(57)【要約】本発明は、特定の莢膜多糖または選択された莢膜多糖のみを構成的に発現するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓの新規な変異体株を産生および選択する方法；特定の莢膜多糖または選択された莢膜多糖のみを構成的に発現するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓの新規な変異体株に関する組成物；個々の莢膜多糖の精製のための改善された方法；ならびに新規なｒｅｓ０２遺伝子およびｉｎｖ１９遺伝子ならびにそれらの遺伝子産物に関する組成物に関する。有意には、本発明は、高い収率で、免疫調節莢膜多糖Ａ（ＰＳＡ）を過剰発現および精製するための方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、（ａ）配列番号２で記載されるポリペプチドと少なくとも約７０％同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１または（ａ）で記載されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）少なくとも約９アミノ酸残基のポリペプチド断片をコードする、配列番号１、（ａ）、または（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、ここで該ポリペプチド断片は、配列番号２で記載されるコードされたポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域；（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドの断片を含む、配列番号１、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域；（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｄ）Ｃ−末端短縮および／またはＮ−末端短縮を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ−末端短縮、およびＮ−末端短縮からなる群から選択される少なくとも１つの修飾を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドの断片を含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項７】
単離されたポリペプチドであって、（ａ）配列番号２のオルソログのアミノ酸配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；（ｃ）少なくとも約９アミノ酸残基を含む、配列番号２で記載されるアミノ酸配列の断片であって、ここで該断片は、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、断片；および（ｄ）配列番号２、（ａ）または（ｂ）で記載されるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体のアミノ酸配列からなる群から選択アミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項８】
単離されたポリペプチドであって、（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；（ｄ）Ｃ−末端短縮および／またはＮ−末端短縮を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；および（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ−末端短縮、およびＮ−末端短縮からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項１、２、または３のいずれかに核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号２に記載されるポリペプチドの活性有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項６、７または８のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合剤またはその断片。
【請求項１１】
請求項１０に記載の選択的結合剤またはその断片であって、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する、選択的結合剤またはその断片。
【請求項１２】
抗体またはその断片である、請求項１０に記載の選択的結合剤。
【請求項１３】
異種のアミノ酸配列に融合した請求項６、７または８のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項１４】
単離された核酸分子であって、（ａ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１５】
単離された核酸分子であって、（ａ）配列番号４で記載されるポリペプチドと少なくとも約７０％同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号３または（ａ）で記載されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）少なくとも約９アミノ酸残基のポリペプチド断片をコードする、配列番号３、（ａ）、または（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、ここで該ポリペプチド断片は、配列番号４で記載されるコードされたポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域；（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドの断片を含む、配列番号３、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域；（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１６】
単離された核酸分子であって、（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｄ）Ｃ−末端短縮および／またはＮ−末端短縮を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ−末端短縮、およびＮ−末端短縮からなる群から選択される少なくとも１つの修飾を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該コードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドの断片を含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１４、１５、または１６のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
単離されたポリペプチドであって、（ａ）配列番号４のオルソログのアミノ酸配列；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；（ｃ）少なくとも約９アミノ酸残基を含む、配列番号４で記載されるアミノ酸配列の断片であって、ここで該断片は、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、断片；および（ｄ）配列番号４、（ａ）または（ｂ）で記載されるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体のアミノ酸配列からなる群から選択アミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
単離されたポリペプチドであって、（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；（ｄ）Ｃ−末端短縮および／またはＮ−末端短縮を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；および（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ−末端短縮、およびＮ−末端短縮からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列であって、ここで該ポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１４、１５、または１６のいずれかに核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号４に記載されるポリペプチドの活性有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１９、２０または２１のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合剤またはその断片。
【請求項２４】
請求項２３に記載の選択的結合剤またはその断片であって、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する、選択的結合剤またはその断片。
【請求項２５】
抗体またはその断片である、請求項２３に記載の選択的結合剤。
【請求項２６】
異種のアミノ酸配列に融合した請求項１９、２０または２１のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項２７】
ｒｅｓ０２発現が不可能である、細菌細胞。
【請求項２８】
ｉｎｖ１９発現が不可能である、細菌細胞。
【請求項２９】
ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される、特定の莢膜多糖を安定に発現する細菌細胞の集団。
【請求項３０】
前記特定の莢膜多糖がＰＳＡである、請求項２９に記載の細菌細胞の集団。
【請求項３１】
請求項２９または請求項３０に記載の細菌細胞の集団であって、該細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓである、細菌細胞の集団。
【請求項３２】
請求項２９または請求項３０に記載の細菌細胞の集団であって、該細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３である、細菌細胞の集団。
【請求項３３】
請求項２９または請求項３０に記載の細菌細胞の集団であって、該細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４である、細菌細胞の集団。
【請求項３４】
請求項２９または請求項３０に記載の細菌細胞の集団であって、該細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２である、細菌細胞の集団。
【請求項３５】
ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される莢膜多糖を発現する細菌細胞であって、該莢膜多糖の発現を制御するプロモーターは、オンに固定されている、細菌細胞。
【請求項３６】
請求項３５に記載の細菌細胞であって、前記莢膜多糖が、ＰＳＡである、細菌細胞。
【請求項３７】
請求項３６に記載の細菌細胞であって、さらに、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される各および全ての莢膜多糖の発現を制御するプロモーターは、オフに固定されている、細菌細胞。
【請求項３８】
請求項３５に記載の細菌細胞であって、さらに、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される莢膜多糖のいずれか１つまたは組み合せは、発現されない、細菌細胞。
【請求項３９】
請求項３５に記載の細菌細胞であって、さらに、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される莢膜多糖のいずれか１つまたは組み合せの発現を制御するプロモーターは、オフに固定されている、細菌細胞。
【請求項４０】
請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の細菌細胞であって、ｒｅｓ０２発現が、不可能である、細菌細胞。
【請求項４１】
請求項２７、２８または３５〜３９のいずれか一項に記載の細菌細胞であって、該細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓである、細菌細胞。
【請求項４２】
請求項２７、２８または３５〜３９のいずれか一項に記載の細菌細胞であって、該細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３である、細菌細胞。
【請求項４３】
請求項２７、３５または３６のいずれか一項に記載の細菌細胞であって、該細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４である、細菌細胞。
【請求項４４】
請求項２７、３５または３６のいずれか一項に記載の細菌細胞であって、該細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２である、細菌細胞。
【請求項４５】
莢膜多糖生合成遺伝子の、相可変プロモーターをオンに固定する方法であって、以下：
細菌細胞においてｒｅｓ０２を不活性化して、莢膜多糖生合成遺伝子の相可変プロモーターをオンに固定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、さらに、以下：
ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される少なくとも１つの莢膜多糖を発現する細菌細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の方法であって、さらに、以下：ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される１つの莢膜多糖のみを発現する細菌細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、前記１つの莢膜多糖がＰＳＡである、方法。
【請求項４９】
細菌細胞からＰＳＡを精製する方法であって、改良が、以下：
ＰＳＡのプロモーターがオンまたはオフに固定されるように該細菌細胞においてｒｅｓ０２を不活性化する工程；および
ＰＳＡを発現する細菌細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法であって、前記細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓである、方法。
【請求項５１】
請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法であって、前記細菌細胞が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３である、方法。
【請求項５２】
純粋な莢膜多糖を産生する方法であって、以下：
ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される、特定の莢膜多糖、または特定の莢膜多糖を含む、限られたセットの莢膜多糖のみを安定に発現する細菌細胞の集団を増殖させる工程；および
細菌細胞の集団から特定の莢膜多糖を単離して純粋な莢膜多糖を産生する工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、特定の莢膜多糖を除く、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される、莢膜多糖のいずれか１つまたは組み合せの発現を制御するプロモーターは、オフに固定されている、方法。
【請求項５４】
請求項５２に記載の方法であって、前記特定莢膜多糖は、ＰＳＡである、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される、各およびすべての莢膜多糖の発現を調節するプロモーターは、オフに固定されている、方法。
【請求項５６】
請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法であって、前記細菌細胞の集団が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓである、方法。
【請求項５７】
請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法であって、前記細菌細胞の集団が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３である、方法。
【請求項５８】
請求項５５に記載の方法であって、前記細菌細胞の集団が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４である、方法。
【請求項５９】
請求項５５に記載の方法であって、前記細菌細胞の集団が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２である、方法。
【請求項６０】
炎症性腸疾患を処置または予防する方法であって、以下：
炎症性腸疾患の処置または予防の必要がある被験体に、特定の莢膜多糖を安定に発現する、炎症性腸疾患を治療または予防するために有効な量の細菌細胞の集団を投与する、工程、
を包含する、方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法であって、前記特定の莢膜多糖が、ＰＳＡである、方法。
【請求項６２】
請求項６０に記載の方法であって、前記細菌細胞の集団が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓである、方法。
【請求項６３】
請求項６０に記載の方法であって、前記細菌細胞の集団が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３である、方法。
【請求項６４】
請求項６０に記載の方法であって、前記細菌細胞の集団が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４である、方法。
【請求項６５】
請求項６０に記載の方法であって、前記細菌細胞の集団が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、免疫調節効果を有すると報告された、莢膜多糖の産生および単離のための組成物および方法に関連する。具体的には、本発明は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）の莢膜多糖Ａ（ＰＳＡ）の産生および単離のための組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３の莢膜多糖Ａ（ＰＳＡ）は、治療的および予防的適用を有する免疫調節剤であると報告された。米国特許第５，６７９，６５４および５，７００，７８７号；Ｔｚｉａｎａｂｏｓ  ＡＯら（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：６７３３−４０。ＰＳＡに加えて、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３は、少なくとも７つの他の莢膜多糖（ＰＳＢ−ＰＳＨ）を合成することが、最近報告された。Ｋｒｉｎｏｓ  ＣＭら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：５５５−５５８。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの８つの莢膜多糖のうち７つの発現は、各多糖生合成遺伝子座のプロモーターを含むＤＮＡ部分の逆位によって規定される相の変化のために変動することも、最近報告された。Ｋｒｉｎｏｓ  ＣＭら、前出。この系統が、そのように多くの多糖を合成するという事実が、この系統からのＰＳＡの精製を非常に困難にしている。その相変化によるＰＳＡの変動する発現と合わせて、これは多くの場合、その精製のための徹底的な手順の後の、ＰＳＡの非常に低い収率を引き起こす。従って、予防的または治療的適用のためのＰＳＡの大規模精製は、技術的障害を提示する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、部分的には、本発明者によるＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓの８つの公知の莢膜多糖、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨのうち７つの相変化を調節する方法の発見から生じる。驚くべきことに、新規遺伝子、ｒｅｓ０２（ｍｐｉ、ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎｖｅｒｔａｓｅとも示される）の不活性化は、各莢膜多糖生合成遺伝子座の逆位可能なプロモーターを、「オン」方向または「オフ」方向のいずれかに固定する効果を有することが発見された。莢膜多糖の逆位可能なプロモーターがオンの方向である場合、そのプロモーターは、莢膜多糖の生合成に関する多糖生合成遺伝子座に関して転写活性である。逆に、莢膜多糖の逆位可能なプロモーターがオフの方向である場合、そのプロモーターは、莢膜多糖の生合成に関する多糖生合成遺伝子座に関して転写不活性である。プロモーターを固定し、そして次いで特定の莢膜多糖のみを構成的に発現する、または特定の莢膜多糖を含む、限られた莢膜多糖のセットのみを発現する細菌細胞を選択することによって、特定の莢膜多糖の収率を増加させることが今や可能であることが、本発明によって発見された。従って、選択された莢膜多糖のあらゆる組み合せを構成的に発現し、そして他は発現しない、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの変異系統を産生および選択することが今や可能であることが、本発明によって発見された。さらに、この方法を用いて、１つの特定の莢膜多糖、例えばＰＳＡのみを構成的に発現し、そして他の莢膜多糖を発現しないＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓの変異系統を産生および選択することが今や可能である。選択された変異系統はそれぞれ、相変化ができないようにされるので、各細胞によって産生される選択された多糖、例えば、ＰＳＡの量は、野生型と比較して増加する。それに加えて、選択された変異系統は、単一の莢膜多糖のみを発現するので、またはそれは望ましい組み合せの莢膜多糖のみを発現するので、莢膜多糖の精製は非常に単純化され、そしてより効率的である。
【０００４】
本発明はまた、部分的には、ｒｅｓ０２に近接して位置し、そして奔出願人がこれもＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓにおける莢膜多糖の発現の調節に関与すると考える、２目の新規遺伝子、ｉｎｖ１９に関連する。ｒｅｓ０２と異なり、ｉｎｖ１９の不活性化または欠失は、莢膜多糖生合成遺伝子座の相変化プロモーターの固定を引き起こさないようである。しかし、ｒｅｓ０２およびｉｎｖ１９両方の欠失は、ｒｅｓ０２欠失単独とは異なる遺伝子型を産生し得ることが、本発明によって発見された。例えば、１つの例において、ｒｅｓ０２の欠失単独はＰＳＣを発現しなかったが、ｒｅｓ０２／ｉｎｖ１９の二重欠失はＰＳＣを発現した。
【０００５】
下記で詳述するように、本発明は従って、特定の莢膜多糖のみを構成的に発現するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓの新規変異系統を産生および選択する方法；特定の莢膜多糖のみを構成的に発現するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓの新規変異系統に向けられた組成物；個々の莢膜多糖の精製に関する改善された方法；およびｒｅｓ０２およびｉｎｖ１９遺伝子およびその遺伝子産物に向けられた新規組成物を含む。
【０００６】
新規ｒｅｓ０２遺伝子によってコードされる新規ｒｅｓ０２ポリペプチドは、特定の構造的特徴を有する核酸配列に関してインベルターゼとして機能すると考えられる。その特定の構造的特徴は、中央配列をはさむ逆方向反復配列の存在を含み、ここで逆方向反復配列は、ｒｅｓ０２ポリペプチドによって特異的に認識される特定の配列を有する。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、ｒｅｓ０２に関連する単離核酸分子を提供する。この局面による核酸は、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号１で記載されるヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。１つの実施態様において、その核酸分子は、配列番号１で記載されるヌクレオチド配列である。１つの実施態様において、その核酸分子は、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重により、コドン配列において配列番号１で記載されるヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は、ｒｅｓ０２に関連する単離核酸分子を提供する。この局面による核酸は、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号２で記載されるポリペプチドと少なくとも約７０％同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｂ）配列番号１番または（ａ）で記載されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）少なくとも約９アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１番、（ａ）、または（ｂ）のヌクレオチド配列の領域、ここでそのポリペプチドフラグメントは、配列番号２で記載されるコードされたポリペプチドの活性を有する、または抗原性である；（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１番、または（ａ）−（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域；（ｅ）（ａ）−（ｄ）のいずれかの相補鎖に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｆ）（ａ）−（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【０００９】
さらに別の局面において、本発明は、ｒｅｓ０２に関連する単離核酸分子を提供する。この局面による核酸は、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｄ）Ｃ−および／またはＮ−末端切断を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ−末端切断、およびＮ−末端切断からなる群から選択される少なくとも１つの修飾を有する、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）−（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；（ｇ）（ａ）−（ｆ）のいずれかの相補鎖に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｈ）（ａ）−（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１０】
別の局面において、本発明は、上記の局面のいずれかのｒｅｓ０２核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、上記のｒｅｓ０２ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、ｒｅｓ０２に関連する単離ポリペプチドを提供する。この局面による単離ポリペプチドは、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
別の局面において、本発明は、ｒｅｓ０２に関連する単離ポリペプチドを提供する。この局面による単離ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）配列番号２のオルソログのアミノ酸配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｃ）少なくとも約９アミノ酸残基を含む、配列番号２で記載されるアミノ酸配列のフラグメント、ここでそのフラグメントは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する、または抗原性である；および（ｄ）配列番号２、（ａ）または（ｂ）で記載されるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体のアミノ酸配列。
【００１４】
さらに別の局面において、本発明は、ｒｅｓ０２に関連する単離ポリペプチドを提供する。この局面による単離ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｄ）Ｃ−および／またはＮ−末端切断を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する；および（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ−末端切断、およびＮ−末端切断からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾を有する、配列番号２で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する。
【００１５】
ある実施態様において、前述のｒｅｓ０２核酸分子のいずれかによってコードされる単離ポリペプチドは、配列番号２で記載されるポリペプチドの活性を有する。具体的には、ある実施態様において、その活性はプロモーターインベルターゼ活性である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、前述の局面のいずれかのｒｅｓ０２ポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合剤またはそのフラグメントを提供する。１つの実施態様において、選択的結合剤またはそのフラグメントは、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する。１つの実施態様において、選択的結合剤は、抗体またはそのフラグメントである。
【００１７】
さらに別の局面において、本発明は、異種アミノ酸配列に融合した、前述の局面のいずれかのｒｅｓ０２ポリペプチドを含む、融合ポリペプチドを提供する。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は、ｉｎｖ１９に関連する単離核酸分子を提供する。この局面による核酸は、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号３で記載されるヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。１つの実施態様において、その核酸分子は、配列番号３で記載されるヌクレオチド配列である。１つの実施態様において、その核酸分子は、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重により、コドン配列において配列番号３で記載されるヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
別の局面において、本発明は、ｉｎｖ１９に関連する単離核酸分子を提供する。この局面による核酸は、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号４で記載されるポリペプチドと少なくとも約７０％同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｂ）配列番号３番または（ａ）で記載されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）少なくとも約９アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号３番、（ａ）、または（ｂ）のヌクレオチド配列の領域、ここでそのポリペプチドフラグメントは、配列番号４で記載されるコードされたポリペプチドの活性を有する、または抗原性である；（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号３番、または（ａ）−（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域；（ｅ）（ａ）−（ｄ）のいずれかの相補鎖に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｆ）（ａ）−（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２０】
さらに別の局面において、本発明は、ｉｎｖ１９に関連する単離核酸分子を提供する。この局面による核酸は、以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む：（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｄ）Ｃ−および／またはＮ−末端切断を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ−末端切断、およびＮ−末端切断からなる群から選択される少なくとも１つの修飾を有する、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）−（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；（ｇ）（ａ）−（ｆ）のいずれかの相補鎖に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および（ｈ）（ａ）−（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２１】
別の局面において、本発明は、上記の局面のいずれかのｉｎｖ１９核酸分子を含むベクターを提供する。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、上記のｉｎｖ１９ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、ｉｎｖ１９に関連する単離ポリペプチドを提供する。この局面による単離ポリペプチドは、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
別の局面において、本発明は、ｉｎｖ１９に関連する単離ポリペプチドを提供する。この局面による単離ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）配列番号４番のオルソログのアミノ酸配列；（ｂ）配列番号４番のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｃ）少なくとも約９アミノ酸残基を含む、配列番号４で記載されるアミノ酸配列のフラグメント、ここでそのフラグメントは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する、または抗原性である；および（ｄ）配列番号４番、（ａ）または（ｂ）で記載されるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体のアミノ酸配列。
【００２５】
さらに別の局面において、本発明は、ｉｎｖ１９に関連する単離ポリペプチドを提供する。この局面による単離ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；（ｄ）Ｃ−および／またはＮ−末端切断を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する；および（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ−末端切断、およびＮ−末端切断からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾を有する、配列番号４で記載されるアミノ酸配列、ここでそのポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する。
【００２６】
ある実施態様において、前述のｉｎｖ１９核酸分子のいずれかによってコードされる単離ポリペプチドは、配列番号４で記載されるポリペプチドの活性を有する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、前述の局面のいずれかのｉｎｖ１９ポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合剤またはそのフラグメントを提供する。１つの実施態様において、選択的結合剤またはそのフラグメントは、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する。１つの実施態様において、選択的結合剤は、抗体またはそのフラグメントである。
【００２８】
さらに別の局面において、本発明は、異種アミノ酸配列に融合した、前述の局面のいずれかのｉｎｖ１９ポリペプチドを含む、融合ポリペプチドを提供する。
【００２９】
本発明のさらに別の局面によって、ｒｅｓ０２の発現が損傷された細菌細胞が提供される。ｒｅｓ０２の発現を、翻訳産物の欠失、切断、またはフレームシフトのいずれかを引き起こす挿入または欠失変異によるｒｅｓ０２遺伝子配列の変化、またはｒｅｓ０２が細胞によって発現されないような、ｒｅｓ０２遺伝子発現配列の妨害を含むがこれに限らない、多くの可能なメカニズムのいずれかによって損傷し得る。
【００３０】
本発明のさらに別の局面によって、ｉｎｖ１９の発現が損傷された細菌細胞が提供される。ｉｎｖ１９の発現を、翻訳産物の欠失、切断、またはフレームシフトのいずれかを引き起こす挿入または欠失変異によるｉｎｖ１９遺伝子配列の変化、またはｉｎｖ１９が細胞によって発現されないような、ｉｎｖ１９遺伝子発現配列の妨害を含むがこれに限らない、多くの可能なメカニズムのいずれかによって損傷し得る。
【００３１】
別の局面において、本発明は、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなる群から選択される、特定の莢膜多糖、または特定の莢膜多糖を含む、限られたセットの莢膜多糖のみを安定に発現する細菌細胞の集団を提供する。１つの実施態様において、特定の莢膜多糖はＰＳＡである。ある実施態様において、細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３を含むＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓである。１つの実施態様において、細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４である。別の実施態様において、細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２である。
【００３２】
本発明はさらに、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなるグループから選択される莢膜多糖を発現する細菌細胞を提供し、ここでその莢膜多糖の発現を調節するプロモーターは、オンに固定されている。１つの好ましい実施態様において、莢膜多糖はＰＳＡである。いくつかの実施態様において、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなるグループから選択される各および全ての莢膜多糖の発現を調節するプロモーターは、オフに固定されている。いくつかの実施態様において、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなるグループから選択される莢膜多糖のいずれか１つまたは組み合せは、発現されない。またいくつかの実施態様において、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなるグループから選択される莢膜多糖のいずれか１つまたは組み合せの発現を調節するプロモーターは、オフに固定されており、ここで当該莢膜多糖のいずれか１つまたは組み合せは発現されない。１つの実施態様において、ｒｅｓ０２の発現は損傷されている。１つの実施態様において、ｉｎｖ１９の発現は損傷されている。１つの実施態様において、ｒｅｓ０２の発現およびｉｎｖ１９の発現は、どちらも損傷されている。１つの実施態様において、前述の局面のいずれかによる細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓである。１つの実施態様において、前述の局面のいずれかによる細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３である。１つの実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４である。別の実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２である。
【００３３】
さらに別の局面によって、本発明は、莢膜多糖生合成遺伝子の、相可変プロモーターをオンに固定する方法を提供する。この局面による方法は、細菌細胞においてｒｅｓ０２を不活性化して、莢膜多糖生合成遺伝子の相可変プロモーターをオンに固定することを含む。
【００３４】
さらなる局面において、本発明は、莢膜多糖生合成遺伝子の発現に影響を与える方法を提供する。この局面による方法は、細菌細胞においてｉｎｖ１９を不活性化して、莢膜多糖生合成遺伝子の発現に影響を与えることを含む。ある実施態様において、その方法はさらに、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなるグループから選択される少なくとも１つの莢膜多糖を発現する細菌細胞を選択することを含む。ある実施態様において、その方法はさらに、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなるグループから選択される１つの莢膜多糖のみを発現する細菌細胞を選択することを含む。１つの実施態様において、その１つの莢膜多糖はＰＳＡである。
【００３５】
別の局面において、本発明は、細菌細胞からＰＳＡを精製する改善された方法を提供する。その改善は、ＰＳＡのプロモーターがオンまたはオフに固定されるように細菌細胞においてｒｅｓ０２を不活性化し、そしてＰＳＡを発現する細菌細胞を選択することを含む。１つの実施態様において、細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓである。１つの実施態様において、その細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３である。１つの特定の実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４である。別の特定の実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２である。
【００３６】
さらに別の局面によって、本発明はさらに、純粋な莢膜多糖を産生する方法を提供する。この局面による方法は、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなるグループから選択される、特定の莢膜多糖、または特定の莢膜多糖を含む、限られたセットの莢膜多糖のみを安定に発現する細菌細胞の集団を増殖させること、および細菌細胞の集団から特定の莢膜多糖を単離して純粋な莢膜多糖を産生することを含む。１つの実施態様において、特定の莢膜多糖を除く、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなるグループから選択される、莢膜多糖のいずれか１つまたは組み合せの発現を調節するプロモーターは、オフに固定されている。１つの実施態様において、特定の発現される莢膜多糖は、ＰＳＡである。１つの実施態様において、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨからなるグループから選択される、各およびすべての莢膜多糖の発現を調節するプロモーターは、オフに固定されている。１つの実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓである。１つの実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３である。１つの特定の実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４である。別の特定の実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２である。
【００３７】
さらに別の局面において、本発明は、炎症性腸疾患を治療または予防する方法を提供する。この局面による方法は、炎症性腸疾患の治療または予防の必要がある被験体に、特定の莢膜多糖を安定に発現する、有効な量の細菌細胞の集団を投与して、炎症性腸疾患を治療または予防することを含む。１つの実施態様において、特定の莢膜多糖はＰＳＡである。１つの実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓである。１つの実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３である。１つの実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４（ｍｕｔ４４）である。別の実施態様において、その細菌細胞は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２（ｍｕｔ２）である。
【００３８】
（詳細な説明）
この出願において記載される技術は、発明者がＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３について発見した遺伝的情報を、１つの莢膜多糖を他の７つの多糖から精製する困難、およびその発現における相変化による当該莢膜多糖の低収率をどちらも回避するために利用した。重要なことに、この出願において記載される技術は、他の７つの多糖からＰＳＡを精製する困難、およびその発現における相変化によるＰＳＡの低収率をどちらも回避する。
【００３９】
本発明の特色となる局面において、莢膜多糖の相変化を排除するように、ｒｅｓ０２が不活性化される。ｒｅｓ０２活性の欠如は、多糖生合成遺伝子座の逆位可能なプロモーターを、オンまたはオフのいずれかの方向に固定する。特定の表現型の選択が、次いで選択された莢膜多糖のプロモーターがオンに固定され、そして他の莢膜多糖のプロモーターがオフに固定された変異体の選択を可能にする。
【００４０】
「ｒｅｓ０２」、「ｒｅｓ０２遺伝子」、および「ｒｅｓ０２核酸分子」という用語は、配列番号１で記載されるヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る核酸分子、配列番号２で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を指す。
【００４１】
「ｉｎｖ１９」、「ｉｎｖ１９遺伝子」、および「ｉｎｖ１９核酸分子」という用語は、配列番号３で記載されるヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る核酸分子、配列番号４で記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を指す。
【００４２】
「ｒｅｓ０２」、「ｒｅｓ０２ポリペプチド」、および「ｒｅｓ０２遺伝子産物」という用語は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドは、ｒｅｓ０２ポリペプチドフラグメント、ｒｅｓ０２ポリペプチドオルソログ、ｒｅｓ０２ポリペプチド改変体、およびｒｅｓ０２ポリペプチド誘導体を含み、それは配列番号２で記載されるポリペプチドの、少なくとも１つの活性を有する。
【００４３】
「ｉｎｖ１９」、「ｉｎｖ１９ポリペプチド」、および「ｉｎｖ１９遺伝子産物」という用語は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドは、ｉｎｖ１９ポリペプチドフラグメント、ｉｎｖ１９ポリペプチドオルソログ、ｉｎｖ１９ポリペプチド改変体、およびｉｎｖ１９ポリペプチド誘導体を含み、それは配列番号４で記載されるポリペプチドの、少なくとも１つの活性を有する。
【００４４】
（莢膜多糖を過剰発現する方法および組成物）
「ｒｅｓ０２発現が損傷された」細菌細胞は、生存能力のある細菌細胞であり、ここで機能的なｒｅｓ０２ポリペプチドのレベルは、同じ条件下でその細菌細胞によって通常発現される機能的ｒｅｓ０２ポリペプチドのレベルと比較してごくわずかである。その発現を、機能的でないｒｅｓ０２遺伝子産物を生ずる、または機能的ｒｅｓ０２遺伝子産物を生じない、ｒｅｓ０２遺伝子における変異の誘導または存在によって損傷し得る。そのような変異は、ｒｅｓ０２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に関わる、少なくとも１つのミスセンス変異、ナンセンス変異、切断変異、挿入変異、または欠失変異、またはそのあらゆる組み合せを含むものを含む。いくつかの実施態様において、損傷されたｒｅｓ０２発現を引き起こす変異は、ｒｅｓ０２プロモーターに関わる、少なくとも１つの切断、挿入、または欠失変異、またはそのあらゆる組み合せを含む。いくつかの実施態様において、ｒｅｓ０２の発現は、ｒｅｓ０２の発現の上流にある因子の操作によって損傷される。例えば、転写アクチベーター、シグナル伝達、および包括的な調節剤が、ｒｅｓ０２の発現に影響を与え得る。例えば、Ｇａｌｌｙ  ＤＬら（１９９３）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７５：６１８６−９３；Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄ  ＩＣら（１９９３）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７５：２７−３６；Ｄｏｒｍａｎ  ＣＪら（１９８７）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９：３８４０−４３；Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ  ＢＩら（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：６５０６−１０を参照のこと。１つの実施態様において、ｒｅｓ０２の発現が損傷された細菌細胞は、ｒｅｓ０２遺伝子の染色体欠失を有する。
【００４５】
例えば、ｒｅｓ０２発現が損傷された細菌細胞は、配列番号１で示した１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、等のヌクレオチドのいずれか１つまたは組み合せの欠失が存在する細胞であり得る。１つの実施態様において、その欠失は、３’末端より５’末端の近くで起こる。例えば、配列番号１で示した１番目、２番目、または３番目のヌクレオチドの欠失は、位置１の「ａｔｇ」開始コドンを除去し、そして最初の「ａｔｇ」開始コドンを配列番号１の位置６７へ移動させ、配列番号２で示すアミノ酸２３−１９７をコードするＯＲＦを産生する。別の例として、配列番号１に示す４番目のヌクレオチドの欠失は、位置１におけるもとの「ａｔｇ」開始コドンを維持するが、多くの隣接するおよび近くの停止コドンを導入する。
【００４６】
さらなる例として、ｒｅｓ０２の発現が損傷された細菌細胞は、配列番号１で示す１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、等のヌクレオチドのいずれか１つまたは組み合せの後に、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入が存在する細胞であり得る。例えば、その挿入は、配列番号１におけるインフレームの停止コドン（ｔａａ、ｔａｇ、ｔｇａ）の挿入であり得る。さらなる例として、その挿入は、ポリヌクレオチド、例えば外来性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であり得る。１つの実施態様において、その挿入は、３’末端よりも５’末端の近くで起こる。
【００４７】
その欠失または挿入は、相同的組換えによって達成し得る。
【００４８】
相同的組換えはもともと、転写的に活性な遺伝子において、変異を導入する、または訂正するために遺伝子を標的化するために開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ＲＳ（１９８９）Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３６：３０１−１０。基本的な技術は、哺乳類ゲノムの特定の領域に、特定の変異を導入する（Ｔｈｏｍａｓ  ＫＲら（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：４１９−２８；Ｔｈｏｍａｓ  ＫＲら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  Ｔら（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：８５８３−８７）、または欠損遺伝子の特定の変異を訂正する（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  Ｔら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５７６−７８）方法として開発された。典型的な相同的組換えの技術は、米国特許第５，２７２，０７１号；欧州特許第９１９３０５１および５０５５００号；およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９５５）において記載されている。
【００４９】
相同的組換えによって、ゲノムに挿入されるＤＮＡ配列を、標的化ＤＮＡに結合させることによって、関心のある遺伝子の特定の領域に向け得る。標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同的）なヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的な、標的化ＤＮＡの小さな部分を、ＤＮＡ複製過程の間に親鎖と接触させる。共通の相同的領域によって、内因性ＤＮＡの他の部分とハイブリダイズ、そして従って組換えを起こすのは、細胞に挿入されたＤＮＡの一般的な性質である。この相補鎖が、変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと結合しているなら、組換えの結果として、それも新規に合成された鎖に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、新規ＤＮＡ配列が鋳型として作用することが可能である。従って、転移されたＤＮＡはゲノムに組み込まれる。
【００５０】
相同的組換えをまた、ゲノムＤＮＡの領域を欠失させるために使用し得る。この例において、標的化ＤＮＡは、欠失させるものに隣接するゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同的）なヌクレオチド配列である。標的化ＤＮＡは通常、各隣接領域に関して少なくとも１キロベース（１ｋｂ）の長さであり、そしてより好ましくは各隣接領域に関して２ｋｂ近い。この相補鎖を、ＤＮＡ複製過程の間に親鎖と接触させると、組換えの結果としてそれは新規に合成された鎖に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、相同的な隣接領域間のもとのゲノム配列を欠く、新規のＤＮＡ配列が、鋳型として作用することが可能である。従って、転移されたＤＮＡがゲノムに組み込まれる。
【００５１】
相同的組換えによる欠失は、ダブルクロスオーバー対立遺伝子交換を含む。この方法において、最初の組換えが１つの隣接領域で起こり、そして次いで２番目の組換えが反対の隣接で起こる。結果として、ダブルクロスオーバー相同的交換は、欠失変異体であるもの、および野生型であるものの、２グループの細胞を生じる。特定の細胞が野生型であるか、または欠失変異体であるかの決定は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物のスクリーニングによって、または染色体欠失の直接スクリーニングによって達成し得る。
【００５２】
「ｉｎｖ１９発現が損傷された」細菌細胞は、生存能力のある細菌細胞であり、ここで機能的なｉｎｖ１９ポリペプチドのレベルは、同じ条件下でその細菌細胞によって通常発現される機能的ｉｎｖ１９ポリペプチドのレベルと比較してごくわずかである。その発現を、機能的でないｉｎｖ１９遺伝子産物を生ずる、または機能的ｉｎｖ１９遺伝子産物を生じない、ｉｎｖ１９遺伝子における変異の導入または存在によって損傷し得る。そのような変異は、ｉｎｖ１９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に関わる、少なくとも１つのミスセンス変異、ナンセンス変異、切断変異、挿入変異、または欠失変異、またはそのあらゆる組み合せを含むものを含む。いくつかの実施態様において、損傷されたｉｎｖ１９発現を引き起こす変異は、ｉｎｖ１９プロモーターに関わる、少なくとも１つの切断、挿入、または欠失変異、またはそのあらゆる組み合せを含む。いくつかの実施態様において、ｉｎｖ１９の発現は、ｉｎｖ１９の発現の上流にある因子の操作によって損傷される。例えば、転写アクチベーター、シグナル伝達、および包括的な調節剤が、ｒｅｓ０２の発現に影響を与え得る。例えば、Ｇａｌｌｙ  ＤＬら（１９９３）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７５：６１８６−９３；Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄ  ＩＣら（１９９３）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７５：２７−３６；Ｄｏｒｍａｎ  ＣＪら（１９８７）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９：３８４０−４３；Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ  ＢＩら（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：６５０６−１０を参照のこと。１つの実施態様において、ｉｎｖ１９の発現が損傷された細菌細胞は、ｉｎｖ１９遺伝子の染色体欠失を有する。
【００５３】
例えば、ｉｎｖ１９発現が損傷された細菌細胞は、配列番号３で示した１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、等のヌクレオチドのいずれか１つまたは組み合せの欠失が存在する細胞であり得る。１つの実施態様において、その欠失は、３’末端より５’末端の近くで起こる。
【００５４】
さらなる例として、ｉｎｖ１９の発現が損傷された細菌細胞は、配列番号３で示す１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、等のヌクレオチドのいずれか１つまたは組み合せの後に、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入が存在する細胞であり得る。例えば、その挿入は、配列番号３におけるインフレームの停止コドン（ｔａａ、ｔａｇ、ｔｇａ）の挿入であり得る。さらなる例として、その挿入は、ポリヌクレオチド、例えば外来性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列であり得る。１つの実施態様において、その挿入は、３’末端よりも５’末端の近くに起こる。
【００５５】
その欠失または挿入は、相同的組換えによって達成し得る。
【００５６】
「細菌細胞の集団」は、細菌細胞の培養である。その培養は、液体培養、半固体培養、例えばゼラチンにおける、または固体培地、例えば栄養添加寒天における培養であり得る。これらの様々な型の細菌培養物の例は、当業者に周知である。液体培養は、好ましくは温度、通気、および攪拌の条件が調節された、試験管、フラスコ、ローラーボトル、バイオリアクター、または他の適当な容器中であり得る。液体培養の容量は、１ｍＬより少ない量から、１０Ｌまたはそれ以上までの範囲であり得る。１つの実施態様において、細菌細胞の集団は、単一の細菌由来、すなわちそれはクローンである。
【００５７】
「莢膜多糖を発現する細菌細胞」は、莢膜多糖に関する、細菌細胞の検出可能な表現型を指す。その表現型は、遺伝子型と一致し得、または不一致であり得る。例えば、ＰＳＥのプロモーターがオンの方向に固定された細菌細胞は、ＰＳＥを発現しても良いし、または発現しなくても良い。もちろん、ＰＳＥのプロモーターがオフの方向に固定された細菌細胞は、一般的にＰＳＥを発現しない。遺伝子型を、ポリメラーゼ連鎖反応、制限エンドヌクレアーゼ消化、直接シークエンシング、または染色体ＤＮＡまたはＲＮＡの関連する部分の配列を決定または推測するために適当な任意の他の方法によって、簡便に評価し得る。表現型は、ウェスタンイムノブロット、イムノアフィニティー、または抗体またはアッセイされる特定の莢膜多糖に特異的な他の莢膜多糖結合剤を用いる他の適当なアッセイによって、簡便に評価し得る。その抗体は、単一特異性抗血清または規定された特異性抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、前述の抗体の多糖特異的結合断片、およびその誘導体の形式であり得る。
【００５８】
「特定の莢膜多糖を安定に発現する細菌細胞」は、その発現の相変化無しに特定の莢膜多糖を発現する細菌細胞を指す。「特定の莢膜多糖を安定に発現する細菌細胞の集団」は、その発現の相変化無しに特定の莢膜多糖を発現する細菌細胞の集団を指す。ある実施態様において、特定の莢膜多糖は、その細菌細胞または細菌細胞の集団によって発現される唯一の莢膜多糖である。相変化の欠如は、多糖生合成遺伝子の通常は逆位可能なプロモーターが、そのオン方向に固定されるような、ｒｅ０２の不活性化を反映し得る。
【００５９】
本明細書中で使用される「莢膜多糖の発現を調節するプロモーター」は、莢膜多糖生合成遺伝子の転写に関連する、およびそれを調節する非転写遺伝的エレメントを指す。莢膜多糖生合成遺伝子は、多シストロン性莢膜多糖生合成遺伝子座の一部として存在し得る。当該プロモーターは、関連する莢膜多糖生合成遺伝子座中の、１つ以上の莢膜多糖生合成遺伝子の転写を調節し得る。１つの実施態様において、そのプロモーターは、介在配列によって分離された、逆方向反復領域を含む。１つの実施態様において、そのプロモーターは、介在配列において逆方向反復領域の間に含まれ、そして逆位を受け、１つの方向においてプロモーターは莢膜多糖生合成遺伝子に関して転写的に活性（「オン」）であり、一方反対の、または反転した方向においてそのプロモーターは莢膜多糖生合成遺伝子に関して転写的に不活性（「オフ」）である。逆方向反復配列の間の、逆位可能なプロモーター領域の逆位は、リコンビナーゼまたはインベルターゼと呼ばれる配列特異的な酵素による調節を受ける。１つの実施態様において、リコンビナーゼまたはインベルターゼはｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９である。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの８つの公知の莢膜多糖のうち７つ、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨのプロモーターは、逆方向反復領域にはさまれ、そして逆位を受けることが報告された。Ｋｒｉｎｏｓ  ＣＭら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：５５５−５８。
【００６０】
Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓにおける７つの莢膜多糖それぞれの下流逆方向反復を、表１に示す。太字で示した配列が、プロモーター逆位に必要なコンセンサスｒｅｓ０２認識配列を示す。
【００６１】
（表１．７つの多糖（ＰＳ）生合成遺伝子座の上流の、逆方向反復（ＩＲ）領域の特徴。）
【００６２】
【表１】
2005519617.tif 000002
「莢膜多糖生合成遺伝子の相可変性プロモーター」は、莢膜多糖生合成遺伝子のプロモーターを指し、それは、今記載したように、介在配列によって分離された逆方向反復領域を含み、そして逆位をうけて１つの方向においてそのプロモーターは莢膜多糖生合成遺伝子に関して転写的に活性（「オン」）であり、一方反対方向においてそのプロモーターは莢膜多糖生合成遺伝子に関して転写的に不活性（「オフ」）である。相変化は、逆位可能なプロモーターの方向に反応して、可変性の莢膜多糖の発現を引き起こす。この相変化は通常、まだ理解されていない理由のために、時間につれて当該細胞で起こり得る。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの８つの公知の莢膜多糖のうち７つ、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨは、相変化を受ける。８つの公知の莢膜多糖に関して、当該細胞の表現型は、理論的には時間につれて２８（２５６）個の表現型のいずれかに変化し得る。しかし、本明細書中で開示されるように、莢膜多糖の相変化は、相変化の基礎となるプロモーター逆位メカニズムを損傷することによって、固定（ｆｉｘｅｄ）または固定（ｌｏｃｋｅｄ）し得る。
【００６３】
莢膜多糖の発現を調節するプロモーターは、逆位可能なプロモーターが転写的に活性な方向にあり、そしてそれが転写的に不活性な方向に転位できない場合に、「オンに固定」される。そのプロモーターを、通常プロモーターを転位させる配列特異的な酵素が存在しない、または他の方法で損傷されているので、オンに固定し得る。あるいは、そのプロモーターを、逆位が不可能であるように、プロモーターの逆位可能な領域をはさむ、少なくとも１つの逆方向反復が変化している、例えば欠失しているので、オンに固定し得る。
【００６４】
莢膜多糖の発現を調節するプロモーターは、逆位可能なプロモーターが転写的に不活性な方向にあり、そしてそれが転写的に活性な方向に転位できない場合に、「オフに固定」される。そのプロモーターを、通常プロモーターを転位させる配列特異的な酵素が存在しない、または他の方法で損傷されているので、オフに固定し得る。あるいは、そのプロモーターを、逆位が不可能であるように、プロモーターの逆位可能な領域をはさむ、少なくとも１つの逆方向反復が変化している、例えば欠失しているので、オフに固定し得る。
【００６５】
「細菌細胞においてｒｅｓ０２を不活性化して、莢膜多糖の生合成遺伝子の相可変性プロモーターを固定する」という語句は、ｒｅｓ０２遺伝子産物による、細菌細胞の莢膜多糖生合成遺伝子の相可変性プロモーターの逆位を不可能にする、あらゆる介入を指す。その介入は、典型的には本明細書中で記載されるようなｒｅｓ０２遺伝子の欠失を含み得る。機能的でないｒｅｓ０２遺伝子産物を生じる他のｒｅｓ０２遺伝子変異の導入、ｒｅｓ０２アンチセンス核酸またはｒｅｓ０２核酸分子に結合する他の薬剤の導入、およびそうでなければ機能的なｒｅｓ０２遺伝子産物の機能を妨害し得る薬剤の細菌細胞への導入を含む、他の介入も企図される。
【００６６】
「細菌細胞においてｉｎｖ１９を不活性化して、莢膜多糖の生合成遺伝子の相可変性プロモーターを固定する」という語句は、ｉｎｖ１９遺伝子産物による、細菌細胞の莢膜多糖生合成遺伝子の相可変性プロモーターの逆位を不可能にする、あらゆる介入を指す。その介入は、典型的には本明細書中で記載されるようなｉｎｖ１９遺伝子の欠失を含み得る。機能的でないｉｎｖ１９遺伝子産物を生じる他のｉｎｖ１９遺伝子変異の導入、ｉｎｖ１９アンチセンス核酸またはｉｎｖ１９核酸分子に結合する他の薬剤の導入、およびそうでなければ機能的なｉｎｖ１９遺伝子産物の機能を妨害し得る薬剤の細菌細胞への導入を含む、他の介入も企図される。
【００６７】
「純粋な莢膜多糖」は、（１）全体の莢膜多糖が供給源細胞から単離される場合にそれが本来一緒に見出される、タンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離された、および（２）実質的に他の全ての莢膜多糖を含まない、本発明の莢膜多糖を指す。「実質的に全ての他の莢膜多糖を含まない」は、その関心のある莢膜多糖が、存在する全ての莢膜多糖の少なくとも８０％に相当することを意味する。好ましくは、その関心のある莢膜多糖は、存在する全ての莢膜多糖の、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９８％に相当する。１つの実施態様において、本発明の純粋な莢膜多糖は実質的に、その天然の環境で見出される、その治療的、診断的、予防的または研究的使用を妨害するいかなる混入物も含まない。
【００６８】
「炎症性腸疾患」は、胃腸管に関わる、未知のまたは自己免疫的原因の慢性炎症性疾患のグループを指す。これらの疾患は、医学的分野において周知であり、そして２つの主なカテゴリー、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む。潰瘍性大腸炎は、粘膜単独に関わる、大腸における継続的な損傷として特徴的に起こり、一方クローン病は、腸管壁の全ての層の炎症を含む、胃腸管のあらゆる場所の非継続的な損傷として特徴的に起こる。炎症性腸疾患の原因ははっきりしないが、基礎となる感染性原因が存在し得ることを示唆する証拠が存在し、そして有効な治療は、局所または全身性の免疫調節剤の使用を含む。Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版、Ｆａｕｃｉ  ＡＳら編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、１９９８、第２８６章におけるＧｌｉｃｋｍａｎ  ＲＭを参照のこと。
【００６９】
発明者は、ＰＳＡを過剰発現する、生きている、または生存能力のある細菌を、炎症性腸疾患を治療または予防するために使用し得ると考える。腸は、通常Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓを含む多くの種の細菌がコロニーを作る。従って、ＰＳＡを過剰発現する、生きている、または生存能力のある細菌の腸への導入は、よく許容されると予測される。しかし、ＰＳＡの抗炎症性サイトカインインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を誘導する能力と関連すると考えられる、以前に記載した炎症性腸疾患におけるＰＳＡの有益な効果、およびこれらの細菌のＰＳＡを過剰発現する能力のために、これらの生きている、または生存能力のある細菌を腸内に導入し、そして従って炎症性腸疾患を治療および予防し得ることが予測される。ＰＳＡを過剰発現する、生きている、または生存能力のある細菌を、炎症性腸疾患の治療の必要がある被験体に、経口または直腸経由で投与し得る。それらの効果を、通常の様式で疾患の活性を追うことによって決定し得る。さらに、ＰＳＡを過剰発現する、生きている、または生存能力のある細菌を、もちろん、ＰＳＡを過剰発現する、生きている、または生存能力のある細菌が感受性である抗生物質を除いて、炎症性腸疾患の治療に有用なあらゆる他の治療薬と組み合せて投与し得る。生存能力のある細菌は、具体的には、適当な条件への復帰時に増殖し得る、凍結乾燥された細菌を含む。
ｒｅｓ０２およびｉｎｖ１９核酸およびポリペプチド
「ポリペプチド対立遺伝子変異体」という用語は、有機体または有機体の集団の染色体において、当該遺伝子座を占める遺伝子の、１つまたはいくつかの可能な天然に存在する代替形式を指す。
【００７０】
「単離核酸分子」という用語は、（１）全体の核酸が供給源細胞から単離される場合に通常一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離された、（２）天然においてその「単離核酸分子」が連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と連結していない、（３）天然においてそれが連結していないポリヌクレオチドに、操作可能に連結している、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然に存在しない、本発明の核酸分子を指す。好ましくは、本発明の単離核酸分子は、実質的にあらゆる他の核酸分子、またはそのポリペプチド産生における使用またはその治療的、診断的、予防的または研究的使用を妨害する、天然の環境において見出される他の混入物を含まない。
【００７１】
「核酸配列」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。その用語は、天然塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル）、および４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル（ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキソブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオミトシン、２，６−ジアミノプリン、およびそのあらゆる組み合せのような、しかしこれに限定されない、ＤＮＡおよびＲＮＡの塩基アナログのいずれかから形成される分子を含む。いくつかの実施態様において、核酸配列または核酸分子は、修飾バックボーン、例えば少なくとも１つのホスホジエステル結合ではないヌクレオシド間結合によって特徴付けられるバックボーンを有し得る。１つの実施態様において、修飾バックボーンは、少なくとも１つの安定化ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合を含む。
【００７２】
「ベクター」という用語は、コードされた情報を宿主細胞へ転移させるために使用する、あらゆる分子（例えば核酸、プラスミド、またはウイルス）を指すために使用される。
【００７３】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適当であり、そして挿入された異種由来核酸配列の発現を指示および／または調節する核酸配列を含むベクターを指す。発現は、転写、翻訳、およびもしイントロンが存在する場合ＲＮＡスプライシングのような過程を含むがこれに限定されない。
【００７４】
「操作可能に連結された」という用語は、本明細書中において、遺伝子発現配列の転写および／または翻訳調節エレメントおよびコード配列のオープンリーディングフレームが、コード配列の発現または転写および／または翻訳を遺伝子発現配列の影響または調節下に置くような方法で共有結合している、遺伝子発現配列およびコード配列の配置を指すために使用される。従って、もし５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの誘導が、コード配列の転写を引き起こすなら、そしてもし２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト変異の導入を引き起こさない、（２）プロモーター領域の、コード配列の転写を指示する能力を妨害しない、または（３）対応するＲＮＡ転写物の、タンパク質へ翻訳される能力を妨害しないなら、２つのＤＮＡ配列は操作可能に連結されていると言われる。従って、もし遺伝子発現配列が、できた転写物が望ましいタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸配列の転写に影響を与え得たなら、遺伝子発現配列は、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸配列に操作可能に連結されている。遺伝子発現配列は、それが正しく機能する限り、コード配列と連続的である必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列およびコード配列の間に存在し得、そしてそのプロモーター配列は、依然としてそのコード配列と「操作可能に連結している」と考えられ得る。さらに、エンハンサーは、コード配列の上流または下流であり得、そしてエンハンサーはコード配列と連続的である必要はない。
【００７５】
「宿主細胞」という用語は、形質転換された、または核酸配列で形質転換され、そして次いで選択された関心のある遺伝子を発現し得る細胞を指すために使用される。その用語は、その子孫が形態学において、または遺伝的構成においてもとの親と同一であるかどうかにかかわらず、選択された遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫を含む。
【００７６】
「ｒｅｓ０２ポリペプチド断片」という用語は、配列番号第２番で記載されたポリペプチドの、アミノ末端における切断および／またはカルボキシル末端における切断を含むポリペプチドを指す。「ｒｅｓ０２ポリペプチド断片」という用語はまた、ｒｅｓ０２ポリペプチドオルソログ、ｒｅｓ０２ポリペプチド誘導体、またはｒｅｓ０２ポリペプチド変異体のアミノ末端および／またはカルボキシル末端切断、またはｒｅｓ０２ポリペプチド対立遺伝子変異体またはｒｅｓ０２ポリペプチドスプライシング変異体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端切断を指す。ある実施態様において、切断および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多いアミノ酸を含む。そのように産生されたポリペプチド断片は、その間のすべての整数を含んで、約１８７、または約１７７、または約１４７、または約１２２、または約９７、または約９までの数の連続的アミノ酸を含む。そのようなｒｅｓ０２ポリペプチド断片は、任意でアミノ末端メチオニン残基を含み得る。そのような断片を、例えばｒｅｓ０２ポリペプチドに対する抗体を産生するために使用し得ることが考えられる。
【００７７】
「ｉｎｖ１９ポリペプチド断片」という用語は、配列番号第４番で記載されたポリペプチドの、アミノ末端における切断および／またはカルボキシル末端における切断を含むポリペプチドを指す。「ｉｎｖ１９ポリペプチド断片」という用語はまた、ｉｎｖ１９ポリペプチドオルソログ、ｉｎｖ１９ポリペプチド誘導体、またはｉｎｖ１９ポリペプチド変異体のアミノ末端および／またはカルボキシル末端切断、またはｉｎｖ１９ポリペプチド対立遺伝子変異体またはｉｎｖ１９ポリペプチドスプライシング変異体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端切断および／またはカルボキシル末端切断を指す。ある実施態様において、切断および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多いアミノ酸を含む。そのように産生されたポリペプチド断片は、その間のすべての整数を含んで、約２９６、または約２８６、または約２５６、または約２３１、または約２０６、または約９までの数の連続的アミノ酸を含む。そのようなｉｎｖ１９ポリペプチド断片は、任意でアミノ末端メチオニン残基を含み得る。そのような断片を、例えばｉｎｖ１９ポリペプチドに対する抗体を産生するために使用し得ることが考えられる。
【００７８】
「ｒｅｓ０２ポリペプチドオルソログ」という用語は、配列番号第２番で記載されたｒｅｓ０２ポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドを指す。
【００７９】
「ｉｎｖ１９ポリペプチドオルソログ」という用語は、配列番号第４番で記載されたｉｎｖ１９ポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドを指す。
【００８０】
「ｒｅｓ０２ポリペプチド変異体」という用語は、配列番号第２番で記載されたｒｅｓ０２ポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列置換、欠失（内部欠失および／またはｒｅｓ０２ポリペプチド断片のような）、および／または追加（内部追加および／またはｒｅｓ０２融合ポリペプチドのような）を有するアミノ酸配列を含むｒｅｓ０２ポリペプチドを指す。変異体は、天然に存在し得る（例えばｒｅｓ０２ポリペプチド対立遺伝子変異体およびｒｅｓ０２ポリペプチドオルソログ）、または人工的に構築し得る。そのようなｒｅｓ０２ポリペプチド変異体を、配列番号第１番で記載されたＤＮＡ配列からそれに応じて変化しているＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製し得る。ある実施態様において、その変異体は、１から３、または１から５、または１から１０、または１から１５、または１から２０、または１から２５、または１から５０、または１から７５、または１から１００、または１００アミノ酸より多い置換、挿入、追加、および／または欠失を有し、ここでその置換は保存的、または非保存的、またはそのあらゆる組み合せであり得る。
【００８１】
「ｉｎｖ１９ポリペプチド変異体」という用語は、配列番号第４番で記載されたｉｎｖ１９ポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列置換、欠失（内部欠失および／またはｉｎｖ１９ポリペプチド断片のような）、および／または追加（内部追加および／またはｉｎｖ１９融合ポリペプチドのような）を有するアミノ酸配列を含むｉｎｖ１９ポリペプチドを指す。変異体は、天然に存在し得る（例えばｉｎｖ１９ポリペプチド対立遺伝子変異体およびｉｎｖ１９ポリペプチドオルソログ）、または人工的に構築し得る。そのようなｉｎｖ１９ポリペプチド変異体を、配列番号第３番で記載されたＤＮＡ配列からそれに応じて変化しているＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製し得る。ある実施態様において、その変異体は、１から３、または１から５、または１から１０、または１から１５、または１から２０、または１から２５、または１から５０、または１から７５、または１から１００、または１００アミノ酸より多い置換、挿入、追加、および／または欠失を有し、ここでその置換は保存的、または非保存的、またはそのあらゆる組み合せであり得る。
【００８２】
「ｒｅｓ０２ポリペプチド誘導体」という用語は、化学的に修飾された、配列番号第２番で記載されたポリペプチド、本明細書中で規定されたようなｒｅｓ０２ポリペプチド断片、ｒｅｓ０２ポリペプチドオルソログ、またはｒｅｓ０２ポリペプチド変異体を指す。「ｒｅｓ０２ポリペプチド誘導体」という用語はまた、化学的に修飾された、本明細書中で規定されたようなｒｅｓ０２ポリペプチド対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドを指す。
【００８３】
「ｉｎｖ１９ポリペプチド誘導体」という用語は、化学的に修飾された、配列番号第４番で記載されたポリペプチド、本明細書中で規定されたようなｉｎｖ１９ポリペプチド断片、ｉｎｖ１９ポリペプチドオルソログ、またはｉｎｖ１９ポリペプチド変異体を指す。「ｉｎｖ１９ポリペプチド誘導体」という用語はまた、化学的に修飾された、本明細書中で規定されたようなｉｎｖ１９ポリペプチド対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドを指す。
【００８４】
「ｒｅｓ０２融合ポリペプチド」という用語は、配列番号第２番で記載されたポリペプチド、本明細書中で規定されたようなｒｅｓ０２ポリペプチド断片、ｒｅｓ０２ポリペプチドオルソログ、ｒｅｓ０２ポリペプチド変異体、またはｒｅｓ０２誘導体のアミノまたはカルボキシル末端における、１つまたはそれ以上のアミノ酸（異種由来タンパク質またはペプチドのような）の融合を指す。「ｒｅｓ０２融合ポリペプチド」という用語はまた、本明細書中で規定されたようなｒｅｓ０２ポリペプチド対立遺伝子変異体またはｒｅｓ０２ポリペプチドスプライシング変異体によってコードされるポリペプチドのアミノまたはカルボキシル末端における、１つまたはそれ以上のアミノ酸の融合を指す。
【００８５】
「ｉｎｖ１９融合ポリペプチド」という用語は、配列番号第４番で記載されたポリペプチド、本明細書中で規定されたようなｉｎｖ１９ポリペプチド断片、ｉｎｖ１９ポリペプチドオルソログ、ｉｎｖ１９ポリペプチド変異体、またはｉｎｖ１９誘導体のアミノまたはカルボキシル末端における、１つまたはそれ以上のアミノ酸（異種由来タンパク質またはペプチドのような）の融合を指す。「ｉｎｖ１９融合ポリペプチド」という用語はまた、本明細書中で規定されたようなｉｎｖ１９ポリペプチド対立遺伝子変異体またはｉｎｖ１９ポリペプチドスプライシング変異体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端における、１つまたはそれ以上のアミノ酸の融合を指す。
【００８６】
「生物学的に活性なｒｅｓ０２ポリペプチド」という用語は、配列番号第２番のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特徴的な少なくとも１つの活性を有するｒｅｓ０２ポリペプチドを指す。１つの実施態様において、その活性は、プロモーターインベルターゼ活性である。それに加えて、ｒｅｓ０２ポリペプチドは、免疫原として活性であり得る、すなわち、そのｒｅｓ０２ポリペプチドは、抗体を産生し得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００８７】
「生物学的に活性なｉｎｖ１９ポリペプチド」という用語は、配列番号第４番のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特徴的な少なくとも１つの活性を有するｉｎｖ１９ポリペプチドを指す。それに加えて、ｉｎｖ１９ポリペプチドは、免疫原として活性であり得る、すなわち、そのｉｎｖ１９ポリペプチドは、抗体を産生し得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００８８】
「単離ポリペプチド」という用語は、（１）供給源細胞から単離される場合にそれとともに天然に見出される、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離された、（２）その「単離ポリペプチド」が天然において連結しているポリペプチドの全てまたは一部と連結していない（共有結合または非共有結合的相互作用によって）、（３）天然においてそれが連結していないポリペプチドと操作可能に連結している（共有結合または非共有結合的相互作用によって）、または（４）天然に存在しない、本発明のポリペプチドを指す。好ましくは、単離ポリペプチドは、その天然環境において見出され、その治療的、診断的、予防的または研究的使用を妨害するあらゆる他のポリペプチドまたは他の混入物を実質的に含まない。
【００８９】
「同一性」という用語は、当該分野で公知のように、配列を比較することによって決定される、２つまたはそれ以上のポリペプチド分子、あるいは２つまたはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当該分野において、「同一性」はまた、場合により、一連の２つまたはそれ以上のヌクレオチドあるいは２つまたはそれ以上のアミノ酸配列間のマッチによって決定されるような、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって扱われる、ギャップアラインメント（もしあるなら）を有する、２つまたはそれ以上の配列のうち小さな方の間の同一のマッチのパーセントを測定する。核酸分子に関する同一性パーセントを、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのような、配列アラインメントアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを用いて、簡便に決定し得る。ポリペプチドに関する同一性パーセントを、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのような、配列アラインメントアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを用いて、簡便に決定し得る。
【００９０】
「類似性」という用語は、関連する概念であるが、「同一性」と対照的に、「類似性」は同一のマッチおよび保存的置換マッチを両方含む関連性の測定を指す。もし２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０の同一アミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換ならば、同一性および類似性パーセントはどちらも５０％である。もし同じ例において、保存的置換である５つ以上の位置がさらに存在するなら、同一性パーセントは５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）である。従って、保存的置換が存在する場合には、２つのポリペプチド間の類似性パーセントは、それら２つのポリペプチド間の同一性パーセントよりも高い。
【００９１】
「単離された」という用語と関連して使用される場合を除いて、「天然に存在する」または「天然の」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等のような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出される、そしてヒトによって操作されていない物質を指す。「単離された」という用語と関連して使用される場合、「天然に存在する」または「天然の」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等のような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出されるような野生型構造的特徴を共有する単離された物質を指す。例えば、単離された天然に存在するｒｅｓ０２ポリペプチドは、１つの実施態様において、配列番号第２番の配列を有する、単離された野生型ｒｅｓ０２ポリペプチドである。本明細書中で使用される「天然に存在しない」または「非天然の」という用語は、天然において見出されない、または構造的に修飾された、またはヒトによって合成された物質を指す。
【００９２】
「有効な量」という用語は、それが使用される目的を達成するのに有用な物質の量を指す。「治療的に有効な量」という用語は、それが使用される治療的効果を達成するのに有用な物質の量を指す。従って、物質の治療的に有効な量は、被験体の状態または疾患を治療または予防するために患者に投与された場合に、被験体の状態または疾患の開始を予防する、その症状を軽減する、またはその進行を停止させる物質の量である。
【００９３】
本明細書中で使用される「薬剤学的に許容できる担体」または「生理学的に許容できる担体」という用語は、医薬品組成物として薬剤の伝達を達成するまたは増強するために適当な、１つまたはそれ以上の処方物質を指す。
【００９４】
「抗原」という用語は、抗体のような選択的結合剤によって結合され得、およびさらに動物においてその抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するために使用され得る分子または分子の一部を指す。抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有し得る。
【００９５】
「選択的結合剤」という用語は、抗原、例えばｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドに対する特異性を有する分子または複数の分子を指す。本明細書中で使用される場合、「特異的」および「特異性」という用語は、選択的結合剤の、関心のある抗原に結合し、そして他の抗原に結合しない能力を指す。
【００９６】
「形質導入」という用語は、通常ファージによる、１つの細菌から別の細菌への遺伝子の転移を指すために使用される。
【００９７】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）または外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、そしてその外来性ＤＮＡが、細胞膜内に導入された場合に、細胞は「トランスフェクト」された。多くのトランスフェクション技術が当該分野で周知であり、そして本明細書中で開示される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）を参照のこと。そのような技術を使用して、１つまたはそれ以上の外来性ＤＮＡ部分を、適当な宿主細胞へ導入し得る。
【００９８】
本明細書中で使用される「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴における変化を指し、そして細胞が新規ＤＮＡを含むよう修飾された場合に、その細胞は形質転換された。例えば、細胞がその天然の状態から遺伝的に修飾される場合に、その細胞は形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換ＤＮＡは細胞の染色体に物理的に組み込まれることによって、細胞のＤＮＡと組換えを起こし得るか、複製されることなくエピソームエレメントとして一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立に複製し得る。ＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合、細胞は安定に形質転換されたと考えられる。
【００９９】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連する核酸分子は、配列番号１または配列番号３いずれかの核酸分子の対立遺伝子改変体を含み、そして上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列を含むことが理解される。関連する核酸分子はまた、配列番号２または配列番号４いずれかのポリペプチドと比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換、修飾、追加、および／または欠失を含む、またはそれから実質的に成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１００】
関連する核酸分子はまた、配列番号２または配列番号４いずれかのｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの、少なくとも約９個の連続的なアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸、または約２００より多いアミノ酸残基のポリペプチドをコードする、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸分子の断片を含む。
【０１０１】
それに加えて、関連するｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸分子はまた、本明細書中で定義されるような中程度または高度にストリンジェントな条件下で、それぞれ配列番号１または配列番号３いずれかのｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸分子の、または配列番号２または配列番号４いずれかで示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子の、または本明細書中で定義されるような核酸断片の、または本明細書中で定義されるようなポリペプチドをコードする核酸断片の、完全に相補的な配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むそれらの分子を含む。ハイブリダイゼーションプローブを、本明細書中で提供されるｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９配列を使用して調製して、ｃＤＮＡ、ゲノムまたは合成ＤＮＡライブラリーを、関連する配列に関してスクリーニングし得る。公知の配列に対して有意な同一性を示すｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列の領域を、本明細書中で記載されたような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定し、そしてそれらの領域を、スクリーニングのためのプローブを設計するために使用し得る。
【０１０２】
「核酸断片」という用語は、それが由来する配列と、それが由来する配列より少なくとも１塩基短い、少なくとも１６個の連続的な塩基のあらゆる配列を共有する核酸分子を指す。その核酸断片は、１６、１７、１８、１９、２０等、それが由来する配列の全塩基数までであるがそれを含まない塩基長であり得る。例えば、いくつかの実施態様において、配列番号１の核酸断片は、配列番号１の塩基１−１６、２−１７、３−１８、４−１９等から塩基５７９−５９４までによって規定される１６マーである。さらなる例として、いくつかの実施態様において、配列番号１の核酸断片は、配列番号１の塩基１−１７、２−１８、３−１９、４−２０等から塩基５７８−５９４までによって規定される１７マーである。ある好ましい実施態様において、核酸断片は、その断片が由来する全長核酸配列によってコードされる、対応するポリペプチドの免疫原性ペプチドをコードする。免疫原性ペプチドは、一般的に少なくとも９アミノ酸長であることが認識されるので、免疫原性ペプチドをコードする好ましい核酸断片は、少なくとも２７塩基長である。本発明の核酸断片はまた、標的ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして、およびＤＮＡハイブリダイゼーションにおけるプローブとして使用するために有用である。いくつかの実施態様において、核酸断片はさらに、連続的な配列にはさまれた、非連続的な配列を含む。例えば、その断片は、少なくとも１塩基を追加、少なくとも１塩基を欠失、または少なくとも１塩基を変化させ、そして依然としてプライマーまたはプローブとして有用であり得る。そのような方法は、ＰＣＲ増幅産物に制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する、特定の配列に変異を導入する等の目的のために、当該分野で周知である。
【０１０３】
「高度にストリンジェントな条件」という用語は、その配列が高度に相補的なＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そして有意にミスマッチのＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するよう設計された条件を指す。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５−６８℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、または４２℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％のホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｃｈ．４（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【０１０４】
よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤のような）を使用し得るが、ハイブリダイゼーションの率が影響される。非特異的および／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを抑制する目的のために、他の薬剤をハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液に含み得る。例は、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のポリビニルピロリドン、０．１％のピロリン酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、フィコール、デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適当な薬剤も使用し得る。これらの添加剤の濃度および型を、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えずに変化させ得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常ｐＨ６．８−７．４において行なわれるが、典型的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーション率はほとんどｐＨと独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｃｈ．４（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【０１０５】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子は、塩基の組成、長さ、および塩基対ミスマッチの程度を含む。ハイブリダイゼーション条件を、これらの変数を配慮し、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために、当業者によって調整し得る。完全にマッチしたＤＮＡ二重鎖の融解温度を、以下の方程式によって推定し得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここでＮは形成される二重鎖の長さ、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションまたは洗浄溶液におけるナトリウムイオンのモル濃度、および％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセントである。不完全にマッチしたハイブリッドに関して、融解温度は１％のミスマッチごとに約１℃減少する。
【０１０６】
「中程度にストリンジェントな条件」という用語は、ＤＮＡ二重鎖が、「高度にストリンジェントな条件」下で起こり得るよりも、より高い塩基対ミスマッチの程度で形成し得る条件を指す。典型的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、または３７〜５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および２０％のホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍのナトリウムイオンにおける５０℃の「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％のミスマッチを可能にする。
【０１０７】
「高度にストリンジェントな条件」および「中程度にストリンジェントな条件」の間に、絶対的な区別は無いことが、当業者によって認識される。例えば、０．０１５Ｍのナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全にマッチした長いＤＮＡの融解温度は約７１℃である。６５℃における洗浄（同じイオン強度において）によって、これは約６％のミスマッチを可能にする。より遠く関連する配列を捕獲するために、当業者は、単純に温度を下げるか、またはイオン強度を上げ得る。
【０１０８】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブに関する、１ＭのＮａＣｌ、例えば６×塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）における融解温度のよい推定は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対につき２℃＋Ｇ−Ｃ塩基対につき４℃。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドの高度にストリンジェントな洗浄条件は、通常６×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて、オリゴヌクレオチドのＴｍより０〜５℃低い温度である。
【０１１０】
別の実施態様において、関連する核酸分子は、配列番号１または配列番号３いずれかで示したヌクレオチド配列と少なくとも約７０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれから成る、または配列番号２または配列番号４いずれかで記載されたポリペプチドと少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むまたは実質的にそれから成る。ある実施態様において、そのヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号３いずれかにおいて示したヌクレオチド配列と約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるか、またはそのヌクレオチド配列は、配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチド配列と約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるポリペプチドをコードする。関連する核酸分子は、配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドの、少なくとも１つの活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１１１】
核酸配列における相違は、配列番号２または配列番号４いずれかのアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列の保存的および／または非保存的改変を生じ得る。配列番号２または配列番号４いずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対する対応する修飾）は、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのものと同様の機能的および化学的特徴を有するポリペプチドを産生する。対照的に、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの機能的および／または化学的特徴における実質的な改変を、（ａ）例えばシートまたはらせん状配置としての、置換の領域における分子バックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ（ｂｕｌｋ）の維持に対する影響において有意に異なる、配列番号２または配列番号４いずれかのアミノ酸配列における置換を選択することによって達成し得る。
【０１１２】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど影響がないか、または影響がないような、天然アミノ酸残基の、標準的な残基による置換を含み得る。さらに、以前に「アラニン走査変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」に関して記載されたように、ポリペプチドにおけるあらゆる天然残基をまた、アラニンで置換し得る。保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によってではなく、化学的ペプチド合成によって典型的には組み込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。これらは、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転したまたは反転した形式を含む。
【０１１３】
天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づいて以下のクラスに分類し得る：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１１４】
従って、例えば、保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つからのメンバーの、同じクラスからの別のメンバーとの交換を含み得る。非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つからのメンバーの、別のクラスからのメンバーとの交換を含み得る。
【０１１５】
そのような変化をさせることにおいて、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮し得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷の特徴に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられた。疎水性親水性指標は：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０１１６】
タンパク質に相互作用的生物学的機能を与えることにおける、アミノ酸疎水性親水性指標の重要性は、一般的に当該分野において理解される。Ｋｙｔｅ  Ｊら（１９８２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５７：１０５−３２。あるアミノ酸を、同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換し、そして依然として同様の生物学的活性を維持し得ることが公知である。疎水性親水性指標に基づいて変化させる場合に、その疎水性親水性指標が＋２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【０１１７】
特に、本場合のように、それによって作成した生物学的に機能的に同等のタンパク質またはペプチドを、免疫学的実施態様において使用することを意図する場合に、同様のアミノ酸の置換を、親水性に基づいて効果的に行い得ることも、当該分野において理解される。その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最も高い局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的性質と関連する。
【０１１８】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性の値に基づいて変化させる場合、その親水性の値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープも同定し得る。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【０１１９】
望ましいアミノ酸置換（保存的または非保存的のいずれにせよ）を、そのような置換が望ましいときに、当業者が決定し得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中で記載したｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの親和性を増加または減少させ得る。典型的なアミノ酸置換を、表２において記載する。
【０１２０】
【表２】
2005519617.tif 000003
当業者は、周知の技術を用いて、配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドの適当な異型を決定し得る。生物学的活性を破壊せずに変化させ得る分子の適当な領域を同定するために、当業者は、活性に重要ではないと考えられる領域を標的化し得る。例えば、同じ種または他の種由来の、同様の活性を有する同様のポリペプチドが公知である場合、当業者はｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列を、そのような同様のポリペプチドと比較し得る。そのような比較によって、同様のポリペプチド間で保存されている残基および分子の部分を同定し得る。そのような同様のポリペプチドと比較して保存されていない、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９分子の領域における変化は、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの生物学的活性および／または構造に有害な影響を与える可能性が低いことが認識される。当業者はまた、比較的保存された領域においてさえ、活性を維持したまま、化学的に同様のアミノ酸を天然に存在する残基と置換し得ることを知っている（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性または構造に重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を受け得る。
【０１２１】
さらに、当業者は、活性または構造に重要な同様のポリペプチドの残基を同定する、構造−機能研究を検討し得る。そのような比較の観点において、同様のポリペプチドにおいて活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの、そのような予測された重要なアミノ酸残基に関して、化学的に同様のアミノ酸置換を選び得る。
【０１２２】
他の実施態様において、関連する核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、そしてここでそのポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドの活性を有し、配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または少なくとも１つのアミノ酸欠失を有し、そしてここでそのポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドの活性を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれから成る。関連する核酸分子はまた、ポリペプチドはカルボキシルおよび／またはアミノ末端の短縮を有し、そしてさらにここでそのポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドの活性を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれから成る。関連する核酸分子はまた、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端の短縮、およびアミノ末端の短縮からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有し、そしてここでそのポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドの活性を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれから成る。
【０１２３】
それに加えて、配列番号２または配列番号４いずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを、相同的ポリペプチドと融合してホモダイマーを形成し得るか、または異種ポリペプチドと融合してヘテロダイマーを形成し得る。異種ペプチドおよびポリペプチドとしては、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通受容体タンパク質または細胞外ドメインまたは膜貫通および細胞内ドメインのようなその一部；膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその一部；触媒的に活性な酵素またはその一部；ロイシンジッパードメインのような、オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド；免疫グロブリン定常領域のような、安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド；および配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドと異なる治療的活性を有するポリペプチドが挙げられるがこれらに限らない。
【０１２４】
配列番号２または配列番号４のいずれかで記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて融合し得る。融合は、リンカーまたはアダプター分子なしで直接であり得るか、またはリンカーまたはアダプター分子により得る。リンカーまたはアダプター分子は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基、典型的には約２０から約５０アミノ酸残基であり得る。リンカーまたはアダプター分子をまた、融合した部分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼの切断部位を有して設計し得る。一旦構築されたら、融合ポリペプチドを、本明細書中で記載された方法によって誘導体化し得ることが認識される。
【０１２５】
本発明のさらなる実施態様において、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つまたはそれ以上のドメインと融合する。抗体は、２つの機能的に区別できる部分、抗原に結合する「Ｆａｂ」として知られる可変ドメイン、および補体の活性化および食細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する「Ｆｃ」として知られる定常ドメインを含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方Ｆａｂは短命である。Ｃａｐｏｎ  ＤＪら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１。治療的タンパク質と共に構築された場合、Ｆｃドメインはより長い半減期を提供し得るか、またはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体の固定、およびおそらく胎盤への移入のような機能さえも組み込み得る。
【０１２６】
１つの例において、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を、当業者に公知の方法を用いて、ｒｅｓ０２ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端いずれかにおいて融合し得る。別の例において、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を、ｒｅｓ０２ポリペプチド断片のアミノ末端またはカルボキシル末端いずれかにおいて融合し得る。
【０１２７】
できた融合ポリペプチドを、プロテインＡアフィニティーカラムを用いることによって精製し得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物よりも、インビボにおいて実質的により長い半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療的性質、循環時間、または凝集の抑制のような、ある性質を改善するために、それを変化させ得る。
【０１２８】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算される。そのような方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ１、Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｌｅ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏら（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３において記載されるものを含むが、これに限らない。
【０１２９】
同一性および／または類似性を決定する好ましい方法は、試験する配列間の、最も高いマッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公共で入手可能なコンピュータープログラムにおいて記載される。２つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２（１  Ｐｔ１）：３８７−９５；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を含むＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０）を含むがこれに限らない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０）から、公共で入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を決定するために使用し得る。
【０１３０】
２つのアミノ酸配列を整列させるための、あるアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングを生じ得、そしてこの小さい整列領域は、２つの全長配列間に有意な関連がなくても、非常に高い配列同一性を有し得る。よって、１つの実施態様において、選択されたアラインメント方法（例えばＧＡＰプログラム）は、請求されたポリペプチドの少なくとも５０個の連続的なアミノ酸にわたるアラインメントを生じる。
【０１３１】
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を用いて、配列同一性パーセントを決定する２つのポリペプチドを、それらのアミノ酸それぞれの最適なマッチングのために整列させる（アルゴリズムによって決定される「マッチした範囲」）。ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ（それは３×平均項として計算される；「平均項」は、使用される比較マトリックスの項の平均である；「項」は、特定の比較マトリックスによって完全なアミノ酸マッチのそれぞれに割り当てられるスコアまたは数である）およびｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ（それは通常０．１×ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙである）、およびＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスを、アルゴリズムと組み合せて使用する。標準的な比較マトリックスも、アルゴリズムによって使用される。Ｄａｙｈｏｆｆら、５  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｓｕｐｐ．３  １９７８）（ＰＡＭ２５０比較マトリックス）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックス）を参照のこと。
【０１３２】
ポリペプチド配列比較のために好ましいパラメーターは、以下のものを含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＳＢら（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−５３；比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）；Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１２；Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：４；類似性の閾値：０。
【０１３３】
ＧＡＰプログラムは、上記のパラメーターで有用である。前述のパラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較のデフォルトパラメーターである（ｅｎｄ  ｇａｐｓに関してはｐｅｎａｌｔｙなしで）。
【０１３４】
核酸分子配列比較のために好ましいパラメーターは、以下のものを含む。アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、前出；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：５０；Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：３。
【０１３５】
ＧＡＰプログラムはまた、上記のパラメーターで有用である。前述のパラメーターは、核酸分子比較のデフォルトパラメーターである。
【０１３６】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９、１９９７年９月において記載されたものを含む、他の典型的なアルゴリズム、ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、比較マトリックス、および類似性の閾値を使用し得る。なされる特定の選択は、当業者に明らかであり、そしてＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡのような、なされる特定の比較；およびさらに、比較が所定の配列のペア間であるか（その場合にはＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）、または１つの配列および大きな配列のデータベース間であるか（その場合にはＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）に依存する。
【０１３７】
（核酸分子）
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を、制限することなく、化学的合成、ゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む、様々な方法において容易に得ることができる。
【０１３８】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ方法は、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）において記載されるものである。本発明は、本明細書中で記載されたような核酸分子およびそのような分子を得る方法を提供する。
【０１３９】
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が１つの種から同定された場合、その遺伝子の全てまたは一部をプローブとして使用して、オルソログまたは同じ種由来の関連する遺伝子を同定し得る。プローブまたはプライマーを使用して、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを発現すると考えられる様々な細菌由来のゲノムＤＮＡをスクリーニングし得る。それに加えて、配列番号１または配列番号３のいずれかで記載された配列を有する核酸分子の一部または全てを使用してゲノムライブラリーをスクリーニングし、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。典型的には、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小限にするために、中程度または高度なストリンジェンシーの条件を、スクリーニングのために採用する。
【０１４０】
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子をまた、発現されたタンパク質の性質に基づく陽性クローンの検出を採用する発現クローニングによって同定し得る。典型的には、核酸ライブラリーを、宿主細胞表面に発現および提示されたクローニングされたタンパク質に対する、抗体または他の結合パートナー（例えば受容体またはリガンド）の結合によってスクリーニングする。その抗体または結合パートナーを、検出可能な標識で修飾し、望ましいクローンを発現する細胞を同定する。
【０１４１】
下記で記載する説明によって行なわれる組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを産生、およびコードされるポリペプチドを発現し得る。例えば、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適当なベクターに挿入することによって、当業者は、大量の望ましいヌクレオチド配列を容易に産生し得る。その配列を、次いで検出プローブまたは増幅プライマーを産生するために使用し得る。あるいは、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。その発現ベクターを適当な宿主に導入することによって、コードされたｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを、大量に産生し得る。
【０１４２】
適当な核酸配列を得る別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ＤＮＡ鋳型を適当な供給源から調製する。典型的にはｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの２つの別々の領域に相補的な２つのプライマーを、次いでＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼと共に鋳型ＤＮＡに加え、そしてそのポリメラーゼは２つのプライマー間のＤＮＡ領域を増幅する。
【０１４３】
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら（１９８９）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ  Ｅｄ  ２８：７１６−３４によって記載されたもののような、当業者に周知の方法を用いた化学的合成である。これらの方法はとりわけ、核酸合成のための、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、およびＨ−ホスホン酸塩方法を含む。そのような化学的合成の好ましい方法は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いた、ポリマー支持合成である。典型的には、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチドの長さである。約１００ヌクレオチドより長い核酸を、これらの方法を用いていくつかの断片として合成し得る。その断片を次いでライゲーションして、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。当業者に公知の他の方法も使用し得る。
【０１４４】
ある実施態様において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの最適な発現のために変化させたコドンを含む。特定のコドン変化は、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドおよび発現のために選択された宿主細胞に依存する。そのような「コドン最適化」を、様々な方法によって、例えば所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子で使用するのに好ましいコドンを選択することによって行ない得る。高度に発現される細菌遺伝子のコドン選択のために、「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込んだコンピューターアルゴリズムを使用し得、そしてそれはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって提供される。他の有用なコドン頻度表は、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｃｅ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」を含む。
【０１４５】
いくつかの場合において、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが望ましくあり得る。改変体をコードする核酸分子を、部位特異的突然変異生成、ＰＣＲ増幅、または他の適当な方法を用いて産生し得、ここでプライマーは望ましい点突然変異を有する（突然変異生成技術の説明に関して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載された方法を用いた化学的合成も、そのような異型を調製するために使用し得る。当業者に公知の他の方法も使用し得る。
【０１４６】
（ベクターおよび宿主細胞）
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的なライゲーション技術を用いて適当な発現ベクターへ挿入する。そのベクターは、典型的には採用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、そのベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こり得るように、宿主細胞の機構と適合性である）。ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）、および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現し得る。宿主細胞の選択は、部分的にはｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドが翻訳後修飾（例えば糖鎖付加および／またはリン酸化）されるかどうかに依存する。もしそうなら、酵母、昆虫、または哺乳類宿主細胞が好ましい。発現ベクターの概説に関しては、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．第１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）を参照のこと。
【０１４７】
典型的には、その宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、プラスミドの維持および外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。ある実施態様において集合的に「フランキング配列」と呼ばれるそのような配列は、典型的には１つまたはそれ以上の以下のヌクレオチド配列を含む：プロモーター、１つまたはそれ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終了配列、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカーエレメント。ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９の発現のために、その宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、典型的には１つまたはそれ以上の以下のヌクレオチド配列を含む：プロモーター、１つまたはそれ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終了配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボゾーム結合部位、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカーエレメント。
【０１４８】
任意で、そのベクターは「タグ」をコードする配列、すなわちｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドコード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子；ポリＨｉｓ（ｈｅｘａＨｉｓのような）または市販で入手可能な抗体が存在するＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、またはｍｙｃのような別の「タグ」を含み得る。このタグは、典型的にはポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、そしてｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの宿主細胞からのアフィニティー精製の手段となり得る。アフィニティー精製は、例えばアフィニティーマトリックスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成し得る。任意で、そのタグを続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような、様々な手段によって精製ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドから除去し得る。
【０１４９】
フランキング配列は、同種由来（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）、異種由来（すなわち、宿主細胞種または系統と異なる種由来）、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来のフランキング配列の組み合せ）、または合成であり得るか、またはフランキング配列は、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチド発現を調節するために通常機能する天然配列であり得る。そのようであるので、フランキング配列の供給源は、そのフランキング配列が宿主細胞の機構において機能的であり、そしてそれによって活性化され得るなら、あらゆる原核生物または真核細生物、あらゆる脊椎または無脊椎生物、またはあらゆる植物であり得る。
【０１５０】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列を、当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって得ることができる。典型的には、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９遺伝子フランキング配列の他に、本明細書中で有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定され、そして従って適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な供給源から単離し得る。いくつかの場合において、フランキング配列の全ヌクレオチド配列が公知であり得る。ここで、そのフランキング配列を、核酸合成またはクローニングに関して本明細書中で記載された方法を用いて合成し得る。
【０１５１】
フランキング配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを用いて、および／または同じまたは別の種由来の、適当なオリゴヌクレオチドおよび／またはフランキング配列断片によるゲノムライブラリーのスクリーニングによって、それを得ることができる。フランキング配列が未知である場合、フランキング配列を含むＤＮＡの断片を、例えば、コード配列または別の遺伝子または複数の遺伝子さえを含み得るＤＮＡのより大きな部分から単離し得る。適当なＤＮＡ断片を産生する制限エンドヌクレアーゼ消化によって、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．）、または当業者に公知の他の方法を用いた単離によって、単離を達成し得る。この目的を達成するために適当な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１５２】
複製の起点は、典型的には市販で購入される原核生物発現ベクターの一部であり、そしてその起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を助ける。ベクターのあるコピー数までの増幅は、ある場合には、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの最適な発現のために重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まないなら、公知の配列に基づいて化学的に合成し、そしてベクターにライゲーションし得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）由来の複製起点が、ほとんどのグラム陰性細菌に適当であり、そして様々な起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶまたはＢＰＶのようなパピローマウイルス）が、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点要素は、哺乳類発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起点は、それが初期プロモーターを含んでいるというだけで、多くの場合使用される）。
【０１５３】
転写終了配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の３’末端に位置し、そして転写を終了させるために作用する。通常、原核細胞における転写終了配列は、Ｇ−Ｃリッチ断片に続くポリＴ配列である。その配列は、ライブラリーから容易にクローニングされるか、またはベクターの一部として市販で購入もされるが、本明細書中で記載されたもののような核酸合成の方法を用いて、容易に合成もし得る。
【０１５４】
選択マーカー遺伝子要素は、選択的培地において増殖する宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を与える；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完する；または（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。ネオマイシン耐性遺伝子も、原核生物および真核生物宿主細胞における選択のために使用し得る。
【０１５５】
他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅し得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生のためにより高い需要がある遺伝子が、組換え細胞の連続的な世代の染色体においてタンデムに反復される過程である。哺乳類細胞に適当な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼを含む。哺乳類細胞形質転換体を、選択プレッシャー下に置き、ここで形質転換体のみが、そのベクターに存在する選択遺伝子によって、生存するよう独特に適応する。培地における選択薬剤の濃度を連続的に変化させる条件下で形質転換細胞を培養することによって、選択プレッシャーをかけ、それによって選択遺伝子およびｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドをコードするＤＮＡ両方の増幅を引き起こす。結果として、増加した量のｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１５６】
リボゾーム結合部位は、通常ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン−ダルガーノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。そのエレメントは、典型的にはプロモーターの３’、および発現されるｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのコード配列の５’に位置する。シャイン−ダルガーノ配列は様々であるが、典型的にはポリプリンである（すなわち、高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのシャイン−ダルガーノ配列が同定され、それらはそれぞれ本明細書中で記載された方法を用いて容易に合成し得、そして原核生物ベクターにおいて使用し得る。
【０１５７】
リーダーまたはシグナル配列を使用して、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを宿主細胞の外へ向け得る。典型的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸分子のコード領域に、またはｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドコード領域の５’末端に直接位置する。多くのシグナル配列が同定され、選択された宿主細胞において機能的であるあらゆるものを、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸分子と組み合せて使用し得る。さらに、シグナル配列を、本明細書中で記載された方法を用いて化学的に合成し得る。ほとんどの場合において、シグナルペプチドの存在による、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの宿主細胞からの分泌は、分泌されたｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を引き起こす。シグナル配列は、ベクターの構成要素であり得るか、またはそれはベクターに挿入されるｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸分子の一部であり得る。
【０１５８】
シグナル配列を有さない天然ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドコード領域に結合した異種由来シグナル配列をコードするヌクレオチド配列いずれかの使用が、本発明の範囲に含まれる。選択される異種由来シグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される、すなわちシグナルペプチダーゼによって切断されるものであるべきである。原核生物宿主細胞に関して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される、原核生物シグナル配列によって提供される。酵母の分泌に関して、シグナル配列は、酵母インベルターゼ、アルファ因子、または酸性ホスファターゼリーダーによって提供され得る。哺乳類細胞発現において、あらゆる適当な哺乳類シグナル配列を採用し得る。
【０１５９】
真核生物宿主細胞発現系において糖鎖付加が望ましい場合のような、いくつかの場合において、様々なプレシークエンスを操作して糖鎖付加または収率を改善し得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変化させ得るか、または糖鎖付加にも影響し得るプロシークエンス（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を加え得る。最終的なタンパク質産物は、１位置に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸と比較して）、１つまたはそれ以上の発現に付随するさらなるアミノ酸を有し得、それは完全に除去されなかったかもしれない。例えば、最終的なタンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、もしその酵素が成熟ポリペプチドのそのような領域で切断するなら、望ましいｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドのわずかに短縮された形式を生じ得る。
【０１６０】
本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的には宿主生物によって認識され、そしてｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドをコードする分子に操作可能に連結したプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち５’）に位置する（一般的には約１００から１０００ｂｐ以内）非転写配列である。プロモーターは、伝統的に２つのクラス：誘導的プロモーターおよび構成的プロモーターのうち１つにグループ分けされる。誘導的プロモーターは、栄養素の存在または欠如、または温度の変化のような、培養条件におけるある変化に反応して、その制御下にあるＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成的プロモーターは、継続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対する制御はほとんど存在しない、または存在しない。様々な可能性のある宿主細胞によって認識される、多数のプロモーターが周知である。プロモーターを制限酵素消化によって供給源ＤＮＡから除去し、そして望ましいプロモーター配列をベクターに挿入することによって、適当なプロモーターを、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結させる。天然ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９プロモーター配列を、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸分子の増幅および／または発現を指示するために使用し得る。しかし、もし天然プロモーターと比較してより高い転写および発現タンパク質のより高い収率を可能にするなら、そしてもし使用するために選択された宿主細胞系と適合性であるなら、異種由来プロモーターが好ましい。
【０１６１】
原核生物宿主と使用するために適当なプロモーターとしては、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。他の公知の細菌プロモーターも適当である。それらの配列は公開され、それによって当業者が、あらゆる有用な制限部位を提供するために必要に応じてリンカーまたはアダプターを使用して、それらを望ましいＤＮＡ配列にライゲーションすることを可能にする。
【０１６２】
酵母宿主と使用するために適当なプロモーターも、当該分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳類宿主細胞と使用するために適当なプロモーターは周知であり、そしてポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるものが挙げられるがこれに限らない。他の適当な哺乳類プロモーターとしては、異種由来哺乳類プロモーター、例えば熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。
【０１６３】
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９遺伝子発現の調節において関心のあり得るさらなるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ  Ｃら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔら（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ＭＪら（１９８１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：１４４１−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ＲＬら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；ベータラクタマーゼプロモーターのような、原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら（１９７８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２１−２５）が挙げられるが、これらに限定されない。以下の動物転写調節領域も興味があり、それらは組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用された：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｍｉｔｚら（１９８６）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ（１９８７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  Ｒら（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｓ  ＪＭら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＷＳら（１９８７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：１４３６−４４）；精巣、乳房、リンパ節および肥満細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ  Ｐら（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ＣＡら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １：２６８−７６）；肝臓において活性なアルファフェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  Ｒら（１９８５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒ  ＲＥら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ＧＤら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １：１６１−７１）；骨髄細胞において活性なベータグロビン遺伝子調節領域（Ｍａｇｒａｍ  Ｊら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  Ｇら（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳の希突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  Ｃら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖２遺伝子調節領域（Ｓｈａｎｉ  Ｍ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；および視床下部で活���な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ  ＡＪら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０１６４】
エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等真核生物による本発明のｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加させ得る。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常約１０−３００ｂｐの長さの、ＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、相対的に方向および位置独立性である。それらは、転写ユニットの５’および３’に見出された。哺乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン）。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーを使用する。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが、真核生物プロモーターの活性化の、典型的な増強エレメントである。エンハンサーをｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９核酸分子の５’位または３’位においてベクターにスプライシングし得るが、それは典型的にはプロモーターから５’部位に位置する。
【０１６５】
本発明の発現ベクターを、市販で入手可能なベクターのような、開始ベクターから構築し得る。そのようなベクターは、全ての望ましい隣接配列を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。本明細書中で記載された１つ以上の隣接配列がベクターに既に存在しない場合、それらを個々に得て、そしてベクターにライゲーションし得る。それぞれの隣接配列を得るために使用する方法は、当業者に周知である。
【０１６６】
本発明を実施するために好ましいベクターは、細菌、昆虫、および哺乳類宿主細胞と適合性であるものである。そのようなベクターは、とりわけ、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃｌｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−アルファ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４３６３）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含む。
【０１６７】
さらなる適当なベクターとしては、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらに限定されず、しかしそのベクターシステムとは選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが認識される。そのようなベクターとしては、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高いコピー数のＣｏｌＥ１に基づくファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のようなプラスミド、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばＴＯＰＯＴＭＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１．ＲＴＭ．プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、およびバキュロウイルス発現システムのような哺乳類、酵母、またはウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫ  プラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
ベクターが構築され、そしてｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適当な部位に挿入された後、完成したベクターを増幅および／またはポリペプチド発現のために適当な宿主細胞に挿入し得る。ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの発現ベクターの、選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術のような方法を含む、周知の方法によって達成し得る。選択される方法は、部分的には使用される宿主細胞の型と相関する。これらの方法および他の適当な方法は、当業者に周知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出において記載されている。
【０１６９】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉのような）または真核生物宿主細胞（酵母、昆虫、または脊椎動物細胞のような）であり得る。宿主細胞は、適当な条件下で培養した場合、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを合成し、それを続いて培地から（もし宿主細胞がそれを培地に分泌するなら）、またはそれを産生する宿主細胞から直接（もしそれが分泌されないなら）回収し得る。適当な宿主細胞の選択は、望ましい発現レベル、活性のために望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化のような）および生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さのような、様々な因子に依存する。
【０１７０】
多くの適当な宿主細胞が、当該分野において公知であり、そして多くがＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手可能である。例としては、チャイニーズハムスター卵細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  Ｇら（１９８０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：４２１６−２０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、または３Ｔ３細胞のような哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適当な哺乳類宿主細胞、および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物の産生、および精製の方法の選択は、当該分野で公知である。他の適当な哺乳類細胞株は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞株、およびＣＶ−１細胞株である。さらなる典型的な哺乳類宿主細胞としては、形質転換細胞株を含め、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養から得られた細胞株、および初代外植片も適当である。候補細胞は、選択遺伝子において遺伝型的に欠損していてもよいし、支配的に作用する選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適当な哺乳類細胞株は、マウス神経芽腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、ＢＡＬＢ／ｃまたはＮＩＨマウスから得られた３Ｔ３株、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞株はそれぞれ、タンパク質発現の当業者に公知であり、そして入手可能である。
【０１７１】
本発明に適当な宿主細胞として同様に有用なのは、細菌細胞である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの様々な系統（例えばＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．等の様々な系統も、本方法において採用し得る。
【０１７２】
当業者に公知の酵母細胞の多くの株も、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１７３】
さらに、望ましい場合、昆虫細胞システムを本発明の方法において利用し得る。そのようなシステムは、例えばＫｉｔｔｓ  ＰＡら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ  ＶＡ（１９９３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４：５６４−７２；およびＬｕｃｋｌｏｗ  ＶＡら（１９９３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：４５６６−７９において記載されている。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１７４】
グリコシル化ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを発現するために、トランスジェニック動物も使用し得る。例えば、トランスジェニック乳産生動物（例えばウシまたはヤギ）を使用して、そしてその動物乳中の本グリコシル化ポリペプチドを得ることができる。植物を使用してｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを産生することもできるが、一般的に、植物において起こるグリコシル化は、哺乳類細胞において産生されるものと異なり、そしてヒト治療的使用には適当でないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１７５】
（ポリペプチド産生）
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞を、当業者に周知の標準的な培地を用いて培養し得る。培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養素を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するために適当な培地としては、例えばＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するために適当な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ１６４０）、最少必須培地（ＭＥＭ）および／またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられ、それらは全て培養される特定の細胞株に必要な血清および／または増殖因子が補充され得る。昆虫培養のために適当な培地は、必要に応じてｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、ラクトアルブミン加水分解産物、および／または胎児ウシ血清を添加したグレース培地である。
【０１７６】
典型的には、トランスフェクトした、または形質転換した細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物を、培地に添加物として加える。その使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミドに存在する選択可能なマーカーエレメントによって規定される。例えば、選択可能なマーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培地に添加される化合物はカナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１７７】
宿主細胞によって産生されるｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの量を、当該分野で公知の標準的な方法を用いて評価し得る。そのような方法は、制限なく、ウェスタンイムノブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイを含む。
【０１７８】
もしｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドが、宿主細胞から分泌されるように設計されたなら、大部分のポリペプチドは細胞培養培地に見出され得る。しかし、もしｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドが宿主細胞から分泌されないなら、それは細胞質および／または核（真核生物宿主細胞に関して）または細胞質ゾル（細菌宿主細胞に関して）に存在する。
【０１７９】
宿主細胞細胞質および／または核（真核生物宿主細胞に関して）または細胞質ゾル（細菌宿主細胞に関して）に存在するｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドに関して、細胞内物質（グラム陰性細菌については封入体を含む）を、当業者に公知のあらゆる標準的な技術を用いて、宿主細胞から抽出し得る。例えば、宿主細胞を溶解して、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理後に続く遠心分離によって、ぺリプラズム／細胞質の内容物を放出し得る。
【０１８０】
もしｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドが、細胞質ゾルにおいて封入体を形成したなら、その封入体は多くの場合内側および／または外側細胞膜に結合し得、そして従って遠心分離後、主にペレット物質中に見出される。ペレット物質を次いで、極端なｐＨで処理するか、あるいはアルカリｐＨにおいてジチオトレイトール、または酸性ｐＨにおいてトリスカルボキシエチルホスフィンのような還元剤の存在下で、界面活性剤、グアニジン、グアニンジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピックな薬剤で処理し、封入体を放出、分解、および可溶化し得る。可溶化ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを次いで、ゲル電気泳動、免疫沈降等を用いて分析し得る。ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを単離することが望ましいなら、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎ  ＦＡら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：２６４−７６において記載されたもののような、標準的な方法を用いて単離を達成し得る。
【０１８１】
いくつかの場合において、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドは、単離時に生物学的に活性でないかもしれない。「リフォールディング」またはポリペプチドをその３次構造に変換し、そしてジスルフィド結合を産生する様々な方法を使用して、生物学的活性を回復し得る。そのような方法は、可溶化ポリペプチドを通常７より高いｐＨに、および特定の濃度のカオトロープの存在下に曝すことを含む。カオトロープの選択は、封入体可溶化に使用された選択と非常に似ているが、通常カオトロープはより低い濃度で使用され、そして可溶化に使用されたカオトロープと同じである必要はない。ほとんどの場合において、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤、または還元剤＋その酸化形態を特定の比で含み、特定のレドックス電位を生じ、タンパク質のシステイン架橋の形成においてジスルフィドシャッフリング（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）が起こることを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかは、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（βＭＥ）／ジチオ−β（ＭＥ）を含む。多くの場合において、共溶媒を使用し得る、またはリフォールディングの効率を上げるために必要であり得、そしてこの目的のために使用されるより通常の試薬としては、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、アルギニン等が挙げられる。
【０１８２】
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの発現時に封入体が有意な程度形成されないなら、ポリペプチドは、細胞ホモジネートの遠心分離後、主に上清に見出される。ポリペプチドをさらに、本明細書中で記載されたような方法を用いて、上清から単離し得る。
【０１８３】
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの溶液からの精製は、様々な技術を用いて達成し得る。ポリペプチドが、そのカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかにおいて、Ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ（ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）またはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のような他の小さなペプチドのようなタグを含むように合成されたなら、溶液を、カラムマトリックスがタグに対して高い親和性を有するアフィニティーカラムに通すことによって、これらのポリペプチドを１工程の処理で精製し得る。
【０１８４】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに高い親和性および特異性で結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラムのような）を、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチド／ｐｏｌｙＨｉｓの精製に使用し得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９３）を参照のこと。
【０１８５】
さらに、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを特異的に認識および結合し得るモノクローナル抗体の使用によって精製し得る。
【０１８６】
精製の他の適当な手順としては、制限なしに、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）に続くゲル溶出、および調製用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」機械／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合において、２つまたはそれ以上の精製技術を組み合せて、純度の増加を達成し得る。
【０１８７】
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドをまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（１９６３）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ＲＡら（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：５１３１−３５；およびＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、１９８４）によって記載されたもののような、当該分野で公知の技術を用いて、化学的合成方法（固相ペプチド合成のような）によって調製し得る。そのようなポリペプチドを、アミノ末端のメチオニンありまたは無しで合成し得る。化学的に合成されたｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを、これらの参考文献において記載された方法を用いて酸化し、ジスルフィド架橋を形成し得る。化学的に合成されたｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドは、組換え的に産生された、または天然の供給源から精製された対応するｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有することが予測され、そして従って組換えまたは天然ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドと交換可能に使用し得る。
【０１８８】
ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドを得る別の手段は、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドが天然に見出される、莢膜多糖発現細菌細胞のような生物学的試料からの精製による。そのような精製を、本明細書中で記載されたようなタンパク質精製の方法を用いて行ない得る。精製中のｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドの存在を、例えば組換え的に産生されたｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドまたはそのペプチド断片に対して調製された抗体を用いてモニターし得る。
【０１８９】
核酸およびポリペプチドを産生する、多くのさらなる方法が当該分野で公知であり、そしてその方法を使用してｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドに対する特異性を有するポリペプチドを産生し得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＲＷ  ら（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１２２９７−３０２を参照のこと、これはｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。また、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＲＷら（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３：２６８−７３も参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得る方法を記載する。その手順は、それぞれ５’無作為化配列、中央の前もって選択された配列、および３’無作為化配列を有する、オリゴヌクレオチドの不均一なプールを産生することを含む。できた不均一なプールを、望ましい生物学的機能を示さない細胞の集団に導入する。次いで細胞の亜集団を、前もって決定した生物学的機能を示すものに関してスクリーニングする。その亜集団から、望ましい生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを単離する。
【０１９０】
米国特許第５，７６３，１９２；５，８１４，４７６；５，７２３，３２３；および５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生する手順を記載する。これは、確率論的な遺伝子またはその断片を産生すること、および次いでこれらの遺伝子を宿主細胞に導入することによってなされ、それはその確率論的遺伝子によってコードされる１つまたはそれ以上のタンパク質を産生する。宿主細胞を次いでスクリーニングして、望ましい活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生するクローンを同定する。
【０１９１】
ペプチドまたはポリペプチドを産生する別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって提出された、ＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０）において記載される。「Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られるその処理は、インサイチュ組換え方法による、内因性遺伝子発現の活性化または遺伝子の過剰発現を含む。例えば、内因性遺伝子の発現を、調節配列を標的細胞に組み込むことによって活性化または増加させ、それは非相同的または変則的な組換えによって、その遺伝子の発現を活性化し得る。標的ＤＮＡは、最初に照射を受け、そして遺伝的プロモーターが挿入される。そのプロモーターは、最終的には遺伝子の前にある分断点（ｂｒｅａｋ）を見つけ、遺伝子の転写を開始する。これは、望ましいペプチドまたはポリペプチドの発現を引き起こす。
【０１９２】
これらの方法をまた、包括的なｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチド発現ライブラリーを産生するために使用し得ることが認識され、それを次いで生化学的アッセイ、細胞アッセイ、および有機体全体のアッセイ（例えば植物、マウス等）のような、様々なアッセイにおいて、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用し得る。
【０１９３】
（選択的結合剤）
「選択的結合剤」という用語は、ｒｅｓ０２ポリペプチド、ｉｎｖ１９ポリペプチド、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＣ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、ＰＳＨ、およびその断片から選択される、１つ以上の抗原に特異性を有する分子を指す。適当な選択的結合剤としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチドならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。適当な選択的結合剤を、当該分野で公知の方法を用いて調製し得る。
【０１９４】
ｒｅｓ０２ポリペプチド、ｉｎｖ１９ポリペプチド、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＣ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、ＰＳＨ、およびそれらの断片に結合する抗体および抗体断片のような選択的結合剤は、本発明の範囲内である。その抗体は、単一抗原特異的なポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂｓ）；組換え；キメラ；ＣＤＲ移植のようなヒト化；ヒト；一本鎖；および／または二重特異的；およびその断片、異型、または誘導体であり得る。抗体断片は、抗原のエピトープに結合する抗体の部分を含む。そのような断片の例としては、全長抗体の酵素的切断によって産生された、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。他の結合断片は、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現のような、組換えＤＮＡ技術によって産生されたものを含む。
【０１９５】
抗原に対するポリクローナル抗体は、一般的に抗原およびアジュバントの複数回の皮下または腹腔内注射によって、動物（例えばウサギまたはマウス）において産生される。抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤のような、免疫される種において免疫原性の担体タンパク質に結合させることが有用であり得る。また、ミョウバンのような凝集剤を使用して、免疫反応を増強する。免疫後、動物から採血して、そして血清を抗原特異的抗体力価に関してアッセイする。
【０１９６】
抗原に対するモノクローナル抗体は、培養中の継続的な細胞株による、抗体分子の産生を提供するあらゆる方法を用いて産生される。モノクローナル抗体を調製する適当な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄら（１９８４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：３００１−５；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９８７））を含む。ｒｅｓ０２ポリペプチド、ｉｎｖ１９ポリペプチド、ＰＳＡ、ＰＳＢ、ＰＳＣ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、ＰＳＨ、およびそれらの断片と反応性のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株も、本発明によって提供される。
【０１９７】
本発明の抗体を、抗原の検出および定量のために、競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ウェスタンイムノブロットアッセイ、および免疫沈降アッセイのような、あらゆる公知のアッセイ方法において採用し得る（Ｓｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７、１４７−１５８頁）。抗体は、採用されるアッセイ方法に適当な親和性で抗原に結合する。
【０１９８】
診断的適用に関して、ある実施態様において、抗ｒｅｓ０２、または抗ｉｎｖ１９、または抗莢膜多糖抗体を、検出可能な部分で標識し得る。検出可能な部分は、直接または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生し得るあらゆるものであり得る。例えば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉのような放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光または化学発光化合物、またはアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であり得る（Ｂａｙｅｒ  ＥＡら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８４：１３８−６０）。
【０１９９】
競合的結合アッセイは、標識した標準物質（例えば、ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチド、莢膜多糖、またはその免疫学的に反応性の部分）の、限られた量の抗ｒｅｓ０２、抗ｉｎｖ１９、または抗莢膜多糖抗体との結合に関して、試験試料分析物（ｒｅｓ０２またはｉｎｖ１９ポリペプチドまたは莢膜多糖）と競合する能力に依存する。試験試料中の抗原の量は、抗体に結合した標準物質の量と逆比例する。結合した標準物質の量の決定を容易にするために、抗体は典型的には競合の前または後に不溶化され、抗体に結合した標準物質および分析物を、結合しないままである標準物質および分析物から簡便に分離し得る。
【０２００】
サンドイッチアッセイは、典型的にはそれぞれ検出および／または定量されるタンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合し得る、２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、試験試料分析物は、典型的には固体支持体に固定化された１番目の抗体に結合し、そしてその後２番目の抗体が分析物に結合し、従って不溶性の３つの部分からなる複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。２番目の抗体を、それ自身検出可能な部分で標識し得るか（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定し得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、１つの型のサンドイッチアッセイは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合検出可能な部分は酵素である。
【実施例】
【０２０１】
以下の実施例は、実例となるのみであり、そしていかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図しない。
【０２０２】
（実施例１．細菌系統およびＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ多糖の単離）
Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３は、もともとＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から得て、使用まで酵母培養液中に−８０°Ｆで保存し、そして以前に記載されたように嫌気的に増殖させた。Ｐａｎｔｏｓｔｉ  Ａら（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５９：２０７５−２０８２。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３由来の莢膜多糖を、高温フェノール／水抽出によって単離し、そして続くＰＳＡおよびＰＳＢの精製を以前に記載されたように行なった。Ｔｚｉａｎａｂｏｓ  Ａら（１９９２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：１８２３０−１８２３５。
【０２０３】
（実施例２．ｒｅｓ０２およびｉｎｖ１９の同定）
７つのプロモーター領域のＤＮＡ逆位は、ＤＮＡの組換えに関与する特定のタンパク質によって調節されると仮説を立て、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅの微生物病原体グループによって提供されたＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３ゲノム配列の検索を行い、ＤＮＡの逆位に関与するＥ．ｃｏｌｉの２つの遺伝子、ｆｉｍＢおよびｆｉｍＥと相同性を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を探した。５つのＯＲＦが回収された。これら５つのＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＯＲＦを、次いでデータベースを再プローブするために使用し、そして２５個のホモログを回収し、そして一時的にｉｎｖ１−ｉｎｖ２５と命名した。続いてさらに３つのホモログを回収し、そして一時的にｉｎｖ２６−ｉｎｖ２８と命名した。
【０２０４】
我々のデータに基づいて、我々は、多糖プロモーターの逆位に関与する遺伝子産物は、全ての系統において保存されていることを知っていた。従って、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ系統のコレクションを、これら２５個のＯＲＦそれぞれの内部部分でプローブするためにＤＮＡハイブリダイゼーションを行なった。
【０２０５】
もとの２５個のＯＲＦのうち７つ（および２８個のＯＲＦのうち９つ）が、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ内で保存されていることが見出された。これらの保存された遺伝子の１つ、ｉｎｖ１９の周りの配列の分析は、セリン部位特異的リコンビナーゼファミリーの分岐して（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｌｙ）転写された遺伝子を示し、それはｒｅｓ０２（今はｍｐｉとも呼ばれる）と命名され、そしてハイブリダイゼーションによってＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ間で保存されていることも示された。
【０２０６】
試験された１５個のＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ株のうち１５個が、ｒｅｓ０２の内部部分で陽性にプローブされた（表３）。試験された２６個のＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ株のうち２５個が、ｉｎｖ１９の内部部分で陽性にプローブされた；１つの陰性株は１２７９１５５Ｉであった（表４）。
【０２０７】
（表３．ｒｅｓ０２プローブ陽性Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ株）
【０２０８】
【表３】
2005519617.tif 000004
（表４．ｉｎｖ１９プローブ陽性Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ株）
【０２０９】
【表４】
2005519617.tif 000005
これらの保存された遺伝子のいくつかを、ＰＳＡプロモーター逆位可能領域とともにベクターにクローニングし、そしてＰＳＡプロモーター領域を逆位させる能力に関して分析した。ｒｅｓ０２は、ＰＳＡプロモーター領域の逆位を引き起こすことが示された。
【０２１０】
（実施例３．Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ９３４３染色体から、ｒｅｓ０２を欠失させる方法）
Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ９３４３染色体からｒｅｓ０２遺伝子を欠失させるために、ダブルクロスオーバーの発生を伴う相同的組換えを採用して、ｒｅｓ０２の全長コピーを欠失コピーで置換した。これを行なうために、プラスミドｐＫＧＷ１０を産生した。このプラスミドを構築するために、９３４３染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、欠失させる領域を隣接するＤＮＡを増幅させた（図５）。プライマーペアｉｎｖ１９Ｄ−１＋ｉｎｖ１９Ｄ−２およびｉｎｖ１９Ｄ−５＋ｉｎｖ１９Ｄ−６を、２つの別々のＰＣＲにおいて使用した。表５は、プライマーｉｎｖ１９Ｄ−１およびｉｎｖ１９Ｄ−６がそれぞれ、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線で示す）を組み込み、一方プライマーｉｎｖ１９Ｄ−２およびｉｎｖ１９Ｄ−６がそれぞれ、ＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線で示す）を組み込むことを示す。
【０２１１】
（表５．ｒｅｓ０２欠失を起こすために使用されたプライマーの配列）
【０２１２】
【表５】
2005519617.tif 000006
増幅時に、できた増幅産物は、Ｌｅｆｔ  Ｆｌａｎｋ、ｉｎｖ１９−Ｄ１→ｔｈｒｏｕｇｈ←ｉｎｖ１９−Ｄ２、１９５８ｂｐ（図６、配列番号５）；およびＲｉｇｈｔ  Ｆｌａｎｋ、ｉｎｖ１９−Ｄ５→ｔｈｒｏｕｇｈ←ｉｎｖ１９−Ｄ６、２５４０ｂｐ（図７、配列番号６）であった。
【０２１３】
５９４ｂｐのｒｅｓ０２オープンリーディングフレームのうち５３４ｂｐが欠失するように、これらのプライマーを置いた。できたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ（プライマーに構築された制限部位）で消化し、そしてエリスロマイシン耐性をコードしたＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ自殺（ｓｕｉｃｉｄｅ）ベクターに３方向反応でライゲーションした。このライゲーション混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして形質転換体を、隣接物の正しいライゲーションに関して、ＰＣＲおよびプラスミド消化の両方によって試験した。隣接物の正しいライゲーションを含むプラスミドを、ｐＫＧＷ１０と命名した。
【０２１４】
ｐＫＧＷ１０を、Ｅ．ｃｏｌｉからＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ９３４３へ接合により移入し、そして相同的組換えで生じた共組換え体（染色体に組み込まれたｐＫＧＷ１０の全てのＤＮＡを含む）を、エリスロマイシン耐性（ｐＫＧＷ１０によってコードされる）によって選択した。共組換え体を、非選択的培地で継代し、２番目の組換えの発生による共組換え体の分離を可能にした（ここでｒｅｓ０２の変異体コピーまたは野生型コピーのいずれかが、介在するプラスミドと共に失われた）。細菌を、抗生物質を含まない培地にプレートした（プレートあたり約２００コロニー）。コロニーを、エリスロマイシンを含む培地にレプリカプレート作成し、そしてエリスロマイシン感受性（Ｅｍｓ）コロニーを選択した（これらのＥｍｓコロニーは、ｒｅｓ０２の変異体または野生型コピーのみを含み、両方は含まないものを示す）。これらのコロニーを、変異体遺伝子型を含むものに関してＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲを使用して、７つの多糖逆位可能プロモーター領域のそれぞれが固定され、そして逆位不可能であることを、各ｒｅｓ０２変異体において決定した。欠失を、各場合においてサザンブロットによっても確認した。
【０２１５】
実施例４．ＰＳＡ−ＰＳＨの単一抗原特異的抗血清
Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの８つの公知の莢膜多糖それぞれに対する単一抗原特異的抗血清を、以前に記載されたように調製した。Ｃｏｍｓｔｏｃｋ  ＬＥら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７：３５２５−３２；Ｃｏｙｎｅ  ＭＪら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：６１７６−８１；Ｃｏｙｎｅ  Ｍら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９：４３４２−５０；Ｋｒｉｎｏｓ  ＣＭら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：５５５−８。これらの単一抗原特異的抗血清を、ｒｅｓ０２変異体のウェスタンイムノブロット表現型分析において使用した。
【０２１６】
（実施例５．ｒｅｓ０２の欠失は、莢膜多糖プロモーターをオンまたはオフに固定する）
ｒｅｓ０２オープンリーディングフレームを、ダブルクロスオーバー対立遺伝子交換によって９３４３染色体から欠失させ、全てｒｅｓ０２の染色体欠失を有するいくつかの変異体を生じた。これらの変異体の分析は、７つの多糖プロモーター逆位領域はそれぞれ単一の方向に固定されたことを示し、Ｒｅｓ０２産物はＤＮＡ逆位に関与することを示した。
【０２１７】
これら変異体のいくつかは、オンに固定されたＰＳＡおよびＰＳＥプロモーター領域およびオフに固定されたＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、およびＰＳＨのプロモーター領域を有していた。従って、この株は、構成的にＰＳＡ、ＰＳＣ（ＰＳＣのプロモーターは逆位を受けない）およびＰＳＥを発現するが、ＰＳＢ、ＰＳＤ、ＰＳＦ、ＰＳＧ、またはＰＳＨを発現しないことが予測された。
【０２１８】
図８は、これらの変異体のうち１つ、９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４（ｍｕｔ４４）の表現型分析の結果を示す。この分析は、ｍｕｔ４４は確かにＰＳＡを大量に合成することを示した（野生型の典型的な増殖物（ｇｒｏｗ−ｕｐ）と比較して、少なくとも１０倍以上の精製ＰＳＡが単離される）。ｍｕｔ４４は、ＰＳＣおよびＰＳＥを含む他の７つの莢膜多糖のうち６つを産生できないことも示した（ウェスタンブロット分析、免疫電気泳動、および精製莢膜多糖の分析によって決定されたように）。ＰＳＦの多糖生合成遺伝子座のプロモーターはオフになっていたという事実にもかかわらず、ｍｕｔ４４は少量のＰＳＦを発現したことが、予測外にも見出された（図８）。この観察は、ＤＮＡ逆位によって影響を受けない２次的なプロモーターの存在と一致し得る。しかし、別の変異体、ｍｕｔ８は、ＰＳＨのみを発現し、そしてＰＳＦを発現しないことが見出された（図８）。ｍｕｔ４４によって発現される少量のＰＳＦは、この株からのＰＳＡの精製を有意に妨害しない。
【０２１９】
別のｒｅｓ０２変異体、９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ２（ｍｕｔ２）が単離され、それもオンに固定されたＰＳＡプロモーター領域を除いて、全ての多糖プロモーター逆転領域がオフに固定されていた。この変異体の表現型は、ｍｕｔ４４と同じであること、すなわちＰＳＡを過剰発現し、そして少量のＰＳＦを発現するが、他の７つの公知の莢膜多糖ＰＳＢ−ＰＳＨは発現しないことが見出された。
【０２２０】
（実施例６．ｍｕｔ４４はＰＳＡを過剰発現する）
ｒｅｓ０２と呼ばれるオープンリーディングフレームの欠失により、野生型と比較してＰＳＡを過剰発現する、そしてこの株の他の７つの公知の莢膜多糖のほとんどまたは全てを欠くＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ株を産生した。これらの株は、容易に精製するのに十分な量のＰＳＡを産生し、このことは、商業目的のための、強力な両性イオン性多糖、ＰＳＡの大規模精製のために魅力的である。
【０２２１】
野生型Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３から単離される全莢膜多糖（８つの多糖すべてあわせて）の収量は、培養１リットルあたり６．２６−２１．９ｍｇの範囲である。他の多糖からＰＳＡを精製するための徹底的な方法の後、野生型Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３から単離される純粋ＰＳＡの収量は、培養１リットルあたり０〜３．１ｍｇの範囲であり、培養１リットルあたり平均１．５６ｍｇである。ｍｕｔ４４の最初の大量増殖物（ｇｒｏｗ−ｕｐ）（１６リットル）において、培養１リットルあたり２１．８ｍｇの純粋ＰＳＡの収量が存在した。その収量は野生型よりも１４倍高かっただけでなく、ＰＳＡを他の莢膜多糖から単離する必要がないので、抽出および精製方法は、非常により簡単であった。野生型と異なり、この変異体からのＰＳＡの収率は、プロモーターが逆転できないためにＰＳＡの発現はもはや相変化を受けないので、一貫して高いことが予測される。
【０２２２】
（実施例７．ｍｕｔ４４からのＰＳＡの大規模精製）
ｍｕｔ４４の１６リットルのバッチ発酵を、補充基礎培地中で増殖させた。一晩増殖させた後、細菌をペレットにし、そして６８℃の６６７ｍｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。ガラスビーズを再懸濁したペレットに加え、そして４リットルの水浴に置いた。６６７ｍｌの７５％フェノール（６８℃に前もって温めた）を混合物に加え、そして少なくとも３０分間攪拌した。混合物を次いで低温室で一晩攪拌した。混合物を次いで８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上部の水相を除去し（約５００ｍｌ）、そして分離用ろうとにおいて５００ｍｌのエーテルに加えた。混合物を振とうし、そして２０分間分離させた。下部の相を保持した。その試料を、エーテルの蒸発および試料の濃縮のために、６０℃の水浴において回転蒸発装置に置いた。その試料を、透析チューブに入れ、そして１０リットルの水に対して、６回緩衝液を交換して透析した。１ＭのＴｒｉｓを加え、容量の６．５％にした。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を、２０ｍＭの最終濃度まで加えた。ＲＮアーゼを加えて３．３３ｍｇ／ｍｌの濃度にし、そしてＤＮアーゼを０．０７ｍｇ／ｍｌまで加えた。その試料を３７℃で一晩消化した。試料のｐＨを、１０ＭのＮａＯＨで７．５に調整した。プロナーゼを０．３３ｍｇ／ｍｌまで加え、そして一晩インキュベートした。新しいプロナーゼを加え、そしてさらに２時間インキュベートした。ＥＤＴＡを加えて溶液を５０ｍＭにし、そして３０分間混合した。その試料を、５容量の−２０℃エタノールを用いて沈殿させた。その試料を、３％のデオキシコール酸中で再懸濁し、そしてセファロース４００カラムにかけた。カラム画分を、高分子量莢膜多糖および低分子量ＬＰＳの分離に関して、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした。ＰＳＡの純度を、免疫電気泳動およびＮＭＲ分析によって試験した。
【０２２３】
（実施例８．ｉｎｖ１９の欠失）
ｉｎｖ１９オープンリーディングフレームを、ダブルクロスオーバー対立遺伝子交換によって９３４３染色体から欠失させ、全てｉｎｖ１９の染色体欠失を有するいくつかの変異体を生じた。
【０２２４】
（生物学的寄託）
ｍｕｔ４４を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに、２００２年３月１１日、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ：９３４３ｒｅｓ０２ｍｕｔ４４の記載のもとに寄託し、そしてＰａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ＰＴＡ−４１３５を割り当てられた。
【０２２５】
本明細書中で同定された、または引用された全ての参考文献、特許、および特許公報は、その全体が参考として援用される。
【０２２６】
本発明は特定の実施態様に関して記載されたが、これらの実施形態の詳細は、限定として解釈されない。様々な等価物、変化、および改変が、本発明の趣旨および範囲から離れることなくなされ、そしてそのような等価な実施形態は本発明の一部であることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２２７】
【図１】図１は、ｒｅｓ０２のヌクレオチド配列である（配列番号１）。
【図２】図２は、ｒｅｓ０２の推定アミノ酸配列である（配列番号２）。
【図３】図３は、ｉｎｖ１９のヌクレオチド配列である（配列番号３）。
【図４】図４は、ｉｎｖ１９の推定アミノ酸配列である（配列番号４）。
【図５】図５は、ｐＫＧＷ１０の構築およびＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３の染色体からｒｅｓ０２を欠失させるために使用される変異戦略を示す図である。ｒｅｓ０２の翻訳の方向は、図の右から左である。
【図６】図６は、Ｌｅｆｔ  Ｆｌａｎｋ、ｉｎｖ１９−Ｄ１→ｔｈｒｏｕｇｈ←ｉｎｖ１９−Ｄ２、１９５８ｂｐのヌクレオチド配列である（配列番号５）。
【図７】図７は、Ｒｉｇｈｔ  Ｆｌａｎｋ、ｉｎｖ１９−Ｄ５→ｔｈｒｏｕｇｈ←ｉｎｖ１９−Ｄ６、２５４０ｂｐのヌクレオチド配列である（配列番号６）。
【図８】図８は、ｍｕｔ２（レーン２）およびｍｕｔ４４（レーン４）は、ＰＳＡを発現するが、ＰＳＢ、ＰＳＣ、ＰＳＤ、ＰＳＥ、ＰＳＧ、またはＰＳＨを発現しないことを示す、ウェスタンイムノブロット画像の合成物である。少量のＰＳＦが、これらの変異体株のそれぞれによって発現されたが、別のｒｅｓ０２変異体、ｒｅｓ０２ｍｕｔ８によっては発現されなかった。野生型（レーン１）およびｒｅｓ０２ｍｕｔ８（レーン３）も、比較のために示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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