(57)【要約】幹細胞または椎間板細胞（例えば線維輪の細胞、または髄核の細胞）などの非骨性哺乳動物細胞において、ＬＩＭミネラル化タンパク質を発現させる方法を記載する。該方法は、機能可能であるようにプロモーターに連結したＬＩＭミネラル化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で、細胞をトランスフェクションすることを伴う。トランスフェクションは、ウイルスまたは裸のＤＮＡの直接注射によって、あるいはプラスミドなどの非ウイルスベクターによって、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで達成可能である。ＬＩＭミネラル化タンパク質の発現は、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲンを産生可能な細胞において、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲン産生を刺激することが可能である。外傷または椎間板変性に関連する椎間板疾患を治療する方法もまた、記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非骨性哺乳動物細胞において、ＬＩＭミネラル化タンパク質を発現させる方法であって：
機能可能であるようにプロモーターに連結したＬＩＭミネラル化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクションする
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
細胞がプロテオグリカンおよび／またはコラーゲンを産生可能であり、そしてＬＩＭミネラル化タンパク質の発現が、細胞において、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲン合成を刺激する、請求項１の方法。
【請求項３】
単離核酸が：
標準的条件下で、配列番号２５の全長に相補的な核酸分子にハイブリダイズし；そして／または
非常にストリンジェントな条件下で、配列番号２６の全長に相補的な核酸分子にハイブリダイズする、請求項２の方法。
【請求項４】
細胞が幹細胞、椎間板細胞、髄核の細胞、または線維輪の細胞である、請求項２の方法。
【請求項５】
細胞をｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションする、請求項１の方法。
【請求項６】
細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションする、請求項１の方法。
【請求項７】
哺乳動物の椎間板に核酸を直接注射することによって、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションする、請求項２の方法。
【請求項８】
核酸がベクター中にある、請求項１の方法。
【請求項９】
ベクターが発現ベクターである、請求項８の方法。
【請求項１０】
発現ベクターがプラスミドである、請求項９の方法。
【請求項１１】
ベクターがウイルスである、請求項８の方法。
【請求項１２】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ウイルスがレトロウイルスである、請求項１１の方法。
【請求項１４】
アデノウイルスがＡｄＨＬＭＰ−１である、請求項１２の方法。
【請求項１５】
プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項１の方法。
【請求項１６】
プロテオグリカンが硫酸化グリコサミノグリカンである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ＬＩＭミネラル化タンパク質がＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、またはＨＬＭＰ−３である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
ＬＩＭミネラル化タンパク質がＨＬＭＰ−１である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
ＬＩＭミネラル化タンパク質の発現が、細胞において、１以上の骨形成タンパク質の発現を増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする単離核酸配列を含んでなる、非骨性哺乳動物細胞。
【請求項２１】
幹細胞、線維輪の細胞、髄核の細胞、または椎間板細胞である、請求項２０の非骨性哺乳動物細胞。
【請求項２２】
多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、請求項２０の非骨性哺乳動物細胞。
【請求項２３】
哺乳動物において、椎間板傷害または疾患を治療する方法であって：
プロテオグリカンおよび／またはコラーゲンを産生可能な哺乳動物細胞に、単離核酸をトランスフェクションすることを含んでなり；
単離核酸が、機能可能であるようにプロモーターに連結したＬＩＭミネラル化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、そしてＬＩＭミネラル化タンパク質の発現が、細胞において、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲン合成を刺激する、前記方法。
【請求項２４】
椎間板変性を逆転させるか、防止するかまたは妨害する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
椎間板疾患が変性椎間板疾患、背下部痛、椎間板ヘルニア、または脊髄の狭窄である、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
細胞が椎間板細胞であり、そして哺乳動物の椎間板に単離核酸を直接注射することによって、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションする、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物細胞をｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションし、そしてその後、該哺乳動物に移植する、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物細胞が非骨性哺乳動物細胞である、請求項２３の方法。
【請求項２９】
哺乳動物細胞が幹細胞、椎間板細胞、線維輪の細胞、または髄核の細胞である、請求項２７の方法。
【請求項３０】
哺乳動物細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、請求項２７の方法。
【請求項３１】
単離核酸がベクター中にある、請求項２３の方法。
【請求項３２】
単離核酸が発現ベクター中にある、請求項２３の方法。
【請求項３３】
単離核酸がプラスミド中にある、請求項２３の方法。
【請求項３４】
単離核酸がウイルス中にある、請求項２３の方法。
【請求項３５】
単離核酸がアデノウイルス中にある、請求項２３の方法。
【請求項３６】
単離核酸がレトロウイルス中にある、請求項２３の方法。
【請求項３７】
アデノウイルスがＡｄＨＬＭＰ−１である、請求項３５の方法。
【請求項３８】
プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項２３の方法。
【請求項３９】
ＬＩＭミネラル化タンパク質がＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、またはＨＬＭＰ−３である、請求項２３記載の方法。
【請求項４０】
ＬＩＭミネラル化タンパク質がＨＬＭＰ−１である、請求項２３記載の方法。
【請求項４１】
単離核酸が：
標準的条件下で、配列番号２５の全長に相補的な核酸分子にハイブリダイズし；そして／または
非常にストリンジェントな条件下で、配列番号２６の全長に相補的な核酸分子にハイブリダイズする、請求項２３の方法。
【請求項４２】
細胞を椎間板に移植する、請求項２７の方法。
【請求項４３】
哺乳動物への移植前に、トランスフェクション細胞をキャリアーと合わせることをさらに含んでなる、請求項２７の方法。
【請求項４４】
キャリアーが多孔性マトリックスを含んでなる、請求項４３の方法。
【請求項４５】
キャリアーが合成ポリマーまたはコラーゲンマトリックスを含んでなる、請求項４４の方法。
【請求項４６】
キャリアー物質；および
ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする単離核酸配列を含んでなる複数の哺乳動物細胞
を含んでなる、椎間板移植物であって；
キャリアー物質が生体適合性物質の多孔性マトリックスを含んでなり、そして哺乳動物細胞が該キャリアーに取り込まれている、前記椎間板移植物。
【請求項４７】
哺乳動物細胞が幹細胞、線維輪の細胞、髄核の細胞、椎間板細胞およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４６の移植物。
【請求項４８】
哺乳動物細胞が多能性幹細胞、間葉系幹細胞またはその組み合わせである、請求項４６の移植物。
【請求項４９】
生体適合性物質が合成ポリマーまたはタンパク質を含んでなる、請求項４６の移植物。
【請求項５０】
生体適合性物質がコラーゲンを含んでなる、請求項４６の移植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６０／３３１，３２１号、２００１年１１月１４日出願の優先権を請求する。この仮出願は完全に本明細書に援用される。
本出願は、米国特許出願第０９／１２４，２３８号、１９８８年７月２９日出願、現米国特許第６，３００，１２７号、および米国特許出願第０９／９５９，５７８号、２０００年４月２８日出願、係属中に関する。これらの出願は各々、本明細書に完全に援用される。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明の分野は、一般的に、椎間板細胞または髄核の細胞などの非骨性細胞において、ＬＩＭミネラル化タンパク質を発現させるための方法に関する。より具体的には、本発明の分野は、ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする核酸で、椎間板細胞などの非骨性細胞をトランスフェクションすることに関する。
【背景技術】
【０００３】
技術背景
骨芽細胞は、多能性間葉系幹細胞から分化すると考えられる。骨芽細胞の成熟は、ミネラル化し、そして骨を形成することが可能な、細胞外マトリックスの分泌を生じる。この複雑なプロセスの制御はよく理解されていないが、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）として知られるシグナル伝達糖タンパク質群が関与すると考えられる。これらのタンパク質は、胚性背側−腹側パターン形成、肢芽発生、および成体動物の骨折修復に関与することが示されてきている。Ｂ．Ｌ．  Ｈｏｇａｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，  １０，  １５８０（１９９６）。トランスフォーミング増殖因子−ベータ・スーパーファミリー分泌タンパク質のこの群は、異なる分化段階の多様な細胞種において、多様な活性を有する；これらの緊密に関連する分子間の生理学的活性の相異は、まだ解明されてきていない。Ｄ．Ｍ．  Ｋｉｎｇｓｌｅｙ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，  １０，  １６（１９９４）。
【０００４】
異なるＢＭＰシグナル伝達タンパク質に特有の生理学的役割をよりよく認識するため、我々は最近、ＢＭＰ−６がラット頭蓋冠骨芽細胞分化を誘導する効力を、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４の効力と比較した。Ｂｏｄｅｎら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １３７，  ３４０１（１９９６）。我々は、分化の開始にＢＭＰまたはグルココルチコイドを必要とする胎児ラット頭蓋冠の第一継代（二次）培養において、このプロセスを研究した。膜状の骨を形成するこのモデルでは、グルココルチコイド（ＧＣ）またはＢＭＰは、骨芽細胞特異的タンパク質であるオステオカルシンを分泌可能なミネラル化骨結節への分化を開始するであろう。この二次培養系は、自発的な分化を経る初代ラット骨芽細胞培養とは異なる。この二次系では、グルココルチコイドは、ＢＭＰ−６  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の１０倍の誘導を生じ、これが骨芽細胞分化の増進に関与した。Ｂｏｄｅｎら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １３８，  ２９２０（１９９７）。
【０００５】
ＢＭＰなどの細胞外シグナルに加え、細胞内シグナルまたは制御分子もまた、新規骨形成を導く事象のカスケードにおいて、役割を果たしている可能性がある。１つの広い種類の細胞内制御分子がＬＩＭタンパク質であり、これらは、ＬＩＭドメインとして知られる特徴的な構造モチーフを所持するため、このように名付けられている。ＬＩＭドメインは、２アミノ酸スペーサーによって連結される２つの特別なジンクフィンガーで構成されるシステインリッチ構造モチーフである。ＬＩＭドメインしか持たないタンパク質もあるが、多様なさらなる機能ドメインを含有するものもある。ＬＩＭタンパク質は多様な群を形成し、これらには転写因子および細胞骨格タンパク質が含まれる。ＬＩＭドメインの主な役割は、同一のまたは異なるＬＩＭドメインを持つ二量体の形成を通じて、あるいは別個のタンパク質と結合することによって、タンパク質−タンパク質相互作用を仲介することにあるようである。
【０００６】
ＬＩＭホメオドメインタンパク質、すなわちＬＩＭドメインおよびホメオドメイン配列両方を有するタンパク質において、ＬＩＭドメインは負の制御要素として機能する。ＬＩＭホメオドメインタンパク質は、細胞系譜決定の調節および分化制御に関与するが、ＬＩＭ単独のタンパク質が同様の役割を有する可能性もある。ＬＩＭ単独のタンパク質はまた、こうしたタンパク質をコードするいくつかの遺伝子が発癌性染色体転位置に関与するため、細胞増殖の調節にも関与している。
【０００７】
ヒトおよび他の哺乳動物種は、骨修復および／または骨再生プロセスを必要とする疾患または傷害の傾向がある。例えば、骨折の治療は、天然骨修復機構を刺激し、それによって骨折した骨が治癒するのに要する時間を減少させることが可能な新規治療措置によって改善されるであろう。別の例では、骨粗鬆症などの全身性骨障害に罹患した個体は、新規骨の全身性形成を生じるであろう治療措置から利益を得るであろう。こうした治療措置は、この疾患に特徴的な骨量の損失に起因する骨折の発生率を減少させるであろう。
【０００８】
少なくともこれらの理由のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで、新規骨の形成を刺激するのにこれらを使用する目的で、ＢＭＰなどの細胞外因子が研究されてきている。ＢＭＰおよび他の細胞外シグナル伝達分子を用いて、初期には成功が達成されたにもかかわらず、これらの使用は、いくつかの不都合な点を伴った。例えば、新規骨の産生を増進するには、比較的多量の精製ＢＭＰが必要であり、それによって、こうした治療法の費用が増加する。さらに、細胞外タンパク質は、宿主動物に導入した後、分解を受けやすい。さらに、これらは典型的には免疫原性であるため、投与したタンパク質に対する免疫反応を刺激する可能性がいつも存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
こうした懸念のため、新規骨形成を誘導するのに、細胞内シグナル伝達分子を使用する、利用可能な治療措置を有することが望ましいであろう。遺伝子治療の分野で進歩があったため、現在では、骨形成前駆細胞、すなわち骨形成に関与する細胞、または末梢血白血球に、骨形成プロセスの一部を担う細胞内シグナルをコードするヌクレオチド断片を導入することが可能である。骨形成のための遺伝子治療は、いくつかの潜在的な利点を提供する：（１）産生コストがより低い；（２）細胞内シグナルが延長された発現を達成する能力を有するため、細胞外治療措置に比較して、有効性がより高い；（３）細胞外シグナルに対する受容体が限定された数でしか存在しないために細胞外シグナルでの治療が妨げられうる可能性を回避するであろう；（４）局在化された骨形成が必要な部位に、トランスフェクションした潜在的な骨前駆細胞を直接搬送することを可能にする；そして（５）全身性骨形成を可能にし、それによって骨粗鬆症および他の代謝性骨疾患の治療措置を提供するであろう。
【００１０】
骨の疾患に加えて、ヒトおよび他の哺乳動物種はまた、椎間板変性になりやすく、これはとりわけ、背下部痛、椎間板ヘルニア、および脊髄の狭窄に関与する。椎間板変性は、プロテオグリカンマトリックスの進行性損失に関与する。これは、椎間板を生体力学的傷害および変性に罹患しやすくする可能性がある。したがって、適切な細胞、例えば髄核の細胞、線維輪の細胞、および椎間板の細胞などによって、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲン合成を刺激する方法があることが望ましいであろう。
【００１１】
発明の概要
本発明の第一の側面にしたがって、非骨性哺乳動物細胞において、ＬＩＭミネラル化タンパク質を発現させる方法を提供する。本発明のこの側面にしたがって、該方法は、機能可能であるようにプロモーターに連結したＬＩＭミネラル化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクションすることを含んでなる。ＬＩＭミネラル化タンパク質の発現が、細胞において、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲン合成を刺激するように、細胞は、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲンを産生可能な細胞であることが可能である。本発明のこの側面にしたがった単離核酸は、標準的条件下で、配列番号２５の全長に相補的な核酸分子にハイブリダイズ可能な核酸；および／または非常にストリンジェントな条件下で、配列番号２６の全長に相補的な核酸分子にハイブリダイズ可能な核酸分子であることが可能である。細胞は幹細胞、椎間板細胞、線維輪の細胞、または髄核の細胞であることが可能である。
【００１２】
本発明の第二の側面にしたがって、ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする単離核酸配列を含んでなる非骨性哺乳動物細胞を提供する。本発明のこの側面にしたがって、細胞は幹細胞、髄核の細胞、線維輪の細胞、または椎間板細胞であることが可能である。
【００１３】
本発明の第三の側面にしたがって、椎間板傷害または疾患を治療する方法を提供する。本発明のこの側面にしたがって、該方法は、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲンを産生可能な哺乳動物細胞に、単離核酸をトランスフェクションすることを含んでなる。該単離核酸は、機能可能であるようにプロモーターに連結したＬＩＭミネラル化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる。ＬＩＭミネラル化タンパク質は、細胞において、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲン合成を刺激する。
【００１４】
本発明の第四の側面にしたがって、椎間板移植物を提供する。本発明のこの側面にしたがって、移植物は、キャリアー物質、およびＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする単離核酸配列を含んでなる複数の哺乳動物細胞を含んでなる。やはり本発明のこの側面にしたがって、キャリアー物質は生体適合性物質の多孔性マトリックスを含んでなり、そして哺乳動物細胞は該キャリアー物質に取り込まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする核酸を用いた非骨性細胞のトランスフェクションに関する。本発明の発明者らは、ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする核酸で、椎間板細胞などの非骨性細胞をトランスフェクションした結果、プロテオグリカン、コラーゲン、並びに他の椎間板構成要素および組織の合成が増加しうることを発見した。本発明はまた、プロテオグリカン、コラーゲン、または他の椎間板構成要素の損失に関連する椎間板疾患を治療する方法も提供する。
【００１６】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はどちらも例示および説明のためのものであり、そして請求するような本発明のさらなる説明を提供することを意図する。
略記および定義
【００１７】
【表１】
2005526488.tif 000002
【００１８】
ＬＩＭ遺伝子（１０−４／ＲＬＭＰ）は、刺激したラット頭蓋冠骨芽細胞培養物から単離された（配列番号１、配列番号２）。米国特許第６，３００，１２７号を参照されたい。この遺伝子は、クローニングされ、配列決定され、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨ミネラル化効果を増進させる能力に関してアッセイされてきた。タンパク質ＲＬＭＰは、骨マトリックスのミネラル化とともに骨芽細胞系譜への細胞の分化に影響を及ぼすことが見出されている。他の既知のサイトカイン（例えばＢＭＰ）とは異なり、ＲＬＭＰは分泌タンパク質ではなく、細胞内シグナル伝達分子である。この特徴は、細胞内シグナル伝達増幅とともに、トランスフェクション細胞のより容易な評価を提供するという利点を有する。これはまた、より有効で、そして特異的なｉｎ  ｖｉｖｏ適用にも適している。適切な臨床適用には、骨折、骨欠陥、骨移植における骨修復増進、および骨粗鬆症を示す患者における正常ホメオスタシスが含まれる。
【００１９】
ヒトＬＭＰ−１（「ＨＬＭＰ−１」）と称する、対応するヒトタンパク質のアミノ酸配列もまた、クローニングされ、配列決定され、そして推定されてきている。米国特許第６，３００，１２７号を参照されたい。ヒトタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで骨ミネラル化の効果増進を示すことが見出されている。
【００２０】
さらに、ＨＬＭＰ−１ｓと称するＨＬＭＰ−１の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）（短）バージョンが性質決定されてきている。米国特許第６，３００，１２７号を参照されたい。この短いバージョンは、ｃＤＮＡクローンの１つの供給源中の点突然変異から生じて、該タンパク質を一部切除する停止コドンを提供する。ＨＬＭＰ−１ｓは、細胞培養およびｉｎ  ｖｉｖｏで発現させた場合、完全に機能することが見出されている。
【００２１】
ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ解析を用いて、２つの選択的スプライシング変異体（ＨＬＭＰ−２およびＨＬＭＰ−３と称する）が同定されてきており、これらは、ＨＬＭＰ−１をコードするヌクレオチド配列において、塩基対３２５〜４４４の間の領域で、ＨＬＭＰ−１と異なる。米国特許出願第０９／９５９，５７８号、２０００年４月２８日出願、係属中を参照されたい。ＨＬＭＰ−２配列は、この領域中に１１９塩基対の欠失および１７塩基対の挿入を有する。ＨＬＭＰ−１に比較して、ＨＬＭＰ−３をコードするヌクレオチド配列には欠失がないが、該配列はＨＬＭＰ−２と同じ１７塩基対を有し、この塩基対はＨＬＭＰ−１配列の４４４位に挿入されている。
【００２２】
ＬＭＰは多能性分子であり、いくつかの生物学的プロセスを制御するかまたはこうしたプロセスに影響を及ぼす。ＬＭＰの異なるスプライシング変異体は、哺乳動物において、異なる生物学的機能を有すると期待される。これらは多様な組織の増殖、分化および／または再生において役割を果たす可能性がある。例えば、ＬＭＰのいくつかの型は、骨のみでなく、筋肉、腱、靭帯、脊椎、末梢神経、および軟骨においても発現される。
【００２３】
１つの側面にしたがって、本発明は、機能可能であるようにプロモーターに連結したＬＩＭミネラル化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸を提供し；プロテオグリカンを産生可能な哺乳動物細胞に前記単離核酸配列をトランスフェクションして；そしてＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を発現させ、それによってプロテオグリカン合成を刺激することによって、哺乳動物細胞において、プロテオグリカンおよび／またはコラーゲン合成を刺激する方法に関する。哺乳動物細胞は、椎間板細胞、線維輪の細胞、または髄核の細胞などの非骨性細胞であることが可能である。トランスフェクションは、例えばプラスミドなどの、ウイルスまたは裸のＤＮＡの直接注射によって、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで起こることが可能である。特定の態様において、ウイルスは組換えアデノウイルス、好ましくはＡｄＨＬＭＰ−１である。
【００２４】
本発明の別の態様は、ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする単離核酸配列を含んでなる、非骨性哺乳動物細胞を含んでなる。非骨性哺乳動物細胞は、幹細胞（例えば多能性幹細胞または間葉系幹細胞）または椎間板細胞、好ましくは髄核の細胞または線維輪の細胞であることが可能である。
【００２５】
異なる側面において、本発明は、非骨性哺乳動物細胞において、ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする単離ヌクレオチド配列を発現させる方法であって、機能可能であるようにプロモーターに連結したＬＩＭミネラル化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸を提供し；非骨性哺乳動物細胞に前記単離核酸配列をトランスフェクションして；そしてＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を発現させることを含んでなる、前記方法に関する。非骨性哺乳動物細胞は、幹細胞または椎間板細胞（例えば髄核の細胞または線維輪の細胞）であることが可能である。トランスフェクションは、例えばプラスミドなどの、ウイルスまたは裸のＤＮＡの直接注射によって、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで起こることが可能である。ウイルスは組換えアデノウイルス、好ましくはＡｄＨＬＭＰ−１であることが可能である。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、椎間板変性を逆転させるか、妨害するかまたは遅延させることによって、椎間板疾患を治療する方法であって、機能可能であるようにプロモーターに連結したＬＩＭミネラル化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸を提供し；プロテオグリカンを産生可能な哺乳動物細胞に前記単離核酸配列をトランスフェクションして；そしてＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を発現させることによって、前記細胞におけるプロテオグリカン合成を刺激して、それによって椎間板変性を逆転させるか、停止させるかまたは遅延させる、前記方法に関する。椎間板疾患は、背下部痛、椎間板ヘルニア、または脊髄の狭窄を伴う可能性がある。哺乳動物細胞は、幹細胞または椎間板細胞（例えば髄核の細胞、または線維輪の細胞）などの非骨性細胞であることが可能である。
【００２７】
トランスフェクションは、例えばプラスミドなどの、ウイルスまたは裸のＤＮＡの直接注射によって、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで起こることが可能である。特定の態様において、ウイルスは組換えアデノウイルス、好ましくはＡｄＨＬＭＰ−１である。
【００２８】
本発明は、本明細書において、ＬＩＭミネラル化タンパク質、またはＬＭＰと称する、新規哺乳動物ＬＩＭタンパク質に関する。本発明は、より詳細には、ＨＬＭＰまたはＨＬＭＰ−１として知られるヒトＬＭＰ、あるいはＨＬＭＰ−２またはＨＬＭＰ−３として知られるヒトＬＭＰの選択的スプライシング変異体に関する。本発明の出願者らは、これらのタンパク質が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた哺乳動物細胞において、骨ミネラル化を増進することを発見した。哺乳動物で産生した場合、ＬＭＰはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで、骨形成も誘導する。
【００２９】
骨髄細胞、骨形成前駆細胞、末梢血細胞、および幹細胞（例えば多能性幹細胞または間葉系幹細胞）を、ＬＩＭミネラル化タンパク質（例えばＬＭＰまたはＨＬＭＰ）をコードする核酸でｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションし、その後、ドナーにトランスフェクション細胞を再移植することは、骨に関連する多様な障害または傷害を治療するのに適している。例えば、この方法を使用して：骨折修復を増大させ；分節状の欠損において骨を生成し；骨折のため、骨移植代替物を提供し；腫瘍再構築または脊椎固定を促進し；そして弱い骨、あるいは臀部、椎骨、または手首の骨粗鬆症におけるような、骨粗鬆症の骨の（注射による）局所治療を提供することが可能である。ＬＭＰまたはＨＬＭＰコード核酸でのトランスフェクションはまた：骨折した長い骨の修復を加速する、トランスフェクションした骨髄細胞の経皮注射；長い骨の骨折の癒合遅延または癒合不全、あるいは脊椎固定の偽関節の治療；および臀部または膝の無血管壊死における新規骨誘導にも有用である。
【００３０】
遺伝子治療のｅｘ  ｖｉｖｏ法に加えて、ＬＭＰまたはＨＬＭＰをコードする核酸配列を含んでなる組換えＤＮＡベクターのトランスフェクションは、ｉｎ  ｖｉｖｏで達成可能である。ＬＭＰまたはＨＬＭＰをコードするＤＮＡ断片を、適切なウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターに挿入した場合、ウイルス構築物は、軟骨内の骨形成が望ましい体の部位に直接注射可能である。ＬＭＰまたはＨＬＭＰ配列を導入するのに、直接、皮下注射を用いることによって、骨髄細胞を得るため（ｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションするため）に、または患者の新規骨が必要とされる部位にこれらを再移植するために、外科的介入の必要性を伴うことなく、骨形成の刺激を達成可能である。Ａｌｄｅｎら，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｆｏｃｕｓ（１９９８）は、アデノウイルスベクターにクローニングされた、ＢＭＰ−２をコードするｃＤＮＡを用いた遺伝子治療の直接注射法の有用性を立証した。
【００３１】
適切な体の部位に、裸の、すなわち被包化されていない、ＨＬＭＰをコードする核酸配列を含んでなる組換えプラスミドを直接注射することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療を行うことも可能である。本発明のこの態様において、トランスフェクションは、記載されている適切な標的細胞によって、裸のプラスミドＤＮＡが取り込まれるかまたは内在化される際に起こる。ウイルス構築物を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療の場合と同様、裸のプラスミドＤＮＡの直接注射は、外科的介入がほとんど、またはまったく必要でないという利点を提供する。内皮細胞マイトジェン、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）をコードする裸のプラスミドＤＮＡを用いた直接遺伝子治療は、ヒト患者で成功を示している。Ｂａｕｍａｇａｒｔｎｅｒら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ９７，  １２，  １１１４−１１２３（１９９８）。
【００３２】
椎間板適用のため、椎間板から細胞を採取し、ＬＩＭをコードする核酸で、該細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションし、その後、椎間板に該細胞を導入することによって、達成可能である。例えば、脊椎に対して使用するのに適した外科的技術いずれかなどの、当業者に知られる手段いずれかを用いて、細胞を椎間板から採取するか、または椎間板に導入しなおすことが可能である。１つの態様において、注射によって椎間板に細胞を導入する。
【００３３】
やはり本発明にしたがって、ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする核酸で、幹細胞（例えば多能性幹細胞または間葉系幹細胞）をｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションし、そして（例えば注射によって）椎間板に導入することが可能である。
【００３４】
ｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションした細胞はまた、キャリアーと合わせて、椎間板移植物を形成することが可能である。その後、トランスフェクションした細胞を含んでなるキャリアーを被験者の椎間板に移植することが可能である。適切なキャリアー物質は、Ｈｅｌｍら，  “Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｉｎａｌ  Ａｒｔｈｒｏｄｅｓｉｓ”，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｆｏｃｕｓ，  Ｖｏｌ．１０（４）：２００１年４月に開示される。キャリアーは、好ましくは、脱ミネラル化骨マトリックス（ＤＢＭ）、生体適合性合成ポリマーマトリックスまたはタンパク質マトリックスなどの生体適合性多孔マトリックスを含んでなる。適切なタンパク質には、コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質が含まれる。移植前に、ＬＭＰを用いてｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションした細胞を、キャリアーに（すなわち多孔性マトリックスの孔に）取り込むことが可能である。
【００３５】
同様に、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションする椎間板適用のため、当業者に知られる適切な方法いずれかを用いて、椎間板にＤＮＡを導入することが可能である。１つの態様において、椎間空間に核酸を直接注射する。
【００３６】
アデノウイルスベクターを用いて骨形成細胞にＬＭＰを搬送することによって、ＬＭＰの一過性発現を達成する。これは、アデノウイルスが、トランスフェクションされる標的細胞のゲノムに取り込まれないために生じる。ＬＭＰの一過性発現、すなわち、トランスフェクションした標的細胞の生存期間中に生じる発現は、本発明の目的を達成するのに十分である。しかし、標的細胞のゲノムに取り込まれるベクターを搬送ビヒクルとして用いた際に、ＬＭＰの安定な発現が生じうる。例えば、レトロウイルスに基づくベクターがこの目的に適している。
【００３７】
ＬＭＰの安定な発現は、骨粗鬆症および骨形成不全症などの、多様な全身性骨関連障害を治療するのに特に有用である。本発明のこの態様のため、標的細胞にＬＭＰをコードするヌクレオチド配列を搬送するのに、標的細胞のゲノムに組み込まれるベクターを用いるのに加えて、ＬＭＰ発現を制御可能なプロモーターの調節下に配置することが可能である。例えば、テトラサイクリンなどの外因性誘導剤への曝露によってスイッチが入るプロモーターが適切である。
【００３８】
このアプローチを用いて、外因性誘導剤の有効量を投与することによって、全身規模で新規骨の形成を刺激することが可能である。十分な量の骨量が達成されたら、外因性誘導剤の投与を中断することが可能である。例えば骨粗鬆症の結果の骨量損失を置換するため、必要に応じて、このプロセスを反復することが可能である。ＨＬＭＰに特異的な抗体は、患者細胞の骨誘導潜在能力、すなわち骨形成潜在能力をアッセイする方法で使用するのに特に適している。この方法で、骨修復治癒が遅いかまたは劣っているリスクを持つ患者を同定することが可能である。また、ＨＬＭＰ特異的抗体は、例えば骨粗鬆症などの骨変性疾患におけるリスク要因を同定するマーカーアッセイで使用するのに適している。
【００３９】
周知の方法および慣用法にしたがって、ＬＭＰをコードする核酸セグメントを、他の核酸配列、例えばクローニングベクターおよび／または発現ベクターに連結することによって、本発明の遺伝子を調製する。これらの組換えベクターを構築し、そして解析するのに必要な方法、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化、クローニング・プロトコル、突然変異誘発、オリゴヌクレオチドの有機合成およびＤＮＡ配列決定が記載されてきている。ＤＮＡ配列決定には、ジデオキシターミネーター法が好ましい。
【００４０】
組換えＤＮＡ法に関する多くの専門書が刊行されてきており、これらにはＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８８），  Ｄａｖｉｓら，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６），およびＡｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）が含まれる。これらの参考マニュアルは、本明細書に特に援用される。
【００４１】
プライマーが指示するＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅は、本発明の遺伝子発現の共通の工程である。これは、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。ＰＣＲは、Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，８００，１５９号および他の刊行出典に記載される。ＰＣＲの基本的な原理は、プライマー伸長の連続した周期によるＤＮＡ配列の指数的複製である。１つのプライマーの伸長産物は、別のプライマーとハイブリダイズすると、別の核酸分子合成のテンプレートになる。プライマー−テンプレート複合体は、複製機能を行う際にプライマーを伸長する、ＤＮＡポリメラーゼの基質として作用する。ＰＣＲに適用される慣用的な酵素は、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００４２】
基本的なＰＣＲ法の多くの変型が存在し、そして本発明の組換えベクターを構築するのに必要な既定の工程いずれかにおいて選択する特定の方法は、当業者に容易に行われる。例えば、１０−４／ＲＬＭＰの細胞発現を測定するため、標準的でそして周知の方法のもと、ＲＮＡを抽出し、そして逆転写する。その後、ＰＣＲによって、生じたｃＤＮＡを適切なｍＲＮＡ配列に関して解析する。
【００４３】
ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする遺伝子を、組換え発現系の発現ベクター中で発現させる。もちろん、構築した配列は、元来のもの、またはその相補配列と同じである必要はなく、ＤＮＡ暗号の縮重によって決定されるにもかかわらず、骨形成活性を有するＬＭＰを発現する配列いずれかであることが可能である。保存的アミノ酸置換、またはアミノ末端メチオニン残基の存在などの他の修飾もまた使用可能である。
【００４４】
選択した宿主発現系で活性であるリボソーム結合部位を、キメラＬＭＰコード配列の５’端に連結して、合成遺伝子を形成する。適切に直線化したプラスミドに連結することによって、発現用の非常に多様なベクターのいずれか１つに、合成遺伝子を挿入することが可能である。制御可能なプロモーター、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ｌａｃプロモーターもまた、キメラコード配列の発現に適している。他の適切な制御可能プロモーターには、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｒｅｃＡ、Ｔ７およびラムダ・プロモーターが含まれる。
【００４５】
いくつかの標準的な公表されている方法、例えばリン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーションまたはプロトプラスト融合の１つによって、ＬＭＰをコードするＤＮＡをレシピエント細胞にトランスフェクションして、安定な形質転換体を形成する。リン酸カルシウム沈殿が好ましく、特に以下のように行った場合、好ましい。
【００４６】
ＤＮＡを細胞にトランスファーする前に、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２，  ４５６（１９７３）の方法にしたがって、リン酸カルシウムで沈殿させる。４０〜５０μｇのＤＮＡのアリコットを、キャリアーとしてのサケ精子ＤＮＡまたはウシ胸腺ＤＮＡとともに、１００ｍｍディッシュに蒔いた０．５ｘ１０６細胞に用いる。ＤＮＡを０．５ｍｌの２Ｘ  Ｈｅｐｅｓ溶液（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０）と混合し、これに等体積の２ｘＣａＣｌ２（２５０ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０）を添加する。３０〜４０分後に現れた白い顆粒状沈殿は、細胞上に一滴ずつ均一に分布し、これを３７℃で４〜１６時間インキュベーションする。培地を取り除き、そしてＰＢＳ中の１５％グリセロールで３分間、細胞にショックを与える。グリセロールを除去した後、細胞に１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥＭ）を与える。
【００４７】
ＤＮＡはまた：Ｋｉｍｕｒａら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ４９：３９４（１９７２）およびＳｏｍｐａｙｒａｃら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７８，  ７５７５（１９８１）のＤＥＡＥ−デキストラン法；Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１，  ７１６１（１９８４）のエレクトロポレーション法；並びにＳａｎｄｒｉ−Ｇｏｄｄｉｎら，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １，  ７４３（１９８１）のプロトプラスト融合法を用いてもトランスフェクション可能である。
【００４８】
オリゴデオキシヌクレオチドおよびポリデオキシヌクレオチドの有機合成には、固相のホスホロアミダイト化学反応が好ましい方法である。さらに、多くの他の有機合成法が利用可能である。これらの方法は、当業者によって、本発明の特定の配列に容易に適応させられる。
【００４９】
本発明はまた、本発明のＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする核酸配列いずれかに、標準的条件下でハイブリダイズする核酸分子も含む。「標準的ハイブリダイゼーション条件」は、プローブの大きさ、核酸試薬のバックグラウンドおよび濃度とともに、ハイブリダイゼーションの種類、例えばｉｎ  ｓｉｔｕ、サザンブロット、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション（ノーザンブロット）で異なるであろう。「標準的ハイブリダイゼーション条件」の決定は、当該技術分野のレベル内である。例えば、この目的のため、本明細書に援用される、Ｆｒｅｍｅａｕらに対する米国特許第５，５８０，７７５号を参照されたい。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９８：５０３（１９７５）、Ａｌｗｉｎｅら，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ６８：２２０（１９７９）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ７．１９−７．５０（１９８９）もまた参照されたい。
【００５０】
標準的ハイブリダイゼーション条件の１つの好ましい組は、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ（１５０ｎＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ７．４］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、５Ｘデンハルト溶液（１００ｍｌの水に対して２０ｍｇ  Ｆｉｃｏｌｌ、２０ｍｇポリビニルピロリドンおよび２０ｍｇ  ＢＳＡ）、１０％デキストラン硫酸、１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、４２℃で２時間プレハイブリダイズするブロットを含む。３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを添加し、そしてハイブリダイゼーションを１４時間続ける。その後、２ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、２２℃で２０分間、２回ブロットを洗浄し、その後、０．１ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１時間洗浄する。その後、ブロットを乾燥させ、そして増感スクリーンの存在下で、ｘ線フィルムに５日間曝露する。
【００５１】
「非常にストリンジェントな条件」下では、プローブとその標的配列が実質的に同一であれば、プローブは標的配列にハイブリダイズするであろう。標準的ハイブリダイゼーション条件の場合におけるように、当業者は、当該技術分野のレベルおよび特定の実験の性質を考慮して、実質的に同一の配列のみがハイブリダイズするであろう条件を決定することが可能である。
【００５２】
本発明の１つの側面にしたがって、ＬＩＭミネラル化タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる単離核酸分子を提供する。本発明にしたがった核酸分子は、標準的条件下で、配列番号２５の全長に相補的な核酸分子にハイブリダイズし、そして／または非常にストリンジェントな条件下で、配列番号２６の全長に相補的な核酸分子にハイブリダイズする分子であることが可能である。より具体的には、本発明にしたがった単離核酸分子は、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−２、またはＨＬＭＰ−３をコードすることが可能である。
【００５３】
本発明の別の側面には、核酸配列がコードするタンパク質が含まれる。さらに別の態様において、本発明は、抗ＬＭＰ抗体に基づく、こうしたタンパク質の同定に関する。この態様において、細胞を溶解し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離することによって、ウェスタンブロット解析用にタンパク質試料を調製する。Ａｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８７）に記載されるように、エレクトロブロッティングによって、タンパク質をニトロセルロースにトランスファーする。インスタント脱脂粉乳（１００ｍｌＰＢＳ中１グラム）を用いてフィルターをブロッキングした後、フィルターに抗ＬＭＰ抗体を添加して、そして室温で１時間インキュベーションする。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でフィルターを徹底的に洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−抗体コンジュゲートとともに、室温で１時間インキュベーションする。再びＰＢＳでフィルターを徹底的に洗浄し、そしてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を添加することによって、抗原バンドを同定する。
【００５４】
単一特異性抗体が、本発明で選択する試薬であり、そしてこれは、ＬＭＰ発現と関連する特定の特性に関して、患者細胞を解析するのに特異的に用いられる。「単一特異性抗体」は、本明細書において、ＬＭＰに関して均質な結合特性を持つ、単一抗体種または複数の抗体種と定義される。「均質結合」は、本明細書において、上述のように、抗体種が、ＬＭＰと関連するものなどの、特定の抗原またはエピトープに結合する能力を指す。ＬＭＰに対する単一特異性抗体は、ＬＭＰに対して反応性である抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製されるか、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの技術を用いて、ＬＭＰと反応性であるモノクローナル抗体として調製される。Ｋｏｈｌｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  ４９５−４９７（１９７５）。例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギまたはウマなどの動物を、免疫アジュバントを伴うか、または伴わないかいずれかで、適切な濃度のＬＩＭで免疫することによって、ＬＭＰ特異的抗体を作成する。
【００５５】
このプロセスにおいて、最初の免疫前に、免疫前血清を収集する。各動物には、望ましい場合、許容しうる免疫アジュバントと会合させた、約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇの間のＬＭＰを投与する。こうした許容しうるアジュバントには、限定されるわけではないが、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、コリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）を含有する油中水エマルジョンおよびｔＲＮＡアジュバントが含まれる。最初の免疫は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）または両方で、多数の部位に注射されるＬＭＰ、好ましくはフロイントの完全アジュバント中のＬＭＰからなる。各動物から一定間隔で、好ましくは毎週、出血させて、抗体力価を測定する。動物は、最初の免疫後、ブースター注射を受けても、または受けなくてもよい。ブースター注射を受ける動物には、一般的に、同一経路により、フロイントの不完全アジュバント中、等量の抗原を与える。ブースター注射は、最大力価が得られるまで、約３週間間隔で与える。各ブースター免疫の約７日後、または単回免疫後、ほぼ毎週、動物から出血させ、血清を収集し、そしてアリコットを約−２０℃で保管する。
【００５６】
近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウスをＬＭＰで免疫することによって、ＬＭＰと反応性であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製する。上に論じるように、等体積の許容しうるアジュバントに取り込んだ、約０．５ｍｇの緩衝剤または生理食塩水中、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＬＭＰで、ＩＰまたはＳＣ経路によって、マウスを免疫する。フロイントの完全アジュバントが好ましい。マウスに第０日に初回免疫を与え、そして約３〜３０週間休ませる。免疫したマウスに、静脈内（ＩＶ）経路により、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝溶液中、約０．１〜約１０ｍｇのＬＭＰの１以上の追加免疫を行う。抗体陽性マウス由来のリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、当該技術分野に知られる標準法によって免疫したマウスから脾臓を取り除くことによって得る。脾臓リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と、安定なハイブリドーマ形成を可能にするであろう条件下で混合することによって、ハイブリドーマ細胞を産生する。融合パートナーには、限定されるわけではないが：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０が含まれ、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞を、約１，０００分子量、約３０％〜約５０％の濃度のポリエチレングリコール中で融合させる。当該技術分野に知られる方法によって、強化したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン中で増殖させることによって、融合したハイブリドーマ細胞を選択する。ほぼ第１４日、第１８日、および第２１日に、増殖陽性ウェルから上清液を収集し、そして抗原としてＬＭＰを用いて、固相免疫放射アッセイ（ＳＰＩＲＡ）などのイムノアッセイによって、抗体産生に関してスクリーニングする。培養液もまた、オクタロニー沈降アッセイで試験して、ｍＡｂのアイソタイプを決定する。ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  “Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｅｒｓｏｎ（監修），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７３）の軟寒天技術などの技術によって、抗体陽性ウェル由来のハイブリドーマ細胞をクローニングする。Ｈａｒｌｏｗら，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）もまた参照されたい。
【００５７】
モノクローナル抗体はまた、プリスタンでプライミングしたＢａｌｂ／ｃマウスに、プライミング約４日後、約２ｘ１０６〜約６ｘ１０６ハイブリドーマ細胞を、マウスあたりおよそ０．５ｍｌ注射することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでも産生可能である。細胞トランスファーのおよそ８〜１２日後、腹水を収集し、そして当該技術分野に知られる技術によって、モノクローナル抗体を精製する。
【００５８】
約２％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマ細胞株を増殖させて、十分な量の特異的ｍＡｂを得ることによって、抗ＬＭＰ  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生を行う。当該技術分野に知られる技術によって、ｍＡｂを精製する。
【００５９】
限定されるわけではないが、沈降、受身凝集反応、酵素連結免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を含む、多様な血清学的アッセイまたは免疫学的アッセイによって、腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価を決定する。同様のアッセイを用いて、体液または組織および細胞抽出物中のＬＭＰの存在を検出する。
【００６０】
単一特異性抗体を産生するための上述の方法を利用して、ＬＭＰのポリペプチド断片、全長新生ＬＭＰポリペプチド、あるいはその変異体またはアレルに特異的な抗体を産生可能であることが、当業者には容易に明らかである。
【００６１】
別の態様において、本発明は、ＨＬＭＰ−１の選択的スプライシング変異体に関する。ヒト心臓ｃＤＮＡをＰＣＲ解析することによって、ＨＬＭＰ−２およびＨＬＭＰ−３と称する、２つのＨＬＭＰ選択的スプライシング変異体のｍＲＮＡが明らかになり、これらはＨＬＭＰ−１配列の塩基対３２５〜４４４の間の領域で、ＨＬＭＰ−１と異なる。ＨＬＭＰ−２配列は、この領域に、１１９塩基対の欠失および１７塩基対の挿入を有する。これらの変化は読み枠を保存し、４２３アミノ酸のタンパク質を生じ、これはＨＬＭＰ−１に比較して、３４アミノ酸の純損失を有する（４０アミノ酸が欠失するのに加えて６アミノ酸が挿入される）。ＨＬＭＰ−２は、ＨＬＭＰ−１に存在しているＣ末端のＬＩＭドメインを含有する。
【００６２】
ＨＬＭＰ−１と比較して、ＨＬＭＰ−３には欠失がないが、４４４位に同じ１７塩基対の挿入を有する。この挿入は読み枠をシフトさせ、塩基対４５９〜４６１に停止コドンを生じる。その結果、ＨＬＭＰ−３は１５３アミノ酸のタンパク質をコードする。このタンパク質は、ＨＬＭＰ−１およびＨＬＭＰ−２には存在するＣ末端ＬＩＭドメインを欠く。ＨＬＭＰ−２およびＨＬＭＰ−３にコードされるタンパク質の予測される大きさを、ウェスタンブロット解析によって確かめた。
【００６３】
３つのスプライシング変異体の組織分布をＰＣＲ解析することによって、これらが差別的に発現されており、異なる組織には異なるアイソフォームが主であることが明らかになった。ＨＬＭＰ−１は、白血球、脾臓、肺、胎盤、および胎児肝臓で発現される主な型であるようである。ＨＬＭＰ−２は、骨格筋、骨髄、および心臓組織の主なアイソフォームであるようである。しかし、ＨＬＭＰ−３は調べた組織いずれでも主なアイソフォームではなかった。
【００６４】
二次ラット骨芽細胞培養中でＨＬＭＰ−３を過剰発現させると、グルココルチコイド（２７２±７）およびＨＬＭＰ−１（２３２±２００）に見られる効果と同様の骨結節形成（２８７±５６）が誘導された。ＨＬＭＰ−３は、Ｃ末端ＬＩＭドメインを欠くため、この領域は、骨誘導活性に必要ではない。
【００６５】
しかし、ＨＬＭＰ−２を過剰発現しても、結節形成は誘導されなかった（１１±３）。これらのデータは、欠失した１１９塩基対にコードされるアミノ酸が骨誘導に必要であることを示唆する。該データはまた、ＨＬＭＰスプライシング変異体の分布が、組織特異的機能に重要でありうることも示唆する。驚くべきことに、我々は、ＨＬＭＰ−２が二次ラット骨芽細胞培養中でステロイドが誘導する骨芽細胞形成を阻害することを示した。したがって、ＨＬＭＰ−２は、骨形成が望ましくない臨床的状況において、療法的有用性を有する可能性がある。
【００６６】
１９９７年７月２２日、ｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと称するベクター中の１０−４／ＲＬＭＰ（挿入物１０−４クローン／ＲＬＭＰを含むベクターｐＲｃ／ＣＭＶ２）の試料を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ  ２０８５２に寄託した。この寄託物の培養寄託番号は２０９１５３である。１９９８年３月１９日、挿入物ＨＬＰＭ−１ｓを含むベクターｐＨｉｓ−Ａの試料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）に寄託した。この寄託物の培養寄託番号は２０９６９８である。２０００年４月１４日、プラスミドｐＨＡｈＬＭＰ−２（ＨＬＭＰ−２のヒト心筋ｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡ挿入物を含むベクターｐＨｉｓＡ）およびｐＨＡｈＬＭＰ−３（ＨＬＭＰ−３のヒト心筋ｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡ挿入物を含むベクターｐＨｉｓＡ）の試料を、ブダペスト条約の条件下で、ＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ，  ２０１１０−２２０９，  ＵＳＡに寄託した。これらの寄託物の寄託番号は、それぞれＰＴＡ−１６９８およびＰＴＡ−１６９９である。これらの寄託物は、ブダペスト条約の定めるところにより、ＡＴＣＣに少なくとも３０年間維持されるであろうし、そしてこれらを開示する特許が付与されると、公共に入手可能となるであろう。寄託物の入手可能性は、政府の法的措置によって許諾される特許権の減損において、本発明を実施するライセンスを構成しない。
【００６７】
本発明の核酸、タンパク質、または抗体を評価する際、酵素アッセイ、タンパク質精製、および他の慣用的な生化学法を使用する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、それぞれサザンブロッティングおよびノーザンブロッティング技術によって解析される。典型的には、解析する試料を、ゲル電気泳動によって、サイズ分画する。その後、ゲル中のＤＮＡまたはＲＮＡをニトロセルロース膜またはナイロン膜に移す。その後、ゲル中の試料パターンのレプリカであるブロットをプローブとハイブリダイズさせた。典型的には、プローブを、好ましくは３２Ｐで放射標識するが、当該技術分野に知られる他のシグナル生成分子でプローブを標識することも可能である。その後、オートラジオグラフィーなどの検出系によって、目的の特定のバンドを視覚化することが可能である。
【００６８】
本発明の好ましい態様を例示する目的のため、以下の限定されない実施例を含む。これらの結果は、本発明のＬＩＭミネラル化タンパク質、およびこれらのタンパク質をコードする単離核酸分子を用いて骨形成を誘導するかまたは増進する実現可能性を立証する。
【実施例】
【００６９】
実施例１：  頭蓋冠細胞培養
先に記載するように、分娩２０日前のラットから、ラット骨芽細胞（「ＲＯＢ」）としても知られる、ラット頭蓋冠細胞を得た。Ｂｏｄｅｎら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １３７，  ８，  ３４０１−３４０７（１９９６）。初代培養をコンフルエントまで（７日間）増殖させ、トリプシン処理し、そして一次継代培養細胞として、６ウェルプレートに継代した（１ｘ１０５細胞／３５ｍｍウェル）。第０日にコンフルエントであった継代培養細胞を、さらに７日間増殖させた。第０日に始まって、３日または４日ごとに、ラミナフローフード下で、培地を交換し、そして処理（Ｔｒｍおよび／またはＢＭＰ）を適用した。標準的培養プロトコルは以下のとおりであった：第１日〜第７日、ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、±刺激；第８日〜第１４日、ＢＧＪｂ培地、１０％ＦＢＳ、５ｍＭ  β−ＧｌｙＰ（ミネラル化を可能にする無機リン酸の供給源として）。骨結節形成およびオステオカルシン分泌の終点解析を第１４日に行った。この系でのパイロット実験に基づいて、ＢＭＰ用量を５０ｎｇ／ｍｌと選択し、これは、研究したすべてのＢＭＰに関して、用量−反応曲線の中央の範囲の効果を示す用量であった。
【００７０】
実施例２：  アンチセンス処理および細胞培養
膜性骨形成中のＬＭＰ−１の潜在的な機能的役割を調べるため、ＬＭＰ−１  ｍＲＮＡ翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成して、そしてグルココルチコイドによって開始される分化を経ている二次骨芽細胞培養を処理した。推定上の翻訳開始部位に渡る２５ｂｐの配列（配列番号４２）に対応する、非常に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（既知のラット配列に有意な相同性をまったく持たない）を用いて、ＲＬＭＰ発現の阻害を達成した。対照培養には、オリゴヌクレオチドを投与しないか、またはセンスオリゴヌクレオチドを投与した。リポフェクタミンの存在下（プレインキュベーション）および非存在下で実験を行った。簡潔には、２２μｇのセンスまたはアンチセンスＲＬＭＰオリゴヌクレオチドを、ＭＥＭ中、室温で４５分間インキュベーションした。このインキュベーション後、さらなるＭＥＭまたはプレインキュベーションしたリポフェクタミン／ＭＥＭ（７％ｖ／ｖ；室温で４５分間インキュベーション）のいずれかを添加して、オリゴヌクレオチド濃度を０．２μＭにした。生じた混合物を室温で１５分間インキュベーションした。その後、オリゴヌクレオチド混合物を、適切な培地、すなわちＭＥＭ／アスコルベート／±Ｔｒｍと混合して、０．１μＭの最終オリゴヌクレオチド濃度を達成した。
【００７１】
適切なオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で、適切な培地（±刺激）を用いて細胞をインキュベーションした。まずリポフェクタミンとインキュベーションした培養には、インキュベーション４時間（３７℃；５％ＣＯ２）後、リポフェクタミンもまたオリゴヌクレオチドもいずれも含有しない培地を再供給した。すべての培養、特にオリゴヌクレオチドを投与した培養には、オリゴヌクレオチドレベルを維持するため、２４時間ごとに再供給した。
【００７２】
ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＭＰ−６オリゴヌクレオチドの効果と同様、ミネラル化結節形成およびオステオカルシン分泌を用量依存方式で阻害した。骨芽細胞分化におけるＬＭＰ−１アンチセンス遮断は、外因性ＢＭＰ−６の添加によってはレスキュー不能であり、一方、ＢＭＰ−６アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は、ＢＭＰ−６を添加すると逆転した。この実験は、骨芽細胞分化経路において、ＢＭＰ−６に比較してＬＭＰ−１が上流の位置にあることをさらに確認した。ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、初代ラット骨芽細胞培養において、自発的な骨芽細胞分化も阻害した。
【００７３】
実施例３：  ミネラル化骨結節形成の定量化
実施例１および２にしたがって調製したＲＯＢの培養物を７０％エタノール中で一晩固定し、そしてフォン・コッサ銀染色液で染色した。半自動化されたコンピューター化ビデオ画像解析系を用いて、各ウェル中の結節数および結節面積を定量化した。Ｂｏｄｅｎら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １３７，  ８，  ３４０１−３４０７（１９９６）。その後、これらの値を割って、結節あたりの面積値を計算した。この自動化プロセスを手動の計数技術に対して確認して、そして０．９２の相関係数を立証した（ｐ＜０．０００００１）。すべてのデータを、各条件の５または６ウェルから計算した、平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表す。異なる頭蓋冠調製由来の細胞を用いて、各実験を少なくとも２回、確認した。
【００７４】
実施例４：  オステオカルシン分泌の定量化
Ｎａｎｅｓら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １２７：５８８（１９９０）に記載されるように、ラット・オステオカルシンのＣ末端ノナペプチドに対して、我々の実験室で作成した単一特異的ポリクローナル（ｐｏｌｙｇｏｎａｌ）抗体（Ｐａｂ）を用いる競合的ラジオイムノアッセイを用いて、培地中のオステオカルシンレベルを測定した。簡潔には、ラクトペルオキシダーゼ法によって、１ｍＣｉ  １２５Ｉ−Ｎａで１μｇのノナペプチドをヨウ素化した。２００ｇｌのアッセイ緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００１％チメロサル、０．０２５％ＢＳＡ）を含有する試験管に、アッセイ緩衝液中、１００ｇｌ／試験管で、細胞培養由来の培地またはオステオカルシン標準（０〜１２，０００ｆｍｏｌ）を添加した。その後、Ｐａｂ（１：４０，０００；１００μｌ）を添加し、その後、ヨウ素化ペプチド（１２，０００ｃｐｍ；１００μｌ）を添加した。非特異的結合に関して試験する試料を、同様に、しかし抗体を含有せずに調製した。
【００７５】
７００μｌヤギ抗ウサギＩｇＧを添加し、その後、４℃で１８時間インキュベーションすることによって、結合したＰＡｂおよび未結合（ｆｒｅｅ）ＰＡｂを分離した。１２００ｒｐｍで４５分間試料を遠心分離した後、上清をデカントし、そしてガンマカウンター中、沈殿物をカウントした。オステオカルシン値をｆｍｏｌ／１００μｌで報告し、その後、これらの値を１００で割ることによって、ｐｍｏｌ／ｍｌ培地（３日間産生）に変換した。各条件に関して５〜６ウェルの３つ組測定の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として値を表した。各実験を、異なる頭蓋冠調製由来の細胞を用いて、少なくとも２回、確かめた。
【００７６】
実施例５：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏのミネラル化に対するＴｒｍおよびＲＬＭＰの影響
非刺激細胞培養系では、骨結節の総産生に対して、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれにも、見かけの影響はほとんどなかった。しかし、ＲＯＢをＴｒｍで刺激すると、ＲＬＭＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、結節のミネラル化を＞９５％阻害した。オリゴヌクレオチドで処理した培養に外因性ＢＭＰ−６を添加しても、ＲＬＭＰアンチセンスで処理した結節のミネラル化はレスキューされなかった。
【００７７】
オステオカルシンは、長く、骨ミネラル化と同義であり、そしてオステオカルシンレベルは結節産生およびミネラル化と相関してきた。ＲＬＭＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オステオカルシン産生を有意に減少させたが、アンチセンスで処理した培養中の結節数は有意には変化しなかった。この場合、外因性ＢＭＰ−６の添加は、ＲＬＭＰアンチセンスで処理した培養中のオステオカルシン産生を１０〜１５％レスキューしたのみだった。これによって、ＲＬＭＰの作用はＢＭＰ−６の下流であり、そしてＢＭＰ−６よりも特異的であることが示唆された。
【００７８】
実施例６：  ＲＮＡの採取および精製
ＲＯＢの２つ組ウェル（６ウェル培養プレート中、実施例１および２にしたがって調製）から、４Ｍグアニジン・イソチオシアネート（ＧＩＴ）溶液を用いて、細胞ＲＮＡを採取して、統計のための３つ組を得た。簡潔には、培養上清をウェルから吸引し、その後、ウェルに、２つ組ウェル採取あたり、０．６ｍｌのＧＩＴ溶液を重層した。ＧＩＴ溶液を添加した後、プレートを５〜１０秒間回旋させた（できる限り一定に）。さらにプロセシングする前に、試料を最大７日間、−７０℃で保存した。
【００７９】
Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第７．１９章，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）にしたがった標準法をわずかに修飾して、ＲＮＡを精製した。簡潔には、融解した試料に６０μｌの２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０μｌのフェノール（水飽和）および１５０μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を添加した。ボルテックス後、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間；４℃）、水性相を新たな試験管に移し、６００μｌのイソプロパノールを添加して、そしてＲＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。
【００８０】
一晩インキュベーションした後、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間）、そして上清を穏やかに吸引した。ペレットを４００μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、そして４０μｌの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）および１．０ｍｌ無水エタノールを添加した後、−２０℃で一晩沈殿させた。細胞ＲＮＡを回収するには、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間）、７０％エタノールで１回洗浄し、５〜１０分間風乾し、そして２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。分光光度計で測定した光学密度から、ＲＮＡ濃度を計算した。
【００８１】
実施例７：  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応２５
加熱した総ＲＮＡ（総体積１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中、５μｇを６５℃で５分間加熱）を、４μｌ  ５Ｘ  ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２μｌ  ｄＮＴＰ、２μｌ  ｄＴ１７プライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、０．５μｌ  ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）および１μｌ  ＭＭＬＶ−ＲＴ（２００単位／μｌ）を含有する試験管に添加した。試料を３７℃で１時間インキュベーションし、その後、９５℃で５分間インキュベーションして、ＭＭＬＶ−ＲＴを不活化した。８０μｌの水を添加することによって、試料を希釈した。
【００８２】
標準的方法論を用いて、逆転写した試料（５μｌ）をポリメラーゼ連鎖反応に供した（総体積５０μｌ）。簡潔には、試料を、水および適切な量のＰＣＲ緩衝液、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ、ハウスキーピング遺伝子）および／またはＢＭＰ−６の順方向および逆方向プライマー、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、およびＴａｑポリメラーゼを含有する試験管に添加した。別に記載しない限り、２２周期（９４℃、３０”；５８℃、３０”；７２℃、２０”）で一貫して反応させるため、プライマーを標準化した。
【００８３】
実施例８：  ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびホスホイメージャー解析による、ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量化
ＲＴ−ＰＣＲ産物に５μｌ／試験管の装填色素を加えて混合し、６５℃で１０分間加熱し、そして遠心分離した。各反応１０μｌを、標準的条件下で、ＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミド：ビス；１５Ｖ／ウェル；定電流）に供した。その後、ゲル保存緩衝液（１０％ｖ／ｖグリセロール、７％ｖ／ｖ酢酸、４０％ｖ／ｖメタノール、４３％脱イオン水）中でゲルを３０分間インキュベーションし、１〜２時間、真空乾燥させ（８０℃）、そして電気的に増進させたリン光画像化系で６〜２４時間現像した。視覚化したバンドを解析した。バンドあたりのカウントをグラフにプロットした。
【００８４】
実施例９：  ディファレンシャル・ディスプレーＰＣＲ
グルココルチコイド（Ｔｒｍ、１ｎＭ）で刺激した細胞からＲＮＡを抽出した。加熱し、ＤＮアーゼで処理した総ＲＮＡ（総体積１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中、５μｇを６５℃で５分間加熱）を、実施例７に記載したとおりであるが、ＭＭＬＶ−ＲＴプライマーとしてＨ−Ｔ１１Ｍ（配列番号４）を用いて、逆転写した。上述のとおりであるが、多様な商業的プライマーセット（例えばＨ−Ｔ１１Ｇ（配列番号４）およびＨ−ＡＰ−１０（配列番号５）；ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐ、テネシー州ナッシュビル）を用いて、生じたｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＤＮＡ配列決定ゲル上でゲル電気泳動することによって、放射標識ＰＣＲ産物を分画した。電気泳動後、生じたゲルを真空乾燥し、そしてオートラジオグラフを一晩曝露した。差別的に発現されたｃＤＮＡに相当するバンドをゲルから切り出し、そしてＣｏｎｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２７８（１９８３）の方法を用いたＰＣＲによって、再増幅した。ＰＣＲ再増幅の産物をベクターＰＣＲ−１１（ＴＡクローニングキット；ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングした。
【００８５】
実施例１０：  ＵＭＲ１０６ラット骨肉腫細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＵＭＲ１０６ライブラリー（２．５ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）を寒天プレート（ＬＢボトムアガー）上、５ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌで蒔き、そしてプレートを３７℃で一晩インキュベーションした。フィルター膜をプレート上に２分間かぶせた。取り除いたら直ちに、フィルターを変性させ、リンスし、乾燥させ、そしてＵＶクロスリンクした。その後、プレハイブリダイゼーション緩衝液（２ＸＰＩＰＥＳ［ｐＨ６．５］、５％ホルムアミド、１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）中、４２℃で２時間、フィルターをインキュベーションした。２６０塩基対の放射標識プローブ（配列番号３；ランダムプライミングによって３２Ｐ標識）を全ハイブリダイゼーション混合物／フィルターに添加して、その後、４２℃で１８時間ハイブリダイズさせた。室温で１回（１０分間、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、そして５５℃で３回（１５分間、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、膜を洗浄した。
【００８６】
洗浄後、上述のようなオートラジオグラフィーによって、膜を解析した。陽性クローンをプラーク精製した。第二のフィルターには４分間用いて、該方法を反復し、偽陽性を最小限にした。プラーク精製クローンをラムダＳＫ（−）ファージミドとしてレスキューした。以下に記載するように、クローニングしたＤＮＡを配列決定した。
【００８７】
実施例１１：  クローンの配列決定
標準法によって、クローニングしたｃＤＮＡ挿入物の配列を決定した。Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）。簡潔には、適切な濃度の終結混合物、テンプレートおよび反応混合物を、適切なサイクリングプロトコルに供した（９５℃３０秒間；６８℃３０秒間；７２℃６０秒間；ｘ２５）。停止混合物を添加して、配列決定反応を終結させた。９２℃で３分間加熱した後、変性６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル（２９：１アクリルアミド：ビスアクリルアミド）上に試料を装填した。６０ボルト、定電流で約４時間、試料を電気泳動した。電気泳動後、ゲルを真空乾燥させ、そしてオートラジオグラフした。
【００８８】
オートラジオグラフを手動で解析した。米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＩＨ、メリーランド州ベセスダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって維持されるデータベースに対して、デフォルトパラメーターにセットしたＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて、生じた配列をスクリーニングした。配列データに基づいて、新規配列決定プライマーを調製し、そして全遺伝子が配列決定されるまで、プロセスを反復した。すべての配列を、両方の方向で、最低３回、確認した。
【００８９】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、ＰＣＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（バージョン１６．０）を用いてもまた解析した。以下のパラメーターを用いて、プログラムＮＡＬＩＧＮにより、ヌクレオチド配列の相同性パーセント値を計算した：非マッチヌクレオチドの加重、１０；非マッチギャップの加重、１０；考慮するヌクレオチドの最大数、５０；および考慮するヌクレオチドの最少数、５０。
【００９０】
アミノ酸配列に関しては、ＰＡＬＩＧＮを用いて相同性パーセント値を計算した。オープンギャップコストおよびユニットギャップコスト両方に関して、１０の値を選択した。
実施例１２：  ＲＬＭＰ  ｃＤＮＡのクローニング
実施例９に記載するディファレンシャル・ディスプレーＰＣＲ増幅産物は、およそ２６０塩基対の主要なバンドを含有した。この配列を用いて、ラット骨肉腫（ＵＭＲ１０６）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンを入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー解析に供して、全長ｃＤＮＡを増幅するのに必要なプライマー配列を得た（配列番号１１、１２、２９、３０および３１）。さらなる研究に選択した陽性クローンの１つをクローン１０−４と称した。
【００９１】
入れ子プライマー解析によって決定された、クローン１０−４中の全長ｃＤＮＡの配列解析によって、クローン１０−４が、ディファレンシャル・ディスプレーＰＣＲによって同定される、元来の２６０塩基対断片を含有することが示された。クローン１０−４（１６９６塩基対；配列番号２）は、４５７アミノ酸（配列番号１）を有するタンパク質をコードする１３７１塩基対のオープンリーディングフレームを含有する。終結コドンＴＧＡはヌクレオチド１４４４〜１４４６に存在する。ヌクレオチド１６７５〜１６８０のポリアデニル化シグナル、および隣接するポリ（Ａ）＋テールは、３’非コード領域に存在した。２つの潜在的なＮグリコシル化部位、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＴｈｒおよびＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒが、それぞれ、配列番号１の１１３〜１１６および２５７〜２５９のアミノ酸位にあった。２つの潜在的なｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存プロテインキナーゼリン酸化部位、ＳｅｒおよびＴｈｒが、それぞれ、１９１および３４９のアミノ酸位に見られた。５つの潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位、ＳｅｒまたはＴｈｒが、３、１１５、１６６、２１９、４４２のアミノ酸位にあった。１つの潜在的なＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ（Ｐ−ループ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒが２７２〜２７９のアミノ酸位にあると決定された。
【００９２】
さらに、２つの非常に保存される推定上のＬＩＭドメインが３４１〜３９１および４００〜４５１のアミノ酸位に見られた。この新たに同定されたラットｃＤＮＡクローン中の推定上のＬＩＭドメインは、他の既知のＬＩＭタンパク質のＬＩＭドメインとかなりの相同性を示した。しかし、他のラットＬＩＭタンパク質との全体の相同性は２５％未満であった。ＲＬＭＰ（１０−４とも称する）は、ヒト・エニグマタンパク質と７８．５％のアミノ酸相同性を有する（米国特許第５，５０４，１９２号を参照されたい）が、最も近いラット相同体、ＣＬＰ−３６およびＲＩＴ−１８に対しては、それぞれ、２４．５％および２２．７％のアミノ酸相同性しか持たない。
【００９３】
実施例１３：  ＲＬＭＰ発現のノーザンブロット解析
実施例１および実施例２にしたがって調製した、ＲＯＢ由来の総ＲＮＡ３０μｇを、１％アガロース・フラットベッドゲル中のホルムアルデヒドゲル電気泳動によってサイズ分画し、そしてナイロン膜に浸透圧でトランスブロットした。ランダムプライミングによって、３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した全長１０−４  ｃＤＮＡの６００塩基対ＥｃｏＲＩ断片を用いて、ブロットを探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。
【００９４】
ノーザンブロット解析によって、１．７ｋｂのｍＲＮＡ種がＲＬＭＰプローブとハイブリダイズすることが示された。ＲＬＭＰ  ｍＲＮＡは、ＢＭＰ−６への曝露２４時間後、ＲＯＢ中でおよそ３．７倍上方制御された。ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４で刺激したＲＯＢでは、２４時間後、ＲＭＬＰ発現の上方制御は見られなかった。
【００９５】
実施例１４：  統計的方法
報告される結節／オステオカルシン結果の各々に関して、代表的な実験から、５〜６ウェル由来のデータを用いて、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を計算した。各パラメーターの最大値に対して規準化したデータを用いてグラフを示し、結節数、ミネラル化面積およびオステオカルシンを同時にグラフにすることが可能である。
【００９６】
報告されるＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイまたはウェスタンブロット解析の各々に関して、代表的な実験の三つ組試料由来のデータを用いて、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を決定した。第０日または陰性対照いずれかに対して規準化し、そして対照値を超える倍増加として表して、グラフを示すことが可能である。
【００９７】
適切なように、ボンフェローニの事後多重比較補正を伴う一元配置分散分析を用いて、統計的有意性を評価した。Ｄ．Ｖ．  Ｈｕｎｔｓｂｅｒｇｅｒ，“Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅ”，  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｖａｒｉａｎｃｅ，  Ｐ．  Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ（監修），  Ａｌｌｙｎ＆Ｂａｃｏｎ  Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ボストン，２９８−３３０（１９７７）およびＳｉｇｍａＳｔａｔ，Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カリフォルニア州コルテマデラ。有意性のアルファレベルはｐ＜０．０５と定義された。
【００９８】
実施例１５：  ウェスタンブロット解析によるラットＬＩＭミネラル化タンパク質の検出
Ｅｎｇｌａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ａｃｔａ，６２３，１７１（１９８０）およびＴｉｍｍｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２４８６３（１９９３）の方法にしたがって、ポリクローナル抗体を調製した。
【００９９】
ＨｅＬａ細胞をｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰでトランスフェクションした。Ｈａｉｒら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０，１（１９９６）の方法にしたがって、トランスフェクション細胞からタンパク質を採取した。Ｔｏｗｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：４３５０（１９７９）に記載されるように、天然ＲＬＭＰのウェスタンブロット解析を行った。
【０１００】
実施例１６：  ラットＬＭＰ特有配列（ＲＬＭＰＵ）に由来するヒトＰＣＲ産物の合成
ラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡの配列に基づいて、順方向および逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号１５および１６）を合成し、そして特有の２２３塩基対配列をラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。同じＰＣＲプライマーを用いて、ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞ｃＤＮＡから、類似のＰＣＲ産物を単離した。
【０１０１】
Ｔ−７５フラスコ中で増殖させたＭＧ６３骨肉腫細胞からＲＮＡを採取した。吸引によって培養上清を取り除き、そしてフラスコに二つ組あたり３．０ｍｌのＧＩＴ溶液を重層し、５〜１０秒間回旋し、そして生じた溶液を１．５ｍｌエッペンドルフ試験管（０．６ｍｌ／試験管の６試験管）に移した。標準法をわずかに修飾してＲＮＡを精製した。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第７章，  １９ページ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＢｏｄｅｎら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １３８，  ２８２０−２８２８（１９９７）を参照されたい。簡潔には、０．６ｍｌの試料に６０μｌの２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０μｌの水飽和フェノールおよび１５０μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を添加した。これらの試薬を添加した後、試料をボルテックスし、遠心分離して（１００００ｘｇ；２０分間；４℃）、そして水性相を新たな試験管に移した。イソプロパノール（６００μｌ）を添加して、そしてＲＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間）、そして上清を穏やかに吸引した。ペレットを４００μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、そして４０μｌの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）および１．０ｍｌの無水エタノールで、−２０℃で一晩沈殿させた。沈殿後、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間）、７０％エタノールで１回洗浄し、５〜１０分間風乾し、そして２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。光学密度から、ＲＮＡ濃度を得た。
【０１０２】
総ＲＮＡ（総体積１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中、５μｇ）を６５℃で５分間加熱し、そしてその後、４μｌ  ５Ｘ  ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２μｌ  ｄＮＴＰ、２μｌ  ｄＴ１７プライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、０．５μｌ  ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）および１μｌ  ＭＭＬＶ−ＲＴ（２００単位／μｌ）を含有する試験管に添加した。反応を３７℃で１時間インキュベーションした。その後、９５℃で５分間、加熱することによって、ＭＭＬＶ−ＲＴを不活化した。８０μｌの水を添加することによって、試料を希釈した。
【０１０３】
標準的方法論を用いて、転写した試料（５μｌ）をポリメラーゼ連鎖反応に供した（総体積５０μｌ）。Ｂｏｄｅｎら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １３８，  ２８２０−２８２８（１９９７）；Ａｕｓｕｂｅｌら，  “Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  ＤＮＡｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第１５．３１−１章，  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，  ニュージャージー州トレントン（１９９０）。簡潔には、試料を、水および適切な量のＰＣＲ緩衝液（２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、順方向および逆方向プライマー（ＲＬＭＰＵ用；配列番号１５および１６）、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを含有する試験管に添加した。放射性バンド検出には、２２周期で一貫して反応するように、そしてスクリーニングプローブとして使用するためのＰＣＲ産物の増幅には、３３周期で一貫して反応するように、プライマーを設計した（９４℃３０秒間；５８℃３０秒間；７２℃２０秒間）。
【０１０４】
アガロースゲルで精製したＭＧ６３骨肉腫由来ＰＣＲ産物の配列決定によって、ＲＬＭＰＵ  ＰＣＲ産物に９５％より高い相同性を有する配列を生じた。この配列をＨＬＭＰ特有領域（ＨＬＭＰＵ；配列番号６）と称する。
【０１０５】
実施例１７：  逆転写酵素由来ＭＧ６３  ｃＤＮＡのスクリーニング
実施例７に記載するように、特異的プライマー（配列番号１６および１７）を用いたＰＣＲでスクリーニングを行った。７１７塩基対のＭＧ６３  ＰＣＲ産物をアガロースゲル精製して、そして既定のプライマー（配列番号１２、１５、１６、１７、１８、２７および２８）を用いて配列決定した。配列を両方向で最低２回確認した。ＭＧ６３配列を互いに並列させ、そしてその後、全長ラットＬＭＰ  ｃＤＮＡ配列に並列させて、部分的ヒトＬＭＰ  ｃＤＮＡ配列（配列番号７）を得た。
【０１０６】
実施例１８：  ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ノーザンブロット実験に基づいて、ＬＭＰ−１が、ヒト心筋を含む、いくつかの異なる組織によって、異なるレベルで発現されることが決定された。そのため、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーを調べた。ライブラリーを５ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌで寒天プレート（ＬＢボトムアガー）上に蒔き、そしてプレートを３７℃で一晩増殖させた。フィルター膜をプレート上に２分間かぶせた。その後、フィルターを変性させ、リンスし、乾燥させ、ＵＶクロスリンクし、そして、プレハイブリダイゼーション緩衝液（２ＸＰＩＰＥＳ［ｐＨ６．５］；５％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）中、４２℃で２時間インキュベーションした。放射標識したＬＭＰ特有の２２３塩基対プローブ（３２Ｐ、ランダムプライマー標識；配列番号６）を添加して、そして４２℃で１８時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、室温で１回（１０分間、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、そして５５℃で３回（１５分間、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、膜を洗浄した。二重に陽性プラーク精製した心臓ライブラリークローンをオートラジオグラフィーによって同定し、製造者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）にしたがって、ラムダファージミドとしてレスキューした。
【０１０７】
陽性クローンの制限消化物は、多様な大きさのｃＤＮＡ挿入物を生じた。長さ６００塩基対より大きい挿入物を、配列決定による最初のスクリーニングに選択した。これらの挿入物を、実施例１１に記載するような標準法によって配列決定した。
【０１０８】
１つのクローン、第７番を、配列番号１１〜１４、１６および２７に対応するプライマーを用いた自動化配列解析にも供した。これらの方法によって得られる配列は、日常的に９７〜１００％相同であった。クローン７（心臓ライブラリー由来の部分的ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡ；配列番号８）は、翻訳領域中、ラットＬＭＰ  ｃＤＮＡ配列と８７％より高い相同性を有する配列を含有した。
【０１０９】
実施例１９：  全長ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡの決定
ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ配列およびヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列の重複領域を用いて、これらの２つの配列を並列させ、そして１６４４塩基対の全長ヒトｃＤＮＡ配列を得た。ＰＣＧＥＮＥソフトウェアパッケージ中のプログラム、ＮＡＬＩＧＮを用いて、２つの配列を並列させた。２つの配列の重複領域は、ＭＧ６３  ｃＤＮＡ（配列番号７）のヌクレオチド６７２の単一ヌクレオチド置換以外は完全な相同性を有する、ほぼ３６０塩基対を構成し、クローン７は、対応するヌクレオチド５１６に「Ｇ」の代わりに「Ａ」を有した（配列番号８）。
【０１１０】
ＭＧ６３骨肉腫ｃＤＮＡクローンの「Ｇ」置換を用い、ＰＣＧＥＮＥの別のサブプログラムであるＳＥＱＩＮを用いて、２つの並列配列を連結した。生じた配列を配列番号９に示す。ラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡと新規ヒト由来配列の並列を、ＮＡＬＩＧＮで達成した。全長ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡ配列（配列番号９）は、ラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡ配列の翻訳部分に８７．３％相同である。
【０１１１】
実施例２０：  ヒトＬＭＰ−１のアミノ酸配列の決定
ヒトＬＭＰ−１の推定上のアミノ酸配列を、ＰＣＧＥＮＥサブプログラムＴＲＡＮＳＬで決定した。配列番号９中のオープンリーディングフレームは、４５７アミノ酸（配列番号１０）を含んでなるタンパク質をコードする。ＰＣＧＥＮＥサブプログラムＰａｌｉｇｎを用いて、ヒトＬＭＰ−１アミノ酸配列が、ラットＬＭＰ−１アミノ酸配列と９４．１％相同であることが見出された。
【０１１２】
実施例２１：  ヒトＬＭＰ  ｃＤＮＡの５’非翻訳領域の決定
ｃＤＮＡ端の５’迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）プロトコルを用いた、ＭＧ６３総ＲＮＡの入れ子ＲＴ−ＰＣＲによって、ＭＧ６３  ５’ｃＤＮＡを増幅した。この方法は、３’端の２つの縮重ヌクレオチド位でロック−ドッキング・オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた第一鎖ｃＤＮＡ合成を含んだ（Ｃｈｅｎｃｈｉｋら，ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ，Ｘ：５（１９９５）；  Ｂｏｒｓｏｎら，ＰＣ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．，２，１４４（１９９３））。Ｇｕｂｌｅｒら，Ｇｅｎｅ，２，２６３（１９８３）の方法にしたがって、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１、ＲＮアーゼＨ、および大腸菌ＤＮＡリガーゼのカクテルを用いて、第二鎖合成を行う。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑端を生成した後、二本鎖ｃＤＮＡを断片（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’）（配列番号１９）に連結した。ＲＡＣＥの前に、アダプターを連結したｃＤＮＡを、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＲＡＣＥ反応に適した濃度（１：５０）に希釈した。その後、アダプターを連結した二本鎖ｃＤＮＡは特異的にクローニングするのに直ちに使用可能である。
【０１１３】
センスプライマーとしてアダプター特異的オリゴヌクレオチド、５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（ＡＰ１）（配列番号２０）を、そして実施例１６に記載する特有領域（ＨＬＭＰＵ）由来の遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を用いて、第一周期ＰＣＲを行った。入れ子プライマーＧＳＰ１−ＨＬＭＰＵ（アンチセンス／逆方向プライマー）（配列番号２３）およびＧＳＰ２−ＨＬＭＰＵＦ（配列番号２４）（実施例１６を参照されたい；センス／順方向プライマー）を用いて、第二周期のＰＣＲを行った。抗体が仲介するが、そうでなければ標準的なホットスタートプロトコルを利用する商業的キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲコアキット；ＣｌｏｎＴｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）を用いて、ＰＣＲを行った。ＭＧ６３  ｃＤＮＡのＰＣＲ条件には、最初のホットスタート変性（９４℃６０秒間）、その後：９４℃３０秒間；６０℃３０秒間；６８℃４分間；３０周期が含まれた。第一周期ＰＣＲ産物は長さおよそ７５０塩基対であり、一方、入れ子ＰＣＲ産物はおよそ２３０塩基対であった。第一周期ＰＣＲ産物を直線化ｐＣＲ２．１ベクター（３．９Ｋｂ）にクローニングした。Ｍ１３順方向および逆方向プライマー（配列番号１１；配列番号１２）を用いて、挿入物を両方向に配列決定した。
【０１１４】
実施例２２：  ５’プライムＵＴＲを持つ全長ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡの決定
重複するＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ  ５’−ＵＴＲ配列（配列番号２１）、ＭＧ６３  ７１７塩基対配列（実施例１７；配列番号８）およびヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列（実施例１８）を並列させて、１７０４塩基対の新規ヒトｃＤＮＡ配列（配列番号２２）を得た。ＮＡＬＩＧＮを用いて並列を達成した（ＰＣＧＥＮＥおよびＯｍｉｇａ１．０両方；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）。重複配列は、ほぼ全７１７塩基対領域を構成し（実施例１７）、１００％相同であった。並列した配列の連結はＳＥＱＩＮで達成した。
【０１１５】
実施例２３：  ＬＩＭタンパク質発現ベクターの構築
実施例１７および実施例１８に記載する配列を用いて、ｐＨＩＳ−５ＡＴＧ  ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの構築を行った。７１７塩基対クローン（実施例１７；配列番号７）をＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶで消化した。小さい断片（〜２５０塩基対）をゲル精製した。クローン７（実施例１８；配列番号８）をＣｌａＩおよびＸｂａＩで消化し、そして１４００塩基対断片をゲル精製した。単離した２５０塩基対および１４００塩基対制限断片を連結して、〜１６５０塩基対の断片を形成した。
【０１１６】
クローン７中の単一ヌクレオチド置換（７１７塩基対ＰＣＲ配列および元来のラット配列に比較したもの）のため、翻訳される塩基対６７２で停止コドンが生じた。この停止コドンのため、以後、ＬＭＰ−１ｓと称する一部切除（短）タンパク質がコードされた。これが発現ベクター中で用いられる構築物であった（配列番号３２）。配列番号３２と５’ＲＡＣＥ配列（配列番号２１）を並列させることによって、５’ＵＴＲを含む全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３３）を生成した。その後、ＬＭＰ−１ｓのアミノ酸配列（配列番号３４）は、２２３アミノ酸タンパク質と推定され、そしてこれをウェスタンブロット（実施例１５におけるようなもの）によって確認すると、〜２３．７ｋＤの予測される分子量に泳動された。
【０１１７】
ｐＨｉｓ−ＡＴＧベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで消化した。ベクターを回収し、そしてその後、６５０塩基対の制限断片を、直線化したｐＨｉｓ−ＡＴＧに連結した。連結した産物をクローニングし、そして増幅した。挿入物ＨＬＭＰ−１ｓを含むｐＨＩＳ−Ａとも称するｐＨｉｓ−ＡＴＧ−ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターを、標準法によって精製した。
【０１１８】
実施例２４：  ＬＭＰ発現ベクターを用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの骨結節形成およびミネラル化の誘導
ラット頭蓋冠細胞を単離し、そして実施例１記載の二次培養中で増殖させた。実施例１に記載するように、培養を刺激しないか、またはグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激した。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）トランスフェクションプロトコルの修飾法を用い、実施例２５にしたがって、二次ラット頭蓋冠骨芽細胞培養に、各ベクター３μｇ／ウェルをトランスフェクションした。
【０１１９】
実施例３に記載するように、フォン・コッサ染色によって、ミネラル化結節を視覚化した。ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物過剰発現は、単独で、骨結節形成（〜２０３結節／ウェル）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導した。結節レベルは、ＧＣ陽性対照に誘導されるもの（〜４１２結節／ウェル）のおよそ５０％であった。他の陽性対照には、ｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−ラット発現ベクター（〜１５２結節／ウェル）およびｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−ラット−Ｆｗｄ発現ベクター（〜２０６結節／ウェル）が含まれ、一方、陰性対照には、ｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−ラット−Ｒｅｖ発現ベクター（〜２結節／ウェル）および未処理（ＮＴ）プレート（〜４結節／ウェル）が含まれた。これらのデータは、ヒトｃＤＮＡが、少なくともラットｃＤＮＡと同程度に骨誘導性であったことを立証する。その効果は、ＧＣ刺激で観察されるものより低く、これは発現ベクターが最適以下の用量であったためである可能性が最も高い。
【０１２０】
実施例２５：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのＬＭＰが誘導する細胞分化
ＮｏｔＩおよびＡｐａＩを用いて、３７℃で一晩、クローンを二重消化することによって、クローン１０−４（実施例１２を参照されたい）中のラットＬＭＰ  ｃＤＮＡをベクターから切除した。ベクターｐＣＭＶ２  ＭＣＳ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を同じ制限酵素で消化した。クローン１０−４およびｐＣＭＶ２由来の直鎖ｃＤＮＡ断片両方をゲル精製し、抽出し、そしてＴ４リガーゼを用いて連結した。連結したＤＮＡをゲル精製し、抽出し、そして増幅のため、大腸菌ＪＭ１０９細胞を形質転換するのに用いた。陽性寒天コロニーを摘み取り、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩを用いて消化し、そして制限消化物をゲル電気泳動によって調べた。陽性クローンのストック培養を調製した。
【０１２１】
用いた制限酵素がＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩであったことを除き、類似の方式で、逆方向ベクターを調製した。これらの制限酵素を用いたため、クローン１０−４由来のＬＭＰ  ｃＤＮＡ断片は、逆方向（すなわち翻訳不能）でｐＲｃ／ＣＭＶ２に挿入された。産生された組換えベクターをｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと称する。
【０１２２】
適切な体積のｐＣＭＶ１０−４（６０ｎＭ最終濃度が最適である［３μｇ］；この実験のため、０〜６００ｎＭ／ウェル［０〜３０μｇ／ウェル］の範囲の最終濃度が好ましい）を最少イーグル培地（ＭＥＭ）に、４５０μｌ最終体積になるように再懸濁し、そして１０秒間ボルテックスした。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを添加し（７．５μｌ／ｍｌ最終溶液）、溶液を１０秒間ボルテックスし、そしてその後、室温で１０分間インキュベーションした。このインキュベーション後、１０％ＦＢＳ（１ｍｌ／ウェル；６ｍｌ／プレート）を補ったＭＥＭを添加し、そしてピペッティングによって混合した。
【０１２３】
その後、生じた溶液を、洗浄したＲＯＢ培養上に直ちにピペッティングした（１ｍｌ／ウェル）。５％ＣＯ２を含有する加湿大気中、３７℃で２時間、培養をインキュベーションした。その後、細胞を無菌ＰＢＳで１回、穏やかに洗浄し、そして適切な通常のインキュベーション培地を添加した。
【０１２４】
結果は、ｐＣＭＶ１０−４で誘導したラット細胞培養すべてで、有意な骨結節形成を示した。例えば、ｐＣＭＶ１０−４でトランスフェクションした細胞は、４２９結節／ウェルを生じた。Ｔｒｍに曝露した陽性対照培養は、４６０結節／ウェルを生じた。対照的に、処理を受けない陰性対照は、１結節／ウェルを生じた。同様に、培養をｐＣＭＶ１０−４（逆方向）でトランスフェクションすると、結節はまったく観察されなかった。
【０１２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｄｅ  ｎｏｖｏ骨形成を立証するため、４〜５週齢の正常ラット（ｒｎｕ／＋；劣性胸腺欠損状態に関してヘテロ接合体）の後肢から骨髄を吸引した。吸引した骨髄細胞をアルファＭＥＭ中で洗浄し、遠心分離し、そしてペレットを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中の０．８３％ＮＨ４Ｃｌに再懸濁することによって、ＲＢＣを溶解した。残った骨髄細胞を、ＭＥＭで３回洗浄し、そして３ｘ１０６細胞あたり９μｇのｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ（順方向または逆方向）で、２時間トランスフェクションした。その後、トランスフェクションした細胞をＭＥＭで２回洗浄し、そして３ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【０１２６】
無菌ピペットで、細胞懸濁物（１００μｌ）を、無菌２ｘ５ｍｍ  Ｉ型ウシコラーゲンディスク（Ｓｕｌｚｅｒ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ、コロラド州ウィートリッジ）に適用した。４〜５週齢の胸腺欠損ラット（ｒｎｕ／ｒｎｕ）の頭蓋、胸部、腹部または脊柱に、該ディスクを外科的に皮下移植した。第３週〜第４週に動物を屠殺し、この時点で、ディスクまたは手術領域を切除し、そして７０％エタノール中で固定した。放射線写真撮影によって、固定した標本を解析し、そしてゴールドナーの三色染色で染色した厚さ５μｍの切片に対して、非脱灰（ｕｎｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ）組織学的検査を行った。コラーゲンディスクの代わりに、失活させた（ｄｅｖｉｔａｌｉｚｅｄ）（グアニジン抽出した）、脱ミネラル化骨マトリックス（Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州シュルーズベリー）を用いた実験もまた行った。
【０１２７】
放射線写真撮影によって、高レベルのミネラル化骨形成が明らかになり、これは、ＬＭＰ−１ｓトランスフェクション骨髄細胞を含有する元来のコラーゲンディスクの形に一致した。陰性対照（翻訳されるタンパク質をコードしない、ＬＭＰ−１ｓ  ｃＤＮＡの逆方向型でトランスフェクションした細胞）では、ミネラル化骨形成はまったく形成されず、そしてキャリアーの吸収は、かなり進行しているようであった。
【０１２８】
組織像によって、ＬＭＰ−１ｓトランスフェクション移植物中で、骨芽細胞に裏打ちされた新規骨小柱が明らかになった。陰性対照では、キャリアーの部分的吸収に沿って、骨は見られなかった。
【０１２９】
１８組（９つの陰性対照ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−ＲＥＶおよび９つの実験ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ）の移植物を、胸腺欠損ラットの腰椎および胸椎の間の部位に交互に添加する、さらなる実験の放射線写真撮影によって、０／９の陰性対照移植物が、脊椎間の骨形成（脊椎固定）を示すことが立証された。ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ処理移植物の９つはすべて、脊椎間に固形骨固定を示した。
【０１３０】
実施例２６：  実施例２および実施例３に示す配列からの、ｐＨＩＳ−５’ＡＴＧ  ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの合成
７１７塩基対クローン（実施例１７）をＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、マサチューセッツ州シティ）で消化した。小さい断片（〜２５０塩基対）をゲル精製した。クローン第７番（実施例１８）をＣｌａＩおよびＸｂａＩで消化した。その消化物から１４００塩基対断片をゲル精製した。単離した２５０塩基対および１４００塩基対ｃＤＮＡ断片を、標準法によって連結して、〜１６５０ｂｐの断片を形成した。ｐＨｉｓ−Ａベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）をＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで消化した。直線化したベクターを回収し、そしてキメラ１６５０塩基対ｃＤＮＡ断片に連結した。連結産物をクローニングし、そして標準法によって増幅し、そして挿入物ＨＬＭＰ−１ｓを含むベクターｐＨｉｓＡとも称する、ｐＨｉｓ−Ａ−５’ＡＴＧ  ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターを、先に記載するように、ＡＴＣＣに寄託した。
【０１３１】
実施例２７：  ｐＨｉｓ−５’ＡＴＧ  ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターを用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨結節形成およびミネラル化の誘導
実施例１にしたがって、ラット頭蓋冠細胞を単離し、そして二次培養中で増殖させた。実施例１にしたがって、培養を刺激しないか、またはグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激した。実施例２５に記載するように、３μｇの組換えｐＨｉｓ−ＡベクターＤＮＡ／ウェルで培養をトランスフェクションした。実施例３記載のフォン・コッサ染色によって、ミネラル化結節を視覚化した。
【０１３２】
ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物を過剰発現しただけで（すなわちＧＣ刺激なし）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有意な骨結節形成（〜２０３結節／ウェル）が誘導された。これは、ＧＣに曝露された細胞の陽性対照が生じる結節（〜４１２結節／ウェル）量のおよそ５０％である。ｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−ラット発現ベクター（〜１５２結節／ウェル）およびｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−ラット−Ｆｗｄ（〜２０６結節／ウェル）でトランスフェクションした培養で、同様の結果が得られた。対照的に、陰性対照ｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−ラット−Ｒｅｖは〜２結節／ウェルを生じ、一方、未処理プレートではおよそ４結節／ウェルが見られた。これらのデータによって、ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡは、このモデル系では、少なくともラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡと同程度に骨誘導性であったことが示される。この実験の効果は、ＧＣ刺激で観察されるものより劣っていたが；いくつかでは効果が匹敵していた。
【０１３３】
実施例２８：  ＬＭＰは可溶性骨誘導因子の分泌を誘導する
実施例２４に記載するように、ラット頭蓋冠骨芽細胞培養中で、ＲＬＭＰ−１またはＨＬＭＰ−１ｓを過剰発現させると、陰性対照で観察されるよりも有意に多い結節形成が生じた。ＬＩＭミネラル化タンパク質の作用機構を研究するため、異なる時点で馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を採取し、１０倍濃縮し、滅菌ろ過し、新鮮な血清を含有する培地中で元来の濃度に希釈し、そして未トランスフェクション細胞に４日間適用した。
【０１３４】
第４日に、ＲＬＭＰ−１またはＨＬＭＰ−１ｓでトランスフェクションした細胞から採取した馴化培地は、結節形成誘導において、トランスフェクション細胞におけるＲＬＭＰ−１の直接過剰発現と同程度に有効であった。逆方向のＲＬＭＰ−１またはＨＬＭＰ−１でトランスフェクションした細胞由来の馴化培地は、結節形成に明らかな影響を持たなかった。また、第４日より前に、ＬＭＰ−１トランスフェクション培養から採取した馴化培地も、結節形成を誘導しなかった。これらのデータによって、ＬＭＰ−１の発現が可溶性因子の合成および／または分泌を引き起こし、この因子はトランスフェクション４日後まで、培地中に、有効量では見られなかったことが示唆される。
【０１３５】
ｒＬＭＰ−１の過剰発現の結果、培地中に骨誘導因子が分泌されたため、ウェスタンブロット解析を用いて、ＬＭＰ−１タンパク質が培地に存在するかどうかを決定した。慣用的手段によって、ＬＭＰ−１（ＱＤＰＤＥＥ）に特異的な抗体を用いて、ＲＬＭＰ−１タンパク質の存在を評価し、そして検出した。ＬＭＰ−１タンパク質は、培養の細胞層にのみ見られ、そして培地中には検出されなかった。
【０１３６】
標準的な２５％および１００％硫酸アンモニウムカットに続いてＤＥ−５２陰イオン交換バッチクロマトグラフィー（１００ｍＭまたは５００ｍＭ  ＮａＣｌ）によって、骨誘導可溶性因子の部分的精製を達成した。すべての活性は、高硫酸アンモニウム、高ＮａＣｌ分画で見られた。こうした局在は、培地の馴化に関与する単一の因子の存在と一致した。
【０１３７】
実施例２９：  低用量アデノウイルスが仲介する、腰椎融合における遺伝子治療
この研究は、正常な、すなわち免疫適格性のウサギにおいて、脊椎固定を促進するのに最適な用量のＬＭＰ−１  ｃＤＮＡ（配列番号２）のアデノウイルス搬送を決定した。
【０１３８】
Ａｄｅｎｏ−ＱｕｅｓｔＴＭキット（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、モントリオール）を用い、ＣＭＶプロモーターが駆動するＬＭＰ−１  ｃＤＮＡ（配列番号２）を用いて、複製不全ヒト組換えアデノウイルスを構築した。商業的に入手可能な（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、モントリオール）、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する組換えアデノウイルスを対照として用いた。
【０１３９】
まず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用量反応実験を行い、細胞あたり０．０２５、０．２５、２．５、または２５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルスの感染多重度（「ＭＯＩ」）で６０分間形質導入して、ラット頭蓋冠骨芽細胞培養中で骨分化を誘導するのに最適なアデノウイルス搬送ＬＭＰ−１（「ＡｄＶ−ＬＭＰ−１」）の濃度を決定した。１０９Ｍグルココルチコイド（「ＧＣ」）に７日間曝露することによって、陽性対照培養を分化させた。陰性対照培養は、未処理で放置した。第１４日、培養をフォン・コッサ染色した後、ミネラル化骨結節の数を計数し、そして培地に分泌されるオステオカルシンレベル（ｐｍｏｌ／ｍｌ）をラジオイムノアッセイ（平均±ＳＥＭ）によって測定した。
【０１４０】
この実験結果を表１に示す。未処理陰性対照培養には、自発的な結節は本質的に形成されなかった。このデータは、骨結節を骨誘導するのに、０．２５ｐｆｕ／細胞に等しいＭＯＩが最も有効であり、陽性対照（ＧＣ）に匹敵するレベルを達成することを示す。アデノウイルスのより低い用量およびより高い用量は、より有効でなかった。
【０１４１】
表１
【０１４２】
【表２】
2005526488.tif 000003
【０１４３】
その後、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最適な用量が、骨格的に成熟したニュージーランド白ウサギにおいて、横突間突起脊椎固定を促進可能であるかどうかを決定した。９匹のウサギを麻酔し、そして１８ゲージ針を用い、顆間窩を通じて、遠位大腿から３ｃｃの骨髄を吸引した。その後、バフィーコートを単離し、ＡｄＶ−ＬＭＰ−１で１０分間形質導入し、そして移植のため、細胞を手術室に戻した。横突起を剥離し、そしてＡｄＶ−ＬＭＰ−１（ＭＯＩ＝０．４）またはＡｄＶ−ＢＧａｌ（ＭＯＩ＝０．４）いずれかで形質導入した８００万〜１５００万の自己有核バフィーコート細胞を含有するキャリアー（失活させたウサギ骨マトリックスまたはコラーゲンスポンジいずれか）を挿入して、単一レベルの後側面腰椎関節固定術を行った。５週間後、ウサギを安楽死させ、そして手での触診、平面ｘ線、ＣＴスキャン、および非脱灰組織像によって、脊椎固定を評価した。
【０１４４】
ＡｄＶ−ＬＭＰ−１を投与した脊椎固定部位は、９匹のウサギすべてで連続した固形の脊椎固定塊を誘導した。対照的に、ＡｄＶ−ＢＧａｌ、またはより低い用量のＡｄＶ−ＬＭＰ−１（ＭＯＩ＝０．０４）を投与した部位は、ほとんどまたはまったく骨を形成せず、そしてキャリアーのみ（＜４０％）に匹敵する率の脊椎固定を生じた。これらの結果は、手での触診、ＣＴスキャン、および組織像によって評価したものと一致した。しかし、平面放射線写真撮影は、ときに、特に対照部位において、存在する骨の量を過大評価した。ＬＭＰ−１  ｃＤＮＡ搬送および骨誘導は、試験したどちらのキャリアー物質でも成功した。アデノウイルスベクターに対する全身性免疫反応または局所免疫反応の証拠はなかった。
【０１４５】
これらの結果は、先に検証されたウサギ脊椎固定モデルにおいて、非常に困難な、一貫した骨誘導を示す。さらに、手術中にｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子形質導入（１０分間）した自己骨髄細胞を用いるプロトコルは、一晩形質導入するか、または何週間も培養中で細胞増殖させることを要求する他の方法よりも、臨床的により実現可能である。さらに、組換えアデノウイルスの最も有効な用量（ＭＯＩ＝０．２５）は、他の遺伝子治療適用で報告される用量（ＭＯＩ  ４０〜５００）よりも実質的により低かった。これは、ＬＭＰ−１が細胞内シグナル伝達分子であり、そして強力なシグナル増幅カスケードを有する可能性があるためと考えられる。さらに、細胞培養から動物実験に形を変えた際、他の増殖因子では、通常、用量の増加が必要であることを考慮すると、細胞培養において骨を誘導するのと同じ濃度のＡｄＶ−ＬＭＰ−１が、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効であるという観察もまた、驚くべきことであった。総合すると、これらの観察によって、アデノウイルスを用いてＬＭＰ−１  ｃＤＮＡを搬送する局所遺伝子治療が可能であり、そして必要とされる用量が低いため、アデノウイルスベクターに対する免疫反応の負の影響を最小限にしうるであろうことが示される。
【０１４６】
実施例３０：  ＬＭＰ−１  ｃＤＮＡを用いて骨を形成する遺伝子治療のための、末梢静脈血有核細胞（バフィーコート）の使用
４匹のウサギにおいて、形質導入細胞が、骨髄でなく、静脈血由来のバフィーコートであったことを除いて、上述のように（実施例２９）、脊椎固定術を行った。これらの細胞をＡｄｅｎｏ−ＬＭＰまたはｐＨＩＳ−ＬＭＰプラスミドでトランスフェクションし、そしてその結果は骨髄細胞を用いた際と同等に成功であった。遺伝子搬送に通常の静脈血細胞を用いると、全身麻酔下の痛みを伴う骨髄採取が回避され、そして１ｍｌあたり２倍多い細胞を有する出発材料が得られるため、この発見は、遺伝子治療を臨床的により実現可能にする。
【０１４７】
実施例３１：  ヒトＬＭＰ−１スプライシング変異体の単離
イントロン／エクソンｍＲＮＡ転写スプライシング変異体は、シグナル伝達および細胞／組織発生の比較的一般的な制御機構である。多様な遺伝子のスプライシング変異体は、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ、およびタンパク質−基質相互作用を改変することが示されてきている。スプライシング変異体はまた、遺伝子発現の組織特異性を調節可能であり、異なる型（そしてしたがって機能）が多様な組織で発現されることを可能にする。スプライシング変異体は、細胞において、一般的な制御事象である。ＬＭＰスプライシング変異体が、神経再生、筋肉再生、または他の組織の発生などの、他の組織における影響を生じうる可能性がある。
【０１４８】
ＨＬＭＰ−１配列のスプライシング変異体に関して、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため、配列番号２２の部分に対応するＰＣＲプライマー対を調製した。標準的技術を用いて合成した順方向ＰＣＲプライマーは、配列番号２２のヌクレオチド３５〜５４に対応する。該プライマーは以下の配列を有する：
【０１４９】
【化１】
2005526488.tif 000004
【０１５０】
配列番号２２のヌクレオチド８２０〜８３９の逆相補体である逆方向ＰＣＲプライマーは、以下の配列を有する：
【０１５１】
【化２】
2005526488.tif 000005
【０１５２】
標準的技術によって、９４℃３０秒間、６４℃３０秒間、および７２℃１分間を３０回反復し、そしてその後、７２℃で１０分間インキュベーションするサイクリングプロトコルを用い、順方向および逆方向ＰＣＲプライマーを用いて、ＨＬＭＰ−１に類似の配列に関して、ヒト心臓ｃＤＮＡ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ、カタログ番号７４０４−１）をスクリーニングした。増幅ｃＤＮＡ配列をゲル精製し、そして配列決定のため、Ｅｍｏｒｙ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに提出した。標準的技術を用いてクローンを配列決定し、そしてＰＣＧＥＮＥ（ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ；プログラムＳＥＱＵＩＮおよびＮＡＬＩＧＮ）で配列を調べて、配列番号２２に対する相同性を決定した。その後、配列番号２２に比較して推定上の選択的スプライシング部位を持つ２つの相同ヌクレオチド配列を、ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃのプログラムＴＲＡＮＳＬで、それぞれのタンパク質産物に翻訳した。
【０１５３】
これらの２つの新規ヒトｃＤＮＡ配列の１つ（配列番号３７）は１４５６ｂｐを含んでなる：
【０１５４】
【化３】
2005526488.tif 000006
【０１５５】
１１９ｂｐ断片の欠失（Ｘの間）および１７ｂｐ断片の付加（下線部）によって引き起こされる読み枠シフトは、以下の派生するアミノ酸配列（配列番号３８）を有する一部切除遺伝子産物を生じる：
【０１５６】
【化４】
2005526488.tif 000007
【０１５７】
この４２３アミノ酸のタンパク質は、上に示すヌクレオチド変化のために異なる、強調した領域（アミノ酸９４〜９９）を除いて、配列番号１０に示すタンパク質と１００％の相同性を示す。
【０１５８】
第二の新規ヒト心臓ｃＤＮＡ配列（配列番号３９）は、１５７５ｂｐを含んでなる：
【０１５９】
【化５】
2005526488.tif 000008
【０１６０】
１７ｂｐ断片（太字体、斜字体、下線部）の付加によって引き起こされる読み枠シフトは、５６５〜５６７位（下線部）の早い翻訳停止コドンを生じる。
派生するアミノ酸配列（配列番号４０）は、１５３アミノ酸からなる：
【０１６１】
【化６】
2005526488.tif 000009
【０１６２】
このタンパク質は、アミノ酸９４までは、配列番号１０に１００％の相同性を示し、ここでヌクレオチド配列中に示す１７ｂｐ断片が付加されて、フレームシフトを生じる。アミノ酸９４〜１５３に渡って、このタンパク質は配列番号１０に相同ではない。配列番号１０のアミノ酸１５４〜４５７は、ヌクレオチド配列中に示す早期の停止コドンのため、存在しない。
【０１６３】
実施例３２：  ゲノムＨＬＭＰ−１ヌクレオチド配列
出願者らは、ＨＬＭＰ−１発現と関連する推定上の制御要素を含めて、ＨＬＭＰ−１をコードするゲノムＤＮＡ配列を同定した。全ゲノム配列を配列番号４１に示す。この配列は、ＡＣ０２３７８８（クローンＲＰ１１−５６４Ｇ９）、ワシントン大学医学部ゲノム配列決定センター、ミズーリ州セントルイスに由来した。
【０１６４】
ＨＬＭＰ−１の推定上のプロモーター領域は、配列番号４１のヌクレオチド２，６６０〜８，７３３に渡る。この領域は、とりわけ、少なくとも１０の潜在的なグルココルチコイド応答配列（「ＧＲＥ」）（ヌクレオチド６１４８〜６１５３、６２２６〜６２３１、６２４７〜６２５２、６３３６〜６３４１、６５１０〜６５１５、６５５２〜６５５７、６７２７〜６７３２、６７５２〜６７５７、７７３８〜７７４３、および８２５５〜８２６０）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｌａ）デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）に対するＭｏｔｈｅｒｓのＳｍａ−２相同体（「ＳＭＡＤ」）の１２の潜在的な結合配列部位（ヌクレオチド３５６９〜３５７５、４５５２〜４５５８、４５８２〜４５８８、５２２６〜５２３２、６２２８〜６２３４、６６４９〜６６５５、６７２５〜６７３１、６９３０〜６９３６、７３７９〜７３８４、７７３８〜７７４２、８０７３〜８０７９、および８３７８〜８３８４）、および３つのＴＡＴＡボックス（ヌクレオチド５９１０〜５９１３、６９３２〜６９３５、および７３８０〜７３８３）を含んでなる。３つのＴＡＴＡボックス、すべてのＧＲＥ、およびＳＭＡＤ結合配列（「ＳＢＥ」）のうち８つは、配列番号４１のヌクレオチド５，８４１〜８，７３３に渡る領域中に集まっている。これらの制御要素を用いて、例えば骨形成プロセスに関与するタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列の発現を制御することが可能である。これは、骨形成および骨修復に関連する療法因子または療法遺伝子とともに、組織分化および発生に関与する因子または遺伝子の全身投与を可能にするであろう。
【０１６５】
推定上の制御要素に加えて、ＨＬＭＰ−１をコードするヌクレオチド配列に対応する１３エクソンが同定されてきている。これらのエクソンは、配列番号４１中、以下のヌクレオチドに渡る：
【０１６６】
【表３】
2005526488.tif 000010
【０１６７】
ＨＬＭＰ−２には、別のエクソン（エクソン５Ａ）があり、これはヌクレオチド１４８８７〜１４９０４に渡る。
実施例３３：  椎間板細胞におけるＨＬＭＰ−１の発現
ＬＩＭミネラル化タンパク質−１（ＬＭＰ−１）は、骨性組織および非骨性組織において、細胞分化を指示することが可能な細胞内タンパク質である。本実施例は、椎間板細胞中でヒトＬＭＰ−１（「ＨＬＭＰ−１」）を発現させると、プロテオグリカン合成が増加し、そしてより軟骨細胞性の表現型が促進されることを立証する。さらに、アグリカンおよびＢＭＰ−２遺伝子発現を測定することによって、細胞性遺伝子発現に対するＨＬＭＰ−１発現の影響が立証された。酵素で穏やかに消化することによって、スプレーグ−ドーリー・ラットから腰部椎間板細胞を採取し、そして１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２中、単層で培養した。その後、これらの細胞をウェルあたりおよそ２００，０００細胞で６ウェルプレートに分割し、そして細胞がウェルあたりおよそ３００，０００細胞に達するまで、約６日間培養した。培地を１％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２に交換し、そしてこれを第０日とみなした。
【０１６８】
サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーターに機能可能であるように連結したＨＬＭＰ−１  ｃＤＮＡを含んでなる複製不全５型アデノウイルスが、先に、例えば米国特許第６，３００，１２７号に記載されている。陰性対照アデノウイルスは、ＨＬＭＰ−１  ｃＤＮＡをＬａｃＺ  ｃＤＮＡと交換したことを除いて、同一であった。陽性対照には、１００ナノグラム／ミリリットルの濃度でＢＭＰ−２を連続して存在させて、未感染培養をインキュベーションした。
【０１６９】
第０日、１％ＦＢＳを含有する培地３００マイクロリットル中、３７℃で３０分間アデノウイルスに培養を感染させた。緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）遺伝子を含有するアデノウイルス（「ＡｄＧＦＰ」）で処理した細胞を蛍光活性化細胞分取（「ＦＡＣＳ」）解析して、導入遺伝子が発現するのに最適の用量範囲を決定した。ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡを含有するアデノウイルス（ＡｄＨＬＭＰ−１）（０、１００、３００、１０００、または３０００のＭＯＩ）、またはＬａｃＺマーカー遺伝子を含有するアデノウイルス（ＡｄＬａｃＺ、１０００のＭＯＩ）（陰性対照）で細胞を処理した。感染３日後および６日後に培地を交換した。
【０１７０】
ジメチルメチレンブルー（「ＤＭＭＢ」）熱量測定アッセイを用いて、培地に存在する硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）を測定する（第０日、第３日、および第６日）ことによって、プロテオグリカン産生を概算した。
【０１７１】
アグリカンｍＲＮＡおよびＢＭＰ−２  ｍＲＮＡを定量化するため、第６日に細胞を採取して、そしてＴｒｉｚｏｌ技術によって、ｍＲＮＡを抽出した。逆転写酵素を用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、そしてリアルタイムＰＣＲに用いて、アグリカンおよびＢＭＰ−２メッセージの相対的存在量を測定するのを可能にした。先の実験で、アグリカンおよびＢＭＰ−２のリアルタイムプライマーを設計し、そして試験した。Ｃｙｂｅｒｇｒｅｅｎ技術を用いた。標準化曲線を用いて、ｍＲＮＡ存在量を定量化した。
【０１７２】
トランスフェクション細胞に関して、光学顕微鏡を用いて細胞の形態を文書化した。細胞はＡｄＨＬＭＰ−１（ＭＯＩ  １０００）処理でより丸くなったが、ＡｄＬａｃＺ処理では丸くならなかった。ＡｄＬａｃＺ感染は、細胞形態を有意には変化させなかった。
【０１７３】
１０００のＭＯＩでＡＤＧＦＰに感染させたラット椎間板細胞のＦＡＣＳ解析によって、最高の割合の細胞（４５％）が感染していることが示された。
ｓＧＡＧ産生およびＡｄｈＬＭＰ−１  ＭＯＩの間には用量依存性増加があった。これらのデータを図１に示し、この図は、単層培養のラット椎間板細胞中、異なるＭＯＩでＨＬＭＰ−１を過剰発現させた後のｓＧＡＧ産生を示す。この結果を第０日の未処理細胞に規準化した。エラーバーは平均の標準誤差に相当する。図１に示すように、第３日に観察されるｓＧＡＧ産生は比較的少量であり、これによって、トランスフェクションおよびＧＡＧの細胞産生の間には、時間のずれがあることが示された。ＡｄＬａｃＺでの処理は、ｓＧＡＧ産生を有意には変化させなかった。やはり図１に示すように、ＡｄｈＬＭＰ−１の最適用量は、１０００のＭＯＩであり、第６日の未処理対照を超えて、ｓＧＡＧ産生の２６０％の増進を生じた。より高い用量またはより低い用量のＡｄｈＬＭＰ−１は減少した反応を導く。
【０１７４】
ｓＧＡＧ産生に対するＡｄｈＬＭＰ−１投薬量（ＭＯＩ）の影響を図２にさらに例示する。図２は、異なるＭＯＩのＡｄｈＬＭＰ−１で処理した６日後のラット椎間板ｓＧＡＧレベルを示すグラフである。図２からわかるように、ＡｄｈＬＭＰ−１の最適用量は、１０００のＭＯＩであった。
【０１７５】
アグリカンｍＲＮＡおよびＢＭＰ−２  ｍＲＮＡ産生を図３に示す。この図は、ＨＬＭＰ−１の過剰発現後のアグリカンｍＲＮＡおよびＢＭＰ−２  ｍＲＮＡの増加を立証する。第６日にラット椎間板細胞から抽出したｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲを行って、２５０のＭＯＩのＡＤｈＬＭＰ−１で処理した細胞と、処理しない（「ＮＴ」）細胞を比較した。図３のデータは、未処理試料を超える増加パーセントとして示される。図３に例示するように、ＡｄｈＬＭＰ−１処理後、アグリカンｍＲＮＡおよびＢＭＰ−２  ｍＲＮＡの有意な増加が注目された。ＢＭＰ−２発現の増加によって、ＢＭＰ−２が、プロテオグリカン合成のＨＬＭＰ−１刺激を仲介する、下流遺伝子であることが示唆される。
【０１７６】
これらのデータは、ＡｄｈＬＭＰ−１でのトランスフェクションが、椎間板細胞のプロテオグリカン合成を増加させるのに有効であることを立証する。最高の導入遺伝子発現を導くウイルス用量（ＭＯＩ  １０００）はまた、ｓＧＡＧの最高の誘導も導き、ＨＬＭＰ−１発現およびｓＧＡＧ誘導間に相関があることが示唆される。これらのデータによって、ＨＬＭＰ−１遺伝子治療は、椎間板におけるプロテオグリカン合成を増加させる方法であり、そしてＨＬＭＰ−１が椎間板疾患を治療する剤であることが示される。
【０１７７】
図４Ａは、異なるＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１に感染させた１２時間後のＨＬＭＰ−１  ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。図４Ａでは、異なる用量（ＭＯＩ）のＡｄ−ｈＬＭＰ−１ウイルスで外因性ＬＭＰ−１発現を誘導し、そしてリアルタイムＰＣＲで定量化した。このデータを比較する目的で、Ａｄ−ＬＭＰ−１  ＭＯＩ  ５のＨＬＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルに規準化する。処理なし（「ＮＴ」）またはＡｄ−ＬａｃＺ処理（「ＬａｃＺ」）の陰性対照群では、ＨＬＭＰ−１は検出されなかった。ＨＬＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルは用量依存様式で、２５および５０のＭＯＩで、およそ８倍のプラトーに達した。
【０１７８】
図４Ｂは、感染３日後〜６日後の培地中のｓＧＡＧ産生を示すグラフである。ＤＭＭＢアッセイを用いて、感染３日後〜６日後の間の総ｓＧＡＧ産生を定量化した。図４Ｂのデータを対照（すなわち処理なし）群に規準化する。図４Ｂからわかるように、ｓＧＡＧには用量依存性増加があり、対照のおよそ３倍増加のピークが、２５および５０のＭＯＩで達成された。陰性対照では、２５のＭＯＩのＡｄ−ＬａｃＺは、ｓＧＡＧの増加をまったく導かなかった。図４Ｂでは、３つの試料の平均とＳＤとして、結果を表す。
【０１７９】
図５は、ｓＧＡＧ産生の時間経過変化を示すグラフである。図５からわかるように、第３日、ｓＧＡＧ産生は、２５および５０のＭＯＩで有意に増加した。第６日、ＡｄＬＭＰ−１に反応してｓＧＡＧ産生に用量依存性増加があった。ｓＧＡＧ増加のプラトーレベルは、２５のＭＯＩで達成された。図５からやはりわかるように、ＡｄＬａｃＺ（「ＬａｃＺ」）での処理は、ｓＧＡＧ産生を有意には変化させなかった。６〜９の試料に関して、各結果を平均とＳＤとして表す。図５において、「＊＊」は、未処理対照に対して、Ｐ値が＜０．０１であるデータ点を示す。
【０１８０】
図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれ、アグリカンおよびＢＭＰ−２に関して、ラット線維輪細胞におけるＬＭＰ−１過剰発現に対する遺伝子反応を示すグラフである。２５のＭＯＩのＡｄ−ＬＭＰ−１（「ＬＭＰ−１」）での感染３日後に、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。図６Ａおよび図６Ｂからわかるように、アグリカンおよびＢＭＰ−２の遺伝子発現は、未処理対照（「ＮＴ」）に比較して、Ａｄ−ＬＭＰ−１での感染後、有意に増加した。さらに、２５のＭＯＩのＡｄＬａｃＺ（「ＬａｃＺ」）での処理は、未処理対照に比較して、アグリカンまたはＢＭＰ−２どちらの遺伝子発現も有意に変化させなかった。図６Ａおよび図６Ｂにおいて、６つの試料に関して、各結果を平均とＳＤとして表す。図６Ａおよび図６Ｂにおいて、「＊＊」は、Ｐ値がＰ＜０．０１であるデータ点を示す。
【０１８１】
図７は、２５のＭＯＩでＡｄＬＭＰ−１に感染させた後の、ラット線維輪細胞におけるＨＬＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルの時間経過を示すグラフである。１８Ｓおよび過剰発現ＬＭＰ−１プライマーの複製係数を用いて標準化した後、５のＭＯＩのＡｄＬＭＰ−１を超える倍増加として、該データを表す。図７からわかるように、ＨＬＭＰ−１  ｍＲＮＡは、感染１２時間後と同程度に早期に、有意に上方制御された。さらに、第１日〜第３日の間に、発現レベルの顕著な増加があった。図７の各結果を、６つの試料の平均とＳＤとして表す。
【０１８２】
図８は、ＨＬＭＰ−１過剰発現に反応したＢＭＰおよびアグリカンのｍＲＮＡレベルの変化を示すグラフである。２５のＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１に感染させた後、多様な時点で、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、およびアグリカンのｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲで測定した。図８からわかるように、ＢＭＰ−２  ｍＲＮＡは、ＡｄＬＭＰ−１での感染１２時間後と同程度に早期に、有意に上方制御された。一方、アグリカンｍＲＮＡは、感染３日後まで上方制御されなかった。各結果を、６つの試料の平均とＳＤとして表す。図８において、「＊＊」は、未処理対照に対するＡｄＬＭＰ−１感染に関して、Ｐ値が＜０．０１であるデータ点を示す。
【０１８３】
図９は、ＨＬＭＰ−１発現に反応したｓＧＡＧ産生増進の時間経過を示すグラフである。図９のデータに関しては、２５のＭＯＩでＡｄ−ｈＬＭＰ−１にラット輪細胞を感染させた。感染後３日ごとに培地を交換し、そしてＤＭＭＢアッセイでｓＧＡＧに関してアッセイした。このデータは、ｓＧＡＧ産生が第６日でプラトーに達し、そして第９日で実質的に維持されることを示す。
【０１８４】
図１０は、ＬＭＰ−１が仲介するｓＧＡＧ産生増加に対するノギン（ＢＭＰアンタゴニスト）の影響を示すグラフである。図１０に見られるように、２５のＭＯＩのＡｄ−ＬＭＰ−１でのラット輪細胞の感染は、第３日〜第６日の間に産生されるｓＧＡＧの３倍の増加を導いた。この増加は、３２００ｎｇ／ｍｌおよび８００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ノギン（ＢＭＰアンタゴニスト）を添加することによって遮断された。しかし、図１０に示すように、ノギンは、未感染細胞においては、ｓＧＡＧ産生を有意に改変しなかった。図１０でやはりわかるように、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２での刺激は、ＢＭＰ−２添加３日後〜６日後の間のｓＧＡＧ産生に３倍の増加を導いた。８００ｎｇ／ｍｌのノギンはまた、この増加も遮断した。
【０１８５】
図１１は、単層培養６日後の培地中のｓＧＡＧに対するＬＭＰ−１の影響を示すグラフである。データ点は、未処理細胞を超える倍増加として表す。図１１に示すように、ＬＭＰ−１とＣＭＶプロモーターをＡＡＶベクターによって搬送すると、単層のラット椎間板細胞によるグリコサミノグリカン合成を刺激するのにも有効である。
【０１８６】
表２：ＳＹＢＲグリーンのＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲのプライマー配列
【０１８７】
【表４】
2005526488.tif 000011
【０１８８】
表２中のＧＡＰＤＨは、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼを示す。
表３：ＴａｑＭａｎ（登録商標）のリアルタイムＰＣＲのプライマーおよびプローブ配列
【０１８９】
【表５】
2005526488.tif 000012
【０１９０】
１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の順方向プライマー、逆方向プライマー、およびプローブ用に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リボソームＲＮＡ調節試薬（パーツ番号４３０８３２９、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を用いた。
【０１９１】
すべての引用刊行物および特許は、本明細書に完全に援用される。
前述の明細書は、本発明の原理を解説し、例示目的で提供する実施例を含むが、当業者が本開示を読めば、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形式および詳細に多様な変化を加えることが可能であることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
本発明は、付随する図を参照することで、よりよく理解される可能性がある。
【図１】図１は、異なるＭＯＩでトランスフェクションしたラット椎間板細胞によるＨＬＭＰ−１の発現後の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の産生を示すグラフである。
【図２】図２は、異なるＭＯＩのＡｄＨＬＭＰ−１に感染させた６日後のラット椎間板細胞の用量反応を示すグラフである。
【図３】図３は、２５０ビリオン／細胞のＭＯＩでトランスフェクションした６日後の、ＡｄＨＬＭＰ−１でトランスフェクションしたラット椎間板細胞によるアグリカンｍＲＮＡおよびＢＭＰ−２  ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、異なるＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１に感染させた１２時間後のＨＬＭＰ−１  ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。図４Ｂは、感染３日後〜６日後の培地中のｓＧＡＧ産生を示すグラフである。
【図５】図５は、ｓＧＡＧ産生の時間経過変化を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、アグリカンに関して、ラット線維輪細胞におけるＬＭＰ−１過剰発現に対する遺伝子反応を示すグラフである。図６Ｂは、ＢＭＰ−２に関して、ラット線維輪細胞におけるＬＭＰ−１過剰発現に対する遺伝子反応を示すグラフである。
【図７】図７は、２５のＭＯＩでＡｄＬＭＰ−１に感染させた後の、ラット線維輪細胞におけるＨＬＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルの時間経過を示すグラフである。
【図８】図８は、ＨＬＭＰ−１過剰発現に反応したＢＭＰおよびアグリカンのｍＲＮＡレベルの変化を示すグラフである。
【図９】図９は、ＨＬＭＰ−１発現に反応したｓＧＡＧ産生増進の時間経過を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＬＭＰ−１が仲介するｓＧＡＧ産生増加が、ノギンによって遮断されることを示すグラフである。
【図１１】図１１は、単層培養６日後の培地中のｓＧＡＧに対するＬＭＰ−１の影響を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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