(57)【要約】グラム陰性細菌の病原性遺伝子を同定し、それによってこれらの病原性遺伝子およびその産物を標的とする新規な抗菌剤を同定することが可能となる。また、ワクチンに有用な新規なグラム陰性細菌突然変異体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、３、７、９、２１、２５、２７、２９、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０４、１０８、１１２、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、および１３０のいずれか１に記載のヌクレオチド配列またはその種ホモログによって表される遺伝子に突然変異を含み、ここに該突然変異が突然変異遺伝子によってコードされる遺伝子産物の活性の低下を生じるグラム陰性細菌。
【請求項２】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現の低下を生じる請求項１に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる不活性遺伝子産物の発現を生じる請求項１記載のグラム陰性細菌。
【請求項４】
該突然変異が該遺伝子の全部または一部分の欠失を生じる請求項１記載のグラム陰性細菌。
【請求項５】
配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、および１７４のいずれか１に記載のヌクレオチド配列またはその種ホモログによって表される遺伝子に突然変異を含み、ここに該突然変異が突然変異遺伝子によってコードされる遺伝子産物の活性の低下を生じる弱毒化パスツレラ科細菌。
【請求項６】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現の低下を生じる請求項５記載のパスツレラ科細菌。
【請求項７】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる不活性遺伝子産物の発現を生じる請求項５記載のパスツレラ科細菌。
【請求項８】
該突然変異が、該遺伝子の全部または一部分の欠失を生じる請求項５記載のパスツレラ科細菌。
【請求項９】
パスツレラ（マンハイミア）ヘモリティカ（Pasteurella (Mannheimia) haemolytica）、パスツレラ・マルトシーダ（Pasteurella multocida）、アクチノバチルス・プレウロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）およびヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）よりなる群から選択される請求項５記載のパスツレラ科細菌。
【請求項１０】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現の低下を生じる請求項９記載のパスツレラ科細菌。
【請求項１１】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる不活性遺伝子産物の発現を生じる請求項９記載のパスツレラ科細菌。
【請求項１２】
該突然変異が、該遺伝子の全部または一部分の欠失を生じる請求項９記載のパスツレラ科細菌。
【請求項１３】
P. multocida細菌である請求項９記載の弱毒化パスツレラ科細菌。
【請求項１４】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現の低下を生じる請求項１３記載のパスツレラ科細菌。
【請求項１５】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる不活性遺伝子産物の発現を生じる請求項１３記載のパスツレラ科細菌。
【請求項１６】
該突然変異が、該遺伝子の全部または一部分の欠失を生じる請求項１３記載のパスツレラ科細菌。
【請求項１７】
A. pleuropneumoniae細菌である請求項９記載の弱毒化パスツレラ科細菌。
【請求項１８】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現の低下を生じる請求項１７記載のパスツレラ科細菌。
【請求項１９】
該突然変異が、突然変異遺伝子によってコードされる不活性遺伝子産物の発現を生じる請求項１７記載のパスツレラ科細菌。
【請求項２０】
該突然変異が、該遺伝子の全部または一部分の欠失を生じる請求項１７記載のパスツレラ科細菌。
【請求項２１】
請求項１ないし２０いずれか１項記載の細菌を含む免疫原性組成物。
【請求項２２】
請求項２１記載の免疫原性組成物および医薬上許容し得る担体を含むワクチン組成物。
【請求項２３】
さらに、アジュバントを含む請求項２２記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、および１７４のいずれか１に記載のヌクレオチド配列またはその種ホモログによって表される遺伝子に突然変異を導入する工程を含み、ここに該突然変異が突然変異遺伝子によってコードされる遺伝子産物の活性の低下を生じることを特徴とするグラム陰性細菌突然変異体を作成する方法。
【請求項２５】
配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、および１７４のいずれか１に記載のヌクレオチド配列またはその種ホモログによって表される遺伝子に突然変異を導入する工程を含み、ここに該突然変異が突然変異遺伝子によってコードされる遺伝子産物の活性の低下を生じることを特徴とする弱毒化パスツレラ科細菌を作成する方法。
【請求項２６】
配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、および１７４に記載のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離および精製されたパスツレラ科細菌のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号：１、３、７、９、２１、２５、２７、２９、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０４、１０８、１１２、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、および１３０に記載のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離および精製されたパスツレラ科細菌のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ａ）請求項２７記載のポリヌクレオチド、
ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
ｃ）中程度のストリンジェンシーの条件下で（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド
よりなる群から選択されるパスツレラ科細菌の病原性遺伝子の産物またはその種ホモログをコードする単離および精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３４、３８、４０、４２、５２、５４、５６、５９、６１、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、および１７５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする精製および単離されたパスツレラ科細菌のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
ＤＮＡである請求項２９記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項３０記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項３２】
ＤＮＡが発現制御ＤＮＡ配列に制御可能に連結された発現ベクターである請求項３１記載のベクター。
【請求項３３】
宿主細胞におけるコードされたポリペプチドの発現を許容するように請求項３０記載のＤＮＡで安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３４】
栄養培地中で請求項３３記載の宿主細胞を培養し、ついで該宿主細胞または該栄養培地からコードされたポリペプチドを単離することを含む組換えポリペプチドを作製する方法。
【請求項３５】
請求項３４記載の方法によって作製した精製されたポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３４、３８、４０、４２、５２、５４、５６、５９、６１、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、および１７５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドを含む精製されたポリペプチド。
【請求項３７】
請求項３６記載のポリペプチドと特異的に反応性である抗体。
【請求項３８】
モノクローナル抗体である請求項３７記載の抗体。
【請求項３９】
請求項１、５、９または１３記載の細菌の抽出物と請求項３８記載のモノクローナル抗体とを接触させ、ついで該モノクローナル抗体の結合の不存在を検出する工程を含む該細菌を同定するための該抗体の使用方法。
【請求項４０】
配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３４、３８、４０、４２、５２、５４、５６、５９、６１、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、および１７５のいずれか１に記載のアミノ酸配列によって表される遺伝子産物の発現または活性に干渉する能力について潜在的な剤をアッセイし、ついで該遺伝子産物の発現または活性に干渉する剤を同定する工程を含む抗菌剤を同定する方法。
【請求項４１】
ａ）配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３４、３８、４０、４２、５２、５４、５６、５９、６１、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、および１７５に記載の遺伝子産物の発現または活性を測定し；
ｂ)（ａ）の遺伝子産物と試験化合物とを接触させ；
ｃ）試験化合物の存在下における遺伝子産物の発現または活性を測定し；ついで
ｄ）試験化合物の不存在下の発現または活性と比較して試験化合物の存在下では遺伝子産物の発現または活性が低下する場合に、試験化合物を抗菌剤として同定する
工程を含む抗菌剤を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、1999年9月10日に出願された米国仮特許出願番号60/153,453号および1999年4月9日に出願された米国仮特許出願60/128,689号の優先権を主張して2000年4月6日に出願された米国特許出願番号09/545,199号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は、一般的に、パスツレラ科細菌の病原性に寄与している遺伝子の同定に関し、それによって、ワクチンに有用な新規な弱毒化突然変異株の生成ならびに病原性遺伝子およびその産物を標的とする新しい抗菌剤の同定が可能となる。
【背景技術】
【０００３】
パスツレラ科細菌には、広範な種々の動物に感染する幾つかの非常に重要な病原菌が包含される。パスツレラ・マルトシーダ（P. multocida）に加えて、その科の重要なメンバーには、パスツレラ（マンハイミア）・ヘモリチカ（Pasteurella (Mannheimia) haemolytica）、アクチノバチルス・プレウロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）およびヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）が含まれる。P. multocidaは、グラム陰性の非運動性の球桿菌であり、それは多くの野生動物および家畜動物の正常細菌叢で見出され、世界中の多数の動物種において疾患を引き起こすことが知られている ［M. Kilian, W. FredericksonおよびE. L. Biberstein（編）, Haemophilus, Pasteurella, and Actinobacillus. Academic Press, LondonにおけるBiberstein, 61-73（1981）］。感染に続く疾患の発現には、敗血症、気管支肺炎、鼻炎および創傷感染症が含まれる［C. L. GylesおよびC. O. Thoen（編）, Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals. Iowa State University Press, AmesにおけるShewenら,216-225（1993）（出典明示して本明細書の一部とみなす）に概説されている］。
【０００４】
P. multocidaによる感染は、一般的には、ストレスの期間の侵入に起因するが、エアロゾルまたは接触曝露による伝播も生じ得、あるいはノミおよびマダニ媒介体によっても生じ得る。家禽においては、P. multocida感染症は、急性ないし過急性の敗血症を生じ、特に、混雑する、産卵、換羽、または厳しい気候変動に関連したストレス条件下の国内産七面鳥および野生の水鳥において特に流行する。ウシにおいては、感染につづいて同様の出血性敗血症が発現し、高熱および鬱病を含む症状を発現し、一般的には、続いて短期に死亡する。伝播はエアロゾル接触を最も起るようであるが、感染症は顕著な気候変動の期間にも発生し得る。ウサギにおいては、感染症は、再発性化膿性鼻炎に続いて、一般的には、結膜炎、中耳炎、副鼻腔炎、皮下膿瘍および慢性気管支肺炎を生じる。重篤な感染症においては、急性の線維素性気管支肺炎、敗血症または内毒素血症によってウサギの死亡率が上昇する。疾患状態は通常ストレスの期間に発生する。ブタにおいては、普通のP. multocida疾患状態には、萎縮性鼻炎および細菌性肺炎が含まれる。また、同様の肺炎の症状は、イヌ、ネコ、ヤギおよびヒツジにおいても検出される。P. multocidaは多くの動物の口腔細菌叢において一般的に検出され、したがって、噛み傷および掻き傷における一般的な汚染菌である。
【０００５】
P. multocida株は、莢膜血清群および菌体血清型によって通常指定される。５の莢膜血清群（Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ）および１６の菌体血清型が、特徴的な高温安定性の抗原の発現によって区別されている。大部分の菌株は宿主特異的であって、１または２を超える動物には滅多に感染しない。伝統的な死滅全細胞細菌は通常、血清型特異的な保護しか提供しないので、異なる血清型が存在することは免疫接種に対する問題を示す。しかしながら、１の血清型での自然感染が複数の血清型に対する免疫学的保護に通じ得ること［C. L. GylesおよびC. O. Thoen（編）, Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals. Iowa State University Press, AmesにおけるShewenら, 216-225（1993）］、交差保護がイン・ビボ（in vivo）で増殖させた不活化細菌を用いることによっても刺激し得る［Rimlerら, Am J Vet Res. 42: 2117-2121（1981）］が実証されている。１の生きている自然発生突然変異P. multocida株はワクチンとして利用されており、強力な免疫応答を刺激することが示されている［Davis，Poultry Digest. 20：430-434（1987）、Schlinkら, Avian Dis. 31（1）:13-21（1987）］。しかしながら、この弱毒化株は、ワクチン受容者がストレスに曝された場合に、病原性状態に戻るまたは死亡を引き起こすことが示されている［Davis，Poultry Digest. 20: 430-434 (1987)、Schlinkら, Avian Dis. 31（1）: 13-21（1987）］。
【０００６】
パスツレラ科のもう１のメンバーであるA. pleuropneumoniaeは、ブタに対して厳密な宿主特異性を示し、高度に伝染性のブタの胸膜肺炎の原因因子である。感染は、通常、集中的な育種状態で発生し、直接様式の伝播によって起ると考えられる。疾患が致死命的で、その結果、ブタ生産産業において重大な経済的損害に通じる場合もある。A. pleuropneumoniae感染症は、慢性また急性であり得、感染症は線維素性胸膜炎を伴う出血性の壊死性気管支肺炎によって特徴付けられる。現在までのところ、細菌の病原性は、血清型特異的な莢膜多糖、リポ多糖を含めた構造タンパク質、および表面タンパク質、ならびに細胞外細胞溶解性毒素に起因している。これらの病原性因子が精製され、幾つかの例においてはクローニングされているにもかかわらず、A. pleuropiieunioniae感染症におけるこれらの病原性因子の正確な役割についてほとんど理解されていない。
【０００７】
１２の血清型のA. pleuropneumoniaeが莢膜多糖における抗原性の差異および細胞外毒素の産生に基づいて同定されている。血清型１、２、５、７および９はヨーロッパにおいて優勢であるが、血清型１、５および７は、米国におけるA. pleuropneumoniae感染症に最も関連している。溶血素ファミリーのメンバーであり、ＲＴＸ毒素と呼ばれるA. pleuropneumoniaeの少なくとも３の重要な細胞外毒素が存在する。ＲＴＸ毒素は、イー・コリ（E. coli）、プロテウス・ブルガリリサ（Proteus vulgarisa）およびパスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）を含む多くのグラム陰性菌によって産生され、該タンパク質は一般的には構造的および機能的な特徴を共有している。しかしながら、様々な血清型からの毒素は、宿主特異性、標的細胞および生物活性においては異なる。
【０００８】
主要なA. pleuropneumoniaeのＲＴＸ毒素には、ApxI、ApxIIおよびApxIIIが含まれる。ApxIおよびApxIIは溶血活性を有しているが、ApxIの方がより強力である。ApxIIIは溶血活性を示さないが、肺胞マクロファージおよび好中球に対して細胞毒性である。大部分のA. pleuropneumoniae血清型は、これらの３の毒素のうち２を産生する。例えば、血清型１、５、９および１１はApxIおよびApxIIを発現し、血清型２、３、４、６および８はApxIIおよびApxIIIを発現する。しかしながら、血清型１０はApxIしか産生せず、血清型７および１２はApxIIしか発現しない。ApxIおよびApxIIを共に産生するそれらのA. pleuropneumoniae血清型は、最も病原性の細菌株である。
【０００９】
Apx毒素は、ランダムに突然変異した野生型細菌を用いて、げっ歯類モデルおよびブタ感染における病原性因子であることが実証されている［Tasconら，Mol. Microbiol. 14: 207-216（1994）］。また、他のA. pleuropneumoniae突然変異体も、AopA外膜病原性タンパク質をコードする遺伝子を不活化するために標的化突然変異を用いて生成されている［MulksおよびBuysee, Gene 165: 61-66 (1995)］。
【００１０】
新生児、離乳後の、生長しているおよび成体の子ヒツジ、子ウシおよびヤギにおける急性肺炎の重篤な大発生に寄与するパスツレラ種であるMannheimia[Pasteurella] haemolytica内では少なくとも１１の血清型（１、２５−９、１２−１４および１６）が実証されている[Ackermannら, Microbes Infect 2 (9): 1079-88 (2000)]。輸送、ウイルス感染、過密状態、および他のストレスを発生し得る状態は、動物をM. haemolytica感染症に罹りやすくする[Ackermannら, 前掲]。The leukotoxin (Lkt) of M. haemolyticaのロイコトキシン（Lkt）は病原性において重要な役割を果たし、ウシ輸送熱の肺病理の特徴に通じる細胞溶解およびアポトーシスならびにウシ肺炎パスツレラ病における肺傷害を引起こすと考えられている[Highlanderら, Infect Immun 68 (7): 3916-22 (2000)] as well as lung injury in bovine pneumonic pasteurellosis [Jeyaseelan, et al., Microb Pathog 30 (2): 59-69 (2001)]。Ｌｋｔは反芻動物の白血球および血小板にのみ細胞溶解を誘導するユニークな特性を有する孔形成外毒素である [Jeyaseelanら, (2001)、前掲]。多くの細胞型の細胞溶解は、アラキドン酸（ＡＡ）によって仲介され、ホスホリパーゼによるその生成はＧ-タンパク質共役型受容体によって調節されている[Jeyaseelanら, (2001)、前掲]。細菌の研究ではM. haemolyticaのＬｋｔが全ベータ２インテグリンの共通のサブユニットであるウシＣＤ１８に結合することが示されている[Jeyaseelanら, Infect Immun 68(1): 72-9 (2000)]。また、ＬＦＡ−１がＬｋｔ受容体であり、ＬＦＡ−１に対するＬｋｔ結合は標的細胞特異的ではなく、ウシＬＦＡ−１に対するＬｋｔ結合がカルシウム上昇および細胞溶解と相関し、ウシＬＦＡ−１発現がＬｋｔ−１によって誘導された標的細胞の細胞溶解の程度と相関することも示されている[Jeyaseelanら, Infect Immun 68 (1): 72-9 (2000)]。
【００１１】
ワクチン組成物を生産する試行において、伝統的な死滅全細菌では血清型特異的な保護しか提供されない［MacInnesおよびSmart、前掲］、しかしながら、強い病原性の血清型を有するものによる自然感染症が複数の血清型に対する強力な保護免疫を刺激し得ることが実証されている［Nielsen, Nord Vet Med. 31: 407-13 (1979)、Nielsen, Nord Vet Med. 36 :221-234（1984）、Nielsen, Can J Vet Res. 29: 580-582（1988）、Nielsen, ACTA Vet Scand. 15： 80-89（1994）］。ApxII毒素の不活性形態を産生する１の明確な生存−弱毒化ワクチン株がブタにおける交差保護を提供する見込みが示されており［Prideauxら, Infection & Immunity 67: 1962-1966（1999）］、一方、他の不明確な生存−弱毒化突然変異体も見込みが示されている［Inzanaら, Infect Immun., 61: 1682-6,（1993）、International Pig Veterinary SocietyにおけるPaltineanuら, 1992, 214、International Pig Veterinary SocietyにおけるUtreraら, 1992, 213］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
不明確で自然発生突然変異を有する細菌株を含むワクチン処方に関連する問題により、同種および異種のパスツレラ科の血清型に対して保護免疫を安全に刺激するワクチンに使用するための生存弱毒化細菌株の合理的構築について当該技術分野に要望が存在する。さらに、弱毒化細菌株および細菌の病原性に必要である遺伝子を同定する要望がさらに存在し、それによって抗菌剤を同定する方法の開発が促進される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一般的には、本発明は弱毒化グラム陰性菌を含むワクチン組成物の生成、ならいびにそれを使用するための材料および方法を提供する。１の態様において、本発明のワクチン組成物は、パスツレラ科細菌における弱毒化種を含み、それは、当該技術分野において知られ、出典明示して本明細書の一部とみなすDewhirstら, J. Bacteriol. 174： 2002-2013 （1992）に一部記載されている。該科における種には、限定されるものではないが、A. actinomycetemcomitans、A. capsulatus、A. equuli、A. lignieresii、A. pleuropneumoniae（H. pleuropneumoniae）、A. seminis、A. suis（H. suis）、A. ureae（p. ureae）、A. capsulatus、Bisgaard分類群１１、H. aegyptius、H. aphrophilus、H. aphrophilus（H. parainfluenzae）、H. ducreyi、H. haemoglobinophilus、H. haemolyticus、H. influenzae、H. paracuniculus、H. paragallinarum、H. parahaemolyticus、H. parainfluenzae、（H. paraphrophilus）、H. paraphrohaemolyticus、H. paraphrophilus、H. parasuis、H. parasuis タイプ５、H. segnis、H. somnus、Haemophilus マイナーグループ、Haemophilus分類群C、P. aerogenes、P. anatis、P. avium（H avium）、P. canis、P. dagmatis、P. gallinarum、P. haemolytica、P. trehalosi（P. haemolytica生物型T）、P. langaa、P. multocida、P. pneumotropica、P. stomatis、P. volantium（H. panainflueizzae）、P. volantium、Pasteurella 種A、Pasteurella 種BおよびHaemophilus paraphrohaemolyticusを含む。好ましくは、ワクチン組成物は、弱毒化Pasteurella haemolvtica、Actinobacillus pleuropneumonae、Haemophilus somnusまたは Pasteurella multocida菌を含む。最も好ましい具体例において、本発明のワクチン組成物は、弱毒化Pasteurella multocidaおよびA. plueropneumoniae菌株を含む。
【００１４】
本発明の１の態様は、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０および１７２のいずれか１によって表わされる遺伝子配列またはその種ホモログ中の機能性突然変異を含むグラム陰性菌を提供し、ここに、該突然変異は、コードされた遺伝子産物（すなわち、遺伝子によってコードされたポリペプチド）の発現および／または生物活性を阻害または廃止し；該機能性突然変異は菌株の病原性の弱毒化を生じる。遺伝子産物の発現および／または生物活性を変調させる（すなわち、増大または低下させる）機能性突然変異には、遺伝子自体の蛋白質コード領域中または、遺伝子発現の制御に寄与もしくは関与する配列中の挿入または欠失が含まれる。欠失突然変異には、特定の遺伝子配列の全部または一部分が欠失したものが含まれる。また、所望により好適なアジュバントおよび／または医薬上許容し得る希釈剤もしくは担体を含んでいてもよい、突然変異し弱毒化されたグラム陰性細菌を含む組成物、好ましくはワクチン組成物も意図する。修飾株をワクチン処方中で有効とするためには、病原菌が重篤な臨床的病徴を発生するのを防ぐのに十分に弱毒化が顕著でなければならないが、宿主における細菌の制限された複製および増殖を許容するよう十分に顕著でないことが必要である。
【００１５】
また、本発明は、グラム陰性菌の病原性に必要であるとなる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドには、相補的ＤＮＡ、相補的もしくはアンチセンスＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ、および全合成もしくは部分合成ＤＮＡのごときＤＮＡ；センスおよびアンチセンス鎖を含むＲＮＡ；および例えば、Corey, TIBTECH 15:224-229（1997）に記載のごときペプチド核酸が含まれる。本発明の病原性遺伝子ポリヌクレオチドには、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載のもの、またはその種ホモログ、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４のポリヌクレオチド、またはその種ホモログによってコードされる病原性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド、および中程度ないし高度にストリンジェントな条件下にて、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載されたポリヌクレオチド、またはその種ホモログのいずれか１の非コード鎖（または相補体）にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。したがって、本発明は、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、���４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載されたパスツレラ科からの遺伝子配列、ならびに自然発生する（すなわち、種ホモログ）およびその人工的に誘導された変異型を含む他のグラム陰性菌からの関連する遺伝子配列を包含する。また、本発明は、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載されたポリヌクレオチドおよびその種ホモログのいずれか１から推定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。本発明のポリヌクレオチドの配列の知識により、そのポリヌクレオチドの全ての可能な断片の入手が容易となる。したがって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの断片を提供する。
【００１６】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現構築体をもさらに包含する。また、本発明のポリヌクレオチドで形質変換した、トランスフェクトした、または電気穿孔した宿主細胞も包含する。本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを生成するための方法を提供し、それは、該ポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現を許容し、好ましくは促進する条件下にて本発明の宿主細胞を増殖させ、ついで該宿主細胞またはその増殖培地から遺伝子産物を単離する工程を含む。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドの同定により、コード化されたポリペプチドが入手可能となる。本発明のポリペプチドには、同類アミノ酸置換が野生型ポリペプチドに導入されたものを含む、完全長または断片、または切形タンパク質；その変異型；融合またはキメラタンパク質；およびアナログが含まれる。また、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体も提供し、それにはモノクローナルおよびポリクローナル抗体、単一鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および相補性決定領域（ＣＤＲ）−移植抗体、ならびに本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物が含まれる。また、本発明は、本発明の抗体に免疫特異的な抗イディオタイプ抗体も提供する。
【００１８】
本発明のもう１の態様によれば、グラム陰性菌の病原性遺伝子または遺伝子産物の機能を変調する、新規な抗菌剤を同定するための方法を提供する。本発明の方法には、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４のいずれか１に記載されたＤＮＡ配列またはその種ホモログによってコード化される病原性遺伝子産物の発現を干渉する能力についての潜在的剤をスクリーニングし、または全体的または部分的に配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４のいずれか１に記載されたＤＮＡ配列、その種ホモログまたはその相補鎖によってコードされる細菌遺伝子産物の生物機能に干渉する能力につき潜在的剤をスクリーニングし、続いてかかるスクリーニングアッセイにおいてポジティブな結果を供する剤を同定することが含まれる。特に、病原性遺伝子産物の発現に干渉する剤には、病原性遺伝子配列に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイムが含まれる。本発明は、さらに、オリゴヌクレオチド指令の三重らせん形成の使用を介する本発明の遺伝子産物の転写を変調する方法も包含する。
【００１９】
病原性遺伝子産物の機能に干渉する剤には、病原性遺伝子産物の変異型、病原性遺伝子産物の結合パートナーおよびかかる結合パートナーの変異型および（該産物が酵素である場合には）酵素阻害物質を含む。
【００２０】
本明細書に記載した方法によって同定された新規な抗菌剤、ならびに細菌の存在を減少させるのに有効な量のかかる新規な抗菌剤の投与を含むグラム陰性菌による感染症に苦しむ対象を治療する方法が提供される。
【００２１】
本発明の多数のさらなる態様および利点は、現在準備されたその具体例を記載する以下の発明の詳細な説明を考慮すれば、当業者に明らかとなるであろう。
【００２２】
本明細書で用いる「病原性遺伝子」は、機能または産物が宿主動物における細菌感染症の首尾よい確立および／または維持に必要である遺伝子である。したがって、病原性遺伝子および／またはそれによってコードされるタンパク質は、宿主生物における病理に関係するが、増殖には必要ではないかもしれない。
【００２３】
本明細書で用いる「シグニチャータグド（signature-tagged）突然変異（ＳＴＭ）」は、一般的には、国際公開ＷＯ９６／１７９５１（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載された方法であり、例えば、菌血症のげっ歯類モデルにおける病原性に必要な細菌遺伝子を同定する方法を含む。この方法においては、各々がゲノム中にランダムな突然変異を有する菌株をトランスポゾン組込みを用いて作成し；各挿入突然変異は、突然変異体を互いに区別することを可能とする異なるＤＮＡシグニチャータグ（signature-tag）を運搬する。該タグは、２０塩基対の不変の「アーム」によって隣接してはさまれた４０塩基対の可変中央領域を含み、それは、中央部分がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって共増幅されることを可能とする。タグを付した突然変異株はマイクロタイター皿中で組立て、ついで感染試験のための「接種物プール」を形成するために合する。接種後の適当な時点にて、細菌は動物から単離され、プールして「回収プール」を形成する。回収プール中のタグおよび接種プール中のタグは、別々に増幅し、標識し、ついでそれを用いて、接種源中の突然変異体を示す異なるタグの全てで整列したフィルターを調べる。弱毒化病原性を持つ突然変異株は、感染した動物から回収できないものであり、すなわち、回収プールからのタグで調べた場合にはハイブリダイゼーションシグナルを示さないが、接種プールからのタグで調べた場合にはハイブリダイゼーションシグナルを与えるタグを持つ株である。この方法の変形において、化学ルミネセンスのごとき非放射性の検出法を用いることができる。
【００２４】
シグニチャータグド突然変異は、多数の挿入突然変異株を、病原性の欠失につき単一の動物において同時にスクリーニングすることを可能とする。突然変異体P. multocida株の１９のプールのスクリーニングにより、病原性が低下した６０を超える株を同定し、その多数は、個々の突然変異体についておよそのＬＤ５０のその後の決定によって病原性が弱毒化されることが確認された。A. pleuropnetmoniae突然変異体のスクリーニングにより、３５の異なる遺伝子中に突然変異を有する１００を超える株を同定した。これらのうち、２２の遺伝子中の突然変異は顕著に弱毒化されたA. pleuropneumoniae株を生じた。トランスポゾン挿入によって破壊されたオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列は、両鎖を配列決定し、コードされるアミノ酸配列を推定することによって決定した。ポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列の双方の新規性は、ＤＮＡおよびタンパク質のデータ・ベース配列と該配列との比較によって決定した。これらの種における病原性遺伝子の知識は、P. (Mannheimia) haemolytica中の種ホモログの同定を可能とした。
【００２５】
細菌および、より詳細には、P. multocida、A. pleuropneumoniaeおよびP. (Mannheimia) haemolytica病原性遺伝子の同定は、ワクチンに有用である低下した病原性を示す微生物（すなわち、弱毒化株）のために提供された。かかる微生物には、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４のいずれか１によって表わされる遺伝子を不活化する少なくとも１の機能性突然変異を含むPasteurellaceae突然変異体を含む。当業者ならば、「機能性突然変異」が、本発明の遺伝子のタンパク質コード領域、ならびに病原性遺伝子のＲＮＡの転写を調節する調節領域において生じ得ることを認識するであろう。
【００２６】
また、当業者ならば、本発明の弱毒化P. multocida、A. pleuropneumoniaeおよびP. (Mannheimia) haemolytica株が１を超える機能性突然変異を有するものを含むことを認識するであろう。１を超える突然変異は付加的または相乗的な程度の弱毒化を生じ得る。設計によって複数の突然変異を調製できるか、または元来単一の突然変異を導入することを意図した欠失事象から偶然に発生し得る。複数の欠失を持つ弱毒化株の例は、cyaおよびcrpの遺伝子が機能的に欠失したSalmonella typhimurium株である。この突然変異体S.typhimurium株は、生ワクチンとしての見込みを示している。
【００２７】
P. multocida、A. pleuropneumoniaeおよびP. (Mannheimia) haemolyticaにおける病原性遺伝子の同定は、他の病原性種における同様の遺伝子に関する情報を提供できる。例えば、aroA遺伝子の同定は、Aeromonas hydrophila、Aeromonas salmonicida、Salmonella typhimurium、Salmonella enteritdis、Salmonella dublin、Salmonella gallanerum、Bordella pertussis、Yersinia entericolitica、Neisseria gonorrhoeaeおよびBacillus anthracisを含む種々の多数の病原体に保存された遺伝子の同定に導く。これらの種の多くにおいて、aroA遺伝子中に突然変異を持つ弱毒化菌株が、ワクチン処方に有効であることが判明した。P. multocida中で同定された病原性遺伝子配列を用いれば、同様または同族の遺伝子を他の生物、特に、Pasteurella科ならびにA. pleuropneumoniae、P. (Mannheimia) haemolyticaおよびHaemophilus somnusにおいて同定できる。同様に、A. pleuropneumoniae病原性遺伝子の同定は、他の生物中の関連する遺伝子の同定を可能とする。プローブとしてP. multocida、A. pleuropneumoniaeおよびP. (Mannheimia) haemolytica遺伝子を用いるサザーンハイブリダイゼーションは、他の生物に由来する染色体ライブラリー中のこれらの関連する遺伝子を同定できる。別法として、ＰＣＲは、種の境界を超えて遺伝子同定に等しく有効となり得る。また、さらにもう１の別法として、例えば、他の種からの染色体ライブラリーを有するP. multocida突然変異体の相補性を用いて、同一または関連する病原活性を有する遺伝子を同定できる。したがって、関連する病原性遺伝子の同定は、なおもう１のワクチン処方として有用となり得る他の生物の弱毒化株の作成に導くことができる。他の種（例えば、P. (Mannheimia) haemolytica、A. pleuropneumoniaeおよびH.somnus）に存在することが実証されたP. multocida遺伝子の例には、遺伝子exbB、atpG、pnp、guaBおよびyjpFが含まれる。
【００２８】
ＳＴＭを用いて同定された弱毒化 P. multocida株は、病原性遺伝子がオープン・リーディング・フレームまたは調節ＤＮＡ配列のいずれかの中におけるトランスポゾン配列の挿入によって機能性でなくなった挿入突然変異体である。
これらの挿入突然変異体には、いまだ細菌病原性に必要な遺伝子情報のすべてが含まれており、挿入されたトランスポゾンの欠失によって病原性状態におそらく復帰し得る。したがって、ワクチン処方を調製することにおいては、弱毒化株から拾い集めた情報を収集し、幾分かの、大部分のまたは全ての病原性遺伝子配列が除去された欠失突然変異株を作成し、それによって細菌が病原性状態に復帰する可能性を排除することが望ましい。
【００２９】
ＳＴＭを用いて同定した弱毒化挿入突然変異体のワクチン特性は同一遺伝子中に欠失を有する細菌のものと同一または類似していることが予想される。しかしながら、挿入突然変異が隣接する遺伝子配列に対して“極性”効果を発揮する場合があり、その結果、挿入突然変異体が同一の遺伝子配列中に欠失を有する突然変異株とはことなる特徴を有する場合もある。欠失突然変異体は、当該技術分野でよく知られており、かつ日常的に実施されている多くの技術のいずれかを用いて作製し得る。
【００３０】
１の例において、対選択可能な（counterselectable）マーカーを用いる戦略が使用でき、それは多くの細菌中の遺伝子を欠失するために一般的に利用されている。概説については、例えば、Reyratら, Infection and Immunity 66：4011-4017（1998）（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）を参照されたい。この技術において、二重の選択戦略がしばしば用いられ、ここでは、目的とする欠失の両側に由来するフランキングＤＮＡ配列を用いて、選択可能および対選択可能なマーカーの両方をコードするプラスミドを構築する。選択可能なマーカーを用いて、適当な場所および様式でプラスミドがゲノムに組込まれた細菌について選択する。対選択可能なマーカーは、組込まれたプラスミドを自然に失った非常に低いパーセントの細菌について選択するために用いる。その場合、これらの細菌の画分は、他の外来ＤＮＡが全く存在しない目的の欠失のみを含むであろう。この技術を用いる鍵は、好適な対選択可能なマーカーの入手性である。
【００３１】
もう１の技術において、ＤＮＡの部位特異的組換えにcre-lox系を用いる。該系は３４塩基対のlox配列からなり、これは細菌creリコンビナーゼ遺伝子によって認識される。lox部位が適当な向きでＤＮＡ中に存在しない場合には、lox部位によって挟まれたＤＮＡがcreリコンビナーゼによって切除され１の残存するLox配列のコピー以外の全ての配列の欠失を生じる。標準的な組換え技術を用いると、P. multocida、A. pleuropneumoniaeまたはP. (Mannheimi)haemolyticaのゲノム中の目的の標的化遺伝子を欠失し、それとlox部位によって挟まれた選択可能なマーカー（例えば、カナマイシン耐性をコードする遺伝子）とを入替えることが可能である。（P. multosida、A. pleuropneumonieaeまたはP. (Mannheimia) haemolytica中で機能するプロモーターの制御下でcre遺伝子を願する自殺プラスミドの電気穿刺による）creリコンビナーゼの一時的発現は、loxに挟まれたマーカーの有効な除去を生じるにちがいない。このプロセスは、目的の欠失突然変異およびlox配列の１のコピーを含む突然変異体を生じるであろう。選択可能および対選択可能なマーカーの双方をコードし、隣接してはさまれたＤＮＡ配列は、所望の欠失の両側から誘導される。選択可能なマーカーを用いて、該プラスミドが適当な位置および様式でゲノム中に組込まれた細菌を選択する。対選択可能なマーカーを用いて、統合されたプラスミドを自発的に消失される非常に低いパーセンテージの細菌について選択する。ついで、これらの細菌の画分は、他の外来性ＤＮＡが存在しない所望の欠失だけを含む。この技術の使用のための鍵は、適当な対選択可能なマーカーの有効性である。
【００３２】
もう１の技術において、cre-lox系をＤＮＡの部位特異的な組換えに用いる。この系は、細菌性cre組換え酵素遺伝子によって認識される３４塩基対のlox配列よりなる。該lox部位が、適当な配向でＤＮＡ中に存在するならば、lox部位によって隣接してはさまれたＤＮＡは、cre組換え酵素によって切り取られ、その結果、残りの１コピーのlox配列を除き全配列を欠失する。標準的組換え技術を用いて、P. multocidaまたはA. pleuropneumoniaeゲノム中の注目する標的とされた遺伝子を欠失し、それを該lox部位によって隣接してはさまれた選択可能な標識（例えば、カナマイシン耐性につきコードする遺伝子）と置換することが可能である。cre組換え酵素の（P. multocidaまたはA. pleuropneumoniaeにおいて機能するプロモーターの制御下、cre遺伝子を含む自殺プラスミドの電気穿孔による）一過性発現は、loxが隣接してはさむマーカーの効果的な消失を生じさせるであろう。このプロセスの結果、突然変異体は、所望の欠失突然変異および１コピーのlox配列を含むであろう。
【００３３】
もう１のアプローチにおいて、P. multocida、A. pleuropneumoniaeまたはP. (Mannheimia) haemolyticaのゲノム中の所望の欠失配列とグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのごときマーカー遺伝子とを直接的に置換することが可能である。この技術において、所望の欠失を隣接してはさむＤＮＡセグメントをＰＣＲによって調製し、P. multocida、A. pleuropneumoniaeまたはP. (Mannheimia) haemolytica用の自殺（複製しない）ベクターにクローニングする。P. multocida、A. pleuropneumoniaeまたはP. (Mannheimia) haemolytica中で活性なプロモーター、および適当なマーカー遺伝子を含有する発現カセットは、フランキング配列の間にクローニングする。該プラスミドは、野生型のP. multocida、A. pleuropneumoniaeまたはP. (Mannheimia) haemolyticaに導入する。マーカー遺伝子を取込み、それを発現する（たぶん非常に低頻度）細菌を、単離し、適当な組換え事象（すなわち、野生型遺伝子とマーカー遺伝子との置換）は、単離され、適当な組換え事象（すなわち、野生型遺伝子の標識遺伝子への置換）について調べる。
【００３４】
これらの生物の低下した病原性およびそれらの免疫原性は、対象動物への投与によって確認し得る。本発明の非発病性の微生物については単独で投与できるが、１またはそれを超えるかかる突然変異体微生物は、好適なアジュバントおよび医薬上許容される希釈剤または担体を含むワクチン組成物で好ましくは投与する。担体は本発明の非病原性微生物と適合し得、免疫化する対象に有害でないという意味において「許容される」ものでなければならない。典型的には、該担体は、無菌で発熱物質が存在しない水または塩類溶液であろう。免疫化すべき対象は、病原性形態のP. multocida、A. pleuropneumoniae、P. (Mannheimia) haemolyticaまたは他の病原微生物によって引き起こされる疾患から保護する必要がある対象である。
【００３５】
本発明のワクチンがヒト医学および獣医学の分野で有用であり得ることは、認識されるであろう。したがって、免疫化すべき対象には、ヒトまたは他の動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギおよび家禽（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウ）を含む農業動物、イヌおよびネコのような愛玩動物；新種の動物および／または動物園動物；ならびにマウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターを含む実験動物が含まれる。
【００３６】
また、本発明は、P. multocida、A. pleuropneumonicaeまたはP. (Mannheimia) haemolyticaの病原性に必要なポリペプチドおよび対応するポリヌクレオチドも提供する。本発明には、天然に存在するおよび天然に存在しないポリヌクレオチドおよびそのポリペプチド産物の双方が含まれる。天然に存在する病原性産物には、異なる遺伝子およびポリペプチド種、ならびにP. multocida、A. pleuropneumoniaeまたはP. (Mannheimia) haemolytica株以外の生物において発現される対応する種ホモログが含まれる。天然に存在しない病原性産物には、共有結合修飾を含むアナログおよび病原性産物のごとき天然に存在する産物の変異型が含まれる。好ましい具体例において、本発明は、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載された配列、およびその種ホモログを含む病原性ポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【００３７】
本発明は、細菌の病原性遺伝子産物をコードする新規な精製され、単離されたP. multocida、A. pleuropneumoniaeおよびP. (Mannheimia) haemolyticaのポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写物、センス鎖および相補的アンチセンス鎖の双方）を提供する。本発明のＤＮＡ配列には、ゲノミックおよびｃＤＮＡ配列ならびに全体または部分的に化学合成したＤＮＡ配列が含まれる。本発明のゲノミックＤＮＡには、本発明のポリペプチドについてのタンパク質コード領域が含まれ、同一種の他の菌株において見出され得る変異型が含まれる。本明細書中で用い、また、当該技術分野において理解されている「合成（された）」とは、酵素的とは反対の純粋に化学的なポリヌクレオチドを製造する方法をいう。したがって、「全（体）」合成したＤＮＡ配列は全体的に化学的手段によって作製され、「部分（的）」合成したＤＮＡは、得られたＤＮＡの一部分だけを化学的手段によって作製したものを含む。P. multocida病原性遺伝子産物をコードする好ましいＤＮＡは、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０ならびにその種ホモログに記載されている。病原性遺伝子産物をコードする好ましいA. pleuropneumoniaeのＤＮＡ配列は、配列番号：１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３および１６４ならびにその種ホモログに記載されている。好ましいP. (Mannheimia) haemolyticaの病原性遺伝子産物は、配列番号：１６６、１６８、１７０、１７２および１７４ならびにその種ホモログに記載されている。当業者であれば、本発明の好ましいＤＮＡが、二本鎖分子、例えば配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４およびその種ホモログに記載の配列を有する分子を、ＤＮＡについてのワトソン−クリック塩基対形成ルールに従う配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６���１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４の配列から推定し得る配列を有する相補的分子（「非コード鎖」または「相補体」）とともに含むことは容易に認識し得るであろう。また、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載されたポリヌクレオチドおよびその種ホモログのいずれか１によってコードされる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドが好ましい。さらに、本発明は、P. multocida、A. pleuropneumoniaeおよびP. (Mannheimia) haemolyticaのＤＮＡの種、好ましくは細菌ホモログを含む。
【００３８】
本発明によって提供されるポリヌクレオチド配列情報は、サザーンおよび／またはノーザンハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むよく知られた技術によって、関連する細菌の病原性分子をコードするポリヌクレオチドの同定および単離を可能とする。関連するポリヌクレオチドの例は、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載されたポリヌクレオチドおよびその種ホモログのいずれか１によってコードされる病原性遺伝子産物に相同的なポリペプチド、ならびに本発明の病原性遺伝子産物の１以上の生物学的および／または物理的特性を共有する構造的に関連するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００３９】
また、本発明には、中程度ないし高度のストリンジェント条件下で、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載されたポリヌクレオチドおよびその種ホモログのいずれか１の非コード鎖または相補体にハイブリダイズする細菌の遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列も包含される。遺伝暗号の縮重を除いてそれらにハイブリダイズする病原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列も本発明によって意図される。例示的な高度のストリンジェンシー条件には、６５℃ないし７５℃の０.２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳを含む緩衝液中の最終洗浄が含まれ、一方、例示的な中程度のストリンジェンシー条件には、３５℃ないし４５℃の２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳを含む緩衝液中の最終洗浄が含まれる。同等のストリンジェンシーの条件を、Ausubelら（編）, Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons（1994）, ６.０.３ないし６.４.１０頁に記載された温度および緩衝液または塩濃度を変化させることによって達成できることは当該技術分野において理解されている。ハイブリダイゼーション条件における修飾は、プローブの長さおよびグアノシン／シトシン（ＧＣ）の塩基対合のパーセンテージに基いて経験的に決定でき、または正確に計算できる。ハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら（編）, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York（1989）, ９.４７ないし９.５１頁に記載されているごとく算出し得る。
【００４０】
また、病原性遺伝子配列を取込むプラスミドおよびウイルスＤＮＡベクターのごとき自律複製性の組換え発現構築体も提供する。また、病原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが内因性または外因性の発現制御ＤＮＡ配列および転写ターミネーターに作動可能に連結された発現構築体も提供する。病原性遺伝子は、鋳型としてP. multocidaゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによってクローン化し得る。発現ベクターに遺伝子を簡単に挿入するために、ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ増幅した遺伝子が開始コドンＡＴＧに先行する５'末端に制限酵素部位を有し、かつ終止コドンＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡの下流の３'末端に制限酵素部位を有するようにＰＣＲプライマーを選択する。望ましい場合には、遺伝子中のコドンを、GrosjeanおよびFiers, Gene, 18: 199-209（1982）、ならびにKonigsbergおよびGodson, Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）, 80:687-691（1983）によって記載されたE. coliコドン優先度に従ってアミノ酸を変化することなく変化させる。E. coli中で産生された場合、コドン使用の最適化は、遺伝子産物の発現の増加に導き得る。遺伝子産物がE. coliまたは他の細菌のペリプラズム中または細胞培養基へのいずれかで細胞外に産生される場合には、遺伝子はその開始コドンなくしてクローン化し、シグナル配列の背後で発現ベクターに位置する。
【００４１】
本発明のもう１の態様によれば、本発明の病原性ポリペプチドを発現できる様式で本発明のポリヌクレオチド配列で安定してまたは一時的に形質変換した、トランスフェクトしたまたは電気穿孔した原核生物および真核細胞を含む宿主細胞を提供する。本発明の発現系には、細菌、酵母、真菌、ウイルス、無脊髄動物および哺乳動物の細胞系が含まれる。本発明の宿主細胞は、病原性遺伝子産物と特異的に免疫反応する抗体を発生させるための価値ある免疫原である。本発明の宿主細胞は、細胞を好適な培養基で増殖させ、目的のポリペプチド産物を細胞からかまたは細胞を増殖させた培養基から、例えば当該技術分野でよく知られており、日常的に実施されている免疫アフィニティー精製または多くの精製技術のうちのいずれかによって単離する。E. coli、P. multocida、BacillusおよびS. aureusを含む他の細菌、Pichia pastorisおよびSaccharomyces cerevisiaeを含む酵母、昆虫細胞またはＣＨＯ細胞を含む哺乳動物細胞のごときいずれの好適な宿主細胞も、当該技術分野において知られている好適なベクターを利用して、遺伝子産物の発現のために用いることができる。タンパク質は、細菌細胞の細胞周辺腔へ、または細胞培養基への分泌によって細胞内または細胞外のいずれかで直接的に産生されるか、あるいはペプチドまたはポリペプチドに融合し得る。タンパク質の分泌には、シグナルペプチド（プレ配列としても知られている）を必要とし；原核生物および真核生物からの多数のシグナル配列が組換えタンパク質の分泌のために機能することが知られている。タンパク質分泌プロセスの間に、シグナルペプチドはシグナルペプチターゼによって除去されて成熟タンパク質が得られる。
【００４２】
タンパク質精製プロセスを単純化するために、精製タグを遺伝子コード配列の５'または３'末端のいずれかに付加できる。一般的に使用される精製タグには、６のヒスチジン残基のストレッチ（米国特許第５,２８４,９３３号および第５,３１０,６６３号）、SchmidtおよびSkerra, Protein Engineering, 6: 109-122（1993）によって記載されているストレプトアビジン−親和性タグ、FLAGペプチド［Hoppら, Biotechnology, 6: 1205-1210（1988）］、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ［SmithおよびJohnson, Gene, 67:31-40 (1988)］、およびチオレドキシン［La Vallieら，Bio/Technology, 11: 187-193(1993)］が含まれる。これらのペプチドまたはポリペプチドを取り除くために、タンパク質分解切断認識部位を融合接合部に挿入できる。一般的に使用されるプロテアーゼは、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼである。
【００４３】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる精製および単離されたP. multocida、A. pleuropneumoniaeおよびP. (Mannheimia) haemolytica病原性ポリペプチドも提供する。配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載されたポリヌクレオチドならびにその種ホモログのいずれか１によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドが現在好ましい。本発明は、ａ）配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４ならびにその種ホモログのいずれか１に記載されたＤＮＡ配列；ｂ） 配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４のいずれか１によってコードされたP. multocida、A. pleuropneumoniaeまたはP. (Mannheimia) haemolyticaのポリペプチドをコードするＤＮＡ分子ならびにその種ホモログ；およびｃ）中程度のストリンジェンシー条件下にて、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズする病原性遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子よりなる群から選択されるＤＮＡによってコードされる病原性ポリペプチドを包含する。
【００４４】
本発明は、本発明の好ましいポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、および少なくとも約５０％の同一性および／または相同性を有するポリペプチドも包含する。本発明の好ましいポリペプチドに関するパーセント（％）アミノ酸配列「同一性」とは、病原性遺伝子産物配列と候補配列の両方を並べて、必要ならギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後の病原性遺伝子産物配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中では定義し、配列同一性の部分としていずれの保存的置換も考慮していない。本発明の好ましいポリペプチドに関する％配列「相同性」は、候補配列と病原性遺伝子産物の配列の両方を並べて、必要ならギャップを導入して最大％配列同一性を達成した後の病原性遺伝子産物配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中では定義し、配列同一性の一部分としていずれの同類置換も考慮しない。同類置換は、表ＡおよびＢに掲載するように定義し得る。
【００４５】
【表１】
2005502315.tif 000002
【００４６】
本発明のポリペプチドは、天然の細菌細胞起源から単離するかまたは化学合成し得るが、好ましくは本発明の宿主細胞を含む組換え法によって生成する。本発明の病原性遺伝子産物は、完全長ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、または特異的な生物学的もしくは免疫学的な活性を保持するそれらの変異型とし得る。変異型には病原性ポリペプチドアナログが含まれ、そこにおいては、（１）病原性遺伝子産物に特異的な１またはそれを超える生物学的活性または免疫学的特徴を喪失することなく；あるいは（２）病原性遺伝子産物の特定の生物学的活性の特定の不能性を有しつつ、１またはそれを超える特定の（すなわち、天然にコードされた）アミノ酸が欠失または置換されているか、あるいは１またはそれを超える非特定のアミノ酸が付加されている。意図する欠失変異型には、生物学的活性に必須でないポリペプチドの部分を欠いているフラグメントも含まれ、挿入変異型には野生型ポリペプチドまたはそのフラグメントがもう１のポリペプチドに融合している融合ポリペプチドが含まれる。
【００４７】
変異型病原性ポリペプチドには、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変によって同類置換が導入されているものが含まれる。同類置換は、その関連する物理学的特性に従ってアミノ酸を分類することと当該技術分野では認識されており、（1997年3月13日公開の国際公開WO 97／09433、10頁（9/6/96出願のPCT／GB96／02197）から引用する）表Ａに掲載したごとく定義し得る。また、同類アミノ酸は、表Ｂに掲載するごとくLehninger,[Biochemistry,第２版；Worth Publishers,Inc.社 NY：NY（1975）, pp71-77]で定義されているごとくグループ分けすることもできる。
【００４８】
【表２】
2005502315.tif 000003
【００４９】
本発明の変異型病原性産物には、成熟病原性遺伝子産物、すなわちリーダー配列またはシグナル配列が除去され、さらなるアミノ末端残基を有するものが含まれる。ポジション−１にさらなるメチオニン残基を有する病原性遺伝子産物は、ポジション−２および−１にさらなるメチオニンおよびリシン残基を有する病原性産物と同様に意図される。これらの型の変異型は、細菌細胞型における組換えタンパク質産生に特に有用である。本発明の変異型には、他のタンパク質に由来するアミノ末端配列が導入されている遺伝子産物、ならびに天然発生タンパク質には見出されないアミノ末端配列を含む変異型も含まれる。
【００５０】
本発明は、特定の発現系の使用から生じるさらなるアミノ酸残基を有する変異型ポリペプチドをも包含する。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として目的のポリペプチドを発現する市販のベクターを使用することにより、目的のポリペプチドからＧＳＴ成分を切断した後にポジション−１にさらなるグリシン残基を有する目的のポリペプチドが得られる。他のベクター系を用いる発現から生じる変異型も意図される。
【００５１】
また、本発明によって意図されるのは、抗体（例えば、本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む複合物を含む、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化、ヒトおよびＣＤＲ−グラフト抗体）ならびに病原性遺伝子産物またはそのフラグメントに特異的な他の結合タンパク質である。「〜に特異的な」なる語は、本発明の抗体の可変領域が排他的に病原性ポリペプチドを認識し、かつ、それに結合する（すなわち、ポリペプチドのファミリーに見出される配列の同一性、相同性または類似性にかかわらず、関連する病原性ポリペプチドから単一の病原性ポリペプチドを識別し得る）が、抗体の可変領域の外側の配列、特に分子の定常領域中の配列との相互作用を介して他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術においてはエス・アウレウス（S. aureus）プロテインＡまたは他の抗体）とも相互作用し得ることを示す。本発明の抗体の結合特異性を測定するスクリーニング・アッセイはよく知られており、当該技術分野で日常的に行われている。かかるアッセイの包括的な議論については、Harlowら（編）, Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), 第６章を参照されたい。本発明の病原性ポリペプチドのフラグメントを認識し、かつ、それに結合する抗体も意図されるが、但し、当該抗体は、前記に定義したごとく、それからフラグメントが由来する本発明の病原性ポリペプチドに第一にかつ最先に特異的である。
【００５２】
本発明により提供されるＤＮＡおよびアミノ酸配列情報により、病原性遺伝子およびそれがコードする遺伝子産物の構造および機能の体系的な分析が可能となる。本発明の病原性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドの知見により、本発明の病原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを認識し、かつ、それにハイブリダイズするアンチセンス・ポリヌクレオチドも利用可能となる。完全長およびフラグメントのアンチセンス・ポリヌクレオチドが提供される。当業者であれば、本発明のフラグメントのアンチセンス分子に、（ｉ）（他の公知分子をコードするＤＮＡに対する本発明の病原性ポリペプチドをコードするＤＮＡの配列比較によって決定される）特定のＲＮＡを特異的に認識し、かつ、それにハイブリダイズするもの、ならびに（ｉｉ）病原性タンパク質のファミリーの変異型をコードするＲＮＡを認識し、かつ、それにハイブリダイズするものが含まれることを認識するであろう。タンパク質の病原性ファミリーの他のメンバーをコードするＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス・ポリヌクレオチドは、配列比較を介して同定可能であり、分子のファミリーにつき特徴的または顕著な（signature）配列を同定する。
【００５３】
さらに、本発明は、リボザイムの使用を介して遺伝子発現をモジュレートする方法も意図する。概説については、GibsonおよびShillitoe, Mol. Biotech. 7: 125-137 (1997)を参照されたい。リボザイム技術を利用して、（ｉ）標的ｍＲＮＡへの相補的ＲＮＡのハイブリダイゼーション、および（ｉｉ）相補鎖に固有のヌクレアーゼ活性を介するハイブリダイズしたｍＲＮＡの切断、を介する配列特異的な方法でｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。リボザイムは経験的な方法によって同定し得るが、より好ましくは標的ｍＲＮＡ上のアクセス可能な部位に基づいて特異的に設計する[Bramlageら, Trends in Biotech., 16:434-438 (1998)]。標的細胞へのリボザイムのデリバリーは、当該技術分野でよく知られておりかつ日常的に行われている外因的または内因的のいずれかのデリバリー技術を用いて行い得る。外因的デリバリー法には、標的化リポソームまたは直接局所注射の使用が含まれ得る。内因的な方法には、ウイルスベクターおよび非−ウイルスプラスミドの使用が含まれる。
【００５４】
リボザイムは、病原性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドにユニークな領域に相補的になるよう設計した場合、病原性遺伝子の発現を特異的にモジュレートし得る。したがって、「特異的にモジュレートする」とは、本発明のリボザイムが単一のポリヌクレオチドのみを認識することを意味することを意図する。同様に、リボザイムは、全てまたは幾つかのファミリーのタンパク質の発現をモジュレートするように設計し得る。この型のリボザイムは、タンパク質のファミリーをコードする全てまたは幾つかのポリヌクレオチド中に保存されたポリヌクレオチド配列を認識するように設計する。
【００５５】
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチド−指向化三重らせん形成の使用を介して本発明の病原性遺伝子の転写をモジュレートする方法を包含する。概説については、Lavrovskyら, Biochem. Mol. Med., 62:11-22 (1997)を参照されたい。三重らせん形成は、ワトソン−クリック・モデルで定義された主溝で二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて行う。その後、配列特異的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、例えば転写因子およびポリメラーゼを含むＤＮＡ−結合タンパク質の活性をモジュレートし得る。ハイブリダイゼーション用の好ましい標的配列には、病原性遺伝子産物の発現をモジュレートする転写調節領域が含まれる。三重らせん形成することができるオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ配列の部位−特異的共有的改変にも有用である。共有的改変に有用なオリゴヌクレオチドは、Lavrovskyら, [前掲]に記載されているごとき種々のＤＮＡ損傷剤にカップリングする。
【００５６】
P. multocida、A. pleuropneumoniaeおよびP. (Mannheimia) haemolyticaの病原性遺伝子の同定は、抗菌剤の同定方法において遺伝子および遺伝子産物を有用としている。かかる方法には、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、および１７４ならびにそれらの種ホモログ（すなわち、配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、および１７４のＤＮＡ配列によって表される遺伝子）は病原性遺伝子産物をコードし、あるいは配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、および１７４のＤＮＡ配列が病原性遺伝子産物をコードしている遺伝子に近接しているか、あるいは配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２９、３１、３３、３７、３９、４１、５１、５３、５５、５７、５８、６０、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、および１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３５、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、および１７４のいずれか１に記載のＤＮＡ配列、その種ホモログまたはその相補鎖によって全体または一部分がコードされる細菌遺伝子産物の機能を干渉する能力につき潜在的剤をアッセイし、つづいてかかるアッセイにおいてポジティブである剤を同定することが含まれる。これらのアッセイに有用なポリヌクレオチドおよびポリ��プチドには、本明細書中に開示する遺伝子およびコードされるポリペプチドのみならず、野生型の遺伝子およびポリペプチドと実質的に同じ活性を有するその変異型も含まれる。
【００５７】
前記した方法によって作製される病原性遺伝子産物は、高処理量アッセイで用いて阻害因子についてスクリーニングする。スクリーニングすべき潜在的剤の起源は、化学化合物ライブラリー、ストレプトマイセテス（Streptomycetes）、他の細菌および菌類の醗酵培地、ならびに植物および他の増殖性植物の細胞抽出物である。公知の酵素活性を有するタンパク質については、活性に基づいてアッセイを確立し、多数の潜在的剤を該活性を阻害する能力についてスクリーニングする。他のタンパク質または核酸と相互作用するタンパク質については、結合アッセイを確立して、かかる相互作用を直接測定し、潜在的剤を結合相互作用を阻害する能力についてスクリーニングする。
【００５８】
当該技術分野で知られている異なるアッセイの使用は、本発明のこの態様に従って意図される。病原性遺伝子産物の機能が公知の遺伝子産物に対する配列類似性によって知られるかまたは予想される場合には、遺伝子産物の機能および／または特性に合わせた酵素的または他のタイプの生物学的および／または生化学的アッセイで潜在的なインヒビターをスクリーニングし得る。病原性遺伝子産物が他のタンパク質または核酸と相互作用する公知の遺伝子産物に対する配列類似性によって知られるかまたは予想される場合には、相互作用のインヒビターを結合アッセイで直接スクリーニングし得る。本発明は、病原性遺伝子産物によって結合のインヒビターをスクリーニングおよび同定する多数のアッセイを意図する。１の例において、病原性遺伝子産物を固定化し、結合パートナーとの相互作用を推定インヒビター化合物の存在および不存在下で評価する。もう１の例において、病原性遺伝子産物とその結合パートナーとの間の相互作用は、推定インヒビター化合物の存在および不存在下の両方で、溶液アッセイにおいて評価する。両方のアッセイにおいて、インヒビターは病原性遺伝子産物とその結合パートナーとの間の結合を低下させる化合物として同定する。他のアッセイもこれらの例で意図され、そこでは病原性遺伝子産物結合パートナーはタンパク質である。例えば、ジハイブリッドアッセイの変形が意図され、そこではタンパク質／タンパク質相互作用のインヒビターを、１９９５年８月３日に公開された国際公開番号WO 95／20652号に記載されているごとき形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞におけるポジティブ・シグナルの検出によって同定する。
【００５９】
本発明により意図される候補インヒビターには、潜在的なインヒビターのライブラリーから選択される化合物が含まれる。小分子モジュレーターの同定に用いる多数の異なるライブラリーが存在し、これには（１）化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー、および（３）ランダムなペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子からなるコンビナトリアル・ライブラリーが含まれる。化学ライブラリーは、公知の化合物、あるいは天然物のスクリーニングを介して「ヒット（hits）」または「リード」と同定された化合物の構造アナログからなる。天然産物ライブラリーは、（１）土壌、植物または海洋微生物からのブロスの醗酵および抽出、あるいは（２）植物または海洋生物の抽出、によってスクリーニング用の混合物を生成するために用いる微生物、動物、植物または海洋生物の収集である。天産物ライブラリーには、ポリペプチド、非−リボソームペプチドおよびそれらの変異型（非天然発生）が含まれる。概説については、Science, 282:63-68 (1998)を参照されたい。コンビナトリアル・ライブラリーは、混合物として多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物よりなる。それは、伝統的な自動化合成法、ＰＣＲ、クローニングまたは特許合成方法によって調製することが比較的簡単である。特に関心があるのは、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドのコンビナトリアル・ライブラリーである。なお他の関心のあるライブラリーには、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、マルチ平行合成収集、組換え、およびポリペプチド・ライブラリーが含まれる。それから創製されたコンビナトリアル化学およびライブラリーの概説については、Myers, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 701-707 (1997)を参照されたい。本明細書中に記載する種々のライブラリーの使用を介するモジュレーターの同定により、候補「ヒット」（または「リード」）を改変して活性をモジュレートする「ヒット」の能力を最適化し得る。
【００６０】
本発明によって意図されるなお他の候補インヒビターを設計し得、それには可溶性形態の結合パートナー、ならびにキメラタンパク質または融合タンパク質としての結合パートナーが含まれる。本明細書中で用いる結合パートナーは、抗体、抗体フラグメント、ならびに同定した病原性遺伝子の発現産物に対して免疫特異的な抗体ドメインを含む改変化合物を広範囲に包含する。
【００６１】
病原性遺伝子産物に対する結合パートナー（すなわち、リガンド）が知られていない場合には、標的タンパク質への試験結合パートナーの直接結合を測定することを介して標的タンパク質の結合パートナーを同定するアッセイ、ならびにイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法または他の物理学的方法もしくは分析方法を用いたアフィニティー限外濾過を介して標的タンパク質の結合パートナーを同定するアッセイが含まれる。また、かかる結合相互作用は、両方とも出典明示して本明細書の一部とみなす、FieldsおよびSong, Nature, 340: 245-246 (1989)、ならびにFieldsおよびSternglanz, Trends in Genetics, 10:286-292 (1994)に記載されている酵母ツーハイブリッド系を用いて間接的に評価する。ツーハイブリッド系は、２のタンパク質またはポリペプチド間の相互作用を検出するための遺伝子アッセイである。それを用いて、関心のある公知タンパク質に結合するタンパク質を同定するか、または相互作用に重要なドメインまたは残基を詳細にすることができる。この方法に対する変形が開発されて、ＤＮＡ−結合タンパク質をコードする遺伝子がクローン化され、タンパク質に結合するペプチドが同定され、薬剤につきスクリーニングされている。ツーハイブリッド系は、レポーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ−結合ドメインのすぐ近接に転写活性ドメインをもってゆく一対の相互作用タンパク質の能力を活用し、一般的に酵母で行う。該アッセイには、（１）第１のタンパク質に融合したＤＮＡ−結合ドメイン、および（２）第２のタンパク質に融合した活性ドメイン、をコードするツーハイブリッド遺伝子の構築が必要である。ＤＮＡ−結合ドメインは第１のハイブリッドタンパク質をレポーター遺伝子のＵＡＳに標的化する；しかしながら、大部分のタンパク質は活性化ドメインを欠いているため、このＤＮＡ−結合ハイブリッドタンパク質はレポーター遺伝子の転写を活性化することができない。活性化ドメインを含有する第２のハイブリッドタンパク質は、それ自体でレポーター遺伝子の発現を活性化することができない。それはＵＡＳに結合しないからである。しかしながら、両方のハイブリッドタンパク質が存在する場合には、第１のタンパク質と第２のタンパク質の非共有的な相互作用が活性化ドメインをＵＡＳにつなぎ、レポーター遺伝子の転写を活性化する。病原性遺伝子産物（例えば、第１のタンパク質）がもう１のタンパク質または核酸と相互作用することがすでに知られている場合には、このアッセイを用いて結合相互作用を干渉する剤を検出することができる。異なる試験剤を系に添加しながらレポーター遺伝子の発現をモニターする；インヒビター因子が存在するとレポーター・シグナルの欠失を生じる。
【００６２】
病原性遺伝子産物の機能が知られておらず、かつ、遺伝子産物に結合することが知られているリガンドが存在しない場合には、酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて遺伝子産物に結合するタンパク質を同定することもできる。第１のタンパク質（標的タンパク質）に結合するタンパク質を同定するためのアッセイにおいては、各々が異なる第２のタンパク質をコードしている多数のハイブリッド遺伝子をこのアッセイで作製およびスクリーニングする。典型的には、第２のタンパク質は、全ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡが活性化ドメインに連結しているプラスミドのプールによってコードされている。この系は広範な種々のタンパク質に適用可能であり、第２の結合タンパク質の同一性または機能を知ることすら必要でない。該系は非常に感度が高く、他の方法によって明らかにされない相互作用（一時的な相互作用が転写の引き金を引いて、繰返し翻訳することができる安定なｍＲＮＡを生成してレポータータンパク質が得られる場合でさえ）を検出することができる。
【００６３】
他のアッセイを用いて標的タンパク質に結合する剤を探索し得る。標的タンパク質への試験リガンドの直接結合を同定するための１のかかるスクリーニング法は、出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,585,277号に記載されている。この方法は、タンパク質が一般的にホールドおよびアンホールド状態の混合物として存在し、２の状態の間を連続的に交代しているという原理に基づく。試験リガンドがホールド形態の標的タンパク質に結合する場合（すなわち、試験リガンドが標的タンパク質のリガンドである場合）には、リガンドによって結合された標的タンパク質分子はそのホールド状態のまま存在する。したがって、ホールド標的タンパク質は、リガンド不存在下よりも、標的タンパク質に結合する試験リガンドの存在下でより多い程度で存在する。標的タンパク質へのリガンドの結合は、標的タンパク質のホールドおよびアンホールド状態の間を識別するいずれの方法によっても判定し得る。このアッセイを行うために、標的タンパク質の機能が知られている必要はない。試験リガンドとしてこの方法によって実質的にいずれの剤も評価し得、限定されるものではないが、金属、ポリペプチド、タンパク質、脂質、多糖、ポリヌクレオチドおよび小有機分子が含まれる。
【００６４】
標的タンパク質に対するリガンドを同定するもう１の方法は、出典明示して本明細書の一部とみなす、Wieboldtら, Anal. Chem., 69:1683-1691 (1997)に記載されている。この技術は、標的タンパク質への結合について溶液相中で一時に２０−３０の剤のコンビナトリアル・ライブラリーをスクリーニングする。標的タンパク質に結合する剤は、遠心限外濾過によって他のライブラリー成分から分離する。つづいて、フィルター上に保持された特異的に選択された分子を標的タンパク質から遊離させ、ＨＰＬＣおよび空気圧アシスト電子スプレー（イオンスプレー）イオン化質量分析によって分析する。この手法は標的タンパク質に対して最高のアフィニティーを有するライブラリー成分を選択し、特に小分子ライブラリーに有用である。
【００６５】
初期スクリーニングによって同定されたインヒビター／バインダーは、P. multocida感染症のイン・ビボ（in vivo）マウス・モデルにおける病原性に対するその効果について評価する。菌血症、心内膜炎、敗血性関節炎、柔組織膿瘍または肺炎のモデルを利用し得る。他の動物の使用を含むモデルも本発明によって理解されている。例えば、ウサギを、変化する量の推定インヒビター／バインダー化合物を投与する前後に野生型P. multocida株で攻撃し得る。推定インヒビター／バインダー化合物の代わりに塩類溶液のみを投与した対照動物は、それによって試験動物の悪化を判定し得る基準を提供する。他の動物モデルには、Animal and Plant Health Inspection Sevice, USDA, 1994年1月1日 編, 第113章, 69-113.70; PancieraおよびCorstvet, Am. J. Vet. Res. 45: 2532-2537; Amesら, Can. J. Comp. Med. 49: 395-400 (1984);ならびにMukkur, Infection and Immunity 18: 583-585 (1977)に記載されているものが含まれる。細菌の病原性を干渉するインヒビター／バインダーは、感染症の確立を予防し得、あるいは一旦確立した感染症の結果を逆転させ得る。
【００６６】
フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント、ミコール酸ベースのアジュバント（例えば、トレハロース ジミコレート）、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチド、またはＮ−オパカ（N−Opaca）、ムラミルジペプチド[ＭＤＰ]またはＭＤＰアナログのごとき糖タンパク質）、プロテオグリカン（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、連鎖球菌調製物（例えば、ＯＫ４３２）、ビオスチムＴＭ（BiostimTM）（例えば、０１Ｋ２）、欧州特許第109 942号、第180 564号および第231 039号の「イスコムス（Iscoms）」、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ−デキストラン、（ミグリオールのごとき）中性油、（落花生油のごとき）植物油、リポソーム、プルロニックＲ（PluronicＲ）ポリオール、Ribiアジュバント系（例えば、GB−A−2 189 141号を参照されたい）、またはインターロイキンのごとき油ベースのアジュバントを含む当該技術分野で知られているいずれのアジュバントもワクチン組成物 に用い得、特に細胞性免疫を刺激するものを用い得る。アミコラータ（Amycolata）、アクチノマイセテールス（Actinomycetales）目の細菌属の抽出物よりなるもう１のアジュバントは、米国特許第4,877,612号に記載されている。さらに、特許アジュバント混合物が市販されている。用いるアジュバントは、一部分、レシピエント生物に依存するであろう。投与するアジュバントの量は、動物のタイプおよびサイズに依存するであろう。最適投与量は日常的な方法によって容易に決定し得る。
【００６７】
ワクチン組成物は、所望により、医薬的なビヒクル、賦形剤または媒体として作用するワクチン−和合性の医薬上許容し得る（すなわち無菌であって無毒な）液体、半固体または固体の希釈剤を含み得る。当該技術分野で知られているいずれの希釈剤も用い得る。例示的な希釈剤には、限定されるものではないが、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ステアリン酸マグネシウム、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、アルギン酸塩、デンプン、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、アカシアガム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオ脂、およびテオブローマ（theobroma）の油が含まれる。
【００６８】
ワクチン組成物はデリバリーに簡便な形態で包装し得る。組成物はカプセル剤、キャプレッツ剤、サシェ剤、カシェ剤、ゼラチン、紙または他の容器内に入れることができる。レシピエント生物への免疫原性組成物の注入と和合する場合、特に、免疫原性組成物をユニット投与量形でデリバリーする場合、これらのデリバリー形態が好ましい。投与量ユニットは、例えば、錠剤、カプセル剤、坐剤またはカシェ剤に包装し得る。
【００６９】
ワクチン組成物 は、例えば、経口、舌下、鼻腔、肛門、または膣デリバリーによって、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹膜内または皮下注射を含む方法いずれかの慣用的な方法によって免疫感作すべき対象に導入し得る。治療は、単一用量または一定期間にわたる複数用量よりなり得る。
【実施例】
【００７０】
本発明は、細菌感染症および／またはそれと関連する病徴を予防または軽減するためのワクチン薬剤を製造するための本発明の弱毒細菌株の使用も包含する。本発明は、細菌感染症および／またはそれと関連する病徴を予防または軽減するための医薬を製造するための本発明のインヒビターの使用も提供する。
【００７１】
本発明を以下の実施例によって説明する。実施例１はP. multocida突然変異体の構築を記載する。実施例２はP. multocida突然変異体のスクリーニングに関する。実施例３はP. multocida突然変異体の病原性を判定する方法を扱う。実施例４はP. multocida病原性遺伝子のクローニングを記載する。実施例５はP. multocida病原性遺伝子に関連する他の種における遺伝子の同定を扱う。実施例６はA. pleuropneumoniae突然変異体の構築を記載する。実施例７は弱毒化A. pleuropneumoniae突然変異体のスクリーニングを扱う。実施例８はA. pleuropneumoniae病原性遺伝子の同定に関する。実施例９はA. pleuropneumoniaeの突然変異体および野生型細菌の競合的攻撃を記載する。実施例１０は同定したA. pleuropneumoniae遺伝子を特徴付ける。実施例１１は野生型細菌攻撃に対して保護するA. pleuropneumoniae突然変異体の効力を扱う。実施例１２はP. (Mannheimia) haemolyticaにおける種ホモログ病原性遺伝子の同定を記載する。
【００７２】
実施例１  タグを付加したトランスポゾンP. multocida突然変異体のライブラリーの構築
タグを付加したトランスポゾン突然変異体のライブラリーは、親ベクターｐＬＯＦ／Ｋｍ[Herreroら, J. Bacteriol., 172: 6557-67 (1990)]中に構築し、これはP. multocidaで機能性かつランダムであることが以前に示されている[Leeら, Vet. Microbiol., 50: 143-8(1996)]。プラスミドｐＬＯＦ／Ｋｍはスーサイド・ベクターｐＧＰ７０４を改変して構築し、それはＴａｃプロモーター制御下のトランスポザーゼ遺伝子ならびにカナマイシン耐性をコードするミニ−Ｔｎ１０トランスポーザブル・エレメントを含んでいた。プラスミドｐＴＥＦ−１は半−ランダム[ＮＫ]３５配列を含む配列タグを受容するようにｐＬＯＦ／Ｋｍを改変することによって以下に記載するごとく構築した。
【００７３】
プラスミドｐＬＯＦ／Ｋｍをまず改変してマルチプルクローニング領域中のユニークＫｐｎＩ制限部位を除去し、ついでミニ−Ｔｎ１０領域中に新たなＫｐｎＩ部位を導入した。そのプラスミドをＫｐｎＩで消化し、生じた突出末端を製造業者が指示するプロトコールに従ってクレノウ・ポリメラーゼで埋めた。本明細書中に記載する制限消化および連結は、製造業者が指示するプロトコールに従って行った（Gibco BRL, Gaithersburg, MD and Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。平滑末端生成物は自己連結して、ｐＬＯＦ／Ｋｍ--ＫｐｎＩと命名したプラスミドを生成し、これを増幅用のイー・コリ（E.coli)ＤＨ５α：λｐｉｒに形質転換した。イー・コリＤＨ５α：（λｐｉｒ φ８０ｄｌａｃＺ△Ｍ１５, ｒｅｃＡ１, ｅｎｄＡ１, ｇｙｒＡ９６, ｔｈｉ−１, ｈｓｄＲ１７(ｒk-, ｍk ｓｕｐＥ４４, ｒｅｌＡ１, ｄｅｏＲ, △(ｌａｃＺＹＡ-ａｒｇＦ)Ｕ１６９を、ＬＢ（Luria-Bertani）培地中、３７℃にて増殖させた。プラスミドはQIAGEN Inc. (Santa Clarita, CA) からのＱＩＡＧＥＮ ＳｐｉｎＰｒｅｐｓを用いて調製し、ミニ−Ｔｎ１０トランスポーザブル・エレメント内のユニーク部位を切断するＳｆｉＩで消化した。ＳｆｉＩ−ＫｐｎＩ−ＳｆｉＩアダプターは、オリゴヌクレオチドＴＥＦ１（配列番号：８６）およびＴＥＦ３（配列番号：８７）をアニーリングさせることによって調製し、得られた二本鎖アダプターをＳｆｉＩ部位に連結させてプラスミドｐＴＥＦ−１を作製した。オリゴヌクレオチドＴＥＦ１およびＴＥＦ３（ならびに本明細書中に記載する全ての他のオリゴヌクレオチド）は、Genosys Biotechnologies（The Woodlands, TX）によって合成した。
【００７４】
【化１】
2005502315.tif 000004
【００７５】
ｐＴＥＦ−１のＫｐｎＩ部位へ挿入するためのユニーク配列タグは以下の通り調製した。２５０μＭの各ｄＮＴＰ、１.５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、テンプレートＤＮＡとしての１００ピコモルの各プライマーＴＥＦ１４（配列番号：８８）およびＴＥＦ１５（配列番号：８９）、１ｎｇのＴＥＦ２６（配列番号：９０）ならびに２.５単位の組換えＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬを含む条件下で、ＧｅｎｅＡｍｐ ＸＬ ＰＣＲキット（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いてＰＣＲを行って二本鎖ＤＮＡタグを作製した。
【００７６】
【化２】
2005502315.tif 000005
【００７７】
反応条件は、９５℃にて１分間の初期インキュベートにつづく、９５℃にて３０秒間、４５℃にて４５秒間、ついで７２℃にて１５秒間の３０サイクルにつづく、７２℃にて２分間の最終インキュベートを含む。ＰＣＲ産物をＫｐｎＩで消化し、製造業者の指示するプロトコールに従ってQIAGEN Nucleotide Removal Kit（QIAGEN, Inc., Chatsworth, GA）を用いて精製した。ユニークタグ配列を、標準的な手法を用いて予めＫｐｎＩで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim）で脱リン酸化した線状ｐＴＥＦ−１のミニ−Ｔｎ１０エレメントに連結した。得られたプラスミド・ライブラリーをイー・コリＤＨ５α：λｐｉｒに形質転換した。ハイブリダイゼーションおよび検出を以下の通り行いつつ、ＤＩＧの使用者案内書（Boehringer−Mannheim）に従ってコロニーブロット分析を行った。
【００７８】
ハイブリダイゼーションは、Genius Non-Radioactive User's Guide（Boehringer Mannheim Biochemicals）、ＤＩＧ−ＰＣＲ labeling kit (Boehringer Mannheim Biochemicals)用製品シート、およびＣＳＰＤ（Boehringer Mannheim Biochemicals)用製品シートに従って本質的に行った。プローブの調製ついては、Ａｍｐｌｉｔａｑ ＰＣＲ緩衝液（PE Applied Biosystems）、２００μＭのｄＮＴＰ、１４０ピコモルの各プライマーＴＥＦ５（配列番号：９）およびＴＥＦ６（配列番号：９２）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２.５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ（PE Applied Biosystems）および１ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて、１００μｌの一次ＰＣＲ反応を設定した。
【００７９】
【化３】
2005502315.tif 000006
【００８０】
サイクル条件は、９５℃にて２分間の初期インキュベートにつづく、９５℃にて３０秒間、５０℃にて４５秒間、７２℃にて１５秒間の３５サイクルにつづく７２℃にて３分間の最終インキュベートを含んでいた。増幅産物を２％−３：１ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ（FMC BioProducts, Rockland, ME, USA）：アガロースゲル上の電気泳動を用いて分離し、１０９ｂｐを切除して精製した。ゲル抽出はＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いて行った。約１５ｎｇの一次産物を、ＤＩＧ ＰＣＲ Ｋｉｔ、５０ピコモルの各プライマーＴＥＦ２４およびＴＥＦ２５およびＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｉｘと２ｍＭのｄＮＴＰ保存溶液の１：１混合物を用いる５０μｌのＰＣＲ反応中で標識した。
【００８１】
【化４】
2005502315.tif 000007
【００８２】
ＰＣＲ条件は、９５℃にて４分間の初期インキュベートにつづく、９５℃にて３０秒間、５０℃にて４５秒間、７２℃にて１５秒間の２５サイクル、ならびに７２℃にて３分間の最終インキュベートを含んでいた。標識したＰＣＲ産物を９０μｌの合計反応体積中でＨｉｎｄＩＩＩで消化し、２％−３：１ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ（FMC BioProducts）：アガロースゲルを用いるコンスタント・プライマーアームから精製した。標識した可変タグを含有する領域を切除し、全ゲルスライスを１０ｍｌのＤＩＧ ＥａｓｙＨｙｂ中、９５℃にて１０分間溶解および変性させた。
【００８３】
ドットブロットは、ＨｙｂｏｎｄＲ−Ｎ＋膜（Amersham−Pharmacia Biotech）を用いて調製した。各タグ用の標的ＤＮＡは、ほぼ３０ｎｇのＰＣＲ産物を用いて９６ウェルプレート中で調製した。等容量の０.１Ｎ ＮａＯＨを添加して試料を変性させ、各試料をSchleicher and Schuell（Keene, NH, USA）からのＭａｎｉｆｏｌｄ ＩＴＭ Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ Ａｐｐａｒａｔｕｓを用いて最小限の真空で膜に適用した。各ウェルを１５０μｌの中和溶液（０.５Ｍ トリス／３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５）および１５０μｌの２×ＳＳＣで洗浄した。膜をＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）中でＵＶ−架橋し、２０ｍｌのＤＩＧ ＥａｓｙＨｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ中、４２℃にて１時間プレハイブリダイズさせた。変性したプローブを添加し、ハイブリダイゼーションを４２℃にて一晩行った。膜を０.１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣで各洗浄につき５分間２回洗浄した。標準Genius Detectionプロトコール（Genius Manual）を用いて進行する前に、２の高ストリンジェンシー洗浄を０.１％のＳＤＳを含有する予め加温した５０ｍｌの０.１×ＳＳＣ緩衝液中、６８℃にて１５分間行った。
【００８４】
安全性、低コスト、使用し易さ、および危険な材料を減少させるために、非−放射性検出系を用いることが望ましい。以前に記載された同様な手法[Meiら, Mol. Microbiol. 26: 399-407 (1997)]を用いる初期実験においては、ネガティブ対照において許容できないバックグラウンド・レベルのハイブリダイゼーションが得られた。バックグラウンドを低下させるために、タグの長さを３０ｂｐ増加させて合計７０とし、増幅プライマーを長くして可変領域を挟む全ての配列を含め、低濃度のｄｉｇ−ｄＵＴＰを用い、配列タグ領域を挟む保存配列をゲル精製によって取り出した。最も重要なことは、ＰＣＲを用いて、トランスポゾンそれ自体からのバックグラウンド・ハイブリダイゼーションを検出した後にタグを付加したトランスポゾンを含有する全プラスミドよりもむしろ、ドット・ブロットにおける標的ＤＮＡとして[ＮＫ]３５配列タグを作製した。これらの改変を用いて、バックグラウンドを排除し、化学ルミネセンス／非放射性スクリーニングをより効果的とした。
【００８５】
ＰＣＲ生成配列タグとｐＴＥＦ−１の連結から生じたほぼ４００の異なる形質転換体をコロニーブロットによってスクリーニングし、さらなる使用のために９６の最も強いハイブリダイズ・コロニーをマイクロタイター・プレートに結合させた。二重のタグの可能性は非常に低いが、マスタータグのプレートの半分を他のものに対してプローブして、タグが二重になっていないことを確認した。これらのタグを含有するプラスミドを精製して、イー・コリＳ１７-１：λｐｉｒ（ｐｉｒ, ｒｅｃＡ，ｔｈｉ，ｐｒｏ，ｈｓｄ，（ｒ−ｍ＋），ＲＰ４−２，（Ｔｃ：：Ｍｕ）,(Ｋｍ：：Ｔｎ７)，[ＴｍｐＲ]，[ＳｍＲ]）に形質転換し、その形質転換細菌をＬＢ培地中、３７℃にて増殖させた。各９６のタグを付加したプラスミドｐＴＥＦ−１を含有するイー・コリＳ１７−１：λｐｉｒ形質転換体を接合交配に用いて、P. multocidaのトランスポゾン突然変異体を作製した。P. multocida株ＴＦ５は、ウシ臨床単離株である、ＵＣ６７３１由来の自然発生ナリジキシン酸耐性突然変異体である。P. multocida株は、プレート上で増殖させる場合には、５％ＣＯ２下、ブレインハート浸出液（ＢＨＩ）培地（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）上、３７℃にて増殖させた。交配は各イー・コリＳ１７−１：λｐｉｒ／ｐＴＥＦ１：[ＮＫ]３５クローンおよびＴＦ５株を後期対数増加期まで増殖させることによって設定した。各タグを付加したｐＴＥＦ−１クローンにつき５０μｌの培地を２００μｌのＴＦ５培地と混合し、１００ｍＭのＩＰＴＧおよび１０ｍＭのＭｇＳＯ４を含有するＢＨＩプレート上に予め置いておいた０.２２ ＴＭ フィルターに５０μｌの各交配混合物をスポットした。５％ＣＯ２下、３７℃にて一晩インキュベートした後に、各フィルターを３ｍｌのＰＢＳに入れて交配混合物を洗い取り、各２５μｌをＢＨＩＮ５０Ｋ１００プレートに平板した。選択的一晩増殖後に、コロニーを２００μｌのＢＨＩＮ５０Ｋ５０へのトゥースピック移植（toothpick transfer）によってマイクロタイター・プレートに合して、マイクロタイター・プレート中の各ウェルが同じ配列タグを有するトランスポゾン突然変異体を常に含むことを確かめた。一晩増殖後に、５０μｌの７５％グリセリンを各ウェルに添加し、プレートを−８０℃にて凍結保存した。
【００８６】
トランスポゾン突然変異体をマイクロタイター・プレートに移すことによって１９のプールを合して、そのウェルに対して適当なタグを有するトランスポゾン突然変異体を各ウェルが含んでいたことを確かめた。他言すれば、これらの突然変異体内のトランスポゾンの位置は異なり得るが、各マイクロタイター・プレート中の特定のウェルは同一配列タグを有するトランスポゾン突然変異体を常に含んでいた。
【００８７】
実施例２  弱毒化P. multocida突然変異体のげっ歯類スクリーニング
敗血症のげっ歯類モデルを用いて、Pasteurella multocidaのトランスポゾン突然変異体の１９のプールをスクリーニングした。プールしたP. multocidaトランスポゾン突然変異体の凍結プレートを−８０℃保存から取り出し、各ウェルからの１０μｌを５０μｇ／ｍｌのナリジキシン酸（Sigma）および５０μｌ／ｍｌのカナマイシン（Sigma）と共に２００μｌのブレインハート浸出液（DIFCO）（ＢＨＩＮ５０Ｋ５０）を含有する新たな９６ウェル丸底プレート（Corning Costar, Cambridge, MA, USA）に移すことによって二次培養した。プレートを振盪せずに５％ＣＯ２下、３７℃にて一晩インキュベートした。各ウェルからの１０μｌをウェル当り１００μｌのＢＨＩを含有する新たな平底９６−ウェルプレート（Corning Costar）に移し、ほぼ１５０ｒｐｍで振盪しつつ３７℃にてインキュベートすることによって一晩プレートを二次培養した。マイクロタイター・プレートリーダーを用いてＯＤ５４０をモニターした。ほぼ０.２ないし０.２５のＯＤ５４０で、各プレートをプールして、マイクロタイター・プレートの各ウェルからの１００μｌを合することによって「投入プール」を形成した。その培養物をＢＨＩ中で適当に希釈してほぼ１０４、１０５、１０６ＣＦＵ／ｍｌの用量とし、０.２ｍｌの各希釈物を用いて、腹膜内投与によって雌性１４-１６ｇのＢＡＬＢ／ｃマウスに感染させた。感染後２日に、１または２の生存しているマウスを安楽死させて脾臓を採取した。全脾臓を１.０ｍｌの無菌０.９％塩類溶液中でホモジナイズした。１０−２から１０−５のホモジネートの希釈物を調製し、ＢＨＩＮ５０Ｋ５０プレートに平板した。一晩増殖後に、少なくとも２０,０００コロニーを１０ｍｌのＢＨＩブロス中にプールして「回収プール」を形成し、以前に記載されたプロトコール[F. M. Ausubelら(編), Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1. John Wiley and Sons, New York, p.2.4.1-2.4.5.(1997)中のWilson]に従って、０.５ｍｌの回収プールを３,５００×ｇにて遠心し、そのペレットを用いてゲノミックＤＮＡを調製した。
【００８８】
病原性野生型P. multocidaを用いた初期実験は、生物を脾臓、肺、腎臓および肝臓から回収し得ることを示し、これは感染の真正な敗血症モデルを示している。「投入」および「回収」の両方のプールについてのドット・ブロットを実施例１に記載したのと同様に行い、視覚的検査および半−定量分析の両方によって評価した。ハイブリダイゼーションは、投入および回収プールからの５μｇのゲノミックＤＮＡをテンプレートとして用いる以外は、実施例１に記載したのと同様に行った。半−定量分析は、単一クローンにおける顕著な減少が起こったか否かを示している。突然変異体が宿主内で生存することができない場合には、回収シグナルは投入シグナルに比して非常に低く、高い投入／回収比を与えるにちがいない。大部分の突然変異体はイン・ビトロ（in vitro)と同様にイン・ビボ（in vivo)で増殖するであろう。したがって、それらのシグナルの比はほぼ１に等しいにちがいない。回収プールで非常に減少しているとして定量分析によって選抜したクローンを、さらなる実験用に選抜した。疑わしい投入／回収比を有するさらなるクローンは、ドット・ブロットから作成したフィルムを視覚的に評価した後にも選抜した。
【００８９】
実施例３  P. multocida候補突然変異体についての病原性の決定
脾臓細胞から低い回収率を示した各潜在的な突然変異体を原プールプレートから単離し、個別に攻撃試験に用いて、該トランスポゾン突然変異体により生じた弱毒化を確認し、おおざっぱに評価した。in vivoスクリーンからの個々の候補突然変異体をヒツジ血液寒天プレート上、５％ＣＯ２中、３７℃にて一晩増殖させた。各突然変異体のおよそ６のコロニーをＢＨＩブロスに接種し、６時間増殖させた。希釈物を調製し、各々５のマウスに、各々１０２、１０３、１０４および１０５ＣＦＵで上記したごとく感染させた。弱毒化を６日後の死亡率をその野生型と比較することによって決定した。生存しているマウスは保護されていたものと推定され、ついで、当該野生型株のＬＤ５０のおよそ２００倍の濃度の野生型P. multocidaの用量で攻撃した。ついで、各攻撃した群のマウスについて生存率を決定した。
【００９０】
結果は、１２０の潜在的トランスポゾン突然変異体のうちの６２が弱毒化し、野生型株よりも少なくとも１０倍高い概算ＬＤ５０を有することを示した。該クローンおよびそれらの概算ＬＤ５０値を表１に掲載する。野生型株での対照実験を各セットの攻撃と並行して行ったが、全ての場合において野生型攻撃群の死亡率は１００％であった。
【００９１】
ＬＤ５０値に加えて、表１にはワクチン化および攻撃実験からのデータも掲載している。簡単には、マウス群（ｎ＝５ないし１０）は、病原性の野生型株のＬＤ５０よりもほぼ２００倍高い用量で表１に示す個々のP. mutocida株を腹膜内注射によりワクチン化した。死亡率の数字を算出した後２８日間、動物を観察した。
【００９２】
【表３】
2005502315.tif 000008
【００９３】
実施例４  P. multocida病原性に必要な遺伝子のクローニングおよび同定
弱毒化していることが確認された各トランスポゾン突然変異体を分析して、破壊されたオープン・リーディング・フレームの同一性をさらに決定した。各突然変異体からのＤＮＡを増幅し、精製し、ついでトランスポゾン内を切断せず、該トランスポゾンとハイブリダイズする４〜８ｋｂフラグメントを通常生成することが知られている制限酵素で消化した。該トランスポゾンによりコードされるカナマイシン抵抗性についての選抜を用いて、各トランスポゾン突然変異体につき少なくとも１のフラグメントをクローン化した。
【００９４】
複数の制限酵素を用いたサザンハイブリダイゼーションを、クローニングに好適なサイズのフラグメントを同定するためのプローブとしてｐＬＯＦ／Ｋｍからの標識化１.８ｋｂ  ＭｌｕＩフラグメントを用いて、各弱毒化突然変異体につき行った。各突然変異体からのミニ−Ｔｎ１０エレメントおよびフランキングＤＮＡを、内部プライマーＴＥＦ３２およびＴＥＦ４０、プライマーウォーキング、およびある場合においてはユニバーサルｐＵＣ−１９プライマーを用いて決定したｐＵＣ１９および該フランキング配列にクローン化した。
【００９５】
【化５】
2005502315.tif 000009
【００９６】
配列決定反応は、PE Applied Biosystems（Foster City, CA）からのBigDyeTM Dye Terminator Chemistry kitを用いて行い、ABI Prism 377 ＤＮＡ Sequencer上で行った。推定される中断（interupted）オープン・リーディング・フレームの二本鎖配列を各クローンにつき得た。Sequencer3.0ソフトウェア（Genecodes, Corp., Ann Arbor, MI）を用いて、配列データを収集して解析した。ＧＣＧプログラム［Devereuxら, 1997. Wisconsin Package Version 9.0, 9.0 ed. Genetics Computer Group, Inc., Madison］を用いて、現在入手可能なデータベースにおいて相同な配列を検索した。
【００９７】
弱毒化していることが同定されたクローンの３７％に、該ミニ−Ｔｎ１０トランスポーザブルエレメントの多重挿入が存在していた。そのフランキング配列を含む各挿入を個別にｐＧＰ７０４中にクローン化し、該野生型株中に交配して、P. multocidaの新たな突然変異体を作成し、その各々は、複数の起源挿入の１のみを運搬していた。個々の突然変異体を個別に再試験して、弱毒化表現型に寄与している挿入を決定した。該破壊された予想オープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列を両方の鎖を配列決定することによって決定し、ついで予想アミノ酸配列を用いて類似配列について現在入手可能なデータベースを検索した。配列は、知られている遺伝子、知られていない遺伝子および以前に配列決定された仮想オープン・リーディング・フレームに適合するか、または以前同定された配列のいずれにも適合しないかのいずれかであった。以前同定された配列にホモロジーを有する遺伝子については、表１に示すごとく、潜在的な機能を割当てた。
【００９８】
実施例５  他の種における関連遺伝子の同定
別の実験において、Actinobacillus pleuropneumoniae（ＡＰＰ）を用いてＳＴＭも行った。Ａｐｐ株の１は、配列決定した遺伝子（配列番号：９７）中に挿入を含有し、P. multocidaのａｔｐＧ遺伝子の種ホモログとして同定された。この結果は、以前に知られていなかったP. multocida遺伝子に対するホモログが他の細菌種にも存在することを示し、それを突然変異させてワクチン組成物に使用するための他の細菌種の弱毒化株を生成することもできることを示した。他のP. multocida遺伝子のホモログが他の細菌種に存在するか否かを決定するために、プローブとしてA. pleuropneumoniaeのａｔｐＧ遺伝子を用いて他の種からのゲノムＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００９９】
Actinobacillus pleuropneumoniae、Pasteurella haemolytica（Ｐｈ）、P. multocida、およびHaemophilus somnus（Ｈｓ）のゲノムＤＮＡをＣＴＡＢ法を用いて単離し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで３７℃にて２時間消化した。消化したＤＮＡを、０.７％寒天ゲル上、ＴＡＥバッファー中で４０Ｖにて一晩分離した。該ゲルを、順次、０.１Ｍ ＨＣｌ中に３０分間、０.５Ｍ ＮａＯＨ／１.５Ｍ ＮａＣｌ中に１５分間を各々２回、ついで２.５Ｍ ＮａＣｌ／１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.５中に２回浸漬した。そのＤＮＡを２０×ＳＣＣバッファー（３Ｍ ＮａＣｌ／０.３Ｍ クエン酸ナトリウム）を用いて、ニトロセルロース膜（Amersham Hybond N+）に一晩転写した。該ＤＮＡは、自己架橋設定（１２０ミリジュール）したUV Stratalinkerを用いて該膜に架橋した。該膜を５×ＳＳＣ／１％ ブロッキング溶液／０.１％ ラウロイルサルコシンナトリウム／０.０２％ ＳＤＳ中、５０℃にて、ほぼ７時間プレハイブリダイズさせ、ついでＰＣＲ生成ａｔｇプローブを含有する同溶液中、５０℃にて一晩ハイブリダイズさせた。
【０１００】
プローブは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム２４００において、ＧｅｎｅＡｍｐＸＬＰＣＲキットのプライマーＤＥＬ−１３８９（配列番号：９８）およびＴＥＦ−４６（配列番号：９９）を用いて調製した。テンプレートはゲノムA. pleuropneumoniae DNAを用いた。
【０１０１】
【化６】
2005502315.tif 000010
【０１０２】
ＰＣＲは、初期加熱工程を９４℃にて５分間、９４℃にて３０秒間の変性、５０℃にて３０秒間のアニーリング、および７２℃にて３分間の伸長の３０サイクル、ついで７２℃にて３分間の最終増幅で行った。増幅産物はアガロースゲル上で分離し、ＱＩＡquickゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、ついでおよびＤＩＧ−Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅｒキット（Boehringer Mannheim）を用いて標識した。ブロットをハイブリダイゼーション溶液から取り出し、２×ＳＳＣ中で濯ぎ、同バッファー中で各洗浄につき５分間、２回洗浄した。ついで、該ブロットを０.５×ＳＳＣ中、６０℃にて各々１５分間、２回洗浄した。相同なバンドをＤＩＧ Nucleic Acid Detection Kit（Boehringer Mannheim）を用いて視覚化した。
【０１０３】
ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを用いて、Pasteurella haemolytica、Haemophilus somnusおよびA. pleuropneumoniaeにおいて単一のバンドを検出した。Pasteurella multocidaからはＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを用いて２のバンドを検出した。
【０１０４】
実施例６  タグを付加したトランスポゾンP. multocida突然変異体のライブラリーの構築
ｐＬｏｆ／Ｋｍを用いるトランスポゾン突然変異誘発は、A. pleuropneumoniaeにおいて機能的かつランダムであることが以前に報告されている［Tasconら, J. Bacteriol. 175:5717-22 (1993)］。A. pleuropneumoniaeのタグを付加したトランスポゾン突然変異体を構築するために、予め選択したタグを付加したプラスミド（ｐＴＥＦ−１：[ＮＫ]３５）を含む９６の各E.coli Ｓ１７−１：αｐｉｒ形質転換体を接合性交配に用いて、A. pleuropneumoniae株ＡＰ２２５、in vivo継代したＡＴＣＣ２７０８８株由来の血清型１の自然発生ナリジキシン酸抵抗性突然変異体を生成した。A. pleuropneumoniae株は、１０μｇ／ｍｌのＢ−ニコチンアミドアデニン=ジヌクレオチド（Ｖ１０）（Sigma, St. Lous, Missouri）を含有するブレインハート滲出液（ＢＨＩ）（Difco Labratories, Detroit, MI）培地上、３７℃にて増殖させ、プレート上で増殖させる場合は５％ ＣＯ２中で増殖させた。E.coli Ｓ１７−１：λｐｉｒ（λｐｉｒ, ｒｅｃＡ, ｔｈｉ, ｐｒｏ, ｈｓｄＲ（ｒｋ−, ｍｋ＋），ＲＰ４−２，（ＴｃＲ：：Ｍｕ），（ＫｍＲ：：Ｔｎ７），[ＴｍｐＲ]，[ＳｍＲ]）をルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ；ＬＢ）培地中、３７℃にて繁殖させた。必要な場合には、抗生物質を１００μｍ／ｍｌ アンピシリン（Sigma）、５０μｍ／ｍｌ ナリジキシン酸（Ｎ５０）（Sigma）、および５０（Ｋ５０）もしくは１００（Ｋ１００）μｇ／ｍｌのカナマイシン（Sigma）で用いた。
【０１０５】
交配は、各E.coli Ｓ１７−１：λｐｉｒ／ｐＴＥＦ１：[ＮＫ]３５クローンおよびＡＰ２２５株を後期対数増加期まで増殖させることによって設定した。各タグを付加したｐＴＥＦ−１クローンにつき５０μｌのアリコートの培養液を１５０μｌのＡＰＰ２５５培養液と混合し、ついで１００μＭ ＩＰＴＧおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有するＢＨＩＶ１０プレート上に予め設置した０.２２μＭ フィルター上に５０μｌの各交配混合物をスポットした。５％ ＣＯ２下、３７℃にて一晩インキュベートした後に、各フィルターの交配混合物を２ｍｌのＰＢＳ中に洗い出し、各々の２００μｌをＢＨＩＶ１０Ｎ５０Ｋ１００プレートに平板した。選択的に一晩増殖させた後に、２００μｌ ＢＨＩＶ１０Ｎ５０Ｋ５０に楊枝で移動させることによってコロニーをマイクロタイタープレートに集めて、マイクロタイタープレートの各ウェルが常に同一の配列タグを有するトランスポゾン突然変異体を含むことを確認した。一晩増殖させた後に、５０μｌの７５％ グリセリンを各ウェルに添加し、プレートを−８０℃にて凍結保存した。
【０１０６】
ＡＰＰは、P. multocidaほどの多くの偏重を該ミニ−Ｔｎ１０エレメントの多重挿入に対して有していないようである。該突然変異体のうちのほぼ３％しか多重挿入を含んでいないことが決定され、それは以前に報告された４％と一致する[Tasconら, J Bacteriol. 175:5717-22 (1993)]。ＡＰＰにおける問題は、２３Ｓ ＲＮＡ領域への挿入を含有する多数の突然変異体（以下で論ずる）：１３のユニーク部位への挿入を有する合計２８の突然変異体を同定することからなる。これは、２３Ｓ ＲＮＡが優先挿入部位を含有すること、およびＡＰＰの増殖が宿主内で異なる生存を生じるのに十分なこれらの挿入によって影響を受けることを示しているのかも知れない。ＡＰＰ ２３Ｓ ＲＮＡプローブを用いるサザンブロット解析は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ中の５[Fleischmannら, Science 269:496-512 (1995)]およびE.coli中の７の完全オペロン[Blattnerら, Science 277:1453-1474 (1997)]と比較して、ＡＰＰが３のリボソームオペロンしか含有していない可能性があることを示している。この部位の優先性および増殖速度に対するその影響は「飽和突然変異誘発」に対する明らかな障害となり得る。何故ならば、相当数のクローンがこれらｒＲＮＡに挿入を含有し、さらなるユニークな弱毒性突然変異体を得るために大量のスクリーニングが必要であろうからである。
【０１０７】
実施例７  弱毒化A. pleuropneumoniae突然変異体についてのブタ・スクリーニング
合計ほぼ８００の突然変異体を含有するA. pleuropneumoniaeトランスポゾン突然変異体の２０のプールを、ブタ気管内感染症モデルを用いてスクリーニングした。各プールを２の別々の動物でスクリーニングした。
【０１０８】
プールしたA. pleuropneumoniaeトランスポゾン突然変異体の凍結プレートを−８０℃の貯蔵庫から取り出し、各ウェルからの２０μｌを１８０μｌのＢＨＩＶ１０Ｎ５０Ｋ５０を含有する新たな９６ウェル丸底プレート（Corning Costar, Cambridge, MA, USA）に移すことによって継代培養した。プレートを振盪することなく５％ ＣＯ２中、３７℃にて一晩インキュベートした。ついで、一晩置いたプレートを、各ウェルからの１０μｌをウェルあたり１００μｌのＢＨＩＶ１０を含有する新たな平底９６ウェルプレート（Corning Costar）に移すことによって継代培養し、１５０ｒｐｍにて振盪しつつ、３７℃にてインキュベートした。マイクロタイタープレートリーダーを用いてＯＤ５６２をモニターした。約０.２ないし０.２５のＯＤ５６２にて、各プレートをプールして、該マイクロタイタープレートの各ウェルからの１００μｌと合することによって、「投入プール（input pool）」を形成した。培養物をＢＨＩ中に適当に希釈して、約２×１０６ＣＦＵ／ｍｌとした。各希釈プールにつき、４.０ｍｌを用いて、気管チューブを用いる気管内投与により１０〜２０ｋｇＳＰＦブタ（Whiteshire-Hamroc, Albion, IN）に感染させた。感染後約２０時間にて、生存している全動物を麻酔し、肺を取り出した。洗浄を行って該肺に１５０ｍｌの殺菌ＰＢＳを潅流させることによって生存する細菌を回収し、ついで、それを揉んで流体を分散させた。洗浄流体を回収し、このプロセスを２回繰り返した。洗浄流体を４５０×ｇにて１０分間遠心して、大量のデブリを分離した。ついで、上清を２,８００×ｇにて遠心して、該細菌をペレット化した。ペレットを５ｍｌ ＢＨＩに再懸濁し、１０−２ないし１０−５の範囲の希釈率でＢＨＩＶ１０Ｎ５０Ｋ５０プレートに平板した。一晩増殖させた後に、少なくとも１００,０００のコロニーを１０μｌのＢＨＩブロス中にプールして、「回収プール」を形成した。各回収プールの０.７ｍｌを用いて、ＣＴＡＢ法[Wilson, In Ausubelら, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1. John Wiley and Sons, New York, p.2.4.1-2.4.5 (1997)]によりゲノムＤＮＡを調製した。通常の動物からの回収率は、肺洗浄物から１０８ＣＦＵ範囲であった。
【０１０９】
先に記載したごとくドットブロットを行い、視覚検査および半定量的分析の両方によって評価した。全てのハイブリダイゼーションおよび検出は記載したごとく行った。簡単には、プローブは、一次ＰＣＲ増幅につづく目的産物のアガロースゲル精製およびｄｉｇ−ｄＵＴＰを取込ませる（incorporating）二次ＰＣＲ増幅によって調製した。ＴＥＦ５、ＴＥＦ６、ＴＥＦ２４、ＴＥＦ２５、ＴＥＦ４８およびＴＥＦ６２を含むオリゴヌクレオチドは、Genosys Biotechnologies（The Woodlands, TX）により合成した。プライマーＴＥＦ６９、ＴＥＦ６５およびＴＥＦ６６もインバースＰＣＲおよび配列決定に用いた。
【０１１０】
【化７】
2005502315.tif 000011
【０１１１】
ついで、標識したＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ユニークタグ領域から一定のプライマーアームを分離した。標識した変化し得るタグを含むリュイ基を切り出し、全体のゲルスライスを溶解し、ＤＩＧ ＥａｓｙＨｙｂ中で変性した。ドットブロットを調製し、標準ＣＳＰＤ検出プロトコルを用いて検出した。フィルム露光を視覚評価のために行い、ルミネセントカウント・パー・セコンド（ＬＣＰＳ）を各ドットブロット試料につき測定した。各突然変異体に対するＬＣＰＳ投入／ＬＣＰＳ回収比を用いて、弱毒化しているようである突然変異体を決定した。
投入プール中に存在するが、回収プール中では非常に減少しているとして選択したクローンをさらなる研究のために選択した。疑問のある投入／回収比を有するさらなるクローンも、ドットブロットから作成したフィルムを視覚評価した後に選択した。合計１１０のコロニーを選択した。
【０１１２】
実施例８  A. pleuropneumoniae病原性遺伝子の同定
部分的フランキング配列を、インバースＰＣＲおよび直接産物配列決定により該１１０の突然変異体の各々について決定した。インバースＰＣＲを用いて、上記した直接配列決定用のフランキングＤＮＡ産物を作製した。配列決定反応は、PE Applied Biosystems （Foster City, CA）からのBigDyeTM Terminator Chemistry キットを用いて行い、ABI Prism 377 DNA Sequencer上で行った。Sequencher 3.0ソフトウェア（Genecodes, Corp., Ann Arbor, MI）を用いて、配列データをアセンブルして解析した。ＧＣＧプログラム［DevereuxおよびHarberli, 1997. Wisconsin Package Version 9.0, 9.0 ed. Genetics Computer Group, Inc., Madison］を用いて、現在入手可能なデータベース中の相同的配列を検索した。
表２は、同定したA. pleuropneumoniae遺伝子およびオープン・リーディング・フレームを決定し得る範囲を示す。配列番号は、ヌクレオチド配列および位置する推定されるアミノ酸配列に付される。
【０１１３】
【表４】
2005502315.tif 000012
【０１１４】
表３（後記、実施例９）に掲載する推定同一性は、細菌データベースと比較することによって割当てた。１１０の突然変異体は３５群のユニークなトランスポゾン挿入を表した。遺伝子座あたりの異なる突然変異体の個数は変化し、いくつかのコロニーは、常に、同一ＯＲＦの異なる部位内に挿入を含有するクローンに対するＯＲＦ内の単一部位に挿入を含有した。３の多重挿入が、多重ＰＣＲバンドの産出および多重配列電気泳動図の生成による決定でスクリーンされた該１１０個のコロニー中に検出された。
【０１１５】
実施例９  A. pleuropneumoniae突然変異体と野生型ＡＰＰ２２５との競争攻撃
回収した集団中に存在しないかあるいは非常に減少していた前記に同定した各ユニークな弱毒化突然変異体群からの代表的なクローンを、起源プールプレートから単離し、野生型株（ＡＰ２２５）との競争攻撃実験に用いて、トランスポゾン突然変異により生じた相対的弱毒化を確認した。突然変異体および野生型株をＢＨＶＩ１０中で０.６−０.９のＯＤ５９０まで増殖させた。ほぼ５.０×１０６ＣＦＵの野生型および突然変異体株を各々４ｍｌのＢＨＩに添加した。合計４ｍｌの用量を用いて気管チューブを用いた気管内投与により１０−２０ｋｇのＳＰＦブタに感染させた。感染後ほぼ２０時間に、全生存動物を麻酔し、肺を取り出した。肺洗浄を記載したごとく行った。プレートカウントをＢＨＩＶ１０Ｎ５０およびＢＨＩＶ１０Ｎ５０Ｋ１００で行って、両方の投入培養物および肺洗浄試料中の突然変異体に対する野生型の相対数を決定した。競争指数（Competitive Index; ＣＩ）は、[突然変異体ＣＦＵ／野生型ＣＦＵ]投入／[突然変異体ＣＦＵ／野生型ＣＦＵ]回収として算出した。
【０１１６】
３５の潜在的トランスポゾン突然変異体のうちで、２２が著しく弱毒化し、０.２未満の競争指数（ＣＩ）を有していた。ＳＴＭスクリーニングの結果に基づくと弱毒化していないようであったトランスポゾン突然変異体を、ポジティブコントロールとして１のプールから選択した。この突然変異体はほぼ０.６のin vivoのＣＩを有していた。この突然変異体についてin vitro競争も行い、０.８のＣＩを得た。その後、該突然変異体は、２のフェニルアラニンｔＲＮＡの間に挿入を含むことが決定された。
【０１１７】
ユニークな弱毒化単一挿入突然変異体の競争指数を表３に掲載する。ａｔｐＧ、ｐｎｐ、およびｅｘｂＢ Ａｐｐ突然変異体についての競合指数は、該突然変異体が野生型株と有効に競争できず、したがって弱毒化していることを示した。
【０１１８】
【表５】
2005502315.tif 000013
【０１１９】
ｅｘｂＢ突然変異体が３の異なる動物内で競争して０.００３、０.００３および０.００６のＣＩが得られたことから、ＣＩの精度は非常に良好のようであった。大きな動物実験における１の競争に基づき弱毒化を割当てるための競合指数の数の使用を、実施例１１に後記するごとく７の突然変異体を用いたブタ（ｎ＝８）における予備ワクチン接種の結果に基づいてさらに確かめた。
【０１２０】
実施例１０  弱毒化A. pleunopneumoniae病原性遺伝子の特徴付け
同定したA. pleunopneumoniae遺伝子は４の広い機能的分類を表す：生合成酵素、細胞内輸送成分、細胞内調節成分および未知物質。
Ｆ０Ｆ１ Ｈ＋ −ＡＴＰａｓｅ複合体のＦ１−γサブユニットをコードするａｔｐＧ遺伝子は、ＡＴＰの産生において、または、ＡＴＰを加水分解することによるプロトンの輸送において機能し得る。関連するａｔｐＧ弱毒化突然変異体は、P. multocidaにおいても同定された。Ｆ１δサブユニットをコードするもう１のａｔｐ遺伝子、すなわちａｔｐＨも同定された。ａｔｐ突然変異体の表現型には、非適合性酸−感受性表現型［Foster, J Bacteriol. 173:6896-6902 (1991)］、Salmonella typhimurium［Garacia del Portilloら, Infect Immun. 61:4489-4492 (1993)］およびP. multocida［前掲］における病原性の喪失、およびHaemophilus influenzae Ｒｄにおける形質転換頻度と反応能調節遺伝子の誘発との両方における低下［Gwinnら, J Bacteriol. 179:7351-20 (1997)］が含まれる。
【０１２１】
ＬｐｄＡは、２の酵素複合体：ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよび２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼのコンポーネントであるジヒドロリポアミド・デヒドロゲナーゼである。病原性に対する関連性は知られていないが、ＬｐｄＡの産生はSaomonella typhimuriumにおいてはヒト由来の殺菌性タンパク質にさらされた場合に誘導され、このことは、この誘導が外膜を修復しようとすることに関与している可能性があることを示唆しているかもしれない［Qiら, Mol Microbiol. 17:523-31 (1993)］。
【０１２２】
増殖および生存に必要な欠乏性化合物の輸送はin vivoにおいて極めて重要である。ＥｘｂＢは、ＴｏｎＢ輸送複合体の一部分であり［HantkeおよびZimmerman, Microbiology Letters. 49:31-35 (1981)］、少なくとも２の異なる方法でＴｏｎＢと相互作用する［Karlssonら, Mol Microbiol. 8:389-96 (1993); Karlssonら, Mol Microbiol. 8:379-88 (1993)］。鉄を獲得することは病理に必須である。この研究において、ＡＰＰおよびP. multocidaの両方において弱毒化ｅｘｂＢ突然変異体を同定した。いくつかのＴｏｎＢ依存性の鉄受容体が他の細菌において同定されている［Biswasら, Mol. Microbiol. 24:169-179 (1997); Braun, FEMS Microbiol Rev. 16:295-307 (1995); Elkinsら, Infect Immun. 66:151-160 (1998); Occhinoら, Mol Microbiol. 29:1493-507 (1998); StojiljkovicおよびSrinivasan, J Bacteriol. 179:805-12 1997)］。A. pleuropneumoniaeは２のトランスフェリン結合タンパク質を産生し、それらは鉄の獲得についてＥｘｂＢ／ＥｘｂＤ／ＴｏｎＢ系に依存するようである。ＰｏｔＤは、細胞周辺結合タンパク質であって、それはスペルミジン（ポリアミン）輸送に必要である［Kashiwagiら, J Biol Chem. 268:19358-63 (1993)］。Pasteurellaceaeファミリーのもう１のメンバーであるPasteurella haemolyticaは、回復期患者または外膜タンパク質でワクチン化した子ウシにおける主要な免疫原であるｐｏｔＤ（Ｌｐｐ３８）のホモログを含んでいる［PandherおよびMurphy, Vet Microbiol. 51:331-41 (1996)］。P.haemolyticaにおいて、ＰｏｔＤは内外膜の両方に関連するようである。以前の研究がStreptococus pneumoniaeのｐｏｔＤ突然変異体が弱毒化していることを示している［Polissiら, Infect. Immun. 66:5620-9 (1998)］にも拘わらず、病原性または保護抗体に対する関係におけるＰｏｔＤの役割は知られていない。
【０１２３】
アドヘシンシンまたはトキシンのごとき比較的わずかな「典型的病原性因子」しか、Haemophilus influenzaeのＯＭＰ Ｐ５のホモログを除いて、同定されていない。H.influenzaeのＯＭＰ Ｐ５は主たる外膜タンパク質であり、それはタンパク質のＯｍｐＡポリンファミリーのタンパク質と関係がある［Munsonら, M Infect Immun. 61:4017-20 (1993)］。非分類Haemophilus influenzaeのＯＭＰ Ｐ５は、繊維状構造として発現されるフィンブリンのサブユニットタンパク質をコードすることが示されており［Sirakovaら, Infect Immun. 62:2002-20 (1994)］、それは病原性ならびにムチンおよび上皮細胞の両方の結合に寄与している［MiyamotoおよびBakaletz, Microb Pathog. 21:343-56 (1996); Reddyら, Infect Immun, 64:1477-9 (1996); Sirakovaら, Infect Immun. 62:2002-20 (1994)］。極めて重要な発見は、ＯＭＰ Ｐ５ホモログをコードするようである２の異なるＯＲＦが同定されたことである。これは、Haemophilus ducreyi由来の２の非常に類似するタンパク質、ＭＯＭＰおよびＯｍｐＡ２の場合も同様である。両方ともフィンブリエの産生に機能的に関与しているのか、および、２のかかるＯＲＦの存在が重複するまたは相補的な機能を有する分岐複製を表すのかを決定することが残っている。興味深いことに、該２のＯＭＰ Ｐ５突然変異体は全く異なるＣＩ値を有するようであり、１のみのコピーについての必須性または機能性の差異を示している。ＯＭＰ Ｐ５は長期の感染の間に分子的な変化を受けていることが示されている［Duimら, Infect Immun. 65:1351-1356 (1997)］が、これは点突然変異を受けている単一の遺伝子に限定されているようであり、多重遺伝子の分別発現（differential expression）に起因する「タイプ・スイッチング」よりもアミノ酸変化を生じる。
【０１２４】
タンパク質折畳み酵素は、細胞周辺および細胞外タンパク質を効果的に折畳むための重要な補助物であり、２の遺伝子が同定され、それらの産物はペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を有する：ｆｋｐＡおよびｔｉｇ（トリガー因子）。ＦｋｐＡはＦＫ５０６−結合タンパク質ファミリーのメンバーである細胞周辺タンパク質である［HorneおよびYoung, Arch Microbiol. 163:357-65 (1995); Missiakasら, Mol Microbiol. 21:871-84 (1996)］。ＦｋｐＡは、Salmonella typhimurium［Horneら, Infect Immun. 65:806-10 (1997)］およびLegionella pneumophilaホモログ、ｍｉｐ［Englebergら, Infect Immun. 57:1263-1270 (1989)］の細胞内生存に寄与することが示されており、病原性およびマクロファージの感染に寄与している［Cianciottoら, J. Infect. Dis. 162:121-6 (1990); Cianciottoら, Infect Immun. 57:1255-1262 (1989)］。Ｔｉｇ、すなわちトリガー因子［CrookeおよびWickner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:5261-20 (1987); GuthrieおよびWickner, J Bacterol 172:5555-62 (1990); Hesterkampおよび Bukau., FEBS Lett. 389:32-4 (1996)に概説されている］は典型的なＦＫＢＰ領域を含有するペプチジルプロリルイソメラーゼであるが［CallebautおよびMornon, FEBS Lett. 374:211-215 (1995)］、ＦＫ５０６によって影響されない［Stollerら, EMBO J. 14:4939-48 (1995)］。Ｔｉｇは、リボソームおよび発生期ポリペプチド鎖に関連することが示されている［Hesterkampら, Proc Natl. Acad Sci USA 93:4437-41 (1996); Stollerら, EMBO J. 14:4939-48 (1995)］。可能性のある役割には、E.coli中の細胞分裂［Guthrie,およびWickner, J Bacteriol. 172:5555-62 (1990)］、Streptococcus pyogenesシステインプロテイナーゼの分泌および活性化における役割［Lyonら, EMBO J. 1:6263-75 (1998)］、およびBacillus subtilis中の飢餓条件下での生存[Gothelら, Biochemistry 37:13392-9 (1998)]への知られていない影響を含む。
【０１２５】
細菌の病理は、宿主内の広く様々な環境条件下で生存するために、多くのメカニズムを用いて、遺伝子発現を配位的に調節する。ｍＲＮＡ安定性における差異は、原核生物中の遺伝子発現を調整し得る［BelascoおよびHiggins, Gene, 72:15-23 (1988)］。例えば、ｒｎｒ（ｖａｃＢ）がShigellaflexneri中のプラスミド運搬毒性遺伝子の発現に要求され［Tobeら, J Bacteriol. 174:6359-67 (1992)］、ＲｎａｓｅＲリボヌクレアーゼをコード化する［Chengら, J. Biol. Chem. 273:14077-14080 (1998)］。ＰＮＰはｍＲＮＡの分解に関わるポリヌクレオチドホスホリラーゼである。致死のｐｎｐ／ｒｎｒ突然変異はなく、機能のありそうな重複を示唆する。したがって、ｒｎｒおよびｐｎｐの両方が毒性遺伝子発現に関わる可能性がある。P.mulcosidaのｐｎｐ突然変異体は、マウス敗血症モデルにおいて無毒である（実施例２）。他のｐｎｐ関連表現型はBacillus subtilisにおける反応能欠乏および低温感受性を含む［WangおよびBechhofer, J Bacterol. 178:2357-82 (1996)］。
【０１２６】
ＨｕｐＡは細菌性ヒストン様タンパク質であり、それはＨｕｐＢと組み合わさって、E.coli中にＨＵタンパク質を構築する。報告は、ｈｕｐＡおよびｈｕｐＢは、いかなる観察可能な表現型をも示さないことを示しているが［Huismanら, J Bacteriol. 171:3704-12 (1989); Wadaら, J Mol. Biol. 204:581-91 (1988)］。ｈｕｐＡ−ｈｕｐＢ二重突然変異体は、低温感受性でありヒートショックに感受性であって、部位特異的ＤＮＡ組換えの多くの形態においてブロックされことが示されている［Wadaら, J Mol. Biol. 204:581-91 (1988); Wadaら, Gene. 76:345-52 (1989)］。一つの限定的データは、以前、ｈｕｐＡは毒性に直接関わることを示した［Turnerら, Infect Immun. 66:2099-106 (1998)］。ｈｕｐＡ弱毒化のメカニズムが知られないまま残っている。
【０１２７】
ＤｎａＫは、よく知られ、高度に保存されたヒートショックタンパク質であり、様々なストレスの多い環境変化に対する調節的反応に関わる（［LindquistおよびCraig, Annu Rev Genet. 22:631-77 (1988)］に論評されている）。ＤｎａＫは、マクロファージに食された後に著しく誘発されたストレスタンパク質であり［Yamamotoら, Microbiol Immunol. 38:295-300 (1994)］、Brucella suis ｄｎａＫ突然変異体は、ヒトマクロファージ様細胞内で繁殖はできなかった［Kohlerら, Mol Microbiol. 20:701-12 (1996)］。対象的に、もう一つの細胞内病気素因、Listeria monnocytogenesは食作用後ｄｎａＫの誘発を示さなかった［Hanawaら, Infect Immun. 63:4595-9 (1995)］。Vibrio choleraのdnaK突然変異体はＴｏｘＲの産生およびin vitroでその調節された毒性因子に影響したが、同様の結果は、in vivo成長細胞からは得られなかった［Chakarabartiら, Infect Immun. 67:1025-1033 (1999)］。A.pleuropneumonia ｄｎａＫ突然変異体のＣＩはほとんどの病因性減弱した突然変異体より高かったが、依然として、陽性対象株のおよそ半分であった。
【０１２８】
ＤｋｓＡは、E.coliのｄｎａＫ突然変異体におけるフィラメンタス（filamentous）および温度感受性成長の用量依存性サプレッサーである［KangおよびCraig, J Bacteriol. 172:205-64 (1990)］。現在、ＤｋｓＡについて明らかな分子機能はないが、該遺伝子はニワトリおよび孵化したばかりのヒヨコにおけるSalmonella typhimuriumの毒性に重要であることが確認された［Turnerら, Infect Immun. 66:2099-106 (1998)］。その研究において、該ＤｋｓＡ突然変異体はグルコースまたはヒスチジンと一緒ではよく成長しなかったが、単に炭素源としてグルタミンまたはグルタミン酸エステルと一緒だとよく成長したことが記されている。この観察は、該ｄｋｓＡ突然変異体は、グルタミン酸エステルの生合成において、幾分、力が減じられることを示すのであろう［Turnerら, Infect Immun. 66:2099-106 (1998)］。
【０１２９】
３つの遺伝子がタンパク質合成において役割を有することが確認された：ｔＲＮＡ−ｌｅｕ、ｔＲＮＡ−ｇｌｕ、およびｒｐｍＦ。タンパク質合成を除いて、ｔＲＮＡは、ペプチドグリカン合成［Stewartら, Nature 230:36-38 (1971)］、ポルフィリン環合成［Jahnら, Trends Biochem Sci. 17:215-8 (1992)］、分解のためのタンパク質の標的［Tobiasら, Science 254:1374-7 (1991)］、タンパク質への翻訳後アミノ酸付加［LeibowitzおよびSoffer, B.B.R.C. 36:47-53 (1969)］、および細菌−真核細胞相互作用［Grayら, J Bacteriol. 174:1086-98 (1992); Hromokyjら, Mol Microbiol. 6:2113-24 (1992)］においても、広汎な機能的な役割を有する。より詳しくは、ｔＲＮＡ−ｌｅｕは、転写減衰［Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8127-8131 (1986)］、Pseudomonas syringaeによる病変形成［RichおよびWillis, J Bacteriol. 179:2247-58 (1997)］およびウロパソゲンE.coliの毒性［Dorbrindtら, FEMS Microbiol Lett. 162:135-141 (1998); Ritterら, Mol Microbiol. 17:109-21 1995)］に関連する。本発明者らが同定したｔＲＮＡがA. pleuropneumoniaeにおけるｔＲＮＡ−ｌｅｕのマイナー種を代表するかどうかは分らない。それにもかかわらず、ｔＲＮＡ−ｌｅｕは広汎な機能のいずれか１を有する可能性がある。ＲｐｍＦはリボ染色体タンパク質であり、その遺伝子もE.coli中の脂肪酸生合成酵素を含有するオペロンの部分である。ｆａｂ遺伝子およびｒｐｍＦの同一のクラスター形成がHaemophilus influenzaeにおいても発生するが［Fleischmannら, Science 269:496-512 (1995)］、これはA. pleuropneumoniaeにおいて事実であるかどうかを示すためのさらなる研究が必要である。該ｆａｂ遺伝子の発現は、必ずしも、ｒｐｍＦｎｏ上流を開始する転写物に依存するとは限らない。それは、ｒｐｍＦ中に同定された第２のプロモータが存在しているからである［ZhangおよびCronan, Jr., J Bacteriol. 180:3295-303 (1998)］。
【０１３０】
病因性減弱した突然変異体の最終クラスは、未知の機能を持つ遺伝子、すなわち、以前に同定されていない遺伝子内の突然変異を含む。ｙａｅＡおよびＨＩ０３７９のホモログは、それぞれ、Escherichia coli［Blattnerら, Science 277:1453-1474 (1997)］およびHaemophilus influenzae［Fleischmannら, Science 269:496-512 (1995)］において、以前同定された。残る未知物はActinobacillus pleuropneumoniae virulence遺伝子（ａｐｖ）と名付けられている。ａｐｖＣ遺伝子は、ＨＩ０８９３に著しい類似性を示すが、脂肪酸反応調節Ｂｍ３Ｒ１に類似する転写レプレッサーとしてのＨＩ０８３９の提案された類似性［Palmer, J Biol Chem. 273:18109-16 (1998)］は疑わしい。ａｐｖＤ遺伝子もE.coli由来の未知の機能を持つ推定膜タンパク質（ｂ０８７８）に最も類似している［Blattnerら, Science 277:1453-1474 (1997)］。２つの他の未知物、ａｐｖＡおよびａｐｖＢは公開データベースには明らかに適合するのもはなかった。
【０１３１】
実施例１１  A. pleuropneumoniae突然変異体の安全性および効能 ９つの群（ｎ＝８）のＳＰＦブタ（４〜５週齢、３〜１０ｋｇ）を用いて、生きた弱毒化したワクチン株として７つのA. pleuropneumoniaeの安全性および効能を決定した。７つの群は、１日目に１０１０ＣＦＵの各突然変異体で鼻腔内感染させた。１つの群は、１日目および１５日目に市販のワクチンPleuromune（Bayer）でワクチン化し、１つのナイーブ群（naive group）はワクチン化しなかった。２９日目に、全群は、ブタあたり１〜５×１０５ＣＦＵの野生型ＡＰＰ２２５で、鼻腔内免疫性テストした。この研究の４２日目に、全ての生存している動物を麻酔し、剖検した。結果を表４に示す。
【０１３２】
【表６】
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【０１３３】
該ｅｘｂＢ、ａｔｐＧ、ｐｎｐ、およびｙａｅＡ突然変異体は、１０１０ＣＦＵの用量を鼻腔内投与したときに死亡を引き起こさなかった。該ＦｋｐＡおよびｔｉｇ突然変異体群は、各々１匹の死亡があり、該ＨＩ０３７９群（最高２０００年４月６日、試験した７の突然変異体のＣＩは実施例９に示す）は４匹の死亡があった。このモデルに用いた野生型ＬＤ５０は、通常、１×１０７ＣＦＵであり、これらの突然変異体の各々は少なくとも１００倍弱毒化され、ＣＩと弱毒化との間にもっともな相関性があることを示している。
【０１３４】
実施例１２  P.(Mannheimia) haemolytica種ホモログの同定
P. multocidaおよびA. pleuropneumoniaeにおいて同定した病原性遺伝子に基づいて、P. (Mannheimia)haemolyticaにおける関連する遺伝子、すなわち種ホモログを同定する試みを行った。示したようにP. (Mannheimia)haemolytica遺伝子を増幅するために以下の縮重プライマーを用いてＰＣＲを行った。Sigma-Genosys（The Woodkans, TX）によって合成されたプライマー配列は標準的な一次略号を含み、ここでＢは（Ｃ、ＧまたはＴ）のいずれかを示し、Ｄは（Ｇ、ＡまたはＴ）のいずれかを示し、Ｈは（Ａ、ＣまたはＴ）のいずれかを示し、Ｋは（ＧまたはＴ）のいずれかを示し、Ｍは（ＡまたはＣ）のいずれかを示し、Ｎは（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）のいずれかを示し、Ｒは（ＡまたはＧ）のいずれかを示し、Ｓは（ＧまたはＣ）のいずれかを示し、Ｖは（Ｇ、ＡまたはＣ）のいずれかを示し、Ｗは（ＡまたはＴ）のいずれかを示し、およびＹは（ＣまたはＴ）のいずれかを示す。
【０１３５】
【化８】
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【０１３６】
最初の変性ＰＣＲ産物を増幅するために、３.３× ＸＬバッファーＩＩ（PE Applied Biosystems）、２００μＭのｄＮＴＰ、２５ピコモルの各適当なプライマー、０.８ｍＭのＭｇＣｌ２、０.５ＵのｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＸＬ（PE Applied Biosystems）およびほぼ１μｇのＴＦ１ ＤＮＡを用いて５０μｌ反応を設定した。
【０１３７】
サイクル条件は９４℃にて１.５分間につづいて；９４℃にて１５秒間、４０一６０℃にて６０秒間、７２℃にて１.５分間を３５サイクル；および７２℃にて４分間を最終ホールドとした。各ＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia CA)を用いたアガロースゲルからバンド精製した。
【０１３８】
配列決定反応は、PE Applied Biosystems（Foster City, CA）からのBigDyeTMDye Terminator Chemistry kitを用いて行い、ABI Prism 377 DNA Sequencer上で行った。各クローンについてのオープンリーティングフレーム（ＯＲＦ）用の二本鎖配列を得た。Sequencher 3.0ソフトウェア(Genecodes, Corp., Ann Arbor, MI)を用いて配列データをアセンブルし、解析した。ＧＣＧプログラムを用い、現在利用可能なデータベース中でホモログ配列を検索することによってＯＲＦの同一性を確認した。
【０１３９】
Vectorette Kit(Genosys Biotechnologies, The Woodlands, TX)を用いて、各遺伝子のさらなるフランキング配列を得た。Vectoretteライブラリーを製造業者の指示するプロトコールに従って調製した。Perkin Elmer Applied Biosystems GeneAmp XL PCR Kitコンポーネントを用いて、以下の反応条件を用いてVectorette ＰＣＲ産物を作製した。５０μｌの反応は、３.３×ＸＬバッファーＩＩ(PE Applied Biosystems)、２００μＭのｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各々の適当なプライマー (以下に示す)、０.８ｍＭのＭｇＣｌ２、０.５ＵのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＸＬ(PE Applied Biosystems)および１μｌの適当なvectoretteライブラリーを用いて設定した。 サイクル条件は、９４℃にて１.５分間; につづく９４℃にて２０秒間、６０℃にて４５秒間、７２℃にて４分間の３５サイクル；および７２℃にて７分間の最終保持であった。各ライブラリーの第２のプライマーは製造業者のvectoretteプライマーとした。
【０１４０】
【表７】
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【０１４１】
VectoretteＰＣＲ産物を前記したごとくバンド精製し、配列決定した。ａｔｏＧ、ｇｕａＢ、ｐｎｐ、ｐｕｒＦおよびｙｊｐＦ遺伝子のポリヌクレオチドを各々配列番号：１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載する。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドを各々配列番号：１６７、１６９、１７１、１７３および１７５に記載する。
【０１４２】
上記の例示的実施例に記載された本発明の数多くの修飾および変形が当業者にとって生じるものと予測される。したがって、添付した特許請求の範囲に表されるごとき単にそのような限定を本発明におくべきである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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