(57)【要約】本発明は、MBLおよび/またはMBL変異体を含む医薬組成物に関する。具体的には、本発明は、マンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体が総タンパク質の少なくとも35%(w/w)を構成する、少なくとも200μg/mlのタンパク質含有物質を含む医薬組成物、または少なくとも400μg/mlマンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体を含む組成物に関する。さらに、本発明はMBLおよび/またはMBL変異体、および二価カチオンを含む医薬組成物に関する。本発明は、該組成物の製造方法も説明する。本発明の医薬組成物は、例えば感染症を含む多くの種々の臨床病状の治療方法に用いることができよう。臨床病状治療用医薬を製造するための該組成物の使用も説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容される添加剤、および
a)マンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体が総タンパク質の少なくとも35%(w/w)を構成する、少なくとも200μg/mlのタンパク質含有物質、または
b)少なくとも400μg/mlのマンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体
を含む医薬組成物。
【請求項２】
タンパク質溶液である請求項1記載の組成物。
【請求項３】
タンパク質懸濁液である請求項1記載の組成物。
【請求項４】
該溶液または懸濁液が凍結している請求項2および3のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
凍結乾燥タンパク質を含む乾燥組成物である請求項1記載の組成物。
【請求項６】
該乾燥組成物を溶液に再構成することができる請求項5記載の組成物。
【請求項７】
該溶液または懸濁液が注射または注入により投与するのに適している請求項1.a)、3および6のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
該溶液または懸濁液がボーラス注射により投与するのに適している請求項1.a)、3および6のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
該溶液または懸濁液が静脈注射または注入により投与するのに適している請求項1.a)、3および6のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
該溶液または懸濁液が皮下注射により投与するのに適している請求項1.a)、3および6のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
該溶液または懸濁液が筋肉内注射により投与するのに適している請求項1.a)、3および6のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも750μg/mlのタンパク質含有物質またはその塩を含む請求項1記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも750μg/mlのMBLまたはMBL塩を含む請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
200〜3000μg/mlの範囲のMBLおよび/またはMBL変異体を含む請求項1記載の組成物。
【請求項１５】
MBLまたはMBL塩が総タンパク質の少なくとも50%(w/w)を構成する請求項1記載の組成物。
【請求項１６】
総タンパク質がさらに1またはそれ以上のMBL関連セリンプロテアーゼ(MASP)またはその断片を含む請求項1記載の組成物。
【請求項１７】
MASPが配列番号2のMASP-1、配列番号3のMASP-2、配列番号4のMASP-3、その断片、ならびにその機能的等価物からなる群から選ばれる請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
MBLが配列番号1のMBL、その断片、ならびにその機能的等価物からなる群から選ばれる先の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
MBLが天然のヒト血清MBLである請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
MBLが組換えにより製造されている請求項18に記載の組成物。
【請求項２１】
50%以上のMBLが非還元SDS-PAGEで測定して200kDaより大きい請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
少なくとも1の医薬的に許容される添加剤が等張化剤である請求項1記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも1の医薬的に許容される添加剤が緩衝剤である請求項1記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも1の医薬的に許容される添加剤が安定化剤である請求項1記載の組成物。
【請求項２５】
さらに二価のカチオンを含む請求項1記載の組成物。
【請求項２６】
二価のカチオンがCa2+である請求項25に記載の組成物。
【請求項２７】
医薬的に許容される添加剤が等張塩、高張塩、緩衝剤、および安定化剤からなる群から選ばれる1またはそれ以上を含む請求項7記載の組成物。
【請求項２８】
医薬的に許容される添加剤が等張化剤、緩衝剤、安定化剤、および抗凍結剤からなる群から選ばれる1またはそれ以上を含む請求項5記載の組成物。
【請求項２９】
医薬的に許容される添加剤がグルコース1水和物、グリシン、NaCl、およびポリエチレングリコール3350を含む請求項5記載の組成物。
【請求項３０】
緩衝剤が溶液をpH6〜8の範囲に緩衝することができる請求項23、25、および28のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
緩衝剤がTRIS、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシネート、ヒスチジン、グリシン、スクシネート、およびトリエタノールアミン緩衝液からなる群から選ばれる請求項23、25、および28のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
等張性、低張性、または高張性である請求項22記載の組成物。
【請求項３３】
等張化剤がNaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、マンニトール、およびグリセロールからなる群から選ばれる請求項22、25、および28のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
安定化剤がポロキサマー、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、メタリオン、アミノ酸、ポリエチレングリコール、Triton、EDTA、およびアスコルビン酸からなる群から選ばれる請求項24〜28のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
該抗凍結剤がデキストラン、ポリエチレングリコール、ショ糖、トレハロース、およびマンニトールからなる群から選ばれる請求項28記載の組成物。
【請求項３６】
滅菌されている請求項28記載の組成物。
【請求項３７】
ウイルス減少工程にかけられている請求項7記載の組成物。
【請求項３８】
タンパク質含有安定化剤を含まない請求項1記載の組成物。
【請求項３９】
界面活性剤を含まない請求項1記載の組成物。
【請求項４０】
安定化剤を含まない請求項1記載の組成物。
【請求項４１】
医薬的に許容される添加剤、およびマンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体、および少なくとも1の二価カチオンを含む医薬組成物。
【請求項４２】
二価カチオンがCa2+である請求項41記載の組成物。
【請求項４３】
マンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体の濃度が少なくとも1mg/mlである請求項41記載の組成物。
【請求項４４】
a)マンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体を得、
b)該MBLおよび/またはMBL変異体と医薬的に許容される添加剤および所望により二価カチオンと混合し、
c)それにより請求項1〜43のいずれかに記載の医薬組成物を得る
工程を含む請求項1〜43のいずれかに記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項４５】
請求項1〜43のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む臨床病状の治療を必要とする個体の臨床病状を治療する方法。
【請求項４６】
該治療が治癒的、改善的、および予防的治療からなる群から選ばれる請求項45記載の方法。
【請求項４７】
投与が注射または注入による請求項45記載の方法。
【請求項４８】
投与がボーラス注射による請求項45記載の方法。
【請求項４９】
投与が静脈内注射または注入による請求項45記載の方法。
【請求項５０】
投与が皮下注射による請求項45記載の方法。
【請求項５１】
投与が筋肉内注射による請求項45記載の方法。
【請求項５２】
臨床病状が感染である請求項45記載の方法。
【請求項５３】
個体がヒトである請求項45記載の方法。
【請求項５４】
個体が感染を受けるリスクが増大しているヒトである請求項45記載の方法。
【請求項５５】
個体の血清MBLレベルが正常以下である請求項45記載の方法。
【請求項５６】
臨床病状の治療を必要とする個体における臨床病状を治療するための医薬を製造するための請求項1〜43のいずれかに化合物試合の組成物の使用。
【請求項５７】
臨床病状が感染である請求項56記載の使用。
【請求項５８】
個体がヒトである請求項56記載の使用。
【請求項５９】
個体が感染を受けるリスクが増大しているヒトである請求項56記載の使用。
【請求項６０】
個体の血清MBLレベルが正常以下である請求項56記載の使用。
【請求項６１】
請求項1〜43のいずれかに記載の組成物を含む臨床病状の治療を必要とする個体の臨床病状を治療するための医薬。
【請求項６２】
臨床病状が感染である請求項61記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノース結合レクチンを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、該医薬組成物を用いる臨床病状の治療方法および医薬を製造するための該医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
MBLはコレクチンファミリーのタンパク質であり、オリゴマー構造のサブユニットを特徴とする。各サブユニットはコラーゲンロッドと結合したカルシウム依存性C型炭水化物認識ドメイン(CRD)からなる。
【０００３】
MBL分子中のサブユニットの数は様々であるが((Lipscombe RJら、1995)、生物学的に活性なポリペプチドは3以上のサブユニットからなるオリゴマーである。血漿中の天然MBLは、主に3以上のサブユニットのオリゴマーを含み、さらに変性および構造的欠陥があるタンパク質型は、例えばSDSゲル上に、より高オリゴマーに対応する優性MBLバンド間にバンドを生じる。
【０００４】
組換え的に製造したMBLには血漿由来MBLと同様のオリゴマー変化がみられる(Vorup-Jensen Tら、2001)。しかしながら、通常組換え的に製造したMBLは血漿由来MBLより低質量型の含有量が高い。低質量型のMBLは、例えば一本鎖ポリペプチド、1サブユニット、およびダイマーサブユニットを含む。
【０００５】
MBLは、補体の補体C1のC1qサブコンポーネントと構造的に関連があり、MBLは古典経路のC1rおよびC1sコンポーネントと同様であるMASPs(Matsushita、M.、1992)またはp100(Ji、Y-H.ら、1993)と呼ばれる関連セリンプロテアーゼを介して補体系を活性化する。MBLコンポーネント活性化経路はMBレクチン(MBLectin)経路と呼ばれる。この経路が前提とする機序によれば、MBLは細菌、酵母、寄生性プロトゾア、およびウイルスを含むある範囲の微生物上にみられる特定の炭水化物構造と結合し(Turner、M.W、1996)、その抗微生物活性は最終的溶菌補体経路コンポーネントの活性化(Kawasaki、Nら、1989)または食菌作用の促進(Kuhlman、Mら、1989)により生じる。
【０００６】
報告によれば、血漿中MBLレベルは遺伝的に決定されるかもしれない(Sumiya、Mら、1991、Lipscombe、R.J.ら、1992、Madsen H.O.ら、1994)。MBL欠乏(不全)は、幼児期(Super、Mら、1989、Garred、P.ら、1995)およびおそらく成人(成体)(Garred、P.ら、1995、Summerfield、J. A.ら、1995)における種々の微生物による頻繁な感染に対する感受性と関連がある。最近の情報は、HIV感染およびAIDS発現後のより急速な死とMBL欠乏を関連づける(Nielsen、S.Lら、1995、Garred、Pら、1997)。MBLは、関節リウマチ患者に上昇した濃度でみられるガラクトシル形のIgG(G0)と結合し、補体を活性化する(Malhotra、R.ら、1995)。MBL欠乏は、再発性自然流産素因(Kilpatrick、D.Cら、1995)および全身エリテマトーデスの発現(Davies、E. J.ら、1995)とも関連がある。
【０００７】
MASP-1(MBL関連セリンプロテアーゼ1)は、補体経路のC1rおよびC1sと構造がよく似たセリンプロテアーゼであるが、トリプシンおよびトリプシン様セリンプロテアーゼにみられるタイプのヒスチジンループ構造を有する。MASP-1は、MBLによる補体活性化に関与することがわかってきた。MASP-1をコードするcDNAクローンは、19アミノ酸の推定リーダーペプチド、次いで成熟ペプチドを形成すると予想される680アミノ酸残基をコードすることが報告されている。
【０００８】
MASP-2(MBL関連セリンプロテアーゼ2)(Thiel、Sら、1997)は、補体経路のC1rおよびC1sと構造がよく似たセリンプロテアーゼである。これらと同様に、そしてMASP-1と反対に、MASP-2はトリプシンおよびトリプシン様セリンプロテアーゼにみられるタイプのヒスチジンループ構造をもたない。MASP-2は、MBLによる補体活性化に関与することがわかってきた。MASP-3は、MASP-1とMASP-2および2つのC1q関連セリンプロテアーゼC1rおよびC1sといくらかの相同性を示す。
【０００９】
血清から精製したMBLは、以前に2人のMBL欠乏個体を治療するための、さらにヒト血清アルブミンを含む医薬製剤に用いられ、該MBL治療は有意な感染の低下をもたらした(Valdimarsonら、1998)。さらに、種々の他のMBL医薬製剤が先行技術に記載されている。
【００１０】
Valdimarssonらは、0.15M NaCl中の200μg/ml MBLおよび1%w/v(=10mg/ml)ヒト血清アルブミンを含む溶液の注入について記載している。
【００１１】
US5,270,199は、5〜100μg/ml MBLおよび/またはMBL断片を含むMBL製剤について記載している。
【００１２】
WO 99/64453は、MBLおよび安定化剤を含む種々のMBL製剤について記載している。好ましい例として0.5%w/vアルブミン(=5mg/ml)含有PBS中の300〜400μg/mlを含む製剤が記載されている。
【００１３】
しかしながら、これらMBL製剤は、低量のMBLおよび/または高濃度の他のタンパク質を含む。
(発明の要約)
【００１４】
しかしながら、安定なMBLを含むMBL製剤、特に例えばヒト血清アルブミン量が低減したような安定化剤を含むタンパク質含有量が低減した該製剤の必要性がある。
【００１５】
タンパク質またはポリペプチドを活性成分として含むほぼすべての医薬製剤は、該タンパク質またはポリペプチドの1またはそれ以上の安定化剤も含む。特に、該安定化剤は、界面活性剤またはタンパク質含有安定化剤であってよい。しかしながら、多くの目的では、種々の添加剤、例えば医薬組成物に用いる安定化剤の量、特にタンパク質含有安定化剤の量を減らすかまたは除くことが望ましいが、タンパク質含有安定化剤を減らすとしばしば活性タンパク質成分の安定性の低下が生じることが多い。
【００１６】
本発明者らは、高濃縮MBLの製造方法を開発し、驚くべきことに、本発明者らは高濃度のMBLを含有するMBL製剤がただタンパク質含有量が低減した安定化剤を加えるかまたは加えなくても医薬製剤に用いるのに十分安定かもしれないことを示した。
したがって、本発明の第一の目的は、医薬的に許容される添加剤、および
a)マンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体が総タンパク質の少なくとも35%(w/w)を構成する、少なくとも200μg/mlのタンパク質含有物質、または
b)少なくとも400μg/mlのマンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体
を含む医薬組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の第二の目的は、医薬的に許容される添加剤、およびマンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体、および少なくとも1の二価カチオンを含む医薬組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の第三の目的は、
a)マンナン結合レクチン(MBL)および/またはMBL変異体を得、
b)該MBLおよび/またはMBL変異体を医薬的に許容される添加剤および所望により二価カチオンと混合し、
c)それにより該医薬組成物を得る
工程を含む該医薬組成物の製造方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、該医薬組成物の投与を含む臨床病状の治療を必要とする個体の臨床病状の治療方法を提供することである。該治療は、治癒的、改善的、緩和的、および予防的治療、および補助治療からなる群から選ぶことができよう。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、臨床病状の治療を必要とする個体の臨床病状を治療するための医薬を製造するための上記組成物の使用を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、上記組成物を含む臨床病状の治療を必要とする個体の臨床病状を治療するための医薬を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前記医薬組成物の投与を含む診断方法を提供し、または診断のための該薬組成物の使用を提供することである。
(図面の簡単な説明)
【００２３】
図1は、+4℃および-20℃に12ヶ月間保存した1mg/ml MBL製剤の標準MBLと比較したC4活性化データを示す。
【００２４】
図2は、上段に標準品、次いで+4℃および-20℃に維持した1mg/ml安定性試料のSECクロマトグラムを示す。総MBL含有量の1%に相当する小さな前方のピークが冷蔵試料中に検出されている。
【００２５】
図3は、質量分析データを示す。標準および12カ月MBL試料の同様のピークは、保存時にMBLポリペプチド鎖に変化がないことを示す。
(配列表の簡単な説明)
配列番号1：ヒトMBLタンパク質配列
配列番号2：ヒトMASP-1タンパク質配列
配列番号3：ヒトMASP-2タンパク質配列
配列番号4：ヒトMASP-3タンパク質配列
(発明の詳細な説明)
MBLおよびMBL変異体
【００２６】
本発明は、MBLおよび/またはMBL変異体を含む医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、一般に高濃度のMBLを含み、例えば該組成物は少なくとも200μg/ml、例えば少なくとも250μg/ml、例えば少なくとも300μg/ml、例えば少なくとも500μg/ml、例えば少なくとも750μg/ml、例えば少なくとも1000μg/ml、例えば少なくとも1300μg/mlのMBLおよび/またはMBL変異体を含んでよい。
【００２７】
したがって、該組成物は、200〜10000μg/ml、例えば200〜5000μg/ml、例えば200〜3000μg/ml、例えば200〜2000μg/ml、例えば200〜1500μg/mlの範囲のMBLおよび/またはMBL変異体を含んでよい。
医薬組成物が二価カチオンを含む本発明の態様において、該組成物は、少なくとも10μg/ml、例えば少なくとも25μg/ml、例えば少なくとも50μg/ml、例えば少なくとも100μg/ml、例えば少なくとも150μg/ml、例えば少なくとも200μg/ml、例えば少なくとも250μg/ml、例えば少なくとも300μg/ml、例えば少なくとも500μg/ml、例えば少なくとも750μg/ml、例えば少なくとも1000μg/ml、例えば少なくとも1500μg/ml、例えば少なくとも2000μg/ml、例えば少なくとも2500μg/ml、例えば少なくとも3000μg/ml、例えば少なくとも3500μg/ml、例えば少なくとも4000μg/ml、例えば少なくとも5000μg/ml、例えば少なくとも6000μg/ml、例えば少なくとも7000μg/ml、例えば少なくとも8000μg/ml、例えば少なくとも9000μg/ml、例えば少なくとも10000μg/mlの範囲のMBLおよび/またはMBL変異体を含むことが好ましい。
【００２８】
MBLの濃度は、一般にMBLを構成するアミノ酸の重量を測定および/または計算することにより決定すべきである。一般に、該重量は非グリコシル化形のMBLに対応するように計算する。したがって、一般にMBLの重量はいかなるグリコシル化も含まず、含水量も含まない。ある態様において、MBL濃度は本明細書に記載のアミノ酸分析を用いて決定することができよう。
アミノ酸分析によるMBL濃度の推定
【００２９】
すべてのアミノ酸をアミノ酸分析で推定するわけではないが、純粋またはかなり純粋なMBL溶液の濃度を決定する場合は通常検出不能なアミノ酸の質量が検出したアミノ酸の組成から容易に推定されるかもしれない。
【００３０】
MBL濃度の推定は、多くの種々の方法にしたがって行うことができよう。好ましくは、以下に本明細書に記載の2つの方法の1つを用いるのが好ましく、以下に本明細書に記載の方法2を用いるのがより好ましいかもしれない。
【００３１】
炭水化物の量は通常推定されない。すなわち、記載したタンパク質濃度は通常ペプチド含量のみを示すだけであろう。しかしながら、アミノ酸量からペプチド+炭水化物の総質量を決定することができる。
検出不能なアミノ酸
【００３２】
MBLを推定するとき検出不能なアミノ酸には以下のものがある。
* トリプトファン(Trpが酸中で加水分解される)；3 Trpがポリペプチド鎖中に存在する。
* ヒスチジン(HisはTrisで同時に溶出される)；1 Hisのみがポリペプチド鎖中に存在する。
* ヒドロキシリジン(Hylは較正時に適用されない)；最大4 Hylがポリペプチド鎖中に存在するかも知れない。
* ヒドロキシプロリン(Hyp)；最大8、典型的には4 Hypがポリペプチド鎖中に存在する。
検出可能な−しかし確実に推定されない−アミノ酸には以下のものがある。
* リジン(Lysは部分的にヒドロキシル化されている)；15-19 Lysがポリペプチド鎖中に存在する；最大4 Lysがヒドロキシル化されているかも知れない。
* プロリン(Proは部分的にヒドロキシル化されている)；10-18 Proがポリペプチド鎖中に存在する；最大8 Proがヒドロキシル化されているかもしれない。
方法1：
【００３３】
分析試料中の検出可能なアミノ酸のモルおよび検出不能なアミノ酸のモル：
検出不能なアミノ酸=Trp、His、Hyp、およびHyl：平均で4 Hyp、4 Hyl、14 Pro、および15 Lysが存在すると推測される。
非検出モル(NonDetectedMoles)=[Trp]+[His]+[Hyp]+[Hyl]=3+1+4+4=12
非検出モルの補正因子=全モル/検出モル(DetectedMoles)=全モル/(全モル-非検出モル)=228/(228-12)=1.0556
検出不能アミノ酸=Trp、His、Hyp、およびHyl: 非検出モル=[MTrp]+[MHis]+[MHyp]+MHyl]=3*186.21+1*137.14+4*113.11+4*144.17=1725.89
検出質量=[MAsx]+[MThr]+[MSer]+[MGlx]+[MPro]+[MGly]+[MAla]+[MCys]+[MVal]+[MMet]+[MIIe]+[MLeu]+[MTyr]+[MPhe]+[MLys]+[MArg]=25*115.09+15*101.11+13*87.08+27*129.12+14*97.12+31*57.05+16*71.08+7*103.15+10*99.13+2*131.20+8*113.16+17*113.16+1*163.18+9*147.18+15*128.17+6*156.19=22429.93
非検出質量の補正因子=全質量/検出質量=(検出質量+非検出質量)/検出質量=1.0769
方法2：
【００３４】
検出不能アミノ酸=Trp、His、Pro/Hyp、およびLys/Hyl:平均で4 Hyp、4 Hyl、14 Pro、および15 Lysが存在すると推測される。
非検出モル=[Trp]+[His]+[Pro/Hyp]+[Lys/Hyl]=3+1+18+19=41
非検出モルの補正因子=全モル/検出モル=全モル/(全モル-非検出モル)=228/(228-41)=1.2193
【００３５】
分析試料中の検出可能アミノ酸の質量および検出不能アミノ酸の質量：
各アミノ酸について質量はモル×モル質量として推定する(不足ペプチド結合水について補正)。
例えば：[MThr]=[Thr]*(119.12-18.01)=[Thr]*101.11
【００３６】
検出不能なアミノ酸=Trp、His、Pro/Hyp、およびLys/Hyl：
非検出質量=[MTrp]+[MHis]+[MPro]+[MHyp]+[MLys]+[Mhyl]=3*186.21+1*137.18+97.12+19*128.17=4879.16
検出質量=[MAsx]+[MThr]+[MSer]+[MGlx]+[MGly]+[MAla]+[MCys]+[MVal]+[MMet]+[Mlle]+[MLeu]+[MTyr]+[MPhe]+[MArg]=25*115.09+15*101.11+13*87.08+27*129.12+31*57.05+16*71.08+7*103.15+10*99.13+2*131.20+8*113.16+17*113.16+1*163.18+9*147.18+6*156.19=19147.70
非検出質量補正因子=全質量/検出質量=(検出質量+非検出質量)/検出質量=1.2548
評価方法1および方法2の比較：
方法1は、アミノ酸の約95%の推定値に基づくが、方法2はアミノ酸の約75%のみの推定値に基づく。
【００３７】
一般に、実施したすべてのアミノ酸含有量推定は両方法により計算し、通常、結果に有意差はみられない。方法2は、HylおよびHypの含有量を推測しないので好ましい。
【００３８】
ある種の目的において、MBL濃度は重量/容量よりモルで表す。MBLは種々の量のサブユニットを含むオリゴマーとして存在してよいが、MBLの1モルを定義するのは難しい。本発明の範囲内において、1モルMBLは個々のMBLポリペプチド鎖の1モルを表すことが好ましい。該個々のMBLポリペプチド鎖はグリコシル化されていなくても、部分的にグリコシル化されていても、または完全にグリコシル化されていてもよい。MBLのモル濃度はMBLがグリコシル化されていないと予想して計算する。
【００３９】
個々の非グリコシル化MBLポリペプチド鎖の分子量は25800Daである。個々の完全グリコシル化MBLポリペプチド鎖の分子量は25900Daである。個々のグリコシル化MBLポリペプチド鎖の最も普通に生じる形の分子量は25500Daである。
【００４０】
したがって、MBLのグリコシル化状態に応じて1mg/ml MBLは38〜41μM、好ましくは38.6〜40.3μMの範囲に相当する。最も実用的適用において、1mg/ml MBLは約39.2μMに相当する。しかしながら、1mg/ml非グリコシル化MBLは約40.3μMに相当するが、1mg/ml完全グリコシル化MBLは約38.6μMに相当する。
【００４１】
上記計算は配列番号1のMBLに言及している。
【００４２】
しかしながら、該方法をMBL断片および/または変異体の濃度を推定するのに適応させることができることは明らかである。
【００４３】
多くの目的において、医薬組成物は減少した量の、MBL以外のタンパク質を含むことが望ましい(下記参照)。
【００４４】
したがって、MBLまたはMBL変異体が総タンパク質の少なくとも35%(w/w)、例えば少なくとも40%(w/w)、例えば少なくとも50%(w/w)、例えば少なくとも60%(w/w)、例えば少なくとも70%(w/w)、例えば少なくとも80%(w/w)、例えば少なくとも90%(w/w)、例えば少なくとも95%(w/w)、例えば少なくとも98%(w/w)、例えば少なくとも99%(w/w)、例えば少なくとも99.5%(w/w)、例えば少なくとも99.8%(w/w)を構成する医薬組成物が好ましい。
【００４５】
本発明のある態様において、MBLは本質的に総タンパク質のすべてを構成する。用語「本質的に」は「すべて検出可能な」、好ましくはクーマシーブリリアントブルー染色で検出可能なすべてのタンパク質を含むことを意味する。
【００４６】
別の態様において、該医薬組成物の広く使用されるタンパク質添加剤、例えば安定化剤として作用するタンパク質またはタンパク質含有安定化剤を含んでいてよい。安定化剤として有用なタンパク質は、例えばヒト血清アルブミンや他の種類の血清アルブミンを含む。さらに、タンパク質含有安定化剤は粗ヒト血清またはその分画で提供してよい。
【００４７】
該安定化剤は、一般に適切な濃度のタンパク質を含むタンパク質含有医薬組成物の安定性に重要である。一般に、目的とするタンパク質の濃度が低い場合、保存容器などの表面に目的タンパク質が非特異的に付着する危険性がかなりある。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用はタンパク質の三次元構造を安定化させるので、より高いタンパク質濃度において変性を低下させることができよう。他方、高濃度の目的タンパク質を含むタンパク質溶液は、該タンパク質の凝集がより早い速度で生じることがあるため一般に安定でない(FrokjaerおよびHovgaard、p.102、Wang、1999)。したがって、上記問題を克服するため安定化剤、例えばタンパク質含有安定化剤、例えばアルブミン (Akersら、2000、pp.166-167)または例えば界面活性剤をタンパク質含有医薬製剤に加える。
【００４８】
しかしながら、安定化剤を医薬組成物に加えるのがいつも望ましいわけではない。アルブミンのようなひろく使用されるタンパク質含有安定化剤は通常血清から精製されるが、血清ドナーから病原体が伝搬する危険性があるため望ましくない。さらに、生成物をできるだけ単純に保つため医薬組成物に加える添加剤の数を減らすことが望ましいことが多い。製造工程が少なければ操作がより簡単であり、経費を削減し、タンパク質が損失および変性する危険性が減少する。したがって、タンパク質安定化剤を加えないこと、例えばタンパク質含有安定化剤および界面活性剤を加えないことが好ましいことが多い。
【００４９】
驚くべきことに、ある態様において、本発明はいかなるタンパク質安定化剤も含まないMBL含有医薬組成物を開示する。すなわち、該製剤はMBL以外の他の検出可能なタンパク質を含まず、該製剤はいかなる界面活性剤も含まない。
【００５０】
したがって、本発明のある好ましい態様において、MBLは本質的に該医薬組成物の総タンパク質すべてを構成する。特に、該組成物は血清または他のヒトもしくは動物体試料から精製されたタンパク質を含まないことが好ましいかもしれない。
【００５１】
したがって、本発明の好ましいある態様において該医薬組成物は血清または他のヒトもしくは動物体試料から精製されたタンパク質またはタンパク質含有物質を含まない。その態様において、すべてもしくは本質的にすべてのタンパク質含有物質を組換え方法を用いて製造することが好ましい。ドナーからウイルスや他の病原性物質が伝搬する危険性があるため、血清や他のヒトもしくは動物体試料から精製した化合物を含まない医薬組成物を投与するのが望ましいことが多い。
【００５２】
本発明のある態様において、さらに安定性を増すためにMBLまたはMBL変異体を修飾してよい。したがって、MBLまたはMBL変異体のin vivo半減期を増大させるため、MBLまたはMBL変異体をペギレート化、アシレート化、または他の方法で修飾してよい。
【００５３】
用語MBLまたはMBL変異体は、あらゆる形のMBLまたはそのあらゆる機能的相同体を含むことを意味する。MBLまたはMBL変異体は、配列番号１として同定されるアミノ酸配列またはその断片もしくはその機能的相同体を含む少なくとも１のポリペプチドを含むタンパク質であってよい。
【００５４】
本発明のMBLは１またはそれ以上のサブユニットを含んでよい。各MBLサブユニットは、通常、好ましくは配列番号１として同定されるアミノ酸配列またはその機能的相同体を含む、３個の個々のポリペプチドからなる。例えば、MBLは、サブユニットのモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ペンタマー、オクタマー、ノナマー、デカマー、11マー、12マーであってよく、MBLは12以上のサブユニットも含むことができよう。好ましくは、MBLは2以上のサブユニットを含む。
【００５５】
本発明において用いるMBLは、あらゆる適切な供給源由来であってよく、例えばMBLは天然のMBLであるか、MBLは組換え的に製造されたMBLであってよい。組換え的に製造されたMBLを本発明で用いるときは、該組換え的に製造されたMBLは天然MBLと同様のサイズ分布プロフィールを持つことが好ましい。したがって、少なくとも50%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも99%のMBLの非還元SDS-PAGEで測定した見かけの分子量が>200 kDaであることが好ましい。
【００５６】
本発明によれば、MBLはヒトMBL、またはこの点で免疫系がヒト免疫系のように作用する他の動物種のMBL、例えば限定されるものではないがチンパンジーおよびアガゲザル由来のMBLであってよい。
【００５７】
本発明のある態様において、MBLは精製天然ヒト血清MBLである。本発明の別の態様において、MBLは組換え的に製造されている。MBLは組換え的に製造されていることが好ましい。
【００５８】
組換えMBLの好ましい製造方法の例は、PCT出願WO00/70043に記載されている(この内容は本明細書の一部を構成する。)。特に、本発明で用いる組換えMBLはPCT出願WO00/70043の実施例1に記載のごとく製造することができよう。該実施例において、組換えMBLはヒトMBL遺伝子由来配列を含む発現ベクターを用いて製造される。MBLは下記実施例1に記載のごとく製造することもある。
【００５９】
非常に濃縮されたMBLおよび/またはMBL変異体を含む医薬組成物を得るには、濃縮MBLおよび/またはMBL変異体組成物を濃縮する必要があることもある。濃縮はあらゆる従来の方法、例えば濾過装置を用い、またそれを遠心力にさらすことにより行うことができよう。しかしながら、大量のタンパク質の濃縮には他の方法が好ましいことがある。
【００６０】
本発明は、MBL変異体変異体を含む医薬組成物およびその使用方法にも関する。MBL変異体は、例えばMBLの機能的相同体であるかもしれない(例えば下記参照)。そのあらゆる機能的相同体を含む単離されたMBLペプチドは、ある態様において少なくとも80アミノ酸残基、例えば少なくとも100アミノ酸残基、例えば少なくとも150アミノ酸残基、例えば少なくとも200アミノ酸残基、例えば少なくとも220アミノ酸残基、例えば少なくとも250アミノ酸残基を含むことができよう。
他のタンパク質
【００６１】
本発明の医薬組成物はMBL以外のタンパク質を含むことがある。
【００６２】
例えば、該組成物は、少なくとも300μg/ml、例えば少なくとも500μg/ml、例えば少なくとも750μg/ml、例えば少なくとも1000μg/ml、例えば少なくとも1300μg/ml総タンパク質またはタンパク質含有物質を含むことができよう。したがって、該組成物は、例えば300〜3000μg/mlの範囲、例えば500〜3000μg/mlの範囲、例えば750〜3000μg/mlの範囲、例えば1000〜3000μg/mlの範囲、例えば1300〜3000μg/mlの範囲、例えば1000〜2000μg/mlの範囲の総タンパク質またはタンパク質含有物質を含むことができよう。
【００６３】
その他のタンパク質は、あらゆる適切なタンパク質であろう。ある態様において、該医薬組成物はMBL以外にMBLと天然に結合している1またはそれ以上のタンパク質を含むことがある。
【００６４】
したがって、ある態様において、本発明はMBL以外の総タンパク質がさらに1またはそれ以上のMBL結合セリンプロテアーゼ(MASP)またはその変異体を含む医薬組成物に関する。例えば、配列番号2のMASP-1、配列番号3のMASP-2、配列番号4のMASP-3、その断片、およびその機能的相同体からなる群から選ぶことができよう。MASPタンパク質の機能的相同体は以下に記載している。
医薬組成物
【００６５】
ある局面において、本発明は医薬組成物に関する。該医薬組成物は特定の医薬組成物の目的に応じて多くの種々の方法で製剤化することができよう。例えば、該医薬組成物は特定の投与形に有用であるような方法ですることができよう。好ましい投与形は以下に記載している。
【００６６】
ある態様において、該医薬組成物は液体であるように製剤化される。例えば、該組成物はタンパク質溶液であるか、または該組成物はタンパク質懸濁液であるかもしれない。該液体は非経口投与、例えば注射または注入に適するであろう。
【００６７】
本発明の好ましい態様において、該医薬組成物は、適切なMBL用量(好ましいMBL用量は下記参照)がボーラス注射により投与できる用量で含まれるようにMBL濃度が十分に高い必要があるボーラス注射に適している。ボーラス注射用の医薬組成物は、好ましくは少なくとも500μg/ml、より好ましくは少なくとも750μg/ml、さらにより好ましくは少なくとも1000μg/ml、例えば少なくとも1300μg/mlのMBLおよび/またはMBL変異体を含む。
【００６８】
該液体はあらゆる有用な液体であってよいが、該液体は水性の液体であることが好ましいことが多い。多くの目的において、特に該液体を非経口投与に用いるとき、該液体が無菌であることがさらに望ましい。無菌はあらゆる常套的方法、例えば濾過、照射殺菌、または加熱によりもたらすことができよう。
【００６９】
さらに、非経口投与用の医薬組成物はウイルス減少工程、すなわちウイルスろ過および/または酸性処理にかけていることが好ましい。ウイルスろ過の目的は、あらゆるウイルス汚染物の減少である。従って用いるフィルターは一般にウイルスおよび他の汚染物質をサイズ排除によりタンパク質溶液から分離する種々の中空繊維膜でできている。分離の原理はMBLとウイルスの該中空繊維の透過性の差である。タンパク質とウイルスの透過性の差は、該溶液が多層を通過するとき非常に増大するので、用いるフィルターはいくつかの層を含むことが好ましい。ウイルスろ過は、例えば下記実施例1に記載しているような当業者に知られたあらゆる常套的方法により行うことができよう。本発明のある態様において、該溶液は1またはそれ以上の脂肪親和性ビークル、例えばMBLまたはMBL変異体の制御放出に適した1またはそれ以上の脂肪親和性ビークルを含むことがある。
【００７０】
さらに、該液体はあらゆる適切な医薬的に許容される添加剤を含むことがある。好ましい医薬的に許容される添加剤は以下に記載されている。
【００７１】
保存目的で、該タンパク質溶液またはタンパク質懸濁液は、-100℃〜0℃、例えば0℃〜4℃、例えば4℃〜10℃、例えば10℃〜15℃、例えば15℃〜25℃、例えば15℃〜35℃で保存することができよう。
【００７２】
したがって、本発明のある態様において、該溶液または懸濁液は凍結していることがある。ほとんどの目的において、該溶液または懸濁液は保存目的でのみ凍結され、使用する前に解凍しなければならない。
【００７３】
該医薬組成物は、使用者がより好都合なように単用量単位に包装することができよう。したがって、ボーラス注射用の医薬組成物は、例えば10mlまで、好ましくは8mlまで、より好ましくは6mlまで、例えば5mlまで、例えば4mlまで、例えば3mlまで、例えば約2.2mlの用量単位に包装することができよう。
【００７４】
該医薬組成物はあらゆる適切な容器に包装することができよう。一例として、該医薬組成物の単用量を注射筒に包装することができよう。
【００７５】
本発明の別の態様において、該医薬組成物は乾燥組成物である。該乾燥組成物はそれ自体で使用することができるが、ほとんどの目的において該組成物は保存用にのみ乾燥組成物である。使用前に、該乾燥組成物を適切な液体組成物、例えば無菌水に溶解もしくは懸濁させることができよう。
【００７６】
したがって、該医薬組成物は凍結乾燥タンパク質を含む乾燥組成物であるかもしれない。好ましくは、該乾燥組成物を再構成して溶液または懸濁液とすることができる。
【００７７】
該タンパク質は当業者に知られたあらゆる常套的方法を用いて凍結乾燥することができよう。凍結乾燥するには、1またはそれ以上の凍結防止剤を加える必要があるかもしれない。好ましい凍結防止剤の例を以下に示す。
【００７８】
本発明のある態様において、該医薬組成物は、MBLまたはMBL変異体に加えて1またはそれ以上のさらなる活性化合物を含む。そのような医薬組成物はキットの部分の形で提供することもできよう。
投  与
【００７９】
該医薬組成物は1またはそれ以上の特定の投与方法に適するように製造することができよう。さらに、本明細書に記載の治療方法は種々の投与方法が含まれよう。
【００８０】
一般に、活性MBLが疾患部位に達するような方法で個体にMBLを投与するあらゆる投与方法を本発明で用いることができよう。
【００８１】
例えば、本発明の医薬組成物は、非経口的に、すなわち静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、直腸内、膣内、または腹腔内投与により投与することができよう。該化合物は、吸入、すなわち鼻内および経口吸入投与により投与することもできよう。そのような投与のための適切な剤形、例えばエアロゾル製剤または定量吸入器を常套的技術により製造することができよう。
【００８２】
したがって、本発明のある態様において、投与の形は、注射、吸入、鼻内投与、経皮投与、肺投与、ターゲッティングおよびイオン注入(iontophoretic)投与からなる群から選ぶことができよう。
【００８３】
一般に、注射および注入用の医薬組成物は無菌溶液であるべきである。
【００８４】
注射は、あらゆる好ましい部位への注射であってよく、例えば注射は筋肉内、皮下、動脈内、筋肉内、および腹腔内注射からなる群から選ばれよう。注入は一般的に静脈内注入である。
【００８５】
本発明のある態様において、投与の形はボーラス注射である。そのような態様では、該医薬組成物は、十分なMBLを投与することができるように高濃度のMBLを含むことが好ましい。提供される該医薬組成物が高濃度のMBLを含み、十分なMBLをボーラス注射として投与することができることが本発明の利点である。
【００８６】
さらに、投与経路は粘膜への局所投与であるかもしれない。本発明医薬製剤を投与する粘膜は、生物活性物質を投与すべき、哺乳動物の例えば鼻、膣、目、口、生殖器、肺、消化管、または直腸内のあらゆる粘膜であるかもしれない。
【００８７】
本発明の医薬組成物は1回または1回以上投与してよく、例えば2〜5回、例えば5〜10回、例えば10〜20回、例えば20〜50回、例えば50〜100回の範囲、例えば100回以上投与することができよう。
【００８８】
投与するMBLの用量は、治療する個体および臨床病状による。一般に、体重10kgあたり0.1mg〜10mgの範囲、例えば0.5mg〜5mgの範囲、例えば約1mgのMBLを投与することができよう。本発明のある態様において、該用量は、成人に対して1投与あたり2〜12mgの範囲、例えば3〜10mgの範囲、例えば4〜9mgの範囲、例えば5〜8mgの範囲、例えば6〜7mgの範囲、例えば約6.6mg MBLである。
【００８９】
本発明の医薬組成物は少なくとも1の他の活性化合物とともに投与することができよう。該化合物は同時にか、別の製剤として、または単位剤形で組み合わせて投与するか、または連続的に投与することができよう。
【００９０】
本発明のある態様において、該医薬組成物は、診断方法の部分として投与することができよう。例えば、診断は個体における1またはそれ以上の化合物のレベルの測定かもしれない。診断目的では、高レベルのMBLを含む医薬組成物を、該測定前に該個体に投与する必要があろう。
医薬組成物の安定性
【００９１】
好ましくは、本発明の医薬組成物は安定であり、活性の大きな損失および/またはサイズ分布の大きな変化なしに長期保存することができよう。特に、該医薬組成物中に含まれるMBLまたはMBL変異体は安定であることが好ましく、MBLおよび/またはMBL変異体が長期保存中安定であることがより好ましい。
【００９２】
用語「安定な」は、好ましくは該医薬組成物内に含まれるMBLおよび/またはMBL変異体が長期保存中に初期の活性の少なくとも部分を維持することを意味する。したがって、好ましくはMBLおよび/またはMBL変異体は、長期保存後に、初期活性の少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、さらにより好ましくは少なくとも40%、さらにより好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも60%、さらにより好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%の、例えば本質的にすべてを含む。
【００９３】
あるいはまた、長期保存MBLおよび/またはMBL変異体試料は、-80℃保存MBL試料の活性の、少なくとも20%、例えば少なくとも30%、例えば少なくとも40%、例えば少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%、例えば本質的にすべてを含むことが好ましい。
MBLの活性は、例えば補体系を活性化または不活性化する能力により決定することができよう。C4がMBL/MASPによって開裂すると活性チオールエステルは暴露され、C4は隣接する求核基と共有結合するようになる。アッセイをコートしたプラスチックウェル中で行うと、C4bのかなりの部分がコートしたプラスチックウェルに結合し、抗C4抗体により検出することができよう。MBL活性の定量的TRIFMAは、1)100L緩衝液中の1gマンナンでマイクロタイターウェルをコートし、2)Tween-20でブロックし、3)予め決定した量のMBL複合体を適用し、被検試料を適用し、5)5g/mlの精製補体因子C4を適用し、6)37℃で1時間インキュベーションし、7)Eu標識抗C4抗体を適用し、8)増強溶液を適用し、9)時間分解蛍光測定法によりEuを読むことにより実施することができよう。(ELISAによる推定は例えば工程7にビオチン標識抗C4を適用し、8)アルカリホスファターゼ標識アビジンを適用し、10)色強度を読むことにより同様に行うことができよう。)各工程間で、プレートを室温でインキュベーションし、工程8および9間を除き洗浄した。較正曲線は既知の活性のMBL希釈液を用いて構築することができる。アッセイは、古典的または代替補体活性経路によるC4の活性化を妨げる条件で行うことが好ましい。C4の活性化は、セリンプロテアーゼ阻害剤ベンズアミジンにより完全に阻害された。古典的経路の活性化は、MBL複合体と干渉しないがC1qrs複合体を完全に破壊する十分高イオン強度(0.7〜2.0M NaCl、好ましくは約1.0M NaCl)の存在下で工程3)を行うことにより効果的に排除され、代替経路の活性化は上記希釈でアッセイすることにより効果的に妨げられる。しかしながら、MBLの活性化は下記実施例9に記載のC4活性化アッセイにしたがって測定することが好ましい。
【００９４】
好ましくは、安定なMBLおよび/またはMBL変異体は分解しないか、長期保存中に限られた量だけが分解する。すなわち、好ましくは安定なMBLおよび/またはMBL変異体は分解しないか、保存中の物理的および/または化学的分解により限られた量だけが分解する。したがって、好ましくはMBLおよび/またはMBL変異体内に含まれるポリペプチドの大部分は保存前と保存後で長さが同じである(すなわち、同じ量のアミノ酸を含む)。MBLおよび/またはMBL変異体の長さ、および該アミノ酸含有量およびMBLタンパク質濃度は、多くの種々の方法、例えばアミノ酸分析、陰イオン交換クロマトグラフィ、還元MBLのクーマシー染色もしくは非還元MBLウエスタンブロット、質量分析、またはサイズ排除クロマトグラフィにより決定することができよう。
【００９５】
したがって、好ましくは少なくとも10%、例えば少なくとも20%、例えば少なくとも30%、例えば少なくとも40%、例えば少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99% のMBL/MBL変異体は、最初の長さの少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%、例えば約100%である。
【００９６】
さらに、少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%のMBL/MBL変異体ポリペプチドは、質量分析で調べたとき、保存後にポリペプチド鎖の変化がみられないことが好ましい。
【００９７】
さらに、少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、例えば少なくとも98%、例えば少なくとも99%の保存MBL/MBL変異体ポリペプチドがサイズ排除クロマトグラフィ後に最初のMBL/MBL変異体または-80℃で保存したMBL/MBL変異体と同様に溶出することが好ましい。サイズ排除クロマトグラフィは例えば下記実施例10に記載のごとく行うことができよう。
【００９８】
用語「初期(最初)の長さ」は、保存前のMBL/MBL変異体ポリペプチドの長さ、または-80℃で保存したMBL/MBL変異体ポリペプチドの長さを意味し、本発明のある態様では、完全長MBL、例えば配列番号1で示されるポリペプチドの完全長に相当する。一般に、MBL/MBL変異体の長さはMBL/MBL変異体ポリペプチドの分子量(ダルトンで測定)を測定することにより決定することができよう。
【００９９】
用語「長期保存」は、1〜4週間、例えば1〜3ヶ月間、例えば3〜6ヶ月間、例えば6〜12ヶ月間、例えば1〜2年間、例えば2〜3年間、例えば3〜5年間、例えば5〜7年間、例えば7〜10年間の範囲で、例えば10年間以上保存することを意味する。好ましくは、長期保存は1〜2年間の範囲、より好ましくは2〜5年間の範囲である。
【０１００】
MBLおよび/またはMBL変異体の安定性は保存条件に依存する。好ましくは、MBLおよび/またはMBL変異体はある温度、例えば-80℃〜-20℃、例えば-25℃〜-15℃、例えば-15℃〜0℃、例えば0℃〜4℃、例えば2℃〜10℃、例えば5℃〜15℃、例えば-10℃〜20℃、例えば15℃〜35℃、例えば15℃〜30℃、例えば15℃〜25℃の範囲で保存すると安定である。本発明のある好ましい態様では、MBLおよび/またはMBL変異体は約4℃の温度で保存することができ、本発明の別の好ましい態様ではMBLおよび/またはMBL変異体は約-20℃の温度で保存することができ、本発明のさらに別の好ましい態様ではMBLおよび/またはMBL変異体は約37℃で保存することができよう。
【０１０１】
さらに、MBLおよび/またはMBL変異体の安定性は該医薬組成物の性質に依存するかもしれない。例えば、MBLおよび/またはMBL変異体の安定性は、該医薬組成物が溶液、懸濁液、または乾燥物である場合に異なるかもしれない。
機能的相同体
【０１０２】
本発明のポリペプチドの機能的相同体は、特定の予め決定した配列のポリペプチドと本質的に同じ機能または部分的に同じ機能を示すことができるあらゆるポリペプチド配列を含むことを意味する。
【０１０３】
したがって、本発明の機能的相同体は、上記の予め決定されたポリペプチド配列と少なくともいくらかの相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１０４】
好ましくは、ヒトMBLの機能的相同体は、配列番号1で示されるポリペプチドと少なくともいくらかの相同性を有するポリペプチドを含む。好ましくは、ヒトMASP-1の機能的相同体は、配列番号2で示されるポリペプチドと少なくともいくらかの相同性を有するポリペプチドを含む。好ましくは、ヒトMASP-2の機能的相同体は、配列番号3で示されるポリペプチドと少なくともいくらかの相同性を有するポリペプチドを含む。好ましくは、ヒトMASP-3の機能的相同体は、配列番号4で示されるポリペプチドと少なくともいくらかの相同性を有するポリペプチドを含む。
【０１０５】
例えば、そのようなポリペプチドは、上記の予め決定されたポリペプチド配列と、少なくとも約40%、例えば少なくとも約50%ホモローガス、例えば少なくとも約60%ホモローガス、例えば少なくとも約70%ホモローガス、例えば少なくとも約75%ホモローガス、例えば少なくとも約80%ホモローガス、例えば少なくとも約85%ホモローガス、例えば少なくとも約90%ホモローガス、例えば少なくとも92%ホモローガス、例えば少なくとも94%ホモローガス、例えば少なくとも95%ホモローガス、例えば少なくとも96%ホモローガス、例えば少なくとも97%ホモローガス、例えば少なくとも98%ホモローガス、例えば少なくとも99%ホモローガスである。
【０１０６】
相同性は、好ましくは、あらゆる適切なアルゴリズム、またはそのようなアルゴリズムのコンピュータ化手段、例えばIntelligeneticsのPC/GeneプログラムのCLUSTAL、またはWisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group(GCG)のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTAにより計算することができよう。さらにアミノ酸配列間の相同性は、例えばBLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85、およびBLOSUM 90のいずれかのようなよく知られたマトリクスの助けをかりて計算することができよう。
【０１０７】
機能的相同体は、あらゆる他のアミノ酸に対するあるアミノ酸の少なくとも1の置換を含むアミノ酸配列を含んでよい。例えば、そのような置換は保存的アミノ酸置換であっても、非保存的置換であってもよい。
【０１０８】
保存的アミノ酸置換は、類似または実質的に類似の特性を有する予め決定された群内のあるアミノ酸の該群内の別のアミノ酸による置換である。本明細書で用いている用語「保存的アミノ酸置換」の意味の範囲内で、あるアミノ酸を下記を有することを特徴とするアミノ酸の群内の別のもので置換することができよう。
i)極性側鎖(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr、およびCys)
ii)非極性側鎖(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、およびMet)
iii)脂肪族側鎖(Gly、Ala Val、Leu、Ile)
iv)環式側鎖(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)
v)芳香族側鎖(Phe、Tyr、Trp)
vi)酸性側鎖(Asp、Glu)
vii)塩基性側鎖(Lys、Arg、His)
viii)アミド側鎖(Asn、Gin)
ix)ヒドロキシ側鎖(Ser、Thr)
x)イオウ含有側鎖(Cys、Met)、および
xi)モノアミノジカルボキシル酸またはモノアミノ-モノカルボキシル-モノアミノモノカルボキシル酸であるアミノ酸(Asp、Glu、Asn、Gln)。
【０１０９】
本発明の機能的相同体は、2以上の該置換、例えば2アミノ酸置換、例えば3または4アミノ酸置換、例えば5または6アミノ酸置換、例えば7または8アミノ酸置換、例えば10〜15アミノ酸置換、例えば15〜25アミノ酸置換、例えば25〜30アミノ酸置換、例えば30〜40アミノ酸置換、例えば40〜50アミノ酸置換、例えば50〜75アミノ酸置換、例えば75〜100アミノ酸置換、例えば100以上のアミノ酸置換を含むことができよう。
【０１１０】
アミノ酸の付加または欠失は、2〜5アミノ酸、例えば5〜10アミノ酸、例えば10〜20アミノ酸、例えば20〜50アミノ酸の付加または欠失であってよい。しかしながら、50以上のアミノ酸の付加または欠失、例えば50〜200アミノ酸の付加も本発明内に含まれる。
【０１１１】
あらゆる変異体およびその機能的相同体を含む本発明のポリペプチドは、ある態様において、5以上のアミノ酸残基、例えば10以上のアミノ酸残基、例えば20以上のアミノ酸残基、例えば25以上のアミノ酸残基、例えば50以上のアミノ酸残基、例えば75以上のアミノ酸残基、例えば100以上のアミノ酸残基、例えば150以上のアミノ酸残基、例えば200以上のアミノ酸残基を含むことができよう。
【０１１２】
本明細書で用いている意味にしたがって機能的相同体を決定するときは、さらなる因子を考慮することができよう。例えば、機能的相同体は、本発明のポリペプチドに特異的な抗血清と結合することができよう。
【０１１３】
N末端アルキル化およびC末端エステル化を有するペプチドも本発明内に含まれる。機能的相同体は、翻訳後修飾ポリペプチド、例えばグリコシル化ポリペプチドも含む。
医薬的に許容される添加剤
【０１１４】
MBLまたはMBL変異体を含む医薬組成物は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 1995、E. W. Martin編、Mack Publishing Company、第19版、Easton、Paに記載のようなあらゆる常套的技術により製造することができよう。
【０１１５】
医薬的に許容される添加剤は、あらゆる常套的に用いられる医薬的に許容される添加剤であってよく、特定の製剤、意図する投与経路などに従って選ぶべきである。例えば、医薬的に許容される添加剤は、Nemaら、1997に記載のあらゆる添加剤であってよい。さらに、医薬的に許容される添加剤は、FDAの「不活性成分リスト」(インターネットアドレス http://www.fda.gov/cder/drug/iig/default.htm.から利用可能)のあらゆる許容される添加剤であってよい。
【０１１６】
本発明のある態様において、該医薬組成物は等張化剤を含むことが望ましい。特に医薬組成物を注射または注入用に製造するときは等張化剤を加えることが望ましいことが多い。
【０１１７】
したがって、該組成物は、等張化剤である少なくとも1の医薬的に許容される添加剤を含むことができよう。
【０１１８】
該医薬組成物は、等張性、低張性、または高張性であってよい。しかしながら、注入または注射用の医薬組成物は投与するときに本質的に等張性であることが好ましいことが多い。したがって、保存用の医薬組成物は等張性または高張性であることが好ましいかもしれない。該医薬組成物が保存用に高張性である場合は、投与前に希釈して等張溶液にすることができよう。
【０１１９】
等張化剤は、イオン性等張化剤、例えば塩、または非イオン性等張化剤、例えば炭水化物であってよい。
【０１２０】
イオン性等張化剤の例には、限定されるものではないがNaCl、CaCl2、KCl、およびMgCl2が含まれる。非イオン性等張化剤の例には、限定されるものではないがマンニトールおよびグリセロールが含まれる。
【０１２１】
少なくとも1の医薬的に許容される添加剤が緩衝剤であることも本発明内に含まれる。いくつかの目的において、例えば該医薬組成物が注入または注射を意味する場合は、該組成物は、溶液のpHを4〜10、例えば5〜9、例えば6〜8の範囲に緩衝することができる緩衝剤を含むことが望ましいことが多い。
【０１２２】
しかしながら、本発明の他の態様において、該医薬組成物は、緩衝剤をまったく含まないか、緩衝剤をマイクロモル量のみ含むことがある。
【０１２３】
緩衝剤は、例えば、TRIS、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩、およびトリエタノールアミン緩衝剤からなる群から選ぶことができよう。したがって、緩衝剤は、K2HPO4、Na2HPO4、またはクエン酸ナトリウムであってよい。
【０１２４】
TRIS緩衝剤は、種々の他の名前、例えばトロメタミンUSP、THAM、Trizma、Trisamine、Trisアミノ、およびトロメタノールを含むトロメタミンで知られている。用語TRISは前記用語すべてに及ぶ。
【０１２５】
特に医薬製剤が非経口使用用である場合、緩衝剤は、さらに例えば非経口使用用のUSP適合緩衝剤から選ぶことができよう。例えば、緩衝剤は一塩基酸、例えば酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸、および乳酸、二塩基酸、例えばアコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸、および酒石酸、多塩基酸、例えばクエン酸およびリン酸、および塩基、例えばアンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、およびTRISからなる群から選ぶことができよう。
【０１２６】
本発明の好ましい態様において、本発明の医薬組成物は安定化剤を含まず、特に該医薬組成物はタンパク質含有安定化剤を含まないことが好ましく、より好ましくは該医薬組成物はタンパク質含有安定化剤および界面活性剤を含まない。一般に活性成分がタンパク質またはペプチドである医薬製剤は、1またはそれ以上の安定化剤を含む。該安定化剤は1またはそれ以上のタンパク質または1またはそれ以上の界面活性剤であることが多い。医薬組成物中の添加剤の量を減らすことが望ましいことが多い。したがって、本発明の好ましい医薬組成物はいかなるタンパク質および/または界面活性剤も含まない。
【０１２７】
しかしながら、本発明の他の態様において、医薬組成物は、すくなくとも1の、安定化剤である医薬的に許容される添加剤を含むことができよう。安定化剤は例えば界面活性剤、アミノ酸、脂肪酸、ポリマー、多価アルコール、金属イオン、還元剤、キレート剤、または抗酸化剤であってよいが、あらゆる他の適切な安定化剤も本発明に用いることができよう。
【０１２８】
例えば、安定化剤は、ポリオキサマー、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、Brij、金属イオン、アミノ酸、ポリエチレングリコール、Triton、EDTA、およびアスコルビン酸からなる群から選ぶことができよう。
【０１２９】
さらに、安定化剤は、アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、アルギニン、ロイシン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸、界面活性剤、例えばポリソルベート20、ポリソルベート80、およびポロキサマー407、脂肪酸、例えばホスホチジルコリネムエタノールアミン(phosphotidyl cholinem ethanolamine)、およびアセチルトリプトファネート、ポリマー、例えばポリエチレングリコール、およびポリビニルピロリドン、多価アルコール、例えばソルビトール、マンニトール、グリセリン、ショ糖(sucorse)、グルコース、プロピレングリコール、エチレングリコール、ラクトース、およびトレハロース、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システインHCl、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、およびグルタチオン、還元剤、例えば種々のチオール、キレート剤、例えばEDTA塩、グルタミン酸、およびアスパラギン酸、および金属イオン、例えばCa++、Ni++、Mg++、およびMn++からなる群から選ぶことができよう。
【０１３０】
本発明に有用な抗酸化剤および還元剤の他の例には、アセトン重亜硫酸ナトリウム、アスコルベート、重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、システイン/システイネートHCl、亜ジチオン酸ナトリウム、ゲンチジン酸、ゲンチジン酸エタノールアミン、グルタミン酸一ナトリウム、ホルムアルデヒド酸性硫化ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム、およびチオグリコール酸ナトリウムが含まれる。
本発明の医薬組成物は1またはそれ以上の抗凍結剤を含んでいてもよい。特に、該組成物が凍結乾燥タンパク質を含むか、該組成物を凍結保存すべき場合は、該医薬組成物に抗凍結剤を加えるのが望ましいことがある。
【０１３１】
抗凍結剤はあらゆる有用な抗凍結剤であってよく、例えば抗凍結剤はデキストラン、グリセリン、ポリエチレングリコール、ショ糖、トレハロース、およびマンニトールからなる群から選ぶことができよう。
【０１３２】
したがって、医薬的に許容される添加剤は、等張塩、高張塩、緩衝剤、および安定化剤からなる群から選ばれる1またはそれ以上を含むことができよう。さらに、医薬的に許容される添加剤は、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、および抗凍結剤からなる群から選ばれる1またはそれ以上を含むことができよう。例えば、医薬的に許容される添加剤は、グルコース一水和物、グリシン、NaCl、およびポリエチレングリコール3350を含む。
【０１３３】
別の局面において、本発明は1またはそれ以上のカチオンを含むMBL組成物に関する。
【０１３４】
驚くべきことに、MBL溶液にカチオンを加えるとMBLおよび/またはMBL変異体の安定性の増大を生じることができよう。好ましくは、該組成物は、0.01mM〜1000mMの範囲、より好ましくは0.05mM〜500mMの範囲、さらにより好ましくは0.1mM〜100mMの範囲、さらにより好ましくは0.2mM〜50mMの範囲、さらにより好ましくは0.3mM〜25mMの範囲、さらにより好ましくは0.5mM〜10mMの範囲、例えば0.5mM〜5mMの範囲、例えば0.5mM〜2mMの範囲、例えば約1mMの二価カチオンを含む。カチオンは好ましくは二価カチオンであり、したがって本発明は1またはそれ以上の二価カチオンを含むMBL組成物に関する。
【０１３５】
二価カチオンは、好ましくは金属二価カチオンである。例えば、二価カチオンはCa++、Ni++、Mg++、およびMn++からなる群から選ぶことができよう。しかしながら、好ましくは二価カチオンはCa++である。Ca++はあらゆる適切な塩、CaCl2として溶液に加えることができよう。
【０１３６】
好ましい態様において、MBL組成物のMBL含有量は上記の通りである。
臨床病状
【０１３７】
多くの臨床病状を本発明の医薬組成物を用いて治療することができよう。しかしながら、特に以下の病状を治療することができよう。
1. 感染症
2. MBL欠乏
3. 免疫不全病状
【０１３８】
感染症は、例えば細菌、真菌、ウイルス、寄生虫による感染であってよい。例えば、以下からなる群から選ばれる1またはそれ以上の細菌による感染症：Achromobacter xylosoxidans、Acinetobacter calcoaceticus、好ましくはA.anitratus、A.haemolyticus、A.alcaligenes、およびA.lwoffii、Actinomyces israelii、Aeromonas hydrophilia、Alcaligenes種、好ましくはA.faecalis、A.odorans、およびA.denitrificans、Arizona hinshawii、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacteroides fragilis、Bacteroides melaninogenicus、Bordetella pertussis、Borrelia burgdorferi、Borrelia recurrentis、Brucella種、好ましくはB.abortus、B.suis、B.melitensis、およびB.canis、Calymmatobacterium granulomatis、Campylobacter fetus ssp.intestinalis、Campylobacter fetus ssp.jejuni、Chlamydia種、好ましくはC.psittaci、およびC.trachomatis、Chromobacterium violaceum、Citrobacter種、好ましくはC.freundii、およびC.diversus、Clostridium botulinum、Clostridium perfringens、Clostridium difficile、Clostridium tetani、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium、好ましくはC.ulcerans、C.haemolyticum、およびC.pseudotuberculosis、Coxiella burnetii、Edwardsiella tarda、Eikenella corrodens、Enterobacter、好ましくはE.cloacae、E.aerogenes、E.hafniae(Hafnia alveiともいう)、およびE.agglomerans、Erysipelothrix rhusiopathiae、Escherichia coli、Flavobacterium meningosepticum、Francisella tularensis、Fusobacterium nucleatum、Gardnerella vaginalis、Haemophilus ducreyi、Haemophilus influenzae、Helicobacter種、Klebsiella種、好ましくはK.pneumoniae、K.ozaenae og K.rhinoscleromatis、Legionella種、Leptospira interrogans、Listeria monocytogenes、Moraxella種、好ましくはM.lacunata、およびM.osloensis、Mycobacterioum bovis、Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosis、Mycoplasma種、好ましくはM.pneumoniae、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Nocardia種、好ましくはN.asteroides、およびN.brasiliensis、Pasterurella haemolytica、Pasteurella multocida、Peptococcus magnus、Plesiomonas shigelloides、Pneumococci、Proteus種、好ましくはP.mirabilis、P.vulgaris,P.rettgeri、およびP.morganii(それぞれProvidencia rettgeriおよびMorganella morganiiとも呼ばれる)、Providencia種、好ましくはP.alcalifaciens、P.stuartii、およびP.rettgeri(Proteus rettgeriともいう)、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas mallei、Pseudomonas pseudomallei、Rickettsia、Rochalimaia henselae、Salmonella種、好ましくはS.enteridis、S.typhi、およびS.derby,、および最も好ましくはSalmonella DT104型のSalmonella種、Serratia種、好ましくはS.marcescens、Shigella dysenteriae、S.flexneri、S.boydii、およびS.sonnei、Spirillum minor、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus saprophyticus、Streptobacillus moniliformis、Streptococcus、好ましくはS.faecalis、S.faecium、およびS.durans、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Treponema carateum、Treponeam pallidum、Treponema pertenue、好ましくはT.pallidum、Ureaplasma urealyticum、Vibrio cholera、Vibrio parahaemolyticus、Yersinia enterocolitica、およびYersinia pestis。
【０１３９】
免疫不全病状には、免疫系の1またはそれ以上の成分、例えば細胞免疫系の1またはそれ以上の成分、例えば免疫細胞、またはヒト免疫系の1またはそれ以上の成分のあらゆる機能不全が含まれる。該不全は、該成分の欠損または該成分の量の減少によって生じるか、または該成分もしくは該成分の部分の機能変化によるかもしれない。
【０１４０】
ある例では、該免疫不全病状はMASP不全であるかもしれない。
MBL治療を要する個体
【０１４１】
本発明のMBL含有医薬またはMBL治療を要する個体はあらゆる個体であってよく、例えば臨床病状に陥っている個体または臨床病状に陥る危険性のある個体であってよい。好ましくは、該個体はヒトである。
【０１４２】
本発明の好ましい態様において、該個体は上記臨床病状の1つに陥っている。別の好ましい態様において、該個体は上記臨床病状に陥る危険性が増大している。
【０１４３】
例えば、該個体は感染症にかかるリスクが増大しているかもしれない。リスクの増大にはいくつかの異なる理由があるが、しばしばリスクの増大は免疫系の1またはそれ以上の成分の機能不全と関連があるだろう。免疫系の機能不全は細胞性免疫系および/または液性免疫系の不全かもしれない。
【０１４４】
細胞免疫系の成分は、例えば好中球、T細胞、B細胞、好塩基球、および食細胞を含む。機能不全は1またはそれ以上の該細胞の数の減少、または1またはそれ以上の該細胞の機能障害により生じるかもしれない。
【０１４５】
ヒト免疫系の成分は、例えば補体経路およびレクチン補体経路を含む。したがって、本発明のある態様において、個体はMBL機能不全の個体である。例えば、該個体はMBLの血清レベルが正常以下かもしれない。
【０１４６】
正常以下のMBL血清レベルとは、MBLの正常血清濃度以下の血清中MBL濃度を表す。例えば、該MBL血清レベルは、<2000ng/ml、例えば<1500ng/ml、例えば<1000ng/ml、例えば<900ng/ml、例えば<800ng/ml、例えば<700ng/ml、例えば<600ng/ml、例えば<500ng/ml、例えば<400ng/ml、例えば<300ng/ml、例えば<200ng/ml、例えば<100ng/mlであるかもしれない。
【実施例】
【０１４７】
以下の実施例は本発明の選ばれた態様を説明するものであり、本発明を限定するものではない。
(実施例1)
2005526084.tif 000002
【０１４８】
MBLは、PCT出願WO00/70043に記載のごとく製造および精製した組換えヒトMBLである。簡単には、ゲノムヒトMBL遺伝子をPCRにより増幅し、pREP9ベクター(cat.no. V009-50、Invitrogen)に挿入した。HEK 293EBNA細胞をMBL/pREP9トランスフェクト細胞由来の構築物および培養液でトランスフェクトし、これを、マンノースと結合し、15mLの0.1Mグリシン(pH 3.0)で予め洗浄し、TBS/0.05%(v/v)Tween-20、2mM CaCl2で平衡化したFractogel TSK HW-75ビーズ(cat.no. 14985、Merck KgaA、Darmstadt、Germany)のカラムに通した。該カラムを75mLのTBS、2mM CaCl2で洗浄した。
【０１４９】
組換えMBLを、最終精製工程で10mM Tris緩衝剤および140mM NaClを含む緩衝液で溶出する。次に、該製剤を高いウイルス保持力(7 log)をもたらす150層からなるPlanovaフィルターでウイルスろ過する。
【０１５０】
数種のPlanovaフィルターが存在し、サイズ75Nおよび35NのフィルターをMBL溶液のウイルスろ過用に選択する。種々のポアサイズのPlanovaフィルターを用いたMBL回収試験後に75Nおよび35Nを選択した。フィルター15Nおよび20Nが市販されているが、MBLをろ過するにはポアサイズが小さすぎる。75NフィルターはHIVのような大きいウイルスのみをろ過し、ウイルス除去フィルターよりプレフィルターとして機能するであろう。Planova 35Nは、レオウイルスを含む35nmサイズより大きなウイルスを除去するが、ポリオウイルスやパルボウイルスのようなより小さなウイルスは除去しないであろう。より小さなウイルスについては、MBL精製中の酸処理工程がウイルス不活化に有効であると思われる。
【０１５１】
第一に、MBL溶液を75Nフィルターに通し、次いで第二にろ液を35Nフィルターに通す。両ろ過はデッドエンドろ過として行う。実験室規模では0.01m2フィルターを用いる。パイロット製造規模では0.3m2のフィルターを用いる。
【０１５２】
最後に、MBL溶液を10mM Tris緩衝剤および140mM NaClで最終濃度1mg/mlに希釈し、0.22μmフィルターで無菌ろ過し、2.2ml部分標本に等分する。
【０１５３】
この製剤は非経口投与に適している。特に、1部分標本をヒトの子供(年齢に応じて)に投与し、3部分標本を成人に投与することができよう。
(実施例2)
2005526084.tif 000003
【０１５４】
MBLは、PCT出願WO00/70043に記載のごとく製造および精製した組換えヒトMBLである。組換えMBLを、最終精製工程で1.2mg/ml Tris緩衝剤および5.8mg/ml NaClを含む緩衝液で溶出する。次に、7.3mg/mlマンニトールを該MBL溶液に加える。該製剤を使用前に無菌ろ過する。
【０１５５】
この製剤は非経口投与に適している。
(実施例3)
2005526084.tif 000004
【０１５６】
MBLは、PCT出願WO00/70043に記載のごとく製造および精製した組換えヒトMBLである。組換えMBLを、最終精製工程で1.2mg/ml Tris緩衝剤および5.8mg/ml NaClを含む緩衝液で溶出する。次に、7.3mg/mlマンニトールおよび0.1mg Tween-80を該MBL溶液に加える。該製剤を使用前に無菌ろ過およびウイルスろ過(実施例1参照)する。
この製剤は非経口投与に適している。
(実施例4)
【０１５７】
10mg/ml MBL
10mM Tris、pH=7.4
140mM NaCl
【０１５８】
組換えMBLを実施例1に記載のごとく製造する。次に、MBLをタンパク質を3500×Gに暴露するろ過装置を用いて濃縮する。該製剤を使用前に無菌ろ過およびウイルスろ過(実施例1参照)する。
【０１５９】
この製剤は非経口投与に適している。
(実施例5)
MBL：1mg/ml
Tris緩衝剤：10mM
NaCl：140mM
CaCl2：0.1mM
【０１６０】
組換えMBLを実施例1に記載のごとく製造する。CaCl2を最終濃度1mMに加える。該製剤を使用前に無菌ろ過およびウイルスろ過(実施例1参照)する。
この製剤は非経口投与に適している。
(実施例6)
【０１６１】
MBL：5mg/ml
Tris緩衝剤：10mM
NaCl：140mM
CaCl2：1mM
【０１６２】
組換えMBLを実施例1に記載のごとく製造する。次に、MBLをタンパク質を3500×Gに暴露するろ過装置を用いて濃縮する。CaCl2を最終濃度1mMに加える。該製剤を使用前に無菌ろ過およびウイルスろ過(実施例1参照)する。
この製剤は非経口投与に適している。
(実施例7)
【０１６３】
MBL：10mg/ml
Tris緩衝剤：10mM
NaCl：140mM
CaCl2：1mM
【０１６４】
組換えMBLを実施例1に記載のごとく製造する。次に、MBLをタンパク質を3500×Gに暴露するろ過装置を用いて濃縮する。CaCl2を最終濃度1mMに加える。該製剤を使用前に無菌ろ過およびウイルスろ過(実施例1参照)する。
この製剤は非経口投与に適している。
(実施例8)
MBLを含む医薬製剤の安定性
【０１６５】
組換えMBLを液体溶液として製剤化し、液体タンパク質保存用に許容される保存物質中の安定性を試験した。異なる濃度のMBLを含む多くの3種の異なる製剤を試験し、1製剤をカルシウムイオンの安定化効果について試験した。
【０１６６】
いかなるタンパク質安定化賦形剤も含まない1mg/ml製剤は、驚くべきことに凍結(-20℃)および冷蔵(+4℃)で12ヶ月間保存したとき高い安定性を示した。活性の低下は測定されず、質量分析による観察でポリペプチド鎖の変化もみられなかった。アミノ酸分析または陰イオン交換クロマトグラフィでタンパク質含有量の変化はみられなかった。還元MBLに対するクーマシー染色または非還元MBLウエスタンブロットにより分解産物はみられなかった。総MBL含有量のわずか約1%に対応する、おそらく凝集MBLにより生じる小さな最前部ピークがサイズ排除クロマトグラフィにより観察された。より高濃度のMBL製剤(10mg/mlおよび5mg/ml)で得られた結果は、保存よりもストレスの多い濃縮工程により生じる凝集形成の可能性を示す。カルシウムイオンの添加は劇的な安定化効果を示し、+37℃で2ヶ月間保存後に活性の変化はみられなかった。
序  論
【０１６７】
組換えマンノース結合レクチン(rMBL)を含む3種の医薬製剤を開発し、医薬的使用のために許容される保存物質中に充填した。充填は無菌バイアル、ゴム栓のみを用いて無菌的に行い、層流空気フードを用いて行った。したがって、製剤の種類、保存物質、および充填方法は、該製剤を臨床使用用のMBL薬製品のきわめて典型的なものにする。これら製剤の安定性を、種々の温度およびインキュベーション時間で保存することにより試験した。保存装置のすべての温度をモニターした。
【０１６８】
以下のMBL製剤を試験した。
- PE0238：1mg/ml MBL；10mM trisおよび140mM NaCl中(pH=7.4)。
- PE0305：10mg/ml MBL；10mM trisおよび140mM NaCl中(pH=7.4)。
- PE0407：5mg/ml MBL；10mM tris、140mM NaClおよび1mM CaCl2中(pH=7.4)。
【０１６９】
これら試験に用いたすべての標準品は-80℃に保ち、使用時に安定であると認められた。
方  法
C4活性化アッセイ
【０１７０】
C4活性化アッセイは下記実施例9に記載のごとく行った。C4活性化アッセイは、MBLのMASP(マンノース結合タンパク質関連プロテアーゼ)に対する結合能、および炭水化物標的に結合するとすぐにMASPを活性化する能力を測定した。次に、MBL/MASP複合体はC4を開裂し、補体活性化のレクチン経路が開始する。したがって、C4活性化は、MBLの生物学的能力の尺度である。
【０１７１】
本アッセイは、MBLの主な安定性を示すアッセイである。
サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)
【０１７２】
SECは、下記実施例10に記載のごとくSuperose6カラム(Amersham Biosciences)を用いて行った；MBLと他の成分を、球状タンパク質に関しては分子量に比例するモル体積により分離する。
【０１７３】
SEC分析をMBLの高質量構造を確認するために用いた。高質量オリゴマーはクロマトグラム中に早く溶出するが、非オリゴマーはクロマトグラム中に遅く溶出する。さらに、オリゴマーMBLより大きい凝集物がサンプル中に存在すれば検出することができる。最後に、該分析はMBL含有量を定量するのにも用いられるかもしれない。
質量分析(MALDI-MS)
【０１７４】
最初に試料を還元し、非タンパク質成分を除去し、バックグラウンドシグナルを限定するための一般的方法にしたがって精製する。MBLポリペプチド鎖の質量プロフィールを確認し、該ポリペプチド鎖の潜在的分解産物を同定するためにMALDI-MSを実施する。
結  果
C4活性化アッセイ
【０１７５】
PE0238：C4-活性化アッセイは、標準品に関して-20および+4℃で12ヶ月間保存したとき1mg/ml製剤について同じ活性を示す。結果を図1に6点曲線として示し、EC50値は、標準品を100%として+4℃保存で105%、-20℃保存で104%であった。
【０１７６】
PE0305：初期活性は、10mg/ml製剤で標準品に対して94%と測定される。2.5ヶ月後の活性は、凍結および冷蔵試料で約80%に低下し、+37℃試料で36%に低下する。5ヶ月後の活性は、凍結および冷蔵試料でまだ約80%であるが、+37℃試料では14.3%に低下する。結果はC4活性化安定性曲線により得られ、表1にEC50値として記載する。-15%以上の変化のみを有意とみなす。
2005526084.tif 000005
表1．安定性試料におけるC4活性化。T=0分析は一回の推定である。活性は、MBL標準品に対するEC50%で計算する。トリプリケートの測定値と標準偏差を示す。
【０１７７】
PE0407：5mg/ml製剤の活性を試験したところ、+37℃保存試料では驚くべきことに活性の低下はきわめてわずかだけであり、凍結試料と比較して変化はみられなかった。活性は、凍結試料で91%、冷蔵試料で92%、+37℃試料で94%であった。カルシウム不含コントロールを+37℃でインキュベーションし、19%の活性が測定された。結果はC4活性曲線により得られ、表2にEC50値として示す。
2005526084.tif 000006
表2．標準N105-11A、EC50=100%と比較した5mg/ml安定性試料のC4活性化データ。
SECデータ
【０１７８】
PE0238：1mg/ml製剤の質量変化を検出する分析を行った。標準品は20.4分間で単一ピークとして溶出する。冷蔵保存では小さな最前部ピークは15分間で溶出し、該最前部ピークは総MBL含有量の約1%に対応する。凍結保存では最前部ピークが検出されない標準品と同じである。図2は、上端に標準品、次いで+4および-20℃に維持した1mg/ml安定性試料のSECクロマトグラムを示す。総MBL含有量の1%に相当する小さな最前部ピークが冷蔵試料に検出される。
【０１７９】
PE305：10mg/ml製剤のSECデータは最前部ピークの発生を示す。最前部ピークのMBL量は、総MBL含有量と比較して計算し、表3に最前部ピークとして総MBLの%で示す。表3では、冷凍および冷蔵温度で保存した総MBLの3〜5%に相当する。+37℃では2.5ヶ月後に40%が観察され、5ヶ月保存後に最前部ピークに56%が存在する。
2005526084.tif 000007
表3：最前部ピークに存在するMBL量(総MBLの%)。すべての測定値はデュプリケートである。
【０１８０】
PE0407：5mg/ml製剤で最前部ピークが1〜3%の量で観察される。+37℃でインキュベーションしたカルシウム不含コントロールの最前部ピークのMBL含有量は62%であった。
2005526084.tif 000008
表4：最前部ピークに存在するMBL量(総MBLの%)。すべての測定値は1回の推定値である。
MSデータ
【０１８１】
PE238：還元MBLの質量分析は、-20および+4℃で12ヶ月間保存中の完全MBLポリペプチド鎖を示し、+37℃で6ヶ月間保存後に変化はみられなかった。MSスペクトルを図3に示す。
【０１８２】
MBLは、種々のヒドロキシル化およびグリコシル化プロフィールにより単一ピークとして出現せず、通常、約25450Daの主要ピークを有する全部で7つのピークを生じる。データは、保存時間による脱グリコシル化やポリペプチド変化を示さない。
【０１８３】
図3は、標準品について同様のピークを示し、12ヶ月試料は保存時にMBLポリペプチド鎖の変化を示さない。
考  察
【０１８４】
1mg/ml製剤は、凍結保存下で12ヶ月間安定であり、C4活性化は変化せず、凝集もポリペプチド鎖の変化も検出されなかった。他の分析のうち、含有量に関するAIEC、サイズ分布に関する非還元ウエスタンブロット、分解産物検出用のクーマシー染色、および含有量を確認するためのアミノ酸分析を実施する。これらの分析はいずれも冷凍および冷蔵温度で12ヶ月間保存後にいかなる変化も示さなかった。総MBLの約99%が冷蔵温度で12ヶ月間保存後に標準MBLと同様に溶出する。
【０１８５】
10mg/ml製剤では、分析したすべての試料でC4活性化が冷凍および冷蔵温度で2.5および5ヶ月間保存後に約80%に低下し、MBLは一旦10mg/mlに濃縮されると安定であることを示す。0時のC4活性化値は94%である。SEC分析は、凝集した量が冷凍および冷蔵温度での2.5および5ヶ月間保存で約4%であることを示す。凝集物の量は温度および保存時間で一定であり、凝集物が試験開始から濃縮製剤中に存在し、保存より濃縮工程により生じるかもしれないことを示唆する。1mg/mlより高いあらゆる製剤は、タンパク質を3500×Gに暴露するろ過装置を用いる濃縮により製造した。あらゆるタンパク質に非常にストレスがかかる方法の工程および一般にタンパク質凝集を生じることが知られている処置。
【０１８６】
5mg/ml製剤は、冷凍、冷蔵、および+37℃保存でも標準品と比べて91〜94%のC4活性化成績を示す。+37℃においたカルシウム不含コントロール製剤は2ヶ月間保存後に19%の活性を示す。SECは、凍結および冷蔵試料で総MBL含有量の1〜3%、また+37℃のコントロールでは62%に相当する量の凝集が検出される。試料はMaldi-MSでは分析しなかった。3回の安定性試験のデータはすべてMBLが冷凍および冷蔵保存で例外的に安定なタンパク質であることを示唆する。最終的結論として、いかなる安定化用賦形剤も含まない非経口使用のためのきわめて安定な1mg/ml液体MBL製剤が開発された。カルシウムの添加は濃縮製剤に劇的な安定化効果を有する。いかなる活性の損失もない+37℃で2ヶ月間保存した5mg/ml製剤は、タンパク質製剤としては例外的である。
(実施例9)
C4活性化アッセイ
マンナンでコートしたFluoro Nuncプレート
【０１８７】
FluoroNuncマイクロタイタープレートを、100μl/ウェルの、50mM NaCO3緩衝液(pH9.6)に溶解した10μg/mlのマンナン(Sigma-Aldrich、粉末#M7504)を含む溶液で加湿チャンバー中20±4℃で一夜コートした。プレートをTBS(Tris(10mM)、NaCl(150mM)、pH7.4)で2回洗浄し、次いでプレートを1mg/ml HSA(Statens Serum Institute、Copenhagen)添加TBS緩衝液200μl/ウェルで20±4℃、1時間ブロックする。各ウェルをTBST緩衝液で3回洗浄する。
C4活性化アッセイ
【０１８８】
MASPを、抗マンナン抗体を用いることなくMBL不全個体から精製した。rMBL標準品は、LISA緩衝液(Tris/Base(20mM)、NaCl(150mM)、CaCl2(10mM)、HSA 1mg/ml、TritonX-100(0.05%)、PH7.4)で最終濃度100μg/mlに予め希釈し、-80℃に保存した精製rMBL標準物質に由来する。
【０１８９】
rMBL標準品および被検試料を予めLISA緩衝液で5μg/mlに希釈する。予め希釈したrMBL標準品および該試料をMASPと1：1容量で混合し、37℃で10分間インキュベーションする。
【０１９０】
C4補体因子を新鮮血から精製し、C4、1M NaCl、20mM Tris、50mM 6-アミノ-ヘキサンシル(hexansyre)、5mM EDTA、0.02% W7v NaN3(pH7.4)中で凍結保存した。C4を氷上で溶解し、B1緩衝液(Barbital(16mM)、NaCl(580mM)、CaCl2(8mM)、MgCl2(4mM)、pH7.4、Cat.No. 210050 Bie Berntsen)で1：2000に希釈する。予め希釈したrMBL：MASP複合体および被検試料をC4:B1緩衝液で1：10に希釈し、2倍希釈の希釈系列を作製する。
【０１９１】
マンナンコートしたプレートを氷上におき、試料をプレートに適用する。試料を37℃インキュベーターに移すと反応が始まる。
【０１９２】
プレートを制御インキュベーター中で37℃で90分間インキュベーションし、プレート洗浄機中でTBST/Ca2+緩衝液(Tris(10mM)、NaCl(150mM)、Tween-20(0.05%w/v)、CaCl2(100mM) pH7.4)で3回洗浄した。TBST/Ca2+緩衝液で1：1000に希釈したビオチン標識ヒト抗C4抗体(ヤギ抗ヒトC4、DAKO)(1μg/ml)100μl/ウェルを加え、加熱タワー中で25℃で90分間インキュベーションする。プレートをプレート洗浄機中でTBST/Ca2+緩衝液で3回洗浄する。100μl/ウェルのユーロピウム(Europium)-ストレプトアビジン溶液(Wallac 1244-360)をユーロピウム希釈緩衝液(Tris(10mM)、NaCl(150mM)、Tween-20(0.05%)、EDTA(25μM))で1：1000に希釈し、加熱タワー中で25℃で60分間インキュベーションする。プレートをプレート洗浄機中でTBST/Ca2+緩衝液で3回洗浄する。100μl/ウェルのエンハンスメント溶液(Wallac 1244-105)を加え、試料をプレート撹拌機で5分間撹拌した。試料を約5分間定着させ、Wallac Victor 2d Multicounter 1420に挿入する。Eu3+の蛍光を標準ユーロピウムプログラムを用いて測定する。
【０１９３】
アッセイの測定値から得たデータは以下のごとくプロットすべきである。
【０１９４】
X軸にMBL濃度およびy軸にユーロピウムカウント(cpm)。MBL濃度は自然logとして示すべきであるが、ユーロピウムは直線データであるべきである。
【０１９５】
データ分析およびEC50計算にはHill係数方程式および4パラメータを用いる。
【０１９６】
rMBL試料の相対有効性を以下のごとくrMBL標準品から決定する。
相対有効性＝(EC50標準品/EC50試験)*100
(実施例10)
サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)
【０１９７】
分析用のすべての試料は目に見える沈殿物がなく、中隔付きのふたを用いHPLCバイアル中で製造すべきである。タンパク質溶液は、Trisベースの緩衝液(pH=7.4)中、室温のSuperoseカラムに適用する。
【０１９８】
Superose 6 HR10/30カラムは、Amersham Biosciencesからプレパックしたものが供給される。
クロマトグラフィは下記仕様書にしたがって実施する。
2005526084.tif 000009
参考文献
【０１９９】
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【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】+4℃および-20℃に12ヶ月間保存した1mg/ml MBL製剤の標準MBLと比較したC4活性化データを示す。
【図２】上段に標準品、次いで+4℃および-20℃に維持した1mg/ml安定性試料のSECクロマトグラムを示す。
【図３】質量分析データを示す。
【配列表】
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2005526084.tif 000013
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2005526084.tif 000017
2005526084.tif 000018
2005526084.tif 000019
2005526084.tif 000020
【図１】
2005526084.tif 000021
【図２】
2005526084.tif 000022
【図３】
2005526084.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月11日(2004.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005526084000001.app
【国際調査報告】
2005526084.tif 000024
2005526084.tif 000025
2005526084.tif 000026
2005526084.tif 000027
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