(57)【要約】試料中の標的生体分子検出用の導電性マイクロプレート器具（１５）が説明される。マイクロプレート（１５）は、多孔性基質（１）と、導電層（２）との組立体を含み、該組立体はマイクロプレート（１５）の少なくとも一部のウェルの底にシールされる。多孔性基質（１）は頂面（３）と底面とを有する。頂面（３９は複数の共有結合で付着したプローブ生体分子を含む。前記共有結合で付着したプローブ生体分子は前記試料中に含まれる標的生体分子と反応する。多孔性基質（１）の底面に取り付けられた導電層（２）は電圧を受けるように適合している。本発明のマイクロプレートは、ロボットワークステーションで使用するように容易に適合できる。したがって１つの実施態様では電源は、迅速なマイクロプレート処理のためのロボットアームツールに取り込まれている。
2005526259.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のウェルを有し、多孔性基質と導電層とを含む、試料中の標的生体分子検出用の導電性マイクロプレートであって、
前記多孔性基質は頂面と底面とを有し、
前記頂面は共有結合で付着された複数のプローブ生体分子を含み、
前記プローブ生体分子は前記多孔性基質の頂面の離散した場所に付着してアレイを形成し、
前記導電層は、前記多孔性基質の底面に取り付けられ、電圧を受けるように適合している、試料中の標的生体分子検出用の導電性マイクロプレート。
【請求項２】
前記頂面は、プローブ生体分子と反応する複数の活性化された側鎖官能基と、該側鎖官能基に共有結合で付着した複数のプローブ生体分子とを含む、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項３】
前記活性化された側鎖官能基はフッ化アシル基である、請求項２に記載のマイクロプレート。
【請求項４】
前記プローブ生体分子は修飾されずに前記多孔性基質の頂面に付着される、請求項３に記載のマイクロプレート。
【請求項５】
各ウェルの前記アレイは約１００ないし約４００種のプローブ生体分子を含む、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項６】
前記導電層は第１の電極を形成し、前記マイクロプレートは第１の電極と通電する第２の電極を含む、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項７】
第１および第２の電極の間の通電状態は電解質溶液によってもたらされる、請求項６に記載のマイクロプレート。
【請求項８】
前記導電層は前記多孔性基質の底面に直接取り付けられる、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項９】
前記導電層は金属コーティングされている、請求項８に記載のマイクロプレート。
【請求項１０】
前記多孔性基質の底面と前記導電層との間に配設される浸透層を含む、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１１】
前記浸透層は、アガロースと、クロスリンクしたポリマーとからなるグループから選択される導電性材料を含む、請求項１０に記載のマイクロプレート。
【請求項１２】
前記浸透層はメタクリレートを含む、請求項１１に記載のマイクロプレート。
【請求項１３】
前記多孔性基質は、側鎖のカルボキシル基を含む材料から調製される、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１４】
前記多孔性基質は、カルボキシル化ポリプロピレン、カルボキシル化ポリエチレンおよびポリカーボネートからなるグループから選択される、請求項１３に記載のマイクロプレート。
【請求項１５】
前記多孔性基質は、側鎖のカルボキシル基を有するコーティングを含む材料から調製される、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１６】
前記多孔性基質は、１６ないし１８μｍの孔径の細孔を有する、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１７】
前記マイクロプレートは、９６個から３８４個までのウェルを含む、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１８】
前記プローブおよび標的生体分子は、核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、糖質、脂質およびこれらのアナログからなるグループから選択される、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項１９】
前記生体分子は、増幅されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡからなるグループから選択されるポリヌクレオチドである、請求項１８に記載のマイクロプレート。
【請求項２０】
請求項６に記載のマイクロプレートと、第１および第２の電極に電圧を供給する電源とを含む、器具。
【請求項２１】
前記電源は、前記マイクロプレートを受け入れるように適合した表面と、電力供給源と、該供給源から前記マイクロプレートの第１および第２の電極へ電圧を供給するための手段とを含むホットプレートである、請求項２０に記載の器具。
【請求項２２】
前記電圧を供給するための手段は、前記ホットプレートに取り込まれたリード線とを含み、該リード線は、前記マイクロプレートが前記ホットプレートの表面に配置されるとき、前記マイクロプレートの第１および第２の電極に接続する、請求項２１に記載の器具。
【請求項２３】
第１の電極は個々のウェルの基部にシールされた電極パッチのネットワークを含み、前記ホットプレートは適合するリード線のネットワークを含み、前記マイクロプレートが前記ホットプレートの表面に配置されるとき電圧が前記リード線から前記電極パッチへ送られる、請求項２１に記載の器具。
【請求項２４】
複数のウェルを有する試料中の標的生体分子検出用導電性マイクロプレートであって、
多孔性基質と、第１の電極を形成する導電層と、第１の電極と通電する第２の電極と、第１および第２の電極に電圧を供給するための電源との組立体を含み、
該組立体は少なくとも一部のウェルの底にシールされ、
前記多孔性基質は頂面および底面を有し、
前記頂面は、標的生体分子と反応する複数の共有結合で付着したプローブ生体分子を含み、
前記導電層は前記多孔性基質の底面に取り付けられ、
第１の電極は個々のウェルの基部にシールされた電極パッチのネットワークを含み、前記電源は適合するリード線のネットワークを含み、前記マイクロプレートが組み立てられるとき前記電極パッチが前記適合するリード線に接続する、試料中の標的生体分子検出用導電性マイクロプレート。
【請求項２５】
請求項１に記載のマイクロプレートと、前記導電層に電圧を供給するロボットアームと、前記導電層に通電する１本の電極を有する電極端子ツールとを含む、器具。
【請求項２６】
電解質溶液を介して第１の電極と通電する第２の電極を含む、請求項２５に記載の器具。
【請求項２７】
第１の電極は前記多孔性基質を貫通する、請求項２５に記載の器具。
【請求項２８】
複数のウェルを有する導電性マイクロプレートを形成する方法であって、
（ａ）頂面および底面を有する多孔性基質を用意するステップと、
（ｂ）プローブ生体分子を共有結合で付着できる反応性の官能基で前記頂面を活性化するステップと、
（ｃ）プローブ生体分子を反応性の官能基に共有結合で付着するのに十分な条件下で、前記多孔性基質の離散した場所のプローブ生体分子と前記頂面を接触させるステップと、
（ｄ）前記多孔性基質の底面に導電層を取り付けるステップと、
（ｅ）前記マイクロプレートの少なくとも一部のウェルの底に、前記導電層を有する多孔性基質をシールするステップとを含み、
前記導電層は電圧を受けるように適合している、導電性マイクロプレートを形成する方法。
【請求項２９】
前記接触させるステップ（ｃ）は、ジェットプリント法、固相または開放キャピラリ素子接触プリント法、微小流体力学的チャンネルプリント法、シルクスクリーン法および電気化学的または電磁的な力に基づくプリント素子を用いる技術からなるグループから選択される技術によって実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記取り付けるステップ（ｄ）は、シルクスクリーン法、金属の化学的析出、糊付け、ラミネート加工、カプセル封入および重合からなるグループから選択される技術によって実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
標的生体分子をプローブ生体分子にハイブリダイゼーションさせる方法であって、
（ａ）請求項７に記載の導電性マイクロプレートを用意するステップと、
（ｂ）標識された標的生体分子を前記電解質溶液に導入するステップと、
（ｃ）第１および第２の電極の間に電圧を印加するステップとを含み、
前記標識された標的生体分子は、前記多孔性基質の表面上の前記プローブ生体分子にハイブリダイゼーションする、標的生体分子をプローブ生体分子にハイブリダイゼーションさせる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には複数のアッセイを同時に実行するための器具に関する。具体的には、本発明は、生体分子の標的被検体を引き寄せるためのアクティブ電極を含むマイクロプレート器具に関する。本発明はかかる器具を作成し使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸ハイブリダイゼーション解析およびタンパク質結合解析を含む分子生物学の現代的な方法の多くは、複雑な試料システム中の標的生物学的分子種（標的）を結合し検出するために、「バイオチップ」、すなわちプローブの生体分子（プローブ）のアレイを用いる。試料がアレイの表面に単に配置され、前記試料に含まれる標的が支持体上に固定化されたプローブに受動的に拡散して該プローブに結合することが、これらの方法において最もありふれている。受動的拡散の原理を用いる市販のマイクロアレイの例は、アフィメトリクス（カリフォルニア州、サンタクララ）製のＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）アレイと、シンテーニ（カリフォルニア州、フリーモント）製のＧＥＭ（商標）アレイを含む。
【０００３】
かかるアレイは、体積が大きくて標的含量が多い試料を扱うときには効率的ではあるが、標的濃度の低い試料においては拡散律速性がある。消費者は、低濃度の標的を捕捉するための１５−２０時間かそれ以上にインキュベーション時間を延長するか、あるいは、前記標的の濃度を上げるために検査前に試料を操作するかのいずれかによって、この律速性に対処するのが典型的である。例えば、試料中の標的ＤＮＡのコピー数は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅できる。代替的には、より多数の細胞が、より高レベルの標的生体分子を有する試料を調製するために用いられる場合がある。
【０００４】
しかし、ハイブリダイゼーション時間を延長することは、ハイスループットおよびウルトラハイスループット試料処理の重大な障害となる。多数の細胞集団を用いることは、前記標的生体分子の代表例でない他の細胞タイプを含む可能性が増大する場合がある。さらに、増幅は、複雑で長時間かかる手順を伴い、低濃度の分子種を過剰増幅することによって著しい傾向を持ち込む場合がある。また、プライマーと標的とのアニーリングの違いのために、必ずしも全ての分子種が同程度に増幅されるわけではない。したがって、費用、簡便さおよび融通性が拡散に基づくアプローチの限界となる。
【０００５】
最近、Ｎａｎｏｇｅｎ社（カリフォルニア州、サンジエゴ）が、試料中のコピー数の少ない標的の検出の代替的なアプローチを提案した（特許文献１−１０）。アレイ器具の特定の領域に電荷を提供することによって、荷電標的生体分子がその領域に向かって移動して、その領域に濃縮される。その結果、上記の受動的拡散法に比べて、プローブ生体分子が標的生体分子により高速かつ効率的にに結合する。
【特許文献１】米国特許第５，６０５，６６２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６３２，９５７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９６５，４５２号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８４９，４８６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９２９，２０８号明細書
【特許文献６】米国特許第６，０１７，６９６号明細書
【特許文献７】米国特許第６，０４８，６９０号明細書
【特許文献８】米国特許第６，０５１，３８０号明細書
【特許文献９】米国特許第６，２２５，０５９号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，２８７，５１７号明細書
【０００６】
Ｎａｎｏｇｅｎ社によて開発された電子アレイ器具は、電流、電圧または電力の供給源と、該供給源に接続された電極と、該電極の１つの面に形成された浸透層（ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｌａｙｅｒ）と、該浸透層の上に形成された生体分子付着層（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｌａｙｅｒ）とを含むのが典型的である。前記浸透層は、前記電極と溶液との間の小さい対イオンの自由輸送を提供し、前記付着層は、特異的結合物の結合を提供する（特許文献３）。かかる電子アレイ器具の１つは、ＮＡＮＯＣＨＩＰという商標で市販されている。
【０００７】
Ｎａｎｏｇｅｎ社によって開発された電子アレイ器具は、プローブと標的との結合速度を著しく増大させたが、これらのアレイは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）用には向いていない。Ｎａｎｏｇｅｎ社の電子アレイ器具は、嵩張り、高価で、制御が困難である。同社の電子アレイ器具はプローブ生体分子が非常に限られた密度しかなく、ＨＴＳで典型的に要求される１日あたり数千個の試料を処理することはできない。
【０００８】
発明の概要
従来のアレイシステムの上記の短所を考えると、増幅なしの生体分子または増幅された生体分子の高速かつ効率的な結合のための安価なアレイ器具を提供することが、本発明の目的である。十分に高にプローブ密度を有し、サンプル分析のＨＴＳフォーマットに適する安価なアレイ器具を提供することは特に望ましい。かかる器具を製造し使用する方法を提供することは本発明の別の目的である。
【０００９】
本発明では、これらおよびその他の目的は、試料中の標的生体分子検出用の導電性マイクロプレートを利用することによって達成される。本発明のマイクロプレートは、多孔性基質と導電層との組立体を含み、該組立体は前記マイクロプレートの少なくとも一部のウェルの底にシールされる。
【００１０】
前記多孔性基質は、頂面および底面を有する。前記頂面は、複数の共有結合で付着したプローブ生体分子を含む。前記共有結合で付着したプローブ生体分子は、前記試料中に含まれる標的生体分子と反応する。前記導電層は、前記多孔性基質の底面に取り付けられ、電圧を受けるように適合している。
【００１１】
１つの実施態様では、前記多孔性基質の頂面は、複数の活性化された側鎖の（ｐｅｎｄａｎｔ）官能基を含む。この実施態様では、複数のプローブ生体分子が前記側鎖の官能基に共有結合で付着している。好ましくは、前記活性化された側鎖の官能基は、フッ化アシル基である。最も好ましくは、前記プローブ生体分子が、アレイが形成される前記多孔性基質の頂面上の離散した場所に付着している。
【００１２】
本発明の別の側面は、前記の導電性マイクロプレートと、該マイクロプレートに電圧を供給する電源とを含む器具を含む。本発明のマイクロプレートは、ロボットワークステーションとともに使用するように容易に適合できる。
【００１３】
本発明の別の側面は、複数のウェルを有する導電性マイクロプレートを形成する方法に向けられる。前記方法は、
（ａ）頂面および底面を有する多孔性基質を提供するステップと、
（ｂ）プローブ生体分子を共有結合で付着できる反応性の官能基で前記頂面を活性化するステップと、
（ｃ）反応性の官能基にプローブ生体分子を共有結合で付着させるのに十分な条件下で、プローブ生体分子に前記頂面を接触させるステップと、
（ｄ）前記多孔性基質の底面に導電層を取り付けるステップと、
（ｅ）導電層を取り付けた前記多孔性基質を前記マイクロプレートの少なくとも一部のウェルの底にシールするステップとを含み、前記導電層は電圧を受けるように適合している。
【００１４】
別の側面では本発明は、標的生体分子をプローブ生体分子にハイブリダイゼーションする方法を提供する。前記方法は、
（ａ）第１の電極を形成し、電解質溶液を介して通電する第２の電極と含む、本発明の導電性マイクロプレートを用意するステップと、
（ｂ）標識された標的生体分子を前記電解質溶液に導入するステップと、
（ｃ）第１および第２の電極の間に電圧を印加するステップとを含み、前記標識された標的生体分子が前記多孔性基質の表面で前記プローブ生体分子とハイブリダイゼーションする。
【００１５】
本発明は、従来の器具に比べて多くの経済的および技術的な長所を提供する。本発明は、マイクロプレートのフォーマットでの生体分子標的の電気泳動的濃縮を開示する。前記マイクロプレートのフットプリントＨＴＳの標準フォーマットとして普遍的に受け入れられているが、標的結合速度を増大させるためにＮＡＮＯＣＨＩＰ（商標）のような従来の超小型電子光学的器具を用いるマイクロプレートの製作は、特に使い捨てマイクロプレートが望ましいときには、法外なほど高価である。
【００１６】
これに対し、本発明のマイクロプレートは、安価な多孔性で導電性の基質を活性化し、マイクロプレートのウェルの底にシールすることによって構築される。したがって本発明の導電性マイクロプレートは、従来のアレイ器具に対して、安価で単純で信頼性のある代替策を提供する。
【００１７】
本発明の導電性マイクロプレートは、未増幅の生体分子または増幅された生体高分子の高速かつ効率的な結合に適する。例えば、本発明の導電性マイクロプレートは、創薬または遺伝子診断を含む、多数のＨＴＳ用途でのマイクロアレイへの核酸の超高速ハイブリダイゼーションに適する。
【００１８】
さらに、本発明の好ましい実施態様では、多孔性基質がフッ化アシル基で活性化される。当業者は、フッ化アシルの化学的特性の長所を理解するであろう。フッ化アシル基は、水との反応に比較的耐性があるが（非特許文献１）、窒素および／または酸素の求核基とは反応性が高い。水溶液条件下での安定性と組み合わせたこの反応性の高さが、フッ化アシル活性化化学原理をバイオアレイ用途で特に魅力的にするが、そのわけは、フッ化アシル活性化化学原理がプローブ生体分子の固定化前後の貯蔵寿命の延長を提供するからである。最後に、前記フッ化アシルで活性化された基質は修飾および未修飾のプローブ生体分子の両方に結合できる。生体分子の修飾が必要でないため、５０％までのかなりな試薬コストの削減が達成される場合がある。
【非特許文献１】「アミノ酸フッ化物によるペプチド合成」、Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｌ．、Ｂｅｙｅｒｍａｎ、Ｍ．、Ｗｅｎｓｃｈｕｈ、Ｈ．＆  Ｂｉｅｎｅｒｔ、Ｍ．：Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．：２９、２６８−７４、１９９６
【００１９】
本発明の上記およびその他の特徴とその達成方法とは、添付する図面とともに以下の説明を参照することによって最もよく理解されるであろう。これらの図面は、本発明の典型的な実施態様のみを示し、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２０】
発明の詳細な説明
核酸ハイブリダイゼーション速度その他の生体分子の結合速度は、反応物の濃度に大きく依存する。反応物の濃度が低いとき、反応する分子間の衝突回数は小さいので、反応はゆっくりと起こる。
【００２１】
起電力は荷電生体分子をさまざまな媒体を通って移動させるのに利用可能であることが観察されてきた。電気泳動法、エレクトロブロッティング法および等電点電気泳動法のような複数の従来の分析法がこの物理現象を利用する。
【００２２】
図１に示すとおり、外部電界強度Ｅに置かれた総電荷数ｑの分子は、該分子が以下の関係式（１）に従う力による影響を受けるような電界力Ｆεが作用する。
【００２３】
Ｆε＝ｑｘＥ        （１）
【００２４】
前記電界力の下での分子の加速に対抗するのは摩擦である。これは、分子の速度Ｖと、その摩擦係数ｆとに比例する抵抗力Ｆｄとして定義される。
【００２５】
Ｆｄ＝ｆ  ｘ  Ｖ      （２）
【００２６】
前記荷電分子が反対に荷電した電極に向かって移動する際、Ｆε＝Ｆｄのとき速度一定の状態が達成される。単位電界強度の速度一定状態は、分子の電気泳動移動度ｐであｒ。
【００２７】
μ＝ｑ／ｆ      （３）
【００２８】
ＤＮＡの場合、摩擦係数ｆと、総電荷数ｑは、生体分子のサイズ（Ｎ塩基対）に正比例する
【００２９】
μ＝ｑ／ｆ  〜  Ｎ／Ｎ      （４）
【００３０】
したがって核酸について電気泳動移動度μは、分子のサイズの変化があっても実質的に一定のままである（非特許文献２）。これは、ＤＮＡ分子が置かれた電界内でほぼ同じ速度で移動することを意味する。同じことは、摩擦係数に対する総電荷数の比が一定に保たれているＳＤＳ−タンパク質のようなタンパク質および荷電生体分子にもいえる。本発明の導電性マイクロプレートは、はっきりわかる分子の分離なしに溶液中から荷電生体分子を迅速に移動させること、および、これらの分子を基質表面の近傍に濃縮することを可能にする。これは、非常に短距離の自由溶液電気泳動を用いることによって最もよく達成させる。
【非特許文献２】Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．；  Ｔｈｅｏｒｙ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（毛管電気泳動法、理論と実際）、Ｇｒｏｓｓｍａｎ、ＰＤおよびＣｏｌｂｕｍ、ＪＣ（編著）１１１−１２０頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンジエゴ、１９９２
【００３１】
自由溶液中の荷電分子の電気泳動は容易に達成される。適当な条件下では、かかる分子が電極の表面あるいはその近傍で濃縮できる。例えば、図２ＡはターゲットＤＮＡ５のハイブリダイゼーション基質１に向かう濃度依存拡散を示す。しかし図２Ｂに示すとおり、電圧が印加されると、拡散が強く偏倚され、標的ＤＮＡ５がハイブリダイゼーション基質１に向かって引き寄せられる。
【００３２】
相補的なＤＮＡの前記電極表面近傍への繋留（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）と、前記前記電極表面に付着したプローブＤＮＡと前記相補的なＤＮＡとの高速なハイブリダイゼーションは、マイクロチップ型ハイブリダイゼーションアレイの文脈でＮａｎｏｇｅｎ社によって示されている（特許文献１−１０）。かかるアクティブ超小型電子器具は選択された領域での核酸の高速輸送および濃縮が可能で、拡散型アレイより速い（３０ないし４０倍）ハイブリダイゼーション速度を有する。しかし従来の超小型電子器具は、ハイスループットスクリーニング用途で必要な１日当たり数千個の試料を処理することができない。
【００３３】
図３、８および９を参照して、本発明の１つの側面は試料中の標的生体分子９の検出用の導電性マイクロプレートに向けられる。本発明のマイクロプレートは、多孔性基質１と導電層２との組立体を含み、該組立体は前記マイクロプレートの少なくとも一部のウェルの底にシールされる。以下のマイクロプレート構築の項に説明するとおり、前記基質組立体がシールされる方法は多数ある。
【００３４】
前記多孔性基質は、頂面３と底面とを有する。頂面３は複数の共有結合で付着したプローブ生体分子４を含む。共有結合で付着したプローブ生体分子４は、前記試料中に含まれる標的生体分子９と反応する。例えば図９は、プローブ生体分子ｋ（プローブ生体分子４の１つ）とハイブリダイゼーションする対応する標的生体分子９の１つである生体分子ｋ’を示す。前記多孔性基質の底面に付着する導電層２が電力供給源２２からの電圧を受けるように適合される。
【００３５】
ここで用いられる用語「生体分子」は、核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、糖質、脂質、これらのコンジュゲート、ハプテンおよびアナログを指す。ここで用いられる「ポリヌクレオチド」は、バラバラの断片状か、あるいは、より大きな構築体の成分としてのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマーを指す。ここで用いられる「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）のようなＤＮＡのアナログ、または合成オリゴヌクレオチドの場合がある。前記ＤＮＡは１本鎖または２本鎖ＤＮＡか、ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡかの場合がある。前記ＲＮＡはｍＲＮＡの場合がある。前記ポリヌクレオチドの長さは、２ｂｐないし１０ｋｂの場合がある。本発明の１つの実施態様によると、ポリヌクレオチドの長さは約５０ｂｐないし１０ｋｂの範囲内で、１００ｂｐないし１．５ｋｂの範囲内が好ましい。本発明の別の実施態様によると、合成オリゴヌクレオチドの長さは約３ないし１００ヌクレオチドの範囲内で、２５ｎｔないし７５ｎｔの範囲内が好ましい。本発明のさらなる実施態様によると、前記オリゴヌクレオチドの長さは約１５ないし３０ヌクレオチドの範囲内である。
【００３６】
ここで用いられるところの用語「ポリペプチド」は、１つのアミノ酸のα−カルボキシル基が別のアミノ酸のαアミノ基にペプチド結合によってつながる、アミノ酸のポリマーを指す。タンパク質は、ジスルフィド結合によって連結された単数または複数のポリペプチドを含む。前記タンパク質のレ委は、ａｂ、アルゴリズム、リガンド、レセプター等を含むがこれらに限定されない。
【００３７】
標的生体分子は、いかなる荷電分子であってもよい。荷電分子は、荷電官能基を含む天然生体分子と、荷電官能基で誘導体化された生体分子とを含む。当業者は、化学的誘導体化に加えて、生体分子は前記試料溶液のｐＨの操作によって荷電状態になることもあることを認識するであろう。
【００３８】
１．基質および表面化学特性の選択
多孔性基質は、プローブ生体分子を共有結合で結合できるいかなる多孔性材料でできていてもよい。細孔は、蛍光標識された標的生体分子が通過できるが、前記基質組立体全体として電位差を維持するのに十分大きい孔径でなければならない。しかし、前記細孔は、標的がかなりのハイブリダイゼーションまたは結合をすることなく前記プローブを通り過ぎて迅速に散逸することを防ぐのに十分小さいものでなければならない。前記基質は、前記ウェルの底にシールできる限り、いかなる形状のものでもよい。好ましくは、前記基質は多孔性フィルムである。例えば、１つの実施態様では前記多孔性基質は、孔径１６μｍ−１８μｍ、厚さ４ｍｍの高密度ポリエチレンである。
【００３９】
多孔性基質は、水素、炭素、酸素、フッ素、塩素、臭素、硫黄および窒素を含むがこれらに限定されない、さまざまな元素の置換基を有する炭素骨格を含む化学的に不活性なポリマー材料の場合がある。代表的なポリマーは、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリドン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデン・ジフルオリド、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホン、および、これらのコポリマーのブレンドを含むが、これらに限定されない。
【００４０】
かかる不活性ポリマーは、外部の化学的分子種が前記ポリマーの表面に吸着されるやり方で表面活性化（すなわち修飾）される場合があるが、ここで前記化学的分子種は、前記ポリマーの表面に生体高分子および生体分子単量体を化学的に連結することができる。前記化学的な連結は求核基を介することが好ましく、前記求核基は前記修飾されたポリマーの表面にあるこのが最も好ましい。
【００４１】
例えば、本発明の承継人に付与され、引用によりここにその全体が取り込まれる米国特許第５，５８３，２１１号明細書は、高周波プラズマ放電法（ＲＦＰＤ）による不活性なポリマー基質の表面活性化（アミノ化）を説明する。アミノ化ポリマー基質の表面アミノ基は、環状酸無水物、例えば、無水コハク酸に反応させることによってカルボキシル基に転化される場合がある。代替的には、不活性な多孔性のポリマーは、カルボキシル基を提供するために、メタクリル酸またはメタクリレートのようなコポリマーでコーティングされる場合がある。カルボキシル基は、化学的蒸着法によるか、２００２年４月２３日出願の「生体分子および細胞固定化用のポリマーコーティングされた基質」という名称の同時係属出願（１９９４−０４５）に開示されるシランリンカーを利用することによって、不活性なポリマー表面と、金属またはシリカ表面のような非ポリマー表面とに直接導入される場合がある。１つの実施態様では、前記多孔性基質は、カルボキシル化ポリプロピレン、カルボキシル化ポリエチレンおよびカルボキシル化シランからなるグループから選択される材料である。
【００４２】
好ましい実施態様では、ポリマー材料は、側鎖のフッ化アシル官能基を形成するために誘導体化される。エチレンアクリル酸コポリマー、エチレンメタクリル酸コポリマーまたは誘導体化ポリプロピレンでできたポリマー支持体のフッ化アシル活性化は、本発明の承継人に付与された米国特許第６，１１０，６６９号および第６，１４６，８３３号明細書に説明されており、それらの関係部分は引用によりここにその全体が取り込まれる。かかるフッ化アシルで活性化されたポリマーは、アミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチド（米国特許第６，１１０，６６９号および第６，１４６，８３３号）と、ｃＤＮＡのような未修飾の生体高分子（米国特許第６，２６８，１４１号）と、タンパク質試薬とを付着するのに用いられて成功している。米国特許第６，２６８，１４１号明細書の関係部分は引用によりここにその全体が取り込まれる。
【００４３】
生体分子の付着のための基質活性化にフッ化アシル化学を応用して成功したことは、フッ素の独特な物理化学的特性のせいである。フッ素は、タンパク質およびハロゲンとははっきりと異なる性質を有し、周期律表のハロゲン族の傾向からはずれている。例えばフッ素は、最も電気陰性度が低い元素であるにもかかわらず、サイズが小さく価電子間の反発力が強いために、塩素よりも低い電子親和性を有する。アシル基のような炭素を含む原子団にフッ素を取り込むことは、その化学的活性および反応速度論に著しい変化を起こす。
【００４４】
フッ素原子が炭素とフッ素の間の結合において電子を共有する独特なやり方と、フッ素の相対的なサイズおよびイオン化エネルギーとのため、フッ化アシルは、タンパク質およびハロゲン化アシルとは異なり、競合する分子種よりも窒素の求核基に選択的である。フッ化アシルは、水またはアルコールのような中性の酸素の求核基に対しては反応性が弱いので（Ｃａｒｐｉｎｏら、前出、２７１頁）、水に比較的耐性がある。フッ化アシルは水との反応性が低いことは、フッ化アシル活性化基質の貯蔵安定性が湿度の高い条件下であっても非常に高いことにつながる。これに対し、タンパク質およびハロゲン化アシルは、空気中のわずかな量の水に容易に反応するので、ハロゲン化アシル活性化ポリマー基質の長期保存の障害となる。
【００４５】
さらにフッ素原子のサイズが小さいことは、アミド結合の形成における立体障害を防ぐ。これに対し他のハロゲンを（Ｈ）他の官能基はしばしば立体障害を起こすので、反応を遅らせる。フッ化アシルの特異的な反応性は、水溶液条件下での安定性と組み合わされて、フッ化アシル活性化の化学を、生体分子の活性化基質への共有結合による付着を必要とする用途で非常に望ましいものにする。
【００４６】
フッ化アシル活性化は、カルボキシル基をフッ化試薬でしょりしてフッ化アシル基に転化することを伴う。カルボキシル基をフッ化アシル基に転化する適当な試薬は、カルボキシル基反応性のフッ化試薬を広く含む。最も好ましい試薬は（ジエチルアミノ硫黄）トリフルオリド（ＤＡＳＴ）である。他の適当な試薬は、フッ化シアヌル酸およびテトラメチルフルオロホルマジニウム六フルオロリン酸を含む。１つの実施態様では、カルボキシル化ポリマー基質が、湿気を除去して該基質を乾燥させるために溶媒中でリンスされた。それから無水溶媒中のＤＡＳＴ（〜１０％ｖ／ｖ）が前記ポリマー基質に適用される。前記基質は常温で１−３時間乾燥した密封容器内でインキュベーションされる。その後、前記基質は溶媒中でリンスされて乾燥された。
【００４７】
基質に結合したフッ化アシルは、水とは比較的反応しないが、アミノ基、１級または２級アミン基およびヒドロキシル基を含む分子種とは容易にかつ選択的に反応して共有結合を形成する。したがってフッ化アシル基は、アミノ基修飾された生体分子および未修飾生体分子の枯草支持体への迅速な固定化を可能にする。これは、核酸の修飾（例えば５’アミノ化）がかなり高価な工程であるため、著しいコスト節約になる場合がある。
【００４８】
求核基を含む分子種またはエステルを含む分子種は、該分子種の前記基質への付着を可能にするのに十分な条件下で接触させることによって、前記フッ化アシルで活性化された本発明の多孔性基質に共有結合で付着される。ある条件は、前記分子が側鎖のフッ化アシル基と反応して共有結合を形することを可能にする場合に十分であるといえる。
【００４９】
本発明の１つの実施態様によると、、ｃＤＮＡが活性化多孔性フィルム上に固定化される。ポリヌクレオチドを前記コーティングされた基質に接触させるステップは、好ましくは中性または塩基性のｐＨの水性バッファーの存在下で達成される。本発明の目的のためには、塩基性ｐＨ条件とは、８を越えるｐＨを有する条件をいう。塩基性ｐＨ条件は、前記ポリヌクレオチドの前記固体支持体への付着を可能にする場合に十分といえる。本発明の１つの実施態様によると、本発明の塩基性ｐＨ条件は、約９ないし１２のｐＨを有する。前記塩基性ｐＨ条件は、用いる方法に応じて異なる場合があることを理解すべきである。当業者は、本発明の開示内容をみて、特定の付着反応の塩基性ｐＨ条件を容易に確かめることができる。
【００５０】
本発明の活性化基質は、当業者にしられた方法によって求核基を含む分子種またはエステルを含む分子種に接触される場合がある。例えば前記接触させるステップは、ジェットプリント法、固相または開放キャピラリ素子接触プリント法、微小流体力学的チャンネルプリント法、シルクスクリーン法および電気化学的または電磁的な力に基づくプリント素子を用いる技術によって実行される場合がある。
【００５１】
本発明の活性化多孔性基質は、分子が該基質に接触される限りいかなる方法によって、生体分子を含む、求核基を含む分子種またはエステルを含む分子種に接触されてもかまわないことが理解されるべきである。ここに明示的に説明されないその他の水性バッファーシステムでも、該バッファーシステムが分子の前記基質への付着を可能にする十分な条件を提供する限り使用してもかまわないことが理解されるべきである。
【００５２】
本発明の実施態様によると、水溶液中に含まれる分子の濃度は、分子のタイプ、サイズ、構造その他の該分子の溶解度に影響を与える可能性のある因子に応じて異なる場合がある。例えば前記付着したポリマーがポリヌクレオチドのとき、該ポリマーは５ｎＭないし４０μＭの範囲内であることが好ましい。より好ましくは前記ポリマーは５ｎＭないし５μＭの範囲内である。当業者は、前記結合する工程の最適化は、バッファー（インク）条件、時間、温度、湿度および使用するプリント素子のタイプの変更を含む場合があることを理解するであろう。かかる最適化は本明細書の内容に基づいて容易に実行できる。
【００５３】
１つの実施態様では、前記プローブ生体分子は前記蛸失せ基質の頂面の離散した場所に付着されて、アレイが形成される。本発明によると、これは予め定められた量の生体分子の溶液を前記基質の予め選択された場所に適用することによって手作業で達成できる。代替的には、米国特許第４，８７７，７４５号明細書に説明される、市販のジェットプリンタと圧電マイクロジェットプリント技術とを利用する熱インクジェットプリント法が、前記基質の選択された表面の部位に選択された生体分子をスポッティングするために利用できる。好ましい実施態様では、ウェルあたり１００−４００種のプローブのアレイ密度が、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ社（カリフォルニア州、アーバイン）製のＰＳ７２００モデルのような高解像度精密プリンタを用いて達成される。ここで適用可能なマイクロアレイプリント素子の他の製造者は、ＰＥ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（コネチカット州、Ｍｅｒｉｄｅｎ）またはＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ（カリフォルニア州、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ）を含む。
【００５４】
２．導電層
図３を参照して、導電層２は化学結合または物理的吸着のいずれかによって、多孔性基質１の底面の底面の側に付着される場合がある。例えば前記基質の一方の側は、プラズマ電着法で金属化されるか、導電性材料でペイントされる場合がある。シルクスクリーン法のようなさまざまなプリント技術が前記基質上に電極のパターンを作成するための用いられる場合がある。
【００５５】
Ｏｘｙｐｈｅｎ（ミシガン州、アナーバー）製ＲＯＴＲＡＣ（登録商標）キャピラリポア膜のような市販の金属化多孔性基質も使用できる。しかし、既製品の金属化多孔性基質を用いるときには、二次的な金属が媒介する（触媒）反応、脱アミノ化その他の望ましくない影響を阻止するために、前記ＤＡＳＴ活性化工程は改変されなければならない。
【００５６】
図４（マイクロプレートの１個のウェルのみが示される）に示す１つの実施態様では、多孔性基質と導電層との組立体は、多孔性基質１と導電層２との間に配置された浸透層６を含む。かかる浸透層は、比較的小さい荷電物質が通過することを許すが、ＤＮＡのような大きな荷電物質が導電層２に直接接触することを妨げる。前記浸透層は、ＤＮＡの電極への強力で非特異的な吸着を避ける役割を果たす。前記浸透層の構築のために適する材料は、導電性ポリマー接着剤と、アガロースのように導電性を支持する水和ネットワーク（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ、例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６，５４１−５４６，１９９８に説明されるグリオキシルアガロースと、メタクリレートまたはアクリルアミドのようなクロスリンクしたコポリマー）とを含むがこれらに限定されない。
【００５７】
３．マイクロプレート構築
本発明のマイクロプレートは、多孔性基質と導電層との組立体をマイクロプレートの少なくとも一部のウェルの底にシールすることによって構築される。図４は、本発明の１つの実施態様によって構築されたマイクロプレートの１個のウェルを示す。前記組立体は、前記導電層が電圧を受けるために利用可能なように前記ウェルに配置される。本発明の目的のためには、「組立体をシールする」とは、前記導電層をバルクの葉腋から物理的に隔離することができるいずれかの工程を意味する。
【００５８】
したがって、図７に示される１つの実施態様では、電極は複数の電極パッチを含み、マイクロプレートの底を形成する。多孔性基質は、導電性ポリマーを用いる前記電極に糊付けされる（ｇｌｕｅｄ）か、あるいは、ラミネート加工される。前記マイクロプレートの底は、底なしのウェルを有するマイクロプレートの上部部分に固定される。組み立てられると、前記マイクロプレートのウェルのパターンは前記電極パッチの場所と適合する。
【００５９】
代替的には、例えば図４および５に示すとおり、マイクロプレートの一部のウェルが導電性モノマーで満たされ、それから前記多孔性基質が、前記ウェル内の前記導電性モノマーの上に配設される。前記導電性モノマーは、その場で重合されて導電性のマイクロプレートを形成する。いずれの実施態様においても、マイクロプレートは標準的な９６個ないし３８４個のウェルのフォーマットを有する場合がある。
【００６０】
一般的に、多孔性基質および導電層の組立体は、物理的な制約（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ、例えば、マイクロプレートの上部部分と底との間に挟まれること、カプセルに封入すること、ラミネート加工または重合）によってウェルの底にシールされる場合がある。
【００６１】
前記多孔性基質は導電層でコーティングされる場合がある。代替的には前記導電層は、前記基質に吸着されるか、重合されるか、その他の手段によって、永久に前記基質の一方の側に固定される場合がある。前記導電層は前記膜と電極とを固定する密封剤の形状の場合もある。
【００６２】
要約すると、本発明は導電性マイクロプレートの新規な製造方法を提供する。前記方法は、
（ａ）頂面と底面とを有する多孔性基質を用意するステップと、
（ｂ）プローブ生体分子の共有結合による付着ができる反応性官能基で前記頂面を活性化するステップと、
（ｃ）反応性官能基へのプローブ生体分子の共有結合による付着に十分な条件下でプローブ生体分子に前記頂面を接触させるステップと、
（ｄ）前記多孔性基質の底面に導電層を付着するステップと、
（ｅ）電圧を受けるように適合した前記導電層で、前記多孔性基質を前記マイクロプレートの少なくとも一部のウェルの底にシールするステップとを含む。
【００６３】
好ましい実施態様では、前記接触するステップ（ｃ）は、前記多孔性基質の離散した場所で前記プローブ生体分子を接触させて、バイオアレイが形成されることを含む。
【００６４】
図４および８を参照して、１つの実施態様では、導電層２は第１の電極を形成し、前記マイクロプレートは第１の電極と通電する第２の電極７を含む。好ましくは、第２の電極は前記多孔性支持体の表面の外側に位置する。第１および第２の電極間の通電は、電解質溶液１０によってもたらされる。第１および第２の電極の極性は、前記多孔性基質の表面に引き寄せられるべき分子種のタイプ（陽イオンか、陰イオンか）に応じて切り替えられるか、あるいは交流になるかの場合がある。
【００６５】
図９を参照して、前記マイクロプレートが組み立てられると、標識された標的生物生体分子が前記電解質溶液に適用されて、前記基質の表面への電気泳動的トランスファーを促進して標的生体分子９のプローブ生体分子４への結合を助長するために、電流が電極間に印加される。
【００６６】
したがって別の側面では、本発明は標的生体分子をプローブ生体分子にハイブリダイゼーションする方法を提供する。前記方法は、
（ａ）導電層が第１の電極を形成し、電解質溶液を介して第１の電極と通電する第２の電極を含む、本発明の導電性マイクロプレートを用意するステップと、
（ｂ）標識された標的生体分子を前記電解質溶液に導入するステップと、
（ｃ）第１および第２の電極の間に電圧を印加して、前記標識された標的生体分子が前記プローブ生体分子と前記多孔性基質の表面でハイブリダイゼーションするステップとを含む。
【００６７】
４．電源
本発明のマイクロプレートは、第１および第２の電極に電圧を供給する電源とともに組み立てられる場合がある。従来の電源が適当であるが、本発明のマイクロプレートはロボットプラットホームとともに使用するために適合されることもある。
【００６８】
図５に示す１つの実施態様では、ホットプレート（すなわち電子的にアクティブなプレート）２０が電源として用いられる。前記ホットプレート電源は、マイクロプレート１５を受け入れるように適合した表面２１と、手段２３を通じて第１の電極２および第２の電極７とに電圧を提供する電力供給源２２とを含む。
【００６９】
図５に示す実施態様では、電圧を供給する手段２３は、前記ホットプレートの表面に取り込まれた電線であるリード線（同一の符号２３で示す）である。前記リード線は、前記マイクロプレートが前記ホットプレートの表面２１に配置されるとき、前記マイクロプレートの第１の電極２および第２の電極７に接続され、電圧を前記電極に提供する。
【００７０】
ホットプレートの電源は、前記マイクロプレートが戴置されるとき電気泳動を起こす電圧を提供するように、ロボットワークステーション２５の上に配置される場合がある。代替的にロボットアームが用いられる場合がある（図示されない）。前記ロボットアームのツールがマイクロプレートに接触すると、電気泳動用の電力が供給される。電気泳動的なハイブリダイゼーションが十分速い場合には、荷電したロボットアームのツールが前記ワークステーション上で１枚のプレートから別のプレートへと単に移動することがある。
【００７１】
図７−９に示す別の実施態様では、第１の電極は個々のウェルの基部にシールされた電極パッチのネットワーク３０を含み、前記電源は適合するリード線のネットワーク３１を含む。前記組立体は、バルクの試料溶液１０に露出した第２の電極７を含む。前記マイクロプレートが組み立てられるとき、電極パッチ３０とリード線３１とは物理的な接触によって直接的に接続されるか、あるいは、導電性の媒体を通して間接的に接続され、電圧が前記リード線から電極パッチに送られる。前記電圧は前記リード線を通って前記電源から前記パッチへと提供される。
【００７２】
代替的に、リード線３１は、ホットプレートに取り込まれる場合がある（図示されない）。この実施態様では、前記マイクロプレートが前記ホットプレートの表面２１の上に配置されるとき、電極パッチ３０とリード線３１とは物理的な接触によって直接的に接続されるか、あるいは、導電性の媒体を通して間接的に接続され、電圧が前記リード線から電極パッチに送られる。
【００７３】
また前記電圧供給手段は、図１０に示す電極端子ツール４０を含む場合がある。電極端子ツール４０は、導電層２と通電する１本の電極４１と、バルク溶液１０に露出したもう１本の電極７とを含む場合がある。電極４１は多孔性基質１の頂面（前記バルク溶液に面する側）を貫通する場合がある。電極４１は導電層２に直接接続するか、あるいは、導電層２に浸透層６を介して接続するかのいずれかの場合がある。いずれの実施態様でも、ロボット液体処理装置（ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｅｒ）によって電力が供給され制御されるＢｉｏｍｅｋ（商標）のようなロボットアーム装置と接続する電極端子ツール４０を使うことによって実施される。前記ロボットアームがマイクロプレートに接触するとき、電気泳動用の電力が供給される。電気泳動ハイブリダイゼーションが十分に速い場合には、荷電したロボットアームのツールが前記ワークステーション上で１枚のプ
レートから別のプレートへと単に移動することがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
以下の実施例は本発明の範囲を例示することを意図するものであって限定するものではない。かかる実施例は使用される可能性のある典型的なものではあるが、当業者に知られた他の手順が代替的に利用される場合がある。実際、当業者はこの開示内容に基づいて過度の実験を行うことなくさらなる実施態様を容易に想到し実施することができる。
【実施例１】
【００７５】
多孔性基質の活性化
同一承継人による米国特許第５，５８３，２１１号明細書に説明される条件下で、ポリプロピレン基質が高周波プラズマ放電法またはＲＦＰＤ法を用いるグロー放電ガス化学プラズマ法を使ってアミノ基で表面を官能基修飾された。表面アミノ基は無水コハク酸を用いてカルボキシル基に転化された。支持体は湿気を除去するために溶媒中でリンスされ、乾燥された。無水溶媒中のＤＡＳＴ試薬が前記支持体に適用され、乾燥し密封された容器中で常温で１−３時間インキュベーションされた。インキュベーション後、前記支持体は溶媒でリンスされ、乾燥された。フッ化アシル活性化基質は必要になるまで−２０°Ｃで乾燥状態で保存された。
【実施例２】
【００７６】
前記活性化基質へのプローブＤＮＡの共有結合付着
ｃＤＮＡ溶液（５０ｍＭ重炭酸バッファー、ｐＨ９中の１ｎＭストック溶液、２０ｎＬ）が実施例１に従って調製された活性化多孔性基質の表面にプリントされた。プリント作業は、Ｂｉｏｍｅｋ３８４ピンＨＤＲＴ（高密度レプリカ用ツール）を使って実施された。プリント細胞魚は、ｃＤＮＡの修飾なしで実施された。ｃＤＮＡをプリントしたスポットは、２５°Ｃに保たれた加湿チャンバー内で１時間前記基質と反応させられた。前記表面に残存する活性フッ素基常温で２時間エタノール中でクエンチされた。アクチン、Ｇ３ＰＤＨおよびＴＮＦのビオチン標識ｃＤＮＡ標的（例えば、４１ｎＭストック溶液１μＬが最終体積１５０μＬに希釈された。４１ｆｍｏｌすなわち〜２４６ｘ１０８個の分子が適用された。）が前記マイクロアレイにハイブリダイゼーションされた（１時間、６０°Ｃ、２ｘＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳ）。それからリンスの後、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼのコンジュゲートが適用され、信号がＥＬＦ試薬（モレキュラープローブ社）を用いて発色され、冷却ＣＣＤカメラの下で検出された。
【００７７】
図６に示す結果は、本発明の活性化基質が前記相補的なｃＤＮＡ標的（アクチン、Ｇ３ＰＤＨおよびＴＮＦ）を特異的にハイブリダイゼーションできることを証明する。したがって、本発明の活性化基質は、未修飾のプローブ生体分子の共有結合付着に使用できる。
【実施例３】
【００７８】
電気泳動援用ハイブリダイゼーション
片側の面にｃＤＮＡプローブが固定化された超高分子量ポリエチレンの多孔性膜ストリップがスラブゲル電気泳動装置の陽電極近傍に取り付けられた。前記ストリップは変性剤（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に浸漬して１５分間インキュベーションされた。残存する変性剤は前記ストリップから除去され、その後前記ストリップはリンスされて、前記電気泳動装置にランニングバッファー（１ｘＴＢＥ）を満たした。標的ｃＤＮＡ（アクチン）は沸騰水中で処理された後、氷上に置かれてから、ランニング色素を含むゲル装荷バッファー（Ｄｉｇｅｎｅ社、メリーランド州、Ｂｅｔｓｖｉｌｌｅ）と混合された。ｃＤＮＡ標的溶液は前記多孔性ストリップから約０．５ｃｍ話して配置された。電圧が前記ストリップに印加され（２７４Ｖ、１２２ｍＡ）、前記色素の先端が前記ストリップに到達してから５分間通電した。電源が切られ、ハイブリダイゼーションが５分間進行させられた。前記ストリップは前記装置から取り外され、化学発光試薬ＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ、ミシガン州、サウスフィールド）とともにストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼを用いて信号が発色された。２ｘＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳによる５分間３回のリンスの後、ＥＬＦ試薬（モレキュラープローブ、オレゴン州、ユージーン）が蛍光信号を発色するのに用いられた。前記化学発光および蛍光信号は、ＣＣＤカメラシステムを用いて検出された。アクチン標的の相補的なアクチンプローブへの特異的なハイブリダイゼーションに対応する蛍光および化学発光スポットが検出された。さらに、非特異的な信号のスメアが前記膜の下端から上端までにわたって動くのが観察され、標的ｃＤ電気泳動中にＮＡアクチンの膜上へのさらなる濃縮が起こったことを示唆する。この実験は、前記膜に共有結合で付着した相補的なプローブの近傍に電気泳動で促進された前記標的の濃縮に続いて標識ｃＤＮＡ標的が迅速かつ特異的に捕捉されたことを証明する。
【００７９】
以上のとおりかなり詳細に好ましい実施態様について説明されたが、これらの実施態様は上記の開示内容または添付する請求の範囲についての限定として解釈されるべきではない。当業者の理解できる範囲内の改変および変更は、添付する請求の範囲内に該当するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】電界中の負に荷電した分子の運動に影響する力を示すダイヤグラム。
【図２Ａ】拡散依存ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション法の概念図。
【図２Ｂ】エレクトロキネティック・ハイブリダイゼーション法の概念図。
【図３】多孔性基質と導電層との組立体の模式図。
【図４】多孔性基質と、浸透層と、ウェルの底にシールされた導電層との組立体の模式図。
【図５】マイクロプレートと、ホットプレート電源との組立体の模式図。
【図６】活性化多孔性フィルム基質上に固定化されたｃＤＮＡプローブへの標識ｃＤＮＡ標的の受動的ハイブリダイゼーションの検出結果画像。
【図７】電極パッチのネットワークを含むマイクロプレートと、適合するリード線のネットワークを含む電源との組立体の模式図。
【図８】ＤＮＡハイブリダイゼーション開始前の本発明のマイクロプレート組立体の概念図。
【図９】ＤＮＡ電気泳動中の図８のマイクロプレート組立体の概念図。
【図１０】電極端子ツールを有する本発明のマイクロプレート組立体の概念図。
【符号の説明】
【００８１】
１    ハイブリダイゼーション基質
２    導電層
３    頂面
４    プローブ生体分子
５    標的ＤＮＡ
６    浸透層
７    第２の電極
９    標的生体分子
１０    電解質溶液
１５    マイクロプレート
２０    ホットプレート
２１    ホットプレートの表面
２２    電源
２３    電圧供給手段
２５    ロボットワークステーション
３０    電極パッチ
３１    リード線
４０    電極端子ツール
４１    電極
４２    ロボットアーム装置
【図１】
2005526259.tif 000003
【図２Ａ】
2005526259.tif 000004
【図２Ｂ】
2005526259.tif 000005
【図３】
2005526259.tif 000006
【図４】
2005526259.tif 000007
【図５】
2005526259.tif 000008
【図６】
2005526259.tif 000009
【図７】
2005526259.tif 000010
【図８】
2005526259.tif 000011
【図９】
2005526259.tif 000012
【図１０】
2005526259.tif 000013
【国際調査報告】
2005526259.tif 000014