(57)【要約】ステルス脂質ナノカプセル、その製造方法、およびその、活性要素用キャリヤーとしての使用。本発明は、周囲温度で液体または半液体である実質的に脂質のコア、および外側の、本来脂質である少なくとも一種の親水性界面活性剤、本来脂質である少なくとも一種の親油性界面活性剤、および少なくとも一種の両親媒性ポリ（エチレングリコール）誘導体を含んでなる脂質外被からなり、ポリ（エチレングリコール）成分の分子量が１０００ｇ／モル以上、好ましくは２０００ｇ／モル以上である、ステルス脂質ナノカプセル、それらの製造方法、およびそれらの、活性要素用のキャリヤーとしての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
周囲温度で液体または半液体である実質的に脂質のコアと、および
本来脂質である少なくとも一種の親水性界面活性剤と、本来脂質である少なくとも一種の親油性界面活性剤と、および少なくとも一種の両親媒性ポリ（エチレングリコール）誘導体とを含んでなる外側脂質の外被とからなり、
前記ポリ（エチレングリコール）成分の分子量が１０００ｇ／モル以上である、ステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２】
前記ポリ（エチレングリコール）成分の分子量が、２０００ｇ／モル以上である、請求項１に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項３】
前記親油性界面活性剤がレシチンであり、前記レシチンのホスファチジルコリン比率が少なくとも９５％であり、好ましくは９９％を超えるものである、請求項１または２に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項４】
前記親油性界面活性剤が、ゲル／液相転移温度が少なくとも２５℃であり、好ましくは３７℃を超えるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項５】
前記親油性界面活性剤が、炭素数が少なくとも１６であるアシル鎖を含んでなるリン脂質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項６】
前記親油性界面活性剤が、ＨＳＰＣ（水素化大豆ホスファチジルコリン）、ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）およびＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項７】
前記親油性界面活性剤が、前記外側脂質の外被を形成する前記分子の５〜３０モル％で存在してなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項８】
前記親水性界面活性剤が、ポリ（エチレングリコール）アルキルエステルおよびポリ（エチレングリコール）アルキルエーテル、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項９】
前記親水性界面活性剤が、１５単位のエチレングリコール鎖を含んでなる、ポリ（エチレングリコール）−６６０の１２−ヒドロキシステアレート型の非イオン系界面活性剤である、請求項８に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１０】
前記親水性界面活性剤が、前記外側脂質の外被を形成する前記分子の６０〜９０モル％、好ましくは８０モル％で存在してなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１１】
前記ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体が、前記外側脂質の外被中に固定できるようにする疎水性成分と、および前記脂質ナノカプセルの外側に向き、その表面に親水性を付与するポリ（エチレングリコール）型の親水性成分とを含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１２】
前記ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体が、生物分解性リン脂質から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１３】
前記生物分解性リン脂質が、
ＤＰＰＥ−ＰＥＧｘ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、
ＤＳＰＥ−ＰＥＧｘ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、
ＤＯＰＥ−ＰＥＧｘ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、および
ＰＯＰＥ−ＰＥＧｘ（パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミン）、
（上記式中、ｘは１０００ｇ／モル以上である）
、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１４】
前記生物分解性リン脂質が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１３に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１５】
前記ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体が、前記外側脂質の外被を形成する前記分子の０．５〜１２モル％、好ましくは１〜１０モル％で存在する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１６】
前記実質的に脂質のコアが、前記ナノカプセルの総重量の２０〜６０重量％、好ましくは前記ナノカプセルの総重量の２５〜５０重量％で存在する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１７】
前記実質的に脂質のコアが、脂肪酸エステルおよび／またはトリグリセリドおよび／または油、および／またはそれらの混合物から構成されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１８】
前記実質的に脂質のコアを形成する前記トリグリセリドが、炭素数が６〜１４である中鎖トリグリセリド、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１７に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項１９】
前記実質的に脂質のコアを形成する前記脂肪酸エステルが、炭素数が８〜１８である中鎖脂肪酸からなる群から選択される、請求項１７に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２０】
前記実質的に脂質のコアを形成する前記脂肪酸エステルが、パルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１９に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２１】
直径が５０〜１５０ｎｍ、好ましくは直径が８０〜１２０ｎｍである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２２】
前記外側脂質の外被の前記外側表面が本来親水性であり、前記実質的に脂質のコアが本来親油性である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２３】
前記ステルス脂質ナノカプセルの表面に特異的なリガンドを有し、前記リガンドが、前記リガンドに対するレセプタ−を有する細胞、特に腫瘍細胞、を積極的に標的化する能力を前記ステルス脂質ナノカプセルに与える、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２４】
前記リガンドが、糖、オリゴ糖、ビタミン、オリゴペプチド、抗体断片およびモノクローナル抗体型からなる群から選択される、請求項２３に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２５】
前記ステルス脂質ナノカプセルが投与されるホストの血液区画で少なくとも２時間の半減期を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２６】
前記ステルス脂質ナノカプセルの内容物を生物分解により、特に酵素的消化により、急速に放出することができる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２７】
一種以上の活性要素を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２８】
一種以上の、本来主として親油性である抗癌性活性要素を含む、請求項２７に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項２９】
前記抗癌性活性要素が、パクリタキセルおよびその誘導体、例えばドセタキセル、カンプトテシンおよびその誘導体、例えばイリノテカン、トポテカン、ルビテカン(rubitecan)、およびブスルファン、クロラムブシル、フタロシアニン、カロテノイドおよびダウノマイシンからなる群から選択される、請求項２８に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項３０】
一種以上の、本来両親媒性である抗癌性活性要素を含む、請求項２７に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項３１】
前記抗癌性活性要素が、シタラビン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロ誘導体、例えば５−フルオロウラシルまたは５−フルオロウリジン、およびドキソルビシンからなる群から選択される、請求項３０に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項３２】
抗炎症性物質、コルチコイド、抗生物質、鎮痛薬および抗感染剤からなる群から選択された一種以上の活性要素を含む、請求項２７に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項３３】
デキサメタソン、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ケトコナゾール、プロスタグランジンＥ１またはアムホテリシンＢを含む、請求項３２に記載のステルス脂質ナノカプセル。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載のナノカプセルの製造方法であって、
ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体が欠けているナノカプセルを予備形成することと、および
次いで前記ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体を前記ナノカプセルの表面中に後挿入することとを含んでなる、方法。
【請求項３５】
前記予備形成することが、数サイクルの温度増加および低下により行う油／水エマルションの転相により、ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体が欠けているナノカプセルを合成することを含んでなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記後挿入することが、予備形成されたナノカプセルを、ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体の存在下で共温置する第一工程と、および
その後に、得られたポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体／予備形成されたナノカプセル混合物を、温度０〜５℃に到達するように急速に冷却する第二の「急冷」工程とを含んでなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体／予備形成されたナノカプセル混合物の共温置工程が、本来脂質である前記親油性界面活性剤のゲル／液体相転移温度よりほんの僅かに高いが、ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体／予備形成されたナノカプセル混合物の転相温度より低い温度で行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記両親媒性誘導体を前記後挿入工程に導入する時に、前記両親媒性誘導体の親水性鎖の比率および長さを調節することにより、前記ナノカプセルの直径が調節される、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載のナノカプセルの製造方法であって、
従来の合成方法の出発混合物中の、塩および親水性界面活性剤の比率、および親油性界面活性剤の純度を調節することにより、前記ナノカプセルの直径が調節される、方法。
【請求項４０】
有機溶剤を含まず、非経口使用に承認された生物分解性化合物だけを使用する、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ナノカプセルが、直径０．４５μｍ〜０．２２μｍのフィルターを通す滅菌濾過により滅菌される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ナノカプセルが凍結乾燥され、次いでコロイド状懸濁液の形態に即座に還元される、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の脂質ナノカプセルを含んでなる、医薬組成物。
【請求項４４】
前記脂質ナノカプセルを含むコロイド状水性懸濁液の形態にある、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
静脈内注射により、癌、特に充実性または循環性腫瘍を処置する医薬品を製造するための、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の脂質ナノカプセルの使用。
【請求項４６】
循環性または充実性腫瘍を積極的な標的化により処置する医薬品を製造するための、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
充実性腫瘍を、腫瘍毛細管を通る前記ナノカプセルの浸出に続いて、控えめな標的化により処置する医薬品を製造するための、請求項４５に記載の使用。
【請求項４８】
組織の炎症および／または感染を処置する医薬品を製造するための、請求項３２または３３に記載の脂質ナノカプセルの使用。
【請求項４９】
医薬品が、非経口的に投与されるか、または患者の循環中に、脈管内、特に静脈内または動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または関節内注射される、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
中毒の場合に続いて血液循環中に存在する疎水性分子を吸収させる医薬品を製造するための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の脂質ナノカプセルの使用。
【請求項５１】
活性要素の、健康な組織に対する毒性が低下する、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の課題は、ナノカプセルに関し、該ナノカプセルは、活性要素用のキャリヤーとして、充実性腫瘍または循環癌性腫瘍の処置に使用でき、溶液中の遊離薬物と比較して毒性が低く、該ナノカプセルを投与するホストの免疫系に対してステルス特性を示し、腫瘍中に浸出できるのみならず、その内容物を放出することもできる。本発明のこの新規なキャリヤーは、ポリ（エチレングリコール）分子と会合したリン脂質分子を表面に有する脂質ナノカプセルの注射可能なコロイド状懸濁液の形態にあるのが有利である。
【０００２】
本発明は、これらのステルス脂質ナノカプセルの製造方法に、特にポリ（エチレングリコール）基を有する該分子を、予め形成されたナノカプセルの脂質外被中に挿入する方法にも関する。最後に、本発明は、そのようなキャリヤーの、血液を経由して活性要素を送達するための、特にヒトにおける充実性または循環癌性腫瘍を処置するための使用に関するが、炎症または他の、血管透過性の増加が観察される病理学的状態（炎症区域、感染箇所）を処置するための使用にも関する。
【０００３】
本発明は、本発明のナノカプセルを含んでなる様々な薬学的医薬組成物にも関する。
【０００４】
先ず、用語「キャリヤー」は、それを投与した生物中で、分子、特に活性要素、例えば医薬品、の輸送および送達を可能にするすべての化学的存在を意味する。
【０００５】
さらに、用語「コロイド状」は、大きさが１マイクロメートル未満の固体物質の安定した液相中分散液を意味する。
【０００６】
本発明のキャリヤーを説明するのに使用する用語「ステルス」は、ナノカプセルの、それらを投与したホストの免疫系により、検出されず、次いで、封鎖(sequestered)および／または分解されないか、またはほとんど検出されず、次いで、封鎖および／または分解されない、および／または後になってから検出され、次いで、封鎖および／または分解される能力を意味する。
【０００７】
用語「浸出」は、ある物体が血液成分から退出することを意味する。この退出は、細孔または「穿孔」を通して、毛細血管の軸に対して接線方向に行われる。この現象は、毛細管が穿孔されている特定の臓器、例えば腎臓または肝臓、において、および特に、血管の透過性が増加している脳外充実性腫瘍および炎症を起こした、または感染した組織においてのみ観察される。
【０００８】
用語「ナノカプセル」は、周囲温度で多少なりとも剛性である円形の壁、および中央の区画またはコア（本発明の場合、脂肪状物質を含む）を含んでなる、直径３００ｎｍ未満の球を意味する。
【０００９】
用語「両親媒性」は、本来疎水性である物質に対して親和力を有する基、および本来親水性である物質に対して親和力を有する基を有する分子を説明するのに使用される。
【００１０】
最後に、「モル％」は、モル百分率を表し、用語「活性要素」は、薬学的に活性な要素を意味する。
【００１１】
本発明の課題であるステルス脂質ナノカプセルは、周囲温度で液体または半液体である実質的に脂質のコア、および外側の、本来脂質である少なくとも一種の親水性界面活性剤、本来脂質である少なくとも一種の親油性界面活性剤、および少なくとも一種の両親媒性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体を含んでなる脂質外被からなり、ポリ（エチレングリコール）成分の分子量は１０００ｇ／モル以上、好ましくは２０００ｇ／モル以上である。
【００１２】
「ポリエチレングリコール化された(pegylated)」両親媒性誘導体が、ナノカプセルにステルス特徴を与えるのに貢献する。ナノカプセルのコアは、有利なことに、溶解した、または分散した形態にある多くの分子、より詳しくは、本来親油性である活性要素、例えば抗癌剤、を取り入れ、輸送することができる。従って、本発明のナノカプセルは、抗癌性医薬品を血液系中で、より詳しくは、腫瘍と境界を接する空隙媒体中で、長時間にわたって運ぶことができる。その上、本発明のナノカプセルは、血液循環時間が十分に長く、循環性腫瘍細胞と相互作用し、充実性腫瘍における浸出を増大させることができる。
【００１３】
「充実性」腫瘍は、充実した凝集塊中、または血液循環により灌注される(irrigated)組織中に組織された腫瘍細胞からなる。多くの腫瘍は、穿孔された毛細管の網目により灌注される。従って、これらの毛細管は、様々な種類の細孔を有し、細孔のサイズに応じて、血液区画から外に固体要素を通過させる。腫瘍血管基礎膜の内皮細胞間の穿孔の大きさは、腫瘍毎に異なる。しかし、大きさが３００ｎｍ未満のコロイド状粒子は、ある種の腫瘍で浸出できる。その上、このコロイド状粒子の、腫瘍の空隙媒体への浸透は、腫瘍のリンパ管排液が悪いために起こる保持効果の増大と組み合わされる。この、浸透性および保持性の強化(Enhanced Permeability and Retention)を表すＥＰＲと呼ばれる二重現象により、コロイド状キャリヤー系に基づく抗腫瘍治療法を開発することができる。特に、ＥＰＲにより、腫瘍周囲の区域におけるコロイド状粒子および巨大分子の蓄積を、健康な組織で観察される蓄積と比較して、著しく持続することができる。
【００１４】
そこで、このＥＰＲ現象を利用し、抗癌性活性要素を移送するためのコロイド状キャリヤーを形成している。しかし、真に効果的であるためには、そのようなキャリヤーは、ホストの免疫系により検出され、次いで破壊される前に、血液区画中で十分な時間循環し得る必要がある。従って、非ステルスコロイド状物体は免疫系の特定エフェクター、特に例えばマクロファージ、により急速に検出され、効果的であるために十分な量では腫瘍に到達できない。
【００１５】
事実、マクロファージは、免疫系の最も重要な成分を構成し、リポソーム、その他のコロイド状粒子を包含する異粒子を血液循環から排除する上で主要な役割を果たしている。
【００１６】
ナノ粒子を捕獲する際に関与する非特異的防御機構を構成するこの一連の循環性および着生単球を表す、一般的に認められた表現は、「単核性食細胞系」（ＭＰＳ）である。
【００１７】
分子レベルでは、注入された粒子の排除は、２段階、すなわち粒子表面における血清タンパク質（または「オプソニン」）の堆積によるオプソニン作用、続いてオプソニン化された粒子のマクロファージによる認識および捕獲、で行われる。
【００１８】
ナノ粒子の表面を、親水性でたわみ性の、一般的にポリ（エチレングリコール）型の重合体の鎖で変性することにより、粒子が立体的に保護され、オプソニンが粒子の表面に到達してＭＰＳの細胞による粒子の排除を引き起こすことが阻止される。これらの重合体鎖の、ステルス性質を与える有効性は、それらの重合体鎖の長さおよび密度によって異なる。例えば、Mori et al. (FEBS Lett., 284: 263, 1991)は、２００ｎｍリポソームの表面に存在する、ＰＥＧ７５０、２０００および５０００ｇ／モルの鎖を含んでなるリン脂質で比較研究を行っている。等モル百分率で、ＰＥＧ７５０は、インビトロで、オプソニン作用に対して立体的な保護を与えるのに、全く無効であることが立証された。他方、最も長いＰＥＧ鎖は、それらの長さに関連するオプソニン作用に対して効果を示す。このインビトロ挙動は、リポソームの半減期に相関しており、マウスに静脈内注射した後、ＰＥＧ７５０、ＰＥＧ２０００およびＰＥＧ５０００に対してそれぞれ３０分間未満、約２時間および３時間を超える。
【００１９】
他の研究(Allen et al., BBA, 1066: 29, 1991)は、１０００ｇ／モル未満では、ポリ（エチレングリコール）鎖は、ナノ粒子の表面で飽和濃度にあっても、十分な立体的保護、従って、ステルス特性を粒子に与えないことを立証している。
【００２０】
ステルスキャリヤーの、抗癌性活性要素を輸送するための設計により、治療効果を高めるのみならず、オプソニン作用現象および免疫系に対する特定の不可視性も確保することができる。その上、この血液半減期の増加（ステルス効果の結果）は、運ばれる活性要素の毒性を下げるのにも役立ち、活性要素は主として腫瘍の空隙組織で放出され、健康な組織における拡散は大きく制限される。
【００２１】
事実、抗癌性活性要素は、一般的に、サイズが小さく、高い、特に分割細胞に対して顕著な細胞毒性を示す分子である。その上、それらの有効治療濃度は、時として、それらが投与される生物に対して毒性となる血漿濃度とあまり変わらない。この狭い濃度寛容度のために、そのような化合物の投与にはキャリヤーの使用が必要になる。ステルスキャリヤーの使用により、キャリヤーが腫瘍の空隙組織に蓄積し、キャリヤー中の活性薬剤を放出することができる。この蓄積のために、活性要素の腫瘍内濃度は非常に高く、従来のキャリヤーを使用して、あるいは活性要素単独で到達できる濃度よりはるかに高い(Allen, Trends, Pharm. Sci., 15: 215, 1994)。従って、ステルスコロイド系により、毒性が高いために活性要素単独で投与できる投与量よりも、はるかに高い投与量で抗癌剤を使用できる。
【００２２】
ナノ粒子の腫瘍中蓄積およびその結果得られる治療効果は、ナノ粒子の血液循環から排除される半減期によって異なる。そのため、従来型または持続性循環を示すリポソームの様々な処方が、それらの血液排除プロファイルおよびそれらの腫瘍中蓄積に関してマウスで比較されている（Gabizon A.およびPapahadjopoulos D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 6949, 1988）。例えば、約８時間の半減期を有するステルス処方は、注射された投与量の１０％を超える蓄積を２４時間後に腫瘍中で示す。１時間より僅かに短い半減期を有する比較処方は、ステルス処方で観察された蓄積よりはるかに低い腫瘍中蓄積を示す。特に、比較処方の２４時間における腫瘍内濃度は、ステルス処方の場合に腫瘍中で検定された量の４〜１６％に過ぎない。これらの結果は、半減期が１時間または１時間未満のオーダーにある処方は、腫瘍中蓄積が悪いことを示している。
【００２３】
リポソームまたはナノ粒子のようなコロイド系、すなわち直径２５ｎｍ〜１μｍの粒子懸濁液は、様々なコロイド状医薬形態の開発および商業化につながっている。
【００２４】
例えば、米国特許第５，８１１，１１９号明細書は、カロテノイドから誘導された抗癌性医薬品を投与するためのリポソームの使用を開示している。このリポソーム処方は、特にこれらの活性要素の生体内毒性を下げることができる。ここでは、腫瘍を処置するためのカロテノイドが、それらをリポソーム中に装填できるようにする挿入(intercalation)促進剤と組み合わされている。コアの性質が親水性であるリポソーム中におけるこれらの親油性活性要素の輸送は、両親媒性化合物、例えばトリグリセリド、の存在により可能である。これらの「挿入促進剤」により、カロテノイドを、トリグリセリド１０モルに対してカロテノイド１モルの比で輸送することができる。
【００２５】
そのようなキャリヤーは、抗癌剤を、それらの細胞毒性を低減させながら輸送することを意図できるが、カプセル封入率が低く、その上、腫瘍を正確に標的とすることも、これらのキャリヤーの血液区画における半減期を増加することもできない。特に、リポソーム型機構の大きな欠点は、特に、循環している酵素による急速な生物分解性のために、循環中の安定性が悪いことである。
【００２６】
米国特許第５，５２７，５２８号明細書は、抗癌性医薬品を運び、投与するための変性リポソームの使用を記載している。開示されているリポソームは、サイズが５０〜１２０ｎｍであり、抗腫瘍性化合物、例えばシタラビン、を含み、それらの表面にポリ（エチレングリコール）の分子鎖を、それらを投与するホストの血液区画中の該リポソームの循環時間を著しく長くするのに十分な濃度で有する。その上、これらのリポソームは、それらの表面に、特定腫瘍抗原に対して特異的な抗体を有し、腫瘍をリポソームの活性標的にすることができる。
【００２７】
この書類は、循環における活性要素の輸送を持続すると共に、腫瘍を標的にするキャリヤーを開示している。
【００２８】
しかし、この型のキャリヤーには大きな欠点がある。具体的には、このキャリヤーは、本来親水性である抗癌剤、例えばシタラビンまたはゲンタマイシン、に特に有利である。ここでも、親油性活性要素、特にダウノマイシンのような抗癌剤の輸送は制限される。これらの化合物は、リポソームの二重リン脂質層中に取り込むことにより輸送される。このため、リポソームのコアの容積が輸送に使用されないので、取込率が低い。これらの系の主欠点は、親油性区画容積に対する水性区画容積の比が好ましくないので、親油性医薬品に対する取込容量が限られることにある。
【００２９】
さらに、活性要素のメンブラン取込率は、このリン脂質二重層の脂質環境に対する活性要素の可溶化度によって異なる。この二重層中の親油性を調整することは、その成分（この場合はリン脂質）の選択が限られているとすれば、困難である。従って、この型のキャリヤーは、輸送される活性要素の油溶性に対する輸送媒体のＨＬＢ＊（親水性−親油性バランス）を、コアの構成成分を広範囲に選択できる本発明のナノカプセルのコアと同じ位に容易に調節することは不可能である。従って、取込率は、リポソーム性メンブランに対する活性要素の溶解度によって異なる。このように、リポソームは、脂質二重層の構造を造り上げるすべての脂質に対して、疎水性活性要素の５モル％（最も一般的には１〜２％）以上をメンブラン中に取り込むことはできない(Lasic, Trends Biotechnol. 16:307, 1998)。
【００３０】
＊ＨＬＢ指数、つまり親水性／親油性バランスは、出版物「Techniques de I'ngenieur」の論文Ｋ．３４２でC. Larpentにより定義されている。
【００３１】
ドキソルビシンを輸送するためにDoxil（商品名）の商標で販売されているリポソームも、血液区画中で特定のステルス特性を示す対象である。これらのリポソームは、それらの表面に、リン脂質二重層中に挿入されたＰＥＧの分子を有し、従って、腫瘍を控えめに標的化する。
【００３２】
この活性要素は、ドキソルビシンが水性コア中に拡散する時にドキソルビシンが複合体形成することにより得られる「活性装填」機構により、リポソーム中に「装填」される。ｐＨ勾配により、ドキソルビシンはリポソーム中に入り、そこでこの活性要素は、ゲルの形態に変化する。この充填機構により、高い活性要素装填率が得られる。
【００３３】
しかし、この機構は、両親媒性でイオン化し得る性質を有し、脂質二重層を横切って容易に拡散でき（従って、小分子である）、沈殿または複合体形成特性を有する、ドキソルビシンやミトキサントロンのような、特定の活性要素だけに利用でき、ほとんどの抗癌剤には適用できない。この機構の恩恵を受けることができない活性要素は、装填率が低く、従って、活性要素をカラム上で分離し、循環使用する追加の工程が必要になる。
【００３４】
さらに、活性要素用のキャリヤーとしてリポソームを使用することには、別の欠点がある。特に、リン脂質二重層の存在が、得られるリポソームのサイズを物理的に制限し、このメンブランにより得られる曲率半径の値が限られるために、約５０ｎｍ未満のサイズを得るのが困難である。
【００３５】
従って、リポソーム系キャリヤーの使用には、特に幾つかの抗癌性物質を輸送する能力において、また使用および保存の容易さに関しても、特定の大きな欠点がある。
【００３６】
具体的には、そのようなリポソーム系キャリヤーは、コロイド状溶液を還元した時にそれらの構造的特性および輸送能力が失われないように、凍結乾燥させることは容易ではない。その結果、リポソーム系懸濁液は、安定性が極めて乏しく、保存期間が比較的短い。
【００３７】
この型のキャリヤーの有効性を制限するこれらの欠点を克服するために、非リポソーム系コロイド状キャリヤーが開発されている。重合体系ミセルは、事実、親油性活性要素、特に抗癌剤、の輸送に関して、リポソームの良好な代替品になる。
【００３８】
例えば、国際特許第ＷＯ０２／００１９４号明細書は、重合体系ミセルの形態にあるコロイド状キャリヤーを開示している。このキャリヤーは、とりわけ、抗癌性活性要素、例えばドキソルビシンやメトトレキセート、を輸送および送達することができる。特許権請求されたミセルは、親油性抗癌剤を中に挿入できる疎水性中央成分、および本来親水性である外側「シェル」を含んでなる。これらのミセルは、事実、ポリ（ビニルピロリドン）を基剤とする親水性半分およびポリ（乳酸）からなる疎水性半分を含んでなる２ブロック重合体の組立に相当する。疎水性中央成分は、これらのミセルを形成する重合体分子の疎水性中央成分が集合したものに相当する。このキャリヤーは、疎水性分子を輸送する能力に加えて、リポソームの場合には達成するのが困難な、サイズが非常に小さい、特に１００ｎｍ未満の粒子を形成することができる。
【００３９】
活性要素を血液中で長時間駆動する目的で、他の型の重合体状ミセルも開発されている(Stolnik et al., J. Drug Target., 9: 362, 2001)。この型のキャリヤーも、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）からなる疎水性成分およびＰＥＧにより代表される親水性成分の２ブロック重合体型の構造を有する。各ブロックの長さに応じて、得られるＰＬＡ−ＰＥＧミセルは様々な大きさを有するが、より一般的には約７５ｎｍである。これらのミセルをラット中に静脈内注射することにより、一定のステルス特性を示し、排除半減期が１〜２時間であり、注射された投与量の２５％が３時間後にも血液中になお存在する。
【００４０】
他方、ミセル系キャリヤーには、生物中で比較的不安定であり、希釈剤により急速に解離するという欠点がある。実際、ミセルの安定性は臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）によって異なり、それより下では、ミセルを形成する重合体状分子が解離する。この相対的安定性のために、抗癌性物質を治療目的で送達するためのミセルの工業的使用が微妙になる。
【００４１】
このため、既存のコロイド状系の安定性の不足、および／またはそれらの、本来親油性である分子を輸送する際の効率の悪さを解決するために、リポソーム以外のナノ粒子径キャリヤーが開発されている。
【００４２】
例えば、国際特許第ＷＯ０１／６４３２８号明細書は、剛性のある脂質表面および脂肪酸とトリグリセリドのエステルから構成された液体または半液体のコアを含んでなる脂質ナノカプセルを記載している。これらのナノカプセルの剛性表面は、一部、幾種類かのレシチンの混合物に相当するLipoid（商品名）S 75.3、およびSolutol（商品名）HS 15から構成されている。この型のキャリヤーにより、疎水性活性要素、特に抗癌剤の輸送を考えることができる。そのようなナノ粒子では、親油性活性要素がコアの内側で溶解した形態で存在し、コアの組成を変え、ＨＬＢを、選択した活性要素の油溶性との関係で調節することができる。国際特許第ＷＯ０１／６４３２８号明細書の脂質ナノカプセルは、それらの脂質ナノカプセルをラット中に静脈内注射した後、生体内で血液中のそれらの挙動が評価されている(Cahouet et al., Int. J. Pharm. 242: 367 2002)。これらのナノカプセルの表面を形成しているSolutol（商品名）HS 15は、疎水性成分および外側に突き出たポリ（エチレングリコール）６６０ｇ／モルの短鎖からなる分子である。上記のように、非常に短いＰＥＧ鎖は、高密度でも、オプソニン作用に対する立体的な保護、従ってステルス特性をナノ粒子に与えるのに十分に効果的ではない。例えば、これらの脂質ナノカプセルの半減期は短く、約４５分間である。しかし、これらの脂質ナノカプセルは、小さな分子、例えば放射性標識単独、よりも長時間循環する。従って、国際特許第ＷＯ０１／６４３２８号明細書の脂質ナノカプセルの半減期は、上記のように腫瘍（肝臓および脾臓以外の臓器における）中に蓄積できるように長時間循環させるには十分では無かろう。
【００４３】
マウス中で一定の長い循環時間を示し、抗癌性活性要素を輸送するための別の型の脂質ナノカプセルが製造され、Mosqueira et al.により開示されている(Pharm. Res., 18: 1411, 2001)。そのような脂質ナノカプセルは、親油性活性要素、特に抗癌剤、を溶解させ、従って、輸送できる脂肪物質から構成されたコア、およびＰＥＧ鎖が上にグラフト化されており、免疫系に対してある程度のステルス特性を与えている重合体の剛性外側層の両方を有する。
【００４４】
これらのナノカプセルは、直径が約２００ｎｍであり、該表面分子が無い同じナノカプセルの循環時間より著しく長い血液循環時間を示す。しかし、これらの結果は、マウスで得られたものであり、マウスのオプソニン作用に対する免疫系の能力は、例えばラットやヒトで観察される能力よりも小さい。これらのナノカプセルの、マウスの免疫系を逃れる上での相対的な効率は、これらの結果を、オプソニン作用に対する能力に関してはるかに強力であるラットやヒトの免疫系に外挿することはできない(Liu D. et al., BBA, 1240: 277, 1995)。
【００４５】
その上、それらの比較的大きな直径のために、ほとんどの充実性腫瘍で容易に浸出することは不可能であろう。例えば、血液区画における滞留時間を増加しても、腫瘍の標的効率は低いままであり、それだけ治療効果が制限される。
【００４６】
ＰＬＡ−ＰＥＧの２ブロック構造からなる重合体で構成され、ラット中でステルス特性を示し、排除半減期が６時間であるナノ球も開発されている(Verrecchia et al., J. Control. Rel. 36: 49, 1995)。この重合体の疎水性成分は、３００００ｇ／モルのＰＬＡからなり、親水性鎖は２０００ｇ／モルのＰＥＧから構成されている。これらのナノ粒子は、相補的活性化には比較的好ましくない表面を有し、その結果、オプソニン作用現象およびＭＰＳの細胞による食作用が低下する。
【００４７】
しかし、この型の、ＰＬＡ型の固体重合体を基剤とするナノ粒子の大きな欠点は、腫瘍細胞の塊の周囲区域に入った後の、活性要素を急速に放出する能力が乏しいことである。具体的には、これらのナノカプセルの剛性の外側層は、ＰＬＡから構成されており、加水分解により比較的ゆっくり分解する。生物浸食が弱いと云うことは、これらのナノカプセル中に含まれる活性要素の放出が遅いことを意味する。ここで、そのような抗癌性キャリヤーの治療的効果は、第一に、それらの免疫系を逃れる能力から、第二に、腫瘍周囲の区域でそれらの内容物を急速に、すなわち２４時間未満で放出する能力から来ている。MosqueiraまたはVerrecchiaにより開示されているナノ粒子は、生物内に２４時間存在した後に実際に分解される(undergraded)が、これは充実性腫瘍の処置に最適とは云えない。
【００４８】
そこで、本発明は、リポソーム系キャリヤーに関して観察される欠点のほとんどを回避すること、および既存の非リポソーム系コロイド状キャリヤーと比較して、腫瘍を標的とすること／腫瘍中で活性要素を放出する効率を改良することの両方を可能にする、活性要素用の新規なキャリヤーを提供する。
【００４９】
治療指数を増加することにより癌、特に充実性または循環性腫瘍をより効果的に処置することができる活性要素用の新規な型のステルスキャリヤーを提供することも本発明の目的である。
【００５０】
治療指数は、好ましくない効果をもたらす薬物投与量と望ましい効果をもたらす投与量の比である。
【００５１】
本発明のナノカプセルは、薬物を溶液形態ではなく、カプセル封入してあるので、それらの低毒性、長い循環特性、および腫瘍標的能力のために、治療指数が改良された薬物を提供する。事実、活性要素をコロイド状薬物キャリヤー中にカプセル封入することにより、それらの流通体積が低下することが示されている。この薬物動態学的プロファイルの変化により、効能の増加および／または毒性の低下につながり、より大量の薬物を投与することができる。
【００５２】
具体的には、本発明のナノカプセルは、本発明のナノカプセルのサイズおよび目立たない特性(furtiveness)により、これらのナノカプセルが腫瘍に近づき、浸出現象によりこれらの腫瘍に浸透することができるので、活性要素用のキャリヤーとして、充実性腫瘍の処置に使用できる。この場合、腫瘍の控えめな標的化に言及する。本出願者の名誉として、標的とする腫瘍の控えめな標的化を可能にするステルス脂質ナノ粒子から構成されたキャリヤーを設計することができた。
【００５３】
さらに、本発明のナノカプセルは、活性要素用のキャリヤーとして、積極的な標的化の現象により循環性腫瘍の処置に使用できる。この積極的な標的化は、該ナノカプセルの表面に、循環性腫瘍の特定表面分子に特異的な分子または「リガンド」を取り付けることにより行われる。そのような表面分子の取付は、ナノカプセルを合成する際に、以下に説明する後挿入により行うのが有利である。一般的に、本発明のナノカプセルは、活性要素用のキャリヤーとして、充実性または循環性腫瘍の処置に、それらの腫瘍がリガンドにより認識され得るレセプタ−を有する場合には積極的な標的化により、あるいは控えめな標的化により（レセプタ−の関与無しに）、使用できる。
【００５４】
本発明のナノカプセルは、活性要素用のキャリヤーとして、腫瘍のすぐ近くの環境中にこの（これらの）活性要素を急速に、従って、より効果的に放出する。そのような急速な放出は、該ナノカプセルの構成成分の急速な生物再吸収(bioresorption)により、特に生物中に存在する酵素の作用により、可能になる。
【００５５】
この生物分解の特徴（特に酵素消化による）は、本発明のさらなる利点であり、これによって、このようにして投与された活性要素の治療的効果が改善される。本発明のキャリヤーは、免疫系に対して有利なステルス特性を示し、毒性が全くないことと組み合わされた完全な生物分解性を示す。事実、本発明のすべての構成成分は、生物分解性であり、生物中で急速に同化され、非経口的に使用でき、また有機溶剤を使用せずに処方されている。従って、ナノカプセルの「固有」毒性は非常に低いか、さらには存在しない。
【００５６】
その上、本発明のナノカプセルは、溶液中の遊離薬物と比較して低い毒性を示す有機体(organism)を通して、比較的高い含有量の潜在的に毒性の活性要素（抗癌剤のような）を運ぶことができる。
【００５７】
本発明のこの態様は、本明細書の例１０、Ｆ）項、および図７（ドセタキセル(docetaxel)を３回静脈内注射した後のマウスの相対的平均体重の推移）および図８（マウスに投与したドセタキセルの様々な処方物に対する、１５％体重損失に到達するまでの平均日数）に示す。
【００５８】
このように、本発明のナノカプセルは、固有毒性が非常に低く、潜在的に毒性の物質を運ぶ時の毒性低下と組み合わされて、哺乳動物における抗癌剤の非常に安全なキャリヤーになり得る。
【００５９】
本発明の新規なステルスコロイド状キャリヤーには、容易に凍結乾燥および滅菌することができ、懸濁液の形態に還元した時にその特性を失わないという利点もある。
【００６０】
このキャリヤーは、血管経路で、組織炎症を処置するための医薬品を投与することもできる。
【００６１】
本発明の脂質ナノカプセルは、直径が５０〜１５０ｎｍ、好ましくは８０〜１２０ｎｍであるのが有利である。
【００６２】
該ナノカプセルのサイズは、腫瘍抗癌剤の控えめな標的化において、ある役割を果たす。具体的には、腫瘍で観察されるＥＰＲ効果により、充実性腫瘍を取り囲む空隙媒体または血液中に存在する要素（その直径は十分に小さいので、この浸出が可能になる）中への通過およびその中における保持が可能になる。本発明のナノカプセルは、有利なことにそれらのサイズを調整することができる方法を使用して製造される。その上、これらのナノカプセルは、血液区画中で２時間を超える半減期を与える長い循環特性を示す。これらの二つの特徴により、有利なことに、腫瘍毛細管の穿孔区域でナノカプセルにより作られる通路の数が増加することにより、浸出現象を促進することができる。
【００６３】
浸出現象を例１１、Ｇ）項に示す（図９および１０も参照）が、そこでは、ドセタキセルを装填し、放射性標識を付けたナノカプセルの腫瘍中蓄積が、ポリエチレングリコール化されていないナノカプセル（ＬＮ）よりも、ステルスナノカプセル（Ｓ−ＬＮ）ではるかに重要であることが分かる。
【００６４】
本発明のナノカプセルのステルス性質は、循環性腫瘍の場合、血液循環中に存在する悪性細胞との接触を強化することもできる。
【００６５】
浸出は、接線方向の濾過現象に相当し、直径２００ｎｍの細孔を有する腫瘍は、同じ直径を有する循環物体を通過させ難い。その上、本発明のナノカプセルのサイズは、肝細胞のレベルにおける浸出による捕獲を回避することができる。事実、肝臓の正弦波状毛細管の穿孔は、約５０ｎｍの粒子を浸出させることができる。最後に、該ナノカプセルは、脾臓でサイズが２００ｎｍを超える粒子に対して観察される濾過現象を回避するためには、サイズが２００ｎｍ未満でなければならない。従って、ナノカプセルの限定されたサイズは、ＥＰＲにより強化される控えめな標的化の現象、および濾過および肝浸出の現象を回避することにより、該ナノカプセルが血液循環中に存続する時間を増加することの両方にとって重要である。
【００６６】
ナノカプセルの直径は、処置すべき腫瘍の種類に応じて調節することができ、適宜、上記の範囲より僅かに小さくても、大きくてもよい。
【００６７】
ナノカプセルのサイズは、実際、破壊すべき腫瘍の穿孔のサイズに調整しなければならないが、このサイズは、腫瘍の成熟度に応じて時間と共に、および同腫瘍中の空間内で変化することがある。その結果、本発明のキャリヤーの控えめな標的化は、本発明のナノカプセルのサイズを正確に調節できれば、治療レベルで可能になる。ここで、本出願者は、有利なことに、様々な、制御可能なサイズのステルスナノカプセルを正確に合成する方法を開発した。これによって、本キャリヤーは、腫瘍環境に適合する能力を有することになり、はるかに効果的になる。
【００６８】
本発明のナノカプセルの外側脂質外被は、本来油性である親油性界面活性剤を含んでなる。この界面活性剤は、レシチンの形態にあるのが有利であり、そのホスファチジルコリン比率は少なくとも９５％に等しく、９９％を超えるのが好ましい。
【００６９】
本出願者は、ホスファチジルコリン含有量が９５％を超えるナノカプセルを構築することにより、ラットで、血液循環中の循環時間を著しく増加できることを見出した。他のリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン、リソリン脂質または遊離脂肪酸、のような不純物は、これらのナノ粒子のオプソニン作用現象を増大させることがある。さらに、本出願者は、ＰＥＧ分子に結合した脂質分子の挿入率は、親油性界面活性剤が９５％を超える初期ホスファチジルコリン濃度を示す場合に、より優れていることも見出した。
【００７０】
従って、本発明のナノカプセルの観察される長い循環時間は、これらのナノカプセルの外側表面が、オプソニン作用を制限するホスファチジルコリンを基剤とする実質的に純粋なリン脂質からなるという事実から来るのであろう。ホスファチジルコリンに関する純度は、オプソニン作用を回避するための機構で、ある役割を果たす。
【００７１】
本来油性である親油性界面活性剤は、該外側脂質外被を形成する脂質分子の５〜３０モル％であるのが有利である。
【００７２】
この界面活性剤は、ゲルから液相への転移温度が好ましくは２５℃を超え、より好ましくは３７℃を超える、すなわち周囲温度では該界面活性剤はゲル形態にあり、２５℃を超える、好ましくは３７℃を超える温度で初めて液相に変化する。ゲル／液体転移温度は、該ナノカプセルの外側脂質外被の剛性において、ある役割を果たす。外側外被の剛性は、本発明のナノカプセルに、それらが懸濁液中にある場合は水性媒体で、ただし血液区画中に投与された場合にも、非常に大きな物理化学的安定性を与える。実際、該外側外被の剛性は、ナノカプセルに、環境的な変化、例えば注射の際に起こるｐＨまたは浸透圧の変化、に耐えられる凝集性を与える。
【００７３】
親油性界面活性剤は、飽和化された炭素系の鎖、好ましくは２本の鎖を有するリン脂質であり、これらの鎖のそれぞれは炭素数が少なくとも１６である。この結果、リン脂質は、Ｃ１８−Ｃ１８ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）、Ｃ１６−Ｃ１８ＨＳＰＣ（水素化大豆ホスファチジルコリン）およびＣ１６−Ｃ１６ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）から選択するのが好ましい。好ましくは、ＨＳＰＣは、より優れた剛性およびより優れたステルス特性を得るために、９９％を超える純度で使用するとよい。ＨＳＰＣは、Doxil（商品名）の商標で販売されている注射可能なリポソーム処方物の組成の一部である。
【００７４】
その上、該外側脂質外被は、本来脂質である、好ましくは非経口使用に承認された親水性界面活性剤を含んでなる。この親水性界面活性剤は、ポリ（エチレングリコール）アルキルエステルおよびポリ（エチレングリコール）アルキルエーテル、およびそれらの混合物から選択するのが有利である。
【００７５】
この親水性界面活性剤は、好ましくは該外側脂質外被を形成する脂質分子の６０〜９０モル％を占める。この界面活性剤は、好ましくは外側脂質外被を形成する脂質分子の約８０モル％のモル比で使用する。
【００７６】
親水性界面活性剤は、親油性界面活性剤と共に、本発明のナノカプセルを製造するのに必要な油／水エマルションの形成に使用する。親水性界面活性剤は、実際、該ナノカプセルの合成方法の際に、トリグリセリドの混合物から形成される脂肪滴を確実に安定化する。その上、この界面活性剤は、該外側脂質外被も確実に凝集させる。該ナノカプセルの外被中に比較的高い比率の親水性界面活性剤があることにより、低い界面張力を得ることができ、親水性界面活性剤の比率が高い程、直径が小さいナノカプセルを製造することができる。
【００７７】
Solutol（商品名）HS15(BASF)、Brij（商品名）(Uniquema)またはMapeg（商品名）(BASF)の名称で販売されている非イオン系界面活性剤を使用するのが好ましい。好ましくは、分子量６６０ｇ／モルに相当する１５単位のエチレングリコールの短鎖を含んでなる、ポリ（エチレングリコール）-660の１２−ヒドロキシステアレートに相当するSolutol（商品名）HS15を使用する。この界面活性剤は、有利なことに、非経口使用、より詳しくは、静脈内投与に承認されており、さらに、凝集性に関して良好な結果をもたらす。
【００７８】
最後に、該外側脂質外被は、該ナノカプセルの長い循環時間に効果的に寄与するＰＥＧの両親媒性誘導体を含んでなる。具体的には、ＰＥＧの両親媒性誘導体により、ナノカプセルのオプソニン作用の現象を一度に減少させ、コロイド状溶液の安定性を改良し、これらのナノカプセルの血液循環中滞留時間を延長することができる。
【００７９】
ＰＥＧの両親媒性誘導体は、該外側脂質外被中に固定できるようにする疎水性成分、および該脂質ナノカプセルの外側に向き、その表面に親水性を付与するＰＥＧ型の親水性成分を含んでなる。
【００８０】
ＰＥＧの両親媒性誘導体は、それらの疎水性末端を経由して該ナノカプセルの外側外被中に挿入される。その結果、ＰＥＧ成分は該ナノカプセルの外側を向き、各ナノカプセルを取り巻く保護性親水性シェルを形成する。疎水性末端は、外側外被の表面に固定することができる。この固定は、ポリエチレングリコール化された脂質の疎水性成分を該脂質外被の表面に存在する界面活性剤の成分に結合する低エネルギー結合力により与えられる。具体的には、本発明のナノカプセルの外側脂質外被の凝集性は、疎水性基、特にこの外被を形成する分子のアルキル鎖間に作用するファンデルワールス力により得られる。これらの低エネルギー結合により、外被の成分間に十分な凝集性を維持し、血液区画中に導入された時に本発明のナノカプセルの過度に急速な分解を回避するが、外被に十分な脆さを与え、急速な生物分解性を確保し、従って、輸送される活性要素を治療上効果的に放出することができる。
【００８１】
事実、Mosqueiraにより記載されているナノカプセルの表面を構成する、生理学的条件下であらゆる温度で固体形態にあるＰＬＡ（ポリ乳酸）またはＰＬＡＧＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）型の重合体状鎖とは異なり、本発明のナノカプセルの外被を形成する脂肪鎖は、互いに共有的に結合しておらず、従って、より解体され易い。具体的には、生物浸食は、酵素の攻撃または局所的なｐＨ条件および水の存在に結びついた自然の生物分解（または生物再吸収）の結果である表面現象である。この浸食は、ナノカプセルの表面におけるリン脂質の損失を引き起こし、これが活性要素の放出を容易にする。
【００８２】
ＰＬＡまたはＰＬＡＧＡを基剤とするナノカプセルの重合体鎖は、長く（Mosqueiraにより記載されているナノカプセルでは４５０００ｇ／モル）、剛性で平滑な厚い表面を構成する。従って、その生物分解ははるかに遅い。例えば、ＰＬＡまたはＰＬＡＧＡを基剤とするナノカプセルを完全に生物分解するには２４時間以上（数週間になることもある）が必要である。本発明のナノカプセルの表面に存在するリン脂質は、別の存在であり、有利なことに、輸送される活性要素を治療的に有効に放出するのに必要な表面抽出および迅速な生物分解が可能である。
【００８３】
最後に、ナノカプセルの外側外被の構成成分は、すべて、生物分解性であり、非経口使用および静脈内注射用に承認されているのみならず、生物が同化することもできる。具体的には、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンのような構成成分は、食品中に一般的に存在し、生物により自然に同化される。
【００８４】
この様に、ナノカプセルの表面を覆う鎖、およびそれらの性質およびそれらを組み立てた状態に維持する化学結合の性質も、血液区画中で１時間以上安定していると共に、循環する酵素または空隙流体中に存在する酵素により急速に生物分解され、同化され得る、本発明のナノカプセルを製造するのに寄与する。
【００８５】
本発明のナノカプセルの半減期は、２時間を超えるのが有利である。理想的には、本発明のナノカプセルには、血漿中半減期が３〜１０時間である。この特徴により、本発明のナノカプセルは、腫瘍中に蓄積し、それらの内容物のほとんどを妥当な時間内に放出することができる。その結果、抗癌剤の効能が増加することになる。ここで、抗癌剤を急速に放出することは、充実性腫瘍を排除する際に、それらの成長速度が高い場合に考慮すべき最初のファクターである。
【００８６】
本発明で使用するＰＥＧの両親媒性誘導体は、好ましくは、疎水性基として、ホスファチジルエタノールアミンを有する。従って、これらの物質はポリエチレングリコール化されたリン脂質である。例えば、特に
ＤＰＰＥ−ＰＥＧｘ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、
ＤＳＰＥ−ＰＥＧｘ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、
ＤＯＰＥ−ＰＥＧｘ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、および
ＰＯＰＥ−ＰＥＧｘ（パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミン）、
およびそれらの混合物から選択された生物分解性リン脂質を使用することができ、ここでｘはＰＥＧ分子のサイズをｇ／モルで表す。
【００８７】
好ましくは、ＰＥＧの分子と結合したリン脂質として、本発明のナノカプセルの外側外被中における安定性の質から、ＤＳＰＥ−ＰＥＧｘを使用する。
【００８８】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３０００およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を使用するのが有利である。
【００８９】
その上、本発明のナノカプセルのステルス効果は、ステロール核−ＰＥＧ、セラミド−ＰＥＧまたはＰＥＧ２０００ソルビタンテトラオレエート型、またはより一般的には外側外被中の少なくとも一種のＰＥＧ分子に固定されて疎水性を与える少なくとも一種のアルキル鎖を有するアルキル−ＰＥＧ型のポリエチレングリコール化された脂質でも得られる。
【００９０】
上記のリン脂質にグラフト化されるＰＥＧ重合体分子のサイズも重要である。具体的には、このサイズが、該ナノカプセルの表面における空間的障害、従って、この表面への到達性、さらにこれらのナノカプセルのＭＰＳを逃れる能力も調整する。
【００９１】
本発明で使用する両親媒性誘導体のＰＥＧ分子は、好ましくは分子量が１０００ｇ／モル以上である。上記のように、サイズが１０００ｇ／モル未満のＰＥＧ鎖が存在すると、オプソニン作用に対して十分に保護されない。従って、上記の親水性界面活性剤Solutol（商品名）HS15の分子上に存在する６６０ｇ／モルの短いＰＥＧ鎖は、その表面をオプソニン作用に対して十分に保護できず、従って、循環を持続できないであろう。本発明で使用できる式（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎのＰＥＧ分子は、１１３ＰＥＧ単位を含んでなるＰＥＧ５０００、６８ＰＥＧ単位を含んでなるＰＥＧ３０００、および４５ＰＥＧ単位を含んでなるＰＥＧ２０００を含んでなる群に属する。これらの長いポリエチレングリコール化された鎖は、脂質ナノカプセルの表面に親水性を与える。
【００９２】
該ナノカプセルの外被中に一体化されるＰＥＧの両親媒性誘導体のモル比は、好ましくは外側脂質外被を形成する脂質分子の０．５〜１２モル％、より好ましくは１〜１０モル％である。好ましくは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧの分子は、外被の総脂質の１〜１０モル％のモル比で使用する。
【００９３】
好ましい実施態様ではＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００分子を使用するが、これはＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００分子のサイズ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００分子の約２倍の長さを有する）が、同じ分子数で、立体効果によるより大きな反発作用、およびより大きなステルス特性を生体内で得ることができるためである。具体的には、ＰＥＧ鎖は脂質外被の表面で一定運動しているので、それらの鎖が長い程、脂質ナノカプセル周囲のより大きな空間を掃き、そのために立体障害が増加し、タンパク質がこれらのナノカプセルの表面に到達する可能性がいっそう小さくなる。従って、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の存在下で、オプソニン作用の現象を逃れる能力が増大する。
【００９４】
本発明のナノカプセルのコアは、脂肪酸エステルおよび／またはトリグリセリドおよび／または脂肪物質として油および／またはそれらの混合物から構成された実質的に脂質コアである。トリグリセリドは、炭素数が６〜１４である中鎖トリグリセリドおよび／またはカプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、およびそれらの混合物から選択するのが有利である。より好ましくは、本発明のナノカプセルのコアを形成する脂肪物質の混合物として、Labrafac（商品名）cc、Miglyol（商品名）812NまたはMiglyol（商品名）810Nを使用するが、これらの材料は、薬局方の名称で、中鎖トリグリセリド、分別されたココナッツ油、またはカプリル酸／カプリン酸トリグリセリドに対応する。トリグリセリドは、純粋なグリセリルトリカプリレート（アルキル鎖中の炭素数８）、例えばTricaprylinから構成されたものでよい。トリグリセリドは、単独で、または非経口使用に承認された他の医薬用油または脂肪酸エステルとの混合物で使用し、コア中に溶解させる薬物の量を最大限にすることができる。
【００９５】
該実質的に脂質のコアを形成する脂肪酸エステルは、炭素数が８〜１８である中鎖脂肪酸、例えばパルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルまたはミリスチン酸オクチルドデシル、およびそれらの混合物、から選択するのが有利である。
【００９６】
無論、これらの構成成分のそれぞれの組成および比率は、混合物に望ましい親水性／親油性バランス（またはＨＬＢ）に応じて調整および調節することができる。実際、外被の内面は本来親油性であるので、外被とコアの内容物の性質間に非相容性は無い。
【００９７】
これらの脂質は、該コアを形成するトリグリセリドおよび油に含まれる炭素系鎖のサイズおよび飽和度に応じて、周囲温度で液体または半液体の形態にある。本発明のナノカプセルのコア内側に脂肪物質が存在することは、輸送される抗癌剤に対する溶剤として作用するのに寄与するが、外部環境が凍結乾燥工程の後で水性液体中の溶液であっても、乾燥状態にあっても、その中におけるこれらのナノカプセルの相対的な安定性を維持するのに使用される固体材料も構成する。脂質メンブランおよび水性内部を有するリポソームまたは他のコロイド状キャリヤーと異なり、脂肪物質の内容物が存在することにより、本発明のナノカプセルに一定の安定性が与えられる（イオン強度または浸透圧の変化）。
【００９８】
有利なことに、本発明の課題であるステルス脂質ナノカプセルの外側脂質外被の外側表面は、本来親水性であり、実質的に脂質のコアは本来親油性である。
【００９９】
従って、コアと外被を形成する、両方の同化され得る生物分解性脂質の組合せにより、輸送される活性要素を急速に放出することができ、凍結乾燥させ、０．４５〜０．２２μｍフィルターを通して滅菌することさえできる物理的安定性がナノカプセルに与えられる。従って、本発明のナノカプセルは、滅菌することができ、所望により、乾燥形態で長期間保存することができる。このように、本発明の新規なナノカプセルは、製剤を工業界で即利用できるものにする、ある種の使い易さを提供する。
【０１００】
本発明の課題であるステルス脂質ナノカプセルの実質的に脂質のコアは、該ナノカプセルの総重量の２０〜６０重量％、好ましくは２５〜５０重量％を占めるのが有利である。
【０１０１】
本発明のナノカプセル（または分散した相）を製造できる水相または分散物相は、最初に一定濃度の塩（好ましくはＮａＣｌ）を含むのが有利である。この濃度は４〜８％であり、４．４〜５．２％であるのが有利である。合成方法の最後で、浸透圧調整剤(osmotic agents)、低温保護剤(cryoprotective agents)または凍結保護剤(lyoprotective agents)、および所望により保存剤をこの水相に加えることができる。
【０１０２】
本出願者は、実際に、この塩濃度により、塩の非存在下より低い転相温度（またはＴＩＰ）が得られ、従来の製造方法（以下に説明する）の場合にＰＥＧと結合したリン脂質分子をより大量に取り入れることができ、最後に、得られるナノカプセルのサイズを大幅に低下できることを見出した。
【０１０３】
該コアを形成する脂肪物質混合物は、弱〜強親油性活性要素、より詳しくは、抗癌性物質を運ぶことができる。具体的には、各活性要素の油溶性に応じて、ＨＬＢを調節し、活性要素を完全に溶解できるようにする。本発明は、溶解度の異なる活性要素の混合物を輸送することもできるが、それには、中間ＨＬＢを適用し、各抗癌剤の少なくとも部分的な溶解度を確保する。
【０１０４】
本発明の課題であるステルス脂質ナノカプセルは、一種以上の活性要素、特に本来親油性の活性要素を含むのが有利である。
【０１０５】
活性要素は、ナノカプセルの脂質コア中に溶解または分散させることができる。
【０１０６】
例えば、主として親油性である下記の抗癌性活性要素、すなわちパクリタキセル(paclitaxel)およびその誘導体、例えばドセタキセル、カンプトテシンおよびその誘導体、例えばイリノテカン(irinotecan)、トポテカン(topotecan)またはルブテカン(rubutecan)、ブスルファン、クロラムブシル(chlorambucil)、フタロシアニン、カロテノイドおよび特にダウノマイシン(daunomycin)を、単独で、または混合物として使用することができる。
【０１０７】
さらに、両親媒性である抗癌性活性要素、例えばシタラビン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロ誘導体、例えば５−フルオロウラシルまたは５−フルオロウリジン、または特にドキソルビシンを本発明のナノカプセルで輸送することができる。活性要素は、前もって脂肪酸エステルまたはトリグリセリドまたは医薬用油および注射用等級の脂肪物質に溶解させる。医薬用油に溶解し難い活性要素を可溶化するには、非経口投与に承認された有機共溶剤を使用し、次いで得られた溶液をこれらの油と混合するとよい。こうして製造された活性要素の溶液は、本方法に直接使用するか、またはトリグリセリド混合物で希釈してから使用することができる。
【０１０８】
最後に、他のあらゆる種類の活性要素、特に炎症または組織中の感染箇所を処置するための活性要素の輸送を意図することもできる。例えば、本発明のナノカプセルは、それらのステルス特性から、およびそれらのサイズを調整できることから、炎症を起こした組織に医薬品を運び、送達するのに特に好適である。具体的には、炎症の際、例えば関節炎で観察されるように、炎症を起こした区域を灌注している毛細管の穿孔は拡大し、血液中に存在する特定の要素、特にタンパク質の輸送を増加させる。同じことが、感染箇所のある組織にも当てはまる。その結果、これらの区域における蓄積が、腫瘍における程著しくなくても、炎症または感染に近い区域で、本発明のナノカプセルにより好適な活性要素を放出することにより、そのような病理学的状態を緩和させることができる。従って、本発明のナノカプセルによる、抗炎症性物質、例えばプロスタグランジンＥ１、非ステロイド系抗炎症剤、例えばイブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシンまたはコルチコイド、例えばデキサメタソン、および抗生物質、鎮痛薬および抗感染剤、例えばアムホテリシンＢまたはケトコナゾールの輸送を十分に意図することができる。
【０１０９】
従って、本発明のナノカプセルのコアは、脂肪相から構成され、その変えられる組成により、ナノカプセルの特定抗癌剤を可溶化する能力を調節することができる。
【０１１０】
本発明の課題であるステルス脂質ナノカプセルは、運ばれる活性要素の毒性（および悪影響の深刻さ）を下げることができ、より大量の薬物を投与し、それによって強力であるが、毒性の高い薬物の治療指数を改良することができる。その上、それらの長い循環特性およびそれらのサイズのため、本発明のステルス脂質ナノカプセルは、従来の抗癌剤溶液と比較して、薬物の量を腫瘍組織中に蓄積し、増加することができる。より多くの薬物を投与でき（健康な組織に対する毒性が低下するため）、より多くの薬物を腫瘍組織に送達できる（腫瘍箇所における特殊な浸出のため）ので、腫瘍処置効能が著しく強化されることが期待される。
【０１１１】
本発明の別の目的は、本発明のナノカプセルの、健康な組織に対する活性要素の毒性が低減された医薬品の製造への使用である。
【０１１２】
一種以上の活性要素を含む本発明のナノカプセルを含んでなる医薬組成物も本発明の課題である。これらの医薬組成物は、該ナノカプセルを含むコロイド状水性懸濁液の形態にあるのが有利である。
【０１１３】
そのようなキャリヤーは、非経口的に、特に静脈内、動脈内、腹腔内、関節内および筋肉内に投与できるが、皮下注射することもできる。実際、皮下注射により、リンパ管に到達し、本発明のナノカプセルをリンパ節中に確実に蓄積させることができる。従って、この到達経路は、リンパ節の不快、より詳しくは、リンパ節腫瘍の処置に特に重要である。
【０１１４】
１）充実性および循環性腫瘍の処置
本発明は、第一に、血液を経由する抗癌治療に使用できる。
【０１１５】
本発明のナノカプセルは、ヒトにおける充実性腫瘍の処置に使用できる。
【０１１６】
その上、本発明のナノカプセルは、白血病またはリンパ腫型の循環性腫瘍の処置に使用できる。実際、上記のように、循環している腫瘍細胞の標的化は、コロイド状系の粒子が、肝臓や循環しているＭＰＳ細胞により捕獲される前に、腫瘍細胞との遭遇を促進するのに十分な循環時間を有する場合にのみ達成できる。従って、本発明のナノカプセルは、循環性腫瘍の処置に特に好適である。
【０１１７】
これらのナノカプセルは、癌細胞の表面に位置するレセプタ−型の分子に対して特異的な親和力を有するリガンドを結合することにより、積極的な標的化能力も有することができる。
【０１１８】
本発明の課題であるステルス脂質ナノカプセルは、それらの表面に特異的なリガンドを有し、これらのリガンドが、これらのリガンドに対するレセプタ−を有する細胞、特に腫瘍細胞、を積極的に標的化する能力をナノカプセルに与えるのが有利である。
【０１１９】
リガンドは、粒子の排除現象を刺激しないか、またはほとんど刺激しないように選択するのが好ましい。
【０１２０】
該リガンドは、糖またはオリゴ糖型、またはビタミン型、あるいはオリゴペプチド型、抗体断片またはモノクローナル抗体型であるのが有利である。
【０１２１】
糖またはオリゴ糖型またはビタミン型（フォレート、リボフラビン）の、およびオリゴペプチド、抗体断片またはモノクローナル抗体型のリガンドでも、有利に使用できる。従って、該リガンドは、前もって、活性化されたポリエチレングリコール化されたリン脂質または他のいずれかの、ナノカプセルの表面に固定され得る疎水性成分、ＰＥＧ型の親水性鎖およびこの親水性鎖の末端にある反応性化学的官能基を含んでなる脂質の分子の反応性末端に結合させる。これらのリガンドは、これらの鎖の末端に付加した後、以下に記載する後挿入技術を使用して優先的に導入される。後挿入法は、実際、本発明のキャリヤーに一連の特性を与えることができる様々な特異性を有する、様々な性質の、特別な型のリガンドを導入することができる。
【０１２２】
従って、本発明のさらなる目的は、本発明の脂質ナノカプセルを、癌、特に充実性または循環性腫瘍を静脈内注射により処置するための医薬品の製造、または積極的な標的化により循環性または充実性腫瘍を処置するための医薬品の製造、または該ナノカプセルを腫瘍毛細管を通して浸出させた後に、控えめな標的化により充実性腫瘍を処置するための医薬品の製造に使用することである。
【０１２３】
２）炎症を起こした組織（特に関節炎）および感染した組織の処置
本発明のナノカプセルを、特にヒトにおける組織感染および／または炎症の処置に使用することもできる。具体的には、上記のように、組織炎症または感染の際は、炎症を起こしている区域を灌注する毛細管は透過性が増加する。この一時的透過性は、充実性腫瘍の処置と同様に、浸出の現象を使用して、炎症を起こした組織中に、炎症の原因および／または結果を低減させるか、または排除するための生物活性物質を導入するのに利用できる。例えば、特に、本発明のナノカプセルにより、炎症を軽減させるための活性要素、例えば抗炎症薬、鎮痛薬または抗体、を輸送することができる。例えば特定関節の炎症に相当する関節炎の場合、本発明のナノカプセルを関節内注射するのが好ましい。これは、作用箇所に対するキャリヤーの直接標的化がこれによって強化され、その上、血液循環全体による希釈でナノカプセルが失われることが少なくなるためである。さらに、本発明のナノカプセルのステルス特性により、炎症箇所に存在するＭＰＳおよび免疫系の多数の細胞によりナノカプセルが認識され、これらの箇所から排除されることが無くなる筈である。
【０１２４】
従って、本発明の別の目的は、本発明の脂質ナノカプセルを、組織の炎症および／または感染を処置するための医薬品の製造に使用することである。
【０１２５】
３）解毒
有利なことに、本発明の課題である脂質ナノカプセルは、中毒の際に血液循環中に存在する疎水性分子を吸収するのに使用できる。
【０１２６】
本来疎水性である活性要素で急性中毒を起こした場合、活性要素を装填していないステルス脂質ナノカプセルを静脈内投与することができる。これによって、本発明のナノカプセルは、それらの循環時間が長いこと、およびそれらの疎水性脂質コアのために、血液循環中に存在する活性要素を吸収し、活性要素の遊離濃度を下げ、その結果、その毒性を下げることができる。続いて、これらの活性要素は、キャリヤーの分解と共に、毒性遊離濃度より低い濃度で徐々に放出される。
【０１２７】
従って、本発明のもう一つの目的は、本発明のナノカプセルを、中毒を起こした場合の血液循環中に存在する疎水性分子を吸収するための医薬品の製造に使用することである。
【０１２８】
４）滅菌濾過
最後に、本発明のナノカプセルには、直径０．４５μｍ、さらには０．２２μｍのフィルターを通して滅菌濾過することにより、滅菌できるという利点があり、この工程は、以下に記載する方法の最終的な急冷工程の直後に行うことができる。実際、本出願者は、本発明のナノカプセルは、大きな変性を行わずに、および特にそれらのステルス特性および生物分解性を失わずに、この型のフィルターを通過させるのに、懸濁液中で十分に固体である。この特徴により、該ナノカプセルは、非経口使用に容易に、安全に使用することができ、そのために、例えば病院における、または工業的な大量使用に最適のキャリヤーになる。
【０１２９】
５）乾燥／濾過形態における使用
本発明のナノカプセルは、有利なことに、凍結乾燥させ、次いでコロイド状懸濁液の形態に還元することができる。従って、これらのナノカプセルは、長期間容易に保存することができる。本発明のナノカプセルの懸濁液は、実際、使用の直前に、その場で、乾燥形態から還元することができる。そのような凍結乾燥は、上記の滅菌濾過工程の直後に行うことができる。
【０１３０】
該ナノカプセルの凍結乾燥は、昇華の現象により製剤から水を除去することからなる。その場合、適量（約５％ｍ／ｍ）の低温保護剤または凍結保護剤、例えばマンニトールまたはトレハロース、を凍結乾燥すべきナノカプセルの懸濁液に加えるとよい。これらの化合物が完全に溶解した後、選択した懸濁液を約−５０℃で急速凍結工程にかける。次いで、これらの懸濁液を、低温、減圧下で、蒸気の形態で水を直接抜くことにより凍結乾燥させる。これで、乾燥形態にあるナノカプセルを、使用するまで、滅菌した形態で長期間保存することができる。
【０１３１】
６）他の投与
本発明のナノカプセルは、活性要素用のキャリヤーとして、腫瘍または炎症以外の種類の障害を処置するために使用することができる。具体的には、このコロイド状キャリヤーの品質の一つは、ホストの免疫系、特にＭＰＳの細胞、例えばマクロファージ、を逃れる能力である。従って、本発明のステルスナノカプセルを、生物の、従来のキャリヤーの使用が特に不適当である区域で使用することができる。そのようなマクロファージ濃度が高い区域は、例えば肺胞およびリンパ節に存在する。従って、該キャリヤーを、食作用および／またはオプソニン作用のために医薬形態の効果が限られる経路を経由して投与することができる。
【０１３２】
ナノカプセルの製造方法
本発明のステルスコロイド状キャリヤーを構成するナノカプセルは、２通りの方法を使用して有利に合成することができる。第一の方法は、脂質ナノカプセルの合成に一般的に使用されているので、「従来」の方法である。第二の方法は、本出願者により開発され、本発明のナノカプセルに適している。この方法は、特に、従来方法を使用して得られるレベルよりも高いレベルの「ポリエチレングリコール化された」リン脂質を配合でき、積極的な標的化を行わせるリガンドに結合したリン脂質を取り入れる可能性も提供する。これら２通りの方法を以下に詳細に説明する。
【０１３３】
１）従来のナノカプセル合成方法
本発明のステルスコロイド状キャリヤーの合成方法は、有利なことに、有機溶剤を全く含まない。その上、本方法は、特別な材料を必要としない、簡単で比較的迅速な方法である。さらに、この方法は、非経口使用に承認された、特に「生物再吸収」の現象を経由して生物により自然に同化され得る生物分解性化合物だけを使用する。最後に、本発明の方法により、使用者により選択される、直径範囲４０〜２００ｎｍの限定された直径を有するナノカプセルを合成することができる。合成されるナノカプセルのサイズを調節することにより、そのキャリヤーを、様々なタイプの処置すべき腫瘍に適用することができる。
【０１３４】
先ず、油／水エマルションを、水、塩、親水性界面活性剤、親油性界面活性剤、該ナノカプセルのコアを構成するのに必要な脂肪物質、ＰＥＧの分子に結合する脂質の分子、および本発明のナノカプセルにより輸送することを意図する活性要素から構成する。活性要素は、本発明のナノカプセルのコアを構成する必要がある油性脂肪相中に前もって溶解させる。
【０１３５】
従って、第一工程では、すべての構成成分を秤量し、それらの成分を親油性界面活性剤の融解温度を超える温度に、例えば磁気攪拌で穏やかに攪拌しながら、均質な油／水エマルションが得られるまで加熱する。例えば、親油性界面活性剤がＨＳＰＣである場合、混合物は最初に６５℃に加熱する。
【０１３６】
ついで、この油／水エマルションの転相を行い、水／油エマルションに変換する。これを行うには、混合物の温度を、このように構成された混合物の転相温度（ＴＩＰ）を超える温度Ｔ２に増加させる。次いで、混合物の温度を温度Ｔ１に下げる。
【０１３７】
転相に続いて、場合により、水／油エマルションが生じた時に処方物の導電性が消失することがあるが、一般的には、肉眼には下記のように映る。Ｔ１は、導電性が、２０℃で測定される導電性の少なくとも９０〜９５％である温度である。Ｔ２は、導電性が消失する温度である。
【０１３８】
この操作は、Ｔ１とＴ２間の転相区域のあたりの温度調整を少なくとも１サイクル行うことにより、半透明の溶液が生じるまで繰り返す。具体的には、ナノカプセルの形態における系の組織化は、最初の系の外観変化により視覚的に反映され、不透明−白色相から半透明−白色に変化する。この変化は、温度が転相温度（ＴＩＰ）より下に下降する時に起こる。この温度は、一般的にＴＩＰより６〜１５℃低い。
【０１３９】
エマルションに作用させるサイクルの数は、ナノカプセルを形成するのに必要なエネルギーの量によって異なる。油／水エマルションと水／油エマルションの間の転相により、温度増加と共に導電性が消失するまで低下する。転相区域の平均温度は転相温度（ＴＩＰ）に相当する。
【０１４０】
次いで、油／水エマルションを急冷、すなわち急激に冷却し、安定したナノカプセルを得る。この操作は、磁気攪拌しながら、２℃±１℃で脱イオン水を使用して細かいエマルション中に急速に注ぎ込み、エマルションを３〜１０倍に希釈することにより行う。この急冷工程により、ナノカプセルを、それらを形成する脂質が液体であるエマルション形態から、脂質がより硬化した、従って、構造的に非常に安定した状態にある懸濁液形態にすることができる。こうして得られる粒子を５分間攪拌する。工業的用途の場合、例えば熱交換機の系で製剤を循環させることにより、製剤の急冷を行うことができる。この特別な場合、製剤の希釈は行わない。
【０１４１】
脂肪相はLabrafac（商品名）ccであり、親油性界面活性剤はＨＳＰＣ（水素化大豆ホスファチジルコリン）であり、親水性界面活性剤はSolutol（商品名）HS15であるのが有利である。ＰＥＧの両親媒性誘導体は、ポリエチレングリコール化されたリン脂質ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００または−ＰＥＧ５０００である。これらの条件下で、Ｔ１＝６０℃、Ｔ２＝８５℃であり、サイクル数は３に等しい。
【０１４２】
ナノカプセルの外被の構成成分に関して、本来脂質である親油性界面活性剤のモル百分率は、５〜３０モル％である。本来親水性である界面活性剤のモル百分率は６０〜９０モル％であり、ポリエチレングリコール化されたリン脂質では０．５〜５モル％である。
【０１４３】
該ナノカプセルの外側脂質外被を構成する各種成分は、例えば下記のモル百分率を有するのが有利である。
・ＨＳＰＣ：１５．４６モル％
・Solutol（商品名）HS15：８１．２モル％
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００：３．３４モル％
【０１４４】
この例では、初期エマルションの塩濃度は４．４％（ｍ／ｍ）であり、脂質ナノカプセルのコアを構成するLabrafac（商品名）ccの質量は、本来脂質である構成成分または製剤中に存在する界面活性剤の４４％（ｍ／ｍ）である。この組の構成成分は、以下、総脂質（水および塩化ナトリウム以外の成分）と呼び、この用語は、特にポリエチレングリコール化されたリン脂質を包含する。従って、外側脂質表面（上記の）と総脂質の構成成分比は５６％である。
【０１４５】
一般的に、該ナノカプセルの外側外被を形成する脂質と、それらを構成する総脂質との質量比が高い程、ナノカプセルは小さくなる。従って、本発明のナノカプセルのサイズは、それらを合成する時に外被の脂質と総脂質の好適な質量比を選択することにより、容易に調整することができる。
【０１４６】
反対に、粒子のコアを構成する脂質の比率を増加させると、粒子径が増加する。
【０１４７】
その上、親水性界面活性剤の比率が増加し、（親水性および親油性）界面活性剤の比率が増加すると、粒子径が低下する。界面活性剤は、界面張力の低下を引き起こし、従って、系の安定化が低下し、小さな粒子の製造が促進される。具体的には、界面張力が低い程、水溶液中における脂質ナノカプセルの懸濁液がより安定する。親水性および親油性界面活性剤の量および脂肪酸エステルの量も固定すると、ポリエチレングリコール化された脂質の添加量を増加することにより、粒子径が増加する。特定量のSolutol（商品名）HS15およびＤＳＰＥ−ＰＥＧを選択することにより、様々なサイズ範囲および様々なポリエチレングリコール化されたリン脂質含有量が得られる（例４の図１参照）。
【０１４８】
好ましい実施態様では、脂肪相はLabrafac（商品名）ccであり、本来脂質である親油性界面活性剤はＨＳＰＣ(Northern ids)であり、非イオン系親水性界面活性剤はSolutol（商品名）HS15であり、ＰＥＧの分子に結合した脂質はＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００である。これらの化合物は、下記の特徴を有する。
【０１４９】
−Labrafac（商品名）cc(Gattefosse, Saint-Priest, 仏国）。これは、カプリル酸／カプリン酸中鎖トリグリセリド（Ｃ８およびＣ１０）から構成された油である。その密度は２０℃で０．９３０〜０．９６０である。そのＨＬＢ指数は約１である。その組成は、Miglyol（商品名）812N(Sasol, 独国）と同等である。Labrafac（商品名）ccは、非経口栄養供給用の製剤の組成物に包含される。
【０１５０】
−Solutol（商品名）HS15（BASF, Ludwigshafen,独国）。これは、ポリ（エチレングリコール）−６６０  １２−ヒドロキシステアレートである。従って、この材料は、処方物中で親水性界面活性剤の役割を果たす。この材料は、注射により使用できる（ＩＶによりマウス中でＬＤ５０＞３．１６ｇ／ｋｇ、ラット中で１．０＜ＬＤ５０＜１．４７ｇ／ｋｇ）。
【０１５１】
−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（Northern Lipids Inc., Vancouver,カナダ）。これは、ナトリウム塩の形態にあるＮ−（カルバモイルメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミンである。この材料は、脂質ナノカプセル上にそれらのステルス特性を与える。ポリ（エチレングリコール）の長鎖により、それらの立体効果で、血液のタンパク質がそれらの上に堆積する（オプソニン作用）のを阻止することにより、ナノカプセルの表面を保護することができる。この材料は、注射により使用でき、リポソーム製剤Doxil（商品名）（Alza, Mountain View,米国）に含まれる。
【０１５２】
最初の油／水エマルションの水相は、４〜８％の塩、例えば塩化ナトリウム、も含むことができる。塩濃度を変えることにより、転相区域がシフトする。塩濃度が高い程、転相温度が低い。この現象は、疎水性の熱に敏感な活性要素をカプセル封入するのに有利である。これによって、それらの活性要素を低温で配合することができる。
【０１５３】
ナノカプセルの直径は、合成方法の出発混合物中の、塩と親水性界面活性剤の比率および親油性界面活性剤の純度を調節することにより、調節するのが有利である。
【０１５４】
２）後挿入によるステルスナノカプセルの合成方法
本発明の課題であるステルス脂質ナノカプセルは、後挿入による方法で製造するのが有利である。
【０１５５】
この方法は、ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体が欠けているナノカプセルを予備形成する工程、および次いで該ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体をこれらのナノカプセルの表面中に後挿入する工程を含んでなる。
【０１５６】
この方法により、該予備形成工程は、従来の方法で上に説明したように数サイクルの温度増加および低下により行う油／水エマルションの転相による、ＰＥＧの両親媒性誘導体が欠けているナノカプセルの合成を含んでなるのが有利である。
【０１５７】
本出願者により開発された方法も、有機溶剤を全く含まず、「ポリエチレングリコール化された」リン脂質を本発明のナノカプセルの表面に好収率で取り入れることができる。
【０１５８】
例えば、外被の脂質に対するＤＳＰＥ−ＰＥＧモル比が５モル％を超える、好ましくは１０モル％のオーダーになるナノカプセルを得ることができる。そのような比率は、本発明のナノカプセルに良好なステルス特性を与える。ここで、上に記載した従来の合成方法では、そのような特性を得るのは困難である。その上、ＰＥＧを含まないナノカプセルを予備形成し、続いて挿入によりＤＳＰＥ−ＰＥＧを取り入れる合成方法により、ナノカプセルのサイズを正確に調節し、それによって両親媒性誘導体の親水性鎖の比率および長さを調節することにより、処置すべき腫瘍のタイプに適合させることができる。ＤＳＰＥ−ＰＥＧの分子をより大きな比率で挿入することに加え、後挿入技術を使用し、ポリエチレングリコール化された鎖の末端にリガンドを含んでなるリン脂質の誘導体を取り入れることができる。これらのリガンドは、本発明のナノカプセルに、問題とする細胞（充実性および循環性腫瘍）を積極的で特異的に標的化する特性を与えることができる。この後挿入法は、６０℃を超えない温度で行われるので、熱に敏感な分子に特に好適である。
【０１５９】
例えば、ＨＳＰＣを基剤とするが、ＤＳＰＥ−ＰＥＧが欠けているナノカプセルを、上に記載する方法により前もって製造する。
【０１６０】
該後挿入工程は、予備形成されたナノカプセルを、ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体の存在下で共温置(coincubation)する第一工程、およびこうして得られたポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体／予備形成されたナノカプセル混合物を、温度０〜５℃に到達するように急速に冷却する第二の「急冷」工程を含んでなるのが有利である。
【０１６１】
例えば、上記のＤＳＰＥ−ＰＥＧが欠けているナノカプセルを含む製剤に水を加え、メスフラスコ中で正確な体積に調節する。これによって、脂質の正確な濃度がｍｇ／ｍｌで分かり、例えば、本発明の脂質ナノカプセルの外側外被の組成物を形成する脂質全体（ＤＳＰＥ−ＰＥＧを包含する）に対して例えば６モル％を得るために加えるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００または−ＰＥＧ５０００  の量を計算するための基礎として使用することができる。続いて、ナノカプセルおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧのミセル溶液の製造を行い、個別に、６０℃で１５分間維持するのが有利である。
【０１６２】
ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体／予備形成されたナノカプセル混合物の共温置工程は、転相現象による系の崩壊を避けるために、本来脂質である該親油性界面活性剤のゲル／液体相転移温度よりほんの僅かに高いが、ポリ（エチレングリコール）の両親媒性誘導体／予備形成されたナノカプセル混合物の転相温度よりは低い温度で行う。上記の例に戻って、６０℃で、脂質ナノカプセルの表面は、はるかに液体状であり、追加のリン脂質を挿入することができる。次いで、必要量のＤＳＰＥ−ＰＥＧのミセル溶液をナノカプセルの製剤中に導入する。これを６０℃で１時間３０分共温置し、１５分ごとに強く攪拌する。この温置時間の後、製剤を氷浴中に１分間浸し、ナノカプセルの外被を急速に硬化させ、その中に挿入されたＤＳＰＥ−ＰＥＧの分子を捕獲する。
【０１６３】
後挿入方法により、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ含有量が、従来方法を使用して得られる含有量よりも高い、本発明のナノカプセルを得ることができる。実際、こうして製造されたナノカプセルは、生体内で、従来方法により製造されたナノカプセルで得られるよりもはるかに大きな、検出され難い性質を示す。
【０１６４】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧの後挿入をより低い温度（３７〜５０℃）で、ただし、より長い温置時間をかけて行うこともできる。例えば、この低温における挿入方法は、ＰＥＧ鎖の末端に、熱的に敏感な基、例えばある種のオリゴペプチドおよびタンパク質、を有するポリエチレングリコール化されたリン脂質の誘導体を取り入れるのに好適である。これらの化合物は、本発明の、ただし腫瘍細胞を積極的に標的にすることができるナノカプセルを製造するための方向付け基として使用することができる。
【０１６５】
さらに、該後挿入方法により、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ分子に加えて、ポリエチレングリコール化された鎖の末端に反応性官能基を含んでなるＰＤＰ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（ピリジルジチオプロピオニルアミノ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）またはＭＰＢ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（ｐ−（マレイミドフェニル）ブタロイルアミノ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）タイプの活性化されたリン脂質（Northern Lipids Inc., Vancouver,カナダ）を導入することができる。これらの反応性官能基は、本発明のナノカプセルが得られた後、本来ペプチドであり、チオール基を含んでなる化合物、例えば抗体タイプのオリゴペプチドまたはタンパク質、を結合し、積極的に標的化する特性をナノカプセルに持たせることができる。
【０１６６】
Ａ）従来方法によるステルスナノカプセルの製造例
下記の例では、
質量％＝製剤の総重量に対する質量百分率
％ｗ／ｗ＝ナノカプセルの総重量に対する質量百分率
モル％＝ナノカプセルの外側外被に対するモル百分率
ｍ％／ｅｎｖ．＝ナノカプセルの外側外被の重量に対する質量百分率
である。
【０１６７】
例１  ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含んでなる製剤
従来方法による、合計約１グラムの脂質に対して２．８６モル％でＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含んでなる製剤の製造。
【０１６８】
本発明のナノカプセルを合成するのに必要な構成成分を、表１に示す量で、２０ｍｌシンチレーションバイアル中に導入する。
【０１６９】
表１

質量(mg)    質量％      モル数        モル％       m%/env.   
ＨＳＰＣ           75        1.50%       9.843E-05      16.98%      13.25%    
DSPE-PEG           46        0.92%       1.658E-05      2.86%       8.13%     
Solutol HS15      445        8.90%       4.645E-04      80.15%      78.62%    
Labrafac          504        10.08%      
ＮａＣｌ          220        4.40%        総脂質        1070   
水                3710       74.20%       外被／合計    52.90%  
合計              5000       100.00%
【０１７０】
一般的に、秤量の際、最大変動（目標値に対する）は、レシチンおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧに対して±１．５％、親水性界面活性剤(Solutol（商品名）HS15)およびトリグリセリドに対して±０．２〜０．５％、および塩に対して±３％まで許容される。導入する水の量は、２％以上である。実際、上に説明したように、得られるナノカプセルのサイズは、粒子の外被を構成する脂質の合計と脂質の総質量の比（外被／合計）によって異なる。
【０１７１】
秤量後、温度を徐々に６０℃に増加し、攪拌を数分間維持し、その間にレシチンまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧの凝集物を確実に崩壊させる。次いで、温度を８０〜８５℃に増加する。続いて、バイアルを加熱されていないプレート上に移し、なお攪拌しながら温度を６０℃に下げる。８０℃までの温度上昇および６０℃への下降を３サイクル行うことができる。二回目の温度上昇の際、転相現象（転相温度（ＰＩＴ）未満では、溶液は半透明であり、ＰＩＴを超えると、不透明になり、クリーム状の外観を呈する）を観察することができる。
【０１７２】
第三サイクルの後、第二および第三の温度上昇の際に観察されるような外観の変化が起こる温度より１０℃温度が下がった時に、１℃の冷水（１２．５ｍｌ）を加えることにより、急冷を行う。急冷に続いて、攪拌を５分間維持する。ここに記載する例では、外観変化が起こる温度は７５℃であり、製造時の最高温度は８２℃であり、急冷は６２℃で行った。
【０１７３】
続いて、細孔径０．２μｍのフィルターを通して製剤を濾過した後、動的光散乱によりサイズ分布プロファイルの分析を行うことができる。例として記載する製造により、サイズが８７．５±１４ｎｍである本発明のナノカプセルを得ることができる。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００含有量は、表面の全構成成分に対して２．８６モル％である。他の特性は表１に報告した。
【０１７４】
従来の製造方法を使用して得られるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の最大比率は３．３４モル％である。ポリエチレングリコール化されたリン脂質をさらに加えることにより、最終的な急冷に続いて得られる製剤の不安定性が引き起こされる。
【０１７５】
例２  ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を含んでなる製剤
従来方法による、合計約０．６グラムの脂質に対して１．４１モル％でＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含んでなる製剤の製造。
【０１７６】
下記の表２に示す量を使用した以外、手順は前の例で記載した手順と同等である。
【０１７７】
表２

質量(mg)    質量％      モル数        モル％       m%/env.   
ＨＳＰＣ          37.5       1.50%      4.921E-05      15.54%      11.89%     
DSPE-PEG          25.8       1.03%      4.461E-06      1.41%       8.18%      
Solutol HS15      252        10.08%     2.630E-04      83.05%      79.92%     
Labrafac          252        10.08%      
ＮａＣｌ          116        4.64%        総脂質        567.3  
水                1816.7     72.67%       外被／合計    55.58% 
合計              2500       100.00%
【０１７８】
この製造では、不透明／半透明の外観変化が約７２℃で起こり、サイクル中に到達した最高温度は８１℃であり、急冷は６５℃未満で、氷水６ｍｌを加えて行った。
【０１７９】
得られたナノカプセルの平均サイズは、細孔径０．２μｍのフィルターを通して製剤を濾過した後、動的光散乱により６３．２±９．８３ｎｍである。
【０１８０】
従来の製造方法を使用して得られるＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の最大比率は１．４９モル％である。
【０１８１】
この様に、従来の方法を使用して取り入れられるリン脂質の量は、これらの分子が長いＰＥＧ鎖を有するために、大きく制限されている。
【０１８２】
Ｂ）本発明の後挿入によるナノカプセルの製造例
例３  予備形成されたナノカプセル中にＤＳＰＥ−ＰＥＧを挿入する方法によるナノカプセルの製造
表３は、予備形成されたナノカプセル中にＤＳＰＥ−ＰＥＧを挿入する技術を使用し、直径約８０ｎｍの脂質ナノカプセルの処方物を得ることができる各種構成成分の量の例を示す。
【０１８３】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含まない予備形成されたナノカプセルの親製剤は、従来の方法により製造する。導入する量を表３に示す。急冷後、製剤をメスフラスコ中に移し、その体積を蒸留水で２５ｍｌに調節する。
【０１８４】
表３

質量(mg)    質量％      モル数        モル％       m%/env.   
ＨＳＰＣ          75         1.50%      9.843E-05      17.48%      14.42%     
DSPE-PEG           0         0.00%      0.00           0.00%       0.00%      
Solutol HS15      445        8.90 %     4.645E-04      82.52%      85.58%     
Labrafac          504        10.08%      
ＮａＣｌ          220        4.40%        総脂質        1024   
水                3756       75.12%       外被／合計    50.78% 
合計              5000       100.00%
【０１８５】
「ポリエチレングリコール化された」リン脂質を秤量し、十分量の蒸留水を加えて溶解させ、完全に溶解した後、体積を正確に５ｍｌに調節することにより、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００のミセル溶液を前もって製造した。
【０１８６】
次いで、親製剤２ｍｌを、６０℃の水浴中に入れた栓付きの溶血管中に分配する。ミセル溶液も水浴中に入れる。脂質ナノカプセルの製剤およびＤＳＰＥ−ＰＥＧのミセル溶液を個別に６０℃で１５分間予備温置する。この時間の後、必要量を加え、ナノカプセル外被中のＰＥＧの分子と会合したリン脂質６モル％の理論的比率を得る。例えば、上に記載するミセル溶液の体積および濃度で、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００５３２μｌまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００１１０８μｌを加える。比較試料も熱水８００μｌを加えて調製する。
【０１８７】
これらの量を加えた後、溶液を６０℃で１時間３０分間放置し、１５分毎に攪拌する。この温置時間の後、製剤を氷浴中に注ぎ込む。
【０１８８】
得られる脂質ナノカプセルのサイズを表４に示す。
【０１８９】
表４

製剤                            ナノカプセルのサイズ（ｎｍ）
温置していない親製剤                ６９±１２．９          
加熱した比較試料                    ６９．９±１４．２      
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００            ７７．９±１４          
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００            ７８．４±１３          
【０１９０】
同じ条件下で温置した比較用製剤は、６０℃で温置しなかった親製剤の粒子径に近い粒子径を有する。ＤＳＰＥ−ＰＥＧの存在下で温置した製剤は、粒子の平均直径が大きく増加しており、ナノカプセルの表面における「ポリエチレングリコール化された」リン脂質の挿入を示唆している。
【０１９１】
Ｃ）本発明のナノカプセルのサイズに対する様々なパラメータの影響
例４  従来方法により製造したナノカプセルのサイズの調整
例１に記載する従来方法により製剤を製造する。これらの製剤は、約１ｇ量の脂質で製造する。図１は、親水性界面活性剤Solutol（商品名）HS15の量をそれぞれ４１４ｍｇ（４１３．５±０．５０）、４４６ｍｇ（４４５．８５±０．０１）または５０４ｍｇ（５０４．４±０．２７）で固定した場合の、ナノカプセルのサイズと、加えるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の比率との関係を示す。ＨＳＰＣ、Labrafac（商品名）ccおよびＮａＣｌの量は、すべての製剤で一定に、それぞれ７６ｍｇ、５０４．０５ｍｇおよび２２０ｍｇに維持する。
【０１９２】
一般的に、サイズは、Solutol（商品名）HS15の量を下げるにつれて増加する。特定Solutol（商品名）HS15量の同系列では、サイズは、加えるＤＳＰＥ−ＰＥＧの比率が増加するにつれて増加する。
【０１９３】
例５  後挿入方法により製造したナノカプセルのサイズの調整
特に長い循環時間を得るか、またはリガンドを導入しようとする場合、例３に記載する後挿入方法を使用する必要がある。例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含まいナノカプセルを前もって製造するが、そのサイズは、粒子の表面を構成する脂質と界面活性剤の合計と、製材（表面＋コア）の組成物を形成する脂質と界面活性剤の合計との質量比を変えることにより調節することができる。後挿入方法に好適な、この表面脂質／総脂質の比と、得られるナノカプセルのサイズの関係を図２に示す。
【０１９４】
図２に示す処方物は、約１ｇ量の脂質で製造した。ＨＳＰＣ、Labrafac（商品名）ccおよびＮａＣｌの量は、一定であり、例４で使用した量に対応する。使用したSolutol（商品名）HS15の量および対応する表面脂質／総脂質比（Ｓ／Ｔ比）を下記の表５に示す。
【０１９５】
表５

Solutol（商品名）HS15 (mg)          Ｓ／Ｔ比    
４００．６                    ４８．６％  
４１３．２                    ４９．２％  
４４５．９                    ５０．９％  
５０４．２                    ５３．５％  
【０１９６】
続いて、後挿入方法を使用してポリエチレングリコール化されたリン脂質ＤＳＰＥ−ＰＥＧを導入し、本発明のステルスナノカプセルを得ることができる。後挿入方法は、例３に従い、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００または５０００の最終的な合計比率６モル％で行う。
【０１９７】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含まず、それぞれ５０４、４４６および４０１ｍｇのSolutol（商品名）HS15を有する親の処方物（ＳＭ系列）、およびそこから、該後挿入方法を使用し、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００および５０００を取り入れて製造した本発明の処方物に対して得たサイズを図３に示す。
【０１９８】
このように、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の挿入により、直径が平均で７．２ｎｍ増加する。サイズ増加は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００でより顕著であり、粒子の直径が平均で９．１ｎｍ増加している。
【０１９９】
脂質ナノカプセルの表面におけるポリエチレングリコール化されたリン脂質の効果的な挿入を反映するこれらの直径増加に基づき、およびＰＥＧを含まないナノカプセルのサイズと表面／総脂質比の関係（図２）から、本発明のナノカプセルのサイズを調節し、特定腫瘍毛細管の内皮に存在する穿孔を通して浸出し易くすることができる。
【０２００】
Ｄ）本発明のステルスナノカプセルを使用して生体内で行った排除実験の結果
例６  キャリヤーの消失速度論（ＰＥＧ２０００／ＰＥＧ５０００比較データ）
本発明のナノカプセルの血液排除を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００３．３４モル％（「２Ｋ−３．３４」曲線）を基剤とするナノカプセルの処方物と、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を基剤とするナノカプセルの処方物（そのＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００のモル比は１．４１モル％（「５Ｋ−１．４１」）である）との間の比較研究で評価した。これらの処方物は、例１および２に記載する該従来方法により製造した。
【０２０１】
これを行うために、本発明のナノカプセルの溶液を雄のラット（Sprague-Dawley、３２５ｇ）中に、処方物あたりラット４匹の比率で静脈内注射した。脂質の注射量は、「ＭＰＳの飽和」現象（これは、除去能力を超過するために長い循環時間を引き起こす）が起こり始める投与量の約１０分の１になるように選択した。そこで、体積４００μｌ中に脂質総量２ｍｇを含んでなるナノカプセル溶液を各ラット中に静脈内注射した。
【０２０２】
本発明のナノカプセルに、前もって滴定した放射性トレーサー、すなわち非交換性標識である［３Ｈ］コレステロールヘキサデシルエーテルで標識を付けた。放射性標識の線量は、ラット１匹あたり３マイクロキューリー（μＣｉ）である。ナノカプセルを注射してから、５、１５および３０分後、および１、２、４、８、１２および２４時間後に、一連の血液試料９点を採取した。
【０２０３】
これらの血液試料を、Soluene 350（Canberra Packard, Mississauga, カナダ）の存在下、５０℃で１時間消化させた。消化後、３０％水性過酸化水素を使用して血液試料を脱色した。次いで、シンチレーション液Hionic Fluor (Canberra)を加え、試料を一晩放置した。次いで、シンチレーション計数器を使用して放射能を計数することにより、様々な時間で血液中に存在する標識を付けたナノカプセルの量を検定した。比較試料を検定することにより、１００％の線量に相当するｄｐｍ（毎分の壊変）数を測定すめことができる。ラット中の総血液量は、７５ｍｌ／ｋｇである。従って、結果を総注射量の百分率として表すことができる。この実験で得られた血液プロファイルを図４に示す。
【０２０４】
表６は、従来方法により該脂質ナノカプセルの外側外被中に取り込んだＤＳＰＥ−ＰＥＧのサイズおよびモル比率を示す。
【０２０５】
使用した命名法は、ＰＥＧ成分のモル質量（２ｋ、５ｋは２０００または５０００を表す）および表面脂質全体に対するＤＳＰＥ−ＰＥＧのモル百分率を示す。
【０２０６】
表６  使用した処方物の説明

名称                  サイズ（ｎｍ）      ＤＳＰＥ−ＰＥＧ    
２ｋ−３．３４        ７７±１５          ３．３４モル％      
５ｋ−１．４１        ６１±１５          １．４１モル％      
【０２０７】
これらの結果は、本発明のナノカプセルの血漿半減期が、ラット中で、３．３４モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を基剤とするナノカプセルおよび１．４１モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を基剤とするナノカプセルの両方で、２および３時間であることを示している。しかし、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の鎖により、より大きなステルス効果が得られることは重要である。具体的には、ナノカプセルの表面でＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル数の２分の１未満であるモル数に対して、長いＰＥＧ鎖により、実際、質量２０００ｇ／モルを有する鎖により与えられる保護効果に匹敵する保護効果が得られる。
【０２０８】
例７  先行技術のナノカプセルと本発明のナノカプセルの比較研究
本発明の脂質ナノカプセルおよび先行技術の国際特許第ＷＯ０１／６４３２８号明細書に記載されている脂質ナノカプセルの、血液中で消失する速度を比較するために、例６に示すものと類似の研究を行った。ラット中、図４に記載されている結果と同等の条件下で、処方物１〜４に関する結果を得た。これらの処方物を以下に簡単に説明し、得られた結果を図５に示す。この図は、比較として、Stolnik et al.（３時間の血液速度論のみ）により、およびCahouet et al.により得たデータも含んでなる。
【０２０９】
処方物１  国際特許第ＷＯ０１／６４３２８号明細書に記載されている従来のナノカプセル。親油性界面活性剤はLipoid（商品名）S75-3であるが、これは純粋なレシチンではなく（ホスファチジルコリン７０％）、粒子はＰＥＧを含まない。
【０２１０】
処方物２  Lipoid（商品名）S75-3を基剤とするナノカプセルであるが、従来方法により導入されたＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（１．６５モル％）を含んでなる。
【０２１１】
処方物３  ＨＳＰＣ（ホスファチジルコリン＞９９％）およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００（１．４１モル％）を基剤とするナノカプセル、従来方法により導入されたＰＥＧ５０００を基剤とする、本発明のナノカプセル。
【０２１２】
処方物４  ナノカプセル−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（３．３４モル％）、ＰＥＧ２０００を基剤とする、本発明のナノカプセル、ＨＳＰＣ用の従来方法により取り込むことができる最大量。
【０２１３】
ＦＳ  Stolnik処方物、ＰＬＡ−ＰＥＧの比率１３：５のミセル（ＰＥＧ成分のモル質量２０００ｇ／モル）、その直径は７５ｎｍのオーダーにある。最良処方物のデータは、公開された文献(Stolnik et al., J. Drug Target., 9: 361, 2001)から引用。これらのデータは、ＭＰＳを飽和させない量のナノカプセルをラット中に静脈内注射した後にも得られる。
【０２１４】
ＮＬ．Ａ．Ａ  先行技術の従来ナノカプセル処方物。これらのデータは、Cahouet et al.による研究(Int. J. Pharm. 242:367 2002)から引用した。これらの結果は、国際特許第ＷＯ０１／６４３２８号明細書に記載されているLipoid（商品名）S75-3を基剤とする処方により上記の著者らにより製造された脂質ナノカプセルをラット中に静脈内注射（量は不明）した後にも得られる。
【０２１５】
処方物１および２は、それぞれ、従来ナノカプセルの、その表面がLipoid（商品名）S75-3（不純物を含んでなるレシチン）を含んでなる処方物、およびこれらの同じナノカプセルの、その表面が１．６５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００も含んでなる処方物を表す。このレベルは、従来方法により製造される、Lipoid（商品名）S75-3を含んでなるナノカプセルに取り込むことができる最大含有量に近い。処方物４のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００含有量も、従来方法のために、その最大にある。ホスファチジルコリンＨＳＰＣは、不純物が無く、均質であるために、そのようなＤＳＰＥ−ＰＥＧ含有量を本発明のナノカプセル中に取り入れることができる（実質的にLipoid（商品名）S75-3より２倍多い）。
【０２１６】
これらの結果は、本発明のナノカプセル（処方物３および４）が、血液区画から非常に急速に排除される先行技術の脂質ナノカプセル（国際特許第ＷＯ０１／６４３２８号明細書に記載されている処方物１）よりも、排除率が著しく低いことを示す。例えば、処方物１では、注射された投与量の１０％だけが１時間後に血液中になお存在する。従って、先行技術のナノカプセルはステルス特性を示さない。その上、先行技術のナノカプセル（処方物２）中にＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を取り入れても、血液循環中でのそれらの持続性はほんの僅かに改良されるだけであり、それらの半減期も１時間未満である。実際、それぞれの、処方物１に対するＡＵＣ（５分と２４時間の間の曲線下の面積）の増加（ＡＵＣＦｏｒｍｘ／ＡＵＣＦｏｒｍ１）は、下記の通りである。
−処方物２：１．０６
−処方物３：２．３１
−処方物４：２．６８
【０２１７】
その上、先行技術の説明で記載したように、国際特許第ＷＯ０１／６４３２８号明細書のナノカプセルも、Cahouet et al.によりラットにおける生体内研究の課題になっている。血液からこれらのナノカプセルが排除される速度論は、処方物１で得られたプロファイルよりも僅かに優れ、処方物２のそれと比較的類似しているプロファイル（図５における処方物ＮＬ．Ａ．Ａ）を示すが、これは、恐らく注射された投与量の差ためであろう（ＮＬ．Ａ．Ａ、投与量不明）。Cahouet et al.のナノカプセル（ＮＬ．Ａ．Ａ）の半減期は、１時間未満（正確には４５分間）である。従って、処方物１に関して本出願者が得たプロファイルは、先行技術の研究で得られたプロファイルと比較的類似している。１０００ｇ／モルを超えるＰＥＧの鎖を全く含まないこれら２種類の比較処方物は、血液循環からの急速な排除に対して保護する上で、Solutol（商品名）HS15の短いＰＥＧ鎖（６６０ｇ／モル）が有効ではないことを示す。例えば、これら２種類の処方物は、ステルス特性も、持続的な循環も示さず（２時間で、注射された投与量の１０％）、キャリヤーの組成物に対する変性（ホスファチジルコリン純度の高いレシチンの使用）、特に長いＰＥＧ鎖の付加、の効果を評価するための、非ステルス試料と考えることができる。
【０２１８】
図５も、Stolnik et al.の文献中に開示されている先行技術のデータを示す（記号ＦＳ）。それらの、ＰＬＡ−ＰＥＧミセルの処方物は、注射された量の４０％より僅かに低い量が２時間後に血液循環中になお存在するステルス性質を示す。しかし、このコロイド状製剤のステルス性質は、処方物３（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００）および４（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）に対して、２時間後に注射量のそれぞれ５０％強および６０％強を示す本発明のナノカプセルのそれより低い。注射してから最初の４時間の間に血液循環中に存在する本発明のナノカプセル（処方物３および４）の比率が先行技術のステルスナノカプセル（処方物ＦＳ）のそれよりも明らかに大きいと仮定すると、充実性および／または循環性腫瘍細胞に到達しそうなキャリヤーの量が、有利なことに増加し、従って、処置が成功する機会も増加するであろう。
【０２１９】
例８  後挿入方法により与えられるステルス特性の強化
以前の研究と同じ条件下で行う生体内研究を、４種類の異なった処方物で行った。後挿入方法の優位性を評価するために、本出願者は、該後挿入方法により製造した３種類の処方物のステルス性質を、従来方法により製造した最良の処方物のステルス性質と比較した。この生体内研究の対象である４処方物は下記の通りである。
【０２２０】
処方物２ｋ−３．３４  ナノカプセル−ＨＳＰＣ−ＰＥＧ２０００（３．３４モル％）、ＰＥＧ２０００を基剤とする本発明のナノカプセル、ＨＳＰＣに対する従来方法により取り込むことができる最大量。この処方物は、例７の処方物４に相当し、新しいラット４匹の群に注射した。
【０２２１】
処方物２ｋ−６％  例３で詳細に説明した後挿入方法により、本発明のナノカプセルの表面総脂質の６モル％に相当する量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を取り込んだ、ＨＳＰＣを基剤とするナノカプセル。
【０２２２】
処方物５ｋ−６％  処方物２ｋ−６％のナノカプセルを製造するために調製した、ＨＳＰＣを含んでなる同じ親処方物を基剤とするが、後挿入方法によりＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を取り込んだ、本発明のナノカプセル。
【０２２３】
処方物２ｋ−１０％  処方物２ｋ−６％のナノカプセルを製造するために調製した、ＨＳＰＣを含んでなる同じ親処方物を基剤とするが、後挿入方法により１０モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を取り込んだ、本発明のナノカプセル。
【０２２４】
上に詳細に説明した３種類の処方物が血液から排除される結果を図６に示す。
【０２２５】
図６に示すデータは、後挿入方法の優位性を立証している。具体的には、該後挿入方法により、本発明の、ただし従来方法により製造されたナノカプセルのステルス特性よりも明らかに優れたステルス特性を有する本発明のナノカプセルを得ることができる。その上、この研究は、本発明のナノカプセルのステルス特性が長時間にわたって安定しており、保持されることも立証している。処方物２ｋ−３．３４は、３箇月早く製造され、この研究のために再度注射された。得られたプロファイルは、同等である（注射された量の２２％より僅かに大きい量が、図４に示すように、４時間後に見られる）。図６に示す処方物は、顕著なステルス特性を示している。比較用ナノカプセルの処方物（ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含まない）または（先行する例の処方物１および先行技術の研究の処方物）は、２時間後に１０％未満の残留投与量を示す。
【０２２６】
後挿入方法により、図６の血液プロファイルにより示すように、従来方法により取り込むことができる量よりも大きい量のＤＳＰＥ−ＰＥＧを取り込むことができ、それによって、製剤の循環時間を改良し、注射した後に続く最初の１２時間の間に血液中に大量のナノカプセルを必要とする用途に採用することができる。例えば、該後挿入方法により製造された処方物は、すべて４時間後に注射量の約６０％を示す。８時間目には、処方物２ｋ−６％のナノカプセルの残留物量は、１８％を超えている。より長いＰＥＧ鎖（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００）を有する同じ６モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧは、８時間目に注射量の４０％を超える量を得ることができる。より多くの、１０モル％までのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を導入すると、８時間目に注射量の５０％であり、処方物５ｋ−６％のプロファイルよりも僅かに優れたプロファイルを得ることができる。従って、後挿入方法により製造された、本発明によるナノカプセル処方物のステルス特性は、文献中に記載されている「ステルス」固体ナノ粒子で観察されるステルス特性より明らかに大きい。
【０２２７】
Ｅ）抗癌薬を装填したステルスナノカプセルの製造例
例９  パクリタキセルおよびドセタキセルステルス脂質ナノカプセルの製造
パクリタキセルおよびドセタキセルを従来方法により脂質ナノカプセル中に配合し、次いで得られた薬物装填したナノカプセルを後挿入方法によりポリエチレングリコール化し、ステルス特性を与えることができる。
【０２２８】
脂質ナノカプセルの内側コアを構成するドセタキセルまたはパクリタキセルのトリグリセリド溶液を、その薬物をトリグリセリド中に７５℃で溶解させることにより、調製する。薬物の量は、室温に冷却した時に再結晶しない溶液を得るように調節する。パクリタキセルおよびドセタキセルの場合、短いアルキル鎖を有するトリグリセリドは、長いアルキル鎖（＞Ｃ８）を有するトリグリセリドよりも優れた溶解度を示す。パクリタキセルおよびドセタキセルの、Ｃ８エステル組成が異なるトリグリセリド溶液を表７に示す。
【０２２９】
表７  パクリタキセルおよびドセタキセルのトリグリセリド溶液

トリグリセリド                        溶解度(%w/w)＊ 
名称／供給者            規格          Ｃ８含有量      パクリ        ドセ
タキセル      タキセル  
Labrafac（商品名）cc    C8:50-80%       56.7%           1.6           2
(Gattefosse)            C10:20-50%                                            
Miglyol（商品名）810N   C8:65-80%       70.4%           2.7           3.9
(Sasol)                 C10:20-35%                                            
Tricaprylin             C8: >99%        >99%            6             7
(Sigma)                 C10: NR                                               
＊ 得られるトリグリセリド溶液中の薬物の重量百分率
【０２３０】
表７は、Ｃ８エステル含有量が高いトリグリセリド（すなわちグリセリルトリカプリレート＝Tricaprylin）が大量のパクリタキセルまたはドセタキセルを可溶化することを示している。純粋なＣ８化合物であるTricaprylinは、両方の薬物に対して最良の溶剤であった。６％以下のパクリタキセルおよび７％以下のドセタキセルのTricaprylin溶液は、室温で長期間保存できる。
【０２３１】
一例として、６％ドセタキセルのTricaprylin溶液は、下記の組成を有する。
−Tricaprylin       ５５２．０ｍｇ
−ドセタキセル      ３５．３ｍｇ
【０２３２】
６％ドセタキセルのTricaprylin溶液は、２５℃で数箇月間安定している。
【０２３３】
薬物装填した、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含まない脂質ナノカプセルは、パクリタキセルまたはドセタキセルのTricaprylin溶液から、従来方法により製造することができる。６％パクリタキセルまたは７％ドセタキセルのTricaprylin溶液を使用して脂質ナノカプセルを製造する場合、薬物の結晶がそれぞれ１０日または１１８日後に生じる。この不安定化現象は、これらのTricaprylin溶液が飽和に近いためである。薬物装填した脂質ナノカプセル製剤の安定性は、Tricaprylin中の薬物量を下げることにより、改良することができる。Tricaprylin中５％パクリタキセルで製造した脂質ナノカプセルは、３２日間安定しており、Tricaprylin中６％ドセタキセルで製造した脂質ナノカプセルは、２５℃または５℃で少なくとも７箇月間安定している。
【０２３４】
５％パクリタキセルまたは６％ドセタキセルの「Tricaprylin溶液」で製造した、パクリタキセルまたはドセタキセル装填した脂質ナノカプセルは、下記の組成を有することができる。
−ＨＳＰＣ                    ７５ｍｇ
−Solutol（商品名）HS15       １５４００ｍｇ
−「Tricaprylin溶液」         ５０４ｍｇ
−ＮａＣｌ                    ２２０ｍｇ
−水                          十分に加える５０００ｍｇ
【０２３５】
薬物装填したナノカプセルは、下記の特徴を有する（表８）。
【０２３６】
表８  薬物装填した脂質ナノカプセルの特徴

使用したTricaprylinの溶液         薬物装填(%w/w)        サイズ(nm)    
薬物無し                          ０                  ７２        
パクリタキセル５％              ２．５８％            ７３        
ドセタキセル６％                ３．０９％            ７７        
【０２３７】
ドセタキセルは、パクリタキセルよりも、薬物装填量が優れており、安定性が改良されているので、好ましい。しかし、２％ｗ／ｗパクリタキセル脂質ナノカプセルは数箇月間安定している。３．０９％ｗ／ｗ（「３％」）ドセタキセル脂質ナノカプセルの安定性は２５℃で７箇月を超える。
【０２３８】
次いで、親の薬物装填した脂質ナノカプセル製剤を使用し、例３に記載した後挿入方法により、薬物装填したステルス脂質ナノカプセルを製造する。手短に言うと、得られた薬物装填した脂質ナノカプセル製剤の体積を２５ｍＬにする。２ｍＬのアリコートを使用してＤＳＰＥ−ＰＥＧミセル溶液（表９参照）と共に温置（１５分間の予備温置に続き、６０℃で９０分間温置）し、後挿入時間の後、製剤を氷浴中で冷却する。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ後挿入の後で得られる本発明の課題である薬物装填した脂質ナノカプセルは、数箇月間安定している（配合した薬物の再結晶も、サイズの大きな変化も観察されなかった）。ドセタキセル３．５％を装填した脂質ナノカプセルの幾つかのＤＳＰＥ−ＰＥＧ後挿入を表９に示す。
【０２３９】
表９  ドセタキセル３．５％（ｗ／ｗ）ステルス脂質ナノカプセルの特徴

製剤                                             サイズ（ｎｍ）         
比較用ＬＮ＊                                          ７２              
ＬＮ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−６モル％              ７８              
ＬＮ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００−６モル％              ７９              
ＬＮ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−１０モル％            ８２              
ＬＮ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００−１０モル％            ８３              
＊ ドセタキセル３．５％を含み、同じ条件下で温置し、後挿入を行わなかった脂質ナノカプセル（ＬＮ）
【０２４０】
どの製剤でもドセタキセルの再結晶は起きなかった。比較用製剤と比較して、直径の大きな増加は、ドセタキセル装填した脂質ナノカプセルの表面におけるＤＳＰＥ−ＰＥＧ脂質の効果的な挿入を反映している。
【０２４１】
Ｆ）本発明の抗癌薬を装填したステルスナノカプセルにより生体内で行った毒性実験の結果
例１０  健康なマウスにおける、ドセタキセル装填したナノカプセルとTaxotere（商品名）の毒性評価
マウスにおけるドセタキセルの毒性を、様々な処方物に対して、様々な投与量で評価した。抗癌薬の毒性は、処方物を静脈内注射した後のマウスの体重損失を測定することにより、評価することができる。ドセタキセルを、市販の注射溶液Taxotere（商品名）(Aventis)＊、または非ポリエチレングリコール化脂質ナノカプセル（ＬＮ）およびステルス脂質ナノカプセル（Ｓ−ＬＮ）中処方物として注射した。
【０２４２】
＊Taxotere（商品名）は、ドセタキセルをポリソルベート８０、エタノールおよび水に入れた溶液である。
【０２４３】
脂質ナノカプセルおよびステルス脂質ナノカプセルは、例９に記載されている方法により、ドセタキセル装填量が３％ｗ／ｗになるように製造した。これらの製剤は、２５℃で７箇月を超える安定性を示し、下記の特徴（表１０）を有する。
【０２４４】
表１０  ３％ｗ／ｗドセタキセルを装填したＬＮおよびＳ−ＬＮの特徴

名称        組成                              ポリエチレン        サイズ
グリコール化                    
ＬＮ        ＨＳＰＣ  75mg                        −              ７０ｎｍ    
Solutol（商品名）HS15  400mg      DSPE-PEG２０００
Ｓ−ＬＮ    「Tricaprylin溶液＊」   504mg      ６モル％           ８０ｎｍ    
＊  ６％ｗ／ｗドセタキセルのTricaprylin溶液を使用した。
【０２４５】
ドセタキセル処方物（Taxotere（商品名）、非ポリエチレングリコール化３％ｗ／ｗドセタキセル装填したナノカプセルおよび３％ｗ／ｗドセタキセル装填したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−６モル％ナノカプセル）を、生理食塩水で希釈し、２０、４０および６０ｍｇ／ｋｇドセタキセルで注射した。注射用ドセタキセル溶液は毒性が高いので、Taxotere（商品名）では６０ｍｇ／ｋｇ投与量は試験しなかった。これらのドセタキセル処方物をマウスの８群に投与し、もう一つの「比較用」群には生理食塩水を注射した（表１１）。
【０２４６】
表１１  毒性研究に使用した処方物および投与量

処方物／投与量                      ２０ mg/kg    ４０ mg/kg    ６０ mg/kg  
3%w/w/ドセタキセル装填した            LN-20         LN-40         LN-60 
脂質ナノカプセル(LN)                                                        
DSPE-PEG２０００  -6モル％
3%w/w/ドセタキセル装填した            S-LN-20       S-LN-40       S-LN-60
ステルス脂質ナノカプセル(S-LN)                                              
Taxotere（商品名）                    TXT-20        TXT-40           -      
【０２４７】
毒性研究は、健康な雄のＢＡＬＢ／ｃマウス、体重１７〜２０ｇで行った（処方物一種あたりマウス７匹、８処方物＋比較用１）。マウスは、特定処方物（または比較用群には生理食塩水溶液）２５０μＬを１回の静脈内投与量として投与された。最初の注射（Ｄ０）前の体重を基準体重とする。マウスは、０（Ｄ０）、５（Ｄ５）および１０（Ｄ１０）日で、３回の投与を受けた。マウスは、Ｄ２８まで毎日、次いで、Ｄ３０、Ｄ３３およびＤ４０に、体重を測定し、明らかな有害反応に関して検査した。
【０２４８】
図７は、９群のマウスに対する相対的な体重（Ｄ／Ｄ０）を示す（誤差範囲は示していない。ＲＳＤはすべて＜２．４％であった。）。すべてのドセタキセル処方物が体重損失を引き起こし、その損失は投与量の増加と共に増加した。比較群（Ｃｔｒｌ）は体重増加を示した。ＴＸＴ−４０群に関しては、２匹のマウスが後脚の萎縮および麻痺を示したので、研究を３回目の注射前のＤ１０で中止した。ＴＸＴ−４０群のマウスは、体重損失が１５％を超え、３回目の注射に耐えられなくなったので、１０日目に殺した。
【０２４９】
ＬＮまたはＳ−ＬＮ中に２０ｍｇ／ｋｇで装填されたドセタキセルは、最下点（Ｄ２３）で、Taxotere（商品名）溶液中の対応するドセタキセル投与量よりも低い体重損失（ｂ．ｗ．ｌ．）を引き起こした（Ｐ＜０．０５、Student Test）。その上、Taxotere（商品名）中ドセタキセル４０ｍｇ／ｋｇ投与量（ＴＸＴ−４０）は、９．７日で１５％（ｂ．ｗ．ｌ．）に達し、最も高い毒性を示したが、その（ｂ．ｗ．ｌ．）は、ＬＮ−４０やＳ−ＬＮ−４０の対応する投与量よりも大きく、さらに６０ｍｇ／ｋｇ投与量（ＬＮ−６０およびＳ−ＬＮ−６０）よりも大きかった。処方物の毒性効果を比較するために、１０％および１５％ｂ．ｗ．ｌ．が観察された日数をそれぞれ表１２および図８に示す。
【０２５０】
表１２  マウス（ｎ＝７）における１０％体重損失に対応する平均日数および投与されたドセタキセルの蓄積量

群                      平均日数±ＳＤ            蓄積投与量(mg/kg)   
ＴＸＴ−４０            ６．４±１．１３                ８０          
ＬＮ−６０              ８．３±０．９５              １２０          
Ｓ−ＬＮ−６０          ９．４±０．７９              １２０          
ＬＮ−４０              １０．７±０．９５            １２０          
Ｓ−ＬＮ−４０          １１．１±２．４１            １２０          
ＴＸＴ−２０            １３．０±１．５３              ６０          
ＬＮ−２０              １６．１±３．０８              ６０          
Ｓ−ＬＮ−６０          １７．３±３．３３              ６０          
【０２５１】
表１２および図８は、Taxotere処方物が、ナノカプセル処方物よりも、等投与量でより急速に体重損失を誘発することを示している。１５％ｂ．ｗ．ｌ．は、ＴＸＴ−４０で、処方物ＬＮ−４０およびＳ−ＬＮ−４０またはＬＮ−６０およびＳ−ＬＮ−６０のどれよりも著しく早く起きている（Student TestＰ＜０．０５）。
【０２５２】
結論として、ドセタキセルを脂質ナノカプセルまたはステルス脂質ナノカプセル中にカプセル封入することは、同じ投与量で静脈内投与された市販の溶液Taxotere（商品名）と比較して、抗癌薬の毒性を下げる上で効果的であることが示された。その上、Taxotere（商品名）８０ｍｇ／ｋｇ（２ｘ４０）の蓄積投与量は、毒性が高く、深刻な副作用を起こすのに対し、ＬＮまたはＳ−ＬＮ中のドセタキセルは高投与量、すなわち１８０ｍｇ／ｋｇ（３ｘ６０）で投与することができ、ｂ．ｗ．ｌ．は最下点でも２０％未満であり、最後の投与から数週間で体重は増加することが分かった。従って、薬物を脂質ナノカプセルまたはステルス脂質ナノカプセル中に処方した場合、溶液よりも、高投与量でドセタキセルを投与するか、または観察される毒性効果を少なくすることができる。
【０２５３】
Ｇ）本発明により抗癌薬を装填したステルスナノカプセルを、腫瘍を帯びたマウスに投与して行った、生体内生物配分研究の結果
例１１  ドセタキセルを装填したナノカプセルとTaxotere（商品名）の、Ｃ２６腫瘍を帯びたマウスにおける腫瘍蓄積
本発明により抗癌薬を装填したステルス脂質ナノカプセルの腫瘍蓄積を、３％ｗ／ｗドセタキセル装填したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−６モル％ステルス脂質ナノカプセル（Ｓ−ＬＮ）の処方物、非ポリエチレングリコール化３％ｗ／ｗ脂質ナノカプセル（ＬＮ）の処方物および市販のドセタキセル溶液Taxotere（商品名）（ＴＸＴ）の比較研究で評価した。
【０２５４】
処方物の製造
ドセタキセル装填したＬＮおよびＳ−ＬＮを、該従来方法および後挿入方法により、例１０に記載されているものと同じ成分および同じ相対比率を使用して製造した。両方のナノカプセル処方物を、［３Ｈ］コレステロールヘキサデシルエーテル（ナノカプセルを追跡するため）および［１４Ｃ］−ドセタキセル（薬物を追跡するため）で放射能標識を付けた。［１４Ｃ］−ドセタキセルは、市販のドセタキセル溶液Taxotere（商品名）の標識付けにも使用した。３種類の処方物ＬＮ、Ｓ−ＬＮおよびＴＸＴを生理食塩水で適切に希釈し、ドセタキセル投与量１ｍｇ／ｋｇ（１５０μＬ）で静脈内注射した。ナノカプセル群は、０．７μＣｉの［３Ｈ］および０．２μＣｉの［１４Ｃ］を受け、Taxotere（商品名）マウスには０．３５μＣｉの［１４Ｃ］を注射した。
【０２５５】
Ｃ２６腫瘍を帯びたマウス
実験は、結腸癌２６（Ｃ２６）腫瘍を帯びた雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１７〜２０ｇ）に対して行った。腫瘍を埋植する前に、マウスの背中の毛を刈り取り、薬品で脱毛した。５０μＬ成長媒体中２ｘ１０６細胞の懸濁液を皮下注射することにより、各マウスの背中に３個のＣ２６腫瘍を埋植した。マウスは、細胞接種後１０日間、腫瘍の直径が平均８ｍｍ（５〜１０ｍｍ）に達するまで試験した。次いで、腫瘍を帯びたマウスを３つの群（ＬＮ、Ｓ−ＬＮおよびＴＸＴ）に分け、１ｍｇ／ｋｇドセタキセルの投与量に相当する１５０μＬの処方物を静脈内注射した。注射から２、６および１２時間後にマウスを殺した（ｎ＝５）。
【０２５６】
処理の前に腫瘍を秤量した。腫瘍をSoluene 350の存在下で消化し、３０％過酸化水素を使用して漂白し、例６に記載するようにして得た溶液にシンチレーション液を加えた。腫瘍中のナノカプセルおよびドセタキセルの量を、シンチレーション計数器を使用して［３Ｈ］および［１４Ｃ］放射能をそれぞれ計数することにより評価した。
【０２５７】
様々な時間における腫瘍蓄積の評価
図９は、様々な時間における腫瘍中の脂質ナノカプセル（ＬＮ）およびステルス脂質ナノカプセル（Ｓ−ＬＮ）の蓄積を示す。本発明の３％ｗ／ｗドセタキセル装填したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−６モル％脂質ナノカプセルは、それらの長い循環およびステルス特性のために、３％ｗ／ｗドセタキセル装填した従来の脂質ナノカプセルよりも、どの時点においても、より高い腫瘍蓄積を示した。腫瘍中のＳ−ＬＮ量は、投与から１２時間後に、従来ＬＮより少なくとも３倍高かった。
【０２５８】
図１０は、脂質ナノカプセル（ＬＮ）、ステルス脂質ナノカプセル（Ｓ−ＬＮ）および基準の市販処方物Taxotere（商品名）（ＴＸＴ）に対する腫瘍中ドセタキセル蓄積の量を示す。統計的に重大な差を、一方向分散分析により計算した（特定時間における処方物の間および特定処方物に対する異なった時間の間）。Ｐ値が重大であると考えられる場合（Ｐ＜０．０５）、post-hoc Scheffe試験を使用し、平均対間の比較を行った。静脈内注射から２時間後、腫瘍中に蓄積したドセタキセルの量は、３種類の処方物に対して大きく異なっていなかった（Ｐ＝０．９５４）。投与から６時間後、腫瘍中に蓄積したドセタキセルの量は、Ｓ−ＬＮがＴＸＴよりも著しく高かった。投与から１２時間後にはさらに大きな差が認められたが、ＴＸＴとＬＮの間でドセタキセルの量に大きな差は無く、Ｓ−ＬＮは、ＬＮまたはＴＸＴよりも、より多くのドセタキセルを腫瘍に送達することができた（しかし、腫瘍中のドセタキセル量は、ＴＸＴとＬＮの間で統計的に異なっていない）。各処方物に対するデータの解析により、ＴＸＴ処方物として投与されたドセタキセル量は、時間と共に変化しない（Ｐ＝０．９９５）ことが分かった。従来のＬＮ中で投与されたドセタキセル量は、腫瘍中で時間と共に僅かに増加したが、統計的に重大ではなかった（Ｐ＝０．０６９）。しかし、本発明のドセタキセル装填したＳ−ＬＮでは、腫瘍中のドセタキセル量が時間と共に著しく増加した。
【０２５９】
結論として、本発明のドセタキセル装填したステルス脂質ナノカプセルは、市販のドセタキセル溶液（Taxotere（商品名））よりも、同じ投与量で投与した場合、腫瘍中により多く蓄積することが示された。その上、本出願者は、本発明の薬物装填したステルス脂質ナノカプセルは、その長い循環特性のために、腫瘍箇所を標的とする抗癌剤の量に関して、従来脂質ナノカプセルよりも効果的であることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】図１は、ＨＳＰＣを使用して製造されるナノカプセルのサイズとＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル百分率との関係を示す。
【図２】図２は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含まずに、ＨＳＰＣを使用して製造されるナノカプセルのサイズと表面脂質／総脂質比との関係を示す。
【図３】図３は、後挿入方法を使用して得られる様々な処方物に対するナノカプセルのサイズを示す。
【図４】図４は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を使用して製造されるナノカプセルの処方物に対するステルス特性の比較（血液中における消失の速度論）である。
【図５】図５は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を使用して製造されるナノカプセル、または先行技術により製造されるナノカプセルの様々な処方物に対するステルス特性の比較（血液中における消失の速度論）である。
【図６】図６は、従来方法を使用して、または後挿入方法を使用して製造されるナノカプセルの様々な処方物に対するステルス特性の比較（血液中における消失の速度論）である。
【図７】図７は、３回のドセタキセル静脈内注射（矢印）後のマウスの相対的平均体重の推移である。値は、１群あたりマウス７匹の、平均相対体重を表す。
【図８】図８は、ドセタキセルの様々な処方物をマウス（ｎ＝７）に投与した場合の、１５％体重損失に達するまでの平均日数を示す。
【図９】図９は、マウス（ｎ＝５）に静脈内注射した後の様々な時間における、Ｃ２６腫瘍中の、ドセタキセルを装填した脂質ナノカプセルの蓄積（注射された［３Ｈ］、すなわちキャリヤーの％として表示）を示す。
【図１０】図１０は、マウス（ｎ＝５）に静脈内注射した後の様々な時間における、Ｃ２６腫瘍中の、ドセタキセルの蓄積（ｎｇ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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