(57)【要約】ヒト化抗ＶＥＥＶ抗体は、ウイルス感染を防御および／または中和するために使用され得る。本発明によって提供されるのは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合するヒト化抗体であって、該ヒト化抗体は、非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域およびヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、ヒト化抗体である。ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合するヒト化抗体であって、該ヒト化抗体が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３とヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域とを含む、ヒト化抗体もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合するヒト化抗体であって、該ヒト化抗体は、非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域およびヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、ヒト化抗体。
【請求項２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
マウス抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
マウス抗体由来のＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスに結合するかまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス感染に関与する抗体の複数配列に由来するコンセンサス配列である少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
前記少なくとも１つの相補性決定領域が由来する非ヒト抗体に対して少なくとも５０％の相同性を有するヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
ヒト生殖系列抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
ヒト生殖系列抗体由来の第一のフレームワーク領域とヒト再配列抗体由来の第二のフレームワーク領域とを含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する抗体フラグメントであって、該抗体フラグメントは、非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域とヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域とを含む、抗体フラグメント。
【請求項１２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１３】
マウス抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１４】
マウス抗体由来のＣＤＲ３を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１５】
ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１６】
ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１７】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスに結合するかまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス感染に関与する抗体の複数配列に由来するコンセンサス配列である少なくとも１つの相補性決定領域を有する、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの相補性決定領域が由来する非ヒト抗体に対して少なくとも５０％の相同性を有するヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１９】
ヒト生殖系列抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項２０】
ヒト生殖系列抗体由来の第一のフレームワーク領域とヒト再配列抗体由来の第二のフレームワーク領域とを有する、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項２１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合するヒト化抗体であって、該ヒト化抗体が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３とヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域とを含む、ヒト化抗体。
【請求項２２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する抗体フラグメントであって、該ヒト化抗体が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３とヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域とを含む、抗体フラグメント。
【請求項２３】
配列番号９８の重鎖配列を含む、抗体。
【請求項２４】
配列番号１００の軽鎖配列を含む、抗体。
【請求項２４】
配列番号１０２の軽鎖配列を含む、抗体。
【請求項２５】
請求項１から請求項２４のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントをコードする、核酸。
【請求項２６】
請求項１から請求項２４のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントをコードする核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２７】
請求項１から請求項２４のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントをコードする核酸を含む発現ベクターによりトランスフェクションされた、宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１から請求項２４のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントと薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項２９】
請求項１から請求項２４のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントを被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
方法であって、
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を選択する工程；および
前記少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域をヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域に結合させてヒト化抗体を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、マウス抗体由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、マウス抗体由来のＣＤＲ３である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのフレームワーク領域が、前記少なくとも１つの相補性決定領域が由来する非ヒト抗体に対して少なくとも５０％の相同性を有するヒト抗体由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのフレームワーク領域がヒト生殖系列抗体由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
方法であって、
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする核酸を同定する工程；および
少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域をコードする該核酸を、ヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域をコードする核酸に連結させる工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする核酸である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、マウス供給源由来である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、マウス抗体由来のＣＤＲ３をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来の相補性決定領域をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つのフレームワーク領域をコードする前記核酸が、前記少なくとも１つの相補性決定領域が由来する非ヒト抗体に対して少なくとも５０％の相同性を有するヒト抗体をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１つのフレームワーク領域をコードする前記核酸が、ヒト生殖系列抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記連結された核酸が、ヒト化抗体フラグメントをコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記連結された核酸が、ヒト化完全抗体をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記連結された核酸を発現ベクターに連結する工程をさらに包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
宿主細胞を前記発現ベクターでトランスフェクションする工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１から請求項２４のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントを発現する、細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００２年５月１３日に出願された米国仮出願番号６０／３７９，９９４ぶに対して優先権主張し、その全内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府契約）
本発明に開示される研究はＣＤＣとの２つのＳＢＩＲ契約（ＳＢＩＲ契約番号第２００−１９９９−０００３４号および第２００−２０００−１００３２号）に基づき資金援助を得て行われたものである。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
（技術分野）
本開示は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）感染の診断試薬またはＶＥＥＶ感染の作用に対抗する抗ウイルス化合物に関する。さらに詳細には、本開示に従って作製されたヒト化抗ＶＥＥＶモノクローナル抗体は、ＶＥＥＶ主要糖タンパク質（Ｅ２）のＥ２ｃエピトープに結合し、ウイルス感染を予防および／または中和することができる。
【０００４】
（関連分野の背景）
ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスは、南アメリカ北部、トリニダード、中央アメリカ、メキシコ、およびフロリダ地方に特有の、節足動物媒介ウイルスのアルファウイルスの一種である（Ｓｍｉｔｈら、１９９７年、およびＰｈｉｌｌｐｏｔｔｓ、２００２年）。ＶＥＥＶ複合体に属する血清学的に異なる８種のウイルスがヒト疾患に関連付けられており、これらの病原体のうち最も重要な２つはサブタイプＩの改変体Ａ／ＢおよびＣと称される。これらの病原体はウマ、ラバ、バーロウ（小型のロバ）、およびロバにも重篤な疾患を引き起こす。家畜流行性の細胞株（血清グループ１Ａ／Ｂおよび１Ｃ）がウマに広がると致死的脳炎につながる重度のウイルス血症を引き起こし、さらに接触によりヒトへと広がる。
【０００５】
ヒトが宿主である場合には、一般的に、ＶＥＥＶの普遍的標的器官はリンパ系および（嗅神経系への直接的感染を通して）中枢神経系であるようである（Ｓｍｉｔｈら、１９９７年）。感染すると急性熱性症候群、場合によっては重篤な脳炎を発症する。このように、ウマにおける流行性感染がヒト脳炎の数千に及ぶ発症および数百の死亡を含む爆発的な自然流行を引き起こす可能性がある。ＶＥＥＶ感染は、通常、蚊刺咬により媒介されるが、このウイルスはエアゾールによっても高い感染力を示す（Ｓｍｉｔｈら、１９９７年）。自然発生による大流行に加え、ＶＥＥウイルスは、他のアルボウイルスに比較して、より多くの研究所内の感染疾患を引き起こした。このウイルスの最初の分離以来、少なくとも１５０例の研究所内獲得感染による疾患が報告されている。
【０００６】
アルファウイルスのインビトロおよびインビボにおける総合的特徴によりこれらは兵器として非常に適している。すなわち、（１）安価での大量生産が容易であり、（２）ヒトに対する強い感染力を安定に保ちつつエアゾールとすることが可能であり、しかも（３）感染により無能力化または致死感染のいずれかを生じる株が入手可能である。ＶＥＥＶは米国生物戦攻撃計画が中止される以前の１９５０年代および１９６０年代の米国において兵器として使用された。他の国々においてもこの病原体を兵器として使用していたか、または使用したことが疑われている。このウイルスは理論上、湿潤状態または乾燥状態のいずれでも産生することが可能であり、兵器としての安定化も可能であると思われる。エアゾールとしてウイルスを散布する生物戦攻撃では、ほとんどの場合、先ず、ヒトに対し疾患を引き起こす。
【０００７】
弱毒化ＴＣ−８３生ワクチンおよびホルマリン不活化Ｃ−８４ワクチンなどのＶＥＥＶに対するワクチンは存在するが、これらのワクチンはそれぞれ欠点を有している（Ｓｍｉｔｈら、１９９７年）。ＴＣ−８３はウマにおいては確実に防御効果を示し、その安全性も高いが、２０％までのヒトにおいて反応性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）であり、４０％までにおいては防御免疫の誘導に失敗する可能性がある（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、２００２年）。さらに、これは、糖尿病誘発および催奇形の可能性がある。不活化ＶＥＥＶワクチンＣ−８４は、残存性ウイルスを含む調製物を生じ、ワクチン投与者の４％に疾患を引き起こした（Ｓｍｉｔｈら、１９９７年）。また、Ｃ−８４ワクチンを投与したハムスターは、皮下チャレンジから防御されたが、エアゾール曝露からは防御されないという観察から、危険性のある研究者は、このワクチンでは十分に保護できないという懸念が生じた。したがって、ＶＥＥＶ特異的なヒトモノクローナル抗体またはヒト化マウスモノクローナル抗体による抗ウイルス治療は、ＶＥＥＶへの危険に曝されている人々、またはＶＥＥＶ曝露が既知の人々に対する代替治療を提供し得る。
【０００８】
マウス中和抗体は、トリニダード・ロバ親ウイルスの病原性サブタイプ１Ａおよびそのワクチン誘導体ＴＣ−８３の研究の中で見出された（Ｍａｔｈｅｗｓ、１９８５年、Ｒｏｅｈｒｉｇ、１９８８年）。２つのウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２には抗原性エピトープが決定されている。大きな糖タンパク質であるＥ２には８つの、小さな糖タンパク質であるＥ１には４つのエピトープが存在する。赤血球凝集および中和といった生物学的作用は主としてＥ２および４つのＥ２エピトープ（Ｅ２ｃ、Ｅ２ｆ、Ｅ２ｇ、Ｅ２ｈ）上に存在し、これらは、重要な中和ドメインにマップされる。これらのエピトープを標的とするマウス抗体の受動伝達により、動物をウイルスの致死的チャレンジから防御してきた。インビトロの研究において、感受性ベロ細胞またはヒト胚肺細胞へのウイルスの付着を最も効率的に阻止したモノクローナル抗体は、Ｅ２ｃエピトープに空間的に近位のエピトープを規定する抗体であった。このＥ２ｃモノクローナル抗体はウイルス付着後の中和においても最も効率的であった。
【０００９】
マウス抗体３Ｂ４Ｃ−４（Ｈｙ−４）（Ｍａｔｈｅｗｓ、１９８５年）はＥ２ｃエピトープに結合し、ＩｇＧ１アイソタイプを有し、付着後の中和を補体以外のＦｃエフェクター機能を介して行うのと同様に、ビリオン上の重要な部位において２価結合により中和を仲介することができる。
【００１０】
残念ながら、多くの事例において、ヒト免疫系はモノクローナル抗体をヒト体内には通常存在しない外来物質として認識する。これはヒトにおける免疫原性あるいは抗原性と称されている。このため、非ヒト起源の抗体をヒトに投与すると、非ヒト抗体に対する抗体が産生され、このことは、この非ヒト抗体の体内のクリアランスを増強し、従ってモノクローナル抗体の治療上または診断上の効果が低減または完全に阻害されてしまう。また、過敏反応を引き起こす可能性もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの感染を防御および／もしくは中和するために使用できる、ならびに／またはベネズエラウマ脳炎ウイルス診断の目的で使用することのできる、最適結合プロフィールを保持しながら、元の種由来の抗体に基づく、低下した免疫原性を示す操作抗体が提供されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（要旨）
ＶＥＥＶ主要糖タンパク質（Ｅ２）のＥ２ｃエピトープに結合し、ウイルス感染を予防および／または中和するために使用し得る、ヒト化抗体および機能性抗体フラグメントが本明細書中に開示される。ヒト化抗体および機能性抗体フラグメントはハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４により産生されるマウス抗体由来の相補性決定領域（特に、ＣＤＲ３）を含む。本発明の抗体を産生する方法は、マウスＣＤＲ３をヒトのフレームワーク領域に結合させて、ヒト化抗体または機能性抗体フラグメントを提供する工程を含んでいる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
ＶＥＥウイルスに結合および／または中和するヒト化抗体について本明細書中に記載する。このヒト化抗体は、ＶＥＥウイルス自体に結合するか、またはＶＥＥＶ感染に関与するレセプターに結合するかのいずれかである。特に有用な実施形態では、本明細書中に記載されるヒト化抗体および機能性抗体フラグメントは、ＶＥＥＶ主要糖タンパク質（Ｅ２）のＥ２ｃエピトープに結合し、ウイルス感染を予防および／または中和するために用いられ得る。ヒト化抗体および機能性抗体フラグメントは、好ましくは、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４により産生されるマウス抗体由来の相補性決定領域（特に、ＣＤＲ３）を含む。
【００１４】
本明細書中で使用される専門用語および科学用語は、本明細書中で別に定義されない限り、本教示が関与する技術分野における当業者が一般的に理解する意味を表す。当業者に公知の種々の方法論が本明細書中で参照される。そのような既知の方法論を記載している、参照した刊行物および他の資料は、全体を記載したかのように、その全体が本明細書中に参考として援用される。本明細書中で説明される方法の実施は、他に示されない限り、当該技術分野の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を用いる。このような従来技術は、文献に充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第１１巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｉｎｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）シリーズ、特に第１５４巻および第１５５巻（ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編）；ＰＣＲ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｑｕｉｒｋｅ，およびＴａｙｌｏｒ編、１９９１）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，１９８９，Ｒｏｉｔｔら、Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，１９９１，Ｍａｌｅら、Ｇｒｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１巻および第１１巻，１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ編）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１９８４（ＨａｒｎｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８６（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，１９８６（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ，１９８４，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ならびにＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，１９８７（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＷＯ９７／０８３２２０号；米国特許第５，４２７，９０８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９６９，１０８号；同第５，５６５，３３２号；同第５，８３７，５００号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，６４３，７５６号；同第５，７２３，２８７号；同第５，９５２，４７４号；Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６；Ｂａｒｂａｓら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら、１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０：１１９−１３５；Ｋｉｔａｍｕｒａ，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，６７：３５１−３５９；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２９−３４；Ｌｉｔｔｌｅら、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４１：１８７−１９５；Ｃｈａｕｔｈａｉｗａｌｅら、１９９２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５６：５７７−５９１；Ａｒｕｆｆｏ，１９９１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｔ．２：７３５−７４１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（編者）ら、１９９６，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈを参照のこと。これらの内容は、本明細書中に参考として援用される。
【００１５】
本明細書中に記載される方法の実施において、当業者に公知の適切なあらゆる材料および／または方法を利用可能であるが、好ましい材料および／または方法について説明する。後述する説明および実施例において参照され得る材料、試薬等は、特に説明しない限り、商業的供給源から入手され得る。用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」とはその最も広い意味で用いられる、すなわち、これらは非限定（オープンエンド；ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であり、そして例えば、「を含んでいるがこれらに限定されない」、「に含まれるがこれらに限定されない」。「を含むがこれらに限定されない」、および「を含むがこれらに限定されない」を意味することが理解されるべきである。
【００１６】
本明細書中に記載される技術に供され得る抗体（Ａｂ）は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、抗体軽鎖、抗体重鎖、および／またはファージディスプレイ技術もしくはファージミドディスプレイ技術由来の抗体フラグメントを包含する。機能性抗体フラグメントとは、完全抗体に通常見出される領域を欠損しているにもかかわらず抗原に結合することのできる抗体フラグメントである。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は機能性抗体フラグメントに含まれる。
【００１７】
本明細書中に記載される抗体または機能性抗体フラグメントは、非ヒト抗体の配列および構造を操作してこれらをよりヒト抗体様にし、したがって、ヒトにおける免疫原性を低減または除去するように調製される。
【００１８】
いくつかのヒト化ストラテジーが当業者に公知であり、そして本発明のヒト化抗体の作製に使用され得る。通常、最初の工程は、ＶＥＥウイルスに結合するかおよび／またはＶＥＥウイルスを中和することが知られている開始非ヒト抗体を取得することである。モノクローナル抗体を作製するための技術およびクローニングする技術は当業者に周知である。２つ以上の所望の抗体を取得した後、各抗体の配列を決定する。すなわち、可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、ＣＤＲの任意の可能な定義（例えば、Ｋａｂａｔ単独、Ｃｈｏｔｈｉａ単独、組み合わせたＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ、および当業者に公知の任意のたのもの）を使用して、構成要素部分（すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）、ＣＤＲ、バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）ゾーン領域、およびＶＨ／ＶＬ相互作用領域）により同定してもよく、そしてこのようにして同定され得る。
【００１９】
本発明の方法によれば、高発現、ＶＥＥウイルスもしくはＶＥＥＶ感染に関与するレセプターに対する高親和性、特異性、および／または活性の中の１つ以上を含む、多数の基準に基づいて１つ以上の特異的非ヒト抗体を選択する。標的に対して高親和性またはより高い親和性を示す抗体を単離するためのスクリーニング法は、当該分野で周知である。例えば、糸状バクテリオファージの表面に融合したポリペプチドの発現は、多数のクローンの組合せから特定の配列を回収するための強力な方法を提供する（Ｓｍｉｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３１５−１５１７，１９８５）。ペプチドまたはタンパク質に結合する抗体は、比較的簡単なパンニング法により大きなライブラリーから選択されている（例えば、Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６−２９０，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６，１９９０；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：６３７８−６３８２，１９９０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４，１９９０；Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２−１０８３８，１９９２；およびＫａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４３６３−４３６６，１９９１）。ファージディスプレイ、ファージミドディスプレイ、リボソームディスプレイ、および細胞表面ディスプレイを含め、種々の技術が、抗体ライブラリーのディスプレイに関して公知である。抗体をスクリーニングするために有用なパンニング法では、標的リガンドを、例えば、プレート、磁性粒子、セファロースなどのビーズ、カラムに用いられるビーズなどに固定し得る。特定の実施形態では、標的リガンドは、例えば、ビオチン、２−蛍光色素（例えば、ＦＡＣＳ選別用）を用いてタグ化され得る。
【００２０】
抗体を発現するファージまたはファージミドのライブラリーのスクリーニングでは、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子に抗体が融合している、ファージベクターおよびファージミドベクターを利用する。標的リガンドを製造者の指示書に従って磁性ビーズに結合させる。ビーズおよび他の未反応基への非特異的結合をブロックするために、ビーズを過剰量のＢＳＡとともにインキュベートしてもよい。次いで、ビーズをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０に懸濁し、プラスチックチューブの側面に沿って強磁石を用いて回収することを多数回行うことによって、ビーズを洗浄する。次いで、ビーズは必要になるまで冷蔵保存する。スクリーニング実験では、ライブラリーのアリコートを、再懸濁したビーズ試料に混合し得る。チューブの内容物を低温（例えば、４〜５℃）で十分な時間（例えば、１〜２時間）回転させる。その後、強磁石を使って磁性ビーズを回収し、液を吸引除去する。次いで、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を加え、試験管を数回倒置してビーズを懸濁させ、さらに磁石を用いてビーズをチューブの壁に引き寄せることにより、ビーズを洗浄する。次いで、内容物を除去し、さらに５〜１０回の洗浄を繰り返す。５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を、この洗浄したビーズに加え、タンパク質を変性させ、そして結合したファージを遊離させる。インキュベーションを短時間行った後、ビーズを強磁石でチューブの壁に引き寄せ、液体内容物をきれいなチューブへ移す。１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）または１ＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）をこのチューブに加えて、ファージ試料のｐＨを中和する。次いで、ファージを、（例えば、１０−３〜１０−６に）希釈し、アリコートを大腸菌細胞とともにプレーティングして、試料のプラーク形成単位数を決定する。特定の場合には、プレーティングはプラークを色で識別するために（すなわち、ｌａｃＺ＋プラークは青、ｌａｃＺ−プラークは白）、ＸＧａｌおよびＩＰＴＧの存在下で行われる。投入した試料の力価も比較のために決定する（希釈は一般に、１０−６〜１０−９である）。
【００２１】
あるいは、抗体を発現するファージライブラリーのスクリーニングを、例えば、以下の通りに、マイクロタイタープレートを用いて達成し得る。標的リガンドを、例えば、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５で希釈し、少ないアリコートのリガンド溶液を（例えば、４℃で一晩のインキュベートにより）マイクロタイタープレートウェル上に吸着させる。ＢＳＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５中）のアリコートを加え、プレートを室温で１時間インキュベートする。マイクロタイタープレートの内容物を除去し、ウェルをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で慎重に洗浄する。プレートを繰り返し洗浄して、未結合の標的を除去する。少量のアリコートのファージ溶液を各ウェルに入れ、室温で１〜２時間インキュベートする。マイクロタイタープレートの内容物を除去後、プレートを繰り返し洗浄する。プレートを各ウェル中に洗浄溶液を入れた状態で２０分間、室温でインキュベートし、高い解離定数の結合したファージを遊離させる。次いで、ウェルを複数回（例えば、５回）洗浄し、未結合ファージを全て除去する。ウェルに結合したファージを回収するために、ｐＨの変更を用い得る。５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、１００μ／ｍｌのＢＳＡ溶液のアリコートを洗浄後のウェルに加えてタンパク質を変性させ、結合したファージを遊離させる。５〜１０分後、次いで、内容物をきれいなチューブに移し、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）または１ＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）の少量のアリコートをファージ試料に加え、ｐＨを中和する。次いで、ファージを、（例えば、１０−３〜１０−６に）希釈し、アリコートを大腸菌細胞とともにプレーティングして、試料のプラーク形成単位数を決定する。特定の場合には、プレーティングはプラークを色で識別するために（すなわち、ｌａｃＺ＋プラークは青、ｌａｃＺ−プラークは白）、ＸＧａｌおよびＩＰＴＧの存在下で行われる。投入した試料の力価も比較のために決定する（希釈は一般に、１０−６〜１０−９である）。
【００２２】
別の代替方法によれば、抗体ライブラリーのスクリーニングは、第一の「濃縮」工程および第二のフィルターリフト工程を含む方法を用いて、以下の通りに達成され得る。（例えば、ファージ中の）発現されたコンビナトリアルライブラリー由来の、所定のリガンドに結合し得る（陽性）抗体を、最初に、アフィニティクロマトグラフィーに１回または２回かけて濃縮する。マイクロタイターウェルを、選り抜きのリガンド（例えば、１００μｌ中約１０μｇ）を用いて受動被覆する。次いで、ウェルをＢＳＡ溶液でブロックして、プラスチック表面への抗体の非特異的付着を防止する。次いで、抗体を発現する粒子約１０１１個をウェルに添加し、数時間インキュベートする。プレートの洗浄を繰り返し、結合しなかった抗体を除去した後、特異的に結合した抗体を酸性グリシン−ＨＣｌ溶液または他の溶出用緩衝液を用いて溶出する。溶出した抗体ファージ溶液をアルカリにより中和し、そして例えば、大腸菌に感染させて、寒天中にブロスを含む大きなペトリ皿にプレーティングすることにより、増幅させる。次いで、抗体を発現している増幅培養物の力価を測定し、そしてこのプロセスを繰り返す。あるいは、市販の活性化ビーズ試薬を用いてリガンドをアガロースビーズまたはアクリルアミドビーズに共有結合させることもできる。次いで、抗体溶液を、結合したビーズマトリックスを含む小さなカラムに単に通した後、このカラムを十分に洗浄し、そして酸または他の溶離液により溶出する。どちらの場合も、陽性物を約１／１０５より高い頻度まで濃縮することを目的としている。濃縮後、フィルターリフトアッセイを行う。例えば、抗体がファージ中に発現されている場合、約１〜２×１０５個のファージを５００μｌの対数増殖期の大腸菌に添加し、ブロス中に０．７％アガロースを含む大きなＬＢ−アガロースプレート上にプレーティングする。アガロースを凝固させ、アガロース表面にニトロセルロースフィルター（例えば、０．４５μ）を置く。一連の位置決めのマークを滅菌針で付けて、下記に示すような発色後のフィルターおよびプレートの置き直しを可能にする。ファージのプラークを、３７℃で一晩インキュベートすることにより発色させる（フィルターがあってもこのプロセスの妨げにはならない）。次いで、プレートからフィルターを取り除くと、それぞれの個々のプラークからのファージは、もとの位置と同じ位置に付着している。次いで、フィルターをＢＳＡまたはその他のブロッキング剤の溶液に１〜２時間曝露して、リガンド（または「プローブ」）の非特異的結合を防止する。プローブ自体を、例えば、ビオチン化（市販のＮＨＳ−ビオチンを使用）によるかまたは例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリフォスファターゼでの直接酵素標識によるかのいずれかで、標識する。この様式で標識されたプローブは無期限に安定であり、数回の再使用が可能である。ブロックされたフィルターをプローブ溶液に数時間曝露して、プローブに対して顕著な親和性を示すペプチドを提示するフィルター上のファージにプローブを元の位置で結合させる。次いで、フィルターを洗浄して未結合のプローブを除去し、次いで、フィルターを、（直接標識されたプローブの場合は）酵素��質溶液に曝露することにより、または（ビオチン化プローブの場合には）酵素標識アビジン溶液にさらに曝露することにより、発色させる。陽性ファージプラークは、元のプレート上のプラークに対応する、フィルター上の着色した酵素切断産物の局所沈着により同定される。発色したフィルターは、位置決めマークを用いてプレートと簡便に再度並べられ、そして「陽性」プラークをアガロースからくりぬいて、ファージを回収する。元のプレート上のプラークは高密度であるので、一回でプレートから単一のプラークを単離することは通常不可能である。したがって、初回のコアから回収したファージを低密度で再度プレーティングし、そしてこのプロセスを繰り返してそれぞれのプラークの単離、それゆえ、ファージのシングルクローンの単離を可能にする。
【００２３】
細菌細胞の外表面上に抗体を発現しているプラスミドベクターのライブラリーのスクリーニングは、下記の通り、磁性ビーズを用いて達成され得る。本質的に、ファージベクターのスクリーニングについて上記で記載した通りに、標的リガンドを磁性ビーズに結合させる。細菌細胞の表面に発現された複数の抗体を発現している組換えプラスミドベクターを含有する細菌細胞試料を、再懸濁させた少量のアリコートのビーズと混合する。チューブの内容物を４℃で１〜２時間、混転させる。次いで、磁性粒子を強磁石を使用して回収し、液体を吸引により除去する。次いで、例えば、１ｍｌのＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加し、チューブを数回倒置してビーズを再懸濁させ、再度、磁石でビーズをチューブの壁に引き寄せ、液体内容物を除去することにより、ビーズを線状する。ビーズを、さらに５〜１０回繰り返し洗浄する。次いで、ビーズを培養培地（例えば、ＬＢ＋アンピシリン）の試料を含む培養フラスコに移す。結合した細胞は、富栄養培地中で細胞分裂し、娘細胞が固定化標的から離れる。細胞が対数増殖期にある場合には、培養物に再度誘導物質を添加して、さらに多くの抗体を産生させる。次いで、これらの細胞を遠心分離により集め、再スクリーニングを行う。スクリーニングを複数回（例えば、一連のスクリーニングを何ラウンドも）用いて、成功裏のスクリーニング実験を最適に実施する。次いで、回収した細胞を低密度でプレーティングして、個々の分析用の単離されたコロニーが得られる。個々のコロニーを選択し、これを用いて、アンピシリン含有ＬＢ培養培地に接種する。３７℃で一晩培養した後、培養物を遠心分離によりスピンダウンする。次いで、個々の細胞アリコートを、ビーズに結合した標的リガンドへの結合について再試験する。無関連のリガンドが結合した他のビーズへの結合は、陰性コントロールとして使用され得る。
【００２４】
あるいは、細菌細胞の表面に抗体を発現しているプラスミドベクターのライブラリーのスクリーニングを、下記の通りに達成し得る。標的リガンドを、ファージベクターのスクリーニングについて上記に記載した通りに、マイクロタイタープレートに吸着させる。ウェルを未結合の標的リガンドがなくなるまで洗浄した後、細菌細胞試料を少量の体積の培養培地に添加し、マイクロタイターウェル中に入れる。十分にインキュベートした後、未結合の細菌を含まないようにプレートを繰り返し洗浄する。大量の体積の、約１００ｍｌのＬＢ＋アンピシリンを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートする。結合した細胞は富栄養培地中で細胞分裂し、娘細胞は、固定された標的から離れる。次いで、ウェル中の内容物を、約１０ｍｌのＬＢ＋アンピシリンを含む培養フラスコに移す。細胞が対数増殖期にある場合には、培養物に再度誘導物質を添加して、さらに多くの抗体を産生させる。次いで、これらの細胞を遠心分離により集め、再スクリーニングを行う。スクリーニングは、磁性ビーズを使用するスクリーニングに関して上記の通りの一連のスクリーニングを何ラウンドも用いて行うことができる。
【００２５】
別の実施形態によれば、ベクターまたは宿主細胞（例えば、ファージまたは細菌細胞）の表面タンパク質として抗体を発現しているライブラリーを、固相マトリックス（例えば、セファロース、シリカなど）上にリガンドを固定したカラムにライブラリーの溶液を通し、十分な洗浄および溶出の後、カラムに結合しているファージを回収することにより、スクリーニングし得る。
【００２６】
ライブラリーのスクリーニングの１つの重要な局面は、溶出の局面である。説明を明確にするために、以下ではファージによる抗体の発現について論考する。しかしながら、そのような論考は抗体が表面の融合分子上に発現されるあらゆる系に応用可能であることは容易に理解できる。ファージの回収の際にペプチド−標的の相互作用を破壊する条件は、ファージ上に発現された複数のタンパク質由来のあらゆる所定のペプチド配列に特異的であると考えられる。例えば、ある相互作用は酸性ｐＨにより破壊されるが、塩基性ｐＨでは破壊されなくてもよく、逆も同様である。したがって、種々の溶出条件（例えば、ｐＨ２〜３、ｐＨ１２〜１３、競合における過剰の標的、界面活性剤、穏やかなタンパク質変性剤、尿素、種々の反応温度、光、金属イオンの存否、キレート剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない）を試験して、各セットの条件下で回収されたファージ上に発現された抗体の一次構造を比較し、リガンド／抗体の各組み合わせにとって適切な溶出条件を決定するべきである。これらの溶出条件のいくつかは、ファージの感染と不適合であり得る。なぜなら、これらは、殺細菌性であり、透析により除去される必要があるからである。異なる発現タンパク質が異なる条件下で溶出される能力は、標的への結合に関わる特定のペプチド領域の変性だけでなく、隣接領域におけるコンホメーションの変化によっても起因し得る。これらの隣接配列は、実際の結合配列との組み合わせで変性され得る；これらの隣接領域はまた、溶出条件下（すなわち、ｐＨ２〜３、ｐＨ１２〜１３、競合における過剰の標的、界面活性剤、穏やかなタンパク質変性剤、尿素、熱、冷却、光、金属イオンの存否、キレート剤など）への曝露に応じてその２次構造または３次構造が変化し、この変化は次に、標的への結合を担うペプチドのコンホメーションの変形をもたらす。
【００２７】
所望の特徴（例えば、良好な発現およびＶＥＥＶ感染に対する所望の効果）を示す抗体の回収に適切なあらゆるパンニング法が適切であることを理解すべきである。回収およびどの抗体が所望の特徴を備えているかを決定した後、これら抗体の配列を決定し、抗体をヒト化について選択する。
【００２８】
配列を決定した後、ヒト化の最初の段階として、この配列と、既知のヒト抗体配列に関する１つ以上のデータベース（例えば、生殖系列、再配列、あるいは両者）との間の比較を行う。この比較は、この配列をデータベース中の配列と整列し、比較している配列間の相同性の程度を決めることにより行われる。整列検索のためのコンピュータープログラム（例えば、ＢＬＡＳＴなど）は、当該分野で周知である。例えば、ヒトアミノ酸配列またはヒト遺伝子配列の情報源は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮＣＢＩタンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）、ヒト抗体遺伝子のデータベースであるＶＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）（生殖系列配列）、および免疫グロブリンに関するＫａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）（再配列された配列）などの任意の適切な参照データベースまたはこれらの翻訳産物により適切に見いだすことができる。整列をヌクレオチド配列に基づいて行った場合、選択された遺伝子を分析して、そのサブセットのどの遺伝子が、本明細書中に記載される通りの元の種の抗体に相同性が最も高いアミノ酸を有するかを決定すべきである。データベース中の他の配列に比較して、より高い程度の相同性に近づくアミノ酸配列または遺伝子配列は、本明細書中に記載の手順に従って利用可能および操作可能であることが予期される。特定の実施形態では、相同性の許容可能な範囲は、約５０％よりも高い。もちろん、より高い相同性が要求され得る。いずれの場合でも、選択された非ヒト抗体配列と比較して最も高い相同性を有するヒト配列を同定する。選択されたヒト配列は、少なくとも、本開示に従って作製されるヒト化抗体のフレームワーク領域を提供する。少なくとも１つの非ヒトＣＤＲ（好ましくは、非ヒトＣＤＲ３）は、これらのヒトフレームワーク領域の間に配置されて、本開示に従ったヒト化抗体が作製される。
【００２９】
さらに、１より多くのヒト配列を選択して、本開示に従ってヒト化抗体の異なる部分を提供し得ることも予期される。１つの特に有用な実施形態では、本発明のヒト化抗体の一部がヒト生殖系列配列由来であり、本発明のヒト化抗体の他の部分が再配列されたヒト抗体配列由来である。
【００３０】
ヒト化抗体または機能性抗体フラグメントを構築するための次の工程は、先に選択したヒト配列のフレームワーク領域に組み込むべきＣＤＲを選択することを含む。選択されたＣＤＲは、１つ以上の供給源に由来し得る。ＣＤＲ３に関しては、相同性決定に使用される特定の非ヒト抗体由来のＣＤＲ３が選択される。上記したように、ＣＤＲ３が選択される特定の非ヒト抗体は、ＶＥＥウイルスまたはＶＥＥＶ感染に関与するレセプターに関する発現効率、親和性、特異性、および活性を含むがこれらに限定されない多数の因子に基づいて、有利に選択され得る。これらの因子のそれぞれを評価するための技術は、当業者の技術範囲内である。
【００３１】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２に関しては、以下の１以上の供給源からの選択が行われる。ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２は、相同性決定に使用される特定の非ヒト抗体から選択することができる。あるいは、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２は、ＶＥＥウイルスあるいはＶＥＥＶ感染に関与するレセプターに結合する複数の抗体配列の配列由来であるコンセンサス配列から選択することもできる。さらに別の代替として、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２は、非ヒト抗体配列との比較により同定されたヒト配列から選択することができる。
【００３２】
特定の位置を除いて、フレームワーク残基は一般にアクセプター種として配列が割り当てられる。例えば、ＶＨ／ＶＬ界面またはバーニアゾーン位置のいずれかでの非相同アミノ酸残基は、ドナー配列とアクセプター配列との間での選択肢として保持される。ヒト化抗体の起こり得る免疫原性をさらに回避するためには、通常、ヒト抗体由来のアクセプターフレームワークの表面残基を保持することが望ましい。しかしながら、表面に出る残基の中には、ＶＨ／ＶＬ界面またはバーニアゾーンと指定されるものもいくつか存在する。そのような場合には、ドナー由来またはアクセプター由来のいずれかのフレームワーク配列を選択することになる。
【００３３】
ＣＤＲの選択およびアクセプターフレームワーク領域へのＣＤＲの割り当てをした後、ヒト化抗体または機能性抗体フラグメントの組立てを当業者に公知の従来方法により達成し得る。例えば、本明細書中で説明する改変された可変ドメインをコードするＤＮＡ配列がオリゴヌクレオチド合成により作製され得る。続いて、本明細書中で説明する改変された可変ドメインをコードする核酸が、プライマー指向性のオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発（すなわち、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを、変異させるべき領域を含む一本鎖核酸にハイブリダイズさせ、その一本鎖をオリゴヌクレオチドの伸長のテンプレートとして使用し、変異を含む鎖を作製すること）により構築されてもよい。部位特異的変異誘発に使用されたオリゴヌクレオチドは、オリゴクヌレオチド合成によって調製されてもいいし、または、適切な制限酵素を用いて標的種のフレームワークをコードする核酸から単離してもよい。
【００３４】
選択ディスプレイシステムのいずれも、本開示によるライブラリーと共に使用できる。大型ライブラリーから所望のメンバーを単離するための選択プロトコールは、ファージディスプレイ技術に代表されるように、当該分野で公知である。そのようなシステムでは、多様なペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面上に提示され［ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６］、インビトロ選択のための抗体フラグメント（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリー作製および標的抗原に結合する特異抗体フラグメントを増幅する上で有用であることが証明されている。ＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列およびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌の細胞周辺腔へそれら領域を誘導するリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結され、結果として、得られた抗体フラグメントはバクテリオファージの表面上に（代表的には、バクテリオファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）への融合物として）提示される。あるいは、抗体フラグメントはλファージのキャプシド（ファージ体）上外面に提示される。ファージまたはファージミドに基づくディスプレイシステムの利点は、抗体タンパク質がそれをコードする遺伝子に連結している生物学的システムであるから、選択されたライブラリーメンバーを含有するファージを細菌細胞中で増殖させることにより、選択されたライブラリーメンバーを簡単に増幅することができる点である。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列はファージまたはファージミドベクターに含まれるので、配列決定、発現、それに続く遺伝子操作が比較的簡単である。バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築方法は、当該分野で周知である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２；Ｋａｎｇら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３；Ｃｈａｎｇら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら（１９９１）Ｇｅｎｅ，１０４：１４７；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｂａｒｂａｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７；ＨａｗｋｉｎｓおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：８６７；Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７；Ｌｅｒｎｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３１３；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。
【００３５】
一つの特に有利なアプローチは、ｓｃＦｖファージライブラリーの使用である（Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）前出；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）前出；Ｍａｒｋｓら（１９９１）前出；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：８０；Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されるｓｃＦｖライブラリーに関する多くの実施形態が記載されている。ファージディスプレイアプローチの改良についても公知であり、例えば、ＷＯ９６／０６２１３号およびＷＯ９２／０１０４７号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌら）ならびにＷＯ９７／０８３２０号（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）に記載されており、これらは本明細書中に参考として援用される。Ｆａｂライブラリーの提示もまた公知であり、例えば、ＷＯ９２／０１０４７号（ＣＡＴ／ＭＲＣ）およびＷＯ９１／１７２７１号（Ａｆｆｙｍａｘ）に記載される通りである。
【００３６】
抗体またはポリヌクレオチドのライブラリーを作製するための他のシステムは、ライブラリーのメンバーをインビトロ合成するための無細胞酵素機構の使用を含む。１つの方法においては、標的リガンドに対する選択とＰＣＲ増幅とを交互に繰り返すことにより、ＲＮＡ分子を選択する（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８）。所定のヒト転写因子を結合するＤＮＡ配列を同定するために同様の技術を使用することができる（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢａｃｈ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３２０３；ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５；ＷＯ９２／０５２５８号およびＷＯ９２／１４８４３号）。同様に、大型ライブラリーを作製するための方法として、インビトロ翻訳を、抗体分子の合成のために用い得る。一般に安定化ポリソーム複合体を含むこれらの方法は、以下にさらに記載されている：ＷＯ８８／０８４５３号、ＷＯ９０／０５７８５号、ＷＯ９０／０７００３号、ＷＯ９１／０２０７６号、ＷＯ９１／０５０５８号、およびＷＯ９２／０２５３６号。例えばＷＯ９５／２２６２５号およびＷＯ９５／１１９２２号（Ａｆｆｙｍａｘ）に開示されているシステムのような、ファージに基づかない代替のディスプレイシステムは、選択用の抗体分子の提示にポリソームを使用する。これらの文献および前述の文献の全てはまた、本明細書中に参考として援用される。
【００３７】
抗体はファージまたはファージミド粒子表面上に存在するので、ディスプレイベクター中にクローン化されたヒト化抗体および機能性抗体フラグメントは、良好な結合活性を保持している改変体を同定するために、適切な抗原に対して選択され得る。例えば、Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。この内容は、本明細書中に参考として援用される。あらゆるファージディスプレイベクターまたはファージミドディスプレイベクターも使用できるが、本方法論においてはｆｄｔｅｔＤＯＧ、ｐＨＥＮ１、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、ｐＲＬ４またはｐＲＬ５（これらは、国際出願ＷＯ０２／４６４３６Ａ２に記載されている）のようなベクターが有用である。例えば、Ｆａｂフラグメントの場合、軽鎖および重鎖のＦｄ産物はｌａｃプロモーターにより制御されており、各鎖は、細菌宿主の周辺腔へと誘導するための、これに融合されたリーダーシグナルを有する。抗体フラグメントが適切に組立られ得るのは、この周辺腔においてである。重鎖フラグメントはファージコートタンパク質ドメインとの融合物として発現され、これにより組み立てられた抗体フラグメントは、新たに作製されたファージまたはファージミド粒子のコートに組み込まれる。新たなファージミド粒子の産生には必要なファージ遺伝子の全てを含有するヘルパーファージの添加が必要である。いったん抗体フラグメントのライブラリーをファージまたはファージミド表面に形成した後にパンニングを行う。ある実施形態においては、上記したように、ｉ）ファージ粒子またはファージミド粒子の表面上に提示された抗体を所望の抗原に結合させ、ｉｉ）非結合のものを洗い流し、ｉｉｉ）結合した粒子を抗原から溶出させ、ｉｖ）溶出させた粒子を新しい細菌宿主に曝露し、さらなる回の選択用の濃縮プールを得る。通常、抗体クローンを特異的結合に関してスクリーニングをする前に、パンニングを３〜４回実施する。このようにして、ファージ／ファージミド粒子により、結合している表現型（抗体）を遺伝子型（ＤＮＡ）に関連付けることができ、抗体提示技術を非常に首尾よくに利用できる。しかし、他のベクター形式を、このヒト化プロセス（例えば、抗体フラグメントライブラリーを、選択および／またはスクリーニング用の溶菌ファージベクター（改変Ｔ７またはλ−Ｚａｐシステム）中にクローニングすること）に使用することも可能である。
【００３８】
所望のヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントを選択した後、当業者に公知の任意の技術（例えば、インビトロ合成、組換えＤＮＡ生産等）によってこれらが大量に生産され得ることが意図される。例えば、ヒト化抗体をコードする発現ベクターを構築する従来技術を用いて、ヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントを産生することができる。適切な宿主中で抗体を発現させるために適切な、適切な制御配列を当業者は容易に推定し得る。
【００３９】
次いで、従来技術により、発現ベクターを適切な宿主細胞に移入し、ヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントの発現用のトランスフェクションされた宿主細胞を作製する。次いで、このトランスフェクションされた宿主細胞を当業者に公知の任意の適切な技術により培養し、ヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントを作製する。
【００４０】
ある実施形態においては、宿主細胞を２つの発現ベクターと共に同時トランスフェクションしてもよく、ここで、第１のベクターは、重鎖由来のポリペプチドをコードしているオペロンを含み、第２のベクターは、軽鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含む。これら２つのベクターは異なる選択マーカーを有していてもよいが、重鎖コード配列および軽鎖コード配列以外は、同一であることが好ましい。この手順により、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの等しい発現が提供される。あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両者をコードしている単一ベクターを使用することも可能である。重鎖コード配列および軽鎖コード配列は、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ、またはその両者を有していてもよい。
【００４１】
ある実施形態においては、ヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントの発現に使用する宿主細胞として、大腸菌のような細菌細胞または真核生物細胞のいずれも使用可能であるが、真核生物細胞の方がより好ましい。好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＬＳ細胞、２９３ＥＢＮＡなどの哺乳動物細胞が使用され得る。発現ベクターの選択は宿主細胞の選択に依存し、選択された宿主細胞中での所望の発現および調節特性を有するように選択され得る。
【００４２】
一旦産生されると、ヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントは、クロスフローろ過、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの、当該分野で標準的な手順により精製することができる。
【００４３】
本開示による抗体の作製にとって好ましい技術には、標的抗原またはその抗原性フラグメントにより免疫した動物から得た抗体ドメインのインビトロ単離技術、およびそのようなドメインを用いて構築された合成ライブラリーから抗体を選択する技術が含まれる。
【００４４】
ＲＮＡは、免疫したマウスの脾臓または骨髄細胞から、例えば、Ｔｒｉ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を用いて入手され得る。代替方法は当該分野で公知であり、そしてまた用いられ得、このような方法の例としては、例えば、グアニジンチオシアネートで処理した後に塩化セシウム密度勾配遠心による単離（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−５２９９，１９７９）、およびバナジウム化合物などのリボヌクレアーゼ阻害剤の存在下にて界面活性剤で処理した後のフェノール処理（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５１４３−５１４９，１９７９）が挙げられる。
【００４５】
ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを取得するために、そのＲＮＡをテンプレートとして使用し、その３’末端のポリＡ鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして使用して逆転写酵素で処理することにより、そのＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し得る（Ｌａｒｒｉｋ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：９３４−９３８，１９８９）。さらに、１つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ１定常領域）に特異的な配列に結合するオリゴヌクレオチドと一緒に遺伝子特異的プライマーを使用することもできる。ｃＤＮＡ合成キットは、当該分野で広く入手可能である。
【００４６】
元の種の抗体可変領域遺伝子の特異的増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅技術を用いて、上記のｃＤＮＡから行うことができる。プライマー（例えば、Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋまたはＪｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１に記載されているプライマー）を、元の種の抗体可変領域遺伝子の増幅に使用することができる。ＰＣＲは遺伝子特異的プライマーを用いても実施され得る。単一プライマーによる増幅（例えば、その開示全体が本明細書中に参考として援用される、２００１年１２月１０日出願の米国出願第１０／０１４，０１２号および２００１年９月１９日出願の同第６０／３２３，４５５号に記載されているプロセス）も用いられ得る。可変領域遺伝子をファージもしくはファージミドまたは他の適切な選択システムにクローン化し、標的に対する選択用ライブラリーを提供し得る。ライブラリーの構築およびパンニングの技術は、当該分野で周知である。
【００４７】
ヒト定常ドメインγ（例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４、好ましくはγ１またはγ４）に融合したヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントの重鎖可変ドメインをコードしている挿入物を含む組換え核酸は、当業者によって、本開示に従って構築することができる。ヒト定常ドメインκまたはλ（好ましくはκ）に融合したヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントの軽鎖をコードしている挿入物を含む同様の組換え核酸もまた、構築することができる。さらに、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがスペーサ基を介して連結されている組換えポリペプチドをコードする組換え核酸を構築することも可能である。核酸は、宿主細胞中での抗体のプロセシングを促進するシグナル配列、ならびに／または抗体の精製を促進するペプチドおよび／もしくは切断部位および／もしくはペプチドスペーサーおよび／もしくはエフェクター分子をコードする核酸を含有してもよい。エフェクター分子をコードする核酸は、診断または治療適用において有用であり得る。したがって、毒素または酵素（特にプロドラッグの活性化を触媒することができる酵素）であるエフェクター分子が特に示され得る。そのようなエフェクター分子をコードしている核酸は、自然に存在する酵素もしくは毒素またはそれらの変異体の配列を有しており、当該分野で周知の方法によって調製することができる。
【００４８】
選択されたＣＤＲは、例えば、適切なオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによりヒト配列に変異を起こすことにより、選択されたフレームワークに組み込まれる。同時に、変異がフレームワークおよび／またはＣＤＲ配列に導入され得る。例えば、結合部位のコンホメーションに影響を与えることが知られているＦＲまたはＣＤＲ残基を変化させてもよい。露出していることが知られている残基を、好ましくは、公知のヒト配列またはコンセンサスヒト配列に一致するように変異させる。特に好ましい特性を有する抗体は、そのようなライブラリーから、例えば、上述した選択手順を用いて、選択してもよい。
【００４９】
ヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントを、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体などの他の抗体（またはそれらの一部分）と共にまたは他の抗体に結合させて使用してもよい。これらの他の抗体は、触媒抗体でもよく、および／または抗体が指向される疾患に特徴的な他のマーカー（エピトープ）に反応性であってもよく、あるいは標的種分子または細胞（例えば、レセプター、標的タンパク質、疾患細胞など）を補充するために選択された異なる特異性を有していてもよい。別々に投与される組成物、あるいは２つの薬剤が従来の化学的または分子生物学的方法により連結された単一の組成物として、抗体（またはその一部分）をそのような抗体（またはその一部分）と共に投与してもよい。さらに、（インビトロまたはインビボでの）検出可能なシグナルを産生する標識または治療特性を有する標識で抗体を標識することによって、ヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントの診断上および治療上の価値を上げることができる。いくつかの標識（例えば、放射性核種）は、検出可能なシグナルを生成し得、そして治療特性をも有し得る。放射性核種標識の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃが挙げられる。他の検出可能な標識の例としては、蛍光顕微鏡検査に用いる緑色蛍光タンパク質、フルオレセイン、フィコビリンタンパク質またはテトラエチルローダミンなどの蛍光色素（ｃｈｒｏｍｏｓｐｈｅｒｅ）、蛍光、吸光度、可視の着色もしくは凝集（これは、電子顕微鏡検査による実証用の高電子密度産物を産生する）による検出用の蛍光産物もしくは着色産物を産生する酵素；または直接もしくは間接の電子顕微鏡検査の可視化用のフェリチン、ペルオキシダーゼ、または金ビーズなどの高電子密度分子が挙げられる。
【００５０】
本明細書中のヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントは、典型的には、薬学的キャリアを含有する組成物中で患者に投与され得る。薬学的キャリアは、患者へのモノクローナル抗体の送達に適している任意の非毒性物質であれば良く、滅菌水、アルコール、脂質、ロウおよび不活性物質がキャリア中に含まれ得る。薬学的に受け入れられた補助剤（緩衝剤、分散剤）を薬学的組成物に組み込んでもよい。これらの組成物は完全ヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントを含有し得ることを理解すべきである。
【００５１】
ヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントの組成物は、種々の方法により患者に投与することができる。好ましくは、薬学的組成物は非経口的（例えば、皮下、筋肉、硬膜外、または静脈内）に投与され得る。したがって、非経口投与用組成物としては、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解した、ヒト化抗体および／もしくは機能性抗体フラグメントの溶液、またはこれらのカクテルが挙げられ得る。水、緩衝化した水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどの多種多様な水性キャリアが使用可能である。これらの溶液は無菌であり、通常、粒状物質を含有しない。これらの組成物は、従来周知の滅菌技術により滅菌されてもよい。これらの組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤などの、生理的状態に近づけるために必要な薬学的に受容可能な補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）を含有してもよい。これらの処方物におけるヒト化抗体および／または機能性抗体フラグメントの濃度は、広い範囲で（例えば、約０．５重量％以下、通常は少なくとも約１重量％程度から１５重量％または２０重量％程度まで）変化し得、選択した特定の投与形態に従って、流体の体積、粘度等に第一に基づいて選択される。
【００５２】
非経口的に投与され得る組成物の実際の調製方法および被験体への投与に必要な調整は、当業者にとって公知または明白であり、例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８５）により詳細に記載されている。
【実施例】
【００５３】
（ハイブリドーマ抗体遺伝子のクローニング）
ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４（Ｈｙ−４と称することもある）を収集し、ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＭＲＣ）に加えた。試料を、総ＲＮＡ単離についてのＭＲＣ使用説明書に従って処理した。次いで、ＲＮＡを、オリゴｄＴプライムｃＤＮＡ作製用のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｉｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  キットとともに用いた。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いる１００μｌのＰＣＲ反応に１μｌのｃＤＮＡ反応を用いた。正方向プライマーを、３つまたは４つの混合物にプールし、次いで、κ鎖遺伝子または重鎖遺伝子のいずれかについての単一の逆方向プライマーとともに使用した。使用したマウスκ鎖ＰＣＲプライマーおよび重鎖ＰＣＲプライマーの一覧表については、図１Ａおよび１Ｂを参照のこと。ＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒間；９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で１．５分を３０サイクル；７２℃で１０分行った後；４℃で保持であった。各プライマープールの組み合わせ中の１０μｌの試料を、２％アガロースゲル泳動に供して、反応が進んでいるかどうかを決定した。産物を生じたＰＣＲ反応物をプールし、エタノール沈殿させた（κ鎖産物と重鎖産物とは別々にプールした）。ゲル精製後、軽鎖産物を消化し、Ｓａｃ  Ｉ／Ｘｂａ  ＩによりｐＲＬ５中にクローニングし、続いて重鎖産物のＸｈｏ  Ｉ／Ｓｐｅ  Ｉ挿入を行った。本質的に以前（Ｒａｄａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，（１９９８）９５：８９１０−８９１５を参照）に記載された通りに、ｐＲＬ５中のマウス軽鎖および重鎖についてＴＣ−８３抗原に対するファージディスプレイ選択を２回行い、適切な軽鎖および重鎖（ハイブリドーマ細胞中では、無関係な軽鎖が産生される）の同定を簡易化した。
【００５４】
それぞれのクローンを、ＴＣ８３抗原への結合についてＥＬＩＳＡにより試験した。２００ｎｇのＴＣ−８３抗原を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）コーティング緩衝液２５μｌに希釈し、２分の１の領域のＣｏｓｔａｒ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄマイクロタイターウェルに添加した。４℃で一晩後、過剰の抗原を洗い流し、ウェルをＢＳＡで１時間ブロッキングした。次いで、細菌上清を３７℃で１時間加えた後、１０×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄した。抗ＨＡタグ抗体１２ＣＡ５を加え３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを上記と同様に洗浄した後、抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体を３７℃で１時間加えた。ウェルを再び上記と同様に洗浄した後、水でリンスし、次いでＳｉｇｍａ１０４基質を添加した。発色を、４０５でモニタリングした。陽性のクローン由来のミニプレップＤＮＡを配列分析に使用した。クローン番号７８をマウスＨｙ−４抗体配列として選択した。図２を参照のこと。
【００５５】
（軽鎖のヒト化）
マウス軽鎖ＣＤＲ３を、再配列したヒトκ軽鎖ライブラリーにグラフト化した。ヒト骨髄単核細胞としては、既にＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＭＲＣ）により処理されたものをＰｏｉｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。上記と同様に、ＲＮＡを分離し、第一鎖ｃＤＮＡを作製した。第一のＰＣＲ反応はヒトκ可変領域正方向プライマー（ＦＲ１特異的）およびＦＲ３末端にアニーリングする逆方向プライマーを用いて設定した。逆方向プライマーは、Ｈｙ−４のＣＤＲ３配列の非アニーリングテイルを有していた。プライマー配列については、図３を参照のこと。産物は、Ｈｙ−４特異的ＣＤＲ３の一部を含む、ヒト化軽鎖ライブラリーの前半部であった。ヒト化軽鎖ライブラリーの後半部を、ヒトκ定常領域逆方向プライマーと組み合わせて、（Ｈｙ−４のＣＤＲ３の非−アニーリングテイルを含む）ＦＲ４正方向プライマーを使って作製した。融合ＰＣＲを、これら２つの半分づつの軽鎖ライブラリーを用いて設定した。ＣＤＲ３領域は重複部分を提供し、上記したようにＲＳＣ−Ｆ（５’ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＴＣ３’−配列番号１）およびＣＫ１ｄＸを用いる同じプロトコールを使用した。融合ＰＣＲ産物をＳａｃ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉにより消化し、既にＨＹ−４キメラ重鎖（下記参照）を保有しているベクターｐＲＬ５に連結した。
【００５６】
キメラ重鎖を、図４に示したプライマーを使って産生した。マウス可変領域を、マウス正方向プライマー（ＭＨｙＶＨ１）およびマウスＦＲ４にアニーリングしてヒトＣＨ１テイルを有するキメラ重鎖逆方向プライマーを使用してマウスＦａｂクローン番号７８のベクターＤＮＡからＰＣＲにより回収した。ヒトＣＨ１ドメインを、図４に示した正方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いてヒトＦａｂクローンから誘導した。マウスＶＨドメインとヒトＣＨ１ドメインを、上記と同様にＭＨｙ−ＶＨ１およびＣＧ１ｚ−ｓｆｉを用いてＰＣＲにより融合させた。融合産物をゲル精製し、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩにより消化し、ｐＲＬ−５中にクローニングした。
【００５７】
次いで、ヒト化軽鎖ライブラリーを、ＴＣ−８３抗原に対するファージディスプレイ選択に４回供した。電気穿孔法、ファージ増幅、およびパンニングを、本質的に以前（Ｒａｄａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９８）９５：８９１０−８９１５を参照）に記載される通りに行った。
【００５８】
個々のクローンを、ＴＣ−８３への結合についてＥＬＩＳＡにより試験した後、４回目のパンニングを行った。３つのヒト化軽鎖クローン（Ｈｙ４−１１、Ｈｙ４−１４、およびＨｙ４−４３）を陽性と同定した。これらのクローンを配列決定した。図５を参照のこと。
【００５９】
（重鎖のヒト化）
マウス重鎖遺伝子を、ＶＢａｓｅデータベースを用いて最も近似するヒト生殖系列と比較した。重鎖の前方部（ＣＤＲ３の前のアミノ酸）は、ヒト生殖系列可変遺伝子ＤＰ−３に最も近似していた。フレームワーク４領域（ＣＤＲ３の後ろのアミノ酸）は、ヒト生殖系列Ｊ遺伝子ＪＨ３ａに最も近似していた。
【００６０】
ヒト生殖系列アミノ酸を、以下の場合を除く全ての位置で使用した：（１）ＣＤＲ３がマウスアミノ酸配列であった場合、（２）マウスまたはヒトのＣＤＲ１およびＣＤＲ２を選択した場合、または（３）選択したフレームワーク部位（バーニアゾーンまたはＶＨ／ＶＬ界面）においてヒトアミノ酸配列とマウスアミノ酸配列とで相違があった場合。これらの場合には、２つのアミノ酸の間で選択される。これらの縮重部分を、図６において「ｄｐ」と示す。ＣＤＲ３の前の最後の位置（バーニアゾーン位置であるアミノ酸番号９４）はその唯一の例外であり、ここでは、ヒト配列はＴｈｒであり、マウス配列はＡｒｇであった。しかし、再配列されたヒト抗体配列ではＡｒｇが優勢であるので、Ａｒｇを用いた。さらに、ヌクレオチド配列を細菌の好ましいコードを用いるために修正した。
【００６１】
ヒト化重鎖ライブラリーを、オリゴヌクレオチド連結アセンブリーを使用して構築し、Ｖ遺伝子の前半部と後半部（後半部はＡｐａＩクローニング部位を組み込むためにＣＨ１領域のごく一部を有している）を別々に作製した。まず、Ｈｙ４−ＬＬ−１、Ｈｙ４−ＬＬ−５、Ｈｙ４−ＬＬ−９、およびＨｙ４−ＬＬ−１３以外の全てのオリゴヌクレオチドの５’末端をリン酸化した。オリゴ配列については図７を参照のこと。そこから、下記のオリゴヌクレオチドの組み合わせを作製した。
【００６２】
【表１】
2005532825.tif 000002
【００６３】
これらのオリゴヌクレオチドの組み合わせを、１×連結緩衝液およびＡｍｐｌｉｇａｓｅ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含有する反応混合物に別々に加えた。オリゴヌクレオチド連結反応物を、次のインキュベーション条件下でサーモサイクイングした：９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および６５℃で１５分間（１サイクル毎に１分間ずつ短縮）を１５サイクル；９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および６５℃で１分間を１５サイクル；そして最後に、最後の１回の６５℃で１５分間のインキュベーション。オリゴヌクレオチド連結試料を１．５％のアガロースゲルでゲル精製した。次いで、これらのＤＮＡ試料を下記のＰＣＲアセンブリー反応と組み合わせて４セットのヒト化Ｈｙ４重鎖挿入物を作製した。
【００６４】
【表２】
2005532825.tif 000003
【００６５】
ＰＣＲ反応混合物は、１×ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ、グリセロール、ＭｇＣｌ２、およびＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含んでいた。このＰＣＲ混合物をまた、５’−ｇａｔｃｃｇｃｔｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔ−３’配列（配列番号１０４）を有するＨｙ４−Ｆ正方向プライマーおよび５’−ｇａｃｃｇａｔｇｇｇｃｃｃｔｔｇｇｔｇｇａ−３’配列（配列番号１０５）を有するＨｙ４−Ｒ逆方向プライマーを使用した。このＰＣＲ反応物について、９３℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を３５サイクル、続いて７２℃で７．０分間の最後のインキュベーションのサーモサイクリングを行った。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ試料を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、Ｈｙ４−ＨＣ  ＤＮＡのバンドをゲルから切り出し、電気溶出手順により精製した。
【００６６】
重鎖フラグメントを、上記の通りに同定された３つのＨｙ−４ヒト化ＬＣクローン（クローンＨｙ４−１１、Ｈｙ４−１４、およびＨｙ４−４３）を含有するｐＲＬ５ベクターに、Ｘｈｏ  Ｉ／Ａｐａ  Ｉによりクローニングした。ファージディスプレイライブラリーを作製し、ＴＣ−８３抗原に対してパンニングを行った。次いで、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングおよび配列分析の後、クローンＨｙ４−２６（Ｈｙ４−１４の軽鎖を有する）を選択した。図８を参照のこと。
【００６７】
（ヒト化軽鎖Ｈｙ−４−１４の更なる改変）
ヒト化Ｆａｂの親和性および機能をさらに向上させるために、マウスＣＤＲ１およびＣＤＲ２をヒト化軽鎖クローンＨｙ−４−１４に組み入れた。前もって選択したヒト化軽鎖の生殖系列分析の結果により、これらが全て、ヒト生殖系列ＤＰＫ９（これは、元のマウス配列に最も近似しているヒト生殖系列である）由来であることが判明したので、これを行った。クローンＨｙ−４−１４は、生殖系列のアミノ酸配列に最も高い相同性を有しており、更なる改変のために選択した。
【００６８】
細菌の好ましいコドンを有するヒト生殖系列配列、マウスＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ならびにバーニアゾーンおよびＶＨ／ＶＬ界面におけるヒト生殖系列アミノ酸配列とマウスアミノ酸配列とで異なっている２つの縮重位置（Ｋａｂａｔ番号４および４３、図９を参照のこと）を組み込んだ、ＦＲ１からＦＲ３の始めまでのＤＮＡカセットを作製した（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａによる）。この選り抜きの２つの部位により、合計４つのカセットが存在することになった。
【００６９】
このカセットを、Ｓａｃ  Ｉ／ＰｐｕＭ  Ｉにより、Ｈｙ４−２６軽鎖中にクローニングした。４つの異なるバージョンを、Ｈｙ４−２６Ａ、Ｈｙ４−２６Ｂ、Ｈｙ４−２６Ｃ、およびＨｙ４−２６Ｄと命名した（図９）。各ＦａｂのＨｉｓタグ精製調製物を、Ｎｉ−ＮＴＡスピンキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて作製した。Ｆａｂを、ＥＬＩＳＡによりＴＣ−８３抗原への結合について試験した。
【００７０】
（Ｈｙ４−２６Ａの競合）
Ｈｙ４−２６Ａ  Ｆａｂのエピトープ特異性を調べるために、競合ＥＬＩＳＡ実験において、Ｈｙ４−２６Ａ  Ｆａｂを元のマウスＨｙ４  Ｆａｂと比較した。この手順を、標準的ＥＬＩＳＡアッセイ系において、Ｈｙ４−２６Ａ  ＦａｂおよびｍＨｙ４  Ｆａｂの力価測定で開始した。この実験で使用したＦａｂの濃度は、４０ｎｇ／μｌから０．００２４ｎｇ／μｌの範囲であり、最終濃度０．００２４ｎｇ／μｌになるまで８つのマイクロプレートウェルのストリップについて４倍減少した。また、用いた一次検出抗体は、１２ＣＡ５（抗ＨＡタグ）であり、一方、二次抗体は、抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ特異的アルカリフォスファターゼ結合体（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）を使用した。力価測定ＥＬＩＳＡは、約２分の１時間での発色を可能にし、この時点で、これをＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて測定した。
【００７１】
力価測定ＥＬＩＳＡ実験によるデータのグラフ解析により、最大結合の約８０％が生じたＨｙ４−２６Ａ  ＦａｂおよびｍＨｙ４  Ｆａｂの濃度を選択した。これは、この値を競合ＥＬＩＳＡで使用した各それぞれのＦａｂの特定の濃度であった。この実験における特異的競合相手としてＨＡ免疫タグを欠いた改変マウスＨｙ４を使用した。Ｈｙ４−２６Ａ（およびＨＡタグ化マウスＨｙ４）を、最初に決定した濃度で保持し、そしてＨＡタグを欠いたマウスＨｙ４を漸増量で添加するように、この実験を設定した。競合物ｍＨｙ４の実際の量を、０．００９６ｎｇ／μｌから開始し、最高濃度４０ｎｇ／μｌまで一連の７つのウェルにおいて４倍ずつ濃度を上げた。ＨＡタグを保有するマウスＨｙ４  Ｆａｂを、自己競合コントロールとして組み込み、そして最大シグナルレベルについてのチェックとして、競合マウスＨｙ４（ＨＡタグを欠くマウスＨｙ４）を欠くウェルを用いた。競合ＥＬＩＳＡを、力価滴定ＥＬＩＳＡと同様の様式により検出および発色させた。
【００７２】
図１０は、ヒト化抗体についての競合曲線が、マウスＨｙ４自体の競合曲線と本質的に同じであることを示し、Ｈｙ４−２６ＡがＴＣ−８３上の同じエピトープを認識していることを表している。
【００７３】
ＩｇＧ発現ベクターへのＦａｂの変換：完全ＩｇＧへの抗体クローンの変換のために、重鎖および軽鎖の両方またはそれらのフラグメントをコードしている領域を、細菌ベクターから哺乳動物ベクターへ別々にクローン化することが可能である。同一プラスミドに軽鎖カセットおよび重鎖カセットの両者をクローン化するために、単一ベクター系を使用することができる。あるいは、重鎖と軽鎖とを別々のプラスミドで作製する二重発現ベクターを使用することも可能である。適切な発現ベクターは、当業者によって容易に同定され得る。哺乳動物のシグナル配列は、最終ベクターに既に存在するか、または重鎖ＤＮＡ挿入物および軽鎖ＤＮＡ挿入物の５’末端に付加される必要がある。これは、適切な哺乳動物リーダー配列を含むシャトルベクターにこれらを最初に移入することによって達成され得る。制限酵素消化に続いて、軽鎖領域および重鎖領域またはそれらのフラグメントをイントロンが存在するかまたは存在しない、残りのＩｇＧ１についての定常領域が提供されている最終ベクターに導入する。イントロンが用いられるいくつかの場合、ｐＲＬ５から軽鎖可変領域および重鎖可変領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー設計は、哺乳動物細胞中での抗体の適切なスプライシングおよび産生を得るために、エキソンスプライスドナー部位を含める必要があるかもしれない。
【００７４】
いずれかのベクター発現系（単一プラスミドまたは二重プラスミド）を用いて、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＩｇＧプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない、哺乳動物細胞中で作動するプロモーターによって、抗体の軽鎖および重鎖の産生が駆動され得る。更に、ベクターは、細菌増殖についての選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、またはゼオシン耐性であるがこれらに限定されない）を含む。哺乳動物細胞における選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ耐性、ＧＳ耐性、ｇｐｔ耐性、ネオマイシン耐性、またはハイグロマイシン耐性であるがこれらに限定されない）はまた、ＩｇＧベクターに存在してもよく、またはコトランスフェクションにより異なるプラスミドに提供されてもよい。
【００７５】
ヒト化Ｈｙ４−２６Ａ  ＦａｂおよびＨｙ４−２６Ｃ  Ｆａｂを、完全ＩｇＧ１／κのそれぞれの発現が可能である単一ベクター発現系に別々にクローン化した。２工程のプロセス（概略を図１１に示す）は、Ｘｂａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉを用いてＦａｂクローンから重鎖の細菌性制御エレメント（リボソーム結合部位およびリーダーシグナル）を最初に除去することを包含した。（ＬＣのポリＡシグナル、ＨＣ発現をもたらすＣＭＶプロモーター、およびＨＣリーダーシグナルを含有する）哺乳動物性の制御エレメントカセットをその箇所に結合させた。Ｘｂａ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉにより消化されたＤＮＡは、一緒に連結可能ではあるが、その後はどちらの制限酵素によっても再切断することのできない、適合性のＤＮＡ突出部を有している。哺乳動物性の制御カセットの配列を図１２に示す。得られたハイブリッドＦａｂクローンは、ＬＣの前に細菌性の制御エレメントを、Ｆｄ重鎖フラグメントの前に哺乳動物性の制御エレメントを有しており、したがって、これは発現目的ではなく、中間体構築物であった。次いで、ハイブリッドＦａｂクローンをＳｆｉ  ＩおよびＡｇｅ  Ｉにより消化し、ＣＨ１ドメインのもともとのＡｇｅＩ部位までに（細菌性の制御エレメントを有していない）ＬＣ、ポリＡシグナル、ＣＭＶプロモーター、ＨＣリーダーシグナル、およびＨＣフラグメントを含有するカセットを遊離させた。このカセットを、ＬＣ発現用の別のＣＭＶプロモーターおよびリーダーシグナル、ならびにＩｇＧ１定常ドメインの残りの部分を含むＥｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸ（その配列（配列番号１０３）を図１５Ａ〜図１５Ｉに示す）に配置した。ＤＮＡを配列決定して、所望のＨｙ４−２６Ａ−ＩｇＧプラスミドまたはＨｙ４−２６Ｃ−ＩｇＧプラスミドの構築を確認した。図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃを参照のこと。
【００７６】
ＰＣＲ反応：約１０．０ｎｇのベクターＤＮＡをテンプレートとし、１．０ｎｇ／μｌの正方向プライマーおよび逆方向プライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１．２５ＵのＴａｑゴールド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、１×ＰＣＲ緩衝液（各ＰＣＲチューブ中の５０μｌの総容量において２．０ｍＭのＭｇＣｌ２および７．５％のグリセロールを含む）とともに使用した。ＰＣＲ反応物を、９３℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクル増幅した。プレインキュベーションは９３℃で１０分間であり、最後のインキュベーションは７２℃で５分間であった。続いて行う制限酵素による消化およびクローニングに用いるに十分なＰＣＲ産物を産生するために、合わせて５００μｌの体積で、１０連のＰＣＲ反応を実施した。次の工程であるクローニングプロセスに移る前に、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを用いて、この試料を「クリーンアップ（ｃｌｅａｎｅｄ−ｕｐ）」した。
【００７７】
制限酵素消化：組換えＤＮＡのクローニングのために、総体積４００μｌ中のＤＮＡ３０μｇを、適切な１×制限消化緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１．０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および少なくとも３倍過剰の所望の制限酵素を用いて消化した。インキュベーションを、その酵素についての特定の温度で約２〜３時間続けた。クローニングした試料の診断分析のため、１×制限酵素（ＲＥ）緩衝液、１．０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび１．０μｌの各制限酵素に、５．０μｌのＱｉａｇｅｎミニ−プレップ精製ＤＮＡを添加した。試料を約１〜２時間インキュベートし、そして１．５％アガロース／ＥｔＢｒゲルにローディングし、ＤＮＡバンドを可視化した。
【００７８】
ＤＮＡフラグメントの単離および精製：４００μｌの制限酵素消化試料にローディング色素を添加し、１．５％アガロース／ＥｔＢｒゲルの複数のウェルにローディングした。ゲルを、約２．０時間電気泳動し、所望のＤＮＡバンドのを分離させた。ゲルフラグメントをゲルから切り出し、透析膜封入体に合わせて入れ、アガロースゲルボックスに戻した。アガロースゲル片からＤＮＡフラグメントを「電気溶出」するために透析膜に電圧を印加した。アガロースゲル片の周囲の緩衝液を透析膜から取り除き、そしてスピンフィルターを通して試料からあらゆる外因性アガロースゲル片を除去した。最後に、ＤＮＡフラグメントを５０％のイソプロパノールで沈殿させ、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて定量した。
【００７９】
連結反応および細菌形質転換：連結反応を、ＤＮＡフラグメントの長さおよびＤＮＡ濃度を考慮して、挿入物：ベクターの割合をモル比３：１として設計した。連結反応物は、１４０ｎｇのＤＮＡベクター（約５．０ｋｂのベクターについて）、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２ＵのＴ４  ＤＮＡ  リガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＤＮＡ挿入物を含んでいた。連結反応物を混合後、これらを室温で少なくとも３時間インキュベートし、電気受容性ＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌にエレクトロポレーションした。形質転換体は、選択寒天プレートにプレーティングし、３７℃のインキュベーター中で一晩増殖させた。個々のコロニーを拾い、３．０ｍｌのＳＢ培地中で一晩成長させた。次の日、Ｑｉａｇｅｎミニ−プレップ  キットを用いてプラスミドＤＮＡを細菌ペレットから作製した。
【００８０】
ＤＮＡ配列決定：クローニングプロセスの終点で組換えクローンが診断用アガロースゲルにおいて予想のＤＮＡバンドパターンを示した場合には、このクローンを大規模細菌培養で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉ−Ｓｐｅｅｄマキシ−プレップ  キットを用いてマキシ−プレップ  プラスミドＤＮＡを作製した。次いで、精製ＤＮＡをＰｉｃｏｇｒｅｅｎ試薬を用いて定量した。この後、ＤＮＡを、ＤＮＡ配列解析および適切なクローニング結果の確認のために、適切なプライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一緒にＲｅｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）のいずれかに送った。
【００８１】
Ｈｙ４−２６Ａ−ＩｇＧまたはＨｙ４−２６Ｃ−ＩｇＧを発現する安定な細胞系の作製：２９３  ＥＢＮＡ細胞に、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＩｇＧ発現ベクターＨｙ４２６Ａ−ＩｇＧまたはＨｙ４２６Ｃ−ＩｇＧをトランスフェクションした。トランスフェクション後３日目に、細胞を、約１×１０６個／ディッシュおよび約４×１０６個／ディッシュの２つの異なる細胞密度で、１５ｃｍのＴＣディッシュに分け、５．０ｍｇ／ｍｌまたは２０．０ｍｇ／ｍｌの２つの異なるピューロマイシン濃度に供した。その時点から、１週間に２回、新鮮培地ならびに適量のピューロマイシンおよびＧ４１８を細胞に供給した。１５ｃｍのＴＣディッシュにプレーティングして２週間後に、これらを、適切な大きさで、かつクローン集団を確実にするために少なくとも１．０ｃｍ以上離れている細胞コロニーの存在について調べた。コロニーを共焦点顕微鏡下にてＰ２００ピペッターを用いて拾い、２４ウェルプレートにさらなる新鮮培地と共に入れた。２０．０μｇ／ｍｌのピューロマイシンにて選択されたコロニーを、１０．０μｇ／ｍｌまで希釈した。ウェルがコンフルエントになってきたら、安定細胞クローンを１２ウェルプレートに移し、さらにＴ５０フラスコに移し、最終的にＴ１７５フラスコに移した。一旦、Ｔ１７５フラスコ中の細胞がコンフルエントになってきたら、５つの凍結バイアル（９５％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯの１ｍｌ中に１×１０７細胞）中で凍結した。
【００８２】
安定細胞クローンのＥＬＩＳＡスクリーニング：Ｈｙ４２６Ａ−ＩｇＧおよびＨｙ４２６Ｃ安定細胞系の候補（各々１０クローンまで）についてＩｇＧの機能的発現についてスクリーニングした。各安定細胞系について１バイアルを解凍し、別々のＴ７５フラスコに移し、細胞を一晩付着させた。次の朝、培地を低ＩｇＧ  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）で作製した新鮮培地に交換した。細胞を更に２日間増殖させ、この時点でこれらは大部分がコンフルエントであった。次いで、馴化組織培養培地のアリコートを各安定細胞クローンから得た。この培地を、ＴＣ８３特異抗原およびＢＳＡバックグラウンドコントロールで一晩コーティングしたプレートについてＥＬＩＳＡアッセイにおいて調べた。ＥＬＩＳＡプレート中での組織培養培地のインキュベーション後、ヒトＬＣに特異的なＡＰ結合体抗体（Ｐｅｉｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、結合したＩｇＧを検出し、そしてアルカリフォスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて発色させた。得られたデータをグラフにした（図１４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行い、続いてウェスタンブロット分析を行って、予想された大きさの抗体軽鎖および抗体重鎖の発現を確認した。安定細胞クローンＨｙ４２６Ａ−７、Ｈｙ４２６Ａ−２、Ｈｙ４２６Ｃ−２、およびＨｙ４２６Ｃ−６は、それぞれのＩｇＧの大規模発現の最良の候補と考えられた。
【００８３】
Ｈｙ４−２６Ａ−ＩｇＧおよびＨｙ４−２６Ｃ−ＩｇＧの発現と精製：ＥＬＩＳＡ発現分析による選択された安定細胞クローンを、適量のピューロマイシン選択および５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を用いてＴ７５フラスコからＴ１７５フラスコに直ちに移した。このフラスコを、完全にコンフルエントになるまで２日間増殖させ、次いで選択培地を用いて１：９で継代した。約４日後、これらの９つのフラスコのそれぞれを再度、１：９に分け、合計８１個のフラスコを得た。これらのフラスコ中の細胞がおおよそ９０％コンフルエンシーに到達した時点で、培地を、選択試薬を含まない新たな低ＩｇＧ  ＦＢＳ培地に交換した。２日間のタンパク質発現の後、これらのフラスコを、２０％のグルコースおよび０．５ＭのＨＥＰＥＳからなる２０×「ＴＣ  Ｓｕｇａｒ  Ｒｕｓｈ」試薬（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）でスパイクした。次いで、細胞を更に３日間インキュベートした後、細胞上清を採取した。これらの８１個のフラスコから採取した組織培養（ＴＣ）培地の量は、馴化ＴＣ培地の合計でほぼ２．０リットルであった。この培地を、遠心分離期中で５０００ｒｐｍで最初に遠心分離して、培地からあらゆる細胞破片をペレット化した。この後、Ｐｅｌｉｃｏｎ濃縮デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて培地を１６倍濃縮して約１２５ｍｌとし、最後にＦＰＬＣ精製用に０．２μｍフィルターを通してこれを調製した。濃縮した培地上清を抗ヒトＦａｂカラムを用いて精製した。０．２Ｍのグリシン（ｐＨ＝２．２）によりＩｇＧをカラムから溶出し、１．５ｍｌのフラクションとして採取し、２．０ＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝９．０）溶液で中和した。各ＦＰＬＣフラクションを、クマシー染色したタンパク質ゲルにおいて別々に分析した。大量のＩｇＧを含有するフラクションを集め、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて回転透析した。最後の遠心分離は、ＩｇＧ含有試料を、より取り扱いが容易な、２〜３ｍｌの体積とする濃縮工程からなっていた。ＩｇＧ試料を別々の０．５ｍｌフラクションに等分する前に、ＩｇＧ試料を、ＩｇＧ標準と共にＢｉｏＲａｄタンパク質定量キット（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて定量した。さらに、精製抗体を、抗体濃度が５．０μｇ／ｍｌから０．００５μｇ／ｍｌの範囲であるＴＣ８３力価測定ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、比活性についてチェックした。精製抗体調製物は、概して、０．０５μｇ／ｍｌまで良好なＥＬＩＳＡシグナルを示した。精製ＩｇＧアリコートを、さらなる使用まで、−２０℃で凍結した。
【００８４】
上記の説明は本発明の好ましい実施形態および実施例を示す。本明細書中には具体的に記載されないが、添付され得る特許請求の範囲の精神および範囲に依然として含まれる、実施形態および実施例の改変物が、当業者によって想定されることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ハイブリドーマ抗体遺伝子をクローニングする際に使用されるマウスκ鎖ＰＣＲプライマーおよびマウス重鎖ＰＣＲプライマーの一覧表を示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、ハイブリドーマ抗体遺伝子をクローニングする際に使用されるマウスκ鎖ＰＣＲプライマーおよびマウス重鎖ＰＣＲプライマーの一覧表を示す。
【図２】図２は、３Ｂ４Ｃ−４ハイブリドーマ配列を示す。
【図３】図３は、マウス軽鎖ＣＤＲ３を再配列ヒトκ軽鎖のライブラリーにグラフト化する際に使用されるプライマー配列を示す。
【図４】図４は、キメラ重鎖を産生する際に使用されるプライマーを示す。
【図５】図５は、ＴＣ−８３に結合する３種のヒト化軽鎖クローンの配列を示す。
【図６】図６は、重鎖のヒト化のストラテジーを示す。
【図７】図７は、ヒト化重鎖ライブラリーの構築に使用されるオリゴ配列を示す。
【図８Ａ】図８ＡおよびＢは、ヒト化クローンＨｙ４−２６の配列を示す。
【図８Ｂ】図８ＡおよびＢは、ヒト化クローンＨｙ４−２６の配列を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒト化重鎖の配列を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂ〜図９Ｅは異なる４種のヒト化軽鎖の配列を示す。
【図９Ｃ】図９Ｂ〜図９Ｅは異なる４種のヒト化軽鎖の配列を示す。
【図９Ｄ】図９Ｂ〜図９Ｅは異なる４種のヒト化軽鎖の配列を示す。
【図１０】図１０は、ヒト化抗体の競合曲線およびマウスＨｙ４自体の競合曲線を示す。
【図１１】図１１は、それぞれ完全なＩｇＧ１／κの発現を可能にした単一ベクター発現系にヒト化Ｈｙ４−２６Ａ  ＦａｂおよびＨｙ４−２６Ｃ  Ｆａｂをクローニングするために用いられる２段階のプロセスを概略的に示している。
【図１２】図１２は、重鎖の細菌制御エレメント（リボソーム結合部位およびリーダーシグナル）をＦａｂクローンから取り除いた際に形成された位置に連結された哺乳動物制御カセットの配列を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、プラスミドＨｙ４−２６ＡおよびＨｙ４−２６Ｃの完全ＩｇＧヒト化重鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、プラスミドＨｙ４−２６Ａの完全ＩｇＧヒト化軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、プラスミドＨｙ４−２６Ｃの完全ＩｇＧヒト化軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４は、ＩｇＧの機能的発現に関しての、Ｈｙ４２６Ａ−ＩｇＧおよびＨｙ４２６Ｃ安定細胞株候補のＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｉは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜図１５Ｉは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜図１５Ｉは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜図１５Ｉは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｅ】図１５Ａ〜図１５Ｉは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｆ】図１５Ａ〜図１５Ｉは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｇ】図１５Ａ〜図１５Ｉは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｈ】図１５Ａ〜図１５Ｉは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｉ】図１５Ａ〜図１５Ｉは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月18日(2005.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合するヒト化抗体であって、該ヒト化抗体は、非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域およびヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、ヒト化抗体。
【請求項２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
マウス抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
マウス抗体由来のＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスに結合するかまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス感染に関与する抗体の複数配列に由来するコンセンサス配列である少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
前記少なくとも１つの相補性決定領域が由来する非ヒト抗体に対して少なくとも５０％の相同性を有するヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
ヒト生殖系列抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
ヒト生殖系列抗体由来の第一のフレームワーク領域とヒト再配列抗体由来の第二のフレームワーク領域とを含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する抗体フラグメントであって、該抗体フラグメントは、非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域とヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域とを含む、抗体フラグメント。
【請求項１２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１３】
マウス抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１４】
マウス抗体由来のＣＤＲ３を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１５】
ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１６】
ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１７】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスに結合するかまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス感染に関与する抗体の複数配列に由来するコンセンサス配列である少なくとも１つの相補性決定領域を有する、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの相補性決定領域が由来する非ヒト抗体に対して少なくとも５０％の相同性を有するヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１９】
ヒト生殖系列抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項２０】
ヒト生殖系列抗体由来の第一のフレームワーク領域とヒト再配列抗体由来の第二のフレームワーク領域とを有する、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項２１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合するヒト化抗体であって、該ヒト化抗体が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３とヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域とを含む、ヒト化抗体。
【請求項２２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する抗体フラグメントであって、該抗体フラグメントが、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３とヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域とを含む、抗体フラグメント。
【請求項２３】
配列番号９８の重鎖配列を含む、抗体。
【請求項２４】
配列番号１００の軽鎖配列を含む、抗体。
【請求項２５】
配列番号１０２の軽鎖配列を含む、抗体。
【請求項２６】
請求項１から請求項２５のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントをコードする、核酸。
【請求項２７】
請求項１から請求項２５のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントをコードする核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２８】
請求項１から請求項２５のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントをコードする核酸を含む発現ベクターによりトランスフェクションされた、宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１から請求項２５のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントと薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項１から請求項２５のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、ウイルス感染を中和するための組成物。
【請求項３１】
方法であって、
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域を選択する工程；および
前記少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域をヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域に結合させてヒト化抗体を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、マウス抗体由来である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、マウス抗体由来のＣＤＲ３である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する、前記非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのフレームワーク領域が、前記少なくとも１つの相補性決定領域が由来する非ヒト抗体に対して少なくとも５０％の相同性を有するヒト抗体由来である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのフレームワーク領域がヒト生殖系列抗体由来である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
方法であって、
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする核酸を同定する工程；および
少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域をコードする該核酸を、ヒト抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域をコードする核酸に連結させる工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの主要糖タンパク質Ｅ２のＥ２ｃエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする核酸である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、マウス供給源由来である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、マウス抗体由来のＣＤＲ３をコードする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来の相補性決定領域をコードする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のエピトープに結合する非ヒト抗体由来の少なくとも１つの相補性決定領域をコードする前記核酸が、ハイブリドーマ細胞３Ｂ４Ｃ−４によって産生されるマウス抗体由来のＣＤＲ３をコードする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１つのフレームワーク領域をコードする前記核酸が、前記少なくとも１つの相補性決定領域が由来する非ヒト抗体に対して少なくとも５０％の相同性を有するヒト抗体をコードする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つのフレームワーク領域をコードする前記核酸が、ヒト生殖系列抗体由来の少なくとも１つのフレームワーク領域をコードする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記連結された核酸が、ヒト化抗体フラグメントをコードする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記連結された核酸が、ヒト化完全抗体をコードする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記連結された核酸を発現ベクターに連結する工程をさらに包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
宿主細胞を前記発現ベクターでトランスフェクションする工程をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１から請求項２５のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントを発現する、細胞株。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ハイブリドーマ抗体遺伝子をクローニングする際に使用されるマウスκ鎖ＰＣＲプライマーおよびマウス重鎖ＰＣＲプライマーの一覧表を示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、ハイブリドーマ抗体遺伝子をクローニングする際に使用されるマウスκ鎖ＰＣＲプライマーおよびマウス重鎖ＰＣＲプライマーの一覧表を示す。
【図２】図２は、３Ｂ４Ｃ−４ハイブリドーマ配列を示す。
【図３】図３は、マウス軽鎖ＣＤＲ３を再配列ヒトκ軽鎖のライブラリーにグラフト化する際に使用されるプライマー配列を示す。
【図４】図４は、キメラ重鎖を産生する際に使用されるプライマーを示す。
【図５】図５は、ＴＣ−８３に結合する３種のヒト化軽鎖クローンの配列を示す。
【図６】図６は、重鎖のヒト化のストラテジーを示す。
【図７】図７は、ヒト化重鎖ライブラリーの構築に使用されるオリゴ配列を示す。
【図８Ａ】図８ＡおよびＢは、ヒト化クローンＨｙ４−２６の配列を示す。
【図８Ｂ】図８ＡおよびＢは、ヒト化クローンＨｙ４−２６の配列を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒト化重鎖の配列を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂ〜図９Ｅは異なる４種のヒト化軽鎖の配列を示す。
【図９Ｃ】図９Ｂ〜図９Ｅは異なる４種のヒト化軽鎖の配列を示す。
【図９Ｄ】図９Ｂ〜図９Ｅは異なる４種のヒト化軽鎖の配列を示す。
【図１０】図１０は、ヒト化抗体の競合曲線およびマウスＨｙ４自体の競合曲線を示す。
【図１１】図１１は、それぞれ完全なＩｇＧ１／κの発現を可能にした単一ベクター発現系にヒト化Ｈｙ４−２６Ａ  ＦａｂおよびＨｙ４−２６Ｃ  Ｆａｂをクローニングするために用いられる２段階のプロセスを概略的に示している。
【図１２】図１２は、重鎖の細菌制御エレメント（リボソーム結合部位およびリーダーシグナル）をＦａｂクローンから取り除いた際に形成された位置に連結された哺乳動物制御カセットの配列を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、プラスミドＨｙ４−２６ＡおよびＨｙ４−２６Ｃの完全ＩｇＧヒト化重鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、プラスミドＨｙ４−２６Ａの完全ＩｇＧヒト化軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、プラスミドＨｙ４−２６Ｃの完全ＩｇＧヒト化軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４は、ＩｇＧの機能的発現に関しての、Ｈｙ４２６Ａ−ＩｇＧおよびＨｙ４２６Ｃ安定細胞株候補のＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｅ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｆ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｇ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｈ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｉ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｊ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｋ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【図１５Ｌ】図１５Ａ〜図１５Ｌは、Ｅｌｍ２  ＩｇＧ  ｐＡＰＥＸベクターの核酸配列を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2005532825.tif 000034
【図１Ｂ】
2005532825.tif 000035
【図２】
2005532825.tif 000036
【図３】
2005532825.tif 000037
【図４】
2005532825.tif 000038
【図５】
2005532825.tif 000039
【図６】
2005532825.tif 000040
【図７】
2005532825.tif 000041
【図８Ａ】
2005532825.tif 000042
【図８Ｂ】
2005532825.tif 000043
【図９Ａ】
2005532825.tif 000044
【図９Ｂ】
2005532825.tif 000045
【図９Ｃ】
2005532825.tif 000046
【図９Ｄ】
2005532825.tif 000047
【図１０】
2005532825.tif 000048
【図１１】
2005532825.tif 000049
【図１２】
2005532825.tif 000050
【図１３Ａ】
2005532825.tif 000051
【図１３Ｂ】
2005532825.tif 000052
【図１３Ｃ】
2005532825.tif 000053
【図１４】
2005532825.tif 000054
【図１５Ａ】
2005532825.tif 000055
【図１５Ｂ】
2005532825.tif 000056
【図１５Ｃ】
2005532825.tif 000057
【図１５Ｄ】
2005532825.tif 000058
【図１５Ｅ】
2005532825.tif 000059
【図１５Ｆ】
2005532825.tif 000060
【図１５Ｇ】
2005532825.tif 000061
【図１５Ｈ】
2005532825.tif 000062
【図１５Ｉ】
2005532825.tif 000063
【図１５Ｊ】
2005532825.tif 000064
【図１５Ｋ】
2005532825.tif 000065
【図１５Ｌ】
2005532825.tif 000066
【国際調査報告】
2005532825.tif 000067
2005532825.tif 000068
2005532825.tif 000069