０６Ｄａと確立された。これらはラクトバシラスによるムタン−様ポリマーの生産の最初の例であった。Ｌ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＭＬ１株により生産されたグルカンは腐食防止剤としての応用のために試験され、そして例えば船体の腐食防止に優れた用途を示した。
【００３０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くＰＡＳ染色（Ｖａｎ  Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）では、約１９０ｋＤａの分子量を持つ細胞外スクラーゼの存在が明らかとなった。この株は２つのグルカンスクラーゼを生産することが分かった。これらスクラーゼの配列情報を配列番号１３および１４（ＭＬ１）および１５および１６（ＭＬ４）に与える。
【実施例４】
【００３１】
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＬＢ３３株に由来するα−（１，６／１，３）グルカンおよびグルカンスクラーゼの単離および同定
新規なラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株を得、そしてＬＭＧ  Ｐ−２０３４９として寄託した。この株は１６Ｓ  ｒＲＮＡによりラクトバシラス  パラボキネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｕｅｃｈｎｅｒｉ）にもっとも近い関連を有すると同定された。この株は、シュクロースを補充したＭＲＳで３７℃にて嫌気的条件下で一晩成長させた（実施例２を参照にされたい）。４２０ｇのグルカンが生産された。この株により生産されたグルカンは、グルコースでの成長中には生産されない。メチル化分析（実施例２を参照にされたい）では、ポリマーが等量の２９〜３９％のα（１，３）結合グルコシル単位、３０〜４０％のα（１，６）結合グルコシル単位、３〜１３％のα（１−３−６）結合グルコシル単位（分岐単位）および１５〜３０％の１−結合（末端）グルコース単位からなることが明らかとなった。
【００３２】
ポリサッカライドの平均分子量は実施例２に記載したＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムを使用して２×１０５Ｄａと確立された。
【００３３】
縮重プライマーでのＰＣＲにより、グルコシル−トランスフェラーゼのスクラーゼ型の一部が単離でき、グルカンがスクラーゼにより生産されることを示す。これはグルカンがグルコースではなくシュクロースでの成長中に生産されるという結果を確認するものである。スクラーゼの一部をコードする遺伝子を配列決定した。推定されるアミノ酸レベルについて、ロイコノストック  メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）に由来するオルタナンスクラーゼと高い相同性が見いだされた。これはＬ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）中でのグルカン合成の原因であるこの酵素が、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）以外の他の細菌で見いだされた最初のオルタナンスクラーゼであることを示す。この部分配列情報は、配列番号３（ＤＮＡ）および４（タンパク質）に与える。完全な配列情報は配列番号１７および１８にそれぞれ与える。
【００３４】
この株により生産されるグルカンは増粘特性を有する。
【実施例５】
【００３５】
ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）８６株に由来するα−（１，６）グルカンおよびグルカンスクラーゼの単離および同定
新規な株はサイレージから得、そしてＬＭＧ  Ｐ−２０３５０として寄託した。この株は１６Ｓ  ｒＲＮＡによりロイコノストック  シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）にもっとも近い関連を有する新規なロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）株と同定された。この株は、シュクロースを補充したＭＲＳで３７℃にて一晩、嫌気的条件下で成長させた（実施例２を参照にされたい）。４１６ｇのグルカンが生産された。得られたグルカンのメチル化分析により、９０％以上のグルコース単位がα（１，６）結合により連結していることが示され、ポリサッカライドをデキストランと同定した。このグルカンの分子量は（実施例２に記載したように決定）、３〜４×１０７Ｄａであり、そしてＲｇは４０ｎｍであった。このグルカンはグルコースでの成長中には生産されない。
【００３６】
縮重プライマーでのＰＣＲにより、グルコシル−トランスフェラーゼのスクラーゼ型の一部を持つ３種のフラグメントを単離でき、これは、グルカンがスクラーゼにより生産され、そしてこの株にはおそらく３種のスクラーゼが存在することを示している。これはグルカンがグルコースではなくシュクロースでの成長中に生産されるという結果を確認するものである。スクラーゼの一部をコードする遺伝子を配列決定した。推定されるアミノ酸レベルで、ロイコノストック  メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）に由来するＤＳＲＣおよびＤＳＲＢ（フラグメント１）、オルタナンスクラーゼ（フラグメント２）およびＤＳＲＡ（フラグメント３）と高い相同性が見いだされた。この配列情報は、配列番号５〜１０に与える。この新規株に最も近い関連性を有するロイコノストック  シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）は、デキストランを生産するとは報告されていない。８６株により生産されるグルカンは、増粘特性を有する。
【実施例６】
【００３７】
ラクトバシラス  サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ）ＫＧ１５に由来するα−（１，６／１，３）グルカンおよびグルカンスクラーゼの同定
ＫＧ１５株はサイレージから得、そしてＬＭＧ  Ｐ−２１５８３として寄託した。これは１６Ｓ  ｒＲＮＡによりＬ．サケ（ｓａｋｅ）と同定された。この株を成長させ、そしてポリサッカライドを実施例２に記載したように回収した。ポリサッカライドの分子量は４，７×１０７Ｄａと決定され（ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ）、そしてＲｇは９２ｎｍであった。メチル化分析（ＧＣ）では、この株により生産されたグルカンが４％の末端グルコース単位、８６％のα（１，６）結合グルコシル単位、２％のα（１，３）結合グルコシル単位および８％のα（１，３，６）二置換グルコース単位（分岐点）を含む大きな直線状のデキストランであることが明らかとなった。この株のグルカンスクラーゼを配列決定した（配列番号１９および２０）。
【実施例７】
【００３８】
ラクトバシラス  ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＫＧ３に由来するα−（１，６／１，３）グルカンおよびグルカンスクラーゼの同定
ＫＧ３株はサイレージから得、そしてＬＭＧ  Ｐ−２１５８４として寄託した。これは１６Ｓ  ｒＲＮＡによりＬ．ファーメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）と同定された。この株を成長させ、そしてポリサッカライドを実施例２に記載したように回収した。ポリサッカライドの分子量は２，４  １０７Ｄａであり（ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ）、そしてＲｇは１０７〜１１９ｎｍであると決定した。メチル化分析（ＧＣ）では、この株により生産されたグルカンが３％の末端グルコース単位、８４％のα（１，６）結合グルコシル単位、８％のα（１，３）結合グルコシル単位および５％のα（１，３，６）二置換グルコース単位（分岐点）を含む大きな直線状のデキストランであることが明らかとなった。この株のグルカンスクラーゼを配列決定した（配列番号２１および２２）。
【実施例８】
【００３９】
グルカンの腐食防止特性
エポキシマトリックスに埋封された平らな１ｃｍ２の炭素鋼シートをわずかに腐食性の媒質（１５０ｍｌの０．１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４）に、細菌のポリサッカライド（０．２ｇ）を含めて、または含めずに数日暴露した。次いでシートを視覚的および電気化学的に時々調査した。腐食電位（Ａｇ／ＡｇＣｌに対するｍＶでのＥｃｏｒｒ）および分極抵抗（ｋΩ／ｃｍ２でのＲｐ）は両方とも腐食防止効果の尺度である。３〜１０時間の初期の適応後、これらのパラメーターは安定な値に達した。実験はラクトバシラス  サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ）に由来するヘテロポリサッカライド、および本発明のホモポリサッカライド（実施例４に従いＬＢ１８０に由来）を用いて、ならびにポリサッカライド無しで行った。結果を以下の表にまとめる。結果として本発明のグルカンの腐食防止特性が優れている。ＭＬ１のホモポリサッカライド（実施例３）はＬＢ１８０ポリサッカライドと少なくとも等しい腐食防止性能を有することが分かった。
【００４０】
【表１】
2005500839.tif 000002
【実施例９】
【００４１】
酸化によるα−１，３／１．６−グルカンの修飾
ＬＢ３３株（実施例４）により生産された１ｇ（６．１５ミリモルのアンヒドログルコース単位）のα−１，３／１．６−グルカンを、１００ｍｌの水に再懸濁する。次いで２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシ（ＴＥＭＰＯ；０．０１ｇ、０．０６５ミリモル）および臭化ナトリウム（１００ｍｇ、１ミリモル）を加え、そして懸濁液を０℃に冷却する。この反応は臭化物無しでも行うことができる。ｐＨ１０．０のハイポクロライトの溶液（３ｍｌ、１５％溶液、６．３ミリモル）（０℃）を加える。このｐＨは０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えることにより一定に維持する。１時間後、溶液を１５０ｍｌの９６％エタノールに注ぎ、生成物の沈殿を生じる。白色沈殿を遠心し、エタノール／水（７０／３０  容量／容量）に再懸濁し、そして再度、遠心する。次いで沈殿を９６％エタノールに再懸濁し、遠心し、そして乾燥させる。ウロン酸の含量はＢｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ  ａｎｄ  Ａｂｄｏｅ−ｈａｎｓｅｎに従いウロン酸アッセイにより測定する（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４（１９７３），４８４）。検量線はポリガラクツロン酸（５、１０、１５および２０μｇ）を使用して作成した。この検量線を用いて、生成物の２０μｇのサンプル中のウロン酸の含量を決定する。６−ヒドロキシル基の主要な部分はカルボキシル基へと酸化された。
【実施例１０】
【００４２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中におけるグルカンスクラーゼ遺伝子の発現のためのプラスミドの構築
２種のプライマーを適当な制限部位を用いて設計した：Ｃ−末端プライマーはすべての場合でＨｉｓ−タグを含んだ。ＰＣＲ産物は最初にｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯにクローン化した。ＰＣＲ産物は適当な酵素を使用してｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯから取り出し、そして発現ベクター（例えばｐＥＴ１５ｂ（ノバジェン：Ｎｏｖａｇｅｎ）の適当な部位に連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＬＢ１８０のグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子の一部を発現させるために（より良い発現には、グルカンスクラーゼのＮ−末端可変ドメインをコードするＮ−末端領域はクローン化しなかった）、ＰＣＲ反応はプライマーとしてＳａｃＩ（太字）およびＮｃｏＩ（下線）部位を含有するＦｏｒｗ１８０（５’−ＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧ  ＣＴＣＣＣＡＴＧＧＧ  ＣＡＴＴＡＡＣＧＧＣ  ＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴ  ＡＴＴＡＴＴＧＡＣＣＣ−３’）およびＡｐａＩ（太字）およびＢａｍＨＩ（下線）および６ｘＨｉｓ−タグ（イタリック）を含むＲｅｖ１８０（５’−ＡＴＡＴＣＧＡＴＧＧ  ＧＣＣＣＣＧＧＡＴＣ  ＣＴＡＴＴＡＧＴＧＡ  ＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴ  ＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧ  ＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡ  ＴＣＡＣＣＡＧＧＴＴ  ＴＴＡＡＴＧＧ−３’）を使用して行った。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯにクローン化した。ＰＣＲ産物はＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩを使用してｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯから取り出し、そしてｐＥＴ１５ｂ（ノバジェン）の対応する部位に連結した。可変Ｎ−末端ドメインを含まないグルカンスクラーゼをコードする７０４アミノ酸のグルカンスクラーゼ遺伝子の一部を含む生成したプラスミド（ｐＥＴ１５ｂ１８０）で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ１２１  ＤＥ３  ｓｔａｒ（インビトロゲン）を形質転換した。
【００４３】
ｐＥＴ１５ｂ１８０を持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞は、３７℃で好気的条件下で１６時間成長させた後に遠心により回収した。ペレットは、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１（容量／容量）％Ｔｗｅｅｎ  ８０を含有する５０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．５で洗浄し、そして懸濁液を再度、遠心した。ペレット化した細胞は、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１（容量／容量）％Ｔｗｅｅｎ  ８０および７．２ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．５に再懸濁した。細胞を超音波で破壊し、そして細胞屑および完全な細胞を４℃で１５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心することにより取り出した（エッペンドルフ：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。生成した無細胞抽出物は酵素源として使用して、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１（容量／容量）％Ｔｗｅｅｎ  ８０および１０ｇ／リットルシュクロースを含有する５０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．５中のシュクロースから高分子量のグルカンを生成した。１６時間のインキューベーション後、グルカンはエタノール沈殿を使用して単離した。プラスミドｐＥＴ１５ｂ（挿入物を含まない）を持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ１２１  ＤＥ３  ｓｔａｒ（インビトロゲン）の無細胞抽出物を酵素源として使用した時、シュクロースからグルカンは生産されなかった。
配列情報
配列番号１および２は、最初に決定した（実施例２）Ｌｂ１８０株からのグルカンスクラーゼの一部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。部分配列はロイコノストック  メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）（Ｌｃ．ｍｅｓ）のデキストランスクラーゼＤＳＲＢ７４２と５３％（１９９／２２３）の配列同一性および６８％の類似性を示し、２つのギャップを含み（アミノ酸残Ｆ１７２とＮ１７３の間）、そしてＬｃ．ｍｅｓの幾つかの他のデキストランスクラーゼおよびオルタナンスクラーゼと５２％の同一性を示す。
【００４４】
配列番号３および４は、最初に決定した（実施例４）Ｌｂ３３株からのグルカンスクラーゼの一部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。部分配列はＬｃ．ｍｅｓのデキストランスクラーゼＤＳＲＢ７４２と６３％（１４３／２２４）の配列同一性および７５％の類似性を示し、１つのギャップを含む。
【００４５】
配列番号５および６は、Ｌｃ８６株（実施例５）からのグルカンスクラーゼ（８６−１）の一部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。部分配列はＬｃ．ｍｅｓのデキストランスクラーゼＤＳＲＢ７４２と９８％（２１９／２２３）の配列同一性および９９％の類似性を示す。
【００４６】
配列番号７および８は、Ｌｃ８６株（実施例５）からの別のグルカンスクラーゼ（８６−５）の一部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。部分配列はＬｃ．ｍｅｓのデキストランスクラーゼＤＳＲＢ７４２と５５％（１２３／２２３）の配列同一性および６８％の類似性を示し、２つのギャップを含み（アミノ酸Ｍ１２８とＲ１２９の間、およびＤ１６２とＨ１６３の間）、そしてＬｃ．ｍｅｓの幾つかの他のデキストランスクラーゼおよびオルタナンスクラーゼと５１〜５６％の同一性を示す。
【００４７】
配列番号９および１０は、Ｌｃ８６株（実施例５）からの別のグルカンスクラーゼ（８６−８）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。この部分配列はＬｃ．ｍｅｓのデキストランスクラーゼおよびオルタナンスクラーゼ（デキストランスクラーゼＤＳＲＢ７４２を含む）と６１〜６８％の配列同一性および７４〜７８％の類似性を示す。
【００４８】
配列番号１１および１２は、Ｌｂ１８０株（実施例２）のグルカンスクラーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。この配列は国際公開第０１／９０３７２号明細書に開示されたＬｂ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＬＢ１２１のグルカンスクラーゼと１３２２／１７６８（７４％）の配列同一性および１４７６／１７６８（８２％）の類似性を示し、１５／１７６８のギャップを含む。−３５および−１０部位ＴＴＧＡＡＡおよびＴＡＴＡＡは、それぞれヌクレオチド５６１および５９９位に位置する。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ＧＡＡＧＧＡＧは５７４であり、そして開始コドンＡＴＧは５８７である。逆反復配列ＡＡＧＣＡＧＣＴＣおよびＧＡＧＣＴＧＣＴＴは６０２５および６０５１である。可能な終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）は＊（５９６３）で示す。
【００４９】
配列番号１３および１４は、ＭＬ１株（実施例３）からのグルカンスクラーゼＩのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。この配列は国際公開第０１／９０３７２号明細書に開示されたＬｂ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＬＢ１２１のグルカンスクラーゼと１３２７／１７７５（７４％）の配列同一性および１４６５／１７７５（８１％）の類似性を示し、１７／１７７５のギャップを含み、そしてＬｃ．ｍｅｓのデキストランスクラーゼと４３〜４４％の配列同一性および５７〜５８％の類似性、およびＬｃ．ｍｅｓのオルタナンスクラーゼと４７％の配列同一性および６１％の類似性を示す。ＲＢＳ  ＡＡＧＧＡＧＡは３１であり、そして開始コドンＡＴＧは４３である。終止コドンＴＡＧは５３５６である。
【００５０】
配列番号１５および１６は、ＭＬ１株（ＭＬ４）（実施例３）からの第２グルカンスクラーゼの部分的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。この配列は国際公開第０１／９０３７２号明細書に開示されたＬｂ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＬＢ１２１のグルカンスクラーゼと３０１／８１７（３６％）の配列同一性および４２７／８１７（５１％）の類似性を示し、１２／８１７のギャップを含み、そしてストレプトコッカス  ムタンズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）のグルコシルトランスフェラーゼと３８％の配列同一性および５３％の類似性を示す。
【００５１】
配列番号１７および１８は、ＬＢ３３株（実施例４）からのグルカンスクラーゼの部分的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。この配列はＬｃ．ｍｅｓの数種の既知のデキストランスクラーゼと５９％の配列同一性、および７１％の類似性を示し、そしてＬｃ．ｍｅｓの他の既知のデキストランスクラーゼ（デキストランスクラーゼＤＳＲＢ７４２を含む）と５３％の配列同一性および６７％の類似性を示す。
【００５２】
配列番号１９および２０は、Ｌｂ．ＫＧ１５株（実施例６）からのグルカンスクラーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。この配列は国際公開第０１／９０３７２号明細書に開示されたＬｂ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）ＬＢ１２１のグルカンスクラーゼと４９６／１１１１（４４％）の配列同一性および６３７／１１１１（５６％）の類似性を示し、７１／１１１１のギャップを含み、そしてＬｃ．ｍｅｓの数種のデキストランスクラーゼ（デキストランスクラーゼＤＳＲＢ７４２を含む）と５７〜５９％の配列同一性および７０％の類似性を示す。−３５および−１０部位ＴＴＧＧＡＣおよびＴＡＴＴＡＴは、それぞれヌクレオチド４７７および５０２位に位置する。ＲＢＳ  ＧＡＡＡＧＧＡは５９３であり、そして開始コドンＡＴＧは６０８である。終止コドンＴＡＧは５３９３である。逆反復配列ＡＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＣおよびＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴは５４９７および５５３１である（−１０．７ｋｃａｌ／モル）。
【００５３】
配列番号２１および２２は、Ｌｂ．ＫＧ３株（実施例７）からのグルカンスクラーゼの部分的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ与える。配列はＬｃ．ｍｅｓの既知のデキストランスクラーゼ（デキストランスクラーゼＤＳＲＢ７４２を含む）と５８配列同一性および７１％の類似性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明によるグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）のアミノ酸配列のアライメントを表す。これはＬｂ１８０のＧＴＦ（第１列、配列番号１２のアミノ酸２１６から始まる）；ＭＬ１のＧＴＦ（第２列、配列番号１４のアミノ酸１５から始まる）、Ｌｂ３３のＧＴＦ（第３列、配列番号１８のアミノ酸２２２または２４３から始まる；ＫＧ１５のＧＴＦ（第４列、配列番号２０のアミノ酸５６７から始まる）およびＫＧ３のＧＴＦ（第５列、配列番号２２のアミノ酸１（ＬＭＡＡＦ）から始まる）；および本発明によるＬｂ．ロイテリ“１０４”株のＧＴＦ（第６列、１（ＷＰＮＴＶ）−５２５）の部分配列を示す。このアライメントは必ずしも自動化アライメントプログラムによるベストフィットではないが、本発明の酵素を明らかにすることが意図されている。本発明はこの図面に示すアミノ酸配列を網羅するだけでなく、図面中に与えられたアミノ酸が図面の別の配列の対応するアミノ酸（ギャップを含む）と交換された配列も網羅する。これは図面の任意の配列、または別に与える配列表中の配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも１００個のアミノ酸の範囲に適応する。これはコンセンサスペプチドＤＮＳＮとＹＹＧＤ（配列番号１２の１２０２から１４２２）の間のアミノ酸の範囲に特に適応する。特に好適であるのは、酵素の活性中心を含んでなる配列であり、これはコンセンサスペプチドＩＮＧＱとＶＰＤＱ（配列番号１２の９５７から１７２４）の間に存在し、好ましくは与えられた中心配列の１つと少なくとも７０％の同一性を有する。所定の配列との好適な非同一性は、別の配列の対応するアミノ酸との交換である。特に好適な配列は、所定の位置のアミノ酸が図の配列の少なくとも２個、特に少なくとも３個の間で共有されているものである。最も好適な配列は、これらコンセンサス配列の１つがＬｂ１８０、ＭＬ１またはＬｂ３３（最初の３列）のＧＴＦのコンセンサス配列であるものである。中心から上流のＮ−末端部分（ＧＴＦ１８０およびＧＴＦ  ＭＬ１のみについて図面では示す）、または中心から下流のＣ−末端部分（図面では示さず）は、完全または一部存在しても、しなくてもよい。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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