(57)【要約】本発明は、植物において、病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を与えるための、単離された核酸断片の作製および使用に関する。このような断片またはその機能的に等価の細断片および適当な制御配列を包含するキメラ遺伝子を使用して、病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対して抵抗性遺伝子仲介防御応答を引き起こすことができる、トランスジェニック植物を作製することができる。
2005502303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変化したＰｉ−ｔａ抵抗性ポリペプチドをコードする核酸配列またはその部分配列を含む単離された核酸断片であって、前記ポリペプチドが、病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を与える単一アミノ酸変化を９１８位に有する、単離された核酸断片。
【請求項２】
前記９１８位におけるアミノ酸変化がＭ、Ｃ、Ｉ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、ＬおよびＱからなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸断片。
【請求項３】
少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された請求項１または２に記載の核酸断片を含む、キメラ遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載のキメラ遺伝子をゲノム内に含む植物。
【請求項５】
前記植物がイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、フィンガーミレット、モロコシ、およびパールミレットからなる群から選択される、請求項４に記載の植物。
【請求項６】
請求項４または５に記載の植物の種子。
【請求項７】
植物中の病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対して、植物における抵抗性遺伝子仲介防御応答を与える方法であって、
（ａ）請求項３に記載のキメラ遺伝子で植物を形質転換するステップと、
（ｂ）病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に抵抗性であるステップ（ａ）の形質転換植物を選択するステップと、
を含む方法。
【請求項８】
前記真菌がＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記真菌がＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａである、請求項１または２に記載の単離された核酸断片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年１１月１４日に出願された米国特許仮出願第６０／２４８，３３５号（その全内容を参照により本明細書に援用する）の利益を主張する。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、植物における、病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を与えるための、単離された核酸断片の調製および使用に関する。このような断片または機能的に等価のこれらの細断片および適当な制御配列を組み込むキメラ遺伝子を使用して、病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を生じさせることができる、トランスジェニック植物を作ることができる。
【０００３】
【発明の背景】
植物は、ウイルス、細菌、真菌および線虫を含む多種多様の病原性生物により損傷を受けることがある。潜在的な病原体による植物の侵襲は、ある範囲の結果を来たす可能性がある：病原体は、宿主内で首尾よく増殖して関連した病害症状を引き起こすこともあり、宿主防御によってその成長が停止されることもある。一部の植物−病原体相互作用において、活性な防御応答の目に見える特徴は、いわゆる過敏感反応（ＨＲ）である。ＨＲは、感染部位付近の急速な細胞壊死を含み、また目に見える褐色の小斑点または病変の形成を含むことがある。所与の宿主でＨＲを誘発する病原体は、その宿主では非病原性（ＡＶＲ）であり、その宿主は抵抗性であると言われ、植物−病原体相互作用は非和合性であると言われる。ある特定の宿主で増殖して病害を引き起こす菌株は、病原性であると言われ、この場合、宿主は感受性であり、植物−病原体相互作用は和合性であると言われる。
【０００４】
ある特定の真菌病原体または細菌性病原体の一連の菌株（系統）が、ある特定の宿主種の一連の品種で病原性または非病原性のいずれかである例について、植物−病原体認識の遺伝的根拠の解明を容易にするために、遺伝分析が使用されてきた。多くのこのような例において、多くの非病原性真菌菌株および細菌菌株は、対応する「抵抗性」（Ｒ）遺伝子を宿主中に有する１つ以上の非病原性（「ａｖｒ」または「ＡＶＲ」）遺伝子を具有することにより、病原性のものと異なることが、宿主および病原体の両者の遺伝分析で明らかにされた。
【０００５】
この非病原性遺伝子−抵抗性遺伝子モデルは、「遺伝子対遺伝子（ｇｅｎｅ−ｆｏｒ−ｇｅｎｅ）」モデルと呼ばれる（植物病害における抵抗性のメカニズム（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ．）Ｒ．Ｓ．Ｓ．Ｆｒａｓｅｒ編中のＣｒｕｔｅら（１９８５）ｐｐ  １９７−３０９；Ｅｌｌｉｎｇｂｏｅ，（１９８１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９：１２５−１４３；Ｆｌｏｒ，（１９７１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｈｏｐａｔｈｏｌ．９：２７５−２９６）。このモデルの簡単な形式化によれば、植物抵抗性遺伝子は、ｄｖｒ遺伝子によって生じる分子シグナル特異的受容体をコードする。シグナル形質導入経路は、宿主防御を開始する一組の標的遺伝子にシグナルを送る。この簡単な予測モデルがあるものの、ａｖｒ−抵抗性遺伝子相互作用の分子機序は未だ明らかでない。
【０００６】
クローン化された最初のＲ−遺伝子は、真菌病原体Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍの特定の系統に対する抵抗性を与える、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）由来のＨｍ１遺伝子であった（Ｊｏｈａｌら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：９８５−９８７）。Ｈｍ１は、病原体が産生する毒素を解毒する還元酵素をコードする。次にクローン化されたのは、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｌｉｕｍ）由来のＰｔｏ遺伝子であった（Ｍａｒｔｉｎら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２−１４３６；米国特許第５，６４８，５９９号）。Ｐｔｏは、トマトにおいて、ａｖｒＰｔｏ非病原性遺伝子を発現する細菌性病原体Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏの菌株に対する抵抗性を与えるセリン−スレオニンタンパク質キナーゼをコードする。現在注目を集めているものは、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）を含有するタンパク質をコードするＲ−遺伝子である（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ａｄｖ．Ｂｏｔ．Ｒｅｓ．Ｉｎｃｏｒｐ．Ａｄｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．２４：８９−１６７）。細胞外ＬＲＲを含む２クラスの膜固着タンパク質が同定されている。一方のサブクラスは、真菌Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍに対する抵抗性に関するトマトＣｆ−９遺伝子等の、細胞質セリン／スレオニンキナーゼドメインを欠くＲ−遺伝子産物を含み（Ｊｏｎｅｓら、１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９−７９３，ＷＯ  ９５／１８２３０）、他方のサブクラスは、細菌性病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅに対する抵抗性に関するイネＸａ−２１遺伝子、細胞質セリン／スレオニンキナーゼドメインを有するＲ−遺伝子産物を含む（Ｓｏｎｇら、１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１８０４−１８０６；米国特許第５，８５９，３３９号）。最大クラスのＲ−遺伝子は、シロイヌナズナＲ−遺伝子ＲＰＳ２（Ｂｅｎｔら、１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１８５６−１８６０；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓら、１９９４，Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９−１０９９）およびＲＰＭ１（Ｇｒａｎｔら、１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：８４３−８４６）等の、細胞質ＬＲＲを有するタンパク質をコードするものを含む。これらのＲ−タンパク質は、推定上のヌクレオチド結合部位（ＮＢＳ）、およびロイシンジッパー（ＬＺ）モチーフかまたはＴｏｌｌ／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）に相同な配列のいずれかも有する。表１は、現在までにクローン化されたＲ−遺伝子のクラスおよび各クラス内のクローン化された遺伝子の例の要約として、Ｂａｋｅｒら（１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：７２６−７３３）から一部写したものである。
【０００７】
【表１】
2005502303.tif 000003
【０００８】
ヌクレオチド結合部位（ＮＢＳ）は、細胞増殖、分化、細胞骨格構築、小胞輸送、および防御等の、基本的な真核生物細胞機能に重要なタンパク質の多くのファミリーに見られる。主要な例としては、ＲＡＳ群、アデノシン三リン酸分解酵素、伸長因子、およびＧ−タンパク質と呼ばれるヘテロ三量体ＧＴＰ結合性タンパク質などが挙げられる（Ｓａｒａｓｔｅら、１９９０，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：４３０）。これらのタンパク質は、共通して、ＡＴＰまたはＧＴＰに結合できる能力を有する（Ｔｒａｕｔ，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：９−１９）。
【０００９】
長期にわたって、イネイモチ病システムは、Ｈ．Ｈ．Ｆｌｏｒにより定義された古典的遺伝子対遺伝子システム（Ｆｌｏｒ，１９７１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９：１２５−１４３）を示すという仮説が立てられてきた。イネイモチ病病原体，Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａにおけるＡＶＲ−遺伝子を同定するのに必要な遺伝子分析は、イネに感染するＭ．ｇｒｉｓｅａ野外株に特徴的に備わっている低い生殖力により妨げられてきた。他のイネ科草本（たとえば、スズメガヤ、Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃｕｒｖｕｌａおよびフィンガーミレット、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）の、生殖能力の低いＭ．ｇｒｉｓｅａイネ病原体と生殖能力の高いＭ．ｇｒｉｓｅａ病原体との間の遺伝的交雑により、ＡＶＲ−遺伝子を同定するのに必要とされる有性生殖能力のレベルを備えた真菌の実験用菌株を得た（Ｖａｌｅｎｔら、１９９１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７−１０１）。珍しい、生殖能力のあるイネ病原体は、それ以来、イモチ病真菌ＡＶＲ−遺伝子と特定のイネＲ−遺伝子との間の１対１の遺伝的対応または機能的対応の証明を可能にした（Ｓｉｌｕｅら、１９９２，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８２：５７７−５８０）。
【００１０】
イネイモチ病の防除に向けての長期にわたる研究にも関らず、真菌病原体Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ（Ｈｅｂｅｒｔ）Ｂａｒｒ（アナモルフＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｇｒｉｓｅａ  Ｓａｃｃ．）によって世界的に引き起こされるイネイモチ病病害は、イネ農産物の最も爆発的であり、且つ潜在的に損害を与える病害として存続するため、イネイモチ病病害システムに対する関心は、極めて強い。真菌集団は、配置された抵抗性戦術を打ち負かすように進化するため、イモチ病抵抗性遺伝子の操作は、依然として、全てのイネ育種プログラムにおける一次標的の１つである（Ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９４，ｅｄ．Ｚｅｉｇｌｅｒ，Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｎｇ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ参照）。
【００１１】
遺伝子制御戦術を補足するための市販の殺真菌薬の使用は、イネ農家が無機銅を主成分とする殺真菌薬を使用した１９１５年ごろに始まった（Ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９４，ｅｄ．Ｚｅｉｇｌｅｒ，Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｎｇ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄの２９章）。イモチ病病害の防除に使用される殺真菌薬は時を経て変化し、１９５０年代に使用された有機水銀化合物等の一部の化合物は、重大な環境被害を引き起こした。殺真菌薬によるイネイモチ病の防除は、現在、農家にとって１年に５億ドルを超える経費に相当する。イモチ病防除のためのこの費用は、世界のイネ殺真菌薬市場の最大区分であり、１９９８年には、総計７億５２００万ドルであった（Ｗｏｏｄ  Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ）。１９９０〜２０２５年の間に、世界的なイネの要求が１年間に推定１．７％増加するため、病害問題が増大することが予想される（Ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９４，ｅｄ．Ｚｅｉｇｌｅｒ，Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｎｇ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ）。増え続ける人口に食糧を供給するため、さらに年間１３００万トンの玄米の推定される必要性が、減り続ける利用可能な土地で、生産強化によってもたらされなければならない。イネイモチ病病害は、多収量を目的とする農学的生産活動によって助けられ、従って、イネイモチ病病害に対する永続性のある遺伝的抵抗性をイネの中に操作できなければ、この病害はイネ農産物収量に対する制約として存続し、増加する可能性が最も高い。本発明は、認識するＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子産物のスペクトルに関して異なる特異性を有する新規なＰｉ−ｔａ対立遺伝子を作ることによって、イネイモチ病に対する、永続性のある遺伝的抵抗性を操作する長期目的に向けた前進を示す。真菌Ｍ．ｇｒｉｓｅａは、イネ科内の異なる族の種、Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ（たとえば、コムギ）、Ｏｒｙｚｅａｅ（たとえば、イネ）、Ｃｌｏｒｉｄｅａｅ（たとえば、フィンガーミレット）、Ｐａｎｉｃｅａｅ（たとえば、パールミレット）、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｅａｅ（たとえば、モロコシ）およびＭａｙｄｅａｅ（たとえば、トウモロコシ）を含む広い宿主範囲を有する。現在、それぞれ制限された一組の宿主種特異性を有する、Ｍ．ｇｒｉｓｅａの宿主種特異的亜集団８つが、分子分析で明確にされている（Ｖａｌｅｎｔ，１９９７，Ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｔａ  Ｖ，Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ，Ｃａｒｒｏｌｌ／Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ｐｐ３７−５４により再検討）。表２は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）型による病原体亜集団の最新の見解を示す。この見解は、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）多型性（制限断片長多型性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ））と内部転写スペーサー（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ））配列の両者を含む）、および反復ＤＮＡおよび単一コピー配列の両者における多型性の、別々の分析によって強く裏付けられる。
【００１２】
イネ、コムギ、フィンガーミレット、オオムギおよびトウモロコシの病原体（ｍｔＤＮＡタイプＩａ〜ｅ）は、密接に関連しているようであるが、Ｄｉｇｉｔａｒｉａ  ｓｐｐ．およびＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｐｐ．の病原体（ｍｔＤＮＡタイプＩＩ−ＩＶ）は、先の群と、また互いに、極めて異なる。しかし、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株は、この広い宿主範囲の全体にわたって、重大な農産物損害を引き起こす可能性がある。この病原体は、アフリカにおけるフィンガーミレット（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）の収穫減の主な原因であるが、多湿の気象条件では、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ；Ｕｒａｓｈｉｍａら、１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ７７：１２１１−１２１６）およびパールミレット（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ；Ｈａｎｎａら、１９８９，Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ８０：１４５−１４７）における感染が（それほど広範囲ではないものの）深刻なこともある。この病害は、オオムギおよびトウモロコシに関して記録されている（Ｕｒａｓｈｉｍａら、１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ７７：１２１１−１２１６の参考文献参照）。
【００１３】
【表２】
2005502303.tif 000004
【００１４】
植物病原性真菌の場合、その病原性および宿主特異性に関する知識は、細菌性病原体およびウイルス性病原体の場合ほど発展しておらず、また同様に、穀類農産物植物における抵抗性の分子的機序は、双子葉植物農作物または双子葉植物モデルシステム、たとえばシロイヌナズナにおける抵抗性の分子的機序ほど知られていない（Ｂａｋｅｒら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：７２６−７３３）。Ｓａｓａｋｉは、１９１７年に日本で開始された研究による、イネイモチ病病害に対する抵抗性の遺伝に関する最初の結果を報告した（Ｓａｓａｋｉ，１９２２，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊａｐａｎ  １，８１−８５）。
【００１５】
このとき以来、世界的な大規模な遺伝分析によって３０を超えるＲ−遺伝子が明確にされ、またこれらのイモチ病抵抗性遺伝子の多くが、イネ染色体にマッピングされている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，１９６５，Ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，３０３−３２９中の参考文献；Ｃａｕｓｓｅら、１９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３８：１２５１−１２７４参照）。これらのＲ−遺伝子は、２０の主要抵抗性遺伝子および１０の推定上の量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を含む。Ｋｉｙｏｓａｗａは、１３の主要抵抗性遺伝子について記載しており、これらの遺伝子のうち９つは、複対立遺伝子として３つの遺伝子座にあり、５つは、染色体１１上のＰｉ−ｋ遺伝子座に、２つは染色体６上のＰｉ−ｚ遺伝子座に、２つは染色体１２上のＰｉ−ｔａ遺伝子座にある（Ｋｉｙｏｓａｗａ，１９８４，Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  １：９５−９７）。日本（Ｉｓｅ，１９９２，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｉｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  １７：８−９）および国際イネ研究所（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｉｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｉｕｔｅ（ＩＲＲＩ））（Ｍａｃｋｉｌｌら、１９９２，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８２：７４６−７４９）での最近の研究により、真菌の個々の菌株を防除する上で、どの抵抗性遺伝子が有効であるかを決定するために、「鑑別用（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）」イネ変種として使用するための、ほぼ同質遺伝子的なイネ系統（ＮＩＬ）が作出された。ＩＲＲＩ  ＮＩＬ（熱帯地方におけるイモチ病真菌集団を鑑別することができる）は、それらの抵抗性遺伝子と、Ｋｉｙｏｓａｗａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓに存在する抵抗性遺伝子との間の遺伝的関係についての分析が行われている（Ｉｎｕｋａｉら、１９９４，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８４：１２７８−１２８３）。
【００１６】
Ｒ−遺伝子にしっかり連結されている分子マーカー（すなわち「タグ」）は、育種プログラムにおけるこれらのＲ−遺伝子の効率的な遺伝子移入および操作に有用である。ほぼ同質遺伝子的な系統、それらのドナー、およびそれらの反復親の遺伝子型パターンを比較することによって、Ｙｕら（１９８７，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ７７：３２３−３２６）は、３つのイモチ病抵抗性遺伝子に連結された５つの制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーを同定することができ、また、分離型集団を使用して、それらをイネ染色体にマッピングすることができた。Ｒ−遺伝子に連結されたＲＦＬＰマーカーが報告されている（Ｙｕら、１９９１，Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８１：４７１−４７６）。農学的に重要なＲ−遺伝子の分子クローニングによって、主要な農産物変種において、Ｒ−遺伝子を他の入力形質および出力形質と組み合わせることができる研究者の能力が、さらなる発展を示す。
【００１７】
抵抗性の遺伝に関する上述の調査研究の間に、Ｓａｓａｋｉは、イモチ病真菌の異なる野外株は、イネの異なる変種で病害を引き起こす能力が異なることを観察することによって、イネイモチ病病原体の生理学的系統を発見した（Ｓａｓａｋｉ，１９２２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ９：６３１−６４４；Ｓａｓａｋｉ，１９２３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  １０：１−１０）。イネイモチ病真菌に対する主要Ｒ−遺伝子抵抗性の不安定性、すなわち野外条件で「破壊」されることにより、鑑別用イネ変種に対する病原性スペクトルによって明確にされる、多数の系統、すなわち、病原型が同定される結果となる。（Ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９４，ｅｄ．Ｚｅｉｇｌｅｒ，Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｎｇ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ中の１３章および１６章）。病原体集団は、新しい抵抗性遺伝子の配置に応答して動的になり、時には、野外での配置後１年または２年以内に、抵抗性遺伝子を打ち負かす新しい系統が生じることもある。
【００１８】
従って、世界的な破壊的イネイモチ病病害の病原である、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ（Ｈｅｂｅｒｔ）Ｂａｒｒ等の、極めて変化しやすい真菌病原体に対して永続性のある抵抗性は、病害抵抗性（Ｒ）遺伝子を農産物植物に組み込むことによっては達成されていない（Ｒｏｓｓｍａｎら、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋｅｗ，Ｓｕｒｒｅｙ，２版，１９８５；Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｚｅｉｇｌｅｒら、ｅｄｓ．，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，Ｏｘｏｎ  ＯＸ１０  ８ＤＥ，ＵＫ（１９９４））。換言すれば、イネイモチ病病害防除におけるＲ−遺伝子の有用性は、病原体の固有の野外可変性によって制限されてきた。
【００１９】
Ｍ．ｇｒｉｓｅａの異なる菌株には、対立遺伝子を認識する、対応するＲ−遺伝子変異形がイネで同定されていない、多数の病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子がある。これまでに、このような対立遺伝子を認識するように、Ｒ−遺伝子を操作した者はいない。明らかに、そうすることができれば、イネイモチ病真菌および他の病原体の病原性菌株を容易に防除するための価値ある道具が提供されるであろう。
【００２０】
明らかに、この点に関して、研究者は十分に成功していない。
【００２１】
１９９９年６月２１日に提出され、出願番号第０９／３３６，９４６号（２０００年２月１７日に公開された、ＰＣＴ公開公報番号第ＷＯ  ００／０８１６２号）を有する、出願人の譲渡人の同時係属特許出願には、病害抵抗性を与えるＰｉ−ｔａ遺伝子が記述されている。同出願は、真菌の異なる菌株で認識することができるＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子に関して、Ｒ−遺伝子の特異性を変えることによってそれらの有用性を高めるために、Ｒ−遺伝子を修飾する必要があることについては述べていない。
【００２２】
Ｗａｎｇら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １９：５５−６４には、Ｐｉ−ｔａと異なる、別のイネイモチ病抵抗性遺伝子、Ｐｉｂが記述されている。
【００２３】
２０００年６月１５に公開されたＷＯ  ００／３４４７９号には、Ｍ．ｇｒｉｓｅａに対する抵抗性を与える異なる病害抵抗性タンパク質をコードする核酸断片が記述されている。
【００２４】
１９９７年７月１５日にＴａｎｋｓｌｅｙおよびＭａｒｔｉｎに発行された米国特許第５，６４８，５９９号には、細菌性植物病原体における非病原性遺伝子に応答することによって植物に対する病害抵抗性を与える、Ｐｔｏセリン／スレオニンキナーゼをコードする、トマトから単離された遺伝子断片が記述されている。
【００２５】
１９９５年１０月２６日に公開されたＷＯ  ９５／２８４２３号には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ＲＰＳ２遺伝子ファミリーに起因する抵抗性、プライマー、プローブおよび検出方法が記述されている。この公開された国際出願は、植物を病原体から保護するための、ＮＨ２末端モチーフ、ＮＢＳモチーフおよびロイシンリッチ反復を有するタンパク質をコードする遺伝子に対する広いクレームを含む。Ｐｉ−ｔａタンパク質特有の特徴がある。Ｐｉ−ｔａ遺伝子産物は、特有のアミノ末端を有し、ＲＰＳ２遺伝子産物サブファミリーの潜在的ロイシンジッパーモチーフ（Ｂｅｎｔら、１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１８５６−１８６０；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓら、１９９４，Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９−１０９９）またはＮ遺伝子サブファミリーによってコードされるＴｏｌｌ／インターロイキン−１受容体相同性（Ｗｈｉｔｍａｎら、１９９４，Ｃｅｌｌ  ７８：１１０１−１１１５）のいずれかを欠く。最も重要なことは、Ｐｉ−ｔａ遺伝子産物のカルボキシ末端部分はロイシンリッチであるが、Ｒ−遺伝子産物に関して報告されているロイシンリッチ反復のコンセンサス配列に合わないことである（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ａｄｖ．Ｂｏｔ．Ｒｅｓ．Ｉｎｃｏｒｐ．Ａｄｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．２４：８９−１６７）。
【００２６】
１９９６年１１月５日にＢａｋｅｒらに発行された米国特許第５，５７１，７０６号は、Ｎ遺伝子によって与えられる植物ウイルス抵抗性について論じている。
【００２７】
１９９９年１月１２日にＳｔａｓｋａｗｉｃｚらに発行された米国特許第５，８５９，３５１号には、トマトにおける病害抵抗性に関与するＰＲＦタンパク質および核酸配列が記述さている。
【００２８】
１９９９年１月１２日にＲｏｎａｌｄらに発行された米国特許第５，８５９，３３９号には、ＬＲＲおよびセリン／スレオニンキナーゼドメインの両者を含む完全膜タンパク質をコードし、イネにおける斑点細菌病に対する抵抗性を与える、イネからクローン化された第１の抵抗性遺伝子、Ｘａ−２１が記述されている。
【００２９】
１９９１年１０月１７日に公開されたＷＯ  ９１／１５５８５号、および１９９９年２月２日にｄｅ  Ｗｉｔらに発行された米国特許第５，８６６，７７６号には、病原体非病原性遺伝子と対応する植物抵抗性遺伝子の組合せを使用して、植物を病原体から保護する方法が記述されている。
【００３０】
１９９７年１０月７日にＫａｗａｓａｋｉらに発行された米国特許第５，６７４，９９３号（’９９３特許）には、イネイモチ病抵抗性遺伝子Ｐｉ−ｂ，Ｐｉ−ｔａおよびＰｉ−ｔａ２と同時分離する核酸マーカー、およびこれらの核酸マーカーを使用することによってイネイモチ病抵抗性遺伝子を単離してクローン化できる可能性があるという提言が記述されている。しかし、’９９３特許には、イネイモチ病抵抗性遺伝子に関するヌクレオチド配列が全く記載されていない。Ｐｉ−ｂイネイモチ病抵抗性遺伝子に関する推定上の配列は、現在は、Ｇｅｎｂａｎｋで入手できる（受入番号ＡＢ０１３４４８）ことに留意すべきである。
【００３１】
加えて、Ｋａｗａｓａｋｉらは、２報の論文を発表した。第１の論文、Ｒｙｂｋａら、ＭＰＭＩ，１０（４）：５１７−５２４（１９９７）は、「インディカ由来のイネイモチ病抵抗性遺伝子の高分解能マッピングＩＩ。Ｐｉ−ｔａ２およびＰｉ−ｔａおよびそれらの起源に関する考察」と題する。５１９ページの第２段の最上部に記載されているＲＡＰＤプライマーに関する配列は、’９９３特許の配列番号：２に記載されているＲＡＰＤプライマーと同じではない。上記論文では、ＲＡＰＤプライマーに関する配列はＴＣＣＣＣＡＧＣＣＡである。’９９３特許では、ＲＡＰＤプライマーに関する配列は、ＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡである。どちらの配列が正しいかは明らかではない。これにもかかわらず、この論文は、イネイモチ病遺伝子に関するヌクレオチド配列を記載していないことは明白である。第２の論文は、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４：６１１−６２（１９９７）である。この論文は、イネＢＡＣライブラリーを使用した、イネイモチ病抵抗性遺伝子Ｐｉ−ｔａ２の動原体領域付近の、８００−ｋｂコンティグの構築について記述している。また、イネイモチ病遺伝子に関するヌクレオチド配列が開示されていない。
【００３２】
従って、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子に関して、Ｒ−遺伝子の特異性を広げることによって、それらの有用性を高めるために、Ｒ−遺伝子を修飾する必要性について述べた者は、これまでにいないと考えられる。広がった特異性によって、修飾されたＲ−遺伝子は、異なる真菌菌株を認識できるようになる。
【００３３】
【発明の概要】
本発明は、変化したＰｉ−ｔａ抵抗性ポリペプチドをコードする核酸配列またはその部分配列を含む単離された核酸断片であって、上記ポリペプチドが、病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を与える単一アミノ酸変化を９１８位に有する、単離された核酸断片に関する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、Ｍ、Ｃ、Ｉ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、ＬおよびＱからなる群から選択される、９１８位における変化に関する。
【００３５】
また別の態様では、本発明は、本発明の核酸断片を含むキメラ遺伝子に関する。
【００３６】
本明細書に記載のキメラ遺伝子をゲノム内に含む植物、ならびにこのような植物から得られる種子もやはり該当する。
【００３７】
またさらなる態様では、本発明は、植物中の病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対して、植物における抵抗性遺伝子仲介防御応答を与える方法であって、
（ａ）本発明のキメラ遺伝子で植物を形質転換するステップと；
（ｂ）病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対して抵抗力がある、ステップ（ａ）の形質転換植物を選択するステップと、
を含む、方法に関する。
【００３８】
【生物学的寄託】
真菌菌株Ｏ−１３７（１９８５年に、杭州のＣｈｉｎａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｉｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで収集）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  タイプ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９に寄託されており、以下の名称、受入番号および寄託日を有する。真菌菌株Ｇ−２１３は、日本でＤｉｇｉｔａｒｉａ  ｓｍｕｔｓｉｉから単離された病原体であり、Ｊｅａｎ  Ｌｏｕｐ  Ｎｏｔｔｅｇｈｅｍ，Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅｓ  Ｔｒｏｐｉｃａｌｅｓ  ｄｅｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｖｉｖｒｉｅｒｅｓ，Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｅｎ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ  ｐｏｕｒ  ｌｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｐｅｍｅｎｔ（ＣＩＲＡＤ），ＢＰ  ５０３５，３４０３２  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  Ｃｅｄｅｘ  １，Ｆｒａｎｃｅのコレクションから得られ、また、ＪＰ３４の名称で入手できた。やはりＪｅａｎ  Ｌｏｕｐ  Ｎｏｔｔｅｇｈｅｍから得たイネ病原体菌株Ｇ−１９８は、もともとはタイでオオムギから単離された。やはりＪｅａｎ  Ｌｏｕｐ  Ｎｏｔｔｅｇｈｅｍから得たイネ病原体菌株ＧＵＹ１１は、Ｌｅｕｎｇら（１９８８）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ７８，１２２７−１２３３に記載されている。イネ病原体菌株Ｉｎａ  ７２は、Ｋｉｙｏｓａｗａ（１９７６）ＳＡＢＲＡＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：５３−６７に記載されている。全ての菌株がＡＴＣＣに寄託されている。
【００３９】
実施例６に記載のＰｉ−ｔａプロモーター、Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ、リンカー配列およびＩｎ２−１ターミネーター配列の配列を有するプラスミドｐＣＢ２０２２は、同様に、ＡＴＣＣに寄託されている。
【００４０】
【表３】
2005502303.tif 000005
【００４１】
【配列リスト】
配列番号：１に、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｏ−１３７からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ヌクレオチド１〜６７６、１８８０〜４１１９）、ＡＶＲ−Ｐｉｔａプロモーター（ヌクレオチド６７７〜１１５７）およびＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ（ヌクレオチド１１５８〜１８２９）の配列を含有する４１１９ｂｐのプラスミドである、プラスミドｐＣＢ９８０の配列を記載する。
配列番号：２は、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｏ−１３７からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡの６７２ヌクレオチド配列である。
配列番号：３は、配列番号：２に記載されているＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の予想されるアミノ酸配列である。
配列番号：４は、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｇ−１９８からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡの７８８ヌクレオチド配列である。
配列番号：５は、配列番号：４に記載されているＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の予想されるアミノ酸配列である。
配列番号：６は、配列番号：５９に記載されているゲノム配列に基づいて予想される、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株ＧＵＹ  １１からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡの６７２ヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号：７は、配列番号：６に記載されているＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の予想されるアミノ酸配列である。
配列番号：８は、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｉｎａ  ７２からのＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムクローンの８８４ヌクレオチド配列である。
配列番号：９は、配列番号：８に記載されているゲノム配列に基づいて予想される、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｉｎａ  ７２からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡの６７５ヌクレオチド配列である。
配列番号：１０は、配列番号：９に記載されている予想されるＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質（Ｉｎａ  ７２．１）の予想されるアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｉｎａ  ７２からの第２のＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムクローンの８８４ヌクレオチド配列である。
配列番号：１２は、配列番号：１１に記載されているゲノム配列に基づいて予想される、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｉｎａ  ７２からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡの６７５ヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列番号：１３は、配列番号：１２に記載されている予想されるＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質（Ｉｎａ  ７２．２）の予想されるアミノ酸配列である。
配列番号：１４は、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｇ−２１３からのＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムクローンの８８４ヌクレオチド配列である。
配列番号：１５は、配列番号：１４に記載されているゲノム配列に基づいて予想される、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｇ−２１３からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡの６７５ヌクレオチド配列である。
配列番号：１６は、配列番号：１５に記載されている予想されるＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の予想されるアミノ酸配列である。
配列番号：１７および１８は、菌株Ｏ−１３７からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、ならびに菌株Ｇ−１９８およびＧＵＹ１１からのＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムの核酸断片を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーである。
配列番号：１９および２０は、菌株Ｏ−１３７からの機能的ＡＶＲ−Ｐｉｔａプロモーター断片を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーである。
【００４４】
配列番号：２１は、菌株Ｉｎａ  ７２からのＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムの核酸断片を増幅するために、配列番号：１８と一緒に使用されるＰＣＲプライマーである。
配列番号：２２および２３は、菌株Ｇ−２１３からのＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムの核酸断片を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーである。
配列番号：２４および２５は、ｐＡＶＲ３を構築する過程でＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーである。
配列番号：２６および２７は、推定上の成熟プロテアーゼを直接コードするＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片であるＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーである。
配列番号：２８および２９は、菌株Ｇ−１９８からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡを増幅するために使用されるＰＣＲプライマーである。
配列番号：３０および３１は、部分的Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡを増幅するために使用されるＰＣＲプライマーである。
配列番号：３２は、感受性Ｃ１０１Ａ５１イネからの感受性Ｐｉ−ｔａ核酸断片を増幅するために配列番号：３０と一緒に使用されるＰＣＲプライマーである。
【００４５】
配列番号：３３〜５１は、Ｐｉ−ｔａコード配列を修飾し、結果として９１８位に表示される全２０種のアミノ酸を有する異なるＰｉ−ｔａタンパク質をコードする核酸断片を含むプラスミドのアレイを生じる、ＰＣＲプライマーである。
配列番号：５２および５３は、Ｐｉ−ｔａロイシンリッチドメイン（ＬＲＤ）を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーである。
配列番号：５４および５５は、Ｉｎ２−１ターミネーター配列を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーである。
配列番号：５６は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ変種Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉからのＰｉ−ｔａ遺伝子のゲノムクローンの５７５７ヌクレオチド配列である。
配列番号：５７は、イネ変種Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉからの、自然のＰｉ−ｔａプロモーターの２４２５ｂｐ（ヌクレオチド１〜２４２５）およびＰｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ（ヌクレオチド２４２６〜５２１１）を含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の５２２２ヌクレオチド配列である。
配列番号：５８は、配列番号：５６および５７に記載されているＰｉ−ｔａヌクレオチド配列によってコードされる予想されるＰｉ−ｔａタンパク質配列である。
配列番号：５９は、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株ＧＵＹ１１からのＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムクローンの８８１ヌクレオチド配列である。
配列番号：６０に、配列Ｐｉ−ｔａプロモーター（ヌクレオチド１〜２４２４）、Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ（ヌクレオチド２４２５〜５２１０）、リンカー配列（ヌクレオチド５２１１〜５２４１）およびＩｎ２−１ターミネーター配列（ヌクレオチド５２４２〜５６９０を含有するプラスミドｐＣＢ２０２２中の挿入物の配列を記載する。
【００４６】
【発明の説明】
この開示との関連で、多数の用語が使用される。
【００４７】
用語「病害抵抗性遺伝子」は、植物細胞または植物組織で、防御応答を誘発することができるポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。用語「病害抵抗性遺伝子」、「抵抗性（Ｒ）遺伝子」および「Ｒ」遺伝子は、互換的に本明細書で使用される。防御応答に起因する抵抗性は、幾つかの形態をとることができる。たとえば、遺伝的背景によっては、抵抗性は接種された植物組織上で目に見える症状がない形態をとることもあり、また他の遺伝的背景では、抵抗性は、真菌が胞子を形成せず、従って感染を再開しない、小さい褐色のスポットを含むこともある。いずれにしても、真菌病原体はその生活環を完結せず、病害の発生が阻止される。場合によっては、病害抵抗性は、完全な病害に特有の多数の真菌胞子を産生しない、より小さいサイズの病変の形態をとることもある。
【００４８】
「防御応答」は、病原菌または病原体の存在と闘うために、宿主、たとえば、植物によっても引き起こされる、特異的な防御的反応である。
【００４９】
「Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子」は、植物細胞または植物組織において、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ等の真菌病原体に対する防御応答を誘発することができるＰｉ−ｔａ抵抗性ポリペプチドをコードする病害抵抗性遺伝子である。
【００５０】
用語「Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答」は、Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子によってコードされ、且つ真菌病原体の存在によって誘発される、ポリペプチドの産生に起因する防御応答を意味する。用語「抵抗性遺伝子仲介防御応答」は、抵抗性遺伝子によってコードされ、且つ真菌病原体または真菌病原体誘発物の存在によって誘発されるポリペプチドの産生に起因する防御応答を意味する。
【００５１】
「真菌病原体誘発物」は、抵抗性遺伝子産物によって直接または間接的に認識される病原体シグナル分子である。
【００５２】
「病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子」は、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉ等の、機能的Ｐｉ−ｔａ抵抗性タンパク質（本明細書に記載のＡ９１８；配列番号：５８）を発現するイネにおいて通常はＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を誘発しない遺伝子産物を産生する、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子の変異形である。本明細書に記載のＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｇ−１９８に由来するａｖｒ−ｐｉｔａ遺伝子は、病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子の１例である。
【００５３】
「非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子」は、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉ等の、機能的Ｐｉ−ｔａ抵抗性タンパク質（本明細書に記載のＡ９１８；配列番号：５８）を発現するイネにおいて、通常、Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を誘発する遺伝子産物を産生する、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子の変異形である。本明細書に記載のＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｏ−１３７に由来するＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子は、非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子の１例である。
【００５４】
「ＡＶＲ−Ｐｉｔａ単離された核酸断片」は、病原体から単離された核酸断片であって、Ｐｉ−ｔａ抵抗性タンパク質との直接的または間接的相互作用がＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を誘発する原因である、ポリペプチドをコードすることを特徴とする核酸断片である。
【００５５】
「単離された核酸断片」は、合成の、非天然の、または変化した、ヌクレオチド塩基を任意に含有する、一本鎖または二本鎖の、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたはそれ以上のセグメントを含んでもよい。
【００５６】
用語「機能的に等価である細断片」、「機能的に等価の細断片」、「機能的に等価の部分配列」および「部分配列」は、互換的に本明細書で使用される。これらの用語は、断片または細断片が活性な酵素をコードしてもしなくても、遺伝子発現を変えるかまたはある一定の表現型を生じさせる能力が保持される、単離された核酸断片の一部または部分配列を指す。たとえば、形質転換植物で所望の表現型を生じさせるためのキメラ遺伝子のデザインに、上記断片または細断片を使用することができる。核酸断片またはその細断片が活性な酵素をコードしてもしなくても、植物プロモーター配列を基準にして適切な方向に、この核酸断片またはその細断片を連結することによって、同時抑制またはアンチセンスで使用するためのキメラ遺伝子をデザインすることができる。
【００５７】
本明細書で使用される用語「実質的に類似した」および「実質的に一致する」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、核酸断片が遺伝子発現を仲介する能力、またはある表現型を生じさせる能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。これらの用語は、本発明の核酸断片の修飾、たとえば、最初の、未修飾断片に比べて、結果として得られる核酸断片の機能特性を実質的に変えない、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失または挿入も指す。従って、当業者には分かるであろうが、本発明は、具体的な代表的配列より多くを含むと理解される。
【００５８】
さらに、本発明によって包含される実質的に類似した核酸配列はまた、それらが、中程度にストリンジェントな条件（たとえば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）で、本明細書に例示の配列と、または本明細書に報告され且つ本発明のプロモーターと機能的に等価であるヌクレオチド配列の任意の部分に、ハイブリダイズする能力によっても規定されることが、当業者には分かる。本発明によって包含される好ましい実質的に類似した核酸配列は、本明細書に報告されている核酸断片と８０％一致するか、または本明細書に報告されているヌクレオチド配列の任意の部分と８０％一致する配列である。さらに好ましいのは、本明細書に報告されている核酸配列と９０％一致するか、または本明細書に報告されているヌクレオチド配列の任意の部分と９０％一致する核酸断片である。最も好ましいのは、本明細書に報告されている核酸配列と９５％一致するか、または本明細書に報告されているヌクレオチド配列の任意の部分と９５％一致する核酸断片である。配列アラインメントおよび％類似性の計算値は、ＬＡＳＡＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算セット（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して決定することが可能である。Ｃｌｕｓｔａｌのアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）とデフォルトパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を使用して、配列のマルチプルアラインメントを実施する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用した、タンパク質配列の、ペアをなすアラインメントおよび％同一性の計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメーターは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、当業者による配列の手作業の評価か、またはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）およびＧａｐｐｅｄ  Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）等のアルゴリズムを使用したコンピューター自動化配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定できるほど十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
「遺伝子」は、コード配列の前の制御配列（５′非コード配列）および後の制御配列（３′非コード配列）を含む、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ等の（しかしこの限りではない）、機能的ＲＮＡ転写物を発現する核酸断片を指す。「自然の遺伝子」は、自然状態で、それ自身の制御配列と共に存在する遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然状態では一緒に存在しない少なくとも１つの制御配列およびコード配列を含む、自然の遺伝子ではない遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来する制御配列およびコード配列を含んでもよく、または同一のソースに由来する制御配列およびコード配列を含んでもよいが、自然状態で見られるものと異なる方式で配置されている。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムの、その自然の位置にある、自然の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物に通常は存在しないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非自然の生物に挿入された自然の遺伝子、すなわちキメラ遺伝子を含んでもよい。「導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００６０】
「コード配列」は、ＲＮＡ転写物に相当する暗号であるＤＮＡ配列を指し、ポリペプチドをコードする遺伝子の場合には、具体的なアミノ酸配列を指す。「制御配列」は、コード配列の上流（５′非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３′非コード配列）に位置し、且つ転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連したコード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。このような配列は、自然の配列であってもよく、非自然の配列であってもよい。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含んでもよいが、その限りではない。
【００６１】
「病原体」は、生存可能な植物組織の細胞の周囲または内部が感染することにより、病害応答を誘発する生物または病原菌を指す。
【００６２】
「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、しばしばエンハンサーと呼ばれる。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、また、プロモーターの生来のエレメントであってもよく、プロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。プロモーターは、全体として自然の遺伝子に由来してもよく、または自然状態で存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されてもよく、または合成のＤＮＡセグメントさえ含んでもよい。当業者には、異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または発生の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令できることが分かる。ほとんどの細胞型において、ほとんどの時に、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞で有用な様々なタイプの新しいプロモーターが絶えず発見されており、Ｏｋａｍｕｒｏ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ  １５：１−８２による編纂物に多数の例が見られる。ほとんどの場合に、制御配列の正確な境界が完全に明確にされていないため、一部の異形のＤＮＡ断片が全く同じプロモーター活性を有する可能性があることが、さらに理解される。
【００６３】
「イントロン」は、タンパク質配列の一部をコードしない遺伝子における介在配列である。従って、このような配列は、ＲＮＡに転写されるが、次には切除され、翻訳されない。この用語は、切除されたＲＮＡ配列にも使用される。「エキソン」は、転写される遺伝子の配列の一部であり、その遺伝子に由来する成熟メッセンジャーＲＮＡに存在するが、必ずしも、最終的な遺伝子産物をコードする配列の一部ではない。
【００６４】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するＤＮＡ配列を指す。この翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の、完全にプロセッシングされたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物からｍＲＮＡへのプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を及ぼす可能性がある。翻訳リーダー配列の例は記述されている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５）。
【００６５】
「３′非コード配列」は、コード配列の下流に位置し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる制御シグナルをコードする他の配列を含む、ＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３′末端への、ポリアデニル酸路の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。異なる３′非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：６７１−６８０により例示されている。
【００６６】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写に起因する産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるとき、このＲＮＡ転写物は一次転写物と呼ばれ、またはＲＮＡ転写物は一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、且つ酵素逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは１本鎖であってもよく、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を使用して、二本鎖形に転換することもできる。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、従って、細胞内またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳されるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、且つ標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分とであってもよく、すなわち、５′非コード配列、３′非コード配列、イントロン、またはコード配列であってもよい。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されなくてもよいが、それにもかかわらず細胞プロセッシングに対して影響を有する他のＲＮＡを指す。
【００６７】
用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方の影響を受けるという、１つの核酸断片に対する核酸配列の関連を指す。たとえば、プロモーターが、コード配列の発現に影響を及ぼすことができるとき、このプロモーターは、コード配列と作動可能に連結されている（すなわち、このコード配列は、プロモーターの転写調節下にある）。コード配列は、少なくとも１つの制御配列に、センスまたはアンチセンス配向で作動可能に連結することができる。
【００６８】
本明細書で使用される用語「発現」は、機能的最終生成物の産生を指す。遺伝子の発現または過剰発現は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳を含む。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、正常の生物または非形質転換生物における産生レベルを超える、トランスジェニック生物における遺伝子産物の産生を指す。「同時抑制」は、同一のまたは実質的に類似した、外来遺伝子または内因性遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００６９】
「変化した発現」は、野生型生物由来の同等の組織（器官および発生型のもの）における、その活性と有意に異なる量または比率での、トランスジェニック生物における遺伝子産物の産生を指す。
【００７０】
「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセッシングされたポリペプチド、すなわち、一次翻訳産物に存在する任意のプレペプチドまたはプロぺプチドが除去されているものを指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物、すなわち、プレペプチドまたはプロぺプチドが未だ存在する一次産物を指す。プレペプチドまたはプロぺプチドは、細胞内局在シグナルであってもよいが、この限りではない。
【００７１】
「葉緑体輸送ペプチド」は、あるタンパク質と併せて翻訳され、そのタンパク質を、葉緑体またはこのタンパク質が製造される細胞内に存在する他の色素体型に誘導するアミノ酸配列である。「葉緑体輸送配列」は、葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。「シグナルペプチド」は、あるタンパク質と併せて翻訳され、このタンパク質を分泌系に誘導するアミノ酸配列である（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｊ．Ｊ．，（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３）。このタンパク質を液胞に誘導するのであれば、液胞ターゲティングシグナル（上掲）をさらに付加してもよく、また小胞体に誘導するのであれば、小胞体滞留シグナル（上掲）を付加してもよい。このタンパク質を核に誘導するのであれば、存在するあらゆるシグナルペプチドを除去し、代わりに核局在化シグナルを含めるべきである（Ｒａｉｋｈｅｌ（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２）。
【００７２】
「形質転換」は、結果として遺伝学的に安定な遺伝を招来する、核酸断片の、宿主生物のゲノムへの移行を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」生物と呼ばれる。イネ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の好ましい細胞形質転換方法は、粒子加速すなわち「遺伝子銃」形質転換技術の使用（Ｋｌｅｉｎら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号）、または導入遺伝子を含有する適切なＴｉプラスミドを使用したアグロバクテリウム仲介方法（Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ．ら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）である。
【００７３】
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、またＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（以後、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）により完全に記載されている。
【００７４】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の反復サイクルからなる、大量の特定のＤＮＡセグメントを合成する技術である（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。一般に、二本鎖ＤＮＡを加熱変性させ、標的セグメントの３′境界域に相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングし、次いで、中間の温度で伸長させる。これらの連続３ステップ１組が１サイクルを構成する。
【００７５】
本明細書で使用される「発現構築物」は、本明細書で論ずる通り、単独でまたは互いに組み合わせて使用される、本発明の単離された核酸断片のいずれかを含み、また、さらに、ベクターまたはその細断片と併せて使用することが可能である。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知の通り、宿主植物を形質転換するのに使用される方法によって異なる。たとえば、プラスミドベクターを使用することができる。熟練した技術者は、本発明の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、増殖させるために、ベクター上に存在しなければならない遺伝因子を十分知っている。異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよび異なるパターンの発現をもたらす結果となり（Ｊｏｎｅｓら、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、従って、所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためには、多数の事象をスクリーニングしなければならないことも、熟練した技術者には分かる。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析によって行うことが可能である。用語「発現構築物」と「組換え発現構築物」は、互換的に本明細書で使用される。
【００７６】
クローン化Ｒ−遺伝子を使用して、病原体に抵抗する農産物植物の構築を容易にすることができる。特に、古典的な育種技術によって移入される遺伝子に随伴する連結されたゲノム配列なしで、多数の単一遺伝子を農学的生殖質に組み入れるために、形質転換技術を使用することができる。また、古典的育種では、植物種間で、病害抵抗性遺伝子を移入できないことを克服するために、クローン化Ｒ−遺伝子を使用することもできる。
【００７７】
本発明は、変化したＰｉ−ｔａ抵抗性ポリペプチドをコードする核酸配列またはその部分配列を含み、上記ポリペプチドが、病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を与える単一アミノ酸変化を９１８位に有する、単離された核酸断片に関する。別の態様では、本発明は、イネにおいて、真菌Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａによって引き起こされる、イネイモチ病病害の防除に有用な単離された核酸断片を提供する。
【００７８】
以下で論ずる通り、Ｍ．ｇｒｉｓｅａの他の亜集団は、イネにおいて、Ｐｉ−ｔａ特異的防御応答を誘発する菌株に含まれるものに相同なＡＶＲ−遺伝子を有する。Ｐｉ−ｔａ−抵抗性遺伝子仲介防御応答を誘発するＡＶＲ−遺伝子が、亜集団Ｉ内のＭ．ｇｒｉｓｅａイネ病原体、亜集団ＩＩ内のＤｉｇｉｔａｒｉａ病原体、および亜集団ＩＩＩ内のＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ病原体に存在し得ることを証明することによって、この真菌に感染されるイネ科草本のような宿主範囲で、Ｍ．ｇｒｉｓｅａを防除する際に、この遺伝子が広く有用なことが裏付けられる。
【００７９】
従って、本発明の単離された核酸断片は、病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌によって引き起こされる病害の防除に有用であると考えられる。たとえば、本発明は、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、フィンガーミレット、モロコシ、およびパールミレットを含むがその限りではない他の穀類農作物で、Ｍ．ｇｒｉｓｅａによって引き起こされる病害の防除に有用である。
【００８０】
あるいは、一部の病原性ａｖｒ−ｐｉｔａ対立遺伝子は、非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａタンパク質に実質的に類似したタンパク質（たとえば、Ｇ−１９８の場合、配列番号：５、およびＩｎａ  ７２．２の場合、配列番号：１３）をコードし、なおかつＰｉ−ｔａ仲介抵抗性応答を誘発することができない。その最も極端な形態では、自然突然変異かまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発のいずれかによって導入された単一アミノ酸置換が、ＡＶＲ−ＰｉｔａがＰｉ−ｔａ−抵抗性遺伝子仲介防御応答を誘発する能力を排除する。
【００８１】
ＰＷＬ２  遺伝子（スズメガヤで、宿主種特異性を調節するＡＶＲ−遺伝子）を同定した遺伝的交雑（交雑種４３６０）（Ｓｗｅｉｇａｒｄら、１９９５，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１）で、イネ病原体がイネ変種Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉに感染する能力を決定するさらなる真菌遺伝子が分離された。この第２のＡＶＲ−遺伝子、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ（以前は、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉにちなんで、ＡＶＲ２−ＹＡＭＯと呼ばれていた）は、親菌株４２２４−７−８から受け継がれ、また中国の野外株Ｏ−１３７（１９８５年に杭州にあるＣｈｉｎａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｉｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで採集）に由来するものであった。交雑種４３６０に由来する完全な四分子５個のそれぞれで、子嚢胞子子孫８個のうち４個は、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉに感染することができ、その他は感染することができなかった。交雑種４３６０および後続の交雑種の無作為胞子分析で、ＡＶＲ−Ｐｉｔａの分離が確認された。交雑種４３６０からの非病原性子孫は、頻繁に、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉ上に完全に病原性の病斑を若干生じさせる。これらの希少な病斑は、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子座で起こる自然突然変異に起因する可能性があると推測された。Ｓｗｅｉｇａｒｄら（１９９５，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１）に記載の通り、ＡＶＲ−Ｐｉｔａの機能を喪失した突然変異体が単離された。Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉに対して完全に病原性であったこれらの突然変異体は、推定的な親の形態学的特性および稔性特性ならびにＭＧＲ５８６  ＤＮＡ  フィンガープリントプロフィールを保持していた。他のＲ−遺伝子を有するイネ変種に対する突然変異体の宿主特異性は変化していなかった。
【００８２】
Ｍ．ｇｒｉｓｅａのように主に半数体真菌で、遺伝子の優性を評価することは容易ではないが、遺伝子対遺伝子仮説によって予測される通り、病原性突然変異体の発生から、このＡＶＲ遺伝子の発現形は、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉの感染を止める機能を果たすことが示唆される。ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子の遺伝的不安定性は、そのクローニングに役立った。ＡＶＲ−遺伝子は、交雑種４３６０から作製されたＭ．ｇｒｉｓｅａ  ＲＦＬＰ地図における関連群の末端の、末端小粒反復配列を含む物理的マーカーの一群と同時分離することが確認された（Ｓｗｅｉｇａｒｄら、１９９３，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｐｓ，Ｓ．Ｊ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ  ３．１１２−３．１１７）。Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉイネに対して病原性になっていた自然突然変異体は、非病原性遺伝子と共にマッピングされた末端小粒の制限断片の構造変化を示し、この遺伝子が、染色体の先端部の１〜２ｋｂ以内にあることが示唆された（Ｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｕｍｌｅｙ，１９９４，Ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｚｅｉｇｌｅｒ、ＬｅｏｎｇおよびＴｅｎｇ編、ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ）。野生型非病原性菌株、および獲得欠失を染色体末尾に有していた自然突然変異体からのゲノムＤＮＡのサザン分析で、様々な制限酵素を用いたゲノムＤＮＡの消化によって生じる末端染色体断片のサイズが確認された。この分析から、ＡＶＲ−遺伝子が、染色体末尾に対応する、末端小粒の６．５ｋｂ  ＢｇｌＩＩ断片内にあることが示唆された。対応する末端小粒断片のクローニングで、イネ品種Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉの病原性病原体を、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉに対して非病原性の菌株に形質転換する機能を果たす、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子を末端小粒断片が実際に含むことが証明できた。
【００８３】
中国のイネ病原体Ｏ−１３７から単離されたＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片は、アミノ酸２２３個を有するタンパク質をコードする（配列番号：３）。中性亜鉛型メタロプロテイナーゼの特徴的なモチーフからのアミノ酸１７３〜１８２、およびこのモチーフ残基の偶発突然変異またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異は、ＡＶＲ−遺伝子活性を破壊する、すなわち、イネ変種Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉで、ＡＶＲ−遺伝子は、もはや病原体の病原性菌株を非病原性に形質転換しない（Ｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｕｍｌｅｙ，１９９４，Ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ｂｌａｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｚｅｉｇｌｅｒ編、Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｎｇ，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ）。予想されるアミノ酸配列は、真菌（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ３７５２４およびＳ１６５４７）から特徴づけられる他のメタロプロテイナーゼと、低レベルの相同性を有する。最高に特性決定された、分泌真菌メタロプロテイナーゼであるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＮｐＩＩは、１７７アミノ酸の成熟領域に先行する１７５アミノ酸のプレプロ領域を含む（Ｔａｔｓｕｍｉら、１９９１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：９７−１０３）。予想されるＡＶＲ−Ｐｉｔａアミノ酸配列は、ＮｐＩＩと３５％の相同性および２９％の同一性を示し、最も顕著な相同性は、ＮｐＩＩの成熟１７７アミノ酸形に限定される。加えて、ＡＶＲ−ＰｉｔａおよびＮｐＩＩのアミノ酸配列アラインメントは、成熟ＮｐＩＩタンパク質におけるジスルフィド結合に関与するシステインの保存を示した。ＡＶＲ−Ｐｉｔａ単離された核酸断片は、１７６アミノ酸を含有する成熟メタロプロテイナーゼにプロセッシングされるプレプロタンパク質をコードすると予想された。この予想に基づいて、機能的分析のために、推定上の成熟プロテアーゼを直接産生するＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６発現構築物を操作した。
【００８４】
機能的ＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片は、イネ以外の宿主植物に感染するＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株からクローン化されており、また、亜集団ＩＩＩからのＤｉｇｉｔａｒｉａ病原体（ＪＰ３４、Ｇ−２１３としても知られる、日本で単離された）、および亜集団ＩＶからのＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ病原体（ＢＦ１７、ブルキナファソで単離された）を含む、亜集団Ｉａにおけるイネ病原体と遠縁である。Ｄｉｇｉｔａｒｉａ  病原体（配列番号：１４）からクローン化されたＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片は、翻訳されたアミノ酸配列（配列番号：１６）に相当し、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  大学コンピューターグループパッケージ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １２：３８７−３９５）のＢｅｓｔｆｉｔアルゴリズムで比較したとき、Ｏ−１３７  ＡＶＲ−Ｐｉｔａアミノ酸配列と８７．９％の類似性および８４．７％の同一性を有する。Ｇ−２１３  ＡＶＲ−Ｐｉｔａ（非病原性）核酸断片は、病原性イネ病原体を、Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を誘発する非病原性菌株に形質転換する能力を保持する、同定された最も多岐にわたる配列を有する。異なるイネ科草本種に感染するＡＶＲ−遺伝子機能が、遠縁のＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株間で保存されることから、クローン化Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子は、その、イネ以外の他の宿主植物でも、イモチ病真菌の防除に有効なことが示唆される。本発明は、変化したＰｉ−ｔａ抵抗性ポリペプチドをコードする核酸配列またはその部分配列を含み、上記ポリペプチドが、病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を与える単一アミノ酸変化を９１８位に有する、単離された核酸断片に関する。
【００８５】
より具体的には、９１８位における単一アミノ酸変化は、メチオニン、システイン、イソロイシン、アルギニン、リシン、アスパラギン、ロイシン、およびグルタミン（Ｍ、Ｃ、Ｉ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｌ、およびＱ）からなる群から選択されてもよいことが分かっている。以下の実施例に示す通り、Ｐｉ−ｔａ抵抗性タンパク質の感受性形および抵抗性形の、この単一アミノ酸変化は、認識特異性と関連がある。
【００８６】
９１８位におけるアミノ酸の変化により、現在はＲ−遺伝子が同定されていない、病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子を認識する突然変異体Ｐｉ−ｔａ遺伝子を作ることが可能になる。明らかに、そうできることによって、イネイモチ病真菌および他の病原体の病原性菌株を容易に防除するための、価値ある道具が実現される。
【００８７】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された、本明細書に記載の単離された核酸断片を含むキメラ遺伝子に関する。このようなキメラ遺伝子で形質転換された植物、およびこのような植物から得られる種子にもやはり該当する。
【００８８】
病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を開始することができる本発明のトランスジェニック植物は、上述の通り、当業者に周知の技術を使用して作ることができる。植物への導入遺伝子の導入、すなわち、形質転換は、当業者に周知である。好ましい植物細胞形質転換方法は、粒子加速すなわち「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号）の使用である。このような導入遺伝子で形質転換することができる植物の例として、単子葉植物が挙げられるが、この限りではない。好ましくは、この単子葉植物は穀類である。最も好ましくは、この単子葉植物は、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、フィンガーミレット、モロコシ、またはパールミレットである。
【００８９】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）本発明のキメラ遺伝子で植物を形質転換するステップと、（ｂ）病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含むに対して抵抗力がある、ステップ（ａ）の形質転換植物を選択するステップとを含む真菌、植物における病原性および／または非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をゲノム内に含む真菌に対して、植物における抵抗性遺伝子仲介防御応答を与える方法に関する。
【００９０】
【実施例】
本発明を、以下の実施例でさらに明確にする。上の論考およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確実にすることができ、また、本発明を様々な用途および条件に適合させるために、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修飾を行うことができる。
【００９１】
特に記載がなければ、全ての部およびパーセンテージは重量基準であり、度はセ氏である。分子生物学における技術は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載の通りに実施した。
【００９２】
場合によっては、アミノ酸を、文献で広く使用されるそれらの１文字表示によって示す。たとえばＡ９１８は、アラニン（Ａ）が、そのタンパク質のアミノ酸配列の９１８位にあることを示す。
【００９３】
実施例１
対応するＲ−遺伝子を同定するための病原体菌株開発
宿主抵抗性遺伝子を同定するためには、病原体の非病原性単離菌が必要であり、新しい病原体菌株を使用することによって、これまでは検出を逃れていた抵抗性遺伝子を同定することが可能である。ある特定のＲ−遺伝子を有するイネ変種に対して病原性を示す２つの真菌菌株（すなわち、これらの真菌菌株はＲ−遺伝子仲介防御応答を誘発することができない）は、対応する機能的ＡＶＲ−遺伝子を欠くと考えられる。しかし、対応するＡＶＲ−遺伝子を有する真菌の非病原性菌株は、宿主抵抗性遺伝子を同定するのに必要ではあるが、２つの菌株が、ある特定のイネ変種に対して非病原性であるとき、これらの菌株は、同一のＡＶＲ−遺伝子を有する可能性もあり、異なるＲ−遺伝子仲介防御応答を誘発する異なるＡＶＲ−遺伝子を有する可能性もある。新しいまたは特性決定されていない真菌菌株を使用することにより、これまでに同定されていないＲ−遺伝子を同定する可能性がある。ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子のソースである、Ｏ−１３７等の野外株イネ病原体を用いて研究するとき、この注意は、特に必要である。加えて、イネイモチ病感染アッセイは、特にイネ変種がイモチ病に対してかなりのレベルの全般的抵抗性を有する場合、または使用される病原体が、病原性および形態特性が不安定な場合、環境条件に敏感なことで悪名が高い。従って、十分に特性決定された病原体菌株の使用が成功するカギである。
【００９４】
ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子を分離する遺伝子集団を含む、多数の病原体供給源は、Ｐｉ−ｔａ遺伝子のクローニングを容易にした。４３６０−Ｒ−１７、４３６０−Ｒ−２７、４３６０−Ｒ−３０、および後続世代菌株４３７５−Ｒ−２６等の子孫菌株（Ｓｗｅｉｇａｒｄら、１９９５，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１−１２３３）は、これらの研究向けに改良された特性を有していた。これらの実験におけるイネ交雑種は、分離する少なくとも２つのＲ−遺伝子、Ｐｉ−ｔａおよびＰｉ−ｋｍを有していたため、また病原体交雑種４３６０が既知の両Ｒ−遺伝子に対応するＡＶＲ−遺伝子を分離していたため、１つのＡＶＲ−遺伝子を担持する遺伝学的に特性決定された病原体菌株を得る必要があった。このような菌株は、個々のＲ−遺伝子／ＡＶＲ遺伝子相互作用が病斑発生に及ぼす作用を確認するために必要であった。マッピング集団内のイネ子孫の間で、抵抗性表現型の採点の正確さを確実にするために、抵抗性の相互作用と感受性の相互作用との間の表現型の違いを最大化する必要もあった。ＡＶＲ−Ｐｉｔａを含むが、ＡＶＲ１−ＴＳＵＹを含まない交雑種４３６０から２８の子孫菌株を得た。ＡＶＲ１−ＴＳＵＹは、ジャポニカ変種Ｔｓｕｙｕａｋｅにおける、イモチ病抵抗性遺伝子Ｐｉ−ｋｍに相当するＡＶＲ−遺伝子と考えられる（Ｙａｍａｄａら（１９７６）Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ  ４２：２１６−２１９）。これらの２８子孫を、１つの親イネ変種で十分に敏感な病害症状（タイプ４〜タイプ５病斑）を引き起こす安定した能力、および他のイネ変種で、代表的な抵抗性応答（タイプ０〜タイプ１病斑）を引き起こす安定した能力についてスクリーニングした（Ｖａｌｅｎｔら、１９９１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７）。Ｍ．ｇｒｉｓｅａ単離株４３６０−Ｒ−６２を、ＡＶＲ−Ｐｉｔａのみを含む試験菌株として選択した。スクリーニングしたさらに９菌株の中から、４３６０−Ｒ−６７を、ＡＶＲ１−ＴＳＵＹのみを含む優れた病原体として選択した。
【００９５】
加えて、ＡＶＲ−遺伝子機能を失ってしまった突然変異体は、突然変異体の起源である親菌株と比較するのに有用である。たとえば、菌株ＣＰ９８７（Ｓｗｅｉｇａｒｄら（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１−１２３３）は、自発的病原性突然変異体の単離によって、菌株４３６０−Ｒ−１７から誘導された。ＣＰ９８７中のＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子は、小さい欠失によって失活した。病原性突然変異体は、非病原性野外株、またはＳｗｅｉｇａｒｄら（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１−１２３３に記載の実験用菌株から、容易に得ることができる。病原体形質変化の反対方向では、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉに対して病原性である野外株Ｇｕｙ１１（Ｙａｍａｄａら（１９７６）Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ  ４２：２１６−２１９）は、クローン化ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子で形質転換して、菌株ＣＰ３２８５を生じさせたとき、この宿主に対して非病原性になった。Ｓｗｅｉｇａｒｄら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１に記載の通り、イネイモチ病系における真菌の形質転換は日常的である。
【００９６】
実施例２
植物感染および評価
既述（Ｖａｌｅｎｔら、１９９１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７）の通り、感染アッセイを実施した。無菌の０．２５％ゼラチン溶液で洗浄することにより、オートミール寒天プレートで成長させた培養物から、分生子を採集した。各イネ変種からの個体５〜６個を、グロースチャンバ内のプラスチック製鉢内のＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ（登録商標）鉢植え用培地に播種した。植物を、１４時間照明の日周期、２８℃および相対湿度７０〜８５％で成長させた。夜間条件は、２２℃および相対湿度８５％であった。病原体進入に必要な相対湿度９５〜１００％を維持するために、２週齢の植物を含む鉢をプラスチックバッグの中に入れ、実施例１に記載の４３６０−Ｒ−６２または４３６０−Ｒ−６７等（しかし、これらに限定されない）の病原体菌株を接種した。美術家用のエアブラシ（Ｐａｓｈａ、サイズ１）を使用して、１ｍｌ当たり２．５×１０５分生子を含有する懸濁液４ｍｌを植物に噴霧した。次いで、接種された植物が入っているプラスチックバッグをビニルタイで閉じ、室温にて２４時間、微光条件でインキュベートした。２４時間後、この植物をバッグから取り出し、グロースチャンバ内に戻した。接種の７日後、感染型、すなわち、病斑症状を記録した。０−５の等級を使用して、感染表現型を分類した（Ｖａｌｅｎｔら、１９９１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２７：８７−１０１）。０および１の病斑型を、抵抗性として記録し、３〜５の病斑型を感受性として記録した。
【００９７】
実施例３
非病原性および病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子をコードする核酸断片の単離ＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムの核酸断片の単離
Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｏ−１３７、Ｉｎａ  ７２、ＧＵＹ１１、Ｇ−１９８およびＧ−２１３からのＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムの核酸断片は全て、３つのイントロンをＡＶＲ−Ｐｉｔａコード配列内に含むと考えられる。サザンブロット分析で、菌株Ｏ−１３７およびＧ−２１３は、１つのＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子を含有するが、ＧＵＹ１１、Ｇ−１９８およびＩｎａ  ７２は、２つのＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子を含有することが決定された。ＣａＭＶ  ３５Ｓ−Ａｄｈ１プロモーターの調節下にあるイネ葉で、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ核断片を効率よく発現させるためには、ｃＤＮＡを単離することが必要であった。Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｏ−１３７、Ｇ−２１３、ＧＵＹ１１、Ｇ−１９８およびＩｎａ  ７２からの２つから、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片がクローン化され且つ／または配列決定されており、一過性発現実験用のＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６核酸断片を作製するために、それらのいずれも使用することが可能である。
【００９８】
末端小粒断片をクローニングすることによる、菌株Ｏ−１３７からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子のクローニング
Ｏ−１３７由来の子孫菌株４２２４−７−８のＭ．ｇｒｉｓｅａ連鎖群２ｃの一端に、ＡＶＲ−Ｐｉｔａをマッピングした。（Ｓｗｅｉｇａｒｄら、１９９３．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｐｓ，第６版、Ｓ．Ｊ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３．１１２−３．１１７）。この分析で、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子は、染色体末端の末端小粒反復配列と同時分離した。末端小粒のＤＮＡ断片の同定は、定型的に実施した。下記の通り、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション以外の、制限酵素消化、ＲＮＡおよびＤＮＡゲルブロット分析には、標準プロトコールを使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ＤＮＡゲルブロット分析で六量体末端小粒反復配列を検出するために、オリゴヌクレオチド［５′−（ＡＡＣＣＣＴ）４−３′］を合成し、γ−３２Ｐ−ＡＴＰを用いたキナーゼ処理によって放射標識した。ゲノムＤＮＡを記述通りに作製し（Ｓｗｅｉｇａｒｄら、１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１−１２３３）、制限酵素で消化し、０．７％アガロースゲルで電気泳動させ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜にブロットした。末端小粒反復オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、膜を６ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔｓ、０．５％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌ  ｓｓＣＴ  ＤＮＡ中、４２℃で２時間プレハイブリダイズさせ、放射標識オリゴヌクレオチドと、４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。膜を、先ず、２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分間洗浄し、次いで、同溶液中、３０〜３４℃で１５分間洗浄した。
【００９９】
Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉに対する非病原性の喪失と相関関係があった末端小粒の制限断片のサイズが変化したことから、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子は、その連鎖末端小粒のすぐ隣に位置することが示唆された。コスミドライブラリーが染色体末端を含むとは考えられなかったため、本発明者らは、この末端小粒を特異的にクローニングすることを決定した。Ｇリッチ鎖のあらゆる３′オーバーハングを除去し、末端小粒に平滑末端を作るために、非病原性親菌株４２２４−７−８からのゲノムＤＮＡ（Ｓｗｅｉｇａｒｄら、１９９５，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１−１２３３）を、先ずＢＡＬ３１ヌクレアーゼで処理した。記述通りに、このゲノムＤＮＡを０．１２５単位／ｍｌのＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で、３０℃にて５０分間処理した（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５３：１２７−１３６）。ＤＮＡゲルブロット分析で決定するとき、こうした条件で、末端小粒の断片のサイズの目に見える減少は起こらなかった。ＡＶＲ−Ｐｉｔａを含有する６．５ｋｂのＢｇｌＩＩ末端小粒断片は、ＳａｌＩ部位を含まないという本発明者らの推論に基づいて、末端小粒断片を含むであろうゲノムＤＮＡの富化分画を作った。Ｂａｌ３１処理したＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで消化し、０．８％低融点アガロースゲルを用いた電気泳動に付し、６〜７ｋｂ断片の、ゲノムサブライブラリーの作製に使用した。７〜８ｋｂのサイズ範囲のＤＮＡ断片をゲルから溶離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶポリリンカー部位にライゲートした。末端小粒のオリゴヌクレオチドを使用して、末端小粒含有クローンについて、サブライブラリーをスクリーニングし、陽性のクローンをさらに分析した。予想される制限断片を有する、ｐＣＢ７８０と呼ばれる１つのクローンを得た。
【０１００】
Ｍ．ｇｒｉｓｅａ病原性菌株を、Ｐｉ−ｔａを含有するイネに対して非病原性に形質転換する能力によって、ｐＣＢ７８０におけるＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子を同定した。非病原性活性授与における機能に関する相補性分析のために、真菌形質転換を記述通りに実施した（Ｓｗｅｉｇａｒｄら、１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１−１２３３）。このクローンのＭ．ｇｒｉｓｅａにおける安定性を高めるために、ｐＣＢ７８０をＫｐｎＩで切断し、エクソヌクレアーゼＩＩＩで部分的に消化し、結果として末端小粒反復の１２３ｂｐ（ほぼ完全な反復）を欠失したプラスミドｐＣＢ８０６を得た。次いで、ｐＣＢ８０６をＮｃｏＩおよびＸｂａＩで切断して、挿入ＤＮＡの４．５ｋｂを除去し、残りの挿入物（１９２８ｂｐ）およびベクターを平滑末端化し、ライゲートしなおしてｐＣＢ８１３を作り、上述の機能アッセイを使用して、無傷のＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子を含むことを確認した。ｐＣＢ８１３中の挿入物（２ｋｂ）のヌクレオチド配列を入手し、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプライマーの一部の基礎として使用した（たとえば、ＬＦ２ＣおよびＬＦ２Ｄ）。
【０１０１】
Ｏ−１３７対立遺伝子用に関するＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡの単離
培地で真菌を純粋培養している間に、ＡＶＲ−Ｐｉｔａは、検出可能なレベルで転写されないようであった。従って、本発明者らは、ＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムのコード配列を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ＴｒｐＣプロモーターおよびターミネーターの調節下にある構成的発現ベクターｐＣＢ９６３にサブクローニングした（Ｓｔａｂｅｎら、１９８９）。ｐＣＢ７８０からのＤｒａＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をプローブとして使用したＲＮＡゲルブロット分析で決定したとき、ｐＣＢ９６３で形質転換され、且つ液体培地で成長させた菌株は、ＡＶＲ−Ｐｉｔａを発現した。この形質転換菌株から得たｃＤＮＡクローンで、３つの予想されるイントロンの位置が確認された。
【０１０２】
具体的には、構成的発現ベクターｐＣＢ９６３を以下の通りに作った。余分のＢａｍＨＩ部位およびＣｌａＩ部位を、より小さいＭｌｕＩ−ＳａｃＩ断片を欠失させることによって除去するように、ベクターｐＣＳＮ４３（Ｓｔａｂｅｎら（１９８９）Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔ  ３６：７９−８１）を先ず修飾した。ＣｌａＩ部位（以下の配列番号：１７の下線部）を開始ＡＴＧに配置し、ＢａｍＨＩ部位（以下の配列番号：１８の下線部）を末端小粒末端に配置するために設計した、オリゴヌクレオチドＬＦ２Ｃ（配列番号：１７）およびＬＦ２Ｄ（配列番号：１８）を使用したＰＣＲによって、ＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムのコード配列をクローン化した。
【０１０３】
2005502303.tif 000006
【０１０４】
次いで、ｐＣＳＮ４３におけるＨＰＨのコード配列を、ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化することによって除去し、次いでＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムのコード配列を含有するＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ断片を挿入してｐＣＢ９６３を作った。
【０１０５】
ＲＮＡを精製するために、ｐＣＢ９６３を含有するトランスジェニック真菌を液体培地中で増殖させた。ランダム六量体プライミングを使用してＲＮＡを逆転写し、続いてオリゴヌクレオチドＬＦ２Ｃ（配列番号：１７）およびＬＦ２Ｄ（配列番号：１８）を使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するために、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキットプロトコールを使用した。ＡＶＲ−ＰｉｔａをコードするｃＤＮＡ断片をＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングしてｐＣＢ９７９を作った。
【０１０６】
プライマーＬＦ２Ｈ（配列番号：１９）およびＬＦ１２（配列番号：２０）を使用して、Ｏ−１３７ゲノムＤＮＡクローンｐＣＢ８１３から、４８６ｂｐの機能的プロモーター断片を増幅した。
【０１０７】
2005502303.tif 000007
【０１０８】
クレノーポリメラーゼ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）を使用して６７２ｂｐのＰＣＲ産物を末端充填し、ＣｌａＩで消化し、ｐＣＢ９７９のＣｌａＩ部位およびＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングしてｐＣＢ９８０を作った。
【０１０９】
他の真菌菌株からのＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノムのコード配列のクローニング
表３に示す、プライマーＬＦ２Ｃ（配列番号：１７）、ＬＦ２Ｄ（配列番号：１８）、ＬＦ２Ｃ＊（配列番号：２１）、ＧＢ８４（配列番号：２２）およびＧＢ８５（配列番号：２３）を使用して、菌株Ｇ−１９８、Ｉｎａ  ７２およびＧ−２１３から単離されたゲノムＤＮＡから、ゲノムのコード配列を増幅した。
【０１１０】
2005502303.tif 000008
【０１１１】
いずれの場合にも、得られた９６０ｂｐのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した。ｐＣＢ９８０もＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化し、菌株Ｏ−１３７からの機能的ＡＶＲ−ＰｉｔａプロモーターおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋ベクター配列の両者を含有する３３９４ｂｐの断片をゲル精製した。次いで、消化した９４５ｂｐ  ＰＣＲ産物を３３９４ｂｐのベクター断片にクローニングした。このクローニングステップは、本質的に、７２５ｂｐのＯ−１３７  ＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ断片を、Ｇ−１９８、Ｉｎａ  ７２およびＧ−２１３からのゲノムＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片のそれぞれと置換した。
【０１１２】
【表４】
2005502303.tif 000009
【０１１３】
これまで単離された全てのゲノムＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片は、３つのイントロン配列を含有すると考えられる。下記の通りに、Ｇ−１９８のＡＶＲ−ＰｉｔａをコードするｃＤＮＡクローンを単離することによって、予想されるイントロンのスプライシングを再度確認した。Ｇ−１９８対立遺伝子に関するｃＤＮＡ配列を、配列番号：４で記載する。他の全てのＡＶＲ−Ｐｉｔａクローンについて、当業者に周知の適切なオリゴヌクレオチド類、サブクローニングおよび／またはＰＣＲ技術を使用して、３つのイントロン配列を除去し、ｃＤＮＡクローンを作ることが可能である。Ｉｎａ  ７２からのＡＶＲ−Ｐｉｔａゲノム配列を、配列番号：８（Ｉｎａ  ７２．１）および配列番号：１１（Ｉｎａ  ７２．２）で記載し、またこれらのゲノム配列に由来する対応する予想されるｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号：９および配列番号：１２で記載する。Ｇ−２１３からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片のゲノム配列を、配列番号：１４で記載し、またＡＶＲ−Ｐｉｔａの配列番号：１４に由来するＧ−２１３から予想されるｃＤＮＡ配列を、配列番号：１５で記載する。
【０１１４】
ＧＵＹ１１から病原性対立遺伝子の配列を得るために、プライマーＬＦ２Ｄ（配列番号：１８）およびＬＦ２Ｃ（配列番号：１７）を使用したＰＣＲで、ゲノムＧＵＹ１１  ＤＮＡからＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片を増幅した。このＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した後、直接配列決定した。このようにして得たゲノム配列を、配列番号：５９で記載する。
【０１１５】
図１は、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｏ−１３７、Ｇ−２１３、Ｉｎａ  ７２、Ｇ−１９８、およびＧＵＹ１１から得たヌクレオチド配列から誘導されるＡＶＲ−Ｐｉｔａアミノ酸配列のアラインメントである。
【０１１６】
植物で、推定上の成熟プロテアーゼを発現させるためのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ核酸断片の単離
既述（Ｖａｌｅｎｔら、１９９１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２７：８７）の通りに、また実施例２に記載の通りに、病原体菌株Ｏ−１３７およびＧ−１９８を使用した感染アッセイを実施した。
【０１１７】
ｐＣＢ９８０（配列番号：１）は、上述の方法を使用してクローン化された、Ｏ−１３７  ＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡを含有する。
【０１１８】
プラスミドｐＡＶＲ３は、予想される成熟プロテアーゼに加えて、さらに１つのＮ末端アミノ酸（プレプロタンパク質のＩｌｅ−４７で開始する、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７７）およびベクターｐＭＬ１４２における３５Ｓ／Ａｄｈ１−６プロモーターに融合した開始コドンをコードするＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｏ−１３７からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片（配列番号：２）のヌクレオチド１３９〜６７２を含有する。プライマーＡＶ１（配列番号：２４）およびＡＶ３（配列番号：２５）を使用して、ＰＣＲで、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡからＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片を増幅し、ＰｍｌＩおよびＫｐｎＩで消化し、クレノーポリメラーゼで平滑末端化し、やはりＰｍｌＩおよびＫｐｎＩで切断し且つクレノーポリメラーゼで平滑末端化しておいたｐＭＬ１４２にクローニングし、結果としてｐＡＶＲ３を得た。
【０１１９】
2005502303.tif 000010
【０１２０】
予想される成熟プロテアーゼのコード配列（プレプロタンパク質のＧｌｕ−４８で開始する）を、インフレームＮｃｏＩ部位を含有するオリゴヌクレオチドＹＬ３０（配列番号：２６）およびＹＬ３７（配列番号：２７）を使用して、ＰＣＲ増幅により、プラスミドｐＡＶＲ３におけるＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片（配列番号：２）から得た。
【０１２１】
2005502303.tif 000011
【０１２２】
ＰＣＲ断片を、ｐＭＬ１４２にＮｃｏＩ／ＫｐｎＩでクローニングし、結果としてベクターｐＣＢ１９４７を得た。これは、ｐＡＶＲ３におけるＩｌｅ−４７コドン（ａｔｔ）を除去してＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６を作るために行われた。さらなる詳細は、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ  ００／０８１６２号（その開示内容を参照により本明細書に加入する）に記述されている。
【０１２３】
菌株Ｇ−１９８からＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡ核酸断片を単離するために、プラスミドｐＣＢ１４４７でＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株ＣＰ９８７で形質転換し、このプラスミドを含有する形質転換体を、感受性Ｔｓｕｙｕａｋｅイネに感染させるために使用した。２×１０６胞子／ｍｌのＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株ＣＰ３４０２（ｐＣＢ１４４７で形質転換されたＣＰ９８７）接種の７２時間後に、それぞれ、ＮｃｏＩ部位およびＫｐｎＩ部位を含有するプライマーＧＢ１８３（配列番号：２８）およびＧＢ１８４（配列番号：２９）を使用して、菌株Ｇ−１９８からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ  ｃＤＮＡコード配列を含む核酸断片を、ＲＴ−ＰＣＲにより、感染イネ葉組織から単離されたｍＲＮＡから増幅した。
【０１２４】
2005502303.tif 000012
【０１２５】
ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、これをｐＭＬ１４２（ＷＯ  ００／０８１６２号に記載）にクローニングした。ｐＭＬ１４２をやはりＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化しておき、５．１ｋｂ断片をアガロースゲルから単離し、精製した。当業者によく知られている技術を使用して、消化されたＧ−１９８ＰＣＲ核酸断片を５．１ｋｂ  ｐＭＬ１４２核酸断片にライゲートし、プラスミドｐＣＢ２１４８を作った。
【０１２６】
実施例４
９１８位に表される全２０アミノ酸を有するＰｉ−ｔａプラスミドのライブラリーを作製するための、９１８位におけるＰｉ−ｔａの突然変異誘発
９１８位に表される２０アミノ酸のそれぞれを有する一組の修飾されたＰｉ−ｔａ遺伝子を作るための、コドン９１８におけるＰｉ−ｔａ遺伝子の突然変異は、下記の２段階工程を必要とする。２つのアミノ酸が既に表示されており、Ａ９１８（９１８位のアラニン）は、Ｐｉ−ｔａの抵抗性形に存在し、Ｓ９１８（９１８位のセリン）は感受性形に存在する。
【０１２７】
逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲおよびサブクローニングを使用して、全長Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ断片をクローンニングした。このアプローチは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに作動可能に連結され（ＷＯ  ００／０１８６２号、実施例１０、発現構築物３に記載）、且つノーザンブロットでＰｉ−ｔａを過剰発現することが証明された、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ変種Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉからのゲノムＰｉ−ｔａ核酸断片を含む導入遺伝子を含有するトランスジェニックＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ系統２７−４−８−１からｍＲＮＡを単離することを含んでいた。単離されたｍＲＮＡ分画を鋳型として使用し、オリゴヌクレオチドＧＢ６７（配列番号：３０）をプライマーとして使用して、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１２８】
2005502303.tif 000013
【０１２９】
プライマーＦ１２−１（配列番号：３１）およびＧＢ６７（配列番号：３０）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡから部分的Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ（２．１ｋｂ）を増幅した。
【０１３０】
2005502303.tif 000014
【０１３１】
次いで、ＢａｍＨＩ（Ｐｉ−ｔａ核酸断片に存在する制限部位）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＧＢ６７配列に存在する制限部位）クローニング部位を使用して、これをｐＳＬ１１８０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。全長合成ｃＤＮＡを得るために、Ｐｉ−ｔａコード配列の５′末端を含有する７０６ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＣＢ１６４９から単離し（ＷＯ  ００／０８１６２号に記載）、２０９０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部分Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ断片の上流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、全長プロモーター−ｌｅｓｓ  Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡを作った。ＤＮＡ配列分析で、予想されるＰｉ−ｔａタンパク質を１１９アミノ酸だけ短縮したであろう、フレームシフト突然変異を来たす結果となった、２ｂｐの欠失がコドン７９６に存在することが決定された（ＰＣＲ人工産物の公算が高い）。１４００ｂｐのＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、正確な配列を含有するｐＣＢ１６４９からの対応する断片と置換することによって、これを補正して、ｐＣＢ１９０６を作った。合成ｃＤＮＡで、予想されるイントロンが正確にスプライシングされることも、ＤＮＡ配列分析で決定された。ｐＣＢ１６４９からの３１７３ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＣＢ１９０６のＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることによって、自然のＰｉ−ｔａプロモーター断片（２４２５ｂｐ）を付加し、結果として、イネ変種Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉからの自然のＰｉ−ｔａプロモーター（配列番号：５７におけるヌクレオチド１〜２４２５）およびＰｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ（配列番号：５７におけるヌクレオチド２４２６〜５２１１）の２４２５ｂｐを含む最終的Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ構築物（図２Ｃ）を含むプラスミドｐＣＢ１９２６を得た。この部分Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の推定されるアミノ酸配列を、配列番号：５８で記載する。
【０１３２】
プライマーＧＢ６１（配列番号：３２）およびＧＢ６７（配列番号：３０）を使用したＰＣＲ反応で、感受性Ｃ１０１Ａ５１イネ（Ｍａｃｋｉｌｌ  ａｎｄ  Ｂｏｎｍａｎ（１９９２）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８２：７４６−７４９）ゲノムＤＮＡからの感受性Ｐｉ−ｔａ核酸断片を増幅することによって、プラスミドｐＣＢ２０２０を作った。
【０１３３】
2005502303.tif 000015
【０１３４】
結果として得られた４４０ｂｐのＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同酵素で消化しておいたプラスミドｐＣＢ１９２６にクローニングした（および対応する４９００ｂｐの核酸断片をアガロースゲルから単離して精製した）。このクローニングステップで、コドン９１８がＡではなくＳをコードすること以外は、ｐＣＢ１９２６と全く同じであるプラスミドｐＣＢ２０２０が生じた。
【０１３５】
ＰＣＲプライマーＧＢ６０（配列番号：３３）および一組の１８プライマー（ＧＢ１６４〜ＧＢ１７９、ＧＢ１８１およびＧＢ１８２（配列番号：３４〜５１））を１８の別々のＰＣＲ反応で使用して（各プライマーにつき１反応）、先ず、プラスミドｐＣＢ１９２６からの断片を増幅することにより、残りの１８のアミノ酸修飾をＰｉ−ｔａに導入した。
【０１３６】
2005502303.tif 000016
2005502303.tif 000017
【０１３７】
結果として生じた４４０ｂｐのＰＣＲ核酸断片をＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで消化し、３２２ｂｐの断片を、同酵素で消化しておいたプラスミドｐＣＢ２１１４（以下に記載）にライゲートした。これによって、プラスミドｐＣＢ２１１４における抵抗性Ｐｉ−ｔａの３２２ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ断片が、変化したコドンを９１８位に含有する核酸断片と置換された。このクローニングステップで、プラスミドｐＣＢ２１５３〜ｐＣＢ２１７０（表Ｘ）を生じた。プラスミドｐＣＢ２１１４は、ＷＯ  ００／０１８６２号に記載のＰｉ−ｔａロイシンリッチドメイン（ＬＲＤ）をコードするヌクレオチド配列を含み、これを、プライマーＧＢ４７（配列番号：５２）およびＧＢ１０７（配列番号：５３）を用いたＰＣＲ反応で増幅した。１０５０ｂｐのＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、同酵素で消化しておいたプラスミドｐＧＡＬ４−ＢＤ−Ｃａｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。
【０１３８】
2005502303.tif 000018
【０１３９】
第２のクローニングステップは、プラスミドｐＣＢ２１５３〜ｐＣＢ２１７０における修飾されたＰｉ−ｔａ断片を、１８の別々のＰＣＲ反応で、プライマーＧＢ６０（配列番号：３３）およびＧＢ６７（配列番号：３０）を用いて増幅することが必要であった。ＧＢ６７（配列番号：３０）は、ＴＧＡ終止コドンの後にＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を付加した。結果として生じた１８のＰＣＲ断片を、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同酵素で消化しておいたプラスミドｐＣＢ１９２６にクローニングした（および対応する４９００ｂｐの核酸断片を、アガロースゲルから単離して精製した）。このクローニングステップで、プラスミドｐＣＢ２１７１〜ｐＣＢ２１８８が生じた（表４）。表４で、プラスミドに含まれる核酸断片によってコードされるＰｉ−ｔａタンパク質の９１８位におけるアミノ酸に関して、プラスミドが識別される。たとえば、ｐＣＢ２１５３（３行目）は、９１８位のアミノ酸が、アラニン残基（Ａ）の代わりにグルタミン酸残基（Ｅ）であるＰｉ−ｔａタンパク質をコードする核酸断片を含み、この変化は、オリゴヌクレオチド配列番号：３３および配列番号：３４（２列目）を使用して、上述通りにＰＣＲによりＰｉ−ｔａヌクレオチド配列を変えることによって引き起こされたことがこの表からわかる。次いで、プラスミドｐＣＢ２１５３を使用して、上述の通りにｐＣＢ２１７１（４列目）を作った；ｐＣＢ２１７１は、実施例５に記載の一過性分析アッセイ実験で実際に使用されたものであった（「一過性分析アッセイプラスミド」）。ＷＯ  ００／０１８６２号の実施例７に記載されているプライマーを使用して配列決定することにより、これらの各プラスミドの配列を検証した。この結果生じたプラスミドｐＣＢ２１７１−ｐＣＢ２１８８、ｐＣＢ１９２６およびｐＣＢ２０２０のセットは、自然の２４２４ｂｐのＰｉ−ｔａプロモーター核酸断片に連結された９１８位に、全２０の可能なアミノ酸組合せを有するＰｉ−ｔａ核酸断片を表した。
【０１４０】
【表５】
2005502303.tif 000019
【０１４１】
実施例５
Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｇ−１９８からの病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子に対する、修飾されたＰｉ−ｔａ遺伝子によるＰｉ−ｔａ仲介抵抗性誘発の有効性を試験するための、一過性粒子衝撃アッセイ
非病原性Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｏ−１３７からのＡＶＲ−Ｐｉｔａは、Ｐｉ−ｔａを含有する抵抗性イネで過敏感反応を誘発するが、病原性Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｇ−１９８からのａｖｒ−ｐｉｔａは誘発しないことが、粒子衝撃で証明される。
当業者には標準的な手法であるが、当該組換え発現構築物で被覆された粒子を用いた植物組織の高速微粒子銃衝撃によって、導入されたプラスミドから核酸断片が一時的に発現する。過敏感細胞死抵抗性応答の誘発についてアッセイするための、レポーター遺伝子発現を使用した一過性葉衝撃実験で、病害抵抗性遺伝子の機能を証明することができる。このようなアッセイは、Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子の機能分析に有用なことが証明されており、またＷＯ  ００／０８１６２号に記載されている。
【０１４２】
真菌ＡＶＲ−遺伝子を植物組織内に一様に組み込むための障害を克服するために、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ発現構築物の導入を、ＧＵＳレポーター遺伝子との同時衝撃によって試験した。特に、植物細胞における構成的発現に関して３５Ｓプロモーターの調節下にある菌株Ｏ−１３７（ｐＣＢ１９４７）およびＧ−１９８（ｐＣＢ２１４８）から推定上の成熟プロテアーゼ（ＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６）を発現する構築物を操作した。
【０１４３】
Ｐｉ−ｔａ含有植物細胞内に誘導されたとき、菌株Ｏ−１３７およびＧ−１９８からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６構築物の同時発現がＰｉ−ｔａ仲介防御応答を誘発するかどうかを決定するために、３５Ｓ／Ａｄｈ１−６：：ＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６遺伝子構築物を含有するｐＣＢ１９４７またはｐＣＢ２１４８および３５Ｓ：：ＧＵＳレポーター遺伝子を含有するｐＭＬ６３（ＷＯ  ００／０８１６２に記載）で、Ｐｉ−ｔａ−植物（Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉおよびＹＴ１４）およびＰｉ−ｔａを欠く植物（ＮｉｐｐｏｎｂａｒｅおよびＹＴ１６）からの実生を同時衝撃した。ＹＴ１４およびＹＴ１６は、ＷＯ  ００／０８１６２に記載されている。Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅは、広く研究されている（たとえば、Ｍａｏら（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １０：９８２−９９０）イネ変種である。種子を、葉アッセイ培地（カゼイン加水分解物１００ｍｇおよび０．５％アガロースを加えた１／２強度のＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４９７）で、１週間、２５℃のインキュベーター内で、１００μＥｍ−２ｓ−１の涼しい白色光を用いた１２時間光周期で４８時間、発芽させた。外科用レザーを使用して二葉実生を寒天培地から切除し、前もって濡らした濾紙が入っているペトリ皿に入れた。確認用に、苗の基部に油性マーカーで標識を付けた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ装置および１１５０−ｐｓｉ破裂板を使用して、実生の微粒子銃衝撃を実施した。製造業者が提供した説明書に従って、金粒子（直径０．６μｍ）を作製した。同時衝撃用に、金粒子１μｇを、３５Ｓ／ＧＵＳ  １．５μｇおよび他のプラスミド１μｇで被覆した。衝撃後、実生を、前もって濡らした濾紙が入っているペトリ皿内で、２５℃にて４８時間維持した。葉を７０％エタノールできれいにし、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）を基質として使用してβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を組織化学的にアッセイした（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８７，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ．５：３８７−４０５）。
【０１４４】
ＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６発現構築物ｐＣＢ１９４７は、内因性Ｐｉ−ｔａ遺伝子を含有するＹＴ１４葉に、ＧＵＳ構築物と共に同時衝撃したとき、ＧＵＳ発現の顕著な低減をもたらした（発現前の細胞死を示唆する）。この作用は、同じ方式で処理した感受性ＹＴ１６葉では確認されなかった。構築物ｐＣＢ２１４８における病原性形ＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６は、抵抗性ＴＹ１４葉または感受性ＹＴ１６葉のいずれでも、ＧＵＳ発現を減少させなかった。従って、内因性Ｐｉ−ｔａ遺伝子を含有するイネ葉に直接誘導されたとき、Ｏ−１３７からのＡＶＲ−Ｐｉｔａコード配列の発現のみがイネ防御応答を誘発した。
【０１４５】
この実験の第２部では、第３の構築物ｐＣＢ１９２６を加えた。Ｐｉ−ｔａ−植物からの実生（Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉおよびＹＴ１４）およびＰｉ−ｔａを欠く植物（ＮｉｐｐｏｎｂａｒｅおよびＹＴ１６）を、３５Ｓ／Ａｄｈ１−６：：ＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６遺伝子構築物ｐＣＢ１９４７またはｐＣＢ２１４８、その自然のプロモーター（ｐＣＢ１９２６）の調節下にあるＰｉ−ｔａ  ｃＤＮＡおよび３５Ｓ：：ＧＵＳレポーター遺伝子で同時衝撃した。この場合、感受性ＹＴ１６イネ葉は、抵抗性ＹＴ１４イネ葉と同じ方式で菌株Ｏ−１３７からの非病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６構築物に応答した。従って、Ｐｉ−ｔａを感受性イネ葉に外因的に加えて、ＡＶＲ−Ｐｉｔａに対するＨＲ応答を誘発することが可能である。病原性菌株Ｇ−１９８からの病原性ａｖｒ−Ｐｉｔａ構築物に対するＨＲ応答は全く認められなかった。
【０１４６】
このアッセイは、上の実施例４に記載の１８の新しいＰｉ−ｔａ変異形を、それらが病原性ａｖｒ−Ｐｉｔａタンパク質に応答してＨＲを誘発する新規なＰｉ−ｔａタンパク質をコードする能力について試験する、次の実験の基礎を築く。
【０１４７】
９１８位で変化したＰｉ−ｔａタンパク質をコードするＰｉ−ｔａ一過性発現ベクターの試験
上の実施例４に記載の２０のベクター（ｐＣＢ１９２６、ｐＣＢ２０２０およびｐＣＢ２１７１〜ｐＣＢ２１８８を、上述の条件を使用した一過性アッセイで試験した。全てを、３５Ｓ：：ＧＵＳレポーター遺伝子を含有するｐＭＬ６３、および異なる３５Ｓ／Ａｄｈ１−６：：ＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６遺伝子構築物を含有するｐＣＢ１９４７またはｐＣＢ２１４８のいずれかで同時衝撃した。表５に結果をまとめる。表中、「−」は過敏感反応（ＡＶＲ−ＰｉｔａとＰｉ−ｔａ遺伝子産物との間には生産的認識がある）を示すＧＵＳ染色の欠如を示し；「＋／−」は、ＡＶＲ−ＰｉｔａとＰｉ−ｔａ遺伝子産物との間で生産的認識を示す可能性がある２、３の希少ＧＵＳ遺伝子座を示し；「＋」は、次善ではあるが、ＡＶＲ−ＰｉｔａとＰｉ−ｔａ遺伝子産物との間の可能な認識を示す少数のＧＵＳ遺伝子座を示し；「＋＋」および「＋＋＋」は、ＡＶＲ−ＰｉｔａとＰｉ−ｔａ遺伝子産物との間の生産的認識を示さない多数のＧＵＳ遺伝子座を示す。プレート１および２は、各ＡＶＲ−Ｐｉｔａ／Ｐｉ−ｔａ組合せの２つの複製を示し、各プレートは試験した実生を２つ有する。「反復」は、ある特定の実験を繰り返した回数を示す。
【０１４８】
【表６】
2005502303.tif 000020
【０１４９】
Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉを様々なＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株に曝露したときに見られる病害表現型と一致して、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉ（Ａ９１８）からのＰｉ−ｔａタンパク質は、Ｏ−１３７からのＡＶＲ−Ｐｉｔａタンパク質を認識する（ｉｎ  ｐｌａｎｔａで、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉをＯ−１３７に曝露したとき、結果として病害抵抗性表現型になる）が、Ｇ−１９８からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ形を認識しない（ｉｎ  ｐｌａｎｔａで、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉをＧ−１９８に曝露したとき、結果として病害感受性表現型になる）ことが表５からわかる。加えて、表５に記載の結果から、非病原性（Ｏ−１３７からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ）および病原性（Ｇ−１９８からのａｖｒ−ｐｉｔａ）ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子産物の両者を認識する、ＭまたはＣに変化したアミノ酸９１８を有するＰｉ−ｔａタンパク質をコードする２つのＰｉ−ｔａ構築物が同定された。表から分かるように、Ｍ９１８Ｐｉ−ｔａは、他の構築物と共に同時衝撃されたＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子がないとき、多数のＧＵＳ遺伝子座をもたらし、単独では、Ｍ９１８は過敏感反応を引き起こせないことを示した；このことから、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子が存在するときに見られたＧＵＳ遺伝子座が存在しなかったのは、確かにＡＶＲ−ＰｉｔａとＰｉ−ｔａ遺伝子産物との間の生産的認識に起因し、過敏感反応につながるＰｉ−ｔａタンパク質の自己活性化のような他の理由からではないことが分かった。９１８位にＩを有する別の形は、病原性Ｇ−１９８対立遺伝子のみを認識するが、Ｏ−１３７対立遺伝子を認識しなかったため、Ｙａｓｈｉｒｏ−ｍｏｃｈｉ（Ａ９１８）からのＰｉ−ｔａタンパク質に比べて変わった特異性を有していた。Ｒ，Ｋ，Ｎ，Ｌ，およびＱを９１８位に含有するタンパク質をコードする他の構築物も、Ｇ−１９８対立遺伝子を認識する結果となった。
【０１５０】
以上のデータから、Ｐｉ−ｔａタンパク質の９１８位のアミノ酸を変えることによって、Ｐｉ−ｔａが認識するＡＶＲ−Ｐｉｔａ対立遺伝子の範囲を変更できることが示唆される。結果として、Ｍ、Ｃ、Ｉ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、ＬおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸を９１８位に有するＰｉ−ｔａタンパク質をコードする修飾されたＰｉ−ｔａ核酸断片でイネを形質転換することによって、Ｍ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｇ−１９８および／または配列番号：でみられ且つＨＲまたは病害抵抗性応答を経験するものに実質的に類似したＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子を含有する他の菌株を認識できるトランスジェニックイネ植物を得ることが可能である。
【０１５１】
さらに、Ｍ、Ｃ、Ｉ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、ＬおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸を９１８位に有するＰｉ−ｔａタンパク質をコードする修飾されたＰｉ−ｔａ核酸断片を、既に機能的Ｐｉ−ｔａ（Ａ９１８）を有するイネ変種に導入することができ、結果として広範囲のＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株に対する病害抵抗性応答を開始することができる系統が生じる。
【０１５２】
実施例６
安定したイネ形質転換のための、修飾されたＰｉ−ｔａタンパク質をコードするキメラ遺伝子の構築
実施例５で同定されたＰｉ−ｔａの変形をコードする核酸断片を含むプラスミドは、ベクターｐＣＢ１９２６を使用して構築され、そのため、ターミネーター配列を含まない。安定したイネ形質転換の場合、ベクターｐＣＢ２０２２は、自然のＰｉ−ｔａプロモーター配列の２４２４ｂｐおよびＰｉ−ｔａコード配列の２７８４ｂｐに加えて、Ｉｎ２−１ターミネーター配列（配列番号：６０）を含むため、Ｐｉ−ｔａ核酸断片に好ましいＰｉ−ｔａフォーマットである。プラスミドｐＣＢ２０２２はＡＴＣＣに寄託されている。前駆体プラスミドｐＣＢ２０２１を作るために、部分的消化（第２のＥｃｏＲＩ部位がＰｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ核酸断片内にあるため）を使用して、５２２２ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｐｉ−ｔａ核酸断片全部をプラスミドｐＣＢ１９２６から切除し、プラスミドＬｉｔｍｕｓ２８ａ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の同一部位にクローニングした。次いで、プラスミドｐＣＢ２０２１をＡｇｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、５０１ｂｐのＡｇｅＩ−ＫｐｎＩ  Ｉｎ２−１ターミネーター核酸断片を同一部位にクローニングして、ｐＣＢ２０２２を作った。Ｉｎ２−１ターミネーター配列は、プライマーＧＢ１８８（配列番号：５４）およびＧＢ１８９（配列番号：５５）を使用して、Ｉｎ２−１ターミネーター配列（たとえば、米国特許第５，３６４，７８０号（その開示内容を参照により本明細書に援用する）に開示のｐＪＥ５１４、ｐＪＥ５１６、およびｐＴＤＳ１３６）を含有するプラスミドから増幅し、次いでＡｇｅＩおよびＫｐｎＩで消化してもよい。
【０１５３】
2005502303.tif 000021
【０１５４】
９１８位におけるアミノ酸変化がＭ、Ｃ、Ｉ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、ＬおよびＱからなる群から選択され且つ安定なイネ形質転換に適する、Ｐｉ−ｔａタンパク質をコードする、実施例５で同定された修飾されたＰｉ−ｔａ核酸断片を、２段階クローニングステップで作ることができる。ｐＣＢ２１７６、ｐＣＢ２１８０、ｐＣＢ２１７７、ｐＣＢ２１７３、ｐＣＢ２１７４、ｐＣＢ２１７５、ｐＣＢ２１８５、またはｐＣＢ２１８３からの２．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をベクターｐＣＢ２０２１にクローニングして、ｐＣＢ２０２１に存在する野生型Ｐｉ−ｔａ核酸断片からの対応する断片を置換することができる。次いで、ＡｇｅＩおよびＫｐｎＩで消化することによって５０１ｂｐのＡｇｅＩ−ＫｐｎＩ  Ｉｎ２−１  ターミネーター核酸断片をベクターｐＣＢ２０２２から切除し、やはりＡｇｅＩおよびＫｐｎＩで消化しておいた新しいベクター上の同一部位にクローニングすることができる。次いで、以下の実施例７に記載する通り、これらの新しいベクターを、安定したイネ形質転換で使用することができる。
【０１５５】
実施例７
安定なイネ形質転換による、実施例６からの修飾されたＰｉ−ｔａタンパク質をコードするキメラ遺伝子の試験
ハイグロマイシンに対する抵抗性を与える、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓからの細菌性ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨｐｔＩＩ）遺伝子を、イネ形質転換用選択可能マーカーとして使用することができる。使用することが可能であったベクター（ｐＭＬ１８）の場合、Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓからの３５ＳプロモーターおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのオクトピンシンターゼ遺伝子からの終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルで、ＨｐｔＩＩ遺伝子を操作しておいた。ｐＭＬ１８は、１９９７年１２月１８に公開されたＷＯ９７／４７７３１号に記載されており、その開示内容を参照により本明細書に援用する。
【０１５６】
発芽Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ種子の胚盤に由来する胚形成カルス培養は、形質転換実験用原材料の役割を果たすことができる。この材料は、無菌のイネ種子を、２７〜２８℃、暗所にて、カルス開始培地（ＭＳ塩類、ＮｉｔｓｃｈおよびＮｉｔｓｃｈビタミン類、１．０ｍｇ／リットル２，４−Ｄおよび１０μＭ  ＡｇＮＯ３）で発芽させることによって作ることができる。次いで、胚の胚盤からの胚形成カルス増殖をＣＭ培地（Ｎ６塩類、ＮｉｔｓｃｈおよびＮｉｔｓｃｈビタミン類、１ｍｇ／リットル２，４−Ｄ，Ｃｈｕら、１９８５，Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ  １８：６５９−６６８）に移した。２週間隔で定期的に継代培養することにより、ＣＭでカルス培養を維持し、開始の１０週以内に形質転換に使用することができる。
【０１５７】
ＣＭ培地上に載せたＷｈａｔｍａｎ  ＃５４１紙の円の中央、直径約４ｃｍの円形領域内に配置された、およそ１ｍｍ離れた０．５〜１．０ｍｍの一部を継代培養することによって、形質転換用のカルスを作製することができる。次いで、カルスを含むプレートを、暗所で２７〜２８℃にて３〜５日間、インキュベートする。衝撃前に、カルスを含む濾紙を、０．２５Ｍマンニトールおよび０．２５Ｍソルビトールを加えたＣＭに、暗所で３時間移す。次いで、無菌フード内で、ペトリ皿の蓋を、２０〜４５分間、半開きにしておき、組織上の水分を四散させる。
【０１５８】
２つの異なるプラスミド、たとえば、イネ形質転換用の選択可能マーカーを含有するｐＭＬ１８、および修飾されたＰｉ−ｔａ核酸断片を含有するベクターからの円形プラスミドＤＮＡを、金粒子の表面上に同時沈澱させることができる。これを遂行するために、ＤＮＡ合計１０ｇを、形質：選択可能マーカーＤＮＡ  ２：１の比率で、６０ｍｇ／ｍｌ−１の濃度で再懸濁した金粒子のアリコート５０リットルに加える。次いで、この金−ＤＮＡ懸濁液に塩化カルシウム（２．５Ｍ溶液５０リットル）およびスペルミジン（０．１Ｍ溶液２０リットル）を加え、チューブを３分間渦巻攪拌する。この金粒子を微量遠心分離機で１秒間遠心分離し、上澄を除去する。次いで金粒子を無水エタノール１ｍｌで２回洗浄し、無水エタノール５０リットル中に再懸濁し、１秒間、超音波処理（バス超音波処理器）して、金粒子を分散させる。次いで金懸濁液を−７０℃で５分間インキュベートし、粒子を分散させる必要があれば、超音波処理（バス超音波処理器）する。次いで、６リットルのＤＮＡ被覆金粒子をマイラーマクロキャリヤディスクに載せ、エタノールを蒸発させる。
【０１５９】
乾燥期間の終わりに、組織が入っているペトリ皿をＰＤＳ−１０００／Ｈｅチャンバに入れる。次いで、チャンバ内の空気を２８〜２９インチＨｇの真空度まで排除する。衝撃波管内のＨｅ圧が１０８０〜１１００ｐｓｉに達したとき破裂する破壊膜を使用して、マクロキャリヤをヘリウム衝撃波で加速する。組織を停止スクリーンからおよそ８ｃｍに置き、カルスを２回衝撃する。この方式で、５〜７プレートの組織を、ＤＮＡ被覆金粒子衝撃する。衝撃後、ソルビトールまたはマンニトールを補足していないＣＭ培地に、このカルス組織を移す。
【０１６０】
衝撃後３〜５日以内に、カルス組織をＳＭ培地（５０ｍｇ／リットルのハイグロマイシンを含有するＣＭ培地）に移す。これを遂行するために、カルス組織を、プレートから滅菌５０ｍｌコニカルチューブに移し、重量を測る。上層寒天２．５ｍｌ／カルス１００ｍｇを使用して、４０℃の溶融上層寒天を加えることができる。１０ｍｌピペットでディスペンシングを繰り返すことにより、カルス凝集塊を直径２ｍｍ未満の断片に分割する。カルス懸濁液のアリコート３ｍｌを、新鮮なＳＭ培地上にプレーティングし、このプレートを、暗所で、２７〜２８℃にて４週間インキュベードする。４週間後、トランスジェニックカルス事象が確認され、新鮮なＳＭプレートに移し、暗所で、２７〜２８℃にてさらに２週間成長させる。
【０１６１】
成長中のカルスを、暗所で、２５℃にて、２週間、ＲＭ１培地（ＭＳ塩類、Ｎｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｔｓｃｈビタミン類、２％スクロース、３％ソルビトール、０．４％ゲルライト＋５０ｐｐｍ  ｈｙｇ  Ｂ）に移す。２週間後、カルスをＲＭ２培地（ＭＳ塩類、Ｎｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｔｓｃｈビタミン類、３％スクロース、０．４％ゲルライト＋５０ｐｐｍ  ｈｙｇ  Ｂ）に移し、２５℃および３０〜４０％湿度にて、１２時間光周期の涼しい白色光（〜４０μＥｍ−２ｓ−１）下に置くことができる。明るい所に２〜４週置いた後、カルスは組織化し始め、苗条を形成する。次いで、周囲のカルス／培地から苗条を取り出し、フィタトレー（ｐｈｙｔａｔｒａｙ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中のＲＭ３培地（１／２ｘＭＳ塩類、Ｎｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｔｓｃｈビタミン類、１％スクロース＋５０ｐｐｍハイグロマイシンＢ）に静かに移し、前ステップに記載されている条件と同じ条件を使用して、インキュベーションを続ける。
【０１６２】
２〜３週間後、十分な根および苗条の成長が起きたとき、植物を、ＲＭ３から、Ｍｅｔｒｏミックス３５０が入っている４″鉢に移す。１２時間／１２時間  明／暗サイクルを使用し、〜３０／１８℃  日中／夜間温度方式を使用して、植物を成長させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
非病原性および病原性ＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片によってコードされる推定されるアミノ酸配列を比較する図である。非病原性菌株Ｏ−１３７およびＧ−２１３からのＡＶＲ−Ｐｉｔａ核酸断片、および菌株Ｉｎａ  ７２からの第１の配列（Ｉｎａ  ７２．１）は、非病原性を与えることが証明されている（実施例５）。第２のＩｎａ  ７２配列（Ｉｎａ  ７２．２）をコードする核酸断片および病原性菌株Ｇ−１９８およびＧｕｙ１１からの断片は、非病原性を与えない（実施例５）。菌株Ｏ−１３７からのＡＶＲ−Ｐｉｔａの推定されるアミノ酸配列との唯一の差を示す。同一のアミノ酸を、ダッシュ（−）で示し、アラインメントを最大化するために導入されるギャップを点（．）で示す。下線を付したアミノ酸は、推定上のプロテアーゼモチーフを示す。
【図２】
プラスミドｐＣＢ１９４７、ｐＭＬ６３およびｐＣＢ１９２６における構築物の線図である。
Ａ．ｐＣＢ１９４７は、一過性発現実験用の、推定上の成熟プロテアーゼを直接コードするように操作されたＡＶＲ−Ｐｉｔａ単離された核酸断片（以前は、ＡＶＲ２−ＹＡＭＯと呼ばれた）を含む。ＡＶＲ−Ｐｉｔａ１７６と呼ばれる、このプロセッシングされた形の単離された核酸断片は、配列番号：６に記載されているアミノ酸４８〜２２３を含むポリペプチドをコードする。クローニング過程で使用されるＮｃｏＩ部位を介して、開始メチオニンを構築物に付加した。インフレームＮｃｏＩ部位を含有するプライマーＹＬ３０（配列番号：２６）およびＫｐｎＩ部位を含有するＹＬ３７（配列番号：２７）を使用したＰＣＲでＡＶＲ−Ｐｉｔａコード配列を先ず増幅し、ｐＭＬ１４２のＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ部位にクローニングし、結果としてベクターｐＣＢ１９４７を生じた。３５Ｓプロモーターの下流に挿入されたトウモロコシＡｄｈ１−６イントロンは、単子葉植物における発現を増強する結果となった。このイントロンは、Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１５：９１３−９２０に記載されている。
Ｂ．ｐＭＬ６３は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよび３′ＮＯＳ配列に作動可能に連結されたｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ酵素をコードする）を含有する。ｐＭＬ６３は、最小限の３′ＮＯＳターミネーター断片を作るために、ｐＭＨ４０から修飾される。ｐＭＨ４０は、１９９８年４月２３に公開されたＷＯ９８／１６６５０号（その開示内容を参照により本明細書に援用する）に記載されている。当業者によく知られている標準技術を使用して、ｐＭＨ４０に含まれる７７０ｂｐのターミネーター配列を、Ｄｅｐｉｃｋｅｒら（１９８２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７４）により公開された配列のヌクレオチド１２７７〜１５５６を含む新しい３′ＮＯＳターミネーター配列と置換した。
Ｃ．ｐＣＢ１９２６は、プライマーＦ１２−１（配列番号：３１）およびＧＢ６７（配列番号：３０）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡからの２．１ｋｂ部分Ｐｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ核酸断片を先ず増幅することによって作られたＰｉ−ｔａ  ｃＤＮＡ構築物を含有する。合成の全長ｃＤＮＡは、ｐＣＢ１６４９からのゲノムＰｉ−ｔａ遺伝子の５′末端を含有する７０６ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を組み入れることによって作り、プラスミドｐＣＢ１９０６を生じる結果となった。次いで、合成ｃＤＮＡ核酸断片の末端の７３６ｂｐの５′末端を置換するために、自然のＰｉ−ｔａプロモーター配列の２４２５ｂｐ（ｐＰｉ−ｔａ）および５′Ｐｉ−ｔａコード配列の７３６ｂｐを含有するｐＣＢ１６４９からの３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＣＢ１９０６のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＣＢ１９２６を作った。
【図３】
ＡＶＲ−Ｐｉｔａコピー数のＤＮＡゲノムブロット分析。表示した菌株からのＭ．ｇｒｉｓｅａゲノムＤＮＡを、既述通りに単離し（Ｓｗｅｉｇａｒｄら、１９９５，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１２２１−１２３３）、Ｅｃｏ  ＲＩで消化し、アガロースゲルにより電気泳動的に分画し、フィルター上にブロットし、標準分子生物学プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）を使用して、ＡＶＲ−Ｐｉｔａ断片で精査した。ＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子にはＥｃｏＲＩ部位が全くないため、レーン当たりのバンド数は、その特定のＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株に存在するＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子の数を示す。たとえば、一番左のレーンは、２つのバンドを示すＭ．ｇｒｉｓｅａ菌株Ｇ−１９８の結果を示し、Ｇ−１９８は２つのＡＶＲ−Ｐｉｔａ遺伝子を有することを示す。図の左の境界に沿った短い水平線は、２３．１ｋｂ、９．４ｋｂ、６．６ｋｂ、４．４ｋｂ、２．３、および２．０ｋｂの全サイズのλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物からのＤＮＡサイズマーカーの位置を示す。
【国際公開パンフレット】
2005502303.tif 000022
2005502303.tif 000023
2005502303.tif 000024
2005502303.tif 000025
2005502303.tif 000026
2005502303.tif 000027
2005502303.tif 000028
2005502303.tif 000029
2005502303.tif 000030
2005502303.tif 000031
2005502303.tif 000032
2005502303.tif 000033
2005502303.tif 000034
2005502303.tif 000035
2005502303.tif 000036
2005502303.tif 000037
2005502303.tif 000038
2005502303.tif 000039
2005502303.tif 000040
2005502303.tif 000041
2005502303.tif 000042
2005502303.tif 000043
2005502303.tif 000044
2005502303.tif 000045
2005502303.tif 000046
2005502303.tif 000047
2005502303.tif 000048
2005502303.tif 000049
2005502303.tif 000050
2005502303.tif 000051
2005502303.tif 000052
2005502303.tif 000053
2005502303.tif 000054
2005502303.tif 000055
2005502303.tif 000056
2005502303.tif 000057
2005502303.tif 000058
2005502303.tif 000059
2005502303.tif 000060
2005502303.tif 000061
2005502303.tif 000062
2005502303.tif 000063
2005502303.tif 000064
2005502303.tif 000065
2005502303.tif 000066
2005502303.tif 000067
2005502303.tif 000068
2005502303.tif 000069
2005502303.tif 000070
2005502303.tif 000071
2005502303.tif 000072
2005502303.tif 000073
2005502303.tif 000074
2005502303.tif 000075
2005502303.tif 000076
2005502303.tif 000077
2005502303.tif 000078
2005502303.tif 000079
2005502303.tif 000080
2005502303.tif 000081
2005502303.tif 000082
2005502303.tif 000083
2005502303.tif 000084
2005502303.tif 000085
2005502303.tif 000086
2005502303.tif 000087
2005502303.tif 000088
2005502303.tif 000089
2005502303.tif 000090
2005502303.tif 000091
2005502303.tif 000092
2005502303.tif 000093
2005502303.tif 000094
2005502303.tif 000095
2005502303.tif 000096
2005502303.tif 000097
2005502303.tif 000098