(57)【要約】ゲノムに霊長類Ｂ１ブラジキニン受容体導入遺伝子を組込んだトランスジェニックラットを作製する。前記トランスジェニックラットでＢ１ブラジキニン受容体遺伝子を発現させると、前記受容体の霊長類形態（例えば、ヒト形態）に対して選択的であるが前記受容体のラット形態に対しては選択的でない化合物が結合する。よって、トランスジェニック系統内の発現導入遺伝子は野生型霊長類Ｂ１ブラジキニン受容体のアンタゴニスト及びアンゴニスト選択性を模倣する。前記トランスジェニック動物は、ヒトまたは近縁種由来のＢ１ブラジキニン受容体のモジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルとして有用であり、前記Ｂ１ブラジキニンモジュレーターの薬力学的特性を評価するための動物モデルシステムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化Ｂ１ブラジキニン受容体占有率または結合プロフィールを示すようにゲノムに霊長類ブラジキニンＢ１受容体遺伝子またはその機能的均等物をコードする導入遺伝子の少なくとも１つのコピーが組込まれていることを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
非ヒトトランスジェニック動物がラット、マウス、ウシ、ブタ、家兎、モルモット、ヒツジ、ハムスター及びヤギからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
非ヒトトランスジェニック動物がラット及びマウスからなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
導入遺伝子が霊長類ブラジキニンＢ１受容体遺伝子を発現させる異種プロモーターに作動的に連結していることを特徴とする請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
非ヒトトランスジェニック動物がラット、マウス、ウシ、ブタ、家兎、モルモット、ヒツジ、ハムスター及びヤギからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
非ヒトトランスジェニック動物がラット及びマウスからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであることを特徴とする請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
ヒト化Ｂ１ブラジキニン受容体占有率または結合プロフィールを示すようにゲノムに霊長類ブラジキニンＢ１受容体遺伝子またはその機能的均等物をコードする導入遺伝子の少なくとも１つのコピーが組込まれていることを特徴とするトランスジェニックラット。
【請求項９】
導入遺伝子が異種プロモーターから発現することを特徴とする請求項８に記載のトランスジェニックラット。
【請求項１０】
異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであることを特徴とする請求項９に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１】
導入遺伝子が更にトランスジェニックラット内で検出可能なレベルで発現するリポーター遺伝子を含むジスシストロン導入遺伝子であることを特徴とする請求項１０に記載のトランスジェニックラット。
【請求項１２】
導入遺伝子が異種プロモーターから発現することを特徴とする請求項１１に記載のトランスジェニックラット。
【請求項１３】
異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであることを特徴とする請求項１２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１４】
ヒト化Ｂ１ブラジキニン受容体占有率または結合プロフィールを示すようにゲノムにヒトブラジキニンＢ１受容体遺伝子またはその機能的均等物をコードする導入遺伝子の少なくとも１つのコピーが組込まれていることを特徴とするトランスジェニックラット。
【請求項１５】
導入遺伝子が異種プロモーターから発現することを特徴とする請求項１４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであることを特徴とする請求項１５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
導入遺伝子がＮＳＥ＿ＣＭＶイントロンＡ＿ｈＢ１  ｃｄｓ＿ＢＧＨポリＡであることを特徴とする請求項１６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
導入遺伝子がＣＭＶ＿ＣＭＶイントロンＡ＿ｈＢ１  ｃｄｓ＿ＩＲＥＳ２＿ＬａｃＺ＿ＢＧＨポリＡであることを特徴とする請求項１６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
導入遺伝子がＴｈｙｌ＿ｈＢｌ  ｃｄｓ＿ＩＲＥＳ２＿ＬａｃＺ＿ＢＧＨポリＡであることを特徴とする請求項１６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
霊長類ブラジキニン受容体タンパク質及び試験化合物の受容体占有率のエキソビボ測定方法であって、
ａ）その動物組織内で内在性天然Ｂ１ブラジキニン遺伝子の発現よりも実質的に高いレベルで非天然霊長類Ｂ１ブラジキニン受容体を発現する非天然霊長類Ｂ１ブラジキニン遺伝子の少なくとも１つのコピーが安定的に組込まれてなる非ヒトトランスジェニック動物に試験化合物を投与するステップ、
ｂ）ステップａ）のトランスジェニック動物から組織サンプルを摘出するステップ、
ｃ）ステップｂ）の組織サンプルを分析することにより霊長類Ｂ１ブラジキニン受容体への試験化合物の総結合、特異的結合及び非特異的結合を測定するステップ、
ｄ）ステップａ）のトランスジェニック動物内での試験化合物の受容体占有率を計算するステップ
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２１】
ステップｃ）の総結合、特異的結合及び非特異的結合はオートラジオグラフィーまたは組織ホモジネートベースの結合アッセイにより測定することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
非天然霊長類Ｂ１ブラジキニン遺伝子がヒトＢ１ブラジキニン遺伝子であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
非天然霊長類Ｂ１ブラジキニン遺伝子が異種プロモーターに作動的に結合していることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
非ヒトトランスジェニック動物がラット及びマウスからなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
非ヒトトランスジェニック動物がトランスジェニックラットであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
非天然霊長類Ｂ１ブラジキニン遺伝子が異種プロモーターに作動的に連結しており、更に非ヒトトランスジェニック動物がラット及びマウスからなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
非ヒトトランスジェニック動物がトランスジェニックラットであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能的Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質、好ましくは哺乳動物Ｂ１ブラジキニン受容体タンパク質、特に機能的非ヒト霊長類またはヒトＢ１ブラジキニン受容体タンパク質を発現するトランスジェニックげっ歯類に関する。本明細書では、異種プロモーターの制御下でヒトＢ１ブラジキニン受容体タンパク質のオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡ配列をげっ歯類ゲノムにランダムに組込んだトランスジェニックげっ歯類の作製を例示しているが、これに限定されない。本発明はまた、非ヒト霊長類またはヒトＢ１ブラジキニン受容体タンパク質の機能的修飾を発現するトランスジェニックげっ歯類に関し、前記修飾にはアミノ酸欠失、付加、置換、ＮＨ２−またはＣＯＯＨ−末端切断、スプライス変異、及びタンパク質にヒトＢ１ブラジキニン様活性を与えるものが含まれるが、これらに限定されない。前記トランスジェニック系統内の発現導入遺伝子は野生型Ｂ１ブラジキニン受容体のアンタゴニスト及びアンゴニスト選択性を模倣する。従って、本発明のトランスジェニック動物は、Ｂ１ブラジキニン受容体（例えば、ヒトＢ１ブラジキニン受容体）のモジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルとして有用であり、受容体活性のアンタゴニストまたはアゴニストのようなＢ１ブラジキニンモジュレーター（例えば、ヒトＢ１ブラジキニンモジュレーター）の薬力学的特性を評価するための動物モデルシステムを提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄｒａｙ及びＰｅｒｋｉｎｓ（ＴＩＮＳ，１６：９９−１０４（１９９３））やＰｒｏｕｄ及びＫａｐｌａｎ（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：４９−８３（１９８８））は、薬理学的特性に基づいて２つの哺乳動物ブラジキニン受容体サブタイプＢ１及びＢ２を定義している。ノナペプチドブラジキニン（ＢＫ）及びデカペプチドＬｙｓ−ＢＫ（カリジン）はカリクレインのタンパク質分解作用により大型タンパク質前駆体キニノーゲンから遊離する。ＢＫ及びカリジンはいずれもＢ２受容体を活性化する。これらのＢ２受容体アゴニストは、カルボキシペプチダーゼにより分解してＢ１受容体アゴニストの脱−Ａｒｇ９ＢＫ及び脱−Ａｒｇ１０カリジンを生じたり、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）により分解して不活性ペプチドを生ずる。ＢＫ及びカリジンはＢ２ブラジキニン受容体サブタイプで等能力アゴニストとして作用する。対照的に、ＢＫはＢ１ブラジキニン受容体サブタイプで全体的に不活性である。脱−Ａｒｇ１０，Ｌｅｕ９［カリジン］（ここでは、“ＤＡＬＫ”）はカリジンに類似の構造を有するペプチドアンタゴニストである。
【０００３】
Ｂ２及びＢ１ブラジキニン受容体はＧタンパク質結合性受容体のスーパーファミリーのメンバーである。多数の哺乳動物Ｂ１及びＢ２受容体遺伝子が単離され、特性決定されている。例えば、
ヒトＢ１ブラジキニン（いずれも１９９８年１月２８日及び１９９９年１０月１２日付けでＭｅｎｋｅらに付与された米国特許第５，７１２，１１１号明細書及び同第５，９６５，３６７号明細書、及びＭｅｎｋｅら，Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２１５８３−２１５８６（１９９４））；
家兎Ｂ１ブラジキニン（ＭａｃＮｅｉｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２３−２２８（１９９５））；
マウスＢ１ブラジキニン（Ｈｅｓｓら，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３３：１−８（１９９６））；
ラットＢ２ブラジキニン（ＭｃＥａｃｈｅｒｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：７７２４−７７２８（１９９１））；
ヒトＢ２ブラジキニン（Ｈｅｓｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８４：２６０−２６８（１９９２））；
ラットＢ１ブラジキニン（Ｊｏｎｅｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３７４（３）：４２３−４３３（１９９９））。
【０００４】
Ｈｅｓｓら（Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３３：１−８（１９９６））は、Ｂ１受容体アゴニストの選択性はマウス、ヒト及び家兎Ｂ１受容体を比較したとき種特異性であることを示している。
【０００５】
Ｂｏｃｋ及びＬｏｎｇｍｏｒｅ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４（４）：４０１−４０７（２０００））は、最新の公知のＢ１及び／またはＢ２ブラジキニン受容体活性モジュレーターを記載している。著者らが検討しているように、正常組織ではＢ１受容体ではなくＢ２受容体が発現していることは科学界で広く認められている。対照的に、炎症、疼痛、組織損傷を招く生物学的プロセスは急速にＢ１受容体活性及び細菌感染を誘発する可能性がある。病的状態でのＢ１受容体の見かけ誘導能により、Ｂ１受容体アンタゴニストを消炎／鎮痛剤として使用する治療機会が与えられ得、よってＢ１受容体を魅力的な薬物標的とし得る。
【０００６】
このために、Ｂ１ブラジキニン受容体モジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルとして使用するためのトランスジェニックラットモデルのような動物モデル、及びヒトＢ１ブラジキニン受容体に対する特異性に対する潜在的モジュレーターの薬力学的特性を評価するための動物モデルシステムを提供することが依然として要望されている。本発明はヒトＢ１ブラジキニン受容体タンパク質を発現する各種トランスジェニックげっ歯類を開示することにより継続中の要望を満たす。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、非天然哺乳動物Ｂ１ブラジキニン受容体の機能的形態をコードする１つ以上の導入遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞及び／または体細胞に安定的に組込んだ非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物（この中には非限定的に創始動物が含まれる）及び／または非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。好ましい非ヒトトランスジェニック細胞はげっ歯類細胞であり、げっ歯類ゲノムに安定的に組込むための好ましい非天然Ｂ１ブラジキニン受容体遺伝子は霊長類Ｂ１ブラジキニン受容体遺伝子である。
【０００８】
本発明の具体例では、非ヒトトランスジェニック動物細胞及び胚はその後トランスジェニックラットを生ずるラットの細胞及び胚であり、前記トランスジェニックラットには、初期創始動物、同腹子、及び後続のヒトＢ１ブラジキニン受容体の機能的形態を発現する安定なトランスジェニック系統のメンバーからなる動物が含まれる。前記トランスジェニック動物は修飾動物がヒトＢ１ブラジキニン受容体の薬理学的特性を有する機能的タンパク質を発現するような遺伝子修飾、すなわちトランスジェニック動物（本明細書では、トランスジェニックラットを例とする）の脳から作成した膜が非トランスジェニック動物とは異なる薬理学的特性を有するような遺伝子修飾を含む。
【０００９】
好ましくは、本発明は、ヒトＢ１ブラジキニン受容体の機能的形態をコードする導入遺伝子の少なくとも１つを標的動物の生殖細胞及び／または体細胞に安定的に組込んだ動物細胞に関する。更に、本発明は、ヒトＢ１ブラジキニン受容体の機能的形態をコードする導入遺伝子の少なくとも１つを含む非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック創始動物、同腹子及び他のトランスジェニック動物に関する。トランスジェニック動物細胞、動物及び同腹子は天然（野生型）Ｂ１ブラジキニン受容体の存在下でも非存在下でも非天然Ｂ１ブラジキニン受容体（例えば、ヒトＢ１ブラジキニン受容体）を発現し得る。本発明のトランスジェニックラットを作製するための好ましい方法にてらして、好ましいトランスジェニック細胞、胚及び／または動物は天然Ｂ１ブラジキニン受容体及びトランスジェニック非天然Ｂ１ブラジキニン受容体に対する対立遺伝子を含む。
【００１０】
本明細書に記載されているトランスジェニックラットモデルは、受容体活性を有する潜在的モジュレーター（例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト）をスクリーニングするために有用であり、前記モジュレーターには非限定的にペプチド、タンパク質または非タンパク質の有機もしくは無機分子が含まれる。よって、本発明は、本発明のトランスジェニックラット及びその子孫の作製方法、並びに薬理試験のためのその使用に関する。更に、本発明は、試験化合物（類）をトランスジェニックラットに投与し、ヒトＢ１ブラジキニン受容体の活性に対する該化合物の効果を調べることによりヒトＢ１ブラジキニン受容体の潜在的モジュレーターの選択性及び活性を測定する方法に関する。よって、本発明は、試験化合物の血液脳関門への浸透、組織への分布及びヒトＢ１ブラジキニン受容体への結合能力を測定する例えば脳組織を用いる各種占有率アッセイに関する。
【００１１】
本明細書中、「機能的」は、細胞またはインビボ系中に存在するとき天然、すなわち未変性の条件または環境中のように通常通り機能する遺伝子またはタンパク質を指す。従って、機能的でない（すなわち、“非機能的”、“破壊”、“変性”等）遺伝子は野生型、天然または未変性タンパク質として機能しないタンパク質をコードしたり、またはタンパク質を全くコードしない。非機能的遺伝子は本明細書に記載されている相同組換えの産物であり得、非機能的遺伝子は遺伝子の機能的形態を含む標的染色体の領域を特異的に標的して野生型または天然遺伝子をノックアウトする。
【００１２】
本明細書中、「モジュレーター」は、ヒトＢ１ブラジキニン受容体のような哺乳動物Ｂ２またはＢ１ブラジキニン受容体の発現または活性を変化させたり受容体とそのリガンドまたは他のタンパク質との相互作用の影響を変化させる化合物であり、例えばアンタゴニストまたはアゴニストである。
【００１３】
本発明のトランスジェニック動物に関して、本明細書中で「導入遺伝子」及び「遺伝子」を用いる。遺伝子はタンパク質または構造ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列である。遺伝子及び／または導入遺伝子は当業界で公知の遺伝子調節要素及び／または構造要素をも含み得る。本明細書中、導入遺伝子は遺伝子を含む遺伝構築物である。導入遺伝子は当業界で公知の方法により動物の細胞中の１つ以上の染色体に組込まれる。一旦組込まれると、導入遺伝子はトランスジェニック動物のゲノム、好ましくは染色体中の少なくとも１ヶ所に運ばれる。当該導入遺伝子はラットまたは他の哺乳動物の標的ゲノムに導入され、よって安定的に組み込まれ且つ所望機能を発揮し得るように生殖細胞及び／または体細胞に導入される。導入遺伝子は標的細胞／動物内の導入遺伝子のオープンリーディングフレームを転写する当業界で公知の異種遺伝子調節要素及び／または構造要素、例えば異種プロモーター配列及び／または異種エンハンサー配列をも含み得る。前記異種調節配列は遺伝子が適切に発現されるようにコード領域に“融合”または“作動的に連結”している。染色体が導入遺伝子を標的動物に安定的に組込むのに好ましい標的であるが、「ゲノム」は核ＤＮＡ（染色体または染色体外ＤＮＡ）を含めた生物の全ＤＮＡ補体並びに細胞の細胞質内に局在するミトコンドリアＤＮＡを指す。上記したように、本発明のトランスジェニックラットは、導入遺伝子（例えば、ヒトＢ１ブラジキニン遺伝子の機能的形態）を発現させてヒトＢ１ブラジキニン受容体モジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルを提供し、ヒトＢ１ブラジキニン受容体を調節する試験化合物の選択性を研究するための薬力学的動物モデルシステムを提供するという所望効果を達成するように１つ以上の導入遺伝子をラットの胚細胞及び／または体細胞（好ましくは両方）に安定的に組込んでいる。情報を子孫に伝える能力を付与するように導入遺伝子を生殖細胞系に導入することが好ましい。実際子孫が遺伝情報の一部または全部を保有しているならば、その子孫もトランスジェニック動物である。
【００１４】
本明細書中、「動物」はすべての哺乳動物を含み得るが、トランスジェニック動物を指すときにはヒトが除かれる。動物には胚及び胎児段階を含めたすべての発育段階の動物が含まれる。「トランスジェニック動物」は細胞下レベルでの計画的な遺伝子操作、例えばマイクロインジェクション、相同組換えのような標的遺伝子デリバリーまたは組換えウイルスの感染により直接または間接的に受けた遺伝子情報を有する１つ以上の細胞を含む動物である。上記したように、この導入ＤＮＡ分子（導入遺伝子）は染色体内に組込まれ得るかまたは染色体外で複製するＤＮＡであり得る。
【００１５】
本明細書中、「げっ歯類」は囓るために一対の上下切歯を有し、歯が連続的に成長し、切歯と臼歯の間にすき間があるげっ歯目のメンバーの種である。トランスジェニック動物を作製するための好ましい例にはドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、クマネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｒａｔｔｕｓ）及びハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書中、「ラット」は、系統的動物学の見地からクマネズミ属（Ｒａｔｔｕｓ）に属する動物を指す。本発明のトランスジェニック動物をクマネズミ属の任意の種から作製し得る。前記種にはドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）やクマネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｒａｔｔｕｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書中、「創始動物」は、げっ歯類遺伝子をそのヒトホモログで置換するように相同組換えにより標的された胚性幹細胞のようなマイクロインジェクトされた卵または標的細胞から発生するトランスジェニック動物を指す。創始動物は遺伝子産物の適当なアッセイにより機能的遺伝子の発現について試験される。
【００１８】
本明細書中、「系統」は、１つの創始細胞の直系子孫であり、生殖系列に安定的に組込まれた１つの導入遺伝子座を有する動物を指す。
【００１９】
本明細書中、「同系繁殖系」は、すべての内在性遺伝子座で遺伝的に同一である動物を指す。当業界で使用するとき、同系繁殖系は１つの動物から次の動物への再現性、動物の中で細胞または組織を伝達する能力及び内在性遺伝子の役割を同定するために規定遺伝子研究を実施する能力を含めるために使用され得る。同系繁殖系はマイクロインジェクションのために使用されるラットが樹立された同系繁殖系のメンバーである前記系統から発達し得る。
【００２０】
本明細書中、「遺伝子型」は生物の遺伝子構成成分である。
【００２１】
本明細書中、「表現型」は、遺伝子型と環境の相互作用により生ずる細胞または生物が有する形態学的、生理学的及び／または生化学的形質の集まりである。この表現型の定義には、遺伝子型プロフィールが変化し、よって動物内での導入遺伝子の発現により１つ以上の化合物に対する新しい薬理学的選択性、例えば当該導入遺伝子の機能的発現に基づく選択性が生ずるように非天然導入遺伝子が動物に導入されている生化学的形質が含まれる。「表現型発現」は、産物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）を産生したり接合子または生物の天然表現型の発現を変化させる導入遺伝子の発現を指す。
【００２２】
本明細書中、「ラットエノラーゼプロモーター」、「ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター」、「ＮＳＥ」等は、本明細書で詳記するように本発明を例示するために使用されるプロモーター断片を指すべく本明細書中同義的に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、機能的形態の非天然哺乳動物Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１つの導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び／または体細胞に安定的に組込まれた動物細胞に関する。よって、本発明は、機能的形態の非天然哺乳動物Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。好ましい非ヒトトランスジェニック細胞はげっ歯類細胞であり、げっ歯類ゲノムに安定的に組込むのに好ましい非天然Ｂ１ブラジキニン受容体遺伝子は霊長類Ｂ１ブラジキニン受容体遺伝子である。Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする単離ＤＮＡ分子の各種非ヒト霊長類ソースの例には、旧世界ザル類のメンバー、例えばアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）のようなマカク（Ｍａｃａｃａ）属の各種メンバー；新世界ザル類のメンバー、例えばタマリンのようなタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ）属の各種メンバー；レムル（Ｌｅｍｕｒ）メンバーのような原猿類；チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、オランウータン（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）やゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ）のような大形類人猿が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
従って、本発明は、機能的形態の非天然哺乳動物Ｂ１ブラジキニン受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞及び／または体細胞に安定的に組込んだ非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び／または非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。本発明の好ましい実施態様は機能的形態のヒトＢ１ブラジキニン受容体を発現し、よってラットトランスジェニック細胞及び胚を含むトランスジェニックラットに関し、前記細胞及び胚からは初期創始動物、同腹子、及び後続の機能的形態のヒト動物Ｂ１ブラジキニン受容体を発現する安定なトランスジェニック系統となるトランスジェニックラットを含めたトランスジェニックラットが生ずる。当該導入遺伝子は、宿主動物において機能するエンハンサー及び／またはプロモーター断片のような調節配列に作動的に連結させた霊長類Ｂ１ブラジキニン受容体発現カセット及びＢ１オープンリーディングフレームの下流に終結シグナルを含む。本発明のトランスジェニック動物により、前記動物において発現導入遺伝子（例えば、ヒトＢ１ブラジキニン受容体）の薬理学的活性を研究して、前記トランスジェニック動物内である試験化合物の効果を試験することができ、よって新しい薬理学的に活性な物質を開発するための予備試験を実施することができる。本明細書に記載されているデーターから、機能的ヒトＢ１ブラジキニン遺伝子またはその生物学的均等物を含む非ヒトトランスジェニック動物が一定の表現型を示し、該トランスジェニック動物がヒトＢ１ブラジキニン受容体の特定の薬理学的性質を有するように有効量の機能的導入遺伝子産物を発現していることは明らかである。上記した表現型については、非トランスジェニックラットとは異なる薬理学的特性を有することが判明しているトランスジェニックラットの脳から作成した膜を用いる結合アッセイにより本明細書中に詳細に記載されている。このことは、ラットＢ１受容体に対する親和性が乏しいヒト特異的Ｂ１化合物が実施例に記載されているトランスジェニックラットの脳から作成した膜に対して高い親和性を有することを示す結合データーから明らかである。内在性ラット受容体はいずれの表現型も隠蔽しないようである。ラジオリガンド３Ｈ−ＤＡＬＫはラットＢ１受容体よりもむしろヒトＢ１受容体に対して高い親和性を有する。このことが、このリガンドを用いて全脳ホモジネートアッセイでも脳切片の受容体オートラジオグラフィーでも非トランスジェニックラットでは内在性Ｂ１受容体活性が見られない理由の一部である。対照的に、ヒトＢ１受容体を発現する例示トランスジェニックラットでは、３Ｈ−ＤＡＬＫを用いていずれの方法でも容易に検出され得る結合部位がある。
【００２５】
本明細書に記載されているトランスジェニックラットモデルは受容体活性の潜在的モジュレーター（例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト）をスクリーニングするために有用である。前記モジュレーターにはペプチド、タンパク質、または非タンパク質有機もしくは無機分子が含まれるが、これらに限定されない。本発明のトランスジェニック動物は、試験化合物のヒトＢ１ブラジキニン受容体活性に対するインビボ効果を研究するための改良モデルを提供する。本発明以前では、野生型Ｂ１ブラジキニン発現を増加させる物質（例えば、細菌性リポ多糖類）で試験動物を処理すると、Ｂ１ブラジキニン発現が増加したり血液脳関門の性質を変化させるようにバラバラの結果が生じた。たとえ成功しても、ヒトに対して選択的な化合物の特性を評価することはできなかった。この問題を解決するために、薬理学的特性がヒトＢ１ブラジキニン受容体に適合している種を同定しようと試みた。その欠点は、１つの種が考慮中のすべての化学的シリーズのすべてではなく１つに関してしかヒトと類似の特性を有し得ないことである。或いは、遺伝的にヒトに近縁の種（例えば、非ヒト霊長類）を使用し得る。しかしながら、非ヒト霊長類のような非トランスジェニック動物を用いて化合物をアッセイすると処理量は少なくなる。
【００２６】
非限定的例として提示する１つのアッセイでは、試験化合物の血液脳関門を浸透する能力及び組織に分布し受容体に結合する能力を評価するために脳での占有率アッセイにおいて本発明のトランスジェニック動物を使用する。占有率受容体アッセイは、本発明のトランスジェニック動物を使用し、ヒトＢ１ブラジキニン受容体に結合する公知の放射線標識化合物の置換を測定することにより実施され得る。例えば、トランスジェニックまたは非トランスジェニックＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ雄ラットに試験化合物を経口投与し、一晩断食させてもよい。実験当日に体重を測定する。総結合を測定するために５０％  ＰＥＧ／Ｄ５Ｗベヒクルを静注するかまたは１％  メトセルを経口投与する。静注投与化合物の場合には、ラットにベヒクル、試験化合物及び／または非特異的結合を測定するために使用する第２化合物を尾静脈に注射するためにラットをｐｅｒｓｐｅｘラット拘束装置に置く。７．５分後、ラットを拘束装置に戻し、２００μＣｉ／ｋｇの［３Ｈ］−試験化合物を静注する。経口投与化合物の場合には、ラットにベヒクルまたは化合物を胃管を介して投与する。非特異的結合を測定する。６０分後、ラットを拘束装置に置き、２００μＣｉ／ｋｇの［３Ｈ］−試験化合物を静注する。尾静脈には１ｃｃ注射器、２５ゲージ，１インチの針を用いて注射する。ラットを温め、尾をアルコールスワブを用いて拭くことにより尾静脈を拡張させる。アイソトープを注入してから７．５分後、動物をＣＯ２により安楽死させ、眼窩に向かう脊髄開口で頭蓋基部から頭蓋を開く。約１００〜１５０ｍｇの皮質スライスを切断し、直ちに風袋を測定済みのポリプロピレンチューブに入れ、秤量する。１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．４とした冷ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ）［脱イオン水２Ｌあたり７．４ｇ  ＮａＣｌ（１５０ｍＭ），４．８ｇ  ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ），０．７５０ｇ  ＫＣｌ（５ｍＭ）］を各チューブに３９ｖｏｌｓ添加する。ＮａＣｌ及びＫＣｌはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＨＥＰＥＳ（Ｃ８Ｈ１８Ｎ２Ｏ４Ｓ）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入した。脳をポリトロンホモジナイザーを用いフルスピードで１０秒間ホモジナイズする。直ちにホモジネート５００μｌを濾過装置（Ｈｏｅｆｆｅｒ）を用いて（０．２％  ＰＥＩに予め浸した）２５ｍｍ  Ｐａｌｌ  Ａ／Ｅフィルターを介して２回濾過する。ホモジネートがフィルターの全表面を覆うように閉じられ、濾過・洗浄するときには開かれる弁を備えたフィルターにホモジネートをヒペットで移した直後に、冷ＨＥＰＥＳ［ＫＣｌ（５ｍＭ），ＮａＣｌ（１５０ｍＭ），ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）］緩衝液を５ｍｌずつ用いて５回洗浄する。各フィルターをシンチレーションバイアルに置き、Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄシンチレーション流体（１０ｍｌ）を各バイアルに添加する。５００μｌずつ２つのホモジネートアリコートをシンチレーションバイアルに入れ、Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄシンチレーション流体（１０ｍｌ）を添加し、カウントして、全脳標識を測定する。トリチウム計数プログラムでカウントする前にサンプルを４時間放置する。アイソトープ溶液をトリチウムプログラムで計数して実際のｍＣｉ濃度を測定する。サンプル０．００１ｍｌを、シンチレーション流体１０ｍｌを含むバイアルにピペットで移す（ピペットの先端をキムワイプで注意深く拭く）。次のように計算する：
（１）各サンプルにつき標識の蓄積率（％  Ａｃｃ）＝（フィルターｄｐｍ／ホモジネートｄｐｍ）×１００、
（２）全アッセイにつき特異的蓄積率（％  Ｓｐ  Ａｃｃ）＝総結合の平均％  Ａｃｃ−非特異的結合の平均％  Ａｃｃ、
（３）結合阻害率（％  Ｉｎｈ）＝（（総結合の平均％  Ａｃｃ−サンプルの平均％  Ａｃｃ）／％  Ｓｐ  Ａｃｃ）×１００、
（４）１μＣｉ＝２．２×１０６ＤＰＭ（０．００１ｍｌアイソトープ溶液（０．２ｍＣｉ／ｍｌ）＝４．４×１０５ＤＰＭ。
１５０ｇのラットに０．１５ｍｌを投与する場合の試験化合物の用量は２００μＣｉ／ｋｇ体重である：１ｍｌの１ｍＣ／ｍｌ（ＮＥＮ）＋４ｍｌ  食塩水。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様は、機能的形態のヒトＢ１ブラジキニン受容体をコードする１つの導入遺伝子を標的動物の生殖細胞及び／または体細胞に安定的に組込んだトランスジェニックげっ歯類の作製である。しかしながら、本発明は、ラット及びマウスの好ましい標的だけでなく、本明細書に例示したトランスジェニックラットと実質的に同様の表現型形質を示す他のトランスジェニック非ヒト動物の作製に関する。前記非ヒト動物の例にはウシ、ブタ、家兎、モルモット、ヒツジ、ハムスター及びヤギが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
好ましくは、本発明は、機能的形態のヒトＢ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を標的動物の生殖細胞及び／または体細胞に安定的に組込んだ動物細胞にも関する。更には、本発明は、機能的形態のヒトＢ１ブラジキニン受容体をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。トランスジェニック動物細胞、動物及び同腹子は天然（野生型）Ｂ１ブラジキニン受容体の存在下でも非存在下でも非天然Ｂ１ブラジキニン受容体（例えば、ヒトＢ１ブラジキニン受容体）を発現し得る。本発明のトランスジェニックラットを作製するための好ましい方法にてらして、好ましいトランスジェニック細胞、胚及び／または動物は天然及びトランスジェニック非天然Ｂ１ブラジキニン受容体の両方に対する対立遺伝子を含む。典型的には、当該導入遺伝子は、宿主動物において機能するエンハンサー及び／またはプロモーター断片のような調節配列に連結させたヒトＢ１ブラジキニン受容体発現カセット及びＢ１オープンリーディングフレームの下流に終結シグナルを含む。ヒトＢ１ブラジキニン受容体をコードするトランスジェニックラットを作製するための好ましい方法では、導入遺伝子を通常非相同組込みにより宿主染色体位置に組込む。これらの導入遺伝子は更に、エンハンサー（例えば、ＳＶ４０エンハンサー）に連結したホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）プロモーターまたはＨＳＶ  ｔｋ遺伝子プロモーターのような構成的プロモーターに作動的に連結させた選択マーカー、例えばｎｅｏまたはｇｐｔ遺伝子を含み得る。
【００２９】
ヒトＢ１ブラジキニン遺伝子をマウスに標的導入するような幾つかの実施態様では、内在性非ヒトＢ１対立遺伝子を機能的に破壊して、内在的にコードしたマウスＢ１の発現を抑制または消滅させてヒトＢ１導入遺伝子の発現を干渉させない。導入遺伝子は胚、胎児または成熟多能性幹細胞に導入され得る（援用により本明細書に含まれるとするＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２８８−１２９２（１９９１）；２００１年３月２０日に付与された米国特許第５，４６４，７６４号明細書、同第５，４８７，９９２号明細書、同第５，６２７，０５９号明細書、同第５，６３１，１５３号明細書及び同第６，２０４，０６１号明細書も参照）。胚性幹細胞はインビトロで培養した胚盤胞から単離され、分化内で安定的に培養され得る。例えば、導入遺伝子は、標的ＥＳ細胞内の特定ゲノム部位に導入遺伝子を指向させるべく使用され得る相同アーム（例えば、上掲のＣａｐｐｅｃｃｈｉ）を含む遺伝子標的ベクター中に含まれ得る。外来ＤＮＡはエレクトロポレーションにより胚性幹細胞に導入され得る。適当に導入遺伝子を有する胚性幹細胞を胚盤胞の内部細胞塊に注入する。キメラ動物を作製し、これを交雑育種させてすべての細胞が導入遺伝子を有する動物を得る。以下に記載するマイクロインジェクションを用いて、トランスジェニックマウスを作製するための好ましい方法はＥＳ細胞ベース技術である。ＥＳ細胞に遺伝子を標的させることにより遺伝子機能を破壊するための一般的スキームは、ＥＳ細胞ゲノムにおいて染色体対応物との相同組換えを受けるように設計した標的構築物を構築することである。標的構築物は通常、ポジティブ選択マーカーのような追加配列を標的遺伝子のコーディング要素に挿入して該遺伝子を機能的に破壊するように配置される。よって、本発明はまた、相同的組換え標的構築物を用いる遺伝子標的により不活化した内在性Ｂ１遺伝子を有する非ヒト動物（例えば、非霊長類哺乳動物）の作製方法に関する。標的構築物の構築及び選択方法に関する一般原理は援用により本明細書に含まれるとするＢｒａｄｌｅｙら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：５３４（１９９２）に記載されている。
【００３０】
本発明では、各Ｂ１ブラジキニン受容体の発現をＢ１ブラジキニン遺伝子に作動的に連結した各種の同種または異種調節配列によりコントロールするように哺乳動物形態をコードする導入遺伝子をＤＮＡ構築物として宿主標的細胞に提示する。その例を図１（ラットニューロン特異的エノラーゼ［ＮＳＥ］プロモーター、及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写終止及びポリアデニル化シグナルの上流にあるヒトＢ１ブラジキニン受容体遺伝子に融合（すなわち、作動的に連結した）ＣＭＶイントロンＡ）に示すが、これに限定されない。この構築物を組込む動物は中枢神経系統においてニューロン特異的発現を提示する。対照的に、ヒトＢ１ブラジキニン遺伝子の末梢発現は図４（内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）により分離される第２オープンリーディングフレーム（ＬａｃＺ）の上流にあるヒトＢ１ブラジキニン受容体遺伝子に融合したＣＭＶプロモーター／イントロンＡ及びＬａｃＺ  ＯＲＦの下流にＢＧＨ終結シグナル）に示す組込み構築物を介して生ずる。また、図７に示す導入遺伝子構築物（内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）により分離される第２オープンリーディングフレーム（ＬａｃＺ）の上流にあるヒトＢ１ブラジキニン受容体遺伝子に融合したＴｈｙ−１プロモーター及びＬａｃＺ  ＯＲＦの下流にＢＧＨ終結シグナル）は脳特異的発現を促進しなければならない。前記した各種構築は、無数のプロモーター／導入遺伝子構築物が安定的なゲノムＤＮＡ組込み及びその後の操作によりトランスジェニック動物を作製するための標的細胞への導入のために作製され得ることを示している。本明細書に例示されている構築物により、ジスシストロン構築物が非ヒトトランスジェニック動物に組込まれる。好ましいジスシストロン構築物は各オープンリーディグフレーム（ＯＲＦ）を分離するために内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を利用する。好ましくは、第１ＯＲＦは機能的形態の霊長類Ｂ１ブラジキニン受容体をコードし、第２ＯＲＦは組織及び／または細胞特異的発現を容易に検出し得るリポーター遺伝子をコードする。各種のリポーター遺伝子が当業界で公知であり、その非限定的例としてＬａｃＺ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼ及びルシフェラーゼが挙げられる。
【００３１】
トランスジェニックラットを作製するための好ましい方法は、通常特定導入遺伝子を含むＤＮＡをラットの生殖細胞（通常、受精卵）に導入することを含む。次いで、受精生殖細胞を用いて完全なトランスジェニック動物を作製する。２つの前核の１つに無傷のＤＮＡを注入するマイクロインジェクターピペット及び顕微鏡を用いてＤＮＡを生殖細胞に導入することを含む公知のマイクロインジェクション方法を用いてＤＮＡを生殖細胞に導入することが好ましい。少なくとも１つ、恐らくは２つ以上の特定導入遺伝子がゲノムに組込まれたトランスジェニック動物を選択する。安定的に組込まれた導入遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニックラット系統を樹立するように繁殖のために少なくとも１つの創始トランスジェニックラットを選択する。この方法は米国特許第４，８７３，１９１号明細書に記載されている。本発明のトランスジェニック動物を作製するために当業界で利用されている他の公知の方法を用いることができるが、この方法には外在性ＤＮＡのキャリアとして精子を用いるインビトロ受精、エレクトロポレーションが含まれるが、これらに限定されない。また、ラット胚性幹細胞系にトランスフェクションして導入遺伝子をラットゲノムに直接標的した後特定の組換えＥＳ細胞を選択し、ラットの胚盤胞に導入してもよい。各種方法がＭｕｌｌｉｎｓら，「トランスジェニック動物：作製及び使用(Transgenic Animal: Generation and Use)」，第２章，「トランスジェニックラット(Transgenic Ras)」，ｐ．７−９，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（１９９７年）発行に記載されている。従って、本発明のトランスジェニックラットを作製するための好ましい公知方法は、過剰排卵を促進するために（卵胞刺激ホルモンを連続注入して）雌をホルモン状態に置くステップ、（好ましくは受精雄と繁殖させるかまたは人工受精により）過剰排卵雌を受精させるステップ、導入遺伝子をマイクロインジェクションのような公知技術を用いて受精卵に導入するステップ、受精卵を偽妊娠雌ラットに移植し、その後出産まで進めるステップを含む。偽妊娠雌の胎児が出産に至ったら、創始動物を離乳子孫由来のゲノムＤＮＡへ導入遺伝子ＤＮＡをハイブリダイズする一般的方法または導入遺伝子の存在に対して特異的なＰＣＲアッセシにより同定する。遺伝子を発現する創始動物、特に遺伝子を高レベル且つ所期の組織分布で発現する（例えば、脳特異的発現）創始動物を選択し、繁殖させて、意図するトランスジェニックラット系統を樹立する。
【００３２】
本発明を実施する際、ヒトＢ１ブラジキニン遺伝子を組込んだトランスジェニック動物のすべてが当該Ｂ１遺伝子の適切な発現を示さないことは自明である。例えば、実施例３及び６に提示されているデーターには、ヒトＢ１ブラジキニン受容体を発現する３つの別々のトランスジェニックラット系統についてヒトＢ１ブラジキニン受容体に対する３Ｈ−ＤＡＬＫの結合の違いが示されている。適当なトランスジェニック系統を同定することはプロモーター強度、ゲノムに組込む導入遺伝子の数、組込む事象の位置の違いのように特異的な構築物でもあり得る。ラットＢ１受容体は通常導入遺伝子よりも非常に低いレベルでしか発現しないが、その発現はある処理、例えばリポ多糖類またはストレプトゾシンにより誘導され得る。トランスジェニックラットと非トランスジェニックラットを比較した本明細書の記載から明らかなように、ラットＢ１ブラジキニン受容体はヒト受容体とは明確に異なる薬理学的特性を有する。すなわち、ヒトＢ１受容体に対して高い親和性を有する多くの合成化合物はラットＢ１受容体に対しては低い親和性しか有さない。通常条件下で十分量の導入遺伝子を発現する動物は受容体占有率アッセイにおいて特に有用である。全組織アッセイで測定して系統０００４と同じかまたはそれ以上の発現レベルを有する動物が好ましい。しかしながら、例えば発現が更なる研究のために利用し得る組織の散在領域に局在化しているならば、低い組織発現を示す系統（例えば、系統００１４及び００１５）を使用することもできる。よって、当業者は生じた系統の少なくとも１つが確実に所望の形質を発揮するように約６〜約１０またはそれ以上の系統を作製しようとする。ヒトＢ１ブラジキニンの複数コピー、例えば特定導入遺伝子の２〜約５０コピーを標的ゲノムに組込んだ動物を同定し、繁殖することも有用であり得る。従って、特定試験化合物の結合及び／または受容体占有率特性を調べるためのインビボ／エキソビボアッセイに対して最適の適合を見つけるために特定トランスジェニック動物を特徴づけることは本発明の範囲であり、前記アッセイでは試験化合物は天然及びトランスジェニックＢ１ブラジキニン受容体タンパク質に対して特定結合／薬理学的プロフィールを発揮する。
【００３３】
本明細書で使用されている命名法並びにトランスジェニックプロトコル、細胞培養、分子遺伝学及び分子生物学の実験手順は当業界で公知であり、慣用されている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養及び導入遺伝子の導入のためには一般的方法（例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション）が使用される。各種酵素反応、オリゴヌクレオチド合成及び精製ステップは製造業者の仕様に従って実施する。技術及び手順は通常当業界の慣用方法及び本明細書に掲げられている文献に従って実施する。本明細書に記載されている手順は当業界で公知であると考えられ、読者の便宜のために記述されている。本明細書に含まれている情報はすべて援用により本明細書に含まれるとする。例示のために下記実施例を提示する。当業者には各種の他の態様が自明であるので、下記実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【実施例１】
【００３４】
トランスジェニック標的ベクターの構築
構築物＃１：ラットエノラーゼイントロンＡ  ｈＢ１ポリＡ２ベクター
（ステップ１）
ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター領域を含むＰＣＲ断片を作成するための鋳型としてラットゲノムＤＮＡ（５０または１００ｎｇ／５０ｕｌ反応物）を使用した。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×３分）を３２サイクル実施した。正プライマーはＲａｔ＿ｅｎｌ．２ｆ（５’−ＣＡＴＣＡＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＣＡＣＡＡ−３’）（配列番号５）であり、逆プライマーはＲａｔ＿ｅｎｌ．２ｒ（５’−ＴＣＡＣＣＴＣＧＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣ−３’）（配列番号６）であった。このＰＣＲ産物の長さは２０５９ｂｐであった。
【００３５】
（ステップ２）
ステップ１からの精製ＰＣＲ産物（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製）を、ＢａｍＨＩ制限部位を付加するための第２回ＰＣＲのための鋳型として使用した。以下のプライマー及びＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×３分）を３０サイクル実施した。正プライマーはＲａｔ＿ｅｎｌ．４ｆ（５’−ＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＧＣ−３’）（配列番号７）であり、逆プライマーはＮＳＥ＿１Ｒ（５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号８）であった。このＰＣＲ産物の長さは１８１４ｂｐであった。
【００３６】
（ステップ３ａ）
ＣＭＶイントロンＡ配列を含むプラスミドＤＮＡをサブクローニング用ＰＣＲ断片を作成するための鋳型として使用した。Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，７２℃×１分）を２５サイクル実施した。正プライマーはＣＭＶｉｎｔＡ．１Ｆ（５’−ＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号９）であり、逆プライマーはＣＭＶｉｎｔＡ．１Ｒ（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧ−３’）（配列番号１０）であった。このＰＣＲ産物の長さは８２７ｂｐであった。
【００３７】
（ステップ３ｂ）
ステップ３ａのＣＭＶイントロンＡ産物に重複末端を付加するためにＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×１分１０秒）を１２サイクル実施した。正プライマーはＮＳＥ＿ＣＭＶ．ＯＬＦ１（５’−ＧＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号１１）であり、逆プライマーはＣＭＶ＿ｈＢ１．ＯＬＲ１（５’−ＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧ−３’）（配列番号１２）であった。このＰＣＲ産物の長さは８６３ｂｐであった。
【００３８】
（ステップ４）
ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列に融合してヒトブラジキニンＢ１受容体配列を含むプラスミドｐｃＤＮＡ３に対してＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，７２℃×３分）を２５サイクル実施して、ヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列及び重複末端を有するＢＧＨポリＡシグナルを含むＰＣＲ断片を構築した。正プライマーはＣＭＶ＿ｈＢ１．ＯＬＦ１（５’−ＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡ−３’）（配列番号１３）であり、逆プライマーはＢＧＨ．１ＲＮｏｔ（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧ−３’）（配列番号１４）であった。このＰＣＲ産物の長さは１５１８ｂｐであった。
【００３９】
（ステップ５）
ステップ３及びステップ４から精製した鋳型を用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×４分３０秒）を２５サイクル実施して、ＣＭＶイントロンＡをヒトＢ１＿ＢＧＨポリＡ断片と組み合わせた。正プライマーはＮＳＥ＿ＣＭＶ．ＯＬＦ１（５’−ＧＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号１５）であり、逆プライマーはＢＧＨ．１ＲＮｏｔ（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧ−３’）（配列番号１４）であった。このＰＣＲ産物の長さは２３４２ｂｐであった。
【００４０】
（ステップ６）
ステップ２からのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ステップ５からのＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化した。ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化ＰＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて三方リゲーションを実施した。
【００４１】
ＰＣＲエラーが最小のクローンを選択するためにＤＮＡ配列を分析した。選択したクローンを、ＢａｍＨＩ／ＡｆｌＩＩ  ２４４３ｂｐ断片及びＡｆｌＩＩ／ＮｏｔＩ  １６９９ｂｐ断片と三方リゲーションすることによりＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）にサブクローン化した。生じた導入遺伝子を図１に示し、導入遺伝子のヌクレオチド配列を図２Ａ〜Ｂに示す。この構築物の転写物の概略図を図３Ａに示し、転写物の投影転写物（ＤＮＡ配列として示す）のヌクレオチド配列を図３Ｂに示す。
【００４２】
構築物＃２：ＣＭＶプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ヒトＢ１  ｃｄｓ＿ＢＧＨポリＡシグナルベクター
（ステップ１：ＣＭＶプロモーター）
ｐｃＤＮＡ３（１００ｎｇ）に対してＰｆｕまたはＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，７２℃×１分）を１８サイクル実施した。正プライマーはＣＭＶプロモーター１Ｆ（５’−ＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＣ−１６’）（配列番号１６）であり、逆プライマーは（５’−ＧＡＣＴＣＴＡＴＡＧＧＣＧＧＴＡＣＴＴＡＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＧ−３’）（配列番号１７）であった。このＰＣＲ産物の長さは７０２ｂｐであった。
【００４３】
（ステップ２：ＣＭＶイントロンＡ）
ＣＭＶイントロンＡ断片を含むＤＮＡプラスミド鋳型（１００ｎｇ）に対してＰｆｕポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，７２℃×１分）を１８サイクル実施した。正プライマーはＣＭＶプロモーター＿イントロンＡ  １Ｆ（５’−ＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号１８）であり、逆プライマーはＣＭＶｉｎｔＡ．１Ｒ（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧ−３’）（配列番号１０）であった。このＰＣＲ産物の長さは８５０ｂｐであった。
【００４４】
（ステップ３）
ステップ１及びステップ２からのＰＣＲ産物に対してＰｆｕポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，７２℃×１分３０秒）を１８サイクル実施し、ＣＭＶプロモーター断片をＣＭＶイントロンＡに連結した。鋳型はステップ１及びステップ２からのＰＣＲ産物それぞれ２ｎｇであった。正プライマーはＣＭＶプロモーター１Ｆ（５’−ＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＣ−３’）（配列番号１６）であり、逆プライマーはＣＭＶｉｎｔＡ．１Ｒ（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧ−３’）（配列番号１０）であった。このＰＣＲ産物の長さは１０５８ｂｐであった。
【００４５】
（ステップ４）
ステップ３からのＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩ（ＣＭＶイントロンＡ中で切断）で消化することによりＣＭＶプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列＿ＢＧＨポリＡシグナルを構築した。本実施例に記載されているラットエノラーゼイントロンＡ  ｈＢ１ポリＡ２ベクターをＥｃｏＲＶ及びＡｆｌＩＩで消化し、これらの消化断片を連結して、図４に示す導入遺伝子を作成した。
【００４６】
構築物＃３：ＣＭＶイントロンＡ：ヒトＢ１コーディング：ＩＲＥＳ要素：ＬａｃＺ：ＢＧＨポリＡ
図５に詳記する標的ベクターを以下のように作成した。
【００４７】
（ステップ１）
ｐＩＲＥＳプロプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として使用して、ＩＲＥＳ要素を含むＰＣＲ断片を作成した。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×１分３０秒）を２０サイクル実施した。正プライマーはＨＢ１＿ＩＲＥＳ  Ｆ（５’−ＣＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＧＣＡＴＣＴＡＧＧＧＣＧＧＣＣＡＡＴＴＣ−３’）（配列番号１９）であり、逆プライマーはＩＳ＿ＬＡＣＺ＿１Ｒ（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＧＡＴＣＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧ−３’）（配列番号２０）であった。このＰＣＲ産物の長さは６３９ｂｐであった。
【００４８】
（ステップ２）
ｐｃＤＮＡ３β−ＧａｌプラスミドＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として用い、Ｐｆｕ及びＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×３分）を２８サイクル実施して、ＬａｃＺコード領域をＰＣＲ断片として作成した。正プライマーはＩＳ＿ＬＡＣＺ＿１Ｆ（５’−ＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＧＡＴＣＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ−３’）（配列番号２１）であり、逆プライマーは（５’−ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧ−３’）（配列番号２２）であった。このＰＣＲ産物の長さは３０９８ｂｐであった。
【００４９】
（ステップ３）
Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×４分）を１８サイクル実施して、ステップ１及びステップ２のＰＣＲ産物を連結した。正プライマーはＨＢ１＿ＩＲＥＳ  Ｆ（５’−ＣＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＧＣＡＴＣＴＡＧＧＧＣＧＧＣＣＡＡＴＴＣ−３’）（配列番号１９）であり、逆プライマーはＩＳ＿ＢＧＨ  Ｒ（５’−ＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＣＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧ−３’）（配列番号２３）であった。このＰＣＲ産物の長さは３７２１ｂｐであった。
【００５０】
（ステップ４）
プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×４分）を１８サイクル実施して、ＢＧＨ  ポリＡシグナルを作成した。正プライマーはＬＺ＿ＢＧＨ  Ｆ（５’−ＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＡＴＡＧＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＧ−３’）（配列番号２４）であり、逆プライマーはＢＧＨ．１ＲＮｏｔ（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧ−３’）（配列番号１４）であった。
【００５１】
（ステップ５）
Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×４分３０秒）を２０サイクル実施して、ステップ４からのＢＧＨポリＡ  ＰＣＲ断片をステップ３のＩＲＥＳ：ＬａｃＺ断片に連結した。正プライマーはＨＢ１＿ＩＲＥＳ  Ｆ（５’−ＣＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＧＣＡＴＣＴＡＧＧＧＣＧＧＣＣＡＡＴＴＣ−３’）（配列番号１９）であり、逆プライマーはＢＧＨ．１ＲＮｏｔ（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧ−３’）（配列番号１４）であった。このＰＣＲ産物の長さは３９６３ｂｐであった。
【００５２】
（ステップ６）
本実施例に記載のラットエノラーゼイントロンＡ  ｈＢ１ポリＡ２ベクターを鋳型として用い、Ｐｆｕポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×２分３０秒）を１８サイクル実施して、ＣＭＶイントロンＡ：Ｂ１コード配列を作成した。正プライマーはＣＭＶｉｎｔＡ．１Ｆ（５’−ＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号９）であり、逆プライマーはＨＢ１＿ＩＲＥＳ  Ｒ（５’−ＧＡＡＴＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＴＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＴＧＧ−３’）（配列番号２５）であった。このＰＣＲ産物の長さは１９３１ｂｐであった。
【００５３】
（ステップ７）
ステップ６のＰＣＲ産物（ＣＭＶイントロンＡ：ヒトＢ１  ｃｄｓ）及びステップ１からのＰＣＲ産物（ＩＲＥＳ）を鋳型として用い、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×４分３０秒）を２０サイクル実施して、ＤＮＡ断片に連結した。正プライマーはＣＭＶｉｎｔＡ．１Ｆ（５’−ＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号９）であり、逆プライマーはＩＳ＿ＬＡＣＺ＿１Ｒ（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＧＡＴＣＴＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧ−３’）（配列番号２０）であった。このＰＣＲ産物の長さは２５４９ｂｐであった。
【００５４】
（ステップ８）
ステップ７及びステップ５のＰＣＲ産物を用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×７分３０秒）を１８サイクル実施して、ＣＭＶイントロンＡ：ヒトＢ  ｃｄｓ（ステップ７）をＩＲＥＳ＿ＬａｃＺ＿ＢＧＨポリＡ（ステップ６）に連結した。正プライマーはＣＭＶｉｎｔＡ．１Ｆ（５’−ＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＣ−３’）（配列番号９）であり、逆プライマーはＢＧＨ．１ＲＮｏｔ（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧ−３’）（配列番号１４）であった。このＰＣＲ産物の長さは５８５１ｂｐであった。次いで、この断片をＤＮＡ発現プラスミドｐＣＲＩＩ  Ｔｏｐｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｔｅｎ）にサブクローン化し、ＤＮＡ配列分析にかけて、適当な導入遺伝子の作成を確認した。
【００５５】
構築物＃４：ＣＭＶプロモーター：ＣＭＶイントロンＡ：ヒトＢ１コーディング：ＩＲＥＳ２要素：ＬａｃＺ：ＢＧＨポリＡ
（ステップ１）
構築物３からの５２０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ／ＮｓｉＩ断片をｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローン化する。このサブクローンをＢｇｌＩＩ／ＮｃｏＩで消化する。ｐｃＤＮＡ３＿ベーターＧａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）鋳型からＰｆｕポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×２分３０秒）を３７サイクル実施して、ＬａｃＺの一部に及ぶＰＣＲ断片を作成する。正プライマーはＬＺ＿ＢｓｐＨＩ（５’ＧＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＧＡＴＣＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ−３’）（配列番号２６）であり、逆プライマーは５‘−ＩＺ＿２６９９Ｒ（５’−ＴＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＴＴＧＣＣ−３’）（配列番号２７）であった。このＰＣＲ産物の長さは２０８１ｂｐであった。この産物をＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＶで消化する。この１１１３ｂｐ断片及び上記したＢｇｌＩＩ／ＮｃｏＩ断片を構築物＃２にライゲートし、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＶで消化する。標的導入遺伝子を図６に概略的に示し、導入遺伝子のヌクレオチド配列を図６Ａ−Ｂに示す。
【００５６】
構築物＃５：Ｔｈｙ−１プロモーター：ヒトＢ１コーディング：ＩＲＥＳ２要素：ＬａｃＺ：ＢＧＨポリＡ
（ステップ１）
マウスゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応からマウスＴｈｙ−１プロモーターを含むＤＮＡ断片を作成した。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いるＰＣＲ反応（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×３分３０秒）を３０サイクル実施した。正プライマーはＴｈｙ１＿１ｆ＿Ｎｏｔ（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＧ−３’）（配列番号２８）であり、逆プライマーはＴｈｙ１＿ｈＢ１ｒ（５’−ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＣＣＡＡＧＡＧＴＴＣＣＧＡＣＴＴＧ−３’）（配列番号２９）であった。このＰＣＲ産物の長さは２９２３ｂｐであった。
【００５７】
（ステップ２）
ｐｃＤＮＡ３にクローン化したヒトＢ１受容体（１０ｎｇ）からヒトＢ１ブラジキニンコード配列の一部を作成した。Ｐｆｕポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×４分）を１８サイクル実施した。正プライマーはＴｈｙ１＿ｈＢ１ｆ（５’−ＣＡＡＧＴＣＧＧＡＡＣＴＣＴＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’）（配列番号３０）であり、逆プライマーはｈＢ１＿２ｒ（５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＧ−３’）（配列番号３１）であった。このＰＣＲ産物の長さは８８１ｂｐであった。
【００５８】
（ステップ３）
Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃×２５秒，６０℃×２５秒，６８℃×４分）を１８サイクル実施して、ステップ１及びステップ２からのＰＣＲ産物を連結した。正プライマーはＴｈｙ１＿１ｆ＿Ｎｏｔ（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＧ−３’）（配列番号２８）であり、逆プライマーはｈＢ１＿２ｒ（５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＧ−３’）（配列番号３２）であった。このＰＣＲ産物の長さは３７５３ｂｐであり、ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した後、クローンのＤＮＡ配列を分析した。
【００５９】
（ステップ４）
ステップ３からのクローンをＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、３４７３ｂｐの断片を単離する。構築物＃４をＢｇｌＩ／ＮｏｔＩＩで消化し、４４５１ｂｐの断片を単離する。これら２つの断片をＮｏｔＩ消化ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）にライゲートして図７に概略的に図示し、図８Ａ〜Ｃのヌクレオチド配列を有する導入遺伝子を得る。
【実施例２】
【００６０】
ヒトＢ１ブラジキニン１受容体を発現するトランスジェニックラットの作製
ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローン化したＮＳＥプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ヒトＢ１（図１）約２０μｇをＢａｍＨＩで消化した。４．１ｋｂインサートを３ｋｂベクターから０．８％アガロースゲルを用いて分離した。４．１ｋｂバンドを切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した後、断片を更に０．８％アガロースゲル分離により精製した。Ｑｕｉｑｕｉｃｋカラムを用いて２回精製するように改変したが、上記したようにバンドをゲルから切り出し、抽出した。最終産物を１０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４），０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに約５０ｎｇ／ｕｌの濃度で再懸濁した。ＣＭＶ（図４）及びＴｈｙ−１プロモーター構築物（図７）を、ベクターからマイクロインジェクション用線状ＤＮＡ断片を切り出すためにＮｏｔＩ消化を使用した以外は同様にして作成した。
【００６１】
前記導入遺伝子を含むトランスジェニックラットを作製するために精製ＮＳＥプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ヒトＢ１（構築物＃１，図１Ａ）断片をニュージャージー州プリンストンに所在のＤＮＸ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｏｗ  Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に契約で移した。一般的方法を用いて前記構築物をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット卵に導入して、少なくとも１つの導入遺伝子コピーをゲノムに組込んだトランスジェニックラット系統を作製する（例えば、米国特許第４，８７３，１９１号明細書参照）。導入し、更なるゲノム及び表現型分析にかけた３つのトランスジェニック系統は系統０００４、００１４及び００１５であった。系統０００４は約１０コピーを有し、系統００１４は系統０００４よりも多くのコピーを有すると推定される。勿論、相関関係はあるが、コピー数及び発現レベルの相関関係は通常低い。
【００６２】
ＮＳＥプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列＿ＢＧＨポリＡシグナルを含むトランスジェニックインサートから生じた転写物に対してＴａｑｍａｎアッセイを実施した。ＣＭＶイントロンＡのスプライシングにより、ヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列に融合してニューロン特異的エノラーゼ遺伝子のエクソン１の１１８ヌクレオチドを含む転写物が生じた（図３Ａ）。正プライマーのＮＳＥ＿ＴＭ１ｆ（５’−ＧＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣ−３’）（配列番号３３）またはＮＳＥ＿ＴＭ２ｆ（５’−ＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧ−３’）（配列番号３４）の３’末端がスプライス転写物に相当し、よって未スプライス転写物もゲノムＤＮＡも検出しないようにＰＣＲプライマーを設計した。ＦＡＭ及びＴＡＭＲＡで標識したＴａｑｍａｎプロープのＮＳＥ＿ＴＡＱ１（５’−ＣＴＣＣＡＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣ−３’）（配列番号３５）及びＮＳＥ＿ＴＡＱ２（５’−ＴＣＣＡＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴ−３’）（配列番号３６）を設計してＰＣＲ産物を検出した。
【００６３】
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて系統００４由来の２匹のトランスジェニックラット及び１匹の非トランスジェニックラットの脳からｍＲＮＡを作成した。トランスジェニック構築物由来の産物を内部コントロールとしてげっ歯ＧＡＰＤＨを用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システムで検出した。げっ歯ＧＡＰＤＨはすべてのサンプルで検出されたのに対して、導入遺伝子に由来する産物はトランスジェニック動物でのみ検出された。このことは、系統００４のトランスジェニックインサートに由来する転写物が適正に処理され、このアッセイがトランスジェニック動物と非トランスジェニック動物を区別するために使用できることを示している。
【００６４】
ラットゲノムＤＮＡをプロテイナーゼＫ消化後フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿して組織から作成した。ゲノムＤＮＡ（５〜１０ｕｇ）をＥｃｏＲＩで消化し、断片を１％アガロースゲルにより分離した。ＤＮＡをＶａｃｕＧｅｎｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてゲルからＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｅｓｔｅｄブロッティング膜（ＢｉｏＲａｄ）に移した。トランスジェニック構築物の７０１ヌクレオチドＰＣＲ産物を正プライマーＣＭＶ＿３８１Ｆ（５’−ＡＡＴＣＴＣＧＧＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧ−３’）（配列番号３７）及び逆プライマーＥｎｌ＿ｇｔ２ｒ（５’−ＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣ−３’）（配列番号３８）を用いて増幅するためにＰｆｕポリメラーゼを用いた。産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ランダムプライムラベリング（Ｒｏｃｈｅ）を用いてα３２ＰｄＣＴＰで放射性標識した。ハイブリダイゼーションを０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６．５％  ＳＤＳ及び１０％  硫酸デキストランにおいて６５℃で一晩実施した。ブロットを０．１ｘＳＳＣ  ０．１％  ＳＤＳの最終洗浄液を用いて６０℃で３０分間洗浄し、フィルムに露出させた。ＮＳＥプロモーター構築物中に１つのＥｃｏＲＩ部位があり、消化により４１３２ヌクレオチドの単位長さバンドが生じる。同様に、６５２２のＣＭＶ構築物も１つのＥｃｏＲＩ部位を含んでいる。
【実施例３】
【００６５】
トランスジェニックラットから精製したヒトＢ１ブラジキニン受容体へのリガンド結合
実施例のセクション２に記載した構築物＃１（ヒトＢ１ブラジキニン受容体の発現を誘導するニューロン特異的エノラーゼプロモーター）を含むトランスジェニックラットの５系統のうちの３系統（０００４、００１４及び００１５）の、３Ｈ−ＤＡＬＫ、このリガンドに対して約４０倍選択的である化合物への結合能について試験した。このアッセイにおいて重要なことはニューロン組織での内在性Ｂ１受容体の発現レベルが低いことである。要するに、系統０００４、００１４及び００１５のトランスジェニック動物（すべて雌）を麻酔後断頭し、全脳を摘出し、矢状方向に二分し、全１／２脳の重量を秤量した。重量は、系統０００４で８１３ｍｇ、系統００１４ｍｇで８５１ｍｇ、系統００１５で８４３ｍｇであった。脳組織を氷冷５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ｏ−フェナントロリン（ｐＨ７．４）中でポリトロンを用いてホモジナイズした。ホモジネートを５０，０００×ｇで２０分間遠心した。ペレットをトリス緩衝液中に再懸濁し、再びホモジナイズし、遠心ステップを繰り返した。最終ペレットをアッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ｏ−フェナントロリン、０．２ｕＭ  エナリプリラット（アンギオテンシン変換酵素を阻害するために加えるエナリプリルの二酸形態及び活性代謝物）、１００μｇ／ｍｌ  バシトラシン、３μＭ  アマスタチン、１μＭ  ホスホラミドン、０．１％  ＢＳＡ（ｐＨ７．４））中に再懸濁した。アッセイを０．５ｍｌ容量で１０ｍｇ湿重量組織／チューブを用いて室温で６０分間実施した。総タンパク質をＢｉｏＲａｄ  ＤＣアッセイキットを用いて測定した。Ｂ１特異的リガンドの冷ＤＡＬＫまたはヒトＢ１受容体に対して特異性を有する化合物との競合に感受性であるものとして特異的結合を測定する。図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃは、ヒトＢ１ブラジキニン受容体を発現しているトランスジェニックラット組織に対する３Ｈ−ＤＡＬＫの総結合、非特異的結合及び特異的結合の量の測定結果を示す。系統０００４（図９Ａ）は４０ｆｍｏｌ／ｍｇ−タンパク質の発現を示し、系統００１４（図９Ｂ）は４ｆｍｏｌ／ｍｇ−タンパク質の発現を示し、系統００１５（図９Ｃ）は７ｆｍｏｌ／ｍｇ−タンパク質の発現を示す。対照的に、非トランスジェニックラットの脳ではＢ１受容体は検出されない。系統０００４において３つの標準リード化合物に対して測定したＫｉ値は、ＣＨＯ細胞で発現したクローン化ｈＢ１受容体で得られた値と非常に類似している。従って、系統０００４におけるヒトＢ１ブラジキニン受容体の発現はヒトＢ１受容体に関して予想した特性を有している。
【００６６】
トランスジェニックラット脳及び脊髄におけるヒトブラジキニンＢ１受容体の発現を調べるために系統０００４をオートラジオグラフィーにかけた。トランスジェニックラット（系統０００４）をまず麻酔にかけた後脳を摘出した直後ドライアイスで凍結した。脳の冠状切片（２０μｍ）をクリオスタットにおいて作成した。選択した脳領域の隣接切片を２つに分け、緩衝液Ａ中室温（ＲＴ）で１５分間プレインキュベートした。プレインキュベート後、２つの脳切片を別々に緩衝液Ｂ中室温で９０分間インキュベートした。前記切片の１組は０．３ｎＭ  ［３Ｈ］ＤＡＬＫとインキュベートし、別の組は０．３ｎＭ  ［３Ｈ］ＤＡＬＫ及び２００μＭ  非標識Ｌ−８６４７４７とインキュベートした。インキュベーション後、両切片を氷冷緩衝液Ａで４分ずつ３回洗浄した後氷冷脱イオン水で５秒間濯いだ。切片を室温で冷風を用いて乾燥した後Ｆｕｊｉイメージングプレート（ＢＡＳ−ＴＲ２０２５）のカセットに室温で１週間置いた。プレートをＦｕｊｉ  ＢＡＳ−５０００マシンでスキャンし、画像をＭＣＩＤ  Ｍ５ソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。緩衝液Ａは５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  ＫＣｌであり、緩衝液Ｂは５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１００μｇ／ｍｌ  バシトラシン（Ｓｉｇｍａ  Ｂ−０１２５）、１μＭ  ホスホラミドン（Ｓｉｇｍａ  Ｒ−７３８５）、１ｍＭ  ｏ−フェナントロリン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−９３７５）、３μＭ  アマスタチン（Ｓｉｇｍａ  Ａ−１２７６）、０．１％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０）である。［３Ｈ］ＤＡＬＫはＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（カタログ番号ＮＥＴ１０９６）から購入する。
【００６７】
本研究の目的は、ヒトブラジキニンＢ１受容体遺伝子を有するトランスジェニックラットの脊髄及び脳組織におけるヒトブラジキニンＢ１受容体の発現をオートラジオグラフィーにより特徴づけることである。本研究では、Ｂ１受容体に対して放射性トレーサー［３Ｈ］ＤＡＬＫを使用し、［３Ｈ］ＤＡＬＫの受容体特異的結合を阻止するためにヒトブラジキニンＢ１受容体のアンタゴニストを使用した。アンタゴニストと競合しなかったシグナルを［３Ｈ］ＤＡＬＫの非特異的結合として定義した。オートラジオグラフィー研究の結果から、トランスジェニックラットの脊髄及び脳組織においてヒトブラジキニンＢ１受容体が発現したことが分かる。ＮＳＥ＿ヒトＢ１受容体トランスジェニック系統０００４では、ヒトブラジキニンＢ１受容体の発現が調べた脳及び脊髄の領域により異なっている。トランスジェニックラットにおいて［３Ｈ］ＤＡＬＫに対して最高の結合シグナルは脊髄の後角、大脳皮質、視床下部、視床、小脳、黒質、脚間核、孤束核、中脳水道周囲灰白質及び橋核で見られた。対照的に、［３Ｈ］ＤＡＬＫは非トランスジェニックラットの脳及び脊髄の対応領域において特異的結合シグナルを示さなかった。このことから、ヒトＢ１ブラジキニン遺伝子をラットゲノムへ組込むと、各種試験化合物及びヒトＢ１ブラジキニン受容体の公知モジュレーターに対して非天然選択的結合特性の表現型が与えられることが分かる。
【実施例４】
【００６８】
ＮＳＥ−ｈＢ１系統０００４に対する導入遺伝子導入部位のマッピング
ゲノムＤＮＡを系統０００４のトランスジェニックラットの組織から作成した。ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ１で部分的に消化し、製造業者（カリフォルニア州ラホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示に従ってｓｕｐｅｒＣＯＳ  Ｉベクターにクローン化した。コスミドクローンを、７０１ヌクレオチドからなる放射線標識プローブを用いるバクテリアコロニーの標準ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりスクリーニングにかけた。プローブは、プライマー５’−ＡＡＴＣＴＣＧＧＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧ−３’（配列番号３９）及び５’−ＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号４０）、鋳型としてＮＳＥ−ｈＢ１導入遺伝子構築物を用い、標準ＰＣＲ条件で得た。ポジティブコロニーを再びスクリーニングにかけ、第二回スクリーニングでポジティブだったクローンからコスミドＤＮＡを作成した。コスミド末端の配列決定をＴ３及びＴ７プライマーを用いて実施した。Ｔ３プライマーを用いて得たコスミドクローン１９のＤＮＡ配列は、透明な糖タンパク質遺伝子１（ＺＰ−１）の一部を含むラットゲノムＤＮＡに一致していることが判明し、Ｔ７プライマー由来の配列はＮＳＥ＿ｈＢ１導入遺伝子構築物の一部に一致した。導入遺伝子導入部位を精巧にマッピングするために、コスミド１９を制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩで消化し、生じた断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（カリフォルニア州ラホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化した。プラスミドＤＮＡはアンピシリン耐性コロニーから作成し、インサートの大きさを測定し、各種サイズインサートを有するクローンをｍ１３正プラスイマー及び逆プラスイマーを用いるＤＮＡ配列分析により分析した。クローンＤｒａ３７のＤＮＡ配列分析から、このクローンはラットゲノムＤＮＡ及びＮＳＥ−ｈＢ１導入遺伝子構築物の一部を含んでいることが分かった。よって、クローンＤｒａ３７は導入遺伝子導入部位の１端を含んでいた。Ｄｒａ３７由来のラットゲノムＤＮＡ配列のバイオインフォーマティックス分析から、このＤＮＡがドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）クローンＣＨ２３０−６Ｂ１１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ０９７３８７）のＤＮＡ配列と一致していたことを示した。クローンＣＨ２３０−６Ｂ１１は、コスミドクローン１９の末端配列決定により同定した同じ遺伝子である透明帯糖タンパク質遺伝子１（ＺＰ１）を含んでおり、染色体１にマッピングされる。従って、染色体１に組込まれた導入遺伝子はＺＰ１遺伝子に近い。導入遺伝子の組込み部位を描写すると、系統０００４ホモ接合型トランスジェニックラットを同定するための表現型アッセイを開発できた。このランダム導入部位は複数の導入遺伝子コピーを含んでいる。系統０００４導入遺伝子導入部位を含むクローンＤｒａ３７の配列は次の通りである。
【００６９】
【化１】
2005502341.tif 000002
【実施例５】
【００７０】
ＮＳＥ＿ｈＢ１系統０００４ホモ接合型トランスジェニックラットに対する遺伝子型アッセイの開発
遺伝子導入部位の下流のゲノムＤＮＡ配列を用いて、正ＰＣＲプライマー５’−ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＴＡＧＣ−３’（配列番号４２）及び逆ＰＣＲプライマー５’−ＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＧＴＡＧＣＣ−３’（配列番号４３）ＰＣＲプライマーを設計した。コスミドＤＮＡ鋳型及び標準ＰＣＲ手順を用いて、前記プライマーから９２２ヌクレオチドの産物を作成した。この９２２ヌクレオチドの断片は、放射線標識され、トランスジェニック染色体から野生型を識別するためのサザンブロット分析に使用され得る外部プローブとして役立つ。従って、野生型ラットゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩを用いてサザンブロット分析すると、外部プローブで約３．１ｋｂの単一断片が検出される。対照的に、導入遺伝子に対してヘテロ接合型のラットから作成したゲノムＤＮＡを消化すると、２つの断片が検出され、１つの断片は３．１ｋｂであり、もう一方の断片は約１．６ｋｂである。１．６ｋｂ断片は導入遺伝子導入部位を有する染色体に相当し、３．１ｋｂ断片は野生型染色体に相当している。よって、ＤｒａＩ消化及び外部プローブを用いるサザンブロット分析はホモ接合型野生型動物、ヘテロ接合型トランスジェニック動物及びホモ接合型トランスジェニック動物を同定するために使用することができる。これを使用して、ホモ接合型トランスジェニック繁殖コロニーを同定、樹立した。驚くことに、系統０００４ホモ接合型動物はヘテロ接合型動物に比して脳及び脊髄においてヒトＢ１ブラジキニン受容体を２倍以上発現する。
【実施例６】
【００７１】
ＮＳＥ  ｈＢ１トランスジェニックラットにおけるエキソビボ受容体占有率アッセイ
トランスジェニックラットを誘導チャンバに入れ、Ｆｌｏｗ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓフードの下でイソフルラン麻酔する。麻酔をかけたら、ラットを循環水加温ブランケット（Ｇａｕｍａｒ  Ｔポンプ）上に置き、ノーズコーンを介して２％イソフルランを用いて麻酔し続ける。尾静脈に、試験化合物またはベヒクルを収容したシリンジに接続した２５Ｇ翼付き注入装置を用いてカニューレを挿入する。所望用量の試験化合物を投与する。実験終了時に血液サンプルを採取し、ラットを安楽死させ、その後のアッセイのために組織（通常、脳及び脊髄）を摘出する。
【００７２】
ヒトＢ１受容体発現のオートラジオグラフィー分析のために、トランスジェニックラットから摘出した組織をドライアイス粉末で凍結し、−７０℃で保存した。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ，ＣＭ３０５０）を用いて脳の冠状切片及び脊髄の横断切片をそれぞれ２０μＭずつ作成した。凍結切片を−７０℃で保存した。分析のために、凍結切片を室温（ＲＴ）で１５分間加温した後、室温でラジオリガンドを含まない緩衝液中で１５分間プレインキュベートした。プレインキュベート後、切片をインキュベーション緩衝液に移し、室温で９０分間インキュベートした。０．３ｎＭ  ［Ｈ−３］ＤＡＬＫを含む緩衝液中でインキュベートすることにより非特異的結合及び特異的結合の両方の総結合を測定した。隣接切片を用いて非特異的結合を測定した。この切片を０．３ｎＭの［Ｈ−３］ＤＡＬＫに加えて２００ｎＭのヒトＢ１ブラジキニン受容体に対して高い親和性及び特異性を示す非ペプチド受容体アンタゴニストを含む緩衝液においてインキュベートした。９０分間インキュベートした後、切片を緩衝液で３分間ずつ３回洗浄し、ＤＩＨ２Ｏを用いて４℃で３０分間濯ぎ、室温で送風機により乾燥した。切片をＦｕｊｉイメージングプレートに置き、室温で一週間露出した。プレートをＦｕｊｉ  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ  ＢＡＳ  ５０００を用いてスキャンし、画像をＭＣＩＤ  Ｍ５ソフトウェアを用いて分析した。図１０に、ＮＳＥ＿ｈＢ１系統０００４トランスジェニックラットの脳及び脊髄切片のオートラジオグラムを示す。高い結合レベルを示す脳及び脊髄の領域を示す。特異的［Ｈ−３］ＤＡＬＫ結合［（総結合）−（非特異的結合）］がヒトＢ１ブラジキニン受容体発現のレベルを表す。非トランスジェニック対照ラットでは［Ｈ−３］ＤＡＬＫの特異的結合は検出できない。
【００７３】
ホモジネートベースの結合アッセイのために、凍結させた脳（大脳皮質または小脳）または脊髄（３５ｍｇ）を大量の氷冷アッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，ｐＨ７．４）においてポリトロンを用いてホモジナイズし、２つの冷却遠心管に移した。ペレット膜に対して管を４℃に予冷したローターにおいて７５，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て各チューブを氷冷緩衝液（２０ｍｌ）で濯いだ後氷冷アッセイ緩衝液においてペレットをホモジナイズした。ホモジネートをプールし、ラジオトレーサー、２０ｐＭの３５Ｓ標識非ペプチドヒトＢ１受容体アンタゴニストラジオトレーサーを収容しているチューブに加えた。各チューブには０．５ｍｌの室温アッセイ緩衝液を収容されている。ホモジネートをラジオトレーサー及び１００ｎＭの非標識非ペプチドヒトＢ１受容体アンタゴニストを含むチューブに添加することにより非特異的結合を測定する。所定時間（１、２、４、６、８、１０分）に、３つのチューブの内容物を０．０５％トリトン−１００に予浸積した２５ｍｍ  ＧＦ／Ｂフィルターを用いて濾過した。濾過ステップは、３つのチューブの各々に氷冷アッセイ緩衝液（４ｍｌ）を添加し、フィルター上に内容物を注ぎ、各フィルターを氷冷緩衝液（４ｍｌ）で洗浄することにより実施する。濾過のためにＨｏｅｆｆｅｒ  ＦＨ２２５Ｖ濾過マニフォールドを用いる。６つの時点が経過後非特異的結合チューブを同様に濾過する。フィルターを５ｍｌシンチレーションバイアルに移し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｒｅａｄｙ  Ｓａｆｅシンチレーション流体（３ｍｌ）に１０時間浸した後カウントした。
【００７４】
各時点で特異的結合を計算し［（総合ｃｐｍ）−（非特異的ｃｐｍ）］、線形回帰により会合の勾配を測定する。薬物処理動物における受容体占有率を下記式により求める。
【００７５】
占有率％＝（１−（勾配薬物／勾配ベヒクル））１００
勾配薬物は薬物処理動物からの会合率の勾配であり、勾配ベヒクルはベヒクル処理動物について測定した勾配である。
【００７６】
複数の特許文献及び刊行物を本明細書中引用したが、その内容物は援用により本明細書に含まれるとする。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】トランスジェニックプラスミド標的構築物のラットエノラーゼイントロンＡ  ｈＢ１ポリＡ２［ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ヒトＢ１ブラジキニン受容体コード配列＿ＢＧＨポリＡシグナル、ＣＭＶ＝ヒトサイトメガロウイルス，ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモン（構築物＃１；ＮＳＥ  ｈＢ１とも称する）］を示す。
【図２Ａ】図１Ａに描画した組込んだ導入遺伝子のラットエノラーゼイントロンＡ  ｈＢ１  ポリＡ２のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２Ｂ】図１Ａに描画した組込んだ導入遺伝子のラットエノラーゼイントロンＡ  ｈＢ１  ポリＡ２のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図３Ａ】ＮＳＥ  ｈＢ１転写物とも称されるラットエノラーゼイントロンＡ  ｈＢ１  ポリＡ２標的ベクターから作成した転写物の構造（図３Ａ）及びその配列番号２に記載の塩基配列（図３Ｂ）を示す。
【図３Ｂ】ＮＳＥ  ｈＢ１転写物とも称されるラットエノラーゼイントロンＡ  ｈＢ１  ポリＡ２標的ベクターから作成した転写物の構造（図３Ａ）及びその配列番号２に記載の塩基配列（図３Ｂ）を示す。
【図４】トランスジェニックプラスミド標的構築物のＣＭＶプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ヒトＢ１  ｃｄｓ＿ＢＧＨの構造を示す。
【図５】ラットゲノムプラスミド標的構築物のＣＭＶプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ｈＢ１  ｃｄｓ＿ＩＲＥＳ２／ＬａｃＺ＿ＢＧＨポリＡ（ｐＣＭＶ  Ｂ１  ＩＺとも称する）の一部を示す。
【図６Ａ】組込んだ導入遺伝子のＣＭＶプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ｈＢ１  ｃｄｓ＿ＩＲＥＳ２／ＬａｃＺ＿ＢＧＨポリＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図６Ｂ】組込んだ導入遺伝子のＣＭＶプロモーター＿ＣＭＶイントロンＡ＿ｈＢ１  ｃｄｓ＿ＩＲＥＳ２／ＬａｃＺ＿ＢＧＨポリＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図７】ラットゲノムプラスミド標的構築物のＴｈｙ−１＿ｈＢ１  ｃｄｚ＿ＩＺ  ｐＢＳ（Ｔｈｙ１  ｈＢ１  ＩＺとも称する）の一部を示す。
【図８Ａ】組込んだ導入遺伝子のＴｈｙ−１＿ｈＢ１  ｃｄｚ＿ＩＺ  ｐＢＳのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図８Ｂ】組込んだ導入遺伝子のＴｈｙ−１＿ｈＢ１  ｃｄｚ＿ＩＺ  ｐＢＳのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図８Ｃ】組込んだ導入遺伝子のＴｈｙ−１＿ｈＢ１  ｃｄｚ＿ＩＺ  ｐＢＳのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図９Ａ】（Ａ）：系統０００４（ラット＃１８１０）、（Ｂ）：系統００１４（ラット＃１８１３）及び（Ｃ）：系統００１５（ラット＃１８１４）のトランスジェニックラット脳組織から単離した膜に対する３Ｈ−ＤＡＬＫ（［脱−Ａｒｇ１０，Ｌｅｕ９］−カリジン）の飽和結合アッセイの結果を示す。
【図９Ｂ】（Ａ）：系統０００４（ラット＃１８１０）、（Ｂ）：系統００１４（ラット＃１８１３）及び（Ｃ）：系統００１５（ラット＃１８１４）のトランスジェニックラット脳組織から単離した膜に対する３Ｈ−ＤＡＬＫ（［脱−Ａｒｇ１０，Ｌｅｕ９］−カリジン）の飽和結合アッセイの結果を示す。
【図９Ｃ】（Ａ）：系統０００４（ラット＃１８１０）、（Ｂ）：系統００１４（ラット＃１８１３）及び（Ｃ）：系統００１５（ラット＃１８１４）のトランスジェニックラット脳組織から単離した膜に対する３Ｈ−ＤＡＬＫ（［脱−Ａｒｇ１０，Ｌｅｕ９］−カリジン）の飽和結合アッセイの結果を示す。
【図１０】ＮＳＥ＿ｈＢ１系統０００４トランスジェニックラットからの脳及び脊髄切片のオートラジオグラムを示す。非特異的結合はヒトＢ１受容体に対してサブｎＭアフィニティーを有するヒトＢ１ブラジキニン受容体の非ペプチドアンタゴニスト２００ｎＭの存在下で０．３ｎＭ  ［Ｈ−３］ＤＡＬＫを用いて測定した。総結合は０．３ｎＭ  ［Ｈ−３］ＤＡＬＫを用いて測定した。高い結合レベルを示す脳及び脊髄の領域を示す。特異的［Ｈ−３］ＤＡＬＫ結合［（総結合）−（非特異的結合）］はヒトＢ１ブラジキニン受容体発現のレベルを表す。非トランスジェニックの対照ラットでは［Ｈ−３］ＤＡＬＫの特異的結合を検出できなかった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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2005502341.tif 000085
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502341.tif 000086
【国際調査報告】
2005502341.tif 000087
2005502341.tif 000088