(57)【要約】インタクトな膜からレセプターを、それらに会合した微環境成分を除去することなく、それらのネイティブな立体配置で回収または「隔絶する」方法が記載される。このレセプターを含む膜は、リガンド結合固体支持体と最初に会合されて、固体支持体に対する微環境を含むレセプター／リガンド複合体を介しての膜の会合が達成され、次いでこのレセプターおよびその微環境から膜が、剪断力によって除去される。次いで、このようにして単離されたレセプターおよびそれらの微環境は、細胞の分化、アポトーシス、トランスフォーメーションなどにおけるそれらの役割について分析され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合レセプターをその微環境とともに単離および特徴付けする方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該レセプターに特異的に結合するリガンドに結合した固体支持体を提供する工程；
（ｂ）該固体支持体を、該膜結合レセプターを含む、有核細胞またはその細胞小器官を含むサンプルで処理する工程であって、該細胞または細胞小器官は、表面が処理されておらず、
ここで、複合体は、該膜結合レセプターと該リガンドとの間で形成され、従って、該レセプターおよびその微環境を含むリガンド／レセプター複合体を作製し、該複合体は、該リガンドを介して固体支持体へと結合されている、工程；
（ｃ）該固体支持体を該サンプルの残余部から分離する工程；
（ｄ）該分離された固体支持体に対して、該レセプターおよびその微環境を該膜から解離するには充分であるが、該リガンド／レセプター複合体を破壊するには不充分である力をかけ、従って、リガンド／レセプター複合体に結合した固体支持体を得て、それによって、該レセプターが、その微環境を保持しているが、該膜からは分離されている、工程；ならびに、必要に応じて
（ｅ）該レセプターの該微環境を分析する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
工程（ｅ）が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レセプターおよびその微環境を含む前記リガンド／レセプター複合体を、前記固体支持体から取り出す工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リガンドを含まない前記レセプターおよびその微環境を、前記固体支持体から取り出す工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）において、前記細胞がインタクトなままである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、脊椎動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、腫瘍細胞または罹病細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、造血細胞であるか、または脂肪組織、疎性結合組織、結合組織、弾性組織、上皮組織、内皮組織、神経組織、粘膜組織もしくは細網組織由来の細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが、抗体またはその免疫特異的部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記レセプターが、ＨＬＡ抗原を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記レセプターが、腫瘍関連抗原を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記レセプターが、サイトカインレセプター、ホルモンレセプター、オピオイドレセプター、またはステロイドレセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記力が、押出しによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記力が、ボルテックスまたは振盪によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記力が、超音波処理によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体が、ビーズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ビーズが、ポリアクリルアミドビーズ、ポリスチレンビーズ、Ｓｅｐｈａｄｅｘビーズ、またはラテックスビーズである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記固体支持体が、マルチウェルプレートである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記リガンドが、光切断可能部分を含むリンカーを介して前記固体支持体へと結合しており、そして前記取り出す工程が、該リンカーを光に曝露することによってもたらされる、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記リガンドが、酵素によって切断可能な部分を含むリンカーを介して固体支持体へと結合しており、そして前記取り出す工程が、該リンカーを該酵素に曝露することによってもたらされる、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記取り出す工程が、前記複合体化した固体支持体を、前記レセプターと競合して前記リガンドを結合する物質で処理することによって達成される、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
多数のレセプターをそれらの微環境とともに回収するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）各々異なるリガンドに結合した多数の固体支持体部分を提供する工程；
（ｂ）少なくとも２つの細胞表面レセプターを含む有核細胞を含むサンプルを処理する工程であって、ここで、該細胞は、リガンド／レセプター複合体が、細胞表面において該リガンドと該レセプターとの間で形成される条件下では、該多数の固体支持体部分で表面処理されていない、工程；
（ｃ）該サンプルから該固体支持体部分を取り出す工程；および
（ｄ）該固体支持体部分を、該レセプターおよびそれらの微環境を該細胞の表面から除去するに充分であるが、該リガンド／レセプター複合体を破壊するには不充分である力に供する工程；ならびに
（ｅ）少なくとも２つのレセプターのそれぞれの微環境を分析する工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記リガンド／レセプター複合体または前記レセプターおよびそれらの微環境を前記固体支持体から取り出す工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レセプターを同定する工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記レセプターを同定する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記微環境における成分を同定する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記微環境における成分を同定する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記同定されたレセプターを、前記膜サンプルの特性を示すプロファイルへと編成する工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記同定されたレセプターを、前記膜サンプルの特性を示すプロファイルへと編成する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の部分の各々が、異なるリガンドへと結合されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記リガンドが、モノクローナル抗体である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国出願第０９／９３２，１６６号（２００１年８月１７日出願）の一部継続出願である。米国出願第０９／９３２，１６６号は、米国特許法１１９条（ｅ）項の下で、出願第６０／３０８，６５５号（２００１年７月２７日出願）に対する優先権を主張する。これらの出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、膜に結合した複合体を単離する方法に関し、ここで、特異的リガンドによって結合された、膜に結合したタンパク質の微環境は保存される。より詳細には、本発明は、これらが会合した分子を伴う、膜に結合した（特に、細胞表面）レセプターの、非破壊的調製物および単離に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
タンパク質の単離のための多数の手順が、当該分野で利用可能であり、そして実施されている。細胞質において生じる可溶性タンパク質のような可溶性タンパク質については、これらのタンパク質をそれらの周囲から遊離させる工程が不要であるので、これらの技術の直接的適用が可能である。しかし、膜結合性であるタンパク質または脂質は、これらを膜から遊離させるために、より過酷な処置を必要としてきた。１つの共通して用いられる技術は、界面活性剤、または他の過酷な試薬（例えば、カオトロピック剤または尿素のような他の変性化合物）を用いた可溶化である。例えば、Ｍｏｌｌｏｙ，Ｍ．Ｐ．ら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９８）１９：８３７−８３４；Ｃｈｅｖａｌｌｅｔ，Ｍ．ら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９８）１９：１９０１−１９０９を参照のこと。このような方法の欠点は、単離プロセスが過度に行われすぎ（すなわち、このタンパク質は、本質的に単独で回収され）、そしてそれと通常会合していてしばしばその生物学的機能に重要である細胞膜成分を伴わないことである。このようなタンパク質の生物学的役割の解明は、その特異的リガンドへのそのタンパク質の結合から生じるシグナル伝達に関与する物質の知識を必要とする。従って、これらの物質の性質、ならびにこれらのタンパク質およびその関連する物質の生物学的役割が決定され得るように、これらの膜タンパク質を、それらの当然生じる物質とともに回収することが極めて有益である。当然生じる物質が、それら自体、膜と会合し得るかまたは細胞質中のレセプターと会合し得ることが留意される。
【０００４】
先行技術の方法の別の欠点は、いくつかの場合には、膜が、隠れたレセプターを露出させるようにし、同時に目的のリガンドに結合する厳しい試薬によって充分に破壊されることである。従って、実施者は、実際には、このレセプターは、問題のリガンドの生物学的機能には無関係である場合に、リガンドに関してレセプターを分析することに誤って導かれる。
【０００５】
界面活性剤を使用することなく赤血球からレクチンレセプターを得る１つの方法の説明は、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８１）１００：１４８４−１４９０によって記載された。この方法では、赤血球をノイラミニダーゼで処理し、次いでレクチンでコーティングした（すなわち、落花生凝集素でコーティングした）セファロースビーズで処理し、それにより、レクチンと細胞表面のこの同属レセプターとの間での相互作用によって、この赤血球をこのビーズへと結合させた。結合していない細胞を除去し、そして赤血球で覆われたビーズのペレットを、パスツールピペットを用いて激しくピペッティングした。次いで、これらのビーズを洗浄して、剪断されたあらゆる赤血球を除去し、そして大部分の赤血球がこの処理の繰返しによって除去され得ることを決定した。あらゆる残りの結合した細胞は、迅速なボルテックスおよびその後の洗浄によって除去され得る。赤血球は除去されたが、レクチンに結合したレセプターは、セファロースビーズに結合したままであった。次いで、これらの「もぎ取られた（ｐｌｕｃｋｅｄ）」レセプターを、煮沸することによって、またはガラクトースを用いた競合的溶出によって、このビーズから遊離させた。
【０００６】
結合した成分の溶出は、アシアログリコホリンと称されるレクチン結合成分の回収をもたらした。この研究は、核を欠く細胞が、関連する糖を露出させるように処理した場合、それらの表面の糖質を介して、凝集素（すなわち、レクチン）に対して結合され得ること、およびこの凝集素に結合した糖質含有部分が、機械的破壊によって細胞膜から取り出され得ることを示した。糖タンパク質レセプター自体とともに、何らかの非共有結合成分が取り出されたとの記載は提供されなかった。さらに、関連する糖を露出させるように処理されていない細胞の説明はなく、レクチン以外のリガンドを用いることの示唆もない。以下に記載の通り、レクチンは比較的非特異的であり、従って、多数のグリコシル化タンパク質に結合し、これらのグリコシル化タンパク質の生物学的機能のうちのいくつかは、このレクチンの特定の性質とは無関係である。
【０００７】
レクチンレセプターがマウス胸腺細胞から「もぎ取られる」さらなる実験が、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｓｃｈｏｏｌへの博士号の本明細書中の発明者に対する奨学金に支援されて提出され、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅによって１９８３年６月６日に承認された、卒業論文の１節に記載された。この実験では、胸腺細胞を種々の方法で標識し、そして上記の一般的手順に従って、レクチン誘導体化ビーズで処理した。これは、複雑なパターンの標識タンパク質の回収をもたらし、これらのうちの多くは、用いられるレクチンによって結合される糖を含むレセプターを提示した。従って、レクチンを結合因子として用いて、関連するレセプターを抽出することの特異性の相対的欠如を実証する。
【０００８】
細胞の有効な結合は、本発明の特異的リガンドを介してよりも、レクチンの使用を介して容易に達成され得るとはいえ、得られるものは、レクチン結合の非特異性に起因して、生物学的に関連するレセプターに関する情報を提供しない。いくつかのレクチンは、生物学的応答を生じ、そしてレクチンは、これらが結合する糖質に関して特異的であるが、ここの糖質の標的は、それらが存在するレセプターに関して無差別である。従って、個々のレセプターに関しては、結合特異性は失われている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
（特に、有核細胞において）タンパク質を含む表面レセプターが、対応リガンドに対するこれらのレセプターの特異的結合、およびリガンド／レセプター複合体からの、細胞または関連する膜の大部分のその後の剪断によって、非共有結合的に会合した複合成分とともに取り出され得ることが現在見出されている。一般に、このプロセスは、レセプターおよびその微環境の「隔絶（ｄｅｒａｃｉｎａｔｉｏｎ）」といわれ得る。所望の場合、このレセプターは、その会合する細胞成分とともに、例えば、レセプター自体もしくはそのアナログによる競合的結合を用いて、または他の多数の技術によって、特定のリガンドから解離され得る。
【００１０】
本発明は、膜に結合した成分（例えば、細胞表面レセプター）を、それらのネイティブなコンホメーションで、そしてそれらのネイティブな微環境において、その成分またはレセプターの状態が保存され、それゆえ、従来の単離方法が用いられる場合に入手可能でないそのレセプターの機能の洞察が可能である条件下で、迅速かつ特異的に単離する方法を提供する。このような従来の方法は代表的に、レセプターの周囲の膜および細胞質環境を歪ませるおよび／または破壊し、それゆえ、そのレセプター自体の環境および機能に関する情報を遮断する、界面活性剤またはカオトロピック剤を含む。従って、本発明の方法は、刺激／リガンドと相互作用する細胞表面標的を同定および特徴付けする情報、ならびにこれらの標的と相互作用する分子の同定および設計を提供する。これらの標的と相互作用する分子の同定および設計（これらを阻害する分子を含む）は、機能様式およびこの標的に関連したさらなる細胞成分を解明する、本発明の方法によって利用可能になる理解によって、さらに情報が与えられる。
【００１１】
従って、１つの局面では、本発明は、膜に結合したレセプター（例えば、細胞表面レセプター）を、その微環境とともに単離する方法に関し、この方法は、所望のレセプターに特異的なリガンドに結合した固体支持体を提供する工程であって、この固体支持体に、このレセプターを保有する膜が、このリガンドとの会合を介して結合して、リガンド／レセプター複合体を形成している、工程、次いで、この細胞をこのリガンド／レセプター複合体から剪断する工程を包含する。この「リガンド」は、例えば、ホルモンもしくは増殖因子であり得るか、または抗体もしくは標的化されたタンパク質に対して特異的である限りその関連フラグメントであり得る。このようにして回収されたレセプターは、その微環境と会合したままである。この微環境は、もちろん、実際、何の会合細胞成分も含まないかもしれず、そしてこのレセプターが単独で回収される。これもまた、このレセプターの性質に関して有益な情報である。これに続いて、必要に応じて、リガンド／レセプター複合体（このレセプターおよびその微環境を含む）をこの固体支持体から解離し得るか、および／またはこのリガンドをこのレセプター／微環境から解離してこのレセプター／微環境自体を回収し得る。いずれにせよ、微環境がこのレセプターと会合したままであるので、この微環境を分析して、どの成分を含むか（ある場合）を決定することは、本発明に含まれ得るさらなる工程である。例えば、クロマトグラフィー分析、質量分析法、２次元ゲルおよびウェスタンブロットを含む多数の方法が、このような分析について利用可能である。
【００１２】
本発明の方法では、このリガンドは、このレセプター自体に特異的であり、そしてこの標的レセプターの生物学的活性に無関係なレセプターと交叉反応しない。本明細書中以下に定義される場合、１つの実施形態では、レセプターに特異的なリガンドは、たいてい、レクチンを含まない。レクチンは一般に、独特の生物学的に重要なレセプターのみに結合する必須の能力を欠く。このレクチンは一般に、タンパク質に会合した糖質に結合し得、従って、一般に、グリコシル化されたタンパク質と交叉反応性である。レクチンは、それらの代表的な一般的挙動とは逆に、特定のレセプターの隔絶をもたらすに充分に特異的である場合にのみ、本明細書中の「リガンド」の定義内に入る。一般に、レクチンは、特異的なリガンド（例えば、抗体）と比較してより高密度の細胞上レセプターに結合する。リガンドとして用いられる抗体またはそれらのフラグメントが、任意の生物学的応答をもたらし得るが、必ずしもその必要はないことに留意すべきである；しかし、これは、リガンドが応答を惹起するレセプターを特異的に標的化する。
【００１３】
さらに、レクチンは、結合するために、これらが結合する糖質部分を露出させるための膜の表面の前処理を必要とし得る。本発明の好ましい方法は、細胞表面に露出した糖質を改変する表面処理には全く供されていない膜を利用する。好ましい実施形態では、利点は、膜が、より現実的なネイティブな状態で用いられることである。この好ましい方法では、膜を特異的リガンドと接触させる前には、膜の何の表面処理も存在しない。
【００１４】
しかし、１つの好ましい実施形態では、レクチンは、このレジメンの少なくとも一部として用いられ得る。糖質分布が特定の型の細胞において異なることが理解される場合、細胞表面レセプターに特異的であるレクチンを提供することが可能であり得、そしてこの特別な場合には、このようなレクチンは、リガンドとして用いられ得る。例えば、腫瘍細胞に関連したレセプターが、正常細胞に関連したレセプターとは異なるグリコシル化パターンを有することが理解される。糖質の会合における相違が、（例えば、腫瘍細胞上の）特定のレセプターを区別するに充分である場合、区別する糖質を露出させるために細胞処理が必要であるときでさえ、この糖質に特異的なレクチンは、充分に特異的なリガンドとして用いられ得る。
【００１５】
なお別の好ましい実施形態では、この膜は、有核細胞または細菌細胞（好ましくは、有核細胞）と会合しているかまたはこれらに由来する。有核細胞は、赤血球を除く、実質的に全ての典型的真核生物細胞の代表である。有核細胞の表面上の膜または有核細胞に含まれる膜は、例えば、赤血球に会合した膜よりも、生得的に、複雑である。さらに、有核細胞は、赤血球よりも複雑な代謝機能を果たし、従って、レセプターの回収のための、より実り多い基質を提供する。
【００１６】
なお別の好ましい実施形態では、本発明の方法は、レセプターが含まれる微環境を分析するための上記の活性な工程を包含する。この微環境は、膜自体に存在してもよく、または、細胞質中のレセプターの近位に存在してもよい。上記のように、この微環境は、密接に会合した成分を何も含まないかもしれず、従って、本発明の方法は、レセプター自体の単離をもたらす。
【００１７】
別の局面では、本発明は、膜結合レセプターのライブラリーを得るための方法に関し、この方法は、多数のリガンドに結合した固体支持体を提供する工程；この固体支持体を、（好ましくは有核細胞由来または有核細胞に会合している）膜のサンプルと、リガンドがその同族レセプターと複合体を形成するように、それによって該膜中または該細胞上のレセプターが、該固体支持体上の１以上のリガンドに結合する条件下で接触させる工程を包含する。次いで、この膜または細胞は、このレセプターおよび微環境を含むリガンド／レセプター複合体から解離される。膜由来レセプター（微環境を伴う）は、単独で、またはそれらのリガンドとともにのいずれかで、この固体支持体から必要に応じて回収される。次いで、このレセプター／微環境を分析して、どの成分（存在する場合）がこの単離されたレセプターと会合しているかが決定され得る。
【００１８】
さらなる局面では、本発明は、本発明の方法によって調製された、微環境と会合している単離されたレセプター、およびそれによって同定される新規レセプターに関する。この回収されたレセプターをスクリーニングアッセイにおいて用いて、これらをアゴナイズまたはアンタゴナイズする化合物を同定し得る。このレセプターが、望ましくない細胞または罹病細胞と会合していると同定された場合、この回収されたレセプターは、さらに、抗体、薬剤またはワクチンの設計において用いられて、これらの細胞を標的化し得る。このレセプターは、正常細胞および罹病細胞の両方から回収され得る。
【００１９】
本発明はまた、膜サンプルまたは細胞サンプルのレセプタープロファイルを包含する。以下にさらに記載されるように、本発明の方法をハイスループット系において用いて、細胞表面での、または膜に含まれる、レセプターのパターンを決定し得る。
【００２０】
従って、本発明の重要な局面は、レセプターおよびそれらの機能に関連した細胞ネットワークとの相互作用を特徴付ける能力である。
【００２１】
（発明を実施するための形態）
本発明は、それによって少なくとも３つの重要な目的が達成される方法を初めて提供する。第１に、この方法は、インタクトな細胞からの直接的な、リガンドへと特異的に結合する膜結合レセプターの、それらのネイティブなコンホメーションおよび会合部分を保存した形態での単離を可能にする。従って、このレセプターおよびこのレセプターが会合している成分についての豊富な情報、従って、以前には入手可能でなかった、回収されたレセプターの機能および役割についての豊富な情報を提供する。このレセプターとネイティブに会合している部分の性質を確認することによって、細胞経路（例えば、増殖、分化、生存、アポトーシス、トランスフォーメーションなど）におけるこのレセプターの役割が決定され得る。一旦、このような役割が決定されると、このレセプター自体を適切なストラテジーの設計において用いて、関連する機能を制御し得る。第２の目的は、そして第１の目的に関連して、生物学的に重大なものではないが、用いたリガンドを同時に結合する、隠れた分子を明らかにする薬剤の使用を回避することによる、回収されたレセプターが、実験のアーチファクトでないことの保証である。第３に、本発明の方法は、これらのレセプターを膜から回収することが容易な系による、膜結合レセプターの迅速な同定のためのハイスループット系を提供する。同定されるいくつかのレセプターは、以前に未知であり得る。
【００２２】
このレセプターによって示されるタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−脂質相互作用、または任意の他の型の相互作用の同定および特徴付けは、このレセプターの生物学的役割、従って、これに結合され得るリガンドの生物学的役割を評価する際に、重要である。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、「レセプター」とは、同族リガンドに特異的に結合する任意の部分をいう。代表的に、このレセプターはタンパク質であり、例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、さらなる構造成分への結合などを通じてさらに誘導体化されていてもよく、誘導体化されていなくてもよい。「レセプター」は、本明細書中で一般的用語として用いられ、細胞経路に必ず関連したタンパク質には限定されない。膜会合レセプターとしては、例えば、Ｇ−タンパク質共役レセプター、サイトカインレセプター、イオンチャネル、オピオイドレセプター、ホルモンレセプター、レチノイドレセプター、ステロイドレセプター、増殖因子レセプター、インテグリン、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプター、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ、ならびに一般に、リガンドに特異的に結合する、充分な露出部を膜表面に含む、任意の膜結合タンパク質が挙げられる。
【００２４】
「リガンド」は、非特異的レクチン以外の任意の同族結合因子であり得、この薬剤は、膜結合レセプター成分に特異的であり、ここでこの成分は、１つまたは（いくつかの場合には）いくつかのレセプターに特有である（特徴的成分は、いくつかのレセプターによって共有され得るが、これらの全てが、同じ生物学的機能を有する必要はないが、これは、例外であると考えられる）。すなわち、このリガンドは、これがアゴニストもしくはアンタゴニストとして特異的に認識するレセプターとのみ相互作用すべきであるか、あるいは、このネイティブなリガンドの抗体またはそれらのフラグメントもしくは他の模倣物の場合、模倣されるネイティブなリガンドによって活性化されるレセプターのみと相互作用すべきである。一般に、レクチンは、リガンドの定義から除外される。なぜなら、これらは、比較的非特異的であるからである。多くのタンパク質はグリコシル化されているので、レクチンは、多数のタンパク質を非特異的に結合する。さらに、レクチンの使用は、（例えば、シアル酸残基によって）マスクされた糖質残基を露出させるために、接触前の膜の処理を必要とし得る。従って、本明細書中に定義される場合、「リガンド」は、多数のレセプターに結合し得るレクチンとは対照的に、特定のレセプターに対して高度に特異的に結合する一定範囲の物質を包含する。レクチンは糖質を結合するとはいえ、糖質を結合する全てのタンパク質がレクチンというわけではない。例えば、抗体は、特異的糖質エピトープを結合し得る。
【００２５】
このリガンドは、このレセプターに対してネイティブであるリガンド（例えば、サイトカインレセプターに通常結合するサイトカイン）であり得るが、特異的結合のために設計された合成化合物（抗体またはそのフラグメントを含む）でもあり得る。それらの化学的性質に関して、このリガンドは、タンパク質、脂質、糖または低分子であり得る。このリガンドは、他の特徴付ける特徴（例えば、免疫グロブリン構造またはそのフラグメントを含むこと、毒素、酵素としての活性または他の生物学的活性）を有し得る。
【００２６】
従って、レクチンを除いて、上記のように、本明細書中で用いられる場合、「レセプター」および「リガンド」とは、単に、このレセプターが膜と会合していて、このリガンドが代表的に、会合していない同族結合対をいう。
【００２７】
「タンパク質」、「ペプチド」、および［ポリペプチド」は、含まれるアミノ酸配列の長さにかかわらず、交換可能に用いられる。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、用語このレセプターの「微環境」とは、このレセプターの極周囲にあって、非共有結合的に会合している、分子をいう。これらの分子は、このレセプターとそのリガンドとの相互作用からのシグナル伝達に関与し得るか、またはこのレセプターとの相互作用によって活性化もしくは不活化される分子であり得る。これらの分子は、このレセプターと構成的に相互作用し得るか、またはリガンドへのその結合の際にのみ相互作用し得る。これらの分子は、膜自体に存在し得るか、または細胞質中のそのレセプターと会合し得る。細胞の機能におけるこのレセプターの役割、作用機構および／または反応速度論についての重要な情報を提供するのは、このレセプターのすぐ隣の微環境におけるこれらの分子の性質である。この評価は、このレセプターの作用が、アゴナイズされるべきかまたはアンタゴナイズされるべきかについての、およびこれは、このレセプターと特異的に相互作用するかまたはそれに対する免疫応答を惹起する、抗体、タンパク質、細胞、薬剤またはワクチンを構築するために有用であるか否かについての決定において重要であり得る。さらに、このレセプターに会合した分子の理解は、有用な治療剤および予防剤の同定のためのスクリーニングアッセイの設計を補助する。
【００２９】
本発明において出発材料として用いられる膜は、それらの起源の細胞とのそれらの会合を保持したままでもよく、またはそれらから分離されてもよい。本発明の方法において出発材料として用いるためには、この膜を、例えば、遮断された糖質または隠れたレセプターを露出させるような任意の「表面処理」に供することは不要である。「表面処理」とは、この膜によって天然では提示されていない、このレセプターの一部分を露出するように設計された処理を意味する。このような表面処理としては、例えば、糖質残基を露出させるための、ノイラミニダーゼを用いた処理が挙げられ得る；このような処理は、本発明に関しては不要である。なぜなら、レクチンは、上記のように、レセプターを特異的に結合するリガンドから除外されているからである。実際、膜に提示されたレセプターを回収する先行技術の方法の欠点の１つは、界面活性剤または他の厳しい試薬を用いた処理が、この方法において用いられるリガンドを結合する隠れた部分を露出させ得、従って、このリガンドのネイティブな機能に特有ではないアーチファクトを作製することである。従って、「表面処理」は、この膜が、レセプターのうちの、この膜のネイティブな状態で提示される部分のみを提示することを確実にするように回避される。
【００３０】
しかし、「微環境」は実際、何の相互作用する物質も含まないかもしれない。この場合、このレセプターは、何の会合する物質もなく単離される；すなわち、この微環境は空である。従って、「微環境」は、このレセプターが、本発明の方法によって回収される場合、さらなる物質の存在を要求すると理解されるべきではない。この「レセプター」が、何の意味のある方法でもさらなる物質と会合していない場合、これは、単独で単離され、これもまた、有益な情報を提供する。
【００３１】
代表的に、このレセプターが会合している膜は、細胞表面膜である。しかし、本発明はまた、細胞の他の膜（例えば、核膜、小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリアまたは他の細胞内小器官）と会合しているレセプターの回収に適用可能である。細胞内レセプターに対してこの方法を適用する際に、核または他の細胞小器官は最初に単離され、そしてインタクトな細胞の代わりに本発明の方法に供される。細胞表面膜もまた、これらの細胞から単離され得る；しかし、細胞表面膜の場合、インタクトな細胞もまた用いられ得る。
【００３２】
露出したレセプターを含む任意の型の細胞または組織は、本発明の方法において用いられ得る。このような細胞としては一般に、真核生物細胞（例えば、酵母細胞、真菌細胞一般、無脊椎動物由来の細胞、および細菌細胞が挙げられる。しかし、本発明において用いられる細胞は好ましくは有核細胞であり、そしてその表面にレセプターを提示する任意の細胞を包含し得る。好ましくは、このような細胞は脊椎動物細胞であり、そして最も好ましくは哺乳動物細胞である。
【００３３】
広範な種々のこのような細胞が用いられる。このような細胞としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：脂肪組織、疎性結合組織、結合組織、弾性組織、上皮組織、神経組織、粘膜組織、細網組織などに由来する細胞。細胞は、消化組織、胸部組織、心血管組織、皮膚組織、内分泌組織、胃腸組織、造血組織、肝胆道組織、リンパ組織、リンパ細網組織、筋肉組織、男性生殖組織もしくは女性生殖組織、呼吸組織、骨格組織、または尿路組織に由来し得る。従って、細胞は、造血細胞（種々の型のリンパ球、前駆細胞、幹細胞、マクロファージ、顆粒球を含む）を含み得る。細胞は、内皮細胞、骨髄性細胞、腫瘍細胞、種々の細胞株由来の細胞、および種々の器官由来の細胞（例えば、膀胱、脳、胸部、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨髄、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣など）を含み得る。高度に組織特異的な細胞（例えば、網膜、角膜または脈絡膜由来の細胞）もまた用いられ得る。免疫系の特化した細胞またはその表面に腫瘍関連抗原を含む腫瘍関連細胞もまた用いられ得る。
【００３４】
従って、腫瘍細胞に含まれるかまたは腫瘍細胞上の、膜に会合したレセプター（例えば、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、結腸腫瘍、胸部腫瘍、膵臓腫瘍、骨腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、脳腫瘍または非固形腫瘍（例えば、リンパ腫および白血病）の良性または悪性の腫瘍細胞に由来するレセプター）は、本発明の方法に従って、回復および研究のために利用可能である。さらに、種々の疾患状態と関連した細胞（感染細胞、自己免疫応答を示す細胞、または他の異常を有する細胞を含む）由来の膜は、これらの細胞に特有の経路およびレセプターの解明のために利用可能にされる。
【００３５】
本発明の利点は、広範な種々の細胞型が、提示されるレセプターの型について評価され得、従って、細胞の分化および増殖におけるこれらのレセプターの役割がさらに解明され得ることである。本発明の方法はまた、特定の型の細胞上でのレセプターパターンのプロファイリングを可能にし、そして特定の組織と関連した細胞または特定の分化段階、特定の加齢にある細胞、または異常と考えられる細胞（例えば、罹病細胞または腫瘍細胞）における膜レセプタープロファイルを対比する能力を提供する。このような適用の１例として、レクチンを用いて、特定の型の正常組織上に発現されたレセプターをプロファイルし得、そしてこれを、同じ型由来の腫瘍組織のそのレセプタープロファイルと対比し得る。従って、罹病腫瘍組織において示差的に発現されるレセプターの同定が導かれる。
【００３６】
本発明の１つの適用では、その微環境を伴った単一のレセプターが、細胞表面または選り抜きの他の細胞膜から取り出される。この実施形態では、所望のレセプターに対するリガンドが結合する固体支持体が最初に提供される。レセプターが既知である場合、便利なリガンドは、そのレセプターについて免疫特異的である、抗体またはそのフラグメントである。このような抗体は、標準的免疫技術を用いるかまたはファージディスプレイ技術を用いる、以前に単離されたレセプター（このような以前の単離は通常、このレセプターの微環境を破壊した）での免疫、またはこのレセプターを提示する細胞での免疫によって調製され得る。次いで、このレセプターについて免疫特異的であるポリクローナル抗体は、免疫された被験体の血清から回収され得るか、またはモノクローナル抗体がこの被験体から調製され得る。抗体もまた、組換えによって、種々の形態（例えば、単鎖抗体）で調製され得る。この抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２）もまた用いられ得る。この抗体のうちの任意の免疫特異的部分は、このレセプターの回収のためのリガンドとして用いられ得る。
【００３７】
このレセプターが未知である場合でさえ、微環境がどのような成分を含み得ようとも、その微環境を伴う、以前は未知のレセプターの単離をもたらす抗体が調製され得る。例えば、細胞は免疫のために使用され得、そしてモノクローナル抗体が免疫被験体から調製され得、そしてハイブリドーマ技術によって、またはファージディスプレイを含む標準的組換え技術を用いて産生され得る。次いで、個々のモノクローナル抗体をリガンドとして用いて、以前は未知であったレセプターを、この細胞表面からまたはこれらの細胞に由来する膜から回収し得る。
【００３８】
抗体に加えて、このレセプターに特異的に結合するアプタマーが、当該分野で理解されるようなＳｅｌｅｘＴＭ手順を用いて入手され得る。あるいは、このリガンドは、このレセプターに対してネイティブなリガンドであってもよく、あるいは、例えば、コンビナトリアルライブラリー（低分子を含むライブラリー、ペプチドを含むライブラリーおよび抗体を含むライブラリーなどを包含する）から回収された任意の選択されたリガンドであってもよい。
【００３９】
ここで選択されたリガンドは、このリガンドが複合体化するレセプターが回収され得るように、固体支持体へと結合される。この固体支持体は、任意の便利な形態（例えば、ポリスチレンから構成されるビーズ、ラテックスから構成されるビーズ、Ｓｅｐｈａｄｅｘから構成されるビーズ、ポリアクリルアミドから構成されるビーズなどを包含する）であり得る。また用いられ得るのは、磁性ビーズ、繊維および他の幾何学的形状である。特に便利なのは、マルチウェルプレートである。
【００４０】
このリガンドは、任意の便利な手段によって固体支持体に対して結合され、ここで、この結合は、剪断による破壊に耐えるに充分に強固である。必ずしもというわけではないが、好ましくは、このリガンドは、この支持体に対して共有結合される。リガンドの選択およびこの支持体の化学的性質に依存して、連結技術は、所望の結合を得るために選択される。このような連結技術としては、例えば、ＣＮＢｒを介した結合、またはリンカー（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能なリンカー）を介した結合が挙げられる。結合は、ペプチド結合、ジスルフィド結合、グルタルアルデヒドを介した架橋、ビオチン／アビジン結合などを介してであり得る。このリンカーはまた、このリガンドをこの固体支持体から解離させるための手段を含み得る。例えば、このリンカーとしては、光切断可能部分または特異的酵素によって切断可能な部分、または回収されるこのリガンドもしくはこのレセプターにとって有害ではない所定の試薬に応答して切断可能な部分が挙げられ得る。プロテインＡをまた用いて、抗体を結合し得、必要に応じて続いてさらに連結手順を行い得る。連結技術の選択は、当業者に明らかである。
【００４１】
次いで、（好ましくは、共有結合したリガンドが提供されている）この固体支持体は、所望のレセプターを含む、細胞、組織または膜で処理される。この膜は、インタクトな細胞もしくは組織、インタクトな核もしくは細胞小器官に含まれ得るか、または単離された膜自体として調製され得る。次いで、リガンド誘導体化固体支持体は、このレセプターとこの結合リガンドとの間で複合体が形成される条件下で、レセプターを含む膜で処理される。これらの条件は代表的に、生理学的条件の、中性ｐＨ、室温もしくはわずかに高いか低い温度、およびインタクトな細胞が用いられる場合、好ましくは適切な浸透圧である。接触時間は、変動するが、１分間程度に短くてもよく、数時間または一晩程度に長くてもよい。リガンドとレセプターとの間の複合体が形成されるに充分な時間が経過した後、この固体支持体は、この膜を含むサンプルから取り出され、そして必要に応じて洗浄して未結合の膜、細胞または細胞小器官が除去される。洗浄は一般に、また、標準的生理学的温度およびｐＨの条件下である。従って、ここで回収された固体支持体は、レセプターに対して複合体化したリガンドを含み、ここで、このレセプターは、インタクトな細胞膜、核膜、または膜調製物に埋め込まれたままである。
【００４２】
次の工程は、このレセプターが存在するこの膜からレセプター／リガンド複合体を解離させることである。この工程を実施するために、穏やかな力（例えば、剪断力）が適用される。この力は、穏やかな剪断力を付与するボルテックス、押出し（例えば、激しい反復ピペッティングによる）、振盪、中程度の条件下での超音波処理、撹拌または任意の他の方法を含め、種々の方法で入手され得る。剪断は、レセプター／リガンド複合体がインタクトなままであるが、このレセプターが、その会合した部分とともに、このレセプターが存在する膜から穏やかに取り出されるようなものである。従って、このレセプターは、インサイチュで、相互作用する分子と会合し続ける。インタクトな細胞または組織が用いられた場合、この細胞または組織は、インタクトなままであり得、そして生存可能なままであり得る。これらが溶解されないという事実は、溶解した細胞または組織から遊離した破片による夾雑の回避を可能にする。この工程は、「隔絶」と呼ばれ得る。
【００４３】
従って、このレセプターが、その微環境とともにこの膜から取り出された後に、このレセプターおよびその会合した成分は、固体支持体上でまたはそこから取り出された後のいずれかで、分析され得、そして同定され得る。この固体支持体からのこのレセプターの取り出しは、例えば、このリガンド／レセプター複合体を競合的に解離することによって、このリガンドをこの支持体から遊離させることによりこの支持体からリガンド／レセプター複合体全体を切断することによって、または解離条件を提供し、それによってリガンド／レセプター複合体を破壊することによって、もたらされ得る。例えば、このリガンドが抗体である場合、この抗体をこのレセプターと競合的に結合する抗原を用いて、このレセプターをこの固体支持体に対する結合から競合により取り出し得る。このような解離はまた、例えば、ｐＨを変更することによって、このリガンドがレセプターにもはや結合しないように条件を変更することによって達成され得る。このリガンドをこの固体支持体へと結合させるために用いられる連結が、光切断可能部分を含むように設計されている場合、この複合体全体は、適切な波長の光への曝露によって取り出され得る。リガンドの連結が、酵素切断部位を含むように設計されている場合、この固体支持体は、適切な酵素を用いて処理される。リガンド／レセプター複合体を解離させてこのレセプターおよびその微環境のみを遊離させるための代替的方法は、競合的結合とともに、高温での処理、または解離をもたらす溶媒もしくはｐＨ条件での処理を包含する。しかし、競合的相互作用は、好適である。なぜなら、この複合体の解離のための代替的方法はまた、このレセプターをその微環境の成分からも解離させ得るからである。
【００４４】
次いで、このレセプターおよびその会合成分のさらなる分析および同定は、当該分野で一般に公知の手段によって実施される。このタンパク質は配列決定され得、そしてこのタンパク質、その転写後モディファイヤおよびこの微環境の付随する物質は、クロマトグラフィー法、ＮＭＲ、質量分析法、赤外分光法などによって分析され得る。種々の分析ツールは、このタンパク質自体およびその微環境を特徴付けるために現在利用可能である。二次元電気泳動、ウェスタンブロット、および質量分析法、ならびにタンパク質−タンパク質相互作用を認識する分析手段によるものが用いられ得る。例えば、Ｒｕｄｅｒｔ，Ｆ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．（２０００）５：４５−８６；Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１７：６７６−６８２；Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ｇ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４：３８５−３９０を参照のこと。これらの文献の内容は、これらの技術の性質を実証するために本明細書中に参考として援用される。
【００４５】
概略を述べると、本発明の１つの例示的実施形態は、以下の通りである：ビーズは、細胞表面で発現された抗原に対して特異的な抗原を用いてコーティングされる。抗体でコーティングしたビーズは、抗原発現細胞に対して曝露され、細胞表面での、この抗体とこの抗原との間での複合体の形成がもたらされる。次いで、ビーズに結合した細胞は、例えば、剪断を用いて除去され、この細胞からこのようにして隔絶されたこの抗原およびその会合した膜成分に対して複合体形成した抗体が後に残される。この複合体から剪断された細胞は代表的に、充分に生存可能である。次いで、その会合した膜成分を有する抗原は、抗体／抗原複合体から溶出され、そして例えば、質量分析法による分析に供されて、この抗原およびそれに会合した成分が、上記の通り、同定される。
【００４６】
本発明の方法は、その存在が既に一般に公知であるレセプターの回収および分析のために、そして以前に同定されていないレセプターを回収するための両方に用いられ得る。同定されていないレセプターを回収するために、特異的リガンドは、任意に選択され得、そして多数の任意の選択されたレセプターを含み得る。例えば、特定のステロイドまたは特定のサイトカインまたは特定のオピオイドまたは特定の抗原もしくは抗体と複合体化され得る、任意の膜に埋め込まれたレセプターを回収することが所望され得る。
【００４７】
あるいは、多数のレセプターを非特異的に回収することが所望され得る。これは、特異的結合対の１つのメンバーに対して、膜上に露出したレセプター部分を提供することによって（例えば、このタンパク質をこの膜表面で一般的にビオチン化し、次いでアビジンをリガンドとして利用することによって）本発明の方法を用いて達成され得る。次いで、回収されたレセプターを、電気泳動によって分離し、そして本明細書中に記載のとおりに分析する。
【００４８】
本発明の方法はまた、ハイスループットスクリーニングに対して適応されて、多数のリガンドに対するレセプターの同定を可能にし得る。例えば、固体支持体の分離部分は、多数のリガンドに結合され得、次いで多数のリガンドが、以前のように、インタクトな細胞、インタクトな核、インタクトな細胞小器官、または膜調製物自体を含み得る膜のサンプルと相互作用され得る。次いで、この膜調製物のレセプタープロファイルは、詳細に確認され得る。
【００４９】
最初に、膜調製物によって結合されたリガンドのアレイは、膜（または細胞もしくは核）を標識し、そして固体支持体上の標識の存在を検出することによって確認され得る。これは、例えば、蛍光標識、比色標識、放射性標識もしくは他の周知の技術を利用して、この膜を検出可能にすることによって、またはこの膜を標識した試薬（例えば、標識抗体）を用いた反応により二次的に標識することによって、行われ得る。次いで、その微環境を含むレセプターをこの膜から回収する本発明の方法を用いて、細胞の生涯において、リガンド結合レセプターのアレイだけでなく、提示されたレセプターの役割の性質をもさらに解明し得る。従って、特徴的なプロファイルは、種々の細胞について入手され得、そして種々の分化した細胞、正常な細胞、罹病細胞、腫瘍細胞などの間での区別がなされ得る。
【００５０】
本発明の方法の特に有用な適用は、ＨＬＡクラスＩ提示およびクラスＩＩ提示に関連したペプチドの回収および同定である。この適用においては、特異的ＭＨＣハプロタイプによってコードされる抗原に対する同族リガンド（例えば、抗体）は、固体支持体に結合され、そして抗原提示細胞とともにインキュベートされる。その結果、複合体が、ペプチドを保有するＭＨＣクラスＩ抗原またはＭＨＣクラスＩＩ抗原と、この同族リガンドとの間で形成される。次いで、複合体含有固体支持体は、この複合体をこの細胞から解離するための機械的破砕に供され、ＨＬＡおよび結合したペプチドの複合体がこの支持体上に残される；次いで、このペプチドは、複合体から便利に取り出され得、そして分析され得る。この方法はまた、例えば、腫瘍細胞に対して適用されて、表面に提示されるペプチドが同定され得、このペプチドは次いで、この腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起するために用いられ得る。なぜなら、腫瘍関連抗原は、ＭＨＣによって制限されているからである。
【００５１】
他の適用としては、特定の細胞に特異的な抗原（例えば、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺膜特異的抗原（ＰＭＳＡ））、種々のリンパ球マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ１０など）、Ｂ細胞に特有の免疫グロブリン、レチノイドレセプター、オピオイドレセプター増殖因子レセプター、イオンチャネル、インテグリンなどの回収が挙げられる。
【００５２】
従って、本発明の方法を用いて、シグナル伝達経路に関連した細胞成分（例えば、ＥＧＦレセプターのＥＧＦ活性化に関連した細胞成分）を同定し得る。抗体を用いて、ＥＧＦレセプターをその微環境とともに入手し、そしてこのＥＧＦレセプターに会合している成分を分析して、これらが同定および特徴付けされる。
【００５３】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図しており、本発明を限定することを意図していない。
【実施例】
【００５４】
（実施例１：抗ＥＧＦＲ  Ｍａｂおよび小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）レクチンによるＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）の隔絶）
ヒト腫瘍細胞の細胞表面からの直接的な、そのネイティブな立体配置でのＥＧＦＲの隔絶を、抗ＥＧＦＲ  Ｍａｂと結合したビーズ、およびコントロールとして、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）レクチンと結合したビーズを用いて達成した。隔絶を、Ａ４３１ヒト類表皮癌細胞について実施した。Ａ４３１ヒト類表皮癌細胞は、フローサイトメトリー（図１）および種々の研究（Ｓａｔｏら，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（１９８３）１：５１１−５２９；Ｇｉｌｌら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９（１２）：７７５５−７７６０）によって示されたように、１細胞あたり１×１０６レセプターの桁の高レベルのＥＧＦＲを発現する。
【００５５】
ＥＧＦＲの特異的隔絶を、マウスＩｇＧ２ａκ抗ＥＧＦＲ  ５２８  Ｍａｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。これは、細胞上に提示されたＥＧＦＲに対して約１×１０−９Ｍの親和性を有する。比較のために、ＷＧＡもまた用いた。ＷＧＡは、ＥＧＦＲを含む細胞表面タンパク質のＮ−アセチルグルコサミン糖質部分に結合するレクチンである（Ｚｅｎｇら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９５）１４２（２）：１１７）。
【００５６】
シアノブロミド（ＣＮＢｒ）活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＭＢ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）ビーズを、製造業者の指示書に従って、マウス抗ＥＧＦＲ抗体５２８（ＩｇＧ２ａκ）と結合させた。５２８コーティングビーズまたはＷＧＡコーティングビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のいずれか約０．１ｇを、１μｇ／ｍｌ  ＥＧＦを用いた５分間にわたる事前刺激を用いてまたは用いずに、５×１０６個のＡ４３１腫瘍細胞とともにインキュベートした。室温での１５分間のインキュベーション後、過剰の未結合細胞を、このビーズを沈澱させ、そして上清中の細胞を捨てることによって、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。
【００５７】
ビーズに結合した細胞を、パスツールピペットで５〜６回ピペッティングすることによって除去した。このビーズを沈澱させ、そして上清中の遊離された細胞を捨てた。このプロセスを４〜５回繰り返した。ビーズに結合した残りの細胞を、穏やかなボルテックスによって取り出した。除去した細胞は、生存可能であることが示された。このビーズをペレット化し、そして上清を捨てた。
【００５８】
このビーズを光学顕微鏡下で可視化して、細胞の完全な除去を確認し、サンプル緩衝液（０．０６Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％  ＳＤＳ、５％β−ＭＥ、０．００１％ブロモフェノールブルー）中に再懸濁し、３分間煮沸し、そして上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲルにローディングした。このゲルをニトロセルロース膜にトランスファーし、そしてブロッティングした。
【００５９】
ブロットを、ウサギ抗ＥＧＦＲ抗体で染色し、続いてＨＲＰ結合体化抗ウサギ抗体で染色し、そしてＥＣＬ化学発光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて発光させた（図２）。１７０ｋＤａのＥＧＦＲタンパク質は、抗ＥＧＦＲを用いてＡ４３１細胞から隔絶された物質において鋭いバンドとして容易に検出された。ＷＧＡでコーティングされたビーズ由来の物質においては、このバンドはより拡散した。なぜなら、より多くのタンパク質が隔絶されるからである。これらの結果は、５２８  Ｍａｂによる、Ａ４３１細胞からのＥＧＦＲの好首尾の隔絶を示した。予想されたように、同様のレベルのＥＧＦＲタンパク質が、ＥＧＦの不存在下または存在下で培養された細胞から隔絶された。
【００６０】
（実施例２：抗ＥＧＦＲ  ＭａｂおよびＷＧＡレクチンによるＥＧＦＲ会合タンパク質の隔絶）
ＥＧＦの、そのレセプターＥＧＦＲへの結合は、レセプターチロシンの自己リン酸化ならびにいくつかの細胞質分子のリン酸化を含め、細胞の生化学的事象のカスケードを誘発する（Ｐａｎｄｅｙら，ＰＮＡＳ（２０００）９７：１７９−１８４）。ＥＧＦＲ自己リン酸化は、ｓｒｃ相同性ドメイン（ＳＨ２）を含む細胞質シグナル伝達タンパク質、およびホスホチロシン相互作用ドメイン（ＰＩＤ）を含む細胞質シグナル伝達タンパク質（例えば、Ｇｒｂ２タンパク質およびＳｈｃタンパク質）とのその相互作用をもたらす（Ｏ’Ｂｒｙａｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（３２）：２０４３１）。ＥＧＦＲとのＧｒｂ２タンパク質およびＳｈｃタンパク質の会合は、蛍光共鳴エネルギー伝達分析（Ｓｏｒｋｉｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）１０：１３９５）、免疫沈降（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４（２９）：２０１３９−１０１４３；Ｋｉｍｏｔｏら，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ（２０００）５：７４９−７６４）および質量分析法（Ｐａｎｄｅｙら，ＰＮＡＳ（２０００）９７：１７９−１８４）によって実証された。免疫沈降と質量分析法との組合わせは、別のＥＧＦＲ相互作用タンパク質Ｖａｖ−２が、ＥＧＦ媒介刺激によってチロシンリン酸化されることを同定した（Ｐａｎｄｅｙら，ＰＮＡＳ（２０００）９７：１７９−１８４）。
【００６１】
活性化されたＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ会合タンパク質をそれらのネイティブな立体配置で単離するために、ＥＧＦを用いて刺激されたＡ４３１細胞についての隔絶を、実施例１に記載されたとおり抗ＥＧＦＲ  Ｍａｂコーティングビーズを用いて実施した。この隔絶産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに泳動し、そして膜をマウス抗ホスホチロシン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）で染色し、続いてＨＲＰ結合体化抗マウス抗体で染色した。
【００６２】
図３に示すように、ＥＧＦ活性化Ａ４３１細胞由来の５２８  ＭａｂによるＥＧＦＲの隔絶は、未刺激の細胞由来の隔絶されたサンプルおよびＡ４３１細胞溶解産物と比較して高度にチロシンリン酸化されたＥＧＦＲの単離をもたらした。未刺激の細胞における低レベルのＥＧＦＲリン酸化の検出は、抗ＥＧＦＲ  ５２８  Ｍａｂ自体が、ＥＧＦＲのリン酸化および活性化を刺激し得ることを示す、以前の刊行物を確認する（Ｇｉｌｌら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：７７５５−７７６０）。この分析はまた、９５ｋＤａ、９０ｋＤａ、８５ｋＤａ、７０ｋＤａ、６５ｋＤａおよび６０ｋＤａというおよその分子量を有するさらなるチロシンリン酸化タンパク質を検出し、これらの大部分（９０ＫＤａ、８５ＫＤａ、７０ＫＤａ、６５ＫＤａおよび６０ＫＤａ）は、ＥＧＦ刺激細胞の隔絶産物において、未刺激の細胞と比較して有意に富化された。これらのチロシンリン酸化タンパク質の大部分は、免疫沈降研究によって、ＥＧＦＲと会合すると以前に同定されたタンパク質（Ｇｒｂ２タンパク質、Ｖａｖ−２タンパク質およびＳｈｃタンパク質（それぞれ、２５ｋＤａ、１１０ｋＤａ、および４６／５２／６６ｋＤａ）を含む）と一致する（約５０ｋＤａの分子量で検出されたバンドは、このビーズから遊離された５２８  Ｍａｂのマウス重鎖（ｍＩｇＨ）との二次抗体の交叉反応性に対応する）。
【００６３】
隔絶されたサンプルのさらなる特徴付けを、Ｖａｖ−２タンパク質に特異的な検出抗体（図４Ａ）、Ｇｒｂ２タンパク質に特異的な検出抗体（図４Ｂ）およびＳｈｃタンパク質に特異的な検出抗体（図５）を用いたウェスタンブロット分析によって実施した。
【００６４】
抗Ｖａｖ−２抗体を用いた５２８  Ｍａｂ隔絶サンプルのウェスタンブロット分析は、Ｖａｖ−２タンパク質（約１１０ｋＤａ）を容易に検出した。このことは、刺激されたＡ４３１細胞および未刺激のＡ４３１細胞の両方における、ＥＧＦＲとのその会合を示す（図４Ａ）。同様に、Ｇｒｂ２タンパク質（２５ｋＤａ）もまた、抗ＥＧＦＲ  Ｍａｂ隔絶物質において容易に検出された（図４Ｂ）。もちろん、約５０ｋＤａの分子量で検出されたバンドは、このビーズから遊離された５２８抗体のマウス重鎖（ｍＩｇＨ）との二次抗体の交叉反応性に対応する。
【００６５】
未刺激の細胞およびＥＧＦ刺激細胞の両方におけるＥＧＦＲ会合タンパク質Ｖａｖ−２およびＧｒｂ２の単離は、抗ＥＧＦＲ自体がＥＧＦＲを活性化し得、このことが、ＥＧＦ刺激の不存在下でのＶａｖ−２との相互作用をもたらし得るという観察によって説明され得る（Ｇｉｌｌら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：７７５５−７７６０）。
【００６６】
Ｓｈｃタンパク質は、３つのアイソフォーム（Ｐ４６、Ｐ５２およびＰ６６）において存在し得る。これらは、ＥＧＦＲと会合することが示されたアダプタータンパク質であり、下流のシグナル伝達を媒介して、ＪＮＫ活性化をもたらす（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４（２９）：２０１３９−１０１４３）。隔絶されたサンプルにおける、ＥＧＦＲとのＳｈｃタンパク質の会合を、抗Ｓｈｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いて調べた。図５は、５２８  Ｍａｂを用いた隔絶が、Ｓｈｃの３つのアイソフォームの単離をもたらしたことを示す。興味深いことに、ＳｈｃのＰ４６アイソフォームおよびＰ６６アイソフォームは、隔絶産物および細胞全体溶解産物において同様のレベルで検出された。しかし、Ｐ５２産物は、未刺激の細胞の隔絶産物において、細胞全体溶解産物と比較して量が少なく、そして刺激細胞において、未刺激の細胞と比較してさらに量が少なかった。この観察は、ＥＧＦ刺激後のＥＧＦＲレセプターに対するＳｈｃタンパク質の示差的結合を示唆する。
【００６７】
結局、これらのデータは、レセプター特異的Ｍａｂまたはレクチン（ＷＧＡ）を用いた隔絶が、このレセプターの特異的相互作用タンパク質を伴ったこのレセプターの単離をもたらすことを示す。５２８  Ｍａｂを用いたＥＧＦＲのリガンド特異的隔絶は、界面活性剤を使用することなく、そのネイティブな立体配置でのＥＧＦＲレセプター、ならびにその相互作用するアダプタータンパク質の特異的単離をもたらす。
【００６８】
（実施例３：抗ＰＳＣＡ抗体およびＷＧＡレクチンを用いたＰＳＣＡの隔絶）
前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら，ＰＮＡＳ（１９９８）９５：１７３５−１７４０；Ｗｕら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００）１９：１２８８−１２９６）は、１Ｇ８  Ｍａｂと免疫反応性である（Ｒｅｉｔｅｒら，ＰＮＡＳ（１９９８）９５：１７３５−１７４０）。１Ｇ８  Ｍａｂは、約１×１０−９Ｍの親和性でＰＳＣＡレセプターに結合し、一方、ＷＧＡは、ＰＳＣＡのＮ−アセチルグルコサミン部分、ならびに他の細胞表面分子（例えば、ＥＧＦＲ）上のこのような部分に特異的に結合する。この実験を、前立腺腫瘍細胞株ＰＣ３（これは、ＰＳＣＡレセプターを発現しない）またはＰＳＣＡをコードするｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＰＣ３（ＰＣ３−ＰＳＣＡ）（Ｗｕら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０００）１９：１２８８−１２９６）を用いて実施した。
【００６９】
図６は、未処理のＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞、ならびに抗体またはレクチンで処理したこれらの細胞のフローサイトメトリーを示す。ＰＳＣＡは、１Ｇ８  Ｍａｂを用いた染色によって、ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞の表面上に発現される（図６Ｅ）が、ＰＣ３細胞の表面上には発現されない（図６Ｂ）ことが示される。可溶性ＰＳＣＡに対するＷＧＡの結合は、ＥＬＩＳＡによって実証され（データは示さず）、そしてＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞の両方に対する結合は、フローサイトメトリーによって実証された（図６Ｃおよび図６Ｆ）。
【００７０】
隔絶を、ＰＣ３細胞、ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞またはコントロールＰＳＣＡ陰性Ａ４３１細胞について、実施例１に記載されるように、１Ｇ８  ＭａｂコーティングビーズまたはＷＧＡコーティングビーズのいずれかを用いて実施した。この隔絶産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに泳動し、そして膜をマウス抗ＰＳＣＡ抗体３Ｃ５（ＩｇＧ２ａκ；Ｗｕら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０００，１９：１２８８−９６）で染色し、続いてＨＲＰ結合体化抗マウスＩｇＧ２ａ抗体で染色し、次いでＥＣＬ化学発光キットを用いて発光させた。図７Ａにおいて示したように、高度にグリコシル化されたＰＳＣＡタンパク質は、ＰＣ３−ＰＳＣＡ溶解産物において検出されたタンパク質と同様に、１Ｇ８  ＭＡｂおよびＷＧＡの両方によってＰＣ３−ＰＳＣＡから隔絶された産物においてのみ検出され、親の細胞株ＰＣ３由来の産物においてもＡ４３１細胞由来の産物においても検出されなかった。
【００７１】
ウサギ抗ＥＧＦＲ抗体を用いたブロットの発光は、ＥＧＦＲの隔絶が、ＷＧＡレクチンを用いてのみ付随的に得られるが、抗ＰＳＣＡでコーティングしたビーズによっては得られないことを示した（図７Ｂ）。ＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞と比較して、Ａ４３１細胞から隔絶された、より高レベルのＥＧＦＲタンパク質は、ＰＣ３細胞と比較してより高い細胞表面レベルの、Ａ４３１細胞上ＥＧＦＲと一致する。１Ｇ８  抗ＰＳＣＡ  Ｍａｂを用いての、ＥＧＦＲではなくＰＳＣＡの隔絶は、Ｍａｂでコーティングしたビーズを用いた隔絶の特異性、およびＰＳＣＡに会合していないさらなる膜タンパク質の非特異的夾雑の欠如を実証する。
【００７２】
ＷＧＡでコーティングしたビーズを用いてＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞において実施された隔絶の結果を、図８Ａおよび図８Ｂに示す。隔絶産物のウェスタンブロットを、マウス抗ＰＳＣＡ  ３Ｃ５  Ｍａｂ（図８Ａ）またはウサギ抗Ｇｒｂ２抗体（図８Ｂ）のいずれかで染色した。ＰＳＣＡは、ＰＣ３−ＰＳＣＡの隔絶産物中で検出されたが、ＰＣ３の隔絶産物中では検出されなかった。抗Ｇｒｂ２抗体を用いたブロットの発光は、ＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞の両方の溶解産物において細胞質タンパク質Ｇｒｂ２を検出したが、ＷＧＡでコーティングしたビーズから隔絶された産物においては、検出されなかった。これは、ＥＧＦＲとは異なり、Ｇｒｂ２が、ＧＰＩ様タンパク質（Ｒｅｉｔｅｒら，ＰＮＡＳ（１９９８）９５：１７３５−４０）であるＰＳＣＡとは会合しないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、Ａ４３１細胞の表面でのＥＧＦＲを検出するためのフローサイトメトリーの結果を示す。Ａ４３１細胞を、コントロールマウスＩｇＧ抗体または５２８抗ＥＧＦＲマウスＩｇＧ２ａκ抗体のいずれか１μｇを用いて、４℃にて３０分間染色した。次いで、細胞を、ＰＢＳ＋１％ウシ胎仔血清中で洗浄し、ＦＩＴＣ結合体化二次抗マウス抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。結果は、Ａ４３１細胞の細胞表面上でのＥＧＦＲの強い発現を示す。
【図２】図２は、抗ＥＧＦＲ  ＭａｂおよびＷＧＡレクチンによって隔絶されたＥＧＦＲのウェスタンブロットを示す。１７０ｋＤａのＥＧＦＲタンパク質は、抗ＥＧＦＲコーティングビーズおよびＷＧＡコーティングビーズを用いて、Ａ４３１細胞由来の隔絶された産物中で容易に検出された。
【図３】図３は、抗ホスホチロシンによって検出された、隔絶された活性化ＥＧＦＲおよびその会合するリンタンパク質のウェスタンブロットを示す。１７０ｋＤａにおけるバンドは、活性化ＥＧＦＲに対応する。（５０ｋＤａにおけるバンドは、このビーズから遊離されたマウス５２８抗体のマウス重鎖（ｍＩｇＨ）との二次抗体の交叉反応性に対応する。）残りのバンドは、会合したタンパク質を表す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、隔絶されたＥＧＦＲに会合したタンパク質（すなわち、Ｖａｖ２およびＧｒｂ２）のウェスタンブロットを示す。これは、５２８  Ｍａｂ隔絶物質中のＥＧＦＲに会合したＶａｖ−２およびＧｒｂ２の両方を示す。（分子量５０ｋＤａにて検出されたバンドは、このビーズから遊離された５２８抗体のマウス重鎖（ｍＩｇＨ）との二次抗体の交叉反応性に対応する。）
【図５】図５は、抗ＥＧＦＲ  ５２８  Ｍａｂによって隔絶された、ＥＧＦＲに会合したＳｈｃタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｆは、ＰＳＣＡ発現系でトランスフェクトしたＰＣ３細胞の表面に対する抗ＰＳＣＡ  １Ｇ８  ＭａｂおよびＷＧＡの結合を示すフローサイトメトリー図である。この細胞を、コントロール抗体、または１μｇの１Ｇ８抗ＰＳＣＡマウスＩｇＧ１抗体、続いてＦＩＴＣ結合体化二次抗マウス抗体、またはＦＩＴＣ結合体化ＷＧＡレクチンのいずれかを用いて、４℃にて３０分間染色した。次いで、この細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。１Ｇ８  Ｍａｂは、ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞のみに結合する；ＷＧＡレクチンは、ＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞の両方に結合する。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、リガンドとしての抗ＰＳＣＡ  １Ｇ８  Ｍａｂによる、ＥＧＦＲではなく、ＰＳＣＡの、特異的隔絶を示すウェスタンブロットである。ＷＧＡは、ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞からのＰＳＣＡおよびＥＧＦＲの両方の隔絶、ＰＣ３細胞、ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞およびＡ４３１細胞からのＥＧＦＲの隔絶を媒介したが、１Ｇ８抗ＰＳＣＡ  Ｍａｂを用いた隔絶は、ＰＣ３−ＰＳＣＡからＰＳＣＡ（ＥＧＦＲではなく）のみを隔絶した。（分子量５０ｋＤａおよび２５ｋＤａにて検出されたバンドは、このビーズから遊離された１Ｇ８抗体のマウス重鎖（ｍＩｇＨ）および軽鎖（ｍＩｇＬ）との二次抗体の交叉反応性に対応する。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ＷＧＡレクチンを用いてのＰＳＣＡの隔絶を示す、ウェスタンブロットである。この結果は、ＰＣ３−ＰＳＣＡ細胞上のＰＳＣＡのＷＧＡ媒介隔絶を示すが、この隔絶物は、細胞内Ｇｒｂ２タンパク質を含まない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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