(57)【要約】  物質を皮膚に送達するための擦過デバイスおよび方法は、基部（１４）を有する、皮膚へ物質を送達するためのマイクロブレーダを含み、この基部は、少なくとも１つの引掻縁を有する微小突起の配列を有する擦過表面（５）が接合されるか、装着されるか、または一体形成された擦過面と把手接合面を持ち、この把手接合面には把手（６）または他の把持デバイスが接合または装着される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質を皮膚に送達するためのマイクロアブレーダであって、前記マイクロアブレーダは擦過表面を含み、前記擦過表面は、少なくとも１つの引掻縁を含み、前記擦過表面から突出した円錐台または角錘台の微小突起と、有効量の前記物質とを備えることを特徴とするマイクロアブレーダ。
【請求項２】
前記擦過表面を受けるのに適合するか、または前記擦過表面と一体化された擦過面を含む基部をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項３】
把手を前記基部に接合するのに適した把手接合面をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項４】
前記基部と一体化された把手、または前記基部に着脱可能な把手をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項５】
前記擦過表面は、前記擦過面から突出していることを特徴とする請求項２に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項６】
前記把手接合面と前記擦過面は、前記基部の対向する側に、実質的に互いに平行に配置されることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項７】
前記基部は、前記擦過面を前記把手接合面に接続する平滑な縁を備えることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項８】
前記平滑な縁は、前記擦過面を前記把手接合面に接続する弧を形成することを特徴とする請求項７に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項９】
前記擦過面は、実質的に第１の直径を有する円で、前記把手接合面は、実質的に第２の直径を有する円で、前記第２の直径は前記第１の直径より大きいことを特徴とする請求項７に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１０】
前記把手は取外し可能であることを特徴とする請求項４に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１１】
前記微小突起は、少なくとも部分的に送達される前記物質で被覆されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１２】
前記物質を含む貯蔵器を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１３】
前記微小突起は、前記皮膚の角質層に浸透するのに十分な長さであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１４】
前記微小突起は、少なくとも２つの引掻縁を含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１５】
前記微小突起は少なくとも３つの面を含み、前記面の任意の２つの面の交差部が引掻縁を形成することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１６】
前記微小突起は微小突起基部を有し、前記微小突起基部の中心間の距離が、前記微小突起の長さの少なくとも２倍になるようなパターンで構成および配列されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１７】
前記微小突起は、前記基部の中心間の距離が、前記微小突起の長さの少なくとも５倍になるような前記パターンで構成および配列されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１８】
微小突起はあるパターンで配列されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項１９】
前記パターンは、列と行から構成されることを特徴とする請求項１８に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２０】
前記パターンは円形パターンであることを特徴とする請求項１８に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２１】
前記パターンはランダムパターンであることを特徴とする請求項１８に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２２】
前記微小突起の前記基部は、前記微小突起の間に谷を形成するように間隔をあけていることを特徴とする請求項１６に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２３】
前記擦過表面に生物活性物質の被膜を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２４】
前記生物活性物質は医薬品であることを特徴とする請求項２３に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２５】
前記生物活性物質はワクチンであることを特徴とする請求項２３に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２６】
前記生物活性物質はアレルゲンであることを特徴とする請求項２３に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２７】
前記生物活性物質は遺伝子治療薬であることを特徴とする請求項２３に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２８】
前記微小突起の長さは、前記微小突起が前記皮膚に浸透する深さより大きいことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項２９】
前記微小突起は、前記皮膚を擦過するのに使用されるときに、前記皮膚の角質層を通って浸透するのに十分な長さを有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項３０】
前記微小突起の長さは、約５ミクロンから約５００ミクロンであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項３１】
前記微小突起の長さは、約３０ミクロンから約３００ミクロンであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項３２】
前記微小突起の長さは、約７５ミクロンから約２５０ミクロンであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項３３】
前記微小突起の長さは、約１８０ミクロンから約２２０ミクロンであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項３４】
前記擦過表面はプラスチックであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項３５】
前記擦過表面はシリコンであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアブレーダ。
【請求項３６】
マイクロアブレーダを前記皮膚の全体にわたって移動させて、擦過領域を生成するステップを含む工程であって、前記マイクロアブレーダが擦過表面を含み、前記擦過表面が、前記擦過表面から突出する、少なくとも１つの引掻縁を有する円錐台または角錘台の微小突起を含む工程と、
前記物質を擦過領域に塗布する工程
を含むことを特徴とする物質を皮膚に送達する方法。
【請求項３７】
擦過前に前記物質を塗布することを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
擦過の間に前記物質を塗布することを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
擦過後に前記物質を塗布することを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記微小突起は、送達する物質を少なくとも部分的に被覆されていることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記微小突起は、前記皮膚の角質層に浸透するのに十分な長さであることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記微小突起は少なくとも２つの引掻縁を含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記微小突起は少なくとも３つの面を含み、前記面の任意の２つの面の交差部が引掻縁を形成することを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記微小突起は平坦な先端をさらに備えることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記微小突起は微小突起基部を有し、前記微小突起基部の中心間の距離が、前記微小突起の長さの少なくとも２倍になるようなパターンで構成および配列されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記微小突起は、前記基部の中心間の距離が、前記微小突起の長さの少なくとも５倍になるようなパターンで構成および配列されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
前記微小突起は均一なパターンで配列されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記微小突起の前記基部は、前記微小突起の間に谷を形成するように間隔をあけていることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記マイクロアブレーダは、前記擦過表面に生物活性物質を含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
前記生物活性物質は医薬品であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記マイクロアブレーダを皮膚全体にわたって少なくとも１回移動させることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
前記マイクロアブレーダを皮膚全体にわたって交互方向に移動させることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項５３】
送達される物質は生物活性物質であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
前記物質はアレルゲンであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記物質は遺伝子治療薬であることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記物質はワクチンであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記ワクチンは、生きた弱毒化ウィルスまたはウィルスベクターを含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ワクチンは、不活性化または死滅ウィルスを含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ワクチンは、不活性化または死滅バクテリアを含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記ワクチンは、核酸を含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記ワクチンは、前記核酸によってコード化されるタンパク質またはペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記ワクチンはアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記ワクチンは、生きた非弱毒ウィルスまたはバクテリアを含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記ワクチンは、多糖または多糖複合体を含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
前記ワクチンは、タンパク質またはペプチドを含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
前記ワクチンはアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項１に記載の少なくとも１つのマイクロアブレーダを含むことを特徴とするキット。
【請求項６８】
投与物がマイクロアブレーダの表面に被覆されていることを特徴とする請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記マイクロアブレーダと一体化された貯蔵器に投与物が含有されることを特徴とする請求項６７に記載のキット。
【請求項７０】
投与物が前記キット内に個別に梱包されることを特徴とする請求項６７に記載のキット。
【請求項７１】
物質を皮膚に送達するためのデバイスであって、物質で被覆された擦過表面と、擦過表面と流体連通した、再構成用液体を含有する貯蔵器とを含むことを特徴とするデバイス。
【請求項７２】
擦過表面は複数の微小突起を含むアレイであることを特徴とする請求項７１に記載のデバイス。
【請求項７３】
物質が微小突起上を被覆していることを特徴とする請求項７１に記載のデバイス。
【請求項７４】
貯蔵器は、擦過表面上の微小突起を通る流路を介して擦過表面と連通することを特徴とする請求項７１に記載のデバイス。
【請求項７５】
貯蔵器は、擦過表面上の微小突起の間の流路を介して擦過表面と連通することを特徴とする請求項７１に記載のデバイス。
【請求項７６】
貯蔵器は、貯蔵器と擦過表面の間の多孔性物質によって擦過表面と連通することを特徴とする請求項７１に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚を擦過するための方法およびデバイスに関する。より詳細には、本発明は、角質層を擦過して、皮膚を介した物質の送達またはサンプリングを促進する方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
皮膚を介する身体への物質の送達は、典型的には侵襲的で、内皮（ＩＤ）、筋肉（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）注射を容易にするために針やシリンジを必要としてきた。これらの方法は対象にとって苦痛で、訓練を受けた実務者の熟練を必要とし、しばしば出血を引き起こす。角質層、すなわち厚さが約１０〜２０μｍの角質化細胞の薄い外層を擦過するデバイスを使用することによって、これらの欠点を克服する努力がなされてきた。露出した生存表皮に生物活性物質を送達する。
【０００３】
この技術は、神経網を避け、血管およびリンパ管にきわめて近接して生物活性物質を配置し、その物質を身体全体に吸収および送達させるためのものである。
【０００４】
ワクチンの局所的送達では、抗原提示細胞が豊富であることから表皮そのものが特に望ましい標的になる。それに比べて、表皮の下の皮層は、より少ない抗原提示細胞を含む。また、角質層および表皮は神経または血管を含んでいないため、この方法は、抗原に対して応答可能な皮膚層への接触を与えながら本質的に苦痛および出血がないという利点を有する。
【０００５】
従来技術は、身体に物質を送達することを目的として角質層を破壊するための様々なデバイスおよび方法を報告している。例えば、Ｃａｒｓｏｎ他に対する特許文献１に教示されているように、穿刺により角質層の破壊を達成できる。この特許は、ツベルクリン皮膚検査およびアレルギー検査用に使用されるデバイス上に見られるような小径の尖叉にポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを塗布し、当該物質の皮膚への送達に使用できることを教示している。当該デバイスを使用する方法は、尖叉で皮膚を穿刺して被覆物質を皮下注射することを含む。
【０００６】
特許文献２、特許文献３および特許文献４は、切削による角質層の破壊を教示している。
【０００７】
本出願は、それぞれ２００１年１０月２９日および２００１年１１月２７日に出願した米国特許仮出願第６０／３３０，７１３号および６０／３３３，１６２号の優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，６７９，６４７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，００３，９８７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８７９，３２６号明細書
【特許文献４】米国特許第３，９６４，４８２号明細書
【特許文献５】米国特許出願第１０／１９３，３１７号明細書
【特許文献６】米国特許出願第０９／４０５，４８８号明細書
【特許文献７】米国特許第３，２８９，６７０号明細書
【特許文献８】米国特許第５，８８２，８７７号明細書
【非特許文献１】McCluskie, MJ et al., Molecular Medicine 5:287, 1999
【非特許文献２】Immunology Today, Apr 21 (4): 163-165, 2000
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、皮膚、特に皮膚の角質層を擦過するための方法およびデバイスに向けられる。本発明は、さらに、角質層上の擦過領域を介して、サンプルを得る方法、または薬品もしくは薬剤の如き物質を皮膚に送達するための方法に向けられる。
【００１０】
送達される物質としては、特に、薬剤、医薬品、ワクチンなどを含む生物活性物質が挙げられる。物質は、配合および送達法に依存して、固体または液体の形をとりうる。物質は、とりわけ、乾燥粉末、ゲル、溶液、懸濁物およびクリームの形で送達できる。好適な配合物は当業者によく知られている。本発明の方法によって送達するのに特に好ましい医薬品としては、ワクチン、アレルゲンおよび遺伝子治療薬が挙げられる。
【００１１】
本発明の一態様は、皮膚の角質層を介して薬剤の送達を強化するために、薬剤が身体によって吸収され、利用されうる十分な深さまで、皮膚上に送達部位を用意するための方法およびデバイスに向けられる。
【００１２】
皮膚組織は、ワクチンおよび遺伝子治療薬の送達に対する魅力的な標的部位である。ワクチン（遺伝子学的かつ従来的）の場合は、皮膚は、この組織内に見いだされる抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＡＰＣ先駆体、特に上皮ランゲルハンス細胞（ＬＣ）の濃度が高いため魅力的な送達部位となる。皮膚疾患、皮膚病および皮膚癌の治療用のいくつかの遺伝子治療薬が設計されている。そのような場合は、影響を受けた皮膚組織に治療薬を直接送達するのが望ましい。加えて、皮膚細胞は、遺伝子治療薬（そのコード化された１つまたは複数のタンパク質が皮膚から離れた部位で活性的になる）に対して魅力的な標的である。そのような場合は、皮膚細胞（例えばケラチノサイト）は、乳頭真皮を介して体循環に迅速に吸収されうる治療タンパク質を生成する「バイオリアクタ」として機能することができる。他の場合は、ワクチンまたは治療薬を体循環に直接接触させることが、皮膚から離れた疾患の治療にとって望ましい。そのような場合は、乳頭真皮を介して体循環を遂行させることができる。
【００１３】
本発明は、核酸、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチドまたはポリペプチドを含むが、それらに限定されない生物活性物質の送達とともに皮膚を擦過するための方法およびマイクロアブレーダを提供する。核酸は、角質層の擦過と同時に送達されると、強化された遺伝子発現を示し、発現されたタンパク質に対して強化された免疫応答を生成することが分かっている。同様に、擦過と同時に送達されたアレルゲンは、従来のアレルゲン試験法より強い免疫応答を示す。
【００１４】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１つの引掻縁を有する微小突起の配列を有する擦過表面が接合、装着または一体形成された擦過面を備えた基部と、把手または他の把持デバイスが接合、装着または一体形成された把手接合面とを有する、物質を皮膚に送達するためのマイクロアブレーダを備える。「擦過表面」とは、微小突起、それらの間の表面領域および周囲の表面を含めて、擦過の過程の間に皮膚に接する表面を意味する。
【００１５】
本発明は、物質を皮膚に送達するための方法であって、マイクロアブレーダデバイスを皮膚のある領域全体にわたって移動させて、皮膚の擦過前に、皮膚の擦過と同時に、または皮膚の擦過後に投与される物質を所定の皮膚層に吸収させることを可能にする十分な深さの窪みを生成することを含む方法をも含む。このマイクロアブレーダデバイスにより、皮膚をデバイスが複数回移動することによって皮膚内の窪みを徐々に深めることができることができ、これにより物質を皮膚内の所望の深さまで送達することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、患者の皮膚の角質層を介した物質の投与を強化するために角質層を擦過するためのデバイスおよび方法に向けられる。
【００１７】
本明細書に用いられるように、「擦過する」という用語は、角質層の少なくとも一部分を除去して、過度な皮膚刺激を引き起こすことなく、または伝染性物質に対する皮膚のバリア性を低下させることなく皮膚の浸透性を高めることを意味する。これは、角質層を貫く個別的な穴を生成し、穴の間に非破壊角質層の領域を有する「穿刺」と対照的である。
【００１８】
本発明のマイクロアブレーダは、皮膚を擦過してこの結果を達成することが可能なデバイスである。好ましい実施形態において、該デバイスは、皮膚を擦過し、これによって角質層に穴を開けることなく角質層に浸透することが可能である。１つの好ましい実施形態において、マイクロアブレーダは、有効量の送達されるべき物質をも含む。これは、例えば、マイクロアブレーダの一体的または着脱可能な部分である貯蔵器に含まれていてもよいし、または、マイクロアブレーダの送達表面に被覆されていてもよい。物質の「有効量」とは、アレルゲンまたはワクチンの場合は免疫刺激または免疫調節応答、または、他の治療または診断的応答を含めた（但しそれらに限定されない）、対象における所望の応答を誘発する量を意味することを意図している。
【００１９】
本明細書で用いられるように、「浸透」とは、角質層を完全に通過して隣接層に進入することなく、角質層に進入することを意味する。これは、角質層が完全に浸透されて、皮膚の下部層の界面を露出することができないことを言うのではない。一方、穴開けは、完全に角質層を通過し、角質層の下の隣接層に進入することを意味する。
【００２０】
本発明のマイクロアブレーダは、ワクチンの送達に独自の免疫学的利点を有し、ワクチンの臨床価値を高める可能性を有すると考えられている。多数の微小突起を角質層に浸透させることは、アジュバント様の刺激効果を有することが示唆されている。多数の微小突起からの「浸透」応答は、単純な急性炎症応答を上回るものと考えられる。これらの「浸透」効果は様々な細胞および細胞構造に損傷を引き起こし、多形核好中球（ＰＭＮ）およびマクロファージ、ならびに、ＩＬ１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および多くの他の免疫応答に繋がる他の物質の出現を引き起こす可能性がある。溶解性刺激因子は、リンパ球の増殖に影響し、ワクチンに対する免疫応答の中心的となる。加えて、これらの因子は、ランゲルハンス細胞および樹状細胞を含む常在の抗原提示細胞の移動および活性化に影響する。本発明のマイクロアブレーダは、擦過領域におけるワクチンに対する重要な免疫応答を促進するのに有用である。微小突起アレイによって擦過領域にわたって形成された小溝およびすじは、擦過を行わずに局所的に適用されるか、または標準的な針を使用して投与されるワクチンに比べて、抗原提示細胞との相互作用に対するワクチン抗原の有効性を高めると考えられる。
【００２１】
本発明の微小突起アレイは、単一注射針の些細な、または極めて小さい免疫刺激衝撃を数倍拡大するものと考えられる。マイクロアブレーダは、アジュバント様の免疫刺激によってワクチン免疫抗原性を促進および強化する。
【００２２】
薬品、ワクチンおよび遺伝子治療薬の送達に対する抵抗性を含む皮膚の主要バリア特性は、角質層と呼ばれる表皮の最外層に存在する。概して、表皮の内層は、一般に顆粒層、マルビーギ層（stratum malpighii）および胚芽層として識別される３つの層を含む。薬品または他の物質が角質層の下に出現すると、皮膚の次の層への拡散、および細胞による最終的な取り込み、または血流もしくはリンパ排流を通じた身体による吸収に対する抵抗が実質的に存在しなくなる。
【００２３】
物質の角質層の通過を助けることは、ある種の物質、特にある種のワクチンの身体による吸収を促進するための効果的な方法でありうる。本発明は、主に、物質、特に生物活性物質または薬剤の角質層への送達を促進して、より大量の生物活性物質または薬剤を患者により迅速に吸収させるためのデバイスおよび方法に向けられる。
【００２４】
本発明のデバイスは、角質層に浸透するが、角質層に穴を開けないものであることが好ましい。本発明の方法を用いて投与される物質は、擦過の前に、擦過と同時に、または擦過の後に皮膚に塗布することができる。しかし、本発明の方法の一実施形態によれば、核酸、アレルゲンおよび生ウィルスワクチンを含む一定または特定の生物活性物質を、既に擦過した皮膚に塗布するよりもむしろ、擦過の前または擦過と同時に皮膚に塗布する。すなわち、核酸、アレルゲンおよび生ウィルスワクチンの如き物質の送達は、当該物質が既に擦過された皮膚に受動的に塗布されるよりもむしろ、皮膚に擦り込まれる場合に強化される。しかし、本発明の方法の他の実施形態では、ウィルス様粒子およびサブユニットタンパク質を含む一定または特定の生物活性物質は、当該物質が予め擦過された皮膚に塗布される場合に強化される。しかし、本発明の方法の他の実施形態では、完全不活性化されたウィルスまたは死滅ウィルスを含む一定または特定の生物活性物質は、皮膚に対して擦過の後に塗布しても擦過と同時に塗布しても同様の効能を示す。
【００２５】
該物質を任意の薬学的に許容しうる形態で皮膚に送達することができる。一実施形態では、該物質を皮膚に塗布し、次いで擦過デバイスを皮膚および物質に対して相互に移動または擦る。所望の結果をもたらす最小量の擦過を用いるのが好ましい。選択した物質に対する適切な擦過量の決定は、当該技術分野におけるスキルの範囲内である。他の実施形態では、塗布に先立って、送達デバイスの擦過表面に該物質を乾燥形態で塗布することができる。この実施形態では、再構成用の液体を皮膚の送達部位に塗布し、物質を塗布した擦過デバイスを皮膚の再構成用液体の部位にあてがう。次いでそれを、物質が皮膚の表面上の再構成用液体に溶解し、擦過と同時に送達されるように、皮膚上を相互に移動または擦る。あるいは、再構成用液体を擦過デバイスに含ませ、デバイスを皮膚に押しつけて擦過するときに放出させて物質を溶解させることもできる。核酸調製物の如き一定の物質をゲルの形態で擦過デバイスに被覆できることもわかった。
【００２６】
物質を患者の皮膚に送達するための方法は、患者の外皮層またはマイクロアブレーダ２（図１Ｂを参照）に薬剤または他の物質を被覆するステップと、マイクロアブレーダ２を患者の皮膚に沿って移動させて擦過を与えて、患者の生存可能な表皮への物質の進入を可能にするのに十分な窪みを残す。マイクロアブレーダ２の構造のデザインにより、マイクロアブレーダ２の先縁は、最初に患者の皮膚を伸ばし、次いでマイクロアブレーダ２の上面が外皮保護層を擦過して角質層を開き、これによって、医薬品または他の物質が患者体内に進入するのを可能にする。外皮保護層の最初の擦過の後に、マイクロアブレーダ２の後縁および先縁は、擦過領域の表面を擦って、医薬品または物質を擦過された皮膚領域に作用させ、これによって、その薬用効果を向上させることができる。
【００２７】
図１Ｂ、２Ａおよび２Ｂに示されているように、マイクロアブレーダ２は、擦過表面５を装着できる基部４を含む。あるいは、擦過表面を基部と一体化し、単一の二要素部品として作製してもよい。基部４は、固体の成型部品であるのが好ましい。一実施形態において、基部４は、上方に向かって屈曲し、頂部が平頭化されたキノコ様の冠４ｂで構成されている。基部４の頂部は、全体的に平坦で、擦過表面５がその上に装着されるか、または一体的に形成される。あるいは、平頭の頂部は、擦過表面５を受けるための凹部を有する。すべての実施形態において、擦過表面５は、平頭の頂部の上に伸びる微小突起のアレイを備えた台を含む。マイクロアブレーダの他の実施形態では、把手基部および擦過表面を互いに一体化し、単一の三要素デバイスとして作製できる。
【００２８】
擦過表面５が対象の外皮保護層または角質層を開くことを可能にするのに十分な圧力で、マイクロアブレーダ２を対象の皮膚に沿って移動させることによって、マイクロアブレーダ２を対象にあてがう。基部に加えられた内向きの圧力によって、マイクロアブレーダ２が対象の皮膚に押しつけられる。よって、傾斜したキノコ様の冠４ｂの高さは、塗布物質が、マイクロアブレーダ２が使用されたときに面４ｃの一面におよびこれの上に流れるのを防ぐのに十分なものであることが好ましい。以下に説明するように、擦過表面５は、微小突起のアレイを含む。
【００２９】
把手６を基部４に接合するか、または基部４と一体化してもよい。図２Ａに示されるように、把手の上端６ａを基部４の内周側壁４ａの間にスナップ嵌めまたは摩擦嵌めすることができる。あるいは、図１Ａおよび２Ａに示されるように、把手６を基部４の下面４ｃに（例えばエポキシで）接着することもできる。あるいは、把手と基部を単一の二要素部品として一体的に作製（例えば射出成型）することもできる。把手は、基部の直径より小さい直径であってもよく、または、基部と同様の直径をであってもよい。基部４の下面４ｃは、キノコ様の冠４ｂと面一であってもよいし、キノコ様の冠の上に伸びていてもよい。把手６の下端６ｂは、把手６の軸６ｃより広くてもよいし、軸と同様の直径を有していてもよい。下端６ｂは、物質を投与し、マイクロアブレーダ２を移動させる人のための親指受けとしての働きをする圧痕６ｄを含むことができる。加えて、把手６を患者の皮膚に対して、または患者の皮膚全体にわたって移動させるときに、使用者が把手６をしっかりと把持するのを補助するために、突起８を把手６の外側に形成する。
【００３０】
図２Ｂにおける図１Ｂの断面に示されるように、下端６ｂは円筒形であってもよい。図２Ａに示されるように、マイクロアブレーダ２は透明材料で構成されうる。圧痕６ｄを、円筒形の下端６ｂの両側に配置してマイクロアブレーダ２を使用する人がそれを把持するのを補助する。すなわち、マイクロアブレーダ２の移動を手または指で行うことができる。マイクロアブレーダの把手６ならびに基部４は、プラスチックまたは同様の材料で成型されるのが好ましい。マイクロアブレーダ２は、マイクロアブレーダ全体および擦過表面を一人の患者に使用した後に、これを処理できるように、安価に製造されるのが好ましい。
【００３１】
擦過表面５は、マイクロアブレーダ２を患者の皮膚全体にわたって移動するときに、生じる擦過が角質層に浸透するように設計される。患者の生存上皮に送達させたい医薬品または物質を擦過表面５に被覆することができる。
【００３２】
所望の擦過を達成するために、マイクロアブレーダ２を少なくとも一度患者の皮膚全体にわたって移動させる必要がある。患者の皮膚を交互の方向に擦過することができる。本発明によるマイクロアブレーダの構造的なデザインは、医薬品または物質をより効果的に吸収させ、これによって、より少ない医薬品または物質を患者の皮膚または被覆擦過表面５に塗布することを可能にする。
【００３３】
患者に送達したい物質を擦過表面５に被覆することができる。一実施形態では、該物質を、擦過表面５に配置される粉体とすることができる。他の実施形態では、マイクロアブレーダ２を患者の皮膚にあてがって移動させる前に、送達すべき物質を患者の皮膚に直接塗布することができる。
【００３４】
図３を参照すると、本発明のマイクロアブレーダデバイス１０は、その底面から伸びる複数の微小突起１４を有する実質的に平面な本体または擦過表面支持体１２を含む。該支持体は、一般には、表面をマイクロアブレーダデバイスの基部に接合させるのに十分な厚さを有することにより、図１Ｂ、２Ａおよび２Ｂに示されるように、デバイスを容易に取り扱うことを可能にする。あるいは、異なる把手または把持デバイスを擦過表面支持体１２の上面に接合または一体形成することもできる。擦過表面支持体１２の寸法は、微小突起の長さ、所与の面積の微小突起の数、および患者に投与される物質の量に応じて変化しうる。典型的には、擦過表面支持体１２は、約１から４ｃｍ２の表面積を有する。好ましい実施形態では、擦過表面支持体１２は、約１ｃｍ２の表面積を有する。
【００３５】
図３、図４、図４Ａおよび図５に示されるように、微小突起１４は、擦過表面支持体１２の表面から突出し、擦過表面支持体１２の平面に実質的に垂直になる。例示された実施形態における微小突起は複数の列および行に配列され、好ましくは均一な間隔をあける。微小突起１４は、全体的に、先端１８へ伸びる側面１６を持つピラミッド形状を有している。ここに示される側面１６は、断面で見たときに、全体的に凹形の輪郭を有し、擦過表面１２から先端１８に伸びる曲面を形成する。例示された実施形態では、微小突起は、実質的に等しい形状および寸法の４つの側面１６によって形成される。図４Ａおよび図５に示されるように、微小突起１４の側面１６の各々は、隣接側面と境を接する対向側方縁を有し、擦過表面支持体１２から外に伸びる引掻縁２２を形成する。引掻縁２２は、側面１６の形状に対応する全体的に三角形または台形の擦過表面を画定する。さらなる実施形態では、より少ない側面またはより多い側面で微小突起１４を形成することができる。
【００３６】
微小突起１４は、鈍先端１８で終端するのが好ましい。全体的に、先端１８は実質的に平坦で、支持体１４に平行である。先端が平坦であるときは、微小突起の全長は皮膚に浸透せず、したがって微小突起の長さは、前記微小突起が前記皮膚に浸透する全深さより大きくなる。先端１８は、それが側面１６と合うきわめて明確な鮮鋭縁２０を形成するのが好ましい。縁２０は、擦過表面支持体１２に実質的に平行で、さらなる引掻縁を定める。さらなる実施形態では、縁２０をわずかに丸めて、側面１６から先端１８への円滑な推移を形成することができる。微小突起は、好ましくは、形状が円錐台または角錘台である。
【００３７】
マイクロアブレーダデバイス１０および微小突起は、投与される物質と反応しないプラスチック材料で作製されうる。好適なプラスチック材料の非包括的なリストには、例えば、当該技術分野において知られているように、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエステルおよびポリカーボネートが含まれる。あるいは、ステンレス鋼、タングステン鋼、ニッケルの合金、モリブデン、クロミウム、コバルト、チタン、およびその合金の如き金属、またはシリコン、セラミックスおよびガラスポリマーの如き他の材料から微小突起を作製することもできる。シリコンウェハのフォトリソグラフィックエッチングに類似した様々な技術、または当該技術分野において知られているダイアモンド付刃ミルを使用した微細機械加工によって金属微小突起を製造することができる。当該技術分野において知られている標準的な技術を用いたシリコンウェハのフォトリソグラフィックエッチングによって微小突起を製造することもできる。それらは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、２００２年７月１２日に出願された特許文献５に記載されているような射出成型法を介してプラスチックで製造することも可能である。
【００３８】
微小突起の長さおよび厚さは、投与される具体的な物質、およびデバイスをあてがう箇所における角質層の厚さに基づいて選択される。微小突起は、実質的に角質層に穴を開けたり、または貫通することなく角質層に浸透するのが好ましい。微小突起は、約５００ミクロンまでの長さを有することができる。好適な微小突起は、約５０から５００ミクロンの長さを有する。微小突起は、好ましくは約５０から約３００ミクロンの長さを有し、より好ましくは約１５０から２５０ミクロンの範囲の長さを有し、１８０から２２０ミクロンの長さが最も好ましい。例示された実施形態における微小突起は、全体的にピラミッド形状を有し、デバイスの平面に垂直である。これらの形状は、所望の深さまで擦過が行われることを確実なものにする上で特に有利である。好ましい実施形態では、微小突起は固体部材である。代替的な実施形態では、微小突起を中空にすることができる。
【００３９】
図２および図５に示されるように、微小突起は、列および行で均等に間隔をあけてアレイを形成して、皮膚に接触し、擦過時に角質層に浸透するのが好ましい。皮膚の表面または皮膚の組織内に投与される物質に応じて、微小突起間の間隔を変えることができる。典型的には、微小突起の列は、１ミリメートル（ｍｍ）当たり約２個から約１０個の密度を与えるように離して配置される。行または列には、一般には、１ｍｍ２当たり約４個から約１００個の微小突起密度を与えるアレイの微小突起の間隔に実質的に等しい間隔をあける。他の実施形態では、微小突起を円形パターンで配列することができる。他の実施形態では、微小突起をランダムパターンで配列することができる。行および列で配列されるときに、微小突起の中心同士の距離が、微小突起の長さの少なくとも二倍になるのが好ましい。１つの好ましい実施形態では、微小突起の中心同士の距離は、微小突起の長さの二倍±１０ミクロンである。微小突起の長さの３、４、５倍およびそれ以上のより広い間隔も含まれる。加えて、上述したように、微小突起の構成は微小突起の高さを突起が皮膚に浸透する深さより大きくできるようにすることができる。
【００４０】
円錐台形（frustoconical）または角錘台形（frustopyramidal）の微小突起の平坦な上面は、幅が、一般には１０から１００ミクロン、好ましくは３０〜７０ミクロン、より好ましくは３５〜５０ミクロンである。
【００４１】
皮膚上の送達部位を用意する方法は、患者の皮膚２８の所望の箇所にマイクロアブレーダを置く。マイクロアブレーダを皮膚に静かに押しつけ、次いで皮膚上をまたは皮膚全体にわたって移動させる。マイクロアブレーダの行程の長さは、所望の送達領域によって定められる送達部位の所望のサイズに応じて変化しうる。送達部位の寸法は、目的とする結果を達成するように選択され、送達される物質および物質の形態に応じて変化しうる。例えば、送達部位は、発疹または皮膚病を治療するために大きい領域を包括することができる。一般には、マイクロアブレーダを約２から１５センチメートル（ｃｍ）移動させる。本発明のいくつかの実施形態では、約４ｃｍ２から約３００ｃｍ２の表面積を有する擦過部位を生成するようにマイクロアブレーダを移動させる。
【００４２】
次いで、マイクロアブレーダを皮膚から引き上げて、擦過領域を露出させ、好適な送達デバイス、パッチまたは局所配合物を擦過領域にあてがう。あるいは、擦過の前または擦過と同時に、投与すべき物質を皮膚の表面に塗布する。
【００４３】
角質層の擦過の範囲は、移動時に加えられる圧力、およびマイクロアブレーダによる反復回数に依存する。一実施形態では、第１の擦過を行った後にマイクロアブレーダを皮膚から引き上げ、実質的に同じ場所および位置の開始位置に戻す。次いで、マイクロアブレーダを再度同じ方向に、同じ距離だけ移動させる。他の実施形態では、第１の擦過を行った後に、マイクロアブレーダを皮膚から引き上げることなく、同じ部位全体にわたって交互の方向に反復的に移動させる。一般に、マイクロアブレーダを用いて２回以上の擦過を行う。
【００４４】
さらなる実施形態では、所望の物質の送達を強化するのに適した深さに角質層を擦過するのに十分な時間にわたって、同じ方向にのみで、格子状パターンで、円形パターンでまたは何らかの他のパターンでマイクロアブレーダであちこちたたくことができる。マイクロアブレーダを皮膚２８の全体にわたって一方向に直線移動させると、組織の一部が除去されて、図６に示されるように、実質的に微小突起の各列に対応する、皮膚２８の尖端２７によって分離された溝２６が形成される。微小突起の縁２０、２２および鈍先端１８は、単純な切断作用ではなく、角質層の一部分を除去して、皮膚に溝または窪みを形成する引掻または擦過作用を提供する。微小突起１４の鈍先端１８の縁２０は、溝２６の底部の組織を引っ掻いて除去し、それらを開状態に維持することによって、物質が身体に吸収されるように溝に進入することを可能にする。好ましくは、微小突起１４は、角質層を浸透し、患者に苦痛または不必要な不快さを引き起こすことなく、擦過領域に塗布された物質を吸収させるのに十分な深さを有する溝２６を形成するのに十分な長さである。好ましくは、溝２６は、角質層に穴を開けずに、端から端まで広がることができる。ピラミッド状の微小突起１４の縁２２は、擦過表面支持体１２から先端１８まで伸びる引掻縁を形成する。擦過表面支持体１２に隣接する縁２２は、溝２６の間の皮膚によって形成された尖端２７を引っ掻きおよび擦過する微小突起の間の引掻面を形成する。溝の間に形成された尖端２７は、一般にはわずかに擦過される。
【００４５】
さらなる実施形態では、マイクロアブレーダは、支持体上、または微小突起上または微小突起の間に、乾燥または凍結乾燥された薬剤を含むことができる。乾燥薬剤を微小突起上または微小突起の間の谷間に皮膜として塗布することができる。皮膚の擦過の間に、薬剤を皮膚の擦過領域に移す。マイクロアブレーダは、薬剤を擦過送達部位から上皮まで移動させるのに十分な時間にわたって、擦過送達部位の所定の位置にとどまることができる。マイクロアブレーダを被覆する接着性のテープまたはパッチによってマイクロアブレーダを皮膚に接合することができる。希釈液または溶剤を使用せずに薬剤を受動的に送達する上記の方法によって用意された擦過送達部位にマイクロアブレーダを接合するのが好ましい。
【００４６】
さらなる実施形態では、蒸留水または食塩水の如き好適な溶剤または希釈液を支持体内の開口部に注入して、マイクロアブレーダを送達部位に接合しながら薬剤を可溶化、再構成することができる。溶媒または希釈液をシリンジまたは他の容器から注入するか、あるいはマイクロアブレーダデバイスの一体部品である貯蔵器に含めることができる。
【００４７】
微小突起は、アレイを形成し、実質的に均一な長さおよび幅を有するように、均一な間隔を設けるのが好ましい。さらなる実施形態では、微小突起はそれぞれ異なる長さを有して、異なる深で皮膚を浸透する。微小突起の長さを変えることによって、物質を皮膚の異なる深さに置くことを可能にし、送達の効果を高めることが可能になる。
【００４８】
擦過デバイスが、デバイスからの流体を収容および排出するための貯蔵器を含まない場合は、物質を含有する液体または再構成用液体を、例えば個別のディスペンサまたはポンプから、擦過の前または後に個別に皮膚に塗布しなければならない。しかし、貯蔵器は、擦過デバイスの一体部品であってもよい。貯蔵器は、例えば、針または突起の流路を介して、または当該針または突起の間の貯蔵器から出る流路を介して、または多孔質の物質を介して、デバイスまたは皮膚の擦過表面と流体連通するか、あるいは擦過表面に隣接するのが好ましい。この実施形態では、物質または再構成用液体が擦過デバイスの貯蔵器に含まれ、擦過前に、擦過と同時に、または擦過後に皮膚表面に分配される。擦過デバイスは、物質または再構成用液体の送達の割合を制御する手段、あるいは送達される物質または再構成用液体の量を制御する手段を含むこともできる。代替形態として、擦過に続いて、乾燥したパッチまたはあらかじめ加湿したパッチを該部位に当てて、再構成を促進させるたり、または物質の皮膚への導入もしくは取り込みを強化することができる。他の実施形態では、パッチに医薬品を含ませ、マイクロアブレーダで前処理された皮膚に当てることができる。
【００４９】
本発明の方法に使用される核酸はＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。核酸は、局所的な投与、ならびに細胞による取り込みおよび発現に適した任意の物理的形態であってよい。核酸をウィルスベクター、リポソーム、粒子、微粒子、超微粒子、または当該技術分野において知られている他の好適な配合物に含めることができ、あるいは核酸を当該技術分野において知られているプラスミドの如き遊離ポリヌクレオチドとして送達することができる。核酸は、典型的には、核酸と相溶性を有する流体またはゲルの如き薬学的に許容しうる配合物に配合される。ワクチンおよびアレルゲン組成物を含む、本発明に使用される薬学的に許容しうる配合物も当該技術分野においてよく知られている。
【００５０】
（皮膚に対して１回擦過する程度の）最小限の擦過で、皮膚細胞への核酸の送達を強化するのに十分であることが見出された。皮膚に対する擦過移動の回数の増加とともに、核酸送達および発現の量が増え続ける。動物実験の研究では、６回以上の擦過で、核酸の送達の最大限の改善がもたらされた。皮膚に対する擦過移動をすべて同一方向で行うこともできるが、その方向を擦過中に変えることが好ましい。今日、核酸ワクチンの送達に対して最も広く使用されているプロトコルは、投与量が少ないときに通常追加の反応増強剤を用いるＩＭ注射である。本発明の方法を用いて送達する核酸ワクチンの適切な投与量の決定は、当該技術分野の一般的なスキルの範囲内である。しかし、遺伝子発現のレベルおよび免疫反応の刺激のレベルによって証明されるように、反応増強剤がなくても、核酸ワクチンをＩＭ送達より効率的に送達することが発明の方法の利点である。
【００５１】
本発明のデバイスおよび方法によれば、アミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチドおよびポリペプチド、特にアレルゲンを局所的に送達することもできる。従来の方法では、ツベルクリン尖叉試験と同様のデバイスを使用した皮下穿刺によって、アレルゲンを皮膚に送達する。しかし、擦過と送達を同時に行うことによって強化されたアレルゲン応答が得られることが思いがけず見いだされた。これは、より鋭敏な試験をもたらし、本発明の方法を用いて、従来のアレルゲン試験に対する小さい、または微細な応答をより容易に検出できるという利点を有する。したがって、本発明のデバイスおよび方法は、当該技術分野において既に知られている尖叉ベースのデバイスを用いる方法より性能が良好で、皮膚の刺激およびエルシマ（erthyma）が小さい。ワクチンならびに他の薬剤を送達するための他の好適なアブレーダとしては、１９９９年９月２４日に出願された特許文献６に開示されているものが挙げられる。当業者であれば理解するように、アブレーダの表面領域の大きさおよび形状、ならびに針または突起の形状およびパターンを、送達される個々のワクチンまたは他の薬剤、ならびに塗布の容易さおよび効能の如き他の要因に応じて変えることができる。
【００５２】
典型的には、本発明を用いてワクチンまたは他の医薬品を投与するために、実務者は、シリンジを使用して、隔膜で封印されたバイアルから適切な体積を取り出し、マイクロアブレーダを使用して、擦過前または擦過後にワクチンまたは医薬品を皮膚に塗布する。この手順は、最低限、投与手順毎にシリンジ針とマイクロアブレーダの両方を使用することになり、投与量の測定に時間と注意を必要とする。したがって、マイクロアブレーダデバイスを、投与する物質と組み合わせて、または投与する物質をそれと一体になるように適合させて、含むキットを用意するのが望ましいと思われる。
【００５３】
投与の器具および治療組成物を備えたキットなどが当該技術分野においてよく知られている。しかし、最小限に侵襲的なマイクロアブレーダデバイスを薬品およびワクチンの送達に適用するには、デバイスを配合物に連結させて、免疫遺伝子応答または他の治療学的応答を可能にするための配合物を投与する安全で、効果的で、経済的で、かつ一貫した手段を提供する必要がある。
【００５４】
本発明が提供するキットは、擦過表面を有する少なくとも１つのマイクロアブレーダ送達デバイスを含み、前記擦過表面は、そこから突出し、あるパターンで配列された微小突起を含み、前記微小突起は少なくとも１つの引掻縁を備える。キットに含まれるマイクロアブレーダ送達デバイスは、完全に一体化されていてもよい。すなわち、前記擦過表面を受けるように適合されているか、またはそれと一体化された面、把手接合面、および前記基部と一体化されたまたは前記基部に対して着脱可能な把手を含むことができる。ワクチンまたは他の医薬品を含有する貯蔵器、および送達を行う手段を送達デバイスに一体化することもできる。あるいは、キットは、使い捨てと見なすことのできるマイクロアブレーダの部分のみ（例えば、擦過表面および医薬品用量）を含み、把手および面の如き再使用可能な品目を個別に供給できる。当該キットは、例えば、大量接種に適した多数の接合可能擦過表面および多数のワクチン投与物を含み、把手および面を個別に（随意により少ない数だけ）供給することができる。あるいは、キットは、「使い捨ての」形態の擦過表面、面および把手を含む１つまたは複数の完全「一回使用」マイクロアブレーダデバイスを含むこともできる。１つの好ましい実施形態では、キットは、投与量のワクチンまたは他の医薬品を含有させ、測定し、かつ／または送達する手段をも含む。特に好ましい実施形態では、キットは、送達デバイスの一体部品である貯蔵器、または送達デバイスに機能的に接合することが可能な貯蔵器に随意に含まれる効果的な投与量のワクチンまたは他の医薬品をも含む。あるいは、擦過デバイスをも備えたキットに梱包されたパッチでワクチンまたは他の薬剤を供給することができる。この実施形態では、最初に擦過デバイスを使用して皮膚を処理し、その後にパッチを皮膚の処理部位に当てる。
【００５５】
特に好ましい一実施形態では、本発明のキットは、投与する効果的な量の薬剤またはワクチンで被覆されたマイクロアブレーダを備える。「効果的な量」または「効果的な投与量」とは、アレルゲンまたはワクチンの場合における免疫刺激応答、または他の治療学的もしくは診断的応答（それらに限定されない）を含む、対象における所望の応答を導く量を意味するものである。
【００５６】
本発明によって想定されるようにキットを使用するには、実務者は、気密シールを破って、マイクロアブレーダデバイス、そして随意にワクチンまたは免疫遺伝子もしくは治療学的組成物に接触する。ゲル、ペースト、油、エマルジョン、粒子、超微粒子、微粒子、懸濁物または液体（それらに限定されない）を含む、任意の好適な形態で、マイクロアブレーダデバイスまたは個別の塗布デバイスに含まれる貯蔵器に組成物をあらかじめ充填するか、あるいは好適な投与量でマイクロアブレーダデバイスに被覆することができる。組成物をキットパッケージ内に、例えば貯蔵器、バイアル、チューブ、ブリスタ、パウチ、パッチなどに個別に梱包することができる。配合物の１つまたは複数の成分を凍結乾燥、吹き付け凍結乾燥、または再構成可能な他の任意の形態にすることができる。要望に応じて、様々な再構成媒体、洗浄または消毒剤、あるいは局所的滅菌剤（アルコール、ヨード）をさらに提供することができる。次いで、実務者は、擦過ステップの前または後に患者の皮膚に配合物を塗布し、あるいはあらかじめ充填または被覆されたマイクロアブレーダの場合は、薬剤を個別に塗布することなく擦過ステップを実施することになる。
【実施例１】
【００５７】
マイクロアブレーダを使用したレポータ遺伝子をコード化するプラスミドＤＮＡの送達
発光性ルシフェラーゼをコード化するプラスミドＤＮＡ（３５μｇ）を、標準的な３０ｇ針および１ｃｃシリンジによるＩＭ注射またはＩＤ注射によって麻酔したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与するか、あるいは図４に示されるように、２００ｍｍ長のシリコン円錐台突起からなる擦過表面を備えたマイクロアブレーダを使用して局所的に投与した。図１および図２に示されるように、擦過表面をマイクロアブレーダデバイスに取りつけた。
【００５８】
マイクロアブレーダデバイスを使用するＤＮＡ投与に対して以下の２つのプロトコルを用いた。
【００５９】
１）擦過と送達を同時に行う場合（ＡＢＲｄｅｌ）：電気クリッパを使用して、マウスの尾側の背中を剃毛し、次いで、Ｎｏ．１０円刄刀によって残りの毛を剃毛した。次いで、皮膚表面の１ｃｍ２の部位にＤＮＡ溶液を塗布し、マイクロアブレーダデバイスの擦過表面をこの溶液に接触させて置き、次いでマイクロアブレーダデバイスを皮膚の表面全体にわたって６回交互の方向に水平に移動させた（各方向に３回ずつ移動させた）。ＤＮＡ溶液を空気中に放置して乾燥させ、皮膚生検体が回復するまで皮膚部位を露出させたままにした。
【００６０】
２）擦過を先に行う場合（ｐｒｅＡＢＲ）：上述のように脱毛した後に、マイクロアブレーダデバイスを皮膚表面全体にわたって６回交互の方向に水平に移動させる（２つの方向のそれぞれに３回ずつ移動させる）ことによって、１ｃｍ２の部位をあらかじめ擦過した。次いで、ＤＮＡを擦過した皮膚表面に散布し、上述のように空気中に放置して乾燥させた。
【００６１】
刈り取り処理による毛の小胞または切れ目を通じたＤＮＡ送達の可能性に対する対照として、上述のように動物を脱毛したが、マイクロアブレーダデバイスによる擦過を行わなかった（ｎｏＡＢＲ）。ＤＮＡ溶液を１ｃｍ２の裸の皮膚部位に局所的に塗布し、空気中に放置して乾燥させた。
【００６２】
すべてのグループにおいて、組織サンプルをＤＮＡ投与後２４時間収集した。発光分析を用い、ルシフェラーゼ活性について組織ホモジネートを分析した。標準的なＢＣＡタンパク質分析によって測定されるように、総タクパク質含量に対してすべてのサンプルを正規化した。データを総タンパク質１ｍｇ当たりの相対光量単位（ＲＬＵ）で表し、結果を図７に示す。各記号は、単一のマウスの反応を表す。２つの個別的な実験の累積データが示されている（各グループに対してｎ＝６）。ＡＢＲｄｅｌに従って達成されたルシフェラーゼレポータ遺伝子活性のレベルは、規模が針をベースとしたＩＭおよびＩＤ注射と類似しており、前もって擦過した皮膚または擦過しなかった皮膚への局所的送達に対するよりも有意に高くなった（ｐ＝０．０２）。
【実施例２】
【００６３】
送達と擦過通過回数との相関性
実施例１に記載したようにＡＢＲｄｅｌによってルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（３５μｇ）を投与したが、皮膚表面全体にわたるマイクロアブレーダの水平の通過の回数を変えた（１２、１０、６、４および２回）。加えて、剃毛して擦過しなかった皮膚の表面にＤＮＡ溶液を置いた後に、マイクロアブレーダデバイスの擦過表面を反復的に（６回）皮膚に押しつけて、穿刺で媒介される送達をシミュレートした。毛の小胞または切れ目を通じたＤＮＡ送達の可能性に対する対照標準として、擦過を伴わない（ｎｏＡＢＲの）ＤＮＡ溶液の局所的塗布を含めた。皮膚生検体（１ｃｍ２）を塗布後２４時間収集し、実施例１に記載したようにルシフェラーゼ活性について分析した。
【００６４】
結果を図８に示す。各記号は、単一のマウスの反応を表し、ｎ＝５である「ｘ１２」および「ｘ６」を除いては、すべてのグループに対してｎ＝３である。皮膚の表面全体にわるマイクロアブレーダデバイスの移動の回数を増やすことによって遺伝子発現のレベルが増加した。６回またはそれ以上の擦過によって処理されたグループでは、発現の平均レベルが、ｎｏＡＢＲ対照標準の１０００から２８００倍の範囲であった。皮膚の表面に沿ってマイクロアブレーダデバイスを４、２または１回通過させた後の平均応答は、それぞれバックグラウンドの約３００、２００および３０倍であった。「穿刺」グループにおける発現の平均レベルは、バックグラウンドの２倍にすぎず、ｎｏＡＢＲ対照標準とさほど大きく違わなかった。
【００６５】
これらのデータは、擦過プロセスがＤＮＡの皮膚への局所的送達の重要な要素であることを証明するものである。マイクロアブレーダデバイスの擦過通過回数の数を増やすことによって、遺伝子発現レベルが高められたが、単一の通過後も遺伝子発現が確認された。加えて、皮膚を水平に擦る、または擦過すると、水平に擦過せずにマイクロアブレーダデバイスを反復的に皮膚に押しつけるのに比べて、核酸送達および遺伝子発現が著しく強化された。
【実施例３】
【００６６】
プラスミドＤＮＡの配合
実施例１に記載したように、ＩＤ注射によって、または、マイクロアブレーダデバイスを皮膚表面全体にわたって６回通過させて、擦過と送達を同時に行う（「ＡＢＲｄｅｌ液」）によって、ルシフェラーゼプラスミド（３５μｇ）を液体配合物として投与した。加えて、ＤＮＡを凍結乾燥して粉末にし、マイクロアブレーダデバイスの擦過表面の表面に被覆し、粉末として直接（「ＡＢＲｄｅｌ粉末」）、または塗布時にＰＢＳ緩衝液で再構成して（「ＡＢＲｄｅｌ粉末／再構成」）、擦過と送達を同時に行うことによって投与した。粉末を被覆した擦過表面を皮膚の表面のＰＢＳの液滴に接触させて配置することによって再構成を遂行した後に、擦過と送達を同時に行った。また、０．５％アガロースゲルに溶解させたＤＮＡをマイクロアブレーダデバイスの擦過表面に被覆し、上述した擦過と送達を同時に行うことによって投与した（「ＡＢＲｄｅｌゲル」）。擦過を伴わない液体配合物の局所的塗布（ｎｏＡＢＲ）を対照標準として含めた。皮膚生検体（１ｃｍ２）を塗布後２４時間収集し、実施例１に記載したように分析した。その結果を図９に示す。各記号は、単一のマウスの反応を表す。各グループに対してｎ＝６である２つの個別的な実験の累積データが示されている。ＩＤ注射グループ、ＡＢＲｄｅｌ液体グループおよび粉末／再構成グループに対して、皮膚における同様のレベル（ｎｏＡＢＲの約２０〜３０倍）のルシフェラーゼ発現が確認された。再構成を伴わないゲルまたは粉末で被覆したＤＮＡの直接的な送達は、統計的にｎｏＡＢＲ対照標準を上回る遺伝子発現をもたらさなかったが、直接的なゲルベースの送達後の応答は、平均対照標準の応答の約２から１０倍であった。これらの結果は、擦過と送達を同時に行う時の、乾燥形態のワクチンの再構成は、液体配合物の擦過と再構成を同時に行った場合と同等の結果をもたらすことを証明している。これは、ワクチンを擦過によって塗布するときに、ワクチンを再構成するように、液体を満たした貯蔵器を備えた擦過デバイスに、ワクチン粉末をあらかじめ被覆することが可能であるため、該方法の商業的応用に対して有益性を有する。
【実施例４】
【００６７】
マイクロアブレーダデバイスによるＢ型肝炎用ＤＮＡワクチンの送達後の抗体応答
Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）をコード化するプラスミドＤＮＡを、標準的な３０ｇ針および１ｃｃシリンジによるＩＭ注射またはＩＤ注射によって麻酔したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与するか、あるいは実施例１のＡＢＲｄｅｌプロトコルに従って、実施例１に記載されているように、マイクロアブレーダを使用して投与した。マウスは、用量あたり１００μｇの免疫化を全部で３回施された。各投与後２〜３週間ＨＢｓＡｇ（全Ｉｇ）に対する抗体について、ＥＬＩＳＡにより血清サンプルを分析した。切れ目または毛の小胞を通じた送達の可能性に対する対照標準として、脱毛して擦過していない（ｎｏＡＢＲ）皮膚にＤＮＡを局所的に塗布した。データは、バックグラウンド（未処置の非免疫化マウスから得られた血清）の少なくとも３倍の吸光度値を与える血清サンプルの最も高度な希釈液として定義される抗ＨＢｓＡｇ力価を表す。
【００６８】
１グループ当たり全部で１０匹のマウスを分析した。平均力価が図１０のバーで表され、個々のマウスの応答が白抜きの記号で示されている。その結果は、ＡＢＲｄｅｌプロトコルによるマイクロアブレーダデバイスを使用したＤＮＡワクチンの投与は、強い生体内血清抗体応答を誘発することを示している。当該応答の規模は、ＩＭ注射（ＤＮＡベースのワクチン送達に対する現行の標準）およびＩＤ注射によって誘発されるものよりも有意に大きい（免疫化２および３の後はｐ＜０．０５）。加えて、ＡＢＲｄｅｌグループにおける応答は、針をベースとした標準的な両注射ルートの後に観測された応答よりかなり変動が小さかった。３回の免疫化の後の平均力価は、ＩＭ注射による８２０、およびＩＤ注射による４８００に比べて、ＡＢＲｄｅｌグループでは１２，１６０であった。注目すべきことは、ＡＢＲｄｅｌアプローチは、２回の免疫化の後の最も効果的な送達ルートであった。すなわち、ＡＢＥｄｅｌにより処理された動物の１００％（１０／１０）が２回の免疫化後に血清変換したのに対し、ＩＭルートによる場合は４０％（４／１０）であり、ＩＤ注射による場合は５０％（５／１０）であった。擦過を伴わずに局所的にプラスミドＤＮＡを投与された動物は、どれも検出可能な抗体応答を起こさなかった。抗体アイソタイプのさらなる特徴は、ＡＢＲｄｅｌプロトコルによるマイクロアブレーダを使用したＤＮＡワクチンの投与が、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａの両方からなる、針をベースとした標準的なＩＭ注射およびＩＤ注射と同様の混合応答を誘発することを明らかにした。これらの結果は、抗体応答がＩｇＧ２ａを含まずに、専らＩｇＧ１から成っていた、遺伝子銃を使用した前述の上皮ワクチン接種と対照的である（非特許文献１を参照のこと）。加えて、マイクロアブレーダによるプラスミドＤＮＡの送達は、抗原特有の細胞障害性Ｔ細胞刺激によって測定した場合の強い細胞免疫応答を誘発した。
【実施例５】
【００６９】
マイクロアブレーダデバイスによるアレルゲンの送達
実施例１に記載したように、マイクロアブレーダデバイスを使用して、擦過と送達を同時に行うことによって（ＡＢＲｄｅｌ；皮膚表面に沿ってデバイスを４回通過させることによって）麻酔下の豚の皮膚にヒスタミン二塩酸塩（２．５ｍｇ）を投与した。ヒスタミンは、液体として、または擦過表面の表面に被覆され、塗布の時に皮膚上の水で再構成される凍結乾燥粉末として配合された。比較のために、ヒスタミン溶液を液滴として皮膚の表面上に置き、その直後に尖叉様デバイスをこの溶液と接触させて置き、皮膚を穿刺するのに使用した。この尖叉様デバイスは、アレルゲン試験に使用される市販のデバイスと同様に、７つの、長さ１ｍｍの金属製の３４ｇ針から構成されていた。ヒスタミンの効果ではなくデバイスによる皮膚反応を監視するために、ヒスタミンを使用せずに、マイクロアブレーダまたは尖叉様穿刺デバイスで皮膚の近隣部位を処理した。追加的な対照標準は、擦過または穿刺を伴わずに局所的にヒスタミンで処理した皮膚の部位を含んでいた。赤み、膨れ、および膨疹・潮紅について皮膚の部位を監視した。
【００７０】
マイクロアブレーダを介してヒスタミンで処理した皮膚の部位には激しい炎症反応が観測された。ヒスタミンで処理した皮膚の全領域にわたって重篤な紅斑および膨れ（組織隆起が２ｍｍに達する）が確認されたのに対して、ヒスタミンを使用せずにデバイスで処理した部位は、擦過の経路に沿って弱い赤みのみを示し、膨れはまったく見られなかった。液体および再構成粉末ヒスタミン配合物についても同様に強い反応が観測された。尖叉様穿刺デバイスを使用してヒスタミン溶液で処理した皮膚も重篤な紅斑および膨れを示したが、応答は尖叉の接触点および隣接した周辺領域に集中していた。擦過または穿刺を伴わずにヒスタミン溶液で局所的に処理した皮膚の部位は炎症を起こしておらず、正常な未処理の皮膚と外見的に区別できなかった。
【００７１】
ヒスタミン二塩酸塩は、当該技術分野において、ペプチドおよびポリペプチドアレルゲンを評価するためのモデルシステムとして使用される。これらの結果は、擦過と送達を同時に行う上記プロトコルを、アミノ酸またはアミノ酸誘導体であるアレルゲンの局所的投与に効果的に利用できることを示し、ペプチドまたはポリペプチドアレルゲンの送達に対しても同様の結果を予測するものである。皮膚穿刺と比べた場合のマイクロアブレーションによるアレルゲン送達の利点としては、皮膚のより広い表面領域に物質を分散させ、これにより、尖叉様デバイスによる穿刺を用いて遂行される局所的な分布に比べて反応を起こしうる部位を広げることが挙げられる。高度に免疫刺激性である上皮組織へのより良好なターゲッティングと組み合わされた、分布の領域の増加は、現行の尖叉ベースの皮膚穿刺試験法に比べて、アレルゲン試験の感度を高めることができる。加えて、毛細血管床および周囲神経網の上の浅い上皮組織を標的にすることにより、本発明による送達は、現行の試験法よりおそらく侵襲性が低く、安全である。
（実施例５Ｂ）
本発明と、当該技術分野において既に知られていたもの（特許文献７）との違いを説明するために、いくつかの実験を行った。第１の実験群（グループＡ）では、ホタルルシフェラーゼレポータ遺伝子をコード化するプラスミドＤＮＡを様々な方法によっていくつかのブラウン−ノルウェイラットに送達し、結果を記録した。グループＡの実験の結果は、本発明を用いると、他の方法に比べて、遺伝子発現が予想外に向上することを示している。第２の実験群（グループＢ）では、ヒスタミン二リン酸塩をいくつかの雌のヨークシャ豚離乳児に送達し、結果を記録した。グループＢの実験の結果は、本発明を用いると、他の方法に比べて、アレルゲン応答が予想外に向上することを示している。
【００７２】
グループＡの実験
このグループの各々の実験において、レポータ遺伝子であるホタルルシフェラーゼをコード化する２０μｇのプラスミドＤＮＡを、全体積１０μｌで、ブラウンーノルウェイラットに投与した。針を皮膚表面に平行に挿入するマントースタイルの注射法に従って１ｃｃシリンジ付きの３０ゲージ針を使用した。
【００７３】
グループ２Ａでは、シリコンの擦過表面の代わりにプラスチックの擦過表面を使用した以外は、ＡＢＲｄｅｌプロトコルに従って、実施例１に記載されているようにマイクロアブレーダを使用した。最初に、ＤＮＡ溶液を、毛を剃り落としたラットの皮膚に液滴の形で塗布した。次いで、マイクロアブレーダデバイスをＤＮＡ溶液および皮膚の上に配置した。その後、マイクロアブレーダデバイスを使用して、皮膚を擦過すると同時にＤＮＡを皮膚に送達した。皮膚を擦過するために、約１〜１．５ｃｍ２の領域全体にわたって、マイクロアブレーダデバイスを皮膚上で水平に４回（交互方向にそれぞれ２回ずつ）移動させた。処理部位の中心１ｃｍ２を分析用に収集した。
【００７４】
グループ３Ａ、４Ａおよび５Ａでは、直径が約０．１９ｃｍの円内に配列された実質的に同一の６つの尖頭要素のクラスタから構成される尖叉デバイス（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｎｏｉｒ、ＮＣ、カタログ番号ＧＰ−１）を、特許文献７の教示に従って使用した。このデバイスにはプラスミドＤＮＡ溶液を充填したが、この充填はこの溶液の１０μｌ液滴に尖叉を浸漬させることによって行い、毛細管作用により尖頭要素（尖叉）のクラスタの間にこの溶液のすべてを本質的に懸濁した。
【００７５】
グループ３Ａでは、出血させるほど深く尖叉を挿入しないように注意しながら、尖叉デバイスを皮膚に押しつけ、約０．０６ｃｍ２の領域全体にわたって引っ掻いた。デバイスを０．３１７５ｃｍ（１／８インチ）の長さに沿って移動させて、約０．０６ｃｍ２の面積の掻き傷を与えた。
【００７６】
グループ４Ａでは、出血させるほど尖叉を挿入しないように注意しながら、尖叉デバイスを皮膚に押しつけ、約１ｃｍ２の領域全体にわたって移動させた。デバイスを１ｃｍの長さに沿って移動させた。次いで、デバイスを皮膚から取り除き、本来の処理部位に隣接する皮膚に押しつけた。デバイスを再び１ｃｍの長さに沿って移動させた。１ｃｍ２の皮膚領域をすべて処理するまでこの処理を繰り返した。
【００７７】
グループ５Ａでは、出血させるほど深く尖叉を挿入しないように注意しながら、尖叉デバイスを皮膚に押しつけた。皮膚を引っ掻くためにデバイスを使用せず、むしろデバイスを一度皮膚に押しつけた直後に皮膚からデバイスを取り除いた。
【００７８】
グループ６Ａでは、プラスミドＤＮＡをラットの毛を剃った皮膚に液滴の形で直接塗布した。次いで、皮膚を引っ掻いたり、または擦過しないように注意しながら、ピペット先端を利用して液滴を１ｃｍ２の領域全体にわたって均一に広げた。
【００７９】
各々の送達部位を含む皮膚の領域を、送達後２４時間摘出し、ホモジナイズし、ルシフェラーゼ分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ルシフェラーゼ活性に対する処理を行った。収集された組織の全量のグループ間の差を明らかにするために、ＢＣＡ分析（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で測定され、総タンパク質１ｍｇ当たりの相対光量単位（ＲＬＵ）で表される組織検体における総タンパク質含有量に対してルシフェラーゼ活性を正規化した。
【００８０】
図１１は、上述のデバイスおよび方法を用いて処理したラットから得られた皮膚サンプルの平均ルシフェラーゼ活性（各グループ毎にｎ＝４）±標準誤差を示す図である。ルシフェラーゼ活性は、グループ１Ａで最も強く、１０７２０ＲＬＵ／ｍｇであった。マイクロアブレーダデバイスを使用した送達（グループ２Ａ）でも、切除された皮膚サンプルのルシフェラーゼ活性が強かった（３８８０ＲＬＵ／ｍｇ）。対照的に、尖叉デバイスを使用した送達では、局所的対照標準グループに比べてルシフェラーゼ活性はほとんど増加していないか、全く増加していなかった。ルシフェラーゼ活性は、尖叉デバイスを使用して約０．０６ｃｍ２の領域を引っ掻いたときは（グループ２Ａでは）２３７ＲＬＵ／ｍｇであったのに対して、尖叉デバイスを使用して約１ｃｍ２の領域を引っ掻いたときは（グループ３Ａでは）１２２ＲＬＵ／ｍｇで、尖叉デバイスを水平移動させずに皮膚に押しつけたときは（グループ５Ａでは）６１ＲＬＵ／ｍｇであった。送達デバイスを使用せずにＤＮＡプラスミドを局所的に塗布した場合（グループ６Ａの場合）も皮膚の強いルシフェラーゼ活性を誘発することができなかった（４３ＲＬＵ／ｍｇ）。
【００８１】
したがって、本願に記載されているマイクロアブレーダおよび送達方法を用いたプラスミドＤＮＡの投与は、特許文献７に記載されている尖叉デバイスおよび送達方法を用いた送達後に観測されたレポータ遺伝子活性の３２倍までのレベルのレポータ遺伝子活性をもたらす。また、本発明のマイクロアブレーダデバイスを使用した送達は、特許文献７に記載されている尖叉デバイスおよび送達方法を用い、皮膚に押しつける送達、または単独で行われた局所的塗布の後に確認されたレポータ遺伝子活性の９０倍までのレベルのレポータ遺伝子活性をもたらす。それに加えて、グループ３Ａ〜５Ａ（尖叉デバイス）に記載されている方法およびデバイスによって物質を投与した後の目視検査により、尖叉のクラスタの間に実質的な量の物質が懸濁して残留していたのが明らかになったのに対して、それとは対照的に、（グループ２Ａ）の方法およびデバイスでは、実質的により少ない量の物質が保持されていたようであった。
【００８２】
グループＢの実験
このグループ各々の実験において、２７６ｍｇ／ｍｌのヒスタミン二リン酸塩（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）溶液（１００ｍｇ／ｍｌヒスタミン）を雌のヨークシャ豚離乳児に１０μｌ投与した。
【００８３】
グループ１Ｂでは、グループＡの実験について記載されているマイクロアブレーダを使用した。最初に、ヒスタミン溶液を豚の剃毛した皮膚に液滴の形で塗布した。次いで、マイクロアブレーダデバイスをヒスタミン溶液および皮膚の上に配置し、それを使用して、皮膚を擦過すると同時にヒスタミンを皮膚に送達した。皮膚を擦過するために、約１〜１．５ｃｍ２の領域全体にわたって、マイクロアブレーダデバイスを皮膚上で水平に６回（交互方向にそれぞれ３回ずつ）移動させた。
【００８４】
グループ２Ｂでは、グループ３Ａ〜５Ａの実験について記載されている尖叉デバイスを使用した。このデバイスにはプラスミドＤＮＡ溶液を充填したが、この充填はこの溶液の１０μｌ液滴に尖叉を浸漬させることによって行い、毛細管作用により尖頭要素（尖叉）のクラスタの間にこの溶液のすべてを本質的に懸濁した。次いで、わずかな圧力を利用して、出血させるほど深く尖叉を挿入しないように注意しながら、充填されたデバイスを剃毛した皮膚に押しつけた。次いで、デバイスを０．３１７５ｃｍ（１／８インチ）の長さに沿って移動させて、約０．０６ｃｍ２の面積の掻き傷を与えた。
【００８５】
グループ３Ｂでは、グループ３Ａ〜５Ａの実験について記載されている尖叉デバイスを使用した。出血させるほど尖叉を深く挿入しないように注意しながら、尖叉デバイスを剃毛した皮膚に押しつけ、約１ｃｍ２の領域にわたって移動させた。デバイスを１ｃｍの長さに沿って移動させた。次いで、デバイスを皮膚から取り除き、本来の処理部位に隣接する皮膚に押しつけた。デバイスを再び１ｃｍの長さに沿って移動させた。１ｃｍ２の皮膚領域をすべて処理するまでこの処理を繰り返した。
【００８６】
グループ４Ｂでは、グループ３Ａ〜５Ａの実験について記載されている尖叉デバイスを使用した。出血させるほど深く尖叉を挿入しないように注意しながら、尖叉デバイスを皮膚に押しつけた。皮膚を引っ掻くためにデバイスを使用せず、むしろデバイスを一度皮膚に押しつけた直後に皮膚からデバイスを取り除いた。
【００８７】
ヒスタミン溶液を塗布しなかったことを除いて、上述の方法を用いて対照標準実験を行った。
【００８８】
処理の２０分後に、赤みおよび膨れについて皮膚の部位を観察した。膨れた皮膚の部位は、デジタルキャリバを使用して、反応の最も長い点および最も広い点で垂直および水平方向の測定を行った。反応部位は均一な幾何学的形状ではなかったが、垂直方向の測定値と水平方向の測定値をかけることによって面積を見積もった。図１２は、皮膚反応の写真を示す。その結果は、本発明のマイクロアブレーダデバイスによるヒスタミン溶液の塗布（グループ１Ｂ）は、特許文献７に開示されている尖叉デバイスによって誘発される対応する反応（グループ２Ｂ〜４Ｂ）より、ヒスタミンで誘発される膨れの面積が大きくなることを示している。注目すべきことは、マイクロアブレーダデバイスによるヒスタミンの送達は強い皮膚反応をもたらしたのに対して、デバイスのみで処理した対照標準部位は、２０分後はまったくクリアで、膨れまたは赤みの形跡を示さなかった。対照的に、ヒスタミンを使用せずに尖叉デバイスを皮膚に押しつけた場合は、膨れおよび赤みがひどく、デバイスのみの効果とヒスタミンの効果を区別することが困難であった。図１３は、ヒスタミンを使用せずにデバイスのみを使用することから観察された膨れ測定値を差し引いた後に得られたグループ毎の組織の膨れの相対的な面積を示す。その結果は、ヒスタミンで誘発された膨れの平均面積は、本発明のマイクロアブレーダデバイスを使用して投与した場合（グループ１Ｂ）は、特許文献７のデバイスを使用した場合（グループ２Ｂ〜４Ｂ）に比べて４倍である。それに加えて、（グループ２Ｂ〜４Ｂ）（尖叉デバイス）に記載されている方法およびデバイスによって物質を投与した後の目視検査により、尖叉のクラスタの間に実質的な量の物質が懸濁して残留していたのが明らかになった。それに対して、（グループ１Ｂ）の方法およびデバイスでは、実質的により少ない量の物質が保持されていたようであった。
【実施例６】
【００８９】
プラスチック擦過表面を含むマイクロアブレーダデバイス
従来技術では、シリコンから構造的に精密な擦過表面を作製する微小電子機械システム（ＭＥＭＳ）ベースの方法が記載されている。プラスチック擦過表面を含むマイクロアブレーダデバイスは、シリコン擦過表面を含むマイクロアブレーダデバイスに比べて、製造が容易であること、コストが低いこと、および再現性が高いことを含めていくつかの利点を有する。当該プラスチック擦過表面はシリコンオリジナルと同様の特徴を有するようであるが、生体内で同じ機能を果たすかどうかは未知であった。
【００９０】
以下の例は、プラスチック擦過表面を備えたマイクロアブレーダデバイスの有用性を示す。
（実施例６ａ）
皮膚のバリア機能の破壊
皮膚の１０〜２０μｍの外層、すなわち角質層は、効果的な物理的かつ化学的バリアである。無傷の角質層は、ワクチンおよび他の薬剤の皮膚内への、かつ皮膚全体にわたる受動的な局所的吸収を防ぐ。プラスチック擦過表面を含むマイクロアブレーダデバイスとシリコン擦過面を含むマイクロアブレーダデバイスの、この皮膚のバリアを破壊する効果を比較するために、実施例１で記載したようにマイクロアブレーダデバイスで処理した後に、ラットの皮膚の経皮水分損失（ＴＥＷＬ）を測定した。
【００９１】
この処理法は、麻酔した動物の尾側の背中の剃毛した部分全体にわたってマイクロアブレーダデバイスを可変回数水平に通過させることからなるものであった。標準的な計測法（ｃｙｂｅｒＤＥＲＭ、Ｍｅｄｉａ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて、処理前で、マイクロアブレーダデバイスのそれぞれの通過後に、ＴＥＷＬの読取りを行った。グループ当たりｎ＝４の総数について評価を行った。図１４は、平均ＴＥＷＬ測定値および標準誤差を示す。
【００９２】
その結果は、プラスチック擦過表面を備えたマイクロアブレーダとシリコン擦過表面を含むマイクロアブレーダを使用すると、皮膚のバリア機能は同程度に破壊されることを証明するものである。各デバイスを皮膚全体にわたって一度通過させた後にＴＥＷＬの著しい増加が観察され、通過回数の追加とともに増加し続けた。どちらのデバイスも、通過の回数にかかわらず、このバリアを破壊する機能は同じであった。対照的に、マイクロアブレーダに見られるような微小構造を欠いた他の種類のデバイス（例えば歯ブラシ）は、この回数の移動では、ＴＥＷＬを増加させなかった（データは省略）。
【００９３】
豚のモデルにおいてもマイクロアブレーダデバイスの試験を行った。豚の皮膚の外皮角質層は、ラットの皮膚の対応する層より約５から１０μｍ厚い。しかしながら、シリコン擦過表面もプラスチック擦過表面もこのバリアを破壊するのに効果があり、デバイスを皮膚全体にわたって１度だけ通過させた後のＴＥＷＬが大きく、通過の追加とともに増加し続けた（図１５；単一の豚に対する条件当たりの部位数ｎ＝３）。上述のように、それら２種類のデバイスにより同一の結果が得られた。
【００９４】
豚における角質層の破壊および蛍光ビーズの浸透の組織学的分析により、シリコン擦過表面とプラスチック擦過表面を比較した場合の結果が類似していることが明らかになった。この例では、マイクロアブレーダデバイスの２回の水平方向の通過によって前処理された皮膚の部位に蛍光ビーズの溶液を塗布した。ビーズ溶液を局所的に塗布した後に、デバイスをアルコールで洗浄し、乾燥させた後、皮膚上のビーズ溶液に接触させて配置し、さらに２回皮膚全体にわたって擦った。回収した塗布部位の組織学的分析により、シリコン擦過表面とプラスチック擦過表面による送達後の角質層破壊およびビーズ分布のパターンおよび範囲が類似していることが明らかになった。ビーズは、処理された皮膚の部位全体にわたって存在しており、表皮浸透の形跡を示していた。
（実施例６ｂ）
レポータ遺伝子をコード化するプラスミドＤＮＡの送達および発現
プラスチックまたはシリコン擦過表面を備えたマイクロアブレーダを使用して、レポータ遺伝子であるホタルルシフェラーゼをコード化するプラスミドＤＮＡをマウスに投与した（図１６）。投与プロトコルは、実施例１に記載されているＡＢＲｄｅｌプロトコルに従った。全部で３７．５μｇの裸プラスミドＤＮＡを２５μｌの体積で投与した。対照標準は、標準的な針およびシリンジを用いたＩＤ注射と、マイクロアブレーダデバイスを使用しない剃毛した皮膚への局所的塗布とを含んでいた（１グループ当たりのマウス数ｎ＝３）。
【００９５】
その結果は、プラスチック擦過面を含むマイクロアブレーダは、プラスミドＤＮＡの送達に極めて効果的で、皮膚における局所的な遺伝子発現を十分なレベルにすることを証明するものである（図１６）。プラスチック擦過表面を含むマイクロアブレーダを介してプラスミドＤＮＡを受けたグループの平均ルシフェラーゼ活性は、マイクロアブレーダデバイスの補助を受けずに局所的にＤＮＡを投与された対照標準の１４０倍であった。シリコン擦過表面を含むマイクロアブレーダによる投与も同様の高い発現をもたらし、平均活性は対照標準の約１００倍であった。どちらのマイクロアブレーダグループにおいても、標準的な針ベースのＩＤ注射に比べて、より高レベルのルシフェラーゼ活性が確認された（平均ＲＬＵ／ｍｇ：プラスチック擦過表面、４３６８８；シリコン擦過表面、３１０３４；ＩＤ注射、２２１４；局所塗布、３１３）。
【００９６】
概して、その結果は、プラスチック擦過表面を含むマイクロアブレーダは、プラスミドＤＮＡの送達および発現において、シリコン擦過表面を含むマイクロアブレーダと少なくとも同程度の効果的を示すことを証明するものである。加えて、マイクロアブレーダデバイスは、プラスミドＤＮＡを皮膚に送達する上で、標準的な針より効果的で、より高レベルの遺伝子発現をもたらす。
（実施例６ｃ）
ＤＮＡワクチンの送達
図１０に示されるデータを、線グラフとして再プロットし、プラスチック擦過表面を含むマイクロアブレーダデバイスを使用した以外は、実施例１に記載されているのと同じ方法に従って免疫化した個別のマウス群（１グループ当たりｎ＝３）から得られた結果とともに示した。
【００９７】
その結果は、プラスチック擦過表面を含むマイクロアブレーダは、抗原特異的免疫応答を誘発する上で、シリコン擦過表面を含むマイクロアブレーダと同程度の効果を示すことを証明するものである（図１７）。両マイクロアブレーダデバイスにより誘発された血清抗体力価は、標準的な針ベースのＩＤおよびＩＭ注射により誘発された血清抗体力価より強かった。マイクロアブレーダデバイスを使用しない局所的塗布の後は大きな反応は観測されず、本発明のデバイスおよび方法は局所的免疫化を可能にすることが証明された。
【実施例７】
【００９８】
マイクロアブレーダデバイスを介して、アジュバントを添加せずにインフルエンザに対するＤＮＡワクチンを投与した後の抗体応答
本発明のデバイスおよび方法によるＤＮＡワクチンの投与の有用性をさらに調べるために、Ａ／ＰＲ／８／３４株からのインフルエンザウィルス赤血球凝集素（ＨＡ）をコード化するプラスミドＤＮＡ（エモリー医科大学（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）のＤｒ．Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎから提供されたプラスミド）によってブラウン−ノルウェイラットを免疫化した。ラット（１グループ当たりｎ＝３）をＰＢＳ溶液中のＤＮＡ（５０μｌの体積で１ラット当たり５０μｇ）で３回免疫化した（０、２１および４２日目）。実施例６に記載されているプラスチック擦過表面を含むマイクロアブレーダデバイスを使用し、実施例１に記載されているＡＢＲｄｅｌプロトコルに従って、ワクチンを投与した。あるいは、針を使用して、ワクチンをＩＤまたはＩＭ注射した。負の対照として、剃毛したがそれ以外は未処理の皮膚にＤＮＡを局所的に塗布した。３、５、８および１１週目に血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより分析して、インフルエンザ特異的抗体の存在について分析した。手短に述べると、マイクロタイターウェル（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に０．１μｇの完全不活性化インフルエンザウィルス（Ａ／ＰＲ／８／３４；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＳＰＡＦＡＳ、Ｎｏｒｔｈ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＣＴ）を４℃で一晩被覆した。ＰＢＳ＋５％スキムミルクにおいて３７℃で１時間ブロッキングした後、試験血清の一連の希釈液で、プレートを３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼと複合体形成させた抗ラットＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ鎖（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で、３７℃で３０分間さらにインキュベーションし、次いでＴＭＢ基板（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して展開した。テカンサンライズ（商標）プレートリーダ（Ｔｅｃａｎ、ＲＴＰ、ＮＣ）で吸光度測定値（Ａ４５０）を読み取った。
【００９９】
その結果（図１８）は、マイクロアブレーダデバイスによる裸プラスミドＤＮＡワクチンの送達後に誘発された血清抗体応答は、ＩＤまたはＩＭ注射によって誘発された血清抗体応答と同じくらい強いか、またはそれより強いことを証明している。
【実施例８】
【０１００】
マイクロアブレーダデバイスを介して、アジュバントを添加してインフルエンザに対するＤＮＡワクチンを送達した後の抗体応答
本発明のデバイスおよび方法によるアジュバントを添加した遺伝子ワクチンの送達をさらに調べるために、製造元の取扱説明書に従ってＭＰＬ＋ＴＤＭ  Ｒｉｂｉアジュバントシステム（ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）を使用して、実施例７に記載されているインフルエンザＨＡをコード化するプラスミドＤＮＡを調製した。実施例７に記載されているように、ラット（１グループ当たりｎ＝３）を免疫化し、インフルエンザ特異的血清抗体について分析した。その結果（図１９）は、マイクロアブレーダデバイスを介してアジュバントを添加したプラスミドＤＮＡワクチンを送達した後に誘発される血清抗体応答は、ＩＤまたはＩＭ注射によって誘発される血清抗体応答より強く、かつ迅速に進展することを証明している。
【実施例９】
【０１０１】
マイクロアブレーダデバイスを介して、アジュバントを添加せずに「プライム−増強」インフルエンザワクチンを送達した後の抗体応答
ＨＩＶを含む多くの疾病に対して最近開発されたワクチン接種の手法は、最初の「プライミング」免疫化および二次的な「ブースタ」が異なるワクチン類を採用するいわゆる「プライム−ブースト」手法である（非特許文献２）。例えば、ワクチンのプラスミドＤＮＡ変種でプライム処理し、次いで、サブユニットタンパク質、不活性化ウィルスまたはベクター化ＤＮＡ調製物で引き続きブーストすることができる。本発明のデバイスおよび方法による送達を調べるために、実施例７のラットを１１週目に完全不活性化インフルエンザウィルスでブーストした（図２０）。（（Ａ／ＰＲ／８／３４）５０μｌの体積に含まれる１００μｇのＰＢＳ）。（ウィルス入手元：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＳＰＡＦＡＳ、Ｎｏｒｔｈ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＣＴ．）。その結果は、すべてのグループにおいて同様のブースタ効果を示している。したがって、マイクロアブレーダを使用する「プライム−ブースト」手法によるワクチンの投与は、ＩＤまたはＩＭ注射によって誘発される免疫応答と少なくとも同程度の強さのレベルで免疫応答の刺激をもたらす。同様の実験において、アジュバントを添加したワクチンを使用した後に、実施例８のラットを上述のように完全不活性化インフルエンザウィルスで１１週目にブーストした。その結果（図２１）は、すべてのグループにおいて同様のブースタ効果を示している。ＩＭグループにおける免疫応答がマイクロアブレーダによって誘発された免疫応答に匹敵するのは、このブーストの後のみであった。したがって、マイクロアブレーダデバイスを使用する、アジュバントを含む「プライム−ブースト」手法によるワクチンの投与は、ＩＤまたはＩＭ注射によって誘発される免疫応答と少なくとも同程度の強さのレベルで免疫反応の刺激をもたらす。
【実施例１０】
【０１０２】
マイクロアブレーダデバイスを介して狂犬病ワクチンを送達した後の抗体応答
０、７および２１日目に２５μｌの狂犬病ワクチン（Ａｖｅｎｔｉｓ  ｉｍｏｖａｘ）でラットを免疫化した。実施例６に記載されているプラスチック擦過表面を含むマイクロアブレーダデバイスを使用し、実施例１に記載されているｐｒｅＡＢＲプロトコルまたはＡＢＲｄｅｌプロトコルに従ってワクチンを投与した。あるいは、針を使用して、ワクチンをＩＤまたはＩＭ注射した。負の対照として、剃毛したがそれ以外は未処理の皮膚にＤＮＡを局所的に塗布した。０、７および２１日目にラット（１グループ当たりｎ＝５）を免疫化した。０、７、２１および３５日目に血清を収集し、カンザス大学で、高速蛍光集中阻害分析（Rapid Fluorescence Focus Inhibition Assay）を用いて、狂犬病特異的抗体の存在について分析した。その結果（図２２）は、マイクロアブレーダを使用して送達した後に誘発される狂犬病中和抗体力価が、注射によって誘発されるものに比べて遅いことを示している。しかし、２１日目までには、そして３５日目まで通して継続すると、力価は注射によって達成されるものと同等になった。また、両送達方法、すなわちＡＢＲｄｅｌおよびｐｒｅＡＢＲに対して同様の応答レベルが確認された。剃毛した以外は未処理の皮膚に対するワクチンの局所的な塗布では、大きな応答を誘発することができなかった。したがって、マイクロアブレーダは、不活性化ウィルスワクチンおよび標準的な注射可能ワクチン配合物の局所的送達を可能にする。これは、マイクロアブレータデバイスと注射用に配合された従来のワクチンとの適合性を証明するものである。加えて、完全不活性化ウィルスワクチン調製物に対しては、マイクロアブレータデバイスによる送達方法は、免疫反応の強さに影響を与えないようである。
【実施例１１】
【０１０３】
（実施例１１ａ）
マイクロアブレーダデバイスを介してＢ型肝炎ワクチンを送達した後の抗体およびＴ細胞応答
他の実験において、以下の送達ルートにより、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質サブユニットワクチンをＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。
【０１０４】
１）標準的な針を使用した筋肉内（ＩＭ）注射。
【０１０５】
２）標準的な針を使用した皮内（ＩＤ）注射。
【０１０６】
３）実施例１に記載されている「ｐｒｅＡＢＲ」法に従って使用される実施例１に記載されているマイクロアブレーダ。
【０１０７】
４）実施例１に記載されている「ＡＢＲｄｅｌ」法に従って使用される実施例１に記載されているマイクロアブレーダ。
【０１０８】
５）剃毛した皮膚に対する直接的な局所的塗布（アブレーダを使用せず；図２３において「局所」と標示されている）。
【０１０９】
すべての動物（１グループ当たりｎ＝４）は、それぞれが１０μｇＨｂｓＡｇ＋アジュバントとしての１０μｇＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドからなる２回の免疫化を受けた。免疫化は、実験開始時（「０日目」、ｄ０）、および２１日目に与えられた。２１、３５および５６日目に、マウスを出血させ、ＥＬＩＳＡによりＨｂｓＡｇ特異的血清抗体力価について分析を行った。その結果（図２３）は、マイクロアブレーダデバイスによる処理は局所的免疫化を可能にすることを証明している。ｐｒｅＡＢＲグループにおける抗体応答は、局所的対照標準グループにおいて観察された対応する非常に弱い応答よりはるかに強いものであった。マイクロアブレーダデバイスによる前処理によって誘発された応答の規模は、標準的な針による直接的なＩＭまたはＩＤ注射の後に観察されたものと同等であった。注目すべきことは、核酸に対して得られた結果（実施例１）と対照的に、擦過と送達を同時に行うこと（ＡＢＲｄｅｌ）によるＨＢｓＡｇの送達はより弱い応答を誘発した。したがって、マイクロアブレーダデバイスを使用する最も適切な送達方法は、少なくとも一部において、送達される物質の種類に依存する。ＨＢｓＡｇは、自己集合してウィルス状粒子になるタンパク質単量体よりなるサブユニットワクチンを表す。実施例１１に示されるその結果は、この種類のワクチンはマイクロアブレーダを用いた前処理によって最も良好に投与されるが、「擦過と送達を同時に行う」方法によっても強い応答を誘発しうることを証明している。
（実施例１１ｂ）
他の実験において、以下の送達ルートにより、ＨＢｓＡｇタンパク質サブユニットワクチンをＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。
【０１１０】
１）標準的な針を使用した皮内（ＩＤ）注射。
【０１１１】
２）皮膚表面に沿うマイクロアブレーダデバイスの移動の回数を２回に限定すること以外は、実施例１に記載されている「ｐｒｅＡＢＲ」法に従って使用する実施例１に記載されているマイクロアブレーダ。
【０１１２】
３）皮膚表面に沿うマイクロアブレーダデバイスの移動の回数を４回に限定することを以外は、実施例１に記載されている「ｐｒｅＡＢＲ」法に従って使用する実施例１に記載されているマイクロアブレーダ。
【０１１３】
４）実施例１に記載されている「ｐｒｅＡＢＲ」法に従って使用する、実施例１に記載されているマイクロアブレーダ（皮膚全体にわたって６回通過させる）。
【０１１４】
剃毛した皮膚に対する直接的な局所的塗布（アブレーダを使用せず；図２４において「局所」と標示されている）。
【０１１５】
すべての動物（１グループ当たりｎ＝３）は、１０μｇＨＢｓＡｇ＋１０μｇＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによる１回の免疫化を受けた。免疫後１０日目に、単細胞懸濁物をドレインリンパ節（ＤＬＮ）から収集し、指定投与量のＨＢｓＡｇにより培地物中で再度刺激した。培養の５日後に、商用のＭＴＳベースの分析を用いてＴ細胞増殖を測定した。
【０１１６】
その結果（図２４）は、マイクロアブレーダデバイスによる前処理は局所的免疫化を可能にすることを証明している。マイクロアブレーダで処理したすべてのグループにおいて強いＴ細胞増殖性応答が観察されたのに対して、局所的対照標準グループでは応答がほとんどまたはまったく認められなかった。マイクロアブレーダ処理グループにおける応答の規模は、標準的な針によるＩＤ注射の後に観察された対応する応答より強かった。デバイスを皮膚全体にわたって２回だけ通過させた後に最も強い応答が観察された。４または６回通過させた後に、増殖活性がわずかに低下した。追加実験によって、デバイスを＞６回通過させると活性がさらに低下し、１０回通過させた後に活性が完全になくなっていることが示された（データは省略）。これらの結果は、所与のワクチンによる局所的免疫化を可能にするために決定しなければならない最適なデバイスの通過回数が存在することを示唆している。加えて、これらの結果は、穏和な処理プロトコル（２回程度の通過）でも、場合によっては、外皮バリアを破壊し、局所的免疫化を可能にするのに十分であることを示唆している。
【実施例１２】
【０１１７】
マイクロアブレーダを介して黒色腫に対するアデノウィルスベクター化ワクチンを送達した後のＴ細胞応答
マウス黒色腫モデルにおいて、とりわけ、マイクロアブレーダ、局所的塗布およびＩＤ送達を用いて、ｇｐ１００（黒色腫抗原）をコード化するＤＮＡを送達するアデノウィルスの試験を行った。以下の実験グループを調べた（ｎ＝８／グループ）。
【０１１８】
１）実施例１に記載されているマイクロアブレーダデバイスを使用して、実施例１に記載されている「ＡＢＲｄｅｌ」プロトコルによって投与されたビヒクルのみ。
【０１１９】
２）実施例１に記載されているマイクロアブレーダデバイスを使用して、実施例１に記載されている「ＡＢＲｄｅｌ」プロトコルによって投与された、黒色腫ｇｐ１００抗原をコード化するアデノウィルス（Ａｄ２）ベクター化ワクチン。
【０１２０】
３）実施例１に記載されているマイクロアブレーダデバイスを使用して、実施例１に記載されている「ｐｒｅＡＢＲ」プロトコルによって投与されたビヒクルのみ。
【０１２１】
４）実施例１に記載されているマイクロアブレーダデバイスを使用して、実施例１に記載されている「ｐｒｅＡＢＲ」プロトコルによって投与された黒色腫ｇｐ１００抗原をコード化するアデノウィルス（Ａｄ２）ベクター化ワクチン。
【０１２２】
５）剃毛したが、それ以外は未処理の皮膚に局所的に投与された黒色腫ｇｐ１００抗原をコード化するアデノウィルス（Ａｄ２）ベクター化ワクチン。
【０１２３】
６）従来の針を使用したＩＤ注射によって投与された黒色腫ｇｐ１００抗原をコード化するアデノウィルス（Ａｄ２）ベクター化ワクチン。
【０１２４】
マウスあたり全部で２×１０９個のアデノウィルス粒子を投与した。脾臓インターフェロンガンマ産生細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって、ワクチン投与後３０日目に、ｇｐ１００に特異的な細胞免疫応答を測定した。その結果を図２５に示す。「ＡＢＲｄｅｌ」プロトコルに従ってマイクロアブレーダを使用した送達（グループ２）は、局所的送達（グループ５）に比べて有意な応答をもたらしたが、ＩＤ注射（グループ６）によってもたらされた応答より幾分弱かった。注目すべきことは、このアデノウィルス的ベクター化ワクチンに対しては、「ｐｒｅＡＢＲ」グループ（グループ４）に比べて、「ＡＢＲｄｅｌ」グループ（グループ２）でより強い細胞免疫応答が観察された。これらの結果は、プラスミドＤＮＡに対して観察されたものと類似している（実施例１を参照のこと）。したがって、マイクロアブレーダデバイスを使用する最も適切な送達方法は、少なくとも一部において、送達される物質の種類に依存する。Ａｄ２ベクターは、生きたウィルスを表す。実施例１３に示される結果は、この種類のワクチンは、擦過と送達を同時に行うことによって最も良好に投与されるが、「ｐｒｅＡＢＲ」法によっても検出可能な免疫応答が誘発されうることを証明している。
【０１２５】
ワクチンに使用する好適なアデノウィルスベクターのさらなる説明は、とりわけ、特許文献８に見いだすことができる。
【実施例１３】
【０１２６】
マイクロアブレーダデバイスを介して炭疽に対する組換えタンパク質サブユニットワクチンを送達した後の抗体応答
他の実験において、マウスを炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の組換え防御抗原（ｒＰＡ）で免疫化した。このｒＰＡは、米国陸軍医療研究伝染病部門（ＵＳＡＭＲＩＩＤ）のＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｕｌｒｉｃｈより提供された。以下に詳述する追加的なアジュバントの存在下または不在下で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／グループ）を１０μｇのｒＰＡにより免疫化した。
【０１２７】
グループ１：ＩＭ−ｒＰＡ＋アルヒドロゲル（明礬）アジュバント。
【０１２８】
グループ２：マイクロアブレーダ、「ｐｒｅＡＢＲ」−ｒＰＡ（アジュバント使用せず）。
【０１２９】
グループ３：マイクロアブレーダ、「ｐｒｅＡＢＲ」−ｒＰＡ＋アルヒドロゲル（明礬）アジュバント。
【０１３０】
グループ４：マイクロアブレーダ、「ｐｒｅＡＢＲ」−ｒＰＡ＋ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドアジュバント。
【０１３１】
グループ５：マイクロアブレーダ、「ＡＢＲｄｅｌ」−ｒＰＡ（アジュバント使用せず）。
【０１３２】
グループ６：マイクロアブレーダ、「ＡＢＲｄｅｌ」−ｒＰＡ＋アルヒドロゲル（明礬）アジュバント。
【０１３３】
グループ７：マイクロアブレーダ、「ＡＢＲｄｅｌ」−ｒＰＡ＋ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドアジュバント。
【０１３４】
グループ８：局所的塗布−ｒＰＡ（アジュバント使用せず）。
【０１３５】
グループ９：局所的塗布−ｒＰＡ＋アルヒドロゲル（明礬）アジュバント。
【０１３６】
グループ１０：局所的塗布−ｒＰＡ＋ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドアジュバント。
【０１３７】
０、２１および４２日目にマウスを免疫化した。２１、４２および５６日目に、血清を収集し、ＥＬＩＳＡによってｒＰＡ特異的抗原について分析した。結果は、以下の表１〜３に要約されている。
【０１３８】
【表１】
2005511248.tif 000003
【０１３９】
【表２】
2005511248.tif 000004
【０１４０】
【表３】
2005511248.tif 000005
【０１４１】
これらの結果は、マイクロアブレーダを使用して、炭疽に対する組換えサブユニットワクチンを送達すると、十分な血清抗体力価が達成されることを証明している。マイクロアブレーダを使用した送達によってもたらされる抗体力価は、従来のＩＭ注射のルートによってもたらされたものと少なくとも同程度の強さである。マイクロアブレーダを使用しない局所的投与は、いくつかの動物では比較的弱い応答を誘発する。実施例１１ａに提示されている結果と同様に、「ｐｒｅＡＢＲ」プロトコルは、わずか１または２回分のワクチンを投与した後で、「ＡＢＲｄｅｌ」プロトコルより強い免疫応答を誘発した（表１および表２）。しかし、３回目の投与までには、力価はこれらのグループ間で同等になっていた（表３）。したがって、マイクロアブレーダデバイスを使用する最も適切な送達方法は、少なくとも一部において、送達される物質の種類に依存する。ｒＰＡは、組換えタンパク質からなるサブユニットワクチンを表す。表１〜３に示されている結果は、この種類のワクチンは、マイクロアブレーダを用いた前処理によって最も良好に投与されるが、「擦過と送達を同時に行う」方法によっても究極的には強い応答が誘発されうることを証明している。
【０１４２】
さらに、これらの結果は、本発明のデバイスおよび方法が、例えば明礬およびＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む多種類のワクチンアジュバントに適合することを証明している。
【０１４３】
これらの結果は、本発明のマイクロアブレーダおよび技術が、標準的な針およびシリンジを使用する従来の送達方法に比べて、広範囲の種類のワクチンの局所的送達を可能にし、多くの場合において送達を向上させることを証明している。
【０１４４】
ここに引用されている参考文献および特許は、参照により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１Ａ】好ましい実施形態の把手末端の立面図である。
【図１Ｂ】マイクロアブレータの好ましい実施形態の側面図である。
【図２Ａ】図１Ａおよび１Ｂのマイクロアブレーダデバイスの透明斜視図である。
【図２Ｂ】図１Ｂのマイクロアブレータデバイスの断面図である。
【図３】対象の皮膚上での図１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂのマイクロアブレーダデバイスの擦過表面の側面図である。
【図４】図３の実施形態における擦過表面の斜視図である。
【図４Ａ】アブレーダ表面の側方断面図である。
【図５】図３の実施形態のアブレーダ表面の底面図である。
【図６】皮膚の擦過溝の部分断面における斜視図である。
【図７】実施例１で試験された、様々な核酸送達プロトコルによって得られる皮膚におけるレポータ遺伝子活性のレベルを示す図である。
【図８】実施例２に記載されている、擦過数を変えることによって得られる皮膚におけるレポータ遺伝子活性を示す図である。
【図９】実施例３に記載されている、核酸の配合および送達プロトコルを変えることによって得られる皮膚におけるレポータ遺伝子活性を示す図である。
【図１０】実施例４に記載されている、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）をコード化するプラスミドＤＮＡの送達後の血清抗体応答を示す図である。
【図１１】マントースタイル注射技術（グループ１Ａ）と、本発明のプラスチック顕微針アレイ（グループ２Ａ）と、皮膚に押しつけられ、約０．０６ｃｍ２の領域にわたって擦られる尖叉デバイス（グループ３Ａ）と、皮膚に押しつけられ、約１ｃｍ２の領域にわたって移動される尖叉デバイス（グループ４Ａ）と、皮膚に押しつけられ、除去される尖叉デバイス（グループ５Ａ）と、剃られた皮膚に液滴の形で直接加えられるプラスミドＤＮＡ（グループ６Ａ）とを用いてレポータ遺伝子で処理されたラットからの皮膚サンプルにおける平均ルシフェラーゼ活性（±ＳＥＭ）を示す図である。
【図１２】ヒスタミンを加え、本発明のプラスチック顕微針アレイ（グループ１Ｂ）と、約０．０６ｃｍ２の領域にわたって一度擦られる尖叉デバイス（グループ２Ｂ）と、複数回擦られて約１ｃｍ２のスクラッチ領域を生成する尖叉デバイス（グループ３Ｂ）と、皮膚に押しつけられ、除去される尖叉デバイス（グループ４Ｂ）とを用いて離乳豚の皮膚を擦過した後の皮膚反応を示す図である。各グループについて、番号１〜５は反復され、「Ｃ」は、擦過を伴わずにヒスタミンが加えられた対照標準である。
【図１３】ヒスタミンを使用せずにデバイスのみを使用することにより得られた膨潤測定値を差し引いた後の、図１２に示される各グループに対する相対的な組織膨潤領域の表示を示す図である。
【図１４】プラスチックマイクロアブレーダとシリコンマイクロアブレーダによる処理の後の皮膚の経皮水分損失（ＴＥＷＬ）を比較した図である。
【図１５】プラスチックマイクロアブレーダとシリコンマイクロアブレーダによる処理の後の皮膚の経皮水分損失（ＴＥＷＬ）を比較した図である。
【図１６】プラスチックマイクロアブレーダとシリコンマイクロアブレーダを使用して、レポータ遺伝子をコード化するプラスミドＤＮＡを送達した後の皮膚におけるレポータ遺伝子活性を示す図である。
【図１７】プラスチックマイクロアブレーダとシリコンマイクロアブレーダを使用して、ＨＢｓＡｇをコード化するＤＮＡプラスミドを送達した後の血清抗体応答を比較した図である。
【図１８】インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）をコード化するＤＮＡプラスミド（裸プラスミド）の投与後の血清抗体応答を示す図である。
【図１９】インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）をコード化するＤＮＡプラスミド（プラスミドとアジュバント）の投与後の血清抗体応答を示す図である。
【図２０】インフルエンザＨＡをコード化する裸プラスミドＤＮＡで前処理を行った後に、完全不活性化インフルエンザウィルスで増強した後の血清抗体応答を示す図である。
【図２１】インフルエンザＨＡをコード化するプラスミドＤＮＡとアジュバントで前処理した後に、完全不活性化インフルエンザウィルスで増強した後の血清抗体応答を示す図である。
【図２２】狂犬病ウィルスに対する不活性化ウィルスワクチンを投与した後の血清抗体応答を示す図である。
【図２３】図１１ａに示されている送達プロトコルを介したＨＢｓＡｇの投与後の血清抗体反応を示す図である。
【図２４】ＨｂｓＡｇの投与後のＴ細胞増殖性応答を示す図である。
【図２５】アデノウィルスベクターによってコード化されたメラノーマワクチンに対する細胞免疫応答を示す図である。
【図１Ａ】
2005511248.tif 000006
【図１Ｂ】
2005511248.tif 000007
【図２Ａ】
2005511248.tif 000008
【図２Ｂ】
2005511248.tif 000009
【図３】
2005511248.tif 000010
【図４】
2005511248.tif 000011
【図４Ａ】
2005511248.tif 000012
【図５】
2005511248.tif 000013
【図６】
2005511248.tif 000014
【図７】
2005511248.tif 000015
【図８】
2005511248.tif 000016
【図９】
2005511248.tif 000017
【図１０】
2005511248.tif 000018
【図１１】
2005511248.tif 000019
【図１２】
2005511248.tif 000020
【図１３】
2005511248.tif 000021
【図１４】
2005511248.tif 000022
【図１５】
2005511248.tif 000023
【図１６】
2005511248.tif 000024
【図１７】
2005511248.tif 000025
【図１８】
2005511248.tif 000026
【図１９】
2005511248.tif 000027
【図２０】
2005511248.tif 000028
【図２１】
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【図２２】
2005511248.tif 000030
【図２３】
2005511248.tif 000031
【図２４】
2005511248.tif 000032
【図２５】
2005511248.tif 000033
【国際調査報告】
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