(57)【要約】  本発明は、動物細胞培養におけるポリペプチドの組換え発現の一般的分野に関する。より詳しくは、本発明は、ポリペプチドを発現するよう設計され組換え操作されたベクターの細胞における改善された選択に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードする第１核酸を含み、該第１核酸は、選択マーカーのサブユニットをコードする第２核酸に機能しうる形で連結されており、該サブユニットは該選択マーカーの別のサブユニットと相互作用して選択活性を付与しうる、単離された核酸分子。
【請求項２】
該第１核酸がコードするポリペプチドと会合してヘテロマー複合体を形成しうるポリペプチドをコードする第３核酸（該第３核酸は選択マーカーのサブユニットの少なくとも１つをコードする第４核酸に機能しうる形で連結されており、該サブユニットは該第２核酸がコードするポリペプチド選択マーカーサブユニットに会合して選択活性を付与しうる）を更に含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
該ヘテロマー複合体が抗体である、請求項２記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
該第１核酸が、抗体重鎖および抗体軽鎖よりなる群から選ばれるポリペプチドをコードする、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
該選択マーカーが、薬物耐性マーカー、代謝生存マーカー、発色マーカーおよび蛍光マーカーよりなる群から選ばれる、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
該選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、βガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質よりなる群から選ばれる、請求項５記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
配列内リボソーム進入部位が該第１核酸と該第２核酸との間に存在する、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列内リボソーム進入部位が該第３核酸と該第４核酸との間に存在する、請求項２記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
該選択マーカーサブユニットが、相互作用ドメインを含む融合ポリペプチドである、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
該相互作用ドメインが、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃおよびｃ−Ｍａｘよりなる群から選ばれるポリペプチドに由来するロイシンジッパーである、請求項９記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
ゼオマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジンＳおよびＧＰＴよりなる群から選ばれる異なる機能的選択マーカーを更にコードする、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
請求項１記載の単離された核酸分子を含んでなる組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１記載の単離された核酸分子を含有するよう遺伝的に工作された宿主細胞。
【請求項１４】
ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞系およびＷＩ３８細胞よりなる群から選ばれる、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
該第１核酸がコードするポリペプチドに会合してヘテロマー複合体を形成しうるポリペプチドをコードする第３核酸（該第３核酸は、選択マーカーのサブユニットの少なくとも１つをコードする第４核酸に機能しうる形で連結されており、該サブユニットは、該第２核酸がコードするポリペプチド選択マーカーサブユニットに会合して選択活性を付与しうる）を含む第２の単離された核酸分子で形質転換された、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１６】
該宿主細胞により該ヘテロマー複合体が発現される条件下で請求項１５記載の宿主細胞を培養する工程を含んでなる方法。
【請求項１７】
該ヘテロマー複合体が抗体である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該ヘテロマー複合体を単離することを更に含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該宿主細胞が、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞系およびＷＩ３８細胞よりなる群から選ばれる、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞培養におけるポリペプチドの組換え発現の一般的分野に関する。より詳しくは、本発明は、ポリペプチドを発現するよう設計され組換え工作されたベクターの細胞における改善された選択に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養内での長期的増殖に適応した組換え工作された細胞において、多数の商業的に重要なタンパク質が製造されている。しばしば、それらのタンパク質は単一のポリペプチド鎖として発現される。また、これらの細胞においては、例えば、重鎖および軽鎖の同等部分の発現により形成される抗体のような、会合してヘテロマー複合体を形成しうる複数の異種ポリペプチドが発現される。
【０００３】
細胞内でのヘテロマー複合体の発現に際して生じうる１つの難題は、該複合体の成分を形成する組換えポリペプチドのそれぞれを適当な量で入手することである。例えば、抗体の発現においては、重鎖または軽鎖のいずれかを対応相手に対して比較的高レベルまで発現させることが多いが、両方の鎖を高レベルまで且つほぼ等量で発現する細胞系を得ることは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの難題のため、組換えポリペプチドを発現する細胞系を作製する方法においては、追加的な工程、そして更には工程の反復が必要となり、そのため、該ポリペプチドの組換え発現に伴う経費をも実質的に増加させる遅延が生じる。したがって、ポリペプチドの産生を増加させて、ポリペプチドを発現する細胞の選択に必要な経費および時間の投入を減少させるための、細胞培養におけるポリペプチドの高レベルの発現に関する、より簡便な選択方法が、当技術分野において必要とされている。本発明は、ポリペプチドを発現する細胞を選択するための改良された方法を提供することにより、この要求を満足させるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、部分的には、細胞内での組換えヘテローマー複合体の効率的な産生が、該複合体の各成分が比例した量で発現されれば改善されるという前提に基づくものである。このように、本発明は、２以上のポリペプチドを発現する組換え工作された細胞を選択するための方法および組成物を提供する。この場合、該ポリペプチドは、それらのポリペプチドが効率的に会合してヘテロマー複合体を形成しうるよう比例した量で発現され、より高い発現が達成される。
【０００６】
１つの実施形態においては、本発明は２つのベクターを含み、各ベクターは、２つの異なるポリペプチドをコードする少なくとも２つのオープンリーディングフレームを含む。この実施形態においては、第１ベクターは第１ポリペプチドをコードしており、該第１ポリペプチドは、第２ベクターがコードする対応第１ポリペプチドに会合してヘテロマー複合体を形成しうる。また、第１ベクターは第２ポリペプチドをコードしており、該第２ポリペプチドは、第２ベクターがコードする対応第２ポリペプチドに会合して、選択活性（選択可能な活性）を有するヘテロマー複合体を形成しうる。
【０００７】
特定の実施形態においては、本発明は、ポリペプチドをコードする第１核酸を含み、該第１核酸は、選択マーカーのサブユニットをコードする第２核酸に機能しうる形で連結されており、該サブユニットは該選択マーカーの別のサブユニットと相互作用して選択活性を付与しうる、単離された核酸分子を意図する。
【０００８】
もう１つの実施形態においては、本発明は、ポリペプチドをコードする第１核酸（該第１核酸は、選択マーカーのサブユニットをコードする第２核酸に機能しうる形で連結されており、該サブユニットは該選択マーカーの別のサブユニットと相互作用して選択活性を付与しうる）と、該第１核酸がコードするポリペプチドに会合してヘテロマー複合体を形成しうるポリペプチドをコードする第３核酸（該第３核酸は、選択マーカーのサブユニットの少なくとも１つをコードする第４核酸に機能しうる形で連結されており、該サブユニットは、該第２核酸がコードするポリペプチド選択マーカーサブユニットに会合して選択活性を付与しうる）とを含んでなる単離された核酸分子を含む。
【０００９】
もう１つの特定の実施形態においては、前記のヘテロマー複合体は抗体であり、前記の選択マーカーは、薬物耐性マーカー、代謝生存マーカー、発色マーカーおよび蛍光マーカーよりなる群から選ばれる。
【００１０】
本発明は更に、本発明の核酸分子の構築方法、本発明の核酸を発現する宿主細胞の製造方法、本発明の核酸を発現する宿主細胞系、ならびに宿主細胞において該核酸から組換え発現されたヘテロマー複合体の製造・単離方法を提供する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
細胞内での組換えヘテロマー複合体の効率的な産生は、該複合体の各成分が、比例した量で大量に発現されると改善される。本発明は、２以上の異種ポリペプチドを比例した量で発現する組換え操作された細胞を選択するための方法および組成物を提供するものであり、それらのポリペプチドは、従来の方法で製造されたヘテロマー複合体より高い発現レベルでヘテロマー複合体を形成するよう効率的に会合しうる。本発明は、所望の組換えヘテロマーポリペプチド複合体を高レベルで発現する細胞を選択するのに要する時間が短縮される点でも有利である。
【００１２】
本発明は、一緒に発現されると相互作用して選択活性を付与する２以上のサブユニットとして存在しうる選択マーカーを使用する。個々のサブユニットは、単独では、有意な選択活性を有していないが、それらの対応サブユニットと共に発現されると、選択活性をもたらす。該サブユニットの最適な活性は、それらの相互作用に左右され得、このように、相互作用ドメインにより促進され得る。そのような相互作用ドメインは、該サブユニットに内因性のものであり得る。あるいは該サブユニットに異種のものであり得る。
【００１３】
ポリペプチドと選択マーカーのサブユニットとをコードしていて該サブユニットが該ポリペプチドの発現と相関するように配置された核酸分子を構築する。したがって、両方のサブユニットをコードする核酸分子を細胞内にトランスフェクトし、選択条件を適用すると、該サブユニットのそれぞれがほぼ等しい且つ高いレベルで発現されることにより、最高の選択活性が得られるであろう。また、機能しうる形で連結されたポリペプチドはほぼ等量かつ大量に発現され、したがって、所望のポリペプチドを等しい且つ高いレベルで発現する細胞の選択の最適化が生じる。
【００１４】
１つの非限定的な実施形態においては、本発明は、２つの選択マーカーサブユニット（それらのそれぞれは相互作用ドメインとの融合タンパク質として発現される）の使用を含む。該相互作用ドメインは、発現されると、それらの２つのサブユニットの会合または二量体化を促進して、該サブユニットが機能し選択活性を付与するのを可能にする（例えば、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら，（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：１２１４１−１２１４６に記載されているものが挙げられるが、これに限定されるものではない）。
【００１５】
もう１つの実施形態においては、本発明は、３つの選択マーカーサブユニット（それらのそれぞれは相互作用ドメインとの融合タンパク質として発現され、それにより会合を増強して選択活性を付与する）の使用を含む。この実施形態においては、該ヘテロマー複合体の３つの成分が存在する。それぞれの配列をコードする発現されたベクターは、該選択マーカー（例えば、単一の重鎖と２つの異なる軽鎖とを発現する二重特異性抗体が挙げられ、ここで、それらの２つの軽鎖は共に該重鎖に会合しうる）の各対応サブユニットのコード配列に機能しうる形で連結されている。本発明はまた、４つ又は更にはそれ以上のサブユニットを有する公知の又は未だ開示されていない選択マーカーの使用を含む。
【００１６】
後記実施例に示すとおり、本発明の方法および組成物は、単一ポリペプチドを高レベルで発現する所望の細胞を選択するのに要する時間を短縮することが見出された。したがって、もう１つの実施形態においては、本発明は、組換えポリペプチドを高レベルで発現する細胞の選択を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、選択マーカーサブユニットをコードする核酸を、リンカーをコードする核酸にインフレームで融合させ、ついで、相互作用ドメインをコードする核酸にインフレームで融合させる。リンカーは、該相互作用ドメインが相互作用し該サブユニットが機能して選択活性を付与するのを可能にする任意の比較的短く柔軟な配列を含みうる。リンカーの具体例は関連技術分野において豊富にあり、ＧＧＰＧＧ、ＧＰＧＧＧ（ここで、一文字のアミノ酸記号において、Ｇはグリシンであり、Ｐはプロリンである）を含みうる。１つの実施形態において、該リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳである（Ｃｕｒｔｉｓら，（１９９１），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８８（１３）：５８０９−５８１３）。
【００１８】
相互作用ドメインは、２以上の同種または異種ポリペプチドの相互作用または会合を促進しうるポリペプチドを含むドメインである（これらに限定されるものではない）。本発明で用いる「会合」または「相互作用」なる語は、１つの分子が他の分子に結合し及び／又は該他分子の活性に影響を及ぼす少なくとも２つの分子の間の関係を表す意である。相互作用は、２つのポリペプチド（またはポリペプチドと核酸と）の直接的または間接的結合、あるいは別の分子による或る分子の活性の機能的活性化または抑制を含みうる。
【００１９】
１つの実施形態においては、該相互作用ドメインは二量体化ドメインである。二量体化ドメインは、２つのポリペプチドの相互作用または会合を誘導しうるポリペプチドでありうる。２つのタイプの二量体が存在し、（同じ配列と）ホモ二量体を又は（別の配列と）ヘテロ二量体を形成しうる。
【００２０】
１つの非限定的な例示的実施形態においては、該相互作用ドメインはロイシンジッパーコイルドコイルポリペプチドである。ロイシンジッパーは、典型的には、特徴的な７残基の反復を含有し該反復の第１および第４残基に疎水性残基を有する約３５アミノ酸を含む（Ｈａｒｂｕｒｙら，（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１）。したがって、ロイシンジッパーは、ポリペプチドのオリゴマー化を目的とする場合、ポリペプチドとの融合に適している。なぜなら、それは小さな分子であり、ポリペプチドの正常な機能を破壊する可能性が、より大きな相互作用ドメインよりも低いからである。ロイシンジッパーの具体例には、ＧＣＮ４、Ｃ／ＥＢＰ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃおよびｃ−Ｍａｘのようなポリペプチドに由来するロイシンジッパードメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
二量体化ドメインの更なる具体例には、ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン（Ｍｕｒｒｅら，（１９８９），Ｃｅｌｌ  ５８：５３７−５４４）が含まれる。レチノイン酸受容体、甲状腺ホルモン受容体、他の核内ホルモン受容体（Ｋｕｒｏｋａｗａら，（１９９３），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：１４２３−１４３５）ならびに酵母転写因子ＧＡＬ４およびＨＡＰ１（Ｍａｒｍｏｎｓｔｅｉｎら，（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：４０８−４１４；Ｚｈａｎｇら，（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８５１−２８５５；米国特許第５，６２４，８１８号）はすべて、このモチーフを含有する二量体化ドメインを有する。
【００２２】
さらにもう１つの実施形態において、該相互作用ドメインは四量体化ドメインであり、これは、３つの他の四量体化ドメインに結合して四量体複合体を形成しうるポリペプチドである。四量体化ドメインを含有するタンパク質の具体例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラクトースリプレッサー（アミノ酸４６−３６０；Ｃｈａｋｅｒｉａｎら，（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１３７１；Ａｌｂｅｒｔｉら，（１９９３），ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：３２２７；およびＬｅｗｉｓら，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  ２７１：１２４７）、および残基３２２−３５５のｐ５３四量体化ドメイン（Ｃｌｏｒｅら，（１９９４），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：３８６；Ｈａｒｂｕｒｙら，（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１；米国特許第５，５７３，９２５）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
１つの実施形態において、２つのサブユニットを２つのベクターから発現させる。ここで、第１ベクターは、第１ポリペプチドをコードする第１核酸を含み、該第１核酸は、選択マーカーのサブユニットをコードする第２核酸に機能しうる形で連結されている。第２ベクターは、該第１核酸がコードするポリペプチドに会合しうるポリペプチドをコードする第３核酸を含む。ここで、該第３核酸は、異なる選択マーカーサブユニットをコードする第４核酸に機能しうる形で連結されている。したがって、両方のベクターを細胞集団内に同時にトランスフェクトし、該選択マーカー（２つのサブユニットから構成されている）の発現に関する選択を行う。
【００２４】
もう１つの実施形態において、本発明は更に、選択マーカーのサブユニットおよびヘテロマー複合体のポリペプチドに加えて、異なる機能的選択マーカーをコードする核酸を含む。本発明の目的においては、「異なる機能的選択マーカー」は選択マーカーのサブユニットではなく、完全な機能的選択活性を有するタンパク質である。ミコフェノール酸などに対する耐性を付与する、ゼオマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジンＳまたはＧＰＴのような良く知られたマーカーを、異なる機能的選択マーカーとして使用することができる。この実施形態においては、本発明は２つのベクターを含み、それらのベクターのそれぞれは、ヘテロマー複合体を形成しうるポリペプチドをコードする第１核酸、該第１核酸に機能しうる形で連結された、少なくとも１つの選択マーカーサブユニットをコードする第２核酸、および異なる機能的選択マーカーをコードする核酸を含む。さらに、各ベクターの第１核酸がコードするそれぞれのポリペプチドは会合して複合体を形成することが可能であり、各ベクターの第２核酸がコードするサブユニットは会合して選択活性を付与することが可能であり、該第３核酸にコードされるポリペプチドは、該第２核酸がコードするサブユニットの選択活性とは異なる選択活性を付与する。例えば、第１ベクターがネオマイシンに対する耐性をコードし第２ベクターがゼオマイシンに対する耐性をコードすることが可能であり、あるいは、一方のベクターだけが追加的な異なる機能的選択マーカーを含有することが可能である。したがって、１つのベクターを細胞系内にトランスフェクトし、選択を行う（すなわち、薬物Ｇ４１８をネイマイシン耐性細胞に加える）。選択後、通常の方法（例えば、ＰＣＲ、サザンブロット、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなど）を用いて、該ベクターの存在と、該ベクター上の核酸がコードするポリペプチドの発現レベルとを確認することが可能である。高レベルの発現が得られたら、該第２ベクターを該細胞系内にトランスフェクトする。該第１ベクターに関する選択を維持しながら、該第２選択マーカー（すなわち、ゼオマイシン耐性）に関する選択を適用し、該第２ベクターの存在およびそれぞれのベクターがコードするタンパク質の発現を評価する。この実施形態においては、両方のベクターが存在することを確認したら、前記の選択活性、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を付与するよう細胞内で会合しているサブユニットの発現に関する選択を適用する。
【００２５】
もう１つの実施形態において、独立した選択活性をコードする本発明の両方の核酸を同時にトランスフェクトし、同時に選択を適用する。両方のベクターが存在することを確認したら、前記の選択活性、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を付与するよう細胞内で会合しているサブユニットの発現に関する選択を適用する。
【００２６】
さらにもう１つの実施形態において、独立した選択活性をコードする本発明のベクターのそれぞれを別々の細胞系内にトランスフェクトする。選択を適用し、それぞれの所望のベクターがコードするタンパク質を高レベルで発現するクローンを同定したら、該細胞を、Ｈｏｒｉら（米国特許第５，９１６，７７１号）に記載されているとおりに融合させる。融合が完了したら、該サブユニットにより付与される選択活性に関する選択を適用する。
【００２７】
さらにもう１つの実施形態において、独立した選択活性を場合によって含有しない本発明の核酸を第３ベクターと同時にトランスフェクトする。該第３ベクターは、成功裏にトランスフェクトされた細胞の予備選択を可能にしうる例えばネオマイシン耐性またはβガラクトシダーゼのような別々の選択活性をコードする。この予備選択を行ったら、サブユニット、該サブユニットの選択活性（例えば、ＤＨＦＲ）に関する選択を適用することができる。この実施形態においては、等量のそれらの２つの発現ベクターをトランスフェクトし、一方、該第３ベクターを最初の２つのベクターの３分の１の濃度（例えば、３：３：１または６：６：１などの比率）でトランスフェクトする。当業者は、該比率の変更は本発明の範囲内であると認識するであろう。
【００２８】
所望のヘテロマー複合体の成分をコードする核酸は、当技術分野で公知の方法により、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとして得ることができる。例えば、ＲＮＡ単離の標準的な技術を用いたり、ポリＡ  ｍＲＮＡを分離するためのオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーを使用して、所望の成分をコードするメッセンジャーＲＮＡを適当な起源から単離することができる。発現させるヘテロマー複合体が抗体である場合には、所望の核酸の適当な起源は成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ培養から単離することができる。また、本発明で使用する核酸は化学合成により得ることができる。
【００２９】
「ヘテロマー複合体」なる語は、少なくとも２つの異なる分子の会合により形成される分子複合体を包含する意である。該会合は非共有的相互作用または共有結合、例えばジスルフィド結合でありうる。それらの２つの異なる分子は、典型的には、２つの異なるポリペプチドであるが、本発明は、ポリペプチドと核酸との間および異なる核酸間のヘテロマー複合体を意図する。１つの実施形態においては、該ヘテロマー複合体は、基質（例えば、対応抗原に結合しうる免疫グロブリン）への結合能、酵素活性などのような機能活性を与える。１つの実施形態においては、本発明のヘテロマー複合体は、それが産生されている宿主細胞の培地内に分泌される。
【００３０】
特定の実施形態においては、該ヘテロマー複合体は免疫グロブリン分子である。脊椎動物系における免疫グロブリンは、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖とから構成される抗体である。それらの４つの鎖はジスルフィド結合により連結されて、各軽鎖は重鎖と連結され、該重鎖はそれらの尾部間で共に連結されてＹ形のヘテロマー複合体を形成する。増強されたアフィニティーを有する抗体のような又は抗体に基づく他のポリペプチドのような組換えタンパク質をコードしうるＤＮＡを得るために免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡを操作する多数の技術が公知である（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら，（１９８９），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４−９３８；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｒｏｂｅｒｔｓら，（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４−３９７を参照されたい）。
【００３１】
また、本発明においては、完全ヒト抗体（例えば、抗体ライブラリーおよび／またはトランスジェニック動物を使用して産生され、所望により更にインビトロで修飾されたもの）およびヒト化抗体を産生する組換え細胞を使用することも可能である。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら，欧州特許第０，１２５，０２３  Ｂ１号；Ｂｏｓｓら，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら，欧州特許番号０，１２０，６９４  Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号；Ｑｕｅｅｎら，欧州特許第０，４５１，２１６  Ｂ１号；およびＰａｄｌａｎら，欧州特許第０，５１９，５９６  Ａｌ号を参照されたい。例えば、本発明は、特定の細胞標的、［例えば、少数のみを列挙すれば、ヒトＥＧＦ受容体、ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗原、ＣＥＡ抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＮＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ４５、Ｅｐ−ｃａｍ、他の癌細胞表面分子、ＴＮＦα、ＴＧＦ−ｂ１、ＶＥＧＦ、他のサイトカイン、α４β７インテグリン、ＩｇＥ、ウイルスタンパク質（例えば、サイトメガロウイルス）など］を免疫特異的に認識するヒト抗体および／またはヒト化抗体の発現を誘導するために使用することができる。
【００３２】
免疫グロブリン以外のヘテロマー複合体の具体例には、任意のヘテロ二量体またはヘテロオリゴマータンパク質、例えばＢＭＰ２／ＢＭＰ７、骨形成タンパク質、インターロイキン１変換酵素（ＩＣＥ）、種々のインターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−１８受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−４受容体およびＩＬ−７受容体）、核の受容体、例えばレチノイド受容体、Ｔ細胞受容体、インテグリン、例えば細胞接着分子、β１インテグリン、腫瘍壊死因子受容体ならびに可溶性および膜結合性形態のクラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合性複合体タンパク質（ＭＨＣ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。受容体であるヘテロマー複合体に関しては、本発明は該ポリペプチドの可溶性および膜結合性の両方の形態を含む。本発明により製造されうる更なるヘテロマータンパク質の説明は、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．ＩＩ（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ，１９９８）；Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）およびＴｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＡＷ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編，；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ；１９９１）に記載されている。
【００３３】
本発明で用いる「融合タンパク質」なる語は、異種タンパク質またはペプチドに融合したタンパク質またはタンパク質ドメイン（例えば、可溶性細胞外ドメイン）を意味する。そのような融合タンパク質の具体例には、免疫グロブリン分子の一部との融合体として発現されたタンパク質、ジッパー部分との融合タンパク質として発現されたタンパク質、および新規多機能性タンパク質、例えば、サイトカインと増殖因子との（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３との、およびＭＧＦとＩＬ−３との）融合タンパク質が含まれる。ＷＯ  ９３／０８２０７およびＷＯ  ９６／４０９１８は、それぞれ免疫グロブリン融合タンパク質およびジッパー融合タンパク質を含む、ＣＤ４０Ｌと称される種々の可溶性オリゴマー形態の分子の製造を記載しており、それに記載されている技術は他のタンパク質にも適用可能である。本明細書に記載の分子はいずれも、細胞受容体分子の細胞外ドメイン、酵素、ホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン分子の一部、ジッパードメインおよびエピトープを含む（これらに限定されるものではない）融合タンパク質として発現させることが可能である。
【００３４】
本発明は、細胞培養法によるヘテロマー複合体の製造の改善に特に有用である。本発明において使用する細胞系は、商業的または科学的に関心の持たれるタンパク質を発現するよう遺伝的に操作することが可能である。「遺伝的に操作された」は、該細胞が所望のタンパク質を発現するよう該細胞系が組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクト、形質転換または形質導入されていることを意味する。関心の持たれるタンパク質を発現させるよう細胞および／または細胞系を遺伝的に操作するための方法およびベクターは当業者によく知られており、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８および年４回のアップデート）およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に種々の技術が例示されている。
【００３５】
該ヘテロマー複合体の所望の成分をコードする核酸に加えて、ベクター構築物は、原核および／または真核細胞内での複製、真核性染色体内への該構築物の組込みを促進するための追加的な成分、ならびに該構築物を含有する細胞の選択および／またはスクリーニングを補助するマーカーを含みうる。本発明のベクターは、所望の核酸を細胞内に挿入する、プラスミド、ファージ、ファジミド、コスミド、ウイルス、レトロウイルスなどを含む（これらに限定されるものではない）組換えＤＮＡベクターである。
【００３６】
核酸は、それが別の核酸に対して機能的関係で配置されている場合、「機能しうる形で連結」されている。さらに詳しくは、「機能しうる形で連結されている」は、異なるポリペプチドをコードする２つの異なる核酸が同時に転写誘導されることを意味する。また、「機能しうる形で連結されている」は、連結されている核酸が単一の転写単位において連続的でありうるが１以上のリボソーム開始部位（例えば、内部リボソーム開始部位）から翻訳が指令されることを意味すると意図される。
【００３７】
また、本発明の方法は、組換えタンパク質の産生を誘導する公知の又は今後見出される方法と組合せて使用することができる。「誘導条件」は、細胞当たりの所望の組換えタンパク質の相対産生量を増加させるための技術を意味する。そのような技術には、具体例を少数のみ挙げると、低温変化、および化学物質の添加、ならびに任意の公知の又は今後見出される技術の組合せ、ならびに任意の今後記載される及び／又は見出される誘導技術が含まれる。典型的には、高密度の細胞のバッチまたは潅流培養を、該組換えタンパク質を産生するように誘導する。しばしば、細胞エネルギーのほとんどを組換えタンパク質の産生に導くために、他の細胞過程（例えば、成長および分裂）を抑制する。
【００３８】
本発明の方法および組成物においては、相補サブユニットを有する任意の選択マーカーを使用することができる。本発明で用いる「サブユニット」なる語は、選択マーカーに関して用いられている場合には、選択マーカーの一部を意味する。さらに、選択マーカーの第１サブユニットを、同じ選択マーカーの第２の異なるサブユニットと共に発現させて、いずれのサブユニットにも単独では存在しない選択活性のレベルを得ることが可能である。サブユニットは、同様に該選択マーカーの異なるサブユニットである別の突然変異ポリペプチドにより相補される突然変異を有するポリペプチドをも意味しうる。
【００３９】
本発明の方法および組成物においては、動物細胞にとって通常は毒性である特定の薬物に対する耐性を付与する選択マーカーを使用することができる。例えば、以下は耐性選択マーカーの非限定的な具体例である：ゼオマイシン（ｚｅｏ）、ピューロマイシン（ＰＡＣ）、ブラストサイジンＳ（ＢｌａＳ）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するＧＰＴ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ（１９８１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するネオマイシン耐性遺伝子（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，（１９８４），Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）。
【００４０】
本発明の方法および組成物においては、所定の条件下で細胞の生存をもたらしたり細胞死を誘発する代謝酵素を使用することも可能である。具体例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）（Ｗｉｇｌｅｒら，（１９７７），Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（１９６２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）（Ｌｏｗｙら，（１９８０），Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）（これらは、それぞれＴＫ、ＨＧＰＲＴまたはＡＰＲＴを欠く細胞において使用されうる遺伝子である）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
特定の実施形態において、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）が、本発明の方法および組成物において使用する選択マーカーである。ＤＨＦＲは、メトトレキセートに対する代謝拮抗剤耐性のためにも使用されうる（Ｗｉｇｌｅｒら，（１９８０），Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅら，（１９８１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７）。より詳しくは、ＤＨＦＲは、本発明において使用する場合には、２つのサブユニット  Ｆ［１，２］およびＦ［３］（アミノ酸１−１０５および１０６−１８７）に分類され、細胞内での該サブユニットの会合は、それぞれのサブユニットに会合する相互作用ドメインにより促進される（後記実施例、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら，（１９９８），ＰＮＡＳ，９５：１２１４１−１２１４６を参照されたい）。該選択過程においては、細胞はＤＨＦＲ活性を欠いており、ＤＨＦＲ活性の非存在下、選択培地（−ＧＨＴ）内では増殖しない。ＤＨＦＲ断片が会合すると、増殖は回復する。あるいは、内因性ＤＨＦＲを発現する細胞を使用し、メトトレキセートの毒性レベルに対する耐性を増強することにより、トランスフェクタントを選択することができる。
【００４２】
また、本発明においては、−ＧＨＴ感受性細胞の選択後に組換え核酸を増幅するためにメトトレキセートを使用することも可能である。選択は、通常は２５ｎＭ、より好ましくは５０ｎＭ、より一層好ましくは１５０ｎＭ、最も好ましくは３００ｎＭのメトトレキセート濃度で行う。本明細書に記載されているような薬物に対する耐性を付与する組換え核酸を増幅するためにはメトトレキセート濃度を５００ｎＭ以上にもすることが可能であると当業者は認識するであろう。重鎖および軽鎖の発現の場合には、両方の鎖がほぼ等しいレベルで増幅されることが判明しているため、本発明のベクターおよび方法を使用する増幅は特に有用である。
【００４３】
本発明の方法および組成物においては、発色選択に基づく選択マーカーを使用することも可能である。特定の具体例において、βガラクトシダーゼを使用することができる（Ｂｌａｕら，ＷＯ  ９８／４４３５０）。本発明の方法においては、蛍光マーカーを使用することも可能である。例えば、タンパク質断片相補アッセイにおけるタンパク質の相互作用を測定するために、細胞のクローン選択にＧＦＰが使用されている（ＲｅｍｙおよびＭｉｃｈｎｉｃｋ（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６：５３９４−５３９９）。同様に、相補的ＤＨＦＲ断片を発現する細胞を検出するために、フルオレセイン結合メトトレキセートを使用することができる（ＲｅｍｙおよびＭｉｃｈｎｉｃｋ（２００１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：７６７８−８３）。蛍光マーカーの利点としては、この選択は任意の動物細胞型において行うことが可能であり、例えばＤＨＦＲ選択の場合のようには代謝経路に欠損を有するものに限定されず、例えばネオマイシンに対する薬物感受性も要求されないことが挙げられる。
【００４４】
本発明で用いる「ポリペプチド」なる語は、天然に存在する又は組換え発現されたタンパク質を含み、典型的には二次構造を保有する翻訳前および翻訳後プロセシング体またはそれらの断片を含む。タンパク質は、高分子量（［５０〜１００アミノ酸の］小さなものでは約１０，０００から、形態によっては１，０００，０００を超えるものまで）を有する大きな分子である。それらは種々の量の同じ２０アミノ酸から構成され、これらは、無傷タンパク質では、ペプチド結合と称される共有化学結合により一体化している。互いに連結されたアミノ酸は、ポリペプチド鎖と称される直鎖状で非分枝状の重合体構造を形成し、そのような鎖は数百個のアミノ酸残基を含有することがあり、これらは、与えられたタンパク質種についての特定の順序で配置される。「ペプチド」なる語は、典型的には２０アミノ酸長未満の、ポリペプチドまたはタンパク質の短い断片を含む。
【００４５】
「細胞培養」なる語は、多細胞生物または組織以外の細胞の成長および増殖を包含する意である。典型的には、細胞培養は、無菌の制御された温度および雰囲気の条件下、組織培養プレート（例えば、１０ｃｍプレート、９６ウェルプレートなど）もしくは他の付着培養（例えば、ミクロキャリアービーズ）または懸濁培養（例えば、回転びん中のもの）において行う。培養は、振とうフラスコ、小規模のバイオリアクターおよび／または大規模なバイオリアクターにおいて成長させることが可能である。バイオリアクターは、細胞を培養するための装置であり、この装置においては、温度、雰囲気、撹拌および／またはｐＨのような環境条件をモニターし調節することができる。多数の企業（例えば、ＡＢＳ  Ｉｎｃ．，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ；Ｃｅｌｌ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ，ＭＤ）ならびに大学および／または政府支援機構（例えば、Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）が、契約により細胞培養サービスを提供している。
【００４６】
選択活性に関して選択する物質と培養とを接触させるための最適期間は、正常な１増殖周期の典型的な期間（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）では、１増殖周期は約２０〜２２時間と報告されている（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら，（１９９８），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８：３１−４２））より長い。本質的には、１つの実施形態においては、該培養は、選択条件、例えば薬物、代謝産物または発色基質を、好ましくは少なくとも約１日間、より好ましくは少なくとも約３日間、より一層好ましくは少なくとも約７日間含む。
【００４７】
培養内での増殖に適した多種多様な動物細胞系が、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）およびＮＲＲＬ（Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ）から入手可能である。企業や大学の研究室において典型的に使用される、より樹立された細胞系の幾つかには、少数例のみを挙げると、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＣＶ１、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＰＣ１２、骨髄腫（例えば、ＮＳＯ）およびＷＩ３８細胞系が含まれる。他の実施形態においては、非動物細胞系、例えば植物細胞系、昆虫細胞系（例えば、ｓｆ９）、酵母細胞または細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、本発明の方法において使用することができる。
【００４８】
特定の実施形態においては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損突然変異細胞系（Ｕｒｌａｕｂら，（１９８０），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）、ＤＸＢ１１およびＤＧ−４４は、特に好ましいＣＨＯ宿主細胞系である。なぜなら、これらの細胞においては、ＤＨＦＲの選択可能かつ増幅可能な効率的な遺伝子発現系が高レベルの組換えタンパク質発現を可能にするからである（Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０），Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：５２７−５６６）。また、これらの細胞は付着または懸濁培養として容易に操作され、比較的良好な遺伝的安定性を示す。また、当業者によく知られた方法（例えば、形質転換、ウイルス感染および／または選択）を用いて、新たな動物細胞系を樹立することが可能である。
【００４９】
前記のとおり、本発明のヘテロマー複合体を発現させるためには、種々の宿主発現ベクター系を使用することができる。該ヘテロマー複合体が可溶性である場合には、該ペプチドまたはポリペプチドを、培養物から、すなわち、該ヘテロマー複合体が分泌されない場合には宿主細胞から、そして該ヘテロマー複合体が該細胞により分泌される場合には培地から回収することができる。しかし、該発現系は、細胞膜に固定された該ヘテロマー複合体を発現する工作された宿主細胞をも含む。
【００５０】
そのような発現系からの該ヘテロマー複合体の精製または濃縮は、当業者によく知られた適当な界面活性剤および脂質ミセルならびに方法を用いて達成することが可能である。しかし、該ヘテロマー複合体の構造的および機能的特徴を保有させることだけではなく生物活性を評価すること（例えば、薬物スクリーニングアッセイにおけるもの）も重要な場合には、そのような工作された宿主細胞自体を使用することができる。
【００５１】
本発明の方法により発現されたタンパク質を集めることが可能である。また、公知方法を用いて、該タンパク質をそのような培養または成分（例えば、培地または細胞抽出物または体液）から精製または部分精製することが可能である。「部分精製」なる語は、何らかの分画方法が行われているが、所望のタンパク質より多くのポリペプチド種（少なくとも１０％）が存在することを意味する。「精製」は、該タンパク質が実質的に均質であること、すなわち、混入タンパク質が１％未満しか存在しないことを意味する。分画方法には、濾過、遠心分離、沈殿、相分離、アフィニティー精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ；フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのような樹脂を使用）、ＨＰＬＣまたは前記の何らかの組合せの１以上の工程が含まれうるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
また、本発明は、所望により、該タンパク質を製剤化することを含む。「製剤化」なる語は、該タンパク質をバッファー交換に付したり、滅菌したり、バルク充填したり及び／又は最終的な使用者のために充填しうることを意味する。本発明の目的においては、「無菌バルク形態」は、製剤が微生物汚染を伴わない又は（食物および／または薬物の目的に許容されうる程度で）実質的に伴わず、一定の組成および濃度を有する。
【００５３】
「無菌単位投与形態」なる語は、顧客および／または患者の投与または消費に適した形態を意味する。そのような組成物は、有効量の該タンパク質と、生理的に許容される希釈剤、担体または賦形剤のような他の成分とを含みうる。「生理的に許容される」なる語は、有効成分の生物活性の有効性を妨げない無毒性物質を意味する。
【００５４】
以上、本発明を説明したが、以下に、限定的でない例示として実施例を記載する。
【００５５】
実施例
【実施例１】
【００５６】
ＤＨＦＲ相補ベクターの構築
選択マーカーのサブユニットを発現する組換えベクターの構築を以下のとおりに行った。以下の実験で使用する選択マーカーとして、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を選択した。これまでの研究は、そのモジュラー三次元構造のため、ＤＨＦＲが２つの部分に分解されうること、および相互作用ドメインを有する融合タンパク質として発現された場合には、ついでそれらのサブユニットが細胞内で再会合して選択活性をもたらしうることを示している。本発明の１つの実施形態において記載されている種々の核酸の順序の全般的概要については、図１を参照されたい。
【００５７】
連続的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ＳＯＥｉｎｇを用いて、ＤＨＦＲのサブユニットに融合したリンカーポリペプチドに融合したロイシンジッパー相互作用ドメインの融合体をコードする発現ベクター内へのクローニングに適した核酸を得た。簡潔に説明すると、ＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇは、制限エンドヌクレアーゼまたはリガーゼの使用を伴わない結合部位における組換えＤＮＡ分子の重複伸長による遺伝子のスプライシングである（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，“ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”および“Ｃｈａｐｔｅｒ  ２５：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，”Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ編，１９９３，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；およびＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍ．Ｈｏｒｔｏｎ，ｐｐ．２５１−２６１）。
【００５８】
組換えようとする遺伝子からの断片を別のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において作製する。該プライマーは、産物の末端が相補的配列（例えば、一般的な制限部位、すなわち、ＢａｍＨ１）を含有するように設計する。ついでこれらのＰＣＲ産物を混合し変性させ再アニーリングさせると、それらの３’末端にマッチ配列を有する鎖が重なり、お互いのプライマーとして働く（Ｈｏｒｔｏｎら，（１９８９），Ｇｅｎｅ，７７（１）：６１−８）。
【００５９】
本実施例において使用するプライマーは以下のとおりである。
【００６０】
【化１】
2005511031.tif 000002
【００６１】
以下の方法を用いて、ＤＨＦＲアミノ酸１−１０５にインフレームで融合したリンカーにインフレームで融合したロイシンジッパー相互作用ドメインをコードする核酸を作製した。第１  ＰＣＲ反応において、プライマーＪＭ２３８（配列番号１）およびＪＭ２３９（配列番号２）を使用して酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー（Ｌｚ）を増幅させた。すべてのＰＣＲ反応において、Ｒｏｃｈｅ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ系を使用し、これは、商業的に入手可能な１０ｍＭ  ｄＮＴＰ以外の必要な試薬のすべてを含んでいた。加熱サイクル条件（ＰＣＲ条件１）は以下のとおりであった。
９４℃で５分間
９４℃で３０秒間‐‐‐‐‐
３７℃で３０秒間          │‐‐‐２５サイクル
７２℃で３０秒間‐‐‐‐‐
７２℃で７分間
４℃（維持）。
【００６２】
ＪＭ２３８プライマーは５’末端にＸｈｏ１部位を有し、ＪＭ２３９プライマーは５’末端にＢａｍＨ１部位を有する。同時に、プライマーＪＭ２４０（配列番号３）およびＰＤＨＦＲ１０６（配列番号４）を使用して、ＤＨＦＲ（配列番号５）のアミノ酸１−１０５をコードするＤＨＦＲサブユニットをＰＣＲ増幅した［９４℃で１分間の持続時間および７２℃で２５サイクル（ＰＣＲ条件２）を伴う以外は前記と同じ］。ＪＭ２４０はその５’末端にＢａｍＨ１部位を有し、ＰＤＨＦＲ１０６はその５’末端にＭｆｅ１部位を有する。標準的なゲル精製技術を用いて、それぞれの対応ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＰＣＲ条件２を用いて第２  ＰＣＲ反応を行った。ついで、得られた産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングし、配列決定した。
【００６３】
同様の方法を用いて、ＤＨＦＲアミノ酸１０６−１８７にインフレームで融合したリンカーにインフレームで融合したロイシンジッパーをコードする核酸を作製した。第１  ＰＣＲ反応において、ＰＣＲ条件１を用いてプライマーＪＭ２３８（配列番号１）およびＪＭ２３９（配列番号２）を使用して酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパーを増幅させた。ＪＭ２３８プライマーは５’末端にＸｈｏ１部位を有し、ＪＮ２３９プライマーは５’末端にＢａｍＨ１部位を有する。同時に、プライマーＪＭ２４２（配列番号６）およびＪＭ２４４（配列番号７）を使用し、ＰＣＲ条件１を用いて、ＤＨＦＲ（配列番号５）のアミノ酸１０６−１８７をコードするＤＨＦＲサブユニットをＰＣＲ増幅した。ＪＭ２４２はその５’末端にＢａｍＨ１部位を有し、ＪＭ２４４はその５’末端にＭｆｅ１部位を有する。標準的なゲル精製技術を用いて、それぞれの対応ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＰＣＲ条件１を用いて第２  ＰＣＲ反応を行った。ついで、得られた産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングし、配列決定した。
【００６４】
正しい配列を確認したら、Ｌｚ−リンカー−ＤＨＦＲ  １−１０５（３６３ｂｐ）およびＬｚ−リンカー−ＤＨＦＲ  １０６−１８７（３４３ｂｐ）断片をｐＧＥＭ−ＴベクターからＸｈｏ１およびＭｆｅ１で切断し、該核酸をゲル精製した。ベクターｐＤＣ３１７をＮｏｔ１およびＸｈｏ１で消化し、５５８ｂｐの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素をゲル精製により回収した。Ｘｈｏ１はｐＤＣ３１７上の唯一の部位ではないため、Ｎｏｔ１／Ｘｈｏ１  ＩＲＥＳ要素、Ｘｈｏ１／Ｍｆｅ１  Ｌｚ−リンカー−ＤＨＦＲ  １−１０５およびＬｚ−リンカー−ＤＨＦＲ  １０６−１８７の間の三重連結をｐＤＣ３１７において行い、単離物を試験し、うまく連結されたことを制限消化により確認した。
【００６５】
マウスインターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）を特異的に認識する抗体をコードする抗体（Ａｂ）重鎖および軽鎖遺伝子をそれぞれ、前記のとおりに調製したベクター内にクローニングした。抗ＩＬ４Ｒ重鎖（ＨＣ）をＮｏｔ１およびＳａｌ１で消化した。この消化から、１４１３ｂｐの断片をゲル精製により単離した。同様にして、抗ＩＬ４Ｒ抗体の軽鎖（ＬＣ）を同じ酵素でベクターから切断し、７３６ｂｐの軽鎖断片をゲル精製した。また、Ｌｚ−ＬＩＮＫＥＲ（リンカー）−ＤＨＦＲ−ｐＤＣ３１７ベクター（共に１−１０５および１０６−１８７）をＮｏｔ１およびＳａｌ１で切断し、重鎖および軽鎖を対応発現ベクター内にクローニングした。以下の組合せを得た。
【００６６】
【化２】
2005511031.tif 000003
【実施例２】
【００６７】
第２セットのＤＨＦＲ相補ベクターの構築
選択マーカーのサブユニットを発現する第２セットの組換えベクターの構築を以下のとおりに行った。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有するビシストロンベクターはｐＥＤ４（Ｋａｕｆｍａｎ（１９９１），Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１６）：４４８５−４４９０）に基づく。基礎ベクターｐＤＣ３１８は、発現増強配列要素（ＥＡＳＥ）のトランケート化６００塩基対部分を含有するｐＧ２．１（Ａｌｄｒｉｃｈ（１９９８），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８：９−１７）の誘導体である。ｐＤＣ３１７は、より大きな３．６キロベースのＥＡＳＥを含有する類似ベクターである。ＰＣＲを用いて、ＧＣＮ４ロイシンジッパー（ＬＺ）および柔軟なリンカーを、選択マーカーであるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の２つの別々の断片に融合させた。該第１断片はアミノ酸１−１０５に伸長し、該第２断片はアミノ酸１０６−１８７を含む。ついで最終的なＰＣＲ産物をＩＲＥＳ要素の直下流のｐＤＣ３１７またはｐＤＣ３１８内にクローニングした。
【００６８】
ＬＺ−リンカー−ＤＨＦＲ断片の翻訳を増強するようＤａｖｉｅｓらにより作製されたｐＥＤ３ベクターに基づき該ＩＲＥＳ要素を修飾した（Ｄａｖｉｅｓ（１９９２），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６（４）：１９２４−１９３２）。プライマーＪＭ２５６（５’−ＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＡＴＧＡＡＡＣＡ−３’）を使用するＰＣＲにより、この変化をｐＤＣ３１７内のＩＲＥＳ  ＬＺ−リンカーＤＨＦＲ断片内に導入した。下線のＡＴＧはｐＥＤ３  ＩＲＥＳからＬＺへの変化を示す。ついで該断片を、完全長ＩＲＥＳ配列を含有するｐＧＥＭ−Ｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングした。ついでｐＥＤ３  ＩＲＥＳ  ＬＺ−リンカー−ＤＨＦＲ  １−１０５および１０６−１８７断片をｐＤＣ３１８内にクローニングしてそれぞれｐＤＣ３２１およびｐＤＣ３２２を、またはｐＤＣ３１７内にクローニングしてｐＤＣ３２３またはｐＤＣ３２４を作製した。
【００６９】
マウス抗ＩＬ−４Ｒ抗体鎖をｐＥＤ  ＩＲＥＳの直上流のｐＤＣ３２１およびｐＤＣ３２２のマルチクローニング部位内にクローニングして、ｐＤＣ３２１  ＬＣ、ｐＤＣ３２１  ＨＣ、ｐＤＣ３２２  ＬＣおよびｐＤＣ３２２  ＨＣを作製した。同様にして、重鎖および軽鎖をｐＤＣ３２３およびｐＤＣ３２４のマルチクローニング部位内にクローニングして、ｐＤＣ３２３  ＬＣ、ｐＤＣ３２３  ＨＣ、ｐＤＣ３２４  ＬＣおよびｐＤＣ３２４  ＨＣを作製した。
【実施例３】
【００７０】
トランスフェクションおよび選択
前記ベクターのトランスフェクションをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞系において行った。標準的なトランスフェクションプロトコールを用いた。細胞を３７℃で対数期までインキュベートし、１５０μＬのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を該製造業者の推奨どおりに使用して適当な濃度の精製プラスミドでトランスフェクトした。ｐＤＣ３２１  ＬＣ：ｐＤＣ３２２  ＨＣ：ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＣ３２１  ＨＣ：ｐＤＣ３２２  ＬＣ：ｐＣＤＮＡ３、ｐＤＣ３２３  ＬＣ：ｐＤＣ３２３  ＨＣ：ｐＣＤＮＡ３、またはｐＤＣ３２４  ＨＣ：ｐＤＣ３２４  ＬＣ：ｐＣＤＮＡ３が６：６：１の比となるよう、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクションを行った。
【００７１】
初期選択を振とうフラスコ内の非ＤＨＦＲ選択培地＋Ｇ４１８において行い（７０％までの生存率の回収）、ついで、グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く（−ＧＨＴ）ＤＨＦＲ選択培地において選択を行った（９０％までの生存率の回収）。Ｇ４１８および−ＧＨＴ選択の後で得られたプールを２５ｎＭ  メトトレキセートに付して、該抗体鎖を増幅し、それにより該プール内の抗体産生を増強した。未増幅プールおよび増幅プールの両方は、この期間における抗体の安定な産生を示している。
【００７２】
クローニングのために、トランスフェクト化細胞を希釈し、９６ウェルプレート内の−Ｔ増殖培地に直接プレーティングした。Ｇ４１８または−ＧＨＴ培地内での前選択は不要であった。
【００７３】
ｐＤＣ３２１およびｐＤＣ３２２ベクターの場合には、該未増幅プールは１μｇ／１０６細胞／日のｑＰを維持した。該増幅プールのｑＰの増加は、選択からの該細胞の回収後の生存率の増加と相関する。該増幅プールのｑＰは８〜１８μｇ／１０６細胞／日の範囲であり、これは、該未増幅プールと比較して抗体産生における８〜１８倍の増加を示す。５つの独立したプールを評価し、それらは類似した発現レベルを示すことが判明している。該プールの分析に加えて、該クローンのうちの２つを振とうフラスコに大規模化し、２５ｎＭ  メトトレキセートで増幅し、発現に関して評価した。発現は、該プールに関して記載されている結果に類似していた。
【００７４】
ｐＤＣ３２３およびｐＤＣ３２４ベクター、すなわち、３．６キロベースのＥＡＳＥ要素を含有するベクターの場合には、該未増幅プールは約５μｇ／１０６細胞／日のｑＰを維持した。
【実施例４】
【００７５】
相補ベクターからの抗体の発現
ついで未増幅および増幅プールを模擬産生条件下で評価した。より低い温度（例えば、３１℃）への変化は、より高い力価を招く。より低い温度に変化させた２０ｍＬ  振とうフラスコ培養において誘導を行った。抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。未増幅プールは８０μｇ／ｍＬの抗体を９日間で産生する一方、６５．８％の最終生存率を維持した。３つの独立したプールを分析した。該増幅プールは平均で４０７．８μｇ／ｍＬの抗体を１０日間で産生し、平均最終生存率は４７．２％であった。該プールの比産生度（ｑＰ）は１０〜２０μｇ／１０６細胞／日の範囲であった。
【実施例５】
【００７６】
抗体のウエスタンブロット分析
ｐＤＣ３２１またはｐＤＣ３２２ベクターでトランスフェクトされた細胞から発現された抗体を標準的な方法により単離し、精製し、変性ゲルおよび天然ゲル上で移動させた。１ｍｍ、１０ウェルの４〜２０％  Ｔｒｉｓ  グリシンゲルを１２５Ｖで約２時間移動させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ６０２５）。該サンプルは加熱せず、５％  βメルカプトエタノール（最終濃度２．５％）の存在下（還元）または非存在下（非還元）、２×天然ゲルＴｒｉｓグリシンサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＣ２６７３）内に懸濁させた。該サンプルバッファーは１×ＳＤＳランニングバッファーであった。該ゲル自体にＳＤＳまたは還元剤が存在せず、示されているサンプルバッファーのみが存在する場合、該ゲルは非変性であった。
【００７７】
ニトロセルロース（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＬＣ２００１）へのトランスファーを３３Ｖで４５分間行った。該メンブレンを、ＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％  脱脂粉乳または「ブロット（ｂｌｏｔｔｏ）」溶液中、４℃で一晩ブロッキングした。該ブロッティング等級のアフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ結合抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１７０−６５１６）をブロット溶液中、１：２０００で希釈し、該ブロットに２．５時間適用した。ついで該ブロットをＰＢＳＴ中で５回（各５分間）リンスし、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮ２１０６）で３０秒間現像した。
【００７８】
該サンプルはすべて、９０継代の該培養の上清に由来するものであった。特に、該精製抗体は、誘導された未増幅培養から採取され、プロテインＧカラム上で精製された。０ｎＭの上清はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器（ＵＦＶ２ＢＣＣ４０）により３０００ｒｐｍで１０倍濃縮した。なぜなら、Ｍｕ  ＦＣ  ＥＬＩＳＡによるその濃度はその他のサンプルより低かったからである。該非還元ゲルが示すところによれば、重鎖および軽鎖を有する抗体はすべての場合に存在し、２５および５０ｎＭ  上清中には遊離軽鎖または二量体化軽鎖がごく僅かしか存在せず、一方、０ｎＭ  上清中には何も認められず、該精製Ａｂ中にはいくつかの二量体化軽鎖が存在する。
【００７９】
該重鎖および軽鎖は、該精製抗体として、等しい比率で該上清のすべてに存在した。重要なことに、メトトレキセートで増幅された上清中には、相当に多くの全抗体が存在しており、このことは、実施例３の結果と一致している。
【００８０】
また、ｐＤＣ３２３またはｐＤＣ３２４ベクターでトランスフェクトされた細胞からも抗体を精製した。該細胞の上清からの抗体は、非還元ゲル上、等しい比率の重鎖および軽鎖を有しており、遊離軽鎖または二量体化軽鎖はごく僅かしか存在しなかった。
【実施例６】
【００８１】
ＤＨＦＲ発現のＦＡＣＳ分析
メトトレキセート曝露後のＤＨＦＲ発現の付随的増幅を確認するために、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を用いた。未増幅および増幅プールを、ＤＨＦＲに結合するフルオレセイン標識メトトレキセートで標識し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ分析装置上で分析した。未標識の未トランスフェクト化ＣＳ９細胞を対照として使用した。予想どおり、未増幅プールおよび増幅プールの両方がＤＨＦＲ活性を示す。２５ｎＭ  メトトレキセート増幅プールにおいては、０ｎＭ  メトトレキセート未増幅プールの場合より大きな度合の蛍光が観察される。これは、抗体発現の増幅がＤＨＦＲ発現の増幅と相関することを証明している。
【００８２】
均等物および参考文献
本発明の範囲は、本発明の個々の態様の単一の例示と意図される本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものではなく、機能的に等価な方法および成分は本発明の範囲内である。実際のところ、前記の説明および添付図面から、本明細書に示され記載されているもの以外に、本発明の種々の修飾が当業者に明らかとなろう。そのような修飾は添付の請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【００８３】
本明細書に記載のすべての刊行物、特許および特許出願を、各個の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】実施例で使用した核酸構築物の概要図。各構築物は、選択マーカーのサブユニットを含み、細胞内で互いに会合してヘテロマー複合体を形成しうる異なるペプチドを発現する。略語は以下のとおりである：ＥＡＳＥ，発現増強配列；ＣＭＶ，サイトメガロウイルスプロモーター；ＨＣ、重鎖；ＬＣ，軽鎖；ＩＲＥＳ，配列内リボソーム進入部位；ＤＨＦＲ，ジヒドロ葉酸レダクターゼ；およびｐＡ，ポリアデニル化シグナル。
【図１】
2005511031.tif 000004
【国際調査報告】
2005511031.tif 000005