(57)【要約】本発明は5-（2-ピラジニル）-4-メチル-1,2-ジチオール-3-チオン［オルチプラズ］の肝硬変組織再生剤としての用途およびオルチプラズを主成分として含有する肝硬変治療のための肝組織再生用薬学的組成物を提供する。本発明のオルチプラズを含む薬学的組成物は、硬化された肝において肝組織の再生を促進し、それを通じて肝硬変治療効果を奏する効果的な薬剤であって臨床的に使用が可能である。2005519926.tif 000006
2005519926.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
5-（2-ピラジニル）-4-メチル-1,2-ジチオール-3-チオン（オルチプラズ）および薬学的に許容される賦形剤を含む、肝硬変治療のための肝組織再生用薬学的組成物。
【請求項２】
組成物がカプセル剤、錠剤、軟質カプセル剤、懸濁化剤、シロップ剤、注射剤、および散剤からなる群より選択される剤形に処方される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
組成物が経口投与のための剤形であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
肝組織を再生させることによって硬変肝臓を治療するための薬剤を製造するための、5-（2-ピラジニル）-4-メチル-1,2-ジチオール-3-チオンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は硬変肝臓を患っている患者において肝組織を再生させるための薬学的組成物、および硬変肝臓の肝組織再生剤としての本組成物の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
肝臓は生体異物の代謝および内在性物質の代謝において重要な役割を果たす。肝臓は持続的な酵素反応およびエネルギー代謝が起こる重要な器官である。韓国における多くの慢性的疾病のうち肝炎、肝硬変、および肝臓ガンが最も広まっており、かつ心血管疾患に次いで最も生命を脅かす疾患である。特に慢性的な飲酒または暴飲は高い割合で肝臓の損傷を引き起こす。ウイルス感染またはアルコール摂取による慢性的な肝組織の損傷はしばしば肝硬変または肝臓の線維化を引き起こす。
【０００３】
肝硬変は、死亡率が高くかつ実質細胞の破壊および結合組織の蓄積を症状とする慢性肝疾患である。肝硬変は、肝感染および他の慢性肝疾患の中で最も損傷を与えるものと考えられている。肝硬変は損傷を受けた肝細胞が正常な細胞に回復せずにむしろコラーゲンのような線維組織に変形し、肝臓の実質細胞が破壊される場合に生じ、肝臓の機能および大きさが低下する。肝硬変はヒトの死因となりうるため、適切な治療薬剤の開発および予防薬剤の開発に対して高い必要性が存在する。しかし、肝硬変の治療のために肝細胞を再生させる薬物は知られていない。
【０００４】
いくつかの合成化合物および生薬調製物を含む多様な物質が、インビトロおよびインビボの双方において肝保護的な作用を示す。シリマリン（silymarin）およびベタインが、サイトカイン阻害またはグルタチオンレベルの増加の結果として肝保護的な効果を有することが知られているが、そのような結果の効果は低く、従って治癒的な効果を得ることは難しい。
【０００５】
アブラナ科の野菜に天然に存在する硫黄含有ジチオールチオン（dithiolthione）のいくつかの置換体は肝保護的な効果を有することが知られている。これらのうち、以下の化学式1によって示されるオルチプラズ（ortipraz）は1980年代初めには住血吸虫症の治療薬剤として使用された。
化学式1
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【０００６】
オルチプラズは細胞のチオール含有量を増加させ、グルタチオン(GSH)プールの維持に関連する酵素および求電子性分子からの組織の解毒に関与する酵素の発現を誘導する。以下の酵素の活性はオルチプラズによって増加する：NAD(P)Hキノンリダクターゼ、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ、グルタチオンS-トラスフェラーゼ（GST）、およびUDPグルクロニルトラスフェラーゼ（UDP-GT）。特にGSTは、肝臓を四塩化炭素およびアセトアミノフェンから防御する（Ansher SS、Dolan P、および Bueding E.、Chemoprotective effects of two dithiolthiones and of butylhydroxyanisole against carbon tetrachloride and acetaminophen toxicity、1983 Hepatology 3,932-935）。
【０００７】
さらに、オルチプラズはベンゾ［a］ピレン、NDEA、およびウラシルマスタードによって引き起こされる化学発癌を阻害し、加えてアフラトキシンB1誘導肝臓腫瘍形成生、およびアゾキシメタン誘導大腸癌発生も阻害した（Bolton MG、Munoz A、Jacobson LP、Groopman JD、Maxuitenko YY、Roebuck BD、およびKensler TW、Transient intervention with oltipraz protects against aflatoxin-induced hepatic tumorigenesis、1993 Cancer Res.53,3499-3504）。
【０００８】
オルチプラズによる発癌の公知の阻害機序は以下の通りである。第1に、オルチプラズは組織内において抗酸化物である還元型GSHのレベルを増加させる。第2に、シトクロム P450のような第1相酵素の阻害により発癌物質の生理活性を阻害する。第3に、GSTおよびUDP-GTを含む第2相解毒酵素の誘導により発癌物質の解毒を促進させる。第4に、オルチプラズはインビトロでヒト免疫不全ウイルス（HIV）I型の複製を阻害する。第5に、チオールレベルを増加させることにより細胞における反応性中間体を除去し、DNA修復を促進させる。既にオルチプラズがほとんどの組織においてGSHレベルを増加させ、放射線または生体異物によって生成されるフリーラジカルを除去することが報告されている。また、オルチプラズが細胞の恒常性維持を補助することにより、放射線に対する保護剤として作用することも公知である。
【０００９】
肝臓癌発生に対するオルチプラズの化学防御効果に関する臨床試験が実施された。結果はオルチプラズが肝臓発癌の抑制において活性が弱く、オルチプラズが毒物誘導肝毒性に対して肝臓を少なくとも中程度に保護することを示した。加えて、オルチプラズの安全性がラットおよびイヌにおいて実施された毒性試験によて実証されている。（Fund. Appl. Toxicol.、 1997 Jan；35(1):9-21）。
【００１０】
しかし、硬変肝臓の肝細胞再生に効果がある化合組成物はまだ報告されていない。したがって、肝組織の生物学的機能およびヒトの体内における肝臓の重要性を考慮すると、肝硬変治療において有効な治療効果を有する薬剤の開発が必要である。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は硬変肝臓の肝組織再生において効果的な薬学的組成物を提供する。1つの局面において、本発明は活性成分として5-(2-ピラジニル(pyrazinyl))-4-メチル-1,2-ジチオール-3-チオン-(オルチプラズ)を含む、硬変肝臓の肝組織再生のための組成物を提供する。
【００１２】
本発明の特徴および利点は、その詳細な例示的態様を添付の図面の参照と共に記載することにより、より明らかになると考えられる。
【００１３】
発明の詳細な説明
最終的に肝硬変を治療するためには、肝硬変の進行を抑制するだけでなく損傷を受けた組織を回復および再生させる必要があるという事実に基づいて、本発明者らは副作用がほどんどなくかつ硬変肝組織を効果的に再生させる薬学的組成物の開発を試み、オルチプラズが硬変肝組織の再生において効果的であることを見出した。
【００１４】
オルチプラズの肝組織に対する再生能は、本発明の実験結果で立証された。
【００１５】
本発明では、肝硬変および線維症の誘導のためにジメチルニトロサミン（DMN）を4週間投与したラットモデルにおいて、肝組織の肝硬変および線維症の修正におけるオルチプラズの治療効果および再生効果を観察した。その結果、オルチプラズを投与する前はラットの生存率は徐々にに減少するが、投与後はラットの生存率に統計的に有意な改善がみられる存在することが立証された。さらに、硬変ラットの血しょうにおける増加したアスパラギン酸アミノトラスフェラーゼ（AST）活性と比較して、オルチプラズを投与した後の血しょうは減少したAST活性を示した。
【００１６】
血しょう内アルブミン含有量は肝臓の状態のの代表的な指標であり、アルブミンは血しょう浸透圧の制御において必須である。硬変肝臓を有するラットにおけるオルチプラズは減少したアルブミンレベルを正常レベルに有意に回復させ、さらに血しょう浸透圧を正常化させて肝硬変に伴う腹水を減少させる。
【００１７】
硬変肝臓の病理組織学的顕微鏡試験によって得られる線維化スコアおよびノデルスコア（Knodell score）によると、門脈周辺に多量の線維が蓄積されかつ炎症部位が観察されたが。しかしオルチプラズを投与した後には、このような肝病変が顕著に治療された。
【００１８】
これら前述の効果の他に、オルチプラズの投与によって肝硬変により萎縮した肝重量が増加した。病理組織学的顕微鏡試験では硬変肝臓において頻繁に肝細胞の分裂が観察された。さらに、通常は細胞増殖周期にのみに現れる増殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen、PCNA）の、免疫化学的染色後の顕微鏡下における研究により、オルチプラズを投与したラットではPCNAを含む肝細胞の数が有意に増加することが示された。このようなPCNA発現の増加はウェスタンブロット分析によって確認された。
【００１９】
さらに、肝細胞増殖因子の受容体であるc-Met、および肝臓濃縮活性タンパク質（liver-enriched activating protein、LAP）であるCCAAT/エンハンサー結合タンパク質（C/EBP-β）のような肝細胞増殖と関連する他のタンパク質の発現は硬変ラットにおいて減少したが、オルチプラズを投与したラットにおいて回復した。一方、肝臓濃縮阻害タンパク質（liver-enriched inhibitory protein、LIP）であるC/EBP-βの切断型アイソフォームの発現は、オルチプラズ投与により減少した。
【００２０】
肝臓の未分化幹細胞を染色した場合、硬変ラットは多くの幹細胞を示した。しかしオルチプラズを投与した硬変ラットは肝臓内幹細胞の顕著な減少を示した。このような知見は、オルチプラズが未分化幹細胞の分化肝細胞への転換を誘導するという推論を支持する。
【００２１】
したがって、本発明の組成物の活性成分であるオルチプラズの治療的効果は、増強された細胞の分裂および増殖によって組織を再生するその能力によるものである。
【００２２】
本発明の薬学的組成物を実際に使用するために製造する場合、適切な薬学的分野における従来的な方法に従って、経口投与に適した単位用量形態および注射剤などが処方および投与される。
【００２３】
適切な経口投与調製物には軽質および軟質カプセル剤、錠剤、散剤、シロップ剤などが含まれる。経口投与処方物は薬学的活性成分としてのオルチプラズに加え、一つまたは複数の薬学的に不活性な従来的の担体を含んでもよい。例えば、経口処方物はデンプン、乳糖、カルボキシメチルセルロース、およびカオリンなどの賦形剤；水、ゼラチン、アルコール、グルコース、アラビアゴム、およびトラガカントゴムなどの結合剤；デンプン、デキストリン、およびアルギン酸ナトリウムなどの崩解剤；ならびにタルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、および流動パラフィンなどの潤滑剤のような添加剤成分を含んでもよい。
【００２４】
本発明による薬学的組成物の日容量は、患者の肝硬変の程度、発症時期、年齢、健康状態、合併症などの多様な要因に左右される。しかし、平均的な成人に対しては、オルチプラズは1日あたり1回または2回投与され、合計日用量は10〜1000mg、より好ましくは50〜300mgである。しかし、患者が重度の肝硬変を有する場合、本発明は薬学的組成物の上記の範囲超えてさらに多量の用量を用いることができる。
【００２５】
本発明は下記実施例によりさらに詳細に説明されるが、本発明はそれらの実施例に制限されるものではない。
【００２６】
実施例
下記実施例では6週齢の体重140〜160gのSDラットを使用した。
【００２７】
実施例1  肝硬変を有するラットの生存率
ラットにジメチルニトロサミン（DMN）を継続的に週3回4週間投与し、硬変肝臓試験モデルを得た。この際、線維症の徴候のみを示すラットを肝硬変の徴候を示すラットとは異なる群に分け、肝硬変を有するラットおよび肝線維症を有するラットの生存率を次の4週間調査した。
【００２８】
硬変肝臓を有する試験モデルの生存率は経時的に減少し、4週後の生存率は48%であった。オルチプラズ30mg/kgを週3回4週間投与したラットの生存率は83%に増加し、統計的に有意な改善を示した。さらに、オルチプラズ30mg/kgを週3回ずつ投与した肝線維症を有するラットの死亡は観察されなかった。
【００２９】
実施例2  組織試料による肝硬変改善
肝硬変におけるオルチプラズの組織病理学的効果を調査した。硬変肝臓ラットの肝組織は著しい量の線維が血管周辺に蓄積され、蓄積の結果として硬変結節が形成されることを示した。硬変ラットにオルチプラズ15または30mg/kgを週3回4週間投与した場合、線維の蓄積は量依存的様式で減少した。
【００３０】
肝硬変におけるオルチプラズの治癒的効果は、指標であるマッソントリクローム染色（Masson's trichrome staining）の後に計測した線維症スコア、ならびに門脈炎症および肝臓の線維症の範囲を示すノデルスコアによって、組織病理学的に決定した（図2、表1）。その結果、オルチプラズを15または30mg/kg投与した場合に肝硬変の効果的な治療であることを示した。
【００３１】
図2において、Aは正常ラット肝組織の写真であり、Bは肝硬変を有する群由来肝組織の写真であり、Cはオルチプラズ15mg/kgを週3回ずつ4週間投与した肝硬変を有する群由来の肝組織の写真であり、およびDはオルチプラズ30mg/kgを週3回4週間投与した肝硬変を有する群由来の肝組織の写真である。
【００３２】
（表１）肝硬変におけるオルチプラズの治療効果
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【００３３】
各数値は平均±標準誤差によって表わされる。使用した動物数は5〜10であった。各群の有意性は対のステューデントt検定によって決定する。有意性は肝硬変または肝線維症を有するラットと比較した*p<0.05、**p<0.01によって示される。肝線維症を有するラットは肝硬変を有するラットよりも低いノデルスコアを有していた（a、p<0.05）。線維症の程度は0＝正常、1＝軽度の線維性組織の存在、2＝中程度の線維性組織の存在、3＝明確な線維性組織の存在、4＝重度の線維症の証拠である。門脈周辺の架橋形成（最高＝10）、小葉内細胞の消失（最高＝4）、門脈の炎症（最高＝4）、および線維症（最高＝4）の値の合計によりノデルスコアを得た。
【００３４】
実施例3  肝硬変を有する動物の血液生化学的指標
正常動物と比較して、肝硬変を有するラットは3〜4倍増加したアラニンアミノトラスフェラーゼ（ALT）活性およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）活性を示した。ラットにオルチプラズ15mg/kgを週3回4週間投与した場合、血しょう内のALT活性およびAST活性は減少し、30mg/kgを投与した場合はAST値が、統計的に有意性を示す、約70%低下した（表2）。
【００３５】
血しょう内ビリルビン含有量は肝機能の指標である。硬変ラットにおけるオルチプラズ投与の結果、肝硬変の結果として生成されたビリルビン含有量は減少する傾向を示した。血しょう内の総コレステロールレベルは、オルチプラズを用いて治療した硬変ラットまたは硬変ラットにおいて顕著な変化を示さなかった（表2）。
【００３６】
（表２）血しょう内のALT、AST、ビリルビン、およびコレステロール
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【００３７】
各数値は平均±標準誤差によって表わされる、使用した動物数は8〜11であった。各群の有意性は対のステューデントt検定によって決定する。有意性は対照と比較した*p<0.05、および肝硬変を有するラットと比較した#p<0.05によって示される。
【００３８】
実施例4  血しょうアルブミン含有量および腹水形成におけるオルチプラズの効果
肝硬変の他の代表的な臨床症状として腹水の蓄積が挙げられる。10種の状態の硬変ラットにおける腹水形成を腹水形成指標（0＝腹水は観察されない、1＝臓器間に少量の腹水が存在する、2＝腹部切開後、蓄積された腹水の顕著な流れが肉眼で観察できる、および3＝腹部切開後、蓄積された腹水の顕著な噴出が観察できる）を用いて試験したところ、硬変ラットの数値は1.7であった。オルチプラズ15mg/kgおよび30mg/kgを投与後、本数値はそれぞれ0.9および0.4に低下した（図3）。有意性は対照と比較した**p<0.01、および硬変ラットと比較した#p<0.05によって示される。
【００３９】
腹水は、血しょうタンパク質（特にアルブミン）の合成が肝組織において減少し、血中浸透圧平衡が撹乱されることによって形成される。硬変ラットの血しょうアルブミン含有量は著しく減少した。しかし、オルチプラズ30mg/kgの週3回4週間の投与後、正常なアルブミン含有量が回復した（図3B）。有意性は対照と比較した**p<0.01、および硬変を有するラットと比較した#p<0.05によって示す。
【００４０】
実施例5  硬変ラットにおける肝組織の再生に対するオルチプラズの効果
肝硬変は肝機能の低下だけでなく、肝組織の萎縮にも関与する。10匹の硬変ラットの肝重量を試験したところ、重量は正常ラットの約56%に減少した。オルチプラズ15mg/kgおよび30mg/kgの週3回4週の投与後、肝重量はほぼ正常重量に回復した（図4A）。一方、腎臓の重量は顕著な変化を示さなかった（図4Aの上段）。肝硬変は重量の減少を伴うため、試験結果の標準化のために肝硬変に通常影響されていない脳の重量を比較重量として使用して重量の変化を得た。有意性は対照と比較した**p<0.01、および肝硬変を有するラットと比較した#p<0.05によって示した。
【００４１】
硬変ラットへオルチプラズ30mg/kgを週3回4週間投与後、肝細胞の分裂が顕微鏡により観察された（図4B)。図4Bの左側は、硬変ラットへのオルチプラズ投与後に得られた肝組織の、マッソントリクローム染色後に撮影した写真である。写真は正常組織または硬変肝組織ではほとんど起こらない細胞分裂を明確に示す。個々の核を選択的に染色するNuclear Fast Red染色を使用した場合でも、オルチプラズを投与した硬変ラットにおいて分裂細胞および染色体の移動が観察された（図4Bの右側）。
【００４２】
PCNA免疫化学的染色法は、動物における細胞増殖を試験するために頻繁に使用される。PCNAは、細胞周期のG1後期およびS期で発現される安定的な細胞周期核タンパク質（36kDa）であり、細胞増殖に対する優れたマーカーとして使用される（Kawamura K,Kobayashi Y,Tanaka T,Ikeda R,Fujikawa-Yamamoto K,Suzuki K.Intranuclear localization of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle in renal cell carcinoma、2000 Anal Quant Cytol Histol 22,107-113）。
【００４３】
PCNA免疫化学的分析はPCNAに対する特異抗体（Santa Cruz Biotech）を使用して行った。分析は、間接アビジン−ビオチン−アルカリンホスファターゼ技術を製造者（InnoGenex）が提供されたプロトコルに従って実施した。対照、硬変ラット、およびオルチプラズ30mg/kgを週3回4週間投与した硬変ラットからのパラフィン処理した肝組織切片をスライド上に置き、パラフィンを除去し、室温で水和させた。阻止血清（blocking serum）の使用により、非特異的抗体結合が防止された。次いで、加湿チャンバ内で切片を抗体と共に室温で30分間インキュベートした。インキュベーション後、0.1% Tween-20を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用してスライドを洗浄した。切片をビオチニル化2次抗体に供し、37℃で5分間反応させ、その後ストレプトアビジン結合アルカリンホスファターゼを加えて37℃で5分間さらに反応させた。次いで5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート（BCIP）およびニトロブルーテトラゾリウム（NBT）をホスファターゼの基質として使用して適した色相が可視化されるまでスライド上の切片をインキュベートした。その後、切片をNuclear Fast Redで再び染色した。
【００４４】
このようなPCNA免疫化学的染色法の結果、対照動物はPCNAを含むいかなる細胞も示さなかったが、硬変ラットは血管線維付近で陽性PCNA反応を示した。オルチプラズを投与した硬変ラットにおいて、PCNAを含む細胞は試験試料の広い範囲に渡って観察された。オルチプラズを投与していない硬変ラットからの試料と比較して、オルチプラズを投与したラットではPCNAが約2倍多く存在した（図5A）。
【００４５】
対照ラット、硬変ラット、およびオルチプラズ（30mg/kgを週3回4週間）を投与した硬変ラットからの肝臓の核分画を、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する希釈溶液で溶解して試料を作製し、-70℃で保管した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、免疫ブロット分析を行った。試料を12%ゲル電気泳動によって分画化させ、ニトロセルロース膜に電気的に移動させた。ニトロセルロース膜をポリクロナールマウス抗PCNA抗体（1：1000）（Santa Cruz Biotech社製）と共にインキュベートした後、西洋わさびペルオキシダーゼ結合2次抗体と共に再度インキュベートした。最後に、Amersham社のECL化学発光キットを使用してバンドを現像した。
【００４６】
ウェスタンブロット分析を用いてPCNAの発現を調査した場合においても、オルチプラズを投与した硬変ラットの肝組織では対照ラットおよび未治療硬変ラットと比較して36kDaのPCNAバンド強度が増加したことから明らかなように、PCNAの発現において有意な増加が存在した。
【００４７】
肝組織を再生する細胞は幹細胞を起源とすることが公知である。本発明において、幹細胞の特異的な表面タンパク質であるThy1.1およびFlt-3（Santa Cruz Biotech）をPCNAと類似した染色法を用いて染色し、肝硬変時の幹細胞の分布を調査した。硬変ラットにおいてはThy1.1およびFlt-3を含む多数の細胞が観察されたが、対照ラットにおいてはそのような細胞は観察されなかった（図5B）。オルチプラズ（30mg/kgを週3回4週間）を投与した硬変ラットにおいては、未治療硬変ラットと比較してThy1.1およびFlt-3を含む細胞の数が著しく低下した。この結果は、未分化幹細胞を分化肝細胞に転換させるオルチプラズの効果の結果であると考えられる。
【００４８】
実施例6  肝硬変によって抑制されたc-Met発現におけるオルチプラズの効果
c-Metは肝細胞増殖因子（HGF）の受容体であって肝細胞の増殖および分化に適用できる。肝硬変によりc-Metの発現は低下する（図6A）。c-Metが適切に存在しない場合はHGFが存在したとしても肝組織は形成されない。
【００４９】
オルチプラズを30mg/kg容量で週3回ずつ4週間経口投与した結果、c-Met発現レベルがオルチプラズを投与していない肝硬変ラットと比較して顕著に増加した（図6A）。この実験結果はオルチプラズが硬化された肝組織を再生する現象と一致する。
【００５０】
実施例7  C/EBPタンパク質の核内移動におけるオルチプラズの効果
肝細胞の増殖に関連して重要な転写因子はC/EBPファミリーに属するC/EBP-βおよびC/EBP-αである。その中でもC/EBP-βは肝細胞の増殖においてより重要であると考えられれる。C/EBP-β遺伝子をマウスから除去した場合、部分肝切除術後の肝臓サイズの回復は有意に減少する（Greenbaum LE、Li W、Cressman DE、Peng Y、Ciliberto G、Poli V、Taub R.、CCAAT/enhancer-binding protein beta is required for normal hepatocyte proliferation in mice after partial hepatectomy、J Clin Invest、(1998)102:996-1007）。
【００５１】
肝再生の調節におけるC/EBPの重要性を考慮して、オルチプラズ（30mg/kgを週3回4週間）を投与した硬変ラットにおいてC/EBP-βおよびC/EBP-αの発現を試験した。硬変ラットにおいて発現が低下したC/EBP-βの発現はオルチプラズを投与した硬変ラットにおいて増加した。硬変ラットにオルチプラズ30mg/kgを週3回4週間の投与すると、C/EBP-βのアイソフォームである肝濃縮阻害タンパク質（LIP）の発生および硬変ラットにおいて増加するその発現はほぼ完壁に消滅した。C/EBP-αは対照ラットにおいて発現するが、硬変ラットにおいて顕著に低下する。しかし、硬変ラットにオルチプラズ30mg/kgを週3回4週間投与すると、C/EBP-αの発現は顕著に回復した。
【００５２】
オルチプラズを投与した硬変ラットにおいてみられたC/EBPの明らかな活性のため、次の試験では1次培養肝細胞において核内に移動したC/EBPの量をウェスタンブロットを使用して定量し、肝細胞でのC/EBP活性におけるオルチプラズの直接的な効果を試験した。1次培養肝細胞を30μM濃度のオルチプラズと共にインキュベートした場合、肝細胞の核内C/EBP-βおよびC/EBP-αの量は経時的に増加した（図7A）。しかし、硬変ラットから分離された肝細胞をオルチプラズを共にインキュベートした場合は有意な変化は観察されなかった。このような結果から、オルチプラズが直接的にC/EBP活性を誘発することが実証された。
【００５３】
次に、オルチプラズが核にC/EBP-β移動を促進させるかどうかを調べるために、ラット肝細胞を30μM濃度のオルチプラズと共に6時間処置インキュベートした。免疫細胞化学的な分析によると、オルチプラズは核へのC/EBP-β移動を明らかに促進した（図7B）。
【００５４】
したがって、オルチプラズによる肝組織の再生はC/EBPの活性を伴う。
【００５５】
オルチプラズは硬変肝組織を効果的に再生させるという以上の実証から、本発明の薬学的組成物は肝硬変の肝組織の再生および硬変肝臓の治療において極めて効果的である。
【００５６】
調製例1
オルチプラズ                       25mg
乳糖                               50mg
デンプン                           10mg
ステアリン酸マグネシウム           適量
上記成分を混合し、従来の錠剤調製法によって錠剤を調製する。
【００５７】
調製例2
オルチプラズ                      100mg
乳糖                               50mg
デンプン                           10mg
ステアリン酸マグネシウム           適量
上記成分を混合し、従来の錠剤調製法によって錠剤を調製する。
【００５８】
調製例3
オルチプラズ                      250mg
乳糖                               50mg
デンプン                           10mg
ステアリン酸マグネシウム           適量
上記成分を混合し、従来の錠剤調製法によって錠剤を調製する。
【００５９】
調製例4
オルチプラズ                       25mg
乳糖                               30mg
デンプン                           28mg
タルク                              2mg
ステアリン酸マグネシウム           適量
上記成分を混合し、従来のゼラチン硬質カプセル調製法によってゼラチン硬質カプセル剤を調製する。
【００６０】
調製例5
オルチプラズ                      100mg
乳糖                               30mg
デンプン                           28mg
タルク                              2mg
ステアリン酸マグネシウム           適量
上記成分を混合し、従来のゼラチン硬質カプセル調製法によってゼラチン硬質カプセル剤を調製する。
【００６１】
調製例6
オルチプラズ                      250mg
異性化糖                            10g
糖質                               30mg
ナトリウムCMC                     100mg
レモン香味                         適量
（蒸留水を適量加えた合計量         100ml）
上記成分を用い、従来の懸濁剤調製法に従って懸濁剤を調製する。100mlの褐色瓶に本懸濁剤を充填して滅菌する。
【００６２】
調製例7
オルチプラズ                      500mg
異性化糖                            20g
糖質                                20g
アルギン酸ナトリウム              100mg
オレンジ香味                       適量
（蒸留水を加えた合計量             100ml）
上記成分を用い、従来の懸濁剤調製法に従って懸濁剤を調製する。100mlの褐色瓶に本懸濁剤を充填して滅菌する。
【００６３】
調製例8
オルチプラズ                      250mg
乳糖                               30mg
デンプン                           20mg
ステアリン酸マグネシウム           適量
上記成分を混合し、ポリエチレンコーティングされた薬包紙に充填した後に密封して散剤を調製する。
【００６４】
調製例9
軟質カプセル剤1錠当たりの含有量
オルチプラズ                      100mg
ポリエチレングリコール            400mg
濃グリセリン                       55mg
蒸留水                             35mg
【００６５】
ポリエチレングリコールと濃グリセリンとを混合し、その後に蒸留水を加える。混合物を60゜Cに維持しながらオルチプラズを混合物に加える。混合物は約1,500rpmで攪拌する。混合物を均一に混合した後、混合物を緩やかに攪拌しながら室温で冷却した。真空ポンプを使用して気泡を除去し、軟質カプセルの内容物は残す。
【００６６】
軟質カプセルの被膜は、1カプセル当りゼラチン132mg、濃グリセリン52mg、70%のジソルビトール（disorbitol）液6mgを含み、適量のエチルバニリン香味剤、およびコーティング剤としてカルナウバろうを含む広く知られた軟質性のゼラチン-可塑剤処方を使用する、従来の調製法に従って製造する。
【００６７】
産業上の利用可能性
本発明において提供されるオルチプラズを含む薬学的組成物は、硬変肝臓の肝組織再生の促進において臨床的に有用であり、本組成物は肝硬変の効果的な治療を呈示する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】オルチプラズを投与した硬変ラットの生存率の増加を示すグラフである。
【図２】硬変ラットの肝組織の写真およびオルチプラズを投与した肝組織の写真であり、マッソントリクローム染色を行っている。
【図３Ａ】オルチプラズ投与後の、硬変ラットにおける腹水の減少を示すグラフである。
【図３Ｂ】オルチプラズ投与後の、硬変ラットにおける血しょうアルブミン増加を示すグラフである。
【図４Ａ】オルチプラズ投与後の、硬変ラットにおける肝重量の増加を示すグラフである。
【図４Ｂ】硬変ラットにおいて、肝細胞分裂がオルチプラズ投与により活性化されることを示す写真である。
【図５Ａ】硬変ラットにおける、オルチプラズ投与による肝細胞の分裂および再生のPCNA染色後の写真である。
【図５Ｂ】硬変肝組織における、オルチプラズ投与による未分化幹細胞の分化幹細胞への促進を示す写真である（上段：Thy1.1染色、下段：Flt-3染色）。
【図６Ａ】硬変ラットにおける、オルチプラズ投与によるc-Met発現の増加を示すゲル電気泳動の写真である。
【図６Ｂ】硬変ラットにおける、オルチプラズ投与後のC/EBP-βの活性剤であるLAPの増加、阻害因子であるLIPの減少、およびC/EBP-α発現の回復を示すゲル電気泳動の写真である。
【図７Ａ】肝細胞をオルチプラズと共にインキュベートした後、細胞核分画内のC/EBP-β量が経時的に増加することを示すゲル電気泳動の写真である。
【図７Ｂ】肝細胞をオルチプラズと共にインキュベートする場合にC/EBP-βが細胞核内へ移動することを示す免疫細胞化学的な写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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