(57)【要約】光学的に活性な式（I):【化２０】2005526074.tif 000023の（−）−７−[２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル]−５−[（３Ｓ）−３−ピペリジニル]−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド[２，３−ｄ][１，３]オキサジン−２−オンまたはその塩。本化合物は、優れた抗炎症活性、および他の生物学的活性を有する。
2005526074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I)：
【化１】
2005526074.tif 000022
の光学的に活性な（−）−７−[２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル]−５−[（３Ｓ）−３−ピペリジニル]−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド[２，３−ｄ][１，３]オキサジン−２−オンまたはその塩。
【請求項２】
少なくとも９０％のエナンチオマー過剰である光学純度を有する請求項１記載の化合物または塩。
【請求項３】
少なくとも９５％のエナンチオマー過剰である光学純度を有する請求項１記載の化合物または塩。
【請求項４】
活性成分として、請求項１、２または３に記載の化合物またはその塩を含んでなる薬剤。
【請求項５】
ひとつまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤と、請求項１、２または３に記載の化合物もしくはその塩を含んでなる薬剤。
【請求項６】
活性成分として、請求項１記載の化合物またはその塩を含んでなるＩκＢキナーゼ阻害剤。
【請求項７】
活性成分として、請求項１、２または３記載の化合物またはその塩を含んでなる抗炎症剤。
【請求項８】
抗炎症剤が、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、結膜炎、春季カタル、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、潰瘍性大腸炎、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、多発性筋炎、皮膚筋炎（ＤＭ）、結節性多発関節炎（ＰＮ）、混合結合組織症（ＭＣＴＤ）、シェーグレン症候群、痛風からなる群から選択される病気を治療するか、または予防するために有効である請求項７記載の抗炎症剤。
【請求項９】
活性成分として、請求項１、２または３に記載の化合物またはその塩を含んでなる免疫抑制剤。
【請求項１０】
活性成分として、請求項１、２または３に記載の化合物またはその塩を含んでなる虚血症の治療剤。
【請求項１１】
活性成分として、請求項１、２または３に記載の化合物またはその塩を含んでなる抗腫瘍剤。
【請求項１２】
有効な量の請求項１、２または３に記載の化合物を、それを必要としている患者に投与することによる病気の治療方法。
【請求項１３】
炎症性疾患を治療する薬剤を製造するための、請求項１、２または３記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、（−）−７−[２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル]−５−[（３Ｓ）−３−ピペリジニル]−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド[２，３−ｄ][１，３]オキサジン−２−オン、その塩、それらを含有する医薬製剤に関する。本発明の（−）−７−[２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル]−５−[（３Ｓ）−３−ピペリジニル]−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド[２，３−ｄ][１，３]オキサジン−２−オンは、ＩκＢキナーゼβ（ＩＫＫ−βまたはＩＫＫ−ｂｅｔａ）活性を阻害し、その結果、核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）活性を阻害し、ＮＦ−κＢ活性に関連する病気の予防および治療、特に炎症性疾患の治療に用いることができる。
【０００２】
（背景技術）
核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）は、ポリペプチドであるＲｅｌ/ＮＦ−κＢファミリーの種々の組み合わせから構成される、密接に関連するホモダイマーおよびヘテロダイマーの転写因子複合体ファミリーに属する。ＮＦ−κＢおよび関連ファミリーメンバーは、免疫および炎症応答に関係する５０以上の遺伝子を調節することに関連している（(Barnes PJ, Karin M, N Engl J Med 336, 1066-1071(1997)）および（Baeuerle PA, Baichwal VR Adv Immunol 65, 111-137(1997))。ほとんどの細胞（cell types)において、ＮＦ−κＢは、５０ｋＤａおよび６５ｋＤａのサブユニットを含むヘテロダイマー（ｐ５０/ＲｅｌＡ）として存在する。このヘテロダイマーは、ＮＦ−κＢ（ＩκＢ）ファミリータンパク質インヒビターと結合して細胞質内に留まり、不活性状態が維持される。ＩκＢファミリータンパク質によって、ＮＦ−κＢの核移行シグナルが遮断される。細胞が種々のサイトカイン（たとえば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１）、ＣＤ４０リガンド、リポ多糖類（ＬＰＳ）、酸化体、マイトジェン（たとえば、ホルボールエステル）、ウイルスまたはその他多くのもので刺激されると、ＩκＢタンパク質は、特定のセリン残基でリン酸化され、ポリユビキチン化され、次いで、プロテアソーム依存性経路を経て分解される。活性なＮＦ−κＢは、ＩκＢから離れると、核に移行でき、そこで望ましいと思われる遺伝子特異的なエンハンサー配列に選択的に結合する。ＮＦ−κＢによって調節されている遺伝子の中には、炎症性メディエーター（pro-inflammatory mediator)、サイトカイン、細胞接着分子、および急性期タンパク質（acute phase protein)を遺伝子情報に指定する多くのものがある。いくつかのこれらのサイトカインおよびメディエーターの発現は、次に、オートクライン（autocrine)およびパラクリン（paracrine)のメカニズムを経てＮＦ−κＢを更に活性化することができる。
【０００３】
気道炎症および喘息を含む多くの炎症性疾患においてＮＦ−κＢの中心的な役割を示唆している多数の証拠が利用可能である（(Yang L ら、J Exp Med 188, 1739-1750 (1998))、(Hart LA ら、Am J Respir Crit Care Med 158, 1585-1592 (1998))、(Stacey MAら、Biochem Biophys Res Commun 236, 522-526 (1997))、(Barnes P および Adcock IM, Trends Pharmacol Sci 18, 46-50 (1997))。
【０００４】
更に、喘息の治療に極めて効果があるとされるグルココルチコイドは、転写因子ＮＦ−κＢおよび活性ペプチド−１（ＡＰ−１）と直接相互作用し、転写因子ＮＦ−κＢおよび活性ペプチド−１（ＡＰ−１）の活性を阻害することによって、気道の炎症を抑制することが示されてきた（(Barnes P Pulmon Pharmacol Therapeut 10, 3-19 (1997))および(Dumont Aら、Trends Biochem Sci 23, 233-235 (1998)）。
【０００５】
一般に、ＮＦ−κＢの活性を阻害すると、強い抗炎症効果をもたらすが、それは、ステロイドによって引き起こされる抗炎症効果と比較して同等かまたは優れている。その結果、ＮＦ−κＢを阻害することにより、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、結膜炎、春季カタル、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、潰瘍性大腸炎、全身性炎症反応症候群、敗血症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合結合組織症、シェーグレン症候群、痛風などに代表される炎症の症状を改善する。
【０００６】
更に、ＮＦ−κＢは、癌化（neoplastic transformation）においてきわめて重要な役割を演じていることが、いくつかの研究によって暗示されている。たとえば、ＮＦ−κＢは、遺伝子の過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子再構成、または転座の結果、インビトロおよびインビボで細胞形質変換に関与している（Mercurio, F., およびManning, A.M. Oncogene, 18:6163-6171 (1999))。ある種のヒトのリンパ球系腫瘍細胞においては、ＮＦ−κＢファミリーメンバーの遺伝子は、再構成されるか、または増幅される。癌病理学におけるそのかかわりの可能性については、Ｍａｙｏ，Ｍ．Ｗ．，Ｂａｌｄｗｉｎ  Ａ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４７０  Ｍ５５−Ｍ６２（２０００）にも開示されている。Ｍａｙｏ，Ｍ．Ｗ．らは、ＮＦ−κＢを阻害することは、ある種の腫瘍、特に結腸直腸癌（colorectal cancer）の開始および/または進行を遮断することになることを開示している。
【０００７】
最後に、ＮＦ−κＢは、ニューロンの細胞死を調節することにも関与している可能性がある。局所脳虚血（focal cerebral ischemia)において、ＮＦ−κＢが活性化され、細胞死を促進することが示されてきた（Nature medicine Vol.5 No.5, May 1999)。
【０００８】
過去数年における広範囲の研究により、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体がシグナルによって誘導されるＩκＢリン酸化を引き起こすことが証明された（(Mercurio, F., およびManning, A.M. Current Opinion in Cell Biology, 11:226-232 (1999))、(Mercurio, F., および Manning, A.M. Oncogene, 18:6163-6171 (1999))、(Barnkett, M., および Gilmore T. D. Oncogene 18:6910-6924 (1999))、(Zandi, E., および Karin, M., 19:4547-4551 (1999))、(Israel, A., trends in CELL BIOLOGY 10:129-133 (2000))、および（Hatada, E.N,ら、Current Opinion in Immunology, 12:52-58 (2000))。この複合体は、ＮＦ−κＢの活性化をもたらす異なった刺激のすべてを統合する部位である可能性が高い。ＩＫＫ複合体（分子量７００−９００ｋＤａ）は、ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−βと呼ばれる二つの相同な（homologous)ＩκＢキナーゼ、ＮＦ−κＢを誘導する上流のキナーゼであるＮＩＫ、この三つのキナーゼを繋ぐＩＫＡＰと呼ばれる裏打ちタンパク質（scaffold protein)、および優先的にＩＫＫ−βと相互作用する調節サブユニットＩＫＫ−γを含む種々のタンパク質から構成される。
【０００９】
ＩＫＫ−βは、７５６個のアミノ酸を有するセリン−スレオニンキナーゼであり、ＩＫＫ−αと５２％の同一性（identity)を有し、ＩＫＫ−αと同一のドメイン構造を有する（(Mercurio Fら、Science 278, 860-866 (1997))、(Woronicz JDら、Science 278,866-869 (1997))、（Zandi Eら、Cell 91, 243-252 (1997))。ＩＫＫ−βは、インビトロおよび細胞内（in cell)で、それぞれＩＫＫ−αとホモダイマーおよびヘテロダイマーを形成する。ＩＫＫ−βは、またＩＫＫ−γ、ＩＫＡＰ、ＮＩＫおよびＩκＢαと相互作用する。組み換え体ＩＫＫ−βは、ＩκＢαおよびＩκＢβを特定のセリン残基で等しい効率でリン酸化する（Li Jら、J Biol Chem 273, 30736-30741 (1998))、（Zandi E, Chen Y, Karin M, Science 281, 1360-1363 (1998))。ＩＫＫ−βは、ＩＫＫ−αと比較すると、より高い恒常性のある（constitutive)キナーゼ活性を示す。このことは、ＩＫＫ−βを過剰発現させると、ＩＫＫ−αと比較してより高い効率でＮＦ−κＢ依存性レポーター遺伝子の転写が活性化されるということを示唆しているデータと一致する。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＬＰＳ、抗ＣＤ３/抗ＣＤ２８共刺激（co-stimulation)、プロテインキナーゼＣおよびカルシニューリン（calcineurin)、Ｂ細胞レセプター/ＣＤ４０リガンド刺激、およびバナジウム酸塩（vanadate)を含む種々の刺激に応答して、種々の細胞系または新鮮なヒト細胞内でＩＫＫ−βが活性化されることが示されてきた。ＩＫＫ−βは、リウマチ性関節炎または骨関節炎を患っている患者の滑膜から単離される線維芽細胞様滑膜（ＦＬＳ）内で活性化される（Zandi Eら、Cell 91, 243-252 (1997))、(O'Connell MAら、J Biol Chem 273, 30410-30414 (1998))、（Kempiak SJら、J Immunol 162, 3176-3187 (1999))。更に、ＩＫＫ−βは、Ｔループ（活性化ループ）内の特定のセリン残基リン酸化を介してなされる可能性が高い、構造的に関連のある上流のキナーゼであるＭＥＫＫ−１およびＮＩＫによって、また、ある種のプロテインキナーゼＣアイソフォームによって活性化され得る((Nakano Hら、Proc Natl Acad Sci USA 95, 3537-3542 (1998))、（Lee FSら、Proc Natl Acad Sci USA 95, 9319-9324 (1998))、（Nemoto Sら、Mol Cell Biol 18, 7336-7343 (1998))、（Lallena MJら、Mol Cell Biol 19, 2180-2188 (1999))。触媒的に不活性なＩＫＫ−βの変異体は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＬＰＳ、抗ＣＤ３/抗ＣＤ２８刺激によってＮＦ−κＢの活性化を阻害することが示されてきた（(Mercurio Fら、Science 278, 860-866 (1997))、（Woronicz JDら、Science 278, 866-869 (1997))。同様な結果は、ＭＥＫＫ１またはＮＩＫが過剰発現されるときに観察される。加えるに、活性化ループ内でのＩＫＫ−βの変異は、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αのシグナルを阻害した（Delhase Mら、Science 284, 309-313 (1999))。上記に述べられた実験結果に基づくと、ＮＦ−κＢの活性化をもたらす種々の経路において、ＩＫＫ−βが重要な関与をしていることの明白な証拠が存在する。
【００１０】
要約すると、ＩＫＫ−βを特異的に阻害すると、その結果、喘息および他の病気の根本にある原因を改善する可能性を有するインビボにおける強力な抗炎症効果および免疫調節効果をもたらすことになる。加えるに、ＩＫＫ−βインヒビターの抗腫瘍および抗虚血効果が期待されうる。
【００１１】
マンナ（Ｍａｎｎａ）らは、一般式：
【化１】
2005526074.tif 000003
[式中、（Ｒ’、Ｒ”）は、（ＯＣＨ３、ＯＣＨ３）、（Ｃｌ、Ｃｌ）、（Ｈ、Ｃｌ）、（Ｈ、Ｂｒ）、（Ｈ、ＣＨ３）、（Ｈ、ＯＣＨ３）、（Ｈ、ＮＯ２）、または（Ｈ、Ｎ（ＣＨ３）２）を表す］、または
【化２】
2005526074.tif 000004
で表される４，６−ジ置換３−シアノ−２−アミノピリジンを一般的な、抗炎症剤、鎮痛剤、および解熱剤として開示している（Eur J. Med. Chem. 34, 245-254(1999)）。
【００１２】
マンナらは、ピリジン環の４の位置に脂肪族基を有するピリジン誘導体を開示していないし、上記の公知のピリジン誘導体についてＩＫＫ−βキナーゼまたはＮＦ−κＢ阻害活性を示唆してもいない。
【００１３】
ＩＫＫ−βキナーゼに対する特異的かつ選択的な阻害活性に基づく有効な抗炎症活性を有する新規化合物を開発することが望まれてきた。
【００１４】
（発明の概要）
ピリジン誘導体の化学的変換に関する広範囲な研究の結果、本発明者らは、本発明に係わる新規な化学構造の化合物が、予測できない、優れたＩＫＫ−βキナーゼ阻害活性を有することを見出した。本発明は、式（Ｉ）：
【化３】
2005526074.tif 000005
の（−）−７−[２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル]−５−[（３Ｓ）−３−ピペリジニル]−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド[２，３−ｄ][１，３]オキサジン−２−オンおよびその塩を提供する。
【００１５】
本発明の化合物は、光学的に活性であり、驚くべきことに、対応するラセミ体（racemic modification)またはそのエナンチオマーである（＋）−７−[２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル]−５−[（３Ｒ）−３−ピペリジニル]−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド[２，３−ｄ][１，３]オキサジン−２−オンと比較して強力なインビボにおけるＩＫＫ−βキナーゼ阻害活性、サイトカイン阻害活性、および抗炎症活性を示す。したがって、とりわけＮＦ−κＢの活性を阻害する薬剤として、特にＮＦ−κＢに依存する疾患を治療するのに有用である医薬または医薬組成物の製造のために適している。
【００１６】
より具体的には、本発明の（−）−７−[２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル]−５−[（３Ｓ）−３−ピペリジニル]−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド[２，３−ｄ][１，３]オキサジン−２−オンは、ＩＫＫ−βキナーゼ活性を阻害するので、ＮＦ−κＢ活性が関与している下記の疾患の治療および予防に有用である：喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、結膜炎、春季カタル、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、潰瘍性大腸炎(diabrotic colitis)、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、多発性筋炎、皮膚筋炎（ＤＭ）、結節性多発関節炎（ＰＮ）、混合結合組織症（ＭＣＴＤ）、シェーグレン症候群、痛風などを含む炎症性症候群。
【００１７】
本発明化合物は、虚血および腫瘍のような病気の治療および予防にも有用であるが、それは、これらの疾患が、ＩＫＫ−βキナーゼおよびＮＦ−κＢ活性にも関与しているからである。
【００１８】
本発明化合物は、種々の公知の方法を組み合わせることによって製造することができる。いくつかの実施態様では、出発原料または中間体として使用される化合物のアミノ基、カルボキシル基および水酸基のようなひとつまたはそれ以上の置換基は、当業者に知られた保護基によって保護することが有利である。保護基の例は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびウッツ（Ｗｕｔｓ）による“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ）”に述べられている。
【００１９】
式（ＩＩ）：
【化４】
2005526074.tif 000006
［式中、−ＯＸは、水酸基または適切な保護基（たとえば、ベンジル基、メトキシベンジル基、およびシリル基）によって保護された水酸基を表す］
の化合物を、式（ＩＩＩ）：
【化５】
2005526074.tif 000007
［式中、Ｘ'は、Ｈまたはたとえば、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニルもしくは従来方法によってＨに容易に変換できる他の置換基を含む保護基を表す］のアルデヒド、
ＣＮＣＨ２ＣＯＯＲ１      （ＩＶ）
［式中Ｒ１は、−ＣＲ１１Ｒ１２Ｒ１３（ここでＲ１１、Ｒ１２、およびＲ１３はそれぞれ独立してＣ１−６アルキルまたはアリールである）である］、
および酢酸アンモニウムのようなアンモニウム塩と反応させ式（Ｖ）：
【化６】
2005526074.tif 000008
［式中、Ｘ、Ｘ'、およびＲ１は、上記で定義のとおりである］
で表される化合物を得る。
【００２０】
反応は、無溶媒または、たとえば、ジオキサン、およびテトラヒドロフランのようなエーテル、ベンゼン、トルエンおよびキシレンのような芳香族炭化水素、アセトニトリルのようなニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルアセトアミドのようなアミド、ジメチルスルホキシドのようなスルホキシドおよびその他のものを含む溶媒中でおこなうことができる。反応温度は、限定はされないが、通常約５０℃から２００℃である。反応は、通常３０分から４８時間、好ましくは、１時間から２４時間おこなうことができる。式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、および酢酸アンモニウムのようなアンモニウム塩は、商業的に入手可能であり、また公知の手法を用いて製造することも可能である。
【００２１】
次に、化合物（Ｖ）の−ＣＯＯ−Ｒ１部分は、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素リチウム、および水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウムのような還元剤を用い、従来方法によるエステル還元法を使用して−ＣＨ２−ＯＨに変換される（ステップ１）。次いで、化合物（ＶＩ）は、たとえば、ホスゲン、ジホスゲン、およびトリホスゲンを用いて、従来方法による環化方法によって、化合物（ＶＩＩ）に変換される（ステップ２）。化合物（ＶＩＩ）の−ＯＸおよび−ＮＸ'における保護基は、従来方法（たとえば、酸処理）によって除去し、化合物（ＶＩＩＩ）を得る（ステップ３）。化合物（ＶＩＩＩ）をキラル異性体分離すると、化合物（Ｉ）が得られる。このキラル異性体分離は、たとえば、光学活性アミノ酸、糖またはその他のものからなるキラルカラムを用いる液体クロマトグラフィーによって、好ましくは、（−）−ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸のような光学活性有機酸を用いてＨＰＬＣまたは再結晶方法でおこなわれる。
【００２２】
【化７】
2005526074.tif 000009
【００２３】
化合物（Ｉ）は、キラル分離ステップを、ステップ１、ステップ２またはステップ３のいずれか任意のステップの前におこなう場合にも得ることができる。
【００２４】
【化８】
2005526074.tif 000010
【００２５】
式（Ｉ）によって示される化合物の典型的な塩は、本発明の化合物を、鉱酸もしくは有機酸、または有機塩基もしくは無機塩基と反応させることによって、製造される塩を包含する。かかる塩は、酸付加塩および塩基付加塩として、それぞれ知られている。
【００２６】
酸付加塩を形成する酸は、限定されないが、硫酸、燐酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、および限定されないが、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などのような有機酸を包含する。
【００２７】
塩基付加塩には、限定されないが、水酸化アンモニウム（アンモニア水：ammonium hydroxide)、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩などの無機塩基、および、限定されないが、エタノールアミン、トリエチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどの有機塩基から誘導されるものが含まれる。無機塩の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムなどが含まれる。
【００２８】
本発明の化合物またはその塩は、変換して低級アルキルエステルまたは公知の他のエステル、および/または水和物または他の溶媒和物を形成してもよい。これらのエステル、水和物、および溶媒和物は、本発明の範囲に含まれる。
【００２９】
本発明の化合物は、限定されないが、通常の錠剤、腸溶剤、カプセル剤、ピル、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンク剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、固体および液状のエアゾール剤およびエマルション製剤(乳濁剤)などの経口剤の形で投与することができる。本発明の化合物は、また、限定されないが、医薬分野の当業者によく知られている、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内などの非経口投与形態で投与することもできる。本発明の化合物は、適切な経鼻用賦形剤を局所使用することによる経鼻用形態、または当業者によく知られている経皮送達システムを用いて、経皮ルートによって投与されてもよい。
【００３０】
本発明化合物を使用する場合の投与計画は、限定されないが、患者（recipient）の年齢、体重、性別、および医学的状態、治療しようとする病態重症度、投与ルート、被投薬者の代謝および排泄機能のレベル、使用投与形式、使用する特定の化合物およびその塩を含む種々のファクターを考慮して当業者によって選択される。
【００３１】
本発明化合物は、投与前に、一つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤と共に製剤化されることが、好ましい。賦形剤は、限定はされないが、担体（carriers）、希釈剤、芳香剤、甘味剤、滑沢剤、溶解剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤およびカプセル封入材料などの不活性物質である。
【００３２】
更に、本発明の別の実施態様は、本発明の化合物と、製剤の他の成分と適合性があり、その被投薬者に有害でない一つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤とを含んでなる医薬製剤である。本発明の医薬製剤は、治療的に効果のある量の本発明化合物を、一つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤と一緒に混合することによって製造される。本発明の組成物を製造する際は、活性成分を、希釈剤と混合してもよいし、または担体に封入することもでき、それは、カプセル、サッシェ（sachet）、紙、または他の容器の形をとることができる。担体は、希釈剤（diluent）としての働きをすることも可能であり、それは、賦形剤として機能する固体、半固体、または液体でもよいし、また錠剤、ピル、散剤、口内錠（lozenge）、エリキシル剤、懸濁剤、乳濁剤、液剤、シロップ剤、エアゾール剤、たとえば、活性化合物を１０％（重量）までを含む軟膏剤、軟・硬ゼラチンカプセル、座剤、滅菌注射用液剤および滅菌包装散剤の形になることができる。
【００３３】
経口投与用には、活性成分は、限定されないが、乳糖、澱粉、蔗糖、ブトウ糖、炭酸ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム、硫酸カルシウム、メチルセルロースなどの経口用、非毒性の医薬的に許容される担体と混合してもよいし、所望により、限定されないが、トウモロコシ、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、アルギン酸などの崩壊剤、更に所望により、限定されないが、たとえば、ゼラチン、アラビアゴム、天然糖類、β−ラクトース、トウモロコシ甘味剤、 天然および合成ガム、アカシア（アラビアゴム）、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋（waxes）などの結合剤、更に所望により、限定されないが、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、タルクなどの滑沢剤を共に混合してもよい。
【００３４】
散剤の際には、担体を細かく砕いた固体とし、細かく砕いた活性成分と混和してもよい。活性成分は、好適な割合で結合性を有する担体と混合し、錠剤を作るのに望ましい形、サイズに圧縮することができる。散剤および錠剤は、本発明の新規化合物である活性成分を約１から約９９重量パーセント包含することが好ましい。好適な、固体担体は、マグネシウムカルボキシメチルセルロース、低融点の蝋（wax）、およびココアバターである。
【００３５】
滅菌液体製剤は、懸濁液、乳化液、シロップ、およびエリキシル製剤を含む。活性成分は、無菌水、無菌有機溶媒、またはその両方の混合物などの医薬的に許容される担体に溶解するかあるいは懸濁することができる。
【００３６】
活性成分は、適切な有機溶媒、たとえば、プロピレングリコール水溶液に溶解することができる。他の組成物は、細かく砕いた活性成分を、澱粉もしくはカルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液または、適切なオイルに分散させることによって作製できる。
【００３７】
剤型は、ヒトまたは他の哺乳類に投与するのに適した、単位投与量を含む物理的に別々の形態である単位投与形態であってよい。単位投与形態は、１個のカプセルまたは錠剤、または複数のカプセルまたは錠剤でありうる。“単位量(unit dose)”は、あらかじめ決定された本発明の成分の量であって、所望の治療効果を生み出すように計算され、一つまたはそれ以上の賦形剤を含んだ量である。単位投与量中の活性成分の量は、関与する特定の治療に応じて、約０．１から約１０００ミリグラムまたはそれ以上に変更または調節してもよい。
【００３８】
指示された効果のために使用する場合、本発明の典型的な経口投与量は、約０．０１ｍｇ/ｋｇ/日から約１００ｍｇ/ｋｇ/日、好ましくは、０．１ｍｇ/ｋｇ/日から３０ｍｇ/ｋｇ/日、最も好ましくは、約０．５ｍｇ/ｋｇ/日から約１０ｍｇ/ｋｇ/日の範囲である。非経口投与の場合は、約０．００１から１００ｍｇ/ｋｇ/日、好ましくは、０．０１ｍｇ/ｋｇ/日から１ｍｇ/ｋｇ/日の量を投与することが一般に有利であることが証明された。本発明の化合物は、一日単回投与でもよいし、一日量を一日２回、３回、またはそれ以上の回数に分割して投与してもよい。送達が経皮形態である場合は、もちろん、投与は継続的に行われる。
【００３９】
本発明の効果は、次のアッセイおよび薬理試験によって検討された。
【００４０】
[ＩＫＫ−βキナーゼ阻害アッセイ］
（１）ＩＫＫ−βキナーゼタンパクの調製
ヒトＩＫＫ−βオープンリーディングフレームをコードしているｃＤＮＡフラグメントを、公表されている配列（Woronicz JDら、Science 278, 866-869 (1997))から設計した対のプライマーを使用して、ＰＣＲによって作成した。鋳型は、Ｅｌｏｎｇａｓｅ（商標）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフテクノロジー）を使用して、クイッククローンｃＤＮＡ（クローンテク）((Quickclone cDNA)Clontech)から入手した。ＰＣＲにより作成されたＤＮＡフラグメントは、ゲル精製され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの中にサブクローン化された。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの中にクローン化されたｃＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１/Ｈｉｓ  Ｃ  ＫｐｎＩ/ＮｏｔＩに挿入し、ｐＶＬ１３９３  ＳｍａＩ/ＸｂａＩ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に移し、バキュロウイルストランスファーベクターを構築した。次いで、このベクターを、リニアのバキュロウイルス（linearized baculovirus：バキュロゴールド(商標名)、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）とともに使用して、Ｓｆ２１細胞（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）をトランスフェクトした。生成した組み換えバキュロウイルスを、Ｓｆ２１細胞内でクローン化し、増幅し、１０％ＦＣＳ、ゲンタマイシン５０ｇ/ｍｌ、０．１％プルロニックＦ−６８（ライフテクノロジー、インク）を補充したＴＮＭ−ＦＨ昆虫細胞培地（ライフテクノロジー、インク）中で、懸濁培養（１Ｌ三角フラスコ（Erlenmeyer flask)に２００ｍｌ；２７℃；毎分１３０回転（rpm))として培養した。Ｓｆ２１細胞を、標準プロトコール（Crossen R, Gruenwald S (1997) Baculovirus Expression Vector System Instruction Manual、 Pharmingen Corporation)にしたがって、感染多重度５であるこの増幅したウイルスで感染させ、４８時間後に回収した。この細胞を溶解させ、生成したヒスチジンと融合したＩＫＫ−βキナーゼのキメラタンパク（ＨｉｓタグＩＫＫ−ベータ）を得た。
【００４１】
（２）精製ＧＳＴ−ＩκＢα融合プロテインの調製
グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＩκＢαのアミノ酸残基１から５４との融合タンパクをコードするヌクレオチド配列（nucleotide sequence)を含んでいる発現ベクターを、ＩＰＴＧ誘導プロモーターのコントロールのもとで構築した。発現ベクターを、大腸菌に導入し、この形質転換体を培養し、溶解させ、ＧＳＴ−ＩκＢα融合プテインを得た。次いで、生じたＧＳＴ−ＩκＢα融合プロテインを、キナーゼアッセイのために、精製し、ビオチン化した。
【００４２】
（３）ＩＫＫ−βキナーゼ活性の測定
ＩＫＫ−βの９６ウエル（well)フォルマットアッセイが、本発明の化合物の阻害活性を試験するために行われた。最初に、５μｌの試験化合物を、２．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下に、Ｕ字型底９６ウエルプレート（Falcon)のそれぞれのウエル（穴）に入れた。バックグランド（ＢＧ）および全リン酸化（ＴＰ）のコントロールウエル用には、５μｌの２．５％ＤＭＳＯが入れられた。組み換えＩＫＫ−β（最終濃度０．６μｇ/ｍｌ）およびビオチン（ｂｉｏ−ＧＳＴ−ＩκＢα（１−５４））（最終濃度０．２μＭ）を２×キナーゼバッファーβ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．６、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  β−グリセロフォスフェート、４０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  クレアチンフォスフェート、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．２ｍｇ/ｍｌ  ＢＳＡおよび、０．８ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド（phenylmethylsulfonyl fluoride)) ２５μｌで希釈し、９６−ウエルプレートに移した。２５ｕｌの２×キナーゼバッファーβ中のＢｉｏ−ＧＳＴ−ＩκＢα（１−５４）を、ＩＫＫ−βの非存在下で、ＢＧウエルに移した。次いで、２０μｌの１２．５μＭ  ＡＴＰ、６２．５μＣｉ/ｍｌ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ（Amersham Pharmacia Biotech)を加え、生じた混合物を２時間、室温でインキュベートした。キナーゼ反応は、１５０μｌのターミネーションバッファー（１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．２ｍｇ  ＮａＮ３）を添加することによって停止させた。１５０μｌのサンプルを、ストレプトビアジンによって被覆されたホワイトＭＴＰ（Steffens Biotechniche Analysen GmbH #08114E14.FWD)に移し、ビオチン化基質を捕捉した。１時間のインキュベーション後に、結合していない放射能は、ウエルを５回にわたり３００μｌの洗浄バッファー（０．９％塩化ナトリウムおよび０．１％（ｗ/ｖ）ツイーン２０を含む）で、ＭＷ−９６プレートウオッシャー（plate washer：Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈ）を用いて洗浄し、除去された。結合している放射能は、１７０μｌのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−ＰＳ  シンチレーションカクテル（Packard)を添加後、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  シンチレーションカンターを使用して測定した。
【００４３】
［選択性に関するＳｙｋチロシンキナーゼ阻害アッセイ］
（１）Ｓｙｋプロテインの調製
ヒトのＳｙｋオープンリーディングフレームをコードしているｃＤＮＡフラグメントを、ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫Ｂ細胞系Ｒａｊｉ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション：American Type Culture Collection)の全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法を使用してクローニングした。このｃＤＮＡフラグメントをｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の中に挿入し、バキュロウイルストランスファーベクターを構築した。次いで、このベクターを、リニアーバーキュロウイルス（バキュロゴールド（商標）、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に、Ｓｆ２１細胞（インビトロゲン、サン  ジエゴ、カルフォルニア）をトランスフェクトするのに用いた。
【００４４】
生成された組み換えバキュロウイルスは、Ｓｆ２１細胞内でクローニングされ、増幅された。この増幅した力価が高いウイルスを、Ｓｆ２１細胞に、感染させて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によって、融合されたＳｙｋキナーゼのキメラタンパクを作成した。
【００４５】
その結果生じたＧＳＴ−Ｓｙｋを、グルタチオンカラム（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)を使用し、製造指針に従って精製した。タンパクの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、９０％以上であることが確認された。
【００４６】
（２）ペプチドの合成
次に、二つのチロシン残基を含む３０残基のペプチドフラグメント、ＫＩＳＤＦＧＬＳＫＡＬＲＡＤＥＮＹＹＫＡＱＴＨＧＫＷＰＶＫＷが、ペプチド合成機で合成された。次いで、フラグメントのＮ−末端を、ビオチン化し、ビオチン化活性ループペプチド（ＡＬ）を得た。
【００４７】
（３）Ｓｙｋチロシンキナーゼ活性の測定
試薬のすべてが、Ｓｙｋキナーゼアッセイバッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）で希釈された。最初に、３．２μｇのＧＳＴ−Ｓｙｋおよび０．５μｇのＡＬを含んでいる混合液（３５μｌ）を、９６−ウエルプレートの各ウエルに入れた。次いで、５μｌの試験化合物を、２．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下に、各ウエルに加えた。この混合液に、３００μＭ  ＡＴＰ（１０μｌ）を添加し、キナーゼ反応を開始させた。最終的な反応混合液（５０μｌ）は、０．６５ｎＭ  ＧＳＴ−Ｓｙｋ、３μＭ  ＡＬ、３０μＭ  ＡＴＰ、試験化合物、０．２５％ＤＭＳＯ、およびＳｙｋキナーゼアッセイバッファーから成っている。
【００４８】
混合物を、１時間、室温（ＲＴ）でインキュベイトし、そして１２０μｌのターミネーションバッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ）を添加して、反応を停止させた。この混合物を、ストレプトアビジンで被覆されたプレートに移し、３０分間、室温でインキュベートし、ビオチン−ＡＬをプレートに結合させた。プレートを０．０５％のツイーン２０（Tween-20)を含んでいるトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）で３回洗浄した後、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１％のＢＳＡ、および予めアメルシャム・ファルマシアのキット（Amersham Pharmacia's kit)を用いてユーロピウム（europiumu)でラベルした６０ｎｇ/ｍｌの抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（anti-phosphotyrosine monoclonal antibody)４Ｇ１０（アップステイトバイオテクノロジー）から成る１００μｌの抗体溶液を添加し、室温で、６０分インキュベートした。洗浄後、１００μｌのエンハンスメントソルーション（enhancement solution: Amersham Pharmacia Biotech)を添加し、次いで、時間分解蛍光度（time-resolved fluorescence)を、マルチラベルカウンターＡＲＶＯ（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて、励起（excitation)３４０ｎｍおよび放出（emission)６１５ｎｍで、４００  ｍｓｅｃのディレイおよび４００ｍｓｅｃのウインドウで測定した。
【００４９】
[ＴＮＦ−αに応答して、Ａ５４９細胞から産生されるＲＡＮＴＥＳの測定］
（１）Ａ５４９細胞の調製
Ａ５４９ヒト肺上皮細胞系（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−８８５）を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ/ｍｌのペニシリン、１００μｇ/ｍｌのストレプトマイシン、および２ｍＭのグルタミン（カルチャーミディアム）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium:Ｄ−ＭＥＭ、Ｎｉｋｋｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）中で保持した。４万個（４×１０４）の細胞（８０μｌ/ウエル）を、９６ウエル組織培養用平底プレート（ファルコン  ＃３０７２）の各ウエルに接種した。プレートを２時間放置すると、その結果、細胞が各ウエルの底部に接着した。各ウエルに、１０μｌの溶媒（vehicle)（１％ＤＭＳＯ）、１％ＤＭＳＯ中における試験化合物の逐次希釈（serial dilutions）、またはレファレンスとしての１％ＤＭＳＯ中の５ｎＭデキサメサゾンを加えた。混合液（９０μｌ/ウエル）は、３７℃で１時間インキュベートされた。１時間後に、培養培地中の１μｇ/ｍｌのＴＮＦ−α（１０μｌ）を、混合液に加え、１００μｌの反応混合物を得た。反応混合液は、２４時間培養し、１００ｎｇ/ｍｌ  ＴＮＦ−αで細胞を刺激した。ＴＮＦ−αの刺激をしていない溶媒（vehicle)だけの細胞も調製された。
【００５０】
（２）ＲＡＮＴＥＳ産生の測定
次いで、各ウエルの上澄み液（supernatant）中の細胞から放出されるＲＡＮＴＥＳの濃度を、定量的サンドイッチエンザイムイミュノアッセイ法を用いて決定した。最初に、ＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４、１００μｌ）中で２μｇ/ｍｌのマウス抗ｈｕＲＡＮＴＥＳモノクロナール抗体（anti-huRANTES mAb)(Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ｍＡｂ６７８）を、９６ウエルのＮＵＮＣフルオロプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＵＳＡ）（最終２００ｎｇ/ウエル）の各ウエルに入れ、そしてプレートを、４℃で一晩放置し、その結果抗体によって被覆した。次いで、プレートの各ウエルを３５０μｌの洗浄バッファー（０．０５％ツイーン２０、０．８５％ＮａＣｌ、および２５ｍＭ  トリス/ＨＣｌ  ｐＨ７．４）で３回洗浄した。１％ＢＳＡ（シグマ  純度９９％、１００ｇ）、５％蔗糖（ナカライテスク、純度９９％、５００ｇ）、および０．０２％アジド（azide：ナカライテスク、１００％、５００ｇ）を含むブロッキングバッファー（blocking buffer)を、それぞれのウエルに添加し（２００μｌ）、次いで、プレートを４時間放置し、被覆抗体を安定化させた。次に、上記（１）で調製された細胞培養の上澄み液５０μｌを、抗体で被覆されている９６ウエルのＮＵＮＣフルオロプレートの各ウエルに入れた。組み換えヒトＲＡＮＴＥＳ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．＃３００−０６）は、ＲＡＮＴＥＳ産生量（リニアレインジは、１と１０ｎｇ/ｍｌの間である）を決定するための標準として使用された。１％ＢＳＡおよび０．０５％ツイーン２０によって補充されたＰＢＳ中のユウトピリウムでラベルされたマウス抗ｈｕＲＡＮＴＥＳモノクロナール抗体（６０ｎｇ/ｍｌ：Ｒ＆Ｄシステム、＃ｍＡｂ２７８）を各ウエルに入れた（５０μｌ）。反応混合液を、室温で４時間インキュベートした。セラ・ウオシャー（Ｓｅｒａ  Ｗａｓｈｅｒ：Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ、＃ＭＷ−９６Ｒ）を使用して、洗浄バッファー（０．０５％ツイーン２０、０．８５％ＮａＣｌ、および２５ｍＭ  トリス/ＨＣｌ  ｐＨ７．４、３５０μｌ/ウエル）で５回洗浄した後、エンハンスメントソルーション（ＤＥＬＦＩＡ、＃１２４４−４０５、１００μｌ/ウエル）を各ウエルに加えた。プレートを、１０分間室温で適度に振盪しながらインキュベートした。蛍光強度は、ＤＥＬＦＩＡ蛍光分光計（DELFIA fluorimeter:Ｗａｌｌａｃ）を用いて測定された。励起は、３４０ｎｍでなされ、放出は、６１５ｎｍで測定された。
【００５１】
[ＬＰＳに応答して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から産生されるＴＮＦ−αの測定］
（１）ＰＢＭＣの調製
ヒトＰＢＭＣを、最初に健康なドナーから血液を入手し、その血液から細胞を単離することによって調製した。単離は、フィコールパック（Ficoll pacque：ファルマシア、＃１７−１４４０−０２）を用いて、フィコール勾配遠心法（Ficoll gradient-centrifugation method)によってなされた。献血（donation)から３時間以内に、単離されたＰＢＭＣは使用された。ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ/ｍｌペニシリン、１００μｇ/ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭグルタミン（培養培地）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｎｉｋｋｅｎ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）でＰＢＭＣを再懸濁した。細胞（１５０μｌ/ウエル中で１×１０５）を、９６ウエル組織培養用平底プレート（ファルコン  ＃３０７２）の各ウエルに接種した。各ウエルに、２０μｌの溶媒（vehicle)（１％ＤＭＳＯ）、１％ＤＭＳＯ中で試験化合物の逐次希釈(serial dilutions)、またはレファレンスとしての１％ＤＭＳＯ中の２５０ｎＭデキサメサゾンを加えた。混合液（１７０μｌ/ウエル）は、３７℃で１時間インキュベートされた。１時間後に、培養培地中の２０ｎｇ/ｍｌのＬＰＳ（３０μｌ）を、混合液に加え、２００μｌの反応混合物を得た。反応混合液は、７時間培養し、３ｎｇ/ｍｌのＬＰＳで細胞を刺激した。ＬＰＳ刺激をしていない溶媒（vehicle)だけの細胞も調製された。次いで、反応混合物の上澄み液を回収した。
【００５２】
（２）ＴＮＦ−α産生量の測定
上澄み液のＴＮＦ−α濃度が、ＤｕｏＳｅｔ（商標名）ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を用いて製造業者の推薦指示（recommendations)に従って測定された。まず、ＰＢＳバッファー（１００μｌ）中の４μｇ/ｍｌのマウス抗ヒトＴＮＦ−α抗体（Ａｂ）を、９６ウエルプレート（ＮＵＮＣ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標名））の各ウエルに入れ、そしてプレートを一晩４℃で放置し、抗体で被覆した。次いで、プレートの各ウエルを、ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０（ナカライテスク）を含んでいる３５０μｌの洗浄バッファーで、セラ・ウオッシャー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ、＃ＭＷ−９６Ｒ）を用いて、５回洗浄した。各ウエルには、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、５％蔗糖を含む３００μｌのＰＢＳを加えた。室温での２時間のインキュベーションの後、バッファーを捨て、５０μｌの培養培地を加えた。次に、上記（１）で調製した刺激を受けた細胞培養液の上澄み液５０μｌを９６ウエルプレートの各ウエルに入れた。組み換えヒトＴＮＦ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ）は、ＴＮＦ−αの産生量を決定するための標準として使用された（３０と２，０００ｐｇ/ｍｌとの間のリニアレインジ（linear range)）。反応混合液は、室温で１時間インキュベートされた。５回洗浄した後、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーンを含むＰＢＳ（希釈液：Ｒｅａｇｅｎｔ  ｄｉｌｕｅｎｔ））に希釈した１００μｌのビオチン化したヤギ抗ヒトＴＮＦ−α抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ、３００μｌ/ｍｌ）を各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートした。５回洗浄した後、１００μｌのストレプトアビジン結合ホースラディシュペルオキシダーゼ（Streptavidin-conjugated horseradishperoxidase)(Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ、希釈液（Ｒｅａｇｅｎｔ  ｄｉｌｕｅｎｔ）中１/１００）が各ウエルに加えられた。２０分後、プレートの各ウエルを５回洗浄（wash)バッファー（３５０μｌ/ウエル）で洗浄した。ホースラディシュペルオキシダーゼの基質および過酸化水素（ＴＭＢＺペルオキシダーゼ検出キット、ＳＵＭＩＬＯＮ  ＃ＭＬ−１１２０Ｔ）を混合液に加え、そして、混合液を室温で放置した。２Ｎの硫酸を加えることにより、１０分後に反応は停止した。４５０ｎｍでの光学濃度（optical density)を、マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ｍｕｌｔｉｓｏｆｔ）を用いて、測定した。各サンプルのＴＮＦ−αの産生量の定量は、各サンプルと標準曲線との間の光学濃度を比較することによってなされた。
【００５３】
［抗体刺激に応答してＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内のＩＬ−２産生の測定］
抗ＣＤ３/抗ＣＤ３抗体刺激に応答して、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（Ｅ６−１  クローン；ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−１５２）におけるＩＬ−２の産生を測定した。
【００５４】
（１）固相化抗体の調製
最初に、抗ＣＤ３抗体（４００ｎｇ/ウエル  Ｎｉｃｈｉｒｅｉ、ＮＵ−Ｔ３を、１００μｌダルベッコＰＢＳ中、４μｇ/ｍｌ）を９６ウエルのプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ＃３０７２）の各ウエルに入れ、プレートを２時間室温で放置して、抗体で被覆をした。次いで、プレートの各ウエルを２５０μｌのＰＢＳで３回洗浄した。
【００５５】
（２）Ｊｕｒｋａｔ  細胞培養の調製
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、１０％熱不活性胎児ウシ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ/ｍｌのペニシリンＧ、および１００μｇ/ｍｌストレプトマイシン（培養培地）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。２０万（２×１０５）個の細胞（１９０μｌ/ウエルを、９６−ウエルのＵ底組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ  ＃３０７７）の各ウエルに接種した。各ウエルに、１０μｌの溶媒（vehicle)（０．２％ＤＭＳＯ）、０．２％ＤＭＳＯ中で試験化合物を逐次希釈(serial dilutions)、または０．２％ＤＭＳＯ中でレファレンスとして、シクロスポリンＡ  ２５ｎＭの添加を行った。混合液（２００μｌ）を３７℃、１時間、加湿した５％炭酸ガス雰囲気下でインキュベートした。
【００５６】
（３）細胞の刺激
（２）で得られた反応混合液（１００μｌ）を、（１）で調製された固相化抗体プレートの各ウエルに入れた。このウエルに、抗ＣＤ２８抗体（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ、ＫＯＬＴ−２、細胞培養培地中６μｇ/ｍｌ、５０μｌ/ウエル）および２．５μｇ/ｍｌのヤギ抗マウスκ鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（Ｃａｔ＃Ａ９０−１１９Ａ）培養培地中１０μｇ/ｍｌ、５０μｌ/ウエル）を加えた。各ウエルの反応混合物を、２４時間、３７℃でインキュベートし、固相化した抗ＣＤ３抗体（４００ｎｇ/ウエル）および抗ＣＤ２８抗体（１．５μｇ/ｍｌ）で細胞を刺激し、次いで、細胞上のレセプターを抗マウスκ鎖抗体（２．５μｇ/ｍｌ）で架橋した。
【００５７】
ＩＬ−２産生量の測定
次いで、反応混合物の上澄み液を回収した。上澄み液（上清）中のＩＬ−２濃度を、ＤｕｏＳｅｔ（商標名）ＥＬＩＳＡディベロップメント・キット（ＧｅｎｚｙｍｅＴｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を用いて、製造業者の推薦指示にしたがって決定した。最初に、ＰＢＳバッファー（１００μｌ）中の２μｇ/ｍｌのマウス抗ｈｕＩＬ−２抗体を、９６−ウエルのプレート（ＮＵＮＣ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標名））の各ウエルに入れ、そして、プレートを４℃で一晩放置し、抗体で被覆した。次いで、プレートの各ウエルを、５回、ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０（ナカライテスク）を含む洗浄バッファー３５０μｌでＳｅｒａ  Ｗａｓｈｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ、＃ＭＷ−９６Ｒ）を用いて洗浄した。各ウエルに、２５０μｌの１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０（希釈バァッファー）を加えた。室温で２時間のインキュベーションの後、バッファーを捨て、５０μｌの培養培地を加えた。次に、上記（３）で調製された刺激された細胞培養物５０μｌの上澄み液（上清）をマウス抗ｈｕＩＬ−２抗体で被覆されている９６−ウエルプレートのそれぞれのウエルに加えた。組み換えヒトＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ）が、ＩＬ−２産生量（２００と５，４００ｐｇ/ｍｌとの間のリニアレインジ）を決定するための標準として使われた。反応混合物を、１時間、室温でインキュベートした。５回の洗浄後、希釈バッファー中で１００μｌのビオチン化されたウサギ抗ｈｕＩＬ−２抗体(Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ、１．２５μｇ/ｍｌ）を各ウエルに加え、そして、室温で１時間インキュベートした。５回の洗浄後、１００μｌのストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ、希釈バッファー中１/１０００）を各ウエルに加えた。２０分後、プレートの各ウエルを、５回洗浄バッファー（３５０μｌ/ウエル）で洗浄した。基質および過酸化水素（ＴＭＢＺペルオキシダーゼ検知キット、ＳＵＭＩＬＯＮ  ＃ＭＬ−１１２０Ｔ）を、混合液に加え、この混合物を、室温で放置した。反応は、１０分後に２Ｎ硫酸を添加することによって停止した。４５０ｎｍの光学濃度を、マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ｍｕｌｔｉｓｏｆｔ）を使用して、測定した。各サンプルのＩＬ−２の産生量の定量は、各サンプルと標準曲線との光学濃度を比較することにより行われた。
【００５８】
[マウスＬＰＳ−誘導ＴＮＦ−α産生］
８週齢雌ＢＡＬＢ/ｃマウスを、コントロールグループと処置グループの二つのグループに配置した。０．９％生理食塩水中２００μｇ/マウスのＬＰＳを含む溶液を、コントロールマウスに腹腔内投与（ip)した。処置グループのマウスには、まず、ＬＰＳ注射の３０分前に、本発明の化合物を腹腔内注射した。ペントバルビタール（８０ｍｇ/ｋｇ、ｉ．ｐ．）の麻酔下で、ＬＰＳ注入後９０分後に、処置マウスおよびコントロールマウスの下大静脈（posterior venous cavity)から採血し、２％ＥＤＴＡ溶液を含んでいる９６−ウエルのプレート内へ回収した。血漿を、１８００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離して分離し、次いで、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸バッファー食塩水（ｐＨ  ７．４）で４倍に希釈した。サンプル中のＴＮＦ−αの濃度は、エリザ・キット（ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて決定された。
【００５９】
各グループから５匹のマウスの平均ＴＮＦ−αレベルを決定し、ＴＮＦ−αレベルの減少パーセントを計算した。処置マウスは、コントロールマウスと比較して、顕著なＴＮＦ−αレベルの減少を示した。この結果により、本発明の化合物によって、ＬＰＳ誘導サイトカイン活性を抑制することができることが示される。
【００６０】
［ラットＬＰＳ−誘導ＴＮＦ−α産生］
７週齢雌ウイスターラットを使用した。リン酸バッファー食塩水中（ｐＨ７．４）に溶解された１ｍｇのＬＰＳ（リポポリサッカライド）を、ラットに腹腔内投与（i．p．)した。化合物をＬＰＳ注入の６０分前に経口投与した。ペントバルビタール（８０ｍｇ/ｋｇ、ｉ．ｐ．）の麻酔下で、ＬＰＳ注入の１２０分後に、ラットの下大静脈から採血し、２％ＥＤＴＡ溶液を含んでいる９６−ウエルのプレートに加えた。血漿を、１８００ｒｐｍで４℃、１０分間遠心分離して分離し、次いで、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸バッファー食塩水（ｐＨ  ７．４）で４倍に希釈した。サンプル中のＴＮＦ−αの濃度は、エリザ・キット（ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ：Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて決定された。
【００６１】
各グループから７−８匹のラットの平均ＴＮＦ−αレベルを決定し、ＴＮＦ−αレベルの減少パーセントを計算した。処置マウスは、化合物が与えられると、コントロールラットと比較して、顕著なＴＮＦ−αレベルの減少を示した。この結果により、本発明の化合物によって、ＬＰＳ誘導サイトカイン活性を抑制することができることが示される。
【００６２】
インビトロ試験の結果が、下記の実施例に示されている。このデータは、固相合成によって得られた化合物、たとえば、約４０から９０％純度レベルに対応している。本発明の化合物は、細胞アッセイおよびインビボアッセイにおいても、優れた選択性と強力な活性を示す。より具体的には、本発明の化合物は、対応するラセミ体（racemic modification)の２倍の強さの細胞活性を示す。また、本発明の化合物は、ラットにおいても、対応するラセミ体の２倍の強さの抗炎症活性を示す。更に、本化合物は、エイムステスト・スクリーニング（Ames-Test Screening)によれば、変異原性がない（non-mutagenic)ことが確認された。
【００６３】
（実施例）
本発明は、実施例の形で、下記に詳細に述べることにするが、それらは、本発明の範囲（metes and bounds）を定義するものとして決して解釈されるべきではない。下記の実施例において、量に関するデータのすべては、特に断らない限り、重量％である。質量スペクトル（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ）は、電子スプレー（ＥＳ）イオン化法（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＬＣ)を用いて得られた。融点は未補正値である。液体クロマトグラフィー−マススペクトル（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ(ＬＣ−ＭＳ））データは流速１ｍｌ/ｍｉｎでアセトニトリル−水の混合溶媒（９：１から１：９）を流すＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＯＤＳ  カラム(４．６ｍｍ×３０ｍｍ)を有しているＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＬＣで記録した。ＴＬＣは、プリコートされたシリカゲルプレート（Merck silica gel 60 F-254)で行われた。シリカゲル（ＷＡＫＯ−ｇｅｌ  Ｃ−２００（７５−１５０μｍ））を、カラムクロマトグラフィー分離のすべてに用いた。化学薬品のすべては、試薬グレードであり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬工業株式会社、東京化成工業株式会社から購入した。
【００６４】
陽子核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）スペクトルは、３００または５００ＭＨｚのいずれかでＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−３００で記録された。５００Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａＳｈｉｅｌｄ（商標名）およびケミカルシフトは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）と関連して１００万単位に分けて報告される。
【００６５】
（実施例１）
１−｛２−[（シクロプロピルメチル）オキシ]−６−ヒドロキシフェニル｝エタノン
【化９】
2005526074.tif 000011
アセトン（１０００ｍＬ）中の１−（２，６−ジヒドロキシフェニル）エタノン（５０．０ｇ、３２８ｍｍｏｌ）溶液を攪拌しながら、これに、炭酸カリウム（２２７ｇ、１６４３ｍｍｏｌ）および（ブロモメチル）シクロプロパン（３５．１ｍＬ、３６１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物は、５０℃で、２日間攪拌した。反応混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ：登録商標）で濾過し、次いで、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。分離した有機層を、水および塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中で懸濁した。次いで、懸濁液を、８０℃で３０分間攪拌した。溶液を、濾過し、濾液を室温まで冷却した。その結果、生じた白色固形物を濾過によって回収し、ヘキサンで洗浄し、減圧下乾燥すると、１−｛２−[シクロプロピルメチル）オキシ]−６−ヒドロキシフェニル｝エタノンを、淡い黄色固形物として得た（５６．３ｇ、収率；８３％）。
【００６６】
１−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝エタノン
【化１０】
2005526074.tif 000012
アセトン（１０００ｍＬ）中の１−｛２−[（シクロプロピルメチル）オキシ]−６−ヒドロキシフェニル｝エタノン（５６．３ｇ、２７２ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌しながら、これに、炭酸カリウム（１８８ｇ、１３６４ｍｍｏｌ）、４−メトキシベンジルクロリド（４０．９ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）およびヨウ化テトラブチルアンモニウム（２０．２ｇ、５４．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一晩還流下で攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、セライト（登録商標）で濾過し、次いで、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。分離した有機層を、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。次いで、生じた白色の固形物を、エタノールで再結晶し、濾過して回収し、エタノールで洗浄し、減圧下乾燥すると、１−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝エタノンを白色固形物として得た（７９．２ｇ、収率；８９％）。
【００６７】
ｔｅｒｔ−ブチル  ２−アミノ−４−［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３−ピペリジニル］−６−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝ニコチネート
【化１１】
2005526074.tif 000013
ジオキサン（１０ｍＬ）中の１−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝エタノン（１０．００ｇ、３０．６３８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル  ３−ホルミル−１−ピペリジンカルボキシレート（１３．０６９ｇ、６１．２７５ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルシアノアセテート（８．６５０ｇ、６１．２７５ｍｍｏｌ）およびアンモニウムアセテート（６．９０２ｇ、９１．９１３ｍｍｏｌ）の混合物を、９０℃で一晩攪拌した。室温まで冷却した後、反応混合物を、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈した。混合物に、クロラニル（chloranil)(１．５０７ｇ、６．１２８ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌した。１．５時間後、アスコルビン酸（１．０７９ｇ、６．１２８ｍｍｏｌ）を、混合物に加える。１．５時間攪拌した後、混合物は、酢酸エチルと水に分離した。有機分離層を、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、次いで減圧下で濃縮した。生じた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝２/1)で精製すると、淡い褐色形態のｔｅｒｔ−ブチル  ２−アミノ−４−［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３−ピペリジニル］−６−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝ニコチネートを得た（４．９ｇ、２４％）。
【００６８】
ｔｅｒｔ−ブチル  ３−[２−アミノ−６−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］−フェニル｝−３−（ヒドロキシメチル）−４−ピリジニル］−１−ピペリジンカルボキシレート
【化１２】
2005526074.tif 000014
テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル  ２−アミノ−４−［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３−ピペリジニル］−６−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝ニコチネート（４．９ｇ、７．４２６ｍｍｏｌ）の冷却した溶液に、アルゴン雰囲気下でヴィトライド（Ｖｉｔｒｉｄｅ：登録商標）（１０ｍＬ）を滴下した。０℃で１時間攪拌を続けた。飽和塩化アンモニウム水で急冷(quenched)した後、飽和酒石酸ナトリウムカリウム水（saturated aqueous potassium sodium tartrate)を混合物に加え、次いで、この混合物を強く攪拌した。混合物を、酢酸エチルで抽出し、水および塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮すると、ｔｅｒｔ−ブチル  ３−[２−アミノ−６−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］−フェニル｝−３−（ヒドロキシメチル）−４−ピリジニル］−１−ピペリジンカルボキシレートを得た（４．３８ｇ、定量収量(quant)）。これは、更に精製することなく、次の工程で使用した。
【００６９】
ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（７−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）−１−ピペリジンカルボキシレート
【化１３】
2005526074.tif 000015
テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル  ３−[２−アミノ−６−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝−３−（ヒドロキシメチル）−４−ピリジニル］−１−ピペリジンカルボキシレート（５．０ｇ、８．４７８ｍｍｏｌ）（実施例１７−１の工程（step)（２）で得られた）およびジイソプロピルエチルアミン（４．１２ｍＬ、２５．４３５ｍｍｏｌ）の０℃に冷却した溶液に、テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中のトリホスゲン（１．２５８ｇ、４．２３９ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン雰囲気下で滴下した。混合物を、室温まで暖め、３時間、攪拌を継続した。水で冷却後、混合物を酢酸エチルで抽出した。分離した有機層を、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。その結果生じた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝１/１）で精製すると、白色形態でｔｅｒｔ−ブチル  ３−（７−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）−１−ピペリジンカルボキシレートを得た（３．２ｇ，収率；６１％）。
【００７０】
７−［２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−５−（３−ピペリジニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン塩酸塩
【化１４】
2005526074.tif 000016
ジオキサン（１５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル  ３−（７−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）−１−ピペリジンカルボキシレート（２．０ｇ、３．２４８ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン（３０ｍＬ）中の４Ｎ塩酸を室温で加えた。攪拌を３時間継続した。溶媒を蒸発により除去した後、その結果生じた固形物をアセトニトリルで粉砕し、濾過して回収し、そしてアセトニトリルで洗浄した。固形物を、減圧下で乾燥し、白色固形物として、７−［２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−５−（３−ピペリジニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン塩酸塩を得た（０．８６５ｇ、収率；６２％）。
【００７１】
（−）−７−［２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−５−［（３Ｓ）−３−ピペリジニル］−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（−）−ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸塩
【化１５】
2005526074.tif 000017
７−［２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−５−（３−ピペリジニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（０．７００ｇ、１．７７０ｍｍｏｌ）および（−）−ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸（０．６８４ｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）の混合物をエタノール（３０ｍＬ）および水（３．０ｍＬ）の混合物に熱して溶解した。混合物を室温まで冷却し、一晩放置した。その結果生じた沈殿物を、濾過して、回収し、エタノールで洗浄した（８５％ｅｅ（光学純度：エナンチオマー過剰率））。生成物を再び同じ溶媒（１０％水/エタノール）で再結晶し、減圧下で乾燥すると、（−）−７−［２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−５−［（３Ｓ）−３−ピペリジニル］−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン（−）−ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸塩（０．１１５ｇ、＞９８％ｅｅ、収率；８％）を得た。
【００７２】
（実施例２）
ｔｅｒｔ−ブチル  （３Ｓ）−（−）−３−（７−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）−１−ピペリジンカルボキシレート
【化１６】
2005526074.tif 000018
ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（７−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）−１−ピペリジンカルボキシレートのキラル分離が、次の条件で、ＨＰＬＣを用いて行われた：
カラム：Ｄａｉｓｅｌ  ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＯＤ  （ダイセル化学工業株式会社）
カラムサイズ：２５０*２０ｍｍＩＤ
溶離液：ヘキサン/イソプロパノール、６０/４０（ｖｏｌ/ｖｏｌ）
流速：２０ｍｌ/ｍｉｎ
保持時間：３１分[（＋）−異性体］、４５分[（−）−異性体］
【００７３】
（−）−異性体、ｔｅｒｔ−ブチル  （３Ｓ）−（−）−３−（７−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）−１−ピペリジンカルボキシレートが分離されて、無色の形態で得られた。
分子量：６１５．７３
マス（質量）スペクトル：６１６
［α］Ｄ＝−２３．８°（ＣＨＣｌ３、ｃ＝１．０３５、２３℃）
【００７４】
（＋）−異性体、ｔｅｒｔ−ブチル  （３Ｒ）−（＋）−３−（７−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）−１−ピペリジンカルボキシレートが分離されて、無色の形態で得られた。
分子量：６１５．７３
マス（質量）スペクトル：６１６
［α］Ｄ＝＋２２．５°（ＣＨＣｌ３、ｃ＝１．０１２、２２℃）
【００７５】
（−）−７−［２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−５−［（３Ｓ）−３−ピペリジニル］−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン塩酸塩
【化１７】
2005526074.tif 000019
ジオキサン（１５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル  （３Ｓ）−（−）−３−（７−｛２−（シクロプロピルメトキシ）−６−［（４−メトキシベンジル）オキシ］フェニル｝−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）−１−ピペリジンカルボキシレート（１．０ｇ、１．６２４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン（３０ｍＬ）中の４Ｎ  ＨＣｌを室温で加えた。攪拌を３時間続けた。溶媒を蒸発により除去した後、生じた固形物を、アセトニトリルで粉砕し、濾過により回収し、そしてアセトニトリルで洗浄した。固形物を、メタノールで再結晶すると、（−）−７−［２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−５−［（３Ｓ）−３−ピペリジニル］−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン塩酸塩を、白色の固体として得た（０．５０２ｇ、収率；７１％）。Ｘ線分析から、キラル原子の絶対立体配置は、（Ｓ）であると決定された。
分子量：４３１．９２
マス（質量）スペクトル：３９６
融点：２６０℃
【数１】
2005526074.tif 000020
ＩＫＫ−βキナーゼ阻害活性：ＩＣ５０＝４ｎＭ
【００７６】
（＋）−７−［２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−５−［（３Ｒ）−３−ピペリジニル］−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン塩酸塩
【化１８】
2005526074.tif 000021
上記と同様な合成手順に従って、（＋）−７−［２−（シクロプロピルメトキシ）−６−ヒドロキシフェニル］−５−［（３Ｒ）−３−ピペリジニル］−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−２−オン塩酸塩を、白色固体として得た。
分子量：４３１．９２
マス（質量）スペクトル：３９６
融点：２６０℃
［α］Ｄ＝＋２１．５°（ＤＭＦ、ｃ＝０．９２０、２５℃）
ＩＫＫ−βキナーゼ阻害活性：ＩＣ５０＝５９ｎＭ
【国際調査報告】
2005526074.tif 000024
2005526074.tif 000025
2005526074.tif 000026