(57)【要約】本発明は、捕獲されている活性成分、例えばアミノ糖を含有する製剤およびその使用に関する。一態様において、本発明は関節内注入可能な製剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ糖を含む捕獲活性成分を含有する、動物またはヒトにおける疾病または症状の関節内治療のための、注射製剤。
【請求項２】
上記疾病または症状が、関節炎、軟骨関連スポーツ損傷、または軟骨分解から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
上記活性成分が、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはイミノサイクリトール、並びにそれらの医薬上許容される塩から選択されるアミノ糖である、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
上記活性成分が、リポソームにより捕獲されている、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
上記活性成分が、ミクロスフェアにより捕獲されている、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
上記活性成分が、固形脂質ナノ粒子により捕獲されている、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリ（乳酸／グリコール酸）とのコポリマー、ポリ（エチレングリコール−γ−（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）のコポリマー、アルギナートゲル、キチン類およびキトサン類からなる群から選択される１種または２種以上の重合担体をさらに含有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
製剤が鎮痛剤である、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
関節炎が、骨関節炎またはリウマチ性関節炎である、請求項２に記載の製剤。
【請求項１０】
リポソームにより捕獲されているアミノ糖を含有する注射製剤であって、
該リポソームが、ジステアロイルＬ−α−ホスファチジルコリン、ジステアロイル−Ｌ−α−ホスファチジル−エタノールアミン、メトキシポリエチレングリコールと結合したジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−エタノールアミン、ジステアロイル−Ｌ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロールおよびジパルミトイルＬ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリンから選択される１種または２種以上の脂質を含有する、上記注射製剤。
【請求項１１】
上記アミノ糖が、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはイミノサイクリトールおよびその医薬上許容される塩から選択される、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
上記リポソームが、一重または多重ラメラであり、且つ１００ｎｍ以上の平均径を有する、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１３】
上記ヒアルロン酸が、約４００〜約１０，０００，００ダルトンの分子量を有する、請求項７に記載の製剤。
【請求項１４】
ミクロスフェアにより捕獲されているアミノ糖を含有する関節炎の関節内処置用注射製剤であって、
該ミクロスフェアがポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマーおよびその医薬上許容される塩を含有する、上記注射製剤。
【請求項１５】
哺乳動物における疾病または症状の治療方法であって、
放出制御製剤としての治療有効量のアミノ糖を投与することを含む、上記治療方法。
【請求項１６】
上記疾病または症状が、関節炎、軟骨関連スポーツ損傷、または軟骨分解から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
更に、痛みの軽減を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
製剤を、医薬的に許容されるゲル、クリーム、ローションまたは貼布剤の形態で局所投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
上記関節炎が、骨関節炎またはリウマチ性関節炎である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
上記放出制御製剤が、リポソーム、ミクロスフェアまたは固形脂質ナノ粒子の少なくとも１種を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物における関節炎の治療方法であって、治療有効量のアミノ糖をリポソーム製剤として投与することを含む、上記治療方法。
【請求項２２】
リポソーム製剤が、ジステアロイルＬ−α−ホスファチジルコリン、ジステアロイル−Ｌ−α−ホスファチジル−エタノールアミン、メトキシポリエチレングリコールと結合したジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−エタノールアミン、ジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロールおよびジパルミトイルＬ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリンから選択される１種または２種以上の脂質を含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記リポソーム製剤が痛みの軽減をもたらす、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
リポソーム製剤として治療有効量のＮ−アセチルグルコサミンを関節内に注射することを含む関節炎の治療方法であって、
該リポソームが、ジステアロイルＬ−α−ホスファチジルコリン、ジステアロイル−Ｌ−α−ホスファチジル−エタノールアミン、メトキシポリエチレングリコールと結合したジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−エタノールアミン、ジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロールまたはジパルミトイルＬ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン、またはそれらいずれかの組合せを含有する、上記治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、アミノ糖などの捕獲された活性成分を含有する製剤およびその使用の分野に関する。より具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する関節内注射製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
骨関節炎（ＯＡ）は、社会的に重要な問題となっている一般的な関節障害である（Ｌａｗｒｅｎｃｅ等によるＡｒｔｈｅｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４１：７７８（１９９８）；Ｇａｂｒｉｅｌ等によるＪ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２４：７１９（１９９７）；Ｍａｒｃｈ等によるＢａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｃｈｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１１：８１７（１９９７））。骨関節炎（ＯＡ）の治療に用いられる医薬品の種類には、アセトアミノフェン類、非ステロイド系抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤＳ）、関節内注射用コルチコステロイド類およびヒアルロン酸がある。これらの医薬は主として痛みの軽減はもたらすが、当該疾病の進行を遅くするか、休止させることにより当該疾病の本質的な寛解を達成することは、いまだに実証されていない（Ａｌｔｍａｎ等によるＯｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ６ Ｓｕｐｐｌ．Ａ：２２（１９９８）；Ｈｏｃｈｂｅｒｇ等によるＡｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３８：１５３５（１９９５）；Ｈｏｃｈｂｅｒｇ等によるＡｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３８：１５４１（１９９５））。
【０００３】
かなりの形態の関節炎は、最初、ＮＳＡＩＤＳ類を、時折、他の鎮痛剤とともに用いて処置される。当該疾病がこれらの薬剤により適切に制御されない場合には、疾病を緩和する（寛解を誘導する）、金塩化合物などの抗リウマチ薬、Ｄ−ペニシラミン、抗マラリア剤および細胞障害性の薬剤を使用することが可能である。最後には、糖質コルチコイド類を、全身的に若しくは関節内経路により投与することが可能である。しかしながら、これらの医薬においては、大部分の患者に対し当該疾病の本質的な寛解を達成するような、格別に効果的な医薬はない。
【０００４】
Ｂｏｈｎｅは、骨関節炎（ＯＡ）の治療におけるグルコサミン（ＧＡ）の使用を開示している（ＢｏｈｎｅによるＭｅｄ．Ｗｅｌｔ，３０：１６６８（１９６９））。それ以来、グルコサミン（ＧＡ）は、広く知られるようになり、現在、骨関節炎（ＯＡ）の治療に一般的に用いられている。グルコサミン（ＧＡ）塩（硫酸塩および塩化物）は、軟骨保護特性または疾病緩和特性を有するものと考えられており（Ａｌｔｍａｎ等によるＯｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ６ Ｓｕｐｐｌ．Ａ：２２（１９９８）；Ｌｏｚａｄａ等によるＢｕｌｌ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．４６：５（１９９７）；Ｍｅｖｏｒａｃｈ等によるＩｓｔ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３０：９２８（１９９４））、また元々、損傷した軟骨の修復を促進することが示唆されていた。
【０００５】
骨関節炎（ＯＡ）を患う患者の軟骨が、軟骨マトリックス成分の代謝回転が促進されていることと、修復が不充分であることをもって特徴付けられることは、いくつかの研究により証明されている（Ｉｎｅｒｏｔ等によるＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１６９：１４３（１９７８）；Ｄｉｅｐｐｅ等によるＡｃｔａ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．（Ｓｕｐｐｌ．２６６）６６：１（１９９５））。グルコサミン（ＧＡ）は、多くの種々のメカニズムにより抗炎症活性を提示することが示されており、例えば、グルコサミン（ＧＡ）が、グリコサミノグリカン合成のアップレギュレーションを誘導することにより抗炎症活性を提示することが示されている。
【０００６】
グリコサミノグリカン合成におけるグルコサミン（ＧＡ）誘導性のアップレギュレーションは、複雑な代謝プロセスを示し、潜在的に、数種のメカニズム、例えばグルコサミン（ＧＡ）がヘキソサミン経路に直接に入って、ウリジン−ジホスフェート−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンからの負のフィードバック制御を回避させることにより（Ｋｏｍｆｅｌｄ等によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｏｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５２：３７１（１９６４））、並びにＴＧＦα１産生のアップレギュレーションにより（Ｋｏｌｍ−Ｌｉｔｔｙ等によるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１６０（１９９８））、媒介される。最近になって、グルコサミン（ＧＡ）の媒介による軟骨保護の新規なメカニズムが開示された。この新規なメカニズムには、グリコホスファチジルイノシトール結合タンパク質の抑制によって（Ｓａｎｄｙ等によるＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６７：２５８（１９９９））、ウシ軟骨移植およびラット軟骨肉腫細胞における（Ｓａｎｄｙ等によるＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３５（ｐｔ１）：５９（１９９８）アグリカナーゼ（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）活性の阻害が含まれる。
【０００７】
グルコサミン（ＧＡ）は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）がシグナルを発信するカスケードにおいて、ホスホリル化を阻害して、これにより抗炎症活性を提示する。ヘキソサミン経路の最終生成物の１種であるＵＤＰ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンは、アンカー部位としてセリンまたはスレオニン残基を利用するタンパク質Ｏ−グリコシル化の動的プロセスに関連することが証明されている（Ｈａｌｔｉｗａｎｇｅｒ等によるＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３１：２３７（１９９７））。潜在的に、セリン残基のＯ−グリコシル化は、同一残基のホスホリル化と競合し、細胞内シグナル変換カスケードの障害を生じる（Ｃｈｏｕ等によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：４４１７（１９９５））。
【０００８】
ＩＬ−１βが培養ヒト関節軟骨細胞において窒素酸化物（ＮＯ）産生を誘導することが知られている（Ｇｅｎｇ等によるＪ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６３：５４５（１９９５））。ＮＯ、シクロ−オキシゲナーゼ−２酵素（ＣＯＸ−２）およびインターロイキン−６−（ＩＬ−６）を含む、ある種の炎症媒体におけるＩＬ−１β媒介性の誘導は、転写核因子−ｋＢ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ））ダイマーの細胞質から核への移行に関連する。そこで、ＮＦ−ｋＢは、標的遺伝子に結合し、それらの転写を調節する（Ｃｈｕ等によるＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４８：８７１（１９９８）；Ｎｅｗｔｏｎ等によるＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１８：１３５（１９９７）；Ｐａｒｉｋｈ等によるＪ．Ｓｕｒ．Ｒｅｓ．６９：１３９（１９９７））。ＮＦ−ｋＢ活性化プロセスは、ｋＢβ阻害タンパク質（ＩｋＢβ）のＮ−末端調節ドメインにおけるｋＢα阻害タンパク質（ＩｋＢα）中の２個のセリン（Ｓｅｒ−３２およびＳｅｒ−３６）のホスホリル化に依存する（ＫａｒｉｎによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３３９（１９９９））。
【０００９】
グリコサミノグリカン合成におけるグルコサミン（ＧＡ）誘導性のアップレギュレーション以外の抗炎症メカニズムも、グルコサミン（ＧＡ）の抗関節炎活性に寄与することがある。グルコサミン（ＧＡ）は、抗炎症活性を示し、ラットをブラジキニン、セロトニンおよびヒスタミンにより誘発される足浮腫から防護する（Ｓｅｔｎｉｋａｒ等によるＡｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４１：１５７（１９９１））。グルコサミン（ＧＡ）はまた、カラゲナンにより誘発された漿膜炎、ホルマリンにより誘発されたラット腹膜炎、および酢酸により誘発されたマウス腹膜炎に対し、動物を防護した（Ｓｅｔｎｉｋａｒ等によるＡｒｚｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４１：１５７（１９９１））。グルコサミン（ＧＡ）は、炎症を起こしたラット足におけるシクロオキシゲナーゼまたはタンパク質分解酵素を抑制しなかったが、ラット肝臓におけるリソソーム酵素活性およびスーパーオキシド生成を抑制した（Ｓｅｔｎｉｋａｒ等によるＡｒｚｎｅｉｎ−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４１：１５７（１９９１））。
【００１０】
経口投与されたグルコサミン（ＧＡ）はまた、ラットにおけるカオリンまたはアジュバント誘導性の関節炎に対し抗炎症活性を示した（Ｓｅｔｎｉｋａｒ等によるＡｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４１：５４２（１９９１））。しかしながら、グルコサミン（ＧＡ）の抗滲出活性および抗炎症活性は、経口投与された場合、経口投与されたアセチルサリチル酸またはインドメタシンの対応する活性に比較して低かった。
【００１１】
特定の関節炎症状の治療におけるグルコサミン（ＧＡ）およびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の使用に関係する数多くの特許がある。即ち、米国特許第３，６８３，０７６号（Ｒｏｖａｔｉ）は、骨関節炎（ＯＡ）およびリウマチ性関節炎の治療におけるグルコサミン（ＧＡ）塩の使用を開示しており、米国特許第４，８７０，０６１号（Ｓｐｅｃｋ）は、変質性関節疾病の治療におけるＧｌｃＮＡｃの口腔投与による使用を開示しており、米国特許第５，８４０，７１５号および米国特許第６，１３６，７９５号（両方ともにＦｌｏｒｉｏ）は、関節炎の軽減をもたらす食事計画における栄養補助剤としてＧｌｃＮＡｃの使用を開示している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の態様の一つは、グルコサミン（ＧＡ）およびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の抗炎症特性および軟骨保護特性に関する。この態様によれば、グルコサミン（ＧＡ）およびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、軟骨細胞におけるサイトカイン誘導性遺伝子発現を妨げることによって、抗炎症特性および軟骨保護特性を示す。
本発明の一の特定態様において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）製剤は、驚くべきことに、哺乳動物において予想外の鎮痛効果を示した。本発明の製剤における鎮痛特性は、例えば骨関節炎（ＯＡ）またはリウマチ性関節炎（ＲＡ）の治療を必要とする患者において、これらの化合物を、このような疾患の治療に対し有用なものとする。
【００１３】
本発明は、その方法の一態様において、治療有効量のＧｌｃＮＡｃを、単独で、または既存の抗炎症性医薬若しくはヘキソサミニダーゼ阻害剤とともに含有する組成物を、患者に投与することを含む方法を提供する。本発明の製剤を投与する適切な方法は、非制限的に、局所および筋肉内の投与方法を含む。製剤が関節内に投与される一態様において、ＧｌｃＮＡｃの封入または捕獲（リポソーム内など）は、関節内に注入されたＧｌｃＮＡｃの利用および薬理動態プロフィールを好ましい方向に変える。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
略語および用語
本発明に従い、本明細書で用いられている下記用語および略語は、別段の記載がないかぎり、下記の意味に定義する。これらの説明は、典型的なもののみを意図している。これらは、本明細書の何れかに記載または言及されている際、これらの用語を限定することを意図するものではない。むしろ、これらの説明は、本明細書に記載され、特許請求されている用語の追加の態様および／または例を包含させることを意図する。
【００１５】
本明細書において使用される略語は、以下の通りである：
Ｃｈｏｌ＝コレステロール；
ＤＭＥＭ＝ダルベッコの修正イーグル培地（Dulbecco,s Modified EagleMedium）；
ＤＳＰＣ＝ジステアロイルＬ−α−ホスファチジルコリン；
ＤＳＰＥ＝ジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−エタノールアミン；
ＤＳＰＥ−Ｃｏｎ＝ポリエチレングリコールに結合したジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−エタノールアミン；
ＤＳＰＧ＝ジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール；
ＤＰＰＳ＝ジパルミトイルＬ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン；
ＥＲＫ＝細胞外シグナル調節キナーゼ；
ＧＡ＝グルコサミン；
ＧＡＧｓ＝グリコサミノグリカン；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；
ＨＡ＝ヒアルロン酸；
ＩＬ−１β＝インターロイキン−１β；
ＩＬ−６＝インターロイキン−６；
ｉＮＯＳ＝誘導性窒素酸化物シンターゼ；
ＭＡＰ＝マイトジェン活性化タンパク質；
ＭＨＡ＝ミューラー−ヒントン（Mueller-Hinton）寒天；
ＭＬＶ＝多重ラメラ小胞；
ＮＳＡＩＤ＝非ステロイド系抗炎症薬；
ＯＡ＝骨関節炎；
ＰＢＳ＝リン酸塩緩衝塩類溶液；
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール；
ＰＭＳＦ＝フェニルメチルスルホニルフルオライド；
ＲＡ＝リウマチ性関節炎
ＳＵＶ＝小型一重ラメラ小胞；
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；および
ＴＮＦα＝腫瘍壊死因子。
【００１６】
「活性成分」の用語は、治療有効量の医薬またはその製剤を表わす。本発明の好適活性成分は、アミノ糖、例えばＧｌｃＮＡｃおよびＧＡである。
【００１７】
「アルギナートゲル」の用語は、１，４−結合β−Ｄ−マンヌロン酸およびα−Ｌ−グルロン酸残基を種々の割合で含有する天然ポリサッカライドポリマーを表わす。アルギナートは、特に、ある種の二価カチオン、例えばカルシウム、バリウムおよびストロンチウムの存在下に安定なゲルを形成することができる。
【００１８】
「アミノ糖」の用語は、１個または２個以上の炭素原子がヒドロキシル基（−ＯＨ）の部位でアミノ基（−ＮＨ2）により置き換えられている合成産出または天然産出の糖のいずれかを表わす。このような置換は、糖中に存在する不斉炭素の配向または配置に関係なく生じることができる。別段の記載がない限り、「アミノ糖」の用語は、環状アミノ糖のアノマー（αまたはβ）のどちらかを表わす。アミノ糖はＮ−アシル化させることができ、この場合、側鎖アミノ基の１個の水素原子がアシル基（−ＣＯＲ、ここでＲ＝低級アルキル）により置換される。本発明の好適態様に従う場合、Ｒ＝メチル（−ＣＨ3）である。
【００１９】
「関節炎」の用語は、関節の炎症を特徴とする特定の疾病を表わすが、この炎症の原因は種々の状態で相違し得る。比較的に一般の関節疾病としては、リウマチ性関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および骨関節炎が包含される。これらはまた、「変質性関節疾病」とも称される。
【００２０】
「関節軟骨」または「軟骨」の用語は、骨末端を覆い、関節表面を形成している物質を表わす。軟骨は圧縮力に耐えることができ、関節がそこを滑動する低摩擦表面を作り出す。関節軟骨は関節細胞と称される細胞、並びにタンパク質およびアミノ糖を含むマトリックスを含含する。
【００２１】
「軟骨分解」の用語は、軟骨を含む組織の分解を表わす。このような分解は関節炎の特徴である。
【００２２】
「キチン」の用語は、β−１，４−様式で結合した（ポリ）ＧｌｃＮＡｃを表わす。キチンは自然界全体に見出され、例えば昆虫および甲殻類の外殻に見出される。
【００２３】
「キトサン」の用語は、脱アシル化されたキチンまたはβ−１，４−様式で結合した（ポリ）Ｎ−グルコサミンを表わす。
【００２４】
「軟骨細胞」の用語は、関節軟骨内に見出される細胞を表わす。軟骨細胞は、コラーゲン、ゼラチン状タンパク質、およびタンパク質に結合したグルコサミングリカンであるプロテオグリカン（これはまた、ムコサッカライドと称される）を産生する。
【００２５】
「結合体」(conjugate)の用語は、化学的に結合されている２種または３種以上の相違する分子の組合せを表わす。本発明における結合体の例は、「ＤＳＰＥ−Ｃｏｎ」であり、エステル結合による場合、ＤＳＰＥはポリエチレングリコールに結合したジステアロイルホスファチジルエタノールアミンに相当する。本発明の結合体における特徴的な他の結合は、非限定的に、アミド、アセタール、チオアセタール、エステル、およびチオエステル、或いは主として反応性カルボニル成分を求核試薬で処理することによって形成されるような結合を包含する。
【００２６】
「ＣＯＸ−１」および「ＣＯＸ−２」の用語は、構造的に関連しているが、機能的に相違しているシクロ−オキシゲナーゼ酵素を表わす。ＣＯＸ−１は恒常的な機能を有し、その阻害は望ましくない。ＣＯＸ−２は誘導性酵素であり、その存在は炎症に対する応答を増大させる。
【００２７】
「封入効率」(encapsulation efficiency)の用語は、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子などの中へ、封入、組込み、充填、会合、結合または捕獲された化合物または活性成分の量を表わす。一般に、「収率」は、活性成分の封入パーセントとして表わされる。
【００２８】
「捕獲」または「封入」の用語は、液相または固相における活性成分の自然な溶解を制限、封鎖または阻害する、活性成分を製剤化する方法を表わす。活性成分を捕獲または封入するための好適例としては、非制限的に、リポソーム、ミクロスフェアまたはナノ粒子、例えば固形脂質ナノ粒子がある。
【００２９】
「グリコサミノグリカン」の用語は、反復するジサッカライド単位を含有する長鎖ヘテロポリサッカライドを表わす。このジサッカライド単位は、２種のアミノ糖、即ち、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはＧｌｃＮＡｃと、ウロン酸、例えばグルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）やイズロン酸（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ）を含むことができる。別の機能として、ＧＡＧｓは関節における潤滑液として寄与する。生理学的に重要な特定のＧＡＧｓは、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸塩、コンドロイチン硫酸塩、ヘパリン硫酸塩およびケラタン硫酸塩である。
【００３０】
「ヘキソサミン」の用語は、アルデヒド基またはケト基を含有する６−炭素多価アルコールのアミノ糖のいずれかを表わす。ヘキソサミンの用語は、その不斉炭素結合の配向または配置に関係なく、アルドース、デオキシアルドースおよびケトースを包含する。好適なアミノ糖は、２−、３−、５−または６−デオキシケトースであり、好ましくはデオキシアミノ糖、例えばＧＡ、マンノサミンおよびガラクトサミンである。さらに好ましくは、アミノ糖はＮ−アシル化されており、例えばＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンなどのデオキシアシルアミノ糖から選択される。
【００３１】
「ヘキソサミニダーゼ」の用語は、キチンまたはキトサンを、それらの各モノサッカライド構造単位、例えばＧｌｃＮＡｃおよびＧＡに、部分的または完全に加水分解するグリコシダーゼ酵素を表わす。代表的な酵素としては、エクソ型ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、リソザイムなどがある。
【００３２】
「ヒアルロン酸」の用語は、交互に存在するグルクロン酸およびグルコサミンからなるサブユニットを含有する天然産生ムコポリサッカライドを表わす。ヒアルロン酸は、β（１−３）およびβ（１−４）グルコシド結合により結合されているＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなる反復ジサッカライド単位により形成されている線状ポリサッカライド（長鎖生体ポリマー）である。ヒアルロン酸は、約５０，０００ダルトンから約８ｘ１０6ダルトンまでの範囲にわたる数種の分子量範囲で市販されている。ヒアルロン酸はまた、ナトリウム塩として入手することができ、乾燥された高純度物質である。ヒアルロン酸ナトリウムは、当業者に公知の種々の保存剤、例えば、非制限的にアルキル置換安息香酸エステル、アルコール、およびそれらの結合体、配合物、および混合物を用いて保存することができる。
【００３３】
「ヒアルロナン」の用語は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸の反復分子のポリマーを表わす。
【００３４】
「ＩＬ−１β」の用語は、Ｂ−細胞およびＴ−細胞の活性化を含む広範囲の免疫応答および炎症応答を媒介する免疫調節物質である、インターロイキン−１βを表わす。
【００３５】
「ＩＬ−６」の用語は、広く種々の細胞により産生される多機能サイトカインであるインターロイキン−６を表わす。ＩＬ−６は、免疫応答、急性期反応および造血の調節物質として機能する。
【００３６】
「イミノシクリトール」の用語は、糖のイミン類縁化合物を表わし、ヘキソサミジナーゼ阻害物質である。
【００３７】
「炎症性関節症」の用語は、消耗性で痛みのある疾病の全集団を表わし、時には、単純にリウマチ性疾病を表わす。種々の炎症性関節症の中で、骨関節炎（骨関節症とも呼ばれる）およびリウマチ性関節炎は最も一般的に知られている。他の認識されている形態の炎症性関節症としては、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、偽痛風、ライテル（Reiter）症候群、または結合組織疾病に引き続いて生じる関節炎がある。
【００３８】
「注射製剤」の用語は、溶解液または懸濁液として調製された無菌の注射用組成物を表わす。注射の前に液体媒質中に溶解または懸濁するのに適する固体形態で、調製しておくこともできる。製剤はまた、乳化させたり、活性成分を捕獲させたりすることもできる。注射製剤はまた、当業者に公知の種々の保存剤を含有させることができ、保存剤としては、非限定的に、アルキル置換安息香酸エステル、アルコール、そられの結合体、配合物または混合物がある。
【００３９】
「関節内」の用語は、医薬を関節に直接に送達する方法を表わす。医薬の伝統的送達経路、例えば経口、静脈内または筋肉内の投与は、医薬を関節に運ぶ滑液の管潅流に依存する。滑液毛細管から関節空隙への小型分子の滑液を経る輸送は一般に、受動的拡散によって生じることから、これは不充分であり、このような輸送は、標的分子の大きさが大きくなるほど効率的でなくなる。従って、分子、例えばＧＡを関節空隙へ伝達する方法は実質的に制限される。医薬の関節内注入によって、これらの制限が回避される。
【００４０】
「リポソーム」の用語は、例えばリン脂質を水中または水性媒質中に分散させた場合、自発的に形成される小胞を表わし、脂質頭部にある基と水との親水性相互作用および生体膜に類似する一重および多重ラメラ系（小胞）の生成によって生じる。一重ラメラリポソームの場合、二層構造が、内部の水の隔室と外部の大量の水とに面する極性端により中空球状形を形成する。数種の利用可能なリポソーム形成方法は当業者に公知である。一般に、多重ラメラ同心二層小胞は、脂質二層を水層が分離することによって形成される。この玉葱状構造は、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）と称される。小型一重ラメラ小胞（ＳＵＶ）は、適当な条件下にＭＬＶを音波処理するか、または透析することによって製造することができる。
【００４１】
リポソームは、安定性を付与するためにＣｈｏｌを用いて形成することができ、その他の材料、例えば中性脂質、および表面改質剤、例えば正または負に帯電した化合物を含有することができる。好適なリポソームは、小型の一重ラメラ−二層状球形シェルである。リポソームは、親油性医薬および親水性医薬の両方を封入することができる。適当な方法で製造すると、リポソームは医薬の放出期間を延長することができ、さらには、リン脂質に伴う毒性がない。種々の天然および合成のリン脂質が、リポソーム製造用に市販されている。当業者に公知な例としては、頭文字による記述で、非制限的に、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−Ｃｏｎ、ＤＳＰＧおよびＤＰＰＳがある。
【００４２】
「ミクロスフェア」の用語は、本発明の活性成分の捕獲または封入に用いられる重合担体を表わす。ミクロスフェアベースの製剤は、種々の活性成分／ポリマーの組合せの選択および組成に応じて、投薬の用量および時機を調整することができる。薬剤の総投与量および放出動態は、変化させることができ、調整可能である。例えば、コポリマー比およびコポリマー分子量を変えることによって、医薬送達パラメーターを最適化することができる。ミクロスフェアベースの系は、活性成分の寿命を長くすることもできる。製剤中にラクチド−グリコライドコポリマーを含有するミクロスフェアを使用すると、生体適応性および生体分解性などの特定の利点が得られる。ミクロスフェアは、例えば当業者に公知の方法に従い、加工処理、機械加工、粉砕、粉引きまたは押出し等により製造することができる。
【００４３】
「医薬の封入パーセント」の用語は、（１）リポソームの最終製剤中に封入されている活性成分の量、対（２）封入前の製剤の製造プロセスで使用される封入させる活性成分の総量の比を表わし、この比を１００倍まで増大させる。
【００４４】
「医薬上許容される」または「薬理学的に許容される」の用語は、適当に哺乳動物に投与された場合（例えば、医師または獣医師による）、有害な、アレルギー反応、またはその他の不都合な反応を生じさせないことを表わす。
【００４５】
「ポリマー担体」の用語は、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリ（乳酸／グリコール酸）とのコポリマー、ポリ（エチレングリコール−γ−（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）のコポリマー、アルギナートゲル、キトサンまたはそれらの医薬上許容される塩を表わす。
【００４６】
「ポリエチレングリコール」および「ＰＥＧ」の用語は、サブユニットＨＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨを含む水溶性ポリマーを表わす。ＰＥＧはアルキル基を末端に付けることができる。
【００４７】
「固形脂質ナノ粒子」の用語は、医薬送達用担体を表わす。固形脂質ナノ粒子は、脂質マトリックス中に医薬がある固溶体である。粒径は、典型的には１μｍ以下であり、この粒子はまた、典型的には単分散される。固形脂質ナノ粒子の製造方法は、有機溶媒の使用を回避でき、通常若しくは高圧のホモゲナイザーおよび個々に適当な賦形剤を使用する。固形脂質ナノ粒子は、脂質マトリックスによって、化学的に敏感な薬剤を安定化させることができる。制御放出系としての固形脂質ナノ粒子の使用は、活性成分の局所適用に特に適する。
【００４８】
「スポーツ損傷」の用語は、スポーツをしている間に受けたストレスまたは損傷に関連する、またはそれによって生じた痛みを伴うか、消耗性である症状のいずれかを表わす。
損傷、例えばスポーツ損傷の結果として関節炎が発症した場合、これは、一般的に「二次」骨関節炎と称される。スポーツ損傷の結果としての軟骨の分解は、外傷によって生じることがある。さらに、この用語には、軟骨損傷のある他の適応症、例えば他の損傷または変質性疾病の結果としての軟骨損傷を含む。
【００４９】
「持続放出」の用語は、医薬が利用されるように放出される時間、または医薬が生理学的取り込みにより利用可能になる時間を表わす。持続放出期間に先行する、医薬が殆ど又は全く放出されない誘導期間を設けてもよく、或いは持続放出期間を、一部の医薬を放出させる初期期間と、追加の医薬を放出させる二次期間とを含む２段階としてもよい。これに対して、「連続放出」の用語は、単に、単一段階と思われる放出プロファイルの説明に使用される用語であり、滑らかな曲線の放出期間プロファイルを有する。当業者には、この放出プロファイルが、指数関数的または対数的な時間放出プロファイルに実際に対応すると理解されよう。
【００５０】
「滑液」の用語は、関節、嚢および腱鞘に少量で見出される粘性で、通常麦藁色を呈する物質を表わす。滑液は、ヒアルロン酸、１００，０００−１０，０００，０００ダルトンの分子量範囲を有するポリサッカライドを含有する。ヒアルロン酸は、比較的非圧縮性であり、有意な量の水と置き換えることができ、また滑液を関節における優れた潤滑剤および衝撃吸収剤とすることを助長する性質を持つ。
【００５１】
「治療有効量」の用語は、所望の薬理学的効果を誘発させるのに必要な生物学的活性物質の量を表わす。この量は、特定の活性物質の効能、個人の年齢、体重および応答性、ならびに個人の症状の種類および重篤度に従い大きく変化し得る。従って、活性物質の量に上限または下限はない。本発明で用いられる治療有効量は、当業者により容易に決定することができる。
【００５２】
「ＴＮＦα」の用語は、ヒトリウマチ性関節炎の病因に関連するサイトカインである、腫瘍壊死因子を表わす。
【００５３】
製剤および方法
本発明は、ＧＡ−およびＧｌｃＮＡｃ−媒介抗炎症活性に関する。従って、ＧｌｃＮＡｃの軟骨保護特性および抗炎症特性の起源を決定するために設計された実験について、下記に詳細に説明する。これらの実験のある種のものは、２００１年３月２９日付けで出願された米国予備出願出願番号６０／２８０，３５１に記載されており、その全記載を引用してここに組入れる。
【００５４】
ＧｌｃＮＡｃが誘導性ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）の活性または対応するタンパク質の発現を抑制するかについて検証するために、ｉＮＯＳタンパク質（ウエスタンイムノブロットで）およびｉＮＯＳｍＲＮＡ（ノーザンブロットで）の両方の発現に対するＧｌｃＮＡｃの効果を分析した。ＧｌｃＮＡｃは、ｉＮＯＳｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を強力に抑制することが見出された。さらにまた、ＧＡおよびＧｌｃＮＡｃは、ＩＬ−１βにより引き起こされるＮＯ産生を抑制することが見出された。ＧＡおよびＧｌｃＮＡｃは、正常ヒト関節軟骨細胞におけるＩＬ−１βおよびＴＮＦα誘導性の窒素酸化物（ＮＯ）産生を抑制する。
【００５５】
見出された現象の糖特異性を分析するために、ＩＬ−１β誘導性のＮＯ産生に対するグルコース、グルクロン酸、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃおよびＧＡの効果を比較した。１０ｍＭの濃度で使用した場合、ＧｌｃＮＡｃおよびＮ−アセチルガラクトサミンのみについて、抑制活性が証明された。数種の別のモノサッカライド（グルコース、グルクロン酸およびＮ−アセチルマンノサミンを包含する）は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα誘導性の窒素酸化物（ＮＯ）産生を抑制しなかった。さらにまた、この分析に従い、ＧｌｃＮＡｃダイマーおよびトリマーを含むＧｌｃＮＡｃポリマーは、ＩＬ−１β誘導性のＮＯ産生に対して抑制活性を発現せず、またＮＯ産生に影響を与えなかった。
【００５６】
ＩＬ−１β誘導性のＮＯ産生において見出された抑制は、誘導性ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現に対する抑制に関連しないものと考えられる。さらに、ＧｌｃＮＡｃはまた、ＩＬ−１β誘導性のＣＯＸ−２およびＩＬ−６の産生を抑制する。ＩＬ−１βにより刺激された培養ヒト関節軟骨細胞におけるＣＯＸ−２発現に対するＧｌｃＮＡｃの効果を検証した。この実験の結果、ＧｌｃＮＡｃが、ＣＯＸ−２タンパク質（ウエスターン イムノブロットで測定した）、およびＣＯＸ−２ｍＲＮＡ（ノーザン ブロットで測定した）の発現を抑制することが実証された。ＣＯＸ−２とは対照的に、ＧｌｃＮＡｃは、構造的に発現されるＣＯＸ−１タンパク質の発現に影響を与えなかった。ＮＯおよびＣＯＸ−２に加えて、ＧｌｃＮＡｃはＩＬ−１βにより刺激された培養ヒト関節軟骨細胞におけるＩＬ−６産生を抑制した。この差違は、統計学的に有意であった（ｐ＜０．００１）。従って、ＧｌｃＮＡｃは、数種のＩＬ−１β誘導性の炎症産物を抑制するが、構造的に誘導される分子を抑制しない。
【００５７】
ＩＬ−１β誘導性のＮＯ、ＣＯＸ−２およびＩＬ−６の産生に対するＧｌｃＮＡｃが媒介する抑制が、ＮＦ−ｋＢ活性化の抑制に依存するかを証明するために、ＩＬ−１βで刺激し、次いでＧｌｃＮＡｃで処理した軟骨細胞と比較して、ＩＬ−１β単独で刺激した軟骨細胞におけるＮＦ−ｋＢの核輸送について検討した。この実験の結果は、ＧｌｃＮＡｃがＩＬ−１β誘導性のＮＦ−ｋＢの核輸送に影響を与えないことを示した。ヒト軟骨細胞のＩＬ−１β応答に対するＧｌｃＮＡｃが媒介する抑制は、ＭＡＰキナーゼ（ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８）の活性化の低減または転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化とは関連しなかった。
【００５８】
ＩＬ−１β経路における細胞内シグナル発信は、ＭＡＰキナーゼを含む数種のタンパク質キナーゼの活性化をもたらす（Ｇｅｎｇ等によるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２４２５：３０（１９９６））。ＧｌｃＮＡｃ残基は、アンカー部位としてセリン残基を利用するタンパク質Ｏ−グリコシル化の動的プロセスに関係する。従って、同一結合部位に対する競合によって、Ｏ−グリコシル残基はセリンホスホリル化効率を減少させることができ、その結果シグナル変換を阻害することができる。この潜在的なメカニズムを取り扱うために、ＩＬ−１βにより誘発される軟骨細胞におけるＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８）活性化に対するＧｌｃＮＡｃの効果を検証した。これらの実験の結果によって、ＧｌｃＮＡｃが、ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化を抑制しないことが証明された。
【００５９】
ＧｌｃＮＡｃは、ＩＬ−１βにより誘発される軟骨細胞における総ての応答を抑制しなかった。ＧｌｃＮＡｃは、例えば、ＩＬ−１βが媒介するヘキソサミナーゼ分泌の増加を抑制しなかった。さらにＧｌｃＮＡｃは、ＴＧＦα１の誘発において、ＩＬ−１βと相乗的に作用した。総じて、これらの知見は、ＧｌｃＮＡｃがサイトカイン誘導性の遺伝子発現、およびある種の前炎症メディエーターの産生を選択的に抑制することを示唆している。
【００６０】
これらの実験の結果は、ＧＡおよびＧｌｃＮＡｃが、ＮＯ産生を、ミリモルの小さな範囲において測定可能な程度で抑制することを示した。しかしながら、１ｍＭ以下の濃度では、効果的ではなかった。この濃度範囲は、培養したブタ糸球体間質細胞におけるＴＧＦα産生のＧＡ誘導アップレギュレーションにかかわる従来の開示と同様である（Ｋｏｌｍ−Ｌｉｔｔｙ等によるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１６０（１９９８））。高濃度のＧＡおよびＧｌｃＮＡｃによる良好な抗炎症活性は、グルコース輸送分子により細胞に侵入するための培地からのグルコースとこれらの糖との間の競合を反映することができる（Ｒａｕｃｈｍａｎ等によるＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１１１：２３１（１９９２））。アミノ糖の治療濃度は、ヒトにおいて、１，５００ｍｇ／日の許容される用量によるＧＡの経口投与とすることができ、現存する刊行物で用いられている濃度よりもかなり低い。従って、ＧｌｃＮＡｃおよびＧＡ活性の抗炎症メカニズムにかかわるインビトロデータは、ＯＡを患う患者におけるＧＡの治療効率の説明に直接に適用することができる。
【００６１】
等モル濃度で使用した場合、ＧＡに比較し、ＧｌｃＮＡｃはＮＯ産生をさらに強力に抑制することが証明された。ＧｌｃＮＡｃの最高抑制効果は、２０ｍＭの濃度で見出され、１ｍＭより低い濃度はＮＯ産生の抑制には不充分であった。ＧｌｃＮＡｃのＩＣ50は４．１±１．３ｍＭであり、ＧＡのＩＣ50は１４．９±２．１ｍＭであった（ｐ＜０．０１）。公知ＭＴＴ分析法により測定し、２０ｍＭまでの濃度では、ＧＡもＧｌｃＮＡｃも細胞生存に影響しなかった（Ｐａｒｋ等によるＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５８７５（１９８７））。
【００６２】
特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、ＩＬ−１β応答に対するＧｌｃＮＡｃの媒介による抑制に関する可能なメカニズムとしては、ＩＬ−１βシグナル発信カスケードにおけるホスホリル化のＮ−アセチルグルコサミンの媒介による抑制がある。ヘキソサミン経路の最終生成物の１種であるＵＤＰ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンは、アンカー部位としてセリンまたはスレオニン残基を利用するタンパク質Ｏ−グリコシル化の動的プロセスに関係することは証明されている（Ｈａｌｔｉｗａｎｇｅｒ等にＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３１：２３７（１９９７））。潜在的に、セリン残基のＯ−グリコシル化は、同一残基のホスホリル化と競合し、その結果として、細胞内シグナル変換カスケードを障害する（Ｃｈｏｕ等によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：４４１７（１９９５））。
【００６３】
この可能性を取り扱うために、ＩＬ−１βにより刺激される軟骨細胞におけるＮＦ−ｋＢの核輸送に対するＧｌｃＮＡｃの効果、並びにＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ、ＩＮＫおよびｐ３８）活性化に対するＧｌｃＮＡｃの効果を検証した。これらのＭＡＰキナーゼの活性化およびＮＦ−ｋＢの活性化は、ＩＬ−１βおよび関連サイトカインに対する軟骨細胞応答における中心的事象である。これらの実験結果は、測定可能な程度のＧｌｃＮＡｃが、ＩＬ−１β誘導性のＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８）の活性化またはＮＦ−ｋＢの核輸送を抑制しないことを明らかにした。
【００６４】
要すれば、本試験は、ＩＬ−１βによる刺激に対するヒト軟骨細胞の応答に関するＧＡおよびＧｌｃＮＡｃの効果を検証した最初の試験であり、ＧｌｃＮＡｃ媒介抗炎症活性の新規メカニズムを説明するものである。我々の試験の結果は、ＧＡ、および（より大きな程度で）ＧｌｃＮＡｃが、培養したヒト関節軟骨細胞におけるＩＬ−１β誘導性のＮＯ産生を抑制できることを明確に示した。グルコース、グルクロン酸およびＮ−アセチル−マンノサミンを含む数種の他のモノサッカライドがこの活性を示さないことから、ＮＯ産生に対する糖の効果は特異的である。さらにまた、ダイマーおよびトリマーを包含するＧｌｃＮＡｃポリマーはまた、ＮＯ産生に影響しないことが証明された。見出されたＩＬ−１β誘導性のＮＯ産生の抑制は、ｉＮＯＳタンパク質およびｍＲＮＡ発現の抑制の結果である。そのＮＯ抑制活性に加え、ＧｌｃＮＡｃはまた、ＩＬ−１β誘導性のＣＯＸ−２およびＩＬ−６の産生を抑制した。しかしながら、ＣＯＸ−１の発現はＧｌｃＮＡｃにより影響を受けなかった。
【００６５】
本発明の一態様において、ＯＡ（若しくは各種炎症性関節症）、スポーツ損傷、または軟骨分解のような治療を要する患者において、その治療方法が提供される。この方法は、治療有効量のＧｌｃＮＡｃを単独で、または少なくとも１種の別の抗炎症性医薬またはヘキソサミニダーゼ阻害剤と組合せて含有する組成物を患者に投与する段階を含み、このような抗炎症性医薬および阻害剤は当業界で公知である。
【００６６】
本発明のもう一つの態様は、関節内、局所または筋肉内投与に適する製剤を含む。好ましくは、この製剤を関節内に投与することが効率的である。
【００６７】
それに溶解または分散させる活性成分を含有する医薬組成物の調製は、処方によって制限する必要はない。このような組成物は、液状の溶解液または懸濁液として注射液として調製することができる。しかしながら、使用以前に、液体中に溶解または再懸濁するのに適する固体形態で調製することもできる。この製剤はまた、乳化させることもできる。
【００６８】
活性成分は医薬上で許容され、活性成分に適合する賦形剤と、本明細書に記載の治療方法に使用するのに適する量で混合することができる。適当な賦形剤は、例えば水、塩類溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびその組合せである。さらに、必要に応じて、組成物は少量の補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの活性成分の効果を増強する物質を含有することができる。
【００６９】
本発明の組成物は、その中の成分の医薬上許容される塩を含有することができる。医薬上許容される塩としては、例えば塩酸、リン酸、硫酸などの無機酸を用いて形成される酸付加塩、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される酸付加塩（いずれかの遊離アミノ基とにより形成される）がある。グルコグルカン中に存在する遊離カルボキシル基により形成される塩は、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄など、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−アミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される。特に好適な塩は、ＴＦＡおよびＨＣｌの塩である。
【００７０】
本発明のもう一つの態様は、活性成分、ＧｌｃＮＡｃの改良された製剤にある。リポソームまたはその他の捕獲剤中にＧｌｃＮＡｃを封入または捕獲すると、関節内に注入された場合、その薬理動態プロフィールが修正される。例えば、関節内に投与されたＧｌｃＮＡｃの水性溶液は、ラット膝関節から急速に移動する。これに対して、リポソーム内のＧｌｃＮＡｃ製剤は、本発明に従い関節内に投与された後、ラット膝関節に保持される。本発明のもう一つの態様において、ＧｌｃＮＡｃのリポソーム製剤は、哺乳動物においてブラジキニン誘導性の痛みに対し予想外の鎮痛効果を示した。リポソーム製剤を用いないＧｌｃＮＡｃそれ自体では、統計学的に有意性が認められない程の小さな鎮痛効果を示した。
【００７１】
本発明をまた、下記実施例によりさらに説明するが、本発明は、このような例に制限されないものと理解されるべきである。
【実施例】
【００７２】
（材料）
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｏｒａｎｇｅ ＣｏｕｎｔｙおよびＳａｎ Ａｎｔｏｎｉｏの剖検サービスおよび組織銀行から、正常な軟骨を得た。大腿関節丘および脛骨平坦部から、関節軟骨を採取した。全部の組織試料を、修正マンキンスケール（Ｍａｎｋｉｎ等によるＪ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．Ａｍ．５３：２３（１９７１））に従い等級分けし、またＯＡの形跡のない軟骨のみを、軟骨細胞供給源として使用した。死亡時点と実験室におけるこれらの膝関節からの軟骨採取時点との間の間隔は、少なくとも２４時間であり、最大でも９６時間までであった。軟骨削片を死後２４時間以内に組織銀行から入手し、組織培養培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）に入れ、次いで４℃において実験室に送った。この組織を採取後、２４時間以内に実験室で処理した。
【００７３】
ＧＡ、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、グルクロン酸およびＮ−アセチルマンノサミンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。Ｎ−アセチルグルコサミンダイマー（Ｎ，Ｎ´−ジアセチルキトビオース）およびＮ−アセチルグルコサミントリマー（Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−トリアセチルキトトリオース）は、ＴＲＣ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）から入手した。
製剤の試験に用いた装置および動物は市販されている以下の物を用いた：
循環水浴（Ｈｕｂｅｒ）、減圧ポンプ（Ｇａｓｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ ＤＯＡ−Ｐ１０４−ＢＮ）、多目的シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ＬＣＳ−６５００）、スピードバック(SpeedVac)濃縮器（Ｓａｖａｎｔ、Ｍｏｄｅｌ ＤＮＡ−２３０）。
ラット実験に使用されたウイスターラット（雄、２００−２５０ｇ）は、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）から得た。
【００７４】
（方法）
コラゲナーゼ消化により軟骨から軟骨細胞を単離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ中で連続単層培地に保持した。正常軟骨のコラゲナーゼ消化による軟骨細胞単離後の細胞生存率は、＞９５％であった。このレベルを、死亡後の少なくとも９６時間にわたり維持した。異化応答としてのＩＬ−１効果に関する試験は、窒素酸化物およびＩＬ−６放出を測定した場合、死亡と組織処理との間の経過時間の変化の関数として、明白な変化は示さなかった。報告された例は最初または第一継代細胞を用いて行った。
【００７５】
軟骨細胞を、１％ＦＢＳの存在下、９６−ウエルプレートにおいて４０，０００細胞／ウエルで培養した。４８時間後、培地を換え、次いで細胞を５ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１β(Sigma)により２４時間かけて刺激した。ＮＯ産生を、培地上清中に蓄積したＮＯ2を、他の箇所で記載されているようにグライス（Griess）反応により測定した（Ｈｅｖａｌ等によるＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３３：２５０（１９９４））。培養上清中のＩＬ−６を、供給業者の指示に従いＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）により測定した。
【００７６】
プレート上の細胞を氷冷溶解緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．６、１５８ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ロイペプチン１１１ｇ／ｍｌ、アプロチニン１μｇ／ｍｌ、および０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）により溶解させることによって上記のとおりに刺激された３ｘ１０６軟骨細胞から、全細胞のエキスを調製した。この緩衝液は使用の直前に添加した。この細胞溶解物を、エッペンドルフ管に移し、次いで４℃において３０分間にわたり２０，０００ｇで遠心処理した。この上清を新しい管に移し、次いでそのタンパク質濃度を、ブラッドフォード（Bradford）分析法により測定した。同量のタンパク質を１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、次いでエレクトロブロッキングによりニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）に移した。
【００７７】
このフィルターを、５％ミルク粉末／ＴＢＳ−Ｔ中で一夜にわたりブロックし、次いで下記抗体の１種とともに、２時間にわたりさらにインキュベートした：
抗−ｉＮＯＳ（Ｃ−１９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、抗−ＣＯＸ−２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）、抗−ＣＯＸ−１（Ｈ−３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、抗−ホスホ−ＪＮＫ（ｐｈｏｓｐｈｏＴｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、抗−ホスホ−ｐ３８ＭＡＰ（ｐｈｏｓｐｈｏＴｈｒ８０／Ｔｙｒ１８２、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）または抗−ホスホ−ＥＲＫ（ｐｈｏｓｐｈｏＴｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）。
膜はＴＢＳ−Ｔにより３回洗浄し、次いで５％ミルク粉末／ＴＢＳ−Ｔ中の対応するホーシュラディッシュペルオキシダーゼ標識した第二抗体とともにインキュベートし、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＩＬ）を用いて顕出させた。
【００７８】
総ＲＮＡを、ＳＴＡＴ−６０試薬（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）を用いて刺激された２ｘ１０6軟骨細胞から単離した。各試料のＲＮＡを光度計により定量し、その５μｇを、１．２％アガロース、６％ホルムアルデヒドゲルで分離した。電気泳動後、このゲルの写真をとり、次いでＲＮＡを、毛細管ブロッティングによりハイボンドＮナイロン膜（ＢＲＬ、Ｂａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ、ＭＤ）上に移した。これらの膜を空気乾燥させ、次いで８０℃で２時間にわたりインキュベートした。５ｘＳＣＣ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＳＤＳおよび５ｘデンハルト溶液中で６０℃において２時間にわたり、予備ハイブリッドダイゼーションを行った。
【００７９】
放射性標識したプローブを添加し、次いで６０℃において一夜にわたりハイブリッド形成を行った。ハイブリッド形成後、フィルターを２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回すすぎ、６０℃において２ｘＳＣＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回洗浄し、次いで６０℃において０．２ｘＳＣＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回洗浄した。これらの膜をプラスティックラップで覆い、次いで−７０℃において１２時間にわたり強化スクリーンを用いて露光した。このハイブリッド形成に使用されたプローブは、従来開示されたとおりに調製した（Ｇｅｎｇ等によるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６６９２（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ等によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：３４９１（１９９３））。
【００８０】
核タンパク質エキスは下記のとおりに調製した。
即ち、２ｘ１０6軟骨細胞を指示に従い刺激した。細胞はトリプシン処理により採取し、氷冷ＰＢＳにより１回洗浄し、次いで２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、ロイペプチン１μｇ／ｍｌおよびアプロニチン１μｇ／ｍｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で溶解させた。核を遠沈し、２５％グリセロール、４２０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、ロイペプチン１μｇ／ｍｌおよびアプロニチン１μｇ／ｍｌを含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）中に再懸濁し、次いで４℃で３０分間にわたり遠心した。
【００８１】
遠心分離により核残さを除去した後、溶解物のタンパク質濃度をブラッドフォード分析法により測定した。等量の核エキス（２μｇ）を、１０％グリセロール、４２０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴおよび０．５ｍＭ ＰＭＳＦを含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）中で室温において１５分間にわたり、ポリ−（ｄｌ−ｄＣ）ポリ−（ｄＩ−ｄＣ）（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、１ｘ１０5カウントのＮＦ−ｋＢ共通ＤＮＡ結合部位を有する二本鎖放性射標識したオリゴデオキシヌクレオチド（配列：５´−ＧＡＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＧＣ−３´）とともにインキュベートした。
【００８２】
競合試験のために、放射性標識したＮＦ−ｋＢを添加する１０分前に、Ｏｃｔ−１共通配列を有する無標識ＮＦ−ｋＢオリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチドを、結合反応物に対して１００倍モル過剰に添加した。結合反応物を、６％ＴＧＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３８０ｍＭグリシン、２ｍＭ ＥＤＴＡ）天然ポリアクリルアミドゲル上に塗布し、次いで４℃で２時間にわたり電気泳動に付した。このゲルを次いで、乾燥させ、次いで−８０℃において１６〜４８時間にわたり強化スクリーンを用いて露光した。発生したデータの統計学的分析を、ウインドーズ（Windows（登録商標））用ＳｔａｔＭｏｓｔ３２プログラム（Ｄａｔａｘｉｏｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を用いて行った。
【００８３】
下記のリン脂質およびリン脂質結合体が市販されている（市販名を示し、次いでカッコ内に、販売元および製品番号、並びに頭文字を示す。）：
ジステアロイルＬ−α−ホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ Ｐ６５１７、ＤＳＰＣ）、ジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−エタノールアミン（Ｓｉｇｍａ Ｐ３５３１、ＤＳＰＥ）、メトキシポリエチレングリコールと結合したジステアロイルＬ−α−ホスファチジルエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ Ｐ７８４０、ＤＳＰＥ−Ｃｏｎ）、ジステアロイルＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール（Ｓｉｇｍａ Ｐ９５２４、ＤＳＰＧ）、ジパルミトイル−Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（Ｓｉｇｍａ Ｐ１１８５、ＤＰＰＳ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ Ｃ８６６７、Ｃｈｏｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ Ａ８６２５、ＧｌｃＮＡｃ）。
【００８４】
トリチウム化Ｎ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−［１−3Ｈ］グルコサミンは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した（Ｃｏｄｅ ＴＲＫ３７６、比活性：１８．６ｍＣｉ／ｍｇ、放射化学純度：９７．４％）。溶媒および試薬、クロロホルム（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−２４３２）、メタノール（Ｍｅｒｃｋ、ＨＰＬＣ品質）、ＮＣＳ−ＩＩ組織溶解剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃｏｄｅ ＮＮＣＳ５０２）、シンチレーシヨンカクテル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃｏｄｅ ＢＣＳ−ＮＡ）は、別段の記載がないかぎり、入手したままで使用した。
【００８５】
（実施例１）
リポソームにより捕獲されているＧｌｃＮＡｃの調製
３３μｍｏｌ ＤＳＰＣおよび３３μｍｏｌ Ｃｈｏｌ（または別の組成物、下記表１参照）を、１００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中のクロロホルム：メタノール（９５：５、容積／容積）溶液３ｍｌに溶解した。有機溶媒を室温において減圧（６００ｍｍＨｇ）で蒸発させた。溶媒の目に見える最後の痕跡を除去した後、少なくともさらに３０分間、減圧を継続した。
【００８６】
０．８５％塩化ナトリウム溶液中のＧｌｃＮＡｃ ２ｍｌ（全部で１０μＣｉの標識ＧｌｃＮＡｃおよび５．３８ｇの無標識ＧｌｃＮＡｃを、最終的に無標識分子対標識分子の比：１０，０００対１で含有する）をフラスコに加えた。このフラスコを６０℃（その他の組成物用の温度は表１に記載されている）の水浴中で５分間、放置し、次いで乾燥脂質を２，５００ｒｐｍにおける１分間の激しい撹拌により懸濁した。リポソームを同一温度で４５分間にわたり放置して、アニーリングした。調製されたリポソームをピペットにより、４本の１．５ｍｌエッペンドルフ管に入れた。リポソームは、スピードバック濃縮器で４５℃において４−５時間かけて減圧下に乾燥させた。
【００８７】
各エッペンドルフ管内の乾燥リポソームに、蒸留水５０μｌを添加した。これらのエッペンドルフ管を６０℃（その他の組成物用の温度は表１に示されている）の水浴中で５分間にわたり放置した。次いで、これらのリポソームを、２，５００ｒｐｍで１分間にわたり遠心することによって懸濁させた。この懸濁液を、室温で４５分間にわたり放置した。
【００８８】
封入されていないＧｌｃＮＡｃを、リポソームから分離し、次いで０．８５％ＮａＣｌ １ｍｌで稀釈した後、２０，０００ｇで１５分間にわたり遠心分離することによってリポソーム中に封入した。同一処理を、０．８５％ＮａＣｌ １ｍｌによりさらに２回反復し、無標識材料を分離した。
【００８９】
この方法に従い、下記リポソーム組成物を調製した：
（１）ＤＳＰＣおよびＣｈｏｌを５：５のモル比で含有する二成分混合物；
（２）ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＤＳＰＥを５：５：１のモル比で含有する三成分混合物；
（３）ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＤＳＰＥ−Ｃｏｎを５：５：１のモル比で含有する三成分混合物；
（４）ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＤＳＰＧを５：５：１のモル比で含有する三成分混合物；および
（５）ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＤＰＰＳを５：５：１のモル比で含有する三成分混合物。
【００９０】
各リポソーム組成物および対応する上清中の［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの量を、液体シンチレーションカウンターにより測定した。簡単に述べると、リポソーム溶液または懸濁液１０μｌを、組織安定剤０．５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＮＣＳ−ＩＩ）中に溶解し、次いで氷酢酸１５μｌと混合して可能なバックグラウンド化学発光を排除した。この溶液または懸濁液を、シンチレーションカクテル４．５ｍｌ（ＢＣＳ−ＮＡ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）と混合した。このリポソームペレット中の放射能を、各リポソーム製剤にかかわる封入効率の計算に使用した。
【００９１】
各種リポソーム製剤のＧｌｃＮＡｃの封入効率を表１に示す。収率は、リポソームまたはそれらの二層に組込まれ、充填され、会合され、結合され、或いは付着された化合物の量を意味する。一般に、収率は、出発量の％として表わされる。表１に示されているように、リポソーム中へのＧｌｃＮＡｃ封入効率は、一致する。表１中の収率値は、封入パーセント（収率）値を表わす。その他の数値（より高いまたはより低い）は、本発明の精神から逸脱することなく、使用される脂質の種類および量に従い得ることができる。
【００９２】
【表１】
2005500991.tif 000002
【００９３】
製造方法は全て無菌状態で行った。製造されたリポソームの無菌性は、細菌培養プレートを用いて検査した。リポソーム５μｌを寒天プレート上に接種し、次いで３５℃で３日間、培養した。別のリポソーム５μｌをＭＨＡ寒天プレート上に接種し、次いで室温において３日間にわたり培養した。これら全てにおいて如何なる生物の成長も示さなかった。
【００９４】
（実施例２）
リポソームからのＧｌｃＮＡｃのインビトロ放出
上記のとおりに製造されたリポソームに封入されたＧｌｃＮＡｃ１００μｌを、５０ｍｌ遠心管内の０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３ｍｌに溶解した。これらのリポソームを振盪インキュベーターにおいて６０ｒｐｍおよび３７℃でインキュベートした。相違する時点で、リポソームを２０，０００ｒｐｍで１５分間かけて遠心分離することによって分離した。上清中に放出されたＧｌｃＮＡｃ（3Ｈ活性）を、液体シンチレーションカウンターにより測定した。リポソームペレットを新鮮なＰＢＳ ３ｍｌに再懸濁し、同一条件でインキュベートした。各種タイプのリポソームについて、経過時間の関数として［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの放出パーセントを図１にグラフとして示す。
【００９５】
図１は、種々のリポソーム製剤中に捕獲された［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）の存在下におけるインビトロ放出にかかわる動的プロファイルを示している。リポソームから放出された［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの量を、上清で測定し、放出された初期捕獲化合物のパーセンテージを計算した。
【００９６】
図１は、［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの放出速度が、使用されたリポソームのタイプにより変化することを明らかにしている。これらの実験において、ＤＳＰＥを用いたリポソーム製剤は迅速な初期放出速度に続き、後続期間の放出速度は緩められることを特徴とするものである。ポリエチレングリコールに結合させたＤＳＰＥを組み込んだ類似の製剤は、格別に相違する様相を示し、ＰＥＧ結合を欠く製剤と同一経過時点で、薬剤の放出について有意な遅延を示す。ＤＳＰＣ含有リポソームは、緩慢でほとんど一定の放出速度を示した。別種の製剤はＤＳＰＥおよびＤＳＰＣの製剤の中間にあるようであった。
【００９７】
炎症性関節炎およびＯＡ患者からのヒト滑液において、インビトロ放出試験も行った。本明細書に記載のとおりに製造したリポソーム１０μｌをヒト滑液９０μｌと混合した。これらを振盪インキュベーターにおいて６０ｒｐｍおよび３７℃でインキュベートした。相違する経過時点で、正常食塩水３００μｌを添加し、次いで２０，０００Ｇで１５分間かけて遠心処理することによって、これらのリポソームを分離した。この上清を液体シンチレーションカクテル４ｍｌ中に添加し、次いで液体シンチレーションカウンターにより、放出されたＧｌｃＮＡｃ（3Ｈ活性）を測定した。これらのリポソームペレットを同一患者からのヒト滑液９０μｌ中に再懸濁し、次いで上記と同一の条件下にインキュベートした。各種リポソームについて滑液の存在下における経過時間の関数としての［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの放出パーセントを図２にグラフで示す。
【００９８】
図２は、相違するリポソーム製剤に捕獲されている［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃについて、３人のリウマチ性関節炎（ＲＡ）患者からの滑液中へのインビトロ放出にかかわる動的プロファイルを示している。リポソームから放出された［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの量を上清中で測定し、次いで放出された初期捕獲化合物のパーセンテージとして計算した。図２において、各点は平均標準偏差（±ＳＤ）として示されている（ｎ＝４）。
【００９９】
図３は、相違するリポソーム製剤に捕獲されている［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃについて、３人のリウマチ性関節炎（ＲＡ）患者からの滑液中へのインビトロ放出にかかわる動的プロファイルを示している。リポソームから放出された［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの量を上清中で測定し、次いで放出された初期捕獲化合物のパーセンテージとして計算した。図３において、誤差棒印は３つのデータ点の平均標準偏差値（ＳＤ）を表わす。
【０１００】
ＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１）またはＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ（５：５：１）をベースとする種々のリポソーム製剤は、関節内投与後、膝関節においてＧｌｃＮＡｃ保持期間を延長させた。
【０１０１】
（実施例３）
関節内投与後のＧｌｃＮＡｃのインビボでの保持
ＧｌｃＮＡｃ溶液５０μｌ（無標識２．６９ｍｇ／ｍｌ、標識付き５μＣｉ／ｍｌ、無標識分子：標識付き分子 １０，０００：１）を６匹のラットの膝関節中に注入した。これらのラット（動物２匹／経過時点）を、ＧｌｃＮＡｃ溶液投与後の０分、３０分および２時間の時点で処理に供した。２匹の別のラットには、陰性対照として正常食塩水を注入した。全部の関節を取り出し、正常食塩水５ｍｌとともに１６，０００ｒｐｍで約３０秒間かけてホモジネートした。この組織ホモジネート１００μｌを組織溶解剤５００μｌに添加した。この溶液を５０℃で１６時間にわたりインキュベートし、氷酢酸３０μｌおよび液体シンチレーションカクテル５ｍｌと混合した。［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ活性を、液体シンチレーションカウンターにより測定した。
【０１０２】
各リポソーム製剤について、１４匹のラットを使用した。リポソーム５０μｌ（本実施例に記載のとおりに製造した；１．１３μＣｉ／ｍｌ、ＧｌｃＮＡｃ濃度０．６１ｍｇ／ｍｌ、無標識分子：標識付き分子 １０，０００：１）を、１２匹のラットの各膝関節に注入した。別の２匹のラットには、陰性対照として正常食塩水５０μｌを注入した。ＧｌｃＮＡｃ投与後の０日、１日、３日、７日、１４日、２１日および２８日に相当する時点で、動物（２匹のラット／経過時点）を処理に供した。膝関節を取り出し、次いで［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ活性を、本実施例に記載のとおりに測定した。図４に示されているこの試験の結果は、関節内半減期の甚大な延長を証明している。
【０１０３】
図４は、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝５：５を含有するリポソーム製剤中に捕獲されたＧｌｃＮＡｃ（実線）または正常食塩水（点線）を、関節内に単独投与した後のラット膝関節におけるＧｌｃＮＡｃの保有にかかわる動的プロファイルを示している。各点は平均値±ＳＤとして示されている（ｎ＝４）。ラット膝関節内におけるＧｃｌＮＡｃ塩溶液の半減期は、非常に迅速であり（４．１分）、またその線は図４における横座標に非常に近接している。ラット関節における脂質製剤化されたＧｌｃＮＡｃの半減期は、１７３時間であった。製剤化しない場合、ＧｌｃＮＡｃは、ＧｌｃＮＡｃ関節内投与後、ラット関節から急速に移動した。
【０１０４】
図５は、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ＝５：５：１を含有するリポソーム製剤中に捕獲されたＧｌｃＮＡｃを関節内に単独投与した後のラット膝関節におけるＧｌｃＮＡｃの保持にかかわる動的プロファイルを示している。各点は平均値±ＳＤとして示されている（ｎ＝４）。このリポソームについて、２つの異なる放出段階に対応する二段階放出曲線が認められた。このリポソーム製剤からのラット関節内に放出されたＧｃｌＮＡｃの半減期計算値は、それぞれ４．８時間および１２８時間であった。
【０１０５】
（実施例４）
関節内投与後のＧｌｃＮＡｃの鎮痛効果
この試験の目的は、ウイスターラットの関節に関節内投与されたリポソーム製剤化されているＧｌｃＮＡｃまたはリポソーム製剤化されていないＧｌｃＮＡｃの鎮痛効果を検討することにあった。痛みは、ブラジキニンの関節内投与によって誘発させた。体重２２０ｇ〜２５０ｇ範囲の成熟雄ウイスターラットを、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅから入手した。ブラジキニンおよびＧｌｃＮＡｃは、Ｓｉｇｍａから入手した。リポソームは上記のとおりに製造した。
【０１０６】
ＧｌｃＮＡｃ溶液またはＧｌｃＮＡｃ製剤化リポソーム懸濁液５０μｌを、ラット関節空隙に注入した。対照として、等量の食塩水を関節内に投与した。ブラジキニン５０μｌ（６０μｌ／ｍｌまたは指示濃度）を、ＧｌｃＮＡｃ投与後の種々の経過時点で関節内に投与した。
【０１０７】
ブラジキニンの関節内注入により生じる歩行挙動の変化を使用し、ラットにおいて誘発された痛みの基準を定義した。痛み応答の観察に用いられた方法は、表２に示されている。痛みの程度は、表３の基準に従うスコアで決定した。
【０１０８】
【表２】
2005500991.tif 000003
【０１０９】
【表３】
2005500991.tif 000004
【０１１０】
図６は、本明細書に記載のとおりに関節内投与した後のラットにおけるブラジキニンの用量応答を示している。より大きい痛みスコアは、注入されたブラジキニンの量と関連する。
【０１１１】
図７は、食塩水またはリポソーム製剤中に捕獲されたＧｌｃＮＡｃの鎮痛効果を示している。ＧｌｃＮＡｃは、脂質組成物ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ（５：５：１）を用いてリポソームに製剤化した。ＧｌｃＮＡｃのリポソーム製剤はより低い痛みスコアを示し、これはウイスターラットにおけるブラジキニン誘導性の痛みに対する鎮痛効果を示している。製剤化されていないＧｌｃＮＡｃそれ自体の鎮痛効果は低かったものの、統計学的に有意の鎮痛効果を示した。
【０１１２】
本発明の種々の修正および変更は、添付特許請求の範囲に定義されている本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者にとって明白であると見なされる。一例として、特許請求の範囲に記載のいずれかの方法に示されている段階は、これらが説明されている順序で行う必要は必ずしもない。当業者はこれらが説明されている順序から当該段階の実行における変更を認識できるものと見なされる。一例として、或る態様において、これらの段階は同時的に行うことができる。添付特許請求の範囲は、これらの精神的原則から構成されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】本発明の一態様による種々のリポソーム製剤に捕獲されている［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの時間依存性放出を示す。
【図２】種々のリポソーム製剤中に捕獲されている［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの３人のリウマチ性関節炎（ＲＡ）患者からの滑液中への時間依存性放出を示す。
【図３】種々のリポソーム製剤中に捕獲されている［3Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの３人の骨関節炎（ＯＡ）患者からの滑液中への時間依存性放出を示す。
【図４】ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌを含有するリポソーム製剤中に捕獲されているＧｌｃＮＡｃの一回の関節内投与に比較した、正常食塩水中のＧｌｃＮＡｃの一回の関節内投与後（対照）のラット膝関節内におけるＧｌｃＮＡｃの時間依存性保有を示す。
【図５】ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥを含有するリポソーム製剤中に捕獲されているＧｌｃＮＡｃを一回、関節内投与した後のラット膝関節内におけるＧｌｃＮＡｃの時間依存性保有を示す。
【図６】関節内に投与されたブラジキニンの関数として、ラットにおける痛み応答（本明細書に定義されている痛みスコアに基づく）を示す。
【図７】食塩水中のＧｌｃＮＡｃおよび食塩水に比較した、ＤＳＰＥ含有リポソーム製剤として関節内（ＩＡ）投与した場合のＧｌｃＮＡｃの鎮痛効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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