(57)【要約】本発明は、抗ウイルス薬として用いるための、ヌクレオキャプシド形成に必要とされる、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を抑制し、あるいはＮＰのグリコシル化を抑制する化合物の同定のためのアッセイに関する。本発明は、多量体化に必要とされるＮＰのグリコシル化ドメインと実質的に相同であるグリコシル化ドメインを有するタンパク質のグリコシル化を遮断する化合物の同定のためのアッセイにも関する。本発明はさらに、免疫原性または予防接種目的のための抗原または抗原性エピトープの提示のための擬似粒子に関する。
2005533111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と既知のリガンドとの相互作用を抑制する化合物の同定方法であって、：
（ａ）既知のリガンドの存在下で、ＮＰ部分、ＶＰ３５部分およびＶＰ２４部分からなる群から選択される部分を含有する反応混合物に試験化合物を添加し、それによりｉｎ
ｖｉｔｒｏで反応混合物を生成し、
（ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
（ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の試験化合物が、ＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分と既知のリガンドとの相互作用を抑制するか否かを判定すること
を包含する方法。
【請求項２】
前記ＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分が標識された請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記既知のリガンドが標識された請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記部分がＮＰ部分であり、既知のリガンドがＶＰ３５またはＶＰ２４である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記部分がＶＰ３５部分であり、既知のリガンドがＮＰまたはＶＰ２４である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記部分がＶＰ２４部分であり、既知のリガンドがＶＰ３５またはＮＰである請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記試験化合物がＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチド断片である請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記試験化合物がＮＰのグリコシル化ドメインに対応するペプチド断片である請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記試験化合物が前記反応混合物中に最初に含入される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記試験化合物がＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分および既知のリガンドの添加の後の時点で添加される請求項１記載の方法。
【請求項１１】
フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と既知のリガンドとの相互作用を抑制する化合物の同定方法であって、：
（ａ）既知のリガンドの存在下で、ＮＰ部分、ＶＰ３５部分およびＶＰ２４部分からなる群から選択される部分を発現するよう組換え処理された細胞に細胞透過性試験化合物を添加し、それにより反応混合物を生成し、
（ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
（ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の試験化合物がＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分と既知のリガンドとの相互作用を抑制するか否かを判定すること
を包含する方法。
【請求項１２】
前記ＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分が標識された請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記既知のリガンドが標識された請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記部分がＮＰ部分であり、既知のリガンドがＶＰ３５またはＶＰ２４である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記部分がＶＰ３５部分であり、既知のリガンドがＮＰまたはＶＰ２４である請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記部分がＶＰ２４部分であり、既知のリガンドがＶＰ３５またはＮＰである請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記試験化合物がＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチド断片である請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記試験化合物がＮＰのグリコシル化ドメインに対応するペプチド断片である請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の相互作用を抑制する化合物の同定方法であって、：
（ａ）ＮＰ部分、ＶＰ３５部分およびＶＰ２４部分からなる群から選択される部分を含有する反応混合物に試験化合物を添加し、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応混合物を生成し、
（ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
（ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の試験化合物がＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分がヌクレオキャプシドを形成する相互作用を抑制するか否かを判定すること
を包含する方法。
【請求項２０】
フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の、ＮＰのグリコシル化を抑制する化合物の同定方法であって、：
（ａ）ＮＰ部分を含有する反応混合物に試験化合物を添加し、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応混合物を生成し、
（ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
（ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、試験化合物がＮＰ部分のグリコシル化を抑制するか否かを判定すること
を包含する方法。
【請求項２１】
フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の相互作用を抑制する化合物の同定方法であって、：
（ａ）ＮＰ部分、ＶＰ３５部分およびＶＰ２４部分からなる群から選択される部分を発現するよう組換え処理された細胞に細胞透過性試験化合物を添加し、それにより反応混合物を生成し
（ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
（ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の試験化合物がＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分がヌクレオキャプシドを形成する相互作用を抑制するか否かを判定すること
を包含する方法。
【請求項２２】
フィロウイルスヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の、ＮＰのグリコシル化を抑制する化合物の同定方法であって、：
（ａ）ＮＰ部分を発現するよう組換え処理された細胞に細胞透過性試験化合物を添加し、それにより反応混合物を生成し、
（ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
（ｃ）試験化合物の非存在下での細胞と比較して、試験化合物がＮＰ部分のグリコシル化を抑制するか否かを判定すること
を包含する方法。
【請求項２３】
前記ＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分が標識された請求項１９または２１記載の方法。
【請求項２４】
前記部分がＮＰ部分である、請求項１９または２１記載の方法。
【請求項２５】
前記部分がＶＰ３５部分である、請求項１９または２１記載の方法。
【請求項２６】
前記部分がＶＰ２４部分である、請求項１９または２１記載の方法。
【請求項２７】
前記試験化合物がＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチド断片である請求項１９または２１記載の方法。
【請求項２８】
前記試験化合物はＮＰのグリコシル化ドメインに対応するペプチド断片である請求項２０または２２記載の方法。
【請求項２９】
フィロウイルス感染の治療方法であって、請求項１〜２８のいずれか一項の方法により同定される治療的有効量の化合物を被験体に投与することを包含する方法。
【請求項３０】
フィロウイルス感染の治療のための医薬品の調製のための請求項１〜２８のいずれか一項の方法により同定される化合物の使用。
【請求項３１】
請求項１〜２８のいずれか一項の方法により同定される化合物。
【請求項３２】
ヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補のＮＰの相互作用を抑制する化合物の同定方法であって、ＮＰがパラミキソウイルス、センダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アレナウイルス、ボルナウイルス、ブンヤウイルス、オルトミキソウイルス、インフルエンザウイルスおよびラブドウイルスからなる群から選択されるウイルスのヌクレオキャプシドを構成し、：
ａ）ＮＰ部分を含有する反応混合物に試験化合物を添加し、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応混合物を生成し、
ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、ヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の試験化合物が、ＮＰ部分がヌクレオキャプシドを形成する相互作用を抑制するか否かを判定すること、
を包含する方法であって、
ＮＰが、パラミキソウイルス、センダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アレナウイルス、ボルナウイルス、ブンヤウイルス、オルトミキソウイルス、インフルエンザウイルスおよびラブドウイルスからなる群から選択されるウイルスのヌクレオキャプシドを構成する、方法。
【請求項３３】
ヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の、ＮＰのグリコシル化を抑制する化
合物の同定方法であって、ＮＰがパラミキソウイルス、センダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アレナウイルス、ボルナウイルス、ブンヤウイルス、オルトミキソウイルス、インフルエンザウイルスおよびラブドウイルスからなる群から選択されるウイルスのヌクレオキャプシドを構成し、：
ａ）ＮＰ部分を含有する反応混合物に試験化合物を添加し、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応混合物を生成し、
ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、試験化合物がＮＰのグリコシル化を抑制するか否かを判定すること、
を包含する方法であって、
ＮＰが、パラミキソウイルス、センダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アレナウイルス、ボルナウイルス、ブンヤウイルス、オルトミキソウイルス、インフルエンザウイルスおよびラブドウイルスからなる群から選択されるウイルスのヌクレオキャプシドを構成する、方法。
【請求項３４】
ヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の、ＮＰの相互作用を抑制する化合物の同定方法であって、ＮＰがパラミキソウイルス、センダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アレナウイルス、ボルナウイルス、ブンヤウイルス、オルトミキソウイルス、インフルエンザウイルスおよびラブドウイルスからなる群から選択されるウイルスのヌクレオキャプシドを構成し、：
ａ）ＮＰ部分を発現するよう組換え処理された細胞に細胞透過性試験化合物を添加し、それにより反応混合物を生成し、
ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、ヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の試験化合物が、ＮＰ部分がヌクレオキャプシドを形成する相互作用を抑制するか否かを判定すること、
を包含する方法であって、
ＮＰが、パラミキソウイルス、センダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アレナウイルス、ボルナウイルス、ブンヤウイルス、オルトミキソウイルス、インフルエンザウイルスおよびラブドウイルスからなる群から選択されるウイルスのヌクレオキャプシドを構成する、方法。
【請求項３５】
ヌクレオキャプシドの構築を抑制するための候補の、ＮＰのグリコシル化を抑制する化合物の同定方法であって、ＮＰがパラミキソウイルス、センダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アレナウイルス、ボルナウイルス、ブンヤウイルス、オルトミキソウイルス、インフルエンザウイルスおよびラブドウイルスからなる群から選択されるウイルスのヌクレオキャプシドを構成し、：
ａ）ＮＰ部分を発現するよう組換え処理された細胞に細胞透過性試験化合物を添加し、それにより反応混合物を生成し、
ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、試験化合物がＮＰのグリコシル化を抑制するか否かを判定すること、
を包含する方法であって、
ＮＰが、パラミキソウイルス、センダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アレナウイルス、
ボルナウイルス、ブンヤウイルス、オルトミキソウイルス、インフルエンザウイルスおよびラブドウイルスからなる群から選択されるウイルスのヌクレオキャプシドを構成する、方法。
【請求項３６】
請求項３２〜３５のいずれか一項の方法により同定される治療的有効量の化合物を被験体に投与することを包含するウイルス感染の治療方法。
【請求項３７】
ウイルス感染の治療のための医薬品の調製のための請求項３２〜３５のいずれか一項の方法により同定される化合物の使用。
【請求項３８】
請求項３２〜３５のいずれか一項の方法により同定される化合物。
【請求項３９】
多量体化に必要なＮＰのグリコシル化ドメインと実質的に相同であるグリコシル化ドメインを有するタンパク質のグリコシル化を抑制する化合物の同定方法であって、：
（ａ）ＮＰとの比較により同定されるＮＰ相同部分を含有する反応混合物に試験化合物を添加し、それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応混合物を生成し、
（ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
（ｃ）試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、試験化合物がＮＰ相同部分のグリコシル化を抑制するか否かを判定すること
を包含する方法。
【請求項４０】
多量体化に必要なＮＰのグリコシル化ドメインと実質的に相同であるグリコシル化ドメインを有するタンパク質のグリコシル化を抑制する化合物の同定方法であって、：
（ａ）ＮＰとの比較により同定されるＮＰ相同部分を発現するよう組換え処理された細胞に細胞透過性試験化合物を添加し、それにより反応混合物を生成し、
（ｂ）該反応混合物をインキュベートし、そして
（ｃ）試験化合物の非存在下での細胞と比較して、試験化合物がＮＰ相同部分のグリコシル化を抑制するか否かを判定すること
を包含する方法。
【請求項４１】
これらのタンパク質のグリコシル化による多量体化により媒介される疾患の治療方法であって、請求項３９または４０のいずれかの方法により同定される治療的有効量の化合物を被験体に投与することを包含する方法。
【請求項４２】
これらのタンパク質のグリコシル化による多量体化により媒介される疾患の治療のための医薬品の調製のための請求項３９または４０のいずれかの方法により同定される化合物の使用。
【請求項４３】
請求項３９または４０のいずれかの方法により同定される化合物。
【請求項４４】
Ｔａｕのグリコシル化を抑制する請求項４３記載の化合物。
【請求項４５】
ａ）ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４タンパク質、ならびに付加的にＶＰ４０タンパク質から成るフィロウイルスヌクレオキャプシド、および
ｂ）擬似粒子の表面に曝露されるフィロウイルスまたは非フィロウイルスタンパク質からの抗原または抗原性エピトープ
を含む擬似粒子。
【請求項４６】
前記抗原または抗原性エピトープが以下の：
ａ）感染性疾患に対する免疫応答を誘導するために適したタンパク質、
ｂ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するために適したタンパク質、および
ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するために適したタンパク質
からなる群から選択される請求項４５記載の擬似粒子。
【請求項４７】
請求項４５または４６の組成物を被験体に投与することを包含する免疫方法。
【請求項４８】
請求項４５または４６の組成物を被験体に投与することを包含する薬学的治療方法。
【請求項４９】
請求項４５または４６の組成物および許容可能な薬学的担体を含む医薬組成物。
【請求項５０】
請求項４５または４６の組成物およびアジュバントを含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、抗ウイルス薬として用いるための、ヌクレオキャプシド形成に必要とされる、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を抑制し、あるいはＮＰのグリコシル化を抑制する化合物の同定のためのアッセイに関する。本発明は、多量体化に必要とされるＮＰのグリコシル化ドメインと実質的に相同であるグリコシル化ドメインを有するタンパク質のグリコシル化を遮断する化合物の同定のためのアッセイにも関する。本発明はさらに、免疫原性または予防接種目的のための抗原または抗原性エピトープの提示のための擬似粒子（pseudo particle）に関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
エボラウイルス(Ebola viruses)は、エンベロープを有する、非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスであって、マールブルクウイルス(Marburg viruses)とともにフィロウイルスファミリーの唯２つの既知の種である（Sanchez, A. et al. 2001 in: Fields Virology, D.M. Knipe and P.M. Howley, eds. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkens, pp. 1279-1304）。エボラおよびマールブルクウイルスは、ヒトおよび非ヒト霊長類における出血熱の多数の致死的勃発に関連づけられてきた（Feldmann, H. and Klenk, H.-D. 1996 Adv Virus Res 47: 1-52）。フィロウイルスは、疾患の初期段階中に単球／マクロファージならびに繊維芽細胞中で急速に複製する（Geisbert, T.W. et al. 1992 J Comp Path 106: 137-152; Feldmann, H. et al. 1996 J Virol 70: 2208-2214）。それらは内皮細胞にも感染し、そして内皮細胞の大量損失と結び付けて考えられるエボラ糖タンパク質の蓄積は、疾患の後期段階の間のその病原性に重要な役割を果たす（Schnittler, H.J. et al. 1993 J Clin Invest 91: 1301-1309; Yang, Z.-Y. et al. 1998 Science 282: 843; Yang, Z.-Y. et al. 2000 Nat Med 6: 886-889）。エボラウイルスには十分に実証された４つのサブタイプが存在する：すなわちエボラ−ザイール、エボラ−スーダン、エボラ−レストン（Geisbert, T.W. and Jahrling, P.B. 1995 Virus Res 39: 129-150）およびエボラ−コートデュボアール（Leguenno, B. et al. 1995 Lancet 345: 1271-1274）である。例えば近年ではウガンダのグル地区(Gulu)における、そして現在ではガボンにおけるような新規の勃発が依然として出現中である。
【０００３】
エボラビリオンは、７５〜８０ｎｍの均一直径を有し、長さ約９７０ｎｍの糸状形態で、ピーク感染力を示す（Geisbert, T.W. and Jahrling, P.B. 1995 Virus Res 39: 129-150）。宿主細胞膜由来と推定されるエンベロープは、直径４５〜６０ｎｍのヌクレオキャプシドを結合し、そして表面スパイクは時々ウイルスエンベロープから突出して観察される（Geisbert, T.W. and Jahrling, P.B. 1995 Virus Res 39: 129-150）。１９ｋｂマイナス一本鎖ＲＮＡゲノムは、７つのウイルスタンパク質：核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質（ＶＰ）２４、ＶＰ３０、ＶＰ３５、ＶＰ４０、糖タンパク質（ＧＰ）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）をコードする（Feldmann, H. et al. 1992 Virus Res 24: 1-19; Sanchez, A. et al. 1993 Virus Res 29: 215-240）。
【０００４】
限定数のエボラウイルスオープンリーディングフレームにもかかわらず、ウイルス構築およびエボラウイルス複製の制御についてはほとんど分かっていない。複製は細胞質で起こり、そして新規のウイルス粒子の構築および出芽は形質膜で起こる、ということをいくつかの研究は示唆した（Feldmann, H. and Kiley, M.P. 1999 Curr Top Microbiol Immunol 235: 1-21; Feldmann, H. et al. 1996 J Virol 70: 2208-2214; Feldmann, H. and Klenk, H.-D. 1996 Adv Virus Res 47: 1-52）が、しかしながら溶菌性複製および細胞内
リポソームからの放出の可能性は排除され得ない。ワクシニアウイルスＴ７発現に基づいた人工複製系を用いたエボラおよびマールブルクウイルスの試験は、３つのタンパク質ＮＰ、ＶＰ３５およびＬがモノシストロン性ミニレプリコンの転写を支持し得る、ということを示した（Muhlberger, E. et al. 1998 J Virol 72: 8756-8764; Muhlberger, E. et al. 1999 J Virol 73: 2333-2342）。さらに近年、ウイルスゲノム断片および４つのｃＤＮＡ（ＮＰ、ＶＰ３５、ＶＰ３０およびＬ）由来の発現ベクターの組合せを用いて感染性エボラウイルスを生成するために、洗練された逆遺伝子系が利用された。この系は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでのウイルス細胞壊死性におけるＧＰの役割を分析するために用いられた（Volchkov, V.E. et al. 2001 Science 291: 1965-1969）。
【発明の開示】
【０００５】
［本発明への推移］
本報告では、エボラウイルス構築の分析は、７つのオープンリーディングフレームのうちの６つをコードするｃＤＮＡを用いて着手された。これらの発現ベクターの同時トランスフェクションは、細胞内ウイルス様粒子を生じた。ウイルス遺伝子産物およびこの過程に必要とされる生化学的相互作用が限定された。これらの結果は、細胞内のフィロウイルスの構築を調節する新規のメカニズムを示す。
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、抗ウイルス薬として用いるための、ヌクレオキャプシド形成に必要とされる、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を抑制し、あるいはＮＰのグリコシル化を抑制する化合物の同定のためのアッセイに関する。本発明は、多量体化に必要とされるＮＰのグリコシル化ドメインと実質的に相同であるグリコシル化ドメインを有するタンパク質のグリコシル化を遮断する化合物の同定のためのアッセイにも関する。本発明はさらに、免疫原性または予防接種目的のための抗原または抗原性エピトープの提示のための擬似粒子に関する。
【０００７】
［好ましい実施の形態の詳細な説明］
エボラウイルスは、その高率の複製を支持する７つのウイルス構造および調節タンパク質をコードするが、しかし感染細胞におけるこのウイルスのヌクレオキャプシド構築についてはほとんど分かっていない。本開示において、エボラウイルス粒子の形成のためには３つのウイルスタンパク質が必要であり、かつそれで十分であるということ、そして細胞内翻訳後修飾はこの過程を調節する、ということを本発明者らは報告する。他のウイルス配列の非存在下での核タンパク質（ＮＰ）およびビリオン関連タンパク質ＶＰ３５およびＶＰ２４の発現は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるトランスフェクト化２９３Ｔ細胞中のヌクレオキャプシドの自発性構築をもたらした。全長核タンパク質は、これらの複合体の形成に必要であり、そしてこれら３つのタンパク質の特異的生化学的相互作用がｉｎ
ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで実証された。面白いことに、核タンパク質の翻訳後修飾、例えばＯ−グリコシル化およびシアル化がそれらの相互作用のために必要であり、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらの生化学的相互作用を抑制する合成グリコシドが同定された。したがってエボラウイルスは、３つのウイルス遺伝子産物によりヌクレオキャプシド構築を指図し、そして細胞内翻訳後修飾に拠る。これらの結果はウイルス構築に関する調節の新規のメカニズムを実証し、そしてエボラウイルス療法およびワクチンの達成のための新しいアプローチを示す。
【０００８】
ヌクレオキャプシド形成に必要とされる、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を抑制するかまたはＮＰのグリコシル化を抑制する化合物に関するアッセイ
本発明は、ヌクレオキャプシド形成に必要とされる、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を抑制するかまたはＮＰのグリコシル化を抑制する化合物の同定および使用に関する。アッセイは、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の相互作用を抑制するか、あるいはＮＰと
の糖の共有結合を抑制し、ＮＰからの結合糖を除去し、または糖の生合成を抑制し、そして感染ウイルスの生成を中断する化合物を同定するために記載される。相対的に非毒性である、例えば良好な治療指数を表示する抑制化合物は、動物、例えばヒトにおけるウイルス感染の治療のための抗ウイルス薬として利用され得る。
【０００９】
考察を明快にするために、本発明は、フィロウイルスに関して下記の小節で説明される。しかしながら原理は他のウイルスに同様に適用されるが、この場合、これらのタンパク質の類似体、Ｎ（ＮＰ）およびＰタンパク質の相互作用が観察された。これらのウイルスとしては、フィラメントを生成し得るマイナス鎖ＲＮＡウイルスであるパラミキソウイルス（例えばセンダイウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルス）、アレナウイルス、ボルナウイルス、ブンヤウイルス、オルトミキソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）およびラブドウイルスが挙げられる。
【００１０】
スクリーニングアッセイ
以下のアッセイは、ヌクレオキャプシド構築を抑制する化合物を同定するよう意図される。本発明に従ってスクリーニングされ得る化合物としては、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と相互作用する（例えば結合する）か、あるいはＮＰのグリコシル化を遮断し、そしてヌクレオキャプシド構築を抑制する小有機分子、ペプチドおよびペプチド模倣物、ならびにＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインを模倣し、そして天然リガンドを結合し、「中和する」ための分子デコイ（molecular decoy）として作用するか、あるいはＮＰのグリコシル化ドメインを模倣する小有機分子、ペプチドおよびペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチド断片は競合し、これらのタンパク質の相互作用を抑制するか、あるいはグリコシル化ドメインに対応するペプチド断片は競合し、ＮＰのグリコシル化を抑制する。本発明に従って用いられ得る上記のスクリーニングアッセイで同定される抑制化合物としては、小有機分子、ペプチドおよびペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。アッセイは、例えば糖の受容体としてＮＰのドメインと競合することにより、あるいは糖結合のための部位を遮断することにより、あるいはヌクレオキャプシド構築部位を遮断することにより、あるいはヌクレオキャプシド構築のための基質としてタンパク質と競合することにより、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の相互作用を抑制する、あるいはＮＰのグリコシル化を抑制する化合物を同定するために用いられ得る。
【００１１】
ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と結合する化合物を同定するために用いられるアッセイの原理は、２つの構成成分を相互作用させ、結合させるために十分な条件下で、そして十分な時間、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４および試験化合物の反応混合物を調製し、したがって反応混合物中で除去されおよび／または検出され得る複合体を生成することを包含する。用いられるＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４種は、スクリーニングアッセイの目標によって変わり得る。例えば全長ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチド、あるいは全長ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を含有する融合タンパク質、あるいはアッセイ系における利益（例えばその結果生じる複合体等のラベリング、単離）をもたらすタンパク質またはポリペプチドに融合されたＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチドが利用され得る。
【００１２】
スクリーニングアッセイは、種々の方法で実行され得る。例えばこのようなアッセイを実行するための一方法は、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４タンパク質、ペプチドまたは融合タンパク質または試験物質を固相上に固定し、そして反応終了時に固相上に固定されたＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４／試験化合物複合体を検出することを包含する。このような方法の一実施形態では、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４反応体は固体表面に固定され、そして固定されない試験化合物は直接または間接的に標識され得る。
【００１３】
実際には、マイクロタイタープレートが固相として便宜的に利用され得る。固定構成成分は、非共有または共有結合により固定され得る。非共有結合は、タンパク質の溶液で固体表面を被覆し、乾燥することにより成し遂げられ得る。あるいは固定されるタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体は、固体表面にタンパク質を固定するために用いられ得る。表面は、予め調製され、そして保存され得る。
【００１４】
アッセイを実行するために、非固定化構成成分は固定構成成分を含有する被覆表面に付加される。反応完了後、非反応構成成分は、生成された任意の複合体が固体表面上に固定されたままであるような条件下で、（例えば洗浄により）除去される。固体表面上に固定された複合体の検出は、多数の方法で成し遂げられ得る。予め固定されなかった構成成分が予備標識される場合、表面上に固定された標識の検出は複合体が生成された、ということを示す。予め固定されなかった構成成分が予備標識されない場合、表面上に固定された複合体を検出するためには、例えば予め固定されなかった構成成分に特異的な標識抗体（抗体は、次に、直接的に標識されるか、または標識抗Ｉｇ抗体で間接的に標識され得る）を用いて、間接的標識が用いられ得る。
【００１５】
あるいは、例えば溶液中で生成された任意の複合体を固定するためのＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４タンパク質、ペプチドまたは融合タンパク質または試験化合物に特異的な固定化抗体を、ならびに固定複合体を検出するための考え得る複合体の他の構成成分に特異的な標識抗体を用いて、反応は液相中で実行され、反応生成物が非反応構成成分から分離され、そして複合体が検出され得る。
【００１６】
あるいは細胞ベースのアッセイは、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と相互作用する化合物を同定するために用いられ得る。この目的のために、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を発現する細胞株、あるいはＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を発現するよう（例えばＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４ｃＤＮＡのトランスフェクションまたは形質導入により）遺伝子組換え処理された細胞株（例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞等）が用いられ得る。細胞透過性試験化合物（cell-permeable test compound）と宿主細胞により発現されるＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４との相互作用は、天然リガンドとの比較または競合により確定され得る。
【００１７】
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために適した任意の方法は、ヌクレオキャプシド構築を抑制する化合物を同定するために用いられ得る。用いられ得る伝統的方法は、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と相互作用する溶解物中のタンパク質を同定するために細胞溶解物または細胞溶解物から得られるタンパク質ならびにＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時免疫沈降、架橋および同時精製である。このアッセイに関しては、用いられるＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４構成成分は、全長ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチド、あるいは全長ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を含有する融合タンパク質、あるいはタンパク質またはポリペプチドに融合されたＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチドであり得る。
【００１８】
ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と相互作用する高分子は、本考察の目的のために、「結合相手」（すなわちＮＰに関しては：ＶＰ３５またはＶＰ２４；ＶＰ３５に関しては：ＮＰまたはＶＰ２４；およびＶＰ２４に関しては：ＮＰまたはＶＰ３５）と呼ばれる。ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４とその単数または複数の結合相手との相互作用を抑制する化合物を同定するために用いられるアッセイ系の基本原理は、全長ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチド、あるいは全長ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を含有する融合タンパク質、あるいはタンパク質またはポ
リペプチドに融合されたＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチド、ならびに結合相手を含有する反応混合物を、２つを相互作用させ、結合させるために十分な条件下で、十分な時間、調製し、したがって複合体を生成することを包含する。抑制活性に関して化合物を試験するために、試験化合物の存在下および非存在下で、反応混合物が調製される。試験化合物は、最初に反応混合物中に含入されるか、あるいはＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分およびその結合相手の添加の後の時点で添加され得る。対照反応混合物は、試験化合物を伴わずに、またはプラセボとともにインキュベートされる。ＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分と結合相手との間の任意の複合体の生成が次に検出される。対照反応における、しかし試験化合物を含有する反応混合物中ではない複合体の生成は、化合物がＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と相互作用性結合相手との相互作用を妨害する、ということを示す。
【００１９】
ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４および結合相手の相互作用を抑制する化合物に関するアッセイは、異質または同質フォーマットで実行され得る。異質アッセイは、ＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分産物または結合相手を固相上に固定し、そして反応終了時に固相上に固定された複合体を検出することを包含する。同質アッセイでは、全反応が液相で実行される。いずれかのアプローチにおいて、反応体の添加の順序は、試験されている化合物についての異なる情報を得るために変更され得る。例えば競合により相互作用を抑制する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を実施することにより、すなわちＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分および相互作用性結合相手の前または同時に反応混合物に試験物質を添加することにより、同定され得る。あるいは予備生成（preformed）複合体を崩壊する試験化合物、例えば複合体から構成成分の１つを置換する高結合定数を有する化合物は、複合体が生成された後に反応混合物に試験化合物を添加することにより試験され得る。種々のフォーマットを、以下で簡単に説明する。
【００２０】
異質アッセイ系では、ＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分または相互作用性結合相手は固体表面上に固定されるが、一方、非固定化種は、直接または間接的に標識される。実際には、微小滴定プレートが便宜的に利用される。固定化種は、非共有または共有結合により固定され得る。非共有結合は、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４または結合相手の溶液で固体表面を被覆し、乾燥することにより簡単に成し遂げられ得る。あるいは固定される種に特異的な固定化抗体は、固体表面に当該種を固定するために用いられ得る。表面は予め調製され、そして保存され得る。
【００２１】
アッセイを実行するために、固定化種の相手は、試験化合物を用いてまたは用いずに、被覆表面に曝露される。反応完了後、非反応構成成分は除去され（例えば洗浄により）、そして生成された任意の複合体は固体表面上に固定されたままである。固体表面上に固定された複合体の検出は、多数の方法で成し遂げられ得る。非固定化種が予備標識される場合、表面上に固定された標識の検出は、複合体が生成されたということを示す。非固定化種が予備標識されない場合、表面上に固定された複合体を検出するためには、例えば最初に固定されなかった種に特異的な標識抗体（抗体は、次に、直接的に標識されるか、または標識抗Ｉｇ抗体で間接的に標識され得る）を用いて、間接的標識が用いられ得る。反応構成成分の添加の順序によって、複合体生成を抑制するか、または予備生成複合体を崩壊する試験化合物が検出され得る。
【００２２】
あるいは反応は、例えば溶液中で生成される任意の複合体を固定するための結合構成成分のうちの１つに特異的な固定化抗体、ならびに固定化複合体を検出するための他の相手に特異的な標識抗体を用いて、試験化合物の存在下または非存在下で液相中で実行され、反応生成物が非反応構成成分から分離され、そして複合体が検出され得る。さらにまた、液相への反応体の添加の順序によって、複合体を抑制するか、または予備生成複合体を崩壊する試験化合物が同定され得る。
【００２３】
本発明の代替的実施形態では、同質アッセイが用いられ得る。このアプローチでは、ＮＰ部分、ＶＰ３５部分またはＶＰ２４部分および相互作用性結合相手の予備生成複合体が調製されるが、この場合、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４またはその結合相手は標識されるが、しかし標識により生成されるシグナルは複合体の生成のためクエンチされる（例えば米国特許第４，１０９，４９６号（Rubenstein）（イムノアッセイのためにこのアプローチを利用する）参照）。予備生成複合体からの種の１つと競合し、それと置換する試験物質の添加は、バックグラウンドより以上のシグナルの生成を生じる。このようにして、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４／結合相手相互作用を崩壊する試験物質が同定され得る。
【００２４】
特定の一実施形態では、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４融合タンパク質は固定のために調製され得る。例えば全長ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４あるいはＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチドは、結果的に生じる融合タンパク質中にその結合活性が保持されるような方法で、融合ベクター、例えばｐＧＥＸ−５Ｘ−１を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いて発現され得る。相互作用性結合相手は、当該技術分野でルーチンに実行される方法を用いて精製され、モノクローナル抗体を産生するために用いられ得る。この抗体は、当該技術分野でルーチンに実行される方法により放射性同位体で標識され得る。異質アッセイでは、例えばＧＳＴ−ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４融合タンパク質がグルタチオン−アガロースビーズに固定され得る。次に、相互作用および結合を起こさせる方法で試験化合物の存在下または非存在下で、相互作用性結合相手が添加され得る。反応期間終了時に、非結合物質は洗い落とされ、そして標識モノクローナル抗体が系に添加されて、複合化構成成分に結合させられる。ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４および相互作用性結合相手間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズと依然として会合する放射能の量を測定することにより検出され得る。試験化合物による相互作用の上首尾の抑制は、測定放射能の低減を生じる。
【００２５】
あるいはＧＳＴ−ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４融合タンパク質および相互作用性結合相手は、固体グルタチオン−アガロースビーズの非存在下で液体中で一緒に混合され得る。試験化合物は、当該種が相互作用させられている間またはその後に添加され得る。次にこの混合物はグルタチオン−アガロースビーズに添加され、非結合物質が洗い落とされる。さらにまた、標識抗体を添加し、そしてビーズと会合した放射能を測定することにより、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４／結合相手相互作用の抑制の程度が検出され得る。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、全長タンパク質の代わりにＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の結合ドメインに対応するペプチド断片を用いて、これらの同一技法が用いられ得る。当該技術分野でルーチンに実行される任意数の方法を用いて、結合部位を同定し、単離し得る。これらの方法としては、タンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異誘発、ならびに同時免疫沈降アッセイにおける結合の崩壊に関するスクリーニングが挙げられるが、これらに限定されない。複合体中の第二種をコードする遺伝子における補償突然変異が次に選択され得る。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列分析は、相互作用的結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異を明示する。あるいは一タンパク質は、上記の方法を用いて固体表面に固定され、そしてトリプシンのようなタンパク質分解酵素で処理されていたその標識結合相手と相互作用させられ、結合させられる。洗浄後、結合ドメインを含む短い標識ペプチドは固体物質と会合したままであり、これは単離され、アミノ酸配列決定により同定され得る。さらにまた、細胞内結合相手をコードする遺伝子が利用可能であるため、短い遺伝子セグメントがタンパク質のペプチド断片を発現するよう組換え処理され、これは次に結合活性に関して試験され、精製され、または合成され得る。
【００２７】
例えばＧＳＴ−ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４融合タンパク質を作製し、そしてそれを
グルタチオンアガロースビーズに結合させることにより、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４は上記のように固体物質に固定され得るが、これらに限定されない。相互作用性結合相手は放射性同位体で標識され、タンパク質分解酵素、例えばトリプシンで切断される。次に切断産物は固定化ＧＳＴ−ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４融合タンパク質に添加されて、結合される。非結合ペプチドを洗い落とした後、結合相手結合ドメインを表す標識結合物質が溶離され、精製され、既知の方法によりアミノ酸配列に関して分析され得る。そのように同定されたペプチドは、合成的に製造されるか、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて適切な促通性タンパク質に融合され得る。
【００２８】
化合物、例えば上記の節に記載されたようなアッセイ法により同定された結合化合物（これらに限定されない）は、ヌクレオキャプシド構築を抑制する能力に関して試験され得る。細胞ベースの系が用いられ得る。このような系は、例えば組換えまたは非組換え細胞、例えばＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４遺伝子を発現する細胞株を含み得る。さらに、例えば化学的または表現型変化により測定した場合に、機能性ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４タンパク質を発現し、そして天然リガンド（例えば対応するＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４タンパク質）による会合に応答するよう遺伝子組換え処理された発現宿主細胞（例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞）は、アッセイにおける最終目的として用いられ得る。
【００２９】
付加的細胞スクリーニングおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ
本明細書中に記載されたアッセイは、遺伝子組換え処理された細胞により合成されるＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築あるいはＮＰのグリコシル化を測定するよう意図される。これらのアッセイは、細胞中でまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行され、そしてＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築あるいはＮＰのグリコシル化、ならびにヌクレオキャプシドの産生を抑制する物質を同定するために用いられ得る。本発明のアッセイにおいて、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４からなる群から選択されるタンパク質は、細胞中またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、試験物質と反応して、反応混合物を生成する。次に混合物は、ヌクレオキャプシド形成が抑制されるか否かを判定するためにインキュベートされる。一例では、ヌクレオキャプシドが形成されると、混合物は漸増的に濁るようになり、したがって混合物により屈折されまたは吸収された光の量を経時的に測定することにより、ヌクレオキャプシド形成率がモニタリングされ得る。結合の抑制は、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築をブロックし、そして感染性ウイルスの生成を抑制する試験物質の能力を示す。あるいはＮＰは、細胞中でまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、グリコシル化に関与するタンパク質グリコシル化酵素の存在下で、糖基または糖基の供与体と反応させられる。ＮＰ中への糖基の取込みは、グリコシル化の一指標である。試験物質による糖基の取込みの抑制は、ＮＰのグリコシル化をブロックし、そして感染性ウイルスの生成を抑制する試験物質の能力を示す。
【００３０】
本発明のアッセイでは、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築、ならびにＮＰのグリコシル化は種々の方法により検出され得る。例えばＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の結合、あるいはＮＰ中への糖基の取込みは、クロマトグラフィー法、例えばＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、あるいは電気泳動法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ（これらに限定されない）により確定されるような反応生成物の移動度の変化により検出され得る。さらに任意の基質、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４、あるいは糖基は、反応生成物中の標識の検出がＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築あるいはＮＰのグリコシル化の指標として用いられ得るよう、標識され得る。この目的のために、種々のシグナル発生化合物、例えば放射性標識（例えば3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、131Ｉ）、蛍光原性化合物、比色測定化合物、酵素等（これらに限定されない）は、当該技術分野で既知の標準代謝標識技法または化学的結合技法を用いて基質中に取り込まれ得る。基質に特異的な抗体は、反応生成物を単離しおよび／または捕獲するために用いられ
得る。固体支持体が利用される場合、反応体の１つは、非共有または共有結合により支持体の表面に固定され得る．例えば抗ＮＰ、抗ＶＰ３５または抗ＶＰ２４のようなタンパク質の固定は、タンパク質の溶液で支持体を被覆し、そして乾燥することにより成し遂げられ得る。被覆された支持体は、予め調製され、そして使用するまで保存され得る。
【００３１】
アッセイ構成成分
反応の構成成分を形成するＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４、あるいは糖基、糖基供与体またはタンパク質グリコシル化酵素は、種々の方法で生成され得る。
【００３２】
細胞スクリーニングアッセイは、任意にグリコシル化し得る細胞中のＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４からなる群から選択されるタンパク質を発現する遺伝子組換え処理された細胞を利用する。このような細胞または細胞株は、当業者に既知の技法を用いてＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４を発現するよう組換え処理され得る（例えばSambrook et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY参照）。このような細胞は、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築、またはＮＰのグリコシル化に必要な構成成分を全て提供し、そして本明細書中に記載されたように、標識ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４とともに、あるいは標識糖とともに、および／またはＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４あるいは糖に特異的な抗体（これらは細胞から反応生成物を回収するためにおよび／または検出のために用いられ得る）とともに用いられ得る。
【００３３】
ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４に特異的な抗体は、種々の既知の技法のいずれかにより調製され得る。好ましい一実施形態では、アッセイにおける抗体は、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築、あるいはＮＰのグリコシル化を妨害しないＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４のエピトープに向けられるべきである。
【００３４】
抗体の産生のために、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４またはそれらの部分を用いた注射により、種々の宿主動物が免疫感作され得る。このような宿主動物としては、２〜３挙げるとすればウサギ、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。宿主種によって、種々のアジュバント、例えばフロイント（完全および不完全）、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム  パルブム（これらに限定されない）が、免疫学的応答を増大するために用いられ得る。
【００３５】
モノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いることにより、調製され得る。これらの例としては、Kohler and Milstein, (1975 Nature 256: 495-497)により最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kosbor et al. 1983 Immunol Today 4: 72; Cote et al. 1983 PNAS USA 80: 2026-2030）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al. 1985 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技法（Morrison et al. 1984 PNAS USA 81: 6851-6855; Neuberger et al. 1984 Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985 Nature 314: 452-454）が用いられ得る。あるいは一本鎖抗体の産生に関して記載された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）は、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４に特異的な一本鎖抗体を産生するために適合され得る。
【００３６】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の技法により生成され得る。例えばこのような抗体としては、抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。あるいはＦａｂ発現ライブラリは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために構築され得る（Huse et al. 1989 Science 246: 1275-1281）。
【００３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのために、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４は、任意の組換え産生タンパク質を、あるいはグリコシル化のための基質としてＮＰを用いる場合には、グリコシル化のための必要なモチーフを有する任意のタンパク質を含み得る。後者の場合、このようなＮＰタンパク質としてはＮＰタンパク質が糖基の付加により翻訳後修飾されていない非処理ＮＰタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技法（例えばSambrook, 1989、上記、参照）を用いることにより、種々の原核生物発現系のいずれかにおいてＮＰ遺伝子をクローニングし、発現することにより、非処理ＮＰタンパク質が有益に得られる。このような原核生物系において発現されるＮＰタンパク質は、真核生物系における場合のようには、プロセシングされないしまたは翻訳後修飾されない。または、グリコシル化不可能な原核細胞系が発現宿主として用いられる。
【００３８】
あるいはＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４は、当該技術分野で既知の技法を用いて化学的に合成され得る（例えばCreighton 1983 Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., NY, Chapter 1参照）。
【００３９】
分子クローニング法により産生されるにしても、または化学合成法により産生されるにしても、本発明の細胞ベースのまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイに用いられ得るＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４のアミノ酸配列は、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の報告された配列と同一である必要はない。ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４は、アミノ酸残基が欠失、付加または置換されて、構築またはグリコシル化のための基質として役立つ機能的に等価の生成物を生じる変更された配列を含み得る。
【００４０】
例えば機能的に等価なアミノ酸残基は、配列内の残基の代わりに置換されて、配列の変更をもたらし得る。このような置換基は、アミノ酸が属するクラスの他の成員、例えば非極性（疎水性）アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン；極性中性アミノ酸、例えばグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン；正荷電（塩基性）アミノ酸、例えばアルギニン、リシンおよびヒスチジン；負荷電（酸性）アミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸から選択され得る。
【００４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに用いられるグリコシル化酵素は、種々の供給源から得ることができる。例えばグリコシル化酵素は、当業者に既知の精製計画を用いて、種々の哺乳動物細胞、組織または器官のいずれかから単離され得る。代替的にはグリコシル化酵素を発現する細胞の、あるいはグリコシル化酵素を発現する細胞、組織または器官の粗製溶解物またはその断片は、アッセイ系の一構成成分として利用され得る。あるいはグリコシル化酵素は、アミノ酸配列を、全部または一部、合成するための化学的方法を用いて生成され得る（例えば、Creighton, 1983,上記、pp. 34-49および50-60参照）。
【００４２】
細胞スクリーニングアッセイ
このアッセイは、構築またはグリコシル化のための基質を発現するよう組換え処理された細胞中の、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を抑制するか、あるいはＮＰのグリコシル化を抑制する化合物を検出する。好ましくは試験化合物は、細胞透過性である。一般
的操作は、試験化合物を細胞に添加することであって、それにより反応混合物を生成する、添加すること、結果を得るために十分な時間、反応混合物をインキュベートすること、および試験化合物の非存在下での細胞と比較して、試験化合物がＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築、あるいはＮＰのグリコシル化を抑制するか否かを判定することを包含する。
【００４３】
一実施形態では、ＮＰを発現するよう組換え処理された細胞に、試験化合物を用いてまたは用いずに、標識糖基または糖基の標識前駆体を添加し、細胞からＮＰを回収し、そして標識糖基または糖基の標識前駆体が回収されたＮＰ中に取り込まれたか否かを検出することにより、アッセイは実行される。糖基の標識前駆体の使用は、感染性ウイルス生成の選択的抑制が達成されるよう糖基の生合成を抑制し得る化合物の検出を可能にする。標識糖基または糖基の前駆体の使用は、感染性ウイルス生成の選択的抑制が達成されるようウイルスＮＰへの糖基の結合を抑制する化合物の検出を可能にする。糖基の標識前駆体または標識糖基は、ＮＰから糖基を除去し、感染性ウイルスの生成を抑制する化合物を検出するために用いられ得る。
【００４４】
別の実施形態では、試験化合物および標識糖基または糖基の標識前駆体は、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４を発現するよう組換え処理された細胞の培養に添加される。アッセイ系におけるこれらの細胞の使用は一利益を提供し、この場合、ヌクレオキャプシド構築の抑制も検定され得る。ＮＰを発現するが、しかしＶＰ３５またはＶＰ２４を発現しない遺伝子組換え処理された細胞の使用は、ＮＰのグリコシル化を抑制する化合物のみを同定する。
【００４５】
別の実施形態では、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４からなる群から選択されるタンパク質を発現するよう組換え処理された細胞に、試験化合物を添加し、細胞から組換え産生タンパク質を回収し、そして化合物が当該群の一成員を結合するか否かを検出することにより、アッセイは実行される。あるいは試験化合物は、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４からなる群から選択される３つの成員全てを発現するよう組換え処理された細胞の培養に添加される。アッセイ系におけるこれらの細胞の使用は、一利益を提供し、この場合、ヌクレオキャプシド構築の抑制も検定され得る。ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４からなる群から選択されるタンパク質を発現する遺伝子組換え処理された細胞の使用は、ＮＰのグリコシル化を抑制し、あるいはＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を結合する化合物のみを同定するが、しかしＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４からなる群から選択される３つの成員全てを発現する遺伝子組換え処理された細胞の使用は、ヌクレオキャプシド構築の抑制を同定する。
【００４６】
試験化合物および糖基または糖基の前駆体の添加の順序は変わり得る。例えば同時または逐次添加が実施され、異なる情報を提供し得る。例えば試験化合物の先の添加は、ＮＰのグリコシル化を防止する化合物を同定する。標識糖基の添加の後の試験化合物の添加は、ＮＰから糖を除去する化合物を同定するために用いられ得る。プラセボは対照に添加されるが、試験化合物は対照に添加されない。
【００４７】
適切な時間の後、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４は培養から単離される。これは、細胞を溶解し、抗ＮＰ抗体、抗ＶＰ３５抗体または抗ＶＰ２４抗体、例えば捕獲しそして固定する固定化抗体を用いて、溶解物からＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を単離することにより成し遂げられ得る。この系は、試験化合物の迅速高処理量スクリーニングを可能にする。あるいはＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４は、免疫沈降または免疫電気泳動（例えばウエスタンブロット）により溶解物から単離され得る。
【００４８】
次に、単離ＮＰ中に取り込まれた標識糖基の存在または非存在が検出される。試験化合
物がウイルスＮＰのグリコシル化を防止し得る場合、ＮＰは標識糖基を取り込まず、アッセイは標識の取込みの非存在により採点される。試験化合物がＮＰグリコシル化を抑制しない場合、タンパク質は標識を取り込み、そして標識タンパク質は上記のような技法により検出される。
【００４９】
別の実施形態では、試験化合物と単離ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４との結合の存在または非存在が検出される。試験化合物がウイルスＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と結合し得る場合、アッセイはこのような結合の存在により採点される。試験化合物がウイルスＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と結合しない場合、上記のような技法により、非結合タンパク質が検出される。
【００５０】
別の実施形態では、ヌクレオキャプシド構築の存在または非存在が検出される。試験化合物がＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を防止し得る場合、上記のような技法により、非結合タンパク質が検出される。試験化合物がＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を抑制しない場合、アッセイはヌクレオキャプシドの形成により採点される。
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ
本アッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を抑制し、あるいはＮＰのグリコシル化を抑制する化合物を検出する。一般原理は、反応混合物に試験化合物を添加すること、結果を得るために十分な時間、反応混合物をインキュベートすること、および試験化合物の非存在下での反応混合物と比較して、試験化合物がＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築、あるはＮＰのグリコシル化を抑制するか否かを判定することを包含する。
【００５２】
一実施形態では、ＮＰおよび酵素を含有する反応混合物に、試験化合物を用いてまたは用いずに、標識糖基を添加し、細胞からＮＰを回収し、そして標識糖基が回収されたＮＰ中に取り込まれたか否かを検出することにより、アッセイは実行される。
【００５３】
別の実施形態では、試験化合物および標識糖基は、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４ならびに酵素を含有する反応混合物に添加される。アッセイ系におけるこの反応混合物の使用は一利益を提供し、この場合、ヌクレオキャプシド構築の抑制も検定され得る。ＮＰを含有するが、しかしＶＰ３５またはＶＰ２４を含有しない反応混合物の使用は、ＮＰのグリコシル化を抑制する化合物のみを同定する。
【００５４】
別の実施形態では、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４からなる群から選択されるタンパク質を含有する反応混合物に試験化合物を添加し、細胞から組換え産生タンパク質を回収し、そして化合物が当該群の一成員を結合するか否かを検出することにより、アッセイは実行される。あるいは試験化合物は、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４からなる群から選択される３つの成員全てを含有する反応混合物に添加される。アッセイ系におけるこれらの反応混合物の使用は一利益を提供し、この場合、ヌクレオキャプシド構築の抑制も検定され得る。ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４からなる群から選択されるタンパク質を含有する反応混合物の使用は、ＮＰのグリコシル化を抑制し、あるいはＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を結合する化合物のみを同定するが、しかしＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４からなる群から選択される３つの成員全てを含有する反応混合物の使用は、ヌクレオキャプシド構築の抑制を同定する。
【００５５】
細胞ベースのアッセイ系で説明したように、反応体に応じた試験化合物の添加の順序は、グリコシル化を抑制または防止することにより作用する化合物、ならびにＮＰから糖を崩壊するかまたは除去するものを区別するために変更され得る。
【００５６】
適切な時間の後、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４は反応混合物から単離される。これは、抗ＮＰ抗体、抗ＶＰ３５抗体または抗ＶＰ２４抗体、例えば捕獲しそして固定する固定化抗体を用いて、反応混合物からＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を単離することにより成し遂げられ得る。この系は、試験化合物の迅速高処理量スクリーニングを可能にする。あるいはＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４は、免疫沈降または免疫電気泳動（例えばウエスタンブロット）により反応混合物から単離され得る。
【００５７】
次に、単離ＮＰ中に取り込まれた標識糖基の存在または非存在が検出される。試験化合物がウイルスＮＰのグリコシル化を防止し得る場合、ＮＰは標識糖基を取り込まず、アッセイは標識の取込みの非存在により採点される。試験化合物がＮＰグリコシル化を抑制しない場合、タンパク質は標識を取り込み、そして標識タンパク質は上記のような技法により検出される。
【００５８】
別の実施形態では、試験化合物と単離ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４との結合の存在または非存在が検出される。試験化合物がウイルスＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と結合し得る場合、アッセイはこのような結合の存在により採点される。試験化合物がウイルスＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４と結合しない場合、上記のような技法により、非結合タンパク質が検出される。
【００５９】
別の実施形態では、ヌクレオキャプシド構築の存在または非存在が検出される。試験化合物がＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を防止し得る場合、上記のような技法により、非結合タンパク質が検出される。試験化合物がＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の構築を抑制しない場合、アッセイはヌクレオキャプシドの形成により採点される。
【００６０】
本発明のさらに別の実施形態では、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４は試験化合物の添加の前に固定され得る。この目的のために、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の溶液を用いて、固体支持体を被覆し得る。あるいは抗体は、ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４を固定するよう、支持体を被覆するために用いられ得る。試験化合物の存在下で標識糖を取り込む固定化ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の能力は、タンパク質による標識の保持により採点される。あるいは標識試験化合物を結合する固定化ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の能力は、結合アッセイにおいて採点される。標識ＮＰ、ＶＰ３５またはＶＰ２４の存在または非存在は、固定化構成成分のオートラジオグラフィー分析により検出される。試験化合物の評価は、試験化合物が添加されない対照実験に対する参照による。
【００６１】
ウイルス構築を抑制する化合物を用いたフィロウイルス感染の治療
ＮＰグリコシル化またはウイルスヌクレオキャプシド構築を抑制する特定の化合物は、治療的有効用量で患者に投与され得る。治療的有効用量とは、ウイルス感染の症候の改善を生じるために十分な化合物の量を指す。
【００６２】
このような化合物の毒性および治療的効力は、例えばＬＤ50（集団の５０％に対して致死である用量）およびＥＤ50（集団の５０％において治療的に有効である用量）を確定するために、細胞培養または実験動物において、標準薬学的手法により確定され得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それは比ＬＤ50／ＥＤ50として表され得る。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が用いられ得るが、しかし非感染細胞に対する損害を最小限にし、そして副作用を低減するために、感染の部位に対してこのような化合物を標的化する送達系を意図するよう注意が払われるべきである。
【００６３】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトに用いるための一連の投与量を処方する場合に用いられ得る。このような化合物の投与量は、好ましくは毒性をほ
とんどまたは全く伴わずにＥＤ50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。本発明の方法に用いられる任意の化合物に関しては、治療的有効用量は細胞培養アッセイから最初に概算され得る。用量は、細胞培養中で確定されるようなＩＣ50（すなわち半最大感染(half-maximal infection)または半最大抑制(half-maximal inhibition)を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルに置いて処方され得る。このような情報を用いて、ヒトにおけるより有用な用量をより精確に確定し得る。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【００６４】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を用いて、慣用的方法で処方され得る。
【００６５】
したがって、治療用化合物ならびにそれらの生理学的に許容可能な塩および溶媒和物は、吸入または吹入（口または鼻を通して）による投与のために、あるいは経口、口腔粘膜、非経口または直腸投与のために処方され得る。
【００６６】
吸入による投与のためには、本発明に従って用いるための化合物は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切な気体の使用を伴って、加圧パックまたは噴霧器からのエーロゾル噴霧提示の形態で便利に送達される。加圧エーロゾルの場合、投与量単位は、測定量を送達するための弁を提供することにより確定され得る。吸入器または散布器中に用いるための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、治療用化合物および適切な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含入して処方され得る。
【００６７】
経口投与のためには、医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば結合剤（例えば前ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えばラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）あるいは湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を伴って、慣用的手段により調製される例えば錠剤またはカプセルの形態をとり得る。錠剤は、当該技術分野で既知の方法により被覆され得る。経口投与のための液体調製物は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとるか、あるいはそれらは使用前に水またはその他の適切なビヒクルを用いた構成のための乾燥製品として提示され得る。このような液体調製物は、薬学的に許容可能な添加剤、例えば沈殿防止剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）、乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）、非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）ならびに防腐剤（例えばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）を伴って、慣用的手段により調製され得る。調製物は、適切な場合には、緩衝塩、風味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。
【００６８】
経口投与のための調製物は、活性化合物の制御放出を生じるよう適切に処方され得る。
【００６９】
口腔粘膜投与のためには、組成物は、慣用的方法で処方される錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。
【００７０】
治療用化合物は、注射により、例えば静脈内ボーラス(bolus injection)または連続注入により、非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、単位剤形で、例えばアンプル中に、または頻回用量容器中で、添加防腐剤を伴って提示され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態をとり得るし、処
方用作用物質、例えば沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤を含有し得る。あるいは活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌発熱物質無含有水を用いて構成するために、粉末形態であり得る。
【００７１】
治療用化合物は、直腸組成物中に、例えば慣用的座薬基剤、例えばココアバターまたはその他のグリセリドを含有する例えば座薬または保留浣腸中に処方され得る。
【００７２】
上記の処方物のほかに、化合物は、デポー調製剤としても処方され得る。このような長期作用処方物は、移殖により（例えば皮下または筋肉内に）、あるいは筋肉内注射により投与し得る。したがって例えば治療用化合物は、適切な高分子または疎水性物質（例えば許容可能な油中のエマルション）、あるいはイオン交換樹脂とともに、あるいは難溶性（sparingly soluble)可溶性誘導体として、例えば難溶性塩として処方され得る。
【００７３】
組成物は、所望により、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサー装置中に提示し得る。パックは、例えば金属またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための使用説明書を添付され得る。
【００７４】
多量体化に必要なＮＰのグルコシル化ドメインと実質的に相同であるグルコシル化ドメインを有するその他のタンパク質のグリコシル化を抑制する化合物に関するアッセイ
別の実施形態では、本発明は、多量体化に必要なＮＰのグルコシル化ドメインと実質的に相同であるグルコシル化ドメインを有するその他のタンパク質（例えばＴａｕ）のグリコシル化を抑制する化合物の同定および使用に関する。ＮＰのグリコシル化を抑制する化合物を同定するための上記のアッセイは、これらのその他のタンパク質（例えばＴａｕ）のグリコシル化を抑制する化合物を同定するために同様に適用され得る。相対的に非毒性である、例えば良好な治療指数を表示する抑制化合物は、動物、例えばヒトにおけるこれらのタンパク質（例えばＴａｕ）のグリコシル化による多量体化により媒介される疾患（例えば神経変性疾患）の治療のための作用物質として利用され得る。
【００７５】
本明細書中で用いる場合、２つのタンパク質（あるいはタンパク質の一領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約１５〜２０％、２０〜５０％、５０〜７０％、典型的には少なくとも約７０〜７５％、さらに典型的には少なくとも約８０〜８５％、最も典型的には少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上相同である場合、実質的に相同である。実際問題として、任意の特定のポリペプチド（またはポリペプチドの一領域）が、例えばGenBank寄託番号ＡＦ２７２００１で示されるＮＰのアミノ酸配列（またはアミノ酸配列の一領域）と実質的に相同であるか否かは、既知のコンピュータープログラム、例えばベクターＮＴＩアラインメントを用いてデフォルトパラメーター下で比較することにより、慣用的に判定され得る。
【００７６】
エボラＮＰ（GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１）とヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（GenBank寄託番号ＡＡＡ５１６０９）との比較は、ＮＰのグリコシル化ドメインはＴａｕ、図７で示される領域と実質的に相同である、ということを明示する。相同領域は、ＮＰのアミノ酸４０１〜７３９およびＴａｕのＣ末端ドメインである。比較は、Ｔａｕ−ＢＣ０００５５８との約１８．２％相同性および１１．３％同一性を示す。したがってＮＰ中のグリコシル化ドメインと実質的に相同である配列が、ヒトＴａｕ中に存在する。その結果として、本発明は、Ｔａｕにより媒介される疾患、例えば神経変性疾患、例えばアルツハイマー病のようなこれらのタンパク質のグリコシル化による多量体化により媒介される疾患の治療に用いるために多量体化に必要とされるＮＰのグリコシル化ドメインと実質的に相同であるグリコシル化ドメインを有するＴａｕのようなタンパク
質のグリコシル化を遮断する化合物の同定のためのアッセイにも関する。
【００７７】
エボラウイルス構築のメカニズム
エボラウイルスヌクレオキャプシドの構築は、ビリオン会合タンパク質３５および２４ならびに核タンパク質の翻訳後修飾を要する。
【００７８】
組換えｃＤＮＡからのヒト２９３細胞中のエボラの構築
エボラキャプシドが適切な組換えウイルスｃＤＮＡ遺伝子産物を発現する細胞株中で構築し得るか否かを判定するために、多ウイルス遺伝子をコードする発現ベクターを、高トランスフェクト性２９３ヒト腎臓上皮細胞株中に同時トランスフェクトした。それぞれエボラＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０およびＶＰ２４をコードする６つのプラスミド（図１Ａ）が同時トランスフェクトされた場合、細胞内エボラウイルス様粒子の実質的蓄積がＴＥＭにより観察された（図１Ｂ）。十分に生成された管状ウイルスヌクレオキャプシドの凝集物が、トランスフェクト細胞の細胞質内に観察された。構造は、ベロ細胞から生成される感染性ビリオンと同様である（Geisbert, T.W. and Jahrling, P.B. 1995 Virus Res 39: 129-150）。
【００７９】
ＮＰ、ＶＰ３５、ＶＰ３０およびＶＰ２４の同時発現は、横断切片における糸状鎖の、あるいは縦断切片における束状六量体の存在により立証されるように、キャプシド形成を支持する能力を保持した（図１Ｃ、Ｄ）。粒子の長さは、１〜４μｍの範囲であった（図１Ｃ）。横断直径は、前の微細構造研究に記載されたエボラウイルスの直径と同様に、均一で約４５〜５０ｎＭ（図１Ｄ）であるように見えた（Geisbert, T.W. and Jahrlng, P.B. 1995 Virus Res 39: 129-150; Zaki, S.R. and Goldsmith, C.S. 1999 in: Current Topics in Microbiology and Immunology, H.-D. Klenk, ed. New York: Springer, pp. 97-116）。細胞からのマイナス鎖ウイルスゲノムＲＮＡおよびウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）の非存在は、それらがエボラヌクレオキャプシドの形成に不可欠でない、ということを示した。
【００８０】
ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４はエボラ構築に必要かつ十分である
キャプシド構築に関する最小遺伝子要件を調べるために、ウイルス遺伝子の異なる組合せを、トランスフェクション試験において系統的に分析した。ヌクレオキャプシド構造の形成は、ＶＰ２４、ＶＰ３５またはＮＰの非存在下では起きなかった（表１）。遺伝子産物単独も、２つの支持構築の任意の組合せも、３つのタンパク質全てがキャプシド構築に必要であることを示さなかった（表１）。その他の同時トランスフェクト化遺伝子の存在下または非存在下で同様なレベルのＮＰが検出されたが、このことは、ＮＰタンパク質発現がキャプシド構築に十分でないことを示唆した。
【００８１】
【表１】
2005533111.tif 000003
【００８２】
ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中のエボラキャプシドを特性化するために、浮遊密度勾配沈降を本発明者らは実施した。予備生成ヌクレオキャプシドコアはトランスフェクト細胞から出芽できなかったが、しかし凍結、解凍したトランスフェクト化２９３Ｔ細胞から放出された（図２Ａ）。３回の凍結−解凍サイクル後に得られた清澄化細胞溶解物の勾配からの画分をウエスタンブロット分析により分析し、そして活性のピークを１．１６〜１．１８ｇ／ｍｌの密度で検出した（図２Ｂ、レーン１１）が、これは、１．１４ｇ／mlの前に記載された無傷ビリオン（Kiley, M.P. et al. 1988 J Gen Virol 69: 1956-1967）に匹敵し、しかしわずかに低浮遊性であった。この分析により、ＮＰおよびＶＰ３５は粒子中の主要構成成分であることが判明し、ＶＰ２４は粒子形成を触媒するがしかし依然としてより弱く会合されたままである、という可能性を生じた（図２Ｂ、レーン１〜１３）。この知見は、ヌクレオキャプシドを単離するために用いられた精製マールブルクウイルスに関するものと同様である（Becker, S. et al. 1998 Virology 249: 406-417）。
【００８３】
粒子形成におけるＮＰの特定ドメインの役割
欠失突然変異を用いることにより、エボラキャプシド構築に関するＮＰ遺伝子中の特定ドメインの役割を分析した（図２Ｃ）。これらのＮＰ突然変異体の発現は、ウエスタンブロッティングにより確証された（図２Ｄ）。比較可能レベルのタンパク質合成にもかかわらず、ＮＰ  ＮＨ2末端および中間領域の欠失はキャプシド構築を廃止し、そしてＣＯＯＨ末端からの２３４個のアミノ酸の除去は、構築キャプシドの形状を修飾した（図２Ｅ、左）が、このことは、ＮＰコード領域のほとんどが粒子形成に不可欠であることを示す。
【００８４】
ＮＰの翻訳後修飾はＮＰ−ＶＰ３５相互作用に必要である
ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４間の相互作用を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳後のこれらのタンパク質の同時免疫沈降により検査した。ＶＰ３５およびＶＰ２４を、抗ＮＰ抗体を用いて同時免疫沈降し得た（図３Ａ、レーン６〜８）が、このことは、ＮＰが２つのタンパク質と直接相互作用することを示す。ＶＰ２４は、ＮＰおよびＶＰ３５とｉｎ  ｖｉｔｒｏでより弱く同時免疫沈降し（図３Ａ、レーン６）、そしてそれは浮遊密度沈降
画分中でそれらと同時分布しなかった（図２Ｂ）が、このことは、それがキャプシド形成中のＮＰ−ＶＰ３５複合体の生成に重要な役割を果たし得るが、しかしウイルスキャプシド中に安定的に取り込まれる場合のようではありえない、ということを示唆する。
【００８５】
エボラＮＰ遺伝子は８３ｋＤａの算定分子量を有する７３９個のアミノ酸をコードするが、しかしＳＤＳ−ＰＡＧＥによるその移動は、約１１５ｋＤａの分子量と一致する。タンパク質はその見掛けの分子量（ＭＷ）をわずかに増大し得るリン酸化を受け得るが、しかし別の修飾、例えばグリコシル化がこの大きなサイズ差を説明する可能性が存在した（Elliott, L.H. et al 1985 Virology 147: 169-176; Kiley, M.P. et al. 1988 J Gen Virol 69: 1956-1967; Becker, S. et al. 1994 J Gen Virol 75: 809-818）。Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）は、真核生物細胞の核および細胞質中に見出されている。ウサギ網状赤血球溶解物は、翻訳化産物を効率的にグリコシル化するために十分な酵素および補因子を含有する（Starr, C.M. and Hanover, J.A. 1990 J Biol Chem 265: 6868-6873; Roquemore, E.P. et al. 1994 Meth Enzymol 230: 443-460）。網状赤血球および大腸菌発現系から翻訳されたＮＰはそれらの電気泳動移動度が異なるに違いない、と本発明者らは仮定した。この仮説を試験するために、本発明者らはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を実施し、そしてＮＰ翻訳後修飾、ならびにＶＰ３５およびＶＰ２４とのその相互作用を分析した。予測どおり、網状赤血球系において翻訳されたＮＰは、大腸菌Ｓ３０系から翻訳されたものより高いＭＷ（≧２０ｋＤａ）を有したが、しかし両ＮＰは抗ＮＰ血清と免疫沈降し得た（図３Ｂ、レーン１３、１４）。しかしながら網状赤血球系由来のＮＰはＶＰ３５と同時沈降し得たが、一方、大腸菌Ｓ３０抽出物から翻訳されたＮＰはＶＰ３５と相互作用しなかった（図３Ｃ、レーン１７、１９、２１）。これらの知見は、ＮＰが翻訳後修飾により広範に変更され、そしてこの変化は粒子形成に必要とされるＮＰとＶＰ３５およびＶＰ２４の相互作用に必要である、ということを示唆する。
【００８６】
脱グリコシル化酵素を用いて、トランスフェクト化２９３細胞からのＨｉｓ−タグ化精製ＮＰを消化した。処理後、ＮＰの移動が変更され、そしてポリクローナル抗ＮＰ抗血清により検出した場合、８５ｋＤａの分子量と一致する顕著な帯域がゲル上に出現した（図４Ａ、レーン３、５）。この作用は、変性および非変性条件下の両方で観察された。さらなる分析は、α２−３，６，８，９ノイラミニダーゼ単独による処理が同様の作用を生じ得ることを示した（図４Ｂ、レーン７）が、このことは、末端シアル酸を含有する糖の存在を示す。付加的低分子量帯域の存在は、考え得る夾雑、または消化反応におけるその他の酵素、例えばプロテアーゼに対する感受性を示唆する。Ｎ−アセチルグルコシダーゼまたはＮ−グルコシダーゼによる処理は、ノイラミニダーゼにより生成される帯域のサイズを低減できなかった。ＮＰ−トランスフェクト化２９３細胞がツニカマイシンおよびデオキシマンノジュリマイシン（ｄＭＭ）とともにインキュベートされた場合、作用は観察されず、この帯域の移動はエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの消化後に変化しなかったが、このことは、ＮＰがＮ−結合されたというよりむしろ、主にＯ−グリコシル化されたことを示唆する（図４Ｂ、レーン９〜１１）。この知見はさらにまた、ツニカマイシンを用いたＮＰ−トランスフェクト化２９３細胞の処理によりｉｎ  ｖｉｖｏで確証されたが、この場合、ＮＰの合成はＨＩＶｇｐ１６０の発現を廃止する濃度で影響を及ぼされなかった（図４Ｃ）が、これは、高度のＮ結合グリコシル化を示す。さらに４つのコンセンサスＮ結合グリコシル化部位の点突然変異は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＮＰ移動を変えなかった。
【００８７】
3Ｈ−グルコサミンラベリングによりＮＰのグリコシル化をさらに確証した。グルコサミンは、細胞によりＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（シアル酸）およびＮ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に転化される。トランスフェクト細胞中のＮＰは、3Ｈ−チミジンより５３倍および１８倍高いレベルで3Ｈ−グルコサミンおよび3Ｈ−ガラクトースを取り込んだ（図４Ｄ、左パネル）。銀
染色により検出されたＮＰタンパク質の匹敵レベルにもかかわらず（図４Ｄ、右、レーン４）、これらの標識は、3Ｈ−チミジンに対比して、ＮＰに対する抗体を用いて免疫沈降された（図４Ｄ、中央、レーン１）。
【００８８】
ＮＰ中のこれらの炭水化物部分の特異性を確証するために、レクチンプルダウンアッセイを実施した。分析のために、以下のレクチンを用いた：落花生（ピーナツ）アグルチニン（ＰＮＡ）。これは、Ｏ−グリカン中の非置換ガラクトースβ（１−３）Ｎ−アセチルガラクトサミンコアを認識する；ヨウシュチョウセンアサガオ  アグルチニン（ＤＳＡ）。これは複合体中のまたはハイブリッド型グリカン中のガラクトースβ（１−４）グルコサミンと特異的に結合する；ガランツスニバリス  アグルチニン（ＧＮＡ）。これは、Ｎ−グリカン中に見出される末端マンノース結合α（１−３）−、α（１−６）−またはα（１−２）−マンノースを認識する；イヌエンジュ  アグルチニン（ＭＡＡ）またはエルダーフラワー  アグルチニン（ＳＮＡ）。これらはそれぞれα（２−３）−結合またはα（２−６）−結合シアル酸と特異的に反応する。激しく４回洗浄後、ＮＰは、ウエスタンブロット分析により５つのレクチンのうち４つと反応した（図４Ｅ、レーン８、９、１０、１２）。ＭＡＡおよびＳＮＡに対する強力な反応は、ＮＰ上のシアル酸の存在を確証した。それはＤＳＡとも反応したが、このことは、ＮＰがセリンまたはトレオニンに対するＯ−グリコシド結合を有する個々のＮ−アセチル−グルコサミン残基を含有し得ることを示す。ＰＮＡと反応できなかったことは、二糖類のガラクトース（１，３）−アセチルガラクトサミンがシアル酸で良好に置換されたことを実証した。ＮＰに対する最も弱い反応は、マンノース特異的レクチンＧＮＡを用いて観察された。
【００８９】
ＮＰ／ＶＰ３５相互作用の薬理学的抑制
いくつかの炭水化物特異的レクチンとのＮＰの反応性は、この翻訳後修飾がヌクレオキャプシドの形成に必要とされた可能性を生じた。この仮説を試験するために、セリン／トレオニン部位および／または細胞質グリコシル化のいくつかの考え得る阻害剤を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳ならびにＶＰ３５に対する抗血清による免疫沈降を用いて、ＶＰ３５とのＮＰの相互作用を抑制するそれらの能力に関して試験した。試験した化合物の中で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確定した場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでウサギ網状赤血球溶解物中の修飾ＮＰの合成に影響を及ぼすものはなかった（図５Ａ、レーン２〜１０）が、しかし分子量の小変化はこの方法により検出されなかった。会合アッセイ（図５Ｂ）では、一合成グリコシド、マンノースα１−Ｏ−オクチル（Ｍａｎα１−ＯＣ8）は、２ｍＭでＮＰとＶＰ３５との相互作用を実質的に低減した（図５Ｂ、レーン１６）。この抑制は、特異的であったが、この化合物のアセチル化バージョン、ＡｃＭａｎα１−ＯＣ8を用いて観察されず（図５Ｂ、レーン１９〜２１）、そして作用は定量的濃度測定により確定した場合、用量依存性であった（図５Ｃ）。ＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後の、ＶＰ３５／２４を用いたインキュベーションの直前の、Ｍａｎα１−ＯＣ8の添加は、相互作用を抑制しなかったが、これは、合成グルコシドが翻訳後グリコシル化を修飾し、ＶＰ３５との結合に必要な重大な決定基を崩壊する、ということを示唆する。したがってこの化合物は、エボラウイルス構築を抑制する抗ウイルス剤を開発するための原型として機能し得る。
【００９０】
キャプシド構築に関するエボラウイルスタンパク質の最小要件
この開示において、エボラウイルスヌクレオキャプシドは、３つのウイルス遺伝子産物：ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞中で効率的に産生される、ということを本発明者らは示した。このトランスフェクト化ヒト細胞株では、エボラキャプシドは細胞質中で構築し、そして無傷ウイルスと同様の糸状構造を生成した（図１Ｂ〜Ｄ）。ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４の同時トランスフェクションはキャプシド形成を支持し、そしてこれら３つの遺伝子のいずれか１つの脱落は作用を無効にしたが、このことは、それらがウイルス粒子形成のために必要かつ十分であることを実証する。レトロウイルスおよびレンチウイルスの構築においては、Ｇａ
ｇ前駆体ポリタンパク質の発現は、ビリオン様粒子を構築するために十分である（Gheysen, D. et al. 1989 Cell 59: 103-112; Delchambre, M. et al. 1989 EMBO J 8: 2653-2660; Luo, L. et al. 1994 Virology 205: 496-502; Smith, A.J. et al. 1993 J Virol 67: 2266-2275; Wills, J.W. et al. 1989 J Virol 63: 4331-4343; Huang, Y. et al. 2001 J Virol 75: 4947-4951）。この点では、エボラウイルス構築は他のマイナス鎖ウイルスおよびレトロウイルスとはいくつかの点で異なる（Garoff, H. et al. 1998 Microbiol
Mol Biol Rev 62: 1171-1190）。レトロウイルスおよびレンチウイルスモデルにおけるこのような試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＩＶ−１粒子の上首尾の生成およびＨＩＶキャプシドバイオゲネシスおよび構造についてのより大きい知識をもたらした。
【００９１】
エボラウイルス発現およびＮＰ翻訳後修飾に関連した観察は、フィロウイルス構築のより良好な理解を促し得る。ＶＰ４０（ウイルスマトリックスタンパク質）は成熟ウイルスの生成に一役を果たす、ということを従来の研究は示唆している（Ruigrok, R.W. et al.
2000 J Mol Biol 300: 103-112; Dessen, A. et al. 2000 EMBO J 19: 4228-4236）。これらの構造の注意深い検査は、ＶＰ４０が周囲エンベロープの生成を促し得る中空管状膜の生成を促す、ということを明示する（Jasenosky, L.D. et al. 2001 J Virol 75: 5205-5214; Timmins, J. et al. 2001 Virology 283: 1-6; Martin-Serrano, J. et al. 2001
Nat Med 7: 1313-1319）が、しかしＶＰ４０が糸状ウイルスキャプシドの生成に寄与するという証拠はない。
【００９２】
エボラＮＰの翻訳後修飾はウイルス構築に必要である
グリカン構造が示差的タンパク質−タンパク質相互作用および免疫応答において重要な役割を果たすという証拠が漸増している（Han, I. and Kudlow, J.E. 1997 Mol Cell Biol 17: 2550-2558; Wells, L. et al. 2001 Science 291: 2376-2378; Lowe, J.B. 2001 Cell 104: 809-812; Moody, A.M. et al. 2001 Cell 107: 501-512; Hanover, J.A. 2001 FASEB J 15: 1865-1876）。ここで、エボラＮＰのＯ−グリコシル化およびシアル化に関する新規の役割を本発明者らは見出したが、このことは、それがＮＰおよびＶＰ３５の相互作用のために必要であることを示す。ウイルス複製におけるＮＰおよびＶＰ３５の重要性は、人工的複製アッセイにおいて前に示されており（Muhlberger, E. et al. 1998 J Virol 72: 8756-8764; Muhlberger, E. et al. 1999 J Virol 73: 2333-2342）、そしてキャプシド形成におけるその関与は前に示されていないが、しかしＶＰ３５は感染細胞から産生されるエボラウイルスとも密接に関連する（Becker, S. et al. 1998 Virology 249:
406-417）。これらのタンパク質の類似体、Ｎ（ＮＰ）およびＰタンパク質の相互作用は、パラミキソウイルス、ラブドウイルスおよびボルナウイルスで観察されており、この場合、それらはそれらの複製においても不可欠な役割を果たす（Huber, M. et al. 1991 Virology 185: 299-308; Horikami, S.M. et al. 1992 J Virol 66: 4901-4908; Schwemmle, M. et al. 1998 J Biol Chem 273: 9007-9012）。この類似性は、これらのウイルスに関するキャプシド構築におけるそれらの役割にも関連する、と本発明者らは予見する。
【００９３】
感染中に細胞からエボラウイルスが如何に放出されるかは明らかでない。微細構造に基づいて、見掛けの出芽構造が、患者からの感染細胞においてならびに組織において定義された（Geisbert, T.W. and Jahrling, P.B. 1995 Virus Res 39: 129-150; Zaki, S.R. and Goldsmith, C.S. 1999 in: Current Topics in Microbiology and Immunology, H.-D.
Klenk, ed. New York: Springer, pp. 97-116）が、しかしながらプラスミドでトランスフェクト化された２９３細胞中では、出芽または細胞外粒子はここでは観察されなかった。この知見は、トランスフェクト細胞が出芽に必要とされる細胞因子またはウイルスタンパク質、例えばＶＰ４０を欠く、という事実を反映し得る。しかしながら、子孫エボラウイルスの放出は、細胞溶解のような代替的メカニズムにより進行し得る、という可能性が依然としてある。マクロファージのエボラウイルス感染が、この代替メカニズムと一致するＥＲ中への出芽に関連する、ということを従来の研究が示している（Feldmann, H. et 
al. 1996 J Virol 70: 2208-2214）。
【００９４】
ウイルス構築の保存ドメインおよび一般メカニズム
ここに記載されたメカニズムは、概して、その他のフィロウイルスおよび多数のパラミキソウイルスを含めた糸状のウイルスの構築への洞察を提供する。種々のエボラおよびマールブルクＮＰ間の核タンパク質の配列比較は、これらのウイルス核タンパク質の高度の配列保存を明示する。興味深いことに、この配列類似性はフィロウイルス内で最も目立っている（図６Ａ）が、しかしそれは、フィロウイルスに最も密接に関連したクラスであるいくつかのパラミキソウイルス、特に麻疹ウイルスにおいても観察される。フィロウイルス、麻疹ウイルス、牛疫ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスに共通である付加的配列も明白であり（図６Ｂ）、このことは、フィラメントを形成し得る特定のマイナス鎖ＲＮＡウイルスが構築の共通メカニズムを用い得ることを示唆する。エボラウイルスで観察される翻訳後修飾は、これらのウイルスの独特の形態の根拠になり得る同定特徴を現す。したがって本開示に記載されたメカニズムは、ウイルス構築への洞察を提供し、それらの構造の独特の特性を説明し、そして抗ウイルス療法のための特定の標的を提供する（図５）。
【００９５】
別の実施形態では、本発明は、免疫原性または予防接種目的のための抗原または抗原性エピトープの提示のための擬似粒子に関する。図８を参照すると、擬似粒子がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチを用いて生成される。図８Ａを参照すると、ＮＰ、ＶＰ３５、ＶＰ２４および付加的にＶＰ４０をコードするＤＮＡプラスミド（あるいはアデノウイルスベクターまたはその他の遺伝子ベースのベクター）、ならびに抗原（おそらくはエボラＧＰ膜貫通および細胞質ドメインに融合される）をコードするＤＮＡプラスミド（あるいはアデノウイルスベクターまたはその他の遺伝子ベースのベクター）が、ｉｎ  ｖｉｖｏで注入されて（マウス、または任意にその他の動物、例えばヒトに）、ｉｎ
ｖｉｖｏアプローチにより擬似粒子を生成する。図８Ｂを参照すると、これらのプラスミドは代替的にプロデューサー細胞、例えば２９３細胞中にトランスフェクトされ、そして次に擬似粒子が採取されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチにより擬似粒子を生成するが、この時点で、擬似粒子はアジュバントとともにまたは伴わずにレシピエントに注入される。
【００９６】
要するに、最低３つのエボラ遺伝子：ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４を用いて、ヒト細胞株中で多数の十分に形成されたエボラヌクレオキャプシドを構築することが達成可能である、ということを本発明者らのデータは実証した。さらにエボラＮＰはＯ−グリコシル化され、これはタンパク質−タンパク質相互作用に必要である。ウイルスの生活環におけるこの重大な段階は正常細胞タンパク質により触媒されるが、しかしエボラウイルス複製は急性であり、持続期間が限定される。したがってそれは、異なるフィロウイルスに共通であり得る抗ウイルス療法のための標的を表すと予見される。あるいは、この過程のＶＰ３５−またはＶＰ２４依存性段階のターゲッティングを本発明者らは予見する。したがってこれらの観察は、それらが代替的抗ウイルス標的およびワクチンの達成を促す場合、エボラウイルス感染および疾患の病原性の理解を助けると予見される。
【００９７】
プラスミド
A. Sanchez（Sanchez, A. et al. 1993 Virus Res 29:215-240）により提供されたＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０およびＶＰ２４ｃＤＮＡを含有するプラスミドを、哺乳動物発現ベクターｐＶＲ１０１２中にサブクローニングした（Tooze, J. et al. 1988 J Cell Biol 106: 1475-1487）。プライマー：ＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＣＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＣＣＴＡＣＡＡＡＡＧＡＣＡ（配列番号１）およびΔ５‘に関するそのアンチセンス、ならびにプライマー：ＣＡＡＡＡＣＡＧＴＡＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴ（配列番号２）およびΔＭに関するそのアンチセンス、ならびにプライマー：ＣＴＴＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＧＡＴＣ
ＴＡＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＧ（配列番号３）およびΔ３’に関するそのアンチセンスを用いて、突然変異誘発ＰＣＲ（Stratagene）により、ｐＶＲ１０１２−ＮＰΔ５’、ΔＭおよびΔ３’を作製した。
【００９８】
プライマー：ＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＣＣＧＡＧＴＡＴＧ（配列番号４）およびＧＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＴＴＧＣＣＡ（配列番号５）を用いてＰＣＲによりＮＰの停止コドンの除去により、ｐｃＤＮＡ−ＮＰ−ｈｉｓを作製し、ｐｃＤＮＡ−ｈｉｓ−Ａ（Invitrogen）のＢａｍＨＩおよびＡｐａＩ部位中にサブクローニングした。配列決定により全突然変異を確証した。ｐＶＲ１０１２−ＶＰ３５および−ＶＰ２４をＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ｐＡｄａｐｔ  ＣＭＶのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングして、組換えアデノウイルス産生のためにｐＡｄ−ＶＰ３５およびｐＡＤ−ＶＰ２４を作製した。
【００９９】
一過性トランスフェクションおよび電子顕微鏡（ＥＭ）
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco-BRL）中に、２９３Ｔ細胞を保持した。二重塩化セシウム沈殿勾配を用いて、プラスミドＤＮＡを精製した。トランスフェクションの１日前に、約３×１０6個の２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ皿に入れた。各プラスミド（各々１つのエボラ遺伝子を含有）２μｇを混合し、リン酸カルシウム法（Chen, C. and Okayama, H. 1987 Mol Cell Biol 7: 2745-2752）を用いて、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトするために用いた。ベクター主鎖を充填剤ＤＮＡとして用いて、各トランスフェクションにおける同一量のＤＮＡを維持した。トランスフェクションの６３時間後、ＤＭＥＭで再懸濁することによりプレートから細胞を引き上げて、次に１０００ｒｐｍでの遠心分離により１５ｍｌ円錐管中でペレット化した。上清を除去し、１０倍容積の固定溶液を添加した（３％グルタルアルデヒドおよび３％ホルムアルデヒド、カコジル酸塩緩衝液、ｐＨ７．３；Tousimis Research Corporation, Rockville, MD）。検体を静かに混合し、ミシガン大学の電子顕微鏡研究室で分析した。
【０１００】
免疫沈降およびウエスタンブロット分析
ＶＰ３５およびＶＰ２４を含有する組換えアデノウイルスを、抗体産生のために生成した（Aoki, K. et al. 1999 Mol Med 5: 224-231）。（Sullivan, N.J. et al. 2000 Nature 408: 605-609）に記載されたレジメンにより、ポリクローナル抗ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４を生成した。ＲｉｂｏＭａｘ  ＲＮＡ産生系（Promega）によりｐｃＤＮＡ−ＮＰ−ｈｉｓ、ｐＧＥＭｇｅｍ−ＶＰ３５およびｐＣＲ−ＶＰ２４のプラスミドから、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４のＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成し、そしてユーザーマニュアルに従って、Ｆｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物または大腸菌Ｓ３０抽出物系（Promega）により、これらのＲＮＡから35Ｓ−標識タンパク質を個別にｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳した。１０μｌの各35Ｓ−メチオニン標識タンパク質を混合し、室温で１時間インキュベートして、次に５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、１ｍＭのＤＴＴ＋プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含有する免疫沈降緩衝液５００μｌ中の１０μｌの抗体を用いて、４℃で１時間、免疫沈降させた。５μｌの３回洗浄プロテインＧアガロース（Invitrogen）を添加し、さらに１時間インキュベートした。上記の緩衝液で５回洗浄後、ペレットをＳＤＳゲル装入緩衝液中で煮沸し、オートラジオグラフィーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解した。記載されたとおりにウエスタンブロットを実施した（Friborg, J. et al. 1999 Nature 402: 889-894）。
【０１０１】
ウイルスキャプシド形成および浮遊密度勾配分析
ＤＭＥＭ培地を入れた１００ｍｍ組織培養皿中の各々３μｇのｐＶＲ１０１２−ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４を用いて、３×１０6個の２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。３日後に細胞を採取し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で３回凍結−解凍させた。清澄化溶解物を６０％のオプチプレ（商標）（Ｏｐｔｉｐｒｅ）（IODIXANOL
）培地（Invitrogen）と混合し、オプチプレの最終濃度を３０％に調整した。ＶＴＩ５０ローターを用いて４５Ｋで６時間の遠心分離により（メーカーの使用説明書に従って;Invitrogen）、密度勾配を形成した。採取画分を各画分の１ｍｌで計量し、画分による密度を用いてプロットした。２０μｌの各画分を４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に分離させて、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）−Ｐ膜上に移して、マウスポリクローナル抗−ＶＰ２４、ＶＰ３５またはＮＰでブロットした。ウエスタンブロットの各レーンは、細胞溶解物を含有する自己勾配オプチプレの一画分を表し、それに適合する。
【０１０２】
エボラ遺伝子産物間の生化学的相互作用
抗ＮＰを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳化および35Ｓ−標識ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４をプルダウン(pulled down)した。ＲｉｂｏＭａｘ  ＲＮＡ産生系（Promega）によりｐｃＤＮＡ−ＮＰ−ｈｉｓ、ｐＧＥＭ−ＶＰ３５およびｐＣＲ−ＶＰ２４のプラスミドから、ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４のＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成し、そしてＦｌｅｘｉウサギ網状赤血球溶解物により、これらのＲＮＡから35Ｓ−標識タンパク質を個別にｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳した。１０μｌの各35Ｓ−メチオニン標識タンパク質を混合し、室温で１時間インキュベートして相互作用を生じさせて、次に５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、１ｍＭのＤＴＴ＋プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含有する免疫沈降緩衝液５００μｌ中の１０μｌのマウスポリクローナル抗ＮＰを用いて、４℃で１時間、免疫沈降させた。５μｌの３回洗浄プロテインＧアガロース（Invitrogen）を添加し、さらに１時間インキュベートした。上記の緩衝液で５回洗浄後、ペレットをレムリ試料緩衝液３０μｌ中で煮沸し、オートラジオグラフィーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解した。
【０１０３】
グリコシル化に対するＮＰ感受性の分析
Ｘｐｒｅｓｓ系（Invitrogen）によりｐｃＤＮＡ−ＮＰ−ｈｉｓトランスフェクト化２９３Ｔ細胞からＨｉｓタグ化ＮＰを精製し、変性および非変性条件下で脱グリコシル化キット（CalBiochem）を用いて消化した。３５．７ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５％ＳＤＳおよび７０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．０を含有する緩衝液３７．５μｌ中で、１００℃で５分間、５μｇの精製ＮＰを変性させた。次にそれを室温に冷却し、２．５μｌのトリトンＸ−１００溶液を添加し、静かに混合して、各１μｌのＮ−グルコシダーゼＦ、α２−３，６，８，９−ノイラミニダーゼ、Ｅｎｄｏ−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，β１，４−ガラクトシダーゼおよびβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを添加し、３７℃で３時間インキュベートした。１０μｌの消化反応溶液を同一容積のレムリ試料緩衝液(Laemmli's sample buffer)と混合し、４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、マウスポリクローナル抗ＮＰを用いてウエスタンブロットにより分析した。
【０１０４】
６ウエルプレート中の２μｇのｐＶＲ１０１２−ＮＰを用いて、０．５×１０6個の２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、グリコシル化阻害剤デオキシマンノジュリマイシン（ｄＭＭ）を添加して、２．５ｍＭツニカマイシンの最終濃度を１６μｇ／ｍｌにした。４８時間インキュベーション後、細胞を３００μｌのＲＩＰＡ（放射性免疫沈降）緩衝液で抽出した。３５．７ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５％ＳＤＳおよび７０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．０を含有する緩衝液３７．５μｌ中で、１００℃で５分間、１０μｌの清澄化細胞溶解物を変性させた。それらを室温に冷却し、２．５ｍｌのトリトンＸ−１００溶液を添加し、静かに混合した。次に、各１μｌのα２−３，６，８，９−ノイラミニダーゼ、０．５％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノールおよび５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５をエンドクリコシダーゼＨに関して添加した。対照は酵素を添加せずに処理した。３７℃で１時間インキュベート後、１０μｌの反応物を４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、ポリクローナル抗ＮＰを用いてウエスタンブロットにより分析した。
【０１０５】
炭水化物の放射能ラベリングおよびレクチン沈降／ウエスタンブロット
６ウエルプレート中の２μｇのｐｃＤＮＡ−ＮＰ−ｈｉｓを用いて、０．５×１０6個の２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。１６時間後、１０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌのＤ−グルコースを有するＤＭＥＭ  ３ｍｌ中で一晩、細胞を各々１００μＣｉの3Ｈ−チミジン、3Ｈ−グリコサミンまたは3Ｈ−ガラクトースで標識した。細胞をＲＩＰＡ緩衝液で抽出し、等量の細胞溶解物を用いて、５０μｌのＰｒｏＢｏｎｄ（商標）樹脂で標識ＮＰを抜き出した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１００ｍＭイミダゾールをｐＨ６．０で用いて３回洗浄し、次に２００ｍＭのイミダゾールの濃度で２回洗浄した後、８０μｌのレムリ試料緩衝液中で１００℃で５分間加熱することにより、ＮＰ−ｈｉｓを溶離した。５ｍｌのＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（商標）２０と混合した各々５μｌの試料を用いて、液体シンチレーション分析器ＴＲＩ−ＣＡＲＢ−３１００ＴＲ（Packard）で3Ｈ取り込みを測定した。４〜１５％ゲル上に分離されるＮＰ−ｈｉｓを含有するレムリ試料緩衝液２０μｌを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。１００ｍｌの固定緩衝液（５０％メタノール、１０％酢酸）とともに３０分間インキュベーション後、Ａｍｐｌｉｆｅｒ（商標）（Amersham）を用いて３０分間浸漬し、１２０分間乾燥して、−７５℃で１週間、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）ＭＰフィルム（Amersham）にゲルを露呈した。銀染色プラスキット（BioRad）を用いてタンパク質発現を検出し、５〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて２０μｌの同一溶離試料を分離した。
【０１０６】
１００ｍｍ皿中の１０μｇのｐＶＲ１０１２−ＮＰを用いて、３×１０6個の２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした（図４Ｂ）。３日後、ＰＢＳを用いて再懸濁することによりプレートから細胞を引き上げて、次に３０００ｒｐｍでの遠心分離によりエッペンドルフ管中でペレット化した。細胞を１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液中で抽出した。５０μｌの細胞溶解物をＨ2Ｏおよび２Ｘ結合緩衝液と混合し、最終１Ｘ結合緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＭｎＣｌ2および１ｍＭのＣａＣｌ2）に調整した。ジゴキシゲニン標識レクチン（Roche Molecular Biochemicals）を、各反応のために用いた：ＧＮＡ  ２５μｇ、ＳＮＡ  ２５μｇ、ＤＳＡ  ２５μｇ、ＭＡＡ  １２５μｇ、ＰＮＡ  ２５０μｇ。撹拌しながら室温で１時間インキュベート後、抗ジゴキシゲニン磁気粒子（Roche Molecular Biochemicals）を１Ｘ結合緩衝液で３回洗浄し、３０μｌを各反応に添加した。さらに１時間インキュベーション後、粒子を１Ｘ結合緩衝液で４回洗浄し、１００℃で５分間加熱することにより、ラムリ試料緩衝液６０μｌ中に回収した。２５μｌを、４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離して、マウスポリクローナル抗ＮＰを用いてウエスタンブロットにより分析した。
【０１０７】
合成グリコシド類似体
ＮＰ／ＶＰ３５相互作用のいくつかの考え得る阻害剤を、ＮＰの合成あるいはＮＰとＶＰ３５およびＶＰ２４との会合を抑制するそれらの能力に関して試験した。研究中の阻害剤化合物は、種々の合成単糖および二糖である。発表済み手法（Oscarson, S. and Tiden, A.K. 1993 Carbohydr Res;247: 323-328 ; Brown, J.R. et al. 1997 Glycobiology 7:
549-558）に従って、Ｍａｎα１−Ｏ−オクチル（Ｍａｎα１−ＯＣ8）、アセチル化Ｍａｎα１−Ｏ−オクチル（ＡｃＭａｎα１−ＯＣ8）およびアセチル化Ｍａｎα１−３Ｍａｎα−Ｏ−メチル（ＡｃＭａｎ１−３Ｍａｎα１−ＯＭｅ）を調製した。対応するデク(dec)−９−エニル(enyl)合成オリゴマーに関してNikolaevおよび共同研究者が記載したとおりに（Nikolaev, A.V. et al. 1995 J Chem Soc Perkin Trans 1: 1977-1987）、アセチル化Ｍａｎα１−６Ｍａｎα−Ｏ−デク−９−エニル（ＡｃＭａｎ１−６Ｍａｎα１−ＯＣ10）を合成した。発表済み手法（Sarkar, A.K. et al. 2000 Carbohydr Res 329: 287-300）に従って、アセチル化Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−ナフタレメタノール（ＡｃＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−ＮＭ）を調製した。Ｐｅｒ−Ｏ−アセチル化は、無水酢酸およびピリジンを用いて達成される。反応生成物は全て、分析用薄層クロマ
トグラフィーおよびシリカゲル６０254（E. Merck）プレート、ならびに紫外線による炭化またはエタノール中の５％（ｖ／ｖ）硫酸を用いた炭化による検出により分析した。シリカゲル６０254（Aldrich）上でカラムクロマトグラフィーを実施した。生物学的試験に付した合成化合物は全て、それらの提唱構造と一致するエレクトロスプレー質量スペクトルを示した（Brown, J.R. et al. 2001 Bioorg Med Chem 9: 815-824; Brown, J.R. et al. 1997 Glycobiology 7: 549-558; Sarkar, A.K. et al. 2000 Carbohydr Res 329: 287-300）。これらの合成グリコシドを、０．５、１．０または２．０ｍＭ濃度で、翻訳前に放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応に添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、または上記のようにＶＰ３５に対する抗血清を用いた同時免疫沈降により、分析した。
【０１０８】
任意の作用を伴わずにこの系で試験されたさらなる化合物としては、ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニルＮ−アセチル−ａ−Ｄ−ガラクトサミニド、ベンジルＺ−ａ−Ｄ−グルコサミニド、ベンジルＺ−ｂ−Ｄ−グルコサミニド、ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（Sigma, St. Louis, MO）、ならびにブレフェルジンＡ（Carbiochem, San Diego, CA）が挙げられる。
【０１０９】
明確にし理解させるために本発明を多少詳細に説明してきたが、本発明の真の範囲を逸脱しない限り、形態および詳細において種々の変更がなされ得る、と当業者は理解する。上記の図、表および付録、ならびに特許、出願および出版物は全て、参照により本明細書中で援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１Ａ】エボラ遺伝子構成およびエボラキャプシド構築の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析の図である。エボラゲノム構成の模式図。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を等尺率で描いている。水玉領域はコード領域を意味し、そして棒領域は非コード配列を意味する。３’から５’へ：ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）をコードするＮＰ、ＶＰ３５、ＶＰ４０、ＧＰ、ＶＰ３０、ＶＰ２４およびＬ遺伝子。
【図１Ｂ】エボラ遺伝子構成およびエボラキャプシド構築の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析の図である。トランスフェクト化２９３Ｔ細胞におけるエボラキャプシドの構築の電子顕微鏡写真（倍率７０００倍）。それぞれｐＶＰ１０１２−ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ４０、ＶＰ３５、ＶＰ３０およびＶＰ２４をコードする６つの２μｇのプラスミドの各々は、リン酸カルシウム法を用いた３×１０6個の２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクトするために用いた（１２μｇの全ＤＮＡ／トランスフェクション）。表１、凡例に記載した方法を用いて、ＴＥＭ分析を実施した。
【図１Ｃ】エボラ遺伝子構成およびエボラキャプシド構築の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析の図である。それぞれＮＰ、ＶＰ３５、ＶＰ３０およびＶＰ２４をコードする４つのプラスミド（各々２μｇ）および４μｇのベクター主鎖で同時トランスフェクトされた２９３細胞の縦断切片（倍率１５０，０００倍）。１２μｇのＤＮＡ全体を各トランスフェクションのために用い、そして細胞を下記のように分析した。
【図１Ｄ】エボラ遺伝子構成およびエボラキャプシド構築の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析の図である。１Ｃに記載された細胞の横断切片（倍率１００，０００倍）。
【図２Ａ】トランスフェクト化２９３Ｔ細胞からの構築キャプシドの放出ならびにトランスフェクト化２９３Ｔ細胞におけるエボラキャプシド構築に関するＮＰ突然変異体のＴＥＭ分析を示す。ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の溶解の電子顕微鏡写真（倍率１９，６００倍）。ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４をコードする３μｇの各プラスミドを用いて、３×１０6個の２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、表１、凡例に記載したように細胞を分析した。
【図２Ｂ】トランスフェクト化２９３Ｔ細胞からの構築キャプシドの放出ならびにトランスフェクト化２９３Ｔ細胞におけるエボラキャプシド構築に関するＮＰ突然変異体のＴＥＭ分析を示す。構築キャプシドの勾配沈降およびウエスタンブロット分析。
【図２Ｃ】トランスフェクト化２９３Ｔ細胞からの構築キャプシドの放出ならびにトランスフェクト化２９３Ｔ細胞におけるエボラキャプシド構築に関するＮＰ突然変異体のＴＥＭ分析を示す。ＮＰ突然変異体の模式図。ＡＡ：アミノ酸。中白領域は、アミノ酸配列が欠失されたことを意味する。
【図２Ｄ】トランスフェクト化２９３Ｔ細胞からの構築キャプシドの放出ならびにトランスフェクト化２９３Ｔ細胞におけるエボラキャプシド構築に関するＮＰ突然変異体のＴＥＭ分析を示す。ＮＰ欠失突然変異体の発現のウエスタンブロット分析。ＮＰおよび異なる突然変異体ＮＰでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物をＲＩＰＡ（放射性免疫沈降アッセイ）緩衝液で抽出し、４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、イムノビロン（商標）−Ｐ膜上に移して、ポリクローナル抗ＮＰ抗体（Ａｂ）を用いてブロットした。
【図２Ｅ】トランスフェクト化２９３Ｔ細胞からの構築キャプシドの放出ならびにトランスフェクト化２９３Ｔ細胞におけるエボラキャプシド構築に関するＮＰ突然変異体のＴＥＭ分析を示す。ＮＰ突然変異体のキャプシド構築のＴＥＭ分析（倍率（左から右に）４０，０００倍、３０，０００倍、２０，０００倍）。３μｇの各ＮＰ突然変異体、３μｇのＶＰ３５およびＶＰ２４を用いて、２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、表１、凡例に記載したようにＴＥＭ分析を実施した。
【図３Ａ】ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４相互作用の免疫沈降分析を示す。ＮＰを用いたＶＰ３５およびＶＰ２４の同時免疫沈降。ヒト転写因子Ｇａｔａ３を内部対照として用いた。
【図３Ｂ】ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４相互作用の免疫沈降分析を示す。抗ＮＰ  Ａｂによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳化ＮＰの免疫沈降。網状赤血球溶解物または大腸菌Ｓ３０抽出物系によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳されたＮＰを、ポリクローナル抗ＮＰ  ＡｂおよびプロテインＧアガロースにより免疫沈降させた。
【図３Ｃ】ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４相互作用の免疫沈降分析を示す。抗ＶＰ３５  Ａｂによるグリコシル化または脱グリコシル化ＮＰの免疫沈降。網状赤血球溶解物または大腸菌Ｓ３０抽出物系によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳されたグリコシル化または脱グリコシル化ＮＰを、ポリクローナル抗ＶＰ３５  Ａｂにより同時免疫沈降させた。
【図４Ａ】エボラＮＰの翻訳後修飾ならびにＮＰグリコシル化の生化学的特徴を示す。脱グリコシル化に対するＮＰの感受性。
【図４Ｂ】エボラＮＰの翻訳後修飾ならびにＮＰグリコシル化の生化学的特徴を示す。ノイラミニダーゼ（レーン６対７）に対するその感受性と対照した、阻害薬なし（レーン９）、２．５ｍＭのｄＭＭ（レーン１０）または１６μｇ／ｍｌのツニカマイシン（レーン１１）で４０時間処置した細胞においてＥｎｄｏ  Ｈによる消化に対するトランスフェクト化２９３細胞からの細胞抽出物中のＮＰの相対的耐性。
【図４Ｃ】エボラＮＰの翻訳後修飾ならびにＮＰグリコシル化の生化学的特徴を示す。ＨＩＶ  ｇｐ１６０（右）と対照した、ツニカマイシン（左）に対するｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスフェクト化２９３細胞におけるＮＰ合成の耐性。
【図４Ｄ】エボラＮＰの翻訳後修飾ならびにＮＰグリコシル化の生化学的特徴を示す。3Ｈ−グリコサミンおよび3Ｈ−ガラクトースを用いたＮＰのラベリング。用いた方法を、下記のように同定する。
【図４Ｅ】エボラＮＰの翻訳後修飾ならびにＮＰグリコシル化の生化学的特徴を示す。レクチン沈降およびＮＰウエスタンブロット分析。各レクチンの同一性および特異性は、以下の本文中に示され、説明される。対照（レクチン添加せず）、その他の条件は同一であった。
【図５】合成グルコシドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヌクレオキャプシド形成に関連した生化学的相互作用を抑制する、ということを示す。Ａ．図５Ｂの場合と同様に確定されたＮＰの転写／翻訳に及ぼす特定のグリコシド類似体の指示濃度の作用。陰性対照（レーン１）として、合成グリコシドに関する希釈物の場合と同様に最高濃度でＤＭＳＯ（２％）を用いた。Ｂ．図５Ｃで説明したように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写化／翻訳化ＮＰ、ＶＰ３５およびＶＰ２４を用いた抗ＶＰ３５による免疫沈降によるＭａｎα１−ＯＣ8によるＮＰ／ＶＰ３５相互作用の抑制。パネルＡで定義したように、ＤＭＳＯを用いた。対照は、陰性対照としての抗ＶＰ３５（５μｌ）と同一濃度での免疫沈降における正常マウス血清の使用を指す。Ｃ．Ｍａｎα１−Ｏ−オクチルによる抑制の定量。図８Ｂにおける指示阻害薬からの画像強度（四角形、Ｍａｎα１−ＯＣ8；三角形、Ａｃ  Ｍａｎα１−ＯＣ8；菱形、ＡｃＧａｌｌ、４  ＧlｃＮＡｃ−ＯＮＭ；丸形、ＤＭＳＯ）を、ＤＭＳＯ対照（０％抑制）と比較してリン画像診断から確定した。
【図６Ａ】フィロウイルスおよびパラミキソウイルス核タンパク質のアミノ酸類似性を示す。異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ１】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ２】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ３】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ４】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ５】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ６】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ７】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ８】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ９】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ａ１０】異なる系統からの関連タンパク質に関するならびにその他のウイルスに関するエボラＮＰの配列アラインメント。
【図６Ｂ】フィロウイルスおよびパラミキソウイルス核タンパク質のアミノ酸類似性を示す。異なるフィロウイルスおよびパラミキソウイルスからの核タンパク質の高度保存モチーフ。
【図７Ａ】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ａ１】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ａ２】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ａ３】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ａ４】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ａ５】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ａ６】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｂ】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｂ１】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｂ２】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｂ３】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｂ４】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｂ５】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｂ６】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｃ】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｃ１】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｃ２】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｃ３】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｃ４】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｃ５】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｃ６】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｄ】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｄ１】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｄ２】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｄ３】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｄ４】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図７Ｄ５】エボラＮＰと、ヒトＴａｕの４つのクローン（GenBank寄託番号：Ｐ１９３３２、Ｐ１０６３６、Ｐ１０６３７、ＢＣ０００５５８）および１つのウシＴａｕ（ＡＡＡ５１６０９）との比較。エボラＮＰは、GenBank寄託番号ＡＦ２７２００１からである。
【図８】免疫原性または予防接種目的のための抗原または抗原性エピトープの提示のための擬似粒子を例示する。
【０１１１】
【表２】
2005533111.tif 000004
【図１Ａ】
2005533111.tif 000005
【図１Ｂ】
2005533111.tif 000006
【図１Ｃ】
2005533111.tif 000007
【図１Ｄ】
2005533111.tif 000008
【図２Ａ】
2005533111.tif 000009
【図２Ｂ】
2005533111.tif 000010
【図２Ｃ】
2005533111.tif 000011
【図２Ｄ】
2005533111.tif 000012
【図２Ｅ】
2005533111.tif 000013
【図３Ａ】
2005533111.tif 000014
【図３Ｂ】
2005533111.tif 000015
【図３Ｃ】
2005533111.tif 000016
【図４Ａ】
2005533111.tif 000017
【図４Ｂ】
2005533111.tif 000018
【図４Ｃ】
2005533111.tif 000019
【図４Ｄ】
2005533111.tif 000020
【図４Ｅ】
2005533111.tif 000021
【図５】
2005533111.tif 000022
【図６Ａ】
2005533111.tif 000023
【図６Ａ１】
2005533111.tif 000024
【図６Ａ２】
2005533111.tif 000025
【図６Ａ３】
2005533111.tif 000026
【図６Ａ４】
2005533111.tif 000027
【図６Ａ５】
2005533111.tif 000028
【図６Ａ６】
2005533111.tif 000029
【図６Ａ７】
2005533111.tif 000030
【図６Ａ８】
2005533111.tif 000031
【図６Ａ９】
2005533111.tif 000032
【図６Ａ１０】
2005533111.tif 000033
【図６Ｂ】
2005533111.tif 000034
【図７Ａ】
2005533111.tif 000035
【図７Ａ１】
2005533111.tif 000036
【図７Ａ２】
2005533111.tif 000037
【図７Ａ３】
2005533111.tif 000038
【図７Ａ４】
2005533111.tif 000039
【図７Ａ５】
2005533111.tif 000040
【図７Ａ６】
2005533111.tif 000041
【図７Ｂ】
2005533111.tif 000042
【図７Ｂ１】
2005533111.tif 000043
【図７Ｂ２】
2005533111.tif 000044
【図７Ｂ３】
2005533111.tif 000045
【図７Ｂ４】
2005533111.tif 000046
【図７Ｂ５】
2005533111.tif 000047
【図７Ｂ６】
2005533111.tif 000048
【図７Ｃ】
2005533111.tif 000049
【図７Ｃ１】
2005533111.tif 000050
【図７Ｃ２】
2005533111.tif 000051
【図７Ｃ３】
2005533111.tif 000052
【図７Ｃ４】
2005533111.tif 000053
【図７Ｃ５】
2005533111.tif 000054
【図７Ｃ６】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｄ１】
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【図７Ｄ２】
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【図７Ｄ３】
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【図７Ｄ４】
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【図７Ｄ５】
2005533111.tif 000061
【図８】
2005533111.tif 000062
【国際調査報告】
2005533111.tif 000063