(57)【要約】  本発明は、タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物および微小管相互作用剤の抗増殖活性の新規評価方法、および細胞成長または腫瘍の増殖を阻害する化合物についてのスクリーニング方法に関するものである。さらに本発明は、細胞成長または腫瘍の増殖に対する処置の進行をモニターする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患に対する活性についての化合物のスクリーニング方法であって、哺乳類細胞を化合物と接触させ、対照と比べて増加したアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを検出することを含む方法。
【請求項２】
哺乳類細胞が増殖性疾患罹患対象から確立されたセルラインである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
対象がヒトである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
増殖性疾患が癌である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
癌が、リンパ腫、骨髄腫、白血病、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、骨肉腫、乳癌、前立腺癌または結腸癌である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
哺乳類細胞が接触阻止マウス線維芽細胞ラインである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞が細胞培養物中にある、請求項２記載の方法。
【請求項８】
哺乳類細胞をヒト以外の哺乳類宿主へ内植する、請求項２記載の方法。
【請求項９】
哺乳類細胞をヒト以外の哺乳類宿主へ内植する、請求項３記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類細胞が、げっ歯動物へ内植されたヒト癌細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アセチル化アルファ−チューブリンを、二次元ゲル電気泳動により測定する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
化合物がタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質脱アセチル化酵素がヒストン脱アセチル化酵素またはチューブリン脱アセチル化酵素である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
化合物が微小管相互作用剤である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物に対する哺乳類対象による応答の評価方法であって、対象の細胞におけるアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを測定し、それをタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物投与前のレベルと比較することを含む方法。
【請求項１６】
タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物がヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物が、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（ベンゾフラ−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミドおよびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、またはその医薬上許容される塩から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
微小管相互作用剤に対する哺乳類対象による応答の評価方法であって、対象の細胞におけるアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを測定し、それを微小管相互作用剤投与前のレベルと比較することを含む方法。
【請求項１９】
微小管相互作用剤がエポチロンＢまたはＤである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
アセチル化アルファ−チューブリンレベルの測定をエクスビボで行う、請求項１５〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類対象が増殖性疾患に罹患したヒトである、請求項１５〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
増殖性疾患が癌である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
哺乳類対象におけるタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物による処置に感受性を示す増殖性疾患の診断方法であって、タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物投与前レベルと比べて増加したアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを、増殖性疾患を呈する対象の細胞で測定することを含む方法。
【請求項２４】
タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物がヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物が、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（ベンゾフラ−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミドおよびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、またはその医薬上許容される塩から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
哺乳類対象における微小管相互作用剤による処置に感受性を示す増殖性疾患の診断方法であって、微小管相互作用剤投与前レベルと比べて増加したアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを、増殖性疾患を呈する対象の細胞で測定することを含む方法。
【請求項２７】
微小管相互作用剤がエポチロンＢまたはＤである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
アセチル化アルファ−チューブリンレベルの測定をエクスビボで行う、請求項２３〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
哺乳類対象における増殖性疾患の処置方法であって、増殖性疾患を呈する対象からの細胞においてアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを測定し、アセチル化アルファ−チューブリンのレベルが、同タイプの正常細胞が呈するレベルより低い場合、対象にタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物を投与することを含む方法。
【請求項３０】
タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物がヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物が、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（ベンゾフラ−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミドおよびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、またはその医薬上許容される塩から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
哺乳類対象における増殖性疾患の処置方法であって、増殖性疾患を呈する対象からの細胞においてアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを測定し、アセチル化アルファ−チューブリンのレベルが、同タイプの正常細胞が呈するレベルより低い場合、対象に微小管相互作用剤を投与することを含む方法。
【請求項３３】
微小管相互作用剤がエポチロンＢまたはＤである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
タンパク質脱アセチル化酵素阻害についての生物マーカーとしてのアルファ−チューブリンアセチル化の使用。
【請求項３５】
微小管相互作用剤の活性についての生物マーカーとしてのアルファ−チューブリンアセチル化の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、タンパク質脱アセチル化酵素阻害についての生物マーカーおよび微小管相互作用剤の活性についての生物マーカーとして、特に抗増殖活性を有する化合物の同定方法としてのアルファ−チューブリンアセチル化レベルの使用に関するものである。
【０００２】
（背景）
タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物、例えばヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害性化合物、および微小管相互作用剤は、増殖性疾患処置用の治療剤として研究されている。タンパク質脱アセチル化酵素、例えばヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性が中断されたとき、アセチル化アルファ−チューブリンの増加が誘導され、それが細胞に蓄積することが見出された。アルファ−チューブリンのアセチル化は、通常リジン４０で行なわれる。さらにまた、微小管相互作用剤がアルファ−チューブリンのアセチル化を誘導することも見出された。様々な適用、例えば化合物のスクリーニングおよび診断で使用するために、タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物または微小管相互作用剤の活性を同定および測定するための生物マーカーを有することは重要である。
【０００３】
（要約）
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素活性を含む、タンパク質脱アセチル化酵素活性についての生物マーカーとしてのアルファ−チューブリンアセチル化の使用に関するものである。この発明は、細胞におけるアセチル化アルファ−チューブリンの蓄積が、タンパク質脱アセチル化酵素阻害剤により誘導されるものであって、細胞周期依存現象ではないという発見に基づいている。すなわち、アルファ−チューブリンアセチル化の測定は、タンパク質脱アセチル化酵素活性を調節する化合物を同定するのに特に有用である。同様に、本発明はまた、微小管相互作用剤の活性に関するバイオマーカーとしてのアルファ−チューブリンアセチル化の使用に関するものである。
【０００４】
（詳細な記載）
本発明は、アルファ−チューブリンアセチル化がタンパク質脱アセチル化酵素活性に関する生物マーカーとして、および微小管相互作用剤の活性に関する生物マーカーとして有用であるという発見の局面に関するものである。
【０００５】
一態様において、本発明は、抗増殖活性についての化合物のスクリーニング方法であって、哺乳類細胞を化合物と接触させ、対照と比べて増加したアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを検出することを含む方法に関するものである。
【０００６】
特に哺乳類対象がヒトであり、増殖性疾患が癌であるとき、一般的に、哺乳類細胞は、増殖性疾患罹患対象から確立されたセルラインである。特に有用なセルラインは、ヒト癌、例えばリンパ腫、骨髄腫、例えば特に多発性骨髄腫、白血病、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、骨肉腫、乳癌、前立腺癌または結腸癌またはげっ歯動物セルライン、例えば接触阻止マウス線維芽細胞ラインから確立されている。
【０００７】
一般的に、細胞は細胞培養物中にあり、様々な実験が潜在的化合物のスクリーニングに使用される。特に、細胞培養物を化合物で処理し、培養する。次いで、培養物を検定することにより、アセチル化アルファ−チューブリンの発現レベルを測定する。化合物による細胞培養物でのアセチル化アルファ−チューブリンの誘導は、化合物がタンパク質脱アセチル化酵素阻害剤としての活性を有することを示す。
【０００８】
細胞培養物における化合物のスクリーニングに特に有用なセルラインには、例えばＨＣＴ１１６結腸癌細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４７）、Ｈ１２９９肺癌細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−５８０３）、Ａ５４９非小細胞肺癌細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１８５）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５非エストロゲン依存的乳腺癌細胞、ＰＣ−３前立腺癌細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４３５）、ＤＵ１４５前立腺癌細胞がある。
【０００９】
これに代わる方法では、哺乳類細胞をヒト以外の哺乳類宿主中に内植する。一般的に、これは、例えばヒト腫瘍セルラインが当業界で公知の方法により、げっ歯動物、例えばマウスへ内植されている異種移植片である。次いで、スクリーニングされる化合物を、用量摂取法に従って、適切な方法、例えば全身的または局所的に、経口投与、注射または別の経路により宿主に投与する。化合物は、ある一定期間にわたって多数回、例えば１、２、３、４週間またはそれ以上にわたって週に３、４または５回投与されることが多い。本発明によると、病気の進行、すなわち化合物の効力は、宿主動物からの腫瘍におけるアルファ−チューブリンアセチル化レベルを測定することによりモニターされる。
【００１０】
アセチル化アルファ−チューブリンの発現レベルを、イムノアッセイおよび電気泳動検定法を含む公知方法により、生物学的試料、例えば細胞ライゼート、組織ライゼートまたは白血球ライゼートにおいて検定する。例えば、アセチル化アルファ−チューブリン特異的抗体を標準免疫検定フォーマットで使用することにより、アセチル化アルファ−チューブリンレベルを測定する。ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）型検定法および例えばモノクローナル抗体を用いる慣用的ウエスタンブロッティング検定法もまた、生物マーカータンパク質としてのアセチル化アルファ−チューブリンの誘導および蓄積を直接測定するのに使用される。
【００１１】
アセチル化アルファ−チューブリンに特異的な抗体は、公知免疫化方法に従って製造される。
【００１２】
アセチル化アルファ−チューブリンレベルはまた、二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動法により測定される。２−Ｄゲル電気泳動法は当業界では熟知されており、典型的には一次元目に沿った等電点電気泳動（ＩＥＦ）の後、二次元目に沿ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行う。得られた電気泳動図を、例えば抗体を用いる免疫ブロット分析により分析する。適切な抗体は、上記で検討した方法により製造されるかまたは市販供給源から入手され得る。免疫ブロッティング分析については、抗体はアセチル化アルファ−チューブリンに特異的である必要は無く、非アセチル化アルファ−チューブリンおよび誘導されたアセチル化アルファ−チューブリンはＩＥＦにより容易に分離されるため、アルファ−チューブリンがいずれの形態にせよ、それに反応性を示す抗体であればよい。
【００１３】
本発明スクリーニング方法は、増殖性疾患に対する治療活性を有する化合物を同定するのに有用である。特に、本発明スクリーニング方法に従って同定される化合物は、タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物、例えばチューブリン脱アセチル化酵素阻害性化合物、特にアルファ−チューブリン脱アセチル化酵素阻害性化合物、およびヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物で、トラポキシン、トリコスタチン、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（ベンゾフラ−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（ＨＤＡＣ−１）、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（ＨＤＡＣ−２）、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（ＨＤＡＣ−３）およびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（ＨＤＡＣ−４）、および他のタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物の活性と質的に類似した活性を有するものである。
【００１４】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物は、典型的には国際公開第０２／２２５７７号の実施例Ｂ２記載のヒストン脱アセチル化酵素阻害検定法において２μＭ未満、特に５００ｎＭ未満、および最も好ましくは１０ｎＭ未満のＩＣ５０を有するものである。前段落で挙げられたＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３およびＨＤＡＣ−４を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物、およびそれらの製法は、例えば２００２年３月２１日に公開された国際公開第０２／２２５７７号に記載されており、出典明示で援用する。
【００１５】
本発明はまた、タンパク質脱アセチル化酵素活性を阻害または調節する活性化合物の治療効力のモニター方法を提供する。本発明によると、アルファ−チューブリンアセチル化は、患者に対するタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物の効力をモニターするための臨床マーカーとして使用される。タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物が増殖性状態に対して有効な効果を有するとき、患者からの生物学的試料、例えば血清または組織は、患者が特に標的細胞において高レベルのアセチル化アルファ−チューブリンを有することを示している。同様に、アセチル化アルファ−チューブリンレベルの測定は、対象からの生物学的試料におけるアセチル化アルファ−チューブリンの誘導および蓄積をモニターすることにより活性化合物の用量および摂取法を最適化するのに使用される。
【００１６】
従って、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、治療有効化合物が見出され、および／または選択された化合物に関する治療有効量または摂取法が見出され、それによって患者についての治療が個々に選択および最適化され得る。この状況で考慮される因子には、処置されている特定の状態、処置されている特定哺乳類、個々の患者の臨床状態、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定タイプ、投与方法、投与スケジュール、および医療実践者に知られている他の因子が含まれる。投与すべき活性化合物の治療有効量は、上記の考慮すべき因子により決定され、疾患の予防、改善または処置に必要な最少量である。上記の量は、好ましくは宿主にとって毒性となる量より少ないか、または宿主の感染に対する感受性を著しく高める量である。
【００１７】
これに加えて、本発明はさらに、新規治療標的ファミリーとして、特に増殖性疾患の処置に有用な治療剤についての標的としての非ヒストンタンパク質脱アセチル化酵素、例えばチューブリン脱アセチル化酵素、特にアルファ−チューブリン脱アセチル化酵素に関するものである。
【００１８】
本発明は、ヒトおよび獣医学的患者において増殖性疾患、特に癌を処置または予防するための組成物および方法、細胞増殖および／または細胞分化の調節における薬理学的活性についての薬剤ライブラリーをスクリーニングするための組成物および方法、バイオプロセス制御での使用および市販の実験試薬としての使用を含む、インビトロでの形質転換細胞表現型の調節用組成物および方法を提供する。さらにこの発明は、アルファ−チューブリンアセチル化を誘導する化合物の抗増殖活性の新規評価方法に関するものである。
【００１９】
すなわち、本発明は、タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物に対する哺乳類対象による応答の評価方法であって、対象の細胞におけるアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを測定し、それをタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物投与前レベルと比較することを含み、特に哺乳類対象が増殖性疾患、例えば特に癌に罹患したヒトである方法を含む。上記方法の実施態様において、アセチル化アルファ−チューブリンのレベルは、エクスビボ、すなわち哺乳類対象の体外で測定される。これは、哺乳類対象から生物学的試料を採取し、公知方法、例えば免疫検定法および電気泳動検定法に従って生物学的試料におけるアセチル化アルファ−チューブリンの発現レベルを検定することにより実施され得る。
【００２０】
さらに本発明は、哺乳類対象においてタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物による処置に感受性を示す増殖性疾患の診断方法であって、増殖性疾患を呈する対象の細胞でタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物の投与前レベルと比べて増加したアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを測定することを含む方法を包含する。この方法の実施態様において、アセチル化アルファ−チューブリンのレベルはエクスビボ（前段落における「エクスビボ」の定義参照）で測定される。
【００２１】
本発明はまた、哺乳類対象における増殖性疾患の処置方法であって、増殖性疾患を呈する対象にタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物を投与し、タンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物の投与前レベルと比べて増加したアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを対象の細胞で測定することを含む方法を提供する。
【００２２】
さらに本発明は、哺乳類対象における増殖性疾患の処置方法であって、増殖性疾患を呈する対象からの細胞においてアセチル化アルファ−チューブリンレベルを測定し、アセチル化アルファ−チューブリンのレベルが、同型の正常細胞が呈するレベルよりも低い場合、対象にタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物を投与することを含み、特にタンパク質脱アセチル化酵素阻害性化合物が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害性化合物、特にＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（ベンゾフラ−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミドおよびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、またはその医薬上許容される塩から選択される化合物である方法を包含する。
【００２３】
驚くべきことに、微小管相互作用剤は、それらの抗増殖および抗腫瘍特性については熟知されているが、アルファ−チューブリンのアセチル化を誘導することも見出された。従って、本発明はまた、微小管相互作用剤の活性に関する生物マーカーとしてのアルファ−チューブリンアセチル化の使用に関するものである。
【００２４】
「微小管相互作用剤」の語は、微小管安定および微小管脱安定剤に関するものであり、限定されるわけではないが、例えばタキサン系パクリタキセルおよびドセタキセル、ビンカアルカロイド類、例えばビンブラスチン、特に硫酸ビンブラスチン、ビンクリスチン、特に硫酸ビンクリスチン、およびビノレルビン、ディスコデルモリドおよびエポチロン類、例えばエポチロンＢおよびＤがある。哺乳類対象、例えばヒトに投与されるとき、ドセタキセル、硫酸ビンブラスチンおよび硫酸ビンクリスチンは、例えば、それぞれ登録商標名タキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ、商標）、ビンブラスチン（ＶＩＮＢＬＡＳＴＩＮ）Ｒ.Ｐ.（商標）およびファルミスチン（ＦＡＲＭＩＳＴＩＮ、商標）として、例えば市販されている形態で投与され得る。ディスコデルモリドは、例えば米国特許第５０１００９９号に開示されている要領で得られる。エポチロンＢおよびＤを含むエポチロン類、および上記エポチロンの製造方法は、特に包括的および具体的に特許および特許出願、国際公開第９３／１０１２１号、米国特許第６１９４１８１号、国際公開第９８／２５９２９号、国際公開第９８／０８８４９号、国際公開第９９／４３６５３号、国際公開第９９／３９６９４号、国際公開第９８／２２４６１号および国際公開第００／３１２４７号の、それぞれの場合において特に化合物に関する請求項および実施例の最終生成物のところに開示されている。これらの特許および特許出願に包含される最終生成物および請求の範囲の内容については、出典明示で援用する。同様に、そこに開示されている、対応する立体異性体および対応する結晶修飾体、例えば溶媒和物および多型も包含される。
【００２５】
コード番号、属名または商標名により識別される活性剤の構造は、標準大要“The Merck Index”の現行版またはデータベース、例えばパテンツ・インターナショナル（Patents International）（例、ＩＭＳ ワールド・パブリケーションズ（World Publications））から引用され得る。その対応する内容については、出典明示で援用する。
【００２６】
従って、タンパク質脱アセチル化酵素阻害に関する生物マーカーとしてのアルファ−チューブリンアセチル化の使用と同様に、本発明はまた、増殖性疾患に対する活性についての化合物のスクリーニング方法であって、哺乳類細胞を化合物と接触させ、対照と比べて増加したアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを検出することを含み、化合物が微小管相互作用剤である方法に関するものである。
【００２７】
従って、本発明はまた、微小管相互作用剤、例えば特にエポチロンＢまたはＤに対する哺乳類対象による応答の評価方法であって、対象の細胞においてアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを測定し、それを微小管相互作用剤投与前レベルと比較することを含む方法に関するものである。
【００２８】
従って、本発明はまた、アセチル化アルファ−チューブリンレベルの測定をエクスビボで行う前段落の方法および上記方法で哺乳類対象が増殖性疾患、例えば特に癌に罹患したヒトである場合に関するものである。
【００２９】
同様に、本発明はまた、哺乳類対象において微小管相互作用剤、例えば特にエポチロンＢまたはＤによる処置に感受性を示す増殖性疾患の診断方法であって、増殖性疾患を呈する対象の細胞において、微小管相互作用剤投与前レベルと比べて増加したアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを測定することを含む方法および上記方法でアセチル化アルファ−チューブリンレベルの測定をエクスビボで行う場合に関するものである。
【００３０】
従って、本発明はまた、哺乳類対象における増殖性疾患の処置方法であって、増殖性疾患を呈する対象に微小管相互作用剤を投与し、対象の細胞において微小管相互作用剤投与前レベルと比べて増加したアセチル化アルファ−チューブリンのレベルを測定することを含む方法を提供する。
【００３１】
最後に、本発明はまた、哺乳類対象における増殖性疾患の処置方法であって、増殖性疾患を呈する対象からの細胞においてアセチル化アルファ−チューブリンレベルを測定し、アセチル化アルファ−チューブリンレベルが、同型の正常細胞が呈するレベルよりも低い場合、対象に微小管相互作用剤を投与することを含み、特に微小管相互作用剤がエポチロンＢまたはＤから選択されるものである方法に関するものである。
【００３２】
以下、実施例により本発明についてさらに詳しく説明し、説明目的で実施例を提供するが、それらは本発明に対する制限を意図したものではないものとする。
【００３３】
実施例１
腫瘍セルラインにおけるＨＤＡＣ阻止の有効性を評価していると、アセチル化ヒストンの予測されるバンドに加えて、５０ｋＤで泳動するタンパク質バンドが抗アセチルリジンにより展開された免疫ブロットで現れることが観察される。このタンパク質を同定するため、ＨＤＡＣ−２処理および対照ＨＣＴ１６６細胞の細胞抽出物を、一次元目における広範囲ＩＥＦゲル（ｐＨ３−１０）での２−Ｄゲル電気泳動により分離し、抗アセチルリジンによるウエスタンブロッティングにより分析する。ＨＤＡＣ−２処理試料においては、ヒストンに対応する低分子量の顕著に染色されたバンドが下方右隅に見え、ｐＨ４.５前後の非ヒストンスポットが見えるが、これは対照細胞抽出物の均等内容分析ではかすかに免疫染色されるだけである。非ヒストンスポットの位置は、アセチルリジン反応性タンパク質がチューブリンであり得ることを示唆しており、これがこの修飾をもつことは熟知されている。
【００３４】
アミド基はプロトン化され得ないため、リジン残基のアセチル化によりタンパク質の電荷は減少する。タンパク質スポットが実際にアルファ−チューブリンに対応する場合、アセチル化形態は、その正常な対応物質の場合よりも低い等電点（ｐＩ）で集まることが予測される。チューブリンに対する抗体によるＩＥＦブロッティング実験により、これらの形態が分離され、粗抽出物に関する一次元分析においてこの仮説が試験され得る。これらの結果は、幾つかの種類のチューブリンに対する抗体の中で、アルファ−チューブリンに対する抗体のみ、ＨＤＡＣ阻害剤誘導酸性方向シフトバンドを示したことを示している。ベータ−チューブリンに対する４抗体については、シフトは全く観察されない。この結果は、一次元目における狭い範囲のｐＨ（ｐＨ４.５〜５.５）−ゲルでの２−次元分離により確認される。抗アセチルリジン抗体検出による免疫ブロッティングに一セットのゲルを用い、クーマシーブルーでのゲル染色用に第二セットを確保する。膜での全タンパク質パターンに抗体染色膜のパターンを重ね合わせると、アセチルリジン反応性スポットがアルファ−チューブリンの位置近くで泳動することがわかる。同じ膜の第二免疫染色（第一抗体除去後）により、スポットの全領域が染色される。
【００３５】
クーマシー染色２−Ｄゲルは、ＨＤＡＣ−２処理試料についてのアルファ−チューブリンの領域においてサイズが類似したスポットの２本の二重線を示す。非処理対照では、アルファ−チューブリンの主たるスポットに隣接した位置にあるスポットはさらに微弱である。４個のチューブリンスポット、および同じくＨＤＡＣ−２処理により特異的に誘導されると思われる小スポットを切断し、質量分析計による分析用に処理する。
【００３６】
データベース検索からは、ヒトチューブリンアルファ−４鎖にマッチするペプチドが得られる（スイスプロットＰ０４６８７）。アセチルリジン反応性スポットから誘導された幾つかのペプチドは、アルファ−チューブリンのアセチル化形態から生じると予測されるフラグメントとマッチする。これらは非反応性チューブリンイソ型から誘導されるペプチドからは見出されない。クーマシー染色ゲル上ではほとんど見えない小スポットもまたアルファ−チューブリンとして同定される。それは明らかにアセチル化チューブリンのフラグメントである。
【００３７】
アルファ−チューブリンのアセチル化形態に特異的な市販のモノクローナル抗体（シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ、米国、カタログ＃Ｔ６７９３）は、これらの結論の確証となる。この抗体により得られるシグナルは、一般的な抗アセチルリジン抗体により得られるものよりかなり強い。
【００３８】
実施例２
セルラインにおけるＨＤＡＣ−２誘導チューブリンアセチル化の時間経過
アルファ−チューブリンのアセチル化は、ＨＤＡＣ−２を加えた後急速に行なわれる。ＨＤＡＣ−２（２００ｎＭ）を加えた後３０分までに、最大アセチル化の３０％を越える割合に達する（４時間で）。最後の時点で（１８時間）、細胞は目に見えて損傷されている。
【００３９】
実施例３
ＨＤＡＣ−２は、マウスのＨＣＴ１１６腫瘍異種移植片においてチューブリンアセチル化を増加させた
ＨＤＡＣ−２の抗腫瘍活性とそのチューブリンアセチル化誘導との相関関係を明らかにするため、アセチル化チューブリンのレベルを、ＨＤＡＣ−２で処置したＨＣＴ１１６を担う無胸腺マウスおよび対照マウスの腫瘍において調べる。マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＨＤＡＣ−２を投与し、腫瘍を投与の３、６、１６または２４時間後に解剖する。チューブリンアセチル化レベルは、アセチル化アルファ−チューブリンに特異的な抗体により検出される。ＨＤＡＣ−２の静脈内投与の結果、３０分以内のうちにアセチル化アルファ−チューブリンが一貫して増加し、それは少なくとも８時間持続する。増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）レベルは本質的に不変である。ＨＤＡＣ−２処置動物におけるチューブリンアセチル化の増加をヒストン脱アセチル化酵素に対する化合物の効果と結び付けると、化合物はＨＣＴ１１６腫瘍異種移植片においてタンパク質脱アセチル化酵素を阻害していることがわかる。
【００４０】
実施例５
ＨＤＡＣ−２の用量に対するチューブリンアセチル化の感受性
ＨＤＡＣ−２に対するチューブリンアセチル化の感受性を測定するため、２ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの静脈内用量を、ＨＣＴ１１６担癌マウスに投与する。腫瘍を投与の１時間後に解剖し、アセチル化チューブリンレベルを、抗アセチル化アルファ−チューブリン抗体でのウエスタンブロッティングにより測定する。２ｍｇ／ｋｇ程度の静脈内低用量で腫瘍におけるチューブリンアセチル化が誘導され得る。
【国際調査報告】
2005511062.tif 000002
2005511062.tif 000003
2005511062.tif 000004