(57)【要約】生体適合性で且つ部分的に生体再吸収性の繊維の実質的に免疫学的に適合性の半月増強デバイスのためのマトリクス材料を、α−ガラクトシダーゼで処理してα−Ｇａｌエピトープを排除することにより製造する。半月の部分的欠損への移植に際して、半月増強デバイスと半月との複合材料は、半月繊維軟骨細胞の内殖に適合された足場を確立する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の２つの骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域における脊椎動物患者への移植のための実質的に非免疫原性のプロテーゼデバイスであって、該デバイスは、生体適合性のグリコシダーゼ処理されたマトリクス材料を含み、該デバイスマトリクスが該患者の２つの骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域と実質的に同じイン・ビボの外表面輪郭を有するように適合された、当該デバイス。
【請求項２】
グリコシダーゼが、ガラクトシダーゼである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
ガラクトシダーゼが、α−ガラクトシダーゼである、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
マトリクス材料が、複数の第一の表面炭水化物部分を実質的に除去されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
マトリクス材料が、下記により生成される、請求項１に記載のデバイス：
(ａ)非ヒト動物由来の軟組織の少なくとも一部分を取り出して、プロテーゼデバイスのためのマトリクス材料を用意し；
(ｂ)このマトリクス材料を水中及びアルコール中で洗い；
(ｃ)このマトリクス材料を細胞破壊処理にかけ；そして
(ｄ)このマトリクス材料をガラクトシダーゼで消化して、複数の第一の表面炭水化物部分を該マトリクス材料から実質的に除去する。
【請求項６】
架橋剤を更に含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
架橋剤を、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、生体適合性二官能性アルデヒド、カルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ビス−イオニデート、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリオキサル、ビスイミデート、アジピルクロリド及びこれらの混合物よりなる群から選択する、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
マトリクス材料の少なくとも一部分の間に架橋を更に含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
架橋が、マトリクス中に、実質的に、不均一に分布している、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
架橋が、化学的架橋剤によって形成される、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１１】
架橋が、デバイスの先端領域で比較的高密度であり、中心領域で比較的低密度である、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１２】
分子架橋の分子量が、約８００〜６０，０００ダルトンの範囲にある、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１３】
架橋が、コンドロイチン４−硫酸；コンドロイチン６−硫酸；ケラチン硫酸；デルマタン硫酸；及びヒアルロン酸よりなるグリコサミノグリカン分子の基の少なくとも一つを含む、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１４】
請求項１に記載のデバイスであって、
(ａ)マトリクス材料が、コラーゲン及びグリコサミノグリカン架橋を含み、且つ
(ｂ)グリコサミノグリカン架橋が、約０．９５架橋／コラーゲン比未満で且つ約０．５０架橋／コラーゲン比より大きい密度で存在する
当該デバイス。
【請求項１５】
デバイスマトリクスが、少なくとも部分的に生体再吸収性の、繊維軟骨細胞の内殖に適合された足場を確立する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１６】
デバイスが、半月の部分的欠損に移植するための半月増強デバイスである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１７】
外表面輪郭が、実質的に、半月の部分的欠損と相補的である、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
半月とデバイスの複合物のイン・ビボ外表面が、部分的欠損を有しない天然の半月のそれと実質的に同じである、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１９】
デバイスが、半月繊維軟骨細胞の内殖に適合されている、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項２０】
デバイスマトリクス及び内殖した半月繊維軟骨細胞が、天然の半月の荷重力を支持する、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
半月の部分的欠損が、裂け目であり、デバイスが、該半月の部分的欠損に挿入される大きさのシートとして形成される、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項２２】
デバイスが、補綴用椎間円板であり、該デバイスは、天然の椎間円板と実質的に同じ外表面輪郭をイン・ビボで有するように適合される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２３】
デバイスマトリクスが、生体再吸収性の、脊椎骨繊維軟骨細胞の内殖に適合された足場を確立する、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
デバイスマトリクス及び内殖した繊維軟骨細胞が、脊椎骨張力を支持する、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２５】
デバイスが、複数の実質的に整列され、伸張されたフィラメントを含む補綴用靭帯である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２６】
デバイスマトリクス中のフィラメントが、生体再吸収性の、靭帯繊維芽細胞の内殖に適合された足場を確立する、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２７】
デバイスマトリクスと内殖した繊維芽細胞が、自然の靭帯張力を支持する、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２８】
請求項２５に記載のデバイスであって、
(ａ)小繊維が、マトリクス中に約７５〜１００重量％(乾量)の濃度で存在し、且つ
(ｂ)マトリクス中の多糖類分子が、約０〜２５重量％(乾量)の濃度で存在する
当該デバイス。
【請求項２９】
多糖類分子を、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、アルギン酸、キトサン、ヒアルロン酸、及びこれらの混合物よりなる群から選択する、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項３０】
デバイスが、自然の関節軟骨と実質的に同じイン・ビボ外表面輪郭を有するように適合された補綴用関節軟骨デバイスである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３１】
デバイスマトリクスが、約１００〜４００ミクロンの範囲の細孔寸法を有する、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
マトリクス材料が、コラーゲン、エラスチン及びレティキュリン、これらの類似体及びこれらの混合物よりなる群から選択する繊維を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３３】
コラーゲンを、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、及びこれらの組合せよりなる群から選択する、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
マトリクス材料が、多糖類を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３５】
マトリクス材料が、グリコサミノグリカン(ＧＡＧ)を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３６】
グリコサミノグリカン分子が、コンドロイチン４−硫酸；コンドロイチン６−硫酸；ケラチン硫酸；デルマタン硫酸；及びヒアルロン酸よりなる群から選択するグリコサミノグリカン分子を含む、請求項３５に記載のデバイス。
【請求項３７】
デバイスマトリクスが、実質的に１０〜５０ミクロンの範囲の細孔寸法を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３８】
デバイスマトリクスが、５０ミクロンより大きく約５００ミクロン未満の範囲の細孔寸法を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３９】
デバイスマトリクスが、約０．０７〜０．５０グラムマトリクス／立方センチメートルの密度を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４０】
デバイスマトリクスが、約０．１０〜０．２５グラムマトリクス／立方センチメートルの密度を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４１】
デバイスマトリクスが、約２〜２５立方センチメートル／グラムマトリクス材料の繊維内及び繊維間空間を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４２】
デバイスマトリクスが、約２〜１４立方センチメートル／グラムマトリクスの繊維内及び繊維間空間を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４３】
マトリクス材料が、更に、少なくとも一種の成長因子を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４４】
成長因子が、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子、又はこれらの組合せである、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項４５】
マトリクス材料が、接着分子を更に含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４６】
接着分子が、フィブロネクチン、コンドロネクチン、オステオネクチン、又はこれらの組合せである、請求項４５に記載のデバイス。
【請求項４７】
マトリクス材料が、ポリエチレングリコール処理された、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４８】
マトリクス材料が、下記により生成される、請求項１に記載のデバイス：
(ａ)非ヒト脊椎動物から軟組織の少なくとも一部分を取り出してプロテーゼデバイスのマトリクス材料を用意し；
(ｂ)このマトリクス材料を水中及びアルコール中で洗浄し；
(ｃ)このマトリクス材料を細胞破壊処理にかけ；そして
(ｄ)このマトリクス材料をプロテオグリカン涸渇因子で消化して、実質的に複数のプロテオグリカンをこのマトリクス材料から取り出し、
それにより、このプロテーゼデバイスのマトリクス材料のプロテオグリカンを実質的に減少させる。
【請求項４９】
プロテオグリカン涸渇因子を、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンＡＣＩＩリアーゼ、ケラタナーゼ、トリプシン及びフィブロネクチン断片よりなる群から選択する、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項５０】
プロテーゼデバイスが、殺菌されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５１】
デバイスが、広い中心領域を２つの狭い末端領域の間に有する、実質的にくさび形状を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５２】
請求項１に記載のデバイスであって、
(ａ)該マトリクスが、中心領域及とその周辺領域を有する円周方向に伸び且つ該中心領域の周囲で予め決めた０度より大きくて３６０度以下の角度に及ぶくさびの形状を有し、そして
(ｂ)くさびの中心領域内の厚みが、その周辺領域における厚みより小さい
当該デバイス。
【請求項５３】
円周方向に伸びるくさびが、広い中心領域を２つの狭い末端領域の間に有する三日月形状である、請求項５２に記載のデバイス。
【請求項５４】
円周方向に伸びるくさびが、３６０度の角度に及ぶ、請求項５２に記載のデバイス。
【請求項５５】
請求項１に記載のデバイスであって、
(ａ)コラーゲン繊維が、マトリクス材料中に、約６５〜９８重量％(乾量)の濃度で存在し、且つ
(ｂ)グリコサミノグリカン分子が、マトリクス材料中に、約１〜２５重量％(乾量)の濃度で存在する
当該デバイス。
【請求項５６】
デバイスマトリクスの周囲にメッシュを更に含み、該メッシュが、被吸収性であり且つ非免疫原性である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５７】
海綿状の骨の相補的な開口部に関節軟骨デバイスを係留するアンカーを含む生体適合性の円錐形のベース成分を更に含み、該ベース成分が、マトリクスの外面の部分から広がる、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項５８】
ベース成分が、少なくとも部分的に再吸収性である、請求項５７に記載のデバイス。
【請求項５９】
ベース成分が、複数の円周方向に伸びる隆起を含む、請求項５７に記載のデバイス。
【請求項６０】
ベース成分が、複合物よりなり、下記を含む、請求項５７に記載のデバイス：
(ａ)コラーゲンの分散及び
(ｂ)リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、及びリン酸三カルシウムとヒドロキシアパタイトの組合せよりなる群から選択する組成物。
【請求項６１】
分散が、約９０重量％のリン酸三カルシウム及び約１０重量％のコラーゲンを含む、請求項６０に記載のデバイス。
【請求項６２】
分散が、約９０重量％のヒドロキシアパタイト及び約１０重量％のコラーゲンを含む、請求項６０に記載のデバイス。
【請求項６３】
患者への移植のためのプロテーゼデバイスを製造する方法であって、該方法は、下記のステップ：
(ａ)実質的に免疫学的に適合性のマトリクス材料を得(ここに、該マトリクス材料は、実質的に、複数の第一の表面炭水化物部分を欠いている)；
(ｂ)このマトリクス材料を加工してデバイスを形成する
ことを含み、このデバイスは、２つの患者の骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域と実質的に同じイン・ビボの外面輪郭を有するように適合されることを特徴とする当該方法。
【請求項６４】
デバイスを、半月増強デバイス、半月の部分的欠損に挿入される大きさのシートとして形成されたデバイス、補綴用椎間円板、補綴用靭帯及び補綴用関節軟骨デバイスよりなる群から選択するプロテーゼデバイスとして形成する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
工程(ａ)で実質的に免疫学的に適合性のマトリクス材料を得る、請求項６３に記載の方法であって、下記：
(ｉ)非ヒト動物から少なくとも軟組織の一部分を取り出してマトリクス材料を用意し；
(ii)このマトリクス材料を水中及びアルコール中で洗浄し；
(iii)このマトリクス材料を細胞破壊処理にかけ；そして
(iv)このマトリクス材料をグリコシダーゼで消化する
ことを含み、それにより、該マトリクス材料を実質的に非免疫原性になる、当該方法。
【請求項６６】
グリコシダーゼが、ガラクトシダーゼである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
ガラクトシダーゼが、α−ガラクトシダーゼである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
工程(ａ)で実質的に免疫学的に適合性のマトリクス材料を得る、請求項６３に記載の方法であって、下記を含む当該方法：
該マトリクス材料を、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンＡＣＩＩリアーゼ、ケラタナーゼ、トリプシン及びフィブロネクチン断片よりなる群から選択する少なくとも一種のプロテオグリカン涸渇因子で消化する。
【請求項６９】
工程(ａ)で実質的に免疫学的に適合性のマトリクス材料を得る、請求項６３に記載の方法であって、下記を含む当該方法：
該マトリクス材料に、成長因子及び接着分子よりなる群から選択する少なくとも一種の薬剤を加える。
【請求項７０】
工程(ｂ)におけるデバイスの加工が、繊維の少なくとも一部分を架橋することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
工程(ｂ)におけるデバイスの加工が、複数のグリコサミノグリカン分子を加工することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
工程(ｂ)におけるデバイスの加工が、下記を含む、請求項６３に記載の方法：
該マトリクス材料を、成長因子及び接着分子よりなる群から選択する少なくとも一種の薬剤で処理する。
【請求項７３】
工程(ｂ)におけるデバイスの加工が、下記を含む、請求項６３に記載の方法：
該デバイスマトリクスに、該デバイスの外面の部分から広がるメッシュを加え、該メッシュは被再吸収性で且つ生体適合性である。
【請求項７４】
工程(ｂ)におけるデバイスの加工が、下記を含む、請求項６３に記載の方法：
(ｉ)高分子の結合組織型成分の複数の本質的に純粋なグリコシダーゼ処理した繊維を用意し；
(ii)これらの繊維をそれらより短いセグメントに切って、小繊維を形成し；
(iii)これらの小繊維を凝集させて、複数の伸長したフィラメントにし；
(iv)これらのフィラメントを、架橋試薬と、フィラメント内の小繊維の少なくとも一部分を架橋するのに十分な時間接触させ、それにより、各フィラメントは乾燥した多孔質のボリュームマトリクスを形成し；そして
(ｖ)複数のこれらのフィラメントを相互に隣接する関係で整列させ、それらの整列されたフィラメントは補綴用靭帯を形成する。
【請求項７５】
工程(ｂ)におけるデバイスの加工が、下記を含む、請求項６３に記載の方法：
生体適合性のグリコシダーゼ処理した繊維の乾燥した多孔質マトリクスを含むプロテーゼ半月を加工し、それで、加工されたプロテーゼ半月が、患者の半月に移植された際に、天然の半月の形状を呈する。
【請求項７６】
工程(ｂ)におけるデバイスの加工が、下記を含む、請求項６３に記載の方法：
(ｉ)複数の生体適合性のグリコシダーゼ処理した繊維を型内に置き、その型は、半月プロテーゼの形状を規定し；
(ii)これらの繊維を凍結及び解凍の第一及び第二のサイクルにかけ；
(iii)これらの繊維を化学的架橋剤と、それらの繊維がその型の形状を呈するように接触させ；そして
(iv)架橋した繊維を凍結乾燥する。
【請求項７７】
工程(ｉ)で置くことが、下記：
マトリクス材料のグリコシダーゼ処理した繊維を、それらの繊維を型内でピストンにより圧縮することによって、実質的に円周方向に配向させることを含み、ここに、該ピストンの運動が実質的に圧縮軸に沿った向きであり、圧縮工程中、該ピストンが、型に関して該圧縮軸の周囲で回転される、請求項７６に記載の方法
【請求項７８】
工程(ｉ)において置くことが下記を含む、請求項７６に記載の方法：
繊維を実質的に半径方向に配向させる。
【請求項７９】
工程(ii)のサイクルにかけることが、更に、凍結及び解凍の第二のサイクルの前に繊維を圧縮する工程を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
患者の組織を再生させる方法であって、下記を含む当該方法：
(ａ)生体適合性のグリコシダーゼ処理されたマトリクス材料を含むプロテーゼデバイスを得、そして
(ｂ)該デバイスを、脊椎動物患者に、その患者の２つの骨の間に配置され且つそれらを繋ぐ領域に移植し、それで、該デバイスマトリクスは、繊維軟骨細胞、繊維芽細胞又は軟骨細胞よりなる群から選択する細胞の内殖に適合された少なくとも部分的に生体再吸収性の足場を確立する。
【請求項８１】
患者が、ヒトである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
請求項８０に記載の方法であって、
(ａ)患者の２つの骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域が、患者の半月内の部分的欠損であり；
(ｂ)該デバイスが、プロテーゼ半月内の部分的欠損に実質的に相補的である外面輪郭を有するように形成された半月デバイスであり;そして
(ｃ)該デバイスが、半月の繊維軟骨細胞の内殖に適合された生体再吸収性の足場を確立する
当該方法。
【請求項８３】
請求項８０に記載の方法であって、
(ａ)患者の２つの骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域が、半月の裂け目であり；そして
(ｂ)該デバイスが、その裂け目に挿入される大きさのシートとして形成される
当該方法。
【請求項８４】
請求項８０に記載の方法であって、
(ａ)患者の２つの骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域が、患者の半月内の部分的欠損であり；
(ｂ)該デバイスが、該デバイスと該半月との複合物のイン・ビボでの外表面が部分的欠損を有しない自然の半月と実質的に同じものになるように形成された半月増強デバイスであり；
(ｃ)該デバイスが、半月の繊維軟骨細胞の内殖に適合された生体再吸収性の足場を確立する
当該方法。
【請求項８５】
請求項８０に記載の方法であって、
(ａ)患者の２つの骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域が、椎間領域であり;
(ｂ)該デバイスが、自然の椎間円板と実質的に同じ外面輪郭をイン・ビボで有するように適合された補綴用椎間円板であり；そして
(ｃ)該デバイスが、脊椎骨繊維軟骨細胞の内殖に適合された生体再吸収性の足場を確立する
当該方法。
【請求項８６】
請求項８０に記載の方法であって、
(ａ)患者の２つの骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域が、関節であり；
(ｂ)該デバイスが、自然の関節軟骨と実質的に同じイン・ビボ外面輪郭を有するように適合された補綴用関節軟骨デバイスであり；そして
(ｃ)該デバイスが、関節軟骨細胞の内殖に適合された生体再吸収性の足場を確立する
当該方法。
【請求項８７】
請求項８１に記載の方法であって、更に下記の工程を含む当該方法：
該デバイスを、該デバイスの外面の部分から広がるベース成分によって、海綿状の骨の相補的な開口部に係留する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、移植可能なプロテーゼデバイスに関係し、一層詳細には、実質的に免疫学的に許容しうるデバイスをイン・ビボの足場として利用する組織の再生に関係する。
【背景技術】
【０００２】
内側及び外側の半月は、大腿骨と脛骨の関節丘の間に挿入された両凹の、繊維軟骨の一般にＣ字形状のくさびである。これらの半月は、一緒に、重要な緩衝材として作用して、力の分配のための機構及びを与え且つ、大腿骨と脛骨の間の潤滑剤として作用する。機能的な半月がないと、異常な関節機構と関連して膝に応力の集中が生じる。これらの現象は、関節炎の時期尚早な発生を生じうる。
【０００３】
しかしながら、半月組織の、永久的な人工材料よりなる構造での置換は、しばしば失敗に終わった。この成功の欠如は、主として、ヒト及び動物の膝関節の関節軟骨がもろいという事実によるものである。この膝関節における関節軟骨は、研磨性界面に、又は最終的に移植された人工プロテーゼ半月から生じるコンプライアンスの正常からの変動に耐えないであろう。加えて、関節の力は、体重の数倍であり、これらは、膝及び臀部の場合、典型的には、年間に百万回遭遇する。今まで、永久的人工半月は、天然の半月の特性を有する材料からなるものでないし、かかる日常的な力に耐えるのに十分なだけ安全に配置されうるものではなかった。
【０００４】
米国特許第６，０４２，６１０号、５，７３５，９０３号、５，４７９，０３３号、５，６２４，４６３号、５，３０６，３１１号、５，１０８，４３８号、５，００７，９３４号及び４，８８０，４２９号(各々を参考として本明細書中に援用する)は、生体適合性の繊維例えば天然ポリマーを含むプロテーゼ半月及びかかるプロテーゼ半月の製造方法を記載している。これらの特許は又、プロテーゼ半月のヒトの膝への移植によって半月組織を再生する方法をも記載している。これらの特許は、一般に、処理した天然繊維例えば再構成された架橋されたコラーゲンの乾燥した多孔性マトリクス(適宜、グリコサミノグリカン分子を含む)から処方されたプロテーゼ半月を開示している。一般に、これらのプロテーゼ半月のためのコラーゲンの起源は、動物のアキレス腱又は皮膚であった。再構成工程は、非コラーゲン性物質例えば糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、ネイティブなグリコサミノグリカンなど(これらは、元の組織に更なる弾性を与えることができる)を除去する。しかしながら、この再構成工程は、プロテーゼ半月を患者に移植したときに免疫学的反応を引き起こす抗原性成分を残しかねない。
【０００５】
従って、当分野には、実質的に免疫学的に適合性のプロテーゼ半月に対する継続的要求がある。
【０００６】
発明の要約
この発明は、患者の２つの骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域における、患者への移植のための実質的に免疫学的に適合性の半月増強デバイスを提供する。この領域は、半月、椎間領域、靭帯領域、又は他の領域の部分的欠損であってよい。患者は、ヒトであってよい。この移植可能なプロテーゼデバイスは、このデバイスが構築されたマトリクス材料の処理のために、減少した免疫原性を有する。このマトリクス材料は、α−ガラクトシダーゼで処理されて、α−Ｇａｌエピトープが除かれている。
【０００７】
患者の２つの骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域への移植に際して、患者の身体領域及び該デバイスにより形成された複合物は、治療される天然の領域と実質的に同じ、イン・ビボの外表面輪郭を有する。このデバイスは、繊維軟骨細胞、繊維芽細胞又は軟骨細胞(半月繊維軟骨細胞、脊椎骨繊維軟骨細胞など)の内殖に適合された生体適合性で且つ部分的に生体再吸収性の足場を確立する。この足場は、内殖した細胞と共に、その領域の自然の荷重力を支持する。
【０００８】
この発明は又、イン・ビボで所望の形状(例えば、半月における部分的欠損)を有するプロテーゼデバイスの製造方法をも提供する。この方法は、α−Ｇａｌエピトープを除去するためのα−ガラクトシダーゼによる処理によるマトリクス材料の製造を含む。この方法は又、その結果生じた複数の生体適合性で部分的に生体再吸収性の繊維を所望の形状を規定する型に入れること、これらの繊維を凍結乾燥すること、及びこれらの繊維を化学的架橋剤と接触させてそれらの繊維がこの型形状の外観を呈するようにすることをも含む。この型は、所望の身体領域を補って完全にするようにこのデバイスの外表面を規定する。
【０００９】
或は、型込め完了後に、型内に形成された構造又はマトリクスを、その外表面が部分的欠損に相補的となるように切断する。この方法は、半月の部分的欠損の外表面輪郭に相補的な外表面輪郭を有するように適合されたマトリクスを生成する。このマトリクスは、半月の部分的欠損に移植された場合に、生体適合性で少なくとも部分的に生体再吸収性の、半月の繊維軟骨細胞の内殖のための及び自然の半月の荷重力を支持するための足場を確立する。この半月と移植されたマトリクスとの複合物のイン・ビボでの外表面は、実質的に、欠損を有しない天然の半月のそれと同じである。
【００１０】
加えて、この発明は、半月組織をイン・ビボで再生する方法を提供する。この方法は、生体適合性で少なくとも部分的に生体再吸収性の繊維よりなり、上記のように減少した免疫原性を有する半月増強デバイスを製造すること、及びその後、そのデバイスを半月の部分的欠損に移植することを包含する。この移植されたデバイスは、生体適合性で且つ少なくとも部分的に生体再吸収性の、半月繊維軟骨細胞の内殖に適合された足場を確立する。
この足場は、内殖した半月繊維軟骨細胞と共に、天然の半月の荷重力を支持する。
【００１１】
他の具体例において、この発明は、プロテーゼデバイスを製造する方法であって、非ヒト動物から組織の少なくとも一部を取り出してマトリクス材料を用意し；そのマトリクス材料を水及びアルコールで洗浄し；該マトリクス材料を細胞破壊処理にかけ；そして該マトリクス材料をグリコシダーゼで消化して第１の表面炭水化物部分を除去してから、該マトリクス材料をプロテーゼデバイスとして上記のように製造することを含む当該方法を提供する。
【００１２】
更に別の具体例において、この発明は、マトリクス材料が非ヒト動物に由来する軟組織の一部分から生成されたデバイスを含み、該部分は、細胞外成分と実質的に死んだ細胞のみを含み、該細胞外成分及び死細胞が実質的に表面α−ガラクトシル部分を有しない、患者への移植のためのプロテーゼ半月を提供する。このプロテーゼデバイスは、実質的に、非免疫原性である。適宜、この材料は、表面炭水化物部分の少なくとも一部分に結合されたキャッピング分子を有し、又は減少したプロテオグリカンを有する。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１は、半月を自然の位置決めにて有するヒトの膝関節の略図である。
図１Ａは、イン・ビボで、内側及び外側関節丘上に位置決めされた内側及び外側半月を示す膝関節の破断図である。
図２は、この発明による典型的なプロテーゼ半月の透視図を示している。
図３は、図２のプロテーゼ半月の放射断面透視図を示している。
図４は、この発明の別の具体例の透視図を示している。
図５は、図４のプロテーゼ半月の直線５−５に沿った断面図を示している。
図６は、円筒形パッド形状を有するプロテーゼ半月の製造のためにデザインされた型を示している。
図７は、三日月形のくさび形態を有するプロテーゼ半月の製造のためにデザインされた型を示している。
図８は、円筒形プロテーゼ半月の製造のためにデザインされた型を示している。
【００１４】
発明の詳細な説明
生体適合性で且つ生体再吸収性の繊維から製造されたプロテーゼデバイスは、２つの患者の骨の間に配置されてそれらを繋ぐ領域に、正常の運動及び強度を与えるように、外科的に移植することができる(外科的移植に関しては、米国特許第６，０４２，６１０号、５，７３５，９０３号、５，４７９，０３３号、５，６２４，４６３号、５，３０６，３１１号、５，１０８，４３８号、５，００７，９３４号及び４，８８０，４２９号(これらの各々を参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。このプロテーゼデバイスは又、組織再生のための足場としても作用し、その内殖は、移植されたデバイスの物理的特性によって促進される。かかる内殖は、患者宿主の身体領域と、自然の身体領域と実質的に同じイン・ビボ外面輪郭を有するプロテーゼデバイスとの複合物を生じる。
【００１５】
図１は、ヒトの膝関節３における、大腿骨２と脛骨４との間の、内側半月７と外側半月８の正常な位置決めの図解である。これらの半月は、大腿骨２と脛骨４との間で圧縮された場合、それらの結合点以外で強靭になる。図１Ａは、膝関節３における内側半月７と外側半月８のイン・ビボ構造を示している。これらの半月は、それらが間に配置された表面の形状に従い、それにより、２つの別個のイン・ビボ形態を生じる。例えば、内側半月７は、比較的開いた三日月形状を有し、外側半月８は、比較的閉じた三日月形状を有する。
【００１６】
典型的なプロテーゼ半月１０を、図２に示す。このプロテーゼ半月１０は、一般に、くさび形状の、多孔性の、乾燥したマトリクス又は足場であって、周囲に又は外側に少なくとも部分的には中心軸１１の周りに拡張する。好適形態において、プロテーゼ半月１０は、三日月形のくさび形状を有し、それは、軸１１の周りに拡張し且つ比較的広い中心領域１２を２つの狭い末端領域１４と１６の間に含む。好適形態において、このくさびは、約０．４インチの最大高さＡを周縁に、約０．２インチの高さＤを中心点に有し、そして約１．０インチの最大半径寸法Ｃを有する。この三日月形状のくさびは、角Ｂを軸１１の周りに実質的に約１３５〜１５５度の範囲に、好ましくは約１５０度に定める。
【００１７】
図２に説明した具体例において、プロテーゼ半月１０は、その周縁から広がるメッシュ部材２０を含む。このメッシュ部材２０は、生体適合性で生体再吸収性の材料よりなり、アレイ１０を適所に固定するために容易に利用される構造を与える。メッシュ部材２０は、十分な組織内殖が起きて機能を提供するまで、この容量で機能することができる。例として、メッシュ部材２０は、吸収性縫合糸材料例えばポリグリコネート、Ｄｅｘｔｏｎ、又はポリジオキサン(ＰＤＳ)(メッシュに織られたもの)よりなる＃１メッシュスクリーンであってよい。非吸収性縫合糸例えばＧｏｒｅｔｅｘ(登録商標)も又、利用することができる。
【００１８】
図４及び５は、組成において図２に描かれたプロテーゼ半月に類似するこの発明の更なる具体例を示している。一層詳細には、図４は、軸１１の周囲全体に広がる直円柱形状の半月２２を描写している(即ち、角Ｂは、０度に等しく、半月は、３６０度に対する)。図５は、図４に示した半月の直線５−５に沿った断面図を示している。図４及び５に図解したデバイスは、移植されたときの半月２２の形状を示している。即ち、領域１１における高さＤは、デバイスの周縁高さＡより小さい。移植前には、このデバイス２２は、ときには、この関係を有しえないが、移植に際しては、身体により加えられる正常な荷重が、この形態を強制する。
【００１９】
定義。用語「軟組織」は、ここで用いる場合、軟骨性の構造例えば半月及び関節軟骨；及び靭帯例えば前部十字形靭帯；及び腱を指す。用語「異種移植片」は、用語「heterograft」と同義語であり、一の種の動物から他の種へ移された移植片をいう。Stedman's Medical Dictionary (Williams及びWilkins, Baltimore, MD, 1995)。用語「異種の」は、例えば、異種の軟組織においては、一の種の動物から他の種の動物に移された軟組織を指す(同上)。
【００２０】
用語「細胞破壊」は、例えば、細胞破壊処理においては、細胞を殺すための処理を指す。
【００２１】
身体の部分の「一部分」なる用語は、各身体部分の全部又は一層小さい部分を指す。
【００２２】
一度個体に移植されたならば、異種移植片は、この発明の方法などによって処置しなければ、その異種移植片の慢性及び急性の拒絶などの免疫反応を誘発しうる。ここで用いる場合、用語「慢性的拒絶」は、個体に移植された異種移植片に対するその個体における免疫学的反応をいう。典型的には、慢性的拒絶は、異種移植片を受けた個体の血清中のＩｇＧ自然抗体と異種移植片の細胞及び／又は細胞マトリクス及び／又は細胞外成分上に発現された炭水化物部分との相互作用により媒介される。例えば、非霊長類哺乳動物(例えば、ブタ又はウシ起源)からの軟骨異種移植片のヒトへの移植は、主として、ヒトの血清中に存在するＩｇＧ自然抗Ｇａｌ抗体と異種移植片で発現された炭水化物構造Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ(α−ガラクトシル又はα−ｇａｌエピトープ)との間の相互作用によって妨げられる。K.R. Stone等、Transplantation 63:640-645(1997)；U. Galili等、Transplantation 63:646-651(1997)。慢性的拒絶において、免疫系は、典型的には、異種移植片の移植から１〜２週間以内に応答する。「慢性的拒絶」と対照的に、「超急性拒絶」は、ここで用いる場合、個体に移植された異種移植片に対するその個体における免疫学的反応であって、典型的には、異種移植片を受けた個体の血清中のＩｇＭ自然抗体と細胞上で発現された炭水化物部分との相互作用により拒絶が媒介される反応を指す。この相互作用は、補体系を活性化して、移植を受けた個体において、数分乃至２〜３時間以内に血管床の溶解及び血流の停止を引き起こす。
【００２３】
ここで用いる場合、用語「細胞外成分」は、任意の細胞外の水、コラーゲン及び弾性繊維、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン及びその他の糖タンパク質を指す。
【００２４】
ここで用いる場合、用語「部分的半月欠損」は、半月全体に及ばない裂け目又は病変(半径方向の裂け目、水平の裂け目、バケツ柄状断裂、複雑な裂け目を含む)を包含し、これは、半月の部分切除を生じる。半月増強デバイスは、生体適合性で且つ少なくとも部分的に生体再吸収性の繊維例えば天然ポリマーからなり、典型的には、半月の部分的欠損と実質的に相補的な外表面輪郭を有する。
【００２５】
ここで用いる場合、用語「患者」は、半月欠損を受けうる生きている生物体例えば哺乳動物を包含する。患者の例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ラット及びマウスが含まれる。
【００２６】
ここで用いる場合、用語「細胞破壊」は、例えば細胞破壊処理におけるように、細胞を殺す処理を指す。
【００２７】
ここで用いる場合、用語「キャッピング分子」は、炭水化物鎖と結合し、それで、異種移植片が、もはや、患者の免疫系によって外来物として認識されなくなる分子を指す。
【００２８】
ここで用いる場合、用語「キャップすること」又は「キャッピング」は、キャッピング分子例えば炭水化物単位を、例えば炭水化物単位の異種移植片上の表面炭水化物部分への共有結合におけるように、炭水化物鎖の末端に結合させることをいう。
【００２９】
ここで用いる場合、用語「第１の表面炭水化物部分」は、炭水化物鎖の非還元末端の末端α−ガラクトシル糖を指す。
【００３０】
ここで用いる場合、用語「第２の炭水化物部分」は、炭水化物鎖の非還元末端のＮ−アセチルラクトサミン残基を指し、該残基は、自然において、又はα−ガラクトシルエピトープの前の開裂の結果として、キャップされていない。
【００３１】
実質的に免疫学的に適合性のマトリクス材料。この発明の方法の第１のステップにおいて、無傷の軟組織を、非ヒト動物から取り出す。内側又は外側半月を、非ヒト動物の膝関節から取り出す。関節軟骨を、非ヒト動物の何れかの関節から取り出す。靭帯及び腱例えばアキレス腱をも、非ヒト動物から取り出す。
【００３２】
軟組織の起源として役立つ関節は、新たに殺した動物から集めるべきであり、好ましくは、直ちに適当な無菌の等張又は他の組織保存用溶液中に入れる。関節の収穫は、動物の屠殺後できるだけ速やかに行なうべきであり、好ましくは、冷却して(即ち、約５〜２０℃の範囲で)行なって、軟組織の酵素的分解を最少にすべきである。好ましくは、この軟組織は、冷却下で、厳密な無菌技術下で収穫する。
【００３３】
半月軟組織に関しては、膝蓋腱の第１の横切開によって、関節を開く。半月の角状の突起を切開して付着組織を無くす。実質的に円筒状の直径約５ミリメートルで深さ５ミリメートルの栓を表す少量の骨を、これらの角状突起に付着したままにすることができる。半月の滑液連絡を注意深く同定して、半月組織自体から除き、それにより、マトリクス材料を形成する。
【００３４】
関節軟骨軟組織に関しては、肋軟骨下の骨の小さい層を伴う関節軟骨の薄皮を、ドナーの関節からそいでマトリクス材料を形成する。
【００３５】
靭帯軟組織に関しては、ドナーの関節を、標準的外科技術により開く。好ましくは、靭帯を、一端又は両端に結合した骨のブロックと共に収穫する(この発明の幾つかの形態においては、靭帯を単独で収穫するが)。この発明の一形態において、直径約９〜１０ｍｍで長さ約２０〜４０ｍｍの実質的に円筒状の栓を表す骨のブロックを、靭帯に結合したままにしておくことができる。この靭帯を注意深く同定し、切開して付着組織を無くし、それにより、マトリクス材料を形成する。
【００３６】
心臓弁軟組織に関しては、ブタの腹膜又は心膜を収穫して、当業者に公知の手順によって、マトリクス材料を形成する。例えば、Laurenの米国特許第４，７５５，５９３号において検討されている腹膜収穫手順を参照されたい。
【００３７】
その結果生成したマトリクス材料を、次いで、約１０倍容の無菌の冷水で洗って、残余の血液タンパク質及び水溶性材料を除去する。このマトリクス材料を、次いで、室温で、約５分間アルコールに浸して、組織を殺菌し且つ非コラーゲン性材料を除去する。
【００３８】
マトリクス材料を、細胞破壊処理にかけて、軟組織の細胞を殺す。典型的には、表面炭水化物部分を生細胞及び細胞外成分から除去した後に、それらの生細胞は、表面炭水化物部分を再発現する。マトリクス材料の抗原性部分の再発現は、そのマトリクス材料の連続した免疫原性拒絶を誘発しうる。対照的に、死細胞は、表面炭水化物部分を再発現することができない。抗原性の表面炭水化物部分の、マトリクス材料の死細胞及び細胞外成分からの除去は、実質的に及び永久的に、プロテーゼ半月の免疫原性拒絶の原因としての抗原性表面炭水化物部分を排除する。
【００３９】
従って、上記の具体例において、マトリクス材料を、上記のように凍結／解凍サイクルにかけて、軟組織の細胞を破壊する(即ち、殺す)。或は、この発明のデバイスのマトリクス材料を、０．２〜約３メガラドの線量を有するガンマ照射で処理する。かかる照射は、軟組織細胞を殺して、マトリクス材料を殺菌する。一度殺せば、軟組織細胞は、もはや、移植された異種移植片の免疫原性拒絶の要因であるα−ｇａｌエピトープなどの抗原性の表面炭水化物部分を再発現することはできない。
【００４０】
この発明の具体例において、軟組織細胞を殺す前又は後に、マトリクス材料を、グリコシダーゼ特にガラクトシダーゼ(例えば、α−ガラクトシダーゼ)によるイン・ビトロ消化にかけて、抗原性の表面炭水化物部分を酵素的に排除する。特に、α−ｇａｌエピトープは、下記の反応に示すように、α−ガラクトシダーゼを用いる酵素処理によって排除する。
【化１】
2005529682.tif 000002
【００４１】
これらのＮ−アセチルラクトサミン残基は、通常、ヒト及び哺乳動物細胞上で発現されるエピトープであり、従って、免疫原性でない。このマトリクス材料のグリコシダーゼによるイン・ビトロ消化は、様々な方法によって達成される。例えば、このマトリクス材料を、グリコシダーゼを含む緩衝溶液に浸し又はインキュベートすることができる。或は、グリコシダーゼを含む緩衝溶液を、圧力下で、脈動的洗浄プロセスによって、マトリクス材料中に押しやることができる。
【００４２】
α−ｇａｌエピトープのマトリクス材料からの排除は、そのマトリクス材料に対する免疫応答を低減させる。このα−ｇａｌエピトープは、非霊長類哺乳動物及び新世界ザル(南米のサル)において、細胞当たり１×１０6〜３５×１０6エピトープで発現され、並びに細胞外成分の巨大分子例えばプロテオグリカン上で発現される。U. Galili等、J.Biol.Chem.263:17755 (1988)。しかしながら、このエピトープは、旧世界ザル(アジア及びアフリカのサル及び無尾猿)及びヒトには存在しない(同上)。抗Ｇａｌは、ヒト及び霊長類において、胃腸管内の細菌上のα−ｇａｌエピトープ炭水化物構造に対する免疫応答の結果として生成される。U. Galili等、Infect.Immunol.56:1730(1988)；R.M. Hamadeh等、J.Clin.Invest.89:1223 (1992)。非霊長類哺乳動物は、α−ｇａｌエピトープを生成するので、これらの哺乳動物から霊長類への異種移植片の異種移植は、これらの異種移植片上のエピトープに対する霊長類の抗Ｇａｌの結合の故に、拒絶を生じる。この結合は、補体結合により及び、抗体依存性の細胞傷害性によって異種移植片の破壊を生じる。U. Galili等、Immunology Today 14:480 (1993)；M. Sandrin等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11391 (1993)；H. Good等、Transplant.Proc.24:559 (1992)；B.H. Collins等、J.Immunol.154:5500(1995)。その上、異種移植は、免疫系の主要な活性化を生じて、増大された量の高親和性の抗Ｇａｌを生成する。従って、α−ｇａｌエピトープの、異種移植片の細胞及び細胞外成分からの実質的排除、及び細胞性α−ｇａｌエピトープの再発現の防止は、α−ｇａｌエピトープと結合する抗Ｇａｌ抗体と関連するプロテーゼデバイスに対する免疫応答を低減させることができる。
【００４３】
更に、この発明のプロテーゼデバイスは、特に、イン・ビトロでのα-ｇａｌエピトープの酵素的排除がよく研究されている。臓器及び他の組織と対照的に、軟骨の細胞外成分は、極度に遅いターンオーバーを受ける。その上、一度軟骨細胞即ち繊維軟骨細胞が殺されれば、これらの細胞は、上記のように、α-ｇａｌエピトープの再発現を防止される。
【００４４】
加えて、軟組織マトリクス材料を、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)で処理してから、又は該処理と同時に、グリコシダーゼで処理することができる。ＰＥＧは、酵素及びコラーゲン細胞外成分への共有結合によってグリコシダーゼのキャリアーとして作用する。更に、ＰＥＧ処理された異種移植片は、低減された免疫原性を有する。
【００４５】
この発明の具体例において、軟組織細胞を殺す前又は後の何れかで、マトリクス材料を一種以上のプロテオグリカン涸渇因子で洗い又は消化する。このプロテオグリカン涸渇因子処理は、グリコシダーゼ処理より先に行なっても後に行なってもよい。プロテオグリカン例えばグリコサミノグリカン(ＧＡＧ)は、マトリクス材料の細胞外成分内に個々の分子として均一に又は変化する量で散在している。これらのＧＡＧは、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸などのムコ多糖分子及びこれらの混合物を含む。かかるＧＡＧを含むプロテオグリカンは、結合した炭水化物例えばα−ｇａｌエピトープを含む。かかるエピトープは、上記のように、一度異種移植片が移植されたならば、免疫応答を刺激する。マトリクス材料をプロテオグリカン涸渇因子で洗い又は消化することは、プロテオグリカン及び結合したα−ｇａｌエピトープの少なくとも一部をマトリクス材料の細胞外成分から除去し、それにより、移植の際のプロテーゼデバイスに対する免疫応答を低減させる。プロテオグリカン涸渇因子処理に続いて移植した後では、天然組織は、残存するコラーゲンシェルを再び増殖することができる。
【００４６】
この発明の方法で用いたプロテオグリカン涸渇因子の非制限的例には、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンＡＣＩＩリアーゼ、ケラタナーゼ、及びトリプシンなどのプロテオグリカン涸渇因子が含まれる。この発明の方法で用いられる他のプロテオグリカン涸渇因子には、フィブロネクチンの断片が含まれる。Homanberg等は、フィブロネクチン断片例えば２９ｋＤａのアミノ末端断片が、関節軟骨軟組織の外表面に結合して、その軟骨を透過して軟骨細胞を包囲することを示唆している。G.A. Homandberg等、Biochem.J.321:751-757(1997)；G.A. Homandberg等、Osteoarthritis and Cartilage 5:309-319(1997)；G.A. Homandberg等、Archives Of Biochemistry And Biophysics 311(2):213-218(1994,6月)；G.A. Homandberg等、Inflammation Research 46:467-471(1997)。選択した濃度において、Homandberg等は、更に、かかるフィブロネクチン断片の軟骨への添加が、イン・ビトロ又はイン・ビボにおいて、プロテオグリカン合成の一時的抑制及び細胞外メタロプロテイナーゼの増強を生じ、これらは、更に、軟骨組織からの急速なプロテオグリカン喪失を生じることを示唆している(同上)。
【００４７】
しかしながら、当業者に公知の他のプロテオグリカン涸渇因子も又、この発明で利用することができる。このデバイスのマトリクス材料を、このマトリクス材料の細胞外成分からのプロテオグリカンの少なくとも一部の除去に有効な量のプロテオグリカン涸渇因子で処理する。好ましくは、このマトリクス材料を、約１．０〜１００．０ＴＲＵ／ｍｌの範囲の量のヒアルロニダーゼなどのプロテオグリカン涸渇因子で又は約０．０１〜２．０ｕ／ｍｌの範囲の量の最も好ましくは約１．０μｌ／ｍｌ〜約２．０μ／ｍｌの範囲の量のコンドロイチナーゼＡＢＣなどのプロテオグリカン涸渇因子で処理する。このマトリクス材料は又、約０．０１〜１．０μＭの範囲の、好ましくは約０．１〜１．０μＭの範囲の量のフィブロネクチン断片(例えば、２９ｋＤａのアミノ末端断片)などのプロテオグリカン涸渇因子で処理することもできる。
【００４８】
グリコシダーゼによる処理又はプロテオグリカン涸渇因子による処理に次いで、マトリクス材料の残存する炭水化物鎖(例えば、グリコサミノグリカン)を、適宜、キャッピング分子で処理して、それらの残存炭水化物鎖の少なくとも一部をキャップする。この発明の方法において利用されるキャッピング分子の例には、フコシル及びＮ−アセチルグルコサミンが含まれる。
【００４９】
プロテーゼデバイスの構築。この発明の半月増強デバイスの繊維を、上記の実質的に免疫学的に適合性のマトリクス材料から製造することができ、このマトリクス材料は、乾燥した多孔質のボリュームマトリクスであり、その一部は、架橋していてよい。好適具体例において、このマトリクス材料は、潤滑並びに機械的強度を提供する能力について選択することができる。
【００５０】
このプロテーゼデバイスの多孔質マトリクスは、半月の繊維軟骨細胞、内皮細胞、繊維芽細胞及び他の細胞(通常細胞外マトリクスを占め並びに細胞外マトリクス成分を合成しそして沈積する)の内殖を促進する。これらの繊維は、コラーゲン、エラスチン、これらの類似体及びこれらの混合物を包含し、これらは、一般に、動物組織から得られ、上記のような低減された免疫原性を伴って生成される。この発明の幾つかの形態において、これらの繊維は、マトリクス中にランダムに配向されうる。或は、これらの繊維は、この半月増強デバイスにおいて、実質的に円周方向に広がる又は実質的に半径方向に広がる配向を仮定することができる。この半月増強デバイスの繊維の密度は、該デバイス中で均一であっても不均一であってもよい。不均一な構成においては、高い応力の予想される点において、繊維の比較的高い密度が確立されうる。
【００５１】
このデバイスは又、他の生体高分子例えばセルロース、アルギン酸、キトサン、及びこれらの類似体、及びこれらの混合物から構築することもできる(コラーゲン、エラスチン及びレティキュリンに代えて又はこれらと共に)。
【００５２】
半月繊維軟骨細胞(脊椎動物の繊維軟骨細胞又は関節繊維軟骨細胞を含む)及び他の種類の細胞の多孔質ボリュームマトリクス内への内殖を、デバイスの機械的強度及び緩衝能を保存しつつ促進するために、半月増強デバイスの密度を操作することができる。例えば、もしマトリクス内への組織の成長を促進するために比較的大きい繊維内及び繊維間空間が望まれるならば、デバイスの密度は、約０．０７〜０．１５ｇマトリクス／ｃｍ3の範囲であってよい(ここに、ｇ／ｃｍ3は、１立方センチメートルのマトリクス中のグラム数を表す)。
【００５３】
或は、この密度は、約０．０７〜０．５０ｇマトリクス／ｃｍ3、又は一層詳細には約０．１０〜０．２５ｇマトリクス／ｃｍ3であってよい。
【００５４】
或は、もし比較的小さい繊維内及び繊維間空間が、膝関節の機械的支持及び改善された緩衝能の提供に望ましいのであれば、デバイスの密度は、約０．１５〜０．５０ｇマトリクス／ｃｍ3の範囲にデザインされる。好適具体例においては、このマトリクスは、自然の半月荷重力を支持するのに十分な機械的強度を維持しつつ、半月繊維軟骨細胞並びに他の細胞の内殖に理想的環境を提供する約８〜９ｃｍ3／ｇマトリクスの繊維内及び繊維間空間を有して約０．１０〜０．２５ｇマトリクス／ｃｍ3の密度を有する。
【００５５】
或は、このデバイスマトリクスは、約２〜２５ｃｍ3／ｇマトリクス(又は、２〜１４ｃｍ3／ｇマトリクス)の繊維内及び繊維間空間を有しうる。
【００５６】
一具体例において、このプロテーゼデバイスは、補綴用椎間円板であり、そのマトリクスは、天然の椎間円板と実質的に同じ外表面輪郭をイン・ビボで有するように適合される。従って、このデバイスマトリクスは、脊椎骨繊維軟骨細胞の内殖に適合された少なくとも部分的に生体再吸収性の足場を確立し、このデバイスマトリクスと内殖した脊椎骨繊維軟骨細胞は、自然の椎間荷重力を支持する。このデバイスは、円板の形状をしており、このデバイスマトリクス中の繊維は、円板の周縁に隣接する領域で実質的に規則正しい様式で配向しうる(その配向は、実質的に、円周方向である)。一つの特定の具体例において、このマトリクス材料は、約０．０５〜０．４０ｇ／ｃｍ3の密度を有する低密度のフィラメントを含む。他の特定の具体例において、低密度フィラメントは、約０．０７〜０．３０ｇ／ｃｍ3である。
【００５７】
他の具体例において、このプロテーゼデバイスは、補綴用靭帯であり、マトリクス材料は、複数の実質的に整列され、伸張されたフィラメントよりなる。このデバイスマトリクスのフィラメントは、靭帯繊維芽細胞の内殖に適合された生体再吸収性の足場を確立し、このデバイスマトリクスと内殖した繊維芽細胞は、自然の靭帯張力を支持する。
【００５８】
特定の具体例において、このデバイスマトリクス材料は、約７５〜１００重量％の濃度でマトリクス中に存在する小繊維(例えば、タンパク質小繊維)、及び約０〜２５重量％乾量の濃度で存在する多糖類分子(例えば、グリコサミノグリカン)を含む。
【００５９】
架橋。このマトリクスは又、これらの繊維中に散在するグリコサミノグリカン分子(ＧＡＧ)を含むこともできる。これらの分子は、Ｎ−アセチル化ヘキソサミンを含む反復する二糖類単位の鎖を含み、半月増強デバイスのための潤滑及び架橋を与える。この発明の方法で利用することのできるＧＡＧの例には、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、及びこれらの混合物がマトリクスの成分として含まれる。これらのＧＡＧは、半月増強デバイス中に、個別分子として均一に分散されうるし、又はそれらは、このデバイスの異なる領域で変化する量で存在しうる。このマトリクスは、約７５〜１００％の天然繊維と約０〜２５％のＧＡＧ(乾量)よりなってよい。これらの割合は、マトリクス中で一定であっても変化するものであってもよい。
【００６０】
一具体例において、このデバイスマトリクス材料は、コラーゲン及びグリコサミノグリカンの架橋を含む。このグリコサミノグリカン架橋は、約０．９５架橋／コラーゲン未満で且つ約０．５０架橋／コラーゲン比以上の密度で存在する。
【００６１】
他の具体例において、これらの分子架橋の分子量は、約８００〜６０，０００ダルトンの範囲内にある。
【００６２】
この半月増強デバイスの形状のイン・ビボにおける一時的安定性及びそれらの繊維(及び、もし該デバイスがＧＡＧを含有するならば、ＧＡＧ)の再吸収速度は、共に、繊維の少なくとも一部の間の架橋に帰因する。加えて、ＧＡＧは、直接、それらの繊維による共有架橋の形成に参加することができ又はそれらの繊維と安定な繊維−ＧＡＧ複合体を形成する絡み合いにより機械的に相互作用することができる。これらの架橋の形成に利用される架橋試薬には、生体適合性の二官能性試薬が含まれる。これらの試薬は、単一分子上のアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシル基と相互作用して分子内架橋を形成することができる。或は、それらは、異なる分子又は繊維及びＧＡＧ上のアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシル基と相互作用して、分子間架橋を形成することができる。有用な架橋試薬には、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、生体適合性の二官能性アルデヒド、カルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ビス−イオニデート、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリオキサル、ビスイミデート、アジピルクロリド及びこれらの混合物が含まれる。
【００６３】
分子間架橋も又、リジン又はヒドロキシリジンのアミノ基とアスパラギン酸又はグルタミン酸のカルボキシル基との間でのペプチド結合の形成を生じる脱水熱工程(熱及び真空)によって確立しうる。架橋したデバイスは、イン・ビボでの十分な安定性のために約５５〜８５℃で(好ましくは、６５〜７５℃で)比較的高い熱安定性を有する。これは、架橋誘導の操作(試薬濃度、温度、ｐＨ及び時間を含む)によって達成しうる。
【００６４】
架橋したデバイスは、十分な程度の疎水性及び弾力性を保持し、それにより、天然の半月又はその一部の特性(即ち、機械的応力を支持し且つ関節表面を保護して潤滑化する能力)を真似る。加えて、この構造は、細胞の侵入及び細胞外マトリクスの合成及び沈着に理想的な環境を与える。
【００６５】
この発明は、更に、半月増強デバイスの製造方法にも関係する。この方法は、一般に、複数の繊維(繊維及びＧＡＧ、又は繊維及び成長因子及び／又は接着因子及び／又はＧＡＧ)を、修復すべき半月中の部分的欠損により規定される形状を有する(又は、修復すべき部分的欠損より一層大きい形状を規定する)型内に置くこと、それらの繊維を凍結乾燥すること、及びそれらの繊維又は繊維及びＧＡＧを化学的架橋用試薬と、それらの繊維又は繊維及びＧＡＧがその型の形状を呈して乾燥した、多孔質のボリュームマトリクスが得られるように接触させることを含む。この型は、部分的欠損を相補するようにこのデバイスの外表面を規定することができる。或は、この発明の他の面においては、化学的に架橋したマトリクスを凍結乾燥してから脱水熱架橋手順にかけるにより更なる架橋ステップを行なう。この型が特定の修復すべき欠損より大きい形状を規定する場合には、マトリクスの外輪郭をカットして、それが欠損を相補するようにすることができる。
【００６６】
このプロテーゼ半月の製造に有用な型１００は、移植可能なステンレス鋼又は生体適合性プラスチック例えばテフロン(登録商標)、ポリプロピレン、デルリン(登録商標)、又はこれらの材料の組合せよりなる。この型１００は、図６〜８に示したように、３つの部分１０２、１０４及び１０６よりなる。
【００６７】
図４及び５に例示した円板形状の半月の例として、図６の型１００が用いられる。第一の部分１０２は、円板様であり、所望の半月の直径と実質的に等しい直径を有している。部分１０２には、圧力下で液体を通すための穴を開けてある。部分１０２の内表面１０３は、形成すべき半月の一側面の所望の形状を有している。
【００６８】
第二の部分１０４は、第一の部分１０２と同じ内側寸法を有する中空のシリンダーである。第三の部分１０６は、部分１０４の内側直径より僅かに小さい外側直径を有するシリンダーのピストンである。ピストン１０６の「先頭」(即ち、冠)表面１０８は、形成すべき半月の一側面の所望の形状を有する。
【００６９】
図３の半月のためには、部分１０２の形状、及び部分１０４の断面が角張ったセグメントの形状を有する図７の型が用いられる。平らな円形の円板状半月のためには、部分１０２と１０４が図６と同じであり且つ１０６が図中のその部分に似ているが、平らな冠表面１０８を有する図８の型１００が用いられる。
【００７０】
半月１０の製造中に、部分１０２は、図６〜８に示したように、先ず、部分１０４内に集められる。構成成分の繊維(液体中)は、部分１０２の表面１０３に対して位置される。次いで、ピストン１０６の冠表面１０８が、部分１０２の表面１０３に向かって、これらの繊維が圧縮されるまで、圧縮軸１０６ａに沿って駆動され、液体は、部分１０２を通って押し出されて、圧縮された繊維のアレイの所望の軸性寸法が達成される。次いで、この型を、化学的架橋の用意において凍結させる。
【００７１】
一具体例において、このマトリクス材料の繊維は、マトリクス中に実質的にランダムな様式で配向される。他の具体例において、このマトリクス材料の繊維は、マトリクス中で実質的に秩序だった様式で配向される。例えば、これらの繊維は、実質的に円周方向に伸張する繊維であっても、実質的に半径方向に伸張する繊維であってもよい。その上、このマトリクス材料の繊維の密度は、マトリクス中で実質的に均一であってもよいし、不均一に分散していてもよい。
【００７２】
従って、これらの繊維は、例えば円筒形などの型内にランダムに又は特定の向きに配向されて置かれる。例えば、このマトリクス材料の繊維を、該繊維を型内に置く際に型を回転させることにより円周方向の配向で型内に置くことができる。或は、これらの繊維を、該繊維を手作業で半径方向に直線的パターンで塗布することにより型内で半径方向に配向させることができる。架橋反応に参加しうる他の成分例えばＧＡＧを、これらの繊維と、ランダムな又はランダムでない様式で、該構造を様々な架橋及び脱水手順(様々な化学的及び／又は脱水方法を含む)にかける前に混合することができる。接着分子又はそれらの接着性断片若しくは類似体、又は成長因子若しくはそれらの生物学的に活性な断片若しくは類似体を、この構造に処理中に組み込むことができる。
【００７３】
このデバイスを型を利用して製造する他の具体例において、製造は、(１)複数の生体適合性のグリコシダーゼ処理した繊維を型内に置き；(２)これらの繊維を凍結及び解凍の第一及び第二のサイクルにかけ；(３)これらの繊維を化学的架橋剤と、これらの繊維がその型の形状を呈するように接触させ；そして(４)これらの架橋した繊維を凍結乾燥するステップを含む。或は、このデバイスの製造は、このマトリクス材料のグリコシダーゼ処理した繊維を、それらの型内の繊維をピストンで圧縮することにより、実質的に円周方向で配向させるステップを含むことができる(ここに、該ピストンの運動は、実質的に圧縮軸に沿った向きであり、この圧縮ステップ中、このピストンは、型に関して圧縮軸の周囲で回転される)。
【００７４】
特定の密度及び細孔寸法を、化学的架橋の工程の前に、型内の繊維及びＧＡＧを圧縮することによりマトリクスの様々な領域において得ることができる。これは、予め決めた形状のピストンを用いてマトリクスの特定の領域に圧力を適用することによって達成することができる。好適な細孔寸法範囲は、約５０〜５００ミクロンである。或は、この細孔は、実質的に、１０〜５０ミクロンの範囲内にあってよい。
【００７５】
上の例に記載した工程に従って、下記の表Ｉに列記した特性を有するこの発明の半月増強デバイスを、構築することができる。
【表１】
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【００７６】
その上、アルデヒド例えばグルタルアルデヒドを架橋剤として利用した場合には、このマトリクス材料は、約０．００１〜５．０％(好ましくは、約０．０１〜５．０％)のグルタルアルデヒドを含み、約７．４のｐＨを有する緩衝溶液中に置かれうる。一層好ましくは、約０．０１〜０．１０％のアルデヒドを、最も好ましくは約０．０１〜０．０５％のアルデヒドを用いる。架橋反応の持続期間(１〜１４日、好ましくは１〜５日、最も好ましくは３〜５日であってよい)の間、溶液のｐＨの制御を維持することが可能である限りにおいて、任意の適当な緩衝液例えばリン酸緩衝塩溶液又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンなどを利用することができる。
【００７７】
或は、このマトリクス材料は、蒸気形態の架橋剤(気化したアルデヒド架橋剤、例えば気化したホルムアルデヒドが含まれるが、これらに限られない)にさらされうる。この気化した架橋剤は、ある濃度及びあるｐＨを有してよく、このマトリクス材料は、気化した架橋剤に、架橋反応が起きることを可能にするのに適当な期間にわたってさらされうる。例えば、このマトリクス材料は、約０．００１〜５．０％の、好ましくは、約０．０１〜５．０％の濃度、及び約７．４のｐＨを有する気化した架橋剤にさらされうる。一層好ましくは、このマトリクス材料は、約０．０１％から約０．１０％に至る量の、最も好ましくは約０．０１％から約０．０５％に至る量のアルデヒドにさらされる。このマトリクス材料は、ある期間(１〜１４日、好ましくは１〜５日、最も好ましくは３〜５日であってよい)にわたってアルデヒドにさらされる。気化した架橋剤にさらすことは、その架橋剤への曝露に由来するマトリクス材料中に低減された残留化学剤を生じうる。
【００７８】
この架橋反応は、免疫原性決定基がマトリクス材料から実質的に排除されるまで持続すべきであるが、この反応は、マトリクス材料の機械的特性の有意の変化の前に終了すべきである。ジアミンも架橋剤として利用する場合には、如何なる未反応ジアミンもキャップされるように、グルタルアルデヒド架橋が、ジアミン架橋後に起きるべきである。これらの架橋反応が上記のように完了するまで進行した後に、このマトリクス材料をすすいで、残留化学剤を除去するべきであり、０．０１〜０．１０Ｍ グリシン(好ましくは、０．０１〜０．０５Ｍ グリシンを加えて、残っている如何なる未反応アルデヒド基をもキャップすることができる。
【００７９】
他の具体例において、このプロテーゼデバイスは、主に、上記のように(α−Ｇａｌエピトープを排除するα−ガラクトシダーゼでの処理により)製造されたＩ型コラーゲン繊維から、ＧＡＧ架橋なしで構築されうる。
【００８０】
その上、異なる型のコラーゲン(例えば、ＩＩ型コラーゲン)又は他の起源から得られたコラーゲン(例えば、生合成で製造されたコラーゲン又はその類似体)も又、この半月増強デバイスの構築において利用することができる。
【００８１】
追加的組織製造工程。上記の組織の製法(α−Ｇａｌエピトープを排除するα−ガラクトシダーゼでの処理による)に加えて、この組織を、一連の機械的及び化学的方法によって処理して、非コラーゲン性物質をすべて除去し又は最少レベルまで減少させることができる。腱又は皮膚を、機械的に破壊して、更なる処理に有用な細片にすることができる。この破壊は、組織を液体窒素温度で破砕することにより又は鋭利なナイフで組織を小さい断片に切断することによって達成することができる。ある適用において、これらの腱は、機械的強度のために繊維の長さを保持するために繊維方向に沿って機械的に破壊される。
【００８２】
中性ｐＨでの腱の塩抽出は、新たに合成されて未だ安定な小繊維に組み込まれていないコラーゲン分子の小部分を除去する。塩は又、コラーゲンと静電相互作用により会合する幾らかの糖タンパク質及びプロテオグリカンをも除去する。他の塩例えばＫＣｌなどを、ＮａＣｌの代りに利用することができる。
【００８３】
細胞膜又はコラーゲンマトリクスと会合する脂質は、先ずトリトンＸ−１００などの洗剤で抽出してから、エーテル−エタノール混合物で抽出することにより除去することができる。トリトンＸ−１００の濃度は、通常、約２〜４％であるが、好ましくは、約３％である。エーテル−エタノールの好適な混合物は、通常、約１：１の比(ｖ／ｖ)である。抽出期間は、通常、８〜９６時間(好ましくは、約２４〜４８時間)である。
【００８４】
更なる抽出を、２つの極端なｐＨで実施するマトリクス膨潤によって達成することができる。酸性及び塩基性膨潤は、共に、非共有結合性分子間相互作用を弱くし、そうして、非共有結合で結合した糖タンパク質、ＧＡＧ及び他の非コラーゲン性分子の、コラーゲンマトリクスの開孔からの遊離を促進する。
【００８５】
アルカリ性ｐＨでのマトリクスの膨潤は、コラーゲンを高いｐＨでＣａ(ＯＨ)2、ＮａＯＨなどで約８〜９６時間にわたって処理することにより行われる。(ＣＨ3)4ＮＣｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4などの三重らせん安定化塩の存在下でのアルカリ抽出は、コラーゲンの変性の潜在的危険を減少させる。アルカリ処理は、架橋されてない糖タンパク質及びＧＡＧをコラーゲンマトリクスから分離する。アルカリは又、残留脂質をも鹸化により除去する。
【００８６】
酸膨潤は、酢酸、ＨＣｌなどの存在下で低いｐＨで行なうことができる。アルカリ処理と同様に、酸膨潤は、架橋されてない糖タンパク質及びＧＡＧを除去する。
【００８７】
アルコール浸漬後に、マトリクス材料を、次の処理の少なくとも一つにかけることができる：照射処理、アルコールでの処理、オゾン処理、１サイクル以上の凍結解凍及び／又は化学的架橋剤での処理。これらの処理の一つより多くをマトリクス材料に適用する場合は、それらの処理は、任意の順序であってよい。
【００８８】
この発明の方法の一具体例においては、マトリクス材料を、約１５分間の紫外線照射又は約０．５〜３メガラドの量のガンマ照射への曝露によって処理することができる。
【００８９】
他の具体例においては、マトリクス材料を、アルコール溶液中に位置させた薬剤により処理することができる。任意のアルコール溶液を利用して、この処理を行なうことができる。好ましくは、このマトリクス材料は、室温で、イソプロパノールの７０％溶液中に置かれる。
【００９０】
この発明の方法の更なる具体例において、このマトリクス材料は、凍結／解凍サイクルにより処理することができる。例えば、このマトリクス材料は、該マトリクス材料が完全に凍結される(即ち、未凍結の軟組織を含む内部温点が残らない)限りにおいて、任意の凍結法を利用して凍結させることができる。好ましくは、このマトリクス材料を、液体窒素に約５分間漬けて、この方法のこの工程を行なう。一層好ましくは、このマトリクス材料を、フリーザー中に置くことによって、ゆっくりと凍結させる。この凍結／解凍サイクルの処理の次のステップにおいて、このマトリクス材料を、室温(約２５℃)で約１０分間の等張塩溶液バスへの浸漬により解凍させる。繊維の分解を最少にするために、外部の熱源又は放射源は利用しない。
【００９１】
尚更なる具体例において、このマトリクス材料を、適宜、米国特許第４，７５５，５９３号に詳細に記載されているように、化学剤にさらして、その細胞外成分中のタンパク質をなめすことができ、更に、マトリクス材料中に存在する免疫原性決定基を最少にし又は低減させることができる。この処理のために、任意のなめし剤を利用することができる。
【００９２】
接着分子、成長因子及び他のマトリクス材料への添加剤。このプロテーゼ半月増強デバイスは、接着分子、又はその接着性部分若しくは類似体(繊維のネットワークに組み込まれるもの)を更に含むことができる。ここで用いる場合、接着分子は、このデバイスにおいて細胞が付着できる粘着性表面を提供することによって半月組織の再生を助けるものである。有用な接着分子には、コンドロネクチン、オステオネクチン及びフィブロネクチン(例えば、米国特許第４，５８９，８８１号、４，６６１，１１１号及び４，５７８，０７９号参照)が含まれるが、これらに限られず、これらの一部は、例えば、コンドロイチン硫酸などに結合体化されうる。
【００９３】
或は(又は、加えて)、このプロテーゼ増強デバイスは、繊維のネットワークの間に散在され又は該ネットワークに組み込まれて半月組織の再生を助ける成長因子を含むことができる。これらの成長因子には、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子など、及びかかる成長因子の対応する天然の成長因子の生物学的活性を有する類似体が含まれるがこれらに限られない。このマトリクスは又、一種より多くの成長因子を、任意の組合せで含むことができる。
【００９４】
利用方法。この発明は、更に、半月組織をイン・ビボで再生させる方法に関係する。この方法は、上記の方法による半月増強デバイスの製造及び該半月増強デバイスの、患者の半月の部分的欠損への移植を含む。
【００９５】
このプロテーゼデバイスは、損傷を受けたヒトの関節に、当業者によって、公知の関節鏡外科手術技術を利用して移植することができる。関節鏡技術を実行するための特別の器具は、当業者に公知であり、これらは、軟組織移植物の正確で且つ反復可能な配置を保証する。
【００９６】
一度プロテーゼデバイスが身体内に位置されると、それは、新たな血管の増殖を助け、それは、傷の治癒過程に重要である。これらの血管は、移植片に栄養を与え、身体が必要とする生体分子を供給して、損傷を受けた組織を再建する。この材料は又、多くの同様の天然組織をも、ストレスに応じて強化する。
【００９７】
ベース成分。このプロテーゼデバイスは又、生体適合性の円錐形ベース成分をも含み、これは、海綿状の骨の相補的な開口部に該デバイスを係留するアンカーを含む。このベース成分は、マトリクスの外面の部分から広がって、少なくとも部分的に再吸収可能である。一具体例において、このベース成分は、複数の円周方向に伸びる隆起を含む。
【００９８】
このベース成分は、複合物、コラーゲンの分散及びカルシウム組成物から作ることができる。このカルシウム組成物は、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、又はリン酸三カルシウムとヒドロキシアパタイトの組合せから選択することができる。一具体例において、この分散は、約９０重量％のカルシウム組成物と約１０重量％のコラーゲンを含む。
【００９９】
この発明の少なくとも一つの具体例の詳細は、上記の付随的記述中に示されている。この発明の実施又は試験においては、ここに記載したものと類似する任意の方法及び材料を利用することができるが、好適な方法及び材料を今から説明する。この発明の他の特徴、目的及び利点は、この説明及び請求の範囲から明らかとなろう。この明細書及び添付の請求の範囲において、特異な形態は、文脈が別のものを明確に指令しない限り、複数の指示物を含む。別に規定しない限り、ここで用いられるすべての技術用語及び科学用語は、この発明が属する当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。この明細書中で引用したすべての特許及び刊行物を、参考として援用する。
【０１００】
下記の実施例は、この発明の好適具体例を一層完全に説明するために与える。これらの実施例は、添付の請求の範囲により規定されるこの発明の範囲を制限するものと解するべきではない。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
デバイス１の製造
(Ａ)約７００ｇのＩ型コラーゲンの分散(α−ガラクトシダーゼで処理して、α−Ｇａｌエピトープを除いたもの)を計って、２リットルの真空フラスコに入れる。約１２０ｍｌの０．６６水酸化アンモニウムをこの分散に加えて、コラーゲンを共活性化する。次いで、約８０ｍｌの２０％ＮａＣｌを、これらの共活性化した繊維に加えて、更に、繊維間の溶液吸収膨潤を減じる。
(Ｂ)完全に共活性化された繊維を、孔の開いたメッシュのバスケット中で、約７０〜８０ｇまで脱水して、過剰の溶液を繊維から除去する。
(Ｃ)部分的に脱水したコラーゲン繊維を、治療すべき欠損の寸法に関して特定の寸法の型内に挿入する。一定(３００〜７００ｇ)重量を利用して水を繊維からゆっくりと除去する更なる脱水が、型内で進行し、しかも終始同じ密度を維持する。このゆっくりした脱水工程は、所望の寸法(約８ｍｍ厚)に達するまで、約２４時間続く。
(Ｄ)この脱水されたコラーゲンマトリクスを、更に、所望の形態に成形する。
(Ｅ)これらの脱水されたコラーゲン繊維を、−２０℃で少なくとも４時間凍結させた後に、Ｖｉｒｔｉｓ(登録商標)フリーズドライヤー中で凍結乾燥する。
(Ｆ)これらの凍結した繊維を、先ず、−１０℃で４８〜７２時間乾燥した後に、２０℃で１６〜２４時間４００ミリバールの真空で乾燥させる。
(Ｇ)凍結乾燥したマトリクスを、ホルムアルデヒド架橋手順にかける。これらのマトリクスを、４０時間にわたって、２２℃で２％ホルムアルデヒド溶液から生成されたホルムアルデヒド蒸気の閉鎖チャンバー内で架橋させる。それらの架橋されたマトリクスを大量に排出して、未結合のホルムアルデヒドを除去する。
(Ｈ)これらのマトリクスを、次いで、熱及び真空処理にかけて、該マトリクスを更に架橋させる。
(Ｉ)これらのマトリクスを、修復すべき半月の部分的欠損の形状に切る。これらの切ったマトリクスを、発熱物質を含まない蒸留水中で大規模にすすいで、残留する塩及びホルムアルデヒドを、これらのマトリクスがイン・ビトロ及びイン・ビボで生体適合性となる程度まで除去する。
(Ｊ)これらのすすいだマトリクスを、ヘパフィルター下で乾燥させ、パッケージにして、殺菌する。
【０１０２】
実施例２
デバイスＩＩの製造
デバイスＩＩを製造する手順は、実施例２に記載したものと同じであるが、但し、ＩＩ型コラーゲン分散約７００ｇ(α−ガラクトシダーゼで処理してα−Ｇａｌエピトープを排除したもの)を使用する。
【０１０３】
実施例３
デバイスＩＩＩの製造
(Ａ)高度に精製したＩ型コラーゲン小繊維(α−ガラクトシダーゼで処理してα−Ｇａｌエピトープを排除したもの)のコラーゲン含量は、重量法により又はヒドロキシプロリン含量を測定することにより測定する(Ｉ型コラーゲン中に約１３．５重量％のヒドロキシプロリンを仮定する)。次いで、所定の密度の半月増強デバイスを製造するのに必要な精製したマトリクスの量を決定して、目方を量る。
(Ｂ)小繊維コラーゲンの溶液を、例えば、上記の典型的な半月増強デバイスに従って、特定の寸法の型に適合させる。コラーゲン繊維を、ランダムな仕方で又は向きをつけて置く。向きをつけた仕方の内で、これらの繊維の円周方向の配向は、材料を型内で圧縮する際のピストンの主軸の周りの回転によって生成され；半径方向の配向は、これらのコラーゲン繊維を手作業で半径方向に直線的に塗布することにより生成される。
(Ｃ)これらの繊維を、−２０℃で凍結させ、型から中身を出して室温で解凍する。
(Ｄ)これらの繊維を、次いで、リン酸緩衝塩溶液中に再懸濁させて、型に所望の配向で戻し、ピストンで圧縮する。
(Ｅ)圧縮した繊維を、次いで、−２０℃で凍結させ、その後、室温で解凍する。
(Ｆ)その結果生成した構造を、０．２％グルタルアルデヒド溶液(ｐＨ７．６)に２４(±０．５)時間にわたって浸すことにより架橋する。各グルタルアルデヒド架橋された半月増強デバイスを、次いで、５００ｍｌのリン酸緩衝塩溶液(ＰＢＳ)(ｐＨ７．４)中で、繰り返し、４、８、２４及び４８時間にわたってすすぐ。
(Ｇ)すすいだマトリクスを、次いで、凍結乾燥する。
【０１０４】
実施例４
移植されたα−ガラクトシダーゼで処理したプロテーゼ半月に対する霊長類の応答の評価
この実施例においては、プロテーゼデバイスのためのマトリクス材料を、α−ガラクトシダーゼで処理してα−ガラクトシルエピトープを排除し、それらの移植物をカニクイザルに移植して、霊長類の軟組織移植物への応答を評価する。
【０１０５】
マトリクス材料の各セットを、２つの部分に切る。各第一の部分を、α−ガラクトシダーゼを予め決めた濃度で含む緩衝溶液に浸す。これらの試料を、緩衝溶液中で、予め決めた時間、予め決めた温度でインキュベートする。各第二の部分を、対応する第一の部分と同じ条件下で、緩衝溶液中で、α−ガラクトシダーゼの非存在下でインキュベートし、これは、対照として役立つ。
【０１０６】
このインキュベーションの最後に、マトリクス材料を、酵素を拡散させる条件下で洗う。アッセイを行なって、α−ｇａｌエピトープの完全な除去を確実にする。
【０１０７】
各プロテーゼデバイスを、６匹のカニクイザルの上部膝蓋嚢に移植する。全身吸入麻酔下の動物を用いて、約１ｃｍの切開を、中心側に伸びる膝蓋骨の内側上縁の上部膝蓋嚢中に直接生成する。
【０１０８】
プロテーゼデバイスは又、次の移植手順を用いても６匹のカニクイザルに移植される。全身吸入麻酔下の動物を用いて、これらのプロテーゼデバイスのための解剖学的挿入部位を同定して、実質的に直径９ｍｍで長さ４０ｍｍの骨栓を合わせるために孔を開ける。このプロテーゼデバイスを、このドリル孔に入れて邪魔ネジを付ける。
【０１０９】
これらの移植手順を無菌の外科的技術の下で行なって、傷を、３−０ビクリル又は当業者に公知の適当な同等物を利用して閉じる。これらの動物を、ケージ内で自由に活動させて、如何なる不快、膨潤、感染又は拒絶の徴候をも監視する。抗体の監視のために、血液試料(約２ｍｌ)を、周期的(例えば、２週間ごと)に採取する。
【０１１０】
このプロテーゼデバイスに対する免疫応答の出現を、抗Ｇａｌ及び非抗Ｇａｌ抗軟組織抗体(即ち、α−ｇａｌエピトープ以外の軟組織抗原に結合する抗体)を、移植を受けたサルの血清試料において測定することにより評価する。少なくとも、２ｍｌの血液試料を、移植を受けたサルから移植手術の日に採取し、移植後周期的(例えば、２週間)間隔で採取する。これらの血液試料を遠心分離して、それらの血清試料を凍結して、抗Ｇａｌ及び他の抗体について評価する。
【０１１１】
抗Ｇａｌ活性を、これらの血清試料において、当分野で公知の方法例えばGalili等、Transplantation 63:645-651(1997)に記載された方法により、α−ｇａｌ−ＢＳＡを固相抗原として利用するＥＬＩＳＡにて測定する。
【０１１２】
アッセイを行なって、α−ガラクトシダーゼ処理したプロテーゼデバイスが抗軟組織抗体の形成を誘導するかどうかを測定する。抗軟組織抗体活性を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを当分野で公知の方法例えばK.R. Stone等、Transplantation 63:640-645(1997)に記載された方法によって行なう。
【０１１３】
これらのプロテーゼデバイスを、移植後１〜２ヶ月で、適宜、外植して、切片を形成して、免疫学的浸潤の組織学的評価のために染色する。抗Ｇａｌ及び他の抗軟骨軟組織抗体活性の移植後の変化は、当分野で公知の方法例えばK.R. Stone等、Transplantation 63:640-645(1997)に記載された方法を利用して、移植後１〜２ヶ月で、プロテーゼデバイス内の炎症性組織学的特性(即ち、顆粒球又は単球の細胞浸潤)と相関する。
【０１１４】
これらのプロテーゼデバイスを移植された動物を回復させて、切り口が癒えて足取りが正常になるまで綿密に監視する。これらのプロテーゼデバイスを集めて、処理し、顕微鏡検査を行なう。
【０１１５】
これらのプロテーゼデバイス及び周囲組織の部分を、当分野で公知の方法により、免疫組織化学的評価のための包埋用型内の凍結組織試料用包埋メディウム中で凍結させる。約１０％ｗ／ｗポリビニルアルコール、約４％ｗ／ｗポリエチレングリコール及び約８６％ｗ／ｗ非反応性成分を含み、Sakura FinTek(登録商標)(米国、カリフォルニア、Torrence在)により製造される「ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ(登録商標)」Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドは、この発明での利用のための可能な包埋メティウムの非制限的例である。当業者に公知の他の包埋メディウムも利用することができる。残りの移植物及び周囲組織を、組織病理学的検査のために、１０％中性緩衝ホルマリン中に集める。
【０１１６】
実施例５
α−ガラクトシダーゼによりマトリクス材料に由来したα−Ｇａｌエピトープ評価のためのアッセイ
この実施例においては、マトリクス材料からのα−ｇａｌエピトープの排除の評価のためのＥＬＩＳＡアッセイを行なう。
【０１１７】
α−ガラクトシダーゼについてのアッセイ。酵素α−ガラクトシダーゼ(以前にコーヒー豆からクローン化されて、遺伝子工学的に酵母ピチア・パストリスで発現されたもの)は、よく特性決定されている(Zhu等、Arch.Biochem.Biophysics 324:65(1995))。α−ガラクトシダーゼは、自然界に広く分布している分子量４１ｋＤａのエキソグリコシダーゼである。それは、末端α−ガラクトース残基を細胞由来のオリゴ糖鎖から開裂させることによって機能する。組換え体酵素の活性を、希釈した酵素をｐ−ニトロフェニル−α−ガラクトシド基質と１０分間室温で反応させることにより測定する(Zhu等、Arch.Biochem.Biophysics 827:324(1996))。ｐ−ニトロフェノールの吸光度を各溶液において、４０５ｎｍで読む。この酵素は、３７℃、２４℃及び４℃で安定であり、反復する凍結・解凍によって影響される。酵素の各バッチの活性を、アッセイで用いる前にチェックする。
【０１１８】
糖タンパク質上のα−ｇａｌエピトープに高度に特異的なモノクローナル抗Ｇａｌ抗体(Ｍ８６と称する)を、１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼについての抗Ｇａｌ産生ノックアウトマウス由来の脾臓細胞とマウスハイブリドーマ融合パートナーとの融合により生成する。
【０１１９】
Ｍ８６は、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)に、１１のα−ｇａｌエピトープを有するウシチログロブリン(R.G. Spiro等、J.Biol.Chem.259:9858(1984))に；又は５０のα−ｇａｌエピトープを有するマウスラミニン(R.G. Arumugham等、Biochem.Biophys.Acta 883:112(1986))に結合された合成のα−ｇａｌエピトープに結合するが；ヒトチログロブリン又はヒトラミニン、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ(Ｎ−アセチルラクトサミン−ＢＳＡ)及びＧａｌα１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ(ＢＳＡに結合されたＰ１抗原)には結合しない(これらは、すべて、α−ｇａｌエピトープを完全に欠く)。
【０１２０】
一度Ｍ８６抗体が単離されれば、モノクローナル抗体を、約１：２０から１：１６０まで好ましくは約１：５０から１：１３０まで希釈する。この抗体を、約５〜２４時間に及ぶ予め決めた時間にわたって、約３〜８℃に及ぶ予め決めた温度でインキュベートする。この抗体を、約５〜１００μｍの大きさの軟組織の断片との、一層好ましくは約１０〜５０μｍの大きさの軟組織の断片と、約２００〜１．５ｍｇ／ｍｌの様々な軟組織濃度で一定の回転に維持する。その後、軟組織断片を、約２０，０００〜５０，０００×ｇの遠心分離速度で遠心分離する。軟組織に結合したＭ８６割合を、上清中に残存するＭ８６の活性を、α−ｇａｌ−ＢＳＡを利用するＥＬＩＳＡにて、従来技術例えばU. Galili等、Transplantation 63:645-651(1997)に記載されたようにして測定することにより評価する。Ｍ８６の軟組織への結合の程度は、次のα−ｇａｌ−ＢＳＡへｂの結合の阻害パーセンテージとして定義される。マトリクス材料中のα−ｇａｌエピトープの量と、マトリクス材料の断片と複合体形成し、それ故上清から除去されたＭ８６の割合(即ち、阻害パーセンテージ)との間には、直接的関係がある。
【０１２１】
酵素タンパク質濃度の測定−特異的活性の測定。このアッセイは、溶液中のタンパク質の量を定量的に測定するシグマ ディアグノスティクス ミクロプロテイン ＰＲ(商標)キットを用いる。この反応媒質は、０．０５ｍモル／Ｌピロガロールレッド、０．１６ｍモル／Ｌモリブデン酸ナトリウムよりなる。タンパク質標準溶液は、防腐剤として０．１％アジ化ナトリウムを含む塩類溶液中のヒトアルブミン(５０ｍｇ／１００ｍｌ)よりなる。９５μｌのピロガロール試薬を各ウェルに加える。脱イオン水を、ブランクとして利用する。これらの試験ウェルに５μｌの酵素溶液(１／５０希釈)を加える。標準アルブミン溶液を別々のウェルに加える。このマルチウェルプレート及び内容物を、３７℃で３分間インキュベートする。吸光度を６００ｎｍで測定する。次の式を利用して、タンパク質濃度を計算する：タンパク質(ｍｇ／ｄｌ)＝Ａtest−Ａblank／Ａstandard−Ａblank×標準の濃度。
【０１２２】
前述の記載は、説明目的のためにのみ提示したものであって、この発明を、開示した通りの形態に制限することを意図するものではなく、本発明は、添付の請求の範囲により規定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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