(57)【要約】本発明は酸性アミノ酸塩を多様な長さの炭化水素鎖に結合させて製造した陽電荷脂質、該脂質の製造方法、及び該陽電荷脂質を含有するリポソームに関する。本発明の陽電荷脂質は従来の陽電荷脂質に比べて遺伝子導入効率と生体適合性において優れた特質を有するので、遺伝子治療用リポソームの製造に実際に適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)で表される陽電荷脂質:
【化１】
2005519966.tif 000004
式中、
Ｒは水素、Ｃ10〜Ｃ18のアルキル又はＣ10〜Ｃ18のアルケニルであり；
ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ3ＣＯ2、ＨＳＯ4又はＮＨ3であり；及び
ｎは１又は２である。
【請求項２】
陽電荷脂質が、リシン-アスパラギン酸塩-テトラデカノール(ＫＤ-ＤＭ)、リシン-アスパラギン酸塩-ヘキサデカノール(ＫＤ-ＤＰ)又はリシン-グルタミン酸塩-テトラデカノール(ＫＥ-ＤＭ)である請求項１に記載の陽電荷脂質。
【請求項３】
酸性アミノ酸塩を用いた請求項１に記載の陽電荷脂質の製造方法であって:
(i)アミノ基が保護された酸性アミノ酸塩(II)をｐ−トルエンスルホン酸一水和物又は無水トルエンの酸触媒存在下でアルコール化合物(III)とエステル化反応又は結合反応によって化合物(IV)を得る工程；
(ii)化合物(IV)の保護基を、無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)有機溶媒中、５〜２０％(ｗ/ｗ)のＰｄ/Ｃ又は水素の存在下に除去して化合物(V)を得る工程；
(iii)化合物(V)を化合物(VI)と結合反応させることによって化合物(VII)を得る工程；
(iv)化合物(VII)をＣｌ-ジオキサン溶液、無水ジオキサン又はこれらの混合物と０〜１０℃で１〜６時間反応させ、Ｒ3を除去して化合物(VIII)を得る工程；及び
(v) 化合物(VIII)の塩を製造して下記一般式(I)の陽電荷脂質を得る工程を含む方法。
【化２】
2005519966.tif 000005
式中、
Ｒは水素、Ｃ10〜Ｃ18のアルキル又はＣ10〜Ｃ18のアルケニルであり、
Ｒ1及びＲ3はベンジルカルバメート(Cbz)、ｐ-メトキシベンジルカルバメート(Moz)、ｐ-ブロモベンジルカルバメート、又は９-フルオロメチルカルバメート(FMOC)、ｔ-ブチルカルバメート(t-Boc)又は１-アダマンチルカルバメート(Adoc)であり、
ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ3ＣＯ2、ＨＳＯ4又はＮＨ3であり、
ｎは１又は２である。
【請求項４】
酸性アミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸である請求項３に記載の酸性アミノ酸塩を用いた陽電荷脂質の製造方法。
【請求項５】
結合反応が無水ジクロロメタン有機溶媒中で２〜４時間、室温で行なわれる請求項３に記載の酸性アミノ酸塩を用いた陽電荷脂質の製造方法。
【請求項６】
陽電荷脂質がリシン-アスパラギン酸塩-テトラデカノール(ＫＤ-ＤＭ)、リシン-アスパラギン酸塩-ヘキサデカノール(ＫＤ-ＤＰ)又はリシン-グルタミン酸塩-テトラデカノール(ＫＥ-ＤＭ)である請求項３に記載の酸性アミノ酸塩を用いた陽電荷脂質の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の陽電荷脂質と、コレステロール又はジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)を３:７ないし９:１(モル比)の比率で混合した混合物を有機溶媒に溶解させる工程、及び有機溶媒を除去し水和させ１０〜７０℃で混合する工程を含む陽電荷脂質リポソームの製造方法。
【請求項８】
有機溶媒がクロロホルムとメタノール（２:１、ｖ/ｖ)の混合溶媒である請求項７に記載の陽電荷脂質リポソームの製造方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法で製造され、リシン-グルタミン酸塩-テトラデカノール(ＫＥ-ＤＭ)とコレステロールが７:３(モル比)で混合される陽電荷脂質を含有するリポソームＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な陽電荷脂質及び該陽電荷脂質を含有するリポソームに関する。さらに具体的には、本発明は酸性アミノ酸塩に様々な長さの炭化水素鎖を結合させて製造した陽電荷脂質、その製造方法及び該陽電荷脂質を含有するリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾病が遺伝子欠陥と関連していることがよく知られている。このような疾病を治療するための方法として、疾病原因遺伝子を入れ替えて遺伝子から正常なタンパク質を生産させて疾病を治療するために開発された遺伝子治療法が、当技術分野で継続的に研究されている。人類史上最初の遺伝子治療はＡＤＡ(アデノシンデアミナーゼ)欠乏症について試みられ、この成功から遺伝子治療の時代が始まり、今日では遺伝子治療について全世界的に数多くの研究がなされている。
【０００３】
所望の外部遺伝子を標的細胞に移すための遺伝子導入系には生物学的方法と物理化学的方法がある。ウィルスを用いる生物学的方法は、遺伝子導入効率は高いものの、ウィルス性遺伝物質の挿入による副作用があり、導入される遺伝子の大きさに制限があるという短所がある。物理化学的な方法は遺伝子銃(gene gun)、遺伝子注射(injection of naked DNA)、又はリポソームを用いる。これらのなかで、遺伝子銃や遺伝子注射を用いる方法は、外部遺伝子の導入される部位が銃又は注射が適用された部位に制限されることにより標的細胞スペクトルが限られるという意味で満足できるものとはいえず、リポソームを用いる方法は、遺伝子の導入効率がウィルスを用いる方法に比べて比較的低く、発現が一時的であるという短所がある。しかし、リポソームには以下のような長所がある：遺伝子と結合して脂質-ＤＮＡ複合体を容易に形成することができる；遺伝子銃又は遺伝子注射を用いる方法に比べて遺伝子の導入効率が比較的高い；ウィルス性遺伝物質挿入による副作用がない；導入される遺伝子の大きさに制限がない；そして、リポソームをリガンドに結合させてリガンドと共に使用すれば標的細胞における遺伝子の発現を持続的に増加させることができる。従って、遺伝子治療においてリポソームを用いる例は徐々に増加しており、腫瘍のような疾患の治療に幅広く使用されている。
【０００４】
上記の理由により、現在まで、N-[1-2,3-ジオレイルオキシ]プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウムクロリド (DOTMA)、N-[1-2,3-ジオレイルオキシ]プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル硫酸塩 (DOTAP)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート (DOSPA)、及び３β-[N-(N'N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール (ＤＣ-Ｃｈｏｌ)などのリポソームが開発され、遺伝子治療に大きな貢献をしてきた。しかしながら、遺伝子の導入効率が低いという短所は克服されるべき問題と考えられている。
【０００５】
このような状況下、より高い遺伝子導入効率を有する新規リポソームを探究及び開発する強い理由があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは高い遺伝子導入効率を有する新規リポソームを開発するために努力し、アミノ基が保護された酸性アミノ酸塩を用いて陽電荷脂質を製造し、該陽電荷脂質を含むリポソームが、従来の陽電荷脂質を含有するリポソームと比較して高い効率で遺伝子を標的細胞に伝達できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明の主な課題は酸性アミノ酸塩を用いた陽電荷脂質の製造方法を提供することである。
本発明の他の課題は該方法で製造した陽電荷脂質を提供することである。
本発明の別の課題は該陽電荷脂質を含むリポソームを提供することである。
【０００８】
本発明の上記課題、その他の課題、及び特徴は添付の図と共に提供される下記の説明で明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は下記の一般式(I)で表される新規な陽電荷脂質を提供する。
【００１０】
【化１】
2005519966.tif 000002
【００１１】
式中、
Ｒは水素、Ｃ10〜Ｃ18のアルキル又はＣ10〜Ｃ18のアルケニルであり；
ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ3ＣＯ2、ＨＳＯ4又はＮＨ3であり；及び
ｎは１又は２である。
【００１２】
陽電荷脂質の製造方法は：アミノ基が保護された酸性アミノ酸塩(II)をｐ−トルエンスルホン酸一水和物又は無水トルエンの酸触媒存在下でアルコール化合物(III)とエステル化反応又は結合反応させて化合物(IV)を得る工程；化合物(IV)の保護基を、無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)有機溶媒中、５〜２０％(w/w)のＰｄ/Ｃ又は水素の存在下に分離して化合物(V)を得る工程；化合物(V)と化合物(VI)を結合反応させて化合物(VII)を得る工程；化合物(VII)をＣｌ-ジオキサン溶液、無水ジオキサン又はこれらの混合物と０〜１０℃で１〜６時間反応させ、Ｒ3を除去して化合物(VIII)を得る工程；及び化合物(VIII)の塩を製造して、下記一般式(I)で表される陽電荷脂質を得る工程を含む。
【００１３】
【化２】
2005519966.tif 000003
【００１４】
式中、
Ｒは水素、Ｃ10〜Ｃ18のアルキル又はＣ10〜Ｃ18のアルケニルであり、
Ｒ1及びＲ3はベンジルカルバメート(Cbz)、ｐ-メトキシベンジルカルバメート(Moz)、ｐ-ブロモベンジルカルバメート、９-フルオロメチルカルバメート(FMOC)、ｔ-ブチルカルバメート(t-Boc)又は１-アダマンチルカルバメート(Adoc)であり、
ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＦ3ＣＯ2、ＨＳＯ4又はＮＨ3であり、
ｎは１又は２である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
新規な陽電荷脂質の製造方法を以下の工程に従って、さらに詳しく説明する。
【００１６】
第１工程: 酸性アミノ酸塩から化合物(IV)の取得
アミノ基が保護された酸性アミノ酸塩(II)をｐ−トルエンスルホン酸一水和物又は無水トルエンの酸触媒存在下でアルコール性化合物(III)とエステル化反応又は結合反応させることにより、化合物(IV)を得る：この時、酸性アミノ酸としてはグルタミン酸及びアスパラギン酸、結合試薬としてはジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)及びジイソプロピルジイミド(DIC)が挙げられる。また、アミノ基の保護に用いられるＲ1は当業界で慣用の保護基から選択すればよく(参照: T・Ｗ．・グリーンら編「プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・ケミストリー」，第２版，ウィリー, pp 309-405, pp 406-412, pp 441-452)、また、それらに限定されるものではないが、酸性の反応条件では、Ｒ1は、ベンジルカルバメート(Cbz)、ｐ-メトキシベンジルカルバメート(Moz)、ｐ-ブロモベンジルカルバメート、又は９-フルオロメチルカルバメート(FMOC)、最適にはベンジルカルバメートであり、塩基性の反応条件では、Ｒ1は、ｔ-ブチルカルバメート(t-Boc)又は１-アダマンチルカルバメート(Adoc)である。
【００１７】
第２工程: 化合物(V)の取得
化合物(IV)の保護基を無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)有機溶媒中で５〜２０％(w/w)のＰｄ/Ｃ又は水素の存在下に除去して化合物(V)を得る。
【００１８】
第３工程: 結合反応による化合物(VII)の取得
化合物(V)を、活性化した化合物(VI)と結合させることによって化合物(VII)を得る：この時、結合反応は無水ジクロロメタン有機溶媒中で２〜４時間、室温で行なわれ、化合物(VII)のアミノ基はＲ3で保護される（Ｒ3は上記で定義したＲ1と同じである）。
【００１９】
第４工程: 化合物(VIII)の取得
化合物(VII)をＣｌ-ジオキサン溶液、無水ジオキサン、又はこれらの混合物と０〜１０℃で、１〜６時間反応させてＲ3を除去し、化合物(VIII)を得る。
【００２０】
第５工程: 陽電荷脂質の製造
化合物(VIII)に塩を形成させることによって一般式(I)で表される陽電荷脂質を製造する。前述のように塩の形成はＲ3の除去と同時に行われ、好ましくは化合物(VIII)をＨＣｌ-ジオキサン溶液及び無水ジオキサンと０〜１０℃で、１〜６時間、より好ましくは０℃で２〜４時間反応させ、最終的に陽電荷脂質を製造する。
【００２１】
前記方法によって製造した陽電荷脂質のうち遺伝子導入効率が高いリシン-アスパラギン酸塩-ドデカノール、リシン-アスパラギン酸塩-テトラデカノール、リシン-アスパラギン酸塩-ヘキサデカノール、及びリシン-グルタミン酸塩-テトラデカノールが本発明において好ましく用いられ、リシン-アスパラギン酸塩-テトラデカノール、リシン-アスパラギン酸塩-ヘキサデカノール及びリシン-グルタミン酸塩-テトラデカノールが最も好ましく、これらをそれぞれ"ＫＤ-ＤＭ"、"ＫＤ-ＤＰ"及び"ＫＥ-ＤＭ"と命名した。
【００２２】
陽電荷脂質と、コレステロール又はジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)を３:７ないし９:１のモル比で混合した混合物を有機溶媒に溶解させた後、有機溶媒を除去して水和させ、１０〜７０℃で混合することによって陽電荷脂質を含むリポソームを製造できる。有機溶媒としてはクロロホルムとメタノール（２:１、v/v)の混合溶媒が使用できる。本発明においては、前記一般式(I)で表される陽電荷脂質、ＫＤ-ＤＭ、ＫＤ-ＤＰ及びＫＥ-ＤＭなどは、ＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＭ/ＤＯＰＥ、ＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＰ/ＤＯＰＥ、ＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ又はＫＥ-ＤＭ/ＤＯＰＥなどのリポソームを製造するために好ましく用いられた。
【００２３】
このように製造したリポソームを用いてＤＮＡ-リポソーム複合体を製造して標的細胞内に遺伝子を導入するために使用し、ヒトの腎臓細胞で遺伝子が効率的に発現するか否かを調べた。その結果、既存のＤＯＴＡＰ(N-[1-2,3-ジオレイルオキシ]プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチル硫酸塩)をコレステロールと混合して製造されるリポソームであるＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌと比較して本発明の陽電荷脂質を含有するリポソームはＤＮＡの導入効率が著しく増加し、また、ＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌに類似の遺伝子導入効果を示すことが確認された。従って、本発明の陽電荷脂質は従来の陽電荷脂質と比較して、遺伝子導入効率と生体適合性においてより優れた特質を有しているため、遺伝子治療用リポソームの製造に実際に適用可能である。
【実施例】
【００２４】
以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されるものではない。
【００２５】
例１: アスパラギン酸を用いた陽電荷脂質ＫＤ-ＤＭの製造
例１-１: 化合物(IV)の製造
アミノ基が保護されたＮ-Ｃｂｚ-Ｌ-アスパラギン酸塩(210 mg,0.8 mmol)とテトラデカノールをｐ−トルエンスルホン酸一水和物(TsOH・H2O)(50 mg, 0.26 mmol)及び無水トルエン(10 mL)と１４時間１１０℃で反応させ、展開液(ヘキサン:ＥｔＯＡｃ=９.５:０.５, v/v)を使用したディーンストック装置(Dean-stock trap)を用いて、ＲがＣ14Ｈ29の化合物(IV)を６２％の収率で得た。
1H NMR(CDCl3)δ: 0.87-1.94(m,62H), 2.85(s,2H), 4.06(m,4H),4.79(m,1H), 5.12(s,2H), 5.7(s,1H), 7.2-7.4(m,5H)
【００２６】
例１-２: 化合物(V)の取得
例１-１で得られた化合物(IV)の保護基、Ｃｂｚを、該化合物(300 mg, 0.46 mmol)を１０％Ｐｄ/Ｃ(58 mg,0.55 mmol)と、無水テトラヒドロフラン(THF)有機溶媒中で水素存在下に室温で反応させることにより除去し、ＲがＣ14Ｈ29である化合物(V)を９１％の収率で得た。
【００２７】
例１-３: 活性化化合物(VI)の取得
L-リシン一塩酸塩(200 mg, 1.01 mmol)とジ-tert-ブチルジカーボネート(477.9 mg,2.19 mmol)を、ＮａＯＨ(131.5 mg, 3.29 mmol)、ＴＨＦ(3 mL)及び水(3 mL)の存在下に室温で反応させ、Ｒ3がｔ-ＢＯＣである化合物(VI)を311 mg得た(収率８２％)。次いで、該化合物、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド (53 mg, 0.46 mmol)、ＤＣＣ(103 mg, 0.5 mmol)及び無水ジクロロメタンを室温で反応させ活性基を有する化合物(VI)を得た。
【００２８】
例１-４: 化合物(VII)の取得
例１-２及び例１-３で得られた化合物(V)及び化合物(VI)を混合し、室温で３時間反応させ、展開液（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝７:３、v/v)を使用したディーンストック装置を用いて、ＲがＣ14Ｈ29である化合物(VII)を６１％の収率で得た。
1H NMR(CDCl3)δ: 0.88-2.01(m,86H), 2.79-3.05(m,4H), 4.10(m,4H), 4.86(m,2H), 6.83(s,1H), 6.9(s,1H)
【００２９】
例１-５: 陽電荷脂質の製造
例１-４で得られた化合物(VII)150 mg (0.16 mmol)をＨＣｌの4.0 Mのジオキサン溶液（4 mL)及び無水ジオキサン4 mLと０℃で反応させ、陽電荷脂質("ＫＤ-ＤＭ")を９４％の収率で製造した。
【００３０】
例２: アスパラギン酸を用いた陽電荷脂質ＫＤ-ＤＰの製造
例２-１: 化合物(IV)の取得
アミノ基が保護されたＮ-Ｃｂｚ-Ｌ-アスパラギン酸塩(210 mg,0.8 mmol)、ヘキサデカノール (343 mg,1.6 mmol)、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（TsOH・H2O)(50 mg,0.26 mmol)及び無水トルエン10 mLを、１１０℃で１４時間反応させ、展開液(ヘキサン:ＥｔＯＡｃ=９.５:０.５, v/v)を使用したディーンストック装置を用いて、ＲがＣ16Ｈ33である化合物(IV)を６５％の収率で得た。
1H NMR(CDCl3)δ: 0.87-1.94(m,70H), 2.85(s,2H), 4.06(m,4H), 4.79(m,1H), 5.12(s,2H), 5.7(s,1H), 7.2-7.4(m,5H)
【００３１】
例２-２: 化合物(V)の取得
例２-１で得られた化合物(IV)の保護基Ｃｂｚを、該化合物(300 mg, 0.46 mmol)を１０％Ｐｄ/Ｃ(58 mg, 0.55 mmol)と無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)有機溶媒中水素存在下で室温で反応させることにより除去し、ＲがＣ16Ｈ33である化合物(V)を９１％の収率で得た。
【００３２】
例２-３: 化合物(VII)の取得
例２-２及び例１-３で得られた化合物(V)及び化合物(VI)を室温で３時間反応させ、展開液（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝７:３、v/v)を使用したディーンストック装置を用いて、ＲがＣ16Ｈ33である化合物(VII)を６２％の収率で得た。
1H NMR(CDCl3)δ: 0.88-2.01(m,94H), 2.79-3.05(m,4H), 4.10(m,4H), 4.86(m,2H), 6.83(s,1H), 6.9(s,1H)
【００３３】
例２-４: 陽電荷脂質の製造
例２-３で得られた化合物(VII)(150 mg, 0.16 mmol)をＨＣｌの4.0 Mのジオキサン溶液（4 mL)及び無水ジオキサン4 mLと０℃で反応させ、陽電荷脂質（"ＫＤ-ＤＰ"）を９２％の収率で製造した。
【００３４】
例３: グルタミン酸を用いた陽電荷脂質ＫＥ-ＤＭの製造
例３-１: 化合物(IV)の取得
アミノ基が保護されたＮ-Ｃｂｚ-Ｌ-グルタミン酸塩 (225 mg, 0.8 mmol)及びテトラデカノール(343 mg,1.6 mmol)をｐ−トルエンスルホン酸一水和物(TsOH・H2O, 50 mg, 0.26 mmol)及び10 mLの無水トルエンと、１４時間１１０℃で反応させ、展開液(ヘキサン:ＥｔＯＡｃ=９.５:０.５, v/v)を使用したディーンストック装置を用いて、ＲがＣ14Ｈ29である化合物を６３％の収率で得た。
1H NMR(CDCl3)δ: 0.81-1.9(m,62H), 2.7-2.85(m,4H), 4.04(m,4H), 4.79(m,1H), 5.12(s,2H), 7.2-7.4(m,5H)
【００３５】
例３-２: 化合物(V)の取得
例３-１で得られた化合物(IV)の保護基Ｃｂｚを、該化合物(300 mg, 0.45 mmol)を１０％Ｐｄ/Ｃ(58 mg, 0.55 mmol)と無水テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)有機溶媒中水素存在下で室温で反応させることにより除去し、ＲがＣ14Ｈ29である化合物(V)を９３％の収率で得た。
【００３６】
例３-３: 化合物(VII)の取得
例３-２及び例１-３で得られた化合物(V)及び化合物(VI)を混合し、室温で３時間反応させ、展開液（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝７:３、v/v)を使用したディーンストック装置を用いて、ＲがＣ14Ｈ29である化合物(VII)を６２％の収率で得た。
1H NMR(CDCl3)δ: 0.81-2.0(m,86H), 2.70-3.05(m,6H), 4.04(m,4H), 4.8(m,2H), 6.79(s,1H), 6.87(s,1H) 
【００３７】
例３-４: 陽電荷脂質の製造
例３-３で得られた化合物(VII)150 mg(0.17 mmol)、ＨＣｌの4.0 Mのジオキサン溶液4 mL、及び無水ジオキサン4 mLを０℃で反応させ、陽電荷脂質（"ＫＥ-ＤＭ"）を９２％の収率で製造した。
【００３８】
例４: 陽電荷脂質を含有するリポソームの製造
例１、２及び３で製造した陽電荷脂質を用いて、ＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＭ、ＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＭ/ＤＯＰＥ、ＫＤ-ＤＰ、ＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＰ/ＤＯＰＥ、ＫＥ-ＤＭ及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌのリポソームを製造した。
【００３９】
例４-１: ＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌリポソームの製造
ＤＯＰＡＴ(Avanti Polar Lipids, USA)とコレステロール(Sigma Chemical Co., USA)を１:１重量モル濃度比でクロロホルムとメタノールの混合溶媒（２:１、v/v)に溶解し、ＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌリポソームを製造した。その後、脂質を含む溶液から有機溶媒を窒素ガスパージにより除去し、続いて残る微量の有機溶媒を、真空ポンプを用いて除去して、脱イオン蒸溜水で水和させ、ボルテックスミキサーを用いてＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌリポソームを製造した。
【００４０】
例４-２: ＫＤ-ＤＭリポソームの製造
ＫＤ-ＤＭを混合溶媒に溶解する以外は例４-１と同様の方法で、ＫＤ-ＤＭリポソームを製造した。
【００４１】
例４-３: ＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの製造
ＫＤ-ＤＭとコレステロールを１:１重量モル濃度比で混合溶媒に溶解する以外は例４-１と同様の方法で、ＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームを製造した。
【００４２】
例４-４: ＫＤ-ＤＭ/ＤＯＰＥリポソームの製造
ＫＤ-ＤＭとジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE, Doosan S.R.L., Korea)を１:１重量モル濃度比で混合溶媒に溶解する以外は例４-１と同様の方法で、ＫＤ-ＤＭ/ＤＯＰＥリポソームを製造した。
【００４３】
例４-５: ＫＤ-ＤＰリポソームの製造
ＫＤ-ＤＰを混合溶媒に溶解し、６５℃でボルテックスミキサーを用いる以外は例４-１と同様の方法で、ＫＤ-ＤＰリポソームを製造した。
【００４４】
例４-６: ＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌリポソームの製造
ＫＤ-ＤＰとコレステロールを１:１重量モル濃度比で混合溶媒に溶解し、６５℃でボルテックスミキサーを用いる以外は例４-１と同様の方法でＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌリポソームを製造した。
【００４５】
例４-７: ＫＤ-ＤＰ/ＤＯＰＥリポソームの製造
ＫＤ-ＤＰとＤＯＰＥを１:１重量モル濃度比で混合溶媒に溶解し、６５℃でボルテックスミキサーを用いる以外は例４-１と同様の方法で、ＫＤ-ＤＰ/ＤＯＰＥリポソームを製造した。
【００４６】
例４-８: ＫＥ-ＤＭリポソームの製造
ＫＥ-ＤＭを混合溶媒に溶解する以外は例４-１と同様の方法で、ＫＤ-ＤＭリポソームを製造した。
【００４７】
例４-９:ＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの製造
ＫＥ-ＤＭとコレステロールをそれぞれ３:７、４:０、５:５、６:４、７:３、８:２又は９:１重量モル濃度比で混合溶媒に溶解させる以外は例４-１と同様の方法で、ＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームを製造した。
【００４８】
例５:リポソームの遺伝子導入効率評価
種々の量のDNA（ルシフェラーゼ遺伝子）を、種々のDNA：リポソームの混合比で含有するように製造したリポソームを、２９３ヒト腎臓細胞株(ATCC CRL-1573)及びマウス黒色種細胞Ｂ１６ＢＬ６に投与して、遺伝子導入効率を評価し互いに比較した。
【００４９】
例５-１:２９３ヒト腎臓細胞株の培養
２９３ヒト腎臓細胞を１０％(v/v)の牛血清、ストレプトマイシン及びペニシリンを含むＤＭＥＭ(Dulbecco's modified eagle medium, Gibco-BRL,USA)に接種し、５％(v/v)ＣＯ2環境下３７℃、インキュベーター(NAPCO,USA)で培養し、２４-ウェルプレートに細胞濃度が１×１０5細胞／ウェル又は５×１０4細胞／ウェルになるよう分注した後、２４時間さらに培養して細胞を安定化させた。
【００５０】
例５-２:マウス黒色種細胞Ｂ１６ＢＬ６の培養
マウス黒色種細胞Ｂ１６ＢＬ６を５％(v/v)牛血清、ストレプトマイシン及びペニシリンを含む最小必須培地(MEM, Gibco-BRL, USA)に接種し、５％(v/v)ＣＯ2環境下３７℃、インキュベーター(NAPCO, USA)で培養し、２４-ウェルプレートに細胞濃度が１×１０5細胞／ウェル又は５×１０4細胞／ウェルになるよう分注した後、２４時間さらに培養して細胞を安定化させた。
【００５１】
例５-３: 種々のＤＮＡ量での遺伝子導入効率評価
種々のＤＮＡ量でのリポソームの遺伝子導入効率を評価するため、ルシフェラーゼ遺伝子量を0.5μg、1μg、2μg及び5μgに変化させて、500μlの無血清培地にＤＮＡとリポソーム（１:１２、w/w)を混合してＤＮＡ-リポソーム複合体を製造した。ＤＮＡ-リポソーム複合体溶液500μlを、２９３腎臓細胞又はＢ１６ＢＬ６細胞を含む各ウェルに分注し、５％(v/v)ＣＯ2環境下３７℃、インキュベーターで４時間培養した後、血清を含む新しい培地に交換し４８時間さらに培養した。培養後、培地を除去し、100μlのルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬(Promega, USA)を添加して細胞を溶解させて、14000 rpmで約１０秒間遠心分離した。その後、10μlの上清を20μlのルシフェラーゼ基質と混合し、発光計数器(Luminometer, Mini lumat LB9506,EG&G BERTHOLD)で発光を測定した。各ウェルのタンパク質はＤＣタンパク質分析法(Bio-rad,USA)で定量した(参照:図１(a)〜（c）、及び図2(a)〜（c）)。
【００５２】
図１(a)及び(b)は、２９３細胞においてＤＮＡ量を変化させたときの、ＫＤ-ＤＭ/Ｄｏｐｅ及びＫＤ-ＤＭリポソームの遺伝子導入効率をそれぞれ示したグラフであり、図１(c)は２９３細胞においてＤＮＡ量を変化させ、ＫＥ-ＤＭとコレステロールを様々な比率で混合して製造したＫＥ-ＤＭリポソームと、ＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。
【００５３】
図１(a)及び(b)に示されるように、陽電荷脂質を含むリポソームの遺伝子導入効率は、従来のＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌリポソームよりも高かった。従来のＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌと比較した場合、各リポソームが最高の遺伝子導入効率を示すＤＮＡ量はＫＤ-ＤＭが1μg、ＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌが2μg、ＫＤ-ＤＭ/ＤＯＰＥが5μg、ＫＤ-ＤＰが2μg、ＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌが2μg、ＫＥ-ＤＭが2μg及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌが2μgであることが分かった。特に、図１(c)に示されるように、各リポソームが最高の遺伝子導入効率を示すＫＥ-ＤＭとコレステロールの混合比は７:３(モル比)であった。
【００５４】
図２(a)及び(b)は、Ｂ１６ＢＬ６細胞においてＤＮＡ量を変化させたときの、ＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＭ/Ｄｏｐｅ及びＫＤ-ＤＭリポソーム、並びにＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＰ/Ｄｏｐｅ及びＫＤ-ＤＰリポソームの遺伝子導入効率をそれぞれ示したグラフであり、図２(c)はＢ１６ＢＬ６細胞においてＤＮＡ量を変化させたときの、ＫＥ-ＤＭ及びコレステロールを７:３のモル比で混合して製造したＫＥ-ＤＭリポソーム及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。
【００５５】
図２(a)及び(b)に示されるように、本発明の陽電荷脂質の中で、アスパラギン酸を用いた陽電荷脂質は、コレステロールと結合したリポソームでは従来のＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌリポソームより遺伝子導入効率が低く、コレステロールと結合していないリポソームでは従来のＤＯＴＡＰ/Ｃｈｏｌリポソームより遺伝子導入効率が高かった。一方、図２(c)に示されるように、グルタミン酸を用いた陽電荷脂質の場合、コレステロールと結合したリポソームがコレステロールと結合していないリポソームより高い遺伝子導入効率を示した。また、各リポソームが最高の遺伝子導入効率を示すＤＮＡ量はＫＤ-ＤＭは1μg、ＫＤ-ＤＰは0.5μg、及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌは5μgであった。
【００５６】
例５-４: 種々のＤＮＡ：リポソームの混合比率での遺伝子導入効率測定
種々のＤＮＡ：リポソームの混合比率での遺伝子導入効率評価のために、1μgのルシフェラーゼ遺伝子を用い、ＤＮＡ:リポソームの混合比を１:３、１:６、１:９、１:１２、及び１:１８(w/w)にする以外は例５-３と同様の方法でＤＮＡ-リポソーム複合体を製造し、２９３腎臓細胞に添加して４８時間培養した。培養後、培地を除去し、100μlのルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬(Promega, USA)を加えて細胞を溶解させた後、14000 rpmで約１０秒間遠心分離した。その後、10μlの上清を20μlのルシフェラーゼ基質と混合し、発光計数器（Mini lumat LB9506,EG&G BERTHOLD)で発光量を測定した。各ウェルのタンパク質はＤＣタンパク質分析法(Bio-rad,USA)で定量した。
【００５７】
図３(a)、(b)及び(c)は、２９３細胞においてＤＮＡとリポソームとの比率を変化させたときのＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＭ/Ｄｏｐｅ及びＫＤ-ＤＭリポソーム、ＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＰ/ＤＯＰＥ及びＫＤ-ＤＰリポソーム、並びにＫＥ-ＤＭ及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの遺伝子導入効率をそれぞれ示したグラフである。
【００５８】
図３(a)及び(b)に示されるように、ＤＮＡとアスパラギン酸を用いて製造した各リポソームとの比率で最高の遺伝子導入効率を示す比率はＫＤ-ＤＭが１:６(w/w)、ＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌが１:１２(w/w)、ＫＤ-ＤＭ/ＤＯＰＥが１:６(w/w)、ＫＤ-ＤＰが１:１２(w/w)及びＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌが１:１２(w/w)であった。図３(c)に示されるように、グルタミン酸を用いて製造したリポソームの場合、最高の遺伝子導入効率を示す混合比は、ＫＥ-ＤＭ:コレステロールが７:３(モル比)、かつＤＮＡ:リポソームが１:９(w/w)であった。
【００５９】
図４(a)、(b)、及び(c)はＢ１６ＢＬ６細胞においてＤＮＡとリポソームとの比率を変化させたときの、ＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＭ/Ｄｏｐｅ及びＫＤ-ＤＭリポソーム、ＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＰ/ＤＯＰＥ及びＫＤ-ＤＰリポソーム、並びにＫＥ-ＤＭ及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの遺伝子導入効率をそれぞれ示したグラフである。
【００６０】
図４(a)及び(b)に示されるように、ＤＮＡとアスパラギン酸を用いて製造した各リポソームとの比率で最高の遺伝子導入効率を示す比率はＫＤ-ＤＭが１:６(w/w)及びＫＤ-ＤＰが１:９(w/w)であった。図４(c)に示されるように、グルタミン酸を用いて製造したリポソームの場合は最高の遺伝子導入効率を示す比は、ＫＥ-ＤＭ:コレステロールが７:３(モル比)、かつＤＮＡ:リポソームが１:３(w/w)であった。
【００６１】
上記で明確に例示及び説明されたように、本発明は酸性アミノ酸塩を多様な長さの炭化水素鎖に結合させて製造した陽電荷脂質、該脂質の製造方法、及び該陽電荷脂質を含有するリポソームを提供する。本発明の陽電荷脂質は従来の陽電荷脂質に比べて遺伝子導入効率と生体適合性においてより優れた特質を有するので、遺伝子治療用リポソームの製造に実際に適用可能である。
【００６２】
本発明は特定の態様を参照して説明されたが、特許請求の範囲に定義された本発明の精神及び範囲から離れることなく、多くの改変、修正を加えることができることは当業者に自明であろう。従って、本発明の実質的な範囲は添付の特許請求の範囲及びその均等物として定義される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】（ａ）２９３細胞においてＤＮＡ量を変化させたときのＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＭ/Ｄｏｐｅ及びＫＤ-ＤＭリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。（ｂ）２９３細胞においてＤＮＡ量を変化させたときのＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＰ/Ｄｏｐｅ及びＫＤ-ＤＰリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。 （ｃ）は２９３細胞においてＤＮＡ量を変化させたときの、ＫＥ-ＤＭとコレステロールを様々な比率で混合して製造したＫＥ-ＤＭリポソーム及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。
【図２】（ａ）Ｂ１６ＢＬ６細胞においてＤＮＡ量を変化させたときのＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＭ/Ｄｏｐｅ及びＫＤ-ＤＭリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。 （ｂ）Ｂ１６ＢＬ６細胞においてＤＮＡ量を変化させたときのＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＰ/Ｄｏｐｅ及びＫＤ-ＤＰリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。  （ｃ）Ｂ１６ＢＬ６細胞において、ＤＮＡ量を変化させたときの、ＫＥ-ＤＭとコレステロールを７:３のモル比で混合して製造したＫＥ-ＤＭリポソーム及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである
【図３】（ａ）２９３細胞においてＤＮＡとリポソームの比率を変化させたときの、ＫＤ−ＤＭ／Ｃｈｏｌ、ＫＤ‐ＤＭ／Ｄｏｐｅ及びＫＤ‐ＤＭリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。 （ｂ）２９３細胞においてＤＮＡとリポソームの比率を変化させたときの、ＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＰ/Ｄｏｐｅ、及びＫＤ-ＤＰリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。 （ｃ）２９３細胞においてＤＮＡとリポソームの比率を変化させたときの、ＫＥ-ＤＭ及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。
【図４】（ａ）Ｂ１６ＢＬ６細胞においてＤＮＡとリポソームの比率を変化させたときの、ＫＤ-ＤＭ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＭ/Ｄｏｐｅ、及びＫＤ-ＤＭリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。（ｂ）Ｂ１６ＢＬ６細胞においてＤＮＡとリポソームの比率を変化させたときの、ＫＤ-ＤＰ/Ｃｈｏｌ、ＫＤ-ＤＰ/Ｄｏｐｅ、及びＫＤ-ＤＰリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。（ｃ）Ｂ１６ＢＬ６細胞においてＤＮＡとリポソームの比率を変化させたときの、ＫＥ-ＤＭ及びＫＥ-ＤＭ/Ｃｈｏｌリポソームの遺伝子導入効率を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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