(57)【要約】二重結合を含有する弱塩基性分子（とりわけビニルピリジン）はタンパク質中の−ＳＨ基と反応し、選択的にアルキル化することによって、その二硫黄架橋への再酸化を防ぐことができる。ヨードアセトアミドのような従来のアルキル化試薬とは違い、そのような分子は、複雑なタンパク質中でも、他の官能基と反応せずに、全ての−ＳＨ基の１００％のアルキル化に至る。それらの使用は、プロテオーム分析において、より一般的には−ＳＨ基がブロックされるタンパク質を分析する上でとりわけ効果的である。さらに、部分的または全体的に重水素化されたビニルピリジンの使用により、したがって非重水素化ビニルピリジンと比較した際の質量の相違によって、タンパク質合成の誘導／抑制の研究が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質中の−ＳＨ基の選択的アルキル化の方法であって、前記タンパク質を中性またはアルカリ性環境中、
（ａ）一個以上の弱塩基性窒素基と
（ｂ）少なくとも一個のアクリル型二重結合と
を有する弱塩基性化合物と反応させることを含み、
全−ＳＨ基のアルキル化率が９０％を超える、前記方法。
【請求項２】
弱塩基性化合物が２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、または４−ビニルピリジンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
弱塩基性化合物が２−ビニルピリジンおよび４−ビニルピリジンから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ビニルピリジンが部分的または全体的のいずれかで重水素化されている、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
全−ＳＨ基のアルキル化率が９５％を超える、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
全−ＳＨ基のアルキル化率が約１００％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項６に記載の方法により分析されるタンパク質の−ＳＨ基の事前アルキル化を含む、電気泳動技術または分析技術によるタンパク質分析のための方法。
【請求項８】
電気泳動技術または分析技術が、
−  未処理の状況下または変性状況下のいずれかでのプロテオーム分析または複合タンパク質／ペプチド混合物の分析；
−  等電点電気泳動（一般的または固定式pH勾配のいずれか）による第一次元と、その後に続く第二のＳＤＳ−ＰＡＧＥ次元を含む、電気泳動二次元マップ；
−  １−、２−、または多−次元のいずれかであり、自由相型、またはゲル型のいずれかである、電気泳動法；
−  自由相またはふるい分け液体ポリマーのいずれか、ＳＤＳの存在下、等電点電気泳動方式、従来のキャピラリー、マイクロチップ、およびナノチップ内での、キャピラリー電気泳動；
−  上記方法と、オンラインまたはオフラインのいずれかでのブロット法および質量分析との組み合わせ；
−  １−、２−、または多−次元のいずれかでのクロマトグラフィー分離；
−  ２−、または多−次元のいずれかでの電気泳動／クロマトグラフィーの混合型分離；
−  単独または組み合わせるかのいずれかの、あらゆる型の電気泳動またはクロマトグラフィー手法による、プロテオーム分析、または複合タンパク質／ペプチド混合物の一般的な分析における事前分画手法；
から選択される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の説明
本発明は、タンパク質内の−ＳＨ基の選択的および効率的アルキル化のための方法に関するものである。本発明の方法は、タンパク質の分析および特徴性決定のための多くの分析技術において有用である。
【０００２】
発明の背景
ポストゲノム時代において、出現しつつある分野は「プロテオミクス」と呼ばれる学問分野である。すなわち、全生体内の、生物学的液体内の、細胞溶解産物内の、組織内に存在する全てのタンパク質を解離し、同定し、定量化し、特徴を決定する方法を組み合わせることによって、遺伝子の発現を包括的に分析することを目的とする研究分野である（Wilkins, M.R., Williams, K.L., Appel,R.D., Hochstrasser, D.F., Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics, Springer, Berlin, 1997）。「プロテオーム」という用語は新しく導入された言葉で、ゲノムによって発現される全ての組のタンパク質を正確に示す。プロテオームは、単純な細胞溶解産物であっても、著しく複雑になる（数千のタンパク質を含む）ことがあるので、その分析のためには、二次元（２−Ｄ）マップと呼ばれる強力な分離法を用いる。この分離法は、第一次元目における電荷ベースの分離法（等電点電気泳動、ＩＥＦ）を、第二次元目における質量ベースの分離法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸ドデシルナトリウムの存在下でのポリアクリルアミドのゲルの電気泳動）と結び付けたものである。１９７５年に既に導入されている（O'Farrell,P.H., J.Biol.Chem., 250, 1975, 4007-4021）この方法は、新しい染色法（Rabilloud,T., Anal.Chem.72, 2000, 48A-55A）の出現、新しい界面活性剤（Chevallet,M.et al., T.,Electrophoresis 19, 1998, 1901-1909）の出現、固定化pH勾配剤の出現とともに、長年にわたって精緻化されてきた。
【０００３】
複合タンパク質混合物の分析における主要な問題は、（ａ）完全な試料の可溶化、（ｂ）多様な電気泳動ステップの間の人工物（artifacts）の排除を含んでいる。第一の問題を解決するために、アミドスルホンベタイン型の新しい界面活性剤が、尿素・チオ尿素のようなカオトロピック試薬とともに記述されている（Rabilloud,T.et al., J., Electrophoresis 18, 1997, 307-316）。人工物の排除については、ジスルフィド架橋の還元とアルキル化が二次元マップの誤ったタンパク質ゾーンの生成を防ぐのに基本的なステップであることが最近になって実証されている。未処理のタンパク質の（典型的にはジチオトレイトール又は２−メルカプトエタノールの過多によって得られる）ジスルフィド架橋の還元だけでは、とりわけ第一のＩＥＦ次元においては、人工物を防ぐことはできない。実際、ＩＥＦ分離の間、とりわけアルカリ性環境においては、還元−ＳＨ基が自発的に再酸化し、同一のまたは異なるポリペプチド鎖間のホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーのために、人工物のバンドを生成する（Herbert,B.et al.,Electrophoresis 22, 2001, 2046-2057）。したがって、どの分離ステップにも先立って、試料の基本的な前処理として、タンパク質を還元しアルキル化することが提案されている。標準アルキル化試薬は常にヨードアセトアミドである。このヨードアセトアミドは、１９５０年代から、タンパク質化学者によって推奨され、全ての分析プロトコルにおいて普遍的に採用されている。しかし、最近のデータは、このアルキル化試薬の深刻な限界を示している。
【０００４】
（ａ）まず第一に、全ての還元−ＳＨ基の１００％のアルキル化を得ることは不可能であり（Galvani, M. et al., Electrophoresis 22, 2001, 2058-2065）、したがって多くの遊離−ＳＨ基が手つかずのままになり、誤ったバンドを生成する潜在的な可能性がある。もし、アルキル化の方法が長時間にわたって（＞６時間）長引けば、遊離−ＳＨ基の反応が進行しないだけでなく、他の反応基、とりわけリジンのε−アミノ基の非選択的なアルカリ化も発生する。
【０００５】
（ｂ）さらに、アルキル化反応は、複合タンパク質混合物を可溶化するために採用された多くの界面活性剤の存在によって強力に阻害される。
【０００６】
（ｃ）最後に、ヨードアセトアミドは、タンパク質分析において現在まで普遍的に採用されている可溶化剤の一つと、厳密にはチオ尿素と急速に反応することが最近になって報告されている。ヨードアセトアミドのチオ尿素（著しく過多に存在する）への付加はタンパク質内の−ＳＨ基への付加よりもさらに急速で、反応収量を著しく抑える、寄生的な反応である（Galvani, M. et al., Electrophoresis 22, 2001, 2066-2074）。
【０００７】
発明の説明
上記全ての欠点を克服する方法が現在見出されている。
【０００８】
本発明の方法は、二重結合を有する弱塩基性化合物がタンパク質の還元−ＳＨ基と定量的、選択的に反応すること（すなわち、リジン、チロシン、末端−ＮＨ2基などのその他のタンパク質基との副反応を避けることによって）を見出すことに基礎をおいている。さらに、前記弱塩基性化合物は、チオ尿素のような可溶性混合物の他の成分との誤った反応を起こさないので、前記可溶性混合物において典型的に利用される界面活性剤によっては阻害されない。
【０００９】
本発明の方法に有用な弱塩基性化合物は次のような構造特性を有している。
（ａ）一つ以上の弱塩基性窒素基の存在
（ｂ）アクリル型二重結合の存在。
【００１０】
したがって、本発明は、
（ａ）一つ以上の弱塩基性窒素基と、
（ｂ）少なくとも一つのアクリル型二重結合とを
有する弱塩基性化合物との前記タンパク質の中性またはアルカリ性環境における反応を含み、全−ＳＨ基のアルキル化率が９０％より高い、タンパク質内の−ＳＨ基の選択的アルキル化の方法を与えるものである。
【００１１】
本発明はさらに、電気泳動技術または分析技術という手段によるタンパク質の分析方法に関するものであり、請求項において定義される方法によって分析されるタンパク質の−ＳＨ基の事前アルキル化を含んでいる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の方法において使用される好ましい弱塩基性化合物の例としては、下記の式を有する２−および４−ビニルピリジンのようなビニルピリジンである。
【００１３】
【化１】
2005519880.tif 000002
【００１４】
【化２】
2005519880.tif 000003
【００１５】
３−ビニルピリジンを使用することも可能である。しかし、より高い自己重合性向を考慮して対策を図る必要がある。
【００１６】
タンパク質中の−ＳＨ基に対するアルキル化試薬としてのビニルピリジンの使用は、M.J. Dunn（in: Gel Electrophoresis: Proteins, Bio. Sci. Publ. Oxford, 1993）によって、ただ包括的に言及されているだけである。にもかかわらず、ビニルピリジンは、実際の研究所での実施の際には、未開示の極端な選択特性、完全な反応性、および非常に高い分子特異性を有するとは認められていない。
【００１７】
本発明の方法は、所与のタンパク質の−ＳＨ基の９０％、好ましくは９５％を超える、さらに好ましくは約１００％のアルキル化を見越している。
【００１８】
さらに、本発明の方法は、アルカリ性および中性のpH値の両方でのタンパク質のアルキル化のために使用することができ、両性イオンの界面活性剤（たとえば、ＣＨＡＰＳ、アミドスルホンベタイン）、陰イオン（たとえばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））型の、中性の界面活性剤（Triton X-100、Nonidet P-40）のタンパク質試料の存在に適合する。さらに、ビニルピリジンは、尿素およびチオ尿素のような複合タンパク質混合物を可溶化するために通常利用されるカオトロピック剤と完全に適合する。それは、ビニルピジンが、通常の実験状態においては、これらの化合物と反応しないからである。
【００１９】
ジチオトレイトールのような適当な還元剤による還元後、タンパク質は、約１５〜３０℃、通常約２０〜２５℃の範囲の温度で、約３０分〜６時間、通常約４５分〜２時間の間、本発明の弱塩基性化合物と反応する。タンパク質溶媒は決定的なものではなく、リン酸塩またはTris−ＨＣＬ緩衝剤などの水性緩衝剤からなる。過剰の弱塩基性化合物が、たとえば分析されるタンパク質の５０μMの溶液に対して、通例、１００mM使用される。
【００２０】
ビニルピリジンは任意に、全体的（ヘプタ−重水素化）または部分的に（ビニル部分またはピリジン環に応じて）重水素化することができる。これは、生物学的試料におけるタンパク質合成の定量的研究のために行われたもので、（Gygi, S. P., Aebersold, R., in Proteomics: a Trend Guide, Blackstock, W., Mann, M., eds., Elsevier, London, 2000, pp. 31-36）に開示された方法に従っている。
【００２１】
本発明の方法は、多くの分析的方法に適用する上でも好都合であり、とりわけ
−  未処理の状況下または変性状況下のいずれかでのプロテオーム分析または複合タンパク質／ペプチド混合物の分析；
−  前記マップは等電点電気泳動（一般的または固定式pH勾配のいずれか）による第一次元と、その後に続く第二のＳＤＳ−ＰＡＧＥ次元を含む、電気泳動二次元マップ；
−  １−、２−、多−次元のいずれかであり、自由相型、または多様なゲル型（ポリアクリルアミドおよびアガロ−スゲルを含むが、これに限定されない）のいずれかである、電気泳動法；
−  自由相またはふるい分け液体ポリマーのいずれか、ＳＤＳの存在下、等電点電気泳動方式、従来のキャピラリー、マイクロチップおよびナノチップ内でのキャピラリー電気泳動；
−  上記方法とその他の方法、たとえば、オンラインまたはオフラインのいずれかでのブロット法および質量分析との組み合わせ；
−  １−、２−、多−次元のいずれかでのクロマトグラフ分離；
−  ２−、多−次元のいずれかでの電気泳動／クロマトグラフィーの混合型分離；
−  単独または組み合わせるかのいずれかの、あらゆる型の、電気泳動またはクロマトグラフィー手法による、プロテオーム分析、または複合タンパク質／ペプチド混合物の一般的な分析における事前分画手法；
において好都合である。
【００２２】
本発明は後述の実施例において、ヨードアセトアミド、およびＮ−置換アクリルアミドを含むアクリルアミドの中性の誘導体と対比して、より詳細に説明される。
【００２３】
比較例１
ウシα−ラクトアルブミン（ＬＣＡ）のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）によるアルキル化の反応動態。pH９．０のTris−アセテート５０μMおよび７Ｍの尿素中のＬＣＡ５０μM溶液がジチオトレイトール（ＤＴＴ）５０mMによって、２５℃で１時間還元された。還元後、タンパク質はＩＡＡ１００mMとともにインキュベートされ、アルキル化の反応動態を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間）方式による質量分析によって、２４時間まで調査した。ＬＣＡは、ポリペプチド鎖中に、Ｃｙｓ残基を８個、したがって−ＳＨ基を８個含有しており、この−ＳＨ基はアルキル化を潜在的に受ける可能性があった。図１に示すように、既に２分後には、オクタ−アルキル化誘導体は全ての反応生成物（パネルｂ、ｍ／ｚ値１４５６３でのピーク）の６０％を表しており、残りの４０％は、ヘプタ−、ヘキサ−、およびペンタ−アルキル化種を、この順番で表した。しかし、反応の２時間後に、該オクタ−アルキル化誘導体が、かろうじて７０％まで増加し（パネルｃ、ｍ／ｚ値１４６５６でのピーク）、残りの３０％がより低い段階のアルキル化の誘導体によって表されていることに気が付くことができる。反応は、長時間のインキュベーションでは、一定以上に進行しないようであった。２４時間後、タンパク質に存在するその他の基（とりわけ、リジンのε−アミノ基）が代わりにアルキル化された（パネルｄ、たとえば、ｍ／ｚ値１４７０７でのピークはノナ−アルキル化誘導体であり、主要ピークを表している。加えて、ピークがデカ−置換され、さらにより高い段階の置換が行われ、最終反応生成物がいずれにしろ極めて不均一となり、ｍ／ｚ値１４６５２の望ましい生成物が今や少ない成分を表していることに気が付くことができる）。定量反応の欠如やその他のアミノ酸残基での副反応の数が適切なプロテオーム分析を強く妨害する。それは、それらが、現在のところたいてい質量分析によって行われているタンパク質の正確な同定を難しくするからである。加えて、リジンやその他の残基の余分な反応が、２次元マップの誤ったスポットを生じるのは、それらが異なる等電点（ｐＩ）を有する新しいタンパク質アイソフォームを生成するからである。
【００２４】
実施例２
中性界面活性剤の存在下でのジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）および４−ビニルピリジンによるウシα−ラクトアルブミン（ＬＣＡ）のアルキル化。pH９．０のTris−アセテート５０mMおよび７Ｍの尿素中のＬＣＡ５０μM溶液をジチオトレイトール（ＤＴＴ）５０mMによって、２５℃で１時間還元した。還元後、タンパク質をＤＭＡまたは４−ビニルピリジン（４ＶＰ）のいずれか１００mMとともに２５℃で１時間インキュベートした。両反応は、プロテオーム分析に利用される可能性のある界面活性剤の一つであるTritonX-100  １％の存在下で行われた。反応生成物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方式の質量分析によって測定した。図２に示すように、４ＶＰの場合、ただ一つの反応生成物（Ｍ／Ｚ値１５０８３）のみ存在していたが、これは８個の４ＶＰの残基を有するＬＣＡ付加体に対応していた。一方、ＤＭＡの場合、全系列の反応種を伴う無反応生成物（Ｍ／Ｚ値１４２１３）がいくらかの量残っているが、このうち最も豊富な成分はトリ−およびテトラ−アルキル化種であった。４ＶＰは格段に最も有効な試薬であり、反応を完全に完成させるまで行うことができる一方で、界面活性剤の阻害効果によって影響を受けなかった。
【００２５】
実施例３
pHが中性における両性イオンの界面活性剤の存在下でのアクリルアミドおよび２−もしくは４−ビニルピリジンによるウシα−ラクトアルブミン（ＬＣＡ）のアルキル化。タンパク質のアルキル化は、典型的には、負帯電した−Ｓ−基（pK ８．３）とＩＡＡやアクリルアミドのような中性試薬との間の反応を促進するpHである、８．５〜９．０の間のpH値で行われた。しかし、このpH値では、反応時間が長くなると、リジンのε−アミノ基のアルキル化のような誤った反応が発生した。逆に、２−および４−ビニルピリジンは弱塩基性であり（pK 約５．２〜５．６）、これらは、pH５でプロトン化形態で存在するため、脱プロトン化−ＳＨ基と非常によく反応した。したがって、対象の反応pHが中性程度のpH、すなわち二つの反応種のｐＫ値の中間値になりうる。pHが約７のとき、アルキル化試薬および−ＳＨ基の両者はそれぞれ部分的に正帯電および負帯電していて、互いによく反応した。pH７．０のリン酸塩緩衝剤５０mMおよび７Ｍの尿素中のＬＣＡ５０μM溶液をジチオトレイトール（ＤＴＴ）５０mMによって、２５℃で１時間還元した。還元後、タンパク質をアクリルアミドまたは２−（２ＶＰ）もしくは４−ビニルピリジン（４ＶＰ）のいずれか１００mMとともに２５℃で１時間インキュベートした。両反応は、プロテオーム分析の際の現在相当に主流となっている両性イオンの界面活性剤である、アミドスルホンベタイン（ＡＳＢ）１％の存在下で行われた。反応生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方式の質量分析によって測定した。図３に示すように、２ＶＰおよび４ＶＰの場合（パネルｂおよびｃ）、Ｍ／Ｚ値１５０８３で、ただ一つの反応生成物のみ存在していたが、これは８個の２ＶＰまたは４ＶＰ残基を有するＬＣＡ付加体に対応していた。一方、アクリルアミドの場合、一連の反応生成物を伴う無反応生成物が相当量残っているが、このうち最も豊富な種はトリ−およびテトラ−アルキル化化合物であった。このことは、２ＶＰおよび４ＶＰがどれほど格段に最も有効な試薬の実例であり、反応を完全に完成させるまで行うことができる一方で、界面活性剤の阻害効果によって影響を受けなかったかを明らかに示している。
【００２６】
実施例４
アルカリ性および中性pH値でのアクリルアミドまたは４−ビニルピリジンによるリゾチームのアルキル化。本発明者は、タンパク質の等電点（ｐＩ）が−ＳＨ基のアルキル化反応に影響を与えうるか否かについても調査した。このことは、とりわけ２ＶＰと４ＶＰの場合（その弱塩基性特性により）欠点となりうる。それは、そのようなアルカリ性タンパク質に対する超過した正帯電が反応部位へのそれらの接近を阻害するからである。したがって、本発明者は、約１０のｐＩを有し、さらにポリペプチド鎖の８個のＣｙｓ残基を含有するタンパク質である、ニワトリの卵のリゾチームの挙動を研究した。両者とも７Ｍの尿素の存在下、pH７．０のリン酸塩緩衝剤５０mM中またはpH９．０のTris−アセテート緩衝剤中のリゾチーム５０μM溶液を、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）５０mMによって、２５℃で１時間還元した。還元後、タンパク質を、アクリルアミドまたは４ＶＰのいずれか１００mMとともに２５℃で１時間インキュベートした。反応生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方式の質量分析によって測定した。図４に示すように、４ＶＰの場合（パネルａはpH９．０での反応、パネルｂはpH７．０での反応）、ただ一つの反応生成物（Ｍ／Ｚ値１５１６４）のみ存在していたが、これは８個の４ＶＰ残基を有するリゾチーム付加体に対応していた。一方、アクリルアミドの場合、主要ピークはＭ／Ｚ値１４８９３（これは８個のアクリルアミド残基を有する付加体に対応していた）であったが、このピークは、それぞれヘキサ−、ヘプタ−アルキル化生成物に対応していたＭ／Ｚ値１４７５０およびＭ／Ｚ値１４８２２での相当量によって不純となっていた。ここでも、いかにして４ＶＰ（およびその類似体２ＶＰ）が、pH９．０に比べるとリゾチームの正帯電が相当増加するpHである、７．０のような不都合なpH値で塩基性タンパク質をも１００％までアルキル化することができるのかということは非常に明らかである。
【００２７】
実施例５
中性pHでのＩＡＡ、または２ＶＰもしくは４ＶＰによる、高システイン含有量を有する、大きなＭｒ値を有するタンパク質のアルキル化。上記実施例において、本発明者は小さな大きさのタンパク質（１３〜１５０００Da）及び−ＳＨ基（８個のＣｙｓ残基）の平均的な含有量を有するタンパク質のアルキル化を調査した。中程度から高い質量のタンパク質及びより高いＣｙｓ残基含有量を有するタンパク質に対する同様の反応を調査することは興味深い。二つの興味深い事例が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｍｒ  ６６４７２、ｐＩ  ５．７で、３５個のＣｙｓ残基を含有）およびウサギホスホリラーゼ（Ｍｒ  ９７１５８、ｐＩ  ６．８で、３６個のＣｙｓ残基を含有）によって示された。pH７．０のリン酸塩緩衝剤５０mMおよび７Ｍの尿素中のＨＳＡまたはホスホリラーゼの５０μM溶液をジチオトレイトール（ＤＴＴ）５０mMによって、２５℃で１時間還元した。還元後、タンパク質をアクリルアミドまたは２−（２ＶＰ）もしくは４−ビニルピリジン（４ＶＰ）のいずれか１００mMとともに２５℃で１時間または６時間インキュベートした。反応生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方式の質量分析によって測定した。その結果が表１に報告されている。
【００２８】
【表１】
2005519880.tif 000004
【００２９】
ここでも、ＩＡＡの場合、両タンパク質とも、１時間の反応後には約６８％のアルキル化という値に到達し、６時間後にはかろうじて約８０％の値に到達していることに気づくことができる。逆に、４ＶＰ（およびその類似体２ＶＰ）の場合、ほんの１時間のインキュベーション後には、１００％の反応値に到達した。
【００３０】
実施例６
タンパク質発現の定量分析のための正常もしくは重水素化２ＶＰもしくは４ＶＰによるアルキル化。対照細胞および多様な化学薬品（たとえば、薬品、抑制剤、促進剤など）によって処理される細胞におけるタンパク質発現の変化の研究のために、二つの細胞個体群を、正常（「軽質」）または重水素化（「重質」）試薬で別々に標識できることは重要である。その後、二つの試料を１対１の比で混合し、２次元マップ分析に付した。定量化プログラム（たとえば、PDQuestまたはMelanie）を用いての分析によって、その発現が変化したように見える（タンパク質合成の上下調節を反映すると思われる染色強度の増減を示すことによって）タンパク質区域を、次にポリアクリルアミドゲルから溶出し、トリプシンによって消化した。得られたペプチドを次にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方式の質量分析によって分析した。この時点で、２ＶＰまたは４ＶＰによってマークした全てのペプチドは二個のピーク、すなわち軽質と重質（この後者は重水素化された同位体によってマークした）とに、７Daによって（ヘプタ−重水素化ピリジンの場合）、４Daによって（ビニル部分ではなく、ピリジン環だけが重水素化される場合）、または５Daによって（ビニル部分の部分重水素化の場合）間隔を置いて分離された。二個の単一同位体のピーク領域間の単位比率は、対照細胞と処理細胞間のタンパク質合成における変動がなかったことを意味する。もし、逆にこの比率が１よりも高い（または低い）場合、これは、処理細胞において、タンパク質合成の誘導または抑制があったことを意味する。したがって、この方法は、正確かつ明白に、どのエフェクターがタンパク質合成を誘導または抑制するかを評価することを可能にし、したがって、薬品によって誘導される全ての生物学的な効果、またはガンの発症などの遺伝子的に誘導された疾患の出現を評価する上で基礎となる。これらの定量的生物学研究に対する同位体比率の使用は既に文献に記述されているが（Gygi, S. P., Aebersold, R., in Proteomics: a Trend Guide, Blackstock, W., Mann, M., eds., Elsevier, London, 2000, pp. 31-36）、アルキル化試薬は非常に複雑な分子であり、その適切な反応性は実証されていない上に、２ＶＰおよび４ＶＰの場合のように、定量的な方法で−ＳＨ基をアルキル化することはできない。さらに、上記試薬（ＩＣＡＴ、同位体コードアフィニティタグと呼ばれる）はビオチン化されており、それはこのアフィニティ−ラベルが、アフィニティークロマトグラフィーにより、極めて不均一なペプチド個体群から、マークされたペプチドのみを捕捉するために必要であるからである。これは必ずしも標準２次元マップによる分析において必要はなく、それは無傷タンパク質のみが分離され、そのペプチドの消化産物は分離されないからである。したがって、本発明者は、J. Finkelstein et al., Journal of Organic Chemistry 4 (1939) 374-380に従って、ヘプタ重水素化された２−メチルピリジンを開始物質として使用し、それから対応するピコリルリチウムを調製することができ、次にパラホルムアルデヒドとの反応により、２−（２−ヒドロキシエチル）−ピリジンを得ることによって、部分的または全体的に重水素化された２−ビニルピリジンを調製した。この最後の化合物から、ｄ2−パラホルムアルデヒドを使用する���合、ヘプタ−重水素化２−ビニルピリジンを、非重水素化パラホルムアルデヒドを使用する場合、ペンタ−重水素化２−ビニルピリジンを得ることができ（I.C. Ivanov et al., Arch. Pharm. 322, 1989, 181-190）、「軽質」（非重水素化）２−ビニルピリジンと比較すると、７Daと５Daの質量の相違が存在した。他の二つの（３ＶＰと４ＶＰ）重水素化ビニルピリジンの合成を、たとえば４−ビニルピリジンの場合は米国特許第２，５５６，８４５号、または３−ビニルピリジンの場合はTetrahedron Letter 1993, 8329およびJournal of the American Chemical Society 75, 1953, 4738に記載された合成に従って、適当な重水素化前駆物質によって得ることができた。
【００３１】
図５はこの型の分析の一つの例を示している。正常なラットの血清を、「軽質」および「重質」（ヘプタ−重水素化）２−ビニルピリジンにより別々にマークし、７０％重水素化／３０％軽質標識で混合し、二次元マップによって分離した。α1−酸性糖タンパク質（Ｍｒ  ２１５４６、ｐＩ  ５．０）の区域を溶出し、トリプシンによって消化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方式の質量分析によって分析した。この分析により、図５の質量スペクトルが得られた。ｍ／ｚ値１２３５．０および１２４１．９における２個のフラグメントを含む多くのペプチドフラグメントを、種々のｍ／ｚ値で観測した。ｍ／ｚ値６．９での相違は、２−ｄ７−ＶＰと非重水素化２−ＶＰとの間の相違と一致した。二個の信号の相対強度の比率（約６８：３２）をともなった、この観察より、このペプチドが、最初のタンパク質混合物中の二つの同位体マーカーの比率（７０：３０）を反映する単一のＣｙｓ残基を含有することが確認される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＩＡＡ１００mMと共にpH９．０でインキュベーション後の還元されたウシα−ラクトアルブミンのアルキル化の反応動態。時間点は２４時間まで取っている。パネルａ：対照（ｍ／ｚ＝１４１９１）、パネルｂ：２分間のインキュベーション（ｍ／ｚ＝１４６５３はオクタ−アルキル化ピークを表している）、パネルｃ：２時間のインキュベーション、パネルｄ：２４時間の反応時間（ｍ／ｚ＝１４７０７ピークはノナ−アルキル化種を表している。望ましい生成物ｍ／ｚ＝１４６５２は、今や非常に不均一な種の生成物の中では少ない成分である）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化時間飛行）方式での質量分析による分析。
【図２】ともに界面活性剤Triton X-100  ２％の存在下でのＤＭＡ（ジメチルアミン）（パネルａ）または４−ビニルピリジン（パネルｂ）と共に１時間のインキュベーション後のウシα−ラクトアルブミンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量スペクトル。パネルｂにおいては、ｍ／ｚ＝１５２４８のピークが、シナピン酸であるＭＡＬＤＩマトリックスを有するＬＣＡの付加体を表していることに注意。
【図３】２％のアミドスルホビタイン−１４、ならびに（ａ）アクリルアミド、（ｂ）２−ビニルピリジン、および（ｃ）４−ビニルピリジンと１時間のインキュベーション後のウシα−ラクトアルブミンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量スペクトル。全ての場合において、反応はpH７．０で行われた。パネルｂとパネルｃの両者において、それぞれ、２ＶＰおよび４ＶＰとのＬＣＡの単一反応のチャンネルであることに注意。より高いピーク（ｂおよびｃにおいて、ｍ／ｚ＝１５２４８およびｍ／ｚ＝１５４６８）は、シナピン酸であるＭＡＬＤＩマトリックスを有するＬＣＡの付加体を表している。
【図４】４−ビニルピリジン（４−vinylpyridinev）（パネルａおよびパネルｂ）およびアクリルアミド（パネルｃ）のリゾチームの−ＳＨ基との反応。（ａ）において、反応はpH９．０で行われた。一方、パネル（ｂ）およびパネル（ｃ）においてはpHは７．０であった。
【図５】軽質または重質（ヘプタ−重水素化）の２−ビニルピリジンのいずれかで標識されたａ１−酸性糖タンパク質（ラットの血清から）のペプチド中の同位体比。標識後、二つのラット血清を７０対３０（重／軽）の比率で混合し、二次元マップによって分別し、α１−酸性糖タンパク質の区域（Ｍｒ２１５４６、ｐＩ５．０）を溶出させ、トリプシンによって消化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方式での質量分析によって分析した。その挿入図は、ｍ／ｚ値１２３５．０およびｍ／ｚ値１２４１．９での二つのフラグメントを示している。ｍ／ｚ値６．９の違いは２−ｄ７−ＶＰと非重水素化２−ＶＰとの間の違いと一致する。二つの信号の相対強度の比率（約６８：３２）をともなった、この観察によって、このペプチドが、最初のタンパク質混合物中の二つの同位体マーカの比率（７０：３０）を反映する単一のＣｙｓ残基を含有することを確認する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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